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遺伝子組み換え型コロニー形成刺激因子の白血病細胞の分化を増殖に及ぼす影響

急性骨髄性白血病各種病型において遺伝子組み換え型顆粒球単球コロニー形成刺激因子(rGM-CSF)、遺伝子組み換え型顆粒球20コロニー形成刺激因子(rG-CSF)遺伝子組み換え型インターロイキン3 (iZ-3)のコロニー形成刺激活性(CSA)を白血病性コロニー法を用いて検討した。またこれらCSFの白血病性幹細胞の自己再生能に及ぼす影響、コロニー構成細胞の表面形質、細胞形態について検討した。さらにCSFの同時添加による併用作用についても調べた。各種CSFのコロニー形成刺激作用を正常ヒト白血球phytohemogglutinin刺激培養工精(PHA-LCM)と比較した。rGM-CSFは20症例中13例で白血病性コロニー(L-CFV)を形成した。その程度は白血病病型により明らかに異なっていたが全般的にPHA-LCMに比べ低値であった。rGM-CSFは病型MIでは全くコロニーを形成しなかったが、M4では非常に多数のコロニーを形成し、その程度はPHA-LCMよりわずかに少ない程度であった。M2とM5ではコロニー数はPHA-LCMに比しかなり少なかった。rG-CSFは21症例中5例でのみコロニーを形成し、このうち、例はM2であった。コロニーを形成した程度はごく軽度でありPHA-LCM、rGM-CSFに比し有意に低値であった。rIL-3は27例中12例でコロニーを形成した。反応例の病型はさまざまで、その程度はrGM-CSF、rG-CSFと有意差は認められなかったが、PHA-LCMに比べると低値であった。各種CSFによる自己再生能はいずれもPHA-LCMによるそれとほぼ同様であった。また20コロニー構成細胞の表面形質、細胞形態はいずれもPHA-LCMとほぼ同様であり、各種CSFは白血病性幹細胞のもっている分心の方向と程度を変化させなかった。rIL-3とrGM-CSF、またはrG-CSF同時添加では、コロニー数は症例によりさまざまな値を示し、CSF併用の反応性はlueterogenecusであり、白血病細胞ではこの〓が正常顆粒球事前駆細胞と異っていると考えられた。急性白血病の治療において化学療法後の正常顆粒球の回復を促進することはきわめて重要である.最近ヒト遺伝子組み換え型顆粒球単球コロニー形成刺激因子(rGM-CSF)や遺伝子組み換え型顆粒球コロニー形成刺激因子(rG-CSF)が開発されこの目的に利用されることが期待されている.臨床応用に先だちこれらの物質が白血病細胞の増殖と分化に及ぼす影響を明らかにしておく事が必要である.本研究では白血病コロニー法を用いこの点について検討した.急性骨髄性白血病患者20人の末梢血または骨髄より白血病細胞を分離し,ウシ胎児血清とrGM-CSFまたはrG-CSFまたはPHA刺激白血球培養士清(PHA-LCM)を加えメチルセルローズ中で培養した.一定期間後にコロニー数の算定を行いコロニー形成刺激因子のコロニー形成刺激作用をPHA-LCMのそれと比較検討した.またコロニー構成細胞の形態,表面形質ならびに自己再生能についても検討した.

rGM-CSFは19症例中12例で白血病コロニーを形成したが,その程度は一般的にPHA-LCMに比べ低かった.病型M1ではコロニー形成はほヾ認められなかったがM4ではPHA-LCMとほヾ同程度のコロニー形成を認めた. M2およびM5ではその中間でありrGM-CSFの作用は病型により明らかに異っていた.rG-CSFは20症例中5例のみでコロニー形成を認めた.反応した症例数はrGM-CSFに比して明らかに少く,反応した例でもその程度はごく軽度でありrG-CSFは白血病細胞の増殖には重要な役割を果していないと考えられる.コロニー構成細胞の形態,表面形質および自己再生能はPHA-LCMのそれとほゞ同様であり分化の傾向は認められなかった.これらのコロニー形成刺激因子を臨床的に用いる場合, rGM-CSFは病型を選んで使用することが必要で, M1では安全に用いることが可能と考えられる.またrG-CSFは白血病細胞をほとんど増殖させないので臨床使用が十分に可能であると考えられる.急性骨髄性白血病細胞各種病型においてコロニー形成刺激因子の一つである遺伝子組み換え型インターロイキン3(rIL-3)に対するコロニー形成刺激活性を白血病性コロニー法を用いて検討した。また白血病性幹細胞の自己再生能の及ぼす影響、コロニー構成細胞の表面形質、細胞形態について検討した。さらに遺伝子組み換え型顆粒球単球コロニー形成刺激因子(rGM-CSF)、遺伝子組み換え型顆粒状コロニー形成刺激因子(rG-CSF)との併用について検討し、コロニー形成刺激作用を正常ヒト白血球plytohemagglutinin刺激培養〓〓(pHA-LCM)と比較した。rIL-3は27例中12例(44%)で、コロニーを形成した。反応した例について病型との関連は認められなかった。反応程度はpHA-LCMに比べて有意に低値であり、rGM-CSF、rG-CSFの反応程度(前年度の結果)と有意差は認められなかった。rIL-3による自己再生能を8例で検討したが、pHA-LCMによるそれらの値とほぼ同様の値を示し、両群間の値には直線関係が見られた。rIL-3によるコロニー構成細胞の細胞表面形質は6例で検討したが、pHA-LCMによる値とほぼ同様であった。また細胞形態は両群共に芽球様であり、組織化学的染色性もほぼ同様であった。これらの結果はrIL-3は白血病性幹細胞の自己再生能、および分化の方向とその程度を変化させなかったことを示す。rIL-3をrGM-CSF又はrG-CSFと9例で同時添加したが、コロニー数はさまざまで、半数例では併用時のコロニー数はそれぞれのCSF単独添加時のコロニー数の合計とほぼ同様であった。残る半数では併用時のコロニー数はそれぞれのCSF単独添加時のコロニー数の合計に比べ有意に高値または低値を示した。白血病細胞のCSF併用による反応性はheterogenousであった。3剤のCSFを同時添加した場合のコロニー数はpHA-LCMのそれに比較し明らかに低値を示すことが多く、そのような症例では3剤のCSF以外のCSFが主なCSFとして働いている可能性が示唆された。
ヒト唾液中に存在する腸内常在性細菌種の特定とその特徴解明

