hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
筋インスリン抵抗性に対するnotch2の作用機序及び運動・食事との相互作用の解明

最終分化を遂げた筋線維におけるNotch2シグナルの機能を解明するため、筋線維特異的Notch2細胞内ドメイン過剰発現マウス(N2ICD-Tgマウス)を作製した。N2ICD-Tgマウスは糖負荷試験中の血糖値が高い傾向にあり、また速筋に筋萎縮を示した。Notch1-4遺伝子のうち、Notch2のみが筋線維に発現した。Notch2遺伝子はサテライト細胞を枯渇させた単離筋線維にも発現することから、検出されたNotch2遺伝子はサテライト細胞由来ではなく、分化した筋線維由来であることが示された。Notch2シグナルの恒常的活性による骨格筋量の低下は、低い耐糖能につながる可能性がある。まず筋線維にNotch2が発現することを確認するため、サテライト細胞特異的にDTAを発現させ、サテライト細胞を除去した筋組織と通常の筋組織のNotch2タンパク量およびNotch2標的遺伝子であるHey1,Heyl遺伝子発現を比較したところ有意差は認められなかった。また、in vitro系においても同様に、DTAによってサテライト細胞を選択的に除去させた培養筋管細胞において、サテライト細胞を含む筋管細胞と同レベルのNotch2タンパク量およびHey,Hesファミリーの遺伝子発現量が認められた。以上のことから、Notch2シグナルは分化後の筋管細胞・筋組織にも観察されることが確認された。次にRNAiによるNotch2遺伝子ノックダウン筋管細胞にインスリンを負荷しインスリン感受性を測定したところ、コントロールの筋管細胞よりも強いAktのリン酸化レベルが観察された。また、サテライト細胞特異的Notch2ノックアウトマウスから採取したサテライト細胞から分化させた筋管細胞でも同様に、コントロールの筋管細胞よりも強いAktのリン酸化レベルが認められた。ゆえに、分化した筋細胞において、Notch2はインスリン感受性を負に調節する可能性が示唆される。In vivo系においては、Notch2の活性型ドメインを筋線維特異的に過剰発現させたマウス(N2ICDマウス)に高脂肪食を継続的に与えたところ、野生型マウスに比べ、糖負荷試験の成績が悪化しやすい傾向があった。さらに、N2ICDマウスは腓腹筋・前脛骨筋などの速筋に顕著な筋萎縮を示すと同時に、type IIb fiberの比率の減少を示した。Notch2シグナルは成熟筋細胞のインスリン感受性を負に調節するだけでなく、全身の骨格筋量を負に調節することで、生体の耐糖能を減弱させる可能性が推察される。Notchシグナルは筋サテライト細胞などの組織幹細胞において増殖・分化を制御する役割を持っているとされているが、分化を終えた成熟組織における機能については明らかでない。本研究は最終分化を遂げた骨格筋線維におけるNotchシグナルの機能を明らかにすることを目的とした。まず骨格筋線維におけるNotch遺伝子およびタンパク質の発現の有無を調べるために、マウスの足底筋を摘出しコラゲナーゼ処理することで単一骨格筋線維を遊離させ、実体顕微鏡下で採取した。Notch1から4まで4つのNotch遺伝子のうち、単離した骨格筋線維にはNotch2遺伝子のみが発現することが確認された。そこで骨格筋線維においてNotch2シグナルが恒常的に活性化する筋線維特異的Notch2細胞内ドメイントランスジェニックマウスを作製し、フェノタイプの変化を調べたところ、特に速筋において顕著な筋萎縮を認めた。そこで萎縮した前脛骨筋の遺伝子発現網羅解析を行い、筋萎縮を惹起する候補遺伝子を探索した。一方、野生型マウスの骨格筋に筋萎縮を惹起させるため、後肢懸垂および坐骨神経の切断を行い、足底筋から骨格筋線維を単離し、筋萎縮に伴うNotch2シグナルの経時的変化を観察した。その結果、坐骨神経切断によってのみ、Notch2タンパク質の顕著な変化を認めた。以上の結果から、最終分化を遂げた骨格筋線維において、運動神経入力の遮断はNotch2シグナルを介して筋萎縮を引き起こすことが示された。骨格筋のNotch2シグナルは筋量の決定に重要な役割を担っていることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。骨格筋生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでNotchシグナルは専ら幹細胞研究において注目されており、成熟した組織細胞においてNotch2が発現しているか否かということ自体、明確に示されていなかった。本研究はNotch2が成熟組織細胞にも存在することを強く示唆するデータを得た。これは、個体のエネルギー代謝にかかるNotchシグナルの役割を解明していくうえで非常に重要なデータである。また、Notch2ノックダウンによるインスリンシグナルの減弱をin vitro系で確認していること、および筋線維特異的Notch2活性化型ドメイン過剰発現マウスに著明な筋萎縮の表現型が確認されてた。

これらはメタボリックシンドローム・ロコモティブシンドロームの発症機序解明に役立つモデルとして、Notch2遺伝子改変動物・細胞が有用である可能性を示唆するものであり、現時点で、本研究はおおむね順調に進んでいると判断した。Notchシグナルが筋萎縮を惹起するメカニズムの解明に重点を置いて研究を進めていく予定である。前年度、サテライト細胞特異的Notch2ノックアウトマウスからの初代培養細胞を用いてin vitro系での研究は行えたものの、筋線維特異的Notch2ノックアウトマウスの作成に成功しなかった。当時用いたloxPマウスが狙い通り作用しなかった可能性が高く、現在、新たなloxPマウスを作製中である。
血管の幾何学的形態と血流との関連

