hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者QOL向上に向けたハイブリッド情報評価型見守り技術の研究

また、昨年度に引き続き、医療・介護に係わる個人情報について機微な情報を閲覧者側の職種に応じてアクセス管理・制御する仕組みについて医療・介護のプライバシー保護に関する研究を進め、評価を試みた。また、在宅医療介護現場における情報獲得支援技術に特化した情報共有システムの研究を進め、評価を試みた。(3)異種情報ハイブリッド・マイニング手法の研究:異種情報データマイニング実行モデルによるプロトタイプ作成・評価を実施した。昨年度に続き,うつ病を早期発見するために、うつ病と深い関わりがあるといわれている「気分」を定量化し測定する尺度や生体データを収集することにより実験を行い、評価を試みた。平成29年度は、全体計画に沿ってほぼ計画通りに研究開発を進めることができた。3つの課題に対してそれぞれチームを組み、分担して取組んできた。その具体的な達成度は以下の通りである。(1)高齢者QOL評価指標研究:質的データ解析ソフトウェアMAXQDA(VERBI Software GmbH)により、介護ブログを中心に質的データ解析を実施している。これにより、高齢者に関する多様な情報から、健康やQOLに関する推定が可能になると期待される。(2)健康情報データベース構築研究:以下の研究を主体に研究開発を進めた。医療・介護のプライバシー保護に関する研究については、患者情報(治療実績等)に対し、リアルタイムに情報の更新を自動で取得し、データ主体である患者の求める最新情報(適切な病院や治療方法等)を提示するPDS (Personal Data Service/Store)エージェントの研究を行った。また、データ主体(患者)の許諾内容に応じて、患者情報を項目毎に匿名化・抽象化して公開する匿名化公開機能を検討した。在宅医療介護現場における情報獲得支援技術に特化した情報共有システムの研究では、情報共有を行う上で、システムから「関心のある情報」を各従事者にPush通知する「関心条件(COI:Condition of Interest)システム」を提案した。業務特性COIと緊急時COIの2種類を用意し、検証実験を行った。(3)異種情報ハイブリッド・マイニング手法の研究:うつ病を早期発見するために、うつ病と深い関わりがあるといわれている「気分」を定量化し測定する尺度と生体データを収集することができるウェアラブルセンサを用いて長期的に脈拍、睡眠深さ、ストレス等のデータを収集し、アソシエーション分析を行うことにより、うつ病の段階に応じた気分と生体データに関する規則性の発見を行う研究を行った。本研究課題では、高齢者QOL評価指標研究、健康情報データベース構築研究、異種情報ハイブリッド・マイニング手法の研究の3分野での研究を行い、得られた結果をとりまとめ、成果として学会発表を行った。具体的な実施内容は以下の通りである。
蛍光トレーサーを用いた眼微小循環解析法の開発

蛍光粒子にはカルボキシル基で表面修飾された粒子を使用していた。アクリジンオレンジで染色されたリンパ球と移動速度を比較したところ蛍光粒子の移動速度はリンパ球より遅く、血管内皮との相互作用が考えられ表面修飾の検討が課題であった。そこで、本年度はプロテインA修飾蛍光粒子を使用したところ下記、3点の進歩が得られた。1.プロテインA修飾蛍光粒子の移動速度はカルボキシル基修飾蛍光粒子よりも早く、リンパ球と同等の速度で移動する蛍光点が網膜血管で見られた。表面が蛋白質で修飾されたことによる親水性の増加とともに血管内皮との相互作用の減少が生じたと考えられた。2.プロテインA修飾蛍光粒子はカルボキシル基修飾蛍光粒子ではラットに致死性が見られた粒子経1μmでもラットは生存可能であり、毒性が低く動物実験に適した蛍光粒子であると考えられた。3.同じ粒子数を静脈内注入した場合プロテインA修飾蛍光粒子ではカルボキシル基修飾蛍光粒子に比べ長時間にわたって移動する蛍光点が網膜血管で見られ、ラット体内臓器への取り込みが少ないことが判明した。疾患モデルとして実験的糖尿病ラットで網膜循環速度を計測したところ、発症後4週齢までは良好に計測可能であった。その後も計測を継続したところ、5週齢以降の計測は困難であった。本測定法はアルゴングリーンレーザー光を使用しているために、白内障、硝子体混濁に励起および検出が妨害される。糖尿病ラットでは白内障が進行し測定を妨害したと考えられた。今後、これら中間透光体による妨害を回避するために、近赤外光で励起、測定可能な蛍光粒子を開発中である。蛍光粒子に関しては以下に示す研究結果と今後の課題が得られた。1.安全に体内を循環する粒子径は0.1-1μmであった。リンパ球と同等の10μmの蛍光粒子は肝臓、脾臓での捕獲が多く測定に実用的ではないだけではなく安全上も問題であった。逆に0.01μmでは蛍光点として検出器が補足することが困難であった。2.ラットを使用した実験において粒子総数1×10^<11>粒子を濃度1×10^9/μlに調整し、注入速度1×10^9/秒で注入することが最も解析に最適な方法であった。本注入法が決定され、移動速度および血管分岐点における流路解析が可能であった。3.眼底血管を流れるフルオレセイン含有粒子はアルゴンレーザーを用いSLO(共焦点レーザー検眼鏡)で検出可能であった。一方、近赤外光を用いたインドシアニングリーン含有蛍光粒子は蛍光強度が弱くSLOでの検出は困難であった。インドシアニングリーンをより多く含む蛍光粒子を作成するかアルゴンレーザーまたはヘリウムネオンレーザーで励起可能かつ検出波長がフルオレセインと異なる蛍光物質を含有する蛍光粒子の探索が課題である。第3の蛍光物質を使用するためにSLOのフィルター変換装置にオプションで作成したフィルターを装着したところ良好な測定が可能であった。4.蛍光粒子には親水性が高いことが予想されたカルボキシル基で表面修飾された粒子を使用した。アクリジンオレンジで染色されたリンパ球と移動速度を比較したところ蛍光粒子の移動速度はリンパ球よりは遅かった。血管内皮との相互作用が考えられ、肝臓などの組織における蛍光粒子の取り込みを最小限にするためも最適な表面修飾検討が課題である。5. SLOに関してはラットを用いた実験系では40度の画角で十分観察が可能でありより屈折率の高いレンズを用いたアタッチメントの必要性はなかった。
屋外における木材表面の劣化過程の組織学的研究

