hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大画面で広視域な表示を可能にするマルチ視域走査型ホログラフィーの研究

ホログラフィーは理想的な立体表示方式であるが、従来は,1ミクロン以下のピクセルピッチで約百万×百万の解像度をもつ表示素子が必要なため実現が困難であるとされてきた。本研究では、逆の発想で、ピクセルピッチを広げて画面サイズを拡大し、空間走査により視域を拡大する方法を提案した。これを、MEMS型空間光変調器とガルバノスキャナを組み合わせた視域走査型ホログラフィーにより実現した。さらに、複数のMEMS型空間光変調器を用いたマルチチャンネル型の構成を提案してさらなる大画面化を実現した。大画面化に対応して回転型平面スキャナを開発した。さらに、RGBレーザーを導入して時分割表示によるカラー化を実現した。(1)ホログラム結像系のマルチチャンネル化:従来の視域走査型のホログラム結像系を変更し、マルチチャンネル化に対応したホログラム結像系を実現した。ホログラム結像系は2枚のレンズで構成し、一方をスクリーンレンズとして表示面に配置して枠なし表示面を実現し、他方を結像レンズとしてSLMの表示面をスクリーンレンズ上に拡大結像した。本研究では、原理確認のために、最小構成の2チャンネルの表示システムを試作した。SLMには、最大フレームレート22,727 Hzで解像度1,024×768のDMDを用いた。各チャンネルは、画面が縦長になるようにDMDを配置して、画面サイズを104 mm×78.0 mmに拡大した。2チャンネルの表示面を横方向にタイリングし、画面サイズを156 mm×104 mm(7.4インチ)に拡大した。ピクセルピッチは101.6 μmに拡大される。縮小された視域の幅は5.05 mmとなる。(2)回転型平面スキャナの実現:回転型の平面スキャナを実現に取り組んだ。レンズ中心軸と回転軸をずらした偏心レンズと、垂直方向拡散板で構成した。レンズが回転すると、レンズによる集光点も回転軸のまわりを回転する。ここで、光線が垂直方向拡散板により垂直方向に拡散され、視域が垂直方向に広がる。そのため、偏心レンズが回転すると、視域が水平方向に往復運動する。偏心レンズには有効径200 mmのフレネルレンズを用い、垂直方向拡散板にはレンチキュラレンズを用いた。回転にはDCモータを用い、回転数を1,800 rpmとして、ホログラム表示のフレームレートを60 Hzとした。このとき、一回の水平走査で189個の視域が水平方向に並ぶ。視域の形成距離を800 mmとし、視域幅が630 mmに拡大される。視域角は43.0 °である。(3)表示システムの実現:以上で実現したマルチチャンネル結像系と回転型平面スキャナを組み合わせて、2チャンネル表示システムを完成し、ホログラム表示を実現した。平成27年度の研究実施計画はすべて実現した。さらに、平成28年度に実現を予定しているカラー化の研究内容を一部先取りして行った。具体的には、回折を用いたRGB合波においてキーになるRGBファイバアレイの設計を行った。平成28年度は、平成27年度に実現した回転型の平面スキャナに比べて機械的移動量が小さい振動型の平面スキャナの実現について研究を行った。振動型スキャナの実現方法として、3枚のレンズアレイで構成する方法を提案した。レンズアレイを構成する各レンズに対して正立等倍結像系を構成し、両端のレンズアレイを水平に反対方向に動かすことで、出射する光の進行方向を水平方向に偏向させる。レンズアレイの移動量は、レンズアレイのレンズピッチ以下でよいので、機械的移動量を小さくできることが特徴である。実験では、レンズアレイのアレイ構造に起因する光の回折が影響しないように、レンズピッチが0.7 mmのレンズアレイを用いた。レンズアレイ間の距離を光学設計ソフトで最適設計し、光の偏向角±20度を実現し、マルチチャンネル視域走査型ホログラフィックディスプレイの水平スキャナとして用いるこができることを確認した。ただし、大画面化した場合に、画面の場所によりムラが生じることが問題になることがわかった。マルチチャンネル視域走査型ホログラフィーのカラー化について研究を行った。光源にRGBの3つのレーザを用い、空間光変調器として用いるDMDのフレームレートが十分に高いことから時分割方式でのカラー化を行った。DMDの表示面はマイクロミラーが並んだBlazed回折格子構造になっているので、波長によって光の回折角が異なる。そこで、本研究では、波長によって照明方向を変えることで回折方向を一致させた。この方法は、RGBレーザ光の合波に光カップラを必要とせず、光カップラによる光損失がない点で優れている。平成27年度に実現した2チャンネル表示システムに対応して、2つのRGBレーザ照明システムを実現した。ただし、DMDのBlazed角に個体差があるため、それぞれのチャンネルでBlazed角を測定し照明方向を設計した。振動型の平面スキャナの実現方法について研究を行い、実証実験により、マルチチャンネル視域走査型ホログラフィーに利用可能であることを示した。また、問題点を明らかにした。カラー化については、回折を用いたRGB合波法を実現した。2チャンネル分の照明システムを作製した。以上のように、概ね研究計画通りに進展している。平成28年度に実現した時分割カラー表示技術を、平成27年度に実現した2チャンネル表示システムに適用して、表示システムのカラー化を実現した。

2チャンネルの表示システムに合わせて、RGBレーザー照明システムを2組作製した。RGBレーザーの波長は、640 nm、515 nm、445 nmとした。最終的に、カラー2チャンネル表示システムを実現し、画面サイズを7.4インチに、視域角を20度に拡大することに成功した。つぎに、マルチチャンネルシステムにおいて、全チャンネルのホワイトバランスを一致させる方法を開発した。そのために、通常の分光型の色彩輝度計を用いる代わりに、RGBレーザー照度計を用いた。これは、RGBレーザーごとに、異なる波長感度特性をもつふたつの光検出器を対応させて、RGBそれぞれで中心波長と光パワーが検出できる。特に、光パワーの絶対値が検出できるため,すべてのチャンネルで光パワーを一致させることができる。ひとつのチャンネルでホワイトバランスを取ったのちにすべてのチャンネルのRGBの光パワーを一致させる方法と、すべてのチャンネルで一色の光パワーを一致させたのちに各チャンネルでホワイトバランスをとる方法を試した。両方の方法で、同等なカラー再生像が得られた。機械的な可動部がなく大画面化が可能な液晶型平面スキャナについて検討した。プリズム型の周期構造を用いることで、十分大きな偏向角を実現できるが、高次回折光成分が発生するため再生像の画質が低下することがわかった。また、以前に検討した振動型平面スキャナでは、対向したレンズアレイを微小振動させることで、十分大きな偏向角を実現できるが、モアレが発生するため再生像の画質が低下することがわかった。以上より、回転型平面スキャナが、機械的な機構を含むが、現状では画質面で最も優れていることがわかった。ホログラフィーは理想的な立体表示方式であるが、従来は,1ミクロン以下のピクセルピッチで約百万×百万の解像度をもつ表示素子が必要なため実現が困難であるとされてきた。本研究では、逆の発想で、ピクセルピッチを広げて画面サイズを拡大し、空間走査により視域を拡大する方法を提案した。これを、MEMS型空間光変調器とガルバノスキャナを組み合わせた視域走査型ホログラフィーにより実現した。さらに、複数のMEMS型空間光変調器を用いたマルチチャンネル型の構成を提案してさらなる大画面化を実現した。大画面化に対応して回転型平面スキャナを開発した。さらに、RGBレーザーを導入して時分割表示によるカラー化を実現した。当初計画通りに研究が進んでいるので、平成28年度も当初の研究計画に従い研究を遂行する予定でいる。さらに、今年度と同様に、当初の研究計画にない内容についても、本研究を推進するうえで必要と認めた内容については、積極的に取り組む。2チャンネル表示システムのカラー化には、表示面のムラが小さい回転型の平面スキャナを用いることにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。光エレクトロニクス29年度が最終年度であるため、記入しない。
百万画素サブミクロン分解能中性子ラジオグラフィのための固体超伝導検出器システム

