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Anthology: Japanese Peruvian Writers

本研究の主な成果は、日系ペルー人作家著作の文学作品分析し、各種学会、研究会、及び学術誌で発表した。日系ペルー人作家、Jose Watanabe、Augusto Higa Oshiro、Fernando Iwasaki、Doris Moromisatoの作品に日系アイデンティティーがどのように描かれているのかを分析した。具体的には、出稼ぎ移民、移動を通し、19世紀後半から現在に至まで「日系ペルー人」というアイデンティティーががどのように生まれ、不均一で固定できないものへと変容しているかを研究した。他の論文2本、Watanabeの詩集分析、Iwasakiの短編小説分析も査読付き学術誌へ投稿済みである。さらにWatanabeの別の詩集分析をした論文も校正中であり、査読付き学術誌へ投稿する予定である。Iwasakiの作品分析の研究発表をコロンビア、カルタヘナで2014年3月に開催された国際シンポジウムで行った。論文執筆が進んだのは、2013年夏の米国図書館での資料集中と勉強、2014年冬休み中ペルーでの図書収集と勉強が進んだおかげである。さらに早稲田大学でアジアとスペイン語圏、ポルトガル語圏を文学文化作品を通じて結ぶというテーマでシンポジウムを開催する準備、打ち合わせも米国の大学に所属する研究者とすることができた。2014年度は、日系ペルー人作家フェルナンド・イワサキ著作の短編小説「La sombra del guerrero」(「侍の影」仮和訳)についてパロディーに関連する学説を適用し、日系ペルー人が江戸時代の侍文化を理解することが可能かどうかを、作者イワサキがなぜ嘲弄的に表現しているかを探求するのに力を入れた。なぜならば、イワサキを本研究である「日系ペルー人作家選集」に含めるかどうか検討中であるからだ。その結果論文を一本終了し、2015年11月に査読付き学術誌で発表される予定である。また、2014年4月には「アジアとスペイン語圏、ポルトガル語圏を結ぶ」をテーマに早稲田大学でシンポジウムを開催した。約35名以上の研究者がアジア、アフリカ、ヨーロッパ、北南米から集まり、研究発表、意見交換をした結果、日系ペルー人作家アウグスト・ヒガ著作の短編小説集と小説の新作が出版されたことを学び、短編小説の分析に取り掛かった。フランス、Universite Blaise Pascalの教授、Axel Gasquetの研究プロジェクトににヒガの「Okinawa existe」(「沖縄は存在する」仮和訳)を分析する論文を投稿した。夏休み、春休みを利用し、アメリカ、ウイスコンシン大学の図書館、シカゴ大学の図書館で日系ペルー人作家、日系アルゼンチン人作家に関する資料を収集することができた。また、3月にはグアテマラ、アンティグア市で開催された学会で(例年のスペイン語文学国際学会)研究発表をした。執筆中の日系ペルー人、ホセ・ワタナベによる詩集について発表した。現在校正中であり、2015年5月末までに査読付き学術誌に投稿する予定である。これと並行し、アウグスト・ヒガ著作の短編小説集の分析を引き続き行っている。今年度の目的は、日系ペルー人作家の文学作品選集の出版企画をMurrup Ediciones (Lima)出版社へ提出することであった。選集はJose Watanabe, Doris Moromisato, Augusto HigaOshiro, Fernando Iwasaki, Carlos Yushimito del Valleの作品の分析を含むものと考えていたが、それぞれの作品のテーマ、形状、作家の日系アイデンティティーに対する姿勢がさまざまであり、共通したある特定のテーマに焦点を置くことが難点であり、執筆終了の論文を無理に選手にまとめるのは相応しくないと考えた。他の手段を見つけるため日本、アメリカ、ペルーの図書館で日系ペルー人作家に関する資料を収集し、上記の作家に共通する点を探索したが、テーマを絞ることはできなかった。その一方、図書館で検索中に日系アルゼンチン作家による文学作品を取得することができた。特にAnna Kazumi Stahlの作品には日系文化の継承、アイデンティティーの衝突、移民に対する「よそ者」のレッテルに関するテーマが表されており、MoromisatoとHigaの作品に共通する点が多いことを発見した。Stahl氏と意見交換をするため、NYU,Asian/Pacific/American Instituteと共同開催した、Global Asia/Pacific Art Exchange (GAX)シンポジウムの東京での最終部(早稲田大学)へStahl氏を講演者として招聘した。Stahl氏とのシンポジウムの打ち合わせ、意見交換を通して、一つの国ペルーを超えて日系文学について考える必要があることを認識した。また、本来出版に向け企画を提出する予定であった選集に代わり、執筆した論文は査読付き学術誌に投稿し、1本は発表された。他の1本は発表が確定している。研究は順調であるが、日系ペルー人作家の選集を本にまとめることはまだ出来ていない。今までは、各著者の作品を分析したものを論文として発表してきたが、これから先はどのように未発表の論文を選集の中に入れていくかが課題である。

また、日系ペルー人作家の研究中に、日系とペルーの領域を超えたアジア系ラテンアメリカ文学、文化のテーマの研究を避けることができなくなり、研究範囲が広がってしまったことも、日系ペルー文学選集の本を出版できていない一理由である。現代日系ペルー人作家による文学作品分析2015年度は選集を出版するため、まず選集出版企画をペルーの出版社Ediciones Murrupに提出することが必要である。論文執筆と並行して出版企画を提出することになる。6月末までに論文を2本終了し、8月末までには企画を提出したい。それ以降は出版社との打ち合わせ、校正等に時間を費やし、2016年3月末までには出版契約までたどり着く予定である。また、今年度7月には早稲田大学でニューヨーク大学、ブエノスアイレス校から作家、教授、研究者であるAna Kazumi Stalh氏を招き講演とシンポジウムを開催する。シンポジウムにはニュウーヨーク大学の専門家が参加する。Stalh氏との意見交換はすでに始まっているが、来日した時には日系アルゼンチン文学と、視覚美術作品、フィルム等をどのようにアジア人のディアスポラのテーマを通して繋げることができるかを話し合う。具体的には、8月はアメリカ、ウイスコンシン大学の図書館で資料収集をする。2016年2、3月はペルー、リマで上述の出版企画を提出し、作家アウグスト・ヒガの研究者と意見交換をする予定である。自己評価は80点である。論文がかなり進んだが、校正に時間がかかり一論文を査読付き学術誌で発表するまで1年から1年半時間がかかってしまった。また、沖縄国立図書館、琉球大学付属図書館、琉球大学国際研究所で研究をする予定であったが、時間の管理がうまくいかず沖縄訪問はできなかった。そのため、沖縄からのペルーへの移民史の知識がまだ浅い。また、最終目的の日系ペルー人文学選集を図書として出版する準備があまりできなかった。しかし、論文の執筆はかなり進んでいる。2015年7月1日にニューヨーク大学、グローバルアーツ、Asian/Pacific/American研究所、所長Alexandra Chang氏と共同でシンポジウムを早稲田で開催する。アルゼンチン、ブエノスアイレスの同大学グローバルセンターより作家であり、研究者であるAnna Kazumi Stahl氏を早稲田に招聘する予定である。Stahl氏は日系アルゼンチン人であり、日系人のアイデンティティー、居場所を探求した文学作品の著者である。シンポジウムで講演するほか、将来の共同研究について意見交換する予定である。そのため、招聘に関わる旅費等などを科研費で支払いたいと考えている。そのため、今年度の助成金を次年度の研究活動に追加したいと考えた。今まで執筆した論文を学術誌、国際学会、シンポジウムで発表することを続ける。さらに、研究中に発見したペルー人作家(日系ではない)
ロボットに対する信頼感の構造：製造元への信頼を考慮に入れた分析

