hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管平滑筋形質転換におけるβ2-カイメリンを介した細胞内情報伝達の解析

本年度明らかになったβ2-カイメリンの分子機能として、Pennsylvania大のKazanietz等は、β2-カイメリンがPhorbol ester刺激により細胞質分画から核周囲のゴルジ野に移行、その際β2-カイメリンのPhorbol ester、diacylglycerol結合部位であるC1ドメインとゴルジ装置に局在するTmp21-I(p23)proteinの存在が必須である事を示した。依然、カイメリンを介した細胞内情報伝達が、どのような細胞機能、病態に役割を演じているかは、ほとんど解明されていないが、同分子がnon-protein kinase C probol ester receptor機能を有する有力な裏付けであり、細胞運動に重要なrac-GTPase活性と合わせて血管細胞生物学おける機能解析が期待される。本年度我々は、まず各種細胞株におけるβ2-カイメリン遺伝子発現をRT-PCR法で解析した。正常ヒト血管平滑筋細胞においてはsteady-stateで発現していたが、SV40T抗原を遺伝子導入した不死化平滑筋細胞株ISS10では、より強い発現を認めた。更に喉頭癌Hep2ないし悪性神経膠腫U251MG株でも強発現を認め、細胞増殖能の亢進にリンクしたβ2-カイメリンの発現調節が示唆された。更に前述のKazanietz groupからrat polyclonal β2-カイメリン抗体の供与を受け、剖検時採取した大動脈組織において酵素抗体免疫染色を施行した。β2-カイメリンは血管内皮に陽性を示し、若年者のintactな血管壁での中膜の平滑筋に淡く染色され、高齢者の動脈硬化病変でも病変部の平滑筋やマクロファージに発現を認めた。現在,PDGF, bFGF等の血管作動物質刺激に対するβ2-カイメリン分子の発現、局在変化をin vitroで検討中である。本年度、更に明らかになったβ2-カイメリンの分子機能として、本研究の研究協力者でもあるPennsylvania大のKazanietz等は、β2-カイメリンがPKCと同様に抗癌抗生物質アナログAD198の結合し機能抑制される事、またこの際、C1ドメインが選択的に薬剤レセプターとして働く事を報告した(Mol Cancer Ther,2002)。この系は、カイメリンの分子機構を検討する上で新たな解析ツールとなるばかりではなく、カイメリン系が臨床薬理のTargetになりうる事を示している。血管平滑筋の形質はもとより心血管病全体にわたりカイメリン系の意義は依然として解明されていない。昨年度、我々は血管平滑筋細胞に内因性のβ2-カイメリン発現が存在する事を培養細胞、組織切片を用いて証明した。本年度は内因性増殖因子の代表である線維芽細胞増殖因子bFGFとprobol ester、TPAを用いてβ2-カイメリン活性を検討した。β2-カイメリンはPKC同様、その活性化に伴い細胞質から細胞膜に移行する。免疫組織染色で1μMTPA刺激により1時間後からβ2-カイメリンのimmuno-reactivityが亢進した。bFGF刺激でも同様な反応を示し、β2-カイメリン発現は、非刺激下の細胞での発現は弱く、細胞質内全体に淡く染色されるが、刺激後、細胞膜、特に紡錘形を示す平滑筋細胞の一端に強調される傾向を示した。β2-カイメリンが細胞運動に重要なrac-GTPase活性を指摘される事を考えると大変、興味深い知見であり、現在、下流のrac活性を検討中である。また更にβ2-カイメリンを強発現するadenovirus vectorを開発中である。現時点でβ2-カイメリンに関する文献報告は準備中であるが、本年度は動脈硬化症、免疫病理、増殖因子シグナルに関する関連分野についての英語論文を公表した。
細菌性コラゲナーゼによる基質認識機構の解明と血管新生薬物シーズへの展開

ガス壊疽菌群の細菌性コラゲナーゼの基質アンカー・モジュールはPKDとCBDよりなる。トロポコラーゲン分子の束である不溶性線維に本モジュールがどのように結合するかを明らかにするため、ColG酵素由来のアンカーPKD-CBD1-CBD2とコラーゲン様ペプチドの複合体の構造をX線小角散乱法により決定した。CBD2はペプチドのC末端に結合していた。また、CBD1は別のコラーゲン分子に結合し、PKDはC末端より下流に触媒モジュールを配置して加水分解することを示唆する結果が得られた(論文1)。他方、ColH酵素由来のアンカーPKD1-PKD2-CBDとコラーゲン様ペプチドとの複合体の構造をX線小角散乱法により決定したところ、CBDはコラーゲン様ペプチドのC末端に、両PKDはいずれもそのN末側に結合すると考えられる結果が得られた。PKD2ではβサンドイッチの片側のシートで4つの疎水性残基が露出しており、これらが結合に寄与すると考えられた。そこで、NMR perturbationによりこれを証明するため、15N標識PKD2-CBDおよび15N/13C標識PKD2-CBDを生産した。これらのタンパク質を国際共同研究先のアーカンソー大学化学生化学部のJoshua Sakon博士に送付して、二次元15N HSQCスペクトルの測定に着手した。また、PKD-CBDの結晶作製にも着手した。コラーゲン結合型塩基性線維芽細胞成長因子(CB-bFGF)の臨床応用では、歯周病による歯槽骨の水平欠損部に対してCB-bFGF固相化コラーゲンを充填することで、bFGF単体に比し有意な骨形成を部位特異的に誘導できることをmicro CTおよび組織学的に示した。また、オステオカルシン、proliferating cell nuclear antigen、およびオステオポンチン陽性細胞が増加したことを示した(論文2)。国際共同研究先より大学院生のPerry Caviness氏を受け入れ、種々の基質アンカーの野生型および変異体を作製した。ColG酵素由来アンカーでは、計画どおり新たにPKD-CBD1-CBD2とコラーゲン様ペプチドの複合体の構造をX線小角散乱法により決定することができた。PKDの配置方向は予想とは全く逆であったが、そのことを含め論文1として発表することができた。また、研究開始当初は、ColH酵素由来アンカーの15N標識PKD2-CBDおよび15N/13C標識PKD2-CBDの生産効率が低く、核磁気共鳴法(NMR)による構造決定が危ぶまれた。非標識塩とグルコースを用いて最小培地の組成と培養条件を工夫することで解析に必要な量の生産・精製を行うことができた。15N/13C標識効率はいずれも96%程度と十分であった。コラーゲン結合型塩基性線維芽細胞成長因子(CB-bFGF)とコラーゲン・パウダーからなる複合材料をもちいた歯槽骨の再生では、当初の予想以上の成果を飛躍的に得ることができ論文2として発表できた。学生を2019年5月より3か月間国際共同研究先に派遣し、ColH酵素由来アンカーの15N標識PKD2-CBDおよび15N/13C標識PKD2-CBDの主鎖の帰属を進める予定である。その後、コラーゲン様ペプチド(早稲田大学先進理工学部小出隆貴教授生産済)を用いてNMR perturbation assayを行い、PKD2の基質結合に関与する残基を網羅的に決定する予定である。また血管新生シーズについては、血管内皮細胞増殖因子(VEGF-A)をHisタグを用いた大腸菌系により生産する予定である。化学的クロスリンカーをPKD2-CBDのN末端アミノ基に導入後、VEGF-Aとクロスリンクさせてコラーゲン結合型VEGFを産生し、in vitroで細胞増殖促進活性とコラーゲン結合能を示す予定である。

