hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
呼吸器疾患の病態における接着分子の役割と新しい治療法の開発

2)IL-8とTNFαとの協同作用によって好中球依存性に血管透過性を亢進させることを示し,このメカニズムに、TNFαによって誘導された血管内皮細胞上の接着分子の発現が関与していることを明らかにした。すなわちサイトカインが、様々なメカニズムによって血管透過性をmodulateし、high permeability lung edemaの病態に重要な役割を果していることを示した。3)サイトカインで活性化させ接着分子の発現をおこした血管内皮細胞への接着により好中球は活性化され活性酸素産生能やロイコトリエン産生能が亢進することを示し、接着分子が細胞の活性化や情報伝達に関与していることを明らかにした。1)種々の呼吸器疾患動物モデルをもちいて抗接着分子抗体、可溶性接着分子、接着阻害ペプチド、接着分子の発現を抑制する薬剤などの効果を検討して新しい治療法の臨床応用の可能性を検討した。i)昨年度ラットのエンドトキシン気管内注入による急性肺障害モデルにおいて好中球の接着分子CD18に対する抗体が肺への好中球の浸潤を抑制しうるという知見を得て報告したが、今年度はさらにこのモデルを用いてanti-oxidantであるN-acetylcysteine(NAC)やレシチン化SODの効果を検討した.これらの薬剤でエンドトキシンによる肺への好中球集積を抑制し得た.この作用には接着分子発現が関与していると考えられるため,さらにラット肺におけるICAM-1mRNAの発現に与える影響を現在検討中である。2)引き続き,サルコイドーシスや間質性肺炎などの呼吸器疾患における血中およびBALF中の可溶性接着分子ICAM-1, VCAM-1を測定し、疾患の活動性や予後との相関を検討した.
家畜は夜作られていない

「家畜は夜作られる」という諺が昔は語られていた。これは、十分な急速によって、エネルギーのロスを少なくすれば、それだけ、家畜の健康を保証し、成長や生産を促進できるという科学的な常識であった。本研究グループは、上記の考えは理論的には間違っていないと考えるが、昨今の近代的、すなわち集約的な使用管理下の家畜での行動などの実態をみていると、現状では全く異なっているのではないかと発想し、下記のような調査を行った。本研究では、草地での放牧、コンクリート床のペン、ケージ(鉄枠)の3種の飼育管理条件を設定し、それらの生理的・行動的状態を、心電図、脳波、および暗視ビデオカメラを用いて調査した。なお、5分毎に睡眠の程度を、身体の動き、心電図、および脳波で評価し、5点満点で評価した。なお、豚の睡眠時脳波については、ヒト脳波の分類に近似させることを試みたが、出現波形の違いと出現頻度の特徴から6種類に分類し、他の生理的指標をあわせた。その結果、豚のおかれた飼育環境によって、睡眠の状態は著しく異なることが明らかとなった。すなわち、ケージ飼育では、見た目では"睡眠"下にあるが、脳波はα波がもっとも多く、深い睡眠を示す脳波は殆ど出現しなかった。この場合、心拍数は少なくなることはなく、多いままであった。従って、拘束下の豚は、行動面では横臥・伏臥しているが、エネルギー消耗の多い状態であることが明らかとなった。逆に、放牧された豚の脳波と心拍数を観察すると、横臥時の脳波は周期的に深いものとなり、心拍数も明らかに少ないことが観察された。従って、この豚ではエネルギー消耗の少ない休息を行っていることが明白であった。コンクリート床のペンで飼育した豚の休息時の生理的指標は、上記のケージ拘束と放牧との中間にあった。以上より、通常の集約的養豚システムでの豚では休息時もエネルギー消耗が多く、「寝る子は育つ」という諺はあてはまらないことが確認された。昔からヒトの子供に関して「眠る子は育つ」「寝てばかりいると牛(豚)なる」という諺があるが、これらが豚にも当てはまるかどうか。筆者らは、ペン等で拘束された豚は一日の大部分を眠て過ごしているが、放牧の豚の方が増体が良好であることを明らかにしている。そこで、本年度は睡眠時脳波の特徴から検討した。本研究では、豚(60→120kg)を、放牧・ペン・ケージの3種の管理条件下で長期間飼育し、その際の脳波形と心電図をテレメーターで5分毎に記録した。前頭部の3点に脳波電極を設置し、ヘッドキャップで保定した。行動動作は暗視ビデオカメラで観察した。豚で見られた脳波形はヒトに類似するものもあったが、複雑な変動を示すので、活動時の雑音主体のものを第0波形とし、15Hz以上の速波を第1波形、8-11Hzの正弦波を第3波形(α波)とし、7Hz以下の徐波を第8波形として、計9種の脳波形に分類した。これを、心拍数、行動動作、等と関連付けて検討し、各波形の意味付けを行って、睡眠の評価を行った。なお、休息時間は放牧区の82.3%に対してケージ区は96.2%であった。放牧区で横臥休息で閉眼している時の脳波を見ると、閉眼5分後には第4-5波形が増加し、さらに閉眼状態が続くと第7波形が60%を占めるまでになった。なお、心拍数は、波形の番号が上がるにつれて減少する傾向にあった。放牧区では第4波形以上が多い傾向にあったのに対し、ケージ区では1日の全時間にわたって波形番号の小さい脳波形が出現した。ケージ区では浅い睡眠が続いて、エネルギー消耗的な休息が多かった。

逆に、放牧された豚の脳波と心拍数を観察すると、横臥時の脳波は周期的に深いものとなり、心拍数も明らかに少ないことが観察された。従って、この豚ではエネルギー消耗の少ない休息を行っていることが明白であった。コンクリート床のペンで飼育した豚の休息時の生理的指標は、上記のケージ拘束と放牧との中間にあった。以上より、通常の集約的養豚システムでの豚では休息時もエネルギー消耗が多く、「寝る子は育つ」という諺はあてはまらないことが確認された。
高所農作業用インテリジェント作業台の開発研究