本研究では血管の幾何学的形態とその機能的意義の解明を目的として,血管の幾何学的計測結果に力学的検討を加えた.動物の脳,腎臓,心臓,消化器,耳の血管鋳型および生理的状態でネコ脳表の血管,鶏胚の周りに発生する血管の幾何学的計測(血管径,長さ,分岐の角度)を行った.血管の幾何学的形態は部位による差が大きく,特にネコの脳では顕著な曲がりのあることが明らかになった.血管分岐での「血管径-分岐角度」には相関関係があり,この相関は分岐する2つの流れの運動量のつりあいを仮定することにより説明しうることが明らかになった.つまり血管の分岐形態は分岐近傍での流体力学的条件の影響を受けていると考えられる.従来,最適原理により血管の分岐形態を説明しうると考えられて来た.しかし今回,この原理を基にした理論的導出を検討した結果,血管の長さを考慮していないため,血管の曲がりを説明できないことが明らかになった.さらに,脳血管の曲がりの生理学的な意義を検討するため,内頚動脈から枝分かれして脳表を走り頭頂葉に分布する血管のルートの沿って血管径と長さを測った.この結果にHagen-Poiseuilleの法則およびFahreaeus-Lindqvist効果を考慮した式を適用し,「血管径-血圧降下」の関係を求めた.その結果,ネコの脳では大きな血管での圧力降下が大きく,内頚動脈から約100ミクロンの細動脈に至る間に,全体の50%程度にまで低下することが分かった.この結果はマイクロピペットを用いた血圧測定の結果とよい一致を示した.従来,血圧降下は大部分細動脈で起こると考えられてきたが,むしろ部位・臓器により大きく異なることが示唆された.以上の結果は,血管の形態は所属する臓器の機能を反映した圧力損失を伴う管路系として理解すべきであることを示している.本研究では血管の幾何学的形態とその機能的意義の解明を目的として,血管の幾何学的計測結果に力学的検討を加えた.動物の脳,腎臓,心臓,消化器,耳の血管鋳型および生理的状態でネコ脳表の血管,鶏胚の周りに発生する血管の幾何学的計測(血管径,長さ,分岐の角度)を行った.血管の幾何学的形態は部位による差が大きく,特にネコの脳では顕著な曲がりのあることが明らかになった.血管分岐での「血管径-分岐角度」には相関関係があり,この相関は分岐する2つの流れの運動量のつりあいを仮定することにより説明しうることが明らかになった.つまり血管の分岐形態は分岐近傍での流体力学的条件の影響を受けていると考えられる.従来,最適原理により血管の分岐形態を説明しうると考えられて来た.しかし今回,この原理を基にした理論的導出を検討した結果,血管の長さを考慮していないため,血管の曲がりを説明できないことが明らかになった.さらに,脳血管の曲がりの生理学的な意義を検討するため,内頚動脈から枝分かれして脳表を走り頭頂葉に分布する血管のルートの沿って血管径と長さを測った.この結果にHagen-Poiseuilleの法則およびFahreaeus-Lindqvist効果を考慮した式を適用し,「血管径-血圧降下」の関係を求めた.その結果,ネコの脳では大きな血管での圧力降下が大きく,内頚動脈から約100ミクロンの細動脈に至る間に,全体の50%程度にまで低下することが分かった.この結果はマイクロピペットを用いた血圧測定の結果とよい一致を示した.従来,血圧降下は大部分細動脈で起こると考えられてきたが,むしろ部位・臓器により大きく異なることが示唆された.以上の結果は,血管の形態は所属する臓器の機能を反映した圧力損失を伴う管路系として理解すべきであることを示している.
大規模複合系に対する自律分散制御の原理に関する研究

今年度の研究成果をまとめると以下の2つとなる。(1)複合分布系の分散VS-MRAC:大規模複合系の適応制御理論では、通常、線形系の制御対象にモデル規範型適応制御とσ修正則を適用し、サブシステム間の結合の適当な大きさの下に、レギュレーション/トラッキングが達成できることを理論的に示しているものが多い。ここでは、制御対象が分布系でしかもある種の非線形系に拡張し、VSS理論とモデル規範型適応制御の考え方を融合したVS-MRACという制御法を取扱い、複合分布系の分散制御にどれほど有効かを理論的に究明した。(2)複合系のマルチモデル制御実際の制御対象はほとんどの場合非線形特性を有するが、制御系の設計はその近似である線形モデルを基に行なわれる。ロバスト制御の思想の背景にはこのギャップを埋めることがあると思われるが、現在のH∞制御では公称モデルが単一の線形系であるため、あまり大きな非線形特性を許容することはできないと考えられる。そこで、複数の線形公称モデルに基づく制御系設計が考えられる。これがマルチモデル制御である。本研究では、御制対象の動特性が複数の公称線形モデルの線形結合で表現でき、しかもその線形結合の重みが動作状態に依存して変動する場合を考察した。ここでの制御戦略は、(a)各公称モデルに対応する(公称)コントロータを個別に設計する。(b)複数の公称コントローラから、動作状態に応じた重みの線形結合で、実コントローラを決定する。というものを採用している。現時点では、1人出力系に限って、安定化可能性が導出できた。複合系への拡張が今後の課題である。
慢性腎臓病の次世代バイオマーカーの開発―伴侶動物の尿中ｍｉｃｒｏＲＮＡを指標に―

近年、慢性腎臓病の罹患者はヒトおよび伴侶動物で急増している。慢性腎臓病の対策では、早期に診断し、治療することが重要である。本研究では、“microRNA"と呼ばれる短鎖の核酸を慢性腎臓病の早期診断に応用することを目的とし、複数の動物種を用いて検証した。結果、慢性腎臓病モデルマウスの解析から、腎臓の病態進行を反映し、かつ尿中にも出現する特定のmicroRNAを同定した。このmicroRNAはマウスのみならず、イヌ、ネコおよびヒトの腎臓にも発現しており、慢性腎臓病の早期診断ツール(バイオマーカー)への応用が期待できる。本研究では、短鎖のRNA(micorRNA ; miRNA)をバイオマーカーとして獣医学に応用することを目的としている。対象疾患としては、伴侶動物で急増する慢性腎臓病に着目した。本年度はバイオマーカーmiRNA候補選抜のため、慢性糸球体腎炎(GN)モデルマウス(B6.MRLc1)を主に解析した。GNマウスは膜性増殖性糸球体腎炎を発症し、メサンギウム増殖、糸球体基底膜の二重化・免疫複合体沈着、足細胞傷害、糸球体でスリット膜関連分子の発現低下ならびに炎症メディエーターの発現増強等を示す。GNマウスの糸球体を分離し、健常マウスとのmiRNAマイクロアレイ比較解析を実施した。4種のmiRNA(miR-92b*、let-7a、miR-26a、miR-195)がGNマウスの病態初期に有意に変動するmiRNAとして同定された。特に、1et-7a、miR-26a、およびmiR-195は健常マウスの糸球体に強く発現し、GNマウスでその発現は低下することをTaqManPCRで明らかにした。miRNAの発現局在をin situ hybridization法で解析し、糸球体構成細胞に陽性シグナルが得られた。さらに、let-7a、miR-26a、およびmiR-195はイヌ、ネコ、ウシ、およびウマの糸球体にも発現することを明らかにした。これらmiRNAは尿に出現し、尿沈渣を除いた尿上清からも検出され、GNモデルにおける1et-7a、miR-26a、およびmiR-195の尿中miRNAレベルは低値だった。in vitro解析において、miR-26aは足細胞株、miR-195はメサンギウム細胞株に強く発現し、特に前者は足細胞の分化と共に発現上昇を示した。足細胞をLPSで傷害したところ、アクチンの減少やCell Viabilityの低下と共に細胞内miR-26a発現も低下した。一方で、LPS刺激中、培養上清中miR-26aレベルは一過性に上昇し、後に減少した。本年度の研究において、糸球体特異的かつ動物種に共通して発現し、さらには尿で検出しうるバイオマーカー候補miRNAを選抜した。特に、糸球体内miR-26aの発現変化は足細胞傷害と関連があり、その尿中検出は非侵襲的な糸球体病変の把握に繋がると考えられる。今後、今回同定したバイオマーカーmiRNA候補さらには新規候補についてマウス以外の動物種でも検討していく。本研究では、短鎖のRNA(microRNA;miRNA)をバイオマーカーとして獣医学に応用することを目的としている。前年度はバイオマーカーmiRNA候補選抜のため、慢性糸球体腎炎(GN)モデルマウス(B6.MRLc1)を主に解析し、バイオマーカー候補miRNAを同定した。一方、伴侶動物におけるこれらの発現は不明である。特に、ネコmiRNAのデーターベース(配列、発現動態)は無い。本年度では、miRNA評価の伴侶動物医療への応用の第一段階として、イヌとネコの腎臓内miRNA発現と配列データをリスト化した。腎機能数値が正常なイヌとネコより腎皮質と髄質を採取し、各組織よりtotal RNAを抽出し、ライブラリーを作製後、Small RNAシークエンスを行った。アライメントでmiRNAデータを抽出した。ネコのmiRNA配列情報は無く、マウスのデータベースを用いて新規に分類、同定した。イヌの腎皮質と髄質で各々241種と225種のmiRNAが検出された。一方、ネコの腎皮質と髄質で各々220種と226種のmiRNAが検出された。イヌとネコに共通し、腎皮質で髄質よりも2倍以上強く発現するmiRNAは31種であり、この中でマウス糸球体でも強発現するmiRNA種は3種だった。一方、イヌとネコに共通し、腎髄質で皮質よりも2倍以上強く発現するmiRNAは14種であり、この中でマウス尿細管間質でも強く発現するmiRNA種は3種だった。以上、伴侶動物の腎皮質と髄質で発現するmiRNA種とその配列を明らかにした。本年度の研究によって、伴侶動物の腎臓に発現するmiRNAデータベースの基礎がつくられた。

