hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Stereptococcus mutansのデキストラナーゼ多型の分子機構

Stereptococcus mutansのデキストラナーゼ(Dex)多型の分子機構の解明を遺伝子学的アプローチにより行った。まず初めに、齲蝕原性細菌のDex分子に共通の特徴を見い出すために、S.downelのデキストラナーゼ遺伝子(dex)の全塩基配列を決定し、S.mutansおよびS.subrinusとの塩基配列および推定アミノ酸配列の相同性を比較した。その結果、いずれの菌種のDexも分子中央に相同性の高い保存領域(約540アミノ酸残基)とその両端の相同性の低い可変領域からなっていることが明らかになった。この3菌種のDexはいずれも活性を有するDex多型を示すことが活性染色パターンから明らかであるため、保存領域がDex活性に必須であり、多型形成にはN末端およびC末端側の可変領域が関与しているものと推測した。この推測をもとに、S.mutansのdex遺伝子操作によりDex分子のN末端及びC末端領域の欠損変異体を作成し、Dexの多型と活性に与える影響を調べた。Dex欠損変異体はPCR増幅により作成し、大腸菌内で発現させた変異体の多型形成と活性の有無は、タンパク染色および活性染色により判定した。その上、この変異体はいずれもDex活性を保持していた。また、このC末端変異が保存領域内部におよんだ変異体では多型は形成されず、酵素活性を消失していた。一方、活性を有する最小分子量のC末端変異体のN末端側の可変領域で作成したN末端欠損変異体では作成したいずれの変異体も多型および酵素活性を示さなかった。これらの結果から、Dexの多型形成には保存領域のC末端側に位置する可変領域が関与していることが明らかになった。また、Dexの多型形成による低分子化と酵素活性の関係から、この保存領域内にはDexの活性中心や基質結合部位などの触媒部位の存在が示唆された。我々は、これまでにS.mutansを含む齲蝕細菌(5菌種)のデキストラナーゼが多型を示すことを見出してきた。デキストラナーゼ分子は、精製過程でプロテアーゼの作用により、除々に低分子化するため、各分子サイズの酵素を精製するのは容易ではなかった。そこで、齲蝕細菌のデキストラナーゼ(dex)遺伝子の塩基配列を決定し、そこから得られるアミノ酸一次構造を比較することで、分子多型に影響を与える領域を推測し、それをクローン化dex遺伝子を用いた遺伝子工学的アプローチにより証明することを試みている。本年度は、齲蝕細菌の一つであるStreptococcus downeiのdex遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果、S.downei dexの読み枠は3,831pbであり、その遺伝子がコードするデキストラナーゼ(Dex)は1,297アミノ酸残基からなっており、その分子量は139,743、等電点は4.48であることが明らかになった。ここで得られたS.downei Dexのアミノ酸配列を既に報告されているS.mutansとS.sobrinusのDexのそれと比較すると、その相同性は各Dex分子内の約540アミノ酸残基に集中しており、その相同性はそれぞれ62%と90%であった。この領域はS.mutansではDex分子の中央に位置し、S.sobrinusとS.downeiでは中央よりややN末端側に位置していることが明らかになった。これらの結果より、この相同領域(上記の540アミノ酸残基)内にはDexの活性中心や基質結合部位の存在が示唆された。このことから、Dexの低分子化による多型は、相同領域以外のN末端およびC末端側領域がプロテアーゼによって消化されるためではないかと推測した。

現在、このN末端およびC末端領域の欠損変異株を作成し、デキストラナーゼ分子多型に与える影響について検討中である。齲蝕原因菌(5菌種)はいずれも菌体外デキストラナーゼを産生する。このデキストラナーゼの分子量は菌種により異なるが、いずれの菌種からも活性型のデキストラナーゼ分子多型が検出されている。そこでこの酵素多型の分子機構を解明する目的で、各菌種のデキストラナーゼのアミノ酸一次構造を比較し、分子多型に影響を与える領域の解明を試みた。現在までに3菌種(S.mutans,S.sobrinus,S.salivarius)のデキストラナーゼ遺伝子の解析が報告されているが、私たちは、これに加えてS.downelのデキストラナーゼ遺伝子の全塩基配列を決定し、これら4菌種のデキストラナーゼを比較した。その結果、いずれのデキストラナーゼもその分子内部に高い相同性を有する保存領域とその両端(CおよびN末端)の相同性の低い可変領域からなっていることを明らかにした。保存領域はどの菌種でも約540アミノ酸残基からなっており、その両端の可変領域は菌種によりその長さが異なることが明らかになった。これらの結果より、この保存領域が酵素活性に必須であり、この領域内における活性中心や基質結合部位の存在が示唆された。さらにこの結果は、S.cricetusおよびS.rattusのデキストラナーゼ分子内にもまた約540アミノ酸残基の保存領域が存在していることを明らかにしたことにより示唆された。さらにデキストラナーゼの分子多型にはプロテアーゼが関与しているという我々のこれまでの結果を考えあわせると、デキストラナーゼの分子多型は、可変領域のプロテアーゼ分解によるものと推測した。次に、この結果を基にS.mutansのデキストラナーゼ分子のN末端およびC末端領域の欠損変異株をサブクローニングおよびPCRを用いて作成し、酵素活性への影響を調べた結果、酵素活性には保存領域の存在が必須で、C末端側の可変領域は活性には無関係であることが明らかになった。現在これらの変異株におけるデキストラナーゼ分子の多型パターンについて解析中である。我々は、これまでに齲蝕原性細菌のデキストラナーゼ(Dex)のアミノ酸一次構造の比較から、Dexはその分子内に約540アミノ酸残基からなる相同性の高い領域(保存領域)とその両端の相同性の低い可変領域から成ることを明らかにした。その結果から、保存領域はDex活性に深く関わっており、可変領域は分子多型に影響を与えていると推測した。この推測から本年度は、Streptococcus mutansのdex遺伝子の全塩基配列をもとに、Dex分子のN末端およびC末端領域の欠損変異体を作成し、Dexの分子多型と活性に与える影響を調べた。Dex欠損変異体はPCR増幅により作成し、大腸菌内で発現させたDex変異体の分子多型と活性の有無はタンパク染色および活性染色により判定した。その結果、保存領域のC末端側の可変領域で作成した欠損変異体は、野生型のDexと同様に分子多型を形成した。その上、この変異体はいずれもDex活性を保存していた。また、この変異が保存領域内部におよんだC末端変異体では分子多型は形成されず、酵素活性も消失していた。一方、活性を有するC末端変異体の最小分子のN末端側の可変領域で作成した欠損変異体では、作成したいずれの変異体も分子多型および酵素活性を示さなかった。
「喧嘩両成敗」概念をめぐる言説に関する総合的研究

