hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
回折イメージング法による結晶化ドロップ評価および最適結晶化条件探索の自動化

生体高分子のX線結晶構造解析において結晶化はその後の構造解析の成否を決める極めて重要な工程である。本研究では、結晶化ドロップに直接微小X線を照射し回折像を得ることで、回折性を可視化する回折イメージング法を開発し、結晶化ドロップ中のタンパク質結晶の有無から結晶の数、結晶の質までの多岐にわたるスコアリングを客観的に、且つ全自動で行うことを目的としてきた。本研究では期間全体を通して、回折像を如何に迅速にスコアリング・可視化を行うか、ということを重要視してソフトウェア開発に取り組んできた。その結果、研究期間中に別予算により導入されたEIGER X 16M検出器では約1800万画素の回折像を最大133Hzにて出力するが、そのような場合でも回折像取得から数秒後にはスコアリングが完了するようになった。このソフトウェアは本研究の回折イメージングのみならず、PFタンパク質結晶構造解析ビームラインで広く使用されている。一方で、最終年度まで課題として残っていた高速測定については、調査の結果駆動ステージのトルク不足で高精度な位置制御が困難であることが分かった。今後高速測定を実現させるためには、結晶化プレートのサポートの軽量化が必須であると考えられる。結晶化ドロップの回折イメージングによるスコアリングと結晶化条件を結びつけ、その相関を解析することで、最適な結晶化条件を導き出すことも本研究の目的の一つであった。実際にスコアリング結果と結晶化条件の相関を調べたところ、現時点では明らかな相関を得ることは出来なかった。これは件数が少ないことが原因と考えられる。今後データを蓄積してさらなる解析を行う。研究計画ではH28年度は要素技術開発として、結晶化ドロップの回折イメージング法の確立と、得られた情報から結晶化ドロップのスコアリング方法の検討を行うこと、さらに結晶化スクリーニングにおける結晶化条件と回折イメージング法から得られるスコアから最適な結晶化条件を導出する方法について検討を行うこととなっていた。しかしながら計画の根幹である回折イメージング法の確立について、測定装置の制御システムおよび駆動ステージの不具合により期待したまで進めることが出来ず、計画は遅れ気味である。不具合の解決方針は決定することができたので、H29年度は早急に不具合の改善を実施し、予定した計画まで戻すことに努める。また、不具合のあるなか限定的な条件でデータを取得できたので、それを用いて回折データのマッピング等は鋭意進めているところである。H28年度は次にあげる3つの要素技術開発を行う予定であった。1結晶化ドロップの回折イメージング法の確立、2結晶化ドロップのスコアリング方法の検討、3最適な結晶化条件の導出。1について年度前半でテストデータを収集している際に、回折計の制御ソフトウェアや駆動ステージの精度に問題があり、正確な回折データセットが得られないという問題が発生し、この対応に相当な時間を割かれてしまった。また、2016年8月2017年2月までは、所属機関の長期海外派遣制度により海外出張を行っていたこともこの問題の解決に時間を要してしまった一因であった。現在は回折計の動作速度に十分な制限を加えることで、信頼に足る回折データを取得できる状態となったが、回折ドロップ全体に回折イメージング法を適用するには時間がかかりすぎるため早急な改善が必要である。2と3を行う上では1のイメージング法の確立とそこから得られる回折データセットが必須であったが、上記の遅れにより、こちらの進捗も遅れが生じている。H28年度からの解決すべき課題として、結晶化ドロップの回折イメージング法の確立における測定装置の制御システムおよび駆動ステージの不具合があった。これは、回折イメージング法を実用的に使用するうえで広い視野を高速にスキャンするために解決が必要不可欠なものであるが、ハードウェアとソフトウェアの両面からの改修が必要であった。ソフトウェアの改修により制御システムレベルでは十分な精度でデータ収集が行えるようになった。しかしながらハードウェアにおいては、ステージの駆動状況をリアルタイムで取得しステージ制御にフィードバックする仕組みの導入を試みているが、既存システムとの接続するために必要な自作電気回路の問題から正常なフィードバックシステムの構築が依然出来ておらず、早急に対策を取る必要がある。回折データの結晶画像へのマッピングは予定通り進めることが出来、結晶化ドロップ中のタンパク質結晶の識別および結晶化ドロップのスコアリングは可能となった。ただし、別予算により高解像度かつ高速な検出器が導入されたため、より多量のデータを一度に取り扱えるようマッピングの仕組みを改良する必要が出てきている。回折スキャンで得られた結晶の識別やスコアリングのデータと結晶化条件データベースとの連携も取れるようにデータベースシステムの改修を進めることが出来た。H29年度に計画していた、この連携を利用した結晶化条件の導出については未完であり、鋭意進める。H28年度は所属期間の長期海外派遣制度により6か月間の海外出張を行っていた。H29年度はこれによる遅れを挽回すべく努めたが、同じくH28年度に直面した制御システムおよび駆動ステージの精度の問題への対策に多くの時間を割く必要があったこともあり、全体的に計画が遅れてしまった。駆動ステージの精度の問題を解決するためには、ステージの制御システムにフィードバック機能を導入することが有効であると考え、そのためのハードウェア整備を行ったが既存システムとの連携に電気回路を自作する必要があり、現在もこの動作検証を続けている。得られた回折データを処理し、結晶化ドロップ画像へマッピングし、ドロップ中のタンパク質結晶を識別するためのソフトウェアについては開発を行った。また、結晶化データベースと回折データのデータベースを連携させる機能拡張も実施した。

H29年度ではさらに、これらのソフトウェアと連携機能を用いて最適な結晶化条件の導出を行う計画であったが、この部分については未実施である。本研究は本来2年間のプロジェクトということで申請していたが、上述する遅れから2年間では完遂することが難しく、3年目への延長を申請し、許可いただいた。生体高分子のX線結晶構造解析において結晶化はその後の構造解析の成否を決める極めて重要な工程である。本研究では、結晶化ドロップに直接微小X線を照射し回折像を得ることで、回折性を可視化する回折イメージング法を開発し、結晶化ドロップ中のタンパク質結晶の有無から結晶の数、結晶の質までの多岐にわたるスコアリングを客観的に、且つ全自動で行うことを目的としてきた。本研究では期間全体を通して、回折像を如何に迅速にスコアリング・可視化を行うか、ということを重要視してソフトウェア開発に取り組んできた。その結果、研究期間中に別予算により導入されたEIGER X 16M検出器では約1800万画素の回折像を最大133Hzにて出力するが、そのような場合でも回折像取得から数秒後にはスコアリングが完了するようになった。このソフトウェアは本研究の回折イメージングのみならず、PFタンパク質結晶構造解析ビームラインで広く使用されている。一方で、最終年度まで課題として残っていた高速測定については、調査の結果駆動ステージのトルク不足で高精度な位置制御が困難であることが分かった。今後高速測定を実現させるためには、結晶化プレートのサポートの軽量化が必須であると考えられる。結晶化ドロップの回折イメージングによるスコアリングと結晶化条件を結びつけ、その相関を解析することで、最適な結晶化条件を導き出すことも本研究の目的の一つであった。実際にスコアリング結果と結晶化条件の相関を調べたところ、現時点では明らかな相関を得ることは出来なかった。これは件数が少ないことが原因と考えられる。今後データを蓄積してさらなる解析を行う。本プロジェクトの根幹である回折イメージング法を現実的なレベル(速度)で行うためには、回折計制御に関しての改善が急務である。特に駆動ステージの動作をリアルタイムで監視し制御システムへフィードバックできる仕組みを整えることで高速かつ信頼性の高い制御へと改善させ、早急に回折イメージング法の確立を目指す。また、その結果を元に結晶化ドロップのスコアリング方法の検討、および最適な結晶化条件の導出も行うが、これらについてはH28年度に得られた部分的なデータを用いて並行して行う。さらに、H29年度は2つのデータベースPReMo(回折実験データベース)とPXS-PReMo(化粧かスクリーニングデータベース)との連携とそれを利用した自動化も計画しているが、こちらも鋭意進める。本研究を実用化するうえでは、高速な回折スキャンを行うことは必要不可欠であり、そのための基礎となるステージ駆動の高精度化は無くてはならないものである。今年度も第一優先でこの実現に取り組む。
カルシウム結合蛋白によるグルタミン酸受容体シグナル伝達系の制御

