hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生命科学の時代が求める新材料‐ソフト＆ウェットマテリアルの創製

そのためには未分化のES細胞を生体外in vitroで大量に増殖させた後、目的の細胞へ分化させることが必要であるが、ES細胞は従来の基盤上ではで非常に分化しやすく、これまで未分化性を維持したままのES細胞を効率よく培養することは困難であった。本研究成果によって、ES細胞を中性ゲル上で培養するとこの問題を克服できる。また、本研究成果は、ES細胞の最適な未分化性維持機構を確立するための良いモデル系を提供することになる。本研究は、ソフトでウェットな高分子ゲル材料を開発し、生体材料に応用することを目的とする。平成20年度-21年度は、さまざまな特性を持っゲルを合成し、それらのゲル上における人内皮細胞、軟骨細胞とマウス胚性幹細胞(ES細胞)の培養、増殖、分化を行った。その結果、ゲルの化学構造、表面Zeta電位が細胞の挙動に著しい影響を与えることを初めて明らかにした。具体的には、内皮細胞に関しては、(1)内皮細胞は-20mVより負のZeta電位を持つゲルの表面で増殖する。(2)内皮細胞の表面糖鎖(glycocalyx)は、培養基盤の化学構造によって異なる。PNaSSゲル上ではPNaAMPSゲル上より表面糖鎖が多く発現している。(3)内皮細胞の表面糖鎖やゲルの弾性率によって、内皮細胞の表面摩擦係数と血小板吸着量が異なる。人軟骨細胞に関しては、(1)負電荷を持つPNaSSゲル上では、軟骨細胞の増殖が速いが脱分化しやすい。(2)脱分化し、繊維が細胞状になった軟骨細胞はPDMAAm、PVA、PAAm、HEMAなどの中性ゲル、またはわずかに負電荷を帯びているP(DMAAm-co-NaSS)ゲル上では、自発的に軟骨細胞に再分化する現象を見出した。(3)ゲルの弾性率の違い(kPaMPa)による軟骨細胞の再分化への影響が見られなかった。これまで平板状の細胞足場材上に脱分化しないままで軟骨細胞を効率よく培養することは困難であった。本研究成果によって、電荷を持つゲルと中性ゲルを組み合わせて、脱分化した軟骨細胞を電荷を持つゲル上で大量に増殖させたあと、中性ゲル上で再分化させることでこの問題を克服できる。マウス胚性幹細胞に関しては、(1)中性ゲル上で培養した細胞は未分化性が高い。(2)負電荷をもつゲル上で培養した細胞が、心筋細胞に分化し易い。(3)ゲルの弾性率の違いによる分化性の違いは少ない。これらのことから、ゲルの化学構造がmESCsの分化・未分化性に最も影響することを初めて解明した。ES細胞は高い増殖能とあらゆる細胞への分化能を持ち合わせた細胞であり、本研究成果は再生医療への応用が期待されている。平成21年度22年度は、柔らかくて含水状態のゲルを細胞外マトリックス(足場)として応用し、マウス胚性幹細胞(ES細胞)からなる胚様体の自己増殖能維持・分化誘導を行った。その結果以下の成果を得られた。中性のPDMAAmゲル上ではES胚様体がLIFを添加しなくても未分化性を維持し、高い自己増殖率を示した。それに対して、負電荷を有するPNaSS電解質ゲル上では、ES胚様体が効率よく分化する様子が観測された。
課題解決型の学校経営に関する教育工学的アプローチの開発

情報通信手段を活用した学校改善のための課題解決方略を,高等教育の取組を事例として検討し,より一般的な教育改善に対する教育経営工学の枠組みを検討した。このために,高等教育の取組として,岐阜大学の教育経営戦略について新たに調査分析を行い,学校教育でのこれまでの調査結果と比較検討して,教育改善を効果的に推進するための方略を検討した。具体的には,以下のように実施した。(1)高等教育における情報通信手段を活用した戦略的な取り組みについての調査分析とくに,教育改善の視点から導入された情報通信手段を中核にして検討し,学生や教員等の意識の変容等についての調査を試み,とくに学生からの取組期待が高く,指導者側の意識改革が肝要となることを指摘した。(2)教育課題に対して,情報通信手段に対する利用実態と期待の分析高等教育での取組は,組織的な教育改善と情報通信手段の位置づけ,及び具体的な方略を分析し,総合的な教育改善を支援するシステムとしての重要性が増していることがしてきされた。さらに,学校教育への適用の可能性について検討し,過去の取組経緯と照らしてCMIの取組を近年の情報通信技術の進展に対応させて検討する枠組みの構成が重要となることを示した。(3)情報通信手段の活用による教育改善の方略のための経営的モデルの検討情報通信手段は,情報共有,組織構成員及び関係者のコミュニケーションなどを支援する手法として活用されるが,学校教育における従来からの取組は基本的な枠組に大きな変化はないことから,過去の事例を「課題解決型の学校経営に関する教育工学的アプローチの開発」として研究資料に整理した。情報通信手段の普及は,個人的な情報処理に加えて組織的な情報処理の段階へと移行しており,学校教育を対象とした組織的な情報活用に関する研究,なすわち,学校経営学と情報学の融合の立場からの研究が求められる。もとより,学校教育における組織的な情報手段の活用実践研究は,1979年に始まる岐阜県川島小学校におけるCMI(Computer Managed Instruction)に基づく「教育のシステム化」に関する研究が教育工学的手法を用いた国内における初期の教育実践として進められてきたが,その後の学校教育における情報手段の活用は,個別学習や情報教育等にみられる学習者を対象とする実践研究が多くみられてきた。しかし,近年のインターネットに代表される情報通信手段の普及により,学校経営及び地域教育委員会による教育経営,家庭との接続による総合的な学校経営等への適用が容易となっており,その教育効果についても具体的事例が見られるようになりつつある。すなわち,組織的な教育経営の観点からの情報手段の活用について教育実践を再検討する必要があると考え,川島小学校等の事例の再調査を行った。川島小学校の実践は,「教育のシステム化」を目指すものであり,学校内の学習者情報(学籍,学習履歴,保健関係など),教材情報(学習プリント,ビデオ,テキストなど)や教育目標を有機的に管理し利用可能なシステムの開発を行っている。当時のコンピュータは,現在のパーソナルコンピュータ以下の機能しか有していなかったが,この一台に必要な情報を蓄積利用するという点からは,現在の校内サーバを中核とした教育情報システムに類似する。さらに,学習者一人ひとりの反応情報を全教室に設置されたアナライザーやマークシートから登録可能なシステムとしている点は,情報端末の充実による容易なアクセス環境の重要性を指摘しており,教育経営情報に関わる情報基盤のあり方が示された。情報通信手段を活用した学校改善のための課題解決方略を明らかにするために,実際の学校教育現場での実践を調査し,調査結果から学校改善に対する教育経営工学の枠組みを検討した。このための主な調査対象校は,過去の取り組み実績の顕著な学校や現在取組みつつある学校である。(1)学校改善に情報手段を活用した戦略的な取り組みについての調査当初,学校課題に対してどのような実践研究を進め,その成果についてどのように判断したか等を調査した結果,コンピュータそのものの活用が学校課題の解決に寄与したかどうかは明確にはできず,取組のプロセスにおいて象徴的な役割を果たし,組織体制,目的の明確化,関連取組の組織化等が重要となることが指摘された。(2)学校課題に対して,情報通信手段をどのように意味づけ活用しつつあるかについての調査調査の結果,管理職として情報通信手段を活用した情報の蓄積・交換の機能を重視し,その機能を積極的に活用した,組織体制の整備,教育方針の明確化,日常的な手段の活用,情報通信手段以外の教育環境の整備に取組み,特に学校と家庭の学習者を媒介とした新たな関係性の開発を目指していること等が示唆された。(3)情報通信手段の活用による学校改善の方略の立場情報通信手段は,情報共有,組織構成員及び学習者,保護者のコミュニケーションなどを支援する手法として活用されており,個人の道具から組織の道具として機能するとの立場に立ち,学校改善の組織的な取り組みに寄与する方略を提供するものであるとの立場が重要となることが指摘された。(1)高等教育における情報通信手段を活用した戦略的な取り組みについての調査分析

