hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Flt-１系を介する心腎連関分子機序の解明：新規LncRNAの関与

最終年度は、慢性腎臓病(CKD)にてsFlt-1の低下する機序、sFLt-1KOで圧負荷時に特異的に発現低下するLncRNAXについて解析を加えた。ApoE KOマウスに5/6腎摘による腎不全マウスを作成すると、腎臓でのsFlt-1が減少し動脈硬化が増悪する報告しているが、この条件でISやpCSの産生を抑制するAST-120を10週間投与するとISとpCSの低下とプラーク面積の減少が確認された。さらに、IS, cCS濃度とプラーク面積は有意に正相関し、sFlt-1発現量とプラーク面積は負の相関を示した。(現在JAHA投稿中)。sFlt-1KOマウスにTAC処理3日目のマウスよりアレイにて特異的に減少するLncRNA Xを同定しているが、LncRNA XはMEKに直接結合し、ERKリン酸化を抑制することにより、細胞増殖抑制性に働くことを確認してきた。本年度は、その作用の解析も引き続き実施した。LncRNAの転写を抑制するshRNAをAAVに導入しLncRNA Xの産生をin vivoでノックダウンすると、TACによる心肥大はコントロールと比べさらに増悪し、EFがさらに低下することを確認し、in vivoでAAV shRNAにより、ERKのリン酸化がさらに増強することが確認され、LncRNA Xがin vivoでも働いていることが証明された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。心腎連関は心臓疾患と腎臓疾患が高率に合併し、心臓と腎臓の機能異常がお互いに一方の機能を増悪し、悪循環を形成する疾患概念であるが、その分子機序は、十分には解明されていない。我々は、慢性腎臓病では、PLGFの産生が亢進することと、PLGF-Flt-1系に拮抗的に働く可溶性Flt-1アイソフォーム(sFlt-1)が産生低下するために、PLGF/Flt-1系が活性化して、腎臓病に合併する動脈硬化や心肥大/心不全を増悪させることを明らかにしてきた。本年度は、sFlt-1特異的ノックアウトマウス(sFlt-1KO)を慢性腎臓病に共う心血管病易発症モデルの一つとして利用し研究を遂行した。sFLT-1KOに大動脈縮窄(TAC)を作成すると、野生型(WT)と比べて、心不全を高率に発症し、心肥大、心臓線維化より顕著であることを認めていたが、そこにはPLGF/Flt-1系の下流でMCP-1が過剰に発現し、心臓の形質発現に関与していることをMCP-1中和抗体を用いて確認した(この結果はHypertension 2017;135:659に発表した)。また、腎不全にともなう心肥大や心不全を発症しているヒト心臓の左室生検組織を用いて、MCP-1の発現が亢進していることを確認し、PLGF/Flt-1/MCP-1と繋がる情報伝達系が、腎臓病にともなう心疾患発症に関与していることを示唆する所見を人でも確認した。当初のsFlt-1KOでの心室リモデリングをきたす機序の解明は、TAC処理を実施したsFlt-1KOではPLGF/Flt-1系の下流でMCP-1が活性化し、その発現が心筋細胞で亢進していることをwestern blot法、PCR法、免疫組織学的手法を用いて確認した。WTでは同様のTAC処理にてもMCP-1の発現亢進は観察されず、このMCP-1の発現亢進がsFlt-KO特異的であることを確認した。また、MCP-1中和抗体を投与すると、sFlt-1KOでTAC処理をした時に観察される、心肥大、心線維化、左室収縮機能の低下、心不全死という一連のフェのタイプが明らかに抑制され、PLGF/Flt-1の下流でMCP-1が重要な働きを担っていることが確認できた。Long non-cording RNA(lncRNA)の実験も順調に進行している。この結果に関しては現在特許申請を考慮中であり、この報告書への記載はこれだけにとどめさせていただきます。我々は、過去10年に渡り心腎連関の分子機序の解明に一貫して携わってきた。その過程で、胎盤増殖因子(PLGF)とその受容体であるFms-like tyrosine kinase-1 (Flt-1)の情報伝達系が、慢性腎臓病(CKD)に合併する動脈硬化や心不全易発症性に関与していることを報告してきた。また、Flt-1の可溶性アイソフォーム(sFlt-1)はPLGFの内因性の拮抗剤として働くが、sFlt-1特異的ノックアウトマウス(sFlt-1KO)に圧負荷(TAC)を加えた時に、特異的に発現低下するLncRNA(Lnc RNA X)を発見しその機能解析と意義を本研究では解析している。本年度は、以下のことを明らかにした。1)LncRNA Xの生化学的解析:LncRNA Xは全長約3.5Kbpであるが、いくつかの欠失変異体を作成して検討し、機能ドメインを全体の1/4までの絞り込みに成功した。このドメインによりMEK-ERK系のタンパク質Yに直接結合しERK1/2のリン酸化が抑制されることを確認した。2) LncRNA Xのin vitro機能解析:LncRNA XをノックダウンするためにsiRNAXやshRNA Xを作成し、AAVに組み込み初代心臓線維芽細胞に強発現すると、細胞増殖が促進することを確認した。

