hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体内で不変的なＥＳＲ活性を保つスピンラベル剤の開発とその応用

本研究では、生体内で不変的なESR活性を保つスピンラベル剤として、ニトロキシラジカル周辺が立体的にかさ高く、中心のニトロキシラジカルが守られたイソインドール骨格をもつスピンラベル剤の開発を行った。開発したスピンラベル剤のビタミンCを用いた還元耐性試験を行ったところ、開発したスピンラベル剤は、従来のスピンラベル剤よりも優れた還元耐性を示した。また、クリック反応を用いた農薬にスピンラベル部位を導入する方法を確立した。本研究の目的は、作物体内への農薬浸透移行過程を植物が生きたままの状態で計測する分析システムの開発であり、本年度は、昨年度から開発を検討していたアセタミプリドミュータントの開発をあきらめ、同じく土壌施用農薬であるイミダクロプリドに、ESR活性なスピンプローブ部位を持たせた分析ツールの開発を行いその開発にほぼ成功した。ーイミダクロプリドミュータントの合成ー昨年度、開発を検討していたアセタミプリドミュータントは、合成最終段階のリンカー形成部位の導入が選択的に行うことができず、リンカー形成部位が異なる位置に導入された混合物として誘導体が得られた。種々、合成条件の検討を行ったが位置選択的な合成方法を見出すことができず、アセタミプリドミュータントの開発を断念した。そこで、交付申請書に記載した研究実施計画の変更を行い、イミダクロプリドミュータントの開発をおこなった。出発物質である2-クロロ-5-クロロメチルピリジンにニトロアミノイミダゾリンを導入し、農薬であるイミダクロプリドとした後、プロパギルブロマイドを作用させ、イミダクロプリドにリンカー形成部位である末端アセチレンの導入をした。イミダクロプリドにおいて比較的簡単にリンカー形成部位が導入できたため、既存のスピンプローブ剤の導入を検討した。2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリドンを臭素化し、続いてFavorskii転位を用いて環縮小反応を行い、2,2,5,5-テトラメチル-2,5-ジヒドロピロールを合成した。続いて二重結合の還元、カルボキシル基の還元を行いアルコール誘導体に導き、アルコールのメシチル化、アジドへの変換、ラジカル化を経て、リンカー形成部位を持ったスピンプローブ部位を合成した。今後、クリック反応を行い目的生成物であるイミダクロプリドミュータントの開発を行い、作物を用いた農薬ミュータントの評価を行う。本年度は、灰色かび病に有効であるフルジオキソニルミュータントの合成を行った。また、初年度、合成を断念したアセタミプリドミュータントの合成に成功した。さらに、得られた三つのミュータントに関してESR測定を行い、農薬の種類によってスピンラベル部位が影響を受けないという知見を得た。ーフルジオキソニルミュータントの合成ー市販のフルジオキソニル水和剤からアセトンを用いて抽出し、フルジオキソニルを得た。フルジオキソニルのピロール部位にクリック反応の足掛かりとなるプロパルギル基の導入を行い97%収率で目的化合物を合成した。続いてクリック反応を用いて、すでに合成しておいたアジド基を有するスピンラベル部位と反応させ、スピンラベル部位を持ったフルジオキソニルミュータントを16%収率で得た。ーアセタミプリドミュータントの合成ー前年度、プロパルギル基の導入がうまくいかず合成をあきらめていたアセタミプリドミュータントの合成をフルジオキソニルミュータントを合成する手法を用いて再検討した。2-クロロ-5-クロロメチルピリジンにアミノ基を導入し、その後、シアノイミド部位を導入した。次に、セシウムを触媒として、臭化プロパルギルと反応させ、アセチレン部位を持ったアセタミプリド誘導体を合成した。続いてクリック反応を用いて、スピンラベル部位を導入し、収率86%でアセタミプリドミュータントを得た。ー農薬ミュータントのESR測定ー合成した三つの農薬ミュータント(アセタミプリド、イミダクロプリド、フルジオキソニル)についてESR測定を行った。比較対象物として、クリック反応させる前のスピンラベル部位を用いた。4つの測定結果を比較したところ、超微細結合定数ならびにg値に大きな変化は見られず、農薬部位によってスピンラベル部位は影響を受けないことが明らかとなった。本研究の目的は、作物体内への農薬浸透移行過程を植物が生きたままの状態で計測する分析システムの開発であり、本年度は、土壌施用剤として広く用いられているアセタミプリド(農薬)に、ESR活性なスピンプローブ部位を持たせた分析ツールであるアセタミプリドミュータントを合成した。アセタミプリドミュータントー農薬部位の合成ー出発物質である2-クロロ-5-クロロメチルピリジン(1)にGabrielアミン合成を行い、2-クロロ-5-アミノメチルピリジン(2)を収率84%で合成した。その後、アミノ基をBoc保護し、プロパルギルブロミドと反応させることでリンカー部位であるアセチレン基を導入した。その後、脱保護を行いN-((6-クロロピリジン-3-イル)メチル)-2-プロピン-1-アミン(3)を3段階、47%収率で合成した。

アセタミプリドミュータントースピンプローブ部位の合成ースピンプローブ部位である1,1,3,3-テトラエチルイソインドリン-2-オキシル誘導体(4)は、出発物質であるm-アニス酸(5)を臭素化した後、カルボン酸部分をエステル化し、続くGrignard試薬による付加反応を行うことで、3-(2-ブロモ-5-メトキシフェニル)ペンタン-3-オール(6)を得た。次に、硫酸-酢酸混合溶媒を用いて脱水し、オレフィン(7)とした後、ブチルリチウムを用いてホルミル基を導入した(5段階、70%)。ホルミル基をオキシムへと変換し、ヒドロキシルアミンへの還元、続くリバースCope転位反応による環化反応によって、イソインドール誘導体(8)へと導いた(4段階、41%)。その後、Grignard試薬を用いたエチル基の導入、ならびにヒドロキシルアミンのオキシムへの酸化反応を繰り返すことで、1,1,3,3-テトラエチルイソインドリン-2-オキシル誘導体(4)を収率11%で得ることができた。本年度、アセタミプリドミュータントの開発を断念し、イミダクロプリドミュータントの開発に切り替えた。イミダクロプリドミュータントの開発は順調に進んだため、研究の大きな遅れは取り戻せたが、研究の中盤での大きな方向転換であったため、全体の研究計画がやや遅れている。現在は、クリック反応に取り組んでおり、リンカー部位の形成を行っている。今後、作物を用いた農薬ミュータントの評価を行っていきたい。以上のことから現時点では、当初の予定よりもやや遅れている。アセタミプリドミュータントの農薬部位の合成は、出発原料である2-クロロ-5-クロロメチルピリジンから順調に達成されてきている。現在は、クリックケミストリーで結合させるためのリンカー部位の導入も達成できており、当初の予定通りである。アセタミプリドミュータントのスピンプローブ部位の合成については、研究の初期段階において、目的化合物や合成ルートの変更があったものの、昨年度の後半からは順調に合成が達成されてきた。現在、計画段階で予定していた生成物の4段階前の化合物まで合成が達成できている。現時点では、当初の予定よりも多少、遅れている。以上のことから本研究の進展具合を評価すると、「おおむね順調に進展している」と考えられる。本年度に達成できなかったイミダクロプリドミュータントの開発を引き続き行う。ミュータントの開発が達成でき次第、作物を用いてLバンドESR計測を行い、「生きたままの」農薬分布イメージング経時変化追跡を検証する。イメージングしたデータを、抽出方法(植物を部位ごとに採取、粉砕後に抽出、HPLCで定量)で得た各部位における実際の農薬分布と比較し、生きたままのESRイメージング経時変化追跡法の実用性検証を行う。本年度に達成できなかったアセタミプリドミュータントのスピンプローブ部位の合成を引き続き行う。合成が達成でき次第、スピンラベル剤と農薬誘導体を、クリックケミストリーを用いて結合させ、スピンラベル化された農薬ミュータントの合成を達成する。次に、上記で開発したスピンラベル化された農薬ミュータントを用いて、LバンドESR計測を行い、「生きたままの」農薬分布イメージング経時変化追跡を検証する。
産育慣行よりみた西オーストロネシア諸民族の生命観の社会人類学的研究(第二次)調査総括

