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mRNA監視機構に起因する神経疾患の病態と治療に関する研究

mRNA監視機構(NMD)が疾患遺伝子の発現に影響する疾患の中には、NMD抑制で病態が回復するものがある。そのひとつウールリッヒ病患者繊維芽細胞をモデル細胞として、NMD抑制が細胞生理機能に及ぼす影響について検討した。NMD構成分子の発現を低下させたNMD抑制下では細胞周期への影響および小胞体ストレスの発生はなかったが、細胞増殖がSMG-8以外のNMD関連因子の発現低下で抑制された。また、化学物質曝露によるセレン欠乏下でセレン含有酸化還元系酵素がNMDにより障害され、酸化ストレスが生じることが明らかになった。mRNA監視機構であるnonsense-mediated mRNA decay (NMD)は、遺伝子配列途中にストップコドンが生じた変異mRNAを排除する生体機構である。セレノシステイン(Sec)はストップコドンと同じUGAでコードされるため、セレン欠乏下ではSecを含むセレノ蛋白質mRNAに対しNMDが作動すると考えられる。NMDを標的とした分子薬理学的治療法を開発するために、マウス筋芽細胞株におけるNMD抑制系を開発するとともに、生体レドックス系の主要なセレノ酵素であるグルタチオンペルオキシダーゼ1(GPx1)やチオレドキシンリダクターゼ1(TR1)のセレン欠乏下での動態にNMDが及ぼす影響について検討した。NMDの活性化には、RNA helicaseであるUpf1の連続的なリン酸化、脱リン酸化が重要である。Upf1の生理的キナーゼであるSMG-1とUpf1の脱リン酸化に関与するSMG-7を標的にsiRNAを作成し、マウス培養細胞に導入、各蛋白質のノックダウン及びNMD活性の抑制を確認した。セレンはメチル水銀に親和性が高く、メチル水銀曝露下では活性型セレンは減少する。事実、メチル水銀曝露下でGPx1 mRNAは低下し、sodium seleniteの添加で回復した。このGPx1 mRNA低下は、NMD抑制細胞ではnon-silencing siRNA導入のコントロール細胞に比し回復したことから、メチル水銀によるセレン欠乏下でのGPx1 mRNAの発現低下はNMDの作動によるものであることが明らかになった。細胞内セレン欠乏下ではselenocystein tRNA^<(Ser)Sec>が機能せず、UGAはストップコドンとして認知され、そのmRNAはNMDにより分解されると考えられる。一方、TR1 mRNAはSecをコードするUGAがNMDの無効な最終exonに存在するため、その発現は増加すると考えられた。mRNA監視機構とされるnonsense-mediated mRNA decay(NMD)は、遺伝子のリーデイングフレーム途中にストップコドンPTCが生じた変異mRNAを排除する生体機構である。NMDがその病態に負に作用することが明らかになったPTCを有するUllrich病患者繊維芽細胞をモデル細胞として、NMD抑制が細胞生理機能に及ぼす影響について細胞種差に関する検討を行った。Ullrich病繊維芽細胞で喪失していたcollagen VIα2 mRNA及びcollagen VI蛋白質を部分的に回復させることが明らかになったNMD構成分子であるUpf1、SMG-1、SMG-8、SMG-6、SMG-7、MAGOH、BtZの各因子のノックダウンで、腫瘍細胞と非腫瘍細胞ではNMD抑制による生体応答に大きな差があること、さらにNMD構成分子間にも細胞機能に及ぼす影響に差があることが明らかになった。即ち、腫瘍細胞であるHeLa細胞ではUpfl、SMG-1、SMG-7、MAGOH、BtZのノックダウンで細胞増殖が著明に抑制されたが、SMG-8のノックダウンでは全く抑制されず、SMG-6のノックダウンでマイルドな抑制であった。一方、Ullrich病患者繊維芽細胞の増殖は、SMG-8のノックダウンではHeLa細胞と同様に全く抑制されず、その他の因子のノックダウンでは抑制は認められるもののマイルドな抑制にとどまった。細胞周期に対する影響は、HeLa細胞、Ullrich病患者繊維芽細胞とも認められなかった。これまでの検討結果から、ノックダウンによる細胞生理機能への影響が少なくかつ治療効果の高いNMD構成因子としてSMG-8が有用と考えられた。そこで、長期的なNMD抑制が細胞生理機能に及ぼす影響についてさらに検討するために、ヒト筋芽細胞株を用いてSMG-1 SMG-8を標的としたsiRNA安定発現細胞株を作成した。mRNA監視機構とされるnonsense-mediated mRNA decay(NMD)は、遺伝子のリーディングフレーム途中に異常な早期終止コドンPTCが生じた変異mRNAを排除する生体機構である。NMDがその病態に負に作用することが明らかになったPTCを有するUllrich病患者繊維芽細胞をモデル細胞として、喪失していたcollagen VI α2 mRNA及びcollagen VI蛋白質を部分的に回復させることが明らかになったNMD関連分子であるUpf1、SMG-1、SMG-8、SMG6、SMG7、MAGOH、BtZ、RNPS1を標的とした合成siRNAによるNMD抑制が、細胞生理機能に及ぼす影響について検討した。NMD抑制により発現が予想される

aberrant proteinによるER stressの発生について、ER stress関連蛋白質の発現をwestern blotにて検討したが、これら7種のNMD関連分子のノックダウンではER stressの発生は認められなかった。細胞生理機能に及ぼす影響から、これら7種のNMD関連分子の中では、細胞増殖への影響が認められなかったSMG-8のノックダウンによるNMD抑制が有用と考えられた。そこで、SMG-8の長期的なノックダウンによるNMD抑制が細胞生理機能に及ぼす影響についてさらに検討するために、ヒト正常筋芽細胞株を用いてSMG-1、SMG-8を標的としたsiRNA安定発現細胞株を確立した。NMDの長期抑制により予想される変異蛋白質の増加によるER stressの発生について検討したが、いずれの細胞株でもER stressの発生は確認されなかったことから、NMD抑制治療の標的として長期的にもSMG-8の有用性が示唆された。NMD抑制による遺伝子疾患の治療をin vivoへ応用するためには、組織特異的にsiRNAを発現させる必要がある。そこで、筋肉特異的にNMDを抑制させるために、筋特異的なプロモーターを利用したsiRNA発現ベクターの確立を試みた。そのためにまず、マウス細胞系のNMDを抑制可能なsiRNAについて検討し、マウス配列が明らかとなっているNMD構成分子であるSMG-1,SMG-7を標的とした合成siRNAを作成した。これらのsiRNAをマウス筋芽細胞株に導入したところ、それぞれの蛋白分子のノックダウンとNMD抑制が確認できた。現在、筋特異的なプロモーターを選択して、siRNA発現ベクターの作成を試みている。
東南アジア地方自治ガバナンスに関する住民意識調査―フィリピンとインドネシアの比較

