hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体膜間オリゴ糖輸送におけるキャリアリピドのフリップ-フロップ転移過程の分子解析

真正細菌のペプチドグリカン層やリポ多糖などの生合成においては、糖キャリア脂質と呼称されるポリプレニルリン酸が親水性のペンタペプチドオリゴ糖などの輸送体として機能しており、高度に疎水的なリン脂質で構成される細胞膜間の動的反転輸送を行なっている。この、フリップ・フロップと呼ばれる細胞膜間の動的糖鎖輸送によって、細胞質で生合成された親水性のペンタペプチドオリゴ糖などを細胞表面にフリップ・フロップ輸送した後に、ウンデカプレニルリン酸の細胞質側への回収反応を触媒する酵素が存在しないと、細菌の高度に効率的な細胞分裂に伴う生活環を維持できない。この糖キャリア脂質の回収のためのフリップ・フロップ反応の存在を証明するために、NBD基を蛍光団とした蛍光ラベル基質を合成した。この蛍光プローブ基質を用いて、生体脂質二重膜の内層および外層に蛍光プローブ基質を導入させた後インキュベーションし、さらにジチオナイトを添加して細胞外層表面の蛍光を消失させ、その状態における蛍光光度を定量化することによる回収反応の測定法を確立したので、この測定法を枯草菌Bacillus Subtilisの細胞膜の内側に取り込ませたプローブの蛍光強度から蛍光プローブの取り込み活性を評価した。この系にトリプシンを添加してプロテアーゼ処理を行うと、プローブの取り込み活性が低下したが、この系にプロテアーゼ阻害薬を加えると取り込み活性の低下は回復した。このことから、このプローブの取り込み過程にはある種のタンパク質が関与していることを示唆する証明がなされた。真正細菌のペプチドグリカン層、リポ多糖などの糖鎖生合成機構では、糖キャリア脂質と呼ばれる長鎖イソプレノイドが、糖の輸送体として重要な役割を担っている。この輸送に伴って糖キャリア脂質が、基本骨格となる糖鎖と結合した状態で脂質二重層間の移動(フリップ・フロップ)を行い、膜の反対側で糖鎖合成が完成する。また、糖鎖を提供した糖キャリア脂質は再びフリップ・フロップしてリサイクルされると考えられている。この段階のフリップ・フロップの基質であるウンデカプレニルリン酸を蛍光標識したプローブの合成に成功し、このプローブと枯草菌Bacillus subtilisの細胞膜を利用したクエンチングアッセイにより内側に取り込まれたプローブの蛍光強度から蛍光プローブの取り込み活性を評価した。プロテアーゼ処理を行うとプローブの取り込みが低下し、また、プロテアーゼ阻害薬を入れるとその低下が回復した。このことから、このプローブの取り込み過程には蛋白質が関与していることが示唆される。ウンデカプレニルリン酸リサイクル過程には今のところ、脱リン酸化された後アルコールの形で単純拡散によってリサイクルされるという説と、一般にフリッパーゼと呼ばれるような蛋白質によってリン酸基が結合したままでリサイクルされるという説の二つがあるが、本研究は後者の説を支持するものと考えられる。細菌の細胞壁生合成機構、特にペプチドグリカン層の生合成機構は細菌が生存するために重要であり、いくつかの抗菌薬の標的となっている。そのため、この機構の詳細な解明は新規抗菌薬開発の足がかりになると考えられる。
知的財産権侵害に対する救済制度の研究－交渉促進規範としての救済法という観点から－

今年度は、複数主体が特許発明の分担実施を行う場合に、単独で特許発明の全部実施が行われた場合と同様の侵害責任を課し、救済を認めるべきかを検討した。デジタル技術・ネットワーク技術が急速に進歩する中、サーバやユーザー端末などがネットワーク上で結び付いたシステム全体について、物の発明あるいは方法の発明として特許権が成立することも多くなっている。このようなネットワーク関連発明においては、その実施行為に、サービス提供者、サーバ管理者、エンドユーザーなど複数の主体が関与し、各主体は当該発明の一部のみを実施しているが、全体として見れば発明の構成要件全てが実施されているというケースが生じうる。このような場合に、全体として見ればクレームの構成要件全てを充足する技術が無断実施されているにもかかわらず、実施を複数主体が分担しているという一事をもって常に侵害を否定し、特許権者に一切の救済を与えないことは、特許権侵害の迂回を容易とし、特許権保護を脆弱なものとしかねない。そこで、特許発明の一部実施を行ったに過ぎず、本来であれば侵害責任を負わない者に対し、実施行為の全部を行った者と同様の責任(差止めを受ける責任、特許法102条の推定規定の適用を受ける損害賠償支払いの(連帯)責任、刑事罰の対象となる責任。「一部実施による全部責任」)をいかなる理論的根拠・法律構成のもとで認めるべきかを検討し、成果を公表した。そのほか、知的財産権侵害に対する救済に関係する研究として、事実審口頭弁論終結時までに訂正の再抗弁を主張しなかったにもかかわらず、上告審で、その後に訂正審決が確定したことを理由に事実審の判断を争うことができるかという問題を扱った最高裁判決や、商標権侵害訴訟において無効審判除斥期間経過後に無効の抗弁や権利濫用の抗弁を提出できるかという問題を扱った最高裁判決の検討なども行い、その成果を公表した。知的財産権侵害に対する救済制度を考えるうえで近時重要となっている事案を分析するという当初の目的をおおよそ達成することができ、成果の公表を行うことができた。今後も引き続き、民事的救済(差止請求権・損害賠償請求権・不当利得返還請求権など)及び刑事罰という救済制度全体を横断的・総合的に分析し、当事者間の交渉を最大限促進させるために救済法をどのように活用すべきかを考察する。今年度予定していた国内出張のうち、調整が付かず断念したものがあった。今年度に引き続き、本研究課題に関連する文献・資料の購入を進める。また、本研究目的を達成するためには、実務的知見を獲得することが必要となる。そこで、学会や研究会等に参加し実務家と交流することで、実務的知見を獲得するとともに、研究成果の報告や意見交換を通して、本研究課題に関する議論を深める。そのための旅費を支出する。
極性応答的な着脱能をもつ分子コートを導入した発光性分子の創製

