hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膀胱癌に対するBCG膀注療法における制御性T細胞の意義と治療応用

NMINCリスク分類で分けると低リスク群(28例)では12.4(±6.4)%、中リスク群(40例)では18.2(±8.9)%、高リスク群(37例)では22.0(±7.8)%であった。単変量解析でTreg割合は再発と相関し(HR: 1.043, 95%CI: 1.0131.073, p=0.005)、多変量解析では術後膀注治療の有無とTreg割合が独立した予後因子であった。Treg=18.0%を境界として2群に分けKaplan-Meier法で術後5年の非再発率を比較すると、Treg low(57例) vs high(48例)=68%vs32% (p=0.001)であった。以上からNMIBCにおいて初発時の腫瘍周囲Tregは膀胱内再発の予後因子であることが示された。つぎに、膀胱癌に対するBCG膀胱注入治療における制御性T細胞の変化を検討するため、ラット膀胱癌モデルを作成しBCG膀胱注入治療群4匹と生理食塩水によるコントロール群4匹で治療中の末梢血免疫細胞(T細胞、B細胞、マクロファージ)の変化を検討した。結果、Tregの変動に大きな差は認めなかったが治療後期にBCG群でマクロファージの割合が増加した。制御性T細胞が膀胱癌の再発や進展に関与しているかを検討した。まず臨床標本を解析し、105例の初発筋層非浸潤膀胱癌を解析した結果、腫瘍組織中にTreg浸潤が多い症例で有意に再発率が高く、BCG膀胱注入症例に限っても同様の傾向が見られた。以上から制御性T細胞が膀胱癌の再発や進展に関連していると考えられた。つぎに膀胱癌に対するBCG注入療法で制御性T細胞がどのように働くか検討するためラット膀胱癌モデルで制御性T細胞の変化を解析した。BCG膀胱注入治療群ではコントロール群に比べて末梢血中のTregが高い傾向が見られた。引き続き、Treg除去体外循環治療を併用する治療実験を行っている。臨床検体を用いた検討では、膀胱癌組織中の制御性T細胞の存在を確認できたが今のところ症例数が限られている。筋層非浸潤膀胱癌に対するBCG膀胱注入治療中の制御性免疫細胞の挙動を検討するための、治療施行中の検体採取が開始できておらず、今後開始する予定としている。動物実験においては癌モデルの作成に時間を要したため、制御性T細胞除去カラムを用いた体外循環を併用したBCG膀胱注入治療実験は開始できず、各種の予備検討を行うにとどまった。BCG膀胱注入治療中のTregの挙動を検討するため、治療中患者からの血液、尿採取を開始する。検体はフローサイトメーターを用いて各免疫担当細胞の発現率を求めて臨床臨床経過との対比を行い、BCG膀胱注入治療におけるバイオマーカーとしての意義を検討する。動物実験では化学発癌ラット膀胱癌モデルにて、無治療群、Treg吸着カラム体外循環治療群、コントロールカラム群、BCG+Treg吸着カラム群、BCG+コントロールカラム群に分け、治療実験を行う。治療のモニタリングは動物用エコーによる膀胱腫瘍体積、フローサイトメーターによる各治療段階における免疫担当細胞分画の測定、ELISA法による血漿中サイトカイン測定を行う。泌尿器癌筋層非浸潤性膀胱癌に対するBCG膀胱注入治療中におけるTregの挙動を検証するため、治療中経過中の血液、尿を採取することを開始する。検体はフローサイトメーターを用いて各免疫担当細胞の発現率を求めて臨床経過との対比を行い、BCG膀胱注入治療におけるバイオマーカーとしての意義を検討する。
ナトリウムチャネル病における致死的不整脈発症機序の解明とその治療応用

Brugada型変異ペプチドをマウス単離心筋細胞内に導入することでNaチャネルブロッカーであるpilsicainideを添加した時と同様の膜電位の形状の変化(脱分極後のhumpの明瞭化)を確認することができた。変異ペプチドを導入した後は、刺激頻度が低下するほどhumpは明瞭化し、Brugada症候群の臨床像に極めて類似していることが判明した。この系を用いて、CaMやGSH-CaMといったドメイン連関障害を是正しうる蛋白質を用いて治療効果を検討していく予定である。IMF motifを含むドメインペプチド、及びLQT3、Brugada症候群における点変異部位を含む種々のドメインペプチドを作成した。ビーグル犬の心筋を用いて界面活性剤による溶出分画を遠心分離し、膜分画の精製を行う。膜分画の確認は膜上の蛋白であるNa-K ATPaseの発現で確認した。また、Naチャンネル(Nav1.5)の存在もWestern blot法で確認した。それぞれのドメインペプチドがNav1.5と結合するかを確認するため、LQT3型ドメインペプチド及び、Brugada型ドメインペプチドを各々担体として、心筋膜分画を蛍光(methylcoumarinacetate:MCA)を内在するbi-functional cleavable crosslinkerであるSAEDで蛍光標識した。蛍光標識した膜蛋白を電気泳動し、SDSゲル上の蛍光とWestern blot法で抗Nav1.5抗体によって現れたバンドの位置を比較した。蛍光の位置とバンドの位置が一致しており、担体として使用した種々のドメインペプチドがNav1.5内の特定のドメインと連関していることが示された。更にIMFペプチドを同様に担体として心筋膜分画をSAEDで蛍光標識し、Nav1.5のC-terminal tailへの特異的な結合を確認した。LQT3型ドメインペプチド、Brugada型ドメインペプチドは、CaMの濃度依存性に結合親和性を増すことを確認した。ビーグル犬の左室心外膜側、あるいはマウスの心筋より心筋細胞を単離した後、全細胞型パッチプランプ法により電流固定化の膜電位測定、及び電圧固定化でのNa電流測定を実施した。電流測定は先端抵抗5メガオーム程度のマイクロピペットを用い、現有のパッチクランプ増幅器(Axopatch700、Axon社製)で行った。対照群の測定を行った後、前年度作成したLQT3型乱Brugada型のドメインペプチドをマイクロピペット内に入れ、パッチクランプ中の拡散作用により細胞内へ導入した。ドメインペプチドを心筋細胞内に導入した後、再度、膜電位測定、及びNa電流測定を行い、膜電位及びNa電流-電圧曲線(I-v curve)に及ぼす影響を検討した。LQT3型ドメインペプチドを心筋細胞内に導入することによって活動電位持続時間は延長し、LQT3型の膜電位波形を示した。更には刺激頻度依存性に早期後脱分極も確認された。これは臨床的に見られる現象に類似している。一方で、Brugada型ドメインペプチドの導入では膜電位は第1相から第2相の形態が変化し、saddle-hack型を呈した。また、刺激頻度とは逆相関の関係でsaddleback型の波形は顕在化した。Na電流に関しては現在検討中である。Brugada型ドメインペプチドとCaMを同時に心筋細胞内に導入することでsaddle back型の波形の形成が抑制される傾向が見られており、今後の新しい治療標的として期待される。
Nanog遺伝子導入による間葉系細胞の高性能化と骨・軟骨再生医療への応用