屋外で木材を使用すると日光や風雨の影響を受けて表層部12mmが劣化する。これは、光による化学的な分解、乾湿繰り返しによる力学的破壊、雨水の表面張力によるコプラスなどが関与すると考えられているが、その相互関係は必ずしも明らかにされていない。ここでは通常の暴露に加えて、太陽光を分光し、降雨も制御した条件下で暴露された木材表層の劣化状況を組織学的に観察した。【実験】1)木材--スギ辺材の板目木表。2)暴露条件--(1)分光:保谷ガラス製の各種フィルター(5×5cm,厚さ2.5mm)を用いて紫外線から赤外線域まで9段階に分光。(2)降雨コントロール:降雨ありと降雨なし。後者はガラスフィルターそのもので可能である。前者は相当する雨量が、試験片表面上に流れ込むようにした。(3)暴露:横浜国大構内の実験棟屋上において、南向き、30°の傾斜角で暴露し、経時的にサンプリング。3)測定・観察項目--(1)色彩測定:ミノルタCR-300。(2)組織観察:光顕・SEMによる通常観察のほか、塩酸フロログルシン呈色反応、偏光顕等、組織化学的な観察。(3)剥離強度:劣化した表面に粘着テープを貼り、180°剥離試験(JIS k 6854)。【結果】1)初期段階の黄変は、500nm以下の短波長光によって生ずる。2)退色は雨が関与した場合にのみ生じる。つまり、黄変化物質は水により流脱する。3)大きな亀裂は、水分応力によるものであり、光は関与しない。4)小じわ状の小さな亀裂は短波長の光が木材表層部を分解し、さらに雨が当たったときに晩材部の放射組織を起点として発生する。この小亀裂はその後、早材部に伝播する。5)短波長光によって、主としてリグニン・ヘミセルロースが分解され、水により流脱する。その結果早材部では細胞壁の薄化、晩材部では細胞間剥離を生ずる。6)細胞壁が薄化して脆弱化した早材部仮道管は降雨後の晴天時に水が蒸発するとき、水の表面張力によってコプラスする。その結果、早材部は沈み込み、目やせを生じる。小じわ状の小亀裂の周辺部も沈み込み、V字溝が広がる。7)劣化後の表層部の剥離強度は健全材の1/4程度に低下する。これは、光による化学的な分解、乾湿繰り返しによる力学的破壊、雨水の表面張力によるコラプスなどが関与すると考えられているが、その相互関係は必ずしも明らかにされていない。ここでは太陽光を分光し、降雨も制御した条件下で暴露された木材表層部の劣化状況を組織学的に観察することによって、光と水の影響について考える。【実験】

1)木材--スギ辺材の板目木表。2)暴露条件--(1)分光:保谷ガラス製の各種フィルター(5×5cm,厚さ2.5mm)を用いて紫外線から赤外線域まで9段階に分光した。(2)降雨コントロール:降雨ありと降雨なしとに分けた。後者はガラスフィルターそのもので可能である。前者は相当する雨量が、試験片表面上に流れ込むようにした。(3)暴露:横浜国大構内の実験棟屋上において、南向き、30°の傾斜角で暴露し、経時的にサンプリングした。3)測定・観察項目--(1)色彩測定:ミノルタCR-300による。(2)組織観察:光顕・SEMによる通常観察のほか、塩酸フロログルシン呈色反応、偏光顕等、組織化学的な観察を行った。(3)剥離強度:劣化した表面に粘着テープを貼り、180°剥離試験を行った。【結果】1)初期段階の黄変は、500nm以下の短波長光によって生ずる。2)退色は雨が関与した場合にのみ生じる。つまり、黄変化物質は水により流脱する。3)大きな亀裂は、水分応力によるものであり、光は関与しない。4)小じわ状の小さな亀裂は短波長の光が当たると生じ、雨が当たると著しく加速される。5)短波長光によって、主としてリグニン・ヘミセルロースが分解され、水により流脱する。その結果早材部では細胞壁の薄化、晩材部では細胞間剥離を生じる。6)細胞壁が薄化して脆弱化した早材部仮道管は降雨後の晴天時に水が蒸発するとき、水の表面張力によってコラプスする。その結果、早材部は次第に沈み込み、いわゆる目やせを生じる。7)劣化後の表層部の剥離強度は健全材の1/8程度の低下する。屋外で木材を使用すると日光や風雨の影響を受けて表層部が劣化する。これは、光による化学的な分解、乾湿繰り返しによる力学的破壊、雨水の表面張力によるコラプスなどが関与すると考えられているが、その相互関係は必ずしも明らかにされていない。ここでは太陽光を分光し、降雨も制御した条件下で昨年に引き続き暴露した木材表層部の劣化状況を組織学的に観察した。【実験】1)木材--スギ辺材の板目木表。2)暴露条件--(1)分光:保谷ガラス製の各種フィルター(5×5cm.厚さ2.5mm)を用いて紫外線から赤外線域まで5段階に分光。(2)降雨コントロール:降雨ありと降雨なし。(3)暴露:横浜国大構内の実験棟屋上において、南向き、30°の傾斜角で暴露し、経時的にサンプリング。3)測定・観察項目--(1)色彩測定:ミノルタCR-300。(2)組織観察:光顕・SEMによる通常観察のほか、塩酸-フロログルシン呈色反応、偏光顕等、組織化学的に観察。(3)剥離強度:劣化した表面に粘着テープを貼り、180°剥離試験(JIS K 6854)を行った。【実験】1)初期段階の黄変は、600nm以下の短波長光によって生ずる。2)その後の退色は雨が関与した場合にのみ生じる。4)小じわ状の小さな亀裂は短波長の光が木材表層部分解し、さらに雨が当たった時に晩材部の放射組織周辺部を起点として発生する。この小亀裂はその後、早材部に伝播する。
機能性RNA創製の革新的新手法の確立と展開:分子デザインと進化工学の融合

