hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物ミトコンドリアの形態を維持する新奇メカニズムの解明

ミトコンドリアの形態はその機能と密接な関係にあり、その制御は植物における細胞の生理機能および個体の発生・環境応答にとって必要不可欠である。本研究では、ミトコンドリア外膜局在型GTPaseであるMIRO1が、voltage-dependent anion channnel (VDAC)をはじめとするミトコンドリア外膜局在タンパク質と相互作用していることを明らかにした。MIRO1の発現抑制株およびVDACの挿入変異株ではミトコンドリアの形態・植物の発生に異常が見られたことから、これらの相互作用はミトコンドリアの形態維持に重要な役割をもつことが示唆された。植物のミトコンドリアは粒状であり、その形態を維持することは胚発生や花粉管伸張など植物の発生・生殖過程を正常に進める上で極めて重要である。この維持にはMiroとよばれる、ほぼ全ての真核生物に存在するミトコンドリア局在型GTPaseによるミトコンドリアの形態制御が必要であるが、その具体的なメカニズムはこれまで全く不明であった。本研究では、シロイヌナズナMiroオーソログであるMIRO1に注目し、MIRO1がどのようなメカニズムによって植物ミトコンドリアの形態を維持・制御しているかを明らかにする。本年度の成果は以下の通りである。1)MIRO1ノックダウン植物の作成:MIRO1の遺伝子欠失(ノックアウト)は胚性致死であり、細胞生物学に基づく詳細な解析が困難である。MIRO1が植物ミトコンドリアの形態維持にどのような役割をもつかを明らかにするために、人工マイクロRNAによるMIRO1の遺伝子発現抑制(ノックダウン)を試みた。得られた形質転換植物ではMIRO1の転写産物およびタンパク質のいずれも顕著な蓄積の低下を示した。また色変換可能な蛍光タンパク質Kaedeによりミトコンドリアを可視化したところ、その形態に異常が見られた。2)MIRO1結合タンパク質の探索:MIRO1がどのような作用機序により植物ミトコンドリアの形態を維持しているかを明らかにするために、MIRO1と相互作用するタンパク質の探索を試みた。MIRO1細胞質ドメインをbaitとしてシロイヌナズナcDNAライブラリーに対しyeast two-hybrid法によるスクリーニングを行ったところ、複数の候補タンパク質を得ることができた。1)MIRO1ホモ多量体形成を介したミトコンドリア融合の可能性の検証:これまで多くの膜局在型GTPaseがホモ多量体形成を行うことでオルガネラ融合に寄与していることが示されている。しかし本研究でのyeast two-hybrid法による検証では、MIRO1同士の相互作用は見られなかった。MIRO1の2つのGTPaseドメインの系統解析から、両者はいずれもRas GTPase superfamilyに属するものであることが示唆されたため、MIRO1は他の低分子量GTPase同様、何らかのエフェクターを介して植物ミトコンドリアの形態維持に関わることが予想された。2)MIRO1結合タンパク質の探索と局在性・機能解析:1)の結果を受けてMIRO1と相互作用するタンパク質の探索を試みた。MIRO1細胞質ドメインをbaitとしてシロイヌナズナcDNAライブラリーに対しyeast two-hybrid法によるスクリーニングを行ったところ、ミトコンドリア外膜のチャネルタンパク質であるvoltage-dependent anion channel (VDAC)の複数のアイソフォーム、および植物に特異的な機能未知タンパク質2種が単離された。機能未知タンパク質についてGFPを用いて細胞内局在性を調べたところ、いずれもミトコンドリア外膜に局在することが示唆された。VDACのT-DNA挿入変異体では、ミトコンドリアの形態異常とロゼット葉の早期黄化が見られた。これらの表現型はMIRO1ノックダウン植物でも観察されていることから、両者は同一の経路で機能することが示唆された。このことから、MiroはVDACをはじめとする複数のタンパク質と相互作用することでミトコンドリアの外膜における物質透過性の制御に寄与しており、これらの欠失によりミトコンドリアの機能低下と形態異常が引き起こされるという可能性が考えられた。植物分子細胞生物学本年度はMIRO1ノックダウン植物のライン確立に成功し、今後の解析の基礎を得ることができた。また当初の計画よりも早くMIRO1結合タンパク質の候補を複数得ることができた。以上のことから、本年度は今後に向けて十分な実績を上げることができたと考えている。1)MIRO1ノックダウン植物におけるミトコンドリア動態の解析:次年度は、MIRO1ノックダウン植物を共焦点顕微鏡および電子顕微鏡観察などを用いて観察し、MIRO1ノックダウンによるミトコンドリアの構造・形態への影響を明らかにする。また蛍光タンパク質Kaedeを用いて、MIRO1ノックダウンによるミトコンドリアの形態変化(分裂および融合)・運動など動態への影響について明らかにする。2)MIRO

1結合タンパク質の同定と機能解析:次年度は、まず本年度のスクリーニングにより得られたMIRO1結合タンパク質の候補について、共免疫沈降法などによりその相互作用を検証する。同定できたタンパク質については、共焦点顕微鏡観察・細胞分画実験などにより細胞内局在を明らかにするとともに、ノックアウト・ノックダウン植物を得ることで、ミトコンドリアの形態維持における役割を明らかにする。本年度は、予定していた国際学会への参加の必要が無くなり、また予定よりもより効率良く期待された研究成果が得られたため、旅費および物品費に次年度使用額が生じた。次年度は、当初の予定よりも多くの国内外の学会・研究会に参加し研究成果の公表を行うため、旅費として使用する。またこれまでに得られた変異株について、当初の予定よりもより詳細な電子顕微鏡観察などを行うため、物品費として使用することを予定している。
デノボ設計による蛋白質構造機能相関の解明

