hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ステロイド生合成酵素を標的とする生物活性天然物の探索研究

前年度までに3'及び5'RACE法により、2,196bpのORFをもち83kDaに相当する723個のアミノ酸配列をコードヒトする由来ラノステロール合成酵素のcDNA塩基配列を得ているが、これは部分長のフラグメントを繋ぎ合わせて得た配列であり、繋がった全長クローンではなく、本年度はまず、全長クローンを得ることから始めた。ラットの場合と全く同様の手法で、ヒトのラノステロール合成酵素のN末及びC末のアミノ酸配列に対応するオリゴDNA(H-Human、Human-B)を合成し、市販のヒト肝臓RNAから逆転写して得たcDNAプールを鋳型にPCRを行ったが、ラットの場合とは異なり、容易に全長クローンを得ることができなかった。そこで、802番目に位置するSacIサイトを挟んで2つのプライマー(467A、254S)を合成し、H-Humanと467A、254SとHuman-Bのプライマーの組み合わせによるPCRを行い2つのDNA断片を得、SacIで消化後繋ぎ合わせ全長クローンを得た。酵母発現ベクターpYES2に組み込み、酵母のラノステロール合成酵素欠損変異株を形質転換し、その欠損の相補を確認した。また、トリチウム標識したオキシドスクアレンを基質にして酵素活性を調べ、このクローンを導入した酵母のホモジェネートにラノステロール合成酵素活性を確認した。今後、ヒト由来ラノステロール合成酵素の選択的阻害剤のスクリーニングを展開するには、迅速かつ容易に阻害活性を調べるアッセイ系が必要であり、それには、酵母のラノステロール合成酵素欠損変異株を用いた系が最も有力なアッセイ系であると考え、現在、このアッセイの諸条件を検討している。ラット肝臓より精製したラノステロール合成酵素をリジルエンドペプチダーゼで消化し、11本のペプチドのアミノ酸配列の情報を得た。これらの配列と、他のグループによって報告されている2本のペプチドのアミノ酸配列の情報を基に、オリゴDNAを合成し、PCRを駆使することにより本酵素遺伝子のcDNAクローニングに成功した。得られたcDNAは2,669bpからなり、2,199bpのORF(推定分子量83kDa)を持っていた。このcDNAを酵母の発現ベクターに組み込み、ラノステロール合成酵素遺伝子を欠損した酵母に導入した。このcDNAが組み込まれたラノステロール合成酵素遺伝子欠損酵母は、エルゴステロールを含まない合成最小培地で生育できるようになり、得られたcDNAはラノステロール合成酵素遺伝子欠損を補完した。また、酵母の野生株に導入し形質転換した野生株のホモジェネートに通常の5倍のラノステロール合成酵素を検出した。以上のことから、得られたクローンはラノステロール合成酵素をコードしている遺伝子であると断定した。医薬品の開発においてはヒトの酵素を標的としたほうが好ましい、と考え、次にヒトのラノステロール合成酵素のクローニングを行った。ラットのラノステロール合成酵素のアミノ酸配列と今までに報告されているオキシドスクアレン閉環酵素のアミノ酸配列を比較すると非常に相同性の高い領域が複数個所存在しており、これらの領域を利用してPCR法でクローニングを行った。最終的に、3′及び5′RACE法により全長に対応する塩基配列を得た。得られた塩基配列からヒト由来ラノステロール合成酵素のcDNAは、2,196bpのORFをもち83kDaに相当する723個のアミノ酸配列をコードしていた。

ラットの場合と全く同様の手法で、ヒトのラノステロール合成酵素のN末及びC末のアミノ酸配列に対応するオリゴDNA(H-Human、Human-B)を合成し、市販のヒト肝臓RNAから逆転写して得たcDNAプールを鋳型にPCRを行ったが、ラットの場合とは異なり、容易に全長クローンナを得ることができなかった。そこで、802番目に位置するSacIサイトを挟んで2つのプライマー(467A、254S)を合成し、H-Humanと467A、254SとHuman-Bのプライマーの組み合わせによるPCRを行い2つのDNA断片を得、SacIで消化後繋ぎ合わせ全長クローンを得た。酵母発現ベクターpYES2に組み込み、酵母のラノステロール合成酵素欠損変異株を形質転換し、その欠損の相補を確認した。また、トリチウム標識したオキシドスクアレンを基質にして酵素活性を調べ、このクローンを導入した酵母のホモジェネートにラノステロール合成酵素活性を確認した。今後、ヒト由来ラノステロール合成酵素の選択的阻害剤のスクリーニングを展開するには、迅速かつ容易に阻害活性を調べるアッセイ系であり、それには、酵母のラノステロール合成酵素欠損変異株を用いた系が最も有力なアッセイ系であると考え、現在、このアッセイの条件を検討している。
海底資源揚鉱用エアリフトポンプ内の固気液三相流大規模数値計算

気相流量を変化させた様々な条件下でシミュレーションを実施し,安定にかつより効率良くレアアース泥水およびマンガン団塊粒子を揚鉱する方法について検討する.特に、泥と海水の割合の異なるレアアース泥水に対してシミュレーションを実施し、揚レアアース量を最大とする条件について調べる。また、同時に引き上げられるマンガン団塊粒子についても,固気液三相の流動形態を考慮した数値解析を実施することにより,安定で効率の良い手法について知見を得る。
学校施設複合化による教育効果の定量分析－効率的な教育環境の高度化を目指して－

