hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3世代にわたる悉皆調査で明らかにする絶滅危惧種ヒョウモンモドキの繁殖生態

その結果、ヒョウモンモドキで利用できる変異性が高いマーカーが得られた。本研究で開発したSNP等の遺伝マーカーは、今後、飼育繁殖個体の再導入などで予想されるヒョウモンモドキ個体群の遺伝的多様性の変化をモニタリングするために活用されることが期待される。一方、本研究で当初の目標とした20022004年の過去サンプルについては保存状態が悪いため、次世代シーケンサーで網羅的解析を行うために必要となる良質なDNAを得ることができなかった。今後は、LAMP法など別の手法で解析を進めることを計画している。絶滅危惧種ヒョウモンモドキの遺伝的多様性や分集団間のgene flowを把握することを研究目的として、部分ゲノム解析を行なった。日本チョウ類保全協会が保存している野生集団及び飼育集団(ハウスサンプル)のサンプルを材料として、近縁種のショットガン配列との相同性が高い領域の一塩基多型が1388座位、得られた。この遺伝マーカーを用いて集団構造解析を行ったところ、ハウスサンプル毎に遺伝的分化が進んでいることが示された。飼育繁殖個体の野外放蝶では、特定のハウスから大量の個体を導入するよりも、各ハウスから一定数の個体を導入するほうが、野外集団の遺伝的多様性を維持するうえで望ましいと結論づけられた。申請者らの先行研究では、一つの幼虫巣が複数の家系で構成される場合があることが、可能性として示唆されている。そのため、27年度に取得したハウスサンプルのSNPデータを用いて、幼虫巣内、幼虫巣間、ハウス内、ハウス間で、個体間の血縁解析を行い、幼虫巣が血縁者で構成されている可能性を検証する。さらに、27年度に取得したSNPデータをもとに、SNP領域を増幅するプライマーを作製し、野外個体群のサンプルの多型解析を行い、メタ個体群内の時間的、空間的なgene flowを定量化する。ゲノムDNAが劣化している野外個体サンプルについて、28・29年度とは異なる方法で,個体レベルの遺伝的多様性を測定する。また、野外個体サンプルと並行して、すでにSNPデータが得られている飼育個体サンプルについては、ベイズ法を用いた集団構造解析を行い、複数の飼育個体群の遺伝的分化を定量化した結果を、論文化する。分子生態学RADseq分析したサンプルのうち、DNAが劣化していたためライブラリー作製ができなかったサンプルについては、その段階で分析を中止したために、その分の費用が残余として生じた。28年度に計画していたRADseqデータに基づいて作製した新規プライマーによるSNPの検出のうち、野外個体サンプルについてはDNAが劣化していたためデータを得ることができなかった。野外個体サンプルは二度と採取できない貴重なサンプルであるため、この問題点が明らかになった段階で未解析だった野外個体サンプルについては、RADseqデータに基づく新マーカーによる分析を中止した。その分の費用が残余として生じた。次年度使用額については、新たなSNPマーカーを作製する費用にあてて、RADseqデータが取得できなかったサンプルを対象とした分析を行う。
心臓流出路および大動脈弓発生異常に関与する遺伝子と環境因子の影響

心臓流出路発生に必須の転写因子Tbx1の発現を低下させたTbx1neo/neoマウスは、ヒト22q11.2欠失症候群同様、総動脈幹症(PTA)を呈する。Tbx1neo/neo胎仔を妊娠した母マウスに、栄養素である葉酸を通常量投与した(CO)群と多量投与した(FA)群で、胎仔の心表現型を比較したところ、CO胎仔は全例重症型PTAを呈したが、FA胎仔では軽症型が25%認められた。心臓流出路に遊走する神経堤細胞数は、CO胎仔では減少していたが、FA胎仔ではその減少の程度が軽度だった。このモデルマウスによる検討から、遺伝的要因で発症するPTAの重症度が、環境的要因により軽症化する可能性が示唆された。交付申請書に記載した研究の目的、実施計画に基づき、今年度は、1心臓流出路、大動脈弓発生に必須の転写因子Tbx1の発現を低下させた遺伝子操作マウスTbx1neo/neoの胎仔を用いて、横断切片にて流出路、肺動脈、大動脈弓を観察する2血流方向による大動脈弓形態変化を、胎仔エコーを用いて解析する3葉酸を過剰に投与した胚とコントロール胚との表現型の差異について、肺動脈の起始部及び中隔の形成を観察することを目標とした。以下に結果を示す。1Tbx1neo/neo胚の表現型を胎生18.5日の胎仔で観察したところ、100%の確率で総動脈幹症(PTA)を認めた。大動脈弓の形態は様々で、胎生13.5日から15.5日までの横断組織切片で観察した結果、左大動脈弓が51%、右大動脈弓が38%であった。胎生11.5日における冠状断組織切片では、大動脈第4弓と第6弓が高頻度に障害されていた。2胎仔エコー検査を行ったが、経時的な大動脈弓内の血流評価は困難であった。横断組織切片を用いて、総動脈幹の、気管を通る正中軸からの偏位角度を測定する方法を考案し、大動脈弓の方向との相関について検討する実験系を構築した。3通常餌を投与したTbx1neo/neo胚は、総動脈幹から2本の肺動脈が個別に分岐するVan praagh分類A2のPTAを呈した。母体に葉酸を過剰に投与した群では、一部の胎仔において表現型が総動脈幹から主肺動脈が分岐するVanpraagh分類A1型のPTAに変化した。葉酸過剰+レチノイン酸欠乏餌を母体に投与した群では、葉酸過剰餌と同様な表現型の変化を認めた。1心臓流出路発生に必須の転写因子Tbx1の発現を低下させた遺伝子操作マウスTbx1neo/neo胎仔の心大血管表現型解析、2Tbx1neo/neo妊娠マウスに通常の10倍の葉酸を含有する葉酸過剰餌、普通餌を各々投与し、胎仔の心大血管表現型解析を行った。1胎生18.5日のTbx1neo/neo胎仔すべてにおいて、大動脈と肺動脈が共通幹を形成する総動脈幹症を認めた。いずれも、主肺動脈がなく、左右肺動脈が総動脈幹より独立して分岐するVan Praagh分類A2型総動脈幹症であった。胎生13.5日のTbx1neo/neo胎仔では、流出路中隔の形成が高度に障害されており、流出路遠位の動脈幹内に大動脈中隔が形成されず、大動脈と肺動脈が分割されない総動脈幹症の表現型を呈することが示唆された。2葉酸過剰餌を投与した母マウスから採取した胎生18.5日のTbx1neo/neo胎仔は、普通餌を投与した母マウスから採取したTbx1neo/neo胎仔と同様に総動脈幹症を認めたが、すべてがA2型の形態から、総動脈幹から主肺動脈が分岐し、その後左右肺動脈が分枝するA1型に変化していた。次に、葉酸過剰餌と普通餌を投与した母マウスから、胎生10.5日のTbx1neo/neo胎仔を採取し、心臓流出路を観察した。心臓流出路内には、胎仔背部の神経堤から間葉系細胞(神経堤細胞)が遊走し、流出路中隔及び遠位の動脈幹中隔を形成することが知られている。葉酸過剰餌を与えた母マウスのTbx1neo/neo胎仔では、普通餌を投与した母マウスのTbx1neo/neo胎仔に比して、同部位の神経堤細胞数が増加していた。以上の観察から、葉酸は、心臓流出路へ遊走する神経堤細胞数を増加させることにより、Tbx1発現低下による動脈幹中隔形成不全を一部代償し、大動脈と肺動脈の分割を招来し、その結果心大血管表現型を軽症化させたことが示唆された。出生直前(胎生18.5日)のTbx1neo/neo胎仔すべてにおいて、左右肺動脈が総動脈幹より独立して分岐する総動脈幹症を認めた。心臓流出路が形成される胎生12.5日のTbx1neo/neo胎仔では流出路近位部から遠位部にかけ、円錐動脈幹を大動脈・肺動脈に分割する円錐中隔隆起の形成は不十分であったが、分割の前段階である内腔のらせん構造は認められた。流出路遠位部よりさらに遠位では、動脈幹中隔隆起が低形成となり、らせん構造も認められなかった。

