hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
出生コホート調査における親子のスキンシップ頻度の実態および、その関連要因の解明

目的:本研究は、幼児期における親子のスキンシップ頻度尺度の開発および、その実践頻度に影響を与える周産期要因を明らかにすることを目的として調査を行った。方法:環境省「子どもの健康と環境に関する全国調査(以下エコチル調査)」の北海道ユニットセンター参加者を対象として、子供が3.54歳を迎えている保護者に対し、先行研究を基に作成した24項目(5件法)から成る自記式質問表調査を行った。得られた回答を基に探索的因子分析を行い、その信頼性を検証した。次に得られたスキンシップスコア16項目(16-80点)を目的変数として、エコチル調査の産後一ヶ月までの各データを説明変数として、重回帰分析を行った。結果:本調査は2016年1月より開始し、2019年6月5日時点において7,587人に送付し、5,665人より回答を得た(回収率74.7%)。このうちエコチル調査北海道UCの出産時全固定データと980人を連結し、その内回答者が母親で、欠損のない951人を解析対象とした。因子分析は、主因子法プロマックス回転により、4因子16項目を抽出し、累積寄与率は46.0%であった。4因子は「愛情表出的かかわり」「文化的かかわり」「アクティブなかかわり」「見つめ合い」と命名し、各因子のCronbachα係数はα=0.660.79、全体はα=0.83であった。重回帰分析では、各説明変数に欠損のない800人を対象とし、結果、スキンシップスコアに影響を与える要因として、出産歴(標準化係数β=-0.12)および、非妊時BMI、近しい人と連絡をとる頻度、相談できる親族や友人の数(各β=0.08, 0.08, 0.12)に、それぞれ有意な関連を認めた。結論:今回開発したスキンシップ頻度尺度の信頼性は概ね確保されていた。また母子のスキンシップ頻度は、出産歴、母の体格、個人の交友関係が影響を与えている可能性が示唆された。本研究は平成27年度については、若干の変更点が生じたものの適切に修正を行い、おおむね当初の計画に沿って順調に経過している。具体的には、スキンシップ頻度に関する調査を平成28年1月27日より開始しており、平成28年4月30日時点までに、2442通の質問票を送付し、1661通の回答を得ている(回答率68.0%)。主な変更点として、3歳時点におけるデータ収集を計画していたが、倫理審査の承認がやや遅れたために、調査対象者の年齢がより均一化されることを目的として、3歳半の時点におけるスキンシップ頻度のデータを収集することへと修正を行った。調査そのものは、データ収集開始後軌道に乗っており、順調に進行している。調査は若干の変更が生じたものの、適切に修正を行い、その後おおむね順調に進展している。調査は、平成28年1月27日より開始され、平成28年4月30日時点までに、2442通の質問票を送付し、1661通の回答を得ている(回答率68.0%)。なお、調査実施時期をエコチル調査参加者が3歳時から3歳6ヵ月時に変更した背景として、倫理審査の承認に関する経緯について説明する。本研究の倫理審査について、旭川医科大学の倫理審査は平成27年1月27日に、また日本赤十字北海道看護大学の倫理審査は平成27年2月26日にそれぞれ承認されていたものの、北海道大学での倫理審査が平成27年11月30日に承認された(申請書は、平成26年12月12日に提出されていたが、倫理委員会が一年に一度しか開催されないため)。これを受け、調査開始が平成28年1月27日となった。また、調査対象者の年齢について、北海道大学の倫理審査承認が得られた時期に、既に3歳を迎えていた参加者が、北海道エコチル調査参加者約8000名の内3000名近くに達していたことを踏まえ、スキンシップ頻度調査時の対象者年齢の均一化を図ることを目的として、調査実施を3歳時から、3歳6ヵ月時に行うことに変更した。また本研究の解析については、データ収集の開始が遅れたことが影響し、スキンシップ頻度の実態および母体要因に関する解析が実施できていないものの、平成28年度には実施できる見込みとなっている。本研究は平成28年度についても、概ね当初の計画に沿って順調に経過している。具体的には、スキンシップ頻度に関する調査については(平成28年1月より開始)、平成29年5月16日までに、4397通の質問票を送付し、3240通(解答率73.7%)の回答を得ている。また、平成29年1月に山梨県において開催された日本疫学会学術集会において、「幼児期における母子のスキンシップ頻度尺度の開発および、スキンシップ頻度に影響を与える周産期要因の検討」と題してポスター発表を行った。発表の概要について説明する。調査は、環境省エコチル調査における北海道ユニットセンター参加者の内、子供が3.54歳を迎えている保護者を対象として、先行研究を基に作成した24項目(5件法;1まったくしない5いつもする)から成る自記式質問表調査を行った。データ入力の完了した951人を対象として、探索的因子分析を行い、その信頼性を検証した。因子分析は主因子法プロマックス回転により行い、4因子16項目を抽出した。

累積寄与率は46.0%で、4因子は「愛情表出的かかわり」、「文化的かかわり」、「アクティブなかかわり」、「見つめ合い」と命名し、各因子におけるCronbach α係数はα=0.660.79、全体はα=0.83であった。また得られたスキンシップ頻度スコア16項目(16ー80点)を目的変数とし、エコチル調査の出産後一ヶ月までに得られている周産期データ27項目を説明変数として、重回帰分析を行い、結果スキンシップスコアに影響を与える産後一ヶ月までの要因として、出産歴(標準化係数β=-0.12)および、非妊時BMI、近しい人と連絡を取る頻度、相談できる親族や友人の数(各β=0.08, 0.08, 0.12)において、それぞれ有意な関連を認めた。以上、調査はおおむね順調に実施されている。平成27年度に調査実施時期を、対象者の年齢が3歳から3歳6ヶ月の時期に変更した影響で、若干の遅れが出たが、平成28年度は概ね順調に推移した。また、調査票の因子分析および、スキンシップ頻度に影響を与える周産期要因の解明が終了し、概ね順調に推移していると判断した。本研究は平成29年度については、データ収集についておおむね順調に経過しているものの、データ解析作業は当初の計画よりやや遅れて経過している。具体的には、スキンシップ頻度に関する調査については(平成28年1月より開始)、平成30年5月15日までに、7540通の調査票を送付し、5557通(解答率73.7%)の回答を得ている。一方で、エコチル調査の1歳までの固定データ配布が、当初の予定から大幅に遅れ、2018年3月に行われたこともあり、スキンシップ頻度に影響を与える1歳時までの要因についてのデータ解析は実施できていない状況にあり、やや遅れた状況にある。今後については、今年度中にスキンシップ頻度の実態に関する自記式質問票による調査は、終了予定である。また今年度中に、スキンシップ頻度に影響を与える1歳までの要因について、解析を行い、学会発表および論文化を目指す。科研費における研究期間中(平成30年度内)に実施できそうな内容は、上記までになると予測されるが、今後将来的には、エコチル調査において、子供の状態に関するデータの固定が行われ次第、まずは3歳までのスキンシップ頻度に影響を与える要因について解析を行う。さらに、対人応答性尺度(SRS)の値の変化のパターンについて、スキンシップ頻度の調査を実施した前後(3歳、5歳)のデータを比較し、3歳半時点におけるスキンシップ頻度が対人応答性尺度の変化のパターンに及ぼす影響について明らかにすることを計画している。エコチル調査の1歳までの固定データ配布が、当初の予定から大幅に遅れ、2018年3月に配布されたこともあり、スキンシップ頻度に影響を与える要因についての解析はやや遅れた状況にある。目的:本研究は、幼児期における親子のスキンシップ頻度尺度の開発および、その実践頻度に影響を与える周産期要因を明らかにすることを目的として調査を行った。方法:環境省「子どもの健康と環境に関する全国調査(以下エコチル調査)」の北海道ユニットセンター参加者を対象として、子供が3.54歳を迎えている保護者に対し、先行研究を基に作成した24項目(5件法)から成る自記式質問表調査を行った。得られた回答を基に探索的因子分析を行い、その信頼性を検証した。次に得られたスキンシップスコア16項目(16-80点)を目的変数として、エコチル調査の産後一ヶ月までの各データを説明変数として、重回帰分析を行った。結果:本調査は2016年1月より開始し、2019年6月5日時点において7,587人に送付し、5,665人より回答を得た(回収率74.7%)。このうちエコチル調査
アセチルCoA合成経路を担う鉄・ニッケル酵素をモデルとする炭素固定反応の開拓

