hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スプライシング調節因子ＳＲＳＦ３によるＧ１／Ｓ期制御と大腸癌細胞の悪性形質転換

平成26年度に、Serine/arginine-rich splicing factorファミリーの一つであるSRSF6をノックダウンするとヒト大腸癌細胞の増殖が停止すること、さらに、SRSF6ノックダウン細胞ではDNA損傷が誘導されることを明らかにした。平成27年度は、これらの新たな知見を基に、SRSF6のゲノム安定性及び細胞周期の制御ついて機能解析を進めた。その結果、FACSを用いた細胞周期の詳細な解析により1.SRSF6のノックダウン細胞ではDNA合成期であるS期の進行が遅延しており、その結果、増殖能の顕著な低下がもたらされることを明らかにした。また、SRSF6のゲノム安定性の制御メカニズムについて、クロマチンとの相互作用に注目し、検討を行ったところ、2.SRSF6のクロマチン分画への局在がS期に顕著に増加していること、さらに、抗SRSF6抗体を用いた蛍光免疫染色法によるSRSF6の局在の検討の結果、3.S期が進行途中のヒト大腸癌細胞において、DNA合成領域にSRSF6が局在していることを見出した。また、抗SRSF6抗体を用いた免疫沈降法から、4.この時にSRSF6がヒストンH3およびDNA合成時の複製フォークの進行に重要なDNAヘリカーゼであるMinichromosome Maintenance Complex(MCM複合体)に結合していることを同定した。以上の結果から、SRSF6がS期進行時にヒストンH3およびMCM複合体との結合を介した新たな分子機構によりDNA合成を制御する可能性を初めて明らかにした。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。平成26年度においてはHeLa TRex細胞株を用いたテトラサイクリン誘導性SRSF3安定過剰発現細胞株を構築し、SRSF3を介した細胞増殖メカニズムの機能解析を進めた。1.SRSF3過剰発現時細胞の増殖能を検討したところ、過剰発現による有意な増殖能の亢進はみられず、細胞周期チェックポイント関連遺伝子の発現量にも有意な変化は無かった。また、2.腫瘍内微小環境モデルとしての低酸素条件及び低グルコース条件下での耐性能を検討したところ、低酸素条件下96時間後でのSRSF3過剰発現細胞の生存率は変化せず、低グルコース条件下でも有意な差は無かった。さらに、3.Doxorubicin、Etoposide、5-FUを用いて薬剤耐性能について検討したところ、SRSF3過剰発現細胞株では有意な耐性能はみられなかった。以上の結果からHeLa細胞におけるSRSF3過剰発現は細胞増殖能、低酸素耐性能、低グルコース耐性能、抗がん剤耐性能に影響せず、SRSF3単独の過剰発現はがん化をもたらさないことが示唆された。これらの研究結果はH26年度日本分子生物学会において報告した。さらに、SRSF3と同様にノックダウンにより細胞死を誘導するSRSF6についても研究を進め、4.ヒト癌サンプルにおける遺伝子発現解析の結果、大腸癌において過剰発現していることを明らかにした。5.これまでの研究で、SRSF6は酸化ストレスにより誘導され、大腸がん細胞株においてSRSF6をノックダウンすると増殖能が顕著に低下し、さらに、6.ノックダウンした細胞ではDNAダメージが誘発され細胞死が誘導されることを突き止めた。ゲノム安定性及び細胞周期の制御に極めて重要な役割を果たすことが示唆された。これらの新たな知見を基に、SRSF6の詳細な機能についてSRSF3とのインタラクションも踏まえ解明すべく取り組んでいる。平成26年度においては、計画していたSRSF3を介した細胞増殖メカニズムの機能解析を進め、HeLa TRex細胞株を用いたテトラサイクリン誘導性SRSF3安定過剰発現細胞株を構築し、1.SRSF3の過剰発現が細胞周期及び細胞増殖能に影響せず、2.腫瘍内微小環境モデルでの生存率を変化させず、3.抗がん剤に対して有意な耐性能をもたらさないことを明らかにし、SRSF3単独の過剰発現はがん化を促進しないことを見出した。さらに、SRSF3と同様にノックダウンにより細胞死を誘導するSRSF6についても研究を進めた。

その結果、4.大腸癌でSRSF6が過剰発現していることを明らかにした。また大腸がん細胞株において、5.SRSF6のノックダウンが増殖能を顕著に低下させ、さらに6.DNAダメージを誘発し、細胞死が誘導されることを突き止めた。これらの新たな知見を基に、SRSF6のゲノム安定性及び細胞周期の制御ついてSRSF3とのインタラクションも踏まえ、解明に取り組みインパクトの高い研究へと発展させている。これらの研究結果の一部は海外及び国内学会において発表し、論文作成に取り組んでいる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。今後はノックダウンにより細胞死が誘導されるSRSF6について詳細に機能解析を行う。特にSRSF6によるゲノム安定性及び細胞周期の制御のメカニズムを解明する。ゲノム安定性の制御についてはクロマチン構造への関連を考え、Histoneとの結合を中心に解析を進める。また、細胞周期制御についてはFACSを用いてSRSF6ノックダウン時の細胞死のタイミングを明らかにし、関連する細胞周期調節因子の発現解析を進める。同時に抗SRSF6抗体を用いた免疫沈降を行いSRSF6に直接結合するターゲット因子の同定を目指す。
キンドリングラットにおけるミクログリアの変化に関する免疫組織化学的研究

まず,科学研究費補助金により,未整備であった研究室の整備,染色システムの構築に着手し,実験プロトコルを作成した。この後,予備実験を開始。生後,第8週のウィスターラットの左貫通路に,深麻酔下にて双極電極を留置した。2週間の回復期間後,後発射閾値強度で刺激を連日行った。平成9年度は発作の発現,発展とは無関係に,術後1日,3日,1週,2週後に,深麻酔下において潅流固定を行い,クレシルバイオレット染色,及び免疫染色のスクリーニングとしてox-42染色を行い,ミクログリアの活性化を観察した。また,対照群として未刺激のラットも術後の同じ日数で染色をした。この結果,キンドリングラットにおいてはミクログリアの活性化はほとんど認められず,現段階では,カイニン酸投与時のような変化を認めていない。平成10年度は,貫通路刺激群,カイニン酸投与群,対照群の3群をもうけ,それぞれの発作完成後の1日,3日,1週,2週,4週,8週,16週の変化を観察,比較してんかん発作の発現,発展におけるミクログリア活性化を観察した。貫通路刺激群,対象群ではミクログリアの有意な変化を認めえなかった。一方で,カイニン酸投与群では,1日後にはミクログリアの活性化を認め,1週後にはピークに達し,8週間は活性がおちなかった。16週目には静止型のミクログリアがほとんどであった。ミクログリア活性化の意義は不明だが神経細胞死の程度に比例するとも考えられ,単に死亡細胞の残滓の処理にとどまらず,活性化自体が神経細胞死に関与している可能性も示唆された。当初,化学研究費補助金により,研究室の整備,染色システムの構築に着手した。具体的には,滋賀医科大学で行っていた免疫染色のプロセスを当教室で行えるよう,標本凍結用の部品及び,鏡検時に使用するメカニカルステージを備品として購入した。また消耗品として各種試薬,実験器具を購入し,研究室での実験プロトコルを作成した。ウイスターラットを使用。生後,第8週のラットの左貫通路に,深麻酔下にて双極電極を留置した。本年度は発作の発現,発展とは無関係に,術後1日,3日,1週,2週後に,深麻酔下において潅流固定を行い,クレシルバイオレット染色,及び免疫染色のスクリーニングとしてox-42染色を行った。また,対照群として未刺激のラットも術後の同じ日数で染色した。この結果,ミクログリアの活性化はほとんど認められず,現段階では,カイニン酸投与時のような変化を認めていない。次年度は,当初の計画若干の変更を加え,貫通路刺激群,扁桃体刺激群,カイニン酸投与群の3群をもうけ,それぞれの発作完成後の1日,3日,1週,2週,4週,8週,16週の変化を観察,比較してんかん発作の発現,発展におけるミクログリア活性化の意義を検討することとした。なお現在のところ,以上の実験内容は予備段階のためいかなるところでも発表を行っていない。染色のためのシステムを利用し,他研究者の組織標本作製を行ったため,それを研究発表として挙げる。
山県有朋・山県系官僚閥の内外史料分析による日本近代の再検討