Tbx1neo/neo胎仔における総動脈幹症は、円錐動脈幹中隔隆起、特に遠位の動脈幹中隔隆起の発達が不十分で、大動脈、肺動脈分割が起こらないために生じた表現型と考えられた。一方、Tbx1neo/neo胎仔を妊娠した母マウスに通常の10倍の葉酸を含有する葉酸過剰餌を与えると、胎生18.5日の胎仔(FA)は普通餌を与えた母マウスの胎仔(NL)と比較して、円錐動脈幹隆起の低形成と総動脈幹症が軽症化した。NLでは、心臓流出路近位で神経堤細胞数の減少が認められたが、FAではNLより細胞数増加の傾向が認められた。心臓流出路に遊走する神経堤細胞を可視化するために、神経堤細胞の遊走に必須の神経血管誘導因子Sema3cのエンハンサー領域にLacZを挿入した遺伝子操作マウス(Sema3c-LacZ)をTbx1neo/+マウスと交配し、得られたTbx1neo/neo:Sema3C-LacZ胎仔をLacZ染色した。胎生13.5の胎仔では、野生型、FA、NLのいずれも動脈幹部に染色細胞が少数存在し、この時期の胎仔では、神経堤細胞がすでに心臓流出路に遊走し、間葉系細胞に分化していることと一致していると考えられた。胎生11.5日の胎仔で同様の実験を行い、FAでNLよりも遊走する神経堤細胞数が多いことを示し、葉酸により総動脈幹症の表現型が軽症化したメカニズムを解明する。心臓流出路発生に必須の転写因子Tbx1の発現を低下させたTbx1neo/neoマウスは、ヒト22q11.2欠失症候群同様、総動脈幹症(PTA)を呈する。Tbx1neo/neo胎仔を妊娠した母マウスに、栄養素である葉酸を通常量投与した(CO)群と多量投与した(FA)群で、胎仔の心表現型を比較したところ、CO胎仔は全例重症型PTAを呈したが、FA胎仔では軽症型が25%認められた。心臓流出路に遊走する神経堤細胞数は、CO胎仔では減少していたが、FA胎仔ではその減少の程度が軽度だった。このモデルマウスによる検討から、遺伝的要因で発症するPTAの重症度が、環境的要因により軽症化する可能性が示唆された。解析を行うTbx1neo/neo胎仔を得るために、Tbx1neo/+ヘテロ接合雄マウスと雌マウスを交配させる必要があるが、交配による妊娠の確率が低いこと、さらに解析対象となるTbx1neo/neoホモ接合胎仔は、妊娠して得られた全胎仔の1/4であることから、Tbx1neo/neo胎仔が想定していたように採取できず、本研究の進行を妨げる要因となっている。小児循環器学心臓流出路が形成される直前の胎生9.5日のTbx1neo/neo胎仔よりRNAを採取し、葉酸過剰餌と普通餌を投与により、Tbx1をはじめとする心臓流出路形成に関与する遺伝子発現を、in situ hybridization法や定量的PCR法で比較する。これにより、葉酸、Tbx1の心臓流出路、大動脈弓発生における分子メカニズム、すなわち遺伝子と環境因子の相互作用の解明を試みる。また、本研究を遅延させているTbx1neo/neo胎仔については、採取数を増加させるために、Tbx1neo/+ヘテロ接合雌マウスを可及的に繁殖、安定継代させ、Tbx1neo/n+ヘテロ接合雄マウスと次々に交配させる方針である。胎仔エコーによる大動脈弓血流の方向の測定と、大動脈弓形態との関係を調べようと試みたが、エコーによる胎仔の同定自体が困難で、血流測定を行うことができなかった。また、葉酸過剰摂取がTbx1neo/neo胚の表現型に与える影響を調べるため、通常の餌、葉酸過剰餌の投与に加え、現在葉酸過剰+1レチノイン酸欠乏餌で心臓流出路形態が変化するかを検討中であるが、Tbx1neo/neo胚を妊娠する雌マウスの数が少なく、葉酸過剰+レチノイン酸過剰餌、高カロリー餌による影響を調べるには至っていない。胎仔エコーによる血流測定は困難であるため、Tbx1neo/neo胚横断組織切片を用いて、総動脈幹の正中軸からの偏位角度を、なるべく多数の検体で測定し、大動脈弓の方向と相関について検討する。
大動脈弁異所性石灰化の原因細胞の同定とその機序解明及び石灰化抑制薬の開発