3) LncRNA Xのin vivo機能解析:sFlt-1KOでは圧負荷によりLncRNA Xが減少しているので、LncRNA Xをアデノ随伴ウィルスベクター(AAV)に組み込んでレスキュー実験を実施すると、AAV-LncRNA XでTAC後の予後が改善することを確認した。また、AAV-LncRNA Xでは、心機能が回復し、心肥大が抑制された。iv)LncRNA Xのin vivoでの機能解析、の4研究を計画していた。その他はLncRNA Xのヒトホモローグの探索を当初の計画としていた。これらの計画の中で心筋細胞での解析は、試みたが綺麗な結果を得られていない。その大きな原因は、心筋細胞が分裂しない細胞であり、細胞数の問題と思われる。線維芽細胞細胞における研究は当初の予定を得た。LncRNAXの生化学的機能ドメインの解析は全体の1/4まで絞り込むところまで進んでいるが、コアドメインまでの同定には至っていない。立体構造がターゲットタンパク質との結合に重要である可能性があり、この点に関してはさらに解析が必要である。In vivo実験は本LncRNA Xの機能を確認するために、最も重要であるが当初の期待される結果を得ることができた。ヒトホモローグの解析は、機能ドメインの解析と協調して進行する点があり、遅れている。また、本Lnc RNA Xをベクターにしてダイレクトに結合するタンパクYを同定し、さらにヒトタンパク質Yをベクターにして結合RNAを探索することを開始している最終年度は、慢性腎臓病(CKD)にてsFlt-1の低下する機序、sFLt-1KOで圧負荷時に特異的に発現低下するLncRNAXについて解析を加えた。ApoE KOマウスに5/6腎摘による腎不全マウスを作成すると、腎臓でのsFlt-1が減少し動脈硬化が増悪する報告しているが、この条件でISやpCSの産生を抑制するAST-120を10週間投与するとISとpCSの低下とプラーク面積の減少が確認された。さらに、IS, cCS濃度とプラーク面積は有意に正相関し、sFlt-1発現量とプラーク面積は負の相関を示した。(現在JAHA投稿中)。sFlt-1KOマウスにTAC処理3日目のマウスよりアレイにて特異的に減少するLncRNA Xを同定しているが、LncRNA XはMEKに直接結合し、ERKリン酸化を抑制することにより、細胞増殖抑制性に働くことを確認してきた。本年度は、その作用の解析も引き続き実施した。LncRNAの転写を抑制するshRNAをAAVに導入しLncRNA Xの産生をin vivoでノックダウンすると、TACによる心肥大はコントロールと比べさらに増悪し、EFがさらに低下することを確認し、in vivoでAAV shRNAにより、ERKのリン酸化がさらに増強することが確認され、LncRNA Xがin vivoでも働いていることが証明された。今後はlncRNAの研究への比重が増えて行くと思われる。In vivoでのこのlncRNAの機能も確認できているが、現在は機能ドメインの詳細な同定、作用発現機序(結合蛋白の同定も含めて)を解明する。我々が2007年より連続症例を前例登録している、心不全や急性心筋梗塞データベースであるNARA-HFあるいはNARA-AMI臨床サンプルを用いて、MCP-1、PLGFの臨床的意義の解明をさらに実施する予定である。今後の予定は、新規LncRNA X研究において、明らかになってきた部分で論文作成作業を開始している。また、これまでで明らかになっていない以下の点に関してさらに解析を続ける。
北九州の真宗を例とした仏教近代化に関する基礎的研究

本研究は明治期の仏教教団とりわけ東西本願寺による布教活動等に表れる対外的活動と、それと相即の関係にあった宗教内部の革新の両面に着目し、宗教や教学が新時代に対応し再編された日本近代化の過程を、広く文化学の見地から捉え直そうとするものである。具体的には、北九州における東西本願寺に地域と宗派を限定して、その特徴と意義について、特に下記の視点から考察を加えた。I北九州の真宗が持つ地理的・歴史的・政治的な特徴、II真宗学寮と漢学塾の関係に着目した、仏教と漢学の関係、III幕末維新期の排耶論に着目した仏教近代化の過程、IV海外布教活動が文化交流と仏教近代化に果たした意義。本研究は、明治期の仏教教団とりわけ浄土真宗(以下:東西本願寺)による布教活動等に表れる対外的活動と、それと相即の関係にあった宗教内部の革新の両面に着目し、宗教や教学が新時代に対応し再編された日本近代化の過程を、広く文化学の見地から捉え直そうとするものである。具体的には、北九州(福岡県・佐賀県・長崎県・大分県など)における東西本願寺に地域と宗派を限定して、その特徴と意義について、特に下記の4つの視点から考察を加える(1北九州の真宗が持つ地理的・歴史的・政治的な特徴。2真宗学寮と漢学塾の関係に着目した、仏教と漢学の関係。3幕末維新期の排耶論に着目した、仏教近代化の過程。4海外布教活動が文化交流と仏教近代化に果たした意義。これまでに、研究代表者をはじめとする研究担当各員が、九州をはじめとする日本国内のみならず、外国においても調査活動を行い研究をすすめ、シンポジウムや論文等で成果を発表してきた。このほか、10月に「国際シンポジウム広域アジアにおける大谷光瑞の活動」(科研費補助金基盤研究(C)「大谷光瑞とアジアーその開教土壌と歴史的考察ー」(研究代表者:柴田幹夫・新潟大学准教授)等と共催)を開催し、日本国内のみならず海外からも発表者を招聘し、研究発表および講演を行った。研究代表者および研究担当者各人が分担して九州・沖縄地方および外国(中国・台湾・韓国)等で資料調査を実施するとともに、国際シンポジウム等で発表をおこなった。上記の成果を各人が論文で発表した。また、研究会・報告会を実施し、研究の進捗状況を確認・調整するとともに、部外者等を講師として招聘し発表を実施した。あわせて、小栗布岳『琉球日記』等の資料の読み合わせ会も実施した。本研究は、明治期の仏教教団とりわけ浄土真宗(東西本願寺)による布教活動等に表れる対外的活動と、それと相即の関係にあった宗教内部の革新の両面に着目し、宗教や教学が新時代に対応し再編された日本近代化の過程を、広く文化学の見地から捉え直そうとするものである。具体的には、北九州における東西本願寺に地域と宗派を限定して、その特徴と意義について、特に下記の4点から考察を加えた。I北九州の真宗が持つ地理的・歴史的・政治的な特徴。II真宗学寮と漢学塾の関係に着目した、仏教と漢学の関係。III幕末維新期の排耶論に着目した、仏教近代化の過程。IV海外布教活動が文化交流と仏教近代化に果たした意義。Iについては、西本願寺の鎮西別院や、明治初期に琉球で発生した真宗法難事件、明治32年の宗教法案などを例として、北九州の地理的特性や北九州出身の真宗僧が果たした役割を、明らかにした。IIについては、漢学塾・咸宜園門下生の中に真宗僧が多かったという点に着目し、現地調査によって得られた資料などをもとに検討することができた。彼等の多くは幕末明治期に排耶活動や海外布教を行っており、当時真宗僧が排耶活動や海外布教に大きな役割を果たしたことを確認した。IIIについては、福澤諭吉と東本願寺との関係について明らかにし、福澤がいかにキリスト教と対抗していったかという点について明らかにした。また、幕末維新期に数多く刊行された排耶書の中で「防耶訓」の意義などについて明らかにした。IVについては、明治初期に東本願寺が行った琉球および清国布教の実態や、当時の東本願寺と明治新政府要人との関係について、各地の寺院等で収集した資料をもとに検討した。研究遂行に当たっては、各自が現地調査および文献調査等を実施し、随時研究会等を主催し、研究成果を発表するとともに、関係資料の読み合わせ会を行った。科研期間中に得られた成果を収録した研究成果報告書を刊行した。近代日中文化交流史採択時に策定した研究計画のもとに、各員が担当部分の調査・研究を実施し、成果を出している。また、国際シンポジウム(他の科研費等との共同)を開催することができた。研究代表者・研究分担者各人が九州各地および外国(中国・台湾・韓国)で資料調査および研究発表を実施した。