神経伝達効率の可塑性の多くの場合AMPA受容体の細胞膜発現の変化によって制御され、その結果としてCREBのリン酸化が亢進し遺伝子発現の変化に繋がる。われわれは(1)Ca^<2+>透過型AMPA受容体の発現がCa^<2+>蛋白CalbindinD28k(CB)によって制御されていることを見出した。さらに(2)このAMPA受容体から流入したCa^<2+>によってCBが核に移行し、AMPA受容体依存性のCREBのリン酸化を促進することを見出した。実際Ca^<2+>透過型AMPA受容体とCa^<2+>結合蛋白CBの共存傾向を前脳領域の抑制性ニューロンで見出しており、この共存には機能的な意味があるという仮説を立てた。このCa^<2+>透過型AMPAR-CalbindinD28kシグナル伝達系を新たな神経活動-遺伝子発現系として提唱し、この分子機能と機能的意義の解明を本研究の目的とする。すなわちCBが如何なる分子メカニズムによってAMPA受容体の細胞膜発現増加を促し、核に移行し、CREBのリン酸化を亢進するのかを明らかにしたい。今年度、初代培養神経細胞を用いて、発生にともなうCBの局在変動を調べたところ、培養日数、細胞密度、グリアの有無などに依存し、成熟を促進する条件下でCBの核への局在化が見出された。今後、このCBの局在変動が活動依存性か否か、また、CBの核移行が神経回路形成、機能発現に果たす役割を明らかにしていきたい。
オートファジーによる腸疾患の制御

オートファジーの様々な疾患への関与が明らかになりつつあり、疾患制御の観点からオートファジーが注目されている。本研究では近年増加の一途をたどる炎症性腸疾患(IBD)に着目し、オートファジーによる疾患制御の可能性を検討した。それによりオートファジーは腸幹細胞の恒常性維持と上皮再生に重要なことが明らかになった。さらに、5-FUを用いるマウス腸炎モデルにおいてオートファジーを欠損する腸管上皮の炎症増悪を確認した。本研究によりオートファジーが腸管上皮の再生に重要であることが明らかになり、IBDの病因解明や制御におけるオートファジーの有用性が示唆された。オートファジーは様々な疾患に関与する事が明らかになりつつあり、疾患制御の観点から大いに注目されている。中でも近年増加の一途を辿る炎症性腸疾患(IBD)に関する研究が精力的に進められ、オートファジー欠損によるパネート細胞の機能障害はIBD発症の一要因とされる。申請者はこれまで、腸管上皮特異的にオートファジーを欠損するマウス(Atg5fl/fl Villin-Creマウス)において腸管上皮幹細胞(Lgr5+幹細胞)が劇的に減少し、腸上皮の再性能低下を招く事を見出していた。Lgr5+幹細胞の減少に伴う再性能低下はIBDなどの腸疾患に直結すると考えられ、平成27年度はLgr5+幹細胞の減少メカニズムを検証した。Lgr5+幹細胞の維持にはニッチ機能を有するパネート細胞が不可欠である。そこで、パネート細胞特異的にオートファジーを欠損するマウス(Atg5fl/fl D6-Creマウス)を用いLgr5+幹細胞数の減少が見られるか検討したが、数は野生型マウスと同程度であった。また、Atg5fl/fl Villin-Creマウスを用い、様々な週令でLgr5+幹細胞数を野生型マウスと比較したところ、パネート細胞が形成される以前の生後2週の時点で既に数は減少していた。こうした結果から、オートファジー欠損によるLgr5+幹細胞の減少はパネート細胞の影響によるものでない事が明らかになった。平成27年度の研究計画に載せた項目は概ね実施されているため。オートファジーは様々な疾患に関与することが報告されており、疾患制御の観点から注目を集めている。中でも炎症性腸疾患(IBD)に関するオートファジーの研究が精力的に進められ、腸管上皮におけるオートファジーの異常が抗菌ペプチドの分泌を担う腸管上皮のパネート細胞の分化や機能に影響することが明らかにされるなど、オートファジーとIBDの関連性が指摘されている。本研究課題の遂行前に腸管上皮特異的にオートファジーを欠損するマウスにおける腸幹細胞(Lgr5+細胞)の著しい減少と腸管上皮の再性能低下を見出していた。Lgr5+細胞の減少により引き起こされる腸管上皮の再性能低下はIBDの発症に繋がると考えられ、本研究課題ではオートファジーの欠損で生じるLgr5+細胞の減少メカニズムを追求した。上述のパネート細胞は幹細胞ニッチとしての役割もあるため、初めにパネート細胞特異的にオートファジーを欠損するマウスのLgr5+細胞数を調べた。だが細胞数の減少は見られず、パネート細胞のオートファジー欠損が原因でないと考えられた(平成27年度遂行)。そこで平成28年度はLgr5+細胞固有のオートファジーに焦点を当てた実験を遂行した。それによりオートファジーを欠損するLgr5+細胞の酸化ストレスと小胞体ストレスの増加を確認した。また、酸化ストレス付与によるLgr5+細胞の減少と幹細胞性の低下をex vivoオルガノイド培養系で確認した。これらの結果からLgr5+細胞におけるオートファジーは酸化ストレスと小胞体ストレスの除去に重要であり、オートファジー機構の破綻によりLgr5+細胞の減少と腸管上皮の再性能低下を招くことが示唆された。オートファジーを欠損に伴うLgr5+幹細胞の減少は生後の早い期間に引き起こされる事から、新生児マウスを用い研究を遂行したい。さらに、Lgr5+幹細胞の減少とIBD発症の関連性についてマウス腸炎モデルで検討したい。免疫学
染色体複製に関わるユビキチンリガーゼの解析

