hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リーシュマニアのトランスポーター型ABC蛋白質の細胞内局在と薬剤耐性分子モデル

リーシュマニアの薬剤耐性機構に関するこれまでの研究で,Leishmania amazonensisからLaMDR1とLaMDR2の2つのトランスポーター型ABC蛋白質遺伝子を単離した。LaMDR1はヒトの薬剤耐性遺伝子であるMDR1の相同遺伝子であり,LaMDR2は新規のMDR型遺伝子であって抗癌剤の5-fluorouracilの排出に関与することを見出した。本研究は,LaMDR2が細胞表面膜に局在して薬剤排出ポンプとして機能しているのか,あるいは細胞内小器官膜に局在して薬剤を隔離しているのかを検証することを目的として計画された。抗LaMDR2ペプチド抗体を用いたウエスタンブロット解析により,LaMDR2遺伝子の過剰発現株ではLaMDR2が対数増殖期の原虫においてより多く産生されていることがわかった。野生株における発現はRT-PCR法で確認できた。間接蛍光抗体法解析では,抗体は原虫の細胞表面膜とは反応せず,細胞質内の不特定構造と反応した。Green fluorescent protein(GFP)とLaMDR2のキメラ蛋白質を発現させた原虫株を生きた状態で共焦点レーザー顕微鏡観察を行ったところ,GFPの蛍光はやはり対数増殖期の細胞で強く,定常期の細胞では微弱であった。GFP蛍光は球状,袋状,棍棒状,管状などの構造として観察され,蛍光局在は細胞ごとで異なっていた。その分布はリソソームの蛍光マーカーの分布とおおむね重なったが,ミトコンドリアの蛍光マーカーとの重なりは少なかった。リーシュマニアにおいては管状構造をとるリソソームが観察されていることから,LaMDR2トランスポーターはリソソームにターゲットされて発現し,リソソームーエキソサイトーシスのシステムと関連して薬剤排出ポンプとして機能している可能性が示唆された。本研究は、LaMDR1とLaMDR2蛋白質という2つの異なるトランスポーター型ABC蛋白質遺伝子による薬剤耐性モデルを検証することで、リーシュマニアにおけるこれら膜蛋白の機能的特性と薬剤耐性との関係を明らかにすることを目的として計画された。今年度は、LaMDR2蛋白質に対する2種類の特異抗体、すなわち、C末端部のアミノ酸配列に対する抗ペプチド抗体と大腸菌で産生させたレコンビナント蛋白に対する抗体を作製した。ウエスタンブロッティング法による解析の結果、両抗体ともLaMDR2遺伝子を過剰発現させた株の分子量約140KDaの蛋白質と強く反応した。抗体の認識した蛋白の分子量は、LaMDR2蛋白質の予想される分子量と一致しており、遺伝子導入株においてLaMDR2蛋白質が産生されていることが確かめられた。現在、本蛋白質の細胞内局在について免疫組織化学的な詳細な検討を進めている。本研究は、リーシュマニアのLaMDR1とLaMDR2という2つの異なるトランスポーター型ABC蛋白質による薬剤耐性のメカニズムを明らかにすることを目的として計画された。今年度は、特異抗体を用いた間接蛍光抗体法(IFA)とGreen fluorescent protein (GFP)を用いた蛍光ラベル法により,LaMDR2蛋白質の細胞内局在についての解析を行った。まず,原虫を固定したIFA法においては,抗LaMDR2抗体は原虫の細胞表面膜とは反応せず,細胞内の不特定構造,とくに体後端部に胞状に反応することが観察された。次に,GFPとLaMDR2のキメラ蛋白質を発現するベクターを作製し,それを導入した原虫株の生きた状態におけるGFPの蛍光動態について,蛍光顕微鏡ならびに共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果,GFPの蛍光は対数増殖期の生細胞で強く観察され,定常期の細胞での発現はきわめて弱かった。GFPの蛍光強度と分布は細胞によって一定しておらず,球状,袋状,棍棒状,管状などの構造として観察された。

また,GFP蛍光の分布はリソソームの蛍光マーカーの分布とおおむね重なりあったが,ミトコンドリアの蛍光マーカーとの重なりは少なかった。近年,生細胞のGFP蛍光ラベル技術の進展に伴い,リーシュマニア細胞においては管状構造をとるリソソームが観察されていることから,GFPとLaMDR2のキメラ蛋白質はリソソームにターゲットされている可能性が示された。以上の結果から,リーシュマニアのLaMDR2トランスポーターによる薬剤排出はエキソサイトーシスと関連していることが強く示唆された。本研究は、リーシュマニアのLaMDR1とLaMDR2という2つの異なるトランスポーター型ABC蛋白質の構造と機能,とくに細胞内局在と薬剤耐性における役割を明らかにすることを目的として計画された。今年度は、LaMDR2蛋白質のC末端のアミノ酸に対する抗ペプチド抗体をさらにペプチドカラムで精製し,野生型とLaMDR2過剰発現株に対する精製抗LaMDR2抗体の反応性について,間接蛍光抗体法(IFA)により解析を行った。その結果,野生型原虫におけるLaMDR2の発現はIFAでは検出できないことが再確認された。LaMDR2過剰発現株に対しては、リーシュマニア膜抗原(gp63),グリコソーム局在蛋白(HGPRT),細胞質局在蛋白(p36),およびアルファチューブリンのそれぞれに対する抗体を対照として観察した。その結果,抗LaMDR2抗体は原虫の細胞表面膜とはほとんど反応せず,細胞質内の不特定構造,とくに体後端部と反応することが観察され,対照抗体のいずれとも異なる挙動を示した。また,蛍光の強さは対数増殖期の原虫において著しく,蛍光局在は細胞によって大きく異なっていた。これらの結果は,GFP-LaMDR2キメラ蛋白質発現原虫株におけるGFPの蛍光動態とよく一致することから,LaMDR2蛋白質は細胞内において構造変化の盛んなオルガネラ.たとえばリソソームのような構造に発現している可能性が強く示唆された。
乱用薬の市場変化に対応する新規薬物スクリーニング法の開発と応用

