hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
RNA情報発現系の時空間ネットワーク

その一例として、遺伝暗号の発見から40年余謎であった終止コドン解読機構が、ペプチドアンチコドンの発見により、はじめて明らかにされ、あわせて機能面と構造面から分子擬態に関する理解が深まった。本領域は総括班と4つの計画研究班及び公募研究から構成され、緊密な連絡の下に領域全体および各班の研究目標を達成するように推進された。各研究班の研究成果の概要は以下の通りである。(総括班)1)総括班実施メンバーにより計画研究項目の内容に関して最新の調査点検議論を実施した。2)国内外における本領域課題に関する研究集会へ出席し情報収集・議論を実施した。3)第1回公開シンポジウムを7月1516日につくば国際会議場において開催した。4)合同班会議を平成15年1月911日に島市東レ研修センターにおいて開催した。5)第2、3回総括班会議を平成14年7月14日(於つくば市)及平成15年1月9日(於三島市)開催した。6)計上備品を予定研究機関に設置し次年度の速やかな計画研究開始の準備を完了した。(A01班・RNPマシーン)リボソーム研究においては、ペプチド転移及び解離因子による翻訳終結の分子機構等のRNA触媒に関する研究がリボソームの立体構造を基盤として進展した。中村らが機能的な研究によって発見したペプチド・アンチコドン(仮説)がクリオ電子顕微鏡解析によって構造的に実証された。(A02班・RNA制御スイッチ)、分裂酵母におけるアンチザイムのフレームシフト研究、植物シスタチオニンγ-シンターゼのmRNA分解制御の研究、再構成系を用いた転写開始複合体の分離解析、tRNA擬態領域の作用部位の解明等、翻訳機構を中心としたRNA制御シグナルの研究が進展した。(A03班・動くRNA)神経特異的RNA結合蛋白質Huの多量体形成能とリボソーム相互作用の発見、クロモドメイン蛋白質の線虫始原生殖細胞の増殖制御機能の発見、スプライシングとmRNA核外輸送のカップリング等に関する分子基盤が明らかにされた。(A04班・高次複合系RNA動態)脆弱X症候群のモデル系としてFMR1相同遺伝子(dfmr1)欠失ショウジョウバエの作成により概日リズムの異常を発見し、dfmr1蛋白質がリボゾーム蛋白質とRNA interference (RNAi)関連因子と相互作用することを示した。ミトコンドリアtRNA遺伝子の変異による「ミトコンドリア病」の病態モデルマウスを樹立し、核DMAの変異が「ミトコンドリア病」の臨床症状の多様性に関与することを明らかにした。(総括班)
MBE法で製作した磁性金属人工格子の円偏光放射光内殻磁気円二色性による研究

1.分子線エピタキシ-(MBE)装置用の試料製作超高真空槽(液体窒素シュラウドを含む)を設計・製作した。Heリ-クテストの結果リ-クはなく、24時間ベ-キングを行った結果、4x10^<-11>Torrの到達真空度が得られた。2.反射高速電子線回折(RHEED)電子銃およびRHEED用電源を製作した。電子銃はビームスポット径φ90μm以下(設計仕様)の条件を十分に満たした。3.試料基板準備槽を設計・製作した。Oリングシールによる開閉で試料基板の交換が手早く行える構造とした。4.平成6年度までに所持していた機器(E型電子銃、クヌードセンセル、水晶振動子膜厚モニター、真空機器等)、RHEED電子銃及び試料基板準備槽を試料製作超高真空槽に組み込みMBE装置を完成させた。5.内殻吸収磁気円二色性実験の試料として使用するCo/Pt人工格子・多層膜試料を製作した。6.小角および広角X線回折実験により、5.項の人工格子・多層膜の人工周期を調べ、ほぼ設計どうりの人工格子ができていることを確認した。また、磁気トルク測定により磁気異方性を調べ、Co層が非常に薄い試料では垂直磁気異方性を示すことを確認した。7.円偏光放射光を利用して内殻吸収磁気円二色性実験を行った。これよりCo層が非常に薄い試料では、Co3d軌道磁気モーメントが大幅に増大していること、及びCo3dバンド幅が狭くなることを見いだした。また元来は非磁性のPt原子に、Coの磁気モーメントと強磁性的にカップルする磁気モーメントが誘起されていることを見いだした。この超高真空槽は、E型電子銃、クヌードセンセル、水晶振動子膜厚モニター、反射高速電子線回折(RHEED)用電子銃、低速電子線回折(LEED)装置、オージェ電子分光装置、試料マニピュレーター、真空排気装置、のぞき窓、試料基板導入等の各種ポートを取付けられる構造とした。この真空槽は、Heリ-クテストを行った結果リ-クはなく(リーディテクターの検出限界2x10^<-10>Torr・1/s以下)、超高真空仕様のための第1条件を満たした。さらに、4001/sターボ分子ポンプで排気しつつ24時間ベ-キングを行った結果、主排気装置として5001/sイオンポンプとチタンサブリメーションポンプを用いることにより、4x10^<-11>Torrの到達真空度が得られた。これはMBE装置用真空槽として、十分良い超高真空と見なされる。2.磁性金属人工格子・多層膜の積層を1原子層のオーダーで制御するために、反射高速電子線回折(RHEED)強度振動を利用する。そのための主装置として、RHEED用電子銃およびRHEED用電源を製作した。RHEED用電子銃は、設計仕様であるビームスポット径φ90μm以下の条件を十分に満足した。また、RHEED用電源は、安定でかつ最大加速電圧30kVという当初の仕様を満たした。3.今後、試料製作超高真空槽に、1.項で述べた各種の装置を取付け・組み込んで、MBE主装置を完成させる予定である。1.分子線エピタキシ-(MBE)装置用の試料基板準備槽を設計・製作した。試料基板の交換が手早く行えるように、Oリングシールによる開閉が可能な構造とした。

2.平成6年度までにすでに所持していたMBE装置用のE型電子銃、クヌードセンセル、水晶振動子膜厚モニター、低速電子線回折(LEED)装置、オージェ電子分光装置、試料マニピュレーター、真空バルブ、真空排気装置、及び平成7年度科研費で製作した反射高速電子線回折(RHEED)用電子銃を試料製作用超高真空槽(平成7年度科研費で製作)に組み込んだ。さらに、試料準備槽をバルブを介して試料製作用超高真空層に取付け、最終的にMBE装置として完成させた。3.内殻吸収磁気円二色性実験の試料として使用するCo/Pt人工格子・多層膜試料を製作した。4.小角および広角X線回折実験により、3.項の人工格子・多層膜の人工周期を調べ、ほぼ設計どうりの人工格子ができていることを確認した。また、磁気トルク測定により磁気異方性を調べ、Co層が非常に薄い試料では垂直磁気異方性を示すことを確認した。5.円偏光放射光を利用して内殻吸収磁気円二色性実験を行った。これよりCo層が非常に薄い試料では、Co3d軌道磁気モーメントが大幅に増大していること、及びCo3dバンド幅が狭くなることを見いだした。また本来は非磁性のPt原子に、Coの磁気モーメントと強磁性的にカップルする磁気モーメントが誘起されていることを見いだした。
細胞夾雑模倣系の構築と細胞内活性分子設計指針の構築