蛍光を利用したバイオイメージングにおける発光分子の細胞への導入においては、その分子の水溶性と脂溶性というの全く正反対の性質のバランスが重要となる。本研究では水中では分子がコートを着るようにシクロデキストリン(CD)に包み込まれて水溶性に、膜などの疎水的な環境ではそれを脱ぎ捨てて脂溶性となる発光分子の開発を試みた。発光性部位にBODIPYを選び、これをCDと連結させたところ、非常に幅広い極性の異なる溶媒系に対して良好な溶解性を示した。種々の検討から分子コート機構が示唆され、今後の新規な蛍光物質導入法のための有用な基礎的知見を得た。媒体の極性に応答して両親媒性部位による包接のオンーオフが起こる「分子コート」の概念の提唱と実証を目指して、界面を介した物質輸送における新機軸の手法の基礎を築くことを目的として検討を行った。ホスト部位には構造反転によるゲストの包接が可能なメチル化シクロデキストリン類を、発光部には優れた発光特性をもつジピリンのホウ素錯体を用いることで、水系溶媒中においては分子内包接錯体を形成するが、非極性媒体中では解離する分子システムを構築する。本年度はジピリンホウ素錯体を導入したメチル化シクロデキストリンの合成とその同定、および光学特性について測定を行った。βーシクロデキストリンを既知の方法に従って化学修飾し、1つの一級水酸基を残し、他の水酸基がメチル化されたシクロデキストリン誘導体を合成した。発光部となるジピリンホウ素錯体の配位子にはチオフェンを導入したジピリンを選び合成した。この含チオフェンジピリンホウ素錯体は発光特性が通常のジピリンホウ素錯体よりも長波長側にあり、バイオイメージングには適した分子となり得るからである。またこのジピリンのペリ位にはp-ヒドロキシフェニル基を導入し、上記のモノヒドロキシシクロデキストリンから得られたトシル体と反応させることで目的の発光部位を導入した化合物を合成した。同定は核磁気共鳴スペクトルや質量分析により行った。またこの化合物は600 nm以上に吸収および発光を有し、発光の量子収率はクロロホルム中で、約0.8と非常に高いことがわかった。現在、構造および光学特性の溶媒依存性について検討を進めている。媒体の極性に応答して両親媒性部位による包接のオンーオフが起こる「分子コート」の概念の提唱と実証を目指し、前年度に引き続き検討を行った。これまでと同様に、ホスト部位には構造反転によるゲストの包接が可能なメチル化シクロデキストリン類を、発光部には優れた発光特性をもつジピリンのホウ素錯体を用い、溶媒の極性に応じた構造変化を起こすことで水から低極性溶媒まで溶解可能な発光性分子システムの構築を目指し、研究を継続した。前年度に合成した含チオフェンジピリンホウ素錯体を導入したメチル化シクロデキストリン(per-Me-CD)については水の含有量が異なるアルコール中でのNMRの検討から、反転の可能性を示唆する結果は得られたものの、水溶性がシクロデキストリンを有するもののかなり低く目的の用途には不十分と判断された。主な原因としてジピリンホウ素錯体(BODIPY)部位の疎水性が考えられるため、これにオリゴエチレングリコール部位を導入した化合物を設計した。実際の合成は、α位にブロモ基を有するBODIPY誘導体とテトラエチレングリコール鎖を導入したボロン酸エステルチオフェン誘導体との鈴木-宮浦クロスカップリング反応と、続くper-Me-CD部位との連結反応により達成された。この色素について、重水/重メタノール溶媒の混合比を変えて1H NMR測定を行ったところ、全ての混合比で緑色の溶液が得られ、水に1 mM以上の濃度で溶解することが確認できた。つまり予想した通り水溶媒系への溶解度は十分に向上したことが明らかとなった。また、重水の比率が高くなるにつれて順にオープン型,キャップ型,そして分子間会合した会合型の3つの状態をとる可能性が示唆された。以上の結果は、分子コートの実現につながる有用な知見であり、側鎖の改良や発光部位となるBODIPYの構造最適化により、高い膜透過性をもつ分子コート型バイオイメージング物質の開発につながると考えている。当初設計した蛍光性プローブを導入したメチル化シクロデキストリンのための、良好な収率の合成経路を確立することができた。得られた化合物の構造も各種分光学的手法により確定することができた。また吸収および発光スペクトルの測定から、ジピリンのホウ素錯体をシクロデキストリンに導入することでその優れた光学特性は損なわれることなく維持されていることも明らかにすることができた。「分子コート」機能についての検討やバイオイメージングへの展開についてまさに開始できる段階で次年度を迎えることができたので、概ね順調に研究は推進できていると考えられる。

超分子化学初年度に合成を行った含チオフェンジピリンホウ素錯体を導入したメチル化シクロデキストリンの各種溶媒に対する溶解度を調べるとともに、水系溶媒における構造や光学特性を核磁気共鳴スペクトルや電子吸収スペクトル、蛍光スペクトル、絶対量子収率の測定等を行って調べ、目指した分子内包接が起こるかどうかについて検討する。水系溶媒に対する溶解度に問題がある場合は、ジピリン骨格へのオリゴエチレングリコール鎖の導入、シクロデキストリンとジピリンホウ素錯体間へのスペーサーの導入などによって構造最適化を行う。また、ジピリンのホウ素錯体の二量体についても同様の検討を行い、バイオイメージングに適した発光性分子の創出を図る。
花粉表層構造の形成機構とそのゲノム障壁における機能の研究

雌しべの先端にある柱頭は、付着した花粉が同種植物のものか異種のものかを認識し、同種の花粉のみを発芽させることができる。これは花粉表層にある物質を柱頭が認識しているためである。このような種間認識に関わる物質が何であるかはまだよくわかっていないが、花粉表面を覆う「エキシン」や「ポレンコート」がその働きを担っていると考えられている。エキシンやポレンコートの形成機構にはまだ不明な点が多いので、その解明を目的としてシロイヌナズナを材料に研究を行った。kaonashi4(kns4)突然変異体はエキシンが著しく薄くなる。電子顕微鏡観察から、エキシンの鋳型であるプライムエキシンの発達が悪いのがこの原因であることがわかった。また、プライムエキシンは減数分裂による小胞子の形成に先立って生合成が開始されることがわかった。kns4の原因遺伝子はガラクトース転移酵素をコードしていたことから、プライムエキシンはガラクトースを含む多糖であると推定された。ポレンコートにはステロールエステルなどの脂質やタンパク質が多量に含まれている。ステロールを生合成できない突然変異体flakypollen1(fkp1)の花粉は正常なポレンコートを形成できず、不稔になる。電子顕微鏡観察から、この変異体ではタペート細胞の脂質蓄積性オルガネラ、タペートソームとエライオプラストがいずれも正常に発達していないことがわかった。このことは、ステロールエステルを作るエライオプラストだけでなく、他の脂質やタンパク質成分を供給するタペートソームの発達にもステロールが重要であることを意味する。さらに、ポレンコート中には他の組織には見られない特殊な脂質が含まれることを見出し、この脂質の存在は花粉が正常な稔性を持つのに必須であることを明らかにした。雌しべの先端にある柱頭は、付着した花粉が同種のものか異種のものかを認識し、同種の花粉のみを発芽させることができる。エキシンやポレンコートの形成機構にはまだ不明な点が多いので、その解明を目的として研究を行った。エキシン形成機構については、エキシンが薄くなるkaonashi4(kns4)突然変異体の解析を中心に研究を行った。KNS4は四分子期の葯のタペート細胞で特異的に発現し、ゴルジ体に局在することを確認した。KNS4はエキシン形成初期にエキシンの鋳型として働くプライムエキシンの生合成に関与する酵素だと推定された。このほか、KNS7とKNS10のマップベースクローニングを行い、候補遺伝子を同定した。ポレンコートについては、柱頭による花粉認識に重要な働きをする物質がシロイヌナズナのポレンコート中に含まれていることを見いだし、その化学構造を決定した。CLV2タンパク質が分子シャペロンSHDと相互作用しうるかどうかを生化学的に検証した。大腸菌で発現させたリコンビナントタンパク質を用いてプルダウンアッセイと表面プラズモンアッセイを行い、いずれの方法でも両タンパク質の相互作用を検出することができた。CLV2がSHDのin vivoでのクライアントである可能性が示された。
フロンティアーが誕生する時:フィリピンにおける米国植民地主義に関する研究