本研究は,昭和61年度において科学研究費(海外学術調査61041083)の交付を受けた「産育慣行よりみた西オーストロネシア諸民族の生命観の社会人類学的研究」に関する,第二次の野外調査の結果を整理,分析することを目的としている.生殖と妊娠,そして出産と子どもの養育に至る一連の過程については,それぞれの社会が独自の認識と価値観をいだいている.本研究では,これらの事象の調査結果をふまえて,親族制度の基本にかかわる行為規範と認識体系について研究会を開催し,調査成果を発表するとともに,資料を整理して,地域ごとの特性と共通性,問題点の洗いなおしを行う.昭和61年度に第二次の現地調査を実施したので,本年度は調査資料を整理し,出産と養育にかかわる行為,規範,親族行動,性差の社会的意味などについて,昭和62年5月22日ー24日,同年7月21日ー23日の二度にわたり,横浜国立大学において研究会を開催し,全員が研究成果を発表し,比較検討を行った.同時に,台湾について,山路がブヌン族・ツォウ族,松沢がタイヤル族,笠原がルカイ族,小川がツォウ族について,新生児の社会的認知・地位決定・首長制およびシャーマニズムとの関連などについて,一連の資料を整理した.フィリピンについて,合田がルソン島のボントック族およびイフガオ族,河合がミンダナオ島のブギノドン族の妊娠・出産・育児に関する資料を整理し,社会的・文化的背景のなかで,産育慣行の意味を検討した.インドネシアについて,倉田はスンバ島のスンバ族,石井はスラウェシのサルアン族について,生命観・出産・育児・性差の意味などについて,調査資料を整理した.その結果,当初の構想に誤りのなかったこと,比較研究のために,より詳細な資料を現地調査によって収集し,妊娠・出産をめぐる親族儀礼,性差や性的行動などについても,さらに継続して調査研究を推進することとした.本研究は,昭和61年度において科学研究費(海外学術調査61041083)の交付を受けた「産育慣行よりみた西オーストロネシア諸民族の生命観の社会人類学的研究」に関する,第二次の野外調査の結果を整理,分析することを目的としている.生殖と妊娠,そして出産と子どもの養育に至る一連の過程については,それぞれの社会が独自の認識と価値観をいだいている.本研究では,これらの事象の調査結果をふまえて,親族制度の基本にかかわる行為規範と認識体系について研究会を開催し,調査成果を発表するとともに,資料を整理して,地域ごとの特性と共通性,問題点の洗いなおしを行う.昭和61年度に第二次の現地調査を実施したので,本年度は調査資料を整理し,出産と養育にかかわる行為,規範,親族行動,性差の社会的意味などについて,昭和62年5月22日ー24日,同年7月21日ー23日の二度にわたり,横浜国立大学において研究会を開催し,全員が研究成果を発表し,比較検討を行った.同時に,台湾について,山路がブヌン族・ツォウ族,松沢がタイヤル族,笠原がルカイ族,小川がツォウ族について,新生児の社会的認知・地位決定・首長制およびシャーマニズムとの関連などについて,一連の資料を整理した.フィリピンについて,合田がルソン島のボントック族およびイフガオ族,河合がミンダナオ島のブギノドン族の妊娠・出産・育児に関する資料を整理し,社会的・文化的背景のなかで,産育慣行の意味を検討した.インドネシアについて,倉田はスンバ島のスンバ族,石井はスラウェシのサルアン族について,生命観・出産・育児・性差の意味などについて,調査資料を整理した.その結果,当初の構想に誤りのなかったこと,比較研究のために,より詳細な資料を現地調査によって収集し,妊娠・出産をめぐる親族儀礼,性差や性的行動などについても,さらに継続して調査研究を推進することとした.
微細結晶粒超塑性材料の組織安定性と界面への偏析挙動に関する研究

