hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
２つのＲｅｃＡホモログＲａｄ５１、Ｄｍｃ１の集合反応の分子レベルでの統括的理解

DNA相同鎖検索反応は組換えの根幹をなす反応であり、真核生物ではRecAのホモログRad51が体細胞分裂期の組換えに機能する一方、減数分裂期組換えにはRad51に加え、減数分裂期特異的RecAホモログDmc1が働く。Rad51, Dmc1ともにDNA上のフィラメント構造は類似していて、その特異性は一緒に働く正,負の因子群の働きにより決まる。本研究は、Rad51, Dmc1によるDNA鎖相同検索反応の分子基盤を理解するために、Rad51集合を助ける新規因子、Psy3-Csm2-Shu1-Shu2複合体の構造学解析に基づく分子論的機能解析、Dmc1の集合を担うMei5-Sae3複合体の構造解析に加え、統括的に体細胞、減数分裂期の組換えの特性を分子レベルで理解することを目的とする。本年度はPsy3-Csm2-Shu1-Shu2複合体, Psy3-Csm2, Shu1-Shu2のサブ複合体を精製して、その生化学的性質を同定した。その結果、Psy3-Csm2二量体であるサブ複合体にDNA結合能があることが分かった。現在、Psy3-Csm2-Shu1-Shu2 4量体、,コア要素であるPsy3-Csm2複合体のX線構造解析に取り組んでいる。遺伝的な解析を用いて、この複合体がRad51のフィラメント形成を促進することが示されているが、クロマチン免疫沈降法により、Rad52, Rad55-57とは独立して染色体に結合することでRad51のフィラメント形成を促すことが示唆された。一方、Dmc1のメデエイターであるMei5の結合する因子として、この因子にFlagタグを導入した株を作成し、その親和性精製により、Mei5と結合するタンパク質を同定する系を作り上げた。複数種類のタンパク質が同定出来、Mei5と複合体を形成するSae3やDmc1が存在することも確認している。また、Mei5-Sae3は結晶化にも成功している基礎生物学組換え反応に中心的な役割を果たすRad51の集合を促す新規のタンパク質複合体、Psy3-Csm2-Shu1-Shu2四量体を同定した。この複合体のコアであるPsy3-Csm2がDNA結合活性を持つことを見つけた。さらに、Psy3-Csm2二量体のX線構造解析を目指し、その結晶化に成功し、さらに、将来構造を得るだけに十分な回折像を得ている。同時にDmc1の集合を促すことが知られているMei5-Sae3の構造解析のもとになる結晶化にも成功した。タンパク質複合体の構造的視点から2つのRecAホモログ、Rad51, Dmc1の減数分裂期の組換えの機能分担に関する情報が得ることが期待でき、今後の大きな進展が期待できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。組換え反応に中心的な役割を果たすRad51の集合を促す新規のタンパク質複合体、Psy3-Csm2-Shu1-Shu2四量体を同定した。さらに、Psy3-Csm2二量体のX線構造解析を目指し、その結晶化に着手している。同時にDmc1の集合を促すことが知られているMei5-Sae3の構造解析のもとになる結晶化にも取り組んでいる一方、Mei5と相互作用する新奇の因子を同定できる系を開発した。今後に大きな展開ができる。特に、タンパク質複合体の構造的視点から2つのRecAホモログ、Rad51, Dmc1の減数分裂期の組換えの機能分担に関する情報が得ることが期待でき、今後の大きな進展が期待できる。Rad51の集合を促すPsy3-Csm2-Shu1-Shu2(PCSS)四量体のコアであるPsy3-Csm2がDNA結合活性を持つことを見つけた。
咬合の変化が精神不安に及ぼす影響

ラットの上顎大臼歯を一側性または両側性に抜去し、学習および記憶への影響を八方向迷路と受動回避装置を用いて調べた。その結果、1日1回、10日間行った迷路実験では1日目を除いて、正解の数に大臼歯片側抜去群、両側抜去群と対照群の間で差を認めなかった。しかし、両側抜去群のエラーの数は1、2、3、4および7日目において対照群よりも有意に低値であった。受動回避行動実験では、ラットを明室に入れ暗室に移動した直後に電気刺激を与えた(訓練試行)。24時間後保持試行を行い、明室にとどまった時間を最長600秒測定したが、保持試行における反応潜時は訓練試行における反応潜時よりも長かった。保持試行における反応潜.0時は抜歯数が多くなるにしたがって短くなった。今回の研究の結果により、臼歯喪失は学習および記憶を障害することが明らかなった。近年,補綴治療を契機として心身症が引き起こされた症例や,口腔神経症的反応を示す症例が数多く報告されている.このような症状の発症には咬合の変化が口腔感覚-運動系の神経系にうまく順応できず,ストレッサーとなり,様々な身体・心理的な反応を引き起こした結果と推察することができる.しかし,咬合の変化と臨床症状の因果関係は未だに解明されていない.平成19年は予備実験として,臼歯を抜歯したラットで受動的回避実験を行った.この実験はドアによって仕切られた明室と暗室の二室からなるステップスルー型受動的回避実験装置を用い,明室に入れたラットが暗室に入った直後にフットショックを与えた.この時の明室から暗室に移動する時間を反応潜時とし,獲得試行と再生試行の2試行の反応潜時を測定した.実験の結果,抜歯群の再生試行の反応潜時は対照群に比べて有意に短縮した.また,この実験では,海馬におけるグルタミン量も同時に測定した.実験の結果,グルタミン量に群間の有意差は無かったが,獲得試行時において,抜歯群のグルタミン量は対照群に比べて有意に少なかった.これらの結果は臼歯の咬合が確立されているラットに比べ,臼歯を喪失したラットは学習・記憶能力が低下していることが明らかにされた.歯科臨床において,口腔内に慢性的な疼痛や不快感を訴える患者は多い.このような患者は必要な歯科治療を行い,明らかな歯科疾患が治癒した後でも主訴が消失しない場合も多々見受けられる.そして,このような患者は治癒の兆しがわからないということに不安感を訴えるようになる場合も多く,歯科医師としてどのような治療を行っていけばよいのかわからなくなる.このような症例を経験していく中で,神経因性疼痛が情動に及ぼす影響を科学的に明らかにしていく必要があると感じ,今回の研究を開始した.今回は受動的回避装置と人方向迷路を用いてCCIモデルラットの学習能力と記憶能力の評価を行い,神経因性疼痛を有するラットの学習記憶能を客観的に評価した.その結果,神経因性疼痛を有するラットの学習記憶能が向上するという結果が得られた。また, NMDA受容体拮抗薬のケタミン, MK-801を与えたラットでは対照群と同様に学習記憶能の低下が起こった.今回の結果は神経因性疼痛を有する場合には学習記憶能が低下するという一般的な結果と異なっていた.これは神経因性疼痛の持続的な疼痛刺激による記憶の長期増強の維持が推察された.また, NMDA拮抗薬の投与により,持続的な長期増強が抑制されることも推察された.このような結果を踏まえて,今後も神経因性疼痛が情動に及ぼす影響を明らかにしていく予定である.
神経破壊剤による交感神経節ブロック後の、交感神経機能の再生機構についての検討

