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側坐核のノルアドレナリンおよびドパミン放出制御機構の研究

口腔ジスキネジアは顎顔面の不随意な反復運動で,加齢以外にパーキンソン病治療薬または抗精神病薬の副作用として誘発される。口腔ジスキネジア発症メカニズムの詳細は不明だが,側坐核や線条体へ投射する中枢ドパミン神経の機能亢進が顎の常同運動を惹起することが,ラットを用いた行動学的研究から示されている。本研究で申請者らは,側坐核のドパミン神経活動制御におけるアドレナリン受容体の役割について無麻酔非拘束ラットを用いin vivo脳微小透析法により検討した。中脳ー辺縁系dopamine(DA)神経が投射する側坐核には,青斑核や延髄腹側部からのnoradrenaline(NA)神経が入力している。側坐核では,DA神経終末に分布するβ受容体刺激を介してNA神経がDA放出を促進的に制御することを我々は報告してきた(Eur J Pharmacol. 2008, 601, 94-98)。一方,β受容体にはβ1とβ2の少なくとも2種類のサブタイプがあり,いずれも側坐核に分布している。当該年度は,無麻酔非拘束ラットを用いたin vivo脳微小透析法により,側坐核におけるβ受容体を介したDA神経活動促進へのβ1とβ2受容体サブタイプの関与について検討した。β1受容体agonistのdobutamine(DOB),β2受容体agonistのsalbutamol(SAL),非選択的β受容体antagonistのpropranolol(PRO)はいずれも灌流液に溶解して,側坐核へ微小透析プローブを介して単独または併用灌流投与した。以上の結果から,側坐核のDA神経終末に分布するβ1およびβ2受容体はそれぞれ単独ではなく同時に刺激することによってDA神経活動を促進することが示された。青斑核および延髄腹側部のノルアドレナリン(NA)神経は,中脳ー辺縁系ドパミン(DA)神経が投射する側坐核へ入力している。我々はα1受容体の作動薬のmethoxamineまたは拮抗薬のprazosinのラットの側坐核への灌流投与実験から,側坐核ではα1受容体が同部位のDA放出を抑制的に調節することを報告してきた(Saigusa et al., 2012)。一方,α1受容体にはα1A,α1B,α1Dの3つのサブタイプがあるが,これら受容体のmethoxamineの惹き起した側坐核のDA量の減少への関与は明らかでない。そこで本研究では,α1受容体の各サブタイプの選択的拮抗薬がmethoxamineの誘発した側坐核のDA放出低下を抑制するか否かを指標として,α1受容体サブタイプがmethoxamineの効果発現において果たす役割について検討した。実験にはS-D系雄性ラット(体重約200 g)を用いた。脳微小透析法により,無麻酔非拘束の条件下で側坐核から回収した細胞外液に含まれるNAおよびDAをHPLC-ECD法で20分毎に定量した。使用薬物は灌流液に溶解し,透析プローブから逆透析で側坐核に局所灌流投与した。Methoxamineの投与の結果,基礎NA量に目立った変化はなかったがDA放出は約20%減少した。このmethoxamineによるDA放出減少は,基礎NAおよびDA放出に影響がない用量の5-methylurapidil(α1A受容体拮抗薬),cyclazosin(α1B受容体拮抗薬),BMY 7378(α1D受容体拮抗薬)をそれぞれ前投与したところ,ほぼ完全に消失した。以上の結果から,α1受容体作動薬のmethoxamineが示す側坐核のDA放出抑制の発現には,同部位のDA神経終末上のα1A,α1B,α1Dの各受容体を同時に刺激する必要があることが示唆された。我々は内因性μ受容体agoinst候補物質のendomorphin(EM)類はラットの側坐核へ灌流投与すると,EM-1とは異なりEM-2はopioid受容体を介さずにドパミン(DA)神経活動を促進することを報告している。側坐核にはμ受容体が発現したアセチルコリン(Ach)神経が分布しているが,EM類が同部位のAch神経に及ぼす影響は明らかでない。そこでμ受容体antagonistのCTOPとμ1受容体antagonistのnaloxonazineを用い,側坐核のAch神経活動へのEM類の作用をμ受容体の役割の面から検討した。EM類が側坐核のDA神経活動に及ぼす効果についても観察した。側坐核の細胞外AchまたはDA量は,in vivo脳微小透析法により15または20分毎に測定した。灌流液にはAch分解酵素阻害薬のphysostigmine(50 nM)を添加した。CTOPとEM類は透析プローブから逆透析で側坐核に30分間灌流投与し,naloxonazineはEM類投与の24時間前に腹腔内投与した。

CTOPとEM類の投与量は灌流液中の総量(nmol)で示した。以上のことから,EM-1と2はμ2受容体を介して側坐核のAch神経を抑制することが示された。また,EM-2の側坐核への灌流投与は同部位のDA放出をopioid受容体非依存性の神経機構で亢進するという我々のこれまでの報告を支持する結果が得られた。歯科麻酔当初,当該年度いっぱいかけて行う予定で会ったβ受容体系薬物の投与実験を昨年度の後半には終えることができ,研究成果を今年度の早々にEuropean Journal of Pharmacology誌に出版できた。また,本研究プロジェクトの成果の一部は,2014年3月に宮城県仙台市で行われた日本薬理学会で発表を行うことができた。当初,予定していたα1受容体サブタイプ系薬物の単独投与実験が,予定よりも4カ月程度早く終了したことに伴い「前倒し請求」を行って,α1受容体サブタイプ系薬物の併用投与実験を開始した。この研究の成果の一部は,研究分担者・協力者の三枝・青野が,2013年3月に福岡県で行われた日本薬理学会で発表を行うことができた。2012年度に「前倒し請求」を行って開始したα受容体系薬物,β受容体系薬物をそれぞれ用いた研究は順調に成果をあげている。当該年度は,側坐核におけるドパミンまたはノルアドレナリンの神経終末からの放出を調節する可能性が示唆されているアセチルコリンの作用機構に着目した研究に着手することを計画している。【役割分担】統括:高田耕司(研究代表者),神経化学・行動学・組織学実験の遂行・助言:三枝禎(研究分担者),神経化学・行動学・組織学実験の遂行:内田琢也(研究協力者),青野悠里(研究協力者),関野麗子(研究協力者),田口寛子(研究協力者),木口友里(研究協力者)「前倒し請求」を行って開始したα1受容体サブタイプ系薬物の併用投与実験は順調に進んでおり,すでにこの研究の成果の一端は2013年3月に福岡県で行われた日本薬理学会で発表した。当該年度はこの実験を継続すると共に,かねてより課題としていたβ受容体を介した側坐核のドパミン神経促進機構(Eur J Pharmacol, 601, 2008)を解明するため,β1受容体サブタイプとβ2受容体サブタイプに選択的に作用する薬物の効果を指標として側坐核のドパミン神経活動制御におけるこれら受容体の役割について検討を加えることを計画している。【役割分担】統括:高田耕司(研究代表者),神経化学・行動学・組織学実験の遂行・助言:三枝禎(研究分担者),神経化学・行動学・組織学実験の遂行:内田琢也(研究協力者),青野悠里(研究協力者),関野麗子(研究協力者),田口寛子(研究協力者),研究の助言:A. R. Cools(海外研究協力者),J. L. Waddington(海外研究協力者)当初予定の実験が完了した際,残金の67円に該当する試薬・消耗品が見つからなかったため次年度使用額に充てることにした。当該年度(平成26年度)は物品費(実験動物,試薬,HPLC用消耗品の購入)として100万円,旅費(国際神経薬理学会:カナダ,日本薬理学会:名古屋での発表のための交通費・滞在費)として30万円をそれぞれ使用する計画である。残金の67円は,物品費のうち試薬代の一部として使用する予定。前年度の繰越金(9万円程度)のほか110万円を実験のための物品費として使用することを計画している。主な使途は,実験動物,試薬,HPLC用消耗品の購入である。このほかに10万円を旅費に充てる予定である。
歯科医療費に関わる要因についての横断的および縦断的研究

