hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微生物資源を用いた中性脂質生成制御からの創薬へのアプローチ

生体内での中性脂質(コレステリルエステル(CE)とトリグリセリド(TG))の蓄積は、脂肪肝や肥満を惹起することから、その予防・治療法が求められている。本研究では、1)中性脂質CEとTGを生成させる細胞評価系を用いて、微生物資源を対象にその生成阻害剤を探索し、2)既に申請者の研究グループが発見してきたCE生成に関与するステロールO-アシル転移酵素2 (SOAT2)阻害剤が脂肪肝発症動物モデルにおいて有効であるかどうかを検証し、3)項目1)で発見した新しい微生物由来の機能分子の構造を明らかにし(4種8成分を発見)、その標的分子の解明を行なった。本研究では、1)中性脂質CEとTGを生成させる細胞評価系を用いて、微生物資源を対象にその生成阻害剤を探索すること、2)既に申請者の研究グループが発見してきたCE生成に関与するステロールO-アシル転移酵素2 (SOAT2)阻害剤とTG生成に関与するやジアシルグリセロールアシル転移酵素2 (DGAT2)阻害剤が脂肪肝や肥満発症動物モデルにおいて有効であるかどうかを検証すること、3)項目1)で発見した新しい微生物由来の機能分子の構造や標的分子の解明を目的として進めている。まず1)中性脂質生成阻害剤の探索については、我々の研究室で供給される約2000株の微生物培養液サンプルを評価した結果、細胞内のCE生成を特異的に阻害する新規化物2成分と既知化合物であったが細胞内のTG生成を特異的に阻害する化合物2種4成分を発見した。現在、精力的にスクリーニングを行ない、精製候補株として細胞内のCE生成を阻害する5株、TG生成を阻害する2株、CEとTGの両方の生成を阻害する1株があり、活性物質の単離精製、構造決定を進めている。つぎに2)動物実験については、SOAT2選択的阻害剤ピリピロペンA誘導体に焦点をあて、研究を進めている。これまで、脂質低下作用と抗動脈硬化作用を確認したが、本年度は脂肪肝(NAFLD)や脂肪肝炎(NASH)に対する影響を評価している。最後に3)標的分子の解明に関する研究については、既知化合物であったが1)で発見したTG生成阻害化合物(クロモマイシン類)について検討を進め、細胞種によってTG生成阻害活性が大きく変わることを明らかにした。中でも、ヒトバーキットリンパ腫由来Raji細胞のTG生成を強力に阻害した。微生物資源を対象に細胞レベルで中性脂質生成阻害剤をスクリーニングした結果、細胞内のCE生成を特異的に阻害する新規化合物を2成分と既知化合物であったが細胞内のTG生成を特異的に阻害する化合物2種4成分を発見し、その作用メカニズム解析も進めている。ピリピロペンA誘導体の動物実験に関しては、脂肪肝/脂肪肝炎発症モデルマウスの選定を行ない、現在、評価を進めている。本研究では、1)中性脂質CEとTGを生成させる細胞評価系を用いて、微生物資源を対象にその生成阻害剤を探索すること、2)既に申請者の研究グループが発見してきたCE生成に関与するステロールO-アシル転移酵素2 (SOAT2)阻害剤ピリピロペンA誘導体が脂肪肝発症動物モデルにおいて有効であるかどうかを検証すること、3)項目1)で発見した新しい微生物由来の機能分子の構造や標的分子の解明を目的として進めている。まず、1)中性脂質生成阻害剤の探索については、我々の研究室で供給される約2000サンプルの微生物培養液サンプルを中心に評価した結果、真菌の培養液から新規化合物3成分と海洋生物から新規化合物5成分を発見した。つぎに、2) SOAT選択的阻害剤の動物実験に関する研究については、SOAT2選択的阻害剤ピリピロペンA誘導体に焦点をあて、研究を進めている。これまで、マウスなどにおいて脂質低下作用と抗動脈硬化作用を確認したが、本年度は脂肪肝(NAFLD)や脂肪肝炎(NASH)に対する影響を評価した。最後に、3)標的分子の解明に関する研究については、1)で発見した8成分は、細胞毒性を示すことなく、いずれも動物細胞内のCEを選択的に阻害した。さらに、CEの最終生成酵素であるSOATに対する影響を、細胞膜画分を用いて、酵素レベルで評価した結果、細胞レベルでの結果と良い一致を示し、その標的分子はSOATであることを明らかにした。今後も引き続き、細胞レベルで中性脂質生成阻害剤を探索し、その構造や標的分子の解明を目指す。さらに、ピリピロペン誘導体の動物実験を精力的に進める。1)微生物資源からの中性脂質生成阻害剤の探索

研究:スクリーニングサンプルは、申請者の研究グループが分離、培養した微生物資源ライブラリーを用いる(年間、2,000から3,000サンプルが供給される)。すでに、申請者が確立した細胞評価系を用いて、[14C]オレイン酸から生合成させた細胞内のCEとTGの変動を定量し、その生成阻害剤を探索する。また、SOATやDGATアイソザイムに焦点をあてたtarget-based assayシステムを用いた探索研究も進め、SOAT2選択的阻害やDGAT2選択的阻害すような機能分子を探索する。2)モデル動物を用いた薬理試験:動物実験では、ピリピロペン誘導体に焦点をあて、脂肪肝/脂肪肝炎発症モデル動物を用いて、その薬理効果を評価する3)作用メカニズムの解析:項目1)で得られた阻害剤について、その作用メカニズムを明らかにし、標的分子の特定を目指す。北里大学薬学部微生物薬品製造学教室天然物化学本年度は、微生物資源からの中性脂質生成阻害化合物の単離精製の過程において、既存のガラス器具、カラムなどで代用できたことから、その分支出額が抑えられたため。すでに、中性脂質阻害活性を示す精製候補培養液は選択されているため、次年度はその培養に用いる培地、培養器具の購入費として使用する。
ソヨゴおよびイヌツゲの種子発芽に及ぼす温度とGA処理の影響

