hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
前立腺癌の分化度と男性ホルモン作用機構上の遺伝子発現の差に基づく悪性度診断

ラットおける5alpha-reductaseの遺伝子発現をRT-PCRによって作成したcADNA probeを用いて検討した。ラットにおいてはnorthern blot analysisによって、5alpha-reductaseのシグナルを確認することができ、このシグナルはtestosterone分泌抑制処置によって増加傾向を示すことから、testostroneによるdown-regulationの可能性が示唆された。このようにアンドロゲン環境そのものによって5alpha-reductaseの遺伝子発現は調節を受けることが考えられる。ヒト前立腺癌でのnorthern blot analysisでは、我々がRT-PCR法によって作成したcADNA probeによってはシグナルを明らかにすることが困難なため、海外より入手したヒト5alpha-reductaseのcADNA probeによって確認を行っている。これによって、この原因がprobeに由来するものか、あるいは、transcriptの量的な減少に由来しているのかを推測することができるものと思われる。ヒト前立腺癌リンパ節転移由来のLNCaP細胞に発言している5alpha-reductasの酵素力学的検討から、この発言が通常の前立腺に見られる酵素と質的に異なることをKm値の相異から推定しているが、さらにpHに対する反応性の違いからもこの点は裏付けられるにいたった。LNCaP細胞はアンドロゲン依存性増殖をしめすヒト前立腺癌培養細胞株として知られている。この細胞には5α-reductaseと17β-hydroxy-steroid dehydrogenaseの存在が確認されており、アンドロゲン代謝研究のモデルとなっている。testosteroneを基質とした時のこの細胞における主たる代謝産物は、androstenedioneであり、5α-dihydrotestosteroneの生成量は極めて僅かであった。これにたいし、androstenedione基質からの代謝では、5α-dihydrotestosteroneの生成量が、testosterone基質からの生成量の9倍に達した。この結果からLNCaP細胞ではandrostenedioneから、より効率的な5α-dihydrotestosterone生成が認められる点で、この細胞におけるアンドロゲン代謝の特異性が示された。この結果はまた、LNCaP細胞の5α-reductaseの性質が、通常の前立腺に認められるものとは異る可能性を示唆しており、この点をさらに詳しく調べる目的で、ミクロソーム分画局在のLNCaP細胞5α-reductaseと、ヒト前立腺肥大症組織5α-reductaseのandrostenedione基質に対するKmおよびVmaxを比較検討した。その結果、LNCaP細胞と前立腺肥大症組織とともに、単位蛋白量あたりのVmaxは、ほぼ同等であったのにたいし、Km値は、前立腺肥大症組織で、7.6×10^<-9>M・LNCaP細胞で4.7×10^<-6>Mと、両者のあいだには1000倍の差を認めた。このように、LNCaP細胞の5α-reductaseでは基質低親和性であることが特徴であり、通常の前立腺に発現しているものとは異るisoenzyrueである可能性が示唆された。これらの点をさらに確認するために、finasterideによるinhibition studyおよび、5α-reductaseの遺伝子発現の両者の観点から検討を進めている。
注意欠如他動性障害の神経基盤の男女差の解明-マルチモダルMRIを用いて

注意欠如多動性障害(ADHD)は小児期に最も多く見られる精神疾患で、男女比が2から10対1と男児が多く、症状の経過にも男女差があるといわれている。男女差の重要性が注目されるようになってきたが、脳神経学的基盤の男女の差は明らかとなっていない。本研究の指標として、侵襲性のない磁気共鳴画像を用い、機能的および構造脳回路結合のADHDの男女の差を検討し、それぞれ定型発達児との判別を行い診断のための客観的指標の開発を目指す。
植物の非宿主抵抗性発現における細胞骨格ネットワークの機能

本研究では、オオムギ細胞における非宿主抵抗性発現への微小管の関与を明らかにした上で、微小管およびアクチンの役割を検証し、以下のような結果を得た。1.オオムギ子葉鞘に非病原菌であるエンドウうどんこ病菌Erysiphepisiを接種し、同時に微小管の阻害剤(コルヒチンおよびオライザリン)で接種子葉鞘を処理したところ、本菌は非宿主であるオオムギに侵入し、吸器を形成した。阻害剤処理した細胞内の微小管を免疫細胞化学的に染色した結果、配向変化がほぼ完全に抑制されていることが明らかになった。以上の結果から、アクチンと同様、微小管もオオムギの非宿主抵抗性発現に重要な役割を果たしていることが明らかになった。2.E. pisiをオオムギ子葉鞘細胞に接種後、抵抗性関連物質ならびにミトコンドリア,ER、ゴルジ体の局在を特異的染色方によって経時的に観察した結果、非病原菌が侵入を開始する前後から、これらの反応の侵入地点下への局在化が観察された。3.我々の研究から、非宿主抵抗性を打破することが既に確認されているアクチン阻害剤および1.で効果を確認した微小管の阻害剤を子葉鞘に処理した結果、2.で観察された抵抗性関連物質およびオルガネラの局在化はほぼ完全に抑制された。以上の結果から、主要な細胞骨格であるアクチン繊維及び微小管はいずれもオオムギの非宿主抵抗性に関与することが明らかになるとともに、抵抗性発現における細胞骨格の機能は抵抗性関連物質やオルガネラを局在化させることである可能性が強く示唆された。
<私>の言語論的存立構造の哲学的研究

独在的<私>と独今的<いま>が非常によく似た仕方で現実概念の根本にあることが明らかとなった。<私>と<いま>が世界のどの個人、どの時点を開闢点とするかは偶然である。にもかかわらず、いったん開闢されるとその特異点は諸個人のうちの一人物と歴史時間の現在に位置づけられ、特異性を失う。そしてこのことがむしろ現実性の条件となっている。このような二重性は、言語の使用者がまさにその使用によって言語世界の限界内に位置づけられる、その仕方によって理解されねばならない。2007年夏に山口大学総合研究棟にて「夏の山口ワークショップ〈私〉の言語論的存立構造の哲学的研究2007年度」を開き、研究分担者に4人の研究協力者を加えて2日間にわたって研究合宿を行った。発表は次のとおり。上野修主体の開設と出来事永井均「ゾンビ」の本質-チャーマーズの問いの真の意味-入不二基義時間のメタ様相と二つの運命論古荘真敬何が誰にとって「存在」しているのか?青山拓央時間の哲学-時間の流れとタイムトラベル-郡司ペギオ幸夫時間の構造討議の中で「独在論的な〈私〉」と時間の〈いま〉との関わりが共通の問題として浮かび上がってき、今後の研究の方向づけを得ることができた。時間そのものの構造が〈いま〉の絶対的な指定を含むとともに、この〈いま〉は居並ぶもののない〈私〉が位置する絶対的な場所である。この〈私〉は死とともに言語共同体を立ち去る可能性のもとにあり、〈いま〉を偶然的で、かつ、ある意味必然的な所与性(運命)として引き受ける位置にある。このように、時間論と独在論の関わりが今後の本研究の中心問題になるであろうという展望を得ることができた。その後メーリングリストを通じて分担者・協力者の間で情報交換を継続し、本年度末には青山学院大学において研究会を開き、関連するテーマで勝守真(秋田大学)、小山悠(東京大学大学院総合文化研究科)を招いて発表を聞き、共同討議を行った。2008年夏に日本大学でワークショップを行った。発表は次のとおり。古荘真敬:「もののあはれ」と「自己触発」中野昌宏:アブダクションの積極的条件としてのファラシー三平正明:一人称:指示と自己意識山田友幸:山田友幸の死が<私>の死を伴わない可能性があるように思えることが錯覚である可能性重田謙:言語ゲームの地平における時間また、2009年3月に本研究の締めくくりとなる「シンポジウム:<私>とは何か-永井均に聞く」を大阪大学で開いた。提題は次のとおり。入不二基義:<私>とクオリア-マイナス内包・無内包・もう一つのゾンビ-上野修:現実指標としての<私>青山拓央:『なぜ意識は実在しないのか』(永井均著、岩波書店、2007)検討永井均:コメント今年度は永井の独在論的な<私>の孕む問題を、指標詞的観点、および現実性の観点から研究討議し、議論を深めることができた。
疾患モデル動物を用いた鎖骨頭蓋異形成症の歯牙の異常の研究