従来、米国統治下フィリピンでのミンダナオ島支配は、植民地政府主導の開発政策の一環とされてきた。しかし本研究により、フィリピン人エリート政治家による積極的なキリスト教徒移住計画の法案化が前提にあることが判明した。同島へのフィリピン政治家の政治的・経済的関与、さらには米国植民地主義とフィリピン・ナショナリズムの共犯性も視野に入れながら、植民地国家フィリピン像を再検討する必要がある。本研究はフィリピン・ミンダナオ島が歴史的に「周縁」化される過程を、1898年から1946年までの米国植民地期に限定し、歴史(文字)資料と文化人類学的手法を併用して、考察することを目的としている。初年度にあたる平成18年度は、神話化されたミンダナオ島をめぐる植民地言説の形成を具体的に考察した。調査は米国国立公文書館(メリーランド州)と議会図書館(ワシントンD.C.)で、一次資料収集を行った。前者には、当時フィリピン植民地支配を担当した米国陸軍島嶼局(通称:BIA)の公文書が、後者の公文書セクションには米国軍人から寄贈された個人コレクションがそれぞれ保存されている。特に調査者は、フィリピン・ミンダナオ島をめぐるイメージ群がどのように変容し、新たに改変されていったのかを探るべく、植民地行政官、職業軍人、米国企業家、あるいはキリスト教徒フィリピン人政治家の資料(英語およびスペイン語)を収集した。その結果、次のような知見が得られた。(1)首都マニラを中心とするキリスト教徒フィリピン人政治家も、南部ミンダナオ島には興味関心を抱いており、積極的にキリスト教徒の移住を議会に働きかけていたこと、一方(2)南部ミンダナオ島でビジネスを展開する米国資本家は米国軍人と協力して、ミンダナオ島をフィリピンから切り離し、米国の領土の一部にしようとする動きが活発化していたこと、である。すなわち、当時米国と植民地フィリピンにはミンダナオ島をめぐって多様なアクター間で利害関係が錯綜しており、フィリピンにおける米国植民地支配は「支配者(米国・為政者)対被支配者(フィリピン・フィリピン人)」という、単純な二項対立構図では捉えきれないことが、理解できた。なお、本研究の成果の一部は、(1)平成18年7月第11回フィリピン研究大会全国フォーラムで「ミンダナオ島は誰のものか:ミンダナオ島分離独立要求とフィリピン自治要求問題(1905年-1913年」(於:中京大学)として、(2)平成18年11月第1回国際フィリピン研究会議にて、「Assimilation or Segregation:"Moro"Muslim Integration and Agricultural Colony Project in Cotabato, Mindanao」(於:東京グリーンパレス)として、それぞれ個人発表を行い、公表している。平成19年度は、宗主国米国が、植民地国家フィリピンの真の政治的主体をどのような存在と定義し、誰を具体的に想定し、さらに主体構築あるいは変革のために、どのような働きかけを具体的におこなったのかを考察した。現地調査は昨年度同様、米国国立公文書館(メリーランド州)と議会図書館(ワシントンD. C.)で一次資料収集を行った。と同時に京都大学東南アジア研究所図書室に所蔵されている日刊紙を閲覧も行った。(1)米国の対フィリピン植民地政策は、国内の利害対立から決して一貫したものではなかったこと、(2)米国内への反帝国主義運動からの批判をかわすためにも、植民地国家フィリピンの独立と自治付与を目標とした、同化政策推進の必要性あったこと、(3)被支配者であるフィリピン人をキリスト教徒と非キリスト教徒に分類し、植民地内にこつの異なる統治機構を導入する独自の政策が実施されたこと、が明らかとなった。このことから、米国は「文明化」されたキリスト教徒、とりわけそのエリート層(指導者層)と連携しながら、参政権や国民議会の設置など、自治付与に向けた大胆な取り組みを行う一方で、ミンダナオ島はイスラム教徒や非キリスト教徒高地民に対しては、自治を著しく制限するなどした軍部主導の政治支配を1903年から1913年まで継続したという、植民地国家フィリピンの固有性・特異性が浮かび上がった。ミンダナオ島に関していえば、同一植民地でありながら、植民地の中にもう一つの植民地、すなわち中央に支配される地方(周縁)の誕生という、フィリピン特有の植民地状況の重層性が確認できた。また、分断的植民地状況下での政治体制がコロニアル主体間にもポスト植民地期から現在まで影を落とす従属関係を必然的に持ち込むという興味深い結果も導き出せた。平成20年度は、米国による植民地統治が被支配者であるイスラーム教徒にとって、どめように経験されたのかを考察した。具体的には、米国植民地統治がどのように近代化・文明化の過程として現出したのかを、植民地プロジェクトにみる価値、観念、規範の内面化という視点より分析した。資料収集は昨年向様、京都大学東南アジア研究所図書室で所蔵されている英字新聞(マイクロフィルム)の閲覧した。