モチノキ属植物の種子は発芽に長い期間を要することから、実生による苗木の安定供給を実現するためには、胚成熟および生理的休眠打破の条件を明らかにする必要がある。そこで本研究では、胚成熟と休眠打破による発芽所要期間の短縮および発芽勢の向上を目的として、ソヨゴおよびイヌツゲの種子発芽に及ぼす温度およびGA処理の影響について調査した。2015年に採取したソヨゴおよびイヌツゲの完熟種子を供試した。果実から果肉を取り除き、流水で24時間洗浄した。13の実験において光強度は80-100μmolm^<-2>s^<-1>とし、全日長下で管理した。発芽数および発芽所要日数、胚長を1週毎に測定した。50粒3反復、胚長の測定は10粒無反復とし、発芽締切は32週目に設定した。1、温度処理: 5、10、15、20、25、30°Cの6区とした。2、低温湿潤処理: 5°C暗黒下において4、8、12、16週の低温湿潤処理を行い、その後20°C下で管理した。3、GA処理: GA_3溶液に種子を入れ、室温下で24時間の浸漬処理をおこなった。濃度は0、25、50、100ppmの4区とし、浸漬後、それぞれ15、20、25°C下に置いた。ソヨゴは32週以内に発芽がみられなかった。イヌツゲは、10°Cおよび15°C区で発芽率が高くなり、温度が高くなるほど低下した。25°Cおよび30°C区では発芽所要日数は短くなったが、発芽率は低くなった。イヌツゲ種子は試験開始時点で胚が未成熟であったことから形態的休眠にあると考えられたが、生理的休眠が打破される過程で形態的に成熟することが明らかとなった。低温湿潤処理区では発芽率は高くなり、処理期間が長いほど発芽日数は短縮した。GA処理は、イヌツゲには無効であると考えられた。本試験により、イヌツゲ種子は5°C16週間の低温湿潤処理後に20°C下に置くことで高い発芽率を示し、発芽所要日数の短縮および発芽勢の向上が可能となった。
塩基非特異的リボヌクレアーゼの触媒機構・塩基認識機構の解析

1.塩基非特異的リボヌクレアーゼ(RNasae T2 family RNase)に属する種々の起原の酵素(ウスバタケ、カキ、牛脾臓、ウシガエル肝、イカ肝、ニワトリ肝)について一次構造の解明を試み、前4者については全構造を後2者については大半の構造を決定した。何れの酵素についても活性中心を構成するアミノ酸残基は2箇所の短いペプチド鎖中に集中しており一種のカセット状になっている。これらの酵素中動物由来の酵素のN-末端付近の配列及びCys残基の位置は真菌の酵素と異なり、むしろ植物の酵素に似た配列を示しRNase T2family酵素の分子進化の筋道を示している。2.RNase RhのX線結晶解析をRNase Rh-2′-AMP及び-d(ApC)複合体について行ったところB1部位はTyr57とTrp49の間にスタッキングしており、Asp51が直接塩基と水素結合していることがわかった。またB2部位に関してPhe101が塩基とスタッキングしておりその他にGln95等が一種の蓋の様に働いている事も明らかとなった。またLys108がリン酸基に近接している場合があることも分かった。3.真菌由来のRNase Rhの活性中心及び塩基認識部位のアミノ酸残基の改変により、各アミノ酸残基の役割の推定を行った。Lys108はLeuに置換すると活性を失う。Ang,Thr,Ser等のプロトン供与能を持った残基への置換は能率は減少するがLys108の代わりとなった。Asp51はGlu,Gln,Asn等に置換することで塩基優先性がアデニンからグアニンに変わる。この事はAsp51がRNase Rhのアデニン塩基優先性に極めて重要であることを示している。塩基認識部位のTyr57は必ずしも芳香環である必要はないが芳香環である方が触媒能が高い。Trp49は活性中心の構造を維持するために必須であり、この改変は活性を極端に減少させる。4.トマトのRNase LEを酵母で発現させることが出来、結晶化にも成功している。現在X線結晶解析中である。近く植物酵素と真菌酵素の差異を明らかにしうると考える。1.粘菌の塩基非特異的リボヌクレアーゼ(RNase )の構造解析を終了し、この酵素のN-末端付近の構造が真菌類と異なり、植物の同種酵素と高いホモロジーを示すことを明らかにした。またこの酵素は塩基非特異的であるがRNAを分解するとき、グアニル酸を最も速やかに遊離する特性を示し、真菌の酵素がアデニル酸を最も速く遊離するのと異なっている。この酵素では真菌の酵素の塩基認識部位のAsp51がGluに変化しており、この置換が塩基特異性を支配していることを示した。ニワトリの塩基非特異的RNaseについては目下その構造を解析中である。なお、従来動物において酸性RNaseとして知られている酵素についてもそのかなりの構造の解析が進み、これらの酵素がRNase T2ファミリーの酵素であることが明らかとなったが、N-末端構造は植物、粘菌などの酵素のものとかなり変化している。これらの酵素の塩基認識部位と塩基特異性の関係は検討中である。

2.塩基認識部位については上述の研究によってAsp51を有するものがアデニル酸優先的、Ser、Gluに置換したものはグアニル酸優先的となることが示されており、現在Asp→Ser,Gluの改変体の作成中で近く特異性の上記仮説を確認する予定である。3.植物由来の酵素と真菌由来の酵素はホモロジーがかなりあるが、立体構造上かなりの相違が予想し得るので、X線結晶解析用サンプルを確保するため、トマト由来のcDNAをシャトルベタクーにつなぎ酵母中で発現しつつある。1.ニワトリ、牛及び豚脾臓リボヌクレアーゼについて構造研究を行った結果、これら酵素のいずれもが精製途中でプロテアーゼによる修飾を受けているため、C-末端20残基及びN-末端40残基ほどの点で部分的切断があり、これら断片がS-S結合により酵素本体に結合していることが明らかとなったので、精製過程にプロテアーゼ阻害剤を入れたが、なおこの修飾を防ぐことができなかった。従って今年度はこれらの酵素の本体と修飾断片を別個に構造決定を行った。豚脾臓酵素についてはほぼその構造を明らかにした。また、牛脾臓リボヌクレアーゼについては約80%の構造が明らかとなり、高等動物のN-末端部分が下等動物、植物のものとかなり異なることを明らかにした。2.リボヌクレアーゼRh(RNase Rh)の反応機構については次のことが明らかとなった。RNase Rhの塩基認識部位を構成するAsp51が植物、動物の類似酵素ではしばしばGlu,Ser,Asn等に置換されている。これを倣いRNase RhのAsp51の置換体を作成したところ、植物の酵素に類似したグアニル酸優先性を獲得した。この実験は51位の側鎖が塩基特異性を支配していることを示している。RNase Rhとその類似酵素中ではLys108が活性中心近傍にあり、かなり保存されているが、ときにはArg,Thr等に置き換わっている。このLys108のLeu置換体は活性が3%程度に下がり、酵素のKm値は変わらず活性のみが減少する。またThr,Ser等の置換体は10%程度の活性を示すことから108位にLys,Thr等の水素供与体があることが活性の発現に重要であることを示した。これらの実験を組み合わせ、His46,His109を一般酸塩基触媒とし、His104をリン酸結合部位、Lys108,Glu105を反応中間体の安定化に役立つものとし、Asp51,Tyr57,Trp49,Phe101を塩基認識部位とする反応機構の仮説を提出した。1.RNase T2familyに属する酵素中ニワトリ肝、牛脾臓、カエル、イカ肝のRNaseの構造研究を行い、ニワトリ肝、イカRNaseの構造を明らかにした。ニワトリ肝の酵素は塩基認識部位、B1およびB2部位の一部の真菌酵素と異なった配列あるいは欠損がみられている。またこれら動物由来の酵素のN-末端の構造は真菌よりむしろ植物の酵素に類似していた。2.動物由来の酵素で欠損のみられるTyr57の場所に側鎖の短いAlaを置換した、Tyr57Alaについて結晶化が成功し、現在詳細なX線結晶解析を行っている。3.第一の塩基認識部位B1サイトのTyr57, Trp49の改変体の作成とその酵素学的研究の結果、Trp49は活性中心の保持に極めて重要な残基であること、Tyr57はかならずしも芳香環である必要が無いが芳香環側鎖の場合の法が高い活性を示すことを見いだした。
LC-ICP-MS/MSによる生体試料中ヒ素代謝物の化学形態別高感度分析法の開発