1.高所作業台の現状調査510数メ-トルの高所作業用では車載型の大型のものが普及しているが、2ないし3メ-トル程度の作業では梯子、キャスタ付きの台車、脚立などがほとんどであり、機械化は遅れている。2.考案した高所作業台の概要本体の中心部の一点に回動自在に取り付けられた伸縮自在の4本の長い脚を持ち、互いに隣接する2つの正三角形の頂点(平行四辺形)上に接地する。この状態でおのおのの脚の長さを変えることによって、作業者搭乗位置の水平移動、垂直移動を可能にしている。また上記平行四辺形と一辺を共有する三角形(4個存在)の頂点に1本の脚を移動し、重心を移動することによって、静歩行することを可能としている。それぞれの脚の長さは、垂直・水平位置の決定のほか、重心位置を安定域内に保持することを目的とし、コンピュ-タによって制御する。3.設計・試作歩行性能や安定度の検討を目的として、1/4スケ-ルの模型の設計・試作を行い、機構的な問題点の抽出を行った。4.まとめ高所作業の多くは、その移動の重要性は少なく、正確な位置だしや安定面が重要となる。従って、連続走行が可能な脚回りは必要ではなく、間欠的な移動で十分であると考える。また、安定性を向上するためには重心を低く、重くするのではなく、脚を長くすることによって、接地間隔を広げ安定化を図り、軽量化を行うことが重要である。本研究により間欠的な歩行を可能にする簡潔なメカニズムが得られたと考えられる。今後は模型レベルでコンピュ-タ制御によるパルスモ-タを用いて歩行試験を行い、油圧駆動の実機の試作へ移行して行く予定である。
重症マラリアの病理発現における細胞接着分子の役割に関する研究

1)ニホンザルを用いたP.coatneyi感染試験:供試した2頭は(J-6,J-7)、感染4日後より末梢血液中にマラリア原虫が認められ、J-6については感染13日後(赤血球感染率13%)、貧血を主徴とした症状(Ht.値19%)にともなって嘔吐、暗赤色尿の排泄、軽度の震戦を繰り返したのち昏睡に至り、ケタミン麻酔下で放血殺に処した。J-7については感染10日後(赤血球感染率15%、Ht.値34%)より暗赤色尿の排泄を認め、感染11日後重度の貧血(Ht.値21%)を示して死亡した。3)P.coatneyi感染経過にともなう末梢単核球の細胞内サイトカインの推移:感染経過にともなう末梢単核球中の細胞内サイトカイン陽性細胞を推移をフローサイトメトリー法により観察した。その結果、J-6、J-7とも感染後の末梢単核球に見られるTNF-αおよびIFN-γ陽性細胞の出現率に著明な変化は認められなかった。4)ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対するP.coatneyi感染赤血球の接着試験:TNF-α,20ng/mlで23時間刺激培養したHUVECに、J-7より採取した感染血球を混和して2時間培養したところ、44%のHUVEC表面に17個の感染赤血球の接着現象が認められた。これらよりP.coatneyi感染血球もヒト熱帯熱マラリア原虫と同様に、接着現象にlCAM-1の関与することが強く示唆された。
光硬化型グラスアイオノマーセメントを用いた補修修復術式の確立に関する研究

申請者らは,この補修修復法への光硬化型グラスアイオノマーセメント(以後,光セメント)応用に関して一連の検討のうち,光セメントを用いた修復法の臨床応用の拡大に関する検討として,被着歯面を歯科鋳造用合金として,メタルプライマーおよび光重合型レジンに付属するボンディング材の使用が,光セメントの接着性におよぼす影響について検討し,その臨床使用術式を確立するものである。実験に供試した補修周修復の対象としては,同種セメントあるいはコンポジットレジン,さらにメタルとしては,20K金合金,12%金銀パラジウム合金,銀合金およびCo-Cr合金の4種類を使用する。表面処理材としては,市販のメタルプライマー4製品と光重合レジンに付属するボンディング材4製品である。接着試片の製作は,通報にしたがって鋳造された金属を被着面とし,これにボンディング処理あるいはメタルプライマー処理などを行った後,この面に設置したテフロン型にセメントペーストを製造者指示に従って填塞,これを接着試片とした。これらの接着試片を,試片製作後37°C精製水に浸漬保管し,インストロン万能試験機(Type4042,Instron)を用いてその剪断接着強さを測定した。あわせて,剪断試験後の試片の破断面を走査型電子顕微鏡(JSM-5400,日本電子)を用いて写真撮影を行った。その結果,いずれの補修対照であっても,ボンディング材の使用はその接着強さの向上に有効であり,さらに,シラン処理材あるいはメタルプライマーの使用が補修修復物の接着性の向上には有効な臨床技法であることが示された。したがって,今後予想される補修修復には,この光セメントが適切な前処理材の使用することでその有効性を発揮することが示唆された。光硬化型グラスアイオノマーセメント(以後,光セメント)などの審美性修復物表面に限局する不快事項に関しては,修復物の事故部分のみを削除して,その削除部を新しく修復する,補修修復法が提唱されている。そこで,表面処理材としてボンディング材を用いた試片にサーマルサイクリング(以後,TC)を負荷し,新旧修復物間の接着耐久性および物性の指標としてその曲げ強さについて検討を加えた。光セメントは,フジアイオノマータイプIILC(ジーシー)およびVitremer(3M))の2製品で,ボンディング材としては市販の5製品を用いた。これらの光セメントを練和,硬化させ,劣化条件としては,TCを10,000回負荷した後に,照射面から1mmの深さまで研削し旧光セメント試片とした。この研削面に供試したボンディング材を塗布して新たな光セメントを補修するものとした。その結果,1.サーマルサイクリングによる接着耐久性は,表面処理材とレてフィラー含有のボンディング材を用いることによって高くなる傾向があった。2.接着試験後の破壊形式は,フィラー含有ボンディング材では混合破壊あるいは凝集破壊が多い傾向があった。また,サーマルサイクリングの負荷回数の増加に伴い,いずれのボンディング材でも界面破壊が増加する傾向があった。3.サーマルサイクリングによる曲げ強さの耐久性は,表面処理材としてフィラー含有のボンディング材を用いることによって高くなる傾向があった。実験に供試したメタルとしては,20K金合金,12%金銀パラジウム合金,銀合金およびCo-Cr合金の4種類を使用する。