安定な染色体の継承には正確なDNA複製が不可欠である。研究代表者はこれまで真核生物のDNA複製に興味を持って研究を行い、複製関連蛋白質が細胞周期でどのように制御を受けているのか明らかにしてきた。最近いくつかの複製関連蛋白質がユビキチン化による制御を受けていることが明らかになり、複製制御においてもユビキチンシステムが重要な働きを持つことが示唆されてきた。そこで、複製に関わる新規ユビキチンリガーゼの機能解析を行いDNA複製研究およびユビキチンリガーゼ研究に貢献することを目的とする。近年出芽酵母で、選択的蛋白質分解に関わるユビキチンリガーゼが、障害を持ったDNAの複製に関与する可能性が報告された。私はこのようなユビキチンリガーゼの機能解析を行った。出芽酵母のF-box蛋白質であるDia2は傷害を持ったDNAの複製に関与することが示唆されている。しかし、SCF^<Dia2>の基質蛋白質は分っておらず、その作用機序も明らかではない。私はDia2が、N末端領域に存在するTPRモチーフを介して複製フォークの構成成分であるMrcl, Ctf4と結合し、複製フォークに局在し複製フォークの進行に重要な働きを持っていること見いだした(Mimura et al., 2009)。また、出芽酵母Cul8はCullinの一種であり、Mms1およびMms22と複合体を形成してDNA複製中の傷害の修復に関与することが示唆されている。私はCul8結合蛋白質を探索し、Esc4、Esc2、Orc5、およびCtf4を同定した。さらにcul8欠失株はテロメアでの転写のサイレンシングに欠損があることも見いだした(Mimura et al. 2010)。加えて、細胞老化に関わるLag2蛋白質がユビキチンリガーゼの活性に影響を及ぼすことも見いだした(Liu et al., 2009)。申請者はこれまで真核生物のDNA複製に興味を持って研究を行い、複製関連蛋白質が細胞周期でどのように制御を受けているのか明らかにしてきた。まず安定なDNA複製に関わるユビキチンリガーゼSCF^<Dia2>の機能解析を行った。その結果SCF^<Dia2>が複製フォークの構成成分であるMrc1,Ctf4およびMcm2と結合して複製フォークに局在すること、および、SCF^<Dia2>が正常なフォークの進行に不可欠であることを見出した。この結果は学会発表を行うとともに現在論文を投稿中である。また、複製に関わることが予想されたがその機能が未知であった出芽酵母Cu18についても機能解析を行った。Cu18結合蛋白質を同定してその結合様式を生化学的に調べた結果Cu18-Mms1-Mms22-Esc4, Cu18-Mms1-Mms22-Ctf4, Cu18-Mms1-Esc2, Cu18-Mms1-Orc5の異なる複合体を形成することを明らかにした。これらの結果はCu18-Mms1が結合因子を取り替えることによりゲノムの安定化に働いていることを示唆している。
固体表面と極薄水膜界面の原子レベル解析と反応過程の制御

制御システムに、フェーズロックロープ(PLL)を1台追加し、1次共振、2次共振周波数を同時に変調できるシステムに拡張した。これにより、1次共振で、大きな(数十ナノメータ)構造に追従しながら、その構造の中の原子レベルの構造を観察可能にした。KBr結晶を大気環境におくと、環境湿度に依存して、1分子吸着から、湿度が上がると厚い水分子層が吸着する。潮解湿度より10%程度低い相対湿度50-60%の環境におき、サファイヤ探針を近づけると、毛管現象も作用して、探針試料間には2-3 nm程度の水架橋(ナノ水膜)が形成される。このナノ水膜/KBr界面の水和構造を安定して、第4層まで分子分解能でFM-AFM像を取得できた。また、KBrに探針を押しつけると、探針直下のみが溶解し、探針がなくなると再析出することを発見した。この作用により、KBr結晶の内部の(001)面を掘りながら原子分解能で観察に成功した。Si(111)基板を一旦超高真空中で、原子レベルの平坦表面を出した後、600度で熱酸化した表面酸化Si(111)基板のを試料とした。70%程度の高湿度環境に2時間程度おき、2nm程度のナノ水膜を形成し、連続的に変化を観察した。凹凸部分から腐食が始まる様子が観察できた。原子間力顕微鏡探針と金属表面間に閉じ込められた水分子の振る舞いをモデル化するため、二枚の白金電極間に約200個の水分子を閉じ込めて、電極間距離を圧縮する分子動力学シミュレーションを行った。電極表面を移動して封入水分子クラスターを圧縮していくと、相互作用ポテンシャル面の極小点(電極表面と電極間の中心面)近傍に、4層の水膜構造が現われ、0.6 Åまで間隙を圧縮するとナノ水膜は更に3層に転移した。電極表面にかかる圧力を評価すると、GPaのオーダーで引力から斥力に増加する振る舞いが見られたが、ナノ水膜構造の変化を反映する微細構造が出現した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。大気圧下で湿度・ガス種・温度を制御した環境で動作する周波数変調原子間力顕微鏡(FM-AFM)/走査型トンネル顕微鏡(STM)を開発する。厚さ数nmの水膜(ナノ水膜)で覆われた固体表面を制御して調製し、固体表面および水膜-固体界面の構造を原子分解能で観察・解析し、原子レベルの局所酸化・還元法の確立を目的としている。1.FM-AFM/STMの開発:音叉型水晶振動子を力センサーとして用いるFM-AFM/STM本体機構をほぼ完成させた。探針として、シリコン小片、サファイア小片を水晶振動子先端に形成し、動作確認した。KBr(100)表面を試料として、単原子ステップが観察できた。2.固体表面上の水膜内の固液界面構造・ナノ水膜内の特性の解明:高湿度大気環境に劈開したマイカ基板を置くと、その湿度・温度に依存して、2nm程度の極薄水膜が形成される。現有のFM-AFMを用いて、極薄水膜/マイカ界面を観察した。極薄水膜/マイカ界面の水和構造は、従来、水中AFMによって観察されている水/マイカ界面の水和構造と比較して、第1・第2水和層は同様の2次元構造であったが、エピタキシャル成長の痕跡を残し、より硬い構造を取っていることが示唆された。3.カンチレバー(三次元バネ)に接続された探針-試料表面系の静的接触モードおよび動的モードAFMの古典的分子力学・分子動力学シミュレータの構築を開始した。テストケースとして、ナノカーボン(ダイヤモンド(111)クラスター)探針、カーボン(グラフェンクラスター)試料表面を考えた。ポテンシャル関数にはTersoffポテンシャルを用いて炭素系を記述した。初年度は探針押し込み・引き剥がしと探針引きずりの予備シミュレーションを行い、探針の試料表面へのスナップイン・スナップオフを示す垂直力曲線、探針のスティック・スリップ運動を示すのこぎり波形を有する水平力曲線を得た。周波数変調原子間力顕微鏡(FM-AFM)/走査型トンネル顕微鏡(STM)の開発立ち上げをほぼ完成させた。音叉型水晶振動子を用いた力センサーは、大気中でもQ値が数千を維持し、高分解に観察できる可能性が高い。試料台の温度を独立に調整できるので、水膜厚さを制御可能である。高湿度大気環境からゆっくりと成長したナノ水膜は、エピタキシャルに成長した痕跡を残し、水/固体界面に形成される水和層は、水バルク中の界面に比べて、狭い範囲に硬く形成されている固有の特性を発見した。接触モードAFMの予備シミュレーションを行い、探針の典型的なスナップイン運動、スティック・スリップ運動が得られている。1.FM-AFM/STMの開発:音叉型水晶振動子に力検出性能を落とさずに防湿処理を施す手法を確立した。防湿処理をした音叉型水晶振動子力

