hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
銅アセチリド分子の自己組織化を用いたナノワイヤー合成法の確立と応用展開

本年度は銅アセチリドナノワイヤー・ナノケーブルの電気伝導特性を活用した応用展開に向けた研究を行った。昨年度までに確立した銅アセチリド分子の自己組織的な性質を利用したナノワイヤー合成方法と真空中における熱アニーリングによる爆発性を活用したナノケーブルへの変換過程は、共に非常に簡便な手法であるため、材料としての性質を見出すことは実用化に向けて非常に重要である。熱変換した銅アセチリドナノケーブル粉末を圧縮成型しペレット状にしたものの電気伝導特性を測定したところ酸素分子の吸脱着により、伝導度が1桁以上も変化することを見出した。酸素分子の吸脱着は室温で進行しており、銅アセチリドナノケーブルが室温において酸素センサーとして働くことを意味する。室温における吸脱着過程は一般に物理吸着と考えられ、そのような弱い相互作用で電気伝導度を変化させる機構の解明を行った。電気伝導度の温度特性を詳細に調べることで、局在化したホールが可変領域ホッピングにより伝導していることが明らかとなり、電子スピン共鳴法を用いることで、酸素分子が局在化したホールと相互作用していることも判明した。つまり、ホッピング伝導であるため、弱い相互作用でもホッピング確率が大きく変化することができたといえる。ナノ物質の一般的な電気伝導であるホッピング伝導が、従来のバンド型伝導では不可能であった室温より低温での酸素センサーなど、新規な材料特性を見出せることを示すことができた。本年度は銅アセチリドナノワイヤーの合成方法の最適化を主に行なった。本研究課題の合成方法は、塩化銅のアンモニア水溶液にアセチレンガスを吹き付けるだけの非常に単純なものであるが、様々な反応条件で合成を行なうことにより、アセチレンの導入速度が非常に重要であることを見出した。アセチレンガスを通常の濃度および速度で反応溶液に導入するとアモルファス状の生成物しか得られないのに対して、1%程度に薄めたアセチレンガスを5mL/minと非常にゆっくりと導入すると銅アセチリドナノワイヤーを得ることができる。これは、銅アセチリド分子がナノワイヤーへと自己集合していく際に、十分な結晶成長時間が必要なためだと考えられる。本研究費は、これらの反応条件を試行錯誤する段階で、超音波洗浄器や真空デシケータ、ホットスターラー(加熱可能な攪拌器)などの小額備品(消耗品扱い)を購入するのに利用した。非常に簡便な方法でナノワイヤー構造物を得る条件を見出したので、分子構造総合討論会(東京都9月)および2005環太平洋国際化学会議(米国ホノルル12月)で口頭発表を行なった。旅費として本研究費を使用し、会議に参加・発表を行なった。これらの会議では様々な研究者から高評を頂き、また、様々な議論を行なうことで今後の課題や問題点を見出し、さらに共同研究等に発展していく可能性を感じたものであった。従って、会議での発表は非常に有意義なものであったと言える。本年度は銅アセチリドナノワイヤーの化学変換過程の最適化を主に行った。17年度の研究により塩化銅のアンモニア水溶液中にアセチレンガスを導入するだけで、銅アセチリド分子が自己組織的にナノワイヤー形状へと結晶成長し、非常に簡便な方法でナノワイヤーを得る方法論を確立している。しかし、銅アセチリド分子は爆発性を有する分子として古くから知られている。そのため、銅アセチリドナノワイヤーのままでは不安定であり応用展開も限られている。爆発させずにより安定な化合物へと化学変換させる条件を探ったところ、真空中で比較的低温である100°C前後の加熱により、銅アセチリドナノワイヤー中の銅元素と炭素元素の分離が起こることを見出した。自己組織化によって得られたナノワイヤーから化学変換をすることによって、銅ナノワイヤーをアモルファス炭素で被覆したナノサイズのケーブル状の物質(ナノケーブル)を得ることに成功した。電子顕微鏡による観測では、ナノケーブルの直径方向に、銅原子が8個程度しか並んでおらず、非常に細い金属ナノワイヤーの作成方法の確立である。一般的にこれほど細い金属ナノワイヤーは空気中で酸化されてしまうが、本ナノケーブルは空気中でも安定であり、アモルファス炭素の被覆が空気酸化を防いでいると考えられる。本研究は、Advanced Materials誌に掲載され、最も安価なナノワイヤー合成方法として紹介され、好評を得ている。

ナノ物質の一般的な電気伝導であるホッピング伝導が、従来のバンド型伝導では不可能であった室温より低温での酸素センサーなど、新規な材料特性を見出せることを示すことができた。
藻類細胞を利用した金属ナノ粒子の生成および放射光X線分析による粒子生成機構の解明

本研究では,藻類細胞を利用した有用金属の回収に資する知見を得ることを目的としている。特に藻類細胞内で生成される金属ナノ粒子の生成に着目し,放射光X線分析を用いて,その生成機構の解明を目指している。初年度では,国立環境研究所NIES collection(微生物系統保存施設)から単細胞藻類を入手して実験を実施した。単細胞藻類Pseudococcomyxa simplexおよびChlamydomonas reinhardtiiを用いて,金,銀,ニッケル,パラジウム,セレン等の添加実験を行い,細胞内においていずれも高濃度に蓄積されることを実証した。これらの元素を蓄積した藻類細胞を凍結乾燥し,加圧成型した試料について,X線吸収分光分析を行った。得られたX線吸収スペクトルを解析し,その化学形態を明らかにした。また電子顕微鏡で観察し,藻類細胞内で生成された金ナノ粒子の粒子サイズについて考察を行った。藻類が添加元素を取り込む際,添加濃度と添加時間が蓄積濃度に影響を与えるが,それ以外の環境条件によっても影響を受けることがわかった。これは予想していなかったことで,計画以上に進展しているといえる。環境条件を制御することで,さらなる知見が得られる可能性がある。細胞内に生成された金属ナノ粒子を詳細に観察するため,藻類の断面について電子顕微鏡で観察を行っていく。初年度は,蛍光X線分析装置の修理が発生したため,思わぬ支出となった。これに伴い,関連する実験を次年度に実施することにしたため,その分の予算を繰り越した。初年度は電子顕微鏡による観察を中心とした研究を推進した。
強磁力な新規ナノコンポジット型フェライト磁石の開発

