hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生薬ならびに薬用植物の生理活性リグナンに関する研究

1.強壮を目的に用いられる生薬・刺五加および杜仲からdioxabicyclo-octane型リグナンのpinoresinol,matairesinol,syringaresinolなどのモノおよびジ配糖体を単離した。そのcAMP-hosphodiesterase阻害活性につき、アグリコンとその配糖体の構造活性相関について検討を行なった。その結果、その相関はジ配糖体≧アグリコン>モノ配糖体という関係にあることが明らかとなった。阻害活性の高い化合物には種々の薬理作用が期待出来る。そこで強壮生薬から共通して見出されたsyringaresinol di-D-B-D-glucosideにつきラットの遊泳運動実験を行なったところ、慢性的運動ストレスに対し、その運動持久性を高める効果のあることが明らかとなった。2.チドメグサから単離したL-sesaminに血液凝固促進作用を見出した。その構造活性相関を検討する目的で、関連化合物のd-sesamin、pino-resinol、isohinakinin、pluviatolide、arctigenin、mateiresinolにつきその血液凝固促進作用のスクリーニング試験を行なった。しかしいずれもその活性は認められなかった。L-sesaminの血液凝固促進作用はその物質に特有の作用と考えられる。3.行〓止血、通経絡、〓風湿薬とされる絡石藤の茎部水エキスに活性酸素産生制御抑制作用ならびにヒスタミンによる気管平滑筋収縮に対する弛緩作用を認めた。その活性本体はエーテル抽出画分に移行する含有成分のarctigenin、matairesinol、trachelogenin、nortrachelogeninでいずれも10^4g/ml濃度で弛緩作用を示した。またarctigenin、nortrachelogeninには現在抗リウマチ薬として市販されているauranofinとほぼ同程度の活性酸素産生抑制作用が、frachelogenin、arctigeninにはaspirinとほぼ同程度の血小板凝集抑制作用が認められた。なお絡石藤に主成分として含有されるリグナン配糖体には上記生理活性作用は認められなかった。強壮を目的に用いられる生薬,刺五加および杜仲からdioxabicyclooctane型リグナンのpinoresinol,medioresinol,syringaresinolなどのモノおよびジ配糖体を単離した.そのcAMP-phosphodiesterase阻害活性につき,アグリコンとその配糖体の構造活性相関について検討を行なった.その結果阻害活性は例えばsyringaresinolの配糖体にみられるようにアグリコンのIC50:7.5×10^<-5>M,モノ配糖体のIC_<50>:14.2×10^<-5>M,ジ配糖体のIC_<50>:8.9×10^<-5>:8.9×10^<-5>Mの如く,その相関はジ配糖体≧アグリコン>モノ配糖体という関係にあることが明らかとなった.またこの関係は絡石藤からの2,6-diarylbutyrolactone型リグナンのmatairesinol,nortrachelogeninなどの配糖体においても同様の結果が得られた.以上のことから高い阻害活性を示すアグリコンからのジ配糖体はさらにその阻害活性を高めることが明らかとなった.そこでオリーブ樹皮から得られ,高い阻害活性IC_<50>:3.2×10^<-5>Mを示す(+)-1-acetoxy-pinoresinolをジ配糖体に誘導したところ予想通り非常に阻害活性の高いIC50:1.1××10^<-5>

Mの化合物を得ることが出来た.これら阻害活性の高い化合物には種々の薬理作用が気体出来る.とりわけジ配糖体が共通して強壮生薬から見出されたことは,その生薬との薬効の関連を予想させた.そこで刺五加から単離したsyringaresinol di-O-β-D-glucosideにつきラットの遊泳運動実験を行なった.その結果syringaresinol di-O-β-D-glucosideは慢性的運動ストレスに対し,その運動持久性を高める効果のあることが明らかとなった.このことはこれら化合物を含む強壮生薬に科学的評価を与える一つの根拠となるものである.チドメグサから単離したl-sesaminに血液凝固促進作用を見出した.さらに現在関連化合物についてその構造活性相関を検討仲である.チドメグサ(Hydrocotyle sibthorpioides)から単離したLーsesaminに血液凝固促進作用を見出した。一方Lーsesaminと対象体であるdーsesaminにはその活性が認められなかった。さらに関連化合物についてその構造活性相関を検討する目的で、芳香環がguaiacyl基でdioxabicyclooctane型のリグナンのpinoresinol、芳香環の置換基にmethylenedioxyl基を有し、diarylbutyrolactone型リグナンのisohinokinin、pluviatolideおよび芳香環がguaiacyl基でdiarylbutyrolactone型リグナンのarctigenin、matairesinolにつきその血液凝固促進作用のスクリーニング試験を行った。しかしいずれもその活性は認められなかった。Lーsesaminの血液凝固促進作用はその物質に特有の作用と考えられる。神農本草経の上品に収載され、行〓止血、通経絡、〓風湿薬とされる絡石藤(Trachelospermum jasminoides)の茎部水エキスに活性酸素産生抑制作用ならびにヒスタミンによる気管平滑筋収縮に対する弛緩作用を認めた。その活性本体はエーテル抽出画分に移行する含有成分のarctigenin、matairesinol、trachelogenin、nortrachelogeninでいずれも10^<-4>g/ml濃度で弛緩作用を示した。またarctigenin、nortrachelogeninには現在抗リウマチ薬として市販されているauranofinとほぼ同程度の活性酸素産生抑制作用(IC_<50>:3×10^<-6>M、8×10^<-6>M)が、trachelogenin、arctigeninには、aspirinとほぼ同程度の血小板凝集抑制作用(試料濃度0.5mg/mlでの血小板凝集抑制率:35.4±7.6%、34.2±6.8%)が認められた。
半数体利用による日本ナスへの房成り性導入

