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素反応経路の実験と理論計算による研究

1)素反応過程を実験的に観測することは極めて困難で、実測値がはたして素反応に対応するかどうかについて十分な検討が必要である。本研究実績の一つは、素反応速度定数をかなりの精度で実測することを可能にしたことである。これは非経験的計算との比較が十分可能であり、その結果、ある系では理論と実測値が一致し、また別の系では大きな違いを示した。この事実からプロピナ-ルでは、その分解の遷移状態で特定の振動モ-ドがとくに励起され、そのことが分解速度を異常に大きくしていることが判った。2)単分子反応が継続して起こるような反応系では、第一段階の遷移状態を経由して生じた分子のエネルギ-や構造が次におこる反応を支配することが考えられるが、分子内・分子間エネルギ-緩和が反応に比べて速いため従来の実験では観測不可能であった。本研究では注意深い実験により2つの効果を見いだした。すなわち、2段階目の反応速度が速くなること、および2段階目の競争反応の分岐比が第一段階の反応を経由しない場合と異なることである。エステルの分解で生じるカルボン酸の競争的分解反応では各反応段階の遷移状態を計算し、それらの構成原子の運動モ-ドから競争反応の分岐比に関して十分な解釈ができた。これに反してピランの分解で生じるアクロレインの分解では、基底アクロレインの分解の分岐比と同じであった。このことはピランの分解で生じるアクロレイン分子は特に励起されないことを意味し、実際計算による遷移状態の構造からこのことが確かめられた。3)反応速度論に分子軌道法を用いて計算した遷移状態が如何ほどの意味があるかについては議論が活発に行なわれているところであるが、本研究において得られた結果によれば、明らかに実験事実と分子軌道計算とは一致した結論を導くことが確かめられた。反応速度論の究極の課題は非経験的に速度定数を算出することであるが,現時点では未だ実測に頼らざるを得ない.一方において,素反応過程を実験的に観測することも容易でないため,測定された値がはたして素反応に対応するかどうかも検討を要する.本研究では先ず反応が一つの経路だけしか含まない反応系を用いて実験的にその反応速度を測定すると共にab initio計算値との比較を行った.取り扱った分子はプロピナール(HC一方ホルムアルドキシムの分子脱離反応では,理論計算と実測の結果がよく一致した. (論文1)この場合の遷移状態の構造と核の運動を調べると,確かに特定の振動モードが励起する過程は含まれていない.このような場合は反応物内の各振動モードは統計的なエネルギー分布であることが判った. CWーCO_2レーザーによる研究は装置の完成が遅れたが,予備実験を終了し,現在本格的な測定を始めデータを出している段階である.波長を選択した光源を用いるため分解や異性化の波長依存性についてのデータを得たので63年度の化学反応討論会で報告する.(1).「プロピナールの単分子分解の速度定数について」この反応速度定数の実測値と計算値との間に大きなギャップを示した。定性的には、遠心力効果で説明はつくが、今回これを更に詳しく調べてみた。すなわち反応座標に沿って分子構造の変化を計算し、結合距離と結合角度が大きく変わる点がTS付近にあるかどうかを調べた。その結果TS付近に反応座標に大きな曲率が存在することが見出され、理論計算にこのような効果を取り入れなければならないことが明らかになった。(2).「エチルビニルエーテル(EVE)の単分子分解と生成するアセトアルデヒドの挙動について」

分解反応が2段階の経路を経る反応では、2段階目の反応が必ずしも統計的な熱分布を取っていない可能性がある。確かに、アセトアルデヒドの分解に比べてEVEより生じる励起アセトアルデヒドは大きな速度定数を与えることが明らかになった。この反応ではTS-1のエネルギーはTS-2より40kcal/molも低いため、エネルギー的には一段階目からただちに二段階目の反応に進行することはできないことから他の因子を考えなければならない。(3).「ジヒドロピランの単分子分解と生じたアクロレインの挙動」ジヒドロピランは分解してエチレンとアクロレインを生じる。またアクロレインは分解してエチレンとCOを生じる。今回ピランおよびラクロレインの分解速度を速定した。その結果TS-1のエネルギーは約50kcal/mol、TS-2では7075kcal/molであった。しかしピランから生じたアクロレインの分解速度は基底アクロレインの場合とほとんど同じであることが明らかになった。この結果は(2)の場合と全く異なる。エネルギー的には(3)の場合の方がむしろ二段階目の反応に移行し易いはずであるが、実際はその逆であった。このような違いを生じる原因について目下検討している。1)エチルビニ-ルエ-テルの熱分解と生成したアセトアルデヒドの分解を実験的に研究した。実験によると生じたアルデヒドの分解速度は異常に大きいことが判った。また一方において理論計算により可能な分解経路を調べた。その結果、分解の最も低いエネルギ-経路は6中心型の分子脱離反応でおこり、その際生じたアルデヒドは局所的に振動モ-ドが励起されていることが明らかになった。2)アクリロニトリルの熱分解を理論計算および実験の両面から研究した。その結果、HCN分子の脱離反応は3中心型の遷移状態をとり、従来報告されている4中心型ではないことが明らかになった。また、最もおこり易い反応はラジカル開裂であった。3)トリフルオロ酢酸エチルの熱分解を理論計算および実験の両面から研究した。このエステルは先に行なった酢酸エチルと類似した反応経路をとると予想したが、第一段階はHFを生じる4中心型をとり続いて二酸化炭素を生じた。しかし、計算では一段階でHFとCO_2を生じ両者の間にくい違いがみられた。4)反応条件を低圧にすると二段階目の反応速度の温度依存性が極端に低下することが判った。これは第一段階で生じた分子のエネルギ-分布が緩和しない状態に低いことと関係しており、実験結果より分布に関する情報がえられた。5)アクロレインの熱分解経路について理論計算を行なった。その結果、エチレンと一酸化炭素を生じる反応にたいして3つの経路を見つけた。一つは遷移状態を一つ経由する3中心型、他の二つは2こ以上の遷移状態を経由する経路である。しかし、いずれが最もおこり易いかについては検討中である。
製品市場における再活性化メカニズムの解明

