hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
革新的な三次元培養装置を用いた血管化ヒト膵島再構成法の開発

尚、ヒト血管内皮細胞、および膵β細胞は、各々レトロウイルスベクターによりEGFP(Enhanced Green Fluorescence Protein)、KO(Kusabira Orange)ラベルにより蛍光標識を行い、細胞を可視化した状態で解析を実施した。培養二日後にはヒト血管細胞よりなる管腔構造の形成が確認された。培養四日後には、膵島スフェロイド周辺へ血管様構造が取り囲む形態を取る三次元構造体の創出に成功した。In vitroにおいて形成された三次元的な血管化膵島スフェロイドを、免疫不全マウスクラニアルウインドウ内へ移植した。驚くべきことに、移植早期の段階で移植片に鮮紅色の血液が還流されることが肉眼的に確認された。さらに、高速ライブイメージング共焦点顕微鏡による追尾定点観測の結果から、移植10日から20日前後には、膵β細胞の増殖と自律的な組織化が生じ、内部にヒト血管ネットワークを有する膵島様構造体へと成熟することが判明した。免疫不全マウスの生体内において形成された膵島様構造体内部のヒト血管ネットワークが、血流を伴う機能的な血管へと成熟しているか否かを確認する目的で,レシピエントマウスの尾静脈から蛍光標識デキストランの静脈内投与を行った。形成された膵島様構造体内部のヒト血管ネットワークは、ホスト血管と接合し、十分な血液還流を受ける機能血管へと成熟していることが判明した。さらに、移植後30日目の移植片の免疫組織学的解析から、膵島様構造体内におけるインスリン発現が確認され、また、コラーゲンIVやラミニンVなどの基底膜成分に裏打ちされた血管網を有することが明らかとなった。これらの膵島様構造体は、成体内に存在する正常膵島と類似の組織構築を有することが示された。前年度から引き続き、我々が開発したヒト血管ネットワーク再構成技術を用いて、ヒト血管内皮細胞・間葉系幹細胞の存在下で膵β細胞の三次元培養を実施した。その結果、膵島スフェロイドの周辺へ血管様構造が取り囲む形態を取る三次元構造体を再現性をもって自律的に創出することに成功した。In vitroにおいて形成された三次元的な血管化膵島スフェロイドを、免疫不全マウスクラニアルウインドウ内へ移植することにより、内部にヒト血管ネットワークを有する膵島様構造体を再構成することが可能であることを再現性を持って確認した。次に、免疫不全マウスの生体内において形成された膵島様構造体が血糖降下作用を有するのか否かを検討することを目的として、任意に糖尿病状態を惹起することの可能な遺伝子改変免疫不全マウス(Ins-TRECK/scidマウス)への移植実験を試みた。その結果、三次元培養法により作成した膵島様構造体に明らかな血糖降下作用があることが判明し、糖尿病モデルマウスの治療が可能であることが示された。現時点においては、膵β細胞を単独で移植する場合と膵島様構造体を移植する場合とを比較して、膵島様構造体移植に定量的な優位性を示し切れていないが、今後、移植条件を至適化することにより、本法の優位性を明確化したいと考えている。また、模擬的な微小重力環境を創出可能な2軸回転型の三次元培養装置を用いて、多数の膵島様構造体をin vitroで創出可能な手法を開発した(Tanaka H, et
新しいヒトMHC関連遺伝子の解析

筆者は、これまでに知られていなかった新しいヒトMHC関連遺伝子(MR1)を発見し、報告した(Science 269,693-695(1995))。cDNAから推測されるアミノ酸配列はsignal peptide, 3個のextracellular domains,そしてtransmembrane,cytoplasmic domainsを有する完璧なクラスI分子を示している。そのアミノ酸配列は、2個のpeptide-binding domainsにおいて、HLAクラスI分子と高い類似性を示しており、ヒトにおける既知のクラスI分子の中では最高の類似性を有する。この新しく発見したMR1遺伝子について、その発現、多型性、機能等、更に詳細な解析を進めており、成果が得られている。1.MR1遺伝子の多型性の検討。MR1遺伝子の多型性を検討する為、ヒト細胞からDNAを調製し、PCRによりMR1遺伝子の一部分を増幅し、クローニングした後、DNA塩基配列を決定した。その結果、古典的なクラスI分子の様な多型性は示さないこと明らかとなった。2.マウスMR1homologの解析。PCRによるマウスDNAより得たMR1homolog断片をプローブとして用い、マウスcDNAライブラリーをスクリーニングし、マウスMR1homologを単離し、その塩基配列を決定して、ヒトMR1遺伝子の配列と比較検討した。非常に類似性の高いMR1homologがマウスで発現していることが明らかとなった。
細胞膜カベオラのクラスター形成機構とその機能分担の解析