センサーにサファイア小片を探針として取り付け、高湿度環境で、ナノ水膜が形成したKBr(100)表面の原子分解能観察に成功した。2.固体表面上の水膜内の固液界面構造・ナノ水膜内の特性の解明:親水性有機分子を分散させた水溶液を劈開したマイカ基板に展開し、FM-AFM試料フォルダーにセットする。環境湿度を80%まで上げ、マイカ基板上に数nm厚のナノ水膜を残した試料を準備した。水膜の外から微弱な引力で、有機分子の概形形状を観察できた。次に、水膜内部に探針先端を浸すことで、有機分子および、界面の水分子のの高分解能観察を試みた。しかし、試料の有機分子は非常に壊れやすく、高分解能観察条件を見いだせていない。3.原子間力顕微鏡探針に働く相互作用力の長距離成分(ファンデルワールス力)の効果を、超高真空中、大気中、水中で数値的・理論的に比較した。長距離力を、試料表面からの探針高さの関数としてプロットしたところ、探針高さ1.0 nm近傍では大気中のメニスカス力が最大値を示す一方、水中では引力が抑えられることが確認出来た。曲率数十nmの探針の場合、空気中では、z=0.2 nm程度で10nNオーダーの引力を示し、AFMの凝着測定で得られるpull-off力のオーダーと良く一致する結果を得た。温度・湿度制御環境(100%に近い高湿度環境を含む)で動作する周波数変調原子間力顕微鏡(FM-AFM)/走査型トンネル顕微鏡(STM)を完成させた。除振性能を向上させ、高湿度環境に置かれた電子回路に防湿処理を施し、S/Nを向上させたことで、ナノ水膜が形成したKBr(100)表面の原子分解能観察に成功した。この過程で、力センサーに用いる音叉型水晶振動子に防湿処理を施す手法を確立した。防湿処理した音叉型水晶振動子力センサーは、大気中でもQ値が数千を維持する。劈開直後のマイカ(100)表面と、劈開後に水洗浄を行ったマイカ(100)表面を比較し、ナノ水膜/マイカ基板界面構造の詳細を明らかにした。親水性有機分子および水素結合している水分子の高分解能観察条件を絞り込んでいる。AFMシミュレータを開発し、水のマクロな効果を評価したことで、次に水のミクロな効果を評価する準備ができた。制御システムに、フェーズロックロープ(PLL)を1台追加し、1次共振、2次共振周波数を同時に変調できるシステムに拡張した。これにより、1次共振で、大きな(数十ナノメータ)構造に追従しながら、その構造の中の原子レベルの構造を観察可能にした。KBr結晶を大気環境におくと、環境湿度に依存して、1分子吸着から、湿度が上がると厚い水分子層が吸着する。潮解湿度より10%程度低い相対湿度50-60%の環境におき、サファイヤ探針を近づけると、毛管現象も作用して、探針試料間には2-3 nm程度の水架橋(ナノ水膜)が形成される。このナノ水膜/KBr界面の水和構造を安定して、第4層まで分子分解能でFM-AFM像を取得できた。また、KBrに探針を押しつけると、探針直下のみが溶解し、探針がなくなると再析出することを発見した。この作用により、KBr結晶の内部の(001)面を掘りながら原子分解能で観察に成功した。Si(111)基板を一旦超高真空中で、原子レベルの平坦表面を出した後、600度で熱酸化した表面酸化Si(111)基板のを試料とした。70%程度の高湿度環境に2時間程度おき、2nm程度のナノ水膜を形成し、連続的に変化を観察した。凹凸部分から腐食が始まる様子が観察できた。
ジアルキルアミド基を含むポリジエンを用いた高分子キラルストレイナーの創製

1.スチレンとキラルなモノマーのブロック共重合逆相系液体クロマトグラフのカラム充填剤としての利用を図るため、二種類の方法でスチレンとキラルモノマーであるL-N-(2-メチレン-3-ブテノイル)-3-メトキシメチルピロリジン(L-MPy)とのブロック共重合を試みた。ラジカル重合法では、まずスチレンをベンジルジチオベンゾエート(BDB)を連鎖移動剤としてRAFT重合させて末端にBDB残基を有するポリスチレンを合成し、これを単離し改めてAIBNとL-MPyを加え、ベンゼン溶液としてから脱気封管中でRAFT重合させた。生成ポリマーの数平均分子量は28200、分子量分布はMw/Mn=1.03であった。アニオン重合を用いる場合には、まずsec-ブチルリチウムを開始剤としてスチレンを重合させ、少量の塩化リチウムを加えてからL-MPyを加え、THF中0°Cでブロック共重合を行った。生成ポリマーの数平均分子量は34400、分子量分布はMw/Mn=1.04となった。いずれの場合も、スチレンとL-MPyの組成比は設計どおり9:1程度となった。2.生成ポリマーのミクロ構造ブロック共重合体中のジエン部分のミクロ構造は、RAFT重合の場合は1,4-E:1,4-Z=50:50で1,2-構造はほとんど見られなかった。アニオン重合では1,4-E:1,4-Z:1,2-=23:38:39程度となり、かなり複雑な混合物のようである。3.光学分割カラムへの摘要ブロック共重合体を平均粒径0.1mm程度のガラスビーズにコーティングし、プロリンラセミ混合物の水溶液への光学分割が可能であるかを検討した。ブロック共重合体を表面にコーティングし、これをHPLCカラムに充てんして少量の硫酸銅を含む水溶液を溶離液としてプロリンラセミ混合物の光学分割を試みたが、温度や濃度を変化させても光学分割を行うことはできなかった。1.不斉炭素を有するジアルキルアミド型モノマーの合成キラルなジアルキルアミド型モノマーとして、α-アミノ酸の一種であるプロリンから誘導した2級アミンを不斉源にもつN-(2-メチレン-3-ブテノイル)-2-メトキシメチルピロリジンの合成を行った。アミノ酸のカルボキシル基を還元して生じる一級水酸基をどの段階で保護するかについて試行錯誤で検討した結果、トリメチルシリル基による保護とメチルエーテルへの誘導が最も効率的であることを見出した。(当初はプロリンの還元体であるプロリノールの段階でメチルエーテル化することを試みたが、ウィリアムソンエーテル合成の条件下では目的どおりの化合物を得ることはできず、窒素上にメチル基が導入される等の副反応が見られたため別法によりモノマーを合成した。)生成物の物性は以下のとおり。2.不斉炭素を有するジアルキルアミド型モノマーのラジカル重合上記モノマーのラジカル重合を行った。ベンゼン中でAIBNを開始剤として重合させると60°C25時間程度で重量平均分子量約7万のポリマーが得られた。キラルなモノマー同士のの共重合やアキラルなモノマーであるジエチルアミド型のモノマーとの共重合を行い、不斉炭素の存在は重合挙動には影響しないこと、モノマー反応性比が共に1に近いことが明らかになった。