組織再生医学を口腔外科臨床に応用するため、胎性幹細胞(ES細胞)の分化多能性維持に必須の因子であるNanog遺伝子を間葉系細胞に導入し、自己複製を促進させ、分化形質を向上させることを試みた。本研究の目的は、間葉系幹細胞の分化性能を向上させるため、Nanog遺伝子を、間葉系細胞へ導入し、効率的な骨・軟骨形成を図ることである。まず、株化培養細胞へのNanog遺伝子導入と機能解析を行った。マウス株化細胞C3H10T1/2、MC3T3-E1、ATDC5におけるNanog遺伝喚およびタンパクの発現レベルの変化をPCRならびにWestern blottingで解析したところ、これらの綱胞においては、遺伝子レベルあるいはタンパクレベルでのNanogの発現はほとんど検出できなかった。ついで、上記細胞にvirus vectorを用いてNanog cDNAを一過性にあるいは恒常的に遺伝子導入した際の細胞分化に与える効果を検討したところ、Nanogは骨分化を制御する機能を有することを示唆する結果が得られた。さらに、Nanog RNAiを用いた発現抑制実験として、同細胞にNanog RNAi virus vectorを導入し、細胞分化、増殖に与える効果を確認するとともに、クローン化細胞の作製を行い、Nanog抑制効果を検討した。さらに、Nanog恒常発現による骨分化能促進メカニズムを解析した。まず代表的な骨分化シグナルであるBMPシグナルの下流分子であるSmad1,5,8のリン酸化をウエスタンブロットで比較検討したところ、Nanog導入群ではSmad1,5,8のリン酸化が長時間継続していた。ついで、ES細胞の自己複製に重要なSTAT3のリン酸化を同様にウエスタンブロットで比較検討すると、Nanog導入群ではSTAT3のリン酸化が弱い傾向が認められた。以上により、NanogがES細胞だけではなく、骨・軟骨分化制御機構においても重要な機能を有する可能性が示唆された。今年度は、株化培養細胞へのNanog遺伝子導入と機能解析を行った。まず、マウス株化細胞C3H10T1/2、MC3T3-E1、ATDC5におけるNanog遺伝子およびタンパクの発現レベルの変化をPCRならびにWestern blottingで解析したところ、これらの細胞においては、遺伝子レベルあるいはタンパクレベルでのNanogの発現はほとんど検出出来なかった。ついで、上記細胞にvirus vectorを用いてNanog cDNAを一過性に遺伝子導入した際の細胞分化に与える効果を検討したところ、Nanogは骨分化を抑制する機能を有することを示唆する結果が得られた。そこで、細胞分化のみならず、増殖に与える効果、各種シグナル伝達系との関連を解析するためのツールとしてのクローン化細胞の作製を行い、Nanog恒常発現系を樹立した。このNanog恒常発現系を用いた、Nanogの分化・増殖への影響を検討しており、一過性発現系と同様の結果を得ている。また、Nanog RNAiを用いた発現抑制実験を目的としたNanog RNAi virus vectorにも着手している。コンピューターを用いて、理想的と思われるいくつかの標的配列に対するNanog RNAiの設計を行い、効率的な遺伝子ノックダウン効果を示す可能性のある標的配列を選択し、Nanog恒常発現系(Nanogを高発現するC3H10T1/2、MC3T3-E1、ATDC5)にプラスミドトランスフェクションを用いて、設計した各種合成オリゴを導入し、細胞内でのNanog遺伝子およびタンパクの発現レベルの変化PCRで確認し、最も高い遺伝子抑制効果を示すものを検索しており、その配列が同定され次第、レトロウイルス化、アデノウイルス化を予定している。

口腔外科臨床において、腫瘍、外傷、先天奇形などによる高度の骨欠損の再建を行う場合、従来、自家骨移植が主要な治療法として選択されてきた。この方法は、多くの治療実績を有する優れた治療法であるが、必ず外科的侵襲を伴い、患者の負担は決して軽くはないという欠点がある。この欠点を解消し、低侵襲の医療を実現しうる新たな医療技術として、近年、組織再生医学が脚光を浴びている。本研究は、組織再生医学を口腔外科臨床に応用するため、Nanogを間葉系細胞に導入し、中に含まれる間葉系幹細胞の自己複製を促進させ、全体としての分化形質を向上させるための基礎研究を行うことを目的としている。本年度は、前年度からの続きとして、株化培養細胞へのNanog遺伝子導入と機能解析をおこなった。マウス株化細胞C3H10T1/2、MC3T3-E1、ATDC5などにNanog virus vectorまたはNanog RNAi virus vectorを導入し、細胞分化、増殖に与える効果を確認するとともに、クローン化細胞の作製を行い、Nanog導入または抑制効果を検討した。その結果、Nanogは細胞分化、特にその後期分化を促進することが確認された。Nanog遺伝子の作用機序の解析に関しては、Nanog遺伝子の作用機序を解析するため、Nanogシグナルの下流遺伝子を網羅的に検索した。その結果、Nanog遺伝子導入細胞と非導入細胞との間で、BMPやSTATなどの骨軟骨分化あるいはES細胞の自己複製に重要な遺伝子の発現変化が認められた。
高圧下でのMg・ベロボスカイトの弾性波速度の測定と下部マントル物質構造の解明

本研究で目標とする下部マントルに相当する圧力領域では実験技術状の制約からmmサイズの試科を用いざるを得ない。Mg・ペロボスカイトは地表では天然には存在しない。本研究では超高圧下で合成された試科を用いる(岡山大学・地球内部研究センタ-の伊藤助教授による)。測定用に研磨後の大きさは、直径約1mm,長さ約2mmである。本研究に於て最も困難な点は、このように試科が非常に微少であることである。このような極微小試科を用いた測定の例はいままで報告されていない。筆者は、今までの長年の研究により、直径2mm,長さ2.5mm程度の高圧鉱物については、パルス法による伝播時間の測定に於て、入射パルスに起因する雑音と信号を確実に区別できるようになっているが、まずこの技術を改良する。まず、このような微小試料の中をも観測に必要な程度のエネルギ-をもって弾性波が伝播し得るかどうかの確認に成功した。しかし、予想していたことではあるが、今までの経験の延長だけではうまく行かない面が多くあった。例えば、試料に対する振動子の大きさ、接着の方法等、極微小試料にあっては、誤差の要因になることが多い。また、試料中を伝播して来る波は、いろいろな「歪」を含んでいる。まず振動子は理想的でなく、当然、不用な周波数成分を含む。また、高圧下で合成された試料は、いろいろな意味で「理想試料」からほど遠い。例えば、粒径一つをとってみても、よくわかってない。したがって、このような試科を伝播する波は、試科を伝播中に「変形」するらしい。結果として、伝播時間の推定に大きな誤差をもたらす要因になり得る。本年度は、これらの負の要因を一つ一つつぶすべく精力的に実験を行ったが未だ完全な解決にいたら図、今後に課題を残した。Mgペロボスカイトを合成するためには、すくなくとも25万気圧程度の高圧を必要とする。このような超高圧下で得られる試料の体積は極めて微少である。現在手元にある試料は、直径約1mm、長さ約2mmである(岡山大学地球内部研究センタ-の伊藤助教授により合成された)。これは、現時点で望み得る最大の試料はあるが、弾性波速度の測定という面から見るといかにも小さい。そのため、まず第一に弾性波速度測定技術の改良が必要であった。このペロボスカイトの縦並速度は10km/sec以上あると予想されるから、音波の伝播時間は片道200ナノ秒以下である。したがって、試料中に励起される音波パルスの幅は最大100ナン秒程度に納める必要があった。しかも試料の直径が極めて小さいため、伝播される音波エネルギ-を観測可能な程度に大きくするためには、入射パルスは高速でかつ大振幅でなければならない。このような要請を満たす電子装置は、現時点では市販されていない。したがって、現在までの経験をふまえて、電子回路と振動子・試料の機械的結合系の両面から技術の極限を追求し、ほぼ実用の域に達する装置・技術の開発に成功した。測定系全体の微妙な制御に、本年度購入した「高度な制御ソフト付きの小型計算機」が不可欠であった。特に重要な発見は、試料中に励起される音波パルスの性状は、振動子に入射されるパルスの形より、振動子・試料間の機械的結合状態によりおおく影響されるということであった。この際、本年度に購入した「電極融着装置」が良好な結合状態を実現するのに大きな役割を果たした。