本研究は、長期的な製品市場の進化過程の中でも、需要の伸びが停滞もしくは衰退した状態から、何らかの作用により、再び成長の軌道に乗る現象、すなわち"再活性化現象"に注目した。本研究では、数量と金額からなる出荷データからみた製品市場の推移を追跡することによって、再活性化現象の視認を図った。出荷データは、日本の製造業の実態をほぼ完全に捉えた「経済産業省経済産業政策局調査統計部編、工業統計表品目編」からの出典である。この工業統計表から、時系列でみて継続的に収集可能な全製品市場を分析対象とした。収集の期間は、1962年から2003年にまで及ぶ。その総数は数量ベースのもので891、金額ベースのもので1,540に上る。本論では、次のような条件を同時に満たす製品市場を、再活性化を遂げた製品市場と定めた。1.起点以前の対前年成長率が、4年以上にわたり、連続して実質経済成長率以下のもの2.起点以後の対前年成長率が、4年以上にわたり、連続して実質経済成長率を上回るもの以上で定めた条件を基に、1970年代・80年代・90年代に起点を有する再活性化市場を抽出した。その結果、起点となった年代を問わず、3%強を満たない程度ではあるが、条件を満たす再活性化市場が存在することを確認した。再活性化市場の生起数と同一年代内での生起率の大小のみを比較すると、数量ベースに関しては、80年代が生起数・生起率がもっとも大きかった。また金額ベースでは、90年代に近付くにつれて、生起数と生起率が大きくなる傾向が確認された。本研究では、再活性化の生起に限らず、起点後の再成長に注目した分析も進めた。起点以後における再成長の持続期間に注目すると、その平均持続期間が4年5年の間にあるものが多く見受けられた。この傾向は、年代ごとに大きな違いが見られるわけではなかった。再活性化の成功による効果は永遠に続くわけではなく、5年も待たないうちに潰えることが多いことが明らかとなった。本研究では、長期的な製品市場の進化過程の中でも、需要の伸びが停滞もしくは衰退した状態から、何らかの要因が作用したことをキッカケに、再び活発化、すなわち再成長の軌道に乗る現象に注目している。このような現象を、本研究では製品市場の再活性化と定義づけている。本研究では、再活性化を遂げた製品市場を抽出するべく、「工業統計表」所収の出荷データを収集した。1985年から2002年までの期間において、欠損なく収集できた製品市場は、金額ベースのもので1,266、数量ベースのもので694に上る。これらの製品市場に関するデータを基にして、企業の再建研究におけるV字回復の条件を参照して、次のような条件を満たす製品市場を探索した。(1)1990年代を起点に、再活性化がみられる製品市場(2)起点以前の対前年成長率が、4年以上に亙って実質経済成長率以下のもの(3)起点以後の成長率が、4年以上に亙って実質経済成長率を上回るものその結果、金額・数量を問わず、2.0%ほどに過ぎないが、条件を満たす製品市場が現存していた。例えば、さば缶詰や果実酒、触媒、アンプル、マシニングセンタ、電気がま、特別用途車、プリズムなどが挙げられる。いわばV字回復を遂げている製品市場において、「その時、何が起こったのか」を実証していくことで、再活性要因の特定化を図りたい。それが、来年度における研究の課題となる。具体的には、再活性化現象を体系的に説明するための概念や視座を整備するとともに、実際に再活性化を遂げている製品市場に迫ることが何よりも求められる。本研究では、製品市場の再活性化という、逆境を好機に変える上で、様々な企業が連動するのではないかと考えている。それはなぜか。現時点では、連動を通して、他社よりも先んじようとする努力が、その企業自身を鍛えるとともに、その努力の成果が他の企業群にも同時影響を及ぼすのではないかと考えている。

再活性化市場の生起数と同一年代内での生起率の大小のみを比較すると、数量ベースに関しては、80年代が生起数・生起率がもっとも大きかった。また金額ベースでは、90年代に近付くにつれて、生起数と生起率が大きくなる傾向が確認された。本研究では、再活性化の生起に限らず、起点後の再成長に注目した分析も進めた。起点以後における再成長の持続期間に注目すると、その平均持続期間が4年5年の間にあるものが多く見受けられた。この傾向は、年代ごとに大きな違いが見られるわけではなかった。再活性化の成功による効果は永遠に続くわけではなく、5年も待たないうちに潰えることが多いことが明らかとなった。
げっ歯類・糞虫類による種子の二次的処理は果実食者の散布効率を変化させるのか？

従来の種子散布研究では、果実食者の種子散布効率は、彼らの行動・消化生理および糞の排泄場所の特性に基づいて評価されることが多かった。本研究では、これまで見過ごされてきた「げっ歯類・糞虫類の二次的処理の効果」が種子散布効率に与える影響について評価する。本研究のアプローチは、これまでの主流であった、果実食者の特性だけに着目するスタイルからの脱却を掲示するものである。
ネコモルビリウイルスの病原性と感染機序の解明

ネコモルビリウイルス(FeMV)は2012年に発見された新しいウイルスで、ネコにおける慢性腎炎への関与が注目されている。我々は、好感度リアルタイムRT-PCRと抗-FeMV抗体検出診断システムの開発を行い、日本国内ネコの尿中FeMVウイルスRNAと血漿中抗FeMV抗体陽性率が、それぞれ、15.1%と22%であることを発見した。腎臓病ネコの腎臓病理切片と抗-FeMV抗体による免疫染色を用いFeMV感染と腎臓病変の関係を調べたところ、尿細管組織萎縮との強い相関がみられた。FeMV局在がほぼ尿細管に限定されていたことも合わせ、今回の研究結果は、FeMVの感染とネコの腎臓病の関係を強く示唆した。本年度は、リアルタイムRT-PCRによるFmoPV陽性ネコ尿検体からのFmoPV分離について、4株の分離に成功した。現在、当初予定していた、FmoPV株の培養細胞感染における性状解析を行っている。また、分離ウイルスのネコにおける実験感染については、京大ウイルス研の宮沢孝幸先生の実験により、感染3か月間で顕著な疾病が観察されなかった(宮沢先生からの個人的な情報)ため、当初の計画を変更し、まずは現在まで試されていない培養細胞における分離FmoPV株の感染を行っている。特に、理研BRCから購入した、マウスマクロファージ培養細胞株J774.1、Mm1と、マウス樹状細胞株Tpit/F1を用いてのFmoPV実験感染を現在行っており、この結果をもとに、次年度はマウスにおける実験感染、特にBALB/cのような一般的な系統に加え、ヌードマウス、SCIDマウスにおける実験感染を予定している。FmoPV腎臓病ネコの腎臓固定病理切片による研究については、東京農工大学町田昇教授の協力により検体を提供いただき、現在、各切片のHE染色スライドの詳細な観察と、切片から抽出したFmoPVウイルスの検出を行っており、今後、これら結果の相関についての検討を行っていく予定である。抗-FmoPV特異抗体の作製については、抗-N-蛋白質抗体については、ペプチド免疫による抗体を宮沢先生から提供いただいており、現在、組み換え大腸菌発現による精製P-蛋白質による抗体を作製準備中である。本年度は、リアルタイムRT-PCRによるFmoPV陽性ネコ尿検体からのFmoPV分離について、4株の分離に成功し、現在、当初予定していた、FmoPV株の培養細胞感染における性状解析を行っている。また、分離ウイルスの実験動物感染については、状況により当初の計画を変更し、現在まで試されていないマウスマクロファージ培養細胞と、マウス樹状細胞を用いてFmoPV実験感染を行っており、この結果をもとに、次年度はマウスにおける実験感染、特にBALB/cのような一般的な系統に加え、ヌードマウス、SCIDマウスにおける実験感染を予定している。FmoPV腎臓病ネコの腎臓固定病理切片による研究については、東京農工大学町田昇教授の協力により検体の提供により、現在、各切片のHE染色スライドの詳細な観察と、切片から抽出したFmoPVウイルスの検出を行っており、今後、これら結果の相関についての検討を行っていく予定である。腎臓病ネコの腎臓固定病理切片による研究について、東京農工大学町田登教授の協力により検体を提供いただき、各切片のHE染色スライドの詳細な観察と、切片から抽出したネコモルビリウイルス(FeMV)の検出、さらに、抗-N蛋白抗体、抗-P蛋白抗体による免疫染色を行い、切片における病変とウイルス核酸、ウイルス抗原の存在の関係を研究した結果、ウイルス感染と腎臓病変に顕著な関係が見られた。また、FeMV感染による遺伝子発現制御を確かめるため、免疫染色した腎臓組織から、マイクロダイセクションによって感染細胞と非感染細胞を切り出し、それぞれの宿主細胞から抽出したmRNAにより、定量PCRを行い、液性免疫因子の遺伝子発現の差を求めた。その結果、現在までにIFNgを始めとする、いくつかのサイトカイン遺伝子の抑制が見られている。また、組み換えFeMV P蛋白質を大腸菌によって発現・精製し、それによってウサギを免疫して抗-FeMV特異抗体を作製するとともに、抗-FeMV抗体検出ELISAを作製し、日本のネコ血漿中の抗体を検出したところ、全体の22 %のネコに抗体が検出された。また、良く分かっていないFeMVの病原性を知るため、ネコ患者の尿検体より、FeMVのウイルス分離を行い、現在まで、最低でも3株の追加FeMV株が分離された。ウイルス分離過程において、FeMV感染による細胞変性(CPE)が、これまで報告されてきた巨細胞を呈するものではなく、細胞死によるものであることが判明し、このため、多くのウイルス感染細胞が長期の培養においては細胞死によってウイルス感染の消失が見られることが分かった。このため、抗ーウイルス蛋白抗体によるモニターによる感染細胞の維持が必須であることが分かった。この分離株を用い、次年度は組織培養細胞や実験動物を用いて、感染モデルの構築を目指す。FeMV陽性ネコ尿検体からのウイルス分離について、当初分離を試みたウイルス株について、培養細胞による増殖に問題が見つかったため、新たな尿検体より分離を試みた。その結果、抗ーN蛋白抗体を用いたIFAにより、少なくとも3株の新たなFeMVの分離が確認され、上清による感染も確認された。これらを用いて、当初予定していた、FeMV株の培養細胞感染における性状解析を現在推進中である。