また、オステオカルシン、proliferating cell nuclear antigen、およびオステオポンチン陽性細胞が増加したことを示した(論文2)。国際共同研究先より大学院生のPerry Caviness氏を受け入れ、種々の基質アンカーの野生型および変異体を作製した。ColG酵素由来アンカーでは、計画どおり新たにPKD-CBD1-CBD2とコラーゲン様ペプチドの複合体の構造をX線小角散乱法により決定することができた。PKDの配置方向は予想とは全く逆であったが、そのことを含め論文1として発表することができた。また、研究開始当初は、ColH酵素由来アンカーの15N標識PKD2-CBDおよび15N/13C標識PKD2-CBDの生産効率が低く、核磁気共鳴法(NMR)による構造決定が危ぶまれた。非標識塩とグルコースを用いて最小培地の組成と培養条件を工夫することで解析に必要な量の生産・精製を行うことができた。15N/13C標識効率はいずれも96%程度と十分であった。コラーゲン結合型塩基性線維芽細胞成長因子(CB-bFGF)とコラーゲン・パウダーからなる複合材料をもちいた歯槽骨の再生では、当初の予想以上の成果を飛躍的に得ることができ論文2として発表できた。学生を2019年5月より3か月間国際共同研究先に派遣し、ColH酵素由来アンカーの15N標識PKD2-CBDおよび15N/13C標識PKD2-CBDの主鎖の帰属を進める予定である。その後、コラーゲン様ペプチド(早稲田大学先進理工学部小出隆貴教授生産済)を用いてNMR perturbation assayを行い、PKD2の基質結合に関与する残基を網羅的に決定する予定である。また血管新生シーズについては、血管内皮細胞増殖因子(VEGF-A)をHisタグを用いた大腸菌系により生産する予定である。化学的クロスリンカーをPKD2-CBDのN末端アミノ基に導入後、VEGF-Aとクロスリンクさせてコラーゲン結合型VEGFを産生し、in vitroで細胞増殖促進活性とコラーゲン結合能を示す予定である。第92回日本細菌学会総会で研究成果を発表する予定であったが、通常の3月ではなく翌年度4月に開催されることとなったため、旅費相当額を次年度に繰り越した。また、13Cグルコースの使用が計画より少なく済んだことにより、相当額を次年度に繰り越した。旅費、消耗品費とも次年度に支出する予定である。
統合失調症発症脆弱性因子ｄｙｓｂｉｎｄｉｎ－１による細胞機能制御

タンパク質間相互作用データベースを用いてdysbindin-1の結合分子を探索し、細胞周期調節に関与するサイクリンD3を見いだした。免疫沈降実験により、dysbindin-1AとサイクリンD1が最も効率よく複合体を形成することがわかった。また、哺乳動物培養細胞において細胞周期の進行に依存した、dysbindin-1とサイクリンD1の細胞質および核での共局在が見られた。さらに、dysbindin-1はサイクリンD1の細胞内局在を制御していることも明らかとなった。これらのことから、dysbindin-1はサイクリンD1と協調して、細胞周期調節等の過程で何らかの役割を果たしていると考えられた。1)サイクリンD1とdysbindin-1の結合の細胞生物学的解析昨年度までに、dysbindin-1は細胞周期調節に関わることがよく知られているサイクリンD1と結合すること、およびdysbindin-1のC末端領域とサイクリンD1のC末端領域が結合することなどを明らかにした。今年度はサイクリンD1とdysbindin-1の細胞内局在を細胞生物学的手法により検討した。増殖期にある哺乳動物培養細胞に、外来性に発現させたサイクリンD1は、多くの細胞で核に局在した。一方、dysbindin-1は多くの細胞で細胞質での局在が見られた。サイクリンD1とdysbindin-1を共発現させると、サイクリンD1が核に局在する細胞の割合が著しく低下し、細胞質での局在を示す細胞の割合が増加した。この結果から、哺乳動物細胞において、dysbindin-1はサイクリンD1の局在を制御している可能性があると考えられた。2)マウス個体を用いた神経前駆細胞の増殖、移動、分化におけるdysbindin-1の機能解析dysbindin-1はサイクリンD1と結合することから、神経前駆細胞の増殖、移動、分化において何らかの役割を果たしている可能性が高い。マウス個体を用いた解析を行うため、新生仔マウスを用いたin vivoエレクトロポレーション法の修得を試みた。新生仔マウスの脳室内にGFP遺伝子を注入し、電気パルスを与えた後に飼育を継続し、脳組織切片を作製した。遺伝子の注入量、注入部位、電気パルスの条件、脳組織切片を作製する時期などを検討し、側脳室周囲部(subventricular zone, SVZ)、rostral migratory stream (RMS)および嗅球の神経(前駆)細胞をGFP標識することが可能となった。1)Dysbindin-1とサイクリンD1の結合の生理学的意義の解明昨年度までに、dysbindin-1は細胞周期調節因子の一つであるサイクリンD1と結合することを見いだし、結合に必要な分子内領域の決定や哺乳動物細胞内での局在などを明らかにしてきた。今年度は、サイクリンD1の細胞内での発現に対するdysbindin-1の機能について解析を行った。NIH3T3細胞にサイクリンD1発現ベクターとdysbindin-1ノックダウンベクターを同時に遺伝子導入したところ、サイクリンD1の発現が増加しており、dysbindin-1はサイクリンD1の細胞内における安定性を制御していると考えられた。サイクリンD1は細胞周期進行に伴ってユビキチンープロテアソーム系により分解されることが知られている。現在、dysbindin-1がサイクリンD1のユビキチンープロテアソーム系による分解に関与しているか、プロテアソーム阻害剤を用いた解析やある種のユビキチンリガーゼの関与などを検証中である。2)生後マウスの神経発達におけるdysbindin-1の機能解析私共は、in vivoエレクトロポレーションにより生後マウス嗅球における神経新生を解析する過程で、ある条件下で海馬歯状回神経細胞の発達を解析できることを見いだした。これまでにdysbindin-1は初代培養海馬神経細胞の樹状突起スパインの成熟を制御することを明らかにしている。Dysbindin-1がin vivoにおける神経発達を制御しているか検討するため、in vivoエレクトロポレーションにより生後マウス歯状回神経細胞の発達を解析する手法を開発することを試みた。その結果、最適な電極の角度、電気パルス等の条件を見つけ、安定した結果が得られるようになった。1)サイクリンとdysbindin-1の結合の生化学的解析Dysbindin-1と結合する分子をタンパク質相互作用データベースにより検索したところ、サイクリンD3を陽性分子として見いだした。サイクリンDにはD1、D2、D3の3種類の分子が知られているため、これらの分子とdysbindin-1は複合体を形成するか、哺乳動物細胞過剰発現系を用いた免疫沈降法により検討したところ、dysbindin-1はすべてのサイクリンDと結合することが明らかとなった。細胞周期制御における機能解析が最も進んでいるサイクリンD1との結合に着目して解析を進めた。

