hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性毒素フラグメント[A]を用いた破傷風毒素の神経伝達阻害作用の分子機構解明

ジギトニンで透過性にしたウシ副腎クロマフィン細胞ノルエピネフリン(NE)開口分泌系で破傷風毒素、毒素フラグメント[A](L鎖)が内在性NE放出をも殆ど完全に阻害することを示し、中毒細胞の細胞情報伝達過程の変化を毒素の標的物質と見なされている細胞内情報物質や開口分泌に関与が推定されているCa^<2+>結合蛋白質との関連において調べ、cGMP,cGMP特異的ホスホジエステラーゼ、ANF依存性グアニレートシクラーゼ、C-キナーゼと毒作用との関係をはっきりと否定した。またcAMP,A-キナーゼやカルモデュリンと本毒素の作用点とは直接関係がないことを示した。その際、開口分泌にカルモデュリンが関与していることを直接示すことができ、ミオシン軽鎖を介する経路の関与を示し、C-キナーゼがmodulatorとして働いていることを明らかにした。中毒細胞の蛋白質リン酸化を本毒素が変化させないことを示した。中毒細胞における毒素結合物質の局在やその細胞骨格との関係を電顕的および抗L鎖抗体を用いて免疫組織化学的に調べ、透過性細胞は形質膜に損傷がみられるがCa^<2+>依存性NE放出機構はよく保たれ、毒素による阻害で開口分泌像がみられなくなり、開口分泌に伴うアクチンの細胞辺縁での断裂凝集化もなくなる結果を得た。二重蛍光染色の結果、毒素は分泌顆粒にほぼ一致して局在し、アクチンやカルパクチンIとは異なる分布をしていた。L鎖のin vitroでのZn依存性蛋白質分解活性がシナプス小胞膜随伴シナプトブレビン2を特異的基質とすることを確かめた。静注によるin vivo毒性はZnを除去した標品でも差がなかった。L鎖はin vitroでのカルパクチンI依存性分泌顆粒凝集系やCa^<2+>ホスホリパーゼA_2依存性膜融合系に影響を及ぼさなかった。従って破傷風毒素の作用点は、これらの物質の作用点と直接関係しない。テタノリジンを高度に精製して、その大きな孔形成特性を明らかにし、新しい高分子物質透過性開口分泌系を開発した。1,破傷風毒素のフラグメントのすべての組合せを単離精製し、それらが高度に純化された標品であることを毒素分子の各ドメインに特異的なモノクローナル抗体を用いて示し、これらのうちフラグメント〔A〕が毒素の扱い手であることを、副腎クロマフィン細胞を透過性にした細胞素で示した。2。破傷風中毒細胞における毒素結合物質の細胞内局在について調べ、毒素、フラグメント〔A〕の単離クロマフィン顆粒画分との結合は、イムノブロット法では検出できなかったが、抗フラグメント〔A〕抗体と蛍光ラベル2次抗体によるin situの免疫組織化学によって網目状のはっきりとした蛍光分布を認め、毒素が細胞内構造物(クロマフィン顆粒または細胞骨格)と結合している結果を得た。その場合Fアクチンを特異的に蛍光ラベル-ファルロイジンで染めると毒素によるカテコラミン分泌阻害に併行して、開口分泌にともなう細胞辺緑のアクチンリングの断裂がみられなくなることを示した。さらに脳の神経終末顆粒からシナプトゾーム小胞を分離し、一方抗カルパクチン抗体を調製しその細胞内分布を調べたので、それらとの関係を含めて、現在、免疫電顕的に毒素が結合する細胞内構造物の同定をすすめている。3。毒素の作用標的を明らかにするため細胞内情報伝達に与かるサイクリックヌクレオチド代謝、Ca^<2+>結合蛋白質との関係について調べ、これまで報告されていたCGMPとの関係を明らかに否定した。またカルモジュリンと毒素作用点とは直接関係ないことを明らかにした。その際カルモジリンが神経伝達物質放出に関与していることを明らかにした。4。中毒細胞におけるA^-,G^-,C^-キナーゼなど酵素系の変化、蛋白リン酸化との関係を調らべこれらとくにこれまで関係ありと報告されていたC-キナーゼが毒素の標的ではないことを明らかにした。その際C-キナーゼが開口分泌のmodulatorとして働いていることを明らかにした。

二重蛍光染色の結果、毒素は分泌顆粒にほぼ一致して局在し、アクチンやカルパクチンIとは異なる分布をしていた。L鎖のin vitroでのZn依存性蛋白質分解活性がシナプス小胞膜随伴シナプトブレビン2を特異的基質とすることを確かめた。静注によるin vivo毒性はZnを除去した標品でも差がなかった。L鎖はin vitroでのカルパクチンI依存性分泌顆粒凝集系やCa^<2+>ホスホリパーゼA_2依存性膜融合系に影響を及ぼさなかった。従って破傷風毒素の作用点は、これらの物質の作用点と直接関係しない。テタノリジンを高度に精製して、その大きな孔形成特性を明らかにし、新しい高分子物質透過性開口分泌系を開発した。
超分子構造の分子間配座解析に資する固体NMR解析法開発とその適用

本研究では、主に多数の分子間水素結合に基づいて会合し、複合体を形成している線維のような超分子に関して、固体NMRを用いた構造解析において分子間配座の解析に資する解析法を開発することを目的としている。このため、超分子複合体中の分子間配座に関する構造情報を効率的に取得する固体NMR解析法の開発を試みる。また、これらの開発法をその典型的な解析対象であるアミロイドペプチドにより形成されるアミロイド線維の構造解析に適用し、当該試料の構造解析を行うと共に、その実用性について検証する。
細胞環境応答性アプタマー（PARCEL）を用いる新規薬剤放出システムの構築