無菌マウスにヒト唾液細菌叢を投与作成したノトバイオートマウスの経時糞便細菌叢の16S rRNA遺伝子とメタゲノム解析、及び同マウスの大腸粘膜固有層の炎症性T細胞のフローサイトメトリー解析を行った。その結果、2030菌種がマウス腸内で常在性を持ち、元の唾液細菌叢に比べてこれら細菌種は豊富な炭水化物代謝関連遺伝子と少ない酸化ストレス耐性関連遺伝子を有していた。また、いくつかのマウスでは炎症性T細胞の蓄積が観察され、その誘導と有意に関連する細菌種を特定した。これらの結果から、ヒト唾液には腸内常在性をもつ細菌種が存在し、そのいくつかは宿主の炎症応答を誘起する作用をもつことが示唆された。本研究では、ヒト唾液中に含まれる腸内常在性細菌の特定とその機能的特徴の解明を行った。具体的には、成人被験者の唾液細菌叢を投与して作成したノトバイオートマウスの糞便中の細菌叢を16S rRNA遺伝子解析し、マウス腸内で安定に常在する細菌叢の菌種分類解析を行った。また、これら細菌叢のメタゲノム解析よりそれらが有する遺伝子(機能)の特徴を投与した唾液細菌叢との比較から解析した。さらに、これらノトバイオートマウスの免疫細胞の増減を調べた。様々なヒト唾液細菌叢を投与して作成したノトバイオートマウスを通常食で飼育し、経時的にその糞便を採取し、その細菌叢の16S遺伝子をロシュ社454GSで解析した。その結果、投与後約4週間以降において、2030菌種が安定に常在することが分かった。一方、ヒト糞便細菌叢を投与したマウスでは、同一条件下で120菌種以上が常在した。これらの結果は、ヒト糞便にくらべてその数は有意に少ないが、ヒト唾液中にはマウス腸管に常在できる細菌が存在することを示した。これらの常在性細菌のうちで、有意に優占する複数の細菌種を特定することもできた。メタゲノム解析からは、腸内常在性の細菌叢には、投与した唾液細菌叢と比較して、炭水化物代謝に関わる遺伝子群が有意に豊富に存在することと、酸化ストレス耐性に関わる機能が有意に減少することが分かった。大腸の粘膜固有層における炎症性T細胞をフローサイトメトリーで解析し、無菌マウスとの比較において、いくつかの唾液投与マウスではTh17細胞やTh1細胞が有意に惹起されることを見いだした。さらに、これらT細胞の誘導と強い相関をもつ細菌種をクラスター解析により特定することができた。以上の結果から、ヒト唾液細菌叢には腸内常在性をもつ細菌種が潜在することと、その中には宿主の免疫系に作用する細菌が含まれることが強く示唆された。
科学教育世界基準の開発へ向けた科学的リテラシーに関する国際比較調査

本研究は17ヶ国における義務教育段階の科学教育課程に盛り込まれる科学的リテラシーの比較をねらいにしている。特に、(1)科学教育の目標は何か、また科学教育の果たす役割は何か、(2)義務教育段階の科学教養の特色は何か、また学校教育全体の教育課程との関係はどうか、(3)科学教育の内容の特色は何か、(4)科学教育課程に関する各国の共通点・差異点は何か、の4点に焦点を当てた。各国の教育課程の基準、教科書等の資料を収集するとともに、学校現場での授業観察、理科教育学者や行政官・指導者・教師等との意見交換を行った。科学教育の目標の共通点は、社会的・経済的な発展をめざして教育、特に科学教育の役割の大きさを主張することにある。発展途上国では一般教育の普遍化と普通科学教育の充実を、先進国では教育の質的向上をねらいとしており、形は異なるものの、全ての者が豊かな科学的リテラシーを習得することを目標に掲げている。また、以前のような科学者人材の育成から、現在は論理的・批判的な思考力や社会との関連の理解、問題解決の能力の育成が科学教育の主流へと移っている。つまり、科学的リテラシーの習得は、学び方と考え方を学び、問題解決の能力を育てる教育によって達成されるという共通認識がある。科学教育の内容を分析すると、(1)学術的内容、(2)領域統合の内容、(3)身近な科学の学習課題の3つに分けられる。例えば、小学校では(3)の多い総合的かつ関連的な学習が中心で、発達段階に応じて五感による経験から科学的概念の習得へと問題解決が行われる。なお、イギリスやアメリカなど5カ国では、国や州の教育課程の基準が示されるが、日本と異なり、学校レベルの授業計画・実践に関わるガイドラインと捉えられる。今後は各国の研究者と協議して世界基準のフレームワークを構築し、本研究をさらに発展させる必要がある。
レジン系接着セメントの硬化に酸素不透過性フィルムがおよぼす影響について

接着性レジンセメント(以後,セメント)を窩洞適合性の低い審美性間接修復物に応用した場合,露出したセメントライン表層の酸素による未重合層が予後に影響することが指摘されており,セメントの重合性の向上が望まれている。そこで,酸素遮断効果の異なるフィルムの貼付が,セメント表層の機械的性質におよぼす影響について,歯ブラシ摩耗試験により検討を加えた。供試セメントは,コンポジット系のPANAVIA Fluoro Cement(クラレ),Bistite II(トクヤマ),RelyX ARC(3M),Chemi Ace II(サンメディカル),MMA系のSuper-Bond C&B(サンメディカル)およびMulti Bond(トクヤマ)を,供試フィルムは,Techbarrier(Mitsubishi),Harder(Toyobo),低密度ポリエチレンフィルム(Toyobo)を使用した。歯ブラシ摩耗試験用試片の製作には,内径11mm,高さ4mmの円筒形ビニル型を使用し,ヌープ硬さ試験と同様の条件で硬化させた。試験に先立ち試片の重量を秤量し,次いで,この試片を歯ブラシ磨耗試験器に固定し,その填塞面を炭酸カルシウム飽和溶液中で荷重5N,ストローク幅50mmの条件で10,000回の摩耗試験を行なった。試験終了後,試片を超音波洗浄し,真空デシケーター内で24時間減圧乾燥した後,その重量を測定し,試験前の重量との差から減少率を求め,ブラシ摩耗率とした。また,試験終了後の試片の表面についてSEM観察を行った。その結果,1.酸素遮断性の高いフィルムの使用により,コンポジット系セメント表面の摩耗率は減少したが,MMA系セメントでは変化が認められなかった。2.SEM観察の結果,コンポジット系セメントでは,フィルムの酸素透過性により異なる表面性状を示したが,MMA系セメントでは変化が認められなかった。以上より,レジンセメント硬化時の酸素遮断性の高いフィルムの貼付は,レジンセメントの種類によっては,硬化物表層の重合率および耐摩耗性を向上させる効果があることが判明した。審美修復治療のニーズの拡大から,歯質に接着性のあるレジン系セメント(以後,セメント)を間接修復物の合着に応用する機会が増加している。しかし,本セメントを合着材として使用する審美性修復物の窩洞適合性は低く,セメントラインの露出に伴うギャップ形成がしばしば観察されている。これは,これらセメントの表層に大気中の酸素によって重合が阻害された部分が口腔内に露出することによるものであり,その改善が望まれている。そこで,この重合阻害層を除去することを目的として,酸素遮断効果のある酸素不透過性フィルム(以後,フィルム)の使用が,セメントの重合特性におよぼす影響についてヌープ硬さの観点から検討を加えた。供試セメントとしては,コンポジット系のPANAVIA Fluoro Cement(クラレ),Bistite II(トクヤマ),RelyX ARC(3M),Chemi Ace II(サンメディカル),MMA系のSuper-Bond C&B(サンメディカル)およびMulti Bond(トクヤマ)を,供試フィルムとしては,Techbarrier(Mitsubishi chemical Pax co.),Harden(Toyobo),低密度ポリエチレンフィルム(Toyobo)を使用した。ヌープ硬さの測定は,製造者指示で練和したセメント泥をビニル型に填塞し,直ちにフィルムを用いて,23±1°C,相対湿度50±5%および37±1°C,相対湿度90%の条件で1時間保管,硬化させ,フィルムを用いないで硬化させた試片と比較し,以下の結論を得た。1.コンポジット系セメント表面におけるヌープ硬さは,酸素遮断性の高いフィルムの使用によって向上し,この傾向は温度の上昇した環境においても同様であった。2.コンポジット系セメントの縦断面におけるヌープ硬さ曲線は,表層で低く,深部では平坦となる形態を示し,酸素遮断性の高いフィルムの使用によって向上し,この傾向は温度の上昇した環境においても同様であった。3.MMA系セメントのヌープ硬さは,フィルムの影響がほとんど認められなかった。