表面処理材としては,市販のメタルプライマー4製品と光重合レジンに付属するボンディング材4製品である。接着試片の製作は,通報にしたがって鋳造された金属を被着面とし,これにボンディング処理あるいはメタルプライマー処理などを行った後,この面に設置したテフロン型にセメントペーストを製造者指示に従って填塞,これを接着試片とした。これらの接着試片を,試片製作後37°C精製水に浸漬保管し,インストロン万能試験機(Type 4042,Instron)を用いてその剪断接着強さを測定した。あわせて,剪断試験後の試片の破断面を走査型電子顕微鏡(JSM-5400,日本電子)を用いて写真撮影を行った。その結果,いずれのボンディング材であってもAg,CCなど比較的卑な金属元素を含有するメタルに高い接着強さを示した。これは前述した酸化皮膜形成の影響と考えられた。また,ボンディング材の種類による接着強さの向上傾向の違いについては,それぞれのボンディング材で使用されている機能性モノマーの種類による違いはほとんど認められなかったものの,ボンディング材に含有されるマイクロフィラーによる違いが認められた。また,接着試験後の破壊形式ではいずれの試片においてもボンディング材からの凝集破壊が大勢を占め,またAgおよびCCでは,光セメントの凝集破壊も認められた。
遺伝子発現制御にかかわる新規RNAの作用機序の解明

元来、細胞内にはRNA干渉と呼ばれる特異的にターゲットとするメッセンジャーRNA(mRNA)を分解する機構が存在する。この機構においてターゲットとするmRNAを識別する分子としてmiRNA(マイクロRNA)が重要な働きをしている。しかし、私はこれまでに本来のmiRNAとは異なる構造のmiRNA(短縮型miRNA、ghRNA)がRNA干渉を引き起こし、ターゲットとなる遺伝子の発現を抑制することを見出している。また、細胞内に存在する全てのRNAの解析から内在性のghRNAが存在することが示唆されている。そこで本研究ではその短縮型miRNAの探索とその作用機序の解明を目的として研究を進めている。本年度の研究では、前年度に引き続き短縮型miRNA(ghRNA)の探索をおこなった。その結果、複数のghRNAと思われる低分子のRNAを見出すことができている。それらghRNAがターゲットとする遺伝子を予測したところ、少数ではあるが今回見出したghRNAのうちのいくつかはがんや増殖、細胞分裂などに関連すると思われる有用な遺伝子をターゲットとしていることが示された。そこで、このghRNAを用いてターゲットとなる遺伝子のRNA干渉が誘導されるかどうか検討を続けている。されに、ghRNAのによるRNA干渉機構を解析するためにRNA干渉に関わるDicer1およびAGOファミリータンパク質を欠損した細胞株の作製を進めている。今年度はDicer1欠損細胞株が完成した。この細胞株を用いた実験では、現在のところ内在性のghRNAはDicer1を欠失していてもターゲット遺伝子の発現を抑制しているようである。このことは内在性ghRNAがDicer1とは独立して機能している可能性が示唆されている。またAGOファミリータンパク質についても欠損細胞株の作製を続けている。Dicer1とAGOファミリータンパク質の欠損細胞の作製に予想以上の時間がかかっており、そのため、これらの細胞株を用いた実験が多少おくれが出ることが予想されている。それ以外の部分においては概ね予定通りに進行している。Dicer1およびAGOファミリータンパク質欠損細胞株の作製に時間はかかっているが、今後の実験にとって肝要な部分であるため時間的スピードを意識しつつ確実な研究を進めていく。Dicer1とAGOファミリータンパク質の複数欠損細胞を用いてghRNAとDicer-Agoによる遺伝子発現抑制の作用機序を解析する。ghRNAをDicer-Ago欠損または非欠損細胞に導入し、標的遺伝子の発現量をqPCRおよびマイクロアレイによって解析する。さらに、ghRNAによるRNA干渉にかかわる分子としてDicer1およびAGO以外に関与することが考えられることから、ghRNAをリガンドとして用いたアフィニティ精製により細胞抽出物からghRNAによるRNA干渉関連分子の取得を試みる。これまで、がん治療のために様々な治療法が生み出されてきた。近年、がん治療において注目を集め盛んに研究が進められているのが、がん細胞特有の分子に焦点をあてた分子標的治療薬の開発である。私は分子標的薬であるmiRNAに着目し、新たな構造を持つ短縮型miRNA(ghRNA)を開発に携わってきた。このghRNAは高いがん遺伝子抑制を示し、副作用も少ないと考えられる。しかし、このghRNAはこれまでのmiRNAとは大きく構造が違うことから、これまで考えられているmiRNAの作用機序とは異なる可能性がある。そこで、本研究では短縮型miRNA(ghRNA)による遺伝子発現の抑制機序を解明することを目的としている。短縮型miRNA(ghRNA)の機能や作用機序を解析するため、まずは細胞内での内在性ghRNAの探索をおこなった。その結果、がん細胞内で転写されたRNAの網羅的解析からsmall-RNAに相当すると思われる長さのRNAを選別し、さらにその配列情報を基に二次元構造予測から本研究の対象とするghRNAになりうるRNA配列を細胞内に多数見出した。今後この解析で見出したghRNAが標的とする遺伝子を予測検討する。さらに、miRNAによる遺伝子発現抑制は二つのRNse活性を持つタンパク質、DicerとAgoファミリータンパク質(Ago14)が重要であることがわかっている。そこで、Dicer-Agoによる遺伝子制御とghRNAの関連を調べるために、DicerおよびAgoファミリータンパク質を欠損した細胞株の作製を進めている。方法としてCRISPR/Cas9を用いてDICER欠損細胞株を作製中である。平成29年度に予定していた研究は概ね終了もしくは進行中であるため元来、細胞内にはRNA干渉と呼ばれる特異的にターゲットとするメッセンジャーRNA(mRNA)を分解する機構が存在する。

