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統合失調症患者の地域生活に向けた援助の構造に関する研究

<研究目的および実施内容>統合失調症患者の入院中から地域での生活に至る包括的な援助の構造を、時間的な経過をふまえて明らかにすることが最終目的である。具体的には、(1)精神病院及び精神科病棟における看護師の行っている統合失調症患者の退院後の生活に向けたケアについて事例を通して把握し、援助内容と援助の特徴について時間軸という観点から明らかにした。特に、今日、短期入院・短期治療が促進されている現状の中で、短期間で退院することができた事例のケアを分析することによって、看護師がいつの時点から、どのような見通しをもって、地域で生活を送ることが可能となるようなケアを意識的に行なっているのかを明らかにした。(2)地域で生活する統合失調症患者に対して、入院中から現在までの期間を通して行われているケアの実際について明らかにした。<結果および考察>1,対象者および患者の特徴;対象看護師36名、患者;38名、平均年齢38.5歳(2062歳)、男性19名(50.0%)、平均入院回数3.6回(112回)、初回入院13名(34.2%)、今回の入院期間平均64.7日(2094日)、6か月後転帰;地域生活継続26名(68.4%)、再入院後退院1名(2.6%)、通院先変更4名(10.5%)、不明7名(18.4%)2,入院中のケア領域とケア数;〔( )内はケア数を示す〕(1)退院後の過ごし方(83件),(2)困ったことへの対処(22件),(3)服薬管理(48件),(4)精神症状のマネージメント(27件),(5)疾病理解(6件),(6)人との関わり方(23件),(7)家族調整(49件),(8)通院の継続(13件),(9)外出・外泊に伴うケア(45件),(10)他職種との連携(29件)3,ケアの開始時期;退院後の生活に向けたケアは1週目より開始され、入院8週目までに全ケースにおいて開始されていた。最も多くのケアが開始されているのが入院4週60件であった。特に、再入院群は初回入院群に比較してより早期に開始される傾向にあり、再入院では退院後の生活をイメージしたケアを行いやすいと考えられた。初回入院の場合は、より丁寧に患者との信頼関係の形成、および、患者の状況や状態の把握に時間をかけ、じっくり関わりながら地域生活に向けてのケアを展開していく必要がある。<研究目的>精神分裂病患者の入院中から地域での生活に至る包括的な援助の構造を明らかにすることが最終目的である。

特に今年度は,短期間で退院することができた事例のケア内容を分析することによって、看護師がいつの時点から、どのような見通しをもって、地域で生活を送ることが可能となるようなケアを意識的に行なっているのかを明らかにすることを目的とした。<結果および考察>1,研究者が共同して,精神科看護領域において精神分裂病患者の退院に向けての援助ならびに地域での生活を促進するための援助についての文献検討を行い,また,精神科病棟看護師からの聞き取り調査により研究方法を検討した。さらに,調査項目の検討およびインタビューの柱の設定,フィールドの確保を行った。2,インタビュー項目の設定・インタビューガイド・インタビュー記録用紙を作成した。3,調査日よりおおむね6ヶ月以内に,診断名が精神分裂病で入院時になんらかの精神症状を呈し入院期間が3週間以上3ヶ月以内の患者を受け持った経験のある看護師を対象にインタビューを行った。4,この結果,調査用具に関してインタビュー記録用紙の改変の必要性が認められた。5,地域生活に向けてのケアとして,服薬管理・指導;再発の要因として服薬コントロールの不良・薬の飲み忘れ等の怠薬がみられたため,症状マネージメント;前駆症状への対処,デイケア導入等が行われていた。「退院」の判断には【外泊での生活】が一つの要因になることが明らかになった。また,看護師は患者の入院前の生活からセルフケア能力や社会適応能力を判断し,家族の力量も把握して地域生活に結びつけていたことが明らかになった。来年度,さらなるインタビューの分析と,本結果を考慮し対象数を増やして調査・分析する予定である。<研究目的>統合失調症(精神分裂病;以下、「統合失調症」と称す)患者の入院中から地域での生活に至る包括的な援助の構造を明らかにすることが最終目的である。今年度は、短期間で退院することができた統合失調症患者へのケア内容を分析することによって、看護師がいつの時点から、どのような見通しをもって、地域で生活を送ることが可能となるようなケアを意識的に行なっているのかを明らかにすることを目的とした。<実施内容ならびに結果および考察>1,平成13年度の調査をもとに、研究者が協働して調査項目およびインタビューガイドを作成した。2,協力の得られた、原則として急性期包括医療体制を採っている精神科医療機関3施設9病棟において、調査日より概ね6ヶ月以内に、統合失調症の陽性症状により入院し、入院時より3ヶ月以内に退院したか、あるいは退院が決定している患者を受け持った看護師を対象として、インタビューガイドに基づいた半構造的なインタビューを行った。なお、対象者には書面にて了承を得た。3,対象者から語られた事実を録音して逐語的に記述し、その内容を質的に分析することにより、退院後の生活に向けて行われた病棟での看護援助を時間軸の観点から把握することを試みた。4,その結果、入院1週間日から退院に向けたケアを実施していたケースは43.6%であった。さらに、短期入院患者の退院後の生活に向けて行われたケア内容は、主に(1)退院後の過ごし方(2)服薬管理(3)疾病理解(4)精神症状のマネージメント(5)困り事への対処(6)人とのかかわり方(7)家族調整(8)他職種との連携に分類することができた。*なお、「精神分裂病」の名称変更に伴い、来年度からは本研究中の名称を「統合失調症」と変更する。<研究目的および実施内容>統合失調症患者の入院中から地域での生活に至る包括的な援助の構造を明らかにすることが最終目的である。今年度は、(1)短期間で退院することができた統合失調症患者へのケア内容、(2)3か月以内の入院期間で退院した統合失調症患者の予後、(3)退院後6か月以上に地域生活を継続している人の入院中のケア内容を分析することによつて、地域生活を送ることが可能となるようなケアを明らかにした。<結果および考察
ドライブレコーダと脳画像による高齢者の実車運転不安全行動に関する特性の検討

