hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フライングホットワイヤ法を用いたおう壁面上の乱流境界層内の縦うずの動的挙動の解明

凸壁面上の乱流境界層では流線曲率の不安定効果に伴う縦渦の空間的安定、不安定性を明らかにすることが重要な課題である。そこで、本研究はこの縦渦の動的挙動を定量的に解明することを目的とした。縦渦の動的挙動の測定方法として、凸壁面から一定の距離を離れて曲がり流路のスパン(z)方向に等速度直線往復運動をするフライングホットワイヤ(FHW)装置を開発する。16ビットの汎用マイコンを制御に用い、スパン方向の速度Wの経時変化を測定するシステムを完成した。熱線プローブの移動速度(バイアス速度)は、スレッドに取り付けたフォトインターラプタが±0.007mmの精度で2mm間隔のスリットを横切る移動時間を10MHzのクロックでカウントすることにより算出する。全行程の中央部の120mmの区間においてバイヤス速度5m/sが得られた。熱線流速計の出力電圧は同時に4チャンネルのサンプリングが可能な12ビットのADCを用いてAD変換する。一台のマイコンはFHW装置の制御に用い、速度データの算出は、制御用とは異なるマイコンを用いる。本システムは単一の熱線流速計を用いることにより、二方向の速度成分UおよびWが算出可能である。ここで、FHW法の測定精度を確認する上で、一組の三角翼からなるボルテックスジェネレータの後流に発生する流れ方向に軸をもつ縦渦の動的挙動を明らかにした。続いて、長方形断面を持つ曲り流路のスパン方向の各位置における速度Wの測定結果より、縦渦の動的挙動を明らかにした。ボルテックスジェネレータ後流に発生する縦渦は定常的に存在すると考えられる。一方、凸壁面上の縦渦は3secの周期で発生および消滅を繰り返す結果を得た。本FHW法はノーマル形熱線流速計を用いて二方向の速度成分が測定出来、マルコセンサを用いると高い周波数をもつ流れ場の測定が可能となるために今後の発展が期待できる測定法である。おう壁面上の乱流境界層では流線曲率の不安定効果に伴う縦うずの空間的安定,不安定性を明らかにすることが重要な課題である.そこで,本研究はこの縦うずの動的挙動を定量的に解明することを目的とした.縦うずの動的挙動の測定法として,おう壁面から一定の距離を離れて曲り流路スパン方向(z方向)に等速直線往復運動するフライングホットワイヤ装置を設計製作する. 16ビットの汎用マイコンを用いて制御し,速度Wの経時変化を測定するシステムを慣性させる.往復直線運動する熱線プローブの移動速度(バイアス速度)は,駆動用のACモータに取り付けたエンコーダと,フライングホットワイヤ本体に取り付けた±0.007mmの精度で2mm間隔のスリットの間のスレッドの移動時間との両者を用いて算出する.フライングホットワイヤ装置は流路中央の120mmの区間においてバイアス速度5m/sが得られ,設計目標が達成された.おう壁面上の流れ場の熱線出力の時系列データを高速かつ同時にデータサンプリングが可能なADボードを用いてAD変換する.一方,熱線出力をFFTアナライザでモニタすることによりノイズの影響を受けないデータのみを収録することが出来る.そして,流路スパン方向の速度Wの測定結果より,縦うずの動的挙動を明らかにした.ところで,全測定データに対して予想外にノイズの影響を受けるデータが多いため,ノイズに強くかつノイズを発生しにくいシステムとする必要がある.また,フライングホットワイヤ装置の制御とデータの収録をそれぞれ別のマイコンに分担させることにより,測定結果が早く得られるシステムにすることが次年度の目標である.

凹壁面上の乱流境界層では流線曲率の不安定効果に伴う縦渦の空間的安定、不安定性を明らかにすることが重要な課題である。そこで、本研究はこの縦渦の動的挙動を定量的に解明することを目的とした。縦渦の動的挙動の測定方法として、凹壁面から一定の距離を離れて曲がり流路のスパン(z)の方向に等速度直線往復運動をするフライングボットワイヤ(FHW)装置を開発する。16ビットの汎用マイコンを制御に用い、スパン方向の速度Wの経時変化を測定するシステムを完成した。熱線プローブの移動速度(バイヤス速度)は、スレッドに取り付けたフォトインターラプタが±0.007mmの精度で2mm間隔のスリットを横切る移動時間を10MHzのクロックでカウントすることにより算出する。全行程の中央部の120mmの区間においてバイアス速度5m/sが得られた。熱線流量計の出力電圧は同時に4チャンネルのサンプリングが可能な12ビットのADCを用いてAD変換する。一台のマイコンはFHW装置の制御に用い、速度データの算出は、制御用とは異なるマイコンを用いる。本システムは単一の熱線流量計を用いることにより、二方向の速度成分UおよびWが算出可能である。ここで、FHW法の測定精度を確認する上で、一組の三角翼からなるボルテックスジェネレータの後流に発生する流れ方向の軸をもつ縦渦の動的挙動を明らかにした。続いて、長方形断面を持つ曲がり流路のスパン方向の各位置における速度Wの測定結果より、縦渦の動的挙動を明らかにした。ボルテックスジェネレータ後流に発生する縦渦は定常的に存在すると考えられる。一方、凹壁面上の縦渦は3secの周期で発生および消滅を繰り返す結果を得た。本FHW法はノーマル形熱線流速計を用いて二方向の速度成分が測定出来、マルチセンサを用いると高い周波数をもつ流れ場の測定が可能となるために今後の発展が期待できる測定法である。
コンクリートのトレーサビリティ管理システム開発に向けての基礎研究