ウイルス分離過程において、FeMV感染による細胞変性(CPE)が、これまで報告されてきた巨細胞を呈するものではなく、細胞死によるものであることが判明し、このため、多くのウイルス感染細胞が長期の培養においては細胞死によってウイルス感染の消失が見られることが分かった。このため、抗ーウイルス蛋白抗体によるモニターによる感染細胞の維持が必須であることが分かった。また、これらの株により、次年度はマウスにおける実験感染モデルの作製を行う。FeMV腎臓病ネコの腎臓固定病理切片による研究については、東京農工大学町田登教授の協力により検体の提供により、当初予定していた、FeMV感染と病変の相関が確認された。抗-FeMV特異抗体の作製は、組み換え大腸菌発現による精製P-蛋白質による抗体を作製し、精製蛋白質を用いた抗体検出ELISAの作製と、日本のネコ患者血漿における特異抗体の検出を行った。次年度は、ネコSLAM強制発現培養細胞によるFeMV感染増強の有無を確認する予定である。腎臓病ネコの腎臓固定病理切片による研究について、各切片における病変の詳細な観察と、切片から抽出したネコモルビリウイルス(FeMV)抗-N蛋白抗体、抗-P蛋白抗体を用いた免疫染色によるウイルス抗原の存在の関係を研究した結果をもとに科学論文を作成し、国際雑誌に投稿を行ったところ、受理されなかったため、現在、論文の修正と再投稿のための実験を行っている。特に、蛍光抗体法によっても免疫染色を行う事と、抗原検出に加えて定量PCRによって、FeMV遺伝子の検出を行い、FeMV感染についてのより客観的かつ信頼性の高い結果に基づく、より正確な病変との相関の確認を行っている。また、抗ネコIgG抗体を用いてFeMV感染腎臓組織の染色を行い、FeMV感染組織中に免疫複合体の形成による病変の有無と、FeMVとの共局在の有無について現在検証中である。また、FeMV抗原を免疫染色した腎臓組織において、マイクロダイセクションにより感染細胞から抽出したmRNAを用いて定量PCRを行い、液性免疫因子の遺伝子発現の差を求めたが、抽出mRNA量が微量のため、定量値の誤差が大きく、確実な結果を得るのが困難であった。そのため、現在、分離ウイルスの培養細胞への接種によって、腎臓組織切片mRNAにおける結果の検証の実験を計画している。また、組み換えFeMV N蛋白質をバキュロウイルスによって発現しELISAに用いることで、以前行った、抗-FeMV P蛋白質によって抗体検出を行った結果と比較を行うと共に、イヌジステンパーウイルスN蛋白質の大腸菌発現をおこない、交差反応の有無について確認を進めている。また、FeMV N蛋白質の部分的発現を行う事で、ネコ血漿中の抗N蛋白質抗体の認識抗原エピトープの大まかなマッピングを行い、今後、組み換え蛋白質を用いた抗体検出系作製をより容易に行えるようにする。ネコモルビリウイルス(FeMV)は2012年に発見された新しいウイルスで、ネコにおける慢性腎炎への関与が注目されている。我々は、好感度リアルタイムRT-
直腸癌における神経接着分子(NCAM)の意義-特に自律神経温存術の適応について-

