hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
autometryによる自己選好型勤務方式の労働衛生学的検討

1.本研究において試作したautorhythmmetry装置の実用性を高めるために、実験室実験において、装置に対する慣れや練習効果などの基礎データの収集に努めた。その結果、練習効果の大きい項目と、比較的小さい項目があったが、いずれも2セットの練習によって、安定したデータの得られることがわかり、フィールド調査でも、十分、実用に耐える装置であることが確認された。2.本研究の最終目標である現実の勤務の負担評価に応用するために、病棟看護婦や、特別養護老人ホームの寮母などの協力を得てフィールド調査を企画した。このautorhythmmetryによる測定のほか、作業観察やポリグラフ法による心電図など生体反応の連続測定、さらに生活時間調査の記録などを同時に測定・調査した。その結果、自覚症状や体温のほか、反応時間や短期記憶検査などが、短時間の測定で、しかもサーカディアンリズムの影響などをよく反映する結果を得た。さらに、フィールドでのデータの蓄積をはかることにより、最近、急増する変則勤務に対する労働衛生学的なガイドラインの作成につなげていく予定である。3.以上のことから、【.encircled1.】autorhythmmetry装置を完成させた。【.encircled2.】このautorhtmmetry装置をフィールドで応用することによって、多種項目を従来より容易に測定できるようになり、変則勤務負担に対する測定・評価法が飛躍的に改善される可能性が示唆されている。3年計画の初年度にあたる本年は、(1)24時間型ワ-クスタイルに適するautometory用測定項目の選択のための基礎実験、(2)実験結果にもとづく関連測定装置の開発、(3)自己選好型勤務方式についての現場実態調査を実施した。主要な結果は次の通りである。(1)autometory用測定項目の選択のための基礎実験の結果;Autometoryに取り入れる測定項目の指標としての有効性を検討するために、実験室において24時間の徹夜断眠実験を行なった。体温、収縮期、拡張期血圧、心拍数、CFF値、眼調節力などの生理機能の測定と疲労自覚症状、眠けスケ-ルを適用したほか、報告文字数、反応時間(単純、選択)、判断時間、追跡標的数、サ-チ文字数などの各種テストを1時間おきに実施した。その結果、体温や血圧などの生理機能の測定と同時に、情報処理能力の変化を追跡するような数種の心理機能の測定を組み合わせることが必要であることが判明した。(2)関連装置の開発;上記基礎実験の結果にもとづき、autometory用測定装置の開発と取り組んだ。労働現場ならびに自宅において多項目の測定が簡単に、しかも比較的短時間で実行でき、同時にデ-タを取り込んでくれる測定装置を試作した。現在、プリテストを行いながら、プログラムそのほかの手直し中である。(3)自己選好型勤務方式についての現場実態調査;コンビニエンスストアやトラック業界、ホテル、病院などにおいて、管理者ならびにワ-カ-から主にヒアリングによって自己選好型勤方式の実態や、メリット、デメレット、勤務・生活時間の概要などについて調べた。前年度、標記Autorhythmmetoryを開発し、主に実験的な手法により、その有効性の検討を行ってきた。今年度は、実験結果にもとづきAutorhythmmetoryの改良に多くの時間を費やした。改良点は、主につぎの2点である。第1は、Autorhythmmetotyに盛り込む測定項目の充実化をはかったことで、最終的に、体温と血圧値の記録のほか、疲労自覚症状、スタンフォード眼気尺度、線分法による疲労感、単純反応時間、4選択反応時間、トッラキングテスト、MAST(メモリーアンドサーチテスト)、時間評価テスト、文章理解テスト、数字の短期記憶テストの問題提示と被験者の反応結果を自動記録するようにした。第2は、このAutorhythmmetotyをフィールドスタディ用として使い勝手の改良を試みたことで、初期設定で測定項目の選択をできるようにした。このことによって、対象の作業の特性別に測定項目の選択ができることと、測定時間の大幅な短縮が可能となった。こうした機器の改良後、再び基礎的な実験を行ったことと、救急医療にたずさわる病院医師の協力で、予備的なフィールド実験を開始した。Autorhythmmetoryを使って、同一被験者に24時間断眠を9時からと21時から2回行った実験では、(1)体温はいずれの実験でも概日リズムを示したが、21時からの方が最高、最低体温を示す時刻が遅くなっていた。(2)疲労や眠気の自覚症状には個人差があり、事前の昼眠が常に眠気防止に役だってはいなかった。(3)選択反応は眠気の得点と関連が強く、眠気の訴えが高い場合には、反応時間が長かったことなどが判明した。さらに、実験を継続する予定でいる。また、実験によって、Autorhythmmetoryのフィールドでの応用が可能となったので、予備的な検討を開始した。

その結果、自覚症状や体温のほか、反応時間や短期記憶検査などが、短時間の測定で、しかもサーカディアンリズムの影響などをよく反映する結果を得た。さらに、フィールドでのデータの蓄積をはかることにより、最近、急増する変則勤務に対する労働衛生学的なガイドラインの作成につなげていく予定である。3.以上のことから、【.encircled1.】autorhythmmetry装置を完成させた。【.encircled2.】このautorhtmmetry装置をフィールドで応用することによって、多種項目を従来より容易に測定できるようになり、変則勤務負担に対する測定・評価法が飛躍的に改善される可能性が示唆されている。
口腔癌のリンパ節転移のメカニズム検討