本研究は、所謂「喧嘩両成敗」の考え方が、主に近代以降のさまざまな言説の中でどのように論じられてきたか解明することを目的とした。特に、背景にある学術的・社会的潮流、法意識の変遷と関連づけ、総合的に考察することを目指した。近代以降の多くの言説で「喧嘩両成敗」概念は過去の遺制として扱われている。しかし、それらを詳細に分析することで、各時代において「喧嘩両成敗」概念が論じられる文脈を明らかにし、その変遷と歴史的意義について新たな知見を得た。本研究は、所謂「喧嘩両成敗」の考え方が、主に近代以降のさまざまな言説の中でどのように論じられてきたかを、その背景にある学術的・社会的潮流、とりわけ法意識の変遷と関連づけて総合的に解明することを目的とする。本研究では、第一に、喧嘩両成敗に関する学術的な成果の背景となった学界における議論及び社会情勢を明らかにするため、関連する論考を博捜するとともに、必要に応じて関連する判例についても収集及び検討を行う。第二に、両成敗に関する一般的な言説がどのような脈絡で生まれたものかを明らかにするため、新聞・雑誌類も含めた各種資料から関連する言説を収集する。収集した資料は電子データベースとして整理するとともに、これを活用して考察を行う。平成21年度は、必要な資料の収集・整理及びデータベースの作成を中心に研究活動を行った。法学分野全般、とりわけ法制史、法意識・紛争処理・刑事法学等、両成敗に深く関わると思われる分野を中心に、「喧嘩両成敗」に言及した文献を博捜して、関連する記述を抜き出し、電子情報(テキストデータ)として随時蓄積した。これらの情報を基に、当該記述の出典や刊行時期、各記述の相関関係等をまとめた電子データベースの構築に向け、他の様々な領域で公開されているデータベースにアクセスしてそれらを研究する等、システムの設計等について検討を行った。また、法制史関連・法学・紛争処理研究関連の文献を入手、検討してこれらの分野に関する広い知見を身につけ、本研究に厳密性と広がりを持たせるよう努めるとともに、喧嘩両成敗に関する研究実績のある研究者と意見交換を行い、研究の方向性や進め方等について示唆を得た。平成22年度は、前年度に引き続いて必要な資料の収集・整理を行うとともに、データベースの拡充を中心に作業を行った。対象としては法学分野全般に加え、日常的に「喧嘩両成敗」的状況が発生していると思われる学校現場の紛争に着目してこれに関する文献の収集を行い、事例を集積した。また、法学のみにとどまらず、教育学分野も含めた幅広い分野の文献を検討し、本テーマに関する知識を深めた。さらに、集積したデータを踏まえて分析を加え、「喧嘩両成敗」観念がどのような文脈で用いられているかについて考察を行った。その結果、「喧嘩両成敗」観念が各時代においてどのように論じられてきたのかについてその変遷と歴史的意義に関する新たな知見を得ることにつながった。その成果についてはとりまとめ、近日中に公表したいと考えている。
PET製剤製造のための同軸円筒型慣性-静電閉じ込めD-^3He核融合陽子源の開発

本研究は,同軸円筒型慣性-静電閉じ込めD-^3He核融合陽子源を製作し,この陽子源の放電特性および陽子生成特性を計測し,数値シミュレーション結果との比較により,PET(Positron Emission Tomography)製剤製造のためのコンパクトな核融合陽子源を開発するための基礎資料を得ることを目的として行われた。1年間の研究により,以下の結果を得た。1.最初に,D-D核融合による陽子の検出を行い,中性子生成率の測定値との比較により,陽子検出器の較正を行った。高電圧放電を用いるため,電子の制動放射によるX線が発生する。このため,X線にも感度のある陽子検出器を使う場合,X線を遮蔽する必要がある。D-D核融合の場合,金属薄膜フィルターだけでは,D-D核融合による低エネルギー(3.03MeV)の陽子を透過し,X線だけを遮蔽することが難しかったため,数値シミュレーションにより陽子軌道を求め,電磁偏向を用いた陽子検出器を製作した。なお,陽子検出素子にはSSD(Silicon Surface Barrier Diode)を使用した。2.中性子生成率と比較すると,陽子の検出効率が非常に低い(計算値の0.10.001程度)ことが明らかになった。シミュレーション結果との比較から,これは真空容器内の比較的広い領域で核融合反応が起こっているため,検出器に到達できない多数の陽子が存在するためであると推定された。この測定方法を使うと,将来,核融合反応の分布を計測できる可能性がある。3.D_2と^3Heの混合比を変化させながら陽子生成率を測定し,^3Heの単位消費量当たりの陽子生成率を最大にする最適なガス混合比として1.5:1を得た。なお,実験では,放電電圧55kV,放電電流15mAにおいて定常的に2×10^6n/sの陽子生成率を得ることができた。
間質性肺炎におけるマイクロパーティクルの役割と情報伝達としての意義