本研究は、山県有朋および山県系官僚閥に関する内外史料の収集と整理・分析を通じて、新版『山県有朋意見書』を編集・公刊し、「日本の近代」の再検討を行おうとするものである。底本には大山梓編『山県有朋意見書』(原書房、1966年刊行、以下「大山本」と略称)を用いる。大山本は日本近代史研究などの学問分野における最も基本的な「データベース」として、長年多くの研究者に利用され、多大なる学問的恩恵をもたらしてきた。本研究は爾後半世紀あまりにわたって関係諸機関によって、収集・公開されてきた史料を中心に、新たな史料の探索にも注力しつつ、それらを整理・統合した新版『山県有朋意見書』を公刊することを目的とするものである。2年度目にあたる本年度は、研究実施計画に沿って着実に研究実績を積み重ねることができた。その概要は以下の通りである。1大山本に掲載されている意見書の典拠確認・史料原本の複写作業はほぼ完了した。ただし、10点あまりは典拠不明である。2『公爵山県有朋伝』『明治天皇紀』『明治天皇御伝記史料・明治軍事史』『陸軍省沿革史』等の刊本からの、関連箇所の複写とデータ入力作業は完了した。上記作業に関しては、松本浩延(同志社大学法学研究科博士後期課程)、徳重伸(同博士前期課程)、井本莞司(同博士前期課程)を研究協力者として作業を行った。3前年度に引き続き、大山本に収録されていない意見書の探索を、国立国会図書館憲政資料室、防衛省防衛研究所図書館、国立公文書館、奥州市立後藤新平記念館、憲政記念館、山口県文書館などで進めており、43点あまりの未刊行の新出意見書を見つけ出すことができた。また、海外での史料調査も適宜実施した。4以上の史料リストを全部統合した「統合リスト」を作成し、それを元に出版社(千倉書房)との出版交渉を行った。理由1大山編『山県有朋意見書』の典拠確認・史料原本からの複写作業、電子データ化はほぼ完了した(ただし、典拠不明のものが若干存在する)。2史料集の中身を示す「統合リスト」の作成も「典拠不明」のものを除いてほぼ完了した。これによって、『新版・山県有朋意見書』の全体のイメージをつかめるようになり、出版に向けて大きく前進することができた。なお、以上の作業を進めるに当たっては、適宜研究会を開催し、衆知を集めることに留意した。3ただし、未収録意見書の電子化作業は未着手であり、これには相当の労力を要することが予想される。4予想以上に多くの「意見書」もしくはそれに類似の文書が発見されたので、「意見書」の再定義が必要となる。大山編では演説なども収録されており、その辺との兼ね合いの付け方には検討の余地が十分ある。1大山梓編『山県有朋意見書』ならびに『公爵山縣有朋伝』等の既刊本所収山県意見書の電子データを画像と照合し、適宜校正を加えるという校訂作業を研究代表者と研究分担者で協働して行なっていく。その際、相互チェックを行ない、校訂の万全を期す。また、未収録意見書の電子データ化を早急に推進しなければならない。これには相当の仕事量が予想される。また、入力データの相互チェックも行う必要がある。2『新版・山県有朋意見書』の解題を研究代表者と研究分担者で分担して執筆する。小林は書誌的な解説と軍事(前半部分)を、瀧井は国制と地方制度を、奈良岡は政治を、西田は外交を、森は軍事(後半部分)をそれぞれ執筆する。軍事を二分割したのは、関係する意見書が多いことによる。以上12については今年度中の入稿を予定している。3適宜共同の史料調査を行なう。また、研究会を京都で開催し、出版に向けての作業の詰めや相互チェックなどを行っていく。4なるべく収録漏れのないように心がけて、能う限り追加的史料調査も行っていくが、万一脱漏があった場合に備えて、電子的な意見書目録を作成し、適当なウェブサイトに掲載することをも検討していく。本研究は、山県有朋および山県系官僚閥に関する内外史料の収集と整理・分析を通じて、日本政治外交史という特定の分析視角から、「日本の近代」の再検討をおこなおうとするものである。初年度にあたる本年度は、研究実施計画に沿って着実に研究実績を積み重ねることができた。1大山梓編『山県有朋意見書』(原書房、1966年)に掲載されている意見書の典拠確認・史料原本の複写作業はほぼ8割方完了した。2『公爵山県有朋伝』等の刊本からの、関連個所の複写とデータ入力、リスト化作業をおこなった。上記作業に関しては、松本浩延(同志社大学大学院法学研究科博士後期課程)、徳重伸(同博士前期課程)、井本莞司(同博士前期課程)を「研究協力者」としてその協力を仰いだ。3以上のデータから山県有朋の意見書を選別する作業は、同志社大学にて二回にわたって開催した研究会で、研究代表者(小林)と分担研究者(瀧井、奈良岡、西田、森)がおこなった。4大山編『山県有朋意見書』に収録されていない「意見書」の探索を、国立国会図書館憲政資料室・防衛省防衛研究所図書館・東京市政調査会などで進めており、相当数の未収録意見書を発見することができた。