とくに,教育改善の視点から導入された情報通信手段を中核にして検討し,学生や教員等の意識の変容等についての調査を試み,とくに学生からの取組期待が高く,指導者側の意識改革が肝要となることを指摘した。(2)教育課題に対して,情報通信手段に対する利用実態と期待の分析高等教育での取組は,組織的な教育改善と情報通信手段の位置づけ,及び具体的な方略を分析し,総合的な教育改善を支援するシステムとしての重要性が増していることがしてきされた。さらに,学校教育への適用の可能性について検討し,過去の取組経緯と照らしてCMIの取組を近年の情報通信技術の進展に対応させて検討する枠組みの構成が重要となることを示した。(3)情報通信手段の活用による教育改善の方略のための経営的モデルの検討情報通信手段は,情報共有,組織構成員及び関係者のコミュニケーションなどを支援する手法として活用されるが,学校教育における従来からの取組は基本的な枠組に大きな変化はないことから,過去の事例を「課題解決型の学校経営に関する教育工学的アプローチの開発」として研究資料に整理した。
気候変動下のアジア大都市における貧困地域の脆弱性マネジメントに関する研究

アジア諸国では大都市圏地域への急速な人口の集中が続いており、気候変動下でますます災害時危険性の高まっている地域でのインフォーマル市街地が急速に拡大している。本研究では、気候変動下の都市貧困地域における脆弱性の観点からみた課題の分析、コミュニティ事例調査を通じての参加型プロセスおける脆弱性改善の評価、コミュニティの有する様々な資源を柔軟に組み合わせることにより脆弱性を漸進的に軽減していく(脆弱性マネジメントアプローチ)ための方法論の検討を通じて、アジア各都市において拡大する都市貧困地域における脆弱性の観点からみた課題を整理したうえでコミュニティを主体とする脆弱性マネジメント方法論を提案した。研究課題に対応して、次の研究を実施した。(1)アジア各都市において拡大するインフォーマル市街地の課題の整理対象国の都市化状況、計画制度、都市貧困地域形成動向、都市貧困地域改善政策、観点からみた都市貧困地域の立地評価についての最新の情報を文献、政策文書、統計、GISデータ、現地政府担当官・専門家ヒアリング等を通じて整理する。研究代表者らのグループはすでに今までの研究蓄積において当該事項についての情報を蓄積しているが、各国における最新の政策・制度展開を踏まえ、その展開過程を比較・整理する。これらの基礎的情報は各国の研究協力者の協力のもとで収集する。(2)参加型調査によるぜい弱コミュニティ調査対象都市のうち、本調査を開始する素地の整っているインド(ムンバイ)、タイ(バンコク)においてぜい弱コミュニティに関する事例調査を先行的に実施した。とくに、事例コミュニティの有する資源(コミュニティ組織能力、ソーシャルキャピタル、経済的能力、ヒューマンキャピタル、ベーシック・ヒューマン・インフラストラクチャー、等)についての調査を実施した。事例コミュニティにおいて、現地研究協力者の協力のもとで住民参加型調査を実施した。結果として、とくにムンバイのぜい弱コミュニティの調査の結果から、コミュニティ内におけるソーシャルキャピタルを醸成する上で、インフォーマル市街地であるがゆえに、漸進的に形成された仕組みがあきらかとなった一方、再開発地区や改善地区においては、これらの仕組みがかえって弱体化しており、現在の都市整備においては、社会的な意味でのぜい弱性と物理的な意味でのぜい弱性がトレードオフの関係に陥っていることがあきらかとなった。(1)参加型調査によるコミュニティ脆弱性に関する事例調査ベトナム(ホーチミン)、バングラデシュ(ダッカ)、フィリピン(マニラ)におけるコミュニティの脆弱性指標に関する事例調査を実施した。調査項目として、脆弱性指標に加えて、事例コミュニティの有する資源についても調査した。(2)コミュニティを主体とする脆弱性マネジメント方法論の検討加えて、本研究全体の結論として、コミュニティの有する様々な資源を柔軟に組み合わせることによりコミュニティの脆弱性を漸進的に軽減していく(脆弱性マネジメントアプローチ)ための方法論についての検討を行った。具体的には、コミュニティの能力とローカル・ガバナンスはともに強化されていく必要があるとの観点から、エンパワーメント型、コミュニティ・インボルブメント型、コミュニティ・マネジメント型の3つのプロトタイプの有効性を検討した。エンパワーメント型は、外部のNGO、NPOなどが、住民の組織化を行い、住環境改善事業の実施を通じて、住民による自立的な地域管理能力の獲得、さらには政治的・社会的な力量の拡大を図っていくタイプである。コミュニティ・インボルブメント型は、住民組織が形成されている地域において、住環境自体の改善とともに、住民組織主導による持続的なまちづくりを可能とするような住民組織のキャパシティ(能力)強化を同時に図っていくことを目指すタイプである。コミュニティ・マネジメント型は、政府が、関連NGO等とも連携し、住民組織にまちづくり事業の分権化を図り、持続的・自立的な地域管理を行っていくことを目指すタイプである。事例調査を通じて、コミュニティ・マネジメント型の脆弱性マネジメントが、漸進型の脆弱性マネジメントアプローチの観点から最も望ましいことを検証した。(1)アジア各都市において拡大するインフォーマル市街地の課題の分析対象国の都市化状況、計画制度、都市貧困地域形成動向、都市貧困地域改善政策、気候変動の観点からみた都市貧困地域の立地評価についての基礎的情報は各国の研究協力者の協力のもとで収集し、分析整理した。(2)参加型調査によるぜい弱コミュニティ調査インド(ムンバイ)、タイ(バンコク)、マニラ(フィリピン)、アチェ(インドネシア)においてぜい弱コミュニティに関する事例調査ならびに気候変動に対する都市戦略に関するを実施した。さらに、中国(天津市)の都市周辺農村コミュニティ、ダカール(セネガル)のインフォーマル市街地においてぜい弱コミュニティに関する調査を実施するとともに、比較事例として、韓国のまちづくり事例に関する資料収集をおこなった。