大動脈弁狭窄症は高齢社会には発病率が多くなっているが、治療方法としては大動脈弁置換術しかないのが現状である。外科的介入が治療成績が満足できるが、手術に耐えない患者は約30%前後存在している。本研究室はTNF-αおよび高リン酸誘発性石灰化を基づいて石灰化の分子機構の解明と石灰化の進行を抑制する薬物の探索を行い、侵襲がない薬物治療法の確立を目指している。大動脈弁狭窄症患者の大動脈弁より大動脈弁間質細胞を単離し、TNF-αや高リン酸の刺激に対して感受性が高く、石灰化が亢進した。石灰化関連遺伝子BMP2/ALPなどの発現や活性が亢進することも明らかにした。大動脈弁間質細胞の集団の中に、CD45-/CD73,90,105+の未分化細胞の存在を明らかにし、特にCD34-の未分化細胞がCD34+の細胞よりTNG-αや高リン酸に対して感受性が高く、易石灰化性を示していた。また、CD34-の未分化細胞はTNXBの遺伝子発現が低下していることがわかった。石灰化に対してどのような機能しているかまた不明である。これらの結果から考えてみると、CD34-の未分化細胞が石灰化の原因細胞に近いと考えられ、今後の石灰化の分子機構のさらなるの解明に対して寄与する。同時に、TNF-αおよび高リン酸誘発性石灰化をモデルにし、石灰化の進行を抑える薬物の探索を行っている。その中、黄連解毒湯は石灰化の進行を抑制する効果を認められた。かつ、石灰化関連遺伝子BMP2の発現を抑制した。黄連解毒湯は大動脈弁石灰化を抑制する薬物治療の候補となる可能性が示された。これから、黄連解毒湯の中に含まれる有効成分をさらに解明し、石灰化を抑制する薬物治療の確立につながる。治療方法が確立できれば、高リスク患者に投与し、大動脈弁狭窄症の発病率を抑え、あるいは大動脈弁狭窄症患者の病態進行を止め、患者負担や医療費の削減につながる。細胞培養の面で思うように進展していない部分があるが、実験室の整備や研究体制の調整が順調に進展しており、概ね順調に進展していると考えている。1. CD34-細胞を基盤し、石灰化関連遺伝子を網羅的に解析を行い、石灰化の進行にキー遺伝子を明らかにする。ある遺伝子の高発現や発現抑制細胞を作製し、その石灰化能の変化を比較し、石灰化の進行の引き金になる遺伝子を見出す。2.黄連解毒湯に含まれている有効成分を明らかにし、さらに石灰化の進行を抑える成分をさらに解明する。同時にその石灰化の進行を抑える分子機構を解明する。3.大動脈弁動物モデルを作製し、黄連解毒湯の治療効果の有無について調べる。さらに、投与量や有害事情の有無を明らかにする。血中石灰化関連遺伝子の変化を調べる。

ある遺伝子の高発現や発現抑制細胞を作製し、その石灰化能の変化を比較し、石灰化の進行の引き金になる遺伝子を見出す。2.黄連解毒湯に含まれている有効成分を明らかにし、さらに石灰化の進行を抑える成分をさらに解明する。同時にその石灰化の進行を抑える分子機構を解明する。3.大動脈弁動物モデルを作製し、黄連解毒湯の治療効果の有無について調べる。さらに、投与量や有害事情の有無を明らかにする。血中石灰化関連遺伝子の変化を調べる。
物理システムに対する多目的ロバスト制御系設計に関する研究

本研究の目的は,研究代表者が従来より研究してきた多目的ロバスト制御系設計理論を,実システムを対象とした制御系設計に適用するための実際的な方法論を理論的・実験的アプローチにより構築することである.この目的のために,理論面では,多目的ロバスト制御系設計において,制御対象の物理システムとしての構造を反映した補償器の設計法を導出した.その成果を,「スプライン型パラメータ依存二次形式を用いたゲインスケジューリング制御系の設計」,「ゲインスケジューリング制御系の設計におけるディスクリプタ形式の利用について」,「フィードフォワード項を持つロバスト安定サーボ系の設計について」として発表した.さらに,設計法を凸最適化に基づく数値計算による設計CADとして計算機に実装した.この成果を「On Numerical Solution to Parameter-dependent Convex Differential Inequalities」「切替が生じるシステムに対する動的補償器の設計について」として発表した.また,模型ヘリコプタの自動制御を行う制御系の設計を行った.模型ヘリコプタにセンサを組み込み,計算機および制御ボードと結んで制御系を構成した.制御対象のモデリングを,本研究で提唱している設計法に適合する形で行った.模型ヘリコプタを半固定としてテスト入力を加えて設計用モデルの同定および不確かさの大きさの見積もりを行った.センサ信号から制御入力を計算する制御則を,本研究の設計法を実装したCADを用いて設計した.この制御則を実験装置に実装して実験システムを駆動し,良好な制御結果を得た.この成果を「模型ヘリコプタのモデリングと制御-ゲインスケジューリングを用いたコントローラの設計-」として発表した.多目的口バスト制御系設計理論を実システムを対象とした制御系設計に適用するための実際的な方法論を確立するため以下のような研究を行った.1.制御対象の構造を反映した補償器の設計理論制御対象の物理特性に起因する構造をもつシステムを扱うための制御理論について研究を行った.システムに含まれる物理パラメータの変動に応じた制御系「ゲインスケジューリング制御系」を数理的手法を援用して構成する手法,および制御則を求めるために解くべき「パラメータ依存LMI」の数値解法を得た.2.制御系設計法のCAD化本研究では制御則の算出のために数値計算を利用している.そのために,制御対象のモデルおよび制御目的から,制御則計算のための数値計算のためのデータを生成し.かつ得られた計算結果から実装すべき制御則を構成するためのCADを構築した.このCADはPC-UNIX上で既存のフリーソフトウエアを利用して作成した.3.実験用制御対象の特性試験次年度に予定している制御実験のための準備として,制御対象となる市販ラジコン模型ヘリコプタの特性試験を行った.本研究の目的は,研究代表者が従来より研究してきた多目的ロバスト制御系設計理論を,実システムを対象とした制御系設計に適用するための実際的な方法論を理論的・実験的アプローチにより構築することである.この目的のために,理論面では,多目的ロバスト制御系設計において,制御対象の物理システムとしての構造を反映した補償器の設計法を導出した.その成果を,「スプライン型パラメータ依存二次形式を用いたゲインスケジューリング制御系の設計」,「ゲインスケジューリング制御系の設計におけるディスクリプタ形式の利用について」,「フィードフォワード項を持つロバスト安定サーボ系の設計について」として発表した.さらに,設計法を凸最適化に基づく数値計算による設計CADとして計算機に実装した.この成果を「On Numerical Solution to Parameter-dependent Convex Differential Inequalities」「切替が生じるシステムに対する動的補償器の設計について」として発表した.また,模型ヘリコプタの自動制御を行う制御系の設計を行った.模型ヘリコプタにセンサを組み込み,計算機および制御ボードと結んで制御系を構成した.制御対象のモデリングを,本研究で提唱している設計法に適合する形で行った.模型ヘリコプタを半固定としてテスト入力を加えて設計用モデルの同定および不確かさの大きさの見積もりを行った.センサ信号から制御入力を計算する制御則を,本研究の設計法を実装したCADを用いて設計した.この制御則を実験装置に実装して実験システムを駆動し,良好な制御結果を得た.この成果を「模型ヘリコプタのモデリングと制御-ゲインスケジューリングを用いたコントローラの設計-」として発表した.
化学気相析出(CVD)法による酸化物高温超伝導体の線材化

