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小・中学校間の理科学習の円滑な接続のための押さえておくべき基礎技能の究明

中学生になった途端に理科の内容が難しいと感じる生徒が多い.特に,目に見えない現象,イメージし難い内容を敬遠する傾向にある.内容を理解しようと思っても,必要な基礎技能を身につけていなければ理解することはできない.理科は特に基礎技能を必要とする学習が多い.中学校の理科の学習を進めていく上で,小学生の理科や算数の何をしっかりと学ばせておけば,中学校に進学しても円滑に学習が進められるのであろうか.本研究の目的は小学生に重点的に指導すべき「押さえておくべき基礎技能」を特定することにある.最終年度は,水溶液の濃度計算におけるつまずきの要因を特定するために,「総合問題」「中位問題」「下位問題」の正誤を生徒ごとに分析し,生徒を6グループに分類した.これらのグループ間で「公式問題」「計算問題」「意識調査」の正答・誤答者数を比較分析した結果,生徒が水溶液の濃度計算に関する問題を解決する際につまずく要因が,「食塩水の構造」「溶液の構造」「食塩水の濃度の公式」「濃度の公式」「百分率から小数への変換」「百分率の計算」「方程式の計算」「濃度の公式の変形」の知識・技能の不足によるものであることが明らかになった.特に数学的技能のうち,「百分率を小数に変換して溶質を求める」での「百分率を小数に変換する」の数学的技能の習得が必須であることが明らかになった.この基礎技能は小学5年時で重点的に習得すべき技能であり,習得できていないと「水溶液の濃度計算」の問題は解決できない.この基礎技能の習得を重点的に指導していくことで,(小学校の理科や算数の学習内容から掘り下げた「カリキュラム・マネジメント」の視点をもって),生徒は水溶液の濃度計算に関する問題が解決できると考える.以上の2点が挙げられる.いずれも研究紀要としての形になっている.・現小学校学習指導要領における,“太い電熱線の方が細い電熱線に比べよく発熱する"と実験事実をただ暗記するだけの学習では,中学校以降に学習する発展的な内容に繋げにくい.今回,児童に電熱線の発熱の現象に関して粒子概念を用いたモデル指導を行うことによって,“電熱線の発熱する仕組み"とともに,“太い電熱線の方が細い電熱線よりもよく発熱する"ことを理解させるのに一定の効果があることが統計的に実証された.したがって,中学2年における「電熱線の発熱」の学習前までに,小学6年の段階で「押さえておくべき技能」として,「電熱線の発熱」を粒子概念を用いて捉える技能を身につけさせおくことは有効である.・平成27年度全国学力・学習状況調査中学校理科報告書によると,濃度問題における正答率は46.0%と,「知識」(技能)に関する問題の中で最も低い正答率であった.今回,濃度問題の解決には,「食塩水の構造」「溶液の構造」「百分率の小数への変換」「百分率の計算」「公式の把握」「方程式の計算」「公式の変形」の知識・技能と深く結びついていることが統計的に実証された.したがって,中学1年の濃度学習前までに,小学6年の段階で「押さえておくべき技能」として「食塩水の構造」を把握させるとともに,「百分率の小数への変換」「百分率の計算」の数学的技能を十分に身につけさせておくことは重要である.「9.研究実績の概要」に記した2つの研究は,以下のような進展状況にある.・前者は,「電熱線の発熱の学習に粒子概念を導入することの効果:小学生に発熱の仕組みを理解させるために」というタイトルの論文として,日本科学教育学会に投稿し,現在審査中である.・後者は,「小・中学校数学と理科の連携を意識した濃度学習指導法の提案:習熟度別のつまずきの要因を究明して」というタイトルの論文として,日本科学教育学会に投稿すべく最終点検中である.○昨年、「水溶液の濃度計算」に関する論文を学会紀要に投稿中であることを報告したが、「カリキュラムマネジメント」の視点での加筆修正を査読員から指摘され、再度考察することで以下のことが明らかになった。「水溶液の濃度計算」の問題におけるつまずきの程度により、6段階に生徒を分けることができた。段階毎にどの知識・技能が欠けてつまずいているのかを分析した結果、「水溶液の濃度計算」の問題を解決する上で基礎となる小数や百分率に関する数学的技能のうち、特に「百分率を小数に変換して溶質を求める」での「百分率を小数に変換する」の数学的技能の習得が必須であることが明らかになった。これは小学5年時で重点的に習得すべき技能であり、習得できていないと「水溶液の濃度計算」の問題は解決できない。したがって、この数学的技能の習得を重点的に指導をしていく必要がある。○小学6年「てこの学習」は、中学3年での「仕事の原理」の学習に深く結びつき、これが理解できないと中学校での理解が難しくなる。小学6年「てこの学習」での「支点・力点・作用点」の並び方が同じ道具を図から選ぶ問題では、児童は「外見が似ているもの」で判断して回答してしまう傾向があることが明らかになった。

また、「ピンセット」や「トング」のような「作用点で働く力が力点に加える力よりも小さくはなるが、細かい作業に適したてこ」もあり、「てこは力点に加える力よりも作用点での力を大きくする道具」といった先入観が、逆に「てこの学習」での「支点・力点・作用点」の並び方の理解を妨げている可能性があることも明らかになった。「月」に関して調査を行ったが、当初は児童に地球の自転と公転の動きをモデルを用いて説明をして、各自に観察させれば理解できるものと考えていたが、2つの動きを同時に考えることが小学6年の児童には難しく、実験群と統制群に差がみられなかった。このため、これ以上、「月」に関しての研究を続けることは難しいと判断し、「てこの学習」の取り組みに変更して研究を行った。その結果、ささやかながら研究成果が得られた。中学生になった途端に理科の内容が難しいと感じる生徒が多い.特に,目に見えない現象,イメージし難い内容を敬遠する傾向にある.内容を理解しようと思っても,必要な基礎技能を身につけていなければ理解することはできない.理科は特に基礎技能を必要とする学習が多い.中学校の理科の学習を進めていく上で,小学生の理科や算数の何をしっかりと学ばせておけば,中学校に進学しても円滑に学習が進められるのであろうか.本研究の目的は小学生に重点的に指導すべき「押さえておくべき基礎技能」を特定することにある.最終年度は,水溶液の濃度計算におけるつまずきの要因を特定するために,「総合問題」「中位問題」「下位問題」の正誤を生徒ごとに分析し,生徒を6グループに分類した.これらのグループ間で「公式問題」「計算問題」「意識調査」の正答・誤答者数を比較分析した結果,生徒が水溶液の濃度計算に関する問題を解決する際につまずく要因が,「食塩水の構造」「溶液の構造」「食塩水の濃度の公式」「濃度の公式」「百分率から小数への変換」「百分率の計算」「方程式の計算」「濃度の公式の変形」の知識・技能の不足によるものであることが明らかになった.特に数学的技能のうち,「百分率を小数に変換して溶質を求める」での「百分率を小数に変換する」の数学的技能の習得が必須であることが明らかになった.この基礎技能は小学5年時で重点的に習得すべき技能であり,習得できていないと「水溶液の濃度計算」の問題は解決できない.この基礎技能の習得を重点的に指導していくことで,(小学校の理科や算数の学習内容から掘り下げた「カリキュラム・マネジメント」の視点をもって),生徒は水溶液の濃度計算に関する問題が解決できると考える.・「月」「密度」については,分析は終了したが,再検討中である.・新たに,「地層」と「グラフの読み」についての調査を今年3月に終了し,現在分析中である.小学校と中学校との円滑な接続を行うための、知識・技能は何なのかを中心に研究を進めてきたが、多くの単元のいろいろな箇所で必要となる知識・技能が存在することが分かってきた。3年程度の研究ではなく、長い期間かけてじっくりと研究を行っていく必要のあるテーマであることが改めて分かった。また、実感を伴った理解とともに、科学を学習することの有用性(意味)についても児童に知らせるためにも、知識・技能の研究は有効であることが分かった。今後は、小・中学校の連携のみならず、中・高校の連携も視野に入れて「カリキュラム・マネジメント」の視点で研究を進めていく。昨年度は、熊本地震があり,日本科学教育学会年会(大分大会)に参加しなかったために,学会発表時の旅費の96022円が結果的に余ってしまった.粒子概念の導入で、水、水蒸気、金属の膨張をリアルに児童に見せるために、マグネチックスターラーに発泡スチロール球を入れ、球の動きで膨張の現象を表現することを考えた。しかし、その現象を児童に演示で見せるか、各班で実際に行わせるかの判断がつかずに購入をしなかった。このため、マグネチックスターラーの購入分の96,022円が余った。研究のデザインの部分で、迷いがありこのような事態となってしまった。96022円の余剰金は,今年度にぜひ学会紀要の掲載費用に当て有効に活用したい.
骨格筋におけるコネクチンおよびカルパインp94を介したシグナル伝達の解析