結果として、インフォーマル市街地の再開発にともなう、ソーシャルキャピタルの弱体化があきらかとなり、とりわけ、都市レベルでの気候変動の緩和策、適応策を策定し実施していく空間ガバナンスの形成と、ぜい弱市街地におけるコミュニティ・ガバナンスの形成を連動させていく仕組みが重要であることが判明し、この点を最終年度の重点研究課題としていくこととした。計画にそって調査が進んでいるため。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後も計画に沿って、他の事例都市における研究を進める予定である。今後も計画に沿って、事例都市における研究を進め、最終的なまとめを行う予定である。
加齢卵母細胞における核小体構造の解析とSUMO化の生理的意義の検討

マウス卵母細胞を用いて新規Bnc1結合蛋白質を同定し、分子生物学的に解析した。そのうちSUMOE3リガーゼPias4が、卵母細胞の核小体様構造NLBにも局在するBnc1と結合し、Bnc1のSUMO化を促進することを見出した。Bnc1のSUMO化はSUMO-1特異的に513番目のリジンを修飾した。GV期卵母細胞を用いてBnc1の局在にSUMO化が関与するか検討したが、Bnc1の局在は核質から変化しなかった。Bnc1ノックアウトマウスの卵母細胞を用いてBnc1がc-Kitシグナルを介して卵胞発育を制御していることを明らかにした。卵母細胞の成熟過程における卵胞発育障害は早発閉経や高齢不妊患者において治療困難な病因であり、それらの大半は原因不明である。GV期卵母細胞の核小体様構造(NLB: Nucleolus-likebody)は片親(卵母細胞)からのみに由来し、NLBが欠損すると第一分割で染色体分離異常を示す。したがって、加齢による受精率・胚発生率の低下や染色体不分離の原因の一端は、NLBの質的変化・構造変化によって引き起こされる可能性がある。タンパク質翻訳後修飾の制御破綻はさまざまな病因・病態に深く関与するが、卵母細胞特異的なNLB構成因子の翻訳後修飾がどのようにNLBの機能を制御しているか不明である。本研究は卵母細胞特異的なNLB構造とNLB構成因子の翻訳後修飾SUMO化に焦点を当て、SUMO化による細胞機能の制御機構を分子レベルで解析し、不妊症の原因の一端を明らかにすることを目的としている。今年度に得られた知見は以下の通りである。生殖細胞とkeratinocyte特異的に高発現するBasonuclin1 (Bnc1)が、マウス卵母細胞において転写活性が高い場合にNLBに局在することを明らかにした。FCS血清や成長因子EGFは細胞培養に必要であるが、単独ではBnc1の局在変化に影響しなかった。C末にGFPを付加したBnc1-GFPをGV期卵母細胞に発現させた場合、通常では細胞質に局在し、核内に移行しないことが判明した。これまでにBnc1がSUMO化(SUMO-1とSUMO-2)されることを明らかにしていたが、SUMO化コンセンサス配列以外の配列でSUMO-2/3が翻訳後修飾することが判明した。また、質量分析器を用いてBnc1結合因子を探索したところ、核小体に局在する脱SUMO化酵素が結合することが判明した。従って、NLBにおいてSUMO化反応が重要な機能を有していることが示唆された。ヒトにおいてもGV期卵母細胞の核小体様構造(NLB: Nucleolus-likebody)は片親(卵母細胞)のみに由来し、NLBが欠損すると第一分割で染色体分離異常を示す。したがって加齢による受精率・胚発生率の低下や染色体不分離の原因の一端は、NLBに存在する蛋白やRNAの量的・質的変化によって引き起こされる可能性がある。本研究は卵母細胞特異的なNLB構成因子の翻訳後修飾SUMO化に焦点を当て、SUMO化による細胞機能の制御機構を分子レベルで解析し、不妊症の原因の一端を明らかにすることを目的としている。タンパク質翻訳後修飾の制御破綻はさまざまな病因・病態に深く関与する。卵母細胞特異的なNLB構成因子の翻訳後修飾がどのようにNLBの機能を制御しているか不明であるが、生殖細胞とkeratinocyte特異的に高発現するBasonuclin1 (Bnc1)がSUMO化され、マウス卵母細胞において転写活性が高い場合にNLBに局在することを明らかにしたことから、平成26年度に引き続きBnc1新規蛋白質の同定を試みた。MS解析の結果からいくつかの蛋白質に対して生化学的・分子生物学的に解析中であるが、新規結合蛋白質としてSUMO化促進酵素であるPIAS4(PIASy)が新たに同定された。生化学的解析から、PIAS4はSUMO-1でもSUMO-2/3でも同様にBnc1のSUMO化を促進することが明らかになった。また、Bnc1に核小体局在シグナルが存在することや、一部のSUMO化される残基を同定した。従ってBnc1がNLBにおいて機能し、SUMO化反応が重要な意義を有していることが示唆された。また、ある試薬によってBnc1が核内移行する比率が高くなることが判明した。本研究は、加齢変化と卵母細胞特異的なNLB(Nucleolus-like body)構成因子の関連性を解析し、NLB構成因子のSUMO(small ubiquitin-related modifier)化による細胞機能の制御機構を分子レベルで解析し、不妊症の原因の一端を明らかにすることを目的としている。前年度までにNLB構成因子の1つとしてBnc1を同定しており、今回質量分析によってもBnc1が脱SUMO化修飾だけではなく、SUMO化促進酵素と結合することを明らかにした。この結果はこれまでの知見や推察を裏付けし、SUMO化修飾の生理学的意義は予想以上に高そうである。また、Bnc1のN末に核小体局在シグナルNoLS (Nucleolar Localization signal)が存在することを分子細胞学的に明らかにできたことも、これまでの推察を支持する知見である。

