hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生きた動物個体内の特定の細胞でのみ機能を発揮する新規機能性生物発光プローブの開発

昨年度までに、生体内における光機能性分子の励起エネルギー源としての生物発光の利用可能性を確立することに成功していたが、本年は、生体内イベントを可視化する手段としての生物発光イメージングの有用性の拡張を試みた。生物発光を用いたイメージング技術は、生体内においてバックグラウンドとなる物質が殆ど存在しないことから、高感度なシグナル検出を可能とする技術として注目を集めている。中でも、特定の生理活性分子と出会った時のみ発光がONになる生物発光プローブを用いたイメージング手法は、特定の生理活性分子の存在を、in vivoで高感度に可視化可能とする優れた手法である。しかしながら、従来の生物発光プローブが検出できるのは、発光性の基質であるD-luciferinやaminoluciferinをuncageする反応を引き起こすことができるpeptidase活性などに限られるという問題があっため、私はこの解決を試みた。私は蛍光プローブの設計原理として汎用される、電子移動による励起発光中間体のquenching(蛍光分子においてはPeTと呼ばれる)が、その励起過程が異なるのみで生物発光基質でも起き得るのではないかという従来の報告を確実なものとし、この現象(BioLeTと命名)を用いて、生物発光のプロセスにおける励起状態からの発光量子収率を生体分子の有無と同期して精密にコントロールできることを示し、既存のプローブ設計法では開発が困難であった一酸化窒素(NO)検出生物発光プローブを初めて開発することに成功した。本成果は、PeTを蛍光制御原理として開発されてきた蛍光プローブと同様のデザインで、様々な生物発光プローブを開発可能であることを示す画期的成果である。またさらに、目的分子との反応前後で、BioLeTと同時に基質の細胞膜透過性をも制御することで、生物発光プローブのターゲットの検出感度を大幅に向上させることができることも見出し、生きたラット内の好中球から発生するhighly reactive oxygen species (hROS)を、開腹、剃毛することなく超高感度に検出可能な生物発光プローブを開発することにも成功した。本結果は、生物発光プローブの新しいデザイン法を提供するのみならず、in vivoにおけるhROSの役割をさらに解明する上で実用的な研究ツールを提供するものである。本年度は、励起状態における電子移動と、基質の細胞膜透過性制御という、全く新しい生物発光制御原理に基づく生物発光プローブを複数開発することに成功した。本結果は、生物発光イメージングの可能性を大きく拡張するものであり、画期的成果であるといえる。採用2年目までに達成した、光機能性分子の励起エネルギー減としての生物発光の利用可能性の確立と合わせて、当初の計画以上に研究が進展したと考えている。本年度が、課題最終年度であるが、今後は、本研究で確立された発光制御法を元に、様々な生物発光プローブが開発されることが期待される。また、採用2年目までに確立した、生物発光を光機能性分子の励起エネルギー源として使用する手法を用いることで、今後生体内イベントをコントロールする手法としても生物発光を利用可能になることが期待される。生物発光は、分析法における検出原理として広く用いられているが、その基質の改変は、基質の発光特性の喪失しやすさ故に殆ど行われて来なかった。そこでまずは、どのような形であれば、基質の発光特性を維持したまま、発光基質に機能性分子を結合できるか検討を行った。報告されているfirefly luciferaseの結晶構造を元にドッキングシミュレーションを行うと、発光部位であるaminoluciferin(AL)と機能性分子の間のリンカーの構造が特に重要になることが予想されたため、様々なAL誘導体を開発してその構造と発光量の相関を取ることで、論理的な基質設計が可能になるかを検討した。結果、ドッキングシミュレーションの結果を矛盾なく説明できる実験結果が得られ、リンカーの構造を最適化することで、様々な機能性分子を生物発光基質に結合可能であることが示された。続いて、上記の設計法に関する知見を元に、in vivoでの近赤外生物発光イメージングを可能とする新規近赤外生物発光基質を開発した。種々の近赤外蛍光団を機能性分子として導入し、その発光特性を精査すると、確立した設計法から予想されたように、すべての基質が近赤外発光を示し、その発光波長を自由にチューニングすることができた。特に、最も発光波長が長いもので、最大発光波長がおよそ800nmに達した。これはこれまでに報告されている発光基質に比べて、100nm以上長波長化しており、特筆すべき結果となった。しかしながら、これらの近赤外発光基質をluciferaseを発現した生細胞内に導入すると、その細胞膜透過性の低さから、近赤外発光は観測できなかった。そこで、蛍光団に修飾を施し、基質に細胞膜透過性を付与し、さらに発光基質の細胞内局在と、luciferaseの細胞内局在を一致させることを試みた。結果、生細胞内からも近赤外生物発光を観測することに成功した。生物発光は分析法における検出原理として広く用いられているが、見方を変えれば生体深部でも利用可能な光機能性分子の励起エネルギー源として使用できる可能性がある。私は昨年度までにAmino luciferinを基盤分子として用いて、この発光特性を維持したまま光機能性分子を結合する分子設計法を確立し、モデル分子として近赤外生物発光基質を世界で始めて開発することに成功し、またこの基質を生細胞や生きた動物個体内でも使用可能であることも示していた。本年度、それぞれの基質に関する更なる分光学的性質、luciferase