部位変異体を作製し、dysbindin-1およびサイクリンD1の結合領域を同様に免疫沈降法により解析したところ、dysbindin-1のdysbindin領域を含むC末端部分と、サイクリンD1のC末端領域が相互作用していることが明らかとなった。2)哺乳動物細胞におけるdysbindin-1とサイクリンD1の局在哺乳動物細胞株を用いて蛍光抗体法によりdysbindin-1の局在を解析したところ、dysbindin-1は、主に細胞質に局在しているが、一部の細胞では核での局在が見られることがわかった。サイクリンD1は、細胞周期に依存して細胞質と核を往来することが知られている。そこで、哺乳動物細胞株を血清飢餓あるいは薬剤処理によって同調培養し、細胞周期依存的なサイクリンD1とdysbindin-1の共局在が見られるか、蛍光抗体法により解析した。その結果、細胞周期のある一時期に核での共局在が見られることがわかった。Dysbindin-1のコイルドコイル領域には、核外移行シグナルと類似した配列が存在する。この部位の変異体を作製し、細胞内での局在を解析したところ、核に多く局在することがわかった。昨年度までに、統合失調症発症脆弱性因子であるdysbindin-1とサイクリンD1の結合について、(1)dysbindin-1とサイクリンD1は、それぞれのC末端側の領域を介して結合すること、(2)哺乳動物培養細胞において、細胞周期の進行に依存的して、部分的ではあるが、核および細胞質においてdysbindin-1とサイクリンD1の共局在が見られること、などを明らかにしてきた。今年度は、まず、3種類のdysbindin-1アイソフォーム(dysbindin-1A、-1B、-1C)と3種類のサイクリンD分子(サイクリンD1、D2、D3)の結合に、分子間で選択性が見られるか検討した。COS細胞一過性発現系を用いて免疫沈降を行ったところ、dysbindin-1AはすべてのサイクリンD分子との複合体形成が見られ、中でもサイクリンD1との結合が最も強く検出された。一方、dysbindin-1B、-1CとサイクリンD1との複合体形成は確認できたが、サイクリンD2、D3との結合は検出できなかった。次に、サイクリンD1の代表的な結合分子であるcdk4のdysbindin-1A/サイクリンD1複合体形成に及ぼす影響について検討した。COS細胞一過性発現系を用いた免疫沈降法により解析した結果、cdk4存在下では、dysbindin-1A/サイクリンD1複合体形成は著しく抑制されることがわかった。一方、サイクリンD1/cdk4複合体に対するdysbindin-1Aの影響は見られなかった。これらのことから、サイクリンD1のdysbindin-1Aに対する親和性はcdk4に対する親和性よりも低いと考えられた。今年度までの解析の結果から、dysbindin-1AはサイクリンD1/cdk4複合体と協調して、細胞周期調節過程で何らかの機能を果たしていると考えられた。神経生物学、生物系薬学
肝癌由来TCF-4 isoformにはWnt5a/b発現の分子スイッチが内在する

TCF-4アイソフォームTCF-4Kに内在するSxxSS motifの変異体K-mutant 269AにおいてWNT5A mRNAおよび蛋白発現を強く認めた.ChIPアッセイではK-mutant 269AのWNT5A promoter領域への直接結合が確認されたことより,TCF-4はSxxSS依存的にWNT5Aの発現を調節していることが示唆された.また,WNT5AをノックダウンによりSLUG発現が顕著に低下したことから,TCF-4はSxxSSモチーフ依存性にWNT5Aの発現調節を介しEMTを制御している可能性が示唆された.SxxSSのセリン残基のリン酸化にはHIPK-2の関与が示唆された.本研究の目的は,Wntシグナル伝達系の中枢転写因子であるTCF-4に内在する「SxxSS」という機能モチーフが,Wnt5a/b(とくに5a)の産生および上皮間葉移行(EMT)誘導に関わっているか否かを明らかにすることである.平成26年度は,このモチーフを持つTCF-4アイソフォームであるTCF-4K(Exp Cell Res 2011)を用いて上記の検討をおこなった.すなわち,TCF-4Kに内在する「SxxSS」モチーフのセリン残基(S)をsite-directed mutagenesisでアラニン(A)に置換した下記の変異体を作成し,それぞれ過剰発現細胞におけるWnt5a/b発現等を評価した.変異体はK-mutant 269A (AxxSS),K-mutant 272A (SxxAS),K-mutant 273A (SxxSA)である.まずreal-time PCRではK-mutant 269AにおいてWnt5aおよびWnt5b,Wnt3a,ROR2の発現が最も強く認められた.とりわけWnt5a mRNAの発現レベルはコントロールの4045倍と高く,Western blotでも高発現が確認された.ChIPアッセイではK-mutant 269Aのwnt5a promoter領域への直接結合が確認されたことより,TCF-4はその構造に内在する「SxxSS」モチーフ依存的にWnt5aの発現を調節している可能性が示唆された.Wnt5aはEMTに関与していることより,Wnt5aをノックダウンし,EMT調節因子であるSnailやSLUGの発現を検討した.その結果,SLUGの発現が顕著に低下していた.このことから,TCF-4は「SxxSS」モチーフ依存性にWnt5aの発現調節を介しEMTを制御している可能性が示唆された.平成27年度には,Wnt5aとその受容体であるROR2,およびWnt5a発現に関わるTCF-4Kがヒト肝細胞癌(HCC)組織においてどこに局在するかを検討した.まず,Wnt5aはHCC細胞および非癌部肝細胞にはほとんど発現しておらず,腫瘍血管を含む血管内皮細胞に局在していた.一方ROR2は,HCCにも強く発現していたが,とくに小型のHCC細胞に強かった.このことから,HCC細胞も発生過程のごとく特定の時期のみWntシグナルが活性化している可能性が示唆された.次にTCF-4 isoformのHCC組織での発現検討の前に,まずヒト肝細胞癌細胞であるHAK-1Bをsingle cell cultureし,そこから採れてきたクローンについてTCF-4JおよびTCF-4KをPCRで半定量化した.しかしながらK単独ないしJ単独を発現しているクローンは採れず,すべてのクローンで両者が任意の割合で混在した形質を示した.したがって,この両isoformをはじめ,TCF-4 isoform全体(14種)の発現量および組織内局在は極めて検出困難なことが予想された.実際,レーザーマイクロダイセクション(ライカ)を用いて採取した肝癌組織から,QIAamp DNA FFPE Tissue Kitにて抽出したRNAを用いてRT-PCRをおこなったが,混在パターンのみが認められ,JとKとの鑑別は不成功に終わった.そこで再度細胞解析に戻り,癌幹細胞あるいは癌幹細胞様細胞が濃縮されうるsphere formation下でのTCF-4J過剰発現細胞(J細胞)およびTCF-4K過剰発現細胞(細胞)についてWnt5aを含めたシグナル系分子の発現を検討している.予想外にもTCF-4Jがsphere形成下においてのみNotchシグナル転写因子Hes1を強烈に発現していることがわかり,その解析も併せておこなっている.ヒトHCC細胞株におけるsingle cell cultureをおこなって,それぞれのクローンのTCF-4 isoformを解析したが,すべて混在型であった.この検討は当初の計画になかったが,isoformの発現様式を理解する上で有意義であった.レーザーマイクロダイセクションおよびRT-PCR系の構築はうまくいき,実際に機能したが,ヒトHCC組織におけるisoformの鑑別は残念ながら不成功に終わった.平成28年度の研究の主たる目標は,研究代表者らがクローニングしてきたTCF-4 isoformに内在する「SxxSS」モチーフのセリン残基をリン酸化する酵素の同定であった.これまでの知見や予備実験より,候補酵素としてNLK (Nemo-like kinase)とHIPK-2 (Homeodomain-interacting protein kinase 2)を挙げ検討してきた.その結果,NLKではTCF-4「SxxSS」モチーフの有意なリン酸化は観察されなかったが,HIPK-2によってリン酸化が促進されることがわかった.TOP/FOP assayによる検討では,「SxxSS」モチーフのセリン残基のリン酸化はそれを内在するTCF-4K isoformの転写活性を低下させた.HIPK-2とTCF-4Kを共発現させた細胞においてTCF

