hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超高密度情報ストレージ用Sm-Co薄膜磁性粒子のナノ構造化と磁気的孤立化の研究

磁化反転体積Vは0.9×10^<-24>m^3となるので、SEMで観察される各粒子は単一磁区挙動をすると予想される。Smの蒸気圧が低い(1mTorrで926K)ため、比較的低温で結晶化し、粒成長に至らないためである。垂直記録は超高密度記録に有利な面を有するので、fcc(111)配向性の強いCuを下地に用いて、垂直異方性をもつSmCo薄膜作製を試みた。基板温度300°Cのとき、膜厚≦50nmの範囲でSmCo膜は大きな垂直異方性を示す。5nmの厚さにおいても、Hc⊥=5.5kOeであった。Sm-Co合金は、SmCo_5組成において10^7J/m^3以上という磁性材料中最大の結晶磁気異方性を有する物質であり、これに垂直磁気異方性をもたせ、必要な諸特性を付与して、超高密度記録に適した媒体を開発することを本研究の目的としている。垂直磁化容易軸をもつSm-Co薄膜はCu下地層を用いて達成された(Sm-Co/Cuと表記する)。Cu作製には膜厚200nm、基板加熱なし、Sm-Co層作製には基板温度300°C、組成比SmCo_5最適であることが分かった。Sm-Co/Cu薄膜においては、Sm-Co層厚が10nmという薄層の場合でも、H_<o⊥>=6-8kOe、M_<r⊥>=400emu/cc、角形比S_⊥=0.55、配向比OR(H_o)=7.6という優れた磁気特性を示した。また、Sm-Co/Cr薄膜(面内磁化容易軸をもつが、特性は優れている)は経時変化(酸化による磁気特性の変化)を防ぐため1nm厚以上のCr表面保護層を必要とするが、Sm-Co/Cu薄膜においてその必要性はない点は、大きな利点である。Sm-Co層厚10nmのSm-Co/Cu薄膜は、平均粒径=35nm、表面粗さ=5nmである。粒径は基板温度と共に増加する。Cu層の表面粗さは9nmである。粒径は20nm以下にしたい。そのために基板温度を250°C程度としたい。Cu薄膜のシード層としてfcc構造の物質を主に種々試みたが、今のところ負の結果しか得られていない。結晶性、融点、固溶性を考慮して更に試行を続ける予定である。適合したシード層を適用することにより、基板温度を低下させても上記の優れた特性を確保できると予想される。SmCo_5薄膜は,磁性材料中で最大の結晶磁気異方性定数を有するので,高密度記録のため磁化反転体積(磁性粒子或いは磁気クラスターの径)が縮小されても,残留磁化が保持できることが特長である.更に,SmCo,NdFeB,FePtのような高M_s材料とBaフェライトのように低砥材料を比べると,どちらが100-200Gb/in^2の記録に適しているか解析した.粒子径と膜厚を10nm以下にできれば,高砥特性が適している.垂直記録磁化は磁化遷移領域が小さいので,高M_s程大きい読出し出力が得られる.垂直磁気異方性をもつSmCo薄膜生成にはCuの下地膜が有効である.Cuの拡散によりSm原子と結びつき,酸化が抑止され,酸化防止用の保護膜は不要になることが見い出された.磁化機構の解析から,磁化変化は単磁区一斉回転によることが分かった.一方,面内磁気異方性をもつSmCo薄膜生成にはCrの下地膜が有効である.磁化変化は磁壁移動による.CuとCr以外に,有効な元素は見い出せなかった.SmCoの垂直異方性を引き出すには,CrとCuをシード層に用いてSmCo/Cu/Crの構成にするのが最適である.なお,SmCo層表面のSEM観察では,粒径は20-100mmであるが,TEM観察では,これが10nmのクラスターを構成していることが分かる.磁化緩和時間の解析(dH/dtとH_cの関係から求める)並びにXRDの半値幅からの計算(Scherrerの式)の結果は,10nm径の単磁区粒子の磁化反転が磁化変化の主因と考えられる.
bowl型分子キャビティを活用した新規な複合反応系の開発

官能基をbowl型分子のキャビティ内に固定すれば、官能基同士の接近が効果的に抑制されるため、通常であれば速やかに反応してしまう試剤を同一系中に存在させた複合反応系を構築できるものと期待される。これまでに用いてきたbowl型置換基はすべて置換部位が炭素であったが、本研究ではこの部位をケイ素とした置換基を開発し、bowl型試剤の汎用性、有用性を高めることを目的として検討を行った。容易に合成でき、かつbowl型キャビティを構築できる骨格として、トリフェニルシリル基のフェニル基を放射状に伸長させた新規なトリス(m-テルフェニル-5'-イル)シリル基を設計した。この骨格をもつクロロシランは、対応するm-テルフェニル-5'-イルリチウムと1/3当量の四塩化ケイ素との反応により調製し、その加水分解によりシラノールを合成した。X線結晶構造解析を行ったところ、このシラノールの分子間での最近接酸素間距離は8Å以上あり、結晶中でも単量体として存在することが明らかとなった。ヒドロキシ基は浅いbowl型キャビティの中心部に位置しており、自己縮合を起こしにくいことが示唆された。実際、このシラノールを酸性および塩基性いずれの条件下においても、シロキサンへの縮合は見られなかった。一方、このシラノールは他の基質に対しては十分に高い反応性を示し、Me3SiClからin situに発生させたシラノールとの反応では非対称シロキサンを速やかに与えた。また、単体硫黄との反応により対応するシランチオールへ変換された。通常であれば即座に反応してしまうような試剤の対、たとえば酸と塩基、酸化剤と還元剤などを同一系中に存在させられるような反応系が開発されれば、有機合成反応の可能性を大きく拡げることができると考えられる。本研究では、高反応性反応中間体の安定化のために独自に開発したbowl型分子を活用して、従来は共存が困難であった複数の試剤を含む複合反応系を構築し、新たな合成反応を開発することを目的として検討を行った。まずbowl型Lewis酸試剤および塩基試剤の合成、およびそれらの共存可能性について検討した。Lewis酸試剤として、m-テルフェニル骨格に基づくbowl型置換基(Bmt基)を有するモノアルコキシアランBmtOAlMe_2(1)を安定な結晶として合成・単離した。X線構造解析の結果、1は結晶中では二量体構造をとることがわかったが、温度可変NMR測定より溶液中では会合することなく単量体で存在していることが示唆された。また、1はスチレンオキシドをフェニルアセトアルデヒドへと選択的に変換でき、Lewis酸試剤として十分な反応性を有することがわかった。次に、塩基試剤としてBmt基を有する三級アミンBmtNMe_2(2)を合成し、1と重トルエン中で混合したところ、^lHNMRで両者のシフト値に変化は見られず、1と2が溶液中で相互作用することなく共存できることが明らかとなった。次いで、bowl型試剤の複合系を用いた合成反応の開発の一環として、エーテル基質からのアルコールのβ-脱離によるオレフィン生成反応への応用について検討した。メチルフェネチルエーテルを基質として1と2の混合系を作用させた。Lewis酸試剤1と基質との錯形成は確認されたが、脱離反応は進行しなかった。塩基として三級アミンの代わりにリチウムアミドを用いれば進行する可能性があると考えられる。
ブドウ球菌細胞溶解毒素のADP・リボシル化と細胞膜障害情報伝達機構の研究