コンクリートのトレーサビリティを確保するための方策の1つとして、各種履歴情報または識別番号を記録したICタグをコンクリート自身に投入する管理システムの開発を目指ざしている。その前段階として、本研究ではコンクリート中に投入されたICタグの通信距離と指向性を明らかにし、コンクリートへのICタグ必要投入個数を計算する方法を提案した。また、コンクリート中に投入されたICタグがコンクリートの耐久性に悪影響を及ぼさないかどうかについて実験的調査を行った。コンクリートのトレーサビリティを確保するための方策の1つとして、各種履歴情報を記録したICタグをコンクリート自身に投入する管理システムの開発を目指ざしている。その前段階として、本研究はコンクリート中に投入されたICタグの通信距離と指向性を明らかにし、コンクリートへのICタグ必要投入個数を計算する方法の提案を目的とする。また、コンクリート中に投入されたICタグがコンクリートの耐久性に悪影響を及ぼさないかどうかについて実験的調査を行う。平成24年度は、以下の研究を実施した。(1)コンクリート中のICタグとリーダ/ライタとの無線通信距離・指向性の調査通信に使用する周波数帯(HF帯、UHF帯)、形状・寸法の異なる8種類のICタグをそれぞれ1個ずつ埋め込んだ球形のコンクリート試験体を作製し、各方向からの通信の可否および通信距離を調べた。(2)ICタグを埋め込んだコンクリート試験体の乾湿繰り返し実験コンクリート中に投入されたICタグがコンクリートの耐久性に悪影響を及ぼさないかどうかを調べるため、乾湿繰り返し実験を行った。コンクリートは乾燥により収縮するが、ICタグのケース部分の樹脂がコンクリートの収縮を拘束してひび割れが発生するかどうかを調べたところ、異常は認められなかった。当初の計画に従って順調に実験を行うことができた。今後、これらの成果の論文投稿および学会発表を予定している。平成25年度は、以下の研究を実施する予定である。1.コンクリート中に投入されたICタグは任意の位置・角度に分布し、必ずしも通信に有利な位置および向きが確保されるとは限らない。そこで、生コンクリート工場でコンクリートを練混ぜ、8種類のICタグをそれぞれ5個ずつ投入し、実部材を模擬した試験体の型枠に打ち込む。この実験により、ICタグの分布傾向や角度の確率等が把握する。指向性の調査結果と組み合わせることにより、コンクリート中に投入するICタグの必要個数の計算方法を検討する。なお、必要個数とは必ず1つは通信可能な位置・角度にICタグが分布するためには何個のICタグを投入したらよいかという指標を表すものである。2.コンクリート中に投入されたICタグがコンクリートの耐久性に悪影響を及ぼさないかどうかを調べるため、温冷繰り返し実験を行う。ICタグのケース部分の樹脂とコンクリートの熱膨張率の違いに起因して、コンクリートにひび割れが発生するかどうかを調べる。3.コンクリートのトレーサビリティ確保のためには、どのような情報をどのタイミングで記録したらよいかを含めたトレーサビリティ管理システムの全体フローを構築し、プロトタイプとしてのプログラムを試作する。次年度は、コンクリート中に投入されたICタグがコンクリートの耐久性に悪影響を及ぼさないかどうかを調べるため、温冷繰り返し実験を計画している。ICタグが投入されたコンクリートは極寒地で使用されることも想定されるため、マイナス20°C程度の温度においてもICタグがコンクリートの耐久性に悪影響を及ぼしてはならない。この実験を行うためには凍結乾燥機が必要である。このため、今年度の研究費を節約して、次年度に凍結乾燥機を購入する計画とした。
レーザー光を用いた根尖歯周組織再生療法の開発

レーザーは殺菌・蒸散だけでなく、周囲に存在する細胞を活性化して組織再生を促進する効果を持つことが数多く報告されている。本研究では、培養細胞および実験動物に対するレーザーの生物学的活性化作用(LLLT効果)を明らかにすることで、生体内での根尖周囲の骨欠損部の治癒促進効果を解明し、最終的には臨床における根尖周囲組織再生のためのレーザー応用の確立を当初の目的とした。根尖周囲組織においてLLLT効果を発揮するには、病変部の除去とともに根管系を無菌化することが重要であると考え、レーザーの根管洗浄作用に関する各種の実験を試みた。根管からデブリとスミヤー層を除去するための3種類の洗浄法の効果を比較するためにウシの歯根象牙質を用いた。根管壁をカーバイドバーで切削してスミヤー層を形成した後、試料を模擬根管模型の根尖部に装着した。洗浄液として次亜塩素酸ナトリウムとEDTAをこの順序で使用した。走査電子顕微鏡観察ではレーザー活性化洗浄法と超音波洗浄法は効果的なスミヤー層除去と開口した象牙細管を示した。逆に、シリンジ洗浄法の試料ではデブリが残存していた。次に、根管模型におけるEr:YAGレーザー洗浄時の流体を可視化した。透明根管模型においてPIV法を用いた高速度撮影後に流体解析ソフトで解析を行った。2種類のサイズの根管内で2種類の太さのレーザーチップを用いてレーザーを照射した結果、大きく拡大された根管で細いチップを使った場合、洗浄効果は減少する可能性があることが分かった。結論として、Er:YAGレーザーは根管系の洗浄に極めて有効であることが明らかとなった。今後さらに、レーザーの有するLLLT効果の解明を目標に研究を進める予定である。レーザーの作用は単に殺菌・清掃効果だけでなく、周囲細胞を活性化して組織再生を促進する効果を持つことが指摘されている。本研究では、レーザーの持つ殺菌・洗浄効果に加えて、培養細胞に対するレーザーの生物学的活性作用を明らかにし、更に実験動物を用いて生体内での根尖周囲の骨欠損部の治癒促進効果を解明することで、最終的には臨床における根尖周囲組織再生のためのレーザー応用法の確立を目的としている。まず、根管からデブリとスミヤー層を除去するための3種類の洗浄法(レーザー活性化洗浄,超音波洗浄,通常のシリンジ洗浄)の効果を比較した。ウシの歯根象牙質を用いた。シリンジ洗浄法の試料ではスミヤープラグとデブリが残存していた。結論として、レーザーや超音波を用いた洗浄液の活性化は根管壁の清掃性に寄与する可能性があることが分かった。2種類のサイズの根管内で、2種類の太さのレーザーチップを用い、チップは根管底部から18 mmの位置に設置した。根管内で活発な流れが起こる領域の割合は、グループ毎に異なった。結論として、Er:YAGレーザーは根管サイズとチップの直径に応じて異なる流れを生み出す可能性が明らかとなった。培養細胞としてマウス頭蓋骨を用いた培養系で、レーザーの持つLLLT効果を解析できることを確認した。さらに、根尖歯周組織の再生の前段階として、レーザーの持つ根管内の清掃効果に着目して、液体内でのレーザー照射時の流体観察と根管清掃効果を対象とした実験を実施した。その結果、レーザーや超音波を用いた洗浄液の活性化は根管壁の清掃性に寄与する可能性があること、及び、根管サイズとチップの直径に応じて異なる流れを生み出す可能性が明らかとなった。この成果を学会発表し、日本レーザー歯学会誌に発表した。本研究では、培養細胞および実験動物に対するレーザーの生物学的活性化作用(LLLT効果)を明らかにすることで、生体内での根尖周囲の骨欠損部の治癒促進効果を解明し、最終的には臨床における根尖周囲組織再生のためのレーザー応用法の確率を目的としている。根尖周囲組織においてLLLT効果を発揮するには、病変部の除去とともに、まず始めに根管系を無菌化することが重要であると考え、レーザーの根管洗浄作用に関する各種の実験を試みた。まず、根管からデブリとスミヤー層を除去するための3種類の洗浄法の効果を比較するためにウシの歯根象牙質を用いた。根管壁をカーバイドバーで切削しスミヤー層を形成した後,試料を模擬根管模型の根尖部に装着した。透明根管模型においてPIV法を用いた高速度撮影後に,流体解析ソフトで解析を行った。2種類のサイズの根管内で2種類の太さのレーザーチップを用いてレーザーを照射した。