NMR構造が解かれているデノボCro蛋白質のフォールディング変異体を作成し、構造物性について解析した。その結果、天然蛋白質の変性過程では、異なる二次構造(αヘリックスとβシート)が協同的かつ同時的に壊れるのに対して、デノボ蛋白質では、βシートだけが協同的に早く壊れ、αヘリックスはゆっくり非協同的に壊れた。また、フォールディング中間体が安定で非協同的な折りたたみ過程を示す変異体は、凝集体やアミロイドの形成能も高い、という傾向が示された。これらの結果から、天然蛋白質のアミノ酸配列が、分子進化の過程で協同的なフォールディング反応を獲得した理由は、それが直接蛋白質機能に結び付く、というよりも、細胞毒性の高いアミロイドや凝集体の形成を回避するためである、と結論した。天然蛋白質が示す立体構造や機能に関する特性は、ポリペプチドとしての高分子的性質と、進化の過程で選択された特定のアミノ酸配列が指定する生物学的性質の両者が複合したものである。したがって、天然蛋白質に関する研究だけでは、この両者を区別して議論することは困難である。そこで、我々が蛋白質について持っている知識を総動員して、"はじめから"蛋白質のアミノ酸配列をデザインし、合成・解析を行う研究、すなわち、「デノボ蛋白質設計」の手法が有効となる。本研究課題では、申請者がこれまで行ってきた蛋白質設計の研究成果を基盤にして、蛋白質の構造物性(とくに構造揺らぎ)と蛋白質機能の関係を解明することを目的として、複数の人工蛋白質の設計と合成、構造と機能の解析を行う。近年、多くの天然蛋白質の立体構造が次々に解明されている。一方、天然の蛋白質にとらわれない物理化学的な観点から、どのようなアミノ酸配列が天然様の構造物性を実現し、それがどの様に蛋白質機能に結びついているのかについては不明な点が多い。本研究では、デノボ設計の手法を用いて、進化による選択を受けていない人工蛋白質の合成と解析を行い、構造物性と蛋白質機能の関係の解明を目指す。本年度は、以下のような研究成果を得た。1.前年度までに設計と合成を行ったデノボ蛋白質sn4mは、NMR解析の結果、設計のターゲットとした天然λCroモノマー変異体の立体構造に良く似た溶液構造にフォールドすることが分かった。このデノボ蛋白質の構造ダイナミクスの情報を得るために、15Nラベルした試料を用いてNMR緩和の測定を行った。その結果、sn4m分子全体としては、天然λCroモノマーと同程度のダイナミクスを示したが、β構造部分に、緩和時間の小さな複数の残基が存在し、その領域に構造多様性があることが示唆された。従って、sn4mが、多くの天然蛋白質と異なり協同性の低い熱変性曲線を示すのは、β構造部分の構造多様性に原因があると考えられる。2.協同的なフォールディング反応を示すデノボ蛋白質を得るために、デノボCro蛋白質sn4mの疎水性コア変異体の作成を行った。得られた変異体の一つは、協同的な熱転移反応を示したが、塩酸グアニジンを用いて行った変性実験では、sn4mのそれと大きな違いを示さなかった。sn4mとその変異体を用いて、結晶のスクリーニング実験を行い、低分解能のX線回折を示す単結晶を得た。近年、多くの天然蛋白質の立体構造が次々に解明されているが、天然の蛋白質にとらわれない物理化学的な観点から、どのようなアミノ酸配列が天然様の構造物性を実現し、それがどの様に蛋白質機能に結びついているのかについては不明な点が多い。本年度は、天然には存在しない新規フォールドをもつ人工蛋白質の設計と合成を試みた。新規フォールドは、λファージ由来Cro蛋白質(λCro)のモノマー変異体の溶液構造を基にして、そのN末からC末への主鎖トレースを、新規構造ではC末からN末への主鎖トレースとなるように書き換えて作成した。具体的には、まず、λCroモノマーのNMR構造情報をもとに各原子間の距離情報を抽出した。得られた距離情報を、λCroモノマーの逆アミノ酸配列に当てはめ、simulated annealingを実行した。得られた構造それぞれを、amber等の分子力場を用いた分子力学計算により緩和させ、その平均構造を最終構造として出力した。このようにして得られた新規構造をターゲットとして、これまでに申請者らが開発した、経験ポテンシャル関数による分子設計法を適用して、新規のアミノ酸配列の設計を行った。

計算に組成等の制限を入れずに、目的の立体構造とポテンシャル関数のみを使って得られた配列をコードする人工遺伝子を合成し、大腸菌に導入して発現させた。得られた人工蛋白質の構造をCDやNMRを使って解析した結果、二次構造含量について、目的とした立体構造に対して期待される値より小さく、構造決定に必要な単一な立体構造を形成していないことが判明した。(1)二次構造としてαヘリックスとβシートの両方をもつデノボCro蛋白質のフォールディング特性を円二色性(CD)と赤外(IR)分光法を用いて解析した。その結果、天然蛋白質では異なる二次構造がその変性過程において同時に協同的に壊れるのに対して、NMR構造が解かれているデノボCro蛋白質では、βシートだけが協同的に早く壊れ、αヘリックスは非協同的にゆっくり壊れることが明らかになった。また一般的なアミロイドの二次構造はβシートからなることが知られているが、デノボCro蛋白質は、αヘリックスをその構造の一部として保持しつつ、顕著なアミロイド形成能を示すことが明らかになった。(2)天然には存在しない蛋白質の新規構造をターゲットとして、アミノ酸組成について拘束条件を設定し、アミノ酸配列の最適化計算を行った。良好な立体構造モデルが得られた複数の設計配列とその変異体を合成し、CDとNMRにより、構造物性の測定を行った。塩基性の等電点と天然蛋白質程度の大き過ぎない平均残基分子量の組成制限は、立体構造形成に有効であった。しかし、今年度得られたた試料の中で最も二次構造含量の高いものでさえ、モルテングロビュール状の物性を示し、詳細な立体構造解析に耐えられるものでは無かった。そこで、設計に使用したものとは異なるポテンシャル関数と最適化法を用いて、大量の計算配列の構造予測を行い、天然様のコンパクトな立体構造に折り畳まれると予想される配列の検索を行い、初期の設計配列のスコア値では100位以下であった複数の配列が、良好な折りたたみ可能性を示すことが示唆された。(1)アミロイド形成能の高い天然タンパク質の一部に、酸化還元成分としてヘムを結合する人工タンパク質を付加することにより、ナノサイズの導電体であるナノワイヤーの合成を試みた。具体的には、均一で規則的な構造をもつアミロイドを形成することが知られているウシ由来ホスファチジルイノシトール-3'-キナーゼのSH3ドメイン(PI3-SH3)と4本ヘリックスバンドルを形成して複数のヘムを結合するポリペプチド(bHH)をN末からC末方向にタンデムに並べた新規人工タンパク質の設計と合成を行った。合成されたポリペプチドは、中性pHのバッファー中で、設計通りのヘリックス含量をもつタンパク質に折り畳まれた。この試料をpHジャンプにより酸性条件下に移すと、ヘリックスは速やかに壊れ、徐々にβシート構造を形成した。この試料にチオフラビンT(ThT)を加えて蛍光測定を行ったところ、アミロイドの形成を示す蛍光強度の増加が確認された。この試料を再度中性に戻し、ヘムを添加したところ、ヘムの特異的結合を示す可視光吸収スペクトルとヘリックスの再形成を示すCDスペクトルの変化が観察された。(2)新規機能性分子の合成を容易にすることを目的として、抗生物質の生産に利用されるN-terminal nucleophile (Ntn) hydrolaseの研究を開始した。Ntn hydrolaseの一つであるセファロスポリンアシラーゼ(CA)の結晶構造をもとに、多数のCA変異体と複数の基質分子とのドッキングシミュレーションを行った。
大規模ニューラルネットワークの追加学習性に関する研究