平成22年度はラットの神経破壊剤による星状神経節ブロック(SGB)モデルにおいてどの程度の期間で交感神経機能が開腹してくるのを観察した。当初の予想に反してアルコールによる星状神経節破壊モデルにおいては12ヶ月以上経過してもホルネル兆候の回復をみなかった。よって当初予定していた交感神経節の再生に関する研究は困難なものとなった。また、ラット顔面への交感神経の分布がブロックによってどのように変化するのかを観察する目的で、逆行性神経標識物質であるフルオロゴールドを生食を用いて1%に希釈し、下垂が見られるラット上眼瞼に注入後3日でラットを灌流固定、上眼瞼、交感神経節(上頚神経節・星状神経節・頚部脊髄)を摘出し、免疫組織学的検討を行うべく組織切片を作成した。なお、研究代表者は平成21年10月中旬から平成22年2月上旬まで健康上の理由から入院・自宅療養の必要が生じ、その後も療養に時間を要したため、その研究においては協力者である横浜市立大学医学部神経解剖学教室紙谷義孝助教の協力のもと進められたが、予想と反する結果であったこともあり当初の計画よりかなり縮小した研究とならざるを得なかった。平成21年度はラットの神経破壊剤による星状神経節ブロック(SGB)モデルの作製及びその条件検討を行った。まず至適なブロック法を検討する目的で、すでに報告のある2つの方法(後方進入法・側方進入法)で、神経破壊剤として100%エタノール(200μL)を用いてブロックを行った。交感神経ブロック成功の可否は、ホルネル兆候(ブロック側の眼瞼下垂、眼球陥凹)により判定した。側方進入法では8匹のラット(300g)のうち3匹が薬剤注入直後に死亡、3匹が注入後3日目までに死亡した。注入直後に死ななかったラット2匹にはホルネル兆候が認められた。後方進入法では8匹のラットのうち1匹が1日目に死亡した。その他のラットはすべて生存しホルネル兆候を伴っていた。生存したラットのうち、後方法の5匹で注入側の上肢の運動麻痺を生じ、うち2匹には同部位の自傷行為が認められた。以上の結果から、SGBのアプローチは後方法と決定した。ついで投与量を決めるために、後方アプローチでアルコール注入量を100μL、50μLと減じ各6匹ずつ行った。100μLでは6匹中4匹が、50μLでは6匹中3匹のブロックに成功し、同量を追加投与することにより、100μL群では6匹すべて、50μL群では5匹のブロックに成功した。以上からアルコールの投与量は100μLと決定した。200μL群は18週まで経過を観察し、16週過ぎからホルネル兆候の減弱を見たが、その後の実験を行う前に施設的な問題によりラットを殺処分せざるを得なかった。現在100μL群、50μL群を10週まで経過観察中である。その他、免疫組織学実験・生化学的実験の予備実験を行った。なお、研究代表者は平成21年10月中旬から平成22年2月上旬まで健康上の理由から入院・自宅療養の必要が生じため、当初の計画よりかなりの遅れが生じていることを申し添える。
省エネ・高効率永久磁石同期電動機の設計法の体系化と設計支援システムの構築

高効率電動機である永久磁石同期電動機について、要求仕様よりモータ構造とその基本構造パラメータを決定できる設計支援システムについて研究した。まず、モータを駆動するときの電圧と電流の制約条件および制御方法を考慮して、要求される速度ートルク特性を満たすモータモデルのパラメータの範囲を導出した。導出されたモータパラメータとモータのパーミアンスモデルに基ずく関係式より、永久磁石同期電動機の各種構造パラメータを決定するアルゴリズムを構築した。本課題に関連する研究資料として,永久磁石同期モータ(PMSM)の各種構造やその解析結果、特性などについて、電気学会やIEEEなど関連する国内外の学会、研究会の論文・資料等を収集し、整理・分析を行った。この結果をもとにして代表的なPMSMの構造の選定を行い、本研究で最初に扱うモータを決定した。PMSMの特性はモータ構造およびそれによって決まるモータパラメータだけでなく,制御法によっても大きく影響を受ける。そこで,モータに供給できる電圧や電流などの制約条件を考慮して、モータ電流の振幅と位相(電流ベクトル)を最適に制御することで得られる速度ートルク特性とモータパラメータ(IPMSMの数学モデルにおけるパラメータである永久磁石による電機子鎖交磁束およびd,q軸インダクタンス)の関係を明らかにした。この関係をもとに要求される速度ートルク特性からそれを満たす各種モータパラメータの範囲を導出した。また,この関係を各種容量のPMSMに適用できるように一般化するために単位法による表現も導出した。表面磁石同期モータにおいて,設計パラメータ(寸法、形状)とモータパラメータの関係をパーミアンスモデルをもとにして導出した。前記のとおり導出した速度ートルク特性とモータパラメータの関係および設計パラメータとモータパラメータの関係より,モータパラメータを中間変数として設計パラメータとモータ特性の関係を数式で表現することができた。この関係をもとにして,要求仕様(速度ートルク特性)を満たすモータの設計パラメータを導出する手法を構築した。本課題に関連する研究資料として,永久磁石同期モータ(PMSM)の各種構造やその解析結果、特性などについて、電気学会やIEEEなど関連する国内外の学会、研究会の論文・資料等を継続して収集し、整理・分析を行った。昨年度、モータに供給できる電圧や電流などの制約条件を考慮して、モータ電流の振幅と位相(電流ベクトル)を最適に制御することで得られる速度ートルク特性とモータパラメータ(永久磁石による電機子鎖交磁束およびd,q軸インダクタンス)の関係を明らかにしたが、この関係をさらに厳密に表現するための改良を加えた。表面磁石同期モータについて、要求される速度ートルク特性から得られるモータパラメータの範囲とステータ外径およびエアギャップ長を与えることで、モータの積厚、ロータ外径、ヨーク幅、ティース幅および磁石寸法を決定するアルゴリズムを完成させた。また、各設計変数には自由度があるため、各構造寸法の選択可能範囲や特性への影響などについて検討し、構造寸法選択の目安を明らかにした。具体的な設計事例として、2つの要求出力点を設定して表面磁石同期モータを設計し、得られた構造寸法を有するモータの特性を有限要素法による磁界解析で評価して要求仕様を満足していることを確認した。また、これらの研究成果を国内の関連学会で2回発表した。より設計自由度のある埋込磁石同期モータについても設計パラメータ(寸法、形状)とモータパラメータの関係をパーミアンスモデルをもとにして導出した。モータパラメータと構造の仕様(ステータ外径およびエアギャップ長)より、各種構造パラメータを導出する手法について検討中である。モータの電圧・電流の制約条件を考慮したときの速度ートルク特性とモータパラメータ(永久磁石による電機子鎖交磁束およびd,q軸インダクタンス)の関係を表す方法は完成した。表面磁石同期モータについて、要求される速度ートルク特性(複数の要求出力点)からモータの構造パラメータを決定するアルゴリズムが完成した。さらに、その有効性を磁界解析を用いて検証した。埋込磁石同期モータについても設計パラメータ(寸法、形状)とモータパラメータの関係をパーミアンスモデルをもとにして導出したが、表面磁石同期モータに比べて設計変数の自由度が大きいため構造寸法を決定する手法について、継続して検討中である。永久磁石同期電動機(PMSM)の特性はモータ構造およびそれによって決まるモータパラメータだけでなく,制御法によっても大きく影響を受ける。そこで,モータに供給できる電圧や電流などの制約条件を考慮して、モータ電流の振幅と位相を最適に制御することで得られる速度ートルク特性とモータパラメータ(永久磁石による電機子鎖交磁束およびd,q軸インダクタンス)の関係を明らかにした。表面磁石同期電動機(SPMSM)において,設計パラメータ(寸法、形状)とモータパラメータの関係をパーミアンスモデルをもとにして導出した。前記のとおり導出した速度ートルク特性から得られるモータパラメータの範囲とステータ外径およびエアギャップ長を与えることで、モータの積厚、ロータ外径、ヨーク幅、ティース幅および磁石寸法を決定するアルゴリズムを完成させた。具体的な設計事例として、2つの要求出力点を設定してSPMSMを設計し、得られた構造寸法を有するモータの特性を有限要素法による磁界解析で評価して要求仕様を満足していることを確認した。埋込磁石同期電動機(IPMSM)について、設計パラメータとモータパラメータの関係をパーミアンスモデルをもとにして導出した。また、モータパラメータから各種構造パラメータを決定するアルゴリズムを構築した。

