hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
緩和時間変化型機能性MRIプローブのデザイン・合成・生物応用

酵素活性のin vivoでの可視化は、基礎研究のみならず遺伝子治療などの医療応用にも関わる重要な技術であり現在大きな注目を集めているが、実用的な手法はほとんど存在しない。蛍光イメージングは、感度は高く細胞レベルでの可視化に適している一方、MRIは、生体深部の断層画像を高い空間分解能で撮影することができる。本研究では、アポトーシスに関わる酵素であるカスパーゼの酵素活性を^<19>F-MRIと蛍光イメージングの二つの方法で検出できるプローブの創製を行った。アポトーシスは、細胞死の一種で生物の発生段階に主に見られ、成体において、アポトーシスの異常は疾患につながることが知られており、カスパーゼはアポトーシスを制御する重要な酵素である。まず、プローブの緩和時間・蛍光強度がともに変化するように、^<19>Fを含む蛍光化合物とランタノイド金属イオンであるGd^<3+>の錯体をカスパーゼ標的配列からなるペプチドでつないだ構造をデザインした。^<19>F-NMRの測定したところ、酵素反応前は、Gd^<3+>錯体の常磁性効果により^<19>Fの緩和時間が短縮しNMRシグナルが消失し、酵素によるペプチド切断により、Gd^<3+>錯体が^<19>Fより解離するためNMRシグナルが回復した。蛍光測定を行ったところ、酵素反応により、蛍光強度が上昇することが示された。さらに、^<19>F-MRIにより、酵素反応を可視化できるかどうかを検討したところ、酵素反応の進行に伴い、コントラストが高くなることが分かった。以上の結果から、蛍光とMRIにより、酵素活性を可視化することのできるプローブの創製に成功した。生体分子の機能や局在を調べる技術として、従来より蛍光プローブが用いられてきた。しかしながら、個体レベルで可視化するには、光透過性の問題があり蛍光法とは異なるアプローチが必要となる。核磁気共鳴画像法(MRI)は、生体の断層画像を非破壊的・非侵襲的に得ることのできる方法のひとつであり、主に医学分野で組織や臓器などの形状・状態を調べるために用いられている。一方、個体レベルで、生体分子の機能を明らかにするために開発されたMRIのためのプローブは、現在のところほとんど知られていない。本研究では、in vivoイメージングに向けて、アポトーシスに関わる酵素の一つであるカスパーゼの活性を捉えることのできるMRIプローブの開発を行った。まず、^<19>Fが体内には殆ど存在しないことに着目し、プローブの観測核として^<19>Fを含む化合物をプローブに組み込み、特異的にF^<19>のシグナル変化を捉えられるようにプローブの設計を行うこととした。さらに、酵素反応によりMRシグナルが変化するようにcaspase切断配列をもつペプチドと、常磁性相互作用により^<19>Fのシグナルを減少させることのできるGd^<3+>錯体を^<19>F化合物に組み込んだプローブを作製した。caspaseをプローブ試料に添加すると、プローブの^<19>Fの横緩和時間が増大しシャープなNMRシグナルが観測された。これは、酵素反応前ではGd^<3+>との分子内常磁性相互作用により^<19>Fの緩和時間が短縮していたが、酵素反応によりプローブが切断され分子内常磁性相互作用が解消されたことを示している。本研究の成果は、in vivoでアポトーシスに関わる酵素であるcaspaseの活性をMRIにより可視化するための基礎的技術を提供するものである。
離散凸解析を軸とする離散最適化アルゴリズム

非線形最適化の分野では,凸解析がその理論的なコアとなっている.一方,離散最適化の分野では,このような統一的な視点は存在しない.しかし,マトロイド的構造が良い性質と認知されている.「離散凸解析」は,連続変数に関する最適化と離散変数に関する最適化を統一的視点から捉える試みとして,研究代表者が提唱した理論体系であり,凸解析の理論とマトロイド理論の両者を結ぶ枠組みである.現実問題として現れる離散最適化問題は,マトロイド的な構造をもつものばかりではないので,分枝限定法のような列挙型の算法や,近似算法などを利用することになる.どのようなアプローチにおいても,問題特有の離散構造の中から扱いやすい部分をうまく抽出することが肝要である.例えば,一般の離散最適化問題を解く際に,ネットワーク的な構造を部分問題として抽出する手法は多くの場合に有効である.本研究の基本的なアイディアは,一般の離散最適化問題を解くために,離散凸解析で扱える問題を部分問題(子問題)として抽出しようというものである.本研究グループではこのアイディアに基づき,一般の離散最適化問題に対する効率的な解法の構築に取り組んだ.本研究グループの研究活動の成果として、以下のようなものが挙げられる:●離散凸解析の枠組みにおいて中心的な役割を果たすM凸関数とL凸関数という概念の諸性質を示した。●M凸関数の最小化問題に対する効率的な算法を提案した。●整数格子点上で定義されているM凸/L凸関数の概念を、実数空間上の関数へと拡張した。●M凸/L凸関数の定義を緩和することにより、準M凸/準L凸関数の概念を提案した。●離散凸解析の経済均衡への応用について粗代替性とM凸性の同値性などの結果を得た。本研究課題では,代表者が近年提案した「離散凸解析」の理論体系を基礎として,一般の組合せ最適化問題を解く実用的なアルゴリズムの構築を目指している.本研究の目標到達までの過程は,(i)理論の構築,(ii)アルゴリズムの開発,(iii)計算機実験による評価,の3段階に分けられるが,本年度は(1)に重点をおいて研究を進めた.離散凸解析は,元来,整数格子点上で定義された整数値関数に関する理論であったが,ごく最近の研究により,滑らかな実数値関数に関しても,解析的視点と組合せ的視点の融合が有効であることが分かってきた.本年度はこの研究をさらに進め,従来の「離散凸解析」を含む枠組みとして「組合せ凸解析」の理論体系を構築した.より具体的には,実数空間上で定義された関数に対して,M/L凸関数の概念を定義し,これらを「組合せ的凸関数」と見なして,解析的視点と組合せ的視点の両面から,以下のことを調べた.●M/L凸関数の集合版をM/L凸集合と定め,既知であると思われる事実を我々の視点からまとめた.●M/L凸関数のもつ様々な性質を示した.特にM/L凸関数の劣勾配,方向微分関数などの構造を明確にした.●多面体的M/L凸関数に対する多面体的な特徴付けを与えた.●離散的なM/L凸関数と連続的なM/L凸関数の関係を調べ,離散的M/L凸関数の凸拡張は連続的M/L凸関数であることを示した.本課題では、「離散凸解析」の枠組みに基づき、一般の組合せ最適化問題に対する効率的なアルゴリズムを構築することを主たる目的としている。本年度は以下の成果をあげ、これらは論文としてまとめ、学会等での口頭発表、学術雑誌への投稿を行なった。・[室田、塩浦]