なお、山県および山県系官僚閥関係の史料収集を海外においても行った。森はアメリカ国立公文書館、奈良岡はイギリス国立公文書館、瀧井はアメリカ連邦議会図書館でそれぞれ調査をおこなった。5収集史料を新たに分析対象に加えながら、各分担者において個別研究の深化を図った。また、出版社への打診も開始した。1大山編『山県有朋意見書』の典拠確認・史料原本の複写作業はおおむね順調に進展している。2刊本からの関連個所の複写とデータ入力、リスト化作業は当初の計画以上の進展を見せている。3意見書選別作業もおおむね順調に進展している。4未収録意見書が当初の予想以上に大量に出てきたので、そういった意味では「当初の計画以上」の進展を見せているが、原本史料のワープロ原稿化には未着手である。5さまざまな意見書の重複チェックや編年順の並べ替え作業は、未収録意見書の発見があまりに多かったので未着手のままである。本研究は、山県有朋および山県系官僚閥に関する内外史料の収集と整理・分析を通じて、新版『山県有朋意見書』を編集・公刊し、「日本の近代」の再検討を行おうとするものである。底本には大山梓編『山県有朋意見書』(原書房、1966年刊行、以下「大山本」と略称)を用いる。大山本は日本近代史研究などの学問分野における最も基本的な「データベース」として、長年多くの研究者に利用され、多大なる学問的恩恵をもたらしてきた。本研究は爾後半世紀あまりにわたって関係諸機関によって、収集・公開されてきた史料を中心に、新たな史料の探索にも注力しつつ、それらを整理・統合した新版『山県有朋意見書』を公刊することを目的とするものである。2年度目にあたる本年度は、研究実施計画に沿って着実に研究実績を積み重ねることができた。その概要は以下の通りである。1大山本に掲載されている意見書の典拠確認・史料原本の複写作業はほぼ完了した。ただし、10点あまりは典拠不明である。2『公爵山県有朋伝』『明治天皇紀』『明治天皇御伝記史料・明治軍事史』『陸軍省沿革史』等の刊本からの、関連箇所の複写とデータ入力作業は完了した。上記作業に関しては、松本浩延(同志社大学法学研究科博士後期課程)、徳重伸(同博士前期課程)、井本莞司(同博士前期課程)を研究協力者として作業を行った。3前年度に引き続き、大山本に収録されていない意見書の探索を、国立国会図書館憲政資料室、防衛省防衛研究所図書館、国立公文書館、奥州市立後藤新平記念館、憲政記念館、山口県文書館などで進めており、43点あまりの未刊行の新出意見書を見つけ出すことができた。また、海外での史料調査も適宜実施した。4以上の史料リストを全部統合した「統合リスト」を作成し、それを元に出版社(千倉書房)との出版交渉を行った。理由1大山編『山県有朋意見書』の典拠確認・史料原本からの複写作業、電子データ化はほぼ完了した(ただし、典拠不明のものが若干存在する)。2史料集の中身を示す「統合リスト」の作成も「典拠不明」のものを除いてほぼ完了した。これによって、『新版・山県有朋意見書』の全体のイメージをつかめるようになり、出版に向けて大きく前進することができた。なお、以上の作業を進めるに当たっては、適宜研究会を開催し、衆知を集めることに留意した。3ただし、未収録意見書の電子化作業は未着手であり、これには相当の労力を要することが予想される。4予想以上に多くの「意見書」もしくはそれに類似の文書が発見されたので、「意見書」の再定義が必要となる。
企業主導による産直流通ネットワーク化の実証的研究

本研究では、組織的な産直流通の一つとして企業主導による産直流通のネットワーク化に着目し、1先進事例の展開過程、2ネットワークにおける流通システム、3ネットワークと出荷農家および集出荷団体との関係性とその評価、4消費者による利用実態と評価の4点から、企業主導による産直流通ネットワーク化の実態と展望を実証的に明らかにすることを目的とする。
C型慢性肝炎に対するインターフェロンの有効性に影響を及ぼす組織学的因子について

C型慢性肝炎患者肝生検組織におけるウイルスRNAの分布とインターフェロンの効果との関連性を明らかにすることを最終的な目標に据えて研究を開始した。まず、組織中のウイルスRNA分布を高感度にしかも特異性高く検出するための方法としてRT in situ PCR法を採用し、その至適反応条件を求める予備実験を行った。Nuovoらによって提唱された方法に従い、4μm厚のパラフィン切片を脱パラフィン、除タンパク処理後、DNase溶液で37°C17時間インキュベートし、DNA消化を行った。次に、逆転写酵素とHCVに対する特異的アンチセンスプライマーを用いて組織切片上でcDNAを合成、さらにDNAポリメラーゼ、センスプライマー、アンチセンスプライマーを含むPCR溶液にジゴキシゲニン標識したdUTPを加えて切片にのせ、サーマルサイクラ-でPCRを行った。HCV感染3例、HBV感染1例を検討したところ、HBV感染例でも陽性所見が出るなど、特異性にやや問題があることが明らかとなった。特異性の改善と手技の簡素化を図るべく、逆転写とDNA増幅が一度に行えるTthポリメラーゼとジゴキシゲニン標識プライマーを用いた改変In situ PCRを案出し、同様に至適反応条件を求めた。その結果、肝細胞および門脈域単核細胞の細胞質にHCVに対する染色が得られ、その染色パターンは以前にIn situハイブリダイゼーションで得られた結果に類似していた。B型慢性肝炎症例では瀰漫性にかすかな背景染色を見るのみで、特異的な染色は観察されなかった。以上より、簡便で特異性の高いHCV染色法が確立出来たと考えられ、今後は本手技をもって更なる組織化学的検討を加えていきたい。
小児ネフローゼ症候群疾患感受性遺伝子及び薬剤感受性遺伝子同定のための国際共同研究

本年度は、日本国内で収集した1,300例を超える小児特発性ネフローゼ症候群患者の血液から単離したDNAを日本人に最適化したSNPsアレイであるジャポニカアレイを用いてタイピングし、そのうちのステロイド感受性ネフローゼ症候群(SSNS)、約1,017例と健常コントロール3,332例によるゲノムワイド関連解析(GWAS)を行ったところ、19番染色体及び9番染色体にゲノムワイド有意(P<5.0E-08)な複数のSNPsを検出した。そのなかから19番染色体から5つ、9番染色体から2つのSNPsを選択し、韓国ソウル大学小児病院で収集した249例のSSNS検体と健常コントロール3,805例を用いてreplication studyを行ったところ、すべてのSNPsでreplicationされた。この時期に、米国及びフランスを中心とするヨーロッパのグループとの共同研究も進行し、彼らの検体を用いたreplication study及び日本、韓国のデータも含めたtrans-ethnicメタ解析を行ったところ、19番染色体のNPHS1領域の2つのSNPsと9番染色体のTNFSF15領域の1つのSNPでゲノムワイド有意な関連が認められた。NPHS1領域の2つのSNPsについては、ミニジーン解析でエクソンスキッピングを誘導することが明らかになり、TNFSF15領域の1つのSNPは、他の研究でTNFSF15のeQTLであることが明らかにされていた。以上のような国際共同研究で、NPHS1とTNFSF15が小児のSSNSの疾患感受性遺伝子であることを世界で初めて明らかにした。当初の計画よりも大規模な国際共同研究に発展し、HLAクラスII以外の小児SSNSの疾患感受性遺伝子を世界で初めて同定することができた。現在、平成30年度に得た成果を論文にまとめており、今年度中に国際誌で公表したいと考えている。さらに、SNPsアレイによる韓国人検体のタイピングを実施中であり、可及的速やかにタイピングを完了する。また、タイでの検体及び臨床情報の収集中であるが、可及的速やかに収集を完了し、SNPsアレイによるタイ人のタイピングを実施する。これらのタイピングテータと、既に完了している日本人タイピングデータ、及び米国及びヨーロッパのタイピングデータを統合した国際GWASメタ解析を行い、NPHS1, TNFSF15以外のSSNS疾患感受性遺伝子の同定を試みる。また、日本人、韓国人、タイ人では、ステロイド抵抗性ではあるが免疫抑制薬に反応して寛解となった症例の検体も収集しているので、ステロイド抵抗性vs.ステロイド感受性のGWASを実施し、ステロイド抵抗性に関与するSNPsの同定も試みる予定である。
イオン駆動型生体分子モーターの光による人為的駆動法の開発