結晶粒径の微細化が超塑性の発現を大きく左右することから本研究では,結晶粒微細化を目的として利用される粒子分散組織と2相混合組織における結晶粒の粗大化や安定性についてのコンピュータシミュレーションを行い,第2相による結晶粒成長の抑制効果を定量的に評価した.(1)粒子分散組織分散粒子による結晶粒成長の抑制効果については,Zenerが1948年にピン止め力を定量的に評価し,母相結晶粒の平均粒径Rと第2相粒子の平均粒径rとの間にR=4r/3fの関係があることを提唱した.ここで,fは第2相の体積分率である.この式は粒子が組織中にランダムに分散し,そのとき粒界上にある粒子が一律にF_<pin>=πrσのピン止め力を粒界に及ぼすという仮定の元で導出されている.しかし,この式は,近年のコンピュータシミュレーションの結果や,実験データと一致しないことが指摘されている.本研究では,まず,Zenerによる上記の仮定の再検討を試みた.粒界が粒子によるピン止めを受けた際の柔軟性を120°の凹凸に評価し,そのときの粒界上の粒子数を見積もり粒径の相関式を以下のように導出した.2次元の式はシミュレーションの結果をまた3次元の式は実験値を良く説明できることが明らかとなった.(2)2相混合組織第2相の分率f_sが10%以上の組織は,それぞれの相の結晶粒がお互いの粒界上に位置し,より組織を微細化するため高温での組織安定性も高く超塑性発現に非常に効果的である.コンピュータシミュレーションの結果から,主相と副相の平均粒径R_MとR_sの相関式が次式のように導かれた.(].SU.[) (2次元および3次元)上式は従来報告されている実験値についても適用可能であることが明らかになった.結晶粒径の微細化が超塑性の発現を大きく左右することから本研究では,結晶粒微細化を目的として利用される粒子分散組織と2相混合組織における結晶粒の粗大化や安定性についてのコンピュータシミュレーションを行い,第2相による結晶粒成長の抑制効果を定量的に評価した.(1)粒子分散組織分散粒子による結晶粒成長の抑制効果については,Zenerが1948年にピン止め力を定量的に評価し,母相結晶粒の平均粒径Rと第2相粒子の平均粒径rとの間にR=4r/3fの関係があることを提唱した.ここで,fは第2相の体積分率である.この式は粒子が組織中にランダムに分散し,そのとき粒界上にある粒子が一律にF_<pin>=πrσのピン止め力を粒界に及ぼすという仮定の元で導出されている.しかし,この式は,近年のコンピュータシミュレーションの結果や,実験データと一致しないことが指摘されている.本研究では,まず,Zenerによる上記の仮定の再検討を試みた.粒界が粒子によるピン止めを受けた際の柔軟性を120°の凹凸に評価し,そのときの粒界上の粒子数を見積もり粒径の相関式を以下のように導出した.2次元の式はシミュレーションの結果をまた3次元の式は実験値を良く説明できることが明らかとなった.(2)2相混合組織第2相の分率f_sが10%以上の組織は,それぞれの相の結晶粒がお互いの粒界上に位置し,より組織を微細化するため高温での組織安定性も高く超塑性発現に非常に効果的である.コンピュータシミュレーションの結果から,主相と副相の平均粒径R_MとR_sの相関式が次式のように導かれた.(].SU.[) (2次元および3次元)上式は従来報告されている実験値についても適用可能であることが明らかになった.
コヒーレントX線回折を用いたクライオバイオイメージング

SPring-8でのX線散乱実験により、ヒト染色体構造に関して定説を覆す発見をした。定説の30nmクロマチン線維やクロマチン繊維の規則的折り畳みは存在せず、ヌクレオソーム線維が不規則に折り畳まれていることを示した。また、凍結水和生体試料では氷が広がっているため、X線回折顕微法の従来のデータ解析アルゴリズムが適用できないが、空間的に制限された照明を用いる新たな手法の提案によりこの問題を解決した。コヒーレントX線を利用したX線回折顕微法(XDM)は、透過電子顕微鏡など従来の顕微法では難しかった、マイクロメートル以上の厚みをもつ生体試料の内部を、高コントラスト、高分解能で観察でき、世界的に注目されている。本研究では、XDMによるクライオバイオイメージングに向けた研究開発を行う。これにより、ヒト染色体、細胞核、精子などにおけるヒトゲノムDNAの折り畳み構造の理解に貢献することを目的とする。本年度は、ヒト精子を研究材料に用いて、XDM測定をおこなった。精子は、細胞核からなる頭部、運動のためのATPを合成するミトコンドリアを含む中片部、べん毛の尾部から構成される。頭部の精子核にはヒトゲノムDNAが非常にコンパクトに収納されている。その構造を調べることは、生物学的にも医学的にも非常に有意義である。ヒト精子を単離し、SiN薄膜に固定し、大型放射光施設SPring-8 BL29XULでコヒーレントX線を照射した。測定は、まず、電子密度が最も高い頭部の精子核に対して行った。7つの試料に対して、いずれも精度の高いコヒーレントX線回折パターンを測定することに成功した。試料像再構成にも成功し、現在、得られた補情報をもとに構造解析をおこなっている。また、1つの試料に対しては、長く伸びる尾部のイメージング行うために、異なる5つの照射領域でのコヒーレントX線回折パターンを取得した。照射領域がオーバーラップしているため、試料像の再構成にタイコグラフィーが適用可能である。本研究では、コヒーレントX線を利用したX線回折顕微法(XDM)によるクライオバイオイメージングに向けた研究開発を行う。本年度は、本課題で用いられるX線顕微法の装置を用いて、ヒトの分裂期染色体の構造を詳しく解析した。DNAはヒストンに巻きついてヌクレオソームとなり、このヌクレオソームが30-nmクロマチン線維に折り畳まれ、さらに規則正しい階層構造を取ることで染色体が構築されると長年考えられてきた。分子生物学の最も有名な教科書である「細胞の分子生物学」では、過去25年以上に渡って、この定説が掲載されてきた。また高等学校の生物IIの教科書にも記載されている。しかし、大型放射光施設SPring-8で得られた実験データを解析した結果、ヒト染色体は30-nmクロマチン線維よりもむしろ、ヌクレオソーム線維の不規則な折り畳みによって構築されていることを発見した。本研究内容を論文にまとめ投稿し、EMBO Journal誌に掲載された。この成果は、EMBO Journal誌、日本経済新聞、日経産業新聞、日刊工業新聞などでも解説記事がとりあげられた。さらに、凍結水和生体試料では、試料粒子の周りは氷の層が広がっているため、従来のアルゴリズムがそのまま適用できない可能性がある。このためデータ解析アルゴリズムの改良に取り組んだ。従来提案されていた試料位置をスキャンしオーバーラップした異なる試料領域からの回折データを用いる方法に加えて、ひとつの試料領域での回折データのみから試料像を再構成する方法についても計算機シミュレーションを行った。この結果、新たに開発したアルゴリズムの有効性を示す結果が得られた。本研究では、コヒーレントX線回折顕微法によるクライオバイオイメージングに向けた研究開発を行う。これにより、ヒトゲノムDNAの折り畳み構造の理解に貢献することを目的とする。本年度は、細胞核の高次構造研究やデータ解析アルゴリズムの開発などを行った。昨年度までは分裂期染色体に焦点を当てたが、今年度は間期のHeLa細胞の単離核に対するX線小角散乱(SAXS)測定をSPring-8において行った。その結果30 nmの構造は検出されず、分裂期染色体と同様に、ヒト間期クロマチンにも30 nmのクロマチン線維が存在しないことが示唆された。さらに超小角X線散乱(USAXS)測定においても、501000 nmの範囲において、間期クロマチンに周期的な構造は観察されなかった。間期クロマチンの限られた領域では30 nm線維や他の規則的な階層構造が存在している可能性は否定できないが、SAXSやUSAXSの結果から、間期クロマチンの大部分の構造もヌクレオソーム線維が不規則に折り畳まれていると考えられる。上記の成果を論文にまとめNucleus誌に掲載された。また、凍結水和生体試料では試料粒子の周りは氷の層が広がっているため、従来のデータ解析アルゴリズムがそのまま適用できない可能性がある。

