hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生理学的手法(脳磁図,脳波,誘発筋電図)を用いた随意運動発現機構に関する研究

ヒトが視覚刺激を受けてからどのような脳内過程を経て運動が遂行されるかを脳磁図を用いて研究した.視覚系では,色,形,運動などは別々の機能系で情報処理が行われていると考えられている.脳磁図がこのような機能系に対応する反応を測定できるかが我々の研究の出発点であった.視覚刺激として色の変化と仮現運動を用いて,脳磁図反応を記録した.色変化では約200msの潜時で紡錘状回付近から,また仮現運動刺激では約150msの潜時で側頭-後頭葉移行部外側からと推定される反応が記録された.この結果は米国神経科学学会にて発表した.また仮現運動に反応する脳部位はヒト運動視中枢付近と考えられ,これはNeuroreport(1997)に発表した.次に,この仮現運動刺激に応じてヒトが運動(ボタン押し)をするとき,脳磁場で記録された反応潜時と運動開始時間との関係を調べた.我々の使用した仮現運動刺激では,約150msをその視覚情報処理に,また約64msが運動開始に必要とされることがわかった.また視覚情報処理には30msほどの個人差があったが,運動開始に費やされる時間に個人差は認めなかった.この結果は,Brain Research(1998)に発表した.次に興味深い問題は,視覚系が情報処理を行うとき,その結果は脳の神経活動に反映されるか,もしそうなら視覚認知の程度が変化したときそれに応じて運動開始は変化するかである.仮現運動刺激では二つの光を使うが,この光の点滅の時間差を変えることにより,自覚する運動の滑らかさを変えることができる.我々は運動視中枢からと思われる脳磁場反応の強度が,自覚する視覚性運動の質と比例して変化することを突き止めた.この結果はJournal of Neuroscienceに投稿中である.ヒトが視覚刺激を受けてからどのような脳内過程を経て運動が遂行されるかを脳磁図を用いて研究した.視覚系では,色,形,運動などは別々の機能系で情報処理が行われていると考えられている.脳磁図がこのような機能系に対応する反応を測定できるかが我々の研究の出発点であった.視覚刺激として色の変化と仮現運動を用いて,脳磁図反応を記録した.色変化では約200msの潜時で紡錘状回付近から,また仮現運動刺激では約150msの潜時で側頭-後頭葉移行部外側からと推定される反応が記録された.この結果は米国神経科学学会にて発表した.また仮現運動に反応する脳部位はヒト運動視中枢付近と考えられ,これはNeuroreport(1997)に発表した.次に,この仮現運動刺激に応じてヒトが運動(ボタン押し)をするとき,脳磁場で記録された反応潜時と運動開始時間との関係を調べた.我々の使用した仮現運動刺激では,約150msをその視覚情報処理に,また約64msが運動開始に必要とされることがわかった.また視覚情報処理には30msほどの個人差があったが,運動開始に費やされる時間に個人差は認めなかった.この結果は,Brain Research(1998)に発表した.次に興味深い問題は,視覚系が情報処理を行うとき,その結果は脳の神経活動に反映されるか,もしそうなら視覚認知の程度が変化したときそれに応じて運動開始は変化するかである.仮現運動刺激では二つの光を使うが,この光の点滅の時間差を変えることにより,自覚する運動の滑らかさを変えることができる.我々は運動視中枢からと思われる脳磁場反応の強度が,自覚する視覚性運動の質と比例して変化することを突き止めた.この結果はJournal of Neuroscienceに投稿中である.本年度は、視覚情報がどのような過程を経て処理されるかを主眼に研究を進めた。人を対象に、色の変化、または物の動きにどの大脳皮質がどのような時間で反応するかを、脳磁図を用いて研究した。色の変化を視覚刺激として与えるために、2色のLEDを用いた装置を開発した。これは、赤と緑の色を交互にある決められた時間間隔で提示するもので、脳磁図測定室には、光ファイバーにて導入した。時間間隔はコンピューターにより制御できるようにした。また、2つの色の輝度が自覚的に同じであるように調製する電気回路を作成した。動きの視覚刺激には、コンピュータープログラム(VSG、Cabridge社製)により作成した画像をプロジェクターで測定室に導入した。画像は、ランダムドットと2本の線分を用いた。これらにより、連続的な運動と仮現運動の視覚刺激を誘発した。色の変化に対しては、約200msで大脳後頭葉底部が、反応した。連続的な運動の刺激には、後頭葉と側頭葉、頭頂葉の移行部に反応が約300msで見られた。これに対して仮現運動刺激では、同じ部位に約160msで反応が見られた。視覚情報は大脳でその早い段階から固有情報(色、動き)に応じた大脳皮質に投射されることが、脳磁図測定により示された。結果は第26回米国神経科学学会に、発表した。また運動刺激の結果はNeuroReportに発表予定(印刷中)である。本年度は,ヒトが視覚刺激に応じて運動を起こすときに,どの処理過程にどの程度時間が費やされるかを検討した.視覚刺激としては仮現運動刺激を用いた.

少し離れた位置にある二つの光を交互に点滅させると,人は運動を知覚する.我々は先に,この仮現運動刺激がヒト運動視中枢付近からの反応を誘発することを見出した.そこで、この脳磁図反応の潜時が二つの光の距離によってどう変化するか検討した.被検者は健康成人男子3名で37チャンネルの脳磁場計を用いて,仮現運動視覚刺激に対する脳磁場反応を記録した.視覚刺激として,二つの線分を左視野に2-3秒ごとに交互に提示した.また線分間の距離は視角で0.05度から5.0度までの6段階を使用した.各被検者の脳磁場反応はいずれの刺激条件でもヒト運動視中枢付近から発生していると考えられた.またその反応潜時は線分間の距離に依存して変化し,距離が大きくなるほど潜時は短縮した.各被験者間の反応潜時を比較すると,30ms程度の有意な差(p<0.01)が認められた.この脳磁場反応は視覚刺激に対する単純な反応ではなく,運動視の知覚に関わっている脳内過程を反映すると考えられる.そこで同じ視覚刺激に応じてボタンを押す単純反応時間を測定し,脳磁場の反応時間と比較した.反応時間も個人差が見られ,また距離が大きくなるほど潜時は短縮した.しかし脳磁場と反応時間の差は視覚刺激条件,個人によらずほぼ一定(約64ms)であった.これは運動知覚に80-180msを要し,その後ボタンを押す運動発現に約64ms要することを示す.また運動知覚に要する時間は運動発現に要する時間より個人差が大きいことを示している.この結果はBrain Researchに投稿中である。昨年度までは,ヒトが視覚刺激に応じてある決められた運動を起こすまでにどの程度時間が費やされるかを検討し,視覚刺激の処理に約150ms,その後運動を起こすまでに約64msかかることが判明した.そこで今年度は種々の視覚刺激がどの脳部位でどのように処理されるかを検討した.第一の実験では,仮現運動を誘発する視覚刺激を二つのLEDを用いて作成した.LEDは被検者の左視野に視覚1度の距離に離れて置かれ,それぞれは交互に2秒ずつ点灯した.これにより被検者はLEDが消える方から点灯する方に向かう仮現運動を知覚した.この時,始めのLEDが消えてから次のLEDが点灯するまでの時間(ISI)を変化させると,被検者が観測する運動の質(滑らかさ)が変化した.ISI=0のとき,もっともスムーズな運動を知覚して,ISIがこれからずれるにつれて運動の質は減衰した.同じ刺激を用いて脳磁図にて誘発される脳活動を記録すると,ISIが変化してもいつも反応はヒト運動視中枢と思われる部位から記録された.そしてその反応の強さは被検者の知覚した運動の質と比例して変化した.この結果は,ヒト運動視中枢に仮現運動の自覚的観測結果を表現する神経活動が存在することを示唆している.これは,現在Journal of neuroscienceに投稿中である.第二の実験では,ランダムドットの運動によって定義された形がどの脳部位で処理されるか検討した.脳磁図の反応は前回のものと異なり,後頭側頭葉の底部にその信号源が認められ,それは被検者の形の認知程度と関連していた.この結果はNeuroreportに発表した.
コレステリック液晶を用いた面発光レーザアレイの研究と位相同期への応用