初年度には基礎的研究として病理解剖体を用いて肉眼的に自律神経の走行を確認し、さらに組織学的特徴を把握した。次年度には主として臨床的研究を進めた。方法:術前に直腸癌の生検組織を採取した後、凍結切片を作製しABC法による免疫組織染色を行い神経接着分子NCAMや癌抑制遺伝子DCCの存在を検索した。同一症例における手術後の切除標本における神経周囲侵襲(PNI)とNCAMやDCCと関連性を検討した。しかし、症例数が当初の目標に達しなかったので、PNIを含めたその他の病理組織学的諸因子とNCAMとの関連性については、過去の症例(パラフィン包埋標本)を追加し検討を行った。また、予後については追跡期間が長い過去の症例が適当と考え、これらの症例についてのみ検討した。結果:(1)NCAM陽性例はパラフィン包埋標本では47例、15.5%に認められた。(2)病理学的予後規定因子のなかでNCAMと統計学的に相関が認められたのはPNI、静脈侵襲、リンパ管侵襲、肝転移、深達度、組織型、リンパ節転移、炎症細胞浸潤で、多変量解析の結果、神経周囲侵覆が最も関連性が深かった。(3)治癒切除例の再発や生存率については、Dukes C症例では、NCAM陽性例の局所再発率が高い傾向が認められ、また、全経過の生存率は陰性例に比べて有意に低かった。(4)術前生検材料におけるNCAMやDCCの発現は、切除標本における発現とほぼ一致し、これらの組み合わせは、切除標本におけるPNIと極めて有意な関連性が認められた。結論:神経接着分子NCAMは予後因子として重要である。NCAMやDCCはPNIを予測し得るマーカーとなる可能性が示唆された。つまり、術前生検材料におけるNCAMやDCCの発現性は、自律神経温存術の適応を決定する良い指標となることが推測された。癌抑制遺伝子DCCはNCAMとともに自律神経温存術式の適応をきめる良い指標となり得ることが新たな知見として興味深かった。本研究は神経接着分子(NCAM)に着目し、自律神経温存術の適応の指標をみいだすものであるが、現在までに以下の結果を得た。初年度の予定どうり、現在までに約30例の直腸癌症例が検索できた。まず手術前にpunch biopsyによって十分な生検組織を採取し、凍結切片を作製した。抗NCAM抗体を用い、ABC法による免疫組織染色を行いNCAMの存在を検索した。次に、自律神経を温存せずに直腸癌の手術を施行した。手術後、切除標本の完全な全割組織切片を作製(連続切片も作製)し、詳細な病理学的構築図を描いた。手術前に生検材料から判定したNCAMと切除標本の病理組織構築図を対比し、NCAMと神経周囲侵襲との関連性を検討したところ、まだ、症例数が少ないために有意な関連性は出ていないが、ある程度関連ある傾向が出ており、今後症例数を増加させれば、期待される結果が出そうである。また、神経周囲侵襲以外の病理学的な生物学的悪性度因子(組織型、静脈侵襲、リンパ管侵襲、炎症細胞浸潤、局所浸潤増殖様式)との関連性についても検討したが、症例数が少ないために、有意な関連性は認められていない。

また、正常な自律神経の走行と対比しながら神経周囲侵襲の分布図を完成させる予定であるが、神経周囲侵襲をきたす症例が少ないために新しい知見を得るまでには至っていない。今年度は、初年度に引き続き症例数をさらに増やし、初年度と同様の検索を行う。約80例をもって終了し、データの生理を行い、すべての所見をコンピュータに登録する。その後、手術前に判定したNCAMが神経周囲侵襲を予測できる指標となり得るか否かについて、林の数量化理論II類、Coxの比例ハザードモデル等の多変量解析プログラムを用いて解析する予定である。平成6年度の研究計画に基づいて、術前に直腸癌の生検組織を採取し凍結切片を作製した。この凍結切片について抗NCAM抗体を用いて、ABC法による免疫組織染色を行いNCAMの存在を検索した。またNCAMと相同性があると言われている癌抑制遺伝子DCCについても検討を加えた。同一症例における手術後の切除標本における神経周囲侵襲とNCAMおよびDCCとの関連性を検討した。しかし、症例の集積が目標よりも少なかったので、神経周囲侵襲を含めたその他の病理組織学的諸因子とNCAMとの関連性については、過去の症例(ホルマリン固定切除標本)を追加し検討を行った。また、予後については追跡期間が長い過去の症例が適当と考え、これらの症例についてのみ検討した。以上より次のような結果が得られた。(1)NCAM陽性例はホルマリン固定切除標本では47例、15.5%に認められた。(2)病理学的予後規定因子のなかでNCAMと統計学的に相関が認められたのは神経周囲侵襲、静脈侵襲、リンパ管侵襲、肝転移、深達度、組織型、リンパ節型、リンパ節転移、炎症細胞湿潤で、多変量解析の結果、神経周囲侵襲が最も関連性が深かった。(3)治癒切除例の再発や生存率は、Dukes c症例では、NCAM陽性例の局所再発率が高い傾向が認められ、また、10年生存率は陰性例に比べて有意に低かった。(4)術前生検材料におけるNCAMやDCCの発現は、切除標本における発現とほぼ一致し、神経周囲侵襲と極めて有意な関連性が認められた。当初の目的であった症例数には及ばなかったが、過去の症例を検討の対象に追加することによって、次のような結論を導くことができた。神経接着分子(NCAM)は予後因子として重要であった。NCAMやDCCは神経周囲侵襲のマーカーとなる可能性が示唆された。つまり、術前生検材料におけるNCAMやDCCの発現生は、自律神経温存術の適応を決定するための良い指標となることが判明した。
腎間質線維化の進展におけるHIF-1を中心とした低酸素応答の関与

本研究の目的は、低酸素応答で中心的な役割を果たすことが知られているhypoxia inducible factor-1 (HIF-1)が腎間質線維化の進展に関与することを明らかにすることである。1.低酸素刺激と腎間質線維化の進展C57BL/6マウスの一側尿管を結紮し、腎間質線維化モデルであるUUOマウスを作製した。Sham operation群、尿管結紮後4日目、8日目、12日目、および16日目の結紮側腎を摘出した後、Hypoxyprobe (Chemicon社)を用いて、腎組織中の低酸素領域を検出した。尿管結紮後8日目、12日目、および16日目の近位尿細管上皮細胞に強いHypoxyprobeの集積が認められた。したがって、間質線維化の進展に伴って尿細管上皮細胞は低酸素状態になることが明らかとなった。2.初代培養の尿細管上皮細胞におけるEMTの誘導Cre-loxPシステムを用いて、尿細管上皮細胞をLacZでパーマネント標識した遺伝子改変マウスの摘出腎を用いて、尿細管上皮細胞の初代培養を行った。1%O2培養下でEMTの誘導について検討した。蛍光抗体法で、LacZをCy3(赤)、FSP1をCy2(緑)で標識し、Cy3+.Cy2+細胞をEMT由来の線維芽細胞と判定した。低酸素培養3日後には、20%O2培養下に比して1%O2培養下では、EMT由来の線維芽細胞数が有意に増加していた。Cre-loxPシステムを用いて、尿細管上皮細胞で特異的にVHL遺伝子を欠損させたマウスを作製した。VHLは、HIF-1αのユビキチンリガーゼとして作用することが知られている。尿細管上皮細胞でVHL遺伝子をターゲッテイングすることで、尿細管上皮細胞特異的にHIF-1が安定化される。UUOマウスでVHL遺伝子改変マウスに腎間質線維化を誘導し、HIF-1が間質線維化の進展に関与するか否かを検討した。左腎尿管結紮後8日目に、両腎を摘出し、抗FSP1抗体を用いた酵素抗体法を実施した。結紮側腎でのFSP1陽性細胞数は著明に増加していたが、コントロールマウスにおけるFSP1陽性細胞数も増加しており、有意差が認められなかった。非結紮側におけるFSP1陽性細胞数は、コントロールマウスに比してVHL遺伝子改変マウスで有意に増加していた。本研究の目的は、低酸素応答で中心的な役割を果たすことが知られているhypoxia inducible factor-1(HIF-1)が腎間質線維化の進展に関与することを明らかにすることである。

