hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
うつ病の素因モデル動物を用いた、うつ病関連遺伝子の探索

我々はこれまで素因的にストレス脆弱性を有するうつ病動物モデルの開発と、その動物モデルを用いたうつ病の病因、病態の解明を目指して研究を続けている。その中で、視床下部-下垂体-副腎(HPA)系ネガティブフィードバック機能、c-fos発現反応をストレスに対する脳内適応反応の指標とし、純系ラットFisher 344ラットが生来的にストレス脆弱性を有することを確認した。更に、HPA系のストレス適応不全が抗うつ薬の慢性投与によって回避されることから、Fisher 344ラットのうつ病動物モデルとしての妥当性を確認した。そこで、本研究では、Fisher344ラットを用いた、うつ病関連遺伝子の探索を行うため、慢性ストレス負荷によりストレス不適応状態に陥ったFisher 344ラットと、適応状態にあるSprague-Dawley (SD)ラットの視床下部での遺伝子発現の比較を行った。その結果、Fisher 344ラットで特異的に発現が変化している約20種の遺伝子を同定した。その中でcytochrome c oxidase (subunit IV)とphosphorylase b kinase遺伝子に着目した。Cytochrome coxidase遺伝子はFisher 344ラット視床下部で発現が低下していたが、海馬では逆に発現が多く、大脳皮質では優位差がなく脳部位特異的に発現量に差があった。一方、Phosphorylase b kinase遺伝子については、Fisher 344ラットの視床下部、海馬、大脳皮質に共通して発現量が高かった。今後この種差や部位差とストレス適応不全との関連を検討していく。生来的にストレス脆弱性を有する純系のFisher344ラットは、我々のこれまでの検討から遺伝的素因を持つうつ病モデルとしての可能性が確認されている。本研究では、このFisher344ラットと雑種のSprague-Dawley(SD)ラットにおける脳内遺伝子発現を比較することにより、うつ病の遺伝的素因ならびに病態に関連する遺伝子を探索することを目的としている。本年度は予備的検討として、本来用いる予定のSAGE (Serial Analysis of Gene Expression)法の前に、DNAチップを用いたマイクロアレイ法によってFisher344ラットとSDラットの視床下部における遺伝子発現の比較を行った。動物には毎日2時間(9a.m.-11a.m.)の拘束ストレスを14日間負荷し、ストレス14日目の午後14時(ストレス開始5時間後)に断頭し、取り出した脳より速やかに視床下部を摘出した。3800種類の遺伝子について解析した結果、発現差のみられた遺伝子にはエネルギー代謝に関連するグルコーストランスポーターやチトクロームオキシダーゼ遺伝子、視床下郎-下垂体-副腎(HPA)系に関連するバソプレシンV2受容体遺伝子、神経情報伝達系に関連するCAMK1、MAPキナーゼ1、IGF-BP3遺伝子、神経可塑性に関連するインテグリンペータ4,カイニン酸容体遺伝子など様々な興味深い遺伝子が抽出された。これらの候補遺伝子をより詳細に検討するため、SAGE法を用い例数を増やして遺伝子探索を行う準備として、Fisher344ならびにSDラットの視床下部より抽出したmRNAからcDNAライブラリーを作製し、それらをペアて混合してSAGEライブラリーを作製した。我々はこれまで素因的にストレス脆弱性を有するうつ病動物モデルの開発とその動物モデルを用いたうつ病の病因、病態の解明を目指して研究を続けている。その中で、視床下部-下垂体-副腎(HPA)系ネガティブフィードバック機能、c-fos発現反応をストレスに対する脳内適応反応の指標とし、純系ラットFisher344ラットが生来的にストレス脆弱性を有することを確認した。更に、HPA系のストレス適応不全が抗うつ薬の慢性投与によって回避されることから、Fisher344ラットのうつ病動物モデルとしての妥当性が確認した。

そこで、本研究では、Fisher344ラットを用いた、うつ病関連遺伝子の探索を行うため、慢性ストレス負荷によりストレス不適応状態に陥ったFisher344ラットと、適応状態にあるSprague-Dawley(SD)ラットの視床下部での遺伝子発現の比較を行った。その結果、Fisher344ラットで特異的に発現が変化している約20種の遺伝子を同定した。その中でcytochrome c oxidase(COX)(subunit IV)とphosphorylase b kinase遺伝子に着目した。Cytochrome coxidase(COX)遺伝子はFisher344ラットで特異的に発現が低下しており、この低下は海馬でも確認された。一方、phosphorylase b kinase遺伝子については、Fisher344ラットの視床下部で発現量が高かったが、海馬ではSDラットと有意差がなく、脳部位特異的な発現差のあることが判った。Cytochrome coxidase(COX)及びphosphorylaseb kinase遺伝子共にストレス脆弱性、神経可塑性、ひいてはうつ病への関連が示唆されている。今後は脳内ストレス適応機構への関与の解明を目指し以下の事項について検討を行う予定である。1)ストレス不適応状態にあるFisher344ラット脳内での、2遺伝子の発現状態をin situhybridization法により精細な脳部位発現量の検討。2)ストレスと平行した抗うつ薬慢性投与による、Fisher344ラット脳内の2遺伝子の発現状態の変化の検討。3)1)により明らかにされるストレス不適応状態で2遺伝子の発現が抑制される脳部位において、SDラットを用いてアンチセンス法により2遺伝子の発現を阻害した場合のストレス適応反応障害の検討。
中国医学の身体観がモンペリエ学派の生気論的生命観の成立に果たした役割の研究