基質としての精査を行った後に、これらの結果をまとめて論文を投稿した結果、化学のトップジャーナルであるAngew. Chem. Int. Ed.に受理され、またEditorらよって"HotPaper"に選出されるなど高い評価を得た。また、本年度は、光機能性分子の励起光源としての可能性をさらに広げるため、新しいluciferaseを用いて、発光によって生じたエネルギーをより短波長の領域に吸収をもつ光機能性分子にも転送可能なシステムの開発を行った。これまで用いていたfireflyの生物発光のシステムにおける基質からの発光波長はおよそ550nmであったが、この領域に吸収波長を持つ光機能性分子はそれほど多くなく、その光機能性分子の励起エネルギー源としての利用可能性は限定されていた。そこで私はfirefly luciferaseに比べて100倍以上の発光量を示し、450nm程度の短波長発光を示すNanoluc(ACS Chem. Biol., 2012, 7, 1848-57)を利用し、ベンジルグアニン誘導体によって効率的にラベル化されるSNAP-tagと組み合わせることで、生細胞内で、比較的短波長(500nm)に吸収を持つ光機能性分子へもエネルギーを転送することが可能なシステムの構築を試み、これに成功した。この結果により、これまでに報告されている様々な光機能性分子や、チャネルロドプシンなどの光機能性タンパク質にも、エネルギーを転送することが可能になると考えられる。昨年度までに、生体内における光機能性分子の励起エネルギー源としての生物発光の利用可能性を確立することに成功していたが、本年は、生体内イベントを可視化する手段としての生物発光イメージングの有用性の拡張を試みた。生物発光を用いたイメージング技術は、生体内においてバックグラウンドとなる物質が殆ど存在しないことから、高感度なシグナル検出を可能とする技術として注目を集めている。中でも、特定の生理活性分子と出会った時のみ発光がONになる生物発光プローブを用いたイメージング手法は、特定の生理活性分子の存在を、in vivoで高感度に可視化可能とする優れた手法である。しかしながら、従来の生物発光プローブが検出できるのは、発光性の基質であるD-luciferinやaminoluciferinをuncageする反応を引き起こすことができるpeptidase活性などに限られるという問題があっため、私はこの解決を試みた。私は蛍光プローブの設計原理として汎用される、電子移動による励起発光中間体のquenching(蛍光分子においてはPeTと呼ばれる)が、その励起過程が異なるのみで生物発光基質でも起き得るのではないかという従来の報告を確実なものとし、この現象(BioLeTと命名)を用いて、生物発光のプロセスにおける励起状態からの発光量子収率を生体分子の有無と同期して精密にコントロールできることを示し、既存のプローブ設計法では開発が困難であった一酸化窒素(NO)検出生物発光プローブを初めて開発することに成功した。本成果は、PeTを蛍光制御原理として開発されてきた蛍光プローブと同様のデザインで、様々な生物発光プローブを開発可能であることを示す画期的成果である。
液胞ATPaseの活性調節と液胞機能のダイナミックス

研究代表者らは,酵母の液胞に新しいタイプのプロトン輸送性ATPase(V-ATPase)が存在することを発見した(1980年).これは酵母液胞膜上の主要なH^+ポンプである.本酵素は少なくとも13個のサブユニットから構成されている超巨大分子である.さらに,その細胞生理機能に関する研究から,V-ATPaseが液胞機能のダイナミックス、とくに,細胞内遊離カルシュウム濃度およびpH調節に不可欠の役割を果たしていることを見いだした(1981-1996年).本研究では、1)V-ATPaseのプロトンポンプとしての機能特性を新たに開発したwhole patch clamp法により詳細に解明した.ATP依存性の液胞内腔への電流を測定し,生理的条件下に100pAの内向き電流の発生が観測され,そのときのH^+/ATP比は3.5はあった.この結果は,液胞V-ATPaseが生理的にプロトンポンプとして働いていることを直接証明することとなった.2)V-ATPaseの構成成分とはならず分子集合と活性調節に関与している新規遺伝子(VMA14,VMA15など)の構造と遺伝子産物の生理機能を解明し,V-ATPaseの超分子集合体形成の制御機構に新たな知見を加えた.3)VMA遺伝子群およびそれらと機能的に関連する新規遺伝子群(STT3,VIS1など)の変異によって生ずる細胞内遊離カルシュウム濃度の調節異常および増殖制御の不調にかかわる分子生理学・遺伝学的研究を行った.Vis1pは214アミノ酸残基からなる新しい膜蛋白質であり,N-末端領域に膜貫通ドメインを持ち,C-末端領域にmyristylation siteを含むことが判明した.興味深いことに,vma3 ubp3二重変異株はvma3 vis1二重変異株と同様にFK506に対して超感受性の表現型を示した.この所見と従来の実験成績,および文献情報を総合して,Vis1pはUbp3pがかかわる細胞質因子によって制御される新規蛋白質か,その因子と協調し液胞膜上で細胞増殖の制御にかかわる新規機能を発現していると結論した.研究代表者らは,酵母の液胞に新しいタイプのプロトン輸送性ATPase(V-ATPase)が存在することを発見した(1980年).これは酵母液胞膜上の主要なH^+ポンプである.本酵素は少なくとも13個のサブユニットから構成されている超巨大分子である.さらに,その細胞生理機能に関する研究から,V-ATPaseが液胞機能のダイナミックス、とくに,細胞内遊離カルシュウム濃度およびpH調節に不可欠の役割を果たしていることを見いだした(1981-1996年).本研究では、1)V-ATPaseのプロトンポンプとしての機能特性を新たに開発したwhole patch clamp法により詳細に解明した.ATP依存性の液胞内腔への電流を測定し,生理的条件下に100pAの内向き電流の発生が観測され,そのときのH^+/ATP比は3.5はあった.この結果は,液胞V-ATPaseが生理的にプロトンポンプとして働いていることを直接証明することとなった.2)V-ATPaseの構成成分とはならず分子集合と活性調節に関与している新規遺伝子(VMA14,VMA15など)の構造と遺伝子産物の生理機能を解明し,V-ATPaseの超分子集合体形成の制御機構に新たな知見を加えた.3)VMA遺伝子群およびそれらと機能的に関連する新規遺伝子群(STT3,VIS1など)の変異によって生ずる細胞内遊離カルシュウム濃度の調節異常および増殖制御の不調にかかわる分子生理学・遺伝学的研究を行った.Vis1pは214アミノ酸残基からなる新しい膜蛋白質であり,N-末端領域に膜貫通ドメインを持ち,C-末端領域にmyristylation siteを含むことが判明した.興味深いことに,vma3 ubp3二重変異株はvma3 vis1二重変異株と同様にFK506に対して超感受性の表現型を示した.この所見と従来の実験成績,および文献情報を総合して,Vis1pはUbp3pがかかわる細胞質因子によって制御される新規蛋白質か,その因子と協調し液胞膜上で細胞増殖の制御にかかわる新規機能を発現していると結論した.研究代表者は、酵母液胞膜V-ATPaseの生合成と活性調節に必須な遺伝子を系統的に分離し、各サブユニットをコードする遺伝子を明らかにしてきた。その中に最終的にV-ATPaseの構成要素とならず、生合成過程における分子集合、活性発現に必須な遺伝子としてVNA14,VMA15遺伝子を発見した。本年度はこれら2種の遺伝子の構造と遺伝子産物の機能を,以下のとおり,明らかにした.1) VMA14遺伝子の全塩基配列を決定し,蛋白質データバンクの検索結果から,その産物(Vma14p)が新規蛋白質(分子量,146kDa)であることを示した.Vma14pは細胞質に存在する親水性蛋白質であることが判った.vma14欠失変異株において,V-ATPaseの活性は親株の25%程度であり,液胞の酸性化は認められなかった.さらに,この欠失株では,V-ATPaseの表在性サブユニットの液胞膜上への分子集合が不安定であることが示された.この所見は,Vma14pがV-ATPaseホロ酵素の分子集合と安定化に関与していることを示唆している.

