hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
破骨細胞から分泌されるスクレロスチン発現抑制因子は骨代謝共役因子か？

(2) Sost発現抑制因子の同定:破骨細胞が分泌するSost発現抑制因子を同定するため、破骨細胞の培養から精製したRNAをマイクロRNA解析に供した。分泌タンパク質に絞って解析したが、発現が高い遺伝子の中で、候補を絞りこめなかった。(3)破骨細胞から分泌されるサイトカインX(X)の解析:マイクロRNA解析において、破骨細胞はXを発現することが明らかになった。さらに、ウェスタンブロット解析とリアルタイムPCR解析において、破骨細胞は、サイトカインX(X)を顕著に発現することを確認した。さらに、中和抗体を用いて、破骨細胞の培養上精のXを中和すると、Sost抑制効果が消失した。以上より、破骨細胞はXを分泌し、Sostの発現を抑制する。これにより、Wntシグナルを高め、骨形成を誘導することが示唆された。骨リモデリングは破骨細胞と骨芽細胞および骨細胞の連携により行われる。骨細胞から分泌されるSclerostin(Sost)は、Wnt/β-カテニンシグナルを阻害し、骨形成を抑制する。OPG欠損マウス(OPG-KO)は骨吸収と骨形成活性が共に高い骨代謝回転を示す。OPG-KOでは、Sostの発現が著しく低下することを見出している。この所見は、骨吸収に伴い増加する因子によりSostの発現が抑制されることを示唆する。破骨細胞の培養から調整した培養上清中にSostの発現を抑制する活性を見出した。破骨細胞はサイトカインXを分泌し、Sostの発現を抑制することを明らかにした。破骨細胞特異的Wnt5acKOマウスおよびリコンビナントWnt5aを用いた解析から、Wnt5aは、直接sclerostin産生細胞に作用し、その産生を抑制するわけではないことが明らかになった。Sclerostin阻害因子候補の中からWnt5aを除外できる結果だと思われる。クロマトグラフィーを用いて破骨細胞の培養上清から抑制因子の精製を試みた。この研究は、破骨細胞の培養上清を集めることが予想以上に困難であること、さらに部分精製が難しいため、因子の同定には至らなかった。この点で、研究計画に多少遅れが生じたと考えている。生化学平成26年度以降の研究実施計画に沿って、Sost発現抑制因子のさらなる同定を行う。クロマトグラフィーでの部分精製がうまくいかなかったため、DNAチップを用いたトランスクリプトーム解析を行い標的因子の同定を試みる。OPGーKOマウスに抗RANKL抗体を投与すると、骨吸収が抑制され、骨組織でのSostの発現が上昇した。この現象は、免疫組織学的解析に加え、リアルタイムPCRを用いたトランスクリプトーム解析でも確認できた。Sostの発現を簡便にスクリーニングするアッセイ系では、UMR106細胞がSostを高発現することを確認している。Sostの発現を抑制することが報告されているPGE2をこの培養に添加すると、Sostの発現が抑制した。この結果から、Sost発現抑制因子を同定するためのバイオアッセイ系が確立できたと考える。このように、研究計画にそって概ね順調に進行していると考えている。平成26年度の研究実施計画に沿って、Sost発現抑制因子の同定を行う。1つは、培養上清中の抑制活性がタンパク質成分に由来するのか?
骨吸収抑制作用と抗炎症作用を併せ持つビスホスホネートの歯周疾患治療医学への応用

強力な骨吸収抑制薬として知られる一連のビスホスホネート(BP、BPs)系化合物の中から8種のBPsを選び、歯周病治療薬として、どのBPが最も高い可能性を有するかについて種々の検討を行った。その結果、(4-メチルチオフェニル)チオメタンビスホスホネート(TRK-530)に高い可能性が見出されたので、このBPを中心にその薬理作用、作用機序、安全性について検討し、概ね以下の結論を得た。1.TRK-530は、LPS, PGE2,IL-1等による骨吸収の促進を、用量依存的に抑制した。2.現在、骨粗髪症治療薬あるいは高カルシウム血症治療薬として最も広く使用されている窒素含有BPs(N-BPs)は、LPS刺激によるPGE2産生の増加を用量依存的に増強するのに対して、TRK-530はこれを用量依存的に抑制した(マウス頭蓋冠骨器官培養系)。その機序は、抗酸化作用に基づくCOX-2の発現抑制に基づくものと推測された。3.N-BPsは、骨芽細胞系のセルラインにおいて、アルカリホスフアターゼ活性を抑制するのに対して、TRK-30は、用量依存的に増加させた。4.ラットやウサギの歯槽骨に局所投与したTRK-530は、投与部位の骨密度と骨量を著明に上昇させた。5.全身的あるいは局所的に投与したTRK-530は、ラットの実験的歯周炎モデルにおいて用量依存的に歯槽骨の吸収を抑制し、歯周組織の破壊を抑制した。6.BPsの副作用の一つとして報告されている抜歯後の骨壊死に関して、ラット抜歯窩の修復に及ぼす効果を検討した。N-BPsの一つであるゾレドロネートの大量全身投与は、抜歯窩の修復を遅らせるのに対して、TRK-530にはそのような作用は認められず、むしろ修復を促進する傾向が見られた。以上、本研究により、TRK-530は、多くのBPsの中でも歯周病治療薬としての比較的優れた性質を有することが示唆された。平成17年度における研究成果は概ね以下の通りである。(1)マウス頭蓋骨の器官培養法を用い、ビスホスホネート(BP、BPs)が破骨細胞の機能と形態に及ぼす作用について検討した。その結果、いずれのBPsもLPS,IL-1β、PGE2等による骨吸収の亢進を用量依存的に抑制した。また、培養した頭蓋骨に免疫組織化学的な染色を施し、共焦点レーザー顕微鏡によって観察した結果、破骨細胞のアクチンリングやβ3インテグリンタンパクが消失し、破骨細胞の細胞骨格や骨への接着に破綻が生じていることが明らかとなった。一方、骨芽細胞や骨細胞には形態的な変化は見られなかった。(2)いくつかのBPsのうち、クロドロネートやエチドロネート、TRK-530などのBPsは、骨吸収抑制作用に加えて、用量依存的にPGE2の産生を抑制し、抗炎症作用を併せ持つ可能性が示唆された。また、側鎖に窒素原子を持つBPsは、大量に与えたとき、逆にPGE2の産生を促進する可能性があることが明らかとなった。(3)骨吸収を抑制し、抗炎症作用を併せ持つ可能性のあるBPsのうち、特にTRK-530について、その抗炎症作用の機序について検討した。