この細胞株を用いた実験では、現在のところ内在性のghRNAはDicer1を欠失していてもターゲット遺伝子の発現を抑制しているようである。このことは内在性ghRNAがDicer1とは独立して機能している可能性が示唆されている。またAGOファミリータンパク質についても欠損細胞株の作製を続けている。Dicer1とAGOファミリータンパク質の欠損細胞の作製に予想以上の時間がかかっており、そのため、これらの細胞株を用いた実験が多少おくれが出ることが予想されている。それ以外の部分においては概ね予定通りに進行している。今年度は昨年度に見出した内在性ghRNAの細胞内での機能の一端を検証する。先の網羅的解析結果から見出した内在性のghRNAとその標的予測によって得られた遺伝子候補を用いて内在性ghRNAの遺伝子抑制機能について検討をおこなう。この実験では細胞増殖および細胞周期などから、がんや疾病に関わる遺伝子およびghRNAを優先的におこなう。機能解析としては、まずは見出した新規ghRNAを細胞に導入し、その後細胞より全RNAを抽出し、導入した新規ghRNAが標的すると予測された遺伝子の発現量の変化を検討する(qPCR)。それによって、実際に発現量の変化する遺伝子を見出し、新規短縮型miRNAと標的遺伝子の制御関係を明らかにする。また、新規短縮型miRNAが標的とする遺伝子が多岐に渡る場合にはマイクロアレイ解析をおこなうことで新規短縮型miRNAが作用する遺伝子群の全体像を明らかにすることができる。さらに、前年度に引き続き、RNA干渉に不可欠と言われる分子のAgoファミリーの欠損細胞株の作製をおこなっていく。そして、DicerおよびAgoファミリータンパク質の欠失した細胞株を作製することでghRNAの作用機序に必須な分子の一端を明らかにできると考えられる。Dicer1およびAGOファミリータンパク質欠損細胞株の作製に時間はかかっているが、今後の実験にとって肝要な部分であるため時間的スピードを意識しつつ確実な研究を進めていく。Dicer1とAGOファミリータンパク質の複数欠損細胞を用いてghRNAとDicer-Agoによる遺伝子発現抑制の作用機序を解析する。ghRNAをDicer-Ago欠損または非欠損細胞に導入し、標的遺伝子の発現量をqPCRおよびマイクロアレイによって解析する。さらに、ghRNAによるRNA干渉にかかわる分子としてDicer1およびAGO以外に関与することが考えられることから、ghRNAをリガンドとして用いたアフィニティ精製により細胞抽出物からghRNAによるRNA干渉関連分子の取得を試みる。
直腸癌術後の予防的骨盤内ドレーンとPelvic sepsisの関連調査

直腸癌の根治治療は手術療法である。直腸癌手術において、Pelvic sepsisは最も重篤な合併症であり、QOLの低下などの短期成績だけでなく、再発率増加など長期成績にも大きな影響を与える。Pelvic sepsisのリスク因子として様々な要因が報告されているが、外科医が合併症予防のために慣習的に挿入する予防的骨盤内ドレーン管とPelvic sepsisの関連に関しては不明である。本研究の目的は、福島県がん診療連携拠点病院の院内がん登録データを基に、多施設共同の過去起点コホート研究を実施し、直腸癌術後の予防的骨盤内ドレーン管と、Pelvic sepsisの関連を明らかにすることである。
カオスと大自由度力学系の理解のための力学系の大域的分岐の研究

カオスや大自由度系を含む力学系の大域的構造とその分岐を幾何的方法,位相的方法,複素解析的方法,さらには応用に現れる具体的な数理モデルの解析などの様々な側面から研究して多くの成果を得た.特に本研究では,位相的方法を,精度保証付き数値計算に基づく計算的方法と組み合わせて力学系の大域的構造と分岐についての数学的に厳密な計算機支援解析の方法を開拓し,特異分岐構造の存在,カオス的振舞いを示す記号力学系の埋め込み,双曲性の検証などのいくつかの重要な問題を解決した.これは力学系の多様な振舞いを解析するための1つの有用な方法として今後,発展していく可能性があると期待される.カオスや大自由度系を含む力学系の大域的構造とその分岐を幾何的方法,位相的方法,複素解析的方法,さらには応用に現れる具体的な数理モデルの解析などの様々な側面から研究して多くの成果を得た.特に本研究では,位相的方法を,精度保証付き数値計算に基づく計算的方法と組み合わせて力学系の大域的構造と分岐についての数学的に厳密な計算機支援解析の方法を開拓し,特異分岐構造の存在,カオス的振舞いを示す記号力学系の埋め込み,双曲性の検証などのいくつかの重要な問題を解決した.これは力学系の多様な振舞いを解析するための1つの有用な方法として今後,発展していく可能性があると期待される.本年度の得られた主な研究成果は以下の通りである。Kuramoto-Sivashinsky方程式の進行波解を記述する常微分方程式系であるMichelson系においてパラメータを変化させるとheteroclinic軌道の無限回の分岐がそれがsaddle-node周期軌道の分岐点に集積する"cocoon bifurcation"と呼ばれる分岐現象が見られる.国府はそれが一般的にcusp-transverseheteroclinic chain(CTHC)と名付けた特異不変集合からの大域的分岐によって引き起こされることを示した.このCTHCの構造は数値的にはMichelson系で存在が確認され,数学的な検証も比較的容易であると考えられる.岡本はいくつかの連続だが微分不可能な関数を含む新しい関数族を構成し,フラクタル的なグラフを持つ関数の性質を調べた.西浦らは1次元格子上の空間離散的な反応拡散系においてカオス的な振る舞いをするパルス解を含むいくつかの興味深い挙動を示す解を数値的に見出した.これは近接結合を持つ結合系の力学系的振る舞いの研究に有用な手がかりを与えると思われる.小川らはSwift-Hohenberg方程式の大域的分岐を,位相的方法と精度保証付き計算に基づく計算機支援証明を組み合わせた位相計算理論を用いて調べた.辻井らはsolenoidal attractorと呼ばれるある種の歪積型の2次元写像のSRB測度の密度関数の微分可能性に関する結果を得た.今年度の研究成果は以下のとおりである:(1)國府はMichelson系と呼ばれる3次元の多項式ベクトル場の1パラメータ族に見られるヘテロクリニック軌道の無限回の分岐の集積現象を調べ、その組織中心を分岐理論的に明らかにした([1])。またその機構が実際にMichelson系において起きることを精度保証付き計算と位相的議論を用いて数学的に厳密に証明した(Zgliczynski, Wilczakとの共同研究、論文準備中)。これにより昨年度に発表したcusp-transverseheteroclinic chainについての結果が補完され,大域的分岐の構造がより明らかになった.(2)國府はまたfast-slow系というベクトル場の特異摂動系の構造をConley指数を用いて調べる理論を、遅い多様体が2次元以上の場合に拡張した([2])。また、その応用としてGardner-Smollerによって研究されたある種の反応拡散系の進行波解をこの理論を用いで調べ.2種類の周期進行波解や.それを任意の順序でつなぎ合わせたような波形を持つ無限個の進行波解の存在を証明した(論文印刷中).(3)荒井はMischaikowと共同でhomoclinic接触を計算機支援により厳密に証明する位相計算理論的方法を与えた.(4)稲生は複素3次多項式の繰り込みについて調べ,繰り込みの列が収束するための組み合わせ論的な条件を得た.(5)辻井はLiveraniとの共同研究で,一様双曲的な力学系のゼータ関数の解析的性質についての新しいアプローチを与えた.これには辻井とBaladiが導入したある種の超関数のなすBanach空間の性質が重要な役割を果たす.(6)小川は浅い長万形領域におけるRayleigh-Benard対流についての分岐解析を行い,中心多様体上の3次までの分岐方程式を得た.これにより六角形パターンやパッチワークキルトと呼ばれる混今モードの解の安定性が例えばGinzburg-Landau方程式と同様に不安定であることが予想されるが,領域の形状によって安定な混合モード解も存在することがわかった.(1)Michelson系と呼ばれる3次元の多項式ベクトル場の1パラメータ族に見られるheteroclinic軌道の無限回の分岐の集積現象(coccon bifurcation)の組織中心が実際にMichelson系において起きることを精度保証付き計算と位相的議論を用いて数学的に厳密に証明した.(2)前年度の研究でfast-slow系というベクトル場の特異摂動系の構造をConley指数を用いて調べる理論を,遅い多様体が2次元以上の場合に拡張したが,その応用としてGardner-Smollerによって研究されたある種の反応拡散系の進行波解をこの理論を用いて調べ,2種類の周期進行波解や,それを任意の順序でつなぎ合わせたような波形を持つ無限個の進行波解の存在を証明した.(3)