本研究は、老朽化の進む学校施設の更新を行う際に、建設費・運営費の削減とともに施設の高機能化による教育の質の向上を図ることができる「学校施設の複合化」(学校施設と他の公共施設との合築・併設)を実施することについて、その効果を定量的に明らかにすることを目的とした。平成28年度分としては、「(1)文献調査によるデータの収集」「(2)国内先進事例の収集」「(3)海外先進事例の収集」を行い、分析の下地となる必要な情報を得て、データの整理を行った。本研究では、老朽化の進む学校施設の更新を行う際に、建設費・運営費の削減とともに施設の高機能化による教育の質の向上を図ることができる「学校施設の複合化」(学校施設と他の公共施設との合築・併設)を実施することについて、その効果を定量的に明らかにすることを目的としている。平成28年度分としては、「(1)文献調査によるデータの収集」「(2)国内先進事例の収集」「(3)海外先進事例の収集」を行った。(1)としては、学校施設の複合化の効果を金銭価値により算出するため、その効果の測定方法の特定や、その測定を行うために必要となる学校施設・その他公共施設の費用や需要に関するデータを収集した。(2)としては、学校施設の複合化を行っている地方公共団体のうち協力を得ることができた2自治体から、実際の学校についての運営体制や利用状況、料金設定、運営費、建設費等に関する情報収集を行った。また、施設管理者や設置者である教育委員会等へのインタビューにより、想定する費用・便益と、文献より得られたデータに不足や誤りがないか、適正性の検討を行った。(3)としては、協力を得ることができた韓国、デンマーク、オランダの3カ国の協力者から、各国の学校施設の複合化について、運営体制や利用状況、料金設定、運営費、建設費等に関する情報収集を行った。また、施設管理者等へのインタビューにより、想定する費用・便益の適正性の検討を行った。引き続き、これら(1)(3)から得られた情報・データを踏まえ、学校施設の複合化の効果について具体的な分析を進める。計画していた研究内容は、「(1)文献調査によるデータの収集」「(2)国内先進事例の収集」「(3)海外先進事例の収集」の3つである。(1)については効果の測定方法について文献により調査を行い、データの不足等がある場合にも数値を推定することにより結果を出すことができる方法をある程度特定することができた。また、(2)については、最もネックと思われた地方公共団体の協力が得られ、分析するに耐えうる費用等に関するデータを得ることができ、また、インタビュー調査により、現場の受け止めを知ることができたため、今後行う分析が容易になった。さらに、(3)としては海外の協力者の尽力により、複数の学校について調査することができ、多様な角度から日本の学校施設の複合化を考察することができた。以上、(1)(3)のどの項目の上でも、順調に研究が進んでいると評価できる。本研究では、老朽化の進む学校施設の更新を行う際に、建設費・運営費の削減とともに施設の高機能化による教育の質の向上を図ることができる「学校施設の複合化」(学校施設と他の公共施設との合築・併設)を実施することについて、その効果を定量的に明らかにすることを目的としており、平成28年度には、「(1)文献調査によるデータの収集」「(2)国内先進事例の収集」「(3)海外先進事例の収集」を行った。平成29年度は、これら(1)(3)により収集した情報・データを踏まえ分析を行った。具体的には、(1)によって特定した学校施設の複合化の効果を測定する手法として、市場価値がわからない公共サービスの価値を市場の類似的なサービスの価値で置き換えて推定する代替法と、サービスの需要曲線の変化から価値を推定する消費者余剰法を用いた。これらの手法により、(2)において得られた国内学校の事例のデータについて、具体的な数値を当てはめて費用・効果の関係を算出した。その際、データが不足している部分については(1)により得られた知見により数値を推定し、データの不足を補いながら進めた。結果として、学校施設の複合化を行った場合の建設費等については、公共サービスの質の向上効果により建物の耐用年数以内に回収可能であることがわかった。また、(3)により海外の学校施設の複合化事例について得られた情報をまとめ、国内事例と比較分析を行った。デンマークや韓国では学校施設と教材開発拠点を複合化して学校教育に直結する成果を出すという新たな潮流が見られ、また、オランダではワイドスクールというコンセプトの下、教育効果を強化する施策がとられており、これらの視点を取り入れることにより、日本における学校施設の複合化がさらに大きな教育的効果を生む可能性を示唆する結果となった。今後は、「(1)文献調査によるデータの収集」「(2)国内先進事例の収集」

「(3)海外先進事例の収集」の3つにより収集した情報・データを踏まえ、分析を進める。具体的には、(1)によって特定した学校施設の複合化の効果を測定する手法を用いて、(2)において得られた国内学校の事例について、具体的な数値を当てはめて費用・効果の関係を算出することとする。その際、データが不足している部分もあることが想定されるが、(1)の文献調査により得られた知見により数値を推定し、データの不足を補いながら進めることとする。また(3)により海外の学校について得られた情報をまとめ、国内事例と比較分析を行うことにより、日本における学校施設の複合化の国際的な位置づけや今後の展望等について考察することとする。29年度が最終年度であるため、記入しない。教育社会学29年度が最終年度であるため、記入しない。
スピン流分布を制御した磁壁移動型デバイス

スピン流分布を取り込んだマイクロマグネティックシミュレーションを用いて,磁性細線における磁壁電流駆動を研究した.その結果,面内磁化ナノワイヤにおける切り込み形状,パルス電流が閾値電流に及ぼす影響を明らかにした.また,垂直磁化ナノワイヤにおけるマルチビット転送を検討し,ナノワイヤメモリ実現のための新たな課題を明らかにした.スピン流分布を取り込んだマイクロマグネティックシミュレーションを用いて,磁性細線における磁壁電流駆動を研究した.その結果,面内磁化ナノワイヤにおける切り込み形状,パルス電流が閾値電流に及ぼす影響を明らかにした.また,垂直磁化ナノワイヤにおけるマルチビット転送を検討し,ナノワイヤメモリ実現のための新たな課題を明らかにした.今年度はスピン流分布を考慮した磁壁移動のシミュレーションを行うため,スピントルク及びスピントルクに対する非断熱項を取り入れたLandau-Lifshitz-Gilbert方程式を解くプログラムを整備した.磁壁移動型ストレージデバイスでは、ストレージのために磁壁をピン止めする必要があるが,スピン流分布を考慮した磁壁ピン止めの設計はなされていない.そのため,磁壁をピン止めするための切り込み形状及びそのサイズが電流駆動磁壁移動に及ぼす影響をシミュレートした.その結果,切り込みがある磁性体では電流の非一様分布が顕著であること,これに付随するスピン流の集中によって磁壁移動が系統的に理解できることを示した.また,切込みを中心に磁壁が振動する可能性を示唆し,その固有振動数が切込み形状によって制御できることを明らかにした.ナノ磁性体加工の可能性を調査研究した.はじめに,スパッタリング装置を用いた磁性膜の作成条件を検討し,所望の膜厚,磁気特性を得るためのスパッタ条件を整理した.また,スピン流分布を制御するためにはナノ磁性体を作製する必要があるが,ナノスケールの加工が簡易に出来る実験環境整備を行った.次年度以降,磁性体のナノ構造制御および磁壁移動実験に取り組む予定である.今年度は,ナノワイヤにおける磁壁移動の計算機シミュレーションを中心に研究を行った.ナノワイヤメモリの記録密度を向上させるための工夫として,ワイヤ端部に切り込みを入れた場合の磁壁移動を調べた.あわせて,スピン流が分布する系を調べるため,電流分布を考慮したマイクロマグネティックシミュレーション手法を提案した.その結果,切り込み部における電流集中及び磁壁幅の減少によって,スピントランスファートルクがワイヤ内で分布することが分かり,スピン流分布によって様々な磁壁モードが出現することを明らかにした.また,磁壁移動の閾値電流密度を低減するため,パルス電流が磁壁移動に及ぼす影響を調べたところ,切り込み固有の磁壁ピニングポテンシャルに対応する振動数のパルス電流を印加したときに磁壁移動に必要な閾値電流密度が低減されることがわかった.現在,ナノワイヤメモリの記録密度を向上させるための具体的な構造検討を進めている.本デバイスを実現するための試料作製検討も併せて行った.紫外線硬化型樹脂を用いた微細パターンプロセスを検討し, 100nm程度の微細パターン形成が可能であるとの見通しを得た.今後,磁性細線の加工とともに,細線幅を変えた系統的な試料作製を行い,シミュレーションで得た結果を実験的に実証する予定である.今年度は,ナノワイヤにおける磁壁移動の計算機シミュレーションを中心に研究を行った.ナノワイヤメモリの記録密度を向上させるための工夫として,ワイヤ端部に切り込みを入れた場合の磁壁移動を調べた.あわせて,スピン流が分布する系を調べるため,電流分布を考慮したマイクロマグネティックシミュレーション手法を提案した.その結果,切り込み部における雷流集中及び磁壁幅の減少によって,スピントランスファートルクがワイヤ内で分布することが分かり,スピン流分布によって様々な磁壁モードが出現することを明らかにした.また,磁壁移動の閾値電流密度を低減するため,パルス電流が磁壁移動に及ぼす影響を調べたところ,切り込み固有の磁壁ピニングポテンシャルに対応する振動数のパルス電流を印加したときに磁壁移動に必要な閾値電流密度が低減されることがわかった.現在,ナノワイヤメモリの記録密度を向上させるための具体的な構造検討を進めている.本デバイスを実現するための試料作製検討も併せて行った.紫外線硬化型樹脂を用いた微細パターンプロセスを検討し,100nm程度の微細パターン形成が可能であるとの見通しを得た.今後,磁性細線の加工とともに,細線幅を変えた系統的な試料作製を行い,シミュレーションで得た結果を実験的に実証する予定である.
本態性高血圧症の発症、進展に関与する遺伝因子の解明