本研究では、東南アジア2カ国(インドネシアおよびフィリピン)における地方自治への住民参加と行政サービスに対する住民評価の現状を明らかにし、あわせて住民の幸福感を明らかにすることを目的に、住民意識調査を実施した。インドネシアについては、現地での実査を行う世論調査機関(Lingkaran Survei Indonesia)との間で質問項目およびサンプリングに関する最終協議を4月に行って調査票を確定させ、5月初旬から実査に入った。実査開始にあたって日本側研究者2名が調査員研修と初日の実査に同席して調査票およびインタビュー法に問題がないことを確認した。実査はおよそ2か月にわたって実施された。ジャワ島の全112県市と特別州の2市から5区村、各区村から3隣組、各隣組から2人(男女一名ずつ)をランダムに抽出した3420名を計画標本とし、3412名からの有効回答を得た。収集されたデータのクリーニングを進めるとともに、一部の調査結果に関して分析を行い、その成果を論文として公表した。フィリピンについては、前年度に引き続きインドネシア調査票との整合性に注意しつつ質問項目に関する検討を進めた。この過程で、8月および11月に現地調査を実施し、その成果を調査票に反映させた。また、現地で実査を行う世論調査機関(Social Weather Stations)との協議も行い、1月末に調査票とサンプル数を確定させた。実査は2月末から開始されたが、開始前の調査員研修と実査の初日には日本側研究者2名(実査に同行したのは1名)が同席し、調査票に問題がないことを確認した。実査は2月末から3月末までの1か月間行われた。ムスリム・ミンダナオ自治地域を除くフィリピン全国から80市町、各市町から5村、各村から6名(男女二名ずつ)をランダムに抽出した2400名を計画標本とし、2400名から回答を得た。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、フィリピンおよびインドネシアにおける地方自治への住民参加の実態をさぐり、地方政府のパフォーマンスに対する住民評価の一般的傾向を、社会調査論や統計学理論を用いて明らかにすることである。したがって、調査自治体や調査対象住民の選定は本研究の成否を左右するポイントになる。そこで、27年度は調査地点や調査対象住民選定の方法および調査票のデザインに関わる理論的検討に重点を置いた。まず、5月にインドネシアの研究者を交えて、特にインドネシアにおける調査方法に関する検討会議を開催し、10月には地域社会学の専門家から調査サンプルの選定方法に関わる理論的検討課題について助言を得た。そして、11月に地方自治に関する住民調査の経験を豊富に有する研究者を招いて、調査票のデザインを含めた住民調査の実施に関わる諸問題についての検討会議を行った。これらの理論的検討を経て調査票案を作成し、再び地域社会学の専門家からのコメントを得て同案を改訂する作業を行った。このような過程を踏んで作成された調査票案を用いて、2月から3月にかけてフィリピン、インドネシア両国においてプレテストを実施し、ここで得られた知見を取りまとめて28年度に継続予定である調査票の改訂作業のための資料を作成した。また、上記プレテストの期間中に、本調査において住民インタビューを担当する両国の世論調査機関の担当者との間で調査概要に関する協議を行った。以上の作業と並行して、調査票の質問項目検討のために、本研究と対応関係にある地方政府エリート調査の結果を用いて地方政府パフォーマンスの規定要因に関する分析を進め、その成果を国内外の学会における報告や学術誌への論文投稿等の形で公開し、また、2016年2月にはIndonesian Institute of Sciencesでワークショップを開催した。平成27年度は、フィリピンとインドネシアにおける地方自治住民調査の方法論および調査票の内容について検討を行い、また、現地の調査実施機関との間で調査委託の概要に関する協議を開始することが課題であったが、そのいずれについてもほぼ計画通りに進めることができた。住民調査の方法論に関しては、地方自治に関する住民調査の経験を有する研究者や都市社会学の専門家によるレクチャーを受けて、調査地点及び調査サンプルの選定方法と実地調査法に関する検討を行った。これをもとに研究代表者が調査票案を作成し、研究協力者の協力を受けながら研究分担者・連携研究者との間で事前の検討を行った。そのうえで、研究分担者が国内外の研究協力者・機関の支援を受けつつ、平成28年2月から3月にかけてフィリピン・インドネシア両国において1回目のプレテストを実施した。また、研究分担者は、プレテスト実施のために両国を訪問した際に、フィリピンおよびインドネシアそれぞれにおいて実査を担当する世論調査機関との間で調査計画の概要についての1回目の協議を行った。平成28年度は、前年度に集中的に実施した調査地点や調査サンプルの選定方法および調査票の設計に関わる理論的検討の結果を受けて、調査票の作成作業を進めるとともに調査サンプル選定方法に関する世論調査会社との協議を行った。まず、5月にインドネシアの研究者や地域社会学の専門家を招いて全体会議を開催し、調査票の設計方針およびサンプル数に関する協議を行うとともに、年度計画について検討した。その後、8月にはフィリピンにおいてプレテストを実施し、インドネシアでは地方自治体の首長や地域開発に携わるNGOスタッフ等へのインタビューを行って自治体と住民の関係の実態に関する情報を得て、調査票の改訂に反映させた。これらの現地調査結果をもとに、国内で各国担当班による検討会議を経て11月に再び全体会議を開催した。この会議では、調査票の共通質問項目の検討を中心に協議を行い、また翌年3月にインドネシアでの実施を予定している現地調査について打ち合わせを行った。

平成29年には、2月にフィリピン担当者による会議を実施して両国共通の質問項目に関する検討を進め、これを受けて、3月に実施するインドネシア調査で用いる調査票案を作成した。インドネシア調査では、東ジャワ州の自治体の中から都市的自治体と農村的自治体を選定し、各自治体で住民を対象にインタビューを行って調査票の改訂作業を進めた。以上の作業と並行して、インドネシア、フィリピン両国の世論調査会社との間で実査に要する予算の交渉を行った。インドネシアについては、調査予算の見積額に関しておおむねの合意を得ることができたため、3月のインドネシア現地調査の際に調査地点の選定方法やサンプリング方法に関する協議を進めた。他方、フィリピンについては、世論調査会社の見積額が当初予定を上回ったため、大学を含む複数の調査機関との間で新たに交渉を開始した。フィリピンにおける本調査で実際のインタビュー調査を委託することを予定している世論調査会社との交渉過程で、先方から提示された見積価格が当初予定していたものより高額になることが判明したため、他の世論調査会社や大学を含む複数の調査機関との間で交渉を進める必要が発生した。このため、調査地点の選定やサンプリング方法についての協議を進めることができなかった。また、フィリピンでは、平成28年に発足したデュテルテ新政権が実施している麻薬取締キャンペーンの影響で、現地調査を予定していた自治体での調査が困難になるなどの問題が発生し、調査票改訂のためのプレテストを十分に行うことができなかった。このため、フィリピンで使用する予定の調査票の改訂作業が遅れている。本研究では、東南アジア2カ国(インドネシアおよびフィリピン)における地方自治への住民参加と行政サービスに対する住民評価の現状を明らかにし、あわせて住民の幸福感を明らかにすることを目的に、住民意識調査を実施した。インドネシアについては、現地での実査を行う世論調査機関(Lingkaran Survei Indonesia)との間で質問項目およびサンプリングに関する最終協議を4月に行って調査票を確定させ、5月初旬から実査に入った。実査開始にあたって日本側研究者2名が調査員研修と初日の実査に同席して調査票およびインタビュー法に問題がないことを確認した。実査はおよそ2か月にわたって実施された。ジャワ島の全112県市と特別州の2市から5区村、各区村から3隣組、各隣組から2人(男女一名ずつ)をランダムに抽出した3420名を計画標本とし、3412名からの有効回答を得た。収集されたデータのクリーニングを進めるとともに、一部の調査結果に関して分析を行い、その成果を論文として公表した。フィリピンについては、前年度に引き続きインドネシア調査票との整合性に注意しつつ質問項目に関する検討を進めた。この過程で、8月および11月に現地調査を実施し、その成果を調査票に反映させた。
キラル・ジエノラート化学の開拓と遠隔不斉合成への展開