PTHrP遺伝子欠損マウスにおける歯胚の形成異常の原因の1つとして歯胚周囲に限局した骨吸収不全があげられることを我々はかつて解明した。さらに歯胚周囲の骨形成を評価するにあたり、胎生14日齢と胎生15.5日齢の、各々の日齢でのホモ接合子と野生型の下顎を比較解析した。また、歯胚周囲以外の部位においても評価を行うため同試料での下肢の光学顕微鏡像を比較したところ、ホモ接合子において両部位で形成された骨と骨芽細胞が明らかに多く認められた。各々の日齢のアルカリフォスファターゼ染色を行った切片を用い、骨形態計測により定量的に評価したところ、骨形成系のパラメターがホモ接合子で下顎、下肢ともに有意に増加していた。以上の事柄より、PTHrP遺伝子欠損マウスにおいて胎生の早期で全身性に骨形成が亢進しており、骨形成の増加もPTHrP遺伝子欠損マウスにおける歯胚の形成異常の原因であることが示唆された。また、大阪大学との共同研究として、多数歯にわたる過剰歯や埋伏歯・萌出遅延を伴うヒト鎖骨頭蓋異形成症(CCD)と類似した表現形を持つRunx2遺伝子欠損マウスが提供された。そのマウスを飼育、繁殖し、歯の形成、萌出の検討を行った。まず、野生型とヘテロ接合子において下顎切歯、上顎切歯、上顎臼歯の萌出時期を出生直後から12時間おきに1日に2度、視診および触診により調べた結果、ヘテロ接合子で有意な歯の萌出の遅延がみられた。両遺伝子型において、TRAP染色を行った切片を用いて臼歯部の萌出路の破骨細胞表面を計測したところ、萌出直前の時期でヘテロ接合子において減少が見られた。以上のことからRunx2遺伝子欠損マウスはヒト鎖骨頭蓋異形成症(CCD)の疾患モデルとして有用であり、同疾患における歯の萌出遅延のメカニズムの1つとして萌出直前の時期の破骨細胞減少が示唆された。PTHrP遺伝子欠損マウスにおける歯胚周囲の骨形成を評価するにあたり、胎生14日齢と胎生15.5日齢のホモ接合子と野生型の下顎と、歯胚周囲以外の部位においても評価を行うため下肢の光学顕微鏡像を比較したところ、ホモ接合子において両部位で形成された骨と骨芽細胞が明らかに多く認められた。実際にアルカリフォスファターゼ染色を行った切片を用い、骨形態計測により定量的に評価したところ、骨形成系のパラメターがホモ接合子で下顎、下肢ともに有意に増加していた。さらに骨の石灰化を評価するため下顎骨のカルセインラベルを行い、三次元画像解析ソフトを用い、立体構築を行ったところ、ホモ接合子において明らかなラベル量の増加が認められた。以上のことからRunx2遺伝子欠損マウスはヒト鎖骨頭蓋異形成症(CCD)の疾患モデルとして有用であり、同疾患のおける歯の萌出遅延のメカニズムの1つとして萌出直前の時期の破骨細胞減少が示唆された。さらに歯胚周囲の骨形成を評価するにあたり、胎生14日齢と胎生15.5日齢のホモ接合子と野生型の下顎と、歯胚周囲以外の部位においても評価を行うため下肢の光学顕微鏡像を比較したところ、ホモ接合子において両部位で形成された骨と骨芽細胞が明らかに多く認められた。アルカリフォスファターゼ染色を行った切片を用い、骨形態計測により定量的に評価したところ、骨形成系のパラメターがホモ接合子で下顎、下肢ともに有意に増加していた。さらに骨の石灰化を評価するため下顎骨のカルセインラベルを行い、三次元画像解析ソフトを用い、立体構築を行ったところ、ホモ接合子において明らかなラペル量の増加が認められた。

両遺伝子型において、TRAP染色を行った切片を用いて臼歯部の萌出路の破骨細胞表面を計測したところ、萌出直前の時期でヘテロ接合子において減少が見られた。以上のことからRunx2遺伝子欠損マウスはヒト鎖骨頭蓋異形成症(CCD)の疾患モデルとして有用であり、同疾患のおける歯の萌出遅延のメカニズムの1つとして萌出直前の時期の破骨細胞減少が示唆された。また現在、CCDにおける過剰歯形成のメカニズムに迫るため、同遺伝子欠損マウスのホモ接合子の歯胚をin situ hybridizationにて解析している。PTHrP遺伝子欠損マウスにおける歯胚の形成異常の原因の1つとして歯胚周囲に限局した骨吸収不全があげられることを我々はかつて解明した。さらに歯胚周囲の骨形成を評価するにあたり、胎生14日齢と胎生15.5日齢の、各々の日齢でのホモ接合子と野生型の下顎を比較解析した。また、歯胚周囲以外の部位においても評価を行うため同試料での下肢の光学顕微鏡像を比較したところ、ホモ接合子において両部位で形成された骨と骨芽細胞が明らかに多く認められた。各々の日齢のアルカリフォスファターゼ染色を行った切片を用い、骨形態計測により定量的に評価したところ、骨形成系のパラメターがホモ接合子で下顎、下肢ともに有意に増加していた。以上の事柄より、PTHrP遺伝子欠損マウスにおいて胎生の早期で全身性に骨形成が亢進しており、骨形成の増加もPTHrP遺伝子欠損マウスにおける歯胚の形成異常の原因であることが示唆された。また、大阪大学との共同研究として、多数歯にわたる過剰歯や埋伏歯・萌出遅延を伴うヒト鎖骨頭蓋異形成症(CCD)と類似した表現形を持つRunx2遺伝子欠損マウスが提供された。そのマウスを飼育、繁殖し、歯の形成、萌出の検討を行った。まず、野生型とヘテロ接合子において下顎切歯、上顎切歯、上顎臼歯の萌出時期を出生直後から12時間おきに1日に2度、視診および触診により調べた結果、ヘテロ接合子で有意な歯の萌出の遅延がみられた。以上のことからRunx2遺伝子欠損マウスはヒト鎖骨頭蓋異形成症(CCD)の疾患モデルとして有用であり、同疾患における歯の萌出遅延のメカニズムの1つとして萌出直前の時期の破骨細胞減少が示唆された。
pooledDNAタイピングを用いた顎顔面変形症のゲノムワイド遺伝的関連解析