多因子遺伝性疾患である本体性高血圧の成因、進展に関与する遺伝因子の解明のため、多数試料の収集および大規模SNPs解析を行った。大阪大学を中心とするH研究では、サイアザイド感受性NaCl遺伝子多型が日本人女性の高血圧易発症性や利尿薬感受性を変化させることを明らかにしたのをはじめ、アディポネクチン、β2運伝子多型が内蔵肥満や高血圧リスクと密接に関連することを解明した。S研究、O研究など大規模遺伝疫学研究の解析結果から、αアデュシン、アルドスデロン合成酵素、G蛋白β3サブユニット遺伝子など食塩感受性リスクアレル頻度が日本人で高いことを示した。家庭血圧の詳細なデータを有するO研究では、アンジオテンシノーゲン遺伝子多型がnon-dipper型血圧日内変動や無症候性脳梗塞リスクが高め、eNOS多型が高齢者認知機能障害に、エンドセリン1遺伝子多型が肥満高血圧リスクになることを明らかにした。都市部一般集団のS研究では、アポリポ蛋白Eのε4アレルが若年者では高血圧抵抗性にはたらくことや、MTHFR遺伝子多型が女性高血圧易発症性と喫煙感受性を高めることが示された。これら個別研究はもとより、高血圧部会の共通解析試料として、A研究の一般集団5700名をはじめ、1万人を加える対象者から遺伝子解析研究のインフォームドコンセントを受理し、採血に成功したことも、本プロジェクト推進の原動力となった。詳細な表現型との関連解析から、環境因子に対する応答性の異なるSNPsが複数明らかになり、遺伝子多型に応じたテーラーメイド医療の可能性が示されたことは本研究の最大の成果と言える。S, O, TS, A研究はいずれも数千人規模の大規模コホート研究であり、本研究の解析成果は、今後の疫学的指標の変化(死亡率、発症率など)との関連解析にも役立つ。我が国には約3000万人の本態性高血圧症患者が存在するが、原因不明の本疾患に対しては、血圧値のみを指標とした対症療法が行われているに過ぎず、降圧療法による合併症予防効果は既に限界に達している。本研究では、遺伝型と表現型の関連を検討するassociation studyの手法を用いて、SNPsの意義を多角的に検討する試みを行った。対象者として、大阪大学医学部附属病院および関連病院に通院あるいは入院中の患者と、I県O町で実施されている農村部大規模コホート研究の参加者を選んだ。研究計画書はそれぞれ大阪大学倫理委員会、東北大学倫理委員会の承認を得た上で、対象者から文書によるインフォームドコンセントを得て実施した。阪大研究では、高齢者における肺炎発症に、ACE (angiotensin converting enzyme)遺伝子のDD型がリスクとなる(オッズ比=2.9倍,vs ID+II)ことや、レニン遺伝子多型は関連がないことが示された。O研究では、エンドセリン1遺伝子多型が肥満者のみで高血圧のリスクとなることや、アルドステロン合成酵素や24時間ABPMや夜間降圧に関与することを示した。一方、ミレニアムプロジェクト高血圧部会への検体供給を行うべく、3省庁合同のガイドラインに沿った研究計画書、共同研究体制を確立し、平成13年11月16日付けでヒトゲノム研究の承認を得たのち、検体収集を開始し、高血圧患者70名、正常血圧者50名の収集を完了している。ゲノム医科学の高血圧部会では、高血圧診断基準を揃えた上で、検体および基本的情報を集約し、多型解析センター等を活用することによるゲノムスクリーニングを実施している。本研究では、重症高血圧および高齢正常血圧(ケース・コントロール)の10万SNPs,3万マイクロサテライトマーカーを検討し、日本人高血圧感受性遺伝子を同定することを目指しており、本年度は3省庁合同ヒトゲノム解析倫理指針に基づいた検体の収集に専念した結果、部会内で最大の検体数を新たに収集した。