今年度は,昨年度に引き続き,カベオラのクラスター形成機構の解析とクラスターごとの機能解析について研究を行った.クラスター形成因子のスクリーニングを行うため,免疫組織化学的方法により,クラスター強陽性細胞の探索を行った.その結果,心筋細胞において,T管と思われる構造にカベオリン-1陽性の反応が検出された.これまでに横紋筋(骨格筋,心筋)におけるカベオリン-1の発現,局在に関する詳細な報告はなされていないことから,今回の結果は,新たなカベオリン-1の局在を見出した可能性がある.T管はカベオラが多数集合し,癒合することで形成されると考えられており,心筋はいわば,カベオラのクラスター形成能が非常に高い細胞であると言える.現在,免疫電顕法等により心筋におけるカベオリン-1の超微細局在の検討を行っている.また,カベオラクラスターごとの機能解析を行っている過程で,風邪の主要原因ウイルスの一つである,ヒトコロナウイルスの細胞内エントリーにおいて興味深い知見を得た.ヒトコロナウイルス229Eは,細胞に結合後,すぐ細胞内へ侵入せずに,ラフトを架橋しながら細胞膜上をカベオラクラスターへ移動し,カベオラもしくはその近傍から細胞内へ侵入すること,そして,この移動,侵入経路は膜コレステロール量に依存することが明らかとなった.従来,SV40のような非エンベロープウイルスがカベオラから細胞内へ侵入するという報告はあるが,コロナウイルスのようなエンベロープウイルスが細胞に結合後,どのようにしてカベオラクラスターへ移動し,カベオラから細胞内へ侵入するかは不明である.今後,クラスターごとの機能解析を含めて,コロナウイルスの細胞内侵入機構を明らかにすることは,コロナウイルスによる上気道感染のメカニズムを解明する上で,重要であると考えられる.今年度は,当初の研究計画に基づき,カベオラクラスター形成因子のクローニングとクラスター形成機構の解析について研究を遂行してきた.これは,クラスター形成陰性の細胞株と陽性細胞株とを比較する事で,クラスター形成因子のクローニングを試みることである.準備段階において,カベオラを持たない細胞株にカベオリン-1をtransientに発現させた系では,クラスター形成能が低いことが確認された.そこで,stableなクラスター陰性細胞株を樹立することを試みたが,残念なことにneomycin耐性細胞株の中で安定してカベオリン-1を発現する細胞株の樹立が困難であった.そこで,ストラテジーの方向性を転換し,クラスター形成能が非常に顕著な細胞と通常のクラスター形成能を有する細胞株との比較を行うことにし,まず,マウスの各種組織におけるカベオリンファミリーの発現を免疫組織学的にスクリーニングを行った.その結果,preliminarilyではあるが,心筋のT管と思われる構造がカベオリン-3陽性であることがわかりつつある.従来,横紋筋(骨格筋,心筋)におけるカベオリンの発現は,カベオリン-3が細胞膜上のカベオラに局在するとされてきたことから,今回の結果は新しいカベオリン-3の局在である可能性が考えられる.T管はカベオラが多数集合し,癒合することで形成されると考えられており,心筋はいわば,カベオラのクラスター形成能が非常に高い細胞であると言える.また,心筋細胞は組織であるため,培養細胞と異なり,大量のクラスター形成因子を生化学的に集めてくることが可能であることから,当初計画していたクラスター陰性,・陽性培養細胞株の比較より,強陽性心筋と通常陽性細胞株との比較の方が,材料として扱いやすい利点があると考えている.今後,免疫電顕法等により心筋におけるカベオリン-3の局在を確認する予定である.今年度は,昨年度に引き続き,カベオラのクラスター形成機構の解析とクラスターごとの機能解析について研究を行った.クラスター形成因子のスクリーニングを行うため,免疫組織化学的方法により,クラスター強陽性細胞の探索を行った.その結果,心筋細胞において,T管と思われる構造にカベオリン-1陽性の反応が検出された.これまでに横紋筋(骨格筋,心筋)におけるカベオリン-1の発現,局在に関する詳細な報告はなされていないことから,今回の結果は,新たなカベオリン-1の局在を見出した可能性がある.T管はカベオラが多数集合し,癒合することで形成されると考えられており,心筋はいわば,カベオラのクラスター形成能が非常に高い細胞であると言える.現在,免疫電顕法等により心筋におけるカベオリン-1の超微細局在の検討を行っている.また,カベオラクラスターごとの機能解析を行っている過程で,風邪の主要原因ウイルスの一つである,ヒトコロナウイルスの細胞内エントリーにおいて興味深い知見を得た.ヒトコロナウイルス229Eは,細胞に結合後,すぐ細胞内へ侵入せずに,ラフトを架橋しながら細胞膜上をカベオラクラスターへ移動し,カベオラもしくはその近傍から細胞内へ侵入すること,そして,この移動,侵入経路は膜コレステロール量に依存することが明らかとなった.従来,SV40のような非エンベロープウイルスがカベオラから細胞内へ侵入するという報告はあるが,コロナウイルスのようなエンベロープウイルスが細胞に結合後,どのようにしてカベオラクラスターへ移動し,カベオラから細胞内へ侵入するかは不明である.今後,クラスターごとの機能解析を含めて,コロナウイルスの細胞内侵入機構を明らかにすることは,コロナウイルスによる上気道感染のメカニズムを解明する上で,重要であると考えられる.
情報社会における評判システムに関する研究

評判システムによる信頼できる情報化社会を実現するために、組織内のヒトの活動と、ウイルス感染下の「信頼」研究を実施した。説得心理学も考慮し、アンケートと実験から、ウイルス感染時の人の心理と行動に関する基礎データを収集・分析した。その結果、ウイルス感染認知は、ITスキルに依存し、ウイルス対策を実施する人は、ウイルス感染経験がある場合が高いこと等が明らかになった。ネットワーク・コミュニティに関しては、組織活動の評価法を提案し、その有効性を検証した。インターネット上のネット・コミュニティを対象にした情報化社会において、人々がネットワークから正確な情報を得るためには、情報セキュリティの研究と共に、システムを扱うヒトの「信頼」の両面を、同時に確保する必要がある。前者については、社会問題となっているDDoS攻撃を対象にした検討を、また後者については、ネットワーク・コミュニティにおけるメンバー間の相互信頼を評価する方法について考察した。情報セキュリティに関する研究としては、従来のIT分野からの視点に加えて、説得心理学も考慮し、しかもアンケートと共に実験まで実施して、ウイルス感染時の人の心理と行動に関する基礎データを収集・分析した。その結果、ウイルス感染状態は、地震や津波等のパニック状態に近いこと、及びウイルス対策を実施する人は、過去にウイルス感染経験がある場合が高いことなどが明らかになった。それらの結果に関しては、国内学会7件で発表し、国際会議に投稿中である。次年度は、これらのデータの精緻と共に、ウイルス感染を防ぐ対策について、検討を進める予定である。ネットワーク・コミュニティに関しては、実際の大学内組織に収集されたメールデータの分析から、組織活動の評価法を提案し、その有効性を検証した。医療データ支援システムや女性研究者支援システムを構築し、実際の現場におけるコミュニティの形成や情報の正確さ等の調査を行い、論文2件、学会発表2件を行った。今後は、評価手法の一般化と、その汎用ツール化を行う。前年度に引き続き、前者については、社会問題となっているDDoS攻撃を対象にした検討を、また後者については、ネットワーク・コミュニティにおけるメンバー間の相互信頼を評価する方法について考察した。その結果、ウイルス感染実験を受けることにより、感染経験のない人が、感染に対する危機意識を持ち、対策行動へのインセンティブが挙がこと、及びウイルス感染を認知した場合の反応は、パニックになる素人型と、落ち着いて熟慮後、行動する専門家型に分類されること等が明らかになった。それらの結果に関しては、本論文2件、国内学会5件で発表し、国際会議に投稿中である。次年度は、これらのデータの精緻と共に、ウイルス感染を防ぐ具体的な対策について検討を進める予定である。ネットワーク・コミュニティに関しては、実際の大学内組織に収集されたメールデータも元に、組織活動のパワー中心性評価法を提案し、その有効性を検証した。論文1件、学会発表1件を行った。今後は、評判システムと、今回の分析方法を統合して、評判値に基づく組織活動の変化に関する考察を進める予定である。前者については、社会問題となっているサイバー攻撃を対象にした検討を、また後者は、ネットワーク・コミュニティにおけるメンバー間の相互信頼を評価する方法について考察した。情報セキュリティに関する研究としては、前年度実施したアンケートと実験結果の分析を中心に検討を進めた。特に、ヒトがウイルスの脅威を提示された時、脅威の深刻さおよび生起確率を認知するレベルに関する研究に焦点をあて検討した。現在までに、実験協力者をPCの習熟度別に高・中・低の3段階に分類した場合、統計的有意な分析結果が得られた。さらにPC習熟度が高く、かつウイルス感染経験の有るメンバーが脅威を正確に認識してウイルス駆除行動まで実施する可能性が高いことを明らかにした。それらの結果に関しては、国内学会3件、国際会議1件で発表した。今後は、これらのデータの精緻と共に、これらの結果を踏まえたウイルス感染を防ぐ技術的対策の具体化を検討する予定である。ネットワーク・コミュニティに関しては、代表的なSNSであるTwitterを対象に、組織活動の評価法を提案し、その有効性の検証研究を開始した。衆議院選挙をトピックとするコミュニティの形成や情報の正確さ等の調査を行い、学会発表1件を行った。今後は、コミュニティ・メンバーにおける類似性から特徴づけられるコミュニティの性質、それに基づくコミュニティメンバーの将来行動予測、さらに提案評価手法の精度検証と、その汎用ツール化を行う予定である。当初、評判システムそのものの研究に集中する計画であったが、評価すべきサービス(情報セキュリティ、および組織内活動モデル)への研究を先に実施することが、社会的な要請から重要と判断し、本期間は優先させた。