2) VMA15の全塩基配列を決定し,本遺伝子が酵母CDC55遺伝子(その機能は生化学的に特定されていなかった)と同一であることを明らかにした.また,そのアミノ酸配列の解析から,VMA15/CDC55遺伝子産物は,ウサギ骨格筋由来の蛋白質脱リン酸化酵素2Aの調節サブユニットBと53%の同一性を持つことが判った.したがって,本遺伝子は,蛋白質の脱リン酸化に関与する調節蛋白質(分子量,60kDa)をコードしていると推定された.vma15欠失株のV-ATPase活性は親株の40%であり,液胞の酸性化も阻害されていた.これらの所見から,Vma15pは新規の調節蛋白質であり,V-ATPaseの分子集合と活性調節に対し,表在性サブユニットのリン酸化ー脱リン酸化が関与していることが強く示唆された(投稿論文執筆中).1)研究代表者らは,現在までに、V-ATPaseを構成する13種のサブユニットの構造遺伝子を明らかにし、それらの遺伝子のいずれか1つが欠損しても、酵素活性が失われ,変異株はCa^<2+>感受性の表現型を示すことを見いだしてきた。本年度の研究では,昨年度までに分離取得したvma3変異株のCa^<2+>感受性を抑圧する劣性抑圧suv変異株の相補性テストを行うかたわら,免疫抑制剤FK506の添加によるCa^<2+>感受性の増強機構を明らかにする実験を開始し、以下の成果を修めた.2)かねてより研究を重ねていた,V-ATPaseのin situプロトンポンプ活性を測定するための新しい電気生理学的システムを完成させ,酵素の特性を記述することができた.この方法は,特殊な培養法により,巨大な液胞(直径20μm)をつくり,インタクト液胞を単離後,patch clamp法により,ATP依存性の液胞内腔への電流を測定するシステムである.生理的条件下に100pAの内向き電流の発生が観測され、そのときのH^+/ATP比が3.5+0.3であることを示した.この結果から,V-ATPaseが生理的に働くプロトンポンプであることが証明された(J.Biol.Chem.,1999年12月号).平成12年度は免疫抑制剤FK506の添加によるCa^<2+>感受性の増強機構を解明するための実験を開始し,以下の成果を修めた.vma3変異株を親株として,FK506超感受性変異株の分離を試み,vis1変異株(vma3-dependent,immunosuppressant-sensitivemutant)を同定した.このvma3依存性vis1変異株は0.1μg/ml FK506の添加により増殖を停止した.多コピー型genomic DNA libraryを用いて,VIS1遺伝子本体および多コピー抑圧遺伝子としてUBA1遺伝子(ユビキチン活性化酵素),UBP3遺伝子(脱ユビキチン化酵素)を同定した.Vis1pは214アミノ酸残基からなる新しい膜タンパク質であり,N-末端領域に膜貫通ドメインを持ち,C-末端領域にmyristylation siteを含むことが判明した.興味深いことに,vma3ubp3二重変異株はvma3vis1二重変異株と同様にFK506に対して超感受性の表現型を示した.現在,Vis1Pの細胞内分布を決定するために必要な抗体の作成を急いでおり,Vis1pに依存する新規の細胞機構に関する生化学的研究を続行している(2001年1月8日,合同班会議(坂出市)発表).本研究代表者は,酵母のstaurosporine感受性変異(stt)の分子生物学的研究を展開していた時期があった.
シダ植物の無配生殖（無性生殖）を引き起こす遺伝領域の特定

無配生殖(無性生殖の一型)を行うシダ植物の種は近縁な有性生殖種と容易に交雑すること、それらの間の雑種個体からは高頻度で減数した子孫が生じることを我々は明らかにしていた。そこで本研究では、3倍体無配生殖種のオニヤブソテツ(オシダ科)と、それに非常に近縁な2倍体有性生殖型のヒメオニヤブソテツあるいはムニンオニヤブソテツの間に生じた4倍体雑種個体に生じた胞子を寒天培地上で培養し、F2世代の子孫における無配生殖型と有性生殖型の分離比を調べた。その結果、両生殖型がほぼ1:1で生じ、無配生殖型がただ一つの遺伝的領域(無配生殖遺伝子)によって支配されていることが強く示唆された。申請者らのこれまでの研究によって、シダ植物の無配生殖種は近縁な有性生殖種と容易に交雑すること、ならびに生じた雑種個体では高頻度で減数した子孫が生じ、無配生殖と有性生殖型の分離も起こることが明らかになっていた。そこで本研究では、近縁な2倍体有性生殖種の遺伝マーカーの連鎖地図を基礎とし、無配生殖種ならびに雑種個体における遺伝的分離をゲノムワイドに解析することによって、無配生殖を引き起こすゲノム領域、および無配生殖種における有害遺伝子の含まれる領域が連鎖地図上のどこに存在するかを特定することを目的とする。平成25年度には、実際にヤブソテツ類、ベニシダ類、イタチシダ類に共通して利用可能な核DNAのマーカーを設計することできた。さらに、それと平行して、オニヤブソテツ(3倍体無配生殖型)とヒメオニヤブソテツ(オニヤブソテツの2倍体有性生殖型)の4倍体雑種、ならびにベニシダ(3倍体無配生殖種)とハチジョウベニシダ(2倍体有性生殖種)の間の4倍体雑種について、それぞれの子孫における生殖様式の分離(無配生殖的に胞子体を形成する子孫群と形成しない子孫群)を調べた。オニヤブソテツ類の雑種については、その子孫で無配生殖型と有性生殖型の分離が見られたが、ベニシダ類については、今年度に調べた雑種個体については、無配生殖型の子孫しか検出できなかった。一方、今年度には、イタチシダ類についても新たな2倍体有性生殖種(モトイタチシダ)を屋久島で発見、採集することができた。そこで、イタチシダ類についてもオニヤブソテツ類、ベニシダ類と同様の解析を進めていける。したがって、新たな2倍体有性生殖種の発見は、本研究の今後の発展に繋がるものである。本研究では、シダ植物の近縁な無配生殖種と有性生殖種の交雑に由来する雑種が胞子形成をする際に高頻度で減数し、無配生殖をする子孫と有性生殖をする子孫の両方を生み出す性質を利用して、シダ植物の無配生殖をする性質を支配している遺伝領域を特定することを最終目標にしている。平成26年度は特にオニヤブソテツ類について特に進展が見られたので、これを報告する。3倍体無配生殖型のオニヤブソテツと2倍体有性生殖型のヒメオニヤブソテツの間の推定4倍体雑種(アツバオニヤブソテツと仮称)、ならびに同じく3倍体無配生殖型のオニヤブソテツと2倍体有性生殖型のムニンオニヤブソテツの推定4倍体雑種(ウスバオニヤブソテツと仮称)、各1個体から胞子を採取して、寒天プレート上で発芽させた。そして、生じた配偶体を1個体ずつ単離して、受精せずに胞子体を形成する配偶体(すなわち、無配生殖能をもつ)と形成できない(無配生殖能のない、すなわち有性生殖をする)配偶体に分けた。その結果、アツバオニヤブソテツでは、無配生殖能をもつ子孫:もたない子孫=209:235、ウスバオニヤブソテツでも、無配生殖能をもつ子孫:もたない子孫=105:135で、どちらも1:1から有意にずれていない割合で両生殖型と考えられる子孫が得られた。これらは無配生殖を引き起こす遺伝領域の特定に十分使える材料になるはずである。さらに、オニヤブソテツ用に開発された核DNAマーカーの一つであるG6pdg遺伝子の塩基配列多型が分離するかどうかについても、同じ推定雑種個体の子孫配偶体を用いて調べた。その結果、ウスバオニヤブソテツではPCR増幅させた402bpの塩基配列の148ー149番目の塩基において、RR(RはA+G)だった部分が「AA」になっている子孫配偶体も見いだされた。したがって、核DNAマーカーにおいても、遺伝的分離が起きていることが明らかになった。平成27年度は、オニヤブソテツ類の無配生殖型(オニヤブソテツ)と2倍体有性生殖型(ヒメオニヤブソテツ)の間に生じた雑種個体に形成された減数性の胞子(胞子嚢あたり64の胞子が形成されていたもの)を寒天培地上に蒔いて生じた配偶体のDNA解析を行った。具体的には、一匹ずつ単離した状態で胞子体を形成した配偶体(無配生殖能があると考えられる、すなわち無配生殖型)、並びにその状態では胞子体を形成できなかった配偶体(無配生殖能を持たない、すなわち有性生殖型と考えられる)をそれぞれ41個体ずつ龍谷大学農学部のクロノミクスNGS解析係に委託してRAD-seq解析を行った。その結果、Q30値の高い7Gbpの配列データが得られた。