平成元年度および2年度の研究実施計画に従って順調な研究成果を得ることができた。その成果を概略すると以下のようになる。1.実験に用いた黄色ブドウ球菌のα毒素とロイコシジンは、加藤と野田の方法で精製し結晶化した標品を用いた。この標品はSDSーPAGEでそれぞれ1本の蛋白バンドとして泳動した極めて高純度標品であった。2.α毒素は新しいADPーリボシルトランスフェラ-ゼを活性をもつ毒素であることを初めた明らかにした。α毒素によってADPーリボシル化される赤血球膜蛋白質は、主として、37kDaと41kDaであり、前者はホスホリパ-ゼA_2を、後者はPI代謝系のホスホリパ-ゼCの活性を制御しているGAP結合蛋白質であることが示唆された。さらに、α毒素は、赤血球膜のプロティンキナ-ゼCを活性化させることも初めて明らかにした。この酸素によってリン酸化されてる蛋白はBand4.1と呼ばれるものであった。プロティンキナ-ゼCの特異的阻害剤であるstaurosporineを用いることによって、Band4.1のリン酸化抑制がみられたことから、このBand4.1のリン酸化がα毒素による溶血機構に重要な役割を担うことが示唆され、α毒素の溶血機構解明に大きな前進が得られた。3.ロイコシジンもα毒素と同様に新しいADPーリボシルトランスフェラ-ゼであることを初めて明らかにした。特に、ウサギ多核白血球膜の37kDaと41kDaの蛋白をADPーリボシル化した。これらの蛋白は、それぞれホスホリパ-ゼA_2とPI代謝系のホスホリパ-ゼCの活性を制御するとみられるGTP結合蛋白質である。ロイコシジンのF成合はPI代謝系のホスホリパ-ゼC,PIPキナ-ゼを活性化させること、さらにS成分と協同してPlキナ-ゼを活性化させることも明らかにすることができた。今後これらの知見をもとにさらにロイコシジンの白血球崩壊機構を明らかにできるものと考えた。平成元年度研究実施計画に従って、以下のように順調な研究成果を得ることができた。1.黄色ブドウ球菌のα毒素とロイコシジンは、Wood46株及びV8株を用いて、加藤と野田らの方法によって精製し、結晶化することができたので、これを実験に供した。2.精製したα毒素とウサギ赤血球膜を〔^<32>P〕-NAD存在下で保温したところ、赤血球膜の分子量95,000、52,000、41,000、37,000、28,000、そして10,000の膜蛋白質がADPリボシル化されたことから、α毒素がADPリボシルトランスフェラ-ゼ活性をもっていることを明らかにできた。又、GTP存在下では、上記の膜蛋白質のうち、41,000と37,000の蛋白質が特に強くADPリボシル化されることから、これらの2つの蛋白質はGTP結合蛋白質であることが示唆された。3.ブドウ球菌ロイコシジンはSとFという2つの蛋白質成分からなっているが、S成分とF成分は、どちらもADPリボシルトランスフェラ-ゼ活性をもっていることを明らかにできた。S成分はウサギ多核白血球の分子量37,000の膜蛋白質を、F成分は分子量41,000の膜蛋白質をADPリボシル化した。

4.ブドウ球菌ロイコシジンのS成分は白血球膜のホスホリパ-ゼA_2を活性化すること、一方、F成分はホスファチジルイノシト-ル代謝系のホスホリパ-ゼCを活性化すること、そしてα毒素は、この2つの酵素活性を一分子でもっていることから、分子量37,000の膜蛋白質と41,000の膜蛋白質は、それぞれホスホリパ-ゼA_2とホスホリパ-ゼCの活性を制御している可能性が示唆されたので、現在、これらの点を研究中である。平成2年度研究実施計画に従って、以下のように順調な研究成果を得ることができた。1.実験に用いた黄色ブドウ球菌のα毒素とロイコシジンは、Wood46株及びV8株を用いて、加藤と野田らの方法によって精製し、結晶化したものである。2.精製α毒素とウサギ赤血球膜とを〔γー^<32>P〕ATP存在下で保温することによって、赤血球膜蛋白質のBand4.1が特異的にリン酸化されることがわかった。このBand4.1のリン酸化は、プロテインキナ-ゼCに特異的な阻害剤であるstaurosporineを添加することによって抑制された。以上から、α毒素は、赤血球膜のプロテインキナ-ゼCを活性化させることが示唆された.さらに、Staurosporineで処置した赤血球ではα毒素による溶血も抑制された。以上から、α毒素によるBand4.1のリン酸化は、溶血機構において重要な役割を担うものと考察された。3.精製ロイコシジンがPI代謝系のホスホリパ-ゼCを活性化させることを昨年度明らかにしたが、今年度はさらに、ロイコシジンを構成するFとS成分のどちらがその役割を担っているのかを詳細に検討した。その結果,PI代謝系のホスホリパ-ゼCとPIPキナ-ゼを活性化させるのはF成分で、S成分ではないことを明らかにすることができた。また、興味深かったのは、PIキナ-ゼの活性化は、F成分単独,あるいはS成分単独ではみられず、両成分がともに存在したときにみられたことである。以上から、PI代謝系の亢進にも、SとF成分が協同作用をしていることがわかり、ウサギ多核白血球を殺す際にSとF成分の協同作用があるという以前に我々が報告したデ-タを,さらにPI代謝というレベルでも確認することができた。
インターネット環境での英語学習に対する動機とコンピュータ不安に関する研究

本研究計画では学習者にインターネット上で電子メールを通して英語でのコミュニケーションを体験させることにより、これまでの学習者にありがちであった英語学習に対する漫然とした不満を解消する糸口を見つけることをねらいとしていた。そこでインターネット接続のためのパーソナルコンピュータを一式導入し、英語学習の教材として利用可能なネット上での資料の調査を行った。またCD-ROMの形態で市販されているマルチメディア教材の実態調査も実施した。一方これまでの英語学習に対する動機づけ研究を広く概観し、研究成果のまとめを行うとともに、英語学習形態の変化に伴い今後はどのような視点を動機づけ研究に新たに導入すべきかといった研究の方向性を提案する論文を執筆した。コンピュータ不安に関する先行研究を調査し、すでに開発されている質問紙調査用紙を入手したり、研究成果の情報収集を行った。インターネット上での電子メールのやり取りの場を設けるために、立正大学のホームページの一部に、本研究の対象となる学生が所属する法学部国際法文化コースのページを作成した。立正大学では今年度コンピュータシステムを導入した語学教育を主たる目的としたマルチメディア教室の設置を完了させることができたが、残念なことに予定より遅れたために、今年度の授業の中でその設備を用いて英語教育を実践するのには間に合わなかった。新年度からの授業の中で、作成したホームページに学生の自己紹介文を掲載することにより、それを見た世界中からの反応を利用して、英語による生きたコミュニケーションを学生たちに体験させたい。その体験との兼ね合いにより、履修学生の持つ英語学習に対する動機づけやコンピュータ不安に関する調査も実施し、研究成果をまとめたい。
ＥＳ細胞の浸透圧応答とＡＶＰニューロンへの再生・分化メカニズムの解明