本年度は以下に示す検討を実施した。1.低酸素刺激と腎間質線維化の進展C57BL/6マウスの一側尿管を結紮し、腎間質線維化モデルであるUUOマウスを作製した。Sham operation群、尿管結紮後4日目、8日目、12日目、および16日目の結紮側腎を摘出した後、Hypoxyprobe (Chemicon社)を用いて、腎組織中の低酸素領域を検出した。尿管結紮後8日目、12日目、および16日目の近位尿細管上皮細胞に強いHypoxyprobeの集積が認められた。したがって、間質線維化の進展に伴って尿細管上皮細胞は低酸素状態になることが明らかとなった。2.ヒト腎生検組織でのHIF-1αの局在に関する検討IgA腎症患者120例のホルマリン固定パラフィン切片を用いて、HIF-1αの局在と線維化面積およびFSP1陽性領域との関連を検討した。高度の間質線維化を呈した症例では、尿細管上皮細胞の核内にHIF-1αの局在が認められた。また、連続切片を用いた検討で、FSP1陽性細胞の多くがHIF-1αを発現していることが明らかとなった。尿細管上皮細胞に特異的なプロモーターであるγGTにCre遺伝子を繋いだ遺伝子を導入したトランスジェニックマウスとloxp-VHL(exon1)-loxpを導入した遺伝子改変マウスを交配して、尿細管上皮細胞で特異的にVHL遺伝子を欠損させたマウスを作製した。VHLは、HIF-1αのユビキチンリガーゼとして作用することが知られている。尿細管上皮細胞でVHL遺伝子をターゲッティングすることで、尿細管上皮細胞特異的にHIF-1が安定化される。現在、自然経過を観察するとともに、UUOマウスおよび抗GBMモデルマウスで腎間質線維化を誘導し、HIF-1が間質線維化の進展に関与するか否かを検討中である。(平成15年度の科学研究費補助金は、マウス維持費、抗体購入費などの消耗品購入に用いた。)本研究の目的は、低酸素応答で中心的な役割を果たすことが知られているhypoxia inducible factor-1(HIF-1)が腎間質線維化の進展に関与することを明らかにすることである。昨年度は、1)実験モデルにおいては間質線維化の進展に伴って尿細管上皮細胞は低酸素状態になること、2)ヒト腎生検組織でFSP1陽性細胞の多くがHIF-1αを発現していること示した。1.初代培養の尿細管上皮細胞におけるEMTの誘導Cre-loxPシステムを用いて、尿細管上皮細胞をLacZでパーマネント標識した遺伝子改変マウスの摘出腎を用いて、尿細管上皮細胞の初代培養を行った。1%O2培養下でEMTの誘導について検討した。蛍光抗体法で、LacZをCy3(赤)、FSP1をCy2(緑)で標識し、Cy3+.Cy2+細胞をEMT由来の線維芽細胞と判定した。低酸素培養3日後には、20%O2培養下に比して1%O2培養下では、EMT由来の線維芽細胞数が有意に増加していた。Cre-loxPシステムを用いて、尿細管上皮細胞で特異的にVHL遺伝子を欠損させたマウスを作製した。尿細管上皮細胞でVHL遺伝子をターゲッテイングすることで、尿細管上皮細胞特異的にHIF-1が安定化される。UUOマウスでVHL遺伝子改変マウスに腎間質線維化を誘導し、HIF-1が間質線維化の進展に関与するか否かを検討した。左腎尿管結紮後8日目に、両腎を摘出し、抗FSP1抗体を用いた酵素抗体法を実施した。結紮側腎でのFSP1陽性細胞数は著明に増加していたが、コントロールマウスにおけるFSP1陽性細胞数も増加しており、有意差が認められなかった。
捩れと曲げ歪みをもつ液晶相の理論的研究

2013年6月,捩れ(ツイスト)と曲げ(ベンド)の2つの歪みをもつ螺旋状の液晶相(ツイスト・ベンドネマチック(NTB)相)が,"バナナ型"の分子を用いた実験で初めて観測された。通常の液晶ディスプレイで用いられている,"棒状"の分子では観測されていない。バナナ型分子には何か秘密があるようである。弾性理論を用いた理論的研究は行われてきたが,バナナ型分子の特徴を考慮した分子論的観点からの研究は少なく,NTB相を含む液晶相転移の全貌は明らかではない。本研究では,バナナ型分子の曲げ角度に依存した分子間相互作用を考慮し,捩れと曲げ歪みを持つ様々な液晶相の統計力学的理論を構築する。新規な相転移や相分離の,温度・濃度・外場(電場や磁場など)依存性について調べ,なぜバナナ型分子が必要なのかについて理論的に明らかにする。このような分子場理論からの研究は,国内外において少なく,捩れと曲げ歪みを持つ新規な液晶相の基礎物性のみならず,光学・機能性材料分野への基礎的知見を提供することができる。本研究の前半では,このようなバナナ型分子の曲げ角度を考慮にいれ,温度・濃度・電場や磁場などの外場に依存して,どのような角度で熱力学的に安定なNTB相が現れるかを明らかにする目的である。そのための準備として,(1)バナナ型分子の曲げ角度を考慮したテンソル秩序パラメーターを導出し,ネッマチック相の自由エネルギーを構築した。温度と曲げ角度に依存したバナナ型分子の相図の計算を行った。とくに,曲げ角度が90度以下でも理論的に記述できるところが大きな成果である。曲げ角度に依存した新規なネマチック相を理論的に予測できた。さらに,コレステリック相へも発展させることができた。これらを基礎として,NTB相への展開をおこなう。現在までのところ,バナナ型分子の曲げ角度を考慮した,バナナ型分子のテンソル秩序パラメータを導出した。それを用いて,等方相ーネマチック相への相転移温度と曲げ角度依存性についての相図の計算を行った。さらに,キラルネマチック相についても研究を行なった。特に,分子の3つの軸の配向に依存した新規なネマチック相を予測できたことは,当初の計画通りであり,さらに,キラルネマチック相へも理論を発展できたことは,今後のねじれと曲げを伴った,NTB相への基礎ができたと考える。以上の結果は,2本の学術論文に採択済みであり,研究は概ね順調に進んでいると判断した。さらに,当初予測していなかったが,バナナ型分子自身の軸不斉からくるねじれを考慮することもできることがわかった。したがって,バナナ型分子は曲げ角度だけではなく,ねじれ角も考慮に入れることで,新しいネマチック相へ発展することが可能である。今後の理論的研究への新しいアイデアが生まれた。研究計画に沿って,NTB相の自由エネルギーを構築し,バナナ型分子の曲げ角度に依存したNTB相や新規なネマチック相について調べる。さらに,電場や磁場などの外場の効果や,ツイストベンドスメクチック相へ研究を進める計画である。さらに,高分子液晶ゲルや高分子液晶系などの高分子液晶系で起こるねじれと曲げ効果など,新しい研究の種の発掘も行う計画である。さらに,軸不斉をもつバナナ型分子が作る,新しいネマチック相へ理論を発展させる計画である。