マイクロパーティクル(MP)の間質性肺炎(IP)病態形成への関与、臨床応用への可能性を明らかにすることを目的とし、気管支肺胞洗浄液(BALF)中のMPを測定した。IPのBALF中のMPは増加しており、MP濃度はBALF中の総細胞数、特にリンパ球数と正の相関をしたが、好中球数やLDH濃度とは相関しなかった。これらの結果からMPは抗炎症性に働いている可能性が考えられた。今後さらに研究を進めたい。新規の情報伝達物質であるマイクロパーティクル(MP)は活性化白血球や血小板,内皮細胞より放出され,様々な細胞を活性化する炎症性メディエータとして機能する.また血液凝固促進や抗原提示など自己免疫性疾患の病態に関与する可能性が示唆されている.間質性肺炎(IP)は,その原因として100種を超える病態が存在し,自己免疫性疾患の代表である膠原病においても,IPの合併が認識されている.原因不明の特発性IPも多く,肺局所にはリンパ球,好中球,マクロファージ等の炎症細胞が集積するが,IPの病態形成におけるこれら細胞の役割は全くわかっていない.治療法はステロイドを中心に免疫抑制剤の併用が推奨されてはいるが,何を標的に治療薬を選択するかが不明瞭で,治療効果もエビデンスが得られていないのが実情である.以上から,IPの診断・治療における新たなアプローチが必要と考えられた.本研究は新規情報伝達物質であるMPについて,IPの病態形成との関連の検討,及び臨床応用・治療へと展開するための研究基盤の確立が目的である.具体的には呼吸器疾患におけるMPのスクリーニング,IPの気管支肺胞洗浄液(BALF)中におけるMPの探索,IPの治療反応性とMPとの関連についての解析を行う.平成22年度においてはIP(特発性および膠原病合併),サルコイドーシス,ニューモシスティス肺炎(PCP)の患者に対し気管支内視鏡検査を実施し,BALFについてMPの解析を行った.MP解析は,MPの発現するホスファチジルセリンに結合するannexin V (AV)を用いたフローサイトメトリー法で行い,BALF中にMPが存在するかどうか検討した.その結果,各病態のBALF中にはMPが存在し,そのBALF中のMP数は,IP,サルコイドーシス,PCPの順に多い傾向を認め,MPが各病態の発症メカニズムの違いを反映する可能性が考えられた.新規の情報伝達物質であるマイクロパーティクル(MP)は活性化白血球や血小板、内皮細胞より放出され、様々な細胞を活性化する。また自己免疫性疾患の病態に関与する可能性が示唆されている。間質性肺炎(IP)は特発性あるいは膠原病との合併があり、肺局所にはリンパ球、好中球、マクロファージ等の炎症細胞が集積する。しかしIPの病態形成におけるこれら細胞由来のMPの役割は不明である。本研究は新規の情報伝達物質であるMPについてIPの病態形成にいかに関与しているか、さらには臨床応用・治療へと展開するための研究基盤を確立することを目的としている。具体的には呼吸器疾患におけるMPのスクリーニング、IPの気管支肺胞洗浄液(BALF)中におけるMPの探索、IPの治療反応性とMPとの関連について解析を行う。平成23年度においては、特に膠原病に関連したIP、サルコイドーシス、ニューモシスティス肺炎(PCP)、細菌性肺炎の患者に対し気管支内視鏡検査を実施し、気管支肺胞洗浄液(BALF)についてMPの解析を行った。MP解析はホスファチジルセリンに結合するannexin V(AV)を用いたフローサイトメトリー法で行い、BALF中のMP濃度、細胞数、血清およびBALF中のLDHや白血球が放出する液性因子などの濃度との比較検討を行った。その結果、IPにおけるMPの中央値は約200,000/mLであり、細菌感染症を除くサルコイドージス、PCPに比して高い傾向を示した。さらにIPにおけるBALF中のMP数は、血清LDHとは負の相関を示し、またBALF中の白血球数や液性因子とは相関を示さなかった。顆粒球由来のMPには抗炎症作用があることが報告されており、IPにおけるMPの役割を考える上で重要な知見と考えられた。本研究ではマイクロパーティクル(MP)の間質性肺炎(IP)の病態形成への関与を明らかにし、さらには臨床応用・治療へと展開するための基礎的知見を得ることを目的としている。平成23年度の研究において、BALF中のMP解析をホスファチジルセリンに結合するannexin V(AV)を用いたフローサイトメトリー法で行った結果、IPにおけるMPの中央値が高く、血清LDHとは負の相関を示し、またBALF中の白血球数や液性因子とは相関を示さなかった。この結果を受けて平成24年度においては、IPの対照疾患としてサルコイドーシス8例(高解像度CTで肺野病変あり5例、縦隔病変あり7例)のBALF中MPについて検討を加えた。BALF中のリンパ球比率は490%と正常域から著明上昇であったが、CD4/8比は全例2.5以上であった。

BALF中のMP数を測定したところ、13.8111.4(中央値44.4)/μlと検出が確認された。肺野病変の有無での解析では、有する群では60.4/μlと有さない群の40.6/μlに比して高い傾向があった。MP数とBALF中の総細胞数、リンパ球数、好中球数との間には明らかな相関は見られなかったが、リンパ球数との間には弱い正の相関傾向があった。以上の結果から、MPはサルコイドーシスの肺野病変形成過程において影響を与えている可能性が考えられた。今後は慢性炎症病変であるIPと肉芽腫性病変であるサルコイドーシスを対比しながら、MPの表面マーカー解析などを行うことでその細胞由来を解析し、ステロイド治療等の影響によるMPの推移を検討し、疾患マーカー、治療標的としての意義を明らかにしたい。解析の対象となる症例数がやや少なく、またBALF中の液性因子等の測定やMPの詳細な性質の検討が不十分である。24年度が最終年度であるため、記入しない。さらに症例数を増加させるとともに、BALF中のKL-6等IPの病勢を反映する因子や血清中の可溶因子との比較を行い、MP濃度との関連について検討する。さらに種々の細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、BALF中に増加しているMPの性状を明らかにし、IPの病態との関連、とくに抗炎症作用との関連を明らかにする。
天然ゴムラテックスの脱蛋白と高純度化天然ゴム誘導体の合成

未処理の高アンモニアラテックスの窒素含有率は0.3%であったが、遠心分離を1回行うと窒素含有率は0.104%、2回行うと0.089%に低下した。アニオン系の界面活性剤を加えて遠心分離を2回行うと窒素含有率は約0.05%に減少し、アニオン系の界面活性剤と蛋白分解酵素を加えた後遠心分離を2回行うと窒素含有率は0.01%以下に低下した。残留窒素は4残基以下のオリゴペプチドによるものであることを確認し、これにより天然ゴムからタンパク質を完全に除去することに成功した。脱蛋白天然ゴムは、これまで問題とされてきた天然ゴムのI型アレルギーの防止に有効であることをラットを用いた研究で明らかにした。遠心分離では小粒径のラテックスを回収できなかったが回転平膜モジュールにより小粒径のラテックスの回収を可能にし、脱蛋白ゴムの機械的強度が向上した。タンパク質を除去しても天然ゴムの物理的性質はほとんど変わらないが、粘度が低くなり加工法が向上することと耐水性が良くなることを見出した。精製したラテックスを65°Cで3時間振とうすると極限粘度は約6程度に低下したが、塩化コバルトを加えて3時間振とうすると32.5程度に低下した。カルボニル反応試薬であるフェニルヒドラジンの存在下、塩化コバルトを加えた振とう酸化分解では極限粘度は0.50.7に低下した。分解により生じた末端アルデヒド基がフェニルヒドラジンにより安定化されたことを分光学的に確認した。塩化コバルトの代わりにラジカル開始剤を加え少量のプロピオンアルデヒドを添加した振とうでもゴムの分子鎖切断が起こり極限粘度は0.65まで低下した。NMR測定から分解生成物の両末端基がアルデヒドとケトンであると推定した。精製したラテックスのグラフト化では、未処理のゴムよりも低分子量のグラフト共重合体とグロスポリマーが得られた。アニオン系の界面活性剤を加えて遠心分離を行うと窒素含有率は約0.05%に減少した。一方、アニオン系の界面活性剤(ドデシル硫酸ナトリウム)の存在下、37°Cで蛋白分解酵素(Alcalase 2.0T)処理を行った後、遠心分離によって蛋白質成分を含む奨液を洗浄除去する試みも行った。クリーム状のゴム分を回収した後、界面活性剤を加えてゴム粒子を再分散させ洗浄と濃縮を2回行うと、窒素含有量は0.01%に低下した。同様に、アニオン及びノニオン界面活性剤(Kao KP3938)の存在下、30°Cで蛋白分解酵素(Kao KP3939)処理を行い遠心分離を行った後、洗浄と濃縮を2回行うと、窒素含有率は0.008%になり、窒素含有率が0.01%以下の脱蛋白天然ゴムの調製が可能になった。濃縮の過程で失われるゴム分は、限外濾過膜を用いることにより回収できることを見いだした。精製したラテックスを65°Cで3時間振とうしても極限粘度はほとんど低下せず約6程度であったが、塩化コバルトを加えて同様に空気酸化分解を行うと極限粘度は32.5に低下した。カルボニル反応試薬であるフェニルヒドラジンの存在下、塩化コバルトを加えて振とう酸化分解すると極限粘度は0.50.7に低下した。