(1)信頼の構造とその動的特性についての分析及びその日米比較信頼の次元をPredictability, Depedability, Faithの3つによって定義した場合に,信頼の動的特性として初期の段階ではFaithが支配的であり,徐々にDependability, Predictabilityへと変わっていくのではないかとの仮説を立て,その検証を行う.Muir&Moray(1996)のレプリカとしてPasteurizerを用いて,日本・米国それぞれで実験を行った.その結果,FaithよりもDependabilityがより支配的であるということが,日米双方の結果として得られた.(2)機械への信頼に対する組織への信頼の影響分析特定の機械・ロボットに対する初期のFaithを支えるものとしての,その機械を製作した組織に対する信頼の影響を分析する.これまでの成果に基づき,システムについて有する知識の影響を分析した結果,知識と信頼感の間に複雑な関係があることがうかがわれる結果を得た.信頼感を支配する下位項目が,先行研究と異なる影響を示したことや,対象とするシステムによっても異なる影響が研究の結果としてうかがわれた.このため,こうした結果をもたらした原因について,慎重に検討しなければならない分,当初予定と比べるとやや遅れぎみであるといえる.ただし,研究が進んでいないというわけではなく,むしろ本来想定していたものと違う方向に進んでいるというのが正しい認識である.平成30年度までに得られた結果の解釈を慎重に進めるとともに,必要に応じて追加の検証実験を行う.これと並行して,本来最終年度に取り組む予定であった,システムを開発した主体に対する信頼感と,実際のシステムへの信頼感との関係につい手の検討を加速する.平成29年度では、研究代表者がこれまで構築してきた信頼感の構造モデルをベースにこれを詳細化した。また、信頼感情勢の初期段階ではFaithが支配的であるとの仮説を立て、その検証に取り組んだ。能力に関する信頼の分析に当たっては、当初自動車の自動運転システムを対象とした実験を行うことを検討したが、心理学分野において研究再現性の問題が全世界的に注目を集めてきたことが明らかになったことから、本研究の出発点であるMuir & Moray (1996)の実験を再現することに注力することとした。このため、Muir &Moray (1996)の実験システムを利用できないか、Moray教授に尋ねたところすでに手元にないとのことであったため、論文をもとにレプリカの構築を行った。古い論文でもあり、実験システムの設計において詳細が記載されていない部分も多いことから、試行錯誤を繰り返し、ようやく実験装置として使える程度に仕上げることができた。実験方法においても、謝金にボーナス・ペナルティを課すなど、現在では研究倫理上実施できない事項もあり、実験条件の詳細化の調整を慎重に行った。また、この一連のプロセスにおいて、Muir & Moray (1996)の研究を再現することの意義を再確認する検討作業を、米国Old Dominion大の山仁氏と共同で行った。このことを通じて、faithに影響を与える要因の分析を行い、国・文化の違い、年齢、世代、性別などの影響を無視すべきではないと考えるに至り、国際比較研究をむしろ早い段階で行うべきではないかと考えるに至った。これを受けて、国際比較研究を実現するための準備にも取り組んだ。心理学分野において研究再現性の確認の重要性が急激に認識されるようになり、むしろMuir & Moray (1996)の出発点から着実に確認していくことが重要であると考えるようになったため、実験を行う対象を切り替えたことによる(研究課題そのものは変わっていない)。(1)信頼の構造とその動的特性についての分析及びその日米比較信頼の次元をPredictability, Depedability, Faithの3つによって定義した場合に,信頼の動的特性として初期の段階ではFaithが支配的であり,徐々にDependability, Predictabilityへと変わっていくのではないかとの仮説を立て,その検証を行う.Muir&Moray(1996)のレプリカとしてPasteurizerを用いて,日本・米国それぞれで実験を行った.その結果,FaithよりもDependabilityがより支配的であるということが,日米双方の結果として得られた.(2)機械への信頼に対する組織への信頼の影響分析特定の機械・ロボットに対する初期のFaithを支えるものとしての,その機械を製作した組織に対する信頼の影響を分析する.これまでの成果に基づき,システムについて有する知識の影響を分析した結果,知識と信頼感の間に複雑な関係があることがうかがわれる結果を得た.信頼感を支配する下位項目が,先行研究と異なる影響を示したことや,対象とするシステムによっても異なる影響が研究の結果としてうかがわれた.このため,こうした結果をもたらした原因について,慎重に検討しなければならない分,当初予定と比べるとやや遅れぎみであるといえる.ただし,研究が進んでいないというわけではなく,むしろ本来想定していたものと違う方向に進んでいるというのが正しい認識である.Muir & Moray (1996)の実験は複数の被験者を同時に扱えるため、実験の実施は加速できる。この実験において、Muir & Moray (1996)で得られている知見が再現されるか、あるいは、国、年齢、性別などの要因によって異なる影響がみられるかの検討も併せて行うことによって、従来の研究成果を包含する体系的な知見を得ることにつなげる。そのうえで、自動車の自動運転における信頼感のモデルと信頼感醸成プロセスの分析に取り組む。一見遠回りのアプローチであるが、トータルで見ればより良い方向に向かうものと確信している。

平成30年度までに得られた結果の解釈を慎重に進めるとともに,必要に応じて追加の検証実験を行う.これと並行して,本来最終年度に取り組む予定であった,システムを開発した主体に対する信頼感と,実際のシステムへの信頼感との関係につい手の検討を加速する.
高分子ゲルによる固定化酵素の反応制御に関する基礎的研究