酸化物超伝導膜を線材として利用するには長尺化が不可欠であり、長尺基体の作製が容易なセラミックや金属の上への成膜が期待されている。本研究では、CVD法により酸化物高温超伝導線材を開発するための基磯的研究として、まず、セラミック多結晶焼結体(Y_2O_3安定化ZrO_2、(YSZ)、Al_2O_3、MgO)を基体に用い超伝導膜の合成を行った。次に金属基体(ハステロイ)上への成膜を試みた。また、基体と膜の間の化学反応を防ぐための中間(バッファ-)層(YSZ層)の効果を調べた。さらに基体との反応を軽減するために析出温度の低温化を試みた。1.セラミックス多結晶基体上への合成各多結晶基体上の膜ともYBa_2Cu_3O_<7ーx>の(001)回析ピ-クが強くみられ、c軸が基体面に垂直に配向していることがわかった。YSZとMgO多結晶基体上に作製した膜において超伝導転移がみられ、それぞれ89Kと85Kで低抗がゼロ(Tc(R=0))となった。YSZ多結晶基体上に作製した膜では、77.3K、0 Tで4.4×4×10^3A/cm^2の臨界電流密度(Jc)が測定された。2.金属基板上への成膜ハスラロイ金属基板上に直接成膜したところ、膜と基体との反応が認められ、超伝導特性は得られなかった。Y_2O_3安定化ZrO_2(YSZ)を中間層に用いた場合、析出した膜はc軸配向の顕著なYBa_2Cu_3O_xであった。オ-ジェ分析の結果、膜と基体との反応は中間層により抑制されていることが明かになった。析出温度850゚Cで得られた膜は、Tc(R=0)が87Kで、77.3K、0 TでのJcが6.4×10^3A/cm^2であった。3.析出温度の低温化結晶性のよい高Tcで高JcのYBCO膜の析出温度が成膜時の酸素分圧に大きく依存していることが明らかになった。P(O_2)=3.6Torrでは850゚付近で、0.036Torrでは700゚C付近で、Tc(R=0)=90-92K、Jc(77.3K,0 T)〉10^6A/cm^2の膜が作製された。1.YBCO膜の大面積化や線材化には、大面積の基体やテ-プ状、線形状の基板が必要で、これらを単結晶で作製することは難しい。このため、大面積基板や線状基板の作製が容易な多結晶基板上への高Tc、高Jc膜の合成が期待されている。

本研究では、化学気相析出(CVD)法により析出温度650ー900°CでYSZ,MgOおよびAl_2O_3の多結晶基板上にYBCO膜の合成を行い、得られた膜の結晶配向性、膜組織およびTcやJcS磁場中での超伝導特性を調べた。2.CVD原料には、Ba、YおよびCuのβージケトン金属錯体を用いた。基板には鏡面研磨した8mol%Y_2O_3安定化ZrO_2(YSZ)、MgOおよびAl_2O_3の多結晶基板(10×5×1mm^3)を使用した。析出温度650900°Cで成膜を行った。析出時間は1時間とした。析出終了後、inーsitu酸素処理を行った。3.650°Cから900°Cで各基板上に析出した膜の厚さはほとんど変化がなく、ほぼ1μmであった。YSZおよびMgO基板上に800°C以上で得られた膜は、主にc軸が基板に垂直に配向したYBa_2Cu_3O_yから構成されていた。Al_2O_3上に作製された膜においては、析出温度850°CでBaAl_2O_4のピ-クが認められ、基板と膜が反応することが明らかになった。最もTc(R=0)の高かった膜は、YSZ、MgO上では、850°Cで析出したもの、Al_2O_3上では800°Cで析出したものであった。YSZ基板上の膜でTc(R=0)は90K、MgO上の膜で87K、Al_2O_3上で71Kであった。YSZおよびMgO上の試料について77.3K、0TでのJcはYSZとMgOの多結晶基板上の膜でそれぞれ8.6×10^3と1.0×10^4 A/cm^2であった。15TにおいてもMgO上およびYSZ上の膜でそれぞれ27と44A/cm^2のJcが測定された。今後、多結晶基板上のCVD膜を長尺線材などの実用に結び付けるためにJcの値をより一層単結晶基板上の膜の値に近づける必要があり、YBCOの結晶配向性の制御に関する研究が重要と考えられる。酸化物超伝導膜を線材やテ-プ材に利用するためには長尺化が不可欠であり、長尺基体が容易にできる金属の上への成膜が期待されている。本年度の研究では、まず金属基体として耐熱鋼の一つであるハステロイを用いてその上に酸化物超伝導膜の形成を試みた。また、従来のCVD法では、高Tcで高Jcの膜の析出温度は850°Cで、PVDで通常行われている析出温度よりも100°C以上高く、利用できる基体の種類も限定されていた。そこで本研究では、異なる酸素分圧条件で析出温度を変化させてYBCO膜を作製し、超伝導特性に及ぼす酸素分圧の影響を調べた。1.金属基板上への成膜CVD法により基板上に直接成膜を行ったところ、YBCO膜と基体との反応が認められ、超伝導特性は得られなかった。そこで、前年度の酸化物多結晶体を用いた研究で最も良好な結果が得られたY_2O_3安定化ZrO_2(YSZ)を中間層に用いて超伝導膜を金属基体上に作製することを試みた。中間層の厚さは、0.51.5μmであった。X線回折により、析出した膜はc軸配向の顕著なYBa_2Cu_3Oxであることが明らかになった。膜の厚さ方向におけるオ-ジェ分析の結果、膜と基体との反応は中間層により抑制されていることが明かになった。析出温度850°Cで得られた膜は、Tc(抵抗ゼロ:R=0)が87K、77.3K、OTでのJcが6.4x10^3A/cm^2であった。この膜では、15Tの磁場中でも4.7x10^2A/cm^2のJcが測定された。2.析出温度の低温化実験の結果、結晶性のよい高Tcで高JcのYBCO膜の析出温度が成膜時の酸素分圧に大きく依存していることが明らかになった。P(O_2)=3.6Torrでは850°C付近で、0.036Torrでは700°C付近で、Tc(R=0)=90-92K、Jc(77.3K,OT)>10^6A/cm^2の膜が作製された。これらの条件はCu_2O-O_2-CuO平衡ライン付近に位置していた。これらの条件で作製されたYBCO膜は77.3K、20Tを越える高磁場中においても10^4A/cm^2を越えるJcを有した。
タイプI繰返し型ポリケタイド合成酵素反応制卸機構の分子基盤