「人工酵素などの機能性生体高分子のテーラーメイドな創製」は、RNAに限らず、広く生体高分子研究において、基礎化学/生物学的に、また医療やバイオ工学などへの応用面からも重要な課題である。本研究では、研究代表者の考案した新手法「design & selection法」を基盤とする人工リボザイムの創製、機能改変、機能解析に取り組み、本手法の確立を行い、その有効性を示した。分子デザインと人工進化の融合法で創製された新規なRNA酵素(リボザイム)DSLは従来の同種のリボザイムには見られない優れた特性を示す。本研究では、その特性を詳細に解析すると共に、本手法を機能性RNA創製の汎用法として確立すること目的としている。本年度は、DSLに続く、新たな人工リボザイムの創製とその機能解析を目的として研究を行った。1)融合法による新規入工リボザイムYFLの創製DSLリボザイムは、分子デザインによって構築されたscaffoldにcatalytic unitをインストールすることにより構築された。このscaoffoldを再び利用し、DSLで用いたものとは異なる反応を触媒できる機能ユニットを構築することを試みた。DSLでRNA-RNA連結反応の脱離基として用いたピロリン酸に変えて、β-ニコチンアミド・モノヌクレオチドを脱離基として利用するリボザイムの創製を試みた。Scaffoldに対して合計45塩基のランダム配列を挿入したライブラリーを構築し、in vitro selection法によって活性の高い配列を選別した。その結果、単一のファミリーからなる配列が選別され、クラスYFLリボザイムと命名した。2)YFLリボザイムの活性構造を支える相互作用の効果YFLリボザイムのP3領域に存在する11ntレセプターユニットは反応点を持つPlユニット中のGAAAループと相互作用するよう、そのscaffoldは設計されている。Selectionで得られたYFLリボザイムにおいてもその相互作用が重要であるかを検証した。その結果、11ntR-GAAA相互作用を破壊した変異体は活性をほとんど示さなかった。本年度は、DSLに続いて創製した新人工リボザイムYFLの機能解析を行った。またそれら機能解析の技術的基盤としてRNA分子と相互作用可能な色素分子とペプチドの創製、RNAの両末端に適用可能な蛍光標識試薬の開発も行った。1)YFLリボザイムの活性構造を支える金属イオンYFLリボザイムの触媒活性に対する金属イオンの寄与を系統的に解析した結果、YFLリボザイムはMgを特異的に要求する事が明らかとなった。興味深いことに通常ほとんどの天然および人工リボザイムに対してMgイオンの代替が可能なMnイオとはYFLリボザイムに対して不活性であった。2)YFLリボザイムのRNA連結反応に置ける位置選択性RNAの連結反応では、天然型の3-5結合の他に、非天然型の2-5結合も可能であり、人工リボザイムのス性においては、その位置選択性が重要なファクターとなる。リボース部位の水酸基を一つ欠失した、あるいはメトキシ基に置き換えた基質を用いてリボザイムの反応性を検定した。その結果、YFLリボザイムは天然型の3-5結合を形成することが明らかになった。3)放射性同位体を用いずにRNAの機能解析を簡便に行うために、合成の極めて容易なBODIPY色素を利用した、RNA標識用誘導体の合成法を確立した。またそれを用いて実際にRNAの標識を行った所、高価な市販の色素と同等の感度での標識と機能解析が可能である事が明らかとなった。本年度は、ターンオーバー型リボザイムの機能解析および、昨年度に続き、新人工リボザイムYFLの機能解析を行った。1)ターンオーバー型リボザイムの機能解析自己修飾型リボザイムを合理的設計により、基質ユニットと酵素ユニットに分割し、ターンオーバー能力をもつトランス型リボザイムへと改変することに成功した。さらに二つのユニットを特異的に会合させる部位を最適化する事を試みた。その結果、もっとも良い結果を与えた改変体は、基質に対して1/1000の酵素ユニットの存在化でも反応が進行し、そのターンオーバー数は400を超える事を見いだした。2) YFLリボザイムの触媒ユニットの最適化と構造解析YFLリボザイムの触媒ユニットをin vitro evolutionにより快適化する事を試みた。その結果3つの変異が性能向上に寄与する事を見いだした。これら三つの変異を同時に導入した変異体では、オリジナルのYFLリボザイムより、反応の最終収率が顕著に向上した。

この結果は、これらの変異がリボザイムが活性な立体構造を正しく形成するプロセスに寄与している事を強く示唆している。構造形成能力の向上した変異体を用い、DMSによる化学修飾実験を行い、触媒ユニットの構造を実験的に検証した。その結果は、in vitro evolutionの配列比較から推定された構造と一致した。
成立期コモン・ロー再考―12世紀のアングロ・サクソン法集成を手がかりに―

本研究の目的は、成立期コモン・ローの特質を、コモン・ロー的要素のみならず、同時期のアングロ・サクソン法的要素や教会法的要素を含む三つの法的要素の複合的産物として、再考することにある。この目的を達成するための手がかりとしたいのは、何故に、アングロ・サクソン法集成等が、コモン・ローの成立期たる12世紀に盛んに編纂ないし筆写されたのかという点の解明である。明らかにすることができたのは、以下の諸点である。すなわち、(1)アングロ・サクソン法集成等の写本のうち、現存するものの大多数は、アングロ・サクソン時代ではなく、その後のノルマン征服以後の時代に由来しており、中でも12世紀に由来する写本の多さは際立っているという点、(2)現存しない複数のアングロ・サクソン法集成の存在が推察され、法集成の編集ないし筆写は、12世紀に全盛期を迎えるという点、(3)アングロ・サクソン法集成の作成には、11世紀から12世紀に教会法分野で盛んに用いられた教会法集成作成の手法が用いられたのではないかと推察される点、(4)アングロ・サクソン法集成等のうち、『エドワードの法』の写本の多さは群を抜いており、これに関しては、その筆写のピークが12世紀に訪れた後、近世に復活ないし言及されるという点、(5)アングロ・サクソン法集成等が、コモン・ローの成立期たる12世紀に、何故、盛んに編纂ないし筆写されたのかという問題に対しては、ノルマン朝とアンジュー朝による征服と支配の歴史を踏まえた上で、法の連続性という観点から検討する必要性が明らかになったという点である。また、ベケット論争の影響も視野に入れておく必要性も明らかになった。この目的を達成するための手がかりとしたいのは、何故に、アングロ・サクソン法集成が、コモン・ローの成立期たる12世紀に盛んに編纂ないし筆写されたのかという点の解明である。この目的を果たすため、今年度に実施した研究の成果は、以下の通りである。まず、P・ウォーモルドやB・オブライアン等の研究を中心に、研究史を整理した。次に、アングロ・サクソン法集成の写本の残存状況について、13世紀初めまでの時代に由来する写本の情報(内容の概要、作成地、作成年代、サイズ等)を調査・整理し、12世紀の重要性を明確化することができた。また、この調査・整理にあたっては、英国のレスター大学とリーズ大学によるhttp://www.le.ac.uk/ee/em1060to1220/index.htmlや、ロンドン大学Institute of Historical Researchとロンドン大学キングスカレッジDepartment of Digital Humanitiesによるhttp://www.earlyenglishlaws.ac.ukを利用することができた。さらに、ロンドンの英国図書館に収録されている写本については、英国に出張し、現物を閲覧・調査することができた。最後に、今年度中に調査・整理することができた研究成果の一部を、苑田亜矢「ノルマン征服から13世紀初めまでのアングロ・サクソン諸法集ー手書本の伝来状況に着目してー」『法政研究』第83巻第3号、659-696頁(2016年)として公表することができた。今年度の調査に本格的に入る前に、ある程度の準備を整えることが出来ていたためだと思われる。第一に、アングロ・サクソン法集成の内容の分析を行なうことができた。分析においては、訴訟手続や証明方法に着目した。すなわち、初期中世以来ずっと用いられていた神判、雪冤宣誓、決闘といった「超自然に訴える証明方法」についてアングロ・サクソン法集成が言及している箇所に着目した。なお、主要なアングロ・サクソン法典については、我が国に日本語訳の成果があるので、必要に応じてそれを参照するとともに、P・ウォーモルドやB・オブライアン等の研究も適宜参照した。第二に、アングロ・サクソン法集成の写本の残存状況について、13世紀初めまでの時代に由来する写本の情報(内容の概要、作成地、作成年代、サイズ等)を調査・整理した研究成果を土台として、ロンドンの英国図書館やケンブリッジ大学図書館等に収録されている写本や刊本について、英国に出張し、現物を閲覧・調査することができた。また、複写や撮影が可能なものについては、それらを入手することができた。アングロ・サクソン法集成の内容が非常に豊かであり、その分析や整理に手間取っていることが理由だと思われる。