^1Hおよび^<13>C-NMR測定で、フェニルヒドラジンを加えて分解したゴムにはカルボニルによるシグナルが存在せずフェニル基によるシグナルが現れたことから末端のほとんどがフェニルヒドラジンと反応したと推定した。未処理の高アンモニアラテックスの窒素含有率は0.3%であったが、遠心分離を1回行うと窒素含有率は0.104%、2回行うと0.089%に低下した。アニオン系の界面活性剤を加えて遠心分離を2回行うと窒素含有率は0.05%に減少し、アニオン系の界面活性剤と蛋白分解酵素を加えた後遠心分離を2回行うと窒素含有率は0.01%以下に低下した。残留窒素は4残基以下のオリゴペプチドによるものであることを確認し、これにより天然ゴムからタンパク質を完全に除去することに成功した。脱蛋白天然ゴムは、これまで問題とされてきた天然ゴムのI型アレルギーの防止に有効であることをラットを用いた研究で明らかにした。遠心分離では小粒径のラテックスを回収できなかったが回転平膜モジュールにより小粒径のラテックスの回収を可能にし、脱蛋白ゴムの機械的強度が向上した。タンパク質を除去しても天然ゴムの物理的性質はほとんど変わらないが、粘度が低くなり加工性が向上することと耐水性が良くなることを見出だした。精製したラテックスを65°Cで3時間振ろうとすると極限粘度は約6程度に低下したが、塩化コルバトルを加えて3時間振ろうとすると32.5程度に低下した。カルボニル反応試薬であるヘニルヒドラジンの存在下、塩化コバルトを加えた振とう酸化分解では極限粘度は0.50.7に低下した。分解により生じた末端アルデヒド基がフェニルフドラジンにより安定化されたことを分光学的に確認した。塩化コバルトの代わりにラジカル開始剤を加え少量のプロピオンアルデヒドを添加した振とうでもゴムの分子鎖切断が起こり極限粘度は0.65まで低下した。NMR測定から分解生成物の両末端基がアルデヒドとケトンであると推定した。精製したラテックスのグラフト化では、未処理のゴムよりも低分子量のグラフト共重合体とグロスポリマーが得られた。
高機能シミュレーターを用いた酸素療法の評価

【背景】経鼻高流量酸素療法(High-flow nasal cannula therapy: HFNC)は、30L/分以上の高流量・高濃度酸素を経鼻で供給できるシステムである。HFNCは、死腔の洗い流しによりCO2の再呼吸を減らし、呼吸負荷の軽減が期待されるが、生体での検証は難しい。本研究では、高機能患者シミュレータ(Human Patient Simulator : HPS)及び臨床データを用いて、HFNCのCO2洗い流し効果が呼吸へ与える影響について調べた。更に当院でのHFNCの呼吸不全終末期における使用実態を調査した。【方法及び結果】我々はまずHPSを用いた研究で、HFNCがCO2洗い流し効果により、呼吸負荷軽減作用を発揮することを明らかにした。引き続き行った急性呼吸不全患者を対象とした後ろ向き観察研究において、HFNCが重症患者に於いて明らかな酸素化の改善をもたらさないにもかかわらず、呼吸仕事量を軽減し、呼吸数減少をもたらすことを明らかにした。更に急性呼吸不全終末期にHFNC導入した患者では80%で、HFNCが事実上最終酸素療法に位置付けられており、またHFNCの使用期間も、2週間程度と比較的長い期間使用され、人生の最終段階の苦痛軽減に寄与していることを明らかにした。【考察】上記の結果は、HPSから得られる酸素療法の効果に関するデータが、臨床における重症呼吸不全患者の病態解明に有用であることを表している。現在シミュレーターから得られた知見と臨床データから得られた知見を統合し、学術論文を投稿段階である。高機能患者シミュレータを用いて酸素療法の評価を行うため、最新の酸素療法である経鼻高流量酸素療法の有効性を検証し、有意義な結果が得られた。【背景】経鼻高流量酸素療法(High Flow Nasal Cannula :HFNC)は正確な高濃度高流量酸素供給が可能であり酸素化改善、呼吸仕事量の軽減などが期待される。SpO2/FIO2(S/F)は急性呼吸窮迫症候群患者においてPaO2/FIO2(P/F)との相関が知られている。PaO2測定には動脈血ガス分析が必要である。今回HFNCを使用した急性呼吸不全患者の治療効果を非侵襲的パラメーターで代用できるかを検討した。【方法】2013年1月2015年5月の期間、急性呼吸不全の診断でHFNCを使用した患者を対象とし換気評価(呼吸数)、酸素化(S/F)について装着後6時間までの経時的変化を後方視的に検討した。値は平均値±標準偏差で示した。HFNC使用患者のうちSpO2≧97%またはS/F≧315は除外した。統計解析は反復測定分散分析、posthoc testとしてBonferroni検定(有意水準p<0.05)を用いた。【結果】HFNCを使用した107人のうち48人が対象となった。主要な原因疾患は間質性肺炎(37%)、市中肺炎(19%)であった。呼吸数は、開始前(28±6)と比較し3,5時間後(25±5,24±6)と有意に減少した。S/Fは、開始前156±63に比べ有意な変化は見られなかった。【考察】HFNC開始後、呼吸数減少は呼吸仕事量を改善したものと考えられ既知の文献とも一致する。S/Fに有意な変化はなかったが、HFNC開始後24時間以内ではP/Fに有意差がなかったとの報告があり本研究とも合致する。SpO2低値を示す急性呼吸不全患者において、HFNC療法使用時にS/Fの値は酸素化指標の1つになる可能性がある。【結語】HFNCを使用した急性呼吸不全患者の治療評価項目として呼吸回数、S/Fを用いた非侵襲的パラメーターの有用性が示唆された。当初予定していたシミュレーターを用いたデータに加え、臨床データからも有益な情報が得られている。<背景>本研究では当院での経鼻高流量酸素療法(HFNC)の呼吸不全終末期における使用実態を調査した。<方法>急性呼吸不全終末期患者は「急性期にHFNCによる積極的な治療を行ったが、最終的に呼吸不全で亡くなった患者」と定義した。2013年1月2015年5月の診療録より、肺炎、間質性肺炎急性増悪の診断で入院した患者を抽出し、死亡した症例の酸素療法の施行期間などに加え、食事摂取状況、治療過程での蘇生不要(DNAR)及び挿管不要(DNI)同意取得の有無につき、調査した。<結果>対象となったのは24例(市中肺炎13例、間質性肺炎の急性増悪11例)で、年齢は76.3±8.8歳、APACHEIIスコアは31.8[28-33]。DNAR同意取得は18例、DNI同意取得は1例、同意なしは5例。HFNC施行日数は17.0±12.5日で、死亡時の呼吸管理は、肺炎群死亡13例中HFNC5例、気管挿管2例、非侵襲的陽圧換気1例、間質性肺炎急性増悪群死亡11例中HFNC8例、非侵襲的陽圧換気1例であった。また、死亡時にHFNCを使用していた患者で死亡直前まで経口摂取を行っていた患者は肺炎群2例、間質性肺炎急性増悪群5例であった。<考察>急性呼吸不全終末期にHFNC導入した患者では80%で経過中にDNAR、DNI同意が得られており、HFNCが事実上最終酸素療法に位置付けられていた。