そのほか、4回にわたって研究会、2回にわたって報告会を実施し、研究の進捗状況を確認するとともに、研究発表等を実施した。あわせて収集した資料の小栗布岳『琉球日記』等の読み合わせ会を行った。上記の成果を各人が論文で発表した。以上のように、当初の予定に沿って進捗していると自己評価する。今後も採択時に策定した研究計画のもとに、各員が担当部分の調査・研究を推進する。あわせて、報告書等の成果の刊行に向けて、各人が論文等を執筆するとともに、研究会などを通じて研究成果を整理・統合する。今後も引き続き、九州各地をはじめとする日本国内および海外で資料調査・研究発表を実施する。あわせて適宜、研究会を実施し、進捗状況を確認するとともに、外部講師を招いて後援を実施する。その他、資料の読み合わせを行い、テキストを翻刻する。上記の成果について各人が論文を執筆するとともに、全体では成果報告書を作成する。公務多忙等による予算執行未消化のため。未消化の出張等に予算を使用する。九州各地をはじめとする日本国内および海外で資料調査・研究発表を実施のために旅費を使用する。報告書作成のため、資料複写費・製本費等に使用する。研究会にともなう外部講師招聘のため、謝金等に使用する。
中性条件下での光学活性な保護基導入法の開発

中性条件下で、テトラヒドロフリル基の高エナンチオ選択的導入反応を目的として研究を行い初年度でほぼ目的を達成することができた。この研究過程で見出されたサレン錯体のキラルルイス酸としての高い不斉誘起能に着目して新たな炭素・炭素結合生成反応の研究を行った。特に、フランと合成等価体であるシリルジエノールエーテルに着目して、アルデヒドとの向山アルドールについて検討した。その結果、カチオン性サレンクロム錯体を触媒に用いたときに、アルコールとアミンの共存下という特異な反応条件で目的とする向山アルドール反応が円滑に進行し、高エナンチオ選択的にかつ高収率でδ-ヒドロキシ-β-ケトエステルを与えることを見出した。特に、これまで高エナンチオ選択性の達成が困難であった脂肪族アルデヒドの反応で最高で99%eeの高選択性を達成することができた。α,β-不飽和アルデヒド、芳香族アルデヒドの反応も高エナンチオ選択的に進行する。また、基質が他の酸素官能基を有していても反応は円滑に進行する。なお、得られた結果の考察から、アルコールはレトロ向山アルドール反応の抑制、アミンはシリルジエノールエーテルの分解の抑制に貢献していることが明らかとなった。本法は、有用なキラルビルディングブロックであるβ,δ-ジヒドロキシエステルの簡便な合成法を提供するものである。これらの結果は,纏められてSynlettに報告されている。現在、今回の知見を基に、シリルシアノ化について検討を加えている。テトラヒドロフラニル(THF)基やテトラヒドロピラニル(THP)基は、水酸基の保護基として合成に広く利用されている。しかし、これらの保護基はその導入に酸触媒を必要とするのみならず、その生成に際して新たな不斉炭素が生じるために、光学活性なアルコールの保護では1対のジアステレオマー混合物が生成する。それ故、これらのアセタール保護基を真に有効なものとするためには、より中性な条件下で立体選択的アセタール化の方法を確立することが必要である。このためには、反応溶液中で必要に応じて活性化されアセタール触媒として働くことのできるキラルな中性錯体の設計が求められる。今回、光照射下でのみアピカル位のニトロシル基を解離してルイス酸性を示す光学活性なサレンルテニウム錯体を触媒に用いてアセタール化の検討を行い、種々のアルコールやフェノールが温和な条件下良好なエナンチオ選択性(70%ee80%ee)でTHF化されることを見出した。この結果は、エナンチオ選択的アセタール保護基導入の最初の例である。また、生成したTHFエーテルを本反応条件にさらしても光学純度の変化が見られないことを確認し、本反応の立体化学は速度論的に支配されていることを明らかにした。このことは、本反応が極めて中性に近い条件で進行していることを示している。一方、天然有機化合物などの合成では光学活性なアルコールを保護する場合が多い。そこでは、触媒のキラリティーと同時に基質のキラリティーによる立体制御が期待される。そこでキラルな2級アルコールについて検討したところ、双方のキラリティーによる不斉誘導が相乗的に働く(マッチする)場合には90%de以上の高選択性が観測されることが明らかとなった。これらの知見は、THF化に限られるものの、天然物合成などにおける水酸基の保護に新たな方法論を提供するものであり、本研究の所期の目的を達成することができたものと考えている。
自己終息シグナル解明に基づく抗血管、リンパ管新生治療への応用

血管新生促進因子であるVEGF/Thrombin刺激によってCn-NFATc経路が活性化され、その特異的feedback因子であるダウン症候群関連因子short-isoform(DSCR-1s)が誘導されること、本因子のpromoter領域をマウスの特定領域(Hprt-locus)にknock-inしたマウスの樹立に成功したことを昨年度までに報告した。そこで、本マウスを用い包括的なDSCR-1s発現のin vivo機構解析存行ったところ、DSCR-1sはマウスembryo(E10-14)では広範囲にわたる強い血管内皮特異的な発現様式を示すが、その後大きく発現は減少し、adultマウスでは局所的に弱い発現を示すことが明らかとなった。しかし、マウスにLPSやVEGFの刺激を付加することによって臓器特異的(脳、心臓、腎臓、肺)かつ血管選択的にDSCR-1sが誘導される興味深い結果が得られた。また腫瘍xenograft環境下では強い血管、リンパ管内皮特異的な発現様式を示した。DSCR-1s promoter上にはNFArcとGATAの結合部位があるが、NFATc1,c2,c3及びGATA2が制御に深く関わっていること、さらにDSCR-1sの内皮特異的な安定発現により、血管新生、肺への腫瘍細胞の転移が顕著に抑制されることを見いだした(投稿中)。また血管内皮での遺伝子発現において重要とされるGATA転写因子であるが、微小血管内皮と大血管で発現するGATA因子の組み合わせが異なり、特にTie2の発現に関しては微小血管、リンパ管内皮ではGATA2が、大血管内皮ではGATA3が主要な役割を担っていることを明らかにした(投稿中)。続いて内皮活性化刺激でDSCR-1sに次いで誘導されるEgr-3についてもその生理的意義を解析し、これがVEGF依存性の増殖、管腔形成に深く寄与することを見いだしている。血管新生促進因子であるVEGFやthrombin刺激によって、Cn-NFATc経路が活性化され、また早期にそのfeedback因子であるダウン症候群関連因子(DSCR)-1が誘導されることを見出し報告したが、本年はこの因子の発現をマウスレベルでさらに探索するために、位置特異的(Hprt-locus)DSCR-1 promoter-lacZ knock-inマウスの樹立及びLPS, VEGF投与での包括的in vivo発現解析を行った。その結果未刺激マウスでは脳(一部の血管、神経)、心臓(心筋、大血管)にDSCR-1発現が認められたが、LPS投与により、大動脈内皮及び平滑筋、肺毛細血管、脳血管内皮、腎臓糸球体内皮に著明な誘導が、VEGF投与により大動脈内皮、脳血管内皮及び神経、肺毛細血管内皮に大きな誘導が生じることが明らかとなった。一方、肝臓、脾臓、骨格筋では全く発現が見いだされなかった。またB16 melanoma, LLCでのxenograftを行った場合、腫瘍内血管、リンパ管内皮にDSCR-1の発現誘導が顕著に認められた。このことから、DSCR-1発現は特に内皮細胞に強く認められ、かつ各臓器微小環境に呼応するheterogeneityを有することが明らかとなった。マウス内でのDSCR-1発現はNFATcに依存しており、CsAを腹腔内投与することで消失し、Xenograft modelでは腫瘍の進展が大きく抑制される結果が得られた。さらに内皮DscR-1発現は転写因子GATAにも依存しており、siRNA導入によってDSCR-1発現が減少することが見いだされた。
疎水性イオン液体を用いるセルロース糖化プロセスの革新