その結果、文明化を受容する被支配者であるイスラーム教徒、とりわけダトゥと呼ばれるエリート層は、米国植民地国家体制下において、自らの権益を維持するために、支配者に協力するなど、植民地制度・政策に積極的に関与した、しかし、他方で武力闘争といった抵抗運動を継続する弱小エリート層が存在するなど、対応に大きな偏差があった。ところカミ、1913年に米国の政権転換による対フィリピン植民地政策の変更、すなわちいわゆる「フィリピン化」政策導入により、植民地国家フィリピンの実権がキリスト教徒エリートに移譲された。それに伴い、キリスト教徒のミンダナオ島の実質的支配を警戒するあまり、イスラーム教徒の中には、米国の植民地支配継続支持というねじれが顕在化する。以後、米国からの独立要求するキリスト教徒エリート層と米国支配継続を要求するイスラーム教徒エリート層間の対立関係が構造化する。このことから、イスラーム教徒による文明化政策・プロジェクトの受容は、フーコーの指摘する「臣民化=主体化」論では十分に説明でさない。むしろ、米国支配継続支持は勢力を拡大しっっあったフィリピン人マジョリティであるキリスト教徒に対する牽制であり、自己の権益擁護と拡大を目的に、米国主導の文明化を擁護したというのがより適切である。
マイクロ流体フロー時分割赤外分光光度計の開発と酵素反応の短寿命中間体の解析

本研究では、これまで困難であった酵素反応の動的構造解析を実現する時分割赤外分光技術を確立した。20 nL単位で送液できる精密フローシステムを開発し、過去に開発したフェムト秒赤外レーザーベースの高感度赤外分光装置に組み込むことで、ケージド基質を用いた酵素反応のマイクロフロー・フラッシュ測定を可能にした。次に応用研究として、地球上の窒素循環を担う一酸化窒素還元酵素の酵素反応を時分割解析し、短寿命のNO結合型中間体の配位様式の解明に成功した。さらに、マイクロフロー・フラッシュ測定法をSACLAでの時分割結晶構造解析にも応用することで、NO結合型中間体の構造の可視化にも成功した。本研究の目的は、高輝度のフェムト秒赤外レーザーを光源に用いて、いまだ困難とされるフロー型の時間分解赤外分光装置を開発し、酵素反応の観測に応用することである。装置の第一の応用として、一酸化窒素還元酵素(NOR)の酵素反応を追跡し、国内外で論争中の反応機構に決着をつける。本年度は、光で反応を誘起する「フロー・フラッシュシステム」を開発し、ケージドNOを用いて、NOR反応の時間分解観測を試みた。このシステムは、励起光照射と同期して未反応試料を20ナノリットルずつマイクロ流路フローセル(光路長20 μm)に送液可能であり、収量の少ない膜タンパク質にも応用可能である。エキシマーレーザー(308 nm, 8 ns)からのUVパルスを励起光に用いて、ケージドNOからのNO放出を誘起した。NO還元反応は、活性部位である鉄二核中心(ヘム鉄と非ヘム鉄)に2分子のNOが配位することから始まる。NOの配位構造は反応機構を考える上で鍵となるが、NO結合型は短寿命であり実験的解析が困難なため、長年未解明であった。まず、励起光照射後500マイクロ秒の赤外スペクトルを測定した結果、反応生成物であるN2Oのバンドが観測され、ケージドNOを用いた反応系の有用性が確認された。次に、励起光照射後10マイクロ秒の赤外スペクトルを測定した結果、ヘム鉄に結合したNOのバンドと非ヘム鉄に結合したNOのバンドの2本が観測された。これはtrans型のNO配位構造(trans型反応機構)を支持しており、論争中の反応機構に決着をつける結果が得られた。フロー・フラッシュシステムを完成させ、NORの反応機構解明にまで至ったため本研究の目的は、高輝度のフェムト秒赤外レーザーを光源に用いて、いまだ困難とされるフロー型の時間分解赤外分光装置を開発し、酵素反応の観測に応用することである。装置の第一の応用として、一酸化窒素還元酵素(NOR)の酵素反応を追跡し、反応機構を解明する。1年目にフローフラッシュ測定装置を開発し、ケージドNOを反応トリガーに用いた反応系で、脱窒菌cNORのNO結合型中間体の観測に成功している。そこで2年目となる本年度は、NO結合型中間体の生成・消滅の時間変化を追跡するとともに、NO結合型中間体の次に現れるNO還元過程の中間体の観測を試みた。理論的には、2分子のNO間でN-N結合が形成されたhyponitrite(N2O22-)中間体の生成が示唆されている。しかし、我々の反応系ではNO結合型中間体の生成後は速やかにN2Oが生成し、NO還元過程を詳細に解析することができなかった。そこでプロトン輸送経路上のアミノ酸残基を置換した変異体(E57A)を調製し、反応速度を制御することで、NO還元反応の途中に現れる不安定な活性種の捕捉を目指した。E57AのNO還元活性はWTと比べて10%程度であった。今後はこの変異体の反応速度論解析を行う計画である。また本年度はフローフラッシュ測定装置を、脱窒カビNOR(P450nor)にも応用した。cNORと同様にケージドNOを反応トリガーに用いて、NO結合型中間体およびそれに続く中間体I(NO結合型がNADHによって2電子還元された中間体)の観測に成功している。cNORのhyponitrite中間体はまだ観測されていないものの、変異体の調製まではできており、来年度に繋げられたため。またcNOR以外にもP450norへと応用範囲が拡がり、研究が発展的に進んだため。昨年度は、脱窒菌由来NOR(cNOR)のキーとなる反応過渡種(NO活性型)の検出を目指して、プロトン輸送経路上のアミノ酸残基を置換した変異体E57Aを調製した。NO活性型はプロトン化により分解するので、変異導入によりプロトン化を律速段階にすることで、NO活性型の安定化を図った。E57Aの酵素活性はWTの10%程度であった。本年度はまず、E57Aの反応速度論解析を行なった。その結果、WTの酵素反応は3相性(数マイクロ秒、100マイクロ秒、数ミリ秒)を示す一方、E57Aではミリ秒の第3相が観測されず、反応は第2相で停止することが分かった。このことは第3相の過程にプロトン移動が関与していることを示している。現在、第2相で生成するプロトン移動直前の反応過渡種を時間分解赤外分光で詳細に解析しているところである。

また、cNOR以外にも脱窒カビ由来NOR(P450nor)の酵素反応を、時間分解赤外分光で観測し、NOが活性化した反応中間体の化学種を決定した(Fe(III)-NHO-)。また、SACLAを用いた時間分解X線結晶構造解析を行ない、反応中間体のNO配位構造の決定にも成功した。P450norの反応機構の全容解明に成功した。本研究では、これまで困難であった酵素反応の動的構造解析を実現する時分割赤外分光技術を確立した。20 nL単位で送液できる精密フローシステムを開発し、過去に開発したフェムト秒赤外レーザーベースの高感度赤外分光装置に組み込むことで、ケージド基質を用いた酵素反応のマイクロフロー・フラッシュ測定を可能にした。次に応用研究として、地球上の窒素循環を担う一酸化窒素還元酵素の酵素反応を時分割解析し、短寿命のNO結合型中間体の配位様式の解明に成功した。さらに、マイクロフロー・フラッシュ測定法をSACLAでの時分割結晶構造解析にも応用することで、NO結合型中間体の構造の可視化にも成功した。NOとN2Oの赤外バンドの時間変化を追跡する。また、変異体を用いて反応速度を制御しながら、NN結合形成時に現れる不安定反応過渡種(hyponitrite)の観測を試みる。一方、溶液混合システムを開発し、フロー型時間分解赤外分光装置の汎用化を目指す。cNORのE57A変異体を用いてNO還元過程の中間体(hyponitrite中間体など)の観測を目指す。またP450norについては、重水中でも酵素反応を観測し、NO伸縮振動の波数から中間体Iのプロトン化状態を明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。生物物理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
19世紀ヨーロッパ文学における「亡霊」のモチーフ

