hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非麻痺側上肢運動が誘発する麻痺側上肢の静脈還流および静脈還流と浮腫の関係性解明

脳卒中後の上肢浮腫の原因の1つとして静脈うっ滞が影響している.本研究の主目的は,健側上肢運動によって患側上肢の静脈還流が促進されるのか確認することであった.最終年度では脳卒中患者を対象とした.研究期間全体を通して,脳卒中患者21名の協力を得た.対象者には背臥位および座位で健側ハンドグリップ運動を実施してもらい,その間の患側上肢静脈還流を腋窩静脈で計測した.加えて,健側ハンドグリップ運動においては抵抗なしと抵抗あり(最大握力の30%の強度)の方法で運動を実施してもらった.計測においては,超音波診断装置を用い,血管径および血流速度を計測した.また,上肢全体の浮腫の程度を計測するために,超音波診断装置および生体電気インピーダンス法を用いた.背臥位および座位ともに,安静時と比較し,健側ハンドグリップ運動によって患側上肢の腋窩静脈の血流速度が増加した.また,静脈還流も有意に増加した.さらに,ハンドグリップ運動について抵抗なしと抵抗ありを比較すると,抵抗ありの方が静脈還流は有意に促進された.これまでの脳卒中後の上肢浮腫を改善する方策については,いずれも効果が制限されている.本研究は新しい方策として健側上肢の運動に着目した.本研究では健側運動によって患側の静脈還流が促進されることが明らかとなった.また,ハンドグリップについては抵抗があった方がより静脈還流が促進されることが明らかとなった.今後は,本研究成果に基づいて,実際に健側運動によって患側の浮腫が軽減されるのか明らかにしていきたい.脳卒中後の麻痺側上肢における静脈うっ滞,それに伴う浮腫は疼痛,静脈血栓,上肢機能廃絶等を惹起する.そのため静脈還流を促進する方策が講じられるが,現在の方策には合併症や問題点があり,効果も疑問視されている.さらに,浮腫の定量評価は困難であり,静脈還流と浮腫の関係性解明には至っていない.本研究の目的は,麻痺側上肢の静脈うっ滞と浮腫予防戦略の構築に向けた基礎的研究として,(1)静脈還流と浮腫の重症度との関係性,(2)非麻痺側上肢運動による麻痺側上肢の静脈還流変化特性について明らかにすることである.目的(1)について,対象者は片麻痺患者である.手背浮腫の計測には,エコーを用い,上肢全体の浮腫は,体組成計を用いる.非麻痺側と麻痺側における液貯留所見および水分量の差から麻痺側浮腫を定量的に計測する.さらにエコーによって腋窩静脈の血管直径,平均血流速度を計測し,分時静脈血流量を算出する.最終的に,算出した静脈還流量とエコーおよび体組成計によって計測された浮腫の容量との相関関係を分析する.目的(2)について,対象者は片麻痺患者である.安静時および非麻痺側上肢運動後に,エコーによって麻痺側の腋窩静脈の血管直径,平均血流速度を計測し,分時静脈血流量を算出する.また,非麻痺側上肢運動による麻痺側上肢筋の血行動態の経時的変化を観察するために,橈側手根伸筋にNIRSプローブを貼付し,安静時および非麻痺側上肢運動時の血行動態をリアルタイムに計測する.最終的に,麻痺側上肢の腋窩静脈の分時血流量について非麻痺側上肢運動後と安静時を比較する.また,NIRS所見から得られた組織酸素化血液量,組織脱酸素化血液量および総血液量の経時的変化を分析する.これまでに10名の片麻痺患者の協力を得て,データを取得した.データ取得の進行はおおむね順調である.また,研究に関するトラブルもなく,さらに予測した結果に近いことから,研究全体を通して,おおむね順調に進んでいると判断する.第42回日本脳卒中学会学術集会において,一部のデータを分析したパイロットスタディを発表した..本研究の目的は,1麻痺側上肢の静脈還流特性と浮腫の重症度との関係性,2非麻痺側上肢運動による麻痺側上肢の静脈還流変化特性,について明らかにすることである.本研究成果は,静脈うっ滞と浮腫の予防に難渋する臨床現場と患者に多大な恩恵を与えると考える.平成28年度に引き続き,脳卒中片麻痺患者を対象として,麻痺側上肢の静脈還流と浮腫の調査および非麻痺側上肢運動による麻痺側上肢の静脈還流変化について計測した.麻痺側上肢の静脈還流については,超音波診断装置および近赤外線分光法によって計測した.麻痺側上肢の浮腫については,超音波診断装置および生体電気インピーダンス法によって測定した.超音波診断装置,近赤外線分光法,生体電気インピーダンス法による計測においては予想通り問題なくデータが得られている.今後も継続してデータの収集に努める.本研究の大きな特色は,静脈還流や浮腫を定量的に計測すること,ならびに非麻痺側上肢運動による麻痺側上肢の静脈還流に着目していることである.本研究の遂行により,脳卒中片麻痺患者の浮腫を軽減する新たな策が構築されると考える.なお,本研究で得られた結果については学会発表が決定しており,パイロット研究として論文を投稿中である.計画したデータの収集が概ね順調に進んでおり,また学会発表や論文投稿の準備もできている.脳卒中後の上肢浮腫の原因の1つとして静脈うっ滞が影響している.本研究の主目的は,健側上肢運動によって患側上肢の静脈還流が促進されるのか確認することであった.最終年度では脳卒中患者を対象とした.研究期間全体を通して,脳卒中患者21名の協力を得た.

対象者には背臥位および座位で健側ハンドグリップ運動を実施してもらい,その間の患側上肢静脈還流を腋窩静脈で計測した.加えて,健側ハンドグリップ運動においては抵抗なしと抵抗あり(最大握力の30%の強度)の方法で運動を実施してもらった.計測においては,超音波診断装置を用い,血管径および血流速度を計測した.また,上肢全体の浮腫の程度を計測するために,超音波診断装置および生体電気インピーダンス法を用いた.背臥位および座位ともに,安静時と比較し,健側ハンドグリップ運動によって患側上肢の腋窩静脈の血流速度が増加した.また,静脈還流も有意に増加した.さらに,ハンドグリップ運動について抵抗なしと抵抗ありを比較すると,抵抗ありの方が静脈還流は有意に促進された.これまでの脳卒中後の上肢浮腫を改善する方策については,いずれも効果が制限されている.本研究は新しい方策として健側上肢の運動に着目した.本研究では健側運動によって患側の静脈還流が促進されることが明らかとなった.また,ハンドグリップについては抵抗があった方がより静脈還流が促進されることが明らかとなった.今後は,本研究成果に基づいて,実際に健側運動によって患側の浮腫が軽減されるのか明らかにしていきたい.平成29年度も引き続き,片麻痺患者の協力を得ながら,着実にデータを取得していく.本研究の計画に特に変更点はない.データの収集とともに,整理についても遂行している.20名のデータが揃えば,論文化に向けた執筆を実施したい.9月ごろまでにはデータの取得を完了し,データの分析ならびに論文を投稿する.年度末に向けて,論文費用を当初予定していたが,執行が29年度に移行したため.(理由)年度末に向けて,論文掲載費用を当初予定していたが,執行が30年度に移行したため.(使用計画)当初の予定通り,論文掲載費用として使用する.当初の予定通り,論文費用として使用する.
生体類似機能性ミニタンパク質・プチラミニンの創製

