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C_1微生物に特異な新規結晶酵素の構造と反応機構の解明

(1)C_1微生物に特異な新規酵素の精製と大量調製および酵素化学的特性の解明C_1微生物Hyphomicrobium methylovorumの特異な新規酵素イソクエン酸リアーゼ(ILC)の精製と性質および一次構造の解析を行った。すなわち、まずHyphomicrobium属細菌におけるICL活性の分布について再検討した結果、SH保護剤としてジチオスレイトールゐ粗抽出液に添加し、ICL活性を特異的に測定することにより、すべてのHyphomicrobium属細菌に有意なレベルのICL活性が検出された。そこでH.methylovorumGM2からICLをメチロトローフとして初めて単一に精製し酵素化学的性質を解明した。これらの性質はC_2化合物代謝に関与するICLの性質と類似していた。セリンーグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ(SGAT)については高発現ベクターを有するE.coli pKK223-3/SGATから得られた菌体を用いて酵素の大量精製を行い単一の標品100mg以上を得ることができた。(2)C_1微生物に特異な新規酵素の結晶化とX線結晶解析ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ(HPR)についてはすでに成功しているアポ型酵素の結晶化法を基に補酵素NADを結合させたホロ型酵素のbipyramid形の結晶を調製しX線結晶解析を行った結果、NADが予想された結合部位に入っていることがわかった。さらにアポ型の構造の触媒部位と基質結合部位の間のクレフトの角度に変化が起こっているという予想に反してアポ型のタンパク質と構造がほとんど変わらなかった。さらにホロ型酵素の結晶と本酵素の基質アナログとから基質-酵素複合体の結晶を取得したので、現在X線結晶解析中である。SGATについてはE.coli pKK223-3/SGATが生産した精製酵素をCrystal Screen Iを用いてhanging drop法により結晶化を行った結果、菱形板状の結晶を得た。この結晶化条件をもとにさらに現在良質の結晶を得るべく条件検討中である。(3)C_1微生物に特異な新規酵素HPRの酵素化学的反応機構および動力学的反応機構の解析SGATについてCook教授のグループによりストップドフロー法やCD、同位体標識した基質を用いて反応動力学的解析の結果、本酵素は他のトランスアミナーゼとは異なる新しい反応機構で触媒することがわかった。今年度の本研究の研究実績はつぎのようにまとめられる。(1)C_1微生物に特異な新規酵素の精製と大量調製および酵素化学的特性の解明C_1微生物Hyphomicrobium methylovorumの特異な新規酵素イソクエン酸リアーゼ(ICL)の精製と性質および一次構造の解析を行った。そこでH.methylovorum GM2からICLをメチロトローフとして初めて単一に精製し酵素化学的性質を解明した。酵素のサブユニット分子量62kDaのホモテトラマ-で、コファクターとしてMg^<2+>を要求した。またコハク酸、シュウ酸、グリコール酸等によって強く阻害されることがわかった。

これらの性質はC_2化合物代謝に関与するICLの性質と類似していた。セリン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ(SGAT)については高発現ベクターを有するE.coli pKK223-3/SGATを37度14時間振とう培養を行って得られた菌体を用いて酵素の大量精製を行った。湿菌体を50mMリン酸バッファーに懸濁して超音波破砕して無細胞抽出液を得、硫安分画、DEAE-Sephacelカラムクロマトグラフィー、Sepharose 6Bゲルろ過カラムクロマトグラフによって精製し、電気永動的に単一の標品100mg以上を得ることができた。(2)C_1微生物に特異な新規酵素の結晶化とX線結晶解析ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ(HRP)についてはすでに成功しているアポ型酵素の結晶化法を基に補酵素NADを結合させたホロ型酵素のbipyramid形の結晶を調製しX線結晶解析を行った結果、NADが予想された結合部位に入っていることがわかった。さらにアポ型の構造の触媒部位と基質結合部位の間のクレフトの角度に変化が起こっているという予想に反してアポ型のタンパク質と構造がほとんど変わらなかった。さらにホロ型酵素の結晶と本酵素の基質アナログとから基質-酵素複合体の結晶を取得したので、現在X線結晶解析中である。SGATについてはE.coli pKK223-3/SGATが生産した精製酵素をCrystal Screen Iを用いてhanging drop法により結晶化を行った結果、菱形板状の結晶を得た。この結晶化条件をもとにさらに現在良質の結晶を得るべく条件検討中である。(3)C_1微生物に特異な新規酵素HPRの酵素化学的反応機構および動力学的反応機構の解析SGATについてCook教授のグループによりストップドフロー法やCD、同位体標識した基質を用いて反応動力学的解析の研究が進行中である。今年度の本研究の研究実績はつぎのようにまとめられる。(1) C1微生物に特異な新規酵素SGATの精製酵素の大量調製C1微生物HyPhomicrobium methylovorumの特異な新規酵素セリン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ(SGAT)についての研究を行うため、すでに取得しているそれぞれの高発現大腸菌形質転換株より本酵素の効率的精製法を改良し大量精製法を確立した。すなわちまず高活性組換え菌株E.coliHB101/pKK20-3 SGAPからのSGATの精製をおこなった。培養液7literから湿重量29.5gの菌体を得、ソニックにより無細胞抽出液76.0mlを取得した。その後硫酸アンモニウム分画、DEAE-sephacel、Sepharose 6Bゲルろ過クロマトグラフィーを行ったのち、活性画分を回収、限外ろ過濃縮した。その結果、総タンパク質量37.2mg、全活性3370Uの酵素溶液2.2mlを取得した。
治療抵抗性気分障害におけるインスリン抵抗性の病態生理学的影響に関する検討（国際共同研究強化）