本研究は、誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)装置の高精度化、高感度化を背景とし、液体クロマトグラフー誘導結合プラズマタンデム質量分析(LC-ICP-MS/MS)装置を用いた信頼性の高い化学形態別分析法の構築を行うことを目的とする。また、未知のヒ素代謝物の構造解析を行い、ヒ素化合物摂取後の時間経過及び摂取したヒ素化合物の化学形態の推定のための基礎的検証を行うものである。
中枢神経系におけるシアル酸の病態生理学的意義の解明

中枢神経系疾患では、髄液中や血清中シアル酸値が上昇する。そこで、本研究ではこれまで不明であったシアル酸の病態生理学的な意義の解明を最終の目的とし、以下の検討を行った。1)ミクログリアの機能に対するシアル酸の作用について検討した結果、細胞膜上シアル酸の切断遊離によって、炎症性因子の発現が著明に亢進した。2)神経細胞に対するシアル酸の影響について検討したところ、シアル酸の切断遊離が神経突起の伸長反応を優位に促進させた。3)脳内における脱シアル酸化の影響を検討した結果、活性化ミクログリアが観察され、神経細胞数は有意に減少した。すなわち脳内での脱シアル酸化が、神経細胞が障害する可能性が示唆された。中枢神経系疾患や炎症性疾患において、髄液中や血清中シアル酸値が上昇する。そこで本研究ではこれまでは全く不明であったシアル酸の病態生理学的な意義に注目し、中枢神経系におけるシアル酸の作用やそのメカニズムについて培養細胞および動物個体を用いた解析を行い、シアル酸およびシアル酸関連分子を標的としたそれら疾患に対する治療・予防という新たな治療戦略の提唱を目指す。1)培養細胞に対するシアル酸の影響:神経細胞は種々の刺激に応じてネットワークを形成するが、このネットワーク生成に突起伸長は欠かせないイベントである。そこで、神経細胞の機能に対するシアル酸およびその関連分子の作用を明らかにするため、神経突起伸長に対する効果について検討した。ヒト神経芽細胞に対してシアル酸を作用させたところ、著明な変化は認められなかった。一方、シアル酸分解酵素シアリダーゼを処理すると、突起伸長の更新傾向が認められた。さらに、突起伸長作用が認められている各種誘導因子を用い、それら依存的な突起伸長に対するシアル酸関連分子の関与について検討したところ、Insulin、IGF-1、およびレチノイン酸誘導性の突起伸長をシアリダーゼ阻害薬が抑制したことから、これら因子誘導性の伸長反応において、少なくとも、シアリダーゼ活性が関わっていることが示唆された。2)動物個体に対するシアル酸の影響:前年度までの検討により、脳内における脱シアル酸が、パーキンソン病などの中枢疾患に認められる神経障害を惹起する可能性が示唆された。そこで、まず実際に疾患モデルにおけるシアル酸および脱シアル酸状態を把握するため、シアル酸および脱シアル酸化を蛍光標識レクチンを用いて評価する系の確立するため、各種条件検討を行っている。今後、病態動物におけるシアル酸および脱シアル酸の影響について、シアル酸の結合状態と病態との関連性を明らかにしていく予定である。そこで、本研究ではこれまで不明であったシアル酸の病態生理学的な意義の解明を最終の目的と以下の検討を行った。1)ミクログリアに対するシアル酸の影響:ミクログリアは、炎症性因子の産生や死細胞の貪食などにより、脳内の環境を整える役割を担っている。そこでミクログリアの機能に対するシアル酸の作用について検討した結果、シアル酸はミクログリアにおける各種炎症性因子の発現には影響なかった。また、細胞膜上シアル酸の切断遊離による影響について検討した結果、シアル酸切断酵素シアリダーゼによってclassical activation時に機能する炎症性因子の発現が亢進した。一方で、alternative activation型のマーカー遺伝子の発現は全く亢進しなかった。従って、脱シアル酸によってclassical activation型のミクログリアへと活性化されていることが示唆された。2)神経細胞に対するシアル酸の影響:神経細胞の細胞膜表面には、数多くのシアル酸複合糖蛋白質、糖脂質が存在している。しかし、それらの詳細な機能や調節機序は未だ不明である。そこで、神経細胞に対するシアル酸の影響について検討したところ、神経突起の伸長反応に対して、シアル酸単独では効果を示さなかった一方で、シアル酸代謝酵素シアリダーゼの活性が寄与することが分かった。3)動物個体に対するシアル酸の影響:パーキンソン病などの中枢疾患では、ミクログリアの活性化を伴う炎症性反応が観察される。そこで、脳内における脱シアル酸化が各種細胞に対してどのように影響するか検討した。シアリダーゼの脳内微量投与の結果、活性化ミクログリアが観察され、神経細胞数は有意に減少した。これらから、ミクログリアにおける脱シアル酸化は、ミクログリアを活性化を経て、神経細胞が障害する可能性が示唆された。1)培養細胞に対するシアル酸の影響:ミクログリアは、種々の刺激に応じて炎症性因子の産生や、死細胞の貪食などにより、脳内の環境を整える役割を担っている。そこでミクログリアの機能に対するシアル酸もしくはシアル酸関連分子作用について、炎症性因子の発現を指標に検討した。マウスミクログリア系