この目的を達成するための手がかりとしたいのは、何故に、アングロ・サクソン法集成等が、コモン・ローの成立期たる12世紀に盛んに編纂ないし筆写されたのかという点の解明である。明らかにすることができたのは、以下の諸点である。すなわち、(1)アングロ・サクソン法集成等の写本のうち、現存するものの大多数は、アングロ・サクソン時代ではなく、その後のノルマン征服以後の時代に由来しており、中でも12世紀に由来する写本の多さは際立っているという点、(2)現存しない複数のアングロ・サクソン法集成の存在が推察され、法集成の編集ないし筆写は、12世紀に全盛期を迎えるという点、(3)アングロ・サクソン法集成の作成には、11世紀から12世紀に教会法分野で盛んに用いられた教会法集成作成の手法が用いられたのではないかと推察される点、(4)アングロ・サクソン法集成等のうち、『エドワードの法』の写本の多さは群を抜いており、これに関しては、その筆写のピークが12世紀に訪れた後、近世に復活ないし言及されるという点、(5)アングロ・サクソン法集成等が、コモン・ローの成立期たる12世紀に、何故、盛んに編纂ないし筆写されたのかという問題に対しては、ノルマン朝とアンジュー朝による征服と支配の歴史を踏まえた上で、法の連続性という観点から検討する必要性が明らかになったという点である。また、ベケット論争の影響も視野に入れておく必要性も明らかになった。今後は、前年度の計画のうち終了させることができなかった部分について継続して取り組むと共に、アングロ・サクソン法集成の内容の分析を行なう。分析においては、訴訟手続や証拠方法に着目する。とりわけ、初期中世以来ずっと用いられていた神判、雪冤宣誓、決闘といった「超自然に訴える証明方法」の記述に注意する。なお、主要なアングロ・サクソン法典については、我が国に日本語訳の成果があるので、必要に応じてこれも参照する。さらに、12世紀の国王裁判所や教会裁判所の実務におけるアングロ・サクソン法集成の利用状況の解明にも着手する。その場合、国王裁判所や教会裁判所における神判、雪冤宣誓、決闘、証人、そして証書を用いた証明方法の利用状況に着目する。国王裁判所や教会裁判所の実務については、12世紀にあっては、いずれの裁判所にも訴訟記録を保管する体制がなかったため、年代記やカーチュラリー等の中から裁判実務史料を拾い集めて分析を行なう。その際、年代記やカーチュラリー等から裁判実務史料を収集したEnglish Lawsuits from William I toRichard I, (Selden Society, vol.106-107)や、English Episcopal Acta (British Academy)も利用する。今後は、前年度の計画のうち終了させることができなかったアングロ・サクソン法集成の内容の分析を、引き続き行なう。また、12世紀の国王裁判所や教会裁判所の実務におけるアングロ・サクソン法集成の利用状況の解明も引き続き行なう。
カルポニントランスジェニックマウスを用いた血管平滑筋の収縮調節機構の解析

アクチン、トロポミオシンの結合蛋白であるカルポニンはin vitroとex vivoの実験より血管平滑筋収縮の調節に関与する可能性が示されている。今回、カルポニンのin vivoでの作用を明らかにするために血管平滑筋特異的にカルポニンを過剰発現するトランスジェニックマウス(Tgマウス)の作製を計画した。Tgマウスにおいて血管平滑筋特異的に導入遺伝子を過剰発現させるためのトランスジーンの構築は開発されていない。このため本年度はヒト血管平滑筋型alpha-アクチン(HSMA)の3種類のプロモーター部位にCAT(chloramphenicol acetyltransferase)遺伝子をつないだTgマウスを作製し、CAT活性を調べることにより血管平滑筋特異的に強く発現するHSMAのプロモーター部位の決定を試みた。3種類のトランスジーンの構築のうち、EA4.7-CATはHSMA遺伝子5'上流-891から第2エクソン内の+3830までを持ち、EA4.7-CATTgマウスでは大動脈、小動脈、及び消化管粘膜筋板の平滑筋で強い転写活性がみられ、この部位に平滑筋特異的な転写活性部位のあることが予想される。HSMA891-CATは5'上流-891から第1イントロン内の+49までを持ち、HSMA891-CATTgマウスの血管平滑筋では、EA4.7-CATより非常に弱いものの、組織特異的発現の可能性のある結果が得られている。HSMA123-CATは5'上流-123から+49までを持ち、HSMA891-CATよりさらに弱い転写活性を示したが、その組織特異的発現の詳細については現在検討中である。
リストラクチャリングの地理学

本研究は、バブル崩壊不況に伴う生産調整、円高に伴う企業の海外進出、いわゆるグローバル・リストラクチャリングが国内の産業配置をいかに再編成しつつあるのか、という問題をテーマとしている。本研究で明らかになったことは、最近の工場閉鎖、生産統合、工場立地が、物流コスト、海外との生産連携を考慮してそれらの地点決定がなされているという点である。日本製粉の高崎工場、神戸工場、門司工場、松山工場は内陸部、または大型船の接岸できない臨海部に立地していた工場で、すべて閉鎖され、生産は大型船の接岸できる福岡工場、神戸甲南工場に集約される。住友大阪セメントは、合併後生産設備が重複する地域の生産統合を検討している。具体的には、内陸部で物流コストのかかる大阪工場、彦根工場が閉鎖される。三菱石油と九州石油は、パラキシレンの新会社、大分パラキシレンと共同で設立する。アジア向けパラキシレンの輸出増加に対応するためであり、それためアジアに近い九州に工場を建設する。さらに日立造船、日産自動車の工場閉鎖、生産統合についても調査、分析を行ったが、これらの分析結果については、『アジア時代の国土計画と産業再配置』東洋経済新報社、1996年秋出版予定のなかで詳しく論じる予定である。
更年期高血圧における圧-利尿(腎機能)曲線の異常とカルシウム代謝の変化

当初予定していた研究対象は人であったが、症例が少ないため高血圧実験動物モデルで実験を行いまずその傾向をみることにした。更年期高血圧の特徴のひとつに食塩感受性があることから高血圧実験動物モデルのなかでも食塩負荷により血圧上昇を認める食塩感受性高血圧ラットであるDahl salt-sensitive ratを用いて以下の実験を行いその結果を得た。まず食塩感受性を評価するために麻酔下でラットの動静脈にカテーテルを留置し、片側腎摘出、両側副腎摘出した。昇圧ホルモン入潅流液を注入しながら血圧を変化させた時の尿中ナトリウム排泄量を測定した。血圧と尿中ナトリウム排泄量から得られたグラフの傾きから食塩感受性を求めた結果、卵巣を摘出したラットではコントロール群に比べその傾きが減少し、すなわち食塩感受性の増大が示唆された。同じラットで蛍光色素であるFURA-2AMを用いて血小板の細胞内カルシウムを測定した結果、卵巣摘出したラットでは細胞内カルシウム濃度の増加を認めた。以上の結果から雌の食塩感受性ラットでは卵巣摘出により食塩感受性の増大とともに血小板細胞内カルシウム濃度の増加をみとめたことからその背景にカルシウム代謝異常が存在する可能性が示唆された。今回のラットの実験結果から今後は人において臨床的に意義のある閉経後の高血圧(更年期高血圧)や妊娠中あるいは経口避妊薬による高血圧の原因究明にあたり、カルシウム代謝異常がひとつの手がかりになる可能性を示唆した。
移入種タンポポによる生物多様性の撹乱と環境指標性に関する緊急再評価