1.供試品種の個体別特性比較と優良母株の選抜:日本ナスの`もぎ'房成りインドナスの`E12'、`E20'を供試し、到花日数、着花節位、花房当りの着花(果)数について調査した結果、房成りインドナスの花房当り着花(果)数において相当の個体差を認めた。各品種の個体群の中から着花数の多い優良個体を選抜し、以後の葯培養における供試系統とした。2.葯培養における半数体の育成:(1)培養に適する葯の花粉発育段階は1核期中後期であった。(2)葯培養による再生幼植物の育成は、カルス経由で行うよりも胚様体経由で行う方が効率的であった。(3)初代培養及び継代培養における培地、培養条件など一連の培養プロセスを設定した。(4)アブラナ花粉から単離された生長調節物質ブラシノライドと類似のエピブラシノライドを供試植物体の茎部より吸収させることにより、胚様体形成率が1015%に向上した。(5)胚様体形成に効果のある葯の低温処理(5°C・515日)と活性炭添加の組合せ処理を行った結果、胚様体形成率が1015%に向上し、1葯当りの胚様体形成数も23に増加した。(6)`E12'の半数体から育成された半数体倍加個体(純系)2系統と元の母株系統の葯培養では、純系2系統の胚様体形成率が8%、12%の高率となった。3.母本品種と半数体倍加個体(純系)との特性比較:`E12'の半数体から得られた半数体倍加個体(純系)と、`E12'多花系統母本における諸特性の比較を行ったところ、着蕾数、着果数、着果率などについて純系・母本系統間にあるいは各系統内の個体間に大きな違いが認められた。4.花粉培養:`もぎ'及び`E12'の1核期中期後期の花粉を用いて花粉培養を行っ蒸留水での前培養、培地組成、ナ-スカルチャ-、コンディショニングなどの検討を試みたが、現時点ではまだカルス、胚様体いずれの形成も認められていない。1.供試品種の個体別特性比較と優良母株の選抜:日本ナスの'もぎ'房成リインドナスの'E12'および'E20'を供試し,第1花の到花日数,第1花の着花節位,主枝上に着生する6段花房までの各花房当り着花数と着果数について調査を行った.その結果, 'もぎ'の到花日数と着花節位, 'E12', 'E20'の花房当り着花数と着果数などでかなりの個体差が認められた.これら多様性のある個体群の中から着花数の多い優良個体を各品種ごとに選抜し,以後の葯培養のための供試個体として維持・増殖を行った.2,葯培養による半数体の育成:

各品種の花らいを経時的に採取して花粉を観察し,あらかじめ花らいの形状と花粉の発育段階との関連について調査した.置床する葯については内部の花粉の発育段階によって区別し比較検討した結果,カルスの形成率は1核期中期1核期後期で最も高くなった.この場合の培養条件は, MS培地+1mg/lNAA+1mg/lkinetin+3%しょ糖, 25°C, 3000lx, 16時間照明とした.葯培養によって得られたカルスは,再分化培地MS+1mg/lkinetin+2%しょ糖に移植し,数回の継代培養によって23か月後に再分化幼植物を得たが,半数体の発現率は極めて低かった.培地MS+0, 1mg/l2,4ーD+0, 1mg/lkinetin+3%しょ糖またはDumasらのC培地+0, 01mg/l2,4ーD+0, 01mg/lkinetin+3%しょ糖と17日間高温処理を併用した後再分化培地に移植することにより, 'E20', '早生真黒'などにおいてカルスを経由せずに胚様体が得られた.3,半数体の確認と同質2倍体の育成:カルス由来の再分化植物体('E12')と胚様体由来の植物体('E20', '早生真黒')で半数体が確認されたが,胚様体由来の方がより効率的と判断された. 'E12'の半数体を供試し, 0, 1%コルヒチン溶液24時間浸漬を行った結果,同質2倍体が得られた.1.葯培養による胚様体の育成:(1)植物生長調節作用を有する物質として、アブラナ花粉から発見・単離されたブラシノライドと同等の作用をもつエピブラシノライド(EB)の効果を検討した。EBをオーキシン(2.4ーD)又はサイトカイニン(Kinetin=Ki)と併用して培地に添加したところ、胚様体形成に対するEBの効果と共に初代培養における低Ki濃度の有効性が示唆された。また、品種"もぎ"、"E12"を供試し、Ki濃度の影響について追試した結果、初代培養では従来より低い00.01mg/lKiの濃度が適当と判断された。(2)EBの効果は培地へ添加するよりも花蕾を採取する親植物の茎から吸収させる方が顕著であった。即ち、親植物から約20cm長に切り取った枝を0.010.1mg/lEB水溶液に2448時間浸漬した後花蕾を採取し、葯培養に供すると、胚様体形成率は1015%に向上した。(3)これまでの実験から高温期(69月)の培養成績(胚様体形成)が著しく劣り、親植物の育成環境(特に温度)の重要性が示唆された。そこで採取した花蕾に010°Cの低温処理(4896時間)を行うと、胚様体形成率が向上した。また、親植物から約20cm長に切りとった枝を18°Cの温度条件下に7日間置いた後培養に供すると胚様体形成率が向上した。葯内の花粉は正常な発育過程を経ると不定胚への分化を起さないが、花粉発育の初期に低温に遭遇させると発育阻害や異常発育を起し、このことが不定胚形成を誘起するものと考えられる。2.花粉培養による胚様体の育成:品種"もぎ"、"E12"で1核期中期後期の花粉を供試し、花蕾の行処理、葯の前培養、培養時の花粉密度、培地のホルモン組成、培地環境など種々の処理を試みた。現段階ではカルスあるいは胚様体の形成は認められていない。しかし、オーキシンとしてIAAを添加した実験区において、球状胚の前身とみられる桑実状の細胞塊の存在が認められた。さらに実験の継続が必要である。1.葯培養による胚様体の育成:昨年度に続き供試材料に対する前処理及び培養条件について検討した。(1)培養初代の培地に0.1%の活性炭を添加した結果、胚様体形成率が著しく向上し、カルス形成は逆に減少した。活性炭の作用は培養1020日の間にあるとみられ、有害物質の吸着の他に培地内ホルモンバランスにも微妙に影響しているものと推測される。(2)葯の低温による前処理(5°C・515日)と活性炭添加の組合せ処理を行った結果、胚様体形成率が著しく向上し(1015%)、1葯当りの胚様体形成数も`E12'で最高8個、`もぎ'では24個に増加した。(3)胚様体経由で得られた`E12'における半数体倍加個体(純系)
最先端プロセスによる次世代型高精度水吸収線量計測法の確立

