hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンキラーゼ1・TAB182の生理機能とその制御機構

ポリ(ADP-リボシル)化は、標的蛋白質に対して最も大きな物性変化を与える翻訳後修飾のひとつであり、ゲノム安定性や転写制御をはじめ、様々な生命現象の調節に重要な役割を果たす。ポリ(ADP-リボシル)化酵素(PARP)ファミリーに属するタンキラーゼ1(tankyrase 1)は、テロメア結合蛋白質TRF1や中心体蛋白質NuMAをポリ(ADP-リボシル)化し、テロメア伸長および紡錘糸極形成に機能する。一方、我々が以前報告したタンキラーゼ1結合蛋白質TAB182は、試験管内でタンキラーゼ1によるポリ(ADP-リボシル)化を受けるが、その生理的意義は不明である。我々は、タンキラーゼ1とTAB182の相互作用によって司られる生理機能およびその制御機構を明らかにすべく、以下の検討を行った。(1)昨年度作出したTAB182+/-ヘテロ接合体マウス同士の交配により、ホモ接合体(TAB182-/-)マウスを取得した。ホモ接合体の出現頻度は、メンデル則に沿うものであった。現在、同個体の表現型解析を進めている。(2)マウスTRF1は典型的なタンキラーゼ1結合モチーフRXX(P/A)DGを持たず、タンキラーゼ1と結合しなかった。事実、ヒト細胞の場合と異なり、マウス細胞ではタンキラーゼ1はTRF1をテロメアから遊離させなかった。マウスはテロメアが長く、体細胞組織でも高いテロメラーゼ活性を保持しているため、タンキラーゼ1によるテロメア伸長システムを必要としない可能性が示唆された。なお、今回確立したタンキラーゼ1可視化システムは、PARP阻害剤探索系として利用出来る。(3)ヒト細胞核内においてタンキラーゼ1を過剰発現させると、分裂期キナーゼの過剰発現により誘導される細胞分裂異常(細胞質分離の失敗・中心体数の増加など)が抑制されることを見出した。同抑制効果は、タンキラーゼ1のPARP活性を必要とした。ポリ(ADP-リボシル)化反応は、標的蛋白質に最も劇的な物性変化を与える翻訳後修飾のひとつであり、ゲノム安定性や転写制御をはじめ、様々な生命現象の調節に重要な役割を果たす。ポリ(ADP-リボシル)化酵素ファミリーに属するタンキラーゼ1は、テロメア結合蛋白質TRF1や中心体蛋白質NuMAをポリ(ADP-リボシル)化修飾し、テロメア伸長および紡錘糸極形成に機能する。新たに同定されたタンキラーゼ1結合蛋白質TAB182はタンキラーゼ1によるポリ(ADP-リボシル)化を受けるが、その生理的意義は全くの不明である。(1)マウスTAB182+/- ES細胞クローンをブラストシストに注入し、これを偽妊娠マウスに移植してキメラマウスを取得した。同キメラマウスと野生型C57BL/6マウスの交配により、ヘテロ接合体(TAB182+/-)F1マウスを取得した。(2)マウスTRF1はタンキラーゼ1結合モチーフを持たず、タンキラーゼ1と結合しなかった。一方、タンキラーゼ1とTAB182の結合はマウスでも再現された。(3)同調培養法やチューブリン阻害剤を用いた検討により、タンキラーゼ1が細胞分裂期特異的にリン酸化されることを見出した。現在、同リン酸化に関与するキナーゼの同定および同リン酸化の生物学的意義について検討中である。

(3)ヒト細胞核内においてタンキラーゼ1を過剰発現させると、分裂期キナーゼの過剰発現により誘導される細胞分裂異常(細胞質分離の失敗・中心体数の増加など)が抑制されることを見出した。同抑制効果は、タンキラーゼ1のPARP活性を必要とした。
骨髄性白血病細胞の分化誘導時における細胞内情報伝達系及び癌遺伝子産物制御の解析