本研究では細胞内の分子夾雑な環境における生体分子の相互作用を定量に解析し、得られた定量的パラメータを基に生体反応を合理的に制御する技術の開発を目指す。そのために、特に生命の遺伝情報を担う核酸に着目し、次の二点を遂行する。(1)細胞環境の化学模倣実験系の構築:細胞の生体分子の物性や形状を模倣した合成分子を用いて細胞模倣実験系を構築する。(2)細胞における生体分子の定量的機能ー環境定量相関(QFER)の解明:上記実験系を用いて、核酸の構造安定性や機能と環境因子の定量的相関関係を解明し、セントラルドグマに関与する核酸の機能を合目的的に制御する。2018年度は、(1)細胞模倣実験系を構築し、(2)生体分子の機能-環境定量相関(QFER)の解明と生体分子の機能制御を目指す2段階の研究を遂行した。まず(1)として、生体高分子、代謝産物、浸透圧調節分子などを共存溶質として水溶液中に添加して細胞模倣実験系を構築し、核酸の構造や機能を熱力学的・速度論的手法によって解析することを試みた(Nucleic Acids Res., 46, 8, 4301-4315 (2018)など)。さらに、細胞の分子環境変化が核酸構造に及ぼす影響を解析するために、溶液環境構造を変化させるG四重鎖のDNA配列を用いた環境応答型DNAセンサーを開発した(Anal. Chem., 91, 2561 (2018))。(2)として、QFERの解明を目指し、細胞内において転写、翻訳反応過程を定量的に解析する手法を開発し、細胞内における核酸構造の重要性を示唆する知見を得た(Nat Struct Mol Biol., 25, 279 (2018)、Anal. Chem., 90, 11193 (2018))。さらにナノデバイス中で遺伝子発現を解析し、夾雑環境で代謝産物が遺伝子発現を活性化することを見出した(ACS Synth Biol. 8, 557 (2019))。また、機能性RNAであるリボスイッチアプタマーは,夾雑環境下では,試験管内よりもよりダイナミックな立体構造を変化させた(Angew. Chem. Int. Ed., 57, 6868 (2018))。さらに、がん細胞に多量に発現するmRNA中のG四重鎖に結合する小分子をがん細胞に導入し、小分子に近赤外光を照射すると、G四重鎖が分解され、特定のがん遺伝子の発現を抑制できる技術の開発を行った(Nat. Commum., 9, 2271 (2018)、日本経済新聞など50社以上に掲載)。2019年度は、「細胞の分子夾雑環境」を化学的に理解し、核酸の四重鎖や三重鎖などの非標準構造とその機能を制御する技術の開発を目的として、次の研究を遂行する。(1)細胞模倣実験系の構築:ポリエチレングリコール等の中性高分子やフィコールなど糖類で細胞の核内や細胞質内をある程度模倣できることが本研究によって示された。これらの夾雑分子を溶液に添加すると同時に、生体分子の物性や形状を模倣した人工分子を開発し、細胞質や核、ミトコンドリア等の細胞小器官内部分子環境を模倣した細胞模倣実験系を創製することを目指す。さらに、このような分子夾雑環境で、核酸の構造や機能を熱力学的・速度論的に解析する方法も確立し、細胞内環境下における核酸構造や機能のデータベースを構築する。細胞模倣実験系は、領域全体に供し、機能性分子やナノバイオデバイスの機能を評価するためのプラットフォームとする。本細胞模倣実験系で得られた知見と、領域内の実細胞実験やナノデバイス実験の結果を比較検討することで、細胞模倣実験系の最適化を進める。(2)生体分子の定量的機能ー環境定量相関(QFER)の解明:上記の細胞模倣実験系と定量解析手法を用いて、近年遺伝子発現に関与することが示唆されている核酸の非標準構造の安定性や機能性を検討する。これにより、細胞の周期や状態に依存して動的に変化する核酸の物性を明らかにする。細胞内の環境因子が核酸や機能性分子の物性に及ぼす影響を系統的に検討し、データベース化することで、細胞における生体分子の定量的機能ー環境定量相関(QFER)を提唱し、QFERを用いた遺伝子発現制御法の開発を行う。本年度(平成29年度)は、夾雑分子(ポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン等)を用いて細胞模倣実験系を構築し、がんや神経疾患に関わる領域のDNAの構造や安定に及ぼす影響を解析した。

その結果、夾雑分子は、DNAの標準構造である二重鎖の全体構造には影響を与えず、二重鎖内のワトソン・クリック塩基対を不安定化し、ミスマッチ塩基対は不安定化しないことがわかった(Biochem. Biophys. Res. Commun., 496, 601 (2018))。一方、夾雑分子は非標準構造であるDNA四重鎖のトポロジーを変化させ(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 114,9605 (2017))、四重鎖の熱安定性を大きく安定化させることを見出した(J. Am. Chem. Soc.,140,642 (2018))。さらに、QFERの解明を目指し、細胞内において転写、翻訳反応過程を定量的に解析する手法を開発し、細胞内における核酸構造の重要性を示唆する知見を得た(J. Am. Chem. Soc., 140,642 (2018))。本年度は、上述した(1)の分子夾雑環境が核酸構造に及ぼす影響について解析を行った。その結果、核酸の構造によって異なる夾雑分子の影響をエネルギーレベルで解析し、データベースの構築に着手することができた。さらに、得られた知見を基に、夾雑環境下における核酸構造が複製、転写、翻訳に及ぼす影響を解析し、夾雑環境下における核酸構造の機能についても明らかにすることができた。具体的には、がん遺伝子中の四重鎖構造という特殊な構造がDNA複製反応を効率的に阻害し、その阻害効果が、四重鎖のトポロジーによって異なることを見出すことができた(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 114, 9605 (2017))。さらに、細胞のがん化とその進行に伴う細胞内の夾雑環境の変化(カリウムイオン濃度の低下)に注目し、カリウムイオンとの結合によって構造が安定化する四重鎖が、がん遺伝子の転写量を制御していることを見出した(J. Am. Chem. Soc., 140,642 (2018))。これらの研究成果は、米国化学会誌「Journal of the American Chemical Society誌」2018年1月17日号の表紙(Supplementary Journal Cover)に掲載され、新聞各紙(2017年10月25日付神戸新聞、2018年1月29日付日刊工業新聞、2018年2月21日付神戸新聞)朝刊に取り上げられた。以上の研究成果から、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。本研究では細胞内の分子夾雑な環境における生体分子の相互作用を定量に解析し、得られた定量的パラメータを基に生体反応を合理的に制御する技術の開発を目指す。そのために、特に生命の遺伝情報を担う核酸に着目し、次の二点を遂行する。(1)細胞環境の化学模倣実験系の構築:細胞の生体分子の物性や形状を模倣した合成分子を用いて細胞模倣実験系を構築する。(2)細胞における生体分子の定量的機能ー環境定量相関(QFER)の解明:上記実験系を用いて、核酸の構造安定性や機能と環境因子の定量的相関関係を解明し、セントラルドグマに関与する核酸の機能を合目的的に制御する。2018年度は、(1)細胞模倣実験系を構築し、(2)生体分子の機能-環境定量相関(QFER)の解明と生体分子の機能制御を目指す2段階の研究を遂行した。まず(1)として、生体高分子、代謝産物、浸透圧調節分子などを共存溶質として水溶液中に添加して細胞模倣実験系を構築し、核酸の構造や機能を熱力学的・速度論的手法によって解析することを試みた(Nucleic Acids Res., 46, 8, 4301-4315 (2018)など)。
核の初期化促進方法の確立およびクローン胚から作成したntES細胞の正常性の検討