本研究では、細胞内酸化還元環境に応答するDNAアプタマーPARCEL(Practical Aptamer Responding to CELlular Environment)を用いる薬剤放出システムの開発を目的とした。これを実現するために、2'-デオキシ-4'-セレノチミジンの三リン酸体(SeTTP)を合成した。得られた三リン酸体を用いて、PCRを検討した。その結果、KOD dash DNAポリメラーゼを用い、DMSO添加の条件下、PCRが効率よく進行することを見出した。これによりPARCELを獲得可能な条件を見出すことが出来た。本研究では、申請者が最近合成に成功した1,2-ジチアンヌクレオシドの三リン酸体を用いて、細胞内酸化還元環境に応答するDNAアプタマーPARCEL(Practical Aptamer Responding to CELlular Environment)を獲得し、これを新規な薬剤放出システムに利用して、副作用の少ない次世代型のがん治療法としての基盤技術の確立を本研究の最終目的とする。平成26年度は、1,2-ジチアンヌクレオシドを合成し、これを三リン酸体へと導くべく種々検討を行った。しかし3価のリン酸化試薬存在下、ジスルフィド結合の開裂が起こり、これをトリガーとしてグリコシル結合の切断が起こり望みとする三リン酸体を得ることが出来なかった。そこで新たな戦略として、1.グリコシル結合の切断が起こらない1,2-ジチアン-C-ヌクレオシドの設計と合成、2.細胞内環境応答型アプタマー獲得の新素子として4'-セレノヌクレオシドの設計と合成に着手した。これらのうち、項目2については2'-デオキシ-4'-セレノチミジン合成ならびにその三リン酸体の合成を達成できた。本研究では、申請者が開発した1,2-ジチアンヌクレオシドの三リン酸体を用いて、細胞内酸化還元環境に応答するDNAアプタマーPARCEL(Practical Aptamer Responding to Cellular Enviroment)を獲得し、これを新規な薬剤放出システムに利用して、副作用の少ない次世代型のがん治療法としての基盤技術の確立を最終目標とする。平成26年度の研究から、当初PARCEL獲得に使用予定であった1,2-ジチアンヌクレオシドの三リン酸体が合成が極めて困難であり、新たな素子として2'-デオキシ-4'-セレノチミジン三リン酸(SeTTP)を開発したことを報告した。平成27年度は、この化学修飾三リン酸体を用いてPARCEL獲得に向けて酵素反応の検討を行った。まず鎖伸長反応を検討した結果、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼを用いた場合に比較的効率よく鎖伸長が進行することが明らかとなった。続いてSeTTP存在下でのPCRを検討した。これによりin vitro selection法によりPARCELを獲得可能な条件を見出すことが出来た。当初、計画していた1,2-ジチアンヌクレオシドの三リン酸体合成が困難であることが明らかとなり、これにかわる新たな細胞内環境応答型アプタマー獲得の新素子の合成が必要となったため。核酸化学新たに分子設計した2'-デオキシ-4'-セレノチミジン三リン酸体を用いてDNAポリメラーゼのスクリーニングならびにin vitroselection法を用いたPARCELの獲得ならびにその性能評価を行なう。用いる三リン酸体の構造が当初計画と変わったが、それ以外の実施計画については申請時から大きな変更はない。合成化合物の変更により消耗品費の額が当初計画より小額となったため。また学会成果発表のための旅費や機器測定料も使用する必要がなかったため。平成26年度、繰越し金が約80万円生じたが、平成27年度は新たな合成化合物が決定し、その大量合成を行なうため試薬購入にその繰越し金を充てる。その他についても生化学試薬や研究成果発表に使用する予定であり助成金の使用に大きな変更は生じない。
幕府奥右筆の分析による近世国家権力構造の研究

平成30年度は、江戸幕府の奥右筆の職掌などを研究するために必要な史料収集およびその内容の分析・検討を進めた。平成30年度に収集した史料は、弘前藩津軽家の史料である弘前藩庁日記(弘前市立弘前図書館)および首都大学東京附属図書館所蔵水野家文書に含まれる老中日記である。具体的には弘前藩庁日記のうち、延宝8年(1680)から9年・宝永6年(1709)・享保1年(1716)2年・5年・15年・延享3年(1750)・明和2年(1765)3年・天保10年(1839)15年・嘉永6年(1853)の江戸藩邸日記、松平能登守乗賢日記・松平右近将監武元日記など19世紀を中心とする老中日記、および「自分雑記」「内願筋公用人共取次候矩則増山弾正少弼尋候ニ付答書」「中務殿公用人不念之取計いたし候一件書付」などの江戸幕府関連史料を収集した。収集はデジタルカメラによる撮影およびマイクロフィルムからのプリントアウトによって実施し、内容の分析・検討を行った。収集した史料から、弘前藩・対馬藩が自藩の運営のために幕府へどのような働きかけを行っていたのかを分析している。研究の成果は、平成30年8月に開催された国際歴史文化研究会第7回合宿において「幕藩関係における老中対客の意義」として報告した。また平成31年5月に開催が予定されている歴史学研究会大会において、「幕藩間交渉における非制度的関係の位置づけ」として報告を行う予定である。既に収集した史料が計画時の予想以上に豊富な内容を持っており、その分析を優先して実施している。そのため、史料収集は計画と比較して若干遅れている。5月に開催される歴史学研究会大会にて前年度に収集した史料に基づいた研究成果を報告する。その後平成30年度同様に史料収集をすすめていく。収集済史料の分析に注力したために、史料収集に若干遅れが発生したために次年度使用額が発生した。平成31年度は史料の収集に注力する計画である。
ヘテロダイン検出キラル和周波発生による界面におけるたんぱく質の二次構造の解明

1350 cm-1までの低波数領域までのヘテロダイン検出キラル振動和周波発生分光(HD-キラルVSFG分光)を可能とする装置を開発し、キラリティーを持つ分子界面に応用を行った。まず、キラリティーをもつ両親媒性分子(ビナフチル誘導体)の単分子膜を空気/水界面においてin situで測定し、単分子膜レベルのキラリティーの検出に成功した。また、共鳴ラマン散乱の理論を用いることにより、このキラルVSFG信号が対称ラマンテンソルに由来するものであることを世界で初めて示した。また、らせん構造を持つポリ乳酸やポルフィリンの超分子構造へと応用し、界面におけるらせん構造を高感度に件検出可能であることを示した。本年度はヘテロダイン検出振動和周波発生(HD-VSFG)分光法による界面分子のキラリティーを検出するHD-キラルVSFG分光法の開発を行った。本年度で達成した主な課題は以下の3つである。1. HD-キラルVSFG分光法をタンパク質水溶液/空気界面へと応用した。αへリックスを主として持つ牛血清アルブミン、反並行βシートを主として持つペプシン、コンカナバリンA、αキモトリプシンについて測定をおこなった。その結果、アキラルなスペクトルは二次構造依存性が見られなかった。一方、キラルなスペクトルについてはアミドIおよびNH伸縮振動がβシート特異的に現れることを示唆する結果が得られた。2.二重共鳴HD-(キラル)VSFG分光法の開発を行った。1,1'-ビ-2-ナフトール(BINOL)および両親媒性を持つビナフチル誘導体へと応用した。それぞれのキラルVSFG信号の励起プロファイルから、BINOLはバルク相からの信号で、反対称ラマンテンソルの電子共鳴が支配的であるという結果が得られたのに対して、両親媒性ビナフチル誘導体を水上単分子膜として測定した結果では、対称ラマンテンソルの電子共鳴が支配的であるという結果が得られた。これは、界面から発生するキラルVSFG信号の電子共鳴効果のメカニズムをはじめて示したものであり、大きな重要性を持つ。3. HD-VSFG分光をより低波数領域へと拡張した。現在までのところ、含フッ素ポリマーから1370 cm-1のバンドの信号を、ビナフチル誘導体からは1300 cm-1付近の信号を得ることに成功しており、これは現在報告されているHD-VSFG分光の結果の中でもっとも低波数のものである。振動SFG分光については予想以上に進展している。特にキラルVSFG信号の電子共鳴のメカニズムに関する研究は、今後キラルVSFG分光を応用する際に重要な情報を提供すると考えられる。一方、電子SFG分光については目覚しい進展はなかった。これは主にESFGを発生する際に必要な、フェムト秒広帯域光の発生に問題が生じたことによる。安定かつ高輝度な可視広帯域光を得ることが、今後の課題となることが明らかとなった。本年度はヘテロダイン検出キラル振動和周波発生分光法(HD-キラルVSFG分光法)をらせん構造を持つポリマー分子の界面およびらせん構造を形成する超分子構造へと応用した。らせん構造はたんぱく質中のα-へリックス構造に代表されるように、生体分子にとって非常に重要な高次構造である。一方向のらせん構造を持つ分子はキラリティーをもつことから、キラルVSFG活性になると考えられるが、その信号の発生メカニズムはよく研究されていない。本研究ではらせん構造を持つポリマー分子であるポリ乳酸に着目した。構築したHD-キラルVSFG装置によりCH伸縮振動領域および指紋領域から明瞭なキラルVSFG信号を符号付で取得することができた。さらに、その信号の符号をらせん構造のモデルから量子化学計算により再現し、界面における分子配向と関係付けることに成功した。これは、生体分子のらせん構造をキラルVSFGにより研究する際に重要な知見になると考えられる。さらに、キラリティーをもつ界面活性剤分子をアキラルなポルフィリン分子と共存させることによって発現する、超分子構造のキラリティーに着目した。溶液/空気界面から明瞭なキラルVSFG信号を取得できた。これは、超分子構造のキラリティーをin situで測定したはじめての研究である。キラルVSFG分光法では界面に存在する分子を選択的に検出できたと考えられるが、その界面における超分子のキラリティーと円二色性により測定したバルク中の超分子のキラリティーを併せて考えることにより、超分子構造が界面活性を持ち、水/空気界面に高濃度に存在しているという結果を得た。2016年度に行うべき研究は以下の通りである。

