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奇妙な形をした新規ポルフィリンの物理化学的機能解析

当該研究では生体中の鉄ポルフィリンの機能に関する研究の基礎的知見を得るために、構造異性体分子である鉄コルフィセンとイミダゾールとの反応性を調べた。はじめに、特異な性質をもつ鉄原子がたんぱく質の反応性をどのように変えるかを検討するため、エチオコルフィセン(周辺置換基が4メチル-4エチル型の化合物)をミオグロビンに組み込んだ再構成ミオグロビンをつくった。このミオグロビンは、驚いたことに、天然ミオグロビンと比べて酸素親和性が1/13にも減少していた。一酸化炭素結合能力にいたっては1/128にまで減少していた。この結果はポルフィセン鉄原子が近位ヒスチジンに引き寄せられやすいことに対応する。また、クロロホルムに溶かした鉄(III)コルフィセンへのイミダゾール類の結合過程を詳細に検討した。その結果、1-メチルイミダゾールが2段階で結合し、途中でモノ錯体が多量に蓄積する現象を見つけた。モノ錯体蓄積がほとんど起きない鉄ポルフィリンとは対照的な結果である。この現象は鉄原子がコルフィセン平面から浮き上がりやすいために起きたと解釈でき、ミオグロビンでの反応性変化とつじつまが合う。鉄原子が分子平面から浮上がりやすいならば、鉄原子の磁気的性質にも影響がおよぶと期待される。そこで、今度は酸化型ミオグロビンのアジド化合物のスピン平衡(高スピン【double arrow】低スピン)を解析した。この現象は鉄イオンの配位環境変化を敏感に反映することからである。スピン平衡の解析結果より、コルフィセン再構成ミオグロビンは高スピン状態にあると判明した。低スピン状態にある天然ミオグロビンと比べるとまったく異常な結果である。すなわち、コルフィセンに含まれる鉄原子は酸化型、還元型ともに平面から浮上がりやすいことが判明した。当該研究により、ポルフィリン鉄とコルフィセン鉄の顕著な差が明らかになった。筋肉にある酸素結合たんぱく質であるミオグロビンはポルフィリンとよばれる補欠分子族をもつ。ポルフィリンはピロール4分子がメソ位炭素4原子で結ばれた対称性のよい分子構造をしている。ポルフィリンの4つのピロール分子を並べ替えるとミオグロビンの酸素結合能力にどのような影響がでるかは興味ぶかい問題である。そこで申請者はポルフィリンのピロール配列を組替えたコルフィセンとよばれる新しい構造異性体に着目した。しかし、必要な原料が入手しにくく、しかもきわめて厳密に制御された反応条件が要求されるため、コルフィセンの合成は難度の高いものであった。申請者は反応条件の詳細な検討から、容易に入手できるジピロールエタンを利用することをみつけた。また、銅(II)イオンをつかえば前駆体物質をコルフィセンへと容易に環化できることも判明した。このふたつの改良により、従来は3日かかっていた反応を1時間に短縮できた。しかも、反応の収率は20%と従来法の10倍あまりも向上した。そこでコルフィセンを大量合成して、ヘムたんぱく質の補欠分子として利用した。奇妙な分子形をもつにもかかわらず、コルフィセン鉄錯体はアポミオグロビンと安定な複合体をつくると判明した。こうして合成した人工ミオグロビンには、酸素や一酸化炭素などを結合する能力があることが明らかになった。しかし、精密な酸素平衡曲線を解析すると、人工ミオグロビンの酸素結合能力は天然ミオグロビンの1/70に落ち込んでいた。反応速度論解析からは一酸化炭素結合能力が1/470も減少すると判明した。

この結果は、コルフィセンがたんぱく質補欠分子として利用できることを示しただけではなく、コルフィセンの中心にある鉄イオンと酸素や一酸化炭素のπ結合性が弱まっていることをはじめて例証するものである。肺から運ばれる酸素分子を貯蔵するたんぱく質がミオグロビンである。酸素はミオグロビンの補欠分子族である鉄ポルフィリンに結合する。ポルフィリンはピロール4分子がメソ位炭素4原子で結ばれた対称性のよい分子構造をもつ。なぜ自然はこのような整然としたポルフィリン構造を選んだのであろうか?この疑問を解くために、申請者はポルフィリンのピロール配列を組替えたコルフィセンとよばれる異性体分子の生物化学挙動を物理化学的手段で調べた。コルフィセンは台形の金属ホールをもつのが特徴である。コルフィセンを鉄錯体に変換して、ミオグロビンに組み込んだ。奇妙な分子形をもつにもかかわらず鉄ポルフィセンはミオグロビンと複合体を形成した。この現象はポルフィセン鉄原子とたんぱく質内のアミノ酸残基、近位ヒスチジンが特異的に結合したことを示している。ミオグロビン内部で形成される鉄-ヒスチジン結合の性質を深く理解するために、申請者はモデル化合物による研究をおこなった。すなわち、クロロホルム溶媒に溶けた鉄(III)ポルフィセンへのイミダゾール類の結合を詳細に検討した。その結果、1-メチルイミダゾールが2段階で結合し、その途中にこのイミダゾールが1分子配位した中間体が多量に蓄積する現象を見つけた。ポルフィリンではそのような中間体がまったく蓄積しないことと比べてこれは異常な結果である。他のイミダゾール類の滴定結果も調べ、その原因がコルフィセンの鉄原子が収まる金属ホールの極端な歪みに由来することを明らかにした。金属ホールの変形は、鉄原子にもともと配位していた塩化物イオンの結合力を弱めること、さらに鉄原子がコルフィセン平面に収まりにくくなることを解明した。これは鉄(III)コルフィセン分子がヘムたんぱく質の反応制御因子になることを世界で初めて示した成果である。生体中の鉄ポルフィリンの機能に関する研究の基礎的知見を得るために、申請者は構造異性体分子である鉄コルフィセンとイミダゾールとの反応性を調べた。すなわち、クロロホルムに溶かした鉄(III)コルフィセンヘのイミダゾール類の結合過程を詳細に検討した。その結果、1-メチルイミダゾールが2段階で結合し、途中でモノ錯体が多量に蓄積する現象を見つけた。モノ錯体蓄積がほとんど起きない鉄ポルフィリンとは対照的な結果である。この現象は、鉄原子がコルフィセン平面から浮き上がりやすいために起きたと解釈できる。特異な性質をもつ鉄原子がたんぱく質の反応性をどのように変えるかを検討するため、エチオコルフィセン(周辺置換基が4メチル-4エチル型の化合物)をミオグロビンに組み込んだ再構成ミオグロビンをつくった。このミオグロビンは、驚いたことに、天然ミオグロビンと比べて酸素親和性が1/13にも減少していた。一酸化炭素結合能力にいたっては1/128にまで減少していた。これは、ポルフィセン鉄原子が近位ヒスチジンに引き寄せられやすいことに対応する。鉄原子が分子平面から浮上がりやすいならば、鉄原子の磁気的性質にも影響がおよぶと期待される。
新規時間分解計測法の開発とABCトランスポーターの分子機構解析への応用