離散凸関数の概念としては、Millerによる離散凸関数、Favati-Tardellaによる整凸関数、MurotaによるM凸/L凸関数、Murota-ShiouraによるM^#凸関数、Fujishige-MurotaによるL^#凸関数が提案されていた。ここではこれらの関係を明らかにし、フェンシェル-ルジャンドル変換などについて各種凸性の性質を調べた。アルゴリズムおよぶ計算量の観点からは、M凸/L凸関数の最小化は多項式時間で解けることは既知であるが、他のものについては現在不明であり今後の課題である。・[塩浦]分担者塩浦は、McCormick、Schulz、Weismantelらとの共同研究として、最小比閉路消去法が混合整数計画問題に対しても有用であることを示した。すなわち、ある種の負閉路を求めるオラクルを弱多項式回用いることで混合整数計画問題が解けることを示した。実用的観点からは、このオラクルをいかに効率的に実現するかが今後の課題である。・[室田、田村]付値マトロイドはマトロイドの基族上の付値としてDress-Wenzelにより当初提案された。これはMurotaによりM凸/L凸関数へと拡張され、独立マッチング問題の付値マトロイドへの拡張などアルゴリズムの観点からも充分な成果を得ている。ここでは、付値マトロイドのサーキット族上の最適化問題とそのアルゴリズム研究の基礎固めとして、付値マトロイドのサーキット族の公理系、双対性、二者択一性による特徴付けなどの研究を行なった。本課題では,「離散凸解析」の枠組みに基づき,一般の組合せ最適化問題に対する効率的なアルゴリズムを構築することを主たる目的としている.本年度は以下の成果をあげ,これらを論文としてまとめ,学会等での口頭発表,学術雑誌への投稿を行なった.・[室田,塩浦]M凸関数の最小化問題に対しては,最急降下法や領域縮小法が提案されているが,スケーリング技法をM凸関数最小化に用いる可能性を研究した.一般にM凸関数はスケーリングに関して閉じていないが,ツリー型M凸関数や2次のM凸関数などのクラスのM凸関数がスケーリングに関して閉じていることを示すとともに,スケーリング技法と最急降下法とを組み合わせた効率的な算法を提案し,その性能を計算機実験によって評価した.・[室田,田村]不可分財を含む経済均衡モデルにおいて,費用関数と効用関数がそれぞれM凸性,M凹性をもつ場合に,M凸劣モジュラ流問題と最短路問題を応用することで均衡を効率的に求める方法を開発した.・[藤江,田村]双向グラフ上で定義される一般化安定集合問題とその半正定値計画緩和が一致するための必要十分条件が双向グラフがパーフェクトであることを示した.このことは,パーフェクト双向グラフ上では一般化安定集合問題が多項式時間で解けることのより簡単な別証明を与えたというアルゴリズム的意味をもつ.・[田村]クローフリーグラフ上の重み付き安定集合問題は,Mintyにより多項式時間で解けることが示されたが,この解法の誤りを指摘し,その誤りを修正したアルゴリズムを提案することで,Mintyの結果を再確認した.
マイクロハイドローリクスの基盤構築

マイクロハイドローリックアクチュエータの開発と実証を行った。マイクロハイドローリックアクチュエータの基本動作機構や、圧力発生源となる埋め込み型電気浸透流ポンプの作製と性能評価、およびその埋め込み型電気浸透流ポンプを小型バッテリーで駆動するための電源制御回路等の基盤技術を構築し、すべての構成要素を集積化させることで、自立的に動作するマイクロハイドローリックアクチュエータの実証ソフトロボットモデルの開発に成功した。本研究課題で提案するソフトアクチュエータ機構である「マイクロハイドローリクス」の基本動作原理を実証した。基本的なマイクロハイドローリックアクチュエータを設計・試作し、それを用いて基本動作原理の検証を行った。基本アクチュエータに圧力を印加すると、設計どおりに一方向へ大きくたわむことが実証された。アクチュエータ材料として2種類の柔軟シリコーン(東レ・ダウコーニング社製Silpot 184、信越シリコーン社製KE1603)を比較した。その結果、材料の力学的特性(応力ーひずみ特性)によって変形や変位量が大きく異なることが分かった。さらに、Silpot 184に比べてKE1603の方がアクチュエータ材料に適していることが分かった。KE1603で作製したアクチュエータを用いて、圧力とアクチュエータ先端部変位量の関係を測定すると、圧力60kPa程度から変形が始まり、圧力120kPaで25mmという大変形を実現できた。さらに、基本アクチュエータを一枚のシート内に並べて配置し動作させることでシートが波打つ動作を、また、4つの基本アクチュエータを足に見立てて、四足で立ち上がる動作をそれぞれ実現した。また、重要な構成要素の一つである圧力発生源(電気浸透流ポンプ)の埋め込みと、基本アクチュエータとの一体化を行った。直径5mm、高さ2.6mmの円筒形多孔質セラミックを、白金線で挟んで構成される埋め込み型電気浸透流ポンプユニットを作製したところ、55Vの印加電圧に対して200kPa以上の圧力を出力できることが実証された。それをアクチュエータに組み込むことで、圧力源を内蔵した基本マイクロハイドローリックアクチュエータを実現した。埋め込み型電気浸透流ポンプに55Vの電圧を印可すると、90秒後に基本アクチュエータの先端部は25mm変位することが確認できた。マイクロハイドローリクスに基づいたソフトアクチュエータの構造解析シミュレーション手法を構築し、その基本動作メカニズムの解明に取り組んだ。前年度の実証実験により、大変形することが明らかであるため、超弾性モデルを用いて静的解析を行った。本解析の最大の特長は、アクチュエータ材料の2軸引張試験で実測した材料の応力ーひずみ関数を解析に組み込んだ点である。実測した2軸応力ーひずみデータに対してMooney-Rivlinの5次近似を用いてフィッティングすることにより、応力ーひずみ関数を得た。印加する圧力を10kPaから120 kPaの間で変化させながら解析を行ったところ、定性的にも定量的にも実証実験と一致する動作をシミュレーションで再現できた。次に、アクチュエータの動作スピード向上を目指して、構造解析シミュレーションと実証実験の2つのアプローチからアクチュエータの改良を行った。その結果、流路の深さやシートの厚み等の寸法を変化させても効果が小さく、アクチュエータ表面に設けた微細な連続溝構造が効果的であることが分かった。溝構造を設けることで、同じ圧力に対する変位は約2倍になり、約70%の圧力で同じ変位を得られることから、電気浸透流ポンプの圧力特性を考慮すると、アクチュエータ動作スピードが上がることが示唆された。実際に、電気浸透流ポンプを内蔵した溝付アクチュエータの実証実験を行ったところ、従来は一回の動作に要する時間が90秒であったが、それが60秒まで大幅に短縮された。一方、もう一つの重要な構成要素である制御回路系の開発も平行して実施した。埋め込み型電気浸透流ポンプを駆動するのに必要な55Vを出力可能で、さらにその出力をPWM制御できる小型電気回路系を開発した。電源として小型リチウムイオン電池を内蔵することで、4個の埋め込み型電気浸透流ポンプを同時に駆動することができた。今年度は、昨年度までに開発した基本アクチュエータ、圧力発生源である埋め込み型電気浸透流ポンプ、およびその電源制御回路系の3要素を組み合わせた実証ロボットモデルの設計・試作を行い、その動作実験を実施した。2本の流路と2個の埋め込み型電気浸透流ポンプを内蔵した手のひらサイズのシート状アクチュエータを作製し、制御回路およびバッテリー等の電気系統をすべて、アクチュエータ本体と同一素材であるシリコーンゴムで封入した。周囲から電気的に絶縁されているため、電気浸透流ポンプの作動流体であるメタノール中での動作が可能になる。電気浸透流ポンプを駆動するメタノールを貯蔵する小型リザーバを搭載することにも成功しており、メタノール中だけでなく、空気中でも動作させることができる。以下のような制御プログラムをマイコンに書き込み、実際に実証実験を実施した。右側CdSセルに光刺激を与えると、2個の電気浸透流ポンプに+55 Vが印可されて圧力が発生し、シート状アクチュエータを屈曲させる。一方、左側CdSセルに光刺激を与えると、2個の電気浸透流ポンプにー55 Vが印可されて圧力が降下し、シート状アクチュエータが初期の平面形状に戻る。光刺激がない場合、電気浸透流ポンプに電圧は印加されずアクチュエータは動作しない。

