hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経回路におけるイオンチャネル機能とリズム形成

本研究では、自然発生変異マウスおよびノックアウトマウスを材料として用い、イオンチャネル変異が一次的・二次的に引き起こす脳神経回路のシナプス前・シナプス後の伝達メカニズムの特性変化を解析することから、脳神経回路におけるイオンチャネルの機能と脳の基本的リズムの形成過程を検討することを目的とした。特に細胞内Ca^<2+>代謝にかかわるイオンチャネルを標的として取り上げ、Ca^<2+>代謝の持続的かつ活動依存的な変化がシナプス伝達・神経回路機能へ及ぼす影響を検討した。具体的には、P/Q型Ca^<2+>チャネル異常マウス(tottering、leaner、rollingなどの自然発生変異マウス)において、チャネル・シナプス伝達等の変化が、どのように失調症・てんかん・不随運動などの症状発現に至るかを解析した。小脳の主要な出力細胞であるPurkinje細胞は、登上繊維と平行繊維の2つの入力を受けるが、Ca^<2+>チャネル変異マウスでは失調症の出現と相応して平行繊維-Purkinje細胞シナプスの伝達低下が見られたが、一方、登上繊維-Purkinje細胞シナプスでは伝達低下はなく、むしろ伝達の増強が見られる場合もあった。また現在プルキンエ細胞より小脳核へのシナプス伝達の変化を解析中であり、変異マウスの間で異なる変化を見出している。これらの現象は、Ca^<2+>動態の持続的な異常が、シナプス間連絡をさまざまに変化させることを示すものであり、その異常には発達におけるCa^<2+>代謝の重要性を示唆するものである。またてんかんを有するtotteeingで、視床皮質路および皮質視床路およびそれら関連する神経細胞の特性とシナプス伝達に関する異常を系統的に検索したところ、視床より大脳皮質内への入力で抑制性の成分がとりわけ低下していることが明らかとなった。この抑制性の成分がfeedforward inhibitionの系として働くと考えられるが、抑制性インターニューロンのある集団がこの機能を担っているのではないかとの仮説のもとに、形態学的な検討を行ったが、顕著な変化は見られなかった。より微細な解析が必要であり、現在検討中である。
地元に原子炉のある高専の物理・応物の授業における一貫した放射線関係の教案の開発

我々の勤務する茨城工業高等専門学校は、日本原子力研究所東海研究所の研究用原子炉群や、日本原子力発電(株)の発電用原子炉、原研大洗研究所の材料試験炉、高温ガス炉、動燃大洗工学センサーの高速増殖試験炉「常陽」、原研那珂研究所の核融合試験炉JT-60に囲まれたひたちなか市に存在する。本校の学生の就職先として、“地場産業"であるこれら原子力関連企業や研究所を選ぶ者も多い。ところが、本校の学生の放射性同位元素や放射能に関する興味・関心は低い。学生及び教職員に環境中の自然放射能の存在と量を認識させることを試みた。CR-39というプラスチック板を固体飛跡検出器とするラドンガスモニター(ラドトラック)を学内の様々な居住空間に吊しラドン農業を測定した。算術平均29.7Bq/m^3、幾何平均21.3Bq/m^3であった。ラドン農業の分布は対数正規分布であった。次に、茨城県全域に点在する本校の学生の自宅178軒の学生の寝室のラドン濃度の測定を同じラドンガスモニターでおこなった。ラドン濃度の分布は学校と同じく対数正規分布であったが、幾何平均10Bq/m^3、幾何標準偏差2で、放医研の全国データや本校の居住空間のデーターのラドン濃度の1/2ないし1/3であった。このようにして自然放射線の存在を実感(認識)させた後、更に学生が自ら進んで放射線や放射能・原子力のことを調べることができるよう助言を与えた。(B)学生に、放射線測定機器の無料貸出しの紹介を行なった。シンチレーション式サーベイメーター(はかるくん)、放射線計測協会(C)各種資料館の紹介、[1]茨城原子力センター展示館、[2]動燃展示館(アトムワールド)、[3]日本原電東海発電所展示館(東海テラパーク)、[4]見学バス(D)外国旅行する学生・教職員へ線量計による自然放射能の計測依頼(タイ、中国、南極)(E)RI教育用のビデオテープの購入・視聴(「アイソトープとは」日本アイソトープ協会)(F)新聞・テレビ報道に現れた放射線・原子力関連の事項の紹介と説明(FBR,もんじゅ)我々の勤務する茨城工業高等専門学校は、日本原子力研究所東海研究所の研究用原子炉群や、日本原子力発電(株)の発電用原子炉、原研大洗研究所の材料試験炉、高温ガス炉、動燃大洗工学センサーの高速増殖試験炉「常陽」、原研那珂研究所の核融合試験炉JT-60に囲まれたひたちなか市に存在する。シンチレーション式サーベイメーター(はかるくん)、放射線計測協会(C)各種資料館の紹介、[1]茨城原子力センター展示館、[2]動燃展示館(アトムワールド)、[3]日本原電東海発電所展示館(東海テラパーク)、[4]見学バス(D)外国旅行する学生・教職員へ線量計による自然放射能の計測依頼(タイ、中国、南極)(E)RI教育用のビデオテープの購入・視聴(「アイソトープとは」日本アイソトープ協会)(F)新聞・テレビ報道に現れた放射線・原子力関連の事項の紹介と説明(FBR,もんじゅ)
北海道針葉樹の成長メカニズムと更新ダイナミクスの北半球における比較研究