細胞株BV-2細胞に対してシアル酸を作用させたところ、シアル酸の単独処理、およびLPSとの共処理では、各種炎症性因子の一過性の発現には影響なかった。一方で、細胞膜上の糖複合体に付加されているシアル酸の切断遊離がミクログリアの機能に及ぼす影響について検討した。BV-2細胞をシアリダーゼ処理により細胞膜上シアル酸の切断遊離を行った結果、炎症性因子の発現が亢進した。また、シアリダーゼ酵素阻害薬DANAによってその反応は消失した。ところが、脱シアル酸ではalternative activation型のマーカー遺伝子の発現は全く亢進せず、貪食能は低下した。従って、シアリダーゼによる脱シアル酸によってclassical activation型状態のミクログリアへと活性化されていることが示唆された。2)動物個体に対するシアル酸の影響:パーキンソン病などの中枢疾患では、ミクログリアの活性化を伴う炎症性反応が観察される。そこで、培養細胞の結果を踏まえて、脳内における脱シアル酸化が各種細胞に対してどのように影響するか検討した。シアリダーゼの脳内微量投与の結果、球状の形態を示すミクログリアが多数観察され、そのほとんどがiNOS陽性であった。さらに、神経細胞数は有意に減少した。このミクログリアにおける変化は、シアリダーゼ阻害薬DANAによって阻害された。これらから、ミクログリアにおける脱シアル酸化は、実際の脳内においてもミクログリアを活性化させ、その結果として神経細胞が障害する可能性が示唆された。1)培養細胞に対するシアル酸の影響:これまでにミクログリアおよび神経細胞、アストロサイトに対するシアル酸およびシアル酸関連分子の関与についてスクリーニング的な解析を行い、興味深い結果を得ている。現時点では、これらの反応を複合的にとられることができる脳スライス切片培養系を用いた実験は準備段階であるが、その予備段階として単一細胞でのより詳細な結果が得られていることから、計画に沿って概ね順調に推移していると考えている。2)動物個体に対するシアル酸の影響:非疾患モデル動物を用いてシアル酸関連分子の影響について検討し、興味深い結果を得ることができた。その一方で、疾患モデルにおけるシアル酸の作用については、現在その条件検討の段階である。ただし、シアル酸状態の変化がどの程度病態に影響するか解析する必要があると考え、その評価系構築を行っているところである。従って、動物を用いたシアル酸の関与についても、計画に沿って概ね順調に推移しているを考えている。ミクログリアにおけるシアル酸およびシアル酸関連分子の関与についてスクリーニング的な解析を行い、興味深い結果を得た。さらに、神経細胞の機能に対するシアル酸の影響についても現在検討中であり、興味深い結果を得ていることから、培養細胞におけるシアル酸の関与については、計画に沿って概ね順調に推移していると考えている。一方、vivoでの検討では、非疾患モデル動物を用いてシアル酸関連分子の影響について検討し、興味深い結果を得ることができた。
癌養子免疫療法の温熱療法併用による臨床効果の成績向上に関する基礎的研究

1.株化腫瘍細胞に対するin vitroにおける温熱療法の効果したがって、非特異的なキラー活性を有するNK細胞やLAK細胞では温熱の併用効果が期待できないことが判明した。2.温熱によるapoptosisの誘導株化腫瘍細胞を42°C,60min間加温した後、種々の時間経過で、TUNEL法とFlow cytometryによりapoptosisを測定したところ、直後と3時間後に強くapoptosisを認めた。3.自己腫瘍細胞における温熱とCTLの併用効果胃癌患者の手術により摘出された自己腫瘍細胞を42°C,60min間加温した後、株化腫瘍細胞においてapoptosisが誘導された温熱直後と3時間後をタイムスケジュールとし固相化CD3・Fibronectinで刺激したCTLのキラー活性を測定した効果、温熱によるキラー活性の増強を認めた。以上より、この治療法の臨床応用に際しては、腫瘍に特異的なキラー活性をもつCTLの系でのみ温熱療法との併用効果が期待できることが判明し、その作用機序はapoptosisの関与が示唆された。
複合表面処理による滑り・転がり機械要素の表面強さ向上に関する研究

本研究は,従来の熱処理による表面硬化処理に加えて,ショットピーニング,メッキその他の表面処理により複合表面処理を施し,滑り・転がり接触機械要素の表面強さ向上を目指すもので,複合表面処理機素の表面損傷モデル,表面強さ向上機構をも解明することを目的としている.これらの目的に対して,実施した基礎研究,すなわちイオン窒化焼結ローラおよび歯車の面圧強さ,表面損傷,動的性能,ショットピーニング歯車の面圧強さ,表面性状と動的性能変化,浸炭硬化に加えてNi-Pメッキあるいは浸硫処理により複合表面処理を施したローラの面圧強さ,スカッフィング強さについて得た主な結果は次のとおりである.1.イオン窒化粉末焼結ローラおよび歯車の面圧強さは硬化層深さが大なるほど,粉末粒子径が小なるほど,圧粉密度が大なるほど向上した.気孔の画像処理およびフラクタル次元解析により,これらの面圧強さは気孔分布に大きく影響されることが理解された.2.ショットピーニングにより表面改質されたホブ加工,放電加工,シェービング加工歯車の面圧強さは,ショットピーニングにより大きくはないが改善される傾向があった.3.複合表面処理機械要素に関し,無電解Ni-P合金めっきや浸硫処理により表面改質された浸炭硬化ローラの面圧強さはこれらにより改善された.また浸硫処理されたものの焼付き強さはほとんど改善されなかったが,無電解Ni-Pめっき処理されたものは高滑り率においてその焼付き強さは向上した.本研究は従来の熱処理による表面強さ向上機構解明の成果に基づいて,従来の表面硬化処理に加えて,ショットピーニング,溶射,メッキなどによる複合表面処理を施し,歯車をはじめ,滑り・転がり接触機械要素の表面強さ向上を目指すもので,複合表面処理機素表面損傷モデル,表面強さ向上機構を明らかにすることを目的としている.本年度においては,複合表面処理材の表面損傷,強さ向上機構に関する基礎的検討を行うために,浸炭材および浸炭材にショットピーニングを施したローラおよびピンとディスク試験片の製作を完了し,二円筒試験機およびピン・オン・ディスク試験機を用いて,複合表面処理機素の表面損傷,強さに関する基本的実験データを収集するための実験を行った.浸炭材およびこれにショットピーニングを施した試験片にさらにMo溶射やMoS_2メッキによる表面処理を行うために,それら被膜の厚さの検討などを行った.また,2円筒試験およびピン・オン・ディスク試験中のトルク,振動,騒音などの動的性能変化ならびに表面あらさ変化を測定し,試験中の表面形状変化と動的性能データの関係を定量的に関係づけるために表面あらさ解析,フラクタル解析などのプログラムを作成した.そして,各試験片の表面損傷形態およびショットピーニングが表面強さに及ぼす効果,さらに表面損傷と試験中の動的性能変化の関係を明らかにした.浸炭材およびこれにショットピーニングを施した試験片にさらにMo溶射やMoS_2メッキを施した試験片の製作がやや遅れているため,それら表面処理試験片の表面損傷,強さに関する基本的実験データを収集することはできていないが,ほぼ当初の研究計画通りであると評価しています.本研究は,従来の熱処理による表面硬化処理に加えて,ショットピーニング,メッキその他の表面処理により複合表面処理を施し,滑り・転がり接触機械要素の表面強さ向上を目指すもので,複合表面処理機素の表面損傷モデル,表面強さ向上機構をも解明することを目的としている.これらの目的に対して,実施した基礎研究,すなわちイオン窒化焼結ローラおよび歯車の面圧強さ,表面損傷,動的性能,ショットピーニング歯車の面圧強さ,表面性状と動的性能変化,浸炭硬化に加えてNi-Pメッキあるいは浸硫処理により複合表面処理を施したローラの面圧強さ,スカッフィング強さについて得た主な結果は次のとおりである.1.イオン窒化粉末焼結ローラおよび歯車の面圧強さは硬化層深さが大なるほど,粉末粒子径が小なるほど,圧粉密度が大なるほど向上した.気孔の画像処理およびフラクタル次元解析により,これらの面圧強さは気孔分布に大きく影響されることが理解された.2.ショットピーニングにより表面改質されたホブ加工,放電加工,シェービング加工歯車の面圧強さは,ショットピーニングにより大きくはないが改善される傾向があった.3.複合表面処理機械要素に関し,無電解Ni-P合金めっきや浸硫処理により表面改質された浸炭硬化ローラの面圧強さはこれらにより改善された.また浸硫処理されたものの焼付き強さはほとんど改善されなかったが,無電解Ni-Pめっき処理されたものは高滑り率においてその焼付き強さは向上した.近年の自動車などの伝動装置に見られるように,そのコンパクト化が推進されるに伴って,歯車などの表面強さ設計が厳しくなり,滑り・転がり接触する表面の強さ向上に関する検討が急務となっている.本研究では従来の表面硬化処理に加えて,ショットピーニングにより複合表面処理を施し,滑り・転がり接触機械要素の表面強さ向上を目指すもので,複合表面処理機素表面損傷モデル,表面強さ向上機構を明らかにすることを目的としている.主に歯車試験機およびローラ試験機を用いて,ショットピーニングを施した鋼製歯車,そして粉末焼結歯車およびローラに対して疲れ試験を実施し,複合表面処理材の表面損傷,強さ向上機構に関する基礎的研究を行った。ショットピーニングを施した歯車は,ショットピーニングを施していない歯車よりわずかに高い表面強さであった.また,ショットピーニングを施した歯車の摩耗量は,概して少ない傾向にあった.