骨髄性白血病細胞の分化誘導時における分子機構の解明のために,ヒト前骨髄性白血病細胞HLー60の単球系への分化誘導因子である腫瘍壊死因子(TNF)の生理活性発現機序を、因子ー受容体結合及び細胞内情報伝達機構との関連から検討し、以下の実験的事実を得てきた。1)高親和性受容体関連蛋白と考えられる分子量約78KDaの膜蛋白を同定した。2)dibutyryl cyclicAMP及び細胞内cyclicAMPの濃度を上昇させ得る物質の共存下でTNFの生理活性は相乗的に上昇する。3)TNF添加直後よりPhosphoinositideの代謝回転の亢進がみられる。4)protein kinase CのactivatorであるTPAの共存下ではTNFの生理活性は相加的促進効果を得る。5)TPAとdbcAMP両者の共存下ではTNFの生理活性は著しく上昇する。これらの結果はTNFの生理活性発現が因子と細胞膜上の高親和性受容体関連蛋白との結合を介し、更に細胞内second messengerとしてA kinase系、C kinase系のmonodirectionalな作動があることを示唆する。本年度の研究では、これらの細胞内情報伝達系に応答して白血病細胞の分化へのcommitmentを獲得していく過程でその初期相としてmRNAのdown regulationがおこることの知られているcーmyc癌遺伝子を着目し、分化誘導時におけるcーmyc蛋白の動態を細胞周期との関連から検討し、以下の合果を新たに得た。1)増殖期HLー60細胞においてcーmyc蛋白は、細胞周期非依存性に一定量発現されているがGo/G_1期において比較的発現量の低い分画が1020%存在する。2)TNFにおける分化誘導は、分化関連形質の発現に先行してcーmyc蛋白の減少がみられ、特にGo/G_1期での減少が著明であった。即ち、HLー60細胞において、cーmyc蛋白は構成的に発現されているが、分化へのcommitment成立にはその発現量の低下を伴い、その発現制御機構は細胞周期Go/G_1期に特異的に存在することが示された。骨髄性白血病細胞の分化誘導時における分子機構の解明のために、ヒト前骨髄性白血病細胞HL-60単球系への分化誘導因子である腫瘍壊死因子(TNF)の生理活性発現機序を、因子-受容体結合及び細胞内情報伝達機構との関連から検討し、以下の実験的事実を得た。1.ヒト遺伝子組換え型TNFをBolton-Hunter法により^<125>I標識しHL-60細胞膜上の受容体との複合体を架橋剤を用いて分離抽出、SDS-PAGE解析によりTNFの高親和性受容体関連蛋白と考えられる分子量約78KDaの膜蛋白を同定した。5.TPAとdbcAMPの共存下ではTNFの生理活性は著しく上昇した。これらの結果より、TNFによるHL-60の単球系への分化誘導は,TNFと細胞膜上の分子量約78kDaの高親和性受容体との結合を介し,細胞内情報伝達機構としてはA kinase系、C kinase系のmonodirectional systemによる受容応答系であることが示唆された。更に、細胞内情報伝達系の最終段階である遺伝子発現の調節機構と関連の深いDNA結合性癌遺伝子産物(c-myc,c-mub,c-fos)の動態について現在検討中である。
ナノバイオ磁性ナノ粒子を用いたマルチスケールバイオマニピュレーション

10nm程の直径の磁性ナノ粒子を、様々なバイオマテリアルで修飾することで、ナノバイオ磁性ナノ粒子を開発し、磁力を用いて細胞を操作する技術を開発した。具体的には、(1)レトロウイルスベクターを磁気操作する技術、(2)共培養後の標的細胞を磁気分離する技術、(3)細胞を磁力で配置するパターニング技術、(4)細胞を磁力で集積させて高度な三次元組織を構築する技術、といったナノからミリメーターに及ぶマルチスケールバイオマニピュレーションの開発を行った。平成19年度は申請書の実験計画通り、以下の通りに進めた。1.ナノバイオ磁性粒子の作製10nmの磁性ナノ粒子を使用して、3種類のナノバイオ磁性粒子を作製した。細胞表面に吸着し、あるいは細胞内に磁性ナノ粒子を取り込ませるために、正電荷脂質を含むカチオニックりポソームで磁性ナノ粒子を包埋することでMCL(magnetite cationic liposome)を作製した。