高分子ゲルの中に酵素を固定すると、網目間隔を制御することにより、目的の物質のみネットワークの網目を通過させることができることから、きわめて選択性の良い反応を行わせることができる。しかし、高分子ゲルの体積(ネットワークの網目間隔)を予測することは極めて困難である。そこで平成5年度は、感温性のN-イソプロピルアクリルアミド(NIPA)ゲルを合成し、PEG(200,1000,6000,20000および50000)・水混合溶液組成に対するゲルの体積変化およびゲル内外のPEG濃度を測定した。これにより、混合溶媒中におけるゲル網目の粗密度および逆浸透圧の知見が系統的に得られた。さらに、高分子溶液モデルを用いて相関を行い、良好な相関結果が得られた。平成6年度は、シリカコロイド水溶液中のNIPAゲルの体積とゲル内外のシリカ濃度を測定することにより、溶質の排除限界を測定した。また、既存の網目孔径の推算法より得られた推定値と実験値を比較し、推定法の妥当性を検討した。さらに、各種PEG水溶液中のゲル網目孔径を推定し、孔径に対するPEG排除率を計算した。その結果、PEGサイズが大きくなると排除率は増加し、孔径が小さくなると全てのPEGに対して排除率は増加した。孔径と同一サイズのPEG分子の約20%がゲル内に侵入した。また、孔径3.3nm以下では、PEG6000以上の分子は完全にゲル外に排除された。平成7年度は、酵素(グルコアミラーゼ)をゲル内に固定し、反応物質(デンプン)をゲル外水溶液に入れ、ゲル体積とゲル外水溶液のグルコース濃度を測定した。その際、温度を変えることによってゲル網目孔径を変化させ、反応率の増減を測定した。その結果、温度が高くなるにつれてグルコース濃度は減少した。これは温度が高くなると固定化ゲルの網目孔径が小さくなり、デンプンのゲル内侵入量が減少し、反応量が減少したものと考えられる。高分子ゲルを選択的分離材料として、あるいは反応制御媒体として応用する際、高分子ゲル網目の孔径や、高分子ゲルと他の成分との親和力(分子間力)が重要な知見となる。平成5年度は、まず高分子ゲル外の成分を低分子から高分子(直鎖状のポリエチレングリコール(PEG);分子量20050000)を含む系に変え、高分子ゲルの体積挙動とゲル内外でのPEG分配挙動を測定した。その結果、PEG6000からPEG50000系では、ゲルは外部PEG濃度の増加とともになめらかな収縮挙動を示した。また、ゲル内のPEG濃度測定よりゲル内にPEG分子があまり入らないことがわかった。さらに、PEGが高分子量になるほど、ゲル体積、ゲル内濃度ともに小さい方に推移することがわかった。PEG1000系では、上述の系に比べてゲル内にPEG分子が多量に入るということがわかった。また、低分子系でみられる体積相転移現象が観察され、ゲル内のPEG濃度も体積相転移点付近で大きな変化がみられた。このことから、ゲル内のPEG濃度の大きな変化により体積相転移現象が引き起こされていると推測される。さらに、PEG200系では一度収縮したものが高濃度域でふたたび膨潤するというreentrant型の体積変化がみられた。このときゲル内のPEG濃度がゲル外のPEG濃度より大きくなっていることから、この再膨潤はPEG分子のゲル網目上への吸着のためであるという知見が得られた。これらの結果のうち、ゲルの体積データはMacromolecules(アメリカ化学会)に報告した。

また、ゲル内外のPEG分配挙動は、京都で開催された「分子熱力学と分子シミュレーション」の国際シンポジウムで報告した。本年度は、直鎖状の高分子を用いての実験であったが、ゲル外水溶液の浸透圧によるゲル網目の粗密度の変化の知見が系統的に得られた。高分子ゲルを選択的分離材料として、あるいは反応制御媒体として応用する際、高分子ゲル網目の孔径や、高分子ゲルと他の成分との親和力(分子間力)が重要な知見となる。平成5年度は、高分子ゲル外の成分を低分子から高分子(ポリエチレングリコール(PEG);分子量20050000)を含む系に変え、高分子ゲルの体積挙動とゲル内外でのPEG分配挙動を測定した。平成6年度はこのデータを基に、高分子溶液理論に立脚したゲル網目孔径の推定モデルを提出した。また分子サイズ既知のシリカ粒子(スノ-テックスXS,5nm)を用いて前年度と同様の実験を行い、網目孔径推定モデルの妥当性を検討した。さらに溶質排除率を定義し、ゲルを用いた分離場の最適化を行った。一方、実際の反応系に用いる反応物質(澱粉)を用い、その水溶液中のゲル体積を測定した。その相平衡関係は高分子溶液理論を用いることにより定量的に表現できた。またグルコアミラーゼをゲル内に固定し、純水中の温度、pH変化に対するゲル体積変化を測定した。現在は、固定化酵素と反応物質をゲル外溶液に注入し、ゲル体積とゲル外溶液のタンパク質濃度を測定している。今後、温度、pHの変化によりゲル網目孔径を変化させ、反応率の増減を測定する予定である。高分子ゲルの中に酵素を固定すると、網目間隔を制御することにより、目的の物質のみネットワークの網目を通過させることができることから、きわめて選択性の良い反応を行わせることができる。しかし、高分子ゲルの体積(ネットワークの網目間隔)を予測することは極めて困難である。そこで平成5年度は、感温性のN-イソプロピルアクリルアミド(NIPA)ゲルを合成し、PEG(200,1000,6000,20000および50000)-水混合溶液組成に対するゲルの体積変化およびゲル内外のPEG濃度を測定した。これにより、混合溶媒中におけるゲル網目の粗密度および逆浸透圧の知見が系統的に得られた。さらに、高分子溶液モデルを用いて相関を行い、良好な相関結果が得られた。平成6年度は、シリカコロイド水溶液中のNIPAゲルの体積とゲル内外のシリカ濃度を測定することにより、溶質の排除限界を測定した。また、既存の網目孔径の推算法より得られた推定値と実験値を比較し、推定法の妥当性を検討した。さらに、各種PEG水溶液中のゲル網目孔径を推定し、孔径に対するPEG排除率を計算した。その結果、PEGサイズが大きくなると排除率は増加し、孔径が小さくなると全てのPEGに対して排除率は増加した。孔径と同一サイズのPEG分子の約20%がゲル内に侵入した。また、孔径3.3mm以下では、PEG6000以上の分子は完全にゲル外に排除された。平成7年度は、酵素(グルコアミラーゼ)をゲル内に固定し、反応物質(デンプン)をゲル外水溶液に入れ、ゲル体積とゲル外水溶液のグルコース濃度を測定した。その際、温度を変えることによってゲル網目孔径を変化させ、反応率の増減を測定した。その結果、温度が高くなるにつれてグルコース濃度は減少した。
心臓ＭＲＩ検査を用いた放射線治療後の心筋変化の検出