本研究は、気分障害における病態生理学的メカニズムの解明を目指し、新規解析方法の確立のため、オタワ大学およびマギル大学と共同し、fMRI解析およびMRS-GABAに関する技術交流を行った。オタワ大学はfMRI解析に関してPower-Law Exponent (PLE)の先進的研究を実施しており、われわれは、先ず健常人を対象として、表情認知課題における前部帯状回の活動抑制に関連したPLE解析を実施した。fMRI信号を高速フーリエ変換した際のパワー値と周波数分布をlog変換することで、線形成分を排出し、この傾きをβと定義した場合、β値は表情認知課題の反応速度と有意に関連していることが分かった。内定年度:2015気分障害の治療に関しては、新規抗うつ薬の開発や非定型抗精神病薬の併用療法など、多様な選択肢が出現したにも関わらず、寛解率そのものは向上していない。本研究は、特に抑制系伝達物質としてもインスリン抵抗性の形成にも双方に深く関与していることが知られているGABAに焦点を当てて、治療抵抗性気分障害群、治療反応の得られた気分障害群、および健常群の3群を対象として、空腹時採血によるインスリン抵抗性の定量的評価、2超音波診断装置を用いた頚動脈内膜・中膜複合体厚測定(IMT)、3 MRI-T1強調および拡散テンソル画像、脳血流検査(ASL)、安静時機能的MRI、MRSによるGABA濃度測定などのMRI諸検査、イオマゼニルSPECTを用いたGABA-Aレセプター分布の定性的評価を施行し、各群間・群内において、インスリン抵抗性や動脈硬化重症度、大脳灰白質の局所体積や連結性、あるいは大脳白質の異方向性比率、灰白質内GABA濃度やGARA-Aレセプター分布など多因子の関連性を包括的に解析・検討するものである。今年度は、オタワ大学長期研修中に、20症例の収集を完了し、マルチモダリティーデータの解析技術の開発・習得を行っている。なお、今年度は、渡航に向けて交付申請を行ったのみであり、本経費を執行しての研究は行っていない。現在20症例を収集完了しており、本年度内に健常群について目標症例数の収集が完了する予定である。健常群収集と並行して、患者群の収集を開始する予定であり、この体制も整っている。データ収集に並行して、マルチモダリティデータの解析技術の開発・習得を行っている。平成27年度は、10月からオタワ大学へ長期研修を行い、同実験に従事していた。本研究は、特に抑制系伝達物質としてもインスリン抵抗性の形成にも双方に深く関与していることが知られているγ-アミノ酪酸(GABA)に焦点を当て、治療抵抗性気分障害におけるインスリン抵抗性の病態生理学的影響を明らかにすることを目的に、治療抵抗性気分障害群、治療反応の得られた気分障害群、および健常群の3群を対象として、空腹時採血によるインスリン抵抗性の定量的評価、超音波診断装置を用いた頚動脈内膜・中膜複合体厚測定(IMT)、MRI-T1強調および拡散テンソル画像、脳内血流検査(ASL)、安静時機能的MRI、MRスペクトロスコピー(MRS)によるGABA濃度測定などのMRI諸検査、イオマゼニルSPECTを用いたGABA-Aレセプター分布の定性的評価を施行し、各群間・群内において、インスリン抵抗性や動脈硬化重症度、大脳灰白質の局所体積や連結性、あるいは大脳白質の異方向性比率、灰白質内GABA濃度やGARA-Aレセプター分布など多因子の関連性を包括的に解析・検討するものである。その際、得られたマルチモダリティーデータ解析のための新規技術開発のため、マギル大およびオタワ大との共同研究を行った。健常群データの収集は目標数(40例)を収集完了し、これらについて、現在解析を始めている。治療抵抗性気分障害群、治療反応の得られた気分障害群(目標症例数各30例)の収集については、若干遅れているが、おおむね順調に進展している。本研究におけるMRS-GABA解析には、Near, Ph.D. (カナダ・マギル大)の支援を得た。また、PLE解析には、Northoff, M.D., Ph.D.(カナダ・オタワ大)の技術援助を得た。先ず、MRS-GABAについて述べる。健常高齢者において、後部帯状回および前部帯状回におけるGlx濃度はMean diffusivityと有意な負の関連性が見られた。このことは、グルタミン+グルタメートの過剰が、軸索走行異常に関連している可能性を示唆するものと考えられる。さらに、右下前頭回におけるGABA-aレセプター濃度は、注意機能と有意に正相関していることが明らかになった。同時に、ASLを用いた脳血流検査、およびVBMを用いた大脳灰白質検査においては、注意機能検査との間に、有意な関連性を認めなかった。右下前頭回は、後部帯状回と注意機能ネットワークを形成しているとの仮説が示されている。GABA-Aレセプター・イメージングは、脳形態学的変化や脳血流の異常に先行するとの報告もあり、今回の結果は、これを指示するものと考えられた。resting functional MRI(fMRI)を用いた解析について述べる。Resting fMRIは、被験者が安静時注視点を眺めている状態でBOLD信号測定を行うことで、安静時における脳機能ネットワークの計測を行う手法である。領域ごとの時間波形を2つずつ組にして波形の相関を求める。時間波形が正の相関を示している脳領域どうしは、互いに機能的連絡を保っていると考えられる。

本研究で得られる解析技術は、他の精神疾患の脳画像におけるマルチモダリティ・データの解析にも応用できることから、汎用性の高い国際共同研究と言えると考えている。本研究は、気分障害における病態生理学的メカニズムの解明を目指し、新規解析方法の確立のため、オタワ大学およびマギル大学と共同し、fMRI解析およびMRS-GABAに関する技術交流を行った。オタワ大学はfMRI解析に関してPower-Law Exponent (PLE)の先進的研究を実施しており、われわれは、先ず健常人を対象として、表情認知課題における前部帯状回の活動抑制に関連したPLE解析を実施した。fMRI信号を高速フーリエ変換した際のパワー値と周波数分布をlog変換することで、線形成分を排出し、この傾きをβと定義した場合、β値は表情認知課題の反応速度と有意に関連していることが分かった。オタワ大学において、SPECTおよびMRIデータの解析技術を、現在学習・開発中である。またマギル大学ともミーティングを継続しており、MRSシーケンスの提供を受け、かつ解析技術の学習を行っている。今後も両大学と共同でマルチモダリティデータの解析技術の開発・習得を進め、本研究で収集したデータの解析を進める。今後もマギル大、オタワ大と解析技術に関する知見の交換を行いながら、得られたマルチモダリティデータと精神症状、認知機能の関連性を解析するとともに、ここで得られた画像解析技術を、他の精子心疾患の脳画像解析に応用する方針である。精神医学
樹木の長命細胞をモデルとした新規細胞死発現機構の解明