このため昨年度に引き続きアルゴリズムの改良に取り組んだ。従来法では試料位置をスキャンして複数回のコヒーレント回折測定をする必要があったが、ひとつのコヒーレント回折データのみから試料像を再構成する新手法について検討した。計算機シミュレーションの結果、複雑な試料構造を持つ場合にも、新たに開発したアルゴリズムの有効性を示す結果が得られた。上記の成果を論文にまとめOptics Exprss誌に掲載された。また、試料を時間的に凍結させる試みとして、X線自由電子レーザー施設SACLAを用いたコヒーレントX線回折顕微法測定を行った。本課題で用いられるX線顕微法の装置を用いて、これまでの定説を覆し、ヒト染色体はヌクレオソーム線維の不規則な折り畳みによって構築されていることを発見した。これにより、ヒトゲノムDNAの折り畳み構造の理解に貢献することができた。また、凍結水和生体試料に対するアルゴリズム開発でも良好な結果が得られた。24年度が最終年度であるため、記入しない。単離したヒト染色体や、興味深いクロマチン構造をもつヒトデ精子核に対して、大型放射光施設SPring-8を用いた測定を進める。また、凍結水和生体試料に対するアルゴリズム開発の研究を論文としてまとめる。
ビスフェノールＡの核内受容体ＥＲＲを介したシグナル毒性の分子メカニズム

ビスフェノールA(BPA)はポリカーボネートプラスチックなどの原料化合物であるが、こうした製品から漏出したBPAが乳幼児の脳神経系や生殖腺系へ及ぶ悪影響が懸念されており、一刻も早くBPAの悪影響を分子レベルで解明することが期待されている。我々は、ショウジョウバエにBPAを食餌させて歩行活動リズムを解析し、BPA食餌ハエでは野生型と比較して活動量が大幅に増加した多動性症状が現れることを見出した。また、「period mRNAのThr-Gly(TG)リピートをコードする領域で分子淘汰が起こる」ことなども発見している。本研究最大の目的は、これらの発見を基点として、BPAによる歩行活動リズムの形成に関わる遺伝子への影響を解析することでBPAの悪影響を分子レベルで解明することである。本年度は、まずハエの活動に大きく関与する神経ペプチドPDFに着目し、ハエ脳を用いた免疫染色を行った。野生型ハエでは活動リズムを発振する神経細胞(時計細胞)でPDFが分泌され、軸索へ運搬される様子が観察されたが、BPA食餌多動性症状ハエでは軸索におけるPDFの染色が薄くなっていた。これにより活動リズムが撹乱されたと考えられる。また、BPA食餌"低活動性症状"ハエも少数存在したため、これを集めて遺伝子解析を実施した。period mRNAのTGリピートをコードする領域について解析したところ、野生型ではTG20回と23回の両方が検出され、BPA食餌多動性症状ではTG23回のみが検出されることが分かっていたが、新しくBPA食餌低活動性症状ではTG20回のみが検出されることが分かった。このことは、periodのTGリピート回数と活動リズムとの間に深い関係があることが示唆される。その他RNAシークエンスなど実施し、BPAが時計遺伝子や転写因子など多くの遺伝子の発現がDNAメチル化を介して変化していることが分かった。27年度が最終年度であるため、記入しない。ビスフェノールA (BPA)を原料とするポリカーボネート製の哺乳瓶は、ミルクへの漏出BPAの乳幼児脳神経系や生殖腺系へ及ぶ悪影響の懸念から、世界各国で製造・販売が禁止された。BPAが生体に悪影響を及ぼす、その分子機構の本質を明らかにするため、ヒトのモデル生物であるショウジョウバエにBPAを食餌させて歩行活動リズムへの影響を解析した。その結果、野生型と比較して活動量が大幅に増加した多動性症状のハエが現れることが明らかとなった。このことから、活動リズムの形成に関わる遺伝子(時計遺伝子)の塩基配列や発現量を解析することにした。本研究では、朝方の活動形成に関わる神経ペプチドpigment-dispersing factor (PDF)をコードするpdf遺伝子に着目し、そのゲノムDNAとmRNAの塩基配列を解析した。その結果、3'UTRの長さが異なる4種のアイソフォームが存在することが分かった。また、3'UTRに9カ所の一塩基多型が存在し、野生型と多動性症状ハエではその変異率が変化していることが判明した。一方、ゲノムDNAの塩基配列には変異が見られないことから、mRNAに存在した一塩基多型は、DNAからmRNAへの転写の段階で引き起こされている可能性が考えられる。また、pdf mRNAの発現量を解析したところ、野生型に比べて多動性ハエで発現量が増加していることが分かった。さらにDNAメチル化状態も解析したが、差異は見られなかった。ショウジョウバエのBPA食餌によるpdf mRNA、ゲノムDNAの塩基配列への影響について解析してきたが、BPAが生体に悪影響を及ぼす分子機構を解明するために、BPAのメチル基の1つが欠失したビスフェノールE (BPE)、2つとも欠失したビスフェノールF (BPF)を用いた比較実験を行うことにした。BPE、BPF食餌ハエの活動を調べると、BPF食餌ハエは継代1世代目から活動量の増強が見られ、BPA食餌の場合よりも早い世代からハエの活動に影響を及ぼす事が明らかとなった。ビスフェノールA(BPA)はポリカーボネート樹脂などの原料化合物であるが、こうしたプラスチック製品から漏出したBPAが乳幼児脳の神経系や生殖腺系へ及ぶ悪影響が懸念されており、一刻も早くBPAのシグナル毒性の本質を分子レベルで解明することが期待されている。我々はヒトのモデル生物であるショウジョウバエにBPAを食餌させて歩行活動リズムを解析し、BPA食餌ハエでは野生型と比較して活動量が大幅に増加した多動性症状が現れることを見出した。本研究の最大の目的は、この発見を基点として、BPAによる歩行活動リズムの形成に関わる遺伝子への影響を解析することでBPAの悪影響を分子レベルで解明することである。本年度は、時計遺伝子、神経ペプチド遺伝子、マイクロRNAに着目し、塩基配列解析、発現量解析を実施した。その結果、ほとんどのmRNA発現量が変化しており、特に神経ペプチドで朝方の活動形成に関わるPDFをコードするpdf遺伝子と、夕方の活動形成に関わるITPをコードするitp遺伝子の両方で発現量が減少していることが分かった。BPA投与がpdfとitpの両方において発現量が減少する原因と、活動量増加の原因はリンクすると見られ、これらの接点の解析が必要なことが始めて明らかになった。一方、BPA食餌はどのようにして遺伝子の発現量を変化させるのか?の課題解決にも取り組んだ。3齢幼虫の株化神経培養細胞・BG2-c6を用いて、BPA暴露によるBPAメチル化の状態を調べた。