ひとつは2015年度に達成することのできなかったヘテロダイン検出キラル電子和周波発生分光法の開発であり、フェムト秒広帯域光の発生に成功すれば比較的に容易に達成できる課題である。もうひとつはキラルVSFG分光法と分子の配向および二次構造の相関を解明することである。これは、二次構造および配向を制御した試料を標準試料として測定することで達成できると考えている。分子分光学
常磁性プローブを用いたNMRによる高分子量蛋白質およびその複合体の構造生物学

常磁性ランタニドイオンをタンパク質に固定することで、PCS (pseudo-contact shift)やPRE (paramagnetic relaxation enhancement)といった常磁性効果が観測され、タンパク質のNMR立体構造解析を行う上で有用な情報が得られる。しかし金属イオンを結合しない一般のタンパク質に対してランタニドプローブを応用するためには、ランタニドをタンパク質に対して強固に固定できるランタニド結合タグを用いる必要がある。H20年度にはタンパク質に対するタグの運動性を最小限に抑えたランタニド結合タグを開発した。H21年度にはそのタグシステムを実際のタンパク質複合体構造解析へと応用し、手法の有効性を実証した。今年度はランタニドプローブ法をさらに発展させ、NMRを用いたリガンドスクリーニング手法の開発を行った。FBDD (Fragment Based Drug Discovery)などの薬剤探索戦略においては、標的タンパク質に対して特異的に結合するリガンドを迅速に同定し、さらにリガンド-標的タンパク質の複合体構造情報を取得することが重要である。本研究ではランタニドタグを用いてランタニドイオンを標的タンパク質に固定することで、PREに基づいて標的タンパク質と結合したリガンドを混合溶液中から同定し、さらにPCSの解析によってリガンド-タンパク質複合体の立体構造を迅速に決定する手法を開発した。常磁性ランタノイドプローブをNMR立体構造解析に応用することで、NOE情報が不足しがちな高分子量タンパク質やその複合体の立体構造解析をより高い精度で行なうことが可能になる。しかし金属イオンを結合しない一般のタンパク質に対してランタノイドプローブを応用するためには、ランタノイドをタンパク質に対して強固に固定できるランタノイド結合タグを用いる必要がある。H20年度には、まずタンパク質に対するタグの運動性を最小限に抑えたランタノイド結合タグを開発し、その効果を検証した。これまでのタグはペプチド性のランタノイド結合タグ(LBT)をタンパク質表面のシステインとのS-S結合を介して固定化するという方式であったが、タグの運動性によりランタノイドからの常磁性効果が減弱してしまっていた。そこで、本研究では、LBTを対象タンパク質の2点て固定化する方式のタグを考案した。この2点固定化LBTを用いることによって、常磁性効果の一つであるRDCと、そこから求めた配向テンソルの値が増強され、ランタノイドがより強固に固定されていることが示された。2点固定化LBTを用いることによって、タンパク質に対するランタノイドのブレを最小限に抑え、より精度の高い立体構造情報が得られるようになると期待される。本研究ではさらに、この2点固定化LBTを実際のタンパク質立体構造解析へと応用することを試みた。対象タンパク質として、選択的オートファジーに関わる、ZIP PB1ドメインを選択した。ZIP PB1はホモダイマーの形成によってオートファジーの基質となるタンパク質の重合体を形成する役割を持ち、アルツハイマー病などの神経変性疾患に深く関わるタンパク質として近年注目を集めている。ZIP PB1に対してランタノイド結合タグを固定化するコンストラクトを設計・作成し、発現・精製系の確立を行なった。常磁性ランタノイドイオンをタンパク質に固定することで、PCS(pseudo-contact shift)やRDC(residual dipolar coupling)といった常磁性効果が観測され、そこからタンパク質の立体構造情報を得ることが可能である。そのため、常磁性ランタノイドプローブをNMR立体構造解析に応用することで、NOE情報が不足しがちな高分子量タンパク質やその複合体の立体構造解析をより高い精度で行なうことが可能になる。H20年度にはタンパク質に対するタグの運動性を最小限に抑えたランタノイド結合タグを開発した。今年度(H21年度)には、開発したタグをp62 PB1の複合体立体構造解析へ応用した。p62はオートファジーに関わるタンパク質で、ユビキチン化された基質を認識しファゴソームへと輸送する働きを持つ。p62N末端に存在するPB1ドメインは自己多量体を形成し、基質重合体を形成する役割を持つ。本研究では、p62 PB1の自己多量化を抑制し、1:1のダイマーを形成する2通りの変異体(DR変異体・KE変異体)を作成した。次いでDR単体でのNMR構造を決定し、DRに対してランタノイド結合タグを導入した。DRに固定化した常磁性ランタノイドイオンを用いて、DR/KE複合体に対するPCSを観測し、PCSに基づいたrigid-body docking計算によってDR/KE複合体の立体構造を決定した。