磁性金属と鉄系酸化物(フェライト相)からなるナノコンポジット磁石を作製することを目的として,両相からなるナスケール複合組織を形成するための反応条件の最適化,ならびに得られたナノコンポジット試料の磁気特性評価を実施した。特に,磁気特性の向上を念頭に,固相ならびに液相プロセスにおいてCo添加の影響について検討した。1)固相プロセスによるFe/Fe3O4ナノコンポジットの作製と磁気特性:H28年度の研究成果より明らかとなった好適条件に基づきFeO単相を作製・熱分解することにより,Fe/Fe3O4ナノコンポジットの形成能について系統的に調べた。その結果,450500°C・10 hの熱処理により,ほぼ完全にFe/Fe3O4に分解することが判明した。得られた試料は,室温においてFe3O4単相のみの場合よりも大きな飽和磁化を示し,高飽和磁化を有するFeの寄与が確認された。また,Co添加の影響についても系統的に調べた結果,Fe-Co-O系酸化物単相の形成およびその熱分解が阻害されるものの,期待された磁気特性の向上(飽和磁化および保磁力の増大)が確認された。2)液相プロセスによるFe/Fe3O4ナノコンポジットの作製と磁気特性:約40 nmのFeOナノ粒子を熱分解してFe/Fe3O4ナノコンポジット粒子を作製し,その熱分解挙動と磁気特性について調べた。その結果,液相プロセスにより作製したFeOナノ粒子は,固相プロセスにより作製したFeO粉末よりも速やかに分解反応が生じることが判明した。また,本件についてもCo添加の手法を考案し,その有効性について確認した。得られたCo添加ナノコンポジット試料において、磁気特性の向上(保磁力の増大)が確認された。H29年度は,固相・液相両プロセスにおいてFe/Fe3O4ナノコンポジット形成のための反応条件最適化ならびに得られたナノコンポジット試料の磁気特性について系統的に調べた。また,H28年度に実施した予備実験結果に基づき,Co添加の影響について系統的に調査し,Fe-Co-O系酸化物の形成条件ならびに熱分解条件の最適化に取り組むとともに,磁気特性について評価した。その結果,Co添加の有無によるFe-Co-O系酸化物の形成能ならびに熱分解挙動の相違が明らかになった。また,得られたナノコンポジット試料において磁性金属相(FeあるいはFe-Co)の寄与による磁気特性の向上(飽和磁化および保磁力の増大)が確認され,ナノコンポジット磁石としての基礎特性が確認できた。H29年度の研究成果よりCo添加が磁気特性の向上に有効であることが確認されたことから,引き続きCo添加の影響について詳細に調べる予定である。特に,Co添加量の増大にともない単相のFe-Co-O系酸化物が作製し難くなるとともに,その熱分解も阻害されという問題が生じていることから,第3元素の添加等による組織制御によりそれらの改善を試みる。また,TEM・SEMによるラメラ相の組織観察ならびにX線回折によるScherrer解析により,ラメラ組織の詳細について調査する。なお,固相・液相両プロセスの違いも次第に明らかとなってきており,両者の実験により得られた知見を総合して,ナノコンポジット磁石の作製プロセスおよび磁気特性の改善を図りたい。磁性金属と鉄系酸化物(フェライト相)からなるナノコンポジット磁石を作製することを目的として,両相からなるナスケール複合組織を形成するための反応条件最適化に取り組んだ。固相あるいは液相プロセスを用いて,高温相としてのみ存在するFeO相を形成するための反応条件について検討した。また,得られたFeO相を共析反応により相分解して,フェライト相と磁性金属相(Fe)からなるラメラ状の複合組織を形成するための基本条件を抽出した。1)固相プロセスによるFeO粉末の作製:FeO相が形成される組成領域は極めて狭い(800°Cで1.5 at%Fe程度)。そこで,FeO単相を得るための条件について検討し,仕込み組成比Fe:O=49:51,焼成条件600800°C・10 hで作製することにより,ほぼ単相のFeOを得ることができた。また,FeO相の熱分解がFeOを作製する際の焼成温度に大きく依存するという,当初予期していない結果も得られた。本件は,簡便にラメラ複合組織を形成する上で有用と考えられる。2)液相プロセスによるFeOナノ粒子の作製:個々の粒子内にラメラ組織を形成したいため,作製するFeOナノ粒子の粒子径を100 nm程度まで拡大したい。出発原料の種類,ならびに界面活性剤であり且つ錯形成剤でもあるオレイン酸とオレイルアミンの混合体の添加量ならびに添加方法の影響について検討した結果,50 nmを超えるFeOナノ粒子を作製することができた。(3)ラメラ複合組織形成のための基本条件の抽出:固相・液相両プロセスにより作製したFeO相について,その熱分解条件(加熱温度・時間)について検討した。その結果,400500°Cの範囲において分解が促進されることが判明した。本年度は,固相・液相両プロセスにおいてFeO相形成のための反応条件最適化を行うとともに,それらを熱分解してラメラ複合組織を得るための基本条件を抽出する実験を実施した。その結果,当初計画したFeO単相を得るための条件(試料粉末の混合組成,加熱温度・時間,冷却方法等),ならびに得られたFeO相の熱分解条件(加熱温度・時間)についての概要を得ることができた。