針葉樹の更新は北半球では重要な課題であり、アカエゾマツ、エゾマツ、トドマツが混交する北海道中央部の亜寒帯山岳林において15N同位体を用いて成長、栄養、光合成に関して樹種間の特性を検討した。500-600mの標高域では植栽したトドマツは年間400-470mmの早い樹高成長を示し、天然のトドマツもエゾマツに比べて樹高成長が速い。天然のトドマツは高標高では20-37mg/gのもっとも高い窒素含有量があった。しかし、低標高になると、トドマツの窒素含有量はエゾマツより若干少なくなる。植栽したトドマツの窒素含有量はエゾマツよりも有為で少なかった。低標高では植栽したエゾマツの樹高成長は植栽したトドマツと同じであり、トドマツよりも光合成がさかんである。アカエゾマツの葉重量、枝長、栄養は他の針葉樹より有為で少ないが、炭素含有量が600-650mg/gで他の針葉樹より有為に高い。温室実験の結果、エゾマツの新芽は光よりも温度で活性化されることが示された。トドマツを植えることは森林の成長を増加させるが、低標高ではアカエゾマツよりもエゾマツを植えるほうが、みかけ上は長期に見て土地生産性が高い。針葉樹苗木は初期の根形成、開芽、光合成が敏感であることから、植栽場所は十分注意して選ばなければならない。アカエゾマツとエゾマツ、トドマツの成長メカニズムについて研究をすすめた。標高域320-800mで成長状態について野外調査を実施した。2882年生天然木と1015年生植栽木について、光合成能力や針葉の栄養状態について調査した。イオン交換膜を用いて土壌養分を調査した。エゾマツとトドマツの共存関係が非常に少ないという結果が得られた。また、植栽木の成長は天然木よりも早く、とくに天然のアカエゾマツの成長が良くないことが確認された。植栽したトドマツでは標高500m以下での成長が良かった。標高500m以上になると、植栽したエゾマツは成長、光合成、栄養状態の点でトドマツよりも良いことが確認された。苗畑において、3年生苗の窒素の摂取について、15N同位体を用いて測定した。エゾマツは窒素の吸収が早く、トドマツは吸収量が多い結果が得られた。アカエゾマツの根切りは吸収を低下させることがわかった。温室実験では、68年生苗について、光や温度条件を変えてその影響を調べた。25%および71%光を少なくしたところ、エゾマツのいくつかは新芽を出し、トドマツはダメージが少なく、アカエゾマツは全く影響がなかった。温度を下げると、エゾマツは他の針葉樹よりも急速に死亡率が増大した。
ウェーブパイプライン化ASIC-FPGA協調設計による機械学習IPSの開発

本研究の目的は極めて危険な標的型攻撃から情報漏洩を防ぐことを可能にするホストベースIntrusion Prevention System (IPS)を実現することです。標的型攻撃を防ぐためには機械学習による挙動監視型振る舞い検知を行う必要があります。本研究では我々が開発してきたASICと再構成可能なハードウエアであるFPGAの協調設計と回路全体のウェーブパイプライン化によるIPS向けの機械学習エンジンの開発を行います。低消費電力動作機械学習が可能なIPSプロセッサのチップ化を行い,動作検証を行うことで本研究の優位性を明らかにします。さらに,情報漏洩対策や新たな攻撃への対応を可能にします。
グラスファイバー補強型高分子材料のクラスプへの応用

グラスファイバー補強型高分子材料Targis/Vectris(Ivoclar)を部分床義歯のクラスプとして臨床応用するために,これまでに3点曲げ試験,疲労試験および熱サイクル負荷による機械的性質について検討し,クラスプへの応用が可能な知見を得てきた.さらに臨床に即した条件設定のもと,鉤腕形態と維持力との関係ならびに繰り返し着脱における維持力の減少について検討してきた.今年度は,支台歯を2種類に増やして繰り返し着脱における維持力の減少について検討し,これまでの実験結果をもとに臨床応用した症例の経過観察とアンケート調査を行った.まず,試料はエーカースタイプクラスプとし,支台歯は下顎第一小臼歯を想定した樽状の硬質レジンとして,繰り返し着脱試験による維持力や永久変形量ならびに摩耗について検討した.5000回の着脱において,破折したクラスプは認められず,維持力は支台歯が焼き付け用陶材の場合と比べて約1/2の大きさであった.また、焼き付け用陶材の場合と同様に,永久変形はほとんど認められず,2.6ミクロンと非常に小さい値で,貴金属とほぼ同程度で卑金属よりかなり小さかったが,鉤尖部に摩耗が認められた.次に,臨床応用した17症例の経過観察について,破折が1症例,コーティング層のクラックが5症例,着色がほとんどの症例に認められた.感覚的な維持力の低下は認められなかったが,これは永久変形がほとんど認められなかった結果と対応すると思われる.アンケート調査では,ほぼ全ての症例で義歯に対する満足が得られ,がたつきやすさやはずれやすさは経時的に増すことがなかった.また,クラスプに関しては,15症例中13例で審美的に満足が得られ,色と形態は適当で,金属クラスプと比べて良いという結果であった.上記の成果は第14回日本歯科審美学会学術大会と日本補綴歯科学会109回学術大会にて発表した.今後,本材料のより適切な適用法を確立するために,さらに材料特性に適った鉤腕形態などについて検討する必要があるごとが考えられた.グラスファイバー補強型高分子材料Targis/Vectris(Ivoclar)を部分床義歯のクラスプとして臨床応用するために,これまでに3点曲げ試験,疲労試験および熱サイクル負荷による機械的性質について検討し,クラスプへの応用が可能な知見を得てきた.本研究の目的は,さらに臨床に即した条件設定のもと,鉤腕形態と維持力との関係ならびに繰り返し着脱における維持力の減少について検討することである.まず,断面形態が半楕円形の棒状試料(厚さと幅が5種類,長さが4種類)を用いて片持ち梁曲げ試験を行い,変位量と荷重量との関係を検討した結果,一定の変位を与えた場合,厚さが厚いほど,幅が広いほど,長さが短いほど荷重量は大きく,その変化は幅よりも厚さの影響を強く受けた.また、変位量と荷重量はそれぞれ支台歯のアンダーカット量とクラスプの維持力に相当すると考えると,鉤腕の厚さや幅を変えることによって,維持力を適切に調整できることが示唆された.しかし,試料形態と荷重量との関係は,荷重量が厚さの3乗と幅に比例し,長さの3乗に反比例する金属とは異なった.次に,試料をエーカースタイプクラスプとし,繰り返し着脱試験による維持力や永久変形量ならびに摩耗について検討した結果,5000回の着脱において,破折したクラスプは認められず,維持力は着脱回数の増加に伴い減少したが,その減少程度は着脱回数が多くなるにつれて小さくなった.また、永久変形はほとんど認められず,4.9ミクロンと非常に小さい値で,貴金属とほぼ同程度で卑金属よりかなり小さかったが,鉤尖部に摩耗が認められた.上記の成果は平成14年度日本補綴歯科学会九州支部会と日本補綴歯科学会108回学術大会にて発表した.今後,本材料のより適切な適用法を確立するために,さらに材料特性に適った鉤腕形態などについて検計する必要があることが考えられた.グラスファイバー補強型高分子材料Targis/Vectris(Ivoclar)を部分床義歯のクラスプとして臨床応用するために,これまでに3点曲げ試験,疲労試験および熱サイクル負荷による機械的性質について検討し,クラスプへの応用が可能な知見を得てきた.さらに臨床に即した条件設定のもと,鉤腕形態と維持力との関係ならびに繰り返し着脱における維持力の減少について検討してきた.今年度は,支台歯を2種類に増やして繰り返し着脱における維持力の減少について検討し,これまでの実験結果をもとに臨床応用した症例の経過観察とアンケート調査を行った.まず,試料はエーカースタイプクラスプとし,支台歯は下顎第一小臼歯を想定した樽状の硬質レジンとして,繰り返し着脱試験による維持力や永久変形量ならびに摩耗について検討した.5000回の着脱において,破折したクラスプは認められず,維持力は支台歯が焼き付け用陶材の場合と比べて約1/2の大きさであった.また、焼き付け用陶材の場合と同様に,永久変形はほとんど認められず,2.6ミクロンと非常に小さい値で,貴金属とほぼ同程度で卑金属よりかなり小さかったが,鉤尖部に摩耗が認められた.次に,臨床応用した17症例の経過観察について,破折が1症例,コーティング層のクラックが5症例,着色がほとんどの症例に認められた.感覚的な維持力の低下は認められなかったが,これは永久変形がほとんど認められなかった結果と対応すると思われる.アンケート調査では,ほぼ全ての症例で義歯に対する満足が得られ,がたつきやすさやはずれやすさは経時的に増すことがなかった.