またHFNCの使用期間も、これまでの急性期の患者対象の報告ではHFNC使用期間は約3日間であり、当院では、比較的長い期間使用されていた。重症呼吸器疾患で死亡率が高いと予測され、DNAR、DNIを取得した患者であっても、数日数10日の間延命ができており、その間の酸素療法としてHFNCが選択され、死亡までHFNCで継続していた患者が多かったことが分かった。当初予定していたシミュレーターを用いたデータに、1昨年及び昨年まとめた臨床データを加え、現在英文論文作成中である。【背景】経鼻高流量酸素療法(High-flow nasal cannula therapy: HFNC)は、30L/分以上の高流量・高濃度酸素を経鼻で供給できるシステムである。HFNCは、死腔の洗い流しによりCO2の再呼吸を減らし、呼吸負荷の軽減が期待されるが、生体での検証は難しい。本研究では、高機能患者シミュレータ(Human Patient Simulator : HPS)及び臨床データを用いて、HFNCのCO2洗い流し効果が呼吸へ与える影響について調べた。更に当院でのHFNCの呼吸不全終末期における使用実態を調査した。【方法及び結果】我々はまずHPSを用いた研究で、HFNCがCO2洗い流し効果により、呼吸負荷軽減作用を発揮することを明らかにした。引き続き行った急性呼吸不全患者を対象とした後ろ向き観察研究において、HFNCが重症患者に於いて明らかな酸素化の改善をもたらさないにもかかわらず、呼吸仕事量を軽減し、呼吸数減少をもたらすことを明らかにした。更に急性呼吸不全終末期にHFNC導入した患者では80%で、HFNCが事実上最終酸素療法に位置付けられており、またHFNCの使用期間も、2週間程度と比較的長い期間使用され、人生の最終段階の苦痛軽減に寄与していることを明らかにした。【考察】上記の結果は、HPSから得られる酸素療法の効果に関するデータが、臨床における重症呼吸不全患者の病態解明に有用であることを表している。現在シミュレーターから得られた知見と臨床データから得られた知見を統合し、学術論文を投稿段階である。引き続きシミュレーターから得られた結果と生体から得られる結果の相関につき、検証を進めていく。今後もシミュレーターを用いた実験と並行して、臨床データの解析を行っていくことで、経鼻高流量酸素療法の呼吸軽減作用に関する新たな知見を得たい。研究開始時には健常ボランティアを用いた研究を考えていたが、臨床データを加えることで健常ボランティアのデータが必須ではなくなった。シミュレーター研究に関し、Nが不足しているため、追加実験が必要となっている。研究計画時には、高機能シミュレーターの精度を検証するため、健常ボランティアでの実験が必須と考えていた。しかし高機能シミュレーターにより得られたデータが信頼度が高いと考えられたため、健常ボランティアでの検証を未だ行っていない。研究開始時には健常ボランティアを用いた研究を考えていたが、臨床データを加えることで健常ボランティアのデータが必須ではなくなったため。計画は順調に進んで、シミュレーターと臨床データの結果をまとめ、学会発表も終えている。H30年度も継続して行うことで、シミュレーターのデータを追加実験で加え、英語論文を作成し、英文雑誌に投稿する予定である。臨床データを後ろ向きに検証しつつ、健常ボランティアでのデータ取得を検討する。引き続きシミュレーターを用いた研究に加え、臨床データを用いた検証を行う。
ヒト概日系の構造解析:同調機序による2振動体仮説の検証とモデル動物を用いた睡眠覚醒リズム中枢の解明

本研究は、1)健康人を対象とした体内時計の同調実験と、2)モデル動物を用いた睡眠覚醒リズムの同調機構に関する実験からなり、以下の結果を得た。1)ヒト体内時計の特性1.サーカディアンリズム振動共役の強度:約2001xの薄明下でフリーランしている全被験者で、睡眠覚醒リズムと血中メラトニンリズムの内的脱同調が観察された。同時に、REM睡眠出現分布の変化を特徴とする睡眠構造の変化がみられた。照度を5001xにした場合は、内的脱同調の頻度は約20%であることから、光照度は振動共役を強化する作用があると思われる。2.メラトニンリズムの社会的同調:強制的な睡眠覚醒スケジュールが血中メラトニンリズムを同調させるか否かを、照度2001xと51xで検討した。2001x下では、8名中3名でリズム同調が認められたが、照度51xでは12名中確実に同調したものは1名もいなかった。この結果から、強制的睡眠覚醒スケジュールは体内時計を直接同調させるのではなく、付随する明暗サイクルが同調に関与すると考えられる。2)モデル動物を用いた睡眠覚醒リズム中枢の解明1.メトアンフェタミン投与による内的脱同調:ラットにメトアンフェタミンを慢性投与すると、活動リズムが24時間成分と30時間成分に分離し、ヒトの内的脱同調に極めて類似した状態を示した。2.社会的同調とドパミン機構:メトアンフェタミン処置視交差上核破壊ラットにドパミン受容体阻害剤であるハロペリドールを睡眠覚醒リズムの各位相で投与し、その位相反応特性を解析した。その結果、睡眠覚醒リズムの社会的同調を説明しうる位相反応曲線が得られ、社会的同調にドパミン神経機構の関与が示唆された。1)社会的同調因子による同調実験:時刻の手がかりを除いた時間隔離実験室で被験者(n=8)を3週間生活させ、概日リズムを低照度下(2001x以下)でフリーランさせた。フリーラン7日目より24時間周期の睡眠覚醒スケジュール(社会的因子)を被験者に課し、直腸温リズムと血中メラトニンリズムの同調の有無を調べた。血中メラトニンリズムは、留置カテーテルによる1時間ごとの36時間連続採血を行い、メラトニンをRIAで測定することにより記録した。また睡眠脳波を測定し、睡眠構造の変化を検討した。その結果、このフリーラン条件下では全被験者に生体リズムの内的脱同調がみられた。睡眠覚醒スケジュールにより血中メラトニンリズムにはっきりとした同調が認められたのは8名中3名で、同調が認められなかったのが2名、判定不能が3名であった。社会的同調因子によるリズム同調には個体差があると考えられるが、2001x以下の低照度光がリズム同調に関与した可能性も除外できない。また社会的同調因子の存在下で内的脱同調が生じた例ではレム睡眠の分布が不正になっており、睡眠の質に変化が認められた。2)モデル動物を用いたヒト生体リズムの内的脱同調シミュレーション:成熟雄ラットにメトアンフェタミンを飲水に溶かして慢性投与してモデル動物を作成し、自発行動の24リズムを測定した。同時に頭蓋骨内に慢性的に銀電極を植え込み、皮質脳波を連続的に記録した。その結果、行動リズムの単周期(ウルトラディアン)成分が減少し、連続した行動と休息が認められる様になり、それに対して睡眠脳波も多相性から単相性へと変化し、ヒトの睡眠に類似してきた。