各miRNAは、糸球体や尿細管間質で機能制御を担うと考えられる。本研究は、短鎖RNA(miRNA)を腎臓病バイオマーカーとして獣医学に応用することを目的とする。平成24年度はマウス、25年度はイヌとネコの腎臓に発現するmiRNAを次世代シークエンス法で明らかにした。以上のデータを統合的に解析し、26年度はマウス糸球体で最も豊富に発現するmiR-26aに着目した。miR-26aはマウスでは糸球体上皮細胞(ポドサイト)に強く発現し、イヌ、ネコの腎臓でも糸球体に強く発現する傾向にあった。ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、アザラシ、ニワトリの腎臓でも同様の傾向を得た。病態時のmiR-26aを慢性腎臓病(CKD)モデルマウス、ループス腎炎およびIgA腎症患者のサンプルで精査した。CKDマウスの糸球体内miR-26a発現量は健常群よりも低く、ループス腎炎およびIgA腎症患者でも同様の傾向を得た。CKDマウスにおいて、糸球体内miR-26a発現量は尿中アルブミン/クレアチニン比と負の相関を、ポドサイト機能関連分子の発現量と正の相関を示した。近年、尿中miRNAは小胞(エクソソーム)に含まれることが示唆されている。各病態群の尿中エクソソーム内miR-26a量は健常群よりも高かった。in vitro培養系で、マウス不死化ポドサイト株のmiR-26aの発現量は、メサンギウム細胞株や集合管上皮細胞株よりも高く、分化と共に発現が上昇した。ポドサイト株のmiR-26a発現量は、ポドサイト機能関連分子の発現量と正の相関を示し、薬物誘導性細胞傷害によって減少した。細胞傷害後、培養液中エクソソーム由来miR-26aは増加した。以上、miR-26aは動物の糸球体に発現し、特にポドサイトの分化や細胞骨格を制御し、病態時に減少することを明らかにした。miR-26aは腎臓病のバイオマーカー候補であり、特に尿中エクソソームの評価が分子診断に繋がる可能性を示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。獣医腎泌尿器学、分子形態学、分子生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度の研究計画では、疾患モデルマウスを用いて、慢性腎臓病におけるバイオマーカーmiRNA候補の選抜を予定していた。本目標は達成されていると考えられ、上記評価とした。本年度の計画は、イヌおよびネコの腎臓で発現するmiRNAの配列および種類をRNA-seqによって明らかにすることにあった。申請者は収集した臨床検体を用いてRNA-seqを行いmiRNAの発現パターンおよび配列を解明した。本結果を第156回日本獣医学会学術集会で発表し、Res Vet Sci誌に学術論文として公表した。当初の目的は達成され、かつ成果を公表するに至ったので、上記評価とした。本研究のゴールは、動物種に共通する腎臓病バイオマーカーを同定し、獣医学に応用していくことである。一方で、伴侶動物(イヌ、ネコ)におけるmiRNAの配列や発現動態に関する知見は未だ乏しい。今後は、イヌおよびネコの腎臓で発現するmiRNAの配列および種類をRNA-seqによって明らかにする。
歩行パターン測定と歩行訓練の両機能を有する可搬型電子制御歩行路の開発