本研究では、放射柔細胞の細胞死発現機構の解明を通じて心材形成の制御機構を明らかにすることを最終目標として、細胞死過程のイメージング解析に加えて、細胞死に伴う遺伝子発現の網羅的解析を行い、細胞死に伴って特異的に発現量が大きく変化する遺伝子や生成されるタンパク質の局在を明らかにする。本年度は、放射柔細胞の細胞死過程のイメージング解析を中心に研究を進めた。これまで、放射柔細胞が細胞死を迎えるまでの形成層からの距離は細胞ごとにばらついていることが報告されている。したがって、細胞死の進行程度を評価する上で、仮道管のように形成層からの距離を用いることは出来ない。そこで、核の形態変化を細胞死進行の指標としたインタクトな放射柔細胞における細胞死過程の解析、および、二次代謝を伴った細胞死を人為的に誘導する実験系を用いた解析を行った。トドマツを供試木として核の形態変化を細胞死進行の指標としたインタクトな放射柔細胞における細胞死過程の解析を行った結果、微小管の消失のタイミングが短命の放射仮道管とは異なることを明らかにし、長命細胞である放射柔細胞の細胞死過程が、道管や仮道管などの管状要素の細胞死と異なる機構をもつ可能性を示した。加えて、デンプン粒の消失のタイミングは、核の形態変化とは連動しないことを明らかにした。スギおよびカラマツを供試木として、二次代謝を伴った細胞死を人為的に誘導する実験系の中で起こる放射柔細胞の変化を解析し、インタクトな放射柔細胞の細胞死過程との比較を行った。本実験系の放射柔細胞においては、核の変形およびデンプン粒の減少が認められたが、これら細胞内における変化が起こるタイミングは、インタクトな放射柔細胞とは異なり細胞ごとにばらつきがほとんど認められなかった。この結果から、本実験系を用いることで、二次代謝を伴った放射柔細胞の細胞死過程を経時的に明らかにできることを示した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
言語行動異常検査のためのオンライン認知関連電位計測・処理システム

1.前年度において作成した認知関連電位計測・処理システムに、DMAデータ収集モジュールを付加して言語課題負荷に対する反応成績逐一検査のための反応時間(RT)計測を実行可能とし、言語課題負荷制御と認知関連電位(ERP)・反応時間同時自動計測・処理を並列して行うオンライン検査システムを構成した。2.上記システムを用いて正常者および言語認知・理解に異常を示す精神疾患者、特に分裂病者を対象に臨床実験を行い、システムの臨床応用上の問題点をランダム系列発生、言語・非言語刺激データ編集ファイル化、言語課題両耳呈示負荷、認知関連電位処理、RT計数、加算誘発反応グラフィック呈示・ファイル化、ERPプロットと特徴パラメタ抽出・ファイル化、RT統計計算、ERP・RTパラメタプリントおよびバックアップ用のオフラインERP・RTファイル生成に関する個々のプログラム・アルゴリズムのソフトウェアに着目して検討し、所期の目的を果すことを確認した。3.さらに、本システムの結果ファイルを中央コンピュータに転送し、特に正常者と服薬・未服薬患者間の判別を既設の統計計算パッケージを用いて行い、本システムによって得られるデータを集積することにより、本研究のシステムを言語行動異常検査用ステーションとして利用し得ることを示した。4.本ステーションより得られたERPと言語行動およびその異常との関連を調べるために、聴覚系における両耳性情報処理の機構をニューロン-シナプス回路モデルにより記述し、さらに脳・神経系における脳内ニューロン-シナプス回路の活動と頭皮上電位との相関性をモデル化・シミュレーションすることにより脳内時系列情報処理とERPや脳波などの脳活動情報との意味的対応をとり得ることを示した。
成人の発達障害者に配慮した学習教材の表示デザイン

平成30年度は、自動車教習所の学科教習に対象を絞り、発達障害者の教習生の学科試験用自習教材アプリの試作と改良を実施した。学科教習問題において、わかりにくい言い回しや道路状況が把握しにくい設問を、イラストで可視化して理解を促すスマートフォン用教材アプリである。具体的には、「すみやかに」「間隔をあける」「必要はありません」のように、あいまいな文言を用いた設問を重点的に選んで、設問で表される場面をイラストで表現した。また、教習員の要望に合わせて試作教材の操作方法や画面レイアウトを素早く改良できるよう、アプリ制作用プロトタイピングツールを使用した。そして、大学生8名を実験協力者として使いやすさ評価実験を行った。「教習所で使用される学科教材ソフト」「無料でダウンロードできる学科試験対策アプリ」と、試作した3種類の教材アプリを評価した。各教材について、System Usability Scale用紙を用いて5段階で評価してもらった。試作教材の使いやすさにおいて大きな欠点は見つからず、教材アプリのインタフェースデザインの方向性は間違っていないことが確認された。次に、発達障害のある教習生を指導できる鹿沼自動車教習所の教習員4名に教材アプリの評価を依頼した。「解答に迷う設問は再復習できる機能が必要」「解答画面にも設問の同時表示が必要」など、教材アプリの操作方法よりも、設問を理解させる方法に対する改良の要望を数多く受けたため、研究日程上、可能な範囲内で教材アプリの表示画面の改良を行った。また、教材アプリで自主学習を続けるには、やる気の維持が必要である。そこで、学習意欲を持続させる機能を教材アプリに付加するために、アプリを用いて自己肯定感が向上する手法の実験検討を実施した。平成29年度の静岡文化芸術大学教員特別研究「発達障害者向け自動車運転免許取得のための支援教材の検討」において、早期に研究を立ち上げていたため、教材アプリの改良に予想以上の時間を要したが、ほぼ予定通りに研究は遂行できている。試作教材アプリの有効性を確認するために評価実験を行う必要がある。自動車教習所の場合、所内で仮運転免許学科試験が行われて、試験結果も所内で採点分析できる。この試験を利用して、教材アプリによる学習効果の評価を行う。そして、教材アプリを試用する教習生の要望に応じて、より理解しやすいイラストや表示画面のデザイン改良を行う。教材アプリを改良するための人件費(アルバイト代)全額を当該年度の個人研究費で充当したため、次年度使用額が生じた。この予算は、次年度の教材アプリ制作とイラスト制作のための人件費で使用する計画である。
形状制御単結晶粒子による高信頼性粒子配向圧電セラミックスの開発