本年度は、細胞体・樹状突起、及び軸索終末からのAVP分泌に重要な役割を担っているCa2+チャネルについて実験を行った。アントラニル酸誘導体であるフルフェナム酸(FFA)は、ラット動脈平滑筋細胞のL型Ca2+チャネルを阻害することが以前に報告されている。そこで、ラット脳の視索前核から単離されたAVPニューロンにおける電位依存性Ca2+チャネルに対するFFAの効果を検討した。電圧固定パッチクランプ法で記録されたラットAVPニューロンのCa2+チャネル電流は、細胞外液を低浸透圧液から高浸透圧液に置き換えても、有意な変化は見られなかった。FFAを投与すると、Ca2+チャネル電流は有意に抑制された。Ca2+チャネル電流は、L型Ca2+チャネルブロッカー、ニフェジピン、及びP/Q型Ca2+チャネルブロッカー、ω-アガトキシンIVAの投与による影響は受けなかった。一方、N型Ca2+チャンネルブロッカー、ω-コノトキシンGVIA(ω-CgTX)またはT型Ca2+チャンネルブロッカー、NNC55-0396(NNC)を投与すると、Ca2+チャネル電流が有意に抑制された。ω-CgTXとNNCを同時に投与すると、Ca2+チャネル電流はほぼ完全に抑制された。FFAは、ω-CgTX非感受性(T型)成分だけでなく、Ca2+チャネル電流のNNC非感受性(N型)成分も有意に阻害した。これらの結果より、N-およびT-型Ca2+チャネルがAVPニューロンの細胞体/樹状突起において機能的に発現しており、共にFFA感受性であることが明らかになった。RPDとして採用していただいていた期間中に行った、本年度の研究成果を含むラットAVPニューロンの高浸透圧条件下における浸透圧応答における研究成果は、現在、論文投稿準備の最終段階にある。RPD期間内での投稿という目標は残念ながら成し遂げることが出来なかったが、今年度中に投稿を予定している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度は、ラットAVPニューロンの低浸透圧条件下において容積調節メカニズムに重要な役割を担う容積感受性外向整流性Cl-チャネル(VSOR)について、培養AVP細胞における機能的発現の有無をパッチクランプ法により電気生理学的・薬理学的な解析をする計画であった。このVSORにおいて、2014年、LRRC8AがVSOR活性の重要な因子である事が報告され、さらに最近、VSORがアシドーシス条件下で活性化する酸感受性外向整流性Cl-チャネル(ASOR)と同一の分子実体ではないかという説を唱える研究者も見受けられてきた。そこで、培養AVP細胞で研究を行うにあたり、VSORのASOR、LRRC8ファミリーに対する関与を明らかにする為、ヒト子宮頸癌細胞由来のHeLa細胞を用いて実験を行った。ASORの阻害剤として知られているDIDS、フロレチンは、VSORの阻害剤としても広く知られており、この事がASOR=VSOR説と唱える理由の1つになっていた。しかし、本研究により、VSORの阻害剤であるDCPIB、ATP、NPPB、カルベノキソロン、PPADS、メフロキニン、タモキシフェン、ガドリニウムの6種の試薬がASORには効果がない事が明らかになった。VSORの阻害剤であるスラミン、DIOA、アラキドン酸、ニフルミン酸は、ASORにも効く事が明らかになったが、ASORにおける抑制効果は、VSORにおける抑制効果の10100倍も高い事が明らかになった。また、LRRC8ファミリーのVSOR、ASORそれぞれの関与について、VSORにおいては、⊿LRRC8A(⊿8A)細胞では電流が抑制されたが、⊿8B8E細胞においてはなんら影響がなく、ASORにおいては、⊿8A8E細胞すべてにおいて影響がないという結果が得られた。これらの結果より、ASOR≠VSORである事が結論付けられた。共同研究者からの細胞提供に予想外の遅れが生じたため、培養AVP細胞を用いた研究の進行に遅れが生じているが、それを補填する基礎的な研究として、低浸透圧条件下における容積調節メカニズムに重要な役割を担う容積感受性外向整流性アニオンチャネル(VSOR)について実験を行い、今後の研究にとって鍵となる重要な知見を得た。よって、本研究課題の進捗状況は、順調に進展していると判断できる。これまでの予備実験において、ラットAVPニューロンの安定したカチオン電流を取ることが出来ず、安定したカチオン電流を取得する液組成の探求こそが本研究課題における最大の山場であった。細胞内液・細胞外液共に、様々な液組成を試した結果、最終的に安定したカチオン電流を記録できる液組成を見出した。この液組成を用いて高浸透圧条件下における電流を測定したところ、通常の浸透圧条件下に比べて電流量が有意に増大する結果が得られた。さらに、高浸透圧条件下においてフルフェナミン酸(FFA)やエコナゾルを作用したところ、カチオン電流が抑制される傾向を示した。これまで、高浸透圧条件下において容積を縮小させる役割を担っているFFA感受性膜タンパク質が存在することを細胞断面積測定法により明らかにしてきたが、パッチクランプ法による上記の研究結果は、細胞断面積測定法によって明らかにしたFFA感受性があり高浸透圧条件下で容積を縮小させる膜タンパク質の存在を電気生理学的に裏付けできた事を意味しており、本研究における大きな成果であるといえる。

