hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
強誘電体のＤ－Ｅヒステリシス曲線を用いた振動子の共振周波数の動的制御

昨年度までの研究で,MOSFETを用いた超音波振動子の共振周波数を制御する手法を確立した.本年度はこれを用いて,実用的なアプリケーションとして水中におけるキャビテーションの効率向上を実証した.キャビテーションは,水中に超音波を照射した際に発生する気泡であり,超音波洗浄や化学反応の促進等,幅広い用途に用いられている.ここで,キャビテーション気泡を効率よく発生させるため,周波数比1:2なる二つの正弦波を重ね合わせる手法が梅村らより提案されている.2波間の位相制御を台形波形圧力が得られるよう行うことにより,キャビテーション気泡発生の効率を改善することができる.また,大きな振動振幅を得るために振動損失の少ない(Q値の大きな)振動子を用いる場合,その共振ピークは鋭敏になる.このため,駆動周波数と共振周波数は可能な限り近づける必要がある.すなわち,台形波形変位を高効率で励振するためには,共振周波数を1:2と制御する必要がある.しかしながら,振動子の設計を緻密に行い共振周波数を1:2としたとしても,駆動中の境界条件の変化や圧電振動の非線形現象によって共振周波数が変化してしまい,振動振幅の減少を招く.この共振周波数の変化を補償するため,前述したMOSFETを用いた共振周波数の制御法を適用し,キャビテーション気泡を観察した.結果として振動の重ね合わせと共振周波数制御により高効率なキャビテーション気泡発生が確認された.この結果はキャビテーション気泡の生成に振動重ね合わせが効果的であるとの先行研究に一致するとともに,共振周波数制御がキャビテーション効率に寄与することを示した.これは前述したような共振周波数の変化を本研究で達成した共振周波数制御法で補償することにより,効率の良い共振振動で台形波形を実現できたためである.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。超音波モータの設計には,複合振動子型モータや共振駆動型SIDMアクチュエータなどに例を見ることができるように,超音波振動子の複数のモード形状やモード次数間での共振周波数を一致させる,比を制御する,といった必要が生じる場合が多い.また,超音波ポンプにおいても,周波数比1:2の正弦振動を重ね合わせることにより特性が向上することが報告されている.従来までこのような制御は振動子の形状や材質による機械的な設計によって行われてきた.しかし,超音波アクチュエータの駆動時には,その出力トルクによって振動の境界条件が変化し,共振周波数が変化してしまう.また,圧電振動子に高電圧を印加しハイパワー駆動を行うと,圧電振動における非線形効果から,共振周波数に変化が生じる.これらは駆動中の現象であることから設計段階での考慮は難しく,動的な共振周波数の制御システムが求められている.そこで,圧電振動子の駆動圧電部の他に,共振周波数制御用の受動圧電部を設け,Field Effect Transistor(FET)を接続して電気的な境界条件を制御することにより,この課題の達成を目指す.一般に圧電体は,その電気的な境界条件によってスティフネスが変化する.これを利用して,超音波振動子駆動時にFETをオン-オフ制御することによる共振周波数の制御原理を確立する.また,前述したような複数のモード形状の重ね合わせを行う多重モード振動子において,一方の共振周波数を変化させることによって駆動原理上理想的な共振周波数の状態を達成するシステムの構築を目指す.本年度までに,超音波振動子の共振周波数制御の方策として,駆動用圧電部と別に設けた共振周波数調整用圧電部にfield-effect-transistor(FET)を接続し,これをオン-オフ制御する手法を確立した.さらに,共振周波数の精密な制御を目指すため,FETのスイッチング周波数を超音波振動子の駆動周波数と同じ周波数として,スイッチオンとなる時間のデューティ比を連続的に変化させる試みを行った.これは,一般的に圧電体のスティフネスが,その電気的な境界条件に依存することを利用している.圧電体が電気的に短絡されている際には圧電効果で生じた電荷が両電極で相殺されるのに対し,電気的開放状態においては生じた電荷が蓄電するために振動エネルギーが用いられるためにスティフネスが上昇し,このような変化が起こる.しかしながら,位相を考慮せずにスイッチングを行ってしまうと,エネルギー損失が起きてしまう問題が生じた.この原因について,等価回路解析や実験を通じて,スイッチオフとして調整用圧電部を電気的開放状態とした際に蓄電された電荷が,スイッチオンとした時刻で全てグランドに流出してしまうことにあることを明らかにした.そこでスイッチオンとなる時刻において調整用圧電部に溜まった電荷が零となるよう位相を制御したところ,スイッチングによる損失を除くことに成功した.これらのシミュレーションや実験の結果を踏まえ,振動子の共振周波数を駆動中に制御し,駆動周波数に制御するシステムを作製した.これにより,従来の駆動においては振動子の共振周波数が変化した際に,駆動周波数を共振周波数に追従するよう制御する必要があったが,振動子の共振周波数を変化させる新たな制御方式を構築することができた.これを用いて,振動子に高電圧を印加した際の共振周波数の変化を補償して,常に同一周波数で共振駆動を実現するシステムを作成することができた.

超音波モータの設計には,複合振動子型モータや共振駆動型SIDM (R-SIDM)アクチュエータなどに例を見ることができるように,超音波振動子の複数のモード形状やモード次数間での共振周波数を一致させる,比を制御する,などといった必要が生じる場合が多い.また,超音波ポンプや超音波浮揚など,系の非線形性を用いる超音波デバイスにおいても,周波数比1:2の正弦振動を重ねあわせることで特性が向上することが報告されている.従来までこのような制御は振動子の形状や材質の特性を考慮した機械的な設計によって行われてきたが,駆動中の変化に対応するための方策が求められている.昨年度までの研究で,field-effect-transistor (FET)を用いた超音波振動子の共振周波数制御の方策を確立することができた.これは,圧電体の剛性が開放状態と短絡状態での電気的境界条件により変化することを用いている.すなわち,FETによる電気的境界条件の制御を通して,振動子の共振周波数を制御することができた.本年度は,より実用的な応用を目指し,共振駆動型SIDM (R-SIDM)アクチュエータ等に不可欠である,一次共振周波数と高次の共振周波数の比が1:2となる超音波振動子を試作し,本手法の適用を試みた.ここで,共振周波数の変化幅は超音波振動子の振動モード形状に依存することがこれまでの研究で明らかになっている.また,共振周波数比を簡便に制御するためには一次共振周波数と三次共振周波数のうち,一方のみが変化することが望ましい.振動モード形状を振動子の形状設計により制御したところ,スイッチングにより一次共振周波数のみが変化する振動子を試作することができた.共振周波数比の計測を行ったところ,目標値である2.000の周辺での変化が得られた.前述のように共振周波数比を制御することのできる超音波振動子の作製をすることができたが,共振周波数比の変化は1.996から2.004と,実際の駆動条件の変化を補償するには十分でない値となってしまった.そのため,インダクタンスの接続によってより大きな共振周波数の変化が得られることに着目した.ここで,単純にインダクタンスを接続するのでは,素子の内部抵抗により系のQ値が悪化してしまう問題や,駆動中にインダクタンスを制御することが難しいなどの問題が生じる.そこでオペアンプと複数の受動素子からなるシミュレーテッドインダクタの利用を試みた.シミュレーテッドインダクタは設計により内部抵抗を非常に小さくできるが,通常の設計では受動素子の抵抗値やキャパシタンスにより値が決定されてしまう.そこで,外部から制御信号を印加することによりジャイレータとして動作するよう設計を行った.設計したシミュレーテッドインダクタを試作したところ,入力信号と外部制御信号の電圧の絶対値の比と位相差によってそのインピーダンスを制御することができた.インダクタンス値を制御することのできる純インダクタとして機能したため,これを超音波振動子に接続したが,期待したような共振周波数の変化は得られなかった.インピーダンスの制御には,前述したように入力電圧の大きさの比と位相差の制御が必要である.しかしながら振動子に接続した際にはこれらが自由パラメータとはならず,純インダクタの実現ができなかった.
多分化能を有する羊膜幹細胞の超大量増幅と細胞バンク化へ向けた基礎的検討