細胞接着性ナノバイオ磁性粒子として、MCLの表面に接着ペプチドであるRGD(アルギニンーグリシンーアスパラギン酸)配列ペプチドを付加することで、RGD-MCLを作製した。さらに、細胞の吸着を抑えるナノバイオ磁性粒子として、磁性ナノ粒子をアミノシランコートして、その表面にポリエチレングリコール(PEG)を結合したPEG-Magを開発した。2.磁力による細胞のパターニングマイクロパターニング磁石は、CADを使ってアクリル板に自在に溝を掘り、そこに200μmの磁性体を埋め込むことで作製した。この磁石を用いて、MCLを取り込ませた細胞を磁石のパターン通りにパターニングすることに成功した。また、RGD-MCLを磁気パターニングし、細胞を磁石のパターンに沿って配置・配列させることができた。さらに、磁性ナノ粒子表面に、細胞非接着性のPEG鎖を結合したPEG-Magは、細胞の非接着スペースを磁力で制御することで、標的細胞のパターニングに成功した。これらの結果から、MCLによる細胞自体を磁気標識してパターニングする技術、RGD-MCLによる細胞が接着するスペースを規定してパターニングする技術、PEG-Magによる細胞が接着できないスペースを規定してパターニングする技術、といった3種類の新しい磁力によるパターン技術を開発した.本研究では、磁性ナノ粒子をバイオマテリアルで修飾した「ナノバイオ磁性ナノ粒子」を用いて、幅広いスケールのバイオ磁気操作の研究を行うことを目的とした。平成20年度は主に以下の2つの研究課題に関して研究を行った。1.レトロウイルスベクターの磁気濃縮レトロウイルスベクターは遺伝子の運び屋であり、遺伝子導入の強力なツールであるが、使用前に力価を高めるためにレトロウイルスを濃縮する必要がある。そこで、レトロウイルスに静電的相互作用で結合するナノバイオ磁性ナノ粒子を作製し、レトロウイルスベクター溶液に添加して、磁石で磁気分離を行ったところ、レトロウイルスベクターを高効率で回収することができ、回収後の懸濁溶液の液量を減らすことで、濃縮することができた。さらに、磁性ナノ粒子に吸着したレトロウイルスベクターは、磁力で感染領域を制御することが可能であった。これらの結果から、レトロウイルスといった極めて小さい物質を磁気操作する技術の開発に成功した。2.再生医療における共培養細胞の磁気分離法再生医療において、目的細胞を他の細胞と一緒に培養する方法(共培養法)は有用な手段である。例えば、胚性幹細胞(ES細胞)は、マウス胚性線維芽細胞やその細胞株であるSTO細胞をフィーダー細胞として、その上で共培養されることで、未分化能が維持される。本研究では、STO細胞に予めナノバイオ磁性ナノ粒子を取り込ませておき、共培養後に磁気分離で排除するといった新しい磁気分離法を開発した。この磁気分離法によって、100%近い精製度でES細胞を回収でき、さらにフィーダー細胞を除去したことで、その後の分化誘導のプロセスである胚様体形成率が向上した。これらの結果から、本方法は再生医療の培養プロセスにおいて有用であると考えられる。
次元縮約を伴う多変量時系列モデルに関する研究

(1)前年度に開発した,次元縮約型多変量自己回帰モデルに基づく市場リスク中立型株式売買法について,より現実的な状況下でシミュレーションを行った.具体的には規模と業種に関する制約を置いて運用した場合のリスク・リターン特性を明らかにした.成果は国際会議で発表され,Computational Finance and Its Applicationsに掲載された.(2)利付債の取引データから金利期間構造を推定する問題に即して、関数データ解析的接近法による動的なイールドカーブの推定法を提案した。具体的には,経時的に取得した債権データに高次元の平滑化を適用することで割引関数の局面推定を行い、その積分型で金利期間構造を経時方向に連関させる方法を提案し,その予測能力を研究した.成果は国際会議で発表され,Proceedings in Computational Statisticsに掲載された.