本施設から提供されたDNAはゲノムスクリーニングに堪えうる十分な量を確保しているため、他施設と異なり、SNPsとマイクロサテライトに同じ検体を提供できた点が特筆すべき箇所と考える。一方、東北地方農村部における大規模前向き研究(0研究)では、家庭血圧と24時間血圧測定が数千人規模で実施され、血圧に関する豊富な表現型が把握されている。高血圧感受性遺伝子同定のための新しいケース・コントロール研究の実施により、αアデュシン遺伝子多型が低レニン性高血圧リスクとなることを示したほか、キマーゼ遺伝子多型が血圧とは関連しないが末梢からのHDLコレステロール輸送に関連すること、0研究ではACE/DDの影響は小さいことなども報告した。また、都市部一般住民における大規模前向き研究(S研究)では、アルツハイマー病や動脈硬化リスクとされるアポサポ蛋白Eのε4アリルが、若年者では高血圧に抑制的に働くことを示した。さらに、都市部地域集団において、一般住民とケース・コントロールを同時に収集する新たな遺伝疫学研究(A研究)の立ち上げに成功し、これまでに3000人以上の検体収集に成功した。ゲノム医科学・高血圧部会では、高血圧診断基準を揃えた上で、検体および基本的情報を集約し、多型解析センター等を活用することによるゲノムスクリーニングを実施している。本研究では、重症高血圧および高齢正常血圧(ケース・コントロール)の10万SNPs,3万マイクロサテライトマーカーを検討し、日本人高血圧感受性遺伝子を同定することを目指しており、本年度中に1次スクリーニングがほぼ終了した。さらに部会内共同研究を候補遺伝子アプローチで進め、case-control併せて1700名を越えるサンプルを用いて解析を進め、十数個の有意な関連を示す遺伝子を同定している。一方個別研究では、複数の大規模集団での解析結果を踏まえ、4つの代表的な食塩感受性遺伝子多型が日本人において全て高率に認められること(Hypertens Res)や、S研究において高ホモシスチン血症のリスクとなるMTHFR遺伝子多型が女性高血圧のリスクとなり、喫煙がさらに増悪因子となること(Stroke)、阪大研究において高血圧の重症度と相関を示す肝細胞増殖因子(HGF)が高血圧感受性を高めること(Hypertens Res)などに加え、0研究における24時間ABPMや家庭血圧とレニンーアンジオテンシン系遺伝子多型の細かい相関(Hypertens Res)について報告した。同時に進めているA研究では、本年度中に一般集団5700名以上、extreme case-controlを計550名以上の収集に成功し、現在鋭意DNA抽出作業を進めている。一方、メタボリックシンドロームの新しいマーカーとして尿酸に着目し、血圧や体重増加の予測因子として血清尿酸値上昇が重要であることを見いだし(Hypertension)、家族歴や各種遺伝因子との関連の検討を進めている。また、電解質の出納に関与するトランスポーターやアディポサイトカイン、G蛋白共役受容体の遺伝子解析も進められており、興味深い知見が集約されつつある。
核内RNP相分離構造体によるゲノム制御

長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)のうち一群のものは、核内で相分離構造体の誘導に必須の役割を持つ。lncRNAはゲノムの特定の位置で転写され、その場で機能分子として機能するため、ゲノム位置を規定する制御因子として重要な役割を担うと考えられる。しかし、このようなRNAにより誘導される相分離構造体を介した遺伝子発現や3次元ゲノム動態の制御機構は明らかになっていない。そこで、本研究ではNEAT1 lncRNAにより誘導される核内相分離RNP構造体パラスペックルをモデルにそのメカニズムの解明を目指す。
数珠状帯電粒子群による空間電荷密度の制御と人工雷放電

雷放電に代表される空間電荷放電の放電機構の解明を最終目的として、所定の電荷量に帯電させた金属帯電体群からの放電現象を観測、測定した。帯電体には、絶縁細線を介して数珠繋ぎした金属球体および金属楕円体を使用し、比較として金属棒および金属平板を使用した。数珠状粒子群の直径は25mmであり、長さ30cmの範囲内で粒子数を調節した。平行平板電極の一端に数珠状粒子群を接触させ、誘導帯電により電荷を与えた。個々の粒子の電荷量は電界の強さと粒子径に依存し、粒子1個あたり最大1nCであった。また、粒子間隔が粒子径よりも広ければ、粒子の電荷量は理論値とほぼ一致することを確認した。楕円状粒子を用いると、粒子表面の電界緩和によってより大きな電荷を粒子に与えることができた。これを約10mm間隔で格子状に配置して縦横約30cmの帯電体群を形成した。比較として長さ30cmの金属棒を5cm間隔で平面状に並べたもの、および縦横30cm金属平板を用いて帯電体を形成させた。これらの帯電体の総電荷量を所定の値に設定し、中心部に接地球電極を近づけて火花放電を起した。放電電流および放電電荷量の大きさは、接地電極の接近に伴う帯電体群の電荷配置に大きく依存した。帯電体が大きいほど、広い領域から電荷が集中するので、放電電荷量は大きくなった。また、周囲に接地体が存在すると、帯電体の電荷の一部が移動せず放電電荷量は低下することが判明した。さらに、火花放電が伸びた先の粒子の電荷量は、周囲の帯電体によって形成される電界によって放電後に周囲の帯電体と逆極性に帯電することが判明した。平板帯電体を用いた場合、火花電流波形に2つのピークが観測された。これは、放電中和の過程で電荷の再配置が起こっていることを示唆しており、今後も詳しく調べる必要がある。帯電粒子群による空間電荷雲と接地体との間で起こる空間電荷放電現象を解明するため,絶縁細線を介して所定の電荷を持つ帯電粒子を空間に固定した状態で放電を起こす方法について実験的に検討した。短径約5mm,長径約10mmの楕円体粒子を直径0.4mmの絶縁細線に固定し,平行平板電極間の下部接地電極に接触させることで誘導帯電させた。粒子の電荷量は平行平板電極間の電界に比例して増加し,0.8MV/mの電界下で1つの粒子に約1nCの電荷を与えることができた。1本の絶縁細線に20mm間隔で15個の粒子を固定し,それぞれに約1nCの電荷を与えた。これを15本用意して20mm間隔で並ベ,格子状に帯電粒子を分布させ,その中心部に直径19.6mmの接地球電極を近づけて放電を起こした。粒子の総帯電電荷量は約200nCである。比較のため,直径5mm長さ30cmの丸棒電極7本を4cm間隔で並べたものと一辺30cmの金属平板電極を約200nCに帯電させたものについても同様に,放電電流波形と放電電荷量を調べた。総帯電電荷量は同程度にもかかわらず,粒子の放電電荷量には大きな差異が現れた。小さい粒子が数多く分布する状態では放電電荷量が小さく,放電後の粒子の電荷量は放電前とは逆極性となることが判明した。これは,放電により帯電粒子と接地電極が導通するので,周囲の帯電粒子によって形成される電界によって帯電粒子と逆極性の電荷が誘起するためである。また,空間電荷雲と接地電極との間で起こる放電の大きさは周囲の接地体に大きく影響され,近くに接地体が存在する場合には放電電流および放電電荷量が大きく低下することを確認した。

平板帯電体を用いた場合、火花電流波形に2つのピークが観測された。これは、放電中和の過程で電荷の再配置が起こっていることを示唆しており、今後も詳しく調べる必要がある。
慢性MRSA感染創内異所性骨化現象の解明