本研究では、セルロース系バイオマスから、簡便かつ効率よくグルコースを取り出すための革新的糖化プロセスの構築に向け、結晶性セルロースを非結晶化する新規溶剤の開発を通して、1つの反応器を使い、1ステップでセルロース系バイオマスからグルコースを生産するための水-疎水性イオン液体二相系プロセスの構築を目的とした研究を行った。その結果、セルロースとの親和性の高い官能基をイオン液体のカチオン部位に導入した新規疎水性イオン液体に塩化リチウムを添加した溶剤を用いることで、セルロースの再生と酵素糖化を二相系界面で促進可能な反応プロセスを実現した。本研究では、セルロース系バイオマスから、簡便かつ効率よく単糖類(グルコース等)を取り出すための革新的糖化プロセスの構築に向け、結晶性セルロースを非結晶化する新規溶剤の開発を通して、1バッチ・1ステップでセルロース系バイオマスからグルコースを得るための水ー疎水性イオン液体二相系プロセスの構築を目的として検討を行った。カチオン/アニオン部位の異なる種々の市販および合成イオン液体を用いた検討の結果、既往のセルロース溶剤であるジメチルアセトアミド部位をイオン液体のカチオン部位に導入した新規疎水性イオン液体を見出した。これに塩化リチウムを添加した溶剤により結晶性セルロースを適当な時間加熱し、ここに酵素セルラーゼ水溶液を添加することで、セルロースの再生と酵素糖化が二相系界面で進行する反応系を実現した。さらに、セルラーゼを界面に能動的に濃縮するため、ペプチドと親和性を有する部位を導入した疎水性イオン液体を新たに合成した。これを二相系界面酵素糖化系に添加し、当該ペプチドを挿入した組換えセルラーゼを添加したところ、添加系において酵素糖化効率の向上が確認されたことから、当初期待した効果を達成した。一方、実バイオマスを対象とするための予備検討として、種々のイオン液体による前処理が酵素糖化効率に与える影響について基礎検討を実施した。本検討で得られた基礎知見は、新たなセルロース系バイオマス分解プロセスの構築に資するものと期待している。近年、再生可能なエネルギー資源であり、食糧と競合しないセルロース系バイオマスからの物質・エネルギー生産が注目を集めている。本研究では、セルロース系バイオマスから、簡便かつ効率よく単糖類(グルコース等)を取り出すための革新的糖化プロセスの構築に向け、結晶性セルロースを非結晶化する新規溶剤の開発を通して、1バッチ・1ステップでセルロース系バイオマスからグルコースを生産するための水ー疎水性イオン液体二相系プロセスの構築を目的として検討を行った。まず、カチオン/アニオン部位の官能基を変えた市販および新規合成疎水性イオン液体を22種類選抜し、これらに結晶性セルロースを添加し、加熱前処理した後に、セルラーゼ水溶液を添加することで水ー疎水性イオン液体二相系を形成させ、酵素糖化反応を試みた。その結果、疎水性イオン液体の種類により、酵素糖化効率において数%70%程度の開きが観察された。特に、イオン液体のカチオン部位の分子構造が結晶性セルロースの界面酵素糖化反応効率に影響を与えることが明らかとなった。また、二相系の形成はセルラーゼ活性に影響を与えなかったことから、その効果はイオン液体種に依るものであることが明らかとなった。さらに、カチオン部位はイミダゾール系が好ましく、カチオン部位側鎖への水素結合受容性の官能基の付与が効率化の鍵を握ることが明らかとなった。以上の成果に基づき、既往のセルロース溶剤であるジメチルアセトアミド部位をイオン液体のカチオン部位に導入した新規疎水性イオン液体の合成を試み、これに成功した。さらに、合成した新規疎水性イオン液体は塩化リチウムを溶媒中に保持すること、その状態で結晶性セルロースを添加して加熱することで、二相系酵素糖化反応の効率が向上することを見出した。セルロース前処理のための新規溶剤の開発については、カチオン/アニオン部位の官能基を変えた新規疎水性イオン液体の構造が結晶性セルロースの溶解/構造緩和に与える影響について、22種類の疎水性イオン液体中に結晶性セルロースを添加し、これらが形成する水ー疎水性イオン液体二相界面での酵素糖化反応について詳細な検討を行い、十分な基礎的知見が得られた。一方、二相系界面形成により生じる再生セルロースの分光学的解析(赤外吸収、X線回折パターン等)について、より詳細な評価が必要である。また、水ー疎水性イオン液体界面共存系における市販セルラーゼの触媒挙動については、水ー有機溶媒二相系と異なり、セルラーゼの失活を伴わずにその触媒機能が維持される系を構築可能なことが明らかとなった。そこで、次年度においては、セルラーゼを界面に能動的に濃縮するための新規イオン液体の合成と、セルラーゼの界面濃縮がセルロース糖化に与える効果を検証する。研究開始時に掲げた何れの検討項目においても、おおよそ計画通りに研究は遂行できており、研究を進める過程において、新たなイオン液体の分子設計に関するアイデアが得られ、これを実践できた点には満足している。次年度においては、セルラーゼ側からのアプローチに力点を置いて検討を進める。