その結果、大きく拡大された根管で細いチップを使った場合、洗浄効果は減少する可能性があることが分かった。結論として、Er:YAGレーザーは根管系の洗浄に極めて有効であることが明らかとなった。培養細胞としてマウス頭蓋骨由来の骨芽細胞系細胞を用いた実験で、レーザーの有するLLLT効果を解析できることを確認した。さらに、根尖歯周組織再生の前段階として、レーザーの持つ根管洗浄効果に着目して、液体内でのレーザー照射時の流体観察と根管清掃効果を対象として実験を実施した。その結果、レーザーを用いた洗浄液の活性化は根管壁の清掃に寄与する可能性があること、並びに、イスマスや側枝などの通常の洗浄法では清掃が困難な部位においても流れを生み出す可能性が明らかとなった。この成果を学会発表し学会誌に投稿した。本研究では、培養細胞と実験動物(ラット)を用いてEr:YAGレーザー照射によって生じる生物学的作用を解明することを第一の目標としている。具体的には、第1段階として培養骨芽細胞の挙動に着目し、Er:YAGレーザーを種々に変えて照射した際の細胞増殖能への影響を調べた。その結果、一定の照射条件で細胞増殖率が増加する傾向を認めるものの、有意な効果を認めるまでには至っていないのが現状である。第2段階では、レーザー光の生体内での影響を調べるために、ラット臼歯部に骨欠損を作製した場合、または臼歯を髄腔開拡し開放することで根尖性歯周炎による骨欠損を誘発した場合を対象に、Er:YAGレーザーによるLLLT照射群と通常の根管治療群(レーザー非照射群)間で骨欠損部の治癒速度や体積量を比較し、さらに遺伝子レベルで治癒過程における関連遺伝子の発現を解析することで、Er:YAGレーザーの有する組織再生促進作用とそのメカニズムを明らかにする予定である。後者の場合、根管内を先に清掃する目的で、レーザーを用いた洗浄作用にも焦点を当てて各種の解析を実施した。歯科用レーザーの中でも水に対する吸収特性が高い波長をもつEr:YAGレーザーを用いたレーザー洗浄法が新しい試みとして注目されている。この方法の原理は、レーザーをパルス照射した際に生じるレーザー誘発気泡(蒸気泡とキャビテーション気泡)の形成・崩壊に伴う圧力波によって起こる根管内での洗浄液の急速な流れを応用したものである。すなわち、洗浄液が根管壁に急激な速度で衝突することで残渣が除去され清掃性が向上する。透明根管模型を用いてトレーサーの動きを高速度カメラで撮影することで、レーザー洗浄時の洗浄液の流れの可視化を試みた。特に根管の太さと使用するチップの太さの流体への影響に着目して解析した。本研究では、最終段階として実験動物を用いて生体内での根尖周囲の骨欠損部の治癒促進効果(LLLT効果)を解明することを目的としているが、現時点では培養細胞によるin vitro研究にとどまっている。この理由として、in vitro研究での最適なレーザー照射条件が見いだせていないことがあげられる。今後さらに、照射法等を改善することよってin vivo研究に適した条件を確立する予定である。また、並行してラットを用いたin vivo研究にも着手する方針である。レーザーは殺菌・蒸散だけでなく、周囲に存在する細胞を活性化して組織再生を促進する効果を持つことが数多く報告されている。
ディープデータから読み解く：テンサイ耐病性獲得機構の解明

北海道河西郡芽室町の北海道農業研究センター芽室研究拠点のテンサイ育種圃場に次の6系統を供試した。親系統としてNK195BR、NK235BR、NK388の3系統を、交雑種(F1)、NK235BR×NK195BR、NK195BR×NK388、NK235BR×NK388の3系統の計6系統を供試し、光合成速度および気孔コンダクタンス等の生理的特徴を、生産力検定の試験区4反復において、各系統各反復1個体の葉を対象に、光合成蒸散測定装置(LCpro-SD, ADC BioScientific Ltd., Hoddesdon, UK)を用い測定した。気孔コンダクタンスについては、F1が親系統より高い傾向が見られ、NK195BR×NK388、NK235BR×NK195BR、NK235BR×NK388、NK195BR、NK388、NK235BRの順で高く、ヘテロシス効果が生じていると考えられた。一方、光合成速度については、NK195BR×NK388、NK195BR、NK235BR×NK195BR、NK235BR、NK235BR×NK388、NK388の順で高く、系統間での差はあるものの、F1と親系統との間に、気孔コンダクタンスほどの明瞭な差はみられなかった。本課題の主要項目である、群落表面温度および群落内外の気温・湿度の測定、有効光合成放射量の連続測定、気孔コンダクタンスおよび光合成速度の品種間差、およびヘテロシス効果の解明のいずれとも、当初の計画に沿った研究成果を挙げつつある。H30年度の研究はおおむね順調に進展したことから、H31年度は、前年度得られたデータをもとに解析を中心とした研究を進める北海道河西郡芽室町の北海道農業研究センター芽室研究拠点のテンサイ育種圃場に次の6系統を供試した。H30年度の研究はおおむね順調に進展したことから、H31年度は、前年度得られたデータをもとに解析を中心とした研究を進める(理由)計画していた予算と交付決定額の間に、差が生じたため、購入計画予定数の測器が購入できず、計画していた反復数で対応した。そのため、次年度使用額が生じた。ただし、反復数を減らしたものの、長期にわたり観測ができたため、十分な試験結果を得ることができた。(使用計画)おおむね順調に研究が進み、1年目で結果が得られたため、次年度は成果の公表を重点化するために使用を検討する。
自律浮沈機能を有する水質浄化ゲル粒子の開発