葉緑体DNAマーカー(trnL-trnF領域)、核DNAマーカー(ITS領域のTaq1による制限酵素断片長多型)、フローサイトメーターによる相対DNA量を組み合わせて、日本産2倍体タンポポとセイヨウタンポポの雑種を判別する方法を開発した。これにより、新潟市及び東京23区とその周辺のセイヨウタンポポについて雑種の判別を行なった。両地域とも、3倍体雑種、4倍体雑種、雄核単為生殖雑種(葉緑体は在来種型、核は帰化種型)があった。新潟では4倍体雑種が49%を占め、純粋なセイヨウタンポポは18%にすぎなかった。東京においても純粋セイヨウタンポポは11.8%しかなかったが、雑種のうち最も多いのは3倍体雑種(57%)であった。一方、全国から採られたのアカミタンポポについては、純粋な帰化種型が66%を占め、雑種のうち最も多かったのは雄核単為生殖雑種(23%)であることがわかった。日本に導入されたばかりの移入種では、種子発芽可能温度域が在来種のカントウタンポポに比べ、高温側に幅広く、休眠性もなかった。雑種についても、おおむね種子発芽可能温度域がやや高温側に広がっていた。既存の「外来種」の知見と同様に、移入種と雑種の成体の多くは夏季にも葉を展開した。東京周辺の調査から、雑種と外来種を含む非在来種および在来種に酷似した形態の雑種は、樹林で出現しにくかった以外は、土地利用に対し特別の選択をせずに出現したが、在来種は農地、土堤などで出現しやすく、樹林では特に出現しにくいということはなかった。以上のように、雑種の多くは従来の「外来種」に近い生態的特徴と生育地をもつので、花粉検定により在来種と非在来種との判別が適確に行なわれるなら、従来の環境指標性は適用できる。一方、雑種のなかには少数ながら生態的性質が異なるものがあり、今後の動向を追跡する必要がある。1.人為的移入種の生活史を葉数相対値の季節変化で見ると、春季(花時)が0.73、初夏(種子生産季直後)が0.80、夏季(8月-9月)が0.56-0.55であり、同所に生育する在来種の初夏及び夏季の値0.09、0.00-0.04と比較して初夏-夏季の葉数滅少が少なく、これまで「外来種」として認識されてきたタンポポの既知の値に酷似していた。2.人為的移入種の種子発芽速度は、これまで「外来種」として認識されてきたタンポポの既知の値と比較して、発芽のピーク時が4-6日目と約2-4日早い傾向があった。3.東京23区で行なったタンポポ調査の結果、1880調査地点中、在来種の出現頻度は1.9%であった。なお、調査現場で在来種と認識された67個体のうち、55%が2倍体在来種ではなかった。これらの結果から、東京23区では在来種に酷似した形態の雑種が高い頻度で在来種と認識される可能性が示された。

4.東京23区で行なったタンポポ調査の結果、これまで「外来種」として認識されてきたタンポポ全体と在来種に酷似した形態を持つ雑種の生育地の土地利用特性には、大きな差異は認められなかった。5.DNAのtrnF-trnLの非コード領域及び核DNAのITS領域を分析することにより雑種を判定するシステム、さらにDNA量をフローサイトメーターにより測定し、3倍体雑種と4倍体雑種を判定するシステムを開発した。6.首都圏においてセイヨウタンポポのサンプリングを行い、27地点372個体をこれらの方法により判定したところ、87%が雑種で(3倍体雑種57%、4倍体雑種24%、雄核単為生殖雑種6%)、純粋なセイヨウタンポポと判定されたものはわずか12%であった。葉緑体DNAマーカー(trnL-trnF領域)、核DNAマーカー(ITS領域のTaq1による制限酵素断片長多型)、フローサイトメーターによる相対DNA量を組み合わせて、日本産2倍体タンポポとセイヨウタンポポの雑種を判別する方法を開発した。これにより、新潟市及び東京23区とその周辺のセイヨウタンポポについて雑種の判別を行なった。両地域とも、3倍体雑種、4倍体雑種、雄核単為生殖雑種(葉緑体は在来種型、核は帰化種型)があった。新潟では4倍体雑種が49%を占め、純粋なセイヨウタンポポは18%にすぎなかった。東京においても純粋セイヨウタンポポは11.8%しがなかったが、雑種のうち最も多いのは3倍体雑種(57%)であった。一方、全国から採られたのアカミタンポポについては、純粋な帰化種型が66%を占め、雑種のうち最も多かったのは雄核単為生殖雑種(23%)であることがわかった。日本に導入されたばかりの移入種では、種子発芽可能温度域が在来種のカントウタンポポに比べ、高温側に幅広く、休眠性もなかった。雑種についても、おおむね種子発芽可能温度域がやや高温側に広がっていた。既存の「外来種」の知見と同様に、移入種と雑種の成体の多くは夏季にも葉を展開した。東京周辺の調査から、雑種と外来種を含む非在来種および在来種に酷似した形態の雑種は、樹林で出現しにくかった以外は、土地利用に対し特別の選択をせずに出現したが、在来種は農地、土堤などで出現しやすく、樹林では特に出現しにくいということはなかった。以上のように、雑種の多くは従来の「外来種」に近い生態的特徴と生育地をもつので、花粉検定により在来種と非在来種との判別が適確に行なわれるなら、従来の環境指標性は適用できる。一方、雑種のなかには少数ながら生態的性質が異なるものがあり、今後の動向を追跡する必要がある。
IoT環境におけるエッジデバイスでの劣化故障検出及び障害予告技術の開発

あらゆるモノが繋がるIoT環境では,多種多様なエッジデバイスがネットワークを介してクラウドと接続することで膨大なデータ収集と解析処理をリアルタイムに行っている。一方,エッジデバイスでの経年が要因になる劣化故障は,デバイスの予告なし「誤作動」や「停止」等の障害を引き起す恐れがあり,システム全体の信頼性に多大な影響を及ぼす。本研究では,IoT向けの高性能エッジデバイスとして新規に開発された再構成論理デバイスMRLD(Memory-based Reconfigurable Logic Device)を対象にして,稼働時の劣化故障に対する早期検出及び障害予告のできる高信頼化技術を開発する。
反芻家畜のメチオニンスルホキシド還元能に関する研究

