hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
尿路性器癌の発生分化に関与するepigeneticな遺伝子変化に関する研究

精子DNAを用いて検討したが、mcthylationの有無に対応して特異的にPCR産物を確認できた.精巣腫瘍においては52例中20例(38%)にメチル化に伴うシグナルを確認したが、少数例を除いてこれらの症例では非メチル化のシグナルも同時に確認された.残りの32例ではメチル化のシグナルは全く検出されなかった.メチル化のシグナルの有無と病理学的所見や臨床病期との関連は認められなかった.Methylation-specific PCRは簡便で特異性の高いメチル化検出法と考えられた.精巣腫瘍の38%にp16遺伝子のメチル化を証明したが、非メチル化シグナルも同時に検出され、p16遺伝子メチル化におけるモザイク状態が推定された.また、Epigeneticな遺伝子異常が関与すると推定されるTelomerase活性の再出現に関しても泌尿器科癌に関して検討を開始している。1)臨床検体ライブラリーの充実尿路性器腫瘍は、近年著しい増加傾向をみせているが、全体的には比較的頻度の低い悪性腫瘍が多い。本研究年度においては、臨床検体(組織、血清、DNA、RNAなど)をさらに充実させたとともに、近年問題となっている患者からのインフォームドコンセントの内容を検討し、倫理的に不備な点を修正し改訂した。2)膀胱癌における第8染色体、第9染色体に着目し、臨床材料を用いた遺伝子解析を行った。その結果、第8番染色体短腕上に転移に関係する遺伝子座が存在すること、また第9染色体上の2つのLocusが膀胱癌発生に関与する事が判明した。この領域にある関連候補遺伝子のメチル化に関しては検討を予定している。もう一つの第9染色体上の膀胱癌関連遺伝子(DBCCR1)に関して、そのプロモータ部位のメチル化の状態に関して様々な膀胱癌細胞株に関して検討した。その結果、DBCCR1遺伝子のプロモータ部位は、種々の程度にメチル化を受けており、メチル化の状態とDBCCR1遺伝子発現とは直接関連していない事が判明した。現在、臨床検体を用いたメチル化解析を継続中である。3)前立腺癌は環境要因と遺伝素因が影響を及ぼし合って、長期過程で発生する。前立腺上皮を取り巻く微細環境は重要な役割を担っており、間質細胞におけるEpigeneticな変化が発癌や悪性進展に影響を及ぼしている可能性がある。この分子標的を明らかにする目的で、種々の遺伝多型と発癌リスクとの関連を検討した。その結果、アンドロゲン受容体遺伝子やビタミンD受容体遺伝子を介する機構が、前立腺上皮の微細環境を介して前立腺癌発生と関連する可能性が示唆された。1)臨床検体ライブラリーの充実臨床検体の取り扱いに際しては、近年社会的に様々な問題点が明らかにされている。本研究年度においては、近年問題となっている患者からのインフォームドコンセントの内容を検討し、京都大学、および京都大学附属病院としての包括的インフォームドコンセントの作成に協力しながら、倫理的に不備な点を修正し改訂した。その結果、第8番染色体短腕上に転移に関係する遺伝子座が存在すること、また第9染色体上の2つのLocusが膀胱癌発生に関与する事が判明した.この領域にある関連候補遺伝子のメチル化に関しては検討を予定している。
就学中の22q11.2欠失症候群の子どもの教育者と医療者の協働に関する研究

本研究では、22q11.2DSの子どもをもつ家族と教育者を対象に「就学ガイド」を配布、疾患や障がいに起因する個がもつ多様性への理解と配慮について、医療、教育の連携の強化を試みる。また、医療教育を実施し、疾患や障がいに起因する個がもつ多様性への理解と配慮について医療と教育の両分野から検討する。さらに、22q11.2DSの子どもの家族と議論を通して就学ガイド、および医療教育の評価と改善を行う。
ヒト大腸癌細胞への段階的染色素体移入による癌抑制遺伝子の研究

5番、17番、18番、22番染色体に欠失を有する大腸癌細胞へ異なる薬剤耐性マーカーで標識された正常染色体を移入するためにMNNG処理しHPRT遺伝子欠損の大腸癌変異細胞を分離した。この細胞にHPRT遺伝子を選択マーカーとするヒト転座染色体(17pter>17q11:Xq11>Xqter;t(X;17))を移入し得られた細胞は非移入細胞に比べ大型で偏平な細胞に変化していた。17番染色体短腕上のDNAマーカにより正常17番染色体の移入を確認後、移入細胞の増殖特性を調べた。液体培地中での細胞増殖速度は非移入細胞と比べ抑制は認められなかったが、軟寒天培地中でのコロニー形成能の低下は認められた。また、ヌードマウスにおける造腫瘍性は腫瘍形成の遅延は認められたが完全には抑制されなかった。一方、t(X;17)転座染色体移入細胞からt(X;17)転座染色体が脱落した細胞では非移入細胞と同一速度で腫瘍が形成された。これらの結果は、もとの大腸癌細胞で不活性化されていた癌抑制遺伝子が正常ヒト17番染色体短腕の移入により補われたため、癌形質の一部が抑制されたと考えられる。そこで、さらに癌形質の完全な抑制を試みるために17番染色体短腕移入細胞ヘネオマイシン耐性遺伝子で標識された正常5番染色体を移入した。G418選択培養により多核で細胞同士の接着性が認められないコロニーが形成されたが、これらのコロニーは初期の段階で増殖が停止してしまった。正常5番と17番染色体を大腸癌細胞へ移入した結果、17番染色体の移入では抑制されなかった大腸癌細胞の増殖能が5番染色体の移入により抑制されたことから、癌形質の完全な抑制には少なくとも2種類の癌抑制遺伝子の機能が補われる必要があること、各々の癌抑制遺伝子は異なる機能を持つことが明らかになった。大腸癌の発生には複数の癌抑制遺伝子の不活化が関与していることが明らかになってきている。既に5番染色体上のAPC遺伝子、17番染色体上のp53遺伝子、18番染色体上のDCC遺伝子がクロ-ン化されたが、染色体およびRFLP分析の結果より1番染色体、22番染色体にも癌抑制遺伝子の存在が示唆されている。そこで、本研究では正常ヒト染色体1本を含む細胞を供与体として、樹立したヒト大腸癌細胞へ微小核融合法により、異なる選択マ-カ-を用いて二段階で複数の正常ヒト染色体を移入し、この間に得られた移入染色体の異なるクロ-ンの性質を調べることにより、癌細胞の造腫瘍性を抑制する染色体を同定しヒトの発癌における抑制遺伝子の役割を究明することを目的とした。HGPRT遺伝子を含むX染色体の一部が17番へ転座したXー17染色体を微小核融合法により17番、18番、22番染色体で欠失が認められている大腸癌細胞へ移入するために、MNNG処理後6TGを含む培地中で選択培養を行い耐性細胞(FuTG)を得た。この細胞が元の大腸癌の性質を保持しているかどうかを17番染色体上のDNAマ-カ-を用いて対立遺伝子欠失を調べると共にヌ-ドマウスにおける造腫瘍性を調べ確認した。FuTGにヒト正常細胞由来のXー17転座染色体を微小核融合法により移入し、HAT培地で選択培養を行い耐性細胞を得た。細胞形態はFuTGは紡錘形を示すのに対し、17番染色体移入細胞は多角形に変化した。また、15%牛胎児血清存在下での細胞増殖速度はFuTGと変わりなかったが、軟寒天培地中でのコロニ-形成能は著しく低下した。現在6TG存在下で培養を行いリバ-タントを取ることを試みると共に、ヌ-ドマウスにおける造腫瘍性を調べている。今後このクロ-ンにNeoで標識された他の染色体を移入する予定である。