また,クラスプに関しては,15症例中13例で審美的に満足が得られ,色と形態は適当で,金属クラスプと比べて良いという結果であった.上記の成果は第14回日本歯科審美学会学術大会と日本補綴歯科学会109回学術大会にて発表した.今後,本材料のより適切な適用法を確立するために,さらに材料特性に適った鉤腕形態などについて検討する必要があるごとが考えられた.
線維芽細胞のIL-1産生およびアポトーシス発現とICEの関連性に関する基礎的研究

今回の研究におて、歯肉線維芽細胞(HGF)におけるIL-1で誘導されるIL-1ファミリー(IL-1α,IL-1β,IL-1R1,IL-1レセプターアンタゴニスト(IL-1Ra),IL-1βcoverting (ICE)のenzyme(ICE)のmRNA発現を確認、およびタンパクプロッセシングを確認したところ、IL-1で刺激したHGFは細胞画分に主としてIL-1α前駆型IL-βおよびIL-1_<ra>を産生した。さらに、IL-1依存的なIL-1_<ra>産生はIL-1産生のピーク後に認められた事から、このIL-1_<ra>は内因性、外因性にIL-1活性のdown-modulatorとして働いている可能性がある。またIL-1αで産生誘導されるIL-1βは、細胞画分において前駆型のみ認めれられたこと、恒常的なICEのmRNA発現が確認されたもののICEキナーゼ活性は認められなかったことからHGFの細胞内においてICEは活性化されておらず、そのため成熟型IL-1βへのタンパクプロッセシングが発現されていないか、あるいはHGFにおける成熟型L-1βへのタンパクパロッセシングにはICEが関係していない可能性が示唆された。また、アポトーシスにおけるICEの関連性を検討するために、細菌感染マクロファージを用いてアポトーシスを誘導し、caspase-1,3が関与しているか否かを検討した。その結果、感染マクロファージの致死活性は、caspase-1,3における阻害剤を培養系に添加すると致死活性が抑制され感染マクロファージからのIL-1βの産生も抑制された。また細胞内のcaspase-1,3の活性を測定したところ、caspase-3の活性に先立ちcaspase-1の活性にが誘導されていることが明らかになった。このことから細菌感染マクロファージのアポトーシス誘導にはcaspaseファミリーの酵素群が一連のカスケードを形成し、その発現に重要な役割を担っていいることが示唆された。その結果、両者の細胞ともrhIL-1β,rhTNF-αで刺激した場合において4種のmRNA発現が確認され、IL-1α,IL-1βのメッセージは刺激後6h前後で、IL-1Ra,ICEは刺激後12h前後で発現peakを示した。しかし、LPSによる刺激(0-100μg、0-72h)においては各mRNA発現はほとんど確認されなかった。また、同様の刺激条件培養後、両細胞のIL-1α,IL-1βおよびICEのタンパクプロセッシングを、培養上清,cell-lysateで確認した。その結果、歯肉線維芽細胞においては、IL-1αが細胞画分において認められ、western blottingにて31kDaと17kDaの両者のタンパクが確認された。また、Ca^+イオノフォアを添加することでmaturationが増加することも確認された。IL-1βに関してはELISA法にてその産生が確認されるが、その量はIL-1αと比較して著しく少なく、現在western blottingにて検討している。また、ICEに関しては、western blottingにおいて検出できなかった。以上の結果から、HGFならびにWI-38細胞においては活性型ICEのプロセッシングは発現していない可能性があり、そのためIL-1βのプロセッシングは発現していないことが示唆される。

可能性がありことが示唆され、一方、細胞画分内のIL-1αは線維芽細胞が産生する主要なIL-1であり、周囲細胞へのシグナル伝達において重要な役割を担っていることが示唆された。今後は、同細胞にICEgeneをトランスフェクトしそのタンパクプロセッシングを促進させ、IL-1βプロセッシングにおける活性型ICEの関与を明確にし、線維芽細胞のIL-1産生の機構を明らかにしていくことを計画している。今回の研究において、歯肉線維芽細胞(HGF)におけるIL-1で誘導されるIL-1ファミリー(IL-1α,IL-1β,IL-1R1,IL-1レセプターアンタゴニスト(IL-1Ra),IL-1βcoverting enzyme(ICE)のmRNA発現を確認、およびタンパクプロッセシングを確認したところ、IL-1で刺激したHGFは、細胞画分に主としてIL-1α、前駆型IL-1βおよびIL-1raを産生した。さらに、IL-1依存的なIL-1ra産生はIL-1産生のピーク後に認められた事から、このIL-1raは内因性、外因性にIL-1活性のdown-modulatorとして働いている可能性がある。またIL-1αで産生誘導されるIL-1βは、細胞画分において前駆型のみ認められたこと、恒常的なICEのmRNA発現が確認されたもののICEキナーゼ活性は認められなかったことから、HGFの細胞内においてICEは活性化されておらず、そのため成熟型IL-1βへのタンパクプロッセシングが発現されていないか、あるいはHGFにおける成熟型IL-1βへのタンパクプロッセシングにはICEが関係していない可能性が示唆された。また、アポトーシスにおけるICEの関連性を検討するために、細菌感染マクロファージを用いてアポトーシスを誘導し、caspase1,3が関与しているか否かを検討した。その結果、感染マクロファージの致死活性は、caspase-1,3における阻害剤を培養系に添加すると致死活性が抑制され、感染マクロファージからのIL-1βの産生も抑制された。また細胞内のcaspase-1,3の活性を測定したところ、caspase-3の活性に先立ちcaspase-1の活性化が誘導されていることが明らかになった。このことから細菌感染マクロファージのアポトーシス誘導にはcaspaseファミリーの酵素群が一連のカスケードを形成し、その発現に重要な役割を担っていることが示唆された。
ヌードマウス前立腺内および骨内におけるヒト前立腺癌細胞の転移関連遺伝子発現の比較