まず当該年度、私は、教育研究機関から臨床機関(病院)への所属機関の変更があった。また、新たな所属機関となった病院は、今年度に建てられた新しい建屋であり、病院を機能させるためにスタッフ全員が多忙となった。臨床現場は常に患者さん中心であり、研究を行うのどうしても就業時間後となってしまう。私の担当となった放射線治療システムは当院の病院にとって数年以来の再開のため,1つ1つ確認しながら毎日夜遅くまでの準備となった。私の研究テーマである「高精度放射線治療」における「新たな線量計測法の確立」であるため、施設のシステムが完了し、高エルギー放射線が照射できるようにならなければならない。私自身、高精度放射線治療の立ち上げが急務であったため、研究を遂行するためには、このシステムの立ち上げが絶対条件であった.そのため当該年度1年間は研究時間の確保ができず、かなりの遅れをとってしまったのは必然であると考える。もう1つ、研究を進めていく上で困ったことが発生した。研究を進めるにあたり,吸収線量計測のために用いるのが期待されてきた「液体電離箱線量計」の使用がかなり厳しくなってしまった。個人による液体電離箱線量計の製造は非常に難しく、予算もかかることから断念せざるを得ない状況となった。今年度は、当初の研究実施契約とは多少異なってしまうが、別の視点から水吸収線量計測を考え、従来の空気電離箱線量計による吸収線量計測法見つけられるよう全力を尽くしたい。平成30年度、所属機関の変更があり研究環境の確保に時間を要したため研究遂行に遅れを生じたため。所属機関変更後の研究環境の整備が済み、延長した研究(新たな吸収線量計測の確立)の遂行に使用する。まず,当初予定していた液体電離箱線量計の購入であるが,メーカー側の供給が終了し入手ルートを探したが見つからず入手が困難となってしまった.そのため,方向性を変更し,まず液体電離箱線量計と比較対象と考えていた国産の新型空気電離箱線量計システムを購入,その安定性と測定精度を確認した.海外のメーカーと比較しても非常に精度の高いシステムを入手することができた.次に,液体電離箱線量計を所持するメーカーを探し出し,線量計の借用をお願いし快く対応してもらった.そしてX線場・電子線場での吸収線量比の測定を実施した.X線場での結果は以前行ったものと同様の結果が得られた.電子線場での測定では通常直接吸収線量比を測定することはできず,阻止能比という補正係数を乗ずる必要があるが,液体電離箱線量計では予想していた通り補正せずとも直接吸収線量比を取得できることが示唆された.液体電離箱線量計を用いて電子線を測定したという報告はあまり知られておらず,その点においては意義のある結果であるといえる.空気電離箱よりも液体電離箱のほうが深さ方向における水との阻止能比が緩やかであることから,X線だけでなく電子線のような粒子線測定にも有用であると考えられる.これらの結果をさらに追及していくつもりである.並行してX線によるモンテカルロシミュレーションの準備を進行中である.研究の進捗はおおむね順調といえる.しかしながら,液体電離箱の供給が終了し,使用機会が今後減る可能性があることから,今後の研究の方向が変更となる可能性もあり得る.研究の進捗はおおむね順調といえる.しかしながら,研究で必要となっていた極小液体電離箱線量計のメーカー供給が終了してしまったため,使用機会が当初の予定よりも少なくなってしまった.また,他施設での放射線治療装置の使用が前提となり,さらにそれは医療機関のためスケジュールを合わせるのが難しく,研究時間を確保するのに苦慮している状況である.当該年度では、昨年度から継続して液体電離箱線量計に関する研究と、電子線におけるモンテカルロシミュレーションを行った。当該年度までの過程で、液体電離箱線量計が本研究における最重要検討事項であることが明確であったことから、液体電離箱線量計の入手を再度試みた。商用の液体電離箱線量計はメーカーからの供給が終了しており、やはり入手が困難であることから、液体電離箱線量計の作成を検討した。だが、材料・製造方法等を何度か検討したものの、本研究の予算での作成は困難との見積もり結果が出たため、前年度同様、メーカーより液体電離箱線量計を借用するという代替え案のもと、実測をベースとした研究を進めた。そして、昨年度の研究結果で示唆された電子線場での測定を引き続き実施した。平行平板電離箱線量計と液体電離箱線量計で電子線の測定を行い、両者を比較した。一方で、モンテカルロシミュレーションを行うために当初から計上していた高性能ワークステーションを当該年度で購入した。そして、ワークステーションを用いて6MeVおよび9MeV電子線モンテカルロシミュレーションを実装した。その結果、前年度に液体電離箱線量計で測定した吸収線量比はモンテカルロシミュレーション結果に近い値となった。つまり、通常の電離箱線量計では測定値に阻止能比という補正係数をかけなければ吸収線量比を取得できないのに対し、液体電離箱線量計ではこの阻止能比がなくとも直接吸収線量比を計測できるということである。この事により、不確定度要因の1つを排除でき、精度の高いデータを収集可能であることの裏付けになった。研究の進捗はやや遅れている状況である。

当該年度は、本研究者が所属する学科において初の国家試験受験および卒業生が出る年度となり、前年度と比較すると業務量(教育)が激化し、結果として研究エフォートを充分に維持できなかった。それに加え、実験施設が医療機関のため、放射線発生装置の使用および実験は臨床時間外が前提となるが、この時間の調整が非常に難しく、当初の予定よりも進まないという結果になった。モンテカルロシミュレーションに関してはワークステーションを購入したことにより、簡易的ではあるが、電子線において実装が可能となり、実測結果との比較ができた点においては多少なりとも進んでいると言える。以上から総合すると「やや遅れている」と判断する。まず当該年度、私は、教育研究機関から臨床機関(病院)への所属機関の変更があった。また、新たな所属機関となった病院は、今年度に建てられた新しい建屋であり、病院を機能させるためにスタッフ全員が多忙となった。臨床現場は常に患者さん中心であり、研究を行うのどうしても就業時間後となってしまう。私の担当となった放射線治療システムは当院の病院にとって数年以来の再開のため,1つ1つ確認しながら毎日夜遅くまでの準備となった。私の研究テーマである「高精度放射線治療」における「新たな線量計測法の確立」であるため、施設のシステムが完了し、高エルギー放射線が照射できるようにならなければならない。私自身、高精度放射線治療の立ち上げが急務であったため、研究を遂行するためには、このシステムの立ち上げが絶対条件であった.そのため当該年度1年間は研究時間の確保ができず、かなりの遅れをとってしまったのは必然であると考える。もう1つ、研究を進めていく上で困ったことが発生した。研究を進めるにあたり,吸収線量計測のために用いるのが期待されてきた「液体電離箱線量計」の使用がかなり厳しくなってしまった。個人による液体電離箱線量計の製造は非常に難しく、予算もかかることから断念せざるを得ない状況となった。今年度は、当初の研究実施契約とは多少異なってしまうが、別の視点から水吸収線量計測を考え、従来の空気電離箱線量計による吸収線量計測法見つけられるよう全力を尽くしたい。平成30年度、所属機関の変更があり研究環境の確保に時間を要したため研究遂行に遅れを生じたため。更に実測データを収集し,空気電離箱との相違を解明する.ワークステーションを購入し,モンテカルロシミュレーションを実施する.その結果から実測したデータの妥当性を検討する.液体電離箱線量計の供給が終了してしまったため,今後入手することが困難となってしまった.今後もメーカー等から借りるなどして研究を遂行していくつもりだが,それが叶わなくなってしまった場合は,別方向からの研究を検討していく.当該年度までで電子線において直接吸収線量比を測定できることがおおむね証明できた。今後はX線におけるモンテカルロシミュレーションを実行し、X線場においても精度の高い計測ができるとの証明をしたい。その後は遅れている課題の推進のため努力したい。つまり液体電離箱線量計内の有機溶媒のイオン密度・移動度を物理化学の観点から推測・解明することである。実際の測定にこの影響がどのくらい出ているのか見積もることが出来れば、従来の電離箱線量計を用いての測定よりも更に高い精度で吸収線量を算出が可能となる。最終的には水吸収線量を求めるために重要な係数である線質変換係数kQを導き出すのが目標である。
デンドリマーリアクターを利用したサブナノ新金属粒子の創製と機能開発