最近我々は、難治性の慢性MRSA感染創内から骨様の石灰化組織の排出を認めた極めて稀な症例を経験し、現在もその治療に苦慮している。本患者は下顎骨骨切り咬合改善術を施行し、術後経過は良好であった。術後1年を経て口腔内の瘢痕修正術を施行したところ不幸にして感染を併発し、同創部からMRSAが検出された。種々の治療法も奏功せず、創部は徐々に悪化して骨髄炎を併発したために下顎骨区域切除術を余儀なくされた。その結果骨髄炎は緩解したものの、区域切除時の口腔内外の手術瘢痕から激痛を伴って骨様石灰化組織が排出する病態が出現し、MRSAも同時に検出された(本症例については、症例報告としてAsian journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.9(2):135-138に掲載した)。本病態解明のための今年度の研究では、すでに単離保存されている患者のMRSAを浮遊培養で増殖させ、その培養上清あるいは抽出された菌体内成分をラットの骨髄由来の線維芽細胞様の細胞に添加して反応を観察するという前年度までの研究内容の継続とラットの皮下あるいは筋肉内への反復投与による異所性骨化現象の観察、そして同成分を他の骨芽細胞系cell lineにin vitroで投与した場合の骨マーカーの発現の分析等を行った。その結果、骨芽細胞系cell line(MC3T3 El)においても骨髄由来の線維芽細胞様の細胞と同様に菌体外毒素あるいは菌1体内毒素の影響と思われる細胞の増殖抑制がみられ、同時にアルカリンフォスファターゼ活性の低下が観察された。また、MRSAの培養上清あるいは菌体内成分をラットの皮下あるいは筋肉内に反復注入しても本症例のような異所性の骨化現象を認めるには至らなかった。いままでの結果を総合すると、本症例における異所性骨化現象は、MRSAという外来性の要因で生じるのではなく、MRSAに対する患者側の細胞の反応の結果生じる可能性も示唆された。今後機会があれば、患者から細胞を採取、培養し、その細胞のMRSAに対する反応の様相について検討してみたい。その結果骨髄炎は緩解したものの、区域切除時の口腔内外の手術瘢痕から激痛を伴って骨様石灰化組織が排出する病態が出現し、MRSAも同時に検出された(本症例については、症例報告としてAsian Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vo.9(2):135-138に掲載した)。本研究ではこの病態を解明する目的で、すでに単離保存されている患者のMRSAを浮遊培養で増殖させ、その培養上清あるいは抽出された菌体内成分をラットの骨髄細胞を培養して得られる線維芽細胞様の細胞に添加して反応を観察した。その結果、菌体外毒素あるいは菌体内毒素の影響と思われる細胞の増殖抑制がみられ、同時にアルカリンフォスファターゼ活性の低下が観察された。また同じくMRSAの培養上清あるいは菌体内成分をラットの皮下あるいは筋肉内に1週間反復注入してその局所反応を観察したところ、炎症反応は生じるものの本症例のような異所性の骨化現象を認めるには至っていない。現在は、添加する菌体成分の濃度を変えて反応の違いを観察するとともに培養する細胞も違うものに変えたり、ラットへの注入実験については投与期間をもっと長期にする等の検討を加えている。

また、MRSAの培養上清あるいは菌体内成分をラットの皮下あるいは筋肉内に反復注入しても本症例のような異所性の骨化現象を認めるには至らなかった。いままでの結果を総合すると、本症例における異所性骨化現象は、MRSAという外来性の要因で生じるのではなく、MRSAに対する患者側の細胞の反応の結果生じる可能性も示唆された。今後機会があれば、患者から細胞を採取、培養し、その細胞のMRSAに対する反応の様相について検討してみたい。
金属とセラミックス界面の研究

金属とセラミックスの界面の物理的、化学的特性は、これらで作製されているデバイスの性能を決定することになり、デバイスがどれだけ最適化されるかを理解するには、この界面の綿密で詳細な解析が必要となる。本研究においては、窒化ケイ素とアルミニウムの界面におおいて熱と電場が同時に作用することによる物理的、化学的特性の変化を解析する。この目的のために純度の異なる窒化ケイ素を用意し、100nm程度のアルミニウム層を物理的な手法によりコートして界面を形成した。この界面をTEMにより観察した。界面においてアモルファス相が観察されたが、相互拡散は認められなかった。さらに、欠陥やツインは観察されず、今後の解析に適した清浄で緻密な界面を作製出来ていることを確認できた。一方、堆積したアルミニウムの組織粒径は約1μmと大きく、これらの組織粒にいくつかの転位が観察されたが、今後の試験には影響がないと考えられる。アルミニウムと窒化ケイ素の相互拡散を解析するには、大きいサイズの組織粒のアルミニウムは解析に適しており、さらに、窒化ケイ素の純度は堆積したアルミニウムの特性へ影響せず、純度の異なる窒化ケイ素のどちらも用いても今後の解析に良好な界面を得ることが可能であることを明らかにした。物理的手法での界面を作製することが可能であることが分かったので、同じ手法で作製した界面においてアルミニウムと窒化ケイ素が相互作用し始める温度を探索した。350°C、450°C、550°C、650°Cで24時間の真空熱処理を行なった。従来の研究からの予想どおり、相互作用した層はSEMの分解能では界面には見られなかったので、これらの試料ではTEM用試料を作製したので、今後観察をしていく。アルミニウムと窒化ケイ素の界面の形成に成功し、SEMによる観察により、SEMでの観察によりガラス相の生成を明らかにすることが出来ている。TEM観察用の作成にも着手しており、概ね研究計画通りに進捗している。今年度の実験により、物理的堆積手法による窒化ケイ素上へのアルミニウムの堆積は、清浄で解析に適した界面となっていることが明らかとなった。350°C、450°C、550°C、650°Cで24時間の真空熱処理を行なった試料に関して、TEM解析用の試料作製を進めている。次年度は、切断、研磨、ディンプル加工、およびイオンエッチングにより作製した試料でTEMでの制限視野回折、EDSとEELSでの組成分析を行う。これらの構造解析と組成分析によりアルミニウム金属と窒化ケイ素セラミックスの反応温度を明らかにする。これらの解析は、温度と電場を同時に印加した場合の金属ーセラミックス界面その場TEM観察の下準備ともなる。反応温度を明確にし、その温度で処理した試料をその場TEM観察に用いる。このその場観察用試料は、FIB加工により作製する予定である。TEM観察用試料において、界面での熱による挙動を検討するために、予備的な加熱時その場TEM観察を実施する。この時の観察でも制限視野回折、EDSとEELSでの組成分析を行う。加熱により物理的、化学的な変化が予想され、その場加熱TEM観察をさらに発展させて、加熱と電場印加の同時作用による影響の検討へと推進する予定である。これは、電場による金属ーセラミックス界面の制御が可能であるかどうかを解明するという、この研究課題の最終目標に向けて重要な知見となる。また、アルミニウムが溶融する前の界面での電気伝導性も確認する。