その結果、TRK-530は、抗酸化作用により活性酸素をスカベンジする作用をもち、その作用により、NOから産生されるONOO^-(ペルオキシナイトライト)の発生を抑制する可能性があることが明らかとなった。すなわち、COX2発現促進作用を持つペルオキシナイトライトの産生が抑制されることが、PGE2産生の抑制と関連することが示された。(4)全身的あるいは局所的に投与したTRK-530は、ラットの実験的歯周炎モデルにおいて、用量依存的に骨吸収を抑制し、歯周組織の破壊を抑制した。平成17年度の研究成果にもとづき、チオメチルフェニルチオビスホスホネート(TRK-530)を歯周病治療薬の最有力候補と考え、その薬理学的性質について動物実験と器官培養実験を中心に種々の検討を行った。その結果、以下のような成果を得た。(1)TRK-530はPGE2産生を抑制するビスホスホネート(BP)の中では、最も強力な骨吸収抑制作用を持つ。(2)ラットやウサギの歯槽骨に局所投与したTRK-530は、投与部位の骨密度と骨量を著明に上昇させ、その作用は0.001mMから10mM濃度の範囲において用量依存的である。(3)上記の作用は、単回投与によって1週間以内に明らかとなり、その効果は、少なくとも数週間持続する。(4)ビスホスホネート系化合物の骨吸収抑制活性はP-C-P結合の炭素原子に付加される側鎖によって大きく異なるが、骨形成形系に対する作用も側鎖の構造によって異なる。骨芽細胞系cell-lineと骨器官培養実験から、N含有BPs(ゾレドロネート、パミドロネート、アレンドロネート、インカドロネート)は高用量でアルカリホスファターゼ活性を低下させるのに対し、エチドロネート、クロドロネート、TRK-530は、ALP活性を用量依存的に上昇させる。(5)BPs大量投与時の副作用の一つとして報告されている顎骨壊死の発現機構を推察するための実験モデルの一つとして、BP投与後、切歯を抜歯し、抜歯窩の修復過程を観察するという実験系を確立した。この実験系において、ゾレドロネート(ALP活性を抑制し、PGE2産生を促進させる)は、抜歯窩の修復を遅らせるのに対し、TRK-530(ALP活性を上昇させ、PGE2産生を抑制する)はそのような作用を持たず、むしろ修復を促進させることが示された。以上の結果、多くのBPの中で、TRK-530は、歯周病治療薬としての優れた性質を有することが示唆された。
新規水素結合型配位子をもつ遷移金属錯体の開発

Hydrogen-Bonded Charge-Transfer(HBCT)システムとして、N-アルキルビオルル酸を配位子とした新規遷移金属錯体、およびビオルル酸のカルボニル基をチオカルボニル基に変換した配位子の合成にも成功し、そのX線結晶解析も行い、ESR測定等により、結晶内における水素結合様式についての知見を得ることができた。また、分子内に種々の水素結合部位をもつ、キナクリドン誘導体の合成を行った。現在では、キナクリドン骨格に焦点を当て、これに電子供与基等の種々の置換基を導入することによって、ドナー性の向上と溶解性の向上をはかり、結晶場における水素結合ネットワークの構築をめざしている。キナクリドン骨格としては初めてキノジイミン誘導体の単離にも成功している。同様に2,7-ジアルキルピリミド[4,5-g]キナゾリン-4,5,9,10(3H,8H)-テトロン誘導体の合成もおこなっている。この分子は、多段階レドックス系としての物性が期待できるようなヘテロ原子をキナクリドン骨格に組み込んだものであり、その電荷移動錯体を合成した。また、シアナニル酸を配位子に用いた種々の遷移金属錯体を合成し、X線結晶解析を行った。Hydrogen-Bonded Charge-Transfer(HBCT)システムとして、N-アルキルビオルル酸を配位子とした新規遷移金属錯体、およびビオルル酸のカルボニル基をチオカルボニル基に変換した配位子の合成にも成功し、そのX線結晶解析も行い、結晶内における水素結合様式についての知見を得ることができた。現在では、キナクリドン骨格のみに焦点を当て、これに電子供与基を導入することによって、ドナー性の向上と結晶場における水素結合ネットワークの構築をめざしている。この分子は、多段階レドックス系としての物性が期待できるようなヘテロ原子をキナクリドン骨格に組み込んだものである。さらに、分子レベルでの水素移動と電子状態との相関関係についての半定量的な知見を得るため、GAUSSIAN-94プロブラムを用いたab-initio分子軌道法(UHF/3-21G^*)を用い、キナクリドン系錯体の計算を行った。モデル錯体として無置換キナクリドンと、N,N'-デヒドロキナクリドン、およびOH置換キナクリドン等のab-initio計算により、新しい電子系であるPET過程の挙動を理解し、水素-電子連動移動型錯体の設計を行なう上での基礎データの一部とすることができた。キナクリドン骨格に種々の置換基を導入することによって、ドナー性の向上と溶解性の向上をはかることができ、TCNEとの電荷移動錯体のX線結晶解析にも成功した。また、キナクリドン骨格としては初めてキノジイミン誘導体の単離にも成功している。同様にDNA型水素結合のモデルをHBCTシステムに組み込み、多段階レドックス系としての物性が期待できるようなヘテロ原子をキナクリドン骨格に組み込んだ、2,7-ジアルキルピリミド[4,5-g]キナゾリン-4,5,9,10(3H,8H)-テトロン誘導体の合成もおこない、電荷移動錯体を合成した。ほとんどの錯体で三次元的な水素結合ネットワークが確認できた。ESRスペクトルの測定より、[Cu(CNAL)_2(H2O)_2](phzH)_2(H2O)_
土壌中におけるダイズ根粒菌のゲノム再編成機構とその生態的意義

本研究は、土着ダイズ根粒菌の遺伝的多様性の解析過程で分かってきた多コピーの挿入配列を保有するダイズ根粒菌Bradyrhizobium japonicum HRS株の生成機構と生態的な役割を明らかにするために、(1)HRS株の地理的分布と分子系統、(2)圃場生態系における種内競争因子、(3)ゲノム再編成、(4)遺伝子水平伝達について検討を行った。(地理的分布と分子系統)アメリカ合衆国、中国および日本保存株からHRS株が検出され、RS-alpha, RS-betaのコピー数の増加の程度と、土壌環境(湛水土壌やアルカリ土壌)、分子系統樹(BJ1,Bj2)、血清型、増殖速度の間に関係が認められた。(圃場生態系における種内競争因子)HRS株がわずかに生息する土壌を畑条件下と水田を想定した湛水条件で2ヶ月間保持し根粒形成を調べたところ、湛水条件下においてHRS株の出現頻度が有為に増加した。土壌環境に近い低栄養条件や栄養ストレス条件下にいおて、HRS株の増殖速度はnon-HRS株とほとんど変わりはなく、30日以上の定常期を経た細胞では、HRS株のコロニー形成率が高い傾向が観察された。したがって、HRS株は、栄養ストレス耐性が高いと考えられた。(ゲノム再編成)HRS株NK6の窒素固定(nif)遺伝子領域約20kbの塩基配列および遺伝子重複を起こしているヒドロゲナーゼ(hup)遺伝子領域の部分配列を決定したところ、機能的に重要な構造遺伝子は保存されていたが、通常株では本来その領域に存在していない挿入配列による領域分断やシャフリングが観察された。(遺伝子水平伝達)B.Jaonicum HRS株NK5からnod遺伝子欠損B.elkaniiへのnod遺伝子の水平伝達が、土壌およびマイクロコズムで観察され、その頻度は14日間のnon-growth conditionのmicrocosm実験において10^<-10>から10^<-11>の範囲であった。以上のように、本研究ではダイズ根粒菌HRS株の遺伝生態的な特徴を明らかにした。土壌微生物の多様化や遺伝子水平伝達の機構を明かにするために、多数の挿入配列(IS)を多コピー保有するダイズ根粒菌(Bradyrhizobium japonicum)超反復配列保有株(HRS株)を同じ圃場に生息している通常株と比較し以下のような結果が得られた・HRS株は、通常株よりカナマイシンなどの抗生物質およびニッケルなどの重金属に対して感受性が高く、B.Japonicum HRS株には、挿入配列IS1631が多コピー存在していた。そこで、これらの性質を利用したHRS株検出法を確立した。今後アジア地域のダイズ圃場におけるHRS株の地理的分布を検討する予定である。16SrRNA遺伝子のシークエンスを調べたところ、HRS株は明らかにB.Japonfcumに属することが明らかとなった。中国で単離命名された非常に生育の遅いダイズ根粒菌B.lioningenseは、16S rRNA遺伝子のシークエンスやその他の生理的な諸性質、挿入配列IS1631の存在などにより、HRS株と類似していると判断された。還元の進んだ水田土壌を想定して・水素ガスを唯一のエネルギー源とする化学独立栄養条件下における生育を比較したが、両者の間に差は認められなかった。