初年度は7月の国際科学史学会で、「モンペリエ学派における生気論的生物観の形成と中国医学(フランス語)」という題目で報告し、その報告がArchives Internationalesd'Histoire des Sciencesの最新号に掲載された。そこでは、1)中国医学(漢方を含む)のヨーロッパへの導入には二ルートがあり、中国医学は共通して西洋医学に器官の共感という問いを提起していたこと、2)中国医学の身体観の生気論的生理的機序(エコノミー・アニマル)観への同化が、被刺激性という問題系をめぐる論争を通じてのみでなく、脈学の生理学的「革命」を通じても実現されたこと、3)機械論に打ち勝つための身体観をメニュレが中国医学のうちに見出したこと、4)メニュレが中国医学の生理的機序観を同化して生気論の生理学的地平を拡大したことを明らかにした。第二年度はモンペリエ学派の脈学が生気論の成立の場として機能したことを明らかにした。論文Lasphygmologie montpellieraine : leroleoublie dupouls dansl'emergence du vitalisme montpellierainによって、18世紀における中国医学と西洋医学との交流、モンペリエ学派の脈学の展開、生気論の成立という、相互に独立に研究されてきた対象について、始めて本格的に解明のメスを入れることができた。その結果、1)モンペリエ生気論が初期には未だアニミズムから自由でなかったが、関係的生理的機序観によってそれを乗り越えたこと、2)この関係的見方は、モンペリエ学派の脈学を狭い予診論的枠組みから広い生理学的地平へと転回させ、身体の表層と内部を結ぶ生理的機序の連関のうちに脈を位置づけ直すのに成功したこと、3)とりわけ、メニュレが中国医学の関係的見方を導入したことを通じてその転回は果たされ、身体全部分の競合・共鳴から生命が成立するという新たな生気論的見方に変わったことを、明らかにできた。7月に北京で開催された国際科学史学会のシンポジウム:International Networks, Exchange and Circulation of Knowledge in Life Sciences,18^<th> to 20^<th> Centuriesで、「モンペリエ学派における生気論的生物観の形成と中国医学」という題目の報告(フランス語)を予定通り行った。そこで、(1)中国医学受容に当たって二つのルート----中国ルート(脈診中心)と日本ルート(鍼灸中心)----があったこと、(2)それらが18世紀半ばまで別々に受容されていたが、『百科全書』において両者を総合する方向性が始めてとられたこと、(3)メニュレの長大な項目「脈」が中国脈学とそれが依拠する身体観の解説に全体の2割を越える分量を割いていること、(4)1760年前後に執筆されたと思われるメニュレの『百科全書』項目群を通じて、ラ・カーズやボルドゥにおいてはまだ曖昧だった生気論特有の有機的全体論的身体観が確立されていったこと、(5)その際に中国脈学の全体論的身体観が、当時主流だった機械論的身体観を批判して、アニミズム、ハラーの被刺激性と構造機能的身体観、淡水ポリプの再生現象などとともに、生気論的身体観成立に寄与したことを発表した。その際に、中国やヨーロッパの多くの研究者と情報交換を行うことができた。このシンポジウムの報告集の出版が、Archives Internationales d'Histoire des Sciencesの特集号として予定されており、現在そのための論文執筆中である。

その過程で、メニュレのみならず、ボルドゥ、ミシェル、フーケなどモンペリエ学派の脈論を読み、脈学への関心が初期モンペリエ生気論に一貫して存在したこと、その背後には、脈を単に心臓ポンプの活動の受動的結果としてではなく、身体諸器官の有り様全体を示すしるしとして症候論的に読み取ろうとする姿勢と全体論的身体観があることが解明できた。今年度は予定通り、モンペリエ学派の脈学が生気論の成立の場として機能したことを明らかにした。論文(La sphygmologie montpellieraine : leroleoublie dupouls dansl'emergence du vitalisme montpellierain、Muriel Brot編になるJacques Proust追悼論文集に掲載予定)によって、18世紀における中国医学と西洋医学との交流、モンペリエ学派の脈学の展開、生気論の成立という、相互に独立に研究されてきた対象について、始めて本格的に解明のメスを入れることができた。中国脈学の影響を扱った2006年の論文では生気論的脈学の展開を十分跡付けることができなかったが、今回の論文では、1)モンペリエ生気論が初期には「トン」概念によって未だアニミズムから自由でなかったが、関係的生理的機序観によってそうした霊魂の力を想起させるものを置き換えるに到ったこと、2)この関係的見方は、モンペリエ学派の脈学を、脈-分利という狭い予診論的枠組みから広い生理学的地平へと転回させたこと、言い換えれば、脈学の文脈で生気論を繰り広げ、身体の表層と内部を結ぶ身体諸部分の生理的機i序の連関のうちに脈を位置づけ直すのに成功したこと、3)とりわけ、メニュレが中国医学の関係的見方を導入し、それをさまざまな隠喩によって示すことによってその転回は果たされ、監視する主体が排除され、身体全部分の競合・共鳴から生命が成立するという新たな生気論的見方に変わったことを、明らかにできた。この研究に当たっては、中国脈学と西洋脈学の展開を追ったMari口の大部の博士論文(2003年提出、未公刊)や、ReyやBouryのモンペリエ生気論についての研究を参照し、それらの研究の不十分な点を補うことができた。研究は、昨年度本科研費で購入した図書ならびにフランスで収集した資料によって主として進めた。広い視野からの研究を進めるべく、今年度も野沢協先生主催のフランス自由思想研究会に参加し、貴重な研究上のアドバイスを得た。
機能性材料の創製を目指したカーボンナノチューブ表面の有機化学的修飾

昨年度明らかにすることができた、カーボンナノチューブ表面への有機チッ素化合物の付加反応による表面の改質反応を発展させる研究を行った。単壁カーボンナノチューブとフェニルヒドラジン誘導体との反応は、界面活性剤存在下に溶液中に分散(一部可溶化)させた状態で再現生良く進行することを見出した。さらに、フェニルヒドラジン上の置換基の電子供与性が大きいほど反応効率が高くなることが判明した。得られた表面改質カーボンナノチューブには、炭素原子250個当り最大1個のフェニルヒドラジンが結合しており、通常の有機溶媒に可溶である。さらに付加反応は可逆的で、生成物を熱することにより脱離反応が進行し、カーボンナノチューブに戻ることも明らかにした。以上の結果を総合し、以下に示す二つの成果を得ることができた。1)フェニルヒドラジンはカーボンナノチューブに対して特異的な付加反応剤として働くことが強く示唆された。2)カーボンナノチューブを付加生成物として有機溶媒に溶解、溶液をスピンコート法やインクジェット法で薄膜やパターン印刷を行い、その後熱して再生させることによりことによりカーボンナノチューブの複雑な加工が可能になる。1)の成果はフラーレンの改質にも応用可能で、フェニルヒドラジンによるフラーレンジケトン誘導体への付加・環拡大反応を用いる大口径開口フラーレン誘導体の合成に成功した。得られた開口フラーレン誘導体は、小分子をフラーレン内部空間に内包させるのに適した物質であり、大員環サイズを1519へと変化させることによって水素分子から水分子と大きさの異なる分子内包フラーレンを合成することに成功した。特に、水分子内包フラーレンの合成は世界で初めての極性分子内包例であると共に極限サイズの成功例でもある。今年度の主テーマとして、カーボンナノチューブのモデルとしてフラーレンを用いた有機化学反応を利用して、カーボンナノチューブ表面に炭素-炭素結合や炭素-ヘテロ原子結合を形成させ共有結合を介した有機化学的修飾法を施すための反応剤の開拓を行った。さらにここで得られた知見を基に、市販単壁型カーボンナノチューブを基質に用いて、フラーレンに対し付加反応生成物を与えることが分かったアニリン,オルトフェニレンジアミン,パラジウムメタラサイクル錯体等の反応剤との熱および光反応を研究した。現在、市販単壁型カーボンナノチューブはメーカーやロットによって純度,結晶性・非結晶性構造特性,不純物の組成などにばらつきが大きく、再現性のある結果を得るためにカーボンナノチューブを実験室で精製する方法についても研究している。さらに、カーボンナノチューブはトルエンなどの有機溶媒に不溶であるため、これを有機溶媒に効率よく分散させる方法についても検討した。フラーレンとのモデル実験から得られた知見の一部は論文として発表済みである。カーボンナノチューブとの反応生成物の構造については、赤外吸収スペクトル,ラマンスペクトル,示差熱分析,元素分析などの手法を通じて、反応剤の導入効率やカーボンナノチューブに見られる結晶性・非結晶性構造部位などのどの部位に反応が起こっているかなどを解析している。このようなカーボンナノチューブとの反応についての結果はまだ発表の段階には至っていないが、有機化学反応は非結晶性構造部位に起こり易いのではないかという知見を得ている。昨年度の成果に基づき、カーボンナノチューブのモデルとしてフラーレンを用いた有機化学反応を利用して、カーボンナノチューブ表面にヘテロ原子を結合させ共有結合を介した有機化学的修飾を施すための反応を行った。さらにここで得られた知見を基に、市販単壁型カーボンナノチューブを基質に用いて、フラーレンに対し付加反応生成物を与えることが分かったアニリン,オルトフェニレンジアミン,フェニルヒドラジン等との反応を研究した。一方、純度,結晶性・非結晶性構造特性,不純物の組成などに違いが大きい市販単壁型カーボンナノチューブを用いて、再現性ある結果を得るための方法についても研究した。