現在、詳しい解析を続けているところではあるが、有性生殖型と無配生殖型の間に生じたF1雑種に由来する無配生殖型と有性植型の子孫配偶体の間で、きれいに分かれるSNPは、残念ながらまだ見出されていない。その理由としては、無配生殖能がないと判断した配偶体の中に無配生殖能をもつが、生理的・環境的な条件のせいで未だ胞子体が形成されていないものが含まれていることが考えられる。実際に有性生殖型(胞子体が形成されなかった)配偶体の方が無配生殖型の配偶体よりも有意ではないものの、数は多かった。今後、さらに無配生殖型と有性生殖型と考えられる子孫配偶体の数を増やしてRAD-seq解析を行いたいと考えている。オニヤブソテツ類の配偶体からも、この方法で質の良い大量の塩基配列データがに得られることが確かめられたからである。一方、平成27年度にはベニシダ類各種のPCRーSSCP法によるゲノム構成の解析も継続して行い、ベニシダ類の1種であるオオベニシダには、ベニシダ類とは比較的遠縁なミサキカグマのゲノムが含まれていることを明らかにすることができた。無配生殖(無性生殖の一型)を行うシダ植物の種は近縁な有性生殖種と容易に交雑すること、それらの間の雑種個体からは高頻度で減数した子孫が生じることを我々は明らかにしていた。そこで本研究では、3倍体無配生殖種のオニヤブソテツ(オシダ科)と、それに非常に近縁な2倍体有性生殖型のヒメオニヤブソテツあるいはムニンオニヤブソテツの間に生じた4倍体雑種個体に生じた胞子を寒天培地上で培養し、F2世代の子孫における無配生殖型と有性生殖型の分離比を調べた。その結果、両生殖型がほぼ1:1で生じ、無配生殖型がただ一つの遺伝的領域(無配生殖遺伝子)によって支配されていることが強く示唆された。オニヤブソテツ類とベニシダ類について、核DNAマーカーの開発は順調に進んでいる。さらに、オニヤブソテツ類では、無配生殖型と有性生殖型の雑種においても、核DNAマーカーが確かに遺伝的分離を起こすことを示すデータも得られた。また、無配生殖型と有性生殖型の推定雑種個体から採取した胞子より、無配生殖能をもつ子孫配偶体(無配生殖の性質をもつ)と無配生殖能をもたない(有性生殖型と推定される)子孫配偶体を数百個体得ることにも成功している。したがって、研究は順調に進展しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。植物分類学・進化学3倍体無配生殖型と2倍体有性生殖型の間の推定4倍体雑種の子孫において、無配生殖能をもたないと判定された子孫配偶体には、無配生殖能をもつが、まだ胞子体を形成するに至っていない個体が少数ながら含まれている可能性が高い。したがって、胞子体を形成しなかった配偶体については、もう少し培養を続けて無配生殖能がある個体には胞子体を形成させ、そのような子孫個体を少しでも取り除く必要がある。さらに、無配生殖能をもたなかった子孫個体が有性生殖能を確かにもつことを確かめる実験も是非したいと考えている。すなわち、胞子体を形成しなかった配偶体の一部について、2倍体有性生殖型(オニヤブソテツ類の場合は、ヒメオニヤブソテツ、あるいはムニンオニヤブソテツ)の胞子を周りに蒔いて、実際に受精が起こるかどうかを調べる実験も行いたい。このような実験を一方で行いながら、分離する遺伝マーカーと無配生殖能の相関を調べることによって、シダ植物において無配生殖を引き起こす遺伝領域の特定を進めて行く予定である。初年度に最も重要な核DNAマーカーの開発は順調に進んだ。一方、ベニシダ類では3倍体無配生殖種のベニシダと2倍体有性生殖種のハチジョウベニシダの間に生じた4倍体雑種の子孫が期待したように無配生殖型と有性生殖型に分離してくれず、無配生殖型ばかりだったのは残念であった。
エネルギー環境問題の解決を目的としたNAS電池システムの計画運用手法