G418選択培養により多核で細胞同士の接着性が認められないコロニーが形成されたが、これらのコロニーは初期の段階で増殖が停止してしまった。正常5番と17番染色体を大腸癌細胞へ移入した結果、17番染色体の移入では抑制されなかった大腸癌細胞の増殖能が5番染色体の移入により抑制されたことから、癌形質の完全な抑制には少なくとも2種類の癌抑制遺伝子の機能が補われる必要があること、各々の癌抑制遺伝子は異なる機能を持つことが明らかになった。正常ヒト細胞由来のX染色体の一部が17番染色体へ転座したX-17染色体を含むマウスA9細胞から微小核を調整しHPRT欠損大腸癌細胞へ移入して得られたHAT耐性細胞中の17番染色体の確認は17番染色体短腕上のDNAマーカーを用いてサザンブロット法により行った。大きく偏平な形態に変化した17番染色体移入細胞の増殖特性を調べたところ、非移入細胞に比べ液体培地中での細胞増殖速度の抑制は認められなかったが、軟寒天培地中でのコロニー形成率の低下を認めた。また、ヌードマウスにおける造腫瘍性は非移入細胞に比べ腫瘍形成の遅延が認められた。一方、移入染色体の脱落した細胞では非移入細胞と同様な速度で腫瘍が形成された。以上の結果から、大腸癌細胞への正常17番染色体短腕の移入により形態変化とコロニー形成能の低下は認められたが、液体培地中での細胞増殖速度とヌードマウスにおける造腫瘍性は完全には抑制されないことが明らかになった。そこで17番染色体移入細胞ヘネオマイシン耐性遺伝子を持つ正常5番染色体をさらに移入した。大腸癌では複数の癌抑制遺伝子の不活性化が起こっていることが明らかになってきている。今回の結果は、17番染色体と5番染色体の移入により増殖能が消失したのは、もとの大腸癌細胞で不活化していた複数の癌抑制遺伝子のうち2種類が補われたためにより悪性度が低下した結果だと考えられる。
NKT細胞のアジュバント効果を応用したAPS制御の為の基礎的研究

NKT細胞の活性化は、樹状細胞におけるIL-12p70産生を増強させ、その一方でIL-23産生を抑制する。これに起因してメモリーCD4+T細胞から産生されるIL-17を抑制する。この観察は、NKT細胞がIL-12p70誘導性の細胞性免疫応答を促進するとともにIL-23依存性の炎症性病態を抑制することを示唆するものである。健常人末梢血単核球よりVα24 invariant NKT(iNKT)細胞を高速自動セルソーター使用して精製分離した。さらにCD4+CD8β-(CD4)およびCD4-CD8β-(double negative:DN)の2つのサブセットに分離し、それぞれの細胞株を樹立した。一方、末梢血単核球よりCD14モノサイトを磁気分離し、これにIL-4,GM-CSFを加えることにより、モノサイトDCを誘導した。モノサイトDCに、種々のToll様受容体アゴニストあるいは細菌を加え、IL-12/23産生を評価したところ、大腸菌と結核死菌を加えた場合にIL-23産生が誘導されることが明らかとなった。この条件に、iNKT細胞由来の液性因子を加えた解析により、iNKT細胞由来の液性因子は、DCにおけるIL-12産生を促進してIL-23産生を抑制することが明らかとなった。iNKT細胞の産生するTヘルパー(Th)サイトカインに対する中和抗体、およびリコンビナントサイトカインを用いた解析では、iNKT細胞由来のIFN-γ,IL-4,IL-13のそれぞれが相乗効果を示すことによりDCにおけるIL-12産生を増大させることが明らかとなった。一方、IL-4,IL-10,IL-13は、IFN-γによって誘導されるIL-23産生を著しく抑制することが明らかとなった。Th細胞共培養系においては、iNKT細胞を活性化することにより、メモリーTh細胞におけるIL-17産生が著しく抑制されることが明らかとなった。以上より、iNKT細胞はDCにおけるIL-12/23バランスを制御することにより、APSの成因に深く関与することが示唆されているTh17応答を抑制することが明らかとなった。最近、IL-17を産生するTh17細胞が多くの自己免疫疾患の病因・病態に深く関与することが明らかにされている。SLEの患者群においては血清中のIL-23、IL-17の上昇、および末梢血中のTh17細胞の頻度の上昇が認められており、同様の病態を示すAPSにおいてもTh17応答の関与が強く示唆されている。さらに最近、Th17応答はがんの進行にも関与することが報告されている。我々は、ヒトNKT細胞と樹状細胞(DC)の相互作用によりTh応答が制御されうることを最近明らかにした。本研究は、自己免疫疾患、および癌の進行に深く関与するTh17応答が、NKT細胞とDCの相互作用によって制御されるメカニズムを明らかにする。また、免疫制御効果を発揮しうる重要な分子を同定し、これら機能的分子をターゲットとすることでAPSなど流産を引き起こす自己免疫疾患あるいはがんを人為的に制御するための分子基盤を構築することを目的とした。本研究により、NKT細胞はDCにおけるIL-12p70/23産生バランスを制御し、IL-12p70によって誘導される細胞性免疫応答を促進すること、IL-23によって誘導される炎症性応答を抑制することが明らかとなった。さらにIL-23産生を抑制することで、メモリーTh細胞から産生されるIL-17を抑制することが明らかとなった。これらの制御には、NKT細胞由来のThサイトカインが重要な役割を演じており、NKT細胞由来のIFN-γ, IL-4,IL-13は相互相乗効果を示して、DCにおけるIL-12p70産生を増大させた。一方、NKT細胞由来のIL-4とIL-10はIL-23産生に対して抑制的に作用した。これらは、IL-23/Th17経路によって誘導されるAPSやがんの炎症性病態が、NKT-DCの相互作用によって制御されうることを示す重要な観察である。
Arginase阻害による肺高血圧治療の検討