実際の測定では、試料が一個しかなく、再製が非常に困難であるため、まず、試料を破壊しない配慮が重要である。そのため、まず、ピストン・シリンダ-装置を用い、静水圧下で、4万気圧までの測定をおこなう。この圧力領域での測定が充分に進んだ後、より高い圧力領域での測定をめざす。本研究で目標とする下部マントルに相当する圧力領域では実験技術状の制約からmmサイズの試料を用いざるを得ない。Mg・ペロボスカイトは地表では天然には存在しない。本研究では超高圧下で合成された試料を用いる(岡山大学・地球内部研究センタ-の伊藤助教授による)。測定用に研磨後の大きさは、直径約1mm,長さ約2mmである。本研究に於て最も困難な点は、このように試料が非常に微少であることである。このような極微小試料を用いた測定の例はいままで報告されていない。筆者は、今までの長年の研究により、直径2mm,長さ2.5mm程度の高圧鉱物については、パルス法による伝播時間の測定に於て、入射パルスに起因する雑音と信号を確実に区別できるようになっているが、まずこの技術を改良する。まず、このような微小試料の中をも観測に必要な程度のエネルギ-をもって弾性波が伝播し得るかどうかの確認に成功した。しかし、予想していたことではあるが、今までの経験の延長だけではうまく行かない面が多くあった。例えば、試料に対する振動子の大きさ、接着の方法等、極微小試料にあっては、誤差の要因になることが多い。また、試料中を伝播して来る波は、いろいろな「歪」を含んでいる。まず振動子は理想的でなく、当然、不用な周波数成分を含む。また、高圧下で合成された試料は、いろいろな意味で「理想試料」からほど遠い。例えば、粒径一つをとってみても、よくわかっていない。したがって、このような試料を伝播する波は、試料を伝播中に「変形」するらしい。結果として、伝播時間の推定に大きな誤差をもたらす要因になり得る。本年度は、これらの負の要因を一つ一つつぶすべく精力的に実験を行ったが未だ完全な解決にいたら図、今後に課題を残した。
樹状細胞への細胞融合及びゲノム導入を用いた腫瘍免疫療法に関する研究

HLA-A2陽性者の健常人ドナーから採取した末梢血より単核球分画を採取し,GM-CSF,IL-4を添加して培養し,DCを誘導した.肺癌培養細胞株PC-14を粉砕したものをtumor lysateとしてこれに加え,TNF-αを添加して培養した.以上の方法にて誘導した抗原負荷DC(pulsed DC)を抗原提示細胞とし,自己リンパ球を培養した.その後リンパ球を回収し,IL-2を添加した培地で培養した.以上より健常人末梢血単球由来のDCからヒト肺癌細胞に対するCILを誘導する系を確立した.これをふまえて,癌性胸膜炎にて再発している肺腺癌患者において実験した.同様の方法で,患者の末梢血から単球由来DCを誘導し,胸水から採取した肺腺癌細胞をtumor lysateとして誘導したpulsed DCを抗原提示細胞として自己リンパ球からCILを誘導したところ,高いIFN-γ産生能を有していた.実際の臨床応用に向けては,tumor lysateとして用いる癌細胞が一定量必要となる.実際には,手術症例や一部の癌性胸膜炎以外の患者以外では必要量の採取が困難である.よって,現在は生検等の少量の癌細胞による効率的なCILの誘導方法について検討中である.HLA-A2陽性者の健常人ドナーから採取した末梢血より単核球分画を採取し,GM-CSF、IL-4を添加して5日間培養し、樹状細胞(DC)を誘導した。肺癌培養細胞株PC-14を粉砕したものをtumor lysateとしてこれに加え、TNF-αを添加して2日間培養した。以上の様に誘導した抗原負荷DC(pulsed DC)を抗原提示細胞とし、自己リンパ球と固相化CD3シャーレで2日間培養した。その後リンパ球を回収し、IL-2を添加した培地で5日間培養した。リンパ球に対して1週間毎に3回の反復刺激を行った。また、tumor lysateを負荷していない抗原未負荷DC(plain DC)を抗原提示細胞とした群、DCを用いず、tumor lysateを直接抗原とした群を同様に作成した。これらの群について、抗原刺激によるINF-γ産生能を測定し、抗腫瘍効果について検討した。誘導したCTLのINF-γの産生はリンパ球+PC-14の群が有意に高く、抗HLA-A2抗体の添加によって有意に抑制された。以上より健常人抹消血単球由来のDCに肺癌細胞株のtumor lysateを負荷することにより、ヒト肺癌細胞に対するCTLを誘導する系を確立した。HLA-A2陽性者の健常人ドナーから採取した末梢血より単核球分画を採取し,GM-CSF,IL-4を添加して培養し,DCを誘導した.肺癌培養細胞株PC-14を粉砕したものをtumor lysateとしてこれに加え,TNF-αを添加して培養した.以上の方法にて誘導した抗原負荷DC(pulsed DC)を抗原提示細胞とし,自己リンパ球を培養した.その後リンパ球を回収し,IL-2を添加した培地で培養した.以上より健常人末梢血単球由来のDCからヒト肺癌細胞に対するCILを誘導する系を確立した.これをふまえて,癌性胸膜炎にて再発している肺腺癌患者において実験した.同様の方法で,患者の末梢血から単球由来DCを誘導し,胸水から採取した肺腺癌細胞をtumor lysateとして誘導したpulsed DCを抗原提示細胞として自己リンパ球からCILを誘導したところ,高いIFN-γ産生能を有していた.実際の臨床応用に向けては,tumor lysateとして用いる癌細胞が一定量必要となる.実際には,手術症例や一部の癌性胸膜炎以外の患者以外では必要量の採取が困難である.よって,現在は生検等の少量の癌細胞による効率的なCILの誘導方法について検討中である.
高周期14族元素のハロ錯体の固体構造とイオン伝導性