平成13年度の研究では、19世紀ヨーロッパ文学に登場する「亡霊」概念と文学的想像力、視覚的娯楽との関係との関わりを明らかにしようとした。また、2年間のまとめとして、19世紀ヨーロッパの亡霊物語か古代以来のパターンをどのように踏襲しながら近代性を獲得していったかを分析した。今年度の研究により得た知見は、主として次ページ「研究発表」のEtude Francaise掲載論文(2001年5月に早稲田大学で口頭発表したものにもとづく)に集約されている。この論文ではまず、亡霊物語を語る場と時間の特殊性(「夜伽」という形が典型)、話し手と聞きての交換可能性、見世物芸術との関連をおさえ、日本の江戸時代にみられた展開と類似した展開がヨーロッパ18世紀後半以降見られることを確認した。また、ヨーロッパではキリスト教の教義との関連で複雑な構造の見られる「信じる」という態度の歴史性と亡霊物語との関連を論じ、「信じる」行為と「書く」行為との間に見られるずれが文学に緊張を与え、そのことが文学という芸術の自律性と関わっていることを諭じた。つぎに、18世紀末以降展開した「ファンタスマゴリア」などの見世物において物理的に目に見える形で演出され、それに対応して文学でもしばしば「目の錯覚」や「機械仕掛け」として描かれた亡霊というモチーフが、ロマン主義から自然主義に至る文学において神秘思想・動物磁気・催眠術・精神病理学などと関連しながら、ついには人間の頭の中で結ばれる像として内化されていった経緯をたどった。なお、Textuelに掲載した論文は、中国起源の奇譚が江戸の浮世草子を経てL・ハーンによってロマン主義的に脚色された例を通し、「手書き文字」を仲介として書き手の分身(一種の「生霊」)が生ずるというモチーフをヨーロッパ文学の「分身」と比較しつつ論じたもので、「魂」の概念やその芸術品制作との関連を、文学における「亡霊」を論じるうえでさらに追究すべき問題として提起した。平成12年度の研究では、19世紀ヨーロッパ文学に登場する「亡霊」の概念と文学的想像力、さらに図像化との関係を追究し(項目1)、物語の構造と亡霊モチーフの関わりを明らかにしようと試みた(項目2)。今年度に予定していた「怪異を語る伝統」と「記載文芸」との関係については、当初把握していなかった複雑な問題(「信じる」ということの歴史性、「信じる」ことと「書く」ことの関係、現実と文学の関係、芸術としての文学の成立等)が含まれることに気づいたため、13年度に継続して成果をまとめることとした。1.日本語の「亡霊」にあたる英・仏・独の語彙を比較した結果、そこには大きくわけて「死者(時には生者)の魂の現前したもの」としての亡霊、及び「悪魔の介入する幻影としての亡霊」との二つの系譜があることがわかった。また、「亡霊」という概念の持つ時間性(記憶や忘却)・空間性(他界のイメージ)について考察し、それらの特徴が亡霊を主題とする図像(挿絵や文学的主題を持つ絵画)においてどのように表れているかを明らかにした。この項目の研究結果は、次ページ「研究発表」のEQUINOXE掲載論文、及び『比較文学』掲載論文(部分的に関連がある)にまとめた。2.アールネ・トムソンの国際話型分類を参照しながら、物語の構造の中で「亡霊」という登場人物の果たす役割について考察した。大きくは、人間的で保護者的・好意的な亡霊と、コミュニケーション不可能で一方的に恐怖をもたらす非情な存在としての亡霊とに分類できるが、さまざまな物語においてこれら二つの特徴はしばしば表裏一体となっている。ロン主義時代の文学作品に多く見られる「恋人の亡霊」というモチーフは、魅力と恐怖の共存を典型的に示しており、亡霊というモチーフの複雑さを示している。この項目に関する研究結果の一部が、『二画文學研究』に掲載した論文である。

なお、Textuelに掲載した論文は、中国起源の奇譚が江戸の浮世草子を経てL・ハーンによってロマン主義的に脚色された例を通し、「手書き文字」を仲介として書き手の分身(一種の「生霊」)が生ずるというモチーフをヨーロッパ文学の「分身」と比較しつつ論じたもので、「魂」の概念やその芸術品制作との関連を、文学における「亡霊」を論じるうえでさらに追究すべき問題として提起した。
fMRIと探索眼球運動の同時記録を用いた統合失調症の情動認知障害の脳内病態の解明

【はじめに】我々は、赤ん坊の「笑い」「泣き」顔を提示した時の、統合失調症者および健常者の視覚認知機i能を探索眼球運動で、脳内活動は扁桃体に注目しfMRIにて検討してきた。今回、視覚認知機能を最も反映する念押し課題を用いて同一被験者において探索眼球運動とfMRIを計測し検討したので報告する。【対象】統合失調症者(12名)と年齢をマッチさせた健常ボランティア(12名)を対象とした。統合失調症者は総て服薬中で、精神症状は、PANSSで評価した。総ての被験者に書面にて研究の内容を説明し同意を得た後計測を施行した。尚、当研究は久留米大学倫理委員会の承認を得ている。【方法】探索眼球運動は、アイマークレコーダーを用いて赤ん坊の「笑い」「泣き」写真を注視してもらい、念押し課題にて観察された10秒間の注視点総移動距離と注視点総数を解析した。fMRI検査は、1.5TのMRIを用いて50秒間に10回の全脳撮影を刺激有りと刺激無し時間を交互に与え行った。解析はSPM2を用い念押し課題における賦課部位を検討した。【結果】探索眼球運動の総移動距離および注視点総数は、「笑い」条件でのみ、統合失調症者群が健常者群より有意に短縮した。健常者群でのみ、総移動距離および注視点総数は、「笑い」条件が「泣き」条件より有意に増大した。fMRIでは、「泣き」条件で、健常群では扁桃体が賦活されたが、統合失調症群では賦活されなかった。「笑い」条件で、統合失調症群では左扁桃体は賦活されたが、健常群では賦活されなかった。「泣き」条件で、健常群では右前帯状回が賦活されたが、統合失調症群では左前帯状回が賦活された。「笑い」条件で、健常群では左右前帯状回が賦活されたが、統合失調症群では賦活されなかった。【考察】統合失調症者における扁桃体の異常な反応は前帯状回が関係している可能性が示唆された。今後、症例数を増すとともに同時記録が必要であると考える。統合失調症では表情認知機能や情動機能が障害されているとされている。今回、我々は、研究費補助金により統合失調症者の、「泣き」や「笑い」写真時の脳内病態をfunctional MRI (fMRI)と探索眼球運動を用いて健常者と比較検討した。本研究に先立ち、総ての被験者に本研究の主旨を書面にて説明し同意を得た。なお、当研究は、久留米大学倫理委員会の承認を得ている。脳画像測定方法は、1.5TのMRIスキャナー用いた。被験者にはMRIスキャナーの中に臥床してもらいヘッドフォンをした状態で、顔面上方に設置した鏡を通してスクリーンを見てもらうようにした。MRI画は、SPM2を用いて解析した。健常群は、「泣き」写真では扁桃体に賦活が観察されが、「笑い」写真負荷状態では扁桃体の賦活は観察されなかった。統合失調症群では、「泣き」写真および「笑い」