歩行パターン計測機能と歩行訓練機能を併せ持つ可搬型電子制御歩行路を開発した。ワンチップマイコンによって制御され、パーソナルコンピュータからソフトウエアで制御し、刺激提示とデータ取得を行うものであり、病院・施設、そして在宅における歩行検査やリハビリテーションに活用することができるものである。1)面発光デバイスの試験と選定歩行路に敷き詰め、足の運びの目標となる面発光デバイスとしては、絶縁など基本的電気特性はもとより、薄さ、高輝度、耐久性などが求められる。摘要可能な面発光デバイスとして現在利用可能な様々な発光デバイスの特性を検討し、エレクトロルミネッセンス(EL)を選択した。有機ELは、電力消費や高輝度、演色性などの点で特に優れた特性を有する最適のものであるが、現段階では、大面積の製作が技術的にもコスト的に困難であった。次世代のデバイスとして今後とも検討を加えていく。2)薄膜センサシートの試験と選定接地位置と反応時間検出のため設置した薄膜センサシートをマトリックス状に配し、on/offを取得するためメンブレンスイッチを検討したが、歩行平面での解像度を上げるにつれて、センサ点数がその反応を取得するためのバスラインの本数が増えると共に、各センサをスキャンする周波数も高速となり、システム全体の負荷がかなり増加することとなる。そのため、センサメーカの協力を得て、試験を行い、改良を施しながらセンサシートを製作することとした。B.歩行ユニットのハード・ソフトの改良と臨床応用への展開本研究でこれまで開発してきた電子制御歩行路の中で、歩行目標提示用視覚刺激部分に用いてきた面発光デバイスは、薄さという点では優れているが、その特性上輝度が低く、臨床現場での応用においては高齢者からは見にくく、照明を低下させる必要が生じ、それが転倒を誘発しかねないという問題点や、表示部分の単位面積が大きく粗い目標提示しかできないという問題点があった。目標提示部の輝度を上げ、表示部の解像度を向上させるために、発光デバイスの改良を行った。また米国の共同研究者からは発光色を変化できないかという要望があり、これも考慮した改良を行った。検討の結果、3色LEDを用いて色の可変と輝度向上、表示単位の精細化を行うこととした。また、コストを下げるためにソフトによる制御割合を高め、通信方式として、USB-RS232C変換を行う方式で改良を行うことができ、臨床応用と今後の応用の可能性を大きく向上させることができた。歩行解析と歩行訓練を同時に行うためには、足接地位置の時間的空間的測定を行うことと、接地位置の目標を示す視覚刺激が必要である。最終年度である本年は、多くの改良を行い、実用に耐える電子制御歩行路を作成した。足接地の目標となる視覚刺激提示には、従来は1色であったが、今回は3色発光ダイオードを用いることとし、更にその間隔も従来の5cm間隔から2cm間隔で配置するように回路を設計・制作し、当初よりも高精細度で刺激提示が可能となり、且つ色の選択が可能となり多様な訓練が可能となった。また、足接地位置測定には、視覚刺激と同様にマトリックス状に配置したメンブレンスイッチの出力を高速でスキャンすることが必要であるが、LANの通信プロトコルを用い、必要な速度でデータ収集を可能とした。これらの制御には、PLD(Programmable Logic Device)とワンチップマイコンを用いて制作を行った。歩行解析においては、on/off型センサよりも、圧力に対して線形の出力を有するセンサが望ましいものの、フレキシブルプリント基板上に同種のセンサを大量に構築するには、技術的にも困難で且つコストや誤差範囲の問題があり、本研究ではon/off型センサで制作を行った。可搬性を維持することと、制作を容易にするために、30cm*45cmの基盤に分割して作成し現場で組み合わせて使用するものとして制作を行った。将来は、on/off型センサを組み合わせて4段階程度の圧力変化を検出できることが技術的には可能であるため、歩行解析の内容をより豊かにした電子歩行路によって実用化を行うことが望ましい。
Nb-W系水素透過膜合金の機能設計-長期間水素透過における耐久性向上にむけて-

Nb-W系水素透過合金の機械的性質、水素化特性および水素透過能に及ぼす合金効果を調査し、得られた結果より、耐久性向上に向けたNb-W系合金の設計指針を確立した。実験結果より、NbへのMo添加は固溶水素量の抑制効果が大きく、W添加は加工硬化したNb合金の軟化温度を向上させることが明らかとなった。さらに、NbにWとMoとを共添加することによって、加工性を維持しつつ、耐熱性および耐水素脆性に優れ、かつ高い水素透過能を発揮することがわかった。一方、Nb膜とPd触媒層との間に酸化物層を形成することによって、Pd触媒層とNb膜との相互拡散反応が防止され、水素透過能の耐久性が向上することが明らかとなった。Nb-W合金はPd系合金と比較して10倍も高い水素透過能を有する。しかしながら、水素透過膜用Nb-W合金の設計において、高い水素透過能と耐水素脆性および耐久性を兼ね備えるための様々な最適条件については不明な点が多い。そこで平成20年度は、Nb-W合金の最適な加工・熱処理条件を明らかにすることを目的として研究を遂行した。W添加量に及ぼす圧延率の変化を調査した結果、Nb-5mol%W合金では、約20gのボタンインゴットから厚さ0.5mmまでの板状まで冷間圧延が可能である。しかしながら、5mol%W合金以上から急激に加工性が低下し、9mol%W合金では、冷間圧延が不可能であることを明らかにした。一方、純NbおよびNb-W合金のビッカース硬さに及ぼす熱処理時間の影響を調べた結果、いずれの試料も冷間加工後、アルゴン雰囲気中、1200°C、1時間の熱処理によって軟化するが、1時間以上の熱処理を行うことによって再び硬度が増大し始めた。また、1200°C、24時間以上の熱処理を行うと冷間加工直後よりも硬度が高くなることが明らかとなった。熱処理時間に対する試料中の酸素濃度を測定した結果、熱処理時間に比例して酸素濃度が増大していることがわかった。また、チタンゲッターなどで雰囲気中の酸素分圧を低下させた場合でも、熱処理時間に従い酸素濃度が増加する傾向を示しており、可能な限り短時間で熱処理を行う必要があることを明らかにした。しかしながら、水素透過膜用Nb-W合金の設計において、高い水素透過能と耐水索脆性および耐久性を兼ね備えるための様々な最適条件については不明な点が多い。そこで平成21年度は、Nb-W合金の結晶組織および表面パラジウム皮膜の安定性に注目して研究を遂行した。Nb-5mol%W合金をアーク溶解して得られたボタンインゴットより、(1)加工・熱処理をせずに膜試料を作製、(2)圧延後、熱処理せずに膜試料を作製、(3)圧延・熱処理後に膜試料を作製と3種の試料を準備して水素透過試験を実施した。その結果、(1)の加工・熱処理をせずにボタンイゴットより直接膜献料を切り出した場合に最も高い水素透過速度が得られ、(2)の圧延加工をすることにより、やや水素透過速度が低下した。興味深いことに、(3)の圧延後に熱処理を施すと水素透過速度は著しく低下することが明らかとなった。これは加工・熱処理による再結晶化が原因であり、水素原子のトラップサイトとなる結晶粒界が増加したためであると考察した。一方、Nb-5mol%W合金の水素透過速度は試験時間の経過に従って低下することが明らかとなった。水素透過試験後の膜試料表面をSEM観察すると、膜表面のパラジウム層にはスポンジ状の孔が一様に形成されていることが明らかとなった。水素透過速度の低下が結果として表面皮膜の形態変化に現れていると考えられる。これはニオブ層とパラジウム層との相互拡散が原因であると予測し、相互拡散を抑制する目的で両層の間に酸化物層を形成した試料を用いて水素透過試験した。その結果、経過時間に対する水素透過速度の低下を抑制することに成功した。水素透過の分野では金属酸化物は水素を透過しないと理解されているが、実際には水素を透過することも明らかとなった。そこで平成22年度は、Nb-W系水素透過合金膜の水素透過速度に及ぼす固溶水素濃度の影響と水素脆性破壊のメカニズム解明に目標を置いて研究を遂行した。アーク溶解した純NbおよびNb-