本研究においては、新規化合物供給のための新たな方法論の開発、開拓を目的として、糸状菌の繰返し型タイプI型ポリケタイド合成酵素を取り上げ、その反応制御機構の解明へ向けて研究を行った。その結果、単環性芳香族化合物合成のSA-PKSとして、A.terreus由来6-methylsalicylic acid synthaseであるATXについて、酵母共発現系を用いたサブユニット-サブユニット相互作用による活性中心の再構成系を確立し、その相互作用に必要なInder Domainの存在と高次構造モデルを提出することができた。また、多環性芳香族化合物合成のAR-PKSにおいては、そのC-末に存在するClaisen Cyclaseドメインを中心に解析を進め、Claisen Cyclaseが単独の酵素タンパクとして機能しうることを初めて実証するとともに、Cyclaseタンパクを大腸菌で活性を有する機能タンパクとして発現することに成功し、さらにその精製法も確立することができた。また、還元型化合物合成のRD-PKS遺伝子をジャガイモ夏疫病菌Alternariasolaniより網羅的にクローニングし、糸状菌発現系を用いてその機能同定を進めるとともに、酵母発現系を用いたalternapyrone合成酵素PKSNのメチルトランスフェラーゼドメインMeTの解析を行った。以上の結果は、繰返し型タイプI型ポリケタイド合成酵素の反応制御機構解明に向けて前進した着実な一歩であると考えられる。単環性芳香族化合物合成のポリケタイド合成酵素SA-PKSとして、Aspergillus terreusよりクローニングした6-メチルサリチル酸合成酵素であるATXを用い、その酵母発現系を構築した。これを用い、N-末、および、C-末欠失体の発現実験を行い、活性発現に必要な領域を決定した。ついで、ともに不活性なN-末欠失体とC-末欠失体の共発現を試みたところ、6-メチルサリチル酸の生産が回復し、異なるサブユニット間の相互作用により活性中心が再構成されることを明らかにした。この共発現系を用いて、欠失体間および活性中心変異体間の共発現によるドメイン間の相互作用を更に検討中である。また、還元型化合物合成のポリケタイド合成酵素RD-PKSについては、ジャガイモ夏疫病菌Alternaria solaniより、数種類の異なるRD-PKS遺伝子をクローニングした。そのうち、PKSNおよびPKSFと名付けたPKSの糸状菌発現系を構築し、その機能同定を行った。その結果、PKSNは新規デカケタイド化合物alternapyroneの合成酵素であると同定した。alternapyroneはデカケタイド鎖に8個のメチル基がPKS反応中に位置特異的に導入されて生成すると考えられることから、PKSNの反応機構について、現在、更に検討中である。また、PKSFは、いずれも新規ポリエン化合物であるC_<22>のaslanipyroneとC_<23>のaslaniolを主生成物として与えるPKSであることを明らかにした。多環性芳香族化合物合成のポリケタイド合成酵素AR-PKSについては、生成物の炭素鎖長と閉環様式の異なる新規AR-PKS遺伝子のクローニングを試みるとともに、C-末のClaisen cyclaseドメインCYCの機能について、酵母発現系を用いた解析を進めている。単環性芳香族化合物合成のポリケタイド合成酵素SA-PKSとして、Aspergillus terreusよりクローニングした6-メチルサリチル酸合成酵素であるATXの酵母発現系を用い、N-末、および、C-末欠失体の発現実験を行い、不活性なN-末欠失体とC-末欠失体の共発現による6-メチルサリチル酸の生産を指標として、異なるサブユニット間の相互作用により活性中心が再構成される最小領域interdomainの同定に成功した。また、各ドメインの活性中心変異株を作製し、そのヘテロな共発現により、従来提唱されてきたHead-to-tailモデルでは説明できないサブユニット間の相互作用の存在を明らかにした。

また、還元型化合物合成のポリケタイド合成酵素RD-PKSについては、ジャガイモ夏疫病菌Alternaria solaniより、新たにクローニングしたPKS(AS2)がソラナピロンの前駆体であるデスメチルプロソラナピロンの合成酵素であることを糸状菌での発現により明らかにした。これにより、AS2の遺伝子クラスターがソラナピロン生合成のクラスターであることが確認された。多環性芳香族化合物合成のポリケタイド合成酵素AR-PKSについては、C-末のClaisen cyclaseドメインCYCの機能について、酵母発現系を用いた解析を進め、これが単独の酵素として機能的に発現し、PKS上のポリケトメチン中間体に作用して、Claisen閉環と生成物の切り離しを触媒することを明らかにした。また、ヘプタケタイド合成酵素であるAlblpのClaisencyclase domainを大腸菌で発現させ、そのin vitroでの活性を確認するとともに、その精製にも成功した。
黒ボク土と土壌菌類を利用した家畜ふん尿処理のためのバイオリアクター開発

本研究では、家畜ふん尿に含まれる過剰なリンの一時的な不動化とその再利用の方法として、黒ボク土によるリンの特異吸着と、共生微生物であるアーバスキュラー菌根菌(以下AM菌)によるリン吸収機能を利用する。本年度は、AM菌-宿主植物共生系による黒ボク土中のリンの吸収メカニズムの解明を試みた。栽培試験では、培土として、北上山地荒廃地周辺部のシバ群落の土壌を使用し、宿主植物としてシバを使用した。同土壌には、土着性のAM菌プロパギュールが存在するが、栽培終了時には土着性AM菌が宿主根系に感染していた。培土中の可給態リンは痕跡であるにも関わらず、供試植物はリンを吸収しており、この量は培土中の全リンの約9%に相当した。このことは、植物がAM菌の感染により可給態以外のリン画分を吸収したことを示している。土壌へのリンの施用が異なる様々な地点(草地、森林、裸地、耕作地)より、黒ボク土とそこに定着する植物の根を採取し、土壌中の全リン、可給態リン、酸性ホスファターゼ(以下APase)活性および植物のAM菌感染率を調べた。その結果、AM菌感染率とAPase活性との間に有意な相関が認められた(P<0.01)。また、黒ボク土の可給態リン含量とAM菌感染率との関係では、可給態リンが2.5mgP/100g乾土以下ではAM菌感染率は2.846%と地点により大きく異なったが、2.5mgP/100g乾土を越えると、20%前後に収束する傾向にあった。同様の傾向は、可給態リン含量とAPase活性との間でも認められ、可給態リンが2.5mgP/100g乾土を越えると、APase活性が減少する傾向が見られた。さらに、滅菌黒ボク土を培土として、シバにAM菌(G.margarita)を感染させたポット栽培実験では、非感染区に比べてAM菌感染区でAPase活性が増加した。以上の結果より、可給態リンが非常に少ない黒ボク土では、AM菌が感染した植物はAPaseを産生することで非可給性のリン(有機態リン)を分解してリン酸を生成し、これを吸収している可能性が示唆された。窒素軽減バイオリアクターの開発のための予備調査として、家畜ふん尿施用現場での窒素動態の現状を評価した。2004年の調査では、家畜ふん尿施用後の表土では、無機化、硝化、脱窒が同調的に進行しており、生成した一部の硝酸は地下水に流入していることが示された。また、家畜ふん尿に含まれる尿素を分解する細菌類の土壌中の生菌数(CFU)を希釈平板法により測定したところ、1g乾土あたり10100,000個と採取時期により大きく変動したが、培養可能な全従属栄養細菌数に対する尿素分解細菌の割合は1218%の範囲にあった。以上のふん尿施用現場での調査結果は、家畜ふん尿由来の窒素の無機化の抑制に対して、無機化した窒素が土壌中に遊離することなく不動化されるプロセスの必要性を強く示唆した。本研究では、無機化した窒素をすみやかに不動化する方法として高等菌類の生理的特性を利用するが、その目的にあう菌類をスクリーニングするため、牛ふん尿放置現場で発生した担子菌子実体を採取し、純粋分離に供試した。子実体の形態的特徴よりCoprionus spp.と同定されたが、種の同定までは至らなかった。Coprinus spp.の滅菌したイナワラへの接種試験では、ワラ全体に栄養菌糸が広がり、光照射下で、容易に子実体を形成し、その形態的特徴は、採取した子実体と同一の特徴を有した。同菌の尿素およびセルロースの分解特性を、それぞれの成分を窒素源および炭素源として添加した平板を用いて定性的に評価した。その結果、尿素分解活性は顕著であったが、セルロース分解活性は小さかった。以上の培養による定性的な試験では、家畜ふん尿の堆肥化において混合する枯死草本をCoprionus spp.が炭素源として利用することが可能であり、ふん尿中の主要な有機窒素化合物である尿素を分解し、それを窒素源として利用できることを示しており、ふん尿由来窒素を不動化する微生物資材の微生物種の候補として利用可能であることが示された。本研究では、無機化した窒素をすみやかに不動化する方法として高等菌類の生理的特性を利用するが、昨年度、牛ふん尿放置現場で発生した担子菌子実体を採取し純粋分離した供試菌Coprinus sp.SIU1およびSIU2の2株の基質分解能および窒素利用特性を評価した。定性的な評価では供試菌SIU1およびSIU2は、糞尿中の主要な有機態窒素化合物である尿素、タンパク質を分解利用でき、炭素源としてセルロースを分解し基質として利用できることがわかった。現地に施用するふん尿スラリーの窒素成分を分析したところ、その大部分はアンモニア態窒素であり、圃場に施用した時の土壌中の窒素濃度は0.25mgN/g乾土であることがわかった。そこで、供試菌SIU1およびSIU2のアンモニア利用特性について分析した。ポテトデキストロース培地を基礎培地として、これにNH_4Clを添加した培地に、SIU1およびSIU2を接種し、暗所25°Cで2週間培養した。