p94は骨格筋特異的に発現するプロテアーゼであり、骨格筋への運動(収縮・伸展)ストレスなどが起きた場合に、これを感知し筋アンキリン反復蛋白質2や熱ショック蛋白質の発現上昇を介して骨格筋細胞の防御反応を引き起こす。この骨格筋への運動刺激に対するp94のシグナル伝達ネットワークが正常に機能するためにはp94のプロテアーゼ活性が必須であり、ない場合は骨格筋が変性・壊死する。骨格筋特異的に発現するカルパインp94は骨格筋細胞のサルコメア内部においてM線およびN2A領域でコネクチンと直接結合する。申請者は以前に培養初代骨格筋細胞を用いたin vitroの実験により、p94のサルコメアでの局在はサルコメア長およびp94の酵素活性に依存して変化することを明らかにした。つまりサルコメアが長くなるとp94はコネクチンのN2A領域に集積し、短くなるとM線に局在変化する。本年度は、in vivo骨格筋においてもin vitroと同様にサルコメア長に応じたp94の局在変化が起きている可能性を検討した。さらにp94の局在変化がp94の酵素活性に依存することも示すために、野生型マウスと酵素不活性型p94を発現する遺伝子改変マウスの骨格筋を実験に用いた。マウスの長趾伸筋を用い、様々な伸展率で筋を固定後、免疫組織染色を行い、サルコメアの長さとp94の局在パターンを詳細に検討した。その結果、in vitroと同様にサルコメアが長くなるとp94はN2A領域に、短くなるとM線に局在変化することがin vivoにおいても確かめることができた。さらに酵素活性不全のp94では、サルコメアの長さの応じた局在変化は観察できるものの、野生型と比較すると、その反応性が有意に低下していることが示された。一連の結果から、骨格筋の伸展・収縮刺激に対してp94はその酵素活性を伴って応答し、局在を変化させる分子であることを示すことができた。骨格筋特異的カルパインであるp94は骨格筋の収縮・伸展刺激に応じてサルコメア内で局在変化を起こすこと、しかもその局在変化はp94のプロテアーゼ活性に依存していることを以前に報告した。昨年度は、骨格筋の収縮・伸展刺激に応じたp94の局在変化の生理的な意義について明らかにすることを目的として研究を行った。骨格筋の収縮・伸展刺激のモデルとして野生型マウス、およびプロテアーゼ活性不全のp94を野生型p94の代わりに発現するp94遺伝子改変マウスに運動負荷を与え、運動直後に骨格筋を採取し、運動刺激の有無によるp94のプロテアーゼ活性能を検討した。その結果、野生型マウスでは運動刺激によりp94のプロテアーゼ活性が活性化することを見出した。一方、p94遺伝子改変マウスでは運動後に筋線維の変性・壊死が観察された。この結果はp94のプロテアーゼ活性がないと運動刺激において筋線維が変性・壊死すること、すなわち骨格筋の運動ストレス防御に対してp94のプロテアーゼ活性が必要であることを示唆している。次に、運動刺激でp94が活性化することから、p94の基質候補分子の探索を行った。すなわち、運動刺激の有無、および野生型、遺伝子改変マウス由来の骨格筋試料をiTRAQにて標識後、質量分析計により、定量的かつ網羅的にタンパク質を解析した。現在、運動刺激の有無、および野生型-p94の遺伝子改変マウス間において増減するタンパク質に注目することで、p94の基質候補を探索している。骨格筋特異的に発現する蛋白質分解酵素であるカルパイン3(p94とも呼ばれる)は、骨格筋細胞内のサルコメアにおいて巨大弾性蛋白質であるコネクチンと直接結合し存在する。本研究では骨格筋細胞の伸展刺激を感知するセンサー分子としてコネクチン、コネクチン結合分子の一つとしてp94に着目し、『骨格筋細胞の伸展刺激→コネクチン分子の伸展→コネクチン結合分子p94への伝達および応答』という、骨格筋細胞への収縮・伸展刺激に応答するシグナル伝達ネットワークの存在を提起し、このシグナル伝達にp94の酵素活性が関与することを明らかにすることを目的とした。生化学的および細胞生物学的な解析を行った結果、p94のサルコメア内での局在が骨格筋の収縮・伸展状況に依存して変化すること、しかもp94の迅速な局在変化のためにはp94の酵素活性が必要であることを示した。さらに、連続的な骨格筋への収縮・伸展のモデルとしてマウスに運動負荷を与えたところ、野生型マウスでは熱ショック蛋白質(HSPs)、および筋アンキリン反復蛋白質(MARP2)の発現が上昇し、骨格筋の運動ストレスに対する応答反応が誘導された。一方、p94の酵素活性不全の遺伝子改変マウスではこれらの蛋白質の発現上昇が起こらず、運動ストレスに対する応答が不全となり筋変性・壊死となった。

これらの結果はコネクチンを介したp94の骨格筋収縮・伸展刺激に対するシグナル伝達ネットワークの存在と、このシグナル伝達を正常に機能させるためにはp94の酵素活性が必須であることを示している。
モデルマウスにおける唾液腺アポトーシス機構解析と口腔乾燥症への臨床応用