危険ドラッグは大きな社会問題となっており、化学構造を包括的に規制しているものの、現在の機器分析に頼る手法では規制当局に過大な負担がかかるため、著しい市場変化に対応できる簡便なスクリーニング法の開発が急務である。DNAアプタマーは、低分子化合物を高親和性で認識でき、抗体と比べて短時間かつ安定的に産生可能である。本研究では、DNAアプタマーをスクリーニング法に応用することを目指して検討を行った。得られた合成カンナビノイドと結合するDNAアプタマーは、典型的な構造認識モチーフを持つことが明らかになった。今後は、捜査現場において利用可能な薬物検出キット開発に向け検討を進めたい。平成25年度の方法・計画の1-1、1-2に記した通り、60,75および90 merのランダムssDNAライブラリーを作成した。JWH-018にカルボキシル基を導入した誘導体(以下JWH-018カルボン酸)を合成した。磁気ビーズであるDynabeads M-270 Epoxy(以下Dynabeads)の全ての活性化基とJWH-018カルボン酸を結合させるため、JWH-018カルボン酸の添加量を検討した。DynabeadsとJWH-018カルボン酸を反応させた後、反応液に残存するJWH-018カルボン酸をHPLCで測定し、理論上、Dynabeadsの全ての活性化基がJWH-018カルボン酸と結合していることを確認し、ssDNAの選択に用いることとした。JWH-018に対するssDNA選択の前に、MDA-Dynabeads(Dynabeadsの活性化基にMDAの側鎖を結合させたのもの)を用いて、方法・計画の1-3、1-4、1-5に従い、MDAに対するssDNA選択を行い、SELEX法の条件検討を行った。その結果、60 merのssDNAライブラリーから、MDAを認識するssDNA28種を得た。これらの配列を特定し、立体構造の決定を行った。28種のssDNAのうち、比較的親和性が高いものをクローン化した。平成25年度の方法・計画の2に従い、MDA誘導体をBiacoreセンサーチップに結合させ、クローン化したssDNAをBiacore T100に流入し、結合性を定量的に解析した。その結果、最も優れたssDNA(MDAアプタマー)の解離定数(Kd値)は50.1 nMであった。これまでに報告されているエタノールアミンのアプタマーや既に実用化されているコカインのアプタマーのKd値が各々19 nM、104 nMであることから、今回得られたMDAアプタマーも実用化に耐えうるものと考えられる。低分子化合物の構造を認識し得る一本鎖DNAであるDNAアプタマーを危険ドラッグのスクリーニングに応用することを目指し、包括指定の基本骨格を持つ合成カンナビノイドであるJWH-018に対するDNAアプタマーの作製を試みた。JWH-018のアルキル側鎖にカルボキシル基を導入した(JCA)と磁気ビーズであるDynabeads M-270 Amineをカップリングさせ、JWH-018結合ビーズ(JMB)を作製した。結合量は、反応しなかったJCAをHPLCで測定することにより求め、磁気ビーズとJCAの至適混合比を求めた。以上の検討より、JCAの固定化量及び固定化の条件が決定された。DNAアプタマーの選択はSELEX法により行った。JMBを用いたSELEX法により、JWH-018を認識するssDNAライブラリを得た。10サイクル目で回収したDNAのシークエンス解析を行った結果、典型的な核酸アプタマーの構造モチーフであるGカルテット構造を取りうる配列を持つことが明らかになった。本年度の研究により、難溶性の薬物に対するアプタマーの選択条件を明らかにすることが出来た。以上のことから、SELEX法は水溶性のみならず難溶性の乱用薬物に対するアプタマーのスクリーニング法としても有用であることが明らかになった。今後、他の乱用薬物に対するアプタマーの選択を行い、実用化(薬物捜査現場において利用可能なオンサイト薬物検出キットの開発等)に向けた検討を進めたい。毒性学JWH-018の溶解性に問題があり、MDAアプタマーの選択の際に決定した(水溶性の薬物に対するアプタマーの選択に適した)条件では、うまく進まないことが明らかになった。現在は、実用化に向けたことも考慮し、JWH-018を認識するssDNAの選択を水溶性で行うのか、有機溶媒中で行うのかについて検討を行っている。今後は、水溶性薬物だけでなく、JWH-018のように溶解性に問題のある薬物に対するssDNAの選択条件を検討する。そして、どのような性質の違法ドラッグに対しても、迅速にアプタマーの作成ができるような基本的なデータを蓄積する。
腫瘍の悪性度診断の指標となりうる新規PET用血管新生イメージング剤の開発

本研究の目的は、腫瘍の悪性度に深いかかわりがあるチミジンホスホリラーゼ(TP)を、Positron Emission Tomography(PET)装置により可視化し、腫瘍に対する様々な知見を得ることである。そのために、本研究では、TPに対して高い親和性を有するウラシル誘導体を母体化合物した新規新規含フッ素TP阻害化合物(F-TPI)ならびにそのF-18標識化合物の合成を目的として研究を進めた。その結果、F-TPIを合成するにあたって、その標識前駆体である化合物の合成にまで至ることに成功した。本研究の目的は、腫瘍の悪性度に深いかかわりがあるチミジンホスホリラーゼ(TP)に対して、高い親和性を持つウラシル誘導体を放射性フッ素標識することで、定量性に優れたPositron Emission Tomgraphy(PET)装置により可視化し、癌の検出、悪性度診断、治療方針の決定に対し重要な知見を得ることである。以上の目的を達成するために、平成21年度は、TPに対して高い親和性を有する6-(2-Iminoimidazoyl)urasilを母体化合物とするTP阻害化合物(FMIMU)の合成を目的として研究を進めた。特にFMIMUを合成するにあたって重要な、フッ素標識するための標識前駆体(SnIMU)の合成を行った。SnIMUは、市販品であり、容易に入手可能な6-chloromethylurasilから5段階の反応を経て、総収率7%で得ることができた。この前駆体を放射性フッ素で標識することによって、目的化合物の合成が完了する。また同時に、目的化合物のTP阻害活性を確認するため、非放射性フッ素を用いて合成したFMIMUの合成も視野にいれ研究を進めた。具体的には、SnIMUから非標識FMIMUを合成する手法と平行して、より効率的な合成経路を用いて非標識FMIMUを合成する経路を検討している。これらの成果によりて得られるFMIMUを用いてTP阻害活性、TP発現細胞へのFMIMUの取込実験を行うことで、PETを用いたTP活性イメージングの可能性が大きく広がると考えている。本研究の目的は、腫瘍の悪性度に深いかかわりがあるチミジンボスホリラーゼ(TP)に対して、高い親和性を持つウラシル誘導体を放射性フッ素標識することで、定量性に優れたPositron Emission Tomography(PET)装置により可視化し、癌の検出、悪性度診断、治療方針の決定に対し重要な知見を得ることである。以上の目的を達成するために、本研究では、TPに対して高い親和性を有する6-(2-Iminoimidazoyl)urasilを母体化合物とするTP阻害化合物(FMIMU)の合成を目的として研究を進めた。また同時に、SnIMUを経由しない、直接フッ素化法によるFMIMUの合成経路の模索も行い、5-Methyluracilを用いたモデル実験で、良好な結果が得られている。この合成経路には、新規化合物を含む興味深い知見が含まれており、今後の検討により新たな反応や、新規化合物合成法を確立したい。これらの成果によって得られるFMIMUを用いてTP阻害活性、TP発現細胞へのFMIMUの取込実験を行うことで、PETを用いたTP活性イメージングの可能性が大きく広がると考えている。
親しみの感情を構成する情動が造形物に対する感情移入を形成する脳機能システムの解明