哺乳類の体内におけるメチオニンスルホキシド(MSO)の栄養上の有効性については、ここ10年の間にかなりはっきりしてきている。筆者らは、反芻家畜のルーメンに生息する繊毛虫類のアミノ酸代謝に関する一連の研究過程で、その内因性の代謝産物の一つとして、たまたま、MSOを分離同定した。また、MSOはルーメン液や反芻家畜の血中にも存在することがすでに知られていた。これらの事実から、反芻家畜のMSOレダクターゼ活性(MSOをメチオニンにもどす酵素)は、単胃家畜のそれよりも高いのではないかとの仮説をもつに至り、本研究を企画した。材料として、宮崎市内で屠殺された牛及び豚の肝臓及び腎臓を使用し、まず、各動物及び臓器毎に同酵素活性の最適測定条件を検討した。最初に、各臓器のホモジェネートの酵素活性を超遠心(10万xg,60分)上清液及び同沈澱の活性と比較し、いずれの臓器においても活性は上清液に認められることを確認した。以後、便宜上、高速遠心上清液(27,000xg,30分)を粗酵素として用いることにした。続いて、この粗酵素液により最適pH及び最適温度を検討し、牛肝:pH6.0、33°C;牛腎:pH6.7、39°C;豚肝及び腎:pH7.0、37°Cであることが分かった。次に、MSOレダクターゼ活性に対する還元剤の促進効果を検討すると、牛豚共に、肝臓ではNADHとNADPHが同程度に促進し、腎臓ではNADPHが大きな促進効果を示すことが分かった。肝臓にNADH、腎臓にNADPHを用いた最適条件下での最大活性を得るための基質濃度(mM)とKm(mM)値は、牛肝:0.80、0.158;牛腎:0.60、0.064;豚肝:0.25、0.049;豚腎:1.00、0.116であった。最後に、最大活性を得る条件下(ただし、温度は39°C)で牛17頭、豚12頭分の同酵素活性を測定した結果、豚が比較的近似の値を示したのに対して、牛では個体差が大きく、この酵素の誘導性が示唆された。全体の平均値(組織重量当り)で見れば、牛肝の活性は豚肝の3.6倍、牛腎は豚腎の1.15倍であった。昭和61年度の研究計画に沿って、牛の肝臓におけるメチオニンスルホキシド(MSO)還元酵素活性を検討し、以下のような成績が得られたので報告する。宮崎県西部食肉衛生検査所宮崎支所で屠殺された牛の肝臓の外側右葉(8g)を材料とし、0.1Mリン酸緩衝液(100ml)を用いてワーリングブレンダーによりホモジェネートを調製した。この一部を遠心分離法(27,000×g,20分)により上清と沈殿に分けた。始めに、ホモジェネート並びにその遠心上清および沈殿物の酵素活性を測定した。

測定条件は次の通りとした:基質濃度、250μM;NADH(還元剤)濃度、1mM;温度、37°C;インキュベーション時間、3時間。その結果、ホモジェネートと遠心上清に活性がみられたが、沈殿物にはみられなかった。そして、上清の活性はホモジェネートよりも高かった。その後、上清を用いて酵素活性の最適な測定条件を検討した。その結果、最適pHは6.0、最適温度は33°Cであることが分かった。次に、上記の条件下で還元剤添加の影響を検討した結果、ジチオトレイトールの添加時が最も高い活性を示し、次にNADHとNADPHがほゞ同じ値の高い活性を示した。グルタチオン添加の影響は無視できる程度であった。続いて、この酵素の基質親和性を知るためにミカエリス定数(Km)を最適条件下で測定した。たゞし、還元剤としてはNADHを用いた。その結果、Kmは0.144mMであった。最後に、これら結果をふまえて、牛10頭分の肝臓のMSO還元酵素活性を測定した。たゞし、本研究が比較生化学的内容を含むことを考慮して、還元剤としては生体内に常在するNADHを用いることにし、測定温度は牛の生体内の肝臓の温度と考えて39°Cとした。なお、測定時間は3時間とした。その結果、肝臓1g当りでは、255±23nmol/hr,タンパク質1mg当りでは、2.75±0.32nmol/hr(ラットの肝臓ホモジェネート(Aymardら、1979):0.271.1nmol/hr)という値が得られた。昭和62年度の研究計画に沿って,豚の肝臓(豚肝)及び牛の腎臓(牛腎)のメチオニンスルホキシド(MSO)還元酵素活性を検討し,以下の結果を得たので報告する.宮崎県西部食肉衛生検査所宮崎支所で屠殺した豚の肝臓及び牛の腎臓を材料とし,昭和61年度研究実績報告書と同様に処理をして酵素活性を測定した.豚肝,牛腎とも牛肝と同様に超遠心(10万g,60分)上清画分にのみ活性がみられた.従って,以後,高速遠心(27,000g, 30分)上清液を用いて検討することにした.その結果,最適pHは,豚肝が7.0,牛腎が6.7であった.次に,最適pH下で最適温度を検討した結果,豚肝が37°C,牛腎が39°Cであった.続いて,最適pHと最適温度下で還元剤の活性促進効果を検討した結果,豚肝では牛肝と同様に,ジチオトレイトール(DTT)>NADH=NADPH>グルタチオン(GSH)となり,牛腎ではDTT)>NADPH=NADH=GSHとなった.これらの結果から,以後,生理的条件を考慮して,肝臓にはNADHを,腎臓にはNADPHを添加して活性を検討することにした.次に,最適pH・温度,還元剤(1mM)添加条件下で基質親和性を検討した結果,みかけのミカエリス定数(Km)は,豚肝で0.049mM,牛腎で0.064mMと牛肝(その後の検討により0.158mM)よりも低く,親和性が高いことが分かった.最後に,上記の条件下で豚肝(10頭分)及び牛腎(12頭分)の平均活性(単位:nmoLメチオニン/hr/g臓器)を測定した.ただし,生理的条件を考慮して測定温度は39°Cとし,測定時間は3時間とした.その結果,豚肝の活性は97±23(n=10)であった.牛肝の活性はその後の17例の結果では,二群に分かれ, 501±142(n=9)と178±37(n=8)となったので,牛肝は,豚肝の5.2倍の群と1.8倍の群に分かれることが分かった.牛腎の活性も,大きくは, 676±87(n=4)と53±30(n=6)の二群に分かれ,その中間の値(平均値:303)を示したものも二頭含まれていた.昭和63年度の研究計画に沿って、豚の腎臓(豚腎)のメチオニンスルホキシド(MSO)レダクターゼ活性を検討し、以下の結果を得たので報告する。宮崎県西部食肉衛生検査所宮崎支所で屠殺した豚の腎臓を材料とし、昭和62年度研究実績報告書(牛の腎臓の場合)と同様に処理をして酵素活性を測定した。豚腎の場合も超遠心(100,000×g,60分)上清画分に活性がみられた。
地球創成期における還元型原始大気の形成と進化

微惑星集積期の原始惑星上における脱ガス大気成分と原始太陽系星雲ガス成分の混合過程について数値的に調査した。これは、微惑星衝突による惑星表面からの集積熱ならびに脱ガス成分の供給と、惑星周囲からの原始太陽系星雲ガスの重力束縛を考慮し、大気の放射対流平衡構造の進化を数値的に求め、両成分の密度成層の安定性を追跡したものである。火星材料物質を想定した脱ガス成分を与えた場合、0.1地球質量を上回る原始惑星では両成分の混合が起き、惑星内部に原始太陽系星雲ガス成分が取り込まれるようになる可能性を示した。太陽極端紫外線の照射によって駆動される、水素に富む初期大気の流体力学的散逸モデルの構築を進め、光学活性分子種による放射冷却と分離の光解離の効果を取り込んだ。手始めとして、火星質量の惑星に対して、紫外線強度や下層大気の重元素濃度などの諸条件を変えた数値シミュレーションを実施した。数値モデルが順調かつ物理的に整合的な動作をすることを確認することができ、また、メタンの光解離と赤外熱放射によるエネルギー消費が、散逸流速を著しく低下させることが示された。初期太陽に推定される紫外線強を当てはめた場合、惑星形成後数億年間に渡って原始大気に水素分子が高濃度で残存する可能性が示唆された。集積期の惑星における揮発性元素のガス・シリケイトメルト・金属鉄間の分配の熱力学モデル構築の検討を進め、水素・炭素に加えて、窒素の取り込みに向けた定式化を進めた。原始大気の組成的成層構造と流体力学的散逸の数値モデリングが予想以上に進展した。原始分配の熱力学モデルについては、窒素分配について予察的な結果を得たが、他の揮発性元素との化学的相互作用を今後とりいれる必要がある。総合的におおむね順調と判断する。1)揮発性元素分配の熱力学モデルを拡張する。2)集積期の原始大気の質量と成層構造の進化を、集積期の惑星内部の熱進化と併せてシミュレートする。3)光化学過程を含む流体力学的散逸モデルを地球質量の惑星に適用し、数値的解析を進める。4)還元型原始大気の温室効果の数値モデリングを行う。以上から、還元型原始大気の形成と、その初期地球における熱・組成構造の進化の理論的な解明を進める。
がん研究に要する研究資材開発

