hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルツハイマー病モデルマウス初期病変における不飽和脂肪酸合成酵素SCDの役割

免疫組織化学、in situ hybridization、real-time PCRによる解析から、神経細胞ではSCD1よりもSCD2優位の発現が認められた。生後発達過程で、SCD免疫活性は細い樹状突起へ微細顆粒状の分布するようになるが、生後6ヶ月の3 x Tg ADマウスでは野生型より免疫活性が増大し、樹状突起で粗大顆粒状、分節状の分布を示す。この時期には比較的大型のビーズ状に腫張した棘突起が樹状突起に沿って認められ、synaptobrevinの免疫活性の減少を伴っていた。これらの所見は、海馬の樹状突起にアルツハイマー病の初期病変が発生し、その過程にSCDが関与している可能性を示唆する。1.脳内におけるSCD isoformの発現:マウスの脳では主にSCD1とSCD2が発現していることが分かっているが、成熟マウスの脳の大脳皮質、放射状層、錐体細胞層を取り分けてreal-time PCRを行なってみると、SCD2 mRNAの発現がSCD1 mRNAのそれぞれ8倍、12倍、34倍程度多かった。オリゴデンドログリアではSCD2が主に発現していることと合わせて、正常の脳内で主に発現しているのはSCD2であることが分かった。2. SCD-1、2を識別できる抗体の作成:これまで用いてきた抗SCD抗体は、マウスSCD-2のC末に近い18アミノ酸を抗原として得られたもので、SCD-1とは17アミノ酸が共通しており、両者を認識する。このため、様々な病変においていずれのアイソフォームが変化しているのかを検討するには不向きであった。そこで相同性の低いN末端領域のアミノ酸配列の中から抗原ペプチドを設計し、両者を識別できる抗体を作成し、Western blotでrecombinant SCD1、2蛋白を区別できる抗体が得られた。3.実験的脱髄過程でのSCD2の変化: Cuprizone経口投与によって誘発した脱髄、それに引き続く髄鞘再生過程でのSCD2 mRNA、SCD2蛋白の発現をreal-time PCR、Western blot分析で検討した。脱髄進行時には白質のFluoroMyelinGreen陽性の髄鞘の面積は対照の6%程度まで減少し、その単位面積当りのSCD2蛋白は対照の80%程度に減少していた。一方、同じ時期に、白質でのSCD2 mRNAの発現は対照の150%程度に増大していた。髄鞘再生期にはSCD2mRNA、SCD2蛋白は対照の3-4倍程度の発現を示すことから、脱髄過程では他の髄鞘構成蛋白に先駆けてSCD2 mRNAが増大することが示唆された。今年度はアルツハイマー病病態モデル動物である3 x Tg-ADマウスを用いて以下の成果が得られた。1.マウスの脳で発現しているSCD1、2を識別できる抗体を用いた免疫組織化学的検索によって、生後400日の野生型マウスの海馬錐体細胞ではSCD1、2いずれの免疫活性も検出されることが分かった。しかし、同齢の3 x Tg-ADマウスでは、SCD1の免疫活性は対照動物並みであったが、SCD2の免疫活性は対照に比べて著しく減少していた。またSCD1の免疫活性はいずれのマウスでもオリゴデンドログリアでは検出されず、オリゴデンドログリアではSCD2のみが発現していることが確認された。2.免疫組織科学的検索によってシナプス関連蛋白の発現を調べてみると、生後200日の3 x Tg-ADマウスの海馬CA1放線状層におけるsynaptobrevinの免疫活性は、野生型マウスに比べて減少していた。一方でvesicular GABAtransporterの免疫活性は生後200日では差がなかったが、生後480日では野生型マウスに比べて3 x Tg-ADマウスの海馬CA1錐体細胞層、放線状層で増大していた。3.生後240日の野生型マウス、3 x Tg-ADマウスの海馬スライスの錐体細胞にパッチ電極からbiocytinを注入した後に固定し、Alexa-Fluor488標識streptavidinと反応させ共焦点レーザー顕微鏡で樹状突起の形状を観察すると中、小型の棘突起が減少し、比較的大型のビーズ状に腫張した棘突起が樹状突起に沿って認められた。こうした所見と一致して、3 x Tg-ADマウスでは、野生型で見られるような細長い頸部を持つspineとの間に形成される興奮性シナプスが少なく、頸部が短い、扁平隆起状の興奮性シナプスが目立つことが電子顕微鏡観察によって見出された。昨年度、作成に成功したSCD-1、2を識別できる抗体を用いて、神経細胞やアストロサイト、オリゴデンドログリア、ミクログリアなど多様な細胞でのSCD isoformの発現を解析するようになった。今年度は3 x Tg-ADマウスでの解析結果から、両者の発現の違いを検出することができた。既に行った抗SCD抗体を用いた免疫組織化学的解析によって、3 x Tg-ADマウスでの初期病変は海馬の樹状突起領域で検出される可能性が示唆されたが、今年度はそれと関連すると思われる、同領域でのシナプス関連蛋白の免疫活性の変化や棘突起の形状の変化が見出された。一方で、3 x Tg-ADマウスを用いた生後早期から老齢期に至る多点での組織学的変化とlaser capture microdissection(以下LCM)による遺伝発現解析を組み合わせる計画は、必要量のマウスの飼育に困難を来たしたため、次年度以降に持ち越すことになった。