本年度は、1)健康人を対象とした体内時計の同調実験と、2)モデル動物を用いた睡眠覚醒リズムの同調機構に関する実験を行い以下の結果を得た。1)健常被験者(7名)の睡眠覚醒スケジュールを1夜の徹夜はさんで8時間前進させ(16時間の後退と等価)、血中メラトニンリズムが再同調過程を解析した。睡眠覚醒スケジュールに付随する明暗サイクルの影響を最小にする目的で、室内照度を夜間のメラトニン分泌に影響しないとされている500ルックス以下に設定した。その結果、血中メラトニンリズムは睡眠覚醒スケジュールを変化させた8日間後には約4時間位相前進し、再同調傾向を示した。しかし、その過程は高照度光による再同調とは質的に異なり、睡眠覚醒スケジュール独自の同調作用が示唆された。しかし、500ルックス以下の光でも同調効果を完全には否定できないので、5ルックスの低照度にセットした時間隔離実験で実験を行った。健常被験者(6名)に、23.5時間周期の強制的睡眠覚醒スケジュールを負荷したときの血中メラトニンリズムの周期を測定し、強制的睡眠覚醒スケジュールの同調効果を調べた。その結果、全被験者でメラトニンリズムは24時間よりわずかに長い周期でフリーランし、リズム同調は認められなかった。以上の結果は睡眠覚醒スケジュールの同調効果を否定するものであり、従来主張されていた同調効果は付随する明暗サイクルの同調効果が現れたものと考えられる。2)睡眠覚醒リズムの社会的同調機序を中枢神経レベルで解明する目的で、メトアンフェタミン処置視交差上核破壊ラットにドパミン受容体阻害剤であるハロペリドールを睡眠覚醒リズムの各位相で投与し、その位相反応特性を解析した。その結果、睡眠覚醒リズムの社会的同調を説明しうる位相反応曲線が得られ、社会的同調にドパミン神経機構の関与が示唆された。
先天性免疫不全症におけるリンパ系幹細胞への欠損遺伝子の導入

先天性免疫不全症のうち、common variable immunodeficiency(CVID)についてのリンパ系幹細胞の培養法を確立した。方法は骨髄有核細胞をpercoll比重遠沈法で40%以上をstromal cell源とし60%層を幹細胞源した。(日本免疫學会抄録)。stromal cellの培養法は1.800ガウスの磁力線培養装置を使用して繊維芽細胞増殖因子、GーCSF GFーβ1の存在を基本に培養した。対照群として胎児骨髄細胞を使用した場合は,ILー1誘導stromal cell上には、前T細胞を主体としたリンパ系幹細胞が培養された。一方、ILー7誘導胎児stromal cell上には前B細胞を主体にしたリンパ系幹細胞が培養されてきた。他方、成人型stromal cellは極めてILー7に良く反応し前B細胞育成能を保有するstromal cellが誘導されてきた。先天性免疫不全症においては、B細胞欠損型CVIDにおいて上記の方法を使用してCVIDーstromal cellを誘導したところ、ILー1反応性stromal cellが誘導されたのみでILー7反応性strmalcellは誘導されてこなかった。しかも、CVIDのstromal cellのリンパ系幹細胞の育成能は、前T細胞を主体としたT細胞系のみで前B細胞及びB細胞の育成能はまったく証明されなかった。以上の結果より、CVIDのstromal cellは胎児型stromal cellであり、B細胞欠損型のCVIDは恐らくILー7反応性stromal cellの欠損により、B細胞系の欠落が引き起こされたと思われる。現在リンパ系幹細胞はmonoclonal抗体を使用した成績からCD34陽性、CD33陰性の多岐能分裂能を保有する幹細胞からTdT陽性,CD38陽性のリンパ系幹細胞に分化し、更にCD10、CD19、HLA DR陽性のB細胞系とCD5,CD7,CD2陽性のT細胞系に分化することが判明した。B細胞欠損型CVIDの骨髄細胞をin vitroで培養してCVIDの患児に養子移入すべき大量培養法を現在開発中である。
免疫抑制剤MTX(メトトレキセート)関連リンパ増殖性疾患の分子病理学的解析