(3)多変量時系列に対し,トレンド成分は各成分個別でトレンド周りの定常変動が共通となるモデルを状態空間モデルの枠組みで推定する方法を提案し,インフレ率予測の問題に適用した.これによって,物価変動に対して先行性を持つ時系列を客観的に探し出すことが可能となった.成果は「日本経済の変化と経済予測」の第3章として公表された.(4)状態空間モデル型季節調整法において,季節成分を表す時系列モデルの特性多項式の一部について単位根制約を緩め,情報量規準に基づき,より予測性の高いモデルを探索的に求める方法を提案した.各国の鉱工業生産指数を例に取った解析で,アウトサンプル予測が改善することが示された.成果はJournal of Forecastingに掲載された.本研究はファイナンスにおけるマルチファクターモデルを統計的により厳密に取り扱いたいという応用問題が出発点となっているので,本年はまず分析のためのデータセットの作成を行った.具体的には,月次の株価情報と財務関連のデータを収集した.アルゴリズム構築に先立ち,情報量フィルタとその平方根分解を利用した逐次公式に関して,先行研究のサーヴェイを行った.特に,状態変数の推移に非定常モデルを仮定する場合の,初期分布の厳密な扱いについて,情報量フィルタとの関連を重視して整理した.本研究が想定するデータは,多変量かつ同時点での相関の強い時系列データである.従って,状態空間モデルの観測方程式の共分散構造にさまざまなモデリングを行うことで,計算負荷とモデルの複雑さの両面でメリットのあるモデルを探索した.具体的には,因子分析的なモデリングとパターン行列の利用を考案した.プログラミングの過程で,一度に扱う観測次元が例えば1000次元程度になるときには,やはり並列計算に依らなければ計算時間が実用的ではないことが判明し,並列プログラミングを行った.また,準ニュートン法に基づく非線形最適化手法で最尤推定を試みると,時点・データセットによっては必ずしも収束が達成されない場合もあり,逐次二次計画法を利用することとした.これは当初f2cによってFortranソースコードを利用していたが,並列化のために改めてC言語でプログラミングを行った.この他,将来的に非線形ノンパラメトリック時系列モデルにおける次元縮約を考慮するときの基礎として,正則化項付き非線形回帰モデルにおける情報量規準の構築に関する研究を行った.また,共通季節成分を持っ多変量季節調整モデルに向けた基礎的研究として,状態空間モデルの枠内で季節単位根問題をモデル選択的に処理する研究を行った.(1)次元縮約型多変量自己回帰モデル(reduced rank AR model)の開発と応用を、市場リスク中立型株式売買法に即して行った。多変量時系列の個々の要素は平均非定常で予測が難しい場合でも、それらの線形結合は定常になる場合があり、統計モデルによる予測が有効となる余地がある。株価に対する時系列モデルという観点から換言すれば、非定常時系列の線形結合から生じる定常過程は、銘柄Aと銘柄Bをそれぞれ売り建て・買い建てで保有した時のスプレッドと見なせる。このスプレッド系列に対して予測モデルを構築することで、割高割安の指標を得て、ほぼリスク中立的なトレードを行うことが可能となる。このような銘柄ペアの抽出は組み合わせが膨大であるため、並列計算機上で多数の次元縮約型自己回帰モデルを計算するプログラムを開発した。開発した手法を使い、過去5年の東証1部上場銘柄に対し運用シミュレーションを行い、この手法のリスク・リターン特性を統計的に明らかにした。(2)利付債券の取引データから金利期間構造を推定する問題に対し、関数データ解析的な接近法を試みることで、動的なイールドカーブの推定モデルの構築を試みた。ある一日の利付債データに対し期間構造を推定するのは、通常のノンパラメトリック回帰の問題と言えるが、この方法では期間構造の時間変化に対して何ら含意を与えない。そこで、債券データを経時的に取得し、それらに高次元の平滑化を適用することで割引関数の局面推定(すなわちデータの関数化)を行い、その積分型で金利期間構造を経時方向に連関させる方法を考察した。この方法は、直接的に離散時間多変量時系列モデルを構築するよりは、計算量の観点から有利である。本課題は引き続き次年度でも研究を進める。