加齢および薬剤投与による唾液腺分泌減少は、自己免疫疾患に位置付けられるシェーグレン症候群患者と同様に、口腔乾燥状態が原因による齲蝕の多発、歯周病の増悪などを起こしやすい。糖尿病のモデルマウスであるNODマウスは、唾液分泌機能も障害されていて、そのことは、腺上皮細胞のアポトーシスが原因の一つと考えられている。本研究では、まず、唾液腺分泌減少と腺上皮細胞のアポトーシスの関連をみるため、NODマウスより得た唾液腺を用いて、アポトーシスの指標となるTUNEL染色を行い、腺上皮細胞のアポトーシスがおこりやすい領域を特定した。次に、アポトーシス領域と正常唾液腺の各々より細胞をライン化し、Facscanを用いて細胞表面の発現について、特にFasやFasLの発現について、培養条件を変えながら解析を行った。また、唾液腺が傷害を受ける機構については、T細胞の関与が大きいことが予想されたため、抗体を用いたelispot法やクロミウムにより、細胞障害活性の程度について確認した。さらに、T細胞のライン化を試みて、抗原認識における機構の解析を行う予定である。また、唾液腺細胞における各種シグナル伝達分子の関わりについては、細胞より得たmRNAを用いて解析を行った。また、インターフェロンの存在、非存在の条件の違いにより、サイトカインの種類によっては、発現に違いが認められ、アポトーシス関連分子の発現にも違いが認められた。一方、TNF-αの存在、非存在の条件の違いによる発現の相違は、ほとんど認めなかった。加齢および薬剤投与による唾液線分泌減少は、自己免疫疾患に位置付けられるシェーグレン症候群患者と同様に、口腔乾燥状態が原因による齲蝕の多発、歯周病の増悪などを起こしやすい。また、コントロールマウスや老化モデルマウス、アポトーシス関連遺伝子であるFasの機能消失変異体であるlprマウス等と比較し、唾液腺におけるアポトーシスを組織染色による解析を用いて行った。次に、マウスより得た唾液腺より、腺上皮細胞の培養に適した条件を決定し、アポトーシス領域とアポトーシスをおこしていない領域から各々cell line化した。この細胞における、FasLとFasの発現強度をFacscanを用いて比較したところ、アポトーシス領域での発現の上昇が認められたが、FasLとFasの共発現は、認めなかった。さらに、cell line化した細胞の培養液に、IFN-αとTNF-αを加えたところ、FasLとFasのさらなる発現の強度が認められた。今後、さらに、加えるIFN-αとTNF-α量による違いや、両方加えることによる変化について、解析を進めている。
中国初期王朝時代の政治的空間構成の考古学研究－GISを応用した地域システムの分析

1現地調査を実施した。2018年8月に黄河流域陝西省関中平原の現地調査を実施した。主な目的は2018年度に出版予定の本研究課題による地理考古学的著作の作成にあたって、これまでに入手できていなかった写真資料を追加で撮影することであった。おもな調査地は中国陝西省の関中平原で、西安市、扶風県、岐山県、宝鶏市であった。今回は黄土地帯における河川交通と水資源に関する情報を得ることを目指したもので、長年の現地調査でも抜け落ちていた写真資料が中心であった。目的地には現地専門家の案内をえて、予定通りの写真撮影を実施することができた。2黄河流域の山東省を対象に、遺跡の位置情報について『中国文物地図集山東分冊』掲載のデータをGIS基盤の地図上に点情報としてデジタイズ記録し、同時に各遺跡の属性データ(年代、遺跡の性格等)をデータベース化する作業を昨年度以来継続してきたが、2018年度8月までに完成させることができた。3上記1にある著書は、『西周王朝の形成と関中平原』(同成社)のタイトルで2019年3月に出版した。関中平原に関する地理考古学的方法を実践した初めての研究書となったと考えている。4上記2にある山東省の遺跡情報については、山東省の研究者の協力をえて青銅器の型式学的分類と型式別の分布パターンの変遷を可視的に明らかにした論文を発表した。「春秋戦国時代青銅和考」『アカデミア人文・自然科学編』第17号。初期王朝時代後期(春秋戦国時代)の青銅器の製作とその分布のあり方をとらえることで、西周時代から東周時代にかけての文化要素の空間的動態の一側面を明らかにし、政治史的変動と文化の動態の相関関係について検討した。中国初期王朝時代の政治的空間の構成を、考古学GISを応用しながら分析することが本研究の課題である。2018年度の研究実績の概要にも書いたように、当初から注力してきた地域である陝西省関中平原(黄河中・上流部)については、560頁余りの著作としてまとめることができ、一つの段階を完了できたと考えている。一方、初期王朝の中心地域の一つである黄河下流域の山東省方面についても、GIS基盤のデータベースの準備が整い、その試論的な論文を発表することができた。2017年度までに発表してきた分析途上の研究発表等にくらべても、到達目標に近づいたと判断している。しかしながら、昨年度の本項目にも記述したように、初期王朝の周辺諸地域(中国大陸南部など)の政治的空間については、問題の奥行き、関連資料の膨大なことをあらためて知ることととなり、今後の大きな研究課題として浮かびあがってきている。「現在までの進捗状況」にも記述したように、中国初期王朝時代の王朝周辺地域の文化と政治的空間の構成については、われわれの研究はいまだ出発点にとどまっている。今後の研究課題と考えている。今回の研究課題は2019年度で終了するので、まずは2019年度中にこれまでの黄河流域における王朝中心地域を対象とした研究を整理して総括する。その上で、可能であればその延長上で再度科学研究費助成を申請して、初期王朝周辺地域(とくに中国大陸南部)について研究の幅を広げていきたい。具体的には、中国初期王朝中心地域に見られた象徴性をもつ(あるいは政治性を帯びた)物質文化の、周辺諸地域への波及状況と、周辺各地域におけるその受容のあり方を分析して、王朝周辺地域(これまでの私の研究で述べてきた「外域」)における地域社会の状況を中原王朝との関係性という文脈の中で分析していきたい。すでに現地専門家との連絡もはじまっており、嶺南地方(広東省)、四川省、雲南省等を対象として次の段階の地理考古学的研究に進みつつある。考古学から見た中国初期王朝時代の政治的空間構成について、GIS(地理情報システム)および衛星画像をもちいたリモートセンシングの手法によって分析することが本研究の目的である。初年度にあたる平成27年度は、まず基本となる衛星画像(1960年代のCORONA衛星画像)の入手とその幾何補正をすすめた。また、CORONA衛星画像のほかに最新の衛星画像についても入手し、GISおよびリモートセンシング解析の基本となる地図データの整理をすすめた。対象とした地域は黄河中、下流域である。黄河中流域、とくに黄河支流の渭河流域(関中平原)については、代表者と研究分担者は本科研の研究の以前からのデータの蓄積もあり、平成27年度は、主として衛星画像の解析と考古学上のデータの照合による初期王朝(主として西周王朝秦王朝)時代の集落遺跡の分布の変遷を再検証する作業をおこなった。また、年度の後半には黄河下流域(山東省方面)にも視野を広め、山東省内の電子地図上に集落遺跡の位置の入力をすすめるとともに、現地の山東大学から専門家(路国権氏)を招いて研究交流をおこない、今後の協力体制について相談するとともに、研究集会を開催して路国権氏に最新の山東方面の古代都城址調査の進展について研究発表をお願いした。山東省の遺跡位置の入力は次年度にも継続し、その完成によって山東方面の新石器時代初期王朝時代(すなわち初期国家形成期)の集落分布の変遷について、従来になく精緻に分析できるものと期待している。山東省方面の分析は、中国初期王朝中心部の「畿内的地域」に隣接する周辺地域の政治的空間の動向を分析する最良の材料となる。なお次年度以降は、研究室におけるデータの解析のみならず、現地での実地調査をすすめていく。