3.アキラルなモノマーのアニオン重合ブロック共重合体を合成するための知見を得るためにジイソプロピル型モノマーのアニオン重合を試みた。THF中、対カチオンとしてカリウムを用いて重合を行ったが、-78°Cでは全くポリマーが得られず、25°Cでは重合物は得られるものの連鎖移動のために重合度が上がらないという問題点が明らかとなった。1.不斉炭素を有するジアルキルアミド型モノマーの合成前年度に引き続き、α-アミノ酸の一種であるプロリンから誘導した2級アミンを不斉源にもつN-(2-メチレン-3-ブデノイル)-2-メトキシメチルピロリジンの合成を行った。合成過程でアミノ酸のカルボキシル基を還元して生じる一級水酸基のトリメチルシリル基による保護とメチルエーテルへの誘導を行っていたが、ステップ数が多く収率も高くないため、途中段階の化合物を購入すると共に別法による合成を行い、収率を向上させることが出来た。2.アキラルなモノマーのアニオン重合ブロック共重合体合成の基礎データを得るため、既にラジカル重合によりポリマーを得ることに成功しているジエチルアミド型のモノマーのアニオン重合を行った。開始剤にはカリウムナフタレンおよびジフェニルメチルカリウムを用いた。昨年度までは立体障害の大きなジイソプロピル体について-78°Cで重合を開始し、次いで25°Cに昇温しなければポリマーは得られないと思われたが、-78°Cで長時間重合させることでポリマーが得られることを見出した。重合開始後の溶液は-78°Cに保つ限りほぼ無色であるが、0°Cあるいは室温に昇温すると深紫色を呈する。ジフェニルメチルカリウムを開始剤にした場合、25°Cで重合すると生成ポリマー中には連鎖移動により生成する開始剤断片を含まないポリマーが混入するが、温度を下げることで連鎖移動による分子量の低下を抑制できることがわかった。このことはブロック共重合体を得る上で極めて重要な知見である。生成ポリマーのミクロ構造は1,4-構造だけでなく50%程度の1,2-構造も含まれており、ラジカル重合生成物との差が顕著に表れた。1.アキラルなモノマーのアニオン重合ブロック共重合体合成の基礎データを得るため、既にラジカル重合によりポリマーを得ることに成功しているジエチルアミド型のモノマーのアニオン重合を行った。前年度に開始剤としてカリウムナフタレンおよびジフェニルメチルカリウムを用い重合温度を-78°Cまで下げることにより連鎖移動による分子量の低下を抑制できることを見出してたが、重合速度が極めて遅いことが問題であった。今年度、重合系中に塩化リチウムあるいはジエチル亜鉛を添加することにより、重合温度を上昇させても連鎖移動は起こらず、また、重合速度が速くなることを見出した。この条件をもちいてスチレンとキラルなアミド基を有するジエンモノマーとのブロック共重合体を合成した。2.生成ポリマーのミクロ構造対カチオンをカリウムとした場合の生成ポリマーのミクロ構造は1,4-E構造だけでなく50%程度の1,2-構造も含まれていた。一方、開始剤の対カチオンにリチウムを用いた場合やカリウム系の開始剤に塩化リチウムあるいはジエチル亜鉛を添加し他系では、この他に1,4-Z構造も混在し、非常に複雑な混合系となった。3.光学分割カラムヘの摘要スチレンとのブロック共重合体を平均粒径0.1mm程度のガラスビーズにコーティングし、ラセミ体アミノ酸水溶液への光学分割が可能であるかを別途購入したキラルカラムを用いた液体クロマトグラフで評価した。ガラスビーズ表面を疎水化処理するとブロック共重合体は効率よく表面にコーティングされる事が判った。
高度に配座を制御できる炭素・炭素結合形成反応を用いた拡張共役電子系の構築と性質

フェナントレンは、ピレンやナフタレン等とは異なりエキシマーの形成が困難であり、濃厚な溶液中においてもエキシマー蛍光を与えないという点で特異な縮合多環芳香族である。しかし、フェナントレノファンの合成が困難なため、これまでその光物理的性質等についてほとんど検討がなされていなかった。我々の見出した光環化付加反応を用いた方法はフェナントレノファンの合成に有効であり、その配座とエキシマー形成挙動の研究を可能とした。例えば、ジビニルフェナントレンから得られたフェナントレノファンのうち、2つのフェナントレン環が短軸方向に約50度と大きく開いたものはモノマー蛍光のみを与えるものの、ほぼ平行に位置したものは室温でエキシマー蛍光を与え、フェナントレンのエキシマー形成には芳香環の平行な配置が必要であることが示された。さらに、シクロブタン環の代わりにオリゴメチレン鎖を有する化合物に関する検討により、短軸方向には約25度まで開いた場合でもエキシマー蛍光を示すことが明らかとなった。一方Staabらは、[2.2](2,7)フェナントレノファンのsyn体とanti体の異性体混合物が4.2ケルビンで、フルオレン結晶中でエキシマー蛍光を与えることを報告しているが、いずれの寄与によるものかは明確でない。そこで我々は、芳香族の重なりの程度の異なる3種類のanti体を分子設計し、エキシマー形成に必要な芳香環の重なりを明らかにした。その結果、エキシマーの形成には少なくとも1つの六員環のほぼ平行に位置した重なりが必要であると結論される。このようにフェナントレンがエキシマー蛍光を与えるための構造上の要因が明らかにされてきたが、今後エキシマー蛍光の量子収率や寿命等、さらに詳細な動的挙動の解明が望まれる。
発生工学的手法を用いたマウスiPS細胞由来膵β細胞樹立と新規糖尿病治療法の開発