平成23年度に得られた成果と、既往のセルロース溶剤を構成部位として有するイオン液体を用いた詳細な評価を通して、望みの性質を与え得る疎水性イオン液体を選抜・合成し、これらが構成する異相系液液界面がセルラーゼ活性ならびに安定性に与える効果を調査する。また、セルラーゼを界面に能動的に濃縮するため、ポリヒスチジンに高親和性を示す金属キレート部位が導入された新規イオン液体の合成と、ポリヒスチジンタグがNあるいはC末端に挿入された組換えセルラーゼを調製し、セルラーゼの界面濃縮がセルロース糖化に与える効果を検証する。具体的には、遺伝子工学的にNあるいはC末端にアフィニティタグを融合させた界面配向型組換えセルラーゼを、糖化酵素系を構成する主要酵素について取得し、水ー疎水性イオン液体二相系における酵素糖化反応効率(速度)を評価する。上記の検討結果を踏まえ、水ー疎水性イオン液体界面への組換えセルラーゼの界面への濃縮がセルロース糖化に与える影響を定量的に評価することを試みる。疎水性イオン液体を含んで膨潤したセルロース表面へのセルラーゼ吸着挙動(濃縮過程)、異相界面形成能、酵素糖化促進効果、酵素の安定性に与える影響を精査する。また、繰り返し利用時における疎水性イオン液体の再利用性(リサイクル)を評価し、産業利用上の優位性について検討する。交付申請書に記載の通りに執行予定である。特に、セルラーゼの調製とイオン液体の合成に関する試薬類についての支出が中心になる。但し、初年度に比べ物品費が半減しているので、初年度に得られた成果に基づき、検討項目を十分に絞って検討を進める必要がある。
インプラントと骨の結合の3次元表示に関する研究

研究実績の概要1.インプラントの形状寸法の詳細数値、及び埋入手術をほどこしたニホンザルのインプラント定着後の埋入部位における剖検データを2.5次元CAD装置に自動入力するアプリケーションを開発実装した。また、そのアプリケーションを用いて同一測定平面上にない骨とインプラントの位置関係を任意の座標系に対して75μm単位の実寸法で測定することが可能となった。2.インプラント埋入部位における手術後の骨改造過程における破骨細胞と骨芽細胞が持つ機能、骨内部の物理的、化学的、細胞学的及び環境に関する圧電効果等の知見に基づいて発展方定式によりモデル化しシミュレーションを行った。骨組織の中にインプラントを埋入するための穴を空け骨髄を満たしたと仮定した初期状態の値からシミュレーションを開始したところ、骨髄中に海綿状に発達した骨梁を確認することができた。3.インプラントを埋入したモデルを仮定し、界面方程式の概念を用いてシミュレーションを行った。その結果、2.5次元CAD装置に実装したインプラント定着後の埋入部位の状況に類似した結果を得られた。今後の研究計画1.実際のインプラントを埋入する形状、及び骨改造現象に係るCa.Pなどの物理的刺激を司る物質、ホルモン、ビタミンなどの化学的刺激を司る物質、alkalinephosphatase、acidphosphataseなどの酵素等について更に調査し、最適なシミュレーションモデルの構築を行う。2.歯学の分野に応用できるよう、シミュレーションモデルの妥当性を評価する方法を開発し、定量的にモデルの検証をする。研究実績の概要・広島大学歯学部より提供を受けたインプラントの形状寸法の詳細数値、及びインプラント埋入手術をほどこしたニホンザルのインプラント定着後のインプラント埋入部位における剖検データを2.5次元CAD装置に自動入力するアプリケーションを開発実装した。・インプラント埋入部位における手術後の骨の改造過程における破骨細胞と骨芽細胞が持つ機能、骨内部の物理的、化学的、細胞学的及び環境に関する圧電効果等の知見に基づいて発展方定式によりモデル化しシミュレーションを行った。これは、2.5次元CAD装置に実装したインプラント定着後のインプラント埋入部位の状況に非常に類似している。・第23回発展方定式研究会(12月2123日、千葉大学)にて、上記のインプラント改造現象のモデルとそのシミュレーションの結果を発表した。今後の研究計画・本研究は、歯科インプラントと骨結合様相をシミュレートし、インプラントとインプラント埋入窩径との関係、インプラントの表面に刻む溝の最適な形状、インプラント上部構造の設計ガイドラインなどを求めることを最終の目的として始めたものである。したがって、実際のインプラントを埋入する形状及び骨改造現象に係るCa、Pなどの物理的刺激をつかさどる物質、ホルモン、ビタミンなどの化学的刺激をつかさどる物質、alkalinephosphatase、acidphosphataseなどの酵素等について調査し、更にシミュレーションを行う。
グリア・トランスクリプトーム解析によるリハビリ後の運動機能回復メカニズムの解明

ヒトを含む哺乳類において、損傷を受けた中枢神経系は極めて再生しにくいと考えられている。しかしながら、脳卒中・脊髄損傷などの中枢神経損傷後に、失われた運動機能がある程度自然回復することが知られている。この自然回復のメカニズムの一つとして、損傷後、障害を免れたニューロンの可塑性が亢進し、新たな側枝を伸ばし、神経回路が再構築されることが報告されている。一方、神経損傷後に、リハビリテーションを行うことによりさらなる運動機能回復が得られることはよく知られている。このことから、リハビリテーションによりニューロンの可塑性がより亢進し、神経回路の再構築が促され、回復が促進するということが考えられているが、その分子メカニズムは不明な点が多い。本研究の目的は、なぜリハビリテーションが神経損傷後の機能回復に有効であるのか、分子レベルでのメカニズムを明らかにし、そこで得られた知見をより適切なリハビリ法の開発に繋げることである。初年度は、研究に必要な遺伝子改変マウスの準備と、運動麻痺を呈する動物モデルの作製を中心に計画を進めた。脳損傷モデルや脊髄損傷モデルを確立し、損傷の程度や損傷後の神経系細胞の動態を評価するための実験を行った。今後、これらの損傷モデルマウスを用いてリハビリテーションの条件検討を行う予定である。また、神経系細胞においてトランスクリプトーム解析を行うための準備を進める計画である。これにより、損傷後のリハビリテーションによる神経系細胞での遺伝子発現変化を明らかにすることができると考えられる。この研究課題に必要な遺伝子改変マウスの作製を終えることができた。また、計画通り、マウスの脳損傷モデルや脊髄損傷モデルを確立し、損傷の程度や損傷後の神経系細胞の動態を評価するための実験を開始することができたため。脳損傷モデルマウスを用いてリハビリテーションの条件検討を行う。また、神経系細胞においてトランスクリプトーム解析を行うための準備を進める予定である。
骨組織による神経を介したリンパ球分化増殖制御機構の解明