我々はクローン動物および体細胞由来ntES細胞を効率よく作出する方法の開発および初期化のメカニズムの解明を試みている。昨年我々はntES細胞と受精卵由来のES細胞には違いが見られないことを証明したが、19年度はさらに詳しい比較と倫理問題の解決を試みた。我々は核移植の影響を調べるために、単為発生ES細胞を用いた遺伝子発現解析法を確立し、これによってついに我々は特定の遺伝子におけるメチル化状態について、ntES細胞とES細胞の間に違いがあることを発見した。現在このntES細胞特異的なDNAメチル化状態の違いが、その後の細胞分化や応用にどのような影響を与えるのか解析中である(Hikichi, et. al., 2007,2008)。一方倫理問題の解決については2つのアプローチを試みた。体外受精に失敗した卵子は、加齢により質が低下することから廃棄されている。この廃棄卵子を用いれば健康な女性から卵子を提供してもらうという倫理問題は解決する。そこでマウスを用いたモデル実験を行った結果、体外受精に失敗した卵子でも核移植およびntES細胞の作成には問題ないことを明らかにした(Wakayama, et. al., 2007a)。この成果は多数の全国紙やテレビで紹介された。また、胚を殺さずに1割球(細胞)を取り出し、そこからES細胞を樹立する手法を開発し、生命の萌芽である胚を壊すという問題についても回避できることを明らかにした(Wakayama, et. al., 2007b)。他に核移植技術をより簡素化した手法についての研究も報告した(Kishigami, et. al., 2007;Wakayama, et. al., 2008)。クローン動物の作出が難しいのは初期化が不十分であるためと考えられており、初期化促進方法の検討が主に行われている。しかし我々は、それ以前の可能性を検討した。すなわちドナー核自身の異常および核移植によるダメージである。そこで核移植直後の卵子内ドナー核を染色しコンフォーカル顕微鏡で紡錘体や中心体タンパク質などを詳細に観察した。その結果、一見区別の出来ない正常な体細胞であっても、核移植後に紡錘体を形成する際、いくつかのパターンに分かれることが明らかとなった。さらに核移植に使用するピペットのサイズによって核にダメージが生じていることを初めて明らかにした。また未処理卵子へ核移植してから卵子の核を除いても成功率は改善されなかったことから、マウスでは初期化因子は、卵子の除核の際に一緒には除去されないことが明らかとなった。一方体細胞から核移植によってクローン胚を作り、そこからES細胞(ntES細胞)を作出することは可能になっているが、その詳細は調べられていない。今回我々は、クローンマウスを作ることが出来ない系統からntES細胞の作出を試みた。その結果、どんなマウスの系統であっても、ntES細胞の樹立成績は20-30%の範囲であり、クローンマウスの作出より容易であった。さらに我々は、生殖細胞を完全に無くしたミュータントマウスの尻尾からもntES細胞の樹立に成功し、キメラマウスを作出後、自然交配させ、そのミュータントマウスの子孫を作ることにも成功した。このことは生殖細胞へ分化能を持たないミュータントマウスの体細胞であっても、ntES細胞は作出でき、そのうえ生殖細胞への分化もキメラマウスの精巣内で起こさせることが出来ることを意味している。これまでに我々はクローン動物の成功率は非常に低いが、ntES細胞の成功率はそれほど低くないことを明らかにしてきた。しかしクローン動物と同様にntES細胞の樹立成績においてもドナーマウスの遺伝的バックグランドが影響するかどうかは分かっていなかった。そこで我々は多数の系統のマウスの雌雄、および異なる組織を用いてntES細胞の樹立を試みた。その結果、いずれのドナーマウス、性別、組織の細胞からでも、さらにはクローンマウスを作ることが出来ない系統であってもntES細胞は比較的高率に樹立することが出来た(Wakayama et al.,2005a)。どの個体からでもntES細胞は樹立できる可能性を初めて示した。しかしながらこの結果はntES細胞のうちのいくつかは致死のクローン胚から樹立されたことを意味している。そこで我々は免疫染色、SKY-FISH法による染色体解析、DNAのメチル化の有無、遺伝子発現などさまざまな手法を用いて受精卵由来のES細胞と体細胞由来のntES細胞を比較している最中である。一方我々は、応用研究として生殖細胞を完全に無くしたミュータントマウスから、核移植およびntES細胞の技術を用いて子孫の作出を試みた。体細胞からのクローン個体の作出には失敗したが、尻尾からntES細胞の樹立には成功した。このntES細胞を受精卵に注入してキメラマウスを作出し交配することで、ntES細胞由来の精子を作り不妊マウスの子孫を作ることに成功した(Wakayama et al.,2005b)。このようにntES細胞は、正常性の検討が遅れてはいるものの研究において重要な技術であることが分かってきた。