木地キナキナこけしを使った予備的実験ではヒトがオブジェクトおよびそれと同じ表面仕上げと重量の円柱について、初見と3-4日所持した後の再見時で計測される生理指標データと動的アンケートデータの違いを比較して「親しみ」の生理機能構造についていくつかの客観的指標となる結果を得た。また、モデル動物実験システムの開発では、後天的経験に基づく情動に関する生体反応の変化を計測するモデルについて検討し、この解析には課題番号:23500254で開発したシステムが有効だったため、これを利用したテレメトリー解析や脳内への試薬投与実験から経験に基づく情動反応特性の一部を明らかにした。申請額に対し配分額が約55%であることを受け、本研究計画を有効に推進するための研究内容の規模縮小とそれに伴う実験計画の見直しを経て本年度の研究を遂行した。被験者実験に関しては感情移入実験の対象となる造形物の調達を見直して、本年度は感情移入実験に最適な提示刺激の基礎的開発とその反応に対する予備実験を重点的に行った。具体的にはこれまでの研究で我々が進めていたプロダクトデザイン理論を視覚提示物の作成過程からより効果が高く被験者実験で有効なデータを得やすいオリジナル刺激の開発を念頭として見直し、内外の研究者との検討による情報収集で得られた知見と併せて実験準備を進めた。また、刺激提示による被験者の神経活動の有効な計測システムの開発を進め、現有の装置を使った実験での不確実性とそれを補完するための方策を検討した。モデル動物実験システムの開発では、これまでの研究から得られたマウスでの後天的経験に基づく情動に関する生体反応の変化を計測するモデルを発展させる形でいくつかの新規システムを導入して検討を進めた。感情移入は後天的経験による現象でありこの実験システムは本研究の一つの核心を成す。具体的にはこれまでの生体反応計測が動物を拘束した状態でしか計測できないことから、非拘束下での実験が不可欠と判断しテレメータシステムや有線心電記録による自由行動条件下での生体反応計測とその記録方式の無線化について、実験対象をマウスおよびラットに拡大して実験を行った。結果、ラットにおけるテレメトリーシステムから有効な生体反応を得ることが可能であることが分かり、非拘束下で心電記録システムを有効に作動させるための問題点とその解決方策が明らかとなった。また、脳内への試薬投与により経験に基づく情動反応をコントロールできることが明らかとなり、これに関する神経メカニズム解明に繋がる一つの実験計画が達成された。被験者実験に関しては、造形物の形状と質感が影響する親しみの深さによる感性情報データ取得にあたり主たる生理機能構計測機器である光トポグラフイ一装置の機能不全で実験遂行が遅延した。この間、予備的実験として異なるテクスチャー刺激による皮膚感覚刺激に対する脳活動計測を現状の光トポグラフイ一装置で検討できる範囲で行い、異なる皮膚感覚での脳活動および視覚と皮膚感覚との同時刺激による脳活動では主に前頭連合野と眼窩野において、有意に活動の異なる領域が存在するというデータを得た。このことから本研究における光トポグラフイ一計測の有効性が確認され、その際に用いた分析方法の検討と併せて、延長期間において当初計画を完成させる事前準備は完了した。モデル動物実験ではマウス用いて動物を快適環境と非快適環境との2つの飼育条件を交互に置き、それぞれの環境下で異なる刺激を提示することで刺激に対する親しみ感覚に関わる経験をさせる実験を、昨年度までの先行実験の手順に従い行った。本年度はこの現象に関わる神経回路を調べるために、嫌悪情動に深く関わるとされる扁桃体に対して5%リドカインを注入して神経活動を局所的に遮断する操作をしたものと、リンゲル液のみを注入した群間の差を比較した。この扁桃体の遮断実験では、操作群と対照群共に同様に快適環境とカップリングした刺激に対する副交感神経作用が確認される結果となったことから、この現象においては扁桃体がその機能に深く関与していないことを示唆するものであったが、同様な薬理学的操作によってこの現象に関わる脳部位が特定できる可能性が示された。また、ラットによるテレメトリー計測を使った実験からは、快適環境飼育時と非快適環境飼育時で平均心拍数に差が無いという結果が得られ、この現象が一般的な学習による条件反射反応と本質的に異なることが示された。被験者対象の造形物の形状と質感が影響する親しみの深さによる感性情報変化の基礎データ取得を目的とした実験にあたり最適な感覚刺激として計画した南部系木地キナキナこけしが入手因難で再実験のリスクが大きく本実験での確度が要求される。しかし、実験の主たる生理機能構検討で使用する光トポグラフイ一装置の機能不全で実験遂行が遅延した。係る装置は共通機器で修理手続きに時間を要し、現在復旧したが本実験が未遂行のため。前年度に達成すべき実験として、本研究課題の実施期間を1年間延長した理由であった計測機器の故障により未達成の、感覚剌激として南部系木地キナキナこけしを使った実験のデータを実験者による予備的実験データとして取得完了した。この実験ではヒトがオブジェクトを初見したときと、持ち帰つた上で上記キナキナとそれと同じ表面仕上げと重量を持つ円柱の異なるオブジェクトについて、初見と3-4日所持した後の再見時で計測される生理指標データと動的アンケートデータの違いを比較して「親しみ」の生理機能構造についての客観的指標が取得できた。現在、これまでの本課題での実験結果と併せての解析と検討が概ね完了しており、最終報告を作成中である。