口腔癌のリンパ節転移の機序を明らかにするため、ヒト口腔扁平上皮癌および高リンパ節転移性扁平上皮癌O-1Nを用いて以下の研究をおこなった。1.FCM分析:ヒト口腔癌新鮮材料90例、パラフィン包埋材料96例について、原発巣と転移巣を比較分析。転移性癌では原発巣ではaneuploidyの頻度が高いが、転移巣でdiploidyにshift downしていることからdiploidcellの方が転移能が高い可能性を指摘した。2.染色体分析:EGFを用いてヒト口腔癌の染色体分析を確立した。3.基底膜形成:O-1Nが局所浸潤をはじめ、リンパ管侵入し転移形成する過程での腫瘍の基底膜の変化を検索。胞巣の小型化と周囲組織への浸潤にともなう基底膜の断裂、消失がリンパ管侵入と転移形成の用件となっている事を示した。4.リンパ管侵襲:4種の染色法の組み合わせにより血管とリンパ管の判別法を確立。これにより、O-1Nはその周囲に増殖したリンパ管にのみ特異的に侵入し、しかも、その機序は今まで考えられていたのとは異なり、腫瘍胞巣の一部がそのまま直接リンパ管に侵入。そこで単離した腫瘍細胞塊がリンパ節に運ばれて転移が成立することを明らかにした。5.間質反応:ヒト口腔癌のリンパ節転移巣における間質形成を原発巣のものと比較検討。両者での間質の性格が類似していることから、癌にはそれぞれ特有の間質誘導能があることを明らかにした。以上の研究成果は多くの国際誌、国際学会に発表された。口腔癌のリンパ節転移の機序を解明するため、ヒトロ腔癌および高転移性実験癌0-1Nを用いて以下の研究を行った。1、ヒトロ腔癌扁平上皮癌40例の新鮮材料につきFCM分析を行い、リンパ節転移をきたした癌ではaneuploidyの頻度、DNA indexいずれも転移のない癌より高値である事を明らかにし、FCMが転移の予測の一助となる事を示した。2、ヒト口腔扁平上皮癌96例のパラフィン包埋切片につきFCM分析を行い、転移をきたした癌の原発巣ではaneuploidyの頻度は高いが、転移巣では多くがdiploidyを示す事から、aneuploid腫瘍であっても転移に関与するcell lineはdiploid cellである可能性を指摘した。これは癌の本質に触れる所見なので今後さらにヒト口腔癌培養株を用いてこの事実を認めたい。3、0-1Nを用いて基底膜の局在をラミニン及びタイプIVコラゲンの免疫染色により観察したところ、癌の浸潤にともなって基底膜の存在が消失していく事を明かにした。4、ラミニンおよびタイプIVコラゲンによる基底膜の免疫染色、BSAによる脈管内皮細胞の染色などにより血管とリンパ管を識別する方法を考案し、0-1Nのリンパ管侵襲が今まで考えられていた血管侵襲とは全く違った機序でおきている事を明らかにした。今後癌周囲のリンパ管の動態をマクロスコープにて検索したい。5、ヒト口腔癌16例の転移巣における間質反応をフィブロネクチン、タイプI、III、IV、Vゴラゲン、ラミニン、ヘパラン酸プロテオグリカンなどの免疫染色を用いて検索し、癌特有の間質誘導能がある事を明かにした。口腔癌のリンパ節転移の機序を明らかにするため、ヒト口腔癌および高転移性実験癌0-1Nを用いて以下の研究を行った。1.転移、非転移株の樹立:0-1Nより樹立した転移株については現在論文投稿中。これよりの非転移株の樹立について検索中。ヒト口腔癌についても、原発巣、転移巣よりの細胞株の樹立を試みている。

2.FCM分析:新鮮材料80例以上の転移および化学療法の反応との関係につき分析を終え、転移性癌の原発巣でのaneuploidyの頻度は高いが、転移巣ではdiploidyにshift downしているものが多い事から、以前指摘したとおり転移性細胞はdiploid cells of populationであると考えられた。この結果は第3回国際口腔癌学会にて発表した。3.染色体分析:扁平上皮癌については技術的に困難が多く、方法の確立に苦心している。現在まで7例の分析に成功した。4.基底膜形成:0-1Nが局所浸潤をはじめてリンパ管に侵入し、転移をきたすまでの過程での腫瘍基底膜の変化を検索し、胞巣の小型化にともなう基底膜の断裂、欠如が腫瘍の浸潤と転移形成の用件である事、それは主に基底膜構成分の細胞外での基底膜への構築障害によると思われる事を明らかにした。結果は現在投稿中。5.脈管侵襲:免疫染色を含む4種の染色法により、血管とリンパ管の判別法を確立するとともに、0-1Nはリンパ管にのみ特異的に侵入し、しかも、その過程は今まで考えられていたのと異なり、腫瘍胞巣が直接リンパ管に侵入し、そこから単離した腫瘍塊がそのままリンパ管に運ばれて転移が成立する事を明らかにした。結果は現在投稿中。その機序の詳細につき、電顕にて観察中である。口腔癌のリンパ節転移の機序を明らかにするため、ヒト口腔扁平上皮癌および高リンパ節転移性扁平上皮癌O-1Nを用いて以下の研究をおこなった。1.FCM分析:ヒト口腔癌新鮮材料90例、パラフィン包埋材料96例について、原発巣と転移巣を比較分析。転移性癌では原発巣ではaneuploidyの頻度が高いが、転移巣でdiploidyにshift downしていることからdiploidcellの方が転移能が高い可能性を指摘した。2.染色体分析:EGFを用いてヒト口腔癌の染色体分析を確立した。3.基底膜形成:O-1Nが局所浸潤をはじめ、リンパ管侵入し転移形成する過程での腫瘍の基底膜の変化を検索。胞巣の小型化と周囲組織への浸潤にともなう基底膜の断裂、消失がリンパ管侵入と転移形成の要件となっている事を示した。4.リンパ管浸襲:4種の染色法の組み合わせにより血管とリンパ管の判別法を確立。これにより、O-1Nはその周囲に増殖したリンパ管にのみ特異的に侵入し、しかも、その機序は今まで考えられていたのとは異なり、腫瘍胞巣の一部がそのまま直接リンパ管に侵入。そこで単離した腫瘍細胞塊がリンパ節に運ばれて転移が成立することを明らかにした。5.間質反応:ヒト口腔癌のリンパ節転移巣における間質形成を原発巣のものと比較検討。両者での間質の性格が類似していることから、癌にはそれぞれ特有の間質誘導能があることを明らかにした。以上の研究成果は多くの国際誌、国際学会に発表された。
ヒト前立腺癌における新規遺伝子PCA-1の同定と応用に関する研究