-4Kと複合体を構成する蛋白を免疫沈降により調べたところ,リプレッサーであるCtBPやTLEが結合していることがわかった.したがって,HIPK-2が「SxxSS」モチーフのリン酸化を介してTCF-4のbeta-catenin依存的転写活性を負に制御している機構が明らかになった.ただし,269番目のセリン(「SxxSS」の先頭に位置するセリン)を特異的にリン酸化しているわけではなかった.したがって,siRNAを用いてHIPK-2をノックダウンした際,TCF-4Kの転写活性は確かに上昇するものの,それがWnt5a/SLUGの発現増強を伴ったEMTと連動しなかった.269番目のセリン残基を特異的に脱リン酸化する酵素の同定が課題として残った.TCF-4アイソフォームTCF-4Kに内在するSxxSS motifの変異体K-mutant 269AにおいてWNT5A mRNAおよび蛋白発現を強く認めた.ChIPアッセイではK-mutant 269AのWNT5A promoter領域への直接結合が確認されたことより,TCF-4はSxxSS依存的にWNT5Aの発現を調節していることが示唆された.また,WNT5AをノックダウンによりSLUG発現が顕著に低下したことから,TCF-4はSxxSSモチーフ依存性にWNT5Aの発現調節を介しEMTを制御している可能性が示唆された.SxxSSのセリン残基のリン酸化にはHIPK-2の関与が示唆された.およそ予定通りに進んでいるが,Wnt5a gene silencingを恒常的におこなうシステムを使用するに至らなかった点が不足していた.消化器病学Wnt5a genesilencingを恒常的におこなうシステムを使用することで,これまでに得られた所見を強固にしていく行程が必要である.また,ヒト肝細胞癌におけるWnt5aやROR2の発現の検討をおこなっていきたい.初年度に比較的効率よく研究が進んだために繰越金額が出たが,年度内の使用金額としたは,ほぼ予定通りである.次年度以降におけるプロテオミクスに重点的に予算を使用したかったことと,H27年度において複数回の海外(米国,ヨーロッパ)における成果発表をおこないたかったことが,その理由である.最終年度において,Wnt-Notchシグナル相関など新たな課題が出てきたため,その解析に使用する予定である.プロテオミクス,および複数回の海外(米国,ヨーロッパ)における成果発表に次年度使用額を使用する予定である.
スピンラダー系超伝導体におけるスピンギャップの圧力効果

低温・高磁場・高圧といったいわゆる多重極限環境下における比熱・帯磁率等の測定は,スピンラダー系超伝導物質を含めた強相関伝導電子系物質に対して重要な情報が得られると期待される.本年度は,圧力下比熱測定を可能とする^3Heクライオスタット,及び,比熱測定用圧力セルの立ち上げを行った.比熱測定用圧力セルに用いる圧力媒体の条件として,試料との化学的活性が無いこと,熱伝導性が良いこと,また圧力媒体の比熱の圧力依存性が小さいことが重要である.今回作成した装置には圧力媒体として,Apiezon-Jオイルを用いた.これにより,圧力範囲0kbar<P<4kbar,温度範囲0.5K<T<20Kでの比熱測定が可能となった.今後は更に高圧測定用として,圧力媒体に塩化銀を用いた装置(圧力範囲0kbar<P<10kbar)の開発,また本研究室既存の希釈冷凍機と組み合わせた低温高圧高磁場下比熱帯磁率測定を目指して行く.昨年作成した圧力範囲0<P<0.7GPa,温度範囲2K<T<100Kにおいて帯磁率測定が可能な圧力下帯磁率測定用セルも順調に稼動しており,興味ある結果も出つつある.低温・高磁場・高圧といったいわゆる多重極限環境下における比熱・帯磁率等の測定により,スピンラダー系超伝導物質を含めた強相関伝導電子系物質に対して重要な情報が得られると期待される.本研究の目的は圧力下比熱・帯磁率測定による強相関伝導電子系物質の研究であるが,本年度はその測定技術の確立の為に,圧力下比熱測定を可能とする^3Heクライオスタット,また既存のSQUID磁束計と組み合わせて使用する帯磁率測定用クランプ式圧力セルの開発を行なった.^3Heクライオスタットは最低到達温度0.4Kを実現しており,現在この装置に取り付ける圧力下比熱測定用セルの開発を行なっている.また圧力範囲0<P<0.7GPa,温度範囲2K<T<100Kにおいて帯磁率測定が可能な圧力下帯磁率測定用セルを製作した.今後この圧力セルを用いてスピンラダー系超伝導物質を含めた強相関電子系物質について圧力下帯磁率測定を行なっていく予定である.さらに本年度我々の研究室に導入された^3He-^4He希釈冷凍機(冷却能力100μW at 0.1K最低到達温度14mK)と12テスラマグネットとを組み合わせた多重極限環境下(低温,高圧,強磁場)比熱測定・帯磁率測定装置の開発も並行して行なっている.科学研究費補助金により,^3Heクライオスタット及び圧力セル製作のための材料(SUS製パイプ,ベローズバルブ,^3Heガス,ベリリウム-銅,他),交流帯磁率による圧力検定に使用する高感度ロックインアンプを購入した.低温・高磁場・高圧といったいわゆる多重極限環境下における比熱・帯磁率等の測定は,スピンラダー系超伝導物質を含めた強相関伝導電子系物質に対して重要な情報が得られると期待される.本年度は,圧力下比熱測定を可能とする^3Heクライオスタット,及び,比熱測定用圧力セルの立ち上げを行った.比熱測定用圧力セルに用いる圧力媒体の条件として,試料との化学的活性が無いこと,熱伝導性が良いこと,また圧力媒体の比熱の圧力依存性が小さいことが重要である.今回作成した装置には圧力媒体として,Apiezon-Jオイルを用いた.これにより,圧力範囲0kbar<P<4kbar,温度範囲0.5K<T<20Kでの比熱測定が可能となった.今後は更に高圧測定用として,圧力媒体に塩化銀を用いた装置(圧力範囲0kbar<P<10kbar)の開発,また本研究室既存の希釈冷凍機と組み合わせた低温高圧高磁場下比熱帯磁率測定を目指して行く.昨年作成した圧力範囲0<P<0.7GPa,温度範囲2K<T<100Kにおいて帯磁率測定が可能な圧力下帯磁率測定用セルも順調に稼動しており,興味ある結果も出つつある.
単一異種染色体添加系統の利用によるタマネギ高密度連鎖地図と染色体の対応関係の解明