HRS株では挿入配列による領域分断やシャフリングが観察された。また、HRS株NK5の根粒形成(nod)遺伝子の適当な位置に薬剤耐性カセットを導入し、根粒形成能保持した薬剤耐性標識HRS株NK5を作成したので、以前観察されたHRS株NK5からのnod遺伝子の水平伝達現象の条件を今後検討する予定である。ダイズ根粒菌HRS株の地理的分布を調べるために、HRS株のみに存在するIS1631を単生の菌体からだけでなく、バクテロイドからもPCR増幅し検出する方法を確立した.この方法によりIS1631を保有する株がアメリカ合衆国、タイ、韓国、中国の株から検出され、世界各地のダイズ畑土壌におけるHRS株の生息の普遍性が示唆された.圃場生態系におけるHRS株の生存に有利な性質(種内競争因子)を解明するためHRS株がわずかに存在する土壌を(A)畑条件下、(B)水田を想定した湛水条件、(C)グルコースを加え強い還元状況を作り出した湛水条件におき、HRS株の出現頻度の変化をIS1631を検出する方法を用いて追跡したところ、(B)(C)の条件でHRS株の出現頻度が有為に増加していた.HRS株のみにIS1631が必ず存在しているので、IS1631の感染がHRS株生成の引き金になっている可能性が考えられた.そこで、2個のIS1631とカナマイシン耐性遺伝子から構成される人エ複合トランスポゾンを作成し、接合によりIS1631を持たない通常のダイズ根粒菌に導入するためのブラスミドを構築した.以前本研究室においてHRS株からの根粒形成遺伝子nodの水平伝達が観察された.遺伝子の受容菌とし、B.japonicumに極めて近縁でニトロゲナーゼ遺伝子nifおよびヒドロゲナーゼ遺伝子hupを保有している低栄養細菌AgromonasoligotrophicaS58にカナマイシン耐性遺伝子を導入した変異株を構築した.本研究の目的は、土着ダイズ根粒菌の遺伝的多様性の解析過程で分かってきた多コピーの挿入配列を保有するダイズ根粒菌Bradyrhizobium japonicum HRS株の生成機構と生態的な役割を明らかにしすることである。平成12年度は、以下のような成果が得られた。B.japonicum HRS株の地理的・系統的分布を検討し、RS-alpha,RS-betaのコピー数の増加の程度と、土壌環境、血清型、増殖速度の間に関係を見い出した。すなわち、日本の新潟農業試験場の田畑輪環圃場に見い出されるRS-alphaコピー数が高いHRS株は、血清型110&122に、16S rRNA遺伝子に基づいた分子系統樹上でBJ1クラスターに属した。一方、米国の鉄欠乏アルカリ土壌から分離されたRS-betaのコピー数の高いHRS株は、血清型135に、分子系統樹上のBJ2クラスターに属した。これらの結果は、ダイズ根粒菌HRS株は、土壌条件や遺伝的背景に応じて生成し環境に適応してきたことを示唆しているものと考えられた。BJ1タイプのHRS株が新潟の田畑輪環圃場に高頻度に分離されるので、その原因を探るために、モデル実験を行った。元来HRS株の出現頻度が低い土壌を、土壌湛水処理を行うことにより、HRS株によるダイズ根粒の占有率が有為に上昇した。この結果は、酸素が遮断される土壌湛水によって、土壌細菌の微生物相が変化し、HRS株のpopulationがnon-HRS株より増加していることを示唆していた。
半単純対称空間上の不変固有超関数の接続公式

半単純対称空間上の不変固有超関数の接続公式の問題、即ち、[問題]各カルタン部分空間(の正則元の全体)の上で与えられた関数が、対称空間全体の不変固有超関数の制限となっているための条件を求めよ。について、我々は従来の研究で、いくつかの半単純対称空間の具体例に対して必要十分条件の候補を求め、その条件が必要条件であることを証明した。この証明には、高階の対称空間上の不変積分を1階の場合に帰着させる原理が不可欠であった。本年度の研究で、我々は、1.不変積分に関する諸定理を、より一般の半単純対称空間に対し、精密に証明した。このことにより、より広い範囲の対称空間に対する(我々の方法による)研究に道が開かれた。2.従来の対称空間と複素化が同型であるU(p,q)/(U(r,s)×U(p-r,q-s))に対して、([問題]の)必要条件に関する考察を行った。1、2については、既に論文の作成に着手した。早急に完成させ発表する予定である。推定した条件が、十分条件であるかどうかについてはまだ明らかになっておらず将来の課題として残されることとなった。今後の研究計画としては、このことに加え、今まで我々が得てきた結果をルート系の概念を用いて統一的に書き直すという作業を完成させ、さらに広い範囲の半単純対称空間に対して研究を進めたい。
生体光イメージングによるがん化プロセスの解明