前立腺癌に極めて高い発現を示す新規遺伝子PCA-1をdifferential display法で見出しクローニングを行ったが、その生物学的機能はいまだ明らかでない。PCA-1遺伝子と相同性を有する大腸菌AlkBの機能から、酸化的脱メチル化に関与することが予想されるため、ヒト前立腺癌組織でいくつかの遺伝子にメチル化を有する症例を用いて免疫組織学的に検討したが、メチル化の程度や組織分化度との相関は得られなかった。また、その分子メカニズムを明らかにするために、PCA-1を発現するヒト前立腺癌細胞株DU145をsiRNA法でknock downすると、EGF刺激によるERKが阻害され、ERKに依存したcyclinD1誘導、cell cycle促進(G1-S transition)が有意に抑制され、FLICE-like inhibitory protein (FLIP)のユビキチン化の促進とEGF刺激によるRaf-1-FLIP相互作用を強く阻害することが明らかとなった。FLIPはRaf-1の上流にあって、そのシグナル伝達を促進させることから、内因性PCA-1はFLIPの安定化とFLIP-Raf-1/ERKシグナルを介して、成長因子による効率的な細胞増殖をもたらすと考えられた。抗癌剤であるpaclitaxel誘導性apoptosisに及ぼす影響について検討したところ、ERK活性化がapoptosis誘導を阻害し、paclitaxelの抗癌効果を低下させた。PCA-1をknock downすると、paclitaxelによるFLIP-Raf-1依存性ERK活性化が抑制され、apoptosis感受性が有意に促進された。FLIPを強発現させたDU145細胞では、親株に比較してpaclitaxel誘導性apoptosisが抑制されたが、この効果はPCA-1のknock downにより遮断された。以上より、PCA-1はFLIP/Raf-1/ERKシグナルを増幅して前立腺癌細胞の増殖を促進する一方、apoptosis誘導や抗癌剤感受性を阻害することで、癌の進展や増悪に関与していると考えられた。私達はdifferential display法により前立腺癌に極めて強く発現する新規遺伝子PCA-1をクローニングしたが、その生物学的機能はいまだ明らかでない。本研究では、前立腺癌細胞の増殖や細胞死にもたらすPCA-1の機能を解析し、その分子メカニズムを明らかにすることである。今年度は上記研究目的を達成するため、内在性PCA-1の発現が確認されたDU145を親株として、PCA-1を強発現させた前立腺癌細胞株ならびにsiRNA法を用いてknock downさせた細胞株をそれぞれ樹立した。PCA-1をknock downさせた細胞株では、親株やコントロール細胞株に比較してElk-1のリン酸化が強く阻害されるとともに、そのtarget genesであるcyclinD1やBclxLの発現が有意に低下し、細胞増殖能の抑制や抗癌剤誘導性apoptosisの促進が確認された。一方、PCA-1を強発現させた細胞株では、mitogen activated protein kinaseの一つである、extracellular stress regulated kinase(ERK)のリン酸化と、Raf-1活性化に深く関わる遺伝子として近年注目されている、FLICE-like inhibitoryprotein(FLIP)の発現が上昇していた。以上の結果から、PCA-1が主にERK関連シグナルに作用することで前立腺癌のcell cycleやapoptosis誘導を調節していると考えられた。このことはPCA-1が、ERKシグナルを下流に持つepidermalgrowthfactorをはじめ各種成長因子の作用にも影響をもたらす可能性を示している。

次年度はこれらの現象を説明できる分子メカニズムについて、特にERKの上流であるRaf-1/FLIPの相互作用やERKによるElk-1リン酸化に注目して解析をすすめる予定である。前立腺癌に極めて高い発現を示す新規遺伝子PCA-1をdifferential display法で見出しクローニングを行ったが、その生物学的機能はいまだ明らかでない。PCA-1遺伝子と相同性を有する大腸菌AlkBの機能から、酸化的脱メチル化に関連することが予想されるため、ヒト前立腺癌組織でいくつかの遺伝子にメチル化を有する症例を用いて免疫組織学的に検討したが、メチル化の程度や組織分化度との相関は得られなかった。また、その分子メカニズムを明らかにするために、PCA-1を発現するヒト前立腺癌細胞株DU145をsiRNA法でknock downすると、EGF刺激によるERKが阻害され、ERKに依存したcyclinD1誘導、cell cycle促進(G1-S transition)が有意に抑制され、FLICE-like inhibitory protein (FLIP)のユビキチン化の促進とEGF刺激によるRaf-1-FLIP相互作用を強く阻害することが明らかとなった。FLIPはRaf-1の上流にあって、そのシグナル伝達を促進させることから、内因性PCA-1はFLIPの安定化とFLIP-Raf-1/ERKシグナルを介して、成長因子による効率的な細胞増殖をもたらすと考えられた。抗癌剤であるpaclitaxel誘導性apoptosisに及ぼす影響について検討したところ、ERK活性化がapoptosis誘導を阻害し、paclitaxelの抗癌効果を低下させた。PCA-1をknock downすると、paclitaxelによるFLIP-Raf-1依存性ERK活性化が抑制され、apoptosis感受性が有意に促進された。FLIPを強発現させたDU145細胞では、親株に比較してpaclitaxel誘導性apoptosisが抑制されたが、この効果はPCA-1のknock downにより遮断された。以上より、PCA-1はFLIP/Raf-1/ERKシグナルを増幅して前立腺癌細胞の増殖を促進する一方、apoptosis誘導や抗癌剤感受性を阻害することで、癌の進展や増悪に関与していると考えられた。
脳室帯のシステム科学的研究