その結果、SIU1およびSIU2は、培地中に存在する窒素源のうちアンモニア態窒素を優先的に利用していることがわかった。高濃度のアンモニアが存在する条件や、アルカリ条件下(pH8.5)では、SIU1およびSIU2の栄養菌糸の成長が抑制されていた。一方、pH4.35.3の範囲でアンモニア態窒素の濃度が0.250.5mg N/mlの条件では、栄養菌糸のアンモニアの吸収は最適であった。この濃度は、スラリー施用圃場での土壌中のアンモニア態窒素濃度とほぼ一致した。そこで、SIU1およびSIU2を2週間暗所25°Cで培養したところ、この供試菌による窒素不動化量は、スラリー施用圃場において、1m^2あたり約5gのアンモニア態窒素に相当した。このことは、これら供試菌が、微生物資材としてスラリー施用土壌に導入された時、最大で5gの窒素が不動化できる可能性を示唆している。本研究では、家畜ふん尿に含まれる過剰なリンの一時的な不動化とその再利用の方法として、黒ボク土によるリンの特異吸着と、共生微生物であるアーバスキュラー菌根菌(以下AM菌)によるリン吸収機能を利用する。本年度は、AM菌-宿主植物共生系による黒ボク土中のリンの吸収メカニズムの解明を試みた。栽培試験では、培土として、北上山地荒廃地周辺部のシバ群落の土壌を使用し、宿主植物としてシバを使用した。同土壌には、土着性のAM菌プロパギュールが存在するが、栽培終了時には土着性AM菌が宿主根系に感染していた。培土中の可給態リンは痕跡であるにも関わらず、供試植物はリンを吸収しており、この量は培土中の全リンの約9%に相当した。このことは、植物がAM菌の感染により可給態以外のリン画分を吸収したことを示している。土壌へのリンの施用が異なる様々な地点(草地、森林、裸地、耕作地)より、黒ボク土とそこに定着する植物の根を採取し、土壌中の全リン、可給態リン、酸性ホスファターゼ(以下APase)活性および植物のAM菌感染率を調べた。その結果、AM菌感染率とAPase活性との間に有意な相関が認められた(P<0.01)。また、黒ボク土の可給態リン含量とAM菌感染率との関係では、可給態リンが2.5mgP/100g乾土以下ではAM菌感染率は2.846%と地点により大きく異なったが、2.5mgP/100g乾土を越えると、20%前後に収束する傾向にあった。同様の傾向は、可給態リン含量とAPase活性との間でも認められ、可給態リンが2.5mgP/100g乾土を越えると、APase活性が減少する傾向が見られた。さらに、滅菌黒ボク土を培土として、シバにAM菌(G.margarita)を感染させたポット栽培実験では、非感染区に比べてAM菌感染区でAPase活性が増加した。以上の結果より、可給態リンが非常に少ない黒ボク土では、AM菌が感染した植物はAPaseを産生することで非可給性のリン(有機態リン)を分解してリン酸を生成し、これを吸収している可能性が示唆された。
神経イメージング手法を用いた痛覚と痒みの脳内認知機構