1.これまでに行った正常ラット、3 x Tg ADマウス、野生型マウスの海馬での免疫組織化学的検索、LCMによって採取した野生型マウス海馬錐体細胞を用いたreal-time PCRによる解析、SCD1、2特異的RNA probeを用いたISHの結果から、神経細胞での発現は主としてSCD2であると考えられた。そこで生後0、1、2、3、4、8週齢ラット海馬でのSCD2免疫活性を免疫組織化学的に検索すると、出生直後では錐体細胞には認められず、周囲の太い突起状構造に強い線状の活性が認められるが、1週から2-3週にかけて細胞体で強い活性が認められるようになり、4週以降はやや減弱する。一方、樹状突起領域では太い突起での発現が薄れ、突起の全長に亘って弱陽性所見が認められるようになった。2.野生型マウスの錐体細胞内、放射状層のSCD免疫活性は微細顆粒状の分布を示し、SCDが小胞体のような細胞内小器官に局在していることを示す可能性が示唆された。一方、3 x Tg ADマウスの錐体細胞内および放射状層でのSCD免疫活性はび漫性に認められた。3.以上の結果からSCDは発生過程および神経細胞の変性過程で局在の変化を示す可能性が示唆された。4.生後750日の3 x Tg-ADマウスおよび対照動物の脳切片を用いて、LCMで切り出した錐体細胞層、放線状層および大脳皮質からRNAを抽出し、real-time PCRによりシナプスに関連する約20遺伝子の定量的解析を行った。その結果、CaMKIIなど、両マウスで発現に差の見られる遺伝子をいくつか見出した。昨年度から、本研究計画の実施に不可欠の3 x Tg -ADマウスの交配、維持に困難を来たし、妊娠率の低下、出産しても母マウスが仔を食殺するなどのトラブルが断続した。その結果、出生後から経時的にサンプリングした検体を用いて、免疫組織化学的検索などの組織学的検索とLCMによって採取した検体を用いての遺伝子発現の検索とを並行して進める計画に支障が出た。このため、研究計画の1年延長を申請し、承認された。この間、待ち時間が長いため、先行して既に検体採取を終えていた老齢3 x Tg -ADマウスおよび野生型マウスを用いて、海馬の錐体細胞層、樹状突起領域である放射状層を取り分け、それらの部位での遺伝発現を解析する技法の確立を進めて来た。その結果、組織学的検索に頻用されるパラフォルムアルデヒド固定切片から切り出した領域、さらに免疫染色を行って同定した細胞をLCMで採取し、それらの検体から抽出したRNAを用いて高感度の定量的PCRを行えるようになった。試験的に調べた20遺伝子の中に、老齢3 x Tg-ADマウスと野生型マウストとで発現変化の認められる遺伝子が同定されたことから、この手法は本来の主題である3 x Tg-ADマウスの初期病変の解析にも有力であることが期待される。一方でSCD2発現の免疫組織学的検索から、発生過程で、また3 x Tg-ADマウスと野生型マウストとで神経細胞内でのSCD2の局在が変化する可能性が示唆され、その機能的意義が注目される。今年度はアルツハイマー病病態モデルマウス、スナネズミの片側総頸動脈結紮による虚血モデルでの免疫組織化学的検索によって以下の成果が得られた。
心筋再構築における心筋線維化の発生機序の解明

心筋内コラーゲンの変性は、心機能に重大な影響を及ぼすと考えられている。本研究は心筋再構築におけるコラーゲン変性の機序の解明を行うために、心筋症、心筋梗塞の動物モデルと正常心筋および心筋培養細胞を用いて研究を行った。(1)心筋症ハムスター(Bio14.6およびBio53.58)を用いた動物実験を行った。Zymographyによるコラゲナーゼの活性の検討では、約65kDaと70kDaのバンドを認め、これらは心筋症ハムスターにおいて亢進していた。これらは、心筋症における心筋再構築にMMPが関与することを示唆する。(2)心筋梗塞(ラット左冠動脈結紮)モデルにおけるZymographyを用いた検討では、約92kDaのバンドの出現を心筋梗塞後24時間をピークに認めた。さらにコラゲナーゼ活性も同様の時間経過にて上昇していた。心筋梗塞早期における心室破裂などにこのコラゲナーゼ活性の増加が関与している可能性が示されている。('95AHAにて報告)新生児ラット心筋より、線維芽細胞を単離し各種サイトカインのMMPに対する検討を行っているが、TGF-β及びATIIによりMMP1およびMMP7のmRNAの増加を認めている。以上の成績を基に現在、圧負荷肥大心及び心筋梗塞モデルにおける心臓より、線維芽細胞を単離し、各種病態における心筋線維芽細胞のサイトカインに対する反応の差異を検討しているところである。
古典籍の異本生成構造と系統判別のための基礎的研究―数理的パースペクティヴ―

連歌を中心として資料収集並びに研究を行った。進化学会においては、日本における写本文献学における成果という位置づけで、宗祇連歌句集「老葉」の写本間の関係を発表した。特に有注本(宗祇、または宗長などによる注記が記される写本)について、その注文の類似性を、単なる一致不一致による分類ではなく、文章としての類似度を考察することにより、精密な関係を見出すことができ、多変量解析による処理、また系統学的処理もより明確になることを発表した。系統樹作成手法として通常は単語や文字の異文比較による最節約的変化を問題とするが、このような注釈が付されているものは、宗祇の注と宗長の注を合併する場合もあり、それも全体を転写するのではなく、一部分のみ利用する複雑な合成が行われる。そのため、個々の差異をとりまとめたより大きな特徴を、基準を定めて数値評価すれば、大局的な考察に適していることがわかる。特に、通常宗長注本の一つとされている系統が、実は宗祇の注を大きく取り入れており、別の一群として取り扱うべきことが明かとなった。この方法は連歌注釈書と限らず、他の文献の系統学的考察にももちろん適用できるものであり、今後様々な発展が見込まれて重要である。『老葉』(宗祇連歌集)今年度は連歌資料の充実の為に「老葉」の写本を入手した。書写のよい無注本であり、既知の写本とはまた違った性質をもっている。これは翻刻等を発表する予定である。これによって、未完となっている「老葉」諸本の精密な成立経過について新知見が得られると期待される。『北野大茶湯大検証』また文献学的成果としては、秀吉が天正十五年十月一日に北野天満宮で行った北野大茶湯に関する資料を集大成した。全資料を網羅し、北野大茶湯記については系統学的考察を行った。これにより、従来の説は大幅な変更が迫られ、特に大茶湯において茶道具の三飾席と、秀吉・利休等による四茶席の配置が初めて実証的に推定できることとなった。『名物茶入の物語』また、従来より進めていた茶道名物記の文献学的考察については、雑誌連載をとり纏めてさらに情報を追加し、総合的な一書とした。今年度は実際の伝書を収集し、伝承の実態を確認した。現物の発する情報に及ぶものはない。また、これまでの成果発表の一つとして、『秀吉の智略「北野大茶湯」大検証』を発刊した。本書は共著であり全体が334ページからなるが、矢野論説pp.119-183のみならず、総合的な資料編pp.209-317も申請者が作成した。この資料編は、北野大茶湯の伝書て新出の北野天満宮本、利休百会記第三種本を含む)12件、関連資料16件、書状・高札14件、その他11件を網羅したものであり、すべて翻刻を与えてあり、今後の研究の指針となるべく意図している。もとより解題(25pages)と研究史(15pages)も執筆した。この網羅的な資料編は、様々な異本と関連資料を承知していたことによって可能になったものであり、本研究の実施計画の一環といえる。論説においても、北野大茶湯記5写本の道具記載を対比した表2(pp.132-135)が核になっており、異本生成構造の考察と、背景で行った数理的処理が基礎となっている。また、『天王寺屋会記』の客組のネットワーク構造の考察について学会発表を行った(口頭発表は共同研究者山田哲也氏による)。
月経周期を考慮した作業・健康管理システムの構築