ラミニン活性ペプチドはラミニンに比べ遥かに活性が弱く活性の増強が望まれている。本研究では、ラミニン活性ペプチドを複合化することにより、天然のラミニンと同等な活性をもつ生体類似機能性ミニタンパク質・プチラミニンの創製を目的とした。ラミニンのアミノ酸配列をすべて網羅した673種類の合成ペプチドを用いたスクリーニングで最も強い細胞接着活性を示したA13(RQVFQVAYIIIKA),A99(AGTFALRGDNPQG),C16(KAFDITYVRLKF),AG73(RKRLQVQLSIRT)の4種類をキトサン膜に化学的に結合させ、種々の細胞を用い接着活性を測定した。キトサン膜にはいずれの細胞も接着しなかったが、活性ペプチドを付加したキトサン膜は細胞特異的な接着活性を示すとともに、ペプチドのみを用いた場合に比べ活性の増強がみられた。線維芽細胞を用いた実験から、キトサン膜にA99を付加したA99-キトサン膜上で細胞は伸展を示しアクチンファイバーの形成がみられたが、AG73-キトサン膜上では星状に伸展しラフリング構造を形成することがわかった。また、線維芽細胞のA99-キトサン膜への接着はEDTAによって、AG73-キトサン膜への接着活性はヘパリンによって阻害されたことから、これらが各々インテグリンおよびシンデカンをレセプターとしていることが示唆された。さらに、AG73とA99を1:525の比でキトサン膜に結合させたとき最も強く細胞の接着及び伸展活性を促進することがわかった。この方法を用いることにより、細胞接着におけるインテグリンとシンデカンとの相互作用を検討中である。以上の実験において、細胞接着ペプチドを組み合わせることによりラミニンと同等の活性をもつミニタンパク質を創製し、医用工学分野への応用の基礎を構築することができた。ラミニンのアミノ酸配列をすべて網羅した673種類の合成ペプチドを用いたスクリーニングで最も強い細胞接着活性を示したA13(RQVFQVAYIIIKA),A99(AGTFALRGDNPQG,A208(AASIKVAVSADR),C16(KAFDITYVRLKF),AG73(RKRLQVQLSIRT)の5種類をキトサン膜に化学的に結合させ、種々の細胞を用い接着活性を測定した。キトサン膜にはいずれの細胞も接着しなかったが、活性ペプチドを付加したキトサン膜は細胞特異的な接着活性を示した。線維芽細胞は、キトサン膜にA99を付加したA99-キトサン膜上で細長い伸展を示し、AG73-またはA208-キトサン膜上では星状に伸展した。A13-およびC16-キトサン膜上ではこれらの中間的な伸展が見られた。また、線維芽細胞のA99-キトサン膜への接着は、EDTAによって低下したが、ヘパリンによる影響はみられなかった。一方、AG73-キトサン膜への接着活性はヘパリンによって阻害されたが、EDTAによっては阻害されなかった。この結果から、ペプチド特異的な細胞接着様式の違いはインテグリンあるいはプロテオグリカンといった細胞膜上のレセプターに依存することが示唆された。さらに、PC12細胞の神経突起伸長がAG73-及びA208-キトサン膜上で認められた。次年度は、これらの細胞接着部位を組み合わせ天然のラミニンと同等の細胞接着、神経突起伸張、血管新生などの活性をもつミニタンパク質を創製し、医用工学分野への応用の基礎を構築していく。

この方法を用いることにより、細胞接着におけるインテグリンとシンデカンとの相互作用を検討中である。以上の実験において、細胞接着ペプチドを組み合わせることによりラミニンと同等の活性をもつミニタンパク質を創製し、医用工学分野への応用の基礎を構築することができた。
ランダム行列理論によるHV-1 Env三量体の構造セクターと進化セクターの推定

蛋白質の機能領域はアミノ酸残基がセクターを形成して機能する。そのため、このセクターを構成するアミノ酸残基を知ることは、蛋白質の機能の理解および制御するために重要である。本研究では、HIV-1 Env三量体の中和抗体逃避および機能発現のメカニズムを明らかにするために、ランダム行列理論により構造セクターおよび進化セクターの推定を行う。本年度は、HIV-1 Envの進化セクターの推定と変異ロバストネスの解析を行った。進化セクターの推定に用いるHIV-1 Clade BおよびClade CのEnv領域全長のアミノ酸配列は、HIV sequence databaseから取得した。はじめに、取得したアミノ酸配列を用いて統計的カップリング行列を求めた。次に、得られた統計的カップリング行列から、ランダム行列理論によりノイズに起因する成分を取り除いた。ノイズを取り除くことで統計的カップリング行列は、Clade Bでは16、Clade Cでは21の主成分からなることが明らかになった。統計的カップリング行列の主成分から進化セクターを推定した。Clade Bにおいて27、Clade Cにおいて33の進化セクターが推定された。最大固有値の進化セクターをHIV-1 Env三量体立体構造に表示した。最大固有値の進化セクターは主にC-C loop近傍に位置していた。最大固有値の進化セクターの変異ロバストネスを知るために、セクターのアミノ酸残基にin silico変異導入解析を実行した。最大固有値の進化セクターを構成するアミノ酸残基の多くは、最も構造を安定にするアミノ酸であることが明らかになった。最大固有値の進化セクターの多様性解析を行うと、多くのアミノ酸残基は極めて保存されていた。このことは、最大固有値の進化セクターが構造安定性を維持するために、変異を許容し難いことを示唆する。本研究では、HIV-1 Envの中和抗体逃避および機能発現のメカニズムを明らかにするために、ランダム行列理論により構造セクターおよび進化セクターの推定を行う。本年度は、HIV-1 Env三量体の平衡構造の解析、およびランダム行列理論によるセクターの推定プログラムの開発を行った。HIV-1 Env三量体の平衡構造を分子動力学計算により得た。分子動力学計算に用いた初期構造は、ホモロジーモデリング法により構築した中和抵抗性株である。糖鎖はMan5GlcNAc2を付加した。分子動力学計算はAmber16のpmemd.cudaモジュール、力場は蛋白質にff14SB、糖鎖にGLYCAM_06j-01を用いた。圧力は1atm、温度は310K、塩濃度は150 mM NaCl、計算時間は500 nsとした。初期構造からの構造変化をRMSD(平均二乗偏差)により調べると、RMSDは約250 n以上でほぼ一定であり平衡構造に達したと考えられる。これまで、ランダム行列理論によるセクター推定は、相関行列の固有ベクトル成分の比較により行っていたが、高々4つのセクターまでしか推定できない問題があった。本研究では、相関行列からランダム行列理論によりノイズ除去を行い、得られたデータのスペクトラルクラスタリングにより、セクターを推定するプログラムの開発を行った。新しく開発したプログラムを評価するために、HIV-1 gp120の分子動力学計算を行い、これまでの手法と新しい手法で構造セクターの推定を行った。これまでの手法では3つのセクターが推定されたが、新しい手法では6つのセクターが推定された。今年度の研究計画は、HIV-1 Env三量体の平衡構造の解析、およびランダム行列理論によるセクターの推定プログラムの開発であった。HIV-1 Env三量体の平衡構造の解析では、分子動力学計算のためにHIV-1 Env三量体の初期構造を構築し、平衡構造を得る計画であった。現在まで、分子動力学計算により平衡構造を得ている。計算時間は100 ns以上としていたが、500 nsまで行った。これは、GPU搭載サーバを購入したことにより、計算速度の向上が達成されたためである。現在、さらに計算時間を1250 nsまで伸ばし、平衡構造における動的性質のデータ収集を行っている。当初の計画よりも計算時間を伸ばすことが可能となった。ランダム行列理論によるセクターの推定プログラムの開発では、これまでのランダム行列理論によるセクター推定は、高々4つのセクターまでしか推定できない問題があった。これを克服するために、新しいセクター推定法としてスペクトラルクラスタリングを取り入れた手法を考案した。新しい手法では、これまでの手法により推定されたセクターを含む、より多くのセクターが推定された。当初の計画の手法よりも多くのセクターを推定できる手法を開発したと言える。本年度は、HIV-1 Env三量体の構造揺らぎの解析と構造セクターの推定を行った。分子動力学計算に用いる初期構造は、中和抵抗性株のEnv三量体をホモロジーモデリング法により構築した。分子動力学計算はAmber16のpmemd.cudaモジュールにより実行した。力場は蛋白質にff14SB、糖鎖にGLYCAM_06j-01を用いた。