1次元写像の双曲性に関連するManeの条件を満たすパラメータ集合をグラフアルゴリズムと精度保証付き数値計算を用いて求める方法を与え,実際に2次関数の場合に適用した(Luzzatto, Mischaikow, Oka, Pilarczykとの共同研究,論文投稿中).(5)写像によって定義される力学系の族について,相空間とパラメータ空間を有限サイズの格子に分割し,それから精度保証付き計算とホモロジー計算によって,力学系のMorse分解と各Morse成分のConley指数の情報を力学系の大域的構造として格納する方法を開発した(Arai,Kalies,Mischaikow,Oka,Pilarczykとの共同研究,論文準備中).(6)分担者荒井迅はHenon写像の双曲性パラメータを判定する計算機支援証明の方法を得た.本年度の研究成果は,主として力学系の様々な大域的構造に対する計算機援用解析の新しい方法の開発に関するものであり,次の2点にまとめられる.(1)力学系のデータベース・スキーマの開発:写像によって定義される力学系の多次元パラメータ族について,相空間とパラメータ空間を有限サイズの格子に分割し,精度保証付き計算を用いてダイナミクスの情報を組み合わせ多価写像として表現して外近似を得ることができる.これに対してさらにグラフ・アルゴリズムなどを用いて力学系のMorse分解を求め,その各Morse成分に対してホモロジー計算によってそのConley指数の情報を力学系の大域的構造として格納し,データベースとして活用する方法をデータベース・スキーマと呼び,そのための方法の基礎付けを行った.さらにこのデータベース・スキーマをLeslieモデルと呼ばれる生物の個体数モデルに対して適用し,具体的なデータベースの構築を試みた.このデータベース・スキーマの方法は,より多様な数理モデルに対して適用でき,それらの大域的構造やパラメータに対する変化を解析するのに有効であると考えらるので,今後,この方法の更なる改良と発展を目指す.(2)力学系の双曲性の位相計算的方法による検証:区間上で定義された1次元写像の1パラメータ族に対して,臨界点近傍の外での一様双曲性に関するManeの条件を満たすパラメータ集合を,グラフ・アルゴリズムと精度保証付き数値計算を用いて求める方法を与えた.また,それを実際に2次関数の場合に適用して,その一様双曲性の強さとパラメータの関係を示すいくつかの計算結果を得た.これらの結果は,1次元写像の振舞いに対する統計的性質と密接に関係しており,これを基にして正のLyapunov数や絶対連続な不変測度の存在するパラメータ集合の計算機援用解析への第一歩となる結果であると考えられる.
陽極酸化法による遷移金属/貴金属人工格子ナノワイヤの界面垂直磁気抵抗と磁区構造

本研究はAlの陽極酸化により得られるアルマイト膜の微細孔に、電着法により遷移金属/貴金属の人工格子を積層析出させたナノワイヤを作製し、界面垂直(以下CPPと略記)巨大磁気抵抗効果及び微細磁区構造と磁化過程を明らかにし高密度磁気ランダムアクセスメモリへの展開を図ることを目的とする.アルミナ層の底面に微細孔を設け、直流電流によるアルマイト法を開発した。この方法を利用すればアスペクト比900のナノワイヤの作製が可能である。更にこの作製法を人工格子ワイヤの作製に適用して以下の事項を検討した。電着法による人工格子の形成には、従来から、金属イオンの析出電位の違いを利用するパルスメッキ法が多用されてきた。しかし、この方法で作製された人工格子の界面はグラニュラー合金状となる。シャープな界面を持つ人工格子を得るために、コンピュータ制御の自動電着ロボットを作製し、2個のメッキ浴を使用することにより直径0.1μm、長さ20μmのCo/Cu/Co人工格子ナノワイヤを作製した。分析した結果シャープな界面を有することを確認した。(2)高アスペクト比微細孔加工法:陽極酸化アルミナ膜をレジストとして利用するフォトファブリケイション微細孔加工法を開発した。この加工法の特長は高アスペクト比の微細孔加工法が可能であり、直径310μm、長さ400μmのワイヤが作製できる。(3)UVカー効果顕微鏡:光源に波長248nmの紫外線を使用したマイクロカー効果顕微鏡を開発した。分解能は0.1μm程度であり、光学顕微鏡としては最大級の5000倍に倍率での観察も可能である。本研究はAlの陽極酸化により得られるアルマイト膜の微細孔に、直流電着法により遷移金属/貴金属の人工格子を積層析出させたナノワイヤを作製し、界面垂直(以下CPPと略記)巨大磁気抵抗効果及び微細磁区構造と磁化過程を明らかにし高密度磁気ランダムアクセスメモリへの展開を図ることを目的とする.本年度はアルミナ層の底面に微細孔を設け、直流電流によるアルマイト法を開発した。シャープな界面を持つ人工格子を得るために、今年度はコンピュータ制御の自動電着ロボットを作製し、3個のメッキ浴を使用することにより直径0.1μm、長さ20μmのFe-Ni/Cu/Co人工格子ナノワイヤを作製した。次年度は磁気抵抗の測定を行う。(2)ナノワイヤの微細磁区構造と磁化過程:光源をグリーンの可視光と紫外線が併用できるマイクロカ-顕微鏡を開発した。分解能は0.1μm程度であり、光学顕微鏡としては最大級の5000倍の倍率での観察も可能である。次年度は線径0.5μmのナノワイヤの磁区構造と磁化過程を解明する。
蛋白質立体構造解析と分子動力学に基づくEGFR分子標的薬の効果予測と創薬