1.生理食塩水に浮遊させたヒト前立腺癌細胞株PC3-MM2(5X10^4/0.05ml)をヌードマウスの前立腺に移植した。34週で移植部位に腫瘍が認められたが、X線および組織学的検索で骨転移は認められなかった。2.大動脈からの血流を介した転移性骨病変を得るためにPC3-MM2(5X10^5/0.05ml)をマウスの左心室に注入したが、転移性骨病変は得られなかった。そこで、脛骨の骨端にPC3-MM2(2X10^4/0.02ml)を直接注入した。X線上、34週で移植部位に骨破壊性と思われる病変が認められた。マウスは5週で屠殺され、組織学的に腫瘍細胞の骨破壊性増殖を確認した。1)生理食塩水に浮遊させたヒト前立腺癌細胞株PC3-MM2(5万個/0.05ml)をヌードマウスの前立腺注入し、同所性移植を試みた。3から4週で移植部位に5mmから10mmの腫瘍が認められた。大動脈周囲リンパ節に腫瘍の転移がみられたが、X線および組織学的検索で骨転移は認められなかった。前立腺部の腫瘍はホルマリン固定後、パラフィン包埋された。2)大動脈からの血流を介した転移性骨病変を得るためにPC3-MM2を浮遊させた生理食塩水(50万個/0.05ml)をヌードマウスの左心室に注入した。しかし、PC3-MM2は肝臓や肺に多数の転移性腫瘍を形成し、マウスが短期間で死んでしまうため、転移性骨病変は得られなかった。そこで、脛骨の骨端にPC3-MM2を浮遊させた生理食塩水(2万個/0.02ml)を直接注入することにより、異所性移植を試みた。X線上、3から4週で移植部位に骨破壊性と思われる病変が認められ、4から5週では肉眼的にも明らかな腫瘍が形成された。マウスは5週で屠殺され、頸骨部の腫瘍はホルマリン固定、EDTA脱灰後、パラフィン包埋された。HE標本上でPC3-MM2は骨を破壊するように増殖しており、脛骨周囲の筋肉内にも浸潤していた。腫瘍と骨が接している部分では破骨細胞が散見された。前立腺および頸骨における腫瘍細胞の形態に違いはみられなかった。3)一部の頸骨部腫瘍からは再度細胞株を得ており、骨に対してはより親和性を増し、他臓器に対しては親和性が少なくなった可能性のあるこの細胞株を用いて左心室からの転移性骨病変の形成を現在試みている。
多検出器CTを用いた肝内外門脈周囲域への癌進展形式の解析

我々は、多検出器CTの1mm-slice多断面再構成画像を用いて、肝内外門脈周囲域への癌進展形式"periportal cancer spread pattern (PCSP)"の解析を行った。その結果、肝内・肝門部胆管癌では38%(9/24例)でPCSP陽性であり、特に肝門部胆管癌において肝内亜区域レベルから肝外門脈周囲域までの広範なPCSPを認めた。一方、肝外胆管癌では、原発巣の門脈周囲域から右腹腔神経節に向かう後肝神経叢がPCSP陽性の要因であり、CTでは同神経叢に一致する索状、網状、腫瘤状の濃度上昇域として捉えられた。平成22年度は、胆管癌(肝門部、肝内)、転移性肝癌、膵体尾部癌を対象に肝内外門脈周囲域への癌進展"periportal cancer spread pattern (PCSP)"に関して多検出器CTを用いて検討した。最初に胆管癌に関しては、浸潤型(10例)と腫瘤形成型(14例)の2タイプに分け、各々のPCSPの頻度、進展範囲を調査した。その結果、胆管癌全体(24例)では、9例(38%)でPCSP陽性であった。内訳は、浸潤型が5例(50%)、腫瘤形成型が4例(29%)であった。肝内門脈周囲域への浸潤に加え、肝外門脈周囲域(肝十二指腸間膜)への進展を伴った症例が5例(21%)に認められた。PSCPを呈した浸潤型胆管癌はいずれも肝門部胆管癌であり、全例で亜区域枝レベルまでの肝内門脈周囲域進展を伴っていた。手術にて病理学的検索が行われたPSCP陽性例では、グリッソン鞘へのリンパ管や神経周囲組織への癌浸潤が確認された。肝門部胆管癌(浸潤型)では高頻度にPSCPを来しやすく、その状態を多検出器CTが門脈周囲域の軟部組織濃度として捉えられることが判明した。次に、転移性肝癌に対してPCSPの頻度、進展範囲を検討した。造影MDCTが撮像され組織学的証明が得られた30例を対象としたが、PCSP陽性例はわずか3例(10%)にしか見られなかった。PCSP陽性3例を病理学的に検索した結果、1例で門脈周囲域への播種巣は確認されたがグリッソン鞘への直接浸潤はなく、他の2例もグリッソン鞘に癌病巣は認められなかった。今回、膵頭部癌症例の多くが減黄チューブやステント留置によるアーチファクトの影響を受けており、先に膵体尾部癌症例(57例、多くが非手術例)を対象にPCSPの検討を行った。その結果、13例(23%)に肝門部レベルまでのPCSPが確認された。病理学的対比は行えなかったが、リンパ管や膵外神経叢を介した門脈周囲域への癌浸潤が示唆された。平成23年度は、平成22年度の研究継続と、多検出器CTと病理所見との対比で得られた新たなる知見を検証する目的で、"periportal cancer spread pattern"とは異なる膵体尾部癌、肝外胆管癌の進展様式に関して研究の裾野を拡げた。その結果、膵体尾部癌では門脈周囲域への進展形式とは別に、膵周囲脂肪織に氷柱状の線維化を伴いながら浸潤する形式が病理学的に判明し、同CT所見をり"peripancreatic strands appearance"と命名した。切除された膵体尾部癌17例中、13例(76%)で同CT所見は認められ、成因として膵星細胞の役割(線維化)ならびに血管新生、リンパ管新生の関与が示唆された。同研究成果を腹部画像診断関係の英文雑誌(Matsumoto S, et al.Abdominal imaging 2011 Sep 13.【Epub ahead of print】)に発表した。一方、肝外胆管癌では、"periportal cancer spread pattern"に進展形式は類似するものの、原発巣の門脈周囲域から右腹腔神経節に向かう二つの神経叢(posterior hepatic plexus【PHL】1,2)を介する癌浸潤が判明し、多検出器CTと病理所見との対比を遡及的に行った。その結果、肝外胆管癌43例中、10例(23%)でPHL1、9例(23%)でPHL2への癌浸潤が病理学的に確認された。多検出器CTでは同神経叢に一致する索状、網状、腫瘤状の濃度上昇域として捉えられ、特に冠状断再構成像で高い正診率(95%)が得られた。同研究成果は放射線医学関連の最高峰である英文