その結果、SDSのような界面活性剤を共存させることによりカーボンナノチューブの水系溶媒中への溶解性・分散性が向上することを利用すると、再現生良くフェニルヒドラジン類の付加反応が進行することを見出した。生成物は、ラマンスペクトル,赤外吸収スペクトル,元素分析などの手法を用いて、従来例のほとんど無かったカーボンナノチューブの側壁面で炭素-チッ素結合を介して有機化学的修飾された構造であることを明らかにした。このようにして得られた表面修飾カーボンナノチューブは、電子顕微鏡観察により束状構造がかなり解けた単一フィラメント構造が見つかっており、その結果極性有機溶媒に可溶となった。これらの結果については、日本化学会84春季年会(西宮市)にて発表する予定である。一方、フラーレンとのモデル実験から得られた知見の一部は論文として発表済みである。昨年度明らかにすることができた、カーボンナノチューブ表面への有機チッ素化合物の付加反応による表面の改質反応を発展させる研究を行った。単壁カーボンナノチューブとフェニルヒドラジン誘導体との反応は、界面活性剤存在下に溶液中に分散(一部可溶化)させた状態で再現生良く進行することを見出した。さらに、フェニルヒドラジン上の置換基の電子供与性が大きいほど反応効率が高くなることが判明した。得られた表面改質カーボンナノチューブには、炭素原子250個当り最大1個のフェニルヒドラジンが結合しており、通常の有機溶媒に可溶である。さらに付加反応は可逆的で、生成物を熱することにより脱離反応が進行し、カーボンナノチューブに戻ることも明らかにした。以上の結果を総合し、以下に示す二つの成果を得ることができた。1)フェニルヒドラジンはカーボンナノチューブに対して特異的な付加反応剤として働くことが強く示唆された。2)カーボンナノチューブを付加生成物として有機溶媒に溶解、溶液をスピンコート法やインクジェット法で薄膜やパターン印刷を行い、その後熱して再生させることによりカーボンナノチューブの複雑な加工が可能になる。1)の成果はフラーレンの改質にも応用可能で、フェニルヒドラジンによるフラーレンジケトン誘導体への付加・環拡大反応を用いる大口径開口フラーレン誘導体の合成に成功した。得られた開口フラーレン誘導体は、小分子をフラーレン内部空間に内包させるのに適した物質であり、大員環サイズを1519へと変化させることによって水素分子から水分子と大きさの異なる分子内包フラーレンを合成することに成功した。特に、水分子内包フラーレンの合成は世界で初めての極性分子内包例であると共に極限サイズの成功例でもある。
19世紀フランス文学における身体、感覚、病理の表象

最終年度の本年は、19世紀末のデカダン文学における身体と病理の問題を、同時代の精神医学や性科学との関連で考察した。年度前半では、とくに女性作家とセクシュアリティの問題、そして自然主義作家における身体表象を考察した。それを通じて、ブルジョワジーの娘に課される〈女らしさ〉の規範や、「感応遺伝」という医学的概念が女性の運命を規定していることを明らかにした。女性作家については、日本仏文学会春季大会のワークショップ「女性作家と文学場のジェンダー」(獨協大学、2018年6月3日)で発表し、後者については紀要論文「若い娘たちの表象ー魂から身体へ」を執筆した。またアラン・コルバン『処女崇拝の系譜』(共訳)の「訳者あとがき」のなかで、本研究の成果を反映させつつ、文学における女性表象の系譜について論じた。年度後半では、ゾラに関する国際シンポジウム(京都工藝繊維大学、2018年12月2日)、および「リアリズム文学研究会」(京都外国語大学、2019年1月26日)に出席して質疑応答に参加し、新たな知見を広げることができた。3年間にわたった本研究の総括として、研究者は単著『逸脱の文化史ー近代の〈女らしさ〉と〈男らしさ〉』(慶應義塾大学出版会、2019年3月)を刊行した。本研究の目的は、19世紀後半20世紀初頭の文学を対象にして、文学が身体、感覚、病をめぐってどのような表象を提示しているかを探究することだった。とりわけ自然主義小説が身体の病理だけでなく、精神の病理(神経症、ヒステリー、性倒錯など)の表現に新たな次元をもたらしことを示すことにあった。『逸脱の文化史』はゾラ、ゴンクール、ユイスマンスなどの自然主義作家、そしてラシルド、ミルボーなど世紀末デカダン作家の作品を取りあげ、感応遺伝、性倒錯、フェティシズムなどのテーマを病理の表象として読み解くことで、わが国の文学研究に新境地を拓いた。本年度は第一段階として、19世紀後半を代表する作家エミール・ゾラの作品における身体と病理の表象について、文献調査と考察を進めた。まずゾラの最新の全集版、彼の主著『ルーゴン=マッカール叢書』の準備ノートの校訂版、いくつかの作品の新しい批評校訂版を購入し、草稿研究の知見を踏まえつつそれらの文献を精読することで、とくに叢書第1巻『ルーゴン家の繁栄』を詳細に分析することができた。その成果は、「ゾラ『ルーゴン=マッカール叢書』の起源」(慶應義塾大学『日吉紀要』第64号)に発表した。文献調査のため、夏期休暇と春期休暇を利用して渡仏し、パリの国立図書館で19世紀後半の医学事典や医学書を参照し、ゾラ文学に見られる身体表象や精神病理との共鳴関係を探った。さらにジェルマンやエフィールが書いた、ヒステリー症の男女が登場する作品を精読して、19世紀末におけるヒステリー表象の構築について考察を深めた。これらの作家は今日まったく読まれないが、申請者の今後の研究において、特に19世紀末のデカダン文学における精神病理の問題を考察する際に重要な要素となるものである。これらの研究、および以前からのゾラ研究の蓄積を踏まえて、申請者は2017年夏にゾラに関する単行本を刊行する予定である。そこでは『ルーゴン=マッカール叢書』全体における民衆と身体の関わり、叢書の成立と歴史へのまなざしを分析する諸章において、本研究の成果を十分取り入れることになる。また申請者は、2015年6月にパリで開催された「自然主義文学の遺産」をめぐる国際シンポジウムで口頭発表しており、その原稿が2016年10月に出版されたNaturalisme--Vous avez dit naturalismes ?に収められている。新しいゾラの全集版、『ルーゴン=マッカール叢書』の準備ノートの校訂版、いくつかの重要作品の批評校訂版などが入手できたこと、大学の長期休暇を活用して2度渡仏する機会を得て、パリの国立図書館や高等師範学校で文献講読と資料調査に従事できたことで、本研究課題はほぼ予定どおりに進捗したと言える。また2017年3月には、パリ第3大学で開催された「ゾラ・セミナー」に出席し、発表聴取と意見交換をつうじて、ゾラ研究に関する最新の知見を深めることができたのは有益であった。特に現在、ゾラと自然主義文学研究を牽引する立場にあるアラン・パジェス氏(パリ第3大学名誉教授)、オリヴィエ・ランブローゾ氏(パリ第3大学教授)らと意見交換できたのは、貴重な機会であった。とりわけ準備ノートの校訂版を精査することによって、『ルーゴン=マッカール叢書』の構想と成立の過程において、ゾラが同時代の精神病理学の知に強い関心をいだき、それをみずからの作品に取り込もうとしていたことが明らかになったのは、大きな収穫だった。もちろん、ゾラ文学における身体と病理の位相のすべてを解明できたわけではない。今後他の作家を詳しく読解し、ゾラ文学とつき合わせることで、ゾラ文学における身体と病理の複雑な次元がよりいっそう明確になるだろう。なお申請者は、アラン・コルバンほか監修になる『男らしさの歴史』(全3巻)の第2巻を監訳する機会を得た。これは19世紀フランスにおいて、男性の身体と精神が、「男らしさ」という価値をめざしてどのように訓練され、形成されていったかを辿った大著である。この翻訳作業は、申請者が自然主義文学における身体のテーマを考察する際しておおいに役立ったことを付記しておきたい。