本研究ではランタニドタグを用いてランタニドイオンを標的タンパク質に固定することで、PREに基づいて標的タンパク質と結合したリガンドを混合溶液中から同定し、さらにPCSの解析によってリガンド-タンパク質複合体の立体構造を迅速に決定する手法を開発した。
母体側スフィンゴ脂質環境が胚発生や着床におよぼす影響

研究目的:スフィンゴ脂質(SL)生合成系に関わる転移酵素のノックアウトマウス(KOM)は胎生致死であることが多く, SLの骨格となるセラミドの輸送に関わるCeramide transfer protein(Cert)のKOMも例外ではない。Cert欠損へテロ接合体(CertKOHe)は野生型の表現型と顕著な差は見られない。しかしながら,野生型雌マウスとCertKOHe雄マウスの交配で生まれてくる仔の匹数に比べ, CertKOHe雌マウスと野生型雄マウスの交配で生まれてくる仔の匹数が少ない傾向にあった。胚の発生や着床にもセラミドが関与している事が報告されていることから,本研究では, KOMが胎生致死であるCertおよびスフィンゴ糖脂質(GSL)合成のキーエンザイムであるグルコシルセラミド合成酵素(Ugcg)のへテロ接合体(UgcgKOHe), CertとUgcgふたつの遺伝子のへテロ接合体(CertKOHe/UgcgKOHe)を用いて,受精から発生の間におけるSLが及ぼす影響を調べ,不妊症あるいは不育症のモデルとなるか検討した。研究方法:受精卵の遺伝型の違いによる影響を避けるため,雌マウスは精管結紮雄マウスと交配して膣栓が確認できたものを偽妊娠マウスとし, C57BL/6の前核期受精卵をC57BL/6およびCertKOHe, UgcgKOHe, CertKOHe/UgcgKOHeの卵管に移植した。移植時には卵管膨大部の有無も確認し,着床後の胚の形態および着床数を調べた。研究結果:1、偽妊娠マウスはいずれの遺伝型の母体でも卵管膨大部がない場合は, 100%着床しなかった。2、移植後11日目に着床数および胚の形態を確認したところ, C57BL/6は移植した7割の前核期受精卵が着床し, 8割が正常に発生した。CertKOHeおよびCertKOHeUgcgKOHeは移植した前核期受精卵の5割が着床し,正常に発生していたのは半数だった。一方, UgcgKOHeは移植した前核期受精卵は3割しか着床せず,そのうち6割が正常に発生した。以上の結果より, UgcgKOHe雌マウスは着床が成立しにくいことが示唆された。また, CertKOHeおよびUgcgKOHe, CertKOHeUgcgKOHe雌マウスはいずれも野生型に比べ正常な胚発生を半数しか維持できないことが示唆された。
酵素進化工学が先導する新規モノマー導入型バイオポリマーの完全生合成システムの創成

再生可能バイオマス原料から高性能バイオポリマーを微生物生産させるシステム(微生物工場)の開発を行った。最も大きなブレイクスルーは、「乳酸重合酵素=LPE」の発見である。従来の微生物ポリマーPHA(ポリヒドロキシアルカン酸)の重合酵素の改変研究を積み重ねてきた過程で見出された。この酵素を大腸菌に遺伝子導入することにより、バイオマス由来グルコースから乳酸を取り込んだポリマーが“一気通貫"に細胞内に合成された。また、代謝と酵素の複合改変を試みたところ、ポリマー中の乳酸分率が6%から47%に上昇した。さらに、合成ポリマーの基礎物性を調べ、従来のポリ乳酸(PLA)と微生物ポリマーPHB(ポリヒドロキシブタン酸)との比較において、ユニーク性を見出した。資源循環サイクルに組み込まれるバイオプラスチック生合成酵素の進化工学的改変をとおして、バイオポリエステルの生産性・物性を積極的に改善する研究を展開している。今年度は、3HBをベースとしたPHA共重合体を合成できるpseudomonas sp.61-3重合酵素(PhaCps)を対象に、特に共重合組成(3HBとそれ以外のモノマーユニットとのモル比)と分子量の精密制御可能なpmの合進化酵素を多数創出し、それら構造機能相関解析から優良変異効果の総括的考察および、各種進化酵素の植物体での発現解析に移行した!対象酵素PhaCpsは、3HBベースのPHA共重合体を合成できるが、3HB基質取り込み能力が微弱であるという課題があった。そこで、この性質を利用することによって、3HBだけから成るPHBホモポリマーの蓄積能力が向上する(PhaCpsの3HBに対する基質特異性向上あるいは全活性の向上)ということを指標とした点変異導入と効率的なスクリーニング系を基盤とした新酵素創成システムを築した。この確立した人工進化システムから得られた複数の優良変異部位4箇所(130,325,477,481)のうち、130番目と325番目は酵素活性そのもののに関与し、477番目と481番目は基質特異性に関与することが明らかとなった。この知見に基づき、組換え大腸菌(b酸化系変異株LS5218使用し、C4からC12までのモノマー基質を供給できる酵素遺伝子(phaAReBReJPa)を補強した状態)によって生成されるポリマーの解析から、優良変異の組み合わせから共重合体中の3HB分率が14%から93%の幅で制御できる進化酵素群を取り揃えることができた。また、477部位がGlyに置換が導入されると分子量が低下し、逆にArgに置換されると向上することがわかり、一アミノ酸置換で分子量制御も可能であった。以上の結果は、側鎖のサイズを系統的に変えたCoA体脂肪酸モノマーを化学合成し、インビトロでの活性試験をした結果とよく符合し、生成ポリマーの解析結果とよい相関を示すことがわかった。この進化酵素をベースに乳酸んモノマーユニットの取り込み実験をしたところ、大変幸運なことにポリマー鎖内への取り込みを確認できた。すなわち、初めて微生物細胞内で乳酸モノマーを含むバイオポリマーの合成に成功したことになる。ポリマーの解析結果から、P(6%乳酸-co-94%3HB)の新規2元共重合体となっていた。環境調和型バイオプラスチック生合成酵素の進化工学的改変を実施することで、バイオポリエステルの生産性・物性を積極的に改善する研究を展開している。今年度は、3HBをベースとしたPHA共重合体を合成できるPseudomonas sp.61-3重合酵素(PhaC_<ps>)を対象に、特に共重合組成(乳酸ユニットとそれ以外のモノマーユニットとのモル比)と分子量の精密制御可能なPHAの合成進化酵素を多数創出し、それら構造機能相関解析から優良変異効果の総括的考察および、各種進化酵素の植物体での発現解析に移行した。対象酵素PhaC_<ps>は、乳酸ベースのPHA共重合体を合成できるが、コポリマー中の乳酸基質取り込み能力が6%と微弱であった。そこで、人工進化システムから得られた複数の優良変異部位4箇所(130,325,477,481)のうち、130番目と325番目は酵素活性そのもののに関与し、477番目と481番目は基質特異性に関与することが明らかとなった。この知見に基づき、組換え大腸菌(b酸化系変異株LS5218使用し、C4からC12までのモノマー基質を供給できる酵素遺伝子(phaA_<Rc>B_<Re>J_<Pa>)を補強した状態)によって生成されるポリマーの解析から、優良変異の組み合わせから共重合体中の3HB分率が14%から93%の幅で制御できる進化酵素群を取り揃えることができた。