骨格性下顎前突症の感受性遺伝子領域のゲノムワイド関連解析を進めるに際して、まず二次スクリーニングを行ったところ、有意な相関を示すマイクロサテライトマーカーはまだ十数個残っていた。そこで、二次スクリーニングでも一次スクリーニングと同様に相関を示した十数個のマーカーに関して、一次、二次で行ったようなpooledDNAを鋳型にしたタイピングを行うのではなく、個々の患者サンプルを用いたindividualタイピング(三次スクリーニング)を行った。その結果、骨格性下顎前突症の感受性遺伝子領域は1p22.3と1q32.2、さらには15q22.2である可能性が示唆された。学童期に顎変形した患者を一度歯科矯正単独(健康保険適応外で自費診療、約50万円)で治療しても、その後の思春期成長で再発し顎顔面変形症となる患者も多く、手術を伴う矯正治療で再治療となってしまう。顎変形症の患者よりゲノムDNAを調製し、顎変形症の原因遺伝子が全ゲノム領域のどの位置に座位しているかを明らかにし、そのいくつかの座位する部位にある原因遺伝子の特定をめざすことが本研究の目的である。初年度である本年度ではまず、三次スクリーニング用のサンプル採取として、北海道大学病院を受診した顎変形症患者のうち、ゲノム倫理委員会の承認のもとに同意・承諾を文書で得られた者より、血液一般検査時に血液(8.5ml)を採取し、DNA抽出キット(QIAGEN社)を用いてヒトゲノムDNAを調製した。これより同時に患者の親のうち同意・承諾を文書で得られた者からもサンプルを採取した。また、平成19-21年度科学研究費若手研究Bの補助を受けて既に行われた一次スクリーニングの結果の信頼性を高めるために、既に設定済みの全ゲノムを約100kbの間隔で網羅する多型マイクロサテライトマーカーを用いて、非血縁患者集団(顎変形症のうち骨格性下顎前突症のみ)と非血縁健常者集団による確認再スクリーニングを行った。さらに、この解析を補正ありで二次スクリーニングとして行うために、一次スクリーニングに用いたものとは別の非血縁患者集団と非血縁健常者集団のpooled DNAを作製した。初年度である昨年度にはまず、平成19-21年度科学研究費若手研究Bの補助を受けて既に行われた一次スクリーニングの結果の信頼性を高めるために、既に設定済みの全ゲノムを約100kbの間隔で網羅する多型マイクロサテライトマーカーを用いて、非血縁患者集団(顎変形症のうち骨格性下顎前突症のみ)と非血縁健常者集団による確認再スクリーニングを行った。二年目である本年度では、この二次スクリーニング用のpooled DNA(非血縁患者集団と非血縁健常者集団による)を用いて、多型マイクロサテライトマーカーによる二次スクリーニングを行った。その結果、一次スクリーニングでは顎変形症陽性マーカーがまだ4,000程度も存在したが、二次スクリーニング後に一次、二次とも陽性だったマーカーは約600となり、絞り込むことに成功した。骨格性下顎前突症の感受性遺伝子領域のゲノムワイド関連解析を進めるに際して、平成23年度に終了した二次スクリーニングまで行っても、有意な相関を示すマイクロサテライトマーカーはまだ十数個残っていた。すなわち、疑陽性を示すマーカーがまだいくつか残っている可能性があった。そこで、二次スクリーニングでも一次スクリーニングと同様に相関を示した十数個のマーカーに関して、一次、二次で行ったようなpooled DNAを鋳型にしたタイピングを行うのではなく、個々の患者サンプルを用いたindividualタイピングを行った(三次スクリーニング)。交付申請書に記載した、研究計画の平成23年度分まで、ほぼ達成することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書に記載した、平成24年度(最終年度)分の研究計画に従って研究を行う。600マーカー全てのindividual typingを行うと、本研究費だけでは施行できないので、第1染色体上のマーカーに絞って研究を行う予定である。
めん羊骨格筋、脂肪細胞におけるグルコース輸送のインスリンによる制御機構

生理学的に活性のあるめん羊単離脂肪細胞および骨格筋あるいはそれ等のsubcellular fractionおよび部分精製インスリンレセプターを使用して、レセプター結合解析、グルコースの膜輸送およびグルコース代謝に及ぼすインスリンの生物学的効果を検索した結果、グルコースの膜輸送系にインスリン抵抗性が存在していることが明らかとなった。次にCytochalasin B binding assayによりグルコース輸送担体の細胞内局在に及ぼすインスリン効果を検索した結果、めん羊におけるグルコースの膜輸送系は非反芻動物と同じ特性を有しているが、グルコース輸送担体数が絶対的に少なく、しかも細胞内プールから原形質膜への輸送担体のトランスローケーションに及ぼすインスリン効果も小さいことが判明した。次に、グルコース輸送担体のアイソホームであるGLUT-1(赤血球/脳型)およびGLUT-4(インスリン感受性型:脂肪/筋型)蛋白をウエスタンイムノブロッティング法により検索した結果、GLUT-1ラベルはラットと差がないもののGLUT-4は原形質膜および細胞内プールで著しく低レベルであること、めん羊はラットと同様にGLUT-1ではなくGLUT-4のインスリン誘引トランスローケーション刺激により細胞内へのグルコース輸送を促進していることが明らかとなった。しかし、インスリンによるGLUT-4のトランスローケーション刺激はラットに比し顕著に低下しており、この過程にインスリン抵抗性が存在していることが判明した。このことはインスリン抵抗性がインスリンの細胞内情報伝達機構に存在していることを暗示している。そこでインスリンレセプターの自己リン酸化能およびチロシンキナーゼ活性を測定した結果、めん羊におけるインスリン刺激レセプターβサブユニットの自己リン酸化能および外因性基質に対するリン酸化能はラットに比し著しく低下しており、これがめん羊グルコース代謝におけるインスリン抵抗性の機序であるとの新知見を得た。
シロイヌナズナにおける茎頂分裂組織構築の分子機構