本年度は前年度に引き続き羊膜細胞の分離、培養法の基礎的知見を得るための研究と、細胞の未分化度の評価、分離した上皮由来細胞・間質由来細胞の骨分化能を検討する研究を実施した。1)羊膜幹細胞の分離・培養・同定のために、酵素処理およびメッシュ濾過法により間質由来細胞と上皮由来細胞の分離と培養を試みた。その結果DNase/hyaluronidase処理→トリプシン処理→フィルター濾過→フィルター濾過された細胞を上皮由来細胞、フィルター上の組織をコラゲナーゼ処理した細胞を間質由来細胞として分離した。従来法に比べ、上皮由来細胞への間質由来細胞の混入割合は減少したが、依然として完全な分離法は確立できておらず、更なる検討が必要である。2)羊膜幹細胞の未分化度の評価未分化細胞のマーカーとしてNanog、Oct-4、Rex-1、Sox-2の特異的プライマーを作製し、継代初期の細胞のRNAを用いてRT-PCRを行った。その結果、上皮由来細胞ではNanog、Oct-4、Rex-1が多く発現し、Sox-2も僅かながら発現していた。また、間質由来細胞においてもNanog、Oct-4が多く発現し、Rex-1、Sox-2も僅かに発現していた。このことより、羊膜幹細胞は未分化な細胞であり、種々の細胞への分化能を持つ可能性が示唆された。間質由来細胞、上皮由来細胞をTissue culturedishに播種しconfluentになるまで培養後、従来法通りの骨誘導メディウムにて経時的に最長4週間培養し、Alizarin Red染色と、Osteocalcin特異的なプライマーを用いたRT-PCRを行った。その結果、間質由来細胞、上皮由来細胞ともに、全ての時期においてAlizafin Redによる染色とOsteocalcinの発現は確認できなかった。さらなる培養条件の検討が必要である。このようなデータの結果を踏まえ来年度は羊膜細胞の分離法についてさらに検討し、主に骨へ誘導するための有効な分化法についても検討を進めたい。本年度は羊膜幹細胞の分離、培養法の基礎的知見を得るために以下の研究を実施した。その結果、従来法であるコラゲナーゼ→DNase→フィルター濾過→フィルター上の組織をトリプシン処理し上皮由来細胞として分離した場合は、培養を継続するにつれて間質由来細胞が増殖し、継代を繰り返すうちに上皮様の形態を示す細胞数は減少した。分離法の再検討が必要である。2)羊膜細胞の増殖法の検討:細胞外マトリックスの増殖能への影響検討間葉系幹細胞の超増幅法に用いるbFGFを羊膜上皮由来細胞に添加したが、増殖効果は認められなかった。そごで、Type I,IVコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンコートされた培養皿上での増殖効果を検討した。さらに、血清を含まない上皮細胞用の培地(カルシウム含有あるいは不含)と血清含有のDMEM F12/HAM培地での増殖効果を比較した。その結果、羊膜上皮由来細胞はカルシウムを含有する無血清上皮細胞用培地で培養し、基質としてのフィブロネクチンあるいはType Iコラーゲン上で培養した場合に著しく増殖した。3)羊膜由来細胞の上皮、間質マーカーによる同定上皮マーカーとしてE-cadherin,cytokeratin 19の、間質マーカーとしてFn-EDA,vimentinの特異的プライマーを作製し、継代初期の細胞のRNAを用いてRT-PCRを行った。その結果上皮由来細胞ではE-cadherinが特異的に、間質由来細胞ではvimentinが比較的多く発現していたことから、これらを分離のマーカーとして使えることが示唆された。このようなデータの結果を踏まえ来年度は羊膜細胞の分離法についてさらに検討し、分化能についても検討を進めたい。

間質由来細胞、上皮由来細胞をTissue culturedishに播種しconfluentになるまで培養後、従来法通りの骨誘導メディウムにて経時的に最長4週間培養し、Alizarin Red染色と、Osteocalcin特異的なプライマーを用いたRT-PCRを行った。その結果、間質由来細胞、上皮由来細胞ともに、全ての時期においてAlizafin Redによる染色とOsteocalcinの発現は確認できなかった。さらなる培養条件の検討が必要である。このようなデータの結果を踏まえ来年度は羊膜細胞の分離法についてさらに検討し、主に骨へ誘導するための有効な分化法についても検討を進めたい。
制御系におけるフォールトトレランス機能の実現とその体系化に関する研究

本研究では,制御系におけるフォールトトレランスの実現,さらには方法論の体系化をめざして、以下のような手順で研究を遂行した。1.故障のモデル化とそれに対する対策を、(1)故障が起こっても安全である、というフェールセーフ機能の実現問題と、(2)故障を検出する故障検出問題の観点から提案した。(1)に関しては、自動車の高速道路上での自動走行における横方向制御や無人宇宙往還機の姿勢制御を対象として、正常なプラントと故障を有するプラントとの同時安定化問題として一般的な形で定式化し、解法を示した。また(2)に関しては、電動機駆動制御系を対象として、制御器と故障検出器の同時設計問題として定式化し、2自由度制御系の内部構造、ならびに線形行列不等式理論を利用した解法を提案した。2.1.で提案した手法の有用性を実験、およびシミュレーションにより検証した。その際に(1)に関しては、自動車に取り付けられた2つの横方向位置検出センサのうちの一つが壊れても安定に走り続けられる制御方策を開発し、実験により有用性を検証した。また、無人宇宙往還機において機体の舵面が固着して動かなくなった場合を想定し、その場合でも安定に帰還できる制御方策を開発した。また、(2)に関しては、電動機駆動用インバータのトランジスタが故障した場合を想定し、故障検出とその抑制を同時に実現する制御方策を開発した。いずれの場合においても設計には市販の制御系設計用ソフトウエアMATLABを使用した。3.上記の成果を誌上にて公表した。本研究では,制御系におけるフォールトトレランスの実現,さらには方法論の体系化をめざして、本年度は以下のような手順で研究を遂行した。1.制御系内における故障の調査とその分類を行った。2.故障のモデル化とそれに対する対策を、(1)故障が起こっても安全である、というフェールセーフ機能の実現問題と、(2)故障を検出する故障検出問題の観点から提案した。(1)に関しては、無人宇宙往還機の姿勢制御を対象として、正常なプラントと故障を有するプラントとの同時安定化問題として一般的な形で定式化し、解法を示した。3.2.で提案した手法の有用性をシミュレーションにより検証した。その際に(1)に関しては、機体の舵面が固着して動かなくなった場合を想定した。また、(2)に関しては、電動機駆動用インバータのトランジスタが故障した場合を想定した。いずれの場合においても市販の制御系設計用ソフトウエアMATLABを使用し、良好な結果を得た。2.1.で提案した手法の有用性をシミュレーションにより検証した。3.(2)にして実験を行ない、良好な結果を得ると共に、誌上にて成果を公表した。