しかしながら、同時に、浸透圧に関係なく、FFAやエコナゾルによって活性化する別のカチオンチャネルによって高浸透圧条件下で活性化した電流がかき消されてしまう現象も多発した。パッチクランプ法の電流固定法において、高浸透圧条件下における発火頻度について実験した結果、高浸透圧条件下において発火頻度が増大し、FFAやエコナゾルによって抑制されることから、FFAやエコナゾルによって活性化されるカチオンチャネルは、高浸透圧条件下におけるAVP分泌に関与しないことが示唆された。これらの結果より、今後の実験において、FFAやエコナゾルによって活性化するカチオンチャネルを阻害する試薬を常時投与した条件下で、高浸透圧条件下におけるカチオンチャネルの同定を進めていく必要性を認識した。本年度は、ラット・バソプレシン(AVP)ニューロンの高浸透圧条件下におけるAVP分泌に関与するカチオンチャネルの同定について集中的に研究を進める計画であったが、本研究における最大の山場であるラットAVPニューロンの安定したカチオン電流の取得に成功し、研究が飛躍的に進んだことによりイオンチャネルの同定に大手をかける事が出来た。以上より、本年度の研究の進捗状況はおおむね順調に進展したと評価できる。今年度は、AVPニューロンにおいて、高浸透圧条件下で活性化し、flufenamic acid(FFA)に感受性があるイオンチャネルについて、主にパッチクランプ法を用いて解析を進めた。昨年度のパッチクランプ法の電圧固定法を用いた研究で安定的に記録できるようになったカチオンチャネルは、高浸透圧条件下で活性化し、FFA投与により抑制されるものと更に活性化されるものとの2種類存在する事が明らかになった。FFAによって更に活性化する電流は、高浸透圧条件下で活性化される電流とは別のタイプのものである事が示唆されたが、今年度中に同定する事ができなかった。このイオンチャネルの同定は、平成30年度に行う予定である。AVPニューロンの自発的発火活動は、高浸透圧条件下において増大し、FFAで抑制されることが明らかになった。自発的発火活動は、ニッケルでも同様に抑制された。高浸透圧条件下におけるAVPニューロンの容積調節メカニズムにおいて,高浸透圧刺激によって細胞容積が減少したまま、その容積を維持する現象が見られた一方で、FFAを投与すると細胞容積が減少した後に元の大きさに回復する現象が昨年度までの研究により確認された。この現象は、ニッケルを投与した時や、テタヌス毒で前処理したAVPニューロンでも確認された。以上の結果より、AVPニューロンは、高浸透圧条件下における容積調節能を保持しており、高浸透圧刺激による容積減少後に容積回復(regulatory volume increase: RVI)が起こることが明らかになった。同時に、体内を循環する血液が高浸透圧になった時にAVP分泌量が増大することによる分泌性容積減少(secretory volume decrease: SVD)が起き、AVPニューロンの容積が小さくなるために高浸透圧性細胞縮小後の容積回復が見かけ上抑制されていることが示唆された。
石垣島・宮古島における津波堆積物の調査ー巨大地震を繰り返す琉球海溝沈み込み

沈み込み帯には巨大地震を伴うもと伴わないものがある。後者は、伸張場の応力場の下にあるとされ、琉球海溝はそのうちの一つと考えられていた。琉球海溝でこの地域に1771年大津波が襲い、波高は30mに達したことが明らかにされている。本研究では、完新世の地層の5カ所で発掘調査を実施し、過去3回の津波:1771年、今から約800年、約2000年前が襲ったと考えられる。他には、同規模の津波の襲来は考えられない。この津波は、1771年の遡上津波高分布に基づくと、琉球海溝で発生したプレート間逆断層地震と考えられ、相対沈み込みすべり量の20ー30%が地震時の滑りとなっていると考えられる。本研究の目的は、琉球海溝に沿う大津波の発生間隔を完新世の堆積層の掘削調査を通して推定することにある。前年度は石垣島において調査を実施し、本年度は、宮古島と石垣島の両島で掘削調査を実施した。6月、10月、2月の3回にわたり調査を行ったが、概要は以下の通りである。16月調査:調査地点は、宮古島1カ所、池間島2カ所、伊良部島2カ所である。以下、それぞれの成果について述べる。宮古島:南部海岸付近での調査を実施したが、津波堆積物と確証できる証拠は見つかっていない.さらなる調査を必要としている。ただし、民家に代々伝わる言い伝えから、海抜18mまで津波が遡上したことは確認された。現在も、有効虫の鑑定から津波の証拠を検討している。池間島:2カ所掘削したものの、島尻マージ以外の地層(完新世以前)より新しい地層は見つからなかったため、ここでの調査は断念した。伊良部島:2カ所掘削。約1000年前に、津波と思われる地層が見つかっている。さらに2000年前との推定もあるが、現在検討中である。210月調査:石垣島桃里地域の3カ所で実施。1771年津波石の下に、津波堆積物と思われる地層が発見された。年代から、1300年前頃と推定される。32月調査:1カ所掘削。桃里部落北の牧場で長さ10m掘削。10月の調査と同様の津波層と1771年津波層が見つかった。これは今回の調査を通して初めてのことであった。2.まとめ:宮古島諸島および石垣島の掘削調査を実施し、1771年の津波の他に、石垣島では約1500年前、宮古島では1000年前ほどに津波が発生したと推定された。沈み込み帯には巨大地震を伴うものと伴わないものがある。後者は、伸張場の応力場の下にあるとされ、琉球海溝はそのうちの一つと考えられている。その理由は、背弧海盆が拡大していることにある。しかし、琉球海溝でこの地域に1771年大津波が襲い、波高は30mに達したことが、古文書や種々の調査から明らかにされており、琉球海溝が巨大地震発生の場であることを示唆している。本研究では、完新世の地層の5カ所で発掘調査を実施してきたが、本年度は、石垣島伊原間での掘削を述べ350m掘削して調査を行った。この結果、過去3回の津波が明らかにすることができた。二枚貝や枝珊瑚を用いて、C14の年代測定を行い、3層の津波は、上の層から順に、1771年八重山津波、その前が、今から約800年前、一番古い津波が今から約2000年前であることが明らかにされた。津波層は、黒色ないし黒茶色の陸成の土壌に比べ、白っぽく、珊瑚や貝などの石灰質の物質に富んでいるため、一目で判断できる。このような巨大な規模の津波の襲来は考えられない。1771年の遡上津波高分布に基づき、津波の発生源を求めると、琉球海溝で発生したプレート間逆断層地震と考えるのが妥当である。沈み込み速度から考慮すると、沈み込み速度の20ー30%が地震時の滑りとなっていると考えられる。本研究の目的は、琉球海溝沿いの巨大津波の発生頻度を推定することにある。1771年明和の大津波が発生し、主に石垣島を中心に、宮古島や多良間島等に、溺死者1万人を超す被害を与えた。この津波以前にも、他の津波が発生したことは、津波石の研究から知られている。本研究は、津波堆積物の掘削調査から、過去の津波発生を推定する新しい試みである。