マイクロ流路加工技術と最先端のレーザー分光・検出装置を組み合わせることで、あらゆるタンパク質分子の反応を時間分解計測できる汎用性の高い計測系を構築した。加えて、X線自由電子レーザーを用いた時間分解シリアルフェムト秒X線結晶構造解析法の適用範囲の拡張をマイクロ流路技術を用いることで可能にした。これらの手法を、ATPを利用して小分子を細胞膜の一方から他方へと輸送する膜タンパク質であるABCトランスポーターの輸送・構造ダイナミクス観察に適用し、その分子機構解析に成功した。ATPを利用して小分子を細胞膜の一方から他方へと輸送する膜タンパク質であるABCトランスポーターの輸送・構造ダイナミクス観察に新規に開発する時間分解計測系を適用し、1輸送を構成する化学反応の共役、2離合・集散を制御する分子間相互作用、3構造変化の連動性、を明らかにし、生体分子システムが分子や分子部分の連動・協奏・相互作用によって実現している高次機能の分子機構解明を目指す。本課題では12に対応する4種類の実験1-1)ヘム輸送ダイナミクスを可視吸収分光計測、1-2) ATP結合/加水分解反応を赤外吸収分光計測、1-3) ABCトランスポーターのコンフォメーション変化を分子内FRET蛍光寿命計測、1-4) ABCトランスポートシステムの離合・集散ダイナミクスを分子間FRET蛍光寿命計測する。また、3に関しては2)ケージドATPを用いたシリアルフェムト秒X線結晶構造解析(SFX)によって明らかにする。平成27年度は分子拡散型マイクロ流路ミキサーの新規設計・作製を行い、上記の1-3)、1-4)に利用する蛍光顕微鏡・蛍光寿命計測装置と、神戸大学で新たに構築した可視吸収分光装置1-1)への組み込みを行った。また1-2)赤外吸収分光計測についてはケージドNOをモデル系として実験を行い、紫外レーザーによる光解離反応によって反応を駆動できる光励起系の構築に成功した。神戸大学への異動に伴うレーザーの移設は不可能であったため、理化学研究所久保稔専任研究員との共同研究という形で時間分解赤外分光計測を引き続き行っている。2)に関しては光励起系の構築に成功し、光反応サイクルを示す膜タンパク質についての時間分解SFX測定および微結晶での時間分解可視吸収スペクトル計測系の構築および測定に成功した。平成27年10月に神戸大学への異動を行い、研究室の立ち上げに時間を要した。その中、神戸大学においてABCトランスポーターの新規発現・精製系の構築および最適化を行い、定常的に試料を獲得する実験系の構築に成功した。また、異動に伴う、蛍光顕微鏡・蛍光寿命計測装置の移設を行った。その後、分子拡散型マイクロ流路ミキサーの新規設計・作製を行い、上記の1-3)、1-4)に利用する蛍光顕微鏡・蛍光寿命計測装置と、神戸大学で新たに構築した可視吸収分光装置(1-1))への組み込みを行った。具体的な時間分解計測は平成28年度以降に引き続き行うことになった。生体分子あるいはその分子部分が『連動・協奏・相互作用』することによって実現される高次機能の分子機構解明を目指している。対象として、ATPを利用して小分子を細胞膜の一方から他方へと輸送する膜タンパク質であるABCトランスポーターを選択し、その輸送・構造ダイナミクスを新規に開発する時間分解計測系によって観察し、1輸送を構成する化学反応の協約、2離合・集散を制御する分子間相互作用、3構造変化の連動性を明らかにする。本課題ではまず、12に対応する以下の4種類の実験を行う。1-1)ヘム輸送ダイナミクスを可視吸収分光計測、1-2) ATP結合/加水分解反応を赤外吸収分光計測、1-3) ABCトランスポーターのコンフォメーション変化を分子内FRET蛍光寿命計測、1-4) ABCトランスポートシステムの離合・集散ダイナミクスを分子間FRET蛍光寿命計測によって明らかにする。また、3に関しては2)ケージドATPを用いたシリアルフェムト秒X戦結晶構造解析によって明らかにする。1)に関して、平成27・28年度には分子拡散型マイクロ流路ミキサーの新規設計・作製を行い、1-1)に利用する顕微型可視吸収装置および1-3), 1-4)に利用する蛍光顕微鏡・蛍光寿命計測装置へ組み込み、その時間分解能の評価を行った。加えて、ヘムのABCトランスポーターであるBhuUV-Tの発現・精製系を構築し、BhuUVがヘムと結合したBhuTと特異的に結合すること、また加水分解に伴って結合型の形成が促進されることを見出した。1-2)についてはケージドNOをモデル系として行い、紫外レーザーの光照射によるケージド化合物の光解離反応によって気質が放出され反応を誘起することに成功した。2)に関しては光反応によって反応が誘起される膜タンパク質の時間分解X線結晶構造解析に成功し、複数の雑誌にその結果を報告した。分子拡散型マイクロ流路ミキサーを用いた時間分解計測系の構築は順調に進んでいる。ミキサーの新規設計・作製を行い、顕微型可視吸収装置および蛍光顕微鏡・蛍光寿命計測装置へ組み込み、その時間分解能の評価を行った。加えて、時間分解X線結晶構造解析を行うための光励起システムの構築を行い、複数のタンパク質へと適用した。さらにその発展系である、ケージド化合物による反応誘起にも成功している。ケージド化合物を用いた系はケージド化合物さえ安定に作成されれば、さらに多くのタンパク質へと適用可能になる。

