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物語性に着目した幼児の自然事象に対する素朴概念の基礎的研究

科学教育の分野では、これまで認知心理学の知見を用いて、子どもたちの素朴概念について、様々な角度から研究が行われ、子どもたちが素朴物理学、素朴心理学、素朴生物学といった領域固有な知識を持っていることが明らかにされてきた。しかし、それらの研究の大部分は、中高学年以上の児童期子どもや青年期の子どもを対象としたものであった。そこで本研究では、まず(1)我が国の幼児期から低学年児童期にかけての科学教育の歴史的変遷について論じた。次に、(2)幼児期の子どもが自然の事象をどのように認識しているのかについて調べた。特に本研究では、これまであまり研究が行われてこなかった空気、光、天体を対象に、幼児の認識を調べた。さらにこれらの自然事象のうち、特に幼児の認識に物語性が見られた天体の事象に対し、(3)大阪府下のB保育園の5歳幼児計24名を対象に、太陽と月についての幼児の認識が、物語絵本(=非科学的な内容の絵本)と科学絵本(=科学的な内容の絵本)とによってどの様な影響を受け、さらに1ヶ月後、それらの認識が持続するかどうかを調べた。認識についての質問内容は、太陽については、「太陽の色」、「太陽の個数」、「太陽の日没後の位置とそこでの行動」、「太陽の運行」、月については、「月の色と形」、「月の満ち欠けの理由」、「月の形体」、「月までの距離」の各4観点について個別面接法を実施した。この結果、我が国の幼児期から低学年児童期においては、第2次世界大戦までに、幼稚園では「観察」・「園芸」が、小学校では「自然の観察」のような科学的な保育・授業が行われていたが、戦後は明確な科学教育が行われていない事が明らかとなった。また、スクリプトの分析の結果、太陽については、各認識調査において12名中2名の幼児が、月については「月の満ち欠けの理由」の質問において12名中2名の幼児が物語絵本の影響を受けたことが示された。平成18年度の研究実績は以下の通りである。[1]空気・光・天体認識に関する先行研究の主要な成果について国内外の幼児・児童を対象とした空気・光・天体認識に関する先行研究を行った。この結果、幼児期における研究は、国内外を間わずほとんど見られないことが明らかとなった。なお、空気認識に関する国内外の先行研究の成果は、「科学教育における幼児の『空気』認識に関する研究動向とその意義」(教育福祉学研究32、2006)にまとめた。[2]空気・光・天体認識に関する基礎的研究の主要な成果について幼児・児童を対象に、太陽・月・星といった天体にっいて、(1)天体の正体、(2)天体の概観と距離感、(3)天体の運動、(4)地球と他の天体との区別の4観点から調査した。この結果、幼児は、太陽は熱く、月は冷たいイメージを持っていることがわかった。また幼児は、天体の大小関係を、見た目の大きさで判断していることが明らかとなった。さらに幼児は、太陽・月の運行の仕方について、自分が動くとそれに追随すると捉えていた。何人かの幼児は、月には「うさぎ」や「きつね」などの生物がすんでいるという考えており、その背景には絵本やイラスト等の影響があることが明らかとなった。幼児を対象に、光について、(1)光の正体、(2)光の存在、(3)光の性質(直進性、反射性)の3観点から調べた。

この結果、幼児は、光の色や形について統一した見解を持っていないことがわかった。また幼児は、光の発生源は天体であると認識していた。さらに幼児は、「影」の存在を知っており、影は物体によって光が遮られるためにできるものと認識していた。光の進み方について、幼児は、光が風・空気との相互作用によって曲線を描いて進むと認識していたことが明らかとなった。幼児・児童を対象に、空気について、(1)空気の物質認識、(2)空気の質量・体積認識、(3)空気の性質(特に弾性)の認識の3観点から調査した。この結果、幼児は、空気は目に見えないが、閉じ込めることによって自由に操作できると認識していたことが明らかとなった。また幼児は、空気が体積置換を起こすことを経験的に認識していたが、首尾一貫した理論は持っていなかった。さらに幼児は、空気の伸縮を直感的に理解していることが明らかとなった。以上の結果を比較すると、天体に関する自然現象に対して幼児が抱く素朴概念は、光と空気のそれと比べ、虚構性が強く現れていることが明らかとなった。[1]空気認識に関する基礎的研究の主な成果について大阪府下のA保育園の幼児23名を対象に、空のペットボトル・ガラス瓶及び空のビニル袋・ビーチボール内の空気の認識を個別面接法によって調べた。この結果、形状が定型であるペットボトルでは23人中17人が「何も入ってない」、23人中1人が「空気」と回答し、ガラス瓶では23人中18人が「何も入ってない」、23人中0人が「空気」と回答した。さらに形状が不定型であるビニル袋では23人中6人が「何も入ってない」、23人中13人が「空気」と回答し、ビーチボールでは23人中6人が「何も入ってない」、23人中13人の幼児が「空気」と回答した。このことから幼児は、定型よりも不定型の容器を用いたほうが、空気を認識しやすい傾向があることが明らかとなった。[2]天体認識に関する基礎的研究の主な成果について大阪府下のB保育園の5歳幼児計24名を対象に、太陽と月についての幼児の認識が、物語絵本(二非科学的な内容の絵本)と科学絵本(=科学的な内容の絵本)』とによってどの様な影響を受け、さらに1ケ月後、それらの認識が持続するかどうかを調べた。認識についての質問内容は、太陽については、(1)太陽の色、(2)太陽の個数、(3)太陽の日没後の位置とそこでの行動、(4)太陽の運行、月については、(1)月の色と形、(2)月の満ち欠けの理由、(3)月の形体、(4)月までの距離の各4観点について個別面接法を実施した。スクリプトの分析の結果、太陽については、各認識調査において12名中2名の幼児が、月については「(2)月の満ち欠けの理由」の質問において12名中2名の幼児が物語絵本の影響を受けたことが示された。
多様体上の量子論とそのゲージ理論への応用