また,試験終了後の試片の表面についてSEM観察を行った。その結果,1.酸素遮断性の高いフィルムの使用により,コンポジット系セメント表面の摩耗率は減少したが,MMA系セメントでは変化が認められなかった。2.SEM観察の結果,コンポジット系セメントでは,フィルムの酸素透過性により異なる表面性状を示したが,MMA系セメントでは変化が認められなかった。以上より,レジンセメント硬化時の酸素遮断性の高いフィルムの貼付は,レジンセメントの種類によっては,硬化物表層の重合率および耐摩耗性を向上させる効果があることが判明した。
ヒト脳内に存在するメラニン様色素の構造とその加齢過程の解明

ニューロメラニン(NM)は中脳黒質および青斑核に存在する黒褐色のメラニンである。このメラニン構造はまだ不明な点が多いが、天然のNMの化学反応から、黒質NMはDA、DOPAC、DOPE由来、一方、青斑核NMは、NE、DOMAおよびDOPEGに加えて、DA、DOPAC、DOPEにも由来していることがわかった。一方、チオグリコール酸とフェノールの共存下、青斑核NMの塩酸水解を行うと、NEまたはCys-NEのベンジル位のヒドロキシ基がチオグリコール酸と置換反応して生成した化合物が得られた。この実験結果は、NEおよびCys-NEが青斑核NMに取り込まれていることを証明する初めての化学的証拠である。ヒトまたはほ乳動物の中脳黒質に存在する褐色のメラニンであるニューロメラニン(NM)の生成過程においては、DAまたはNEとともに、DAとNEからの代謝物の酸化的重合の関与も重要視されている。DAとNEからの代謝物としては、DOPAC、DOPE、DOPEGおよびDOMAが知られている。これらの代謝物がNMに含有されているかどうかを調べるには、HI法が最も有用である。NMのHI還元によりDOPAC、DOPE、DOPEGおよびDOMA由来の構造単位は、アミノヒドロキシフェニル酢酸(AHPAA)とアミノヒドロキシエチルベンゼン(AHEB)を与えると予想される。これらの化合物は、市販品がないため新たに合成する必要があった。今回、まず、AHPAAは、m-またはp-ヒドロキシフェニル酢酸のo-ニトロ体を得るために60%硝酸と反応させた後、57%HIによりニトロ基を還元して望ましいAHPAAを合成した。AHEBはm-またはp-ヒドロキシエチルベンゼンに同様に硝酸を反応させた後、HIにより還元し、目的のAHEBを合成した。以前合成していたAHPEAも今回新たに、m-またはp-ヒドロキシエチルアミンのニトロ化、還元により合成した。天然の黒質由来と青斑核由来のNMをHI水解したところ、黒質由来のNMからは初めてAHEBを確認することができた。また、青斑核由来のNMからは、AHPEA、AHPAA、AHEB、AHPを初めて検出することができた。このことは、黒質由来、青斑核由来のNMは、DAおよびNE由来のみならず、DOPA、DOPAC、DOMA、DOPEおよびDOPEG由来であることを暗示している。褐色で不溶性のメラニン様色素(ニューロメラニン、NM)は、ヒトやほ乳動物の中枢神経系に存在する褐色色素である。NMは、中脳黒質および青斑核のカテコールアミン作動性ニューロンに存在するが、非カテコールアミン作動性ニューロンである被殻、前運動野皮質、小脳などにもNM様色素が存在することを以前報告した(2008)。しかしながら、毛髪、皮膚メラニンとは対照的にその構造や機能は単離の困難さや適切な生化学的モデル化合物がないため不明な点が多い。NMの構造は、DA:Cys (2:1)から合成された合成NMを100°Cで8時間加熱した構造に近いことを報告したが、まだまだ不明な部分がある(2012)。我々はすでにメラニンの化学分解におけるメラニンマーカーとして、DOPA由来から4-アミノ-3-ヒドロキシフェニルアラニン(4-AHP)、DA由来からは4-アミノ-3-ヒドロキシフェニルエチルアミン(4-AHPEA)を合成した。しかしながら、NM中には、DA、DOPA由来のメラニン以外にDOPAC、DOPAL、DOPEなども含まれていることが知られている。よって、これらのカテコール類から合成されるメラニンのマーカーを新たに合成した。DOPAC由来メラニンのHI水解により得られる4-アミノ-3-ヒドロキシフェニル酢酸(4-AHPAC)は以下の方法で合成した。m-ヒドロキシフェニル酢酸を硝酸で反応させ、ニトロ体を合成し、このニトロ体をHIで還元し、得られた混合物をDowexカラムで分離後4-AHPACを得た。DOPE由来のメラニンマーカー、4-アミノ-3-ヒドロキシエチルベンゼン(4-AHEB)は、m-エチルフェノールのニトロ化後、ニトロ体をHI還元、Dowexカラム分離して合成した。DOPALについては、現在合成を検討中である。海外共同研究者のL. Zecca博士(イタリア高等医科学研究所)から天然のSNおよびLC由来NMの供与を受け、NMの構造解析を進めた。SN由来およびLC由来のNMをアルカリ性過酸化水素酸化および還元的HI水解して得られた分解産物を定量した。なお、新規メラニンマーカー(AHPAA、AHEB)は、Molecule, 2014に記載した方法で新たに合成した。今回、過酸化水素酸化法によりTDCAおよびTTCAが得られたことは、NM中にPM由来の構造単位があること、PDCA、PTCAが得られたことはDAまたはNE由来の構造単位が含まれていることが示された。