根治が期待できる胸部食道癌症例を対象に心臓MRI検査を施行し、放射線治療前後で照射部位に一致した心筋変化を検討した。心臓MRIは、放射線治療前と治療後6か月経過した時点で撮像した。2015年3月の時点で25症例で本試験の同意を頂き、予定された化学放射線治療を施行し、大きな合併症なく終了した。そのうち20例で照射後6カ月後のMRIの撮像した。照射後のMRI撮像時に、臨床症状を呈する症例はいなかった。心筋変化に関する詳細な検討は、後日報告する予定である。近年の放射線治療をはじめとする癌治療の技術向上により長期生存が望めるようになり、その後の心臓障害の問題が顕在化している。心臓MRI検査は、梗塞などによる心筋線維化を鋭敏に捉えることが可能であり、臨床では虚血性心疾患を中心に広く用いられている。本研究の目的は、放射線治療による心筋変化を、放射線治療前後で心臓MRIを施行することで、プロスペクティブに評価することである。本研究の成果を食道癌の放射線治療に還元することで、心疾患のリスクを避けた照射法の確立や心疾患の早期発見を目指す。今年度は主に症例収集と放射線治療前のMRIの施行である。心疾患の既往がなく、化学放射線治療によって根治が期待できる食道癌患者を対象とし、対象の選別は当科で慎重に判断して決定された。治療前に十分に本研究の説明を行い、同意の得られた症例に対して心臓MRIを実施した。心臓MRI検査に関しては全症例問題なく終了した。画像診断からは、心筋に明らかな異常所見を認める症例は認めていない。同意の得られた症例に対して本研究で予定した放射線治療を施行し(1回線量2.0Gy、1日1回週5回の放射線治療、総線量60Gy程度)、全例重篤な副作用なく終了した。その後は、再発の有無も含めて外来で経過観察中である。まだ少数ではあるが、治療後半年経過した時点で心臓MRIを撮像した。照射線量と心筋変化の相関性については今後詳細に検討する予定である。早期食道癌患者の症例収集を前年度に引き続き行った。書面にて本研究の十分な説明を行い、同意の得られた症例に対して本研究を施行した。適応に関しても慎重に判断して選別した。全症例で照射前のMRIで遅延造影効果は認めなかった事を確認した。また、照射前に心疾患の既往のない事も確認した。化学放射線治療は全症例予定通り施行され、治療中に心イベントを発症した症例は認めなかった。化学放射線治療前と化学放射線治療終了6カ月後にMRIを撮像し、照射部位に一致した心筋障害(ガドリニウム遅延造影効果)の有無を評価した。再発した症例を除いて、同意の得られた症例はほぼ6カ月後のMRIの撮像を行った。一致の有無に関しては、線量分布図とMRI画像を融合させる事により評価した。この評価にあたり、放射線腫瘍医、放射線医学物理士、放射線診断医と連携して、綿密に遅延造影効果判定や融合方法について検討した。照射野に一致して遅延造影効果を認めた症例も散見された。この時点では臨床症状を呈する症例はいなかったが、十分に経過観察する必要があると考えられ、放射線治療計画の際には心臓への照射を可能な限り減らす工夫をする必要があると考えられる。遅延造影効果を認めた症例で、臨床的所見との因果関係を調べるために、身体所見・心電図・脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)の検査を施行した。また、化学放射線治療後1年6か月から約2年後に改めてMRIを撮像し、新たな所見の有無をみていく。データがまとまり次第、学会発表・論文作成に速やかに取り組む予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。放射線治療26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定より症例が集まらないため今後は更なる症例収集を行う予定である。放射線治療半年後に心臓MRI検査を施行する症例が増えてくるので、心筋変化と線量との相関性を調べる予定である。心電図や血液検査も施行し、異常所見との関連性をみていく。また、虚血性心疾患などの心臓関連イベントも厳重に観察する予定である。
全ゲノム解析による河川水中の薬剤耐性腸内細菌科細菌の実態解明

近年、抗生物質が効かない細菌(薬剤耐性菌)が世界規模で増加している。河川水といった環境水は、薬剤耐性菌や薬剤耐性遺伝子の拡散に寄与していると言われているが、その詳細はわかっていない。本研究では、河川水から単離した薬剤耐性腸内細菌科細菌の全ゲノム配列を決定して、保菌株や臨床分離株と比較することで、河川水が保菌や感染の原因となる薬剤耐性菌や薬剤耐性遺伝子の拡散に寄与している、という仮説を検証する。
会陰アプローチによる仙骨前隙を利用した腹腔鏡下手術

解剖学的に仙骨前隙正中に主要な血管や神経叢が無いことに着目し、仙骨前隙経路を利用した腹腔鏡下手術の可能性を検討した。一般的に仙骨前隙正中に主要な血管及び神経叢を認めない。更に会陰ポート挿入時は鏡視下で血管・神経を確認しながら行えるのでこれらの損傷を回避する安全確実な手技といえる。仙骨前隙を利用した腹腔鏡手術の手技の実現性、難易度、安全性を確認するために1動物実験、2画像による検証、3献体による正常解剖の確認、4組織学的検討の4項目を行った。研究目的:遂行可能で安全且つ整容性に優れた鏡視下手術の可能性を探る為に、会陰部(仙骨前隙経路を利用したカメラポート)と臍部(鉗子操作ポート)を利用した新たな手技を開発する。当該年度の研究実施計画通りLW系仔豚を用いて胆嚢摘出術・噴門形成術・脾臓摘出術・腎摘出術・S状結腸切除術・低位前方切除術を施行した。それぞれの手術画像を解析し検討した結果、上腹部の手術は問題なく施行可能だったが、直腸の手術はEndo CAMeleonでは困難でファイバースコープが適していると考えられた。カメラポートを臍部から会陰部に変更することで鉗子の操作性は格段に向上した。これはカメラポートとの干渉がなくなることと、2本の鉗子操作ポート間の距離を延長できることにあった。仔豚の腹部中央に臍を仮想した円形下縁に弓状切開を置き皮下を広範に剥離しそれぞれの切開端にトロッカーを挿入した。我々が行っている従来のTRANSUMBILICAL ENDOSCOPY ASSISTED SURGERY(経臍内視鏡補助手術)では切開創対側にカメラポートを挿入しているが、これがアンカーとなって切開創が思うように伸展できなかった。また研究実施計画にはなかった会陰部仙骨前隙経路をカメラポートだけでなく腹腔内洗浄時のドレナージとしての活用法を実験のなかで新たに開発できたので合わせて報告する。ヒトでの仙骨前隙の血管系・神経系のCT・MRIの画像データは集積中である。当該年度の研究実施計画通り画像データ解析を行った。会陰部から仙骨前隙を通り腹腔内までの距離をCTで計測する予定だったが、直腸後部の腹膜繙転部が同定できず計測はできなかった。当該年度の研究実施計画通り画像データ解析を引き続き行った。前年度より40例追加し71例で造影CTで正中仙骨動脈を確認できたのは69%だったが第5仙骨を超えて造影されたのはわずか4.2%だった。使用機器、撮像条件は前年度と同様だった。対象症例の男女比は38:33で、年齢は19歳から86歳(平均66歳)だった。平均体重は58kgで年齢や体重と描出率は関係なかった。仙骨岬角の角度は平均127.8度で、女性(126.8度)の方が男性(128.6度)より角度が小さかった。組織学的検討では2頭のpigletで飼育実験をおこなったが、1頭は麻酔の問題で死亡した。残りの1頭で会陰部からtrocarを腹腔内に挿入、トロッカー抜去後に刺入創を縫合閉鎖し4週間飼育。その後犠牲死させ会陰から腹腔内まで、直腸後壁を含めた仙骨前部の組織を病理学的に検討した。HE染色標本を用いて瘢痕組織の形成または瘢痕化の傾向(繊維芽細胞の増生など)および炎症所見(炎症細胞浸潤など)の有無について評価した。Trocar刺入全経路に共通して炎症像はほとんど認められないが、小血管の新生が認められた。明らかな瘢痕組織の形成(瘢痕化)はみられないが、繊維系細胞の浸潤は比較的強く、肛門周囲軟部組織から筋層(肛門括約筋を含む)内部にわたり広範囲に中等度に存在していた。献体(dedicating dead body)による正常解剖の確認のため献体を用いて会陰部からのtrocar挿入を2体に行い、会陰部から腹腔内まで問題なく挿入できた。ただし献体は薬液で固定されているため挿入時に血管の確認はできなかった。当該年度の研究実施計画通り画像データの蓄積、解析を前年度の引き続き行い結果を得た。動物実験と飼育実験、組織標本作成を行い、評価した。献体による解剖を行いヒトでの正常解剖を確認した。研究目的:会陰部(仙骨前隙経路を利用したカメラポート)と臍部(鉗子操作ポート)を利用した安全で整容性に優れた新しい鏡視下手術を開発する。当該年度の研究実施計画通りファイバースコープとカプセル内視鏡を用いた研究をおこなった。