本研究では、キラル・ジエノラート化学という新分野を開拓し、これとシグマトリピー転位の化学を合体させることにより「不斉誘導/不斉転写/不斉誘導への連続」という遠隔不斉合成の新しいアプローチを確立した。すなわち(1)キラル補助基として(-)-サルタムを有するα,β-、もしくはβ,γ-不飽和カルボニル化合物から調製したリチウムもしくはボロンキラルジエノラートのアルキル化反応、もしくはアルドール反応が高い不斉誘導率(%de)と中程度のE/Z選択性を伴い進行することを見出した。さらにアルキル化反応の立体選択性に関して不斉補助基、塩基等の影響を精査した結果、(2R,5R)-ビス(メトキシメチル)ピロジリンを不斉補助基として、LHMDSを塩基として用いることにより、ほぼ完璧な立体選択性(%de,E/Z比)でアルキル化体を得ることに成功した。(2)この様にして得られたアリル化体およびアリルアルコールの[2,3]-転位(熱的)は高い不斉転写率を伴い進行し、それぞれCope転位体、oxy-Cope転位体が高立体選択的に得られた。これにより高度な遠隔不斉誘導法の確立に成功した。(3)上述のキラルジエノラートの不斉アリル化/Cope転位生成物を、1,4-還元し、キラルエノラートのアルキル化を行うことにより、1,3-synの遠隔不斉合成に成功した。さらにこの手法を用いてザラゴジン酸AのC6側鎖の不斉合成を達成した。(4)本手法を発展させ、キラルジエノラートのα-オキシ化、引き続くPd触媒[3,3]転位により遠隔位のC-O不斉制御にも成功した。効率的な不斉合成法の開発は、現代有機合成化学の中心課題である。近年、様々な不斉合成手法が開拓されているが、中でもキラル補助基をもつキラル・エノラートを用いる手法は、最も信頼性の高い不斉合成法の一つとして認知されている。これに対して、α,β-あるいはβ,γ-不飽和カルボニル体から生成されるキラル・ジエノラートの化学は、その高い潜在的有用性にも拘わらず全く未開拓の分野であった。もちろんキラル・ジエノラートの化学には、その求電子剤との反応における不斉誘導(%de)と末端二重結合の幾何制御など、キラルエノラート化学以上に難しい問題が含まれている。そこで本研究では、キラル・ジエノラート化学という新分野を開拓し、これとシグマトロピー転位の化学を合体させて新しい不斉合成法の開発を試みた。とくに「不斉誘導/不斉転写/不斉誘導の連続」という手法によって従来困難とされていた遠隔不斉合成の新しいアプローチを提供することを目指した。その結果、キラル・ジエノラートの高立体選択的生成法を確立し、これに基づく効率的遠隔不斉合成法を開発した。すなわち、キラル補助基として(-)-サルタムを有するα,β-不飽和アミドおよびβ,γ-不飽和アミドから、リチウムおよびボロン・ジエノラートを生成させ、そのアルキル化反応、アルドール反応を行った結果、高い不斉誘導率(%de)および高いE/Z選択性で末端二重結合の幾何配置を制御できることを見出した。また、このようにして得られたアリル化体およびアリルアルコールの[3,3]-転位(熱的)によりそれぞれCope転位生成物、oxy-Cope転位生成物を高立体選択的に得ることに成功し、13-遠隔不斉合成の新手法を開発することに成功した。本研究結果は、不斉合成の新しいコンセプトを提供し、キラル補助基をより高度に活用している点においても、極めて独創性に富んだ不斉合成手法である。

本研究では、キラル・ジエノラート化学という新分野を開拓し、これとシグマトロピー転位の化学を合体させることにより「不斉誘導/不斉転写/不斉誘導への連続」という遠隔不斉合成の新しいアプローチを確立した。既に前年度の本研究において、キラル補助基として(-)-サルタムを有するα,β-、もしくはβ,γ-不飽和カルボニル化合物から調製したリチウムともしくはボロンキラルジエノラートのアルキル化反応、もしくはアルドール反応が高い不斉誘導率(%de)の中程度のE/Z選択性を伴い進行することを見出している。そこで本年度は、このキラル・ジエノラートのアルキル化反応の立体選択性に関して不斉補助基、塩基等の影響を精査した。その結果、(2R,5R)-ビス(メトキシメチル)ピロジリンを不斉補助基として、LHMDSを塩基として用いることにより、ほぼ完璧な立体選択性(%de,E/Z比)でアルキル化体を得ることに成功した。得られた1,5-ジエン体のCope転位もしくはoxy-Cope転位に高い不斉転写率を伴い進行し、高度な遠隔不斉誘導に成功した。また、本概念をさらに発展させて、キラルジエノラートのα-オキシ化、引き続きPb触媒による[3,3]転位を行うことにより、遠隔位のC-O不斉を高度に制御することにも成功した。さらに、これらの新手法の遠隔不斉合成法としての有用性を明らかにするために、1,3-synの遠隔不斉を有するザラゴジン酸AのC6側鎖を合成した。すなわち、キラルジエノラートの不斉アリル化/Cope転位生成物を1,4-還元、キラルエノラートのアルキル化を経ることにより、その高立体選択的合成に成功した。
エキゾチック原子の分光による基礎物理量の精密測定