1.(K,Na)NbO3(KNN)系セラミックスの粒子配向制御に使用する板状NaNbO3(NN)結晶粒子の改良をおこなった。NaClとKClの混合塩を用いた一段階溶融塩法により合成した際には、単板状粒子が凝集した形状のNN結晶粒子が得られる。この凝集形状のNN結晶粒子へ施す超音波後処理の条件を調整した。超音波処理を行う媒質、容器の材質、洗浄槽内に固定する容器の位置等を最適化することにより、より効率的な凝集板状結晶粒子の解砕が実現された。マイクロメッシュを併用することにより、平均粒径が従来の70%に減少した。加えて粒径分布の非常に小さな単結晶粒子が得られた。2.この改良されたテンプレートを用い、配向制御に必要なテンプレートの重量混合比を従来の5wt%から0.5wt%へと1/10に削減する手法を開発した。テンプレート使用量の減少に伴い、配向セラミックスの作製に必要な焼結温度は低下した。0.5wt%までテンプレート使用量を減らした場合でも、得られた配向焼結体の配向度や圧電定数は、テンプレート使用量が5wt%の時と同等であった。一方、テンプレート使用量の減少に伴い、焼結体に異常粒成長の発現が頻出した。この原因は、従来のテンプレート自身に含まれていたBi成分が配向焼結体の異常粒成長を抑制していたこと、作製法の改良に伴うテンプレート使用量の削減により焼結体に混入するBiが不足し、異常粒成長が抑制できなくなったことが原因であることが判明した。焼結前のKNN仮焼粉へBi2O3を後添加することにより、テンプレート量を減らしても異常粒成長を抑制できるも確かめられた。LiやK成分を多量に含有する板状NaNbO3テンプレート粒子の作製には成功しなかったが、当初の見積もり通り、従来よりも粒径の小さく粒度のそろった板状NaNbO3テンプレート粒子を作製することができた。この小型化されたテンプレートを用いることにより、テンプレート粒子の使用量を従来よりも大幅に減らすことに成功した。このため、初年度の研究目的をほぼ達成することができた。今年度確立された小型少量のテンプレートによる配向セラミックスの作製法を用い、粒径のより小さな配向焼結体を作製するための諸条件を決定する。粒径の小さな焼結体が得られたならばその機械的強度や高電界印加時の信頼性評価を試みる。物品費で購入したマイクロスコープの入札価格が予想よりも安価であったため、直接経費に残が発生した。
児童期・思春期における不定愁訴症候群の発生メカニズムに関する社会生態学的解明

近年自律神経系の不調をともなう不定愁訴(起立性調節障害、OD)を訴える児童が非常に高い頻度で観察される。研究者らの昭和56年以来の広範囲(日本、タイ)にわたる調査結果からすると調査地によって変動が大きく小学生で350%、中学生、高校生では1560%程度がODと判定される。これらの児童は夜更かし、朝の覚醒状態の不調、不定期の排便、朝食の欠食、午前中の不調、注意力の散漫、乗り物酔い、倦怠感などの諸症状を訴え、自律神経平衡悦が特に午前中に乱れており、学校生活や社会生活上も様々な不適応症状を引き起こしている。しかも、こうした現象は北京やバンコクでも共時的に見い出されており、都市化との関係が注目される。しかし、これらの不定愁訴は特定の独立した疾患ではなく死亡に至る危険性もないために、医学的にも関心も低く今日に至っているが、その高い頻度は社会的にも教育的にも重要な問題となりつつある。そこで本研究では児童生徒の不定愁訴は単に生物学的・病態学的にのみ説明されるものではなく、高度に情報化されつつある社会状況のもとで社会生態学的視点からも解明されるべきであるとの立場から日本全国の児童生徒集団を対象に生活環境やライフスタイルと不定愁訴の関係を疫学的に追及した。その結果は以下の様に要約される。1.ライフスタイルは一連の変数のセットとして把握すべきである。特に就寝時刻と起床時刻の組み合わせは重要である。本研究ではこの2変数による座標空間が歴史・社会的に子どものライフスタイルを表現しうることを示した。2.子どもは生活の自律性を欠いており、自然覚醒率は20%程度である。また中高校生の50%が睡眠不足である。その連鎖として朝食の欠食、排便の不良、午前中の不調、夜食、深夜化した生活が現われている。3.ODは本研究では小学生3%、中学生男子11.5%女子15.3%、高校生男子13.1%、女子17.7%であって従来の報告よりは低い結果が得られたが、約40%が午前中の体調不良を訴えていた。4.子ども達の生活の深夜化が一段と進み、ついに高校生は就寝時刻が0時を越えてしまった。近年自律神経系の不調をともなう不定愁訴を訴える児童が非常に高い頻度で観察される。これらの児童は一般に夜更し、朝の覚醒状態の不調、不定期の排便、朝食の欠食、午前中の不調、注意力の散漫、乗り物酔い、倦怠感などの諸症状を訴え、自律神経平衡が特に午前中に乱れており、学校生活や社会生活上も様々な不適応症状を引き起こしている。しかも、こうした現象はアジアの各地でも共時的に見い出されており、都市化との関係が注目される。本研究では児童生徒の不定愁訴は単に生物学的・病態学的にのみ説明されるものではなく、高度に情報化されつつある社会状況のもとで社会生態学的視点からも解明されるべきであるとの立場から居住環境の明確に異なる日本及びアジア地区から特徴的な児童生徒集団を抽出し、それらの教育環境と不定愁訴の関係を比較文化的かつ疫学的に追求している。