本研究では,制御系におけるフォールトトレランスの実現,さらには方法論の体系化をめざして、以下のような手順で研究を遂行した。1.故障のモデル化とそれに対する対策を、(1)故障が起こっても安全である、というフェールセーフ機能の実現問題と、(2)故障を検出する故障検出問題の観点から提案した。(1)に関しては、自動車の高速道路上での自動走行における横方向制御や無人宇宙往還機の姿勢制御を対象として、正常なプラントと故障を有するプラントとの同時安定化問題として一般的な形で定式化し、解法を示した。また(2)に関しては、電動機駆動制御系を対象として、制御器と故障検出器の同時設計問題として定式化し、2自由度制御系の内部構造、ならびに線形行列不等式理論を利用した解法を提案した。2.1.で提案した手法の有用性を実験、およびシミュレーションにより検証した。その際に(1)に関しては、自動車に取り付けられた2つの横方向位置検出センサのうちの一っが壊れても安定に走り続けられる制御方策を開発し、実験により有用性を検証した。また、無人宇宙往還機において機体の舵面が固着して動かなくなった場合を想定し、その場合でも安定に帰還できる制御方策を開発した。また、(2)に関しては、電動機駆動用インバータのトランジスタが故障した場合を想定し、故障検出とその抑制を同時に実現する制御方策を開発した。いずれの場合においても設計には市販の制御系設計用ソフトウエアMATLABを使用した。3.上記の成果を誌上にて公表した。
半乾燥地域での地面蒸発・降雨と塩類集積の消長の関係

半乾燥地での蒸発-塩類集積の関係を実験的、数値計算的に調べた。実験では、PVCパイプ(直径10cm)に、西オーストラリア半乾燥地での砂質土壌で厚さ100cmの砂層を作り、その表面を温度25°C、湿度20%の大気に開放し、また太陽照射を模擬した場合には熱照射(550W/m^2)を与えた。その際の砂層水分条件として、一定の深さ(50cm、20cm)に地下水面を、その上部は脱水平衡とした場合(Case A)、地下水面を有さず、field capacityの一様分布とした場合である(Case B)。その結果、土壌水には土壌粒子より迅速に溶出したCl^-、Na^+、Mg^<2+>等が高濃度に含まれた。砂層表面直下部分の乾燥化はCase Bの方が顕著に進行し、蒸発域は一ヵ月半で、2cmの深さにまで達した(Case Aでは約1cm)ことが、水蒸気密度の測定より分かった。そこでの塩類集積は顕著で、砂層表面上には厚さ5mmのクラストが盛り上がった形で形成された。蒸発域で発生した水蒸気は乾砂層、同クラストを通って外界に放出されるが、その輸送抵抗(有効拡散係数の逆数)はクラスト部分で1オーダ大きくなることが分かった。なお、熱照射を与えた実験では、蒸発で生じた水蒸気の一部は下方にも輸送されて、凝結することが特徴的に見出された。高解像度鉛直一次元モデルによるHEIFEデータを用いた現地再現実験において、バルク係数、反射率、放射率などのパラメータについて、観測データとの比較により検討を行った。その結果、正味放射量の観測値が観測誤差の範囲で過小評価にあると考えるとほぼ完全に地温が再現できることが分かった。また、水分移動に伴う塩類の移動集積に関しては、現実は多年の集積の結果であり直接の再現は困難であるが、10年間相当の計算の結果、現地観測結果と同様の特徴を示す鉛直分布が得られた半乾燥地での蒸発-塩類集積の関係を実験的、数値計算的に調べた。また、水分移動に伴う塩類の移動集積に関しては、現実は多年の集積の結果であり直接の再現は困難であるが、10年間相当の計算の結果、現地観測結果と同様の特徴を示す鉛直分布が得られた半乾燥地域での地面蒸発・降雨と塩類集積の消長の関係を実験的、数値計算的に検討した。1.蒸発実験の結果は以下の通りである。本年度は、塩類集積については集積過程のみを対象とした。西オーストラリア半乾燥地での砂質土壌を用いたカラム蒸発実験を、地下水面が浅い条件(深さ50cm、20cmに固定)で行った。大気条件として、一定の温度(25°C)・湿度(20%)とし、熱照射(550W/m^2)の付与の有無の場合を設定した。また、含水量の初期分布を脱水平衡とし、水として蒸留水を用いた。早い段階より砂層表面にクラストが形成され、実験終了時(1ヶ月程度)には厚さはおよそ1mmにも発達した。その際、クラストは蒸発強度を50%程度低下させ、蒸発過程に重要な役割を与えることが分かった。また、塩類集積の主成分は土壌より迅速に溶出するNa^+、Cl^-等であったが、深さ5cmより浅い領域で顕著な集積が起り、その濃度分布は指数関数的となった。当該土壌の水理特性と地下水面の設定条件より、蒸発域は砂層表面直下と推定され、砂層上部での乾砂層の形成は砂層内の水蒸気計測より確認できなかった。2.数値計算の結果は以下の通りである。中国北西部半乾燥地域でのHEIFE観測の砂漠観測点のデータを用い、高解像度の多層モデルでのシミュレーションを行った。