本研究は、FoF1-ATP合成酵素を、光照射により駆動させる挑戦的な研究である。この目的を達成するために、(1)マイクロ流路デバイスをベースとしたFoF1-ATP合成酵素測定・操作システムを構築し、巨大化大腸菌膜に存在する呼吸鎖複合体I、並びにFoF1-ATP合成酵素のプロトン輸送活性の機能イメージングに成功した。その後、(2)エバネッセント光照射によりFoF1-ATP合成酵素が駆動されるか評価・検討を行った。結果としては、FoF1-ATP合成酵素の活性は検出されなかった。今後の課題として、ATP合成に必要な自由エネルギー濃度を下げるなどの溶液条件を検討する必要性などが明確となった。FoF1-ATP合成酵素は、生体膜内外のプロトン濃度・電位勾配により作り出される電気化学ポテンシャルをエネルギー源としてATPを合成する、イオン駆動型回転分子モーターである。本研究では、この電気化学ポテンシャルを光により創出し、従来不可能であったFoF1-ATP合成酵素の光による人為的な駆動に挑戦する。この目標を達成するために、研究期間内にFoF1の回転運動の計測を可能にする系を構築する必要がある。そこで、平成26年度は、本研究で必要となるマイクロデバイスや光学系等からなる測定・操作システムの開発・構築を行った。本研究に用いるデバイスは2つの流路を持ち、流路の間が壁で仕切られている。壁が薄くなっているところに微細小孔(2 μm)を持つ。このデバイスの動作を評価するために、次のように、巨大化大腸菌の膜に存在する呼吸鎖複合体Iの機能イメージングを行った。まず、ペニシリン系抗生物質により得られた巨大化大腸菌を微細小孔に捕捉・固定した。次に、直流パルスにより微細小孔部にて膜を穿孔することで、大腸菌内部側にあるNADH(複合体Iの駆動剤)結合部位にアクセスすることを可能とした。その後、流路内を蛍光性pH指示薬で満たし、巨大化大腸菌内部とつながっている側の流路へNADHを導入した。すると、もう一方の流路で、蛍光性pH指示薬が明るくなる様子が観察できた。これは、複合体Iが膜を超えてプロトンを大量に輸送したことを示唆している。以上のように、本デバイスは生体膜に挿入されている膜タンパク質の機能をリアルタイムで測定することができる。また、光による駆動に必要な光学系として、エバネッセント照明の導入を行い、顕微鏡観察領域への入射を確認した。本年度は、以下の4つの項目について取り組んだ。1.前年度までに開発したMEMS流路デバイスを用いた計測システムでは、流路内微細小孔にリポソーム状の巨大化生体膜を捕捉する。しかしながら、巨大化生体膜を含む懸濁液は、細かな細胞破砕物を多く含み、微細小孔部を詰まらせるため、捕捉成功率に大きな問題があった。研究実施計画にあるFoF1回転運動は、経験的に発見確率が非常に低いことが予想されるため、回転運動の観察には捕捉成功率の向上が必須である。そこで、回転計測に先立ち、捕捉成功率を大きく改善する目的で、MEMS流路デバイス内に1対の平行電極を用意し、誘電泳動により懸濁液から目的の巨大化生体膜のみを分離する機構を開発した。この仕組みにより、懸濁液から巨大化大腸菌が高い割合で分離取得されることが確認され、ほぼ巨大化大腸菌だけが微細小孔部に到達するため、実験効率の大幅な改善を実現した。2.前年度は、計測システムの有効性を実証するために、NADH駆動による呼吸鎖複合体Iの活性の確認を行った。本年度は、本研究課題の対象であるFoF1-ATP合成酵素の機能イメージングを行い、ATP駆動によるFoF1-ATP合成酵素のプロトン輸送活性の保持を確認した。今後、プローブを導入し、回転運動の計測を行う。3.前年度に引き続き、光駆動に必要な光学系として、1064 nmレーザーを用いたエバネッセント照明光学系の構築を行った。IR励起蛍光粒子を励起すると、ガラス表面近傍の粒子のみが蛍光を呈することから、エバネッセント光の成立を確認した。4.基板への固定やプローブの結合を行うために、遺伝子工学的にFoF1へビオチンやHis-tagを導入した。この、大腸菌細胞膜に発現しているビオチン・His-tag変異体が、生化学的にATP駆動によるプロトン輸送活性を有していることを確認した。1分子のFoF1回転運動の検出率は非常に低いことが予想されるため、本年度は捕捉成功率の向上を優先させた。結果として、目的の巨大化生体膜を分離取得する機構の開発に成功し、実験効率は大きく改善した。しかしながら、当初本年度に予定していたFoF1-ATP合成酵素の回転運動の計測は次年度に持ち越しとなるため、成果の発表には至っていない。ただし、上記した捕捉効率の向上の達成とともに、光駆動用のエバネッセント照明光学系の構築、FoF1変異体の構築を終えており、次年度には回転計測を行い、また、当初の予定通り光駆動に挑戦することは十分に可能である。本研究は、モータータンパク質であるFoF1-ATP合成酵素を、エバネッセント光により形成される急激な電場勾配によって駆動させる挑戦的な研究である。本研究は、以下に述べる様に進めた。まず、平成26年度は、膜タンパク質解析用のMEMS流路デバイスを開発し、巨大化大腸菌膜タンパク質の機能のリアルタイム測定を行った。