今年度は、日本児童生徒の平成4年6年までのデータ約27000人と、タイ国、東北地方ウボン県の都市と農村、および同国北部地方のチェンマイ県の都市と山岳地区(山岳少数民族を含む)のデータを整理、集計している。その結果、現時点では日本人についてのみの結果が明らかになっている。それによると起立性調節障害の陽性率は小学生3、4学年では男子1.5%、女子2.0%、同5、6年生1.1%と3.2%、であるが中学生(13年生計)では13.1%と16.5%と急激に上昇し、さらに高校生(13年生計)になって13.4%と17.2%と漸増することが明らかになった。従来、思春期に特有の症候群であるといわれた同症が高校生になっても減少せずかえって上昇することに重大な関心が払われるべきである。これは夜型化したライフスタイルと密接に関連づけて理解すべきであろうというのが今年度の主たる成果といえよう。今年度は日本人児童・生徒を対象として、自律神経系不定愁訴(OD)とその背景にある社会生態学的条件に関する調査を実施した。そのために,都市、農村、漁村等に層別化した調査標本5,749人を対象とした。その結果、以下の結論を得たが、さらに詳細な解析を現在継続中である。1.OD陽性率は小4から小5、小6、中1、中2、中3の順で男子では39.8%、35.8%、40.2%、47.5%、52.4%、56.1%で、対する女子では41.9%、46.9%、54.9%、60.9%、61.3%、62.7%と年齢とともに上昇していた。2.このODはかつてのように都市に多いとは言えず、近年では都市と農村の差が少なくなってきている。一方、見方によっては農村の方にODが多発しているとも言いうるような逆転が起きている。3.生活の夜型化が着実に進行し、それに伴ってODが増加している。近年自律神経系の不調をともなう不定愁訴(起立性調節障害、OD)を訴える児童が非常に高い頻度で観察される。研究者らの昭和56年以来の広範囲(日本、タイ)にわたる調査結果からすると調査地によって変動が大きく小学生で350%、中学生、高校生では1560%程度がODと判定される。これらの児童は夜更かし、朝の覚醒状態の不調、不定期の排便、朝食の欠食、午前中の不調、注意力の散漫、乗り物酔い、倦怠感などの諸症状を訴え、自律神経平衡が特に午前中に乱れており、学校生活や社会生活上も様々な不適応症状を引き起こしている。しかも、こうした現象は北京やバンコクでも共時的に見い出されており、都市化との関係が注目される。しかし、これらの不定愁訴は特定の独立した疾患ではなく死亡に至る危険性もないために、医学的には関心も低く今日に至っているが、その高い頻度は社会的にも教育的にも重要な問題となりつつある。そこで本研究では児童生徒の不定愁訴は単に生物学的・病態学的にのみ説明されるものではなく、高度に情報化されつつある社会状況のもとで社会生態学的視点からも解明されるべきであるとの立場から日本全国の児童生徒集団を対象に生活環境やライフスタイルと不定愁訴の関係を疫学的に追求した。その結果は以下の様に要約される。1.ライフスタイルは一連の変数のセットとして把握すべきである。特に就寝時刻と起床時刻の組み合わせは重要である。本研究ではこの2変数による座標空間が歴史・社会的に子どものライフスタイルを表現しうることを示した。2.子どもは生活の自律性を欠いており、自然覚醒率は20%程度である。また中高校生の50%が睡眠不足である。その連鎖として朝食の欠食、排便の不良、午前中の不調、夜食、深夜化した生活が現われている。
青少年保護育成条例が少年非行に及ぼす影響の実証分析

青少年を健全に育成することは社会にとって極めて重要な課題であるが、経済学の観点からの議論は日本においては少ない現状がある。本研究における学術的問いは、「各都道府県の青少年保護育成条例の施行は青少年の非行行動に影響を及ぼしたのか?」である。本研究課題で都道府県パネルデータを用いた分析と個票データを用いたプロビットモデルによる分析を予定している。当該年度は、当初の予定通り少年非行に関する資料収集と都道府県別データの構築を行った。本研究では青少年保護育成条例の都道府県ごとの制定時期や施行内容の違いに注目し、独自に条例のデータを構築し分析に用いる。このため、複数のリサーチ・アシスタントを雇用した。都道府県で施行時期、条例のあり方に違いのある青少年保護育成条例に注目することで、こうした条例の効果について分析を行うことが可能である。こうした条例の地域差は法学の立場から論じられてきたが、経済学的な分析は未だにされていない。規制事項として、有害図書等の制限、自販機の制限、健全育成を阻害する行為の規制の大きく3種類に分かれるが、29種類に細分化されている。青少年の保護育成に関する都道府県条例規制事項一覧から制定時期がわかるため、保護条例を制定もしくは施行した時期とそれ以降に1、それ以前の時期に0を付与した変数を作成した。また、少年非行に影響を与えると考えられる労働市場に関するデータや都道府県別人口当たり警察官数についてもデータ化を行った。得られたデータを分析し、その結果を2019年度に報告することを予定している。当該年度において、予定通りに、矯正図書館においての資料収集とデータ構築を進めた。2019年度に予定している学会発表に向けて順調に進捗している状況である。施行と制定の効果に関しては1年目にパネルデータ分析を終える予定であったが、資料収集を進めるうちに当初予定していなかった変数を分析に含める必要性が明らかとなった。このため、いくつかの点においては修正が必要となっている。ただし、2年目の研究報告において得られたコメントの修正と並行して進められるものであるため、おおむね予定通りに進んでいると言える。今後の研究の推進方策としては予定通り、2019年度は都道府県パネルデータ分析結果の発表と個票データの分析を進める。2019年6月に日本応用経済学会において研究成果を報告することを予定している。また、2019年秋ごろに個票データを入手し分析を始める予定である。初年度にパソコンを購入する予定であったが、データ構築と整備に重点を置いたため、パソコン購入を次年度に持ち越したため。
Exosomeを用いた「機能分子移植療法」の開発

前年度の研究結果を受け、本研究の第一目標であるexosomeが他の細胞の膜へ移動・融合し新たな機能分子として働くことを確認する作業に焦点を合わせた。方法としては、exosomeの分泌能が高くかつ分離精製が比較的容易なヒト末梢血由来樹状細胞を標的とし、アデノウイルスベクターによるHER2あるいはCEA発現システムを作り、この系を用いて、1)exosome上へのHER2およびCEAの発現および2)Exosomeの他の細胞への移動・接着を検討した。1)遺伝子導入した樹状細胞では膜表面での明らかな発現をFACSにて捕らえることはできなかったが、興味あることに、これら遺伝子導入樹状細胞より分泌されるexosomeへの発現がFACSにて確認された。すなわち、遺伝子導入により細胞膜への発現がなくともexosome上には発現誘導しうる可能性が初めて示唆された。2)さらに、遺伝子導入した樹状細胞の分泌したHER2やCEAを発現するexosomeが標的細胞膜上へ移動する像を共焦点レーザー顕微鏡により捕らえることができた。今回の研究において、exosome上に新たな分子を発現させることが可能であり、この分子が他の細胞膜へ移動・接着することはほぼ確認できた。しかし、本年度もこれら膜上に接着した新たな分子が機能していることは確認できなかった。しかし、本年度の研究成果は、「exosomeによる機能分子移植」といった全く新しい研究領域創生の可能性を支持する結果であり、他の機能測定が容易なレセプター系の遺伝子導入による系を検討中である。Exosomeの細胞間移動と機能解析HER2陰性乳癌細胞分泌exosomeをわれわれの開発したHER2抗体結合ビーズで精製し、精製exosomeをPKH26で蛍光標識し、他の乳癌細胞と混合培養する系において、exosomeが速やかに細胞表面に移動・結合することを共焦点レーザー顕微鏡において確認した(Anticancer Research 25:3703-3707,2005)。現在、この乳癌細胞表面へ移動したexosomeの細胞融合をFACSにて解析中だが、移動したexosomeと癌細胞膜との明らかな融合像を得ることには成功していない。しかし、exosomeは量依存性に乳癌細胞の増殖を促進させ、逆にHerceptinの効果を減弱させることが明らかとなり、乳癌細胞表面へ移動したexosomeが機能分子として作用している間接的なデータを得ることができた。Exosomeによる機能分子移植本研究の第一目標である、exosomeが他の細胞の膜へ移動・融合し新たな機能分子として働く系(機能分子移植)を確立するために、HER2陽性乳癌分泌exosomeや樹状細胞にHER2遺伝子を導入し、HER2発現樹状細胞exosomeをHER2陰性細胞と混合培養し、生物活性(細胞増殖)やシグナル伝達(HER2抗体結合シグナルの誘導による細胞内Ca増加)などにより検討中だが、現時点では、exosomeが機能分子として細胞に移植されたことを支持する直接的なデータは得られていない。
幼児期から成人期にかけてのコンピテンスの発達における日本文化の影響過程-縦断および横断資料に基づく発達・社会心理学的研究-