内皮由来一酸化窒素合成酵素(eNOS)の活性低下と一酸化窒素(NO)産生減少は、多くの血管障害に関与しており、肺高血圧症においても肺血管のeNOS活性低下が知られている。arginaseは基質であるarginineをeNOSと競合するため、その亢進は血管障害への関与が疑われるが、肺血管での役割は殆ど知られていない。我々はモノクロタリン誘発肺高血圧ラットの肺組織において、eNOS発現量に変化が無いにも関わらず、肺血管張力測定における肺動脈の内皮機能依存性弛緩反応の減弱していることを観察した。同時にarginaseの著しい発現亢進を認めたことから、発現の亢進したarginaseがeNOSと基質のarginineを競合し、eNOS活性に影響している可能性が示唆された。そこで、血管リング標本において、内皮依存性弛緩反応をarginase阻害薬を用い検討した。正常ラット肺動脈では、arginase阻害薬NOHA存在下で、内皮依存性弛緩反応は亢進した。一方肺高血圧ラットでは、eNOS活性は低下し、内皮依存性弛緩反応は減弱しているが、NOHA存在下でも変化なかった。しかしNOHAとarginine両方の存在下では、内皮依存性弛緩反応が回復が見られた。以上より、内皮依存性弛緩反応の減弱の原因として、細胞内arginineのavailabilityの低下による可能性が示唆された。NOHA単独で弛緩反応が改善しなかったため、arginase発現亢進以外の要因もeNOS activity低下の原因として疑われた。肺高血圧ラットにおける肺血管内皮由来弛緩反応減弱の原因として,arginase発現亢進に加え細胞内arginineの利用障害の関与が疑われた。更に、eNOS activity自身が低下し、またNOHA単独では弛緩反応を改善しなかったことから、arginase亢進以外にeNOS activityを低下させる要因の存在が示唆された。肺動脈における内皮細胞由来弛緩反応に対するarginase阻害による増強は、正常ラットでは観察され、一定の関与は認められた。しかし肺高血圧モデルにおける弛緩減弱の原因として、arginase亢進によるargininの消費、細胞内arginineの利用障害等、要因が関緒していることも明らかになった。eNOSへの細胞内外のargnine供給経路の更なる解明が、肺高血圧発症機序の理解につながると思われた。内因性、外因性のarginineの利用経路を分けて考えるため、選択的阻害剤の使用、細胞内arginine濃度の測定等が今後有用と考えている。内皮由来一酸化窒素合成酵素(eNOS)の活性低下と一酸化窒素(NO)産生減少は、多くの血管障害に関与している。肺高血圧症においても肺血管のeNOS活性低下が知られているが、その経路は様々な経路で修飾される。arginaseはeNOSと基質であるarginineを競合するため、血管障害への関与が疑われるが、血管での役割は殆ど知られていない。本研究はモノクロタリン誘発肺高血圧ラットを用い、肺組織においてarginaseの著しい発現亢進と、同時に肺血管張力測定における肺動脈の内皮機能依存性弛緩反応の減弱を観察した。一方でeNOSの発現量は変化なかった。このことからNOS活性を阻害する要因として、eNOSと基質のarginineを競合するarginaseが関与している可能性が示唆された。そこで、arginase阻害剤の存在下に内皮機能依存性弛緩反応への影響を観察した。まず、肺高血圧ラットでは弛緩反応は減弱していることを確認した。次に正常と肺高血圧ラットでarginase阻害薬の肺血管の弛緩反応を検討した。正常ラットでは弛緩反応に対する影響は認められなかったが、肺高血圧ラットではその影響は異なり、arginaseの発現量が関与する可能性を検討している。更に、全身麻酔下の循環動態測定(血圧、右室圧、心拍出量、全身血管抵抗、肺血管抵抗等)により、arginase阻害剤の循環動態への影響を検討している。吸入、静脈内投与等の投与経路の最適化も検討する予定である。肺高血圧ラットモデルを用いた血管張力測定によるarginase存在下の内非依存性弛緩反応、循環動態測定は平成28年度の研究実施計画に沿ったものである。阻害剤の投与方法等の詳細な条件検討も行い実験条件が確立されたが、予定された実験数には達していない。

正常ラット肺動脈では、arginase阻害薬NOHA存在下で、内皮依存性弛緩反応は亢進した。一方肺高血圧ラットでは、内皮依存性弛緩反応は減弱しているが、NOHA存在下でも変化なかった。しかしNOHAとarginine両方の存在下では、内皮依存性弛緩反応が回復が見られた。以上より、内皮依存性弛緩反応の減弱の原因として、arginase発現亢進に加え、arginineのavailabilityのe低下によるeNOS活性低下が関与している可能性が示唆された。肺高血圧ラット肺動脈において、arginase阻害薬を用いた血管張力実験は一定の結果が得られた。eNOS活性測定等の実験も必要と思われるが、実験の方向性は得られた。内皮由来一酸化窒素合成酵素(eNOS)の活性低下と一酸化窒素(NO)産生減少は、多くの血管障害に関与しており、肺高血圧症においても肺血管のeNOS活性低下が知られている。arginaseは基質であるarginineをeNOSと競合するため、その亢進は血管障害への関与が疑われるが、肺血管での役割は殆ど知られていない。我々はモノクロタリン誘発肺高血圧ラットの肺組織において、eNOS発現量に変化が無いにも関わらず、肺血管張力測定における肺動脈の内皮機能依存性弛緩反応の減弱していることを観察した。同時にarginaseの著しい発現亢進を認めたことから、発現の亢進したarginaseがeNOSと基質のarginineを競合し、eNOS活性に影響している可能性が示唆された。そこで、血管リング標本において、内皮依存性弛緩反応をarginase阻害薬を用い検討した。一方肺高血圧ラットでは、eNOS活性は低下し、内皮依存性弛緩反応は減弱しているが、NOHA存在下でも変化なかった。以上より、内皮依存性弛緩反応の減弱の原因として、細胞内arginineのavailabilityの低下による可能性が示唆された。NOHA単独で弛緩反応が改善しなかったため、arginase発現亢進以外の要因もeNOS activity低下の原因として疑われた。肺高血圧ラットにおける肺血管内皮由来弛緩反応減弱の原因として,arginase発現亢進に加え細胞内arginineの利用障害の関与が疑われた。更に、eNOS activity自身が低下し、またNOHA単独では弛緩反応を改善しなかったことから、arginase亢進以外にeNOS activityを低下させる要因の存在が示唆された。28年度に行った血管張力測定と同様の検体を用い、arginase活性、NOS活性、cGMP量等のpathwayの検討からarginase阻害剤の効果を詳細に検討する予定である。arginase阻害薬を用いた血管張力実験は一定の結果が得られた。肺血管内皮細胞における、arginineのavailabilityの減少に関する実験を追加する必要があると思われる。これら結果をもとに、予定していた肺高血圧ラットの循環動態測定実験を行っていく。肺動脈における内皮細胞由来弛緩反応に対するarginase阻害による増強は、正常ラットでは観察され、一定の関与は認められた。
乳癌、胃癌におけるDISH法の検討