W合金よりφ12mm×0.5mmの膜試料を切り出し、水素透過試験を実施した。膜中の固溶水素濃度と水素透過速度との間の関係を調べた結果、膜間の固溶水素濃度差が一定であるにも関わらず、膜中の固溶水素濃度が変化するに従い、水素透過速度も大きく変化することが明らかとなった。興味深いことに、固溶水素濃度の変化に対する水素透過速度の変化には極小点が存在した。この結果は、固溶水素濃度が増大するに従い、膜中の水素の拡散係数が複雑に変化していることを表している。したがって、フィックの法則に基づいた従来の水素透過能の解析方法では、水素透過反応を理解することができない。そこで、水素拡散の駆動力が膜間の水素の化学ポテンシャル勾配にしたがって拡散していると仮定し、拡散方程式を用いて水素透過速度を解析した。その結果、化学ポテンシャル勾配と水素透過速度との間に直線関係が成立することを明らかにした。
タイ南部の大規模災害後のコミュニティ自立再生と癒しの過程に関する研究

本研究はタイ南部パンガー県タクワパー郡ナムケム村と周辺被災者住宅で、スマトラ沖地震9年後のコミュニティ再生について聞き取り調査を行った。本研究は1津波被災から復興までサイクル、2鎮魂の癒しと儀礼、3個々の構成員の癒しの多様性、4外部アクターとのかかわりの4点について調査を行った。その結果、災害ボランティア等の制度化が進んだナムケム村村民と生活再建が遅れた周辺被災者住宅に滞留する被災者との間に再生と癒しの過程で格差が見られた。更に本研究はタイと日本の学会で結果発表を行った。その一環として2013年12月19-23日東京で研究報告会として日タイの津波経験を繋ぐ企画展示を開催し、社会還元を行った。本年度は、チュラーロンコーン大学政治学部にカウンターパートになって頂き、タイ国立研究委員会の認可の下、パンガー県タクワパー郡ナムケム村周辺で2か月間の現地聞き取り調査と資料収集を行った。本研究は1スマトラ沖地震による津波被災から復興までサイクルの記録保存、2鎮魂の癒しと儀礼、3個々の構成員の癒しの多様性、4外部アクターとのかかわりの4点について調査することを目的としており、個々の項目についての今年度の成果を述べる。1第一年目の現地調査では当初の期待通り、津波の被災から復興まで8年間一貫した語りが被災住民の中で記憶されていることがわかり、被災後のコミュニティ構成員の個々の動態を把握するのに適したデータが得られた。2鎮魂と癒しについては、ナムケム村を筆頭にアンダマン海沿岸村落では、津波慰霊祭が年中行事の中に組み込まれ、コミュニティ形成と観光招致のために活用されている。津波記念公園や記念碑の建設などハード面やコミュニティ防災というソフト面を含めて「防災文化」の創出が試みられている実態が観察された。3被災後のコミュニティの構成員は、土地の権利の有無、民族の違い、生業、家族構成、地元有力者とのつながり、避難場所の違いなどの要素によって援助を受けられる状況が異なった。そのために復興後の生活への不満や満足、優遇者への妬みを伝える語りに個々に大きな違いが出ている。4外部アクターに対する関わり方、協働の仕方について、特にNGOや海外の団体が多くかかわった地域では、外部団体の巻き込み方を学び、より自主的に地域住民の生活防衛の交渉を図るリーダー層が出現している。また海外援助が住民のなかに明確に記憶されており、そのかかわり方がその後の住民行動(海外旅行者への評価、防災ボランティアへの参加)に影響を与えている。以上、本年度の調査を通じて、当該地域の概説的な問題を把握し、次年度の着目点の設定を行った。本年度はパンガー県タクワパー郡ナムケム村と周辺被災者住宅で2か月間の現地聞き取り調査とタイ及び日本で研究発表を行った。本研究は1スマトラ沖地震による津波被災から復興までサイクルの記録保存、2鎮魂の癒しと儀礼、3個々の構成員の癒しの多様性、4外部アクターとのかかわりの4点について調査することを目的としており、個々の項目の成果を述べる。1第二年目の現地調査ではナムケム村と集落外再定住地を調査し、それぞれ津波後の復興の語りの違いを明らかにした。防災活動を通じて語りが統合されていったナムケム村に比べて、再定住地では復興・防災に対するより多様な評価が残されている。2鎮魂と癒しについては、ナムケム村では津波に関する式典を伴う「防災文化」の創出をもって癒しを得ている。他方、被災者住宅の一部では災害後9年間の間に復興できたものが流出し、復興に取り残されたものが行き場を探して流入する現象が見られる。十分に救済されなかったことに不満の残している者同士が境遇を語り合う中に癒しを見出している状況が見られた。そのため復興後の生活への不満や優遇者への妬みに個々に大きな違いがある。4外部アクターに対する関わり方、協働について外部団体の巻き込み方を学び、自主的に地域住民の生活防衛の交渉を図るリーダー層が出現している。また海外援助が住民のなかに明確に記憶されており、その後の防災などの住民行動に大きな影響を与えている。本研究は更にタイと日本の学会で結果の発表を行った。また12月19-23日までの期間、東京三鷹で研究報告会として日本、タイ、アメリカの芸術家、若手研究者と共に日泰の津波経験を繋ぐ企画展示を開催し、研究の社会還元を行った。タイ王国から調査許可を受け、チュラーロンコーン大学政治学部客員研究員として現地調査、資料収集を開始した。

すでにアンダマン海沿岸タクワパー郡の被災地と再定住地域で2か月間の住み込み調査を行い、当該地域において研究者としての立場を確立し、インフォーマントを順調に増やし、情報の蒐集を行っている。25年度が最終年度であるため、記入しない。調査地における文献調査によって、政府やNGOなどによってタイ語レポートが多く出版されていることがわかり、本研究における災害記録の緊急保存の重要性は低下した。しかし、多くの記録は被災直後から3年間に集中し、また地震の支援活動の正当性を示す記述となっているために被災者の多様な言説、態度に対する配慮はあまり見られない。今回の聞き取りによって被災から現在に至るまで、被災前の家族の構造、立場、土地家屋の所有権、被災の仕方によって、それぞれの世帯のその後の復興に格差が生じているということがわかってきたため、次年度はこの被災者の多様性に考慮して記録し、震災後コミュニティの長期的な変化についての新しい知見を加えてゆくことにする。特に今後は研究の少ない再定住地域での調査を行い、1.被災地域・再定住地域の社会構造の長期変化、2.再定住地域での復興の格差問題、3.コミュニティ再生と結束の課題について調査を進める。
動脈硬化の発生と平滑筋細胞の分化異常に関する研究平滑筋動ミオシン重鎖アイソフォ-ムとPDGFーA鎖アイソフォ-ムを示標とした検討