本研究は、我々が独自に開発した無機金属元素を原子単位で自在に操る精密金属集積合成法を基盤として、未踏の領域であるサブナノサイズ新しい物質の創製・配列制御から機能性の実証までを目指すものである。さらにデバイスへ拡張するため、サブナノ粒子の基盤上への配線を目指し、デンドリマーをテンプレートとして利用した新しいナノ粒子ファブリケーションの開発を目的とした。今年度は(1)精密金属集積合成法の確立(1.1分子リアクターの開発、1.2ヘテロ金属集積法の確立)と(2)サブナノ合金粒子の創製と機能解明(2.1サブナノ白金粒子の精密構造の解明)の研究課題に取り組む計画であった。まず研究を早急に立ち上げるため、初年度計画の(1)の合成と(2)分析にいち早く対応するため、導入のための時間を最も要する機器類(マイクロウェーブ合成装置、フーリエ変換赤外分光光度計、空冷ペルチェセルフォルダ、質量分析装置AXIMA-CFR修理)の購入および修理手続きを開始し、性能試験を実施、機器の要求スペックを満たしている事を確認し設置を完了した。精密金属集積デンドリマーとして最も汎用性の高い、テトラフェニルメタンをコアとするデンドリマーの量合成に取り組んだ、コアとなる4置換アミノテトラフェニルメタンのコア合成から始まり、ベンゾフェノンとアミノ化合物の縮合反応により第三世代までのデンドロンの合成を達成した。さらに、ヘテロ金属集積ヘの展開を目論み、安定な塩化ガリウム塩を用いてタイトレーションを行ない、多段階放射状錯形成の再現を確認できた。27年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞競合により制御される前立腺癌間質リモデリングの解明

CAFsは増殖因子やサイトカインの産生などを介し、癌の進展を様々な側面から促進させる。そのため、我々は癌細胞の増殖抑制に加えて、CAFsの働きを阻止することができれば、より効率的に癌の進展を抑制することが可能になると考えている。本検討により、CAFsは癌細胞と同様に正常な線維芽細胞を活性化し、CAF様の性状を誘導することが明らかとなった。さらにCAFsによるパラクライン作用は極めて不均一であることが明らかとなり、これは前立腺癌間質が不均一であることを意味する、すなわち臨床的にも前立腺の組織構造を考慮した前立腺癌治療の必要性を強く示唆するものであった。実験1:ヒト前立腺癌間質に得意的な遺伝子発現解析を行う予備検討として、PAXgene Tissue Systemという新規組織固定法の導入を試みた。PAXgeneTissue Systemは、ホルマリン固定と同様の病理組織学的な解析が可能なだけでなく、質の良いRNAやmiRNAも抽出できることが大きな特徴である。今回、膀胱全摘の男性患者から摘出した前立腺組織をPAXgene Tissue Systemにて固定し、Laser Capture Microdissection (LCM)を用いて間質層を回収し、専用のキットを用いてRNAを抽出後にcDNAを作製し、リアルタイムPCRにて標的遺伝子の増幅を検討した。その結果、PAXgeneTissue Systemにて固定された前立腺組織標本から効率良く遺伝子発現解析できることを確認した。次年度は、癌を含む前立腺組織を使って、前立腺癌細胞の周囲に限局する間質と正常腺管周囲の間質を選択的に採取し、遺伝子発現解析を試みる予定である。実験2:ヒト前立腺癌間質における細胞競合のin vitro再現系の構築を行う予備検討として、市販されている正常ヒト前立腺間質細胞PrSCとPrSMC、および摘出手術材料より初代培養法にて単離したヒト前立腺癌関連線維芽細胞PCaSC-8の性状解析を行った。その結果、細胞増殖速度はPrSC>PCaSC-8>PrSMCの順に速く、VEGF産生量はPCaSC-8>PrSC>>>PrSMCの順で高かった。また、IL-6およびTGF-beta1産生量はPCaSC-8>PrSMC>PrSCの順で高いことを確認した。次年度は、これら3種の線維芽細胞を用いたin vitro共培養系を構築すること。さらに当科で独自に初代培養して得られるヒト前立腺癌関連線維芽細胞とのin vitro共培養系の構築へと発展させる予定である。本年度は、複数の前立腺癌患者の組織から初代培養して得られた線維芽細胞を活用して、ヒト前立腺癌間質で生じる細胞競合を模したin vitro共培養実験系における線維芽細胞同士の相互作用を検討した。実験には市販されている正常ヒト前立腺間質細胞PrSCとPrSMC、および摘出手術材料より初代培養にて単離したヒト前立腺癌患者由来線維芽細胞PCaSC-8, pcPrF-M5, pcPrF-M6, pcPrF-M7を用いた。Falconセルカルチャーインサートを用いた共培養実験において、PCaSC-8はPrSCの細胞増殖率を有意に促進させたが、pcPrF-M6とpcPrF-M7はPrSCの細胞増殖率を有意に抑制した。PrSCからのTGFb1産生量はpcPrF-M6およびpcPrF-M7との共培養群で有意に増加した。IL-6産生量は全ての共培養群で有意に増加した。その中でもpcPrF-M6と共培養したPrSCからのIL-6産生量は4倍以上に増加した。VEGF産生量はPrSMCを除き、癌患者由来の線維芽細胞との共培養群で有意に増加した。pcPrF-M6との共培養群でPrSCにおけるCOL1A1 mRNA量は有意に発現上昇した。一方、pcPrF-M5, pcPrF-M7との共培養群ではCOL1A1, TNC mRNA量が有意に発現低下した。ACTA2 mRNA量はPCaSC-8, pcPrF-M6, pcPrF-M7との共培養群で有意に発現上昇した。EGF mRNA量はpcPrF-M5, pcPrF-M6との共培養群で有意に発現上昇した。FGF2 mRNA量はPCaSC-8, pcPrF-M5との共培養群で有意に発現上昇した。pcPrF-M5, pcPrF-M7との共培養群ではFGF7, IGF1 mRNA量が有意に発現上昇した。HGF mRNA量は全ての共培養群で有意に発現上昇した。泌尿器科学ヒト前立腺癌間質に特異的な遺伝子発現を解析するために、従来のホルマリン固定法では難しいことが判っていたため、PAXgene Tissue Systemという新規組織固定法の導入を試みた。