研究代表者は上記の課題について研究を行ない、平成8-9年度の研究期間中に次のような成果を得た。まず、自明でないトポロジーを持つ多様体上として単純なクラスとして等質空間G/Hを考察した。その結果、等質空間G/H上では群G上の経路積分に基く量子力学の構成がDiracの拘束条件つき量子化の見地から可能であり、そこでは本質的にBerry位相として誘導されるものと同等なYang-Mills場が誘導されること、即ち従来より知られていたパラメター空間におけるBerryの誘導ポテンシャルと同等で、数学的には正準接続と呼ばれるものになっていること示した。次に、これとは別のクラスのモデルとして戸田格子模型を考察し,この模型をSL(n)群上の模型からHamiltonian reductionの方法によって構成した時の系の時間発展の様子および位相空間の性質を詳しく調べた。特にn=2,3,4の場合について位相空間の構造を完全に決定した。さらにSL(2)上のLiouville模型の場合にはその量子力学を構成することに成功し、それがある角度パラメターによって特徴づけられることを明らかにした。これとは別に、一般の自明でないトポロジーを持つ多様体上の経路積分量子化法を幾何学的見地から構成するための手がかりとして、等質空間上での経路積分法を研究した。その結果、その経路積分の形は従来の多重連結空間上の経路積分と類似した。部分群Hの既約表現による重みつき経路積分になることを証明し、また同時にこれが上記のDiracの拘束条件つき量子化による等質空間上の量子力学の解釈をも再現できることを明らかにした。平成7年度では、まず、等質空間上の量子論を構成する際に、Landsman・Lindenによって発見された背景場としてのYang-Mills場(等質空間上の正準接続canonical connection)の幾何学的意味と、またそのBerry位相などのgeometric phasesとの関連を調べた。結果は、従来の代数的量子化による方法で生じる等質空間上のYang-Mills場は量子化の基礎となる対称性の要請によって規定されており、正準接続は自然な幾何学的接続として現われることが判明した。そして、これが多くの場合geometric phasesに現われる接続とも同一であることを示した。この結果はJourn.Math.Phys.に発表した。また一方、この接続がFeynman流の経路積分の直観的な考えに基いてどの様に現われるかを研究した。このため、従来より知られたS^1の場合の経路積分の構成法を等質空間上に拡張し、実際そこでholonomyとしての正準接続がFeynman積分核に現われることを明らかにした。この仕事はMod.Phys.Lett.A.に発表した。当初の研究計画の内、平成7年度分についてはFeynman流の経路積分を等質空間上に構成する、という点は計画通り達成できた。また、その幾何学的意味とgeometric phasesとの関連を明らかにできた。今後の課題として、Feynman流の経路積分の構成を等質空間上のものからさらに拡張し、より一般の多様体あるいは場の理論に応用することを考えたい。研究代表者は上記の課題について研究を行い、平成8年度には主に次のような実績を得た。まず、自明でないトポロジーを持つ多様体上として単純なクラスとして等質空間G/H上を考察した。その結果、その空間上で量子力学を構成するとゲージ場は誘導され、それが本質的にはBerry位相の誘導と同等であること、即ち従来より知られているパラメター空間におけるBerryの誘導ポテンシャルと同等で、数学的には正準接続と呼ばれるものになっていることを明瞭にした。次に、これとは別のクラスのモデルとして戸田格子模型を考察し,この模型をSL(n)群上の模型からHamilton reductionの方法によって構成した時の系の時間発展の様子および位相空間の性質を詳しく調べた。

さらにSL(2)上のLiouvlle模型の場合にはその量子力学を構成することに成功し、それがある角度パラメターによって特徴づけられることを示した。これとは別に、一般の自明でないトポロジーを持つ多様体上の経路積分量子化法を幾何学的見地から構成するための手がかりとして、等質空間上での経路積分法を研究した。その結果、その経路積分の形は従来の多重連結空間上の経路積分と類似した、部分群Hの既約表現による重みつき経路積分になることを証明し、また同時にDiracの拘束条件つき量子化による等質空間上の量子力学の解釈をも再現できることを明らかにした。
がん抑制遺伝子(PITX1)の機能解析による細胞老化分子メカニズムの解明

本研究は、SASP経路におけるPITX1の役割を検討し、細胞老化現象および発がん機構への関連を明らかにすることを目的に研究を実施した。その結果、PITX1が、SASP経路の主要なマーカー因子として知られているIL-6およびIL-8、両方の正の発現制御に直接関与していることを見出した。さらにそれは、SASP経路においてp16といった細胞老化誘導因子の発現上昇も伴うものであった。一方で、Pitx1をコンディショナルにKOできるアレルをもつマウスを世界で初めて作成した。以上の結果から、PITX1がSASP経路内で一連の分子シグナルにおける新たな制御因子として機能している可能性が示唆された。本年度は、先行研究よりがん抑制遺伝子PITX1によって制御される新規因子として可能性が示唆されたIL-8遺伝子について、直接的な制御を追求する実験を行った。具体的には、PITX1の過剰発現系によるIL-8の発現動態解析を行った。細胞には293T, HeLa細胞に加え、ヒトメラノーマ細胞株であるA2058細胞用いて、PITX1の過剰発現ベクターの導入後、リアルタイムRT-PCR法を用いた遺伝子発現解析を行った。その結果、PITX1の発現上昇に伴って、コントロール群と比較し、HeLaでは250倍、293Tでは3倍、A2058では25倍と、異なる3種の細胞において共通してPITX1発現誘導によるIL-8の発現上昇が確認された。また、A2058細胞においはPITX1の安定発現株を樹立、同様にIL-8の発現動態解析を行った結果、PITX1の発現量に比例してIL-8遺伝子の発現量が上昇していたことから、これらの遺伝子間に相互作用があることが強く示唆された。加えて、先行研究より関連が示唆されたIL-6遺伝子の発現量についても同様にA2058細胞株を用いて解析を行ったところ、PITX1の発現上昇に伴って、コントロール群と比較して260倍もIL-6遺伝子の発現上昇が認められた。これらの結果より、PITX1の新規機能としてIL-6、IL-8の産生制御の可能性が示唆された。IL-6およびIL-8は、SASP(Senescence Associated secretory Phenotype)現象において老化細胞が分泌する主要な炎症性サイトカインとして報告され、さらに発がんとの関連も示唆されている因子であることから、今後は得られた知見を基に、PITX1の新規機能の可能性として、老化細胞おける炎症性サイトカインの分泌に着目し、SASP制御機構における役割について検討を行く予定である。本研究期間において、PITX1によって制御される新規の遺伝子としてSASPの主要因子であるIL-8に加えて、IL-6の可能性を直接示す結果が得られたことから、本研究の目的であるPITX1とSASP制御機構の関連性を解明する上で骨子となる知見を得ることができたと考えられるため。本年度はPITX1のSASP経路への関与をより詳細に明らかにする目的で、1FLAGタグを用いたプルダウン解析および2in vivo解析に向けたpitx1のコンディショナルノックアウト(Pitx1 CKO)マウスの作製を行った。1については、HeLa細胞に加えて293T細胞およびU2OS細胞を用いてFLAGタグを付加したPITX1を安定発現する細胞株を樹立した後、FLAG-PITX1タンパクの発現解析を行った。次に、FLAGをターゲットとした抗体によるプルダウンとLC/MS/MS解析によりPITX1に直接結合する分子群を検索した。その結果、当初予定していたPKD1との関連については直接的な知見は得られなかったが、hnRNPAをはじめとするSASPとの関連が報告されている因子を含む新規のPITX1関連遺伝子の候補を見出した。現在は、これら因子についての機能の特徴からPITX1によるIL-6,IL-8の発現誘導とSASP経路とを結ぶ分子機序について具体的な実験を行っている。2Pitx1 CKOマウスを作製するために、文部科学省の動物作製支援(先端モデル動物支援プラットフォーム)のもと、ゲノム編集技術(CRISPR/Cas9システム)を用いて、マウスES細胞へのPitx1 loxP/loxP遺伝子変異導入、Pitx1のエクソン2番をCre/loxPシステムによって欠損させることできるマウスES細胞の樹立に成功した。現在は得られたES細胞を用いてキメラマウスの作製を行っている。プルダウン解析の結果から、PITX1によるIL-6およびIL-8の発現誘導における関連因子の候補を獲得できたことにより、SASPにおけるPITX1の役割について検討をするための具体的な分子経路を予測できことに加えて、Pitx1のCKOマウスの作製において、マウスES細胞でのターゲティングが順調に進んだことから、in vivoでのPitx1とSASPの関連を解析する体制が整いつつあるため。本年度はPITX1のSASP経路への関与をより詳細に明らかにする目的で、1PITX1の下流で機能する遺伝子の解析、2Pitx1 CKOマウスの作製および3PITX1発現に関わる化合物の同定を目指した研究を行った。1については、分子シグナル伝達系におけるPITX1の下流遺伝子を特定するために、FLAGタグによるプルダウン解析に加えて、遺伝子活性化マーカーであるH3K27アセチル化抗体によるChIP-seq法によって網羅的な解析を試みた。その結果、IL-6とIL-8の発現を正に制御する遺伝子Aの発現上昇と、負に制御する遺伝子Bを候補として獲得した。