がんの研究のためには,各種の研究資材が必要である。本研究班は、がん研究に必要な資材を調製し,分与し,あるいはそれらの所在情報を「がん特」「新バイオがん」の研究者に供給することを目的としている。具体的には次の8つの事業を行った。1.移植腫瘍分与(東北大・抗酸菌研・及川淳):45種の移植腫瘍を85件分与した。2.がん遺伝子プロ-ブ(東大・医科研・渋谷正史,豊島久真男):8種のがん遺伝子プロ-ブを29件分与した。3.染色体マッピング(北大・理・吉田廸弘,東大・医科研・渋谷正史):染色体マッピング用にヒト・マウスハイブリド-マDNAを2件分与した。4.RFLPプロ-ブ(癌研・中村祐輔):ヒト染色体マッピング用プロ-ブ900種を分与した。5.遺伝情報(九大・理・宮田隆,遺伝研・五條堀孝,癌研・伊藤彬):遺伝情報について12件の相談があった。蛋白デ-タベ-スパンフレットを作成中。6.単クロ-ン抗体(東北大・薬・橋本嘉幸,愛知がんセンタ-,高橋利忠):単クロ-ン抗体所在情報のパンフレットを作成した。7.化学物質(東大・医科研・松島泰次郎):発がん物質MeIQを3件分与した。8.DNA保存(東大・医科研・黒木登志夫,愛知がんセンタ-・青木國雄,国立がんセンタ-・西村暹):コホ-ト集団のDNA2530人からDNAを分離し,保存した。
高速・連続3次元計測システムの開発

1.まず、申請者らが提案した高速・連続3次元形状計測法をさらに具体化した。2.ついで、その手法の中枢となる30チャンネルのPSDセンサアレイを設計し試作した。3.上記のPSDセンサアレイを用いて高速・連続3次元形状計測装置を設計し・試作した。4.この試作装置を使って、高速で動く3次元物体を実際に計測したところ、極めて忠実度の良い計測結果が得られた。ちなみに、試作装置の段階で、1シ-ンあたりの計測時間が10ms程度で連続的に計測できることが確認できた。5.得られたレンジデ-タの雑音除去、欠落点再生アルゴリズムを開発した。6.ついで、高速で回転するNーK変わり文字ブロックおよび自由落下しその後バウンシングしているテニスボ-ルの連続測定結果から表面モデルの最構成を試み良好な結果が得られることを確認した。7.平面と曲面から構成される物体に対しては、拡張ガウス像を利用して領域分割を行ない、平面を抽出した後、平面は回帰平面で近似し曲面をBースプライン補間法で平滑化して、表面形状を精度よく復元できることを示した。以上のように、本研究によって、申請者らの計測方法に基づけば、従来のこの種の装置の計測時間を数百分の1ないし千分の1へと抜本的に短縮し、しかも連続的に計測できる3次元形状計測装置を実際に作製できることが確認できた。これらの成果は、電子情報通信学会、国際会議等で発表済み、ないし、発表予定である。
受精卵への簡便なゲノム編集ベクター導入法の開発

本研究は、高額な装置と高度な技術を必要とするマイクロインジェクション法を用いることなく、当センターの生殖工学技術や設備を活用し、受精卵への簡便なゲノム編集技術導入法の開発を目的とした。使用したリポフェクション法は、核酸とトランスフェクション試薬の混合液を受精卵の培養液へ添加するだけで、多くの卵を一度に処理できる利点があるため、非常に簡便な方法であり、この方法が受精卵への核酸導入およびゲノム編集個体作製に利用可能であったことから、本研究は、今後の遺伝子改変マウス作製およびその応用研究に大いに貢献できると考える。ただし、実用的な個体作製には、効率改善が必要であり、今後更に条件検討を行う必要がある。今年度は「1、透明帯除去受精卵を用いて、簡便なリポフェクション法による受精卵へのゲノム編用ベクターの導入法を開発する。」ことを目的として研究を行った。その成果を以下に示す。(1)現在販売されている様々な核酸導入試薬のうち、ウシ血清アルブミンを含む受精卵の培養液へ直接添加でき、核酸導入効率が高く、受精卵の生存率や胚発生率の良いトランスフェクション試薬を選定した。その際、透明帯除去受精卵(裸化卵)を用いて、GFPレポーター遺伝子を含むゲノム編集ベクターの導入を検討したが、GFPレポーター遺伝子の発現が弱く、卵の自家蛍光が観察の妨げとなった。そのため、ベクター導入後、染色観察が可能なLacZマーカー遺伝子を含むプラスミドDNAと裸化卵を用いて、核酸導入のための試薬選定を行った。7種類の試薬を検討した結果、Lipofectamine 3000 Reagent(Thermo Fisher Scientific)とFuGENE HD Transfection Reagent(Promega)の2試薬は良好な成績であったため、これらの試薬を使って研究を進めた。(2)既にマイクロインジェクション法にて変異導入効率を確認済のゲノム編集ベクター(プラスミドDNA)の裸化卵への導入を試みた。PCR産物のシーケンシング解析を行ったところ、変異型の波形は非常に弱く、変異導入効率は低率であると考えられた。使用実績のあるベクターであったため、プロモーター強度ではなく、プラスミドDNAの核内移行や発現強度が問題と考えられたため、ゲノム編集可能なmRNAの導入を検討した。(3)既にマイクロインジェクション法にて変異導入効率を確認済のTALEN mRNAを裸化卵へ導入するため、mRNA用の導入試薬であるLipofectamine MessengerMAX reagentとFuGENE HD Transfection Reagentを使用し、検討を行った。PCR産物のシーケンシング解析を行ったところ、変異配列導入胚を高効率に得ることができた。平成27年度の研究計画に沿って研究を遂行し、概ね目的を達成することができた。今年度は、主にプラスミドDNAやmRNAを用いた導入試薬の検討を行うため、核酸の濃度測定に不可欠な微量分光光度計を購入した。極少量のサンプルで正確な核酸の濃度測定を行うことができ、迅速に研究を進めることが可能となった。また、本研究では多くのマウス受精卵を作製する必要があるが、当研究室で開発した新規の超過剰排卵誘起法を用いることによって通常の過剰排卵誘起法を用いた場合に比べ、雌1匹あたり23倍多くの卵を採取することが可能となり効率的に受精卵を作製することができた。当研究室の超過剰排卵誘起法は動物愛護や作業効率の観点から優れた方法であり、このような技術を活かすことにより、効率的な作業の進行が可能となった。体外受精後に行う卵の選別では、多核卵、単為卵、未受精卵を確実に除外し、正常な受精卵のみを研究に使用するため、高倍率で立体感のある観察が可能な実体顕微鏡を購入した。これまでに使用していた実体顕微鏡よりも格段に観察しやすく、卵の選別作業をスムーズに行うことが可能となった。さらに、広島大学の山本研究室と連携して研究を進めることにより、本研究に必要なゲノム編集ベクター等を速やかに作製および供与いただいた。山本研究室と頻繁に意見交換を行い、技術協力をいただくことにより、確かなゲノム編集技術を用いて本研究課題に取り組むことができた。また、本研究と平行してマイクロインジェクション法を用いたゲノム編集個体の作製を進め、導入する核酸種やゲノム編集方法の違いによる産子への発生率や変異導入効率の差異を精査することにより、本研究課題を効率よく進めるための基盤作りを行うことができた。本研究では、受精卵でのゲノム編集を容易にし、様々な研究へのアプローチに役立つ技術開発をめざす。今年度は「2、透明帯が存在しても受精卵内に核酸が取り込まれるような方法を開発する。」ことを目的とし、以下3通りの受精卵へのゲノム編集ベクター導入を試みた。昨年度は裸化卵へCRISPR-Cas9プラスミドベクター(内在遺伝子を標的とするgRNAとCas9を発現するプラスミドDNA)を導入することが困難であったが、今年度、使用条件を細かく検討することにより、プラスミドベクターを高効率に受精卵へ導入でき、ゲノムへの変異導入も可能な条件を見出すことができた。そのため、このプラスミドベクター、および昨年度、裸化卵にて変異導入を確認済のTALEN mRNAの導入を検討し、胚盤胞期胚の解析を行った。