予報方程式は熱、液体水、水蒸気、塩分移動に関する基礎式であるが、その際、地中温度の観測結果や地表面熱収支の推定結果との比較を通して、多くのモデルパラメータについて検討を行った。その結果、地表面からの顕熱及び潜熱の輸送量を表すバルク式は、多用されるBusinger-Dyer式よりも、Brutsaert式(強不安定成層時の振舞に優れる)を用いた場合に観測誤差の範囲内での良好な一致を得た。また現地の放射の観測値は観測誤差内であるが10%以内の過小評価があった。塩類集積に関しては、計算に用いた1991年のデータを繰り返し10年分与えた結果、観測値に近い分布を得ると共に、蒸発による表層への塩分の集積と夏季の降水による下方への輸送、降水期における表層での塩分濃度の減少が計算された。半乾燥地での蒸発-塩類集積の関係を、特に雨季より乾季に移行し、地下水面が消失した段階に着目して、実験的に調べた。昨年度と同様、西オーストラリア半乾燥地での砂質土壌を用い、下記の条件下でのカラム蒸発実験を約40日実施した。即ち、PVCパイプを用いて長さ100cm、直径10cmの砂層を作り、これを水分量一様なfield capacityの状態にして(昨年度は地下水面を形成)、その表面を温度25°C、湿度20%の大気に開放し、また砂層表面に太陽照射を模擬した熱照射(550W/m^2)を与えた場合も行った。得られた結果は以下の通りである。1)実験終了時までの累積蒸発高は熱照射を与えた方が約10mm大きかったが、終了時の蒸発強度は同一で、0.016mm/hとなった。2)砂層表面下約8cmまでの乾燥化は顕著であったが、特に熱照射は含水量を照射を与えない場合に比し、半分程度まで低下させた。3)蒸発に伴って塩類集積が起こるが、砂層表面上に厚さ約5mmの塩クラストが盛り上った状態で形成され、また実験終了時、表面下約2cmの範囲で塩析出が認められた。塩分不飽和の領域での濃度は熱照射を与えた方が顕著となった。4)砂層中の水蒸気密度測定より、蒸発域が深さ約2cmまで進行することが分かった。その密度分布は、熱照射を与えない場合には水蒸気は上方にのみ輸送されるが、与えた場合には、下方への輸送も認められた。5)上方への水蒸気輸送抵抗は、乾砂層に比し塩クラスト部分で、1オーダー大きくなることが分かった。なお、数値計算的研究に関しては、昨年度、中国北西部半乾燥域での観測(HEIFE)データを用いて水分・熱・塩分移動のシミュレーションを成功裏に実施できたので、今年度、同数値計算モデルを上記のオーストラリアの観測地に適用するため準備を始めたが、基本データの整理に終始し、数値計算までには至らず、今後の課題となった。
11q23転座型ALLにおけるFLT3/FLT3リガンドシステムの解析

11q23転座を有する白血病細胞株を用いてFLT3リガンド(FL)刺激による細胞回転停止のメカニズムと抗白血病剤に対する抵抗性獲得の検討を行った。(1)培養系にFLを添加するシステムを用いた検討:11q23転座型ALL細胞株KOCL-58に各種濃度のFLを添加して3日間培養すると、GO/G1arrestが誘導され、その機序として、CDK inhibitorであるp27の発現増強、STAT5の脱リン酸化が考えられた。daunorubicin(DNR)あるいはcytosine arabinoside(AraC)を加えて、FL添加あるいは無添加で3日間培養すると、FL存在下で有意に生細胞数とviabilityが増加した。(2)骨髄ストローマ細胞株との共培養システムを用いた検討:11q23転座型ALL細胞株KOCL-58を膜結合型FLを高発現している骨髄ストローマ細胞株と共に3日間培養すると、GO/G1arrestが誘導され、抗FL抗体の存在下で部分的に解除された。また、DNRあるいはAraCを加えて3日間培義したところ、骨髄ストローマ細胞株との共培養で有意に生細胞数とviabilityが増加し、抗FL抗体の存在化でその効果が部分的に解除された。これらの結果から、生体内において、膜型あるいは分泌型FLを産生している骨髄ストローマに接着したllq23転座型ALL細胞は、細胞回転停止状態に誘導され、抗白血病剤に対する感受性が減弱するために微小残存病変を形成し、臨床的に早期再発に結びつく可能性が示唆される。1.FL刺激による11q23転座型ALL細胞の休眠メカニズムの解明11q23転座型白血病細胞株にFLT3リガンド(FL,20ng/ml)を添加すると、S期の細胞割合が低下し、Go/G1期の細胞割合が有意に増加した。FL刺激によって、Go/G1停止が誘導されることが明らかとなった。(2)Western blot法を用いた細胞回転関連分子の発現変化、シグナル伝達分子の活性化状態の検討:11q23転座型白血病細胞株にFLを添加して2日間培養すると、サイクリン依存性キナーゼ阻害分子であるp27の著明な発現上昇が誘導された。他の分子の発現には変化が認められなかった。FLはp27の発現増強を介してGo/G1停止を誘導すると考えられた。2.FL刺激による11q23転座型ALL細胞の薬剤抵抗性獲得の検討(1)培養系にFLを添加するシステムを用いた検討:11q23転座型白血病細胞株にFLを添加して2日間培養すると、daunorubicinあるいはcytosine arabinosideに対する薬剤耐性が誘導された。(2)FL産生骨髄ストローマ細胞株との共培養システムを用いた検討:FL産生骨髄ストローマ細胞株上で11q23転座型細胞株を培養すると、daunorubicinあるいはcytosine arabinosideに対する薬剤耐性が誘導された。この耐性は、FL中和抗体の存在化で部分的に解除された。骨髄ストローマ細胞はFLT3/FLシステムを介して、11q23転座型ALL細胞を休眠期に導入し、薬剤耐性を誘導していると考えられた。白血病細胞株(n=20)と新鮮白血病細胞(n=10)を用いてFLT3リガンド(FL)刺激による11q23転座型急性リンパ性白血病(ALL)細胞の抗白血病剤に対する抵抗性獲得の検討をin vitroで行った。(1)培養系にFLを添加するシステムを用いた検討:11q23転座型ALL細胞(2-5x10^4/well)を各種濃度のFLを添加あるいは無添加で96-

well平底培養プレートで2日間培養後に、daunorubicin(DNR)あるいはcytosine arabinoside(AraC)を加えて、FL添加あるいは無添加でさらに3日間培養したところ、FL存在下で有意に生細胞数とviabilityが増加した。(2)膜結合型FLを高発現している骨髄ストローマ細胞株との共培養システムを用いた検討:96-well平底培養プレート内で単独あるいはconfluentになった骨髄ストローマ細胞株と共に11q23転座型ALL細胞を2日間培養後に、DNRあるいはAraCを加えて3日間培養したところ、骨髄ストローマ細胞株との共培養で有意に生細胞数とviabilityが増加し、抗FL中和抗体の存在化でその効果が部分的に解除された。これらの結果から、生体内において、膜型(あるいは分泌型)FLを産生している骨髄ストローマに接着した11q23転座型ALL細胞は、抗白血病剤に対する感受性が減弱するために微小残存病変を形成し、臨床的に早期再発に結びつく可能性が示唆される。
ストレスレベルとの関連性からみたクレンチングコントロールに対するアプローチ

