hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体膜機能分子のリン脂質平面膜法による解析

2.陽イオン性脂質を用いた平面膜の形成(桐野)、両親媒性物質による単分子膜の性質の解析(木下)などからリン脂質平面膜の概念のシミュレ-ションが行われた。3.特異的に膜融合を促進するペプチドの合成を行った(高橋)。4.タコ視細胞の光情報伝達に関与すると思われるcGMP結合タンパク質の性質の解析を行い(津田)、cGMPによって活性化されるカチオンチャンネルの存在が示された(平田)。5.バクテリオロドプシンを平面膜に効率よく再構成する方法が開発された(宗行)。6.電子顕微鏡を用いてCl^ーチャンネルが12nm×16nmのタマゴ型をしていることがしめされ(藤墳)、無染色、無固定のままで急速凍結を行うクライオ電子顕微鏡法によりタンパク質ー分子の動きを10msオ-ダ-で解析できるようになった(徳永)。7.リン脂質平面膜の中でのリン脂質分子の動きをコンピュ-タ-シミュレ-ションによって可視化し、リン脂質分子の拡散速度やO_2の透過速度の推定を行った(楠見)。本総合研究の本年度の主な成果は次の通りである。1)シナプス小胞膜に存在するC1^ーチャネルを平面膜法で解析したところ少なくとも2種類の性質の異なるものが同定された。さらにシナプス小胞とリポソ-ムとの融合活性に蛋白性因子が関与することが示された(曽我部、葛西)。2)ポリエ-テル及び脂肪酸の4級アミン化合物との混合によりK^+イオンに特異性のあるチャネルが形成されることが示された(曽我部)。また、イオンチャネルのモデルとしてグラミシジンや合成ペプチドを用い、それらの化学修飾とイオン透過との関連が詳細に検討された(老木、木下)。3)インフルエンザウィルスの膜融合モチ-フであるペプチドを化学合成し、類縁ペプチドによる膜融合の機序についての解明がなされた(高橋)。4)イオンチャネルの精製法として平面膜法を用い、筋小胞体からK^+及びCl^チャネルの精製に成功した(葛西)。5)凍結・融解、脱水・水和、PEG法などにより巨大リポソ-ムを作製し、再構成したイオンチャネルの性質について平面膜法との比較が詳細に検討された(桐野)。6)新たな平面膜法としてpinchingoil layer methodが考案され、再現性のよいイオンチャネル活性測定法が開発された(高木)。7)無脊椎動物(タコ)の視細胞における光情報伝達に関与するロドプシンやGー蛋白質、cGMP依存性カチオンチャネルに関する詳細な解析がなされた(津田、平田)。8)バクテリオロドプシンやH^+ーATPaseなどのイオンポンプを直接挿入法あるいは膜融合ペプチド法など、効率よく平面膜に再構成する方法が開発された(宗行、平田)。9)電子顕微鏡を用いてCl^チャネルなどの形態が詳しく計測され、イオン透過路などの微細構造に関しての推定が行われた(藤墳)。10)時間分解能クライオ電子顕微鏡技術が考案され、5ミリ秒の時間分解能で蛋白質の構造変化の解析が行われた(徳永)。11)コンピュ-タシミュレ-ションによるリン脂質2分子層膜の中でのリン脂質分子の動きを可視化し、その拡散速度や酸素分子の透過速度の推定が行われた(楠見)。
連星中性子星の合体によるガンマ線バーストと重力波

標準的なシナリオによれば、連星中性子星は合体した後にブラックホールと降着円盤からなる系を生成する。その後、降着円盤は粘性によって徐々に角運動量を失いながら、ブラックホールに物質を落としていくと考えられるが、このときに発生する熱エネルギーからγ線バーストは発生する可能性があるとされている。このときγ線バーストのエネルギーの総量は、降着円盤の質量に依存する。本研究では、連星中性子星の合体、及びその後の降着円盤形成を調べるシミュレーションを主に行なった。中性子星は一般相対論的な効果が重要な星なので、シミュレーションを行なうに当たっては、一般相対論的効果を取り入れる必要がある。ここでは、ポストニュートン近似を用いて最低次の相対論的効果を取り入れてシミュレーションを行なった。今年度は、正確なシミュレーションを行なうためのテストに終始し、今のところ確実な結論は得るに至っていないが、テスト計算によると、以下のようなことが示唆されている。一般相対論的な強い重力の効果により、合体した後に物質は合体後の生成物(ブラックホールまたはブラックホールになる前の巨大中性子星)に飲み込まれやすくなる。従って、降着円盤を形成する物質の量は減る。これまで行なわれてきたニュートン近似でのシミュレーションにおいては、形成される降着円盤の質量はγ線バーストを起こすには十分でないとされてきた。従って一般相対論的な効果は、連星中性子星の合体によるγ線バーストのモデルを更に否定する方向に働く可能性がある。
一酸化窒素の生理機能解明を志向する一酸化窒素-鉄・銅錯体の特異な反応場構築

1.鉄錯体及びNO錯体の電子状態・構造に関する研究:2の反応機構の解明にも関連するが、水溶性を有する数種類のジチオカルバメート鉄錯体の酸化還元電位を測定したところ、鉄3価/鉄4価の電位が+300mV程度と他の鉄錯体と比較して非常に低いことが判明した。電位と錯体の反応性、安定性との関連は今後の課題である。2.NO錯体の生成・分解機構に関する研究:昨年度までの研究で、鉄3価ジチオカルバメート錯体とNOとの反応が既知の還元二トロシル化反応とは異なるメカニズムで起こっていることが示唆されていた。そこで、この反応機構の詳細を明らかにするために、生成物の解析を高速液体クロマトグラフィー、エレクトロスプレーイオン化質量分析により行ったところ、鉄3価錯体と一酸化窒素との反応の生成物は鉄2価二トロシル錯体と配位子がジスルフィド結合により二量体化したものであることが分かった。これらの結果は、一酸化窒素の配位により鉄錯体の酸化還元電位が正にシフトし、未反応の錯体からの電子供与を受けて還元され、一方電子供与した錯体は鉄4価中間体となり、この鉄4価錯体と脱離した配位子との反応で配位子のジスルフィド2量体が形成される、という反応モデルで最も良く説明された。つまり、本系では一酸化窒素の配位がトリガーとなり錯体間電子移動が誘起される新規な反応場が実現していることが示唆された。反応機構の解明により得られた知見は、生体内で問題となっている鉄一硫黄蛋白質の一酸化窒素による機能制御の反応モデルとして有用である。3.銅錯体への展開:現在、上記の知見をふまえて銅錯体への展開を図っている。1.鉄錯体及びNO錯体の電子状態・構造に関する研究:ジチオカルバメートのアルキル置換基が鉄錯体及びNO錯体の電子状態に及ぼす影響を調べるため、本年度は我々が開発したN-(dithiocarboxy)sarcosine(DTCS)の誘導体であるN-i-propyl-glycine dithiocarbamateおよびそのエチルエステルを合成し、鉄錯体、NO錯体の電子状態を調べた。その結果、これら2種の配位子を用いた鉄錯体の電子状態は既知のジチオカルバメート誘導体鉄錯体(Fe-DTC)とほぼ同様だが、NO錯体の電子状態はDTCSのみならずその他の既知のジチオカルバメート誘導体を配位子とした場合とはかなり異なり、NO及び配位子から鉄への電子の流れ込みの大きいNO錯体が得られた。この傾向は特にIRスペクトルにおいて観測されたが、可視紫外吸収やESRスペクトルには余り変化は現れなかった。この特異な電子状態をもたらす原因を深るため、今後、結晶化やその他の物理化学的測定を試み、より詳細な構造・電子状態を調べる予定である。2.NO錯体の生成・分解機構に関する研究:Fe-DTCがNOと反応すると、NO-Fe(II)-DTC錯体が生成する。この時、出発錯体のFeが2価であればシンプルな付加反応であるが、内因性NOの捕捉に通常行われているような条件では鉄は3価であることが本研究で明らかとなった。そこでこの還元ニトロシル化反応をパルスラジオリシス法で調べたところ、これまでヘムタンパク質やポルフィリン化合物で知られていた既知の還元ニトロシル反応とは異なるメカニズムで起こってこることが分かった。現在、HPLCなどを用いて生成物の分析を行い、反応の詳細を検討している。
骨免疫学の創成