Bnc1の機能はもともとribosomal DNAプロモーター領域に結合する転写因子として報告されているが、その詳細な機能は不明のままである。質量分析や生化学的手法による解析によって、これまで得られてきた知見と合わせてBnc1の分子レベルでの機能が少しずつ明らかになってきたことは意義がある。昨年度FCS血清や成長因子EGF単独ではBnc1の局在変化に影響しないことを明らかにしたが、今年度はある試薬によって細胞質から核内に移行するBnc1の比率が高くなることが判明した。培養細胞とfeeder細胞を用いた実験系のように、未だ卵母細胞におけるBnc1の局在を強力に制御する因子の同定はできていないが、その他の新規結合蛋白質とともに卵母細胞成熟、あるいは維持機構に関与するシグナル伝達経路を明らかにできる可能性が高く、加齢変化による卵の質的変化の一旦を解明できる可能性が高いことは非常に意義がある。卵母細胞の成熟過程における卵胞発育障害は早発閉経や高齢不妊患者において治療困難な病因であり、それらの大半は原因不明である。ヒトにおいてもGV期卵母細胞の核小体様構造(NLB: Nucleolus-likebody)は片親(卵母細胞)のみに由来し、NLBが欠損すると第一分割で染色体分離異常を示す。したがって加齢による受精率・胚発生率の低下や染色体不分離の原因の一端は、NLBに存在する蛋白やRNAの量的・質的変化によって引き起こされる可能性がある。本研究は卵母細胞特異的なNLB構成因子の翻訳後修飾SUMO化に焦点を当て、SUMO化による細胞機能の制御機構を分子レベルで解析し、不妊症の原因の一端を分子レベルで明らかにすることを目的としている。タンパク質翻訳後修飾の制御破綻はさまざまな病因・病態に深く関与する。卵母細胞特異的なNLB構成因子の翻訳後修飾がどのようにNLBの機能を制御しているか不明であるが、本研究により生殖細胞とkeratinocyte特異的に高発現するBasonuclin1 (Bnc1)の新規結合蛋白質としてSUMO化促進酵素であるPIAS4(PIASy)や脱SUMO化酵素Senp5が同定されたことから、今年度も引き続きBnc1のSUMO化の意義を解析するため、Bnc1のSUMO化部位の探索を行った。生化学的解析から、Bnc1の513番目のリジンがSUMO-1によって特異的にSUMO化され、その他の複数の部位がSUMO-2/3化されることが判明した。また、Bnc1ノックアウトマウスの卵母細胞を用いて、Bnc1欠損によって引き起こされる初期卵胞の発育制御異常の原因の一端が判明した。マウス卵母細胞を用いて新規Bnc1結合蛋白質を同定し、分子生物学的に解析した。そのうちSUMOE3リガーゼPias4が、卵母細胞の核小体様構造NLBにも局在するBnc1と結合し、Bnc1のSUMO化を促進することを見出した。Bnc1のSUMO化はSUMO-1特異的に513番目のリジンを修飾した。GV期卵母細胞を用いてBnc1の局在にSUMO化が関与するか検討したが、Bnc1の局在は核質から変化しなかった。Bnc1ノックアウトマウスの卵母細胞を用いてBnc1がc-Kitシグナルを介して卵胞発育を制御していることを明らかにした。NLB(Nucleolus-like body)の収集をする前に興味深いデータが得られた。
視床下部および卵巣におけるGnRHの遺伝子発現とその調節機構に関する研究

(a)ラット脳におけるGnRH遺伝子すでに過年度に明らかにしているラット視床下部におけるGnRHmRNAをもとに、今年度は、性ステロイドのフィードバック機構調節の基本的現象であるエストロゲン、プロゲステロン投与後のGnRHmRNAの分析を試みた。しかし、視床下部GnRHmRNAが少なく、その量的変化を、今回はNorthern blot hybridization法では明らかにすることが出来なかった。その後、in situ hybridization法によっても、GnRHmRNAの量的変化を観察しようと試みたが、現在までのところ、未だ明確な結果は得られていない。(b)ラット卵巣におけるGnRH遺伝子前年度に明らかにした知見、すなわち、ラット卵巣顆粒膜に存在するGnRHmRNAは、PMSG投与とともに陽性化することから、卵巣性GnRHの産生はゴナドトロピンの制御下にある、という知見を、今年度さらに再確認した。しかし、卵巣性GnRHmRNAの大きさが、700bpで、視床下部のそれの約500bpと異なることも前年度明らかとなっていたので、今年度は、一部、卵巣GnRHmRNAのcDNAクローニングを試みた。まだ研究半ばであり、未だ報告できる結果は得られていない。性機能調節上重要な役割りを果たしているGnRHの産生,分泌機構を明らかにするため,ラット視床下部と卵巣におけるGnRH遺伝子の発現を検討することを目的とした本研究のうち,平成2年度は視床下部について分析した。すでに我々が作成したRNAプロ-ブを用いて,ラット脳におけるGnRHmRNAのNorthern blotおよびin situ hybridizationを試みた。まず,ラット脳より抽出したmRNAを用いてのNorthern blottingの結果では,約500塩基対の位置にGnRHmRNAの単一バンドが認められた。これは,ラット視床下部のGnRHmRNAのサイズが約500塩基対であると報告したAdelmanらの結果とも一致しており,今回作成して用いたoligoRNAプロ-ブが,ラットGnRHmRNAを検出可能であることを示している。一方,ラット脳でのin situ hybridizationでは,前額断切片で観察すると,対側角の部位のneuroneに銀粒子の明らかな集績が認められた。また,視索前野の領域のneuroneにも同様に,明確な銀粒子の集積がみられた。以上の観察から,これらの細胞がGnRHを合成しているneuroneであることが同定された。弓状核にはGnRH産生細胞は認められなかった。以上の基礎的検討に基づき,ラット性周期によるGnRHmRNAの動態や,性ステロイドホルモン投与によるその変動についても検討を開始したが,まだ結論を出すだけの十分な成績を得ていない。In situ hybridizationによるGnRH産生細胞の脳内分布は,免疫組織化学的手法による,これまで発表された結果とほぼ一致するものであった。GnRHがラット卵巣に対して作用を有し、卵胞発育や排卵などの卵巣機能に関与することを示唆する報告がある。しかし、そのGnRHの産生部位、産生細胞については未だ不明の点が多い。平成2年度では、ラット卵巣でGnRH遺伝子が発現することを明らかにしたが、今年度はGnRH遺伝子が、卵胞発育通腔でどのように変化するか検討した。4週令の幼若ラットにPMSGを投与し、投与前後の卵巣からそれぞれmRNAを抽出した。すでに我々が作成したプロ-ブを用いてNortherblotを行なったところ、投与前ではバンドが認められなかったの対して、投与48時間後では約700bpの位置に単一のバンドが認められた。さらに、同様に処理した卵巣で、in situ hyhridizationを行なったところ、投与前では銀粒子の集程が認められなかった。一方、投与後48時間後の卵巣では、顆粒膜細胞に著明な銀粒子の集程が認められ、ラット卵巣におけるGnRH産生細胞が髄粒膜細胞であることが示唆された。以上の成績に基づき、さらに排卵期から黄体期にかけての遺伝子発現の変化について検討しているが、結論に至るような結果はまだ得られていない。さらに、卵巣で認められたGnRHmRNAの大きさは約700bpで、視床下部のそれの約500bpと異なることが判明したため、この機序を解明するために、cDNAクロ-ニングを含めた解析をすることを検討中である。
KaiC概日時計の動作プログラム：２つのATPaseの協働の生理・生化学的解析