具体的には,経時的に取得した債権データに高次元の平滑化を適用することで割引関数の局面推定を行い、その積分型で金利期間構造を経時方向に連関させる方法を提案し,その予測能力を研究した.成果は国際会議で発表され,Proceedings in Computational Statisticsに掲載された.(3)多変量時系列に対し,トレンド成分は各成分個別でトレンド周りの定常変動が共通となるモデルを状態空間モデルの枠組みで推定する方法を提案し,インフレ率予測の問題に適用した.これによって,物価変動に対して先行性を持つ時系列を客観的に探し出すことが可能となった.成果は「日本経済の変化と経済予測」の第3章として公表された.(4)状態空間モデル型季節調整法において,季節成分を表す時系列モデルの特性多項式の一部について単位根制約を緩め,情報量規準に基づき,より予測性の高いモデルを探索的に求める方法を提案した.各国の鉱工業生産指数を例に取った解析で,アウトサンプル予測が改善することが示された.成果はJournal of Forecastingに掲載された.
後期三畳紀隕石衝突が引き起こした全球的環境変動の解明

本研究は,後期三畳紀の堆積物を用いることにより,今から約2億1500万年前の巨大隕石衝突によって引き起こされた環境変動記録を復元することを目的としている.平成30年度は,これまで調査・試料採取を進めてきたイタリア南部・シチリア島に分布している上部三畳系炭酸塩岩を対象として,隕石衝突起源層準(イジェクタ層)を同定するための化学分析を行った.具体的には,微化石により年代が明らかになっているシチリア島南部の石灰岩およびマールを対象として,石英製ガラスチューブを用いた同位体希釈-質量分析法による(1)負イオン表面電離型質量分析装置を用いたオスミウム同位体比分析,(2)ICP-MSを用いた白金族元素濃度の定量分析を行った.初年度の研究により,同地域に産出する堆積物中の主要・微量元素組成が明らかになっていたため,隕石由来である可能性のあるNiやCrといった親鉄性元素の含有量が高い層準を優先的に分析を行った.また化学分析と並行して,イタリア・パドヴァ大学の研究協力者とともに,海生の微化石(コノドント,放散虫)を用いた高時間解像度での年代決定および生物多様性の変化について検討を行った.現段階では,後期三畳紀イジェクタ層の復元には至っていないが,より詳細な化石年代が明らかになってきたことから,次年度のシチリア島での地質調査および試料採取が決定している.これにより,イジェクタ層の復元および巨大隕石衝突による環境変動の検討が進んでいく可能性を秘めている.これまで得られた試料を用いた化学分析および微化石を用いた年代決定については概ね終了した.またこれまでの結果から,次年度における地質調査・サンプリング地点を選定することが可能となった.本研究において,来年度はイタリア中央部南部に分布する三畳紀後期の陸棚堆積物について地質調査および試料採取を行い,2億1500万年前のイジェクタ層を復元する.イジェクタ層が復元された場合,大陸縁辺の基礎生産や海洋環境の変動など,隕石衝突が地球環境に与えた影響について評価する.本研究では,堆積環境の異なる後期三畳紀の堆積物を用いることにより,約2億1500万年前に起こった巨大隕石衝突の全地球規模での古環境変動を捉えることを目的としている.平成29年度は主に,これまでの予察的な現地調査によって得られた堆積物を用いて,巨大隕石衝突の地球化学的マーカーとなり得る元素(親鉄性元素および白金族元素)の定量分析を行い,イジェクタ堆積物の候補となる層準の探索を行なった.