自然界の炭素固定を担う金属酵素COデヒドロゲナーゼ(CODH)およびアセチルCoA合成酵素(ACS)の活性中心モデルを構築し、反応検討によって酵素反応機構解明を進めた。CODHについては独自に開発した三座チオラート配位子を利用し、CODH活性中心のモデルとなる[4Fe-5S-Ni]クラスターの構築に成功した。ACSについてはテトラアニオン性のジアミドジチオラートmbpaをもつニッケル二核錯体を合成し、酵素基質であるメチルカチオン、CO、チオラートからアセチルチオエステルを合成するモデル反応を達成し、アセチルCoA合成経路の反応機構解明を大きく前進させ、新たな炭素固定反応の端緒を拓いた。アセチルCoA合成酵素(ACS)は自然界の炭素固定を担う重要な金属酵素で、活性中心に存在するニッケル二核錯体部位にはトリペプチドCys-Gly-Cysがテトラアニオン性N2S2型ジアミドジチオラートとして結合している。ACSの構造は解明されているが、その触媒反応機構は未解明である。申請者らはこれまでジアニオン性ジアミノジチオラートN2S2配位子を用いたモデル研究により、酵素反応の解明を目指してきたが、本課題ではこの研究をより深化させ、より実際の酵素に近いテトラアニオン性N2S2配位子であるmbea (H2mbea = N,N'-(3-Hydrothio-3-methylbutyryl)-o-ethylenediamine)を導入した種々の二核ニッケルモデル錯体の合成を検討した。ニッケル(II)単核錯体[Ni(mbea)]2-(1)にメチル基とチオラートを併せ持つ(tmeda)Ni(Me)(STip)を加えたところ、Ni(II)-Ni(II)錯体[Ni(mbea)Ni(Me)(STip)]2-(2)が得られた。また錯体1にNi(0)錯体であるNi(cod)2を作用させ、アセトン存在下でMeIを作用させた場合には[Ni(mbea)Ni(Me)(acetone)]-(3)が生成した。メチル基やチオラートをもつこれらの二核錯体は酵素反応中間体に相当すると考えられる。そこで錯体2にCOを作用させたところ、ACS反応で合成されるアセチルチオエステルMeC(O)STipが80%の収率で得られ、同時に還元状態の[Ni(mbea)Ni(CO)2]2-が生成した。これらの結果は、錯体2がACS触媒サイクルの中間体モデルであることを示す結果であり、ジアミドジチオラート配位子をもつニッケル二核錯体を用いてACSモデル反応を達成した初めての例である。アセチルCoA合成酵素のモデル研究:活性中心であるニッケル二核錯体部位にジアミドジチオラート型で配位するテトラアニオン性トリペプチドCys-Gly-Cysのモデルとして、テトラアニオン性N2S2配位子であるmbea (H2mbea = N,N'-(3-Hydrothio-3-methylbutyryl)-o-ethylenediamine)を導入した種々の二核ニッケルモデル錯体の合成を検討している。前年度、合成に成功したNi(II)-Ni(II)メチル錯体[Ni(mbea)Ni(Me)(STip)](1)および[Ni(mbea)Ni(Me)(acetone)](2)は酵素反応中間体モデルと考えられるため、これらを用いたモデル反応を検討した。錯体(1)とCOの反応からACS類似反応の一部が進行することはすでに見いだしていたが、錯体(1)の生成段階、すなわち還元状態にあるNi(II)-Ni(0)二核錯体[Ni(mbea)Ni(cod)]とMeIおよびTipSKから錯体(1)が生成することが明らかとなった。これによって一連のACSの反応を段階的に達成し、形式的な酵素反応モデルサイクルを構築することができた。COデヒドロゲナーゼのモデル研究:独自に開発した三座チオラート配位子TefpS3を導入した[4Fe-4S]クラスターの1つの鉄上にSH基を導入した。このSH基を足がかりとしてTp*基を補助配位子とするNi錯体Tp*Ni(OH)を作用させたところ、[4Fe-4S]クラスターとニッケル錯体がスルフィドで架橋された[4Fe-5S-Ni]錯体の合成に初めて成功し、その構造をX線解析によって明らかにしたアセチルCoA合成酵素のモデル研究:活性中心であるニッケル二核錯体部位にジアミドジチオラート型で配位するテトラアニオン性トリペプチドCys-Gly-Cysのモデルとして、テトラアニオン性N2S2配位子であるmbea (H2mbea = N,N'-(3-Hydrothio-3-methylbutyryl)-o-ethylenediamine)を導入した種々の二核ニッケルモデル錯体を用い、前年度に引き続き酵素反応機構の解明に挑んでいる。前年度はモデル錯体を用いた酵素反応サイクル構築に成功し、NiII-Ni0の還元状態にある酵素活性中心がメチルカチオン、チオラート、COの順で基質と反応し、触媒反応が進行する機構の妥当性を明らかにした。そこで今年度は、生化学研究から提案されているもうひとつの基質作用機序、すなわちメチルカチオンの次にCO、その後チオラートが作用する機構の可能性を探った。酵素還元状態Ni(II)-Ni(0)モデル錯体[Ni(mbea)Ni(cod)](2-)とアセトニトリルの酸化的付加で得られたNi(II)-Ni(II)錯体[Ni(mbea)Ni(Me)(CN)](2-) (1)を用いた。