高周期14族元素のうちSnおよびPbの元素について,カチオンとハロゲンを系統的に変えてハロ錯体を合成し,それらについてDTA,磁気共鳴(NQR,NMR)法,X線回折法などの物性測定手段を用いて,錯アニオンやカチオンの静的構造と動的構造を明らかにし,イオン伝導機構を調べた。その結果,Sn(II)の塩化物のうち,Cs塩やCH_3NH_3塩では高温で立方晶ペロブスカイト型構造に相転移した。Cs塩は温度上昇すると相転移し,導電率は急激にジャンプし高い値(10^<-3>S/cm)を示すが,冷却しても高い導電率を維持し,大きなヒステリシスを伴っている。CH_3NH_3塩では高温で高い導電率(10^<-2>S/cm)を示すが,温度変化に急激な変化は見られなかった。いずれも高温で着色し,直流による分極効果が観測できなかったことなどから電子伝導性が導電率を支配していると考えられる。しかし,CH_3NH_3塩のリ-トベルト解析からのフーリエマップと^<119>SnNMR測定の,結果は塩化物イオンの拡散が始まっていることを示した。しかし,^<119>SnNMRの緩和時間の温度依存性より求めた活性化エネルギーは54kJ/molであり,Ge化合物に比べ2倍近い大きな値であった。一方,CH_3NH_3PbCl_3やCsPbF_3は室温で立方晶ペロブスカイト型構造をとり,後者は前者に比べ2桁高い導電率を示した。後者の^<19>FNMRでは170Kの相転移で既にシャープな成分が現れ,室温ではほぼ先鋭化したスペクトルを示し,フッ化物イオンの拡散が低温から励起されていることが明らかとなった。
大きな揺らぎの存在する媒体中での高分子挙動に関する理論的解析手法の開発とその応用

本研究の目的は大きな揺らぎが存在する媒体中での高分子挙動を理論的に調べる事であるが,昨年度に行った,一成分溶媒の気-液臨界点近傍および二成分混合溶媒の液-液相分離臨界点近傍での高分子鎖の解析に引き続き,今年度は,電解質水溶液中でのDNA鎖の自己凝縮転移に関する研究を行った.DNA鎖は電解質水溶液中において,負に帯電した荷電高分子鎖となり,鎖内のクーロン反発によって,ランダムコイルを形状する.この状態に,三価ポリアミンであるスペルミジン(SPD^<3+>)を数から数十mM程度添加すると,環状コイル形状へ自己凝縮転移する現象が観測されている.また,温度変化に関しては,低温でランダムコイル形成をとるDNA鎖は,温度上昇に伴い環状コイルへ自己凝縮転移する観測結果が報告されている.一般に電解質水溶液中での荷電高分子鎖(DNAの粗視化モデル)のブラウニアン動力学法では,水は連続誘電体とし,イオンは荷電粒子としてモデル化する.このモデルにおける自己凝縮転移のメカニズムとしては,多価イオンのイオン強結合による電荷秩序状態の形成が考えられるが,水を露に考慮しないこのモデル化では,自己凝縮転移を再現する事は出来なかった.また,温度変化に関しては,温度の上昇により慣性半径が増加する(実験とは逆の)結果が得られた.そこで我々は,タンパク質の天然構造の安定性において重要となる疎水性相互作用に着目し,水の凝集性液体としての性質(強い界面張力)を考慮した電解質水溶液モデルを構築した.この粗視化モデルに対して,密度汎関数理論(DFT)に基づく液体論的手法を用いたマルチスケールシミュレーション法を適用し,荷電高分子鎖(DNA鎖)の自己凝縮現象について解析を行った.その結果, SPD^<3+>の添加および温度上昇に伴う自己凝縮転移を定性的に再現出来る事が示された.また,溶媒和自由エネルギーの解析から, SPD^<3+>の添加および温度上昇により,溶媒和自由エネルギーが大きく上昇する事が分かった.これらの結果から,(a)SPD^<3+>の添加に伴う疎水性相互作用の強化,(b)温度上昇に伴う水和エントロピーの増加に起因した疎水性相互作用の強化,が電解質水溶液の貧溶媒化を導き,これが自己凝縮転移の駆動力となる事が示された.本研究で考慮した電解質水溶液における水の寄与は,タンパク質やコロイドの塩析に関する現象を記述するのに必要不可欠であり,ソフトマター物理においても重要な要素の一つであると考えられる.本研究の目的は大きな揺らぎが存在する媒体中での高分子挙動を理論的に調べる事であるが,今年度は一成分溶媒の気-液臨界点近傍および二成分混合溶媒の液-液相分離臨界点近傍での高分子鎖の普遍的挙動と特異的振る舞いについて明らかにした.古くから高分子物理の分野では高分子鎖は臨界点近傍で凝縮すると考えられてきた.しかしながら近年,幾つかの実験により,高分子鎖が膨潤する事を示唆する結果が報告されている.今回,我々は密度汎関数理論に基づく理論的解析から,一成分超臨界溶媒中では,高分子鎖が親溶媒的か疎溶媒的かに関わらず,普遍的に膨潤する可能性を示した.また,親溶媒性が強い高分子鎖の場合には,超臨界溶媒の密度揺らぎが理想気体のそれと等しくなる状態点において,特異的に凝縮する事も示した.前者の臨界点近傍における高分子鎖の膨張は,高分子の個性に依存しない事から,普遍的現象であり,後者の親溶媒性の強い高分子鎖に見られる凝縮は特異的振る舞いであると言える.上記の気-液相転移における粒子と空孔の関係を,粒子1と粒子2で置き換える事により,二成分混合溶液での液-液相分離に対応させる事が出来る.二成分混合溶液中での高分子鎖は,どのように振る舞いのかを調べるために,上述の手法を適用し,解析を行った.それにより,高分子鎖が選択的親溶媒性を持つ場合,臨界点近傍において大きく膨潤する事が明らかと成った.一方,どちらの溶媒に対しても,疎溶媒性的である場合は,臨界点近傍で凝縮する可能性を示した.二成分混合溶媒の場合は,一成分系における空孔に対応した溶媒2の高分子鎖に対する親和性を制御する事が出来るので,一成分溶媒系では現れなかった,臨界点近傍での高分子鎖の凝縮的振る舞いも示唆される.本研究の目的は大きな揺らぎが存在する媒体中での高分子挙動を理論的に調べる事であるが,昨年度に行った,一成分溶媒の気-液臨界点近傍および二成分混合溶媒の液-液相分離臨界点近傍での高分子鎖の解析に引き続き,今年度は,電解質水溶液中でのDNA鎖の自己凝縮転移に関する研究を行った.DNA鎖は電解質水溶液中において,負に帯電した荷電高分子鎖となり,鎖内のクーロン反発によって,ランダムコイルを形状する.この状態に,三価ポリアミンであるスペルミジン(SPD^<3+>)を数から数十mM程度添加すると,環状コイル形状へ自己凝縮転移する現象が観測されている.また,温度変化に関しては,低温でランダムコイル形成をとるDNA鎖は,温度上昇に伴い環状コイルへ自己凝縮転移する観測結果が報告されている.一般に電解質水溶液中での荷電高分子鎖(DNAの粗視化モデル)のブラウニアン動力学法では,水は連続誘電体とし,イオンは荷電粒子としてモデル化する.このモデルにおける自己凝縮転移のメカニズムとしては,多価イオンのイオン強結合による電荷秩序状態の形成が考えられるが,水を露に考慮しないこのモデル化では,自己凝縮転移を再現する事は出来なかった.