そのため、当初予定よりも、評判システム自体の研究の進捗が、やや遅れ気味になってしまった。24年度が最終年度であるため、記入しない。評判システムで評価するサービスのデータ収集法や評価法については、ほぼ具体化できたため、今後は、当初の計画通り、主としてエージェントを使った評判システムの性能評価の研究をシミュレーションにより推進可能と思っている。
非意図的生成PCBの異性体組成の解明とその生体影響評価に関する研究

顔料や化成品の製造に伴い非意図的に生成するPCBsについて、新たにクロロフェニルシラン類にも含有している事を明らかとした。非意図的生成PCBsに特異的なコンジェナーについて、10種の核内受容体を介した作用を検討したところ、いくつかのコンジェナーにエストロゲン受容体(ER)α/βアゴニスト及びアンタゴニスト作用などが認められた。環境中での非意図的生成PCBsの動態について検討した。環境大気や底質ではカネクロールの影響が強かったものの、一定程度のアゾ系顔料に含まれるPCBsの影響も認められた。しかしながら、海棲哺乳類の脂皮や肝臓には顔料に由来するPCBsはほとんど含まれていなかった。非意図的生成PCBsとしては、これまで物の燃焼による発生の他に、顔料や塩素化パラフィンの製造過程における副生成が知られてきた。しかし、その他化成品にもこのようなPCBsが含有する可能性があることから、特に製造工程においてクロロベンゼンを使用する化成品のPCBs含有の有無について検討した。フェニル系シリコーンの原料であるクロロフェニルシラン類中に非意図的にPCBsが含有していることが判明し、その濃度とコンジェナーパターンを各試薬メーカーが販売しているクロロフェニルシラン類について検討した。トリクロロフェニルシラン、ジクロロジフェニルシラン、クロロトリフェニルシラン、ジフェニルシランジオールにおけるPCBs濃度は、それぞれ0.000722.7、6.51,500、0.0191.1、0.12120mg/kgであり、特にジクロロジフェニルシランとその加水分解生成物であるジフェニルシランジオールの濃度が高い傾向が認められた。いずれも低塩素化体であるmono-CBsやdi-CBsが高い割合で検出された。特にdi-CBsで検出されたコンジェナーは、PCBsにおける2つのビフェニル骨格に塩素原子が一つずつ置換した構造のものであり、クロロフェニルシラン類を合成する際に使用されるクロロベンゼンが、その合成過程で二量化していることが示唆された。シリコーンを使用している接着剤中のPCBsを分析したところ、ND40mg/kgであった。PCBsが検出されたロットの同族体及びコンジェナーパターンはジクロロジフェニルシランやジフェニルシランジオールとほぼ同等であった。一方、リン系難燃剤中のPCBsの検討も行った。しかしながら、PCBsを検出したものは僅かであり、その濃度も全て0.05ppm以下の低濃度であった。すなわち、非意図的に生成したPCBsは検出されなかった。実際の環境試料における非意図的生成PCBsの実態について、室蘭港の底質を対象として検討した。底質中のPCBsについてコンジェナーごとに定量し、これを未知発生源の存在を考慮したケミカルマスバランス法を用いて、PCBsの汚染由来を推定した。PCBsの汚染由来として、4種のカネクロールと燃焼の他、非意図的生成PCBsとして2種の顔料(アゾ、フタロシアニン)を仮定し、主成分分析を用いてそれらのコンジェナーパターンの特徴を縮約し、説明変数を決定した。次にその説明変数をベイズ型組成半因子モデル(CBMK2)に適用し、底質のPCBs汚染由来を解析した。各底質の寄与率推定結果は、未知発生源の存在がほぼ無視でき、仮定した7種の汚染由来で適切に説明できた。港湾内部では船底塗料として使用されてきたKC500やKC600の寄与が高かったが、港湾外ではアゾ顔料の影響も認められ、PCB製品以外のPCBs汚染が環境中に存在していることが示唆された。生物についても、ハッブスオウギハクジラの脂皮及び肝臓中を用いて検討した。脂皮及び肝臓におけるPCBs濃度は、それぞれ13,000、7,300 ng/g-lipidであり、脂皮の方が濃度が高かった。コンジェナーパターンは概ねカネクロールと同等だったが、生体内に特異的に残留するコンジェナーや、逆にほとんど残留しないコンジェナーが認められた。一方、非意図的生成PCBs(顔料)に特異的なコンジェナーであるPCB-11やPCB-209は、前者についてはほとんど存在せず、後者についてはカネクロールか顔料のどちらに由来しているかについて判断は出来なかった。なお、生物試料の分析にあたっては、Supelclean sulfoxide SPE tubesとDiscovery Ag-ION SPE tubesを適用し、油分の効率的に除去する方法についても検討し、確立した。当該年度に予定していた環境中におけるPCBsの汚染由来解析は、ベイズ形半因子モデルを使用して室蘭港の底質試料について検討した。この結果については国内及び国際学会でまた、学術論文として受理・発行されている。また、北海道衛生研究所と共同で行っている非意図的生成PCBに特徴的なコンジェナーのAhR及びホルモン受容体との反応性に対する代謝の影響についての検討も、当初予定どおり終了し、国内の学会で発表され、学術論文として投稿準備中である。生物種における非意図的生成PCBsの検討については、海棲哺乳類である鯨類について、部分的ではあるが検討を行った。この成果についても国内学会での発表及び学術論文への投稿の準備中である。これらのことから、本研究は当初予定どおり順調に進行していると考える。なお、化成品等に非意図的に含まれるPCBsについては、新規に可能性のある化成品に関する情報が無かったことから、調査を実施しなかった。