本研究では、コンピューターによる動的立体構造解析の手法を用いて、各種EGFR-チロシンキナーゼ阻害薬(EGFR-TKI)と変異EGFR分子の組合せについて、その結合性を予測し、実際のin vitroでの抗腫瘍効果との関連について検討した。【1】肺癌細胞株における各種EGFR-TKIの添加実験各種のEGFR変異をもつ肺癌細胞株に対して、第1世代から第3世代の各種EGFRチロシンキナーゼ阻害薬(EGFR-TKI)を添加し、MMTアッセイによりIC50を求めた。また、過去の論文を検索し、各種のEGFR変異を有する肺癌細胞株に対しMMTアッセイを行った研究を見出し、EGFR-TKIに対するIC50を論文から明らかにした。その結果、第1世代のEGFR-TKIに対しては、delE746A750変異, L858R変異、delE746A750+T790M変異、L858R+T790M変異、V843I+L858R変異の順に効果が高かった。一方、第2世代、第3世代のEGFR-TKIは、第1世代のEGFR-TKIに比べ、T790M変異を有する細胞株に対し有効性が高かった。【2】阻害剤結合部位特徴解析6種のEGFR蛋白に対し、EGFR-TKI結合ポケットのタンパク質変異に基づく空間形状変化を、計算プログラムMOEのSiteFinderを用いて解析し、EGFR-TKIのアフィニティーについて予測した。その結果、上記した細胞株におけるEGFR-TKIの効果と概ね一致する結果が得られた。また、モデリング時のサンプリング時間の単位を短くし、サンプリング頻度を増加させることで、L858RとdelE746A750変異の比較における分子動力学的モデルとin vitroの実験系との差異が解消された。この結果はすでに論文化され、現在投稿準備中である。【1】肺癌細胞株における各種EGFR-TKIの添加実験:本年度は、各種のEGFR変異をもつ肺癌細胞株に対して、各種EGFRチロシンキナーゼ阻害薬(EGFR-TKI)を添加し、MMTアッセイによりIC50を求めた。【2】阻害剤結合部位特徴解析:L858R、L858R+T790M、delE746A750変異、delE746A750+T790M変異、V843I+L858R変異、および変異を有しない6種のEGFR蛋白に対し、EGFR-TKI結合ポケットのタンパク質変異に基づく空間形状変化を、計算プログラムMOEのSiteFinderを用いて解析し、EGFR-TKIのアフィニティーについて予測した。しかしながら、構造予測では、delE746A750変異よりL858R変異の方が第1世代EGFR-TKIに対する有効性が高いと予測された点は、細胞株の実験と異なる結果であった。<成果の上がった点>動的立体構造解析の結果は、概ね細胞株を用いたin vitroの実験結果と一致しており、本解析法の有用性が示唆された。29年度は、研究計画に基づき、以下の研究を実施した。<阻害剤結合部位特徴解析>前年度までの研究で作成した、変異EGFRとEGFR-TKI(チロシンキナーゼ阻害剤)との結合能を予測する分子動力学的モデルでは、L858R、delE746A750変異を持つEGFR蛋白はwild-type EGFRよりも各種の変異に対する結合能が高いこと、およびL858R+T790M、delE746A750+T790M、およびL858R+V843I変異を持つEGFR蛋白はT790MやV843Iを持たない単独変異EGFRよりも結合能が低下することが示され、実際の細胞株を用いた感受性試験やEGFR変異を有する肺癌患者における臨床効果と合致する結果が得られた。しかしながら、L858RとdelE746A750変異を比較した場合、構造予測ではdelE746A750変異よりL858R変異の方が結合能が高いと予測された点は、in vitroの感受性試験の結果でL858RよりもdelE746A750変異の方が感受性が高いことと一致しない結果であった。これに対し、モデリング時のサンプリング時間の単位を短くし、サンプリング頻度を増加させることで、L858RとdelE746A750変異の比較における分子動力学的モデルとin vitroの実験系との差異が解消された。今後、in vitroの追加実験を行い分子動力学的モデルとの適合性を確認した後、この研究結果を論文化する予定であり、現在追加実験を予定している。L858RとdelE746A750変異の比較における分子動力学的モデルとin vitroの実験系との差異が見られ、その解消に時間を要したため。【1】肺癌細胞株における各種EGFR-TKIの添加実験【2】阻害剤結合部位特徴解析6種のEGFR蛋白に対し、EGFR-TKI結合ポケットのタンパク質変異に基づく空間形状変化を、計算プログラムMOEのSiteFinderを用いて解析し、EGFR-TKIのアフィニティーについて予測した。

その結果、上記した細胞株におけるEGFR-TKIの効果と概ね一致する結果が得られた。また、モデリング時のサンプリング時間の単位を短くし、サンプリング頻度を増加させることで、L858RとdelE746A750変異の比較における分子動力学的モデルとin vitroの実験系との差異が解消された。この結果はすでに論文化され、現在投稿準備中である。今後は、立体構造解析結果と実際の細胞株実験で乖離が見られたdelE746A750変異とL858R変異に対する第1世代TKIの有効性について、より正確な予測ができるような解析モデルを開発することを目指す。新たなモデルの適合性を確認するためのin vitroの追加実験を行った後、学会発表、論文投稿を行う予定である。一部の細胞株の実験については、過去の論文で同様の実験が行われていたことから、これで代用したため、その分の細胞株の購入費用やアッセイの試薬代が減額となった。また、学会発表の旅費分も使用していない。これらの理由により、未使用額が生じた。論文投稿や学会発表を行わなかったこと、また新たな解析ソフトの購入などが不要となったことから、未使用額が生じた。今後、in vitroの追加実験を行った後、学会発表、論文投稿を行うため、試薬の購入や論文投稿費用に充てる予定である。今後、新たな立体構造解析法の開発に使用する予定である。
大腸がん浸潤・転移制御におけるFrizzled/Wntシグナル分子解析