1.研究目的トラスツマブを用いた乳癌・胃癌のHER2分子標的治療選択には組織標本を用いたHER2タンパク過剰発現および遺伝子増幅検査が必須となっている。組織切片を用いたHER2遺伝子増幅検査には暗視野観察のFISH法が主に行われているが近年、明視野下で観察可能なDISH法が開発された。従来のFISH法とDISH法との検査精度の比較,DISH法での至適条件の検討を行った。2.研究方法(1)IHC法で2+となりFISH法を行った乳癌、胃癌症例について連続切片を作製し、IHC法、FISH法、DISH法で染色して増幅率を比較検討した。(2)FISH法で計測困難であった症例をDISH法で染色し、染色結果を比較検討した。3.研究成果(1)今回検討した乳癌、胃癌25症例のDISH法の結果は従来のFISH法と100%の一致率となり良好な相関性が得られた。(2)FISH法でシグナルの発色が弱く計測が困難であった7症例のうち6症例はDISH法でも通常症例に比べてシグナルの発色は弱かったがDISH法は銀で黒色に染色されるためシグナルが弱くても計測が可能であった。1症例についてはFISH法、DISH法とも通常の条件ではシグナルが見えず計測不可能であった。(3)通常条件で計測できなかった症例は酵素処理時間を延長することでシグナルの増強が可能であった。以上よりDISH法は従来法であるFISH法と同等な検査精度であり遺伝子増幅検査ではFISH法に代用しても問題ないと思われた。また、DISH法は明視野で観察できるため、暗視野で観察するFISH法では腫瘍組織がわかりにくい(散在性に浸潤している。異型が弱い等)症例も明視野でHE染色と比較して腫瘍組織を確認して計測することができた。FISH法では蛍光色素で発色するため時間がたつと退色し、冷蔵保存を必要とするがDISH法は常温で保存観察ができる。などFISH法よりも運用しやすい点もあった。
マルファン症候群新規責任遺伝子の探索

申請者らは2004年にマルファン症候群(MFS)2型の原因遺伝子を単離して以降、全国からMFS症例を集積した(65症例)。MFS及びMFS類縁疾患の原因遺伝子としてこれまでにTGFBR1/TGFBR2及びFBN1/FBN2の4個が知られており集積した症例について網羅的遺伝子変異解析を行った。その結果、MFSの半数にFBN1変異を、約5%にTGFBR1/TGFBR2変異を同定した。TGFBR2変異を有する患者は臨床診断基準を満たす典型的マルファン症候群ではなかった。残りの45%程度の症例では、遺伝子異常を確認できず、その他の原因遺伝子が存在することが示唆された。本研究は責任遺伝子ごとの疾患スペクトラムの決定および変異未同定群における新規遺伝子同定を目的とする。MFS類縁疾患であるビールズ症候群の15症例について網羅的な遺伝子変異解析を行った。これまでFBN2に複数の遺伝子変異が報告されているが、TGFB受容体異常を含めた網羅的解析の報告はこれまでにない。その結果27%(4/15症例)にFBN2の遺伝子変異が見つかった。他の11症例にはいずれの遺伝子異常も同定されなかった。これまでの解析から臨床診断基準を満たす典型的マルファン症候群および重症の心血管症状、軽度の眼症状、顔面小奇形を特徴とするマルファン症候群2型の主要な責任遺伝子はそれぞれFBN1、TGFBR1/TGFBR2であることが示唆された。また心血管系異常を伴わないビールズ症候群の一部はFBN2変異が原因となっている。新規遺伝子同定に関しては、染色体異常inv(14)を合併する症例の解析を行った。具体的には14番染色体長腕逆位の逆位切断点を蛍光in situ hybridization法を用いて解析し、患者の14番染色体長腕逆位の近位および遠位切断点を200Kbまで狭めた。切断点領域には複数の遺伝子が登録されており有力な候補遺伝子群と考える。原因遺伝子であるかどうかの検討は遺伝子変異解析済みコホートを用いFBN1・FBN2・TGFBR1・TGFBR2異常のない症例で当該遺伝子の変異解析を行うことで結論する。申請者らは2004年にマルファン症候群2型の原因遺伝子を単離して以降、全国からMFS症例を集積し(65症例)、既知当該責任遺伝子の変異解析を行なった。その結果、MFSの半数にFBN1変異が、約5%にTGFBR2変異が同定されるもの、残りの45%程度の症例では、遺伝子異常を確認できないことが判明した。TGFBR1/TGFBR2及びFBN1/FBN2の網羅的な遺伝子変異解析を継続し、それぞれの変異遺伝子ごとの疾患スペクトラムを決定すると共に、変異未同定群を選択する。この過程で集積された染色体異常inv(14)を合併する症例およびFBN1・TGFBR2異常のない症例群は本研究における新規遺伝子単離の重要な解析対象である。具体的には染色体構造異常を有する患者の14番染色体長腕逆位の逆位切断点を分子細胞遺伝学的に解析し候補遺伝子を特定する。症例と偶然に合併したMFSの発症に関与しない染色体異常である可能性も否定はできないが、ゲノム解析を行うことで結論できる。18年度は患者の14番染色体長腕逆位の近位および遠位切断点を200Kbまで狭めた。切断点領域には複数の遺伝子が登録されており、今後さらに詳細な解析をおこない逆位切断点において断裂した遺伝子が存在しないか研究を進める。染色体逆位においては遺伝子量の増減は存在しないため、切断点に遺伝子が位置していた場合有力な候補遺伝子である。原因遺伝子であるかどうかの検討は遺伝子変異解析済みコホートを用いFBN1・TGFBR2異常のない症例で当該遺伝子の変異解析を行うことで結論する。試料等提供者に対する倫理的配慮として(1)研究対象者の拒否権の尊重:患者・および親権者(両親)が自由に同意・拒否できるように配慮し、(2)インフォームドコンセント:本研究の主旨、方法、危険性の有無などを十分に説明した後、文書による同意を得て提供された試料を研究に用いる。

これまでの解析から臨床診断基準を満たす典型的マルファン症候群および重症の心血管症状、軽度の眼症状、顔面小奇形を特徴とするマルファン症候群2型の主要な責任遺伝子はそれぞれFBN1、TGFBR1/TGFBR2であることが示唆された。また心血管系異常を伴わないビールズ症候群の一部はFBN2変異が原因となっている。新規遺伝子同定に関しては、染色体異常inv(14)を合併する症例の解析を行った。具体的には14番染色体長腕逆位の逆位切断点を蛍光in situ hybridization法を用いて解析し、患者の14番染色体長腕逆位の近位および遠位切断点を200Kbまで狭めた。切断点領域には複数の遺伝子が登録されており有力な候補遺伝子群と考える。原因遺伝子であるかどうかの検討は遺伝子変異解析済みコホートを用いFBN1・FBN2・TGFBR1・TGFBR2異常のない症例で当該遺伝子の変異解析を行うことで結論する。
塩基駆動型原子価互変異性を示すピリジルアミン系金属錯体の開発と応用