[目的]高密度連鎖地図作成によるタマネギゲノム解析が日米蘭NZの研究グループにより進行中である.蘭AFLP連鎖地図はネギ-シャロット単一異種染色体添加系統シリーズを利用し,いち早く染色体への振り分けを完了した.また,米RFLP連鎖地図は,新たに約100個のESTマーカーが書き加えられ,その飽和度を増す作業を完了した.さらに,これらの連鎖地図の統合・高密度化を目指す取組みがNZチームにより開始されており,共通の新規ESTマーカーが両地図へ書き込まれた.また,両地図を同じ添加系統を利用して染色体に振り分けることも統合を円滑に行う為に必要である.そこで,本研究では,我が方(日本)の添加系統シリーズを用いて新RFLP連鎖地図が対応する染色体を解明したので報告する.[材料および方法]添加系統シリーズ及びその両親の葉身から前報と同様に全DNAを抽出した.次に,108種類のEST配列から設計したプライマーセットを用いてnested-PCRを行い,AGEによる増幅確認を行った.また,得られたPCR産物は銀染色を伴う変性PAGE分析及びSSCP分析に用いられた.[結果および考察]108種類のプライマーセットについてnested-PCRを行った結果,72種類でシャロットにおける増幅が確認された.ネギと併せて分析を行ったところ,異なる電気泳動法により,61種類で種間多型が検出された.その内訳は,AGEで6種類,変性PAGEで51種類,また,SSCPで4種類であった.添加系統シリーズの分析により,47個のESTマーカーの座乗染色体を決めることができた.このうち29個は,RFLP連鎖地図上のマーカーであり,14連鎖群のうち12が染色体にそれぞれ振り分けられた.[目的]ウィスコンシン大USDA-ARSのHaveyらは,TIGR(The Institute for Genomic Research)と共に,タマネギcDNAの大量塩基配列解析を伴うEST配列情報のデータベース化を実行している。この膨大なデータを利用してマッピングを効率的に行うためには,適当な遺伝学的基準による情報整理が必要である。我々は,この種の情報整理に有効なツールとして,「シャロット(A. cepa L. Aggregatum group)の染色体をもつネギの単一異種染毎体添加系統シリーズ(添加系統シリーズ)」を保有しており,カタログ化されたEST配列を染色体ごとに整理することが可能である。本研究の目的は,添加系統シリーズを用いてタマネギEST配列情報に基いて作成したDNAマーカーの座乗染色体を明らかにしていくことにある。[材料および方法]シャロット'チェンマイ',ネギ'九条'および添加系統シリーズの葉身からvan Heusden(2000)らの方法により全DNAを抽出した。次に,ゲノミックサザン解析により単一コピー配列と推定された62種類のEST配列を基に設計したSTSプライマーセットを用いてfirst PCRを行った。このfirst PCR産物を50倍希釈したものを鋳型としてnested PCRを行い,2%アガロースゲル電気泳動により増幅および多型性の確認を行った。多型検出感度を向上させるため,7M尿素を含む5%ポリアクリルアミドゲル(変性ゲル)で電気泳動し,銀染色によりDNAバンドを検出した。さらに,上記分析で多型が観察できないプライマーセットに関しては,SSCP分析による多型検出を試みた。[結果および考察]62種類のプライマーセットについてnested PCRを行った結果,46種類において,シャロットおよびネギでバンドの増幅が確認された。次に,これらのPCR産物を変性ゲルおよびSSCPゲルで電気泳動した結果,前者にて21種類のプライマーセットで、また,後者にて5種類でそれぞれ種間多型性が確認された。さらに、添加系統シリーズを分析したところ,26種類のESTマーカーの座乗染色体を決定することができた。これらの中のいくつかは既にタマネギ高密度遺伝子地図中にマッピングされており,本研究で得られた情報は各連鎖群が対応する染色体を解明していく上で重要な手がかりを与えることになった。今後,タマネギ染色体地図の完成へ向けて、さらに多くのESTマーカーについて同様の解析を行っていく予定である。[目的]高密度連鎖地図作成によるタマネギゲノム解析が日米蘭NZの研究グループにより進行中である.蘭AFLP連鎖地図はネギ-シャロット単一異種染色体添加系統シリーズを利用し,いち早く染色体への振り分けを完了した.また,米RFLP連鎖地図は,新たに約100個のESTマーカーが書き加えられ,その飽和度を増す作業を完了した.さらに,これらの連鎖地図の統合・高密度化を目指す取組みがNZチームにより開始されており,共通の新規ESTマーカーが両地図へ書き込まれた.また,両地図を同じ添加系統を利用して染色体に振り分けることも統合を円滑に行う為に必要である.そこで,本研究では,我が方(日本)の添加系統シリーズを用いて新RFLP連鎖地図が対応する染色体を解明したので報告する.[材料および方法]添加系統シリーズ及びその両親の葉身から前報と同様に全DNAを抽出した.次に,108種類のEST配列から設計したプライマーセットを用いてnested-PCRを行い,AGEによる増幅確認を行った.また,得られたPCR産物は銀染色を伴う変性PAGE分析及びSSCP分析に用いられた.[結果および考察]108種類のプライマーセットについてnested-PCRを行った結果,72種類でシャロットにおける増幅が確認された.ネギと併せて分析を行ったところ,異なる電気泳動法により,61種類で種間多型が検出された.その内訳は,AGEで6種類,変性PAGEで51種類,また,SSCPで4種類であった.