直列接続の電流バイアス運動インダクタンス検出器(CB-KID)の各CH出力から中性子飛来番地をエンコードするSFQ回路を完成し動作を確認した。さらに、X1000CH、Y1000CHの100万画素配列とSFQ読出回路の中性子イメージングチップを完成させたが、J-PARCの過大ノイズ環境では回路が動作せず想定外となった。新たに、膜厚40nm、サブミクロン線幅0.9μmのNbナノ細線(全長150m)を22mm角チップの15mm角有感域にXY直交配置した遅延時間型CB-KID方式で位置同定を創出し、当初計画の100万画素級中性子イメージングに成功し、当初計画を超える波長分散型ラジオグラフィを実現した。石田:高品質MgB_2薄膜成膜用超高真空MBE装置の設計・発注を行い大阪府大クラス1000のクリーンルームに設置した。MgB_2ナノワイヤ検出器の4K動作に関しては、MgB_2検出器の運動インダクタンス変化を検出する基礎実験に成功した。研究の方針を討議するために10月にチームミーティングを開催した。藤巻:検出器の出力信号はインパルス状(数ns以下)で、パルス高はたかだか数μAであり、この微小信号を確実にSFQ回路で検出するためパルス幅時間帯に100回サンプリングによる尤度判定を実施できるSFQサンプリング回路準1接合SQUIDの高周波特性を評価し、数値解析と実験で20GHzまで10μAの感度を確認した。回路パラメータの最適化により低周波測定感度1μAを達成し、今後、信号読み取り回路の入力磁気結合を工夫することで高感度測定が可能となった。王:スパッタ装置が故障し、必要な排気系の修理などの整備を行った。共蒸着法によるMgB_2薄膜作製条件出しを行い、評価のために厚さ10nmのMgB_2薄膜を作製し、超伝導転移温度4.2Kを得た。実際には、厚膜が必要となる。四谷:超伝導MgB_2単結晶薄膜のR-T特性、Jcの磁場-温度依存性などデバイス化に必要な特性を測定するために、必須となる磁場に依存しない性質を持つ小型CrN薄膜温度計を開発し、小さな磁気抵抗効果、室温1Kまで同じ感度など世界最高水準の温度計であることを確認した。町田:MgB_2検出器の理論・数値シミュレーションで現有のTDGL計算の枠組みを再検証し、必要な改良ポイントを明らかにした。運動インダクタンスの評価のため、MgB_2の複素伝導率を計算するため二バンド効果を取り入れた理論を構築する方針を得た。実験で通用する理論を構築するため、第一原理計算を入れた理論・シミュレーションへの道筋をつけた。新規に電流バイアス運動インダクタンス検出器(CB-KID)を提唱して、この方式のMgB2検出器を初めて作製し、従来のMgB2検出器が転移点近傍でしか動作しなかったのに対して、4Kを含むTc以下のすべての温度で動作することを実証しました。ついで、Nb細線を用いたCB-KID検出器の開発も推進しました。途中、J-PARCの運転中止の想定できない事態に遭遇しましたが、平成26年2月にJ-PARCの運転が再開され、3月にBL10でビームタイムが得られました。計画的に準備して来たNb細線と10B膜のCB-KID中性子検出器で世界で初めてパルス中性子源からの中性子を超伝導検出器で検出することに成功しました。同じマシンタイムで、計測サンプリング時間を短くしても数回の中性子パルス信号をカバーする長時間時系列測定を行い、統計処理をして、時間スペクトルを導出し、中性子の輸送シミュレーションと良く一致することを実証し、間違いなく中性子が検出できていることを証明しました。多チャンネルのCB-KID検出器からの読み出し回路に関しても、最終形式の一次元版を設計・試作をして、準単一接合SQUID(QOS)以外の純粋なデジタル回路で最も動作確認が難しいと思われた4ビットエンコーダと6ビットエンコーダ要素回路の2進カウンタに関して、既に平成26年3月に動作確認に成功しました。これにより、ワンチップ化した大画素CB-KID検出器の製作への見通しをつけることができました。石田:多素子化に適する新規な超伝導検出技術(電流をバイアスした超伝導ナノワイヤの両端の電圧をモニターし運動インダクタンスを検出する方式)を新たに提案し、MgB2を用いた基礎実験で実証した。6月にチームミーティング、11月には原子力機構協力者とミーティングを行った。藤巻:電流バイアス運動インダクタンス検出器アレイの隣接した検出器への伝搬・干渉を避けるローパスフィルタの設計を行った。また、検出器出力(1ns程度の電圧パルス)を実質的に高感度で読み出すための単一磁束量子(SFQ)尤度判定回路を設計・試作し、基本的な動作を確認し、超伝導磁気シールド構造のSFQ回路を設計し動作を確認した。町田:電流バイアス運動インダクタンス検出器の理論を構築するため、超伝導時間依存のGinzburg-Landau理論と運動インダクタンスの関係を調べ、十分な精度で扱うには、時間応答に対して有限の振動数も含めた運動学的方程式を導出する必要があることを見出した。また、奇周波数超伝導の表面応答特性について理論的考察を進めた。王:カルーセルスパッタ装置のターボポンプの交換・修理、セットアップ及び動作確認を行い、MgB2薄膜の試作を開始した。