17年度にはntES細胞の樹立成績はマウスの性別や系統に影響を受けないこと、組織によって成績に若干の差が出ることを明らかにした(Wakayama et al., 2005a)。この技術を応用することで生殖細胞を完全に欠損している不妊マウスから子孫を得ることに成功した(Wakayama et al., 2005b)。またクローン個体を確実に作出するための手段としてntES細胞が利用できることを明らかにした(Wakayama et al., 2005c)。一方クローン動物特異的な異常により出生直後に死んでしまう個体から未熟な生殖細胞を採取し、ヌードマウスなどに移植することで成熟させ、その後体外受精に用いることで致死のクローンマウスから正常な子孫を得ることに成功した(Ohta and Wakayama 2005)。この成果は現在の不完全な核移植技術であっても子孫を得ることが可能であることを証明し、絶滅危倶種などの救済に利用できることを示している。さらに我々は最近、ヒストンのアセチル化促進剤であるトリコスタテンAを培養液に加えることでクローンマウスの成功率が6倍に、ntES細胞の樹立成績は3倍に改善できることを明らかにした(Kishigami et al., 2006)。最初の体細胞クローン動物が生まれてから10年近くたつが、これまで誰も成功率の改善に成功した者はなく、今回の成果は薬品処理で核の初期化が促進できること、初期化にはヒストンの修飾が重要であることなどを初めて明らかにした。我々はクローン動物および体細胞由来ntES細胞を効率よく作出する方法の開発および初期化のメカニズムの解明を試みている。18年度にはntES細胞と受精卵由来のES細胞をDNAマイクロアレイやメチル化度、臓器への分化能などを比較し、両者にはまったく違いが見られないこと、つまりntES細胞は正常であることを証明した(Wakayama et al., 2006)。さらに我々は、分化能が低いことがネックとなっている単為発生由来ES細胞を核移植技術によって、受精卵由来ES細胞に近いレベルまで分化能を改善することに成功した(Hikichi et al., 2007)。一方17年度に我々はクローンマウスの成功率を最大で6倍にまで改善できたことを証明したが、この方法によりこれまで作ることが不可能だったICR系統のマウスのクローンにも成功した。ICR系統のマウスは最も一般的に使用されている系統であり、マウスのコストや利便性が改善されると思われる(Kishigami et al., 2007)。またクローンの成功率はドナー細胞の分化の程度に左右されると考えられていたが、しかしES細胞(未分化)、体性幹細胞である神経幹細胞(一部分化)、体細胞(完全分化)でクローンを作り比較した結果、クローンの成功率と分化の程度には相関がないことが明らかとなった(Mizutani et al., 2006)。クローン動物に頻発する異常については、卵子から核を取り除く際に卵子側の因子も除いてしまうこと(Thuan et al., 2006a)、体細胞の核を卵子に注入する再に発生阻害効果のある体細胞の細胞質まで一緒に注入してしまうこと(Thuan et al, 2006b)を発見した。それらの影響でクローン胚においては胎盤側より胎児側で異常が頻発していた(Kishigami et al., 2006)。
モリエール劇団の演目についての分析的研究-17世紀フランス演劇への新しいアプローチ-

一六五九年の復活祭の休み明け以降劇団のメンバーとなったラ・グランジュが公演日の演目と興行収入の記録を残した『帳簿』を手がかりとしてモリエール劇団の演目を分析的に研究することを目的として、平成10-11年度にかけては資料の収集ならびに、専門家の指導を仰ぐため渡仏し、パリ第12大学教授アラン・クプリ氏、トゥールーズ=ル=ミライユ大学教授クリスティアン・デルマス氏、パリ第4大学名誉教授ロジェ・ギシュメール氏、パリ第4大学教授ジョルジー・デュロゾワール教授などの指導を受けた。その成果として、モリエール研究誌le Nouveau Molieristeに論文Le spectacleen mouvement dans les deux premierescomediesen unacte deMoliere:Les Precieuses ridicules etSganarelleなどを発表し、報告書「モリエール劇団の演目についての分析的研究---17世紀フランス演劇への新しいアプローチ」を作成した。この報告書においては、第一章でモリエール劇団の興行記録について各演劇シーズンごとの特徴をまとめ、第二章でコルネイユ兄弟の作品とモリエールの戯作との関係について論じた。第三章では、デマレ・ド・サン=ソルランの『真昼に夢見る人たち』の一場面がモリエールの『人間嫌い』(第二幕第四場)のエリアントの名台詞の源泉のひとつであることなどを示した。第四章では、モリエールのふたつの初期作品と、劇団がパリで興行を始めた時の演目の柱となった作品(トマ・コルネイユの『ドン・ベルトラン・ド・シガラール』、ゲラン・ド・ブスカルの『お殿さまサンシュ・バンサ』、スカロンの二つの喜劇、『ジョドレ、あるいは主人づらする召使』と『ドン・ジャフェ・ダルメニー』)との関係について詳しく分析を行った。報告書の巻末には、ラ・グランジュの『帳簿』の抄訳を附した。17世紀フランス文学・演劇関連の資料収集にあたるとともに、モリエール劇団の演目のうちでも、とくに、劇団がパリの常設の劇場で活動を始めた1659年1661年についての検討を行った。この時期には、モリエールの初期の笑劇『才女気取り』と『スガナレル』が生まれているが、この二つの作品の成立条件として、劇団の演目の問題が大きく関わっていることを、実証的に論証しようとした。その結果を、国際的研究誌Le Nouveau Molieriste第3号に“Le Spectacleen mouvement dans les deux premierescomediesen unacte deMoliere:Les Precieusesridicules et Sganarelle"のタイトルで発表した。また、日本で上演されたモリエール劇『守銭奴』についての観客の反応から、日仏文化の違いについて考察した小論を同じくLe Nouveau Molieriste第3号に“Molire au Japon"のタイトルで発表した。『流域』第45号に発表した論文「ピエール・コルネイユの復権」は、これとは逆に、現代フランスにおけるコルネイユの受容の問題を演出という手法から考察したものである。啓蒙的な書物として、モリエールの『守銭奴』の語学訳注書を大学書林から上梓した。

引き続き、研究を深めるため、平成11年3月5日21日まで、パリに滞在し、国立図書館での資料収集(17世紀の演劇関係の版画や、トマ・コルネイユ、ボワロベールの戯曲)に当たる一方で、パリ第4大学名誉教授ロジェ・ギシュメール氏、同大学教授ジョルジー・デュロゾワール氏、パリ12大学教授アラン・クプリ氏、トゥールーズ・ル・ミライユ大学名誉教授クリスティアシ・デルマス氏、パリ国立図書館員マリー=フランソワーズ・クリストウー氏に研究指導を受けて、大きな収穫を得ることができた。モリエール初期の喜劇と後期作品との比較検討を行い、後期作品に見られる特徴が初期作品のうちにすでにその萌芽があることを指摘して、劇団の演目がモリエールの創作活動に深い関わりを持っていたことを示した論考"Les comedies-ballets etles autres pieces de Moliere"を、国際的研究誌XVIIe Siecle第201号に発表した(この雑誌の発行年は1998年となっているが、実際に発刊されたのは1999年である)。また、モリエール劇団の演目、特にトマ・コルネイユの戯曲のマイクロ・フィルム、また1684年版『モリエール全集』のマイクロ・フィルム、モントーバンの牧歌劇のマイクロ・フィッシュ等をパリの国立図書館より購入し、それらの戯曲に検討を加えながら、日本における新たな『モリエール全集』の企画・編集準備にもあたった。パリ第12大学教授であるアラン・クプリ氏には、「モリエールと宮廷」について、トリノ大学教授ダッラヴァッレ氏には「モリエールとイタリア喜劇」について、パリ第3大学名誉教授ミシュリーヌ・ケナン氏には「プレシオジテの文学」について、パリ第4大学名誉教授であるロジェ・ギシュメール氏には「モリエールと笑劇」について、同大学教授ジョルジー・デュロゾワール氏には「17世紀における音楽付き芝居」について、トゥールーズ=ル=ミライユ大学名誉教授クリスティアン・デルマス氏には「仕掛け芝居の伝統」について、ご指導をいただき、重要な視座を提供していただいた。平成12年度は、過去2年間の資料収集と文献読解の成果を生かし、報告書の作成に専念した。報告書では、一六五九年の復活祭の休み明け以降劇団のメンバーとなったラ・グランジュが公演日の演目並びに興行収入の記録を残し始めた『帳簿』を手がかりとして、この時期以降のモリエール劇団の演目を調査した。これによって、当時の演劇の動向についての知識を獲得し、モリエールの戯作がどのような作家の作品の影響を受けたのかという問題について考察した。第一章では、モリエール劇団の興行記録を整理したが、これによって次の事実が明らかとなった。すなわち、劇団がパリで興行を始めた最初の数年間は数多くの戯曲を上演することで地歩を固めるという戦略を取ったが、それから約十年後の16691670年の興行シーズンにおいては、劇団はモリエールの戯曲を専門に上演するようになったということである。第二章においては、コルネイユ兄弟の作品とモリエールの戯作との関係について論じた。なかでも突出した上演回数を誇るピエール・コルネイユの喜劇『嘘つき男』に用いられていた手法がたとえばモリエールの『人間嫌い』にどのように取り込まれているかなどについて分析を行った。
鶏の未受精卵への核移植