骨組織内骨細胞の選択的破壊モデルマウスの解析により、骨とは接していない胸腺のリンパ球造血ニッチを、骨細胞が液性因子を介さず制御している構図を明らかにした。これは、正常マウスと骨細胞除去マウスの並体接合による血液循環の共有モデルで骨細胞除去マウス側のみの胸腺細胞が激減することで証明された。また、同様の機構で全身の白色脂肪の保持や、脳と協調した肝臓での正常な脂肪蓄積にも骨細胞がかかわっていることも示し、骨組織を頂点とした多臓器間ネットワークの存在が見えてきた。これは、長期臥床患者や宇宙飛行士が急速に骨粗鬆症を発症すると同時にリンパ球の数や機能の低下など免疫異常を呈する機構を一部説明していると考えられる(論文投稿中)。これらの研究は、運動不足の現代人や近未来の宇宙移住などで骨細胞への刺激が減少する状況において、骨を標的とした多臓器機能保持という新たな治療戦略を提示する根拠となると思われる。これらの表現系が神経を介したものであるかどうかについての研究も予定通り行ったが、現在のところ明らかに神経を介しているという直接的な証拠は捉えられていない。しかし、液性因子を介していない可能性が高いことから今後も神経系のメカニズムへの関与を探っていく予定である(領域総括班池田恭治先生との共同研究)。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度には、骨組織内主要細胞成分である骨細胞がリンパ球造血に影響を与えている可能性について検証した。骨細胞特異的にジフテリア毒受容体を発現させたマウス(DMP1-DTR Tg)に15週齢でジフテリア毒を投与し骨細胞を死滅させた後、3週間後に骨髄B細胞、胸腺T細胞の数を確認したところ、いずれも著明な低下を来していることを確認した。造血幹細胞や骨髄球系細胞には数や機能の異常がみられず、これらの変化がリンパ球特異的であることを確認した。正常マウスとDMP1-DTR-Tgマウスをparabiosisにより血流を交流させ、骨細胞除去後も血流にのって正常リンパ球前駆細胞や液性因子が供給される状況でも、骨細胞除去マウス側の胸腺は同様の萎縮を示し、これが血球側の問題ではなく、リンパ球造血微小環境側の異常であることが示唆された。Bリンパ系骨髄長期培養システムを詳細に検討したところ、骨細胞除去マウス骨髄からはB細胞が産生されず、これが造血支持細胞の欠落に起因することが示された。これら、骨細胞除去に起因するリンパ球特異的造血支持細胞の異常は、更に約3ヶ月ののちには、骨細胞の再生とともにほぼ正常にまで回復した。これらの結果から、当初研究計画調書に記載した球心性神経シグナルの関与が強く示唆され、現在これが神経系を介した骨細胞からのシグナルの異常に基づくものであることを各種神経ブロックにより検証中である。研究計画調書に記した平成23年度の研究をほぼ計画通りに進めている。骨細胞とリンパ球造血の関係は、本研究全体においても最も重要な知見であり、研究結果も含めおおむね順調に進展している。既知の老化マウスモデルの解析については次年度行う予定である。今後は、現在までに得られた知見と神経系、特に研究計画調書に記載している脳視床下部からのシグナルとの関係を追求していく。
イネの栽培化過程におけるゲノムアダプテーション

紫黒米の起源となるKala4遺伝子の誕生過程を知るために、高精度マッピングとゲノム断片の単離により、原因変異を明らかにした。プロモーター領域の重複に加えて、同じ染色体の83kbp上流から11.0kbpのゲノム断片の挿入を確認した。また、形質転換実験により、この重複と挿入が黒米化の原因変異であることが明らかにした。加えて、アジアで栽培されている多くのイネ在来系統でのKala4遺伝子の状態を解析し、黒米化を起こすKala4遺伝子の変異は、熱帯ジャポニカと呼ばれるイネ亜種で起こり、その変異がイントログレッションによって、アジア各地域に伝搬した様子をゲノム変化から明らかにした。イネの栽培化過程における種子色の変化は、主に、野生種の赤米(果皮にタンニンを蓄積)から白米の変化であるが、イネ品種の中には、果皮にアントシアニンを蓄積し、黒色を呈し、黒米と呼ばれる系統が存在している。本課題では、その原因と考えられるKala4遺伝子を単離し、栽培化における変化を特定し、その変化を多様なイネ品種のゲノムの変化の中で、調査をする。また、黒米遺伝子の変化が起こった過程をゲノム情報や既知の栽培化関連変異の有無と比較することで推定する。今年度は、Kala4遺伝子のファインマッピングを行い、候補領域を約5kbに絞り込んだ。その5kbの中のDNA配列は、黒米色を示す系統とそうでない系統で変異がないので、エピジェネティックな変化による変異であると考え、現在、タイリングアレイ法によるDNAメチル化の解析とBisulfate法による変化を調査中である。また、Golden Gate法により、ゲノムワイドなイネ品種の多型解析を行い、黒米系統を約20系統調査したところ、インディカ型系統が7系統、熱帯ジャポニカ型系統が8系統、温帯ジャポニカ型系統が6系統、確認できた。その後、Kala4遺伝子領域のハプロタイプグループを解析したところ、すべての系統で、典型的な熱帯ジャポニカ型のタイプを示したことから、インディカ型品種も温帯ジャポニカ型品種も、イントログレッションによる遺伝子導入が栽培化過程、初期育種過程で起こったことにより、多様なゲノム背景を持つ黒米イネ系統が生まれたことを示唆する結果を得た。今年度は、去年度のファインマッピングでの約5kbの候補領域にDNAメチレーションの変化を示す領域を確認した。また、その領域がLINEタイプのレトロトランスポゾンの挿入によること。イネ品種内に挿入の有無があること、メチレーションが高いアリルが高発現であること。CGとCHGメチレーションの高く、CHHは低いことなどが明らかになった。このことは、LINEの挿入後、その活性を抑えるために、DNAのメチル化が進んだことが、コメ色を黒米にする転写因子の発現を組織・時期特異的に誘導する新規遺伝子が誕生したことを示唆している。また、前年度までに、黒米遺伝子が、多様なイントログレッションを経て、多様なゲノム背景を持つ黒米イネ系統が生まれたことを示唆する結果を得ているが、今年度は、その起源と想定されるゲノムと似たゲノムをもつイネ系統から、赤米2系統、白米2系統、黒米2系統を選び、ゲノムリシークエンス解析を行った。現在、その多様性の解析を進めているところである。目的:自生する野生稲から、作物である栽培イネへの変化過程で、ゲノムがどのように変化したかをエピジェネティック変異による形質獲得の広範な伝搬を例に明らかにする。研究成果要旨:野生稲は果皮にタンニンを蓄積し、赤米となるのに対し、我々が主に食しているのはタンニン合成系酵素の発現を制御する転写因子のDNA欠失変異が品種内に広がったものである。一方、本研究で、品種の一部にみられる形質である黒米(果皮にアントシアニン)が蓄積する)が、アントシアニン合成系酵素を制御する転写因子の異所発現が、交配遺伝で後半に広がったことを明らかにした。H25年度の研究成果の具体的内容:果皮にアントシアニンが蓄積する原因遺伝子を高精度マッピングした。その結果、bHLH転写因子をコードするKala4遺伝子に変異が座乗することを明らかにし、黒コシヒカリだけで、高度なDNAメチレーションを示す領域を候補領域内に見出した。