大規模ニューラルネットワークの追加学習性に関する研究を行ってきた.追加学習には,新しいカテゴリーが発生した場合の追加学習(以下,カテゴリー追加学習と呼ぶ)と学習済みカテゴリーに対する知識修正のための追加学習(以下,知識修正追加学習と呼ぶ)がある.カテゴリー追加学習については、我々が過去に提案している"Honeycombネット"にその能力があることが判明し,実験を通し明らかにした(研究発表2番参照).知識修正追加学習については,新たに"HoneycombネットIII"を提案した."HoneycombネットIIIは3層構造のニューラルネットワークであり,1層目と2層目にベクトル量子化型ネットワークを配置することにより、追加学習能力を実現している.HoneycombネットIIIに関する研究成果は,すでに電子情報通信学会に論文を投稿し,条件付き採録となっている.上記の研究を通し,ニューラルネットワークの追加学習が手書き漢字用マルチテンプレート認識辞書に適用可能であることが明らかになった.「手書き漢字用マルチテンプレート辞書の調整法(研究発表1番参照)は,その成果をまとめたものである.さらに電子情報通信学会に「手書き文字認識における個人辞書の作成法」を投稿し,条件付き採録となっている.これもニューラルネットワークの追加学習を適用したものである.大規模ニューラルネットワークの追加学習性に関する研究を行ってきた.追加学習には,新しいカテゴリーが発生した場合の追加学習(以下,カテゴリー追加学習と呼ぶ)と学習済みカテゴリーに対する知識修正のための追加学習(以下,知識修正追加学習と呼ぶ)がある.カテゴリー追加学習については、我々が過去に提案している"Honeycombネット"にその能力があることが判明し,実験を通し明らかにした(研究発表2番参照).知識修正追加学習については,新たに"HoneycombネットIII"を提案した."HoneycombネットIIIは3層構造のニューラルネットワークであり,1層目と2層目にベクトル量子化型ネットワークを配置することにより、追加学習能力を実現している.HoneycombネットIIIに関する研究成果は,すでに電子情報通信学会に論文を投稿し,条件付き採録となっている.上記の研究を通し,ニューラルネットワークの追加学習が手書き漢字用マルチテンプレート認識辞書に適用可能であることが明らかになった.「手書き漢字用マルチテンプレート辞書の調整法(研究発表1番参照)は,その成果をまとめたものである.さらに電子情報通信学会に「手書き文字認識における個人辞書の作成法」を投稿し,条件付き採録となっている.これもニューラルネットワークの追加学習を適用したものである.
宿主細胞内シグナル伝達に着目したウイル感染対策基盤

ウイルス感染症は科学技術が進歩した現代でも人類最大の脅威の一つであり、2009年に世間を震撼させた新型インフルエンザパンデミックは記憶に新しい。我々はイメージングを用いたシグナル伝達研究の過程で、エンドゾームにおいてRasと結合したPI3Kが、エンドサイトーシス制御に重要な役割を担うことを明らかにした。本研究では、Ras-PI3Kシグナルがインフルエンザウイルス感染に重要なこと、また細胞内カルシウムがインフルエンザウイルス感染過程を制御するキーとなる分子であることを明らかにした。これらの成果の応用による宿主細胞因子を標的とする新概念のウイルス感染抑制法確立も期待される。研究開始時までに、インフルエンザウイルスエントリーには、Ras-PI3Kの結合とその上流因子としての細胞内カルシウムシグナル、およびRhoファミリーGタンパク質群が関与することが明らかになっていた。本年度には、これら個々のシグナル伝達要素活性化・不活性化の分子機構を、生化学的実験とGFPやFRETを用いた蛍光バイオイメージング手法により時空間的に解析した。その結果、ウイルス感染により宿主細胞内カルシウム濃度が上昇し、その下流で低分子量GTP結合タンパク質RhoAが活性化、さらにその下流で再びカルシウム濃度が上昇するという循環したシグナルによって、Ras-PI3Kシグナルが活性化されることを突き止めた。また、これらRhoAによるカルシウム上昇には、ROCK-PIP5K-PLCが関与することを明らかにした。特にROCKについては、RhoAの下流因子でアクチンストレスファイバーの形成に関与するキナーゼとして知られていたが、ウイルス感染時にはROCKのキナーゼ活性はむしろ負に機能しており、カルシウムシグナルに対する正の制御ではRhoAとPIP5Kを橋渡しするアダプター分子として機能していることが新規に同定された。これらの成果は、ウイルス侵入において重要な鍵であるカルシウムシグナルを標的としたウイルス感染対策基盤への発展が期待される。一方、PI3KのRas結合領域には他の標的因子には無い特徴的なアミノ酸配列が存在し、この配列がRas-PI3K複合体のエンドゾーム移行およびエンドサイトーシス制御に重要であることを見出していた。本年度はこの配列を実際のペプチド製剤として応用可能な長さまでに削り込むことに成功した。具体的には、上記アミノ酸配列を10アミノ酸ずつに分割したペプチドを培養細胞に発現させ、中央の10アミノ酸がウイルス感染抑制効果に必要十分であることを明らかにした。ウイルス感染症は科学技術が進歩した現代でも人類最大の脅威の一つである。さらに継続した研究の結果、インフルエンザウイルスがこの制御下にあるエンドサイトーシス介して細胞に取り込まれることも明らかとなった。本研究は、これらの成果を発展させウイルス感染によって活性化される細胞内シグナル伝達機構、すなわちウイルスに対する細胞側の「受容シグナルネットワーク」を解明することを目的として行われた。受容シグナルネットワークの解明:本年度の研究により、当初の目標であったインフルエンザウイルスの「受容シグナルネットワーク」として、細胞内カルシウムイオンを中心とし、RhoA-ROCK-PIP5K-PLCからなる経路を同定した。当該研究成果はNature Communication誌に公表した。また、さらに研究を継続した結果、「インフルエンザウイルスの受容体」に該当する分子の同定にも至った。生化学的な手法によるウイルス粒子と当該因子の直接結合は確認済みである。さらに、当該因子には機能阻害薬存在し、この薬剤により、ウイルス粒子の細胞内取り込みと感染が抑制された。現在は本成果を学術雑誌に投稿するため最終的な検討に入っている。新規エンドサイトーシス制御因子の探索:昨年度までに、ウイルス感染とエンドサイトーシスを抑制するPI3K由来のペプチドを同定した。本年度は、本ペプチドの結合因子を酵母ツーハイブリッド法と免疫共沈ー質量分析法で探索した。その結果、20数種の結合因子群の同定に至った。このうち5因子については、生化学的な手法でPI3K都の結合を確認し、エンドゾームに局在することを確認した。今後はそれら因子の機能解析を行う予定である。昨年度までにRas-PI3Kの結合とその上流因子である細胞内Caに加え、RhoファミリーGタンパク質群や複数のフォスフォイノシタイドがウイルス感染を制御するシグナルネットワークに関与するというデータが蓄積されていた。本年度は、これら個々のシグナル伝達要素活性化・不活性化の分子機構を、ウエスタンブロッティングなどの生化学的実験とGFPやFRETを用いた蛍光バイオイメージング手法により時空間的に解明した。その結果、それぞれの詳細な機能連関についても理解が進み、ウイルス感染に惹起される「シグナルネットワーク」とも呼べるシステムの全貌を明らかにする事が出来た。本研究成果は学術雑誌に論文を投稿中である。また、上記の研究から派生し、上記シグナルネットワークに関連する細胞表面分子群を新たに同定した。これら因子群の絞り込みの結果、ウイルス受容システムのトリガーとなりうる細胞表面分子の候補になる、あるファミリー分子群の発見に至った。