アルギン酸ゲル粒子に微生物を内包すると、ゲル粒子は水中や水底で気泡を発生させつつ液面まで浮上し、液面で気泡が消失すると沈降し、気泡を発生させながら浮上と沈降を繰り返すゲルの自律浮沈現象を初めて発見し、その製造法に関する特許を公開した。本研究では自律浮沈機能を有するアルギン酸ゲル粒子に吸着機能と回収性能を層状に付与する「多層ゲル粒子」の構造設計と使用条件を明らかにし、新興国で課題となっているフッ素汚染を解決するためのアルギン酸ゲル粒子を開発する。ゲル粒子が自ら浮沈することでフッ素の除去率が向上し、凝集剤の回収も簡単になる。どんな場所でも低コストで施工が可能な水質浄化材の開発を目指す。
脳梗塞患者におけるConjoint分析を用いた定量的に機能予後評価スケールの作成

modified Rankin Scaleに基づいた定量的な脳梗塞患者の機能予後評価スケールを開発した。神経徴候、発症前の仕事、外出・買い物、歩行、食事、整容、排泄の7つの評価項目を抽出し、23項目の具体的な内容を設定した。評価項目の異なる組み合わせからなる模擬患者18例を創出し、医師20名、看護師34名に機能予後が不良と考えられる順に順位付けを依頼した。結果、相対重要度は歩行21.1%、排泄19.8%、食事18.3%、発症前の仕事11.6%、外出・買い物10.6%、整容9.3%、神経徴候9.2%であった。Conjoint分析により定量化され、022.6点の間で変動するスケールを作成した。これまで脳梗塞期の予後について定量的なスケールが開発されておらず、治療の効果判定には未だ客観性・再現性に乏しい既存の評価スケールが用いられており、日々進歩する高度な脳梗塞治療の効果を判定する上で大きな問題となり、真に有効な治療が適正に評価されていない可能性があった。これに対して我々は客観性と定量性に優れた脳梗塞機能予後評価スケールの作成を計画した。すでに脳梗塞診療の現場で用いられているmodified Rankin Scaleの内容を分解し、コンピュータ上の直交計画に基づいた様々な症状を呈する架空の患者を創出し、医師や看護師、リハビリスタッフから重症度の高い順に順位づけをしてもらうアンケートに取る。これまでに使用されているスケールを利用する事と各職種からの意見を取り入れることで客観性を担保し、定量性についてはJapan Stroke Scaleなどにおいて臨床の現場でもすでに用いられているConjoint分析をそのアンケート結果で活用することで、定量性が担保できる。現在、すでに各職種にアンケートを配布し、回答を待っている状況である。一定数の回答が集まり次第、その結果にConjoint分析を用いて、定量的かつ客観的な脳梗塞機能予後評価スケールを作成する。現在、スケール作成に必要なアンケートを各職種に依頼をしており、5月中には一定数の回答が得られる見込みである。mRSの内容を分解し、1神経徴候、2発症前の仕事、3外出、買い物、4歩行、5食事、6整容、7排泄の7つの評価項目を抽出し、それに対して23項目の具体的な内容(カテゴリー)を設定した。各評価項目の異なる組み合わせからなる模擬患者18例を創出し、各患者の状態を示すカード(模擬患者カード)を作成した。模擬患者カードを医師20名、看護師34名から、機能予後が不良と考えられる順に順位付けを依頼し、それをもとにConjoint分析を行った結果、相対重要度は歩行21.1%、排泄19.8%、食事18.3%、発症前の仕事11.6%、外出・買い物10.6%、整容9.3%、神経徴候9.2%であった。これをもとに重みづけされた評価項目からなるスコア:Quantified Functional Scale after Stroke(QFSS)を作成した。QFSSスコアは評点が0(機能予後良好)22.6点(機能予後不良)の間で変動する比例尺度であり、これを用いて脳梗塞急性期の症例30例の評点を行い、mRSと比較した。スコア低値例はmRSでは軽症例、スコア高値例はmRSでは重症例が多かった。しかし、mRS 3と判定された症例の中にはQFSSスコア上では、mRS 2または4の症例に含まれる症例が散見された。またmRS 3から2に改善した症例は、かならずしもQFSS Scoreの点数が反映されておらず、QFSSのスコアとmRSの重症度に乖離がみられた。このことからmRSが患者の状態を適切に判断できていない可能性が考えられた。今後症例数をさらに増やし、その妥当性と有用性を検証する必要がある。その結果、Conjoint分析を用いて作成した脳梗塞機能予後評価スケールを実際の症例に対して使用し、その有用性や妥当性について検討予定である。神経内科スケール開発の遅れがあり、成果発表予定であった海外学会での発表が行えなかったため、繰り越しが発生した。国内学会・国際学会での成果発表を行う。
ヒコナミザトウムシ交雑帯における核型とミトコンドリアDNAの変異パターン

ヒコナミザトウムシNelima nigricoxaの核型の交雑帯の性質や形成過程を明らかにする目的で,近縁種をも含めた各地の集団について核型,アロザイム,mtDNAの分析を行なった。本種には西から2n=20(九州・四国・旭川以西の中国地方),2n=18a(鳥取県大山の東側と近畿地方),2n=18b(岡山市の北部),2n=16(旭川以東の中国山地),2n=22a(伊豆箱根),2n=22b(三浦半島),2n=22c(千葉県清澄山)の7核型が識別された。うち,2n=20/18a,2n=18a/16,2n=16/18aはそれぞれ互いの分布域の接点において幅数km以内の交雑帯を作る。鳥取県関金町の2n=16/18の交雑帯中の1集団では,2n=17の個体の比率がHardy-Weinberg期待値よりも有意に小さいことがわかった。2n=16の個体を1とした場合の2n=17の個体の相対適応度は0.4で,大山の2n=18と2n=20集団の交雑帯中の1集団(大山川床)で得られている相対適応度0.7と比べてかなり低い。これは,2n=16/18の核型の差に関わっている染色体(2n=16の第1染色体)が,2n=18/20の差に関わっている染色体(2n=18核型の第3染色体)と比べて著しく大きいためかもしれない。本種と近縁種の各地の集団について,mtDNAにコードされているCOI遺伝子の断片(約1kbp)の塩基配列を比較した。分析の終了しているのは7集団のみだが,それは(ヒコ千葉県清澄山2n=22,オオ札幌市北大構内,2n=22)(オオ山口県徳仙の滝2n=22(ヒコ山口県徳仙の滝2n=20(ヒコ船上山2n=18(ヒコ大山槙原2n=20,ヒコ2n=20大山種原))))という系統関係となり、各枝を支持するブ-ツストラップ確率は全て100%であった。西日本のヒコナミザトウムシ類の集団間では,大山の2n=20の集団とその東に近接する2n=18(船上山)の間,あるいは山口県徳仙の滝の2n=20の集団との間では遺伝的に分化していることがmtDNAの塩基配列レベルでも確認できた。