また、研究対象であるABCトランスポーターに関してはその発現・精製系を構築に成功しており、膜貫通ドメインを持つトランスポーターに対して、輸送基質と結合したペリプラズムタンパク質とが特異的に結合することを可視吸収測定によって初めて明らかにし、加水分解に伴って結合型の形成が促進されることを見出した。生体分子あるいはその分子部分が『連動・協奏・相互作用』することによって実現される高次機能の分子機構解明を目的とし、それに係る新規時間分解測定装置の開発と応用を行なった。研究対象として、ATPを利用して小分子を細胞膜の一方から他方へと輸送する膜タンパク質であるABCトランスポーターを選択し、その輸送・構造ダイナミクスを新規に開発する時間分解計測系によって観察し、1輸送を構成する化学反応の共役、2離合・集散を制御する分子間相互作用、3構造変化の連動性、を明らかにする。12に関して以下の4種類の実験を行うことを目標とした。1)ヘム輸送ダイナミクスを可視吸収分光計測、2) ATP結合/加水分解反応を赤外吸収分光計測、3) ABCトランスポーターのコンフォメーション変化を分子内FRET蛍光寿命計測、4) ABCトランスポートシステムの離合・集散ダイナミクスを分子間FRET蛍光寿命計測によって明らかにする。また、3に関しては5)時間分解シリアルフェムト秒X線結晶構造解析を行う。平成29年度には、前年度までに作製した分子拡散型マイクロ流路ミキサーを利用した顕微型可視吸収装置[1)]、顕微赤外分光装置[2)]、蛍光顕微鏡・蛍光寿命計測装置[3), 4)]を用いて、ヘムのABCトランスポーターであるBhuUV-Tに対して時間分解測定を行った。その結果、BhuUVがヘムと結合したBhuTと特異的に結合すること、また加水分解に伴って結合型の形成が促進されることを見出した。5)に関しては光反応によって反応が誘起される膜タンパク質の時間分解X線結晶構造解析に成功し、複数の雑誌にその結果を報告した。また、溶液混合を用いた新規時間分解X線結晶構造解析法の構築を進めた。BhuUV-Tに関する結晶化を試み、ヌクレオチド結合型は解析には成功しなかったが、微結晶化条件の最適化を行なった。マイクロ流路加工技術と最先端のレーザー分光・検出装置を組み合わせることで、あらゆるタンパク質分子の反応を時間分解計測できる汎用性の高い計測系を構築した。加えて、X線自由電子レーザーを用いた時間分解シリアルフェムト秒X線結晶構造解析法の適用範囲の拡張をマイクロ流路技術を用いることで可能にした。これらの手法を、ATPを利用して小分子を細胞膜の一方から他方へと輸送する膜タンパク質であるABCトランスポーターの輸送・構造ダイナミクス観察に適用し、その分子機構解析に成功した。平成28年度は立ち上げた装置の性能評価を金属膜タンパク質への基質配位反応およびその酵素反応の実時間観察によって評価する。その後、1-1)ヘム輸送ダイナミクスをヘムの吸収スペクトルに着目して、滴定実験を定常状態測定を行い、最適な実験条件を検討した上で、時間分解可視吸収分光計測を行う。また、1-3)BhuUVのコンフォメーション変化を分子内FRET蛍光寿命計測によって観察する。そのためのABCトランスポーターの蛍光ラベル標識のプロトコルを確立する。
近代日本における政治と倫理――北一輝の倫理思想

平成14年度は、平成13年度に行った明治期日本の思想・政治状況に即して北一輝の政治と倫理の問題を考察する作業を更に深める一方で、東アジア圏における政治と倫理というより広い文脈で問題を捉えなおすことを行った。前者に関して具体的には、政治と倫理をつなぐ要の一つとして注目される明治期科学思想(特に進化論、及び有機体論)について研究を進めた。その結果、「科学的なもの」に圧倒的な権威が認められる中で、議論の内実を問わないままに、より「科学的」な論が尊重されるような風潮が生じていたことを明らかにした。また、北の「辛亥革命以降」の思想の独自性と普遍性の両面を明らかにするため、北とその時期に深い思想的・人間的交流があった大川周明の思想についても考察した。これによって、日本の特殊性にこだわらない形で愛国を説く北の独自性が、より鮮明に示すことができるようになった。東アジア圏における政治と倫理という問題に関しては、特に北が関係した辛亥革命とそこに参加した革命家達の思想のあり方を検証し、それが北の思想に与えた影響を分析した。だが、結果としてはむしろ北と交流のあった宋教仁と北の思想は、深く交わることなく、むしろ平行線を描くかのように見えることが明らかになった。以上から、北一輝の革新性と限界の双方を、より広い文脈で示すことができるようになったと思われる。それはまた、近代日本の思想に潜む革新性と限界を示唆するものと言えよう。
耐き裂メカニカルシール摺動リングの開発

メカニカルシール摺動画に発生するき裂は摺動発熱による熱衝撃に起因して発生するとする説が一般的であり、現メカニカルシールの摺動リングは、熱衝撃に強い材料選択を設計指針としている。本研究の目的は、この設計指針は誤りであるとする基礎研究に立脚して実用面からこの説の正しさを確認することである。き裂は、摺動材料に依存して、(1)密封流体の粘性に起因するせん断力、(2)摺動発熱と密封液による冷却に起因して摺動面の密封液側端部に発生する円周方向引張熱応力、(3)真実接触部で誘起される円周方向引張応力、によって発生する。この3点が基礎研究の成果および基礎研究からの推測である。(1)に関しては、密封面の油膜形式を阻害するような通常とは逆の手法によってき裂発生が防止できることが実用シールを用いて確認できた。(2)に関しては、基礎理論通り、密封液体側のしゅう動面端部としゅう動接触部の距離を近づけることやしゅう動面端部の仕上げの改善によって防止できることが実用シールで確認された。(3)が原因と考えられる超硬合金材料に対しては、冶金学的設計指針の確立を目指した。すなわち、WC、TiC、TaC、Co、Niの金属粉末の結合相量を変えて8種類のリングを焼結成形し、窒化珪素製リングを相手材として、同一表面粗さに対してき裂再現実験を実施した。その結果、耐荷重能は、材料の熱および機械的特性に依存しないこと、き裂形態は金属粉末粒子の大きさに依存すること、金属粉末粒子の大きさが大きいほどき裂発生頻度は高くなること、などが判明した。この知見は、基礎研究結果を支持するものといえる。今後、表面粗さの影響を検討することによって、本理論の最終的裏付けをとり、実用試験する予定である。
<醜>と<排除>の感性論-否定美の力学に関する基盤研究-

本研究は、〈醜〉という〈否定美〉に注目した。それは広い意味でのアートを、社会的、政治的文脈に戻して捉え直すことが、今日の大切な課題だと考えられるからである。〈醜〉の判定と、それを〈排除〉しようとする感情とは、人々の倫理観や宗教観と深く関わっている。また政治イデオロギーや、宗教的信念は、人間の感情の奥底にまで染み込み、美や醜の判断はそれに結びついている。〈醜〉に考察を加えることは、単に非歴史的な美的カテゴリー論にとどまるものではなく、きわめて歴史的社会的、そして政治的な文脈の中で知らないうちに形作られる、私たちの感情の文化的枠組みに光を当て、そこに隠れている力学を批判的に考察する文化研究的作業になる。古今東西の〈醜〉現象(判定)と、〈排除〉の感情の構造を考察し、現在の、私たち自身の経験のあり方に反省を加えること、これが本研究の主な課題となる。特に「醜」が主題にされたのは、このような否定美への感情こそが、人間の美意識の変遷のありようをむしろ鮮明に示すと思われるからであるし、また同時に、美的カテゴリーと政治的感情、人間経験におけるイメージと言語、感情とイデオロギーとの切り離せない関係を灸り出す重要なヒントになると思われるからである。本研究は、平成17、18年度は各年4、5回の公開研究会を開き、ゲストをも迎えて、課題遂行のための議論の場を設けた。最終年度は、これらの成果に基づく報告書作成に当て、分担者から寄せられた諸論考において、多様な切り口で醜の問題が論じられている。この報告書は、「醜の国」が「美の国」以上に豊穣な国であること多様な角度から照らし出すであろう。今年は初年度に当たる。第一回会合は前代表者岩城による、科研趣旨説明と、ローゼンクランツ『醜の美学』(1853)に関する発表が行われた。岩城が7月1日付で京都国立近代美術館長に就任のため、代表者は宇佐美文理に交代した。第二回以後の会合は公開講演会とし、分担者以外の聴衆にも門戸を開いた。<第二回>岸文和「醜陋を神として祭れる-写楽と笑い-」、宇佐美文理「中国藝術論における「醜」の諸相」(11月12日(土)、京都大学文学研究科・新館第一講義室)。<第三回>碓井みちこ「ヒッチコック映画のサスペンス」、西欣也「感性の言説化における否定性の介入の諸相」(1月8日(日)京大会館)。<第四回>特別講演会:Reto SORG(ローザンヌ大学)「パトスの変容:形体から形態へ-アビ・ヴァールブルク、カール・アインシュタイン、クレーにおける<可視化>の芸術」、奥田修(パウル・クレー・センター研究員)「アブストラクションと失語症-クレーと脳医学者ロトマー」、Wolfgang Koersten(チューリヒ大学)「クレー-心の絵画」(2月14日京都国立近代美術館講演室)、<第五回>岩城見-「醜の美学の概要」、ゲスト講演会、佐々木健一(日本大学文理学部教授)「美とエロス、そして醜」(3月18日、京都国立近代美術館)以上の講演会を巡り活発な意見交換が行われた。議論が活発に行われ充実した年度だったと考える。今年度は本研究の二年目であるが、前年度と同様に、公開講演会のかたちをとって、京都国立近代美術館講義室を会場に、ゲスト講演者も招き、以下のような会合を開催し、関西を中心に分担者以外の若手研究者、大学院学生が参加し活発な質疑応答がなされた。