また,温度変化に関しては,温度の上昇により慣性半径が増加する(実験とは逆の)結果が得られた.そこで我々は,タンパク質の天然構造の安定性において重要となる疎水性相互作用に着目し,水の凝集性液体としての性質(強い界面張力)を考慮した電解質水溶液モデルを構築した.この粗視化モデルに対して,密度汎関数理論(DFT)に基づく液体論的手法を用いたマルチスケールシミュレーション法を適用し,荷電高分子鎖(DNA鎖)の自己凝縮現象について解析を行った.その結果, SPD^<3+>の添加および温度上昇に伴う自己凝縮転移を定性的に再現出来る事が示された.また,溶媒和自由エネルギーの解析から, SPD^<3+>の添加および温度上昇により,溶媒和自由エネルギーが大きく上昇する事が分かった.これらの結果から,(a)SPD^<3+>の添加に伴う疎水性相互作用の強化,(b)温度上昇に伴う水和エントロピーの増加に起因した疎水性相互作用の強化,が電解質水溶液の貧溶媒化を導き,これが自己凝縮転移の駆動力となる事が示された.本研究で考慮した電解質水溶液における水の寄与は,タンパク質やコロイドの塩析に関する現象を記述するのに必要不可欠であり,ソフトマター物理においても重要な要素の一つであると考えられる.
超高バイオマス生産サトウキビの光合成能力と群落内炭酸ガス濃度の挙動

C_4光合成経路を有し,単位葉面積当たりCO_2固定能力が高いサトウキビ品種,サトウキビ近縁野生種との雑種であるモンスターケーンおよびエリアンサスを用いて栽培期間内のバイオマス生産能力の違いを比較解明し,次に,その生産されたバイオマスをサトウキビの土壌改良資材として,またエネルギー源として変換することで,大気CO_2を抑制,削減するシステムを構築した.C_4光合成経路を有し,単位葉面積当たりCO_2固定能力が高いサトウキビ品種,サトウキビ近縁野生種との雑種であるモンスターケーンおよびエリアンサスを用いて栽培期間内のバイオマス生産能力の違いを比較解明し,次に,その生産されたバイオマスをサトウキビの土壌改良資材として,またエネルギー源として変換することで,大気CO_2を抑制,削減するシステムを構築した.1.圃場にサトウキビ(品種農林8号,18号),モンスターケーン(95GS-11),ネピアグラスを栽培し,CGR, NAR, SLA, LAI等の成長関数,吸光係数および太陽エネルギー利用効率(EU)を調べ,種間で比較した.その結果,農林8号と95GS-11のEUが高く,CGRの影響が著しかった.2.本年度購入したカロリーメーターで,部位別,層別の熱量を調べた.さらに,様々な種子の熱量を調べ,リストを作成した.種子の熱量は,ゴマで7259cal/gで最も高く,ついでラッカセイの7089cal/gであった.葉の熱量は,上位葉ほど熱量が高く,茎よりも葉の方が高かった.3.圃場で栽培したサトウキビ2品種,モンスーケーンおよびネピアグラスを用い,夏期に群落内吸光係数と生産構造図を調べ植え付け後短期間内にどの程度のバイオマス生産能力と光エネルギー利用に差異が生じるか比較した.特に,生産構造図に熱量のデータを加え,熱量の垂直分布を層ごとに明らかにした.4.裸地,ネピアグラス,サトウキビキャノピー内のCO_2濃度プロファイルの日変化を調べ,バイオマス生産能力および生産構造図,さらには個葉の光合成能力との関係を明らかにした.その結果,群落内部のCO2濃度は,日中低く,夜間に増加し,特に明け方に著しく増大した.5.生産されたバイオマスを600°Cで炭化し,化学的特性,物理的特性,熱量を調べ種間で比較する実験は,現在継続中である.1.圃場にサトウキビとソルゴーを栽培し,CGR,NAR,SLA,LAI等の成長関数,吸光係数および太陽エネルギー利用効率(EU)を調べた.2.それらサトウキビとソルゴーを用い,夏期に群落内吸光係数と生産構造図を調べ植え付け後短期間内にどの程度のバイオマス生産能力と光エネルギー利用に差異が生じるか比較した.特に,生産構造図に熱量のデータを加え,熱量の垂直分布を層ごとに明らかにした.3.サトウキビおよびソルゴーの群落におけるCO_2濃度プロファイルの日変化を調べ,バイオマス生産能力および生産構造図,さらには個葉の光合成能力との関係を明らかにした.4.C_3植物であるマングローブのCO_2濃度プロファイルの日変化を調べ,C_4植物のサトウキビやソルゴーと比較した.本研究では,CO_2固定能力の高いC_4光合成を有するサトウキビ,その近縁野生種との雑種である高バイオマス量サトウキビおよびソルゴーを用いて栽培期間内のバイオマス生産能力の違いを比較解明し,次に,その生産されたバイオマスをエネルギー変換して有効に活用して地球温暖化ガスの削減に貢献するカーボンリダクションシステムの確立を目的に実施した.特に,サトウキビの絞りカスを炭化することで大気CO_2を永続的に固定する新システムの構築の実現を目指した.様々なバイオマスをエネルギーとして利用しようとした場合,バイオマスを周年供給し,変換プラントを効率よく運転する必要があり,そのためには亜熱帯島嶼地域における植物のバイオマス生産能力の解明が重要となる.研究の概要は1.南大東島のサトウキビ圃場において,プリンスベイト区と慣行区を設け,収量調査,成長函数,吸光係数および太陽エネルギー利用効率(EU)を調べ,サトウキビ増産について検討した.2.両処理区におけるサトウキビ群落のキャノピー内のCO_2濃度プロファイル,光合成速度を計測し,糖収量,バイオマス生産能力および生産構造図との関係を検討した.3.生産された様々なバイオマスをバイオエタノールに変換し,化学的特性,物理的特性,熱量を調べ,エネルギー変換効率を調べ,C_4植物の優位性と沖縄地方の太陽エネルギーの重要性を明らかにした.
可逆的神経伝達阻止法による小脳運動学習機構の解析と解明