歯周疾患の医科医療費と歯科医療費への影響を評価した。3年半の観察期間において、重度歯周炎群の累積総医療費は病的な歯周ポケットのない群より21%高かった。男女とも入院割合は、重度歯周炎群で最も高かった[男性:odds ratio(OR)=1.34;女性:OR=1.29]。男性では、重度歯周炎群の年間入院医療費は、病的な歯周ポケットを有しない群より75%高かった。外来医療費では、一定の傾向は認められなかった。年間歯科受診割合は重度歯周炎群で最も高く(男性:OR=2.07;女性:OR=1.46)、歯科医療費は男女とも歯周疾患が重症になるにつれ増加していた。歯周疾患は、男性において糖尿病、胃腸疾患の医療費と、男女とも肝疾患の医療費との関連が示唆された。以上より、歯周疾患は歯科のみならず入院による医療費の増加への影響があるのではないかと考えられた。メンタルヘルスと口腔状況との関連について検討した。メンタルヘルスはGeneral Health Questionnaire(GHQ-12)で測定された。GHQスコアは、ウ蝕のありなし、喪失歯、歯周病とは関連していなかった。自覚症状"見かけが気になる"に関する調整されたGHQスコアの平均は男女とも有意な差が認められた。ほとんどすべての口腔内症状で、「あまりない」「まったくない」と回答した人がもっとも低いGHQスコアを示した。メンタルヘルスと臨床的な指標で測定した口腔状況とに関連は認められなかったが、自覚症状のいくつかの項目とは関連が認められた。口腔の自覚症状がないことは良好なメンタルヘルスと関連しているようであった。歯科検診参加群と不参加群の歯科医療費を比較した。50歳以上では参加率が低く、参加群で歯科医療費が高い傾向を示した。50歳以上になると歯周疾患による口腔内の困りごとが顕著になり、複雑な歯科治療へのニーズが高まることによるものと考えられる。○壮年期における歯周疾患の医療費への影響-職域集団における縦断研究-背景:歯周疾患はよく知られた慢性疾患のひとつであるが、入院、外来、歯科を含む医療費の増加と歯周疾患が関連は明らかになっていない。方法:日本の公務員(40-59歳)4,285名の一般健康診断、歯科検診および健康保険のデータを用いて、歯周疾患の医科医療費と歯科医療費への影響を前向きに3年半の間評価した。解析対象者は3カテゴリーに区分された;病的な歯周ポケットのない群、中等度歯周炎群、重度歯周炎群。心疾患、肝疾患または糖尿病の既往があるものを除いた後、多変量解析においては、年齢、性別、喫煙、BMI、高血圧で調整された。結果:重度歯周炎群の累積総医療費は、病的な歯周ポケットのない群より21%高かった。男女とも入院割合は、重度歯周炎群で最も高かった(男性:OR=1.34,95%信頼区間:1.00-1.80;女性:OR=1.29,95%信頼区間:0.75-2.20)。外来医療費では、はっきりした傾向は認められなかった。

年間歯科受診割合は重度歯周炎群で最も高かった(男性:OR=2.07,95%信頼区間:1.50-2.86;女性:OR=1.46,95%信頼区間:0.76-2.78)、歯科医療費は男女とも歯周疾患が重症になるにつれ増加していた。男女別に歯周状況によるそれぞれの疾患分類に関する年間平均医療費を算出したところ、糖尿病と胃腸疾患に関して、男性の重度歯周炎群の年間医科医療費が最も高かったが、女性ではその差は認められなかった。歯周病が悪化するほど、男女とも肝疾患の医科医療費は増加していた。結論:特に男性において、歯周疾患は歯科のみならず入院による医療費の増加に影響していた。任意で実施されている歯科健診の参加群と不参加群について年間平均歯科医療費を検討した。歯科健診の参加率は男性が高く、年齢が高くなるに従って減少し、50歳以上の年齢群で約50%であった。50歳以上の年齢群では男女とも参加群が不参加群より1.5-2倍程度高い歯科医療費を示していた。50歳以上になると歯周疾患による口腔内の困りごとが顕著になり、歯科治療へのニーズが高まることによるものと考えられる。高い年齢群ほど参加率が低いことから、不参加群に潜在する歯科治療のニーズを加味すると、50歳以上の歯科医療費のインパクトはさらに大きいものと推察される。歯科医療費について解析した結果が男女で異なる傾向を示したことから、精神健康状態と口腔内状況との関連を男女別に検討することを目的に、20-59歳の某自治体職員について断面研究を実施した。精神健康状態の指標としては、日本語版General Health Questionnaire(GHQ-12)を用いた。GHQスコアが高いほど精神健康状態が不良であることを示す。口腔状況については、自記式調査による口腔の主観的健康感、自覚症状、および臨床的な指標(ウ蝕歯、歯周病、喪失歯)が測定された。各口腔状況指標のレベルに応じた平均GHQスコアを、年齢、性別、喫煙、職種を調整して、分散分析を用いて男女別に算出した。精神健康状態は、臨床的な指標(ウ蝕および喪失歯の有無、歯周病の程度)とは関連していなかった。口腔の主観的健康感が悪いと答えた人は、良いと答えた人より高いGHQスコアを示し、女性においてのみ統計学的に有意であった。自覚症状"見かけが気になる"に関する調整済みGHQスコアの平均は男女とも有意な差が認められた。以上の結果から、精神健康状態と口腔内状況との関連は男女でほぼ同じ傾向を示しており、歯科受診行動における性差については、さらなる検討が必要と考えられる。
航空写真観測と数値モデルによるクラゲ集群密度と湾規模の現存量推定手法の開発