第一回講演会(8月26日)、若林雅哉(関西大)「翻案する(させる)権利-ジャンルの変更・著作権法・『ケロロ軍曹』」、石田美紀(京大)「現実と虚構のはざまに漂う幽霊表象-中田秀夫監督『女優霊』」、第二回(10月21日)、前川修(神戸大)「写真のなかの幽霊」、篠原資明(京大)「軟体構築の美学」、第3回(2007年1月27日)佐藤守弘(京都精華大)「<珍奇なもの>のコレクションとしての横浜写真アルバム」、長野順子(神戸大)「メドゥーサ幻想」。また分担者、岩城、加藤、北村清彦、北村知之は、中国曁南大学創立百周年記念シンポジウム(「中日比較美学」曁南大学外国語学院主催)に招かれ、パネリストとして報告した。ここでの報告はすべて中国語に翻訳され公にされる(現在曁南大学で準備中)。代表者宇佐美は「中國藝術論における<醜>の問題:序説」を公にした(曾布川編『中國美術の圖像學』)。また他の分担者も、それぞれの専門分野で活発に研究成果を公表した(今年度業績参照)。なお2007年度は本研究の成果報告書作成の年度になる。会合(公開講演会)をさらに続けるととともに、各分担者は、充実した報告書公刊のために論文を執筆することになる。今年度は、本研究の最終年度に当たる。このためまず目指されたのは分担者の論文を収めた報告書の編集である。幸い報告書は、代表者宇佐美が中国哲学研究者を中心に論集としてまとめた『中國思想における美・氣・忌・死』、前代表者岩城が編集した『<醜>と<排除>の感性論-否定美の力学に関する基盤研究-』の二つを刊行できることになった。後者には、当研究分担者17名の論文が収められ、醜と排除というテーマを巡り、「身体美学」、「醜の美学」の出発点としての「へーゲル派の美学と後期シェリング」、「アドルノ美学」、「現代美術における不気味さ」、写楽における「醜陋」、「メドゥーサ」、「病草紙」、「異相」像に表された良源、「心霊写真」、彫刻家イサム・ノグチの「二重国籍性」、等々、古今東西にわたって広範な醜の問題が論じられている。なお今年度は当初予定されていた分担者による公開講演会は、分担者、および企画を担当すべき岩城の日程が合わず開催できなかったが、各分担者は、それぞれ内外でこの研究にかかわりの深いテーマで口頭発表し、またあるものはシンポジウムの司会、パネリストを務めた(北村清彦、加藤哲弘、「第17回国際美学会」(アンカラ)で発表。西欣也、「哲学と文学国際会議」(ヘルシンキ)で発表。篠原、講演「目の中の星」(台北大学)。加須屋「国際日本研究会議」(クラクフ)で発表。宇佐美「日本中国学会第58回大会」で発表等々。また今回提出される二つの報告書以外にも、分担者は各自、学会誌をはじめとして様々なかたちで成果を公にした(業績表参照)。これらの成果はさらに次の一歩を踏み出すための土台になる。多くの読者の意見、批判を待ちたいと思う。
小胞体内腔で生成する遊離糖鎖の代謝機構の解明