軽度認知障害や高次脳機能障害をもつ高齢ドライバーの自動車運転安全性について、神経心理学的検査、有効視野検査、簡易ドライビングシミュレータ、運転適性スクリーニング検査日本語版とともに、教習所内の実車行動に対する教習指導員の他覚的評価と、そのドライブレコーダー画像を見た作業療法士の事後評価、さらに実車前後の対象者自身の自己評価とを比較検討した。その結果、教習指導員による評価と作業療法士による事後評価とは高い関連性を示した。一方、実車成績が低い対象者は実車前の自己評価が相対的に高く、事後は評価が低下した。本研究を通じて、運転に関する自己評価が適切な運転行動に寄与していることが明らかとなった。背景と目的:健常高齢者および軽度認知機能障害のなかには、「運転に関わる認知機能が低下」し、運転安全性に問題ある者は少なくない。しかし、その実態は十分に把握されていない。そこで、本研究では、1ドライブレコーダを用いて、実車運転行動のデータを解析して定量化2有効視野、運転行動の自己評価尺度などと相関するドライブレコーダのパラメーターを同定3頭部MRI画像の拡散テンソル画像と光トポグラフィを用いて、不安全行動に関する神経基盤を解明以上の観点から、高齢者のための適切な安全運転教育の方略を確立するのが目的である。方法:都内のシルバー人材センターから健常高齢者を募集する。軽度認知機能障害の患者は、慶應義塾大学附属病院精神科から募集する。課題:1高次脳機能と質問紙の評価MMSEと論理性記憶課題を施行。日常生活の実行機能評価と運転行動質問紙などの自記式の質問紙も施行する。2ドライブレコーダの設置と記録車に、2種類のドライブレコーダ(常時記録型とトリガー型)を設置し記録する。3頭部MRIの画像および光トポグラフィおよびVFITドライブレコーダ設置と同時期に施行する。頭部MRIのデータ収集には、3テスラのGE社MRI(慶應義塾大学病院)を用いて拡散テンソル画像の撮影を行う。光トポグラフィは、慶應義塾大学病院臨床検査部に設置されている。VFITは、慶應義塾大学病院外来に設置されたノートパソコンに組み込まれた課題であり、コントローラーなどを用いて、約20分程度の課題を遂行する。結果:平成26年に、以上のような課題を遂行できるように慶應義塾大学病院に検査機器を装備し、慶應義塾大学医学部の倫理委員会にも申請した。現在、被験者を募集できるように準備中である。潜在的に運転行動に問題が生じうる健常高齢者および軽度認知障害者、高次脳機能障害患者に関して、昨年度に引き続き運転能力に関して多角的な評価を継続実施している。健常高齢者に関しては、運転行動の指標となる有効視野(Useful Field of View, UFOV)が眼科的な実用視力(Functional Visual Acuity)と関連することを検証し、UFOVとともに実用視力を評価することが運転能力評価の一助となることを示した。また、軽度認知障害ないし高次脳機能障害のケースに関しては、ドライブレコーダーを用いた実車行動の定量的評価を行うとともに、実車行動による運転安全性と関連する神経心理学的指標に関して検証を進めている。実車の評価とUFOV、トレイルメーキングテストや符号問題などの複雑な注意機能の指標とはやはり関連する傾向にあるが、現在症例数を増やしながら検討中である。これらの運転安全性に関する指標の検討を進めた後、高齢者、軽度認知障害者、高次脳機能障害患者が安全に運転できるためのガイドラインを策定し、それぞれのケースに応じた適切な安全運転教育のための方略を確立していく予定である。上記のデータ収集と併せて、軽度認知障害患者および軽度の認知症患者30例に関しては、臨床的認知症尺度とともに講習予備検査(認知機能検査)とを行い、その関連性を検討した。その結果をもとに、警察庁運転免許課とも、高齢ドライバーが安全に運転できるための基準作成や将来の方策をどのように行っていくべきかについて意見交換を行った。軽度認知障害者の実車による評価にエントリできる症例が少なかった。今後、さらに外来での症例数を増やしていく予定である。運転行動に問題が生じうる高次脳機能障害者と軽度認知障害者を対象に、頭部MRI画像、運転適性に関する神経心理学的検査、有効視野検査(以下VFIT)、簡易ドライビングシミュレータ(以下DS)、新たに開発された脳卒中患者の運転適性スクリーニング検査日本語版(以下J-SDSA)を用いて多面的な運転能力評価を実施した。対象者のプライバシーや倫理上の問題から、実生活と密接につながる市街地走行の路上評価を実施することは困難であり、指定教習所にて実車行動に対する教習指導員の評価、およびドライブレコーダーを用いた作業療法士による事前・事後評価に切り替え、それぞれの関連について検証を行った。対象者の不安全行動を定量的に評価するために、教習指導員の協力を得て運転行動評価表を作成した。この評価表を用いてドライブレコーダー画像での評価を行い、その成績を評価対象者の運転行動に関する自己評価(実車評価の事前、事後の2回実施)と比較し、その関連性を検討した。その結果、教習指導員の評価と、ドライブレコーダーを用いた作業療法士の事後評価は高い関連を示した。また、教習指導員による実車評価成績が低い者は実車評価前の自己評価が相対的に高かったが、実車評価後には低下した。これは、運転に関わる自身の身体および認知機能に不安を感じていない対象者が、その低いリスク知覚の影響で不安全行動を行った結果、実車評価および事後評価ともに低い結果となったものと推測される。

また、頭部MRI画像、神経心理学的検査、VFIT、DS、J-SDSAと実車成績との間には明らかな関連は認めなかった。これは今回の対象者がいずれも神経心理学的検査で一定レベル以上の成績であり、主治医が実車評価を許可した対象者であったためであると考えられた。本研究では、運転に関する自己評価が、適切な運転行動に大きく寄与していることが明らかとなった。軽度認知障害や高次脳機能障害をもつ高齢ドライバーの自動車運転安全性について、神経心理学的検査、有効視野検査、簡易ドライビングシミュレータ、運転適性スクリーニング検査日本語版とともに、教習所内の実車行動に対する教習指導員の他覚的評価と、そのドライブレコーダー画像を見た作業療法士の事後評価、さらに実車前後の対象者自身の自己評価とを比較検討した。その結果、教習指導員による評価と作業療法士による事後評価とは高い関連性を示した。一方、実車成績が低い対象者は実車前の自己評価が相対的に高く、事後は評価が低下した。本研究を通じて、運転に関する自己評価が適切な運転行動に寄与していることが明らかとなった。頭部MRI画像の拡散テンソル画像と光トポグラフィなどによる準備は達成できたが、実車による評価検討の準備が遅れている。実車による評価検討の遂行を行い、患者データベースを構築していく予定である。老年精神医学実車による評価検討の遂行が可能なように準備を行い、平成27年度以降もひきつづき調査を継続し、患者データベースを構築していく。実車を用いた評価検討のリクルートが遅れて遅れたため27年度に使用予定としていた経費が当初の予定より少なくなったため実車評価準備が遅れているため関係する予算の執行に至らなかった。平成28年度は実車を用いた評価検討及びその解析を行うことにより資金執行を予定している。平成27年度は実車評価を行うことにより、評価期間への支払いおよび、得られた評価についての事務処理、解析等を行う際の資金とする。
HMGA2がん遺伝子を標的とした新規治療法の開発