BPA暴露48時間後にゲノムDNAのメチル化シトシン量を解析・比較したところ、DNAメチル化量が有意に増加していた。次いで、DNAメチル化と遺伝子発現が核内受容体を介した現象であるかを、BG2-c6を用いたルシフェラーゼ遺伝子アッセイ系を構築して調べることにした。現在、ショウジョウバエ核内受容体21種について解析中である。ビスフェノールA(BPA)はポリカーボネートプラスチックなどの原料化合物であるが、こうした製品から漏出したBPAが乳幼児の脳神経系や生殖腺系へ及ぶ悪影響が懸念されており、一刻も早くBPAの悪影響を分子レベルで解明することが期待されている。我々は、ショウジョウバエにBPAを食餌させて歩行活動リズムを解析し、BPA食餌ハエでは野生型と比較して活動量が大幅に増加した多動性症状が現れることを見出した。また、「period mRNAのThr-Gly(TG)リピートをコードする領域で分子淘汰が起こる」ことなども発見している。本研究最大の目的は、これらの発見を基点として、BPAによる歩行活動リズムの形成に関わる遺伝子への影響を解析することでBPAの悪影響を分子レベルで解明することである。本年度は、まずハエの活動に大きく関与する神経ペプチドPDFに着目し、ハエ脳を用いた免疫染色を行った。野生型ハエでは活動リズムを発振する神経細胞(時計細胞)でPDFが分泌され、軸索へ運搬される様子が観察されたが、BPA食餌多動性症状ハエでは軸索におけるPDFの染色が薄くなっていた。これにより活動リズムが撹乱されたと考えられる。また、BPA食餌"低活動性症状"ハエも少数存在したため、これを集めて遺伝子解析を実施した。period mRNAのTGリピートをコードする領域について解析したところ、野生型ではTG20回と23回の両方が検出され、BPA食餌多動性症状ではTG23回のみが検出されることが分かっていたが、新しくBPA食餌低活動性症状ではTG20回のみが検出されることが分かった。このことは、periodのTGリピート回数と活動リズムとの間に深い関係があることが示唆される。その他RNAシークエンスなど実施し、BPAが時計遺伝子や転写因子など多くの遺伝子の発現がDNAメチル化を介して変化していることが分かった。申請書には2年目の計画として、夕方活動リズムを調節する神経ペプチドの発現リズム解析と多動性症状への関与の検討を予定していた。当初はhugγのみを対象にしていたが、夕方の活動リズム形成にはhugγの他にもPK2、ITP、NPFというペプチドも関与しているため、すべてに対して発現量解析を行った。また3年目に予定していたBPAによるDNAメチル化への関与についても着手しており、さらに計画を越えてショウジョウバエ培養細胞を用いた核内受容体のルシフェラーゼ遺伝子アッセイ系の構築に至った。このことから、当初の計画以上に進展していると言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、ショウジョウバエにBPAを食餌させることによる時計遺伝子や活動形成に関わる遺伝子について、その発現量と塩基配列解析を実施してきた。また、BPA食餌ハエは野生型ハエに比べてメチル化DNAの割合が高いことが分かり、これにより遺伝子発現量が変化しているものと考えられる。
ストレス負荷に対する生理・内分泌反応の個人差に関する予防医学的研究

安静時の心拍間隔変動のパワースペクトル分析から得られる2つの成分は、非侵襲的な自律神経活動の指標として最近注目されている。本研究では、最初に正常者を対象として、覚醒安静時の上記2成分(Mayer Wave性洞性不整脈成分(MWSA成分)と呼吸性洞不整脈成分(RSM成分)についてその変動要因とされる年齢、性、肥満、食事、喫煙、飲酒、さらにはストレス関連性格や各種ストレス指標との関連を検討した。結果、年齢、食事、肥満との関連が有意であった。また、同法を用いて交感神経系緊張を特徴とする「不安神経症」患者を調べたところ、交感神経系活動を示すMWSA成分/RSA成分の比(Ratio)は、予想通り、不安神経症>汎不安症候群>対照群の順であり、方法の妥当性とともに、同疾患では非発作時でも交換神経活動が上昇している傾向が示され、同疾患が高血圧や動脈硬化のリクスであるとする疫学研究の結果を支持した。さらに、事務系職場の集団健診対象者についての検討した結果、通勤時間や残業時間が長いもので交感神経活動の亢進傾向が示された。最終年度の平成7年度には、13名の若年被験者で、睡眠時の睡眠深度によるMWSA成分とRSA成分の変動を観察したところ、とくに交換神経系活動を示す指標と考えられるMWSA成分/RSA成分の比は睡眠深度(14段階)が深くなるほど有意に低下した。絶対安静時と考えられる深睡眠時に最も低下した時の比と覚醒安静時の比の差異は、覚醒時での精神的ストレス(緊張)による交感神経系活動の増加を示していると予想され、できれば同一被験者を対象とした継続的な検討がさらに必要と考えられる。なお、本研究の成果として、軽量携帯型の心拍R-R間隔モニター計を用いる方法についても検討しており、同法による長期観察が可能となっている。初年度の研究として、安静時(仰臥位)における心拍(R-R)間隔の変動係数(CVRR)とその自己相関スペクトルの2大成分であるMayer Wave性洞性不整脈成分(C-CV_<MWSA>)と呼吸性洞性不整脈成分(C-CV_<RSA>)及びそれらの比(C-CV_<MWSA>/C-CV_<RSA> ratio)、また立位負荷によるそれらの変化、夜間睡眠時の尿中カテコールアミソ排泄速度、音刺激に対する指尖容積脈波反応などを指標として、自律神経系機能の個人内・個人間変動とその変動要因として示唆されている年齢、肥満、喫煙等との関連についての正常者を対称とした検討(パート1)と、自律神経機能亢進症状を特徴とするgeneralized anxiety disordersの患者についての検討(パート2)を行った。なお、パート1では、さらにストレス関連性格や日常的な主観的ストレスとの関連について引き続き検討中である。主要な結果として、パート1では、75名の中高年男子で、心臓系副交感神経活動に対応すると考えられるC-CV_<RSA>及びその立位負荷による変化量が加歳と肥満によって有意に低下する傾向が明らかであったが、立位負荷による変化量の方が上記活動をより鋭敏に示すことが示唆された。また、C-CV_<MWSA>によって示される交感神経活動と夜間の尿中カテコールアミン(ノルエピネフリンとエピネフリン)とは、個人間の相関で有意であった。パート2では、音刺激に対する指尖容積脈波の反応及び各心拍間隔変動成分については、年齢による変動を調整した場合にも、患者一対照間の有意な差異は認められなかったが、心拍数の早いものでは脈波反応が低下する傾向が患者群のみで認められ、心拍間隔変動成分指標では示されない交感神経系活動の亢進状態が示唆された。