秋期における収穫後の田園地帯における環境大気の秋期のダイオキシン類及びPCBの日間変動について調査を行い、気象要因との関連性や高濃度要因、非意図的生成PCBの影響等の検討を行った。ダイオキシン類及びPCBが高濃度となる気象的要因としては、風速が弱く大気が安定であること、降水が少ないこと、大気が安定であること、等が確認された。PCBについては、これらの他に温度依存性も認められた。ベイズ型組成半因子モデルによる解析から、調査地点の大気中のダイオキシン類のほとんどが燃焼発生源由来であったが、PCBについてはダイオキシン類濃度が高い時は燃焼発生源由来の寄与が強く、低い場合はカネクロールの寄与が強くなっていた。一方、非意図的生成PCBの影響は小さかった。非意図的生成PCBとして代表的な25のコンジェナーについて、ホルモン受容体を含む10種の核内受容体及びダイオキシン受容体(AhR)を介した作用を高感度レポーターアッセイにより検討した。エストロゲン受容体(ER)α/βアゴニスト及びアンタゴニスト作用は、19及び13コンジェナーにそれぞれ認められた。グルココルチコイド受容体では5コンジェナーに、アンドロゲン受容体では全てのコンジェナーにアンタゴニスト作用が認められた。AhRアゴニスト作用は5コンジェナーに認められた。非意図的生成PCBとして代表的なPCB-11は、他のコンジェナーに比べ各受容体の作用は小さかった。PCB-11は、底質や環境大気といった試料には一定の濃度で含まれていた。海棲哺乳類中にはPCB-11をはじめとする低塩素化PCBはほとんど含まれておらず、取り込まれたPCBsが生体内で蓄積せず速やかに代謝されているものと考えられた。このため生体における非意図的生成PCBの定量的な影響評価には、代謝物である水酸化PCBについても検討が必要であった。顔料や化成品の製造に伴い非意図的に生成するPCBsについて、新たにクロロフェニルシラン類にも含有している事を明らかとした。非意図的生成PCBsに特異的なコンジェナーについて、10種の核内受容体を介した作用を検討したところ、いくつかのコンジェナーにエストロゲン受容体(ER)α/βアゴニスト及びアンタゴニスト作用などが認められた。環境中での非意図的生成PCBsの動態について検討した。環境大気や底質ではカネクロールの影響が強かったものの、一定程度のアゾ系顔料に含まれるPCBsの影響も認められた。しかしながら、海棲哺乳類の脂皮や肝臓には顔料に由来するPCBsはほとんど含まれていなかった。当該年度に予定していた未測定・未解明の顔料・化成品中のPCBs異性体パターンの把握はほぼ達成された。この検討結果については既に国際学会で発表され、また、学術論文として受理・発行されている。また、非意図的生成PCBに特徴的に含まれるコンジェナーのAhR及びホルモン受容体との反応性に対する代謝の影響について検討するための検液の作成も終了していることから、今後これらのレポータージーンアッセイを進める準備も整っている。さらに、海洋における高次捕食者である、鯨類等の海棲哺乳類の試料の確保も進行中であり、今後検討を進める上で順調に研究が進んでいると考える。前年度に引き続き、生体試料中のPCBs分析を進め、非意図的生成PCBsの動態を観察する。
鋼構造物の崩壊過程に関する理論的研究

鋼構造部材及び骨組に着目し、これが完全崩壊に至るまでの挙動を解析するための理論及び技術的方法を確立するという本研究の主題に沿って、研究遂行の道筋を3段階に分割して研究を進め、下記の研究成果を得た。(1)構造の崩壊過程を律する法則の把握:単調載荷過程における構造の崩壊とはどのようなものであるかは微視的には分かっていたのであるが、これを巨視的にいかに表現するかを見出すことが主たるテーマであった。研究の結果、崩壊が発生するか否かに依らず、単調載荷とはある種の巨視量が増え続ける過程に他ならないのではないかという仮説をほぼ立証し得た。崩壊が発生する時の正しい負荷経路とはこのパラメータが減らない方向であると解釈した。(2)プログラムコードの開発:単調載荷過程における構造局部の負荷・除荷の別は上記の単調載荷仮説によって判定できる。このアルゴリズムを骨組構造解析プログラムに組み込み、崩壊過程追跡プログラムを作成した。(3)ケーススタディの蓄積:作成プログラムを実用上重要な下記2例の構造崩壊問題に適用してケーススタディを積み重ね、理論の有効性を数値実験的に検証すると共に、不安定な部材ないしこれを含む骨組の挙動特性の一端を明らかにした。1)円形鋼管柱部材の局部座屈後の挙動2)鋼ラーメン架構の火災高温時における崩壊挙動鋼構造部材及び骨組に着目し、これが完全崩壊に至るまでの挙動を解析するための理論及び技術的方法を確立するという本研究の主題に沿って、研究遂行の道筋を3段階に分割して研究を進め、下記の研究成果を得た。1)円形鋼管柱部材の局部座屈後の挙動2)鋼ラーメン架構の火災高温時における崩壊挙動
児童の運動有能感の発達に関する研究

本研究では、これまでの幼児を対象とした研究を基礎に、児童を対象とした運動の有能感を測定する尺度を開発し、さらに、運動能力、遊びの調査、学校での行動特徴、体育の授業に対する取組などを調査し、それらの関係を明らかにすることを目的として行ってきた。昨年は、児童の運動有能感尺度のデーター収集を目的として、神奈川県下の3校、山梨県甲府市の1校の計4校の小学1年、2年生の児童(男女)を対象に以下の検査項目の測定を行った。研究の最終年度である本年度は、昨年度に収集されたそれぞれのデータを処理し、10項目からなる低学年用運動有能感尺度を作成した。さらに、この尺度の信頼性と妥当性を求めると同時に、児童期の子どもたちの運動に関する有能感と子どもたちの行動傾向を明らかにするために、運動有能感尺度の結果と運動能力、有能さを含む教師による児童の行動評定、教師の運動評定、遊びの実態、体育の授業に対する取組との関連性に関して分析を行った。その結果、運動有能感尺度の結果と文部省の小学校低学年用の運動能力検査の間には「もちはこび走」を除く4種目と有能さを含む教師による児童の行動評定のうち「運動場面」、教師の運動評定の間に有意な相関を認められた。また、遊びの実態、体育の授業に対する取組との関連性に関しては、全体として、学年が1年生から2年生へと進行するに従い、男子の方が運動有能感が学校や家庭での運動活動に対して影響を与える傾向が高いことを示していた。本研究では、これまでの幼児を対象とした研究を基礎に、児童を対象とした運動の有能感を測定する尺度を開発し、さらに、運動能力、遊びの調査、学校での行動特徴、体育の授業に対する取組みなどを調査し、それらの関係を明らかにすることを目的とした。本年度は、神奈川県横浜市2校、川崎市1校、山梨県甲府市1校の計4校の小学1年、2年生の児童(男・女)を対象に測定を行った。手続きは、被験児に対して面接法で運動有能感尺度を行い、さらにこの結果と運動能力、有能さを含む教師による児童の行動評定、教師による運動評定、彼等の遊びの実態、体育の授業に対する取組の実態との関連性に関する調査を行った。実施した具体的な検査項目については以下の通りである。1)運動有能感尺度;面接法による幼少年期の子どもたちを対象にした運動に関する有能さの認知を測定する尺度2)有能さを含む教師による児童の行動評定;従来用いられてきた行動の自発性・積極性等をみるチェックリストを再検討して作成した一般場面と運動場面の2つの場面に関する行動評定3)体育の授業及び遊びに関する実態調査;今現在行っている遊びの実態や体育の授業に対する取組の実態などについての質問紙調査4)運動能力検査:文部省の小学校低・中学年運動能力テスト5)教師の運動評定:児童に行った運動有能感尺度と同じ種目に関しての担任の教師に「上手な方」、「ふつう」、「へたな方」の3段階で評定を依頼本研究では、これまでの幼児を対象とした研究を基礎に、児童を対象とした運動の有能感を測定する尺度を開発し、さらに、運動能力、遊びの調査、学校での行動特徴、体育の授業に対する取組などを調査し、それらの関係を明らかにすることを目的として行ってきた。
鉄基磁性微粒子を孤立分散した半導体酸化チタン膜の合成と磁気抵抗の光誘起効果の測定