我々はHMGA2遺伝子が高発現している胎児型横紋筋肉腫(以下ERMS)の細胞株におけるHMGA2の機能解析を行った。HMGA2の発現抑制によりERMS細胞株の増殖抑制、G1期細胞周期停止、筋分化の促進が生じた。次にHMGA2とDNAの結合を阻害すると予想されるnetropsinの抗腫瘍効果を検討した。3種類のERMS細胞株でIC50は、それぞれ148、158、87microMであった。ERMS細胞株の異種移植腫瘍に対し、netropsinは用量依存的に抗腫瘍効果を示した。これらの結果からHMGA2はERMS細胞株の造腫瘍性に関与しており、netropsinが抗腫瘍効果を有することが示唆された。HMGA2遺伝子は、様々ながん腫、肉腫でがん遺伝子として働くことが証明されており、一方で正常組織での発現は胎児期に限られている。したがって、HMGA2遺伝子を阻害することにより、悪性腫瘍の増殖を阻害し、かつ、副作用の少ない治療が可能であると予想される。本検討でHMGA2高発現腫瘍のモデルとする胎児型横紋筋肉腫は、小児で最も頻度の高い軟部悪性腫瘍で、組織型は胎児型(ERMS)と胞巣型(ARMS)に大別される。近年、HMGA2遺伝子はERMSにおいて発現が高く、また核内での免疫染色陽性所見はERMSに特異的で、病理組織学的にARMSとの鑑別診断に有用であることが明らかとなった(Davicioni E, et al. 2009)。以上の背景より、我々は、HMGA2がERMSの造腫瘍性や増殖、分化の阻害に関与していると仮定し、ERMSをHMGA2高発現腫瘍のモデルとして、HMGA2の機能解析を行い、以下を明らかにした。1.HMGA2強制発現により筋芽細胞株が造腫瘍性を獲得する。2.HMGA2ノックダウンにより横紋筋肉腫の分化が促進される。3.ERMSにおいて、HMGA2ノックダウンにより増殖抑制とG1期細胞周期停止を引き起こす。さらに、HMGA2阻害剤であるnetropsinのin vitroでの増殖に及ぼす影響について検討を行ったところ、RD、RMS-YM、Rh18細胞株において、IC50が148、158、87microMであった。またヌードマウスのERMS細胞株の異種移植腫瘍に対し、netropsinは用量依存的に抗腫瘍効果を示した。本検討でHMGA2高発現腫瘍のモデルとする横紋筋肉腫は、小児で最も頻度の高い軟部悪性腫瘍で、組織型は胎児型(ERMS)と胞巣型(ARMS)に大別される。近年、HMGA2遺伝子の核内での免疫染色陽性所見はERMSに特異的で、病理組織学的にARMSとの鑑別診断に有用であることが明らかとなった。以上の背景より、我々は、HMGA2がERMSの造腫瘍性や増殖、分化の阻害に関与していると仮定し、ERMSをHMGA2高発現腫瘍のモデルとして検討を行った。HMGA2は3つのAT hookを有し、DNAのAT rich領域に結合して転写因子の結合能を変化させる、転写共役因子である。netropsinはHMGA2と競合的にDNAのAT rich領域に結合することでHMGA2を阻害すると考えられている。H27年度は、netropsinの抗腫瘍効果がHMGA2とDNAの結合阻害に由来するものかの検討を行った。HMGA2が結合・転写活性を行う遺伝子として、筋芽細胞の増殖に関わるIGFBP2遺伝子が報告されている。われわれは、netropsin投与前後でのHMGA2とIGFBP2遺伝子の結合能の変化を定量的ChIP-PCR法を用いて比較することを試みた。しかし、コントロールとなるnetropsin投与前のHMGA2とIGF2BP2遺伝子の結合がPCRで検出できなかった。検体のDNA量やChIP-PCRに用いるプライマー設計の検討が必要と考えられた。研究期間全体を通して、ERMSにおけるHMGA2の機能解析を行い、増殖や分化の阻害に関与していることを明らかにした。本研究では、以下の項目の検討を予定している。現在、134の検討の一部を終了しており、概ね順調に進んでいる。小児がん本検討では、胎児型横紋筋肉腫をHMGA2高発現腫瘍のモデルとして、HMGA2とDNAの結合を阻害する抗生物質であるnetropsinの抗腫瘍効果を検討し、HMGA2阻害剤を臨床応用することを最終目標とする。

これまでの検討から胎児型横紋筋肉腫におけるnetropsinの抗腫瘍効果はあると考えられ、この抗腫瘍効果がnetropsinによるHMGA2とDNAの結合阻害に由来するものかの検討が必要であり、今後、これを中心に検討を進める。
伸展刺激における膀胱上皮から排尿筋・DRGへの細胞間シグナル伝達機構の解明

膀胱上皮培養細胞を用いたin-vitroの実験系では、膀胱上皮がTRPV4を介して伸展刺激を感知し、改めてメカノセンサー分子であることを再確認した。また伸展刺激により膀胱上皮細胞が情報伝達物質としてATP放出し、求心路へシグナル伝達することを明らかとし、なかでも開口放出経路がそのATP放出に主に関与していることを発見した。以上の研究結果により、蓄尿時において膀胱上皮はTRPV4分子などのセンサーを介して伸展刺激を感知し、ATPなどの神経伝達物質を放出することで排尿筋やDRGへシグナル伝達を行い、その結果、尿意としての知覚ならびに排尿筋の安定に寄与しているのではないかと考えられた。これまでの研究でマウス膀胱上皮細胞は伸展刺激に応答し、ATP放出を行うことが確認された。我々は「蓄尿時の膀胱伸展→膀胱上皮が伸展刺激を感知→ATPなどのmediatorを放出→求心性神経や排尿筋にシグナル伝達」という仮説を立て、尿意のメカニズムや排尿筋過活動の病態解明に向け精力的に研究を続けている。1.マウスから膀胱上皮細胞・平滑筋細胞・DRG細胞をそれぞれ酵素処理にて単離し、培養細胞系を樹立。膀胱上皮細胞およびDRG細胞は初代培養細胞のみをその都度作成し、以後の実験に用いる。膀胱平滑筋細胞については継代が可能なため、cell lineとして用いる。2.各種培養細胞に対し形態的ならびに機能的な発現に問題がないかどうかを遺伝子レベル・タンパクレベルで再確認。具体的にはCK7(上皮マーカー)・α-SMA(筋性マーカー)・S-100(神経マーカー)を各々RT-PCR法や免疫染色(蛍光抗体法)でそれらの発現を確認している。3.ストレッチチャンバー上に膀胱上皮培養細胞を播種させ、伸展刺激を加える前と後でのチャンバー内solutionに含まれる物質について、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で成分分析を実施し、定量化を行い、刺激前後での神経伝達物質を解析中である。これまでの研究成果としてマウス膀胱上皮細胞は伸展刺激に応答しATP放出を行うことが証明された。我々は「蓄尿時の膀胱伸展→膀胱上皮が進展刺激を感知→ATP等のmediatorを放出→求心性神経や排尿筋にシグナル伝達」という仮説を建てて、尿意のメカニズムや排尿筋過活動の病態解明に向け精力的に研究を続けている。1.マウスから膀胱上皮細胞・平滑筋細胞・DRG細胞をそれぞれ酵素処理にて単離し、各々培養細胞を樹立。膀胱上皮細胞及びDRG細胞は初代培養細胞のみをその都度作成し、以後の実験に用いている。膀胱平滑筋細胞については継代が可能なため、cell lineとして使用中である。2.各種培養細胞に対し形態的ならびに機能的な発現に問題がないか否かを遺伝子レベル・タンパクレベルで再確認。具体的にはCK7(上皮マーカー)・α-SMA(筋性マーカー)・を各々RTーPCR法や免疫染色(蛍光抗体法)でそれらの発現を確認した。3.ストレッチチャンバー上で膀胱上皮細胞を播種させ、伸展刺激前後のチャンバー内solutionに含まれる物質について高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で成分解析を行った。4.現在、培養細胞間のシグナル伝達について、パッチクランプやカルシウムイメージングを用いそれぞれの伝達物質の関与を調べている。PCRや免疫染色などの生化学的実験はほぼ終了しているが、伸展刺激での生理実験データが未だ不十分。昨年までは、各種培養細胞の状態が安定していなかったためであったが、現在は解決。しかしながらノックダウン効果にばらつきがあり、再現性に乏しいため更にデータの蓄積を要す。我々は「蓄尿時の膀胱伸展→膀胱上皮が伸展刺激を感知→ATPなどのmediatorを放出→求心性神経や排尿筋にシグナル伝達」という仮説を立てて、尿意のメカニズムや排尿筋過活動の病態解明に向け分子レベルで研究を行ってきた。1.マウスから膀胱上皮細胞・平滑筋細胞・DRG細胞をそれぞれ酵素処理にて単離し、各々培養細胞系として樹立。膀胱上皮細胞及びDRG細胞は初代培養細胞のみをその都度作成。膀胱平滑筋細胞については継代が可能なためcell lineとして使用した。2.各種培養細胞に対し形態的ならびに機能的な発現に問題がないか否かを遺伝子レベルやタンパクレベルで再確認した。3.ストレッチチャンバー上で膀胱上皮細胞を播種させ、伸展刺激後のチャンバー内solutionに含まれる物質についてHPLCで成分分析を行った。4.培養細胞間のシグナル伝達について、パッチクランプやカルシウムイメージングを用いそれぞれの伝達物質の関与を調べた。(結果)膀胱上皮から放出される伝達物質のうちATPはDRGや平滑筋に対し促進的に作用することが判明した。一方NOやAchは逆に抑制的に働くことが証明された。以上より、蓄尿時には膀胱伸展に伴い様々な伝達物質が放出されることが分かり、これらのシグナル伝達系の異常により過活動膀胱膀胱などの病態が引き起こされる一因となりうることが推測される。