反陽子ヘリウム原子(ヘリウム原子核に反陽子と電子が束縛された準安定原子)の精密レーザー分光により、反陽子と電子の質量比を10^-9の高精度で決定した。この結果は科学技術データ委員会CODATAに提供され、基礎物理定数CODATA2010(理科年表や高校理科教科書などにも掲載されている基本的な物理量)の決定に貢献した。これにより、当初目標が達成された。反陽子原子,K中間子原子,エキゾチック原子,CERN,J-PARC,レーザー分光,X線分光,基礎物理定数エキゾチック原子は、反陽子など、電子以外の負電荷の粒子が原子核のまわりを回っている、自然界には存在しない奇妙な原子であり、それらが放出・吸収する光の周波数を精密に測定することで、通常原子の分光では得られない基礎物理定数を精密に決めることができる。本研究では、(1)反陽子ヘリウム原子と(2)K-中間子ヘリウム原子の二種類のエキゾチック・ヘリウム原子を高精度で分光し、陽子・電子質量比などの基礎物理定数の精度を格段に高めることをめざす。前者の研究はCERN研究所の反陽子減速器施設で、後者の研究はJ-PARC加速器のハドロン実験施設で推進する。エキゾチック原子は、反陽子など、電子以外の負電荷の粒子が原子核のまわりを回っている、自然界には存在しない奇妙な原子であり、それらが放出・吸収する光の周波数を精密に測定することで、通常原子の分光では得られない基礎物理定数を精密に決めることができる。本研究では、(1)反陽子ヘリウム原子と(2)K-中間子ヘリウム原子の2種類のエキゾチック・ヘリウム原子を高精度で分光し、陽子・電子質量比などの基礎物理定数の精度を格段に高めることをめざす。本年度、CERNにおいては反陽子ヘリウム原子レーザー分光でドップラー巾を減少させるための新しい分光手法を3つ考案し、そのうち二色二光子分光法についてはデータ収集を終え、残りの二つについても実験可能な方法であることを確認した。二色二光子分光法では、相対精度がlppb(10億分の1)を切り、従来の精度を更新することに成功した。一方J-PARCにおいては、K1.8BRというK中間子ビームラインの整備を進め、年度末にJ-PARCの陽子シンクロトロンから初めて30GeVの陽子ビームが試験的に取り出された時点で、飛行時間差測定からK中間子の発生が確認できた。これと並行して進めたX線測定用のシリコン・ドリフト検出器(SDD)を組み込むヘリウム3標的の建設と冷却試験も完了した。本年度、CERNにおいては反陽子ヘリウム原子レーザー分光でドップラー巾を減少させるための新しい分光手法のうち、二色二光子分光法についてはデータ収集を終えた。これに加えて、新しい試みとして飽和分光法を開発し、この方法が将来的には最も系統誤差を減らせる方法であるとの見通しを得た。ただし、現在のままでは信号強度が微弱であり、標的ヘリウムガスを1.5Kに冷却する必要があることも判明した。また、以前の測定では理論値と実験値の間に数十ppbの違いが見られた反陽子ヘリウム3原子を新しく改良したチタン・サファイアレーザーで分光し、理論値と実験値は数ppbの実験誤差範囲で一致することが示された。一方J-PARCにおいては、K1.8BRというK中間子ビームラインの整備を進め、ビーム中のK中間子とπ中間子の分離、K中間子の収量などを最適化した。これと並行してX線測定用のシリコン・ドリフト検出器およびヘリウム3標的の調整も進めた。これらにより、加速器の陽子ビーム強度が上がれば、本番実験が行える見通しを得た。

本年度、CERNにおいては反陽子ヘリウム原子を1.5Kの低温ガス中で生成してドップラー幅を減らす実験を開始すべく、標的減圧用の大型ポンプを設置した。それを用いて実験を行い、予定通りに分光精度が高まっていることが確認されたため、反陽子ヘリウム3と反陽子ヘリウム4の12本の共鳴線を高精度かつ系統的な測定を行った。一方J-PARCにおいては、K中間子ビームラインの整備やX線測定用のシリコン・ドリフト検出器およびヘリウム3標的の調整が進み、加速器の陽子ビーム強度が上がれば、K中間子ヘリウム3原子のX線分光の本番実験が行える見通しであったところであるが、東日本大震災でJ-PARCが被災し、我々の実験装置も被害を受けたため、実験開始に至らなかった。また、2011年日本物理学会春の年会は震災で中止になったため繰越を行った。エキゾチック原子は、反陽子など、電子以外の負電荷の粒子が原子核のまわりを回っている、自然界には存在しない奇妙な原子であり、それらが放出・吸収する光の周波数を精密に測定することで、通常原子の分光では得られない基礎物理定数を精密に決めることができる。本研究では、(1)反陽子ヘリウム原子と(2)K-中間子ヘリウム原子の2種類のエキゾチック・ヘリウム原子を高精度で分光し、陽子・電子質量比などの基礎物理定数の精度を格段に高めることをめざす。前者の研究はCERN研究所の反陽子減速器施設で、後者の研究はJ-PARC加速器のハドロン実験施設で推進する。本年度、CERNにおいて行なってきた反陽子ヘリウム原子の二光子分光の成果がまとまり、Nature誌に発表した。これに先立ち、我々がこの実験で決定した反陽子・電子質量比(CPT対称性を仮定すればこれは陽子・電子質量比に等しい)を、基礎物理定数を調整している科学技術委員会CODATAに提供したところ、基礎物理定数の最新値CODATA2010に、我々の実験結果が反映された。これにより本研究の当初目的の一つが達成された。また、昨年度より行なっている1.5Kに冷却してドップラー幅を狭めた反陽子ヘリウム原子の分光データの収集を完了した。一方J-PARCにおいては、東日本大震災で被害を受けた実験装置等の復旧につとめ、加速器運転がされれば実験が可能な状況にまで回復することが出来た。しかし現時点では実験開始に至っていない。エキゾチック原子は、反陽子など、電子以外の負電荷の粒子が原子核のまわりを回っている、自然界には存在しない奇妙な原子であり、それらが放出・吸収する光の周波数を精密に測定することで、通常原子の分光では得られない基礎物理量を精密に決めることができる。本研究では、(1)反陽子ヘリウム原子と(2)K中間子ヘリウム原子の2種類のエキゾチック・ヘリウム原子を高精度で分光し、陽子・電子質量比などの基礎物理定数の精度を格段に高めることをめざしている。本年度、CERNにおける反陽子ヘリウム4原子および反陽子ヘリウム3原子の分光については、ヘリウムガス標的温度を1.5Kまで冷却することで、ドップラー効果による単光子共鳴線幅を従来の1/10に減らした測定を完了した。これにより、反陽子・電子質量比の相対精度が、陽子・電子質量比に匹敵する0.5ppb(20億分の1)程度にまで向上したと見込んでいるが、最終的な結果の取りまとめには今後約1年を要する。
金融機関のリスク・エクスポジャーと新しい金融規制