女性労働者に対する社会的な支援の必要性を推進するポジティブ・アクションが行われ,社会一般や企業の女性労働者に対する意識は大きく変化し,女性労働者の雇用管理面での配慮はなされつつある.しかし,雇用管理面においてそれ以外の女性特有の生理特性に関する支援や施策は十分でないのが現状である.特に,月経周期を考慮した労働負担とその効率性についてはまだ明確な知見は得られていない.この月経周期を考慮した労働負担とその効率性における知見を得ることにより,女性労働者の労働安全衛生管理システムを構築することが可能となる.そこで,本研究では労働負担の中でも精神負担を取り上げ,月経周期が精神負荷作業に及ぼす影響を月内変化の連続的データを用いて検討し,月経周期を考慮した作業・健康管理システムを構築することを目的とする.実験課題として,単純反応作業と思考作業の精神負荷作業を2種類用いた.実験期間中,毎日基礎体温の測定,月経随伴症状調査も実施した.測定指標は,作業量,反応時間,エラー率を作業効率として測定し,さらに月経随伴症状の訴え数,基礎体温とした.作業効率と月経随伴症状との関連性について検討した結果,思考作業より複雑な思考を伴わない単純反応作業においての方が月経期の影響を強く受けていることが示唆された.また,作業効率に関連する月経随伴症状としては,「痛み」と「集中力」であることが示唆された.月経に関わる痛みを緩和させることにより作業効率を向上させることができる可能性があることが示された.これらの結果から,個人対応ではあるが,次月経周期における作業効率と月経随伴症状を予測するシステムを構築することが可能であることを確認した.女性労働者に対する社会的な支援の必要性を推進するポジティブ・アクションが行われ,社会一般や企業の女性労働者に対する意識は大きく変化し,女性労働者の雇用管理面での配慮はなされつつある.しかし,雇用管理面においてそれ以外の女性特有の生理特性に関する支援や施策は十分でないのが現状である.特に,月経周期を考慮した労働負担とその効率性についてはまだ明確な知見は得られていない.この月経周期を考慮した労働負担とその効率性における知見を得ることにより,女性労働者の労働安全衛生管理システムを構築することが可能となる.そこで,本研究では労働負担の中でも精神負担を取り上げ,月経周期が精神負荷作業に及ぼす影響を月内変化の連続的データを用いて検討する.その作業効率と月経周期との関係性を定量的評価により明らかにすることにより,月経周期を考慮した作業・健康管理システムを構築することを目的とする.本研究は2カ年計画で行うが,初年度である本年度の実績概要を報告する.被験者としての条件を満たす女性を個別面談にてスクリーニングし,月経周期を把握するため基礎体温の測定と同時に月経随伴症状の調査を3ヶ月間行った.基礎体温測定の結果から,規則正しい月経周期でない被験者および実験に協力的でない被験者にはこの時点で実験対象から除外した.実験対象となった被験者については,引き続き基礎体温の測定と月経随伴症状の調査を継続して行った。また,実験システムの設計と開発を進め,予備実験として数名の被験者に実験を実施し稼動確認を行った.実験課題としては,精神負荷作業として単純反応作業と思考作業の2種類を用いる.実験時間は,各作業5分間程度とした.また,被験者には充分な習熟を確認した後,実験を実施することとした.現在,実験対象となった被験者全員に対して,実験を実施し,データを収集し,整理している.来年度は,引き続きデータを収集,整理し,解析を行い,作業効率,基礎体温および月経随伴症状との関連性について検討する.さらに因子分析を用いて作業効率と関連のある因子を抽出する予定である.女性労働者に対する社会的な支援の必要性を推進するポジティブ・アクションが行われ,社会一般や企業の女性労働者に対する意識は大きく変化し,女性労働者の雇用管理面での配慮はなされつつある.しかし,雇用管理面においてそれ以外の女性特有の生理特性に関する支援や施策は十分でないのが現状である.特に,月経周期を考慮した労働負担とその効率性についてはまだ明確な知見は得られていない.この月経周期を考慮した労働負担とその効率性における知見を得ることにより,女性労働者の労働安全衛生管理システムを構築することが可能となる.そこで,本研究では労働負担の中でも精神負担を取り上げ,月経周期が精神負荷作業に及ぼす影響を月内変化の連続的データを用いて検討し,月経周期を考慮した作業・健康管理システムを構築することを目的とする.実験課題として,単純反応作業と思考作業の精神負荷作業を2種類用いた.実験期間中,毎日基礎体温の測定,月経随伴症状調査も実施した.測定指標は,作業量,反応時間,エラー率を作業効率として測定し,さらに月経随伴症状の訴え数,基礎体温とした.作業効率と月経随伴症状との関連性について検討した結果,思考作業より複雑な思考を伴わない単純反応作業においての方が月経期の影響を強く受けていることが示唆された.また,作業効率に関連する月経随伴症状としては,「痛み」と「集中力」であることが示唆された.月経に関わる痛みを緩和させることにより作業効率を向上させることができる可能性があることが示された.これらの結果から,個人対応ではあるが,次月経周期における作業効率と月経随伴症状を予測するシステムを構築することが可能であることを確認した.
腹腔内温熱化学療法の消化管吻合部創傷治癒への影響に関する実験的研究