次に、より直接的なPITX1によるSASP経路への関与を解析するために、メラノーマ細胞株A2058へPITX1を強制発現する実験を行った結果、遺伝子Aの発現上昇、遺伝子Bの発現低下とともにIL-6およびIL-8の発現上昇と細胞老化マーカーであるp16とp21の発現上昇が認められた。以上の結果から、SASPとPITX1を結ぶ新規分子経路の存在が示された。2については、文部科学省の動物作製支援のもと、Cre/loxPによって欠損させることできるマウスES細胞(Pitx1 CKO ES細胞)を樹立し、3匹状態の良いキメラマウスが得られた。この内2匹から受精卵を作製し、さらにこの受精卵にFlp mRNAをエレクトロポレーションによって導入した。続いて、ICRの仮親に移植することで、Pitx1 CKOアレルをもつマウス雌5匹と雄2匹を作成できた。Creマウスと掛け合わせてPitx1 CKOマウスの作製を行っている。3PITX1機能促進に関わる化合物の同定データベースおよび文献検索からソラフィニブおよびレゴラフィニブを、PITX1の発現を誘導しうる低分子化合物として同定した。現在、実際にPITX1の発現を変化させるかどうか検討を行っている。本研究は、SASP経路におけるPITX1の役割を検討し、細胞老化現象および発がん機構への関連を明らかにすることを目的に研究を実施した。その結果、PITX1が、SASP経路の主要なマーカー因子として知られているIL-6およびIL-8、両方の正の発現制御に直接関与していることを見出した。さらにそれは、SASP経路においてp16といった細胞老化誘導因子の発現上昇も伴うものであった。一方で、Pitx1をコンディショナルにKOできるアレルをもつマウスを世界で初めて作成した。以上の結果から、PITX1がSASP経路内で一連の分子シグナルにおける新たな制御因子として機能している可能性が示唆された。今後はPITX1によるIL-8,IL-6の産生誘導経路がSASP制御機構の一端を担うか否か、詳細な解析を行う。具体的にはSASPの制御因子としてp16やPKD1が報告されていることから、これらの分子経路へ直接的な関与について検討を行う。また、PITX1コンディショナルノックアウト(CKO)マウスの作製:時期および組織特異的PITX1-CKOマウスを作製し、個体および組織内におけるPITX1の老化制御の役割を解明する。マウスの作製が予定通り進まない場合は、正常細胞株IMR90を用いた細胞老化モデルによってin vitroの系により評価を行う。加えて、PITX1の発現制御あるいは相互作用する分子群の同定および機能解析を行い、PITX1自身を制御しうる分子を探索し、PITX1を軸とした炎症性因子の発現誘導と細胞老化およびSASP現象の全体像を明らかにしたい。PITX1によるIL-6およびIL-8の発現誘導経路とSASPとの関連性を明らかにするために、プルダウン解析から得られた候補因子を足掛かりに、その分子経路を探る。具体的には、PITX1の過剰発現条件下で認められるIL-6,IL-8の発現誘導の経路の中で、候補因子の発現動態解析を行いキー因子の同定に繋げる。
ヒト蛋白質の細菌による分泌生産とそれに伴う蛋白質の構造変化の制御に関する研究

バチルスブレビスを宿主とする蛋白質分泌生産システムを用いれば、ヒト蛋白質の生産が可能となったが、その効率は細菌由来の蛋白質の生産に比べれば一部の例外を除いてはるかに低い。その効率の差はそれぞれの蛋白質の分泌過程における構造変化の差に原因があると考察し、本研究では分泌過程における蛋白質の高次構造の生成を支配する酵素類、即ちペプチジルプロリルシス・トランスイソメラーゼ(PPI)やプロテイン・ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)、さらに蛋白質の高次構造を認識して分解するプロテアーゼなどの機能を解析してきた。PPI活性をバチルスブレビスの培養上澄液と細胞抽出液中に見出し、後者から部分精製してその性質を調べた。本酵素は比較的熱に安定であるが、塩濃度が高くなると活性が低下した。サイクロスポリンAやFK506に感受性を示さなかった。一方、バチルスブレビスのPDI様酵素すなわち、蛋白質ジスルフィド結合生成酵素(DSB)について精製を行ったところ、培養上澄液中にのみ活性が見出された。次に大腸菌の鞭毛機能を失った変異株を用い、その機能回復に必要な遺伝子を相補するようなバチスルブレビスの遺伝子をショットガンクローニングにより検索した。約12万株の形質転換体を調べた結果、本菌のDSB遺伝子を見出した。そのヌクレオチド配列を決定し、分子量が13,000で、DSBに特徴的なCysGlyTyrCysの配列を有し、分泌性の蛋白質であることを明らかにした。従って、本酵素が分泌した蛋白質のジスルフィド結合を促進する活性を有することが分り、蛋白質の分泌に伴う構造変化に大きな役割を有することが強く示唆された。さらに細胞内で異種蛋白質を特異的に認識して分解することが知られているlonプロテアーゼ様の酵素の遺伝子を本菌ゲノムよりクローン化し、その全ヌクレオチド配列を決定した。バチルスブレビスを宿主とする蛋白質分泌生産システムを用いれば、ヒト蛋白質の生産が可能となったが、その効率は細菌由来の蛋白質の生産に比べればはるかに低い。その効率の差はそれぞれの蛋白質の分泌過程における構造変化の差に原因があると考察し、本研究では分泌過程における蛋白質の高次構造の生成を支配する酵素類、即ちペプチジル・プロリル・シストランス・イソメラ-ゼ(PPI)やプロテイン・ジスルフィド・イソメラ-ゼ(PDI)、さらに蛋白質の高次構造を認識して分解するプロテア-ゼなどの機能を解析した。PPI活性をバチルスブレビスの培養上澄液と細胞抽出液中に見出したので、本酵素を精製してその性質を明らかにし、さらにその遺伝子をクロ-ン化する過程にある。PDI活性は本菌の細胞内に見出され、その性質は細菌に広く見出されるチオレドキシンに類似していた。本酵素についても精製を進め、その性質について詳細な検討を加えようとしている。本酵素の遺伝子もクロ-ン化を行っており、この遺伝子を用いて本酵素の蛋白質分泌に対する役割等を明らかにする。一方、細胞内で異種蛋白質を特異的に認識して分解することが知られているlonプロテア-ゼ様の酵素の遺伝子を本菌ゲノムよりクロ-ン化し、その全ヌクレオチド配列を決定した。その配列から推定される分子量は87,400で大腸菌のlon遺伝子と高い相同性(61%)を示し、分子のほぼ中央にATP結合部位を有していた。このlon遺伝子を利用してバチルスブレビスからlon遺伝子欠損変異株を作製しその生理作用を研究した。