本結果は、側鎖のサイズを系統的に変えたCoA体脂肪酸モノマーを化学合成し、インビトロでの活性試験をした結果とよく符合し、生成ポリマーの解析結果とよい相関を示すことがわかった。この進化酵素をベースに乳酸モノマーユニットの取り込み実験をした結果、高分率で乳酸ユニットのポリマー鎖内への取り込みを確認できた。低炭素社会の構築を目指した研究として、環境調和型バイオプラスチックの生合成酵素の進化工学的改変を実施し、微生物ポリマーのの生産性・物性を積極的に改善する研究を展開してきた。最終年度は、乳酸モノマーベースとした共重合体を合成できるPseudomonas sp.61-3重合酵素を対象に、特に乳酸ユニットと共重合化する他種モノマーとの組成およびポリマー分子量の精密制御可能なPHAの合成進化酵素を系統的人工進化により多数創出できた。取得した変異体ライブラリーの機能マッピングにより、酵素活性の増強や基質特異性に関与する優良変異効果の総括的考察および、重合過程における乳酸モノマーユニットのポリマー鎖への取り込み反応の解析へと展開した。本乳酸重合酵素は、乳酸ベースのPHA共重合体を合成できるが、コポリマー中の乳酸基質取り込み能力が数%と微弱であった。すでに、人工進化実験により特定された複数の優良変異部位4箇所のうち、130番目と325番目は酵素活性そのもののに関与し、477番目と481番目は基質特異性に関与することが明らかとなった。この知見に基づき、組換え大腸菌(β酸化系変異株を使用し、C4からC12までのモノマー基質を供給できる酵素遺伝子(phaA_<Re>B_<Re>J_<Pa>)を補強した状態)によって生成されるポリマーの解析から、優良変異の組み合わせから共重合体中の3HB分率が広域幅(数%から70数%)で制御できる進化酵素群を取り揃えることができた。本結果は、側鎖のサイズを系統的に変えたCoA体脂肪酸モノマーを化学合成し、インビトロでの活性試験をした結果とよく符合した。最後に、合成ポリマーの熱的・機械的物性を丁寧に調べた。その結果、乳酸分率の上昇に伴い、ガラス転移温度が向上し、透明性も増した。また、硬質製のポリ乳酸よりも柔軟性を取り込み、従来にないポリマー特性を発現することが新たに明らかとなった。
てんかんに併発する精神障害の発症機序に関する神経化学的研究

【目的】てんかんに併発する精神障害の発症機序を明らかにするため,電撃けいれん(ECS)動物モデルを用いて神経化学的および行動薬理学的検討を行った。Wistar系雄性ラットにECS(50mA,0.2sec)を7日間反復負荷することによりY-maze試験での自発的交替行動率の低下とOpen-field試験での自発運動量の増加が引き起こされる。我々は既に,これらの行動障害は抗てんかん薬の前投与によってけいれんを抑制することで改善されることを明らかにしている。今回は,脳由来神経栄養因子(BDNF)とドパミン神経系の関与について検討を行った。【実験I:神経化学的検討】ECS負荷前に抗てんかん薬のバルプロ酸(400mg/kg,i.p.)を投与し,7日間けいれんを抑制した。7日目のECS負荷24時間後に,海馬および前頭皮質のBDNFを測定した。【結果】海馬および前頭皮質のBDNFは,対照群と比較して反復FCS負荷群で有意に増加した。しかし,反復ECS負荷で増加したBDNFは,バルプロ酸の前投与で影響されなかった。【実験II:行動薬理学的検討】同様に,7日間けいれんを抑制したラットを用いて,7日目のECS負荷24時間後にドパミン受容体作動薬アポモルヒネを投与し,アポモルヒネ誘発常同行動の変化を観察した。【結果】アポモルヒネ誘発常同行動は,対照群と比較して反復ECS負荷群で有意に増加した。さらに,この増加は,バルプロ酸の前投与によって有意に低下された。【考察】以上の結果より,反復ECS負荷ラットにおける行動障害にBDNFは関与しないがドパミン神経系の機能亢進が関与していることが示唆された。
超高圧下で単体が示す特異な構造相転移と超伝導の理論的解明