以上の研究結果により、蓄尿時において膀胱上皮はTRPV4分子などのセンサーを介して伸展刺激を感知し、ATPなどの神経伝達物質を放出することで排尿筋やDRGへシグナル伝達を行い、その結果、尿意としての知覚ならびに排尿筋の安定に寄与しているのではないかと考えられた。PCRや免疫染色などの生化学的実験はほぼ終了しているが、伸展刺激での生理実験データがいまだ不十分。理由として、各種培養細胞の状態が未だ安定しておらず、再現性のあるデータが得られていない。今後の対策として、培地を変更するなど諸条件を整えていくよう検討中である。現在、パッチクランプやカルシウムイメージングを用いた生理実験を中心に実験を行っている。予備実験で得られたデータをもとに予想されたmediatorに対しノックダウンや各種inhibitorを適宜用いて、それらの効果につき検証していく。最終的には上皮から放出された伝達物質のうち、平滑筋やDRGに対してそれぞれ何が最も重要な役割を担っているのかを明らかとする。排尿生理学次年度以降は、本実験として平滑筋培養細胞ならびにDRG培養細胞が、上皮から放出されたmediatorにどのように応答するかを電気生理学的解析により検証する。また、前年度までに得られた予備実験でのデータを参考にし、予想されたmediatorに対しノックダウン法や各種inhibitorを適宜用いて、それらの効果についても同様に検討していき、最終的には上皮から放出された伝達物質のうち、平滑筋やDRGに対してそれぞれ何が最も重要な役割を担っているのかを明らかとする。購入予定の物品費等が安価におさえられた為、繰越金が生じた。新規物品購入費が当初の見積りよりも安価に抑えられたため、上記のような繰越金が生じる結果となった。最終年度は、遅れている実験のデータ解析等で多くの消耗品が必要となる為繰越金で補填する予定である。次年度以降は、当初の予想より、より多くの消耗物品が必要と見込まれるため、当該繰越金にて補填する予定である。
ミクスト・リーガル・システム研究序説-日本法の比較法的再定位と実践的再構成