本研究は,トランスジェニック鶏作出を最終目的として行なったものである。1.未受精卵は、推定放卵時刻の約30分後と殺、開腹して腹腔またはろ斗部から採取した。精子は4羽の雄より採取混合し、リンゲル液で1000倍に希釈したのち、一部は76°Cで凍結融解(運動性0)した。これら精子または赤血球核は、マイクロシリンジに入れ胚盤内に16個入るよう注入し41°Cで12時間培養した。培養後ホルマリンで固定、染色して卵割の有無を観察した。その結果、凍結融解精子を顕微注入した63個の卵子のうち14個(22%)が正常卵割を起し、14個は異常卵割であった。一方、赤血球核を注入した21個のうち5個が正常に発達していた。これらの結果から、精子の生死にかかわらず、また赤血球核でも卵子に注入することによって卵割が誘起されることを認めた。2.トランスジェニック鶏作出のためには、遺伝物質を卵子に注入後雛の産出への技術を確立する必要がある。しかしPerry(1988)の体外培法は確率が低いので、本研究では新しい方法を試みた。供試鶏は白色レグホン種、雄鶏は産子の羽装が雄方を示すロードアイランドレッド種を用した。卵子は前述の方法で採取し、抗生物質を入れたリンゲル液に入れ静置した。精子は4羽の雄から採取混合したのちリン酸緩衝液で2倍に希釈し、卵子への媒精直前にリンゲル液で100倍に希釈した。この希釈精液0.10.01mlを卵子胚盤上に注ぎ、15分後その卵子を放卵直後の卵管内に挿入した。翌日放卵した硬殻卵をふ卵器に入れた。その結果、25個のうち16個が受精卵であったが、0.1mlのグループのみに6羽のひな(38%)がふ化した。これらの結果から、本研究による方法は、効率がよくトランスジェニック鶏作出のために有効な手法であると思う。1.卵子の採取には,白色レグホン系コマ-シャル鶏を用い,推定排卵時刻の約15分後開腹し,ビ-カ-に取出した。精子は,ロ-ドアイランドレッド種の精管膨大部から無菌的に採取し,リンゲル液で100倍希釈後耐凍剤を添加しないで-70°Cで凍結保存した。卵子胚盤内への精子の注入は,凍結融解精液(精子の運動性は0)をマイクロピペットに入れマニピュレ-タ-を操作することにより、1卵子に約1数個の精子を注入した。2.精子注入後,卵子は卵白を入れたビ-カ-に移し,41°Cの恒温器内に12時間インキュベイトした。次に,ビ-カ-内の卵白を除去し,10%ホルマリンを入れて卵子を固定したのち,コシンの方法で卵割の有無を観察した。以上本年度に確立した技術を用いた結果を下に述べる。3.排卵直後開腹し,腹腔内をリンゲル液で満たしたのち採卵すると,その確率は極めて良く,採卵中の破卵は10%以内であった。

4.無菌精液の採取には,開腹後出血した血液を除去したのち,膨大部の先端を切開して精管上部から下部に向って押し出して得るのがもっても効果的であった。すなわち,精管を摘出したのち絞り出す従来の方法に比較して,約2倍量とれること及び血液,脂肪の混入が少なかった。5.以上の方法を用いて,63個の卵子に凍結融解精子を注入したところ14個に正常卵割が見られ,異常卵割卵14個,無卵割卵35個の結果が得られた。すなわち,正常卵割が22%であったが,この値は低く,現段階では精子注入卵子を,産卵鶏の卵管に挿入して皺を得るのは困難であると考えられた。したがって今後は,精子の注入数を正確に行なう工夫をすること,また精子注入ピペットの挿入時におけるぶれをなくし,挿入深度も正確に行なうなら,かなり高率で正常卵割を得ることが出来るものと推測された。1)卵子の採取には,白色レグホン系コマ-シャル鶏を用い,推定排卵時刻の約20分後と殺開腹し,リンゲル液を入れたビ-カ-に取出した。精子はロ-ドアイランドレッド種の腹部マッサ-ジ法により採取し,リン酸緩衝液で2倍に希釈して冷蔵庫に保存した。この精液は使用直前リンゲル液で100倍に希釈して胚盤上に注いだ。上記卵子の採取には開腹後腹腔内に大量のリンゲル液を注ぎ,スプ-ンで卵子を取出すと約90%の確率で採卵出来ることがわかった。また,採取精液はすみやかにリン酸緩衝で希釈することが重要な処置であることが明らかとなった。2)41°Cのリンゲル液を80ml入れたビ-カ-に排卵直後の卵子を入れ,希釈精液0.1(最終希釈倍率,200倍),0.05,または0.01mlを胚盤上に静かに注入し41°Cの恒温槽に15分間入れて受精させた。一方,排卵直後の鶏の腹部を切開したのち,ろ斗部を体外に引き出し,その先端部をゴムひもで連結した3個のクリップではさみ吊した。受精が達成された卵子をこのろ斗部開口部に挿入し,卵白分泌部の入口まで進入するのを待って,切開部を縫合した。3)受精卵挿入の翌日産卵した硬穀卵をふ卵器に入れ,入卵3日後から検卵を行なった。その結果,90個の採卵数に対し39個(43%)が硬穀卵として産卵された。硬穀卵の受精率は33%(21個)であった。注入精液量に対する受精率は,0.1mlで65%,0.05mlで20%,0.01mlで38%であった。しかし,ふ卵9日目に死亡した胚が17個もあり,受精卵の大多数の胚(81%)がその期間に死滅した。一方,12日以上生存した胚は4個あり,このうち1個がふ化し約1ヵ月間成長を続けた。このように,体外受精によりふ化した例はなく,またこの方法を用いてふ化率を向上させることが出来れば,鶏においても遺伝子挿入による新品種の作出も可能である。トランスジェニック鶏作出のためには,遺伝物質を卵子に注入したのち,雛を産出する技術を確立する必要がある。しかし,Perry(1988)の体外培養法では確立が低いので,本研究では新しい方法を試みた。1.供試鶏には白色レグホン系コマーシャル種,雄鶏は産子の羽装が雄方を示すロードアイランド種を用いた。卵子は,推定排卵時刻の約30分後と殺,開腹して腹腔または3斗部から採取したのち抗生物質を入れたリンゲル液に入れ静置した。精子は4羽の雄から採取,混合したのち,リン酸緩衝液で2倍に希釈し,卵子への媒精直前にリンゲル液で100倍に希釈した。この希釈精液0.10.01mlを卵子の胚盤上に注ぎ,15分後その卵子をあらかじめ開腹した別の鶏の卵管内に挿入した。この鶏は,排卵直前のものを用い,最初授精卵をろ斗に入れ.両手で卵白分泌部の入口まで入るよう押込めた。この様にすると卵子の殆んでは子宮に到達し翌日硬殻卵を産出する。産卵した卵は,市販のふ卵器に入れ,通常の方法でふ卵を行なった。2.その結果,胚盤上に希釈精液0.01ml注いだグループでは,受精率が55%(6/11),0.1mlのものでは65%(13/20)であったが,いずれの場合もふ卵途中で胚は死亡した。
NF-κB活性化の選択的阻止による重症急性膵炎の治療法の開発-NLS-IκBαの組み換えアデノウィルスを用いた基礎検討-