錯体1の末端ニッケル上にはシアノ基が強固に結合しており、チオラートを加えても配位しなかったが、チオラート存在下でCOを加えるとアセチルチオエステルが生成し、酵素モデル反応が進行することがわかった。この結果は、提案されているいずれの作用機序でも酵素反応が進行しうることを化学実験的に示した初めての成果である。自然界の炭素固定を担う金属酵素COデヒドロゲナーゼ(CODH)およびアセチルCoA合成酵素(ACS)の活性中心モデルを構築し、反応検討によって酵素反応機構解明を進めた。CODHについては独自に開発した三座チオラート配位子を利用し、CODH活性中心のモデルとなる[4Fe-5S-Ni]クラスターの構築に成功した。ACSについてはテトラアニオン性のジアミドジチオラートmbpaをもつニッケル二核錯体を合成し、酵素基質であるメチルカチオン、CO、チオラートからアセチルチオエステルを合成するモデル反応を達成し、アセチルCoA合成経路の反応機構解明を大きく前進させ、新たな炭素固定反応の端緒を拓いた。アセチルCoA合成酵素のモデル研究は予定通り順調に進捗しており、特に、これまでモデル反応検討の鍵となる酵素反応中間体モデルの合成収率が十分でなかったため反応検討の実験が限られていたが、今年度当初に安定的な合成手法を確立することに成功し、モデル反応検討による酵素反応機構解明を大きく加速することができた。すなわち、錯体酵素活性中心の構造を模倣したモデルを合成するだけでなく、酵素基質であるCOやチオラートとの検討を段階的に検討することが可能となり、形式的に触媒反応サイクルをすべて実現に成功することに成功した。アセチルCoA合成酵素の反応サイクルは、実際の活性中心に類似した配位構造をとるジアミドジチオラート配位子を用いて達成した初めてのACSモデルサイクルであり、実際の酵素においても、Ni(II)-Ni(0)状態を活性状態として、メチルカチオン源、CoAチオラート、COの順で酵素反応が進行しうることを示す重要な結果である。またCOデヒドロゲナーゼについても、これまで先例のない活性中心モデルである[4Fe-5S-Ni]クラスターの構築に成功した。この成果は、新規なCOデヒドロゲナーゼモデルクラスターに成功したこと以上に重要な意味を持っている。それは、[4Fe-4S]上のSH基を利用して他の金属錯体と連結させる上で、金属ヒドロキシ錯体が有用であるという知見である。本クラスター成功に至るまで、ニッケル上にハライドやSHをもつ類縁体との反応を検討したが、いずれも[4Fe-4S]上のSH基がハライドに置換されたクラスターが得られるのみで、ニッケルを連結するには至らなかった。唯一、ニッケルヒドロキシ錯体との反応で本クラスターの合成に至り、今後はヒドロキシ錯体を用いた金属導入を検討する。生物無機化学研究は順調に進捗しており、今後の実施計画に大きな変更はない。ACSのモデル研究については、さらに酵素反応中間体として考えられる錯体類の合成を進めるとともに、COとモデル錯体の反応を溶液中で赤外分光に寄って追跡し、ACS酵素反応のより詳細な機構解明をめざす。またCOデヒドロゲナーゼモデル研究を前年度から本格的に開始している。三座チオラート配位子を導入した[4Fe-4S]クラスターを合成し、チオラートが配位していない1つの鉄上を様々な配位子で置換した[4Fe-4S]
モデル生物を用いた膜輸送系におけるバルプロ酸標的分子の同定

バルプロ酸は、抗てんかん薬として広く用いられる。近年、抗がん薬の作用を増強すること、iPS細胞の作製効率を上昇させること、また脊髄損傷マウスへの神経幹細胞移植の効果を増強することが報告されている。我々は、多彩な作用を示すバルプロ酸の標的分子が何であるのか、どのような分子メカニズムで働くのかに関してはほとんど不明である。分裂酵母モデル生物として、バルプロ酸の標的分子同定を行った。バルプロ酸は細胞内輸送に深く関わっていることを明らかにした。本研究は,哺乳動物細胞に極めて近い細胞内情報伝達系を持つ分裂酵母モデル系を用いて,バルプロ酸(valproic acid, VPA)の膜輸送系における標的分子の同定を分子遺伝学的に解明しようとするものである。VPAはてんかんや躁状態に対して有効であることが発見されて以来,薬物として広く用いられている。最近体細胞からiPS細胞をつくる過程でVPAを加えると作製効率が100倍以上にあがることも報告されている。このように,VPAは多彩な作用を示すが,その標的分子が何であるのか,そしてどのような分子メカニズムでVPAが働くのかに関してはほとんど不明である。我々は,分裂酵母をモデル生物として用いて分子遺伝学的研究を進め,本年度は以下の結果を得た。(1) VPA超感受性変異体の遺伝子及び機能的に関連する因子の同定と解析:VPA超感受性変異体を同定したところ,TGNからのクラスリン被覆小胞に存在するアダプタータンパク質複合体-1(AP-1)のσサブユニートをコードするAps1であった。興味深いことに,四量体Apl2(β)/Apl4(γ)/Apm1(μ)/Aps1(σ)の各ノックアウト細胞は異なる表現型を示し,Δapm1とΔapl2変異体は同じ表現型,Δapl2とΔapl4は同じ表現型を示した。結合実験により,Aps1とApl4の非存在下でもApm1とApl2は結合し、Apm1とApl2の非存在下でもApl4とAps1は結合することが分かった。これらの結果から、ヘミコンプレックスの存在が明らかになった。また、別のVPA超感受性変異体原因遺伝子として,低分子量G蛋白質RabファミリーRyh1/Rab6のGEFをコードするRic1が同定された。さらに、Ric1変異体の温度感受性は、セリン/スレオニンキナーVps15の高発現によって抑圧されるという遺伝学的関係を発見した。(2) VPA耐性変異体の取得と解析:ニトロソグアニジンで突然変異処理した野生細胞を15mM,17mM,20mMのVPA培地に播き、30個のVPA耐性コロニーを得た。30個中4個の株ではVPA耐性が遺伝した。今後は、相補性を指標としたスクリーニングを行い,変異遺伝子の同定を行う予定である。バルプロ酸(VPA)は、抗てんかん薬,抗躁薬として広く用いられ、抗がん薬の作用を増強することも知られている。近年、ips細胞の作成過程でVPAを加えると、作製効率が100倍以上上昇すること、また本年8月には、神経幹細胞移植とVPAの同時投与による脊髄損傷マウスの治癒が報告されている。このようにVPAは多彩な作用を示すが、その標的分子が何であるのか、そしてどのような分子メカニズムで働くのかに関してはほとんど不明である。我々は、VPAの標的分子を分裂酵母モデル生物を用いて、分子遺伝学的研究を進め、本年度は以下の結果を得た。(1)VPA超感受性変異体の遺伝子及び機能的に関連する因子の同定と解析:今までVPA超感受性変異体を同定したところ、細胞内輸送に関わっているVps45とアダプタータンパク質複合体-1(AP-1)のσサブユニートをコードするAps1を同定できた。今年度、別のVPA超感受性変異体原因遺伝子として,低分子量G蛋白質RabファミリーRyh1/Rab6のGEFをコードするRic1が同定された。さらに、Ric1変異体の温度感受性は、セリン/スレオニンキナーゼVps15の高発現によって抑圧された。興味深いことに、Vps15の高発現はRic1ノックアウトの表現型を抑圧できなかった。Vps15はRic1依存的に相補能を示していることを明らかにできた。これまで同定したVPA超感受性変異体の原因遺伝子がすべて細胞内膜輸送に機能していることから、VPAの標的分子は細胞内膜輸送に機能する遺伝子と深く関連していることが示唆された。(2)VPA耐性変異体の取得と解析:今年度、分裂酵母のほぼすべての非必須遺伝子のKO細胞ライブラリーが入手できたので、これらの細胞をVPA含有プレートにストリークし、超感受性またはVPA耐性の細胞をスクリーニングした。現在詳細の結果を確認しているところである。今後さらなる解析を行う予定である。
ボツリヌス毒素複合体のサブユニット間相互作用およびX線結晶解析に関する研究