本研究は,可視光で透明な酸化チタン膜中に鉄磁性微粒子を孤立分散堆積して,そこにおける異種物質の界面部分での電子状態を光照射(含UV線)で刺激誘起して電子授受の確率を増大させ伝導電子を膜中に過剰供給し孤立鉄磁性微粒子間のトンネル電流の増大を図り,磁気抵抗効果を増大させること(光誘起磁気抵抗効果)を検証する。数度のスパッタ装置内のターゲット配置等改良を踏まえて,2源スパッタリングにより,トンネル電流が励起される程度に孤立分散した酸化チタン/孤立分散鉄微粒子膜の合成を実施し,合成膜の構造評価の結果を踏まえて主として以下の研究計画を実施した。(1)合成した複合膜の構成(堆積鉄量)と膜の光学的透明度の測定,(2)構成膜の透明度と熱処理条件,(3)膜の電気抵抗測定,(4)合成膜の磁気測定,(5)磁気抵抗効果の測定と光誘起効果の検出であった。最終年度は薄膜堆積時のガス流安定制御の問題や真空排気系の故障(ターボポンプの交換等のトラブル)が発生し,予定した研究計画の達成度は50%以下であったが,今後の研究のために解決すべき課題を抽出することができた。本研究の主な実験結果と今後の課題は以下の通りである:(1)鉄微粒子と酸化チタンが交互堆積した複合構造膜は,堆積時の酸化チタンはアモルファス状態であり低温加熱(200°C)で二酸化チタン膜となった。この時点では微量ながら巨大磁気抵抗効果(GMR)を示した。鉄微粒子の堆積量が増大すると膜の透明度は著しく低下した。(2)窒素・酸素ガス中の加熱処理(400°C)後,膜の透明度は著しく増大することが分かった。しかし,鉄堆積量が比較的多い交互堆積膜では,熱処理後は鉄の酸化によるものと思われる黄色を呈し,磁気測定の結果は,焼鈍前に比べて著しく磁化が低下した。これは,加熱温度域が合成酸化チタン膜の結晶構造がルチル型よりアナターゼ型が安定な温度域のためと鉄の酸化によるものと推測されたが,X線回折では鉄酸化物の存在は明確には検知されなかった。(3)合成膜の電気抵抗は合成直後で光学透明度と相関があり,透明度の高い膜は測定ができず,磁気抵抗効果の測定の難しさを示唆した。微少な巨大磁気抵抗効果が認められたが,透明な複合膜では測定ができなかった。今後は解決すべき課題(ガス流量計,膜厚計測計などの設置による合成膜作製)を解決し,バンド幅を変化できると言われている窒素ガスを含むスパッタガス中での膜製造を行い,磁気抵抗効果の測定ならびにUV照射による光誘起効果の増大を明確に示す実験データを集積する。

本研究の目的は,異種物質を複合した膜中で隣接した異種物質の界面で起こる電子状態を光(含紫外線)照射により刺激して電子授受の確率を増大させ伝導電子を過剰供給し孤立磁性微粒子間のトンネル電流の増大を図り,その結果として磁気抵抗効果の増大させること(光誘起磁気抵抗効果)を目指す.今年度は最初の試みであり,当初予想した通りに複合膜が合成できるかが課題であった。主な実験結果と今後の課題は以下の通りである。(1)購入したrf型スバッタ装置で,粉末二酸化チタンの焼結材ターゲットを使用し.電力60100WでArガス圧3×10-3Torrで堆積させ,鉄微粒子は直流電源50100mA電圧300700Vでスバッタさせて半導体二酸化チタン膜中に鉄基磁性微粒子を分散した試料膜を合成できた。鉄基磁性微粒子の分散状態およびサイズは電圧・電流のスパッタ条件で堆積速度を変化させて制御した。今後は.製膜時に基根付近に1軸性の磁場を印加して堆積する鉄基磁性微粒子が結晶異方性を有するよう配慮することにした.(2)合成膜のX線解析した結果、二酸化チタン膜の結晶構造はルチル型であり、鉄微粒子は孤立分散した状態ではなく、連続したBCC構造を示す薄膜であることが分かった。今後トンネル電流が励起される程度に孤立分散した複合膜の合成のためには装置の改良が必要であることが判明し、そのため横配置したターゲットからの堆積を抑制する改良設計を実施した。(3)合成した複合膜は合成後はTiO2/Feの積層構造を成すが,200度の低温度加熱で多層構造を破壊し、鉄微粒子と二酸化チタンは均質に混合することが分かった。(4)磁気抵抗を測定した結果、加熱前の膜では巨大磁気抵抗(GMR)を示すが、加熱後は鉄膜単体膜に相当する磁気抵抗の特徴を示し、この特徴は加熱に伴う構造変化過程と対応して説明できた。(4)今回は鉄微粒子が孤立分散したものでなかったので透明ではなく、光誘起による磁気抵抗の変化は顕著には測定できなかった。(5)一方,ゾル・ゲル法で作成した二酸化チタン膜は400度の加熱処理でアナターゼ型を示し、メチレンブルーによる光触媒能の結果から光誘起特性があることが分かった。次年度以降,磁性微粒子の分散状態を制御し透明複合膜を合成し光誘起効果と光触媒能を評価する.本研究は,異種物質を複合した膜中で隣接した異種物質の界面で起こる電子状態を光(含紫外線)照射により刺激して電子授受の確率を増大させ伝導電子を過剰供給し孤立磁性微粒子間のトンネル電流の増大を図り,磁気抵抗効果の増大させること(光誘起磁気抵抗効果)を目指す.前年度は装置の設計上の不備の関係で当初計画した成膜実験は出来なかった。したがって,本年度の研究計画の実施計画は,(1)スバッタ装置の配置等改良,(2)トンネル電流が励起される程度に孤立分散した鉄微粒子膜の合成,(3)膜の構造評価,(4)合成膜の半導体特性と光吸収特性の測定であった。また,基盤となる技術等は他の研究にも活かされた。本研究の主な実験結果と今後の課題は以下の通りである。(1)スバッタ装置の配置等改良:2源を利用したスバッタ膜の堆積装置としての機能を発揮できるよう堆積基盤の周囲に遮蔽板を配置して,積層構造を有する不連続な分散粒子膜の製作が可能になった。(2)孤立分散した鉄微粒子膜の合成:遮蔽板配置とスバッタ源の距離・電力を変化させて鉄微粒子の不連続膜を製造することができた。鉄微粒子の膜厚制御は現有装置の性能の点で不可能なので堆積時間による手動制御を採用した。(3)膜の構造評価:前年度は鉄微粒子と酸化チタンが堆積時に混合したと思われる複合構造膜であった。堆積時の酸化チタンはアモルファス状態であり低温加熱(200C)で二酸化チタン膜となった。
実行意図の形成による恋人間暴力への予防的介入とスマートフォン・アプリの開発