その結果、本遺伝子は本菌にとって必須のものではないが、分泌過程で異種蛋白質や折りたたまれていない蛋白質を本酵素が分解している可能性が示唆された。バチルスブレビスを宿主とする蛋白質分泌生産システムを用いれば、ヒト蛋白質の生産が可能となったが、その効率は細菌由来の蛋白質の生産に比べれば一部の例を除いてはるかに低い。その効率の差はそれぞれの蛋白質の分泌過程における構造変化の差に原因があると考察し、本研究では分泌過程における蛋白質の高次構造の生成を支配する酵素類、即ちペプチジルプロリルシス・トランスイソメラ-ゼ(PPI)やプロテイン・ジスルフィドイソメラ-ゼ(PDI)、さらに蛋白質の高次構造を認識して分解するプロテア-ゼなどの機能を解析した。PPI活性をバチルスブレビスの培養上澄液と細胞抽出液中に見出した。それぞれの液から、PPIを硫安塩析、DEAEセルロ-ス等で精製しその性質を調べた。菌体内および培養上清液中のPPIともに熱安定性の高い酵素であり、85°C10分の処理によっても失活しなかった。本酵素は真核生物のPPIの阻害剤であるFK506およびサイクロンスポリンAに対して有意な感受性を示さなかった。本酵素の遺伝子のクロ-ン化を試みているがまだ成功していない。PDI活性は本菌の細胞内に見出され、その性質は細菌に広く見出されるチオレドキシンに類似していた。本酵素についも精製を進め、その性質について詳細な検討を加えようとしている。本酵素の遺伝子のクロ-ン化を行っており、この遺伝子を用いて本酵素の蛋白質分泌に対する役割等を明らかにする。一方、細胞内で異種蛋白質を特異的に認識して分解することが知られているlonプロテア-ゼ様の酵素の遺伝子を本菌ゲノムよリクロ-ン化し、その全ヌクレオチド配列を決定した。このlon遺伝子を利用してバチルスブレビスからlon遺伝子欠損変異株を作製することにより、分泌過程で異種蛋白質や折りたたまれていない蛋白質を本酵素が分解している可能性が示唆された。バチルスブレビスを宿主とする蛋白質分泌生産システムを用いれば、ヒト蛋白質の生産が可能となったが、その効率は細菌由来の蛋白質の生産に比べれば一部の例外を除いてはるかに低い。その効率の差はそれぞれの蛋白質の分泌過程における構造変化の差に原因があると考察し、本研究では分泌過程における蛋白質の高次構造の生成を支配する酵素類、即ちペプチジルプロリルシス・トランスイソメラーゼ(PPI)やプロテイン・ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)、さらに蛋白質の高次構造を認識して分解するプロテアーゼなどの機能を解析してきた。本年度はバチルスブレビスのPDI様酵素すなわち、蛋白質ジスルフィド結合生成酵素(DSB)について焦点をしぼって研究した。まず、酵素の精製を行ったところ、培養上澄液中にのみ活性が見出された。次に、大腸菌の鞭毛機能を失った変異株を用い、その機能回復に必要な遺伝子を相補するようなバチスルブレビスの遺伝子をショットガンクローニングにより検索した。約12万株の形質転換体を調べた結果、本菌のDSB遺伝子を見出した。そのヌクレオチド配列を決定することにより、分子量が13,000で、DSBに特徴的なCysGlyTyrCysの配列を有し、分泌性の蛋白質であることを明らかにした。従って、本酵素が分泌した蛋白質のジスルフィド結合成形を促進する活性を有することが分り、蛋白質の分泌に伴う構造変化に大きな役割を有することが強く示唆された。
黒質―脚橋被蓋核系によるサッカード運動開始時間の強化学習