実証モデルの電源スイッチを入れ、メタノール水槽に投入したところ、LEDライトで右側CdSセルに光を照射すると、シート状アクチュエータが徐々に上方向に屈曲し、50秒後に約15 mm上方へ変位した。左側CdSセルに光を照射すると、徐々にたわみが小さくなり、約30秒後にもとの状態に戻った。以上より、すべての構成要素を集積して一体化したマイクロハイドローリックアクチュエータモデルが、スタンドアローンで動作することが実証され、さらに明るさという外部環境をセンシングして、それに応じた動作をする自律動作も可能であることが示された。マイクロハイドローリックアクチュエータの開発と実証を行った。マイクロハイドローリックアクチュエータの基本動作機構や、圧力発生源となる埋め込み型電気浸透流ポンプの作製と性能評価、およびその埋め込み型電気浸透流ポンプを小型バッテリーで駆動するための電源制御回路等の基盤技術を構築し、すべての構成要素を集積化させることで、自立的に動作するマイクロハイドローリックアクチュエータの実証ソフトロボットモデルの開発に成功した。アクチュエータ材料として、計画段階では東レ・ダウコーニング社製のシリコーンゴムSilpot 184を想定していた。しかし、Silpot 184を用いて基本アクチュエータを試作し、基本動作の実証実験を行ったところ、当初予測していたほどの大変形を得ることができず、アクチュエータ材料の変更を余儀なくされた。そのため、新しい材料の調査と選定、新しい材料の力学的特性を調べるための実験、さらにその新しい材料を使った基本アクチュエータの試作と実証実験を行う必要が生じたため、計画にやや遅れが生じた。Silpot 184は応力に対するひずみ量が小さいという材料特性を持っているため、超弾性変形が求められるマイクロハイドローリックアクチュエータ用材料としては不適であることが分かった。そこでそれに変わる材料として信越シリコーン社製のKE1603を調達し、その応力ーひずみ特性を調べる試験を実施したところ、Silpot 184と比べて2倍の伸び率を有することがわかったため、アクチュエータ材料としてKE1603を採用した。その後、材料をKE1603に変更してアクチュエータの試作と実証実験をやり直した。そのため計画に遅れが生じ、当初計画していた構造解析シミュレーションと動作メカニズム解析を実施することが出来なかった。なお、平成25年度に実施できなかったこれらの項目については、翌年平成26年度に実施し、無事に達成することができた。本研究は本年度、ほぼ計画どおり順調に進行した。本年度の目標に掲げた、構造解析シミュレーション手法の構築や、マイクロハイドローリックアクチュエータの動作スピードの向上、および制御回路系の開発は順調に進み、ほぼ達成された。ただ、作製したマイクロハイドローリックアクチュエータの性能評価について、やや不十分であった。動作メカニズム、変位量、動作スピードは実験や構造解析シミュレーションにより定量的に評価することができたが、発生力を評価することができなかった。発生力はアクチュエータの基本性能の一つであり、重要な評価項目であるため、次年度の実施項目とした。27年度が最終年度であるため、記入しない。応用マイクロ流体システム
胃癌の進展・転移に関与する癌関連遺伝子異常の解明と治療への応用

1)胃癌切除症例145例について、p53異常の検索とgenetic insiabilityの評価をおこない、p53異常を認める症例では有意にaneuploidyの頻度が高く、p53が正常機能を失うことにより細胞ゲノムのいたるところに変異遺伝子を持つようになりこの中から癌化した細胞が選択されさらに悪性度が高まることが示唆された。2)早期胃癌159例における発育形式を分類し、発育形式によって癌腫の持つ生物学的悪性度が異なっていることが明かになった。またその進展のメカニズムにおいて遺伝子レベルでの検索を行ったところ癌抑制遺伝子p53異常が重要な役割を担っていることを報告した。3)胃癌細胞株において、制癌剤処理後早期にMDR1遺伝子の発現の増加が認められた。この知見より胃癌においても薬剤耐性の機序としてMDR1遺伝子の関与が示唆された。4)ヒト胃癌細胞株および胃癌組織におけるMRP(MDR-associated protein)遺伝子発現をRT-PCR法によるmRNAの発現と抗MRP抗体(MRP-r1)を用いた免疫染色とで検出し、その発現と抗癌剤感受性との関係について検討した。MRP遺伝子の発現はヒト胃癌細胞株5株中4株の細胞で発現が認められた。そしてMRP陽性のMKN28やMKN74細胞では発現陰性のMKN-1よりVP-16、ADR、CDDPに有意に低感受性であった。また切除胃癌組織では43例中27例(63%)にMRP遺伝子の発現を認めた。抗癌剤感受性はMRP陽性群でVP-16、ADR、CDDPに有意に低感受性であった。近年、分子生物学の進歩により、癌の発生・浸潤・転移・薬剤耐性のメカニズムが遺伝子の異常として捉えるようになったが、現実の診断や治療との隔たりは大きい。その臨床的意義を明らかにするためには、臨床データを詳細に解析する必要がある。これまで、胃癌の転移・浸潤に関与する生物学的特性を多変量解析で解析したところ、胃癌の転移と密接な関係を持つrisk factorが明らかになり、転移の予知が可能となった。転移の高危険群に対して胃癌治療のstrategyを立てるために、制癌剤感受性試験を行ない各特性に基づいた治療法の確立の必要性を提唱してきた。今回、以下の点に注目を明らかにした。(1)DNAの修復には、障害に反応して細胞周期を遅らせ修復するチェックポイントとp53の癌抑制遺伝子産物との密接な関係が報告されている。ヒト胃癌においてもp53異常とDNAaneuploidと密接な関係があることを明らかにし、p53はGl-S移行のチェックポイント機構に関与する因子であることを示した。(2)制癌剤感受性との関連で、MPR遺伝子の発現をRT-PCR法で調べたところ、胃癌組織の63%で発現が認められ、ADM、VP-16の低感受性と関係あることが認められた。以上よりp53とgenetic instabilityのin vitroでの知見を、臨床検査で実証することができ、癌の発生・進展のメカニズムに新しい展開を与える結果が得られると考えられる。また、化学療法における耐性の分子機構が明らかとなり、我々が提唱しているtype-oriented chemotherapyを発展し、臨床に応用できる点で意義深い研究であると考えられる。
再生核の理論のチホノフ正則化法への応用