ファイバースコープを用いて行なったpigletの動物実験では会陰部手術は視野も良好で問題なく施行できたが、カプセル内視鏡内部に磁石を装着しdrybox内に入れbox外から強力な磁力を有する複数の磁石でコントロールすることはある程度できたが、完全にカプセルを浮遊コントロールすることはできなかった。磁石コントロールが大変微妙で今後更なる工夫が必要と感じた。研究期間全体を通じて行なった研究成果は概ね達成でき、臨床応用可能と考えられた。新たに得られた知見として仙骨甲角の測定研究時に尾骨が内側に強く屈曲している症例が7%あり、これらの症例では実際のトロッカー挿入には注意が必要である。解剖学的に仙骨前隙正中に主要な血管や神経叢が無いことに着目し、仙骨前隙経路を利用した腹腔鏡下手術の可能性を検討した。一般的に仙骨前隙正中に主要な血管及び神経叢を認めない。更に会陰ポート挿入時は鏡視下で血管・神経を確認しながら行えるのでこれらの損傷を回避する安全確実な手技といえる。仙骨前隙を利用した腹腔鏡手術の手技の実現性、難易度、安全性を確認するために1動物実験、2画像による検証、3献体による正常解剖の確認、4組織学的検討の4項目を行った。当該年度の研究実施計画通り画像データ解析を行い結果を得た。症例集積は最終年度まで行い、解析する。本法を用いた骨盤内手術が視野を確保するのが困難であるためファイバースコープやカプセル内視鏡を用いて動物実験を行う。すべての成果を論文投稿する。内視鏡外科これまでの研究実施計画通り順調に進展しており、今後の研究実施計画に大きな変更は予定していない。動物実験の手配が概ね終了し、次年度は動物実験、引き続き画像データ集積と解析、組織標本の作成を予定している。当該年度の研究実施計画の胆嚢摘出術・噴門形成術・脾臓摘出術・腎摘出術・S状結腸切除術・低位前方切除術が行われた。ヒトCT・MRIのの画像データは集積中であり、最終年度まで症例を集め解析する。次年度に追加実験が必要になり、それに伴い学会発表、英文論文投稿が次年度になった。当該年度に購入予定だった実験動物、英文論文添削費が次年度に持ち越した。英文論文、添削費、投稿費、海外学会参加費、旅費を予定している。これまで研究計画通り順調に伸展しており、今後の研究実施計画に大きな変更は予定していない。次年度は動物手術、画像データ解析に加え組織標本の作成、検討を予定している。当該年度に購入予定だった実験動物を購入予定。英文論文添削費を支払い予定。当該年度に購入予定だった映像解析装置と動画編集機器が次年度に持ち越した。当該年度に購入予定だった映像解析装置と動画編集機器を購入予定。
繊毛の構造的・機能的多様性を生み出す分子メカニズム