その結果、我々が求めるレベルで遺伝子発現解析を施行できると考えられ、次年度以降の解析に期待が持てた。また、当科における癌関連線維芽細胞の初代培養実験も順調に進んでおり、症例数が目標に達した段階で性状解析からin vitro共培養系の実験まで今年度に予備検討した実験が活かされると考えている。おおむね順調に進展しているので、次年度以降も精力的に実験を続けていきたい。
菌従属栄養植物タヌキノショクダイの共生メカニズムの解明、および人工栽培法の確立

昨年に引き続き、キリシマシャクジョウの菌根菌の分離実験を行った。昨年はアルファルファ、ソルガム、シバ(西洋シバ)、タマネギ、シロツメクサを、自生地より採集した土壌に植え付け、アーバスキュラー菌根菌の増殖・分離を試みた。しかし、キリシマシャクジョウの菌根菌とは異なるアーバスキュラー菌根菌が増殖してしまい、目的の菌根菌を得ることができなかった。そこで、目的の菌根菌を増殖させるため、採集したキリシマシャクジョウの根の表面を丁寧に洗浄し、滅菌した土に埋設した後、そこへ上記5種の宿主植物を植え付けたところ、特にソルガムにおいてアーバスキュラー菌根菌が旺盛に増幅することがわかった。さらに、増殖した菌の塩基配列を確認したところ、キリシマシャクジョウの菌根菌と同一の菌であることが確認された。現在、宿主植物の根を接種源とし菌糸体の増殖を行っており、かなりの菌体量を得ることができている。今後、自生地における宿主植物を選定し、接種・播種実験を行う予定である。ソルガム自体が菌従属栄養植物の生育を菌根菌の宿主として支えることが可能か否かは現在のところ不明だが、2か月前にソルガムの根近くに播種した種子は現在のところ発芽が確認できていない。研究に費やすことができた時間が充分とは言えなかったが、アーバスキュラー菌根菌と菌根共生する菌従属栄養植物の育成技術の開発という面では、1目的とする菌根菌の増幅、2菌根菌を増殖するために好適な宿主の選定、という2点において、有用な知見を得ることができた。今後は得られた知見を論文にするとともに、宿主植物・アーバスキュラー菌根菌・菌従属栄養植物の3者共生系を構築に向けて研究を進めてゆきたいと考えている。この手法を応用することによって、絶滅危惧植物であるタヌキノショクダイの増殖技術の確立を目指したいと考えている。タヌキノショクダイは非常に希少な植物であるため、今年度は個体数が多く比較的採集しやすい状況にあったキリシマシャクジョウを用い、予備的な実験を行った。キリシマシャクジョウの根やその周囲の土壌、周囲に生育する緑色植物の根を使い、アーバスキュラー菌根菌の分離を試みた。自生地の土に植えつけるアーバスキュラー菌根菌の宿主植物として、アルファルファ、ソルガム、シバ(西洋シバ)、タマネギ、シロツメクサを使用した。現在接種試験を実施中で、1ヶ月以内に実験の成否が判明する。宿主植物に使用している植物種の生育は順調で、ソルガムの苗に菌根形成が期待できる。今後根の染色を行い、菌根形成の確認を行うとともに、DNA抽出と解析を行うことで目的の菌株が得られたか否かをチェックする予定である。タヌキノショクダイの自生地の植生調査も行っている。高木層はスギが優占しており、この樹木がアーバスキュラー菌根菌の宿主となっている可能性が考えられた。しかし、ヤブツバキやサカキといったアーバスキュラー菌根菌の宿主となる樹木も同所的に成育することから、これらの樹木も菌根菌の宿主として機能している可能性も考えられた。また、タヌキノショクダイの株の周囲には複数のアーバスキュラー菌根性の草本植物もみられた。これらの植物種についても、菌根菌の宿主となっており、タヌキノショクダイの生長に影響を及ぼしていることが考えられた。今後、共生培養実験において、どの宿主植物・菌根菌の共生系が、タヌキノショクダイの生育を支えうるか調査する予定である。

本年度に北海道大学から国立科学博物館に所属が変わり、実験室の体制を整えるのに時間がかかってしまい、特に培養に関する研究が当初よりかなり遅れている状況にある。培養に関する環境整備も整いつつあり、6月中に不足している試薬や施設を整え、7月初旬に調査を実施する。9月中には一定の成果を出せるよう努力したいと考えている、実験・調査遂行のための経費として使用する。また研究成果を論文にする際の英文校閲費用も必要である。主に6月中に、培養に必要な物品の購入を行い、7月中に植物種の調査を行う。
バイアス電圧による電子熱伝導度の制御と革新的熱スイッチ材料の創製