本研究はコレステリック液晶と有機発光材料の組み合わせにより、可視の広い波長範囲で高効率に発振する円偏光型面発光レーザアレイを実現することを目的とした。平成14年度は、発光効率の高いレーザを実現するための基礎検討として、円偏光に対する選択反射率の高いコレステリック液晶膜の作製方法、ならびにフィネスの高い光共振器の作製条件について理論を中心に検討を行った。更に、実験により、自由スペクトル間隔57.4pm、フィネス8.5の特性を有する左回り円偏光共振器を作製している。平成15年度は、前年度に引き続き、コレステリック液晶による円偏光共振器の作製、および性能向上のための評価を進めた。前年度に得られた知見のもと、波長638nmの可視光に対し、左円偏光の反射率が73%のコレステリック液晶膜の作製に成功した。更に、反射膜の平行度、共振器内部と液晶膜との屈折率整合等をとることで、フィネスが9.2まで改善され、レーザを構築する上で充分な特性の共振器を実現することができた。更に、レーザの注入同期を考える上で重要となる共振器内部の電界状態について理論解析を行った。その結果、通常のFabry-Perot共振器では定在波が現れるが、本共振器では、共振器内部で偏波面が螺旋状に変化するだけで、電界振幅の大きさが常に0となる節点が存在しないという特異な現象を明らかにすることができた。コレステリック液晶(CLC)は螺旋分子構造を持つ液晶で、螺旋周期の光学長と同じ波長で、螺旋と同じ回転の円偏光を選択反射する。例えば、右回り螺旋分子構造を有するCLCであれば、通常の反射鏡と異なり、右回り円偏光を右回り円偏光のまま反射し、反射に際し偏光の変換が起こらない。本年度は、CLCを利用した円偏光レーザ構築の第一段階として、CLC液晶膜の作製条件についての検討、CLCを2枚平行に配置したファブリーペロー共振器の作製、およびその特性評価を行った。本年度は、UV硬化性ポリマー、カイラル剤、ネマティック液晶の混合物をUV光により光重合させることで、CLCを作製した。CLCの選択反射波長は、UV作製時のUV光パワー、照射時間、温度等により決まる。そこで、様々な条件下でCLCを作製し、最適な反射特性を有するCLCの作製条件を検討した。検討結果に基づき、波長633nmの左回り円偏光に対し反射率が80%のCLCミラーの作製に成功した。続いて、このCLCミラーを2枚用い、光共振器を構築した。CLCミラーで挟まれた空間が空気の場合、鋭い共振ピークをもつ共振器は得られないが、この空隙にCLCと同じ屈折率のマッチングオイルを充填することで、フィネス、並びに共振波長での最大透過率の向上を実現した。これは予め行った解析結果と一致する。波長可変レーザを用いた測定により、完成した光共振器の自由スペクトル間隔は57.4pm、フィネスは8.5であった。更に、左回り円偏光が共振することを実験により確認した。
スウェーデンのラジオ放送に見られる「こども」と「こどもの権利」への視点

本研究は、「こども文化」においてスウェーデンのラジオ放送が果たしてきた役割を概観・解説した上で、インターネットが普及した今日におけるこども向けラジオ番組のあり方を検証し、スウェーデンではいかにしてラジオが「こどもの視点に立ったメディア」として成立しているのかを分析するものである。スウェーデンにおいては「子どもの権利条約」を前提とした考え方が広く普及しており、こどもも含め誰もが豊かな文化活動を享受できることへの多様な取り組みがなされている。本研究では、こどもの権利保障・擁護の視点から見たスウェーデンのラジオ放送の特色を解明し、今後のこども文化発展に対する示唆を得ることを目指している。
四肢形成領域および前後肢identityの決定機構

以下の3つの項目に分けて研究を進めたので、それぞれの研究成果の概要をまとめる。1、側/壁側側板中胚葉の領域化メカニズム内臓を作る臓側側板と四肢などを形成する壁側側板は、それらが分離する以前から頭尾軸に沿った領域分けがなされており、その大まかな領域分けにしたがって内臓であれば胃や小腸(前側)と大腸や盲腸(後ろ側)四肢であれば前肢(前側)と後肢(後ろ側)の構造の違いを形成していることが示唆するデータを得た。さらにそれぞれの構造内の詳細な軸形成はそれぞれが分離した後に形成されている可能性が強い。2、Tbx5/4発現を指標とした前後肢の誘導メカニズム前肢/後肢の運命づけ・決定・分化に関して、運命づけられる時期と両者の分化時期(Tbx発現開始時期)はほぼ同時であるが、決定をされる時期が大きく異なっており、またその決定には必要の無いTbxの発現を抑制する力が大きくかかわっている、というモデルを提唱した(Saito et al.,2002)。その可能性を更に検証するために行った、発生段階およびレベルの異なる沿軸中胚葉(体節もしくは体節板)を後肢レベルの予定体節領域へ交換移植した実験から、首、前肢、脇腹レベルの沿軸中胚葉はTbx5を誘導し、Tbx4の発現を抑制する能力をもつことを示唆するデータを得た。3、1および2を、軟骨魚類胚、硬骨魚類胚、両生類胚および哺乳類胚を用いて検証する軟骨魚類胚からTbx5遺伝子断片がクローニングされたことは、現存する脊椎動物はすべてTbx5/bx4遺伝子に規定される前後肢のidentityをもっていることを意味する(Tamura et al.,2001)。この事実は、脊椎動物の四肢の起源と進化そしてその多様性を考える上で、非常に重要な知見をもたらした。肢芽位置決定機構の解明のため、壁側側板中胚葉と臓側側板中胚葉の交換移植実験を行った。この実験により、肢芽の中胚葉は、側板が壁側・臓側に分離する前からどの場所に前肢・後肢が作られるかが運命づけられていること、ただし肢芽の中の領域分けは側板が二層に分離したのちに起こることなどを明らかにした。現在、このことをAER形成の位置関係を解析している。一方で、前肢・後肢のidentityの決定機構を明らかにする目的で、さまざまな移植実験・組織培養実験を行い、tbx5/4遺伝子発現を指標にして解析を行った。その結果、上述のような側板中胚葉の分化と前後肢identityの獲得は側板中胚葉の中で自立的に行われるのではなく、他の組織からの影響、とくに中軸組織からの誘導と抑制の作用が大きく影響していることを見出した。ここまでの研究成果は論文として報告した(Saito eta1., 2002)。さらに、前後肢identity決定に関わる中軸組織が、体節である可能性を占めるデータを得ており、詳しい解析は因子の同定を目標に来年度の課題として現在も研究を続けている。3番目の研究目的として、上のような決定メカニズムの帰納する目的とともにこのメカニズム解析を通した四肢の位置決め機構の起源と進化を考察する目的で、現存する脊椎動物の中でもっとも原始的な鰭構造を持っとされている軟骨魚類胚を用いて遺伝子発現解析を行った。サメ胚からTbx5/4遺伝子の部分配列をPCR単離し、発現解析を行った結果、すでに軟骨魚類では四足動物同様にTbx5/4が胸鰭(前肢)と腹鰭(後肢)に局在していることを見出した。