ヒコナミザトウムシNelima nigricoxa(クモガタ綱:ザトウムシ目)の核型分化と交雑帯の性質を検討するため,1996年は(1)本種とその近縁種エゾナミザトウムシN.sp.,オオナミザトウムシN.genufuscaを含むナミザトウムシ種群3種の核型分析と交雑帯の位置の決定,(2)ヒコナミ交雑帯中の核型の異なる個体どうしの交配実験,(3)mtDNAとアイソザイム分析用の材料の採集,を行った。核型分析(1)では,A)ヒコナミは3n=16-22の幅で変異し,合計8つの核型が区別されること;B)北陸北近畿にかけての地域にはRobertson型変異で生じたと考えられる2n=18と2n=16の集団があること;C)この地域の2n=18の核型は,鳥取県大山東部に従来から知られている2n=18aの核型と同じであり,これより,2n=16の核型は派生形質であることが示唆されること;D)オオナミは2n=18-22(例外的に2n=24)の幅で分化しており,うち22Ha(22箱根型)と22To(22東海型)は北陸地方で交雑帯を形成していること;E)近畿地方北部にみられる2n=20と2n=18の核型は互いにロバートソン型転座で生じていることなどが判明した。以上の結果より,本種群の祖先的染色体数は2n=22であり,ヒコナミとオオナミでは一部の地域で染色体数の減少が順次進行したと推測される。交配実験(2)は,残念ながら,飼育下で雌個体の卵巣が十分に発達せず産卵が順調になされなかったことにより,当初の目的が達成できなかった。交雑帯の分析に使う分子マーカー探索のための材料の採集(3)は予定どおりおこない,今後予備実験にとりかかる予定である。ヒコナミザトウムシNelima nigricoxaの核型の交雑帯の性質や形成過程を明らかにする目的で,近縁種をも含めた各地の集団について核型,アロザイム,mtDNAの分析を行なった。本種には西から2n=20(九州・四国・旭川以西の中国地方),2n=18a(鳥取県大山の東側と近畿地方),2n=18b(岡山市の北部),2n=16(旭川以東の中国山地),2n=22a(伊豆箱根),2n=22b(三浦半島),2n=22c(千葉県清澄山)の7核型が識別された。うち,2n=20/18a,2n=18a/16,2n=16/18aはそれぞれ互いの分布域の接点において幅数km以内の交雑帯を作る。鳥取県関金町の2n=16/18の交雑帯中の1集団では,2n=17の個体の比率がHardy-Weinberg期待値よりも有意に小さいことがわかった。2n=16の個体を1とした場合の2n=17の個体の相対適応度は0.4で,大山の2n=18と2n=20集団の交雑帯中の1集団(大山川床)で得られている相対適応度0.7と比べてかなり低い。これは,2n=16/18の核型の差に関わっている染色体(2n=16の第1染色体)が,2n=18/20の差に関わっている染色体(2n=18核型の第3染色体)と比べて著しく大きいためかもしれない。本種と近縁種の各地の集団について,mtDNAにコードされているCOI遺伝子の断片(約1kbp)の塩基配列を比較した。分析の終了しているのは7集団のみだが,それは(ヒコ千葉県清澄山2n=22,オオ札幌市北大構内,2n=22)(オオ山口県徳仙の滝2n=22(ヒコ山口県徳仙の滝2n=20(ヒコ船上山2n=18(ヒコ大山槙原2n=20,ヒコ2n=20大山種原))))という系統関係となり、各枝を支持するブ-ツストラップ確率は全て100%であった。西日本のヒコナミザトウムシ類の集団間では,大山の2n=20の集団とその東に近接する2n=18(船上山)の間,あるいは山口県徳仙の滝の2n=20の集団との間では遺伝的に分化していることがmtDNAの塩基配列レベルでも確認できた。
レプチン遺伝子による上皮間葉移行制御の分子機構

癌細胞が細胞外基質を分解する過程は、癌細胞の浸潤・転移に最も重要な過程である。クロマチンリモデリング因子、reptinは癌転移抑制遺伝子の発現を抑え、癌の浸潤・転移を制御するという報告されている。今回2種類のヒト口腔扁平上皮癌細胞株OSC-19細胞およびOSC-20細胞を用いてreptinをノックダウンしたところ、両者とも遊走能の亢進と細胞形態の紡錘形変化を認めた。上皮系マーカーであるE-cadherinの発現が低下と間葉系マーカーであるN-cadherinの発現の上昇を認めた。以上の結果よりreptinはEMTに関与することで口腔扁平上皮癌細胞の基底膜浸潤を制御する可能性が示唆された。原発巣で増殖した癌細胞は多数の複雑なプロセスを経て遠隔転移を成立させているが、なかでも癌細胞が細胞外基質を分解し、組織間を移動する過程は、癌細胞の浸潤・転移に最も重要な過程と考えられる。癌細胞による細胞外基質を分解し、細胞が移動する過程を分子レベルで解析し、この過程を特異的に抑制することができれば癌細胞の浸潤・転移を防ぐことが可能となる。われわれは癌細胞による細胞外基質分解をin vitroで観察することが可能なフィブロネクチン分解・浸潤モデルを用い、転移抑制を目標に分子標的治療のターゲット分子の検討を行ってきた。近年、いくつかのクロマチンリモデリング因子が同定され、ATP依存的にヌクレオソームを除去し、クロマチン構造を変化させ、GTPのプロモータへの結合を助ける本来の役割のみならず、細胞増殖、遺伝子発現、など種々の細胞イベントに関与していることが解ってきた。本研究ではクロマチンリモデリングコンプレックスの一つである、reptin遺伝子に焦点を当て、reptinがヒト口腔扁平上皮癌の浸潤・転移をいかに制御しているのかを検討した。Reptin遺伝子をknockdownすることで、OSC-19細胞、OSC-20細胞ともに浸潤能、遊走能の有意な亢進が認められた。そのメカニズムとして考えられる、蛋白分解酵素の発現については、Gelatin zymographyにてMMP-2、MMP-9の発現および活性が、reptinのknockdown群とcontrol群、wild type群とで差は見られないことより、reptinは細胞外基質の分解活性に直接的に関与していないことが示唆された。われわれは口腔扁平上皮癌の治療を目的に、治療に応用し得る分子標的薬の開発を目的に研究を行ってきた。癌細胞が細胞外基質を分解する過程は、癌細胞の浸潤・転移に最も重要な過程であると考えて今まで低分子GTP結合タンパクの解析を行ってきた。その中でrho,rac,cdc42が細胞の形態維持及び細胞運動に大きな役割を果たすことを報告してきた。さらに今回はその延長上にクロマチンリモデリング因子として知られているreptin遺伝子の解析を行った。reptin遺伝子は癌転移抑制遺伝子の発現を抑え、癌の浸潤・転移を制御するという報告がなされているがその詳細な役割はいまだ不明である。そこで、2種類のヒト口腔扁平上皮癌由来細胞株であるOSC-19細胞およびOSC-20細胞を用いてreptin遺伝子をノックダウンし、その機能解析を行ったところ、両者とも遊走能の亢進と細胞形態の紡錘形変化を認めた。加えて上皮系マーカーであるE-cadherinの発現が低下と間葉系マーカーであるN-cadherinの発現の上昇を認めた。以上のことからreptin遺伝子は上皮間葉移行(Epiehtlial Messenchimal Transition)に関与することで口腔扁平上皮癌細胞の基底膜浸潤を制御する可能性が示唆された。今後この分子が一時治療の後、転移を抑制し得る分子標的薬として臨床応用可能かどうかの検討を行う予定である。クロマチンとは真核細胞内に存在するDNAとタンパク質の複合体であり、クロマチンの構造とダイナミックスは、遺伝子の発現、複製、分離、修復等、DNAが関わるあらゆる機能の制御に積極的な役割を果たしていることが解かってきている。しかしながら、このクロマチンリモデリング因子が癌細胞の浸潤・転移の過程にはいかなる影響を及ぼしているかに関してほとんど解明されていない。本研究ではクロマチンリモデリングコンプレックスの一つである、reptin遺伝子に焦点を当て、reptinがヒト口腔扁平上皮癌の浸潤・転移をいかに制御しているのか、その分子機構を明らかすることを目的に実験に着手した。実験には浸潤様式の異なる2種のヒト口腔扁平上皮癌細胞株であるOSC-19細胞、OSC-20細胞を用いた。