それを用いて,等方相ーネマチック相への相転移温度と曲げ角度依存性についての相図の計算を行った。さらに,キラルネマチック相についても研究を行なった。特に,分子の3つの軸の配向に依存した新規なネマチック相を予測できたことは,当初の計画通りであり,さらに,キラルネマチック相へも理論を発展できたことは,今後のねじれと曲げを伴った,NTB相への基礎ができたと考える。以上の結果は,2本の学術論文に採択済みであり,研究は概ね順調に進んでいると判断した。さらに,当初予測していなかったが,バナナ型分子自身の軸不斉からくるねじれを考慮することもできることがわかった。したがって,バナナ型分子は曲げ角度だけではなく,ねじれ角も考慮に入れることで,新しいネマチック相へ発展することが可能である。今後の理論的研究への新しいアイデアが生まれた。研究計画に沿って,NTB相の自由エネルギーを構築し,バナナ型分子の曲げ角度に依存したNTB相や新規なネマチック相について調べる。さらに,電場や磁場などの外場の効果や,ツイストベンドスメクチック相へ研究を進める計画である。さらに,高分子液晶ゲルや高分子液晶系などの高分子液晶系で起こるねじれと曲げ効果など,新しい研究の種の発掘も行う計画である。さらに,軸不斉をもつバナナ型分子が作る,新しいネマチック相へ理論を発展させる計画である。注文した洋書の郵送予定が3月であったが,海外からの郵送が遅れ,次年度予算にずれこんだため。4月になり注文した洋書が手元に届き,すでにこの予算は使用済みである。
タウタンパク質によるアミロイド繊維形成を支配するアミノ酸リン酸化コードの探求

アルツハイマー病患者の神経細胞内で観察される繊維状凝集物の主成分は、過剰なリン酸化を受けたタウタンパク質である。タウ凝集体形成の核となるアミノ酸配列の特定位置をリン酸化したペプチドを系統的に合成し、それらの凝集特性を解析した結果、特定位置のアミノ酸リン酸化が繊維状凝集体形成を促進もしくは阻害することが明らかになった。この結果は、タウのリン酸化の組み合わせによって凝集体形成が促進もしくは阻害される『タウ・リン酸化コード』が存在することを支持する。アルツハイマー病患者の神経細胞内に蓄積するアミロイド凝集体の主成分は、過剰にリン酸化されたタウタンパク質である。しかし、リン酸化タウの『どのアミノ酸がリン酸化されることによってアミロイド凝集体形成が引き起こされるのか』は謎に包まれている。タウの凝集体形成に関与するアミノ酸配列の特定位置をリン酸化したペプチドおよび立体的な配置を制御したリン酸化ペプチドオリゴマーを系統的に合成し、それらの凝集特性を解析した。タウ凝集体を形成するうえで重要なSVQIVYK配列のN末端(305位)セリンは生体内でリン酸化を受ける可能性が示唆される。305位セリンを含むペプチド、305位セリンと310位のチロシンをそれぞれリン酸化したSPHF誘導体ペプチド(pSPHF, SPHFpY)、そしてタウのスプライシング・バリアントに対応した305位にリシンが存在するKPHFおよびそのリン酸化体KPHFpYを合成した。また、同じく凝集体形成に重要なVQIINKKLDLSNVQSの生体内でリン酸化を受けることが示されているセリン残基をリン酸化したペプチド(CORE1S, CORE1pS)を合成した。各ペプチドのアミロイド繊維形成特性を凝集体形成臨界濃度測定、構造を蛍光・赤外分光法、円二色性スペクトル、繊維の形状・サイズを電子顕微鏡(TEM)・原子間力顕微鏡(AFM)により観察した。これらの結果をもとにして、pSPHF、SPHFpY、KPHFおよびKPHFpYの凝集特性と凝集体の形状を明らかにして、その結果をBiochemistry誌に発表した。また、リン酸化されたSPHFおよびCORE誘導体ペプチドを組み合わせたペプチド二量体は、必ずしも高い凝集体形成能は示さなかった。これらの結果から、「凝集特性を決定する複数位置のリン酸化の組み合わせ「タウ・リン酸化コード」の存在が示唆された。タウ凝集体を形成するMBD中のコア配列のひとつと予測されるVQIVYK配列のN末端には生体内でリン酸化を受ける可能性が示唆される305位セリンが存在する。セリンを付加したSPHFペプチド、305位セリンと310位のチロシンをそれぞれリン酸化したSPHF誘導体ペプチド(pSPHF, SPHFpY)、そしてタウのスプライシング・バリアントに対応した305位にリシンが存在するKPHFおよびKPHFpYを合成した。また、繰り返しアミノ酸配列に存在するコア配列VQIINKKLDLSNVQS(COREペプチド)をもとにして、生体内でリン酸化を受けることが示されているセリン残基(下線部)をリン酸化したペプチドを合成した。これらを用いて、各ペプチドのアミロイド繊維形成特性を超遠心による凝集体形成臨界濃度測定、構造を蛍光・赤外分光法、円二色性スペクトルにより解析した。各ペプチドによって形成された繊維の形状・サイズを電子顕微鏡(TEM)・原子間力顕微鏡(AFM)により観察する条件を決定した。当初の予定通り、タウタンパク質の凝集に重要と考えられるVQIVYK配列とVQIINK配列に由来するペプチドを合成した。合成したペプチドpSPHF、SPHFpY、KPHFおよびKPHFpYの凝集特性と凝集体の形状を明らかにして、その結果をBiochemistry誌に発表した。1.二量体形成による凝集性ペプチドの配向制御タウ繰り返し配列中の凝集コア配列がどのように配向してアミロイド繊維を形成するかを探る。リン酸化されたSPHFおよびCORE誘導体ペプチドを組み合わせたペプチド二量体を作製することにより、タウがさまざまな組み合わせでリン酸化された状態での、同一タウ分子内もしくはタウ分子間でのタウMBD内の凝集コア配列間相互作用をモデル化する。そのために、アンチパラレル配向もしくは平行βシートを安定化するパラレル配向に立体規制した同種および異種ペプチド二量体を合成する2.リン酸化タウMBDとタウ凝集ペプチド二量体によるアミロイド形成「凝集性が高いコードを持つリン酸化タウペプチド」により、タウのアミロイド凝集体形成が促進されるかを検証する。組み換えタンパク質タウMBDをリン酸化し、それぞれのリン酸化タウMBDに「凝集性が高い(もしくは低い)コード」を持ったペプチドを加えて凝集体形成反応を解析し、「タウ・リン酸化コード」の妥当性を検証する。ペプチド合成に必要な消耗品費と、アミロイド繊維の形状を観測するための透過型電子顕微鏡およびAFMの消耗品費に充てる。
新しい人工歯根材料(Diopside)と骨芽細胞との親和性に関する研究