カルシウムについて高圧VI相とVII相の存在を予測するとともに、単純立方構造III相は有限温度下において動的安定構造として出現することを示した。また、金において400万気圧以上でABCACBという特異な積層構造に転移する可能性を示すとともに、開発した遺伝的アルゴリズム計算コードを用いてイットリウムの高圧V相とVI相の構造同定に成功した。超伝導については、金単体を超伝導化させるためには0.04 μK以下まで冷却する必要があるが、12.5 at%だけインジウムと置換すれば0.1 Kまで超伝導転移温度が上昇することを明らかにした。カルシウムの圧力誘起構造相転移について二つの重要な結論を得た。第1に、IV相(P4_12_12 : 74-109 GPa)とV相(Cmca : 109-117 GPa)の高圧側で、VI相(Pnma : 117-135 GPa)とVII相(I4mcm(00γ) : 135 GPa-)の存在を第一原理的計算で予測したが、最近の実験によりこの相転移が実際に確認された。第2に、実験ではIII相が単純立方(sc)構造と同定されているのに対し、静的状態での第一原理的研究ではscはエネルギー的・力学的に不安定であるという問題が存在するが、我々は300Kにおいて第一原理分子動力学シミュレーションを実行することにより、scは有限温度下において動的安定構造として出現する可能性があることを突き止めた。超高圧下にて物質の安定な構造を探索する手法については、遺伝的アルゴリズムを採用した計算コード開発に成功した。これは、探索アルゴリズムの局所最適化部分に、密度汎関数理論に基づく局所密度近似の第一原理計算を採用したものであり、広範な物質群に適用可能なものとなっている。まずは、単原子の単位胞1原子の系に適用して、探索法の有効性を検証した。この検証にはシリコンやリンの高圧相を使い、これまでに明らかになっているいくつかの理論計算および実験結果を再現することに成功した。遺伝の確率を制御するいくつかのパラメータに対する探索結果を比較することによりパラメータ値と探索結果の因果関係を調査した。また、第一原理計算の部分では膨大な計算時間が必要なため、K点サンプリングに由来する計算精度と得られる安定構造との関係について検討した。高圧下で高い超伝導転移温度をもつCaとLiに、周期律表で近い元素であるBeとMgについて、圧力誘起超伝導性の可能性を調べたところ、どちらも期待できない結果を得た。Auについても、同様な結果であった。理由は、圧力印加によってフォノン異常が起きるわけでもなく電子格子相互作用が弱いままだからである。Auの圧力誘起構造相転移の可能性を調べた結果、250GPa付近でfcc→hcp転移を示すという従来主張されていた結果とは異なり、ABC積層(fcc)ともAB積層(hcp)とも異なる複数の積層構造を経て、1,000GPa以上で初めてhcp構造が実現されることが明らかとなった。昨年度までに開発していた遺伝的アルゴリズムを採用した計算コードの開発改良と検証計算を行った。この計算コードは、探索アルゴリズムの局所最適化部分に、密度汎関数理論に基づく局所密度近似の第一原理計算を採用したものであり、広範な物質群に適用可能なものとなっている。単原子の単位胞1原子の系であるシリコン高圧相やリン高圧相の結晶構造についての検証計算を行った結果、この探索法の有効性を得るとともに、開発した計算コードの有用性を明らかにした。またリン高圧相を例にとり構造相転移現象を記述するエンタルピーや圧力等の物理量の検証を行った。この探索アルゴリズムでは安定相だけでなく準安定相の候補を見出すことが可能であるが、このことが高圧相の探索に非常に有効であることが示された。探索アルゴリズムに採用されている第一原理計算は、結晶構造を探索するためには比較的確度の高い方法であるが、固体酸素のような複雑な系においては、膨大な計算資源や計算時間を必要とする。そこで第一原理計算には及ばないが、電子状態を記述する方法としてタイトバインディング(TB)法は非常に有効である。そこでTB分子動力学法を開発することを念頭に、原子間に働くTB法の有効ポテンシャルの開発を開始した。【結晶構造予測】静的状態では不安定となるCaの単純立方相が、有限温度下において熱力学的に安定化することを第一原理分子動力学シミュレーションによって明らかにした。金について、およそ400万気圧まで圧縮すると積層順序がABCACBという特異な積層構造に転移する可能性を初めて示した。昨年度に開発した遺伝的アルゴリズムコードをイットリウム高圧相探索に適用し、V相(45-110万気圧)が三斜晶または単斜晶の歪んだfcc構造に、VI相(110万気圧以上)が空間群P3112の3回螺旋構造になることを理論的に予測した。【超伝導】

金単体を超伝導化させるためには0.04 μK以下まで冷却する必要があるが、12.5 at%だけインジウムと置換すれば系の電子-格子相互作用が急激に強まって0.1 Kまで超伝導転移温度が上昇するという結果を得た。計算で得られたイットリウム高圧相の超伝導転移温度はV相で14 K、VI相で18 Kとなり、実験データと良い一致を示した。【固体酸素の特異な構造相転移の解明に向けた取組み】分子間のファン-デル-ワールス(vdW)力をより第一原理的に取り入れるため、vdW密度汎関数(vdW-DF)法を実装した第一原理電子状態計算コードの開発を行った。具体的には圧力テンソル計算などを含む実装が計画され、50%程度が実現している。磁性体への適用を念頭にスピン密度を仮定したときのvdW-DFについて新しく検討をおこない、計算コードへの開発実装を進めた。この過程において、気体中の酸素分子間の相互作用は、主に、超交換相互作用に由来する磁気的相互作用エネルギーと分散力によるエネルギーがありこれらのエネルギーが非常に小さくかつ拮抗しており、高圧下では、これらのエネルギーが分子内の磁性非磁性状態間のエネルギーや分子間を電子が飛び移る運動エネルギーとが絡みあっているとの考察を得た。非磁性単体の圧力誘起構造相転移と圧力誘起超伝導については予定通り研究は進捗しているが、磁性単体(具体的には酸素)については、結晶構造探索の計算規模が大きいため実際の成果が探索だけに留まっており、高圧相における超伝導状態の議論がまだできていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究成果の質を維持向上させながら研究計画を着実に推進して、所期の目的を達成することを目指す。
美的環境造形思想におけるイギリス的伝統の研究

現在、環境の美的造形を支えるのが、一八世紀に始まるイギリスの造園・造景美学であることは、広く認められている。一八世紀イギリスは、従来のヨーロッパで一般的だった整形的・幾何学的西洋庭園の伝統とは異なる独自の自然風庭園様式、いわゆる「風景式庭園」を生み出した。このイギリス風景式庭園は、後に一般化ないし平板化され、文字通り「自然」で快適なものと認められることで、若く広大な国アメリカの環境造形に継承される。すなわち、都市計画や開発と一体化した、大規模な「ランドスケープ・アーキテクチャー」の発展である。これはイギリス的伝統を長く引き継ぎながら、今日、全世界中で実践・教育されている。本研究の目的は、以上の流れを跡付けつつ、同時にそうした単純な整理ではつくされない忘れられた伝統、あるいは現在の環境造形を批判的に評価・深化するための多様な基準を、イギリスを中心とする美的環境造形思想に探ることである。そのため、従来、美学に省みられることの稀であった、美的な造園・計画に関する主に英語圏の文献を、美学芸術学的な思想として通時的・体系的・包括的に精査した。しかも同時に、具体的な庭園のいくつかに則しつつ、さらにそれらを取り巻く社会政治的なイデオロギーをも十分顧慮しながら、現在の環境造形にまで至るその意義を考察した。その概要は、以下の通り。(1)風景式庭園の美的政治学:ストウ庭園とイングリッシュ・ガーデンのイングリッシュネス。(2)農業と美:風景式庭園のライトモチーフ。(3)仮象の廃墟・風景四季亭園における人工廃墟(4)埋められた不協和音・キュー庭園を巡るカンヴァセーション・ピーシーズ(5)ピクチャレクの「移植」:イギリスから現代へ。一九世紀イギリスにおける美的環境造形思想を、文献実証的・美学思想的に読解・体系化した。特にそれを支えたイデオロギー的な基盤が、本年度の焦点となった。すなわち、一九世紀以降のイギリスの美的環境造形思想は、基本的には一八世紀初頭のイギリスに誕生した風景式庭園の語彙を引き継ぐもので、その継承の過程を跡付けることが、本研究の主目的の一つであったが、この風景式庭園が、後のイギリスの田園都市運動や、さらにはヨーロッパやアメリカのランドスケープ・アーキテクチャーへ引き継がれるに際しては、それが或るイデオロギー的なオーラと呼べるものに支えられてゆくのである。具体的には、自然的・土着的なものと見なされた風景式庭園(実際には、必ずしも当初からそうしたものではなかったのだが)は、イギリスにいち早く発達した開かれた自由な市民社会の象徴とされる。そして両者は融合した形で、世界の美的環境設計の模範として伝搬してゆくのである。本年度にとりわけ明らかにしたのは、そうした庭園や環境設計における自然と自由のイデオロギー的な癒着が、一八世紀後半のイギリスの植民地主義的な政治的文脈と密接に関わる形で醸成されたことであり、さらにそうした癒着が、一九世紀イギリスを代表する造園家ラウドンや、同時期のドイツを代表するムスカウ他の著者にも、典型的な形で見られたことである。同時に、パリやプラハにおける風景式庭園の実作に関しても、同様の知見を得ることができた。また田園都市運動を始めとするイギリス本国のユートピア的な環境設計においても、なるほど商業活動、あるいは労働運動や社会主義といった前進的・進歩的な傾向・思想と結びつきながらも、一八世紀的な自然的・土着的風景式庭園へのノスタルジーが見られる点も明らかになった(つまりそこにも、無意識的に叙上のイデオロギー的癒着がみられる訳である)。主として十八紀末から十九世紀のイギリスにおける美的環境造形思想と、さらにそれとアメリカのランドスケープ・アーキテクチャーとの接合関係を研究した。