研究代表者の大学内における職務が、非常に忙しくなったため、平成27年度に予定されていた現地調査を次年度以降に変更することとした。平成28年度以降は研究代表者の情況も変化するので、再度計画して、現地調査を実施していく。中国初期王朝時代の政治的空間の構成について、平成28年度は主に次の3点に集中して研究を進めた。1黄河下流域(山東省)に関する遺跡データベース(GIS基盤)の作成:中国から出版されている『中国文物地図集』のデータに基づき、遺跡の位置情報を中心に4000箇所余りを入力し、デジタル地図内に格納した。また、半年間南山大学に滞在した山東大学の専門家との学術交流を毎週定期的におこない、意見交換して、当該データベースに反映させた。山東省に関する遺跡データベースの完成は平成29年度になる予定である。2黄河中流域(河南省、陝西省)の現地調査と学術交流:10月末から10日間余り、河南省、陝西省の初期王朝時代遺跡とその政治空間に関わる周辺地域の地理環境を調査した。二里頭遺跡(「夏」王朝の王都)では立地する盆地空間の周辺地理環境、陝西省では豊鎬遺跡・周原遺跡(西周王朝の王都)において、同様の周辺地理環境を調査した。地理環境調査の眼目は「可耕地」の広がりを確認することで、今回幾つかの具体的な新認識を得ることができた。3中国初期王朝の「遠隔地」としての「外域」に関する研究:研究代表者の提起する初期王朝政治圏の「外域」という概念がある。これに関連して「牙璋」という初期王朝時代の政治性を帯びた特異な儀礼用玉器に注目し、その分布と拡散の経緯を初期王朝政治圏の形成と関係させて検討した。その成果は中国で開催された国際会議(東亜牙璋学術研討会議)において発表した。今後の研究の方向として、上記1のデータベースの完成とそれにもとづく黄河下流域の分析を進め、2の黄河中流域の研究をさらに深化させる一方で、3の「外域」に対する内容にも重点を置いて研究を進める必要を考えている。予定していた黄河流域遺跡データベースの作成は、概ね順調に進められている。「研究実績の概要」にも触れた黄河下流域山東省の研究者の参与を得て、データベース自体の内容を深めるとともに、諸作業がスムーズに進行できた点も指摘しておきたい。ただ、政治的空間の分析過程においては、現地調査で得られる地理的情報が予想以上に豊富で、それを分析結果に反映するためには予定以上の時間を要することとなっている。一方、「研究実績の概要」にも触れた初期王朝政治圏の遠隔地である広大な「外域」については、本研究の進展とともにその研究対象としての重要性が増しており、当初の計画が黄河流域を中心にしたものであったが、それよりはるかに広大な地域に対する検討も必要となってきた。こちらへの対応にも予定を若干超えた時間を要する状況となっている。中国初期王朝時代の政治的空間の構成について、平成29年度は次の3点に集中して研究を進めた。1中国現地の調査(山東省、陝西省、四川省、河北省、広東省等の現地調査と学術交流:本年度研究代表者は所属大学の研究休暇をえて、あわせて約2か月間の現地調査を行った。7月初旬から8月中旬まで北京に滞在し、その間、7月初旬に山東省(西部)、中旬に陝西省(関中平原)、下旬から8月上旬に四川省(成都平原と川中川東)、8月中旬に河北省(中部)を踏査した。また2018年1月には香港および広東省(珠江デルタ地域)の踏査と学術交流をおこなった。
心筋収縮制御の加齢変化とその性差

「加齢」は循環器疾患のリスク因子として認知されている。また循環器疾患リスクには性差の存在も知られている。そこで加齢が心機能に与える影響とその性差について基礎的知見の蓄積を目的として、マウス心筋細胞の収縮機能と細胞内Ca^<2+>動態およびそれらの液性因子、特にエンドセリン(ET-1)による制御について、若齢(6-10週齢)-老齢(100週齢以上)間および雌雄間での比較検討を計画した。その老齢化を待つ必要上、老齢マウスは入手に時間がかかるため、本年度は主に若齢マウスにおけるET-1による変力作用の細胞内機序についての検討を行った。ET-1はマウス心筋において陰性変力作用を示す事、その機序としてNa+/Ca^<2+>交換体活性化による細胞内Ca^<2+>排泄能の増大および収縮タンパクCa^<2+>感受性の低下が示唆される事を我々は示したが、今回、ジアシルグリセロール(DG)分解酵素であるDGキナーゼを心臓特異的に過剰発現させたマウスを用いた検討により、ET-1の陰性変力作用にはDGの産生によるプロテインキナーゼCの活性化を介する事が示された。性差に関して、収縮弛緩とCa^<2+>トランジェントのキネティクスおよびET-1によるそれらの修飾について有意な差は観察されなかった。また、現時点では十分な量のデータは得られていないが、雄性老齢マウスにおける検討も行い、若齢マウスと比較して、Ca^<2+>トランジェントのキネティクスに有意差が見られないにもかかわらず収縮時間の延長が見られる事、ET-1の陰性変力作用が減弱傾向にある事、それらのパラメータの細胞間でのバラツキが大きい事が観察された。さらなる老齢マウスからのデータ取得は次年度に予定されていたが、研究代表者の転出に伴い、本研究は今年度で終了する事となった。心筋興奮収縮連関と液性因子によるその制御機構における加齢と性差の影響についての検討を目的として、若齢(57週齢)および老齢(7090週齢)Ca^<2+>蛍光指示薬indo-1を負荷したマウス単離心筋細胞を用いて細胞収縮と細胞内Ca^<2+>トランジェントの同時測定を行い、以下の結果を得た。ただし、老齢マウスの入手には加齢を待つための時間を要するため、現時点では充分な動物数を得られておらず、したがってデータ数も不充分である。今後、データ数を増やし解析結果の定量性を上げる必要がある。1)雄性マウスを用いて、単収縮とCa^<2+>トランジェントのキネティクスを若齢-老齢間で比較したところ、単収縮の収縮・弛緩時間共に老齢マウスにおいて長く、加齢による収縮時間の延長が観察されたが、Ca^<2+>トランジェントの持続時間は逆に老齢マウスにおいて短縮傾向にあった。この単収縮とCa^<2+>トランジェントのキネティクスの加齢変化は互いに相反する方向であり、Ca^<2+>トランジェントの減衰相に関与する機構と収縮タンパクの両者の機能に加齢変化が生じる事を示唆している。2)若齢雄性マウスを用いたテタヌス法による検討で、ET-1は収縮キネティクスを遅延させる事が示され、この作用が"見かけ上のCa^<2+>感受性低下現象"として陰性変力作用に寄与している事が示唆された。3)ET-1の陰性変力作用は雄性の若齢-老齢間で有意ではないものの、老齢マウスにおいて減弱している傾向が見られ、ET-1の変力作用にも加齢変化が存在する可能性がある。
インフルエンザウイルス粒子に取り込まれる低分子ＲＮＡの同定と機能解析