本研究「脳室帯のシステム科学的研究」は,脳細胞産生の場である「脳室帯」が異なる細胞群によって一種の「生態系」あるいは「社会」として構成されていることに注目し,大脳皮質細胞の「生産ライン」群がどのような近隣関係性をもって三次元的にパックされ,効率的細胞供給が果たされているか,マウスおよび他哺乳類を対象に明らかにすることで,大脳形成を支える原理,組織形成上の脆弱点,ヒトの先天性疾患の病因などを理解できるようになるとの期待のもと実施されている.平成30年度は,これまでの成果を複数の論文として発表した.まず,新しく誕生した細胞が脳室面から速やかに立ち去り,次の細胞産生すなわち前駆細胞による分裂の邪魔にならないようにするために,弾性が利用されていることを見いだした.この弾性は,細胞の密集性により成立している.親細胞が分裂のため膨らむ際に周囲を押し,そこにいったん蓄えられた弾性エネルギーが,親細胞の分裂の直後に子細胞に戻ってきてその初動が助けられるという受動的な機構である(PLOS Biologyに報告).次に,そのような細胞密集による組織の弾性・圧縮性が一定の範囲内に限定されることに重要な意味がある(さもないと細胞づくりがうまく進まない)と見いだした(Developmentに報告).「限定」は,分化途上の細胞がお互いに絡み合ってバリア構造を作ることで果たされると分かった(煮物料理における落としぶたのような存在).さらに,脳原基での役割がまだよく分かっていないミクログリアに関して,脳室帯付近における振る舞いとそのしくみの一端を明らかにした(Genes CellsおよびeNeuroに報告).これらにより,脳室帯についての理解が大いに増しつつある.地道に行なって来たイメージング,定量解析,力学的な試験などが集約されて大きな突破をいくつかの異なる切り口・対象において果たすことができた.こうした成果によって,新しい立ち位置・視点で残された課題に挑むことができる態勢が整いつつあると考えられ,最終年度の研究の進捗が大いに期待できる.脳室帯から発される放射状ファイバーは脳構造の支柱であるとともに,ニューロン移動のガイドに貢献することが知られる.このように「ニューロンを助ける」と知られてきた脳室帯由来ファイバーに対して胎生早期に誕生するニューロンが接線方向移動をすることで物理的な影響を及ぼし,放射状ファイバーの走行,ひいては大脳皮質形成,生後の領野マップ形成を下支えする可能性が生じてきた(昨年度,国際学会で部分的に発表)ので,イメージング,力学的シミュレーション,流れを止める・弱くする実験など,詰めの解析を行い,論文発表を目指す.大脳皮質を含む脳の形成とは,細胞の「生産」と「組み立て」からなる.人間社会のさまざまな製造・建築の現場では,組み立て工程のみならず,生産現場にも常に材料および産物の適切な「動き」が求められる.本研究「脳室帯のシステム科学的研究」は,脳細胞産生の場である「脳室帯」が,性質や「齢」の異なる細胞群によって一種の「生態系」あるいは「社会」として構成されていることに注目し,大脳皮質細胞の「生産ライン」群がどのような近隣関係性をもって三次元的にパックされ,効率的細胞供給が果たされているか明らかにすることをめざす.H28年度は,まず,神経上皮・脳室帯の細胞の突起の先端部分が接着的に束ねられることで成立している「apical面」付近に注目した.この箇所は,G2期に「ひとつ」としてやって来た核・細胞体が細胞分裂の結果生じた「ふたつ」として狭苦しい群れのなかに突っ込んでいかねばならぬという「流れ増幅に起因するボトルネック」の問題を抱えるので,「クラウドダイナミクス」(ヒトや車の流れを制御し,活動の効率,安全,持続可能性などへの貢献をめざすとりくみ)の観点からは,鉄道車両の出入り口やプラットフォームなどに匹敵する相当な「危険箇所」であり,「出」への手厚い対策が求められる.こうしたリスク・交通難度に対して,細胞レベルのどのような巧みな工夫がなされているかという観点でイメージングを中心とする解析を進めた結果,分裂期の前駆細胞がアクトミオシンを用いて「丸くなる」・「2つに割れる」という力仕事(エネルギー消費的)を行なう際に周囲(側方)の空間に対して,力学エネルギーが「預け」られ,それが「その前駆細胞から生じる2つの子細胞」に戻って来る(したがって親から子への,近所の助けを借りながらの力学的エネルギーの相続)可能性が浮上した.これまでに,神経前駆細胞がbasal面までつながる長い形態をしたままで分裂し,basal突起(ファイバー構造)を丸ごと,2つの娘細胞のうち片方に(一子相伝的に)譲り渡すことにより,ファイバーを相続した娘細胞の核・細胞体が,非相続の娘細胞のそれよりも素早くapical面付近から出て行くことが分かっていたが,それ以外に集団的な動きの効率化につながる「妙案」の読み解きはできていなかった.今回,可能性を見いだした「組織弾性を利用した省エネ的細胞運動」は,脳形成の過程に秘められた巧みさのひとつとして大いに注目される.大脳皮質細胞の「生産ライン」群がどのような近隣関係性をもって三次元的にパックされ,効率的細胞供給が果たされているか明らかにすることをめざす本研究は,全細胞の動態観察,力学的要因の関与を考慮した核移動と脳室面離脱の分子機構解析,数理シミュレーションによる「バーチャル脳室帯」作成などを通じ解析を行なってきた.従来研究で「生理的な混雑」の状態にある脳室帯という細胞産生の場において,わずかな移動遅滞が全体に悪影響を及ぼすことが分かっていた.本年度,その点に関連する論文をさらに発表した.

一方,集団がそうしたリスクを抱えながらも「混雑」を享受することに何かポジティブな意味がありはしないかとの発想のもと,神経前駆細胞の集団が,生理的レベルの混雑をうまく利用して「組織弾性」を生じさせていること,そして,分裂期の前駆細胞が膨らもうとする際に,弾力に富む周囲を押し,力学的エネルギーがいったん蓄えられること,そして,親細胞の分裂によって誕生した子細胞に対して,その「親が膨らむ時に周囲に預けた力学的エネルギー」が戻って来て,子細胞の速やかな旅立ちに役立つことを見いだした(論文を投稿し,受理された[印刷中]).これは,見事な「省エネ」戦略ととらえることができる.似た「省エネ」は,心臓の吐き出した血液が大動脈の壁の弾性で受動的に先送りされる例,足の裏をアーチ型に支える靱帯が筋肉を使った運動の最中に蓄えた力学的エネルギーを走行やジャンプのために活用する例などに認められる.人の社会で,大都市の機能が交通や物流の効率化に支えられて成立してることに表れるように,本研究で明らかになったような「省エネ」の積み重ねは,大きなヒトの大脳を生み出す細胞生産を物流の点で下支えしている可能性がある.マウスを用いた本研究の成果は,ヒトの大脳形成を支える原理の解明,先天性疾患の病因解明などにもつながると期待される.大脳皮質を含む脳の形成とは,細胞の「生産」と「組み立て」からなる.人間社会のさまざまな製造・建築の現場では,組み立て工程のみならず,生産現場にも常に材料および産物の適切な「動き」が求められる.しかし,大脳皮質細胞の「生産ライン」群がどのような近隣関係性をもって三次元的にパックされ,効率的細胞供給が果たされているか全く分かっていなかった.本研究のこれまでの取り組みは,脳室帯における生産と物流を結ぶ効率的システムの一端を明らかにすることができた.ヒトの大脳形成を支える原理の一端,組織形成上の脆弱点,先天性疾患の病因などを理解するための基盤形成を達成し得た.本研究「脳室帯のシステム科学的研究」は,脳細胞産生の場である「脳室帯」が異なる細胞群によって一種の「生態系」あるいは「社会」として構成されていることに注目し,大脳皮質細胞の「生産ライン」群がどのような近隣関係性をもって三次元的にパックされ,効率的細胞供給が果たされているか,マウスおよび他哺乳類を対象に明らかにすることで,大脳形成を支える原理,組織形成上の脆弱点,ヒトの先天性疾患の病因などを理解できるようになるとの期待のもと実施されている.平成30年度は,これまでの成果を複数の論文として発表した.まず,新しく誕生した細胞が脳室面から速やかに立ち去り,次の細胞産生すなわち前駆細胞による分裂の邪魔にならないようにするために,弾性が利用されていることを見いだした.この弾性は,細胞の密集性により成立している.親細胞が分裂のため膨らむ際に周囲を押し,そこにいったん蓄えられた弾性エネルギーが,親細胞の分裂の直後に子細胞に戻ってきてその初動が助けられるという受動的な機構である(PLOS Biologyに報告).次に,そのような細胞密集による組織の弾性・圧縮性が一定の範囲内に限定されることに重要な意味がある(さもないと細胞づくりがうまく進まない)と見いだした(Developmentに報告).「限定」は,分化途上の細胞がお互いに絡み合ってバリア構造を作ることで果たされると分かった(煮物料理における落としぶたのような存在).
ポリアミン輸送系並びにNMDA受容体の構造活性相関に関する分子生物学的研究