圧力は1 bar、温度は310K、塩濃度は150 mM NaCl、計算時間は1250 nsとした。分子動力学計算により得られたデータを用いて、AmberTools16のcpptrajによりRMSF(根平均二乗揺らぎ)、および動的相互相関行列を計算した。HIV-1 Env三量体の構造揺らぎをRMSFより調べると、単量体では大きく揺らいでいたループが、三量体では揺らぎが抑えられていることが分かった。次に、動的相互相関行列からランダム行列理論によりノイズに起因する成分を取り除き、スペクトラルクラスタリングによって構造セクターの推定を行った。構造セクターには、HIV-1の主要エピトープであるV3 tipも含まれているものがあった。この構造セクターには隣接するプロトマーのV1/V2も含まれていた。抗V3抗体の中和エピトープのマスキングは、隣接するプロトマーのV1/V2との相関運動により制御されていると考えられる当初の計画では、平成29年度までに、分子動力学計算によるHIV-1 Env三量体の構造ゆらぎの解析と構造セクターの推定を行う予定であった。GPU搭載サーバを購入したことにより、計算速度の向上が達成されたため、当初の計画よりも長い計算時間(1250 ns)まで伸びた。そのため、解析に用いるデータ数を増やせたので、ランダム行列理論の適用条件を十分に満たすことができた。HIV-1 Env三量体の動的相互相関行列を解析することで、連動して運動するアミノ酸残基のグループである構造セクターの推定を行った。推定した構造セクターにHIV-1 Env三量体における中和抗体逃避のメカニズムを示唆するセクターがあり、広域中和抗体の誘導する抗原デザインのアイデアが得られた。蛋白質の機能領域はアミノ酸残基がセクターを形成して機能する。そのため、このセクターを構成するアミノ酸残基を知ることは、蛋白質の機能の理解および制御するために重要である。本研究では、HIV-1 Env三量体の中和抗体逃避および機能発現のメカニズムを明らかにするために、ランダム行列理論により構造セクターおよび進化セクターの推定を行う。本年度は、HIV-1 Envの進化セクターの推定と変異ロバストネスの解析を行った。進化セクターの推定に用いるHIV-1 Clade BおよびClade CのEnv領域全長のアミノ酸配列は、HIV sequence databaseから取得した。はじめに、取得したアミノ酸配列を用いて統計的カップリング行列を求めた。次に、得られた統計的カップリング行列から、ランダム行列理論によりノイズに起因する成分を取り除いた。ノイズを取り除くことで統計的カップリング行列は、Clade Bでは16、Clade Cでは21の主成分からなることが明らかになった。統計的カップリング行列の主成分から進化セクターを推定した。
敗血症・エンドトキシンショック時の抵抗血管の病態:腸間膜動脈の膜電位への影響

モルモット回腸粘膜下細動脈で直径と血管の膜電位を同時測定し、エンドトキシンショックによる影響を調べた。静止膜電位に有意差はなかった。塩化バリウム投与により膜の脱分極と収縮を起こした状態でアセチルコリンを投与するとおこる再分極と弛緩はLPS投与群有意に減弱していた。この再分極と弛緩は二種類のカルシウム依存性カリウムチャネルによるものだがその二種類の働きにコントロール群とエンドトキシンショック群に差は見られなかった。当初ラットの腸間膜動脈を用いて等尺性収縮力と膜電位測定の同時測定を検討したが、等尺性収縮力測定装置が故障し、利用できなくなった。そこで、収縮力測定に変えてビデオ画像から直径を測定するダイアムトラックシステムを用いた血管収縮測定に変更した。しかしラットの腸間膜動脈の直径はこのシステムでは測定できなかったので、腸間膜動脈より末梢の小腸粘膜下層細動脈を標的にした。またこのシステムでは粘膜を剥して細動脈を露出させる必要があるが、ラットではこの標本が極めて作りにくい上にガラス電極を細動脈に刺入し、安定して膜電位を記録し続けることができなかった。そこでモルモットにおいて検討したところ、標本の作製とガラス微小電極による膜電位の安定した測定に問題がないことが分かった。細動脈は腸間膜動脈よりも体血圧への寄与が大きいので実験の目的により適うと判断し、モルモット小腸粘膜下層細動脈での検討を行った。静止膜電位はコントロールでは-75±4mV、LPS投与群-73±7mVで有意差はなかった。塩化バリウム(0.5mM)を投与すると膜は脱分極し、収縮を起した。塩化バリウム存在下での膜電位、血管径変化量はともに有意差はなかった。アセチルコリン(ACh)を投与するとコントロールでは15.1±2mV過分極し、10±1.0μm弛緩した。一方LPS投与群ではACh投与により11.2±2mV過分極し、8±2μm弛緩した。この過分極は内皮細胞上にある二種類の細胞内カルシウム依存性カリウムイオンチャネルを介するものであることがわかっているが、どちらのチャネルも同程度抑制されて過分極反応を抑えていると考えられた。以上の結果からモルモット小腸粘膜下細動脈では、エンドトキシンによる静止膜電位の変化は少ないが、内皮細胞依存性弛緩反応が障害を受けている可能性が示唆された。モルモット小腸粘膜下層細動脈において、血管径と膜電位の二つの同時測定を行った。静止膜電位はコントロールでは-70±9mV、LPS投与群-69±10mVで有意差はなかった。イベリオトキシンを投与すると、コントロール群の膜電位は-69±10mV、LPS投与群-66±10mVで静止膜電位との優位な差は見られなかった。塩化バリウムにより脱分極と収縮を起した血管において、アセチルコリン(ACh)を投与するとコントロールでは15.1±2mV過分極し、10±1.0μm弛緩した。一方LPS投与群ではACh投与により11.2±2mV過分極した、8±2μm弛緩した。この過分極と弛緩はカリブドトキシンにより抑制され、アパミンの追加投与により完全に見られなくなった。しかし、抑制具合にコントロール群とLPS処置群に差は見られなかった。以上の結果より、モルモット小腸粘膜下層細動脈ではLPS処置により静止状態での変化は見られなかったが、AChによる血管弛緩機構が抑制されていることがわかった。しかし、その機構については今後の検討課題となった。
常時微動測定に基づく中低層建築物の地震応答特性の総合的評価