コモン・ローとシヴィル・ローの混合を問題とするミクスト・リーガル・システムに対する研究蓄積を日本法の考察に反映すべく、その基本概念、方法論、代表的地域における法の展開を検証した。これに基づいて、法技術的な比較を通して日本法を再定位するための方法的試論を発表し、さらに実証的な比較論へと議論を進めるために対象とすべき法概念・法制度の選定を行って、各論的考察を開始した。本基盤研究の目的は、コモン・ローとシヴィル・ローの「混成」法システム即ち「ミクスト・リーガル・システム(Mixed Legal System)」に対する最近の研究を批判的に吟味することを通じて、日本法の比較法上の位置と特徴の一端を明らかにするともに、日本法を英語で説明・発信するための教材を準備することである。本年度は、第一に、ミクスト・リーガル・システムのキーであるローマン・ダッチ・ローについて、その資料調査を行った。特に英国における調査に際し、オランダのローマ法資料、とりわけ17世紀、18世紀の裁判資料に関する文献について、オクスフォード大学B.Sirks教授の貴重な助言・協力を得ることができた。第二に、南アフリカ法について資料収集・資料情報の整理を行った。これについては、英国における資料調査の際、ケンブリッジ大学J.Allison博士の協力の下に作業を進めた。第三に、日本法をミクスト・リーガル・システムとしてとらえる枠組みを明らかにすべく、理論的探求を進め、「diffusion of law」、「法の界面」概念を用いた試論を発表して内外に批判を仰いだ(葛西「法の界面活性」NBL900号)。第四に、日本法を英語で発信するための準備・試みとして、ドイツにおける学会報告を英語で行った(松本"Reception of German Law in Japan")。第五に、ミクスト・リーガル・システムの視点を活かした日本人を読者とするコモン・ロー入門書の編集について、ケンブリッジ大学教授ジョン・ベイカー卿と協働し、執筆者との具体的な相談を進めた。本研究「ミクスト・リーガル・システム研究序説-日本法の比較法的再定位と実践的再構成-」は、コモン・ローとシヴィル・ローの「混成」法システム、即ち「ミクスト・リーガル・システム(Mixed Legal System)」に対する最近の研究を批判的に吟味することを通じて、日本法の比較法上の位置と特徴の一端を明らかにするともに、日本法を英語で説明・発信するための教材を準備することを目的とする。かかる目的のために、ミクスト・リーガル・システムについて日本法との比較を行う基礎を構築するためには、同システムについての理論的な探求と、実際の法システムについての具体的な検証とが必要となる。本年度は、第一に、ミクスト・ジュリスディクション国際協会事務局のあるアメリカ合衆国テュレーン大学法学部を訪ね、協会長パーマー教授、ヤノプルス教授、フェトケ教授らと面談し、ルイジアナ法についての貴重な知見を得ると同時に、日本法への方法論の適用に関して議論し、日本における研究会の企画を具体化した。第二に、南アフリカ法についてケンブリッジ大学J.Allison博士と意見交換を行い、調査計画を具体化することができた。第三に、日本法をミクスト・リーガル・システムとしてとらえる枠組みを明らかにすべく理論的探求を進あ、「diffusion of law」、「法の界面」概念を用いた試論を日英両語で発表して内外に批判を仰いだ。第四に、日本法を英語で発信するための準備・試みとして、名誉棄損に無点を当て、英語による発表を研究代表者・分担者共同で行った。第五に、ミクスト・リーガル・システムの視点を活かした日本人を読者とするコモン・ロー入門書の編集について、ジョン・ベイカー教授、ブラント博士、イベトソン教授、ハルセボッシュ教授らと検討を進めた。本年度は、「ミクスト・リーガル・システム(Mixed Legal System;あるいはミクスト・ジュリスディクションMixed Jurisdiction)」に対して1)スコットランドにおける調査(Edinburgh大学)2)米国ルイジアナにおける調査(Tulane大学)3)南アフリカにおける調査(Stellenbosch大学、Cape Town大学、South Africa大学、Pretoria大学)を行い、各大学において、ミクスト・リーガル・システム研究方法論をめぐる論争に対する日本法の貢献の可能性について発表および意見交換を行った。方法論を巡ってはミクスト・リーガル・システムをコモン・ローとシヴィル・ローの混合と定義するアプローチと、より広く様々な法の混合と定義するアプローチの間での議論がさかんであるが、前者を採用して日本法をMLSとして考察する可能性を具体的に示し、むしろ狭義の概念による方が厳密かつ双方向の比較がおこないやすい面がある、という試論を展開した。加えて4)イングランドにおいて集中的にコモン・ロー法源論を中心とした探求を進め5)オクスフォード、ケンブリッジ両大学のMLSに関する蔵書調査を行うと共に6)MLS研究にとって不可欠なコモン・ロー理解について、日本人ジュリスト向けの教科書作成の準備を進めた。以上を通じて、さらに研究を深化させるための海外研究協力体制が強化れ、序論の次の段階として焦点を当てるべき論点(法源、衡平、信託、名誉毀損等)が明確になった。
暖地型マメ科牧草の耐湿性機構解明並びに水田を活用した良質粗飼料生産基盤の確立

湛水下での植物体の耐湿性機構を解明するため,湛水条件下の根での代謝産物の動態を調査した。湛水条件下(嫌気条件下)のGlennにおいては,耐湿性の低い植物の根でみられるようなエタノールの蓄積は認められなかった。また,耐湿性の高い植物でみられるような代謝産物はGlennでは認められず,これらと異なる代謝経路をもっている可能性が示唆された。マメ科牧草を組み入れた水田での飼料用イネの栽培管理・利用法の検討14年度に続き,乾田直播栽培において飼料用イネとしての利用が有望視されているテテップ及び浮イネ(FRC14)と耐湿性の高いマメ科牧草Glenn及びファジービーン(Pb)との混作が乾物収量,可消化乾物収量及び粗タンパク質収量に及ぼす影響について調査検討した。15年度は多肥栽培(慣行栽培の約1.5倍の施肥)を行ったため14年度と同様の混作による乾物収量,可消化乾物収量及び粗タンパク質収量の増加効果は認められなかったが,混作区では,光を効率的に利用できるような群落が形成されることが示された。飼料イネ(テテップ)ロールベールサイレージ及びPbを混合した飼料イネ(テテップ)ロールベールサイレージを乳牛へ給与し,採食量,体重,乳量,乳質,ルーメン液,血液性状等を調査した。対照サイレージとして給与したイタリアンライグラスサイレージと同程度の採食量,体重,乳量,乳質,ルーメン液,血液性状等を示したが,供試牛が少なかったこと及び調査期間が短かったことなどから,更なる検討が必要と思われた。マメ科牧草と飼料用イネを混作する場合,栽培条件,イネ品種により群落生産構造,収量等に及ぼす影響が異なり,更なる品種選定,栽培管理法等の検討が必要である。湛水下での植物体の耐湿性機構を解明するため,湛水条件下での根の非構造性炭水化物の動態を調査し,湛水条件下(嫌気条件下)では根の可溶性炭水化物(単少糖)及び貯蔵性炭水化物(デンプン)含量が低下することが認められ,呼吸基質である光合成産物を多量に消費するものと思われた。マメ科牧草を組み入れた水田での飼料用イネの栽培管理・利用法の検討飼料用イネとしての利用が有望視されている西海203号,テテップ及び浮イネ(FRC14)とサイレージの発酵品質が良好で,耐湿性の高いマメ科牧草ファジービーン(Pb)との混作が乾物収量,可消化乾物収量及び粗タンパク質収量に及ぼす影響について調査検討し,乾田直播栽培においてPb・西海混作は西海単作と同程度の乾物収量及び可消化乾物収量を示し,粗タンパク質収量では西海単作より有意に高い値となることが認められた。Pb・FRC14混作はFRC14単作より有意に高い乾物収量,可消化乾物収量及び粗タンパク質収量となることが認められた。混作では,光を効率的に利用できるような群落が形成され,収量を高めていた。Pbを混合した飼料イネサイレージではpHが低下する傾向が認められたが,発酵品質は飼料イネ単独サイレージと同様であった。ヤギを用いた嗜好性試験において,Pb・西海混合サイレージの採食量は西海単独サイレージと同程度であったが,Pb・テテップ混合サイレージではテテップ単独サイレージより有意に高い採食量を示した。マメ科牧草と飼料用イネを混作する場合,イネ品種により群落生産構造,収量等に及ぼす影響が異なり,更なる品種選定,栽培管理法等の検討が必要である。

マメ科牧草と飼料用イネを混作する場合,栽培条件,イネ品種により群落生産構造,収量等に及ぼす影響が異なり,更なる品種選定,栽培管理法等の検討が必要である。
組織器官誘導性生体移植材料の開発