A型インフルエンザウイルス粒子内に、宿主由来の低分子RNAなどの様々な低分子RNAが取り込まれているかどうかはわかっていない。発育鶏卵あるいはVero細胞で増殖させたウイルス粒子中の低分子RNAを次世代シークエンサーを用いて解析した。その結果、tRNAやウイルスゲノムRNA断片が検出された。HA分節のRNA断片を恒常発現するMDCK細胞を作製し、ウイルス増殖に与える影響を調べたが、ウイルス増殖性に影響は与えなかった。作製した細胞では発現量や局在がウイルス感染細胞と異なる可能性があることが考えられる。今後はよりウイルスゲノム末端の発現量を高めた恒常発現細胞を作製し、解析することが必要である。インフルエンザウイルスの粒子内に宿主由来低分子ノンコーディングRNA (sncRNA)が取り込まれるかどうかわかっていない。また、その機能に関しては全くの未知である。そこで、本年度では、ウイルス粒子内に取り込まれた宿主由来sncRNAの機能を解析するための前段階として、次世代シークエンサーを用いて粒子内に取り込まれた宿主由来低分子のncRNA網羅的に同定することを目的とした。発育鶏卵にA/Puerto Rico/8/1934(PR8)株を感染させ、培養後、漿尿液を回収し、ウイルス粒子をショ糖密度勾配超遠心法によって精製した。精製ウイルス粒子から200塩基以下のRNAを抽出し、5'および3'にアダプターを付加した後、逆転写によってcDNAライブラリーを作製した。さらにPCR法を用いてcDNAライブラリーを増幅した。作製したcDNAライブラリーの配列は次世代シークエンサーを用いて解析した。その結果、ウイルスのゲノムRNAの5'および3'末端の配列、リボソーマルRNA(28S、18S、5.8S、5S)の断片配列、およびtRNAが検出された。全体リード数に占める割合はそれぞれ29.6%、13.5%、11.8%であった。特にtRNA-Glyは全体のリード数の6.6%を占めており、他の低分子RNAよりもリード数が多かった。さらにノーザンブロット法によっても、tRNA-Glyが粒子内に取り込まれていることを確認した。Vero細胞で増殖させたPR8株でも同様の結果が得られた。ウイルス粒子内に取り込まれていることが確認されたtRNAやrRNAの断片がウイルス増殖に与える影響およびその機能は不明である。これらのsncRNAがインフルエンザウイルスの増殖環のどのステップに作用するのかを強制発現系などを用いて、今後詳細に解析する予定である。ウイルス粒子内には、ウイルスの増殖に必須なウイルスゲノムおよびウイルスタンパク質が取り込まれている。それらウイルス由来の因子に加えて、粒子内に、低分子RNAが選択的に取り込まれていることがいくつかのウイルスで報告されている。A型インフルエンザウイルスにおいては、ウイルス粒子内に宿主由来の低分子ncRNAなどの低分子RNAが取り込まれているかどうかはわかっていない。様々な宿主で増殖させたウイルスに共通して取り込まれているRNAを調べることで、ウイルス粒子内に選択的に取り込まれる低分子RNAが存在するかどうかを調べることを目的として、次世代シークエンサーを用いてウイルス粒子内に取り込まれる低分子RNAを同定した。精製A/Puerto Rico/8/1934(PR8)ウイルス粒子から200塩基以下のRNAを抽出しcDNAライブラリーを作製した。その結果、宿主由来低分子RNAも検出されたが、得られたリードのうち30%がウイルスのゲノムRNAの5'および3'末端の配列がであった。そこで、レトロウイルスを用いて、一番多く含まれていたHA分節の5'および3'末端の配列を恒常発現するMDCK細胞を作製し、ウイルス増殖に与える影響を調べた。しかしウイルスゲノム末端を発現する細胞でのウイルス増殖性は野生型のMDCK細胞と同程度であり、ウイルスゲノム末端の増殖における役割を明らかにすることは出来なかった。今回用いたレトロウイルスによる強制発現系は発現量が低いためにウイルス増殖に違いがなかった可能性が考えられる。今後はよりウイルスゲノム末端の発現量を高めた恒常発現細胞を作製し、解析することが必要であると考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。ウイルス学26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究計画は、1.インフルエンザウイルス粒子内に取り込まれる低分子ncRNAの定量、2.インフルエンザウイルス粒子内に選択的に取り込まれる低分子ncRNAの解析、3.次世代シークエンサーで読まれたデーターの解析および選択的に取り込まれる低分子ncRNAの同定であった。1についてはインフルエンザウイルス研究によって最もよく用いられるイヌ腎上皮細胞(MDCK)細胞に代表的な実験室株であるA/Puerto Rico/8/1934(PR8)を感染させ、培養上清に含まれるウイルス粒子をショ糖密度勾配超遠心法によって精製し、ゲノムRNAを回収し、cDNA化したのち次世代シークエンサーにかける。

結果を解析し、低分子ncRNAが取り込まれていること、およびその量を調べることを目的としていた。今回MDCK細胞の代わりに発育鶏卵を用いたが、インフルエンザウイルス粒子が精製できたことそして粒子内に取り込まれる低分子ncRNAの種類およびその割合を求めることができたことから目的を達成できたと考えている。2については発育鶏卵およびVero細胞で同様の結果が得られたこと、そして細胞内と粒子内の低分子ncRNAの存在比をノーザンブロット法により定量出来たことから、この目的についても達成できたと考えている。そして3については得られたデータを解析した結果、おもにウイルスゲノムRNA、リボソーマルRNA、tRNAが取り込まれていること、そしてその割合も明らかにすることが出来たことから、目的を達成できたと考えている。以上1、2、3すべて目的を達成できたことから、研究は順調に進展していると考えている。ここまで順調に研究が進んでいることから、当初の計画通りに研究をすすめることとする。まず同定した低分子ncRNAがインフルエンザウイルス増殖に与える影響をしらべる。同定した低分子ncRNAがインフルエンザウイルス増殖に与える影響を以下の方法で調べる。1同定した低分子ncRNAを合成し、細胞にトランスフェクションする。2同定した低分子ncRNAのアンチセンス鎖をトランスフェクションする。3同定した低分子ncRNAの数か所に変異を導入したRNAを合成し、ドミナントネガティブ効果を調べる。13それぞれで、ウイルスの増殖カイネティクスを調べ、ウイルスの増殖に影響を与える低分子ncRNAを同定する。次に相互作用するインフルエンザウイルス構成物の決定する。ウイルスの増殖に影響を与える低分子ncRNAがどのウイルス構成物と相互作用するか決定する。ウイルスタンパク質と相互作用するかどうか調べるために、ウイルスタンパク質に対する抗体で免疫沈降し、共沈してきた低分子ncRNAをノーザンブロットで検出する。またウイルスのゲノムと核タンパク質(NP)・ポリメラーゼの複合体(RNP)と相互作用する場合も考えられるが、この場合は超遠心によってRNPを精製し、その画分に同定したncRNAが含まれるかノーザンブロットにて検出する。相互作用するウイルス構成物が決まった後には、その構成物によってその影響を調べる。例えば、ポリメラーゼと相互作用することがわかった場合は、ウイルスゲノム複製、あるいは転写への影響などを調べる。RNPに相互作用することがわかった場合は、RNPの核から細胞膜直下への輸送の影響やゲノムパッケージング効率を、NPに対する蛍光抗体顕微鏡法や精製ウイルス粒子内のゲノムRNAをノーザンブロットで定量し調べる。
社会ゲームの学融合的展開-華巌ゲームの応用研究-