具体的な設計事例として、2つの要求出力点を設定してIPMSMを設計し、得られた構造寸法を有するモータの特性を有限要素法による磁界解析で評価して要求仕様を満足していることを確認した。高効率電動機である永久磁石同期電動機について、要求仕様よりモータ構造とその基本構造パラメータを決定できる設計支援システムについて研究した。まず、モータを駆動するときの電圧と電流の制約条件および制御方法を考慮して、要求される速度ートルク特性を満たすモータモデルのパラメータの範囲を導出した。導出されたモータパラメータとモータのパーミアンスモデルに基ずく関係式より、永久磁石同期電動機の各種構造パラメータを決定するアルゴリズムを構築した。関連研究資料の収集と整理・分析を完了した。表面磁石同期モータにおいて,モータパラメータを中間変数として設計パラメータと電動機特性の関係を数式で表現し,要求仕様を満たすモータの設計パラメータを導出する手法を構築できた。しかし,埋込磁石同期モータについての検討がまだ十分ではない。磁界解析による形状パラメータと出力特性の関係の明確化については,さらに解析を進める必要がある。埋込磁石同期モータについて,モータパラメータ(永久磁石による電機子鎖交磁束およびd,q軸インダクタンス)から各種構造パラメータを決定するアルゴリズムを構築する。埋込磁石同期モータは構造設計自由度が非常に高いため、代表的な基本構造に的を絞るとともに、磁界解析の結果も利用して各種構造寸法とモータパラメータおよびモータ特性の関係を明らかにする。これらの結果をもとにして埋込磁石同期モータの設計支援システムを構築し、その有効性を検証する。電気機器工学・パワーエレクトロニクス表面磁石同期モータに比べて設計自由度が高い埋込磁石同期モータについて,主要な形状パラメータとモータパラメータおよびモータ特性の関係を磁界解析を用いて明らかにする。埋込磁石同期モータについて,モータパラメータを中間変数として設計パラメータと電動機特性の関係を数式で表現し,要求仕様を満たすモータの設計パラメータを導出する手法を構築する。また,設計支援システムを用いて設計したモータの特性をシミュレーションで評価する。当該年度に予定していた成果発表のための国際会議への出張が研究進捗の遅れにより行えなかったため。当該年度に予定していた調査等のための国際会議への参加が行えなかったため。関連研究の調査および研究成果の発表のため、国内の学会および国際会議に参加する予定であり、学会参加費および出張費を使用する。埋込磁石同期モータにおける設計支援システムの構築が遅れているため、磁界解析により各種構造寸法とモータパラメータおよびモータ特性の関係を明らかにする必要があり、これを加速的に進めるために電磁界解析ソフトウェア(JMAG-Designer Ver.15.0 (株式会JSOL))とパソコンを購入する。
日本古代宮都の官衙配置の研究