具体的には,微化石・古地磁気層序により年代が詳細に決定されているイタリア・シチリア島に露出する上部三畳系石灰岩およびマールを対象として,ノーリアン中期・後期境界付近の範囲について,(1) XRFを用いた粉末ペレット法による主要・微量元素濃度の定量分析,(2) ICP-MSを用いたNiS fire assay法による白金族元素濃度の定量分析を行なった.その結果,他の層準に対してNiやCoといった親鉄性元素の含有量が高い層準があることが明らかとなった.しかし,同層準において行なった白金族元素濃度の定量分析については,異常濃集は確認されなかった.また,CIコンドライトで規格化された白金族元素の相対存在度についても一様な値は得られず,イジェクタ堆積物の復元には至っていない.しかし,この結果をもとに今後の現地調査の選定およびサンプリング地点の再検討を行なうことで,イジェクタ堆積物の復元および巨大隕石衝突が引き起こした環境変動を明らかにすることができる可能性を秘めている.これまでの予察的現地調査によって得られた試料を用いたイジェクタ堆積物候補の検討は概ね終了した.一方,現地調査でのサンプリング地点を再検討する必要が生じたが,先行研究の微化石・古地磁気層序をもとに概ね選定済みである.本研究は,後期三畳紀の堆積物を用いることにより,今から約2億1500万年前の巨大隕石衝突によって引き起こされた環境変動記録を復元することを目的としている.平成30年度は,これまで調査・試料採取を進めてきたイタリア南部・シチリア島に分布している上部三畳系炭酸塩岩を対象として,隕石衝突起源層準(イジェクタ層)を同定するための化学分析を行った.具体的には,微化石により年代が明らかになっているシチリア島南部の石灰岩およびマールを対象として,石英製ガラスチューブを用いた同位体希釈-質量分析法による(1)負イオン表面電離型質量分析装置を用いたオスミウム同位体比分析,(2)ICP-MSを用いた白金族元素濃度の定量分析を行った.初年度の研究により,同地域に産出する堆積物中の主要・微量元素組成が明らかになっていたため,隕石由来である可能性のあるNiやCrといった親鉄性元素の含有量が高い層準を優先的に分析を行った.また化学分析と並行して,イタリア・パドヴァ大学の研究協力者とともに,海生の微化石(コノドント,放散虫)を用いた高時間解像度での年代決定および生物多様性の変化について検討を行った.現段階では,後期三畳紀イジェクタ層の復元には至っていないが,より詳細な化石年代が明らかになってきたことから,次年度のシチリア島での地質調査および試料採取が決定している.これにより,イジェクタ層の復元および巨大隕石衝突による環境変動の検討が進んでいく可能性を秘めている.これまで得られた試料を用いた化学分析および微化石を用いた年代決定については概ね終了した.またこれまでの結果から,次年度における地質調査・サンプリング地点を選定することが可能となった.

今後は,現地調査において詳細な岩相観察・記載を行うことで,イジェクタ堆積物候補の絞り込みを行う.その後,親鉄性元素および白金族元素の異常濃集の有無を決定し,隕石衝突記録の復元とそれによる古環境変動の解明を目指す.本研究において,来年度はイタリア中央部南部に分布する三畳紀後期の陸棚堆積物について地質調査および試料採取を行い,2億1500万年前のイジェクタ層を復元する.イジェクタ層が復元された場合,大陸縁辺の基礎生産や海洋環境の変動など,隕石衝突が地球環境に与えた影響について評価する.平成29年度は,これまでの予察的現地調査によって得られた堆積物試料を用いて分析を行なったため,当初予定していた現地調査を延期した.そのため,旅費および試料運搬費として計上していた支出分を次年度に繰り越したため,次年度使用が生じた.次年度使用額は海外における調査旅費に使用予定である.平成30年度は,予察的な現地調査によって得られた堆積物試料を用いて分析を行なったため,当初予定していた現地調査を延期した.そのため,旅費および試料運搬費として計上していた支出分を次年度に繰り越したことで次年度使用が生じた.次年度使用額は海外における調査旅費に使用予定である.