被験者への装置装着そのものに対するストレスレベルの変動は,クレンチングイベント数およびPOMSの結果より認められなかった(P<0.05; Mann Whitney U-Test).ストレスレベルの変動については,心理テスト結果より,不安傾向の強いものほどPOMSおよび唾液アミラーゼの変動が強くあらわれ,強い相関関係であった(r=0.712).また,クレンチングイベント数も不安傾向の影響を受ける結果となり,中程度の相関関係であった(r=0.631).クレンチングイベント数とストレスレベルの相関関係についても同様に,不安傾向の影響を強く受ける結果となった(r=0.702).さらに,第4回東洋大学生体医工学研究センターシンポジウムにおいて,共同演者として現在までの研究状況報告ならびに今後の展望について包括的に発表した.実験状況については,データ解析まで完了している被験者は女性5名,男性6名の計11名である.被験者には連続しない7日間の日中日常生活環境下における筋電図計測,各日の唾液アミラーゼ計測,実験開始時の舌圧測定,実験開始時および終了時の心理テスト(POMS, CMI, SDS, MAS, Y-G)を行い,短期的なストレスレベルと日中のクレンチングの関連性について検討を行った.筋電図計測では,各日ともクレンチングイベントが検出された.クレンチングイベントと各ストレス指標の関係は,イベント数の増減との関連性からみると,POMSからは疲労,抑鬱との関連性が,CMI,MAS,SDSおよびY-Gからは神経症傾向とクレンチングイベントの増減に関連があることが考えられる.各日の唾液アミラーゼ計測との関連についても同様のことが考えられる.以上の結果は,平成24年度の研究報告と同様の傾向が認められた.被験者への装置装着そのものに対するストレスレベルの変動は,クレンチングイベント数およびPOMSの結果より認められなかった(P<0.05; Mann Whitney U-Test).ストレスレベルの変動については,心理テスト結果より,不安傾向の強いものほどPOMSおよび唾液アミラーゼの変動が強くあらわれ,強い相関関係であった(r=0.712).また,クレンチングイベント数も不安傾向の影響を受ける結果となり,中程度の相関関係であった(r=0.631).クレンチングイベント数とストレスレベルの相関関係についても同様に,不安傾向の影響を強く受ける結果となった(r=0.702).咀嚼筋痛を有するクレンチング習癖者に対し,ストレスレベルと日中クレンチングの関連性について検討するため,平成24年度は明海大学学内の倫理委員会に申請を行い,本実験計画についての承認を得た.また,被験者の選定,具体的な実験系の策定,必要器材の購入などを行い,実験を開始.関連内容の学会発表および雑誌掲載も,著者ならびに共著者として行った.被験者には連続しない7日間の日中日常生活環境下における筋電図計測,各日の唾液アミラーゼ計測,実験開始時の舌圧測定,実験開始時および終了時の心理テスト(POMS, CMI, SDS, MAS, Y-G)を行い,短期的なストレスレベルと日中のクレンチングの関連性について検討を行った.筋電図計測では,各日ともクレンチングイベントが検出された.クレンチングイベントと各ストレス指標の関係は,現時点では統計学的な評価はできないものの,イベント数の増減との関連性からみると,POMSからは疲労,抑鬱との関連性が,CMI,MAS,SDSおよびY-Gからは神経症傾向とクレンチングイベントの増減に関連があることが考えられる.各日の唾液アミラーゼ計測との関連についても同様のことが考えられる.データの解析が終了した被験者は女性1名であるが,データ収集を完了し,現在解析中のものが女性4名,男性6名である.関連内容の学会発表は,日本顎口腔機能学会,日中歯科医学会,日本補綴歯科学会,日本顎関節学会,日本歯科心身医学会,日本歯科医学会にて行い,日本歯科医師会雑誌にも関連内容が掲載された.咀嚼筋痛を有するクレンチング習癖者に対し,ストレスレベルと日中クレンチングの関連性について検討するため,明海大学学内の倫理委員会の承認(A1206)後.被験者の選定,具体的な実験系の策定,必要器材の購入などを行い,実験を開始.関連内容の学会発表および雑誌掲載も,著者ならびに共著者として行った.被験者には連続しない7日間の日中日常生活環境下における筋電図計測,各日の唾液アミラーゼ計測,実験開始時の舌圧測定,実験開始時および終了時の心理テスト(POMS, CMI, SDS, MAS, Y-G)を行い,短期的なストレスレベルと日中のクレンチングの関連性について検討を行った.筋電図計測では,各日ともクレンチングイベントが検出された.クレンチングイベントと各ストレス指標の関係は,イベント数の増減との関連性からみると,POMSからは疲労,抑鬱との関連性が,CMI,MAS,SDSおよびY-Gからは神経症傾向とクレンチングイベントの増減に関連があることが考えられる.各日の唾液アミラーゼ計測との関連についても同様のことが考えられる.実験開始前後の心理テストの結果には有意な差は認めず,各日のストレスレベルとクレンチングイベント数の相関はPOMS,唾液アミラーゼともに認められた.本研究内容の結果は,平成27年度中に学会発表および論文発表予定である.データ収集を完了し,現在解析中のものが女性4名,男性6名である.

関連内容の学会発表は,日本顎口腔機能学会,日中韓歯科医学会,日本補綴歯科学会,日本顎関節学会,日本歯科心身医学会,日本歯科医学会にて行い,日本歯科医師会雑誌にも関連内容が掲載された.歯科補綴学現時点で11名の被験者についてデータ解析が完了している.また,関連内容の学会発表および論文投稿も行っている.現時点でデータ解析途中の被験者を含め、11名の被験者のデータ収集が完了している。また、関連内容の学会発表および雑誌投稿も行っている。研究計画最終年度となる為,データのとりまとめおよび発表を行い,成果報告を行っていく.昨年度の実施状況を鑑み、今年度中に出来るだけ被験者の確保、データ収集を予定数完了させることを目標に研究を行う。次年度の学会発表ならびに研究報告としての論文作成について,研究協力者との打合せなどの旅費を計上するために生じた.同上研究内容の中間発表を国際学会で発表予定であるため、その渡航費ならびに参加費等に使用予定である。また、データ解析用のノートパソコンを購入し、解析時間の迅速化を図る。
内因性カルシニューリン抑制蛋白質RCAN1の破骨細胞分化制御因子としての役割