本研究では,外場(バイアス電圧)により熱流を制御できる革新的熱スイッチ材料の創製を目指した挑戦的研究を行った.目的の機能を材料に持たせる為に,格子熱伝導度が著しく小さく,かつ,半導体的電子構造を有している材料を用いる必要がある.この要請に合致する材料群としてAg2S, Ag2Se, Ag2Teを選択した.ポリイミドフィルムを2枚のAg2Sで挟み込む素子を試作した結果,僅か数Vの電圧で最大7%の熱流変化を生み出すスイッチング素子を試作することに成功した.現状では熱流の変化量は小さいが,薄膜化により100程度大きな変化に出来る可能性が高い.化石燃料の燃焼により得られる熱量のうち,電力などに変換され有効に利用されているエネルギーは40%程度であり,残りの60%は低温廃熱として捨てられている.発電所,工場,自動車,家庭などで発生した熱を,必要とする箇所に運び,有効利用することが強く望まれている.固体材料を流れる熱流は,フーリエの法則で記述されるため,固体材料中において任意の方向に熱を振り分けることは容易ではない.機械的要素(接触・切断機構)を導入すれば熱の振り分けは可能であるが,システムの巨大化,設置費用,メンテナンス等の問題から,エネルギー効率化のために導入された例はない.機械部品なしに固体材料において熱流の大きさや方向を制御することができれば,その市場価値は極めて高いと判断される.上述した社会的要求に対応するために,本研究では,熱流を任意の方向に振り分けることが可能な革新的熱流制御材料を開発することを最終目標としている.この目的を達成するために,金属や半導体内の電子濃度を電場により制御し,電子濃度の変化を通して電子熱伝導度を著しく変化させる技術を確立する.さらに,電子熱伝導度の変化を目的に応じて最適化する指針を構築し,構築した指針に基づき,実用化可能な革新的熱流制御材料(熱スイッチ材料)を創製する.平成28年度に行った研究では,格子熱伝導度が著しく小さい半金属材料にバイアス電圧を印加することで,熱伝導度に変化が生じることを実証した.一方で,電子濃度を有効に変化させることができるのは試料表面のみであるため,得られる変化は5%以下であった.現在,この問題を解決するための素子構造を考案し,その有効性を確かめる実験を行っている.これにより,バイアス電圧の印加で熱伝導度が1桁以上変化する素子の創製を行えると考えている.熱伝導度測定装置の作製に,予定よりも多くの期間を要した.また,提案した機構により熱伝導度が変化することが確認できたものの,その肝となる電子濃度変化をバルク全体に広げることができなかった.この問題に関しては,電磁気学の考察が十分でなかった為であると考えている.ただし,問題は解決可能であることが確認できている.化石燃料の燃焼により得られる熱量のうち,有効に利用されているエネルギーは40%程度である.残りの60%は低温廃熱として捨てられている.発電所,工場,自動車,家庭などで発生した廃熱を必要とする箇所に運び,有効利用することが強く望まれている.固体材料を流れる熱流は任意の方向に熱を振り分けることは容易ではない.機械的要素(接触・切断機構)を導入すれば熱の振り分けは可能であるが,システムの巨大化,設置費用,メンテナンス等の問題から,エネルギー効率化のために導入された例はない.機械部品なしに固体材料において熱流の大きさや方向を制御することができれば,その市場価値は極めて高い.上述した社会的要求に対応するために,本研究では,熱流を任意の方向に振り分けることが可能な革新的熱流制御材料を開発することを目的とした.この目的を達成するために,金属や半導体内の電子濃度を電場により制御し,電子濃度の変化を通して電子熱伝導度を著しく変化させる技術を確立し,電子熱伝導度の変化を目的に応じて最適化する指針を構築した.また,構築した指針に基づき,革新的熱流制御材料(熱スイッチ材料)を試作した.熱スイッチに利用する材料では,デバイス内の格子熱伝導度を著しく低減させる必要がある.また,半導体敵な電子構造を有し,著しく格子熱伝導が小さい試料を作成する必要がある.これらの課題に対して,FeVAlホイスラー相とMoあるいはWの超格子構造を作製し,界面散乱による格子熱伝導度低減機構の詳細な解析を行った.さらに,(Ag,Cu)2(S,Se,Te)合金を作製する手法を改善を行い,熱スイッチ材料の要素となる材料の選定を行い,これらの材料を用いたデバイスの試作も行った.その結果,10%弱の熱流の変化を観測することに成功した.本研究では,外場(バイアス電圧)により熱流を制御できる革新的熱スイッチ材料の創製を目指した挑戦的研究を行った.目的の機能を材料に持たせる為に,格子熱伝導度が著しく小さく,かつ,半導体的電子構造を有している材料を用いる必要がある.この要請に合致する材料群としてAg2S, Ag2Se, Ag2Teを選択した.ポリイミドフィルムを2枚のAg2Sで挟み込む素子を試作した結果,僅か数Vの電圧で最大7%の熱流変化を生み出すスイッチング素子を試作することに成功した.現状では熱流の変化量は小さいが,薄膜化により100程度大きな変化に出来る可能性が高い.本課題において作製した装置でバルク材料の熱伝導度が測定できるようになったことに加え,新たに導入した時間分解サーモリフレクタンス法により,薄膜状態でも熱拡散率が求められるようになった.

表面電荷をより有効に使えるのは薄膜であることから,薄膜素子を作製し,時間分解サーモリフレクタンス法により熱拡散率を解析することで,目的の機能を有する材料の創製を行っている.平成29年に,バイアス電圧の印加により.熱伝導度が1桁以上変化する素子の創製を目指す.金属物性
半導体表面における化学反応の微視的機構と不安定反応中間体の同定

1.ダイヤモンド表面の研究ダイヤモンドC(100)2x1単結晶表面をモデル表面として,表面の構造,物性(電子状態,表面フォノン),反応性に関する原子・分子レベルでの実験的研究を行った.用いた実験手法はLEED, EELSおよびTDSである.特に,C(100)表面上でディールスアルダー反応が起こることを見出した.共役ジエンを含む有機分子が沢山存在することを考えると,非常に多様で興味ある表面化学の新しい一研究分野を開いたと結論される.半導体表面に有機分子を共有結合させ,表面修飾できることは,マイクロエレクトロニクス,センサー,ダイヤモンド薄膜の低温成長などへの応用という観点からも非常に意義深い.2.シリコン表面の研究(1)Si(100)(2x1)清浄表面の表面フォノンの測定をEELSを用いて行った.EELSスペクトルから得られた情報と理論との比較,EELSの散乱機構の選択則を用いて,損失ピークの同定およびエネルギー分散関係を求めた.とりわけ,シリコン・ダイマーのロッキング・エネルギーが20meVであることを測定するのに始めて成功した.(2)シリコン表面の反応性の研究に関しては,Si(111)7x7表面と酸素分子との相互作用について,極低温(10K)から室温(300K)までの広範囲温度領域のSTM研究を実施した.不安定反応中間体に関する新しい情報を得た.1.ダイヤモンド表面の研究ダイヤモンドC(100)2x1単結晶表面をモデル表面として,表面の構造,物性(電子状態,表面フォノン),反応性に関する原子・分子レベルでの実験的研究を行った.用いた実験手法はLEED, EELSおよびTDSである.特に,C(100)表面上でディールスアルダー反応が起こることを見出した.共役ジエンを含む有機分子が沢山存在することを考えると,非常に多様で興味ある表面化学の新しい一研究分野を開いたと結論される.半導体表面に有機分子を共有結合させ,表面修飾できることは,マイクロエレクトロニクス,センサー,ダイヤモンド薄膜の低温成長などへの応用という観点からも非常に意義深い.2.シリコン表面の研究(1)Si(100)(2x1)清浄表面の表面フォノンの測定をEELSを用いて行った.EELSスペクトルから得られた情報と理論との比較,EELSの散乱機構の選択則を用いて,損失ピークの同定およびエネルギー分散関係を求めた.とりわけ,シリコン・ダイマーのロッキング・エネルギーが20meVであることを測定するのに始めて成功した.(2)シリコン表面の反応性の研究に関しては,Si(111)7x7表面と酸素分子との相互作用について,極低温(10K)から室温(300K)までの広範囲温度領域のSTM研究を実施した.不安定反応中間体に関する新しい情報を得た.走査トンネル顕微鏡を試作し,超高分解能電子エネルギー損失分光と組合せることにより,半導体表面における化学反応の微視的かつ動的機構の解析を行った。1.極低温走査型トンネル顕微鏡観測部の設計と試作極低温(8K)における単一吸着原子の振動励起観測をめざしたSTM-IETS装置の観測部を試作した。STM本体,極低温冷却機構真空チャンバーから成り立つ。2.超高分解能電子エネルギー損失分光装置の整備と改良磁気シールドの設計・試作などによって1meVの分解能を実現した。3.ダイヤモンド(100)^<2×1>表面の物性,反応性の研究(100)^<2×1>表面のフォノン,電子状態,単純な気体分子の反応性を解析した。とくにDiels-Alder反応の発見に成功した。4.シリコン(100)^<2×1>表面のフォノン分散の測定と解析走査トンネル顕微鏡-走査トンネル分光装置の試作,高分解能電子エンルギー損失分光装置の改良と半導体表面における化学反応の微視的機構の実験的研究を行った。(1)装置の試作と改良走査トンネル顕微鏡観測部の拡張機能を目的として,超高真空試料処理装置の設計・試作を行った。また8Kにおいて吸着分子の振動励起の測定のための電子回路の設計試作を行った。電子エネルギー損失分光に関しては,分析器電極部品の改良を行った。(2)化学反応の実験(i)極低温走査トンネル顕微鏡により,Si(111)表面の初期酸化を調べ,解離吸着に至るまでの準安定分子状酸素の存在の確認に至った。(ii)ダイヤモンド(100)(2×1)上のKの吸着状態を調べた。(iii)Kで修飾したダイヤモンド(100)(2×1)表面上におけるO_2,COの化学吸着状態を調べ,Kの反応促進効果に関する情報を得た。高分解能電子エネルギー損失分光装置,走査トンネル顕微鏡,低速電子回折装置を用いて,ダイヤモンド,シリコンなどの半導体表面における化学反応の微視的機構を解析した。(1)ダイヤモンド表面における表面反応清浄C(100)表面にKを吸着させていくと,仕事関数がΔφ=-3.35eVに達するまで減少する。K-基板結合は低被覆率領域(Qk=0.6まで)において,非常に分極している。Qk=0.51では,Kは電子を取り戻し,ほぼ中性になる。清浄C(100)はO_2,COと反応してないが、K-修飾面ではO_2は解離し,>C=0,C-O-Cを生成する。CO_1はK-修飾表面上でK-CO錯体をつくる。
20世紀における恐怖の言説