磁性金属と鉄系酸化物(フェライト相)からなるナノコンポジット磁石を作製することを目的として,両相からなるナスケール複合組織を形成するための反応条件の最適化,ならびに得られたナノコンポジット試料の磁気特性評価を実施した。特に,磁気特性の向上を念頭に,固相ならびに液相プロセスにおいてCo添加の影響について検討した。1)固相プロセスによるFe/Fe3O4ナノコンポジットの作製と磁気特性:H28年度の研究成果より明らかとなった好適条件に基づきFeO単相を作製・熱分解することにより,Fe/Fe3O4ナノコンポジットの形成能について系統的に調べた。その結果,450500°C・10 hの熱処理により,ほぼ完全にFe/Fe3O4に分解することが判明した。得られた試料は,室温においてFe3O4単相のみの場合よりも大きな飽和磁化を示し,高飽和磁化を有するFeの寄与が確認された。また,Co添加の影響についても系統的に調べた結果,Fe-Co-O系酸化物単相の形成およびその熱分解が阻害されるものの,期待された磁気特性の向上(飽和磁化および保磁力の増大)が確認された。2)液相プロセスによるFe/Fe3O4ナノコンポジットの作製と磁気特性:約40 nmのFeOナノ粒子を熱分解してFe/Fe3O4ナノコンポジット粒子を作製し,その熱分解挙動と磁気特性について調べた。その結果,液相プロセスにより作製したFeOナノ粒子は,固相プロセスにより作製したFeO粉末よりも速やかに分解反応が生じることが判明した。また,本件についてもCo添加の手法を考案し,その有効性について確認した。得られたCo添加ナノコンポジット試料において、磁気特性の向上(保磁力の増大)が確認された。H29年度は,固相・液相両プロセスにおいてFe/Fe3O4ナノコンポジット形成のための反応条件最適化ならびに得られたナノコンポジット試料の磁気特性について系統的に調べた。また,H28年度に実施した予備実験結果に基づき,Co添加の影響について系統的に調査し,Fe-Co-O系酸化物の形成条件ならびに熱分解条件の最適化に取り組むとともに,磁気特性について評価した。その結果,Co添加の有無によるFe-Co-O系酸化物の形成能ならびに熱分解挙動の相違が明らかになった。また,得られたナノコンポジット試料において磁性金属相(FeあるいはFe-Co)の寄与による磁気特性の向上(飽和磁化および保磁力の増大)が確認され,ナノコンポジット磁石としての基礎特性が確認できた。当初の計画では,最初の2年間においてはFe-O系酸化物に注力してFeOの作製・熱分解挙動の概要を明らかにした上で,最終年度にそこで得られた知見をCo添加したFe-Co-O系酸化物に援用して磁気特性向上について検討する予定であった。しかし,H28年度にCo添加した場合の予備実験を行ったところ,Fe-O系酸化物の場合と比べて熱分解挙動が大きく変化するため,Fe-O系酸化物における結果が直接的に役立つとは限らないことが判明した。また,Co添加により,大きな磁気異方性を有するCoフェライトの形成にともなう磁気特性向上が確認された。そこで,磁気特性の優れたFe-Co-O系酸化物の実験に効果的に対処するために,H29年度とH30年度(最終年度)の研究計画を入れ替え,最終年度に予定していたFe-Co-O系酸化物の実験を前倒しで進めることを計画している。Fe-Co-O系酸化物の形成条件
脳出血病態形成における好中球ーマクロファージ／ミクログリア表現型連関

本研究は、脳出血発症後に進行する内包領域の軸索路損傷・修復過程を大きく左右すると推定される浸潤好中球の病態生理学的役割に焦点を当て、内包出血後に脳組織内で産生される好中球走化因子の役割の解明や、好中球によって動員されるミクログリア/マクロファージ(MG/MΦ)の病態への関与の解析、MG/MΦによる浸潤好中球の制御に関する解析に加え、浸潤好中球およびMG/MΦのフェノタイプの制御が内包出血の病理・病態に及ぼす影響の解析を行い、好中球関連事象を標的とした新たな脳出血薬物治療戦略の提唱を目指すものである。本年度は、好中球様に分化させたHL60細胞と培養大脳皮質・線条体組織切片との相互作用を解析する実験系において、血中プロテアーゼのトロンビンを作用させて疑似的な脳出血後の脳内環境を創出した際に生じる好中球フェノタイプのシフト(炎症性サイトカインIL-1β産生の増強)が、Toll様受容体4の遮断薬によって著明に抑制されることを見出した。すなわち、脳組織由来のDAMPsが浸潤好中球の機能に影響を与えることが示唆された。またその一方で、培養脳組織切片においてトロンビンによって誘発される大脳皮質領域の細胞死の程度は、好中球の存在量に依存して二相性に変動する(少量で増強され、多量では抑制される)ことを見出し、好中球由来の複数の可溶性因子が脳組織傷害の程度を規定していることを示した。マウスin vivo脳出血病態モデルを用いた検討では、核内受容体Nurr1 (NR4A2)のリガンドであるアモジアキンが血腫周縁部に集積するMG/MΦの炎症性フェノタイプを著明に抑制するとともに、脳出血後の運動機能障害を有意に改善することを明らかにした。この結果は、MG/MΦのフェノタイプの制御が脳出血治療における有望な戦略であるという仮説をさらに支持するものである。前年度までに構築した独自の好中球ー脳組織間相互作用解析系を用いることにより、可溶性因子を介する脳組織から好中球への情報伝達、ならびに好中球から脳組織への情報伝達によって脳出血病態時に相互の機能制御が生じていることを捉え、その機序を解析する研究を着実に進めることができている。またin vivo脳出血病態モデルにおいては、MG/MΦフェノタイプを制御する要因として、特定の遺伝子群の発現に直接影響を与えるリガンド依存性転写因子であるNurr1に焦点を当て、新たな治療標的としての可能性を明らかにした。今年度得られたこれらの知見は、いずれも詳細についてさらに検討すべき課題を提示するものであるが、一方でより大きな展開へとつながる可能性を秘めている。これらのことから、今後も順調に研究成果を挙げられるものと考えている。好中球-MG/MΦフェノタイプ連関を標的とした内包出血病態への治療介入法について検証する。1) MG/MΦの組織保護性(M2型)フェノタイプへの極性化作用が報告されている薬物(TLR2作動薬、CCR2遮断薬等)の処置、およびMG/MΦの貪食能を強化するTREM2遺伝子の導入下での内包出血病態について、好中球浸潤の程度とフェノタイプ、組織内MG/MΦフェノタイプ、内包線維束の傷害および運動機能障害の程度に対する効果を中心に解析する。2) TGFβが好中球の組織保護性(N2型)への極性化を促すこと、G-CSFが好中球の組織保護性を増強することを踏まえ、内包出血モデルにおける浸潤好中球フェノタイプ、MG/MΦの集積とフェノタイプ、軸索路の傷害・修復、および運動機能障害に対するTGFβおよびG-CSFの効果(脳内投与あるいはベクター導入による脳内強制発現)を調べる。3)上記2)の検討では、TGFβやG-CSFが好中球以外の細胞に及ぼす効果の影響を排除できない。そこで、in vitro実験系を用いて好中球フェノタイプ極性化の制御が出血性脳組織傷害に与える影響について評価する。内包出血を誘導した脳組織から、特異的マーカーの発現に基づいて各フェノタイプの好中球を分離し、これを血中プロテアーゼの処置と併せて培養脳組織切片に適用する。好中球無処置と比較してN1型/N2型好中球を適用した時の脳組織傷害の程度およびMGフェノタイプに対する影響を評価する。また、同じく培養脳組織切片を用いて、好中球有り/無しの条件下で血中プロテアーゼ誘発性の軸索路傷害に対するTGFβおよびG-CSFの効果を検討し、病理形成における好中球フェノタイプの寄与を評価する。本研究は、脳出血発症後に進行する内包領域の軸索路損傷・修復過程を大きく左右すると推定される浸潤好中球の病態生理学的役割に焦点を当て、内包出血後に脳組織内で産生される好中球走化因子の役割の解明や、好中球によって動員されるミクログリア/マクロファージ(MG/MΦ)の病態への関与の解析、MG/MΦによる浸潤好中球の制御に関する解析に加え、浸潤好中球およびMG/MΦのフェノタイプの制御が内包出血の病理・病態に及ぼす影響の解析を行い、好中球関連事象を標的とした新たな脳出血薬物治療戦略の提唱を目指す。本年度はまず、内包出血によって生じる軸索損傷の病理形成プロファイルを解析し、軸索の構造的破綻に先行して軸索輸送機能の障害が生じること、および軸索輸送機能障害が内包出血発症最初期の感覚運動機能の障害と密接に関連していることを明らかにした。