(1)無処理受精卵では、試薬量やリポプレックス複合体作製時のメディウム検討を行い、卵が死滅することなく、正常発生可能な極限まで高濃度のリポフェクション処理を検討したが、胚盤胞期胚の解析において変異導入を確認することはできなかった。(2)透明帯の菲薄化処理では、透明帯の構造を脆弱化させる試薬として、当研究室でその作用を確認済みの還元型グルタチオンを使用した。また、マウスや家畜の受精卵において広範に使用されている透明帯除去試薬(酸性タイロード、プロナーゼ、コラゲナーゼ)を用いて、受精卵の生存や発生に毒性を与えない程度の段階的な透明帯菲薄化処理を行い、核酸導入を試みた。胚盤胞期胚のゲノミックPCR産物を用いてDNAシーケンス解析を行ったところ、一部の実験区において、弱いピークの標的配列への変異導入を確認することができた。(3)当研究室に設置済みのレーザー装置を用いて透明帯を穿孔し、透明帯穿孔受精卵へ核酸導入を検討した。胚盤胞期胚のゲノミックPCR産物の塩基配列を解析したところ、標的配列への変異導入を確認することができた。平成28年度の研究計画に沿って研究を遂行し、概ね目的を達成することができた。昨年度「1、透明帯除去受精卵(裸化卵)を用いて、簡便なリポフェクション法による受精卵へのゲノム編集用ベクターの導入法を開発する。」ことを目的として研究を行い、受精卵の培養液へ直接添加でき、核酸導入効率が高く、卵の生存率や胚発生率の良いリポフェクション試薬を選定した。ゲノム編集用核酸を導入した裸化卵を培養し、胚盤胞期胚を仮親の子宮へ移植したが、裸化卵の使用では、リポフェクション処理や仮親への胚移植作業が困難なうえ、産子への発生率が極めて低率であったことから、本年度は「2.透明帯が存在しても受精卵内に核酸が取り込まれるような方法を開発する。」ことを目的として研究を行った。昨年度に選定したリポフェクション試薬を使用し、透明帯無処理受精卵や透明帯菲薄化受精卵、透明帯穿孔受精卵へのゲノム編集ベクター導入を検討した。核酸導入後、発生した胚盤胞期胚のゲノミックPCRを行い、ヘテロ二重鎖移動度アッセイ、Cel-Iアッセイおよび制限酵素断片長多型解析にて標的とするゲノム配列への変異導入の有無を確認した。多数の胚盤胞期胚の微量なゲノムDNAを各々増幅し、複数の解析を効率的かつ正確に行うため、多検体の自動分析が可能かつ高感度なマイクロチップ電気泳動装置を購入した。本装置は正確な解析と作業効率化に大変有用であった。さらに広島大学の山本研究室と連携して研究を進めることにより、確かなゲノム編集技術を用いて本研究課題に取り組むことができた。また、本研究と平行してマイクロインジェクション法を用いたゲノム編集個体の作製を進め、導入する核酸の種類や方法の違いによる産子への発生率や変異導入効率の差異を精査することにより、本研究課題を効率よく進めるための基盤作りを行うことができた。近年、受精卵へのマイクロインジェクション法とゲノム編集技術を組み合わせることにより、高速な遺伝子改変マウスの作製が可能となった。しかしながら、高額な装置と高度な技術が必要なマイクロインジェクション法を用いた受精卵への核酸導入法は、誰もが簡便に行うことのできる方法とは言い難い。そこで、本研究では、簡便な受精卵へのゲノム編集技術導入法の開発を目的とした。
帰納的関数論の計算量問題への応用

本研究により本年度になされた結果の主なものをあげる。(1)一般化されたKolmogorov complexityに関して、self P-printableでない粗(sparse)な集合が存在することを示した。しかもそのような集合は連続体の濃度あることを示した(今田、篠田)。(2)集合論のブール値モデル内の超構造から超準宇宙を構成する方法を確立した。これにより、強制法が利用可能な超準解析学の新しい枠組みが得られる。その応用として,一様非完備な実数体のブール超巾を構成することに成功した(小澤)。(3)計算量クラスの分離問題に関して、Ajtaiの方法を分析して非標準モデル上のBool値モデルの理論作りを上げ、それを用いてIΣ_0+Pigeon Hole PrincipleからCountが導かれないことを示した(安本)。(4)過渡的な加法過程を強過渡的、弱過渡的へ分類する判定条件を、その対数特性関数の性質によって与えた。さらに,再帰的,過渡的のSpitzer型の判定条件の対応物は得ることができないということを示した。この判定条件を用いて、5次元以上の非退化の加法過程が必ず強過渡的であることなどを示した(佐藤)。(5)通信路容量,相互情報量,および2乗平均誤差の間に成り立ついくつかの不等式を証明した(井原)。これらの不等式は情報理論において基本的な役割を果たすことが期待される。(6)確率過程の応用として、光合成において重要な意味を持つ金属錯体の分子進化論を考察し、遺伝子の中立説的な結論を導いた(森本)。