1)SAM形成に関わるるCUC1(CUP-SHAPED-COTYLEDON1),CUC2遺伝子の下流候補遺伝子をマイクロアレイ解析で多数同定し、それらに対して心臓型胚における発現をin situ hybridizationで調べた。その結果、これらの多くの遺伝子が、CUCが発現する所で発現しており、cuc1cuc2二重変異株胚の対応する領域で発現が見られなかった。ただ、これらの中には、野生株でもcuclcuc2でも胚の中で他の領域で特異的な発現を示す遺伝子が幾つかあった。そして、それらの遺伝子の一つであるLAS(LATERAL SUPPRESOR)をCUC2のプロモーターで発現させた所、cuc2cuc3の地上部が示す異常を抑圧した。これは、LASがCUCの下流でSAM形成に関わる事を示唆する。2)側根基部の細胞分裂を制御するPUCHI遺伝子の変異株は、地上部において花茎の基部に一対の突起物を生じ、その間に構造物が出来る。分子遺伝学的な解析により、この突起物は托葉である事が強く示唆された。また、花芽におけるPUCHIの発現を調べた所、花芽初期に一過的に花芽の上側に発現する事が判った。これらの結果と、野生株と変異株の初期の花芽の形態学的観察の結果から、PUCHIはシロイヌナズナの野生株において花芽分裂組織が形成される時、その根元で包葉が発達するのを阻害している可能性が示唆された。3)シロイヌナズナの胚頂端部において、オーキシンの細胞外排出タンパク質PIN FORMED1(PIN1)の分布が2枚の線対称な子葉構築に関わり、PID(PINOID)はPIN1タンパク質の働きを後期心臓型胚期から強める事をこれまでに明らかにした。我々はpidエンハンサーmacchibou(mab)1-4を単離し解析しているが、MAB4はNPH3ファミリーのタンパク質をコードしており、PIN1タンパク質の細胞内局在に関与する事を明らかにした。そして、MAB4タンパク質が主として細胞内の機能未知の小胞に局在し、それらの小胞にPIN1やPIDも共局在する事も明らかにした。植物は上下軸とそれに直交する同心円状の軸を組合わす事で基本的な体作りを行っているとうまく説明できる。そして、この2軸は胚発生過程で確立する。また、この過程で上下軸にそって胚軸と幼根の先端に分裂組織ができ、発芽後これらの分裂組織から新たな器官が次々と作られる。本研究は植物における体作りの基本的な分子機構、特に茎頂分裂組織(SAM)形成の分子機構の解明と、胚における上記の2軸と双子葉植物が2枚の子葉を線対称に生じる機構に関する分子的実体の解明をシロイヌナズナを材料にめざす。胚発生過程および不定芽形成過程で、CUC1(CUp)-shaped Cotyleon 1)とCUC2の転写因子が遺伝学的に下流に存在するSTM(ShooTMeristemless)の発現を調節する事によりSAM形成を促す事を既に示唆した。さらに、2重変異株の芽生えで子葉が融合するが単独変異株の芽生えの子葉は正常である事を示した。本年度は主としてcuc1やcuc2の単独変異株を変異原処理し、融合した子葉を持つエンハンサーラインに関する研究を行った。現在までに、cuc2エンハンサーが14ライン取られておりそのうち7ラインはcuc1の新しいアリルである。残り7ラインの内4ラインは同じ遺伝子の変異であった。これをクローニングした所NACドメインを含む新規の遺伝子でありCUC3と名付けた。残りの一つはGNOMの弱い変異であった。さらに、残り2つは同じ遺伝子の変異であり、新規の遺伝子の可能性が高い。一方、cuc1のエンハンサーを現在3つ解析しており、1つはPIN1、1つはGNOM、残りの1つは新規の遺伝子の可能性が高い。現在、更に新しいエンハンサーを探すと共に、これらのラインの分子遺伝学的な解析を進めている。植物の地上部において、発芽後に胚軸の先端の分裂組織(Shoot Apical Meristem;SAM)から新たな器官が次々と作られる。本研究の目的の一つはシロイヌナズナを材料にSAM形成の分子機構の解明をめざすことである。これまでに、胚発生過程および不定芽形成過程で、転写の活性化因子であるCUC1(CUp-shaped Cotyleon 1)とCUC2タンパク質が遺伝学的に下流に存在するSTM(ShooT Meristemless)の発現を調節する事によりSAM形成を促す事を示唆した。そして、CUC1を異所的に発現すると、子葉に切れ込みが入り子葉の上に異所的な不定芽が誘導できる事_一方、stm変異株に導入すると子葉に切れ込みはできるが不定芽は誘導されない事を示した。本年度はこの実験系を用いてオリゴDNAマイクロアレイ解析を行う事で、CUC1の下流で機能する新規遺伝子を同定する実験を試みた。まず、野生型(Ler)と35S::CUC1、stm変異体と35S::CUC1/stmそれぞれの組み合わせでマイグロアレイによる発現のプロファイルの比較を行った。次にこの2つの実験から得られたCUC1下流遺伝子の可能性の高い候補遺伝子に対して、RT-PCRによる発現の再確認を行った。その結果、Lerバックグラウンド及びstmバックグラウンドのどちらにおいても35S::CUC1によって発現が上昇したものが7遺伝子得られた。それらはCUC1の下流かつSTMの上流に位置すると考えられる。

またLerバックグラウンドでのみ発現が上昇したものを5遺伝子得ることができ、それらはSTMの下流に位置すると考えられる。両方をあわせるとCUC1の下流で働く遺伝子の候補として、新たに少なくとも12遺伝子を得た。現在、それらに関してin situ hybridization法で胚発生過程における発現パターンを調べている。現在までに、その中の2遺伝子が胚発生過程でCUCやSTMと良く似た発現パターンを示す事を明らかにした。その一つはCUC遺伝子の後期の発現と同じく器官の境界部で強い発現がみられた。もう一つはBELL型ホメオドメインタンパク質BELLRINGER(BLR)をコードしていた。BLRはSTM等と結合してSAMの維持に関わると考えられている。1)シロイヌナズナの胚頂端部の線対称性の確立にオーキシンが重要な働きをする事、オーキシンの分布を決めるPIN FORMED1 (PIN1)およびPINOID (PID)が重要である事、オーキシンにより子葉の形成に負に働くCUP-SHAPED COTYLEDON1 (CUC1)の発現を2つの子葉原基の間に限定させる事が子葉の発達に取って重要である事を既に示していた。その中でも、PIN1は線対称なパターン形成に関わる事、PIDはPIN1の働きを後期心臓型胚期から強める事を示し,これらの遺伝子の2重変異株は子葉発達が極端に悪くなり、棒状の芽生えに成る事を示していた。この線対称性や子葉の形成に関係する新規の遺伝子を捜す為に、pidを変異原処理する事で棒状の芽生えを持つpidエンハンサーを4ライン単離した。これらはその表現型からmacchibou (mab)変異株と名付けた。それぞれが独立の遺伝子の変異であり、MAB3はPIN1であった。MAB1はクローニングし、MAB4も原因遺伝子の候補を見つけた。2)シロイヌナズナから地上部の形態が異常な新規の変異株uni-1dを単離した。この変異株は多くのロゼット葉と短い花茎を持つ。遺伝学的な解析の結果、この変異は1遺伝子座の半優性変異であった。発生過程の解析から、ヘテロ変異植物において葉脇に生じる側芽が子葉や第1葉、第2葉にも複数生じ、葉の形態異常や葉序も乱れ、頂芽優性が見られず、花成が遅れ、花茎が伸長せず、花芽分裂組織は数個の花芽を形成して発生を停止する事が判った。そして、ホモ変異植物は異常な形態の本葉を形成し、多くの側芽を形成するが花茎は形成されない。この変異の原因遺伝子は、CC-NBS-LRRの一つをコードしており、ヘテロ、ホモ変異株で抵抗性遺伝子の幾つかの転写が上昇していた。さらに、この変異株から遺伝子内復帰変異株を取り解析した結果、この変異が恒常的な活性型タンパク質の産生により生じる可能性が示唆された。1)シロイヌナズナの胚頂端部において、オーキシンの分布を決めるPIN FORMED1(PIN1)が線対称なパターン形成に関わり、PID(PINOID)はPIN1の働きを後期心臓型胚期から強める事、オーキシンにより子葉の形成に負に働くCUP-SHAPED COTYLEDON1(CUC1)の発現を2つの子葉原基の間に限定させる事が子葉の発達に取って重要である事を既に示した。そしてpin1pid2重変異株は子葉発達が極端に悪くなり、棒状の芽生えになる事を示した。
いもち病圃場抵抗性遺伝子Pb1の抵抗性発現機構の解析