破骨細胞分化誘導過程においてRCANのmRNA発現が、分化が進むに従い、増大することを見出した。機能抑制実験では、予想に反して破骨細胞形成への影響はほとんど見られないため、RCANファミリーであるRCAN2および3の代償機構が働いている可能性を示した。一方、破骨形成分化過程において、交感神経系のα1-アドレナリン受容体の発現が増加していること、α-作動薬は破骨細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を引き起こすことを見出した。本研究によりRCAN1は、交感神経による骨代謝にも重要な役割を持つことが考えられる。本研究の目的は、内因性カルシニューリン抑制蛋白質(RCAN)1の破骨細胞の分化や骨吸収活性における役割について検討し、破骨細胞の分化に必須のシグナル伝達系であるカルシニューリン-NAFTcl系を自らが負に制御するという新たなメカニズムの存在を明らかにすることである。そこで、可溶性RANKLによるRAW264.7細胞の破骨細胞分化実験系を用い、siRNAによるLoss-of-functionおよび過剰発現ベクターの遺伝子導入によるGain-of-functionの2方向からのアプローチを行った。本実験に至る予備実験において、破骨細胞分化が進むに従いRCAN1のmRNA発現の増大を確認した。実験1) siRNAによるLoss-of-functionとして、はじめにsiRNAの種類・濃度・投与方法等の条件設定を行った。その条件の下、可溶性RANKL(100ng/ml)あるいはsiRNAを投与後、0, 2, 4, 6日目をサンプルとし、形成過程においてどの段階でのRCANノックダウンが最も効果的であるかについて現在検討中である。さらに今後は、骨吸収活性に与える影響を調べる予定である。実験2) RCAN1過剰発現によるGain-of-functionとして、pcDNA3.1にマウスRCAN1 cDNA、恒常的活性型カルシニューリンcDNA、Green fluorescent protein cDNAを組み込んだ発現ベクターを構築した。それらをRAW264.7細胞にトランスフェクションし、薬剤耐性によって遺伝子導入された細胞を選択的に採取し、限界希釈法によってクローン化した。現在、可溶性RANKL刺激による破骨細胞分化に与える影響を検討中である。これらの実験によって、RCAN1の破骨細胞分化における役割を明らかにし、破骨細胞自らが分化や増殖を負に抑制するメカニズムの存在を提唱することが可能になると考えており、さらに今後の研究が期待される。本研究の目的は、破骨細胞自身がRCAN1を産生することでカルシニューリン-NFATc1シグナル伝達系を抑制し、自らが分化あるいは骨吸収活性を負に調節する新規の破骨細胞分化のメカニズムの存在を明らかにすることである。そこで申請者は、マウス由来マクロファージ細胞株であるRAW264.7細胞を用いて、可溶性RANKL(sRANKL)による破骨細胞分化誘導過程におけるRCANの役割を調べた。はじめに分化過程におけるmRNA発現をRT-PCR法によって調べたところ、大変興味深いことに、分化が進むに従いRCAN1-4のmRNA発現の増大を確認した。またsiRNAを利用したloss-of-function実験では、予想に反して破骨細胞形成への影響はほとんど見られなかった。その理由として、手技的な問題も考えられるが、RCANはファミリーを形成しており、RCAN2のmRNAを調べたところ、分化過程による変化は見られなかった。それらRCANファミリーによって、破骨細胞分化におけるRCAN1の役割が代償されている可能性が示唆された。今後、それらRCANファミリーについても検討する必要性を示した結果となった。本研究は、RCAN1がDown syndrome critical (candidate)region (DSCR)1として、21番染色体トリソミーであるダウン症症候群の原因遺伝子座にある遺伝子の一つとして発見されたことからも骨形成(骨代謝)に重要な役割を持つと考え、さらにはRCANを利用した骨粗鬆症等の骨吸収が促進する疾患における新規の治療法の開発を最終目標とした。RCANは大変興味深い分子であり、今後さらに研究を進めることで発展が期待される。
人工媒質中の電磁波伝送・漏洩特性解析に基づくミリ波回路素子の開発

本研究では、人工媒質となる右手系左手系複合伝送線路の単位セル形状の提案を行い、これを用いて低サイドローブ特性を有する漏洩波アンテナの開発を行った。また2層構造の平面回路線路の各層に任意形状導体片や欠損が存在する回路を用いたフィルタの設計法を提案し、UWBフィルタを開発した。さらにこの設計法を人工媒質の設計に応用し、人工媒質の設計が可能なことを数値的、実験的に示した。本研究では先ず高周波伝送線路の漏洩現象解明の実績をもとに左手系人工媒質を含む伝送線路の漏洩現象についての基礎的研究を進めるとともに、コプレーナストリップ線路に基づく左手系媒質を利用した漏洩波アンテナの開発を目指す。開発にあたっては、複雑な漏洩現象の物理的解明により、設計のための基礎的データを集積するとともに、低サイドローブ化などアンテナの高性能化も行っていく。また、任意形状導体素子によるマイクロストリップフィルタ開発に用いた最適化手法を左手系媒質構築に組み込むプログラム開発を行う。そして、これを用いてフィルタ、結合器、移相器など各種回路素子の開発を行い、漏洩波アンテナをシステムとして動作させることを最終目的とする。それぞれについての計画の概要は以下の通りである。(1)漏洩波アンテナの開発(1)申請者の提案したコプレーナストリップ線路に基づく左手系媒質の伝送・漏洩特性について詳細な検討を加え、その表面波漏洩および空間漏洩機構の線路形状との関連を明確にする。(2)アンテナ設計に必要な漏洩定数の正確な値の抽出法を確立し、各種形状線路の漏洩定数の導出を行う。(3)アンテナの低サイドローブ化を図るため、位相定数は一定で、かつ漏洩定数が可変となる単位セル形状の開発を行う。(4)上記で得られた結果の実験的検証としてフォトリソグラフにてマイクロ波帯における伝送線路、アンテナを試作し、その伝送特性ならびに漏洩特性の測定を行う。(5)開発した単位セル形状を用いて低サイドローブ漏洩波アンテナを構成する設計法を確立し、一例について設計を行う。(6)設計アンテナを試作、測定し、その妥当性を実験的に検証する。(2)任意形状導体素子回路の開発(1)平面回路線路に任意形状導体片や欠損が存在する場合の伝送・漏洩特性の解析が行える効率的な解析プログラムの開発を行う。(2)開発した解析プログラムを用いて、フィルタ回路の開発を行う。(3)開発プログラムを用いて、任意の特性を有する左手系媒質についての設計を検討し、左手系媒質構築の可能性を明確にする。(4)上記で得られた結果の実験的検証としてフォトリソグラフにてマイクロ波帯におけるフィルタ、左手系媒質を試作し、その伝送特性の測定を行う。(5)平面回路線路を多層化の第一歩として2層構造とし、各層に任意形状導体片や欠損が存在する場合の伝送・漏洩特性の解析が行えるプログラムの開発を行う。(6)開発した解析プログラムを用いて、高性能フィルタ回路の開発を行う。(7)開発プログラムを用いて、任意の特性を有する左手系媒質についての設計を検討する。(9)上記で得られた結果の実験的検証としてフォトリソグラフにてマイクロ波帯におけるフィルタ、左手系媒質を試作し、その伝送特性の測定を行う。(10)アンテナシステムに必要な回路素子の開発を左手系媒質の特長を活かして行い、実験的にもその有用性を検証する。本年度の実施計画の1つであるコプレーナストリップ線路に基づく左手系媒質の伝送・漏洩特性については、形状に依存して表面波漏洩および空間漏洩領域で左手系モードと右手系モードの結合の生じることを見出した。これは本研究の目的である漏洩波アンテナへの応用に関しては排除すべき特性であり、アンテナ特性の検討を進める上では結合の生じない形状を中心に検討を進めた。その際、アンテナについては低サイドローブ化を先ず目標として、位相定数を一定として漏洩定数を可変にできる構造パラメータについて詳細な検討を行った。その結果、人工媒質となる左手系の媒質特性を得るのに必要な直列インダクタンスを構成する高インピダンス線路の両側に溝を設けた構造が漏洩定数の制御に最適であることを見出した。この形状変化により位相定数もわずかに変化するが、これは周期構造の周期を少し補正することで解決した。これらの特性についてはスケールダウンしたマイクロ波帯にてアンテナを試作し、放射特性の測定を行うことで実験的にも検証した。一方、もう一つ実施計画である左手系不均質媒質構築については、その第一歩として平面回路線路に任意形状導体片や欠損が存在する場合の伝送・漏洩特性の解析が行える効率的な解析手段の開発を行った。開発プログラムのチェックとして、マイクロストリップ線路のグランド面に任意形状のスロットを設けたフィルタの設計を行い,その妥当性を数値計算結果とマイクロ波帯での測定結果との良い一致から検証した。次年度以降の研究はこれら本年度の成果をもとに進めていく。本年度実施計画に基づき、コプレーナストリップ線路を用いた左手系媒質の漏洩定数の抽出法を検討した結果、漏洩定数は左手系媒質を構成する繰り返し周期を可変にすることによる放射電力量の変化から評価できることを見出した。