木地キナキナこけしを使った予備的実験ではヒトがオブジェクトおよびそれと同じ表面仕上げと重量の円柱について、初見と3-4日所持した後の再見時で計測される生理指標データと動的アンケートデータの違いを比較して「親しみ」の生理機能構造についていくつかの客観的指標となる結果を得た。また、モデル動物実験システムの開発では、後天的経験に基づく情動に関する生体反応の変化を計測するモデルについて検討し、この解析には課題番号:23500254で開発したシステムが有効だったため、これを利用したテレメトリー解析や脳内への試薬投与実験から経験に基づく情動反応特性の一部を明らかにした。当初の研究計画では本年度にまず、感覚刺激として、素材の質感と伝統的に統一された形態以外に彩色や表情などの表現特徴を持たない岩手県の伝統的工芸品である南部系木地キナキナこけしを使った実験として。被験者がオブジェクトを初見したときと、持ち帰った上で目につくところに置き1日1回あいさつをするタスクを1週間程度してもらった後に同一オブジェクトを見たときとの各計測データの違いを比較して「親しみ」の生理機能構造について検討する実験を計画していた。この造形物は提示刺激として最適であるが現有物の代替品が入手し難い。従って、実験に当たっては前項で示した現有の装置を使った実験での不確実性とそれを補完する方法についての予備実験の上で遂行するべきと判断し、神経活動の有効な計測システムの開発を優先して行ったため、本実験は次年度に行うこととなった。また、モデル動物実験システムの開発では、感情移入による神経活動の後天的評価にはリアルタイム計測が不可欠でありそのシステム開発を優性して行ったため、聴覚以外の感覚刺激を用いた実験モデルによる計測実験まで進行しなかった。科学研究費助成事業(学術研究助成基金助成金)補助事業期間延長承認申請書を提出し、受理された。次年度は本来本年度に行うべきであった実験を含め、実験遂行不能期間に行った文献研究や予備的実験の成果を反映して本研究課題の完成を目指す。感性情報学本年度の予備実験の成果を踏まえて、未達成の実験として感覚刺激として南部系木地キナキナこけしを使った実験を行う。この実験では被験者がオブジェクトを初見したときと、持ち帰った上で所定のタスクを1週間程度してもらった後に同一オブジェクトを見たときとの各計測データの違いを比較して「親しみ」の生理機能構造について客観的指標の取得を行う。被験者がオブジェクトを鑑賞している間、装着したプローブにより心拍数や自律神経の活動状態や脳活動を光トポグラフイ一装置、局所脳波で記録する。上記の実験が終了した後、オブジェクトにより惹起された気分や感情について被験者にスライダー操作で回答させ、そのスライダー位置情報と回答中の被験者の生理情報とを同時記録する「動的アンケートシステム」回答させ、生体反応を同時取得する。また、私的通信での使用率と商品展開が他の顔文字に比べて突出して高い( ́・ω・`)と他の顔文字を比較し、記号・文字配列の違いがもたらす生体反応の相違点と親しみ感情との関連を調べる実験や、本年度に検証したデザイン理論に基づいて制作された造形物など、提示刺激を変更して同様の実験を行う。
工作物剛性の異方性に着目した動的な材料除去プロセスデザイン

本研究の目的は,切削工具の位置・姿勢制御により工作物の動的な変位を抑制する材料除去プロセスをデザインすることである.まず,工作物の剛性の異方性にあわせて,加工点および工具送り方向,工具姿勢を変更することで切削抵抗の方向を制御し,加工点での工作物変位を抑制するためのアルゴリズムを考案する.次に,工具姿勢と切削条件から切削抵抗の方向を計算するための切削抵抗計算モデルを作成し,アルゴリズムに組み込むことで切削抵抗の方向制御を行う,本年度は,切削工具の位置・姿勢を制御して工作物の変位を抑制する加工パス生成のアルゴリズムの作成と,開発した加工プロセスの検証を行った.・切削工具の位置・姿勢を制御して工作物の変位を抑制する加工パス生成のアルゴリズムの作成に関して3次元形状の工作物に対して,工作物の変位を抑制する加工パスの生成を行うアルゴリズムを作成した.本研究では,加工パスは材料除去手順,工具の送り方向,工具姿勢の3つからなる,材料除去手順,工具の送り方向,工具姿勢の3つを変更し,工作物剛性の高い方向に切削抵抗を向けることで,加工中に生じる工作物変位を低減する,片持ちはりのエンドミル加工を対象としてシミュレーションを行った結果,熟練者が用いていた従来の加工パスに比べて,加工パス生成アルゴリズムにより生成した加工パスでは,工作物変位を約33%にまで低減できた.・開発した加工プロセスの検証に関して片持ちはりのエンドミル加工を対象とし,考案した加工パス生成アルゴリズムの実証実験を行った.熟練者が用いていた従来の加工パスと,加工パス生成アルゴリズムにより生成した加工パスを用いて加工実験を行い,加工中に生じる工作物変位を比較した.その結果,加工中に生じる工作物変位の平均値が,従来の加工パスでは11.4umであったが,加工パス生成アルゴリズムを用いることで4.0umに低減できた.本研究の目的は,切削工具の位置・姿勢制御により工作物の動的な変位を抑制する材料除去プロセスをデザインすることである.まず,工作物の剛性の異方性にあわせて,加工点および工具送り方向,工具姿勢を変更することで切削抵抗の方向を制御し,加工点での工作物変位を抑制するためのアルゴリズムを考案する.次に,工具姿勢と切削条件から切削抵抗の方向を計算するための切削抵抗計算モデルを作成し,アルゴリズムに組み込むことで切削抵抗の方向制御を行う.本年度は,最適化アルゴリズムに用いる評価関数の研究と,アルゴリズムに組み込める切削抵抗計算モデルの研究を行った.・最適化アルゴリズムに用いる評価関数の研究に関して最適化アルゴリズムに用いる評価関数として,加工点変位,加工点工作物コンプライアンスのノルムの最大値,最小値の3つを考案した.加工点工作物コンプライアンスのノルムの最大値,最小値は,工作物の剛性のみから定まるため,加工によって生じる切削抵抗が未知の場合においても,工作物の材料除去手順を提案することができる.これらの評価関数を用いた場合での材料除去プロセスデザインを比較した結果,評価関数によって材料除去手順が変化することがわかった.・アルゴリズムに組み込める切削抵抗計算モデルの研究に関して粒子法を用いた切削シミュレーションの手法について1粒子法の理論,ソフトウェアの使用法,エンドミル加工のシミュレーション手法,シミュレーションに必要なノウハウなどを学んだ.粒子法による切削シミュレーションの研究は現在も継続して行っている.七三黄銅のシェーパ加工を実際に行った結果とシミュレーション結果を比較した.切削抵抗の値に関してはほぼ一致したが,切りくず形状や加工面については一致しなかった.本研究の目的は,切削工具の位置・姿勢制御により工作物の動的な変位を抑制する材料除去プロセスをデザインすることである.まず,工作物の剛性の異方性にあわせて,加工点および工具送り方向,工具姿勢を変更することで切削抵抗の方向を制御し,加工点での工作物変位を抑制するためのアルゴリズムを考案する.次に,工具姿勢と切削条件から切削抵抗の方向を計算するための切削抵抗計算モデルを作成し,アルゴリズムに組み込むことで切削抵抗の方向制御を行う,本年度は,切削工具の位置・姿勢を制御して工作物の変位を抑制する加工パス生成のアルゴリズムの作成と,開発した加工プロセスの検証を行った.・切削工具の位置・姿勢を制御して工作物の変位を抑制する加工パス生成のアルゴリズムの作成に関して3次元形状の工作物に対して,工作物の変位を抑制する加工パスの生成を行うアルゴリズムを作成した.本研究では,加工パスは材料除去手順,工具の送り方向,工具姿勢の3つからなる,材料除去手順,工具の送り方向,工具姿勢の3つを変更し,工作物剛性の高い方向に切削抵抗を向けることで,加工中に生じる工作物変位を低減する,片持ちはりのエンドミル加工を対象としてシミュレーションを行った結果,熟練者が用いていた従来の加工パスに比べて,加工パス生成アルゴリズムにより生成した加工パスでは,工作物変位を約33%にまで低減できた.・開発した加工プロセスの検証に関して片持ちはりのエンドミル加工を対象とし,考案した加工パス生成アルゴリズムの実証実験を行った.熟練者が用いていた従来の加工パスと,加工パス生成アルゴリズムにより生成した加工パスを用いて加工実験を行い,加工中に生じる工作物変位を比較した.その結果,加工中に生じる工作物変位の平均値が,従来の加工パスでは11.4umであったが,加工パス生成アルゴリズムを用いることで4.0umに低減できた.加工パス生成アルゴリズムに用いる評価関数については,今年度の研究成果として,十分な結果が得られたと考えている.