繊毛の構造と機能に関連する新規遺伝子を見出し、KOマウスを作出してその表現形を解析した。顕著な異常が見られた組織を電子顕微鏡で解析したところ、繊毛表面の脂質二重膜構造、軸糸の配置および数などが乱れており、また繊毛内部に異常な小胞も認めた。これら形態学的な異常に伴い繊毛の機能低下も認めた。この新規分子は繊毛の形成時に機能していると推測された。この遺伝子の変異によるヒトの疾患は報告されていないが、ゲノムのSNP解析により、この遺伝子の機能を損なうようなSNPが存在していることを見出した。研究代表者は平成26年度に以下の研究成果を得た。1.TRPV4の活性化に伴いCPECsのバリヤー機能が低下し、またTRPV4の基礎活性を阻害に伴いCPECsによる基底側から頂端側への(すなわち血液から脳脊髄液への)α2マクログロブリン(A2M)の極性輸送が減少することを見出した。これらの知見に基づき、CPECsが中枢神経系の炎症の有無をTRPV4によって監視し、炎症が生じた際には抗炎症性タンパク質の輸送を増加させることにより炎症を沈静化させるという、これまで知られていなかった生理機能を持つ可能性を示すことができた。2.研究代表者のこれまでの解析に基づいて繊毛に関連すると予想された新規分子に対する抗体を作成し、その細胞内局在性を様々な組織を用いて検討した。その結果、この新規分子が繊毛基部に局在することを見出した。またこの分子をノックダウンすることにより運動繊毛による細胞外液の流れが低下することを蛍光ビーズの動態解析によって確認することが出来た。更に、この分子をコードするゲノム領域に遺伝子編集技術を用いて変異を導入した遺伝子改変マウスを作出した。3.研究代表者が以前プロテオーム解析を目的として確立したCPECs繊毛の精製方法を改変し、より精製度を高めたCPECs繊毛を得ることが出来た。これにより繊毛の詳細な内部構造を電子線トモグラフィーで解析するための基盤を確立することが出来た。4.本邦において世界で初めて症例報告された繊毛病である有馬症候群の臨床研究を行っている国立精神・神経医療研究センターの伊藤室長との共同研究として、患者から採取された線維芽細胞が持つ繊一次繊毛を透過型電子顕微鏡および免疫染色によって解析した。その結果、患者由来の細胞における繊毛の形成機構および繊毛局在性タンパク質の分布に異常があることを確認できた。研究代表者は平成27年度に以下の研究成果を得た。1.研究代表者が以前報告したCPECs繊毛の精製方法を改変し、より精製度を高めたCPECs繊毛を大量に調製して、プロテオーム解析およびクライオ電子線トモグラフィー解析を行った。これにより、精度の高い繊毛プロテオームのデータと、CPEC繊毛軸糸の微細構造に関する新知見を得ることができた。また今回の調製方法を用いて得られたサンプルには当初の予想と異なるタイプの繊毛が混在していることが明らかになった。2.研究代表者のこれまでの解析に基づき、繊毛に関連すると予想された新規遺伝子にゲノム編集技術を用いて変異を導入し、生殖系列に変異が導入された遺伝子改変マウスを3系統樹立した。これらを近交系へと戻し交配を行う傍ら、ホモ変異体を作出しその表現形を解析したところ、水頭症および精子形成異常を呈することを確認した。また昨年度、この遺伝子産物に対する抗体を作成してその細胞内局在性を検討したが、ホモ変異体の組織を用いた免疫染色実験の結果、昨年度の知見は抗体の非特異的なシグナルに基づくものである可能性が示唆された。3.本邦の繊毛病である有馬症候群の臨床研究を行っている国立精神神経医療研究センターの伊藤室長との共同計画として、患者から採取された線維芽細胞に対してゲノム編集技術を用いた遺伝子治療を試みた。その結果、この方法を用いた遺伝子変異修復の効率は低く、修復された細胞を効率良く選択する必要があることを確認した。4.繊毛を介したシグナル伝達の解析を行うために、繊毛局在性カルシウムセンサータンパク質を全身の細胞に発現するトランスジェニックマウスの作出を試みたが、胎生致死となりマウスを得ることが出来なかった。そこで胎生致死の原因と考えられる遺伝子配列を他の配列と置換し、改変型の繊毛局在性カルシウムセンサータンパク質を発現するコンストラクトを作成した。本研究課題に関する研究成果を2報、査読付学術誌に掲載することができた。更に現在もう1報を投稿中である。繊毛に関する新規分子の機能解析に関しては、ホモ変異体の表現型解析により、幾つかの組織で繊毛の形成不全・機能不全を確認できた。またその分子の細胞内局在に関しても昨年度に比べて正確な知見が得られた。繊毛の機能解析に関しては、当初利用を計画していた繊毛局在性カルシウムセンサータンパク質は胎生致死を招くことを確認でき、新たにタンパク質をデザインすることができた。またプロテオーム解析と構造解析を行うことによって、今後研究を展開する上での課題を幾つか明らかにすることが出来た。1.脈絡叢におけるTRPV4の機能解析を行い、脈絡叢の新たな生理機能を提唱することができた。2.繊毛の構造と機能に関連する新規遺伝子を見出し、KOマウスを作出してその表現形を解析した。顕著な異常が見られた組織を電子顕微鏡で解析したところ、繊毛表面の脂質二重膜、軸糸の配置および数などが乱れており、また繊毛内部に異常な小胞も認めた。これら形態学的な異常に伴い、繊毛運動の振幅は減少した。

この新規分子は繊毛の構造分子ではなく、その形成時に機能していると推測された。またヒトにおけるこの新規遺伝子のSNP解析も行い、この遺伝子の変異による繊毛病患者が存在する可能性を見出した。3.本邦の繊毛病である有馬症候群の病態を解明するため、患者由来の線維芽細胞を用いて電子顕微鏡解析と免疫組織学的解析を行うとともに、ゲノム編集技術やレンチウイルスを用いた遺伝子治療を試みた。電子顕微鏡解析によって正常細胞には見られない特異的な繊毛形成過程の異常を見出すことができた。一方で遺伝子治療の試みはいずれも成功を示す確実なデータは得られなかった。4. CPECが持つ9+0型繊毛の構造解析を試みた。以前論文に報告した方法を再検討し、より精度の高い試料を調製することができた。そしてこの試料をプロテオーム解析することで、CPECの繊毛機能解明の基盤となる分子も同定することができた。しかしこのサンプルにはなお他の不純物が混在しており、トモグラフィー解析は未だできていない。5.繊毛局在性カルシウムセンサータンパク質を全身の細胞に発現するマウスの作出を試みた。センサータンパク質を繊毛へ局在させるための配列を何種類か試し、培養細胞系ではいずれも機能することが確認できたが、トランスジェニックマウスを作出するためにマウス受精卵にマイクロインジェクションを行うと胎生致死を引き起こし、目的のマウスは作出できなかった。繊毛の構造と機能に関連する新規遺伝子を見出し、KOマウスを作出してその表現形を解析した。顕著な異常が見られた組織を電子顕微鏡で解析したところ、繊毛表面の脂質二重膜構造、軸糸の配置および数などが乱れており、また繊毛内部に異常な小胞も認めた。これら形態学的な異常に伴い繊毛の機能低下も認めた。この新規分子は繊毛の形成時に機能していると推測された。この遺伝子の変異によるヒトの疾患は報告されていないが、ゲノムのSNP解析により、この遺伝子の機能を損なうようなSNPが存在していることを見出した。本研究課題に関する研究成果を3報、査読付き学術誌に掲載することが出来た。繊毛に関与する新規分子の機能解析に関しては、抗体を作成することでその細胞内局在を明らかにするとともに、ゲノム編集技術を用いてノックアウトマウスを作成することも出来た。計画書に記載した通り、昨年度までに得た結果を更に発展させるために以下の解析を行う。1.新規繊毛関連遺伝子の機能解析:注目遺伝子のノックアウトマウスで異常が見られた組織を電子顕微鏡で解析し、病態を把握する。またこの新規分子と協調して働いていると予想される分子との相互作用などを解析する。2.CPEC繊毛の構造解析:非運動性繊毛の微細構造に関するデータ蓄積を進める。3.有馬症候群:患者由来細胞を用いて繊毛の構造的異常が生じる分子機構を明らかにする。また遺伝変異修復した細胞を効率良く選択する方法を確立する。細胞生物学前年度に得た結果を更に発展させるために、以下の解析を行う。1.繊毛数調節分子の機能解析:細胞内局在性の解析によって推定された共局在分子との相互作用を免疫沈降法によって解析する。更にこの相互作用に関わる分子内ドメインを決定する。
重度障害児のコミュニケーション行動の形成における指導法の比較研究ー行動療法と動作法ー