出芽酵母には、小胞体内腔でオリゴ糖転移酵素がドリコールオリゴ糖を分解して遊離糖鎖を生成する経路が存在する。小胞体内腔で生成した遊離糖鎖は何らかの機構によって細胞質に輸送され、細胞質/液胞マンノシダーゼの作用によって代謝されることがわかっていたが、遊離糖鎖の代謝に関する分子メカニズムは不明な点が多い。本研究では遊離糖鎖の代謝に関与する遺伝子を同定するため、出芽酵母の非必須遺伝子破壊株コレクションを用い、遊離糖鎖の代謝異常を示す遺伝子を探索したところ、HRD1欠損株で遊離糖鎖の量が2倍に増加することが明らかとなった。この結果はHRD1が遊離糖鎖の代謝に関与することを強く示唆している。出芽酵母には、(1)細胞質でPNG1が糖タンパク質から遊離糖鎖を生成する経路と、(2)小胞体内腔でオリゴ糖転移酵素がドリコールオリゴ糖を加水分解し、遊離糖鎖を生成する2つの経路が存在する。我々のこれまでの研究から、小胞体内腔で生成した遊離糖鎖は、小胞体から細胞質に輸送されることが明らかになっていたが、遊離糖鎖の詳細な代謝経路および遊離糖鎖の輸送体(トランスポーター)の遺伝子は未同定のままであった。本研究は、遺伝子破壊法を用いて、遊離糖鎖の代謝経路および遊離糖鎖トランスポーター遺伝子の同定を目的とする。遊離糖鎖が小胞体膜を横切って細胞質に輸送されることから、膜たんぱく質が遊離糖鎖の代謝・輸送に関与する可能性が高い。そこで、出芽酵母ゲノムデータベースから膜貫通領域を持つタンパク質をコードすると予想される非必須遺伝子を約400選出した。これらの単独破壊株の大部分は、当研究室で保有している酵母変異株コレクションに含まれていた。次に、上述の経路(2)に由来する遊離糖鎖だけを検出できるように、選出された単独破壊株においてPNG1遺伝子をさらに欠損させ、2重欠損変異株を作製した。幾つかの遺伝子とPNG1遺伝子との2重破壊では、目的とする酵母変異株が得られない場合があり、それらの間ではgenetic interactionが存在することが想定された。現在までに、約300の2重破壊株を得ることに成功した。これら2重破壊株のうち、すでに約100株については遊離糖鎖の解析を行っており、現段階で遊離糖鎖の量や構造に変化を及ぼす遺伝子の同定には至っていない。(研究目的)出芽酵母には、(1)細胞質でPNG1が糖タンパク質から遊離糖鎖が生成される経路と、(2)小胞体内腔でオリゴ糖転移酵素がドリコールオリゴ糖を分解して遊離糖鎖を生成する2つの経路が存在する。我々の研究から、小胞体内腔で生成した遊離糖鎖は、何らかの機構によって細胞質に輸送され、細胞質/液胞マンノシダーゼの作用によって代謝されることがわかっていたが、トランスポートに関する分子メカニズムは不明であった。本研究は、小胞体に存在する遊離糖鎖トランスポーターを同定することを目的とする。(方法および結果)出芽酵母の非必須遺伝子破壊株コレクションの中から、小胞体に局在する(または局在し得る)タンパク質をコードする遺伝子の破壊株、約400株を用い、PNG1との二重破壊株を作成後、遊離糖鎖を定量することによって遊離糖鎖トランスポーターの候補遺伝子をスクリーニングした。PNG1との二重破壊株の作成が可能であった約300株の二重破壊株について遊離糖鎖の定量解析を行ったところ、hrd1との二重破壊株で遊離糖鎖の量が2倍に増加することを発見した。糖鎖構造解析の結果、hrd1deltaおよびpng1deltaの単独破壊株間で変化がないことがわかった。(考察)本研究では、小胞体に関連する出芽酵母の非必須遺伝子のうち、Hrd1が小胞体内腔で生成した遊離糖鎖の代謝に関与することを発見した。このことから、Hrd1が遊離糖鎖トランスポーターである可能性が考えられた。また、hrd1破壊株において、遊離糖鎖の構造に変化が見られなかったことから、この変異株において、遊離糖鎖は細胞質/液胞マンノシダーゼによる代謝を受けることがわかった。今後、hrd1破壊株において、遊離糖鎖の細胞内局在性を明らかにするとともに、in vitroにおけるHrd1の遊離糖鎖トランスポーター活性を、再構成系を用いて検証する予定である。出芽酵母ゲノムデータベースから、約400の膜タンパク質をコードする遺伝子を選出している。このうち、すでに約300の遺伝子に関して2重破壊株を取得しているが、網羅することはできなかった。

糖鎖生物学今後は、残り100種類程度の二重破壊株の作製と、取得した変異株の遊離糖鎖の解析を進める。もし、遊離糖鎖の構造または量に変化がある変異株が見つかった場合、その分子機構の解明を行う予定である。
動的共有結合ポリマーの多様な反応場におけるラジカル構造変換反応

可逆的な切断と形成が可能な「動的共有結合」と呼ばれる特殊な化学結合を含む高分子は、熱や光などの刺激を与えると構造変換を起こす。本研究では、このような特性を示す「動的共有結合ポリマー」の構造変換反応を様々な環境中(反応場)で検討した。その結果、目標として設定した3つの反応場(極性溶媒系、無溶媒系、無機材料表面系)の全てにおいて構造変換反応が進行することを明らかにした。得られた成果は、環境低負荷高分子、リサイクル性高分子、自己修復性高分子など様々な応用展開が期待される。本研究では、多様な反応場における動的共有結合ポリマーの反応性について調査し、様々な反応場において駆動する動的共有結合ポリマーの開発を目的とする。具体的には、3つの反応場(極性溶媒系、無溶媒系、無機材料表面系)に着目し研究を推進する。本研究では3つの反応場(極性溶媒系、無溶媒系、無機材料表面系)に着目し研究を行うことを目的としている。本年度は、1)極性溶媒中と2)バルクフィルム中の反応に着手した。1)に関しては、アルコキシアミン骨格を有するモノマーと親水性モノマーとの共重合を行い、極性溶媒中における交換反応の進行を検証した。また、モデル反応を行い、極性溶媒(水・アルコール・テトラヒドロフランなど)中において、アルコキシアミンの交換反応が進行することを確認した。2)に関しては、これまでに合成した主鎖に動的共有結合を有するポリマーのフィルム状態における構造変換反応を検討した。加熱による反応のみならず光反応についても検討した。これまでに合成した主鎖型の動的共有結合ポリマーに関してフィルム状態における構造変換反応を検討した。アルコキシアミン骨格を有するポリエステル、ポリウレタンは、フィルム中での反応により分子量の低下が確認された。一方、光反応骨格を有する動的許佑結合ポリマーのフィルム状態での反応を行った結果、速やかに反応が進行することを見いだした。反応の確認は、GPC測定、NMR測定、などにより系統的に確認した。本年度は、前年度に得られた知見および成果をもとに展開し、1)極性溶媒中、2)バルクフィルム中、無機材料表面、の反応を行った。1)に関しては、アルコキシアミン骨格を有するモノマーと親水性へと変換できるモノマーとのラジカル共重合を行い、水溶性の共重合体の合成に成功した。さらにその共重合体を水中で加熱し、ラジカル交換反応による3次元架橋を実現した。さらに共重合比を変えることで、架橋反応の度合いが変化することを系統的に示すことができた。2)に関しては、主鎖に動的共有結合を有するポリマーフィルム(無溶媒系)の光反応による構造変換挙動を検証し、ラジカル構造交換反応および異種ポリマーの複合化反応が進行することを、GPC測定、NMR測定、DSC測定、偏光顕微鏡観察などにより多角的に検証することができた。さらに、3)に関しては、シリコン基板表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、それを基点にして動的共有結合骨格を側鎖に有するポリマーブラシの合成に成功した。動的共有結合を末端に有するフッ素系の高分子との結合組み換え反応を行い、フッ素系の高分子がポリマーブラシに結合することを明らかにし、無機材料表面でのラジカル構造変換反応が進行することを示すことができた。本年度は、前年度に得られた知見および成果をもとに展開し、1)極性溶媒中、2)バルクフィルム中、3)無機材料表面、の反応を行った。1)に関しては、前年度に得られた水中でアルコキシ架橋したポリマーの脱架橋に成功し、アルコキシアミンの交換反応を利用した水中での可逆的な構造変換反応を達成した。2)に関しては、前年度に引き続きバルクフィルム中のラジカル交換反応を検討した結果、ジスルフィド結合を有する様々な高分子において反応が進行することを明らかにした。3)に関しては、前年度に引き続き、シリコン基板表面に形成された動的共有結合骨格を側鎖に有するポリマーブラシを用いた高分子反応を検討した。動的共有結合を末端に有するポリビニルピリジンとの結合

組み換え反応を行い、その後に四級化反応を行うことで、親水性表面へと変換できることを明らかにした。本研究では、目標としていた3つの反応場(極性溶媒系、無溶媒系、無機材料表面系)の全てにおいて、動的共有結合ポリマーのラジカル交換反応が進行することを明らかにすることができた。本研究で得られた成果は、今後、環境低負荷高分子、リサイクル性高分子、自己修復性高分子など様々な応用展開が期待される。
歯周病による脳炎症誘発および加齢に伴う増悪における「髄膜-グリア連関」破綻の関与