軽量小型の多チャンネル常時微動測定システムを作成した.ハードウェアは,小型地震計,小型増幅器,カード型AD変換器,ミニノートパソコンの組み合わせからなっている.このうち,小型増幅器は自作し,その他は既成のものを利用した.感度特性は周期1秒程度まで速度に対して平坦なものである.電源は充電池を使用し,数時間程度の連続測定が可能である.地盤および構造物の常時微動測定用にそれぞれ3チャンネル用および12チャンネル用のシステムを作成した.重量は,3チャンネル用の場合には5kg,12チャンネル用の場合には12kg(ケーブル含まず)におさまり,容易に現場まで運搬できる.ソフトウエアとしては,各チャンネルの波形のモニター,記録の取り込みについては既存のものを利用した.スペクトル解析およびスペクトル・スペクトル比や波形の表示・印刷のプログラムについては,C++Builderを用いてWindows上で動作するものを自作した.波形は目的に応じて表示の拡大縮小などが簡単に操作でき,解析区間を簡単に指定してスペクトル解析ができるよう配慮した.また,解析されたスペクトルやスペクトル比も任意のスケールで描けるようにし,これにより,解析結果を理解しながら現場で測定を行うことが可能となった.作成した測定システムを用いて,マニラ市および横浜市で地盤の常時微動を,横浜市で建物の常時微動を測定した.地盤の常時微動を測定する場合には10分程度で,構造物の常時微動を測定する場合には2時間程度で測定を完了することができ,現場で記録を確認しながら迅速かつ効率よく測定を行うことができることを確認した.また,測定結果に基づいて常時微動の水平動/上下動スペクトル比により地盤の震動特性を定量的に評価する手法についても検討した.建物内での測定記録の解析から,固有周期,減衰定数,振動モード形等の評価を行い,測定建物の振動特性を明らかにすることができた.軽量小型の多チャンネル常時微動測定システムを作成した.ハードウェアは,小型地震計,小型増幅器,カード型AD変換器,ミニノートパソコンの組み合わせからなっている.このうち,小型増幅器は自作し,その他は既成のものを利用した.感度特性は周期1秒程度まで速度に対して平坦なものである.電源は充電池を使用し,数時間程度の連続測定が可能である.地盤および構造物の常時微動測定用にそれぞれ3チャンネル用および12チャンネル用のシステムを作成した.重量は,3チャンネル用の場合には5kg,12チャンネル用の場合には12kg(ケーブル含まず)におさまり,容易に現場まで運搬できる.ソフトウエアとしては,各チャンネルの波形のモニター,記録の取り込みについては既存のものを利用した.スペクトル解析およびスペクトル・スペクトル比や波形の表示・印刷のプログラムについては,C++Builderを用いてWindows上で動作するものを自作した.波形は目的に応じて表示の拡大縮小などが簡単に操作でき,解析区間を簡単に指定してスペクトル解析ができるよう配慮した.また,解析されたスペクトルやスペクトル比も任意のスケールで描けるようにし,これにより,解析結果を理解しながら現場で測定を行うことが可能となった.作成した測定システムを用いて,マニラ市および横浜市で地盤の常時微動を,横浜市で建物の常時微動を測定した.地盤の常時微動を測定する場合には10分程度で,構造物の常時微動を測定する場合には2時間程度で測定を完了することができ,現場で記録を確認しながら迅速かつ効率よく測定を行うことができることを確認した.また,測定結果に基づいて常時微動の水平動/上下動スペクトル比により地盤の震動特性を定量的に評価する手法についても検討した.建物内での測定記録の解析から,固有周期,減衰定数,振動モード形等の評価を行い,測定建物の振動特性を明らかにすることができた.軽量小型の多チャンネル常時微動測定システムを作成した.ハードウエアは,小型地震計,小型増幅器,カード型AD変換器,ミニノートパソコンの組み合わせからなっている.このうち,小型増幅器は自作し,その他は既成のものを利用した.感度特性は周期1秒程度まで速度に対して平坦なものである.電源は乾電池等を使用し,予備の小型バッテリ-を併用すれば,5時間程度の測定が可能である.全体の重量は3チャンネル用の場合には5kgにおさまり,非常に容易に現場まで運搬できる.ソフトウエアとしては,各チャンネルの波形のモニター,各チャンネルの波形の演算(和,差)・表示については既存のものを利用した.スペクトル解析およびスペクトル・スペクトル比や波形の表示・印刷のプログラムについては自作した.これにより,解析結果が現場で即座に確認できる.作成した測定システムを用いて実際に現場で測定を行った.地盤の常時微動を測定する場合には10分程度で測定を完了することができ,現場で記録を確認しながら迅速かつ効率よく測定を行うことができることを確認した.また,いくつかの地点で常時微動の水平動/上下動スペクトル比により地盤の震動特性を評価し,対象敷地の地盤特性を反映した合理的な模擬地震動を作成するための基礎資料を得た.前年度に引き続き,軽量小型の12チャンネル常時微動測定システムを作成した.ハードウエアは,小型地震計,小型増幅器,カード型AD変換器,ミニノートパソコンの組み合わせからなっている.感度特性は周期1秒程度まで速度に対して平坦なものである.電源は充電池を使用し,数時間程度の連続測定が可能である.重量は12kg(ケーブル含まず)におさまり,容易に現場まで運搬できる.ソフトウエアとしては,各チャンネルの波形のモニター,記録の取り込みについては既存のものを利用した.スペクトル解析およびスペクトル・スペクトル比や波形の表示・印刷のプログラムについては,C++ Builderを用いてWindows上で動作するものを自作した.