衝動性眼球運動(サッカード)の制御に着目し、動機付け、運動制御、報酬情報に対する脚橋被蓋核(PPTN)の神経機序を解析した。眼前に光点が呈示されるとヒトやサルは光点を標的としてサッカードとよばれる眼球運動で視野移動を行う。サッカードは注意や動機付けと密接に関係しており課題の遂行度は誤差や報酬によって絶えず学習されている。学習には外部から与えられる誤差信号、報酬と動物の内的状態(報酬や誤差信号の履歴による動機付けや注意)が重要な要素となるはずであるがその相互作用は明らかにされていなかった。これまで解剖学的研究や破壊実験より脳幹のコリン作動性ニューロン核のPPTNが学習や動機付けに関係していることが示されてきたので、サルに視覚誘導性サッカード課題を行わせ、課題遂行とPPTNのニューロン活動の関係を解析した。課題遂行中に、課題が成功した結果与えられる報酬量を増加させると課題の成功率が上昇すると共にPPTNニューロンの持続的活動が上昇した。この活動は課題の成功率という動機付けを反映する指標と密接に関係していると思われる。さらにこれらのニューロンが運動誤差や報酬にも反応することを明らかにした。この結果はPPTNニューロン上で動機付け、誤差、報酬に関する情報が収束することを示しており、学習の際に必要な異種感覚情報の統合に対するPPTNを含む神経回路の寄与が示唆された。サルのサッカード反応時間を指標にしてコリン作動性システムによる動機付けのメカニズムを解析した。サルの視覚誘導性サッカード課題において、一部のニューロンがサッカード運動に関連した活動を示した。その中で視野のある部位にサッカードを行う時に発火を増加させるニューロン群(サッカードバーストニューロン)と視野のすべての部位にサッカードを行う際に発火を減少させるニューロン群(サッカードポーズニューロン)が見られた。サッカードバーストニューロンは最適方向に対してバーストを生じさせると同時にギャップ課題におけるギャップ期間中に徐々に発火を増加させた。また、サッカードポーズニューロンは発火のポーズと同時にサッカードギャップ期間中に発火を徐々に減少させた。一部のニューロンで課題遂行中の報酬に対する活動が見られた。PPTNにおいて課題なしの報酬のみに対する反応は約200msの潜時で得られるが、サッカード課題遂行中では報酬反応の開始は報酬前から報酬後にわたって見られる。この結果はPPTNニューロンの課題中の報酬活動は課題遂行に関連した活動によって修飾を受けていることを示唆している。報酬量を増加させると課題の成功率が上昇すると同時に課題開始時に点灯する注視点に向かうサッカードの反応時間が減少するという行動実験の結果を得た。さらに、報酬量を変化させると注視点へのサッカードの反応時間が変化すると同時に脚橋被蓋核(PPTN)ニューロンの注視点点灯に対する視覚応答が変化するという実験結果を得た。この反応は注視点に向かうサッカードの反応時間や課題の遂行度合い〔成功率〕という動機付けやglobal attentionを反映する指標と密接に関係していると思われる。また、PPTNにおいて報酬に対する直接の反応と報酬に対する予測反応を得たが、この活動は、黒質緻密部ドーパミン作動性ニューロンの報酬に対する予測的反応の形成に寄与していると考えられる。
生命リスクのベイズ・モデリングと証券化

過去半世紀にわたり、全世界的に長寿化が進行している。その顕在化は特に高齢層において著しく、いわゆる長寿リスクが大きな問題となっている。この長寿リスクの資本市場への移転手段として、欧米を中心に長寿リスクの証券化商品である長寿債券が注目を集めている。本研究では、長寿リスク証券化のスキームについて、ベイズ法によるアプローチを用いてモデル推定、将来生存率の予測、長寿リスク評価および長寿債券の評価を一貫した枠組みで行う評価手法を提案し、数値例を用いてわが国データの下で長寿債券のプライシングを行った。平成19年度計画に従って,以下のように研究を行った.1.死亡率予測のベイズ統計モデリング基本的なLee-Carterモデルをベイズモデルへと拡張した.状態空間モデルの枠組みを用い,観測方程式として正規モデルとボアソンモデルを取り上げ,時間パラメータを記述する状態方程式として,確定トレンド,確率トレンド,定常モデルの3種類の時系列モデルを採用した.これらを組み合わせた6種類のモデルを構築し,周辺尤度を用いてモデル選択を行った.各モデルの周辺尤度の値から,65歳以上の人口に対しては,確率的トレンドモデルがデータから最も支持されることが明らかとなった.これらの計算を実行するにあたり,C#によるMCMC法のプログラムを作成し実装した.2.長寿リスクの評価と証券化1.で構築した死亡率予測モデルを我が国死亡率に適用し,年金現在価値分布を導出し,将来の長寿リスクを定量的に評価した.特に,長寿リスクのバリューアットリスクを算出し,期待される長寿リスクに対して,期待されないリスクが最大で20%程度であることを示した.さらに,この長寿リスクをヘッジする手段として死亡率スワップという形態の証券化の実現可能性を考察した.スワップ評価にあたっては,ワン変換を用いて観察死亡率のリスク中立化を行った.ワン変換のパラメータ同定には,2006年に改定された標準生命表(年金用)を用いた.3.成果公表これらの成果は,2007年度統計関連学会連合大会,2007年度日本保険・年金リスク学会,東京大学応用統計ワークショップ,東北大学実学ブリッジ・プロジェクト応用統計計量ワークショップで報告した。また,「長寿リスク評価へのベイズ統計モデリング」と題する論文を日本保険・年金リスク学会誌へ投稿し,採択された.平成20年度研究計画に基づき,以下のように研究を行いその成果を公開した.1.ベイズ・モデリングによる長寿リスクの評価と証券化前年度の成果に基づき,我が国長寿リスク評価の基本フレームワークとして,正規回帰モデルを観測方程式,確率トレンドモデルを状態方程式とするベイジアンLee-Carter解析手法を採用した.この解析手法に最大エントロピー法に基づくベイズ・リスク中立化法を適用し,既存の保険市場と整合的に長寿リスクの評価を行った.特に,長寿リス証券化の有望な手段と考えられる死亡率スワップを取り上げ,我が国データに基づきその価格付けをおこなった.2.死亡リスク評価への拡張また,1で構築したベイジアンLee-Carter解析手法と最大エントロピー法に基づくベイズ・リスク中立化法を死亡リスク評価へと拡張した.CAT型の突発的なリスクに対処するため,状態方程式にジャンプを取り込んだモデルや非正規性を反映したモデルを考察した.3.成果公表本年度は本研究の最終年度にあたる.前年度までの研究成果を踏まえ,生命リスクのベイズ・モデリングとその証券化のスキームに関する本研究の総括的考察を行った.具体的には,以下のように研究を実施し,その成果を公開した.1)生命リスク証券化のためのベイジアン・プライシングの枠組み構築証券化のためのリスク中立化プロセスとして,平成20年度で提案した最大エントロピー法をさらに詳細に考察した.特に,エッシャー変換が最大エントロピー法の特別なケースとして得られることを明らかにした.また,複数のリスクの中立化を実現するために,最大エントロピー法の多変量への拡張を考察した.この成果は,生存リスクと住宅価格リスクの2つのリスクに依存するリバース・モーゲージのような仕組みの評価に利用可能である.2)ベイズ統計モデリングベイジアン・プライシングを行うために,Lee-Carterに基づく予測分布の導出とそのリスク中立化が必要となる.これを実際に行うMCMC法は,特にリスク中立化のプロセスにおいて膨大な計算を必要とする.今年度は,カルマン・フィルター法を一部組みこむことにより,昨年度までの手法より効率的で高速なアルゴリズムを実装した.3)研究成果の公表これらの成果は,2009年度統計関連学会連合大会や第12回「ノンパラメトリック解析とベイズ統計」で口頭報告するとともに,Insurance Mathematics and Economicsや日本保険・年金リスク学会誌といった内外の雑誌に論文として掲載した.また,Life Riskというホームページで,平成19年度以来の本研究の成果をインターネット上で公開している.
コエンザイムQ10によるインスリン分泌システムの調節機構