日本文化におけるコンピテンスの発達過程を実証的に明らかにすることが本研究計画の目的である。Harter(1987)によるコンピテンスに関する理論的枠組みと測定尺度、および、Markus & Kitayama(1991)の文化的自己観とその測定尺度(高田,2000)に立脚して、青年期・成人期・老人期を対象とした3つの横断的資料と、児童期から青年期にかけての縦断的資料を収集した。その結果、日本文化における幼児期から成人期にかけてのコンピテンスの発達過程について、以下の知見と結論を得た。(1)コンピテンスの構造に関して、一部の例外、とりわけ対人能力に関する下位領域を除き、各発達段階で基本的に原尺度とほぼ対応するコンピテンスの下位領域が認められる。(2)コンピテンスの発達経過に関しては、(1)幼児期青年期の縦断的検討によれば、大半の下位領域において幼児期から青年中期までコンピテンスの自己評価は一貫して低下した後、青年後期で上昇する。自己価値については、児童期中以降青年後期まで有意な変化は見られない。(2)青年期成人期の横断資料によれば、大半の下位領域と自己価値で、成人期に自己評価が上昇する。(3)成人期老人期の横断資料によれば、幾つかの下位領域と自己価値で、老人期に自己評価が上昇する、の各傾向が認められる。(3)文化的自己観との関係に関して、横断資料に基づく従来の知見に概ね合致する相互独立性・相互協調性の発達経過傾向が確認されたが、青年期と老人期の資料の一部で調査対象者の偏りに由来すると思われる例外が認められた。また、西欧文化を背景としたコンピテンスの概念は、日本文化においても一定の有効性を持つと考えられる一方、その発達過程は、相互協調的自己観が優勢な白本文化における自己認識の発達過程に概ね沿ったものであることが、自己スキーマの概念を援用した分析から示唆された。1.コンピテンスと文化的自己観の相互関係の確認30代・40代・50代成人合計600名を対象とした郵送調査を実施した。この調査は、(1)Harter(1986)の成人用コンピテンス尺度、(2)高田・大本・清家(1996)の文化的自己観尺度、(3)高田(1998)の成人規範尺度、を含むものである。約30%の回答率を得、予備的分析を行ったところ、以下のような結果を得た。(1)コンピテンスに関し、Harterが北米文化を対象として見出したようなコンピテンスの下位領域は明確には認められないこと、(2)加齢と共に相互碑立性は上昇し、相互依存性は低下すること、(3)加齢と共に規範遵守意識は上昇すること。これらはいずれも従来の知見を再認するものである。2.コンピテンスと文化的自己観に関する行動観察幼児期児童期前期のコンピテンスの諸様態に関する行動観察技法は、従来、一応の標準的技法が得られているが、この時期における文化的自己観の行動的反映に関する研究ならびに技法は皆無である。そのため、群馬大学付属幼稚園において幼児を対象とした予備的行動観察ならびに面接を実施した。その結果に基づき、相互独立性・相互協調性に関する行動観察カテゴリーを分析・開発中である。3.日本的コンピテンス測定のための暫定尺度の開発1で述べた資料について、(1)(3)の尺度の全てを含む探索的因子分析を実施したところ、各尺度ははっきりとは区分されず、相互が混淆した因子が幾つか認められた。

この結果を基礎に、日本的コンピテンスの構造をモデル化し、それに沿った尺度を開発するため、現在、確証的因子分析を通じて幾つかのモデルの妥当性を比較検討中である。日本文化におけるコンピテンスの発達過程を実証的に明らかにする本研究計画の一環として、本年度は成人期から老人期にかけてのコンピテンスの発達経過と、文化的自己観の内面化との関係を、(1)2・30歳代の若年成人、(2)4・50代の中年成人、(3)60歳以上の老人、の3群の計320名を対象に、質問紙調査により検討した。この調査の結果,以下の諸点が明らかとなった。即ち、(1)コンピテンスの構造に関しては、Harterの理論とほぼ一致する傾向が見られた、(2)コンピテンスの発達経過に関しては、コンピテンスの各下位領域と全般的自己価値共に、総じて老人期に上昇する傾向が見られた。(3)文化的自己観の内面化に関しては、年齢と共に相互独立性は上昇する一方、相互協調性は低下する傾向が見られた、(4)各年齢層群を通じ、コンピテンス・全般的自己価値と相互独立性との間には正の相関、相互協調性との間には負の相関が認められる、(5)コンピテンス、相互独立性、相互協調性の相互関係について、各年齢層群に共通する類型が存在する、等がそれである。これらの結果は事前の予測や従来の知見と一致するものも多いが、(1)日本人成人・老人に関してもHarterの枠組みがほぼ妥当する、(2)成人期から老人期にかけても相互協調性がなお低下する、の2点は事前の予測に反するものである。これらの矛盾を詳細に検討し、本研究計画の目的を達成するためには、日本文化におけるコンピテンス概念の再吟味、及び、調査対象者の代表性に関して更に検討を加える必要性が示唆された。日本文化におけるコンピテンスの発達過程を実証的に明らかにする本研究計画の最終年度として、本年度は従来の研究成果を総合的にとりまとめるとともに、青年と4・50代の中年成人を対象とした以下の2つの質問紙調査を行なった。すなわち、(1)各側面のコンピテンスの自己評価、文化的自己観の内面化の程度、コンピテンス・文化的自己観の重要性認知、日常生活での社会的比較の頻度、の4変数の相互関係を検討する調査、(2)どのような心理特性が人格的成熟として重要であると認知されているかに関する自由回答式調査、である。これら2種の質問紙調査の分析は既に終了しており、得られた分析結果、および前年度までに実施した調査の分析結果とも併せると、おおむね以下の4点が結論づけられるように考えられる。すなわち、(1)コンピテンスの自己評価と相互独立性との相関が高く、しかも、その両者は成人期に上昇する様相を呈する、(2)成人期に高くなる相互独立性は、青年期において定着した相互協調性に基盤をおくものである、(3)コンピテンスの内的特性、および社会的特性に関する領域の重要性評価と、相互独立性の重要性評価とをみると、両重要性評価の相関が高い、(4)以上を総合的に検討すると、日本人成人においてもHarterの理論とほぼ一致するコンピテンスの傾向を媒介している変数は、相互協調性に基づく相互独立性である可能性があるといえる。
ナノ空間を利用した新規1分子DNA解析法の開発