骨代謝と免疫学の融合分野である骨免疫学の確立を目指した。特に、骨代謝に関与する細胞と免疫担当細胞の分化・活性化メカニズムならびに相互作用を、網羅的解析手法や新規の遺伝子改変マウスを作成することにより解析し、関節リウマチや骨粗鬆症などの疾患治療に対する分子基盤の確立を行った骨代謝と免疫学の融合分野である骨免疫学の確立を目指した。特に、骨代謝に関与する細胞と免疫担当細胞の分化・活性化メカニズムならびに相互作用を、網羅的解析手法や新規の遺伝子改変マウスを作成することにより解析し、関節リウマチや骨粗鬆症などの疾患治療に対する分子基盤の確立を行った骨免疫学の創成と確立をめざして、骨代謝と免疫系の相互作用を制御する遺伝子の同定と機能解析を行った。【破骨細胞のプロテオーム解析と分化機構の解明】骨吸収細胞である破骨細胞分化のメカニズムを解明するために、破骨細胞分化因子RANKLの刺激によって引き起こされるタンパク発現の変化を種々のプロテオーム解析法を用いて検討し、トランスクリプトームの結果と合わせで解析した。LC-MS法によってRANKL刺激後に500程度のタンパクが、2次元電気泳動(2D-)MS/MSによっても700程度のタンパクが発現変化の大きいタンパクとして同定され、詳細な解析を続けている。また、破骨細胞で重要な転写因子NFATc1結合タンパク質のプロテオーム解析を行い、同定された数種類のタンパクの機能解析をsiRNAなどを用いて行った。分化過程で発現増強されるNFATc1遺伝子やOSCAR遺伝子の制御機構を詳細に調べ、シグナルの自己増幅が不可逆的な細胞の分化を可能とする機構を解明した。【マウス発生工学的手法を用いた破骨細胞分化必須遺伝子の同定】破骨細胞欠損マウスをレシピエントとした造血幹細胞移植法および破骨細胞欠損マウス由来胚盤胞杯へのノックアウトES細胞注入法を開発した。この方法を用いて、ノックアウトマウスが胎性致死となるNFATc1遺伝子の破骨細胞分化における必須性を証明した。【骨芽細胞分化制御遺伝子の機能解析】NFATファミリー転写因子のノックアウトマウスを用いて、NFATが骨形成において果たす役割を解析した。この結果、NFATが骨芽細胞においてOsterixと呼ばれる他の転写因子と協調して骨形成を制御することを解明した。T細胞で発見された転写因子NFATが、骨吸収でも骨形成でも重要な役割を担うことが解明され、新たな骨免疫制御機構が明らかになった。骨代謝と免疫系の相互作用を制御する遺伝子の発現解析を網羅的に行い、その結果に基づき重要遺伝子に関する機能解析を細胞培養系で行うとともに、遺伝子改変マウスを用いた個体レベルでの機能解析を進めた。また、免疫細胞と骨格系細胞の相互作用については、炎症性骨破壊性疾患における骨破壊性T細胞の同定を行い、IL-17産生を特徴とするTh17細胞の重要性を明らかにした。【破骨細胞のプロテオーム/トランスクリプトーム解析】破骨細胞分化因子RANKLの刺激によって発現変化のあるタンパク質を種々のプロテオミクス解析により同定した。またNFATc1結合タンパク質を同定した。同定された因子を,トランスクリプトームの結果と合わせて詳細に検討し、破骨細胞分化に重要である可能性のあるタンパク質候補群については、siRNAを用いたノックダウン実験による予備的機能解析を行い、遺伝子破壊実験の対象とする因子を決定した。現在これら因子の遺伝子欠損マウスの作製を行っている【新規破骨細胞分化制御機構の解明】前述のsiRNAスクリーニングの結果重要性が示唆されたcalmodulin-dependent kinase(CaMK)IV遺伝子のノックアウトマウスの骨組織の解析を行った。その結果、CaMK IVが破骨細胞分化に必要であり、その欠損により破骨細胞数が減少し骨量が増加することを見いだした。さらに、CaMK IV/CREB経路が、c-Fosの発現を増強することにより、破骨細胞分化の必須転写因子NFATc1の発現を誘導すること、ならびに、NFATc1の標的遺伝子の発現を直接促進することで、二層性に破骨細胞の制御に関わることを明らかとした。【T細胞による破骨細胞制御機構の解明】関節リウマチ等の炎症性骨破壊疾患においては、骨破壊部位に集積したT細胞と骨破壊の強い関連が示唆されていたが、いかなるT細胞サブセットが骨破壊に関与するか不明であった。そこで種々のエフエクターT細胞について解析を行い、IL-17を強発現するTh17細胞が破骨細胞を効率よく誘導することを示すとともに、IL-17遺伝子欠損マウスを用いてin vivoでもTh17細胞が骨破壊に重要であることを解明した。骨免疫学の創成と確立をめざして、骨代謝と免疫系の相互作用を制御する遺伝子の同定と機能解析を行った。骨吸収細胞である破骨細胞分化のメカニズムを解明するために、破骨細胞分化因子RANKLの刺激によって引き起こされるタンパク発現の変化を種々のプロテオーム解析法を用いて検討し、トランスクリプトームの結果と合わせて興味ある遺伝子を抽出した。同定された数十種類の遺伝子からsiRNAなどを用いて選別し、数種類の遺伝子についてコンディショナル遺伝子改変マウスの作成に着手した。また、破骨細胞分化に関わるチロシンキナーゼの網羅解析の結果に基づき、TecおよびBtkの二重欠損アウトマウスの解析を行った。TecおよびBtkが破骨細胞分化で必須の役割を担うこと、これらの酵素を抑制すると骨粗鬆症が予防できることを解明した。