雑誌Radiologyに投稿し、acceptされた(Yamada Y, et al.Radiology 2012 May 263 ; 419-28【Epub ahead of print】)。過去2年の研究期間で、対象となる肝臓癌、胆管癌、膵臓癌の"periportal cancer spread pattern"の典型的な病理学的所見が得られた症例数は少ないが(多くが進行癌で手術非適応例であるため)、今後予後検索を行い、同CT所見の臨床的意義を解明する予定である。平成22年度と平成23年度の研究により、多検出器CTによる膵体尾部癌の膵周囲進展の特徴的CT所見である"peripancreatic strands appearance"と、肝外胆管癌における“periportal cancer spread pattern"の中心的役割を担う二つの神経叢(後肝神経叢I,II)浸潤のCT所見をが明らかにすることができ、二つの英文雑誌に投稿し、高い評価を受けた.また、日本医学放射線科専門医会主催のミッドサマーセミナー(2012年7月2122日開催)の教育講演で同知見を紹介した。平成24年度は、既に平成23年度内で膵胆道癌における“periportal cancer spread pattern"関連の論文を完成することができたため、平成22年の日本医学放射線学会総会(横浜市、神奈川県)で発表した「転移性肝癌におけるperiportal cancer spreadのMDCTによる検討」の病理学的裏付けを得るため、転移性肝癌での同所見陽性9例の病理を病理専門医に評価してもらった。その結果、9例中6例でグリッソン鞘における癌浸潤は証明されず、また残りの3例は癌浸潤を認めるものの、いずれも微小浸潤であり、門脈域に沿って広く進展するMDCT所見との間に解離が見られた。病理上、グリッソン鞘に随伴性浮腫性変化が確認されており、“periportal cancer spread pattern"のMDCT所見は、癌浸潤の微小浸潤もしくは腫瘍による圧排に合併するリンパ浮腫を主に反映しているものと結論付けた。未だ、学会発表には至ってないが、平成25年度内に学会発表を行い、その後論文に投稿する予定である。また、これまで得られた知見を、2012年11月2122日にブルガリアで開催された第10回バルカン放射線学会の教育講演で紹介した。肝臓癌、胆管癌、膵臓癌において、多検出器CT上、明らかな"periportal cancer spread pattern"を呈する症例は手術適応となることが極めて少なく、病理学的所見との対比が思った以上に進まなかったのが最大の要因である。しかしながら、先の"研究実績の概要"で述べたように、胆管癌、膵臓癌の手術症例の病理所見を評価していた際に、新たなる知見が得られ、関連研究として成果を発表(2論文)できた点は満足している。24年度が最終年度であるため、記入しない。多検出器CT上、"periportal cancer spread pattern"を呈する肝臓癌、胆管癌、膵臓癌での手術例数が少ないため、今後は画像的変化(進行状況)と予後との関連を中心に、同CT所見の臨床的意義を追及して行く予定である。勿論、その間手術症例があれば過去2年間の研究と同様、病理学的対比を継続する。
メカニカルストレス受容による歯周組織の破骨細胞分化誘導機構の解析と臨床応用の探索

歯周組織は咬合力や矯正力などのメカニカルストレスに順応して、合目的に構築されている。本研究は、歯槽骨吸収に主要な役割を果たす破骨細胞の局所におけるメカニカルストレスによる分化誘導機構について総合的に解明し、臨床応用の探索を目的とした。その結果、以下のような知見が得られた。2.ヒト末梢血由来単核球画分もしくはHL-60(promyelocyte様細胞株)と歯根膜細胞を直接接触可能な条件で培養すると、破骨細胞が形成され、この細胞は吸収活性を有していた。RT-PCR法により歯根膜細胞にRANKLとOPGの発現が認められた。3.SV40 tsA58large Tantigentransgenic ratを用いて15種類の細胞株を遺伝子発現プロファイルにより樹立した。3株において、1,25(OH)_2D_3(D_3)処理によりRANKL発現が認められた。一方、8株においてみられたOPGの発現はD_3処理により消失した。4.培養歯根膜細胞に圧縮力を負荷するとRANKLの遺伝子発現が増強したが、OPGの発現は変化せず一定であった。圧縮力負荷によりCOX-2遺伝子発現と培養上清中のプロスタグランジンの増強が認められた。圧縮力によるRANKL発現上昇はインドメタシン添加により完全に抑制された。5.伸展刺激を負荷した歯根膜培養細胞の培養上清は、破骨細胞形成を抑制した。また、伸展刺激負荷により歯根膜細胞のOPG、RANKL、TGF-βmRNA発現が上昇し、OPGおよびをTGF-β産生量は増加した。本研究は、歯槽骨の吸収に主要な役割を果たす破骨細胞の局所におけるメカニカルストレスによる分化誘導機構について総合的に解明し、臨床応用の探索を目的としている。1.ヒト末梢血由来単核球画分と歯根膜細胞を直接接触可能な条件で培養すると、破骨細胞が形成され、RT-PCR法により歯根膜細胞にRANKLとOPGの発現が認められた。歯根膜細胞に圧縮力を負荷すると負荷依存的・時間依存的にRANKLの遺伝子発現が増強した。一方、OPGの発現は変化せず、一定であった。培養上清中のプロスタグランジンを測定したところ、圧縮力負荷により増加が認められた。またプロスタグランジン合成酵素COX-2の遺伝子発現が増強した。圧縮力によるRANKL発現上昇はインドメタシンの添加により完全に抑制され、プロスタグランジン依存的であった。歯根膜細胞に周期的伸展刺激を負荷すると、RANKLが増強する細胞と減少する細胞があり、細胞による違いが認められた。歯根膜細胞はmixed populationの初代培養ため、細胞のpopulationにより反応に違いが出ることがある。歯根膜細胞の解析に数種類の株化細胞が必要であると考え,SV40ts transgenic ratを用いて15種類の株化細胞を樹立し、遺伝子発現によりcharacterizationを行った(特許申請中)。今後、この株化細胞も用いて解析する予定である。2.Wistar系雄性ラットを用い、超弾性ワイヤーを用いて持続的な力を臼歯に負荷するような固定式装置を7日間装着し、矯正学的歯の移動の動物モデルを作成した。通法に従って固定・脱灰・包埋した。今後、in situ hybridization法・免疫染色法により解析する予定である。