今年度の実験により、物理的堆積手法による窒化ケイ素上へのアルミニウムの堆積は、清浄で解析に適した界面となっていることが明らかとなった。350°C、450°C、550°C、650°Cで24時間の真空熱処理を行なった試料に関して、TEM解析用の試料作製を進めている。次年度は、切断、研磨、ディンプル加工、およびイオンエッチングにより作製した試料でTEMでの制限視野回折、EDSとEELSでの組成分析を行う。これらの構造解析と組成分析によりアルミニウム金属と窒化ケイ素セラミックスの反応温度を明らかにする。これらの解析は、温度と電場を同時に印加した場合の金属ーセラミックス界面その場TEM観察の下準備ともなる。反応温度を明確にし、その温度で処理した試料をその場TEM観察に用いる。このその場観察用試料は、FIB加工により作製する予定である。TEM観察用試料において、界面での熱による挙動を検討するために、予備的な加熱時その場TEM観察を実施する。この時の観察でも制限視野回折、EDSとEELSでの組成分析を行う。加熱により物理的、化学的な変化が予想され、その場加熱TEM観察をさらに発展させて、加熱と電場印加の同時作用による影響の検討へと推進する予定である。これは、電場による金属ーセラミックス界面の制御が可能であるかどうかを解明するという、この研究課題の最終目標に向けて重要な知見となる。また、アルミニウムが溶融する前の界面での電気伝導性も確認する。
フェムト秒放射光X線パルス源の要素技術開発

本研究では、物質の相転移や化学反応のダイナミウスを研究するための重要な要素技術である超短パルスレーザーと軟X線放射光パルスの精密な時間同期技術を確立し、それによって超高速時間分解軟X線分光実験を試み、本システムを用いた時間分解光電子分光実験装置の開発も行った。放射光源として使われている加速器内の電子ビームにフェムト秒レーザー光を照射すると100フェムト秒(femto second,10^<-15>sec)のパルス幅を持つ極めて輝度の高い光子エネルギー数100eV数1000eVのX線が発生する。本研究の目的は,この「レーザースライシング」現象を元にしてフェムト秒放射光X線パルス光源の立ち上げに必要な要素技術を確立する。そしてこの技術を国内の放射光施設に提供し,フェムト秒の時間幅で様々なX線分光,回折,発光,散乱測定が可能な研究環境を用意することである。本研究では「レーザースライシング」などのレーザーと放射光を組み合わせた高速時間分解X線分光測定に必要な要素技術の開発を行っている。そのため高速パルスのレーザーが必要不可欠である。昨年度は,本研究に不可欠な高速パルスのレーザーとして,超短パルスレーザー用ポンプレーザーと超短パルス(〈50fs)Ti:サファイアレーザーを本科学研究費補助金によって導入し,現有のパルスレーザーシステムも活用して,フェムト秒パルスレーザー発生システムを整備することができた。また,KEKの放射光源施設(フォトンファクトリー)のアンジュレータビームライン(BL-19)において光源加速器のRF信号に同期させて,レーザーパルスを発生させることにも成功した。レーザーと放射光を組み合わせた時間分解実験では(例えばポンプ-プローブ法)では両者のタイミングが最も重要である。昨年度はその実現のためにピエゾ素子を用いた自動同期回路とIQモジュレーターを利用した遅延回路を設計・開発を行った。さらに,Photon Factory蓄積リング内の電子を一定速度に保つRF空洞器の高周波発生源とレーザーの共振周波数との同期をコンピューター制御で自動に行わせることに成功した。本研究では「レーザースライシング」や「レーザーポンプ・軟X線プローブ法」など、レーザーと放射光を組み合わせた高速時間分解X線分光測定に必要な要素技術の開発を行っている。昨年度までにフェムト秒パルスレーザーシステムを立ち上げ、また放射光パルスとレーザーパルスのタイミングを高時間精度で合わせるIQモジュレーターを利用した遅延回路を完成させた。本年度はこれらを組み合わせて実際に放射光施設(Photon Factory)の軟X線ビームラインにて時間分解の実験を行った。実際の時間分解実験では、上記光源パルスだけなく信号検出とのタイミングも必須である。そのため、遅延回路を用いて半球型2次元電子分析器の検出器と両光源を同期させ、金属表面及びその分子吸着系の時間分解光電子分光測定を行った。また、光電子分光の測定時間精度をフェムト秒ピコ秒に上げるために、本年度はより高感度で応答時間の早いDelay iine detector検出器を導入し、さらに時間分解測定効率を上げるために飛行時間型のエネルギー分光を用いた電子分析器の設計を行った。本分析器は年度内に放射光施設(spring9-8)に設置され、来年度は我々のレーザーおよび放射光同期システムを組み合わせてより高度な時間分解光電子分光実験を行う。平成19および20年度は、放射光施設(フォトンファクトリー)の軟X線ビームラインで既存の電子分析器を用いて、レーザーと放射光のポンプ・プローブ法による時間分解光電子分光のテスト実験を行い、開発した測定システムのR&Dを行ってきた。平成21年度は、昨年度までに得たR&Dの成果をふまえて、高輝度放射光施設(スプリングエイト(SPring-8))に建設・整備した最高性能の高輝度軟X線ビームラインBL07LSUにレーザーシステムを移設し、より高い時間分解能と信号検出能力を持つ2次元角度分解飛行時間型電子分析器を本システムに繰り込んだ。その結果、システム全体の同期及び遅延時間の制御を10ピコ秒以下で行うことができた。また赤外可視光のフェムト秒レーザーパルスと軟X線放射光パルスを用いたポンプ・プローブ実験をBL07LSUで行い、半導体表面のキャリアダイナミクスを時間分解軟X線光電子分光測定で捉えることに成功した。本研究で開発した同期・遅延時間制御の要素技術では、時間誤差が放射光のパルス幅(約50ピコ秒)よりも十分小さいく、本研究が当初目指した目標は達成されたといえる。また本研究によって、世界に例のない新しい時間分解角度分解型軟X線光電子分光測定システムが初めて導入された。現在、本装置は全国共同利用実験に供されている。なお、本研究の成果の一部は、学会で発表され学会発表賞を受賞した。
超オイル細胞：カロテノイドと長鎖不飽和脂肪酸を大量生産する細胞工場の作出