酸化還元活性(redox non-innocent)な配位子を有する遷移金属錯体は、金属イオンと配位子間での分子内電子移動により金属の酸化数の変化や配位子ラジカルの生成など、多彩な金属錯体の機能発現が期待できる。近年、高いルイス酸性を示すRh(III)イオンを中心金属に用いたRh(III)-TPA錯体(TPA: tris(2-pyridylmethyl)amine)に塩基を作用させると、酸化還元活性な脱プロトン化TPA配位子が生成する事が報告された。本研究では、酸化還元活性と高いルイス酸性を示すCo(III)イオンと脱プロトン化TPA配位子との分子内電子移動を利用したCoIIITPA錯体の電子構造の改変を目的として、TPA誘導体を支持配位子とするCo(III)-LH6錯体(LH6: tris(5-methoxycarbonyl-2-pyridylmethyl)amine)の合成と脱プロトン化錯体の同定を行った昨年度は、分子内電子移動によるCo(II)配位子ラジカル錯体の生成を確かめるため、Nオキシルラジカル化合物であるTEMPOやAZADOを用いたラジカルトラップによる反応速度追跡を行った。そのCo(II)配位子ラジカル錯体とNオキシルラジカルとの反応性を評価するために、Nオキシルラジカルに異なる置換基を導入し、その酸素原子上のスピン密度や酸素原子周りの立体障害を変えて実験を行った。現在、その速度論的結果を基に、Co(II)配位子ラジカル錯体の生成評価を行っている。スピンアダクトの結晶化や詳細な速度論解析などラジカルカップリングのキャラクタリゼーションに時間がかかっており、今後、これらのデータが出揃い次第、論文投稿などを行う予定である。今後は論文発表も含め、この脱プロトン化に伴う分子内電子移動によるラジカル種の生成を優先的に行う錯体の合成やその反応機構を以下の方針に従って遂行する。1)スピンアダクトの結晶化などにより、構造解析を行う。2)Co(III)イオンだけでなく、他の遷移金属イオンを用いて塩基の添加により原子価互変異性(分子内電子移動)が観測出来るかについて検討を行う。本研究では、酸化還元活性と高いルイス酸性を示すCo(III)イオンと脱プロトン化TPA配位子との分子内電子移動を利用したCoIIITPA錯体の電子構造の改変を目的として、TPA誘導体を支持配位子とするCo(III)-LH6錯体(LH6: tris(5-methoxycarbonyl-2-pyridylmethyl)amine)の合成と脱プロトン化錯体の同定を行った。また、分子内電子移動によるCo(II)配位子ラジカル錯体の生成に関して、Co(III)イオンに対して異なる電子供与性を示す二座キレート配位子である1,3-ジケトナト誘導体(dbm-X: X = H, Cl)による制御を行った。また、酸化還元活性と高いルイス酸性を示すCo(III)イオンとTPA配位子を組み合わせることにより、TPA配位子の脱プロトン化をトリガーとした分子内電子移動の発現とラジカルカップリング反応の進行を見出した。また、1,3-ジケトナト補助配位子の2位に導入した置換基により、Co(III)イオンの還元電位を変化させることで、脱プロトン化錯体における脱プロトン化TPA配位子からCo(III)イオンへの分子内電子移動の制御に成功した。概要に記載した通り、Co(III)-LH6錯体を脱プロトン化することで、脱プロトン化配位子からCo(III)イオンへの分子内電子移動が起こり、配位子ラジカル錯体が生成していることを示す事ができた。この分子内電子移動は、Co(III)中心の酸化還元電位に大きく依存していることから、この電位制御を行う事で脱プロトン化をトリガーとする分子双安定性発現できることが判明した。その結果、初年度の成果としては順調に進展したと考えられる。

本研究では、酸化還元活性と高いルイス酸性を示すCo(III)イオンと脱プロトン化TPA配位子との分子内電子移動を利用したCoIIITPA錯体の電子構造の改変を目的として、TPA誘導体を支持配位子とするCo(III)-LH6錯体(LH6: tris(5-methoxycarbonyl-2-pyridylmethyl)amine)の合成と脱プロトン化錯体の同定を行った昨年度は、分子内電子移動によるCo(II)配位子ラジカル錯体の生成を確かめるため、Nオキシルラジカル化合物であるTEMPOやAZADOを用いたラジカルトラップによる反応速度追跡を行った。そのCo(II)配位子ラジカル錯体とNオキシルラジカルとの反応性を評価するために、Nオキシルラジカルに異なる置換基を導入し、その酸素原子上のスピン密度や酸素原子周りの立体障害を変えて実験を行った。現在、その速度論的結果を基に、Co(II)配位子ラジカル錯体の生成評価を行っている。スピンアダクトの結晶化や詳細な速度論解析などラジカルカップリングのキャラクタリゼーションに時間がかかっており、今後、これらのデータが出揃い次第、論文投稿などを行う予定である。今後は論文発表も含め、この脱プロトン化に伴う分子内電子移動によるラジカル種の生成を優先的に行う錯体の合成やその反応機構を以下の方針に従って遂行する。1)Co(III)中心の酸化還元電位を制御するため、二座キレート配位子だけでなくTPA類縁体の電子供与性も変化させ、熱力学的に安定なCo(II)配位子ラジカル錯体の生成を目指す。2)ラジカルカップリング反応の生成物同定や反応機構解明を行い、Co(II)配位子ラジカル錯体に特徴的な反応探索を行う。3)Co(III)イオンだけでなく、他の遷移金属イオンを用いて塩基の添加により原子価互変異性(分子内電子移動)が観測出来るかについて検討を行う。1)スピンアダクトの結晶化などにより、構造解析を行う。2)Co(III)イオンだけでなく、他の遷移金属イオンを用いて塩基の添加により原子価互変異性(分子内電子移動)が観測出来るかについて検討を行う。
均衡モデルに基づく階層型デマンドバスのミクロシミュレーション