木簡・墨書土器をはじめとする出土文字資料、『続日本紀』・正倉院文書などの文献史料から平城宮・京の構造を考えるための基礎的な史料の抽出を行い、それぞれのもつ歴史的な意義を整理した。そして、律令国家形成の舞台であり、古代を代表する都城としての平城宮の官衙・宮殿の配置について考察した。この成果に基づき、平城宮をはじめ古代の宮都の構造を考えるための基礎資料を編年順に並べ、一つ一つのもつ意義を綱文として端的に示し、かつ重要事項について註釈を加えた史料集である『平城宮編年史料集成(稿)』を編集し、冊子体の報告書の主体とした。本史料集は、3ヵ年の研究の基礎作業であると同時に、研究成果の集大成としての性格を併せもっている。史料集の註釈の形ではあるが、3ヵ年の研究成果に基づく現在の知見を盛り込むことができたと考える。また、研究成果の概略は、別掲の論考などで逐次発表したが、特に、2001年10月13日に行った九州史学研究会大会(於九州大学)における公開講演「平城宮・京の構造と出土文字資料」はその要旨を述べたものである。そこで、冊子体の報告書においても、『平城宮編年史料集成(稿)』とともに、この講演を元にその後の研究成果を加味して活字化した「平城宮・京の構造と出土文字資料」(『九州史学』134、2001年11月)に、さらに補訂・加筆した論考を掲載した。なお、平城宮の全体像と歴史的な流れについての私見を盛り込んだ概説書『平城京と木簡の世紀』(講談社版日本の歴史04巻)を別に刊行しているので、併せて参照されたい。木簡・墨書土器などの出土文字資料の出土位置図については、なお検討を要する部分が多く、付図の形でその概略を示すにとどめた。発掘成果と文献史料の研究成果の融合という当初の目的は、なお課題として残っていることを銘記しておく。研究の初年度にあたる平成12年度は、これまでの研究成果を踏まえた上で、3年計画の研究の準備として以下のような作業を行った。(1)木簡・墨書土器を始めとする出土文字資料のうち、宮城の構造を考える素材となる史料を抽出して整理する作業を行い、どのような文字資料がどこから出土しているかの全体的な把握を目指した。その上で、出土遺構と合わせて当該地の性格を考察した。(2)正倉院文書など奈良時代の文書史料から、平城宮などの都城関連史料を抽出する作業を行った。この作業の過程で国立歴史民俗博物館所蔵の正倉院文書レプリカの熟覧を行い、その成果を活用した。(3)続日本紀など編纂史料から都城関連史料を抽出する作業を行った。(4)従来、平城宮で遺構の性格の推定がなされている官衙について、その根拠などを再検討するための資料整理を行った。以上の作業はいずれも継続中であり、まとまった成果として公表するには至っていないが、その一事例として別掲の「阿弥陀浄土院と光明子追善事業」を活字化し、正倉院文書熟覧の成果として「二つの新任国司食料支給と公廨食法・国司巡行食法」を公表した。また、『平城京と木簡の世紀』を刊行し、平城宮の全体像と歴史的な流れについて現在の知見を盛り込んだ。研究の第2年度にあたる平成13年度は、初年度の研究成果を踏まえ、その継続を中心として、以下のような作業を行った。

(1)初年度に行った平城宮の構造を考える素材となる木簡・墨書土器の収集作業の補足整理を行い、そのデータとしての入力、及び出土位置図を作成した。また、その結果に基づいて、平城宮内の官衙名推定を行うとともに、従来の官衙名比定の妥当性について考察した。その成果の一部は、2001年10月13日に行った九州史学研究会大会(於九州大学)において、「平城宮・京の構造と出土文字資料」と題する公開講演を行い、公表した。(2)初年度に引き続き、正倉院文書など奈良時代の文書史料から、平城宮などの官衙や構造に関する史料を抽出する作業を行った。この作業の過程で、初年度に引き続き、国立歴史民俗博物館所蔵の正倉院文書レプリカの熟覧を行い、その成果を活用した。(3)続日本紀など編纂史料から都城関連史料を抽出する作業を初年度に引き続き行った。(4)都城研究の嚆矢である裏松固禅の『大内裏図考証』のうち、大内裏内の官衙に関する史料について、その研究成果の再検討を行った。これについては、最終年度も引き続き作業を継続して行う予定である。研究の最終年度(第3年度)にあたる平成14年度は、過去2カ年にわたる研究成果を踏まえ、それを継続しつつ総まとめとして、以下のような作業を行った。(1)初年度、及び第2年度に行った平城宮の構造を考える素材となる木簡・墨書土器の収集作業の補足整理を行い、出土位置図を補訂した。また、昨年口頭報告し今年度活字化された「平城宮・京の構造と出土文字資料」における官衙配置の検討の妥当性について改めて検討を加えた。(2)初年度、及び第2年度に引き続き、正倉院文書など奈良時代の文書史料から、平城宮などの官衙や構造に関する史料を抽出する作業を行った。この作業の過程で、引き続き、国立歴史民俗博物館所蔵の正倉院文書レプリカの熟覧を行い、その成果を活用した。(3)続日本紀など編纂史料から都城関連史料を抽出する作業を初年度、第2年度に引き続き行った。(4)都城研究の嚆矢である裏松固禅の『大内裏図考証』のうち、大内裏内の官衙に関する史料について、その研究成果の再検討を第2年度に続いて行った。(5)(1)(4)の総まとめとして、これまでに収集・整理・検討してきた史料をもとに、平城宮をはじめ古代の宮都の官衙配置を考えるための基礎資料を編年順に並べ、一つ一つのもつ意義を綱文として端的に示し、かつ重要事項について註釈を加えた史料集である『平城宮編年史料集成(稿)』を編集した。これは、宮都の官衙配置を考察するための基礎資料であるとともに、平城宮・京の時代そのものを考えるための基礎的かつ網羅的な資料集として、今後の研究に大いに資するものとなろう。
制御性Ｔ細胞を分化成熟させる胸腺内Ｔｒｅｇニッチの実証とそのクロストーク分子機構