我々は3つのKaiタンパク質による概日時計の再構成に成功し、概日時計の特性(24時間周期と温度補償性)が1日当たり10-20分子のATP分解で達成されていることを見出した。その後、ATPase活性の詳細な解析から、概日時計の特性が2つのATPaseの巧みな分業で達成されるという機械式時計モデルを構築した。本研究ではこのモデルの実体をさらに明確なものにするため、ATPase活性の高精度解析を利用し、これらの機能を担っているタンパク質の内部部位とその動作様式を解明することを目標とした。これによりKaiCタンパク質内に時間測定機構を明らかにすることができよう。今年度は2つATPaseのカップリングを具体的に示すためCIのゲート機構によってCIIが活性化するタイミングを制御するメカニズムの解明を試みた。得られた結果はKaiA添加によりCIがまず振動を開始し、脱リン酸化後約16時間の決まったタイミングでCIがCIIのリン酸化のゲートを開いてCIIにKaiAが作用できるようにしていることを示唆している。この結果は我々の想定する時計機構の核心であり、新しいモデルに重要な基礎となるので、これを含めた論文を準備している。また2つのATPaseのカップリングに重要なアミノ酸の変異体の解析を進め、その働きを解明し論文を準備中である。さらにKaiC様の時計タンパク質の存在を真核生物で探るためATPase活性に注目してスクリーニングを行なった。その結果、いくつかの候補から安定した微弱な活性を測定でき、今後の解析がまたれるところである。平成30年度の解析ではCIとCIIのカップリングのタイミングを解明し、真核生物のKaiC様の時計タンパク質のスクリーニングも進め、生化学的解析の方法を確立した。まずCIはゲート機構の存在を確認するため、KaiAまたはKaiBを添加するタイミングをずらし、リン酸化および脱リン酸化のタイミングがどのように変化するかを調べた。はじめにリン酸化したKaiCにKaiBを加えて脱リン酸化位相となったKaiCにさまざまなタイミングでKaiAを加えて調べた。脱リン酸化後16時間まではKaiAを加えたタイミングに関わらずKaiCは脱リン酸化を続け、脱リン酸化後16時間後の同じタイミングでリン酸化が始まった。このときATPase活性はKaiAを添加直後に緩やかに上昇し始めた。CIIのATPase活性はリン酸化を促進する事から、KaiA添加直後に上昇したATPase活性はCIのATPase活性に由来すると考えられる。従ってこの結果はKaiA添加によりCIがまず振動を開始し、脱リン酸化後約16時間の決まったタイミングでCIがCIIのリン酸化のゲートを開いてCIIにKaiAが作用できるようにしていることを示唆している。なお、脱リン酸化のタイミングについても同様の結果が得られている。KaiCのようにATPase活性を基盤とした、転写翻訳に依存しない概日時計因子(ヒトKaiC)は真核生物にも存在する可能性がある。このようなヒトKaiCは安定で、温度に依存しない極めて低い活性を持つと予想される。この可能性を検討するため遺伝子配列データベースからKaiCの特徴を参考に、P-loop (Walker Aモチーフ)を1つあるいは2つ持つATPaseを探し、大腸菌およびヒト培養細胞を用いて高純度のタンパク質を精製し、ATPase活性を調べた。30年度の研究は順調に推移しているので今後は概日時計の特性を念頭にあらたな時計モデルの検証を進めていく。まずこれまでの成果をまとめ、新たな概日時計のメカニズムを提案する論文を発表することを進める。また、真核生物の時計タンパク質の解明も大変多くの研究者の興味を喚起するものなので、引き続き進める。ここでは特に生化学的活性測定を丁寧に行い、解析を進める。さらに以下の3つの計画も継続して進める。1)CI-CIIカップリングの解析: UPLC法を用いたCIとCIIのATPase活性分離解析を様々な温度条件で検証し、CI-ATPaseの振動とCIIATPaseの振動が我々のCI-CIIカップリングモデルと一致することを確認した。本年度は「KaiAとKaiBの添加による位相のずれ方」に着目し、安定なリズムが発生する経過を解析し、CI-CIIカップリングの時間的プログラムについて解析する。2)CIIの解析. pHは酵素反応の基礎であり、概日時計の周期決定に大きな影響をもつ。本年度は幅広いpHや温度補償性との関連も知るため、反応液に用いる緩衝液の検討を行ない、様々なKaiAの濃度やpH条件下で周期を調べ、CIIの活性が周期決定に及ぼす仕組みを解明する。3)位相決定は概日時計の最も重要な機能である。我々の提案する2つのATPase結合モデルは位相決定機構の新たな基礎として重要で、これまで解明出来なかった位相決定の統一的理解を期待させる。そこでKaiCの新しいモデルで位相変位とATPase活性の変動を解析し、同調機構の解明を目指す。我々は3つのKaiタンパク質による概日時計の再構成に成功し、極めて特徴的な概日時計の特性(24時間周期と温度補償性)が1日当たり10-20分子のATP分解で達成されていることを見出した。