重症化した糖尿病を改善させるためには、患者の体細胞からiPS細胞を樹立し、分化誘導した膵β細胞を患者へ移植する方法が考えられる。この場合、移植後の膵β細胞は患者の体内で長期間に渡り十分に機能していなければならない。膵β細胞内でグルコースセンサーとして機能するグルコキナーゼ(Gck)は膵β細胞の代償性過形成やグルコキナーゼ活性化薬による膵β細胞のインスリン分泌能増強作用と肝での糖利用亢進作用が認められる。本研究では、Gckを強制発現させたiPS細胞より機能的な膵β細胞を樹立し、生体へ移植することで新たな糖尿病の治療法を確立する。糖尿病は発症後の罹病期間が長期に渡ると、インスリンを産生する膵β細胞数が減少して重症化する。重症化した糖尿病を改善させるためには、患者の体細胞からiPS細胞を樹立後にインスリン産生細胞へ分化誘導し、患者へ移植する方法が考えられるが、この場合、移植後のインスリン産生細胞は患者の体内で長期にわたり十分に機能していなければならない。インスリン産生細胞である膵β細胞内でグルコースセンサーとして機能するグルコキナーゼ(Gck)は膵β細胞の代償性過形成に関与し、また、グルコキナーゼ活性化薬による膵β細胞のインスリン分泌能増強作用と肝での糖利用亢進作用が認められる。すなわち、Gckは膵β細胞のインスリン分泌および自己増殖を担う重要な因子である。本研究では、Gckを強制発現させたマウスES細胞またはマウスiPS細胞より機能的なインスリン産生細胞を樹立し、生体へ移植することで新たな糖尿病の治療法を確立する。具体的には、Gckを強制発現させたマウスES細胞またはマウスiPS細胞を作製し、in vitroにてインスリン産生細胞へ分化誘導を試みる。つぎに、分化誘導したインスリン産生細胞の中でインスリン分泌能および自己増殖能が最も良好な細胞株をsterptozotocin投与によってインスリン分泌を枯渇させることで糖尿病を発症させたマウスの腎臓皮膜下へ移植し、糖尿病の改善効果について検討する。なお、糖尿病・代謝関連解析を行うことで糖尿病の改善効果について評価する。研究の進捗状況:まず、マウスES細胞およびiPS細胞より膵β細胞の樹立を試みた。ES細胞およびiPS細胞よりEB(Embryonic Body)を作製後にインスリン産生細胞へ分化させたところ、インスリン抗体で染まったインスリン産生細胞を樹立することに成功した。樹立したインスリン産生細胞のグルコース応答性インスリン分泌機能を検討したところ、グルコース応答性インスリン分泌が確認された。つぎに、C57BL/6JマウスへStreptozotocin(STZ)を投与することで内在性の膵β細胞を破壊し、高い血糖値を示すマウスの腎臓皮膜内へ樹立したインスリン産生細胞を移植し、血糖値の改善について検討を行った。その結果、移植開始一週間は血糖値が下がり続けたが、その後、徐々に血糖値の上昇が見られた。つまり、移植したインスリン産生細胞が移植マウスの免疫反応により拒絶された可能性が考えられた。現在、この問題を解決するためにドナーとホスターマウスを同一のマウスで行うことを検討している。実験動物学現在までに複数のGckを強制発現させたマウスES細胞を得ることができた。その中から、最も良好にGck発現する細胞株を複数得ることができた。また、マウスES細胞およびマウスiPS細胞よりin vitroでインスリン産生細胞への分化誘導を試みた。その結果、インスリン活性およびグルコース応答性インスリン分泌を示す細胞を得ることができた。これらの細胞は、STZ投与によりインスリン分泌を枯渇させることで人為的に糖尿病を発症させたマウスの腎臓皮膜下へ移植し、糖尿病の改善効果について検討した。その結果、移植後の血糖値が低下する傾向を示した。今後は、Gck発現を示すマウスiPS細胞を獲得し、すでに獲得しているGck発現を示すマウスES細胞と共にin vitroでインスリン産生細胞への分化誘導を試みる。その中から、インスリン活性およびグルコース応答性インスリン分泌を示す細胞の獲得を試み、STZ投与により人為的に糖尿病を発症させたマウスの腎臓皮膜下へ移植し、糖尿病の改善効果について検討する。研究に使用する試薬類や器具類などの消耗品や動物の購入、病態解析などに利用する。研究経費の殆どは分子生物学試薬、細胞培養器具、マウス作製、飼育、病態解析に用いられる予定である。分子生物学試薬としては、ES細胞培養用試薬、RNA抽出・精製試薬、cDNA合成試薬、RT-PCR試薬、PCR試薬、TaqMANアッセイ用プローブ、サザンブロッティング用メンブレン、ハイブリダイゼーション用試薬、P32(RI)、DNAオリゴ、タンパク質抽出・精製試薬、ウェスタンブロッティング用抗体(1次・2次抗体)、DNAマイクロアレイ用マウスオリゴチップ、細胞培養器具としては、培地、血清、培養シャーレ、ピペット、チップ、チューブなどがあげられる。
電子カルテのための3次元的マルチメディアデータベースの開発研究

本研究では病理剖検症例を対象としてデータベースの構築行った。病理剖検は1)長期入院を経過している症例が多く、検査、手術など多くの臨床医学情報を含んでおりそれらを時系列データとして扱わなければならない、2)病理検査でマクロ(肉眼写真)からミクロ(顕微鏡写真)までを含んでおりそれらの関連を3次元的に扱わなければならないなどの特徴を有しており、本研究の課題とする高機能な電子カルテの機能を必要としている。昨年度に作成した要件をまとめた要求モデル、および剖検データを時間的空間的に連続した情報として扱えるようにした高度な表現及び解析の可能なドメインモデルをもとに、本年度はこれらのモデルを実際のデータベース上に実装し、システム化を行った。データベースは関係データベースシステム(RDBMS)とオブジェクト指向データベースシステム(OODBMS)の両者を用いて、同じモデルを実装したが、臨床医学データの複雑性を反映して、OODBMSでの実装がRDBMSの実装に比較して、遥かに単純であり、また機能的にも優れていた。また、検索などに要する時間は両者とも大きな違いは見られなかった。また、病理顕微鏡カメラなどのマルチメディアデータをフリーソフトウェアJunやVTXを利用して3次元表示する実験も行い、パソコン上で2-30枚のスライス画像を数分で元の3次元立体画像に再構成できることを確認した。ただし、入力画像の準備に人手を要するため今後は顕微鏡を自動制御して等間隔のスライス画像を自動的に取得するメカニズムの開発が必要であると思われた。さらに、これまで開発研究してきた概念学習システム及びベイジアンネットワークと病理データベースとを接続し、データベースからの知識発見を行い、軟部腫瘍の悪性度分類に関する知識を抽出した。また、こうした実際の患者データを複数の医師が扱うことより、データべースのアクセスに関するセキュリティを保持する手法を開発し実装した。本研究の目的は、電子カルテとして使用できる3次元知的マルチメディアデータベースのプロトタイプを開発し、実際に患者データを入力、検索し性能を評価することにある。従って本研究では、1)臨床医学情報として何が含まれ、それらがどのように使われているかを明確にし、要求モデルを作成する、2)そこからオブジェクト指向技術を用いて、ドメインオブジェクトモデルを作成する、3)オブジェクト指向プログラミング言語、オブジェクトデータベースを用い、3次元マルチメディアデータベースを構築する、4)臨床データを入力し、構築してモデル及びソフトウェアの性能を評価する、5)概念学習システムを統合し、臨床医学的に意味のある新しい情報の発見を試みる、の5段階の研究目標を設定している。そのうち平成9年度にはこれまで要求モデルの作成、分析モデルの作成、3次元視覚化のクラスライブラリの開発を行ってきた。要求モデルは病理解剖報告書、病理組織診断報告書、病理細胞診断書などをもとにヤコブソンのユ-スケースモデルを作成したが、特に情報のセキュリティを重視したモデルを構築した。分析モデルはさらに人体解剖などの3次元構造の知識や臨床経過などの時間による変化などを背景知識として上記の要求モデルに基づきUMLを用いて作成した。さらにプロトタイプの実装としてはWindowsNT4.0上で、純粋なオブジェクト指向言語であるSmalltalkとC_<++>を用い、グラフィックライブラリとしてはOpenGLとVisualization Toolkitを用いてオブジェクト指向データベースMatisseと接続したプロトタイプを開発した。特に3次元情報の描画に関する性能評価ではPentium200クラスのマシンであれば十分な速度が引き出せることを確認した。
こどもの健康に対する放射線被ばくの蓄積性についての検討