また、共蒸着装置用3インチ基板ホルダーを作製し、大面積基板へのMgB2薄膜の条件出しを行った。日高、前澤:中性子を検出するための中間層にBを挟んだNbナノワイヤとSFQ多重読出し回路を1チップ上にハイブリッド化するためのデバイス構造などデバイス作製面からの検討を行った。その結果、1チップの大きさを産総研が所有するステッパーで露光できる最大サイズである22mm角とし、その問題点を抽出した。また、ナノワイヤ部分とSFQ回路部分の作製順序とハイブリッド化による問題点を明らかにした。四谷:温度計の開発とMBE法によるMgB2の成膜とX線回折装置による薄膜の品質評価を行った。大阪府大グループは、電流バイアス運動インダクタンス検出器CB-KIDを製作し、パルスレーザー照射試験に成功し、J-PARCにて中性子の照射実験にも成功した。中性子信号の伝搬速度が光速の22%であること、X方向とY方向の積層素子で核反応によるHe4イオンとLi7イオンの検出に成功した。また、超高真空MBE装置で基板加熱をしないで3インチ基板にB10膜を成膜した。名古屋大では、直列接続CB-KID多素子を単一の電流源で駆動し、個々のCB-KIDを独立した検出器として機能させる接続方法と単一磁束量子読出回路の設計を行った。隣接するCB-KIDに影響を与えないよう低域通過フィルタを検出器間に配置し、磁気結合を介して読出回路に信号が伝わることを光照射によって実証した。産総研グループは、B10を間に挟んだCB-KID検出器とSFQ信号処理回路をモノリシック化したデバイスの作製プロセス開発を行った。22mm角チップ上にXY両方向のCB-KIDとX方向CB-KIDとSFQ回路を融合し、設計値通りのパラメータを有するジョセフソン接合を用いて作製できることを確認した。一方、B10膜上のSiO2膜の剥がれなど解決すべきいくつかの問題点が明らかにした。原子力機構理論グループは、運動インダクタンス検出器に対するシミュレーション法開発の一環として、運動インダクタンスのバイアス電流依存性を精査し、高温領域での熱ゆらぎ補正を予測した。加えて、新奇検出器開発の一環として、トポロジカル超伝導体で強いスピン-軌道結合由来の応答を見出した。情報通信研究機構グループは、MgB2デバイスのために薄膜化しても超伝導性が損なわれないような高品質な膜の成膜条件を探った。スパッタ装置の修理を完了し、高品質なMgB2膜の作製条件について基板温度やMgとBの成膜レートの再最適化とデバイスプロセスの検討を行った。高分解能(サブミクロン分解能を視野に)100万画素、高フレームレート、全固体素子の実現を目指して研究を実施した。そのために新しく電流バイアス運動インダクタンス検出器(CB-KID)を発明した。一つの取り組みは、直列接続した多数のCB-KIDからの出力を個別に読み出し、かつ中性子が照射された検出器の番地を生成するエンコーダの開発であった。光を用いた予備実験によって32チャンネル(5ビット)分の回路動作を実証した。これを、x方向に32個並べ、y方向も同様な構成を取ることで、最終的に1000x1000=100万画素の中性子イメージングチップを設計・試作した。J-PARCでの実験でノイズ対策が必要なことが分かったが評価は継続中である。
肩腱板断裂における酸化ストレスの寄与の解明

今年度の研究目的はラット腱板変性モデルにおけるSOD(Superoxide dismutase)または酸化ストレス関連分子の発現を調べる事である。まずはラット腱板変性モデル作製のための検討を行い、SDラットに対してコラゲナーゼを右肩峰下滑液包へ2日間注射、3日目に皮膚を切開し直視下に注射するとしっかり腱板が変性する事を組織学的評価で証明した。その方法を用いて右肩をコラゲナーゼ群、対側の左肩に同様の方法で生理食塩水を注射しコントロール群とし、注射後1, 3, 7, 14日目に屠殺、ラットの腱板を採取し、HE染色で組織学的評価、酸化ストレスマーカーであるDihydroethidium(DHE)染色で蛍光強度・陽性細胞数を計測して酸化ストレスの評価、さらに腱板から抽出したmRNAをRT-PCRにて、Sod1, Sod2, Col1, Col3, JNK1, JNK2, PRDX5, MMP1, MMP3, MMP13, VEGF, IL-1β, IL-6の発現を測定し、コラゲナーゼ群とコントロール群で比較した。HE染色では3, 7, 14日目でコラゲナーゼ注射群はコントロール群に比べて腱繊維の不整が見られ細胞数は有意に多かった。DHE染色ではコラゲナーゼ群が14日目でコラゲナーゼ群の蛍光強度が有意に高く、3、7、14日目で陽性細胞数が有意に多かった。RT-PCRではSod1が7日目、Sod2が3、7日目、Col1が1日目、MMP1が1、3日目、MMP3, JNK1が3日目にコラゲナーゼ群でコントロール群に比べて発現が有意に多かった。HE染色・MMP1・3の発現量増加によりコラゲナーゼで腱板が変性を起こしており、DHE染色・Sod1, Sod2, JNK1, JNK2の発現増加によりコラゲナーゼ群の腱板に酸化ストレスが関与していることが示され、腱板変性モデルに酸化ストレスは関係している事が示唆された。来年度の目的であったヒト腱板損傷におけるSODの寄与の解明についての実験も今年度開始する事ができ、上腕骨骨幹部骨折手術にて採取した腱板の対照群と比べ腱板断裂患者のDHE染色では蛍光強度が高い傾向であった。平成30年度の動物実験は継続中ではあるが、平成31年の研究につながる実験を30年度に行う事が出来たため、全体としてはおおむね順調と思われる。今後はさらに動物を用いた腱板断裂モデルを作製し、平成30年度にしらべたのと同じ伝子評価を行い、平成30年度の結果と比較検討する予定である。さらにヒト腱板を用いた実験もさらにNを集め検討していく予定である。

今年度は研究初年度であり、研究結果がまだ完全にでていないため旅費分が少なかったこと、さらにヒトで使用する高額な試薬を今年度多量に購入しなかったことが考えられる。来年度は30年度に得た結果をもとに学会発表やヒトの検体を解析するための試薬などに差額の生じた分を使用する予定である。
疾患ｉＰＳ細胞を用いたＬ１症候群患者神経系細胞の機能障害の解析