次に、好中球走化因子の一つであるロイコトリエンB4 (LTB4)が内包出血病態形成に果たす役割を詳細に解析した。内包出血誘発後のマウス脳内ではLTB4含量およびLTB4合成に関わる5-リポキシゲナーゼ(5-LOX)の発現量が増加しており、内包出血誘発直後に5-LOX阻害薬を投与すると、好中球の脳内浸潤およびマウスの運動機能障害が抑制された。またLTB4受容体であるBLT1を欠損したマウスでは内包出血後の好中球浸潤および運動機能障害が野生型マウスと比較して軽度であった。さらに、BLT遮断薬は内包出血誘発3時間後からの投与で好中球浸潤、MG/MΦ活性化、軸索損傷および運動機能障害を著明に抑制した。これらの結果から、LTB4の介在する脳内への好中球浸潤が脳出血病態形成において重要な役割を持つことが示された。脳出血に伴う軸索損傷の病理の解析、および好中球走化因子LTB4の脳出血病態形成への関与の解析を進め、MG/MΦ活性化と軸索損傷を伴う出血性脳卒中の病態における好中球の重要な役割を示唆する多角的な実験的証拠を得た。また、MG細胞株であるBV-2細胞を用いた基礎検討も並行して進め、MG活性化を制御できるいくつかの薬理学的ツールを見出しており、今後も予定している研究項目を滞りなく実施できるものと考えている。本研究は、脳出血発症後に進行する内包領域の軸索路損傷・修復過程を大きく左右すると推定される浸潤好中球の病態生理学的役割に焦点を当て、内包出血後に脳組織内で産生される好中球走化因子の役割の解明や、好中球によって動員されるミクログリア/マクロファージ(MG/MΦ)の病態への関与の解析、MG/MΦによる浸潤好中球の制御に関する解析に加え、浸潤好中球およびMG/MΦのフェノタイプの制御が内包出血の病理・病態に及ぼす影響の解析を行い、好中球関連事象を標的とした新たな脳出血薬物治療戦略の提唱を目指す。本年度はまず、内包出血と比較検証することを目的として、高齢化と共に症例数の増加している皮質下出血の病態モデル解析と薬物による治療効果の検証を進めた。マウス大脳皮質頭頂領域の感覚野と運動野の境界付近にコラゲナーゼを微量投与して皮質下出血を誘発するモデルを作成し、当該モデルにおいて著明な運動機能障害が誘発されることを示した。また出血誘発後からニコチンを連日投与することにより運動機能障害が軽減されるとともに損傷領域の神経細胞死やグリア細胞の活性化が抑制されたが、この時好中球の浸潤にはニコチンの効果が認められず、内包出血と皮質下出血とでは好中球依存性の脳内炎症応答の病態形成への寄与が異なることが示唆された。一方で、好中球様に分化させたHL60細胞と培養大脳皮質・線条体組織切片との相互作用を解析する実験系を構築し、血中プロテアーゼのトロンビンを作用させた際の病理・生化学的変化を解析したところ、脳組織の共存下ではHL60細胞からの炎症性サイトカイン(IL-1β)産生が増強し、逆に抗炎症性サイトカイン(IL-10)産生が抑制されることが判明した。したがって、出血性の傷害を受けた脳組織由来の何らかの可溶性因子が好中球のフェノタイプを制御する可能性が示された。皮質下出血の病態モデル作出に成功し、特に好中球性炎症応答に関して異なる脳領域(内包を含む大脳基底核と大脳皮質)の脳出血病態の間の相違を示唆する重要な知見を見出し、論文発表を行った。また、好中球ー脳組織間の相互作用を解析するための実験系の構築が着実に進んでおり、外的要因による好中球フェノタイプの変換がin vitroで簡便に解析できる状況となっている。
アレル優位性を有するクロマチン高次構造解析による子宮内膜症の分子機序解明