結晶歪誘起高輝度発光結晶化ガラス材料の開発

グラセライト(K_3Na(SO_4)_2)と同型の結晶構造をもつMn含有M_3MgSi_2O_8(M: Ba, Sr, Ca)に紫外光を照射すると赤色発光を示した。Mで示される2価イオン中のバリウムの比率が増えると、マンガンからの赤色発光強度が増大した。結晶構造解析の結果から、バリウム添加に伴う結晶構造の歪みが発光強度の増大に寄与していることが明らかとなった。同組成にアルミニウムを添加することでM3MgSi2O8結晶-ガラス相共存試料の作製に成功した。1.具体的成果種々の比率で混合した炭酸バリウム、酸化チタン、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウムを白金るつぼ中で1450度、4時間の条件で溶融後、融液をステンレス板上に流し出し、急冷することで得た酸化物ガラスに、600度がら1000度の温度条件下で所定時間熱処理を施すことで、強誘電結晶として知られるチタン酸バリウム(BaTiO_3)をガラス相から析出させることに成功した。熱処理条件(温度、時間)を調整することで、析出するBaTiO_3結晶子(粒界のない結晶構造を保っている領域)のサイズを約170nm以上の任意の値(上限は不明)にコントロールできることを確認した。ただし現段階において析出結晶粒のサイズが結晶子のサイズと一致するかは明らかではない。同ガラスに添加したユーロピウムイオンの紫外励起光下における発光をBaTiO_3結晶析出前後で比較したところ、両試料とも赤色の発光を示したものの、色、強度に有意な差はなかった。これは3価の状態(ガラス相であるか結晶相であるか)を反映しないためであると考えられる。2.意義・重要性周囲がBaTiO_3結晶を構成する他のイオンにより取り囲まれている結晶内部と比較して、一部ガラス相などの結晶相と異なる相を構成するイオンで取り囲まれる結晶粒表面では誘電率が非常に大きくなるとの数値解析結果が報告がある。本研究で開発されたBaTiO_3結晶化ガラスは、広範囲で析出結晶の(表面/体積)比をコントロールすることが可能であることから、表面物性の調査や、現有の誘電体材料を凌ぐ高誘電率をもつ材料の開発など、基礎、応用両面に渡って波及効果の大きな媒質であるといえる。一部の遷移金属イオンは、軌道間電子遷移に伴い可視波長域の光吸収、発光を示す。蛍光灯や薄型ディスプレイなどに用いられる蛍光体の多くは、呈色の少ない材料に遷移金属イオンを微量添加することで合成されている。遷移金属イオンから観測される発光の色や強度は、遷移金属イオンとその周囲の環境に強く依存するため、遷移金属イオンを内包するホスト材料の選択、構築が蛍光体を設計する上で重要な要素となる。本研究では、発光中心としてEu、Ce、Mnを、ホスト相としてペロブスカイト型酸化物結晶、グラセライト型酸化物結晶を選択し、固相反応により合成した蛍光体の発光特性を調査すると共に、ホスト相に構造歪みを誘起することで発光効率を改善することができないか検討を行った。得られた研究成果を以下に記す。1ペロブスカイト化合物BaTiO_3BaO-TiO_2-Al_2O_3-Na_2O-SiO_2-Eu_2O_3ガラスに、730°Cで30分熱処理を行うことで、BaTiO_3結晶化ガラスが得られたことをX線回折法により確認した。同ガラスに数十フェムト秒のパルス幅をもつTiサファイアレーザーを連続集光照射することでも焦点付近にBaTiO_3が析出した。レーザー焦点付近ではガラス相にも大きな歪みが観測された。ここで得られた数十ナノメートルの結晶子サイズをもつEu含有BaTiO_3結晶化ガラスは、蛍光体としての応用以外に、誘電材料への展開が可能であると考えられる。Baを多く導入した化合物では、Ba近辺の立体障害によるMgサイトの対称性低下を示唆する結果が得られた。同試料にCe^<3+>, Mn^<2+>イオンを添加すると、対称性が低下したMgサイトを占有するMn^<2+>イオンの赤色発光強度が増大することを確認した。結晶構造へ誘起した構造歪みがMn^<2+>の発光効率を改善したものと考えられる。