本研究では、「電圧安定性向上への応用」に関しては、NAS電池を配電系統の電圧安定性を向上するために利用することを考え、NAS電池の最適配置および最適PQ(有効・無効電力)出力比を決定する手法を提案した。従来の研究では、適切な「配置とPQ出力比」ではなく、適切な「配置と容量」を導くものが多く見られるが、コスト面を考慮しなければ容量は大きければ大きいほど良いと考えられてしまう。したがって、容量についての議論を行うよりも、むしろ決められた容量の中で有効電力と無効電力をどのような比で出力すれば効果的か、すなわちPQ出力比についての議論を行うことが重要であり現実的である。「電圧変動抑制への応用」に関しては、系統事故によって生じる電圧変動を抑制するためにNAS電池を利用することを検討し、母線のサンプリング電圧からNAS電池の制御操作量を決定する手法を提案した。一般に、系統事故などによって母線の電圧が大幅に低下すると、その母線に接続されているNAS電池は停止するようになっている。しかし、NAS電池の交直変換装置を有効に用い、NAS電池による適切な運転制御を行えば、系統事故による影響を小さくすることが可能であると考えられる。「線路過負荷解消への応用手法」に関しては、送電線事故によって生じる線路過負荷を解消するためにNAS電池を利用することを考え、そのために必要な設置計画と運転制御を決定する手法について提案した。一般的に、送電線n-1基準の線路過負荷を抑制するためには、送電線を増強したり、発電機有効電力出力を振り替えたりして対処する。しかし立地条件などにより送電線を増強することができない場合や、放射状系統のように発電機有効電力出力振り替えでは対応することが難しい場合も考えられる。このような状況においてNAS電池を利用することが望ましい手法を提案した。本研究では、電力貯蔵装置の1つであるNAS電池に対して、「電力の貯蔵」という役割を果たさせるだけでなく「電力系統の制御」という機能を持たせることを検討し、その応用方法について提案した。現在の電力系統において、SVC(静止型無効電力補償装置)やSTATCOM(自励式無効電力補償装置)といった「無効電力」を高速に制御できる機器は既に導入されているが、「有効電力」と「無効電力」を同時に制御できる機器は今のところ実用化されていない。このような背景のもと、有効電力と無効電力の両方を高速かつ柔軟に取り扱うことができ、定格出力の25倍程度の電力を瞬時に放電することもできるNAS電池の登場により、将来の電力系統において多種多様な系統制御が実現されると予想され、今までの電力系統にはない新たな制御体系が確立されると期待される。特に、本研究では「NAS電池システムと既存VQCシステムの協調制御」および「NAS電池システムによる線路過負荷の解消」について検討し、その解析手法および制御アルゴリズムについて提案した。既存VQCシステムとの協調制御では、2段階から成る最適潮流計算を解くことによりNAS電池とVQC機器の制御パターンを決定し、地域供給系統における母線電圧と電圧安定性の維持を図る手法について提案した。そしてシミュレーションを行った結果、NAS電池の優れた無効電力調整機能により、配電用変電所に設置されるVQC機器の容量の削減が可能となることを確認した。線路過負荷の解消では、送電線事故によって生じる線路過負荷を解消するためにNAS電池を利用することを考え、そのために必要な設置計画と運転制御を決定する手法について提案した。設置計画の段階ではNAS電池の最適配置と最適容量を決定し、運転制御の段階では高出力型NAS電池により過渡状態の系統動揺を抑制しつつ最終的には線路過負荷も解消することができる手法を適用した。

そしてシミュレーションを行い、設置計画段階で決定されたNAS電池システムの最適配置と最適容量により、運転制御段階で線路過負荷現象が効果的に抑制されることを示した。本研究では、電力貯蔵装置の1つであるNAS電池に対して、「電力の貯蔵」という投割を果たさせるだけでなく「電力系統の制御」という機能を持たせることを検討し、その応用方法について検討した。特に、送電線事故によって生じる線路過負荷を解消するためにNAS電池を利用することを考え、そのために必要な設置計画と運転制御を決定する手法について提案を行った。一般的に、送電線n-1基準の線路過負荷を抑制するためには、送電線を増強したり、発電機有効電力出力を振り替えたりして対処する。しかし、立地条件などにより送電線を増強することができない場合や、放射状系統のように発電機有効電力出力振り替えでは対応することが難しい場合も考えられる。本研究では、このような状況においてNAS電池を利用することが望ましい手法を提案した。まず、設置計画の段階では、線路過負荷抑制の対象となる想定事故を特定し、その事故に対するNAS電池の最適配置と最適容量、および、発電機有効電力出力の減少量を最適潮流計算により決定する。最も厳しい線路過負荷が生じると考えられる時季・時間を考慮すればよいと考えられるため、夏季・昼間の需要ピーク時間断面を想定した計画を行うことにする。次に、運転制御の段階では、NAS電池の制御内容を過渡安定度計算により検討する。「電圧変動の抑制」と「線路過負荷の解消」という2つの機能を持った運転制御を考え、高出力型NAS電池により過渡状態の系統動揺を抑制しつつ最終的には線路過負荷も解消することができる手法を適用している。最後に例題系統を用いてシミュレーションを行い、設置計画段階で決定されたNAS電池システムの最適配置と最適容量により、運転制御段階で線路過負荷現象が効果的に抑制されることを示した。
核酸医薬の経口デリバリーを可能にするキトサン被覆ＤＮＡマイクロゲル製剤の開発