血管平滑筋ミオシン重鎖(MHC)には一遺伝子からRNAスプライシングの差によって2種類のアイソフォ-ム(SM1とSM2)が産生されることを我々は示してきた。この2種類のMHCの発現は血管発生の過程で異なる調節をうけている。我々は胎児・新生児期大動脈にはSM1,SM2とは異なる第三のMHCが大量に存在することを見出した。そこで本年度の研究ではこの胎児型平滑筋MHCの分子特性と、血管発生、平滑筋分化および血管病における分子マ-カ-としての意義を明らかにすることを目的とした。まずウサギ胎児大動脈よりcDNAライブラリ-を作製し,胎児型MHC(SMemb)のcDNAクロ-ニングを行った。得られた塩基配列よりアミノ酸配列を推測、SMembに特異的なペプチドと抗体を作製した。この抗体を用いてSMembの発現を組織学的に検討すると,SMembは胎児・新生児期に強く発現し,以後減少することが明らかとなった。さらにバル-ンカテ-テルによる内膜損傷と高コレステロ-ル食負荷によって2種類の動脈硬化モデルを物製したところ、新生内膜で増殖する細胞は胎児期平滑筋にきわめて類似した表現型を示した。以上の結果は、胎児型MHC(SMemb)が平滑筋の細胞分化だけでなく,血管病変を病理学的および生化学的に診断する分子マ-カ-としての役割を有していることを意味し、同時に平滑筋細胞の胎児型細胞への先祖返りが動脈硬化発生の一要因となっていることを明らかにしている。
GM2型脂質ラフトの可視化と構成タンパク質の同定及び新規機能の解明

神経芽腫細胞とガングリオシドGM2に対する抗体(anti-GM2)を組み合わせることにより,これまで難しかった脂質ラフトの光学顕微鏡レベルでのイメージングに成功した。GM2ラフトとフロチリンの相互作用(共局在)を確認した。さらにラフトの主要脂質成分(ガングリオシドとコレステロール)の一つであるコレステロール含量に依存してエンドサイトーシス後の運命,すなわちリサイクル系に入るかあるいはリソゾームに送られて分解されるかが決まるという興味深い事実を見出した。これまでの研究で,特定のがん細胞とのみ特異的に反応するモノクローナル抗体の作製に成功し,それが糖脂質のGM2を認識していることを明らかにした。この抗体で,神経芽腫の一種であるGOTO細胞を染色したところ,細胞表面が斑点上に染色され,しかも脂質ラフトのマーカータンパク質と考えられているFlotillinと染色像が重なった。世界で初めて脂質ラフトの可視化に成功した可能性が高いので,そのことを証明するべく細胞生物学的な研究を行い以下の成果を得た。(1)GM2型脂質ラフトの可視化と生細胞膜上での動態の解明:マウス腹水から回収した抗GM2モノクローナル抗体をAlexaFluor 555で蛍光標識し,培養神経芽腫細胞(GOTO細胞)を用いてラフトを可視化することに成功した。共焦点蛍光顕微鏡で問題のラフトのエンドサイトーシス過程を追跡することにも成功した。(2)Flotillinの標識とラフトへの集積過程の追跡:Flotillinは細胞内タンパク質であるが,脂質修飾により細胞膜の内側に結合することが知られている。このFlotillinをGFP(Green Fluorescent Protein)との融合タンパク質としてGOTO細胞に発現させることにより,Flotillin-GFPがラフトに集積する過程を可視化することに成功した。さらに,GM2抗体-Alexa Fluor 555とFlotillin-GFPで二重標識し,染色像の多くが重なることより,これまで推定されていたFlotillinが脂質ラフトの裏打ちタンパク質であることを実験的に初めて示すことができた。糖脂質の一種であるガングリオシドGM2を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて神経芽腫由来のGOTO細胞を染色すると多数の斑点状の染色像が得られることから,GM2を主成分とする脂質ラフトの可視化に初めて成功したと考えられる。これら斑点状の染色像とラフトのマーカーとみなされているフロチリンの染色像が良く重なることも,GM2ラフトであることを強く支持する。本年度はこのGM2ラフトのエンドサイトーシス過程を詳細に検討し,以下の成果を得た。(1)GM2ラフトの動態をAlexa Fluor555標識抗体でモニタリングした結果,GM2ラフトは通常は,トランスフェリン受容体に代表されるリサイクルエンドゾーム系を介して定常的に細胞内輸送されていることが明らかになった。(2)コレステロール包接試薬シクロデキストリンを作用させてラフトの構成成分であるコレステロールを引き抜き,ラフト構造を不安定化すると細胞内輸送経路はリサイクルエンドゾーム系からライソゾームに至る分解系に変化することが判明した。これは,これまで未知であった脂質ラフトの細胞生物学的な機能がコレステロール代謝の基地である可能性を示唆するものであり,今後の研究の発展が期待される。脂質ラフトが細胞間コミュニケーション等の情報伝達の基地であることを示唆する研究は多数なされているが,脂質ラフトがコレステロール代謝の基地(貯蔵庫)としての重要な役割を果たしている可能性を示唆したのは初めてであり興味深い。
ショウジョウバエのミトコンドリア動態を監査する新規細胞周期チェックポイント機構