粉末焼結歯車およびローラでは,表面強さは気孔の密集度に支配されており,気孔の大きさを小さくするような複合表面処理,すなわちショットピーニングが表面強さ向上に有用であることが推論できた。以上のように当初の目的をほぼ達成することができたが,今後,上記の知見を生かして,歯車にMo溶射やMoS_2メッキによる表面処理を行い,複合表面処理機素の表面強さ向上機構を解明していこうと考えている.
マウス後脳分節化過程に発現するカドヘリンの機能解析

我々ヒトを含めた脊椎動物の後脳領域は発生初期段階で前後軸に沿って互いに細胞が混和しない7つの区画rhombomere17(以下r1r7)へと分節化される。これら後脳分節構造はその背側から生じて頭部末梢神経節や耳小骨、下顎/咽頭軟骨等を形作る神経冠細胞群の移動様式をも規定するため、頭/顔面/咽頭部形成に少なからぬ影響を与えるが、それら分子発生機序に関しては依然不明な点が多い。本研究代表者はこれまで細胞に選択的接着性を与える分子群カドヘリンのサブクラスCadherin-6(Cdh6)を単離し、その発現がマウス発生初期の後脳分節形成過程で、r57の3区画からr6 1区画へ限局すること、偶数区画(r2/4/6)の背側から移動する神経冠細胞の一部集団にのみ認められることを見出している。さらにCdh6はマウス前脳分節に対応して発現し、その結果生じる区画間の細胞接着性の違いが前脳分節境界維持に関わることを実証している。本研究はマウス後脳分節化過程で領域時期特異的な発現様式を示すCdh6が同様の区画境界維持機能をもつか、(1)後脳全域でのCdh6強制発現、(2)本来偶数区画に限局して発現するCdh6の時空間特異的なエンハンサー(Hoxa2-r3/5 specific enhancer)を用いた奇数区画への異所性発現、(3)カドヘリン機能を後脳全域もしくは一部区画で阻害するドミナントネガティブ型(CdhΔ6)の強制発現、を通して明らかにすることを主目的とする。平成17年度は、前年度(2),(3)の状態を得るため作出に成功したトランスジェニックマウス系統(r3/5-Cdh6:4系統,r3/5-CdhΔ6:1系統)の解析としてr3/5マーカー遺伝子Krox20の分布変化を免疫組織化学法によって徹底追求したが、E8.0E9.5で野生型と大きな差異が認められなかった。これは用いたエンハンサー活性の強度と誘導時機が表現型を見出すには不十分であった可能性が考えられるため、現在(1)による解析でさらなる詳細を実験解析中である。なお(1)で用いる特殊解析技術については世界的に権威ある実験指針書新版に発表した(研究発表欄)。我々ヒトを含めた脊椎動物の後脳領域はその発生初期段階で胚前後軸に沿って互いに細胞が混和しない7つの区画rhombomere17(以下r1r7)へと分節化されてゆく。これら後脳分節構造は、その背側から生じて頭部末梢神経節や耳小骨、下顎/咽頭軟骨等を形作る神経冠細胞群の移動様式を規定しており、頭/顔面/咽頭部形成にも少なからぬ影響を与えるが、その分子発生機序については不明な点が多い。本研究代表者はこれまで細胞に選択的接着性を与える分子群カドヘリンのサブクラスCadherin-6(Cdh6)を単離し、その発現がマウス発生初期の後脳分節形成過程で、r57の3区画から最終的にr6の1区画へ限局すること、偶数区画(r2/4/6)の背側から移動する神経冠細胞の一団に対応して認められることを見出している。さらにはCdh6がマウス前脳分節に対応して発現し、その結果生じる区画間の細胞接着性の違いが前脳分節境界維持に関わることを実証している。そこで本研究ではマウス後脳分節化過程においても領域時期特異的に動的な発現様式を示すCdh6が区画境界維持機能をもつのかどうか、(1)後脳全域でのCdh6強制発現、(2)本来偶数区画に限局して発現するCdh6の時空間特異的なエンハンサー(Hoxa2-r3/5 specific enhancer)を用いた奇数区画への異所性発現、(3)カドヘリン機能を後脳全域もしくは一部区画で阻害するドミナントネガティブ型(CdhΔ6)の強制発現、によって検証を試みる。平成16年度は当初の計画通り、上記(1)(3)でCdh6の異所性発現に必要な発現ベクターの構築全てを完了した。またトランスジェニックマウス作出に必要な倒立微分干渉顕微鏡の所属研究機関動物管理施設内への設置を終え、既に本装置を用いて解析(2)/(3)の主翼をになうr3/5-Cdh6およびr3/5-CdhΔ6をもつトランスジェニックファウンダーをそれぞれ4および1系統得ることに成功した。平成17年度は得られたマウス系統の表現型を解析するとともに、(1)についても検討を重ね、マウス後脳分節化過程に発現するCdh6の役割に迫る予定である。