Btkはブルトン型無ガンマグロブリン血症の原因遺伝子であることから、B細胞における抗体産生に必須の遺伝子だが、骨代謝においても重要な役割を担うことが見いだされだ。破骨細胞の基質分解酵素カテプシンKの新規の阻害剤を開発し、関節炎モデルの治療実験を行った結果、骨破壊のみならず炎症抑制効果を示した。詳細な検討の結果、カテプシンKが樹状細胞の非メチル化DNAに対するToll様受容体9シグナル活性化に関与しており、Th17細胞の誘導を介して自己免疫炎症誘導に関与することを解明した。従来破骨細胞特異的と考えられてきた酵素が、免疫系の制御に重要な役割を果たすことが解明され、骨と免疫の相互作用の重要性が示された。(1)トランスクリプトーム解析・プロテオーム解析を利用した骨格系細胞発現遺伝子の網羅解析破骨細胞・骨芽細胞のトランスクリプトーム解析を終え、分化過程において発現が変動する分子の同定を行った。これら分子の機能解析を行うため、KOマウス作成に着手した。また、骨細胞培養細胞株を入手して、骨細胞のトランスクリプトーム解析を開始した。一方、破骨細胞分化のマスター転写因子NFATc1と相互作用する分子をフォーカスドプロテオームの手法により同定した。この結果、新規NFATc1結合タンパク質を同定し、新たなNFATc1による転写制御機構の存在を明らかにした。(2)骨免疫細胞間相互作用(破骨細胞-骨芽細胞、リンパ球-破骨細胞等)の解明抑制性免疫受容体LILRB/PIRBが破骨細胞形成に抑制的に働いていることを見出した。また、Fc受容体であるFcγRIIB・FcγRIIIの機能を解明するために、これら分子のKOマウスを用いた解析を実施し、IgGは破骨細胞分化を負に制御していることを明らかにした。これらの結果はFc受容体の骨代謝における新規機能を示唆している(論文投稿準備中)。一方、胸腺髄質形成における破骨細胞分化因子RANKLの必須性、髄質細胞分化におけるRANKとCD40シグナルの協調的作用の必須性を解明し、免疫系におけるRANKLの重要性を確立した。(3)KOマウスを用いた個体レベルでの機能解析トランスクリプトーム解析により、骨芽細胞分化過程で発現が上昇する転写因子としてMafを同定し、そのKOマウスの解析を行った。このマウスは骨形成異常を示し、in vitroにおけるMaf欠損細胞の骨芽細胞分化は抑制されていた。また興味深いことに、Mafヘテロマウスでは加齢に伴って著しく骨量が減少し、骨髄腔は脂肪細胞で満たされていた。骨形成が抑制され、脂肪細胞が増加する老人性骨粗鬆症にMafが関与することを解明した(論文投稿中)。(4)骨免疫疾患への応用を視野に入れた治療実験KOマウスを用いた骨免疫学的疾患モデル実験を実施し、治療効果が期待される標的分子を同定した。(1)トランスクリプトーム解析・プロテオーム解析を利用した骨格系細胞発現遺伝子の網羅解析これまで行ってきた破骨細胞・骨芽細胞のトランスクリプトーム解析を終え、分化過程において発現が変動する分子の同定を行った。また、骨細胞のトランスクリプトーム解析を実施し、物理的刺激を加えた際に発現上昇する遺伝子の同定を行った。
CMB偏光観測実験における偏光変調器に用いる半波長板の極低温偏光特性測定

宇宙のインフレーションを探索するCMB偏光観測実験の高感度化のためには、偏光変調器に使用する半波長板の偏光特性を十分に理解することが不可欠である。本研究では、半波長板の極低温環境下における偏光特性を広帯域かつ高精度で測定することを目的としている。ベクトルネットワークアナライザーと開発済みの極低温回転機構を搭載した4Kクライオスタットを統合することで、低温光学測定システムを新たに構築する。このシステムを用いて、半波長板の透過率、反射率、変調効率の測定、及び回転機構の振動や熱ゆらぎ起因の偏光特性の定量的評価を行う。最終的に、本研究成果を実際の実験に還元し、インフレーションの実験的検証を目指す。
脊髄GABA-B受容体持続活性化による難治性疼痛緩和の試み

モルヒネの動かない痛みに対し、近年、脊髄に存在するGABA_B受容体の活性化を目的として、アゴニストであるバクロフェンをくも膜下に投与する(髄腔内投与)方法が著効することが知られてきた。しかし持続投与は鎮痛効果を減弱させることも判明してきた。これはGABA_B受容体の脱感作によると考えられているが、GABA_B受容体脱感作にG protein-coupled receptor kinase 4(GRK4),GRK5というリン酸化酵素が関与していることを私たちは発見した(Kanaide et al.,J Cell Physiol(2007)。この結果に基づいてさらに私たちは平成17-18年度にわたり研究を行い、(1)GRK4は脊髄にGABA_B受容体とともに発現していること、(2)GRK4,GRK5活性を抑制し、結果的にGABA_B受容体脱感作を抑制する薬物のスクリーニングを行ったところ、麻酔薬でありかつNMDA受容体の阻害剤であるケタミンが、GABA_B受容体を持続活性化させることを見いだした。1)ケタミンはGRK4の細胞内運動、すなわち、バクロフェン刺激による細胞膜へのtranslocationを抑制することを共焦点レーザにより証明した。2)さらにケタミンはバクロフェン刺激により促進される、GABA_B受容体とGRK4の蛋白複合体化をも抑制することを、a)Fluorescence Resonance Energy Transfer(FRET)可視化assayにより、加えて、b)免疫沈降によるウェスタブロットアッセイによって証明した。3)また、バクロフェン長期投与ラットの摘出脊髄を用いた免疫染色アッセイにより、GABA_B受容体とGRKの局在を検討できる実験系を確立した。4)加えて、バクロフェン長期髄腔内投与を行ったラットを用いて脊髄組織の免疫組織学的検討を行ったところ、バクロフェン長期処理によりGABA_B受容体蛋白量には変化はないものの、GRK4蛋白が増加していることを見いだした。この結果は、増加したGRK4がGABA_B受容体を過度に修飾することで受容体脱感作を引き起こしていることを示唆する。ケタミンがGRK4蛋白の増加にも影響を及ぼしているかどうかは不明であるが、さらに検討を加えていきたいと考えている。最終的には、日本における緩和医療多施設共同研究チーム(SCORE-G)(代表施設:北里大学病院麻酔科)と共同で、バクロフェン臨床治験、並びにバクロフェン+ケタミンの併用療法による持続的GABAB受容体活性化が可能であるかどうかの治験が行えればと願っている。その前段階となる基盤となるデータをH19年度以降も継続して蓄積していきたいと考えている。近年、脊髄に存在するGABA_B受容体の活性化を目的として、アゴニストであるバクロフェンをくも膜下に投与する(髄腔内投与)方法が、モルヒネの効かない痛みに著効することが知られてきた。しかし持続投与により鎮痛効果が減弱することが報告されている。