2年目の本年度は、エミール・ゾラの作品における身体と病理の問題を、同時代の生理学や精神医学との関連において考察した。彼の主著『ルーゴン=マッカール叢書』の準備ノートの批評校訂版の第7巻が刊行され、申請者の研究にとって大いに有益だった。昨年度からの研究成果も採り入れて、2017年7月には『ゾラと近代フランスー歴史から物語へ』(白水社)を刊行した。また、2017年11月にフランスで刊行されたDictionnaire des naturalismes(『自然主義事典』)にも寄稿し、国際的なプロジェクトの一翼をになった。いずれも本科研費による研究成果を示すものである。また本年は、ゴンクール兄弟、ユイスマンスなどゾラと同時代の他の作家に軸足を移して研究・調査を進めた。どちらの作家も、近年の研究の蓄積を踏まえて新たな校訂版が出ているので、それらを購入し、精読することで考察を深めた。それによって、ゴンクール兄弟のいくつかの小説においては、同時代の医学的な知がゾラの作品以上に深く取りこまれていることが分かってきた。彼らの文学は一般にリアリズム(レアリスム)文学と呼ばれるが、民衆や、身体と病理のテーマをリアリズム文学全体の中に位置づけることで、研究を進展させることができた。その成果を公開研究会「19世紀文学とリアリズム」(2018年2月3日、京都大学)で発表し、その後まとめられた報告書に寄せた原稿にまとめる機会を得た。2018年3月9日は、朝日カルチャーセンター(新宿)において、「ゾラー近代を突き抜けた作家」というタイトルで講座を担当して、これまでの研究成果を一般市民に向けて公表することができた。2018年3月には、フランス国立図書館で文献調査を行ない、主として19世紀末の女性の身体表象をめぐる資料を参照した。『ルーゴン=マッカール叢書』の準備ノート批評校訂版の続巻、ゾラの作品の新たな批評校訂版、さらにゴンクール兄弟やユイスマンスの作品の新たな校訂版が次々に上梓されたので、それらを入手した。また大学の春期休暇を利用して渡仏し、パリ国立図書館で文献調査にあたり、19世紀のまなざしに関するシンポジウムに参加して、研究テーマに関する貴重な知見を得ることで、本研究課題はほぼ順調に進捗したと言える。とりわけ、ゴンクール兄弟の小説のすぐれた批評校訂版が二種類刊行されていることで、彼らの文学における精神医学やヒステリーの位相に新たな光があてられつつあるという印象を抱いている。2018年3月には、パリ第三大学で開催されたゾラ・セミナーに参加し、発表聴取と質疑応答をとおして、自然主義研究に関する最新の知見と、リアリズム作家に関連する今後の著作の刊行予定を知ることができた。またその場でアラン・パジェス氏(パリ第三大学名誉教授)、ピエール・デュフィエフ氏(パリ第十大学名誉教授)ら、現在自然主義研究を先導する研究者と意見交換する機会が持てたのは有益だった。最終年度の本年は、19世紀末のデカダン文学における身体と病理の問題を、同時代の精神医学や性科学との関連で考察した。年度前半では、とくに女性作家とセクシュアリティの問題、そして自然主義作家における身体表象を考察した。それを通じて、ブルジョワジーの娘に課される〈女らしさ〉の規範や、「感応遺伝」という医学的概念が女性の運命を規定していることを明らかにした。女性作家については、日本仏文学会春季大会のワークショップ
追記型・文字粒度の追跡子による，ソフトウェア追跡性の高精度な確保