胃癌手術後の再発様式として、腹膜再発は最も高頻度である。われわれはこの腹膜再発予防対策として、術直後にマイトマイシンC添加生食水による持続温熱腹膜灌流(42°C)を行い、そのrandomized control studyにより、本法の腹膜再発抑制効果を報告してきた。この際、さらに高温の灌流が可能であれば、再発抑制効果はより高まると考えられるが、消化管吻合創傷治癒への影響が危惧されるため、小腸吻合を加えたwister ratに各種温度の加温を加えてこの点への検討を行った。1.46°Cの小腸局所加温による死亡率は100%、45°Cでも90%であったが、44°Cでの死亡率は0%であり、以下44°C加温の影響を検討した。2.44°C加温(30分)による吻合部張力を継時的にみると、術後3日目に最も低下がみられたが、control群との間に差はなかたっか。術後7日目の吻合部張力は加温群、control群ともにほぼ吻合直後の張力へ回復した。14日目の加温群の張力はcontrol群に比して有意に増加し、加温群では吻合部以外の部の断裂がしばしばみられた。3.rat体重を経時的にみると、各群ともに低下がみられた。しかし、14日目にはcontrol群では吻合前値を超えたのに対し、加温群の体重は増加傾向がみられたものの、なお、吻合前値以下であった。4.吻合部の組織学的検討では、加温群で術後早期に一過性の絨毛の脱落がみられ、炎症細胞も長期間局所にみられた。また、加温群では術後7日目以降、controlに比して吻合部fibrosisおよびその周辺の筋層の肥厚が著明であった。以上の結果から、44°Cの腸管局所加温は、腸管吻合部創傷治癒にさしたる影響を与えることなく(吻合部線維化増強は残存するが)、施行が可能と考えられた。現在までの成果:胃癌の再発様式の中で最も高頻度なものは腹膜再発である。われわれはこれへの対策として42°Cの生食水(MMC添加)による持続温熱腹膜灌流(CHPP)をrandamized control studyにて行ない、その再発抑制効果を報告してきた。この際に、更に高温灌流が可能であれば抗腫瘍性は高まると考えられるが、消化管吻合部創傷治癒への影響が危倶された。そこで今回、消化管吻合に及ぼす温熱の影響について検討した。まず、腸管加温(30分)の温度限界を調べると、45°C加温ラットはすべて死亡し、44°C加温ラットの死亡率は低率であった。そこで、小腸の端々吻合後に同部に加温(44°C)を行ない、吻合部張力、組織所見を経時的に観察した。その結果、術後3日目に吻合部張力の低下がみられたが、7日目には元に回復し、14日目には術前値を上廻った。組織学的には加温群に一過性の小腸絨毛の脱落がみられたが、粘膜下層以下の所見には非加温後と大差はみられなかった。7日目以降では、加温群において粘膜下層を主とするfibrosisと筋層の肥厚が強くみられた。

加温群では非加温群に比べ、術後の体重減少とその回復の遅延がみられ、加温に起因したfibrosisによる腸管狭窄や腸管運動への影響が示唆された。なお、腸管加温の際にMMCを併用した場合にも、それによる大きな影響はみられず、加温単独群にほぼ類似した結果であった。現段階での考察と今後の予定:腹腔内加温には当然温度限界があるが、ラットにおいては44°Cと考えられた。この際の消化管吻合の創傷治癒への加温の影響は軽微なものと考えられた。臨床的にも、現行の42°Cから更に高温灌流の可能性が示唆され、それに伴う抗腫瘍性増強を期待しうると考えられる。今後はmicroangiogmphyによる吻合部血流への影響や、吻合部組織のcollagen量などhistochemicalな分析を行なう予定である。胃癌手術後の再発様式として、腹膜再発は最も高頻度である。われわれはこの腹膜再発予防対策として、術直後にマイトマイシンC添加生食水による持続温熱腹膜灌流(42°C)を行い、そのrandomized control studyにより、本法の腹膜再発抑制効果を報告してきた。この際、さらに高温の灌流が可能であれば、再発抑制効果はより高まると考えられるが、消化管吻合創傷治癒への影響が危倶されるため、小腸吻合を加えたwister ratに各種温度の加温を加えてこの点への検討を行った。1.46°Cの小腸局所加温による死亡率は100%、45°Cでも90%であったが、44°Cでの死亡率は0%であり、以下44°C加温の影響を検討した。2.44°C加温(30分)による吻合部張力を継続的にみると、術後3日目に最も低下がみられたが、control群との間に差はみられなかった。術後7日目の吻合部張力は加温群、control群ともにほぼ吻合直後の張力へ回復した。14日目の加温群の張力はcontrol群に比して有意に増加し、加温群では吻合部以外の部の断裂がしばしばみられた。3.rat体重を経時的にみると、各群ともに低下がみられた。しかし、14日目にはcontrol群では吻合前値を超えたのに対し、加温群の体重は増加傾向がみられたものの、なお、吻合前値以下であった。4.吻合部の組織学的検討では、加温群で術後早期に一過性の絨毛の脱落がみられ、炎症細胞も長期間局所にみられた。また、加温群では術後7日目以降、control群に比して吻合部fibrosisおよびその周辺の筋層の肥厚が著明であった。以上の結果から、44°Cの腸管局所加温は、腸管吻合部創傷治癒にさしたる影響を与えることなく(吻合部線維化増強は残存するが)、施行が可能と考えられた。
アトピー性化疾患における好酸球遊走・活性化因子受容体の発現とその調節に関する研究

本年度の研究により以下の点を明らかにした。1.好酸球に作用することが知られているサイトカインであるIL-5、TNF-α及びIL-16で健常人末梢血好酸球を12時間刺激した場合のPAF、LTB_4、5-oxoETE、fMLP及びeotaxinに対する細胞内カルシウム応答の変化について調べたところ、IL-16は全てのメディエーターに対する応答に対して影響が見られなかったものの、IL-5刺激では全て、またTNF-α刺激ではPAF、LTB_4、fMLP及びeotaxinに対する細胞内カルシウム応答が亢進することが明らかとなった。同様にこれらのメディエーターによる好酸球からの活性酸素の産生に対するこれらサイトカインの影響についても検討したところ、IL-5とTNF-αがPAFとfMLPによる活性酸素産生を増大させることも明らかとなった。2. IL-5とTNF-αで同時に好酸球を刺激することによりこれらのメディエーターに対する応答は相加的に増大した。また、この作用はPAFに対する応答について最も顕著であった。3. IL-5及びTNF-αの刺激により好酸球のPAF受容体の発現量及びmRNA量が増加し、両者の併用によってさらに相加的に増大した。この増加の割合は先の応答性の亢進のそれに近いものであったころから、これらのサイトカインによる好酸球のPAFに対する応答性の亢進はその受容体の発現増強を介して起こることが示唆された。4. TNF-αは好中球等他の血球細胞に対してはアポトーシスを促進する因子であることが知られているが、好酸球に対しては若干寿命を延長することがわかった。すなわち、TNF-αによる応答性の亢進及びPAF受容体の発現増強はアポトーシスに起因するものではないことが確認された。本研究では、健常人又は気管支喘息患者の末梢血好酸球の各種遊走・活性化因子に対する応答性、および受容体の発現について調べた。健常人末梢血好酸球の、PAF、LTB_4、5-oxoETE及びeotaxinに対する細胞内カルシウム応答について調べたところ、EC_<50>値はPAF<eotaxin=LTB_4<5-oxoETEの順で低く、PAFが最も強力なアゴニストであることがわかった。また、気管支喘息患者好酸球の細胞内カルシウム応答及び遊走反応におけるPAFのEC_<50>値は健常人好酸球でのそれに比べて低かったことから、気管支喘息患者の末梢血好酸球はPAFに対する応答性が亢進していることがわかった。また、気管支喘息患者好酸球におけるPAF受容体数及びmRNA発現量は、健常人のそれに比べ有意に増加していたことから、上記の応答性の亢進の少なくとも一部はPAF受容体の発現増加を介したものであることが強く示唆された。健常人好酸球のPAFに対する細胞内カルシウム応答及び遊走能におけるIL-5の影響について調べたところ、30分間IL-5で刺激することにより若干の応答性の亢進がみられ、12時間刺激した場合ではさらにその応答性が亢進した。このことから、IL-5による好酸球のPAFに対する応答性の亢進が短時間のプライミングの作用と受容体の発現増加の両者を介して起こる可能性が強く示唆された。同様に、LTB_4、5-oxoETE、eotaxinに対する応答性もIL-5で12時間刺激することにより亢進することが明かとなった。これらの因子に対する受容体の発現がIL-5により増加するか否かについては次年度で検討する予定である。
分子線エピタキシによる平面創成メカニズムに関する研究