まず、その時期に重要となるピクチャレスクの美学(アメリカでの影響も含む)について、それが十九世紀からさらには現代にいたるまで、どのような影響をもたらしているのか、それjへの理解を論文で公表するとともに、美学会全国大会での討論の中で深めた。次に、イギリスの美的環境造形思想が伝播する中で、極めて重要な役割を果たした政治性、特にイギリスの植民地主義的なイデオロギーを解明した。すなわち、イギリスを代表する風景式庭園、ストウにおける政治性の反映・忘却、植民地主義的イデオロギーを剔抉すると同時に、イングリッシュ・ガーデンがどのような国際政治学のコンテクストで発生・展開・伝播したかを研究した。その際、ドイツ・グライフスバルト大学のゲルト=ヘルゲ・フォーゲル氏から、庭園を含む風景と政治性、ナショナリズム等に関する多大な指導を受けた。またパリ第一大学のフィリップ・ニス教授には、庭園や風景の原理的な考察について学ぶと同時に、アメリカ化する世界風景との対時峙という、本研究にとって本質的な点に関する教示を得た。さらに、国際美学会議において、美的環境造形思想のイギリス的伝統に関する比較美学的な原理的な発表を行い、内外の研究者から多くの指摘や指導を受けることができた。さらに、この成果を現代の美的環境設計に生かすという本研究の目的から、イギリス的伝統を現代のランドスケープの批評という枠内で検討するという作業も行った。本年度は若干視野を広げて、開かれた風景式庭園とピクチャレスクの美学を基調とする、美的環境造形思想におけるイギリス的伝統が、その後、イギリスの帝国主義的拡大にともなって、現代までの美的環境造形にどのような意義をもってきたかを、歴史的・批判的に考察した。まず重要なトピックとして、十九世紀にイギリス国内でピクチャレスクなものが「イギリス性」のイコンになってゆくことを取り上げた。特に風景画家、ジョン・コンスタプルにおけるそのような意識の自覚的発現と、同時代における彼の版画の流通にみるイギリス的風景の物神化について研究した。同じトピックにかんして、十九世紀に新しい展開を見せたイギリスの公園が、同時代のブルジョワ的な娯楽の考え方に支配されながらも、基本的には風景式庭園の語彙や美学を踏襲しつつ、エキゾチックなピクチャレスクとも呼ぶものを展開していることを、たとえばキュー庭園の歴史に即して見た。その際、いわゆるプラント・ハンターと呼ばれる博物学的植物収集家たちが重要な役割を果たしたことも確認した。またそれと関連することであるが、江戸末期の日本を旅行したサー・ラザフォード・オールコックのようなイギリス人が、いかに日本のような異国の地をピクチャレスクなイギリス風景式庭園と見たのかも、出来る限り実証的に研究した。さらに、現代イギリスの黒人写真家、イングリッド・ポラードのような芸術家が、いかに反植民地主義的・反帝国主義的な視点からイギリスの美的環境造形の伝統と批判的に対持しているかをも考察した。最後に、たとえば芭蕉のような日本の風景観、あるいは洗練された美的強度をもつ伝統的な日本庭園などとイギリス的な伝統とを比較することで、現代におけるイギリス的伝統の支配にたいする批判的な対決を行い、そこからたとえば閉ざされた庭の復権を含む、新しい美的環境造形思想の提出を試みた。
強光子場中での溶媒和金属クラスターイオンの反応ダイナミックス

1.強光子場中での気相溶媒和金属イオンクラスターの多価イオン化過程と金属イオンの酸化還元反応の機構解明と制御の可能性を検討するため、Mg(H_2O)_nやCa(H_2O)_nについて非経験的理論計算による構造計算とイオン化ポテンシャル(IP)および光解離分光法を用いた電子スペクトルの測定を行った。IPはサイズの増加とともに減少し、n【greater than or equal】9(Mg),n【greater than or equal】8(Ca)で3.18eVと一定の値に収束し、イオン対状態の形成を示唆する結果が得られた。またクラスターの構造とIPの計算を行い、Mg(H_2O)_nではn=6で水素結合ネットワークを有したring構造からMg-O結合が最多となる構造へ構造転移が起こることが予測され、実測のIPの急激な変化と一致することがわかった。さらに水和Mgクラスターの吸収スペクトルの測定を光解離分光法により行った。この結果、金属原子の^1P-^1S遷移は水が付加すると低エネルギー側にシフトし、原子から自発的にイオン化した電子がクラスターの表面で安定化されることを明らかにした。2.アルカリ金属を含む極性溶媒クラスターが、溶媒和電子の生成と金属の溶解過程の分子レベルでのモデルとして重要である点に注目し、レーザー蒸発法を用いて超音速噴流中に生成したNaクラスターを含む水クラスター負イオンNa_m^-(H_2O)_n(m【less than or equal】3)の光電子分光を行った。また非経験的分子軌道法を用いて、クラスターの構造および光電子スペクトルの理論計算を行い、微視的な溶解過程を研究した。さらにNa_m^-(H_2O)_4の光解離実験を行い、Na_3^-のクラスター内での溶解状態を実験的に検証した。本課題では、強光子場中での気相溶媒和金属イオンクラスターの多価イオン化過程と金属イオンの酸化還元反応の機構解明と制御の可能性を検討するため、レーザー分光法と飛行時間質量分析器を用いた研究を進めている。今年度は以下の研究を行った。1.Mg^+(NH_3)_nの二価イオンをTi-サファイアフェムト秒レーザーの基本波を用いて詳細に検討し、多価イオンの生成機構について検討した。またMg^+(NH_3)_4の励起状態の動的緩和過程および酸化還元反応の詳細な情報を得るために、Mg^+(NH_3)_4についてフェムト秒レーザーの基本波(800nm)を用いたポンプ-プローブ実験を行った。時間変化より励起状態の寿命は800fsと得られた。この結果は、溶媒和に伴って励起状態が非常に大きく安定化され、基底状態への無輻射過程の速度が非常に速くなっていることを示している。他方、蒸発生成物であるMg^+(NH_3)_3イオンの検出により、Mg^+(NH_3)_4の励起後の吸収回復に相当する信号変化を初めて観測し、時定数を決定した(1.2ps)。この時定数は基底状態への内部転換と(3+1)構造から(4+0)構造への異性化過程に帰属した。現在、これらの溶媒和ダイナミックスを直接実時間で観測するために、赤外レーザーを用いたポンプ-プローブ実験の準備を進めている。上記の研究をより興味深い水の系に拡張するために、Mg(H_2O)_n、Ca(H_2O)_nの電子状態の研究を行った。ここではレーザー蒸発で生成したこれらのクラスターについて、光イオン化過程を検討した。この結果、アルカリ金属原子の系と同様に、8個以上の水分子の配位によりイオン化ポテンシャルは3.1eVに収束することが実験的に明らかになり、金属原子のクラスター内での自発的イオン化を示唆する新しい結果が得られた。