ボツリヌス毒素は、1分子の神経毒素(約150kDa)に非毒非血球凝集素成分(NTNHA)と3種の血球凝集素成分(HA)の合計5種のタンパク質が非共有結合的に会合し、650kDaの巨大な分子量を有するサブユニット構造の複合体(TC)として培養液中に産生される。本研究において、P型菌4947株(D-4947)を用い、複合体における個々のサブユニットタンパクの構成比を初めて明らかにした。すなわち、D-4947は、毒素複合体種(650kDaL-TC、610kDa TCおよび540kDa TC)を大量に産生する。いずれも同じSDS-PAGEパターンを示すが.複合体におけるHA-33/17の分子数が異なっていた。HA-33/17分子の各TC種への滴定実験によち、完全型のD型ボツリヌス650kDa L-TCは、神経毒素およびNTNHAが各1分子、HA-70が2分子、HA-33およびHA-17が各4分子からなるヘテロ12量体サブユニット構造であると結論した。これにより、ボツリヌス毒素複合体のX線結晶解析による高次構造解析のための情報を得た。また、D-4947毒素複合体種のうち、610kDa TCおよび546kDa TCは、温度などの保存条件により影響を受け、その構成成分の組換えが起こることを見出した。グリセロールなどの添加により抑制することが出来、安定な毒素複合体を実験に供することが可能となった。一方、従来法では困難であったD-4947ボツリヌス毒素複合体から神経毒素と無毒成分の大量分離・精製法を新たに確立した。さらにCおよびD型の4株から得られた毒素複合体(M-TCおよびL-TC)の純度を動的光散乱測定により検定し、各々の結晶化を130通り実験条件により試みたが、解析に供する大きな結晶は得られていない。ボツリヌス毒素は、1分子の神経毒素(約150kDa)に非毒非血球凝集素成分(NTNHA)と3種の血球凝集素成分(HA)サブコンポネントの合計5種のタンパク質が非共有結合的に会合し、650kDaの巨大な分子量を有するサブユニット構造の複合体(TC)として培養液中に産生される。TCのサブユニット構造は、毒素が消化管での酸性条件や種々の蛋白分解酵素に曝されるという過酷な条件下でも強い耐性を持つ特異的な構造を有していることが示されてきた。本研究において、D型菌4947株(D-4947)を用い、複合体における個々のサブユニットタンパクの構成比を初めて明らかにした。D-4947は、全ての構成成分にnickが認められないintactな毒素複合体(650kDa L-TC、610kDa TCおよび540kDa TC)を大量に産生する。いずれも同じSDS-PAGEパターンを示すが、650:kDaL-TC、610kDa TCおよび540kDaTCに結合しているHA-33/17の分子数は、その染色強度から各々4:3:2と推定し、HA-33/17分子を各TC種に滴定すると全てL-TCへ変換した。

これらの結果などからD型ボツリヌスL-TCは、神経毒素およびNTNHAが各1分子、HA-70がが2分子、HA-33およびHA-17が各4分子からなるヘテロ12量体サブユニット構造であると結論した。一方、従来法では困難であった神経毒素の分離方法を検討し、高アルカリ条件(pH8.8)で安定なD型4947株神経毒素を結晶解析に供する新たな大量分離・精製法を確立した。神経毒素および毒素複合体の構造及び機能の特徴を明らかにするため、サブユニット間相互作用の情報を総合し、毒素複合体および個々のタンパクの結晶化とX線解析により、その高次構造を明らかにする。ボツリヌス毒素は、1分子の神経毒素(約150kDa)に非毒非血球凝集素成分(NTNHA)と3種の血球凝集素成分(HA)の合計5種のタンパク質が非共有結合的に会合し、650kDaの巨大な分子量を有するサブユニット構造の複合体として培養液中に産生される。このサブユニット構造は、毒素が消化管での酸性条件や種々の蛋白分解酵素に曝されるという過酷な条件下でも強い耐性を持つ特異的な構造を有していることが示されてきた。本研究において、D型菌4947株(D-4947)を用い、複合体における個々のサブユニットタンパクの構成比を初めて明らかにした。すなわち、D-4947は、毒素複合体(650kDa L-TC、610kDa TCおよび540kDa TC)を大量に産生する。いずれも同じSDS-PAGEパターンを示すが、複合体におけるHA-33/17の分子数が異なっていた。HA-33/17分子の各TC種への滴定実験により、D型ボツリヌス650kDa L-TCは、神経毒素およびNTNHAが各1分子、HA-70が2分子、HA-33およびHA-17が各4分子からなるヘテロ12量体サブユニット構造であると結論した。一方、従来法では困難であった複合体から神経毒素と無毒成分の大量分離・精製法をあらたに確立した。動的光散乱測定により純度を検定した毒素複合体(CおよびD型の4種)の結晶化を130通り実験条件により試みたが、解析に供する大きな結晶は得られていない。一方、サブユニットの種々の組合せの再構成によって調製された複合体および単一成分に対するトリプシン感受性の実験から、各サブユニット間相互作用を調べ、それらの立体的配置を推定した。これらにより、ボツリヌス毒素複合体のX線結晶解析による高次構造解析のための情報を得た。
再生可能エネルギーが大量連系されたスマートコミュニティの最適運用計画と実現