さらにCdh6はマウス前脳分節に対応して発現し、その結果生じる区画間の細胞接着性の違いが前脳分節境界維持に関わることを実証している。本研究はマウス後脳分節化過程で領域時期特異的な発現様式を示すCdh6が同様の区画境界維持機能をもつか、(1)後脳全域でのCdh6強制発現、(2)本来偶数区画に限局して発現するCdh6の時空間特異的なエンハンサー(Hoxa2-r3/5 specific enhancer)を用いた奇数区画への異所性発現、(3)カドヘリン機能を後脳全域もしくは一部区画で阻害するドミナントネガティブ型(CdhΔ6)の強制発現、を通して明らかにすることを主目的とする。平成17年度は、前年度(2),(3)の状態を得るため作出に成功したトランスジェニックマウス系統(r3/5-Cdh6:4系統,r3/5-CdhΔ6:1系統)の解析としてr3/5マーカー遺伝子Krox20の分布変化を免疫組織化学法によって徹底追求したが、E8.0E9.5で野生型と大きな差異が認められなかった。これは用いたエンハンサー活性の強度と誘導時機が表現型を見出すには不十分であった可能性が考えられるため、現在(1)による解析でさらなる詳細を実験解析中である。なお(1)で用いる特殊解析技術については世界的に権威ある実験指針書新版に発表した(研究発表欄)。
非平面π共役系分子を用いたレーザ誘起含窒素グラフェンの構造選択的ボトムアップ合成

本研究は、含窒素グラフェン(グラファイト)をボトムアップ方式で窒素/炭素(N/C)比を保持しつつ構造選択的に合成する方法を開発し、より簡便な設計を提供することを目的としている。今年度は、前年度の検討で得られた知見をもとに合成した含窒素グラファイトの応用研究として、固体高分子形燃料電池の正極で起こる酸素還元反応(ORR)の触媒活性に焦点を当てた。まず、ORR触媒活性測定用のグラッシーカーボン電極上に塗布した非平面π共役系分子スマネンの含窒素誘導体をレーザ誘起グラファイト化させた。顕微ラマン分光測定によって塗布した原料の炭素化を、導電測定によって電極と炭素体間の導通をそれぞれ確認し、電極上でも含窒素グラファイトを直接合成できることが分かった。次に、ORR活性の測定を行ったが、必ずしも高い活性を示さなかった。スマネン誘導体以外のπ共役系分子の合成技術を習得するため、ウルム大学(ドイツ)で半年間合成経験を積んだ。帰国後、炭素化するための原料と合成法の詳細な検討を重ねたところ、ホスホン酸部位を有するポリアニリンと鉄塩等の添加物を混合して1000 °Cで熱分解したものが、現行の白金に匹敵するORR活性を示すことを見出した。この熱分解物の構造特性を調べたところ、顕微ラマン分光測定によって試料の炭素化を、X線光電子分光測定によって試料に窒素、リン、鉄が含まれていることをそれぞれ確認した。本成果は当初の計画から派生したもので、世界最先端の結果に匹敵すると考えられ、十分な進展があったといえる。また、本成果は日本化学会第96春季年会で発表された。27年度が最終年度であるため、記入しない。含窒素グラフェン(グラファイト)のグラファイト様骨格内における窒素原子の量や結合様式は、その触媒特性や電気特性に大きな影響をもたらすため、それらを制御可能な合成法が開発できれば有用である。そこで、歪みを有する非平面π共役系分子がグラファイト化に有利な出発物になり得ると考え、含窒素グラフェン(グラファイト)をボトムアップ方式で炭素に対する窒素の比を保持しつつ構造選択的に合成する方法を開発し、より簡便な設計を提供することを目指して研究に取り組んだ。まず、レーザ照射でグラファイト化し易い骨格に関する知見を得るための実験を行った。具体的には、ラマン分光装置を活用したその場観察法および、時間分解マイクロ波伝導度法によって、レーザ誘起グラファイト化が起こる過程を追跡した。その結果、非平面π共役系分子であるスマネンの骨格が、その平面部分骨格(シクロペンタフェナントレン骨格、フルオレン骨格)と比べてグラファイト化し易いことを明らかにした。次に、窒素原子を含んだスマネンイミン誘導体を合成してレーザ照射を行うことにより、含窒素グラファイトの合成に関する検討を行った。レーザ照射後の化合物をラマン分光法およびX線光電子分光法によって分析したところ、含窒素グラファイト様の炭素化合物の生成が示唆された。また、元素分析の結果から、炭素に対する窒素の比は、レーザ照射の前後においてほとんど保持されていることも明らかにした。来年度は、今年度に得られた知見が構造選択的な含窒素グラファイトの合成につながるかを検討する。今年度は、ラマン分光装置を活用したその場観察法および、時間分解マイクロ波伝導度法によって、レーザ誘起グラファイト化が起こる過程を追跡し、スマネン骨格が、その平面部分骨格(シクロペンタフェナントレン骨格、フルオレン骨格)に比べてグラファイト化し易いことを明らかにした。それだけにとどまらず、非平面π共役系分子スマネンの含窒素誘導体の合成および、それを出発分子に用いたレーザ誘起含窒素グラファイト化の検討を行い、炭素に対する窒素の比の保持も達成したため。

今年度に得られた知見を活用し、構造選択的な含窒素グラファイトの合成に取り組む。具体的には、スマネン誘導体がグラファイト化し易い傾向があるという知見から、含窒素スマネン誘導体をリード化合物群として位置づけ、レーザ誘起含窒素グラファイト化の検討を行う。さらに、レーザ誘起含窒素グラファイト化の前後において、窒素部位の構造をX線光電子分光法によって評価し、比較検討もする予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。
胃癌の新しい癌抑制遺伝子RUNX3の細胞分化・癌化機構の解明と診断・診断への応用