高純度シリコンウエハ・サブストレート(4インチ),面方位(100)について,サブストレートの結晶軸,結晶方位,結晶化度,結晶歪,結晶構造を微小領域解析装置X線回析部によって計測すると同時に,面性状(平面性など)を光干渉法と微小領域解析装置形状解析部による観察によって評価した.そして,そのサブストレート上にシリコンをエピタキシャル結晶成長させた.このとき,成長条件として,成長温度のみを400°Cから800°Cまで,100°Cずつ変化させて実験を行った.この時,基板温度以外の成長条件は一定とした.そして,上記において成長前に解析された同一箇所を,エピタキシャル成長層について同様の解析を行い,ある微小領域についての結晶成長プロセスを解析した.その結果,成長温度については,400°Cでは,エピタキシャル成長はおこらなかった.また,500°C以上の温度では,温度が高くなると,結晶性は良くなるが,成長層の性状は荒れたものとなった.性状は600,700°Cのものが良好であった.これは,温度によって,成長の様式が変化するためと考え,温度のみの関数である分子の基板表面での表面拡散距離と基板温度の関係から,この成長の様式の解析を試み,実験結果と解析の結果が傾向として一致した.すなわち,分子線エピタキシでは,適切な前後処理および成長条件を設定すれば,結晶性が良好でかつ平滑な表面性状の平面が創成できることが明らかとなった.高純度シリコンウエハ・サブストレート(4インチ),面方位(100)について,サブストレートの結晶軸,結晶方位,結晶化度,結晶歪,結晶構造を微小領域解析装置X線回析部によって計測すると同時に,面性状(平面性など)を光干渉法と微小領域解析装置形状解析部による観察によって評価した.そして,そのサブストレート上にシリコンをエピタキシャル結晶成長させた.このとき,成長条件として,成長温度のみを400°Cから800°Cまで,100°Cずつ変化させて実験を行った.この時,基板温度以外の成長条件は一定とした.そして,上記において成長前に解析された同一箇所を,エピタキシャル成長層について同様の解析を行い,ある微小領域についての結晶成長プロセスを解析した.その結果,成長温度については,400°Cでは,エピタキシャル成長はおこらなかった.また,500°C以上の温度では,温度が高くなると,結晶性は良くなるが,成長層の性状は荒れたものとなった.性状は600,700°Cのものが良好であった.これは,温度によって,成長の様式が変化するためと考え,温度のみの関数である分子の基板表面での表面拡散距離と基板温度の関係から,この成長の様式の解析を試み,実験結果と解析の結果が傾向として一致した.すなわち,分子線エピタキシでは,適切な前後処理および成長条件を設定すれば,結晶性が良好でかつ平滑な表面性状の平面が創成できることが明らかとなった.シリコンで,面方位が異なった単結晶・高純度シリコンウエハ・サブストレート(4インチ)を製作した。ついで,サブストレートの結晶軸,結晶方位,結晶化度,結晶歪,結晶構造を微小領域解析装置X線回析部によって計測すると同時に,面性状(平面性など)を光干渉法と微小領域解析装置形状解析部による観察によって評価した。そして,そのサブストレート上にシリコンをエピタキシャル結晶成長させた。このとき,成長条件として,成長速度と成長温度を変化させて実験を行った。上記において解析された同一箇所を,エピタキシャル成長層について同様の解析を行い,ある微小領域についての結晶成長プロセスを解析した。なお,分子線エピタキシでは,エピタキシャル成長中だけでなく,前後の処理法によっても成長層の性状が変化するため,十分な基礎実験によって,常に同一条件で成長が行われるように,成長のシーケンスを定めて行った。その結果,成長速度を変化させると,速度が速いほど,結晶性が悪く,成長層の性状は荒れたものとなった。これは,成長速度が速くなると,十分なエピタキシャル成長がなされなくなるためと考えられる。また,成長温度については,温度が高くなると,結晶性は良くなるが,成長層の性状は荒れたものとなった。これは,温度によって,成長の様式が変化するためと考えられる。これらの成長速度,成長温度による性状の荒れ方は異なっており,それぞれ別の要因によって引き起こされていると考えられるが,今年度は十分な解析が行えなかった。いずれにせよ,分子線エピタキシでは,適切な前後処理および成長条件を設定すれば,結晶性が良好でかつ平滑な表面性状の平面が創成できることが明らかとなった。高純度シリコンウエハ・サブストレート(4インチ),面方位(100)について,サブストレートの結晶軸,結晶方位,結晶化度,結晶歪,結晶構造を微小領域解析装置X線回析部によって計測すると同時に,面性状(平面性など)を光干渉法と微小領域解析装置形状解析部による観察によって評価した.そして,そのサブストレート上にシリコンをエピタキシャル結晶成長させた.このとき,成長条件として,成長温度のみを400°Cから800°Cまで,100°Cずつ変化させて実験を行った.この時,基板温度以外の成長条件は一定とした.そして,上記において成長前に解析された同一箇所を,エピタキシャル成長層について同様の解析を行い,ある微小領域についての結晶成長プロセスを解析した.その結果,成長温度については,400°Cでは,エピタキシャル成長はおこらなかった.