現在、他のいくつかの遺伝子マーカーとの発現比較を検討中である。側板中胚葉組織の領域分けについて、前肢領域と後肢領域の決定にその中軸側に位置する体節が重要な役割を持つことを明らかにした。すなわち、前肢領域の体節を後肢領域に移植すると後肢特異的調節因子Tbx4の発現が抑制され、代わって前肢特異的調節因子であるTbx5が誘導されてくる。このような体節の働きは前肢よりも頭部側にのみ存在していることがわかった。また、このような体節の作用が肢芽の基となる壁側側板中胚葉のみならず内臓中胚葉原基である臓側側板中胚葉にも影響を与える可能性を見出しており、解析を続けている。また、わき腹領域に過剰肢を誘導する活性を持つ細胞であるヒト胎児肺由来繊維芽細胞(MRC細胞)が後肢のみを誘導することを見出した(現在、この細胞が持つ活性と体節が持つ活性を比較することにより後肢の決定に関わる液性因子の探索を行っている)。また、わき腹の過剰肢形成と細胞死との関係を調べた。まだ予備的ではあるが、肢形成領域に比べわき腹では細胞死が顕著であること、さらに過剰肢形成によってこの細胞死が抑制されることを見出している。前肢/後肢のidentityが脊椎動物の進化上いつ確立されたかを調べる目的で、軟骨魚類ガンギエイ胚からTbx5/4およびTbx4の上流調節因子であるPitx1の単離を行った。さらにこれらの遺伝子のガンギエイ発生過程における発現解析を行い、Tbx5が胸鰭原基にまたTbx4およびPitx1が腹鰭原基に特異的に発現することを見出した。これにより軟骨魚類においてTbxのみならずPitx1がすでに存在していることが明らかとなり、脊椎動物に鰭構造がもたらされた初期の段階で前肢/後肢のidentityがすでに確立されていた可能性が強く示唆された。
コミュニティにおける遺児支援技術の習得プログラムの開発と拡大に関する研究

わが国では年間約10万人の子どもが親を亡くしているが、遺児の理解や対応は不十分であり、家庭や学校、病院、地域での不適切な対応によってさらなる傷つき体験をしている。本研究は、コミュニティにおける遺児支援を充実させることを目的とし、各支援者を対象に遺児のイメージ調査、遺児支援プログラムに参加している子どもと家族を対象に、参加前後の心理的・社会的特性の変化を調査した。結果、遺児のイメージ調査では、支援者の属性によって異なり、特に医療関係者は、ネガティブなイメージを抱いていることが示唆され、プログラム参加前後の調査では、家族の心の健康度、子どもの多動性・向社会性、家族の社会的支援が改善されていた。死別を体験した子ども(遺児)は、年齢や発達段階、生活環境、死別した方との関係などによって様々な反応を示すが、これらの反応が子どもの心身の成長発達に大きく影響し、成人期以降のうつ病の発症などのメンタルヘルスにも大きく関連すると言われている。しかし、わが国では遺児へのサポートはほとんど実施されておらず、コミュニティにおいては、遺児の理解が乏しく、周囲の不適切な対応(支援)により、傷つき体験を繰り返すことも多い。死別は誰もが体験するものである。死別によって生じる様々感情や反応は自然な感情であり、正常な反応である。このため、遺児支援は、日常生活の中で、コミュニティの中で十分にサポートされることが支援の要諦である。そこで本研究は、コミュニティにおける遺児の実態、および支援の課題を明らかにすると、また、実施している遺児支援プログラムや、スタッフ養成研修の有用性を検証し、調査結果をもとに、遺児にかかわる方々(保護者・教師・支援者・市民等)の遺児の理解の向上と支援技術の習得に向けた研修プログラムを開発することを目的とした。本年度は、支援者(保護者・教師・支援者・市民等)の遺児への支援課題を明確化するために、遺児に関する理解度、コミュニティにおける支援課題、スタッフ養成研修を受講した方々の遺児に関する理解度の変化を調査し、大学生、専門学校生、会社員、医療・専門職、教職員、行政職など約150名のデータが得られた。現在、分析段階であるが、属性によって遺児の理解度は異なり、コミュニティにおける調査では、特にネガティブなイメージに差が生じてることが示唆された。また、スタッフ養成研修前後での遺児に関する理解度の変化も確認された。今後、さらに調査を進めることにより、属性による遺児に関する理解度が明らかとなり、コミュニティにおける遺児への支援課題が明確化すると考える。死別を体験した子どもは、年齢や発達段階、生活環境、死別した方との関係などによって様々な反応を示すが、これらの反応が子どもの心身の成長発達に大きく影響し、成人期以降のうつ病の発症などのメンタルヘルスにも大きく関連する。わが国では、年間約10万人の子どもが様々な死因により保護者を亡くしている。その1割は自死遺児であり、多くの自死遺児が、自殺の第一発見者である。また、東日本大震災で保護者を亡くした子どもは1500人を超え、兄弟や祖父母、友人などを含めると極めて多くの子どもたちが死別体験をしている。遺族へのサポートは、2006年の自殺対策基本法の制定後、全国に自死遺族の支援団体が発足したことを機に急速に拡大し、現在では、他の死因の遺族へのサポートも数多く実施されている。しかし、自死遺児を含め遺児へのサポートはほとんど実施されていない。研究責任者は、2010年に仙台市で遺児と家族を対象としたサポートプログラムを開始し継続的に実施している。現在では、自死や事故死、病死で保護者を亡くした子どもや、東日本大震災で家族を亡くした子どもたちが参加している。継続して参加する子どもが多く、プログラムの中で子どもたち同士で体験を共有し、様々な思いや感情を自分のペースで表現・発散している。しかし、コミュニティにおいては遺児に対するイメージが、支援者主導の過度な支援や一方的な支援に発展する可能性があり、このような支援が、子どもが本来持っている対処能力を奪い、子どもの成長発達に悪影響を及ぼす危険性がある。よって、本研究は、コミュニティにおける遺児支援を確立するための基礎的検討として、コミュニティの遺児のイメージを調査し、イメージの相違から属性の特徴を明らかにすること、また、プログラム参加前後の子どもと家族の変化を検証することを目的とした。今年度の研究計画は、遺児サポートプログラム、およびスタッフ養成研修の検証である。遺児のサポートプログラムは定期的に開催し、プログラムを通して遺児や家族の心理的・社会的・経済的な問題やニーズを把握し、プログラムを主催する研究協力団体とともに、プログラムの検証に関する討議を定期的に開催している。しかし、研究協力団体の組織改編等により、当初予定していた遺児や家族の調査、遺児サポートプログラムに参加するスタッフの養成研修の調査が実施できていない。わが国では、年間10万人の子どもが様々な死因で親を亡くしている。親を亡くした子どもへの支援プログラムは年々増加しているが、全国的には限られた地域でのみ開催されている。また、コミュニティにおいては遺児の理解や対応は不十分であり、家庭や学校、病院、地域での不適切な対応により、さらなる傷つき体験を繰り返している。そこで本研究は、コミュニティにおける遺児支援を充実させる(遺児支援技術の習得プログラムの開発等)ことを目的に以下の研究を実施した。1.コミュニティにおける子ども支援・教育に携わる支援者、及び各講演・研修会に参加した地域住民、大学生を対象に、遺児のイメージ調査を実施した。