ミトコンドリア(Mito)は細胞内で融合と分裂を繰り返す。これはMito内の異常部分の除去、Mito間で不足因子の交換、補填に必要である。ショウジョウバエ雄の減数分裂前細胞でMitoDNAの損傷修復を強く阻害すると、分裂開始因子であるサイクリンBの核と細胞質間の移行が変化して、CDK1の活性化がおこらず、減数分裂の開始が阻害されることをみいだした。このようなミトコンドリアの異常を感知して細胞周期を停止させる機構は体細胞には認められなかった。異常な精子が産生されるのを妨げるための生殖系列細胞特異的な機構と考えられる。ミトコンドリアは細胞内で融合と分裂を繰り返している。ショウジョウバエ雄の減数分裂期およびその前後の時期ではとくにミトコンドリア構造およびその分布がダイナミックに変化する。哺乳類の培養細胞では細胞分裂期直前にミトコンドリアが断片化することが知られている。ショウジョウバエの雄減数分裂細胞内のミトコンドリアを免疫染色法で染色し、超解像度顕微鏡を用いて観察しところ、精原細胞の有糸分裂時には、培養細胞と同様にミトコンドリアの断片化が観察された。これに対して減数分裂前のG2期にミトコンドリアが連なったネットワークが形成され、それが断片化することなく分裂期に進行するのが観察された。分裂中期には微小管に依存して赤道面に集約、分裂後期にはセントラルスピンドル微小管構造の上に配列し、分裂終期に細胞質へ拡散した。その結果、娘細胞に均等分配される。減数分裂終了後の精細胞ではミトコンドリアの巨大凝集体が構築された。ミトコンドリアダイナミクスの意義を推定する目的でその融合、分裂を担う遺伝子をノックダウンすると、どちらの場合でも減数分裂期の細胞が観察できなかった。精母細胞の細胞周期が減数分裂前に停止していることがわかった。ミトコンドリアのATP合成阻害剤オリゴマイシンで細胞を処理したり、ミトコンドリア電子伝達系の構成因子をノックダウンしたりして、ATP合成を阻害しただけでは細胞周期の停止は観察されなかった。以上の結果から、ミトコンドリアの動態を監査して細胞周期を調節するチェックポイント機構の存在が予想された。細胞周期を分裂期に進行させるには、サイクリンBの合成とCDK1のリン酸化状態の変化が必要である。融合因子をノックダウンした状態でサイクリンBを強制発現させたところ、一部の細胞は分裂期に進行した。この結果は細胞周期停止の一因はサイクリンBの発現抑制である可能性が考えられた。哺乳類の培養細胞では分裂期直前にミトコンドリア分裂因子が活性化され、それが断片化される。この断片化を阻害すると細胞周期が停止する。一方、ショウジョウバエの精子形成過程でもダイナミックに変化する。ミトコンドリア構造と細胞内分布を超解像度顕微鏡にて観察した。培養細胞と違い、減数分裂前のG2期にミトコンドリアのネットワークが形成され、断片化なく分裂期に進行することがわかった。分裂中期には微小管に依存して赤道面に集約、微小管構造を介して娘細胞に均等分配された。その融合、分裂因子をノックダウンすると、どちらでも減数分裂直前に細胞周期が停止した。ATP合成酵素のノックダウンでも開始は阻害されなかった。以上から、ミトコンドリアの動態を監査して細胞周期進行を制御する機構の存在が推定された。減数分裂の開始には、1)サイクリンBの発現誘導、2)Cdk1のCAKによるリン酸化、3)Cdk1のT14Y15がTweによる脱リン酸化が必要である。この減数分裂の開始阻害の原因を検討した。まずCAKによるCdk1のリン酸化を調べた結果、分裂開始が抑制された細胞でもCAKによるリン酸化は検出された。次にCdk1のT14Y15をアミノ酸置換した構成的活性型変異体を発現させた。この変異体でも分裂の開始阻害は解除されなかった。さらに脱リン酸化酵素Tweの強制発現でも同様の結果を得た。最後にサイクリンBを強制発現させたところ、減数分裂へ移行する細胞が見られた。一方、直接核に移行することができるサイクリンA-NLSを発現しても効果は認められなかった。したがって、ミトコンドリアのダイナミクスに異常があると、サイクリンBの発現が抑制されるため、減数分裂の開始が抑制されることがわかった。H27年度は、精巣から単離した精母細胞をexo vivoで培養し、ミトコンドリア局在シグナルーGFPを発現させた生細胞において、ミトコンドリア動態を観察できる実験系を構築できた。さらにCdk1のThr14Tyr15をアミノ酸置換した構成的活性型変異体Cdk1を精巣特異的に発現させたり、脱リン酸化酵素Tweも強制発現して、効果を調べることができた。直接核に移行して働くことのできるサイクリンA-NLSを強制発現して、細胞周期停止への効果を調べる実験もおこなうこともできた。たとえば哺乳類の培養細胞では細胞分裂を始める直前にDrp1がCdk1のリン酸化により活性化し、ミトコンドリアを分裂させて断片化する。これを阻害すると分裂期に移行できない。一方、ショウジョウバエの精母細胞では、減数分裂開始前にミトコンドリアが融合したネットワークが作られる。そしてネットワークを維持しながら減数分裂を開始し、微小管に依存してミトコンドリアは娘細胞に均等に分配されることをみいだした。

このネットワーク形成にはミトコンドリアの融合因子と分裂因子の両方が必要であることがわかった。この際、どちらの因子を阻害しても減数分裂直前に細胞周期が停止した。その後、減数分裂をおこなわずに精細胞に分化した。この細胞周期停止は、単にATP合成が阻害された結果ではない。ATP合成阻害剤による処理、ATP合成酵素のノックダウンでは周期停止は起こらなかった。この停止は分裂開始に必要なCdk1のリン酸化、脱リン酸化ではなく、そのパートナーであるサイクリンBの発現が阻害されたことによることが分かった。この細胞分裂停止の生物学意味を探るために、ミトコンドリアDNAの合成修復に必要なDNAポリメラーゼgammaの触媒あるいは調節サブユニットをノックダウンした。これらの操作でも同DNAのコピー数が低下していることを定量PCRで確認した。どちらの場合も減数分裂開始が同じように阻害された。ミトコンドリアの分裂、融合は、損傷したDNAやタンパク質を交換、補てんする意味がある。これが阻害された場合は異常な精子が産生されないように減数分裂を開始させない、細胞周期チェックポイント機構が働いていると考えられる。現在、融合、分裂の阻害と同じ調節機構が働いていることを引き続き調査している。ミトコンドリアの分裂、融合が阻害された場合は異常な精子が産生されないように減数分裂が開始しない、細胞周期チェックポイント機構が働いていることが明らかになった。当初の計画では、ショウジョウバエの培養細胞を用いて、同様な制御機構が培養細胞の有糸分裂時にも働いているか、検証することを計画した。しかし、この点については哺乳類の培養細胞を用いてすでに報告がなされた。生物種を超えて同じような制御機構が保存されている可能性は高い。したがってこの点に関しては研究の新規性が高く保たれているとは言い難い。一方、精原細胞の有糸分裂の過程は体細胞分裂すなわち有糸分裂である。この過程では培養細胞と同じようにミトコンドリアが分裂前に分断化され、小さな断片として娘細胞に分配されているように見える。そこで同じ精巣内の一連の発生現象である、精子形成過程にみられる2種類の細胞分裂、すなわち有糸分裂と減数分裂ではミトコンドリアの状態をモニターして細胞分裂周期を進行させるメカニズムが異なることを証明しようとしている。この時期の細胞は哺乳類の細胞よりもはるかに細胞質が小さい。それにしたがってミトコンドリアのサイズも小さいので通常の蛍光顕微鏡の解像度(200nm)では観察がしにくいという問題点がある。この問題点はショウジョウバエの培養細胞でも同じである。これらを解決するために観察法の改善を試みている。ミトコンドリアは細胞内で融合と分裂を繰り返している。ショウジョウバエの精母細胞では、減数分裂開始直前にミトコンドリアが連結した構造が作られ、分裂期にはこれを維持しながら娘細胞に均等に分配する。この構造の形成にはミトコンドリア融合因子Marf1と分裂因子Drp1が両方必要である。どちらを阻害しても減数分裂前に細胞周期が停止した。その後、減数分裂せずに精細胞に分化したが、成熟精子は認められなかった。
巨脳症-毛細血管奇形症候群におけるPI3K/AKT経路の網羅的解析とその制御