宇和海に生息するミズクラゲについて、湾全体での現存量及びミズクラゲ集群内のクラゲ個体の空間分布、遊泳行動を、高台に設置された定点カメラによる空撮、水中カメラと計量魚群探知機を用いた船舶観測から調査した。海面で見られた帯状や塊状のミズクラゲパッチには、水中では中空の構造をしているものがあることを発見した。また、湾全体の現存量を知る方法として、計量魚群探知機により得られた音響データをクラゲ個体数密度に換算する手法が有効であることを立証した。今後、アメリカ西海岸でも同様に報告されているミズクラゲ集群の中空構造の形成メカニズムを解明することが期待される。クラゲパッチの動態を知るために、ミズクラゲの表層集群が多く出現する法華津湾において、6月から11月まで高所から海面をインターバル撮影した(略称:JAMSUS)。また、パッチ内のクラゲ現存量推定法を開発するために、8月すでに法華津湾で現場観測を行った。観測項目はCTD、水中ビデオカメラによるクラゲの個体密度の測定、計量魚探による反射強度マッピング、ADCPによる流速マッピング、バルーンによる空撮などがあった。また、内部波を検出するため、2分間隔の水温係留観測を7月、8月、9月に行った。データ解析から反射強度とミズクラゲの個体密度の間に一定の線形関係が見られた。この関係を利用して、計量魚探による反射強度マッピングデータからクラゲ現存量を推定することが可能になる。また、その現存量は数値計算の入力条件及び検証データにもなる。これは平成25年度の最大の成果とも言える。また、水温計データの解析から内部波の存在を確認できた。内部波の大潮小潮の周期も見られた。しかしながら、内部波とミズクラゲの集群形成との関係はまだ明確ではない。数値モデルの方は瀬戸内海の全域を対象とする潮流モデルを構築し、観測データとの比較を中心とした論文を出版した。2014年8月25日から27日まで豊後水道に面する愛媛県宇和島市の法華津湾でミズクラゲを対象とした現地観測を行った。観測項目は計量魚群探知機による音響探査、水中ビデオカメラによる撮影、クラゲの傘径測定、環境要素(CTD,DO,流速)の計測などが有った。その詳細は以下の通りである。1)計量魚群探知機によるミズクラゲの観測を行った。計量魚探がクラゲを定量的に計測できているかどうかを確認するため、水中ビデオカメラを用いて求めた個体数密度と、音響データとを比較した。その結果、計量魚探で得られた平均SVと水中カメラから求めたクラゲ個体数密度の間に有意な正の相関が見られ、魚探でもクラゲを定量的に測れていることがわかった。2)魚探による湾のスキャンを行いクラゲの空間分布を求めた。2013年はパッチ状の高密度な集群と、表層に層状に分布する低密度な分布が見られた。パッチ状の集群は、その断面が中空の構造をしているものも多数見られた。それに対して、2014年は湾内ではパッチ状の分布はほとんど見られず、低密度で層状に広範囲に分布していた。3)CTD観測のデータと比較すると、2013年、2014年ともに層状の分布は密度躍層が存在する水深と分布が一致していた。しかしパッチ状分布との対応関係はみられなかった。2014年の観測でスキャンを3日間にわたって行った結果、湾内の個体数が10分の1にまで減少しており,短期間で大きく変動することも分かった。現場データを蓄積するために、引き続き宇和海で現地観測を行った。法華津湾では、9月2日と3日に計量魚探による湾全域のスキャンを行い,ミズクラゲの分布を調査した。9月3日に実施した観測で得られた,平均SVの各水深における水平分布図と鉛直断面図より、湾内にミズクラゲが存在しなかったことが分かった。実際に,海面の目視や水中カメラによる海面下の観測も行ったがミズクラゲの存在は全く確認されなかった。CTD観測の結果から水深2m以深は水温・塩分・密度ともに平年と比べ極端な差はなかったことから,法華津湾内のクラゲが観測期間前後だけの短期的な水質条件(水温・塩分等)の変化に影響されて一時的に存在していなかったとは考えにくい。宇和海では,冬季(2月4月)の日平均水温15°C以下日数が少ないと,その年のミズクラゲ出現頻度が増加するという傾向があることが知られている(武岡ほか,未投稿)。そこで,法華津湾の南約10kmの遊子沖に設置している水温計データを用いて,冬季の日平均水温が15°C以下の日数を数えた結果,2015年は2013年と2014年に比べ水温15°C以下日数が多いことが分かった。冬季水温が低くなると,ポリプの分裂数や越冬個体が減少するため,2015年は法華津湾周辺の宇和海で年間を通してミズクラゲ現存量が少なかったと考えられる。法華津湾内にミズクラゲがほとんど存在しなかったため,9月4日からは三瓶湾で観測を行うこととなった。三瓶湾では,計量魚探と水中ビデオカメラを用いた同時観測を行い,音響データ(平均SV)をクラゲ個体数密度に変換する手法の検証を行った。

その結果2015年も2013年と2014年と同じく有意な正の相関となり,本手法の有効性が確認された。相関係数は2013年、2014年よりも大きい値となった。数値モデルの研究は継続的に行ったが、集群形成のメカニズムを解明するまでには至らなかった。宇和海に生息するミズクラゲについて、湾全体での現存量及びミズクラゲ集群内のクラゲ個体の空間分布、遊泳行動を、高台に設置された定点カメラによる空撮、水中カメラと計量魚群探知機を用いた船舶観測から調査した。海面で見られた帯状や塊状のミズクラゲパッチには、水中では中空の構造をしているものがあることを発見した。また、湾全体の現存量を知る方法として、計量魚群探知機により得られた音響データをクラゲ個体数密度に換算する手法が有効であることを立証した。今後、アメリカ西海岸でも同様に報告されているミズクラゲ集群の中空構造の形成メカニズムを解明することが期待される。現地観測及び観測データの解析は予定通りで終えたが、数値モデルの構築及びその応用はやや遅れている。その原因は、観測データの解析に時間が要することに加え、数値モデルの理解や計算コードの解読は予想以上時間がかかった。海洋物理学次年度の現地観測は従来の魚探計測と水中カメラの撮影以外に、簡易型の空撮を導入する予定である。さらに、数値モデルによる研究に重点を置き、ミズクラゲ集群形成に物理過程の役割を解明する。現場観測は予定通りで行ったが、データ解析に予想以上に時間が要したため、高解像度モデルの準備と構築は遅れた。夏の観測は予想より経費の節約ができたため、未使用の経費が生じた昨年の観測から見られた魚探データとミズクラゲ密度の相関式を確かめるため、平成26年8月に法華津湾において、2回目の現場観測を行う。また、法華津湾でのJAMSUS及び水温観測を続ける。高解像度モデルを精力的に準備し、構築していく。次年度に現場観測、さらに研究成果の国際学会での発表が予定されるため、研究費を使う予定である。データ解析に予想以上の時間が要したため、学会発表ができなくなり、計上した学会参加旅費が余った。次年度の学会発表に使用する予定である
乳腺サイクルにおけるＤＮＡ修復遺伝子の役割と放射線発がん機構の解明