1.酵母のポリアミン輸送系について解析した。1)ポリアミン輸送タンパク質TPO1が細胞膜に存在し、ポリアミンを排出すること、及び、細胞質側に存在する3個のSer/Thr残基のリン酸化により、輸送活性や細胞膜への移行が調節されていること、また、これらのアミノ酸残基はprotein kinase C、casein kinase 1及びcAMP-dependent protein kinase 1 & 2によりリン酸化されることを明らかにした。2)YKL174c遺伝子のコードするTPO5タンパク質がpost-Golgi小胞に存在し、ポリアミン排出活性を有すること、及び、この過程にはendocytosisとexocytosisが関わることを明らかにした。3)細胞膜に存在する尿素輸送蛋白質DUR3とS-adenosylmethionine輸送蛋白質SAM3がポリアミンに特異性の高い輸送蛋白質であることを見出した。2.神経可塑性に重要な役割を果たすNMDA(N-methyl-D-aspartate)受容体の新しいチャネルブロッカーとして、アントラキノンスペルミジン(AQ34)誘導体を見出した。さらにAQ34のAQ部分がチャネルの最も狭い部分と結合し、スペルミジンtailは細胞質側に位置することを明らかにした。また、NMDA受容体のN末端領域にはポリアミン等種々の調節物質が結合してNMDA受容体活性調節を行う調節領域(R-domain)が存在する。NMDA受容体サブユニットNR1、NR2A、及びNR2Eの3種のR-domain蛋白質(NR1-R, NR2A-R及びNR2B-R)を精製し、スペルミンとイフェンプロジルとの結合活性を検討した。その結果、スペルミンとイフェンプロジルのR-domain上の結合部位が異なることが示唆された。1)ポリアミン輸送タンパク質TPO1が細胞膜に存在し、ポリアミンを排出すること、及び、細胞質側に存在する3個のSer/Thr残基のリン酸化により、輸送活性や細胞膜への移行が調節されていること、また、これらのアミノ酸残基はprotein kinase C, casein kinase 1及びcAMP-dependent protein kinase 1&2によりリン酸化されることを明らかにした。2)アミノ酸輸送タンパク質Gaplpが細胞膜に存在し、プトレスシンとスペルミジンを細胞内に取り込むことを見出した。3)YKL174c遺伝子のコードするTPO5タンパク質がpost-Golgi小胞に存在し、ポリアミン排出活性を有すること、及び、この過程にはendocytosisとexocytosisが関わることを明らかにした。2.神経可塑性に重要な役割を果たすグルタミン酸受容体の1種であるNMDA(N-methyl-D-aspartate)受容体の新しいチャネルブロッカーとして、アントラキノンスペルミジン(AQ34)誘導体を同定した。AQ34はAMPA/Kainate受容体活性を阻害せず、NMDA受容体の特異的チャネルブロッカーであった。このAQ34を用いてNMDA受容体の構造を検討したところ、NR1(Asn616)とNR2B(Asn616)がチャネルの最も狭い部位に位置すること、並びにAQ34のAQの部分がこの最も狭い部分と結合し、スペルミジンtailは細胞質側に位置することが明らかとなった。1)ポリアミン輸送タンパク質TPO1が細胞膜に存在し、ポリアミンを排出すること、及び、細胞質側に存在する3個のSer/Thr残基のリン酸化により、輸送活性や細胞膜への移行が調節されていること、また、これらのアミノ酸残基はprotein kinase C、casein kinase 1及びcAMP-dependent protein kinase 1&2によりリン酸化されることを明らかにした。2)YKL174c遺伝子のコードするTPO5タンパク質がpost-Golgi小胞に存在し、ポリアミン排出活性を有すること、及び、この過程にはendocytosisとexccytosisが関わることを明らかにした。

3)細胞膜に存在する尿素輸送蛋白質DUR3とS-adenosylmethionine輸送蛋白質SAM3がポリアミンに特異性の高い輸送蛋白質であることを見出した。2.神経可塑性に重要な役割を果たすNMDA(N-methyl-D-aspatate)受容体は、そのN末端領域にポリアミン等種々の調節物質が結合してNMDA受容体活性調節を行う調節領域(R-domain)が存在する。NMDA受容体サブユニットNRI、NR2A、及びNR2Bの3種のR-domain蛋白質(NRI-R, NR2A-R及びNR2B-R)を精製し、スペルミンやイフェンプロジルとの結合活性を検討した。NR1-R, NR2A-R及びNR2B-Rとスペルミンは結合活性を示した。イフェンプロジルはNR1-R及びNR2B-Rとは結合したが、NR2A-Rとは結合しなかった。NR1-Rとスペルミンとの結合はイフェンプロジルによって阻害されず、また、NR1-Rとイフェンプロジルとの結合もスペルミンにより阻害されなかったことから、R-domain上の結合部位が異なることが示唆された。
中世社会と童子の研究

1、古代における筑波山の信仰のあり方について明らかにした論文「筑波山と歌垣」(今井雅晴編『日本文化と神道』筑波大学日本語・日本文化学類、2003年10月)を出した。本論文を執筆するにあたっては、筑波山や筑波山神社て調査を行なった。2、平安時代から鎌倉時代にかけての熊野参詣の実態について論じた論文「熊野参詣における王子社への信仰」(今井雅晴編『日本文化と神道』筑波大学日本語・日本文化学類、2003年10月)を出した。本論文では、熊野の王子社がいかなる意味を持っていたのかという点について明らかにした。3、2003年10月に金沢学院大学で行なわれた日本古文書学会第36回大会で、「熊野牛王宝印への信仰」という題で研究発表を行なった。熊野で頒布された牛王宝印がいかにして成立し、どのような意味を持たされていたのかを明らかにした。本発表に基づいた論文を執筆中であり、近日中に日本古文書学会の機関誌『古文書研究』に投稿する予定である。4、古代から中世にかけての護法童子信仰について輪じた著書『護法童子信仰の研究』(自照社出版、2003年10月)を出版した。本書では、現在までほとんど着目されてこなかった護法童子への信仰の成立から展開までを時代をおって明確にした。また本書では、各地への調査をもとに、様々な新出史料の紹介もした。5、親鸞の他力念仏と門弟の信仰の実態について論究した論文「親鸞の他力念仏と門弟の信仰」(『日本歴史』第666号、2003年11月)を出した。先行研究では、親鸞の信仰と門弟の信仰がかけ離れているものであることばかりが強調されてきた。しかし親鸞の信仰は、必ずしも一貫したものではなく、門弟の信仰と似通っている部分も多いのである。この点について本論文では論究し、明らかにした。
超高輝度特性を有する電界放出型液体リチウム電子源の長寿命化