1.Wistar系雄性ラットに、超弾性ワイヤーを用いて持続的な力を臼歯に負荷する固定式装置を装着し、実験期間終了後に通法に従って免疫組織学的に検討した。その結果、OPGが、圧迫側のresorption lacunaeを含む骨吸収領域に、一方、RANKLが、圧縮側の歯根膜細胞に強く陽性反応が認められた。さらにOPGmRNA発現は培養破骨細胞様細胞には認められなかった。培養歯根膜細胞に圧迫力を負荷すると、負荷カおよび負荷時間依存的にRANKLの遺伝子発現が増強したが、OPGの発現は変化せず、一定であった。このことより、歯の移動において、RANKLの発現は破骨細胞の形成を誘導し、歯槽骨吸収を選択的に引き起こすことが推測された。また、OPGは吸収領域に集積し、過剰な歯槽骨吸収を抑制する防御機構の役割を果たしていることが推測された。歯周組織は咬合力や矯正力などのメカニカルストレスに順応して、合目的に構築されている。本研究は、歯槽骨の吸収に主要な役割を果たす破骨細胞の局所におけるメカニカルストレスによる分化誘導機構について総合的に解明し、臨床応用の探索を目的としている。その結果、以下のような知見が得られた。1.ヒト歯根膜細胞をconfluentになるまで培養し、周期的伸展力を負荷した。刺激後の培養上清を回収し、1,25(OH)2D3存在下でヒト末梢血単核球を前駆細胞とする破骨細胞形成系に、培養上清を添加した。その結果、伸展刺激を負荷した歯根膜培養細胞の培養上清を加えることにより、破骨細胞形成は減少した。また、刺激後の歯根膜細胞からtotal RNAを抽出し半定量的RT-PCR法によりmRNAの発現の変化を調べると、OPGとRANKL mRNAは伸展刺激負荷により発現が上昇した。また、OPG発現上昇因子のひとつであるTGF-βmRNAの発現も伸展刺激負荷により上昇していた。さらに、ELISA法にて培地中に産生されたOsteoprotegerinおよびをTGF-β量を測定すると、伸展刺激負荷によりOPGおよびTGF-β量は経時的に増加した。これらの結果より、産生されたTGF-βがautocrineにOPG発現を上昇させて破骨細胞の活性化を抑制し、骨代謝バランスを骨形成に傾けている可能性が示唆された。2.SV40 tsA58large Tantigentransgenic ratを用いて15種類の細胞株を遺伝子発現プロファイルにより樹立した。刺激をしない状態の細胞においては、破骨細胞の形成に関与するRANKLを発現する細胞はなかったが、3株において、1,25(OH)2D3処理によりRANKL発現が認められた。一方、OPGを発現する細胞は、8株得られたが、このOPG発現は1,25(OH)2D3処理により消失した。
S100Bノックアウトマウスにおける耐糖能および細小血管障害の検討

本研究は糖尿病・肥満における全身の慢性炎症の新たなメディエータとして、S100B蛋白に着目したものである。S100Bノックアウトマウスを用いた検討により、高脂肪食負荷時に、S100BKO群は野生群に比べ、ブドウ糖負荷試験ではインスリン分泌の亢進と耐糖能の改善傾向、インスリン感受性の改善傾向、血清中性脂肪・レプチンの高値、肝臓の脂質・胆汁酸代謝に関連する分子の変動が見られた。以上の結果は、S100B蛋白が糖・脂質代謝に一定の役割を担っていることを示唆しており、今後S100Bを糖尿病・脂質異常症の新たな治療目標分子として展開できる可能性がある。当該年度は、肥満・インスリン抵抗性におけるS100Bの意義を明らかにする目的で、S100Bノックアウトマウスの作成とこれを用いた基本的な検討を行った。まず理化学研究所BRCから100Bヘテロノックアウトマウスを入手した。同マウスを交配させて仔マウスの遺伝子型を確認し、S100Bホモノックアウトマウスを得た。得られたホモノックアウトマウスを交配させて本実験に必要な個体数まで繁殖作業を行った。同時に、予備実験としてヘテロマウスから得られた少数の野生型、ヘテロ、ホモマウスを高脂肪食で飼育しており、実験計画書に従い、体重変化、耐糖能、インスリン抵抗性、炎症性サイトカイン測定などを近日中に実施予定である。また、我々は細胞実験において脂肪細胞とマクロファージの炎症性相互作用におけるS100Bの重要性を確認し、これを論文報告した(Obesity 22:371-79, 2014)。この結果は肥満・インスリン抵抗性における脂肪細胞由来のS100B蛋白の重要性を証明したものである。現在、肝細胞(HepG2細胞および上記マウスから得た初代細胞)を用いて、肝におけるインスリン作用・糖代謝に対するS100B蛋白の影響を検討しており、興味深い結果を得つつある。我々はS100B蛋白の門脈内濃度が末梢血より高いことも確認しており、これらの結果は、内臓脂肪由来のS100B蛋白が脂肪組織の炎症のみならず肝代謝にも影響する可能性を示唆するものととらえている。平成26年度はS100Bホモノックアウトマウス(S100BKO)の繁殖作業を継続すると同時に、いくつかの予備実験を施行した。当初の計画に沿って、同マウスを野生型マウスとともに高脂肪食で612週間飼育し、体重変化を観察するとともに、空腹血糖値、経口および腹腔内ブドウ糖負荷試験、さらにインスリン負荷試験の評価を行った。その結果、S100BKOでは野生型マウスに比べ、高脂肪食負荷状態における体重増加の抑制傾向、ブドウ糖負荷時の耐糖能の改善およびインスリン分泌低下の抑制、インスリン抵抗性の改善傾向が認められた。これらの表現型の背景にある機序を明らかにするため、同マウスより膵、肝、内臓脂肪、筋肉および血液を採取し、当初の計画通りの遺伝子発現および組織学的変化につき検討中である。現在、本実験として、各群のマウス数を増やすとともに通常食餌群も設定して再度飼育中である。予備実験の結果も参考にしたうえで、近日中に同様の負荷試験および生化学的、組織学的検討予定である。予備実験で得られた結果は、S100B蛋白が糖エネルギー代謝に重要な役割を担っていることを示唆している。S100Bは主に神経系で炎症に関与することが知られているが、糖エネルギー代謝への関与は全く新しい知見である。現在施行中の本実験により、上記結果が確認され、その機序を明らかにすることができれば、S100Bを肥満・糖尿病の新たな治療目標分子として意義づけることができる。平成27年度はS100Bホモノックアウトマウス(S100BKO)・野生型C57B6Jマウスを高脂肪食群および通常食群に分け、マウス数を増やして512週間飼育した。飼育6週あるいは12週目に空腹血糖値、経口ブドウ糖負荷試験、さらにインスリン負荷試験の評価を行った。また12週終了後に深麻酔科で静脈血、副睾丸周囲脂肪組織、肝臓、膵臓、下腿筋を採取し、遺伝子解析、サイトカイン測定、脂質測定、組織学的評価に供した。得られた結果として、高脂肪食負荷時に、S100BKO群は野生群に比べ、1)体重は有意差を認めなかった、2)ブドウ糖負荷試験では耐糖能の改善傾向が見られた、3)ブドウ糖負荷時のインスリン分泌は、高脂肪食負荷5週目ではKO群で有意に高値であった、4)インスリン感受性の改善傾向が見られた、5)血清中性脂肪が有意に高値であった、6)高脂肪食負荷5週目でレプチンが高値、7)肝臓の遺伝子発現ではELOVL7,3, FAS, Slco1a1, Cyp7b1, Ces1Gなど脂質・胆汁酸代謝に関連する分子の変動が見られた、8)各臓器の組織学的の検討では明らかな差を認めなかった。以上の結果は、S100B蛋白が糖・脂質代謝に一定の役割を担っていることを示唆している。S100Bは主に神経系で炎症に関与することが知られているが、糖・脂質代謝への関与は新しい知見であり、今後S100Bを糖尿病・高脂血症の新たな治療目標分子として展開できる可能性がある。二つ目の課題である糖尿病細小血管障害に対する検討については、S100BKOマウスを肥満・糖脂質代謝の実験に集中したため、予備実験に着手した段階である。