また、HI水解によりAHPEA、AHPAA、AHEBおよびAHPが得られたことは、NM中にDA、DOPA、DOPACのシステイニル体が含まれていることが示された。以上の結果からSN由来およびLC由来のNMは、DAおよびNE由来のみならず他のカテコールアミン由来神経に存在するいくつかのカテコールアミン類(DOPA、DOPAC、DOMA、DOPEおよびDOPEG)に由来していることを暗示していた。この分析からはSN-NMとLC-NMともに上記の分解産物が得られたため、LC-NMとSN-NMの明確な違いが判別できなかった。そこで5%チオグリコール酸および1%フェノール存在下、6M-塩酸で110°C、6時間、天然のSN-NMとLC-NMの加水分解反応を行った結果、SN-NMからは遊離型およびタンパク結合型DA、DOPAおよびCys-DAが得られた。一方、LC-NMからはDA、Cys-DAおよびDOPAが得られたが主生成物として構造未知化合物が得られた。驚いたことに目的とするNEは得られなかった。そこでこの化合物を単離精製し、構造研究を行ったところ、この未知化合物はβ-カルボキシメチルチオ-DAであることが同定された。有機化学NMがDA、NEのみならず、これらの代謝物由来のカテコールアミンも含まれていることが初めて証明され、新たな合成反応により新規マーカーを得ることができ、DA、NE以外のカテコールアミン代謝物の定量が可能になった。様々な年齢のNMと部位の異なるNMを分析して、加齢に伴うNMの構造変化を調べた。青斑核から得られたNMで42歳から92歳までのヒトの検体を調べたところ、TTCA/PDCA比が53歳まで上昇したが、それ以降減少することがわかった。一方、被殻、前運動野皮質、小脳から得られたNMで年齢差を比較したところ、4-AHP/PTCA値が年齢の上昇にしたがい、有意に高くなることがわかった。メラニンマーカーの合成に思わぬ時間がかかっている。これは、DOPALが非常に不安定なため、純度よい化合物を合成できてないためである。しかし、これはそのうち解決できるものと考えている。一方、共同研究者のZecca博士からのニューロメラニン(NM)のサンプルの供給も遅くなっている。このサンプルは、色々な年齢のヒトのNMサンプルであり、NMのagingによる構造変化を調べるためのものである。しかしながら、これも最近のE-mailの連絡から近いうちに送付できるとの連絡があった。合成NMとタンパク(例えばBSA)と反応させて、得られたEuBSA (DA由来のメラニンとBSAとのcomplex)とPheoBSA(DA-cys由来のメラニンとBSAとのcomplex)のメラニン含量を調べる。さらに、Fe2+イオンを加えた場合に、その含量がどの様に変化するかを調べる。これらのメラニンの合祀枝は、L. CasellaによるJ. Biol. Inorg. Chem (2012)の方法に従って合成する。つづいて、得られたNM-BSA complexを用いて、加熱処理したメラニンのagingのシュミレーションを行い、天然NMと比較する。
皮質骨および海綿骨の特異的骨代謝マーカーの開発とその臨床応用

ヒト骨組織より初めてChondroadherin(CHAD)を分離・精製する方法を確立した。CHADは骨、軟骨に特異的に存在する非コラーゲン性蛋白質であるが、それぞれの組織において異なった翻訳後修飾を受けることにより、固有の機能を発現しているものと考えられている。これまでに、骨由来CHAD(bCHAD)のみリン酸化修飾が見られることを報告し、本蛋白質がosteopontinやbone sialoproteinなどのリン蛋白質と同様に、骨系細胞の骨基質への接着や機能の発現に、何らかの役割を演じている可能性のあることを指摘している。本研究ではbCHADの機能の一端を明らかにすることを目的としてbCHADと破骨細胞との結合様式および破骨細胞がhydroxyapatite(HAP)に接着する際のbCHADの役割について検討した。bCHADはOPNと同程度にHAPと強い親和性を有し、破骨細胞のHAPへの接着を促進することが明らかになった。また、破骨細胞とbCHADとの接着に際しては、破骨細胞上のα2β1integrinを介していることが判明したが、コラーゲン上のα2β1integrin結合ドメインである。DEGA peptideの過剰投与による測定においても接着が阻害されなかったことから、破骨細胞はbCHAD上でDEGA配列とは異なる一次構造を認識するものと推察される。これまでの破骨細胞の骨基質への接着は主に破骨細胞上のαVβ3integrinがOPNなどのリン蛋白質のRGD配列を認識することにより発現するものと考えられてきたが、RGD配列を有しないCHADを介した新たな接着機構の存在が明らかになったことは、今後、骨吸収機序を解明するうえでも大変に興味深い。ヒト骨組織より初めてChondroadoherin(以下CHAD)を分離、精製する方法を確立し、これまでに報告されているウシのCHAとの比較検討を行った。(方法)ヒト新鮮屍体より採取した、皮質骨・海綿骨を、それそれ液体窒素を用いて凍結粉砕し、0.5MEDTA Tris bufferで、脱灰抽出を行った。抽出液をCM52イオン交換クロマトグラフィーを用いて、0から0.5MNaClのlinear gradientで分画したCHADを含む画分を、phenyl-TSK-5PW/reverse phascカラムを用いて精製した。(結果)ヒト皮質骨・海綿骨、およびウシ皮質骨の脱灰抽出液を還元条件下でSDS-PAGEに展開したところ、ヒトでは36,37kdの蛋白質が、ウシに比べて多量に抽出された。精製画分のアミノ酸分析の結果、精製された36,37kDaの蛋白質はCHADであることが証明された。CHADのリン酸化の有無についての検討では、ヒトおよびウシ骨由来のCHADにphospho-Serが存在していたが、軟骨由来のCHADには、リン酸基は認められなかった。(考察)ヒトの皮質骨および海綿骨から分離、精製したCHADは、ウシ軟骨由来のものと同一の一次構造を示したが、リン酸化や糖鎖付加などの翻訳後修飾に関しては、明らかな相異がみられた。すなわち、骨由来のCHADにのみリン酸化修飾がみられたことは、本蛋白質が骨、軟骨のそれぞれの組織において、固有の翻訳後修飾を受けることにより、異なった機能を有して存在する可能性があるものと推察された。現在、精製蛋白質に対するモノクローナル抗体を作製中であり、抗体が得られ次第、代謝マーカーとなり得るかの検討をヒト血清を用いたELISA法により行う予定である。