本研究の目的は,恋人間暴力の発生や激化を防ぐための予防的介入を開発することにある。その目標を達成するために,if-then形式の行動計画である実行意図の形成による予防的介入を提案し,その効果検証を行う。研究1では,webメールを用いて実行意図の形成による予防的介入の効果測定を行う。研究2では,恋人間暴力の予防的介入のためのスマートフォン・アプリを開発し,利用可能性を検討する。研究3では,スマートフォン・アプリを改良した上で,アプリを用いた予防的介入プログラムを実施し,その効果検証を行う。これらの研究を通して,特定のターゲットへのピンポイント介入も可能な恋人間暴力の予防的介入を開発する。
中国民営ゾンビ企業発生の契機と径路の実証研究：開発ミクロ経済学からのアプローチ

この研究課題は、中国などの新興国経済が直面する経済停滞の克服のための政策提言を行うことを目的として、現在、中国でもその存在が問題となっているゾンビ企業について、特に民営企業のゾンビ企業化に注目してその存在の有無の確認、中国民営企業をゾンビ企業化させる要因の実証的解明、そしてより詳細に企業のライフサイクル上のどのタイミングでゾンビ企業化していくのか、を明らかにする。それにより、市場のゆがみ、経済停滞をもたらす一因となっている企業の市場競争力の停滞を克服するという観点から上記の政策提言を行う。
高品質酸化物単結晶の育成とその評価に関する研究

本年度は、(1)FZ法による偏光子用材料のルチル単結晶の高品質化、(2)高い複屈折が期待される三重ルチル構造のMgTa_2O_6およびNiTa_2O_6単結晶の育成とその評価、(3)高品質水晶の水熱育成、(4)育成結晶の完全性を評価など、工業材料としてそれが応用可能な高品質酸化物単結晶の育成法の確立を目的として、以下のような成果が得られた。1)ルチル単結晶に関しては、小傾角粒界の制御に効果のあるAlと同様に不純物元素ZrとScを添加し、育成条件と小傾角粒界の生成状態との相関関係について明らかにした。とくに育成結晶の光学的な評価により欠陥発生機構を解明し、高品質化の単結晶を育成することができた。2)三重ルチル型酸化物結晶の育成では、MgTa_2O_6を[001]方向に育成できた。この単結晶は歪みのない複屈折率0.11、吸収端280nmを有しており、ルチルより広い光透過領域を持っていることが明らかになった。また、NiTa_2O_6の育成も行い、その復屈折率は0.15であり、光透過率測定では300-500、650-900および1100-1600nmに強い吸収が認められた。3)水晶はNH_4F水溶液やケイフッ化ナトリウム水溶液などを用いて水熱育成した。アルカリ溶液を用いた従来の育成(-400°C、-200MPa)よりも低温低圧(-300°C、-100MPa)下で水晶を育成でき、結晶のZ軸方向の成長がX軸方向に比べて非常に早いことが明らかとなった。しかし、その結晶はかなり欠陥の多く、デバイスとして実装するには程遠いものであった。このため、紫水晶を育成するために酸化鉄を添加して育成したのちガンマ線を照射した。この紫水晶の光吸収スペクトルは天然に産するものに遜色ないものであった。単結晶が有する特性を最大限に引き出すためには目的とする単結晶の高品質化が基本である.各種の光学デバイスや電子デバイスの高性能化,高信頼化,小型化はますます必要となることは明かであり,多様な用途を持つ単結晶に対して育成結晶の高品質化を目的として欠陥生成機構を明らかにし,欠陥の生成を抑制・低減させる育成法を確立することが極めて重要である。この様な観点から本年度の研究結果は次のとおりである。(1)ルチル単結晶に関して,A1と同様に小傾角粒界の制御に効果のある不純物元素ZrとScを添加し,育成条件と小傾角粒界の生成状態との相関関係について詳細に検討した。特に育成結晶については光学的な評価方法を用いて欠陥発生機構を解明し,単結晶の高品質化のための育成法を明確にした。(2)三重ルチル型酸化物の育成では,NiTa206の育成を行った。この結晶については育成法および光学的性質に関するデータがないため,高品質化とともに屈折率や光透過率などを明らかにした。(3)水晶の水熱育成に対する溶媒の影響を明らかにするためにNH4F水溶液やケイフッ化ナトリウム水溶液などを用いての育成を行うとともに育成結晶についての種々の評価を行った。単結晶が有する特性を最大限に引き出すためには目的とする単結晶の高品質化が基本である.各種の光学デバイスや電子デバイスの高性能化,高信頼化,小型化はますます必要となることは明かである。

したがって、多様な用途を持つ単結晶の高品質化を目的として育成時に生成する欠陥の抑制・低減させる育成法を確立するとともに、その生成機構を明らかにすることは極めて重要である.このような観点から、本年度行った研究成果は次のとうりである。(1)ルチル単結晶に関しては,小傾角粒界の制御に効果のあるAIと同様に不純物元素ZrとScを添加し,育成条件と小傾角粒界の生成状態との相関関係について明らかにし、とくに育成結晶の光学的な評価をにより欠陥発生機構を解明し,高品質化の単結晶を育成することができた。(2)三重ルチル型酸化物の育成では,NiTa_2O_6の育成を行い、この光学的性質を明らかにした。その単結晶の屈折率はn_0=2.29,n_e=2.44であり、また光透過率は300-500、650-900、1100-1600nmに強い吸収が認められた。(3)水晶はNH4F水溶液やケイフッ化ナトリウム水溶液などを用いて水熱育成した。アルカリ溶液を用いた従来の育成(400°C,200MPa)よりも低温低圧(300°C,100MPa)下で水晶を育成でき,結晶のZ軸方向の成長がX軸方向に比べ非常に速いことが明かとなった.しかし、その育成結晶はかなり欠陥が多くデバイスとして実装するには程遠いものであった。本年度は、(1)FZ法による偏光子用材料のルチル単結晶の高品質化、(2)高い複屈折が期待される三重ルチル構造のMgTa_2O_6およびNiTa_2O_6単結晶の育成とその評価、(3)高品質水晶の水熱育成、(4)育成結晶の完全性を評価など、工業材料としてそれが応用可能な高品質酸化物単結晶の育成法の確立を目的として、以下のような成果が得られた。1)ルチル単結晶に関しては、小傾角粒界の制御に効果のあるAlと同様に不純物元素ZrとScを添加し、育成条件と小傾角粒界の生成状態との相関関係について明らかにした。とくに育成結晶の光学的な評価により欠陥発生機構を解明し、高品質化の単結晶を育成することができた。2)三重ルチル型酸化物単結晶の育成では、MgTa_2O_6を[001]方向に育成できた。この単結晶は歪みのない複屈折率0.11、吸収端280nmを有しており、ルチルより広い光透過領域を持っていることが明らかになった。また、NiTa_2O_6の育成も行い、その複屈折率は0.15であり、光透過率測定では300-500、650-900および1100-1600nmに強い吸収が認められた。3)水晶はNH_4F水溶液やケイフッ化ナトリウム水溶液などを用いて水熱育成した。アルカリ溶液を用いた従来の育成(-400°C、-200MPa)よりも低温低圧(-300°C、-100MPa)下で水晶を育成でき、結晶のZ軸方向の成長がX軸方向に比べて非常に早いことが明らかとなった。しかし、その結晶はかなり欠陥の多く、デバイスとして実装するには程遠いものであった。このため、紫水晶を育成するために酸化鉄を添加して育成したのちガンマ線を照射した。この紫水晶の光吸収スペクトルは天然に産するものに遜色ないものであった。
PETトレーサー合成に向けた高速化学反応の開発研究