コエンザイムQ10(CoQ_<10>)はATP産生賦活作用と抗酸化作用という二つの生理作用を有する唯一の生体内物質である。それぞれ、膵ss細胞の機能発現と機能維持に重要な役割を果たすと推定される。そこで、この仮説を証明するため、CoQ_<10>のインスリン分泌システムにおける役割について検討した。ラット由来膵ss細胞株RIN5F細胞に高濃度の亜セレン酸ナトリウムを添加して酸化ストレスを誘導すると、24時間後には大部分の細胞が死滅した。しかしながら、CoQ_<10>で前処置するとこの細胞障害は著明に抑制された。また、CoQ_<10>の合成経路を促進あるいは抑制すると、インスリン分泌に関わる遺伝子群の発現が変動することが明らかとなった。一方、ストレプトゾトシンにより膵ss細胞を部分的に破壊した1型糖尿病ラットの膵臓でCoQ_<10>含量は低下したが、糖尿病状態が改善した個体ではCoQ_<10>含量は正常レベル近くまで回復していた。以上の結果から、CoQ_<10>は、膵ss細胞の保護ならびにインスリン分泌システムに重要な役割を果たすと考えられる。膵β細胞が血糖値の上昇を感知すると、グルコースは細胞内に取り込まれ代謝されることによってATP/ADP濃度比は増加する。これが引き金となりインスリンが分泌され、血糖値は正常の範囲に保たれる。また、膵β細胞は抗酸化系酵素の発現がきわめて弱いことから、酸化ストレスを受けやすい。コエンザイムQ_<10>(CoQ_<10>)はATP産生賦活作用と抗酸化作用という二つの生理作用を有する唯一の生体内物質である。それぞれ、膵β細胞の機能発現と機能維持に重要な役割を果たすと推定される。そこで、この仮説を証明するため、CoQ_<10>のインスリン分泌システムにおける役割を明らかにする。本年度は膵β細胞に酸化ストレスを与えることによって生じる細胞障害をCoQ_<10>が抑制することができるのかどうか検討した。その一例を挙げると、ラット由来膵β細胞株RIN5F細胞に過酸化水素を添加すると、その次の日には多数の細胞が培養皿から剥離し、細胞の形態は著しく変化したが、過酸化水素を添加する前日からCoQ_<10>を細胞に添加すると、これらの細胞障害は著名に抑制された。一方、ストレプトゾトシンにより膵β細胞を部分的に破壊した1型糖尿病ラットの膵臓でCoQ_<10>含量は低下したが、糖尿病状態を改善させるとCoQ_<10>含量は正常レベル近くまで回復した。以上の結果は、膵β細胞障害ならびに糖尿病の発症に対してCoQ_10が抑制的な役割を果たす可能性があることを示唆しており、現在、その作用機序について検討中である。血糖値が上昇すると、グルコースは膵β細胞内に取り込まれ代謝されることによってATP/ADP濃度比は増加し、これが引き金となりインスリンが分泌される。一方、膵β細胞は抗酸化系酵素の発現がきわめて弱いことから、酸化ストレスの影響を強く受けやすい。酸化ストレスにより膵β細胞の機能が低下すると、糖尿病の重篤化を招く恐れがある。それぞれ、膵β細胞の機能発現と機能維待に重要な役割を果たすと推定される。ラット由来膵β細胞株RINm5F細胞に高濃度の亜セレン酸ナトリウムを添加して酸化ストレスを誘導すると、24時間後には大部分の細胞が死滅した。また、そのメカニズムとして、CoQ_<10>は亜セレン酸ナトリウムによる活性酸素種(ROS)の産生やミトコンドリア膜電位の消失を抑制することで、その後に続くアポトーシス経路の活性化を防ぐ可能性が示唆された。一方、CoQ_<10>の合成経路を促進あるいは抑制することによって、膵β細胞内のCoQ_<10>含量を増減させると、インスリン分泌に関わる遺伝子群の発現が変動することが明らかとなった。したがって、CoQ_<10>は膵β細胞の保護ならびにインスリン分泌システムに重要な役割を果たすと考えられる。
Duchenne型進行性筋ジストロフィー症児の認知機能に関する研究-認知機能特性に基づく教育指導法開発のための基礎的研究-

Duchenne型筋ジストロフィー症(以下DMD)は,X-連鎖性(伴性劣性)の遺伝性疾患であり,進行性の筋萎縮と筋力低下を主徴とするが,非進行性の知的能力障害を伴う者が多く出現することが知られている。その原因としては,遺伝的に規定された中枢神経系の障害に起因するとする説が有力である。本研究では2カ年にわたり,DMD男児,DMD児の同胞である性染色体に異常を持つ女児(キャリア児),並びにまれに出現するDMD女児を対象として,その認知機能を詳細に分析,検討することにより,DMDの認知機能障害について明らかにするとともに,認知機能特性に基づく教育指導法の開発に関する基礎的知見を得ることを目的として行った。平成5年度に行った<研究I>では,510歳の幼少DMD男児を対象とした,知能構造と認知機能特性に関する研究を行った。その際,知能検査としてWISC-R検査を,認知機能に関する検査としてK-ABC検査をそれぞれ用いた。その結果,DMD男児においては,知能構造のアンバランスと継次情報処理と呼ばれる認知処理機能の弱さが存在していること,およびこれらが筋萎縮の進行に伴う運動機能障害とは無関係であることを明らかにした。平成6年度に行った<研究II>では,DMDキャリア女児およびDMD女児を対象として,DMD男児の研究において確認された,知能構造のアンバランスおよび継次情報処理の弱さが,これらの女児においても同様に認められることを明らかにした。さらに<研究III>では,<研究I>および<研究II>より得られた知見に基づき,DMDの認知機能特性に基づく指導法の開発に関する研究を行い,Apple製コンピュータを中心として,プログラム言語にハイパート-クを使用した,文字の読み学習に関するCAI指導システムを開発した。Duchenne型筋ジストロフィー症は(以下DMD)は,性染色体Xの異常による伴性劣性の遺伝性疾患であり,非進行性の知的能力障害を伴う者が多く出現する。その障害は,中枢神経系の遺伝的に規定された障害による,認知機能障害の弱さに起因するという説が有力である。幼少のDMD男児,DMD児の同胞である性染色体に異常を持つ女児(キャリア児),並びにまれに出現するDMD女児において,認知機能を詳細に分析,検討することは,DMDの認知機能障害への影響を明らかにする上で重要な知見を得ることができ,さらには,認知機能特性に基づく教育指導法の開発のための基礎的知見を得ることができる。平成5年度における510歳の幼少DMD男児30名を対象とした研究より,DMD男児においては,筋萎縮の進行に伴う運動機能障害とは無関係に,知能構造のアンバランスおよび継次情報処理様式の弱さという認知特性が存在していることが確認された。平成6年度の研究においては,DMDキャリア女児およびDMD女児を対象として,平成5年度のDMD男児を対象とした研究において確認された,知能構造のアンバランスおよび認知機能特性が,これらの女児においても同様に認められるか否かを検討するとともに,DMD児の認知機能特性に基づく教育指導法の開発を目的とした研究を行った。現在までに,キャリア女児1名およびDMD女児1名に対して,WISC-R知能検査およびK-ABC心理・教育アセスメントバッテリーを実施し,DMD男児の知能構造および認知機能特性との比較検討を行っている。また,認知機能特性に基づく指導法の開発においては,算数および読みの領域を中心に,具体的な指導課題の作成を行った。平成7年度において,これらの指導課題を用いて,CAIシステムを中心とした指導法の開発を行う。