炎症性腸疾患に対する核酸医薬による治療システムの開発を目的に、「自己ゲル化核酸」技術を利用してキトサン被覆DNAマイクロゲル製剤の開発を試みた。まず、DNAハイドロゲルの粘膜面への投与可能性を検証するために、免疫刺激性CpG1668結合DNAハイドロゲルを開発した。CpG1668結合DNAハイドロゲルのマウス膣内への投与により、高いサイトカイン産生、単純ヘルペスウイルス2型の増殖抑制が得られた。次いで、CpG1668結合DNAハイドロゲルをキトサンで被覆したマイクロゲル製剤を開発した。キトサンの被覆により、酸性条件下およびDNA分解酵素存在下におけるDNAハイドロゲルの安定性は顕著に増大した。炎症性腸疾患に対する核酸医薬による治療システムの開発を念頭に、消化管内での核酸の分解と、炎症性腸疾患の標的となる消化管下部への効率的送達の問題を解決する方法として、申請者らが独自に開発した「自己ゲル化核酸」技術を利用してキトサン被覆DNAマイクロゲル製剤の開発を試みた。平成27年度は、基本DNAユニットとして6本足のhexapodnaを選択し、2種類のhexapodnaを混合することでDNAハイドロゲルを作製した。このとき、Toll-like receptor 9(TLR9)のリガンドであり、代表的なフォスホロチオエート化CpGオリゴヌクレオチド(ODN)であるCpG1668を核酸医薬として選択した。Hexapodnaを構成するODNの末端部分をCpG1668相補的な配列とすることでhexapodnaにCpG1668を結合した。TLR9を発現するRAW264.7細胞に添加したところ、CpG1668結合hexapodnaはCpG1668単独と比較して効率よく取り込まれた。また、これにより細胞からのTNF-αの産生も有意に増大した。次に、2種類のCpG1668結合hexapodnaを混合し、CpG1668内包DNAハイドロゲルを作製した。その結果、CpG1668はDNAハイドロゲルに安定に組み込まれ、徐放されることが示された。CpG1668に相補的な配列を含まない場合にはCpG1668はhexapodnaに結合せず、DNAハイドロゲルから速やかに放出された。CpG1668内包DNAハイドロゲルの投与部位での安定性を評価することを目的にマウス膣内に投与した。その結果、CpG1668単独と比較してDNAハイドロゲルに内包することで、CpG1668が長期間投与部位に滞留することが明らかとなった。当初計画していたパルスインジェクターを利用したDNAハイドロゲルのマイクロゲル化については、DNAハイドロゲルの粘性が高く、この機器の利用が適当ではないと考えられたことから検討しなかった。これに代えて、当初予定していた消化管粘膜への適用に加えて、定量的評価がより簡便であった膣粘膜での評価も行い、DNAハイドロゲルにCpG1668を内包することで持続的な免疫応答の誘導に成功した。平成27年度には、DNAハイドロゲルの粘膜面への投与の可能性を検証するために、炎症性腸疾患に有効と報告のあるToll-like receptor 9(TLR9)のリガンドの一種であり、代表的なフォスホロチオエート化CpGオリゴヌクレオチド(ODN)であるCpG1668を選択し、これを構造中に含むDNAハイドロゲルを開発した。平成28年度は、CpG1668結合DNAハイドロゲルの粘膜への作用を簡便に評価するため、マウス膣内に投与した。その結果、CpG1668単独と比較して、CpG1668結合DNAハイドロゲルは高いサイトカイン産生、単純ヘルペスウイルス2型の増殖抑制作用を示した。このことから、CpG1668をDNAハイドロゲルに結合させることで、粘膜免疫のさらなる活性化が示唆された。そこで、CpG1668結合DNAハイドロゲルをキトサンで被覆することで、消化管内における核酸医薬の安定化ならびに消化管粘膜への吸着による消化管内滞留化を試みた。DNAハイドロゲルをマイクロスフェア化し、その表面をキトサンで被覆することでキトサン被覆DNAマイクロゲル製剤を開発した。また、蛍光標識デキストランの消化管内移動は、キトサン被覆DNAマイクロゲルに内包することで有意に遅延した。以上、本研究で開発したキトサン被覆DNAマイクロゲル製剤は、炎症性腸疾患に対する核酸医薬による治療システムの開発につながる可能性が示された。

次いで、CpG1668結合DNAハイドロゲルをキトサンで被覆したマイクロゲル製剤を開発した。キトサンの被覆により、酸性条件下およびDNA分解酵素存在下におけるDNAハイドロゲルの安定性は顕著に増大した。今後は膣内投与後の核酸医薬の活性ならびに治療効果を判定する。また、パルスインジェクターを使わずに均一なDNAマイクロゲルを作製し、その表面をキトサンで被覆することで、DNAハイドロゲルの分解抑制ならびにマイクロゲルの粘膜表面への付着によるさらなる滞留化を図る。生物薬剤学当初はクラスターテクノロジー社製パルスインジェクターの購入を計画していたが、DNAハイドロゲルの粘性が高いためにこの機器の利用が適当ではないことが判明し、購入を見合わせたため。インジェクターの購入費の一部は、追加で検討した膣内投与実験のためのマウスをはじめとする消耗品の購入費に充てた。残りについては、インジェクターを使わずに均一なDNAマイクロゲルを作製するための研究に使用する予定である。
長管骨長径成長における新たな制御機序の解明

週齢8週のラット大腿骨骨幹部骨膜の全周性切除を行って6週間の自由飼育を行うと、大腿骨長径が過成長した。骨形態計測では、骨膜切除は、大腿骨遠位成長軟骨板における内軟骨性骨化を刺激して長径成長速度を高め、その結果として、大腿骨長径の過成長をもたらすことがわかった。さらに、μCTを用いた海綿骨構造解析では、骨膜切除を行うと大腿骨遠位骨幹幹端部における骨梁数の増加を示した。これらの結果は、骨膜は成長軟骨板における内軟骨性骨化を調節していることを示唆した。平成20年度の研究では、8週齢雄ラットの右大腿骨骨幹部骨膜を全周性に切除し、以後6週間の自由飼育を行ない、その長径成長を促進する動物実験モデルを確立した。この動物実験モデルを用いて、以下の解析を行った。1.骨膜切除側大腿骨の長径は41.1±0.7mm、対照側は39.9±0.7mmと、骨膜切除側大腿骨の長径は対照側に比べて、約2.5%の骨延長がみられた(p<0.0001)。3.μCTを用いた二次海綿骨の構造解析では、骨量bone volumeは、骨膜切除側5.6±0.9m^3、対照側4.7±0.8m^3と、骨膜切除側が有意に多かった(p=0.0416)。骨梁数は、骨膜切除側3.8±0.41/mm、対照側3.4±0.41/mmと、骨膜切除側が有意に多かった(p=0.0116)。4.組織学的解析では、骨膜切除側大腿骨の遠位成長軟骨板は、対照側に比べて、肥大軟骨細胞数が増加し、その結果、肥大軟骨細胞層が増幅していることが明らかになった。以上から、ラット大腿骨骨幹部骨膜を全周性に切除すると、成長軟骨板における内軟骨性骨化が促進され、その結果、長径が延長することを明らかにした。平成21年度の研究は、これまで取り組んできた長管骨骨膜切除による長径過成長モデルを用いて、骨膜による内軟骨性骨化の制御機序を解明するとともに、骨膜と骨幹部における膜性骨化との関わりについて明らかにした。実験動物は、週齢8週の雄Sprague-Dawleyラット24匹である。右大腿骨骨幹部の骨膜を約8mmの幅で全周性に切除した(骨膜切除群)。左大腿骨は非侵襲の対照とした(対照群)。骨形態計測は、骨膜切除後6週(週齢14週)の大腿骨において実施した。骨膜切除群の大腿骨長径は41.50±0.76mm、対照群は40.48±0.38mmと、骨膜切除群は対照群に比べ長径が長かった(p=0.0039)。骨膜切除後6週の大腿骨長径成長速度は、骨膜切除群44.1±3.4μm/day、対照群27.6±5.1μm/dayと、骨膜切除群は対照群に比べて有意に高かった(p<0.0001)。大腿骨骨幹部の外骨膜周囲径は、群間で差がなかったものの、内骨膜周囲径は、骨膜切除群6.661±0.498mm、対照群8.249±0.709mmと、骨膜切除群は対照群に比べて有意に低下していた(p=0.0003)。骨幹部骨密度は、骨膜切除群961.5±32.3mg/cm3、対照群766.1±44.1mg/cm3と、骨膜切除群は対照群に比べて有意に高かった(p<0.0001)。骨幹部骨皮質幅は、骨膜切除群0.999±0.069mm、対照群0.711±0.041mmと、骨膜切除は対照群に比べて有意に高かった(p=0.0008)。これらの結果から、成長期の長管骨骨膜は、成長軟骨板の内軟骨性骨化と骨幹部における膜性骨化とを制御していることが明らかになった。申請者はこれまでの研究の中で、ラット大腿骨骨幹部の骨膜を全周性に切除することにより、その長径が過成長する実験モデルを確立した。そして、本実験モデルを多面的に解析し、その長径過成長の機序の解明に取り組んだ。主な成果は、ラット大腿骨骨幹部の全周性骨膜切除は、長径成長速度と骨代謝回転とをいずれも促進し、その結果、大腿骨長径が過成長することを明らかにしたことである。以下1から5は、これまでの研究成果の要諦である。