我々はかねてよりバイオアクティブな生体材料であるディオプサイドについて様々な面から検討してきた。家兎下顎骨埋入実験ではディオプサイド面と母床骨面の両面から骨形成が生じることを確認しており、ディオプサイドは人工歯根材料などをじめとする医用材料として有用であると考えている。今回、我々はディオプサイドの骨組織に対する親和性を検討するために培養下の骨芽細胞に対する反応を定量的に検討し、骨組織への影響について研究した。実験にはディオプサイド、チタン、ヒドロキシアパタイトの3種類の材料を使用した。継代3日目の骨芽細胞を、試料の入った10%ウシ胎児血清添加培地に播種し、5時間後に培地より採取できる細胞数を計数して相対的な細胞初期接着率を算定した。さらに継代3日目の骨芽細胞を試料の入った10%ウシ胎児血清添加培地に播種し、1日目、2日目、3日目の細胞数を計数して細胞増殖数を算定した。相対的細胞初期接着率については、ディオプサイド、チタン、ヒドロキシアパタイトともにほぼ差異はなかった。また、細胞増殖数についてもディオプサイド、チタン、ヒドロキシアパタイトともに差異は認められなかった。チタン、ヒドロキシアパタイトなどは従来より生体親和性に優れた材料であると言われているが、我々の得た結果ではディオプサイドは個々の骨芽細胞に対してはチタン、ヒドロキシアパタイトなどに匹敵する優れた生体親和性を有することが示唆された。
「国際英語」教授法の開発と応用:非母語話者モデルの英語教育の実践のために

本研究代表者による「国際英語」教授法であるIPTEILの応用性を高めた。このIPTEILの実践により、本研究期間のうちに「大阪大学共通教育賞」を6回受賞した。また、IPTEIL以外の「国際英語」教授法開発への道筋を提示した。さらに、日本人の国際的な自己表現の手段としてのJapanese Englishのモデルの試案を示した。これらの成果は、国際学会誌・国内学術誌の論文、共著書、国際学会・国内学会での発表等で公表している。「国際英語」教授法の基礎理論と授業実践に関わる文献として、第2言語・外国語教育論及びWE論やELF論における最近の文献の精査を行なった。その結果、特にELF論のLingua Franca Coreの概念が本研究に与える示唆にっいての考察を深めた。具体的には、Non-Core featuresを用いての個性の表現が国際英語の要諦であることを示すことができた。本研究代表者が提案する「国際英語」教授法のアクション・リサーチを実施した。Pre-test及びPost-testや受講者アンケートなどである。また、公開授業を実施し、参加者からのフィードバックを得た。これらの結果、学習者の自律性の養成などにおける課題が明らかになった。「国際英語」の理念に共鳴する英語教員の授業実践を観察した。大阪府立鳳高等学校、岐阜大学、国際基督教大学などでの授業観察及び授業者へのインタビューである。その結果、国際英語の授業の最も重要な要素が、日本人英語教員の英語を、学習者が目指すべき英語のひとつのサンプルとして授業で積極的に提示することにある、という点が明らかになった。本年度の成果は、これまで、香港での国際学会を含む学会発表や学会招待講演等を通じて発表し、論文も現在執筆中である。また、本研究で開発中の、この「国際英語」教授法による大阪大学での授業実践により、本研究代表者は、平成20年5月に「大阪大学共通教育賞特別賞」、平成20年11月に「大阪大学共通教育賞」、平成21年2月に「大阪大学教育・研究功績賞」を受賞した。本年度の最大の成果は、応用言語学において世界的に最も高い権威を有する国際学会誌のひとつであるAILAReview(John Benjamins,年1回発行)に、本科研研究のここまでの成果の一端を論文として発表できたことである。その論文においては、日本における「国際英語」教育へのニーズ、「国際英語」教育の実践の現状、国際コミュニケーションにおける日本人の自己表現のためのJapanese Englishのモデルの試論などについて論じた。また、2009年10月にフィリピンで開かれた、国際英語の分野における最大の国際学会であるIAWEの年次大会において、本科研研究における授業観察等の成果である「国際英語」教授法の類型の分析について発表した。続いて、2009年11月のJALT年次国際大会における国際英語をテーマとするシンポジウムでの招待講演として、本科研研究の成果から、国際英語の教材やJapanese Englishのモデルに関する考察をはじめ、「国際英語」教育の原理と実践について発表した。さらに、同月の大学英語教育学会関西支部秋季大会のシンポジウムでの招待講演として、本科研研究の成果を用い、国際英語の教材・教授法・評価・教員のあり方についての考察を発表した。また、本科研研究で開発中の「国際英語」教授法を用いた授業実践により、本研究代表者は、優れた教育実践に対して与えられる「大阪大学共通教育賞」を2009年5月に受賞し、続いて2009年11月にも同賞を受賞した。「国際英語」教育のためのJapanese Englishのモデルの構築を進め、音韻・文法・語法・社会言語的規則・談話規則・非言語行動などの側面について、部分的にではあるがその特徴を記述することができた。その成果は、国際英語の専門学会としての日本「アジア英語」学会の全国大会(2010年7月)、国際英語の分野で世界的に最も高い権威を有する学会のひとつであるIAWEの年次大会(カナダ、2010年7月)、国際英語の分野における著名な研究者を世界各国から招待して開かれたMacaoInternationalForum(マカオ、2010年12月)、コミュニケーション能力への新たな視点をテーマとする愛知大学でのラウンドテーブル(2011年2月)などで発表した。また、上記のJapanese Englishのモデルを活用した産出能力とともに多様な英語の受容能力の養成を目指す「国際英語」教授法の開発と応用を進めることができた。その成果は、英語教育学の分野で世界的に最も高い権威を有する学会のひとつであるTESOLの年次大会(アメリカ合衆国、2011年3月)において発表した。また、本科研研究で開発した「国際英語」教授法を用いた授業実践により、本研究代表者は、2010年5月に「大阪大学共通教育賞特別賞」、2010年11月には「大阪大学共通教育賞」を受賞した。
皮膚・毛包形成におけるRas下流Raf/PI3K/RalGEFシグナル経路の役割