また,500°C以上の温度では,温度が高くなると,結晶性は良くなるが,成長層の性状は荒れたものとなった.性状は600,700°Cのものが良好であった.これは,温度によって,成長の様式が変化するためと考え,温度のみの関数である分子の基板表面での表面拡散距離と基板温度の関係から,この成長の様式の解析を試み,実験結果と解析の結果が傾向として一致した.すなわち,分子線エピタキシでは,適切な前後処理および成長条件を設定すれば,結晶性が良好でかつ平滑な表面性状の平面が創成できることが明らかとなった.
栄養飢餓状態における植物培養細胞の液胞内オルガネラ分解機構の解明

タバコ培養細胞BY-2株にチトクロムb5とRFP (Red fluorescent protein)の融合タンパク質を発現させた場合、細胞増殖期にRFPは凝集パターンを呈し、定常状態期に移行すると液胞内にRFPの蛍光が検出された。そこで我々は、RFPの蛍光を指標にタンパク質凝集体の液胞移行および分解機構について解析を行った。RFP凝集体の液胞移行を誘導する条件を検討した結果、RFPの蛍光は栄養飢餓条件で液胞に移行することがわかった。栄養飢餓条件下でプロテアーゼ阻害剤を加え培養した場合、RFP凝集体は液胞移行せずにオートリソソーム(自食作用胞)様の構造体内に観察されることから、RFP凝集体の液胞移行にはオートファジー機構の関与が示唆された。そこで、オートファジーに中心的な働きを担っているAtg8のBY-2ホモログNtAtg8とYFP (Yellow fluorescent protein)の融合タンパク質を発現させて動的解析を行った。その結果、栄養飢餓条件下に移行すると、リング状のオートファゴソームが誘導されることがわかった。そして、オートファゴソームは中央液胞へ直接、または、小さい液胞内に取り込まれてから中央液胞へ移行することが確認された。その上、RFP凝集体は他のオルガネラに比べ、優先的にオートファゴソームにより取り込まれることがわかった。以上の結果から、RFP凝集体は栄養飢餓により誘導されたオートファゴソームにより取り込まれ、液胞へ移行することが推定された。これらの成果は、国内外の学会およびシンポジウムで発表し、細胞生物学の国際雑誌へ論文を投稿中である。タバコ培養細胞BY-2株を様々な培養培地に移し、増殖速度や細胞内のタンパク質量を測定した結果、ショ糖、窒素、リン酸がない飢餓状態においてタンパク質分解が起きていることがわかった。そこで、透過型電子顕微鏡観察により飢餓状態における形態構造観察を行った結果、二重膜構造の自食作用胞(オートファゴソーム)が観察された。そして、当研究室で解析したタバコ培養細胞BY-2株のEST情報をもとにオートファジーに中心的役割を担うタンパク質(NtApg8)へ蛍光タンパク質(YFP)を融合しBY-2株に発現させ、共焦点レーザー顕微鏡およびデコンボリューション蛍光顕微鏡により詳細に観察を行った。その結果、酵母や動物細胞と形状が似た二重膜構造体を確認し、液胞へ移行していることがわかった。また、抗NtApg8抗体を作製し、免疫電子顕微鏡観察を行った結果、飢餓状態にのみオートファゴソーム様の構造体を確認し、オルガネラの分解へ関与が示唆された。以上の結果から、飢餓条件において細胞内のオルガネラの一部は、オートファジー機構により液胞内で分解されることが推定された。これらの成果は、日本植物生理学会およびアメリカ植物学会にて発表した。また、オートファジー機構以外の分解機構を見出すために、ショ糖、窒素、リン酸がない飢餓状態におけるタバコ培養細胞BY-2株のmRNAを単離し、当研究チームで作製したタバコ培養細胞BY-2株の約9000クローンを貼り付けたマイクロアレイを用いて解析を行った。現在、通常培養細胞の遺伝子プロファイルと比べて極端に発現が多い遺伝子または少ない遺伝子について解析を進めている。
微小欠陥-元素分布トモグラフィーによる原子炉圧力容器鋼の照射脆化機構の解明

まず、「微小欠陥-元素分布トモグラフィー」で行う電子線トモグラフィー(ET)、三次元アトムプローブ(APT)測定のための針試料作製方法の確立を目的とした。板状試料の表面を電子線後方散乱回折測定して結晶方位を特定した後、集束イオンビーム加工装置によって、長手方向が特定の結晶方位となるような針試料を作製することに成功した。針試料長手方向を軸として試料を回転することで、一定の回折条件の下、走査透過電子顕微鏡(STEM)像の連続傾斜シリーズの取得が可能になった。連続傾斜像の取得後、低加速Arイオンミリング装置を用いて、STEM観察時に試料表面に形成された汚染層を除去し、APT測定を行った。これにより、APT測定時の試料破壊頻度を大きく減少させることができた。なお、放射化した試料を取り扱うため、実験は東北大学金属材料研究所附属量子エネルギー材料科学研究センターの放射線管理区域内で行った。上述の手法を、ベルギーの商用炉で約30年間中性子照射された、高照射量の原子炉圧力容器監視試験片に適用し、転位線や結晶粒界と溶質原子クラスター(SC)との三次元位置相関を調べた。ETで空間分布が特定された転位線や結晶粒界に沿って優先的にSCが形成されていることが明らかになった。これは転位線や結晶粒界がもたらす歪み場とSCの形成に強い相関があることを示唆している。また、微小な歪み場しか持たない照射誘起転位ループの三次元空間分布を測定するため、新たなETの手法も開発した。この新手法により、従来実験的な知見がほとんどなかった転位ループとSCとの複合体の存在を直接示すことに成功した。これらの研究成果は国内外の学会等で発表を行った。また、現在原子炉圧力容器鋼の照射脆化機構に関わる論文を投稿し、受理可能な内容の修正コメントを受けている。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
中南米産矢毒蛙のアルカロイド