穂いもち病圃場抵抗性Pb1は、すでに育種利用されているいもち病圃場抵抗性遺伝子であり、真性抵抗性に関わるRタンパク質と類似の構造を有する。本研究では、Pb1によるシグナル伝達が、WRKY45への直接的なタンパク質間相互作用を介していることを明らかにした。また、このタンパク質間相互作用によりWRKY45のタンパク質が安定化し、その結果防御応答が亢進することが示された。いもち病は全国的に発生する稲の最重要病害である。Pb1は、すでに育種利用されているいもち病圃場抵抗性遺伝子であり、真性抵抗性に関わるRタンパク質と類似の構造を有する。しかしながら、Pb1による抵抗性は、真性抵抗性とは異なり安定で菌系特異性も認められない。このような抵抗性の特性を決定する要因を分子レベルで明らかにし、真性抵抗性との違いを明らかにすることは、Pb1遺伝子の育種利用に重要である。Pb1による抵抗性の特性を規定する要因の一つとして、感染認識から抵抗性発現に至るシグナル伝達が重要と考えられる。本申請研究では、これまでの申請者らの研究で示唆されたPb1からWRKY型転写因子へのタンパク質間相互作用を介したシグナル伝達の検証およびその分子機構の詳細な解明を通じ、Pb1による抵抗性の安定性の分子基盤を明らかにすることを目的としている。まず、Pb1の抵抗性に細胞内での移行が抵抗性を発揮するために必要か否かを検証した。そこで、Pb1にeGFPを付加した融合タンパク質を恒常的に発現する形質転換イネを作出して実験を行った。この形質転換イネにいもち病を感染させたが、この融合タンパク質のGFPシグナルが非常に低いことから細胞内での移行について明らかにすることができなかった。一方で、Pb1に核排除配列を付加した融合タンパク質を、恒常的に発現させた形質転換イネを作出した。この形質転換植物のいもち病抵抗性を調べると、優位に野生型恒常的発現体に比して抵抗性が低下していた。このことから、Pb1抵抗性には核内に移行することが必須であることが示された。また、Pb1系統においてWRKY45の遺伝子発現を抑制した形質転換イネを作成した。この植物の穗いもち抵抗性を調べると、その抵抗性が低下していた。これらのことから、Pb1の抵抗性にはPb1の核内への移行が必要であり、WRKY45に依存していることを明らかにした。本申請研究では、これまでの申請者らの研究で示唆されたPb1からWRKY型転写因子へのタンパク質間相互作用を介したシグナル伝達の検証、およびその分子機構の詳細な解明を通じ、Pb1による抵抗性の安定性の分子基盤を明らかにすることを目的としている。GFPを用いた解析からPb1は細胞質と核に存在し、WRKY45は核に局在した。まず、Pb1の抵抗性にPb1タンパク質の細胞内での移行が抵抗性発現のために必要か否かを検証した。Pb1に核排除配列を付加した融合タンパク質を、恒常的に発現させた形質転換イネを作出した。この形質転換植物のいもち病抵抗性を調べると、野生型恒常的発現体に比較して抵抗性が低下していた。Pb1系統においてWRKY45の遺伝子発現を抑制した形質転換イネを作成した。この形質転換植物の穂いもち抵抗性を調べると、その抵抗性が低下していた。これらのことから、Pb1の抵抗性はWRKY45に依存していることを明らかにした。さらに詳細にWRKY45への依存性を調べるために、Pb1とWRKY45の相互作用能が低下した変異体Pb1(Pb1-Quad)の過剰発現体(Pb1-Quad-ox)を作成した。Pb1からWRKY45の直接的なシグナル伝達の機構として、Pb1によるWRKY45のプロテアソーム分解からの抑制が関与している可能性があることを、in vitroで明らかにしてきた。これをin vivoで検証するために、本年度ではイネプロトプラストを用いた一過的発現系を用いて解析を行い、イネ細胞内においてPb1の共存によってWRKY45タンパク質が蓄積を示唆する結果を得た。いもち病はイネに大きな被害を与える病害ですが、特に穂で発生する穂いもち病は、米の収量や品質の低下等を直接招きます。穂いもち病抵抗性遺伝子Pb1 (Panicle Blast1 )は、すでに育種利用されている抵抗性遺伝子であり、真性抵抗性に関わるRタンパク質と類似のタンパク質構造(CC-NB-LRR)を有しています。しかしながら、Pb1による抵抗性は、真性抵抗性とは異なり安定で菌系特異性も認められません。このような抵抗性の特性を決定する要因を分子レベルで明らかにし、真性抵抗性との違いを明らかにすることは、Pb1遺伝子の育種利用や遺伝子組換えによる利用において非常に重要であります。