実際この分子は細胞膜タンパク質であり、かつ細胞外部分がシアル化されることも確認済みである。すなわち、本分子は複数存在する細胞側ウイルス粒子結合タンパク質の中にも、感染のキーとなる最重要分子である可能性が高く、本年度の計画通り、当該因子の同定を達成したといえる。一方、新規エンドサイトーシス制御因子の探索として、PI3K上に存在し、ウイルス感染およびエンドサイトーシス抑制効果のあるペプチドについて、その結合タンパク質のスクリーニングに着手し、2つの独立したスクリーニング系を確立した。インフルエンザウイルスの細胞内侵入に重要なシグナルネットワークの全貌を予定通りの期間に解明し、現在その成果をEMBO Journalに投稿しrevise中である。Ras-PI3Kのエンドゾームに移行に必要なPI3K特異的配列からエンドサイトーシスとウイルス感染の抑制に必要十分な配列を同定した。今回達成したペプチド長は実用化可能な短さであることから、当初の目的を達している。25年度が最終年度であるため、記入しない。上記3つの研究項目のうち、前者2つについては当初の計画通りまたはそれ以上の進展であった。第3項目については、年度内に候補因子のリストアップを終了予定であったが、現在リストアップをしている段階である。1ヶ月ほど予定より遅れているものの、全体研究期間からみると大きな影響の出る遅れではない。インフルエンザウイルスの細胞内侵入の重要な鍵であるカルシウムシグナルを標的としたウイルス感染対策基盤への発展が期待されるものの、カルシウム自身は正常細胞のホメオスタシスに重要であるため、標的とすることは現実的ではない。そこで、インフルエンザウイルスがカルシウム上昇を惹起するメカニズムを明らかにする。また、PI3K由来ペプチドについては、今年度同定した必要十分なペプチドにポリリジン等の細胞内移行シグナルを付加し、実際の細胞での感染抑制効果を検討すると主に、ヒト培養細胞でのTwo-hybridスクリーニング系を導入し、結合因子群の同定を行う。研究は概ね当初の計画通り進んでおり、ウイルス粒子認識タンパク質群についてはファミリー分子群から最重要分子の絞り込みを行った後、機能解析を行う。エンドサイトーシス制御因子についてはスクリーニングの後、候補因子群の確認と絞り込みを行い、それぞれの因子について個別に機能解析を行う予定である。
貝殻形成制御による高品質真珠の産出率向上

貝殻形成または形成される貝殻層の別には、外套膜で発現する遺伝子が大きく影響することが知られている。また、これまでに高品質真珠を産出したアコヤガイ母貝の真珠袋では、真珠品質の低下原因となる稜柱層形成にかかわる遺伝子群の発現が、低品質真珠のそれと比較し有意に低いことが明らかになった。そこで、本研究は、RNA干渉技術を応用して人為的にアコヤガイ稜柱層形成の遺伝子群の発現を抑制することにより、高品質真珠産出率の増大を目指した。現在までに、アコヤガイ生体内において、特定の遺伝子群(とくには稜柱層形成の遺伝子群)の発現を抑制するRNA干渉技術を確立した。具体的には、外套膜におけるaspein、msi31およびprismalin-14遺伝子の発現を、dsRNAを閉殻筋に注射することにより、有意に抑制することができた。また、貝殻の詳細なSEM観察を行った結果、上記遺伝子発現の抑制が見られた個体では、外套膜による貝殻形成が阻害されていることが明らかになった。すなわち、生体内において真珠品質の低下原因となる稜柱層の形成を阻害することに成功した。これらの技術を応用すれば、たとえば真珠を形成している真珠袋での稜柱層形成遺伝子の発現を、dsRNAの閉殻筋への注射で抑制できる可能性があり、その結果、真珠晶質低下の原因である稜柱層の形成を阻害できる可能性がある、,今後は、実際に核を挿核したアコヤガイ母貝について、dsRNAを注射したのち飼育を行い、真珠袋での遺伝子発現を計測するとともに、産出される真珠品質についての詳細な調査が必要である。
農業ロボット用走行装置の研究

本研究では軟弱地盤や一般畑地に適応する農業ロボット用走行装置開発ための基礎的な知見を得るため走行性能、旋回性能などの基本的性能に着目して新たな走行装置形態を提案することを目的としている。そこで、文献調査、車両の試作、実験による性能評価を行った。試作した車両の特徴は、畦や障害物などの乗越えの際にも車両上部のプラットフォームを水平に保ち、かつ走行路面の凹凸を吸収し鉛直方向への変動を抑えることである。そこで、文献調査や考案車両の机上での検討を行った結果、3車軸6輪をベースとした1/3スケール車両を開発した。車両前部に設置した超音波センサが路面高さの変化を検知する。各車輪は空気圧シリンダによって上下方向への移動が可能で、これら車輪の高さを超音波センサの信号をもとに制御することによって乗越えや路面凹凸の吸収を行う。また、車輪の上下動作に伴う前後方向への車体の傾斜を回避するために車体内部に移動パレットを設置し重心位置の積極的な移動を行った。車輪の位置制御には不感帯をもつオン/オフ制御を採用し、この不感帯幅は予備実験より決定した。車両の乗越え性能を評価するため、幅1800[mm]、長さ2100[mm]、高さが100、180、210[mm]の障害物を製作しこれを畦と見立てて乗り越え実験を行った。その結果、車両はいずれの高さの畦も円滑に乗越えることができた。プラットフォームの水平の程度はピッチ角センサの出力値を定量的に評価する方法で行ったが、車体各部の動作に起因する衝撃が出力値にも現れており、適切な信号処理を行う必要があることが判明した。また、超音波センサの信号は畦の前端および終端を検知し、そのときの検出高さを制御に利用しているだけであるが、路面の変化状況に対応した乗越え動作を行うには路面までの距離を連続的に計測しつつ車輪位置の制御を行う必要があることは当然である。さらに、車輪に作用する荷重に耐えられずに車体の一部が沈下することによる車体の傾斜が観察されるが、これは車体を支える空気圧シリンダが発生する力が十分でないことを示しており、圧搾空気を常に高圧に保持することや空気圧シリンダの受圧面積を増加させるなどの対策が必要であることが明らかとなった。本年度は,走行装置の形態決定を目標に以下の項目を実施した.・走行装置の基本性能の現状調査と分析これまでに開発された各種走行装置の乗り越え性能と旋回性能の観点から過去の文献資料等により調査し,屋外作業を主とする農業ロボット用として有効と考えられる新たな走行装置形態の候補を検討した.その結果,車両の最低地上高を大にするような走行装置支持部をもつ履帯型装置とタイヤ型装置,さらに軟弱地に威力を発揮すると考えられる可動ラグ型剛体車輪装置を選択した.・走行装置の数値シミュレーション用プログラムの準備走行装置形態案のいくつかについて,ワークステーションを利用した数値シミュレーションにより乗り越え性能と旋回性能を計算することを試みるため;