添加系統シリーズの分析により,47個のESTマーカーの座乗染色体を決めることができた.このうち29個は,RFLP連鎖地図上のマーカーであり,14連鎖群のうち12が染色体にそれぞれ振り分けられた.
高次ストレス下での社会性機能の維持機構の解明

本研究は、宇宙と地上の高次ストレス下での社会性機能の維持(破綻)機構を解明すること、その研究成果を現代ストレス社会の病理の克服に応用することを目的とするものであった。この目的を達成するために、本研究では2つの高次ストレス環境における社会的情報処理プロセスの機能変化および神経生物学的な基盤に関する研究に取り組んだ。(1)閉鎖環境ストレス研究では、宇宙航空研究開発機構(JAXA)が有する閉鎖環境適応訓練施設に2週間滞在する閉鎖実験にサンプルシェアとして参加し、閉鎖環境ストレスが社会性機能に及ぼす影響を調べるための心理学実験データを取得した。社会生活を送る上で必要不可欠な社会性機能のうち表情認知に焦点を当てた。実験課題の認知行動指標を用いて、閉鎖環境ストレスに伴う社会性機能(前熟慮的または熟慮的な表情認知能力)の変化を探索している。閉鎖環境ストレス研究では、データ取得から解析の段階であり、引き続き成果報告および社会発信に取り組んでいく。(2)養育環境ストレス研究では、抑うつ気分といったストレス状態がより高い養育者ほど、子どものではなく大人の気持ちを推測する課題を遂行中の右下前頭回の活動がより低下したが、それらの課題成績(正答率など)に低下がなく維持されることが分かった。養育者が他者の気持ちを推測する能力の認知行動面の指標が低下する前に、脳機能面の指標としてその能力に関与する神経基盤の一部の右下前頭回の脳活動が低下することが示唆される。養育環境ストレスに伴う社会脳機能の低下現象は、大人との対人関係性の問題へとつながりうる徴候として、養育環境ストレスに対する理解を促すとともに、養育者の子育て困難の予防的指標の開発・展開に資するものといえる。研究成果は、地上だけでなく宇宙での社会生活を支える社会性機能の維持機構の理解に貢献していくものといえる。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、宇宙と地上の高次ストレス下での社会性機能の維持(破綻)機構を解明すること、その宇宙科学研究の成果を現代ストレス社会の病理の克服に応用することを目的とするものである。この目的を達成するために、本研究は(1)閉鎖環境ストレスと(2)養育環境ストレスといった2つの高次ストレス環境における社会的情報処理プロセスの機能変化および神経生物学的な基盤に関する研究に取り組む計画である。そこで本年度は、(1)閉鎖環境ストレス研究として、宇宙航空研究開発機構(JAXA)が有する閉鎖環境適応訓練施設に2週間滞在する閉鎖実験にサンプルシェアとして参加し、閉鎖環境ストレスが社会性機能に及ぼす影響を調べるための心理学実験データを取得した。現在、これらの実験データの解析に取り組んでいる。また、(2)養育環境ストレス研究として、養育環境ストレスが社会性機能およびその神経基盤に及ぼす影響を調べるための脳機能イメージング実験に取り組んできた。その実験データに対する個人差解析の結果、抑うつ気分がより高い養育者ほど、表情認知課題を遂行中の右半球の腹外側前頭前野の活動が有意に低下したが、その課題成績との間に相関関係はなかった。また、養育者の抑うつ気分には養育ストレス指標の中でも「社会的孤立」が有意に影響を及ぼしていることが分かった。本結果は、社会性機能の低下に先立って社会脳の機能低下が生じるという前駆現象と解釈され、ストレス状態が深刻化する前の予防的指標の開発に繋がるといえる。平成28年度は計画調書に記載された研究を予定通り遂行できただけでなく、研究データの解析から論文執筆・投稿までを完了することができた。また、本研究課題の研究成果を特許として出願することができた。その点で、おおむね順調に進展しているといえる。

今後は、引き続きJAXA閉鎖環境適応訓練施設を用いた閉鎖実験にサンプルシェアとして参加し心理学実験データの取得を進めることに加えて、現在取得済みの実験データ解析により、閉鎖環境ストレスが社会性機能に及ぼす影響を明らかにする。また、他機関とのデータシェアの可能性を探り、例えば、内分泌機能(唾液中コルチゾルなど)と社会性機能との間の関係性について検討を試みる。また、養育環境ストレス研究では、養育環境ストレスと課題時-脳機能の関係性だけでなく、安静時-脳機能や脳形態の画像データを用いた多角的な脳画像解析に取り組み、また、養育環境ストレスで修飾されうるエピジェネティックな機構(例、DNAメチル化)について検討を試みる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
宇宙環境下の走化性バクテリアによる生物対流に及ぼす重力変調の影響に関する数値解析