平成29年度には、周期を決定しその温度補償性を実現するATPase協働機構の解明に取り組んだ。このためUPLCを用いた精密測定技術の開発によりCIとCIIのATPase活性の分離解析を確立させ、CI-ATPaseの振動(サイン波)とCII-ATPaseの振動(矩形波)を分離する方法を考案した。さらに、温度補償・周期変異体について、温度やKaiA・KaB量を変化させてATPase活性を精密に測定し、その波形解析を行うことで、2つのATPase活性の評価を確立し、CI-ATPaseとCII-ATPaseについて以下の解析を行った。CI-ATPase(ペースメーカー)の解析のため、周期変異体の変異KaiCを利用し、そのATPase活性が温度ステップに対する応答過程を解析した。その結果、過渡応答がそのペースメーカーと対応することを明らかにしテンションの実体を解明することを可能にした。一方、CIIのATPaseはリン酸化を駆動し、KaiAKaiB共存下でリズムを発生する。そこで、KaiAの濃度や反応温度を変えた測定を積み重ねることで、リズムの駆動力となるATP消費を素過程レベルで解析した。29年度の解析ではKaiCの2つのATPaseの機能解析を行った。高精度UPLCを用いてCIとCIIのATPase活性の分離解析を確立し、KaiCのATPase活性リズムの特徴的な波形を高解像度で捉えることに成功した。次にこの波形をCI-ATPaseの振動(サイン波)とCII-ATPaseの振動(矩形波)を分離する方法を考案し、予測した2つの成分を温度補償や周期の変異体、あるいは温度やKaiA・KaB量を変化させて、ATPase活性を精密に測定し、その波形解析を行うことで、2つのATPase活性の評価法を確立した。この成果は2つATPase機能の組み合わせで概日振動が実現される可能性を示すとともに様々な条件下でモデルの検証を可能とするものである。次にATPase協働機構の解明するため、多くの変異体を検討し、CIとCIIの協働が外れてCII-ATPaseの活性が暴走している変異体を見出した。これらの成果により、先行した研究から取り組んでいる概日時計の機械式時計モデルを実証する実験が可能となり、これまでの細胞レベル遺伝子発現制御に基づいたモデルに代わるモデルの提案が可能となった。また生物発光によるスクリーニングを利用し、CIとCIIの境界面やCIとCIIのリンカー部位に全アミノ酸置換型のランダム変異を導入し、KaiCのCI-CIIカップリングに関与する部位を特定することに成功した。これらの変異体はあらたな時計モデルの実証に貢献することが期待される。さらにCII-ATPaseによるリン酸化サイクル駆動についても調査を開始し、ATPase活性の経時変化とKaiCのリン酸化状態の変遷を高時間分解能で測定し、添加するKaiAの濃度や反応温度を変えた測定を積み重ねることで、リズムの駆動力となるATP消費を素過程レベルで解明する試みを開始した。
極限環境耐性動物クマムシの共生細菌の耐性基盤の解析

クマムシは周囲の環境が乾燥すると、水分量約3%の無代謝状態になり乾燥に耐える。このような乾燥耐性機構の解明は細胞などの長期保存法の開発に有用と考えられるが、その全貌は明らかではない。そこで私はDNAや生体膜をもつミトコンドリアを耐性モデルとして、乾燥耐性に関わるタンパク質の同定をトランスクリプトームおよびプロテオームの2つのアプローチから試みた。クマムシの核ゲノムには耐性に関わると考えられる新規遺伝子が大量に見出される一方で、ミトコンドリアゲノムには新規遺伝子は見出されなかった。また、乾燥による遺伝子発現誘導も見出されない。このことからミトコンドリアの耐性は核ゲノムコードの常時発現遺伝子が基盤となっていると考えられた。そこでクマムシのトランスクリプトームデータにおいて高発現量の遺伝子に着目し、GFP融合タンパク質を用いた細胞内局在解析によりミトコンドリアに局在する2種類の新規遺伝子産物を同定した。このうちの1種類は、熱処理によって凝集沈殿しない「熱可溶性」という性質をもつことを示した。さらに、このタンパク質を導入することでヒト培養細胞の高浸透圧耐性が向上することを示した。また、ミトコンドリアにおける乾燥耐性タンパク質を網羅的に探索するため、クマムシから分離したミトコンドリア分画とクマムシ個体の破砕液におけるショットガンプロテオミクスによりタンパク質の網羅的な同定をおこなった。クマムシ破砕液とのペプチド検出数の比較により、ミトコンドリア分画に濃縮されたタンパク質を844種類同定した。乾燥耐性に関わることが期待されるクマムシ固有のタンパク質は130種類同定されていた。クマムシ固有のタンパク質について、GFP融合タンパク質を用いた細胞内局在解析をおこなったところ、ミトコンドリアに局在する性質をもつタンパク質が9種類見出された。これらはクマムシの耐性を解析する上でよい候補タンパク質と考えられる26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。そこで私はDNAや生体膜をもつミトコンドリアを耐性モデルとして乾燥関連タンパク質の網羅的な同定をおこなうことにした。クマムシの核ゲノムには耐性に関わると考えられる新規遺伝子が多くコードされているが、ミトコンドリアゲノムには新規遺伝子は見出されなかった。そこでクマムシのトランスクリプトームデータにおいて高発現量のミトコンドリア局在予測遺伝子を選出し、各GFP融合タンパク質の細胞内局在を確認した。これにより、2種の新規クマムシタンパク質がミトコンドリアに局在する性質をもつことが示された。さらに網羅的な耐性タンパク質の探索を行うため、ミトコンドリア分画におけるショットガンプロテオミクスを計画した。まず、分画評価としてWB解析をおこなうために、既存抗体からクマムシの細胞質・ER・ミトコンドリアの抗体を探索した。条件検討によりWB解析においてミトコンドリアに対する抗体におけるバンドのみが検出される分画条件を確立した。これにより、濃縮されたミトコンドリア分画の分離が可能となった。次に、クマムシのミトコンドリアタンパク質を網羅的に同定するために、ミトコンドリア分画とクマムシ破砕液におけるショットガンプロテオミクスをおこなった。クマムシ破砕液とのペプチド検出数の比較により、ミトコンドリア分画に濃縮されたタンパク質を849種類同定した。このうち新規タンパク質は95種類あり、これら新規タンパク質はミトコンドリアの乾燥耐性に関わるタンパク質のよい候補である。

これらはクマムシの耐性を解析する上でよい候補タンパク質と考えられる26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。WB解析用の抗体が思うように見つからずに当初の計画より時間がかかったが、ミトコンドリア分画の分離においては他の細胞内コンパートメントの混入が検出されずに解析に必要なタンパク量を得るという分画条件を見出すことが出来た。これにより、共同研究であるショットガンプロテオミクス解析にスムーズに進むことが出来、ミトコンドリアに局在するタンパク質の網羅的な同定まで到達することができた。今後はショットガンプロテオミクス解析において見出した新規タンパク質から、実際にミトコンドリアに局在する性質をもつものを選出する。ミトコンドリアに局在することが示された新規タンパク質を複数種類導入した細胞を作出し、高塩濃度や乾燥などのストレスへの曝露に対して耐性を示すかを検証する。また、クマムシのミトコンドリアにおいて亢進または減少している機能についてもプロテオミクスデータから探索する予定である。これにより、乾燥耐性生物のミトコンドリアの再構成をおこない、乾燥耐性の分子基盤の解明を目指す。
星間塵への水の吸着機構と水の存在量の解明