またエバネッセント照明を導入し、光による駆動に必要な光学系の構築を行った。次に、平成27年度は、MEMS流路デバイスの巨大化大腸菌捕捉成功率の向上に取り組み、実験効率を大幅に改善するとともに、ATP駆動によるFoF1-ATP合成酵素のプロトン輸送活性の機能イメージングに成功した。最終年度である本年度は、MEMS流路デバイスを用いた計測システムにおける溶液交換手法の改良を行った。前年度までは流路内の溶液交換を手動で行っていたため、微細小孔に保持された巨大化大腸菌は溶液交換時に起きる流路の圧力変動により破壊されてしまうことが多く、効率的な実験を妨げていた。そこで、溶液交換に伴う圧力変化を補償する機構を考案・開発し、外部からの特別な制御なしに流路内の圧力をほぼ一定に保つことが可能となった。改良したシステムを用いて流路内部溶液を反応溶液へと交換した後、エバネッセント光照射によりFoF1-ATP合成酵素が駆動されるか評価・検討を行った。結果としては、FoF1-ATP合成酵素の活性は検出されなかった。電気化学ポテンシャルの形成に必要なエネルギーを十分に供給できていないことなどが原因と考えられる。今後の課題として、ATP合成に必要な自由エネルギー濃度を下げるなどの溶液条件を検討する必要性などが明確となった。本研究の今後の発展は、光という電磁波によるモータータンパク質の機能操作への端緒を切り開き、生物学の研究を次世代のステージに押し上げるものと期待される。本研究は、FoF1-ATP合成酵素を、光照射により駆動させる挑戦的な研究である。この目的を達成するために、(1)マイクロ流路デバイスをベースとしたFoF1-ATP合成酵素測定・操作システムを構築し、巨大化大腸菌膜に存在する呼吸鎖複合体I、並びにFoF1-ATP合成酵素のプロトン輸送活性の機能イメージングに成功した。その後、(2)エバネッセント光照射によりFoF1-ATP合成酵素が駆動されるか評価・検討を行った。計画通りに、マイクロデバイスと巨大生体膜リポソームを融合した測定システムを構築し、膜上に存在する膜タンパク質、呼吸鎖複合体Iの機能イメージングに成功することで、測定システムの有効性を実証した。次年度においては、FoF1-ATP合成酵素の機能イメージングを行うことが課題となる。また、光駆動に必要となるエバネッセント照明光学系を構築し、現在は購入したレーザーの波長(1064 nm)に適した全反射条件の検討をしている。計測システム、測定試料、光駆動用照明などの準備は整ってきている。したがって、回転計測を遂行し、研究計画通りに最終年度の実施項目である光駆動に挑戦する。具体的には以下の通りとなる。1.これまでに構築してきた測定システムを用いて、FoF1の回転運動を計測する。回転運動は、ATPやプロトン濃度勾配(pH差)、電極を介した電圧印加等により引き起こされる。各条件におけるビーズの運動を解析することにより、FoF1の回転速度、回転方向、トルクなどのモーターとしての特性を詳細に調べる。2.エバネッセント照明により、FoF1の光駆動に挑戦する。
レ-リ散乱法を用いた瞬時多点温度測定による乱流拡散火災構造の基礎的研究

火災構造を調べる場合に瞬時の空間的温度分布の検出は重要な測定要因となる.レーザー・レ-リ散乱光は比較的散乱断面積が大きいために散乱光強度を測定するのには適している.ただし,散乱光強度は温度に反比例するために火炎内の高温度部では信号強度が減少し,S/N比が低下する.このため,高出力のNd:YAGパルスレーザ光を利用することで散乱光強度を強め,受光信号のノイズを軽減し,受光時間も短縮することができ,化学発光の影響を除去することができた.次にこのレーザー光の2倍波(532nm)を用いてレ-リ散乱光の瞬時多点同時測定を行うための装置を構成し,異なる乱れ強さの乱流拡散火炎に適用し瞬時火炎温度分布の測定を行った.燃焼ガスのレ-リ散乱断面積が空気とあまり変わらないようにするため水素と窒素を3:7の体積割合で混合したものを燃料として用い,燃料噴流と周囲空気流との間で拡散燃焼をさせた.レイノルズ数が高くなり温度変動が増すと,平均温度および瞬時温度の最高値が下がる傾向があることが認められた.この傾向はレイノルズ数が高い場合に顕著で,1000K以下になる場合も生じた.また,温度変動のrms値が火炎の両側で大きくなっているのは小さいスケールの乱れよりもむしろ大きなスケール乱れが支配的であると考えられる.火炎内部では温度の確率分布の広がりが大きくなり,様々な当量比で燃焼したガスが混合していることが予想できる.火災構造を調べる場合に瞬時の空間的温度分布の検出は重要な測定要因となる.レーザー・レ-リ散乱光は比較的散乱断面積が大きいために散乱光強度を測定するのには適している.ただし,散乱光強度は温度に反比例するために火炎内の高温度部では信号強度が減少し,S/N比が低下する.このため,高出力のNd:YAGパルスレーザ光を利用することで散乱光強度を強め,受光信号のノイズを軽減し,受光時間も短縮することができ,化学発光の影響を除去することができた.次にこのレーザー光の2倍波(532nm)を用いてレ-リ散乱光の瞬時多点同時測定を行うための装置を構成し,異なる乱れ強さの乱流拡散火炎に適用し瞬時火炎温度分布の測定を行った.燃焼ガスのレ-リ散乱断面積が空気とあまり変わらないようにするため水素と窒素を3:7の体積割合で混合したものを燃料として用い,燃料噴流と周囲空気流との間で拡散燃焼をさせた.レイノルズ数が高くなり温度変動が増すと,平均温度および瞬時温度の最高値が下がる傾向があることが認められた.この傾向はレイノルズ数が高い場合に顕著で,1000K以下になる場合も生じた.また,温度変動のrms値が火炎の両側で大きくなっているのは小さいスケールの乱れよりもむしろ大きなスケール乱れが支配的であると考えられる.火炎内部では温度の確率分布の広がりが大きくなり,様々な当量比で燃焼したガスが混合していることが予想できる.
電子強誘電体の特徴を活かした新規セシウム除染材料の開発