写真で扁桃体に賦活が観察された。この結果は、健常者には快刺激である「笑い」を統合失調症者は不快刺激と認知している可能性が示唆され、この扁桃体の不適切(ミスマッチ)な賦活が統合失調症者に指摘されている情動認知の障害の原因もしくは結果である可能性が強く考えられた。情動関連探索眼球運動においては、健常者群では、陰性感情「悲しみ;泣き」喚起に対する探索眼球運動が陽性感情「楽しい:笑い」喚起により、適切(マッチした)な探索眼球運動反応が生じ、陰性情動反応が陽性情動反応へとスイッチし探索眼球運動は回復した。しかし、統合失調症者群は、「悲しみ」に対する情動反応が持続し、陽性感情「笑い」喚起により、不適切(ミスマッチした)な「笑い」情動反応が生じ探索眼球運動は回復しなかった。これらの結果から、情動機能を認知機能の一部と考えれば、統合失調症者は情動に関連した認知機能に障害が存在すると考える。今後、科学研究費によりfMRIと探索眼球運動との同時記録を試みていく。【はじめに】我々は、赤ん坊の「笑い」「泣き」顔を提示した時の、統合失調症者および健常者の視覚認知機能を探索眼球運動で、脳内活動は扁桃体に注目しfMRIにて検討してきた。今回、視覚認知機能を最も反映する念押し課題を用いて同一被験者において探索眼球運動とfMRIを計測し検討したので報告する。【対象】統合失調症者(12名)と年齢をマッチさせた健常ボランティア(12名)を対象とした。統合失調症者は総て服薬中で、精神症状は、PANSSで評価した。総ての被験者に書面にて研究の内容を説明し同意を得た後計測を施行した。尚、当研究は久留米大学倫理委員会の承認を得ている。【方法】探索眼球運動は、アイマークレコーダー用いて赤ん坊の「笑い」「泣き」写真を注視してもらい、念押し課題にて観察された10秒間の注視点総移動距離と注視点総数を解析した。fMRI検査は、1.5TのMRIを用いて50秒間に10回の全脳撮影を刺激有りと刺激無し時間を交互に与え行った。解析はSPM2を用い念押し課題における賦課部位を検討した。【結果】探索眼球運動の総移動距離および注視点総数は、「笑い」条件でのみ、統合失調症者群が健常者群より有意に短縮した。健常者群でのみ、総移動距離および注視点総数は、「笑い」条件が「泣き」条件より有意に増大した。fMRIでは、「泣き」条件で、健常群では扁桃体が賦活されたが、統合失調症群では賦活されなかった。「笑い」条件で、統合失調症群では左扁桃体は賦活されたが、健常群では賦活されなかった。「泣き」条件で、健常群では右前帯状回が賦活されたが、統合失調症群では左前帯状回が賦活された。「笑い」条件で、健常群では左右前帯状回が賦活されたが、統合失調症群では賦活されなかった。【考察】統合失調症者における扁桃体の異常な反応は前帯状回が関係している可能性が示唆された。今後、症例を増すとともに同時記録が必要である。
大型ミューオンテレスコープによる太陽フレアと銀河宇宙線の異方性の研究

大規模な太陽フレアの発生などによりCME(Coronal Mass Ejection)が生じ,その影響により地球上において磁気嵐や時には大規模な停電など種々の影響を受ける事が知られている。この様な現象の発生メカニズムとCMEの伝播等に関して,その基礎的理解をより良く図るために,今回の研究は計画された。既に,我々はインドのウーティ山において同様の観測を実施しており,それと殆ど同型の装置を明野観測所において建設し,約7,000km離れた地点で立体的に現象を観測する。これだけの大面積(75m^2と600m^2)を持つ狭角望遠鏡はこれまでの観測史上初めてであり,より統計精度の良い観測が期待出来る。平成17年9月現在では本研究費補助金によって,明野観測所において2台(50m2)の新しい検出器が稼働中である。3台目の観測装置は比例計数管部分の組み立てが終了し,データ記録回路、インターフェース回路,トリガー回路などを大阪市立大学において製作中であり,来年度早々に装置に組み込んで観測を開始出来る予定である.現在使用中の光ファイバーによるネットワークシステムはAGASA実験に固有のシステムであるので,故障した場合廃棄される予定であるので,公衆回線を通したADSL化を進めている.平成16年7月30日,31日に銀河系宇宙線のロスコーン型の異方性と見られる一次宇宙線の異方性が,明野観測所とウーティ山宇宙線観測所の両方の同時観測の解析から天球上の同一方向に観測された.惑星間磁場にボトルネック構造によるロスコーン損失を計算で求めてみると,観測された異方性は非常にうまく再現する事が出来た.これは世界で初めてこの様な異方性が直接観測された例として特筆に値するものと考えている.この現象に関する詳しい報告は8月にインドのプーナで開催される第29回宇宙線国際会議で報告を行った.大規模な太陽フレアの発生などによりCME(Coronal Mass Ejection)が生じ,その影響により地球上において磁気嵐や時には大規模な停電など種々の影響を受ける事が知られている。3台目の観測装置は比例計数管部分の組み立てが終了し,データ記録回路、インターフェース回路,トリガー回路などを大阪市立大学において製作中であり,来年度早々に装置に組み込んで観測を開始出来る予定である.現在使用中の光ファイバーによるネットワークシステムはAGASA実験に固有のシステムであるので,故障した場合廃棄される予定であるので,公衆回線を通したADSL化を進めている.平成16年7月30日,31日に銀河系宇宙線のロスコーン型の異方性と見られる一次宇宙線の異方性が,明野観測所とウーティ山宇宙線観測所の両方の同時観測の解析から天球上の同一方向に観測された.惑星間磁場にボトルネック構造によるロスコーン損失を計算で求めてみると,観測された異方性は非常にうまく再現する事が出来た.これは世界で初めてこの様な異方性が直接観測された例として特筆に値するものと考えている.この現象に関する詳しい報告は8月にインドのプーナで開催される第29回宇宙線国際会議で報告を行った.大規模な太陽フレアの発生などによりCME (Coronal Mass Ejection)が生じ,その影響により地球上において磁気嵐や時には大規模な停電など種々の影響を受ける事が知られている。この様な現象の発生メカニズムとCMEの伝播の様子などの基礎的理解をより良く図るために今回の研究は計画された。これだけの大面積(100m^2と600m^2)を持つ狭角望遠鏡は他に見られない。追加研究として採用して頂いたので実際の建設などの具体的な準備は11月から開始した。1.1月初旬に東京大学宇宙線研究所の明野観測所において比例計数管200本を用いた最初の1モジュール(25m^2)を建設した。2.データ記録回路、インターフェース回路,トリガー回路などはインドにおいて製作、調整の後,2月下旬に持ち帰り、最終テストなどを大阪市立大学において行った。3.3月下旬に再び明野観測所において,データ記録回路とPCとのインターフェース回路の組み込みとそのテスト,PCの立ち上げ等を行った。その後予備観測を行い所定の性能が得られていることを確認した。本観測は5月に開始する予定である。なお,残りの3モジュール(75m^2)は9月初旬から建設を行う予定である。一方、ウーティ山における観測は継続して行っており、フォービュッシュ減少の前兆現象の観測などを物理学会で発表した。この事は大規模な太陽フレアによって磁気嵐が生じる時期を,数時間1日前に予報する事が出来る可能性を示唆しており,宇宙天気予報に大きな貢献が出来ることを意味している。