末梢炎症を誘発した若年ラットの大脳皮質のグリア細胞において抗炎症性サイトカインのIL-10ならびにTGF-β1の発現が認められた。一方、末梢炎症を誘発した中年ラットの大脳皮質では、炎症性サイトカインであるIL-1βの発現が髄膜に加えて脳実質内のグリア細胞にも認められた。さらに、末梢炎症を誘発した中年ラットの大脳皮質では髄膜における密着結合タンパク質であるオクルディンならびにZO-1の発現が低下しており、髄膜透過性の増大ならびに血球細胞の脳実質内への浸潤が認められた。初代培養髄膜細胞においてIL-1βならびにPGE_2は各々オクルディンならびにZO-1の発現を有意に低下させた。IL-10ならびにTGF-β1はIL-1βならびにPGE2の作用を抑制した。以上の結果、慢性の末梢炎症に対して髄膜.グリア連関は若齢ではニューロン保護的に、中年では逆にニューロン傷害的に作用することが明らかとなった。このことから特に中高年者では慢性の末梢炎症が深刻な脳炎症を引き起こすことが示唆された。慢性感染症時には病者行動と呼ばれる食欲低下、体重減少、疲労感、鬱などの生理的・精神的変化が誘発される。病者行動は加齢により増悪することが知られているがそのメカニズムについては不明な点が多い。そこで今年度はLPSにより誘発される病者行動ならびに脳炎症に及ぼす加齢の影響について検討した。4、12、24ケ月齢のC57BL/6Jマウスを用い、LPS腹腔内投与後の自発運動ならびに社会行動量の変化を解析した。さらに、脳凍結切片を用いて免疫染色により脳炎症の状態を調べた。その結果、LPS投与後何れのグループにおいても自発運動ならびに社会行動量は有意に減少した。しかし、LPS投与24時間後には4ケ月齢では投与前のレベルに回復したが、12ならびに24ケ月齢では回復しなかった。また、24ケ月齢では4ケ月齢と比較してLPS投与後のグリア細胞におけるIL-1β産生の増大が認められた。さらに、ルイスラットにおけるアジュバント関節炎モデルを用いて大脳皮質の髄膜ならびにそれに近接したグリア細胞の動態における加齢変化の検討を行った。その結果、4ケ月齢ではアジュバント関節炎に伴い髄膜ならびにそれに近接したグリア細胞に抗炎症性サイトカインのIL-10ならびにTGF-β1の発現が認められた。一方、12ケ月齢では炎症性サイトカインのIL-1βの発現が認められた。以上の結果より、髄膜-グリア細胞を介した炎症反応増大が中高年者における病者行動の増悪に関与していることが示唆された。平成19年度、若齢ラットではアジュバント関節炎に伴い髄膜ならびにそれに近接したグリア細胞に抗炎症性サイトカインのIL-10ならびにTGF-β1の発現が認められ、中年ラットでは炎症性サイトカインのIL-1β1ならびにプロスタグランジンE合成酵素が発現することを明らかにし、『加齢に伴うグリア細胞の末梢炎症に対する反応の変容が病者行動の加齢に伴う増悪において重要である』ことを示唆した。平成20年度は、『末梢炎症の髄膜バリア機能が加齢に伴って変容するのか』を明らかにする目的で、若齢ならびに中年ラットにおいてアジュバント関節炎に伴う(1)末梢性炎症細胞の脳実質内への浸潤、ならびに(2)髄膜における密着結合タンパク質(オクルディン、ZO-1)の動態を解析した。若齢ラットではアジュバント関節炎のピーク時においても末梢性炎症細胞の脳実質内への浸潤ならびに密着結合タンパク質の変化は認められなかった。一方、中年ラットではアジュバント関節炎に伴い好中球ならびにヘルパーT細胞の大脳皮質脳実質内への浸潤が見られた。さらに、オクルディンならびにZO-1の免疫反応性も有意に低下した。さらに初代培養髄膜細胞を用いて解析した結果、IL-1βはオクルディンの発現を抑制し、プロスタグランジンE_2はZO-1の発現を抑制することが明らかとなった。

このことから中年では末梢炎症時にグリア細胞から産生分泌されるIL-1βならびにプロスタグランジンE_2は密着結合タンパク質の発現を低下させ、末梢性炎症細胞の脳実質内への浸潤を促進することで脳炎症をさらに増強することが強く示唆された。
イタリア語における複合語生成の確立過程について-主要部を中心として-

ロマンス語は、一般的に複合語の生成に関してゲルマン語などと比較する非生産的であるとされる。本研究では、このようなロマンス語に属するイタリア語複合語について、(1)非生産性の実態と分析、(2)主要部と語形成の確立、という二転から考察を行っている。まず、(1)に関して、「名詞+名詞」(N+N)複合語が、英語と比べて未発達であることを実証するために、英伊辞典と小説・論説分の翻訳を言語材料として、英語名詞複合語がイタリア語でどのように表現されているかの数量的調査を行った。この結果、イタリア語では、その多くが「名詞単独」「名詞+前置詞+名詞」(N+P+N)「名詞+形容詞/形容詞+名詞」(N+A/A+N)などのような複合語以外の構造で表現され、N+N複合語として表現されているものは全体の僅か数%に過ぎないことを明らかにした。このことから、イタリア語における派生接尾辞の発達、N+P+N・N+A/A+Nでの語彙化などを指摘した。次に(2)に関しては、形容詞を構成要素として含む名詞複合語の複数屈折形態素が主要部に規則的に起こらないということに着目し、複合語における「語形成レベル」を考察した。Composti Larghi(CL)(ammortizzatore socialeなどのように構成要素を分離して記述するもの)は、規則的に主要部である名詞と修飾部である形容詞の両方に複数形態が出現するのに対して、Compsti Sretti(CS)(camposantoのように密着して記述するもの)には、CLと同様二つの要素に複数形態が出現するもの(A)と修飾部である形容詞(語末)にだけ複数形態が出現するもの(B)の二種類が存在する。本研究では、「屈折形態の出現位置の違いは、生成過程に差異がある」という仮説を立て、複合語における派生語の可否や単純語と複合語の類似性などから分析を行った。このことから、CLとCSの(A)は語形成規則に従って生成されるのに対して、CSの(B)は初めからLexiconに登録されているということを主張できると考える。
イネいもち病菌エフェクターの宿主細胞内移行機構の解明