収集された約400データを分析した結果、各属性によって遺児へのイメージには差があり、特に医療関係者は他と比較し、ネガティブなイメージを抱いていることが示唆された。2.遺児支援プログラムに参加している子どもと家族を対象に、プログラム参加前後の心理的反応、生活行動特性、ソーシャル・サポートを調査した。結果、子どもの向社会性(思いやりや優しさ等)、家族の心の健康度、及び他者との関係性に差があった。3.遺児へのコミュニティ支援を充実させるための普及・啓発を実施した。子ども支援・教育に携わる支援者を対象とした事例検討会、教育関係者、及び医療関係者を対象とした講演・研修会、地域住民を対象とした講演・研修会、遺児支援プログラムに関連する人材育成を3年間で約30回実施し、講演・研修会終了後のアンケート調査では、約80%以上の満足度は得られた。また、遺児支援プログラムに関連する人材育成においては、上記1・2の結果をもとに、研修内容を一部修正して実施した。4.遺児支援プログラムを継続し、参加する子どもや家族からナラティブな情報を収集した。また、子どもや家族の困難事例等に関しては必要に応じて個別介入を行った。わが国では年間約10万人の子どもが親を亡くしているが、遺児の理解や対応は不十分であり、家庭や学校、病院、地域での不適切な対応によってさらなる傷つき体験をしている。本研究は、コミュニティにおける遺児支援を充実させることを目的とし、各支援者を対象に遺児のイメージ調査、遺児支援プログラムに参加している子どもと家族を対象に、参加前後の心理的・社会的特性の変化を調査した。結果、遺児のイメージ調査では、支援者の属性によって異なり、特に医療関係者は、ネガティブなイメージを抱いていることが示唆され、プログラム参加前後の調査では、家族の心の健康度、子どもの多動性・向社会性、家族の社会的支援が改善されていた。今年度の研究計画は、遺児にかかわる方々(保護者・教師・支援者・市民等)の支援課題の明確化と、コミュニティにおける遺児の実態把握である。支援課題の明確化においては、当初の調査実施予定数を上回る様々な支援者に調査を実施することができた。遺児の実態把握に関しては、全国的な調査は実施できていないが、遺児支援プログラムを開催している研究協力者(団体)とともに、遺児とその家族の心理的・社会的・経済的な問題やニーズについての討議を定期的に開催している。今後の研究計画は以下の通りである。1、コミュニティにおける遺児の実態把握1全国的な遺児と保護者の実態調査(対象:遺児・遺族支援団体に所属する遺児と保護者)2、遺児にかかわる方々(対象:保護者・教師・支援者・市民等)の支援課題の明確化1遺児に関する理解度の調査2コミュニティにおける支援課題の明確化3、遺児サポートプログラム、およびスタッフ養成研修の検証1遺児・保護者の調査2スタッフの調査3遺児サポートプログラム、およびスタッフ養成研修の有用性の検証4、コミュニティにおける遺児の理解の向上と支援技術の習得を目的としたプログラムの開発今年度実施できなかった調査を含め、以上の調査を計画的に実施する。精神看護学今後の研究計画は以下の通りである。
ゲノム刷り込み現象のスクリーニングによるモヤモヤ病原因遺伝子の単離

モヤモヤ病(ウイルス動脈輪経閉塞症)は、幼児期から学童期にかけての発達期に、中大脳動脈起始部の血管の内皮が異常増殖し、脳梗塞の症状で発症する比較的稀な疾患であるが、目本人など東アジアの民族に特徴的な疾患である。原因は未だ不明であるが、家族集積性があり、遺伝性が強く疑われ、特に発症者は共通の遺伝子異常を保有していることが予測される。そしてこの疾串の原因遺伝子は発達期の血管内皮細胞の増殖制御に関与している新規遺伝子であると考えられる。モヤモヤ病の親子例のうち母親からの遺伝が圧倒的に多い事実から、この疾患の原因遺伝子がゲノム刷り込みに関連している可能性に注目している。最近、日本の他の研究施設により、3番染色体短腕(3p24.2-26)に、この疾患に関連する遺伝子が位置している可能性が示された(Am J Hum Genet 64:533-537,1998)。今後はこの領域に注目し、3番染色体短腕に位置するESTを患者および正常コントロールのリンパ球を使ってRT-PCRを行い、解析したところ、複数のESTで患者での発現低下を認めた。この領域では、親起源の明らかなヒト3番染色体1本を保持したマウスA9雑種細胞で同様の解析を行ったところ、父親由来のヒト3番染色体を保持するマウスA9雑種細胞では発現が見られなかった。これらのことから、当初の予想どうり母由来のアリルのみが発現する、ゲノム刷り込みを受けた新しい遺伝子が存在する可能性があり、その遺伝子がモヤモヤ病と関連している可能性が示唆された。今後はこれらの遺伝子断片からRACE法、あるいはcDNAライブラリーのスクリーニングなどにより全長を解析し、患者ではどのような遺伝子異常が原因になっているかを同定し、原因遺伝子を確定する。そしてゲノム刷り込みの状態を解析する。
ESR法を用いた培養肝細胞における胆汁酸の活性酸素ラジカル生成に関する研究