1.ラット大腿骨骨幹部骨膜の全周性切除は、骨膜切除後2週間で、骨膜切除側大腿骨は無処置の反対側大腿骨(対照)に比べて有意に長径が長くなった。骨膜切除後6週では、その長径差が最大となった。2.二重標識による骨形態計測法で算出した、遠位成長軟骨板と骨幹端海綿骨における骨膜切除後2週、4週、そして6週の長径成長速度は、骨膜切除側大腿骨は対照側に比べ、いずれの時期も有意に速くなっていた。3.骨膜切除後6週の大腿骨軟X線写真は、骨膜切除側大腿骨は対照側に比べ、長径が長いこと、骨幹端部の肥大、骨陰影濃度の上昇とを示した。4.骨膜切除後6週のμCTの海綿骨構造解析では、骨膜切除側の骨幹端部海綿骨数は対照側に比べ、増加するとともに、骨幹端部が肥大していた。5.組織学的には、骨膜切除側大腿骨は対照側に比べ、肥大軟骨細胞数の増加、骨芽細胞性骨形成と破骨細胞性骨吸収のいずれもが亢進しており、骨代謝回転の亢進が示された。
ものづくり学習担当教員養成プログラムの開発

本研究では,ものづくり学習に対する意識を小学生などから明らかにした。その結果,1器用さや巧緻性を高める必要性,2情報を元に思考・判断する力を高める必要性,3製品を技術的・科学的な観点から評価する力を高める必要性が求められた。また,ものづくり学習の実態調査から,巧緻性を高める時間や,構造やしくみについて思考・判断する時間が与えられていないものづくりである傾向が明らかになった。これらを問題点を踏まえて,ものづくり学習を担当できる教員養成カリキュラムを開発し,その学習内容・指導方法・教材を開発した。本年度は,我が国における小学生,大学生のものづくりに対する意識調査について分析し,学習内容,指導法,教材開発の検討を行った。1.調査:ものづくりに対する児童の器用・不器用意識調査,及技術的素養に関する調査2.調査依頼・実施:全国の教員養成系大学の大学生1000名程度,及び小学4,5,6年生各学年100名程度とした。3.結果及び考察:(1)小学生5年生において器用意識が低下し,ものづくり嫌いも急激に増加する傾向が見られた。(2)小学生の技術的素養の質問においては,製品をいろいろな観点から評価する力や製品をつくり,使い,捨てることに対する考え方は,将来役に立たないとする傾向が見られた。(3)ものづくりの内容に関しては,ダムや電車・飛行機のしくみを知ることや,それらの知識を活用することに将来役立つと考えない傾向が見られた。(4)大学生の技術的素養の質問においては,創造・工夫に関する資質・能力の習得意識が高いが,製品をいろいろな観点から評価する力や,生産に関する倫理観の意識は低く示された。上記(2)ものづくりの内容に関しては,社会や環境,安全に関連する技術の学習内容について有効性が高く認識されたが,エネルギー変換に関する内容やプログラムによる計測・制御の内容については,有用性が低い傾向が認められた。4.学習内容,指導法,教材開発の検討:手先・指先を使った興味深いものづくりをさせ,自ら課題を乗り越え,成功経験を高められる教材の検討本年度は,我が国の小学校教員養成課程における目的や用途を意識したものづくり教育担当教員養成プログラムのあるべき方向性について検討した。プロジェクト的な活動を中心とした設計・製作(ものづくり)学習のあり方とその学習内容,指導方法,教材の有効性の結果を基に,小学校教員養成課程において,ものづくり学習を担当できる教員を養成できるプログラムとして,独自性のある教科選択科目の創設やその教材開発を行った。特に,ものづくり教育担当教員養成プログラムについては,諸外国や国内で先進的に実践している事例等を参考にして,教科選択科目の内容や教材の配列を行った。前年度の調査より,小学生5年生において器用意識が低下し,ものづくり嫌いも急激に増加する傾向や,製品を評価する力,機械等のしくみ,それらの知識を活用することは役立たないと考える傾向が見られたことから,教員養成においては,科学的な分析による手先・指先の技能について検討する教材を開発し,それらを用いた効果を検討した。また,ボール紙によるものづくりや,シミュレーションを用いて製品を評価したり,計測・制御技術を利活用したりしたものづくりを通して,自ら課題を乗り越え,成功経験を得させ,創造・工夫に関する資質を高めるとともに,社会や環境,安全に関連する技術を意識する教材を開発した。ボール紙によるものづくりに関しては,I大学教育学部学生を対象にして,30時間の授業を計画,実施し,その有効性を検証した結果,おおむね良好の成果を得ることができた。本年度は,我が国における小学生のものづくりに対する経験調査と意識調査の質問内容について検討した。1.調査項目の検討:質問紙の作成は,日本産業技術教育学会が2005年に国立の教員養成大学・学部学生を対象に行った「技術的素養に関する調査」の項目,ものづくりに対する児童の器用・不器用意識調査等を下敷きにして質問紙を作成した。2.調査依頼・実施:I県内の小学校のうち,調査協力者として同意を得られた小学4,5,6年生とした。3.暫定結果の概略:(1)小学生5年生で器用意識が低下し,ものづくり嫌いも急激に増加する傾向が見られた。(2)技術的素養の質問においては,製品をいろいろな観点から評価する力や製品をつくり,使い,捨てることに対する考え方は,将来役に立たないとする傾向が見られた。本年度の予定は,質問紙による調査及び学習内容,指導法,教材開発を行い,実践実施することにあった。しかし,質問紙の分析が遅れ,学習内容の検討が不十分であったため,指導法と教材開発が遅れ,授業実践するまで至らなかったため。本年度の予定は,質問紙の作成を行い,予備調査を実施することにあった。研究計画通りのスケジュールで進んでいるため。