自閉症・重度精神遅滞といった重篤なコミュニケーション障害を示す心身障害児に対して、様々なアプローチが考察され試みられており、それぞれ有効性を主張している。本研究では伝統的な行動変容法・所謂フリーオペラント法・腕上げコントロール法・動作対話法を取り上げ、各々の有効性を比較検討することを目的とした。各アプローチには、各々のねらいがあり、またその効果の評価方法も多様である。そこで、89年度は比較検討の基礎とすべく、各アプローチで共に使用できる、行動変容のチェック・リストの作成を行なった。チェック・リスト作成上の基本方針は次の通りであった。1.各アプローチで用いたチェック・ポイントのリストを持ち寄り、各アプローチでのチェック項目を8領域に分類した((1)対人関係、(2)興味・関心・遊び、(3)言葉・コミュニケーション、(4)身辺自立、(5)運動、(6)幼稚園・学校での様子、(7)一応「病理的な」行動、(8)その他)。2.評価は行動レベルで行なう。3.項目のチェックは、親が行なうもの・指導者が行なうもの分けた(親へのインタヴューを通して、指導者がチェックするものを含む)。4.リストを作成する観点から、各項目は精選し、複数の領域間で重複しないようにした。5.しかし行動変容を評価する上では、同じチェック項目が複数の領域で評価される場合が有り得る(例えば、「兄とふざけあう」は「対人関係」と「遊び」とで評価される)。6.チェック対象児の年齢は26歳(小学校入学)ぐらいまでを仮定した(「学習活動」の項目との関連)。7.各チェック項目の順番(時間的・発達的な順序)は現時点では考えない。90年度は、このリストを下に、各アプローチでの指導効果の比較検討を行なう予定である。
血管奇形における神経性の分子機構解明と血行動態の解析

より副作用の少ない血管奇形治療法の開発が"神経"系の血管奇形への関与メカニズム解明が重要である。1.虚血モデルへの組織への血流付加について、細胞群との比較検討し、"神経"系の関与について細胞膜受容体アダプター(接合)分子(Shc)KO mouseを用いると血流は2週でvon Willebrand因子による総血管密度を有意に上昇させた。2.ShcC欠損マウスモデルでは1×1 cm2の肉様膜を含めた全層欠損への人工真皮による被覆では6日までに対象群は創の完全閉鎖を認めたがShcC欠損群では全く閉鎖しなかった。血管奇形は、血管の異形性などに伴い局所に血流の過剰流入・貯留があり、一部に創傷治癒遅延や、うっ滞する血流のため、疼痛と可動域制限など生活の質の制限を認める。また、疼痛など知覚神経異常が長期間残存することがあり、より副効果の少ない治療方法の開発が“神経"系の血管奇形への関与メカニズム解明と共に重要である。血管奇形治療における局所循環動態の調節と臨床分類での塞栓療法が高流量(high flow)動静脈奇形の第一選択であり、局所血流制御に高い治療効果を示している。末梢組織の血管、血流調節および血流動態(ヘモダイナミクス)、更に発展させて血管・循環系と末梢神経の相関について体系的に検討した研究は少ないため1.虚血モデルへの組織への血流付加について、脂肪幹細胞群との比較検討し、神経"系の関与について細胞膜受容体チロシンキナーゼ・ドメインのアダプター(接合)分子(Shc系タンパク)ノックアウトマウスモデルを用いて2.神経と血管新生及び創傷との関係について検討したところ、下肢20Gy放射線照射後総腸骨動脈結紮ラットモデルでは1.非接触性レーザーによる組織血流は2週で、浅腹壁皮弁付加により有意に増加し、von Willebrand因子免疫染色による総血管密度を有意に上昇させた。2.ShcC欠損マウスモデルでは1×1cm2の肉様膜を含めた全層欠損への人工真皮による被覆で6日までに対照群は総閉鎖したが、ShcC欠損群では全く閉鎖しなかった。H & E染色による組織検討では、血管形成が有意に低下していた。虚血ラット血管系操作と神経結合タンパク遺伝子操作マウスモデルにより血管奇形近似モデルとして更に検討が必要であると考えられた。
肝癌患者等の肝切除限界の指標および肝予備力についての基礎的・臨床的研究

1.SPECTを用いた肝血流指標K値の測定には高速度SPECT装置の導入で可能となった。1回転37秒(そのうち7秒は加速時間で実測時間は30秒)で50回転のデータ収録を行ない各回転毎の再構成画像の厚さ1.06mmで作製し、各スライスごとに50枚時系列に配列し、それぞれの時系列画像よりK値と体積を求め、さらに任意の部位の切除を行うプログラムを作製した。この方法によって立体的に切除範囲を求めることができ、残存予定肝体積および同部でのK値の測定が可能となった。従ってプラナーシンチグラムでの欠点である切除範囲の決定の不正確さが改良され、内側区域や前区切除の場合も容易に切除予定部分を切除して計算できる。また前年度不正確であったK値の算出方法も改良した。正常者6名での平均K値は0.365±0.038と前年報告したプラナーシンチグラフィによる正常者に名の平均K値0.351±0.036とほぼ一致する値を得た。さらに肝硬変症7例のSPECTによる平均K値は0.241±0.057,プラナーシンチグラフィによる肝硬変症17例の平均値が0.243±0.052と両者の場合も同様の値を示した。従ってSPECTによる肝血流指標K値の精度は十分に信頼できるものと判断した。2.肝切除術前に【^(198)Au】コロイドを用いた患者の予後の判明した21症例では肝不全による死亡6例の残存予定肝機能体積率は0.335±0.071,肝不全以外の原因による死亡者5例では0.692±0.174,生存者では0.570±0.165であり肝不全による死亡者と他2群との間には有意の差を認め肝切除限界値は0.40.45と推定された。SPECTを用いて肝切除前に検査しえた症例は4例である。いずれも生存中であるが同法による残存予定機能体積率は0.3910.846である。
インターフェロン系転写因子IRF-2遺伝子欠損による急性膵炎モデルの解析