はじめにESRスペクトル解析の基礎的検討として,ステアリン酸スピンラベル剤(5-DSA, 12-DSA)を用いて,ラット肝ミクロゾームの脂質流動性(order parameter(S))に対する胆汁酸やethanol, taurine添加の影響を検討した.その結果,非抱合型胆汁酸ではSが増加し流動性が低下したが,閉塞性黄疸時に増加する抱合型胆汁酸ではSが減少して流動性が増加した.閉塞性黄疸に伴いミクロゾームの脂質流動性は低下することから,胆汁酸の組成変化は合目的的といえる. Ethanolは流動性を増加させたが,胆汁酸とは相加的に作用した.胆汁酸は生体膜の浅層(5-DSA)に, ethanolは深層(12-DSA)に主として影響した.Taurine単独では流動性は不変であるが, taurine投与はtaurine抱合型胆汁酸生成を介して流動性を増加させると考えられる.次いでラット培養肝細胞の表面膜(plasma membrane)にスピンラベル剤を取り込ませて,流動性と共にラジカル消去速度と細胞内抗酸化物含量の測定を行った.ラジカル消去は主に細胞内抗酸化物によってなされ,消去速度は抗酸化物含量の多少と温度に影響され流動性との関連も若干見られた.一方,肝細胞において活性酸素ラジカルの関与の明らかな実験系として,酸素(カルシウム)・パラドックスの検討を行い,これらで強調されたスーパーオキサイド(O_2^-)による障害は胆汁酸や四塩化炭素による肝障害発生にも普遍的に関与することを明らかにした.さらにO_2^-の生成が高酸素状態ならびにCa^<++>,膜障害の存在で促進されることから,活性酸素消去剤, Ca拮抗剤,膜安定化剤などが肝障害予防に有用であることを示した.ESRスピントラップに関しては, Fenton反応を利用した活性酸素ラジカル発生系ではDMPOやPBNでラジカルアダクトを検出し得たが,肝細胞を用いる実験系では感度的に不充分であり,なお検討を余地が残った.はじめにESRスペクトル解析の基礎的検討として,ステアリン酸スピンラベル剤(5-DSA, 12-DSA)を用いて,ラット肝ミクロゾームの脂質流動性(order parameter(S))に対する胆汁酸やethanol, taurine添加の影響を検討した.その結果,非抱合型胆汁酸ではSが増加し流動性が低下したが,閉塞性黄疸時に増加する抱合型胆汁酸ではSが減少して流動性が増加した.閉塞性黄疸に伴いミクロゾームの脂質流動性は低下することから,胆汁酸の組成変化は合目的的といえる. Ethanolは流動性を増加させたが,胆汁酸とは相加的に作用した.胆汁酸は生体膜の浅層(5-DSA)に, ethanolは深層(12-DSA)に主として影響した.Taurine単独では流動性は不変であるが, taurine投与はtaurine抱合型胆汁酸生成を介して流動性を増加させると考えられる.次いでラット培養肝細胞の表面膜(plasma membrane)にスピンラベル剤を取り込ませて,流動性と共にラジカル消去速度と細胞内抗酸化物含量の測定を行った.ラジカル消去は主に細胞内抗酸化物によってなされ,消去速度は抗酸化物含量の多少と温度に影響され流動性との関連も若干見られた.一方,肝細胞において活性酸素ラジカルの関与の明らかな実験系として,酸素(カルシウム)・パラドックスの検討を行い,これらで強調されたスーパーオキサイド(O_2^-)による障害は胆汁酸や四塩化炭素による肝障害発生にも普遍的に関与することを明らかにした.さらにO_2^-の生成が高酸素状態ならびにCa^<++>,膜障害の存在で促進されることから,活性酸素消去剤, Ca拮抗剤,膜安定化剤などが肝障害予防に有用であることを示した.ESRスピントラップに関しては, Fenton反応を利用した活性酸素ラジカル発生系ではDMPOやPBNでラジカルアダクトを検出し得たが,肝細胞を用いる実験系では感度的に不充分であり,なお検討を余地が残った.ESRのスペクトル解析の基礎的検討として、ステアリン酸スピンラベル(5-DSL)を用いて、胆汁酸が肝細胞小器官膜に及ぼす影響を検討し、胆管結紮(閉塞性黄疸)時の変化と比較した。実験系:正常および胆管結紮ラット肝からHogeboom法によりミクロソーム(Micro.)およびミトコンドリア(Mit.)分画を分離し、正常ラット肝より得たMicro.に対して5mMの各種胆汁酸を添加した。これらの試料に対し、5-DSAでスピンラベルしたのちESR装置を用いて測定し、得られたスペクトルよりorder parameter(S)を算出し膜脂質流動性を比較した。成績:胆管結紮ラットから得たMicro.およびMit.におけるSは、それぞれ0.634,0.642で正常肝における0.624,0.640よりも高値であり、閉塞性黄疸(胆管結紮)時には肝細胞小器官膜の脂質流動性が低下した。胆汁酸添加時のSは、無添加時の0.624に対し、CA0.631,DCA0.634,CDCA0.641,UDCA0.639,LCA0.637,TCA0.621,GCA0.617,β-MCA0.614であり、非抱合型胆汁酸では膜流動性が低下したが、抱合型CAやβ-MCA(ラット)では上昇する傾向があった。

したがって、閉塞性黄疸時には膜脂質流動性が低下するが、この時増加すると考えられる抱合型CAやβ-MCA添加時には流動性が上昇することにより考えて、閉塞性黄疸肝の膜脂質流動性の変化には胆汁酸以外の因子の関与が推測される。一方、培養肝細胞の調整は充分なviabilityが得られたが、長期の培養については厳重な清潔操作が必要であり、今後の検討が必要である。活性酸素ラジカルのtrapにつき、現在検討中である。
宿主消化管内におけるボツリヌス毒素の動態解明