がんの死亡の最も大きな要因である転移のメカニズムを明らかにすることが、癌の死亡率の上昇に歯止めをかけることに繋がると考えら、がんはまさに全身を対象にして研究すべき病気である。我々は、これまで、化学発光イメージングが適応できるレポーターを組み込んだ腫瘍細胞を移植し、経時的に観察する研究を行っていた。しかし、それでは外来の腫瘍細胞の生体内での応答を見ているに止まり、「生体レベルでのがん化プロセス」を解析することはできない。そこで本研究において、腫瘍内微小環境の重要な因子であるHIF-1の生体応答を経時的に観察することで、「生体レベルでのがん化プロセス」の情報取得を試みた。HIF-1は、低酸素環境下で誘導され、癌の転移や浸潤、血管新生の亢進、アポトーシスの回避といった癌の悪性化に関与する様々な遺伝子の発現を誘導することが知られており、HIF-1の活性が、癌の悪性度と相関があるという臨床報告も多数なされている。本研究では、全身の細胞にHIF-1活性をモニターするレポーター遺伝子をもったトランスジェニックマウスを構築し、腫瘍の悪性化にともなって上昇する内在性のHIF-1活性をモニターすることで「生体レベルでのがん化プロセス」の解明を試みた。21年度は、RasH2マウスとの交配トランスジェニックマウスを用いたMNU等の突然変異誘導作用をもつ薬物を投与したりする事で、がんを誘発するなどして、内因性発がん過程を経時的に観察することに成功した。これらの結果は、「発がん過程を生体イメージングでモニタリングする」という本研究の目的を達成するとともに、今後多くの発がん刺激に対して生体レベルでのがん化プロセスを解明し、創薬研究や、遺伝子や化合物等の発がん実験に貢献することが期待できる成果である。がん悪性化の主因と考えられている低酸素誘導転写因子HIF-1は、正常組織では存在しない様な低酸素状態やがん遺伝子機能の亢進といった異常な状態に応答して活性化される。従ってこのHIF-1活性を生体レベルで、しかもリアルタイムでモニタリングすることができるトランスジェニックマウス(ODD-Tg)を用いて観察すれば、発がんプロセスを生体レベルで解明することができると考え、リアルタイムにHIF-1活性を感度良くイメージングすることができるレポーター遺伝子を全身にもつトランスジェニックマウスを3ライン(Balb/c,FVB,B6)構築し、性状解析を行っている。虚血処置による、イメージングでの応答性確認もできており、生体レベルでHIF-1活性をモニタリングができる事を確かめた。これまでの解析から腫瘍細胞以外の腫瘍内細胞でのHIF-1活性を可視化することが出来ており、かなり高いHIF-1活性を有していることを確認することができた。このことは、がんの微小環境ががんの悪性化に大きく係わっていることを具体的に示しており、その本質とメカニズムを解析するツールとしてODD-Tgマウスを活用し、生体イメージングで腫瘍内微小環境と治療抵抗性や悪性化との関係を明らかにすることができると考えられる。また、早期発がん試験用マウスとして用いられているRasH2マウスは、FDAが認知し、欧米各製薬会社で使われている。そこで、RasH2とODD-Tgを交配させたRasH2xODD-Tgマウスを用いて、発症するがんの生体イメージングの観察を計画した。このマウスにおける発癌の時期や位置を生体イメージングで経時的に観察できれば、創薬研究や腫瘍生物学研究において、極めて有用なツールを提供することができる。RasH2マウスは、MNUのような発がん性物質の投与により、早期にがんを発症する事が分かっているため、RasH2xODD-TgマウスをMNUで処理して経時的にイメージングを行ったところ、がんの発症をモニターできる事を示す成果が得られつつある。

これらの結果は、「発がん過程を生体イメージングでモニタリングする」という本研究の目的を達成するとともに、今後多くの発がん刺激に対して生体レベルでのがん化プロセスを解明し、創薬研究や、遺伝子や化合物等の発がん実験に貢献することが期待できる成果である。
米国資本市場法制における投資会社法の行為規制の意義

本研究では米国投資会社法の行為規制が米国資本市場法制において果たしている役割について検討した。3年間の研究期間においては、1940年当時に各種行為規制が導入されるに至った経緯を詳細に検討するとともに、投資会社の組織再編の場面における行為規制の役割、ベンチャーキャピタル規制の文脈における行為規制の意義、投資会社のアクティビズムとの関係における行為規制の意義について検討を行った。それにより、各種行為規制制定の背景をなす歴史的経緯を明らかにするとともに、それぞれの場面においてSECが投資家保護の要請を図りながら行為規制の適用除外を認めることで投資会社法を運用している実態に迫ることができた。本年度においては、米国投資会社法における各種の行為規制が導入された歴史的経緯を中心に研究を行った。はじめに、SECにより公表された「投資信託および投資会社に関する調査報告書」を読み進める作業を行った。それにより、米国において投資会社が1920年代に発展していった歴史から、1920年代および30年代において投資会社を巡りどのような濫用行為が問題にされたかを理解することができた。次に、連邦議会における投資会社法制定を巡る議論の内容を検討した。そこでは、SECにより厳格な行為規制の導入が当初提唱され、当時の会社法制の主要論者もSECによる提案に賛成していたにもかかわらず、投資会社業界の代表者から反対意見が次々と出され、結局のところ当初の提案から大幅に後退した規制が導入された経緯が明らかとなった。以上の作業に加え、投資会社法の組織再編計画の公正性確保に関する行為規制については、投資会社法制定後から今日に至るまでの歴史的展開について考察を行った。それにより、行為規制導入当初はSECが積極的な法執行を行うことにより組織再編計画の公正性を確保しようとしていたが、次第に投資会社のガバナンスの整備を通じて過半数の独立取締役からなる取締役会の監督機能を通じた公正性確保へと変化していったことが明らかとなった。以上の研究成果の一部について、2014年3月28日(金)に開催された早稲田大学の金融商品取引法研究会において、報告させていただいた。本年度においてはベンチャーキャピタル規制としての米国投資会社法の歴史的展開について研究を行った。米国においてはベンチャーキャピタルに対する投資会社法の適用の是非を巡ってSECとベンチャーキャピタル業界との間で半世紀以上にわたる争いが展開され、現在の法制度を形成していることから、その歴史的経緯を検討することにより、投資会社法の行為規制がベンチャーキャピタル規制の文脈で有している意義を明らかにすることができると考えたからである。本研究でははじめに、ベンチャーキャピタルに対して投資会社法が適用されるようになった背景および投資会社法が適用されることにより生じる問題点について確認し、投資会社法の適用の是非を巡るSECとベンチャーキャピタル業界の立場について検討を行った。次に、1980年投資会社法改正により企業育成会社に関する特例が設けられた経緯とその内容について検討を行った。第三に、1996年投資会社法改正によりベンチャーキャピタル規制の州法への委任規定の新設、適格購入者概念の導入、企業育成会社に関する特例の改正が行われた経緯およびそれらの内容について検討を行った。本研究の検討結果から明らかになったことは、1.SECとベンチャーキャピタル業界との間における半世紀以上にわたる論争を経て、米国投資会社法の下でベンチャーキャピタル規制の多様性が実現されていること、2.投資会社法の行為規制は公募により資金調達を行うファンド一般において投資家保護の役割を果たしていると考えられること、3.企業育成会社に関する特例はわが国において公募により資金調達を行うベンチャーキャピタル規制のあり方を考える上で重要な示唆を与えてくれることである。本年度の研究成果については、正井章筰先生古稀記念論文集(成文堂、2015年7月刊行予定)にて公表する予定である。最終年度においては、投資会社によるアクティビズムの文脈で投資会社法の行為規制の意義について研究を行った。米国においては1990年代初頭にミューチュアルファンドが投資先企業の経営改革への関与に消極的である要因を巡り議論が行われ、投資会社法の行為規制が障害になっているとの指摘がなされるようになった。そこで投資会社によるアクティビズム促進のための投資会社法改革論が提唱されるようになった。本研究ではこれらの改革論について検討を行った。具体的には、1.ギルソンとクラークマンによるMSIC制度の導入構想および連邦議会における同制度導入の是非を巡る審議内容、並びにSECによるMSIC制度の承認、2.1996年投資会社法改正による適格購入者概念の導入の経緯とその後のヘッジファンド・アクティビズムの展開およびヘッジファンドアクティビズムの評価を巡る議論の展開、3.パルミタによる投資会社法改革論および2003年投資会社法規則改正による投資会社に対する議決権行使の手続・方針および議決権行使結果の開示制度の導入について、歴史的経緯を順に追いながら検討を行った。それにより投資会社によるアクティビズムが盛んになっていった経緯を明らかにすることができた。研究期間全体を通じて明らかにできたことは、投資会社法の行為規制は投資会社に参加する一般投資家の利益を保護するために導入され、現在でもその役割を十分に果たしているという点である。ただし、投資会社法の行為規制を形式的に適用したのでは投資会社の効率的な運用を妨げ、投資家に不利益を及ぼすことになる。そこで、SECは規則制定により独立取締役による監督機能等を行い、それと引き換えに投資会社法の行為規制を緩和している。このような方法を投資会社法制定以降、今日まで繰り返し継続することによりルールが形成され、米国資本市場法制を支えているものと思われる。