そして本抽出法を前年度に検討したアンテナ構造に適用し、漏洩特性の詳細な検討を行った。その結果、位相定数を一定としたときの漏洩定数の変化量が小さく、低サイドローブ特性を持つアンテナの構成が極端に制限されることが判明した。そこで、本年度は新たなアンテナ構造の検討を行い、ストリップ線路の側面に平行に細いストリップ線路を付加することで、従来構造の欠点の克服が可能となることを先ず、数値計算結果から明確にした。次いで、新たに導入した形状のアンテナをスケールダウンしたマイクロ波帯にて試作し、放射特性の測定を行うことで、形状の有用性を実験的にも検証した。一方、もう1つの実施計画である前年度開発した平面回路線路に任意形状導体片や欠損が存在する場合の回路素子解析プログラムを用いた回路開発については、まず、超広帯域無線用のUWBフィルタの設計を行い、設計仕様を満たすフィルタが任意形状を用いる特長を活かした超小型で構成可能なことを見出し、試作フィルタの測定結果からもその有用性を確認した。また、開発プログラムを基に左手系媒質構築のための設計法についての検討も行った。その結果、有限数の周期構造の伝送特性を評価関数にした最適化による左手系媒質の構築が1つ設計法となり得ることを数値的に明らかした。また試作した媒質の伝送特性の測定結果からも左手系として動作することが確認できた。次年度以降の研究はこれら本年度の研究成果をもとに進めていく。本年度実施計画に基づき、コプレーナストリップ線路を用いた左手系媒質漏洩波アンテナの低サイドローブ化を図るために、右手系左手系複合伝送線路単位セル形状の新たな開発を行った。形状群に要求される特性は位相定数が一定で、かつ漏洩定数が可変となるもので、昨年度提案したストリップ線路の側面に平行に細い副ストリップ線路を付加した構造はこの要求を満たすものであったが、左手系と右手系通過域の間にバンドギャップが生じてしまうため、バンドギャップのない漏洩特性を持つ形状を新たに見出した。その構造は主ストリップ線路に方形ホールを設けたもので、方形ホール形状が右手系通過域だけに影響し、左手系通過域には影響しない特性を活かし、バンドギャップのない漏洩特性を実現した。この新たな単位セル形状を用いた均一セルのアンテナをスケールダウンしたマイクロ波帯にて試作し、放射特性の測定を行うことで、形状の有用性を実験的にも検証した。これにより、最終年度に向けて低サイドローブ特性を持つアンテナの開発が行える環境が整ったと言える。一方、もう1つの実施計画である2層構造の平面回路線路の各層に任意形状導体片や欠損が存在する回路に対して、その伝送・漏洩特性の解析が行えるプログラムの開発については本年度で開発が完了し、その妥当性も有限要素法やFDTD法など他の数値解析法を用いた計算結果との比較、さらには測定結果との比較から検証した。また、左手系媒質構築のための遺伝的アルゴリズムを用いた設計法についても引き続き検討を行い、分散特性に基づく評価関数を用いれば左手系通過域幅をある程度可変にできることを明らかにし、設計試作した媒質の伝送特性の測定結果からも通過域幅の変化が確認できた。
味覚応答と嗜好識別の分子基盤を検証するセンサリーゲノミクスの展開

WGAトレーサー導入マウスを用いて、味覚を伝達する味細胞、味神経、中枢の細胞の遺伝子発現(ゲノミクス)解析を行い、嗜好物質の甘・旨味受容細胞および忌避物質である苦味受容細胞と連結する鼓索神経節、舌咽神経節、NSTのWGA陽性神経細胞の分子特性を解明した。モデル魚においても嗜好性にかかわるアミノ酸受容(T1Rs陽性)細胞、忌避性にかかわる苦味受容(T2R陽性)細胞にそれぞれWGAを導入したトランスジェニックメダカを作製し、味覚伝導路を可視化した。味蕾細胞は約10日毎にターンオーバーする。このように再生・増殖・分化・細胞死を繰り返す味蕾細胞がどのようにして5基本味の受容細胞の細胞系譜を決めているのかは重要な課題である。筆者らは味蕾細胞の細胞系譜に関与する転写調節因子を見出した。それらの中のHNF一叩は、味細胞に分化した後のTIR系の細胞にのみ発現すること、さらに味細胞系譜に分化する以前に発現する新しい因子を見出しKOマウスを作製した云KOマウスの味蕾において発現する味細胞の種類をin situハイプリグイゼーションならびに抗体染色により解析したところ、甘味、旨味および苦味受容体を発現する味細胞を欠失していた。一方、酸味・塩味のマーカー分子を発現する味細胞は、野生型マウスの味蕾と同様に存在することが観察された。さらにこれらのKOマウスを用いた2瓶選択の嗜好性テストを行ったところ、甘味(シュクロース)、旨味(アミノ酸Glu)、苦味(デナトニウム)に対する感受性が有意に低下していた。一方、酸味(クエン酸)および塩味(塩化ナトリウム)の嗜好性は変化が見られなかった。さらに、鼓索神経・舌咽神経における味物質の応答を電気生理学により計測したところ、KOマウスにおいては甘味(シュクロース)、旨味(アミノ酸Glu)、苦味(デナトニウム)の応答は認められず、酸味(クエン酸)と塩味(塩化ナトリウム)の応答は野生型マウスと同様であった。本成果は味蕾細胞の分裂、増殖、分化、細胞死、さらには味細胞系譜に関する新たな知見を示唆するものである。味物質の嗜好あるいは忌避する生体システムは、末梢の味蕾細胞レベルで規定されている。つまり、T1R陽性味細胞は嗜好性の甘味と旨味(アミノ酸)物質など、T2R陽性細胞は忌避性の苦味物質などの摂食に関与している。われわれは、この味覚嗜好性が「ヒトから魚」までの脊椎動物の共通基盤であるという"概念"を世界に提出した。本研究は、この概念に基づき、嗜好-忌避を分担する味細胞、味神経、中枢の分子・細胞レベルの特性を遺伝子発現(ゲノミクス)から解析することを目途として実施した。▼嗜好・忌避に関わる味神経および中枢(NST)神経細胞のセンサリーゲノミクス解析嗜好味物質を受容する甘・旨味細胞と連結する鼓索神経節、舌咽神経節、さらにはNSTのWGA陽性細胞の遺伝子発現解析を行い、細胞特性を解明した。忌避物質であるデナトニウムおよびシクロヘキシミド受容細胞にWGAを導入するトランスジェニックマウスを作製し、このマウスについてもWGA陽性味神経細胞ならびにNST細胞の分子特性をDNAマイクロアレイにより解析した。モデル魚においても嗜好性にかかわるアミノ酸受容味細胞(T1Rs陽性)、忌避性にかかわる苦味受容細胞(T2R陽性)、酸味受容細胞(PKD陽性)にそれぞれWGAを導入するトランスジェニックメダカを作製し、身体全体におけるWGAシグナルを観察した。▼味刺激により応答する味神経細胞ならびにNST細胞の検証T1R3-WGAマウスの舌にシュクロース、サッカリンなどの甘味物質およびグルタミン酸ナトリウム+イノシン酸などの旨味物質で刺激し、味神経細胞、NST細胞の応答性をc-fosシグナルの組織染色により解析した。つまりTIR陽性味細胞は嗜好性の甘味と旨味(アミノ酸)物質など、T2R陽性細胞は忌避性の苦味物質などの摂食に関与している。1.嗜好・忌避に関わる味神経および中枢(NST)神経細胞のセンサリーゲノミクス解析(1)神経トレーサーを用いて嗜好味物質の甘・旨味細胞と連結する鼓索神経節、舌咽神経節の細胞さらにはNSTの細胞を特定した。これらのWGA陽性細胞の遺伝子発現解析を行い、細胞特性を解明した。(2)忌避物質であるデナトニウムおよびシクロヘキシミド受容細胞にWGAを導入するトランスジェニックマウスを作製した。このマウスについてもWGA陽性味