これはGABA_B受容体の脱感作によると考えられている。このGABA_B受容体脱感作にG protein-coupled receptor kinase 4(GRK4)というリン酸化酵素が関与していることが報告された。私たちはこれまでに、・GKR4は脊髄にGABA_B受容体とともに発現していることを確認し、・クローン化GRK4とGABA_B受容体発現細胞を用いて、GRK4によるGABA_B受容体の脱感作を分子レベルで解析できるアッセイシステムを構築した。現在このアッセイ系を用いて、GRK4活性を抑制し、結果的にGABA_B受容体脱感作を抑制する薬物のスクリーニングを行っている。その結果、麻酔薬ケタミンが、GABA_B受容体を持続活性化させることを見いだした。平域17年度の研究においてはケタミンによる受容体持続活性化のメカニズムを分子レベルで解析した。これまでに1)ケタミンはGRK4の細胞内運動、すなわち、バクロフェン刺激による細胞膜へのtranslocationを抑制することを共焦点レーザにより証明した。2)さらにケタミンはバクロフェン刺激により促進される、GABA_B受容体とGRK4の蛋白複合体化をも抑制することを、a)Fluorescence Resonance Energy Transfer(FRET)可視化assayにより、加えて、b)免疫沈降によるウェスタブロットアッセイによって証明した。3)また、バクロフェン長期投与ラットの摘出脊髄を用いた免疫染色アッセイにより、GABA_B受容体とGRKの局在を検討できる実験系を確立した。次年度においては、・常法により作製した難活性疼痛モデルラットにバクロフェン長期髄腔内投与を行い、GABA_B受容体とGRK4の局在の変化を免疫染色アッセイにより検討すること、さらに・実際ラットにバクロフェン+ケタミンを同時投与した際の持続性鎮痛効果の有無について、In Vivoで行動薬理学的解析を行う。加えて、摘出脊髄切片でのGABA_B受容体とGRK4の局在の変化を免疫染色アッセイにより検討する。最終的には、日本における緩和医療多施設共同研究チーム(SCORE-G)(代表施設:北里大学病院麻酔科)と共同で臨床活験が行えるようにその基盤となるデータをH18年度末までに蓄積したい。モルヒネの効かない痛みに対し、近年、脊髄に存在するGABA_B受容体の活性化を目的として、アゴニストであるバクロフェンをくも膜下に投与する(髄腔内投与)方法が著効することが知られてきた。しかし持続投与は鎮痛効果を減弱させることも判明してきた。これはGABA_B受容体の脱感作によると考えられているが、GABA_B受容体脱感作にG protein-coupled receptor kinase 4 (GRK4),GRK5というリン酸代酵素が関与していることを私たちは発見した(Kanaide et al., J Cell Physiol(2007)。この結果に基づいてさらに私たちは平成18年度研究を行い、1)ケタミンはGRK4の細胞内運動、すなわち、バクロフェン刺激による細胞膜へのtranslocationを抑制することを共焦点レーザにより証明した。
元朝国家祭祀の研究

モンゴル民族による征服王朝である元朝の中国支配の実態を祭祀制度を通して明らかにする目的で『元史』本紀などを中心に元朝国家祭祀関連記事を収集した。元朝中央における岳涜・太廟・社稷・宣聖の郊祀等の諸祭祀の各年度毎の実施表を作成し、以下の諸点がわかった。まず、『元史』本紀には、中央における諸祭祀の実施の事実が必ずしも全て記載されてはいない。しかし、他の史料から確認できる事例もあるので、『元史』本紀に記載がなくても、岳涜・太廟・社稷・宣聖の諸祭祀については毎年継続実施されたと考えてよいこと。頻度と形態について、成宗テムル以降、中国王朝的な祭祀の内実が、更に整えられていったと考えられる。特に、太廟祭祀は、5代英宗以降、年1回から年4回となり、社稷:宣聖春秋2回の祭祀とともに伝統的中国王朝と変わらない回数となった。また皇帝即位の際などに、南郊、宗廟、社稷において告祭が実施されるようになることからも、フビライ後継者にとって、正統性の権威づけとして、これら中国的王朝諸祭祀が重視されたことがわかる。ただし、皇帝親祀の回数が少ないのは、元朝中央祭祀のひとつの特徴である。祭儀の内容は、楽舞をともない三献官が神々に神酒・供物を捧げる中国的儀式が踏襲されている。太廟祭祀の際にモンゴルのシャーマン、料理人、馬乳酒等の要素が付加されているのは、祭祀の対象が元朝皇帝の先祖であるから当然である。祭儀担当官については、例えば、成宗テムルの1305年の郊祀の初献官右丞相アルスカン、亜献官左丞相アグタイ、終献官御史大夫テムデルの人選からわかるように、中央政府の首脳が担当するのが通例であるが、この点については、さらなる検討が必要である。元朝国家祭祀の実施表の分析を通していえることは、フビライの後継者達の中国化の傾向である。他の中国征服王朝の中国的祭祀採用の経過と比較すれば更に興味深い結果が得られるであろう。
暦法の普及と民俗変容に関する民俗学的調査研究

本研究は暦の普及の様相を大雑書類をはじめとする近世期に刊行された陰陽道書の受容に着目して検討するものであった。特に自然暦に深く関わる民俗儀礼の執行に際して干支をはじめとする暦の知識がどのように取り入れられ、影響を及ぼしているかについて、北奥羽と南西諸島を中心に民俗調査及び資料の収集、検討に努めた。その成果は主として次の5つに集約できる。(1)初期大雑書の内容検討と民俗事象との関連の検討。暦の知識の浸透には簡略に暦注を記した大雑書の刊行、流通、受容による力が大きいが、その様態を把握するためには大雑書の本来の姿を復元し、把握しなければならない。そのために最古の刊本である寛永9年版の『大ざつしよ』の内容を検討し、民俗資料との関連を考察した。(2)大雑書類がどのように読まれてきたかについて、民俗的な暦との関連を配慮した検討。具体的には沖縄先島地方の2つの文書に注目した。ひとつは石垣島登野城村で我那覇孫者によって記された『大雑書廣集』であり、これは日本の大雑書と中国福建省で印行された『玉匣記』とを生活風土に合わせながら編集した地方大雑書と位置づけることができる。もうひとつは宮古島のトキ双紙であり、これは従来、中世陰陽道の亀鑑『金烏玉兎集』の影響下に成立したとされてきたが、大雑書の影響も考えられることが判明した。(3)暦法が民俗化した事例の調査。生まれ年によって守護仏が決定されるというイチダイ様信仰に関する調査で、当該信仰が青森県南津軽地方、岩手県北地方、沖縄県本島部に展開していることを確認した。(4)大雑書の利用状況の調査。岐阜県羽島市の花村家に伝来した大雑書の書き込みや保存の状態から検討を進めた。(5)陰陽道以外の経路による暦の普及を考えるために運気論に注目しその立場の『年中運気指南』の内容を検討してその意義を考察した。既に(1)、(2)、(5)は成果の一部を発表し、その他についても発表準備中である。
百日咳における発作性咳嗽に関連する菌側遺伝子の機能解析