平成11年度は、核局在シグナルを結合させたlκBαcDNAの組み換えアデノウイルスベクター(NLS-lκBα)の作成を試みた。しかしながら、正確な配列のlκBαとSV40 large T抗原cDNAを得ることに難渋した。一方、アデノウィルスへのコンストラクトが組み込み可能かどうかも検討したが、こちらも充分な組み込みが得られず再検討が必要となった。アデノで挿入可能な遺伝子導入は、CAプロモーター付きで5kbまでとされているがlκBαのコンストラクトのサイズが3720bpと大きいため、充分な組み込みが得られなかった。そこで、NF-κBの特異的阻害剤であるPDTC、NACを用いて、in vivoにおけるNF-κBの活性化抑制が、致死性膵炎モデルであるタウロコール酸膵炎(TCA膵炎)ラットやTCA膵炎腹水の上清(PAAF)の軽症膵炎ラット腹腔内への移入モデルで生じる肺障害を軽減するか検討した。PDTC、NACはこれら致死性膵炎モデルの肺障害を軽減し、生存率を著しく改善した。その改善効果はNF-κB活性化の阻害による肺でのTNF-α、IL-1βの産生抑制が一因と考えられた。平成12年度と13年度も引き続き、NLS-lκBα組み換えアデノウィルス作製を継続している。なお、in vivoで認められたNF-κBの抑制による重症膵炎モデルの病態改善の機序を明らかにするため、血管内皮細胞や単球の培養細胞系を用いて、PAAF中にNF-κBを直接活性化し、接着分子やIL-6,IL-8の発現を誘導する因子が存在することを証明した。また、NF-κBの阻害がこれらの発現を抑制することも確認できた。本研究ではNF-κBの活性化抑制サブユニットであるIκBαを核内に発現させる組み換えアデノウィルスを作成し、重症膵炎の致死率に与える効果を検討することを目的とした。平成11年度の研究目標は組み換えアデノウイルスを作成することだった。組み換えアデノウィルス調整に必要な設備、物品を整備する一方、データベース上に公開されているブタIκBαのDNA配列情報を利用してプライマーを設計し、ブタcDNAライブラリーよりブタIκBαcDNAを単離している。ブタIκBαcDNAの開始ATGをBamHIで置換してSV40 large TAgを結合させたNLS-1を接続し、シークエンスで確認する。また、組み換えアデノウィルス増殖用の293細胞の大量培養、ストックを作成している。斉藤らのCOS-TPC法に従って調整されたインサート遺伝子を挿入したコスミドベクターと制限酵素処理したアデノウィルスDNA-TCPを293細胞内で相同組み換えさせ、アデノウィルスベクターを作成する。これを限界希釈でモノクローン選択し、293細胞を用いて大量培養を塩化セシウム濃度勾配と透析を用いて濃縮精製して目的とする組み換えアデノウィルスを得る。年度内にウィルスベクターの完成を目指している。その後は培養ヒト臍帯静脈血管内皮細胞[HUVEC]に組み換えアデノウィルス(NLS-IκBαvirus)を感染させ、その発現をNorthernブロットで確認する。また、NLS-IκBαvirusを感染させたHUVECをTNF-αまたはLPSで刺激後に核蛋白を抽出し、EMSA法にてNF-κB活性化の阻止を確認する予定である。我々は重症急性膵炎の重症化機序にiNOS、IL-8やICAM-1、VCAM-1の誘導・発現が重要な役割を果たすことを示してきた。これらの発現の転写レベルでの調節に中心的役割を果たしているのがNFκBであった。

NFκBの活性化を抑制するpyrolidine dithiocarbamateは致死的膵炎モデルの生存率を改善したが薬剤の特異性と毒性に問題があった。NF-κβは活性化抑制サブユニットであるIκβαと結合し細胞質から核への移行が妨げられるのみならず、核内でもIκβαによるpostinductionリプレッサー効果を受ける。またIκβαは古典的なNLSを持たず、核移行の機序は明らかでなかった。そこでIκβαを核内に強発現させることによりNFκBを抑制する系を作成し重症膵炎モデル動物の致死率に与える効果と機序を検討することを計画した。ブタcDNAライブラリーより開始ATGをBamHIで置換したIκBαcDNAを単離し、NLS-1を接続SV40largeTAgに結合させたコンストラクトの作成を進める一方、核内移行性の高い、非増殖性で免疫源性の低いE1A、E1B、E3を欠損したアデノウイルスを用いたコスミドカセット法による組み換えアデノウイルスベクターを調整していた。しかしIκBαのN-末端36塩基を欠損したNFκBのsuperantagonistであるIκβdNを組み換えアデノウイルスで導入し、NFκBの活性化を抑制するとTNFによるアポトーシスが誘導されること及び、IκBαの核内移行が第二ankyrin反復によることが報告された。従って当初の計画のIκβαの核内発現のためにNLSを接続する意義が薄れ、またIκβαの強発現がアポトーシスを誘導するため致死率を検討する系としては適当でないことが明らかとなり、方法を再検討する必要があると考えられた。平成11年度は、核局在シグナルを結合させたIkBαcDNAの組み換えアデノウィルスベクター(NLS-IkBα)の作成を試みた。しかしながら、正確な配列のIkBαとSV40 large T抗原cDNAを得ることが難渋した。一方、アデノウィルスへのコンストラクトが組み込み可能かどうかも検討したが、こちらも充分な組み込みが得られず再検討が必要となった。アデノで挿入可能な遺伝子導入は、CAプロモーター付きで5kbまでとされているがIkBαのコンストラクトのサイズが3720 bpと大きいため、充分な組み込みが得られなかった。そこで、NF-kBの特異的阻害剤であるPDTC,NACを用いて、in vivoにおけるNF-kBの活性化抑制が、致死性膵炎モデルであるタウロコール酸膵炎(TCA膵炎)ラットやTCA膵炎腹水清(P-AAF)の軽症膵炎ラット腹腔内への移入モデルで生じる肺障害を軽減するか検討した。PDTC, NACはこれら致死性膵炎モデルの肺障害を軽減し、生存率を著しく改善した。その効果はNF-kB活性化の阻害による肺でのTNF-α、IL-1βの産生抑制が一因と考えられた。平成12年度と13年度も引き続き、NLS-IkBa組み換えアデノウィルス作製を継続している。なお、in vivoで認められたNF-kBの抑制による重症膵炎モデルの病態改善の機序を明らかにするため、血管内皮細胞や単球の培養細胞系を用いて、PAAF中にNF-kBを直接活性化して接着分子やIL-6、IL-8の発現を誘導する因子が存在することを証明した。また、NF-kBの阻害がこれらの発現を抑制することも確認できた。
糖尿病動物を用いた糖尿病網膜症発症における網膜循環動態の経時的検討