神経細胞ならびにNST細胞の分子特性をDNAマイクロアレイにより行った。(3)モデル魚においても嗜好性にかかわるアミノ酸受容味細胞(TIRs陽性)、忌避性にかかわる苦味受容細胞(T2R陽性)、酸味受容細胞(PKD陽性)にそれぞれWGAを導入するトランスジェニックメダカを作製し、身体全体におけるWGAシグナルを観察した。2.味刺激により応答する味神経細胞ならびにNST細胞の検証(1)T1R3-WGAマウスの舌にシュクロース、サッカリンなどの甘味物質およびグルタミン酸ナトリウム+イノシン酸などの旨味物質で刺激し、味神経細胞、NST細胞の応答性をc-fosシグナルの組織染色により解析した。c-fos陽性細胞とWGA陽性細胞の相関性をしらべた。
原発性肺癌におけるp16、pRB、cycIinD1の異常と癌増殖能の関連

研究経過平成10年度【目的】非小細胞肺癌切除標本を用いて、細胞周期を調節しているpRB、p16及びcyclinD1の各蛋白発現異常を検索し、これら蛋白の異常と切除標本における癌細胞の細胞増殖能との関連について検討した。またp16発現異常に関してはp16遺伝子の異常との関係について検討した。【方法】当院で切除された非小細胞肺癌101例を対象に、1)pRB、p16及びcyclinD1の各蛋白の発現は免疫組織染色で検索した。2)細胞増殖能は、細胞増殖の活発な細胞に発現しているKi67蛋白を免疫組織染色をおこない、癌細胞中のKi67蛋白陽性細胞の比率をKi67 indexで表し検討した。3)p16遺伝子異常の検索はPCR-SSCPで遺伝子変異を、またp16遺伝子のメチル化はSouthernHybridizationを行い検索した。また、これら遺伝子の異常とp16蛋白発現異常の関係について検索した。【結果】1)各蛋白の発現異常はpRBで41.6%、p16で46.5%及びcyclinD1で44.5%に認められた。pRBとp16の発現には逆相関が認められたが、cyclinD1の発現とpRB、p16の発現には明らかな関係は認められなかった。また90%の症例においてpRB、p16及びcyclinD1の少なくとも1つ以上の発現異常が認められた。2)cyclinD1の発現異常例は正常例に比してKi67 indexで示される細胞増殖能は有意に高値を示したがpRBとp16の発現による差は認めなかった。3)DNAを検索し得た45例の内、遺伝子変異は1例2%、メチル化は12例27%に認められた。この45例中p16発現異常例は18例でこのうち9例(50%)にメチル化が認められた。【まとめ】細胞周期を調節しているpRB、p16及びcyclinD1は非小細胞肺癌に於いて高頻度に異常が認められ、非小細胞肺癌の発生及び増殖に関与していることが示唆された。また非小細胞肺癌におけるp16発現異常にはp16遺伝子のメチル化が関与していることが示唆された。
生体情報分子として機能する糖鎖抗原とその作用機構

マウス腹腔マクロファージ、ヒト単球由来細胞株THP-1細胞を用いて、ムチン型糖タンパク質(ムチン)による活性化とその影響について検討した。ムチンとしては、ウシ、ヒツジ顎下腺ムチン(BSM,OSM)及びヒト腸癌細胞LS180の培養上清より単離したムチン(M-GP)を用いた。BSM,OSM(100μg/ml)、M-GP(2μg/ml)及び比較のためにLPS(1μg/ml)の存在下で、腹腔マクロファージを培養し、上清に分泌されたサイトカイン(IL-1β、TNF-α)、PGE2をELISAで測定した。サイトカインの産生に関しては、ムチンによる大きな効果は認められなかったが、PGE2については、LPSと同程度の分泌の亢進が認められた。次にムチンの受容体を検討する目的で、マクロファージの可溶化物をBSM-セファロースに通し、十分に洗浄後、1M塩化ナトリウムを含む溶液で溶出した。溶出液を脱塩後、非還元条件でSDS-PAGEを行い、ウエスタンブロットを行った。抗マウススカベンジャーリセプター抗体で検出したところ、主に同リセプターの2量体と3量体の位置に検出された。また、同リセプターのcDNAをトランスフェクトしたCHO細胞についても同様の結果を得た。従って、スカベンジャーリセプターを介してマクロファージが活性化されることがわかった。THP-1細胞については、ムチンによる活性化に伴うウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターの産生について検討した。BSM存在下で、3-24時間培養後、RNAを調製し、RT-PCRにより検討した結果、約8時間後に著しい誘導が認められた。上皮性癌組織に浸潤したマクロファージにおいても同様の現象がおこっているものと考えられ、癌細胞にとって有利な環境をもたらすものと考えられる。