ボツリヌス菌が産生するボツリヌス神経毒素(BoNT)は、重篤な食中毒である食餌性ボツリヌス症を引き起こす。BoNTは無毒タンパク質(NAPs)と複合体を形成し、NAPの機能によって宿主腸管から効率よく吸収される。本複合体はpH 7.0以上の緩衝液中でBoNTとNAPsに解離することから、弱アルカリ性である宿主腸管でも解離すると考えられてきた。本研究では、宿主腸管に存在する宿主由来因子が、弱アルカリ性環境下で本複合体の解離を阻害することを明らかにした。このことは、宿主腸管内でも本毒素複合体が解離しないことを示唆しており、本研究によってボツリヌス食中毒の発症機構における重要な知見が得られた。本研究では、宿主消化管内においてボツリヌス神経毒素複合体が毒素成分と無毒成分に解離するか否かについて解析を進めている。マウス小腸上部を結紮し、貯留した腸液を得た。このマウス腸液を含む弱アルカリ性緩衝液中(pH 7.0 - 7.8)では、ボツリヌス神経毒素複合体(B16S毒素)は毒素と無毒成分に解離せず複合体を維持していることを明らかにした。次いで、マウス腸液を種々の方法で分画し、解離阻害活性を示す画分から責任分子を同定した。同定分子を含まないマウス腸液では解離阻害活性が失われていることを確認した。さらに、トランスウェルを用いて培養・作製したCaco-2 monolayerに対するB16S毒素分子の結合・局在様式を、毒素成分と無毒成分それぞれに対する抗体を用いた蛍光免疫染色法によって共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。B16S毒素は無毒成分中に含まれるヘマグルチニンの糖鎖結合活性によってCaco-2細胞膜上に結合することが分かっている。頭頂側の培地がMEM培地(pH 7.4)単独の場合、Caco-2細胞膜上には無毒成分を示すシグナルしか観察されなかったことから、毒素成分は弱アルカリ性の培地中で解離していると考えられた。これに対し頭頂側MEM培地(pH 7.4)にマウス腸液、あるいは同定分子を添加した場合、Caco-2細胞膜上には毒素・無毒両成分のシグナルが観察され、細胞膜上に共局在している様子が観察された。このことからボツリヌス神経毒素複合体は、同定した解離阻害分子の存在下では弱アルカリ性環境中であっても毒素成分と無毒成分の結合が維持され、単一分子として挙動しうることが明らかとなった。本研究では、宿主消化管内においてボツリヌス神経毒素複合体(以下、複合体)が毒素成分と無毒成分に解離するか否かについて解析を進めている。平成27年度には、宿主腸管内において複合体が解離するか否かが毒素成分の活性に及ぼす影響について解析を行った。毒素成分が単独で存在する場合は宿主消化管内プロテアーゼの分解作用によって容易に失活するが、無毒成分との複合体として存在する場合は分解抵抗性を獲得し長時間にわたって活性を保持できることが知られている。弱アルカリ性緩衝液にエンドプロテアーゼを加えた人工腸液を調整し、複合体あるいは毒素成分のみを加え、37°Cで最長30分間インキュベートした。反応後の溶液を希釈してラットの腓腹筋に投与し、24時間後のラット後肢の複合筋活動電位を筋電計を用いて測定した。本神経毒素を未処理まま投与した場合、神経毒素の活性により弛緩性麻痺が惹起され、計測される活動電位は非常に微弱なものとなる。人工腸液で処理した複合体あるいは毒素成分を投与した各群ではvehicle投与群とほぼ同等の大きな活動電位が計測された。次いで、上記人工腸液に平成26年度までに同定した解離阻害因子を加えたものを調整して同様の実験を行ったところ、毒素成分のみの場合ではvehicleと同等の活動電位が計測されたが、複合体の場合で活動電位が有意に低下していた。この結果から本複合体は、弱アルカリ性環境下であっても解離阻害因子によって複合体形成を維持し、毒素成分がプロテアーゼの消化作用に対して抵抗性をもつことでその毒素活性を長時間保持したものと考えられた。他方、平成27年度中には複合体と解離阻害因子の相互作用についても解析を行った。核磁気共鳴を用いて解析をおこなったところ、複合体と解離阻害因子が弱く相互作用していることが確認された。研究代表者の所属変更に伴い、平成27年度の後半は研究を遂行することが困難であった。そのため、実験条件の細分化などが十分に行えていない。本研究課題に対する本来の助成期間は平成27年度までであったが、平成28年度までの期間延長を申請し、平成27年度に行えなかった実験を行う。ボツリヌス菌が産生するボツリヌス毒素(BoNT)は、重篤な食中毒である食餌性ボツリヌス症を引き起こす。BoNTは無毒タンパク質(NAP)と複合体を形成し、NAPはBoNTが宿主腸管から吸収されることを亢進する。本毒素複合体は、pH 7.0以上のアルカリ性緩衝液中におくと速やかにBoNTとNAPに解離することから、弱アルカリ性環境である宿主腸管では本複合体は解離すると考えられてきた。本研究では、これまでに、宿主腸管に存在する宿主因子が本毒素複合体の解離を阻害することを明らかにしてきた。

最終年度(平成28年度)には、前年度から引き続き、解離阻害因子の有無がエンドプロテアーゼ混合溶液(pH 7.8)中でのBoNTの毒性変化に及ぼす影響を、ラット腓腹筋における筋電位の変化を計測することで解析した。解離阻害因子非存在下では速やかに毒性が失われたのに対し、解離阻害因子存在下では少なくとも30分間に渡って毒性が維持された。また、本複合体をpH 6.0 7.8のリン酸緩衝液(-/+解離阻害因子)で処理したとき、その前後でどの程度の複合体分子が解離せずにいるかを、ELISA法によって定量的に解析した。本研究では研究期間全体を通して、宿主腸管に存在する宿主由来因子が、弱アルカリ性環境下におけるボツリヌス神経毒素複合体の解離を阻害することを明らかにした。このことは、宿主腸管内でも本毒素複合体が解離しないことを示唆しており、本研究によって食餌性ボツリヌス症の発症機構において重要な知見が得られた。ボツリヌス菌が産生するボツリヌス神経毒素(BoNT)は、重篤な食中毒である食餌性ボツリヌス症を引き起こす。BoNTは無毒タンパク質(NAPs)と複合体を形成し、NAPの機能によって宿主腸管から効率よく吸収される。本複合体はpH 7.0以上の緩衝液中でBoNTとNAPsに解離することから、弱アルカリ性である宿主腸管でも解離すると考えられてきた。本研究では、宿主腸管に存在する宿主由来因子が、弱アルカリ性環境下で本複合体の解離を阻害することを明らかにした。このことは、宿主腸管内でも本毒素複合体が解離しないことを示唆しており、本研究によってボツリヌス食中毒の発症機構における重要な知見が得られた。マウス腸液がボツリヌス神経毒素複合体の解離を阻害することを確認し、責任分子を同定した。同定分子とボツリヌス神経毒素複合体の相互作用をBiacoreを用いて検出しようと試みているが、相互作用のパラメータを明確に求めるための条件検討が難航しており、現在のところ良好な結果を得るには至っていない。申請時、平成26年度中に相互作用パラメータを求める計画としていたが、この点でやや遅れている。しかし、Biacoreによる解析と並行して、相互作用していることを確認するための代替法を講じており、こちらは良好な結果が得られていることから本研究は概ね順調に進展していると判断した。平成27年度後半に行う予定であった実験計画を進める。すなわち、宿主消化管内における神経毒素の毒素活性保持に関するシミュレート実験、および、核磁気共鳴による相互作用検出について、実験条件を細分化して追加実験を行う。細菌学平成26年度中の計画であった「ボツリヌス神経毒素複合体-解離阻害分子の相互作用パラメータ解析」を引き続き遂行する。Biacoreによる解析だけでなく、現在進行中の代替法による解析もさらに進展させ、いずれかの方法で相互作用について解析を進める。また平成27年度には申請時の計画のとおり、同定分子による解離阻害の分子メカニズム、および、宿主腸管内でボツリヌス神経毒素複合体が解離する場合としない場合の経口毒性の違いを解析する。研究代表者の所属変更がとなり、研究環境を移転させるため、平成27年度下半期に研究を遂行することが困難な期間が生じたため。実験計画の遂行にあたり販売会社の値引きキャンペーンなどを利用して物品を購入したところ、平成26年度末に次年度使用額が発生した。補助金をより有効に活用するべく、本金額は平成27年度に使用することとした。平成27年度内に計画していた研究を行うために使用する。平成27年度には大腸菌によるリコンビナントタンパク質を用いた実験を行う予定である。
糖鎖アレイを指向した、糖鎖－蛋白質相互作用の電気化学的検出法