波形は目的に応じて表示の拡大縮小などが簡単に操作でき,解析区間を簡単に指定してスペクトル解析ができるよう配慮した.また,解析されたスペクトルやスペクトル比も任意のスケールで描けるようにし,これにより,解析結果を理解しながら現場で測定を行うことが可能となった.作成した測定システムを用いて,マニラ市および横浜市で地盤の常時微動を,横浜市で建物の常時微動を測定し,現場で記録を確認しながら迅速かつ効率よく測定を行うことができることを確認した.建物内での測定記録の解析から,固有周期,減衰定数,振動モード形等の評価を行い,測定建物の振動特性を明らかにすることができた,また,地盤の常時微動から地盤の振動性状を定量的に評価する手法についても検討した.
細胞死誘導システムを用いた病害虫・有用昆虫の不妊化系統の作出

バイナリシステムあるいは組織特異的発現プロモーターを利用した細胞死誘導は、基礎研究および昆虫の遺伝的防除方法への応用に有用である。我々のグループは、哺乳動物のプロアポトーシス因子であるBax(B-cell leukemia/lymphoma 2-associated X protein)を組織特異的に発現誘導することによって限定的にアポトーシスを誘導できることを示した。今年度は、以下の論文を投稿した。マラリア媒介蚊(Anopheles stephensi)の精巣特異的プロモーターを単離して、組織特異的な発現誘導ができることを確かめた。つぎに、精巣特異的プロモーターの制御下でmBaxを発現するトランスジェニックハマダラカ(TG蚊)を作製した。TG蚊のオスは機能的な精子ができず、完全な不妊となることを交配実験等により確認した。一方、TG蚊のメスの妊性は正常であった。オスの精巣は異常であったが、副精巣の機能および交尾行動は正常なため、メスと正常に交尾した。蚊のメスは、交尾後、さらなる交尾を避けることが知られている。したがって、このTG蚊のオスは正常メスの生殖を妨げることができる。このように、mBaxの細胞死誘導システムが昆虫の不妊化ができることを示すことができた。現在、論文はリバイズを終えて再投稿中である。また、カイコでも同様の仕組みで不妊化システムが構築できるように、去年度から引き続き、生殖にかかわる遺伝子の上流域にGal4遺伝子を導入する実験を継続して行なっている。ノックインを実施する領域のシーケンスを終え、この配列を元にノックインのためのTALENベクターを構築した。カイコにおける組織特異的発現遺伝子の選択が思うように進まないなか、ノックインの部位を、機能的遺伝子の上流域とするのではなく、これまでにトランスジェニック系統として得られているカイコ系統とすることも検討した。多型が多い領域や繰り返し配列があるためにこれまで構築が難しかったという点を克服でき、ベクターの構築は概ね終えている。今年度は、カイコ胚へのインジェクションを実施し、ノックイン個体を得たいところであるが、カイコ系統の調子が悪く、インジェクション後、飼育が困難であり、ノックイン系統が得られていない。系統を作出するためには少なくとも3ヶ月程度を要するため(カイコの一世代が1.5ヶ月と比較的長いため)、予定より遅れている。前年度までに選定したカイコのターゲット遺伝子のうち、胚発生初期に機能するとみられる興味深い遺伝子が見つかった。この遺伝子のORFを同定し、機能解析を進めることも計画している(この領域にGal4をノックインすることでノックアウトと同様の効果を観察できる可能性があるので、目的を達成するとともに新たな遺伝子解析も可能であると考えられる)。ノックインを実施する領域のシーケンスを終え、この配列を元にノックインのためのTALENベクターを構築したので、カイコ胚へのインジェクションを実施して、G0世代における切断効率を調べるとともに、ノックイン系統の作出を試みる。系統が樹立できたのち、すでに樹立済みのmBaxをGal4依存的に発現する系統と交配して、目的組織あるいは時期に細胞死が誘導できるか検証する。生殖に関わる特定の細胞や時期にGal4が発現できるような組換えカイコを樹立するため、本年度は以下のような実験を行なった。はじめにターゲット遺伝子として、生殖巣特異的発現遺伝子を探索するために、RNAseqのデータを解析した。Gal4をノックインする遺伝子領域の選定を行う段階までが本年度の計画であった。妥当な候補遺伝子を数種類ピックアップし、組織特異的であるかどうかの発現解析を行なっているところである。具体的には、これらの候補遺伝子の発現特性についてRT-PCRなどを行い、標的遺伝子として最適かどうか判別を行なった。次に、ターゲット領域にGal4遺伝子を挿入するために、これらの遺伝子についてカイコ実験系統であるwc系統のゲノムDNA配列をクローニングし、シーケンスを決定した。このようにノックインベクターを作成する準備は終えることができた。確かめたGenom DNA配列をもとに、ノックインに使用するdonor vectorを構築する予定である。これとは別に、これまでの研究でカイコにおいて開発した細胞死誘導エフェクターが昆虫に汎用的に使用でき、不妊化技術に有用であることを示すために、マラリア媒介昆虫であるハマダラカのオス不妊系統を作出し、不妊化できることを確かめた。使用したエフェクター遺伝子は、細胞死誘導が可能なマウス由来のBax遺伝子である。この遺伝子を精巣特異的に発現させ、オス不妊になるか調べた。この蚊は精子が形成できず、不妊であることを確かめた。カイコにおける組織特異的発現遺伝子の選択が思うように進まない。生殖細胞において発現する遺伝子は、理由はわからないが、神経などの組織でも発現が認められる場合が多い。また、有効な候補遺伝子であるものでも、ノックインベクターの構築に難がある(多型が多い領域や繰り返し配列がある)配列があり、絞り込みや当初の見込みよりも時間を要した。しかしながら、概ね達成できているので今年度は計画通りに進めることができると考えている。マラリア媒介蚊(Anopheles stephensi)の精巣