超スマート社会において、再エネを無駄なく利用するために、配電側と需要側の運用戦略による経済的かつ技術的利益の創出を目標とした。細分化した需要家から数千戸までを対象とし、様々な観点から配電系統の運用方法と需要家側の消費形態について下記の3つの側面から研究に取り組み、成果を得た。1.負荷需要応答(以下、DR)のサービス内容の提案と最適運用方法(配電側と需要家側の戦略の均衡点算出)による相互利益の創出を確認した。有効電力に関するDRと無効電力が影響を及ぼす電圧維持に関するDRをサービス内容として,需要家の無理ない参加(実際の電力消費に影響を及ぼさないこと)を提案し,DR内容の有用性を定量的に評価した。2.需要家の多様な運用と意思決定に着目した研究を行った。その際,地産地消型のスマートハウスやEVによる電力融通による災害時運用と再エネの有効活用方法について議論した。意思決定のために快適度の概念を導入することで,多目的最適化問題を定式化し,数値解析に基づく多様な需要計画を提供できることを確認した。また、低価格シングルボードコンピュータによるHEMSの作成を行った。3.再エネ導入に伴う三相不平衡問題に着目し,再エネを配電系統へ連系するための単相インバータを利用した三相不平衡補償方法について議論した。従来の不平衡指標だけでは,三相不平衡検出および補償不能な場合があることをベクトル図と数値解析により確認した。新たな不平衡指標による検出・補償方法を提案し,電力系統の安定運用に資する研究を行った。超スマート社会実現のための電力系統,特に配電系統の運用と設計について研究し,そのシステムに属する需要家も参加者として多様な戦略と運用による利益創出方法について言及しつつ、工学的に有用な研究結果を示している。配電技術,システムの構築,サービス内容の提案は総括的に超スマート社会実現に寄与する内容である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。研究は「再生可能エネルギーが大量連系されたスマートコミュニティの最適運用計画と実現」を促進するために、不確実性を含む将来の次世代電力運用者に対して、1.多様な解を提供できる多目的最適化手法の開発および評価、2.電力系統と電力市場の解析が可能なモデルの作成, 3.次世代配電系統における電気自動車(EV)の役割とV2HとV2Gによる有効無効電力制御の定量的評価を達成目標として研究を行った。研究1では特に多様な消費形態を達成するため、系統設計者または消費者目線でのトレードオフの関係を可視化することを一般的な多目的最適化手法の適用により達成した。研究2では、再生可能エネルギーが大量連系された配電系統モデルの制作と日本卸電力取引「JEPX」の電力価格予測を組み込んだ配電系統モデルを製作した。この電力系統モデルと電力の価格弾力性の特性により、価格ベースのデマンドレスポンス効果を定量的に評価した。これにより、上げ下げのデマンドレスポンスによる負荷の平準化が期待されたが、消費者の不確実性の対処が課題となった。研究3ではEVが電力系統の調整力として資する運用方法の検討を行った。消費者の行動を考慮したV2HとV2Gは充電率とインバータ制約をもとに、再エネが大量連系された配電系統の運用計画の最適化を行った。75%程度の電力損失削減と追加的な制御機器を導入せずに電圧の逸脱を解消できたことより、十分電力系統の安定性維持に貢献することを示した。上記の研究実績概要は、学術論文誌への掲載と複数の国際または国内学会にて発表した。申請当初の計画では、達成した実績の2/3程度が今年度の実施計画であったが、基礎的な電力系統モデルの簡略化や最適化手法の開発に伴い、当初の計画以上に進展している。

超スマート社会実現のための電力系統,特に配電系統の運用と設計について研究し,そのシステムに属する需要家も参加者として多様な戦略と運用による利益創出方法について言及しつつ、工学的に有用な研究結果を示している。配電技術,システムの構築,サービス内容の提案は総括的に超スマート社会実現に寄与する内容である。平成30年度は低コストHEMSの試作とその機能開発に努める。HEMS製作では研究実績より得られた多様な消費形態のための解の提供をもとに、消費者が選択可能な範囲で最適な運用計画を提供する機能開発を目的とする。また電力系統および一需要家のシミュレーションにおいては、通常時および災害時シミュレーションを行い、エネルギー確保に資するシステム構築を検討する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ウイルスベクターを用いたマツ材線虫病の分子機構の解明

マツノザイセンチュウ(以下、線虫)により引き起こされるマツ材線虫病は東アジア及び欧州の一部地域で猛威を奮っている。その発病機構は未だ不明な点が多く、根本的に問題を解決するための新たな防除手段の開発が望まれている。本研究の目的は、マツ材線虫病を引き起こす原因となると考えられる線虫病原候補因子がマツ発病に実際に関与する因子であるかを検証することである。研究の方法としては、ウイルスベクター用いてクロマツにおいて線虫遺伝子の発現およびクロマツ遺伝子の機能破壊をする。本研究では線虫病原因子およびクロマツにおける線虫感受性遺伝子を同時に明らかにできるため、その成果はマツにおける線虫抵抗性育種に応用できる。
大学ガバナンスへの学生参加に関する研究