本研究では、先天性遺伝性神経難病の一つであるL1症候群の原因遺伝子である神経接着因子L1CAM異常を持つ患者由来線維芽細胞から、疾患iPS細胞の作成を行った。このL1CAM異常iPS細胞は多能性幹細胞特性を保持し、神経前駆細胞(iPS-NPCs)の誘導に成功した。生物学的特性解析により、L1CAM異常iPS-NPCsは終末分化能が低く、出現したニューロンとグリア細胞はマトリックスとの接着能が低く脆弱であった。また細胞遊走能も低下していることが明らかとなった。iPS細胞技術を用い、L1CAM異常に起因する神経系細胞の機能障害メカニズムを明らかとするマテリアルを得ることに成功した。神経接着因子L1CAMに、重症型L1症候群の表現型となる膜貫通ドメイン以下のC末端が欠損するClass III変異を持つヒト疾患iPS細胞2株(細胞外ドメインのナンセンス変異c.2250C>A, p.Tyr750Stopと、スプライスドナー部位変異c.400+5G>Aによるフレームシフト)より、自己増殖能と神経系細胞に特化した多分化能を持つ神経前駆細胞の誘導を試みた。SMADシグナル阻害作用を持つ低分子化合物DorsomorphinとSB431542を用いた無血清凝集浮遊培養(SFEBq)法により神経分化誘導を実施した。誘導後、増殖因子FGF2/EGF/LIFを添加した神経幹細胞用培地で培養を継続した結果、神経前駆細胞の樹立に成功した。同様の方法で樹立した健常幼児iPS細胞由来神経前駆細胞と比較したところ、ほぼ同程度の細胞増殖能を持っていた。誘導後70日前後の疾患ヒトiPS細胞由来神経前駆細胞より全RNAを抽出し、アフィメトリクス社HG-U133 Plus 2 Arrayを用いて遺伝子プロファイルを取得した。比較対照として、健常幼児iPS細胞由来神経前駆細胞を使用し、L1CAM変異に伴い発現が変化する遺伝子(群)の抽出を行った。その結果、L1CAM異常を持つiPS細胞由来神経前駆細胞では、細胞外マトリックスや細胞接着因子、細胞周期制御に関する遺伝子などに発現差があることが示唆された。また抽出されたいくつかの遺伝子について、定量的RT-PCR法で確認を行った。神経系分化マーカーでは、グリア細胞マーカーS100Bに顕著な発現低下が検出された。この結果は、患者脳組織より樹立した神経幹/前駆細胞の結果とも一致し、L1CAM変異がグリア系細胞の発現に影響を与えることが示唆された。神経接着因子L1CAMの遺伝子異常が同定され、初代培養線維芽細胞が樹立されている3症例のXLH患者より、疾患ヒトiPS細胞を作成した。3症例の内訳は、2例が重症型のL1症候群の表現型となる膜貫通ドメイン以下が欠損するClass III変異(細胞外ドメインのナンセンス変異1例: c.2250C>A, p.750Tyr>Stop、スプライシング異常によるフレームシフト変異1例: c.400+5G>A)、1例が細胞外ドメインのミスセンスによるClass II変異(c.2135C>T, p.712Arg>Val)である。iPS細胞の作成は、プラスミドベクターの遺伝子導入によるインテグレーションフリー(Okita et al, Nat Methods 2011)のシステムを用い、シークエンス解析による遺伝子異常保持の確認と、一般的な多能性幹細胞の細胞特性解析を行った。3症例のL1CAM遺伝子変異を持つ患者線維芽細胞より、疾患iPS細胞を樹立した。2) iPS細胞の神経系細胞への誘導法の検討細胞特性解析を終えたClass III L1CAM変異を持つ2例のiPS細胞から、神経系細胞への誘導を行った。セミコンフルエントのiPS細胞を回収し、BMPシグナル阻害剤(Dorsomorphin)とTGF-βI型受容体の拮抗剤(SB431542)という2種類の低分子化合物を用い、神経外胚葉性の細胞を誘導した。また健常人iPS細胞からも同様の方法で誘導を行い、正常コントロールとした。分化誘導の成否は、qRT-PCR法や免疫細胞染色法により神経系細胞マーカーの発現比較で確認を行った。予備的な実験ではあるが、2症例のClass III L1CAM遺伝子変異を持つ疾患iPS細胞から、神経系細胞を誘導することに成功した。神経接着因子L1CAMにミスセンス変異(Exon16、c.2135C>T,p.Arg712Val:フィブロネクチン様リピート(III型)のdomain1と2の境界)を持つヒト線維芽細胞より、疾患iPS細胞の作成を行った。コロニー形態や免疫染色等でスクリーニングを行い,解析対象として5クローンを樹立した。各クローンよりゲノムDNAを抽出し、遺伝子変異を持つことを確認した。

これらのiPS細胞クローンの自己増殖能やES細胞マーカー発現に、正常コントロールとの差は見られなかった。また、先に樹立し、in vitro分化能を確認済のL1CAM変異iPS細胞(膜貫通ドメイン以下のC末端が欠損するClass III変異)2株(ナンセンス変異c.2250C>A, p.Tyr750Stopと、スプライスドナー部位変異c.400+5G>Aによるフレームシフト変異)について、実験動物中央研究所において奇形腫形成を実施し、in vivoでも三胚様分化能を持つことが確認された。SMADシグナル阻害作用を持つ低分子化合物DorsomorphinとSB431542を用いた無血清凝集浮遊培養(SFEBq)法により、神経分化を誘導し、増殖因子FGF2/EGF/LIFを添加した神経幹細胞用培地で培養を継続して神経前駆細胞を作成した。接着因子であるL1CAM遺伝子の変異が、細胞遊走能に与える影響をボイデンチャンバー法で検討した。同様の方法で作成した正常コントロールと比較したところ、L1CAM変異により、細胞遊走能は10-20%に低下していることが明らかとなった。この結果より、遺伝子変異の表現型を再現することに成功した。幹細胞学L1CAM細胞内ドメインの欠失となる、Class IIIタイプの遺伝子変異を持つ幼児線維芽細胞由来疾患iPS細胞より、自己増殖能と神経系に特化した分化能を持つ神経前駆細胞を樹立することに成功した。死亡症例でしか樹立できない脳組織由来神経幹細胞の代替となる生体マテリアルを確保し、各種特性解析を実施する目処を立てる事ができた。また、健常人コントロールとなる幼児線維芽細胞由来iPS細胞からも、同じ手法を用いて神経前駆細胞を樹立し、比較対照となるマテリアルも得ることができた。樹立した神経前駆細胞を用い、アフィメトリクスHG-U133 Plus 2Arrayによる遺伝子プロファイルを取得し、変異に伴い発現に影響を受ける遺伝子の抽出と確認作業に着手した。L1CAM異常を伴う神経前駆細胞の遺伝子プロファイルのデータマイニングに着手する事ができたことから、本研究の進捗は、概ね順調に伸展していると判断した。平成24年度計画(1) L1CAM異常を有する疾患ヒトiPS細胞の作成について、Class III変異を持つ重傷型L1症候群患者2例及び、Class II変異を持つ患者1例の線維芽細胞より、疾患iPS細胞の作成に成功した。遺伝子異常が保持されている事を確認し、各種多能性幹細胞特性も概ね確認作業を終了した。計画(2) iPS細胞の神経系細胞への誘導法の検討について、2種類の低分子化合物を用いた分化誘導法により、神経系細胞への誘導に成功した。遺伝子発現解析により、神経系細胞マーカーが十分発現している事が確認された。以上より、初年度内にL1症候群発症の分子メカニズムの解明に必要となる細胞材料を用意する事ができたことから、本研究は概ね順調に進展していると判断した。現在までに、L1症候群患者由来線維芽
ネットワーク解析による高機能自閉症の機能障害メカニズムの研究