3年間の研究期間においては、1940年当時に各種行為規制が導入されるに至った経緯を詳細に検討するとともに、投資会社の組織再編の場面における行為規制の役割、ベンチャーキャピタル規制の文脈における行為規制の意義、投資会社のアクティビズムとの関係における行為規制の意義について検討を行った。それにより、各種行為規制制定の背景をなす歴史的経緯を明らかにするとともに、それぞれの場面においてSECが投資家保護の要請を図りながら行為規制の適用除外を認めることで投資会社法を運用している実態に迫ることができた。昨年度と今年度の研究作業により、米国投資会社法の行為規制が米国資本市場法制において果たしている役割は確実に明らかになりつつあるように思われるからである。昨年度の研究においては米国投資会社法の組織再編規制を中心に、行為規制について検討を行った結果、投資家保護のために厳格な行為規制が導入された一方、過半数の独立取締役から構成される取締役会が監督機能を十分に発揮できる状況では行為規制を緩和し、組織再編規制の柔軟化を図っていることが明らかとなった。また、今年度の研究作業から、ベンチャーキャピタル業界が再三にわたってベンチャーキャピタルに対する投資会社法の適用除外を主張してきたにもかかわらず、SECが投資会社法を適用すべきとの立場を維持してきたのは、ファンドの性格如何にかかわらず、多数の投資家が参加するファンドについては投資会社法を適用し投資家保護を図るべきと考えてきたからであると思われる。以上から、投資会社法の行為規制は公募により資金調達を行い多数の投資家の参加が予定されているファンドにおいて投資家保護の役割を果たしているという、米国のファンド法制において一般的に位置付けられる普遍的な制度と評価することができるように思われる。また、同法の独立取締役制度は、それが十分機能している状況においては、行為規制に代替する制度として位置付けることができ、それにより行為規制を大幅に緩和しても投資家の利益が確保されているように思われる。資本市場法制米国資本市場法制における投資会社法の行為規制の意義を明らかにするためには、昨年度および今年度と同様、投資会社法のある一定の行為規制が導入された経緯から今日に至るまでの展開について、歴史的な考察を行うことである。このような研究作業をできるだけ多くの行為規制について行っていきたい。また、今年度の研究成果を踏まえた新たな研究課題として、金融危機後のヘッジファンドをはじめとする私募ファンド規制の議論との関係において、米国投資会社法の行為規制の意義を検討していきたい。私募ファンドの文脈において投資会社法の適用の是非が論じられているならば、まさにファンド法制一般について投資会社法の行為規制は投資家保護の役割を果たし得るものと評価できるからである。さらに、投資顧問業者の受託者責任に関する判例法の進展についても検討していきたい。
ヒトiPS細胞を用いたオンチップ型肝小葉シミュレータの開発と創薬への応用

従来の静置培養系と比較してより生体内の肝臓に近い環境を生体外で再現するため、マイクロ流体デバイス技術を用いて肝小葉特異的な酸素濃度勾配を形成可能な肝小葉環境模擬デバイスを開発した。脱酸素剤の亜硫酸塩を培養液中に添加し、層流現象を利用してマイクロ流体デバイス内に酸素濃度勾配を形成する方法と、デバイス下層の一端に空気を送達し、細胞播種底面に用いたPDMSを介して酸素供給を行う方法の2種を比較検討したところ、いずれのデバイスにおいてもシミュレーション結果に一致した酸素濃度勾配が形成された。とりわけ後者においては、デバイス内肝細胞の生存率が高く、肝細胞の特異的機能を保持した高密度培養が可能となった。新たな薬剤の開発において肝毒性および肝細胞機能の評価は極めて重要であり、生体内の肝小葉環境を模した評価系が求められている。しかしながら、従来の培養系では肝小葉特異的な門脈・肝動脈枝から中心静脈へと向かう肝類洞環境の再現は困難であった。この解決法として、本研究では肝小葉特有の酸素濃度勾配を再現しうるマイクロ流体デバイスの開発と機能評価を目的とした。研究初年度となる平成27年度は、自ら設計したマイクロ流体デバイスの流路内における酸素濃度勾配をシミュレーションした後、酸素応答性色素のポルフィリン膜上にデバイスを設置して、酸素濃度勾配の蛍光可視化を行った。その後、このデバイス内にマウス由来の初代培養肝細胞を播種し、カルセインAMによって生細胞の細胞質を染色するとともに、ICG含有培地(1mg/ml)を灌流して肝細胞の取り込みを観察した。また、デバイス内に酸素濃度勾配を形成するため、脱酸素剤として亜硫酸塩を用いた際の培地中の酸素濃度を計測し、生体内近似的な酸素濃度における肝細胞の生存を評価した。その結果、デバイス内において約80%の肝細胞の生着と、ICG取り込みを確認した。亜硫酸塩濃度別の培地中酸素濃度を計測した結果、門脈および中心静脈周辺域の酸素分圧(門脈周辺域:70mmHg、中心静脈周辺域:40mmHg)をもたらす亜硫酸塩濃度がそれぞれ0.06%、0.08%であることを決定した。この濃度における肝細胞の生存率を測定した結果、controlと比較して24時間後で60%、48時間後では40%を示したが、両濃度間において同程度の生存率を確認した。酸素濃度勾配を有する肝小葉環境模擬デバイスを開発するなど、計画通りに順調に進んでいる。創薬においては肝臓における薬物代謝を評価することが必須であり、その際には部位特異的な肝細胞機能の差異(zonation)を考慮することが重要である。肝小葉内における部位特異的な機能発現には、肝細胞の酸素消費によって形成される酸素濃度勾配が重要であると報告されている。そこで本研究では、肝小葉特有の酸素濃度勾配を生体外で再現するデバイスの開発を目的とした。研究初年度となる昨年は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いて酸素濃度勾配を形成可能なデバイスを設計し、予想される酸素濃度勾配をシミュレーションにより確認した。また、実際の酸素濃度勾配の形成には脱酸素剤の亜硫酸塩を培養液中に添加し層流現象による拡散を利用する方法を用いて、生体内近似的な酸素濃度における肝細胞の生存を評価したところ、亜硫酸塩による肝細胞傷害が問題となった。これらの結果を踏まえて、今年度はデバイス下層に空気を送達して細胞播種底面に用いたPDMSを介して酸素供給を行う新たな方法の有用性を検討した。酸素応答性色素のポルフィリン膜上にデバイスを設置して酸素濃度勾配の蛍光可視化を行った結果、シミュレーション結果に近似的な酸素濃度勾配の形成が確認された。また、カルセインAM/PI二重染色により評価した肝細胞の生存率は、亜硫酸塩法では約60%であるのに対して、今回の酸素供給法では約80%と良好であり、後者を用いることで飽和播種密度での肝細胞培養が可能となった。以上、PDMSを用いた微小流路と適切な酸素供給を行うことで、従来の培養皿では実現困難であった肝小葉環境を生体外で模倣することに成功した。本研究の最終年度となる平成28年度には、亜硫酸塩の肝細胞傷害性を避けるべく、人工酸素運搬体や酸素ガスの使用など、酸素濃度勾配をもたらす新たな方法を模索する。また、ブドウ糖濃度勾配の影響についても併せて検討を行う。消化器肝臓病学研究初年度においては、分離した肝細胞を用いての培養条件や使用する亜硫酸塩濃度の検討に多くの時間を割いたため、マウスの使用(購入)数自体は当初予定よりも限られた。また、酸素濃度勾配がもたらす糖代謝関連遺伝子発現の変化や低酸素条件下で発現が誘導されるHIF-1α/βの免疫染色文字年度に持ち越されたことから、当初計上した試薬類等の研究経費を全額使用するには至らなかった。