大学の運営に学生はどう関与できるのか。この問いに対して,海外の事例を調べ,かつ我が国でもかつては存在したこの種の議論を振り返った。海外の事例としては,ノルウェーおよびスコットランドへの訪問調査を行い,情報収集につとめた。国内の歴史的展開については,戦後すぐの全国的な動向と,具体例として名古屋大学物理学教室の研究を行った。これらの活動から,西洋では国により学生の位置づけ,参加制度などに違いがあること。日本にも昔は学生参加に関する議論が国会レベルで行われたり,終戦直後から実際に取り入れられてきたことなどが明らかとなった。本研究は,国際的に広まりつつある大学運営への学生参加について,欧米の事例と日本国内での状況を比較しつつ調査を進めるものである。学生参加とは,学生が大学の運営,たとえば授業評価はもとより,学科,学部,全学レベルの意思決定機関に議決権をもったメンバーとして加わることを指す。今年度の実績であるが,1ノルウェー王国へ約1週間出張しての現地調査を実施したこと,2欧米における学生の権利に関する研究を行い,平成27年6月に大学教育学会第37回大会において報告したこと,3近年の中央教育審議会答申の作成過程で,学生の声が取り入れられることになった経緯を論文として公表したことがある。ノルウェー王国への出張は平成27年8月下旬に行った。アグデル大学(クリスチャンサンド),ノルウェー科学技術大学(トロンハイム),ソル・トロンデラグ大学(トロンハイム)の3大学を訪問し,それぞれで,大学運営と学生の意向を橋渡ししていると思われる学生団体のメンバーにインタビューを行った。これらのインタビューからは,学生の参加が大学運営で重要な役割を果たしていること,参加する学生メンバーは有給であり,それもアルバイト程度の賃金ではなく,それで生活が成り立つほどの額を得ていることが明らかとなった。大学教育学会における研究発表では,学生の権利が明文化されている事例を探して報告した。具体的には,ヨーロッパ学生連盟,アメリカ大学教授職連合,バージニア大学,ボールステイト大学,サンディエゴ州立大学,カイロ・アメリカン大学のハンドブック等である。いずれも,学生の意見を大学に伝えることができる旨が保障されていた。中央教育審議会答申作成過程における学生の関与については,文部科学省ウェブサイトに公開されている同審議会議事録をもとに研究を行い,所属機関の年報に論考を発表した。当初の計画に比べるとやや遅れている。理由としては,本研究以外の業務が当初の予測を超えて多忙化したことがあげられる。本研究は,国際的に拡大しつつある大学運営への学生参加について,西洋の実態調査および日本との比較,我が国における歴史的展開の詳細,国内の現状把握といった観点から検討するものである。なお学生参加とは,学生が大学に関する意思決定や評価活動に正式なメンバーとして関わることを指す。平成28年度の研究実績としては,1オーストラリアで開催された学生参加に関するシンポジウムおよびワークショップに参加して情報収集をしたこと。2スコットランドで開催された同国における全国レベルの学生参加支援団体の年次大会に出席して資料収集をしたこと。3日本国内における学生参加の歴史的展開について日本高等教育学会研究交流集会で発表したこと。4前記3の内容を広島大学高等教育研究開発センターが出版する学術雑誌『大学論集』に掲載できたこと。5所属機関である岐阜大学にて,岐阜大学版学生参加モデルを模索しながら既存の学生団体と教育改善について議論し,一部は実際の改革に繋げたことなどをあげることができる。また,学生参加に詳しい研究者や実践家をたずねて国内での出張も複数回実施した。上述の活動の中でもとりわけスコットランドへの出張では有益な情報を得ることができた。例えば,同国では国の質保証機関に類する全国的な機関が,学生参加を奨励・支援しており,このことは平成27年度に訪問したノルウェーが,ほぼ学生だけで学生参加活動を展開していることと好対照であった。前年度に比べて本研究以外の業務が一層多忙化したため。本研究は,我が国の高等教育界において,長らく等閑視されてきた学生の地位や権利を積極的に評価する観点から,とりわけ大学ガバナンスへの学生参加について調査するものである。調査の範囲は,欧州における実態,および日本におけるこの種の議論の歴史的展開と現状である。平成29年度の研究実績としては,1海外の実態に迫るべく,国内で開催されたシンポジウム等の会合に出席し情報収集に取り組んだこと。2国内における戦後の学生参加のケーススタディとして名古屋大学理学部物理学教室について調べたことの2つが大きな柱であった。特に2の名古屋大学の事例については,これまでの先行研究が触れてこなかった一次史料レベルの調査を展開できた。具体的には,名古屋大学において戦後すぐの様子を記録した一次史料を発掘したことをあげることができる。昭和20年代の同大学物理学教室の運営への学生参加については,同教室の実質的な運営を担った物理学者坂田昌一の手による講演録や,当時の会議の議事録など,多数の簿冊にたどり着くことができた。これらは,名古屋大学坂田史料室に存在するが,ここ以外にも同大学の大学文書資料室に多数保存されていることを突き止めた。また,この2に関しては,昭和期の同大学物理学教室を実際に知る人物に複数回面会し,話を聞くことも実現した。これらの研究から得られた知見を,平成29年10月に日本女子大学で開催された日本教育行政学会の年次大会で報告した。

国内の歴史的展開については,戦後すぐの全国的な動向と,具体例として名古屋大学物理学教室の研究を行った。これらの活動から,西洋では国により学生の位置づけ,参加制度などに違いがあること。日本にも昔は学生参加に関する議論が国会レベルで行われたり,終戦直後から実際に取り入れられてきたことなどが明らかとなった。平成28年度は,昨年度の遅れを取り戻すべく努力している。具体的な方策としては,国内での出張調査を年度初めから密に行うことで,研究活動のペースを維持することである。進捗は遅れているものの,過去2ヶ年の研究により方向性は明確化できている。よって今後は欧州の実態調査に注力することで遅れを取り戻すことが可能であると考えている。高等教育論勤務校における本研究以外の業務が,当初の予想を超えて多忙化したため。勤務校における本研究以外の業務が,一層多忙化したことにより,当初平成28年度中に開催を予定していた学生参加に関するシンポジウムが開催できなかったため。平成28年度は国内の出張調査を密に行うことで研究を活発化する,そして,適宜謝金を用いてアルバイトを雇用するため,これらの額を使うことができると考えている。最終年度となる平成29年度には,これまでの研究成果を公表するシンポジウムの開催を予定しており,適切に執行できる見込みである。
VIP受容体蛋白質の分離とその遺伝子解析