制御性T細胞(Treg)は、主な分化の場を胸腺とするが、ここにおけるTreg成熟過程・胸腺からの流出過程において作用する因子等は不明な点が多い。我々はこの問題に対し、Tregを分化成熟させるための特別な微小環境(Tregニッチ)が存在するという作業仮説よりアプローチを試みている。本研究期間中では、新たな胸腺Treg成熟マーカーの同定がなされ、また、胸腺Tregの流出に際し、胸腺ストロマ細胞中において、胸腺上皮以外に重要な役割を持つ細胞種の存在が示唆された。Tumor Necrosis Factor α(TNFα)/RelAダブルノックアウトマウス(TA-KOマウス)では胸腺からのTregの流出不全がみられる。我々は胸腺内におけるTreg分化のための微小環境(“Treg niche")が存在するという作業仮説より、胸腺環境によるTreg流出制御機構について研究している。我々は前年度までに、1、TA-KOと対照(TNFα単独KO)マウスの胸腺Treg分画間で発現の異なる遺伝子の探索を行い、TA-KO Treg分画で発現増強しているものとしてIL-7Rαを同定した。2、野生型マウス胸腺Treg分画でIL-7Rα陽性分画のほうが陰性分画よりも成熟Tregの頻度が高いことを確認した。これより、IL-7Rαが成熟Tregマーカーとして有用であることを示した。前年度は、3、IL-7Rα発現をマーカーとして用いTA-KOと対照群とで成熟Treg分画間で発現の異なる遺伝子の探索を行い、49候補遺伝子を得た。一方で、4、TA-KOマウス成熟Tregの流出不全は胸腺環境側でRelAを欠損するためであるが、このRelAの下流因子の探索を目的として、(1)TA-KOと対照マウス胸腺より胸腺上皮細胞と血球系ストロマ細胞(マクロファージ・樹状細胞など)とをそれぞれ単離し、発現遺伝子プロファイルを作成した。(2)胸腺環境側のどの細胞種でRelAを必要とするのかをデオキシグアノシン処理胎児胸腺移植により検討し、結果胸腺上皮でRelAを欠損していても成熟Tregの流出は起こることを見出した。この結果は、成熟Tregの流出制御に、胸腺上皮以外の細胞の関与があることを意味する。本研究は胸腺環境の更なる理解の礎となるものと期待している。TA-KOマウス胸腺のTreg(CD4+CD25+)分画は成熟Tregで占められている。よって、TA-KO Treg分画での発現遺伝子プロファイルは成熟Tregを強く反映したものになる。そこで、TA-KOとTNFα-KO(対照)マウス胸腺のこの分画を単離し、発現遺伝子の違いをDNAマイクロアレイを用いスクリーニングした。発現量に差のみられる遺伝子が68候補得られたが、この中にはTA-KO Treg分画で発現増強しているものとしてIL-7Rαが含まれていた。これについてはフローサイトメトリーにてTA-KO胸腺Treg分画内でCD4+CD25+Foxp3+IL-7Rα+のものの頻度が高くなっていることを確認した。そこで、IL-7Rαが成熟Tregのマーカーとなる可能性の検討を行った。野生型マウス胸腺のCD4+CD25+IL-7Rα陰性/陽性分画それぞれについてTregの成熟度合いを解析し、IL-7Rα陰性Treg分画には未成熟なTregが一定量含まれる一方、IL-7Rα陽性Treg分画は成熟Tregで占められているという結果を得た。これにより、胸腺Treg分画中に成熟Tregという新たな亜集団の分子的な定義が可能となる。現状では、胸腺Tregの成熟度合いはゲノムfoxp3領域の特定のCpGモチーフのメチル化程度の解析により行われるが、これには細胞をセルソーターにて回収しDNA抽出・バイサルファイト処理、PCR・サブクローニング、シーケンス、と多大な労力と費用が掛かる。ここで今回同定されたIL-7Rαを、メチル化程度解析を代替する新たな成熟Tregマーカーとして用いることで、解析労力と費用が大幅に削減される上に、他抗体との共染色や成熟Tregのソーティングも可能となり、胸腺Treg研究への大きな波及効果が期待される。<Treg流出に際しRelAを必要とする細胞種の同定とスクリーニング:やや遅れている>胸腺からの成熟Treg流出に際しどの細胞種でRelAを必要とするか検討を行っている。まず胸腺上皮選択的にRelAを欠損させるためfoxn1-cre:rela floxed/floxedマウスを作出したところ、このマウスの胸腺上皮においてrelaの組み換え効率が悪かったため、現在foxn1-cre:rela floxed/KOマウスを作出し解析している。同時に、この解析結果が出次第すぐにスクリーニングに移れるよう、胸腺上皮とこれに加え胸腺ストロマを構成し得る他の細胞種の単離・プールを進めている。

<流出に関与するTreg側での分子の探索:計画以上に進展した>TA-KOとTNFα-KO胸腺Treg分画でのスクリーニングの結果、前述(研究実績の概要)の通り1成熟Tregマーカーとなる因子の同定がなされた。加えて、2成熟Treg流出の実働分子である可能性が疑われる因子を同定した。1の成果により、流出できる成熟Treg(TNFα-KO IL-7Ra陽性Treg)と流出できない成熟Treg(TA-KO IL-7Ra陽性Treg)の直接比較が可能となったため、現在この分画間でのスクリーニングのため細胞の単離・プールを進めている。また、2の因子のノックアウトマウスが存在していたため提供を受け、凍結胚からの個体作成を理研バイオリソースセンターに依頼している。foxn1-cre:rela floxed/KOマウスでの解析結果が出次第、単離・プールを進めている胸腺上皮・胸腺ストロマ細胞サンプルを用いてDNAマイクロアレイによるスクリーニングを行う。得られた候補遺伝子について、胸腺上皮細胞由来の培養細胞株(TSt-4など)に強制発現させ、これとTA-KO胸腺成熟Tregとを共培養し、前述2の因子の発現誘導がみられるか検討を行う予定である。また、成熟Tregの流出におけるTreg側の実働分子と疑われる前述(現在までの達成度)2の因子のノックアウトマウスについて、マウス個体が得られた後、このマウスの胎児肝移植による血球系キメラマウスを作出し、胸腺Treg側でこの因子を欠損した場合に胸腺からの流出に異常がみられるか、胸腺Treg分画中の成熟Treg比率解析による検討を行う。また、前述のとおり流出できる成熟Treg(TNFα-KO IL-7Ra陽性Treg)と流出できない成熟Treg(TA-KO IL-7Ra陽性Treg)の発現遺伝子プロファイルの比較をDNAマイクロアレイを用いて行う。該当なし
トレハロースを用いる臓器の長期低温保存に関する基礎的研究