様々な糖リンカーを合成しレクチンとの反応を表面プラズモン共鳴法と電気信号により追跡した。S/N比が高く、再現性が良い手法を確立すべく種々検討を行った結果、11-メルカプトウンデカン酸を金表面に導入した後、4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミンを導入、最後にラクトースまたはマルトースを導入することにより末端にβガラクトースとαグルコースを配置した新たな糖リンカーをデザインしたものが、電気測定(SWV測定)において顕著な差が認められた。これにより電気測定により糖鎖とタンパク質の結合を追跡可能な手法として確立した。現存する糖鎖アレイは天然から単離した糖鎖を基板上にスポットした物がほとんどであり、その検出法に関しては、標的蛋白質に蛍光ラベルするか、蛋白質を結合させた後、蛍光ラベルした抗体により検出する手法が主であり、検出に蛍光検出装置が必須である。近年、SPR(Surface Plasmon Resonance)や、QCM(Quarts Crystal Microbalance)により糖と蛋白質の結合を無蛍光で検出する研究が盛んに行われているが、より簡便な糖鎖アレイ用の無蛍光検出法として、本研究では糖鎖とその認識蛋白質との結合を電気化学的に検出する技術の確立を目指し、糖鎖アレイ検出技術の基礎を築くことを目的とする。金基板上で、糖がレクチン蛋白質に認識されるのをSPRと電気化学測定により追跡しようとするプロジェクトである。本年度からスタートしたプロジェクトであるため、まずは金基板上に結合させる糖の合成を行った。糖としてガラクトースを選択し、適切に保護されたガラクトースドナーを合成し、Fmoc-βAla-olと縮合させた。ここでは、β選択的に結合した。その後、塩基を用いすべての保護基を脱保護し、末端を1級アミノ基に変換した糖リンカーを合成した。金基板にリンカーとして2-アミノエタンチオール、トリエチレングリコールビス(クロロホルメート)を順に結合させた後、先ほどの糖リンカーを結合させた。これらの一連の反応はSPRで追跡可能であった。簡便な糖鎖アレイ用の無蛍光検出法として、本研究では糖鎖とその認識蛋白質との結合を電気化学的に検出する技術の確立を目指し、糖鎖アレイ検出技術の基礎を築くことを目的とする。本年度は昨年度作製したガラクトースにリンカーを結合させた化合物がガラクトース認識レクチンによって認識されるか検討を行った。残念ながら、これではレクチンにより末端のガラクトースが認識されない事がSPRにより判明した。そこで本年度は種々のリンカーを調製して検討を行った。トリエチレングリコールビス(クロロホルメート)の代わりに、ドデカンダイオニックアシルクロライドを導入したもの、2-アミノエタンチオールに直接ガラクトースユニットを導入したもの、さらに短くガラクトースユニットを直接金基板に結合させたもの等を合成しレクチンとの反応をSPRにより追跡した。しかし、いずれもうまく認識されなかった。そこで、リンカー同士疎水結合が期待できる11-メルカプトウンデカン酸をリンカーに用い、さらにPAMAMデンドリマーを結合させた後にガラクトースユニットとαグルコースユニットをそれぞれ基板の別の位置に導入したものを合成しレクチンアッセイに供した。SPRにて観察すると濃度依存的にガラクトース認識レクチンがガラクトース部位を、αグルコース認識レクチンがαグルコース部位を選択的に認識している事がわかり、見事金基板上の糖の違いをSPRにより観察する事に成功した。本年度は本プロジェクトの最終年度であり、今までの成果を踏まえより実用的な条件を検討した。昨年度はPNAレクチンが結合している所と結合していない所の電気測定(CV)において優位な差が認められたが、その差はごく僅かでありなかなか再現が得られないものであった。そこで、よりはっきりとして、再現性が良い手法を確立すべく種々検討を行った結果、11-mercaptoundecanoic acidを金表面に導入した後、4,7,10-trioxa-1,13-tridecandiamineを導入、最後にラクトースまたはマルトースを導入することにより末端にβガラクトースとαグルコースを配置した新たなリンカーをデザインし、レクチン(PNAとConA)においては、マレイイミドを介して酸化還元物質であるフェロセンを導入したものを新たに作製し、上記基板と反応させた所、電気測定において顕著な違いが観測された。