イヌ各組織の^<125>I-VIP結合実験の結果,イヌの肝臓と大腸粘膜で分析可能な量の^<125>I-VIP結合が観察された.イヌ肝臓粗製膜標本へのVIP結合はすばやく生じ,飽和性,可逆的,かつ親和性が高く,受容体への結合と考えられた.GTP,GTPγs及びGDPは同じ濃度範囲で^<125>I-VIP結合を抑制したが,GDPβsとGMPはその力価は弱く,ATPの1mMでも抑制効果を示さなかった.非標識ペプチドによる^<125>I-VIP結合阻止実験の結果,ペプチドの結合力価はVIP>pituitary adenylate cyclase activating peptide(PACAP)27>PACAP38>>peptide histidine isoleucine(PHI)=secretinであった.PHIとsecretinはイヌではVIPよりも5000倍と極端に力価が低く,イヌ肝臓のVIP受容体のVIP認識部位はいままで報告されたVIP受容体と大きく異なっていると思われる.Ishiharaら(neuron,1992,8,811-819)が,ラット肺からVIP受容体タンパク質のcDNAをクローニングした.そこで,VIP結合特性が大きく異なるイヌ肝臓VIP受容体の遺伝子をクローニングするため,ラット肺VIP受容体cDNAよりプライマーを合成し,ラット肝臓VIP受容体をコードするcDNAを鋳型としてPCR法により遺伝子増幅をおこないプローベを作成した.イヌ肝臓cDNAライブラリーのスクリーニングの結果,4個の陽性クローン(約1-1.5kb)を得た.その中の1クローン(#35)はラットパラサイロイドホルモン受容体遺伝子と高度なホモロジーを有していた.#102クローンはラットVIP受容体遺伝子の膜貫通領域(M1)と類似のアミノ酸配列をもつことが明らかとなった.残りのクローン#201と#513に関してはアミノ酸の類似性は余り大きくなかった.#102クローンがイヌVIP受容体遺伝子をコードしている可能性が考えられるため,さらにデリーションクローンを作成し,この遺伝子の全塩基配列を調べている.イヌ各組織の^<125>I-VIP結合実験の結果,イヌの肝臓と大腸粘膜で分析可能な量の^<125>I-VIP結合が観察された.イヌ肝臓粗製膜標本へのVIP結合はすばやく生じ,飽和性,可逆的,かつ親和性が高く,受容体への結合と考えられた.GTP,GTPγs及びGDPは同じ濃度範囲で^<125>I-VIP結合を抑制したが,GDPβsとGMPはその力価は弱く,ATPの1mMでも抑制効果を示さなかった.非標識ペプチドによる^<125>I-VIP結合阻止実験の結果,ペプチドの結合力価はVIP>pituitary adenylate cyclase activating peptide(PACAP)27>PACAP38>>peptide histidine isoleucine(PHI)=secretinであった.PHIとsecretinはイヌではVIPよりも5000倍と極端に力価が低く,イヌ肝臓のVIP受容体のVIP認識部位はいままで報告されたVIP受容体と大きく異なっていると思われる.Ishiharaら(neuron,1992,8,811-819)が,ラット肺からVIP受容体タンパク質のcDNAをクローニングした.そこで,VIP結合特性が大きく異なるイヌ肝臓VIP受容体の遺伝子をクローニングするため,ラット肺VIP受容体cDNAよりプライマーを合成し,ラット肝臓VIP受容体をコードするcDNAを鋳型としてPCR法により遺伝子増幅をおこないプローベを作成した.イヌ肝臓cDNAライブラリーのスクリーニングの結果,4個の陽性クローン(約1-1.5kb)を得た.その中の1クローン(#35)はラットパラサイロイドホルモン受容体遺伝子と高度なホモロジーを有していた.#102クローンはラットVIP受容体遺伝子の膜貫通領域(M1)と類似のアミノ酸配列をもつことが明らかとなった.残りのクローン#201と#513に関してはアミノ酸の類似性は余り大きくなかった.#102クローンがイヌVIP受容体遺伝子をコードしている可能性が考えられるため,さらにデリーションクローンを作成し,この遺伝子の全塩基配列を調べている.(1)Vasoactive intestinal peptide(VIP)受容体の存在を調べるために,イヌの各組織の膜分画を採取し, ^<125>I標識VIPを用いて総合実験を行った。VIP受容体量は,肝臓>大腸粘膜=小腸粘膜>大腸平粘膜>胃粘膜=小腸,胃平滑筋=脳で順であった。大腸平滑筋よりもVIP結合量の少ない組織では,その分析は困難であった。(2)イヌ肝臓細胞膜へのVIP結合は飽和性であり,高親和性で結合量の少ない結合部位と,低親和性で結合量の多い結合部位に分離できた。(3)肝臓細胞膜への標識VIP結合は,VIP濃度に依存して阻止され,そのIC_<50>は1nMであった。構造類似ペプチドであるpeptide histidine isoleucineは千倍力価が低く,他の組織と比べてVIP特異性が極めて高いことが明らかとなった。(4)1991年にBIP受容体をコ-ドする遺伝子がヒトリンパ球よりクロ-ニングされた。その結果,VIP受溶体は7つの膜貫通領域を持つGタンパク質と関連した362アミノ酸からなるタンパク質であることが明らかとなった。しかし,細胞に発現された受容体への標識BIPの結合は,イヌ肝臓のそれと著しく異なっていた。(5)そこで,受溶体の分離実験を中止し,イヌBIP受溶のサブタイプを調べる実験に変えた。

(6)イヌ小腸のmRNAからオリゴdTプライマ-により作成したcDNAをラムダファ-ジに組替え,cDNAライブラリ-とした。(7)ヒトVIP受溶体をコ-ドする遺伝子の約500塩基離れた2ケ所(20塩基)の塩基にEcoR1とHind3の認識塩基配列を付けたプライマ-を合成した。イヌ小腸のcDNAライブラリ-を鋳型として,プライマ-を用いてPCR法により遺伝子増幅を行った結果,約500塩基対の増幅が認められた。(7)現在,このDNA断片をプラスミドに組み込み,大腸菌の形質転換を行い,そのDNA解析を進めている。VIP受容体タンパク質分離の過程でVIP受容体遺伝子がクローニングされたので,受容体分離実験を中止し,直接遺伝子クローニングを実施した。イヌ肝臓のVIP受容体のVIP認識部位はいままで報告されたVIP受容体と大きく異なり,イヌ肝臓VIP受容体はVIP受容体の亜型である可能性があるので,この受容体の遺伝子クローニングを行った。Sreedharanら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88,4986)によりヒトリンパ球のcDNAライブラリーからVIP受容体をコードするcDNAがクローニングされたので,これよりプライマーを合成しPCR法による遺伝子増幅を行った。しかし,Ishiharaら(neuron,1992,8,811-819)が,ヒトリンパ球からクローニングした遺伝子と類似したcDNAとラット肺から新しいVIP受容体タンパク質のcDNAをクローニングし,前者のタンパク質にはVIP結合能がないことを示した。そこで,VIP結合特性が大きく異なるイヌ肺臓VIP受容体の遺伝子をクローニングするため,ラット肺VIP受容体cDNAより再度プライマーを合成し,ラット肺臓VIP受容体をコードするcDNAを鋳型としてPCR法により遺伝子増幅をおこないプローベを作成した。イヌ肝臓cDNAライブラリーのスクリーニングの結果,4個の陽性クローン(約1-1.5Kb)を得た。その中の1クローン(#35)はラットパラサイロイドホルモン受容体遺伝子と高度なホモロジーを有していた。#102クローンはラットVIP受容体遺伝子の膜貫通領域(M1)と類似のアミノ酸配列をもつことが明かとなった。残りのクローン#201と#513に関してはアミノ酸の類似性は余り大きくなかった。#102クローンがイヌVIP受容体遺伝子をコードしている可能性が考えられるため,さらにデリーションクローンを作成し,この遺伝子の全塩基配列を調べている。
ミトコンドリア融合とDNA組換えの動的・分子形態学的解析