臓器保存ヘトレハロースを応用するためには、1)トレハロース添加により個々の細胞のストレス耐性がどの程度向上し、それがどのようなメカニズムによって起こるのが、及び2)トレハロースは細胞の集合体である組織の構造を安定化する能力があるのがどうが、という点を明確にする必要がある。本研究では、1)及び2)の問題に答えるため次の実験を行った。1)細胞としては酵母(S.crevisiaeの野性株)及び中性トレハラーゼを破壊した変異株を準備した。後者はこの糖を細胞内に多量に蓄積する。いずれの株についても対数期と定常期の細胞を調製し、計4種のサンプルについて熱および凍結ストレスに対する耐性を測定した。その結果、細胞の生存率とトレハロース含量の間によい相関が見出された。トレハロースの作用機構を調べるため、^1H-NMR、熱重量天秤及び等蒸気圧法を用いて細胞内の水の物性を測定した。これより、トレハロースは細胞膜やタンパク質の表面近傍に存在する構造化された水の層に侵入し、この層を安定化することが示唆された。各サンプルの水の縦緩和時間と生存率の間によい直線関係が得られたことから、細胞のストレス耐性は水の構造化によって誘起されると結論した。2)組織のモデルとしてアガロースゲルを調製し、その平衡膨潤度のトレハロース濃度依存性を測定した。また、その結果をマルトース、スクロースの場合と比較した。実験データをFloryの理論に従って解釈したところ、トレハロースはゲルの構造水層に侵入し、ゲル-水間の親和力を低下させることがわかった。その結果、トレハロースはゲルの膨潤を抑える効果が大きい、言い替えると、ゲルのような3次元網目構造を安定化する効果に優れていることが判明した。以上より、トレハロースは細胞及び組織いずれに対しても安定化剤として働くと結論できる。一般に、細胞の凍結状態では、自由水は失われているが細胞膜の周囲に結合水(あるいは不糖水)は残っている。したがって、トレハロースによる臓器の凍結保存のメカニズムを解明するためには、少なくとも結合水程度の水が残存する系で、この糖が膜とどのうような相互作用をするか調べる必要がある。本年度は、intact cell(酵母)とモデル系(DPPCリン脂質二重膜)を用いた実験により、次の成果を得た。1)トレハロース含量の異なる酵母を調製し、細胞内の水状態を重量熱天秤と^1H NMR法により評価した。その結果、細胞内に蓄積されたトレハロースは、その量が菌体乾燥重量に対し3%を越えると、細胞膜表面の結合水に置き換わって膜表面に結合するらしいことが判明した。これらの実験と並行し、凍結乾燥ストレスに対する生存率の測定を行ったところ、やはりトレハロース含量3%を境に大きな変化が見られた。すなわち、トレハロース含量3%以下の細胞は完全に死滅するが、それ以上含む細胞では有為な生存率を示した。以上より、トレハロースは結合水の代理として働くことにより、細胞を凍結から保護することが示唆された。2)310重量%の水を含むDPPCリポソーム/トレハロース混合系を調製し、DSC、^<31>PCP/MAS NMRおよびFTIR等を用いて、トレハロースと膜表面の相互作用を解析した。その結果、膜がゲル状態にある場合、トレハロースは結合水を挟んで膜表面と間接的に相互作用していることが判明した。また、NMR実験より、膜表面の糖・水混合物はゲル化した膜を可塑化する役割を果たすことがわかった。この事実は、次のように解釈される。すなわち、この糖は膜を柔軟に保つことにより乾燥や凍結に伴う膜構造の破壊(ひび割れ等)を防いでいる、と考えられる。

その結果、トレハロースはゲルの膨潤を抑える効果が大きい、言い替えると、ゲルのような3次元網目構造を安定化する効果に優れていることが判明した。以上より、トレハロースは細胞及び組織いずれに対しても安定化剤として働くと結論できる。
RNAポリメラーゼの分子解剖

転写制御の研究は、ふたつの方向に分化しはじめた。そのひとつは、RNAポリメーゼや転写因子の分子解剖を基盤として、RNAポリメラーゼサブユニット間、RNAポリメラーゼ転写因子間の蛋白分子間のコミュニケーションの実体を解明し、その上で特定遺伝子の転写水準決定機構を理解しようとする方向である。もうひとつは、ゲノム上の遺伝子全体を対象とし、その転写水準の順位の決定とその変動の包括制御機構を解明するための全体論的研究である。後者の研究は、個別遺伝子の転写制御機構の認識が前提となるために、現在では限られた系、例えば原核生物(大腸菌か枯草菌)に限られる。本研究は、これらの転写研究最前線の課題に正面から取り組んだもので、その一環としてRNAポリメラーゼの徹底した分子解剖を実施した。研究は、原核生物・大腸菌RNAポリメラーゼを中心に展開されたが、これと並行して、真核生物・酵母やウイルスのRNAポリメラーゼの分子解剖をも実施した。これと並行して、大腸菌ゲノムの多数の遺伝子の転写順位決定機構の先駆的研究が、RNAポリメラーゼの特異性変換機構を試験管内で実証する系を開発して進められた。研究の最大の成果は、大腸菌RNAポリメラーゼ上で、各種転写因子の作用点の同定に成功したことであった。真核生物では、1、000種以上の転写因子が同定されているが、それらの作用機構は殆ど分かっていない。RNAポリメラーゼとの蛋白-蛋白コミュニケーションの接点の発見は、転写研究に新展開をもたらすものと評価された。なお、本研究で開発された、多数のRNAポリメラーゼ変異体より転写因子の応答能を欠いたものを単離する方法は、現在転写研究領域に広く導入され、本研究を機に世界20ケ国50研究室以上の共同研究が展開された。転写装置の転写対象遺伝子選択特性の変化が,転写の包括制御の主要な機構であると,われわれは主張して来た。この理論を実証するために,RNAポリメラーゼの徹底した分子解剖を行ない,そのプロモーター識別能の変動を検出することを目標とした研究を実施し,下記の成果を得た。従って,目標は,予想以上の速度が達成された。1)大腸菌RNAポリメラーゼは、RNA合成を行なう基幹酵素(コア酵素)が,シグマサブユニットの1種類と会合してホロ酵素になる第一段階と,ホロ酵素に転写因子が会合して変化する第二段階を経て,プロモーター選択特性の異なる多成分に機能分化することを実証した。2)第一段階機能分化に関与する新たなシグマサブユニット(σ^<38>またはσ^S)同定した。σ^Sは,大腸菌増殖停止後の定常期にだけ発現するわずかの遺伝子群の転写を担当するホロ酵素を形成した。3)第二段階の機能分化に関与する各種転写因子とRNAポリメラーゼの分子間直接相互作用を実測した。純化転写因子をもつ,世界12ケ国40研究室以上との共同研究の結果,一群の転写因子(クラス1因子)は,アルファサブユニットのC端領域(サイト1)と,クラス2因子群は,シグマサブユニットのC端領域(サイト2)と接触することを明らかにした。4)転写因子によって活性化されない変異RNAポリメラーゼの変異部位のマツピングから,転写因子を結合するのは,アミノ酸残基10個以下の局所構造であることが判明した。蛋白分子間コミュニケーションの特異性規定の新しい構造モデル概念を提出した。5)酵母(分裂酵母,出芽酵母),動植物ウイルス(インフルエンザウイルス,イネ稿葉枯ウイルス)RNAポリメラーゼの分子解剖を継続した。遺伝子の情報をRNAに転写する酵素RNAポリメラーゼは、単にRNAを合成するのみでなく、さまざまの転写制御因子と相互作用して、転写対象遺伝子を選択する役割さえ果たしていることが最近判明した。