本研究では、Pb1タンパク質が、いもち病に対してイネの免疫に重要な役割を果たす転写因子WRKY45にシグナルを伝達することで、穂いもち抵抗性が高まることを証明しました。WRKY45へのタンパク質間相互作用の弱いPb1を、人工的に作成してその機能を調べると、Pb1の抵抗性は喪失していました。このことから、Pb1とWRKY45が直接相互作用することが重要であることを明らかにしました。また、通常WRKY45はユビキチン/プレテアソーム分解により、不必要な活性化が行われないように制御されています。Pb1タンパク質はWRKY45タンパク質と直接相互作用することにより、WRKY45を蓄積させ免疫シグナルを亢進することによって、いもち病への抵抗性を付与していることが明らかになりました。この成果は、米国科学雑誌「米国科学アカデミー紀要のオンライン版」に公開される予定です。Pb1からWRKY45へのシグナル伝達について解析を行った結果、Pb1の抵抗性にはPb1の核局在性が必要であることを明らかにした。また、その抵抗性にはWRKY45が必須であることを、二つの独立な実験によって証明することができた。さらに、植物細胞内においてPb1の共発現によるWRKY45保護の作用について、示唆的なデータを得た。これらのことから、本研究は計画通り順調に進んでいると評価する。24年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度までに得られた実験において、データの再現性の確保および論文を執筆するレベルのデータを収集する。さらに、プロトプラストを用いた一過的な発現系を用いて、Pb1およびWRKY45を発現させ、WRKY45タンパク質の蓄積および、転写活性化能の活性化等を解析する。
腸内細菌叢の精査解析法の開発と潰瘍性大腸炎原因菌の特定・有効抗菌薬の検索

UC発症モデルマウスならびに健常マウスの糞便からDNAを抽出し、DGGEにて解析した。その結果UC発症マウスに特異的な複数のバンドを確認することができた。さらにmetagenome法により、各検体より15,00040,000リードの塩基配列を得て、それぞれ菌種名を特定したところ、UCマウスで優位に菌数が増えていた菌群を見出すことができた。これらはBacteroides, Parabacteroides, Clostridiumなどの有害菌・日和見菌とされる菌群であった。UCマウスで有意に多数存在していたClostridium sp. ID4株をマウスに経口投与したところ、腸管壁における炎症像が見られた。以上のことより、本研究で見出された菌群は、少なからずUC発症と関係していると考えられた。潰瘍性大腸炎(UC)の発症に関しては、これまでの多くの知見から特定の腸内細菌との関連性が取り沙汰されているが、膨大な量の腸内細菌叢の陰に隠れ、その原因菌の特定は出来ていない。UC発症にかかわる責任微生物を特定し、加えて有効な抗菌薬の検索を行うことを目的として研究を行っている。初年度は、まず比較対象菌種基準株の入手をいった。腸内細菌叢の中で特にメジャーであるとされているBacteroides spp., Clostridium spp., Lactobacillus spp., Propionibacteriumspp.など26属35菌種の基準株を入手し、それぞれ培養条件の確認を行い、併せて菌体よりDNAを抽出し、DGGE解析をはじめ、種々の解析法のための比較基準として使用する準備を整えた。岐阜薬科大学の森教授(研究協力者)より分与を受けたUC発症マウスおよび健常マウス由来の糞便から全DNAを抽出し、DGGE解析を行ったところ、UC発症マウスに特異的に見出される電気泳動バンドが見られた。この特異バンドの切り出しと、その産物からの塩基配列決定を試みたが、信頼性の高いデータを得ることが困難であることが判った。今後は、メタゲノム解析の手法を導入し、UC発症マウスで優位に増加している菌種を見出し、その培養方法の確立と共に疾患との関連を見出していく予定である。2年目は、初年度にDGGE解析によりUCマウス特異的と思われるバンドが見出されたこと、その特異バンドを切り出し、塩基配列から菌種名を特定する試みが十分な信頼性をもって実行し得なかった事より、同様のサンプルを使い、pyrosequenceにより網羅的に塩基配列を決定するメタゲノム解析を行った。その結果、健常マウスにはなくUCマウスに特異的に検出される複数の菌群由来の塩基配列を見出すことに成功した。それらの菌群の中には、文献的にUCと同じ慢性疾患であるクローン病の原因であると推定されているものも含まれており、UC発症との関連の可能性がひときわ高いものも含まれていた。現在、これらの論文著者より菌株分与の連絡を取り、一部については入手することができた。最終年度は、上述の菌株でUC症状を再現できるかを確認し、加えて有効薬剤の選定を行いたい。潰瘍性大腸炎の発症に関しては、これまでの多くの知見から特定の腸内細菌との関連性が取り沙汰されているが、膨大な量の腸内細菌叢の陰に隠れ、その原因菌の特定は出来ていない。潰瘍性大腸炎発症にかかわる責任微生物を特定し、加えて有効な抗菌薬の検索を行うことを目的として研究を行っている。2年目にメタゲノム解析法によりデキストラン硫酸で潰瘍性大腸炎を発症させたマウスに特異的に存在している菌群を見出すことに成功した。文献上、それらの幾つかについては潰瘍性大腸炎と同じ慢性腸疾患であるクローン病の原因であると推定されていた。そこで当該菌株を米国より輸入し、培養の後、健常マウスに経口投与を行った。経口投与を4週間実施したところ、外観上は下痢や軟便あるいは下血といった顕著な症状は示さなかったが、剖検の結果、腸管には炎症細胞の塊と思われる所見が見られ、炎症状態となっていることが確認できた。健常マウスより有意に多数検出された菌種についても同様に経口投与を実施したが、まったく炎症症状は見られなかった。

以上のことより、我々が実施したアプローチで見出すことができた菌群は潰瘍性大腸炎の発症に少なからず関与していると考えられた。
広帯域無線産業の競争環境整備のための制度設計――「上下分離とEMM」導入