バーゼルII導入後の日本の金融機関の自己資本比率の調整行動を実証的に分析した。部分調整モデルを用いて、ポートフォリオのサイズと構成を分析し、自己資本比率の分子と分母の調整速度を推計した。その結果、日本の銀行は資産サイズよりもポートフォリオの構成をより早く調整したことが分かった。また、自己資本比率の分子の調整速度は分母の調整速度よりも早いことが分かった。さらに、自己資本比率の余剰が少ない銀行はポートフォリオの構成をリスクの低い資産に移したことも分かった。また、日本の金融危機におけるシステミックリスクの研究では、政府の危機管理策がシステミックリスクの低下に一定の貢献をしていることが分かった。バーゼルIIにおいて新たに導入された、信用リスクの計測における内部格付け手法を取り上げて、新規制が金融機関に与えた影響を検討した。バーゼルII規制においてもっとも重視されたことは、金融機関みずからがリスク管理を適切に行い、また、それが反映されるような規制体系を作ることであったといえる。このような観点からは、内部格付け手法の導入が信用リスク・エクスポジャーの低下につながったか否か、内部格付け手法を導入した銀行とそうではない銀行の競争力に違いが生じたか否か、今後のバーゼルIIIにおいて、自己資本比率基準の引き上げなどがどのような影響をもつかが問題となる。こうした点について、計量経済学的な手法に基づいて分析・検討を行った。具体的には、内部格付け手法の導入は金融機関の信用リスク・ウェイトを引き下げたという仮説を検証するため、リスク加重資産について部分調整モデル方程式を推計した。その結果、内部格付け手法は有意にリスク加重資産を減少させることが確認された。これは、信用リスク評価に標準的手法を用いた場合と、内部格付け手法を用いた場合のリスク・ウェイトに統計的に有意な差がみられることを示す。推定方法は、アレラノ=ボンドの一般化モーメント法によるパネル推定である。これは、リスク加重資産などの内生性を考慮するためである。また、同時に、自己資本比率の分子と分母の調整速度の推計も行った。調整速度の推計値はモデルに依存するが、おおむね、分母であるリスク加重資産の調整速度は分子である規制資本または自己資本比率自体よりも遅いことが示された。まとめると、日本の銀行はバーゼルIIの導入以後、やや時間をかけながら、自己資本比率の分母を中心に自己資本比率の維持に努めてきたが、一部の銀行は内部格付け手法を取り入れることによって、より高い自己資本比率を実現してきたといえる。分析は、今後バーゼルIIIに導入されることが決まっている資本保全バファー等への政策的インプリケーションをえることができる。また、日本の金融危機におけるシステミックリスクの研究では、公的資金注入、早期是正措置、預金保険改革など政府の危機管理策がシステミックリスクの低下に一定の貢献をしていることが分かった。ただし、破たん処理政策はシステミックリスクを増大させる場合があった。これらの結果は、銀行救済が流動性の供給をつうじてシステミックリスクを低下させるという理論的予想と整合的である。また、この流動性供給は、破たん銀行や資本注入行のシステミックリスクを低下させるよりも、他の銀行のシステミックリスクを低減させるという外部効果を通じていることが分かった。当初の予定よりも、実証分析の手法が容易であったため。金融システミックリスクの分析について、より包括的なアプローチを試みるようにする。途中で推計方法の変更を行ったため、やや遅れが出たが、おおむね当初の予想通りの推定結果をえることができたため。日程等の調整がうまくいかなかったため、研究会を開催することができず、謝金の支出が計画どおりにいかなかったから。

今後は、リスク加重資産の部分調整モデルに、証券保有比率を導入し、推定結果の改善を試みる。マーケットでは、ローンと比べ相対的に、ポートフォリオの変更を速やかに行うことができるため、より精緻な推定結果がえられることが期待される。特に、証券保有比率がリスク加重資産を低下させるという仮説を検証する。また、自己資本比率の分子である資本の増資についてもデータを収集し、分析の対象に加えることを考える。特に、増資を行う確率モデルを推定し、自己資本比率の低い銀行が、バーゼル規制の強化にあわせて、増資をおこなったという仮説を考える。研究成果の発表のための出張を計画よりも増やす。また、社会への情報発信のために追加的な研究を行う。
レーザアブレーションプラズマを用いた自然水の現場成分分析手法に関する研究

本研究では、湖、海、川などの水に含まれる成分を、その場で計測する化学分析技術を開発している。開発した、レーザー誘起破壊分光では、高出力のレーザーを液中に照射し、プラズマを生成する。プラズマの光の波長を分析することによって、含まれている元素成分をリアルタイムに知ることができる。本研究では、このような計測が、自然界に存在する高圧(数100気圧)、高温(数100度)の極限環境でも適応可能であることを実証した。さらに、照射するレーザーのショットごとのエネルギー、また、発生するプラズマの光量を時系列で計測することによって、本研究で開発した手法によるその場計測の高精度化を図ることができた。レーザアブレーションプラズマを用いた自然水の現場成分分析の高精度化、高感度化を図る事が本研究の目的である。ベースとなるプラズマ分光では、3000mの高圧下において、液体に含まれている複数元素を100ppbの感度、20%程の精度でその場分析する事が可能である。今年度は、分光するプラズマを生成するレーザの照射方法、また得られるスペクトルの解析手法による計測の高精度化、高感度化ついて検討した。レーザ照射に関して、従来の<10nsパルスによる計測と、150nsのロングパルスを用いた計測実験を実施した。スペクトル分析と合わせて高速カメラによるプラズマイメージングを3000mまでの高圧下でおこなった。すべての計測した圧力条件で、同じパルスのエネルギーでは150nsのロングパルスを用いた方が、従来の<10nsより効率的にプラズマが発光することを実証し、さらに、得られるスペクトルピークの幅が細いため、より理想的な元素発光が観測できることを示した[1]。スペクトルデータの解析に関して、ロングパルスを使う事によって励起されやすくなる複数のピークを、統合的に解析する事によって、元素あたり一つのピークのみを使う場合より、定量的に解析できる濃度範囲が広い新たな分析手法を研究開発した。2013年12月には、3000mで適応可能な現場型ロングパルスレーザを用いたプラズマ分析装置を用いて、1000m以上の深度で現場計測データを取得することに成功した。開発した分析手法を用いて、実海域のデータを解析中である。これらの研究内容と合わせて、より高感度な計測を目的とした電気分解による計測領域の濃縮手法の検討を行った。来年度は、引き続き電気分解濃縮実験を行い、さらに時間分解計測を有するプラズマ分光計測を行うことによって、より高精度・高感度な現場分析が実現できるか検討する。レーザーアブレーションプラズマを用いて、リアルタイムに濃度が変化する自然水の物理元素を定量的に現場分析できる手法の開発を行っている。今年度は、現場化学分析センサの開発に関しては、実験室でのセンサに関する評価試験において、時間分解を有する分光計測装置を開発し、これを用いて50ナノ秒の時間分解を持つ、連続的な発光計測実験を行った。上記実験室における評価を踏まえ、改良を加えた現場化学分析センサを用いて、実海域における計測試験を2014年12月に実施した。実海域調査に関しては、3000m級の現場型LIBS装置を1000mより深い伊平屋北海域において、アクティブな熱水噴出海域で他元素化学成分を定量解析するためのデータを取得することに成功した。センサ開発・改良と同時並行して、取得したデータの解析手法の開発に取り組んだ。自然水では、得られるスペクトルにピークが少ないため、プラズマ現象を検出できず、定量評価できない場合がある。これを解決するために、レーザパルスの発光を同様に50ナノ秒の時間分解で計測できるシステムを開発し、レーザのバラつきの観測信号への影響を定量的に評価した。レーザのエネルギを一定にしても信号の値がばらつくことが分かり、得られた信号を用いて、観測信号をフィルタリングすることによって計測信号の誤差を少なくできる定量解析手法を開発した。本提案手法は、H27年度に、国際学会で発表することが決まっている。今年度は、自然の水環境における、溶存元素の濃度をその場で定量化するため、標準資料を用いた室内実験を行った。これには、レーザーでプラズマを発生すると同時に、プラズマの発生条件を把握するため、プラズマの発生位置を計測し、プラズマ光量の時系列変化及びプラズマを発生するレーザーパルスの波形と強度を同期して計測した。高温熱水を想定し、高温、高圧熱水計測試験装置を用いた試験も実施した。本実験により、計測するLIBS信号の強度をプラズマの発生条件によってフィルタリングすることによって、計測のバラツキを大幅に軽減できることを実証できた。特にレーザーを発生するレーザーパルスの条件の計測への影響が大きいことがわかり、これを元に補正することで現場での計測制度が向上できることを実証した。今年度は、計画していた時間分解計測を実施することに成功した。また、レーザのバラ付きによる計測への影響を解析し、計測誤差を軽減する手法を開発した。実海域調査において、解析するデータを取得することに成功した。