運動学習の獲得・維持・表出の各過程における小脳皮質・その投射先である前庭核の役割を調べた。皮質から前庭核への情報伝達を遮断すると、学習スコアは上昇していかなかった。しかし情報伝達を回復させて再学習させてみると、学習スコアは高かった。反対に、情報伝達遮断前に学習を誘導し、その後情報遮断後に再学習を測定してみると、情報伝達を遮断しているにもかかわらず学習スコアは高かった。以上より、運動学習の表出には皮質は必要だが、一旦皮質が機能して運動学習を獲得・表出してしまうと皮質は必要でないことが明らかとなった。テトラサイクリン発現調節システムを用いることにより、小脳顆粒細胞からプルキンエ細胞への神経伝達を可逆的に阻害することが可能なRNBマウスを用いて、反射性眼球運動(OKR)を測定した。まず、様々な速度・周波数のサイン刺激に対するOKRダイナミクスを測定したところ、非遮断・回復時においてはRNBマウスのOKRダイナミクスは野生型マウスと変化なかった。また、伝達遮断時においてもRNBマウスのOKRダイナミクスは野生型マウスと同様であった。これにより、OKRダイナミクスには小脳顆粒細胞からの神経伝達は必要ないことがわかった。次に、1時間のOKR刺激に対する適応変化を調べたところ、遮断時のRNBマウスは適応が変化しなかった。1時間の刺激後すぐに暗室内で飼育しながら連日測定することにより5日間のOKR適応変化を調べたところ、RNBマウスは5日間の長期OKR適応変化は誘導されなかった。その後、14日間暗室内で飼育しながら神経伝達を回復させた後に再度適応変化を測定すると、野生型マウスと同様に高い適応を示した。以上より顆粒細胞からの神経伝達は適応変化の表出に重要であると考えられる。今度は、まず遮断前に5日間の長期OKR適応変化を誘導し、その後暗室内で14日間飼育しながら神経伝達を遮断した後に再び適応を測定した。その結果、RNBマウスの適応は神経伝達が遮断しているにもかかわらず、野生型マウスと同様に高い適応を示した。このことから、5日間の長期学習により前庭核でも可塑性が誘導され、その可塑性が誘導されると、OKRの適応変化には顆粒細胞からの神経伝達は必要ないことがわかった。RNBマウスのOKR適応変化学習は、小脳顆粒細胞からの神経伝達を遮断する前に一度誘導されると、遮断後にも維持・表出されることがわかっていた。そこで、このOKR適応変化が高いRNBマウスのプルキンエ細胞の活動を覚醒状態においてin vivo細胞外電気記録により測定したところ、小脳顆粒細胞からの神経伝達を示す単純スパイクのみが消失していており、小脳顆粒細胞からの神経伝達が遮断されていることが確かめられた。よって、小脳皮質とその投射先である前庭核において一度可塑性が誘導されると、OKR適応変化には小脳顆粒細胞からの神経伝達は必要ないことがわかった。次に、神経伝達遮断中のRNBマウスにおいて、小脳皮質を単純スパイクの様に電気刺激することによりOKR適応変化学習が誘導されないか検討した。まず、野生型マウスを用いて水平眼球運動を担っている小脳皮質領域、小脳片葉HゾーンのOKR中のプルキン工細胞からin vivo細胞外電気記録によって単純スパイクの発火パターンを計測し、RNBマウスに与える電気刺激のひな形とした。次に神経伝達遮断中において、OKR学習前のRNBマウスの小脳片葉Hゾーンに電極を埋め込み、スクリーン刺激と同時に電極から電気刺激を行った。5日間電気刺激付きOKR学習刺激を行うと、RNBマウスの適応は野生型マウスと同様に変化していった。しかしながら、OKR学習刺激によって野生型マウスは様々な周波数のOKRダイナミクスも変化したのに対し、電気刺激付きOKR学習刺激を行ったRNBマウスは、OKRダイナミクスは変化しなかった。これは電気アシスト刺激は完全なOKR適応変化学習を引き起こすことはできないことを示している。
衝撃波・岩石破砕を含む噴火シミュレータのための高精度数値計算スキームの開発

「噴火シミュレータ」をさらに高精度化するための以下の数値計算法の開発を行った。火山噴火は爆風の衝撃波伝播とかなり類似した部分があり圧縮性流体計算を必要とする。非常に狭い領域で大きなエネルギーを短時間に放出し、その影響が広範囲に及ぶ。数値計算手法に求められることとして、噴火口付近の領域に十分細かい計算格子を配置する、密度・圧力の急激な変化に対して安定に計算できるスキームである、長時間積分が可能である、ことが必要である。これらの全てを満足する数値計算手法として、保存形の局所補間微分オペレータ(IDO)法をさらに発展させた。(1)従来の物理量の値と微係数を従属変数として補間関数を構築するIDO法を値と区間積分値を従属変数として補間関数を構築する方式に変更し、区間積分値に対しては偏微分方程式を区間積分して得られる方程式で時間積分を行い、flux formの保存形IDO法を構築した。(2)保存形IDO法の精度検証を行い、風上補間の場合には補間関数は2次多項式になるにも関わらず、移流計算の精度は3次精度であることが明らかになった。また、中心補間に対しては4次多項式になり4次精度がでることが分かった。非保存形IDO法と比較して補間関数の多項式の次数は下がるが、フーリエ解析の結果はgainおよびphaseとも非保存形と区別できないほど一致した結果が得られた。(3)噴火の最中は火口付近の空間解像度を十分高くし、噴火終了後は噴煙を精度よく捕らえるために上空の空間解像度をAdaptiveに高くするAMR (Adaptive Mesh Refinement)法にIDO法を検討した。非保存形IDO法の場合と異なり、Cellのマージ過程に補間操作が無くなり、積分値は単純な足し算となるためこの部分の誤差がゼロであることが分かった。(4)岩石のモデル化として、複雑な形状を反映するために非球形モデルの個別要素法をさらに発展させ、球形粒子を複雑形状の岩石を多数(1000個)配置し、斜面を転がり落ちる落石過程をより高精度化した。また、岩石の慣性モーメントもより忠実に計算する方法に改善した。また、岩石破壊過程のモデルを検討し、計算量の問題から岩石全体の構成粒子を要素バネで連結することは困難であることが判明し、剛体連結したクラスター粒子の間を断裂するバネで連結し落石計算を行った。「噴火シミュレータ」を構築するための基礎となる以下の数値計算法の開発を行った。火山噴火は非常に狭い領域で大きなエネルギーを短時間に放出し、その影響が広範囲に及ぶ。数値計算手法に求められることとして、(1)噴火口付近の領域に十分細かい計算格子を配置する、(2)密度・圧力の急激な変化に対して安定に計算できるスキームである、(3)長時間積分が可能である、ことが必要である。これらの全てを満足する数値計算手法として、局所補間微分オペレータ(IDO)法をベースとして新たな改良を行った。(1)噴火の最中は火口付近の空間解像度を十分高くし、噴火終了後は噴煙を精度よく捕らえるために上空の空間解像度をAdaptiveに高くするAMR(Adaptive Mesh Refinement)法にIDO法を適用した。1:2の非等間隔格子にも関わらず、空間微係数を従属変数として計算するために、空間3次精度の計算が可能であることが明らかになった。このAMR法により爆発で生じる衝撃波の捕獲やレーリーテーラー不安定性に適用し、有効性を確認した。(2)IDO法は1000倍を超える密度や圧力が急激な変化する現象を計算するためには、安定性のためにスタッガード格子配置にしなければならなかった。しかし、空間精度が2次精度に低下してしまうため、コロケート格子において安定化カップリング法を開発し、4次精度を保ちつつ安定に計算することが可能になった。(3)これまでのIDO法は十分良い精度で計算できたが非保存形であり、長時間積分には不安が残っていた。従来の物理量と空間微係数を従属変数とする方法から物理量と格子区間積分値を従属変数とする方法の保存形IDO法を開発した。物理量に対しては従来のIDO法と同様に計算し、積分値に対してはfluxベースで完全に保存させ、短い時間の計算精度は従来と全く同じであり、長時間積分では大きな利点があることを確認することができた。(4)岩石のモデル化として、複雑な形状を反映するために非球形モデルの個別要素法を開発した。球形粒子を複雑形状の岩石の表面に配置することで、従来の手法の拡張として非球形の岩石が斜面を転がり落ちる過程を再現することができ、落下の併進運動エネルギーが回転エネルギーに変化する割合を求めることができた。