これまでに、骨由来CHAD(bCHAD)のみにリン酸化修飾がみられることを報告し、本蛋白質がosteopontinやbone sialoproteinなどのリン蛋白質と同様に、骨系細胞の骨基質への接着や機能の発現に、何らかの役割を演じている可能性のあることを指摘している。本研究ではbCHADの機能の一端を明らかにすることを目的としてbCHADと破骨細胞との結合様式および破骨細胞がhydroxyapatite(HAP)に接着する際のbCHADの役割について検討した。bCHADはOPNと同程度にHAPと強い親和性を有し、破骨細胞のHAPへの接着を促進することが明らかになった。また、破骨細胞とbCHADとの接着に際しては、破骨細胞上のα2β1integrinを介していることが判明したが、コラーゲン上のα2β1integrin結合ドメインであるDEGApeptideの過剰投与による測定においても接着が阻害されなかったことから、破骨細胞はbCHAD上でDEGA配列とは異なる一次構造を認識するものと推察される。これまで破骨細胞の骨基質への接着は主に破骨細胞上のαVβ3integrinがOPNなどのリン蛋白質のRGD配列を確認することにより発現するものと考えられてきたが、RGD配列を有しないCHADを介した新たな接着機構の存在が明らかになったことは、今後、骨吸収機序を解明するうえでも大変に興味深い。
生体分子アレイ化TFTフォトセンサを用いた新規マイクロデバイスの開発

前年度までに、TFTフォトセンサ上へ生体分子を簡便に高密度に固定化できることを示し、このセンサを抗体アレイ、ペプチドアレイやプロテインアレイに応用できることを示してきた。また、化学発光を用いて検出感度の向上も達成した。今年度は、このフォトセンサを用いた新規マイクロデバイスの構築を行い、装置の小型化を試みた。これにより、測定システム全体の小型化と半自動化を達成することができた。また、マイクロ流路と流速を制御することで、DNAハイブリダイゼーション時間を短縮することも可能にした。その結果、全血サンプルから3時間以内で遺伝子診断が可能であった。次に、このマイクロデバイスと化学発光を組み合わせた、新規検出システムの開発も行った。これにより、励起光源も不必要となり更なる小型化も達成することができた。化学発光に合わせて流路を再設計することで、一般的な発光検出システムより受光効率の高い検出システムを構築することが可能であった。また、反応全体の最適化を行い、全血サンプルから1時間以内で遺伝子診断が可能な検出システムを開発することができた。最後に、人工核酸であるlocked nucleicacid(LNA)を用いて迅速な遺伝子診断に向けた遺伝子増幅技術の開発を行った。遺伝子増幅反応であるPCRで用いるプライマーの一部にLNAを導入し、アニーリング温度を向上させることで、全体の温度変化量の少ないPCRの設計が可能になる。酵素や諸条件の最適化を行った結果、このLNAを用いた遺伝子増幅技術とマイクロデバイスを組み合わせることで、全血サンプルから30分程度で遺伝子診断が可能であることを示した。以上の成果により、当初の目的である小型の生体分子固定化TFTフォトセンサ内臓マイクロデバイスの構築が達成できたと考えられる。また、このマイクロデバイスの開発によって、非常に迅速な遺伝子診断が可能になった。これまでにフォトセンサとマイクロアレイが一体となった、DNAアレイ化TFTフォトセンサを開発してきた。このセンサは、センサ表面のシグナルのみを検出できるセンサである。そのためDNA以外の生体分子をセンサ表面へ固定化することで、バイオセンサにも応用展開できると考えられる。そこで、このセンサの応用範囲を広げるために、このフォトセンサ上にさまざまな生体分子を固定化できる手法の検討を行った。その結果、各種シランカップリング剤と架橋剤を用いて、フォトセンサ上へガラス基板並みのさまざまな表面修飾が可能であることが示された。また、その固定化量は理論最大固定化量とほぼ同程度の値を示すことが示された。このことから、従来から行われているガラス基板への生体分子の修飾方法と同様の手法で、このフォトセンサ上へ生体分子を簡便に高密度に固定化できることが示唆された。さらに、このフォトセンサを用いた新規マイクロデバイスを構築するために、化学発光検出も可能な系の設計も試みた。これにより、3桁以上の検出感度の向上が確認され、zmolオーダーの検出が可能になった。また、蛍光から化学発光に切り替えることで、励起光源も不必要となり更なる小型化も達成することができた。また、感度向上に伴い遺伝子判別の検出感度も100倍向上することが確認された。さらに実用化を視野にいれ、全血からダイレクトPCRを行い未精製のままハイブリダイゼーションを行った。その結果、マイクロデバイス中で抽出・精製操作を行わずして、遺伝子診断が可能であることが示された。現在まで、抽出・精製を行わないで、遺伝子診断が可能なマイクロデバイスの報告はされていない。現在、本データを用いて論文査読中及び執筆中である。
寺院仏教とソーシャル・キャピタルー過疎・中間・過密地域の比較