子宮内膜症におけるアレルに伴う遺伝子発現変化を検討している。遺伝子領域に存在していないSNPは、エンハンサー活性に影響を与える。アレルによるエンハンサー活性の違いをクロマチン3次元構造などで示すことができた。in vivo測定としてエンハンサー候補領域をGFP遺伝子の上流にクローニングし、ゼブラフィッシュ受精卵にインジェクションし、エンハンサー活性をGFP活性として検出した。疾患に関連するSNP解析からアレルに伴うエンハンサー活性の違い、in vivoでのエンハンサー活性を示すことができ、疾患遺伝子研究に大きく貢献することとなった。本研究では子宮内膜由来細胞、組織、および子宮内膜症組織を用い、GWASヒットした遺伝子座について機能SNPを同定し高次クロマチン構造解析から転写調節ネットワークへの機能的関与を網羅する。子宮内膜症DNA検体800例および対照2,000例を有しており、必要に応じ遺伝子タイピングを行う。またすべての症例で詳細な臨床症状をファイル化できている。現時点で正所性子宮内膜組織は23例収集しており、アレル優位的遺伝子発現解析に供与する。子宮内膜症組織は腹膜、卵巣から21例得ている。連携研究者の新潟大学、日本医科大学の協力により検体は随時増やす予定である。子宮内膜由来癌細胞株は4種有している。機能SNPの同定に伴いヘテロ接合性を有する細胞をアレル優位的クロマチン相互作用解析に用いる。初年度は子宮内膜症GWASで同定されたSNPから機能的なSNPを特定し、その分子機能変化について明らかにすることであった。9p21領域のGWASヒットからDNase hypersensitive領域に存在するSNP (rs17761446)をリストアップし、候補SNPとした。そしてchromatinconformation capture (3C)法によりANRILプロモーター領域とループ構造を形成すること、そして次世代シーケンサー解析によりアレルにより結合度が異なることを示すことができた。さらにはTCF7L2など転写因子結合もアレルにより差があることを示した。その成果をまとめることができPLoSGenet (2016)に報告した。ゲノムワイド関連解析(GWAS)により複数の子宮内膜症関連一塩基多型(SNP)が報告されている。報告されたSNPは非転写領域に存在しているため近隣の遺伝子発現を調節することで子宮内膜症に関連すると推測される。GWASによって報告されるSNPはマーカーSNPに過ぎず、そのSNPと強い連鎖不平衡にある他のSNPが真の疾患リスクSNPである可能性がある。本研究では真の子宮内膜症リスクSNPの同定を行い、その分子メカニズムを明らかとすることを目的とした。子宮内膜症関連領域としてGWASで報告されているWNT4遺伝子周辺領域に含まれる2つのSNPを基準とし、それらと強い連鎖不平衡にあり、かつオープンクロマチン領域の指標とされるDNase I高感受性部位に存在している8つのSNPを機能的SNPの候補として選択した。これらのうち、rs3820282はプロゲステロンレセプター(PRGR)とエストロゲンレセプターβ(ESR2)の認識モチーフ配列上に存在していることを明らかにした。また、バイオインフォマティクス解析の結果、プロテクティブアリルはPRGRに高い結合親和性を示し、リスクアリルはESR2に高い結合親和性を示した。このことから、当該SNPはアレルに応じて、プロゲステロンあるいはエストロゲンに選択的に応答し、WNT4遺伝子の転写制御に寄与する『ホルモン作用スイッチ』として働いていることが推察される。この仮説を細胞内で実証するため、rs3820282をヘテロに持つヒト子宮体癌細胞株(HEC265)を用いて機能解析を行った。rs3820282部位は近傍遺伝子であるWNT4プロモーターに対してクロマチン・インタラクションを形成することを確認した。さらに、ホルモン条件下でクロマチン・インタラクションおよびWNT4遺伝子発現のアレル特異性について検討を行った。GWAS hitの9p21領域のSNPについては我々が独自に開発したallele-specific chromosome conformation capture(AS3C)法によりリスクアレルではANRILプロモーターとの相互作用が弱くなり、ANRIL転写に影響を及ぼすことを明らかにし論文発表した(Nakaoka et al. PLOS Genet 2016)。今回はさらにWNT4領域において、エストロゲン、プロゲステロンのホルモン作用スイッチが働きWNT4転写量を変化させることをAS3C法で示すことができた。子宮内膜症はエストロゲン依存性の炎症性疾患である。女性の10%程度が罹患しており、quality of lifeを著しく損なっている。しかしながらその治療法は確定していない。我々はゲノム全域アソシエーション・スタディの結果から得られたSNPの機能解析を目指し、アレルに伴う遺伝子発現変化を検討している。対象としたのは9p21で得られたシグナルで、エンハンサー活性に影響を与えると予想され、ターゲットとなる遺伝子はnon-coding RNAのANRILである。すでにアレルに伴いANRIL発現が変化することを示すことができている(PLOS Genet 2016)。これらはアレルによりエンハンサー活性の違いが認められることをクロマチン三次元構造などで示したものである。しかしながらin vitro studyであり、in vivoでのエンハンサー活性は不明であった。そこで、エンハンサー活性検討システムをゼブラフィッシュで確立した。このシステムでは、SNPを含むエンハンサー候補領域をGFP遺伝子の上流にクローニングし、これをゼブラフィッシュの受精卵にマイクロインジェクションすることで、in vivoでのエンハンサー活性をGFPシグナルとして検出可能にした。

このように疾患に関連するSNP解析からアレルに伴うエンハンサー活性の違い、そしてin vivoでのエンハンサー活性を示すことができ、ありふれた疾患の疾患遺伝子研究に大きく貢献することとなった。子宮内膜症におけるアレルに伴う遺伝子発現変化を検討している。遺伝子領域に存在していないSNPは、エンハンサー活性に影響を与える。アレルによるエンハンサー活性の違いをクロマチン3次元構造などで示すことができた。in vivo測定としてエンハンサー候補領域をGFP遺伝子の上流にクローニングし、ゼブラフィッシュ受精卵にインジェクションし、エンハンサー活性をGFP活性として検出した。疾患に関連するSNP解析からアレルに伴うエンハンサー活性の違い、in vivoでのエンハンサー活性を示すことができ、疾患遺伝子研究に大きく貢献することとなった。子宮内膜症GWASではいくつかの領域でアソシエーションが検出されている。それらの遺伝子座について前年度と同様の解析を行い、機能SNP同定とアレル特異的な転写調節について検討する。さらには、4C法などを用い、複数の領域でのシスおよびトランスのクロマチン構造の相互作用について検討する。このような検討から子宮内膜症の遺伝要因の機能的関与の全貌が明らかになるであろう。子宮内膜症のGWASによりいくつかの遺伝要因が報告され、集団によっても異なることが示されている。この結果は環境要因の関与が強いことを再確認させる。これまでの手法により関連SNPの機能的関与を明らかにし、遺伝要因としての全貌を明らかにするが、同時に環境要因との相互作用解析も始めたい。疫学的調査により、経口避妊薬を服用している人、経産婦では子宮内膜症の罹患率が低いことが知られている。このような環境要因と遺伝要因との相互作用を明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。ゲノム医科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
友好的企業買収交渉における取締役の裁量に関する責任規範の比較法的考察