遺伝子改変糖尿病ブタを飼育し、血糖値が400を超える糖尿病を発症することを確認した。生後1ヶ月から全身麻酔下での眼底検査を開始した。ブタ用に改良されたレーザースペックル血流計(LSFG)を用いて、ブタの眼底血流を測定できるようになった。これにより、非侵襲的かつ経時的にブタの網膜血流を測定することが可能となった。さらに血流の変化に加えて網膜機能の変化を捉えるために、ブタの網膜電位図Retevetを導入し、安定して網膜電位図の測定が可能であることを確認できた。さらには光干渉断層計OCTを用いたin vivo検査を施行できるようになった。これまでに遺伝子改変糖尿病ブタを3頭飼育し、予定どおりの検査を施行している。生後3ヶ月で白内障が発症して眼底検査や血流測定が困難となったため、白内障手術を施行して眼底の透見性の確保を試みた。予想以上に白内障手術後の炎症反応が強く、眼底検査が難しいこともあるが、ヘパリンを投与するなどして炎症反応を軽減させて、眼底の透見性の確保に成功した。現在生後5ヶ月の時点で、屠殺後の眼球を組織学的に解析し、網膜毛細血管網の消失が認められており、網膜症早期病変に類似した所見と考えている。また、LSFGを用いて眼底血流を測定すると、生後1.5ヶ月では正常ブタとの差は明らかではなかった。同じ区Retevetを用いた検討でも糖尿病ブタと正常ブタとの間に明らかな差はなかった。今後は経過観察期間を延長させて、経時的な網膜組織の変化と網膜血流および網膜機能の変化を経時的に評価したいと考えている。ブタの眼血流測定、網膜電位図、眼底検査はおおむね順調にできている。今後は遺伝子改変糖尿病ブタをさらに4頭購入、飼育して、糖尿病網膜症の発症・進展をさらに詳しく評価したいと考えている。白内障手術後の炎症反応もおおむね克服できており、今後さらに詳細な検討が可能と考えている。血流検査に関しては、通常の検査のみでは微細な血管障害を捉えることは簡単ではないため、高酸素吸入などの負荷試験を行い、網膜循環の反応性について詳細に検討したいと考えている。蛍光眼底造影検査に関しては、動物用に改良された眼底カメラを入手して、より精度の高い眼底評価を目指したいと考えている。(基礎研究)遺伝子改変糖尿病モデル動物を用いた研究の実験を行った。遺伝子改変糖尿病ブタでは確実に高血糖を惹起させることが可能であること、インスリン治療によって血糖を正常化させることが可能であることなどを確認した。さらに一定観察期間後に安楽死して眼球を摘出して組織学的検討を行ってみると、正常血糖ブタに比べて、糖尿病モデルブタでは網膜血管走行異常が認められ、糖尿病網膜症の初期病変と類似していた。さらに、ミクログリアの活動性についても検討し、遺伝子改変糖尿病ブタの網膜ではミクログリアの活性化が認められることを確認した。ブタ摘出血管の研究では、SGLT2阻害剤などの新しい糖尿病治療薬やフィブラート系の脂質異常症治療薬、さらにレニンアンジオテンシン系阻害剤などの高血圧治療薬の網膜血管に及ぼす影響を評価し、眼血流改善効果のある薬剤の探索を行っているところである。さらに動物用の網膜電位図(ERG)を設置して、遺伝子改変糖尿病ブタでの測定が可能であるかどうか検討を進めているところである。(臨床研究)血糖コントロール入院患者の血糖コントロール前後での眼血流を眼血流装置を用いて評価し、網膜症病期との関連についても検討したいと考えている。具体的には、糖尿病腎症と網膜症・網膜血流との関連に着目して、腎機能が黄斑浮腫に及ぼす影響についての検討を進めている。

さらに、全身血管内皮機能と黄斑浮腫との関連についても検討し、黄斑浮腫症例では内皮機能の減弱が認められた。上述の通り、遺伝子改変糖尿病モデルブタの確立は完了している。この実験により、長期間の持続高血糖により網膜症様変化を示すことが明らかとなっている。組織学的検討についても実験系を確立することができた。今年度は実際に所属施設での飼育を開始して、実験計画通り、眼血流と網膜神経機能の経時的変化を観察する予定である。眼血流装置の設置、もう膜電位図の設置、摘出ブタ網膜血管実験装置の設置はいずれも問題なく終了しており、すでに稼働している。以上より、今後の研究計画は問題なく、かつ速やかに実行に移すことができると予想される。遺伝子改変糖尿病ブタを飼育し、血糖値が400を超える糖尿病を発症することを確認した。生後1ヶ月から全身麻酔下での眼底検査を開始した。ブタ用に改良されたレーザースペックル血流計(LSFG)を用いて、ブタの眼底血流を測定できるようになった。これにより、非侵襲的かつ経時的にブタの網膜血流を測定することが可能となった。さらに血流の変化に加えて網膜機能の変化を捉えるために、ブタの網膜電位図Retevetを導入し、安定して網膜電位図の測定が可能であることを確認できた。さらには光干渉断層計OCTを用いたin vivo検査を施行できるようになった。これまでに遺伝子改変糖尿病ブタを3頭飼育し、予定どおりの検査を施行している。生後3ヶ月で白内障が発症して眼底検査や血流測定が困難となったため、白内障手術を施行して眼底の透見性の確保を試みた。予想以上に白内障手術後の炎症反応が強く、眼底検査が難しいこともあるが、ヘパリンを投与するなどして炎症反応を軽減させて、眼底の透見性の確保に成功した。現在生後5ヶ月の時点で、屠殺後の眼球を組織学的に解析し、網膜毛細血管網の消失が認められており、網膜症早期病変に類似した所見と考えている。また、LSFGを用いて眼底血流を測定すると、生後1.5ヶ月では正常ブタとの差は明らかではなかった。同じ区Retevetを用いた検討でも糖尿病ブタと正常ブタとの間に明らかな差はなかった。今後は経過観察期間を延長させて、経時的な網膜組織の変化と網膜血流および網膜機能の変化を経時的に評価したいと考えている。
サイトカインレセプタートランスジェニックマウスを用いた造血幹細胞の分化機構の解析