その原因としては,遺伝的に規定された中枢神経系の障害に起因するとする説が有力である。本研究では2カ年にわたり,DMD男児,DMD児の同胞である性染色体に異常を持つ女児(キャリア児),並びにまれに出現するDMD女児を対象として,その認知機能を詳細に分析,検討することにより,DMDの認知機能障害について明らかにするとともに,認知機能特性に基づく教育指導法の開発に関する基礎的知見を得ることを目的として行った。平成5年度に行った<研究I>では,510歳の幼少DMD男児を対象とした,知能構造と認知機能特性に関する研究を行った。その際,知能検査としてWISC-R検査を,認知機能に関する検査としてK-ABC検査をそれぞれ用いた。その結果,DMD男児においては,知能構造のアンバランスと継次情報処理と呼ばれる認知処理機能の弱さが存在していること,およびこれらが筋萎縮の進行に伴う運動機能障害とは無関係であることを明らかにした。平成6年度に行った<研究II>では,DMDキャリア女児およびDMD女児を対象として,DMD男児の研究において確認された,知能構造のアンバランスおよび継次情報処理の弱さが,これらの女児においても同様に認められることを明らかにした。さらに<研究III>では,<研究I>および<研究II>より得られた知見に基づき,DMDの認知機能特性に基づく指導法の開発に関する研究を行い,Apple製コンピュータを中心として,プログラム言語にハイパート-クを使用した,文字の読み学習に関するCAI指導システムを開発した。
電界による磁気エントロピー変化を応用した革新的冷却素子

菱面体晶(R相)反強磁性強誘電体BiFeO3結晶のFe位置へのGa置換による結晶系の変化を、新たに開発した有機前駆体法により常圧低温合成した粉体試料を用い詳細に調べた。その結果、R相はGa量0.10.2で擬正方晶(T相)に相転移すること、磁気秩序温度はT相では140 Kに低下し、R相ーT相転移により室温で磁気秩序は反強磁性から常磁性に変化することを明らかにした。また、電界印加が可能な焼結体をプラズマ焼結法により作製できることが示された。本年度の研究計画に基づき、以下の具体的成果を上げた。1.BiFe1-xGaxO3粉体の単相作製条件の確立と相図作製:新しく開発した有機錯体法を用いて上記の粉体を500°Cの低温、常圧にて単相で作製することに成功した。この物質は、高温高圧法によってのみ作製可能とされていたが、新しい手法を提案できた点で大変重要な成果である。相図作製により、x=0.1以下では菱面体晶、0.2以上では本研究の目的とした擬正方晶が得られ、0.10.2において両相の共存するモルフォトロピック相境界が存在することが明らかとなった。2.BiFe1-xMxO3(M= Al, In, Zn-Ti)粉体の常圧合成と相図決定:高圧合成法以外作製不可能であったAl, In, Zn-Ti置換体の合成を試み、目的とする擬正方晶がAl置換でのみ菱面体晶との混相としてx=0.20.4の組成範囲で得られることを明らかにした。この成果は高圧合成法では得られなかった新しい知見である。3.メスバウアー分光測定による結晶相転移に伴う磁気秩序の探査:Ga置換量0.3の擬正方晶BiFeO3の磁気秩序温度をメスバウアー分光法により調べ、擬正方晶反強磁性のネール温度が140K付近にあることを明らかにした。この成果は、モルフォトロピック相境界付近で、電界をこの材料に印加することにより、室温で、磁気秩序(菱面体晶)ー磁気無秩序(擬正方晶)間の転移を起こさせることの可能性を示唆する重要な成果である。当初計画に盛り込んだ研究計画は、バルク焼結体の作製条件およびその強誘電体特性の解析以外、順調に遂行され、本研究の目的達成に必要な情報及び成果を挙げている。前年度に当初計画に盛り込んだ、BiFe1-xGaxO3粉体の単相作製条件の確立と相図作製、BiFe1-xMxO3(M= Al, In, Zn-Ti)粉体の常圧合成と相図決定、メスバウアー分光測定による結晶相転移に伴う磁気秩序の探査に関し、大きな成果を得たが、電界による磁気冷却の実証に不可欠なバルク体の作製およびその強誘電特性の解析については未達成であった。本年度は、目標を達成するため、最初に、バルク焼結体の低温での作製条件を明らかにするとともに、焼結が不十分な場合でも電気的特性を維持し、高電界印加による菱面体晶ー擬正方晶間の相転移を誘起できる低い抗電界を有する組成、イオン置換種を探査した。その結果、以下のような具体的成果を上げた。1.電界誘起による相転移に必要な菱面体晶ー擬正方晶モルフォトロピック相境界の組成を持つBiFe1-xGaxO3(x=0.10.2)は、550°C以上では分解するため、低温焼成は不可欠である。このため、プラズマ焼結法を用いて、低温でのセラミックス焼結条件を探査し、450500°Cでの粉体合成における前駆体を用いての焼結が最も適していることを明らかにした。また、これらのセラミックスに対する強誘電性の評価から、十分に飽和した分極特性を得るには、高いGa置換量に対して異相の生成を抑える対策が必要なことが明らかとなった。2.イオン置換による低い抗電界を達成するため、評価の容易な単結晶薄膜試料を作製し、電気特性を評価した。擬正方晶BiFe0.7Ga0.3O3(c/a=1.26)と正方晶BaTiO3(c/a=1.03)との固溶体(1-x)BiFe0.7Ga0.3O3-xBaTiO3では、xの増加とともにx=0.10.2で緩やかにc/aが減少して1に近づき、比例して抗電界も減少し飽和した分極特性が得られることを明らかにした。研究目的を達成するために、今後は、バルク焼結体の低温での作製条件を明らかにするとともに、焼結が不十分な場合でも電気的特性を維持し、高電界印加による菱面体晶ー擬正方晶間の相転移を誘起できる低い抗電界を有する組成、イオン置換種を探査する。

これにより、次年度の目標を達成し、電界による磁気冷却の原理を実証していく。電子物性工学当初計画で予定した設備備品が他予算で購入でき研究が順調に進展した。このため、その分の使用額が減少した。研究の最終目標に向け、作製試料を増やすため次年度使用額と合わせて化学薬品費を増額するとともに、バルク体の電気的評価のための薄膜電極材料用ターゲットを購入する。
メタン発酵による組換え微生物の有効利用に向けた導入遺伝子の動態研究