平成9年度の液体窒素を用いた液体リチウムコーンの急冷凍結による長寿命化の検討に引き続き、平成10年度はリチウムの蒸発に応じたその場蒸着による長寿命化(逐次蒸着法)の検討を行った。この方法は、蒸発によるリチウムの減少に伴い、コーンから放出される全電流も減少することがこれまでに判明しているため、放出電流を常時モニターし、電流減少に応じて動作中のタングステン陰極側面にリチウムをその場蒸着するものである。今回、リチウム蒸着をシーケンシャルに自動で行うための制御電源を新たに試作し、これを用いて実験を行った。その結果、初期放出電流が200μAで、蒸着開始および終了する放出電流をそれぞれ、170μAおよび180μAに設定したところ、蒸着源の熱的慣性で多少の応答遅れが見られたものの、約4分毎に首尾よく蒸着を繰り返し、10時間以上電流放出が継続した。電流放出中に観測された電子放出パターンは、リチウムコーンが形成されていることを示す円形の輝点であり、その場蒸着中でもその位置やサイズ、および明るさの強度には変化が見られなかった。これらの実験結果から、逐次蒸着法は、電界放出型液体リチウム電子源の長寿命化に適した方法であると思われる。次に、残留ガス圧に対する放出電流の安定性を調べるために、液体リチウム電子源動作中の真空槽内に乾燥大気を導入し、真空度に対する電流変化を調べた。その結果、大気への暴露量が1ラングミュア(L=10^<-6>Torr・s)に達すると、放出電流は急激に不安定となることが判明した。後に、大気の主成分である窒素および酸素をそれぞれ導入したところ、窒素を導入した時にのみこの現象が見られる事から、コーン表面で窒化リチウムが1分子層程度形成され、表面が固化したことが原因と思われる。(投稿論文準備中)リチウムを蒸着したタングステン電界放出陰極の先端では、リチウムの融点以上の動作温度で強電界を印加すると、微小な液体リチウムのコーンがbuild-upしたファセット上に形成されることが我々の研究で明らかになっている。この微小コーンからは従来の高輝度電子源を凌駕する約20mA/srの放射角電流密度(dI/dΩ)を有した電子ビームが放出されるため、電子放出がコーン先端の極微小領域で生じることを考えると、これまでにない超高輝度特性を有すると期待できる。しかしその反面、蒸気圧の高いリチウムは電子放出に伴う熱により容易に蒸発するため、微小コーンの寿命は1回の蒸着に対して約10分1時間程度に制限されている。そこで本研究は、(1)液体窒素によるコーンの急冷凍結法、(2)リチウム蒸発に応じたその場蒸着法、の2つの方法を検討し、リチウムコーンの長寿命化を検討するものである。まず平成9年度は、液体窒素によるコーンの急冷凍結法を試みた。これは液体窒素が充填可能なコールドフィンガーにタングステン陰極を取り付け、リチウムを蒸着してコーンを形成させた後に液体窒素でコーン形状を保ったまま急冷凍結する方法である。電子放出に伴って発声した熱は、熱伝導性の高いリチウムを通して液体窒素で冷却されるために、リチウムの蒸発を抑制が期待できる。この結果、コーンは首尾よく凍結されたが、高い電流密度で電子放出が生じているサイトから選択的にリチウムは蒸発し、蒸発抑制が為されていないことが電界放出顕微鏡観察から明らかとなった。現在、リチウムの蒸発に応じたその場蒸着法の検討を行っている。(投稿論文準備中)
共分散構造分析による外国語としての英語における学習者要因総合モデルの構築

本年度は昨年度までに得られた全実験参加者にさらに最適と思われる方法で予測値を代入する方法により、サンプル数を増やすことによるデータ全体の再分析を行った。それにより、推定値を代入する前と比較して約5分の1程度の、従来は排除せざるを得なかった実験参加者をデータ内に取り込むことができた。しかし、最終的には、選択された最適モデル、及び、最適モデルにおける各パラメーターの推定値も、推定値代入以前のものと比べて、顕著な差は発見されず、各モデルの安定性を間接的に確認する結果となった。この結果、データにおける推定の要素を排除し、多重共線性やLinear Dependencyなど、最適モデルのさらなる改良の可能性を探究する上で、潜在的障害となる要素を減少させるため、最終的結果としては推定値代入以前のものを使用することとした。最終結果としては、提唱された検討された5つのモデルのうち、平等影響モデルとよぶ、学習者要因間に全て平等な相関リンクを認めるモデルが、他のモデル、特に、Krashenのモニター理論に基づいて、モニターをフォーマルが学習によって生まれる従属因子であるとするモデル群より、データに対して有意によい適合度を示した。これにより、学習者要因では、習得と学習の関係について、両者の間の関連を認めるインターフェース理論を支持する結果となった。また、モニターと他の要因、とりわけ、インフォーマルインプットの間の強い結合から、これまで提唱されたことがなかった、モニターからインプットへという、逆インターフェースの存在の可能性を示唆することとなった。本研究の目的は第二言語能力と個人特性の関係を、多変量解析の中で最も進んだ手法の一つである共分散構造解析を用いて、これまでの諸理論を構造方程式によりモデル化し、それらを直接比較することで、統計的な有意検定を通して、実証的に最適モデルの発見を目指すというものである。進捗状況に関して、当初の計画では本年度中にパイロットスタディ(予備調査)と調査の本体の両方を終える予定であった。しかし、実際には、予備調査のうち、被験者の背景を探る質問紙法による調査が、日本語に翻訳したことから生じた意味の微妙なずれにより、本調査に使用できないと判断される項目が全体のうち、10数%生じたため、本来の大規模な調査以前に、調査項目群を適正化する必要が生じた。また、当初予定していた標準テストが、予備研究の結果、やはり、予想される被験者群の平均レベルより、難度が高すぎ、被験者の多数が比較的低位に集中し、分散が小さくなり、信頼性係数が低くなってしまった。この点も、被験者の実情により近い、難易度をもつと思われる、別種の標準化テストに代えることとした。このように、予備調査の結果、本調査で、予定していなかった変更を余儀なくされることとなった分、次年度に計画がずれこんでいる。しかしながら、一方で、予備調査で得たデータを、共分散構造解析のモデルに持ち込んでみた部分については、個人特性と第二言語能力の関係の諸理論に関して、現在も有力な一つと考えられているKrashenのモニター仮説のモデルを、統計的有意差をもって排除することができた。さらに、筆者独自のモデルとして、個人特性からの間接的影響を表すパスが直接的影響を表すパスと同程度に重要であることを示唆する知見もえられた。今後は早急に、遭遇した測定の信頼性に関する問題を改善して、本来の実験に入る予定である。本研究の中心課題は多変量解析の分野で最も進んだ手法の一つの共分散構造解析とそれを実現するための最新のソフトであるEQSを用いて、第二言語能力の構成因子とその習得に関連する学習者要因を中心とした因子群のモデルについて、主要な2つの仮説を実証的に検証することであった。