イネいもち病は、イネの収量減少を招くため、発生を抑えることが重要である。そのため、イネいもち病を引き起こすいもち病菌の感染過程を明らかにする必要がある。いもち病菌は、イネに感染時に、エフェクターというタンパク質を分泌し、イネの細胞内に移行後、イネの防御応答を攪乱し、病気を助長する。本研究では、エフェクターのうち、細胞外へ分泌する時に重要な短い領域だけで、イネの細胞内へ移行できることを示した。植物病の多くは、糸状菌によって引き起こされる。糸状菌は、植物感染時にエフェクターというタンパク質を分泌し、その中のいくつかは、植物の細胞内に移行し、植物の防御機構を攪乱し、糸状菌の病原性を助長する。エフェクターの細胞内移行モチーフを同定することができれば、糸状菌におけるエフェクター単離速度が飛躍的に速くなる。なぜなら、次世代シークエンサーによって、迅速かつ安価に糸状菌のゲノム配列を決定する時代が到来しつつあり、決定したゲノム情報から分泌タンパク質を予測し、細胞内移行モチーフを探せば、細胞内で作用するエフェクター候補を絞り込むことができるからである。そこで、本研究は、我々がこれまでに単離したイネいもち病菌のエフェクタータンパク質のどのアミノ酸配列が、イネの細胞内に移行することに重要であるかを検証した。その結果、エフェクターの分泌シグナル配列があれば、イネ細胞内へ移行することがわかった。また、エフェクターのプロモーターで発現させた場合、エフェクターではないキシラナーゼタンパク質の分泌シグナル配列でもイネ細胞内への移行が観察された。以上の結果は、エフェクターには、細胞内移行に必要なモチーフがあるかどうかにかかわらず、エフェクターのプロモーターによってタンパク質が発現し、細胞外に分泌されれば、宿主細胞内へ移行するということを示唆している。この結果は、当初予想していたエフェクターとイネ因子のタンパク質間相互作用によって宿主細胞内移行する機構と反していた。現在、エフェクターのプロモーター領域が宿主細胞内移行に重要な働きをするかどうか詳細に検証している。更に、感染時に発現し、細胞内に移行しないことが報告されている分泌タンパク質Bas4のプロモーターの下流で発現させた場合でも、エフェクターの分泌シグナル配列があれば、イネ細胞内に移行することがわかった。そして、驚くべきことに、Bas4の分泌シグナル配列でも移行することが観察された。以上の結果は、細胞外分泌タンパク質は、感染時にタンパク質が発現し、細胞外に分泌されれば、宿主細胞内へ移行するということを示唆している。そして、イネ細胞内に移行しないBas4に代表されるタンパク質は、分泌タンパク質の本体部分が、イネ細胞内への移行を阻害していると推測された。
非レトロウイルス性内在性ウイルスによる同種ウイルス感染阻害機構解明と治療への応用

ボルナウイルスのN遺伝子が内在化した内在性ボルナウイルス様N因子(EBLN)は多くの動物で見つかっており、特にジュウサンセンジリス由来のEBLN(itEBLN)はBDVの感染を抑制することがわかっている。そこで、本研究ではその抑制機構を解明するために欠損体を作成しBDVに対する影響を確認した。共免疫沈降法及び蛍光抗体法によりitEBLNとBDVタンパク質との結合性を確認した。その結果itEBLNはBDVのNタンパク質に結合してBDVのmRNA発現を抑制させることでウイルスの感染を阻害している可能性が示唆された。本研究では、非レトロウイルス性内在性ウイルスによる同種ウイルス感染阻害機構の解明及びその応用を目指している。ヒトをはじめとする動物のゲノムには多くのレトロトランスポゾンや内在性レトロウイルスといったウイルス由来の配列が存在する。これらの内在性ウイルス因子は逆転写酵素を持つウイルス感染の痕跡であり、逆転写酵素を持たないRNAウイルスは内在化しないと考えられてきた。ところが、ボルナウイルスが哺乳動物のゲノムに組み込まれている事が発見されて以来、フィロウイルス等の非レトロウイルス性の内在性ウイルス因子が複数報告されている。ボルナウイルスのN遺伝子が内在化したEBLN(Endogenous Bornavirus-like N element)はヒトを含む多くの哺乳類に発見されている。これまでの研究により、ジュウサンセンジリス由来のEBLN(itEBLN)はボルナ病ウイルス(BDV)の感染を阻害することが判明していが、その詳細な機序は明らかとなっていない。27年度は研究計画に則りウイルスの結合するタンパク質の決定、及びその結合領域の同定のため実験を実施した。BDVタンパク質との結合を免疫沈降法により確認したところ、itEBLNはBDVの核タンパク質であるNタンパク質とリン酸化タンパク質であるPタンパク質のどちらとも結合していることが判明した。また、蛍光抗体法により細胞内局在を確認したところ、itEBLNとPを同時に細胞に強制発現させると細胞質及び核内にドット状の構造物を作ることが判明した。これらの結果から、itEBLNはゲノムを含まないウイルス構造物を作ることで、ウイルスの転写複製を抑制している可能性が示唆された。27年度は研究計画にしたがってitEBLNと相互作用するタンパク質の探索及び、それらの局在を解析した。またBDV感染を抑制するドメインの解析のため、itEBLNの変異体を作成し結合領域を決定する予定であったが、作成に時間がかかってしまった。現在変異体の一部は作成できているため、それらを用いて結合領域の同定を進めていく。本研究では、itEBLNの抑制機序を明らかにする事で、非レトロウイルス性内在性ウイルスによる同種ウイルス感染阻害機構の解明及びその応用を目指している。また、N及びPタンパク質との結合を欠くitEBLNはBDVのmRNA抑制が認められなかった。一方、Nタンパク質との結合を示すitEBLNは全長のitEBLNと同程度の抑制傾向を示した。以上より、itEBLNはBDVのNタンパク質と結合することによりBDVの感染を抑制する可能性が示唆された。BDVは核内にウイルスゲノムや複数のウイルスタンパク質を含むドット状のウイルス構造物を形成し、そこがウイルスの転写複製の場ではないかと考えられている。このことから、itEBLNはウイルスのタンパク質と相互作用し、ウイルス複製の場に取り込まれることで転写複製を阻害する可能性が考えられる。28年度は前年度に継続してitEBLNとウイルスタンパク質との結合領域の決定を行い、続いて研究計画に従ってitEBLNによる感染抑制機序の解明及びTat融合itEBLNによるBDV感染抑制を評価する。ウイルス学必要な試薬の納品が遅れたためキャンセル扱いとし、次年度使用となった。必要な試薬の購入に当てる。
ミゾリビン吸収における濃縮型拡散トランスポーターの関与