ソフトウェア保守コストを下げるために,ソフトウェア追跡性を高めることが重要である.本研究では「追記式・文字粒度の追跡子」を用いた新しい手法を提案実装し,ソフトウェア追跡性を高めることを試みた.成果として,Unicode第14面を用いた追跡子の実装,ハッシュ値を用いたソースコードとドキュメントの一貫性保持方式の実装,厳格なアンサーセットで構成する追跡性リンクの事例集の作成を行った.また,追跡子の派生技術として,教育用コンパイラの研究などの成果も得た.ソフトウェア保守コストを下げるために,ソフトウェア追跡性を高めることが重要である.本研究では「追記式・文字粒度の追跡子」を用いた新しい手法を提案実装し,ソフトウェア追跡性を高めることを試みた.成果として,Unicode第14面を用いた追跡子の実装,ハッシュ値を用いたソースコードとドキュメントの一貫性保持方式の実装,厳格なアンサーセットで構成する追跡性リンクの事例集の作成を行った.また,追跡子の派生技術として,教育用コンパイラの研究などの成果も得た.・より詳細な既存技術・既存研究の調査・サーベイ(平成21年4月9月)これまでの調査では「追記型・文字粒度の追跡子」に類する研究は無った.しかし,ここ数年,追跡性に関する研究は活発であり,継続的な調査・サーベイが不可欠である.(知覚困難型)電子透かし,ステガノグラフィー,暗号の署名技術,(他分野の)追跡子などの既存研究について,広範囲に渡って調査を行った.また,エディタ,Webブラウザ,統合開発環境(IDE)などでの文字エンコーディングの処理方法なども,より詳細に調査を行った.この調査・サーベイは次年度以降に実装する「ソフトウェア追跡性の高精度に確保するシステム「をより適切に開発するために重要な基礎となる.・「追記型・文字粒度の追跡子」のための文字エンコーディング方式の検討・設計(平成21年9月22年3月)案1:文字符号化方式の標準であるISO/IEC 2022(いわゆるISO-2022)として,「追記型・文字粒度の追跡子」のための文字エンコーディング方式を定義可能かを検討する.案2:Emacsの文字属性機能等,アプリケーションレベルでの「追記型・文字粒度の追跡子」の実現方法を検討する.という2つの案を検討したが,当初の予定通り,案1を採用する方向で設計等を行った.これはエディタやWebブラウザに「追記型・文字粒度の追跡子」を対応させる際に,文字エンコーディングを追加させるだけで済むためである.この設計は「ソフトウェア追跡性の高精度に確保するシステム」の中核となる部分であり,後付けによる推論ではなく,細粒度で高精度に追跡性を確保することで,ソフトウェア保守性の向上を図るという大きな意義がある.・「追記型・文字粒度の追跡子」のための文字エンコーディング方式のプロトタイプ試作平成21年度は文字符号化方式の標準であるISO/IEC 2022(いわゆるISO-2022)を用いて,「追記型・文字粒度の追跡子」のための文字エンコーディング方式の検討・設計を行った.平成22年度はこの実装方法とは異なり,Unicodeを用いたアプリケーションレベルでの「追記型・文字粒度の追跡子」の実現方法を検討し,プロトタイプを試作した.これは「追記型・文字粒度の追跡子」の実現方法自体が複数あり,どの実現方法がソフトウェア工学的に良い性質を持つかが自明ではなく,プロトタイプ試作によって比較検討する必要があるためである.具体的にはUnicodeの第14面に配置されている言語タグ(RFC2482, RFC6082)を文脈性を廃止した形で追跡子として利用することにした.エディタなどのアプリケーションレベルでの実装となるが,Unicode文字単位で追跡子か否かが判定可能な点で実装が容易であること,Unicodeという同一のエンコーディングで複数言語を自然にサポートできるという大きな利点がある.ただし,簡単のため,ASCIIコードをU+E0000U+E00FFにマップして追跡子とすることにしたため,追跡子内で使用できるのはASCIIコードのみとなる.以上の方式で,Java Swing上に「追記型・文字粒度の追跡子」の機能を含んだ簡易エディタを試作した.これには,細粒度で高精度に追跡性を確保し,ソフトウェアの保守性を大幅に向上させるという最終目的に対して,重要な基盤となる成果である.・ハッシュ値を用いた,ソースコードとドキュメント間リンクの矛盾検知方式のプロトタイプ試作平成23年度は「追記型・文字粒度の追跡子」の使用を前提として使用する,ハッシュ値を用いたソースコードとドキュメントー貫性保持方式の実現方法を検討し,プロトタイプを試作した.「追記型・文字粒度の追跡子」では通常の状態ではプログラマの目には見えない,隠れたテキストとして働くが,この隠れたテキストとして何を埋め込むべきかは自明ではない.ここでは外部のソフトウェアオブジェクトへの追跡性リンクが矛盾した状態(obsolete)になる問題を解決する方式として,ハッシュ値を用いる方式を提案している.具体的にはメソッドのボディ部分のテキストを対象としてハッシュ値を計算し,そのハッシュ値を見えない追跡子として埋め込む.リンク先のドキュメントなどが参照先として適切かどうかを確認せずに(つまりリンクを確認あるいは更新せずに)メソッドを書き換えると,メソッドのハッシュ値と追跡子中のハッシュ値が矛盾するため,ツールによる自動的な警告が可能となる.この方式を,Java言語を対象として,Eclipseのプラグインとしてプロトタイプ実装した.実装の容易さのため,追跡子としては埋め込まず,Javadocの@seeタグが表現するリンクに対して,@hashcodeタグ部分にハッシュ値を表現する方式をとった.

これにより,コンパクトに実装できることや,ツールによる自動警告が可能であることを確認できた.・リンクの追跡,矛盾検知に関する研究「追記型・文字粒度の追跡子」のリンク追跡・矛盾検知に関する研究成果として,「誤解放を防ぐための新しい型修飾子stricLlifetime」「競合回避機構を備えた高互換かつ高精度な境界検査手法」の研究成果もあげた.本年度は研究全体を取りまとめた.本研究の目的は,追記型・文字粒度の追跡子データを用いて,ソフトウェア追跡性の高精度な確保をすることであった.研究のポイントは次の4つであった:・特別な文字エンコーディング方式を開発してplaintext中の各文字に追跡情報を埋め込み可能にする,・追跡子情報としては,識別番号,URL,作成者氏名などを追記方式で書き込む.削除や修正は不可,・追跡子情報は,通常は不可視にする.これにより可読性が落ちる問題を回避する,・追跡子情報は,最初だけユーザが手動で入力する.文字を修正しても追跡情報が残るので,変更・派生時に大部分の手動の保守が不要になる.このような追跡子として,本研究では様々な方法を比較検討した結果,Unicodeの第14面の言語タグの使用が追跡子として最も適切であるという結論に達した.既存の文字エンコーディング方式を利用しつつ,他の目的に使われないことが事実上保証されていること,グリフが割り当てられてないため,多くの実装で自然に不可視な文字となることがその主な理由である.また,この方式の有用性を確認するために「追記型・文字粒度の追跡子」の実装をEmacsのマイナーモードとして昨年度,実装した.今年度はこれらの成果を統括し,プログラムのハッシュ値を追跡子の値とする手法を考案した.解析的手法では人間の意図は解析できないため精度が悪いが,本手法のハッシュ値では1文字でも異なれば事実上確実に異なるハッシュ値となり高精度化が可能である.また,コピー&ペーストに付随したリンク自動挿入が可能なため,ハッシュ値の追跡子は挿入・保守のコストも安い.また本年度は本研究の「追記型・文字粒度の追跡子」のリンク追跡・矛盾検知に関する研究成果として,「整数オーバーフローの未定義動作検出に対する整数境界値の定量的評価」の研究成果もあげた.「追記型・文字粒度の追跡子」の実装をEmacsのマイナーモードとして実装した.平成23年度までにUnicodeの第14面の言語タグを用いたプロトタイプ実装を行い,平成24年度にEclipseプラグインとして洗練・統合する予定だったが,実装上の困難さがあったため,Emacs上で動作するマイナーモードとして再実装を行った.この実装は言語タグ文字の入力,可視化・不可視化の制御なども可能となっており,実装規模はEmacs Lispで約300行程度とコンパクトに実装できることを確認した.また,追跡性リンクの有用性を示すための事例集として,厳格なアンサーセットで構成する追跡性リンクの事例集作成を行った.
プリオン蛋白欠損マウスで認められる加齢に伴う神経細胞変性死の分子機構解明