また非経験的分子軌道法を用いて、クラスターの構造および光電子スペクトルの理論計算を行い、微視的な溶解過程を研究した。さらにNa_m^-(H_2O)_4の光解離実験を行い、Na_3^-のクラスター内での溶解状態を実験的に検証した。
口腔癌細胞の浸潤開始の分子機講-低分子G蛋白による制御-

近年の研究により低分子G蛋白質Rhoファミリー(Rho, Rac, Cdc42)がアクチンの再構成を制御して,細胞形態の維持,細胞接着,細胞運動などに関わっていることが報告されている。私たちは癌細胞が基底膜を分解し,浸潤を開始する過程に焦点を絞り,細胞運動の分子機構の解析を行っており、本研究ではRhoファミリーの癌細胞の基底膜浸潤への関わりを検討した。一方,口腔扁平上皮癌の治療において,病理組織標本における,悪性度の評価には山本・小浜分類(Y-K分類)が広く用いられているものの、個々の癌細胞がいかなる機序で異なった浸潤様式を示すかについては全く不明である。本研究では口腔粘膜由来のヒト扁平上皮癌細胞で,Y-K分類において3型,4C型および4C型の浸潤像を示す細胞株OSC-20,0SC-19,HOC313細胞を用い,異なった浸潤像を示す分子機構-特にRhoファミリーとの関わりを中心に一の解析を試みた。口腔粘膜由来のヒト扁平上皮癌細胞で,YK分類において3型,4C型および4C型の浸潤像を示す細胞株OSC-20,0SC-19,ROC313細胞を用いて各細胞を異なった基質上で培養し,その細胞形態の変化を観察した。各々のsmall G protein activityを標的蛋白のGST-fusion蛋白を用いたpull down assayにて調べた。さらに基底膜分解の初期段階をフィプロネクチン分解・浸潤モデルを用いて浸潤パターンの違いを検討した。その結果、その結果、HOC313細胞でrho activity, OSC-20とOSC-19細胞でrac, cdc42 activityが認められた。それらの浸潤像を検討したところ癌細胞の単独培養ではOSC-20細胞とOSC-19細胞でフィプロネクチン分解活性が高かった.ROC313細胞は線維芽細胞と混合培養することによって他の2種の細胞より高いフィプロネクチン分解活性を得られた。すなわち線維芽細胞との相互作用の影響を大きく受けていることが示唆された.近年の研究により低分子G蛋白質Rhoファミリー(Rho, Rac, Cdc42)がアクチンの再構成を制御して,細胞形態の維持,細胞接着,細胞運動などに関わっていることが報告されている。本研究では口腔粘膜由来のヒト扁平上皮癌細胞で,Y-K分類において3型,4C型および4C型の浸潤像を示す細胞株OSC-20,OSC-19,HOC313細胞を用い,異なった浸潤像を示す分子機構-特にRhoファミリーとの関わりを中心に-の解析を試みた。口腔粘膜由来のヒト扁平上皮癌細胞で,Y-K分類において3型,4C型および4C型の浸潤像を示す細胞株OSC-20,OSC-19,HOC313細胞を用いて各細胞を異なった基質上で培養し,その細胞形態の変化を観察した。さらに基底膜分解の初期段階をフィブロネクチン分解・浸潤モデルを用いて浸潤パターンの違いを検討した。

その結果、HOC313細胞でrho activity, OSC-20とOSC-19細胞でrac,cdc42 activityが認められた。さらにOSC-20とOSC-19細胞およびHOC313細胞の浸潤能を検討したところ,OSC-20細胞ではdiffuse typeな浸潤像,OSC-19細胞ではdot typeの浸潤像,そしてHOC313細胞ではアクチンファイバーの増生が認められるとともに浸潤パターンはdiffuse type (fibrous)な像が認められた。近年の研究により低分子G蛋白質Rhoファミリー(Rho,Rac,Cdc42)がアクチンの再構成を制御して,細胞形態の維持,細胞接着,細胞運動などに関わっていることが報告されている。私たちは癌細胞が基底膜を分解し,浸潤を開始する過程に焦点を絞り,細胞運動の分子機構の解析を行っており、本研究ではRhoファミリーの癌細胞の基底膜浸潤への関わりを検討した。一方,口腔扁平上皮癌の治療において,病理組織標本における,悪性度の評価には山本・小浜分類(Y-K分類)が広く用いられているものの、個々の癌細胞がいかなる機序で異なった浸潤様式を示すかについては全く不明である。本研究では口腔粘膜由来のヒト扁平上皮癌細胞で,Y-K分類において3型,4C型および4C型の浸潤像を示す細胞株OSC-20,0SC-19,HOC313細胞を用い,異なった浸潤像を示す分子機構-特にRhoファミリーとの関わりを中心に一の解析を試みた。口腔粘膜由来のヒト扁平上皮癌細胞で,Y-K分類において3型,4C型および4C型の浸潤像を示す細胞株OSC-20,0SC-19,HOC313細胞を用いて各細胞を異なった基質上で培養し,その細胞形態の変化を観察した。各々のsmall G protein activityを標的蛋白のGST-fusion蛋白を用いたpull down assayにて調べた。さらに基底膜分解の初期段階をフィブロネクチン分解・浸潤モデルを用いて浸潤パターンの違いを検討した。その結果、その結果、HOC313細胞でrho activity,OSC-20とOSC-19細胞でrac,cdc42 activityが認められた。それらの浸潤像を検討したところ癌細胞の単独培養ではOSC-20細胞とOSC-19細胞でフィブロネクチン分解活性が高かった.HOC313細胞は線維芽細胞と混合培養することによって他の2種の細胞より高いフィブロネクチン分解活性を得られた。すなわち線維芽細胞との相互作用の影響を大きく受けていることが示唆された.