その分子機構を解明する目的で、RNAポリメラーゼの分子解剖を実施して、以下のことを新たに発見した。この発見によって、転写制御研究に新しい突破口を開いた。1.RNAポリメラーゼalphaサブユニットは、betabeta′サブユニット集合の中核となる。サブユニット会合の機能域をN端側220アミノ酸残基内に同定した。一方、転写因子の一群(クラスI転写因子と命名)が作用する機能域を、alphaサブユニットC端100アミノ酸残基内に固定した。ひとつの転写因子と相互作用をする領域は約10アミノ酸残基で、このC端範囲内で多数のクラスI因子との相互作用部位の集合を同定した。RNAポリメラーゼ・sigmaサブユニットは、DNAプロモーター認識で主要な役割を果たす。クラスII転写因子との相互作用をする部位を、sigmaサブユニットC端域に同定した。この場合も、各因子との作用部位は、約10アミノ酸残基と狭い領域であった。クラスI転写因子はプロモーター上流域DNAに結合シグナルがあるが、クラスII転写因子は、プロモーター域に結合する特徴があった。
食事ができる非利き手箸操作の獲得に向けた練習の効果と方法の確立

利き手に障害が残存する場合、利き手を交換した代償動作の獲得は活動や参加において重要な課題となる。代表的な利き手交換である非利き手での箸操作については、その練習効果が様々な指標で検証されてきた。しかし、練習効果は評価課題の方法や難度の影響を受けるにもかかわらず、非利き手での箸操作練習の効果を食事場面で検証した報告はなく、非利き手での箸操作の練習が食事摂取場面に効果をもたらすかは明らかではない。本研究の目的は1食事摂取に必要な箸操作獲得に向けた非利き手への箸操作練習の効果を明らかにする、2非利き手での実用的な食事摂取に必要な箸操作能力水準とその獲得に必要な練習期間を明らかにすることである。
低温粒界拡散、転位拡散の分析電子顕微鏡による研究

本研究では、ECAP(Equal Channel Angular Pressing)加工でAl固溶体合金を微細粒化し、拡散対を作製してAl中のHg,Znの粒界拡散係数の評価をおこなった。また、モデル合金としてAl-3.7mass%Cu合金を用い、粒界無析出帯における濃度変化を分析電子顕微鏡を用いて測定し、析出時における粒界近傍のCu原子の拡散について定量的に評価した。添加元素としてCu原子と親和力の異なるMg,Sn,Zr元素を選び、Cu原子の拡散に与える影響について調べた。1,偏析の有無について(1)Znを微細粒Al-0.1mol%Scの表面に電着し、拡散熱処理を行い、拡散領域での粒界を分析電子顕微鏡で調べたが偏析は確認できなかった。2,Cu原子の拡散について(1)溶体化熱処理後、水冷した材料において時効温度が下がるにつれて、拡散係数が従来報告されているCuの不純物拡散係数値よりも高い値を示した。その原因は水冷で導入された過剰空孔によるものと考えられた。(2)溶体化処理後、空冷した試料を453Kで時効すると、同温度で時効した水冷材に比べて母相内の析出密度が低いが、粒界近傍の濃度プロファイルに違いは見られなかった。この違いについて、粒界無析出帯の形成メカニズムとして提案されている空孔集合体モデルが考えられた。(3)粒界角度が2°以内の小角粒界を除いては、対応粒界、ランダム粒界および小角粒界において、濃度プロファイルに違いは生じなかった。(4)親和力がCuと大きいMgやSnを添加した場合、453Kの時効では非添加剤に比べて粒界におけるCuの拡散距離が短くなり、拡散係数が減少した。空孔との親和力が大きいがCuとの親和力が小さいZrを添加した場合、どの温度においても拡散係数は同じであった。Cuの拡散は空孔よりもCuとの親和力の大きい元素の添加によって抑制されることがわかった。
ポリエチレンゲルと金属表面処理剤の併用による金属とポリエチレン成形物の接着

1)チタネート及びシランカップリング剤による金属表面処理種々のアルコキシ鎖長を有するテトラアルコキシチタネートのテトラクロロエチレン溶液及びアルキル鎖長の異なるアルキルエトキシシランのメタノール溶液中に各種の金属板(鉄、アルミニウム、銅)を一定時間浸漬し、自然乾燥後加熱反応させた。特に、溶液濃度、浸漬時間、加熱温度及び時間の異なる条件で処理した。2)金属表面のキャラクタリゼーション1)の条件下で処理した金属表面の改質状態を、FT-IR、TG、及び濡れ性試験により調べた。表面反射IR及びTG測定により、アルコキシ基またはアルキル基が金属表面に導入され、化学結合していることが確認された。濡れ性試験では、顕著なカップリング剤濃度依存性が観察され、ある濃度で水の接触角が極大となることが明らかとなった。さらに、その極大を与える濃度はカップリング剤によって異なることも判明した。3)ポリエチレンゲルによる接着1)の各条件で表面処理した各種金属板とポリエチレン板の間にポリエチレンゲルを塗布し、適度に加熱して接着した。接着強度は表面処理条件に強く依存し、接触角測定結果と良い相関を示した。最良な条件下では、1cm^2当たり40kg以上もの剪断引っ張り強度を示すことが明白となった。また、接着強度はカップリング剤処理条件により強く影響され、浸漬時間、加熱反応温度及び時間にそれぞれ最適値が存在することが判明した。さらに、金属の種類によって最適処理濃度が異なる、アルキル鎖の長いカップリング剤ほど接着強度が高い等、カップリング剤と金属との反応性及びカップリング剤により導入されたアルキル鎖長とポリエチレンゲルとの相互作用に関する知見が得られた。本研究の結果、金属表面処理剤とポリエチレンゲルとを併用することにより金属とポリエチレンとを強力に接着できることが明らかとなった。これらの成果は、金属とポリエチレンの複合材料化のための一方法を提供するものであり、実用化が期待される。
TET2によるエピゲノム制御を介したミネラルコルチコイド活性制御と高血圧発症機構