本研究課題は、従来、マイクロチャネル中に充填した高分子分離媒体により達成されてきたDNA分離を、ナノメートルサイズの柱・ナノピラーを使用することにより、さらなるDNA解析の高速化と省サンプル化を計り、ひいてはDNA1分子レベルでの解析に応用することにより、DNA解析の新しい基盤技術を確立することを目的として研究を進めてきた。当初は、ナノピラーの形成するナノ空間と分離可能なDNAサイズとの相関から、ナノピラーによるDNA分離メカニズムが解明できることが期待されたが、ナノピラーチップ中に生じる電気浸透流や、ナノピラーの存在により大きく乱された電場の影響を詳細に検討しなければ、高い分離度を達成できないことが明らかとなった。光の波長と同程度のサイズであるナノ空間内で生じているこのような現象を光学的に観察することは非常に難しいため、流体力学シミュレーションと平行して実験を行ったところ、実際の実験結果を支持する結果、すなわちナノピラーチップ内で生じる電気浸透流により泳動中のDNAバンドが大きく乱され、分離度の低下を引き起こすことが明らかとなった。また、ナノ空間(サブミクロン空間)では、水の物性が変わるという報告もあるので、ナノピラーチップ中における水の粘性を調べる目的で、一分子追跡法によりナノ粒子の拡散係数を求めて水の粘性を推測したところ、バルク中よりも水の粘性が上昇していることを示唆する結果が得られた。これらナノ空間内で生じる現象の詳細な検討により、ナノピラーチップのパフォーマンス向上を達成することに成功した。これらの研究から、実際の実験と平行して、ナノ空間の物性を考慮したより正確なナノ空間内における流体力学シミュレーション法を開発することが、ナノピラーチップをはじめとしたナノデバイスをさらに発展させるための大きな課題であると考える。本研究課題は、生体高分子のサイズに近いナノ空間(ナノメートルサイズの空間場)と、DNA解析の1分子レベルからのアプローチを融合させることにより、1.ナノ空間を利用した1分子レベルでの新規ゲノム解析法の開発2.超微細加工技術を用いて作製したナノ空間(ナノピラーを有するマイクロチャネルにより形成される空間中)でのDNA分離の高速化とその分離メカニズムの解明を実現することを目的として研究を進めてきた。その結果、従来用いられてきた高分子ポリマーやゲルの代わりに、ナノピラーを密に配置してDNA分離媒体としたマイクロチャネル中にて、DNAを分離することに成功した。アガロースゲルのボアサイズを参考に設計した、直径500nm、間隔500nmのナノピラーでは、1kbpから165.6kbpまでの非常に広範囲なサイズのDNAの分離が可能であることを明らかとした。特に長鎖DNAの分離に関しては、直流電場下にも関わらず20秒程度で高速に分離可能であることも明らかとした。さらに、ナノピラー中におけるDNAの泳動挙動は、ポリマーやゲルにおいてみられる泳動挙動とは異なっていることを明らかとした。また、1分子レベルでの新規ゲノム解析法の開発については、ナノピラー中でDNAを交流電場印加により伸張させることを計画していたが、最終的に伸張現象は見られなかった。この原因として、ナノピラーの間隔はアガロースゲルと同程度であるが、その直径はゲルのような高分子鎖と比較すると非常に大きく(500nm)、DNAとの絡み合いが不十分であることが考えられた。これは、既述の結果と併せて考えても妥当な見解であり、これを打開するため高分子鎖とナノピラーとの相互作用を理論的にシミュレートし、その結果を実験に反映させてパフォーマンスを向上させる方向で研究を進めている。
急性尿細管壊死回復期の細胞増殖分化に関与する体液性因子の同定とその分子機構の解明

S.D.ラットの腎動脈クランンプによる一過性腎虚血による急性腎不全モデルを作製し、腎皮質、髄質よりm-RNAを抽出した。94年にこれまでリガンドが不明であったeph familyの受容体型チロシンキナーゼのリガンドが相次いでクローニングされ、リガンド間のhomologyも確認されたため、それらのアミノ酸配列をもとにプライマーを作製しRT-PCRを試みたが特異的なバンドは得られなかった。一方、グリア細胞より抽出精製クローニングされた増殖因子であるFGF9のmRNAが腎臓に特異性高く発現していることが明らかとなったため、recombinant FGF9を黒川勉博士より供与を受け、腎尿細管細胞にたいする増殖能、hypertrophy誘導能を検討した。近位尿細管由来のOKP細胞、MCT細胞、ならびに、遠位尿細管由来のMDCK細胞を用い、ヘパリンの存在下、非存在下においてFGF9を作用させ、DNA量、蛋白量を定量することにより増殖能の検討を行ったが、いずれの細胞においても活性は認めなかった。ついで、FGF9が腎より産生されている可能性を検討するため、黒川博士より供与をうけた3種類の抗FGF9抗体を用いてラット腎組織の組織染色、western blotを試みたが、特異的染色、バンドは得られなかった。また、尿中に排泄されている可能性を検討するため、ラット尿でwestern blotよる解析を行ったが、特異的な抗原を認識することはできなかった。さらに、抗体の特異性を上昇させる目的、又、蛋白質を濃縮する目的で腎抽出蛋白、ならびにラット尿より免疫沈降を行い、別種の抗体にてWestern blotを試みたが特異的なバンドは得られなかった。
骨髄球系細胞の系列転換における「遷移細胞」の解析