そのうち、第一の仮説はモデル基準側の因子群である外国語能力の部分について、80年代から続いている単一能力説と複数能力説の対立を止揚し得るものとして、現在、理論的には、最も多くの人に受け入れられている多層複数能力説、つまり、最上層に一般第二言語能力(本研究では英語能力)、その下層に4技能、語彙力、社会言語学的能力などの個別能力が存在するという説であった。第二の仮説は、説明側の因子群の中で、情意因子群に関するGardner他の統合型学習意欲優位説と認知因子群に関する、Krashenのモニターモデルによるノンインターフェースモデルとを組み合わせた総合モデルの優位性であった。本年度は昨年度に行なった予備実験で見いだされた問題点、即ち、学習者要因の因子群用の観測変数の中の、セルフモニターの部分について、自己評価についての文化差によるアンケート項目の解釈と反応パターンの違いに留意して修正をほどこした上で、当初の予定より約30%小さい200名弱の大学レベルの実験参加者に対して本調査を行った。結果は本研究の2つの中心的仮説のうち、多層複数能力仮説はおおむね支持され、この点では理論的な定説が妥当であることが示唆された。他方、Gardnerに基づく統合型学習意欲優位の仮説とKrashen型のノンインターフェース仮説はいずれも支持されず、特に後者については、フォーマルなインストラクションとインフォーマルな接触、さらには、それらから生成される、明示的知識と暗示的知識の間には何らかのインタフェースの必要が示唆された。
Assessment of HDL levels and Risk of a First Myocardial Infarction Among Bangladeshi population: A comparison with the data of Japanese population

本研究はバングラデシュのACS患者738人を対象とした。ACS患者の52%が低HDLであり(男性45%、女性74%),都市部と農村部では差がなかった。低HDL罹患率はSTEMIで51%(男性46.9%、女性73%),非STEMIでは49%(男性39%、女性88%),ACSかつ不安定狭心症患者では52%(男性41%、女性73%)であることから女性のACS患者では低HDL罹患率が高いことが明らかになった。低HDLのACS患者の心筋トロポニン値は、正常HDL患者より高いことが明らかになった。狭心症の既往歴をもつACS患者は39%であったのに対し、心筋梗塞の既往歴をもつACS患者は25%であった。循環器内科学
萩藩徴租法の研究

1.県内所在の藩政史料のうち、とくに県文書館所蔵毛利家文庫の年貢・財政・検地に関する史料を調査し、必要なものを写真複写し、整理した。2.県内所在の村方史料のうち、年貢に関する史料を調査し、必要なものを写真複写し、整理した。3.萩藩徴租法について、幕藩制の諸段階とかかわらせて段階区分を試みているが、寛永末期と天明期に徴租法上の転換のあることを解明した。4.租率の決定から皆済・請払に至る手続のサイクルについて、とくに、春定-紙・皆済-紙・請払-紙の関連や、春定と検見との関連について、解明を進めた。5.萩藩検見法について、従来体系的理解が得られていないことにかんがみ、萩藩検見法を具体的に解明した。すなわち、春定と検見の関係,検見の範囲,見取と検見の関係,下見と上見の関係,例苅の仕方,早田・中田と晩田や、一毛作田と二毛作田によって租率や籾摺率の異なること,検見の計算式,検見法上のバリエーション,検見法の転換等を解明した。6.中国筋諸藩と萩藩の徴租法,とりわけ検見法の比較を行い、萩藩の検見法が、とりわけ細かくて厳しいことを解明した。7.36,とりわけ5・6を中心に、山口県地方史学会で研究発表を行い、それを「萩藩検見考序説」として、同学会誌上に公表した。8.検見法について、村方史料を用い、細かい数値を駆使しての実証的研究を現在進めているので、近い将来成果を公表する予定である。9.徴租法と関連して、萩藩の石高についての史料がある程度収集できたので、もう少し深く解明してみたい。
東アジア仏教電子辞典の開発

(1)2000年6月17日に、研究代表者は東洋学園大学で「オープンプラットフォム、オープンデータ、および電子化漢文資料の共有」学会を主催した。会議には日本から15名の研究者が参加した。また、クリスチャン・ウィッテアン氏は特別招待講演者として台湾から来日参加した。会議後に、辞典の更なる開発計画の為に、特別会合を行い、XML形式の為のガイドラインを作成し、また、データ入力を可能にする為の大学生と大学院生を従事させる計画立案を行った。(2)2000年7月1月までの研究期間では、スキャニング、OCR、およびデータ入力が大学院生と大学生によって行われた。約3,000の新しい語彙が辞典に追加され、現在、総語彙数は9,000にまで達している。(3)2001年1月に、マイケル・ベッドー教授(英国、リーズ大学)が新しいメンバーとしてプロジェクトに加わった。ベッドー氏は非常に卓越した技術を有するXMLプログラマーである。彼はXSL、Xlinking、およびPerlに基づいて辞典を検索する新しいシステムを作成した。我々の知る限り、ユニコード(UTF-8)漢字を用いたXMLデータを処理できる検索エンジンは、我々のシステムが世界初である。ベッドー氏と共に6週間研究を続け、我々はこの新しいシステムを完成させた。2001年3月以降、その新システムはインターネットで利用可能である。辞典はhttp://www.acmuller.netの新しいウェブサイトに掲載されている。現在、我々は将来に於ける更なる大規模な辞典作成の為に、研究努力を続けている。
枯草菌細胞内低分子RNAによる転写・翻訳制御ネットワーク解析

非翻訳型RNAの機能は多岐にわたり、生命活動にとって重要な機能を有している。本研究では、枯草菌の全塩基配列情報をもとに500塩基以上のスペース領域を抽出し、この領域を増幅するPCRプライマーを用いて新規非翻訳型RNAの探索と発現・機能解析を目的とした。LB培地で4時間培養した枯草菌から抽出した全RNAを、PCRで増幅したスペース領域に対応するプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行った。次に、発現が確認された領域については、より詳細な発現時期の解析を行った。一方、100500塩基の大きさのスペース領域配列については、RNAの構造形成に必要と予想される配列またはエネルギー安定性を考慮に入れ、コンピューター上で計算し、ゲノム配列から非翻訳型RNAと思われる領域を推定する手法を用いた。さらに、枯草菌の近縁Bacillus属3種のゲノム配列に対して相同性検索にかけ、非翻訳型のRNAが発現している領域を抽出した。これらの領域からの転写の可能性について解析した。500塩基以上のスペース領域123カ所に対して、ノーザンハイブリダイゼーションで解析した結果、8カ所のスペース領域(No.6、7、40、61、62、72、80、および101)においてRNAのバンドが検出された。このうち、胞子形成培地で生育させた菌体について行った発現解析では、No.61、62を除いた6カ所で、発現が確認できた。さらに詳細に、発現時期を解析した結果、No.6、40は対数増殖期のみ、No.101は対数増殖期胞子形成期、No.7、72、80は全ての生育ステージにおいて発現していた。枯草菌を胞子形成培地で培養したところ、対数増殖期、胞子形成期、および定常期のいずれにおいても、No.61、No.62に相当するバンドは検出されなかった。一方、100500塩基のスペース領域について、ノーザンハイブリダイゼーションを行った結果、No.126、129、130、131、135、136、138の7カ所で、RNAの発現を確認した。今回の研究により、枯草菌には非翻訳型RNAが少なくとも10種類存在することが明らかにした。さらに、500塩基以下のスペース領域の解析から、下流の遺伝子の発現を転写レベルで制御し得る低分子RNAの存在を明らかにしたが、その機能解明が期待される。本研究において、機能未知な非翻訳型RNAを明らかにすると同時に、RNAによる転写レベルでの遺伝子発現制御という新たな機構の可能性を発見した。
敗血症増悪化に関わる遊離ヘムによる消化管上皮バリア機能障害機構の解明