本研究では、百日咳の主症状である咳嗽発作を引き起こす原因因子(咳嗽因子)の同定を目指し、新たに発見された咳嗽発作に関連する細菌側の遺伝子(cough X: cx、仮称)の機能解析を行った。動物モデルを用いた解析の結果、cx遺伝子産物であるCXは感染宿主体内で咳嗽因子の発現を制御している可能性が高いことが分かった。さらに解析の過程で、既知の転写制御因子が培養液中で咳嗽因子の発現に関与している可能性を見出した。これらの制御因子の下流に存在する遺伝子群の中から、咳嗽因子の探索を行い、いくつかの咳嗽因子候補を見出した。今後これらを詳細に解析することで、咳嗽因子の特定が可能になると考えられた。本研究の最終的な目的は、ボルデテラ属の百日咳菌の感染によって起こる百日咳の主症状である発作性咳嗽の原因因子を同定することにある。これまでに申請者らは、咳嗽発作を再現する感染動物モデルを確立して咳嗽を定量化する方法を樹立(感染咳嗽試験)し、さらに咳嗽発作に関連する細菌側の遺伝子(cough X: cx)を同定した。まず、未確定であったcx遺伝子産物であるCXの翻訳開始コドンの位置を決定した。感染動物に咳嗽発作を引き起こさない自発性変異株(A株)の染色体上では、cx遺伝子全長576塩基の254番目の塩基欠失によるフレームシフトが起こっていた。野生株cx遺伝子の252番目の直後に終止コドンを挿入したC末ドメイン破壊株を作出し、感染咳嗽試験を行ったところ、cx遺伝子全長欠失株と同様に咳嗽発作の回数が野生型と比べて減少した。このことから、少なくともCXのC末端側のドメインが菌体による感染動物の咳嗽発作の惹起に必要であることが示唆された。これまでに、感染動物に菌体破砕液を投与した場合も生菌投与と同様に咳嗽発作が起こることが明らかとなっている。cx遺伝子全長欠失株の菌体破砕液は、野生型と同程度に投与動物に咳嗽発作を引き起こした。また、CX組み替えタンパク質を発現する大腸菌の菌体破砕液は投与動物に咳嗽発作を引き起こさなかった。これらのことから、CXが咳嗽の直接原因である可能性が低いこと、試験管培養液中では感染動物体内とは異なり、CX以外にも咳嗽発作の原因因子(咳嗽因子)の発現を制御する機構が存在する可能性があることが示唆された。この一方で、ボルデテラ属菌の主要な病原因子の発現制御に寄与する二成分制御系因子、BvgASを不活性化させた菌の破砕液は投与動物に咳嗽発作を引き起こさなかった。このことから、咳嗽因子の試験管培養液中における発現がBvgASによって制御されていることが示唆された。感染動物に咳嗽発作を惹起する菌側因子CXについて、機能ドメインを推定した。さらに、cx遺伝子全長欠失株の菌体破砕液およびCX組み替えタンパク質を用いた解析から、CXは動物に感染した菌体内で咳嗽発作の直接的な原因因子の発現を制御している可能性が示唆された。また、上述の咳嗽因子は培養菌体内において二成分制御系因子BvgASによって制御されていることが示された。CXの機能推定に加え、咳嗽因子の同定にとって重要な知見が得られたことから、研究課題は順調に進展されていると考える。本研究では、百日咳の主症状である咳嗽発作を引き起こす原因因子(咳嗽因子)の同定を目指し、申請者らが発見した咳嗽発作に関連する細菌側の遺伝子(cough X: cx)の機能解析を行った。前年度までに、菌体あるいは破砕液の投与で咳嗽発作を引き起こす実験動物を用いた咳嗽の定量的評価法によって、cx遺伝子産物であるCXが咳嗽因子の発現を制御することを示唆する結果を得た。CXの下流で転写制御を受ける遺伝子を個別に欠失させた変異株(21株)を作製した。各変異株の咳嗽発作惹起能を野生型と比較すると、ある遺伝子(cough-related gene: creg)を感染させた動物の咳嗽発作回数が低下していることが分かった。一方で、creg欠失株の菌体破砕液投与による咳嗽発作の誘発も明らかとなったことから、cregによって発現されるCregが咳嗽因子として機能する可能性は低いと考えられた。菌体破砕液による定量的咳嗽惹起能評価法の条件検討の過程で、ボルデテラ属菌の主要な病原因子の発現制御に寄与する二成分制御系因子である、BvgASを不活性化させた菌の破砕液が投与動物に咳嗽発作を引き起こさないことを新たに見出した(前年度に報告)。そこで、これまでのcx遺伝子の機能解析に加え、上記の咳嗽評価法を用いて、BvgASの下流に存在すると予想される咳嗽因子の探索を行った。結果的に、17の候補遺伝子の中から、染色体上に連続して局在するx1とx2の両遺伝子欠失株の破砕液を投与した動物の咳嗽発作が減少することが分かった。さらにこの変異株を感染させた動物においても咳嗽の回数が減少したことから、咳嗽発作とX1あるいはX2、またはその両方との関連性が強く示唆された。

本研究によって咳嗽発作に関連する遺伝子をそれぞれ明らかにした。今後これらの遺伝子の詳細な機能解析を行うことで、咳嗽因子の特定が可能になると考えられた。本研究では、百日咳の主症状である咳嗽発作を引き起こす原因因子(咳嗽因子)の同定を目指し、新たに発見された咳嗽発作に関連する細菌側の遺伝子(cough X: cx、仮称)の機能解析を行った。動物モデルを用いた解析の結果、cx遺伝子産物であるCXは感染宿主体内で咳嗽因子の発現を制御している可能性が高いことが分かった。さらに解析の過程で、既知の転写制御因子が培養液中で咳嗽因子の発現に関与している可能性を見出した。これらの制御因子の下流に存在する遺伝子群の中から、咳嗽因子の探索を行い、いくつかの咳嗽因子候補を見出した。今後これらを詳細に解析することで、咳嗽因子の特定が可能になると考えられた。概要の項で述べたように、CXは真の咳嗽因子の発現を制御することで間接的に咳嗽発作に関与している可能性が考えられた。さらに、BvgASによる培養菌体内における咳嗽因子の発現制御も示された。これらのことから、次年度は当初の計画を変更し、CXあるいはBvgASの下流にあると考えられる咳嗽因子の探索を行う。具体的には、BvgASの活性化および不活性化条件で菌体を培養し、各条件を比較して発現が大きく変化する遺伝子をマイクロアレイによってリストアップする。菌体破砕液によって引き起こされる咳嗽発作の原因が菌体感染と異なる場合、CXは培養菌体内においても感染時に誘導される真の咳嗽因子の発現を制御している可能性がある。この仮定に基づき、培養条件下でcx遺伝子の下流で転写制御を受ける遺伝子もリストアップする。2つのリストから咳嗽発作に関与する可能性のある遺伝子の候補を選出し、候補遺伝子破壊株を用いた感染実験、あるいは菌体破砕液投与実験を行い、咳嗽発作の原因因子の同定に迫る。細菌学
金属バッファ層上でのGaN半導体の結晶成長-遷移金属窒化物に着目して-