研究代表者らは、以前、マウス骨髄マスト細胞は、GATA2欠失によりマスト細胞の分化形質を失い未分化な形態を示すことを見いだした。このGATA2欠失細胞は、正常な血球分化の過程にはみられない不安定な「遷移状態」にあると考えられた。本研究は、この細胞を解析し、骨髄球系細胞の細胞系列転換機構を明らかにすることを目的として行った。研究結果の概要は、以下のとおりである。GATA2欠失細胞は、マスト細胞にはほとんど発現していないC/EBPαを高発現しており、培養条件によってマクロファージや好中球様の細胞に系列転換した。一方、好塩基球や好酸球には分化しなかったが、一部の好塩基球特異的な遺伝子群の発現が増加していた。野生型BMMCにC/EBPαを過剰発現させると、C/EBPαの発現量依存的にGATA2mRNAの発現量が低下し、GATA2欠失細胞の表現型が一部再現された。GATA2とC/EBPαを同時に欠失させると、マクロファージや好中球に発現する遺伝子の発現増加は見られなくなったが、マスト細胞特異的な遺伝子の発現低下は観察された。BMMCとは異なり、腹腔細胞由来の培養マスト細胞(PMC)では、GATA2を欠失させてもC/EBPαの増加は見られなかった。これらの結果から、BMMCにおいて、GATA2とC/EBPαはお互いの発現を抑制している可能性が示唆された。GATA2欠失BMMCが正常な好塩基球に系列転換できなかったことから、好塩基球への分化にはGATA2が必要であると考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究代表者らは、転写因子GATA2の機能欠失がマウス骨髄マスト細胞(BMMC)の脱分化を引き起こすことを見い出した。この細胞は、マクロファージと顆粒球への分化能を有し、正常な前駆細胞とは性質を異にする不安定な状態にあると考えられたため、研究代表者はこの細胞を「遷移細胞」と命名した。本研究では、この細胞を解析することによって、骨髄球系細胞の運命転換にとって鍵となる分子機構を見い出したいと考えている。平成25年度は、GATA2の機能欠失後、最も早期に、また顕著に増加するCebpa遺伝子の発現が、GATA2によって直接制御されているのかどうかについて解析を進めた。Cebpa遺伝子近傍の塩基配列を調べたところ、転写開始点から約37Kb(Cebpa+37K)3'の領域に、種間で保存された複数のGATA配列が存在していた。この領域は、骨髄球系前駆細胞株である32D細胞において、Runx1が結合しCebpa遺伝子を正に制御するエンハンサーとして報告されている(Guo et al, 2012)。また、この領域にはRunx1、GATA因子の結合配列に加えて、PU.1が結合するEts配列も存在している。野生型BMMCsを用いたChIP解析では、GATA2、Runx1、PU.1の3者がCebpa+37Kに結合していた。GATA2欠失後、CebpamRNAの発現量は著しく増加するが、Runx1とPU.1の結合活性には大きな変化が見られなかった。また、このエンハンザー領域を用いたレポーターアッセイでは、GATA2とRunx1・PU.1の拮抗的な作用が再現できなかった。これらの結果から、GATA2によるCebpa遺伝子抑制の分子メカニズムは、これらのシス領域、トランス因子のみでは説明しがたいと考えられた。今後は、+37Kと他のシス領域との相互作用や、他の転写因子の役割にも注目して解析を続けたい。

GATA2によるCebpa遺伝子抑制の分子メカニズムについては、当初の計画以上に解析が進んでいる。しかしながら、GATA2機能欠失BMMCをマウス個体に移植して、生体内でその運命を観察する実験に用いる予定であったCAG-floxed Neo-EGFPマウスを搬入し、繁殖させて、CreによるEGFPの発現を確認したところ、何らかの理由でGFPの発現がみられなかった。平成26年度はレポーターとしてTdtomato発現するマウスを用いて実験を行う。この理由から、この実験は、当初の計画よりも若干遅れている。マウス個体でも、GATA2deltaCF細胞の脱分化と運命転換がみられるかどうか、次の2つの方法で解析を進める。1マスト細胞特異的な誘導的Creマウス(Cpa3CreERT2)を作成し、成体マウスでマスト細胞特異的にGATA2を欠失させる。2G2deltaCFBMMCをマスト細胞欠損マウス(Kitw-sh)に移植し、マウスにタモキシフェンを投与する。いずれもCre-loxP組み換えにより細胞が赤色蛍光を発するCAG-floxed Neo-TdTomaotoを発現するマウスと交配した細胞を用いて、GATA2機能欠失細胞を判別できるようにする。2.GATA2によるcebpa遺伝子発現抑制機序の解明H25年度に引き続き、cebpa遺伝子の制御領域でのGATA2、PU.1、Runx1の機能をChIPアッセイやレポーターアッセイにより解析する。離れたシス領域間の相互作用が考えられた場合には、3Cアッセイによる解析を行う。また、cebpa条件付きKOマウスと交配し、GATA2機能欠失によるBMMCの脱分化にC/EBPαの発現上昇が必要なのかどうかについて、検証する。
ソクラテスにおける幸福主義の研究

本研究では、初期プラトン哲学におけるソクラテス的主知主義の内実を明らかにする作業の一環として、ソクラテスの幸福主義の問題に焦点を当て、ソクラテスの幸福概念の内実ならびにその主知主義との関係について、次に挙げるような具体的研究を行った。(1)初期対話篇において、いわゆる「徳の十分性テ-ゼ」が表明される文脈を、『ソクラテスの弁明』、『クリトン』、『ゴルギアス』、『エウテュデモス』、『国家』篇第I巻等整理・検討した。(2)『ゴルギアス』篇を中心に、初期プラトン哲学全体における徳と幸福との関係についてのこれまでの研究成果を、英米圏の研究を中心に調査・整理した。このテーマに関する英米圏の研究、特にVlastosやZeylなどの研究は非常に質の高いものであり、基本的な見方は間違ってはいないが、テキストの詳細な検討の結果、これらの解釈には不十分な点も多く、彼らの解釈をさらに発展されることが可能であることが判明した。(3)『エウテュデモス』篇において提示されているソクラテスの主張を検討した。この対話篇は、従来の解釈の発想の一つの重要な典拠となっているが、この問題を回避するための方策を模索した。以上の作業によって、最初に立てられた予想(すなわち、ソクラテスは楽観的な主知主義を抱いていたから徳と幸福との必然的なつながりを主張したのではなく、むしろ、人間の生の価値と、徳の発揮によって実現される人間の倫理性との密接な結びつきを協調したかったからこそ、パラドクシカルな見解を表明したのだという予想)が的外れなものでないことが明らかとなった。