我々が作製したプリオン蛋白(PrP)欠損マウスではプルキンエ細胞の変性脱落死が認められたが、他の研究室で作製されたPrP欠損マウスにはこのような異常は認められなかった。最近我々は、PrPと高い類似性を持つPrP類似蛋白(PrPLP)をコードする新規遺伝子を同定し、この遺伝子がプルキンエ細胞死を呈するPrP欠損マウス脳特異的に過剰発現していることを見い出した。そこで本研究では、プルキンエ細胞死を呈しないPrP欠損マウスにPrPLP遺伝子を導入したマウスを作製し、PrPの欠損とPrPLPの過剰発現がプルキンエ細胞死に関与しているかどうか明らかにすることにした。また、PrPLPの正常機能を解明するために、PrPLP遺伝子欠損マウスの作製も行う。PrPLP遺伝子導入マウス作製のために、2つのコンストラクトを作製した。神経細胞特異的に発現させるためPrPLP遺伝子の翻訳領域をneuron specific enolase遺伝子プロモーターの下流に挿入したものと、プルキンエ細胞特異的に発現させるためにPurkinje cell protein-2遺伝子のプロモーターの下流に挿入したものである。常法に従い、これらのコンストラクトをC57BL/6マウスの受精卵にマイクロインジェクションし、遺伝子導入マウスを作製した。また、これらのマウスとプルキンエ細胞の変性脱落死を起こさないPrP欠損マウスとを交配し、PrP遺伝子欠損PrPLP遺伝子導入マウスを作製した。現在では、プルキンエ細胞の変性死は認められていない。また、PrPLP遺伝子欠損マウス作製のためのターゲッティングコンストラクトを作製し、129Svマウス由来のES細胞に電気穿孔法にて導入した。約250のES細胞クローンクローンをサザンブロッティングにてスクリーニングした結果、相同組換えを起こしたES細胞クローンを1つ得ることができた。現在、このクローンから何匹かのキメラマウスが得られたが、ヘテロマウスはまだ得られていない。これらの結果は、このプルキンエ細胞の変性死にはPrPの欠損以外にも何らかの異常が関与していることを示唆した。現在常法に従い、これらのコンストラクトをC57BL/6マウスの受精卵にマイクロインジェクション中である。現在、このクローンからキメラマウスを作製中である。

また、PrPLP遺伝子欠損マウス作製のためのターゲッティングコンストラクトを作製し、129Svマウス由来のES細胞に電気穿孔法にて導入した。約250のES細胞クローンクローンをサザンブロッティングにてスクリーニングした結果、相同組換えを起こしたES細胞クローンを1つ得ることができた。現在、このクローンから何匹かのキメラマウスが得られたが、ヘテロマウスはまだ得られていない。
歯周病原細菌による菌血症モデルを用いた心血管系疾患の発症メカニズムの検討

ヒト冠状動脈内皮細胞は、歯周病原細菌由来の内毒素であるlipopolysaccharideに対して、炎症性サイトカイン遺伝子の発現が時間依存的に増加した。次に、菌血症モデルでは心臓の炎症性サイトカイン遺伝子の発現がコントロールと比較して有意に増加した。しかしながら、48時間後にはその発現が有意に減少するとともに、骨髄由来免疫細胞の割合が増加した。歯周病原菌は、冠動脈内皮細胞および心臓組織全体の炎症を惹起し、骨髄由来免疫細胞が炎症の鎮静化に関与する可能性が示唆された。【目的】「健康日本21」において、生活習慣がもたらす生活習慣病として「歯の健康」が明記され、生活習慣の改善として口腔内環境が重要視されるようになった。現在、「歯周病が全身にどのように影響を与えるか」という歯周医学に関する報告がされるようになった。そして、歯周病と動脈硬化・心臓病、骨粗鬆症、肺炎、喫煙、糖尿病、肥満・高脂血症、低体重児出産・早産などとの関連について研究されている。そのなかでも、糖尿病との関係が代表的であるが、その他にも近年、心血管系疾患と歯周病との関係について多数報告がある。これには、歯周病原細菌自体、またはLPSやその他菌体構成成分が影響を与え、冠動脈血管の内皮細胞、心内膜細胞が関与している可能性が高い。【考察】以上より、歯周病原細菌がヒト冠状動脈内皮細胞における炎症反応の起炎菌と成りうる可能性が示唆された。近年,心血管系疾患と歯周病との関係についての報告が多数認められ,歯周病原細菌のLPSや菌体構成成分などが冠動脈内皮細胞や心内膜細胞に影響を与える可能性が示唆されている。そこで,ヒト冠状動脈内皮細胞を用いて,P. gingivalis LPS刺激に対する炎症性サイトカインを測定し,歯周病原細菌がヒト冠状動脈内皮細胞に及ぼす影響について検討を行った。ヒト冠状動脈内皮細胞は,増殖因子を添加した培地にて培養, P. gingivalisで刺激を行った。その後, IL-6,IL-1β,TNF-αをreal-time PCR法とELISA法で, ICAM,VCAMはreal-time PCR法にて測定した。なお,細胞活性をWST-assayにて測定した。LPS刺激6,24時間後,時間依存的にIL-6,IL-1β,TNF-αの発現が増加した。また,LPS刺激後, IL-6の産生が増加した。そして,細胞活性は増殖曲線を示した。以上より,歯周病原細菌がヒト冠状動脈内皮細胞における炎症反応の起炎菌と成りうる可能性が示唆された。申請書に従い、マウス大動脈から心臓血管内皮細胞の分離を予定していたが、速やかに実施できなかった。このため、ヒト冠状動脈内皮細胞を用い、前年度に引き続き、培養上清中のタンパク産生・形態学的変化・WSTアッセイを実施しているために、研究の遂行がやや遅れている。近年、口腔と全身疾患との関係について報告が散見されるようになり、なかでも、歯周病原細菌が冠動脈内皮細胞や心内膜細胞に影響を与える可能性が示唆されている。そこで今回我々は、歯周病原細菌P. gingivalis由来のLPS(lipopolysaccharide:リポ多糖)(以下、P. g LPS)が、マウス心臓に与える影響について検討した。マウス心臓の炎症性サイトカイン遺伝子の発現は、P. g LPS投与1・3時間後にコントロールと比較して有意に増加した。その後、P. g LPS投与48時間後にその発現が有意に減少するとともに、骨髄由来免疫細胞(CD11b+Gr-1+骨髄細胞)の割合が増加した。歯周病原菌は、マウス心臓組織全体の炎症を惹起し、骨髄由来免疫細胞が炎症の鎮静化に関与する可能性が考えられた。マウス大動脈より心臓血管内皮細胞を分離することを試みたが、分離培養は困難であった。このため、ヒト冠状動脈内皮細胞を用いた研究を行っているため、実験の遂行が、やや遅れている。これまでの研究成果をもとに、心臓病態におけるIL-17関連遺伝子やTh17関連遺伝子について検討し、そのシグナリングを解明する。口腔内から菌血症を引き起こす理想的な菌血症モデルの完成をめざす。第62回公益社団法人日本口腔外科学会総会・学術大会2017/10/20-22京都にて、「P. gingivalis由来LPSが冠動脈内皮細胞および心臓に与える影響」大迫文重・山本俊郎・中尾恵理子・大塚有美・滝沢茂太・足立哲也・足立圭司・雨宮傑・金村成智が演題登録済み。歯周病学平成26年度に引き続き、real-time PCR法を継続し、これまでに行ったサイトカインに加え、その他のサイトカインについても検討を行う。さらに、培養上清中のタンパク産生をELISA法により測定する。また、形態学的変化を検鏡像にて比較する。