特異的プロモーターを単離して、組織特異的な発現誘導ができることを確かめた。つぎに、精巣特異的プロモーターの制御下でmBaxを発現するトランスジェニックハマダラカ(TG蚊)を作製した。TG蚊のオスは機能的な精子ができず、完全な不妊となることを交配実験等により確認した。一方、TG蚊のメスの妊性は正常であった。オスの精巣は異常であったが、副精巣の機能および交尾行動は正常なため、メスと正常に交尾した。蚊のメスは、交尾後、さらなる交尾を避けることが知られている。したがって、このTG蚊のオスは正常メスの生殖を妨げることができる。このように、mBaxの細胞死誘導システムが昆虫の不妊化ができることを示すことができた。現在、論文はリバイズを終えて再投稿中である。また、カイコでも同様の仕組みで不妊化システムが構築できるように、去年度から引き続き、生殖にかかわる遺伝子の上流域にGal4遺伝子を導入する実験を継続して行なっている。ノックインを実施する領域のシーケンスを終え、この配列を元にノックインのためのTALENベクターを構築した。カイコにおける組織特異的発現遺伝子の選択が思うように進まないなか、ノックインの部位を、機能的遺伝子の上流域とするのではなく、これまでにトランスジェニック系統として得られているカイコ系統とすることも検討した。多型が多い領域や繰り返し配列があるためにこれまで構築が難しかったという点を克服でき、ベクターの構築は概ね終えている。今年度は、カイコ胚へのインジェクションを実施し、ノックイン個体を得たいところであるが、カイコ系統の調子が悪く、インジェクション後、飼育が困難であり、ノックイン系統が得られていない。系統を作出するためには少なくとも3ヶ月程度を要するため(カイコの一世代が1.5ヶ月と比較的長いため)、予定より遅れている。前年度に剪定したターゲット遺伝子のコード領域の開始メチオニン部位を特異的に切断するTALENを設計する。はじめに、設計したTALEN mRNAが目的領域を効率よく切断できるかG0世代の個体を解析して確かめる。現在作製しているdonor vectorとともにTALEN mRNAをカイコ胚に顕微注入し、部位特異的組換え個体を作出する実験に着手する。この研究と並行して、病気媒介昆虫や有用昆虫を多く含むハチ目昆虫の生殖巣特異的遺伝子の同定とゲノム編集による変異体作成についての研究を行う。病気媒介昆虫としてはマラリアを媒介するハマダラカ、有用昆虫としてはセイヨウミツバチを用いる予定であるが、ゲノム情報が入手可能な近縁種も候補として、昆虫全般のゲノム編集技術の向上に貢献できるような成果を目指す。具体的には、ゲノムデーターベースを用い、カイコで標的とした遺伝子のオルソログを探索・同定し、発現部位について調べ、不妊化のターゲット遺伝子に適するか調べる。
水分屈性初期応答の分子機構―水分勾配刺激が生物学的情報へ変換される場と仕組み

昨年度の解析から,根の皮層細胞におけるMIZ1機能とアブシシン産応答が必要であることが明らかとなった。一方,アブシシン酸応答や合成欠損変異体の表現型が水分屈性の低下にとどまるのに対して,miz1やmiz2変異体は水分屈性を完全に欠損する。このことは,これら遺伝子産物の機能がアブシシン酸応答に先んじて水分屈性に必要であることを示唆する。そこで,今年度はMIZ2機能が必要とされる組織の同定とMIZ1機能との関係について解析を行った。組織特異的プロモーターを用いて野生型MIZ2をmiz2変異体背景で発現させる系統を作出し解析した結果,野生型MIZ2を皮層細胞で発現するmiz2系統でのみ,水分屈性の回復が認められた。一方,変異型miz2タンパク質を皮層細胞で発現させてもmiz2変異体の表現型は相補されなかったため,水分屈性の発現には皮層細胞でのMIZ2機能が必要であると考えられた。一方,他の組織で野生型MIZ2を発現する系統の中には皮層細胞ほどではないものの,miz2変異体の表現型をマイルドにする系統が認められた。そこで,これらの系統間での掛け合わせを実施し,水分屈性発現時に皮層細胞以外でMIZ2機能を必要とする細胞群がないかを検証している。また,野生型およびmiz2変異体背景でMIZ1-GFPを発現する系統を用いて解析した結果,水分勾配刺激時に皮層細胞におけるMIZ1-GFPの細胞内局在が野生型では変化するのに対して,miz2変異体においては変化しないことが観察された。また,水分屈性発現時にみられたようなMIZ1-GFPの局在変化は重力屈性発現時には認められなかったことから,この局在変化が根の屈曲によるものではなく,水分勾配刺激によるものであることが明らかになった。前年度の成果に基づき研究を進めた結果,根の皮層細胞が水分屈性初期応答の起こる場である可能性がより高くなるとともに,水分屈性初期応答の分子機構にMIZ1のMIZ2依存的な細胞内局在の変化が必要である可能性を見出すことができた。このmiz1局在変化は,本研究で目的に掲げる水分勾配刺激の生物学的情報への変換に関わる分子機構の解明に重要であると考えられるため,課題を非常に順調に進めることができていると考えている。最終年度である次年度は,論文化へのまとめの実験を進めるとともに,今年度MIZ1局在変化とアブシシン産応答の関係を明らかにする。すなわち,水分勾配刺激によってアブシシン酸内生量の増大が起こる場所の特定を進める。この際,単に合成系の活性化だけでなく,貯蔵されている不活性型グリコシルエステルから活性型アブシシン酸についても解析を行う。これまで解析されてきたキュウリやエンドウにおいては,水分勾配感受部位は根端であると明らかにされてきたことから,当該年度は,まずシロイヌナズナにおいて顕微レーザー照射による根端細胞破壊を行い,その水分屈性に対する影響を解析した。その結果,シロイヌナズナの水分屈性には根端細胞は必要ではないことが明らかになった。そこで,根においてさまざまな組織で特異的に機能するプロモーター(TSP)の下流で水分屈性に必須な遺伝子であるMIZ1を発現する系統を用いて,水分屈性に必要な組織の特定を行った。その結果,根の皮層組織におけるMIZ1の発現が水分屈性に必須であることを見出した。加えて,共同研究により,皮層組織におけるアブシシン酸信号伝達が水分屈性に必須であることも見出された。これらの知見をNature Plants誌に発表した。さらに,植物種間での水分勾配感受部位とその情報伝達の仕組みに差異があるかを検証する目的で,イネとミヤコグサを用いて研究を行った。その結果,イネにおいては根端で水分勾配刺激が感受され,その情報はオーキシンの極性輸送により屈曲部位へ伝達されることが強く示唆された。一方,ミヤコグサは同じマメ科のエンドウと異なり,水分勾配刺激の感受部位が根端ではない一方で,水分屈性にはオーキシン合成が必要であることも明らかになった。前述のシロイヌナズナにおける知見やそれまでに解析されたキュウリ,エンドウの知見を合わせると,水分屈性の発現機構は,植物種間で異なることが強く示唆された。これらの知見をJournal of Experimental Botany誌に発表した。また,キュウリの水分屈性発現に根の表皮細胞で発現するCsPIN5が重要であることを見出し,これをNew Phytologist誌に発表した。並行して,研究計画に基づき,次年度以降に用いる形質転換系統の作出を行った。水分勾配刺激の感受部位と情報伝達の仕組みが植物種間で異なるという重要な発見をできただけでなく,モデル植物であるシロイヌナズナにおいて,水分屈性に必須の組織として皮層細胞を同定できたことから,研究は非常に順調に進んでいると考えている。また,形質転換系統の整備も順調に進んでいる。