種々の非侵襲的計測法を用いてヒトの脳内での痛覚と痒みの認知機構を明らかにすることが主要研究目的である。さらに関連深い触覚の認知機構の研究も行う。脳波、脳磁図、経頭蓋磁気刺激といった生理学的検査法と、機能的MRI,近赤外線分光法などの脳血流検査法を組み合わせて総合的に研究を進めていく、世界的にも最先端の研究である。前年度までに、痛みとかゆみに関する新知見と新しい治療法に関する多くの論文を発表し、新聞やテレビ、ラジオなどの多くのメディアで紹介された。平成30年度は、痛みとかゆみ認知に関するこれまでの研究成果を、1編の英文原著論文として発表した。「脳磁図の臨床応用に関するガイドライン」で、世界中の著名な脳磁図研究者との共同執筆である。申請者は主として「痛覚」に関する部分を執筆した。本分野のトップジャーナルに発表され、今後の脳磁図研究の指針として数多くの引用が予想される。「かゆみ」研究に関しては、現在、英文原著論文を1編投稿中で、近日中に採択予定である(Journalは、Frontiers in Physiology)。機能的MRIを用いて、かゆい時の脳活動を分析した研究である。特に、かゆみ認知に重要な「後部島」の活動を詳細に解析した。また、1編の総説論文を発表した。本分野において、このような詳細かつ最先端の総説論文はこれまでには無く、高く評価された。また、国際学会で2回、国内学会で2回の招待講演を行った。特に海外での評価が高く、米国とエジプトで開催された国際学会での講演は高く評価された。脳波、脳磁図、経頭蓋磁気刺激(TMS)といった生理学的検査法と、機能的MRI(fMRI),近赤外線分光法(NIRS)などの脳血流検査法を組み合わせて総合的に研究を進めていく、世界的にも最先端の研究である。平成27年度の主要な研究業績を紹介する。大脳皮質感覚運動野を非侵襲的に刺激することで痛み知覚が抑制されるという現象に注目し、痒み知覚に対しても同様の抑制効果がみられるかどうか検討した(Clnical Neurophysiology, 127:827-832,2016)。脳刺激には、微弱な電流を流すことで大脳皮質の興奮・抑制性をコントロールする経頭蓋直流電気刺激法(transcranial direct current stimulation; tDCS)を用いた。その結果、tDCSを15分間施行したところ、ヒスタミン刺激に対する痒み知覚が減少し、痒みの持続時間も短縮することが分かった。今回の研究結果は、痒みの抑制に対する大脳皮質刺激の効果を実験的に検討した初めての報告であり、今後の新たな痒みの抑制法の開発につながる成果として期待できる。本研究は朝日新聞など多くのメディアで紹介された。また、皮膚科領域のトップジャーナルであるJournal of Dermatologyと、臨床神経生理学領域のトップジャーナルであるClinical Neurophysiologyに、痒みに関する総説を発表した。研究課題に関し、英文原著論文を2編、英文総説を2編、邦文総説を4編発表した。Springer社より、編集者として、英文書籍「Clinical Application of Magnetoencephalography」を出版した。また、国際学会の招待講演を1回、国内学会の特別講演、教育講演等を5回行った。痛み、痒み、触覚に関する研究は、いずれも順調に進んでいる。他に英文総説2編、日本語総説4編を発表した。英文原著論文、日本語総説論文を多数発表した。また、国内外での学会でも積極的に発表した。平成29年度は、痛みとかゆみ認知に関するこれまでの研究成果を、総説論文として発表した。(望月秀紀、柿木隆介:かゆみと痛みの脳内認知機構日本臨床、総説シリーズ「現代医学の焦点(406)」75(2), 334-343, 2017)また、一般の方向きの、かゆみに関する書籍を発行した(柿木隆介:世界にかゆみがなくなる日、ナツメ社、2017)。かゆみを主要研究テーマとする皮膚科医と基礎研究者との協力のもとにまとめた書物である。

これまでに類書は無く、画期的な書物として非常に高く評価された。また、国際学会で2回、国内学会で3回の招待講演を行った。特に海外での評価が高く、今年度はインドでの国際学会で2度の講演を行ったが、来年度は3回の特別講演の依頼を受けている。さらに、英文と邦文の総説論文の執筆依頼を受け、現在、投稿準備中である。英文原著論文、日本語総説論文を多数発表した。研究成果が高く評価されて、多くの国内外での学会で特別講演を行った。さらに、一般の方向きの「かゆみ」に関する書物を発行した。これまでに類書の無い書物として、書評などで高く評価された。種々の非侵襲的計測法を用いてヒトの脳内での痛覚と痒みの認知機構を明らかにすることが主要研究目的である。さらに関連深い触覚の認知機構の研究も行う。脳波、脳磁図、経頭蓋磁気刺激といった生理学的検査法と、機能的MRI,近赤外線分光法などの脳血流検査法を組み合わせて総合的に研究を進めていく、世界的にも最先端の研究である。前年度までに、痛みとかゆみに関する新知見と新しい治療法に関する多くの論文を発表し、新聞やテレビ、ラジオなどの多くのメディアで紹介された。平成30年度は、痛みとかゆみ認知に関するこれまでの研究成果を、1編の英文原著論文として発表した。「脳磁図の臨床応用に関するガイドライン」で、世界中の著名な脳磁図研究者との共同執筆である。申請者は主として「痛覚」に関する部分を執筆した。本分野のトップジャーナルに発表され、今後の脳磁図研究の指針として数多くの引用が予想される。「かゆみ」研究に関しては、現在、英文原著論文を1編投稿中で、近日中に採択予定である(Journalは、Frontiers in Physiology)。機能的MRIを用いて、かゆい時の脳活動を分析した研究である。特に、かゆみ認知に重要な「後部島」の活動を詳細に解析した。また、1編の総説論文を発表した。本分野において、このような詳細かつ最先端の総説論文はこれまでには無く、高く評価された。また、国際学会で2回、国内学会で2回の招待講演を行った。特に海外での評価が高く、米国とエジプトで開催された国際学会での講演は高く評価された。当初の予定通り、28年度以後は、痛覚では「痛覚認知と情動との関係(心の痛み)」をさらに深く追求していく。特に痛覚認知と情動の関係における個人差と人種差に非常に大きな興味がある。痛み自覚の個人差には帯状回と前頭葉が深く関与しているという仮説を立てており、その立証を行っていきたい。痒みに関しては、「痒みを想像する時の脳内活動(心の痒み)」と「痒いところを掻く時の快感のメカニズム」を主テーマとして研究していく。先行研究で基礎的な知見を得ることができたので(Mochizuki, Kakigi et al., Pain, 2013, J Neurophysiol 2014)、さらに詳細なメカニズムを解明していく。触覚に関しては、高次認知機能との関連について、詳細に検討していく。痛み、痒み、触覚に関して行っている現在の研究をさらに発展させていく。特に、痛みと痒みに関しては、心理的効果が大きいため、「心の痛み」、「心の痒み」というテーマのもとに研究を展開していく。
低分子G蛋白質ARF依存性ホスホリパーゼDの活性化機構の解析