本研究は、「過疎と寺院」という30年来の問題設定を超えた人口減少社会における寺院仏教のあり方を展望するものである。具体的には、各地域における寺院の過疎化や高齢化への対応に加えて、檀徒・信徒(門徒)のメンバーシップと行事参加(信仰の深まり)が、寺檀関係や檀家同士の紐帯を強化するだけではなく、地域社会への参加、他者への信頼、社会倫理の獲得に結びついていく事例を調査分析した。また、寺院が行う社会貢献事業(ビハーラ、傾聴、地域福祉的活動など)のバリエーションを示した。なお、本研究の成果は、「人口減少社会と寺院ーソーシャル・キャピタル創成をめざして」として2016年度に法蔵館から刊行予定である。本研究では、1仏教寺院が地域社会形成に果たす役割を過疎地域(限界集落)/中間地域(地方都市)/過密地域(大都市)において明らかにし、2宗教施設が今後の日本社会におけるソーシャル・キャピタル形成に果たす潜在的可能性を議論するための基礎的な資料提供を目的とし、2013年度は2012年度に引き続き、浄土真宗本願寺派、真宗高田派で上記の三地域で調査を行い、浄土・真宗系教団における寺院・門徒間の関係と地域における社会関係の重なり具合を比較検討した。具体的な成果としては、1北海道大学と龍谷大学、浄土真宗本願寺派総合研究所と合同で滋賀県の本願寺派寺院調査を2013年8月に実施し、真宗高田派では分担研究者の川又が三重県内の寺院を研究協力者とともに30ヶ寺ほどの寺院調査データを蓄積した。調査内容としては、寺院の社会的機能を項目ごとに調べ上げるだけではなく、檀徒・信徒(門徒)のメンバーシップと行事参加(信仰の深まり)が、寺檀関係や門徒同士の同朋意識を強化するだけではなく、地域社会への参加、他者への信頼、社会倫理の獲得に結びついていくというソーシャル・キャピタル論の課題を明らかにする事例蓄積に努めた。研究成果の社会的発信としては、浄土宗総合研究所主催の「過疎地域における寺院に関する研究会」に分担研究者の大谷が、日蓮宗千葉教区の教化教育研修会に代表者の櫻井がそれぞれ講師として招かれ、過疎と寺院、少子高齢化時代における寺院の社会的役割にかかる事例紹介や検討会を行った。本研究では、寺院の社会的機能を項目ごとに調べ上げるだけではなく、檀徒・信徒(門徒)のメンバーシップと行事参加(信仰の深まり)が、寺檀関係や門徒同士の同朋意識を強化するだけではなく、地域社会への参加、他者への信頼、社会倫理の獲得に結びついていくというソーシャル・キャピタル論の抽象的な命題を観察可能な行為・イベントから分析するものである。本年度の研究では、1ソーシャル・キャピタルと地域寺院との関係を理論的に考察することと、2過疎地域の寺院調査を実施することを柱とした。研究代表者の櫻井義秀は、2012年には浄土真宗本願寺派の福井教区の寺院(福井県福井市,鯖江市,越前町等)と真宗大谷派高山教区(岐阜県高山市荘川町,大野郡白川村等)の寺院を調査した。分担者の大谷栄一は浄土宗の総合研究所での機関調査を主に行った。川又俊則は真宗高田派の宗務所調査と、津市郊外の過疎地域の寺院調査を実施した。猪瀬優理は、広島県三次市において浄土真宗本願寺派の研究所と共同で調査を行い、また、櫻井と合同で福井県の調査にも参加した。これらの調査研究の成果は、12月22日京都市の京都キャンパスプラザにて共同研究会を行い、有益な情報交換を行うことができた。また、共同通信の西出勇志氏にも出席してもらい、ジャーナリズムからのコメントと、取材している住職の寺院経営塾についての報告も受けることができた。今後は、日蓮宗他他教団の過疎対策をも教団付設研究所の資料等を参照しながら検討し、教団間の比較研究をも行う予定である。平成26年度の研究成果としては、過疎地域/人口減少地域における寺院活動の調査報告を重ねたことであり、研究代表者・分担者の研究内容は次の通りである。櫻井義秀(代表者)は、8月に秋田県藤里町社会福祉協議会、梅林寺・月宗寺、高齢者サロン「よってたもれ」、地域住民の自宅でそれぞれ聞き取を行い、同町の寺院活動と地域福祉の関連を考察して、各処で研究成果の報告を行った。川又俊則(分担者)は、三重県内の真宗高田派寺院28ヵ寺(および曹洞宗・高野山真言宗他)を調査。住職や檀家総代インタビュー、行事参加など行った。主に近郊・過疎の寺院の現況と歴史、地域における寺院の存在意義、講組織による複数寺院の檀家たちの活動実態を調べた。また、三重県の浄土真宗高田派における七里講を通して複数寺院が連携する事例の分析を行った。

大谷榮一(分担者)は、11月に滋賀県甲賀郡信楽町の浄土宗寺院・来迎寺で開催された浄土宗滋賀教区青年会主催の「別時念仏会並びに檀信徒青年層教化事業」に出席し、参与観察を行い、平成27年3月には浄土宗滋賀教区所属寺院470ヶ寺に「地域社会における浄土宗寺院の社会的役割に関するアンケート調査」を実施した。猪瀬優理(分担研究者)は、7月都市部寺院の調査を兵庫県神戸市で実施、阪神大震災後の復興の状況についても調査した。10月末に広島県三次市を訪問し、地域における福祉・医療活動を含めた活動について住職、坊守、女性門徒等に話を聞いた。2月には滋賀県米原市の寺院の副住職に話を聞いたほか、あそかビハーラ病院を訪問、3月には福井県福井市の寺院の活動を見学した。宗教社会学寺院調査は継続的に進められているが、2013年度は研究代表者の櫻井が8月中盤から2014年3月まで香港中文大学に出張していたので、分担研究者が主な調査活動を実施することになり、分担研究者の諸般の事情もあって共同の研究会を持つことが難しかった。研究成果の社会的発信としては、浄土宗や日蓮宗の教化教育の研修会に分担研究者の大谷と代表者の櫻井がそれぞれ講師として招かれ、過疎と寺院、少子高齢化時代における寺院の社会的役割にかかる事例紹介や検討会を行った。学術的成果公表としては、分担研究者の川又が「過疎地域における宗教ネットワークと老年期宗教指導者に関する宗教社会学的研究」(川又の科学研究費補助金研究報告書、代表者も分担執筆している)をまとめた他、宗教とソーシャル・キャピタル論にかかる研究報告はなしたものの、寺院関連での報告は少なかった。本年度、研究代表者の櫻井は,大阪大学大学院准教授の稲場圭信との責任編集で叢書『宗教とソーシャル・キャピタル』全4巻(明石書店,20122013年)を企画した。このなかで,宗教制度と組織が生み出すコミュニティや互助協働への志向性を検討してみたが,多くの論考は地域の宗教施設や宗教者の地道な取り組みを調査したものである。研究者の論考のみならず,地域福祉や医療現場,NGO/NPOやボランティア活動の実践を行っている方にもコラムやインタビューという形で現状と課題について語ってもらっている。現代日本の宗教団体や宗教文化がどのようにソーシャル・キャピタルの構築や活性化と関わっているのかが論じられている。また、櫻井は上記叢書の第二巻『地域社会をつくる宗教』において第4章「過疎と寺院」を担当することができ、また、関連する業績として、「限界寺院からソーシャル・キャピタルの寺院へ」『社会と調査』10:97ー101、「論説人口減少社会における心のあり方と宗教の役割」『宗務時報』115:1ー18をまとめることができ、本研究課題を社会学者、宗教研究者と宗教実務家に示すことができた。上記の諸論考では、時代の価値観が定まらない現代において,宗教にはどのような役割が期待されるのかを考察した。この問題を考える思考の補助線として,過疎化によって地域社会の存続が危ぶまれている地域において,寺院仏教がどのような活動を地域社会で維持し,将来を展望しているのかを論じてきた。地域社会に寄り添うという寺院のあり方は消極的に見えるかもしれないが,地域福祉という観点から一つの可能なあり方と言えるのではないか。その論点を宗教が形成するソーシャル・キャピタルという議論に展開し,現代宗教の可能性として地域社会に信頼,互恵的社会関係を取り戻すネットワーク作りという新たな課題を提示しえたものと考えている。
超音波キャビテーションによる物理化学的作用を利用した洗浄法の検討