a)走行装置の対象となる土を第1近似として剛体で置き換えることで乗り越え機構のみに着目した力学解析,b)土との接触部分の影響を単純化する旋回性能解析,c)軟弱土を剛塑性体と仮定して土の変形を考慮する剛塑性有限要素解析のためのプログラムを開発した.本年度は目標としている性能を得るための理想的な形態を昨年度の研究成果をもとに検討し,新走行装置模型の具体的な設計を行なった.新走行装置模型の形状は3車軸6輪の形態とすること,それぞれの駆動輪の動力は直流モーターを採用することなどを決定し,当初の目標である畔の乗り越えをスムーズに行うため,圃場の凹凸に合わせて各車輪を空気圧シリンダを用いて上下方向に制御し車体の安全を保つ.また,圃場を荒らすことなく旋回するために6輪中4輪の駆動輪はそれぞれ独立に回転数を設定できるようにする.以上の制御は車載のコンピュータによって集中的に行う.コンピュータへの各センサー(駆動トルク,回転数など車両運動の基本的な制御に必要なもの)からの信号はA/D変換ボードによってデジタル値に変換し,コンピュータ内で各種演算を行なう.その結果得られた値はD/A変換ボードによってアナログ値に再度変換され,アクチュエータを駆動する.新走行装置模型への電力供給は,モーターについては専用バッテリ-を車両に搭載し、コンピュータなど弱電部分は当面商用電源を有線で供給するが、バッテリ-からDC/ACインバータ-によって供給することも併せて検討する.さらにシャシ-など車両の主構造はアルミ鋼材を用いることで車体全体の重量の軽量化を図る.また,主要設備であるシグナルコンディショナ-の性能を確認するため,既存のトラクタを用いて,けん引力や駆動トルクなどの計測を実施しその性能を評価した.農業ロボット用走行装置が具備すべき条件として、(1)走行装置上部のプラットフォームは不整地走行でも常に水平状態を保ち、農業ロボットとしての高い作業効率と作業精度を保持する、(2)旋回時に車輪の横滑りや縦滑りにって地表面を乱さない、(3)化石燃料の使用を極力抑え、環境問題に配慮する、(4)可能な限り計量であること、(5)複雑な機構を持たず、安価であること、などを挙げ、設計、試作、障害物乗り越え実験を行った。開発した走行装置は、3車軸6輪をベースにした三分の一モデル車両で、物理的な車軸は存在せず、前方左右車輪と後方左右車輪は全て独自に電気モーターを装着し、独立して駆動される。また、6輪とも空気圧シリンダによって独立して上下に移動することができる。中間の左右車輪は操舵用のもので、旋回の場合は前方あるいは後方の車輪を上げ、小型電気モーターによって独立して最適実舵角に設定される。車両前部に設置した超音波センサが路面の高さの変化を検出すると、その信号に基づいてシーケンシャルに各車輪の高さをコンピュータ制御する。この車輪の位置制御は空気圧切換弁のオンオフ制御で行った。また、車輪の上下移動に伴う前後方向への車体の傾斜を回避するために、バッテリやコンプレッサを搭載したパレットを前後に移動させて車両の重心位置を積極的に移動させた。本機の障害物乗り越え性能を進行方向の側方から見た断面が矩形状の高さ10・18・21cmの段差乗り越え実験によって評価した。実験の結果、車両はいずれの高さの段差もスムーズに乗り越えることができた。高さ検出超音波センサ、ピッチ角センサやロール角センサの特性、空気圧シリンダの容量、フィードフォワード制御の問題点など、今後解決しなければならない課題がいくつか発生したが、過去に例のないユニークな車両が開発されたと評価している。
芸術表現教育に関する基礎的研究:幼・小・中の系統的音楽学習プログラムの開発