昨年度の研究成果に基づき,ミトコンドリアやミトコンドリア核融合過程を遺伝的に制御し,mtDNAの組換えを誘起しmtDNAの大幅な構造変換に関与するミトコンドリア融合課程を動的・分子形態学的に解析した.真正粘菌Physarum polycephalumのミトコンドリア融合は特殊なミトコンドリアプラスミドによって誘起される.このmFプラスミドに注目して,粘菌アメーバ接合時のミトコンドリアとミトコンドリア核の挙動をDAPI蛍光顕微鏡法およびDiOC7を用た生体蛍光顕微鏡法を用いて解析した.粘菌アメーバの交配型遺伝子はmatAやmatBばかりでなくmatCも考慮し,粘菌アメーバの接合頻度を高めた.また,ミトコンドリアの融合頻度はミトコンドリアの交配型遺伝子であるmitA1,2,3を組合わせ,高頻度ミトコンドリア融合を可能にした.その結果,mFプラスミドを持たない株同士の接合では,ミトコンドリアの融合は起こらないが,mFプラスミドを持いる粘菌アメーバを交配すると接合期にミトコンドリア融合が誘起されることが確かめられた.この時期のミトコンドリア融合は同一接合子内の全ミトコンドリアが融合し,多核だったミトコンドリア核が1本になってしまうという激しいもので,mFプラスミドの優先的な伝達やミトコンドリア染色体の組換えが十分可能になるものであることがわかった.また,変形体の3つの不和合性遺伝子fusA,B,Cを揃え,変形体を融合させた場合にもミトコンドリアが融合し,mFプラスミドの優先的な伝播が起こることも確かめた.ミトコンドリア融合に直接関与する遺伝子を同定するため,ミトコンドリア融合欠損変異株を単離し,その欠損領域を解析した.全ての融合欠損変異株に共通してミトコンドリアDNAと組換えを起こす領域の近傍がmFプラスミドから欠損しており,そこには376アミノ酸残基のORFがあることがわかった.現在,先のORFを起点にmFプラスミドの全塩基配列を決定しつつあり,mFプラスミドの末端にはプラスミドの安定性,伝播能力あるいは線状DNAの複製様式に深く関わると考えられる複雑な構造の繰り返し配列があることも明らかになっている.真正粘菌のミトコンドリアはアメ-バ(n)の接合期と変形体(2n)の子実体形成期に融合し、mtDNAの高頻度組換えを引き起こす。この融合にはミトコンドリアのプラスミドが直接関与している。ミトコンドリア非融合株のmtDNA(M型)は約86kbpの線状分子で、約20kbpの同方向に並んだ重複領域を末端付近に持ている。このM型のmtDNAを持つアメ-バ株に、融合株でN型のmtDNAとプラスミドを持つアメ-バ株を交配した。この交配によって得られた変形体にはプラスミドとどちらの親型とも異なる組換え型のmtDNAが遺伝していた。組換え型mtDNAを調べたところ、それは基本的には非融合株のもので、重複領域にプラスミドが挿入されていることがわかった。プラスミドは約125bpの繰り返し構造を末端に持つ約16kbpの線状分子であり、この挿入によってプラスミドの末端が組換え型mtDNAの新たな末端になっていた。挿入領域の塩基配列を調べたところ、mtDNAとプラスミドの両方に477bpのほぼ完全な相同配列が存在しており、プラスミドは相同組換えによって挿入されることがわかった。ミトコンドリア融合株から融合欠損株を単離し、そのmtDNAを解析したところ、全ての融合欠損株でプラスミドの挿入領域の一方の近傍が約300bp欠失しており、この領域にミトコンドリア融合遺伝子が存在することが明らかになった。真正粘菌の予実体形成期は同調的に誘導でき、胞子内ではミトコンドリアは融合した状態で静止している。胞子内の多核ミトコンドリアの出現頻度をDAPI蛍光顕微鏡法で解析し、ミトコンドリア融合頻度に差異のある株を単離した。これらの株を交配し、融合頻度を制御する細胞核の複対立遺伝子(mitAlー3)の存在を見いだした。このようにしてミトコンドリア融合遺伝子と融合頻度の制御遺伝子が同定できたことで、ミトコンドリアの融合を任意に制御し、ミトコンドリア融合とmtDNAの組換えの分子機構を動的・分子形態学的に解析することが可能となった。昨年度の研究成果に基づき,ミトコンドリアやミトコンドリア核融合過程を遺伝的に制御し,mtDNAの組換えを誘起しmtDNAの大幅な構造変換に関与するミトコンドリア融合課程を動的・分子形態学的に解析した.真正粘菌Physarum polycephalumのミトコンドリア融合は特殊なミトコンドリアプラスミドによって誘起される.このmFプラスミドに注目して,粘菌アメーバ接合時のミトコンドリアとミトコンドリア核の挙動をDAPI蛍光顕微鏡法およびDiOC7を用た生体蛍光顕微鏡法を用いて解析した.粘菌アメーバの交配型遺伝子はmatAやmatBばかりでなくmatCも考慮し,粘菌アメーバの接合頻度を高めた.また,ミトコンドリアの融合頻度はミトコンドリアの交配型遺伝子であるmitA1,2,3を組合わせ,高頻度ミトコンドリア融合を可能にした.その結果,mFプラスミドを持たない株同士の接合では,ミトコンドリアの融合は起こらないが,mFプラスミドを持いる粘菌アメーバを交配すると接合期にミトコンドリア融合が誘起されることが確かめられた.

この時期のミトコンドリア融合は同一接合子内の全ミトコンドリアが融合し,多核だったミトコンドリア核が1本になってしまうという激しいもので,mFプラスミドの優先的な伝達やミトコンドリア染色体の組換えが十分可能になるものであることがわかった.また,変形体の3つの不和合性遺伝子fusA,B,Cを揃え,変形体を融合させた場合にもミトコンドリアが融合し,mFプラスミドの優先的な伝播が起こることも確かめた.ミトコンドリア融合に直接関与する遺伝子を同定するため,ミトコンドリア融合欠損変異株を単離し,その欠損領域を解析した.全ての融合欠損変異株に共通してミトコンドリアDNAと組換えを起こす領域の近傍がmFプラスミドから欠損しており,そこには376アミノ酸残基のORFがあることがわかった.現在,先のORFを起点にmFプラスミドの全塩基配列を決定しつつあり,mFプラスミドの末端にはプラスミドの安定性,伝播能力あるいは線状DNAの複製様式に深く関わると考えられる複雑な構造の繰り返し配列があることも明らかになっている.