高温メタン発酵槽に、組換え遺伝子(緑色蛍光タンパク質)を恒常発現する酵母を投入することで、外来遺伝子が廃棄物処理を行う微生物群集へ水平伝播・環境拡散する可能性について検討を行った。長期間の発酵槽の運転と分子生物学的・微生物学的解析の結果、組換え遺伝子を保持する酵母の死菌・生菌をメタン発酵槽に投入して処理する場合、その遺伝子は直ちに分解され、伝播も拡散も起こらないことを示唆する結果を初めて明らかにすることができた。初年度は、高温メタン発酵槽の設置およびその安定運転をはじめに実施した。メタン発酵の研究において、研究対象であるサンプル(微生物群集)が安定して得られることが最も重要である。そこで、その安定的な獲得のための連続運転を目的にして、自動化システムの構築を行った。具体的にはpH調整、攪拌スピード、ガス回収、基質の流入出のモニタリングと調節を自動で行う発酵槽(発酵容量:800mL)を作成した。この槽内に、家畜を由来とする堆肥の10%溶液を種汚泥として加え、グルコースを炭素源とする一般的な嫌気微生物培地を用いて運転を開始した。運転パラメーターは、発酵温度55°C、攪拌スピード100rpm、水理学的滞留時間10日で試運転を行った。メタン発酵の安定運転の評価については、最低でも1ヶ月以上のメタン発酵微生物群集の馴養が必要である。その間に生じたシステムの不具合を調整し、何度かの運転を実施した結果、現在では数々の問題を解決した高温メタン発酵の安定運転が可能となっている。高温メタン発酵の運転パフォーマンスとしては、発酵の良し悪しを判断する上で重要なファクターである揮発性低級脂肪酸(有機酸)が挙げられる。現時点でその蓄積がほとんど起っておらず、150ー250mL/日という安定したガス発生量が見られ、安定運転のためのシステム構築および運転パフォーマンスの獲得に成功している。この安定したパフォーマンスを発揮している高温メタン発酵槽に「遺伝子組み換え菌」として、緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein, GFP)遺伝子を、まずはプラスミドとして保持する酵母(Saccharomyces cerevisiae)を滅菌した状態または生菌の状態、別々に投入し、組み換え遺伝子がメタン発酵微生物群集に水平伝播するかどうかを評価するため、遺伝子組み換え酵母の大量培養の準備を進めている。前述のように、メタン発酵の安定運転のシステム構築のために、幾度となく運転方法を改善した結果、予定していた「遺伝子組み換え菌体」の投入試験が遅れている。具体的な大きな問題の一つとして、グルコースを炭素源とする基質が保存中にコンタミしてしまい、解析対象として安定な微生物群集の構築ができない事態が頻繁に起った。これは、間欠タイマーで制御されたペリスターポンプと発酵槽、基質タンク間がシリコンチューブで介されているが、この中が何種類かの微生物群で自然に汚染されてしまうためであった。しかしながら、コンタミの問題を含め、それらを一つ一つ解決済みである。高温メタン発酵槽(1% glucose,HRT10日,55°C)に、組換え遺伝子(gfp:緑色蛍光タンパク質)を恒常発現する酵母を投入することで、外来遺伝子が廃棄物処理を行う微生物群集へ水平伝播・環境拡散する可能性について検討を行った。組換え遺伝子の変遷を明らかにするため、酵母のゲノム中またはプラスミド中にgfpを保有する2種類の株を用い、それぞれの滅菌処理あり/なしの添加試験を30日ずつ、最後に30日間の非添加試験を実施した。gfpを5つの領域に分割したPCRプライマーを作成し、それぞれの投入試験の1日目と30日目の発酵液から抽出した全ゲノムを鋳型としたPCR-ゲル電気泳動によって、組換え遺伝子の発酵槽中での残存を確認した。ゲノム組込み・プラスミド保持の酵母はすべてのプライマーの組み合わせでバンドが検出されたが、それらを滅菌処理(121°C, 20min)した後にバンドは消失した。そのため滅菌処理した菌液には、組換え遺伝子の水平伝播や拡散の可能性がないことが予測され、実際にメタン発酵槽に投入してもgfpの発酵液中での残存は解析期間中に確認されなかった。投入試験は、培地TOCに対して10%当量の酵母菌体をPBSに懸濁して1日1回、毎日添加したが、生菌を直接発酵液に投入した24時間後にはgfpは断片化しており、全長をPCR増幅できない状態になっていることが明らかになった。また、蛍光顕微鏡やFACSを用いた発酵液中のGFP蛍光の検出、投入後の発酵液のYPD培地での培養を試みたが、蛍光・菌体は全く検出されなかった。したがって、組換え遺伝子を保持する酵母の生菌をメタン発酵槽に投入して処理する場合、その遺伝子は直ちに分解され、環境中への拡散が起こらないことを示唆する結果を初めて明らかにすることができた。これらの結果とともに遺伝子組換え菌体を廃棄物として捉えた際の微生物群集構造の変遷についてNGSによる網羅的な結果を蓄積しつつ、これらの研究成果の論文化を進めている。

現在では安定的な高温メタン発酵の自動連続運転が可能となっているため、予定されていた「遺伝子組み換え菌体」の投入試験により、外来遺伝子が廃棄物処理を行う微生物群集に水平伝播してしまうかどうかについて評価を順次行っていく予定である。はじめにGFP遺伝子をプラスミドとして保持する酵母を組み換え菌体として、それを滅菌処理した状態と未滅菌の生菌の状態でメタン発酵槽へ投入した時の微生物群集の動態・組み換え遺伝子の残存とその場所に関して特定するための解析を進める。次に、同遺伝子を染色体上に保持する酵母を解析対象として同様の試験を進める。解析方法としては、核酸の分析だけでなく、代謝解析やGFPの蛍光の確認を行い、総合的に水平伝播の可能性について検証を行っていく。現在は、研究計画の通り、酵母のGFP遺伝子を選択してその大量培養の準備を進めている。組み換え遺伝子の動態次第ではあるが、投稿論文としてまとめる方向で研究を展開するとともに、学会での成果の発表を予定している。応用微生物学オミクス解析用のPCを購入する予定であったが、購入は今年度に見送った。理由は、ハイスペックPCでそれぞれの解析ソフトを使用できるパイプラインの構築とその学習を今年度は行ったためである。また、予定していた学会の年次大会への参加が、大学行事の関係で不可能になり、旅費の使用が叶わなかった。今年度は、実際の解析結果を評価する必要があるため、準備が整い次第、PCを購入予定である。また、消耗品も例えば次世代シーケンスのキットなど、高額なものが必要になってくるため、年度末までの使用には問題はないと考えている。旅費に関しては、今年度は幾つかの学会へ参加を予定しているため、「旅費」としての使用を見込んでいる。