特に電気測定の一つであるSWV測定時におけるip値(A)は40倍の違いがあり電気測定により糖鎖とタンパク質の結合を追跡可能な手法を確立した。簡便な糖鎖アレイ用の無蛍光検出法として、本研究では糖鎖とその認識蛋白質との結合を電気化学的に検出する技術の確立を目指し、糖鎖アレイ検出技術の基礎を築くことを目的とする。金基板上で、糖がレクチン蛋白質に認識されるのをSPRと電気化学測定により追跡しようとするプロジェクトである。本年度はフェロセンをリンカーに適切な割合にて配合し電気化学的信号を捕らえる検討を行った。金基板上に適切な割合の11-メルカプトウンデカン酸と11-フェロセニル-1-ウンデカンチオールの混合物を流し、SPRを用いてリアルタイムに結合を観察すると共に電気を流した際のSPRの変化を観察した。SPRにより混合物が金基板上に結合したのを確認後、電気を流す事によりSPRシグナルの上昇が観測され表面状態の変化を捉える事に成功した。更に、11-メルカプトウンデカン酸の先端にPAMAMデンドリマーを結合させた後、ラクトース(ガラクトースβ1-4グルコース)とマルトース(グルコースα1-4グルコース)をそれぞれ基板上の別の位置に結合させる事により、末端にβガラクトースとαグルコースを配置した。昨年度はβガラクトースユニットとαグルコースユニットを別途有機合成したが本年度はラクトースとマルトースという二糖を用いて簡便にガラクトースとグルコースを導入することに成功した。βガラクトースを選択的に認識するタンパク質(PNAレクチン)を流したところ、SPRにより選択的にラクトースに結合している事が分かった。更にその際、電気測定(CV)した所、PNAが結合している所と結合していない所で優位な差が認められた。独自手法によりリンカーを開発し、そのリンカーを用いSPRにてレクチンの反応追跡に成功したため。25年度が最終年度であるため、記入しない。SPRを用いて、金基板上に糖を配置した信号を得ることに成功し、かつその糖に対して親和性のあるタンパク質が結合した信号も得ることに成功している。さらに電気化学的手法により糖に対して親和性のあるタンパク質が結合したものと、していないもの優位な差が認められたから。平成23年度で確立した手法を元に電気化学計測を行う。金基板上に11-メルカプトウンデカン酸、PAMAMデンドリマー、ガラクトースユニットまたはαグルコースユニットを順に結合させる。こうする事によりレクチンにより末端の糖が認識される事は昨年度明らかにしたが、本年度は電気化学測定を狙い11-メルカプトウンデカン酸を導入する際に、様々な割合にて末端にフェロセンが結合した11-フェロセニル-1-ウンデカンチオールを混ぜる。この混合比の違いによりレクチンが末端の糖と結合した際の酸化還元電位の違いを測定し、レクチンの結合を酸化還元電位をはかる事により確認できるか検討する。また、リンカーにフェロセンが結合した化合物も合成し、レクチンの結合を酸化還元電位の違いとしてとらえる事ができるか検討する。平成24年度までに確立した手法を元に電気化学計測を行う。
亜鉛に応答した遺伝子発現変化に対するエピジェネティック制御機構

亜鉛は必須微量元素で、生理的役割は多岐にわたる。その役割いくつかは遺伝子発現を介して発揮されていると予想され、遺伝子発現の調節には転写因子MTF-1が関与している。今までに我々は、メタロチオネイン-I(MT-I)遺伝子プロモーターの構造が亜鉛に応答して変化し、転写が促進されることを明らかにしてきた。本研究課題では、この構造変化はMTF-1支配遺伝子にほぼ共通であり、これに関わる因子はBrmとBrg1以外の因子であることを明らかにした。本研究課題では、亜鉛に応答した遺伝子発現について、エピジェネティックな制御機構の存在を明示するとともに、その機序を解明することを目的とした。エピジェネティックな影響を与える環境要因・条件を見出すため、エピジェネティックに定常的なメタロチオネイン-I (MT-I)遺伝子発現が抑制され、なおかつ、亜鉛によるMT-I誘導が認められないリンパ肉腫細胞株P1798細胞を用いた解析を行った。その結果、1月間の亜鉛処理ではMT-I誘導能を変化しなかったが、1週間のカドミウム処理がMT-I発現を増加する傾向が観察された。これは、環境要因によってMT発現がエピジェネティックな影響を受けてその発現が変化する可能性を示すものである。次に、亜鉛処理に応答して遺伝子プロモーターのクロマチン構造が変化するという現象が重金属応答性転写因子MTF-1によって発現制御を受けている遺伝子に共通の現象なのかを明らかにするための解析を行った。その結果、解析を行った遺伝子プロモーター全てで亜鉛に応答したクロマチン構造変化が観察され、本現象がMTF-1支配遺伝子に共通したものであることを示唆した。更に、この現象に関与する因子を明らかにするため、クロマチンリモデリングファクター、Brg1およびBrmのノックダウンを行い、mRNAレベルで20%以下に減少させたところ、MT-I遺伝子発現に影響は認められなかった。これら因子を欠失している細胞株SW13細胞に、これらを強制発現した解析においても、これらリモデリングファクターは亜鉛に応答した発現誘導には影響を与えないことが明らかとなった。以上の通り、本研究課題により亜鉛に応答して遺伝子プロモーターの構造が変化するという現象は、MTF-1支配遺伝子に共通であり、これに関わる因子はBrg1やBrm以外の因子であることを明らかにすることができた。本研究課題では、亜鉛に応答した遺伝子発現についてエピジェネティックな制御機構の存在を明示するとともに、その機序を解明することを目的としている。本年度は、(1)エピジェネティックな影響を与える環境要因・条件を見出すため、リンパ肉腫細胞株P1798細胞を用いた。本細胞は、メタロチオネイン-I (MT-I)遺伝子のプロモーター領域のクロマチン構造が密であるため、定常的なMT-I遺伝子発現が抑制されており、なおかつ、亜鉛によるMT-I誘導が認められないことが知られている。そこでまず、一過性にルシフェラーゼレポータープラスミドをP1798細胞に導入し、外来性のMT-Iプロモーターを介した発現について、定常的な発現および亜鉛による誘導が認められることを確認した。その後、1ヶ月間にわたって高濃度の亜鉛を含む培地で細胞を培養し、MT-I遺伝子発現量を調べた。しかしながら、内因性のMT-I遺伝子の発現量は、この培養により変化することはなかった。エピジェネティックな影響を与える環境要因・条件は、本研究課題を継続するにあたって必須の情報であるため次年度も条件の探索を継続する。次に、(2)MT-Iプロモーターのクロマチン構造変化に関与する因子を明らかにするため、クロマチンリモデリングファクターであるBRG1およびBRMを欠失している細胞株、SW13細胞を用い、これらファクターの強制発現がMT遺伝子発現に与える影響を検討した。その結果、これらリモデリングファクターを発現させることでMT発現量が増加することを明らかにした。次年度は、この時のMTプロモーター領域のクロマチン構造の解析を行い、リモデリングファクター発現とクロマチン構造との関係を明らかにする。エピジェネティックな影響を与える環境要因・条件は、本研究課題を継続するにあたって必須の情報であり、いまだに明らかにできていない点は問題ではある。しかしながら、クロマチン構造と転写速度に関する解析、クロマチン構造変化の持続性に関する解析、クロマチン構造変化に関与する因子に関する解析については、順調に成果が出つつあることから、全体としては、おおむね順調に進展していると判断している。SW13細胞を用いた解析により、BRG1およびBRMがMTF-1の関連する転写にかかわっていることを示唆するデータが得られていることから、SW13細胞でのクロマチン構造変化に関する解析を重点的に行う。また、今まではマウスMT-I遺伝子に焦点を当て、その解析を行ってきたが、今後は、他のMTF-1支配遺伝子(MT-II、ZnT1など)に関しても解析を行う。

MTF-1によるクロマチン構造変化機構について、これにかかわる因子を調べるために、siRNAを用いた包括的リモデリングファクターノックダウンと、MTF-1と亜鉛依存的に複合体を形成する因子の同定のため、2次元電気泳動・ゲル内消化およびLC-MS/MS解析によるタンパク質同定のために研究費の多くを使用する。また、研究成果を積極的に公表するため、英文校閲、学会参加にも研究費を使用する。