reptin遺伝子のsiRNAを作成し、OSC-19細胞、OSC-20細胞にsiRNAを導入した細胞の動態を観察した。reptin遺伝子をノックダウン扁平上皮がん細胞は、浸潤能、遊走能の著明な亢進が認められた。この結果は上皮間葉移行に関与することを示唆している。さらなる研究を継続する。初年度で研究分担者の変更があり、研究の進行が大幅に遅れたが、新たな研究組織を構築し、研究を開始し、結果がではじめたところである。この研究組織で今後研究を継続していきたい。研究組織の変更があり、分担者の変更があったために研究の進行状況がやや遅れている。研究遂行にあたり、研究組織の充実を図りたい。可能であれば、人員の増員をはかりたいが現時点では未定である。研究組織を再編し、初期の研究目標に到達できるよう勧めていく予定である。一部データの解析のため、備品購入を予定している。申請時の研究計画通りに、研究施設には問題ないので、現有の備品を使用し、研究費の使用は消耗品等の物品費にあて、研究発表のための学会旅費および論文作成費用に使用する予定である。
細胞内動態を応用した新規ＤＤＳナノキャリアーの検討

NF-κBは癌細胞では恒常的に刺激され、浸潤・転移・apoptosis抵抗性に関わる関連遺伝子の転写・活性化が亢進されていることが明らかにされており、その阻害により効果的な癌治療が期待されている。DHMEQは強力なNFκ-B阻害剤で、その特異性の高さや副作用の少なさから臨床応用への期待が大きい分子であるが、極度に疎水性であること、体内での半減期が短すぎることから未だ臨床応用には至っていない。CMC/DHMEQ懸濁液を用いてヒト膵癌株AsPC1に対して細胞増殖試験を行ったところ、DHMEQ1, 5, 10, 20μg/mlそれぞれの濃度において、PMB/DHMEQ製剤群がCMC/DHMEQ懸濁液群よりも高い細胞増殖抑制効果を示した。ただし、PMBポリマー単独では使用した範囲の濃度では細胞毒性はほとんど見られなかった。1回投与量を12mg/kgとしたin vivo投与試験では、PMB/DHMEQ製剤を2日おきにi.v.した群が、CMC/DHMEQ懸濁液を連日i.p.した群より高い腫瘍増殖抑制効果を示した。DHMEQの血液中での安定性、組織内濃度及び血中滞留性をLS-MS装置を用いて分析した結果、採取した血液に混和した時のDHMEQの安定性には2群間で変化が見られなかったものの、12mg/kgのDHMEQを担癌マウスにi.v.した実験系で、肺・肝臓などの臓器にCMC/DHMEQ懸濁液群、癌部にはPMB/DHMEQ製剤群でより多くのDHMEQが集積している傾向が見られた。25年度が最終年度であるため、記入しない。光線力学療法(Photodynamic therapy,以下PDT)は光感受性物質とレーザー光線による光化学反応を利用した全身的または局所的治療法である。酸素存在下において、活性化した光感受性物質は細胞障害または細胞死を引き起こす。ベルテポルフィンは疎水性のポリポルフィリンオリゴマーである。本研究では、PMBN及びPMBをナノキャリアーとして用いDDSとPDTの組み合わせにより、ベルテポルフィン封入ナノ粒子の腫瘍特異性と抗腫瘍効果の検討を行うことを目的とする。Zetasizer Nanoを用い測定した粒径では、それぞれPMBNは59.8±1.5nm、PMBN-抗体は101.5±5.5nm、ベルテポルフィン-PMBNは125.0±4.1nm、ベルテポルフィン-PMBN-抗体は129.7±3.9nm、ベルテポルフィン-PMBは197.4±9.1 nmあった。In vitroにおけるベルテポルフィン-PMBN-抗体の取り込みは、抗EGFR抗体を用い、EGFR過剰発現株であるA431を対象とした。ベルテポルフィンは細胞質内に取り込まれていた。30分後には抗体ありの群がなしの群の取り込み量の3倍となっていた。これはPMBN-抗体によって細胞内への取り込みが増えることを示している。In vivoでのベルテポルフィンの取り込みは、A431担癌マウスにベルテポルフィンを6mg/kgの量にて投与した。腫瘍内のベルテポルフィンの濃度は、抗体ありの群がなしの群よりも1.74倍取り込まれていた。EGFR未発現株であるH69でも同様に実験したが、腫瘍のベルテポルフィン濃度は微量であった。作用機序の異なる薬剤(NFκ-B阻害剤)用いて、最適なデリバリー法の検討を行う。
少数細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを用いた左右軸形成機構の解析