再生核の理論をチホノフ正則化法に適用して、相当一般的なヒルベルト空間上の作用素方程式の数値解析的な解法を確立して、典型的な例として難問として有名なラプラス実逆変換の数値解析的解法に藤原宏志氏などと成功して、国内及び国際特許の申請を済ませるまで研究を進める事が出来た。他方、山田正人氏などと非線形システムの同定と逆を確立する新しい数学的な理論をある程度構成することに成功した。難問として有名なラプラス変換における実逆変換の新しいアルゴリズムを確立して,数値実験にも成功して,京都大学と群馬大学では,数学関係では初めて,特許の申請を行なった。ラプラス変換の実逆変換については,数学的に,またアルゴリズム的にも大いに研究が進み,ソフトの開発から,販売できる情況まで進めることが出来たと考えている。他方,新しい博士課程の学生が入学して来て,非線形システムの同定問題と逆を求める課題を持ってきたが,それらのいずれにおいても数学的な原理を確立して,数値実験にも成功していて,新しいいろいろな数学上の問題でも大いに発展した。しかし,結果が具体的に陽に書く公式になっているので,ここでの成功は次元,方程式の数に制限があり,1.2.3次元に限られるという,強い制限が課せられているのは,今後の大きな問題である。再生核の理論を学術レベルの本として出版する計画も大いに進み相当な部分の出筆まで進んだ。その際,出版済みの論文の定式化の甘い点が発見されて,より精確な定式化などの研究も進んでいる。上記特許の出願後,適用できる関数空間をできるだけ一般な関数数空間に広けるための研究を行ない,相当に進んだがどの程度まで広けるべきかの問題について,応用上用いる人たちの情報を集めている。また,実ラブラス変換が成功した場合についての具体的な応用や効用についての評価についても情報を集めている。非線形システムの逆についても,従来法との比較や,そのときに考えられた特異積分の正則化法について,関係情報の検討と評価が問題として残されている。まだ完成からは程遠い状態である。藤原宏志氏たちとラプラス変換の実逆変換の応用と数値解析的な完成を目指して、研究を進めてほぼ完成の域にまでもって行き、国際特許の申請まで済ませる事ができた。さらに、博士課程の学生山田正人氏たちと(1)2次元実数空間の区分的に滑らかな境界を持つ有界領域上の向きを保つ写像の逆写像に対して、その積分表現公式を与えた。特に、像領域が凸集合のとき、本公式はArctan関数と定義域の境界の座標の中点で表され、境界上の写像の微分値が不要となることを示した。また、本公式は複素微分にグリーンの公式を適用して得られる一般化されたコーシーの積分公式を用いて導出されることを示した。さらに、いくつかの数値実験例を提示し、本公式は、単連結でない有限個の区分的に滑らかな閉曲線で囲まれた領域で定義された関数やヤコビアンがゼロになる場合などの関数にも有効に適用できることを示した。(2)一般のn次元実数空間の区分的に滑らかな境界を持つ有界領域上の向きを保つ写像の逆写像に対して、その積分表現公式を与えた。本公式は、異なる方法で導出された一変数関数、二変数関数の公式を統一することを示した。さらに本公式は、ポアッソン方程式の解の積分表示から得られる公式を含むことを示した。さらにいくつかの数値実験例を提示し、本公式の有効性を示した。(3)再生核とTikhonov正則化を用いることにより、物理的実験データに基づく線形システムの新しい逆公式を与えた。特に、本方法は、線形システムに何ら解析的な仮定を置かず、物理的実験データのみを用いて、線形システムの近似逆を求める方法であり、一般的で、大きな線形方程式を解く事に帰着される方法であるが、線形システムを陰に定めるのに入力として再生核を用いる新しい一般的な方法を用いている。どの様な再生核を用いるかは物理的なシステムに依存するもので、具体的な適用には実験と経験を必要とする要素を含んでいる。さらに澤野嘉宏氏たちと(4)ポテンシャル積分作用素に対するいくつかの不等式を考察した。さらに逆写像の積分表現公式に現れる特異積分に対し、数値計算の観点から考えられる自然な正則化に対し誤差評価を与え、その数値実験例を示した。
硬組織代替材料の開発-スパッタデポジション法による金属とセラミックスの複合化-