本年度は石垣島を調査対象とし、島内4カ所(新川、名蔵、桃里2カ所)、で掘削調査を行った。掘削は、ジオスライサーを用いて、ハンマー重機で地層に打ち込み、サンプルを採取した。C14年代測定のため、計8本の地層を抜き取り、津波層の調査を行った。調査結果概要は、以下の通り。新川サイトにおいては、表層に近い泥炭質土壌から現代、その下位の細砂層からAD1650-1950とAD1580-1810、さらに下の層からAD1550-1800の年代とほぼ同じ年代の結果が得られた。これらの地層は、地層構成物質の解析結果と合わせて、明和津波層であると判断した。さらに下位に含まれる現地性の合弁貝はAD810-1000を得た。上記のデータからAD810-1000以降,明和の津波だけ発生したと言える。名蔵サイトでは、表層に近い泥炭質土壌からの種子の年代は現代であった。津波堆積物の可能性がある砂層からは年代測定に適した試料は得られなかった。最下層の泥質堆積物からは、AD670-850であったので、最上層を津波堆積物と考えると,明和津波の可能性がある。桃里ては、BC1870-1650,AD690-880,AD420-600と年代値は幅広く,明和の津波の一つ前の津波堆積層の可能性がある。結論として、1771年明和津波の堆積資料が得られると共に、一つ前の津波は、少なくともAD420-600年以降に発生した可能性が高い。研究成果で述べたように、掘削調査を通して、1771年の津波堆積物を見つけ出すことができ、かつその一つまえの津波は、石垣島では1500年BP程度、宮古島では1000年BPと求められたことは、予定通りであった、ただし、当初は、数回の津波を求めることを目的としたが、掘削した地層は、2-3千年前は、すぐに島尻マージ(完新世)に不整合的に接し、さらに古い津波を推定することが困難である。また、当初は、ジオスライサーを使用する予定であったが、この掘削方法は大型重機を必要とする上に、サンゴ礁が卓越する沖縄諸島では、石灰によるセメンティング効果があり、ほとんど打ち込むことができず、能率の悪い方法で有ることが分った。このため、バックホーによる掘削を行った。この手法の方が、経費は10分の1、時間も短縮することができた。石垣、宮古島のように、土地に余裕があるところでは、現在の掘削方法は望ましいと思う。H23年度は、石垣島の津波堆積層を同定し、C14年代を決定した。既に述べたように、本研究では、異なる時代、異なる堆積環境の構成物質からなり、かつ明らかに短期間に堆積したと思われる地層を津波堆積層と判断した。これらの地層構成物質の年代から、深さ50cm程度の地層は1771年明和の津波層、下層はAD420-600年以降の津波層と判断した。この結果、津波の発生間隔は、少なくとも、1000年程度であると考えられる。このように、穂年度の目的である、石垣島の津波の発生間隔推定はほぼ達成されたものと思われる。23-24年度で得た資料の分析と論文執筆を行う。分析は有孔虫を用いて、堆積物の深さの推定を行う。津波層は、現在、C14年代測定と有孔虫の種の個体数の分布から判断している。あきらかに、深層有孔虫の多い地層を、表層の有孔虫と比較して、津波層と決めている。ただし、浜の砂層を陸地内部に運んだ場合は、必ずしも深層有孔虫とは限らない。したがって、総合的な判断が必要とされる。この種の検討を加え他の値、論文を作成する。さらに、深い検討を行うために、さらに調査研究を推進するため、次の科研費に申請する予定である。H24年度は、宮古島を調査象地点としている。ジオスライサー調査は、本研究の経費枠内では実施が困難なこと、および宮古島ではジオスライサー打ち込みのインパクターのパワーが十分に望めないことの理由から、バックホーによる掘削調査に適宜変更する。
乳牛の起立不能症の病因と予防・治療に関する研究

乳牛の起立不能症の発症要因の究明を目的として、本症の再発率が高いとされている起立不能症経歴牛14頭(ホルスタイン種)を用いて、分娩前7日から分娩後3日までの血漿の1α,25(DH)_2D、25OHD、PTH、CaおよびPi濃度の推移を、各個体毎に対照群(6頭)と比較し検討した。その結果、次のような成績が得られた。1.経歴牛14例中8例では、血漿1α,25(OH)_2D濃度は血漿のCaおよびPi濃度の低下に反応して上昇したが、他の6例中2例ではその上昇が遅れた。従って、これら2例においては25OHDの1α炭素位水酸化反応の遅延が推察された。2.経歴牛14例中6例では血漿25OHD濃度は、対照群と同様に分娩前後で上昇する傾向にあった。3.経歴牛14例中8例では、血漿PTH濃度は対照群と同様に、血漿Ca濃度の低下に反応して上昇した。しかし、他の6例中2例においては,PTH分泌機能の低下が推察された。4.経歴牛14例中10例では、血漿のCaとPi濃度は分娩前後で対照群より低下する傾向にあった。5.経歴牛14例中2例に本症の発症をみた。その中の1例では、PTH分泌機能の低下が推察された。しかし、他の1例では血漿Ca濃度の低下に対して血漿のPTHおよび1α,25(OH)_2D濃度は上昇していた。以上の成績から、大部分の経歴牛においては、血漿Ca濃度の低下に鋭敏に反応して血漿1α,25(OH)_2DおよびPTH濃度は上昇するが、少数例においては、上皮小体機能不全や、PTHおよび1α,25(OH)_2Dの標的器官に対する抵抗性の存在が推察された。
出生コーホートを用いた７歳児のアトピー性皮膚炎に関する環境要因と遺伝要因の解明