栄養塩飢餓と強光ストレスで誘導される超オイル細胞を用いて、ω3に代表される機能性脂肪酸やカロテノイドなどの機能性物質を蓄積した細胞工場(クロレラ・ファクトリー)を作り出すことにある。超オイル細胞の代謝メカニズムも過酷なストレス存在下の細胞動態として研究対象であるが、細胞工場で製造するものの選別から始める。(1)トレボウクシア藻綱を中心にした網羅的な探索で長鎖不飽和脂肪酸とカロテノイドの潜在的な生産力を調べ、(2)長鎖不飽和脂肪酸の場合は、重イオンビーム照射株のなかからEPA(20:5)やDHA(22:6)など付加価値の高い特定の脂肪酸を生産する株を単離する。(3)カロテノイドの場合は、クロレラだけでなくヘマトコッカスも用いてアスタキサンチンをモデルに、強光誘導による特定カロテノイドの選択的産生が可能かを調べる。こうした誘導方法を超オイル細胞に実施することで、カロテノイドをはじめとする脂溶性物質の細胞工場を構築する。まず、トレボウクシア藻綱を中心に分子系統解析を実施することで、(A)トレボウクシア藻綱と緑色植物門の他の綱との関係も含め、カロテノイドと長鎖不飽和脂肪酸という視点で優良種あるいは株をスクリーニングしている。先行収集したトレボウクシア藻26種に関しては、パラクロレラのように偶数系の超長鎖不飽和脂肪酸に加え奇数系の超長鎖不飽和脂肪酸をもつ株や種の単離が可能か文献も含め調査することになっている。(B)重イオンビーム照射によるEPA(20:5)やDHA(22:6)などの特定脂肪酸株の単離が可能かを文献も含め調査する。(i)のシステイン要求性株の単離に加え、(ii)の他の含硫アミノ酸要求株の単離、(iii)S欠過感受性株あるいは非感受性株の単離に力を入れる。高度不飽和脂肪酸の微量アッセイ系を確立してスクリーニングのハイスループット化をはかる。今回の調査や実験は全て独立栄養条件下と同時に混合栄養と従属栄養条件下でも実施する。また、候補株に関しては、分取用液体クロマトグラフでの濃縮に加え、一次スクリーニングでTLC解析、二次スクリーニングでGC-MS解析できるようにすることを目標としている。パラクロレラでは超オイル細胞化とほぼ同時にカロテノイド組成の劇的変化が起こる。例えば、ルテインとゼアキサンチンだけで全カロテノイドの90%を占めるようにすることができる。トレボウクシア藻綱のさまざまな種と株で超オイル細胞を誘導し、カロテノイド合成を誘導するとカロテノイドの組成比をさまざまに変えることができるのか確かめる。まずはヘマトコッカスを含む狭義の緑藻とトレボウクシア藻綱含まれる82種の系統樹を作成し機能性優良株調査の指標とし82種を全て収集する方針でスクリーニングを開始している。狭義の緑藻としてヘマトコッカスに関しては27株、トレボウクシア藻綱に関しても目レベルで網羅的に26株をスクリーニング対象として、弱光と強光両方の独立栄養条件下でのカロテノイド蓄積量とオイルの蓄積量を調べている。完全には網羅されたいないが、ヘマトコッカスに関しては27株すべてでアスタキサンチン合成誘導後の蓄積量を調べたが株間で大きな差異があることがわかった。また、ラマン蛍光フローサイトメーターを用いたスクリーニングの可能性も調べている。超オイル細胞の誘導はこれまで独立栄養条件下の強光条件で実施していたが、今回は混合栄養と従属栄養条件下で光照射条件の緩和が認められないか確かめてる。炭素源としては廃糖蜜(モラセス)の利用も考えており、クロレラによるショ糖の取り込みを調べたが問題なく成長することがわかった。こうした試みよって光照射条件を緩和できれば著しいコストダウンが可能となる。トレボウクシア藻綱に狭義の緑藻を加え分子系統解析を実施することで、スクリーニング対象となった種や株の系統関係を理解しながら、以下の(A)と(B)の実施を目指している。カロテノイドの中でも特にアスタキサンチンに関してはラマン蛍光を利用したフローサイトメーターによるリアルタイム・スクリーニングの可能性もでてきている。(A)トレボウクシア藻綱と緑色植物門の他の綱との関係をカロテノイドと長鎖不飽和脂肪酸という視点でスクリーニングを実施する。先行収集したトレボウクシア藻26種に関しては、パラクロレラのように34:1や36:1といった偶数系の超長鎖不飽和脂肪酸に加え、45:1や47:1といった奇数系の超長鎖不飽和脂肪酸をもつ株や種とカロテノイドを文献も含め調査する。重イオンビームの核種(C, Ar, Feなど)とLETを最適化することも重要な課題である。重イオンビーム照射は高等植物では多くの実績があるが、微細藻類の場合どの核種が脂肪酸のバリエーションを効率よく生み出すかはまだ十分分析されていない。こうした点を解明することで、クロレラ類の高増殖性能と安全性を担保に、世界的にニーズの高い乳幼児向け粉ミルクを含め、機能性表示食品への利用を可能とする。本研究の最終目的は、(A)と(B)をメインテーマに、(1)長鎖不飽和脂肪酸とカロテノイドの潜在的な生産力を調べ、

(2)付加価値の高い特定の脂肪酸を生産する株を単離し、(3)クロレラだけでなくヘマトコッカスも用いて特定カロテノイドの選択的産生が可能かを調べることで、実用化のための実証実験を行うことにある。このためにはできるだけバイオリアクターに関する国内外の施設状況を詳しく調査研究する必要がある。栄養塩飢餓と強光ストレスで誘導される超オイル細胞を用いて、ω3に代表される機能性脂肪酸やカロテノイドなどの機能性物質を蓄積した細胞工場(クロレラ・ファクトリー)を作り出すことにある。超オイル細胞の代謝メカニズムも過酷なストレス存在下の細胞動態として研究対象であるが、細胞工場で製造するものの選別から始める。(1)トレボウクシア藻綱を中心にした網羅的な探索で長鎖不飽和脂肪酸とカロテノイドの潜在的な生産力を調べ、(2)長鎖不飽和脂肪酸の場合は、重イオンビーム照射株のなかからEPA(20:5)やDHA(22:6)など付加価値の高い特定の脂肪酸を生産する株を単離する。(3)カロテノイドの場合は、クロレラだけでなくヘマトコッカスも用いてアスタキサンチンをモデルに、強光誘導による特定カロテノイドの選択的産生が可能かを調べる。こうした誘導方法を超オイル細胞に実施することで、カロテノイドをはじめとする脂溶性物質の細胞工場を構築する。まず、トレボウクシア藻綱を中心に分子系統解析を実施することで、(A)トレボウクシア藻綱と緑色植物門の他の綱との関係も含め、カロテノイドと長鎖不飽和脂肪酸という視点で優良種あるいは株をスクリーニングしている。先行収集したトレボウクシア藻26種に関しては、パラクロレラのように偶数系の超長鎖不飽和脂肪酸に加え奇数系の超長鎖不飽和脂肪酸をもつ株や種の単離が可能か文献も含め調査することになっている。(B)重イオンビーム照射によるEPA(20:5)やDHA(22:6)などの特定脂肪酸株の単離が可能かを文献も含め調査する。(i)のシステイン要求性株の単離に加え、(ii)の他の含硫アミノ酸要求株の単離、(iii)S欠過感受性株あるいは非感受性株の単離に力を入れる。高度不飽和脂肪酸の微量アッセイ系を確立してスクリーニングのハイスループット化をはかる。今回の調査や実験は全て独立栄養条件下と同時に混合栄養と従属栄養条件下でも実施する。また、候補株に関しては、分取用液体クロマトグラフでの濃縮に加え、一次スクリーニングでTLC解析、二次スクリーニングでGC-MS解析できるようにすることを目標としている。パラクロレラでは超オイル細胞化とほぼ同時にカロテノイド組成の劇的変化が起こる。例えば、ルテインとゼアキサンチンだけで全カロテノイドの90%を占めるようにすることができる。トレボウクシア藻綱のさまざまな種と株で超オイル細胞を誘導し、カロテノイド合成を誘導するとカロテノイドの組成比をさまざまに変えることができるのか確かめる。まずはヘマトコッカスを含む狭義の緑藻とトレボウクシア藻綱含まれる82種の系統樹を作成し機能性優良株調査の指標とし82種を全て収集する方針でスクリーニングを開始している。狭義の緑藻としてヘマトコッカスに関しては27株、トレボウクシア藻綱に関しても目レベルで網羅的に26株をスクリーニング対象として、弱光と強光両方の独立栄養条件下でのカロテノイド蓄積量とオイルの蓄積量を調べている。完全には網羅されたいないが、ヘマトコッカスに関しては27株すべてでアスタキサンチン合成誘導後の蓄積量を調べたが株間で大きな差異があることがわかった。また、ラマン蛍光フローサイトメーターを用いたスクリーニングの可能性も調べている。
ミトコンドリアおよびミトコンドリアDNAの直接導入による細胞質雄性不稔性の研究