IRF-2遺伝子欠損マウスはウイルス感染や合成二重鎖RNAの腹腔内投与により急性膵炎を発症する。合成二重鎖RNA投与後のIRF-2遺伝子欠損マウス脾臓ではIL-17,IL-22mRNAの発現が著しく上昇した。しかし脾臓細胞をin vitroで培養し、合成二重鎖RNAを添加した場合のIL-17,IL-22mRNAの発現上昇はin vivoほど著明ではなかった。骨髄移植の実験では、IRF-2遺伝子欠損マウスの膵臓を有している場合に、著しいアミラーゼの上昇をみとめている。合成二重鎖RNAの膵臓での情報伝達系の検討のため、NF-κB、STAT3のゲルシフトを行った。そのバンド出現位置に違いが認められたが、IRF-2抗体でのsuper shiftは見られなかった。p65、STAT3の蛋白質の発現をウエスタンでみると、IRF-2遺伝子欠損マウスでは正常な位置に検出されず、蛋白質のdegradationが生じていることが推測された。このように、IRF-2遺伝子欠損マウスの膵臓では蛋白質が壊れやすい傾向が示唆された。これらの結果より、急性膵炎の一次的な原因は膵臓の障害である可能性が高い。現在、野生型とIRF-2遺伝子欠損マウスの膵臓での発現遺伝子の差異の検討のため、マイクロアレイをおこなっている。また、IRF-2とIRF-1のダブルノックアウトマウスでは、IRF-2遺伝子欠損マウスと同様なアミラーゼの上昇をみとめ、IRF-1の関与は低いことが推測された。TRIFとのダブルノックアウトマウスでは、アミラーゼの上昇率は低いが、野生型よりは高く、RIG-I、MDA5を介した経路も関与していることが示唆された。IL-22は受容体が免疫細胞にはなく、膵臓や皮膚などの臓器に発現するという特徴がある。IRF-2遺伝子欠損マウスの膵炎発症時に著明な上昇をみとめており、膵炎との関与が示唆されている。現在IL-22受容体遺伝子欠損キメラマウスが生まれており、今後、IRF-2とIL-22受容体のダブルノックアウトマウスを作成し合成二重鎖RNAに対しての反応を見ていく予定である。IRF-2遺伝子欠損マウスでは急性出血性膵炎がウイルスだけでなく合成二重鎖RNAの腹腔内投与によっても起こる。そしてDNA microarrayによってIRF-2遺伝子欠損マウスの肺臓において合成二重鎖RNAを投与したときにのみ誘導される遺伝子群の中にIL-22(膵外分泌細胞特異的サイトカイン)が含まれることを同定したことから、IRF-2遺伝子欠損状態での膵臓のIL-22感受性の変化を明らかにすること、そしてIL-22受容体遺伝子とIRF-2遺伝子を二重に欠損したマウスの作成をおこなうことを目標とした。IRF-2遺伝子欠損状態での膵臓のIL-22感受性の変化を検討するためにマウス膵外分泌腺由来細胞株266-6を用いてレトロウイルスベクター(pSUPERretro vector)によるIRF-2 RNAiノックダウン実験をおこなったが選択マーカーであるピューロマイシン耐性細胞の中からIRF-2がノックダウンされた細胞はえられなかった。IRFファミリーの結合

配列であるISREをIL-22のイントロン1に見出しEMSAにてIRF-2遺伝子欠損マウス脾臓で特異的に消失するバンドを同定したが、そのバンドはIRF-2抗体によってもスーパーシフトが起こらなかった。またIRF-2遺伝子欠損マウスにrIL-22を投与しても膵炎の指標となるアミラーゼの上昇は起こらなかった。IL-22受容体遺伝子欠損マウスの作成のためにexon2-exon4の部分をNeo^rのカセットと置換したベクターを構築し、ES細胞E14Kへelectroporationを行い、G418処理で耐性クローンを選択後、耐性クローンの中から相同組み換えが起こったクローンを選択する作業をおこなった。現在までに約800個のG418耐性コロニーのスクリーニングを行い3つの陽性クローンプールを得てクローニング作業を行っているところである。IRF-2遺伝子欠損マウスではウイルス感染や合成二重鎖RNAの腹腔内投与によって急性出血性膵炎が生じる。合成二重鎖RNA腹腔内投与後のIRF-2遺伝子欠損マウスの脾臓においてIL-22、IL-17の発現が増加していることを見出した。放射線照射したIRF-2遺伝子欠損マウスにIRF-2ヘテロマウスの骨髄を移植する骨髄移植実験において、急性膵炎が合成二重鎖RNAを腹腔内投与にて再現されたが、逆の組み合わせでは再現出来なかった。これらの結果は、IRF-2遺伝子欠損マウスでは膵臓組織の障害が膵炎の一次的な原因である可能性を推測させる。現在さらに、IRF-2と、IRF-1、TNF-R、Rag2などのダブルノックアウトマウスを作成し、合成二重鎖RNA誘発性急性膵炎における他の因子との関与の検討を進めているところである。In vitroの系においては、マウス膵外分泌腺由来細胞株266-6で、siRNAにてIRF-2をノックダウンさせ、合成二重鎖RNAやサイトカインとの相互作用の解析をおこなっている。また、266-6細胞よりcDNAライブラリーを作成し、two-hybrid法にてIRF-2と会合する因子の同定を行い、IRF-2のメチル化に関与する可能性の遺伝子を同定したところである。また膵炎に関与するサイトカインであるIL-22の作用にはSTAT3の活性化が重要であることを証明し、更にIRF-2遺伝子欠損マウスの脾臓では合成二重鎖RNAによるSTAT3のDNA結合能やNF-kBのDNA結合能にも違いが認められた。またIL-22RのKOマウスの作成のためのES細胞スクリーニングも進行中であり、現在まで約8000個のコロニーから2個の陽性クローンを見いだしたがランダム挿入も同時におこっていたためコンストラクトの作成からやり直しているところである。
肝再生誘導法の開発を目指した新規分化誘導因子の探索

今後、肝幹細胞の分化・増殖機構を精度の高い解析系を用いて、ひとつひとつ丹念に検証していくとともに、実用化技術の開発に向けた疾患モデル動物における治療効果についても並行して検討する必要がある。単離した肝細胞集団の中から、多能性を持つ肝幹細胞をFACS(Fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた細胞分離法により濃縮・純化し、それらの機能解析を行うことを目的として研究を行った。まず、肝前駆細胞の同定を行い、c-Kit-CD49f+CD29+ CD45-TER119-細胞中に限定して増殖能の高いコロニー形成能を有した前駆細胞が存在し、肝細胞と胆管細胞という異なる細胞系列へと分化し得ることを明らかにした(Hepatology 32(6):1230-1239,2000.)。さらに、c-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-細胞の画分化を段階的にすすめ、自己増殖能をも備えた幹細胞画分を明らかにすることを試みた。その結果、c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+ CD45-TER119-細胞中に限定して増殖能、多分化能、自己複製能、組織再構築能を兼ね備えた肝幹細胞(hepatic stem cell)が高頻度に存在することが判明した。そして、この肝幹細胞の自己複製に必須の液性因子がある細胞株の培養上清中に存在することを明らかにしており、現在タンパク精製によるクローニングを試みている。今後、さらに、この因子の肝幹細胞の分化・増殖・自己複製機構における役割を解析し、「臓器再生治療薬」として有用か否かを検証する予定である。FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により、マウス胎児肝臓から純化された肝幹細胞画分であるc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞を回収し、これらのクローナルな培養系を用いて、肝細胞および胆管細胞への分化誘導能を有する新規サイトカインのスクリーニングを行うことを目的として研究を行った。前年度までに肝幹細胞から胆管細胞への分化誘導能を有するある培養上清を得ていたが、本年度の研究により、この培養上清の特定分子量分画にc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞の増殖抑制活性が限定的に存在することを確認した。この分子量分画には、既知の細胞増殖抑制活性を有するTGFbなどは含まれておらず、新規分子の可能性があるものと考えられた。今後、この培養上清中より活性タンパクを精製しその本体を明らかにする。c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞の培養系における経時的なジーンプロファイリング(発現している数千以上にのぼる遺伝子を網羅的にリストアップすること)を行った。肝再生誘導法の開発を目指した新規分化誘導因子の探索