本研究の目的は、インターネット移動通信サービスを供給する「広帯域無線産業」に競争環境を導入するための制度・システムを設計し、制度の基盤について分析を加えることである。日本の同産業では、規模の経済と規制当局による電波の直接配分の結果生じた「暗黙協調下の寡占」状態が続き、消費者・ユーザの高負担・不便・不公平に加え、産業成長の減速を招いている。本年度は、次年度から導入が予定されている「第5世代(5G)通信」の電波利用基盤において生ずる「自然独占問題」を検討した。5Gにおける技術的特色からスモールセルの採用と、その結果としての重複設備投資の回避と同供給独占(自然独占)が不可避であり、競争推進のためには5Gサービスの上下分離が自然な対応策である。これにより、少なくとも「上部サービス」で競争環境を実現できる。問題は「下部基盤(インフラ)」の独占から生ずる弊害である。そのために、まず同上下分離を実施した場合に事業者に課すことが適切と考えられる規制内容を考察した。ただし、企業統合経営の利益を損じないよう、会社分割ではなく、「サービスの分離」のみを提案した。これに次いで、「地域分割」と同インフラ事業の「交代可能性(contestability)」による長期的な独占の弊害防止策を提案した。これに関連し、基地局共有のための「タワー事業」が米国、中国他において近年普及している事実も、上下分離の先取りになっている。これらについても検討を加え、タワー事業やインフラ共用方策の無規制導入は、将来における地域独占とその弊害を招くことを指摘した。これに対し米国においては、周波数オークションを含む競争促進政策が採用され、(規模は大小混在するが100を超える)多数の事業者による競争が同産業の成長に貢献している。本年度においては、放送用周波数帯を通信用に転用するための「インセンティブ・オークション」が実施された。同オークションは、テレビ放送用の600MHz周波数帯を放送用から広帯域無線用に転換することを目的とする。FCCは、2000局を超す放送事業者にテレビ・チャンネルの応札(リバース・オークション)を呼びかけ、他方では通信事業者による入札(フォワード・オークション)を反復実施するという市場メカニズム(多段階売買価格調整方式)を採用し、2016年-17年3月末まで1年間にわたって需給均衡価格を見出した。また需給調整の各段階において、放送用電波を通信用に(周波数帯・地域の2次元において)変換する作業も実施した。この種の市場形態自体はミクロ経済学で前例がなく、また日本における競争促進の参考にするため、同オークションの内容・経過を調査して学会発表をおこなった。広帯域無線産業(BWI)においては、これまで産業活動の必須要件である電波(周波数帯)の稀少性が重要であり、競争の促進や新規参入の実現についても周波数帯(再)配分が主要な問題になっていた。他方最近の技術進歩により、次世代(第5世代、5G)通信においては、高い周波数の電波(センチ波、ミリ波)の利用が可能になり、その結果今後10-15年程度の期間後に電波の稀少性が緩和され、本産業の環境が一変するものと予想される。他方これらの高周波数電波については、到達距離が短いため多数のセル(電波到達範囲)の設定が必要となり、(電力配送に類似する)自然独占が発生すると考えられる。本研究ではこの事態に対応して、研究計画のうち(電波稀少性への対策である)「EMMの検討」よりも(自然独占対応策として有力な)「産業の上下分離」を優先して実施する予定である。本年度においては、独占要因が不可避となっている「電波アクセス部分」と、成長促進のために有用な競争導入が可能な「インターネット、Web等通信サービス部分」を上下に分離する産業構造を採用し、その大要について提案をおこなった。以下はそのための学会発表の要旨である。次世代の移動通信(以下5G)では、高い周波数帯域の電波を利用するので通信容量が大幅に増大するが、到達距離が短いため多数の小型セルの建設を必要とし、(電力配送に類似する)自然独占問題を生じる。また日本では、従来から電波割当が政府管理下にあって市場メカニズムが機能していないこともあり、移動通信への新規参入が皆無で、MNO 3事業者による暗黙の協調寡占と、多数のMVNOによる不公平な環境での競争が続いている。本論文ではこの2問題に対処するため、5G以降において移動通信産業を上下に分離し、中間に公的レイヤーを設ける産業組織(規制方策)を提案する。下部レイヤーは上部および公的レイヤーに対し、変調済電波による無線アクセス・サービスを小規模の地域ごとに供給するフランチャイズ事業である。上部レイヤーは下部および公的レイヤーから周波数帯利用権を購入して通信サービスを供給する競争レイヤーである。

本論文ではレイヤーの切分け方策、各レイヤーの行動原則も検討する。(10.研究発表[学会発表]5件のうち第1項目)本研究の主題である「第5世代通信産業についての上下分離構造の設計」につき、本年度はその大要を完成して、学会発表をおこなったこと。本研究の目的は、インターネット移動通信サービスを供給する「広帯域無線産業」に競争環境を導入するための制度・システムを設計し、制度の基盤について分析を加えることである。日本の同産業では、規模の経済と規制当局による電波の直接配分の結果生じた「暗黙協調下の寡占」状態が続き、消費者・ユーザの高負担・不便・不公平に加え、産業成長の減速を招いている。本年度は、次年度から導入が予定されている「第5世代(5G)通信」の電波利用基盤において生ずる「自然独占問題」を検討した。5Gにおける技術的特色からスモールセルの採用と、その結果としての重複設備投資の回避と同供給独占(自然独占)が不可避であり、競争推進のためには5Gサービスの上下分離が自然な対応策である。これにより、少なくとも「上部サービス」で競争環境を実現できる。問題は「下部基盤(インフラ)」の独占から生ずる弊害である。そのために、まず同上下分離を実施した場合に事業者に課すことが適切と考えられる規制内容を考察した。ただし、企業統合経営の利益を損じないよう、会社分割ではなく、「サービスの分離」のみを提案した。これに次いで、「地域分割」と同インフラ事業の「交代可能性(contestability)」による長期的な独占の弊害防止策を提案した。これに関連し、基地局共有のための「タワー事業」が米国、中国他において近年普及している事実も、上下分離の先取りになっている。これらについても検討を加え、タワー事業やインフラ共用方策の無規制導入は、将来における地域独占とその弊害を招くことを指摘した。次世代(5G)のBWIにおいては、多数セルの重複から生ずる自然独占に対処するため、産業の上下分離を実施し、(自然独占の結果として不可避である)独占レイヤを、独占の弊害を抑制するために最小限導入することが望まれる。次年度以降の本研究においては、BWIの上下分離のための制度設計、とりわけ分離ポイントの設定、上下各レイヤ内における競争確保の方策、中間の独占レイヤ(公社、特殊法人等を想定)における「産業全体の観点からの望ましい(経済)行動原則」の記述と分析を実施する。上記7.に述べた「上下分離構造の設計」において、その細部につきさらに設計・提案を試みる。その項目として、たとえば(1)下部組織である「インフラ部分」は全国を地域別に分割し、ローカル独占・フランチャイズ方式として長期的な競争構造(いわゆるコンテスタブル競争)を導入することが望ましいが、その際地域区分の大小を定めるパラメターは何か。(2)当初「分離構造を導入」する際に必要な(リバース)オークションの細目。(3)インフラ建設(deployment)を加速させるための方策。(4)現存第4世代の通信産業構造からの遷移(transition)方策、などである。本研究代表者による研究成果一覧(発表年別、本事業以外の分を含む)については下記を参照。
重症筋無力症のアセチルコリン受容体主要免疫原性領域に対する抗体：多施設共同研究