恐怖の表明が特定の世界観や自然観を前提にし、特定の歴史認識や宗教信条に依拠し、また様々な芸術的表象に浸透され、さらにまた政治的主張や社会的不満の原因となっていることを解明した。言語圏としては中国語・日本語・英語・フランス語・ドイツ語をカヴァーし地域的多様性を重視し、時代的には20世紀を中心に置いて、恐怖の言説にかかる顕在的あるいは潜在的な多様な文脈を検討して、現代の錯綜した文明状況の総体を考察した。1.20世紀における.恐怖言説を、小説・音楽・言語・哲学・政治・ジェンダー・民族といった多様な領域に検討した。また、言語圏としては、中国語・日本語・英語・フランス語・ドイツ語をカヴァーし、20世紀における恐怖言説の世界性と地域性を考慮した。2.研究分担者はそれぞれ、書籍・CD・DVDを購入したり、インターネットを利用したりして、恐怖言説関係の資料を収集することに努めた。こうして収集された基礎資料は、私たちの今後の研究活動にとって大きな収穫であることはもちろんであるが、今後広く研究者・学生に公開して、その用に供することができる。3.研究分担者のうち今年度は三名が海外出張を行った。藤井たぎるはスイスのチューリッヒ大学などに、松本伊瑳子はフランスのパリ第八大学などに、飯野和夫はフランスのリヨン高等師範学校などに赴き、それぞれ資料調査と意見交換を行なった4.外部の専門家を招いてのセミナーを開催した。今年度は、岡真理氏(京都大学助教授)に、「恐怖(Terror)と恐れ(fear)のはざまでパレスチナでパレスチナ人、ユダヤ人が生きるということ」というテーマでお願いした。20世紀後半から現在まで続くパレスチナ問題における恐怖を、主にアラブ側の視点から解明しようとする刺激に富んだ講演であった。5.名古屋大学大学院国際言語文化研究科の教員に研究協力を得て、10回にわたる公開講座「恐怖を読み解く-日々の生活から国際政治まで-」を開催した。社会人・大学院生など、多数の受講者があった。また、年度末には、公開講座の参加者を中心に、論文集『恐怖を読み解く』を刊行した。3.研究分担者のうち今年度は二名が海外出張を行った。田所光男はフランスにあるショアー記念館、フランソワ・ミッテラン図書館などに、柴田哲雄はインドにおけるチベット亡命政府の所在地ダラムサラ、上海大学などに赴き、それぞれ資料調査を行なった。4.外部の専門家を招いてのセミナーを開催した。今年度は、玉田敦子氏(中部大学中部高等学術研究所常任研究員)に、「『悦ばしき恐怖』から『リベルタン美学』へ-18世紀美学から見た現代の恐怖-」というテーマでお願いした。恐怖のポジティヴな側面に焦点をあてる刺激に富んだ講演であった。5.松本伊瑳子が中心となって組織した日仏二国間セミナー「グローバルで変化する日仏の国家アイデンティティ、ジェンダー関係、社会格差」に、田所光男と布施哲も参加し、現代世界における恐怖の問題にかかわる発表を行った。1. 20世紀における恐怖言説を、小説・音楽・言語・哲学・政治・ジェンダー・民族といった多様な領域に検討した。とりわけ言語圏としては、中国語・日本語・英語・フランス語・ドイツ語をカヴァーし、20世紀における恐怖言説の世界性と地域性に配慮した。2.三年間の共同研究の総括として、2008年9月30日、名古屋大学において、国際シンポジウムを開催した。総テーマ「恐怖からの思考-現代世界を解明する-」の下、ミレイユ・カル=グルーバー氏(パリ第三大学教授、カナダ・ロイヤル・ソサエティ会員)、エベラルト・グルーバー氏(パリ第三大学研究員)、川崎惣一氏(北海道教育大学釧路校准教授)、アレクサンドル・グラ氏(岩手大学准教授)を招聘し、本研究グループからは、研究代表者の田所光男、研究分担者の松本伊瑳子・藤井たぎる・布施哲・柴田哲雄の5名が研究発表を行った。小説、哲学、精神分析、政治、歴史、音楽、民族、犯罪、など多様な領域での恐怖言説を対象にして、それにかかる多様な文脈を解明した。また、そこでの発表と討議を踏まえて、2009年2月、論文集『恐怖からの思考-現代世界を解明する』を刊行した。3.三年間にわたる共同研究全体の成果報告書を、2009年3月に発行した。

特に、長畑明利(研究分担者)と、研究協力を仰いだ玉田敦子氏(中部大学中部高等学術研究所常任研究員)の論文、および飯野和夫(研究分担者)と柴田哲雄(研究分担者)の研究報告は、アメリカ文学・フランス思想・中国政治の領域における恐怖言説を対象にした未発表の論考である。
ナノ球殻分子磁性体の開発