アトピー性皮膚炎(AD)の環境要因として自宅のダニアレルゲンや化学物質曝露、遺伝的素因のフィラグリンFLG遺伝子の変異、さらにこれらの要因を複合的に明らかにすることを目的とした。研究対象は出生コーホート北海道スタディの7歳児で、1,064名のうち約10%が変異を保有し、国内外の先行研究と同程度であった。FLG変異があることが、2歳・4歳時のADのオッズ比をそれぞれ1.6倍・1.5倍上昇させたが、7歳時では有意な上昇を認めなかった。環境要因では、ハウスダスト中の化学物質DiNP濃度が高いことが児のADのオッズ比を1.3倍上げ、FLG変異で層別すると、変異がない群でオッズ比を1.45倍上げた。近年、小児のアトピー性皮膚炎の有病率増加、寛解の減少が指摘されている。本研究では出生コーホート「環境と子どもの健康に関する北海道スタディ」7歳児を対象に、アトピー性皮膚炎に対する、自宅環境中のダニアレルゲンや合成化学物質曝露等の環境要因、遺伝的素因としてFLG遺伝子の変異、さらに遺伝的素因と環境曝露による影響を包括的に明らかにすることを目的とする。平成25年2月末までに7歳に達した対象者4167人に、調査票と自宅環境調査への協力依頼を行った。このうち協力の回答が得られた1093人にダストと児の尿採取キットを順次送付し、798名から回収した。7歳の調査票、曝露データ、検体がそろう527件について臍帯血中DNAを抽出し、FLG変異7カ所(3321delA、S1695X、Q1701X、S2554X、S2889X、S3296X、K4022X)をシークエンス解析した。この結果、40名がこれらの変異のいずれかのheterozygoteであること、及びスクリーニング中に偶発的に同定した新規フレームシフト変異を2名がヘテロで保有していることが判明した。すなわち527名中42名がFLG変異をヘテロで保有しており、変異の保有率は約8%であった。近年、小児におけるアトピー性皮膚炎の有病率増加、および寛解の減少が指摘されている。そこで、本研究では出生コーホート「環境と子どもの健康に関する北海道スタディ」の7歳児童を対象に、アトピー性皮膚炎の環境要因として自宅環境中のダニアレルゲンや合成化学物質曝露、遺伝的素因としてフィラグリン遺伝子の変異、さらに遺伝的素因と環境曝露との複合要因について明らかにすることを目的とする。平成25年度は、7歳に達した対象者1693人にアトピー性皮膚炎を含むアレルギーに関する調査票を配付し、995人から回収した。さらに、環境調査に協力すると回答が得られた540人に、郵送法にて自宅ダストと児童の尿採取キットを順次送付し、413名から回収した。平成25年度までに収集したダスト975検体についてELISA法を用いてダニアレルゲンDer f1およびDer p1を分析したところ、Der f1は検出率96.5%で中央値(25%-75%値)は1.39(0.49-4.05)μg/g fine dust、Der p1は検出率36.1%で75%値0.37μg/g fine dustだった。アトピー性皮膚炎の有無とダニアレルゲン量に関連はなかった。また、539人の臍帯血中DNAを抽出し、FLG変異6カ所(321delA、Q1701X、S2554X、S2889X、S3296X、K4022X)をシークエンス解析した。この結果、変異カ所は60カ所、2名は2カ所の変異をヘテロで有しており、変異の保有者は56人(保有率は10.4%)だった。最も変異の保有が多かった部位はS2889X、次いでK4022Xだった。本研究では出生コホート北海道スタディの7歳児を対象に、アトピー性皮膚炎の環境要因として自宅のダニアレルゲンや合成化学物質曝露、遺伝的要素としてフィラグリン遺伝子の変異、さらに遺伝的素因と環境曝露との複合要因について明らかにすることを目的とした。平成26年度は、7歳に達した対象者1490名にアレルギーに関する調査票を発送し、921名より回収した(61.8%)。さらに、環境調査に協力が得られた454名に自宅ダスト採取キットを配布し、350名から回収し(77.1%)、280検体のハウスダスト中ダニアレルゲンを分析した。

1064名のFLG変異8ヵ所(3321delA, S1695X, Q1701X, S2554X, c.8640delG, S2889X, S3296X, K4022X)のシークエンス解析を行った結果、いずれかにFLG変異がある児は99名(9.3%)だった。ISAAC調査票より評価したアトピー性皮膚炎の有病割合は21.4%であった。FLG変異があることがアトピー性皮膚炎のリスクを1.3(95%CI:0.71-2.27)倍上昇させる傾向を示したが、統計学的有意差は認められなかった(性別、母親のアトピー性皮膚炎既往歴、ダニアレルゲンで調整)。ハウスダスト中のフタル酸エステル類・リン酸トリエステル類、ダニアレルゲンを測定した532人についてFLG変異の有無における環境要因とアトピー性皮膚炎との関連を解析した。この結果、FLG変異がある児でTPhP濃度が1単位(自然対数)上昇するとアトピー性皮膚炎リスクは2.89(1.10,7.58)倍になった(性別、母親のアトピー性皮膚炎既往歴で調整)。また、FLG変異のない児でDINP濃度が1単位(自然対数)上昇すると、アトピー性皮膚炎リスクは1.30(1.02,1.67)倍になった。FLG変異の有無とダニアレルゲン、アトピー性皮膚炎有病とに関連はなかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。公衆衛生学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度中に予定していた7歳児4000人に調査票を発送し、800件から自宅ダストを回収することができた。このうち、530件のダニアレルゲンの分析及びFLG解析が終了できた。調査は順調に進行しており、平成25年度には、平成24年に引き続きダニアレルゲン分析およびFLG解析を実施し、環境と遺伝子の関連について解析予定である。平成25年度は、平成24年度との総計で3000件の7歳児のアレルギーに関する調査票を収集し、自宅ダスト1200サンプルを回収することができた。ダストと併せて、7歳時の自宅環境、特にこれまでに喘息やアトピー性皮膚炎との関連が指摘されてきた床材、ペットの有無、ダンプネス(カビの生育、カビ臭、結露、水漏れ)、暖房燃料や排気の有無などについて調査票を用いて回答を得ている。平成26年度には、得られたデータの入力、データクリーニング、データの連結を実施し、統計解析に用いることができるようにする。これまでに、合計1050人のFLG変異を解析した。調査は順調に進展しており、FLG遺伝子およびダニアレルゲンのデータを用いて統計解析を実施し、環境と遺伝子の関連について論文を執筆する。また、交絡調整として解析に必要な母親の妊娠中の化学物質曝露、食生活、喫煙・飲酒の調査は既に実施済みであり、データが保存されている。特に、喫煙については、母親の妊娠中喫煙曝露として血中コチニン濃度に加えて7歳児の尿中のコチニン濃度も分析しているため、これらバイオマーカーによる喫煙曝露の評価が可能である。近年、むしろ喘息のリスクである可能性が指摘されている妊娠中の葉酸過剰摂取についても、妊娠中の葉酸値が測定済みであり、これらのデータはすぐに利用が可能となっている。加えて、平成26年度には、引き続き1700人程の7歳児にアレルギーに関する調査票を発送する。従って、これまでの回収率から、アレルギー有病については1000人程のデータを回収し、450程度のダストサンプルを収集できる見込みである。まだ分析が終了していない52検体のダストと併せて500検体のダニアレルゲン量を分析し、アトピー性皮膚炎の有病およびFLG変異の有無と曝露との関連を解析する予定である。平成24年度に引き続き、7歳児のアトピー性皮膚炎、および自宅環境調査、環境曝露要因の評価、遺伝的素因の解析を実施する。
不完全長型CAチャネルサブユニットによるCA電流発現抑制機構の解明