38 kHzおよび130 kHzの市販超音波洗浄機を用いて,水溶液中でポリエチレンテレフタレートフィルムおよびポリエステル布の超音波洗浄を行なった.モデル汚れとしてカーボンブラックとオレイン酸を用いた.その結果,同じ超音波出力の場合,38kHzの方が高い洗浄率が得られた.また,0.6μmより小さいカーボンブラック粒子は,130 kHzの方が洗浄率は大きかった.布洗浄では,NaOHおよびSDSの添加効果が認められた.38kHzの試作超音波洗浄機を用いて照射方向および布の洗浄ムラについて調べた.その結果,洗浄槽底面から照射した場合に洗浄率はやや高く,洗浄ムラは洗浄率と関係があることがわかった.昨年度に試作した超音波洗浄試験機の性能特性を知るため,底面または側面から超音波を照射して液温上昇を調べた.その結果,いずれの方向とも電力量40Wを越えると温度上昇が認められ,同電力量では温度上昇はほぼ等しく,側面照射と底面照射とも超音波強度がほぼ同じであることが示唆された.また,ルミノール法により視覚的に超音波場を調べたところ,側面照射の方が底面照射よりもやや明るく,全体が発光し,キャビテーション現象が広範囲で起っていることが認められた.PETフィルムにモデル汚れ(カーボンブラック(CB),オレイン酸(OA))を付着させ,試作超音波洗浄機を用いてNaCl水溶液,NaOH水溶液,SDS水溶液中で洗浄実験を行った.PETフィルムは,超音波による音響流(直進流)で動かないように金属枠にはめて固定した.超音波は,底面(50 W)のみ,側面(50 W)のみ,底面(25 W)と側面(25 W)から同時に照射した.その結果,超音波の照射方向の違いにより洗浄率に大きな差は認められなかったが,底面(50 W)のみから超音波照射した場合洗浄率がやや高く,両面から同時照射した場合洗浄率が低く,超音波の干渉が洗浄性に影響していることが認められた.また,OAではSDSの添加効果が認められた.次に,モデル汚れを付着させた人工汚染布(CB,OA,JIS湿式人工汚染布)を洗浄したところ,いずれもSDSの添加効果が認められ,OAで顕著だった.洗浄率が6075%の洗浄率のOA洗浄布の洗浄ムラを調べるため,洗浄布の画像解析を行った.その結果,照射方向の違いにより洗浄ムラに大きな差は認められなかった.すなわち,洗浄ムラを少なくするためには,洗浄率を上げることが必要であることが示唆された.初年度は,38kHzおよび130kHzの周波数変調式汎用超音波洗浄機を用いて,NaCl水溶液,NaOH水溶液,SDS水溶液の液中で人工汚染布(カーボンブラック(CB),オレイン酸(OA))の超音波洗浄を行った.その結果,130kHz機では,いずれの汚れとも洗浄率が非常に低く,38kHz機は低出力で高い洗浄率が得られた.したがって,布洗浄には低周波数域の38kHzの方が適していることがわかった.次に,超音波を底面,側面から照射できる実験式超音波洗浄器を連携研究者(本多電子株式会社:佐藤正典)と共同設計し,作製した(本田電子株式会社).計画段階では,38kHzと130kHzの2種類の振動子を取り付ける予定であったが,先の実験結果から底面,側面とも周波数を38kHzとした.超音波音圧計を用いて音圧を計測し,出力を変えて人工汚染布の洗浄実験を行って操作性を調べたところ,正常に作動していることが確認された.標準となる洗浄条件(出力,洗浄時間,洗浄位置など)を設定し,NaCl水溶液,NaOH水溶液,SDS水溶液の液中で人工汚染布(CB,OA,JIS湿式汚染布)の超音波洗浄を行った.洗浄率は表面反射率法,洗浄ムラは画像解析法で行った.その結果,SDS水溶液中では洗浄効果があったが,NaCl水溶液,NaOH水溶液中ではいずれの汚れとも洗浄率が低かった.SDS水溶液中で超音波の照射方向を変えて洗浄実験を行ったところ,側面より底面から超音波照射した方が,いずれの汚れとも洗浄率がやや高く,底面と側面から同時照射した場合,CBでは高い洗浄率が得られ,OAでは洗浄ムラがより低減することがわかった.超音波洗浄では,振動子を入れる洗浄槽の材質が洗浄性に影響を及ぼすことが指摘されている.そこで,高い洗浄性が期待できる硬質素材であるステンレスで洗浄槽を作製し,各種洗浄液中で洗浄性に及ぼす周波数および超音波の照射条件の影響,洗浄ムラについて調べた.洗浄基質には,PETフィルムおよびポリエステル布を,汚れのモデルにはカーボンブラック(CB),および着色オレイン酸(OA)を使用した.その結果,フィルムからのCBの洗浄率は,38 kHz, 130kHzともに短時間で見かけの洗浄平衡に達し,38 kHzの方が小さい電力量で高い洗浄率が得られた.また,CBの二次粒子の粒径が0.6μmより小さい粒子では130 kHzの方が,0.6μmより大きい粒子では38 kHzの方が洗浄率は大きく,小さい粒子が付着している系の洗浄には130 kHzのほうが有利である可能性が示された.また,フィルムおよび布からの洗浄性は,いずれも38 kHzの方が汚れ除去に有効であること,フィルムに較べて布からの汚れ除去が困難であること,洗浄液へのアルカリや界面活性剤の添加が洗浄性を向上させることがわかった.ただし,フィルムからのCB洗浄にSDSの添加効果が認められず,布では認められる理由については明らかにはできなかった.

また,洗浄ムラは,130kHzの方がやや小さいことがわかった.38kHz超音波洗浄機および回転ドラム型洗浄試験機Wascatorを用いて布の洗浄実験を行った.その結果,超音波洗浄では洗浄率は同程度であるが機械力は小さく,布の損傷が軽減できる可能性が示唆された.家庭用電気洗濯機(たて型,ドラム型)を用いて湿式人工汚染布の洗浄実験を行った.洗浄前に1分間超音波照射した場合と洗浄液に浸漬した場合では,洗濯機により洗浄率に差は認められなかった.環境負荷の少ない洗浄法が求められている社会的背景のなか,布などの軟質物質を超音波洗浄するための最適洗浄法を明らかにすることを目的とした.実験では,周波数38kHzおよび130kHzの市販超音波洗浄機および照射方向可変型の試作超音波洗浄機を用い,超音波キャビテーションによる物理的および化学的作用と洗浄性との関係を解析した.最終年度は,試作超音波洗浄機を用いて,照射方向と人工汚染布の洗浄性について追加実験を行なった.基布にはポリエステル布,汚れのモデルにはカーボンブラック(CB),および着色オレイン酸(OA)を使用した.その結果,いずれの汚れとも底面から布面に対して垂直方向に超音波を照射した場合に最も洗浄率が高く,フィルム基質での洗浄結果と同傾向となった.側面から超音波を照射した場合,照射面の向かい側の洗浄槽壁面からの反射波の影響などが考えられる.また,2方向照射の場合は,伝搬方向の異なる超音波が干渉する.本研究では,ルミノール法により側面から照射した場合に最も超音波場が増大して,超音波化学反応が促進されていることを明らかにしている.以上の結果から,超音波化学反応は,布洗浄には有効に働かない可能性が示唆された.先行研究では,超音波の周波数の組み合わせや重ね合わせ位置,超音波出力のバランスなどの要因が超音波化学反応に複雑に影響することも指摘されている.したがって,2方向照射により洗浄効果を得るためにはさらに詳細な実験が必要であることがわかった.また,画像解析ソフトを用いた洗浄ムラ解析法を構築し,照射方向と洗浄ムラについて調べた.超音波場の増大により洗浄ムラが解消されると仮定したが,効果はえられなかった.研究成果は,国際学会および国内学会で発表し,学術雑誌に投稿した.また,一般消費者に向けての実験参加型の講演を行なった.38 kHzおよび130 kHzの市販超音波洗浄機を用いて,水溶液中でポリエチレンテレフタレートフィルムおよびポリエステル布の超音波洗浄を行なった.モデル汚れとしてカーボンブラックとオレイン酸を用いた.その結果,同じ超音波出力の場合,38kHzの方が高い洗浄率が得られた.また,0.6μmより小さいカーボンブラック粒子は,130 kHzの方が洗浄率は大きかった.布洗浄では,NaOHおよびSDSの添加効果が認められた.38kHzの試作超音波洗浄機を用いて照射方向および布の洗浄ムラについて調べた.その結果,洗浄槽底面から照射した場合に洗浄率はやや高く,洗浄ムラは洗浄率と関係があることがわかった.超音波と攪拌の機械力を用いた洗浄実験が遅れている。
車いすパラリンピック選手における神経可塑性修飾