1.二次元NMRスペクトルの解析により、コスタリカ産矢毒蛙Dendrobates pumilioの新塩基の立体化学を含めた構造解析を行った。この際ローパスフィルターなどを組み込んだCOLOC-パルスを開発,利用した。この方法では、従来避けられられなかった不要ピークが消滅、また位相感応型にすることにより優れた解像力を出現するなど、高い有用性を認めた。2.蛙毒シス-デカヒドロキノリン塩基には環結合の配座異性体間の平衡が存在しうる場合が多く、立体構造の決定は容易でない。構造解析に際して参照される文献値は低感度の^<13>C核のものに限られ、化学シフトの経験的な扱いに基づくものが多い。本研究では主として感度の高い^1H-NMRによる構造解析法の開発を目的とした。矢毒蛙塩基の構造確定とともに、別途調製した数種のシス-デカヒドロキノリン誘導体についても検討し、環結合異性体間の平衡に及ぼす各置換基の要素、特に5-,8-equatorial置換基の特性など構造解析に役立つ知見を得た。3.蛙毒ピロリチジン-オキシム塩基の構造解析に関して残された主な問題はメチルオキシム基の立体配置である。メチルオキシム基周辺に観測されたわずかな差NOE値は、立体配置の根拠とするには充分でなかった。本研究中、芳香族溶媒中に現れるNMR溶媒シフト値にオキシム基の立体配置が現れていることをモデル化合物について見いだした。矢毒蛙塩基の溶媒シフト値が示すオキシム基の立体配置の知見は、差NOE値が示すものと一致した。一般に差NOEの観測には綿密な事前の配慮が必要であり、観測の容易さ、信頼度にも問題のあることが多い。いっぽう溶媒シフト値の測定は容易であり、立体構造全般との間に相関性が確立すれば有用な解析法となる。目下多種多様のモデル化合物について検討を進めている。3.については日本化学会第67回春季年会(平成6年3月31日)にて発表予定1989年、コスタリカサラピグイ河で採集したD.pumilioの塩基性主成分は、すでに構造が明らかなOctahydrohistrionicotoxin C_<19>H_<33>NO,Isodihydrohistrionicotoxin C_<19>H_<27>NOである。副成分としてC_<19>H_<27>N(1),C_<19>H_<33>N(2)(3)などを単離した。副アルカロイド(1)は各種2D-NMR解析に基づいて2,5-2置換ーシスーデカヒドロキノリン誘導体であり、8a-HはA環上axial、2,5-位の置換基はいずれもequatorialなる配座をとることを明らかにした。一般に、シスーデカヒドロキノリン類には環結合の配座変換の問題があって立体構造の決定は容易でない。シスーデカヒドロキノリン自身のP-COSY-NMR低温測定により環結合に関わるJ-結合値を観測した。シスーデカヒドロキノリンアルカロイド類の構造研究の基本資料になると思われる。新アルカロイド(2),(3)はいずれもトランス-デカヒドロキノリンアルカロイドであった。これらの構造解析の過程で、異核相関2D-NMRの分解能向上を必要とし、COLOC型測定法への種々のフィルターの組み込みを検討した。ローパスフィルターとBIRDパルスの組み込みを行ったものが優れた結果を与えることを見いだした。最近新たに単離した副アルカロイドC_<13>H_<22>N_2O(4),C_<14>H_<24>N_2O_2(5)はNMRの解析の結果、新型アルカロイド、インドリチジン-オキシム類であると推定されるが、先にパナマ産D.pumilioから単離、構造を明らかにした同アルカロイドの立体異性体と思われる。現在矢毒蛙から初めて単離されたこれらの新規アルカロイドの立体構造の解明を進めている。

一般に差NOEの観測には綿密な事前の配慮が必要であり、観測の容易さ、信頼度にも問題のあることが多い。いっぽう溶媒シフト値の測定は容易であり、立体構造全般との間に相関性が確立すれば有用な解析法となる。目下多種多様のモデル化合物について検討を進めている。3.については日本化学会第67回春季年会(平成6年3月31日)にて発表予定
新規機能性ポリマー・ピーポッドの合成と応用

新規ナノ複合素材の作製を目的として、不斉官能基など、様々な機能性官能基を導入したナノサイズの筒状高分子(ポリマーナノチューブ)の作成と、その内部に金属ナノ粒子やフラーレン(C60)、マグネタイトナノ粒子(ナノサイズの磁性物質)などを内包したポリマー・ピーポッド(さやえんどうに似た構造を持つポリマーナノチューブ複合体)の作成と、その特性について検討した.本研究成果により、さまざまなナノサイズの物質を内包した新規な機能性ポリマー・ピーポッドの簡便な合成手法が確立された.新規ナノ複合素材の作製を目的として、不斉官能基など、様々な機能性官能基を導入したナノサイズの筒状高分子(ポリマーナノチューブ)の作成と、その内部に金属ナノ粒子やフラーレン(C60)、マグネタイトナノ粒子(ナノサイズの磁性物質)などを内包したポリマー・ピーポッド(さやえんどうに似た構造を持つポリマーナノチューブ複合体)の作成と、その特性について検討した.本研究成果により、さまざまなナノサイズの物質を内包した新規な機能性ポリマー・ピーポッドの簡便な合成手法が確立された.本研究では、新規ナノ複合素材の作成を目的として、ポリマーナノチューブ内にフラーレンやマグネタイトナノ粒子といったナノマテリアルを導入したピーポットの作成について検討した。まず、電解重合能を有するチオフェンを主骨格としたethylenedioxythiophene(EDOT)及びcyclohexane-dioxythiophene(CDOT)をテンプレートであるポーラスアルミナ細孔内で電解重合し、EDOTポリマーナノチューブ(EDOT-PNT)及びCDOTポリマーナノチューブ(CDOT-PNT)を合成した。その後、合成したポリマーナノチューブにマグネタイトナノ粒子やフラーレンの溶液を物理的に流し込むという非常に簡易な方法を用いて、ポリマーナノチューブヘナノマテリアルの導入を行った。次いで、1N-NaOH水溶液を用いてポーラスアルミナの除去を行った後、ポリマーナノチューブの透過型電子顕微鏡(TEM)及び走査型電子顕微鏡(SEM)走査透過型電子顕微鏡(STEM)観察やRaman測定、cyclic voltammetry(CV)測定、UV-vis測定を行い、ポリマーナノチューブ内にマグネタイトナノ粒子及びフラーレンが導入されていることを確認した。マグネタイトナノ粒子を内包したポリマーナノチューブにおいては、マグネタイトナノ粒子が内包環境においても安定的にその性質を保持し、外部磁場との間で吸引的な相互作用を示すことを確認した。本研究成果により、さまざまなナノマテリアルを複合した新規な機能性ポリマーナノチューブの簡便な合成手法が確立された。本研究では、新規ナノ複合素材の作製を目的として、不斉官能基を有するポリマーナノチューブ(PNT)内部に金属ナノ粒子やフラーレン(C_<60>)を導入した金属ナノ粒子およびフラーレン内包キラルPNT・ピーポッドの合成と、その特性について検討した。まず電解重合能を有するターチオフェンに、BINOL誘導体を導入した(R)-TBOHを合成した。その後、ポーラスアルミナをテンプレートとし、(R)-TBOHを電解重合することでPNTを合成し、合成したPNT内部で水酸基と金属錯イオンを形成後、還元することでPNT内部への金属ナノ粒子の担持を試みた。次に(R)-TBOHにピレン基を導入した(R)-TBOPを合成後、同様にしてPNTを合成し、ピレン基とのπ-π相互作用を利用して内部へC_<60>を導入した。その後、(R)-TBOH-PNTについては、走査型電子顕微鏡(SEM)及び透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて金属ナノ粒子が導入されていることを確認した。また、(R)-TBOPPNT内部へのC_<60>の導入に関しての確認は、ラマンスペクトルを測定する事で行った。(R)-TBOP-PNTは、(R)-TBOPが有するピレン基の特性により、蛍光を示すPNTであることが確認でき、またC_<60>導入後には、導入されたC_<60>との相互作用の結果、(R)-TBOP-PNTの蛍光が消光されること確認した。本研究成果により、さまざまなナノマテリアルを複合した新規な機能性ポリマー・ピーポッドの簡便な合成手法の確立が導かれた。
炎症誘導型樹状細胞系サブセットがB細胞の生存を増強する機構の解明