(2)保存形IDO法の精度検証を行い、風上補間の場合には補間関数は2次多項式になるにも関わらず、移流計算の精度は3次精度であることが明らかになった。また、中心補間に対しては4次多項式になり4次精度がでることが分かった。非保存形IDO法と比較して補間関数の多項式の次数は下がるが、フーリエ解析の結果はgainおよびphaseとも非保存形と区別できないほど一致した結果が得られた。(3)噴火の最中は火口付近の空間解像度を十分高くし、噴火終了後は噴煙を精度よく捕らえるために上空の空間解像度をAdaptiveに高くするAMR (Adaptive Mesh Refinement)法にIDO法を検討した。非保存形IDO法の場合と異なり、Cellのマージ過程に補間操作が無くなり、積分値は単純な足し算となるためこの部分の誤差がゼロであることが分かった。(4)岩石のモデル化として、複雑な形状を反映するために非球形モデルの個別要素法をさらに発展させ、球形粒子を複雑形状の岩石を多数(1000個)配置し、斜面を転がり落ちる落石過程をより高精度化した。また、岩石の慣性モーメントもより忠実に計算する方法に改善した。また、岩石破壊過程のモデルを検討し、計算量の問題から岩石全体の構成粒子を要素バネで連結することは困難であることが判明し、剛体連結したクラスター粒子の間を断裂するバネで連結し落石計算を行った。
実用的な『手話-日本語辞典』を編纂するための手話の言語学的基礎研究

17年度の基本見出し手話選定再検討の作業を受け、『手話-日本語辞典』のサンプル作成の第1ステップとして、手話形態素としての片手(右手)の働きから見出し手話を排列できるように、片手だけを使って表現する「片手手話」159例を選定した。これらすべてについて静止画起こしを行い、専門家にそのイラスト作成を依頼した。できあがったイラストに関しては、手話通訳専門家の助言を仰ぎながら随時修正し、手話を知らない一般の人々が見ても理解しやすい表現となるように心がけた。イラスト作成と平行して、見出し手話の排列を決めるために、それぞれの手話に見出しキーワードを貼り付ける作業を行った。見出しキーワードとは『手話-日本語辞典』を効率的に引くために、見出し手話の視覚的特徴を表す語である。したがって今回選定した見出し手話159例には、すべてにまず「片手・右手」という共通の見出しキーワードが貼り付けられることになる。次に右手のどの部分が主に使われているか、という見出しキーワードを貼り付けた。たとえば、【思う】(「思う」を表す手話(以下同じ))には「人差し指」、【泣く】には「親指と人差し指」、【みんな】には「手のひら」、【勝つ】には「こぶし」などのように、その向きや形に関係なく視覚的に最も捉えやすい形や部分を表す語を選んだ。さらに、「口」や「胸」などのように右手が触れるか近くになる身体の部位と、その部位に対して「近づく」「離れる」「回す」などの動きの方向も見出しキーワードに加えた。以上の作業後、最終的に80例の手話を選定し、見出しキーワードから引くことのできる『手話-日本語辞典サンプル』を作成した。この辞典サンプルの特徴は、実際に調べたい手話の意味を知りたい時に、見出しキーワードの組み合わせからある一定の手話グループを特定し、その中から初めてイラストを見ながら目的の手話にたどりつくという点にある。
デジカメの動画撮影機能を利用した形成的評価のあり方と学びの共有化を図る授業設計

教育活動における形成的評価は、学習水準の向上に大きな影響を及ぼすと言われている。それを受けて、形成的評価の一つの方法である自己評価を適切に行わせることができれば、生徒のメタ認知力を高めて生涯学習の基礎となる自立的な学習者を育てることができると考えてきた。しかし、従来の自己評価は、スピーチ活動などの発表のあと、記憶に頼りながらの曖昧な自己評価しかできなかった。そこで、本研究の目的は、デジカメの動画撮影機能を使って生徒に自分のパフォーマンスを見させ自己評価させることが効果的であるか否かをみることであった。また、モデルとなるパフォーマンス映像を即時に共有し学びあう方法を実践することでもあった。授業は3年の一斉授業で年5回実施した。生徒数は各クラス約40名であった。カメラは既存の10台と補助金で購入した10台の計20台を使用した。10台だけの時と比べペアで1台を使用することができたので、撮影回数が増え、生徒は意欲的に何度も自分の姿を視聴しながら、評価指標をもとにパフォーマンスの改善に努めていた。この様子は5月の研究発表会で公開した。その際、金沢大学滝沢先生から、デジカメによる自己評価は効果的であるという評価を受けた。パフォーマンスの共有化については、まず、優秀なパフォーマンス映像が収められているデジカメから記憶媒体を抜き、パソコンに挿して映像をプロジェクターで投影する。次に、その映像を見ながら良い点をクラスで共有するという流れでおこなった。これをおこなうと、その映像が目標になりその後の練習に効果的であった。この様子は11月に公開した。生徒の変容はドラスティックなものとまではいかないが、自己評価前後では確実に改善が見て取れた。このことは、「デジカメの動画は自分の英語の改善に役立ったと思いますか」というアンケートに対する生徒の回答で、肯定的なものが96%に達したことからも知ることができた。
O-1N由来高転移、低転移株を用いたリンパ節転移機序の検索