乳腺の発生・分化の過程においてDNA損傷応答に違いがあること、DNA修復遺伝子BRIP1が乳腺の発生・分化にも機能し、その機能低下が様々な細胞内シグナル伝達経路の異常を介して、DNA損傷応答と発生・分化両方の異常を引き起こすことを示す結果を得た。BRIP1遺伝子の発現量は、放射線で誘発されたラット乳癌において減少していることから、同遺伝子の機能低下は、放射線による乳腺の発がんにおいて重要な役割を果たしていると考えられる。乳腺は、放射線発がん感受性の高い組織である。これまで、乳がんのリスクが幼少期や思春期の被ばくで高いことや、妊娠・出産を経験することによりリスクが低下することが示唆されているが、それは乳腺が増殖・分化と脱分化・退縮のサイクルを繰り返すことができるユニークな器官であり、その過程で放射線に対する応答が大きく異なるためであると考えられる。しかしながら、それら放射線感受性の違いをもたらす分子基盤は依然として不明である。今年度は、これまでに見出した、乳がん原因遺伝子BRCA1と結合し、DNAの損傷修復に関わる遺伝子(10種)の乳腺発生・分化過程および放射線照射による発現変動を動物個体レベルにおいて検証すると共に、昨年度に樹立したBRIP1遺伝子ノックダウン細胞を用いて、同遺伝子の乳腺の発生・分化および癌化における役割を明らかにすることを目的とした。具体的には、幼若期および思春期にガンマ線(5 Gy)全身照射を行ったラットより採取した乳腺組織標本(照射後148時間後)を用いて、免疫組織化学染色法による候補遺伝子(10種)およびDNA損傷マーカー等の検出を行った。また、樹立したBRIP1遺伝子ノックダウン細胞の解析を行い、BRIP1遺伝子の機能が抑制された細胞を基底膜マトリクス存在下で3次元培養すると、腺管構造のサイズの増大や形態異常、内腔空間不形成といった癌の初期病変に観察されるような異常が引き起こされることを明らかにした。今年度の研究結果は、乳腺の発生・分化にDNA損傷を修復する遺伝子が機能していることや、発生・分化の過程で機能するDNA損傷修復機構や修復活性の違い、発がんへの関与を明らかにするために有益な基礎的情報を提供するために重要である。特に、BRIP1遺伝子ノックダウン細胞の放射線感受性や分子解析を行うことで、乳腺の発生と放射線誘発乳がんの接点が明らかになると期待される。本研究では、幼若期、思春期及び、経産ラットの乳腺組織における放射線応答を解析し、幼若期の乳腺では、思春期及び、経産した個体の乳腺組織に比べ、放射線照射後に発現量が変動する遺伝子(DNA修復遺伝子を含む)の総数が多いことが分かった。放射線照射後、既知のDNA損傷応答遺伝子に加え、思春期の乳腺では発生・分化、経産後の乳腺では免疫に関わる遺伝子群の発現変動が起こることが分かった。また、DNA修復に機能するBRIP1遺伝子ノックダウン細胞の樹立及び、細胞表現型の解析を行い、BRIP1遺伝子の発現が抑制された細胞を基底膜マトリクス存在下で3次元培養すると、腺管構造のサイズの増大や形態異常、内腔空間不形成といった癌の初期病変に観察されるような異常が引き起こされることを明らかにした。遺伝子発現解析から、BRIP1遺伝子の発現が抑制された細胞では、細胞接着、極性、増殖、発生に関わる遺伝子や、DNA損傷、LPA、Myc、Wnt、PI3K/Aktシグナル伝達経路に異常があることが分かった。これらの結果は、乳腺の発生・分化の過程で機能するDNA損傷応答機構に違いがあることや、DNA修復遺伝子は乳腺の発生・分化にも機能し、その機能異常がDNA損傷応答と発生・分化両方の異常を引き起こすことで発がんに関与していることを示唆している。これまで、乳がんのリスクが幼少期や思春期の被ばくで高いことや、妊娠・出産を経験することによりリスクが低下することが示唆されているが、それは乳腺が増殖・分化と脱分化・退縮のサイクルを繰り返すことができるユニークな器官であり、その過程において放射線に対する応答が大きく異なるためであると考えられる。今年度は、これまでに見出した乳がん原因遺伝子BRCA1と結合しDNAの損傷修復に関わる遺伝子(10種)の乳腺における発生・分化過程および放射線照射による発現変動を、動物個体レベルにおいて検証することを目的とした。具体的には、幼若期(3週齢)、思春期(7週齢)および経産前後の雌ラット(各34個体)より、乳腺組織サンプルの採取および、組織標本の作製を行った。

また、上記修復遺伝子の発現変動と、放射線感受性の関連性を明らかにするため、幼若期および、思春期にガンマ線(5 Gy)全身照射を行ったラット(各34個体)より、照射1、3、6、12、24および48時間後の乳腺組織サンプルを採取し、組織標本の作製を行った。作製した組織標本を用いて、免疫組織化学染色法による候補遺伝子およびDNA損傷マーカーであるガンマH2AXタンパク質の検出のための条件検討を行った。それらの内、BRIP1遺伝子について、同遺伝子産物の実験動物個体内における発現と放射線照射による発現上昇を確認したことから、RNA干渉法を用いた遺伝子操作による遺伝子発現抑制乳腺細胞の作製を行った。今年度の研究結果は、乳腺の発生・分化にDNA損傷を修復する遺伝子が機能していることや、発生・分化の過程で機能するDNA損傷修復機構や修復活性の違い、発がんへの関与を明らかにするための基礎的情報を提供するために重要である。乳腺における発生・分化過程および放射線照射による候補遺伝子10種全ての詳細な発現変動解析は、それらを検出するための実験条件の検討に予定よりも多くの時間を要したためやや遅れているが、昨年度に見出したBRIP1遺伝子については、その遺伝子の発現を遺伝子操作により抑制した乳腺細胞を作製し、乳腺の発生・分化および放射線感受性への関連性を示す結果が得られつつある。乳腺における発生・分化過程および放射線照射による候補遺伝子10種全ての詳細な発現変動解析は、それらを検出するための実験条件の検討に予定よりも多くの時間を要したためやや遅れているが、今年度に見出したBRIP1遺伝子については、その遺伝子の発現を遺伝子操作により抑制した乳腺細胞を作製し、乳腺の発生・分化および放射線感受性への関連性を示す予備的結果が得られつつある。今後は、収集した乳腺組織サンプルを用いて、乳腺における発生・分化過程および放射線照射による候補遺伝子の詳細な発現変動解析を実施する。また、遺伝子操作により、BRIP1遺伝子を始めとするDNA損傷修復遺伝子の発現を制御した乳腺細胞を作製し、それら細胞の三次元培養系を用いて、乳がんの前がん病変から観察されるような乳腺の組織構造の異常の発生や、放射線感受性の変化を検証する。その後、動物個体レベルにおける解析を行い、発生・分化および放射線感受性、さらには、発がんにおける候補遺伝子の関与を明らかにする。今後は、今年度収集した乳腺組織サンプルを用いて、乳腺における発生・分化過程および放射線照射による候補遺伝子の詳細な発現変動解析を実施する。次年度は、BRIP1遺伝子を始めとするDNA損傷候補遺伝子について、それらの発現を遺伝子操作により制御した乳腺細胞の作製を行う。
生体肝移植後の移植肝に発生する慢性肝機能障害の病理学