対象となる物質である電子強誘電体RFe2O4について、R3+のイオン半径が最大のYFe2O4と最小のLuFe2O4に対してセシウム吸着実験を行った。上記2種類の試料を乳鉢で細かく粉砕し、CsCl水溶液(濃度0.01重量%程度)に24時間程度浸透させた。前年度行った実験からは、浸透させた試料のX線回折パターンが変化した。すなわち、試料にセシウムが吸着していることが示唆された。本年度は吸着の有無を観測するため、放射光を用いた吸収分光測定を行った。SPring-8のBL14B1において、CsのK吸収端の吸収分光測定(広域X線吸収微細構造;EXAFS)測定を行った。しかし、両方の試料とも、セシウムの光吸収は観測されなかった。すなわち、試料にセシウムは吸着していることは認められなかった。これと並行し、RFe2O4と関連構造を有する強誘電体R2Fe3O7についてもセシウム吸着実験を行うため試料合成を行った。対象物質は空孔と見做せる構造を有するが、セシウムを吸着させるため空孔を大きくする必要があることから、R3+イオンを変えて実験を行った。しかし、空孔が小さくなるR=Scの一部置換は成功したものの、空孔を広げてセシウムを吸着させる可能性を有する大きなR3+(Tm3+など)の置換では単相物質は得られなかった。また、前年度行ったRFe2O4の強誘電相の理論解析を行った。Rと誘電性の相関について検討を行う目的から、平均場近似計算を行った。最も物性が調べられているLuFe2O4については、誘電性を持つ電荷秩序構造は出現するものの、最安定な状態ではないことなどが分かっていることから、R=Yなど他の希土類でも計算を行った。R3+のイオン半径により強誘電相が再安定になるか否かを検証しようとしたが、LuFe2O4の明瞭な違いは見られなかった。対象物質のセシウム吸着の有無を観測するための放射光吸収測定は行えた。また関連系R2Fe3O7について、単相となるR3+イオンに制限があることが分かったことは固体化学的な知見である。さらに、R=Lu以外の系について理論計算を行った。しかし、電気炉のマシンタイムが確保できなかったため合成が遅れたことと、また、セシウムの吸着が観測されていないため、この区分となった。5.研究実績の概要で述べたR2Fe3O7の合成を進め、セシウム吸着の有無を調べる。対象物質は常温において電気分極を持つため、水溶液中では、表面電荷が極性分子である水分子により中和されている可能性がある。これにより分極がない状態になっている可能性があるため、強誘電相転移温度以上の高温(数十°C以上)からのセシウム吸着も試みる。この実験についても、5.研究実績のX線回折測定および水溶液のセシウム濃度分析を行う。本研究で対象となる電子強誘電体RFe2O4におけるセシウム吸着実験を行った。対象としては、安価かつ運搬に有利な軽希土類Yを含むYFe2O4、および物性が良く調べられているLuFe2O4を選んだ。これらを粉末にし、ppm程度の濃度の塩化セシウム溶液に浸透させ、一晩ほど放置した。吸着の有無を確かめるため、まずはX線回折により構造変化を測定した。水溶液に浸透させた試料では、メインピークを含む数本の回折ピークの強度が最大半分程度に低下していることが分かった。この結果は、試料にセシウムが吸着することにより周期構造に変化が生じていることを強く示唆する。現在、吸着後の残った水溶液中のセシウム濃度の分析を行い、セシウム含有量が吸着により減少したかどうかの検証実験を行っているところである。本実験と並行して試料作製に着手した。面内のFe-O多面体の空孔の大きさとセシウム吸着能力の相関を見るためのRを変えた試料の作製、また、Fe-O三角格子が余分に一枚入ったR2Fe3O7への希土類置換などを行いつつある。対象系の物性は未だ不明な点が多いため、Rと誘電性の相関を検討を行うなどの目的から、理論計算にも着手した。最も物性が調べられているLuFe2O4に対し、バンド計算を基にしたハバード模型の平均場近似を行ったところ、誘電性を持つ電荷秩序構造は出現するものの、最安定な状態ではないことなどが分かった。結果は3月の日本物理学会で発表した。現在、R=Yなど他の希土類でも計算を行い、セシウム吸着に有利と考えられる強誘電状態が最安定となる物質についての知見を得ながら研究を進める。溶液中のセシウム吸着測定を行う誘導結合プラズマ(ICP)分析装置の故障や電気炉のマシンタイムの確保不足から、実験の進捗は多少遅れている。しかし、5.研究業績で述べた通り、X線測定から吸着の可能性の示唆が得られ、また、当初予定していなかった理論解析に着手したことから、多角的な研究を進められる可能性が開けてきた。

前年度行った実験からは、浸透させた試料のX線回折パターンが変化した。すなわち、試料にセシウムが吸着していることが示唆された。本年度は吸着の有無を観測するため、放射光を用いた吸収分光測定を行った。SPring-8のBL14B1において、CsのK吸収端の吸収分光測定(広域X線吸収微細構造;EXAFS)測定を行った。しかし、両方の試料とも、セシウムの光吸収は観測されなかった。すなわち、試料にセシウムは吸着していることは認められなかった。これと並行し、RFe2O4と関連構造を有する強誘電体R2Fe3O7についてもセシウム吸着実験を行うため試料合成を行った。対象物質は空孔と見做せる構造を有するが、セシウムを吸着させるため空孔を大きくする必要があることから、R3+イオンを変えて実験を行った。しかし、空孔が小さくなるR=Scの一部置換は成功したものの、空孔を広げてセシウムを吸着させる可能性を有する大きなR3+(Tm3+など)の置換では単相物質は得られなかった。また、前年度行ったRFe2O4の強誘電相の理論解析を行った。Rと誘電性の相関について検討を行う目的から、平均場近似計算を行った。最も物性が調べられているLuFe2O4については、誘電性を持つ電荷秩序構造は出現するものの、最安定な状態ではないことなどが分かっていることから、R=Yなど他の希土類でも計算を行った。R3+のイオン半径により強誘電相が再安定になるか否かを検証しようとしたが、LuFe2O4の明瞭な違いは見られなかった。対象物質のセシウム吸着の有無を観測するための放射光吸収測定は行えた。また関連系R2Fe3O7について、単相となるR3+イオンに制限があることが分かったことは固体化学的な知見である。さらに、R=Lu以外の系について理論計算を行った。しかし、電気炉のマシンタイムが確保できなかったため合成が遅れたことと、また、セシウムの吸着が観測されていないため、この区分となった。5.研究実績で述べた通り、残った水溶液中のセシウム濃度の分析を行う。もし水溶液中のセシウム濃度が吸着により減少しているならば、セシウム吸着したRFe2O4試料を水中で加熱し、強誘電相転移温度330K以上においてセシウムが簡便に脱離するかを調べる。この実験についても、5.研究実績のX線回折測定および水溶液のセシウム濃度分析を行う。並行して物質合成を行い、どの希土類や結晶構造でセシウム吸着が最も効率的かなどの知見を得る。理論解析についてはLuと格子定数が最も異なるY系で行い、強誘電相が最安定であれば、5.研究実績の通り本系が応用に最も適していることから、Y系を中心に実験を行う。5.研究実績の概要で述べたR2Fe3O7の合成を進め、セシウム吸着の有無を調べる。対象物質は常温において電気分極を持つため、水溶液中では、表面電荷が極性分子である水分子により中和されている可能性がある。これにより分極がない状態になっている可能性があるため、強誘電相転移温度以上の高温(数十°C以上)からのセシウム吸着も試みる。(理由)7.現在までの進捗状況で述べた通り、ICP分光装置の故障や電気炉マシンタイムの確保不足等で実験が遅れたことにより、H29年度に実施できなかった実験に係る経費が次年度使用額として生じることとなった。(使用計画)
近代中国・日本における西洋数学の受容