ここ数年イオンチャネルの不完全長型分子の存在は、多くの例で報告され、ヒトの遺伝病においても報告されるなど、分子メカニズムの解明は単にチャネル分子の制御機構の理解にとどまらず、病態の理解に重要性と緊急性が増しつつあるが、その抑制のメカニズムには不明な点が多く残されてきた。不完全長型分子によるCaチャネル発現抑制の分子レベルでのメカニズムを探るため、哺乳類のCav1.2型CaチャネルについてN末端細胞質側及びドメインIを欠くcDNAを作成し、アフリカツメガエル卵母細胞と、BHK6細胞での強制発現を行った。微小電極膜電位固定法およびパッチクランプ法による計測により不完全長型Cav1.2は、全長型Cav1.2の機能発現を顕著に抑制した。ストップコドンをN末端側に近い部位に挿入した分子では全く抑制現象が観察されないことから、この抑制はタンパクレベルで起こると推定された。そこでWestern blotによる解析を行ったところ、不完全長型分子は、不溶性分画へ移行し、全長型Caチャネル分子の発現量を減少させることが明らかになった。このことは不完全長型分子と全長型分子がなんらかの機構により相互作用することを示している。電位依存性Navチャネルに関しても不完全長分子による抑制が観察され、4モチーフ型イオンチャネルに共通の発現制御機構を反映する可能性が示唆された。更に電位依存性KチャネルのうちKv4型分子について、原索動物胚から不完全長分子を同定し、その発現様式についても明らかにした。(1)不完全長型分子によるCaチャネル電流抑制機構:全長型Caチャネルサブユニットタンパク量が、不完全型長サブユニットの共発現により、変化するかどうかを、BHK6細胞への強制発現系を用いたパッチクランプ法およびWestern blot法により検討した。以前のXenopus oocyteでの発現実験と同様に、BHK細胞においても不完全長サブユニットにより、Caチャネル電流量は有為に減少することが確認された。パッチクランプを行なった同じバッチのtransfectionした細胞から、タンパク量の定量を行なうと、不完全型サブユニットの共発現により有為に減少し、導入する不完全長型の量に依存して減少することが明らかになった。一方、不完全長型タンパクは、少量しか検出されず、不溶出分画へ移行している可能性が示唆された。そこで、不溶出分画についてもWestern blotを行なったところ、不完全長型タンパクは不溶出分画へ多く存在しており、同時に不完全長型分子を共発現させることにより全長型タンパクが不溶出分画へ移行することが見出された。これらの結果は、不完全長型タンパクが正常なタンパクフォールディングが行なわれず、また全長型タンパクと相互作用することにより全長型タンパクのタンパク合成を抑制するか、分解を促進する可能性を示した。(2)サブファミリー特異性の機構:Cav2.1に関しても同様な不完全長型分子を作成したところ、Cav1.2およびCav2.1に対して抑制効果を大きく示さないことが明らかになった。従って、不完全長型分子による抑制は、L型Caチャネルに特異的な分子機構に基づく可能性が示された。(1)電位依存性Caチャネルと同様に4ドメイン型電位依存性チャネルである、電位依存性Naチャネルに関しても、同様な分子機構が存在する可能性があり、実際、発生過程で発現するNav1.6スプライスバリアント由来の分子(I-IIshort)は、完全長型Naチャネルの機能を強く抑制することを見出していた。そこで、哺乳類において4種類知られている電位依存性Naチャネルのそれぞれと、I-IIshortをツメガエル卵母細胞に共発現させ、電流抑制の程度を検定した。その結果、domain I-IIからのみなる不完全長型分子は、全長型分子の発現を顕著に抑制した。Nav1.6の不完全長型分子は、Nav1.1,Nav1.2,Nav1.4,Nav1.5すべてにおいて同様な抑制を示し、サブタイプ特異的ではなかった。一方、電位依存性チャネルであるshaker型Kチャネルに対しては抑制効果をまったく示さず、Naチャネル特異的であった。最近、重症幼児ミオクローニーてんかんの原因遺伝子としてヒトNav1.1が注目され、Nav1.1のdomain IIの直後でストップコドンが入るために、domain I-IIのみの蛋白が発現する家系が報告された。

これらの病態の原因として、不完全長蛋白による抑制が起こるかどうかを検討するため、ヒトNav1.1をtsA201細胞に機能発現させた。(2)前年度ドメインIとN末端側を欠失したCaチャネル分子はサブタイプ特異的な抑制を示すことから、膜貫通部位領域の特定の部位での相互作用を同定する目的で、二種類のCavチャネル分子、Cav1とCav2の間の複数のキメラ分子を用い、これにタグ配列を導入したコンストラクトを作成した。
実験的な歯の移動における破骨細胞と顆粒球の動態に関する組織学的・免疫組織化学的研究

【目的】矯正学的な歯の移動に対応する歯槽骨の改造機転を解明するため、骨吸収の指標となる液胞型H^+-ATPaseに対する抗体を用いて免疫組織学的に検討した。また同条件下で単核食細胞系の動態についても免疫組織化学的な検討を加えた。【方法】生後7週齢のWistar系のラットの上顎第一、第二臼歯間にゴム片を挿入しWaldo法に準じた歯の移動を行った。ゴムを挿入しない対照群、ゴム挿入後6時間、1日、4日、7日、14日のラットの上顎骨を観察試料とした。この試料に対し、第一抗体に抗液胞型H^+-ATPase抗体、抗granurocyte & macrophage抗体を用いた免疫染色を行った。【結果.結論】ラット臼歯の上顎臼歯間にゴム片を挿入し、歯の実験的な移動における破骨細胞と単核食細胞系の動能を免疫組織化学的に解析したところ、以下の結果が得られた。1)H^+-ATPaseの免疫組織化学によって、光顕的・電顕的に破骨細胞と前破骨細胞が同定された。2)加圧開始後,破骨細胞と前破骨細胞は圧迫側付近の歯槽骨頂部の血管孔内に最初に出現した。3)加圧開始後7日目まで、経日的に圧迫側の歯根膜内で破骨細胞と前破骨細胞の数が増加したがそれ以降は破骨細胞が減少した。4)加圧開始後6時間では,一過性に多数の好中球が牽引側の歯根膜に浸潤したが1日以降は急速に消退した.5)加圧開始初期の牽引側歯根膜での好中球の侵出は、破骨細胞の誘導と一致しなかった。以上の実験結果から、実験的な矯正力の適用による破骨細胞と前破骨細胞の動態は、歯周組織中での圧の継続と血流の変化が重要な因子となることが示唆された。
難治性閉塞性動脈硬化症に対するエリスロポエチン添加培養による骨髄間質細胞移植