工作物の共振への対策は,計算過程において質量マトリクスを考慮することで,工作物の固有振動数を計算できることがわかった.切削抵抗の動的な変化の考慮のために,現在,粒子法による切削シミュレーションを研究している最中であり,エンドミル加工での切削抵抗が推定できるかどうかを今後検証する予定である.切削抵抗の動的な変化の考慮では,現在,粒子法による切削シミュレーションによって,切削抵抗の値に関してはほぼ一致しているが,切りくず形状や加工面については一致しなかったという結果が得られている.しかしながら,本研究で必要としているのは切削抵抗の値のみであるため,得られた切削抵抗の値を用いてエンドミル加工における切削抵抗が推定できるかどうかを検証する予定である.上記以外に関しては,年次計画に沿って研究を進める予定である.
栄養転換の進展と世帯内二重負荷の関連－インドネシア・スンダ農村における調査－

当初の計画通り、調査地(インドネシア・西ジャワ州スメダン県の農村)を訪問しての現地調査を実施した。当地ではまず、質問紙をもとに、過去に収集した基礎情報の確認とアップデートをおこなった。くわえて聞き取りと観察によって、1)出生や移動による住民の増減と新たな住民の基礎情報、2)5年ごとの食事・身体活動調査の背景情報となる、健康観や食に関する意識、3)村落の過去のできごとと当時の食習慣、等について情報を収集した。とくに食行動・食選択に関して、人びとは個食傾向であること、体によい食べものの認識が異なっていることに関心をもち、重点的に聞き取りをおこなった。個食傾向の背景には、個食がしばしば問題視されている欧米や日本とは異なった家族のありかたがうかびあがった。すなわち、食卓を囲んでの家族団らんを理想とするに至った近代家族の特徴が、インドネシア・西ジャワ農村ではあまりみられないことが個食傾向の一因となっていると考えている。また、食物に対する、身体に良い・悪いという判断は、年齢によって異なる傾向を示すことが示唆された。すなわち、若年齢層ではメディアや学校教育が判断に強く影響するのに対し、高齢層では自身の経験に基づいた判断をするという特徴がみられた。そのため、身体に良い、あるいは悪いと判断する食物の種類も年齢によって異なる傾向がみられた。本研究対象地域でこれまでに行った調査の成果は、本年度、学術論文としてPLOSONEへ投稿し受理・掲載されたほか、23th Conference of Society for Human Ecologyにて口頭で発表し、他の研究者とともに議論し情報交換をした。当初計画では、平成30年度は、1)乾期期間中に現地を訪問し質問紙調査を実施すること、2)データの整理・分析、学会発表および学術雑誌への投稿論文執筆、を予定しており、いずれも実現できた。調査地やインドネシア側カウンターパートとの連絡も円滑に進んでいる。平成31年度は、これまでに収集したデータや分析結果をまとめて学会発表と学術雑誌への論文投稿をおこなう。調査対象村落でこれまでに収集したデータは質的なもの、量的なものを含め多岐にわたり、じゅうぶんに整理されたとはいいがたい。これらを統合して研究対象の全体像や進捗状況の全体を俯瞰し、最終年度(平成32年度:ベースライン調査から5年後のフォローアップ調査を実施予定)に臨みたい。事前準備では質問紙の質問項目の検討、現地調査許可の取得等がその主な内容であった。現地調査では、インドネシア・西ジャワ州スメダン県の農村1カ所に滞在し、栄養状態に影響する要因として人びとの食行動に関わる聞き取り調査などをおこなった。インドネシア人の調査補助者とともに世帯を個別に訪問し、村内のほとんどの世帯(約40世帯)からデータを集めることができた。今後も引き続き当該農村で調査を継続する予定である。国際学会では、前年までに得たデータの分析結果と上記の現地調査の見聞とを合わせた内容でポスター発表をおこなった。また、本学会では、本研究課題のメイントピックである「栄養不良の二重負荷」について論文等を発表している他の研究者の最近の研究内容についても知ることができた。以上に加え、文献収集や、食に関心をもつ他の研究者との研究会に積極的に参加し、意見交換をおこなった。当初の計画では、平成29年度は、調査許可取得や質問紙の検討・作成等、翌年の現地調査実施のための準備期間としていた。しかし現地調査を実施する手筈が整い、調査地を訪問する機会を得たため、今年度にも現地調査を実施することができた。今回の調査ではインドネシア・西ジャワ州スメダン県の農村1カ所に滞在し、約40世帯を対象として食行動に関わる聞き取り調査などをおこなった。今回はとくに個食/共食のスタイルに注目し、24時間思い出し法によって、摂取した食品とともに「誰と」「どこで」食べたかの情報を収集した。当初計画では、平成30年度は、1)乾期期間中に現地を訪問し質問

紙調査を実施すること、2)データの整理・分析、学会発表および学術雑誌への投稿論文執筆、を予定しており、いずれも実現できた。調査地やインドネシア側カウンターパートとの連絡も円滑に進んでいる。現地調査を平成29年度に前倒しで実施したが、30年度にも実施できる可能性があり、現地調査許可等の状況を確認している。本来の計画では研究対象村落を2カ所としており、29年度に調査を実施した1か村に加えてもう1か村を選定する必要がある。現地カウンターパートと十分にコミュニケーションをとり、議論を深めたい。30年度も89月頃に現地調査を実施する見通しである。平成31年度は、これまでに収集したデータや分析結果をまとめて学会発表と学術雑誌への論文投稿をおこなう。調査対象村落でこれまでに収集したデータは質的なもの、量的なものを含め多岐にわたり、じゅうぶんに整理されたとはいいがたい。これらを統合して研究対象の全体像や進捗状況の全体を俯瞰し、最終年度(平成32年度:ベースライン調査から5年後のフォローアップ調査を実施予定)に臨みたい。本来の計画では、平成29年度には現地調査の実施を予定していなかったが、実施できる運びとなったため、現地調査にかかる費用について前倒しの支払いを申請した。しかし、規模の大きな調査は実施できなかったため、差額が生じる結果となった。平成30年度にもやはり現地調査を予定しているため、この調査にかかる費用に充てることとしたい。最も大きいのは旅費を支出しなかったことである。平成30年度はインドネシア現地調査を実施したが、これを他の調査と乗り合わせることで、旅費や研究補助者の人件費等を他の研究経費から支出することができたためである。当初計画では平成31年度に海外での学会発表は予定していなかったが、これまでに収集したデータやその分析は発表すべき段階にあると考えているので、海外での学会発表の参加費や旅費に充当することを予定している。
含硫黄生体成分の微生物代謝系の解析とXenobiotics分解系への適応進化