「芸術表現教育」という観点から系統的な学習プログラムを開発・展開するための基礎研究である本研究は、幼稚園や学校現場と大学、すなわち実践者と研究者が協働し、相互交流を図りながらプログラム開発のための理論的枠組みを構築した点に特色がある。本研究では、フィールドワークや実証的研究と結んで理論研究を深化、発展させるとともに、幼稚園や学校現場と連携し、事例分析・授業研究を通してプログラム開発の方向性や課題的視点を明確化した。平成17年度は、研究の一環として、立教女学院短期大学において「芸術表現教育フォーラム子ども・遊び・アート」(12月17日)を開催し、佐藤学氏(東京大学)と河邉貴子氏(立教女学院短期大学)による基調対談と三つの分科会を通して、子どもの表現をどうとらえはぐくむかという根本問題を中心に、幼児の表現や障害をもつ子どもの自己表現、音楽科における創造的活動などについて、事例を介した実践的な協議を行った。このフォーラムを機に「芸術表現教育研究会」を立ち上げ、フォーラム等を通して明らかになった問題点や課題を踏まえつつ、学習指導要領改訂の動向なども視野に入れながら、平成18年度は子どものイメージや創造性をはぐくむための実践研究を推進した。東京藝術大学で開催された研究発表会(12月16日)では、幼児期のイメージのとらえ方や学校音楽における「つくって表現する活動」の在り方を再考する視点、「能」を窓口にした日本音楽における「わざ」の習得過程に学ぶものなど、多様な視点から芸術表現教育を実践的にとらえ直す方向性や課題について、その研究成果を明らかにした。音楽という営みが本来もっている創造性や総合性が生きる学習プログラム開発のための基礎的研究である本研究は、幼稚園から小・中学校までのスパーンを視野に入れた系統的な学習プログラムづくりである点、幼稚園・学校現場と大学が協働で構想・開発することなどが特色である。そのための基盤づくりとなった17年度は、学校現場との研究交流という点では、幼稚園と小学校において大きな成果を得ることができた。主に幼稚園でフィールドワークを展開する研究分担者の今川は、日常表現と音楽表現との関係性、とりわけ「声」と「音遊び」に着目し、それらが生きるプログラムの開発に取り組んでいる。幼・小をどう関連させ結び付けていくかが今後の課題である。研究協力を呼びかけた小学校の中では、和歌山大学教育学部附属小学校の江田司教諭による言葉・動き・音楽を結び付けた音楽づくりの学習プログラムが際立っている。子どものもっている様々なイメージを音・音楽へ収斂させていこうとするこのプログラムは、まだまだ改善の余地は残されているが、創造的な音楽学習の概念を広げる可能性をもつものとして高く評価できる。平成17年12月17日には、本研究の一環として、立教女学院短期大学において「芸術表現教育フォーラム子ども・遊び・アート」(12月17日)を開催した。佐藤学氏(東京大学)と河邉貴子氏(立教女学院短期大学)による基調対談では、子どもの表現をどうとらえはぐくむかという根本問題が事例を通して具体的に議論され、「幼児からの発信」「障害をもつ子どもの音を介した自己表現」「音楽をつくる」をテーマに取り上げた各分科会では、発表者とフロアの間で活発な意見交換が行われた。このフォーラム等を通して明らかになった問題点や課題を踏まえて、今年度具体化までには至らなかったプログラムモデルを来年度早々に構築し、検証・再構成することが焦眉の課題である。本研究は、幼稚園から小・中学校までを視野に入れた、系統的な音楽学習プログラムを開発するための基礎研究であり、実践者と研究者の協働が大きな特色である。17年度は、「芸術表現教育フォーラム子ども・遊び・アート」を開催し、子どもの表現をどうとらえはぐくむかという根本問題を軸に、「幼児からの発信」「障害をもつ子どもの音を介した自己表現」「音楽をつくる」といったテーマについて議論を深め、その成果や課題を引き継いだ18年度は、実践研究の視点を一層焦点化するために、「創造性とイメージ」をテーマに研究会を開催した。

そこでは、幼児の音楽活動における創造性とイメージに関する発表、インタビュー調査等を通して音楽科教育における創造性を問い直した発表、能における「わざ」の習得過程を分析・検討した発表、「つくって表現」の内容の系統性及び音楽的な質の問題を追究した発表が行われた。幼児の日常表現と音楽表現との関係性、とりわけ「声」と「音遊び」に着目したグループは、それらが生きる学習プログラム開発のための基礎研究として理論構築と事例研究に取り組んだ。日本の伝統音楽の中から能楽を対象としたグループは、今日的視点及び歴史的文脈からわざの習得過程を理論面、実践面より明らかにした。「つくって表現」のグループは、実践現場の意識や指導の状況を調査研究するとともに、教科書の分析・検討を通して、学習プログラムの方向性を探究した。17年度から継続している江田司教諭(和歌山大学教育学部附属小)との共同実践研究では、言葉・動き・音楽を結び付けた学習プログラムの再構成に取り組み、モデル授業の検証を行った。子どものもつ様々なイメージを音・音楽へ収斂させようとするこのプログラムは、確かに改善の余地や課題も少なくはないが、表現・鑑賞活動における創造性の育ち、系統的な表現教育への可能性を拓くものである。
1970年代以降における科学社会学派の歴史的・包括的研究

本研究は1970年代以降の科学社会学、科学哲学、科学史を総合した「科学論」の展開を通覧することを試みた。特に社会構成主義という立場を視座にして、ここ30年ほどの英米圏を中心にした科学論史を鳥瞰した。その過程で、より細かい概念として、SSKとか、STSといった領域群を特定し、その成立過程や領域の特徴を探った。1980年代にその最盛期を迎えたSSKは激しい科学批判を展開し、認識論的にもかなり極端な相対主義を顕揚した運動だった。それは、80年代当時としてはポストモダニズムなどの背景とも絡み合い、一定の歴史的役割を果たした。だが、その極端な相対主義は、科学批判を単なる蒙昧主義的な反科学と混同せしめるという負の帰結も生んだ。そのため1990年代には科学者陣営から激しい反発を招き、それは1994年頃から数年間にわたって、特にアメリカで「サイエンス・ウォーズ」という、極めて激しい論争となって奔出した。本研究では、その論争をその理論的背景ともども詳しく分析することが出来た。その最大の成果が拙著『サイエンス・ウォーズ』である。なお、その後、科学論は自らの反省を深め、現在、理論的にはやや停滞期にある。だが、地球温暖化、GMO、原発、エイズなど、科学技術に関連してそこからでてくる社会問題は今度ますます重要性を増していく、というのは、あまりに明らかである。科学論は、単純な相対主義的言辞を弄してそれで自己満足するというのではなく、科学と社会との新たな関係を模索しながら、自分の理論装置を錬磨していく必要がある。本研究では、ここ30年あまりの歴史的地図を描くことで、その理論的趨勢の歴史的必然性を浮き彫りにすることが出来た、と自負している。本研究は1970年代以降の英米系を中心とした科学社会学派の歴史的な研究を主軸とする。科学社会学は1970年代以降、いわゆるコロンビア学派として知られていたロバート・マートンを中心とした外在的な科学社会学的研究、つまり研究者の報償体系の分析や制度的分析、ピアレヴューなどのシステム分析などという話題を中心とするものから、大きく内容を変えて展開を遂げた。それは一言でいうなら、従来の外在的な社会学的研究から、より一歩踏み込み、実際の科学理論が社会的文脈や文化的文脈に影響を受けて、その内容自身にまで変化をこうむるという可能性に着目し、後は個別事例に即して、いったいどのような社会外圧のもとで特定の科学理論が構成されていくのかを調べる、いわゆる「科学知識の社会学」(SSK)の展開をみた。それはその後、より広範な社会的文脈のなかでの科学理論の位置付けをめぐる「科学・技術・社会論」(STS)にさらなる発展をとげて現在に至っている。研究初年度の本年は、以上のような背景のなかで、現代科学論が必然的に科学理論内部にまで踏み込んだ分析を行い、それによって従来の科学者にとっては古典的な発想である実在論や実証主義さえも否定するような流れがあるという事実をまずは確認した。そしてそれに対する科学者の側からの激しい反発(サイエンス・ウォーズ)を詳しく分析した。また現代科学のなかで社会的、経済的にだけでなく、知識論一般からみて極めて興味深い事例として分子生物学をとりあげ、特にその組換えDNA技術の規制をめぐる史的分析をした。初年度の作業としてはかなり順調な仕上がりを実現をすることができたと思う。本研究は1970年以降の英米系を中心とした科学社会学派の歴史的な研究を主軸とする。