本研究の最終年度となる平成28年度には初代培養肝細胞を用いた実験が本格化し、多数のマウスが必要となるとともに、遺伝子発現解析や免疫染色実験にも多くの試薬類の購入が予定されている。
哺乳動物の神経分化を制御する転写因子ネットワーク

神経発生過程は、(1)神経幹細胞の維持、(2)ニューロンの分化、(3)グリア細胞の分化に分けることができる。本研究では、これら3つの過程を制御する転写因子を明らかにした。(1)神経幹細胞の維持およびグリア細胞の分化について抑制性bHLH因子Hes1やHes5をレトロウイルスベクターを用いて強制発現させたところ、神経幹細胞に止まるかグリア細胞に分化した。一方、Hes1やHes5を欠損させると神経幹細胞が維持できなくなり、すべてニューロンに分化した。したがって、Hes1やHes5は神経幹細胞の維持およびグリア細胞分化に重要な役割を担うことが明らかになった。次に、Hes1の発現量をしらべたところ、mRNAおよび蛋白レベルともに2時間周期で増減を繰り返していた。この発現のオシレーションはネガティブフィードバックを介して自律的におこること、すなわちHes1は2時間周期の生物時計として機能することがわかった。この発現変動によって神経幹細胞に止まるか、ニューロンに分化するかの振り分けが行われることが示唆された。(2)ニューロンの分化について促進性bHLH因子Math3やMash1をレトロウイルスベクターを用いて強制発現させたところ、神経幹細胞はニューロンに分化した。一方、Math3-Mash1ダブルノックアウトマウスでは、神経系の多くの領域で幹細胞からニューロンへの分化がブロックされ、本来ニューロンになるべき細胞がすべてグリア細胞に運命転換していた。すなわち、Math3とMash1は幹細胞からニューロンへの運命決定を行うことが明らかとなった。ただ、bHLH因子のみでは特定のニューロンを形成させることはできず、ホメオボックス因子との組合せが重要であった。以上の結果から、3つの神経発生過程のいずれもがbHLH因子によって制御されることが明らかとなった。哺乳動物の神経発生過程は、(1)神経幹細胞の増殖・維持、(2)神経幹細胞からニューロンの分化、(3)神経幹細胞からグリアの分化という3つに分けることができる。(1)ニューロンの分化を制御する転写因子促進性bHLH型転写因子Math3をレトロウイルスベクターを用いて強制発現させたところ、神経幹細胞はニューロンに分化した。また、Math3と多くの領域で一緒に発現している促進性bHLH型転写因子Mash1にも同様の活性があった。次に、Math3-Mash1ダブルノックアウトマウスを作製したところ、神経系の多くの領域で幹細胞からニューロンへの分化がブロックされていた。しかも、本来ニューロンになるべき細胞がすべてグリア細胞に運命転換していた。(2)神経幹細胞の維持およびグリアの分化について抑制性bHLH因子Hes1やHes5をレトロウイルスベクターを用いて強制発現させたところ、神経幹細胞に止まるかグリア細胞に分化した。Hes1やHes5はMath3やMash1の機能を抑制するので、両HesはおそらくMath3-Mash1ダブルノックアウトマウスと同じ状況を作ることによって神経幹細胞にとどめるかグリアへの分化を決定することが示唆された。以上の結果から、神経幹細胞の維持(Hes1,Hes5)、幹細胞からニューロンへの分化(Math3,Mash1)、幹細胞からグリア細胞への分化(Hes1,Hes5)のいずれもがbHLH因子によって制御されることが明らかとなった。特に、促進性および抑制性bHLH型転写因子間のバランスによって正常な神経発生がなされるという結果が得られた。神経発生過程は、(1)神経前駆細胞の維持、(2)ニューロンの分化、(3)グリア細胞の分化に分けることができる。