RasはMAPキナーゼ経路のみならず、PI3キナーゼ経路やRalGEF経路などの他のシグナル伝達経路にもシグナルを伝達する。本研究では、特定の下流シグナル経路のみを活性化するRasエフェクター変異体をケラチノサイト特異的に発現する遺伝子導入マウスにおいて、Ras変異体の種類に特徴的な表皮形成での表現型異常が認められる点に着目し、表皮の発生・分化、癌化におけるRas下流シグナル経路の機能分担や意義を明らかにすることを目的とした。MAPキナーゼ経路を特異的に活性化するH-Rasエフェクター変異体(T35S)を表皮ケラチノサイト特異的に過剰発現する遺伝子導入マウス(CGHT35S;K14Creマウス)は、生育可能だが、表皮ケラチノサイトの分化抑制傾向と細胞増殖亢進を特徴とした異常を呈する。そこで、この異常を指標にし、表皮ケラチノサイトにおいてRasにより引き起こされるがん化シグナルを調節する分子を探索した。ヒストンや転写因子などのリシン残基をアセチル化することでクロマチン構造の弛緩や転写活性化に寄与するCBP/p300は、細胞増殖においてRas/MAPキナーゼ下流転写制御因子のコファクターとして機能することが知られている。CGHT35S;K14Creマウスと、CBP/p300コンディショナルノックアウトマウスを交配し、CBP/p300の発現量を減少させると、予想に反してCGHT35S;K14Creマウスの表皮で見られた異常がさらに顕著になり、皮膚乳頭腫様病変の形成を促進した。分子レベルでは、CBP/p300の発現量減少によってEGFR-Ras- Erkシグナリングの亢進が引き起こされていた。平成30年度は、分子レベルでの解析に加え、以上の結果を論文としてまとめた。RasはMAPキナーゼ経路のみならず、PI3キナーゼ経路やRalGEF経路などのシグナル伝達経路にもシグナルを伝達することがわかっているが、癌化や形態形成におけるRas下流シグナル伝達経路のそれぞれの役割については明らかになっていない。本研究では、特定の下流シグナル経路のみを活性化するRasエフェクター変異体をケラチノサイト特異的に発現する遺伝子導入マウスにおいて、表皮の肥厚、薄毛、縮毛といった、Ras変異体の種類に特徴的な表現型異常が認められる点に着目し、表皮および毛包の発生・分化におけるRas下流シグナル経路の機能分担や意義を明らかにする。平成27年度では、変異型Rasをケラチノサイトで発現するTgマウスのうち、薄毛および縮毛が見られた系統に着目し研究を進めた。薄毛が見られた系統の毛包間表皮では、基底細胞層および有棘細胞層に過形成が生じていることを明らかにした。また、毛包幹細胞マーカーや、毛包の分化マーカーに対する免疫組織学的解析を行い、胎生期の表皮細胞から毛包への分化は正常であり、生後3日目の毛包数および毛包の分化は対照マウスと差が無いことを明らかにした。また、生後8日目において、対照マウスの毛包は成長期にあるのに対し、薄毛系統のマウスの毛包では、毛包下部がアポトーシスを起こし退行期に移行していることを明らかにした。縮毛が見られた系統では、生後2週齢では毛包間表皮の増殖・分化、毛包の数および分化に異常は見られなかったが、対照マウスと比較して毛包の向きが均一でないことを明らかにした。平成27年度は、薄毛および縮毛が見られた系統における組織学的解析を中心に進めた。K15-CrePRマウスを用いた、in vivoにおけるRasエフェクター変異体の毛包幹細胞での機能解析は行えなかったが、薄毛および縮毛が見られた系統の表現型を明らかにすることに成功しており、おおむね順調に進展しているといえる。RasはMAPキナーゼ経路のみならず、PI3キナーゼ経路やRalGEF経路などの他のシグナル伝達経路にもシグナルを伝達することがわかっているが、癌化や形態形成におけるRas下流シグナル伝達経路のそれぞれの役割については明らかになっていない。本研究では、特定の下流シグナル経路のみを活性化するRasエフェクター変異体をケラチノサイト特異的に発現する遺伝子導入マウスにおいて、Ras変異体の種類に特徴的な表皮形成や発毛での表現型異常が認められる点に着目し、表皮および毛包の発生・分化におけるRas下流シグナル経路の機能分担や意義を明らかにする。平成28年度は、以下の結果を得た。MAPキナーゼ経路を特異的に活性化するエフェクター変異体をケラチノサイトで発現するTgマウスにおいて、胎生期におきる表皮層構造の分化は進行するが、生後1週齢までにK5陽性のbasal layerと、K1陽性のsuprabasal layerの肥厚が生じることを組織学的解析により明らかにした。また、EdU取り込みを指標にした細胞増殖を解析し、生後4日目におけるbasal layerでのケラチノサイトの増殖が対照マウスに比べ有意に亢進していることを明らかにした。この表皮の肥厚は、Rafキナーゼ経路の下流に位置するErk MAPキナーゼの発現量を、Erk1およびErk2コンディショナルKOアリルを用いて減少させることで、レスキューすることが可能であった。このことから、Ras下流シグナルのうち、Raf-Erk経路の活性化が、表皮の肥厚に中心的役割を果たしていることが明らかとなった。この成果は、学会において発表した。

当初、K15-CrePRマウスを用いた、in vivoにおけるRasエフェクター変異体の毛包幹細胞における機能の解析を行う予定であったが、K15-CrePRマウスによる遺伝子組み換え効率がCreレポーターマウスの場合と比較して著しく悪く、Rasエフェクター変異体の発現誘導が確認できなかった。現在、他のリガンド誘導型Creマウスを用いることを計画している。しかし一方で、毛包間表皮における解析を優先的に進めた結果、Ras-Raf-Erk経路の活性化が表皮の肥厚を引き起こすことを明らかにできたことから、おおむね順調に進行しているといえる。RasはMAPキナーゼ経路のみならず、PI3キナーゼ経路やRalGEF経路などのシグナル伝達経路にもシグナルを伝達することがわかっているが、癌化や形態形成におけるRas下流シグナル伝達経路のそれぞれの役割については明らかになっていない。本研究では、特定の下流シグナル経路のみを活性化するRasエフェクター変異体をケラチノサイト特異的に発現する遺伝子導入マウスにおいて、表皮の肥厚、薄毛、縮毛といった、Ras変異体の種類に特徴的な表現型異常が認められる点に着目し、表皮および毛包の発生・分化におけるRas下流シグナル経路の機能分担や意義を明らかにする。平成29年度は、以下の結果を得た。MAPキナーゼ経路を特異的に活性化するエフェクター変異体をケラチノサイトで発現するTgマウスで認められる表皮肥厚のメカニズムを明らかにするために、マウスより得た初代ケラチノサイトを用いたin vitroの解析を中心に進めた。Ras-Rafシグナルが亢進しているマウス表皮ケラチノサイトでは、コントロールと比較して、未分化マーカーであるp63およびintegrin-alpha6の発現が上昇していることが分かった。また、培地へのカルシウム添加による、keratin1、involucrin、loricrinなどの分化マーカーの発現誘導を検討した結果、コントロールと比較して分化が抑制されていることが分かった。in vivoにおいても、生後4日目の表皮基底細胞層において、コントロールでは見られない、p-cadherinおよびkeratin1共陽性の細胞が存在することが分かり、Ras-Rafシグナルによる分化抑制が表皮肥厚の一因であることが示唆された。K15-CrePRマウスに代わる他のリガンド誘導型Creマウスを導入したが、交配によるマウス生産で時間を要し、毛包幹細胞を対象にした組織学的解析が開始出来なかった。しかし、表皮肥厚に関しては、in vivo、in vitroの両面から解析を行い、現在、その結果をまとめた論文を投稿準備中であり、おおむね順調に進展しているといえる。RasはMAPキナーゼ経路のみならず、PI3キナーゼ経路やRalGEF経路などの他のシグナル伝達経路にもシグナルを伝達する。本研究では、特定の下流シグナル経路のみを活性化するRasエフェクター変異体をケラチノサイト特異的に発現する遺伝子導入マウスにおいて、Ras変異体の種類に特徴的な表皮形成での表現型異常が認められる点に着目し、表皮の発生・分化、癌化におけるRas下流シグナル経路の機能分担や意義を明らかにすることを目的とした。