目的:生体部分肝移植は小児の非可逆性肝疾患末期の肝不全症の唯一の治療法として定着してきている。その移植不成功の最大の原因となる移植肝に発生する慢性の進行性肝機能障害を臨床病理学的に解析した。方法:1990年6月から1996年5月の6年間に224例(5再移植例を含む)に生体部分肝移植が行われた。このうち移植後2ヵ月以降に進行性肝機能障害を来した33例の生検材料、手術材料、剖検材料について、免疫組織化学、in situ hybridization法を含む病理組織学的検索を行い、臨床病理学的に解析した。結果及び考察:進行性肝機能障害を示した33例中、21例が移植後64日から5年11カ月の間(中央値174日)に移植不成功(死亡16例、再移植5例)となった。そのうち慢性拒絶反応は7例(死亡4例、再移植3例)にみられた。3例が主として血管性、4例が主として胆管消失性拒絶反応であった。また、上記33例中、慢性胆管炎が15例(うち死亡9例、再移植1例)に見られた。うち7例はABO血液型不適合移植例であり、その2例は抗血液型抗体価が高く、胆管吻合部分に問題がないにも拘わらず胆管炎が発生した。また他の1例はリンパ球クロスマッチ試験陽性例であった。これらのことから胆管炎とhumoral mechanismの関連が注目された。移植後リンパ増殖性疾患は4例(うち1例は胆管炎に、1例は慢性拒絶反応に合併、全例死亡)に見られ、Epstein-Barrウイルスの関与が組織学的に証明された。慢性肝炎・肝硬変は8例(うち死亡1例)に見られ、5例はB型、1例はC型の慢性肝炎、他の2例は原因が不明であった。結論:生体部分肝移植後の慢性進行性肝機能障害の原因として、慢性拒絶反応、慢性胆管炎、移植後リンパ増殖性疾患及び慢性肝炎・肝硬変が重要であることが判明した。
ヒト悪性黒色腫細胞より抽出された腫瘍増殖抑制因子に関する研究

この研究で、我々はMMN9細胞培養上清中に放出される増殖抑制因子を精製し、それをβ2-Microglobulin (β2M)と同定した。β2Mは用いた6種類の黒色腫細胞株にアポトーシスを誘導したが、正常線維芽細胞には誘導せず、β2Mはアポトーシス誘導因子であると確認された。カスパーゼの抑制剤であるZ-VAD-fmkとカスパーゼ3/7の抑制剤であるDEVD-CHOはβ2Mで誘導されるアポトーシスを抑制しなかった。これは、β2M誘導性のアポトーシスは古典的なFas誘導性のアポトーシスに特徴づけられるカスパーゼ経路を含んでいないことを示唆する。さらに、bcl-2の発現はβ2M誘導性のアポトーシスの進行中で変化無く、また、MMN9細胞のFas依存性アポトーシスで見られるBcl-2の断片化は見られなかった。しかし、アポトーシス誘導性のBaxとBakの発現はβ2M誘導性アポトーシスの後期で増加していた。故に、β2M誘導性アポトーシスはBax,Bak依存性のアポトーシス経路を持つ。β2M誘導性アポトーシスの形態学的変化はMHC-I抗原へのリガンドの結合により誘導されるアポトーシスと同様であった。加えて、MHC-1リガンド誘導性アポトーシスのごとく、PI-3 kinaseがβ2M誘導性アポトーシスの早期で活性化されていた。そして、PI-3kinaseの抑制剤であるWortmanninはアポトーシスを抑制した。以上より、MMN9細胞のβ2M誘導性アポトーシスはPI-3 kinaseの活性化を伴うMHC-I抗原を通じてのシグナル伝達とアポトーシス後期のBcl-2 family遺伝子蛋白の活性化を包含している。β2Mよって誘導されるアポトーシス経路の解明はメラノーマ治療への有用な治療方法をもたらすであろう。1.今回購入した等電点蛋白分取電気泳動装置ロトフォアで得られた活性画分はpH4の画分に約70%の抑制効果を示した.しかし,そう雑蛋白が多いため,全ての画分をpH別に集め,凍結乾燥後Gel濾過クロマトグラフィーを行った.結果,pH3,4で強い活性が,pH8,9で中糖度の活性が見られた.次いで,これらの活性画分を集めミニロトフォアで分画した結果,pH3,4では約10%,pH8,9では約2030%の抑制活性がみられたため,後者についてelectroblotting後に蛋白シークエンスの解析を行ったが,N末端のBlockのため解析不能であった.以後の実験はpH8,9の画分について分析を行った.2.再採取した上澄をロトフォアで再分画し,Frac.15,16がpH89であったため,Gel濾過クロマトグラフィーで分画した.この時の活性度はFrac.1215で約3050%であった.目的蛋白の分子量は,電気泳動の所見とcut off 3,000のセントリコンのろ液にも活性が見られたことより,約35KDと推定できた.1.ヒト悪性黒色腫細胞MMN9の培養上清を遠沈・濃縮行い、陰イオンクロマト、および2段階でのゲル濾過クロマトを経て、MMN9細胞に対して増殖抑制活性を持つ画分を精製した。蛋白シークエンスの分析の結果、活性画分はbeta 2 microglobulin(B2M)と94.1%のホモロジーを持ち、B2Mであることを確認した。2.ヒト尿より精製されたB2Mを用いてMMN9細胞に対する効果を検討した。

B2Mは濃度依存性で、10-20μg/mlで強い増殖抑制活性をもつ。しかし、効果が現れるまでの作用時間は他の抗癌剤に比べ長く、72-96時間を要した。48時間では細胞形態に変化を示さず、60時間以降に細胞死が急速に進行する。3.続けて、他のメラノーマ細胞(PMP,MAA)、扁平上皮癌細胞(KB)、正常線維芽細胞(HF)に対する効果を検討した。B2Mは20μg/ml作用72時間後で順に78.6、56.7、54.1、101.3%の効果を示した。正常細胞に効果を示さないことより悪性腫瘍特異的に効果を示していると思われた。4.B2Mは白血病細胞でカスパーゼ依存性に効果を示すと報告されているが、bcl-2 familyとの関係は不明であるため、MMN9細胞で発現の確認されているbcl-2およぴbakについて検討を行った。興味あることにapoptosisを抑制するbcl-2の発現が強くなっており、また、caspase阻害剤のZ-VAD添加によりB2Mの効果は抑制されていた。現在、さらに検討を進めている。この研究で、我々はMMN9細胞培養上清中に放出される増殖抑制因子を精製し、それをβ2-Microglobulin(β2M)と同定した。β2Mは用いた6種類の黒色腫細胞株にアポトーシスを誘導したが、正常線維芽細胞には誘導せず、β2Mはアポトーシス誘導因子であると確認された。カスパーゼの抑制剤Z-VAD-fmkとカスパーゼ3/7の抑制剤DEVD-CHOはβ2Mで誘導されるアポトーシスを抑制しなかった。これは、β2M誘導性のアポトーシスは古典的なFas誘導性のアポトーシスに特徴づけられるカスパーゼ経路を含んでいないことを示唆する。さらに、bcl-2の発現はβ2M誘導性のアポトーシスの進行中で変化無く、また、MMN9細胞のFas依存性アポトーシスで見られるBcl-2の断片化は見られなかった。しかし、アポトーシス誘導性のBaxとBakの発現はβ2M誘導性アポトーシスの後期で増加していた。故に、β2M誘導性アポトーシスはBax, Bak依存性のアポトーシス経路を持つ。β2M誘導性アポトーシスの形態学的変化はMHC-1へのリガンドの結合により誘導されるアポトーシスと同様であった。加えて、MHC-Iリガンド誘導性アポトーシスのごとく、PI-3 kinaseがβ2M誘導性アポトーシスの早期で活性化されていた。そして、PI-3 kinaseの抑制剤であるWortmanninはβ2Mによるアポトーシスを抑制した。以上より、MMN9細胞のβ2M誘導性アポトーシスはPI-3 kinaseの活性化を伴うMHC-Iを通じてのシグナル伝達とアポトーシス後期のBcl-2 family遺伝子蛋白の活性化を包含している。β2Mによって誘導されるアポトーシス経路の解明はメラノーマ治療への有用な治療方法をもたらすであろう。
ＤＮＡアルキル化剤の新規作用機序に関する研究