科学社会学は1970年代以降、いわゆるコロンビア学派として知られていたロバートマートンを中心とした外在的な科学社会学的研究、つまり研究者の報償体系の分析や制度的分析、ピアレビューなどのシステム分析などという話題を中心とするものから、大きくないようを変えた展開を遂げた。一言でいうなら、それは従来の外在的な社会学的研究から、よりー歩踏み込んで、実際の科学理論が社会的文脈や文化的文脈に影響を受けて、その内容自身にまで変化を被るという可能性に着目し、個別事例に即しながら、どのような社会外圧の下で特定の科学理論が構成されていくかを調べる流れを主とするものになった。それは普通、「科学知識の社会学](SSK)といわれ、80年代に最盛期を迎えた。ただしSSKは90年代に入ると若干停滞し、現在徐々に撤退しつつある。その代わりに「科学・技術・社会論」(STS)という潮流が台頭しつつある。本年度は上記の基本的認識にたち、そのなかでも特に二つのテーマに的を絞った研究をした。まずは、単なる科学的認識だげでは覆い尽くせない環境問題一般をめぐる、社会学的、政治学的な問題の分析。その際特に80年代アメリカで激しい活動を展開したラディカル派環境アクティヴィズムの一種、アースファーストの活動をめぐる詳細な分析をした。次に現代医療がはらむ暗黙の政治性を、産婦人科学という科学のなかに剔抉することを試みる、一種の「身体の政治学]論。その両者ともに巨大な問題系であるだけに本年度の成果は起動的なものにすぎないが、今後一層その深化をはかるつもりである。本研究は1970年以降の英米系を中心とした科学社会学派の歴史的な研究を主軸とする。科学社会学の動向は70年代後半から80年代にかけて急速な展開を示した「科学知識の社会学」SSkによって代表することができる。それは、科学者だけでなく、科学者が展開する科学理論や科学的概念までをも歴史的、文化的に文脈づけるという相対主義的傾向を強くもっていたため、90年代に入ると科学者の側からの強い反発を招いた。その反発と、科学論者側からの反批判は、90年代なかば、数年にわたってアメリカ知識界を震憾させた。その激論のことを、ややジャーナリスティックにサイエンス・ウォーズと呼ぶ。拙著『サイエンス・ウォーズ』は、その論争の委細顛末と、それの理論的背景となったSSKの通史をえがき、なおかつ、私なりに科学論の伝統をふまえて三つのケーススタディをあげるというものだった。幸運にも山崎賞とサントリー学芸賞を受賞できた。そのときの勉強の副次的な産物が井山弘幸氏との共著『現代科学論』である。このように、本年は過去数年にわたる研究の成果が形になって現れた年だった。次には、『サイエンス・ウォーズ』のなかで取り上げた遺伝子工学、身体の政治学、環境問題という相互に比較的独立した問題系のなかから、特に最初の遺伝子工学を巡る科学論的な分析を行いたい。本研究最終年度は特に昨年6月のゲノム解読を受けて、ゲノム解読以降の社会に固有に成立する諸問題に関する倫理的、社会的問題分析を遂行したい。それは、科学社会学の歴史というような問題構制より、特化し、深化した問題意識によるものである。本研究は1970年代以降の科学社会学、科学哲学、科学史を総合した「科学論」の展開を通覧することを試みた。特に社会構成主義という立場を視座にして、ここ30年ほどの英米圏を中心にした科学論史を通覧した。その過程で、より細かい概念としてSSKとか、STSといった領域群の特徴を探った。
PEG脂質を介した低分子抗体の細胞膜表面修飾による細胞選択的接着の向上

従来の薬物治療と同様に、細胞治療においてもDrug Delivery Systemの概念に基づく治療法の開発が有効である。まず、低分子抗体をリガンドとして細胞膜表面に修飾する方法を開発した。E-selectinに対するscFvにアジドフェニルアラニンを導入し、DBCO-PEG-DSPEとの結合体を作製した。その結合体を含む培地中で間葉系幹細胞(MSC)をインキュベーションすることで、MSCにscFvを修飾することができた。細胞に修飾されたscFvはE-selectinとの結合能を保持していた。さらに、scFv修飾により、流れ場におけるMSCのHUVECへの接着を向上させることができた。本研究の目的は低分子抗体を細胞に修飾することで、その細胞と標的細胞との接着を増強させることである。まず、mCherryに対する低分子抗体VHHを用いて、アジドフェニルアラニン(Az-F)を導入するベクターの構築を行った。可溶化および精製を目的にGSTtagを導入し、さらにGSTtagの切り出しを目的にGSTtagとVHHの間にTEV protease切断配列を挿入したが、切断効率が極めて悪く十分なタンパク質量が得られなかった。そこで、TEV proteaseの前後にリンカー配列を挿入すると切断効率を向上できた。この他にも、Az-F導入低分子抗体を十分量得るための最適化、得られた抗体の安定化を確立するのに時間を要したため、次年度に使用する予定の接着分子を標的とする低分子抗体の作製に着手した。配列の入手が可能な接着分子E-selectinに対するscFvに対して上記の方法を応用してベクターを作製し、十分なAz-scFvを得られる方法を確立した。得られたAz-scFvまたはscFvとアジド基と結合するDBCOを結合させたTexas-redを混合して電気泳動したところ、Az-csFvの位置に蛍光のシグナルは認められたが、scFvの位置には認められなかったことから導入したアジド基が反応活性を有することを確認した。Az-scFvとDBCO-PEG-DSPEを結合させて得られたscFv-PEG-DSPEを間葉系幹細胞(hMSC)に添加し、さらにFITC標識したE-selectinを添加したところ、細胞膜上に蛍光シグナルが確認できた。さらに、未修飾のMSCにFITC標識E-selectinを添加した場合にはほとんど蛍光シグナルが認められなかった。以上、本年度は、scFv-PEG-DSPEを作製し、これを用いて細胞膜表面に導入されたscFvがE-selectinと結合できることを確認できた。十分な量の低分子抗体を安定な状態で得るための条件設定に時間がかかったが、モデルの低分子抗体から2年目に実際に使用する低分子抗体へ前倒して変更したため、2年目へ向けての準備は概ね整っている。前年度、接着分子E-selectinに対するscFvに非天然アミノ酸アジドフェニルアラニンを導入し、DBCO-PEG脂質とクリック反応させてscFv-PEG脂質を合成し、scFv-PEG脂質含有培地中で間葉系細胞の表面にscFvを表面に修飾する方法も確立した。本年度は、それらの最適化されたscFv修飾法を用いて、scFv修飾が細胞接着に及ぼす効果を評価した。まず、E-selectinまたはPEGを固定化したプレートを作成し、蛍光標識細胞を添加して、ウェルの蛍光強度を指標に接着した細胞数を評価した。scFv修飾細胞は、PEG固定化プレートと比較してE-selectin固定化プレートに約5倍の細胞が接着し、未修飾細胞およびPEG修飾細胞はいずれのプレートにもほとんど接着しなかった。さらに、E-selectin固定化プレートに対するscFv修飾細胞の接着の増強は、抗E-selectin抗体の前処理により有意に阻害され、scFvを介した接着増強が示唆された。また、サイトカイン処理したE-selectin高発現HUVECを播種したプレートにscFv修飾細胞を添加すると、未修飾細胞と比較して接着が増強された。最後に、生体内では血流の流れ場で血管内皮細胞と接着するため、流れ場においてHUVECと間葉系幹細胞の接着する実験系を構築した。流路の底面にHUVECを播種し、サイトカイン処理後、蛍光標識間葉系幹細胞をシリンジポンプで送り出し、HUVEC上の間葉系幹細胞の移動速度をリアルタイムイメージングで評価した。scFv修飾細胞はPEG修飾細胞と比較して移動速度が低く、さらに、一定時間流した後HUVEC上に接着した細胞数は、scFv修飾細胞はPEG修飾細胞の約1.5倍であった。以上、scFvを間葉系幹細胞に修飾することで流れ場においてHUVECへの接着を向上させることができた。2年目は予定通りにE-selectinに対する低分子抗体を間葉系幹細胞に修飾し、細胞間接着の評価を行う。