現状の汎用青色LEDは、サファイア基板上に成膜したGaN系半導体で作製されている。サファイア基板上に連続かつ平坦なGaNをヘテロエピタキシャル成長させるには、AINバッファ層の開発が欠かせなかった。しかし、サファイアとAINは絶縁体であるため、複雑な横型LED構造を取らざるを得ない。より高輝度なLEDを作製するには、簡単な縦型LED構造にすることがひとつの方策である。縦型LED構造には、導電性の基板とバッファ層が必要であり、本研究では、その第一歩として導電性バッファ層の開発を試みた。昨年度は、導電性バッファ層として遷移金属窒化物に着目し、その中でもTiN膜上ではGaN膜が連続、平坦に成長することを報告した。連続で平坦なGaN膜の成膜には、TiNバッファ層成膜条件として、1)2軸配向性((111)面配向+面内配向)、2)窒素濃度を化学量論組成より増加させること、3)結晶粒を微細化させることが重要であることを報告した。本年度は、高品質なGaN膜成膜に及ぼす基板温度の低減とTiN膜厚の低減の影響を調べた。その結果、基板温度の低減とTiN膜厚の低減は、TiN結晶粒の微細化に有効であり、微細化によりGaN膜の平坦性が向上することを見出した。基板温度が室温でTiN膜厚が5nmのときに最も平坦なGaN膜が得られた。その表面平坦性は約10nm以下であった。この条件で、TiN膜の結晶粒は最も微細とあった。このTiNバッファ層上では、GaN初期成長時のGaN島密度が最大となり、その後の平坦なGaN層状成長へと移行した。つまり、TiN膜の粒界が核生成サイトとなり、平坦なGaN膜成膜にはGaN核生成頻度の増加が必須であることを実証した。TiN膜厚を5nmより薄くすると、TiN結晶粒は5nm厚のときより微細化せず、GaN島の成長は横方向より縦方向が優先的となり、GaN膜表面には多数の溝と穴が形成した。5nm厚より薄いTiN膜では、バッファ層としての効果が低減されてきたのも高品質なGaN膜が得られない一因と考えられる。サファイア基板上に連続かつ平坦なGaNをヘテロエピタキシャル成長させるには、AlNバッファ層の開発が欠かせなかった。しかし、サファイアとAlNは絶縁体であるため、複雑な横型LED構造を取らざるを得ない。導電性バッファ層には、抵抗の低い金属であること、GaN成膜時の高温で安定であるため、高融点を有すること、GaNの(0001)面と整合性の良い結晶面を有することなどが求められる。そのような金属バッファ層として、遷移金属窒化物に着目した。我々はこれまで、遷移金属窒化物としてTiNに着目し、TiN上に連続かつ平坦なGaNの成膜に成功した。連続かつ平坦なGaNの成膜には、TiN膜の1)2軸配向性((111)面配向+面内配向)、2)窒素濃度を化学量論組成より増加させること、3)結晶粒を微細化させること、4)表面平坦性を約10nm以下にすることが必須であることを明らかにした。他の遷移金属窒化物として、TiNと同じ構造を有するZrN、TaNなどにも着目し、それら金属膜の成膜条件の検討とGaNの成膜も行った。しかし、どちらの膜上でも連続かつ平坦なGaNの成膜に至らなかった。ZrN、TaN膜どちらでもTiNの場合の2)窒素濃度の増加によりGaNの核生成頻度を増加させられたが、1)の配向性および4)の表面平坦性がTiNの場合より劣っているため連続かつ平坦なGaNの成膜に至らなかった。

基板温度が室温でTiN膜厚が5nmのときに最も平坦なGaN膜が得られた。その表面平坦性は約10nm以下であった。この条件で、TiN膜の結晶粒は最も微細とあった。このTiNバッファ層上では、GaN初期成長時のGaN島密度が最大となり、その後の平坦なGaN層状成長へと移行した。つまり、TiN膜の粒界が核生成サイトとなり、平坦なGaN膜成膜にはGaN核生成頻度の増加が必須であることを実証した。TiN膜厚を5nmより薄くすると、TiN結晶粒は5nm厚のときより微細化せず、GaN島の成長は横方向より縦方向が優先的となり、GaN膜表面には多数の溝と穴が形成した。5nm厚より薄いTiN膜では、バッファ層としての効果が低減されてきたのも高品質なGaN膜が得られない一因と考えられる。
C型慢性肝疾患に対する運動療法のインスリン抵抗性改善効果とそのメカニズムの解析

C型慢性肝炎患者に対して歩行による運動療法を行った。有酸素運動による運動療法は、肝機能や肝予備能を悪化させることなく体重、肥満度、インスリン抵抗性を改善させた。QOLの面では、活力を上げる可能性が示唆された。また、C型肝炎ウイルスを発現した細胞では糖の取り込み低下がみられ、糖尿病発症の機序の一因であると考えられた。これらの結果から、C型肝炎に対する運動療法は糖尿病、肥満の改善に有用な治療法であると考えられた。1. C型慢性肝炎、肝硬変に対する運動療法の検討本年度はC型慢性肝炎、肝硬変に対する運動療法の検討を行った。16例のC型慢性肝炎、肝硬変患者から書面による同意を得て研究を開始した。事前に栄養指導を行った上で運動療法を6ヶ月間行った。運動内容は一日8000歩の歩行を指導した。指導が終了し、効果判定が可能な11例のうち、6例が目標歩数を達成した。これらの症例では運動指導前と比較し指導開始後6ヶ月目において有意に体重の減少が得られた。また、インスリン抵抗性を示すHOMA-IRも有意に低下した。一方、肝細胞障害を反映するトランスアミナーゼの上昇や、血清アルブミン値の低下やプロトロンビン時間の延長などの肝予備能低下はみられなかった。16例中1例は腰痛のため、1例がうつ症状のため運動指導を中止した。また、判定可能な11例中5例は目標歩数を達成できなかった。これらの症例では栄養指導を継続して行ったにもかかわらず、体重の減少、インスリン抵抗性の改善はみられなかった。これらの結果から、C型慢性肝炎、肝硬変において一日8000歩の運動指導は肝機能を悪化や肝予備能を低下させることなく、体重の減少やインスリン抵抗性を改善させた。肥満やインスリン抵抗性が抗ウイルス効果を減弱させたり、肝発癌を増加させることが報告されているが、運動療法によりこれらのデメリットやリスクの回避が可能であることが示唆された。一方、運動指導を行ったにもかかわらず実施できない症例が約半数にみられ、運動指導の方法や運動内容に工夫が必要である。本年度はC型慢性肝炎、肝硬変に対する運動療法の17例の最終効果判定と、HCV発規・増殖によるインスリン抵抗性発現のメカニズムについて培養細胞を用いたin vitroの系にて検討した。C型慢性肝炎、肝硬変患者において、栄養指導を行いながら運動療法(運動内容は一日8000歩の歩行)を6ヶ月間行った。全体の47%(7/15)が目標歩数を達成した。2例が膝関節痛、うつ病で中断した。運動指導時と比較し、運動開始後6ヶ月目において、摂取カロリーに差はみられなかったが、体重、BMI、脂肪量は有意に低下した。一方、骨格筋量の低下はみられなかった。経過中、血清ALT値は有意に低下し、血清アルブミン値、プロトロンビン時間に変化はみられなかった。耐糖能については空腹時血糖に有意な低下はみられなかったが、HbAlc、インスリン値、HOMA-IRは有意に低下した。運動前後のQOL評価をshort Form-36を用いて行った。統計学的な有意差はみられなかったが、運動前後においてVitalityのスコアの増加がみられた。また、HCV発現細胞における糖取り込みについて、HCV増殖システムを用いて、HCV full-genomeを発現させたHepG2, Huh7細胞を作成し、^3H-2-deoxy-glucoseの取り込みを用いて評価した。HepG2細胞において有意な取り込み低下がみられた。抗酸化剤であるMnTBAPを添加し、酸化ストレス測定のためDCF assayを用いて検討したが、HCV発現の有無による酸化ストレスに差はみられなかった。以上のことから、HCV感染自体が耐糖能異常を引き起こす原因となる事が示唆された。また、C型肝炎に対する運動療法は糖尿病、肥満の改善に有用な治療法であると考えられた。
新規von Willebrand因子阻害アプタマーの血栓形成阻害効果の多面的検討

von Willebrand因子(VWF)のA1ドメインは血小板のGP1bドメインと結合することで血小板血栓を形成し、適切な止血作用を発揮する。しかし、本邦の死因の上位を占める心筋梗塞や脳梗塞などでは血中のVWF濃度が大きく上昇しており、VWF A1阻害薬は治療薬として有望視されている。本研究では、国内バイオベンチャー(タグシクス・バイオ社)が開発した核酸アプタマーのVWF A1への結合部位の同定および血小板血栓形成に対する阻害活性の詳細な評価を行う。開発中の他のVWF A1阻害薬と比較を行うことで、結合様式の相違が薬理学的効果に与える影響を検討する。
マクロファージのスカベンジャー受容体と動脈硬化発症機構の研究