平成25年度は,平成24年度の調査を踏まえ,学習内容,指導方法,教材を開発するとともに,その有効性をI大学附属小学校等で検証する。また,小学校教員養成課程におけるものづくり教育担当教員養成プログラムのあり方を明らかにする。平成24年度は,平成23年度の予備調査を踏まえ,本調査を実施する。本調査では,面接や自由記述の質的調査及び4件法による量的調査とし,それらのデータを分析することにより,我が国のプロジェクト的な活動を中心とした設計・製作(ものづくり)学習のあり方を明らかにする。また,結果を基に学習内容,指導方法,教材を開発するとともに,その有効性をI大学附属小学校等で検証する。前年度不十分であった,質問紙による調査を実施するための印刷費と郵送料。小学校へ訪問する旅費に充てる。また,教材開発費用が,当初計画より膨らんだため,教材開発費用に充てる。教材開発のための3次元加工機(250千円),教材開発用材料(250千円),調査データ読み込みのためのドキュメントスキャナ(50千円),スキャナ用パソコン(90千円),スキャナ用ソフトウェア(200千円),各種資料印刷用のカラープリンタトナー(60千円)を購入する。また,全国の小学校の状況把握のための調査旅費として280千円,分担研究者同士の打合せのための旅費として100千円を使用する。
胚発生de novoメチル化におけるDNMT3作用機序と標的調節

DNAメチル化酵素Dnmt3ファミリー分子(Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3L)は、ゲノムDNAの未修飾領域に新たにメチル基を導入する「de novoメチル化」を担う。本研究は、マウスES細胞を用いて、de novoメチル化調節における各Dnmt3ファミリー分子の機能的な違いをあきらかにすることを目的とした。この目的のため、遺伝子ターゲティングによって主要な内因性Dnmt3遺伝子を欠損させたマウスES細胞(Dnmt3a-/-Dnmt3b-/-Dnmt3L-/-)を作製し、各Dnmt3遺伝子を再び導入する実験系を構築した。これらのDNAメチル化状態を解析することによって、各Dnmt3ファミリーに特徴的な傾向を示す結果が得られている。一方、この解析の過程で、当初のDnmt3欠損ES細胞実験系に不十分な点も明らかになった。一つは、遺伝子機能を不活性化させたと考えていたDnmt3L欠損遺伝子から部分欠損タンパク質が生じており、一部の機能が残存していたこと、もう一つは、導入した外来Dnmt3遺伝子発現量のサンプル間のばらつきの影響が大きいことであった。これらの問題を解決するため、まず、ゲノム編集によりDnmt3L遺伝子のほぼ全域を除去し、部分欠損タンパク質が生じないDnmt3欠損ES細胞を再作製した。さらに、細胞に導入する外来Dnmt3遺伝子の発現と同時に、薬剤耐性遺伝子と蛍光レポータータンパク質が発現するプラスミド発現系を作製し、外来Dnmt3遺伝子発現量に応じて細胞を可視化・選別できる実験系を再構築した。これらの改良によって、より信頼性の高いデータを得られることが期待できる。この改良実験系を用いて、DNAメチル化状態に関するデータを再取得している。本研究は、ゲノムにおける細胞特異的なDNAメチル化修飾を形成する過程「de novoメチル化」について、その制御に中心的な役割をはたすDNAメチル化酵素Dnmt3ファミリーの作用機序の詳細を明らかにすることを目的とする。研究計画初年度である平成27年度は、計画にしたがい、de novoメチル化制御研究に必要な実験材料(発現プラスミドベクター、遺伝子改変ES細胞)を作製した。本研究では、遺伝子操作により変異を導入したDnmt3をマウスES細胞に発現させ、Dnmt3タンパク質がES細胞ゲノム上のどの位置のクロマチンに結合するか、ゲノム上のどの塩基のDNAメチル化が変化するかを解析する。外部から導入したDnmt3をマウスES細胞内で効率良く発現させるため、PiggyBacシステムを用いたDnmt3発現プラスミドベクターをあらたに構築する。哺乳類がもつ3種のDnmt3ファミリー遺伝子について、各遺伝子のアイソフォーム分子を個別に発現するプラスミドベクターを作製した。さらに、Dnmt3タンパク質機能を調べるため、種々の変異を各Dnmt3遺伝子へ導入し、これらの変異Dnmt3を発現するプラスミドベクターを同様に作製した。一方、本研究課題の解析目的には従来のES細胞株では不十分であるため、本研究の実験内容に適したDnmt3遺伝子改変ES細胞株をあらたに作製した。現在、この細胞株の性状解析をすすめている。以上の進展により、本研究課題の本実験に必要な実験系を構築した。初年度の主な目標であった、本実験の遂行に必要なDnmt3発現プラスミドベクター、Dnmt3遺伝子改変ES細胞株はほぼ計画どおりに作製できている。初年度の計画には、作製したDnmt3発現ベクターとES細胞を用いて遺伝子導入実験を開始することも含まれていた。しかし、当該実験において、当初の計画になかった前処理を追加したため、実際のDnmt3発現ベクター導入は次年度に開始するように変更した。具体的には、Dnmt3導入前のES細胞を、特殊培地(2iLIF)による継代培養あるいはDNAメチル化低下薬剤で処理することによって、あらかじめES細胞ゲノムのDNAメチル化レベルを十分にさげておく前培養を追加した。理由は、研究計画後半におけるエピゲノム解析をより正確におこなうためである。DNAメチル化酵素Dnmt3ファミリーは、ゲノムDNAにあらたなメチル化修飾を形成する過程、de novoメチル化の中心的な制御因子である。哺乳類の初期胚発生および生殖細胞形成過程では、ゲノムのDNAメチル化修飾が一度おおきく消去され、その後、胚あるいは配偶子に特徴的なDNAメチル化修飾が、Dnmt3によるde novoメチル化によって再形成される。体を構成する個々の細胞は、細胞種に特徴的なゲノムDNAのメチル化修飾分布をもつ。この特徴的なDNAメチル化分布が、その細胞のもつ細胞分化能や正確な遺伝子発現制御を部分的に規定するため、未分化細胞や他種の細胞へリプログラムされることを抑制する因子のひとつであると考えられている。正常なde novoメチル化制御は、胚発生、生殖細胞におけるゲノムインプリント形成、レトロトランスポゾン抑制に必須である。本研究は、哺乳類初期胚の細胞モデルであるマウスES細胞を実験系とし、Dnmt3によるDNAメチル化制御の作用機序を明らかにすることを目的とする。平成28年度は、DNAメチル化酵素欠損ES細胞に、機能変異をもつDNAメチル化酵素遺伝子などを発現させた様々なレスキューES細胞株を作製してきた。次の段階であるDNAメチル化解析やクロマチン結合解析に用いるため、取得したES細胞株の中から、外部導入遺伝子のタンパク質発現量が内在性遺伝子からの発現量と同程度であるクローンを選別している。候補遺伝子・反復配列についてのDNAメチル化解析を開始している。