本年度は、Pseudomonas putida DS1株のdimethyl sulfide(DMS)代謝系ネットワークの解析を中心として研究を展開した。昨年度、DMS代謝産物であるdimethyl sulfone(DMSO_2)の代謝に必須な新規転写制御因子SfnR[Endoh et al.(2003)Microbiology,149,991-1000]の標的遺伝子を単離することに成功したので(第3のDMS代謝系オペロン)、まずはこの遺伝子とその周辺領域について詳細な解析を行った。この領域にはsfnAおよびsfnB遺伝子からなるオペロンと、sfnFおよびsfnG遺伝子からなるオペロンが互いに逆向きに約300-bpの間隔を置いて存在していた。相同配列を検索した結果、SfnAとSfnBは互いに30%程度の相同性しかないが、両方ともacy1-CoA脱水素酵素ファミリーに属しており、一方SfnFはNADH-dependent FMN reductaseと、SfnGはFMNH_2-dependent monooxygenaseと類縁性を示した。各sfn遺伝子の破壊および相補実験を行ったところ、DS1株のDMSO_2代謝にsfnG遺伝子が必須であることが明らかとなった。またノーザン解析およびレポータージーンassayを行った結果、sfnFGオペロンはSO_4^<2->の有無に関わらず、SfnRによって正に制御されることが明らかとなった。そこでsfnFGオペロン上流のSfnR結合部位を、gel mobility shift aasayとDNase I footprintingにより調べたところ、4つのSfnR結合部位が同定され、そのうちsfnF遺伝子に近接した2つがsfnFGオペロンの転写調節に機能していることが明らかになった。さらに、SfnR結合配列に部位特異的変異を導入することで、SfnR結合のための共通認識配列を示すことができた。今後、SfnGの酵素活性を測定するなど、sfn遺伝子の機能解析を行っていく。有機硫黄化合物の資化に関与するσ^<54>依存性の転写活性化因子について、その転写調節機構を詳細に研究したのは本研究が初めてである。一方、微生物学的手法によるDMS代謝系の進化適応については、昨年度に引き続きDMS、DMSO_2などDS1株が利用可能な基質と共に加えるDBTの最適量等について、選択圧を複数設定しながら馴養実験を行った。Pseudomonas putida DS1株のdimethylsulfid(DMS)代謝系ネットワークの解析に関して本年度は、DMSの代謝産物であるdimethyl sulfone(DMSO_2)の代謝に必須な新規制御因子SfnRについて、その標的遺伝子(第3のDMS代謝系オペロン)の同定を試みた。Transposon5(Tn5)内部にPseudomonas属細菌で構成的に発現するP_<BAD>プロモーター外向きに繋いだプラスミドを構築し、DS1株のsfnR破壊株にelectrophoration法により導入することでDMSO_2の資化能が復活した菌株の取得に成功した。

変異株のTn5挿入位置を調べたところ、FMNH_2-dependent monooxygenaseをコードする遺伝子と相同性を示すORFの上流に存在しており、本ORFの直上流にはσ^<54>依存性のプロモーター配列が確認された。一方ゲノム情報を利用したDMS、DMSO_2代謝関連遺伝子の単離も試みた。Rhodococus等グラム陽性菌で単離されているdibenzothiophene(DBT)の代謝酵素遺伝子の一つであるdszA遺伝子ホモログを、P.putida、P.aeruginosa、P.fluorescensの全ゲノム塩基配列データを基に検索した。DszAとアミノ酸での相同性が30%以上で、大きさもほぼ同じホモログについてalignmentを行い、consensus配列から作製したdegenerated primerによりPCRを行った。増幅遺伝子断片をプローブとしてサザン解析を行った結果、DszAと全長に渡り40%の相同性を持つホモログをDS1株から単離することに成功した。今後、これら両方法により取得されたDMSまたはDMSO_2の代謝に関与していると推測される遺伝子について、硫酸飢餓応答性、sfnR破壊株の遺伝子相補実験、活性確認等を行い、DS1株のDMS代謝ネットワークにおける役割を明らかにしていく予定である。また、微生物学的手法によるDMS代謝系の適応進化については、DMSなどDS1株が利用可能な基質に加えるDBTの最適な量について検討を行った。今後、馴養実験を継続して行っていく。本年度は、Pseudomonas putida DS1株のdimethy1sulfide(DMS)代謝系ネットワークの解析を中心として研究を展開した。昨年度、DMS代謝産物であるdimethy1 sulfone(DMSO_2)の代謝に必須な新規転写制御因子SfnR[Endoh et al.(2003)Microbiology,149,991-1000]の標的遺伝子を単離することに成功したので(第3のDMS代謝系オペロン)、まずはこの遺伝子とその周辺領域について詳細な解析を行った。この領域にはsfnAおよびsfnB遺伝子からなるオペロンと、sfnFおよびsfnG遺伝子からなるオペロンが互いに逆向きに約300-bpの間隔を置いて存在していた。相同配列を検索した結果、SfnAとSfnBは互いに30%程度の相同性しかないが、両方ともacyl-CoA脱水素酵素ファミリーに属しており、一方SfnFはNADH-dependent FMN reductaseと、SfnGはFMNH_2-dependent monooxygenaseと類縁性を示した。各sfn遺伝子の破壊および相補実験を行ったところ、DS1株のDMSO_2代謝にsfnG遺伝子が必須であることが明らかとなった。またノーザン解析およびレポータージーンassayを行った結果、sfnFGオペロンはSO_4^<2->の有無に関わらず、SfnRによって正に制御されることが明らかとなった。
喉頭神経調節の仕組みとその障害に関する体系的解明