27年度が最終年度であるため、記入しない。海洋フォトニックス研究の最終年度は、これまで取得した実海域データの定量解析を行う。また、レーザのバラ付きによって、計測信号への影響を定量的に解析することができたが、レーザのバラ付きだけで説明できないバラ付きの要素が残ることが、時間分解を有する分光計測とレーザ時間分解プロフィール計測の結果から明らかになった。このため、最終年度では、より高精度な他元素分析を実現するため、プラズマ発光をトリガーとしたスペクトル計測手法を開発する。LIBS計測では、レーザを打つタイミングを元に、スペクトルを観測するのが一般的だが、これまでの研究でレーザそのもののバラ付きによって、プラズマが発生するタイミングその物が変わることがわかり、一定のタイミングで最適な計測を行うことができない。そこで、昨年度の研究では、時間分解を有するプラズマ計測システムを開発し、その有効性を示したが、時間分解を有するセンサ及び記録回路は、チャンネルの数が限られるため、広い班長範囲において他元素分析を行うには、波長分解能がすくない問題がある。このため、本研究では、プラズマの発生のタイミングを時間分解計測するシステムを開発し、発生のタイミングそのものをトリガーとし、従来の分光計測システムを用いて広い波長範囲において、プラズマ発光を分校計測するシステムを開発する。これによって、プラズマ発光を基準としたタイミングで計測することが可能となり、発光時間のバラ付きの影響が軽減できるため、より高精度で安定的な他元素分析が実現できると考える。レーザ照射方法について、研究は順調に進んでいる。従来手法と定量的な比較をおこなうことができ、以下のPeer review Journalに成果が刊行される(現在in press)。本目的に関しては、当初計画していた通りである。スペクトルデータの解析手法に関しては、おおむね計画通りである。当初計画していた複数のピークを解析することによって、計測できる濃度範囲を広げることができ、感度と計測精度の向上が実現できていることは実証した。従来手法との定量的な比較は現在行っているところで、比較結果がまとまるのは来年度中となる。当初の計画されていなかった、ロングパルスレーザを用いた実海域試験を行うことができ、1000m以上の深海において、順調にデータを取得する事に成功し、現在データは解析中である。また、来年度計画していた電気分解濃縮の基礎実験が実施できており、これらの2点に間しては当初計画以上に進展している。現場計測データが取得できていることと、来年度の研究項目の検討が進められているため、総合的には当初の計画以上に進展していると考えている。来年度は、当初の計画通りに、電気分解濃縮によるプラズマ計測の高感度化の研究を行う予定である。
RNA結合タンパクのノックダウンによる口腔がん治療のための基礎研究

HuRは細胞増殖などに関連するARE-mRNAを核外輸送及び安定化するRNA結合タンパクである。本研究では、口腔がん細胞のHuRをノックダウンすることにより、ARE-mRNAの核外輸送及び安定化が抑制され、細胞周期を促進するタンパクの発現が減少し、足場非依存的な細胞増殖能などの悪性形質も減弱することが明らかになった。これらの結果はHuRノックダウンが口腔がんの治療に応用可能であることを示している。本研究の目的は口腔がん細胞でHuRの発現をRNAi法でノックダウンし、その手法を口腔がんの治療に利用するための基礎的研究を行うことである。ノックダウンのために、RNAi法用のsiRNAの設計を行い、細胞にsiRNAを導入してHuRのmRNAや,タンパクの減少を確認し、さらにc-fosなどのARE-mRNAの核外輸送や安定化が阻害されるかどうか検討する。次にHuRがノックダウンされた細胞の性質、特にがんに関わる形質を様々な角度から検討する。また開発したRNAiの技術を最終的にはヒトへの遺伝子治療への応用ができるように、RNAiのベクターを組み込んだアデノウイルス開発も目的に含める。RNAi法の確立初年度はHuRのノックダウンに必要なsiRNAを設計・作成し、実際に口腔がん細胞に導入してみてRuRがノックダウンされるかどうか基礎的検討を行った。1、siRNAの設定(研究代表者の東野史裕、研究分担者の樋田京子、北村哲也が担当)2、siRNAの細胞への導入(研究代表者の東野史裕、研究分担者の進藤正信、戸塚靖則が担当)設定したsiRNAが細胞中で実際にHuRの発現をノックダウンするかどうかを調べるために、口腔がん細胞(HSC3、Ca9.22等)や口腔正常細胞(HGF、PDL細胞等)にsiRNAをsiMAX(RNAi用のトランスフェクション試薬)を用いて導入した。その後、real-time RT-PCR法でHuRのmRNAの量を確認し、さらにウエスタン法でHuRタンパクの増減も検討した。その結果、siRNAの導入により、HuRのmRNAもHuRタンパクも効率よくノックダウンされることが明らかになった。今後、HuRノックダウン細胞の性質を詳細に調べる予定である。1)口腔がん細胞で発現しているARE-mRNAの核外輸送・安定化初年度は各種がん細胞と正常細胞でのARE-mRNAの核外輸送・安定化を検討した。その結果どのがん細胞でも、正常細胞と比べるとおおむねARE-mRNAが細胞質に多く局在し、さらに安定化されていることが明らかになった。さらにがん細胞では、CRM1非依存的にARE-mRNAが核外輸送されていることも解明した。これらの研究結果はBritishjournal of cancer, 100, 1943-1948, 2009に発表した。2)RNA結合タンパクのノックダウン次にHuRとpp32をノックダウンするために、RNAi法用のsiRNAの設計を行い、細胞にsiRNAを導入してHuRのmRNAやタンパクの減少を確認し、さらにc-fosなどのARE-mRNAの核外輸送や安定化が阻害されるかどうか検討した。さらにHuRがノックダウンされた細胞の性質、特にがんに関わる形質を様々な角度から検討した。その結果HuRノックダウンによりARE-mRNAの核外輸送・安定化が阻害され、HuRがノックダウンされたがん細胞は、足場非依存性の増殖能や、浸潤能などのがん細胞の性質を失った。以上の研究成果は、Molecular Cancer Researchに掲載が決定し、現在印刷中である。初年度は、ノックダウンのために、RNAi法用のsiRNAの設計を行い、細胞にsiRNAを導入してHuRのmRNAやタンパクの減少を確認し、さらにc-fosなどのARE-mRNAの核外輸送や安定化が阻害されるかどうか検討した。また次年度は、HuRがノックダウンされた細胞の性質、特にがんの足場非依存性増殖に関わる形質を検討した。本年度は、HuRノックダウンされた口腔がん細胞の浸潤能を検討し、HuRをstableにノックダウンするためにHuRのshRNAを持つ発現ベクター作成を試みた。1)RNA結合タンパクのノックダウンHuRノックダウンした口腔がん細胞の浸潤能に焦点を当て詳しく解析した結果、HuRノックダウンにより浸潤能が低下し、この現象にはマトリクスメタロプロテアーゼMMP1の発現が関わることを解明した。さらに、MMP1遺伝子の転写に関わる転写因子、AP1やEtsファミリーの発現も低下していることを確認し、現在論文投稿中である。2)HuRのノックダウン用ベクターHuRのshRNAをpSuperプラスミドに導入することにより、HuRをstableにノックダウンする発現ベクターの作成に成功した。