ベンダムスチンは2010年に国内で承認されたリンパ腫の治療薬である。その作用機序はこれまでDNAアルキル化と考えられてきた。本研究ではがん細胞の増殖や生存と深く関わっている転写制御因子STAT3に着目して解析を進めた結果、ベンダムスチンがSTAT3のSH2ドメインに作用することによって、その機能を阻害することを新たに見出した。またベンダムスチンががん細胞内STAT3と共有結合複合体を形成することも示唆された。以上、本薬剤による優れた抗がん活性や免疫調節作用はSTAT3機能阻害と関わっていることが考察され、今後新たな抗がん剤をデザインするための鍵となることが期待さる。DNAアルキル化剤は、一般的にDNAと共有結合複合体を形成によるDNA複製阻害がその主たるメカニズムと考えられている。本研究ではDNAアルキル化剤の新規メカニズムを解明し、その優れた薬効を裏付けると共に次世代抗がん剤のデザインへ繋げることを目的としている。これまでのアルファスクリーン法を用いた非細胞系での試験の結果、ベンダムスチンは、組換えヒトSTAT3(rhSTAT3)とリン酸化チロシン含有ペプチドとの結合を強力に阻害する、つまりSTAT3-SH2アンタゴニストとして作用することを明らかとしてきた。またベンダムスチンはSTAT3が恒常的に活性化している乳がん細胞MDA-MB-468に対して、比較的強い細胞増殖阻害を示した。さらに不活性型代謝産物はSTAT3阻害活性を示さなかったことから、ベンダムスチンの細胞増殖阻害活性にはSTAT3阻害が重要であることが示唆された。そこでシステインのチオール基と容易に反応可能な蛍光ラベル体Alexa488-C5-madeimideを用いてrhSTAT3への蛍光色素の取り込み実験を行った。その結果、ベンダムスチンは濃度依存的にrhSTAT3への蛍光色素取り込みを阻害し、不活性代謝産物では阻害が見られなかった。以上の結果からベンダムスチンはrhSTAT3のシステインと共有結合複合体を形成していることが示唆された。さらにアルキル化部位を同定する目的で、現在STAT3の二量化において重要なSH2ドメイン及びその近傍に存在するシステインのアラニン置換体を作製中である。ベンダムスチン誘導体に関するこれまでの構造活性相関情報から、カルボン酸部位の修飾が可能と判断された。そこでこの部位へのポリエーテルリンカーを介してビオチンを導入することにより、ビオチンラベル体の合成を完了しており、今後細胞系の解析に用いる予定である。本研究初期の組換えヒトSTAT3を用いたin vitroの研究結果から、ベンダムスチンはシステインのチオール基を介した共有結合複合体を形成することによって、STAT3-SH2アンタゴニストとして作用することが示唆された。そこで細胞内におけるベンダムスチンのSTAT3への作用を解析した。STAT3が恒常的に活性化しているヒト乳がん細胞株であるMDA-MB-468細胞にベンダムスチンを接触させ、核抽出液中のSTAT3によるDNA結合率をELISA法で測定した。その結果ベンダムスチンによりDNA結合率が低下し、また不活性代謝産物HP2では低下しなかった。さらにReal time PCR法によって、STAT3の標的遺伝子である、Survivin等のmRNAレベルを測定した結果、上記DNA結合率と同様にベンダムスチン処理細胞で低下し、HP2処理では変化が見られなかった。次にベンダムスチンのSTAT3-SH2アンタゴニスト活性に影響を与えないカルボン酸部位に対して、ポリエーテルリンカーを介してビオチンを導入したビオチン化ベンダムスチンを調製し、細胞内におけるSTAT3との相互作用の検討を行った。ビオチン化ベンダムスチンに接触させたMDA-MB-468細胞の細胞抽出液を用いて、抗STAT3抗体によってSTAT3を免疫沈降し、streptavidin-HRPによるブロッティングを行った。その結果、STAT3のバンドの位置にstreptavidin-HRPが反応したことから、細胞内STAT3にビオチン化ベンダムスチンが共有結合していることが示唆された。さらにこれらのバンドのインテンシティーは過剰量のベンダムスチン処理で競合的に低下し、HP-2では低下しなかった。以上の結果からベンダムスチンは細胞内STAT3に直接結合することによって、その機能を抑制していることが示唆された。これまでのアルファスクリーン法を用いた非細胞系での試験の結果、ベンダムスチンは、組換えSTAT3の二量化を最も強力に阻害し、またSTAT3が恒常的に活性化している乳がん細胞MDA-MB-468に対して、比較的強い細胞増殖阻害を示すことを明らかとしてきた。