本研究は、友好的買収において買収会社との交渉にあたる取締役の責任にかかる基準について、デラウェア州における議論を元に考察するものである。本研究によって、近年のデラウェア州裁判例が、強圧を受けていない株主の多数が、十分な情報開示に基づいて当該合併を承認した場合には、取締役の判断を尊重する傾向にあることが明らかになった。その背景には、デラウェア州におけるM&A関連訴訟の増加があり、この点でわが国とは状況が異なる。しかし、日本の裁判例にも同様の視点に基づく判断が見られており、米国の議論との結節点は見いだすことができる。本研究は、日米の比較法的考察に基づいて、友好的企業買収の交渉に関わる企業経営者の裁量の範囲と負うべき責任の内容を明らかにし、わが国において望ましい規律のあり方を見出そうとするものである。特に買収交渉における対象会社取締役の判断に対し、裁判所がどのような視点に基づいて審査を行うべきか、また合併契約等における取引保護条項の法的評価をどのように行い、合併等の差止めの可否や買収対象会社の取締役の責任について判断されるべきかを検討の対象とする。本年度は、特にデラウェア州を中心とし、友好的買収に関する米国裁判例の近年の動向を確認することにより、上記の論点に関する米国裁判例の姿勢を把握することを主な目的とした。とりわけ、1)米国では合併契約等の成立過程や契約条項について、どのような視点から訴訟が展開されているか、2)近年の裁判例では、買収対象会社の取締役の裁量をどのように理解する傾向が見られるかの二点を中心的に検討した。検討の結果としては、まず、取締役の判断に対し裁判所が積極的に審査を行う姿勢が見られていた従来の議論状況に変化が見られ、デラウェア州最高裁判所も友好的買収に関する取締役の裁量の範囲を広く認める姿勢を示していることが確認された。また、このような傾向から、裁判所は取締役が行った交渉の内容を積極的に審査することよりも、特別委員会の独立性や交渉権限を阻害する事由がないことや、株主総会に対して十分な情報開示がなされていることが重視されている状況が明らかになった。以上の裁判例の動向が学説・実務においてどのように評価されているかは、次年度の研究において分析する予定である。本年度は、デラウェア州を中心とした近年の米国裁判例の検討を通じて、友好的買収の交渉や契約締結に関する買収対象会社の取締役の判断について、裁判所がとる姿勢や審査基準について検討と整理を試みた。この作業を通じて、わが国の買収に関する取締役の判断について、裁判所が積極的にその合理性などの審査を行うべきかを検討するにあたり、重要な示唆を得た。また本年度は、友好的買収の場面における表明保証保険の意義をどのように理解するかという新たな問題意識を得た。この点は次年度の研究課題とすることとし、本年度はその前提となる保険法の知識の習得にもつとめた。表明保証保険については、当初想定していなかった論点ではあるが、申請時より新たな論点の把握も初年度の達成目標としており、概ね順調に研究を進められていると考える。本研究は、日米の比較方的考察に基づいて、友好的企業買収の交渉に関わる経営者の裁量の範囲と負うべき責任の内容を明らかにし、わが国において望ましい規律のあり方を見出そうとするものである。特に買収交渉における対象会社取締役の行動や判断について、裁判所がどのような視点に基づいて審査を行うべきか、また合併契約等における取引保護条項の法的評価をどのように行い、合併等の差止めの可否や対象会社取締役の義務違反の有無の判断を行うべきかを検討対象とする。平成28年度は、前年度に引き続き、デラウェア州を中心とした米国の裁判例の動向について調査・検討を行った。友好的買収に関しては、Omnicare事件においてデラウェア州最高裁が経営判断原則よりも厳格な審査基準を用いて取締役の信認義務違反の有無を判断する旨を下しており、この判示は現在でも有効性を保っている。しかし近年は特にRevlon基準の適用事例において、敵対的買収の場合よりも取締役の裁量を広く認める傾向が見られていたところ、デラウェア州最高裁もCorwin事件において意思決定過程の適切さを示すことができれば、取締役の判断が尊重されうる旨を示した。同事件判決については、平成28年4月に神戸大学商事法研究会において報告を行い、参加者との議論を通じて有益な示唆を得ることができた。この裁判所の姿勢の変化が何を意味するのか、またわが国にどのような示唆をもたらすのかは本研究の最終年度における重要な検討課題である。本年度は、友好的買収におけるRevlon基準の用い方についてデラウェア州裁判例の姿勢が変化していることを確認した。この点は研究開始前からの大きな関心事であったところ、研究期間中に最高裁による判断を確認できたことで、裁判所の姿勢について一定の結論を得ることができた。他方、当初の研究計画では、取引保護条項の種類ごとに裁判例を整理する予定であり、研究期間中にも新たな取引保護条項に関する裁判例が現れることを想定していた。しかし、種類ごとの議論に入る以前に、上記のような変化が起こったため、議論の中心が審査基準の適用方法に移ることとなった。本研究においても、そもそも友好的買収に関する取締役の裁量が広く認められるということになれば、取引保護条項を種類別に検討することの意義は大きく減じられるため、よりわが国への示唆を得られるよう、当初の研究計画を修正することを検討している。本研究は、友好的企業買収に関する交渉過程や締結した契約の内容等について、買収対象会社の取締役がどのような基準のもとに行動すべきかを、米国の裁判例の状況を踏まえて考察するものである。

平成29年度は、まず例年通り神戸大学商事法研究会において、アメリカの判例報告を行った(In re Saba Software, Inc. Stockholder Litigation, No. CV 10697-VCS (Del. Ch.2017))。この裁判例は、友好的買収における対象会社取締役に対する損害賠償請求訴訟において、どのような審査枠組みが発展しつつあるかを示すものであり、報告準備を通じて最新の議論状況に関する情報収集を行い、研究会では多くの有益な示唆を得た。また、平成28年度に報告した判例研究(合併に関する取締役の責任追及訴訟における審査基準の決定[Corwin v. KKR Financial Holdings LLC, 125 A.3d 304 (Del. 2015)])を旬刊商事法務2159号で公表した。そして、平成28年度から平成29年度にかけては、日本法との比較検討を行う必要もあったことから、関西学院大学商法研究会で判例報告を行い、その評釈を同大学の紀要である「法と政治」68巻3号に寄稿した(勧告的決議に対する無効確認の訴え)。さらに、研究の最終年度として、成果物である論文の執筆に多くの時間を費やした。当該論文については、関西企業法研究会平成29年度例会において研究報告を行い、大変有益な示唆を得た。なお成果物となる論文(買収対象会社取締役に対する責任追及訴訟におけるデラウェア州の判断枠組み: Corwin事件最高裁判決を中心に)は、平成30年3月に発行された大阪府立大学経済研究63巻1=2=3=4号で連載を開始している。本研究は、友好的買収において買収会社との交渉にあたる取締役の責任にかかる基準について、デラウェア州における議論を元に考察するものである。本研究によって、近年のデラウェア州裁判例が、強圧を受けていない株主の多数が、十分な情報開示に基づいて当該合併を承認した場合には、取締役の判断を尊重する傾向にあることが明らかになった。その背景には、デラウェア州におけるM&A関連訴訟の増加があり、この点でわが国とは状況が異なる。しかし、日本の裁判例にも同様の視点に基づく判断が見られており、米国の議論との結節点は見いだすことができる。平成28年度は、前年度に引き続き米国法に関する研究を中心とし、さらに米国法研究の総括を行う。ここで行う作業は、特に取引保護条項の類型化と、合併契約等にそれらの条項を導入した取締役の判断に対する審査基準の適用関係を整理することである。取引保護条項の中には、取締役の行動を制約するもの、会社の行動を制約するもの、株主の行動を制約するものなど様々なものがあり、条項の種類によってその強弱も変わってくる。さらに、複数の取引保護条項が同じ契約に盛り込まれることも珍しくないことから、裁判所がどのような事実関係に着目し、条項の種類によってどのように対応を変化させているかを整理する。平成29年度は本研究の最終年度であることから、これまでの米国法研究がわが国にあたえる示唆を整理し、研究成果として公表するための作業を行う。成果物となる論文の執筆が中心的な作業となるが、公表に先立って各研究会における報告や議論を通じて研鑽に努める。
後眼部疾患の革新的核酸医薬療法を実現する点眼微粒子DDS製剤の開発