本研究では,重力変調が存在する微小重力場において,走化性バクテリアにより生じる生物対流とその輸送特性に関する数値解析を行った.安定な懸濁液に重力変調が作用すると,生物対流が発生し,複数の三次元的なプルームや生物対流パターンが形成される.重力変調の周波数が低い場合,生物対流は重力変調に追従しやすくなる.プルーム同士の干渉が強くなると,輸送特性が向上する.これらの結果は既存の実験では得られていない初めての研究成果である.本研究は,重力変調が存在する微小重力場において,走化性バクテリアにより生じる生物対流とその輸送特性を数値解析により明らかにすることによって,宇宙環境における生物対流の有効利用の可能性を探るものである.平成25年度では,地上の重力場と微小重力場における生物対流について詳細な三次元解析を行い,プルーム同士の干渉と輸送特性を調査した.また,プルーム同士の干渉には生物対流パターンが大きく影響するので,多様な生物対流パターンも発生させた.対象とする容器は浅く,表面張力による水面の変形はないものとする.水面から酸素が一様に供給され,懸濁液中には走化性バクテリアが存在している状況を考える.得られた知見は以下のとおりである.1.地上の重力場において,バクテリアの初期濃度に様々な乱れを加えると,波長が異なる多様な生物対流パターンが発生する.プルームの波長が短くなると,プルーム同士の干渉が強くなり,輸送特性が向上する.2.微小重力場において,生物対流が発生していない懸濁液に,重力変調が作用すると,生物対流が発生し,複数の三次元的なプルームが形成される.重力加速度の増加とともにプルームが出現し,重力加速度が減少するとプルームは消失する.3.重力変調の周波数が低くなるにつれて,生物対流は重力変調に追従しやすくなる.このとき,プルームの数は減少し,プルームの規模が大きくなるため,波長が長くなる.その結果,容器内全体の輸送特性が向上する.4.プルーム間では,周囲のプルームとの干渉によって速い上昇流が発生し,輸送特性が向上する.このとき,より多くのプルームからの干渉が発生し,プルームの波長が短くなるほど,輸送特性が向上する.本研究では,重力変調が存在する微小重力場において,走化性バクテリアにより生じる生物対流とその輸送特性に関する数値解析を行った.安定な懸濁液に重力変調が作用すると,生物対流が発生し,複数の三次元的なプルームや生物対流パターンが形成される.重力変調の周波数が低い場合,生物対流は重力変調に追従しやすくなる.プルーム同士の干渉が強くなると,輸送特性が向上する.これらの結果は既存の実験では得られていない初めての研究成果である.本研究は,重力変調が存在する微小重力場において,走化性バクテリアにより生じる生物対流とその輸送特性を数値解析により明らかにすることにより,宇宙環境における生物対流の有効利用の可能性を探るものである.残留重力や重力変調が生物対流に及ぼす影響が不明であるため,平成24年度は二次元解析により生物対流の基本特性を調査した.対象とする容器は浅く,表面張力による水面の変形はないものとする.水面から酸素が一様に供給され,懸濁液中には走化性バクテリアが存在している状況を考える.得られた知見は以下のとおりである.1.生物対流が発生していない状態において,重力変調が作用すると,生物対流が発生し,周期的に複数のプルームが形成される.重力加速度の増加とともにプルームが出現し,重力加速度が減少するとプルームは消滅する.プルームの個数や間隔は周波数によって異なる.2.レーリー数によらず,重力変調の周波数が低い場合,生物対流は重力変調に追従しやすくなる.このとき,プルーム内のバクテリア濃度が過濃となり,プルーム中心における下降流の速度は速くなるため,生物対流による輸送特性が向上する.3.重力変調の周波数が高くなるに従って,生物対流は重力変調に追従できなくなり,プルームの規模は減少し,輸送特性は低下する.臨界レーリー数より低い場合,高周波数では,プルームが形成されず,生物対流は発生しなくなる.4.生物対流が発生している状態において,重力変調が作用すると,定常状態と比較してバクテリアの輸送特性が低下する.周波数が高くなるに従い,上述と同様に輸送特性は低下する.本研究は,重力変調が存在する微小重力場において,走化性バクテリアにより生じる生物対流とその輸送特性を数値解析により明らかにすることによって,宇宙環境における生物対流の有効利用の可能性を探るものである.平成26年度の当初の計画では,容器の下壁面を振動させることによるプルームの周波数応答性を調査する予定であった.しかしながら,微小重力場においては容器の加振により生物対流が発生しなかった.そこで,基本周波数の重力変調に高周波成分を重畳させることにより重力変調の条件を変えて,様々な生物対流を発生させ,生物対流の周波数応答性を調査した.得られた知見は以下のとおりである.1.安定な懸濁液に重力変調が作用すると,生物対流が発生し,複数の三次元的なプルームが形成される.水面上には複雑な生物対流パターンが現れる.パターンの波長は地上における値より大きくなる.2.重力変調に重畳させる高周波成分が低くなると,懸濁液の周波数応答性が良くなり,下降流と上昇流の平均速度が増加する.重力変調に高周波成分を重畳させると,沈降速度の増加が2回発生する.

3.重畳する高周波成分の周波数が低くなると,対流速度が増加するため,懸濁液全体におけるバクテリアと酸素の輸送特性が向上する.次に,今後の研究の方向性を探るため,輸送特性の大きな変化を得ることを目的として,温度差を懸濁液に与えることにより,生物対流と熱対流の干渉を調査し,輸送特性の制御の可能性を探ることができた.研究期間全体を通して,重力変調を伴う微小重力場の流体中における走化性バクテリアによる生物対流や輸送特性を解明することができ,さらにはバクテリアと酸素の輸送を制御できる可能性を見出すことができた.工学当初の計画の通り,地上の重力場において,バクテリアの初期濃度に様々な乱れを加えると,波長が異なる多様な生物対流パターンが発生することを明らかにした.さらに,微小重力場において,生物対流が発生していない懸濁液に,重力変調が作用すると,生物対流が発生し,複数の三次元的なプルームが形成されることを明らかにした.しかしながら,計算時間の問題から,微小重力場において,バクテリアの初期濃度に様々な乱れを加えることができず,波長が異なる多様な生物対流パターンを発生させることができなかった.そのため,最も出現パターンが多い生物対流を見つけ出すことができなかった.ただし,重力変調の周波数や振幅を変化させたときのプルームの周波数応答性や輸送特性を明らかにできたことは計画通りであった.平成24年度の研究は,申請書の計画通りに進んでいる.最初に,既存の計算コードを組み合わせて新しい計算コードを作成することにより,重力変調が存在する微小重力場において,生物対流が発生することを確認できた.また,重力変調の周波数や振幅を変えたときのバクテリアと酸素の濃度場および流れ場,さらには流束分布から輸送特性を明らかにすることができた.微小重力場において,バクテリアを動力源,化学分析,環境浄化など様々な用途に有効利用するために,バクテリア制御の工学的応用の可能性を調査する.申請者の過去の研究において,容器の下壁面を振動させることが簡単で有効な制御方法であることを見出している.この制御方法を微小重力場にも適用し,プルームの周波数応答性を調査する.解析手順は以下の通りである.1.容器の下壁面を加振させたときのプルーム同士の干渉による濃度場や生物対流の時間的変化を観察し,バクテリアと酸素の輸送に関する非定常特性を調査する.また,重力変調と加振による生物対流の共振現象が現れるかを探る.2.以上の結果を総合して,微小重力場における生物対流と輸送特性を制御することにより,宇宙環境における微生物の有効利用の可能性について,一つの指針を提供する.平成25年度では,微小重力場における生物対流について詳細な三次元解析を行い,重力変調がプルーム同士の干渉に及ぼす影響を調査する.プルーム同士の干渉には生物対流パターンが大きく影響するので,多様な生物対流パターンも発生させる.解析手順は以下の通りである.1.今年度において微小重力場で生物対流が発生する臨界条件が判明しているので,先ずは残留重力や重力変調を固定し,バクテリアの初期濃度に様々な乱れを加え,波長の異なる多様な生物対流パターンを発生させ,プルームの波長による輸送特性の変化を明らかにする.2.次に,最も出現パターンが多い生物対流に着目し,重力変調の周波数や振幅を変化させたときのプルームの周波数応答性を調査し,輸送特性を向上あるいは抑制させる最適な条件を明らかにする.該当しない.
生活雑排水中に流入する蛍光増白剤量逓減化への一試行