本研究では,既存の表面加工とは違う観点から硬組織と早期結合する材料を開発するための検討である.骨組織と直接結合する材料は,燐酸カルシウム系のセラミックスが知られているが,これらの材料は強度的には強くないため,単独で生体材料に用いるには問題がある.そのためプラズマ溶射やスパッタリングなど表面改質法などにより,表面特性向上を目的として行われるようになって来た.PVD法の中でもスパッタデポジション法は均質で強固なコーティングが出来ることから生体活性材料な材料を開発するためには,有効な方法であると考え検討を行った.装置は,ANELVA社製L-332S-5FHS、スパッタ条件は,放電出力200w,放電圧力0.2Paで,石英ガラス表面にβ-TCPとTi金属を混合コーティングした.コーティーングされたCa-P層の表面状態について,島津社製X線光電子分析装置AXIS-ULTRAによる定量分析を行いエネルギー状態を評価した.1.01sは530eV付近にピークを持ち,高結合エネルギー側にすそを引くような形をとり,変遷金属と結合した状態を示していると考えられることからTi金属と化合物を形成していると考えられる.3.Clsのピークは表層に存在することから,これはコンタミであり内層では汚染の少ない状態であることが推察できる.4.P2pは128eV付近にピークが現れ,これはリン酸イオンではなくリン化合物の状態を示していることが推察できる.本研究では、既存の表面加工法とは違う観点からのスパッタデポジション法を高周波によりTi金属とCaP系セラミックスを同時に原子・分子に分解し、硬組織代替材料表面にイオンスパッタすることにより、その表面にはTi金属やCaP系セラミックスの単体の層ではなく、Ti原子とCaP系セラミックス分子の状態で混在した新しい表面性状・新しい医療素材を開発することを目的とし、Bio-activeな材料としてβ-TCP(Ca_3(PO_4)_2)を選択しスパッタターゲットを製作した。ファインセラミックス系のターゲット製作に関しては、焼桔法や溶解法があるが、アパタイト系のターゲットは過去に製作した経緯がなかったため、焼桔法による製作を何度もくり返して亀裂のない均質な状態のターゲットを完成させた。スパッタ装置は、ANELVA社製L-332S-FHSを用いて、RF電源による高周波スパッタリング法により金属材料のTiおよびBio-active材料としてβ-TCPを個々に石英ガラス資料片上にスパッタコーティングを行った。スパッタ条件は、RFパワー200W、スパッタ圧22×10^<-1>、Ar流量50Sccm、成膜時間60minであった。スパッタされた試料表面の分析は、表面状態を島津社製走査型電子顕微鏡Super Scan SS-550、分析条件は加速電圧5.0kV、Probe 2.0、倍率×10000による観察を行い。また、Seiko社製蛍光X線分析装置SEA5120、分析条件は管電圧45kv試料電流16μA測定時間100Secによる定性分析を行った。観察されたスパッタ表面は緻密で均一な表面状態であるため、高品質なスパッタコーティングがなされているものと推察できる。また、β-TCPスパッタコーティング膜の定性分析においては、理論値膜圧0.2μm、Ca約90w%、P約10w%であったが、それぞれ化合物を形成し易く、精度の高い定量分析の必要があると考えられ、スパッタコーティングが均質であるため、アモルフアス状態でCa、Pが存在することも考えることができる。本研究では,既存の表面加工とは違う観点から硬組織と早期結合する材料を開発するための検討である.骨組織と直接結合する材料は,燐酸カルシウム系のセラミックスが知られているが,これらの材料は強度的には強くないため,単独で生体材料に用いるには問題がある.そのためプラズマ溶射やスパッタリングなど表面改質法などにより,表面特性向上を目的として行われるようになって来た.PVD法の中でもスパッタデポジション法は均質で強固なコーティングが出来ることから生体活性材料な材料を開発するためには,有効な方法であると考え検討を行った.装置は,ANELVA社製L-332S-5FHS、スパッタ条件は,放電出力200w,放電圧力0.2Paで,石英ガラス表面にβ-TCPとTi金属を混合コーティングした.コーティーングされたCa-P層の表面状態について,島津社製X線光電子分析装置AXIS-ULTRAによる定量分析を行いエネルギー状態を評価した.1.01sは530eV付近にピークを持ち,高結合エネルギー側にすそを引くような形をとり,変遷金属と結合した状態を示していると考えられることからTi金属と化合物を形成していると考えられる.3.Clsのピークは表層に存在することから,これはコンタミであり内層では汚染の少ない状態であることが推察できる.4.P2pは128eV付近にピークが現れ,これはリン酸イオンではなくリン化合物の状態を示していることが推察できる.
変性反応過渡状態にあるリゾチームの水素パルスラベル法による研究

蛋白質の折りたたみ機構を分子科学的に解明するために、これまではCDスペクトルや蛍光強度変化をモニターとして種々の実験が行われてきた。しかしこれでは分子全体の構造変化に関する情報しか得ることが出来なかった。そこで我々は、水素交換反応とNMR分光法を用いることによって、リゾチーム分子の変性(アンフォールディング)反応を原子レベルの分解能で観測することを試みた。すべての主鎖アミドプロトンをあらかじめ重水素で置換しておき、これを変性反応させ一定時間経過後に、短時間溶媒をpH9の軽水に変化させることによって、溶媒にさらされた蛋白質の領域を^1Hでパルス的にラベルした。このようにして作製した水素パルスラベル・リゾチームの2次元NMRスペクトル(HOHAHA)を測定することによって、残基毎に溶媒露出の速度定数を決めることが出来る。pH3.0、塩酸グアニジン4.0Mの条件下でリゾチームの変性反応を追跡し、約60個の主鎖アミドプロトンの交差ピークを観測して、ほぼすべての残基がいっせいに位相をそろえて溶媒露出するという結果を得た。さらに残基レベルの構造変化の活性化エネルギーを決定した結果、どの残基も36kcal/molとほぼ一定の値を持つことが明らかになった。これは、蛋白質の変性反応が分子全体にわたって協同的に構造変化するものであることを、はじめて実験的に明らかにしたものである。さらに、このような分子全体に渡る協同的な構造変化が、どのようなきっかけで引き起こされるのかという点に注目して、変性条件下において過渡的に折りたたまれたリゾチーム分子の水素交換反応のプロテクション・ファクター(遅延因子)を決定することを試みた。まだ数少ない実験データからの予測であるが、変性溶媒条件下の過渡的な折りたたみ構造においてリゾチームのβドメインの残基のプロテクション・ファクターが著しく減少していることが予測された。この点を今後明らかにするつもりである。
ゆらぎに基づく超臨界流体溶液系の特性の解明