今年度は、科学研究補助金による研究課題の「近代中国・日本における西洋科学技術の受容」に関する調査と資料収集を行った。特に、「翻訳」という一つの重要な経路を通じて、いかに科学知識の移転を可能となるのかについて、西洋近代科学知識の世界的波及の動向と、それに関連する内容を調査した。それまでの研究を、8月15日から20日にかけてドイツのミュンヘンで開催された第11回東アジア科学史国際学会(The 11th International Conference on the History of Sciencein East Asia)で発表した。そこで、科学史分野の複数の有名な研究者から研究に関する多くの有益な情報とアドバイスを受けた。一昨年の10月20日から約1年間、イギリスに渡航し、ケンブリッジ大学とニーダム研究所で研究を続けた。イギリスのケンブリッジでは、ケンブリッジ大学の科学史・科学哲学研究室において、授業とゼミに参加しながら、東アジア科学の研究で有名なニーダム研究所で、所長のカレン先生の指導を受けた。一方、現地で活躍している当該分野の研究者たちとの交流も行った。又、近代中国と日本における西洋科学知識の伝播に関する文献と資料などを、イギリスだけではなく、ヨーロッパのフランスとイタリアの博物館と図書館にも調査してきた。10月14日には、ニーダム研究所での文献読書会(NEEDHAM RESEARCH INSTITUTE TEXT READING SEMINARS)において、それまで収集してきた文献の分析結果を発表した。イギリスに訪問した後、昨年の11月19日まで資料調査のため、イギリスから直接台湾に渡り収集作業を行った。日本に帰ってから、それまで収集した資料を整理しながら、研究論文の執筆に着手した。新たな論文を一件、今年度英文ジャーナルで発表したいと考えている。又、博士論文の執筆も続けている。今年度は、科学研究補助金による研究課題の「近代中国・日本における西洋科学技術の受容」について積極的に調査を展開していた。まず、西洋近代科学知識の世界的波及の動向とその関連する研究を調査した。その中から、自らの研究課題に対しても新たな発想を得て、特に「翻訳」という一つの重要な経路として、いかにして科学知識の移転を可能とするのかを一つの原稿で仕上げた。その成果は6月27日に共立出版社で行われた第128回「数学文献を読む会」で発表することになった。8月から約1ヶ月間は主に台湾で研究を続けた。台湾では近代中国と日本における西洋科学知識の伝播に関する新たな資料が発見されため、当地で情報収集の作業をしていた。同時に、台湾History and Padagogy of Mathematics研究グループの刊行物『HPM通訓』で、いままでの自らの研究に関する紹介を二つの文章で発表された。11月には、ヨーロッパへ資料と研究情報の収集をし始めた。最初にイギリスの大英図書館で資料と文献の所在を調べた。それからはケンブリッジを訪問し、特に東アジア科学の研究で有名なニーダム研究所にも訪ねて、同分野の学者たちと研究のことで交流した。その後、フランスへ足を運び、まずパリでREHSEIS(精密科学と科学の制度に関する認識論的歴史的研究グループ)の「アジアにおける科学史」という連続セミナーに参加し、学者たちから研究に関する情報とアドバイスをももらった。そのきっかけで資料の収集も順調に行われた。12月に帰国した直後、東京大学大学院の中国思想研究室の研究者たちと一緒に東北大学へ訪問し、東北大附属図書館で重要な原始文献をも入手した。1月からはそれまで収集した資料を整理しながら、研究論文を書くのも着手した。一つの新たな論文は、東京大学大学院科学史・科学哲学研究室から発行の学術雑誌『科学史・科学哲学』で発表した。またほかの論文はいまでも書き続けており、それらを発表する予定は来年度になる。今年度は、科学研究補助金による研究課題の「近代中国・日本における西洋科学技術の受容」に関する調査と資料収集を続けていた。特に、「翻訳」という一つの重要な経路として、いかにして科学知識の移転を可能とするのかについて、西洋近代科学知識の世界的波及の動向とその関連する研究を調査した。それまでの研究を、5月末に台湾で開催されたAsian-Pacific HPM国際会議で発表することになり、さらに自らの発表内容に基づく一つの論文はその学会誌にも掲載された。4月末頃から約1ヶ月間は主に台湾で研究を続けた。台湾では近代中国と日本における西洋科学知識の伝播に関する新たな資料がよく整理されはじめたので、当地で情報収集の作業をしていた。一方、現地で活躍している当該分野の研究者たちと交流することをもできた。10月20日からには、ヨーロッパへ一年間の渡航で資料と研究情報の収集をし始めた。イギリスのケンブリッジで訪問学生として、ケンブリッジ大学の科学史・科学哲学系で授業とゼミを参加しながら、主に東アジア科学の研究で有名なニーダム研究所で、カレン教授の指導を受けている。又、イギリスにある各図書館で資料と文献の所在を調べた。12月のはじめ頃には、フランスのパリでREHSEIS(精密科学と科学の精度に関する認識論的歴史的研究グループ)に訪問した。特に、科学史分野で有名な学者たちから研究に関する有益な情報とアドバイスももらった。

それまでの研究を、8月15日から20日にかけてドイツのミュンヘンで開催された第11回東アジア科学史国際学会(The 11th International Conference on the History of Sciencein East Asia)で発表した。そこで、科学史分野の複数の有名な研究者から研究に関する多くの有益な情報とアドバイスを受けた。一昨年の10月20日から約1年間、イギリスに渡航し、ケンブリッジ大学とニーダム研究所で研究を続けた。イギリスのケンブリッジでは、ケンブリッジ大学の科学史・科学哲学研究室において、授業とゼミに参加しながら、東アジア科学の研究で有名なニーダム研究所で、所長のカレン先生の指導を受けた。一方、現地で活躍している当該分野の研究者たちとの交流も行った。又、近代中国と日本における西洋科学知識の伝播に関する文献と資料などを、イギリスだけではなく、ヨーロッパのフランスとイタリアの博物館と図書館にも調査してきた。10月14日には、ニーダム研究所での文献読書会(NEEDHAM RESEARCH INSTITUTE TEXT READING SEMINARS)において、それまで収集してきた文献の分析結果を発表した。イギリスに訪問した後、昨年の11月19日まで資料調査のため、イギリスから直接台湾に渡り収集作業を行った。日本に帰ってから、それまで収集した資料を整理しながら、研究論文の執筆に着手した。新たな論文を一件、今年度英文ジャーナルで発表したいと考えている。又、博士論文の執筆も続けている。
チェックポイント蛋白質複合体9-1-1の細胞分裂周期における本質的機能の解明