近年の放射線診療において「こどもの反復被ばく」による健康影響ついての関心が高くなってきている。そこで、マウスを使って「反復被ばく」による寿命短縮とTリンパ腫発生率を調べた。その結果、1週齢被ばくの場合、1回照射と反復照射、反復の場合は照射の間隔によって影響の大きさが異なった。7週齢被ばくは、影響は照射方法に関係しなかった。反復被ばくの効果は年齢に依存することを明らかにした。また、小児のCT撮影の実態調査を行ったところ、撮影線量は、国際的な診断参考レベルとほぼ同値であった。調査の一部は、我が国の診断参考レベルとして採用された。今後、個人の撮影の追跡が必要であると思われた。本研究の目的は、社会的関心が高くなっている「こどもの放射線影響」に対し、動物を使って放射線の反復被ばくの影響を明らかにするとともに、病院における放射線診療の実態、並びに、コミュニケーションに必要なパンフレットを作成するとこである。1反復被ばく実験: B6C3F1マウス、生後1週ならびに7週齢時から、0.125Gy、0.25Gy、0.5Gy、1Gyを毎日4日間連続(反復)で照射した群(各群50匹)と非照射群(100匹)を設定した。中間段階(3月末)で、Tリンパ腫の発生率が、1週齢群で24%、7週齢群で6%であった。発生したリンパ腫は、病理標本を作製し、また、分子解析用に凍結保存した。1回0.5Gy以下の反復照射群にはTリンパ腫の発生は観察されていない。さらに、飼育観察中である。2病院での医療被ばくの実態調査:こども(小児)病院での放射線検査は、年齢が若いほど多い。病気の種類によっては反復検査を受けている患者もいる。小児ファントムを用いてガラス線量計で実際に臓器吸収線量を測定し、実効線量を計算したところ、国際的に報告されている値に比べ同じか低い程度であった。また、測定値は、モンテカルロシミュレーションの用いたImpactやCT-Expoのツールを用いて計算した値とくらべ、最大2割程度の違いがあった。3パンフレットの作成:こども病院の医療スタッフと意見交換し、保護者のよくある質問に答えるためのパンフレットを作成した。今後改訂版を作成するために、配布したパンフレットに対する意見を募集中である。本研究の目的は、現在社会的関心が高くなっている“こどもに対する放射線の健康影響"に対し、実験的なエビデンスを提供するとともに、病院における小児の放射線診療の実態を調査し、実用的な一般向けの解説書・パンフレットを作成することである。。(i)こども期の反復被ばくによる放射線影響の蓄積性と低減係数に関する実証研究:24年度は、動物実験の設定ができなかったが、25年度前半に設定を終える予定である。(ii)病院での医療被ばくの実態調査(倫理審査は、3病院で承認済み):千葉県の3病院について倫理審査の承認を受け、それぞれ過去4年と8年間にわたるCT診断をうけた15才未満の小児を対象に、診療記録やDICOM情報から、撮影条件,撮影部位に関するデータの収集・整理をはじめた。入力データは、連結可能な匿名化データに変換し、1診療の種類別頻度、2年齢別、性別頻度、3疾病別頻度、4CTのCTDIとDLPなどの撮影パラメーター、5患者別頻度について解析した。その結果、中間評価であるが、小児は頭部の撮影が最も多く、CTDIやDLPなどの撮影のめやす線量は、世界的な値に比べ頭部ではほぼ同値、胸部、腹部の撮影は低いことが確認された。現在、さらに1病院について倫理審査中である。(iii)パンフレットの作成(患者用、医療関係者用):パンフレットは、患者の立場、医療関係者の立場にたって作成する必要がある。24年度は、患者や医療関係者はどのような情報が必要と考えているかニーズ調査をインタビュー形式で開始した。がんなどの特定の疾患を持っている患者の母親と、たまにしか病院に行かない一般のこども母親では、診療についての関心や知識のレベルや異なることがわかったので、入院患者(千葉こども病院)の母親と、病院にほとんどいかない母親(千葉県内の幼稚園や保育園の園児の母親)を別々に聞き取りするための予備調査を開始した。本研究の目的は、社会的関心が高くなってきている「こどもの被ばく影響」について、1マウスを使って「反復(分割)被ばく」の影響を調べ、2病院における放射線診療(特に線量の高いCT)の実態調査と3コミュニケーションに必要なパンフレットを作成することである。1反復被ばく

実験:B6C3F1マウスを生後1週目(乳児期)もしくは7週目(青年期)から、0.125Gy、0.25Gy、0.5Gy、1.0Gyを毎日4日間連続で反復照射した(各群50匹)。3月現在、各々の線量を被ばくした群の生存率は、1週齢群で14%、16%、28%、86%で、7週齢群で7%、12%、36%、44%であり、1週齢群が放射園感受性であった。Tリンパ腫の発生は、1Gyで比べると1週齢群は26%、7週齢群は8%と1週齢群のリスクが高かった。過去の結果と比べると、1週齢被ばくの場合、寿命短縮は、毎日被ばく(1Gyx4回、合計4Gy)が最も短く、次いで1回被ばく(4Gyx1回)、1週おきの被ばく(1Gyx4回、合計4Gy)の順となった。即ち、合計4Gyの被ばくであっても、1回照射と分割照射、分割照射の間隔によって影響が異なる。胸腺リンパ腫の発生も同様の傾向であった。一方、7週齢被ばくは、寿命短縮においては照射方法に関係しなかった。反復被ばくの影響の様式は年齢に依存することを初めて明らかにした。2病院における放射線診療(特に線量の高いCT)の実態調査の結果を論文として報告した。3パンフレットに対する意見募集は、郵送にしたためか、福島原発事故から時間が経っていたためか、返事はあまりなかった。放射線発がんマウスの実験群を設定し、順調に観察が進んでいる。病院での調査結果は、現在、論文をまとめているところである。パンフレットについて、脳外科(外傷で運ばれた患者のCT撮影の正当化の基準)や循環器科(心臓カテーテルの最適化)について質問を受け、CT検査の実態調査以外の、今後の課題もでてきた。こども期の反復被ばくによる放射線影響の蓄積性と低減係数に関する実証研究のための、動物実験の設定開始できなかった。しかし、CT検査の実態調査については予定以上に進展している。1反復被ばく実験(マウス実験):設定した照射群の飼育観察を引き続き行う。解剖したマウスは全ての臓器について病理標本作製を行う。また、1週齢ならびに7週齢のマウスに反復被ばく(1Gy x 4回)した後の胸腺、小腸、肝臓、肺を固定し、γH2AXやPCNA、カスパーゼ3などの発現を、1Gyならびに4Gy1回被ばくの臓器と比較する。2病院での医療被ばくの実態調査:現在、CT検査の実態調査(患者の年齢や診療科、撮影部位、回数)を論文として投稿準備中である。また、患者の被ばく線量ならびに実効線量についても、各国間比較を終え、論文を執筆中である。病院と相談して、CT検査以外の、IVRの調査や線量評価を行ないたいと考えている。3パンフレットの作成:配布後、医療スタッフや保護者の意見を取り入れ、改訂版を作る。また、患者が必要としている情報の発掘を行う。(i)動物実験は今年度前半に設定を終える。1週齢マウスを、0Gy,125mGy,250mGy,500mGy,1000mGyを4日続けて1回(合計4回の反復被ばく)、各群50匹(合計250匹)照射し、終生飼育を開始する。7週齢についても同様の照射を行う。(ii)病院の実態調査を進め、学会発表を行い、論文にまとめる。(iii)パンフレットには、患者のニーズ調査の論点をまとめ、倫理審査を通して、本格的に調査を始める。平成24年度は、病院での医療被ばくの実態調査に時間を使ったことと、動物導入後の動物飼育のスペース調整をおこなった。
偶蹄類における首の構造と機能の進化