1.外科的に摘除された大腸smがん102例を対象とし,パラフィン包埋ブロックから代表切片を薄切した.抗MMP-7,抗β-catenin,抗cytokeratinモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的検討により,がん浸潤先進部のtumor budding, MMP-7タンパクの発現レベルおよびその発現様式を検討した.102例中11例(10.8%)にリンパ節転移を認めた.MMP-7とβ-cateninは主に先進部に発現したが,その発現はむしろ異なって局在した.MMP-7は2種類の発現様式を認めた.先進部がん腺管が高分化から中分化腺がんで腺管構造を維持している場合にはその管腔側に,一方,先進部が脱分化し,tumor buddingが認められた場合には,細胞質・基底側に発現した.後者の発現様式を陽性と判定すると,42例(41.2%)にMMP-7陽性であった.Tumor buddingは64例(62.7%)に,またβ-cateninは69例(69.7%)に陽性であった.このMMP-7の基底側発現とTumor buddingはお互いに強く相関(p<0.0001)するのみならず,両者はリンパ節転移とも統計学的に有意に相関した(MMP-7, p=0.0005;β-catenin, p=0.0006).しかしながら,β-cateninはいずれの臨床病理学的事項とも統計学的に相関を認めなかった.リンパ節転移の危険因子を同定するために,ステップワイズロジスティック回帰分析を施行したところ,脈管浸襲(リンパ管浸襲,p=0.0436,オッズ比2.84;静脈浸襲,p=0.095,オッズ比2.44)と浸潤先進部のMMP-7基底側発現(p=0.0162,オッズ比14.37)が独立したリンパ節転移危険因子であることが同定された.2.Frizzled/Wntシグナル分子であり,かつ細胞間接着機構の中心的役割を担うE-cadherin/catenin系の細胞膜裏打ちタンパクであるβ-cateninはMMP-7のシグナルの上流に存在するため同分子に着目して,がん浸潤先進部におけるその発現量と細胞内局在に関し,MMP-7発現様式と比較検討した.β-cateninはがん細胞質内に過剰に蓄積し,がん浸潤先進部がん細胞の核内に過剰発現する傾向を認めたが,β-catenin核内発現とMMP-7発現様式には明らかな相関を認めなかった.少数例の検討ではあるが,FAP(家族性大腸腺腫症)に合併したデスモイド腫瘍では,腫瘍細胞の90%にβ-cateninの異常核内蓄積が認められ,かつそれに一致するように大部分の腫瘍細胞細胞質内に過剰発現が認められFAPと散発性大腸がんではがん浸潤・転移に果たすFrizzled/Wntシグナル伝達系の重要性に相違があることが示唆され検討を続けている.1.外科的に摘除された大腸smがん100例を対象とし,パラフィン包埋ブロックから代表切片を薄切した.抗MMP-7,抗β-catenin,抗cytokeratinモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的検討により,がん浸潤先進部のsprouting.MMP-7タンパクレベルの発現およびその発現様式を検討した.MMP-7は大腸smがん浸潤先進部のとくにsprouting(簇出)した個々のがん細胞に選択的に過剩発現し,その発現パターンは腺腔側(apical)および基底側(basilar)に大別された.また,分泌タンパクとして極性の失われた発現様式と考えられるbasilarパターンを呈した場合,独立したリンパ節転移の危険因子であることが明らかにされた.ロジスティック回帰分析では,大腸smがん浸潤先進部がん細胞にMMP-7タンパクがbasilarに発現した場合,そのリンパ節転移のodds比は約12倍であった.2.Frizzled/Wntシグナル分子であり,かつ細胞間接着機構の中心的役割を担うE cadherin/catenin系の細胞膜裏打ちタンパクであるβ-cateninに着目して,がん浸潤先進部におけるその発現量と細胞内局在に関し,MMP-7発現様式と比較検討した.β-cateninはがん細胞質内に過剰に蓄積し,がん浸潤先進部に核内過剩発現する傾向を認めたが,β-catenin核内発現とMMP-7発現様式とは明らかな相関を認めなかった.少数例の検討ではあるが,FAP(家族性大腸腺腫症)に合併したデスモイド腫瘍では腫瘍細胞の90%にβ-cateninの核内発現が認められ,かつMMP-7は大部分の細胞質に過剰発現が認められ,FAPと散発性大腸がんでは浸潤・転移機構に果たすFrizzled/Wntシグナル伝達系の重要性に相違があることが示唆され検討中である.3.Frizzled/Wntシグナルが活性化された大腸がん細胞株を用いて,β-catenin,Tef/LefなどのFrizzled/Wntシグナル分子のアンチセンス,ドミナントネガティブ導入株あるいは強制発現系におけるin vitroおよびin vivoにおける浸潤・転移能を解析し,Frizzled/Wnt系が浸潤・転移制御の新たなターゲットになりうるか,現在検討中である.TCFのβ-catenin結合部位を欠損したconstructを作製し,構成的にTef/Lefが活性化された大腸がん細胞株DLD-1を用いて,安定したトランスフェクタントを得た.そのドミナントネガティブ導入株は培養シャーレでの足場非依存性増殖