大規模な太陽フレアの発生などによりCME(Coronal Mass Ejection)が生じ,その影響により地球上において磁気嵐や時には大規模な停電など種々の影響を受ける事が知られている。この様な現象の発生メカニズムとCMEの伝播の様子などの基礎的理解をより良く図るために今回の研究は計画された。既に,我々はインドのウーティ山において同様の観測を実施しており,それと殆ど同型の装置を明野観測所において建設し,約7,000km離れた地点で立体的に現象を観測する。これだけの大面積(100m^2と600m^2)を持つ狭角望遠鏡は他に見られない。1.昨年度に設置し、調整中であった一台目の観測装置の本観測を11月初旬から開始した.2.平成16年1月に明野明野観測所において比例計数管400本を用い2台のミューオン観測装置(計50m^2)の建設を終えた.3.これら2台分の観測装置用のデータ記録回路、インターフェース回路,トリガー回路などの製作および最終テストを大阪市立大学において行った。3.4月下旬に明野観測所において,データ記録回路およびPCとのインターフェース回路の組み込みとそのテスト,ネットワークシステムの立ち上げ等を行う予定である.3台(75m^2)のミューオン観測装置による本観測は平成16年6月頃に開始できる予定である.福岡における春の日本物理学会において明野観測所における結果とウーティ山における結果の比較を行い、フォービュッシュ減少の前兆現象の観測などを発表する予定である.これまでの、ウーティ山における観測の詳細な解析から、一定規模以上の太陽フレアの約30%に関しては、磁気嵐が生じる時期を,数時間前に予報する事が出来ることが明らかになった.このことは宇宙天気予報などに大きな貢献が出来ることを意味している。1.1台目の観測装置(25m^2)は昨年度11月から本観測を開始し,現在も観測を継続している.2.2台目の観測装置は平成16年12月から明野観測所において観測を開始した.3.3台目の観測装置は比例計数管部分の組み立てが終了し,データ記録回路、インターフェース回路,トリガー回路などを大阪市立大学において製作中であり,来年度早々に装置に組み込んで観測を開始出来る予定である.4.現在使用中の光ファイバーによるネットワークシステムはAGASA実験に固有のシステムであるので,故障した場合廃棄される予定であるので,公衆回線を通したADSL化を進めている.以上は観測装置に関する報告である.明野観測所とウーティ山宇宙線観測所の両方の観測結果の解析から,平成16年7月30日,31日に銀河系宇宙線の異方性が同時に観測された.
マイクロアレイによる、卵巣明細胞腺癌に有効な薬剤の探索

卵巣癌細胞株のマイクロアレイ解析によって、明細胞腺癌を特徴づける遺伝子群を同定した。その結果、1)卵巣明細胞腺癌を特徴づける遺伝子群には、チョコレートのう胞内の酸化ストレス環境によって上昇する遺伝子が多く含まれること、2)明細胞腺癌は腎細胞癌と類似し、キナーゼ活性との関連が深いRas活性が高く、増殖能との関連が深いE2F活性が低いことを明らかにした。したがって、明細胞腺癌に対して、増殖をターゲットとする抗がん剤ではなく、キナーゼ活性を阻害する分子標的薬が有用と考えられた。1)卵巣癌組織のOncogene活性解析卵巣癌組織のマイクロアレイ解析によって、明細胞腺癌はSrc活性が高いことが示唆された。リン酸化活性化Srcの量ををWestern blottingで調べると、明細胞腺癌で活性が高いことがわかった。明細胞腺癌は化学療法に抵抗性であるが、今回の結果から、明細胞腺癌にはSrc inhibitorが治療薬として有効である可能性がある。2)卵巣癌のメチル化解析卵巣癌細胞株に5Aza-dCを添加してマイクロアレイを行って予測したメチル化360遺伝子のリストを用いて、卵巣癌組織のクラスタリングを行うと、組織型別に明瞭に分かれることがわかった。とりわけ、明細胞腺癌は他と異なるメチル化プロファイルであることがわかった。この知見は、明細胞腺癌の発生機序の解明や、メチル化阻害剤の臨床応用に向けて、有用である。3)卵巣癌細胞株のマイクロアレイ解析元々の組織型が明らかな卵巣癌細胞株を39種類集め、RNAを抽出して、マイクロアレイを施行した。明細胞腺癌細胞株を特徴づける遺伝子群は、臨床検体においても、明細胞腺癌組織を特徴づけることがわかり、細胞株と臨床検体が相関することが明らかになった。4)卵巣癌細胞株の化学療法感受性卵巣癌細胞株のシスプラチンへの感受性を調べると、卵巣明細胞腺癌細胞株は、それ以外に比べてシスプラチンに対して抵抗性であることがわかった。したがって、明細胞腺癌を特徴づける遺伝子群には、シスプラチン抵抗性遺伝子が含まれている可能性がある。もとの組織型の明らかな卵巣癌細胞株を38種類集めてマイクロアレイを行い、さらに、Websiteの臨床データと比較することによって、明細胞腺癌を特徴づける"Clear Cell Signature"を同定した。Clear Cell Signatureの解析により、以下のことが明らかとなった。1) Clear Cell Signatureは、再現性をもって、他のマイクロアレイデータセットにおいても、明細胞腺癌を同定した。さらに、RT-PCRによって、細胞株と臨床サンプルを調べることによっても、その再現性を確認できた。2) Clear Cell Signatureに含まれる遺伝子は、鉄やチョコレートのう胞の内容液を不死化卵巣表層上皮細胞に添加することにより有意に発現上昇し、チョコレートのう胞という環境因子を反映している。3) Clear Cell Signatureに含まれる遺伝子には、kidnery developmentというGO termが濃縮しており、さらにclustering解析によって、明細胞腺癌細胞株と、腎細胞癌細胞株はきわめて類似していた。卵巣明細胞腺癌細胞株RMG-2を用いて、腎細胞癌で使われているSorafenibのin vivoでの抗腫瘍効果を検討した結果、きわめて有効であることがわかった。このことは、明細胞腺癌において、E2F活性が低いがRas活性が高いというマイクロアレイデータと関連している可能性がある。今後は卵巣明細胞腺癌に対して、Sorafenibの臨床試験を検討すべきである。
新規分泌分子ILEIの加齢に伴う発現低下がアルツハイマー病の一次要因となり得るか