自律神経機能(活動)の非侵襲的検査である覚醒安静時の心拍間隔動揺の2つの周波数スペクトル成分(交感神経活動と心臓系副交感神経系活動にそれぞれ対応するMWSAとRSA成分)を用いる方法を中心に、ストレス負荷に対する生理反応の指標としての有用性を引き続き検討した。昨年実施した職域健診での調査を対象者を増やして再度実施し、データの再現性、スペクトル成分に変動を与える要因の検討を行った他、覚醒時には、安静といっても精神活動によるスペクトル成分への影響が無視し得ないことから、夜間睡眠中の睡眠段階応じたスペクトル成分の変動についての検討、を行った。前者では、新規の222名と今回も受診した者60名の男子計282名(21-49才)のデータを再解析した結果、心臓系副交感神経系活動(RSA成分)が加齢と同時に肥満と密接な関係にあることが示され、ストレスの評価をする場合には、肥満度を調整する必要のあることが再確認された。一方、後者では、睡眠中の自律神経機能のうち交感神経活動(MWSA成分)は睡眠中でも深睡眠時に対応して低下している傾向が明らかであり、同値が絶対安静時における自律神経活動に対応することが示唆された。覚醒時における安静状態と深睡眠時における絶対安静状態での自律神経活動の差は、慢性的なストレスの指標となる可能性があり、次年度さらに検討すべき課題と考えられた。さらに尿中カテコールアミンと上記2成分との関連についても検討し、現在結果の詳細を解析中である。安静時の心拍間隔変動のパワースペクトル分析から得られる2つの成分は、非侵襲的な自律神経活動の指標として最近注目されている。本研究では、最初に正常者を対象として、覚醒安静時の上記2成分(Mayer Wave性洞性不整脈成分(MWSA成分)と呼吸性洞性不整脈成分(RSM成分))についてその変動要因とされる年齢、性、肥満、食事、喫煙、飲酒、さらにはストレス関連性格や各種ストレス指標との関連を検討した。結果、年齢、食事、肥満との関連が有意であった。また、同法を用いて交感神経系緊張を特徴とする「不安神経症」患者を調べたところ、交感神経系活動を示すMWSA成分/RSA成分の比(Ratio)は、予想通り、不安神経科>汎不安症候群>対照群の順であり、方法の妥当性とともに、同疾患では非発作時でも交感神経活動が上昇している傾向が示され、同疾患が高血圧や動脈硬化のリスクであるとする疫学研究の結果を支持した。さらに、事務系職場の集団健診対象者についての検討した結果、通勤時間や残業時間が長いもので交感神経活動の亢進傾向が示された。最終年度の平成7年度には、13名の若年被験者で、睡眠時の睡眠深度によるMWSA成分とRSA成分の変動を観察したところ、とくに交感神経系活動を示す指標と考えられるMWSA成分/RSA成分の比は睡眠深度(14段階)が深くなるほど有意に低下した。絶対安静時と考えられる深睡眠時に最も低下した時の比と覚醒安静時の比の差異は、覚醒時での精神的ストレス(緊張)による交換神経系活動の増加を示していると予想され、できれば同一被験者を対象とした継続的な検討がさらに必要と考えられる。なお、本研究の成果として、軽量携帯型の心拍R-R間隔モニター計を用いる方法についても検討しており、同法による長期観察が可能となっている。
都市部住民におけるＬＤＬ酸化予防のための生活習慣の解明

神戸研究では、食事指標として血清ビタミンEを測定し、ビタミンE摂取が酸化LDLの血管内皮機能障害の抑制に関連する可能性を学会報告した。その他の学会発表は、塩分摂取量や塩分知覚低下と血圧について、酸化LDLと肥満について報告を行った。論文発表では、食事指標である血中脂肪酸と、酸化LDLが強く関与するとされる慢性炎症との関連について分析した原著論文がJ Nutr Health Agingに受理された。篠山研究では、酸化LDLのほか、尿中L-FABP(酸化ストレスや細小動脈硬化に関連)の測定を行った。篠山研究では、生活習慣要因について対象者に詳細に聴き取りをしており、今後成果を公表していく。神戸市一般住民を対象とした都市部住民コホート「神戸トライアル」では、平成22,23年度にベースライン調査を実施し、4074歳のガン、循環器疾患の既往がなく高血圧・糖尿病・脂質異常症の治療中でない1,134人がコホートに参加した。平成24年度以降は追跡調査の期間となり、コホート参加者にとって1回目の追跡調査を平成24年度26年5月の期間に実施中である。平成25年度は、平成24年度に引き続き、コホート参加者の約半数を対象として追跡調査の一環である来所検査を実施し、食事、サプリメント類摂取、喫煙状況をはじめとする生活習慣情報、QOL指標、動脈硬化性疾患の発症情報等および血液検体を収集した。平成26年2月時点の来所検査の受診率は90 %(1,015人)であった。並行して、2回目の追跡に向け、検査項目の検討や、ニュースレターによる案内を行った。さらに、ベースライン調査で収集した血中ビタミンEとLOX-1系変性LDL指標との関連について学会報告を行った。α-トコフェロール/non-HDLコレステロール(mmol/mol)は、LAB(標準化係数=ー0.186)およびLOX-index(標準化係数=ー0.150)と有意な負の関連を示した。sLOX-1とは有意な関連はみとめなかった。対象者をLDLコレステロール低値群(130 mg/dL未満)と高値群(130 mg/dL以上)に分類すると、LDL低値群では、血清ビタミンEはLAB(標準化係数=ー0.204)およびLOX-index(標準化係数=ー0.171)との間に有意な関連がみとめられたが、LDL高値群では有意な関連はみとめられなかった。ビタミンE摂取は、LOX-1系変性LDLの血管内皮機能障害の抑制に、LDL-コレステロールが低値の集団でより強く関連することが示唆された。平成24年度以降は追跡調査の期間となり、コホート参加者にとって1回目の追跡調査を平成24,25年度の間に計画している。平成24年度は、コホート参加者の約半数を対象として追跡調査の一環である来所検査を実施し、食事、サプリメント類摂取、喫煙状況をはじめとする生活習慣情報、QOL指標、動脈硬化性疾患の発症情報等および血液検体を収集した。来所検査の受診率は86%であった。さらに、ベースライン調査で収集したLOX-1系変性LDL指標との関連を検討するため、コホート参加者の検体のうち520件の血中ビタミンE(α,β,γ-トコフェロール)を本研究費および連携研究者らが別途取得した科研費により測定した。血中α-トコフェロール(μg/mL)の中央値は男性11.8、女性12.9、β-トコフェロール(μg/mL):男性0.22、女性0.23、γ-トコフェロール(μg/mL):男性1.05、女性0.96、LOX-系変性LDL指標の1つであるLAB(μg/mL)の中央値は男性23.0、女性24.0と、γ-トコフェロール以外は女性の方が高い傾向を示した。前年度で終了したベースライン調査に関しては、研究代表者および連携研究者らが研究成果を報告した。LDL-コレステロールの低い日本人においてCRPが心臓足首血管指数(CAVI)に強く関連することを示した原著論文を1報、学会報告ではLOX-1系変性LDL指標であるLABとsLOX-1が健常者の動脈硬化予測因子となる可能性を示した他、ストレス状況に検査時血圧よりも家庭血圧が強く関連することなどについて8報発表した。都市部住民コホート「神戸研究」では平成26年5月まで追跡調査の一環としての2回目の来所検査を実施し、平成26年6月に研究代表者は先端医療センター研究所から兵庫医科大学に異動した。