抑制および接触阻止の回復が認められ,その浸潤能の低下が示唆された.現在,in vitroおよびin vivoにおける浸潤・転移能に関し解析中である.4.大腸smがん内視鏡治療後の取扱いに関する無作為比較対照試験のバイロットスタディーとして,とくに,がん浸潤先進部に発現するMMP-7などの機能分子をターゲットとしたmicrometastasis検出系の確立をめざして,多数例で検討中である.以上のように、大腸smがん内視鏡治療後の取扱いに関する臨床試験の準備が整いつつある.1.外科的に摘除された大腸smがん102例を対象とし,パラフィン包埋ブロックから代表切片を薄切した.抗MMP-7,抗β-catenin,抗cytokeratinモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的検討により,がん浸潤先進部のtumor budding, MMP-7タンパクの発現レベルおよびその発現様式を検討した.102例中11例(10.8%)にリンパ節転移を認めた.MMP-7とβ-cateninは主に先進部に発現したが,その発現はむしろ異なって局在した.MMP-7は2種類の発現様式を認めた.先進部がん腺管が高分化から中分化腺がんで腺管構造を維持している場合にはその管腔側に,一方,先進部が脱分化し,tumor buddingが認められた場合には,細胞質・基底側に発現した.後者の発現様式を陽性と判定すると,42例(41.2%)にMMP-7陽性であった.Tumor buddingは64例(62.7%)に,またβ-cateninは69例(69.7%)に陽性であった.このMMP-7の基底側発現とTumor buddingはお互いに強く相関(p<0.0001)するのみならず,両者はリンパ節転移とも統計学的に有意に相関した(MMP-7, p=0.0005;β-catenin, p=0.0006).しかしながら,β-cateninはいずれの臨床病理学的事項とも統計学的に相関を認めなかった.リンパ節転移の危険因子を同定するために,ステップワイズロジスティック回帰分析を施行したところ,脈管浸襲(リンパ管浸襲,p=0.0436,オッズ比2.84;静脈浸襲,p=0.095,オッズ比2.44)と浸潤先進部のMMP-7基底側発現(p=0.0162,オッズ比14.37)が独立したリンパ節転移危険因子であることが同定された.2.Frizzled/Wntシグナル分子であり,かつ細胞間接着機構の中心的役割を担うE-cadherin/catenin系の細胞膜裏打ちタンパクであるβ-cateninはMMP-7のシグナルの上流に存在するため同分子に着目して,がん浸潤先進部におけるその発現量と細胞内局在に関し,MMP-7発現様式と比較検討した.β-cateninはがん細胞質内に過剰に蓄積し,がん浸潤先進部がん細胞の核内に過剰発現する傾向を認めたが,β-catenin核内発現とMMP-7発現様式には明らかな相関を認めなかった.少数例の検討ではあるが,FAP(家族性大腸腺腫症)に合併したデスモイド腫瘍では,腫瘍細胞の90%にβ-cateninの異常核内蓄積が認められ,かつそれに一致するように大部分の腫瘍細胞細胞質内に過剰発現が認められFAPと散発性大腸がんではがん浸潤・転移に果たすFrizzled/Wntシグナル伝達系の重要性に相違があることが示唆され検討を続けている.
ミダゾラムの呼吸中枢ニューロンに対する抑制機序とフルマゼニルによる拮抗

ミダゾラム(ベンゾジアゼピン系薬物)の呼吸中枢神経機構に対する抑制機序を解明する目的で,ミダゾラムの静脈内投与を行い呼吸中枢ニューロンの変化を検討し,あわせてフルマゼニルによる拮抗作用を調べた.標本には,除脳,無麻酔,非動化,人工呼吸下ネコを用いた.血圧,直腸温,呼吸中酸素および炭酸ガス濃度を連続的に監視し,適正に保った.頸部より横隔神経遠心性活動を記録し中枢呼吸リズムの指標として用いると共に,吸息時間および呼息時間を測定した.ガラス微小電極により延髄腹側呼吸性ニューロン群領域より呼吸中枢ニューロンの膜電位および活動電位を記録した.また,迷走神経および上喉頭神経の電気刺激を行い,呼吸性ニューロンに誘発されたシナプス後電位,特に抑制性シナプス後電位の変化を調べた.その結果,ミダゾラムは横隔神経活動を抑制し,吸息および呼息時間をともに短縮させた.一方,GABA_A受容体の遮断薬であるビククリンでは逆に横隔神経活動は不規則に増大し,呼吸周期も乱れた.このビククリンによる変化は,ミダゾラムの投与により拮抗された.すべての呼吸性ニューロンはミダゾラムにより過分極し,活動相に認められる自発性活動電位発射は減少あるいは抑制された.非活動相に認められる抑制性の過分極電位は増大した.また,誘発性シナプス後電位のうち興奮性のものは変化しなかったが,抑制性シナプス後電位は増大した.ミダゾラムによる変化は,ベンゾジアゼピン受容体遮断薬であるフルマゼニルの投与により拮抗された.以上より,ミダゾラムによる呼吸抑制は,呼吸中枢神経系に存在するGABA_A-ベンゾジアゼピン受容体の機能を亢進することにより発現することが明かとなった.ミダゾラム(ベンゾジアゼピン系薬物)の呼吸中枢神経機構に対する抑制機序を解明する目的で,ミダゾラムの静脈内投与を行い呼吸中枢ニューロンの変化を検討し,あわせてフルマゼニルによる拮抗作用を調べた.標本には,除脳,無麻酔,非動化,人工呼吸下ネコを用いた.血圧,直腸温,呼吸中酸素および炭酸ガス濃度を連続的に監視し,適正に保った.頸部より横隔神経遠心性活動を記録し中枢呼吸リズムの指標として用いると共に,吸息時間および呼息時間を測定した.ガラス微小電極により延髄腹側呼吸性ニューロン群領域より呼吸中枢ニューロンの膜電位および活動電位を記録した.また,迷走神経および上喉頭神経の電気刺激を行い,呼吸性ニューロンに誘発されたシナプス後電位,特に抑制性シナプス後電位の変化を調べた.その結果,ミダゾラムは横隔神経活動を抑制し,吸息および呼息時間をともに短縮させた.一方,GABA_A受容体の遮断薬であるビククリンでは逆に横隔神経活動は不規則に増大し,呼吸周期も乱れた.このビククリンによる変化は,ミダゾラムの投与により拮抗された.すべての呼吸性ニューロンはミダゾラムにより過分極し,活動相に認められる自発性活動電位発射は減少あるいは抑制された.非活動相に認められる抑制性の過分極電位は増大した.また,誘発性シナプス後電位のうち興奮性のものは変化しなかったが,抑制性シナプス後電位は増大した.ミダゾラムによる変化は,ベンゾジアゼピン受容体遮断薬であるフルマゼニルの投与により拮抗された.以上より,ミダゾラムによる呼吸抑制は,呼吸中枢神経系に存在するGABA_A-ベンゾジアゼピン受容体の機能を亢進することにより発現することが明かとなった.