(1)神経前駆細胞の維持について狭部オーガナイザーはFgf8やWnt1を分泌する神経前駆細胞からなり、中脳および前側後脳の発生を制御する。この細胞は、胎生期後半にFgf8やWnt1の発現を失い、ニューロンに分化する。抑制性bHLH因子Hes1およびHes3は狭部オーガナイザー細胞に発現しており、Hes1-Hes3欠損マウスは中脳および前側後脳が形成されなかった。このマウスでは、狭部オーガナイザー細胞は正常よりも早くFgf8やWnt1の発現を失い、ニューロンに分化した。すなわち、Hes1およびHes3は狭部オーガナイザーの神経前駆細胞の維持に必須であった。(2)ニューロンの分化について促進性bHLH因子Mash1およびMath3は網膜の双極細胞に発現し、Mash1-Math3欠損マウスでは双極細胞は形成されない。しかし、Mash1やMath3を単独で強制発現させても双極細胞は形成されなかった。次に、双極細胞の分化に必須なホメオボックス因子Chx10を強制発現させたところ、双極細胞の存在する内顆粒層の細胞を形成したが、双極細胞は存在しなかった。そこで、Chx10とMash1あるいはMath3を同時に発現させたところ、多数の双極細胞が形成された。したがって、Chx10は内顆粒層という層特異性を決めるのに対して、Mash1やMath3はChx10によって規定された層に特異的なニューロンを形成させると考えられた。すなわち、bHLH因子とホメオボックス因子の組合せが特定ニューロンの形成に重要であった。(3)グリア細胞の分化についてHes関連因子であるHesr2が網膜のグリア細胞に発現していること、さらに網膜における強制発現でグリア細胞の分化を促進することがわかった。bHLH型転写因子Hes1は神経分化を抑制し、神経幹細胞の維持に重要な役割を担う。Hes1の発現様式を詳細に解析したところ、mRNAおよび蛋白ともに発現レベルは一定ではなく、2時間周期で絶えず増減を繰り返すことがわかった。このHes1の2時間周期の発現変動(オシレーション)はいろいろな種類の細胞でみられ、普遍的なものであった。半減期をしらべたところ、Hes1 mRNAおよび蛋白ともに約20分ときわめて短く、これによって2時間周期のオシレーションが可能になると考えられた。Hes1蛋白量を強制的に増やすとHes1 mRNA量は減少したままになり、Hes1蛋白を無くすとHes1 mRNA量は増加したままになった。したがって、Hes1は自分自身の発現量を抑制するネガティブフィードバックをすることがわかった。これらの結果から、Hes1オシレーションは以下のメカニズムでおこると考えられた。すなわち、Hes1 mRNAが増えるとHes1蛋白も増えるが、Hes1蛋白はネガティブフィードバックによりmRNA合成を阻害する。Hes1 mRNA合成が止まるとmRNAおよび蛋白ともに半減期がきわめて短いため、すぐに無くなる。
ナノ粒子・生体分子のアクティブナノポア通過制御

ナノポア技術への期待はシーケンサ応用にとどまらず、分子・粒子識別、タンパク分子解析や細胞観察・遺伝子導入などに広がりつつある。本研究では、固体ナノポアに対してアクティブな制御機能を具備させることを目的とした。ナノポアを相変化材料で被覆し、結晶相・アモルファス相間の大きな光学的コントラストを利用することによって、ナノポア近傍に生じる対流、熱泳動を制御し、DNAやナノ粒子のナノポア通過過程のスイッチング機能を実証した。(1)相変化ナノポアの作製:窒化シリコンメンブレン(厚さ1020nm)に対して、透過電子顕微鏡中での電子線照射を用いて直径1020nmのポア、集束イオンビーム照射により、100200nmのポアを安定して形成する手法を確立した。さらに相変化薄膜(GeSbTe)を成膜した後、サブナノ秒パルスレーザにより、水中にてポア近傍で局所結晶化を誘起するためのフルエンス、パルス数を最適化した。(2)相変化による体積変化を利用したナノポア径の制御:(1)の手法で作製した直径150200nmの相変化ナノポア(GeSbTeアモルファス相)に対してナノポアを通過するイオン電流計測を行い、サブナノ秒パルスレーザによる結晶化にともなって、電流値が数%増大することを確認した。結晶化にともなう相変化膜の体積収縮に起因して、ポア径が減少した結果と理解できる。(3)相変化による帯電粒子・ナノポアメンブレン間静電誘導の制御:アモルファス相GeSbTe薄膜に部分的結晶化パターンを形成し、その上で浮遊する帯電金ナノ粒子(DNA修飾金ナノ粒子)を観察したところ、結晶相箇所に選択的に粒子が誘引され、粒子によっては結晶相上で固定される現象を確認した。結晶相とアモルファス相の導電率の違いによって発現する現象であると理解している。(4)相変化によるナノポア粒子通過過程の制御:(1)の手法で作製した相変化ナノポアに対し、ポア周辺の相状態による帯電粒子通過レートの違いを観察したところ、結晶相の場合に圧倒的に通過レートが高いことを確認した。結晶相の場合、ポア周辺での光吸収とそれにともなう温度上昇が大きく、局所的な対流が生じ、帯電粒子が効率的にポアに誘引される結果であると解釈している。この現象とマイクロ粒子のレンズ効果を利用することにより、サイズ選択性を有する粒子通過履歴効果の発現が期待される。相変化ナノポアによる粒子通過過程の高コントラスト制御が初年度の主たる目標であり、年度内に大筋で達成できた。(1)集束イコンビームによるナノポア形成後、GeSbTeをスパッタリングによって100nm成膜し、最終的に直径100200nmの相変化ナノポアを作製した。測定中にポアを流れるイオン電流によって相変化膜の剥離が確認されたため、保護膜としてSiO2を原子層堆積法によって成膜し、剥離を抑制した。(2)直径20nmの蛍光ポリスチレンビーズをテスト試料として、ポア通過と通過後のドリフト・拡散運動過程を光学的に検出した。電圧依存性をドリフト・拡散モデルにより解析し、先行研究と同様の移動度、拡散係数を得た。相変化材料に固有の異常な振る舞いは確認されなかった。(3)蛍光観察のための励起光の強度とナノポア通過頻度の相関を計測した。明瞭な傾向として、励起光強度増大とともに、ポリスチレンビーズの通過頻度が大幅に減少した。また、その傾向はGeSbTeが結晶相の場合により顕著であった。これらの結果は、GeSbTeによる励起光吸収にともなう加熱、熱泳動発生によって説明でき、光吸収量のコントラストが大きな波長を光源とすることで、ナノポア通過頻度のスイッチングが可能であることを示唆する。また直径100nm以上の粒子の場合、レンズ効果により、粒子通過時にポア近傍で相変化を誘起できることを確認した。アモルファス相を始状態とした場合、粒子通過とともに結晶化が段階的に進み、ある一定数の粒子通過後に通過率がほとんどゼロとなる粒子通過履歴効果の発現が可能であることを実証した。(4)DNA修飾金ナノ粒子に対して同様の挙動の確認を行った。直径40nmの金ナノ粒子とその二量体の通過過程を、イオン蛍光プローブを用いて計測し、ポリスチレンビーズと同様の結果を得た。また、複合体粒子を用いた場合、ポア内に粒子が固定化され、それがイオン蛍光プローブ発光強度として検出され、ポア内の相変化によって発光強度が変化することが確認された。(1)サイズ選択性を有する粒子通過履歴効果の実証結晶相ナノポアへのパルス光照射下でナノポア径とほぼ同一サイズの金ナノ粒子が通過すると、その瞬間プラズモン共鳴に起因して粒子と壁面間で電場増強が起こり、GeSbTeがアモルファス化する。すなわち粒子の通過にともなって、ナノポアが高透過性から低透過性にスイッチする。