さらに不活性型代謝産物はSTAT3阻害活性を示さなかったことから、ベンダムスチンの細胞増殖阻害活性にはSTAT3阻害が重要であれることが示唆された。一方、STAT3と同様に、ある種の癌細胞においてその恒常的な活性化が報告されているSTAT5への作用を検討したが、ベンダムスチンによる阻害活性は見られなかった。これらの結果から本薬剤がSTAT3選択的な作用を示すことが明かとなった。そこでアルキル化部位を同定する目的で、現在STAT3の二量化において重要なSH2ドメイン及びその近傍に存在するシステインのアラニンに置換体を作製中である。さらに、ベンダムスチン誘導体に関するこれまでの構造活性相関情報から、カルボン酸部位の修飾が可能と判断された。そこでこの部位へのポリエーテルリンカーを介してビオチンを導入することによりビオチンラベル体の合成を完了した。今後の非細胞だけでなく細胞レベルでの解析に利用予定である。一方、他のアルキル化剤としてシスプラチンがSTAT3の二量化を阻害することを新たに見出したことから、現在オランダRadboud大学のグループと共同でシスプラチンの細胞内における詳細なメカニズム解析を検討中である。ベンダムスチンまたはシスプラチンを用いた実験結果から、これらアルキル化剤がSH-2ドメイン内またはその近傍のシステインのチオール残基と反応しているという仮説を立て、解析を進めてきた。rhSTAT3へのAlexa488-C5-madeimideの取り込み実験においてベンダムスチンは濃度依存的に蛍光色素の取り込みを阻害し、不活性代謝産物では阻害が見られなかったことから、ベンダムスチンはSTAT3-SH2内またはその近傍のシステインと共有結合複合体を形成していることが示唆された。このことがベンダムスチンによるSTAT3-SH2拮抗作用に関係していると考えられる。そこでアルキル化部位を同定する目的でSTAT3-SH2ドメイン及びその近傍に存在するシステインをアラニンに置換した変異体の作製を進めている。これまでに、野生型STAT3のcDNAをテンプレートとしてインバースPCR.法によって部位特異的な変異の導入に成功している。今後は発現ベクターを構築し合計5種類の変異型rhSTAT3タンパク質を取得予定である。現状では非細胞系での選択的なSTAT3阻害が明らかとされたものの、細胞系での明確なSTAT3阻害が検証できていない。ベンダムスチンは反応性の高いNH-2構造を有するため不安定な薬剤である。よって特に細胞系での解析に関しては薬剤接触時間や溶液調製等の条件検討には十分な時間を割く必要があると考えている。また細胞株の検討も必要と考えられる。薬剤処理した細胞の核抽出液中のSTAT3によるDNA結合活性(ELISA法)や細胞イメージアナライザーを用いたSTAT3の核内移行の解析について条件を検討中である。ビオチンラベル化
輸入・新興感染症から医療従事者を守れ！臨床現場ガイドライン策定のための防護具研究

平成30年度は医療従事者の二次感染を防ぐために感染防護服着用による動作性や汚染部の特定や素材の細菌(菌液)付着性と透過性を評価し、ガイドラインの策定につなげることが目的であった。二次改良型感染防護服の動作性に影響を及ぼすパターンに前年度に問題が残った箇所の二次改良を行い、三次改良型二部式防護服の製作を行った。結果、パターンの形状を二次改良したことで、従来品に比べて改良品では各部位の圧迫感はいずれの動作でも減少し、特に前頭部と股の部位が改善されたことを確認できた。次に看護師による従来型と三次改良型感染防護服着用時における看護動作の三次元の動作を分析中である。加えて、感染防護服着用下の看護動作における感染防護服表面の汚染部位を特定するために、蛍光パウダー用いて防護服表面の汚染状況を観察した。結果は胸部・前腕部、大腿・背部にまで拡大した。感染性防護服素材の違いの細菌透過性や菌液付着性を実験評価した。看護師が防護服を着用し患者立位時の防護服胸腹部に生じた接触圧は27.4gf/cm2で、対象防護服は手術用ガウン、TA、TCの3種で同じ圧力をかけた素材片を実験に用いた。細菌はMRSA標準株を用い、血液は健常人の静脈血を採取した。マクファーランド法により菌濃度を調整し、素材片をシャーレに置き一定濃度のMRSAを含む血液50μLを素材片にのせ1分後に血液を除去後、素材片を滅菌生食水10mLに入れ、残存する細菌を溶出しマンニット食塩培地にまき、37°C、24時間培養後にコロニー数をカウントした。その結果、圧をかけない素材片では手術ガウンの付着菌数が最も少なく、TCの付着菌数が最も多かった。27.4gf/cm2で10回摩擦をかけた素材片では、手術ガウンとTAでは付着菌数が有意に増加し、TCでは付着菌数が有意に減少することがわかった。なお、この条件では感染防護服裏側への菌の透過はみられなかった。平成30年度計画の実験研究が遅れ気味になった。理由として挙げられるのは、代表者及び分担者の家族が急な病気のため看護・介護が必要となり、本年度予定してた期日に実験を中断せざるを得なくなった。そのため被験者(臨床看護師)への再度依頼・承諾および臨床現場への倫理委員会の提出ができなくなり、また病院との調査調整の困難を生じた。よって、本年度予定の実験であった感染防護具着用による生理的負荷および性能評価である看護ケア時の防護具にかかるの研究スケジュールが遅れ気味となり、ガイドラインの作成の着手まで至っていない。平成30年度の研究の推進方策として、まず当該の臨床病院おける倫理委員会に申請し、承認を得たうえで、早急に被験者に依頼し実験を行う。最新型(二部式)感染防護服を用いて、被験者である臨床看護師による衣服内温湿度・体温・心拍数・SPO2濃度を測定と官能評価、疲労度測定、三次元動作、汚染度測定実験を行う。感染防具服の改良の改善点や効果を検討し、PPE素材を検討したデータを参考に、ガイドラインにエビデンスとして加える。感染防護具のガイドライン作成:個人防護具の輸入・新興感染症に対する着脱の実際をガイドライン化するためのシミュレーションを実施する。臨床現場で有用な個人防護具の適正使用に関するマニュアル草稿に着手、推敲する。輸入・新興感染症の診療に際しての適切なPPEの使用に関する標準的な方法を検討する。さらに、それらをまとめ、学会、論文発表を行う予定である。平成27年度は輸入・新興感染症対応時の個人防護具の着脱や治療・ケア時の使用方法に問題点・防護具の備えなど、防護具に関する現状問題を明らかにし、医療従事者を守る防護具の性能評価、防護具へのウイルス・細菌の浸透防護性能の評価、作業効率向上のための衣服内環境と生体機能への影響の検証を目的として以下を進めた。1.輸入・新興感染症対応時に、臨床現場における個人防護具の着脱や治療・ケア時の使用方法に問題点および防護具の備えなど、防護服に関する要望や改善点について現状問題を明らかにするために、インタビュー調査による実態調査を進めた。2.防護具性能評価のための新規開発試験装置装置(圧力負荷装置)を使用しての性能評価(ウイルス、細菌の浸透防護性能)を実施した。医療従事者向けの防護具のクリティカルポイントの選定と負荷状況の整理、防護要件の整理(耐水、耐圧など)とそれに基づいた新規試験装置(圧力負荷装置)の設計や防護具性能解析のために必要な試験方法と試験装置(圧力負荷装置)を新規開発し、当該試験装置を用いて、医療従事者向け防護具の性能再評価を行った。3.防護服・防護具の素材によるウイルス、細菌の浸透防護性能(侵入阻止)の評価については、防護服3種、手術ガウン2種、プラスチックエプロンのカット片を用い、MRSA、大腸菌、緑膿菌、およびレンチウイルスの透過や付着量を検討した結果、どの素材も細菌の透過はなかったが、細菌やウイルスの付着量は異なることがわかった。4.防護服の温熱的快適性・運動性の評価は防護服着用時の温熱的快適性を評価するために、発汗サーマルマネキンを用いて衣服の熱抵抗および蒸発熱抵抗を測定し、さらに防護服着用実験は被験者による温度・湿度環境条件を設定した人工気候室にて、防護服を着用した被験者の体温、皮膚温、心拍数、発汗量、衣服内気候、体重減少量、官能量を測定した。