地方部都市圏では,公共交通の利用促進のため利便性の高い交通機関が求められている.本研究では,複数レベルのデマンドバスを乗り継ぐ階層型デマンドバスシステムを提案し,実際の都市圏をモデルとしてシミュレーションによる評価実験を行った.提案システムは,既存の路線バスと同程度の旅行時間で移動可能で,かつ歩行距離が大幅に削減されると推定された.さらに,デマンドバスを含む交通網の定量的評価を行うための動的交通シミュレータの開発を行い,人口100万人規模の中核地方都市圏モデルを実用的な速度で実行可能であることを確認した.マルチエージェントシステムをベースとしたミクロ交通シミュレータの性能向上(現況再現性の向上)に関する研究及びデマンドバスモデルの導入に向けてTDM(交通需要マネジメント)のシミュレーション実験を行った.ミクロ交通シミュレーションの精度向上のため,信号を直接モデル化することなく「交差点における平均待ち時間」を新たに提案した.実際の交通においては,交差点は信号機により路線間の接続を制御する事で任意方向への通行を可能としている.本研究では,平均待ち時間を導入する事でサイクル長,オフセット,スプリットなどの一般的な信号制御パラメータを個別に入力することなく高い現況再現性が実現できる事を確認した.交通利用者の行動の変化を促す事で既存交通の利用効率を高め旅行時間等の短縮を図る政策はTDMと呼ばれ,手段,時間,経路の変更等様々な方策が実施されている.これを広く社会に普及させるためには,合理的な判断基準を利用者に提示する必要があると考え,スマートフォン等のGPS付き通信デバイスにより現況及び過去の旅行時間が正しく推定できる状況化において合理的な出発時間を利用者に提示することで時間的・空間的に交通需要を分散させる手法のシミュレーション実験を行った.その結果,経路のみを変更した場合と比較してより多くの利用者において旅行時間が短縮することが分かった。また,デマンドバスシミュレータ構築へ向けて,簡易的な運行経路探索アルゴリズムを実装したモデルを交通シミュレータに組み込んだ.交通利用者の手段選択の変化を促すには旅行時間の短縮が重要であるため,より効率的な(利用者の旅行時間が短い)運行経路の探索が重要となる.そのため,デマンドバスの経路探索手法に関する調査を行った.平成25年度は,末端交通を担う小型デマンドバスと都市間の移動を担う基幹大型バスを組み合わせた階層型デマンドバスの設計及びシミュレーション実験を行った.本研究の目的は,中規模都市圏におけるデマンドバスの導入可能性を評価するためのシミュレータの開発である.デマンドバスをシミュレーションにより評価するには,想定される利用者に対する経路計画問題(DARP)を解く必要がある.DARPはNP困難な問題であるため,これまでにさまざまな近似解法が提案されている.Jawらにより提案されたADARTWが計算効率及び解の精度ともに優れていると判断し,同アルゴリズムを採用したデマンドバスモデルを構築した.また,実乗車時間の削減を目的とした階層型デマンドバスの設計及びモデル化し,シミュレーションによる両者の比較実験を行った.シミュレーション実験では,行政による調査データに基づき入力データを作成した.さらに,既存交通網との比較のため現在運行中の路線バスをモデルとした固定路線バスモデルを構築した.シミュレーション実験の結果,市町村毎に若干のばらつきはあるものの,移動コストに関しては概ねADARTWと提案手法でほぼ同等であることが示された.また,両手法ともに固定路線バスモデルに対して旅行時間の点で優れている事が示された.一方,運用コストに関する評価実験として,車両の占有時間(車両を他の路線として再度利用可能となるまでの時間)を評価したところ,提案手法はADARTWモデルに対して半分程度の時間で再利用可能となることが示された.これは,提案手法が,既存手法と同じ旅行時間を提供可能な交通機関でありながら運用コストを半減できる可能性があることを示唆している.また,経路計画の求解に要する計算時間は,ADARTWに対して10分の1以下となる事が示された.地方部都市圏では,公共交通の利用促進のため利便性の高い交通機関が求められている.本研究では,複数レベルのデマンドバスを乗り継ぐ階層型デマンドバスシステムを提案し,実際の都市圏をモデルとしてシミュレーションによる評価実験を行った.提案システムは,既存の路線バスと同程度の旅行時間で移動可能で,かつ歩行距離が大幅に削減されると推定された.さらに,デマンドバスを含む交通網の定量的評価を行うための動的交通シミュレータの開発を行い,人口100万人規模の中核地方都市圏モデルを実用的な速度で実行可能であることを確認した.デマンドバスを交通シミュレーションに統合する上で,ベースとなる交通シミュレータ(以下,RTS)が十分な再現性を持っていることが重要となる.そこで今年度は,交通シミュレータの現況再現性の向上に関して,以下の2テーマについて研究を行った.まず,静的配分における分担交通量の現況再現性の向上を狙ったパラメータ推定を行った.RTSは,現状では自家用車の配分交通量及び各OD間の分担交通量の内,自家用車,モノレール,徒歩に関しては実測値と推定値に高い相関があるが、バスの推計値の誤差が大きい.RTSは,分担交通量推定モデルと配分交通量推定モデルを統合しており,両者を単一の利用者均衡配分問題として同時に解く.その際,各交通モードのサービスレベルは,平均乗車待ち時間,アクセス・イグレス距離,乗車時のランニングコストなどを外生変数として入力する必要がある.したがって,これら外生変数の最適値を探索することでより相関の高い推定値が得られると仮定し実験を行った.その結果,路線バスの全トリップにおける分担率及びOD間分担率の相関が改善された.さらに,道路交通のミクロシミュレーション部の改良を行った.

これまで用いていたNagelらの多速度モデルをベースとしたセルオートマトン(CA)モデルは,実装が容易でありかつ本質的に高度な並列性をもつため並列演算に適しているが,時間・空間的に離散的であるためサイズの異なる車両のモデル化やショックウエーブなどのドライバーの反応遅れに起因する現象の微調整が難しいという問題がある.そこで,マルチエージェント・システムをベースとした追従モデルを新たに実装した.新たに採用したモデルは,ニュートン力学に基づき車両の挙動をモデル化するためショックウエーブを含む渋滞に関連する現象を再現可能である.さらにスレッド化によりマルチコアCPUにおける処理速度を大幅に向上させた.本研究では,中規模都市圏(地方中心都市圏)における運行を想定したデマンドバスモデルの設計及びミクロシミュレータの開発を行った.デマンドバスを運行するためには,利用者の要求に合わせた経路計画を行う必要がある.この問題は一般にNP困難に分類され,利用者の数が一定以上の時,実用的な時間内での求解が困難となる.本研究は,多数の利用者を広範囲に輸送することを想定している点で従来研究と異なる.提案交通システムは,利用者の出発地及び目的地へ直接輸送する小型デマンドバスと市町村間をつなぐ比較的長距離を輸送する基幹バスを協調させた2層からなるシステムである.提案手法の評価として,利用者均衡配分により背景交通の交通負荷を推定し,調査時点での路線バス利用需要に対して,静的シミュレーションにより提案交通システム,既存の固定路線バス,既存のデマンドバスの3システムを用いた場合の旅行時間及び運行コストの比較を行った.実験結果は,提案手法が固定路線バスと同等の旅行時間で移動可能であることを示した.提案手法では,歩行距離が大幅に減少するため総合的なサービスレベルは向上すると考えられる.提案手法は,交通量の比較的多い地域を想定するため背景交通との相互作用を調べる必要がある.そのため,個々の利用者及び車両をエージェントとしてモデル化し,エージェントの相互作用をシミュレートするミクロ交通シミュレータの開発を行った.ミクロシミュレーションにより,渋滞が与える影響のより正確な評価や,乗継ぎ地点に必要なバス停の規模,渋滞回避を目的とした動的な経路変更などの評価が可能である.また,スレッド並列化による高速化を行ったため,沖縄県中南部(人口約110万人,面積478km2)地域の24時間のミクロシミュレーションが数分程度で実行可能である.交通シミュレーション本研究では,100万人規模の中核地方都市圏を対象として,実際の交通需要に基づくデマンドバスを含む交通網の定量的評価を行うための交通シミュレータの開発を目的の一つとしている.実務等でよく行われる静的な分担・配分交通量の推定手法と比較して個々の車両の振舞いをモデル化したミクロ交通シミュレータは,大域シミュレーションの実施例が少ないため,現況再現性の向上を目指してモデルの改良や提案を行っている.
光応答型化合物の水および環境有害物質分解システムの構築とその反応機構の解明