[目的]銀河中心方向の星間塵は3μmに吸収を示す。この吸収は星間塵のSiーO骨格に吸着したH_2Oによることを明らかにした(Wada etal.,ApJ,375,L17ーL20,1991)。この吸着水の銀河中心方向へのコラム密度を、実験をもとに算出する。[測定系の改善]1.製造したSiーO急冷固体に吸着した水の量を測定するために、石英製加熱セルを製作した。2.超微量天秤(0.1μgまで測定可能)を活用し、試料の加熱前後の質量の微少変化から脱離水の質量を測定できるよう、条件設定した。3.加熱時の熱量変化から構造変化を推定するために、走査熱量測定装置(DSC)を活用した。4.これと並行し、加熱前後の試料の赤外スペクトル変化を調べた。[結果および成果]1.SiーO固体に含まれる水は2種類である。すなわち、生成時に骨格に取り込まれ、100°Cで脱離しない難脱離水と、および生成時以後に吸着された、100°Cまでに脱離する易脱離水である。星間塵の吸着水量の推定には、この混合比率の確定が前提となる。2.赤外スペクトル測定から、難脱離水は2.802.86μmに、易脱離水は2.99μmにピ-クを示す。3.難脱離水は生成時の条件(H_2Oの共存の度合い)により、取り込まれる量が決まる。4.Siー0急冷固体の吸着水の赤外ピ-クは、離脱離水と易脱離水の混合比率により、形が多少変化する。5.赤外スペクトルの差スペクトルから、易脱離水の赤外ピ-クを求められる。これと併せ、加熱時の質量減量の測定を行い、易脱離水の質量吸収係数を求め、1.9×10^4cm^2/g得た。難脱離水の質量吸収系数測定には、加熱時のSiー0骨格の変化が大きく関連しているので、今後の課題である。したがって、星間塵の吸着水のコラム密度は、難脱離水の質量吸収係数が確定したのち算出できる。
パラ言語情報を示す発話の第二言語習得ードイツ語心態詞の音声の発話と知覚

話し手の発話の意図や心的態度はパラ言語情報として音声に現れるが、本研究では外国語を学習することがパラ言語情報の発話・知覚にどのような影響を与えるかを考察し、その発話・知覚の習得のメカニズムの解明を目指す。具体的には、申請者がこれまでに行った研究の成果をふまえ、パラ言語的情報を伝達するとされるドイツ語のja, dochなどの心態詞を含む発話音声の特徴を、ドイツ語学習者とドイツ語母語話者とで比較する。同時にドイツ語学習者によるパラ言語情報の知覚をドイツ語母語話者、ドイツ語非学習者と比較し、パラ言語情報の知覚における言語普遍性と言語依存性を解明する。
変位電流・光第2次高調波測定によるフレキシブルナノ界面分子膜の電子物性評価

本研究では、(i)分子形状、(ii)フレキシブル性、(ii)界面での特異性の3点より有機分子を総合的に取り上げた。そして、(1)誘電現象計測による有機ナノ界面のフレキシブル性と界面電気現象との関係の評価、(2)有機フレキシブルナノ界面の電子構造評価、(3)柔構造分子膜の伝導特性評価とフレキシブルな構造の有機単電子トンネル素子の試作・特性評価の3点を重点的に研究した。(1)(2)(3)についての研究の方針と成果の概略は以下のようである。(1)基本となる界面単分子膜を「柔構造体」という視点でとらえた。構成分子の向きが界面で規制され、そのため自発分極や非線形分極等の誘電現象が発生することに着目し、これを有機膜におけるフレキシブル性の評価法として採用した。具体的には、MDCとSHGを通してナノ界面の誘電現象を計測して、膜のフレキシブル性とナノ界面の電気現象との関係を明らかにした。(2)有機分子の特徴は形状にあり、これがフレキシブルナノ界面の電子構造を特徴づけることに着目した。そこで、棒状液晶分子、2鎖型生体膜分子、キラル・ヘリックス構造の分子、構造可変なアゾ系光異性化分子という一連の分子を選び、これらを単分子膜として形成し、MDC、SHGの発生の様子から分子膜構造の特徴と電子的構造を明らかにした。(3)有機FET用顕微SHGシステムを用いて電荷の注入過程について検討を行い、Off状態における金電極からペンタセンへの電子注入に関して、初めて光学的手法を用いた観測に成功した。時間分解測定法と顕微SHGシステムを組み合わせ、ナノ秒オーダでキャリア挙動の観測ができるシステムの立ち上げを行った。以上、界面分子膜の物理を基本とし、フレキシブルな有機素子特性を評価するにいたるまでの手法を研究した。本研究により、フレキシブル有機分子素子の特性評価をするための工学的手法の一旦が明らかになったと考えている。本研究では、分子膜のフレキシブルな構造についての物理を基礎として、有機電子素子作製への展開を円滑にする工学的手法の確立に向け、マックスウェル変位電流(MDC)測定と光第2次高調波(SHG)の同時測定を基礎として、柔構造界面分子膜の電子・光物性を評価する手法を探求することを目的としている。本年度はまず、新たに導入した波長可変レーザー光源を用いて、キラル分子(アキラルバナナ分子を含む)の水面上単分子膜における変位電流(MDC)と光第2次高調波発生(SHG)を計測した。その結果、キラル分子において単分子膜レベルでのキラル性の観測に成功した。一方、バナナ分子では拡張過程における特徴的な変位電流、表面圧波形が得られ、ピエゾ効果、フレクソエレクトリック効果の観点からの理論解析により説明できた。また分子膜のフレキシブル性の特徴は面内パターン構造として現れるため、現在ブリュスター角顕微鏡の製作を行い、膜の直接観察を試みている。さらに、ナノ界面で発生している電極からの注入による過剰電荷による帯電現象、異種有機分子界面で発生している電子移動などについて評価するため、表面電位、SHG測定を通じて、過剰電子による界面電位形成と双極子による分極現象とを分離する技術を開発している。本研究の目的は、分子膜のフレキシブルな構造についての物理を基礎として、有機電子素子作製への展開を円滑にする工学的手法の確立に向け、マックスウェル変位電流(MDC)測定と光第2次高調波(SHG)の同時測定を基礎として、柔構造界面分子膜の電子・光物性を評価する手法を、理論ならびに実験両面から開拓することである。