本研究計画では華厳ゲームの応用とネットワーク型シミュレーションの開発を二大目標とした。さらに、突然変異の発生およびその影響を解析することも期待した。潜伏的利得構造を組み込んで未知のエージェントを扱うことはできなかったが、以下のようにして、おおむね目標を履行した。2人華厳ゲームとの比較で様々なディレンマを伴う2人ゲームを取り上げ社会行動の進化を分析する。華厳ゲームは古典的なゲーム論の意味でどんなプレイも最適反応である。本研究では、繰り返し2人ゲームにおいて様々なディレンマ、プレイヤーの相互作用の形態、シグナル交換、記憶・計算の様式、ミスをすることの影響の研究してみた。Nowak(1993)型の進化ゲーム動学方程式を利用する。これによって、進化、変異、アクションノイズの影響をセットで解析できる。とくに、プレイヤーが記憶を持っていない(m=0)、相手の前回の行動についてだけ記憶を持っている(m=1)、相手の前回の行動と自分の前回の行動について記憶を持っている(m=2)の三ケースを分析する。通常、(1)自分だけが損する状況は拒否する、(2)両者がディレンマに陥る場合は協調行動を選択する、(3)協調関係にあるときは協調行動を継続する、ような戦略はPAVROV戦略と呼ばれる。秋山(2003)は、m=2で、華厳ゲームで最強の戦略は、PAVROVであることを示した。囚人のディレンマではPAVROVは進化的安定戦略ではない。また、華厳ゲームの脈絡では、(1)の行動は、相手の行動を道徳的に促すという積極的な意味がある。華厳ゲームのPAVROVをとくにPunishment within Compassion(PwithC)と呼ぶ。華厳ゲームとは異なるが、利他的な懲罰の有効性はBoyd et al.(2003)からも引き出される。この点で、華厳ゲームは近年の利他主義研究に貢献することができた。1.研究経過の報告:(1)「分析枠組みの見通し」:ゲームは当初、プレイヤーの個々の判断に左右されるが、そこで発生する履歴に依存して決まる確率過程としてみるとき経路依存性が働く。まず、確率過程で経路独立的過程、経路依存的過程の二通りに分類する。経路独立的過程で「突然変異の発生」について青木正直(UCLA)の研究がある。一方、経路依存過程の研究にはB.W.アーサーの研究『収益逓増と経路依存』がある。有賀はアーサーの論文集全訳を行い経路依存過程に詳細な見通しを与えた。青木統夫は経路依存確率過程の厳密な定義を与えた。(2)「プレイヤーの内的認知」:これまでのゲームは利得構造などの外部世界構造の記述に力点を置いてきた。秋山英三はプレイヤーの内部構造、特に、相互作用の中での個人の認知・意思決定に関する理論形成の研究を行った。この観点から、Coupled Dynamical Recognizerを用いて「華厳ゲーム」にシミュレーションを開始した。(3)「社会ゲームのネットーワーク実験」:生天目はマイノリティゲーム、寡占ゲームについてネットワークゲームの実験環境を構築し、群衆行動の変異、収入曲線の推定の可能性を調査できるようにした。また、ゲーミングでエージェントによるリスクの考慮についての研究を開始した。(4)小田宗兵衛は小山友介とともに市場のミクロ構造の実験、また、小山は公共財供給ゲームの実験的接近の研究を進化させ、数理社会学会、日本シミュレーション&ゲーミング学会などで継続的に発表を重ねた。CS02で小田は国際的な実験経済学セッションを組織した。

本研究計画では華厳ゲームの応用とネットワーク型シミュレーションの開発を二大目標とした。さらに、突然変異の発生およびその影響を解析することも期待した。潜伏的利得構造を組み込んで未知のエージェントを扱うことはできなかったが、以下のようにして、おおむね目標を履行した。2人華厳ゲームとの比較で様々なディレンマを伴う2人ゲームを取り上げ社会行動の進化を分析する。華厳ゲームは古典的なゲーム論の意味でどんなプレイも最適反応である。本研究では、繰り返し2人ゲームにおいて様々なディレンマ、プレイヤーの相互作用の形態、シグナル公刊、記憶・計算の様式、ミスをすることの影響の研究してみた。Nowak(1993)型の進化ゲーム動学方程式を利用する。これによって、進化、変異、アクションノイズの影響をセットで解析できる。とくに、プレイヤーが記憶を持っていない(m=0)、相手の前回の行動についてだけ記憶を持っている(m=1)、相手の前回の行動と自分の前回の行動について記憶を持っている(m=2)の三ケースを分析する。通常、(1)自分だけが存する状況は拒否する、(2)両者がディレンマに陥る場合は協調行動を選択する、(3)協調関係にあるときは協調行動を継続する、ような戦略はPAVROV戦略と呼ばれる。秋山(2003)は、m=2で、華厳ゲームで最強の戦略は、PAVROVであることを示した。囚人のディレンマではPAVROVは進化的安定戦略ではない。また、華厳ゲームの脈絡では、(1)の行動は、相手の行動を道徳的に促すという積極的な意味がある。華厳ゲームのPAVROVをとくにPunishment within Compassion(PwithC)と呼ぶ。華厳ゲームとは異なるが、利他的な懲罰の有効性はBoyd et al.(2003)からも引き出される。この点で、華厳ゲームは近年の利他主義研究に貢献することができた。
母親の松果体ホルモンが齢と関連して妊娠・発達・性の分化に及ぼす影響