磁気共鳴画像法(MRI)を用いて、自閉症スペクトラム障害(ASD)の社会相互性の障害を中心とした脳内メカニズムを明らかにすることを目標した。ASD当事者を対象とした安静時機能的MRIのネットワーク解析によって、社会性に関わる脳領域のハブとしての機能の損失だけでなく、全体的なネットワーク構造がランダム化していることを明らかにした。加えて、拡散テンソル画像と構造MRIのマルチモーダルの画像解析によって、顔認知などに関わる脳領域とそれらを繋ぐ神経線維の異常の共起を明らかにした。これらの観察から、社会相互性の障害は、ネットワークレベルで機能的だけでなく形態的にも異常があることを明らかにした。成人ASD患者46名(女性:7名、男性:39名)と健常被験者(女性:7名、男性:39名)から撮像されたrsfMRIデータを、脳のネットワークを点(脳領域)と線(機能結合)で表現し、その性質をグラフ理論と呼ばれる数学的枠組みを用いて解析を行った。グラフ理論に基づく様々な指標を用いた解析によって、健常群では局所的な脳機能結合と全体的な結合が適度なバランスを保っているが、ASD群ではこのバランスが崩れていることが明らかになった。また、ネットワークには、情報集約・伝播で中心的役割を果たすハブとよばれる点が存在しているが、右上側頭回など社会性に関連のある脳領域が健常群ではハブになっているにも関わらず、ASD群ではハブでない事等が明らかになった。このことから、脳機能ネットワークのバランスの欠如や社会機能に関連のあるハブの損失が、ASD患者が持つ社会機能障害に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。本年度は、自閉症スペクトラム障害(Autism Spectrum Disorder; ASD)のMRI研究を継続して行った。成人ASD男性46名および健常成人男性46名から収集した高解像度構造画像および拡散テンソル画像に対して、データ融合型の解析手法を用いて解析を行った。ASD当事者は、紡錘状回、上側頭溝や前頭眼窩野などの社会性に関わる脳領域の体積が減少し、同時にそれらを繋ぐ線維(下縦束、鉤状束、下前頭後頭束)の結合低下が生じていることが明らかになり、ASD当事者の灰白質・白質の形態的異常はネットワークレベルで生じている可能性が示唆された。この解析結果は、2014年9月に国際専門誌(Neuroimage: Clinical)へ投稿し、同年12月に受理された。また、成人ASD当事者50名および健常成人50名から収集した安静時fMRIデータを用いて、局所的な結合(local connectivity)と脳活動レベルを定量的に評価した。その結果、ASD群は健常群と比べて、両側の紡錘状回および右中側頭回後部のlocal connectivityが低下し、脳活動レベルも右紡錘状回および右中側頭回後部で低下していることが明らかになった。さらに、ASD群における右中側頭回後部のlocal connectivityの低下が、自閉症スペクトラム指数の社会性に関する項目と負の相関を示すことが明らかになった。この結果の一部は、2014年の日本神経科学会にて発表した。さらに解析をすすめまとめたものを現在国際専門誌に投稿中である。加えて、認知課題を策定し、その行動研究を実施した。健常成人18名、ASD患者15名から行動データを収集し、現在解析を進めている。信号処理本年度は、安静時機能的磁気共鳴画像のデータ解析に加えて、心理実験中の脳活動をMRIによって測定する予定であったが、MRI装置を(1.5 Teslaから3.0 Teslaへ)刷新するための工事などのためfMRI実験を行わなかったため。MRI設置が完了次第、新しいMRI装置でpilot的な撮像実験を行い、撮像パラメータおよび実験パラダイムの最適化を図り、本実験に移行する。ASD患者のリクルートは、昭和大学医学部附属烏山病院の医師や心理士と連携し進める。MRI装置の刷新に伴い、心理実験を行わなかったため謝礼が発生しなかった点と本年度は国際会議に参加しなかった為。
環境移行における内的作業モデルと予期不安および学校適応感との関連

本研究では中学校入学という新環境への移行にあたり,中学生自身の考え方や行動をガイドする働きを持つと考えられるIWMのタイプの違いと予期不安から中学校への学校適応感について縦断的に検討し,中学校における適応促進のあり方についての知見を得ることが目的であった。調査は中学1年生の2011年4月(1回目)と6月(2回目),中学2年生の2012年11月(3回目)の3回にわたり実施された。学校適応感を従属変数とし,IWM水準,予期不安水準,時期を独立変数とする3要因混合計画による分散分析を行った。主な結果は以下の通りである。(1)「部活動の意欲」は「不安/アンビバレント型」低群かつ友人関係不安低群において1・2回目よりも3回目の得点が低かった。また,「回避型」中間群かつ友人関係不安高群と「回避型」高群かつ友人関係不安高群とにおいて2回目よりも3回目の得点が低かった。また「安定型」中間群においては2回目よりも3回目の得点が,「安定型」高群においては1・2回目よりも3回目の得点がそれぞれ低かった。(2)「教師との関係」は「安定型」〓〓かつ友人関係不安高群と「安定型」高群かつ友人関係不安低群において1回目よりも2回目の得点が高かった。また「回避型」高群においては友人関係不安低群よりも友人関係不安高群の得点が高かった。(3)「自己肯定感」「家族との関係」「学習への意欲」においてはいずれも「安定型」低群よりも「安定型」高群の得点が高かった。中学校入学時における部活動に対する意欲の高さは「不安/アンビバレント型」,「回避型」の劣勢性のあらわれである比較的良好な対人関係の形成であると考えられる。また,「安定型」の優勢性は対人不安の低さを示し,友人関係不安の低さとも関連していた。このことが学校適応感すべての下位尺度得点の高さにあらわれており,学校適応に影響を与えている可能性が示唆された。IWMの3つのタイプから中学校における適応促進のあり方について検討することの意義が確認されたといえる。
転写因子IRF-3による細胞生理機能の制御