超臨界状態は、分子分布の非常に不均一な状態として特徴づけられる。この構造の特徴は、「大きなゆらぎ」、「様々なサイズのクラスターの生成」あるいは「局所密度の増加」など、研究者により、また測定手段により、あるいは観測スケールの違いにより様々な言葉で表現されている。そして、この分子分布の不均一さが超臨界流体の特異な物性と密接に関係していることが明らかになりつつある。我々の過去の成果も含め、本プロジェクト研究で明らかにしてきたことは以下に纏められる。1)密度ゆらぎの等高線をp-T相図に描くと、気液曲線を延長する形で尾根線が存在する。尾根線は、臨界点を除いて臨界等密度線とは一致せず、臨界点から離れるに従いそのずれは大きくなる。2)尾根線上で、Gibbsの2次の微分量に関連した物理量は極値をとる。例えば、比熱、等温圧縮率、部分モル体積、音速、熱伝導率などの例を挙げることができる。3)溶解度の変化率は、尾根線上で最大になる。すなわち尾根線を境として非常に溶解度の大きな領域と溶解度の小さな領域に分かれる。4)超臨界流体を媒体として反応を行った場合、反応の特異点は尾根線上にある。5)密度ゆらぎをそのまま相関距離に置き換えても1)4)が成り立つ。6)水素結合系を除いて、上記の現象には対応状態の原理が適用できる。7)動的光散乱実験により密度ゆらぎの動的挙動の情報が加わった。動的挙動においても対応状態の原理が成立している。8)超臨界流体中の高分子の膨潤現象もゆらぎが密接に関連している。上記のように、超臨界流体における「ゆらぎ」の普遍性・重要性を明らかにした。超臨界流体の性質を論じる、あるいは実際に利用する際、「ゆらぎ」は最も重要なパラメータである。相図上に「ゆらぎ」をパラメータとして簡便に地図を描ける装置を製作し、「超臨界流体の活性領域探索方法と装置」も製作した。我々は、一成分超臨界流体系で分子分布の不均一さを定量的に表現する「ゆらぎ」を求め、これが超臨界流体の特性を決めている最も基本的な概念であることを明らかにしてきた。実用性・発展性を考慮すると、一成分系から溶液系への展開が必要である。超臨界流体溶液系で、混合状態・濃度ゆらぎ・各成分の密度ゆらぎなどの物理量を実験的に求めるために、装置を立ち上げ、方法論を確立することを第1の目的とした。本年度に完成あるいは製作途中の装置は、1)小角X線散乱実験を実験室レベルで行うためのX線発生部分、2)様々な濃度で気体と気体を混合するサンプリング装置、3)濃度の決まった試料を様々な密度で測定用試料セルに入れる装置、4)ベローズを用いた我々の独自のアイデア・設計による超臨界流体の密度測定装置である。興味深い超臨界流体溶液系のいくつかに実際に適用し、個々の系の物理化学的挙動を「ゆらぎ」の観点から解明することを第2の目標とした。具体的には、a)水-メチルアルコール系、b)二酸化炭素-トリフルオロメタン系の小角X線散乱実験に着手した。また、分光学的にも、一成分系でラマン散乱、動的光散乱、THz電磁波を用いた遠赤外吸収スペクトル測定を行い、超臨界流体溶液系へ発展させるべく準備を進めている。

超臨界状態は、分子分布の非常に不均一な状態として特徴づけられる。この構造の特徴は、「大きなゆらぎ」、「様々なサイズのクラスターの生成」あるいは「局所密度の増加」など、研究者により、また測定手段により、あるいは観測スケールの違いにより様々な言葉で表現されている。そして、この分子分布の不均一さが超臨界流体の特異な物性と密接に関係していることが明らかになりつつある。我々が過去及び本プロジェクト研究で明らかにしてきたことは以下に纏められる。1)密度ゆらぎの等高線をp-T相図に描くと、気液曲線を犀長する形で尾根線が存在する。尾根線は、臨界点を除いて臨界等密度線とは一致せず、臨界点から離れるに従いそのずれは大きくなる。2)尾根線上で、Gibbsの2次の微分量に関連した物理量は極値をとる。例えば、比熱、等温圧縮率、部分モル体積、音速、熱伝導率などの例を挙げることができる。3)溶解度の変化率は、尾根線上で最大になる。すなわち尾根線を境として非常に溶解度の大きな領域と溶解度の小さな領域に分かれる。4)超臨界流体を媒体として反応を行った場合、反応の特異点は尾根線上にある。5)密度ゆらぎをそのまま相関距離に置き換えても1)4)が成り立つ。6)水素結合系を除いて、上記の現象には対応状態の原理が適用できる。7)動的光散乱実験により密度ゆらぎの動的挙動の情報が加わった。動的挙動においても対応状態の原理が成立している。8)超臨界流体中の高分子の膨潤現象もゆらぎが密接に関連している。上記のように、超臨界流体における「ゆらぎ」の普遍性・重要性を明らかにした。超臨界流体の性質を論じる、あるいは実際に利用する際、「ゆらぎ」は最も重要なパラメータである。相図上に「ゆらぎ」をパラメータとして簡便に地図を描ける装置を製作し、「超臨界流体の活性領域探索方法と装置」として特許を申請している。
分極バイオマテリアルの骨形成制御メカニズムの解明

本研究では,生体材料として広く使用されているチタンを用いて,動物実験用チタンインプラントを作製し,インプラント表面にマイクロアーク酸化により酸化チタン膜を作製し,さらに酸化チタン膜を電気分極により表面改質を行い,その生体に及ぼす影響を検討した.作製したチタンインプラントを日本白色家兎の左右大腿骨内側上顆に埋入し,4,6,12週間後に周囲組織を含むインプラントを摘出し,生体内評価を行ったところ,インプラントの安定性の向上や,インプラント-骨接触率の向上が認められた.本表面改質法は,インプラント表面に新たな物質を追加することなく,骨形成を促進することから,幅広く臨床応用可能であることが示された.生体と接する生体材料の表面の形態や性状は生体の反応に影響を及ぼすことが明らかとなってきた.そこで,我々は生体反応をマニピュレートすることを目的としたベクトルマテリアルを作製するために,生体親和性を有するセラミックスを,電気分極を用いて表面改質を行い,培養細胞の増殖・接着・分化に及ぼす影響を検討する実験系を確立してきた.本研究では,生体材料として広く使用されているチタンを用いて,動物実験用チタンインプラントを作製し,インプラント表面にMAO処理により酸化チタン膜を作製し,さらに電気分極による表面改質を試みた.また,作製したチタンインプラントを日本白色家兎の左右大腿骨内側上顆に埋入し,4,6,12週間後に周囲組織を含むインプラントを摘出し,生体内評価を行ったところ,以下の知見を得た.1,動物実験用インプラントを作製し,電気分極処理による表面改質を行った.2,分極インプラントは未分極インプラントと比較して,すべての期間において有意に引っ張り強さが増加した.3,マイクロCTによりインプラント周囲の骨形成量を比較したところ,分極インプラントおよび未分極インプラント間で差は認められなかった.4,引張り試験後のインプラントに付着している骨量を比較したところ,分極インプラントでは有意に骨付着量が増加した.5,光学顕微鏡による組織学的検討を行ったところ,分極インプラントおよび未分極インプラントともに,骨とインプラントが直接結合するオッセオインテグレーションを獲得していることが分かった.以上より,分極インプラントは生体内において,骨とインプラントの化学的結合の増加によりインプラントの安定性が増すことが明らかとなり,電気分極処理によるインプラントの表面改質が有用であることが示唆された.本研究では,生体材料として広く使用されているチタンを用いて,動物実験用チタンインプラントを作製し,インプラント表面にマイクロアーク酸化により酸化チタン膜を作製し,さらに酸化チタン膜を電気分極により表面改質を行い,その生体に及ぼす影響を検討した.作製したチタンインプラントを日本白色家兎の左右大腿骨内側上顆に埋入し,4,6,12週間後に周囲組織を含むインプラントを摘出し,生体内評価を行ったところ,インプラントの安定性の向上や,インプラント-骨接触率の向上が認められた.本表面改質法は,インプラント表面に新たな物質を追加することなく,骨形成を促進することから,幅広く臨床応用可能であることが示された.生体と接する生体材料の表面の形態や性状は生体の反応に影響を及ぼすことが明らかとなってきた.そこで,我々は生体反応をマニピュレートすることを目的としたベクトルマテリアルを作製するために,生体親和性を有するセラミックスを,電気分極を用いて表面改質を行い,培養細胞の増殖・接着・分化に及ぼす影響を検討する実験系を確立してきた.本研究では,生体材料として広く使用されているチタン表面にMAO処理により酸化チタン膜を作製し,さらに電気分極による表面改質を試みた.また,分極した酸化チタン膜上で,培養細胞として骨芽細胞を用い,細胞の挙動を検討したところ,以下の知見を得た.1,酸化チタン膜を電気分極により表面改質を試みた.熱刺激脱分極電流測定により,表面電荷を計測したところ,蓄積電荷量が確認され,分極処理により酸化チタン膜の表面電荷を制御可能であることが分かった.2,分極した酸化チタン膜は,表面形状と化学組成を変化させることなく,ぬれ性が向上し,骨形成に有利に働く可能性が示唆された.3,分極酸化チタン上での骨芽細胞は未分極チタン上のものと比較して,MTTアッセイによる細胞増殖率を検討したところ,増殖率が有意に向上した.4,分極酸化チタンが骨芽細胞分化に与える影響を検討するために,骨芽細胞の分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ染色を行ったところ,分化が促進されていることが分かった.5,分極酸化チタン上では未分極チタン上と比較して,骨芽細胞のインテグリンα5遺伝子の上昇が認められた.本年度は,生体材料として広く使用されているチタン表面にMAO処理により酸化チタン膜を作製し,電気分極により表面改質を試みた.また,その骨芽細胞に与える影響を検討したところ,骨形成に有利に働くことが分かった.また,日本白色家兎を用いたin vivoでの分極インプラントが骨形成に与える影響の評価を開始した.分極インプラントと未分極インプラント(対照群)を大腿骨に埋入後,一定期間経過後に大腿骨を含むインプラントを摘出し,引張試験による引張強さの測定を行い,骨結合に与える影響を検討している.また,マイクロCTによる骨形成量の評価や,骨質評価,組織学的評価を行い,その解析を行っている.分極インプラントの引張強さや骨接触率が増加したことから,分極インプラントは骨形成を亢進することが分かった.また,骨粗鬆症患者を想定した疾患動物モデルの作製を行った.