ヒトと同様に生殖活動に季節変動の見られない雌性ウィスターラットで、松果体からのメラトニンの有無は加齢と関連して生殖機能、その胎仔・乳仔の発達にいかなる影響を及ぼすかなどを検索した。1.先に松果体除去(PX)母からの出産仔数は90100日齢の初産時に多く、体重も軽い事を報告したが、膣スメア診を約10日間行なった後に交尾させると、出産仔数と体重に有意差は認められなくなった。膣スメア診というストレスに対する反応は対照群よりもPXラットで強いことが示唆された。2.PX母からの出産仔の中に無尾症などの先天奇形を有する仔が時々見出されること、頻度はPX群(出産仔1263匹中7匹)で対照群(1328匹中0匹)よりも有意に高い(P<0.006)ことを確認した。従って、母親の松果体の存在は胎仔の発達に影響を与え、奇形の発現を抑制する可能性がある。3.妊娠20日期でPX母の胎仔68匹中に1匹の無尾症奇形胎仔を見出したが、対照群の胎仔89匹中には現在までのところ奇形はない。引き続き心臓および染色標本により骨格系の奇形の有無を検索中。4.生後発達:脳の乾・湿重量とその体重比は生後714日期でPX群において対照群よりも低値を示す傾向が見られ、腎臓や精巣では変化は見られなかった。従って、母親の松果体の存在は全身の発達における脳の発達の割合を高めている可能性がある。PX群の新生仔の中には眼球の乾燥重量や水分含量が低値を示す個体が存在すること、また、生後14日期には対照群では眼球の水分含量に日内変動が認められるようになるが、PX群ではそのような日内変動は不明瞭であることを明らかにした。5.性周期:膣スメアは生後6090日期ではPX群・対照群共にほぼ全例が4日周期を示した。生後1718か月の中年期では、4日周期を示す個体数は対照群では約10%だったのに対し、PX群では半数を占めた。それ以外では不規則から連続的非発情状態を示す個体が大部分で、連続発情状態を示す個体はPX群・対照群共に低頻度であった。4日周期または類似の状態を示す18か月齢ラットにメラトニン入り飲料水を時間制限装置により日内暗期に飲ませると、発情間期が増え4日周期が崩れる例が多かった。この効果は対照群の方がPX群よりも弱かった。一方、生後1718か月期で連続非発情状態または連続発情状態にある対照ラットおよびPXラットに同様にメラトニンを飲ませても、一般に連続非発情状態または連続発情状態は各々変化しなかった。また、稀には例外的な変化も見られた。ヒトと同様に生殖活動に季節変動の見られない雌性ラットで、松果体からのメラトニンの有無は加齢と関連して生殖機能、その胎仔・乳仔の発達および出産仔の性比にいかなる影響を及ぼすかを検索した。1.出産仔数:対照母と比較して松果体除去(PX)母からの出産仔数は、90100日齢の初産時に多く、以後の齢期では初産と2回目以後とに拘わらず差がなかった。又、生後1年以後の中年期で対照母に時々見られる出産仔数の著しく少ない例はPX母では非常に少なかった。2.性周期:生後1719か月の中年から老齢期で、一般に対照ラットでは4日周期が崩れて発情間期・発情期が極めて低頻度にしか見られないのに対し、PXラットでは4日周期を示す場合が多かった。このPX効果はメラトニン投与により逆転することを確認する実験を進めている。3.出産仔の性比:予備実験で繰り返し雄性仔をより多く出産したPXラットの仔から近交系を作ってその子孫を調べたが、同様の現象は起こらなかった。しかし、大量のデータを解析した結果、性比(雄:雌)は一般に1.0前後であるが、生後6か月以前の交配例よりも7か月以後の交配例で高い傾向があり、特に注目すべきことにPX母群で0.9から1.4へと明瞭な増加を示す(P<0.03)ことがわかった。現在、この事実を確認すべく更に多くの例について観察を続けている。4.3と関連して、遺伝子的性と性器の肉眼所見とがどの程度一致するかの検討をするため、sry geneをFISH法で、またFISH法は高価で大量の検体処理には不適当なため、キナクリン法によるY染色体の検出のための条件の検討を行なっているFISH法によるsry geneの検出には成功している。5.PX母からの出産仔に無尾症などの奇形をもつ例を見出した。6.脳の発達:PX母からの新生仔の脳の水分含量は対照母からのものよりも減少し、逆に乾燥重量は増加した。しかし、離乳期に近づくにつれて、PX母からの乳仔の脳水分含量はむしろ増加したり、変化なしの状態へと移行した。つぎに、脳内の部位について、メラトニン受容体サブタイプを含め種々の化学的物質の増減などについて検討を進めている。メラトニン受容体サブタイプの免疫組織化学的検出は現在世界中でできておらず、カナダの研究者との協同研究で化学的検索を進めている。

ヒトと同様に生殖活動に季節変動の見られない雌性ラットで、松果体からのメラトニンの有無は加齢と関連して生殖機能、その胎仔・乳仔の発達にいかなる影響を及ぼすか等を検索した。1.対照母と比較して松果体除去(PX)母からの出産仔数は、90100日齢の初産時に多く、以後の齢期では初産と2回目以後とに拘わらず差がないことを確認した。2.性周期:生後1819か月の老齢で、対照ラットでは4日周期を示す個体が極めて少ないのに対し、PXラットでは4日周期を示す個体が約半数以上を占めた。4日周期を示す18か月齢PXラットにメラトニン入り飲料水を時間制限装置により日内暗期に飲ませると、発情間期が増え4日周期が崩れる例が多かった。その後に溶媒のみの飲料水を与えた場合、4日周期に復帰しない例も見られた。一方、生後18か月で連続非発情状態にある対照ラットおよびPXラットに同様にメラトニンを飲ませても連続非発情状態は変化しなかった。3.生殖器の肉眼構造上の性と染色体形態上の性を、PXラットと手術対照ラット総計約100匹を用いて比較したが、ほぼ100%一致していた。4.PX母からの出産仔の中に時々無尾症又は水腎症(腎嚢胞)等の先天奇形をもつ個体が見出された。一方、対照群の母ラットからの出産仔にはこのような奇形はまったく見出されなかった。PX群と対照群の仔、各々約1000匹づつを観察・剖検し、PX母からの出産仔において奇形の発現率が有意に増加する(Fisherの直接確率法)事を認めた。従って、母親の松果体の存在は胎仔の発達に影響を与え、奇形の発現を抑制する可能性がある。5.PX母ラットからの出産仔の網膜アマクリン細胞におけるある種のカルシウム結合タンパクの量が、対照母ラットからの出産仔のそれよりも生後35日で増加している事を見出した。妊娠中は連続照明、生後は通常の24時間明暗周期のもとで飼育した仔の成績をあわせると、母親の松果体ホルモンが胎仔の網膜の発達に影響を及ぼす可能性がある。ヒトと同様に生殖活動に季節変動の見られない雌性ウィスターラットで、松果体からのメラトニンの有無は加齢と関連して生殖機能、その胎仔・乳仔の発達にいかなる影響を及ぼすかなどを検索した。1.先に松果体除去(PX)母からの出産仔数は90100日齢の初産時に多く、体重も軽い事を報告したが、膣スメア診を約10日間行なった後に交尾させると、出産仔数と体重に有意差は認められなくなった。膣スメア診というストレスに対する反応は対照群よりもPXラットで強いことが示唆された。2.PX母からの出産仔の中に無尾症などの先天奇形を有する仔が時々見出されること、頻度はPX群(出産仔1263匹中7匹)で対照群(1328匹中0匹)よりも有意に高い(P<0.006)ことを確認した。3.妊娠20日期でPX母の胎仔68匹中に1匹の無尾症奇形胎仔を見出したが、対照群の胎仔89匹中には現在までのところ奇形はない。引き続き心臓および染色標本により骨格系の奇形の有無を検索中。4.生後発達:脳の乾・湿重量とその体重比は生後714日期でPX群において対照群よりも低値を示す傾向が見られ、腎臓や精巣では変化は見られなかった。従って、母親の松果体の存在は全身の発達における脳の発達の割合を高めている可能性がある。PX群の新生仔の中には眼球の乾燥重量や水分含量が低値を示す個体が存在すること、また、生後14日期には対照群では眼球の水分含量に日内変動が認められるようになるが、PX群ではそのような日内変動は不明瞭であることを明らかにした。5.性周期:膣スメアは生後6090日期ではPX群・対照群共にほぼ全例が4日周期を示した。生後1718か月の中年期では、4日周期を示す個体数は対照群では約10%だったのに対し、PX群では半数を占めた。
化学増幅を利用した酵素電極の高感度化に関する研究