光応答型化合物の水および環境有害物質分解システムの構築のために, Mn, Pt, Mg錯体を合成して錯体の反応性と発光特性を検討し,それらの錯体を用いて可視光照射による酸素発生系の反応機構を解明した。さらに,これらの錯体をITO基板上に化学修飾することなく粘土単層膜による無機-有機ハイブリッド多層膜を形成させた電極を作製し,可視光応答型システムによる水および環境有害物質であるETDA・2Na分解電池の構築を行った。光合成は,十数億年前に完成したシステムであり無駄の無いエネルギー変換を行っているが,21世紀に予想される炭酸ガスによる地球温暖化,化石燃料の枯渇によるエネルギー問題,急激な人口増加による食料問題が包含されている反応システムである。本研究は,このシステムから多くの情報を得ることにより,光合成類縁錯体による水を酸化触媒する機能性Mn錯体と白金錯体の開発とそれらを用いたシステムの構築と反応機構の解明を行うことを目的としている。光合成のPSIIの4核Mnクラスターでは,水の4電子酸化を触媒し酸素が発生するが,本研究で合成したMn(III)錯体が水から酸素発生を触媒していることを明確にするために,先ず始めにモデル系(Ru(II)+Co(III)系)を用いた系で,H_2^<18>Oを用いて質量計により発生した酸素を測定した結果,質量数36の酸素が認められ,水から酸素への酸化が確認された。現在,Ru(II)+Mn(III)+Co(III)系について検討中である。また,光合成中の光励起種であるP680のモデル錯体として,現在,[Ru(bpy)_3]Cl_2を使っているが,P680はMg(II)錯体であるので,合成したMg(II)錯体の光特性を検討した。さらに葉緑体のPSIIが存在するチラコイド膜は,液晶性を示す分子2層膜でできており,その中にP680などの種々の触媒が配列されている。以前に,そのモデル錯体として長鎖アルコキシ鎖を持つVO(IV),Ni(II),Cu(II)錯体を合成し,新規な液晶構造を持つことを報告したが,今回,Pt(II)錯体を合成し,その液晶特性と溶液内挙動を検討した結果,発光する液晶性錯体であることが認められた。本研究は,このシステムから多くの情報を得ることにより,光合成類縁錯体による水を酸化触媒する機能性Mn錯体とPt錯体の開発とそれらを用いたシステムの構築と反応機構の解明を行った。さらに,光合成はチラコイド膜(分子2層膜)に触媒が順序よく埋め込まれていることから,これらの錯体をITO基板上に化学修飾することなく粘土単層膜による無機-有機ハイプリッド多層膜を形成させた電極を作製し,可視光応答型システムによる水および環境有害物質であるETDA・2Na分解システムの構築を行った。以下に得られた結果を示す。(1) Ru(II)-Mn(III)-Co(III)系について,H_2^<18>Oを用い,質量計により発生した酸素を測定して水分解による酸素発生の反応機構を解明した。(2) Mg(II)錯体と電子受容体であるメチルビオローゲンとの間の消光反応機構を解明した。(3)平成19年度は,Pt(II)錯体を合成し,その液晶特性と溶液内挙動を検討した結果,発光する液晶性錯体であることが認められた。20年度は液晶構造の同定を行い,Col_L相であることが分かり,今までに報告を見ないPt-Pt相互作用が存在するCol_L相であることが分かった。(4)合成された錯体をLB膜作製装置により粘土単層無機-有機ハオプリッド多層膜電極を作製し,環境有害物質であるETDA・2Na分解システムの構築を検討した結果,光電流が得られ,ETDA・2Na分解システムの構築がなされた。
細胞分化形態形成と細胞間相互作用の関係に関する細胞生物学及び分子遺伝学的解析

哺乳類における種々の成長因子やホルモンの作用、また高等植物における植物ホルモンによる生長調節や頂芽優勢の例に見られるように、他の細胞で作られた物質が別の細胞に影響して、増殖、生長、分化を支配する現象はよく知られている。このような細胞間相互作用を仲介する物質は、まず細胞に受容され、細胞内シグナルに変換され、細胞内の標的分子へと伝達される本プロジェクトは、細胞性粘菌を用い、細胞分化や形態形成における細胞外シグナルの重要性に注目し、その普遍的なシグナル変換素子として、MAP-キナーゼERK2が機能しているのかどうかを明らかにすることを目的とした。科研費の交付の期間内には、胞子の成熟に関与する葉酸類似の構造式をもつmonapterin、予定柄細胞特異的な遺伝子の発現に必須因子DIF-1、またこれに拮抗するアンモニアなどの効果がERK2によって仲介されいるのかどうか、仲介されているならばras依存性なのか、ヘテロ3量体G-タンパク依存性なのかを調べる。成果:(1)葉酸は生長期の細胞を誘引し、且つアデニリルシクラーゼを活性化する。この活性化にはERK2が関与しており、ヘテロ3量体G-タンパクを介して起こることを明らかにした。また、α4-サブユニットが関与していることを明らかにした。さらに、葉酸誘導体のmonapterinもERK2をα4-サブユニットに依存的に活性化することを明らかにした(JBC,272:23690-23695,1997)。(2)ERK2の活性化にはrasは阻害的に、PKAは促進的に働くことを明らかにした(JBC,272:3883-3886,1997)。(3)DIF-1もアンモニアもERK2活性には影響を与えなかった(未発表)。(4)DIF-1と膜透過性のcAMPアナログ、8-ブロモcAMPは予定胞子から柄細胞への転換を促進することを明らかにした(Com.Biochem.Physiol.118A:841-845,1997)。本プロジェクトでは、細胞性粘菌を用い、細胞分化や形態形成における細胞間相互作用の果たす役割を明らかにするために、細胞外シグナルの変換素子として働くMAP-キナーゼ(ERK2)に注目して、その活性化にどのような細胞外シグナルが関与しているかを解明することを目標とした。また、ERK2を欠損する突然変異株を用いて、この表現型を抑制する遺伝子の単離を目指した。成果1)ERK2はサイクリックAMP(cAMP)によって活性化されることを既に報告したが、この活性化は癌遺伝子rasおよびcAMP-依存性タンパク質キナーゼ(PKA)によって調節されていることを明らかにした(文献1)。2)ERK2を活性化する新しい細胞外シグナルとして葉酸が働くことを明らかにした。また、この活性化は発生段階で調節されており、増殖期および細胞分化が開始する時期に高い活性化が起こることが分かった。さらに、この活性化にはG-タンパクのアルファ・サブユニット4が不可欠であることを明らかにした(文献2)。3)細胞分化の転換を試験管内で可能にする実験系を確立した。細胞性粘菌には予定柄細胞と予定胞子細胞が分化するが、細胞外シグナル分子の一種類であるDIFとcAMPのアナログ(8-bromo cAMP)を用いることにより、予定胞子細胞を予定柄細胞へ転換させることが可能になった(文献3)。