本研究では、眼内注射を不要とし点眼により後眼部疾患治療が可能な革新的な核酸医薬微粒子DDS製剤を開発することを目的とした。まず、核酸医薬に近い分子量や物性を有するモデル化合物をリポソーム内部へ封入し、後眼部治療の有用性を評価した。その結果、リポソームを利用することで網膜への薬物送達率が向上することを明らかにした。また、高分子ナノ粒子を用いた場合でもモデル薬物を後眼部へ送達できることを見出した。ナノ粒子に対し機能性ポリマーによる表面修飾を施すことで、後眼部への薬物送達能が向上することを見出した。siRNAを始めとする核酸医薬は、配列特異的にターゲット遺伝子の発現を制御できるため、薬物治療が困難な難治性疾患に対する切り札と考えられている。この治療の具現化には、細胞内へ核酸医薬を的確に導入する薬物送達システム(DDS)が必要不可欠である。本研究は、近年大きな期待を集めている核酸医療を具現化し、眼科領域のアンメットメディカルニーズに応える革新的な実用製剤開発に繋げることを目的として、核酸送達用微粒子DDS点眼製剤の設計基盤を構築する。我々はこれまでに低分子医薬を封入したリポソーム点眼製剤による網膜疾患治療に関する研究を行った実績がある。そこで今年度は、核酸医薬に近い分子量や物性を有するモデル化合物をリポソーム内部へ封入し、後眼部薬物治療の有用性を評価した。その結果、水溶性高分子の場合でもリポソームを利用することで網膜への薬物送達率が向上することを明らかにした。また、生分解性高分子ナノ粒子(PLGAナノ粒子)を点眼用薬物キャリアとして用いた場合でもモデル薬物を後眼部へ送達できることを見出し、論文として報告した。PLGAナノ粒子点眼製剤はリポソームの場合と同様の経路で網膜付近まで到達すると考えている。リポソームやPLGAナノ粒子に対し機能性ポリマーを用いて表面修飾を施すことで、後眼部への薬物送達能が向上することも見出している。このように後眼部送達には微粒子への表面修飾が有効であるが、わずかな粒子物性の変化が薬理効果に大きな影響を及ぼすため、極めて精密な粒子設計の確立が必要となる。そこで現在、微粒子点眼製剤の高機能化や最適化などを行うために、マイクロ流体場における新規ナノ粒子合成法に関する研究を行っている。当初の予定通り研究は進展している。マイクロ流体場における微粒子合成の最適化を行うとともに、実際に動物を用いたin vivoでの研究を中心に、点眼DDS微粒子製剤の機能評価及び動態特性を明らかにする。製剤学一部の実験を次年度に行うことにしたため。主に実験用の物品費として使用する予定である。
リガンド導入リン脂質を用いた幹細胞の表面修飾による炎症部位選択的送達法の開発

本研究では、炎症部位認識リガンドを導入したPEG脂質をヒト間葉系幹細胞(hMSC)表面に修飾することでhMSCの炎症組織への接着を促すことを目指している。今年度はリガンド修飾の効果を評価するため、1流れ場におけるhMSCの接着能評価法の確立、2PEG鎖分子量がhMSCの接着能におよぼす影響の検討、3ペプチド導入PEG脂質修飾hMSCの接着能評価に取り組んだ。1実際の血管内に近い流れ場においてhMSCの接着能を評価するため、底部にヒト肝類洞血管内皮細胞(hLShE)を接着させたフローチャンバー内に一定流速で蛍光標識したhMSCを流し、hLSME上を移動するhMSCの平均移動速度と移動速度の経時的変化から接着能を評価する方法を確立した。2昨年度の研究から、高分子量PEG鎖を有するPEG脂質を修飾すると、PEG鎖分子量および修飾量の増大に伴ってhMSCの接着能が低下することが明らかとなった。そこで、2,6,12,24のEG unit(分子量: 88,264,528,1056)をもつ短鎖PEG脂質を合成し、修飾量と共培養後の接着能の相関を検証し、EG2量体をもつPEG脂質は修飾量が増大しても、接着能が低下しないことを明らかにした。3炎症組織に特異的に高発現する接着関連分子であるICAM-1に特異的に結合するペプチドをEG2量体をリンカーとして脂質に化学結合したペプチド導入PEG脂質を合成した。また、TNF-αを含む培養液中で培養することで、hLSMEにおけるICAM-1の発現が向上することを免疫染色によって確認し、このhLSMEを炎症モデルhLSMEとして用いることとした。ペプチド導入PEG脂質を修飾したhMSCの炎症モデルhLSMEとの共培養後の接着能を評価したところ、ICAM-1認識配列アミノ酸修飾群は、未修飾群、Reverse配列修飾群と比べて移動速度が小さい細胞が多く存在しており、平均移動速度の中間値も小さかった。以上の結果から、hMSCに対するPEG脂質を介したペプチド修飾によって炎症モデルhLSMEへの接着能が増強されることが示された。(抄録なし)本研究では、炎症部位認識リガンドを導入したPEG脂質をヒト間葉系幹細胞(hMSC)表面に修飾することでhMSCの炎症組織への接着を促し、治療効果を向上することを目指している。初年度は、リガンド修飾hMSCのin vitro評価を行うために、(1)PEG脂質修飾条件の最適化、(2)修飾効率向上のための添加剤の探索と評価、(3)PEG脂質修飾hMSCの接着性評価に取り組んだ。(2)PEG脂質の修飾効率を顕著に向上させる添加剤としてシクロデキストリン(CD)を見出した。特にαCD添加群(10mM)では、未添加群と比較してPEG脂質修飾量が約80倍まで向上した。これはhMSC表面へのPEG脂質の修飾量の制御を容易にするという点で非常に有用である。(3)炎症関連接着分子を高発現させたヒト肝類洞血管内皮細胞(hLS柵)に対するPEG脂質修飾hMSCの接着能の評価を試みた。量子ドットによる蛍光標識hMSCを、hLSMEがコンフレントになった培養皿上に添加し、所定時間培養後、接着hMSCと接着hLSMEの細胞数の比からhLSMEに対するhMSCの接着率を算出した。リガンド未導入PEG脂質を用い、異なるPEG鎖長およびPEG脂質修飾量で修飾を行ったhMSCに対して本評価を行ったところ、PEG鎖長が長く、PEG脂質修飾量が増大するほどhMSCの接着性が低下することが確認された。また、来年度実施予定であるhMSC表面へのリガンド修飾について、hMSCの炎症組織への接着を促進するために炎症関連接着分子であるICAM-1を特異的に認識するペプチドをリガンドとして選定し、同ペプチドの合成、精製を行った。ペプチド導入