神戸研究では客員研究員として引き続き研究運営に携わった。兵庫医科大学では農村部住民コホート「篠山研究」の実務担当となり、調査の運営と本課題に関連する測定を行った。平成26年度は808名に研究用採血と尿検体の収集を行った。尿検体を用いて酸化ストレスや細小動脈硬化と関連する尿中L型脂肪酸結合蛋白(L-FABP)を測定した。L-FABPが男性で1.57μg/gCRE以上と高値だった者の割合は、現在喫煙者59%、過去喫煙者49%、非喫煙者44%、女性で1.89μg/gCRE以上と高値だった者の割合は同52%、50%、50%であり、男性において喫煙者ではL-FABPが高値の者の割合が高かった。血液検体を用いて、酸化LDLとしてLOX-1系変性LDL指標である可溶型レクチン様酸化LDL受容体(sLOX-1)とLOX-1 ligand containing ApoB(LAB)を男性において測定した。sLOX-1の中央値は、現在喫煙者356、過去喫煙者326、非喫煙者311 ng/L、LABの中央値は同5.0、4.6、4.2 mg/Lと、sLOX-1とLABは喫煙者ほど高い傾向がみとめられた。これらの指標と生活習慣要因について、引き続き分析を進める。平成26年度には、神戸研究の成果として、学会発表では、日本公衆衛生学会総会にて生活習慣要因である塩分摂取量や塩分知覚低下と血圧との関連について、日本疫学会学術総会にてLOX-1系変性LDL指標と肥満指標について報告を行った。論文発表では、生活習慣としての食事指標である血中脂肪酸と、酸化LDLが強く関与するとされる慢性炎症との関連について分析した原著論文(研究代表者筆頭)がJ Nutr Health Agingに受理された。栄養疫学コホート研究「神戸トライアル」の参加者は一般市民のボランティア集団である。追跡調査では、コホート参加者の神戸トライアルへの関心が、来所検査への参加率や郵送調査の回答率つまり追跡率を左右することになる。研究代表者と連携研究者らの諸活動により、来所検査への参加率は平成26年2月時点で90%と、高い追跡率を維持し、追跡調査のデータおよび血液検体の収集、データベース作成は順調に進展している。コホート維持のための資金を優先する必要があり、検体分析については、計画を縮小せざるを得なかった。しかしながら、コホート維持に関しては、既に2回目の追跡検査に90%の申し込みがある状態であることや、神戸トライアル関連の学術論文を筆頭、共著含めて4本投稿中であることなどから、総合的に見れば、おおむね順調に進展していると考えられる。コホート研究「神戸トライアル」の参加者は一般市民のボランティア集団である。研究代表者と連携研究者らの諸活動により、来所検査への参加率は86%、コホート参加者全員を対象とした郵送調査の返信率は90%と、高い追跡率を維持し、追跡調査のデータおよび血液検体の収集は順調に進展している。しかしながら、ベースライン調査の成果報告が前述の通り得られており、これらは今後の追跡調査結果の分析の基礎情報となる上、神戸市民への研究成果の還元にもつながるため、長期的な視点で見れば順調に進展していると考えられる。引き続き追跡調査を継続する。
心不全重症化の分子機序解明と、それに基づく遺伝子治療法開発

心不全は先進国において入院、死亡に至る最大の原因である。特に、拡張型心筋症や梗塞後心不全等の重症例に対する根本治療としては、心移植という選択しかありえなかった。ところが移植には、社会的、医学的問題が山積しており、移植に代わる新たな治療法が待ち望まれていた。そこで申請者は、心不全重症化の分子機序を解明し、それに基づいた遺伝子治療法の開発を目指した。心不全ではその原因によらず、心筋細胞の細胞骨格と細胞外基質を橋わたす役割を果たす、ジストロフィン結合蛋白複合体の崩壊がみられる。これによりサルコメアの発生張力が細胞外に伝達され難くなり、収縮力は顕著に減弱していく。この複合体崩壊は、蛋白分解酵素カルパインによるものである証拠が集まってきているが、この酵素がいかにして分解対象にまで到達するのか、その分子機序の詳細は不明であった。そこで申請者は、カルパインを分解対象までターゲットする蛋白を、酵母Two-hybridスクリーニング法により単離しようと考えるに至った。一方、細胞運動の分野では、カルパインの活性と局在が様々なキナーゼによるリン酸化により制御されるという知見が集まってきている。心不全では、上記の複合体をはじめ多くの膜蛋白が分解されることを勘案するとカルパインはいずれかのキナーゼによるリン酸化によりその活性や膜局在が制御されている可能性が高いと申請者は考えた。そこでそのような制御機序の解析もあわせて行った。その結果、(1)カルパインとジストロフィン結合蛋白複合体の双方に結合する蛋白の単離、および(2)カルパインの活性と膜局在を制御しているキナーゼの同定、に成功した。今後の計画としては、(1)in vivoにおいて、これらの蛋白が果たす役割を明らかにし、さらには、(2)これら、心不全重症化を促進する蛋白の機能を阻害することにより効果を発揮する遺伝子治療法を開発していこうと考えている。我々は、拡張型心筋症に代表される重症心不全に対する、心移植に代わる遺伝子治療法を開発すべく、本研究を開始した。重症心不全時の心筋細胞では、原疾患によらず共通して細胞内骨格と細胞外基質を橋渡すジストロフィン関連蛋白複合体(以下DAP)の崩壊が見られる。これにより心筋細胞膜を裏打ちしているジストロフィンが遊離・分解され、筋ジストロフィー様の変性・壊死につながると考えられている。DAP崩壊は、複合体を構成する膜蛋白いずれか一つの欠損(遺伝性心筋症)あるいは量減少(一般的な心不全)によりもたらされる。より具体的には、後天的要因による心不全、例えば冠結紫で梗塞後心不全をきたしたラット心では、DAP構成因子の一つの蛋白量のみが著減している(申請者ら、発表済)。ところが転写量では対照ラット心と有意差のないことから、この蛋白量減少には分解など転写後の機序が示唆された。サルコグリカンの異常で発症することのある骨格筋ジストロフィーの一部には、その分解酵素、カルパインの遺伝子異常によるものが存在することから、申請者らはこの酵素に着目した。心筋におけるメジャーなカルパインであるm・カルパインは、in vitroで上記蛋白を含め様々な蛋白を基質とする。ところが梗塞後不全ラット心では上記蛋白は選択的に分解され、この選択性の機序は判っていない。そこで申請者は、上記蛋白をカルパインによる分解に供し、心不全一般で増悪に働く蛋白を検索しようと考えるに至った。そのためにまず酵母two・hybrid法により侯補蛋白を選別した。続いて培養細胞においてこの蛋白を強制発現し、その機能を検討した。今後は、in vitoroで、このcDNAを発現蛋白として得て蛋白分解の再構成系に添加し、蛋白の相互作用関係や分解効率への影響等を調べる所存である。引き続き小動物、ひいては大型動物において、個体レベルでの機能解析を行う計画である。