4)erk2サプレッサー遺伝子の単離ERK2を欠損する突然変異株を用い、挿入突然変異法により2種類のサプレッサーを単離した。その一種から、遺伝子の回収に成功したが、既知のタンパク質に相同性を示すものはなかった。これについては現在解析中である。哺乳類における種々の成長因子やホルモンの作用、また高等植物における植物ホルモンによる生長調節や頂芽優勢の例に見られるように、他の細胞で作られた物質が別の細胞に影響して、増殖、生長、分化を支配する現象はよく知られている。このような細胞間相互作用を仲介する物質は、まず細胞に受容され、細胞内シグナルに変換され、細胞内の標的分子へと伝達される。本プロジェクトは、細胞性粘菌を用い、細胞分化や形態形成における細胞外シグナルの重要性に注目し、その普遍的なシグナル変換素子として、MAP-キナーゼERK2が機能しているのかどうかを明らかにすることを目的とした。科研費の交付の期間内には、胞子の成熟に関与する葉酸類似の構造式をもつmonapterin、予定柄細胞特異的な遺伝子の発現に必須因子DIF-1、またこれに拮抗するアンモニアなどの効果がERK2によって仲介されいるのかどうか、仲介されているならばras依存性なのか、ヘテロ3量体G-タンパク依存性なのかを調べる。成果:(1)葉酸は生長期の細胞を誘引し、且つアデニリルシクラーゼを活性化する。この活性化にはERK2が関与しており、ヘテロ3量体G-タンパクを介して起こることを明らかにした。また、α4-サブユニットが関与していることを明らかにした。さらに、葉酸誘導体のmonapterinもERK2をα4-サブユニットに依存的に活性化することを明らかにした(JBC,272:23690-23695.1997)。(2)ERK2の活性化にはrasは阻害的に、PKAは促進的に働くことを明らかにした(JBC,272:3883-3886,1997)。(3)DIF-1もアンモニアもERK2活性には影響を与えなかった(未発表)。(4)DIF-1と膜透過性のcAMPアナログ、8-プロモcAMPは予定胞子から柄細胞への転換を促進することを明らかにした(Com.B10chem.Physiol.ll8A:841-845.1997)。
肺癌発生におけるDNAメチル転移酵素およびmicroRNAの役割

1.発癌課程におけるDNMTとHMTの関与を検討するため、不死化から癌化に至る各段階の肺細胞株(NHBE)を作成した。DNMTに関しては、DNMT3bの各spliced form(DNMT3b1-3b5)の発現パターンが、不死化までしか認めなかったNHBEと癌化NHBEでは明らかに変化した。またDNMT3bのKOにより、腫瘍増殖能が減弱し、その機序として一部の癌抑制遺伝子の再発現が関与していた。一方HMTに関しては、不死化・癌化細胞においては種々のHMTのうち、H3K9あるいはH3K27に対するHMTであるSuvh39、G9a、Ezh2の発現亢進が認められた。H3K9のHMTに対するsiRNAは細胞増殖速度・腫瘍形成能を有意に減少させ、H3K27のHMTへのsiRNAは腫瘍形成能を著明に抑制したが、H3K4のHMTに対するsiRNAはいずれにも影響しなかった。2.DNAメチル化とmicroRNAとの関連については、当初計画していた癌抑制遺伝子のプロモーター領域に対するprobeによるRNase protection assayを用いた方法では、最終的にシークエンスを行うだけの十分な検体が得られないことから、microRNAに対するマイクロアレイを用いて、癌化NHBEに特異的に発現している網羅的な解析を行った。さらに現在、メチル化DNA特異的な抗体を用いてメチル化DNA免疫沈降後に、プロモーターアレイを行い、DRIMアルゴリズムに基づいたバイオインフォマティック解析により、メチル化を来しやすい共通塩基配列を見いだすべく実験を行っている。仮にそれぞれの実験系で類似、あるいは同一の塩基配列が得られた場合、その塩基配列を持つmicroRNAはDNAのメチル化に関与している可能性が強く示唆され、細胞内へmicroRNAの導入により、標的遺伝子のメチル化が誘導されるか否かを検証していく計画である。1)非小細胞肺癌細胞株および正常ヒト気管支上皮細胞(NHBE)の不死化・癌化モデルでの各ヒトHMTのmRNA発現量を測定した。また各HMTに対するsiRNAを不死化または癌化NHBEに導入し、細胞増殖能と軟寒天培地腫瘍形成法により癌化能を評価した。NHBEに比し、全ての非小細胞癌細胞株で各HMTの発現は亢進しており、不死化・癌化NHBEではH3K4を除く全てのHMTの発現が亢進していた。H3K9のHMTに対するsiRNAは細胞増殖速度・腫瘍形成能を有意に減少させた。H3K27のHMTへのsiRNAは腫瘍形成能を著明に抑制したが、細胞増殖速度は変化させなかった。H3K4のHMTに対するsiRNAはいずれにも影響しなかった。以上から、H3K9・K27のHMT発現の変化は、肺癌の不死化・癌化過程に関与していることが示唆された。現在、ヒストンのメチル化状態を調べるため、各種のメチル化ヒストン抗体でのWestern-blotを行い、また各種HMTの標的遺伝子の検討も行っている。2)一方、microRNAとDNAメチル化との関連については、癌抑制遺伝子のTSLC1をターゲットとして、TSLC1のプロモーター領域がメチル化されている細胞(癌化NHBE)とされていない細胞(不死化NHBE)を用いて、それぞれの細胞から抽出したmicroRNAと細分化した複数のCpG islandを含むプロモーター領域をprobeとしてhybridizationを行い、RNase protection assay法により、検出されるバンドを比較した。癌化NHBEでのみ検出される20-30bpのバンドが認められたが、微量な検体のためシークエンスの結果が得られていない。そこで現在は、感度を上げるための検討を行うとともに、microRNAに対するmicroarrayを用いて、同様の細胞から網羅的な解析も同時に行っている。