巨脳症-毛細血管奇形症候群は、PI3K/AKT経路の遺伝子異常により巨脳症、結合織の異常、手指の数的異常を来す先天奇形症候群であり、PI3KCA関連過成長スペクトラムに包括される。本疾患患者から樹立した皮膚繊維芽細胞を用いてアレイ解析を行った。創傷治癒時などの皮膚組織増殖に関与するWFDC1、KRT17などの10遺伝子の発現増加を認めた。さらにmicroRNAでは、miR-10aの低発現やmiR-27b、miR-138、miR-486の高発現を認め、結合織や骨組織の過剰増殖への関与が示唆された。また巨脳症の臨床像の客観的な評価法の一つとして、脳MRI画像による測定法を確立した。巨脳症-毛細血管奇形症候群(Megalencephaly-CAPillary malformation、MCAP)は、PI3K/AKT経路の遺伝子異常により巨脳症、結合織の異常、手指の数的異常を来す先天奇形症候群である。出生後も中枢神経の異常増殖は続き、外科手術を要する高度な水頭症を高率に合併するが、現時点で組織増殖を抑制する特異的な治療薬はない。またAKT3、PIK3R2、PIK3CA遺伝子のミスセンス変異により、PI3K/AKT経路の恒常的亢進が生じることが同疾患の原因と推定されているが、経路亢進の詳細な分布は不明である。また手指の数的異常では一般的にヘッジホッグ経路(Hh経路)が関与することが知られており、PI3K/AKT経路とHh経路に相互作用があると予想した。本研究の目的は、AKT3変異によるPI3K/AKT3の下流経路やHh経路などの活性化の分布を解析し、分子標的治療の標的部位となる経路を特定することである。PI3K/AKT経路とHh経路の相互作用について培養細胞で評価し、PI3K/AKT3経路の亢進がHh経路を抑制することを初めて確認した。さらにMCAPの遺伝子解析が可能な体制を構築した。採取した静脈血中のリンパ球からゲノムDNAを抽出し、疾患パネル(Trusight Oneシーケンスパネル)及び次世代シークエンサー(Miseq,Illumina)を用いた網羅的遺伝子解析が可能となり、すでにMCAP近縁疾患の患者の遺伝子解析を開始した。採取した静脈血中のリンパ球からゲノムDNAを抽出し、疾患パネル(Trusight Oneシーケンスパネル)及び次世代シークエンサー(Miseq,Illumina)を用いた網羅的遺伝子解析が可能となり、すでにMCAP近縁疾患の患者の遺伝子解析を開始している。想定外の事としては、既にAKT3遺伝子変異が同定した患者からの皮膚線維芽細胞の樹立を予定していたが、病状の悪化のため皮膚検体の採取の施行ができなくなった。巨脳症-毛細血管奇形症候群は、巨脳症、結合織の異常、手指の数的異常を来す先天奇形症候群である。本研究は、遺伝子変異によるPI3K/AKT経路の恒常的亢進が、下流経路に与える影響を解析し、潜在的な治療標的や遺伝子変異ー表現型相関を明らかにすることを目的とする。本疾患では、手指の数的異常を伴うため、特に手指発生を制御するHedgehog経路(Hh経路)との相互作用に着目して解析を行った。まず、巨脳症患者3人の原因遺伝子の同定を行った。さらにPIK3CAモザイクの症例について、正常皮膚及び病変皮膚から皮膚繊維芽細胞を樹立し、アレイ解析によるmRNA・microRNAの網羅的発現解析を行い、発現プロファイリングを行った。また、PI3K/AKT経路とHh経路の相互作用についてC3H10T1/2細胞で評価した。恒常的活性型のAKT3発現ベクターの一過性強制発現、リコンビナントヘッジホッグ蛋白またはSMO刺激薬(SAG)によるHh経路の刺激を行い、ルシフェラーゼアッセイ及びreal time RT PCRによりHh経路活性を評価した。何れのHh経路刺激も、PI3K/AKT経路の活性化により強く抑制され、PI3K/AKT3経路の亢進がHh経路を抑制することを初めて確認した。さらにPI3K/AKT活性によるHh経路の抑制効果は、mTOR阻害剤・GSK3β阻害剤のいずれの投与でも不変であり、Hh経路の抑制はPI3K/AKT経路の下流蛋白ではなく、AKTとHh経路構成蛋白の蛋白相互作用の可能性が示唆された。さらに、脳形態の客観的評価を行うための解析法を確立するために、本疾患と同様に巨脳症を呈するGorlin症候群患者の脳MRI画像の解析を行った。今後は本解析法を用いて巨脳症-毛細血管奇形症候群の遺伝子変異ー表現型の関連について解析する予定である。

また巨脳症の臨床像の客観的な評価法の一つとして、脳MRI画像による測定法を確立した。培養細胞を用いた解析として、前年度から引き続きC3H10T1/2細胞におけるMyr-AKT3の一過性強制発現を行いPI3K/AKT経路とHh経路の相互作用について解析を進める。具体的には、PI3K/AKT経路の亢進によりHh経路の下流蛋白であるGLIの細胞内分布がどの様に変化するかを免疫染色で確認する。また、Hh経路がPI3K/AKT経路に与える影響を評価するために、ヘッジホッグ刺激によってPI3K/AKT経路の下流蛋白(BAD、GSK3β、mTOR)のリン酸化がどのように変化するかをImmunoblottingで確認する。次に患者検体と用いた解析として、MCAP近縁疾患と臨床診断している患者の健常皮膚及び病変部皮膚を採取し、各々に由来する皮膚線維芽細胞を樹立することを予定している。樹立した2系統の繊維芽細胞のDNA変異の出現率の違いを次世代シークエンサーによる遺伝子解析で評価する。さらに両者におけるmRNA/microRNAの発現量をチップアレイによる網羅的解析とreal-time RT PCRで測定し、MCAPにおける遺伝子発現のネットワークを明らかにする予定である。小児科