前年度までに、我々はRUNX遺伝子群のスクリーニングと機能解析を行い、RUNX1は血球系の分化に重要であり急性骨髄性白血病の原因となることを報告してきた(Sakakura et al.,PNAS,1994; Okuda etal, Cell, 1996)。またRUNX遺伝子群の一つであるRUNX3を単離し(Bae et al., Gene, 1995)、これらがTGFbeta;シグナル伝達系の重要な分子であるSmad2-4と結合することを報告した(Hanai et al., JBC 1999)。我々は、世界に先駆けてRunx3ノックアウトマウスを作製し、その解析をおこなったところ、胃粘膜の高度の過形成を認めた。Runx3遺伝子が胃粘膜の発生や分化に重要な役割をはたしており、この遺伝子の異常が胃粘膜の脱分化や異常増殖や癌化に関連する可能性が考えられた。またRUNX3は胃癌の共通欠失領域の一つである1p36にマップされる。ノックアウトマウスでのデータと併せて、胃癌発生との関連が推測されたため、胃癌細胞株及び臨床検体のRUNX3遺伝子のコピー数、発現異常の解析を行った。約25%にコピー数の減少、約65%に発現低下を認めた。さらにRUNX3のプロモーター領域を同定し、塩基配列を調べたところCpGアイランドが多数存在することが明らかとなった。そこで胃癌細胞株及び臨床検体でmethylation specific PCRを行ってメチル化の有無を調べたところ、RUNX3発現低下とプロモーター領域のメチル化に正の相関が認められた。今後、RUNX3遺伝子が、いかなるシグナルの制御を受けて胃粘膜の発生、分化、癌化に寄与しているかが近未来の研究課題と考えられ、さらに新たな知見が得られると考えられる。またRUNX3遺伝子が、いかなる下流遺伝子群を制御しているかが重要な点である。これまでのDNAチップの解析によると下流遺伝子群は細胞周期調節因子や増殖因子受容体であり、一部はルシフェラーゼアッセイなどのプロモーター解析で確認されている。RUNX遺伝子ファミリーは、ヒトの疾患に深く関わる重要な遺伝子群であることが明らかとなってきている。今回我々は、世界に先駆けてRunx3ノックアウトマウスを作製し、その解析よりRUNX3遺伝子が胃粘膜の発生や分化に重要な役割をはたしており、この異常が胃粘膜の脱分化や異常増殖や癌化に関連することを示した。さらに胃癌細胞株及び臨床検体におけるRUNX3遺伝子の高頻度のコピー数減少、主にメチル化による発現低下、機能喪失型変異を確認しており、RUNX3が胃癌の新規がん抑制遺伝子であることを報告した。さらに胃癌の発生母地である慢性胃炎粘膜や腸上皮化生におけるRUNX3の解析や胃癌の転移浸潤におけるRUNX3の関与を明らかとし(Cllin Cancer Res, 2005)、将来的にはこれらに基づく胃粘膜の発ガンリスク予測や胃癌の転移予測などの遺伝子診断や遺伝子治療を目指しており、胃癌の発ガン予防や消化管粘膜再生にも応用しうると考えている。また胃癌以外の肝癌、膵癌、乳癌、胆管癌などにおけるRUNX3の異常も明らかになってきており、最終的には、RUNX3を分子標的とした癌予防と治療により国民健康の増進と医療費の抑制に寄与しうると考えている。おおむね順調に推移している。前年度までのRUNX3ノックアウトマウスや胃癌臨床検体の解析結果に基づき、より詳細なRUNX3の機能解析と遺伝子診断や発癌予防・治療への応用を目指して以下を展開した。1. RUNX3のSNPs (single nucleotide polymorphism)のタイピングと胃癌罹患感受性診断への応用2胃癌臨床検体及び周囲背景粘膜における胃癌前駆細胞のスクリーニング3.胃癌発生リスク評価への応用・胃癌前駆細胞の探索とその追跡調査(コホート研究)4.複数遺伝子MSPによる遺伝子診断、定量的検査の自動化・血清診断への応用5.ラット・マウス化学発癌モデルを用いたRUNX3遺伝子発現誘導による発癌予防実験6.各種悪性腫瘍におけるRUNX3の放射線や抗がん剤感受性への関連の検討既に我々は、胃癌前駆細胞のマーカーを数種類同定しており、早期多発胃癌切除標本の背景粘膜において胃癌前駆細胞を探索しつつある。また新しいHDAC阻害剤FK228やSAHAなどが開発され臨床応用されつつある。我々はこれらの薬剤がRUNX3を発現誘導し、マウス化学発癌モデルにて発癌抑制効果を示すことを確認しており、RUNX3を分子標的とした発癌予防や癌治療に応用しうると考えている。さらにRUNX3はTGFβ依存性アポプトーシスに重要な役割を果たしており、放射線化学療法の感受性に関与していることが明らかになった(Oncogene, Sakakura et al., 2007)。また我々はRUNX3ノックアウトマウスとAPCノックアウトマウスの掛け合せにより大腸病変の発生を確認している。大腸癌の発癌シグナル伝達系(Wntシグナル系)とRUNX3-TGFβシグナル伝達系のオーバーラップする分子も同定されており、今後更なる発展が期待しうる。概ね順調に推移している。

またRUNX遺伝子群の一つであるRUNX3を単離し(Bae et al., Gene, 1995)、これらがTGFbeta;シグナル伝達系の重要な分子であるSmad2-4と結合することを報告した(Hanai et al., JBC 1999)。我々は、世界に先駆けてRunx3ノックアウトマウスを作製し、その解析をおこなったところ、胃粘膜の高度の過形成を認めた。Runx3遺伝子が胃粘膜の発生や分化に重要な役割をはたしており、この遺伝子の異常が胃粘膜の脱分化や異常増殖や癌化に関連する可能性が考えられた。またRUNX3は胃癌の共通欠失領域の一つである1p36にマップされる。ノックアウトマウスでのデータと併せて、胃癌発生との関連が推測されたため、胃癌細胞株及び臨床検体のRUNX3遺伝子のコピー数、発現異常の解析を行った。約25%にコピー数の減少、約65%に発現低下を認めた。さらにRUNX3のプロモーター領域を同定し、塩基配列を調べたところCpGアイランドが多数存在することが明らかとなった。そこで胃癌細胞株及び臨床検体でmethylation specific PCRを行ってメチル化の有無を調べたところ、RUNX3発現低下とプロモーター領域のメチル化に正の相関が認められた。今後、RUNX3遺伝子が、いかなるシグナルの制御を受けて胃粘膜の発生、分化、癌化に寄与しているかが近未来の研究課題と考えられ、さらに新たな知見が得られると考えられる。またRUNX3遺伝子が、いかなる下流遺伝子群を制御しているかが重要な点である。これまでのDNAチップの解析によると下流遺伝子群は細胞周期調節因子や増殖因子受容体であり、一部はルシフェラーゼアッセイなどのプロモーター解析で確認されている。これまでのRUNX3ノックアウトマウスや胃癌臨床検体での解析結果に基づき、より詳細なRUNX3の機能解析と診断や予防・治療への応用を目指す。具体的には以下を展開する。1.胃癌発生母地、特に腸上皮化生や残胃粘膜、残胃癌でのRUNX3の発現変化の検討2. RUNX3のSNPs (single nucleotide polymorphism)のタイピングと胃癌罹患感受性診断への応用3.胃癌臨床検体及び周囲背景粘膜における胃癌前駆細胞のスクリーニング4.胃癌発生リスク評価への応用・胃癌前駆細胞の探索とその追跡調査(コホート研究)5.複数遺伝子MSPによる遺伝子診断、定量的検査の自動化・血清診断への応用6.ラット・マウス化学発癌モデルを用いたRUNX3遺伝子発現誘導による発癌予防実験7. HDAC (ヒストン脱アセチル化酵素)阻害剤やウイルスベクターや各種化合物を用いたRUNX3の発現誘導と癌治療への応用8.各種悪性腫瘍におけるRUNX3の放射線や抗がん剤感受性への関連の検討既に我々は、胃癌前駆細胞のマーカーを数種類同定しており、早期多発胃癌切除標本の背景粘膜において胃癌前駆細胞を探索しつつある。また新しいHDAC阻害剤FK228やSAHAなどが開発され臨床応用されつつある。
特発性肺胞蛋白症の病因・診断・治療における抗GM-CSF自己抗体の役割