酵素電極は分子認識・物質変換部位としての固定化酵素部位と、信号変換部位としての電極とから構成されているので、各々の部位あるいは両部位を高感度化することによって、高感度応答を与える酵素電極を得ることが期待できる。本研究では、前者の部位を高感度化するため、i)酵素反応ー電極反応リサイクリング、ii)酵素反応ー酵素反応リサイクリング、による化学増幅原理に基づいた高感度酵素電極を開発することを計画した。その結果、グルタミン酸酸化酵素とグルタミックーピルビックトランスアミナ-ゼを同時固定化して作製したLーグルタミン酸センサ-は、通常の酵素センサ-で得られた応答の約1000倍増幅された応答を与えた。更に、フェロセン、リン酸、ニコチンアミド補酵素に高感度に応答する増幅型センサ-を開発し、増幅機構に関与する諸因子を明らかにした。これらの増幅型センサ-は酵素電極の感度を著しく上げることに成功したが、2、3の問題点もあった。それは電極の長期安定性に劣ることと、検量線が直線でないことであり、その原因として、固定化できる酵素量に限りがあることが考えられる。そこで、比較的多量の酵素を固定化できる酵素リアクタ-を増幅素子として用いた酵素電極システムについて、更に検討した。その結果、第一の酵素の生成物が第二の酵素の基質となる組合せの酵素を、アミノプロピル多孔性ガラスに同時固定化した種々のリアクタ-を作製し、酵素電極流れシステムに組み入れることによって、Lー乳酸、ピルビン酸、Lーグルタミン酸、リン酸、ニコチンアミド補酵素に対し、数十数百倍増幅された応答が得られ、数か月間にわたり繰り返し測定が可能であった。また、これらの増幅型酵素センサ-システムは、高速液体クロマトグラフィ-の高選択的、高感度なポストカラム検出器としても有用であった。基質サイクリング反応を利用した化学増幅型酵素電極は、従来の酵素電極の感度を大幅に増大させる有用な方法であることを明らかにした。現在までに得られた研究成果の概要を以下に示す。1.酵素膜型電極(1)L-グルタミン酸センサ-:L-グルタミン酸酸化酵素とグルタミック-ピルビックトランスアミナ-ゼを同時固定化したセンサ-の最適化を行った。得られたL-グルタミン酸センサ-は、通常の酵素センサ-で得られた応答の約1000倍増幅された応答を示し、検出下限は0.1nMであった。(2)フェロセンセンサ-:グルコ-ス酸化酵素を固定化したセンサ-は、電気化学反応・酵素反応基質リサイクリングにより、フェロセンに対して約100倍の増幅応答が得られた。(3)リン酸センサ-:キサンチン酸化酵素/ヌクレオシドホスホリラ-ゼ固定化酵素センサ-は、オルリン酸に特異的に応答した。更に、アルカリ性ホスファタ-ゼを加えて固定化したセンサ-は、有機リンにも応答し、更に増幅応答を示すので、全リン測定用高感度酵素センサ-として機能した。(4)亜硫酸、ヨウ化物、ニコチンアミド補酵素等に高感度に応答する化学増幅センサ-についても検討した。(5)以上の化学増幅型酵素電極の増幅機構を明らかにした。2.リアクタ-型酵素電極システム(1)L-乳酸計測システム:L-乳酸酸化酵素と乳酸脱水素酵素を固定化したリアクタ-を組み込んだ電極システムは、L-乳酸とピルビン酸に対して、300-500倍の増幅応答を示した。これをHPLCのポストカラム検出器として用いることで、1pmolのL-乳酸とピルビン酸を同時計測できた。

(2)その他の高感度酵素電極システムについても、現在検討を行っている。前年度に行った酵素リサイクリング反応に基づいた化学増幅型電極は、通常の酵素電極の測定感度を100ー1000倍上げることに成功したが、2、3の問題点もあった。それは電極の長期安定性に劣ることと、増幅率が基質の低濃度で高く、高濃度で低いこにより、電極応答と基質濃度との間に良好な直線関係が認められないことであっる。これは酵素電極では、固定化できる酵素量に限りがあるので、僅かな活性の低下がセンサ-の安定性に関わってくることと、酵素リサイクリング反応を定量的に行わせることが難しいからである。そこで、比較的多量の酵素を固定できる酵素リアクタ-を増幅素子として用いた酵素電極システムについて、更に検討を行った。アミノプロピルCPGにグルタルアルデヒドを橋架け剤として、第一の酵素の生成物が第二の酵素の基質となる様な組合せの酵素を同時固定化したミニ酵素リアクタ-を作製した。Lー乳酸とピリビン酸の測定には乳酸酸化酵素/乳酸脱水素酵素固定化リアクタ-をリン酸の測定にはアルカリ性ホスファタ-ゼ/ヌクレオシドホスホリラ-ゼ/キサンチン酸化酵素リアクタ-を、Lーグリタミン酸の測定にはグルタミン酸酸化酵素/グルタミック-ピリビックトランスアミナ-ゼリアクタ-を、NAD補酵素の測定にはグルコ-スー6ーリン酸脱水素酵素/乳酸脱水素酵素/乳酸酸化酵素リアクタ-を用い、電気化学検出器を備えたフロ-インジェクション流路に組み入れた。試料ゾ-ンがリアクタ-を通過する際に、効率の良いリサイクリング反応が起こると共に、多量の過酸化水素を生成するので、これを電流検出することで、数十数百倍増幅された応答が得られた。本法は、酵素の高選択的触媒機能を有効利用したもので、特定の分析種をオンラインで増幅できることから、本酵素電極システムを、HPLCの高感度ポストカラム検出器として用いることもできた。