昨年度までの研究で得られた候補遺伝子に対してモルフォリノオリゴの顕微注入による左右軸形成関連遺伝子の同定を試みましたが再現性がありかつ左右軸形成に関与していると考えられる遺伝子の同定には至りませんでした。そのため本研究課題での研究の続行は困難と判断して以下の研究課題での研究を行うこととしました。新たな研究課題は「メダカ近交系Hd-rR及びHNIを用いたゲノム高次構造解析」としました。まず、全ての動物は形態や機能が異なる多数の細胞から成り立ちます。しかし各細胞の核にあって細胞の形態や機能を決定するDNA配列は同一です。ではどのようにして同一のDNA配列から形態や機能の異なる細胞を生み出しているのでしょうか。近年ゲノム(核内のDNA全体)の高次構造の違いが細胞種の違いに寄与することが報告されました。しかしながらどのような塩基配列がこの高次構造構築に寄与しているかはごく一部が知られているだけです。そこで私は「交配可能ながらゲノム配列が2%以上異なる」というゲノムの高次構造の解析に有利な特徴を持つメダカの2系統のゲノム構造を比較することで、ゲノムの高次構造構築に寄与する新規配列を見出すことにしました。そしてメダカ近交系Hd-rR及びHNIのハイブリッドの脳、肝臓、繊維芽細胞からゲノムの近接情報を維持したままDNA断片を取り出し次世代シーケンサーで配列を読み取ったデータを用いました。まずHd-rR及びHNIの全ゲノムシーケンスのデータからHd-rRーHNI間の差異を取得し、得られたデータをHd-rR由来及びHNI由来のものに分けました。そしてこれらのデータとHd-rRのみのゲノムデータをもとに2次元マトリクスを作成しました。その後当研究室の先行研究により同定された巨大DNAトランスポゾンteratornの挿入配列部位周辺のみを切り出しマトリクス上での差が見られる領域を探索しました。29年度が最終年度であるため、記入しない。A.異なる発生ステージ・変異体のクッペル胞上皮の少数細胞RNA-seq:個体間での遺伝子発現のばらつきが大きいことが示唆されたため同一個体のクッペル胞上皮の右と左の遺伝子発現を比較した。この結果4体節期では19個の、9体節期では11個の遺伝子の発現が左右で異なることが示唆された。そしてより早期のクッペル胞上皮の遺伝子発現を見るために0体節期の、pkd1l1の遺伝子発現への影響を見るためにabc変異体(pkd1l1変異体)の9体節期のクッペル胞上皮の少数細胞RNA-seqを行った。そしてabc変異体と野生型との比較によってこの2系統間では、4体節期で約300、9体節期で約1800の遺伝子の発現が統計的に有意に異なっていることが分かった。B.クッペル胞上皮特異的な遺伝子の探索:これまでに確立した少数細胞単離手法を応用して、運動繊毛を持つ上皮組織である腎菅と内胚葉性上皮組織である腸管などがGFPタンパク質でラベルされたFoxa2:GFP系統を用いて少数細胞RNA-seqの系を確立し、RNA-seqを行った。またRを用いて遺伝子発現標準化手法TCCを含む多量サンプル間の遺伝子発現比較パイプラインを構築した。そして腎管と腸管の遺伝子発現をクッペル胞上皮の各発生ステージの遺伝子発現と比較し、クッペル胞上皮特異的に左右軸形成期を通じて高発現の遺伝子群を同定した。C. RNA-seqで同定された遺伝子の発現確認:これまでにRNA-seqで同定されたクッペル胞上皮の左右で発現が異なる遺伝子についてRT-qPCRを用いて発現の左右差の確認を行っている。これに加えてこれまでにRNA-seqで同定されたクッペル胞上皮の左右で発現が異なる遺伝子についてクローニングを行い、発現を確認するためのin situ hybridization用のプローブを作成した。予定していたRNA-seqのデータを集めることができ、また新たに構築したパイプラインによって多数のサンプルを解析対象に含めることができるようになった。そしてこれらを用いて左右で発現の異なる遺伝子を同定することができた。これは本研究の目的の第一段階が達成されたことを意味する。さらに腸管や腎管のRNA-seqとの比較からクッペル胞上皮特異的遺伝子の候補群を得ることもできた。そしてこれらの遺伝子の解析を進めることでクッペル胞上皮での左右軸形成機構の一端が明らかにできることが期待できるため。昨年度同定した4または9体節期のクッペル胞上皮で右と左で発現量に差があるものについてRT-qPCRによって発現差を確認した。また昨年度同定した野生型とabc変異体との間で発現量に差があるもののうちクッペル胞特異的に発現している遺伝子を同定することで候補遺伝子を絞り込んだ。さらにこれらのうち左右軸形成への関与の可能性が高いものを選び出し、その遺伝子のノックダウン実験を、モルフォリノオリゴを1細胞期のメダカ胚にインジェクションするという手法で行った。これを25条件計2017個のメダカ胚に対して行った。そしてノックダウンの結果左右逆位の表現型が出るかを確かめることでその遺伝子が左右軸形成に関与しているかを確かめた。その結果egfl6という遺伝子が現在着目している左右軸形成に関与している可能性が示唆された。

また先に述べた候補遺伝子のin situ hybridizationを行うことでその遺伝子の発現を確かめた。野生型の左右で発現が異なることが示唆された遺伝子では、in situ hybridizationでも左右差が見られることが期待されたが、発現が弱いものが多く、本来は発現領域を可視化するための手法であるin situ hybridizationでは左右の発現差を見出すことはできなかった。しかし多くの遺伝子においてクッペル胞上皮での発現が示唆される発現パターンを得ることができた。そしてここまでに述べた結果の大部分をまとめて11月14日から11月17日に開催されたthe 22nd International Congress of Zoology(一部は国内学会である動物学会とのジョイント学会)でポスター発表を行い複数の参加者から今後の研究の展望や結果の解釈に対してフィードバックを得ることができた。ノックダウン実験においてほとんどの条件において左右逆位の表現型が観察されず、期待していたよりも多くの遺伝子を調べることとなったため、想定していた以上にノックダウン実験に時間がかかり次の段階へ移ることができなかったため。もっとも結果的に候補を得ることはできたという点は進捗として評価できるが、まだその結果が正しいかの検証は済んでおらず具体的な解析に取り掛かることができておらずこの点において予定よりも進捗が遅れているため。昨年度までの研究で得られた候補遺伝子に対してモルフォリノオリゴの顕微注入による左右軸形成関連遺伝子の同定を試みましたが再現性がありかつ左右軸形成に関与していると考えられる遺伝子の同定には至りませんでした。そのため本研究課題での研究の続行は困難と判断して以下の研究課題での研究を行うこととしました。新たな研究課題は「メダカ近交系Hd-rR及びHNIを用いたゲノム高次構造解析」としました。まず、全ての動物は形態や機能が異なる多数の細胞から成り立ちます。しかし各細胞の核にあって細胞の形態や機能を決定するDNA配列は同一です。ではどのようにして同一のDNA配列から形態や機能の異なる細胞を生み出しているのでしょうか。近年ゲノム(核内のDNA全体)の高次構造の違いが細胞種の違いに寄与することが報告されました。しかしながらどのような塩基配列がこの高次構造構築に寄与しているかはごく一部が知られているだけです。そこで私は「交配可能ながらゲノム配列が2%以上異なる」というゲノムの高次構造の解析に有利な特徴を持つメダカの2系統のゲノム構造を比較することで、ゲノムの高次構造構築に寄与する新規配列を見出すことにしました。そしてメダカ近交系Hd-rR及びHNIのハイブリッドの脳、肝臓、繊維芽細胞からゲノムの近接情報を維持したままDNA断片を取り出し次世代シーケンサーで配列を読み取ったデータを用いました。まずHd-rR及びHNIの全ゲノムシーケンスのデータからHd-rRーHNI間の差異を取得し、得られたデータをHd-rR由来及びHNI由来のものに分けました。そしてこれらのデータとHd-rRのみのゲノムデータをもとに2次元マトリクスを作成しました。その後当研究室の先行研究により同定された巨大DNAトランスポゾンteratornの挿入配列部位周辺のみを切り出しマトリクス上での差が見られる領域を探索しました。
根粒菌における酸素克服機構の解明:内生窒素固定細菌としての利用に向けて