ミネラルコルチコイド受容体(MR)のエピゲノムを介した転写活性化の分子メカニズムの解明のため、新規MR相互作用因子スクリーニングで得られた因子のうち、脱メチル化酵素であるten-eleven translocation 2(TET2)に注目した。TET2のknock downによりアルドステロンによるMR標的遺伝子のSGK1とENaCのmRNAレベルの増加の抑制が認められ、TET2はMRの転写活性を促進する転写促進因子であることが示唆された。他のMRスクリーニングで同定されたエピゲノムに関連する因子についても転写共役因子である可能性が示唆された。近年多くの大規模臨床研究の結果から、心血管リスクにミネラルコルチコイド受容体(MR)の活性化が大きく関与していることが明らかとなっており、現在これらの疾患を治療する上でMR作用メカニズムを解明することは必須となっている。MRのエピゲノムを介した標的遺伝子転写活性化の分子メカニズムやヒストン修飾とDNA脱メチル化のクロストークについては未だ不明な点が多く、また高血圧との関連も不明な点が多い。我々はFLAG-MRを用いた新規MR相互作用因子スクリーニングの結果得られた因子のうち、C末端側に典型的なα-ケトグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有するten-eleven translocation 2(TET2)に注目し、MR転写に与える影響の解析を行うことでMRによるエピゲノム制御機構を明らかにすることとした。まずTET2のknock downのためのshRNAを作成し、TET2 knock down下でのMR活性をLuciferase assayで評価したところ、MR活性には変化が見られなかった。これはLuciferase assayで用いるレポーター遺伝子ベクターにはTET2の標的となるCpG islandが含まれていないためで、TET2はMRとの相互作用においてもCpG islandを要すると考えられた。次にMR stableHEK293細胞においてTET2のknock downを行い、アルドステロン処置によるMR標的遺伝子のSGK1とENaCのmRNA発現をリアルタイムPCRで評価したところ、いずれの標的遺伝子もmRNAレベルでの低下が認められた。このことからTET2はMRの転写活性を促進する転写促進因子であることが示唆された。TET2をMRと共にHEK293細胞に強発現させ、共免疫沈降法により細胞内の相互作用を検討したが、現時点で有意な結合が見られていない。既にTET2の内因性のMR転写調節に関する影響がreal time PCR法により示されている。ただしMRとTET2の蛋白同士の直接結合の確認が行えていない。近年多くの大規模臨床研究の結果から、心血管リスクにミネラルコルチコイド受容体(MR)の活性化の関与が示唆されており、これらの疾患を治療する上でMR作用メカニズムを解明することは必須となっている。MRのエピゲノムを介した標的遺伝子転写活性化の分子メカニズムやヒストン修飾とDNA脱メチル化のクロストークは未だ不明な点が多い。我々はFLAG-MRを用いた新規MR相互作用因子スクリーニングの結果得られた因子のうち、ten-eleven translocation 2(TET2)に注目し、MR転写に与える影響の解析を行うことでMRによるエピゲノム制御機構を明らかにすることとした。TET2はMR標的遺伝子プロモーターにおいてゲノムDNAのシトシンの脱メチル化を生じて遺伝子発現活性化に関わる役割が推測される。まずTET2のMR転写活性に与える影響を調べるために、MR stable HEK293細胞においてTET2のknock downを行い、アルドステロン処置によるMR標的遺伝子のSGK1とENaCのmRNA発現をリアルタイムPCRで評価したところ、いずれの標的遺伝子もmRNAレベルでの低下が認められ、TET2はMRの転写活性を促進する転写促進因子であることが示唆された。TET2をMRと共にHEK293細胞に強発現させ、共免疫沈降法により細胞内の相互作用を検討したが、有意な結合が認められていない。今後はMR相互作用因子スクリーニングで発見されたTET2以外の因子のうち、脱メチル化酵素であるKDM4BおよびUTX,ヒストンメチル化酵素であるEHMT1およびEHMT2,ヒストンアセチル化酵素であるMYST等の因子についての解析を予定している。既にshRNAによるUTXのノックダウンでSGK1のmRNAレベルでの上昇を認めたとのpremilinaryな結果を得ている。既にTET2のMR転写調節に関する直接的な影響がreal time PCR法により示されている。ただしMRとTET2の蛋白同士の直接結合の確認が行えなかった。近年多くの大規模臨床研究の結果から、心血管リスクにミネラルコルチコイド受容体(MR)の活性化の関与が示唆されているが、MRのエピゲノムを介した標的遺伝子転写活性化の分子メカニズムやヒストン修飾とDNA脱メチル化のクロストークは未だ不明な点が多い。我々はFLAG-MRを用いた新規MR相互作用因子スクリーニングの結果得られた因子のうち、脱メチル化酵素であるten-eleven translocation 2(TET2)に注目し、MR転写に与える影響の解析を行うことでMRによるエピゲノム制御機構を明らかにすることとした。TET2のMR転写活性に与える影響を調べるために、MR stable HEK293細胞においてTET2のknock downを行い、アルドステロン処置によるMR標的遺伝子のSGK1とENaCのmRNA発現をリアルタイムPCRで評価したところ、いずれの標的遺伝子もmRNAレベルでの低下が認められ、TET2はMRの転写活性を促進する転写促進因子であることが示唆された。TET2をMRと共にHEK293細胞に強発現させ、共免疫沈降法により細胞内の相互作用を検討したが、有意な結合が認められず、条件を変更しても結合の確認はできなかった。

そのためMR相互作用因子スクリーニングで発見されたTET2以外の因子のうち、脱メチル化酵素であるKDM4BおよびUTX,ヒストンメチル化酵素であるEHMT1およびEHMT2,ヒストンアセチル化酵素であるMYSTについての解析を行った。UTXのノックダウンでSGK1のmRNAレベルでの上昇を認め、UTXが転写抑制因子である可能性が示唆された。EHMT2およびHDAC2のノックダウンではSGK1のmRNAレベルの低下を認め、これらの因子が転写促進因子である可能性が示唆された。KDM4B、EHMT1のノックダウンでは変化が明らかでなかった。ミネラルコルチコイド受容体(MR)のエピゲノムを介した転写活性化の分子メカニズムの解明のため、新規MR相互作用因子スクリーニングで得られた因子のうち、脱メチル化酵素であるten-eleven translocation 2(TET2)に注目した。TET2のknock downによりアルドステロンによるMR標的遺伝子のSGK1とENaCのmRNAレベルの増加の抑制が認められ、TET2はMRの転写活性を促進する転写促進因子であることが示唆された。他のMRスクリーニングで同定されたエピゲノムに関連する因子についても転写共役因子である可能性が示唆された。共免疫沈降法でMRとTET2の有意な結合を示す結果が得られていない原因がTET2の発現レベルの不足による可能性を考え外部機関よりTET2発現ベクターの供与を受ける予定である。アデノウィルスを用いた強制発現も検討する。また、スクリーニングの条件に近いFLAG抗体結合ビーズを使用することも予定している。MR table HEK293細胞ではTET2のknock downによりMR標的遺伝子の転写の低下が示されていることから、同細胞での共免疫沈降法施行やアルドステロン処置時間等も検討する。またスクリーニングの性質上考えにくいことではあるが、MRとTET2が直接の強い結合をせずに転写調節を行っている可能性を考えTET2と強調する因子の同定を念頭に研究を進める。現在までの検討の結果、MR-TET2の直接結合は証明できていない。MR相互作用因子スクリーニングで発見された他の因子のうち、TET2と同じく脱メチル化に関連する因子やヒストンのメチル化やアセチル化に関連する因子につき、機能解析を予定している。内分泌内科