当該期間における研究成果は以下のとおりである。1)RA患者に発生したLPD77例を一般人に発生する悪性リンパ腫(150例)を対照として臨床病理学的に検討した。その結果、RA患者に発生するLPDは一般の悪性リンパ腫に比べて高齢で発症し、予後が悪いことを示した。また、non-MTX-LPDを含むRA患者に発生するLPDの臨床病理学的所見からMTX-LPDの発生要因は大部分原疾患の免疫学的機序の異常により、残りの約1割がMTXの投与が要因であると推測できた。また、LPD発症時のRA重症度class分類における機能障害度はMTX投与患者ではむしろ非投与患者よりも軽かった。(J Rheumatol, in revision)2)RA患者に発生したLPD35例におけるCD40発現の臨床的意義について検討した。RA患者に発生したLPDでは一般のリンパ腫に比べCD40発現が高頻度であり、またCD40発現を認める症例は認めない症例に比べ予後がよく、CD40発現と予後が相関することが判明した。(J Cancer Res Clin Oncol, 2005)3)インフリキシマブ関連LPDの本邦第一例目の英文報告を行った。(Int J Hematol, 2005)4)RA-LPDについてMTXの投与を受けた患者群(32例)と受けなかった患者群(21例)で、p53遺伝子変異の頻度を比較検討し、両群間でp53遺伝子変異の頻度に有意な差があることを解明した。(in submission)当該期間における研究成果は以下のとおりである。(in submission)本年度、我々はRA患者に発生したLPDにおけるp53 geneの点突然変異を解析した結果、MTX投与群、非投与群間で頻度の差があることを明らかにした。p53 geneは癌抑制遺伝子で、その遺伝子変異は種々のヒト腫瘍の発生、進展に関与しているおり(Hollstein,et al.Science,1991)、ある種のヒトリンパ増殖性疾患においてもp53 geneの点突然変異が、腫瘍の進展に関与していることが報告されている(Ichikawa,etal. Blood, 1992)。我々はこれまでaggressiveで予後不良な経過を示すT、NK/T細胞性の臓器移植患者に発生したリンパ増殖性疾患(PT-LPD)においてもp53 geneの点突然変異が高頻度に見られること(Lab Invest, 2002)、リウマチ患者を含む種々の自己免疫性疾患患者(大部分MTX非投与)に発生したT細胞性LPDでもp53 geneの点突然変異が高頻度に廃られること、また、これらの点突然変異が予後と相関することを明らかにしてきた(in submission)。本年度我々はRA患者に発生したLPDについてMTXの投与を受けた患者群と受けなかった患者群で、p53遺伝子変異の頻度を比較検討した。その結果、MTX-LPD:15.6%、MTX非投与群でのLPD:47.6%で、両群間でp53遺伝子変異の頻度に有意な差を認めた(P<0.05)。即ち、同じRA患者に発生するLPDでもMTX投与例とMTX非投与例では分子生物学的性質が異なることを明らかにした(投稿準備中)。昨年度(平成16年度)の実績我々はRA患者に発生したLPDについてMTXの投与を受けた患者群と受けなかった患者群で、p53遺伝子変異の頻度を比較検討したところ、両群間で有意な差を認めた。したがって、同じRA患者に発生するLPDでもMTX投与例とMTX非投与例では分子生物学的性質が異なることを明らかにした(in submitted)本年度(平成17年度)の実績1)関節リウマチ患者に発生したリンパ球増殖性疾患(LPD)につきCD40発現の臨床的意義について検討した。関接リウマチ患者に発生したリンパ球増殖性疾患(LPD)35例におけるCD40発現の臨床的意義について検討した。

関節リウマチ患者に発生したLPDでは一般のリンパ腫に比べCD40発現が高頻度であり、またCD40発現を認める症例は認めない症例に比べ予後がよく、CD40発現と予後が相関することが判明した。その機序ついては今後の検討課題である。(J Cancer Res Clin Oncol,2005)2)インフリキシマブ関連LPDの本邦第一例目の英文報告を行った。インフリキシマブはTNF-αを阻害する作用を有する生物製剤で、2003年に関接リウマチに対して保険適応になっている薬剤である。本症例はインフリキシマブ投与9ヵ月後にLPDが発症し、薬剤投与中止後腫瘍が退縮し、寛解が8ヵ月続いている。(Int J Hematol,2005)
ショウジョウバエの生殖細胞に特異的な新規核内蛋白質キナーゼDmnkの機能解析

本年度の研究においては、ショウジョウバエの生殖細胞に特異的に発現する新規核内蛋白質キナーゼDmnk(Drosophila maternal nuclear kinase)の細胞レベルにおける詳細な発現解析を行った。Dmnkは卵形成過程における択一的スプライシングの結果、Dmnk-L,Dmnk-Sの2種のキナーゼが存在することが明らかとなっている。そこで、まずエピトープタギングを行ったDmnk-L,Dmnk-S蛋白質をCOS細胞に遺伝子導入により強制発現させ、これらのキナーゼ蛋白質の細胞内局在を免疫化学的方法により解析した。その結果、Dmnk-Lが殆ど核内においてのみ局在が認められるのに対し、Dmnk-Sは細胞質内、核内の両者に局在することが明らかとなった。従って、これらの2つのキナーゼが細胞内において異なる機能を有する可能性が示唆された。現在、Dmnkの機能を明らかにする目的で、Dmnkと会合する分子の検索をyeast twohybrid法を用いて行っているが、既に既存のあるボディーパターン形成に関わる遺伝子産物と会合することを示唆する知見を得ている。また、データベース解析を行ったところ、線虫においてもDmnkの相同キナーゼ(Cmnk:C.elegans ortholog of Dmnk)が存在することが明らかとなった。Cmnkの機能を明らかにする目的で、RNAi法による解析を行ったところ、Cmnkの発現を抑制すると多くの線虫胚において胚性致死の表現型が認められるが、一部では発生が進行し(エスケーパーと呼ばれる表現型)発生が進行した線虫においては、him(high incidence ofmale)と呼ばれる表現型が観察された。また、RNAi法を行った線虫においては減数分裂の異常が認められることが明らかとなった。
肝線維化における細胞接着因子リセプターファミリーの動態に関する研究

(1)Integrinβ1およびβ3 subunitに対するモノクローナル抗体を用いて、健常者および肝硬変患者ヒト血清中にintegrinβ1およびβ3が存在することをWestern immunoblotttingにて確認した。(2)それぞれのIntegrinのELISAによる測定系を開発し、各種肝疾患患者血清にて測定した。その結果、Integrinβ1は、肝線維化と相関して血中に増加することを見いだした。Integrinβ1は、免疫組織学的検討でも線維化領域、肝細胞膜および類洞壁細胞に強い染色性を示し、Integrinβ1濃度の測定が新しい肝線維化マーカーとして有用であることを明らかにした。(3)一方Integrinβ3は、慢性肝障害患者血清中に増加するが、免疫組織学的検討では、肝の線維化領域には全く染色されず、血小板、肝細胞膜、血管内皮細胞および類洞内皮細胞に染色された。血小板膜蛋白GPIa/IIa(α2β1)、GPIc/IIa(α5β1)、GPIIb/IIIa(αIIb/β3)は、肝臓と同じIntegrinのβサブユニットを有していことから、慢性肝疾患の血小板におけるIntegrinβ3濃度の変動を検討した結果、健常者と比較して、慢性肝疾患では有意な高値をとり、血小板のIntegrinの表出の増強も一血中での増加する一因と考えられた。(4)細胞接着因子のなかで、integrinα_Lβ_2(LFA-1)をリガンドとするintercellularadhesion molecule-1(ICAM-1)およびintegrinα_4β_1(VLA-4)をリガンドとするvascularcell adhesion molecule-1(VCAM-1)をアルコール性肝障害で測定したところ、アルコール性肝炎における血清ICAM-1濃度はアルコール性肝線維症、肝硬変と比較して有意に増加していたが、血清VCAM-1濃度は、アルコール性肝炎で増加するものの、他の病型との間で差を認めなかった。肝の免疫組織学的検討でも、肝細胞膜および内皮細胞での発現はICAM-1のほうが強かった。これらの成績から、アルコール性肝炎の発症には、VCAM-1/VLA4系よりもICAM-1/LFA1系の関与の大きいことが示唆された。Fibronectin receptor(FNR)のβsubunitを,人胎盤よりPytela et alらの方法に従って精製し,この精製蛋白に対するモノクロ-ナル抗体を作成した.この抗体を用いて,以下の検討を行った.(1)正常人血清および肝硬変血清を,FNR抗体結合affinity columnで精製した後,SDSーPAGEにかけ,FNR抗体でWestern immunoblottingを行い,血清中にFNRのβsubunitに一致する95,000daltonsの位置に単一なバンドを認め,FNRが血清中に存在することを明らかにした.(2)antiーFNR抗体を用いたsandwich ELISAによるimmunoreactive FNRの測定法を開発し,各種肝疾患において測定した.その結果,血清FNR濃度は,血清PIIIP(procollagen III aminopeptide)と正の相関と示した.さらに組織学的変化との関係を検討すると,血清FNR濃度は,肝線維化,肝の変性・壊死,門脈域の細胞浸潤の程度,とくに肝線維化と有意な正相関を示した.(3)antiー