本研究はスカベンジャー受容体の(1)生理的役割(2)アテローム形成における役割(3)ファミリー遺伝子の役割(4)実験動物と異なるヒトにおける役割、の4点について研究を進め下記のような成果を本年度はえた。i)スカベンジャー受容体欠損マウスを用いて、抗ヒトスカベンジャー受容体モノクロナール抗体の作成に成功し、各種疾患での役割を解明した。とくにアテロームでの発現は早期のファッティーストリークに多かった。脳ではMATO細胞に多量の発現し、アルツハイマー病や脳虚血性疾患でミクログリアに発現誘導が見られた。ii)スカベンジャー受容体欠損マウスをアポE欠損マウス、LDL受容体欠損マウスと交配し、アテロームサイズへの影響をみたところ、アポE欠損においてはスカベンジャー受容体がないとアテロームサイズが大きく減少したのに、LDL受容体欠損では軽度低下をみるのみであった。iii)スカベンジャー受容体欠損マウスでの血中酸化LDLのクリアランスは不変であることがわかった。マクロファージにおいてはスカベンジャー受容体欠損の場合CD68が重要なことが示唆された。スカベンジャー受容体欠損マウスのアテロームではマクロサイアリン、CD36、MARCOの発現が見られた。iv)各種のLDLの抗酸化剤を用いた実験ではマウスとウサギでまったく異なった作用効果がみられアテロームおよび黄色腫病変を悪化させる場合もみられアテロームの形成における酸化的ストレスの作用の仕方に種差がみられた。v)ES細胞とYACをもつ酵母の高い効率でのスフェロプラストフュージョンの系の樹立に成功しヒトスカベンジャー受容体染色体遺伝子領域1MbをもつES細胞を多数樹立した。現在キメラマウスを作成中である。マクロファージのスカベンジャー受容体の動脈硬化発症への関与と生理的役割の解明のため、樹立したスカベンジャー受容体ノックアウトマウスを用いて次の結果をえた.(1)スカベンジャー受容体の動脈硬化への関与アポEノックアウトマウスにおける動脈硬化サイズはスカベンジャー受容体欠損により60%減少し、スカベンジャー受容体の関与が始めて直接的に証明された.LDL受容体ノックアウトマウスでは有意な差はみられずスカベンジャー受容体の関与はリポ蛋白の種類、マクロファージにおけるコレステロール代謝の変化によりことなることがわかった.(2)マクロファージの接着はスカベンジャー受容体欠損により大きく遅延することがわかった.これは腹腔マクロファージにはスカベンジャー受容体が発現されており、培養ディッシュなどへの初期接着はスカベンジャー受容体が重要であるが、培養時間の経過とともにβ2インテグリンなどが重要になってくるためと思われた.(3)マクロファージの酸化LDLやアセチルLDLの取り込みは低下するのに対し、血液中からりクリアランスはスカベンジャー受容体ノックアウトマウスでは変化しないことがわかった.これらの結果をまとめるとLDLの変性は血管壁でおこり、血液中で変性したLDLはマクロファージ以外の細胞でおこっている可能性が高いことを示す.本研究はスカベンジャー受容体の(1)生理的役割(2)アテローム形成における役割(3)ファミリー遺伝子の役割(4)実験動物と異なるヒトにおける役割、の4点について研究を進め下記のような成果を本年度はえた.i)スカベンジャー受容体欠損マウスを用いて、抗ヒトスカベンジャー受容体モノクロナール抗体の作戦に成功し、各種疾患での役割を解明した。脳ではMATO細胞に多量の発現し、アルツハイマー病や脳虚血性疾患でミクログリアに発現誘導が見られた.ii)スカベンジャー受容体欠損マウスをアポE欠損マウス、LDL受容体欠損マウスと交配し、アテロームサイズへの影響をみたところ、アポE欠損においてはスカベンジャー受容体がないとアテロームサイズが大きく減少したのに、LDL受容体欠損では軽度低下をみるのみであった.iii)

スカベンジャー受容体欠損マウスでの血中酸化LDLのクリアランスは不変であることがわかった。マクロファージにおいてはスカベンジャー受容体欠損の場合CD68が重要なことが示唆された。スカベンジャー受容体欠損マウスのアテロームではマクロサイアリン、CD36、MARCOの発現が見られた.iv)各種のLDLの抗酸化剤を用いた実験ではマウスとウサギでまったく異なった作用効果がみられアテロームおよび黄色腫病変を悪化させる場合もみられアテロームの形成における酸化的ストレスの作用の仕方に種差がみられた.v)ES細胞とYACをもつ酵母の高い効率でのスフェロプラストフュージョンの系の樹立に成功しヒトスカベンジャー受容体染色体遺伝子領域1MbをもつES細胞を多数樹立した.現在キメラマウスを作成中である.
多胎児をモデルとした胎児発育と循環動態の相互関連に関する研究