今後の計画としては、(1)in vivoにおいて、これらの蛋白が果たす役割を明らかにし、さらには、(2)これら、心不全重症化を促進する蛋白の機能を阻害することにより効果を発揮する遺伝子治療法を開発していこうと考えている。
家族正大腸腺腫症関連遺伝子の単離と解析

家族性大腸腺腫症(FPC)におけるポリープ発生に関連した遺伝子を同定するため,ポリープと正常大腸粘膜において発現量に差のあるcDNA7ローンの単離を試みた.はじめに,正常大腸粘膜及びFPC患者のポリープよりcDNAライブラリーを作製した.正常及びポリープからのプローブを用い分別的ハイブリダイゼーション法により,ポリープまたは正常粘膜で発現の高いcDNAクローンを検索した.その結果,ポープの方で,より発現の高いcDNAクローンを2株得た.正常細胞の方で,より発現の高いクローンはまだ得られていない.また, FPC発症よ関連した癌遺伝子を検出するため, DNAをNIH3T3細胞に導入したあとヌードマウスに移植して腫瘍を形成するか否かを検討した.FPC患者のポリープ6例,大腸癌1例,抹消血リンパ球2例について調べたところ,全例でAlu配列陽性の腫瘍が形成された.この中で癌遺伝子の存在が確かな2例につき詳しく解析した.rasを含む10種類の癌遺伝子を各々プローブとしたハイブリダイゼーションにより, 1例のポリープ由来癌遺伝子はN-rasであることがわかった.もう1例は抹消血リンパ球由来で,調べた癌遺伝子のどれとも反応せず,まだ調べていない既知の癌遺伝子か,新しい遺伝子と考えられる.現在, EMBL3ファージを用いてこの遺伝子のクローニングをおこなっている.最近, FPCの原因遺伝子が染色体の5番にあるらしいことが欧米で報告された.日本人のFPCでも同じ部位に異常があるか否かを調べるため,同じプローブを用いて検討した.11家系54名について調べたが,ヘテロになったのは1家系3名のみで,他はホモのため充分な解析ができなかった.結論を出すには更に多くのプローブ及び家系を集めて検討する必要がある.家族性大腸腺腫症(FPC)におけるポリープ発生に関連した遺伝子を同定するため,ポリープと正常大腸粘膜において発現量に差のあるcDNA7ローンの単離を試みた.はじめに,正常大腸粘膜及びFPC患者のポリープよりcDNAライブラリーを作製した.正常及びポリープからのプローブを用い分別的ハイブリダイゼーション法により,ポリープまたは正常粘膜で発現の高いcDNAクローンを検索した.その結果,ポープの方で,より発現の高いcDNAクローンを2株得た.正常細胞の方で,より発現の高いクローンはまだ得られていない.また, FPC発症よ関連した癌遺伝子を検出するため, DNAをNIH3T3細胞に導入したあとヌードマウスに移植して腫瘍を形成するか否かを検討した.FPC患者のポリープ6例,大腸癌1例,抹消血リンパ球2例について調べたところ,全例でAlu配列陽性の腫瘍が形成された.この中で癌遺伝子の存在が確かな2例につき詳しく解析した.rasを含む10種類の癌遺伝子を各々プローブとしたハイブリダイゼーションにより, 1例のポリープ由来癌遺伝子はN-rasであることがわかった.もう1例は抹消血リンパ球由来で,調べた癌遺伝子のどれとも反応せず,まだ調べていない既知の癌遺伝子か,新しい遺伝子と考えられる.現在, EMBL3ファージを用いてこの遺伝子のクローニングをおこなっている.最近, FPCの原因遺伝子が染色体の5番にあるらしいことが欧米で報告された.日本人のFPCでも同じ部位に異常があるか否かを調べるため,同じプローブを用いて検討した.11家系54名について調べたが,ヘテロになったのは1家系3名のみで,他はホモのため充分な解析ができなかった.結論を出すには更に多くのプローブ及び家系を集めて検討する必要がある.
バルプロ酸ナトリウムによる肝障害発症機序の検討

バルプロ酸ナトリウム(VPA)は治療スペクトラムが広く、てんかんの治療に頻用されている。VPAによる肝障害の機序は世界的に検討されてきた。今なお、明らかでなく、VPAのより安全な投与のためにはその解明は急務である。我々は、尿中アシルカルニチンが肝障害機序解明には重要な鍵になると考えて研究をしてきた。これまでの継続的研究の中で、バルプロイルカルニチンを含めたVPA代謝物のより詳細な検討が必要となってきた。今回VPAの種々の投与条件下すなわち、VPA通常投与、VPA単独大量投与、VPAとフェニトン(PHT)の併用、L-カルニチンの併用の5群での臨床検体を対象とした。これら群での肝ミトコンドリアにおけるβ酸化とマイクロゾームにおけるω酸化の状態、肝障害物質と考えられてる4-en-VPA、カルニチン値、およびバルプロイルカルニチン値との関係について検討をおこなった。今年度は、VPA大量+PHT併用群はVPA単独投与群に比して、GOT,GPT,LDH値の増加を認めた、VPA単剤大量群とVPA大量+PHT併用群における肝機能障害とβ、ω酸化の代謝産物、4-en-VPAとの関係について検討した。VPA大量+PHT併用群はVPA単剤大量群に比べ、血中VPA濃度は低値であり、総β酸化代謝産物、4-en-VPA、ω+(ω-1)酸化代謝物の濃度は減少していた。VPA大量+PHT併用群において、肝機能障害と4-en-VPA値とVPAにおけるβ酸化、ω酸化代謝産物には関連性は認められなかった。今回VPA大量+PHT併用群での肝機能障害とVPA代謝産物の比率において有意な関連性をみいだすことはできなかったが、この検討結果については、すでにEpilepsiaに報告した。今後もアシルカルニチンのさらに詳細な検討をし、VPAによる肝機能障害について検討を続ける予定である。