今回、ミゾリビン(MZR)吸収における個体差がhCNT1、hCNT2、hCNT 3の遺伝子多型に関連するかについて検討した。hCNT1,2,3の遺伝子多型とMZR血中濃度の間には明らかな有意な関係は認めなかった。hCNT1,2,3の遺伝子多型の各組合せとMZR血中濃度の間にも明らかな有意な関係は認められなかった。MZR血中濃度上昇例と非上昇例に分けた検討にても、性別、hCNT1,2,3の遺伝子多型との間には優位な関係はなかった。以上結果より、hCNT1、hCNT2、hCNT 3のそれぞれの遺伝子多型、および組み合わせにおいても、MZR血中濃度の間には明らかな関係性が認められないことを見出した。免疫抑制作用のあるミゾリビンは、小児の頻回再発型ネフローゼ症候群の治療薬として血中濃度が十分に認められた場合に著効を示す。しかし、ミゾリビンの血中濃度は、個体差および日による変動が激しく、消化管での吸収不良が体内薬物動態に大きく影響すると考えられる。申請者はこれまでに、ミゾリビン吸収にはconcentrative nucleosidetransporter(CNT)2輸送系が関与していることを見出している。本研究では、ミゾリビン吸収におけるCNT2遺伝子多型の関与、および類似する輸送系であるCNT1、CNT3での遺伝子多型の関与、さらにCNT輸送系に深く関わる塩分摂取量の影響を検討することを目的とした。研究計画を遂行するために、平成26年度にはCNT13遺伝子多型の関与について検討した。現時点において、CTN1でのG565Aアレル頻度は野生型(G/G)が4例、ヘテロ型(G/A)が10例、ホモ型(A/A)が3例、CTN2でのC665Tアレル頻度は野生型(C/C)が15例、ヘテロ型(C/T)が2例、ホモ型(T/T)は認められなかった。また、CTN3でのA338Gアレル頻度は野生型(A/A)が15例、ヘテロ型(A/G)が2例、ホモ型(G/G)は認められなかった。今回の検討により、CTN13多型の日本人での発現頻度の一部を確認することが出来た。さらに、症例数を増やすことによって、ミゾリビン吸収とCNT13遺伝子多型の関与についてさらに検討を進めていく。免疫抑制薬であるミゾリビンは、小児の頻回再発型ネフローゼ症候群の治療薬として十分な血中濃度が維持された場合に著効を示す。しかし、ミゾリビンの血中濃度は、個体差および日による変動が激しく、消化管での吸収状態が体内薬物動態に大きく影響すると考えられる。申請者は、ミゾリビン吸収にはconcentrative nucleosidetransporter(CNT)2輸送系が関与していることを見出しことから、本研究にて、ミゾリビン吸収におけるCNT1,2,3遺伝子多型の関与、およびCNT輸送系に深く関わる塩分摂取量の影響を検討している。研究計画を遂行するために、平成26年度にはCNT13遺伝子多型の判定を行なう方法の確立を目指して検討した。その結果、CTN13多型の判定法を確立し、一部の症例における発現頻度を確認した。今年度は症例数を増やし、測定症例が77例で、現時点では統計学的有意差は示されてはいないが、目標症例数に達することにより、ミゾリビン血中濃度と各遺伝子多型の関与について明らかになると考えられる。また、ミゾリビン吸収における塩分摂取量の影響について検討として、食事内容についての食事日誌の記載、および塩分計を使用した塩分量の測定をパイロット的に数例施行したが、問題なく行なえることが確認された。目標症例数として、日本人でのSNPsの頻度はCNT1は0.090、CNT2は0.167、CNT3 0.156とされ、実際に1つ以上の多型を有する頻度を10&#12316;15 %程度と仮定すると、有意差を示すために100例程度は必要と考えており、現在は77例を測定している。そのために、現時点では統計学的有意差は示されてはいないが、来年度に症例数をさらに集積することによって、ミゾリビン血中濃度と各遺伝子多型の関与について明らかにしていくことが可能と考えている。また、CNT輸送系に関わる塩分摂取量の影響についての検討も、問題なく行なえることが示されたため、症例数を増やしていく予定である。免疫抑制薬のひとつであるミゾリビンは、小児の頻回再発型ネフローゼ症候群の治療薬として使用されるが、十分な血中濃度が維持された場合に著効を示す。申請者は、これまでにミゾリビン吸収にはヒト濃縮型核酸トランスポーター(concentrative nucleoside transporter:hCNT)のCNT2輸送系が関与していることを見出している。本研究では、ミゾリビン吸収における個体差の原因が、hCNT1,2,3遺伝子多型に関連しているかを究明することを目標に検討してきた。研究計画として、平成26年度には、hCNT13遺伝子多型の判定を行なう方法の確立を目指して検討した。その結果、全血によりhCTN13多型の判定を簡便に行なう方法を確立し、一部の症例における遺伝子多型の発現を確認した。平成27年度には症例数を増やしてhCNT13遺伝子多型とミゾリビン吸収との関連について検討した。

今年度は、最終集計として、正確に登録出来た症例73例について、統計学的処理を行ない、関連性について結論を出した。その結果、今回の検討においては、hCNT13のSNPとミゾリビン体表面積当たりの血中濃度値には明らかな関連性が認められないことを明らかにした。また、ミゾリビン血中濃度が2(μg/ml/m2)以上と2未満の症例に分けての検討においても、明らかな差がみられなかったことを見出した。今回、ミゾリビン(MZR)吸収における個体差がhCNT1、hCNT2、hCNT 3の遺伝子多型に関連するかについて検討した。hCNT1,2,3の遺伝子多型とMZR血中濃度の間には明らかな有意な関係は認めなかった。hCNT1,2,3の遺伝子多型の各組合せとMZR血中濃度の間にも明らかな有意な関係は認められなかった。MZR血中濃度上昇例と非上昇例に分けた検討にても、性別、hCNT1,2,3の遺伝子多型との間には優位な関係はなかった。以上結果より、hCNT1、hCNT2、hCNT 3のそれぞれの遺伝子多型、および組み合わせにおいても、MZR血中濃度の間には明らかな関係性が認められないことを見出した。サンプルの同時分析にてCTN13遺伝子多型の判定を行う方法を確立することが可能と成り、それにより各遺伝子多型でのアレル頻度を見出し、有益な情報を得ることができた。今後、症例数を集積することによって、ミゾリビン血中濃度と各遺伝子多型の関与について明らかにしていくことが可能と考えている。今後の予定として、目標症例数におけるCNT13遺伝子多型の検討を進め、ミゾリビン吸収におけるCNT13遺伝子多型の関係を明らかにして、個体差の原因を明確化する。また、ミゾリビン血中濃度の日による変動が、CNT輸送系に関わる塩分摂取量の影響について、ミゾリビン吸収における塩分摂取量とミゾリビン血中濃度との関連を明らかにする。さらに、これらの事柄について、動物実験にても証明できるかを検討していく。小児科学今後の予定として、より多数の症例でのCNT13遺伝子多型の検討を進めていき、ミゾリビン吸収におけるCNT13遺伝子多型の関係を明らかにし、個体差の原因を明確化していく。また、ミゾリビン血中濃度の日による変動が、ミゾリビン吸収における塩分摂取量の影響について調べるため、食事内容についての食事日誌の記載、および塩分計を使用した塩分量の測定を行い、ミゾリビン血中濃度との関連性を検討していく。該当年度に試薬等を中心に購入したが、試薬の金額が高いものが多く、若干の残金としてわずかに発生した。次年度の研究費は、ミゾリビン吸収と各遺伝子多型の関連性をより明らかにするため、追加症例での検討を行うために、各遺伝子多型の検索に必要な消耗品費の購入に残金を充填する予定である。