STZ投与による糖尿病モデルを作成して飼育中であり、今後、神経機能評価および末梢神経組織の生化学的・組織学的評価を行う必要があると考えられる。本研究は糖尿病・肥満における全身の慢性炎症の新たなメディエータとして、S100B蛋白に着目したものである。S100Bノックアウトマウスを用いた検討により、高脂肪食負荷時に、S100BKO群は野生群に比べ、ブドウ糖負荷試験ではインスリン分泌の亢進と耐糖能の改善傾向、インスリン感受性の改善傾向、血清中性脂肪・レプチンの高値、肝臓の脂質・胆汁酸代謝に関連する分子の変動が見られた。以上の結果は、S100B蛋白が糖・脂質代謝に一定の役割を担っていることを示唆しており、今後S100Bを糖尿病・脂質異常症の新たな治療目標分子として展開できる可能性がある。昨年度の報告書に記したとおり、S100BKOマウスの繁殖に予定外の時間を要したため、現在も当初計画よりやや遅れた進捗状況である。しかし第一の目的である耐糖能に関する検討は興味深い結果が得られつつあり、期間内に必要な検討を終えられると予想している。第二の目的である糖尿病細小血管障害に対する検討については、耐糖能の検討に使用するマウスの確保が終了した段階で開始する予定であり、当初計画よりも遅延する可能性がある。代謝学マウスの繁殖速度が最も進捗に影響しているため、繁殖と予備実験に同じ個体を用いるなど、時間的に効率化を図る。具体的には通常食の雄S100BKOマウスをペアリングに用いつつ、基本的な神経機能の評価を行い、今後の糖尿病誘発群との予備的な比較に利用する。また予算の範囲内でキット類を使用し、測定の迅速化を進める。理化学研究所BRCにS100Bノックアウトマウスを購入依頼したが、事前に同施設より得た情報ではホモノックアウトマウスで納入される予定であった。しかし同施設における凍結保存胚からのホモノックマウス作成が不調であったため、ヘテロマウスでの納入となった。そのため、まずヘテロマウスからホモマウスを作製する手順が必要となり、予定よりも数カ月の遅れが生じている。実施中の少数個体を用いた高脂肪食負荷予備実験および細胞実験の結果を確認し、本実験の内容を適宜修正したうえで開始する。平成26年度末までに、肥満モデル実験の検討を完了したい。並行して、少数個体において薬剤性糖尿病を誘発し、糖尿病モデルにおける末梢神経障害など合併症に関して予備実験を施行する。
キンギョのまだら模様体色パターン形成における体色調節ホルモンの役割

キンギョのまだら模様は皮膚の色素胞の分布の違いによってもたらされる。本研究では色素胞の分化と維持に体色調節ホルモンが果たす役割を検討した。シュブンキンの黒色素胞と黄色素胞ならびにワキンの黄色素胞において特異的に発現するMCH受容体とMSH受容体が、これらの色素胞の分化と維持に関わることが明らかとなった。一方、MSH受容体のアンタゴニストであるASPは、シュブンキンのまだら模様形成に関与しないことが示唆された。黒色素胞刺激ホルモン(MSH)とメラニン凝集ホルモン(MCH)は硬骨魚類の皮膚色素胞における色素運動を調節し、生理学的体色変化を引き起こすホルモンである。MSHは色素胞の分化も誘導し、形態学的体色変化も引き起こす。本研究はシュブンキンやニシキゴイに特徴的な体色のまだら模様形成におけるこれらのホルモンの役割の解明を目的とする。今年度は黄色素胞を持ち、黒色素胞を持たないワキンの鱗をモデルとして、MSH受容体(MC1RとMC5R)とMCH受容体(MCHR2)の発現分布と動態の解析、ならびにMSH遺伝子の新たなサブタイプの検索を行った。ワキンの鱗においてホルモン受容体が黄色素胞特異的に発現しているか否かをマイクロダイセクションと逆転写PCRの組み合わせによって検討した。しかしこの方法ではmRNAを検出することができなかった。そこで鱗のホールマウントin situハイブリダイゼイション(WISH)を行った。その結果、MC1RとMC5Rが黄色素胞において発現することが明らかとなった。ワキンを黒背景または白背景下において一定期間飼育した。鱗1枚当たりの黄色素胞数を光学顕微鏡観察により算出した。また鱗内のMC1R、MC5R、MCHR2 mRNA含量をリアルタイムPCR法により測定した。その結果、背馳応答による体色変化には生理学的体色変化に加えて形態学的体色変化も寄与すること、その際の形態学的体色変化に黄色素胞におけるこれらのホルモン受容体発現量の変化が連動することが示唆された。MSH遺伝子のサブタイプを新たに2つ、cDNAクローニングによって同定した。これらのサブタイプは、既知のサブタイプに比べてMSHのアミノ酸配列が異なっていた。黒色素胞刺激ホルモン(MSH)とメラニン凝集ホルモン(MCH)は硬骨魚類の皮膚色素細胞における色素運動を調節するホルモンである。MSHは色素細胞の分化も誘導する。MSHの作用を拮抗阻害するアグーチシグナリングタンパク質(ASP)は腹側の皮膚における鱗以外の真皮組織において特異的に発現し,体色の背腹パターンを形成する。皮膚色を指標にしてシュブンキンの背側と腹側の皮膚を類型化した。シュブンキンの皮膚においてMSH受容体であるMC1RとMC5R,MCH受容体であるMCHR2,ならびにASPが発現することが逆転写(RT-)PCR法により示された。さらにMCHR2の発現は背側皮膚において腹側皮膚よりも多いこと,ASPの発現は腹側皮膚において背側皮膚よりも多いこと,皮膚の色の違いは両者の発現量と関連しないことが示唆された。MC1RとMC5Rの発現と皮膚の色との関係は明確ではなかった。さらに詳細に解析するため,ワキンのMC1R,MC5R,MCHR,およびASPをcDNAクローニングしてmRNAの定量系を構築した。ワキンの鱗の色素胞におけるMC1R,MC5R,MCHR2の発現を明らかにするため,シングルセルPCR法を試みたが,再現性のある結果が得られなかった。皮膚の黒化は黒色素胞の異所的な分化による。白色水槽において長期間飼育されたワキンを黒色水槽に移したところ,1日で背側の皮膚と背鰭の一部が黒化し,数日で元の赤色に戻ることを見いだした。カレイの仲間において背景色が黒化現象に関わることが知られている。実験的に取り扱いが容易なキンギョにおいて同様の黒化現象を見いだしたことは,魚類における黒化メカニズムの解明において極めて有意義である。本研究はシュブンキンに特徴的な体色のまだら模様形成におけるこれらのホルモンの役割の解明を目的とする。最終年度である平成26年度では、背景色がシュブンキンの鱗色素胞に及ぼす影響を検証した。また、シュブンキンの多様な鱗において発現するMSH受容体(MC1RMC5R)の発現分布を、ワキンから得られた遺伝子情報をもとにして検証した。シュブンキンを14日間白水槽または黒水槽で飼育した後、それぞれの水槽のキンギョを白水槽と黒水槽に分配してさらに14日間飼育した。この過程における体色と色素胞の変化を調べた。