特発性肺胞蛋白症は、肺胞及び終末気管支に過剰なサーファクタントの貯留がおこり、労作時の呼吸困難を来す希な疾患である。無症状から重篤な呼吸不全により致死的な症例まで、予後は多様であるが、一般的には予後良好な疾患とされている。病因は長い間不明であったが、主任研究者は1999年に、病因物質として患者の肺及び血液中に抗顆粒球マクロファージコロ昌一刺激因子(GM-CSF)中和自己抗体が大量に存在することを発見し(J Exp Med190(6),875-880,1999)、本疾患の病因は、肺胞マクロファージの分化・機能維持に重要な肺のGM-CSFが自己抗体により中和され、肺胞マクロファージのサーファクタント分解能が低下するためであると考えられる。一方、全国アンケート調査で明らかとなった安静時動脈血酸素分圧が70mmHg未満の重症者は46例で全体の23%である。これまで、こうした重症者に対する治療は、全身麻酔下の全肺洗浄法や気管支ファイバースコープによる反復区域洗浄が一般的で、患者の負担や苦痛が大きく、新治療法が望まれていた。近年、オーストラリアのSeymourらが始めたGM-CSF連日皮下注療法は、肺洗浄によることなく、重症患者の44%に呼吸機能の改善をもたらすことが報告されている。GM-CSFの全身投与は時に悪寒戦慄などの副作用を惹起することや、疾病が肺に限局していることから、我々は、GM-CSFを吸入で投与することを思い立ち、2001年以降、重症患者3例にGM-CSF吸入療法を試み、呼吸機能が劇的に改善すること、また、肺胞洗浄液中の自己抗体が消失することを確認した。#肺胞蛋白症モデルマウスの作製(分担研究者中垣が担当)モデルマウスの作製のために、マウスが自己抗体を産生しうるかどうかを調べた。マウス腹腔にCpGを投与し、炎症を惹起させると、14日後に抗GM-CSF自己抗体が血清中に数100ng/ml検出されることを見いだした。そこで、ハイブリドーマを作製し、抗GM-CSFモノクローナル抗体のスクリーニングを行い、6クローンを取ったが、いづれも非中和抗体であった。#ヒト型抗GM-CSFモノクローナル抗体を用いた自己抗体測定システムを患者検体の測定に応用する(分担研究者慶長が担当)。ヒト型抗GM-CSFモノクローナル抗体は患者の末梢血単核球をEB transformし、line化したあと、スクリーニングを繰り返し、抗体産生クローンを樹立した。このクローンのH鎖、L鎖遺伝子を抽出し、ベクターに入れてCHO細胞に発現させ、ヒト型モノクローナル抗体を得た。この抗体を標準抗体として従来のELISA測定系に適応したところ、従来プール血清から精製純化して用いていた標準自己抗体に比べて5.9倍の急峻な標準線が描けた。#吸入GM-CSFの薬効機序に関する研究(主任研究者中田が担当):特発性肺胞蛋白症の患者末梢血リンパ球集団を調べた。25例の解析では、NK,NKT,regulatory Tなどの集団が有意に低下していた。つぎにGM-CSF吸入治療前後の患者の末梢血で同様の検討をおこなった。一部の患者で症状徴候の改善と共にNK,NKT細胞が増加していた。
カンファー水酸化酵素P450と鉄イオウたんぱく質の複合体:複合体形成によって誘導されるP450の活性型構造と誘導機構の解明

P450camの活性型構造における分子状酸素の開裂機構を検討するため活性部位アミノ酸残基Thr252をIleに置換し、構造と機能の関連を検討した。本変異酵素のカンファー水酸化活性は野生型のほぼ1/10に低下した。そこで酵素反応サイクルの各部分反応の反応速度論的解析の結果、還元型酵素、基質カンファーそして酸素の3者複合体である酸素化型反応中間体が還元型プチダレドキシン(Pdx)によって還元され、酸化型酵素、水酸化カンファーならびに水を生成する反応の速度が野生型の1/30に低下したことが明らかになった。しかし酸化型中間体が還元型Pdxに還元される過程を含めて、その他の部分反応は変異によって殆ど変化しなかった。還元型Pdxによる酸素化型中間体の還元反応は、酸化型酵素の還元反応とは異なりプロトン供給と強く共役している。したがって前者の反応のみが遅くなったとの結果は、還元反応に共役したプロトン供給が変異によって遅くなったことを示唆する。そこで本酵素の結晶構造と、一方プロトン供給反応が速いことが知られている野生型とThrをAlaに置換した変異酵素の結晶構造を比較検討した結果、活性部位の水酸基と水分子があるいはその両者がプロトンの速やかな供給に必要な因子と推定された。またIle変異酵素ではプロトン供給が酸素分子の開裂に共役する効率は、Ala変異酵素の約10倍に上昇したが野生型の1/2であった。この結果はAla変異酵素のように水酸基が存在しない場合の水分子は、プロトン供給を妨げないが、分子状酸素の開裂反応を妨げる作用をもつことを示唆する。またP450反応においては分子状酸素が2電子還元されたペルオキシド型酸素が解裂する。この開裂機構を検討するためP450とは活性部位構造を異にするミオグロビン(Mb)を用いてペルオキシド酸素(過酸化水素)との反応を速度論的に解析し、開裂機構の全貌を初めて明らかにすることに成功した。カンファー水酸化酵素系の末端一原子酸素添加酵素であるシトクロムP450camは、活性中心にヘムを有する。酵素反応では、基質カンファーと結合した還元型P450camは、還元型の鉄イオウ(2Fe-S)たんぱく質、プチダレドキシン(Pd)および酸素分子と3者複合体を形成する。複合体内でPdが酸素化型P450camを還元するとカンファーの水酸化が起こり、PdとP450camはそれぞれ酸化型に変換され反応が終了する。我々は上述した3者複合体、あるいは酸素の代わりに一酸化炭素、一酸化窒素がP450camに結合した3者複合体の類似体が形成されるとP450camとPdに同時に構造変化が誘導されることを既に見出している。しかし酸素が結合した複合体でのPdの構造変化は見出したが、P450cam側の構造変化の検出は難しく今後の問題として残っている。本年度は誘導機構の解析を行った。P450camのPd結合部位と推定されるアミノ酸残基Arg109、Arg112のLys変異体は、上記の3者複合体の一酸化炭素型類似体が形成されても二つのたんぱく質の構造変化の程度が少ない。従ってこれら変異酵素は構造変化の誘導機構を理解しる上で重要なたんぱく質と考えられ、Lys109とLys112変異体のX-線結晶構造解析を行った(理研・播磨研究所との協同研究)。その結果、どちらの変異体においてもPdと複合体を形成すると野生型に比較して水素結合一つが消失すると推定された。この結果は、この複合体の解離定数が変異によって約100倍程度大きくなることと一致する。さらに変異酵素の構造からPdとP450camとの複合体が形成されて生じる鉄イオウクラスターとヘムの間に張り巡らされた水素結合のネットワークが両たんぱく質の構造変化に重要と示唆された。

またP450反応においては分子状酸素が2電子還元されたペルオキシド型酸素が解裂する。この開裂機構を検討するためP450とは活性部位構造を異にするミオグロビン(Mb)を用いてペルオキシド酸素(過酸化水素)との反応を速度論的に解析し、開裂機構の全貌を初めて明らかにすることに成功した。