これはサイズ選択性を有する粒子通過履歴効果に相当し、例えば特定サイズの粒子を1回のみ通過させるといった用途に利用できる。パルスフルエンスの調節により、低透過性から高透過性へのスイッチも可能であり、正のフィードバック性を付与することに相当する。この動作を金ナノ粒子通過観察により実証する。(2)ナノポア径制御を利用した粒子捕捉・マニピュレーションナノポア中での粒子の捕捉を試みる。ナノポア径とほぼ同一サイズの金ナノ粒子が通過すると、アモルファス化にともなう体積膨張によりポアが収縮し、粒子を捕捉できる可能性がある。パルス光照射下で金ナノ粒子通過観察を実施し、捕捉過程を電流計測にて確認する。捕捉に加え段階的相変化(膨張・収縮変化)や表面モフォロジー変化にともない、ナノポア内で粒子を回転させるなどのマニピュレーションも可能であると考えている。(3)ナノポア選択的エレクトロポレーションの検証実験電極付き相変化メンブレン上に脂質二重膜を張り(脂質ベシクルをメンブレン上で展開)、エレクトロポレーションによってナノポア通過後の金ナノ粒子が膜を貫通する過程を観察する。局所相変化によって単一の高透過性ナノポアを形成し、粒子がそのポアだけを通過、膜貫通していることを確認する。金ナノ粒子でのデモが終了次第、DNAの通過を同様に試みる。ナノフォトニクス・光物性・バイオセンシングナノポア電流計測用の低ノイズ高利得アンプを購入予定であったが、本年度は直径100200nmのナノポアを用いた測定を中心に実施し、想定以上に大きな電流値、かつ低ノイズ測定が可能であったため、次年度の10nmナノポアの実験に向けて、機種選定を慎重に行うために、繰越すこととした。現在、10nmナノポアでの計測を実施しており、電流値の評価も進んでいる。早急にアンプの機種選定を行い、購入する予定である。
疾患モデル動物を活用した2型糖尿病疾患感受性遺伝子の機能解析

近年,全ゲノム関連解析(GWAS)によって2型糖尿病疾患感受性遺伝子が続々と同定され,その数は70を超えている.2008年に我々を含む2つのグループは,電位依存性カリウムチャネルKCNQ1が2型糖尿病疾患感受性遺伝子であることを見出し報告した.このことはその後の多くの検討でも追試され,KCNQ1はヒトにおいて普遍的かつインパクトの大きい2型糖尿病疾患感受性遺伝子であることがコンセンサスとなっている.さらに,2010年にパネル数を増加させ検出感度を上げることによりユビキチン結合酵素UBE2E2とC2CD4A/Bを同定した.特にUBE2E2は,欧米人では2型糖尿病との相関が認められず,日本人・アジア人に特有の疾患感受性遺伝子であると推察され,インスリン分泌に関連しており,そのPopulation Attributable RiskがKCNQ1と並んで日本人2型糖尿病疾患感受性遺伝子の中でも重要であると考えられた.その後もアジア人を対象とした解析で,KCNQ1とUBE2E2のSNPがインスリン分泌低下を伴う耐糖能異常と関連していることが追認されている.インスリンを分泌する膵β細胞で電位依存性カリウムチャネルとしてのKCNQ1やユビキチン結合酵素としてのUBE2E2が担う生理的・病態生理的役割を解明することは,2型糖尿病の発症機構のより深い理解と早期の診断法・最適な治療法の開発において重要な研究課題であるが,そもそもヒトにおける「インスリン分泌低下」という表現型が,KCNQ1・UBE2E2の発現や機能の亢進あるいは低下によるものか,未だ明確な結論が得られていない.そこで我々は本研究で, KCNQ1・UBE2E2に着目して疾患モデル動物を作製・解析することを通じて, 2型糖尿病疾患感受性遺伝子が膵β細胞で担う役割をin vivoで明らかにすることを目指す.疾患モデル動物としてKCNQ1の機能低下型遺伝子変異マウスの同定に成功したことに加えて,機能亢進型(チャネルopen型)KCNQ1を膵β細胞に発現させた遺伝子改変マウスについても作製に成功し,その表現型について解析を進めることができた.また,UBE2E2に関しても,膵β細胞に過剰発現させた遺伝子改変マウスの作製に成功した.表現型が明確なKCNQ1の機能を亢進させた遺伝子改変マウスについて,膵β細胞特異的な蛍光レポーターマウスも活用して単離膵島から膵β細胞を採取し,分子生物学的解析・電気生理学的解析を進めていく.また,KCNQ1に関する種々の遺伝子改変マウスについて,高脂肪食負荷下にて,耐糖能・インスリン分泌能・膵β細胞量を検討する.UBE2E2に関する遺伝子改変マウスについても表現型の解析を進める.近年,全ゲノム関連解析(GWAS)によって2型糖尿病疾患感受性遺伝子が続々と同定され,その数は70を超えている.2008年に我々を含む2つのグループは,電位依存性カリウムチャネルKCNQ1が2型糖尿病疾患感受性遺伝子であることを見出し報告した.このことはその後の多くの検討でも追試され,KCNQ1はヒトにおいて普遍的かつインパクトの大きい2型糖尿病疾患感受性遺伝子であることがコンセンサスとなっている.さらに,2010年にパネル数を増加させ検出感度を上げることによりユビキチン結合酵素UBE2E2とC2CD4A/Bを同定した.特にUBE2E2は,欧米人では2型糖尿病との相関が認められず,日本人・アジア人に特有の疾患感受性遺伝子であると推察され,インスリン分泌に関連しており,そのPopulation Attributable RiskがKCNQ1と並んで日本人2型糖尿病疾患感受性遺伝子の中でも重要であると考えられた.その後もアジア人を対象とした解析で,KCNQ1とUBE2E2のSNPがインスリン分泌低下を伴う耐糖能異常と関連していることが追認されている.インスリンを分泌する膵β細胞で電位依存性カリウムチャネルとしてのKCNQ1やユビキチン結合酵素としてのUBE2E2が担う生理的・病態生理的役割を解明することは,2型糖尿病の発症機構のより深い理解と早期の診断法・最適な治療法の開発において重要な研究課題であるが,そもそもヒトにおける「インスリン分泌低下」という表現型が,KCNQ1・UBE2E2の発現や機能の亢進あるいは低下によるものか,未だ明確な結論が得られていない.そこで我々は本研究で, KCNQ1・UBE2E2に着目して疾患モデル動物を作製・解析することを通じて, 2型糖尿病疾患感受性遺伝子が膵β細胞で担う役割をin vivoで明らかにすることを目指す.疾患モデル動物としてKCNQ1の機能低下型遺伝子変異マウスの同定に成功したことに加えて,機能亢進型(チャネルopen型)KCNQ1を膵β細胞に発現させた遺伝子改変マウスについても作製に成功し,その表現型について解析を進めることができた.また,UBE2E2に関しても,膵β細胞に過剰発現させた遺伝子改変マウスの作製に成功した.表現型が明確なKCNQ1の機能を亢進させた遺伝子改変マウスについて,膵β細胞特異的な蛍光レポーターマウスも活用して単離膵島から膵β細胞を採取し,分子生物学的解析・電気生理学的解析を進めていく.また,KCNQ1に関する種々の遺伝子改変マウスについて,高脂肪食負荷下にて,耐糖能・インスリン分泌能・膵β細胞量を検討する.UBE2E2に関する遺伝子改変マウスについても表現型の解析を進める.