加えて、LPS刺激による細胞活性の変化(WSTアッセイ)の検討を追加で予定している。平成26年度に引き続き、心臓病態におけるIL-17関連遺伝子やTh17関連遺伝子について検討し、そのシグナリングを解明する。また、歯内歯周病変モデルを作製し、口腔内から菌血症を起こす理想的な菌血症モデルを完成させる。今年度の研究遂行に必要な物品を購入したが、当初予定と差額が生じたため。次年度の直接経費としてさらなる研究の遂行に充てる予定である。
2重リングを用いた2重散乱体のがん治療用陽子線照射野形成への応用研究

陽子線によるがん治療に必要な、安定で一様な照射野を形成する方法として、2重リングを用いた2重散乱体法を開発した。この方法は、一様な第一散乱体でビームを拡げた後、2重リング(内側が高原子番号物質で、外側が低原子番号物質で出来ていて、エネルギー損失を一定にして、内側外側での散乱強度を変えたもの)第2散乱体でビームの散乱に空間的な変調をかけ、一定距離走った所で分布の中央部を平坦化するものである。この方法の特徴は、短距離で効率良くビームを平坦化できることである。この手法を実際の陽子線回転ガントリーの照射野形成装置へ組み込む際に問題となる、他の散乱要素(ファインディグレーダとリッジフィルタ)の影響を定量的に明らかにし、陽子線のエネルギー範囲を8区間に区切ってそれに対応する8種類の2重リング散乱体とそれに対応した可変厚の第一散乱体を用意すれば、広い治療範囲をカバーできることを示した。また、ビームの位相空間パラメータの照射野への影響を定式化し、(1)ビームのエミッタンスが大きいときは、位相空間パラメータの変化により照射野の平坦度が大きな影響を受けることを示し、(2)位相空間パラメータを考慮した散乱体の設計法について明らかにした。2重散乱体法は、ビームのミスアライメントに分布の平坦度が敏感でミスアライメントがあると分布に傾きが生じることが分かっている。このため分布の傾きを測る平坦度モニターを開発し、実際に平坦度が1%以下の精度でモニター出来ることを示した。これらの研究により、2重リングを用いた2重散乱体法を実際のがん治療用の陽子線照射野形成装置に組み込む際の技術的要件を明らかにした。最近、陽子線治療専用の照射設備が建設されつつあり、その施設には陽子線を回転ガントリ-が設置され、短距離で照射野を形成する確立した方法が求められている。2重リング第2散乱体を使った2重散乱体法は、散乱体法としては効率が高く短距離で照射野が形成できる可能性を持つ方法である。この方法をがん治療装置の照射野形成装置に導入する際には解決しなければならない問題が2つある。一つは、がん治療では対象とする患部の深さや奥行き方向の大きさが広範囲にわたるので照射野の深さ調整のためのファインディグレーダ(FD)や拡大ブラッグピーク形成のためのリッジフィルター(RF)のビームラインへの挿入が必要となる。これらは、新たな散乱源となり最適化した分布を歪ませてしまうので挿入機器の散乱を考慮した2重散乱体法の設計が望まれる。本年度の研究では、解析計算および簡易モンテカルロ計算で、2重リング第2散乱体を使った2重散乱体法で、患部の広い深度領域(3-35cm)、SOBP幅範囲(2-10cm)をカバーし、半径10cmの円内での一様領域の照射野の平坦度が±3%p-p以内の領域を形成し、一様領域のフルエンスが全体の30%以上にできる仕組みを提示した。即ち、可変エネルギーの加速器を使い、患部の深度に応じて段階的にエネルギーの異なるビームを引きだして使用する。各エネルギーのビームに対応して4cmのSOBPをつくるRFを挿入したときに照射野の一様性が最も良くなるように散乱体パラメータを最適化する。これにより挿入するRFの範囲、FDの範囲が最も広くとれることがわかった。そして7段階のエネルギー設定と同じ数だけの2重リング、散乱強度を可変にする1次散乱体の組み合わせでこれを実現できることを示した。もう一つの問題であるビームの軸ずれによる分布の歪みの測定を行い、これを測定する平坦度モニターを試験し補正の仕組みを提示した。陽子線によるがん治療に必要な安定で一様な照射野を形成する方法として、2重リングを用いた2重散乱体法を開発した。

この方法は、一様な第一散乱体でビームを拡げた後、2重リング(内側が高原子番号物質で、外側が低原子番号物質で出来ていて、エネルギー損失を一定にして、内側外側での散乱強度を変えたもの)第2散乱体でビームの散乱に空間的な変調をかけ、一定距離走った所で分布の中央部を平坦化するものである。この方法の特徴は、短距離で効率良くビームを平坦化できることである。この手法を実際の陽子線回転ガントリーの照射野形成装置へ組み込む際に問題となる、他の散乱要素(ファインディグレーダとリッジフィルタ)の影響を定量的に明らかにし、陽子線のエネルギー範囲を8区間に区切ってそれに対応する8種類の2重リング散乱体とそれに対応した可変厚の第一散乱体を用意すれば、広い治療範囲をカバーできることを示した。また、ビームの位相空間パラメータの照射野への影響を定式化し、(1)ビームのエミッタンスが大きいときは、位相空間パラメータの変化により照射野の平坦度が大きな影響を受けることを示し、(2)位相空間パラメータを考慮した散乱体の設計法について明らかにした。2重散乱体法は、ビームのミスアライメントに分布の平坦度が敏感でミスアライメントがあると分布に傾きが生じることが分かっている。このため分布の傾きを測る平坦度モニターを開発し、実際に平坦度が1%以下の精度でモニター出来ることを示した。これらの研究により、2重リングを用いた2重散乱体法を実際のがん治療用の陽子線照射野形成装置に組み込む際の技術的要件を明らかにした。
真空アーク型金属イオン源の開発と金属多価イオン分光へ応用