平成27年度の代表研究者が病気療養を余儀なくされ、当初計画した通りの現状調査の実施が順調に進まなかった。それらの調査結果を基にした実験計画は、遅れ気味となった。防護具性能評価のための新規開発試験装置装置(圧力負荷装置)については、新規試験装置(圧力負荷装置)の設計や防護具性能解析のために必要な試験方法と試験装置(圧力負荷装置)を新規開発し、当該試験装置を用いて、医療従事者向け防護具の性能再評価できた。防護服・防護具の素材によるウイルス、細菌の浸透防護性能(侵入阻止)の評価はプレテストから順調に評価を進めている。しかし、防護服の温熱的快適性・運動性の評価は実験のための人工気候室が工事のため予定通りに使用できなくなり、加えて、改修後に予定被験者が病気となり計画通り進められなくなった。平成28年度は、1.臨床現場で医療従事者が外来での輸入・新興感染症対応時の現状問題を明確のためにインタビュー調査とアンケート調査を実施した。インタビュー調査は10病院の救急部医師・ICDと救急看護師長・ICNの21人に実施。結果、救急部医師は感染対策の曖昧さが目立ち、ICDと感染認定看護師は感染教育の意識が高かった。防護具着用経験者は着衣による不快、脱衣の困難さ、教育不備と改良を望む意見を語った。アンケート調査は、感染専門家123名、84施設に実施した。結果、教育マニュアル整備のない病院は約半数、院内着脱訓練を6割が実施した。クリティカルゾーンは顔面、手肢が危険と認識した。2.防護具性能評価は防護服素材の局所加圧耐久性を評価のため、ISO16603準拠の人工血液浸透防護試験を行い防護性能と比較した結果、織物素材の方が耐久性のあることが観察された。phageウイルス定量の精度と迅速性の向上を目的にReal-time PCR系を検討した結果、有用性を確認した。局所加圧負荷の防護服素材にphageウイルス浸透防護試験を行い、局所加圧負荷前の防護性能と比較した。目視評価では合格の素材も、phage培養法・phagePCR法ではphageの漏れを認めた。これらの防護具性能評価実験は平成28年度で終了した。3.防護服素材によるウイルス、細菌の浸透防護性能評価をしたところ、細菌・ウイルスの付着性は関連性がなく、バリア性能が高評価の素材で、細菌やウイルスの付着量が多い素材があったが、手術ガウンの素材は、防護服素材よりも付着量が少なかった。4.防護服動作性に着目しパターン及びデザインを検討し、改良型防護服を製作した。温熱・快適性の着用実験の結果、素材に対する表面加工の透湿性、通気性、吸水性の差が示唆された。暑熱環境の着用実験では安静時でも衣服内湿度は上昇し、運動を停止しても下降しなかった。平成27年度予定の遅れ気味の調査研究(インタビュー調査とアンケート調査)について、平成28年度完結を目指し精力的に取り組んだ。しかしながら、上記研究に時間をかなり費やさなければならなかったため、平成28年度計画の実験研究がやや遅れ気味になった。理由として挙げられるのは、各当該施設で倫理申請を行ったが、倫理委員会の承認が遅れ、実験のプレテストを開始することができなく研究計画が遅れた。さらに、実験予定施設の再度工事および被験者(臨床看護師)への承諾や病院の勤務調整の困難に加え、予定期日に被験者である看護師が病気(インフルエンザ等)に罹患する事態が重なった。
中国農村人民公社研究-形成・展開・崩壊過程-

中国農村人民公社の展開過程を系統的に分析することによって以下の知見が得られた。(1)人民公社体制とは毛沢東理論に基づく「備戦体制」と「社会主義から共産主義への移行」を結合した「戦時共産主義体制」であり、「自力更正、刻苦奮闘」による「まとまった地域経済圏」構想は経済理論としても成り立たないものであった。私は農村人民公社の組織編成、管理体制、再生産構造の分析を通じてその破綻の必然性を明らかにした。(2)人民公社体制が崩壊し、農業は家族単位の経営請負制へ、「社隊企業」は「郷鎮企業」へと転換するが、そこでの中国的特徴は地域(「社区」)が土地や企業資産の集団所有主体となり、個人や私人がそれらの請負経営主体に転嫁し、それと同時に地域は集団資産を基礎にした地域社会の経営=運営主体となったことである。それ故に共同体的、官僚主義的規制力は依然として大きく、個人の集団からの自立は制限され、従って所有と経営は未分離で、経営体が純化しにくい。(3)家族単位の経営請負制は過渡的曖昧性を持ち、経営権が自律化しにくく、土地経営が安定しにくい。そこで土地土地利用権の株式化が打ち出されたが、土地利用権の流通の地域的範囲をめぐって当該地域の内と外との関係を如何にするかが決定的条件になっている。(4)郷鎮企業での株式合作制での株の流通範囲をめぐって同様な問題が存在する。(5)人民公社の解体により「政社分離」が行われ、生産大隊レベルでは村民の自治組織としての村民委員会が設立され、住民自治の確立が謳われているが、土地や企業資産の地域集団所有、地域に負担を押しつけた行財政の前近代的あり方によって、住民自治は封鎖的共同体的自治であり、地方自治に発展する芽を押さえられている。本研究は「中国型社会主義」の中心的内容をなす農村人民公社の理論とその形成から崩壊に至る歴史過程を全面的に整理し、それを通じて中国農村の歴史段階的・類型的特質を明らかにし、併せて国家と農民の対抗関係、権力による包摂の特徴を明らかにしようとするものである。本年度は(1)「成功による幻惑」=農業集団化運動。集団農業への急激な制度的改変と「生産関係」の反作用重視、(2)初期人民公社構想=「社会主義から共産主義への移行形態」、(3)「農業は大〓に学べ」=「生産関係」重視から「主観能動性」・「階級闘争」重視へ、三部分について主として『毛沢東与中国農業発展』、『大躍進狂乱』、『人民公社狂想曲』、『大〓紅旗的昇落与墜落』、『中華人民共和国歴史紀実曲折発展』、『大躍進』等の中国の新たな研究に依りながら、分析を進めた。明らかにすべき問題点は、(1)何故に人民公社形態が誕生したのか。何故にそれは農民に歓迎され、熱狂的運動として全国で展開されたか、(2)人民公社体制は何故に急速に破綻したか、(3)にもかかわらず人民公社体制が27年に渡って存続し得た理由は何か、(4)「農業は大〓に学べ」が全農民的運動と展開された理由は何か、等であるが、自給自足的な農村経済と封建的宗族関係の伝統と「国権的社会主義」関係との融合により社会経済関係が政治関係に包摂され、それがために、政治に翻弄される側面とにも拘わらず、農民的生産力発展の系譜によって「共同体的規制」の下から小経営的萌芽が現れざるを得ない事実関係が浮かび上がってきた。現在この部分を纏めつつある。