本年度の研究は予定通り遂行され、以下のような成果が得られた。(1)昨年度までに、波長可変レーザー光源を用いて、キラル分子(アキラルバナナ分子を含む)の水面上単分子膜における変位電流(MDC)と光第2次高調波発生(SHG)を計測し、その結果、キラル分子において単分子膜レベルでのキラル性の観測に成功していたが、この結果を理論的に解析することができた。とくに、オーダパラメータを導入して、キラル性とSHG発生の関係を明確にすることができた。(2)アキラルなバナナ型分子について、分子論的な考察から,MDCおよびSHG発生との関係を明らかにすることができた。特に、アキラルなバナナ型分子の集合体が、どのような場合にキラルな性質を示すかを明確にできた。また、実験的にも理論を検証することができた。(3)フレキシブル性の立場から、界面分子膜のフレクソエレクトリック効果について理論解析した。また、MDC測定結果に現れるフレクソエレクトリック効果を初めて明らかにすることができた。(4)分子膜のフレキシブル性の特徴は面内パターン構造として現れる。昨年度、導入したブリュスター角顕微鏡をMDC-SHG測定装置に付設し、界面膜のパターンの直接観察に成功した。(5)有機物の特徴を明確にするため、有機FET素子特性をin-situで評価できるシステムを構築した。また、実際にペンタセンFETの試作をした。本研究の目的は、分子膜のフレキシブルな構造についての物理を基礎として、有機電子素子作製への展開を円滑にする工学的手法の確立に向け、マックスウェル変位電流(MDC)測定と光第2次高調波(SHG)の同時測定を基礎として、柔構造界面分子膜の電子・光物性を評価する手法を、理論ならびに実験両面から開拓することである。[1]分子膜のフレキシブル性の特徴は面内パターン構造として現れる。昨年度から稼動しているBAM-MDC同時測定装置により、膜圧縮に伴って現れる様々なドメインパパターンの直接観察に成功した。[2]上記のパターンを理論的に予測するために、これまで単分子膜の形状を決定する方程式を提案してきた。これまでは水面垂直方向のダイポール相互作用と一様な方向にチルトしたダイポールの相互作用のみが考察されてきたが、本年度は静電相互作用の観点からダイポール相互作用を見直し、ドメイン内の配向歪みがドメイン形状に与える効果を含むように拡張した。その結果、形状エネルギーの自発曲率項とFrankの弾性エネルギーは、ダイポール相互作用のパラメータを使って表わすことができることが分かつた。[3]色素分子の1つであるヘミシアニンは、分子内電荷移動による巨大なダイポールモーメントを有し、ドメイン-ダイポールの評価を行う上で興味深い分子である。そのため、MDCとSHG測定を用いて、圧縮に伴う界面単分子膜の構造について評価を試みた。結果、ずり流動による相転移の確認、圧縮に伴うp受光SHGの減少などが確認された。[4]昨年度から継続して行っている有機FETについて、チャネル間に対して顕微SHG測定を行い、チャネル間の電界分布に対する直接的なプローブ技術として実用可能であることを示した。
骨リモデリングと破骨細胞形成における骨形成因子の機能の解析

骨形成因子(BMP)は骨代謝において重要なタンパクである。これまでに、BMPが骨芽細胞に作用し、分化を促進することが知られているが、破骨細胞に対する作用は明らかにされていない。そこで、破骨細胞でのBMPシグナルの作用メカニズムを解析した結果、骨リモデリングおけるBMPシグナルは、破骨細胞においても重要な役割を担っており、骨組織の形成維持に不可欠である事が分かった。骨に成因子(BMPシグナル)の破骨細胞における機能の重要性と作用メカニズムを解析するため、破骨細胞特異的にBMPシグナルを抑制したマウスを作製した。IA型BMP受容体遺伝子のfloxedヘテロマウス(Bmprla flox/+)とカテプシンKローカスにCre遺伝子をノックインしたヘテロマウス(Ctsk Cre/+)を入手し、これらのマウスをクリーンナップして飼育した。まず、Bmprla flox/+とCtsk Cre/+を交配し、Ctsk Cre/+ ; Bmprla flox/+マウスを得た。次にCtsk Cre/+ ; Bmprla flox/+マウスとCtsk Cre/+を交配し、Ctsk Cre/Cre ; Bmprla flox/+マウスを得た。そしてCtsk Cre/Cre ; Bmprla flox/+マウスとBmprla flox/+を交配し、Ctsk Cre/+ ; Bmprla flox/floxコンディショナルノックアウトマウス(CKO)を得た。コントロールマウスとして、Ctsk Cre/+ ; Bmprla +/+マウスを用いた。CKOとコントロールマウスの骨組織を生後3, 8, 12週のレントゲン及びマイクロCTで解析したところ、8週で著名な骨量の増加を認めた。骨組織の組織切片においても、8週で骨マトリックスの増加を認めた。切片を破骨細胞のマーカーとなるTRAP(酒石酸抵抗性アシッドフォスファターゼ)染色を行った結果、破骨細胞数の減少が示唆された。さらに破骨細胞の形成能を調べるために、マウスの脾細胞を、M-CSFとRANKLの存在下で培養を行った。CKOとコントロールマウスともに、脾細胞から破骨細胞を誘導することができた。また、PCRにてCreによる組み換えを検討したところ、RANKL刺激により、CKO由来の脾細胞から誘導された成熟破骨細胞で完全に組み換えが起きていることを確認した。CKOで骨量が増加したことから、破骨細胞において、BMPシグナルは重要な役割を担っていると考えた。骨形成因子(BMP)は骨代謝に重要なタンパクであり、骨組織を構成する各細胞についてその特異的機能を明らかにすることが重要である。BMPの骨芽細胞に対する機能は広く調べられているが、BMPの破骨細胞に対する機能については、未だ十分には明らかにされていない。BMPシグナルの破骨細胞における作用メカニズムを解明するため、昨年度作製した、破骨細胞特異的にIA型BMP受容体遺伝子を抑制したCtsk Cre/+;Bmprla flox/floxコンディショナルノックマウス(CKO)とコントロールマウス(Ctsk Cre/+;Bmprla+/+)の解析を行った。生後2日のマウスの脛骨組織において、抗cre recombinase抗体(500倍希釈)の免疫染色を行い、CKOマウスでは、破骨細胞特異的にCre recombinaseタンパクが発現しており、IA型BMP受容体遺伝子が破骨細胞特異的にノックアウトされていることが示唆された。また、破骨細胞の形成能を調べるため、脾細胞を用いてM-CSFとRANKL存在下で単培養を行った。コントロールマウスと同様にCKOマウス由来の脾細胞から破骨細胞形成は誘導され、骨吸収活性を評価する上で重要なアクチンリングも観察された。TRAPやMMP9などの破骨細胞マーカー遺伝子発現も認められた。さらに、コントロールマウスのcalvaria由来の培養骨芽細胞と、コントロールマウス及びCKOマウスの脾細胞を用いて其々VitaminD_3存在下での共存培養を行った結果、どちらの場合も破骨細胞は誘導された。よって培養下では破骨細胞の形成能が比較的保たれていることが判明した。また、8週齢マウスを用いて骨形態計測を行った。その結果、CKOマウスではコントロールマウスと比較して、破骨細胞数及び骨吸収面は減少しており、骨量は増加していた。以上の結果から、破骨細胞におけるBMPシグナルは、骨組織の形成維持に重要な役割を担っていると考えた。