また、このベクターを用いて、アデノウイルスのがん遺伝子E4orf6でトランスフォームしたがん細胞のHuRを恒常的にノックダウンすることにも成功した。この細胞はソフトアガー中でコロニーをほとんど形成できず、HuRノックダウンががんの足場非依存性増殖を抑制することを再確認できた。この成果を含む論文はOncogeneに受理された。
フレイト・フォワーダーの法的地位―イギリス及び英法系諸国を中心に―

国際複合一貫輸送において荷主と運送業者との間に介在し、重要な役割を果たしているフレイト・フォワーダー(以下、フォワーダー)の地位をどのように法的に位置づけるべきかという現代的問題に関して、実際のフォワーダーの業務内容の時代的、質的変容を考察するとともに、伝統的海運国である英国及び英法系諸国におけるフォワーダーの性格を検討した。その結果、同法系の下ではフォワーダーを荷主の代理人としての地位から運送契約の主体として捉えられており、その地位の識別やそれぞれの理論構成に関して新しい示唆を得ることができた。本研究は、近年の国際複合一貫輸送を背景に台頭した運送の第三当事者であるFreight Forwarder(以下、フォワーダーとする)の法的な地位ないし性質を検討し、その変貌する経済活動主体を法的に位置づけることを目的とする。筆者はすでにこの頭記研究につき、アメリカ法につき考察を行ったが、本年度は、伝統的海運国家であり、かつ英法体系の本源であるイギリスを中心に研究を行なった。イギリスは、アメリカと異なり、フォワーダー概念の定義規定を有さず、また、その参入規制、約款規制、料金規制等の法的規制がない。そこで、根拠法のないフォワーダーの私法上の地位の考察にあたっては、判例法の検討が重要な手法であり、フォワーダーの実際の機能・業容を把握しながら検討を進めた。伝統的判決から最新判決に至る判例法の理論構成について、その社会的背景、実務実態を踏まえつつ考察し、また、判例法の考察とリンクさせて、英法上補助的法源とされる学説の検討を行なった。その結果、イギリスでは、実際のフォワーダーの業容の質的変化とともに、判例法によるフォワーダーの地位の理論構成も新たな展開があり、伝統的な代理法に基づき荷主ないし荷送人の代理人(agent)として構成されていたのが、現代では、利用運送人としての機能を果たすようになり、自己の名で実運送人と顧客の貨物の運送を契約する本人(principal)として構成する判例が現れている。また、こうしたフォワーダーの地位の識別に関しては、複数の基準を定立し個々の事案において判断されている。本年度の成果は、研究の発展段階での中間発表として日本海法学会において研究報告を行なった。そこで得られた問題点は、理論を詰める作業を行うとともに、これまでの英米2国に関する考察を踏まえ、来年度は、豪、加など英米法系諸国を対象として、フォワーダーの法的地位ないし性質を検討していきたい。本年度は、昨年度のイギリスの考察を踏まえ、英法系に属するオーストラリアを対象とした。オーストラリアに関する固有の文献や論文は少なく、継続的に検索・収集を行いながら研究を進めた。まず、オーストラリアにおけるフォワーダーの地位は、当初、イギリスの一連の判決の影響を受け、荷主のために海上運送人と運送契約を締結する荷主の「代理人(agent)」として法律構成されてきたが、近年では、コンテナによる海陸複合輸送の中で急成長したオーストラリアのフォワーダーの実像に合わせ、「本人(principal)」として荷主と運送契約を締結する者と解するのが判例及び学説の見解であることを確認した。このようにフォワーダーが荷主と運送契約をする地位にある者として法律構成する場合、問題となるのは、海上輸送中の貨物の滅失・毀損の場面で、海上運送人と直接の契約関係(privity of contract)にない荷主が、運送人に対して損害賠償請求訴訟を提起しうるかである。この議論に関して、オーストラリアの判例およびその母法であるイギリス判例も含めた考察を行い、その結果、フォワーダーの地位の理論構成にみられる特徴として、寄託(bailment)法理による法律構成が展開されてきたことが明らかになった。すなわち、荷主を寄託者、フォワーダーを受寄者(bailee)、実運送人を再受寄者(sub-bailee)として捉えることにより、荷主は、B/L上の当事者ではなくとも、B/L条項の主張を受ける地位にあると理論構成するのである。さらに、近時の判例では、寄託構成の成否をめぐる判断基準に関しても議論が進んでいる。研究過程において、イギリスおよびオーストラリアの法状況の根本的解明には、母法たるイギリス法の寄託理論の基礎研究が不可欠であることも認識するに至ったが、まずはここまで得られた研究成果を近日中に公表すべく準備をしている。商法、会社法本研究の目的は、荷主と運送業者との間に介在し、第三者として運送の手配を行うフォワーダーの地位を法律的にどのように理論構成をすべきかという問題に関して、海運国家として伝統のあるイギリスを中心に、オーストラリア、カナダなど英米法系諸国を対象として、変貌する経済活動主体であるフォワーダーの法的な地位ないし性質を検討し、法的に位置づけることである。現在までのところ、まず英法体系の本源であるイギリスに関して、判例法の検索・入手およびその分析を行ない、伝統的判決から最新判決に至る判例法の理論構成を明らかにした。また、学術書、その他論文等の検索および入手し、学説の状況を踏まえ、判例法の理解および客観的検討を進めた。