これまでの研究よりチェックポイント蛋白質複合体9-1-1複合体(Rad1, Rad9, Hus1)は,細胞周期、特にS期およびG2/M期チェックポイントにおけるダメージセンサーと考えられている.9-1-1複合体のDNAダメージ依存的なリン酸化やPCNAとの構造的な類似性、またチェックポイント機構の大まかなシグナル伝達経路については報告されてきている.しかしながら,1)Rad1, Rad9, Hus1それぞれの本質的かつ固有な機能は何であるのか.2)なぜ9-1-1複合体がPCNAのようにホモ三量体ではなくヘテロ三量体でなくてはならないのか.3)9-1-1複合体のどのような働きがダメージセンサーの本態をなすのか,4)9-1-1複合体がDNA修復系や複製系、また細胞死とどの様に関わっているのかなどの点については明らかにされていない.そこで、本研究ではマウスembryonic carcinoma細胞株F9細胞を用いた遺伝子ターゲッティングにより,Rad1, Rad9, Hus1遺伝子のコンディショナルノックアウト(KO)細胞を樹立,及びRad1, Rad9, Hus1それぞれの遺伝子への変異の導入もしくは9-1-1分子間のドメインの入れ替えによる変異遺伝子のノックインにより、9-1-1蛋白質の固有な機能について明らかにすることを目的とした.Rad1遺伝子およびHus1遺伝子についてはKO細胞株を樹立し研究に用いた.Rad9遺伝子についてはKO細胞株を樹立することは出来なかったため,Rad9遺伝子に対する組換miRNAをデザインした.Rad1のKO細胞ではRad1遺伝子のノックアウトにより,細胞死が誘導されたが,Hus1のKO細胞では細胞死は観察されなかった.また,Rad1遺伝子配列中に保存されている潜在的ヌクレアーゼモチーフの点変異を作製し,野生型と共に組換タンパク質を作製し,in vitroでヌクレアーゼの活性を検索したが,有効なヌクレアーゼ活性は観察されなかった.また,Hus1は以前の報告と同様に,ユビキチン化されるが,このユビキチン化は恒常的におきており,DNAを傷害する薬剤処理によってHus1のユビキチン化が大きく影響されることは観察されなかった.これまでの研究よりチェックポイント蛋白質複合体9-1-1複合体(Rad1, Rad9, Hus1)は,細胞周期、特にS期およびG2/M期チェックポイントにおけるダメージセンサーと考えられている.9-1-1複合体のDNAダメージ依存的なリン酸化やPCNAとの構造的な類似性、またチェックポイント機構の大まかなシグナル伝達経路については報告されてきている.しかしながら,1)Rad1, Rad9, Hus1それぞれの本質的かつ固有な機能は何であるのか.2)なぜ9-1-1複合体がPCNAのようにホモ三量体ではなくヘテロ三量体でなくてはならないのか.3)9-1-1複合体のどのような働きがダメージセンサーの本態をなすのか,4)9-1-1複合体がDNA修復系や複製系、また細胞死とどの様に関わっているのかなどの点については明らかにされていない.そこで、本研究ではマウスembryonic carcinoma細胞株F9細胞を用いた遺伝子ターゲッティングにより,Rad1, Rad9, Hus1遺伝子のコンディショナルノックアウト(KO)細胞を樹立,及びRad1, Rad9, Hus1それぞれの遺伝子への変異の導入もしくは9-1-1分子間のドメインの入れ替えによる変異遺伝子のノックインにより、9-1-1蛋白質の固有な機能について明らかにすることを目的とした.Rad1遺伝子およびHus1遺伝子についてはKO細胞株を樹立し研究に用いた.Rad9遺伝子についてはKO細胞株を樹立することは出来なかったため,Rad9遺伝子に対する組換miRNAをデザインした.Rad1のKO細胞ではRad1遺伝子のノックアウトにより,細胞死が誘導されたが,Hus1のKO細胞では細胞死は観察されなかった.また,Rad1遺伝子配列中に保存されている潜在的ヌクレアーゼモチーフの点変異を作製し,野生型と共に組換タンパク質を作製し,in vitroでヌクレアーゼの活性を検索したが,有効なヌクレアーゼ活性は観察されなかった.また,Hus1は以前の報告と同様に,ユビキチン化されるが,このユビキチン化は恒常的におきており,DNAを傷害する薬剤処理によってHus1のユビキチン化が大きく影響されることは観察されなかった.これまでの研究よりチェックポイント蛋白質複合体9-1-1複合体(Rad1,Rad9,Hus1)は,細胞周期、特にS期およびG2/M期チェックポイントにおけるダメージセンサーと考えられている.9-1-1複合体のDNAダメージ依存的なリン酸化やPCNAとの構造的な類似性、またチェックポイント機構の大まかなシグナル伝達経路については報告されてきている.しかしながら,1)Rad1,Rad9,Hus1それぞれの本質的かつ固有な機能は何であるのか.2)なぜ9-1-1複合体がPCNAのようにホモ三量体ではなくヘテロ三量体でなくてはならないのか.3)9-1-1複合体のどのような働きがダメージセンサーの本態をなすのか.4)9-1-1複合体がDNA修復系や複製系、また細胞死とどの様に関わっているのかなどの点については明らかにされていない.

そこで、本研究ではマウスembryonic carcinoma細胞株F9細胞を用いた遺伝子ターゲッティングにより,Rad1,Rad9,Hus1遺伝子のコンディショナルノックアウト細胞を樹立,及びRad1,Rad9,Hus1それぞれの遺伝子への変異の導入もしくは9-1-1分子間のドメインの入れ替えによる変異遺伝子のノックインにより、9-1-1蛋白質の固有な機能について明らかにすることを目的としている.現在までにRad1遺伝子についてはコンディショナルノックアウト細胞株の樹立はすでにおえており,現在,ヌクレアーゼ活性中心と考えられる部位について,点変異の作製,組換え蛋白質による試験管内反応系の確立,変異遺伝子のノックアウト細胞へのノックインとチェックポイント機構への関係について研究を進めている.Rad9についてはある種のDNA傷害剤依存的にユビキチン化される実験結果を得ており,どのリシン残基を解して,ユビキチン化するのか,ユビキチン化とチェックポイント機構の発動,シグナル伝達にどのように関係しているのかについて解析している.Hus1についてもコンディショナルノックアウト細胞の樹立はすでに完了している.今後,Rad1,Rad9についてはさらに解析を進めるとともに,Hus1についてもユビキチン化,SUMO化について検討する.これまでの研究よりチェックポイント蛋白質複合体9-1-1複合体(Rad1,Rad9,Hus1)は,細胞周期,特にS期およびG2/M期チェックポイントにおけるダメージセンサーと考えられている.9-1-1複合体のDNAダメージ依存的なリン酸化やPCNAとの構造的な類似性,またチェックポイント機構の大まかなシグナル伝達経路については報告されてきている.しかしながら,1)Rad1,Rad9,Hus1それぞれの本質的かつ固有な機能は何であるのか.2)なぜ9-1-1複合体がPCNAのようにホモ三量体ではなくヘテロ三量体でなくてはならないのか.3)9-1-1複合体のどのような働きがダメージセンサーの本態をなすのか.4)9-1-1複合体がDNA修復系や複製系,また細胞死とどの様に関わっているのかなどの点については明らかにされていない.そこで,本研究ではマウスembryonic carcinoma細胞株F9細胞を用いた遺伝子ターゲッティングにより,Rad1,Rad9,Hus1遺伝子のコンディショナルノックアウト(KO)細胞を樹立,及びRad1,Rad9,Hus1それぞれの遺伝子への変異の導入もしくは9-1-1分子間のドメインの入れ替えによる変異遺伝子のノックインにより,9-1-1蛋白質の固有な機能について明らかにすることを目的とした.Rad1遺伝子およびHus1遺伝子についてはKO細胞株を樹立し研究に用いた.Rad9遺伝子についてはKO細胞株を樹立することは出来なかったため,Rad9遺伝子に対する組換miRNAをデザインした.Rad1のKO細胞ではRad1遺伝子のノックアウトにより,細胞死が誘導されたが,Hus1のKO細胞では細胞死は観察されなかった.また,Rad1遺伝子配列中に保存されている潜在的ヌクレアーゼモチーフの点変異を作製し,野生型と共に組換タンパク質を作製し,in vitroでヌクレアーゼの活性を検索したが,有効なヌクレアーゼ活性は観察されなかった.また,Hus1は以前の報告と同様にユビキチン化されるが,このユビキチン化は恒常的におきており,DNAを傷害する薬剤処理によってHus1のユビキチン化が大きく影響されることは観察されなかった.