PEG脂質を修飾したhMSCの炎症モデルhLSMEとの共培養後の接着能を評価したところ、ICAM-1認識配列アミノ酸修飾群は、未修飾群、Reverse配列修飾群と比べて移動速度が小さい細胞が多く存在しており、平均移動速度の中間値も小さかった。以上の結果から、hMSCに対するPEG脂質を介したペプチド修飾によって炎症モデルhLSMEへの接着能が増強されることが示された。当初の計画で予定していたPEG脂質修飾条件の最適化については、修飾量に影響を及ぼす因子を特定し、さらに修飾されたPEG脂質の安定性の評価も実施した。修飾効率を向上できる添加剤の探索については、修飾量を顕著に向上するシクロデキストリンを見出した。PEG脂質修飾hMSCの接着性評価については、PEG鎖がhMSCの接着能を低下させることが見出され、修飾に用いるPEG脂質の最適化の必要性が明らかとなった。PEG脂質は、PEG分子量および修飾量依存的に被修飾細胞の接着能を低下させることが明らかとなったため、今後は短鎖PEG脂質の合成に取り組み、接着能に対する影響を明らかにする。同時にICAM-1認識ペプチドを導入したPEG脂質を合成し、PEG脂質を介してICAM-1認識ペプチドを修飾したhMSCの、炎症関連分子を高発現させたヒト肝類洞内皮細胞に対する接着能の評価を行う。(抄録なし)
細胞外および細胞内カルシウム代謝と遺伝子の発現調節

PTH遺伝子上に存在し、細胞外液Caによる本遺伝子の転写抑制に必要なDNAエレメント(nCaRE、negative Ca responsive element)を用いて、このエレメントに対する特異的な結合が外液Ca濃度依存的に増強する性質を有し、かつ転写抑制を直接的に司る細胞核蛋白nCaREB(nCaRE binding protein)を検出した。その結果、nCaREBは、還元因子ref1(redox factor 1)と、少なくとももう一つの別の核蛋白から構成されることが判った。これらの因子のヘテロダイマー或いはマルチマ-と考えられるnCaREBの特異的DNAへの結合活性がほとんどすべての細胞種に認められるのに一致して、ref1は、広い範囲の細胞種にわたって普遍的に発現される核蛋白であった。その蛋白量及びこれをコードするmRNA量は、細胞外Ca度の上昇に伴い増加する。シクロヘキシミドによって蛋白合成をブロックするとnCaREBのnCaREに対するCa依存的結合活性上昇が見られなくなることは、この結果を支持する。これまでref1については、DNA修復に関連するエンドヌクレアーゼで、種々の転写因子のredox stateを修飾して、DNA結合活性を上昇させることが知られていた。しかしこうした機序とは別に、我々の系において実験的に、(1)抗ref1抗体により、nCaREBのnCaRE結合活性は明らかに減弱する、(2)ref1のアンチセンスcDNAを細胞に導入すると、nCaREを介する細胞外Caによる転写抑制は消失するという結果が得られており、ref1はさらにnCaRE配列に特異的に結合して転写を抑制する負の因子であることが強く示唆された。現在、nCaREBのもう一つの構成因子についてすでにクローニングを終え、ref1との関連等について研究を進めている。本研究はこれまでに蓄積されてきた副甲状腺ホルモン(PTH)遺伝子の転写調節、二次性副甲状腺機能亢進病態の分子生物学的解析に引き続くプロジェクト(A New Mode for Ca^<++> Regulation.pp.129-143)として、さらに基礎的な転写調節の分子メカニズムを解明し、その知見に基づいた各種カルシウム(Ca)代謝異常病態の解析と臨床応用を目的として計画された。その第1年度においては当初の計画以上の成果が得られており、第1にCaによるPTH遺伝子の抑制的調節に関わると考えられる核内転写因子の候補とも言うべきRedox factor 1(ref-1)のクローニングに成功したことである(内分泌学の進歩VOL.10,pp.102-120、Prog.in Endocrinol.,1992;pp.407-410,ASBMR,1992発表、投稿中)。いくつかの状況証拠から、ref-1単独ではCaによる転写調節のすべてを説明できないため、何らかの共役因子が想定されたが、初年度の第2の成果はその同定に成功したことである(3rd Internatl Conf on New Action of PTH,京都、1993発表予定、Endocrine Society,76th Annual Meeting発表予定)。一方、我々は副甲状腺細胞をはじめとした細胞の表面に想定されたカルシウム受容体のクローニングをも平行して進めていたが、残念ながら米国のE.Brownらのグループに先を越されてしまった。この受容体は細胞外のCa濃度の変化に応じて、PTH分泌を調節するキーとなる蛋白で、同じ機構が我々の研究している転写系でも機能していると考えられるため、E.Brownらとの共同研究を行い、本研究計画の第2年度の基本プロジェクトとして進めることとした。

その結果、nCaREBは、還元因子ref1(redox factor 1)と、少なくとももう一つの核蛋白から構成されることが判った。これらの因子のヘテロダイマー或いはマルチマ-と考えられるnCaREBの特異的DNAへの結合活性がほとんどすべての細胞種に認められるのに一致して、ref1は、広い範囲の細胞種にわたって普遍的に発現される核蛋白であった。その蛋白量及びこれをコードするmRNA量は、細胞外Ca度の上昇に伴い増加する。シクロヘキシミドによって蛋白合成をブロックするとnCaREBのnCaREに対するCa依存的結合活性上昇が見られなくなることは、この結果を支持する。これまでref1については、DNA修復に関連するエンドヌクレアーゼで、種々の転写因子のredox stateを修飾して、DNA結合活性を上昇させることが知られていた。しかしこうした機序とは別に、我々の系において実験的に、(1)抗ref1抗体により、nCaREBのnCaRE結合活性は明らかに減弱する、(2)ref1のアンチセンスcDNAを細胞に導入すると、nCaREを介する細胞外Caによる転写抑制は消失するという結果が得られており、ref1はさらにnCaRE配列に特異的に結合して転写を抑制する負の因子であることが強く示唆された。現在、nCaREBのもう一つの構成因子についてすでにクローニングを終え、ref1との関連等について研究を進めている。