造血幹細胞の増殖・分化におけるサイトカインの役割を明らかにするため、GM-CSF,G-CSFの受容体を発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作成した。hGM-CSFR-Tgマウス骨髄細胞をGM-CSF存在下で培養すると単球、好中球系のみならず未分化、赤芽球系、巨核球系、肥満細胞系の前駆細胞の増殖と最終的な分化、成熟が得られた。また、TgマウスヘのGM-CSFの投与により赤血球、好中球、単球、NK細胞の著明な増加が観察されている。GM-CSF単独で赤血球産生が起こることから、これがEPORを介するか否か検討するため、EPOR-/-マウスとGM-CSFR Tgマウスを掛け合わせて検討した。EPOR-/-xGM-CSFR Tgは胎生14日前後で死亡したが、このマウスから胎児肝を取りだし、GM-CSF存在下で培養すると多数のCFU-Eコロニーが形成された。以上の結果はEPORシグナルとは全く関係なく受容体さえ発現していればGM-CSFシグナルによっても赤血球産生が起こることを示している。hG-CSF-Tgマウスでも同様にG-CSF刺激により様々な前駆細胞の増殖・分化・成熟が見られたが、CSF単独での赤血球までの最終分化は見られなかった。以上のG-CSFの作用はFACSでソーテイングした細胞の単細胞培養でも確認された。さらに、ヒトG-CSF存在下で形成された芽球コロニーを取り出して、ヒトG-CSF存在下で培養すると、再びさまざまな血球系のコロニーが形成された。以上よりGM-CSFやG-CSFは多能性造血幹細胞から好中球、マクロファージへの分化を決定する因子として作用するのではなく、受容体を発現している細胞に単なる増殖因子として働き、全ての血球の分化がもたらされることを示唆している。造血幹細胞の増殖・分化におけるサイトカインの役割を明らかにするため、本年度は好中球、マクロファージの特異的増殖・分化因子と考えられているGM-CSF,G-CSFの受容体を発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作成し解析した。H2-Ldプロモーター下流にヒトGM-CSFRα,βcDNA,ヒトおよびマウスG-CSFR cDNAをそれぞれつないだコンストラクトを作成し、型のごとく3系統のTgマウスを作成した。誕生したマウスの尾よりDNAを調整し、hGM-CSFRα,βおよびhG-CSFR、mG-CSFRのgenomicな発現をPCR法、Southem blot法で確認したところ、7匹にhGM-CSFRα,β遺伝子が、11匹にhG-CSFR遺伝子が、5匹にmG-CSFR遺伝子が確認された。それぞれのマウスを交配し得られたFlマウス骨髄における蛋白の発現をFACSを用いて確認したところ、2系統のhGM-CSFRα,β-Tgマウス、2系統のhGCSFR-Tgマウスが得られた。mGCSFR-Tgマウスは最近出来たばかりであり、現在、Flマウスを作成中である。hGM-CSFR-Tgマウス、hG-CSFR-Tgマウスおよびそれぞれのリッターメイトより骨髄細胞を採取し、メチルセルロース培養法を用いてhGM-CSF、hG-CSFの作用を検討した。hGM-GSFR-Tgマウス

骨髄細胞をGM-CSF存在下で培養すると好中球系前駆細胞のみならず未分化造血前駆細胞、赤芽球系前駆細胞、巨核球系前駆細胞、肥満細胞前駆細胞等の増殖と最終的な分化、成熟が得られることが明らかとなった。また、TgマウスへのGM-CSFの投与により赤血球、好中球、単球、NK細胞の著明な増加、著明な胸腺の縮小、CD4+CD8+細胞の消失などが観察されている。またhG-CSF-Tgマウスでも同様にG-CSF刺激により様々な前駆細胞の増殖・分化・成熟が見られたが、-CSF単独での赤血球までの最終分化は見られなかった。エリスロポエチン(EPO)存在下にG-CSFを添加すると赤芽球バーストの著明な増加が見られた。以上のG-CSFの作用はFACSでソーティングした細胞の単細胞培養でも確認され、G-CSFの直接作用であることが明らかとなった。さらに、ヒトG-CSF存在下で形成された芽球コロニーを取り出して、再度ヒトG-CSF存在下で培養すると、再びさまざまな血球系のコロニーが形成された。このことはGM-CSFやG-CSFは多能性造血幹細胞から好中球、マクロファージへの分化を決定する因子として作用するのではなく、受容体を発現している細胞に単なる増殖因子として働き、全ての血球の分化がもたらされることを示唆している。造血幹細胞の増殖・分化におけるサイトカインの役割を明らかにするため、GM-CSF,G-CSFの受容体を発現するトランスジェニツク(Tg)マウスを作成した。hGM-CSFR-Tgマウス骨髄細胞をGM-CSF存在下で培養すると単球、好中球系のみならず未分化、赤芽球系、巨核球系、肥満細胞系の前駆細胞の増殖と最終的な分化、成熟が得られた。また、TgマウスヘのGM-CSFの投与により赤血球、好中球、単球、NK細胞の著明な増加が観察されている。GM-CSF単独で赤血球産生が起こることから、これがEPORを介するか否か検討するため、EPOR-/-マウスとGM-CSFR Tgマウスを掛け合わせて検討した。EPOR-/-xGM-CSFR Tgは胎生14日前後で死亡したが、このマウスから胎児肝を取りだし、GM-CSF存在下で培養すると多数のCFU-Eコロニーが形成された。以上の結果はEPORシグナルとは全く関係なく受容体さえ発現していればGM-CSFシグナルによっても赤血球産生が起こることを示している。hG-CSF-Tgマウスでも同様にG-CSF刺激により様々な前駆細胞の増殖・分化・成熟が見られたが、CSF単独での赤血球までの最終分化は見られなかった。以上のG-CSFの作用はFACSでソーティングした細胞の単細胞培養でも確認された。さらに、ヒトG-CSF存在下で形成された芽球コロニーを取り出して、ヒトG-CSF存在下で培養すると、再びさまざまな血球系のコロニーが形成された.以上よりGM-CSFやG-CSFは多能性造血幹細胞から好中球、マクロファージヘの分化を決定する因子として作用するのではなく、受容体を発現している細胞に単なる増殖因子として働き、全ての血球の分化がもたらされることを示唆している。