本プロジェクトではHAPをフレームワークとして使用したHAP-BMP複合体ならびに人工膜-BMP複合体は組織器官誘導性生体移植材料として骨、軟骨誘導が可能である事が判明した。ただし、HAPを芯材として使用した移植体の外側は平滑かつ突起部分が無い形状が有利である事が本実験結果から示唆されており、組織器官誘導性生体移植材料にHAPを使用する場合には可及的に滑らかな表面仕上げをすると共に鋭角部調整を行なう事が重要である。内側性空洞を有する円筒形HAPの骨形成は内部空洞内では生じにくいという結果が得られており、何らかの別のファクターが関与しているものと推定される。したがって、血管誘導因子等、他のサイトカインが骨形成における補助因子である可能性が示唆され、今後の研究指針にとり有力な情報が得られた。人工膜材料はいずれも新生骨誘導を行なう事がin vivoで確認され、GTR法などに応用する可能性はきわめて高いと考えられる。吸収性人工膜の場合には培養系では軟骨誘導が難しく、この系を臨床応用するにはまだ基礎研究が必要と考えられる。アセテート膜を使用した実験ではこれまで、1例しか報告例がなかったが、本プロジェクトでは人工膜上の器官培養による軟骨誘導が達成され、大きな収穫を得た。この系はin vitroにおいては軟骨誘導に留まり、新生骨誘導を行なう事が不可能であるが、培養系から、in vivoに移す事により生体内で新生骨誘導を行なう事が可能であると推定される。このように一連の実験から組織器官誘導性生体移植材料として、HAP-BMP複合体、人工膜-BMP複合体の2種を得る事ができ、また、これらの材料を臨床応用する上での重要な情報を蓄積する事ができた。本年度はまず当初の計画に従いBMPの大量生産を行なった。現在部分精製BMPを5g製作する事ができ、このうち500mgを水溶性化した。この水溶性BMPはきわめて生体内で溶解性が大きく、単独移植では容易に血流等により運び去られ活性を発揮しないことが判明したため、キャリアーの選択を行なった。これまでに、コラーゲン類のキャリアーを使用していたが、今年度はポリサッカライドの使用を始め、良好な成績を得ている。人工合成のBMPの作成は系を樹立しているが、その生産品はきわめて生理活性が低く、いまだ本実験には使用する事ができてはいない。他のサイトカインの分離に関しては、部分精製BMP中の分子量4万付近の分画がオステオネクチンであることを同定した。現在、オステオネクチンとBMPとの相互作用について実験中である。ポリクロナール、モノクロナール両抗体の作成を行ない現在そのタイターを確認中である。ポリクロナール抗体はELISAレベルではBMP合成ペプタイド、並びに部分精製BMPに対する反応を確認している。この抗体を使用して来年度はBMPの精製にとりかかり、高精製BMPを抽出する予定である。メッシュ金属の鋳造にはAu-Pt-Ta合金を使用し、良好な鋳造体を得ることができた。予備的な複合実験を部分精製非水溶性BMPで行なった結果では、新生骨を誘導する複合材料を作成することに成功している。来年度は他のサイトカインとの複合も行ない、骨組織以外の組織器官の誘導も試みる予定である。本年度は昨年度と同様BMPの大量生産を行った。現在、部分精製BMPを年間5g安定製作する事を可能としており、このうち1gを水溶性化した。キャリアーの実験を引き続き行ないポリサッカライドの骨形成能上昇が著しい事が判明した。このため水溶性BMPの保持材としてPindex#100を使用し、生体内部で安定した新生骨誘導を得ることができるようになった。さらにPindexに対して、合成ハイドロキシアパタイトを含有させ強度を上昇させると共に局所におけるリン酸カルシウム濃度の上昇を図りより安定した新生骨形成を試みた。

昨年度作成した抗体をディテクターとして使用しrecombinantBMPの生産を試みた。その結果きわめて少量のBMPを得ることができたが、天然抽出BMPと比較してその活性度はきわめて低かった。これらのBMPを元にin vitroにおける軟骨誘導を行ない、人工膜上において安定した軟骨誘導を行なうことができた。さらに生体内部におけるスキャフォールドの形態を模索し、金属メッシュ、セラミック中空チューブにBMPを結合しその新生骨形成能を調べた。その結果メッシュ状あるいは多孔質材料においては新生骨誘導はきわめて良好であるが、中空の形状では新生骨形成が著しく阻害されることが判明した。このように生体内部で新生骨誘導を行なう手法については最終段階に近づいていると考えられ、さらに研究を続行する事により単に新生骨を誘導する材料の開発のみならず、骨系の組織を体内で培養する事が可能な技術の開発にもつながるものと考えられる。
膵癌におけるp16遺伝子異常の検索と膵液を用いたその臨床的応用

私は、膵液中のK-ras変異の検索が膵癌診断に有用であることを報告してきたが、p53分析を加えても陽性率は100%になるわけではなく、さらに特異性の高い遺伝子を分析の対象に加えることが望まれる.p16は、cyclin dependent kinase(CDK)インヒビターをコードする癌抑制遺伝子として注目され、膵癌培養細胞株では高頻度に不活性化されていると報告されている。手術ないしは剖検で得られた膵癌62例、嚢胞腺種8例、慢性膵炎20例、正常膵6例のパラフィン包埋切片に対してp16モノクローナル抗体(G175-405)を用いた免疫染色の検討では、膵癌で41.9%(26/62)にp16蛋白発現の欠失がみられ、膵癌は慢性膵炎に比較してp16蛋白発現の欠失が有意に高率であった(p<0.01)。さらに、膵癌の組織学的分化度でも、中.低分化度(G2,G3)は高分化度(G1)に比してp16蛋白発現の欠失は有意に高率であった(p<0.01)。しかし、膵癌の各臨床病理学的事項とp16蛋白発現の有無を比較しても有意差はみられなかった。一方、膵癌組織のp16免疫染色性すなわち蛋白発現の低下した領域をmicrodissection法にて区分し、DNAを抽出した。p16遺伝子の3つのエクソンに対応するプライマーを用いてPCRを行ない、homozygous deletionの有無を判定した。膵癌26例中エクソン1では5例(19.2%)に、エクソン2では6例(23.1%)にPCR産物の欠損が認められたが、エクソン3には認められず、合計すると26例中9例(34.6%)にhomozygous deletionが認められた。さらに、PCR産物が得られた17例については、PCR-SSCPによりp16の突然変異の有無を検索したが、明らかなmutationを認めたものはなかった。最近、p16蛋白発現低下の原因のひとつにCpG island領域のmethylationの関与が示唆されており、現在、p16のmethylationについても検索中である。また、ヒト膵液中のp16変異の検討については、正常膵管上皮が多量に含まれている膵液中では、homozygous deletionの検討は困難であることから、p16のmutationの有無につき検討を行っているが、現在のところ、明らかなp16mutation陽性症例はみられていない。私は、膵液中のK-ras変異の検索が膵癌診断に有用であることを報告してきたが、陽性率は80%を越えるものの、偽陽性もかなりみられ、癌特異性が問題となっている。最近、K-ras変異の定量化により癌特異性の向上が得られることを報告したが、p53分析を加えても陽性率は100%になるわけではなく、さらに特異性の高い遺伝子を分析の対象に加えることが望まれる。