衣料品、特に下着類等に対する消費者の白さ追求は異常と云っても過言ではない。とりわけ洗濯等によって達成される白さは本来被服の清潔さの裏付けとなるべきものであるが、近年蛍光増白剤(FBA)という染料によって付与される「まやかしの白さ」によって一部代替されているという事実がある。こうした流れの中にあって生活雑排水として排出され水質汚濁への影響も少なくないと見られるFBAについて、その逓減化を目標に検討した。まず消費者教育を通じての逓減化の研究では、消費者の無意識的な問題行動を改善する必要があることに鑑み、消費者教育によって衣料品や洗剤中のFBAの存在を知らせ、洗濯や衣料品購入行動への注意を促そうとした。教育内容の構成には、衣料品の生産から洗濯排水に至るまでの衣生活の循環の中で問題を指摘した。教育実施時には実物見本や視聴覚機器など教具に工夫した。消費者の意識と実態のずれ、ならびに問題行動に対して、FBAに関する情報提供を中心にした科学的多方面的な教育を実施すれば消費者の白さ指向を押え、洗剤や衣料品購入行動が改善できることを確認した。従って逓減化のため今後このような教育機会の拡大、継続が必要と思われる。一方FBAの有効利用に依拠して逓減化をはかる研究では、吸尽したFBAが繊維内部へ浸透し繊維構成分子と固着した場合蛍光が強化されることに着目し、浸透剤を利用して固着増強を試みた。即ち各種界面活性剤の蛍光比強度への影響を検討し、エーロゾルOTのような優れた浸透作用をもつ助剤を導入すれば、ある温度条件のもとではFBAの配合割合を減少させても所定の蛍光強度の得られる可能性を見出した。これは結果的には排水中のFBAを減じることになり、前述の消費者教育の結果と相俟って環境汚染防止のための一石となりうるものと考える。
妊娠・出産に伴う血中ケトン体の役割：胎児の成長と産後うつ病の回避

ケトン体は脂肪の分解により生成され、グルコースと並び心臓と脳の主要な栄養源である。近年、一般成人における糖質制限食(ケトン産生食)に関連して研究が進み、ケトン体が神経保護作用や抑うつという有用な効果を持つことが明らかにされた。しかし、妊娠中の糖質制限食が母体や胎児の発育へ与える影響については、危険性も示唆されてはいるが、基本的な臨床データが十分でないのが現状である。本研究では、統計解析が可能な集団サイズで、母体の血中ケトン体濃度の妊娠・出産にともなう変動を測定し、新生児の頭の大きさ、並びに産後うつ病との相関関係を定量的に明らかにする。
皮質回路シナプス可塑性に伴う生体脳神経グリア回路の変化

今年度は、感覚刺激を操作することにより、大脳皮質体性感覚野のシナプス変化を誘発する実験系を洗練した。マウスの重要な感覚器であるヒゲを除去することにより、誘発される大脳皮質感覚野神経回路の再編をarc-dVenusトランスジェニック動物マウスを用いて観察した。シナプス変化が起きている可能性の高い神経細胞は過渡的にVenusの明るい黄緑色蛍光タンパクで可視化され、エレクトロポレーション法などを用いて周辺のアストロサイト細胞は水色蛍光タンパクでラベルした。この時、アストロサイトに発現する蛍光タンパクは膜移行性にして、光学顕微鏡の解像度が許す限りアストロサイトの微小プロセスを可視化できるようにした。このように脳細胞が、蛍光ラベル化されたマウスの大脳皮質の細胞形態を二光子励起顕微鏡を用いて観察した。その結果、水色蛍光とVenusの信号の分離は容易でないことがわかった。そこで、アストロサイトのラベルにAAV9ウィルスベクターを用いて膜移行性tdTomatoを発現し、アストロサイトの微小プロセスの形態をイメージングした。これらの可視化に成功し、ヒゲ操作前後の慢性的な形態的変化を観測する礎を築くことができた。さらに、アストロサイトに光刺激によりGタンパク質共益受容体を活性化する分子を発現するトランスジェニック動物を作製し、アストロサイトカルシウム発火を任意に誘発できる実験系を確立した。また、無麻酔で慢性的な神経回路再編を誘発する「豊かな環境」での飼育についても取り組み、海馬脳波のガンマ波に大きな変化が出ることを発見した。またこの時、錐体細胞のシナプス数にも特徴的な変化が現れることを見出し、周辺のアストロサイトの関与を示唆する結果となった。24年度が最終年度であるため、記入しない。脳は神経細胞とグリア細胞、血管とで構成されている。グリア細胞はヒトの脳細胞の約半数を占め、大脳皮質で最も数が多いのがアストロサイトである。アストロサイトは、神経細胞への栄養補給など補助的役割だけを担うと考えられてきたが、近年、シナプス可塑性へも関与する可能性が示唆されている。しかしながら、これまでの研究はいずれも脳切片※5などを用いていたため、生きたままの動物の脳では、アストロサイトとシナプス可塑性の関係は全く不明であった。今回、我々は、生きたままのマウスの大脳皮質にシナプス可塑性を誘導し、このときの大脳皮質にあるアストロサイトの活動を、2光子励起顕微鏡を用いてリアルタイムで観察した。その結果、シナプス可塑性の誘導中に、アストロサイト内のカルシウム濃度が顕著に上昇することを発見した。細胞内のカルシウム濃度は、通常、細胞外と比べて低く保たれており、この濃度が上昇することで多くの生理的反応が生じることが知られている。アストロサイトの場合には、細胞内カルシウム濃度の変動が、細胞活動の指標となり、カルシウム濃度上昇により、物質放出(グリオトランスミッション)が起こることが培養細胞を使った実験系で実証されている。今回の実験で、細胞外のアミノ酸の量を測定できる微小透析法で調べたところ、生きている動物の脳内でも、アストロサイト内カルシウムの上昇に伴って、アストロサイトが放出するとされているアミノ酸の一種(D-セリン※7)の量が、細胞外で増加することも見いだした。アストロサイトの活動がシナプス可塑性にマクロなレベルで関連のあることは示すことができたが、微小突起等のミクロなレベルでの実体が明らかにされていない。感覚刺激を操作することにより、大脳皮質体性感覚野のシナプス変化を誘発する実験系を洗練する。トランスジェニック動物や無麻酔頭部固定系等の方法を導入し、シナプス可塑性と周辺のアストロサイトの活動実態をより明らかにする。