熱帯マメ科植物セスバニアは根粒菌Azorhizobiumcaulinodansと共生し、茎に茎粒という窒素固定器官を形成する。本研究では、A.caulinodansの推定内膜タンパク質をコードすると推測される遺伝子ocmAが菌体外多糖生産に関与し、菌体外多糖のバリアで菌体内酸素濃度を制御している可能性を示した。また、Lonプロテアーゼも菌体外多糖の生産に関与しており、さらに、Lonプロテアーゼは宿主攻撃に関与するreb遺伝子群の発現抑制に関与することも明らかにした。Azorhizobium caulinodansはマメ科植物セスバニアと共生する根粒菌であり、非マメ科植物の組織内に定着する内生窒素固定細菌でもある。A. caulinodansは、ある程度酸素が存在する条件下でも窒素固定を行うことが可能であり、これは、非マメ科植物内で窒素固定を行う上での重要な特性の一つである。本研究では、A. caulinodansが如何にして酸素を克服しているのかという点に着目し、「新規内膜タンパク質(OcmAと暫定的に命名)が細胞内の酸素濃度を低下させる機構を担っている」という仮説を提起し、それを証明することを当初の目的としていた。研究を進める最中に、A. caulinodansのocmA遺伝子破壊株は野生型株に比べて多量の菌体外多糖を生産することが判明し、OcmAは菌体外多糖生産に関与し、菌体外多糖のバリアで菌体内酸素濃度を制御している可能性が浮上してきた。また、Lonプロテアーゼをコードするlon遺伝子破壊株の菌体外多糖生産能が野生型株に比べて劣ることが判明し、lon遺伝子が細胞内酸素濃度低下機構を担う可能性がある遺伝子として候補に挙がった。A. caulinodanslonにおけるlon遺伝子の機能解析を進めていった結果、lon遺伝子は菌体凝集にも関与している可能性が判明し、菌体凝集により細胞内酸素濃度の低下が制御されている可能性も見いだされた。さらに、細胞内酸素濃度とは関係ないが、lon遺伝子は宿主植物細胞に対する本菌の攻撃性に関与するreb遺伝子群の発現制御にも関わっていることも、本研究により見いだされた。本研究では、A. caulinodansが如何にして酸素を克服しているのかという点に着目し、「新規内膜タンパク質(OcmAと暫定的に命名)が細胞内の酸素濃度を低下させる機構を担っている」という仮説を提起し、それを証明することを目的としている。本研究ではまず、細菌細胞内の酸素濃度測定技術の開発を研究の第一段階としており、ニードル式マイクロ酸素濃度計を用た直接的測定法と、低酸素プローブとして汎用されているpimonidazole-HClを用いた分子生物学的測定法を検討していた。しかし、本研究における細菌内の酸素濃度測定への応用は本年度中には確立できなかった。また、OcmAはN末端領域に3回膜貫通領域を持つ内膜タンパク質であることが、in silico解析により予想されている。OcmAのC末端側のアミノ酸配列を基にした抗ペプチド抗体を用いたウェスタン解析を行ったところ、確かに内膜画分にバンドが確認された。到達目標としては、(1)細胞内酸素濃度測定技術の開発(2)OcmAの機能・構造解析(3)他の細胞内酸素低下機構の探索、を申請書に記載した。まず、(1)の課題である細菌細胞内の酸素濃度測定技術の開発が遅れている。本研究で採用した2つの測定方法は高等真核生物に至適化されており、微小な細菌への応用が未だ困難な状況であることが原因である。次に(2)の課題であるが、OcmAが菌体外多糖の生産に関与することを見いだし、内膜タンパク質であることを証明できたので、おおむね順調である。(3)の課題であるが、lon遺伝子が菌体外多糖生産に関与していることが判明し、細胞内酸素濃度の制御に関与している可能性が浮上してきたことから、おおむね順調と言える。(1)の課題が遅れているとは言えども、OcmAの機能の一部を見いだせたことから、総じておおむね順調と考えている。

細胞内酸素濃度の測定技術の開発に関しては、ニードル式マイクロ酸素濃度計を用た直接的測定法は不適切であると考えられたので、低酸素プローブを用いた分子生物学的測定法での確立に集中することとした。また、菌体外多糖の生産が細胞内酸素濃度の低下に関与することを集中的に証明するべきであると考え、ocmA遺伝子破壊株およびlon遺伝子破壊株の詳細な比較研究を進めていくこととした。特に、LonプロテアーゼとOcmAタンパク質が如何にして菌体外多糖生産を制御しているのか、その二者が如何にクロストークしているのかを分子レベルで調査する。本年度から、OcmA相互作用タンパク質の探索を行う予定で有るが、OcmAと相互作用するタンパク質を探索するために、共免疫沈降を行い、共沈降物の同定を質量分析計により行う。ただし、膜に埋め込まれた状態でのOcmAのままでは共免疫沈降に供するのは困難なため、N末端側の膜貫通領域を欠損したOcmAを作製し、用いることとする。当初購入予定であったニードル式マイクロ酸素濃度計をレンタルで使用することが出来たため、研究費の余剰が生じた。上述の通り、細胞内酸素濃度の測定技術の開発に関しては、ニードル式マイクロ酸素濃度計を用た直接的測定法は不適切であると考えられたので、本機材の購入を本年度に行うことはない。しかし、比較的試薬等のコストがかかる分子生物学的測定方法に集中するため、余剰予算はこちらに配分していく予定である。また、菌体外多糖の生産は菌体凝集にも関与している可能性があり、菌体凝集により細胞内酸素濃度の低下が制御されている可能性もある。そこで、顕微鏡観察の機材を多少拡充する必要があると考えている。翌年度に請求する研究費はおおむコストのかかる分子生物学的解析、特にOcmAと相互作用するタンパク質を探索に充当していく予定である。