パラリンピックアスリートは身体のいずれかに障害を持ちながらも日々ハードトレーニングを行うことで、運動に関連する脳領域が可塑的に再編されることが明らかとなってきた。本研究では特に体幹の制御が重要な車いす競技選手に焦点をあて、競技特性に関連した中枢神経の可塑的変化とそれを効果的に導く神経修飾法の効果に迫ることを企図するものである。具体的には、1)パラリンピック車いす競技選手の脳における可塑的再編成を調べ、これを導く計算モデルを構築すること、2)脳に対する神経修飾法として経頭蓋直流電気刺激、末梢神経刺激としての機能的電気刺激、それぞれの急性的影響を脳神経画像および電気生理学的に明らかにすること、を目的とする。本研究の成果は、車いす使用を余儀なくされている脊髄損傷者や下肢の障害を有する人々の日常生活動作の改善、ひいては生活の質の改善に寄与することが期待される。本研究の結果次の成果が得られた。1当初脊髄損傷パワーリフターを対象として脳の再編を調べたところ、運動野上肢領域の機能マップに健常者と異なるパターン、すなわち前腕や手指の支配領域に比べて上腕領域が大きいパターンを観察した。その過程で、グリッピングの力保持課題においてパワーリフター力の安定性が極めて高いことを発見した。一般の脊髄損傷者に対象を広げてこの能力を調べたところ、完全損傷者において健常者や他の障害による車いす使用者に比べて、この能力が有意に優れることを明らかにした。2下腿筋の機能的電気刺激が下肢筋全体に対し脊髄反射を抑制する急性の効果があることを明らかにした。3外傷性脳損傷による高次脳機能障がい者を対象として、手指の巧緻性向上を目指し、機能的電気刺激と手指の巧緻性トレーニングを実施したところ、巧緻性の改善とともに脳の活性化領域の増大が起こることを明らかにした。研究計画の一部変更はあったが、当初は予期しなかった研究成果が派生的研究から得られるとともに、関連した基礎実験結果においてまとまった結果が得られ、その成果を国際誌数編にまとめることができたため。今後の研究方策として、脊髄損傷者の脳再編に関する研究をさらに進める。現在のところ上肢機能マップにパワーリフターにおいて特異的パターンを見出しているが、これを一般の脊髄損傷者にまで対象を広げて調べる。さらに上記した成果に関連する研究として、一定の力保持課題遂行中の脳の活動領域を調べる。それによって、脊髄損傷による代償性脳活動と競技トレーニングによる可塑的変化がどのように関連するのかを明らかにする。
抗体産生細胞ホーミング機序の解明と臨床応用への試み

抗体産生細胞である形質細胞には長期寿命型と短期寿命型の2種類存在する。ところがこれらの役割の違いや局在、表面マーカーの違いなどにおいて、多くのことが不明のままである。そこで、これら2つのサブセットの違いを明確にし、さらに2次リンパ器官から骨髄へのホーミングメカニズムの制御機構の解明を目指すことを本研究の目的とする。申請者らは、短期寿命型形質細胞が、CXCR4hi+S1P1lo+であり、長期寿命型形質細胞がCXCR41o+S1P1hi+であること、さらに形質細胞が2次リンパ器官から血中にegressする際に、sphingosine-1-phosphateとその受容体の一つであるS1P1が関与していることを明らかにした。B細胞の後期分化を調節する転写因子の一つであるBlimp-1は抗体産生細胞に特異的に発現することが知られている。Blimp-1 GFPknockinマウスに免疫を行い免疫後の脾臓、血液、骨髄中のGFP陽性サブセットを調べると、脾臓にGFPint+とhigh+の2サブセットあるが、血中にはGFPint+のみ存在し、骨髄中では、GFPhigh+のみ存在していた。この所見に一致し、脾臓中の形質細胞はS1Pに対してGFPint+の形質細胞のみがS1Pへの化学遊走能を有しており、S1P1mRNAの発現もBlimplGFPint+に強く発現していた。また、ハプテン反復塗布により誘導するアトピー性皮膚炎モデルを行うと、皮膚や所属リンパ節にIgE産生形質細胞が認められた。以上より、形質細胞のホーミングや寿命の決定においてS1P-S1P1シグナルが重要であり、このシグナルを調節することが、今後アトピー性皮膚炎をはじめとするアレルギー疾患や自己免疫疾患における治療へ発展する可能性を呈した。ところがこれらの役割の違いや局在,表面マーカーの違いなどにおいて,多くのことが不明のママである。そこで,これら2つのサブセットの違いを明確にし,さらに2次リンパ器官から骨髄へのホーミングメカニズムの制御機構の解明を目指すことを本研究の目的とする。我々は,短期寿命型形質細胞が,cxcR4hi+s1Pllo+であり,長期寿命型形質細胞がcxcR41o+SIPlhi+であること,さらに形質細胞が2次リンパ器官から血中にegressする際に,sphingosine-1-phosphateとその受容体の一つであるS1P1が関与していることを明らかにした。S1P-S1P1シグナルを阻害するFTY720を投与すると,NP-BSAで免疫を行っても形質細胞が骨髄や血中で検出されなかった。さらに,S1P1欠損マウスの胎仔マウス由来のfetal liver chimeraマウスでは,NP-BSAで腹腔内に免疫しても,形質細胞が脾臓に認められるのみで,血中や骨髄には検出されなかった。さらに,形質細胞はS1Pへの化学遊走を認め,この遊走能はFTY720による前処置により消失した。以上より,形質細胞のホーミングや寿命の決定においてS1P-S1P1シグナルが重要であり,このシグナルを調節することが,今後自己免疫疾患における治療へ発展する可能性を期待させる。