女性ホルモンの低下による骨粗鬆症患者は,現在,増加傾向にあり,骨形成を制御できるベクトルマテリアルは,インプラント治療において有益であると考えられる.そのため,骨粗鬆症モデルにおける分極インプラントの骨形成制御のメカニズムの解明のため,10週齢日本白色家兎の雌に卵巣摘出術(OVX)を行い,一定期間経過したのちに,インプラント埋入を行った.埋入後,一定期間経過後に大腿骨を含むインプラントを摘出し,引張試験による引張強さの測定を行い,骨結合に与える影響を検討する.また,マイクロCTによる骨形成量の評価や,骨質評価,組織学的評価を行い,その解析を行っている.以上より,実施計画以上の成果が得られていると判断した.近年,歯科領域において歯牙欠損に対する治療法として,審美的・機能的側面からインプラントによる治療が盛んに行われるようになってきた.しかしながら治療に要する期間はインプラントと骨が結合するオッセオインテグレーションの獲得に依存しており,通常インプラント埋入後約6か月の期間を必要とする.オッセオインテグレーションの早期獲得による治療期間の短縮は患者にとって肉体的・精神的・社会的に有益であると考えられる.申請者のグループでは生体親和性を有するセラミックスを電気分極による表面改質により,生体の反応をマニピュレート可能なベクトルマテリアルの創製を世界に先駆けて行い,報告してきた.申請者のグループは生体材料であるハイドロキシアパタイトを電気分極により表面改質を行い,擬似体液浸漬下でのハイドロキシアパタイト沈着の亢進や,骨形成能の促進,骨芽細胞分化の亢進など良好な結果を得ており,電気分極処理がオッセオインテグレーションの早期獲得に貢献できると考えている.近年,外国の研究者も追随を受けており,英国Bath大学のBowen、Turnerのグループや米国Wahington state大学のBoseのグループが分極ハイドロキシアパタイトの生体に与える影響を検討し,その有用性を報告している.しかしながら,近年インプラント材料として非常に多く用いられているチタンに対して、電気分極による表面改質を施し生体に及ぼす検討を行った報告は、現在のところ申請者のグループのみであり,早急に分極チタンインプラントが生体に及ぼす影響とそのメカニズムを解明し、臨床応用への基盤研究を世界に先駆けて行うことが必要であると考える.
紡錘体極派生シグナルの非対称化操作による細胞の非対称化の検証