また、その研究成果は、昨秋、イギリスにおけるフォワーダーの法的地位をテーマとして日本海法学会において研究報告(単独)を行なった。右学会報告においては、実務家の弁護士、学者などから有意義な質問・意見を戴き、議論を通して新たな問題点を発見することもできた。これらの点を踏まえて、さらに検討を進めている。以上の通り、25年度の研究目的および計画に示した点は概ね順調に進捗している。今後は、イギリスの考察を踏まえ、英法系に属するオーストラリア及びカナダの2カ国を研究対象とする。現段階の資料収集を基にしていえば、2カ国のうちオーストラリアの方が研究材料は多いように思われる。そこで、研究の順番としては、オーストラリア法から研究をスタートする。オーストラリアにおいてフォワーダーの地位は、当初、先に示したイギリスのリーディング・ケースであるJones事件をはじめとする一連の判決に影響され、フォワーダーの立場を荷送人の代理人と解釈し、あるいは、隠れたる本人法理(as an undisclosed principal)で、フォワーダーは荷送人のために海上運送人と運送契約を締結する者として法律構成されてきた。しかし、近年のコンテナによる輸送革新の中で急成長したオーストラリアのフォワーダーの実像は、本人(principal)として荷送人と運送契約を締結するのが当然であるとされており、これが、フォワーダーの地位に関する現在のオーストラリアの判例法の主流であり、学説も支持する考え方でもある。なお、カナダについても、概ねオーストラリア法と同様の法状況にあると想定しているが、この辺りは、オーストラリアの研究と並行しながら、適当な研究材料を収集して解明していく。最終的には、わが国での法制度のあり方を提示することも目途とする。そこで、わが国におけるフォワーダーに関する資料・情報収集のため「一般社団法人国際フレイトフォワーダーズ協会」(JIFFA)への訪問調査も行う予定である。
ゆらぎ原理にしたがう長期シナプス可塑性

申請者が記憶の固定過程のモデル実験系と提唱する「繰返しLTP誘発後のシナプス新生」と「繰返しLTD誘発後のシナプス廃止」について、その進行過程を、同一細胞の同一部位を経時的に観測することで解析した。その結果、シナプスは常時新規伸出と退縮を行う「ゆらぎ」状態にあるが、シナプス新生はまず「ゆらぎの増大」期、ついで「ゆらぎのバイアス(伸出率>退縮率)」期を経て、確率論的に進行することがわかった。しかし、シナプス廃止は「ゆらぎの増大」期を経ることなく、刺激後直ちに「ゆらぎのバイアス(伸出率<退縮率)」期に入った。様々な点で鏡像的な性質をもつシナプス新生と廃止は、途中過程の点では鏡像的ではなかった。本課題の目的は、申請者らが発見し、記憶固定過程のガラス器内再現と見なしうる、繰り返しLTP誘発後のシナプス強化・増加現象(RISE)と、繰り返しLTD誘発後のシナプス弱化・減少現象(LOSS)について、シナプス増加/減少という結果に至るまでの過程を経時的に追跡して、その確率論的(stochastic)なふるまいを明らかにすることである。本年度は、昨年度の知見を確定させて論文として発表するいっぽう、以下の新知見をえた。第一に、シナプスは常時発出・退縮を繰り返す動的平衡状態にあり、RISEでは「ゆらぎの一過的増大期」と「ゆらぎのバイアス期」を経て、結果的に増加するのに対し、LOSSでは「ゆらぎ増大期」が見られず、即「バイアス期」に入るという結果を、観測間隔をより小さくとることで「ゆらぎ増大期はあるが、それが短いために数日間隔の観測では見逃されていた」という可能性を排除した。第二に、RISEが成熟後脳でのシナプス形成の再現であるならば、同様の確率論的振舞いが、発達期脳でのシナプス形成においても見られるか、という問いを立て、培養開始直後(培養は生後5-7日の新生仔脳から作成する)の切片について、同様の経時的観測を行った。その結果、たしかに常時ゆらぎはあるものの、発出率が退縮率を上回っており、培養の経過(成熟)とともに退縮率が上昇する形で、成熟期での均衡状態に至ることがわかった。これらの知見を通じて、シナプスの動態を調節してシナプス数の増加・減少を決めているのは、発出率ではなく退縮率である、という意外な事実が明らかになった。本研究課題は、長期記憶の細胞基盤であるシナプスの新生・廃止が、どのような動態で進行するかを、私たちが独自に樹立したインビトロ・モデル実験系を用いて解析することを目的とする。シナプス新生(廃止)は、刺激によりシナプスを発出(消退)させる機構が起動して実現するように考えられている。しかし、実際のシナプスは無刺激時にも一定の率で発出・消退を繰り返しており、両者が均衡して総数に増減のない状態(動的平衡)を保っている。したがって、シナプス数の増加(減少)は、発出率を上げ(下げ)ても、消退率を下げ(上げ)ても実現する。実際はどうなのか。今年度は以下のような成果を得た。培養海馬切片中の神経細胞を蛍光標識し、同一細胞の同一部位を経時的に追跡観察しながら、LTPを繰り返し誘発すると、シナプス新生は(1)発出率・消退率がともに増す「ゆらぎ増大期」(2)消退率が下がって総数が増す「ゆらぎ不均衡期」(3)発出率も下がる「再均衡期」の順を追って進行することがわかった。つまり、刺激後単に発出率が上がって増加するような「一方向的過程」をたどるわけではなかった。次に、LTDを繰り返し誘発すると、シナプス廃止が新生と裏返しの経過をとると予想したが、予想に反してそうではなく、発出率は不変のまま、(4)消退率が上がって総数が減る「ゆらぎ不均衡期」(5)消退率が下がる「再均衡期」という順を追って進行した。これまでシナプス新生と廃止は、時間経過、刺激の繰り返し回数、要求する神経栄養因子など、さまざまな点で鏡像的なふるまいをみせてきたが、詳細に動態を追うと必ずしも鏡像的ではないことがわかった。この結果は、シナプスの新生・廃止を生み出す制御機構、とくに骨格の安定性制御機構に関して、多くの示唆を与えるものである。予想と違う結果になったという意味では3であるが、意外な発見がえられたという意味では1である。そこで2と総合評価する。シナプス廃止は、予想と異なり「ゆらぎ増大期」を経ることはなかった。その結果、新たな疑問が生じた。