ウイルス感染が起きた細胞内では、はじめにIFN遺伝子を含む種々の遺伝子の発現が誘導され、抗ウイルス作用などの生体防御機構が働くことになる。我々はこの一連性化機構のうちIRF-3が最初に活性化される転写因子である事を明らかにした。IRF-3はほとんど全ての細胞に比較的大量に発現されでいるが、その分子内に在在するNuclear ExportSignal(NES)の機能により細胞質に局在しており、しかも転写因子としての機能を持たない不活性型である。しかしながら、ウイルスあるいは二重鎖RNA刺激にによってC端側に存在する特定セリン残基がリン酸化されることにより核内に移行し、核内に存在するp300/CBPと複合体を形成すると共にDNA結合能を獲得することにより活性型に変換する。その結果、上記の遺伝子活性化が引き起こされる。本年度はこの活性化の最も重要な鍵を握ると考えられるIRF-3の燐酸化酵素の本質に迫ることを目的に解析を進めた。培養細胞株を二重鎖RNAによってある条件で処理するとアボトーシスが強く誘導されることを見い出した。この条件下ではIFN遺伝子の発現が強く誘導されている。大量の細胞をこの条件で処理することにより選別し、細胞死に耐性のクローンを多数得ることができた。これらに対して二重鎖RNAによるIRF-3の燐酸化誘導能を検討したところ、幾つかのものはIRF-3の燐酸化が観察されなかった。しかしこれらの細胞ではNF-κBの誘導は親察されることから、単に二重鎖RNAの細胞への取り込みなどの段階での阻害ではないと考えられた。さらにこれらの細胞は、ウイルス感染等、様々なプロトコールで誘導をしてもIFN遺伝子が存在するにもかかわらず、IFNの産生がほとんどみられない事も明らかとなった。このような機能欠損細胞について、相補性の検討、cDNAライブラリーによる機能相補などにより、IRF-3燐酸化の分子機構を明らかにして行きたい。
ウイルス特異的T細胞のホーミングにおけるフコース転移酵素の関与

T細胞の皮膚へのホーミング活性を制御するフコース転移酵素IV, VII(FucT-IV, VII)が、ウイルス感染に際して活性化されるT細胞に、どのように発現されるか、その調節機構を明らかにしようと考えた。1.ナイーブCD4^+T細胞がメモリーCD4^+T細胞に分化する過程で、これらの酵素がどのように発現し、その結果としてそのT細胞の皮膚へのホーミング能がもたらされるかを検討した。FucT-IV^+ FucT-VII^+Eセレクチンリガンド^+(ESL),CLA^+細胞は分化の早い段階に出現し、その後FucT-IV^-FucT-VII^+ESL^<++>CLA^+細胞へと分化していくことが分かった。2.次にこの分化過程におけるサイトカイン環境の役割を明らかにしようと考えた。IL-4あるいはIL-12環境のいずれにおいても活性化されたT細胞にはFucT-IV, FucT-VIIの発現が見られ、表面形質はESL^+CLA^-であった。しかし、そのCD4^+T細胞をIL-12環境に移し、刺激を止めた場合にはFucT-IV発現は低下し、FucT-IV^-FucT-VII^+ESL^<++>CLA^+へと分化した。一方、IL-4環境へ移し、刺激を止めた場合にはFucT-IV発現は保たれ、さらなる分化は阻害されESL^+CLA^-のままであった。このようにT細胞の活性化とサイトカイン環境により、メモリーT細胞の皮膚へのホーミング能は制御されていることが明らかになった。3.ウイルスの再活性化を伴う薬疹の特殊型である薬剤性過敏症症候群では、T細胞の活性化を制御する制御性T細胞(Treg)が著明に増加しており、その細胞の皮膚へのホーミング能は極めて高く、その多くがFucT-VII陽性であることが分かった。しかしウイルスの再活性化を伴わない重症薬疹では、FucT-VIIはTregの一部にわずかに発現しているに過ぎなかった。以上の結果は、ウイルス特異的T細胞に発現するFucT-IVとFucT-VIIのバランスが皮膚へのホーミング能を決定する要素であり、それを制御するTregとの相互作用が皮疹の重症度を決めていることを示唆している。本年度の実験では、末梢血リンパ球分画(PBMC)よりナイーブCD4^+及びCD8^+T細胞分画を得、基本的にはそれを抗CD3抗体で刺激をすることにより、effector memory細胞にまで分化させるという培養系を用いて、その分化過程で発現してくる分子、糖転移酵素について検討を行った。1.抗CD3によるactivation cultureにおいて、これらT細胞にまず発現してくる接着分子はE-selectin ligand(ESL)であり、これはCLA分子の発現を伴わず発現レベルも低かった。しかし、これをIL-12richのresting culture(抗CD3を含まない)にtransferすると、CLA分子を伴って強いESLの発現を認めた。さらに分化が進むと、このESL発現は低下し、CLA単独陽性となった。2.以上の分化過程におけるフコース転移酵素(Fuc-T)の発現を検討したところ、activation cultureの時期にはFuc-TIVとFuc-TVIIがともに強く発現していた。

しかし、その後resting cultureへtransferすることにより、Fuc-TIVの発現が著明に低下するのに対し、Fuc-TVIIの発現レベルには変動が認められなかった。このFuc-TIVの発現低下が起こることが、よりT細胞の分化が進みCLA発現を伴った高度のESL発現が起こるためには必須であることが分かった。3.次にFuc-TIVの発現低下をきたすサイトカイン環境について検討したところ、IL-12の存在が必須であることが明らかになった。4.Fuc-TIVとFuc-TVIIは同じ基質を使用することから、基質の競合がこのようなFuc-TIVの発現低下をもたらすのではないかと考え、現在様々な培養条件を検討中である。本年度の研究では、ウイルス特異的T細胞の皮膚へのホーミングに対して抑制的に働く制御性T細胞regulatory T cell (Treg)に関する検討を中心に行った。2.急性期におけるTregの増加は、ウイルスの再活性化を認めない他の重症薬疹では起こらなかった。4.DIHSの急性期に増加しているTregは、ウイルス特異的、あるいは薬剤特異的T細胞が抗原刺激による活性化の際のIFN-γ、TNF-α、IL-産生を抑制することが示された。しかしこのようなTregは回復期には減少し正常範囲に戻る。しかしサイトカイン産生の抑制機能は著明に低下した。5.DIHSの急性期に著明に増加するTregは、in vitroでの抗原機能によっても増加した。つまり抗原特異的にエフェクターT細胞の活性化を抑制する細胞と考えられた。以上の結果から、ある種のウイルスの再活性化を伴う重症薬疹ではウイルス特異的、薬剤特異的にTregが活性化し、effector T細胞の活性化、皮膚への遊走を選択的に抑制する。この細胞自体が皮膚へのホーミング能を有することが明らかになった。
離散気泡モデルによる沸騰二相流の熱流動ダイナミクスモデルの構築