敗血症を誘発する各種炎症性腸疾患で見られる腸管出血が腸管上皮細胞のバリア機能へ及ぼす影響は不明だった。申請者はヒト結腸癌由来培養細胞を用いて、遊離ヘム濃度の増加がバリア機能の崩壊を起こすこと、さらにこの障害はヘム分解酵素の発現誘導によって抑制できることを明らかにしたが、ヘムによるバリア機能障害のメカニズムは不明である。本研究では、ヘムが様々なタンパク質に結合し、構造や機能を変化させることに着目し、ヘム結合性バリア構成タンパク質複合体の同定と、遊離ヘムがバリア機能障害を引き起こす分子メカニズムを解明することで、各種炎症性腸疾患誘発性敗血症の治療薬開発を目指した情報基盤を構築する。
TRF2依存性ORCリクルートによるテロメア維持機構の特異的変異体創出による解明

真核生物のゲノム複製は、複製開始点制御タンパク質ORCの染色体結合に依存して複製開始前複合体(pre-RC)が形成されることにより始まる。我々は、ORCとテロメア結合/保護因子TRF2が協調して、テロメアにpre-RCを形成する仕組みを解析してきた。本研究では、TRF2-ORC結合様式を詳細に解析し、その結合を特異的に欠損したTRF2変異体を創出し、ゲノム編集技術によってこの変異体置換型ヒト培養細胞株を樹立した。最終年度には、以下の表現型解析により、TRF2依存的ORCリクルートの阻害がテロメア恒常性・染色体安定性におよぼす影響を明らかにした。1.テロメアへのORC1結合量をChIP-qPCR法により評価した。その結果、TRF2変異体置換株においてORC1結合量がTRF2野生型置換株に比べて減少しており、TRF2-ORC1タンパク質間結合がテロメアへのORC1リクルートに重要であることが示された。2.上記置換株のテロメア長を測定した。その結果、ORC1リクルート阻害によるテロメア長への影響は認められなかった。3.上記置換株を複製ストレス誘導剤ヒドロキシウレアで処理し、テロメア配列を含む微小核の出現頻度を解析した。その結果、野生型置換株に比べてTRF2変異体置換株での出現頻度が有意に上昇していた。これは、テロメアのORC結合が複製ストレス下でのテロメアの堅牢な複製と染色体安定性に寄与するという仮説に一致する。また、本研究では、過剰発現によりTRF2-ORC1結合を競合的に阻害できるORC1フラグメントも作製した。これは、ゲノムワイドな複製活性を阻害しないことが示唆されたので、テロメアのORC結合を特異的に阻害することが期待できる。TRF2変異体を用いた研究の成果を相補することで、テロメア維持機構とその生物学的意義のさらなる解明につながると考えている。真核生物のゲノム複製は、複製開始点制御タンパク質ORCの染色体結合に依存してpre-RC (pre-replication complex:複製開始前複合体)が形成されることにより始まる。我々は、ORCとテロメア結合/保護因子TRF2が協調して、pre-RCをテロメアに形成する仕組みを解析してきた。本研究は、TRF2-ORCタンパク質の結合様式に焦点を当て、テロメアの複製開始制御機構および染色体安定性維持におけるその意義の解明を目的とする。本年度は、我々のこれまでの結果(Higa et al., BBA Mol. Cell Res. 1862, 191-201, 2017)に基づき、TRF2のTRFHドメイン内でORC結合への関与が予想される複数のアミノ酸を置換した変異型タンパク質をいくつか作製した。それらの機能解析の結果、ORCリクルート活性を著しく欠損した変異型TRF2を得ることができた。この変異体では、テロメア保護に重要なホモ二量体の形成、シェルタリン因子Rap1との結合、および末端維持に関連する他のTRF2結合蛋白質(RTEL1とApollo)との結合は妨げられていないことを確かめた。以上の結果から、ORC結合特異的な欠損を持つ機能分離型TRF2変異体(ORCリクルートはできないがテロメア結合/保護能は保持するTRF2)の有力候補が作製できたと考えている。現在は、計画通り、変異体置換型ヒト培養細胞株の樹立を進めている。次年度には、本細胞株での表現型解析を行う。また、TRF2変異体での解析を相補するために、ORC1側のTRF2結合に必要なドメインの決定にも取り組んだ。結合に必要十分な領域を既に186アミノ酸まで絞り込んでいる。今後、さらに絞り込み、TRF2-ORC相互作用の詳細を明らかにするとともに、ORC1の特異的欠損変異体を探索する。現在までの主な成果は、下記の4点である。当初の計画から前後した部分はあるが、概ね順調である。(1) ORCとの相互作用にのみ欠損がある特異的変異型TRF2タンパク質の探索を目的として、TRF2TRFHドメインにおいてTRF1に保存されておらず、タンパク質表面にあるが二量体の接触面ではないアミノ酸をいくつかアラニンと置換した。その結果、ORCリクルート活性が著しく低下した変異型TRF2を得た。本研究では、変異型TRF2がORCリクルート以外の機能は保持することが重要である。そこで、ホモ二量体の形成や他のTRF2結合蛋白質との結合が妨げられていないことを免役沈降法等により確かめた。(2) ORC結合特異的欠損型TRF2変異体置換細胞株の樹立を、複数種の細胞において進めた。HeLa細胞では、CRISPR/Cas9を用いて野生型遺伝子破壊ならびに変異遺伝子導入を行った。現在、得られた細胞クローンについて、変異の確認を進めている。また、HCT116細胞およびHFF2/T細胞では、CRISPR/Cas9あるいはレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入により変異体安定発現細胞株を樹立した。これらについて、今後、内在性TRF2をRNAi法で抑制することにより変異体置換細胞を作製する予定である。(3) ORC1側のTRF2結合に必要なドメインの解析に着手した。計画当初は、理想的TRF2変異体が得られない場合の回避策として位置付けていたが、ORC1側の特異的欠損型変異体の探索は、TRF2-ORC結合様式の解明に加え、TRF2変異体置換細胞の解析結果を相補することによって本研究の精度を高めうると考えている。