FNR抗体を用いて,慢性肝炎,肝硬変の肝生検組織を免疫染色とすると,FNRは肝細胞膜,線維化領域,伊東細胞に染色された.以上の成積より,血清FNR濃度の測定は,肝障害,特に肝線維化の指標として有用であることが明らかとなった.ヒト胎盤よりPytela et alの方法に従って作成したfibronectin receptor(FNR)とvitronectin receptor(VNR)のβサブユニットに対するモノクローナル抗体によるIntegrinβ1とIntegrinβ3のELISAによる測定系により、慢性肝疾患患者の血清中のそれぞれのLntegrin濃度を測定した。β1、β3IntegrinともにWestern blottingにより血清中に存在することを確認した。血清Integrinβ1は、肝線維化の程度と相関して増加し、免疫組織化学的には肝細胞膜、線維化領域および類洞壁細胞に強い染色性を認め、線維化マーカーとして有用であることを明らかにした(Hepatology14:244, 1991)。さらに血清FNRは血清アルブミン値、ヘパプラスチンテスト、ICGなど肝予備能を反映する臨床検査と有意な相関を示した。一方血清Integrinβ3濃度も肝の重症度と相関して増加したが、肝線維化とは相関せず、免疫組織学的にも、類洞内皮細胞と肝細胞膜に染色された(アルコール代謝と肝12:69-73,1992)。さらにFNRのαサブユニットであるα5に対する抗体CDw49eにより免疫染色すると、線維化領域には染色性を認めなかった。以上の成績から、慢性肝疾患における細胞接着因子リセプターであるIntegrinβ1とIntegrinβ3は重症度と相関して血中に増加するが、増加する機序は異なることが推察された。肝癌組織のIntegrinの局在を検討したところ、Intrgrinβ1は肝癌細胞膜に不均一に染色されたが、Integrinβ3は肝癌細胞膜のほかに血洞内皮細胞に強い染色性を認めた。
ヒト口蓋扁桃における上皮細胞間リンパ球の免疫学的意義:免疫電顕法および酵素抗原法による機能形態学的アプローチ

ヒト口蓋扁桃を覆う網状粘膜は、B細胞・形質細胞を中心とする単核球浸潤と毛細血管網の存在で特徴づけられた。形質細胞はIgG型が主体で主として粘膜の下半分に分布していた。粘膜上半部に多いB細胞には、bcl-2陽性、CD10・CD23陰性のmarginal zone型、slgD・CD5・CD24陽性のmantle zone型、CD10・DNA7陽性のgerminal center型、およびCD11b陽性、CD16陰性のB-1型の4種が観察された。CD5陽性B細胞の存在は、免疫電顕-重染色法により確認された。網状粘膜におけるT細胞としては、CD4陽性のT_H細胞が主体であった。少数ながら、CD56・TCRγδ陽性の胸腺外分化T細胞と思しき細胞の分布も確認された。B-1細胞や胸腺外分化T細胞は、発生学的に古く、自己反応性を示すことが知られている。これら細胞群の扁桃における機能的意義は今後の検討課題である。口蓋扁桃における網状上皮細胞間におけるB細胞分化に関しては、胸腺髄質との発生学的、形態的および機能的な類似性が注目された。酵素抗原法によるHemophilus influenzaeに対する特異抗体産生の観察に関しては、予想以上の困難が経験された。当初予定していた細菌DNAからのランダムな標識抗原作製法は、手技ならびに抗原の安定性からみて適切な方法ではなかった。そこで、すでにDNA塩基配列の報告されているH.influenzae由来蛋白(protein D、脂肪酸結合蛋白)をねらってMBP標識リコンビナント蛋白の作製を試みた。残念ながら、現在のところ、満足のゆく標識抗原は得られていない。その原因は、これら細菌蛋白にに対する特異抗体が準備できなかった点と、目的とする蛋白分子のどの部分が標識抗原として最適なのかの検討が不十分だった点にあった。今後も、酵素抗原法の第一歩である標識抗原作製法の確立を目指して一層の努力を重ねてゆきたい。われわれがこれまでに得た成果は次のごとくである。重層扁平上皮系に属す網状上皮間に分布するリンパ球系細胞はB細胞が主体であり、T細胞よりなる消化管円柱上皮の上皮細胞間リンパ球ときわめて対照的である。網状上皮基底部には多数の形質細胞が分布しており、免疫染色上、IgG型がIgA型、IgM型、IgD型より優勢である。上皮細胞間B細胞には、marginal zone型(bcl-2^+)、mantle zone型(CD5^+)、胚中心型細胞(CD10^+)に加えて、いわゆるB-1細胞とみなされるCD11b^+細胞が観察される。網状上皮間に散在するT細胞の多くは、CD4,TCRαβ陽性細胞であり、TCRγδ陽性細胞は少数である。CD4陽性helperT cellの優位性は、網状上皮内におけるB細胞分化に好都合であると考えられ、CD8優位の腸管上皮との大きな相違点をなしている。網状上皮は、電顕的に、広い細胞間隙における微絨毛形成、小型顆粒の存在が特徴的である。網状上皮は、免疫染色上、リゾチーム陽性であるが、sIgAによる局所免疫反応に重要な役割をはたすSC(secretory component)は陰性である。