ボイラ,沸騰水型原子炉等の各種沸騰関連機器を設計,運転する際に,限界熱流束が重要な安全基準の一つとなる.限界熱流束は蒸発管内の気液二相流における,気相と液相の幾何学的な配置パターンから形成される流動様式に大きく影響する.特に水平流では,重力と流動方向が異なるため垂直上昇流よりも流動様式は複雑となることに加え,重力による浮力の影響と表面張力のバランスにより間欠流に伴うドライアウトが比較的低クオリティ条件でも発生してしまう危険性がある.このような二相流のダイナミクスに起因する諸問題を解決するために,垂直上昇流を対象にパターンダイナミクスに基づく離散気泡モデルを構築した.これはボイド伝播方程式を基礎式とし,気泡のウェーク効果,気相の圧縮性そして管路との幾何学的整合性に基づいた相再配分を運動量効果として組み込むものである.本離散気泡モデルを水平流に適用する際には,運動量効果となる気相の相対速度および局所圧力損失の変更が必要になる.また,沸騰系に拡張する場合は気相の圧縮性および加速項の考慮が必要になる.以上の変更を適切に行うことで水平等温二相流において,ボイド率の時空間変動特性を得ることができ,気泡流,スラグ流,環状流といった典型的な流動様式に加え,スラグ環状流,波状環状流といった水平流に特有な遷移流れを数値的に実現することができた.また実際に作動流体に二酸化炭素を用いた強制流動沸騰系において,流動観察実験を行うことで水平細管内の流動様式を把握すると伴に,この流動様式の遷移を水平流に拡張した本離散気泡モデルを用いることで上手く再現することができた.そして沸騰水平二相流に適用することでボイド率の時空間変動挙動を得ることができ,沸騰流路中のボイド率が発達する様子を実現することができた.ボイラ,沸騰水型原子炉等の各種沸騰関連機器を設計,運転する際に,限界熱流束が重要な安全基準の一つとなる.限界熱流束は蒸発管内の気液二相流における,気相と液相の幾何学的な配置パターンから形成される流動様式に大きく影響する.特に水平流では,重力と流動方向が異なるため垂直上昇流よりも流動様式は複雑となることに加え,重力による浮力の影響と表面張力のバランスにより間欠流に伴うドライアウトが比較的低クオリティ条件でも発生してしまう危険性がある.このような二相流のダイナミクスに起因する諸問題を解決するために,垂直上昇流を対象にパターンダイナミクスに基づく離散気泡モデルを構築した.これはボイド伝播方程式を基礎式とし,気泡のウェーク効果,気相の圧縮性そして管路との幾何学的整合性に基づいた相再配分を運動量効果として組み込むものである.本離散気泡モデルを水平流に適用する際には,運動量効果となる気相の相対速度および局所圧力損失の変更が必要になる.また,沸騰系に拡張する場合は気相の圧縮性および加速項の考慮が必要になる.以上の変更を適切に行うことで水平等温二相流において,ボイド率の時空間変動特性を得ることができ,気泡流,スラグ流,環状流といった典型的な流動様式に加え,スラグ環状流,波状環状流といった水平流に特有な遷移流れを数値的に実現することができた.また実際に作動流体に二酸化炭素を用いた強制流動沸騰系において,流動観察実験を行うことで水平細管内の流動様式を把握すると伴に,この流動様式の遷移を水平流に拡張した本離散気泡モデルを用いることで上手く再現することができた.そして沸騰水平二相流に適用することでボイド率の時空間変動挙動を得ることができ,沸騰流路中のボイド率が発達する様子を実現することができた.
光周期補償性メカニズムの解明

シロイヌナズナの野生型(WT)は明期長が異なる光周期下で生育させても、クロロフィル含量はほぼ一定であった。我々はこの機構を光周期補償性と定義した。一方、概日時計遺伝子の二重変異体lhy;cca1では明期の長さに依存してクロロフィル含量が増加した。これに伴って、アンテナタンパク質である、Light Harvesting Complex(LHC)のタンパク質量が増加していること分かった。さらに、lhy;cca1では葉緑体内膜構造のうち、グラナの重層数が著しく増加していることを透過型電子顕微鏡観察により明らかにした。本研究では、葉緑体内膜構造(特にグラナスタッキング)ダイナミクスのライブイメージング技術を確立して、光周期補償性メカニズム(光周期の違いによらずに、クロロフィル量及びクロロフィルa/b比が一定レベルに調節される機構)を解明することを目的としている。平成25年度は、次の2課題について、研究を行った。(課題1)葉緑体が巨大化する変異体背景(arc2、arc6など)でlhy;cca1変異による光周期依存的なグラナスタッキング数の変化を透過型電子顕微鏡により観察するために、lhy;cca1と葉緑体変異体との交配を行った。三重変異体の選抜を行い、顕微鏡観察を実施する予定である。(課題2)lhy;cca1変異による光周期依存的なグラナスタッキング数の変化を抑圧または増強する変異を同定するために、lhy;cca1変異体にEMS処理を行い、約25系統ごとに、M2種子プールを作成した。これらを恒明条件下で培養土上に播種して、植物体の葉の色が、lhy;cca1変異体の葉の濃緑色に比べて、淡いもしくは濃い変異体候補を多数選抜した。自家受粉により、各系統の次世代種子を収穫した。恒明条件/長日条件(16時間明期/8時間暗期)/短日条件(8時間明期/16時間暗期)の3種類の光周期条件下で、これらの種子を播種して、葉の緑色、花成時期、胚軸長、葉柄長を観察・測定した。恒明条件下において、野生型に比べて、lhy;cca1変異体の葉の緑色は濃く、花成時期は遅延して、杯軸長及び葉柄長が短縮することが分かっている。単離した候補系統の中で、10系統については、lhy;cca1変異体に比べて、葉の緑色は淡く、花成時期は野生型程度にはやくなり、杯軸長及び葉柄長も野生型程度まで回復した。以上の結果は、これら10系統は抑圧変異体の良い候補であり、本研究の良好な研究材料となることを示している。1葉緑体内膜構造ダイナミクスのライブイメージング技術を確立すること、さらには2この新規技術を利用してシロイヌナズナにおけるクロロフィル量及びa/b比の光周期補償性メカニズムを解明することを本研究提案の目的として実施している。4課題の中の課題2では、シロイヌナズナの概日リズム制御因子の二重変異体であるlhy;cca1変異による光周期依存的なグラナスタッキング数の変化を抑圧または増強する変異を同定することを目的として、研究を行った。抑圧変異体の1つとして、early flowering 3 (elf3)変異体を、増強変異体の1つとして、gigantea (gi)変異体を既に単離し、解析中であった。elf3及びgi変異体を用いて、さまざまな環境下におけるクロロフィルa/b蓄積パターンを解析するとともに、elf3;gi二重変異体についても同様の解析を行った。また、クロロフィル量の制御において主要な働きをもつことが知られている3つの転写制御因子PIF3、PIF4、PIF5の遺伝子発現量を、上記の変異体において、RT-PCR法により比較解析した。新規な抑圧・増強変異体候補については、遺伝学的解析を実施し、原因遺伝子特定に向け、解析を進めた。1)葉緑体内膜構造ダイナミックスのライブイメージング技術を確立すること、2)この新技術を利用してシロイヌナズナにおける光合成色素であるクロロフィル量及びa/b比の光周期補償性メカニズムを解明することを本研究提案の目的として実施している。4課題の中の課題2では、シロイヌナズナの概日リズム制御因子の二重変異体であるlhy;cca1変異体による光周期依存的なグラナスタッキング数変化を抑圧または増強する変異体の解析を行った。抑圧変異体の1つlhy;cca1;elf3、増強変異体の1つlhy;cca1;gi、これらの変異を組み合わせたelf3;giとともに、新規変異体について、クロロフィル量ならびにクロロフィルa/b比を測定した。明暗周期下で栽培後に、暗所に移行後のクロロフィル量の減少がgiにより抑圧されることを見出した。また、新規抑圧変異体については既知の抑圧変異であるelf3、svp、phyBとのアレリズム試験を行った。研究代表者・溝口は、2014度まで所属機関の生命科学デパートメント長を務めていた。しかし、2015度から理系3デパートメント(生命科学、物質科学、数学・情報科学)が統合し、研究代表者・溝口が本統合デパートメント長に選出された。当初予定にはなかった他業務の増加に伴う多忙のため、当初計画の遅延が生じた。また、本研究実施に必要な多重変異体(概日時計遺伝子変異と葉緑体サイズ制御遺伝子変異の組合せ)の作成作業に、想定以上の時間を要した。これらの理由により、当初計画の遅延が生じた。