喉頭神経調節の仕組みとその障害における現状での重要課題として考えられた、延髄における疑核異所性局在、喉頭神経系におけるアセチルコリン合成酵素の関与、喉頭神経系における神経栄養因子の関与、脳幹運動神経細胞における軸索損傷時のTDP43の変化、そして、喉頭における概日リズムと時計遺伝子の関与について、現時点で考えうる手法を駆使して解明した。(1)延髄における疑核異所性局在の解明SRKラットのヘテロ親を交配し出生させ、生後1721日齢の離乳期直前のSRKラットを使用した。この時に表現型としてSRKとヘテロ、ワイルドタイプ分けるのは困難なため、マウス・リーリンの遺伝子配列をもとに、プライマーを作成し、PCR法にてSRKラットのgenotypingを行い分離した。内喉頭筋である輪状甲状筋、甲状披裂筋、後輪状披裂筋、頚部食道、また腹部食道にそれぞれHRPを注入し、2日間の生存期間の延髄を含む全脳を摘出し、延髄の凍結連続切片を作成し組織化学的手法を用いて、疑核へ投射する運動神経細胞を同定した。標識細胞は、第4脳室から延髄の腹外側部に散在して分布するのが観察された。この結果は、延髄疑核の運動神経細胞が、発生部位から疑核へ移動するにあたって、リーリン蛋白による誘導が不可欠であることを意味すると考えられた。(2)喉頭神経系における神経栄養因子の関与の解明神経栄養因子であるFGF1の喉頭神経系における局在、密度を免疫組織学的に検討した。迷走神経背側核細胞において、FGF1とcholine acetyltransferaseとの共存率を調べた結果、8%に共存を認めるのみであった。一方、唾液核では13%、仙骨副交感神経節では18%の共存を認めた。このように、迷走神経背側核細胞で共存率の低いことは、これらの細胞の易傷症性の一つの原因であると考えられた。概日リズムに関する研究上気道および下気道に末梢時計が存在し、迷走神経を介して、視交叉上核によって制御されることを明らかにした。また、喉頭腺分泌に関与するMUC5b蛋白も概日リズムを有することが分かった。これらの結果は、喉頭疾患の時間特異的な発症に関与すると考えられ、今後の治療開発における重要な情報源となりうるものである。副交感神経に関する研究Fibroblast growthfactor-1(FGF1)は、成長因子の一つで、副交感神経細胞に存在するとされてきたが、我々は迷走神経背側核細胞には存在しないことを明らかにした。そこで、他の副交感神経細胞におけるFGF1の局在を検討した。その結果、Edinger-Westphal nucleus、唾液腺核などにおいてもFGF1は少ないことを明らかにした。また、動眼神経核、顔面神経核、舌下神経核および脊髄運動神経細胞の多くがFGF1を有していた。これらの結果は、副交感神経細胞の特性を表すものとして興味深い。疑核運動神経細胞に関する研究内喉頭筋を支配する運動神経細胞の発生過程における脳幹内で移動するが、リーラーマウスによく似た細胞構築異常を呈するミュータント動物であるShaking Rat Kawasaki(SRK)においてどのように変化するかを検討した。これらのマウスの疑核運動神経細胞は、正常群で見られるような配置が脳幹ではなされないことが明らかとなった。この結果は、発生過程における疑核運動神経細胞群の構築を考える上で重要なものと考えられる。(1)ラット脳幹運動神経細胞における軸索損傷時のTDP43の変化TDP43はALSの病理マーカーとして注目されている。TDP43の核外脱出はALSの病理学的特徴であるが、その分子病態は不明である。軸索損傷下の延髄運動神経細胞における核輸送系の障害とTDP43の核局在との関係、神経再生との関連を検討した。軸索輸送障害でTDP43の核局在が障害され、この背景にTDP43の軸索内蓄積とImportin系を介した核細胞質輸送機能異常が関与する可能性が示された。TDP43の異所性局在は可逆性であり、それ自体がALSの運動ニューロン死の原因ではなく、他の何らかの機序の関与が推察された。(2)ラット迷走神経背側核における軸索切断によるコリンアセチル基転移酵素の選択的スプライシングの変化末梢型コリンアセチル基転移酵素(pChAT)は、従来のChAT(cChAT)のスプライスバリアントで、主に末梢のコリン神経に発現する。本研究では、迷走神経切断後、迷走神経背側核にpChATが発現することを見出した。非手術対照群の迷走神経背側核では、cChAT陽性の神経細胞が認められたが、pChAT陽性細胞は認めなかった。迷走神経切断後7目目にcChAT陽性細胞はほとんど消失したが、多数のpChAT陽性細胞が出現した。切断後28日目には、cChAT陽性神経細胞数は再び増加したが、pChAT陽性細胞数は減少した。

こうした変化は、pChATが軸索切断後の神経変性の病態に関与していることを示唆している。(3)マウス喉頭における時計遺伝子の発現喉頭における時計遺伝子の発現と、喉頭腺での粘液分泌のリズム発現について検討した。wild-typeマウス、mCry1-/-mCry2-/-ミュータントマウスおよび視交叉上核破壊マウスを用い、免疫組織化学法、Northern blot法にてPer1、Per2、MUC5bの発現について解析した。喉頭粘膜、喉頭腺上皮細胞核にPER1、PER2タンパクの時間特異的な発現を認めた。MUC5bタンパクの発現にも概日リズムを認め、喉頭腺分泌は、喉頭の時計遺伝子Per1、Per2によって制御されている可能性が示唆された。
血圧低下と整腸作用のダブル機能性を備えた発酵ホエードリンクの開発

チーズを製造する際に副生するホエーの利用拡大は世界的な問題となっている。この有効利用をはかるため、プロテアーゼ処理をして血圧低下性ペプチドを生じさせておき、これを腸内生育性乳酸菌で発酵させることにより、降血圧作用と整腸作用を持つホエードリンクを作ることを考えた。まず、チーズホエータンパク質をトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、プロティナーゼK、アクチナーゼEおよびサーモライシンの7種のプロテアーゼで分解した後の、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を調べたところ、サーモライシンとプロティナーゼK処理が高い活性を示した。これらを高血圧自然発症ラット(SHR)に投与して、血圧低下効果を調べたところ、やはりプロティナーゼK処理が最も効果が高かった。これから有効ペプチドを検索した結果、5種のペプチドが得られたのでその構造解析を行い由来するタンパク質をつきとめた。さらにこれらを合成して、SHRラットに投与することによって、効果の高いペプチドをつき止めた。このうち、トリペプチドIle-Pro-Alaを経口投与したラットの諸器官から回収試験を行ったところ、主として肺に到達しACEに結合していることが判明した。更に食品添加物として認可されているプロテアーゼのうちから、アクチナーゼAS、プロテアーゼA、コクラーゼPおよびデナチームAPによってチーズホエーを処理し、SHRに対する降血圧効果を調べたところ、アクチナーゼASおよびプロテアーゼAが有効で、これらを乳酸菌で発酵させた後では、アクチナーゼASの効果が高かった。ヒト腸管由来のLactobacillus acidophilusグループ乳酸菌7菌株のホエー中での生育は、プロテアーゼ処理によって向上した。これらを組み合わせることによって、腸内生育性乳酸菌で発酵させた、降血圧作用を持つホエードリンクの作製のための基本工程を定めた。牛乳からチーズを製造した際、その重量の90%がホエーとして排出される。ホエーはパウダーとしたり、成分を分離して食品添加物として利用されているが、用途が限られているため余剰に悩まされている。これをプロテアーゼで処理をして、更に腸内生育性乳酸菌で発酵させることにより、降圧作用と整腸作用を持つホエードリンクを作ることを考えた。チーズホエーをトリプシン、プロティナーゼK、アクチナーゼE、サーモライシン、ペプシン、パパインおよびキモトリプシンの7種のプロテアーゼで、それぞれの至適pHと温度において24時間分解した。分解物について、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性(ACE活性)を調べた。その結果、プロティナーゼKとサーモライシン処理によって、95%以上の強い阻害活性が認められ、ペプシンやパパインでも80%以上の阻害活性がみられた。トリプシンやアクチナーゼE処理によるものはあまり高い活性を示さなかった。次に、酵素分解したホエーに、ヨ-グルト製造乳酸菌Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusおよびStreptococcus thermophilusを接種して、37°Cで8時間培養を行った後、同様にしてACE活性を測定した。ペプシン、トリプシン、サーモライシンおよびパパイン処理を行ったものは、乳酸菌による発酵後にACE活性が低下したが、プロティナーゼKでは低下はわずかであった。これらの結果から、プロティナーゼKによるホエーの消化により、強いACE活性が誘導され、それは乳酸菌発酵でも低下しないことが認められ、プロティナーゼKを用いるのが最適であることが判明した。更に、プロティナーゼKによって生成したペプチドを分画、精製し、これらの中からACE活性を示すペプチドの構造解析を進めている。ホエータンパク質をプロテアーゼで分解することによって生成する血圧降下作用を、動物試験によって確認した。