p16は、cyclin dependent kinase (CDK)インヒビターをコードする新しい癌抑制遺伝子として注目され、膵癌培養細胞株系では高頻度に不活性のみられることが報告されている。そこで、まずヒト膵癌組織において免疫染色によりp16蛋白発現の欠失程度を検討した。手術ないしは剖検で得られた膵癌62例、嚢胞腺腫8例、慢性膵炎20例、正常膵6例のパラフィン包埋切片に対してp16モノクローナル抗体(G175-405)を用いた免疫染色の検討では、正常膵6例と慢性膵炎1例を除く19例ではp16蛋白の発現がみられた。一方、嚢胞腺腫で37.5%(3/8)、膵癌で41.9%(26/62)にp16蛋白発現の欠失がみられ、膵癌は慢性膵炎に比較してp16蛋白発現の欠失が有意に高率であった(p<0.01)。さらに、膵癌の組織学的分化度でも、中・低分化度(G2,G3)は高分化度(G1)に比してp16蛋白発現の欠失は有意に高率であった(p<0.01)。しかし、膵癌の年齢、性別、臨床病期、腫瘍局在部位、切除可能の有無に分けてp16蛋白発現の有無を比較しても有意差はみられなかった。但し、p16蛋白発現欠失群の方が発現群に比して、有意差は認められないものの、生存期間の短縮や多臓器転移を生じやすい傾向がみられた。一方、免疫染色にてp16蛋白発現の低下した部位をmicrodissection法を用いて分離し、それよりDNAを抽出した。p16遺伝子のExon1,Exon 2A,2B,2C,Exon 3に対応するプライマーを設定し、PCR-SSCPにてp16遺伝子レベルにおける欠失や突然変異の有無の頻度を現在検索中である。また、膵液についても、同様に臨床診断に有用か否かを検索中である。私は、膵液中のK-ras変位の検索が膵癌診断い有用であることを報告してきたが、p53分析を加えても陽性率は100%になるわけではなく、さらに特異性の高い遺伝子を分析の対象に加えることが望まれる。p16は、cyclin dependent kinase(CDK)インヒビターをコードする癌抑制遺伝子として注目され、膵癌培養細胞株では高頻度に不活性化されていると報告されている。手術ないしは剖検にて得られたヒト膵癌の組織において、p16モノクローナル抗体を用いた免疫染色により、膵癌組織のp16免疫染色低下すなわち蛋白発現の低下した領域をmicrodissection法にて病変を区分し、DNAを抽出した。p16の3つのエクソンに対応するプライマーを用いてPCRを行い、homozygous delectionの有無を判定した。膵癌26例エクソン1では5例(19.2%)に、エクソン2では6例(23.1%)にPCR産物の欠損が認められたが、エクソン3には認められず、合計すると26例中9例(34.6%)にhomozygous deletionが認められた。現在、DNAシークエンスでも確認中である。さらに、PCR産物が得られた17例については、PCR-SSCPによりp16の突然変異の有無を検索したが、明らかなmutationを認めたものはなかった。最近、p16蛋白発言低下の原因のひとつにCpGisland領域のmethy lationの関与が示唆されており、現在p16のmethylationについても検索中である。一方、ヒト膵液中のp16変異の検討については、正常膵管上皮の剥離細胞成分が多量に含まれている膵液中では、homozygous deletionの検討は困難であることから、p16のmutationの有無につき制限酵素を用いた検討を行っている。現在のところ、明らかなp16mutation陽性症例はみられていない。
ケミカルバイオロジーによるエストロゲン陽性乳癌の病因解明と化学予防法の開発

本邦において乳癌の罹患率は増加傾向にあり、その病因解明と化学予防法の確立は喫緊の課題である。本研究においてまずエストロゲンレセプター(ERα)陽性乳癌の増殖を抑制し、かつ細胞増殖に本質的な役割を担うcyclin D1の発現を低下させる化合物3種を見出した。次にこれら3化合物共通の結合タンパク質としてミトコンドリア内膜タンパク質ANT2を同定した。さらにANT2はcyclin D1をmRNA及びタンパク質レベルにおいて多面的に制御している可能性について示した。以上より、ANT2を標的とした癌予防は、乳癌をはじめとしたcyclin D1を過剰発現する多くの癌腫に対し、有望な戦略であると期待される。まずヒト乳癌細胞株MCF7に対し、細胞増殖抑制効果をもたらし、かつエストロゲンレセプター(ERα)の発現を下方制御する化合物のスクリーニングを行い、既に交付申請書内で示したセサミノールとペリリルアルコール以外に、PPARγアゴニストとして知られるトログリタゾンを見出した。次に、これら3化合物各々を、ケミカルバイオロジーの手法を用いてナノ磁性ビーズに固定化し、MCF7細胞抽出液を反応させることで、各化合物の結合蛋白質を精製した。精製した各結合蛋白質を質量分析計を用いて解析したところ、これら3化合物共通の結合蛋白質としてXを同定した。Xは細胞のエネルギー代謝の調節維持に重要な役割を果たす蛋白質で、癌細胞においては過剰発現していることが知られているが、これら3化合物がこのXに結合することは新規の発見である。さらに、Xの機能解析として、MCF7にsiRNAを形質導入してXの発現を抑制したところ、有意な細胞増殖抑制効果とG1期停止が確認された。続いて、siRNAによるXの発現抑制によるERα発現への影響について解析したところ、XをノックダウンしてもERαの発現に変化はみられなかった。この結果はERα陽性乳癌細胞において、ERα以外に、細胞増殖や細胞周期進行に影響をもたらす別の重要な分子Yが存在することを示唆し、あらたな予防標的分子の発見につながることも期待されるため、研究方針を修正し、Yの同定を優先することとした。siRNAによりXをノックダウンした際に発現抑制を認める分子について、G1期関連蛋白質を中心にスクリーニングしたところ、乳癌を含む多くの癌で過剰発現している癌遺伝子産物Yを特定した。この結果は、XがYの発現を正に制御する上流分子として機能し、癌細胞の増殖に重要な役割を果たす可能性を示す新規発見である。現在、XがYを制御する分子メカニズムについて検証中である。本研究はエストロゲンレセプター(ERα)陽性乳癌の増殖を抑制する食品成分や化合物をスクリーニングし、ケミカルバイオロジーの技術を駆使して、それらの化合物共通の結合タンパク質を同定し、乳癌の化学予防法実現に向けた分子基盤の確立を目標とするものである。第1段階として、ERα陽性ヒト乳癌細胞株MCF7に対し、ERαの発現を抑制し、かつ増殖抑制効果をもたらす化合物として、セサミノール、ペリリルアルコール、トログリタゾンの3化合物を見出した。第2段階として、それら3化合物共通の結合タンパク質として、MALDI-TOF MSによりミトコンドリア内膜タンパク質として知られるANT2を同定した。第3段階として、siRNAの手法を用いて乳癌細胞内におけるANT2の機能解析を行った。siANT2処理により、MCF7はG1期停止および細胞増殖抑制効果を示した。さらにsiANT2処理により、乳癌を含む多くの癌で過剰発現しているcyclin D1の発現量が減少することを発見した。その詳細なメカニズムとしてsiANT2により、(1)cyclin D1 mRNAが減少すること、(2)cyclin D1 mRNAの翻訳に重要なmTORC1経路を抑制すること、(3)プロテオソーム依存的にcyclin D1タンパク質の発現が減少することを見出し、ANT2による多様なcyclin D1制御機構を明らかにした。さらにセサミノールおよびトログリタゾンは、これらsiANT2と同様の作用機序を有することが明らかとなり、これらの化合物がANT2と結合することでその機能を阻害している可能性が示唆された。研究計画の第1段階として、ERα陽性乳癌細胞に対し、細胞増殖抑制効果をもたらす化合物のスクリーニングは終了し、セサミノール、ペリリルアルコール、トログリタゾンの3種をヒット化合物として絞り込めた。第2段階として、ケミカルバイオロジーの技術を用いて、それら3化合物共通の結合蛋白質Xを同定しえた。第3段階として、結合蛋白質XをsiRNAを用いて発現抑制することにより、乳癌細胞に対し、G1期停止および細胞増殖抑制効果をもたらすことを確認した。さらに、Xの下流分子として、当初の想定していたERαではなく、別の癌遺伝子産物Yを特定した。