また、課題1については、技術的問題から当初計画していた多重変異体の作成に至っておらず、実施が遅れている。課題3については、十分鮮明な画像を確認できるレベルに至っていない。植物にとって、光は最も重要な情報の一つである。それを効率的に利用するために、約24時間周期の内生リズムを作り出す機構(概日時計)が重要な働きをしている。シロイヌナズナにおける概日時計の主要な構成因子であるLATE ELONGATED HYPOCOTYL(LHY)とCIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1)の二重欠損変異体(lhy;cca1)では、恒明条件下で概日リズム制御機能が著しく低下し、花成遅延や胚軸・葉柄の短縮及び、顕著な濃緑色葉の形質が表れる。葉の緑色は、クロロフィルという光合成色素由来であり、クロロフィルはアンテナタンパク質に結合して葉緑体内で光エネルギーを集める働きをしている。アンテナタンパク質は光ダメージによる分解と生産を繰り返しているが、概日時計による制御機構は殆ど着目されていない。この分子メカニズムを明らかにするため、恒明条件下でlhy;cca1が示す濃緑色葉形質に着目して研究を行った。野生型(WT)は明期長が異なる光周期下で生育させても、クロロフィル含量はほぼ一定であった。我々はこの機構を光周期補償性と定義した。一方、興味深いことにlhy;cca1では明期の長さに依存してクロロフィル含量が増加した。これに伴って、アンテナタンパク質である、Light Harvesting Complex(LHC)のタンパク質量が増加していること分かった。さらに、lhy;cca1では葉緑体内膜構造のうち、グラナの重層数が著しく増加していることを透過型電子顕微鏡観察により明らかにした。シロイヌナズナの野生型(WT)は明期長が異なる光周期下で生育させても、クロロフィル含量はほぼ一定であった。一方、概日時計遺伝子の二重変異体lhy;cca1では明期の長さに依存してクロロフィル含量が増加した。上記のとおり、4研究課題の中で、課題2はほぼ計画通りに進んでいる。しかし、他の3課題については、実施計画よりも遅れている。課題1では、葉緑体が巨大化する変異体背景でlhy;cca1変異による光周期依存的なグラナスタッキング数の変化を透過型電子顕微鏡により観察する計画であったが、技術的問題から、当初計画して来た多重変異体の作成に至っておらず、実施が遅れている。変異体の組合せによる致死率や生存率に関する問題も考えられるが、単純に栽培環境の維持管理上の問題も考えられる。問題点を解決し、次年度に実施予定である。課題3では、葉緑体内膜構造ダイナミクスのライブイメージング技術を確立する計画であったが、十分鮮明な画像を確認できるレベルには未だ達していない。顕微鏡技術を専門とする共同研究者との協議を重ね、問題点を解決し、次年度に実施予定である。
NMRを用いた紫外線損傷DNAの構造生物学的研究

本年度は安定同位体標識した紫外線損傷DNAを調製し,これを用いることで紫外線損傷DNAを認識・修復する高度好熱菌由来のCPD photolyaseの基質認識メカニズムの解明を行った.最少培地を用いて同位体標識した大腸菌DNAからヌクレオチド混合物を抽出・分離し,DNAポリメラーゼ反応を利用してTT配列を含む標識DNAオリゴマーを調製した.得られた標識DNAに紫外線を照射してシクロブタン型ピリミジンダイマー(CPD)を形成させ,相補鎖と組合せて二重鎖とした.多次元NMR法により,NMRシグナルの帰属を行った後,DNAの^<31>P-NMRシグナルを利用した解析から,CPDの認識にはDNAのリン酸基とphotolyaseの塩基性アミノ酸残基による静電相互作用が重要であることが判明した.またphotolyaseの変異体を用いた解析から,結合するDNAの配向を決定することができた.さらに,CPD部位はDNA二重らせんの外部に飛び出した(フリッブアウト)状態で,photolyaseの2つのクラスターにより形成されるキャビティー部分に結合することが明らかとなった.本年度は安定同位体標識した紫外線損傷DNAを調製し,これを用いることで紫外線損傷DNAを認識・修復する高度好熱菌由来のCPD photolyaseの基質認識メカニズムの解明を行った.最少培地を用いて同位体標識した大腸菌DNAからヌクレオチド混合物を抽出・分離し,DNAポリメラーゼ反応を利用してTT配列を含む標識DNAオリゴマーを調製した.得られた標識DNAに紫外線を照射してシクロブタン型ピリミジンダイマー(CPD)を形成させ,相補鎖と組合せて二重鎖とした.多次元NMR法により,NMRシグナルの帰属を行った後,DNAの^<31>P-NMRシグナルを利用した解析から,CPDの認識にはDNAのリン酸基とphotolyaseの塩基性アミノ酸残基による静電相互作用が重要であることが判明した.またphotolyaseの変異体を用いた解析から,結合するDNAの配向を決定することができた.さらに,CPD部位はDNA二重らせんの外部に飛び出した(フリッブアウト)状態で,photolyaseの2つのクラスターにより形成されるキャビティー部分に結合することが明らかとなった.