本研究の当該年度の目的は、金属多価イオンの分光学および衝突過程研究のための電子ビームイオントラップ(Electron Beam Ion Trap、以下EBITと略す)に1次イオンを打ち込むための金属イオン源を開発することであった。この目的にかなうイオン源として金属蒸気真空アーク(Metal Vapor Vaccum Arc、以下MEVVAと略す)型イオン源を採用した。当初の計画どうり、MEVVAを設計・製作し、動作テストを行った。製作したMEVVAイオン源は、陽極と調べようとする元素を含む陰極との間に、大容量コンデンサーによる放電をトリガーとして使ってアーク放電を起こさせてイオンを生成する。テストは陰極材料に鉄(Fe)およびアルミニウム(Al)を使って行った。トリガー電圧24kV、放電電圧100500V、イオン引き出し電圧3keVの条件で、イオン源の出口から0.5mの点で0.2cm^2の補集面積で得られたイオン電流は10^<-3>10^<-2>Aであった。イオン信号の継続時間が510musであったので、1スパーク当りのイオン数は10^<10>10^<11>個となる。最初に製作したイオン源はいくつかの不備な点があったので、改良したものを製作した。これに対するテストは、イオン強度に関する限り最初のものとほぼ同じ結果を与えた。イオンビームの電荷分布とエネルギー幅を静電アナライザーを使って調べるという当初の計画は今後に持ち越されたが、製作したイオン源が、EBITの1次イオン入射用イオン源として十分なイオン強度をもつことが示された。次年度はイオンビームの診断を行ったのち、EBITヘイオン入射を行うための回路系の整備を行い、さらに入射テストを行う。
節足動物媒介性オルソブニヤウイルス検出系の確立と野生動物における感染状況の調査

節足動物媒介性の人獣共通感染症ウイルスであるオルソブニヤウイルス(OBVs)は世界各地で家畜や野生動物と蚊やその他の節足動物の間で広く維持され、多くのヒト感染例も報告されているが、日本では数種類が単離されているだけである。本研究はヒトに病原性を示すOBVsの国内の野生動物における感染状況の調査を目的とする。複数種のOBVsを認識する抗体を作製して様々な動物種に利用可能な検出系を確立し、野生動物に対するOBVsの感染状況を調査する。世界での発生状況を鑑みると国内でも未確認のOBVsが潜在する可能性があり、本調査により人獣共通感染症に対する対策・予防につながる重要な情報を提供できると期待される。
器官培養法とRNA干渉法を用いたマウス下顎骨形成におけるBMP2の機能研究

骨形成因子(BMP)は様々な組織・器官の発生・発達に重要な役割を果たしている増殖因子である。この研究ではマウス胎生期下顎および舌形成にBMPの果たす役割について調べた。その結果BMP2が金属プロテアーゼ13(MMP13)とMMP阻害因子1(TIMP1)の発現バランスを調節することによりマウス胎生期の舌形成を制御していることが明らかになった。我々はRNA干渉法を用いて培養したマウス第一鰓弓におけるBMP2発現を抑制した結果、舌の側溝形成が促進され、MMP11とTIMP1のmRNA発現が抑制されることをすでに報告している。本年度は、さらにBMP2の発現抑制がMMP11、TIMP1、BMP2受容体の分布及びメッケル軟骨の形成に影響するかどうかを検討した。【材料と方法】胎齢10日のICR系マウス胎仔より第一鰓弓を摘出し、無血清化学合成培養液中で8日間培養した。実験群にはBMP2のsiRNAを添加し、対照群には非特異的なsmallRNAを添加した。培養後、組織切片を作成し、MMP11、TIMP1、BMPR-I、BMPR-II、ActR-Iの免疫染色を行った。また、メッケル軟骨を観察するためにホールマウントでアルシアンブルー染色を行った。【結果】対照群の舌側溝の最深部にTIMP1の局在が観察されたが、siRNAで処理した実験群では観察されなかった。MMP11については、その分布に差は認められなかった。調べた全てのBMP2の受容体は舌および側溝の表層に分布が認められたが、実験群と対照群の間でその分布に差は認められなかった。第一鰓弓のサイズは実験群と対照群の間で差はなかったが、左右メッケル軟骨間の距離が近位で約14%狭くなり(p<0.05)、逆に長さは約14%長くなった(p<0.05)。【結論】BMP2はTIMP1の発現を調節することにより舌側溝形成およびメッケル軟骨の形態形成にも関わっている可能性が示唆された。我々は昨年度までにマウス胎生期下顎形成にBMP2の果たす役割について検討するために、マウス第一鰓弓を培養しRNA干渉法を用いてBMP2の発現を抑制した。その結果、BMP2の発現抑制により舌の側溝形成が促進されること、BMP2のレセプター(I型、II型、ActR-I)が舌および側溝の表層に存在していることを確認した。また下顎全体をアルシアンブルーで染色したところメッケル軟骨の形態形成にも関わっている可能性についても示唆した。本年度は、さらにTIMP1のmRNA発現とそのBMP2とTIMP1の局在の違いを組織学的に検討した。実験群にはBMP2のSiRNAを添加し、対照群には非特異的なsmall RNAを添加した。培養後、厚さ10μmで凍結切片を作製し、2重酵素抗体法によりBMP2とTIMP1の局在を同一切片上で観察した。さらにTIMP mRNA発現量をReal time PCR法を用いて測定した。【結果】2重酵素抗体法では、対照群で側溝最深部の同一部位にBMP2とTIMP1の発現が観察された。実験群では観察されなかった。またReal time PCRによる解析の結果、TIMP1のmRNA発現量が対照群と比較して実験群では少なかった(ρ<0.05)。【結論】BMP2はTIMP1の発現を調節することによって舌側溝の成長を調節している可能性を示唆した。我々はマウス胎生期下顎および舌形成にBMPの果たす役割について検討するために、胎齢1115日におけるマウス下顎、舌におけるBMPおよびその受容体の発現を調べた。さらに胎齢10日のマウス第一鰓弓を培養しRNA干渉法を用いてBMP2の発現を抑制する実験を行い、以下のような知見を得た。1. BMP2、4が胎齢1115日における舌筋に発現が認められた。2. BMP2のレセプター(I型、II型、AetR-I)が舌筋および側溝の表層に発現していた。5. BMP2siRNA処理により約3倍舌の側溝が深くなった。6. BMP2siRNA処理により舌の側溝の形成がおこる上皮領域ではBMP2の顕著な発現抑制が観察された。7. BMP2siRNA処理はTIMP1 mRNA発現を抑制した。8. BMP2siRNA処理は側溝形成部でのTIMP1蛋白質発現を抑制した。9. BMP2siRNA処理により、舌の側溝が形成される上皮領域にMMP13の顕著な発現の上昇が認められた。In Vivoの実験結果からBMP2が舌筋の形成に関与している可能性が示唆された。