我々は脳内Aβ産生を抑制するタンパク質ILEI/FAM3Cを同定し、老化やアルツハイマー病(AD)では脳内発現が負に制御されることを示してきた。本研究では、ADの基本病態である脳内Aβ蓄積をきたす一次的原因を解析し、発症前診断法や先制治療法の開発に資することを目的としている。1加齢に伴う脳内ILEI発現低下のメカニズム解明・ILEI転写因子の同定:前年度に続き、ILEI転写因子の特定を進めた。マウス神経系細胞Neuro-2aやHEK293細胞株等に対し、レポーターアッセイで特定したILEI転写制御領域への結合が予測される候補因子に関して強制発現、ノックダウン等を施し、前年度に作製したルシフェラーゼ型レポーターによるILEI転写活性の定量に加え、real-time RT-PCRやウエスタンブロットによりILEIの発現変化を定量解析することによりILEIの転写因子の解析を進めた。これらの解析により、ILEI発現亢進させる候補因子を3個、発現抑制する候補因子を3個得た。2脳内ILEI発現レベルの減少がAD発症のリスク因子となることの検証・ILEI-floxedマウスの作製: ILEI遺伝子の開始コドンを含むエクソン2を挟む形でloxP配列を挿入するジーンターゲティングを行ったES細胞を用い、6ラインのILEI-floxedキメラマウスを得たが、いずれもgermline transmissionが認められなかった。そこで、ゲノム編集CRISPR/Cas9により、作製したところ、ILEI-floxedアレルを持つマウスを得られた。得られたILEI-floxedマウスのうち3ラインの産仔でloxP挿入されたアレルを確認できた。続いて、目的のコンディショナルノックアウトマウスを得るため、App(NL-F)マウスおよびCaMKII-CreERT2マウスと掛け合わせを進めている。1加齢に伴う脳内ILEI発現低下のメカニズム解明・ILEI転写因子の同定:前年度に引き続き、ILEI転写因子の特定を進めており、候補因子が得られている。マウス神経系細胞株Neuro-2aや非神経系細胞株HEK293等に対し、特定したILEI転写制御領域への結合が予測される候補因子に対し、強制発現、ノックダウン等を施し、real-time RT-PCRやウエスタンブロット等によりILEIの発現変化を定量解析することによりILEIの転写因子の解析を進め、ILEI発現亢進させる候補因子を3個、発現抑制する候補因子を3個得た。2脳内ILEI発現レベルの減少がAD発症のリスク因子となることの検証・ILEI-floxedマウスの作製: ILEI遺伝子へのジーンターゲティングを行ったES細胞を用い、計6ラインのILEI-floxedキメラマウスを得たが、いずれもgermline transmissionが認められなかった。そこで、ゲノム編集CRISPR/Cas9を用い、ILEI-floxedマウスを作製したところ、得られたILEI-floxedマウスのうち3ラインの産仔でloxP挿入を確認できた。目的のコンディショナルノックアウトマウスを得るため、App(NL-F)マウスおよびCaMKII-CreERT2マウスと掛け合わせを進めている。1加齢に伴う脳内ILEI発現低下のメカニズム解明・ILEI転写因子の同定:前年度より継続し、ILEI転写因子の特定を行う。得られた候補因子の強制発現、ノックダウン等を施し、ルシフェラーゼ型レポーターによるILEI転写活性の定量に加え、real-time RT-PCRやウエスタンブロットによりILEIの発現変化を定量解析し、ILEIの転写因子を特定する。加えて、加齢によるILEI転写低下機構の解析を行う。2脳内ILEI発現レベルの減少がAD発症のリスク因子となることの検証・ILEI-icKOマウスの解析:前年度に引き続き、ILEI-floxedマウスとCaMKII-CreERT2マウス、APP(NL-F)マウスの交配によるAPP(NL-F);ILEI-icKOマウスの作出を進める。タモキシフェン投与によるILEI遺伝子欠損誘導後の脳Aβ蓄積の経時的変化と記憶障害出現について、行動実験や脳組織および脳髄液に対するELISA、ウエスタンブロット、免疫組織化学等の実験を行い、陰性対照マウスと比較評価を行う。3脳内ILEIレベルが発症前ADのバイオマーカーとして成立することの検証AD及び軽度認知機能障害(MCI)患者の髄液中ILEI定量:AD及びMCI患者の髄液のILEI定量解析を進め、髄液中ILEIレベルが発症前ADのバイオマーカーとなるかどうかを明らかにする(髄液サンプル収集は新潟大学で行う。)。我々は脳内Aβ産生を抑制するタンパク質としてILEI/FAM3Cを同定し、老化やアルツハイマー病(AD)では脳内発現が負に制御されることを示してきた。1加齢に伴う脳内ILEI発現低下のメカニズム解明[1-1]ILEI遺伝子の転写調節領域解析:ヒトILEI遺伝子転写開始点上流約8kbをクローニングし、Luciferaseレポーターアッセイで解析した。転写開始点上流から段階的に短縮し、さらに領域を区切り、領域特定を進めたところ、転写開始点上流約-49bp-20bpに顕著な転写活性が認められた。[1-2]転写因子アレイによるILEI転写因子の同定:神経系細胞株SH-SY5YでILEI発現抑制性候補因子GSP2、DMAP