そこで,今年度はMIZ2機能が必要とされる組織の同定とMIZ1機能との関係について解析を行った。組織特異的プロモーターを用いて野生型MIZ2をmiz2変異体背景で発現させる系統を作出し解析した結果,野生型MIZ2を皮層細胞で発現するmiz2系統でのみ,水分屈性の回復が認められた。一方,変異型miz2タンパク質を皮層細胞で発現させてもmiz2変異体の表現型は相補されなかったため,水分屈性の発現には皮層細胞でのMIZ2機能が必要であると考えられた。一方,他の組織で野生型MIZ2を発現する系統の中には皮層細胞ほどではないものの,miz2変異体の表現型をマイルドにする系統が認められた。そこで,これらの系統間での掛け合わせを実施し,水分屈性発現時に皮層細胞以外でMIZ2機能を必要とする細胞群がないかを検証している。また,野生型およびmiz2変異体背景でMIZ1-GFPを発現する系統を用いて解析した結果,水分勾配刺激時に皮層細胞におけるMIZ1-GFPの細胞内局在が野生型では変化するのに対して,miz2変異体においては変化しないことが観察された。また,水分屈性発現時にみられたようなMIZ1-GFPの局在変化は重力屈性発現時には認められなかったことから,この局在変化が根の屈曲によるものではなく,水分勾配刺激によるものであることが明らかになった。前年度の成果に基づき研究を進めた結果,根の皮層細胞が水分屈性初期応答の起こる場である可能性がより高くなるとともに,水分屈性初期応答の分子機構にMIZ1のMIZ2依存的な細胞内局在の変化が必要である可能性を見出すことができた。このmiz1局在変化は,本研究で目的に掲げる水分勾配刺激の生物学的情報への変換に関わる分子機構の解明に重要であると考えられるため,課題を非常に順調に進めることができていると考えている。前述したように,シロイヌナズナにおいて皮層細胞が水分勾配刺激の生物学的情報に変換される部位であることが明らかになったが,実際の水分勾配刺激を感受する部位が皮層細胞であるという確証は得られていない。今後は,研究計画に基づき,水分勾配刺激によってアブシシン酸がどこで合成され,最終的に皮層細胞でMIZ1発現を誘導するのかを明らかにしていく。そのために,必要に応じて作出・整備を進めている系統に加え,各種アブシシン酸関連突然変異体やmiz2変異体を用いる。最終年度である次年度は,論文化へのまとめの実験を進めるとともに,今年度MIZ1局在変化とアブシシン産応答の関係を明らかにする。すなわち,水分勾配刺激によってアブシシン酸内生量の増大が起こる場所の特定を進める。この際,単に合成系の活性化だけでなく,貯蔵されている不活性型グリコシルエステルから活性型アブシシン酸についても解析を行う。
シアル酸認識蛋白質Siglec-9可溶型分子の抗腫瘍メカニズム

シアル酸認識免疫グロブリン様レクチンSiglec-9の可溶型分子(sSiglec-9)を発現するトランスジェニックマウスではMUC1発現腫瘍の増殖や悪性化が阻止されることが明らかになった。また、この抗腫瘍機構は宿主の免疫系を介して間接的に働くことが示唆された。一方、sSiglec-9はMUC16発現腫瘍では腫瘍増殖をむしろ活性化する傾向が示唆された。以上より、Siglec-9は腫瘍細胞で発現するムチン類と相互作用して腫瘍増殖や悪性化に関与することが示され、これらの知見はSiglec-9を介した癌の分子標的治療法を見いだす糸口となると考えられた。糖タンパク質MUC1は多くの悪性腫瘍で発現する予後不良因子であるが、悪性進展に関わるメカニズムは明らかにされていない。近年、MUC1が免疫細胞上のシアル酸認識蛋白質Siglec-9に作用して免疫を抑制する可能性が示唆された。本研究では、MUC1とsiglec-9の結合を競合阻害する可溶型Siglec-9を発現するトランスジェニックマウスを用いて、このマウスがMUC1発現腫瘍の増殖に対して抵抗性を示すこと、すなわち可溶型Siglec-9が抗腫瘍効果を持つことと、そのメカニズムの解明、新規の分子標的治療法の提案を目的とする。平成26年度はまず、可溶型Siglec-9発現TgマウスにMUC1発現乳癌腫瘍(MM46-MUC1)を腹腔内移植し、このマウスが腫瘍の増殖に対して抵抗性を有することを示した。次に、MM46-MUC1を移植し担癌状態にしたTgマウスおよび野生型マウスから腹水腫瘍細胞を採取し、多重蛍光免疫染色により腫瘍細胞上のMUC1と可溶型Siglec-9が共局在すること、また、Tgでは腫瘍細胞におけるMUC1の発現が抑制されていることを明らかにし、可溶型Siglec-9がMUC1に何らかの作用をしていることを示唆した。野生型マウスの腫瘍細胞は大型・多形性に富むのに対し、Tgの腫瘍細胞は小型で多形性に乏しく細胞増殖マーカー陽性率も低下しており、可溶型Siglec-9が腫瘍の悪性化を阻止していることが示された。また、Tgマウスおよび野生型マウスの両方の腫瘍腹水中にT細胞が認められたが、野生型のT細胞は変性・壊死し集簇しているのに対し、Tgマウスでは正常なT細胞が均質に浸潤していた。また、Tgマウスでは野生型マウスと比較して、腹水中の顆粒球・単球コロニー刺激因子などのケモカインが有意に上昇していた。糖タンパク質MUC1は乳癌や卵巣癌などで発現する予後不良因子で、腫瘍の悪性進展に関わるとされているが、そのメカニズムは未だ不明な部分も多い。近年MUC1が免疫担当細胞の表面に存在するシアル酸結合レクチンSiglec-9に結合し相互作用することで、免疫機能を抑制して腫瘍の悪性化に荷担することが示唆された。本研究では本来細胞表面で発現しているSiglec-9を可溶型に変異させたSiglec-9(可溶型Siglec-9)がMUC1と細胞表面の内在性Sigle-9との結合を競合阻害しMUC1発現腫瘍の増殖を抑制するという仮説を立て、Siglec-9発現トランスジェニック(Tg)マウスを作成して解析を進めている。平成26年度には、可溶型Siglec-9発現TgマウスにMUC1発現腫瘍を移植すると、腫瘍の増殖や悪性化が阻止されることを示した。本年度は、Tgマウスに移植した腫瘍腹水中に浸潤する免疫担当細胞の同定やケモカインのスクリーニングを進めた。免疫組織学的解析では、Tgマウスの腹水中ではT細胞、マクロファージ、樹状細胞が増加している可能性が示唆された。また、Tgマウスでは顆粒球単球コロニー刺激因子(GM-CSF)、白血病阻止因子(LIF)等の血清中濃度が有意に上昇していた。in vitroの解析では、可溶型Siglec-9はMUC1に結合するが、直接的に培養腫瘍細胞を傷害したり増殖を抑制することはないことを確かめた。これらの成績から、可溶型Siglec-9はTgマウスにおける何らかの細胞シグナル伝達や免疫能を調整し、腫瘍の増殖を阻止することが推察された。・腫瘍増殖抵抗性となった可溶型Siglec9発現Tgマウスにおける免疫担当細胞の同定や変動しているサイトカインのスクリーニング、MUC1と可溶型Siglec-9の相互作用に関するin vitroでの解析を推進し、腫瘍増殖抑制のメカニズム解明に近づくことができた。・MUC16発現卵巣癌細胞の移植実験の準備を推進した。MUC1は多くの上皮系腫瘍で発現する予後不良因子だが、腫瘍悪性化に関与する機序は明らかにされていない。本研究では、MUC1が免疫細胞表面のシアル酸結合レクチンSiglec-9に結合することで、免疫を抑制して腫瘍悪性化に荷担するという仮説を基盤に、本来は細胞表面で発現しているSiglec-9を可溶型に変異させたSiglec-9(sSiglec-9)がMUC1と内在性Siglec-9との結合を競合阻害し、MUC1発現腫瘍の増殖を抑制すると考え実施した。前年度までに、sSiglec-9発現トランスジェニックマウス(sSiglec-9 Tgマウス)ではMUC1発現腫瘍の増殖や悪性化が阻止されることを明らかにした。