重症筋無力症(MG)は、神経筋接合部に免疫反応が生じることによって、シナプスの伝達障害が生じる疾患である。その80%以上にアセチルコリン受容体(AChR)に結合する抗体(AChR抗体)が検出され、診断的価値は高い。しかし、個体間で抗体価を比較しても、各々の臨床症状や重症度を反映しない。そこで我々は、主に免疫反応を引き起こすと考えられるエピトープにたいするモノクローナル抗体と患者血清を競合阻害させることで、患者血清中に含まれる主要免疫原性領域(MIR)に対する抗体(MIR抗体)の測定に成功した。重症筋無力症(Myasthenia Gravis: MG)は、神経筋接合部に生じる免疫反応のため、シナプスの伝達障害が生じる疾患である。その80%以上にアセチルコリン受容体(acetylcholine receptor: AChR)抗体が検出され、診断的価値は高い。そこで我々は、AChRにおける主要免疫原性領域(main immunogenic region; MIR)に対する阻害抗体測定法を開発した。MIR抗体測定の方法は、1982年にTzartosらによって発表された方法を基にして、当方で二次抗体などの調整工夫を行い、確立した。我々は前述のとおり、この測定方法を用いて眼筋型と全身型でMIR抗体価に有意な差が見られることを報告している。また、従来の結合抗体と比較してMIR抗体はMGFA分類、QMGスコア、球症状の有無と有意な相関がみられ、一方で眼筋型かどうかという点では負の相関がみられた(J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2012)。本研究では、詳細にその特徴や測定方法を検討して、MIR抗体の実用化を目標とする。施設によってはRI使用できないこともあり、代替法として非RIによる抗体測定方法の検討も同時に行う。H26年4月1日H27年7月31日は産前産後の休暇および育児休業のため、研究の実績活動はない。その80%以上にアセチルコリン受容体抗体(acetylcholine receptor: AChR)抗体が検出され、診断的意義は高い。しかし、個体間で抗体価を比較しても、高値であるから重症であるといったような指標としては用いることができない。そこで我々は、AChRにおける主要免疫原性領域(main immunogenic region: MIR)に対する阻害抗体測定法を開発した。我々はこの測定方法を用いて、眼筋型と全身型でMIR抗体価に有意な差が見られることを報告している。また、従来の結合抗体と比較して、MIR抗体はMGFA分類、QMGスコア、球症状の有無と有意な相関がみられ、一方で眼筋型かどうかという点では負の相関がみられた(J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2012)。本研究では、JaMRに登録されているMG患者676名のうち226名についてMIR抗体を測定し、本年度は、登録されている臨床情報と抗体価の比較検討を行った。その結果は、採血時期が統一されておらず、免疫治療介入後の検体も含まれており、一定の症候による抗体価の有意性などは確認できなかったが、眼筋型に比して全身型でMIR抗体価が高値である傾向がみられた。産前産後、及び育児に伴う休業中のため。神経病態免疫学現在まで、JaMRのデータベースに登録されたMG患者266名についてMIR抗体測定を行ったが、結果はMGFA分類都の有意な相関は得られず。その要因としては、発症時や免疫治療後の検体を同時に測定したためと考えられる。今後は発症時や治療後効果判定など目的に応じた抗体測定を行い、検討してゆく。また、施設によってはRIを使用できないこともあり、非RIによる抗体測定の検討も同時に行う。JaMR、すなわち、共同研究者である槍沢公明、長根百合子、鈴木重明らを中心として他施設から収集されたMG患者データベースに登録されたMG患者676名のうち、226例についてMIR抗体価の測定を行った。その結果は、眼筋型に比して全身型でMIR抗体価が高値である傾向はあるが、MGFA分類との有意な相関はみられなかった。その要因としては、採血時期が一定でなく、発症時の検体やすでに免疫治療が行われている検体を同一に測定したことが考えられる。また、非RIでの測定系樹立に関しても、現在検討中である。実験に使用する物品の残調整などで昨年度予算に残額が生じた。本年度は育児休業中のため使用せず、次年度使用額が生じた。

発症時や治療効果判定など、抗体価測定する目的に応じて、サンプルを整理する必要がある。また、非RIを用いた測定方法についても検討してゆく。発症時や治療効果判定など、抗体測定する目的に応じて、サンプルを整理し、抗体価の測定や結果の解析を行う。実験に使用する物品の残調整などで本年度予算に残額が生じ、次年度使用額が生じた。発症時や治療効果判定など、抗体価測定する目的に応じて、サンプルを整理し、抗体価の測定や結果の解析を行う。また、非RIでの抗体測定系樹立に関しても、引き続き検討してゆく。
味覚神経機構研究のためのin vitroラット脳幹-脊髄-舌標本の開発

本研究は、舌から鼓索神経・舌咽神経および鼓索神経膝神経節・舌咽神経下神経節を介して延髄孤束核のニューロンネットワークにいたる味覚神経機構について、膜電位イメージング法を用いて解析するためのin vitro実験系を確立することを目的としている。平成13年度には、若齢ラットより脳幹脊髄・顔面神経(鼓索神経)・舌咽神経・舌を一塊として摘出した脳幹舌標本について、その作成手術手技およびin vitroでの維持条件を確立した。そこで、平成14年度には、同標本を用いて本格的に味覚神経機構解析を行った。味覚神経機構を刺激するため、平成13年度には、標本の舌表面各部を微小金属電極を用いて電気的に刺激したが、その場合、舌内筋肉の収縮により標本が動くという問題があった。そこで、平成14年度には標本を計測用チェンバーに確実に固定する工夫を行うとともに、変法として舌を切除し吸引電極により鼓索神経に対して直接に電気刺激を加える実験系も開発した。これら標本を用いた解析の結果、刺激側と同側の延髄孤側核内において、吻側から尾側へと神経興奮波が伝播する過程を可視化することに成功した。さらに、平成14年度には、味覚神経機構の発達過程を解析するため、各種日齢(07日齢)のラットを用い、鼓索神経電気刺激に対する延髄孤側核の神経興奮様式を比較した。その結果、鼓索神経電気刺激に対する延髄孤側核の神経応答は、生後3日以降に特に増強することが明らかになった。これらの成果の一部は、第79回日本生理学会大会で発表した。哺乳動物味覚神経機構は、舌表層部味覚受容器-顔面神経分枝(鼓索神経)・舌咽神経舌枝等-延髄背側部の孤束核等により構成される。中枢性即ち孤束核味覚関連ニューロンの機能については、従来主にin vivo動物を用いた舌の電気・味覚刺激に伴う孤束核ニューロン活動の電気生理学的記録等により機能解析が行われてきたが、それらはほとんどが細胞外記録によるものであり、詳細なニューロン機能解析は遅れている。そこで本研究においては、味覚神経機構研究のための全く新しいin vitro実験系として、ラットより摘出した脳幹脊髄にさらに顔面神経、舌咽神経、舌を付けた脳幹脊髄舌標本を開発することを目的とした。ラットを用いて、下部脳幹、脊髄、顔面神経(鼓索神経)、舌咽神経、舌からなる標本を作成し、in vitro環境においてそのシステム機能を維持することを試みた。具体的には、エーテル麻酔下で若齢ラットから下部脳幹・頚髄・舌を一塊として摘出し、橋・延髄・頚髄に片側の顔面神経・舌咽神経を介して舌がつながった標本を作成した。この標本を膜電位感受性色素(di-4-ANEPPS)で染色後、正立蛍光顕微鏡下の計測用チェンバー内に脳幹背側面を上にして固定し、酸素化人工脳脊髄液により28°Cで連続的に灌流・維持した。本標本の舌表面各部を微小金属電極を用いて電気刺激を行ったところ、膜電位感受性色素を用いた光計測により、刺激側の孤束核神経活動を動的イメージとして解析することに成功した。本in vitroラット脳幹-脊髄-舌標本は、舌から中枢神経系(脳幹)までの神経ネットワークのシステム機能を維持した独創的な実験系であり、味覚神経システムを解明するための各種薬理実験、生理実験に有用であると考えられた。