トリプシン、プロティナーゼK、アクチナーゼE、サーモライシン、パパイン、ペプシンおよびキモトリプシンで分解したのち、高血圧自然発症ラット(SHR)に投与し、血圧低下作用を調べた。最も効果の高かったのは、プロティナーゼKによって処理したものであり、これはACE活性の発現と一致していた。プロティナーゼKで処理したホエータンパク質を逆相HPLCなどを用いて分画し、活性の高い画分から5種のペプチドを分離した。これらの構造を明らかにし、由来するタンパク質の部位を特定した。更にこれらを合成し、SHRに投与したところ、いずれも降圧効果を示した。食品添加物として認可されているプロテアーゼを使用する目的で、アクチナーゼAS、プロテアーゼA、コクラーゼPおよびデナチームAPによってホエーを処理したのち、SHRによる降圧効果を調べたところ、アクチナーゼAS、プロテアーゼAの降圧効果の高いことが認められた。これらプロテアーゼ処理後ホエーを乳酸菌で発酵させた後の降圧効果は、アクチナーゼASが最も高かった。一方、ホエー溶液中での乳酸菌の増殖を、ヒト腸管から分離したLactobacillus acidophilus7菌株を用いて、プロテアーゼ処理前後について調べたところ、いずれもプロテアーゼ処理によって改善されることが認められた。これらの結果を組み合わせることによって、腸内由来乳酸菌で発酵させた、降圧作用と整腸作用のダブル機能を持ったホエードリンク作製のための基本工程を定めた。
NK細胞、NKT細胞の機能調節による感染防御機構の制御

NK細胞やNKT細胞は感染の初期防御において重要な細胞である。NK細胞やNKT細胞の感染防御機能に重要な分子を明らかにし、これらの細胞の活性を調節することで感染防御機構の制御を図ることを目的として研究を進めてきた。今年度は、NKT細胞の特異的リガンドによる活性化後の機能変化と、それを応用してNKT細胞の活性を高める手法を見出し報告した。NKT細胞は、CD1d上に提示された糖脂質をT細胞レセプターで認識し活性化する。生理的なリガンドとしてバクテリア由来のGSL-1等が知られており、またα-galactosylceramide(α-GalCer)によるNKT細胞の特異的な活性化が、腫瘍治療や感染防御に応用され始めているが、充分な成果は得られていない。我々は、特異的リガンドで活性化されたNKT細胞では、細胞表面のレセプターが一時的に消失し、その後、T細胞レセプターがNK細胞レセプターより早く再発現することを見出した。この現象はOCH刺激後に顕著で、OCH刺激後、抑制性NK細胞レセプターであるCD94/NKG2Aの発現の無いNKT細胞は、α-GalCerによる再刺激で10倍以上の量のサイトカインを産生した。また、このCD94/NKG2Aを介したNKT細胞の機能抑制はIFN-γにより増強されることを見出し、これがNKT細胞の活性化調節に重要であることを示した。この結果により、NKT細胞の活性を制御する自己に対する抑制性NK細胞レセプターが見出され、この機能調節によりNKT細胞の反応性を制御できる可能性が示された。また、1次反応と2次反応でNKT細胞のリガンドに対する反応性が異なることは、感染時期等によりNKT細胞が異なった反応をしている可能性を示しており、今後、感染時期を追って詳細にNKT細胞の反応性を解析し、感染防御機構におけるNKT細胞の真の機能を解明する必要性が示唆された。NK細胞はウイルス感染防御において、またNKT細胞はマラリア等の寄生虫や結核菌などの感染防御において、重要な役割を担っている。そして、これら自然免疫系に属する細胞は獲得免疫系より早く分化し、獲得免疫系の成立以前の感染防御機構の中心をなすと考えられている。しかし、NK細胞の分化には出生後2週間近くかかるとされ、この期間の生体防御に関しては不明な点が多かった。今回、胎生時からNK細胞が存在し、このimmatureなNK細胞は、adultマウスに存在するmatureNK細胞に比べperforin依存性の細胞傷害活性は弱いものの、TRAIL依存性の細胞傷害活性を強く示すことを見出した。これまでの研究で、NK細胞に発現するTRAILが、生体内でのウイルスの除去において重要な役割を担っていることが示されている。そして、脾臓においてNK細胞は速やかにmature NK細胞へと分化しTRAILの発現が見られなくなるのに対し、肝臓では一部のNK細胞はTRAILを発現したimmature phenotypeのまま、adultマウスでも存在し続けることを明らかにした。これまでNK細胞は自己に対する抑制性NK細胞レセプターにより制御され、自己の正常細胞を傷害せずに、選択的に感染細胞を傷害するとされてきた。しかし、この研究の結果により、若年期においては、NK細胞は抑制性レセプターによる制御のほかに、TRAILの正常細胞は傷害せずに感染細胞を選択的に傷害するという特性により、正常細胞を傷害せずに感染細胞を傷害し、生体防御に寄与していることが示された。一方、NKT細胞の活性化には、補助シグナルであるICOSが重要な役割を担っていることを示し、NKT細胞の機能発揮に関与する新たな分子機構も示した。これらの結果は、感染予防および感染症の治療に早期に応用可能な基礎的知見である。

また、1次反応と2次反応でNKT細胞のリガンドに対する反応性が異なることは、感染時期等によりNKT細胞が異なった反応をしている可能性を示しており、今後、感染時期を追って詳細にNKT細胞の反応性を解析し、感染防御機構におけるNKT細胞の真の機能を解明する必要性が示唆された。