本研究グループではこれまでに、陽電子放射断層画像撮影法(PET法)による生体内分子イメージングを自指して、sp^2/sp^3炭素間のStille型高速クロスカップリング反応の開発に成功している。本反応では、[^<11>C]ヨウ化メチルの活用を前提に、それに対して大過剰量の有機スズ化合物をPETトレーサー前駆体として用いている。有機スズ化合物は第一に、多くの有機反応剤や精製資材に対して安定であるため最終段階での放射核の導入が可能であること、第二に、低極性であり、従って、クロスカップリング後の超微量^<11>C標識化合物の精製の際に、大過剰の残存非放射性スズ基質からの分離が容易であることなどの理由から、その使用はPETトレーサー合成に要求される諸条件を満たしている。しかし一方で有機スズ化合物は、PETトレーサー合成の観点からはそれほど深刻ではないにしても、その生体に及ぼす毒性が問題になることがしばしばある事も事実である。そこで本研究では、そのような毒性の心配のないSuzuki型クロスカップリング反応、すなわちホウ酸エステルのPETトレーサー前駆体としての活用を検討することにした。まず、モデル基質において種々反応条件のスクリーニングを行った結果、目的とする高速メチル化反応が収率良く準行する条件を見出すことに成功した。本反応は、従来のStille型高速クロスカップリング反応では低収率であった窒素原子などのヘテロ原子が分子中に存在しているような基質の場合でも高収率で目的のメチル化生成物を与える。今後、実際のPETトレーサー合成条件下で本反応の適用可能性を検討する予定である。イソキノリンスルホナミド系化合物である塩酸ファスジル(HA-1077)は、セリン/スレオニンプロテインキナーゼの一種であるRhoキナーゼを阻害する。また、攣縮状態にある血管を拡張し血流を増加させるなどの作用を持ち、くも膜下出血術後における脳血管攣縮による虚血の予防・改善薬として臨床で用いられている。当研究グループでは、HA-1077に2つのメチル基を導入したH-1152が、HA-1077よりも阻害活性および他のキナーゼに対する阻害選択性のいずれもが優れていることを明らかとし、本化合物は今後の創薬展開が期待されているが、その薬効の詳細な分子機構および脳内動態についてはHA-1077とともに明らかとなっていない。本研究では、HA-1077やH-1152の作用発現分子機構の解明研究の一環として、陽電子断層画像撮影(PET)法によるH-1152の脳内動態解析を行うことを目的に、半減期が約20分である短寿命陽電子放射核^<11>Cを含有するPETトレーサー[^<11>C]H-1152の合成を計画した。当研究グループではこれまでにsp^2/sp^3炭素間のStille型高速クロスカップリング反応を新たに開発し、ヨウ化メチルと芳香環スズ化合物との高速メチル化反応を実現しているが、その条件は窒素原子などのヘテロ原子が分子中に存在しているような本研究の場合には適用できないことがわかった。そこで今回、本問題の克服に向けてヨウ化メチルとイソキノリンスズ化合物とのモデル反応において種々反応条件のスクリーニングを行った結果、反応溶液に適切な塩基を添加することで目的とする高速メチル化反応が収率良く進行することを見出した。今後、本反応をH-1152のスズ前駆体化合物を用いて検討するとともに、実際のPET条件下で反応を行い[^<11>C]H-1152の合成を達成し、分子イメージングを行う予定である。
腸管神経節欠損ラットの原因遺伝子解析と薬理試験への応用

腸管神経節欠損ラットの肺において、エンドセリンタイプBレセプター(Ednrb)遺伝子の発現をNorthern blot解析により調べたところ、このラットにおいてこの遺伝子の発現が著明に減少していることを見い出した。更にEdnrbのmRNAについて、RT-PCR法により解析したところ、このラットにおいては2種類の異常なサイズのEdnrb mRNAが発現されていることが明らかになった。この配列をEdnrbゲノム遺伝子の配列と比べた結果、一つは第2エクソンの翻訳開始コドンから数えて第20番ヌクレオチドから第2エクソンの終わり(第483番ヌクレオチド)までの458bpが欠失したもの、もう一つは第2エクソンの第213番ヌクレオチドから同じく第2エクソンの終わりまでの270bpが欠失したものであることが判明した。以上の結果から、このラットにおいては、Ednrb遺伝子の発現が著明に低下していること、及び発現したmRNAも異常なスプライシングの結果その一部を欠失していることが、本ラットにおける腸管神経節欠損の原因であることが推察された。我々は以前にラット骨髄ストローマ細胞からのIL-6分泌がエンドセリンの調節を受けていることを既に報告しているので、この作用を腸管神経節欠損ラットを用いて解析を試みた。しかしながらヘテロ及びワイルドタイプのコントロールラットにおいてさえもエンドセリンによるIL-6分泌の増強が見られなかった。従ってこのミュータントラットを使ってのエンドセリン刺激による骨髄ストローマ細胞からのIL-6分泌の実験を遂行することは不可能となった。しかしながら、我々はこれとは別に他の血圧調節ホルモンvasoactive intestinal peptide(VIP)及びpituitary adenylate cyclase activating polypeptide(PACAP)が第3のPACAP/VIPレセプターを介してラット骨髄ストローマ細胞からのIL-6分泌を増強させていることを発見することができた。腸管神経節欠損ラットの肺より調製したRNAについて、エンドセリンタイプBレセプター(EDNRB)遺伝子cDNAをプローブとし、Northern blot解析を行ったところ、このラットにおいてこの遺伝子の発現が著明に減少していることを見い出した。更にEDNRBのmRNAについて、RT-PCR法により解析したところ、このラットにおいては2種類の異常なサイズのEDNRB mRNAが発現されていることが明らかになった。この配列をEDNRBゲノム遺伝子の配列と比べた結果、一つは第2エクソンの翻訳開始コドンから数えて第20番ヌクレオチドから第2エクソンの終わり(第483番ヌクレオチド)までの458bpが欠失したもの、もう一つは第2エクソンの第213番ヌクレオチドから同じく第2エクソンの終わりまでの270bpが欠失したものであることが判明した。以上の結果から、このラットにおいては、EDNRB遺伝子の発現が著明に低下していること、及び発現したmRNAも異常なスプラインシングの結果その一部を欠失していることが、本ラットにおける腸管神経節欠損の原因であることが推察された。前年度の研究結果より腸管神経節欠損ラットはエンドセリンタイプBレセプターEDNRBゲノムの一部欠欠によりEDNRBの発現が極度に減少していること、またその欠失の結果異常なmRNAのスプライシングが起こり第2エクソンの殆どが欠失したmRNAを産生することが判明した。この欠欠した部分はレセプターのシグナル伝達に重要な部位であることから、たとえ少量ながらレセプターが発現したとしてもリガンドの結合によるシグナルの伝達は行われないことが予想された。そこでこのラットをエンドセリンの薬理学的解析に用いることとした。エンドセリンの血圧に対する作用は既にこれまで多くの研究がなされているので、その他の作用について調べることとした。我々は以前にラット骨髄ストローマ細胞からのIL-