その結果、シュブンキンは背景色の明暗に応じて体色の明暗を変化させること、黒色素胞と黄色素胞どちらにおいても、黒背景下では色素顆粒が拡散し、白背景下では色素顆粒が凝集することが明らかとなった。ワキンのMC1RMC5Rを増幅するプライマーを用い、逆転写PCRを行った。脳RNAからはMC1RからMC5RまですべてのMCRが増幅された。鱗を黒色素胞と黄色素胞の有無によって4種類に分類し、それぞれのRNAを鋳型として逆転写PCRを行った結果、MC1RとMC5Rは黒色素胞と黄色素胞のどちらにも発現するが、MC3Rは色素胞以外の細胞に発現することが示唆された。MC1RとMC5Rの演繹アミノ酸配列をシュブンキンとワキン間で比較した結果、MC1Rには2残基(K104T、S130F、左がワキンで右がシュブンキン)、MC5Rには3残基(A6S、T26A、F166L)に違いがあったものの、アミノ酸の一致率はMC1R、MC5Rとも99%であり、魚種間で機能に違いはないと考えられる。魚類内分泌学ワキンの鱗において発現するMCRのWISHによる検出法を確立した。本法はシュブンキンおよびニシキゴイの鱗にもそのまま応用できる可能性が高い。また、黒または白背景飼育によるワキンの形態学的体色変化とホルモン受容体の発現変動は、シュブンキンにおいても同様に起こることが期待される。シュブンキンにおいてまだら模様を形成する色素胞には黄色素胞の他に黒色素胞があり、また虹色素胞の分布も光の反射の差を生み出す重要な要素である。本研究の結果は、シュブンキンにおけるこれらの色素胞の消長とホルモン受容体の発現動態の関連を検証する重要な足掛かりとなるものである。MSH遺伝子を解析する過程で、本遺伝子の新たなサブタイプを2つ同定した。これは本研究の想定外であった。興味深いことに、これらのサブタイプから生じるMSHは既知のサブタイプから生じるMSHと異なるアミノ酸配列を持つ。したがって新たなMSHは色素胞に対して既知のものと異なる活性を示す可能性がある。当初の研究目的はシュブンキンの皮膚において発現するMCR,MCHR,ASPをcDNAクローニングすること,皮膚の色の異なる領域におけるそれぞれの遺伝子発現をRT-PCRによって評価すること,さらにそれらの定量系を構築することであった。シュブンキンとワキンの遺伝的差異は極めて少ないと考えられることから,当該年度ではワキンのMCR,MCHR,ASPの遺伝子情報を元にしたRT-PCRを行い,シュブンキンの各皮膚領域において発現するMCRサブタイプを明らかにした。また半定量的評価によってMCHRとASPの発現量が皮膚色と対応しない可能性を示した。さらにワキンのMCR,MCHR,およびASPのmRNA定量系を構築した。今後はこの定量系がシュブンキンの各遺伝子に適用できるか検討する必要があるが,当初の目的は達成できた。色素胞1つからMCRおよびMCHRのmRNAを検出するため,シングルセルPCR法を試みたが,再現性のある結果は得られなかった。mRNA量が本法の検出限界以下であることが示唆されたことから,別の方法としてマイクロダイセクション法の適用を検討する。この変更は当初の研究計画の想定内である。
干拓で変貌する予定の河口域の幼稚魚生育場としての意義関する研究

干拓事業で失われる予定の水域における幼稚魚成育実態を明らかにすることを目的に、1993年3月から12月に長崎県諌早湾に注ぐ本明川の河口で稚魚網による採集と塩分、水温と流速の観測を行った。採集結果は、河口域を潮流とともに流下する稚魚数として計数するとともに、稚魚網でろ過した水塊の満潮時における位置を流速から逆算、感潮域における仔稚魚類の地域分布を推定した。さらに、最も多く採集されたコイチについて胃内容を調べ、プランクトンの組成との比較から、餌料の面からの仔稚魚類の水域利用形態を明らかにした。調査期間の現場の水温は、6.4-27.1°Cであった。塩分は、0-23.9‰の間で変化したが、特に6-8月の間で満潮時でも14.6‰以下と低い値を示した。このような環境の中で、3月から12月に12科29種、16,379尾の稚魚が採集された。このうち、ハゼ科魚類が17種、9,364尾で、57%を占めた。特に個体数が多かったのはコノシロ、コイチ、ハゼクチ、ショウキハゼ、シモフリシマハゼとワラスボで、この6種で全体の85%を占めた。有明海特産魚8種のうち、ハゼクチ、ワラスボ、ムツゴロウ、ヤマノカミの4種が幼期にこの水域に生息することが分かった。多くが河口域外で産卵され、幼期に来遊するものであったが、出現状況から、様々ん河口域利用形態であることが分かった。コイチは、来遊当初から感潮域の広い範囲に分散し、比較的短い期間過ごして域外に出るので、河口域では、狭い体長範囲の個体のみが存在する。ハゼクチは、河口からしだいに上流へ分布を広げ、成長にともない上流側に片寄って分布するようになる。特に長期間多くの個体が採集されたコイチとショウキハゼについて環境の塩分と採集個体数との関連をみたところ、0-23‰の範囲で相関は認められず、幼期に塩分耐性の広い魚類がこの水域を成育場として利用することが分かった。