本申請では、光遺伝学の手法等を用いて、ヒト細胞において紡錘体極派生のPlk1キナーゼの局在、活性勾配を非対称化する操作法を確立し、紡錘体極派生シグナルの非対称化が紡錘体の配置・構造、細胞分裂後の娘細胞サイズの非対称化に十分かどうか検証を行うことを目的としている。[本年度の結果]昨年度に作成した、光照射依存的中心体局在化ツールPACT-BFP-iLIDを、ゲノム編集技術によってAAVS1部位にノックインし、恒常的に発現するヒト細胞株を樹立した。この株を用いると、光照射依存的に細胞質に局在するRFP-nanoを分裂期中心体に局在化させる事に成功したが、その局在範囲が狭いため、そもそも中心体に局在するPlk1の量を2極間で明らかな違いが見られるほどに非対称化できなかった。そこで、より広範囲な紡錘体極領域に局在するNuMAのC末端に、BFP-iLIDをノックインした細胞株を樹立したところ、PACT-iLIDと比較して、有意なPlk1-RFP-nanoの非対称化を誘導することに成功した。また恒常的に活性型、不活性型のPlk1キナーゼの中心体局在を光操作するために、Rosa26部位から発現誘導可能なノックイン株を作成することにも成功した。またより顕著なPlk1の非対称化を誘導する目的で、iLIDを紡錘体全体に局在化できる細胞株の作成も進めている。[重要性、意義]本研究で樹立した、光照射依存的に、紡錘体極間に人為的に非対称性を誘導する技術を用いれば、今後Plk1キナーゼのみならず、様々な分子の非対称化の誘導とその表現型の解析を通じて、それらの紡錘体極での機能の十分性を理解できるのみならず、紡錘体構造や配置の新たな操作法にもつながり、異なる角度から紡錘体形成や配置制御の理解に貢献できると考えられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。本申請では、光遺伝学の手法等を用いて、ヒト細胞において紡錘体極派生のPlk1キナーゼの局在、活性勾配を非対称化する操作法を確立し、紡錘体極派生シグナルの非対称化が紡錘体の配置・構造、細胞分裂サイズの非対称化に十分か検証を行うことを目的としている。[結果]H27年度では特に光遺伝学ツールの最適化、光操作による分裂期細胞表層や中心体への局在化の検討、CRISPR/Cas9法を用いたノックイン技術の確立に焦点を当てて研究を進め、以下の点を明らかにしてきた。1.青色光照射依存的なCRY2-CIBNの相互作用誘導系では効率よく局所的に光操作できないことが分かった。2. CRY2-CIBNの代わりに、iLIDシステム(Guntas et al., 2015 PNAS)を用いたところ、分裂期の細胞で青色光照射依存的に効率良く局所的に光操作することができた。3.分裂期の細胞表層においてPlk1キナーゼを非対称に局在誘導することに成功した。すると予想外に紡錘体を引き寄せる効果があることが分かった。4. PACT domainをもちいてiLIDを中心体に局在化させ、光照射依存的に細胞質のRFP-nano(iLID結合因子)を中心体に局在誘導することに成功した。5. CRISPR/Cas9を用いて、CDK5RAP2など分裂期PCMタンパク質にタグをノックインすることに成功した。[意義・重要性]上記の結果から、iLIDを用いることでPlk1の分裂期紡錘体極間での非対称性を光操作できる道筋がついた。このような試みはこれまで報告がなく、新規で独自の発見につながる可能性が高い。一方、Plk1を細胞表層に非対称局在させると、予想とは逆の現象が起きた。今後さらに解析を進めることで、Plk1が担う未知の仕組みを明らかにできるのではないかと期待している。以下の3点について、達成できた。1.光操作ツールの最適化、および光照射と高解像度な画像取得の両立可能な顕微鏡システムのセットアップ。2. CRISPR/Cas9法を用いた内在性中心体タンパク質へのタグ付け、またはAAVS1、Rosa26領域への任意の発現コンストラクトのノックイン。3.PACTdomainによる光操作ツールの中心体局在化。4.細胞表層でのPlk1の非対称局在操作。H27年度は光操作ツールおよび顕微鏡システムのセットアップ、最適化に時間を要したため、十分な解析に踏み込めなかったが、必要な装置やシステムはほぼ準備ができたと言える。H27年度の成果を土台に、来年度は効率的に研究を推進できると考えている。[本年度の結果]昨年度に作成した、光照射依存的中心体局在化ツール

PACT-BFP-iLIDを、ゲノム編集技術によってAAVS1部位にノックインし、恒常的に発現するヒト細胞株を樹立した。この株を用いると、光照射依存的に細胞質に局在するRFP-nanoを分裂期中心体に局在化させる事に成功したが、その局在範囲が狭いため、そもそも中心体に局在するPlk1の量を2極間で明らかな違いが見られるほどに非対称化できなかった。そこで、より広範囲な紡錘体極領域に局在するNuMAのC末端に、BFP-iLIDをノックインした細胞株を樹立したところ、PACT-iLIDと比較して、有意なPlk1-RFP-nanoの非対称化を誘導することに成功した。また恒常的に活性型、不活性型のPlk1キナーゼの中心体局在を光操作するために、Rosa26部位から発現誘導可能なノックイン株を作成することにも成功した。またより顕著なPlk1の非対称化を誘導する目的で、iLIDを紡錘体全体に局在化できる細胞株の作成も進めている。[重要性、意義]本研究で樹立した、光照射依存的に、紡錘体極間に人為的に非対称性を誘導する技術を用いれば、今後Plk1キナーゼのみならず、様々な分子の非対称化の誘導とその表現型の解析を通じて、それらの紡錘体極での機能の十分性を理解できるのみならず、紡錘体構造や配置の新たな操作法にもつながり、異なる角度から紡錘体形成や配置制御の理解に貢献できると考えられる。まずはiLIDを用いて、光操作タグのついたPlk1(Nano-mCherry-Plk1)をRosa26領域から発現し、分裂期紡錘体極間で非対称な局在操作を実現したのち、その後の紡錘体配置の変化を生細胞で解析する。Plk1はそもそも分裂期紡錘体極に局在するため、iLIDによる光操作のみでは、2極間に顕著な非対称性を誘導できないかもしれない。その場合は、局在化の増幅が可能なSun-tagを組み合わせることで、顕著なPlk1局在の非対称化誘導を試みる。また野生型のPlk1の光操作で表現型が得られた場合には、その表現型がキナーゼ活性に依存するかどうか、不活性変異体を同様に発現、操作し、その表現型を比較する。一方、興味深いことに、Plk1を細胞表層に光操作すると、予想とは逆に紡錘体を引き寄せる現象が観察された。これは申請者のモデルを否定するというよりも、光操作したPlk1がダイニン非依存的に未知の方法で紡錘体を引き寄せたためと考えることもできる。H28年度にはこの新しい仮説の検証も進める。また光操作以外にも、Plk4のノックダウンにより2極間で異なる中心体数をもった紡錘体の作出を試みる。H26年度の成果によって、CDK5RAP2など分裂期PCMタンパク質を蛍光標識することに成功したので、実際に中心体数を観察しつつ、分裂期紡錘体の形状、配置の解析を進める。光操作は、CRISPR/Cas9によるノックインの容易なガン細胞(HCT116)を用いてまず行うが、条件が確立できれば、同じ光操作を不死化正常細胞(hTERT-Rpe1)や幹細胞などでも行い、紡錘体極の非対称化による表現型が普遍的あるいは細胞種特異的なものかどうかを解析する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
乾燥地におけるヒモによる低コスト地中灌漑法の社会実装に向けた実証研究

開発途上国の乾燥地において灌漑農業を実現するために,現地で調達可能な資材を用いて節水型,かつ,低コストで灌漑効果の高い地中灌漑方法を開発する.マイクロ灌漑方式で課題となる均一な水分分布を可能とするために,ヒモの毛管現象を利用したヒモ灌漑システムを提案し,効果検証を行う.ポンプを使わず地中のパイプ内の水位調節により,ヒモと土壌の負圧を利用した負圧差灌漑方式によりシステムを構成する.社会実装を念頭に,持続可能な農業のために,低コストで,資材の入手が容易で,現地住民が扱い易い方法を提案する.開発途上国の乾燥地において灌漑農業を実現するために,現地で調達可能な資材を用いて節水型,かつ,低コストで灌漑効果の高い地中灌漑方法を開発する.マイクロ灌漑方式で課題となる均一な水分分布を可能とするために,ヒモの毛管現象を利用したヒモ灌漑システムを提案し,効果検証を行う.ポンプを使わず地中のパイプ内の水位調節により,ヒモと土壌の負圧を利用した負圧差灌漑方式によりシステムを構成する.社会実装を念頭に,持続可能な農業のために,低コストで,資材の入手が容易で,現地住民が扱い易い方法を提案する.