Toll-like receptor 7 (TLR7)はウイルスなどの核酸を認識して免疫応答を惹起する一方で、宿主由来の核酸をも認識し、自己免疫疾患などを誘導すると考えられている。我々が樹立したUnc93 homologB1 (Unc93B1)にD34A変異を持つマウスは(D34Aマウス)、TLR7の応答が亢進することで自己免疫性肝炎などの表現型が誘導される。D34Aマウスの細胞を詳細に検討した結果、野生型マウスでは見られない細胞表面マーカーを持つ特殊な単球系細胞サブセットが認められた。このサブセットは炎症によって誘導される単球系細胞であると仮定し、以下inducible MC (iMC)と呼ぶ。iMCの主な特徴は、(1)定常状態においても炎症性サイトカインの産生が見られること、(2)B細胞との共培養によってB細胞の生存を増強すること、の2点である。このことから、自己抗体の産生などB細胞の活性化を伴う自己免疫疾患において、iMCが何らかの寄与をしている可能性が考えられた。本研究ではiMCが誘導される条件を検討するため、数種類の自己免疫疾患モデルマウスから細胞を採取し、iMCの有無を調べた。その結果、D34Aマウス以外にも特定の全身性エリテマトーデス(SLE)モデルマウスなどでiMCの誘導が認められたことから、iMCの誘導に関わる慢性炎症は広範に渡ると考えられる。また、これらのマウスにおいてTLR7の応答を阻害するとiMCの誘導が見られなくなたっため、iMCはTLR7依存的に誘導されている可能性が示唆された。動物飼育室における問題により、マウスを用いた実験を停止せざるを得ない状況になった。現在は問題が解決し、実験を再開することが可能となっている。(1)iMCと他の単球系細胞をRNA-seqによって比較し、iMCの系列や性質の決定を行う。(2)トランスウェルなどの実験系を用いて、iMCによるB細胞の生存増強には細胞同士のコンタクトが必要か、もしくは液性因子によって生存シグナルの増強が行われているのかを明らかにする。(3)上記「(1)および(2)」によって得られたデータから、iMCの誘導に関わる因子を予測し、そのノックアウトマウスにおいてiMCが誘導されるかを検討する。(4)同様に、iMCによるB細胞の生存増強に関わる因子を予測し、候補分子のノックアウトマウスから細胞を採材して検討を行う(5)老齢マウスなど、炎症性疾患モデルマウス以外においてもiMCが誘導されるかを検証する。動物飼育室における問題(感染)により、実験の停止を余儀なくされた。RNA-seqなどの実験を翌年度に行う。
培養骨芽細胞様株細胞における骨基質タンパク遺伝子発現の多様性について

平成11年度は,骨芽細胞様株細胞C20およびC26細胞を用い,以下の検討を行った。【方法】C26およびC20細胞を114日間にわたってそれぞれ培養した後,経日的に細胞を回収した。これらの細胞からRNAを抽出し,[α-^<32>P]dCTPで標識したラットosteopontin(OPN),bonesialoprotein(BSP),osteocalcin(OC),alkaline phosphatase(ALP)cDNAプローブを用い,これらのタンパクのmRNAの発現をNorthern blot法を用いて分析した。この方法で検出できないものについては,RT-PCR法でその発現を確認した。【成績】C26およびC20細胞は培養6日目にほぼconfluentに達した。OPN mRNAは,両細胞において同様で,培養1日目から発現し,以後一定な発現を示した。ALP mRNAは,C26細胞では培養2日目から発現し,8日目までやや増加し,以後一定な発現を示したが,C20細胞においては,1日目から発現し,9日目までやや強度な増加傾向を示し,以後一定な発現を示した。なお,Northern blot法では,両細胞ともにOCとBSPのmRNA発現を検出できなかったが,RT-PCR法でOCの遺伝子発現のみを確認することができた。【考察および結論】平成10年度の検討では,前骨芽細胞から骨芽細胞へ分化するとともにdecorinの遺伝子発現は顕著に低下するが,biglycanはほぼ一定の発現を示すことを示した。平成11年度ではALPのmRNA発現は細胞分化とともに遺伝子・タンパクレベルで増加するが,OPN mRNAは前骨芽細胞および骨芽細胞の両細胞においてほぼ同様の発現を示し,培養日数による変化も示さないことを明らかにした。しかしながら,in vivoにて成熟骨芽細胞に発現するOCとBSP mRNAは両細胞においてNorthern blot法の検出感度以下で,発現の違いを確認することができなかった。これらの結果より,biglycanとOPNは前骨芽細胞および骨芽細胞の機能発現に重要な役目を果たしていると考えられた。なお,これらの結果については論文発表を準備中である。本研究に関連する論文(2報)を平成11年度に発表した。平成10年度は,骨芽細胞様株細胞であるC20およびC26細胞を用い,培養日数の経過に伴う表現形質の変化について以下の検討を行った。結果:1. ALPase活性C20細胞のALPase活性は培養1日目より徐々に増加し6日目に最大に達すると,以降は減少傾向を示した。C26細胞のALPase活性は,112日において経日的な上昇傾向を示した。2.ノーザンブロット法を用いたdecorin,biglycanの遺伝子発現C26細胞のdecorin遺伝子発現は播種後しばらくの間は極めて軽度に発現していたが,経日的に上昇し,11日目にピークに達した。C20細胞のdecorin遺伝子発現は12日間通して認められなかった。一方,biglycan遺伝子発現は両細胞ともに培養1日目よりその発現が認められ,培養日数の経過による発現量の著しい変化は見られなかった。結論:ALPase活性およびdecorin遺伝子発現は骨芽細胞の増殖や分化に伴って変化するが,biglycan遺伝子発現は常に一定の発現が認められることから,biglycanは骨芽細胞の増殖や分化に必須のものである可能性が考えられる。