基礎研究においては、間葉系幹細胞(MSC)においてエリスロポエチン(EPO)受容体が発現し、培養MSCにEPOを添加することによりMSCの増殖活性が亢進した。EPOは虚血肢において一部は骨格筋における局所間葉系前駆細胞の活性化を介して血管新生を増強することを証明した。マウスでの下肢虚血実験では、EPO-MSC群は、MSC単独群と比べ、虚血肢での血流が有意に改善していたが、移植細胞の長期生着はみられなかった。臨床研究において、厚生労働省ヒト細胞臨床研究に関する審査委員会の承認を得て、閉塞性動脈硬化症に対するエリスロポエチン添加培養による骨髄間質細胞移植を開始し、すでに2例に施行した。(1)エリスロポエチンの骨格筋における局所間葉系前駆細胞の刺激作用:エリスロポエチン(EPO)が虚血刺激に対する組織修復を改善させることが報告されているが、そのメカニズムは未だに明らかではないため、虚血肢におけるEPOによる血管新生誘導のメカニズムを検討した。EPO 5000U/kgをラット虚血肢に局所投与した。EPO投与群は対照群に比して血流が有意に回復し血管数も増加した。また、血管周囲組織におけるKi67陽性細胞数も有意に増加していた。増殖している細胞は間葉系前駆細胞のマーカーであるPDGF-αとEPO受容体に免疫陽性であった。一方、in vitro研究において、EPOはラット骨格筋から単離した培養間葉系前駆細胞を有意に増殖させAktとSTAT3のリン酸化を増強したが、血管内皮細胞は増殖させなかった。骨格筋間葉系前駆細胞のconditioned mediumは、ラット骨格筋芽細胞や骨髄間葉系前駆細胞に比してVEGF濃度は有意に高値であった。(2)ヒトへの臨床試験へむけてのプロトコール承認:カテーテル治療やバイパス手術が不可能な難治性の閉塞性動脈硬化症に対する治療法として、骨髄間質細胞(間葉系幹細胞)の局所投与の臨床試験を計画しているが、本プロトコールを昭和大学と成育医療センターの倫理委員会で承認をうけ、その後厚生労働省のヒト幹細胞臨床研究に関する審査委員会でも平成25年11月に承認を受けた。(3)総括:本年の基礎研究により、エリスロポエチンは虚血肢において一部は骨格筋における局所間葉系前駆細胞の活性化を介して血管新生を増強すると考えられた。平成25年度にヒト幹細胞臨床研究審査委員会での承認を得られ、平成26年度は臨床試験を開始する。(1)エリスロポエチンによる間葉系幹細胞(MSC)の活性化:本年の研究によりMSCにおけるエリスロポエチン受容体発現を免疫染色で確認した。また、培養系において、エリスロポエチン添加は、MSCの増殖活性を有意に亢進した。増殖活性以外に、リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析では、血管内皮増殖因子・肝細胞増殖因子などの血管新生サイトカインの発現増強を認めた。(2)下肢虚血モデルへのMSC移植:これまでの報告同様、MSC移植がラット下肢虚血モデルにおいて血管新生を促進することを、生理学的にも組織学的にも確認した。次に、上記培養実験の結果を踏まえ、MSC単独移植とエリスロポエチンによる前処置を加えたMSC移植(エポMSC群)の2群での効果の比較を行った。移植2週後、エポMSC群は、MSC単独群と比べ、有意に虚血肢での血流改善を促進した。両群において、移植細胞の長期生着は見られなかった。今年度の検討において、エリスロポエチンによるpretreatmentは、MSCの向血管新生能・パラクライン効果を向上させることが確認された。今後、更なるメカニズムの検討を行っていく。(3)ヒトへの臨床試験へむけてのプロトコール作成:カテーテル治療やバイパス手術が不可能な難治性の閉塞性動脈硬化症に帯する治療法として、骨髄間質細胞(間葉系幹細胞)の局所投与の臨床試験を計画しているが、本プロトコールを昭和大学と成育医療センターの倫理委員会に提出し、その後厚生労働省のヒト幹細胞臨床研究に関する審査委員会で審査予定である。(4)総括:本年の研究で、MSC単独投与あるいはエリスロポエチン前処置MSC投与ともに虚血肢における血流改善に有効であることが明らかとなった。平成25年度以降は臨床応用にむけて研究をすすめていく。(1)最終年度に実施した研究の成果本プロトコールは、厚生労働省ヒト細胞臨床研究に関する審査委員会で平成25年4月25日了承され、平成25年11月25日に厚生労働大臣の承認を受けた。シミュレーションを施行し、患者登録を開始している(UMIN ID: UMIN000013820)1)対象:閉塞性動脈硬化症のFontaine II以上の患者で、薬物治療にも反応せずカテーテル治療やバイパス手術が不可能な患者10例。

2)方法:1自己細胞の採取:自己骨髄20mlを局所麻酔下に患者の腸骨より採取する。2細胞培養;分担研究施設である国立成育医療センター研究所へ搬送する。間葉系細胞は自己の骨髄液とウシ血清を用いて培養する。3細胞移植:細胞は昭和大学藤が丘病院に搬送し、患者下腿に合計約1×107の細胞を移植する。4安全性、有効性の評価:移植7日、1、3、6ヶ月に評価を行う。有効性は自覚症状の評価、生命予後、下肢温存率、皮膚還流圧等により評価を行う。3)結果:2014.6.13に1例目を施行した。下肢動脈バイパス術を3回施行するも閉塞し、血管内治療も不可能で安静時疼痛を有する症例であった。合計3.3×107の細胞を両下腿に移植した。左足背皮膚還流圧は術前の20から術後30mmHgまで上昇し、最大歩行距離も125mから210mまで上昇した。2例目は2015.3.6に施行した。何度も両足の血管内治療を施行するも再狭窄、再閉塞を繰り返し、足部の潰瘍が悪化している症例であった。予定通りの手順で合計2.5×107の細胞を両下腿に移植した。術後有害事象は認めず現在リハビリテーションを施行中である。(2)研究期間全体を通じて実施した研究の成果本研究の基礎部分に関しては、エリスロポエチンの骨格筋における局所間葉系前駆細胞の刺激作用を証明した。また、臨床部分に関しては上記に記載したように臨床研究をすでに開始している。循環器内科(1)基礎動物実験昨年度の基礎研究において、間葉系幹細胞(MSC)においてエリスロポエチン(EPO)受容体が発現していることが確認でき、培養MSCにEPOを添加することにより、MSCの増殖活性が亢進した。また、細胞上清でVEGF,HGF,FGF等の濃度が上昇しており、これらの増殖因子の活性化がMSCの血管新生作用をより増強させていると考えられた。In vivo実験では、マウスで下肢虚血を作成し、その回復過程をMSC単独移植とEPOによる前処置を加えたMSC移植(エポMSC群)で比較するとエポMSC群は、MSC単独群と比べ、虚血肢での血流が有意に改善していたが、移植細胞の長期生着はみられなかった。本年度は、虚血肢におけるEPOによる血管新生誘導のメカニズムを検討した。EPO 5000U/kgをラット虚血肢に局所投与した。EPO投与群は対照群に比して血流が有意に回復し血管数も増加した。また、血管周囲組織におけるKi67陽性細胞数も有意に増加していた。増殖している細胞は間葉系前駆細胞のマーカーであるPDGF-αとEPO受容体に免疫陽性であった。一方、in vitro研究において、EPOはラット骨格筋から単離した培養間葉系前駆細胞を有意に増殖させAktとSTAT3のリン酸化を増強したが、血管内皮細胞は増殖させなかった。上記より当初の計画の基礎研究はほぼ終了した。(2)臨床試験(安全性試験)本プロトコールは昭和大学医の倫理委員会で平成23年12月20日に承認後、厚生労働省ヒト細胞臨床研究に関する審査委員会に提出し、約1年半を要したが平成25年4月25日了承され、平成25年11月25日に厚生労働大臣の承認を受けた。シミュレーションを施行し、患者登録を開始している。