6分泌がエンドセリンにより調節を受けていることを既に報告しているので、この作用を腸管神経節欠損ラットを用いて解析を試みた。しかしながら理由は分からないが、ヘテロ及びワイルドタイプコントロールラットにおいてもエンドセリンによるIL-6分泌の増強が見られなかった。従ってこのミュータントラットを使ってのエンドセリン刺激による骨髄ストローマ細胞からのIL-6分泌の実験はできなかった。しかしながら、我々はこれとは別に他の血圧調節ホルモンvasoactive intestinapeptide (VIP)及びpituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP)が第3のPACAP/VIPレセプターを介してラット骨髄ストローマ細胞からのIL-6分泌を増強させていることを発見することができた。
治癒を目指した慢性骨髄性白血病幹細胞の分子遺伝学的、免疫学的特性解析

本研究では、チロシンキナーゼ阻害薬(TKI)に抵抗性を示し、治療後も残存する慢性骨髄性白血病(CML)幹細胞の分子遺伝学的特性の全貌を明らかにすることを目的とする。本年度は、CML幹細胞の抗腫瘍免疫回避機構について解析を行った。申請者らが見出したCD34+38-225+120a+で定義されるCML幹細胞において、免疫チェックポイント分子PDL1は、初発時18.8±14.2%に発現を認めたのに対し、TKI投与により細胞遺伝学的寛解(CyR)を得ている症例のCML幹細胞では47.6±22.5%と有意な発現上昇を認めた(n=17, p<0.01)。投与TKIによる差は認められず、PDL2の発現は初発、治療中いずれにおいても認められなかった。興味深いことにCD34+38-225+120a- CML細胞では、PDL1の発現上昇が軽度であったことから、CD120a/NF-κB経路がCML細胞におけるPDL1の発現調節に機能している可能性が示唆された。PDL1/L2以外の免疫チェックポイント分子であるCD80/CD86, B7ファミリー分子, CD112/CD155, CD226, Galectin 9, CD137 ligand, CD252 (OX40) ligandの発現に関しては、TKI治療前後での一定の傾向は認められなかった。次に、CyRを得ている患者骨髄よりPDL1+、PDL1-CML幹細胞をsotingし、同一患者由来のCD8+細胞とサイトカイン非存在下で48時間共培養した際の培養上清中に産生される液性因子を定性的に評価した。その結果PDL1+細胞との共培養では、PDL1-細胞との共培養と比較して、IFNγ, TNFα, IGFBP2の上清中の濃度が低く、IL10の濃度が高かったことから、PDL1+細胞はCD8+細胞に対して抑制性に作用していると考えられた。平成30年度は、生体内に残存するCML幹細胞の抗腫瘍免疫回避機構について解析を行った。申請者らが同定した表面マーカーを用いてCML幹細胞を分離、解析した結果、CML幹細胞は、TKI投与に対してPDL1の発現増強を介してCTLの機能を抑制し、生体内に残存している可能性を明らかにした。また、CML幹細胞におけるPDL1発現制御機構として、CD120a/NF-κB経路の役割についての新たな知見が得られる可能性が示唆されたことから、ほぼ計画通りに研究を遂行できていると考えられる。シングルセルレベルでの全トランスクリプトーム解析に向けた基盤、体制整備を行う。TKI治療前・深い寛解達成後、TKI中止後の再発例・TFR維持例それぞれの時期における細胞を用いてSmart-SeqシングルセルRNAシーケンスを行うことで、臨床病態の違いにかかわる分子基盤を明らかにする。治療前、治療後の様々な深さの寛解達成後、TKI中止後の再発例、TFR維持例の患者骨髄からCML幹細胞を単離し、シングルセルRRBS(Reduced-Representation Bisulfite Sequencing)用ライブラリーを作成し、イルミナのHiSeq2000によりCML幹細胞におけるDNAメチル化のランドスケープの違いを明らかにする。

申請者らが同定した表面マーカーを用いてCML幹細胞を分離、解析した結果、CML幹細胞は、TKI投与に対してPDL1の発現増強を介してCTLの機能を抑制し、生体内に残存している可能性を明らかにした。また、CML幹細胞におけるPDL1発現制御機構として、CD120a/NF-κB経路の役割についての新たな知見が得られる可能性が示唆されたことから、ほぼ計画通りに研究を遂行できていると考えられる。シングルセルレベルでの全トランスクリプトーム解析に向けた基盤、体制整備を行う。TKI治療前・深い寛解達成後、TKI中止後の再発例・TFR維持例それぞれの時期における細胞を用いてSmart-SeqシングルセルRNAシーケンスを行うことで、臨床病態の違いにかかわる分子基盤を明らかにする。治療前、治療後の様々な深さの寛解達成後、TKI中止後の再発例、TFR維持例の患者骨髄からCML幹細胞を単離し、シングルセルRRBS(Reduced-Representation Bisulfite Sequencing)用ライブラリーを作成し、イルミナのHiSeq2000によりCML幹細胞におけるDNAメチル化のランドスケープの違いを明らかにする。本年度分は、主に試薬の購入に充当する費用として算出していたが、予定よりも少額に収まったため、次年度に繰り越すこととした。次年度以降の遺伝子、タンパクの発現解析などに必要な試薬、細胞をFACSで単離するための抗体、実験動物等に研究費を使用する予定である。また国内、国外の学会における旅費、論文投稿料にも使用する予定である。