ナノスケールの物質開拓が盛んに行われている。しかし磁性体を考えると、バルク強磁性体の微小化は、超常磁性的な性質に帰結してしまい、強磁性としての性質を保持しようとするとサブミクロンスケールの物質開拓が必要になる。強磁性体の場合、その内部では磁壁で分けられた磁区が形成されており、その生質は磁性体の形状に著しく依存することが知られている。したがって、サブミクロンスケールで磁性体の形状を制御する研究が、基礎としても応用としても大変重要である。ポリスチレンのビーズにはさまざまな用途があり、粒径のよく揃ったものが廉価で市販されている。ごく最近、硝酸銅水溶液を尿素で塩基性にすることによって、直径1ミクロン弱のポリスチレンビーズの表面を、塩基性炭酸銅で均一にコートできることが報告されている。本研究では、この手法を用いることによりナノ球殻磁生体を合成した。中心金属としてコバルトを選び、塩基性炭酸コバルトを均一沈殿させた。始物質の濃度などを最適化することによって、均一コーティングの条件を求めるととができた。これを水素気流下でか焼することによって、直径800nm、厚み80nm程度のナノ球殻形状の金属コバルト磁石をつくることができた。粉末X線回折を測定したところ、fcc相であることが分かった。得られた試料は室温でソフト強磁性を示し、その温度以下で磁化曲線の温度変化はほとんどなかった。ポリスチレンのラテックスにはさまざまな用途(例えば電子顕微鏡の標準試料)があり、粒径のよく揃った試料が廉価で市販されている。分子磁性体が溶媒中で合成されるという利点を生かし、ポリスチレン・ラテックスの表面に、均一に球状のナノ球殻分子磁性体を沈殿させ、さらにそれを〓焼させてナノ球殻磁石の合成を目指した。硝酸銅と硝酸コバルトを原料にして、加水分解反応によって塩基性炭酸銅とコバルトをポリスチレン表面に沈殿させた。電子顕微鏡で確認したところ、厚みが15nm程度でほぼ均一にコーティングが成されていた。銅錯体の場合、キュリー定数やワイス温度において、サイズを変えることによって系統的な変化を観測することができた。コバルト錯体の場合、空気中で〓焼することによって、ナノ球殻の酸化コバルトをつくることができた。
緑膿菌クオラムセンシング機構の総体的理解に向けたAHLレセプターの機能解析

緑膿菌は、自身の病原性をクオラムセンシング(QS)と名付けられた細胞間情報伝達機構により制御している。本菌のQSには、転写制御因子として3種のアシルホモセリンラクトン(AHL)レセプター(LasR, RhlR, QscR)が関与することが明らかとなっているが、RhlRとQscRの解析はLasRに比べて大きく遅れており、その性質や機能には不明な点が多い。本研究では、RhlRの発現・精製と分子機能解析、および、QscRの普遍性と感染症における役割の検証を行うことを主目的としている。一昨年度の取り組みにより、N末端を数残基分切り縮めたRhlRは、大腸菌細胞内において高い可溶性/安定性を示すことが明らかとなった。そこで、昨年度は、大腸菌無細胞抽出液からのN末端短縮型RhlRの単離・精製に取り組んだ。結果、硫安沈殿による分画と複数のカラムクロマトグラフィーを組み合わせることにより、本タンパク質を高純度に精製することに成功した。次に、本精製標品を用いて、ゲルシフトアッセイによるDNA結合活性の検出を試みた。しかし、反応液へのAHLの添加の有無に関わらず、精製標品に目的の活性は検出されなかった。上記実験と並行して、RhlRの発現プラスミドと、RhlRが制御するプロモーター配列の下流にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を配置したプラスミドを保持する大腸菌レポーター株を作出し、レポーターアッセイによる完全長RhlRとN末端短縮型RhlRの転写促進活性の比較・検討を行った。結果、完全長RhlRは、AHLの添加量に応じて顕著な活性を示したのに対し、N末端短縮型RhlRは全く活性を示さなかった。以上のことから、RhlRのN末端側の数残基は、RhlRの不安定性の要因である一方、転写促進因子としての機能に不可欠であると結論した。昨年度までの取り組みにより、N末端短縮型RhlRの大腸菌を用いた発現と精製に成功した。過去に、C末端側のDNA結合ドメインのみを発現・精製した実験の報告がなされているが、完全長に近い形でのRhlRの精製が達成されたのは今回が初めてであり、大きな進展と考える。しかしながら、精製タンパク質を用いたゲルシフトアッセイでは、DNA結合活性を検出することはできなかった。また、大腸菌レポーター株を使用した実験では、N末端側アミノ酸残基が、RhlRの転写促進因子としての機能に不可欠であることが明らかとなった。上記実験は、RhlRの構造・機能相関に関していくつかの重要な知見をもたらしたが、RhlRの性質と機能には未だ多くの謎が残されており、本研究課題の達成のためには、完全長RhlRの精製と解析を含め、更なる研究が必要と考える。1. RhlRの発現・精製と解析:前年度までに決定した条件により、大腸菌で完全長RhlRを発現させ、N末端短縮型RhlRと同様の手順により単離・精製する。精製標品(完全長RhlRとN末端短縮型RhlR)を用いて、各種AHLのRhlRとの親和性を解析するとともに、AHLの解離/結合によるRhlRの分子量、安定性(凝集・失活の有無やプロテアーゼに対する抵抗性)の変化を調べる。本実験と並行して、RhlRのDNA結合活性を検出するための方法の検討を行う。RhlRが機能を発揮するためには緑膿菌由来の未知の小分子化合物またはタンパク質性因子が必要である可能性が考えられるため、緑膿菌の培養上清や無細胞抽出液の添加の影響を調べる。これらの試みがうまくいかなかった場合は、DNase Iフットプリント法、蛍光偏光解消法、分子間相互作用解析装置(Biacore)による解析などの、ゲルシフトアッセイ以外の方法による検出を試みる。以上の実験を通して、RhlRの性質や機能に関して、新たな知見の獲得を目指す。2. QscRの普遍性の検討および生理的役割の検証:当初の計画通り、QscRの普遍性と生理機能に関する研究を進める。具体的には、様々な症例由来の緑膿菌臨床分離株を対象として、qscR遺伝子の保存性を確認し、発現の有無、発現量、機能性に関する検証を行う。qscR遺伝子破壊株を作製し、病原因子の産生性を野生株と比較するとともに、マウスの感染実験を実施し、緑膿菌感染におけるQscRの役割を検証する。前年度は、特にRhlRの発現方法の検討とDNA結合活性の検出に重点的に取り組んだ。まず、市販のpETシステム(Novagen)による大腸菌発現系を構築し、発現条件の検討を行った。結果、37°Cで発現誘導した場合は、RhlRは不溶性の凝集物となるばかりで可溶性画分にはほとんど発現しなかったが、低温で発現誘導することにより可溶性に若干の改善が見られた。一般に、タンパク質の細胞内における安定性は、N末端側のアミノ酸配列に大きく依存することが知られている。