ドラッグデリバリー低分子抗体の精製に時間がかかったため、モデル低分子抗体での細胞間接着の評価の代わりに、抗E-selectin低分子抗体の作製を前倒して行った。そのため、細胞接着の評価に必要な試薬やプラスチック製品、ガラス製品を購入しなかった。1年目に抗E-selectin低分子抗体の精製・保存法が確立できたため、2年目の細胞接着の評価に充当する。
脂肪由来幹細胞の治療効果増強のためのホーミング機序解明と制御

本研究は、脂肪由来幹細胞(ADRC)の標的臓器への特異的集積能力(homing効果)の制御を目的とした。ADRCはin vitroにおける肝細胞保護効果、肝切除(Hx)+虚血再灌流傷害(I/R)モデルマウスにおける肝傷害軽減効果とともにIn vivo imaging・蛍光顕微鏡により肝に特異的に集積していることを確認した。さらにADRCの臓器特異的集積能にSDF-1/CXCR4 axisが機能している可能性も確認した。脂肪由来幹細胞の治療効果増強のためのホーミング機序解明と制御脂肪由来幹細胞(ADRC)は新たな幹細胞資源として期待され、主に標的臓器への分化誘導に関し研究されているが、なぜ傷害された(もしくは再生中の)疾患臓器特異的に集積(homing effect)するのかについてほとんど解明されていない。本研究ではADRCの肝再生・傷害修復過程のhoming effectメカニズムの解明を目指し、ADRCによる細胞療法の効率化を実現する。脂肪由来幹細胞の肝切除/虚血再灌流モデルにおける肝細胞保護効果・Homing効果:balb/c nu-nuマウスに70%肝切除(Hx)施行後、20分間肝虚血(IR)による致死モデルを作成しheparin併用下にADRC(1.0×105 cells)を経静脈的に投与(コントロール群:heparinのみ)した。術後6・24時間後の肝傷害(AST・ALT・T-Bil)は有意に改善し、術後24時間における残肝再生も有意にADRC投与群で増加した。また術後24時間生存率はcontrol群が23.5%であったのに対し、ADRC群では41.2%と改善傾向を認めた。Homing効果についてADRCの再生肝への強い集積をIVIS®、Neo-Stem®により確認し、Hx+IR群はSham群(開腹のみ)と比較して肝内SDF-1発現(免疫染色)の増強とともに、CXCR4 mRNA発現はSham群、Hx+IR群と比較してHx+IR+ADRC群で有意に上昇していること確認した。さらにSDF-1発現細胞が術後6時間では肝実質細胞と非実質細胞が同等であったが、術後24時間後には非実質細胞に有意にシフトしていた。はこれは肝内にhomingしたADRCが接着因子であるCXCR4を発現するとともに、肝再生過程においてHomingするターゲット細胞に変化が生じることを示唆している。脂肪由来幹細胞の治療効果増強のためのホーミング機序解明と制御本研究ではADRCの肝再生・傷害修復過程のhoming effectメカニズムの解明を目指し、ADSCによる細胞療法の効率化を実現する。1.脂肪由来幹細胞による肝保護効果:マウス肝細胞(1.0×105 cells / well)・ADRC(1.0×105 cells / well)のcell-cell contact(-)共培養では、肝細胞のviabilityは共培養群で良好。培養液中VEGF mRNA高値で抗VEGF抗体により肝細胞viabilityが低下したことから、ADRCの肝保護効果にはVEGFが強く関与している可能性が示唆。2.脂肪由来幹細胞の肝切除術後Homing効果:balb/c nu-nuマウスに70%Hx施行後、heparin併用下にADRC(1.0×105 cells)を経静脈的に投与(コントロール群:heparinのみ)し、肝傷害は有意に改善し(heparinのみ投与群vs heparin+ADRC投与群:血清GPT 848±75 vs. 615±82)、肝再生率の上昇とともにADRCの再生肝への強い集積をIVIS®、Neo-Stem®により確認した。さらにHx群はSham群と比較して肝内SDF1発現(免疫染色)の増強を確認するとともに、CXCR4 mRNA発現はSham群、70%Hx群と比較して70%hx+ADRC群で有意に上昇していること確認した。これは肝内にhomingしたADRCが接着因子であるCXCR4を発現していること示唆していることが予想される。脂肪由来幹細胞の治療効果増強のためのホーミング機序解明と制御本研究ではADRCの肝再生・傷害修復効果とともに傷害臓器へのhoming effectメカニズムの解明を目指し、ADRCによる細胞療法の効率化を目指す。脂肪由来幹細胞の肝切除/虚血再灌流モデルにおける肝細胞保護効果・Homing効果(膵島傷害モデルとの比較):balb/c nu-nuマウスに70%肝切除(Hx)施行後、20分間肝虚血(IR)による致死モデルを作成しheparin併用下にADRC(1.0×105 cells)を経静脈的に投与(コントロール群:heparinのみ)し、術後6・24時間後の肝傷害(AST・ALT・T-Bil)の改善、術後24時間の残肝再生の増強を確認した。術後24時間生存率はcontrol群が23.5%で、ADRC群では41.2%と改善傾向を認めた。Homing効果についてはADRCの再生肝への強い集積をIVIS;、Neo-Stem;により確認した。