前年度、再マッピングにより候補領域が広がり、その中に、エクソンの一部の重複が起こったと考えられる多型が見出され、その配列の単離と、抑制変異体の確認から、DNAメチレーションは強い相関を示すだけで、エクソン重複時のDNA離アレンジメントで、新しいプロモータ活性をKala4遺伝子が獲得した結果、黒米遺伝子が創生したことが明らかになった。また、この領域は、組み換えが起きやすいことを示す結果を得た。また、他のイネの栽培化関連遺伝子として、イネの栽培化時に脱粒性の難化に関わった遺伝子の変化も解析している。すべての栽培イネ品種で欠損アリルを持つSh4遺伝子の機能型アリルが、形質転換体のみで、コメを大粒化する機能を持つこと、また、その大粒化形質は、交配でのイントログレッションでは、強い抑制を受けることを見出している。このエピジェネティックな発現抑制機構に関する成果も報告する。目的:自生する野生稲から、作物である栽培イネへの変化過程で、ゲノムがどのように変化したかをエピジェネティック変異による形質獲得の広範な伝搬を例に明らかにする。研究成果要旨:野生稲は果皮にタンニンを蓄積に、玄米が赤色に見えるのに対し、我々が主に色しているのはタンニン合成系の酵素の発現を制御する転写因子のDNA欠失変異が品種内に広がったものであることが明らかとなっている。本研究では、イネ品種の極一部に見られる形質で、イネの栽培化過程で創生された形質と考えられる黒米形質(果皮にアントシアニンが蓄積)が、ある特定の転写因子の重複等が原因である異所発現を起こす変異が、交配育種で広範に広がったことを明らかにした。この仕事は、現在、Plant Cell(IFが約10)で、in revisionとなっている。また、栽培化時に変異を受け、機能を失ったと考えられる脱粒性遺伝子sh4の機能型アリルが、おコメの粒サイズを顕著に大きくすることを見出した。この形質は形質転換した時のみに、確認でき、交配によって、野生稲のアリルを導入しても、大粒化は確認できなかった。そのため、相同性組み換えを利用した遺伝子導入法等を駆使して、解析したところ、ヒストンのメチレーション状態により、大粒化機能は野生稲アリルで抑制を受けていることを明らかにした。多機能な単独遺伝子の一部の機能のみが、エピジェネティックに抑制を受けていることを示した初めての遺伝子発現制御の事例である。アジアに自生する野生稲は、種子色は赤いが、多くの栽培アジアイネは、種子色は白い。これは、Rc転写因子の欠損変異でタンニン色素が合成できなくなっているからであるが、一部の栽培イネでは、アントシアニン色素貯める黒米品種の存在が知られており、この黒米形質は、イネの栽培化・初期の育種過程で、創出された新しい農業形質と考えられる。1.遺伝解析から、3つの遺伝子座が黒米化に関与しており、その中で、一番貢献が大きいQTL座であるKala4遺伝子を、高精度マッピングにより、約25kbの範囲に、候補領域を絞り込んだ。その中には、bHLH型の転写因子がコードされており、また、黒米系統でだけ、この遺伝子は果皮で発現している。そのため、この遺伝子がKala4遺伝子であると考えられた。イントロン内の5つのSNPが存在したが、Kala4転写産物量に大きな影響を与えそうな多型は見つからなかった。
イネにおけるオゾン耐性メカニズムの生理学的、遺伝学的な特性評価

イネにおいてオゾン存在下で高い乾物重を示す量的形質遺伝子座(QTL)OzT8を明確にする事を目的とした。Ozt8を含むSL46と、親系統である日本晴にオゾン照射実験(3週間を1期間)を繰り返し行い、光合成量、炭素同化量および乾物重を測定した。Ozt8座を含むイネ系統は、乾物重に対してだけでなく葉の光合成能や日々の炭素同化量に関しても、オゾン耐性を示す事が分かった。また、SL46はオゾン耐性ストレスにおいて日本晴よりも優れていた。また、OzT8遺伝子座は気孔伝道度には影響を及ぼさないことが明らかになった。このことから、OzT8における耐性は気孔閉鎖によりオゾンストレスを回避しているのではなく、むしろ葉内に浸透したオゾンに対して実際に何らかの耐性が存在するためと考えられる。OzT8系統のSL46は日本晴と比べると、21日間に及ぶオゾン暴露の後でも、オゾンストレス下で光合成能力の減退がかなり小さかった。これらの結果から、OzT8遺伝子座は葉内の光合成能力を維持することでオゾン耐性を付与するものであり、オゾン耐性増加のためのイネ品種改良にとって貴重な標的形質である。生殖成長期での実験から、OzT8は幼苗期に効果を発揮するだけでなく、特に生殖力への効果など、子実生産期にもOzT8効果が明白であった。オゾン暴露により、日本晴では成熟種子の割合が著しく減少したが、SL46では減少しなかった。同様な効果が一穂あたり種子重や植物個体あたりの総種子重にも見られており、SL46ではこうした生殖特性のいずれにおいても減退はなかった。マイクロアレイ・ホルモン分析は、ごく一部分を終えただけであり、現時点ではごく予備的な所見を示すにとどまる。日本晴はエチレン放出量増加を伴ってオゾンに反応していると見られており、こうした高エチレン水準がオゾンストレス下における日本晴の光合成減退に寄与している可能性があるものと思われる。SL46では、そのようなオゾン影響下でのエチレン放出量増加は見られなかった。これらの結果から、OzT8はエチレン放出を制限し、さらにルビスコの下方制御を防ぎ、それによって高い光合成能力を維持しながらイネを保護している、との仮説が導き出される。本研究は、オゾン存在下でのイネ(Oriza sativa L.)の耐性メカニズムを生理学的および生物学的に解明することを目的としている。これまでの研究において、オゾン存在下で反応する相対的乾物重に対する量的形質遺伝子座(QTL Ort8)解析を行った。Ort8を含む二品種、'日本晴'および'カサラス(SL37および46)'に対し、それぞれオゾン照射(1421日間、100-120ppb、8時間/日)を行い、CO_2排出および日中の光合成量を継時的に測定した。また、前回の実験では相対的乾物重に大きな変化は見られなかった為、今回はオゾン照射終了後に、葉の乾物重についても評価を行った。その結果、SL37および46の両品種はオゾン照射終了間近により高い光合成能、炭素同化値および気孔コンダクタンスを示した。これらの結果から、SL46は気孔コンダクタンスを通してオゾンダメージから自らを防御し、'日本晴'よりも全体の炭素吸収および葉の光合成能を優先的に維持している事が分かる。また、SL46が'日本晴'より高い生物量および収穫高が見込まれることから、今年度、検討を行う予定である。一方、SL34(Ort8遺伝子座ヘテロ接合体置換系統)に関して、ファインマッピングを行っている。Ort8遺伝子座領域内のSL34のジェノタイピング等を行う事によって均一な遺伝子座を持つ個体が増加した場合、オゾン照射後に乾物重に関する遺伝子座のファインマッピングを行う。本研究は、イネにおいてオゾン存在下で反応する相関的に高い乾物重を示す量的形質遺伝子座(QTL)OzT8を特徴づける事を目的としている。Ozt8を含むSL46が選抜され、親系統である'日本晴'と比較したオゾン照射実験(3週間を1期間)を繰り返し行い、光合成量、炭素同化値およびバイオマスに関して調査した。Ozt8座を含むイネ系統は、バイオマスに対してだけでなく葉の光合成能や日々の炭素同化値に関しても、オゾン耐性を示す事が分かった。また、SL46は、オゾン耐性ストレスにおいて'日本晴'よりも優れている事も示した。そこで、群馬県前橋市近くの圃場において、昨夏、SL46が'日本晴'よりもより高いバイオマスおよび収量を示すかどうか検定を行った。しかし、SL46と'日本晴'の間で収量の差異を得られなかった。同時に、同じ遺伝子型を持つイネの開花期にオゾン照射を行う事によって、生殖成長期に何らかの影響が与えられるかどうかを調べるために、光合成量、稔性および収量について調査した。その結果、SL46は野生型'日本晴'に比べて、高収量・低不稔である事が分かった。一方、イネにおける亜鉛欠乏ストレスとオゾンに対するストレスは、似たような葉の形態を示す。そのため、予備スクリーニング実験として、亜鉛欠乏に対して耐性をもつものと罹病性をもつと知られている遺伝子型を持つイネ系統が、オゾンストレスに対して同様の反応を示すかどうか調査した。その結果、全ての系統がオゾンに対して罹病性を示したが、系統間で葉の褐変化の兆候は見られなかった。また、藻のチトクロームであるC6タンパク質をイネに導入する事によって、光合成能が高まるかど計うかを現在、他の研究グループと調査している。