また、腫瘍を移植したTgの腹水中ではT細胞や樹状細胞が増加していること、顆粒球単球コロニー刺激因子等のサイトカイン濃度が上昇していることを示唆した。H28年度は、Siglec-9の抗腫瘍作用をさらに追究するため、検体数を増やしてTgマウスにおける免疫細胞の可視化、サイトカインの定量を進めた。その結果、対照マウスと比較して、Tgマウス脾臓の中心動脈周囲では樹状細胞が増数していること、脾臓の濾胞が萎縮していないことが明らかになり、sSiglec-9が免疫系を介して間接的に腫瘍の悪性化を抑制する可能性が強く支持された。平行して、Siglec-9と相互作用するとの報告があるもうひとつのムチン、「MUC16」を過剰発現する卵巣癌細胞(HM-1_MUC16)を樹立し、この移植実験を実施した。in vitroの実験でsSiglec-9はHM-1_MUC16に結合することが確認できたが、直接的に細胞を傷害したり増殖を阻害したりすることはなかった。本結果も、sSiglec-9による抗腫瘍作用が直接的な細胞傷害ではなく免疫系等を介して間接的に働くという仮説を支持するものである。シアル酸認識免疫グロブリン様レクチンSiglec-9の可溶型分子(sSiglec-9)を発現するトランスジェニックマウスではMUC1発現腫瘍の増殖や悪性化が阻止されることが明らかになった。また、この抗腫瘍機構は宿主の免疫系を介して間接的に働くことが示唆された。一方、sSiglec-9はMUC16発現腫瘍では腫瘍増殖をむしろ活性化する傾向が示唆された。以上より、Siglec-9は腫瘍細胞で発現するムチン類と相互作用して腫瘍増殖や悪性化に関与することが示され、これらの知見はSiglec-9を介した癌の分子標的治療法を見いだす糸口となると考えられた。in vivoの解析から、可溶型Siglec-9が腫瘍細胞の増殖を抑制することを明らかにし、Tgマウスにおける腫瘍免疫機能の変化を示唆できたことから、当該年度の目的はおおよそ達成できた。(1) Tgマウスで腫瘍増殖の抑制に寄与している免疫担当細胞や分子の探索を推進する。(2) MUC16発現腫瘍細胞の移植実験と解析を実施する。(3)生体外より投与された可溶型Siglec-9がMUC1発現腫瘍の増殖を抑制するか、すなわち治療的効果を示すか、検証をすすめる。農学(1) Tgマウス腹水中の免疫担当細胞のタイプや機能活性の解析を推進し、可溶型Siglec-9が腫瘍免疫機能に及ぼす影響の詳細を明らかにする。(2)卵巣癌は、Siglec-9が作用することが知られているMUC16 (CA125)を高頻度に発現し、また腹水貯留・腹水播種を特徴とする。このことから可溶型Siglec-9がMUC16発現卵巣腫瘍にも抗腫瘍効果を示せば、その臨床的意義や治療応用への可能性は大きい。そこで、MUC16安定発現卵巣癌細胞株を樹立し、可溶型Siglec-9 Tgマウスへの移植実験・解析の準備を進める。(3)可溶型Siglec-9が生体外から投与された場合、MUC1発現腫瘍の増殖を抑制できるか、すなわち腫瘍治療薬として応用できるかを検証する。次年度使用額のほとんどは研究分担者所属機関におけるトランスジェニックマウスの飼育・系統維持にかかる物品費等であり、マウスの繁殖状況の変動により支出額が若干少なくなったため生じた。腫瘍移植実験における免疫担当細胞の同定に供したマウス個体数および解析のための研究資材の量や種類(免疫染色等に使用する試薬・抗体等の消耗品)が予定より若干少なかったため。
調和組織制御されたチタン系材料の微細組織と機械的特性

我々の研究グループでは、材料の微視的組織を従来と異なる「不均一・調和・超微細」に制御するという発想を基に、超強加工粉末冶金プロセスを用いて、超微細結晶粒と粗大結晶粒が調和的に配置した「調和組織」を有する材料を作製した。調和組織が、二律背反とされてきた「高強度・高延性」を同時に発現することを、種々の金属材料で実証した。しかし、これまでの研究では実用的に重要な50ミクロンより小さな微細粒子粉末を用いた調和組織材料の作製には未だ至っていない。また、調和組織が変形挙動にどのように影響を及ぼし、機械的特性の改善をもたらしているのかは未だ明らかでない。本研究では高速気流粉末加工処理を施した純チタン、およびTi-6Al-4V合金の微細粒子粉末を用い、放電プラズマ焼結法によって焼結体を作製し、微視的組織、および機械的特性を検討した。さらに、これまでに作製した調和組織材料も含め、変形による加工硬化挙動を検討した。研究成果について以下に示す。1、高速気流粉末加工処理を施した微細粒子粉末を用いて焼結体を作製し、微細組織の観察、および機械的特性の評価を行った。その結果、調和組織を有した焼結体は高強度かつ高延性を示した。2、調和組織材料の変形による加工硬化挙動を検討した。その結果、調和組織材料は、変形初期に均一微細結晶粒材料と同様な加工硬化挙動を示し、その後、均一粗大結晶粒材料のように加工硬化する、という特徴が明らかとなった。3、調和組織材料の変形挙動について研究を行った成果について、国際会議(PM2012(横浜))、および国内会議(日本鉄鋼協会第164回秋季講演大会、第63回塑性加工連合講演会)において発表を行った。また、高速気流粉末加工装置を用いて作製した調和組織材料の研究成果について、国内会議(第63回塑性加工連合講演会、粉体粉末冶金協会平成24年度秋季大会)において発表を行った。