報告者は、偶蹄類における首の構造と機能の進化の解明をめざし、多数の種を対象として、頸部筋骨格構造の記載・比較を行っている。本年度は特に、キリン(Giraffa camelopardalis)、ヒトコブラクダ(Camelus dromedarius)、アルパカ(Vicugna pacos)、リャマ(Lama glama)の4種に注目し、首の伸長に伴う筋構造の派生的変化の特定を目指した。2014年度・2015年度に行ってきた肉眼解剖データを整理し、上記4種の頸部筋構造と詳細に記載した。また、シカ科のニホンジカ(Cervus nippon)の頸部構造と基準とし、比較解剖学的手法を用いて、頸部伸長に伴う筋構造の適応進化の解明を目指した。筋構造の比較の結果、長い首をもつ上記4種に共通する特異的筋構造は確認されなかったため、偶蹄類における頸部伸長に伴う筋構造の派生的変化を一般化することはできなかった。一方で、前肢と頸部をつなぐ複数の筋肉では、キリン、アルパカ、リャマの3種に共通した構造が確認された。さらに、頸部を拳上・側屈する役割をもつ筋肉において、キリン特有の構造が確認された。筋肉の走行方向の変化や付着位置の変化を踏まえ、これらの筋構造の変化は、首の姿勢や運動機能の進化に関連した適応進化であることが示唆された。また、本年度は、昨年度に調査・解析を行ったウシ科ブラックバック族の頸部骨格構造の進化に関する知見をまとめ、日本哺乳類学会にて発表し、優秀ポスター賞を受賞した。また、当該研究に関する論文を執筆し、国際誌に投稿した。28年度が最終年度であるため、記入しない。報告者は、偶蹄類における首の構造と機能の進化の解明を目指し、様々な種の頸部筋骨格構造の観察・記載を行っている。2014年度は特に、偶蹄類の中で何度も独立に起きた「首が長くなる進化」に着目し、キリン科・ラクダ科・ウシ科に焦点を当て、種ごとに筋骨格構造の記載を行った。研究手法としては、皮膚や筋肉ごと冷凍保存された標本の解剖と、骨格標本として保存された標本の観察を採用した。解剖では、動物園等で死亡し、国内の協力研究機関(東京大学総合研究博物館、国立科学博物館、神奈川県立生命の星・地球博物館)に収蔵された偶蹄類標本を利用した。頸部に存在する複数の筋肉の起始・終止・付着位置を種間で比較したところ、キリンでは、他の偶蹄類に比べ、頸椎背側に位置する「最長筋」「板状筋」、腹側に存在する「頸長筋」の付着領域が変化していることが明らかになった。また、骨格構造の観察では、頸部を構成する椎骨の形態に注目し、椎骨の形状・大きさを反映するいくつかの部位を計測するとともに、関節面や突起の位置の記載を行った。骨格構造の観察には、国立科学博物館、アメリカ自然史博物館、パリ自然史博物館に保管されている骨格標本を用いた。頸部の著しい伸張が知られるキリン(キリン科)とゲレヌク(ウシ科)の頸椎を比較したところ、キリンでは第1ー第7頸椎全てが伸張しているのに対し、ゲレヌクでは頭方にある一部の頸椎のみが伸張していることが明らかになった。また、ゲレヌクの第1・第2頸椎は、キリン科やラクダ科がもつ椎骨形態の特徴とは大きく異なり、ウシ科の他種でも見られない形態学的特徴を数多く示した。これらの特殊な形態学的特徴は、後肢で立ち上がって採食を行うというゲレヌク独自の行動への適応であると解釈した。報告者は、偶蹄類の首の構造と機能の進化の解明を目指し、様々な種の頸部筋骨格構造の観察・記録を行っている。2015年度は特に、「首の伸長・短縮を引き起こす骨格構造の進化」の解明を目指し、偶蹄目ウシ科ブラックバック族に注目して研究を進めてきた。研究手法としては、ノギスを使った標本の計測を採用し、首を構成する骨格要素「頸椎」の長さ・太さ等を計測し、種間で比較を行った。国内の自然史博物館には、ブラックバック族の骨格標本は極めて少ないため、共同研究者であるニューヨーク工科大学のNikos Solounias教授の協力を得て、アメリカ自然史博物館にて計15種78個体の骨格標本の観察・計測を行った。計測データを利用して、各頸椎の成長様式を算出したところ、頸部が著しく長い種(ゲレヌクLitocranius walleri)の頸椎の成長速度は、近縁の首が短い種と同程度であることがわかった。また、首の長さに対する各頸椎の長さの割合を算出したところ、首の長さによらず、各頸椎の割合のパターンは一定であることがわかった。これらの結果から、首の長さの変化は、特定の頸椎の伸長・短縮によって起こるのではなく、全ての頸椎の長さが一定のルールのもとで変化することで起こることを示唆する。2015年度は、これまで取り組んできたキリンの第一胸椎の機能に関する研究を論文としてまとめ、学術雑誌「Royal Society Open Science」にて発表した。この研究成果は、東京大学の研究成果広報サイト「UTokyo Research」でも紹介された。第121回日本解剖学会総会・学術大会では、上記論文の内容に関して、招待講演も行った。さらに、日本哺乳類学会2014年度大会にて開催した自由集会「体骨格の適応進化を考える」の内容をまとめ、学術雑誌「哺乳類科学」にて発表した。