Yは乳癌以外の癌に広く過剰発現していることが知られていることから、本研究が乳癌の化学予防の範疇のみにとどまらず、広く癌一般の化学予防にも応用されうる可能性が期待される。以上、若干の研究方針の修正は生じたものの、ほぼ当初の計画通りのペースで進行しており、かつ既に現段階で複数の新規発見を含んでいることから、プロジェクトは順調に進捗していると判断している。分子標的癌予防引き続き、in vitroの実験としては、今回、セサミノール、ペリリルアルコール、トログリタゾン共通の結合蛋白質として同定したXが、下流の癌遺伝子産物Yを制御する分子メカニズムの解明を継続するとともに、本研究の最終段階として、マウスの乳癌発癌モデルを用いて、結合蛋白質Xに対するsiRNAの全身投与により、実際、発癌が抑制されるのかどうかについて検証していく予定である。
マウス半数体精子細胞特異的に発現する遺伝子群の解析

精細胞特異的cDNAクローニング(精細胞特異的抗体によるクローニング及び精巣全体から支持細胞を差し引くサブトラクションクローニング)によって精細胞にのみ発現し、他の組織では全く発現の見られない新規の遺伝子が多数存在する事も明らかになってきた。これらの我々が単離した個々の遺伝子についてはそれぞれの機能の解析を進めた。pAP-3ベクターを用いて行う我々のサブトラクションクローニング法では半数体精子細胞に特異的な発現の見られる遺伝子群のクローニングを効率良く行う事が出来、すでに多数のcDNAクローンを単離し、これらの遺伝子産物の精子細胞分化に果す役割を順次解析を行った。さらに残りの遺伝子についても解析中である。我々は、全cDNAを含むクローンを単離し、そのコードする産物の機能を解析する事をめざしているため、すべて完全長cDNAを単離したうえで解析を進めている。さらにこのライブラリーには既知の精細胞特異的遺伝子も多数含まれており、半数体精子細胞特異的遺伝子をほぼ網羅しているものと考えている。またcomputerに登録されたtestis EST libraryから各臓器のEST libraryをsubtractしgerm cell specific ESTのみを拾い上げ、我々のサブトラクションクローニングで得られた結果と比較してみると、testis ESTにのみ存在する半数体精子細胞特異的遺伝子はほとんど見つからず、我々のsubtraction cloningが如何に優れているかを示している。これらの遺伝子の解析から、半数体特異的遺伝子のゲノム構造がイントロンを含まないもしくは、単純な構造であること、今まで、半数体特異的遺伝子は少ないと考えられてきたが、かなり多く存在すること、ヒトにおいてもこれらマウスの相同遺伝子が機能していること、などが明らかとされた。今後も、さらに継続しこれら遺伝子の解析を網羅的に行っていきたい。
細胞毒性ポリエーテル分子の多様性指向型全合成と活性発現構造の解明

本研究では、多様な生物活性を有する梯子状ポリ環状エーテル化合物の中より強力な細胞毒性を有するギムノシン類を取り上げ、効率的かつ迅速な構造類縁体の合成と詳細な構造活性相関によりその生物活性発現に要求される構造要因を明らかにすることを目的とする。本年度は主として以下の二点を達成した。1.ギムノシン-Aは複雑で巨大分子構造を持つために化学修飾による誘導化が困難であり、微量の天然物を用いた詳細な構造活性相関研究はほとんど行われていなかった。昨年度、ギムノシン-Aの細胞毒性発現にはエーテル環縮環構造の長さが重要であることを明らかにした。今回はギムノシン-Aの側鎖に焦点を当て、14環性梯子状ポリエーテル骨格を有した各種構造類縁体を全合成の中間体より合成した。ギムノシン-Aと側鎖の構造類縁体のEC_<50>値を比較することにより、細胞毒性を発現するためには、側鎖に共役不飽和アルデヒド構造が必要であることを明らかにした。2.ギムノシン-Bはギムノシン-Aと同等の細胞毒性を有する15環性梯子状ポリ環状エーテルである。ギムノシン-BのNO環部は7員環エーテル酸素を挟んで二つの核環メチル基を有しており、これは合成例のない構造であった。ギムノシン-Bの全合成に向けて、昨年度、NO環部ポリエーテル骨格を酸化的開環と閉環メタセシス反応を鍵反応として合成した。本年度はこの方法によりNO環部フラグメントを合成し、鈴木-宮浦カップリング反応を基盤とする収束的ポリエーテル骨格構築法を用いてLMNO環部の合成経路を確立した。本年度は主として以下の三点を達成した。1.現在までに、ギムノシン-Aの生物活性発現機構は全く明らかにされていない。本研究では鈴木-宮浦カップリング反応を基盤とした収束的ポリエーテル骨格構築法を用いてギムノシン-Aの全合成を達成している。今回、生物活性発現機構の解明研究に必要とされているギムノシン-Aを、既に確立したこの全合成経路に従い、供給した。2.ギムノシン-Aは複雑な巨大分子構造を持つために化学修飾による誘導化が困難であり、微量の天然物を用いた詳細な構造活性相関はほとんど行われていなかった。今回、ギムノシン-Aの全合成中間体より当グループで独自に開発した鈴木-宮浦カップリング反応を基盤とする収束的ポリエーテル骨格構築法を用いて、ギムノシン-Aの構造類縁体となる9環性化合物を合成した。ギムノシン-Aと9環性構造類縁体のEC_<50>値を比較することによって、細胞毒性を発現するためには少なくとも10個以上の連続したエーテル環縮環構造が必要であることを明らかにした。3.ギムノシン-Bはギムノシン-Aと同等の細胞毒性を有する15環性梯子状ポリ環状エーテルである。ギムノシン-Bの全合成に向けて、これまでに合成例のない構造を有するNO環部のモデル化合物の合成をおこなった。NO環部は7員環エーテル酸素を挟んで二つの核環メチル基を有している。この構造を二つの核環メチル基を持つ6員環エーテルよりの酸化的開環と、閉環メタセシス反応により構築することに成功した。