我々はこれまでG_<M2>アクチベーターによるホスホリパーゼD1(PLD1)の活性調節機構について報告してきた。本年度はこの研究計画の最終年度にあたることを鑑み、総括的な観点からPLDの活性化機構を調べる目的で、比較的研究の遅れているPLD2に焦点を絞り競究をおこなった.PLD2はPLD1と異なりARFやPKCαにより活性化されず、その活性化機構に関しては不明であった。そこで我々はG_<M2>アクチベーターによるPLD2の活性調節の有無を調べるため、リコンビナントPLD2を作成しこの精製タンパク質を用いてin vitroに於けるPLDの活性測定を行った。その結果、我々が開発した硫酸アンモニウムを用いたPLD活性測定法においてもBrownらの開発した活性測定法を用いても、PLD2はG_<M2>アクチベーターにより強力に(約5倍)活性化された。興味深いことに、PLD2の活性化には影響を与えないとされていたARFは単独ではPLD2を活性化しないが、G_<M2>アクチベーター存在下に於いてはPLD1と同様に相乗的にPLD2を活性化した。更に免疫沈降実験に於いて、G_<M2>アクチベーターとPLD2が結合すること。またG_<M2>アクチベーター存在下ではPLD2とARFの結合が亢進することが明らかにされた。今までPLD2はPIP_2存在下で高い活性を示すことから、細胞内では抑制的にその活性が調節され、細胞刺激の結果その抑制が解除され活性を発現すると考えられてきた。今回の我々の結果は、PLD2はPLD1と同様に、複数の活性化因子が組み合わさって活性化を引き起こすことが強く示唆された。以上の結果から、刺激に連動したPLD2の活性化機構解明には至らなかったものの、分子レベルに於けるPLD2の活性化機備の瑛解に大きな進展が見られたと言えよう。ホスホリパーゼD(PLD)は、様々な細胞刺激に連動して活性化され、ホスファチジルコリンを加水分解し、脂質メディエーターを産生する情報変換酵素である。PLDの活性化にはARFなどの低分子量型G蛋白質が関与することが報告されていたが、精製された系ではその活性化が弱いことから、別の因子の関与が示唆されてきた。我々は、ラットの腎臓の可溶性画分にPLDに対する熱に安定な活性化因子を見い出し、これを単離精製した。この因子は、電気泳動上分子量約23kの蛋白質で、in vitroに於いてARFと相乗的にPLDを活性化した。次に、この蛋白質をプロテアーゼ処理を行い、得られたペプチドのアミノ酸配列を決定したところ、ガングリオシド代謝に関与するG_<M2>アクチベーターと一致した。更に、精製されたPLDの活性化因子を用いて、G_<M2>アクチベーター活性として知られる、βヘキソミニダーゼAの活性化を測定した結果、この酵素の活性化能を有することが分かった。以上の結果は、G_<M2>アクチベーターが多機能を有する調節蛋白質であるとともに、G_<M2>アクチベーター欠損の結果引き起こされる、G_<M2>ガングリオシドーシスの病態にPLDが関与することを示唆するものである。私達は近年phospholipase D(PLD)の活性化にガングリオシドの代謝に重要な調節因子として知られるG_<M2>アクチベーターが関与していることを報告した。そこでこの度、G_<M2>アクチベーターによるPLDの活性化様式をin vitro及び細胞系を用いて解析したのでその結果の概要を報告する。G_<M2>アクチベーターは、リコンビナントのPLD1及びPLD2をin vitroで用量依存性に活性化した。PLD1の活性化は、ARFおよびにPKCによる活性化に対して相乗的に起こることから、G_<M2>アクチベーターによる活性化はこれらの活性化因子とは異なるメカニズムによるものと推定された。一方、PLD2の活性化に関しては、ARFおよびPKCは無効であったのに対し、G_<M2>アクチベーターでは単独で約5倍の活性化が見られた。これらの結果から、G_<M2>アクチベーターはPLDのどちらのサブタイプも活性化し得るが、特にPLD2においては現在報告される唯一の活性化蛋白質であるため、より重要な調節機能を果たしている可能性がある。また、G_<M2>アクチベーターはストレプトリジンOによる細胞膜透過性処理を行ったHL-60細胞に於いても、PMAによるPLDの活性化を更に増強した。以上の結果は、G_<M2>アクチベーターがガングリオシドの代謝を調節するのみならず、コリン燐脂質代謝調節にも関与する多機能調節蛋白質であることが強く示唆する。今までTay-Sachs病やG_<M2>アクチベーター欠損によるG_<M2>ガングリオシドーシスでは、G_<M2>ガングリオシドの蓄積以外には病気の発症に関与する現象は報告されていなかった。今回の我々の発見で、これらの病気の原因にPLDを介するコリン燐脂質代謝を介する情報伝達系障害の関与が示唆された。今後ヒトのG_<M2>ガングリオシドーシスの病因におけるコリン燐脂質代謝の関与を検討して行きたい。

種々の増殖因子による細胞刺激の結果、ホスホリパーゼD(PLD)が活性化され細胞膜コリン燐脂質代謝が亢進することが、細胞分化や増殖などの細胞内シグナルとして重要であることが分かってきた。我々は最近PLDの活性化にG_<M2>アクチベーターが重要であることを見出した。平成12年度はG_<M2>アクチベーターが生理的なPLDの活性化因子であることの証明に焦点をあて解析を行った。そこでG_<M2>アクチベーターのcDNAをクローニングし、これをNIH3T3細胞やCHO細胞などに発現させ、PLDの活性化能を調べたところ、非導入細胞の場合と比べ顕著な差は認められなかった。一方、G_<M2>アクチベーターに対するドミナントネガティブ変異体を発現したNIH3T3細胞やCHO細胞を用いてPLDの活性化能を調べたところ、コントロール細胞に比べドミナントネガティブ変異体を発現した細胞では、刺激に依存したPLDの活性化能が顕著に抑制されていた。これらの結果を総合すると、正常細胞ではG_<M2>アクチベーターの外にリダンダントな機能を有する蛋白質が発現していて、G_<M2>アクチベーターがPLDの活性化の律速的な調節機能は有していないが、G_<M2>アクチベーターはリダンダントな機能を有する蛋白質と共にPLDの活性調節に重要な機能を担っていることが強く示唆された。今後更にこれらの機能を有する蛋白質の同定が重要な課題である。我々はこれまでG_<M2>アクチベーターによるホスホリパーゼD1(PLD1)の活性調節機構について報告してきた。本年度はこの研究計画の最終年度にあたることを鑑み、総括的な観点からPLDの活性化機構を調べる目的で、比較的研究の遅れているPLD2に焦点を絞り競究をおこなった.PLD2はPLD1と異なりARFやPKCαにより活性化されず、その活性化機構に関しては不明であった。そこで我々はG_<M2>アクチベーターによるPLD2の活性調節の有無を調べるため、リコンビナントPLD2を作成しこの精製タンパク質を用いてin vitroに於けるPLDの活性測定を行った。その結果、我々が開発した硫酸アンモニウムを用いたPLD活性測定法においてもBrownらの開発した活性測定法を用いても、PLD2はG_<M2>アクチベーターにより強力に(約5倍)活性化された。興味深いことに、PLD2の活性化には影響を与えないとされていたARFは単独ではPLD2を活性化しないが、G_<M2>アクチベーター存在下に於いてはPLD1と同様に相乗的にPLD2を活性化した。更に免疫沈降実験に於いて、G_<M2>アクチベーターとPLD2が結合すること。またG_<M2>アクチベーター存在下ではPLD2とARFの結合が亢進することが明らかにされた。今までPLD2はPIP_2存在下で高い活性を示すことから、細胞内では抑制的にその活性が調節され、細胞刺激の結果その抑制が解除され活性を発現すると考えられてきた。今回の我々の結果は、PLD2はPLD1と同様に、複数の活性化因子が組み合わさって活性化を引き起こすことが強く示唆された。以上の結果から、刺激に連動したPLD2の活性化機構解明には至らなかったものの、分子レベルに於けるPLD2の活性化機備の瑛解に大きな進展が見られたと言えよう。