高等植物におけるオルガネラの形質転換の研究は分子育種への応用および分子細胞生物学の基礎の両面において興味ある課題である。高等植物オルガネラの形質転換の研究は世界的にみても緒についたばかりであるが、最近パ-ティクルガン法を用いたタバコ葉緑体の形質転換の成功例が報告され、本法がオルガネラ形質換研究に有力な方法であることが示された。他方、本法を用いた高等植物ミトコンドリアの形質転換例は未だ報告されていない。本研究はまず、パ-ティクルガン遺伝子導入装置を試作・開発し、さらに本装置を用いて高等植物ミトコンドリアの形質転換に敢えて挑戦したものである。結果的には未だ成功しなかったが、将来における本課題の研究の基礎を確立することが出来た。1.窒素ボンベ圧およびエア-ライフルの発射機構を利用した圧縮空気圧を駆動力とするパ-ティクルガン装置を開発した。窒素ボンベ圧式装置の最大加速圧力は25kg/cm^2であるが、圧縮空気圧式装置では220kg/cm^2以上(プロジェクタイルの最大初速度は440m/s以上)であり、パワ-は10倍近く高い。また,圧縮空気圧式装置では径5cm以上の試料面に展開した培養細胞あるいは組織片の細胞に遺伝子導入することが可能である。2.開発した空気圧式および窒素ガス式パ-ティクルガン装置を用いてイネ、コムギなどの単子葉およびタバコ、ダイズなどの双子葉植物の培養細胞および組織片において核の発現ベクタ-の遺伝子(GUSおよびLUS遺伝子)発現に成功した。3.また、タバコ培養細胞の形質転換体(NPTII遺伝子)の育成に成功した。さらに、シロイヌナズナの根組織に同遺伝子を導入し、カナマイシン耐性の植物体を得ることが出来きた。すなわち、本研究において開発したガス、空気圧式パ-ティクルガンを用いたトランスジェニックス細胞、植物の育成が可能であることが示された。本年度の研究において次の研究成果を挙げることが出来た。また、圧縮空気圧式装置では径5cm以上の試料面に展開した培養細胞あるいは組織片の細胞に遺伝子導入することが可能である。2.パ-ティクルガン法を用いて核の発現ベクタ-の遺伝子発現には成功した。すなわち、イネ、コムギなどの単子葉およびタバコ、ダイズなどの双子葉植物の培養細胞および組織片において核での発現ベクタ-のトランジェントな遺伝子(ベ-タグルクロニダ-ゼおよびホタルルシフェラ-ゼ遺伝子)発現およびタバコ培養細胞の形質転換体(ネオマイシンフォスフォトランスフェラ-ゼ遺伝子による)の育成には成功した。このことは本法により、遺伝子が細胞内へ確かに導入され、発現していることを示すものである。3.一方、ミトコンドリアおよびミトコンドリアDNAの精製についてはニコチアナ・グラウカおよびニコチアナ・ラングスドルフィ-について完了した。それらDNAの制限酵素パタ-ンの解析も完了しつつある。4.しかし、本研究の目的であるミトコンドリアの発現ベクタ-の遺伝子発現には未だ成功していない。

そこで、今後の研究において、まず、すでに本法により得られている形質転換体の核およびオルガネラ(ミトコンドリア)DNAのサザンハイブリダイゼ-ション分析を進め、外来遺伝子が核およびミトコンドリアゲノムに組み込まれていることを確かめる。また、トランジェントな発現に焦点をしぼり、本法によるミトコンドリアへの遺伝子導入が可能であることを明らかにする。本年度は昨年度試作・開発した圧縮空気圧を駆動力とするパ-ティクルガン装置を用い、シロイヌナズナ根を実験材料としてまず、遺伝子導入条件について詳細に検討した。さらに、その結果を用いてシロイヌナズナ根にNPTII遺伝子を導入し、トランスジェニック植物育成を目指して研究し、以下の成果を挙げることが出来た。1.GUS遺伝子の一過的遺伝子発現のアッセイ法を用い、シロイヌナズナ根への遺伝子導入におよぼす種々の条件の効果について研究した。その結果、最適遺伝子導入条件(前培養=3-4日、金粒子濃度=プロジェクタイル当り0.4mg、ショット回数=3回、加速圧力=200kg/cm^2)により、遺伝子を発現した細胞からなる青色スポット数がシャ-レ当り約5000個になった。この数は条件の詳細な検討前に比べ約20倍の数である。2.シロイヌナズナ根からの植物体育成条件を検討した。その結果、根組織を4ー5日間カルス誘導培地(0.5ppm2,4ーDおよび0.05ppmカイネチンを含む)に置床した後、茎葉形成培地(5ppmゼアチンを含む)に置床するとによりシャ-レ当り、約1000本の茎葉が再分化する条件が見いだされた。3.次に、トランスジェニック植物の選抜に用いるネオマイシン系抗生物質としてカナマイシン、ジェネティシン(Gー418)について比較し、20μg/mlジェネティシンが対称区における茎葉の再分化をほぼ完全に阻害することが判明し、本濃度をトランスジェニック植物の選抜に用いれば良いことが見いだされた。4.シロイヌナズナ根に上記のパ-ティクルガン遺伝子導入条件で、NPTII遺伝子を導入、上記の培養条件下で培養し抗生物質耐性茎葉を選抜した。現在までに、20本以上のジェネティシン耐性植物が得られた。本植物体は20μg/mlジェネティシン存在下で旺盛に発根し、開花、種子形成をしており、トランスジェニック植物である可能性が高い。