双胎胎児における心収縮率、心室拡張終期径、尿産生率および臍帯動脈RI値をクラスター分析を用いて郡別化し、さらに新生児予後及び胎盤所見との関連を検討した。その結果、対象例(71例)から、大きい方の児(L児)に心機能不全、腎血流量の増加及び小さい方の児(S児)に腎循環不全を有する一絨毛膜双胎、ならびにS児のみに胎盤循環不全があり、臍帯の胎盤付着部位の異常あるいは胎盤梗塞を有する双胎胎児の、2つの疾病胎児群を抽出することが可能であることかが分かった。さらに、118例の双胎妊娠例を対象に、カラードプラ法を用いて胎盤における両児の血管吻合の出生前診断を試みた。一絨毛膜性双胎5例において、両児の心拍数の差に起因して、最大・最小血流速度が周期的に変化する動脈シャント血流が認められ、胎盤表面の動脈一動脈吻合を出生前に診断し得た。5組のうち、出生後に双胎間輸血症候群およびDiscordant twinと診断された症例は各々3例、4例であった。以上の結果から、一絨毛膜性双胎において動脈一動脈吻合およびシャント血流の同定が可能であることが分かった。双胎胎児における心収縮率(FS),心室拡張終期径(EDD),尿産生率(UPR)及び臍帯動脈RI値(RI)をクラスター分析を用いて群別化し,さらに胎盤所見との関連を検討した。その結果,1)対象例76例は大きい児(L児)のEDD及びUPR高値でFS低値(I群),小さい児(S児)のUPR低値,S児のRI高値(II群),各指標正常(III群)の3群に群別された。2)胎盤所見はI群全例,II群5例(41.7%),III群11例(19.0%)で一絨毛膜性胎盤であり,II群は他の群より臍帯卵膜付着及び胎盤梗塞の頻度が有意に高かった。3)各群の臨床像は,I群はII,III群より周産期死亡が有意に多く,分娩時妊娠週数は有意に低く,II群の臍帯動脈血pHはI,III群より有意に低く,また,I,II群のdiscordancyの頻度はIII群より有意に高かった。以上より,L児に心機能不全,腎血流量の増加及びS児に腎循環不全の存在する群では一絨毛膜性胎盤が,S児のみに胎盤循環不全の存在する群では臍帯の胎盤付着部位の異常あるいは胎盤梗塞が疾病発生の要因であることが分かった。【目的】双胎胎児における心拍数変動は、卵性の相違と母体要因のいずれに影響を受けているかを明らかにすることを本研究の目的とした。【対象と方法】母親から研究への同意を得られた、妊娠34-39週の双胎胎児18組を対象とし、双胎児の出産体重は当該妊娠週数における単胎児の標準体重の±2S.D.以内で,両児の体重差は20%以内であった。個々の胎児から、ドプラ探触子を用い、両児の心拍数データを同時に、連続する120-180分間収集し、on-lineでマイクロコンピュータに記録した。瞬時心拍数変動の1分間刻みの双胎児相互の関連をχ2 test of goodness of fitによって解析した。ついで、両児の心拍数変動のなかで数理的に有意な関連を有する時間帯の、全観察時間に占める割合を適合率(%)と定義した。卵性(一卵性:M、二卵性:D)および重症妊娠中毒症の有無(有:tox+、無:tox-)により、対象例を4群(Mtox+、Mtox-、Dtox+、Dtox-)に分類し、各々の適合率を郡間比較した。重症妊娠中毒症の診断には、日本産科婦人科学会妊娠中毒症問題委員会の基準を用い、母体に薬物投与のない状態でデータ採取を行った。適合率の群間比較にはt-検定を用いた。

【成績】各郡における適合率は、Mtox+群(3例)が33.2±11.5%(平均±S.D.)、Mtox-群(5例)が25.5±10.5%、Dtox+群(4例)が35.6±12.4%およびDtox-群(6例)が15.2±8.6%であった。Mtox+群およびDtox+群はともに、Mtox-群およびDtox-群に比べて有意に高値を示した(p<0.05、P<0.05)。また、Mtox-群はDtox-群に比べて有意に高値を示した(p<0.05)。【結論】妊娠34週以降においては、一卵性双胎は二卵性双胎に比較して、心拍数変動を司る生物時計に相同性があること、さらに、母体からの外的要因によって生物時計の偏位が生しることが示唆された。双胎胎児における心収縮率、心室拡張終期径、尿産生率および臍帯動脈RI値をクラスター分析を用いて群別化し、さらに新生児予後および胎盤所見との関連を検討した。その結果、対象例(71例)から、大きい方の児(L児)に心機能不全、腎血流量の増加および小さい方の児(S児)に腎循環不全を有する一絨毛膜性双胎、ならびにS児のみに胎盤循環不全があり、臍帯の胎盤付着部位の異常あるいは胎盤梗塞を有する双胎胎児の、2つの疾病胎児群を抽出することが可能であることが判った。さらに、118例の双胎妊娠例を対象に、カラードプラ法を用いて胎盤における両児の血管吻合の出生前診断を試みた。一絨毛膜性双胎5例において、両児の心拍数の差に起因して最大・最小血流速度が周期的に変化する動脈シャント血流が認められ、胎盤表面の動脈-動脈吻合を出生前に診断し得た。5組のうち、出生後に双胎間輸血症候群(TTTS)およびDiscordant twinと診断された症例は各々3例、4例であった。以上の結果から、一絨毛膜性双胎において動脈-動脈吻合およびシャント血流の同定が可能であることが明らかとなった。
可視光による遺伝子の発現制御

ヘム生合成系の中間産物は光感剤として,可視光があたると活性酸素を発生するケースがある。大腸菌の可視光による応答・発現制御には活性酸素が関与する場合があることを,これまでの一連の研究で明らかにしてきた。ヘム生合成系の解明は本研究課題に重要と考えて研究を進めた。大腸菌のΔvisA(=ΔhemH)株は光感受性であるが,この株から光抵抗性の復帰株を分離することにより,heme生合成に関与する遺伝子の変異株を容易に得ることが出来た。それらの変異株を利用して,(1)これまで遺伝子解析がなされていなかった遺伝子のhemEおよびhemGのクローニングと塩基配列の決定を行なった。(2)heme生合成に関与する2つの新しい遺伝子を発見した。hemKと名命した遺伝子は226アミノ酸からなるタンパク質をコードしており,hemA-prfA-hemKのオペロンを構成していること,この遺伝子の欠損によってプロトゲンの蓄積は見られるが,プロトIXの蓄積がないことから,HemG関与のステップに働いていると思われる。もう1つの新しい遺伝子についても小原クローンによる相補実験から座位を決定し,現在塩基配列を調べている。(3)大腸菌hemA^-,hemH^-の変異株を相補するクローンとして,大麦とキューリからcDNAの単離に成功し,遺伝子の塩基配列を決定した。光合成に重要なクロロフィル合成系は途中のステップまでheme合成系と共通であり,単離した植物遺伝子を呼吸や光合成の研究に役立てたいと考えている。(4)hemHはプロトポルフィリンIXに鉄を入れる酵素,フェロキラターゼをコードしているが,この酵素の大量発現系を構築し,大量精製を行なった。精製酵素の生化学的・物理化学的性質を調べると共に,結晶化に着手しX線回折による高次構造の解析を進めている。1.E.Coliからの光感受性のプロモーターを含むフラグメントの解析を行なってきたが、転写活性が弱いことから、実験系としてあまり有用でないことが分ってきた。2.光によって生育が制御される系を調べている際、可視光に感受性の大腸菌の変異株を見いだした。このうちvisAと命名した変異株は、実はhem合成系の遺伝子であるhemHの変異株であった。この遺伝子の欠損によって、ヘムの前駆体であるプロトポルフィリンIXが細胞内に多量蓄積していることを証明した。3.visA変異株より光に対して非感受性になったものを分離して調べてみると、それらはヘム生合成系の各ステップに関与する遺伝子の欠損株であることが判明した。4.3で得た変異株のうち、hemA遺伝子の欠損株を用いて、hemA遺伝子のプロモーター領域の解析を行なった。5.ヘム合成系の遺伝子群で、hemE、hemGなど解析の進んでいなかったものについて、物理的な遺伝子座位やDNA塩基配列の決定を行なった。6.visA変異株のほかに、遺伝的性質の異なった光感受性の大腸菌変異株を分離して、visBと命名した。解析の結果、この変異はユビキノン生合成系の1つの遺伝子の変異であることが判明した。ヘム生合成系の中間産物は光感剤として,光があたると活性酸素を発生するケースがある。大腸菌の光による応答はこうした活性酸素によって引きおこされる場合があることをこれまでの一連の研究で明らかにしてきた。ヘム生合成系の解明は光応答や調節に重要と考え研究を進めた。大腸菌のΔvisA(=ΔhemH)ミュータントから光抵抗性の復帰株を分離することにより,hem生合成系に関与する遺伝子のミュータントを得ることが出来た。