そして、JIRCASの石垣拠点にて行われている形質転換系統に関して、光合成能の実地調査を昨夏に行った。明確な結果は得られなかったが、現在進行中である。このように現在、多角的にオゾン耐性に関する研究が進められている。イネにおいてオゾン存在下で高い乾物重を示す量的形質遺伝子座(QTL)OzT8を明確にする事を目的とした。Ozt8を含むSL46と、親系統である日本晴にオゾン照射実験(3週間を1期間)を繰り返し行い、光合成量、炭素同化量および乾物重を測定した。Ozt8座を含むイネ系統は、乾物重に対してだけでなく葉の光合成能や日々の炭素同化量に関しても、オゾン耐性を示す事が分かった。また、SL46はオゾン耐性ストレスにおいて日本晴よりも優れていた。また、OzT8遺伝子座は気孔伝道度には影響を及ぼさないことが明らかになった。このことから、OzT8における耐性は気孔閉鎖によりオゾンストレスを回避しているのではなく、むしろ葉内に浸透したオゾンに対して実際に何らかの耐性が存在するためと考えられる。OzT8系統のSL46は日本晴と比べると、21日間に及ぶオゾン暴露の後でも、オゾンストレス下で光合成能力の減退がかなり小さかった。これらの結果から、OzT8遺伝子座は葉内の光合成能力を維持することでオゾン耐性を付与するものであり、オゾン耐性増加のためのイネ品種改良にとって貴重な標的形質である。生殖成長期での実験から、OzT8は幼苗期に効果を発揮するだけでなく、特に生殖力への効果など、子実生産期にもOzT8効果が明白であった。オゾン暴露により、日本晴では成熟種子の割合が著しく減少したが、SL46では減少しなかった。同様な効果が一穂あたり種子重や植物個体あたりの総種子重にも見られており、SL46ではこうした生殖特性のいずれにおいても減退はなかった。マイクロアレイ・ホルモン分析は、ごく一部分を終えただけであり、現時点ではごく予備的な所見を示すにとどまる。日本晴はエチレン放出量増加を伴ってオゾンに反応していると見られており、こうした高エチレン水準がオゾンストレス下における日本晴の光合成減退に寄与している可能性があるものと思われる。SL46では、そのようなオゾン影響下でのエチレン放出量増加は見られなかった。これらの結果から、OzT8はエチレン放出を制限し、さらにルビスコの下方制御を防ぎ、それによって高い光合成能力を維持しながらイネを保護している、との仮説が導き出される。
活性酸素種が関与する有機および金属有機化学反応の理論的研究

1)ジオキセタンの生成機構CASSCF{2,2}/6-31G^*法とMP2/6-31G^*法を用いて、反応の中間体および遷移状態を決定した。中間体である1,4-BRでは、結合C-Oを軸とした回転障壁は4.0kcal/molよりも小さく自由に回転すること、始原系とゴーシュ型1,4-BR中間体とを結ぶ遷移状態、および、1,4-BRからジオキセタンへの遷移状態を決定した。さらに高精度な手法であるCASPT2,CCSD,CCSD(T)から、この反応が、PEを経て進行するよりはむしろ1,4-BRを経て二段階機構で進行することが判った。2)ジオキセタンの分解機構MP4/6-31G^*法を用いて検討した結果、この分解反応は、まずO-O結合が切れ1,4-BRを形成し、その後C-C結合が切れてホルムアルデヒドが生成することが解った。これらの遷移状態を決定し、律速段階はO-Oの解離であり活性化エネルギーは20kcal/molであった。現在、ジオキセタノン、および、電子供与性置換基を付与し、生物発光のモデルとして検討を進めている。3) CcO活性部位のモデル計算Hemea_3のポルフィリン環およびヒスチジン残基のイミダゾール環をアンモニア分子に置き換えたモデルに対し、ab initio分子軌道法がら検討した。反応中間体である[a_3^<2+>,OO-CU_B^<1+>]および[a_3^<2+>-OO,CU_B^<1+>]の構造を決定した。特に酸素がa_3^<2+>に結合した構造では、酸素原子間の距離は1.47Åと非常に長くなっており、実験結果と良好な対応を示した。還元反応の初期段階を検討した結果、活性部位への酸素分子の付加と酸素分子のプロトン化が協奏的に起こっていると結論された。