口腔癌の転移機序をO-1N細胞・腫瘍組織およびヒト口腔癌を用いて研究し、以下の結果を得た。1.脈管侵襲の検索。光顕・電顕観察では、O-1Nの腫瘍組織移植と同様、O-1N由来高転移、低転移細胞株の頬嚢移植でも胞巣ごとリンパ管に侵入、転移をきたす様子が観察された。ヒト口腔癌についてもリンパ管侵襲、血管侵襲いずれもO-1Nにおける所見と同様な所見が観察された。2.接着因子発現の検索。E-カドヘリン、α-、β-カテニン、α6インテグリン、ラミニンの発現は高転移株、低転移株いずれにも認められた。O-1Nの移植部では、浸潤先端ではこれらの因子の発現は低下するが、脈管侵襲部では、発現の低下は見られず、その発現低下が直接転移に関与する事を支持する所見は見られなかった。3.微小転移の検索。ヒトサイトケラチン19mRNA塩基配列をもとに作ったプライマーにてRT-PCRをおこない、O-1Nサイトケラチン19の増幅、検出に成功し、O-1Nでのリンパ節、肺転移過程における血中癌細胞の変化を観察し、本法の微小転移予測の有用性を示唆する知見を得た。4.MMP,TIMP発現の検索。O-1N高転移株でのMMP3とMMP9活性は低転移株に比して非常に強く、RT-PCRの結果では、MMP2,3,TIMP1,2 mRNAは腫瘍組織、高転移株で発現していた。転移リンパ節腫瘍ではMMP9の強い活性が見られたが、TIMP1,2活性は頬嚢、リンパ節腫瘍では陰性か低下していた。しかし転移と関連づける明確な証拠は得られなかった。なお、高転移株へのTIMP遺伝子導入による転移能の変化については結果は得られなかった。5.血管新生抑制と転移の検索。血管新生抑制剤TNP-470を用いて、その転移に及ぼす影響につき検討したが、まだ充分な結果は得られていない。6.以上の結果より、口腔癌の転移機序は従来の説とは異なる可能性が示唆された。1.脈管侵襲の検索。3.微小転移の検索。1。脈管侵襲の検索。光顕観察では、O-1Nの腫瘍組織移植と同様、O-1N由来高転移、低転移細胞株の頬嚢に移植でも胞巣ごとリンパ管に侵入、転移をきたす様子が観察された。なお、低転移株でも転移を起こすようになったため、新しい株を樹立中である。電顕観察では、リンパ管、血管いずれにも胞巣の圧迫による内皮細胞の変性部位から侵襲するが、血管では胞巣が分断されるのに対しリンパ管では胞巣形態がよく保たれていた。現在、ヒト口腔癌についてもその脈管侵襲様式を検索中である。2。カドヘリン、カテニン発現の検索。O-1Nの腫瘍組織移植では、カドヘリンの発現低下が観察された。O-1N由来高転移株、低転移株の培養では、細胞質内にドット状に見られるシグナルが細胞接着とともに辺縁に移行する様子が見られ、両細胞間では、それらの発現に明らかな差は認められなかった。3。MMP9の発現の検索。

O-1Nの腫瘍組織移植にて、MMP9に対する抗体を用いて、proMMP9の局在とラミニンの免疫染色による腫瘍基底膜の変化の関係をリンパ管侵襲と関連づけて観察中である。また、転移株のMMPとTIMP1の発現も検索中である。4。TIMP1の転移阻止の検索。ヒトTIMP1のcDNAをO-1N由来細胞に導入し、ハムスターのMMPをブロックできるかどうか、検索中である。5。微小転移の検索。ヒトサイトケラチン19mRNA塩基配列をもとに作ったプライマーにて増幅されたPCR生成物の塩基配列はマウスおよびヒトサイトケラチン19と90%以上の相同性がみられたため、ハムスターのサイトケラチン19と考えられ、これによりO-1Nの微小転移の検出が可能と思われる。1.脈管侵襲の検索。光顕・電顕観察では、O-1Nの腫瘍組織移植と同様、O-1N由来高転移、低転移株の頬嚢移植でも胞巣ごとリンパ管に侵入、転移をきたす様子が観察された。なお、低転移株でも転移を起こすようになったため、移植後もよく生着する新しい株を樹立中である。ヒト口腔癌についてもリンパ管侵襲、血管侵襲いずれもO-1Nにおける所見と同様な所見が観察された。2.接着因子発現の検索。E-カドヘリン、α-、β-カテニン、α6インテグリンの発現は高転移株、低転移株いずれにも認められた。O-1Nの移植部では、浸潤先端ではこれらの因子の発現は低下するが、脈管侵襲部では発現低下は見られなかった。3. MMP9の発現の検索。O-1N高転移株でのMMP9の発現は低転移株に比して非常に強く、その組織移植においても浸潤先端での腫瘍胞巣基底膜の消失が認められたが、リンパ管侵襲部の胞巣では基底膜は保たれていた。O-1Nの腫瘍組織移植にて、MMP9に対する抗体を用いて、proMMP9の局在と腫瘍基底膜の変化の関係をリンパ管侵襲と関連づけて観察中である。4. TIMP1の転移阻止の検索。TIMP1遺伝子をO-1Nに強制的に発現させ、転移能が変化するかを検討するため、ヒトTIMP1遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作成中である。5.微小転移の検索。ヒトサイトケラチン19mRNA塩基配列をもとに作ったプライマーにてRT-PCRをおこない、O-1Nサイトケラチン19の増幅、検出に成功し、血液2ml中に100個以上の癌細胞があればその検出が可能になった。現在O-1Nでの転移過程における血中癌細胞の変化を観察中である。1。接着因子発現の検索。O-1N由来高転移、低転移株のE-カドヘリン、α-、β-カテニン、α6インテグリンの発現の観察とO-1Nの転移過程、とくに脈管侵襲におけるそれらの発現とラミニン、IV型コラゲンなどの基底膜分子の動態の検索をした。これらの因子の発現はいずれの細胞株でもみられ、腫瘍胞巣では胞巣辺縁で低下しているが、脈管侵襲部では低下していなかった。2。MMP,TIMP発現の検索。細胞、腫瘍組織におけるMMP、TIMPの活性とmRNAの発現を検索した。O-1N高転移株でのMP3とMMP9活性は低転移株に比して非常に強く、RT-PCRの結果では、MMP2,3,TIMP1,2mRNAは腫瘍組織、高転移株で発現していた。転移リンパ節腫瘍ではMMP9の強い活性が見られたが、TIMP1,2活性は頬嚢、リンパ節腫瘍では陰性か低下していた。しかし転移と関連づける明確な証拠は得られなかった。なお、高転移株へのTIMP遺伝子導入による転移能の変化については結果は得られなかった。3。微小転移の検索。
難治性皮膚潰瘍に対する炭酸ガスレーザーを用いた低出力照射治療の創傷治癒効果解析

炭酸ガスレーザーの低出力照射治療による、創傷治癒促進効果の細胞生物的なメカニズムを解明することを目的とし、難治性潰瘍における低出力炭酸ガスレーザー治療法の開発を目指した研究である。応募者はin vitroの研究で、炭酸ガスレーザーの低出力照射治療により、皮膚線維芽細胞の増殖能、及び遊走能が促進し、それらの過程にAkt, ERK, JNKといった細胞内シグナル伝達分子の活性化が大きく関与することを報告した。今回はin vivoの実験として、糖尿病マウスを用いた皮膚潰瘍モデルにおける、炭酸ガスレーザーの低出力照射治療の治癒効果を解析する。