小胞体品質管理におけるタンパク質分解の新規分子メカニズムの解明

近年、多くのコンフォメーショナル病(とくに神経変性疾患)において小胞体ストレスの関与が示されており、小胞体品質管理機構を明らかにすることは、様々な疾患の病態分子機構の解明に繋がり意義は大きい。申請者はこれまでに、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態分子メカニズムに関する研究から、細胞質内に蓄積した疾患原因タンパク質が特異的に結合する標的分子として、小胞体膜貫通型タンパク質Derlin-1を同定し、さらにDerlin-1の獲得性機能異常により小胞体ストレスが惹起され、神経細胞死が誘導されることを示している。これまでDerlin-1については、小胞体品質管理に関わることが示されているものの、この分子がどのように機能しているかは不明であった。そこで本研究では、ALS病態において変異型SOD1と結合することによりDerlin-1が新たに獲得した機能異常を解析することにより、本来持っている生理的機能を逆行性に明らかにすることを試みた。その結果、Derlin-1は新規小胞体品質管理システムに関与することを示唆する結果を得た。すなわち、小胞体ストレス下においては、小胞体内腔の不良タンパク質蓄積を軽減させるために、シグナル配列または膜貫通領域をもつタンパク質のSec61トランスロコンを介した小胞体への輸送が阻害され、細胞質内プロテアソーム系で分解される。変異型SOD1-Derlin-1結合は、この「タンパク質の翻訳時小胞体輸送阻害:ER-translocational attenuation」を介した新規小胞体品質管理機構を阻害する。生体内の生理的状況で、この新規小胞体品質管理機構がどのようなメカニズムでどのように機能しているかは不明で、今後の研究課題であるある。近年、多くのコンフォメーショナル病の発症メカニズムの一つとして、小胞体ストレスの関与が明らかになっている。しかし、小胞体の品質管理がどの様な分子機構によるかは不明な点が多く、現在最も注目されている研究対象の一つである。合成途上で相当な割合で生じる小胞体不良タンパク質は、小胞体シャペロン分子の発現誘導を介してリフォールディングされるか、あるいは小胞体関連分解(ER-associated degradation)により小胞体内腔から排除されなければならない。しかし、これらの小胞体品質管理機構が何らかの原因により破綻すると、細胞機能異常やアポトーシスによる疾患発症につながる。その具体的な例として、我々はこれまでの研究により、細胞質内異常タンパク質の蓄積が小胞体ストレスを惹起し、アポトーシスを誘導することを明らかにしてきた。すなわち、ポリグルタミン病や筋萎縮性側索硬化症では、細胞質内に蓄積した疾患原因異常タンパク質がERAD機能を直接阻害し、その下流でストレス応答性MAPキナーゼ(ASK1-JNK)経路の活性化を介した小胞体ストレス誘導性アポトーシスが誘導されること示してきた。平成20年度は、小胞体品質管理機構の中でも特に未解明なERAD分子機構に着目し、その詳細を明らかにすることで、小胞体ストレス下にある細胞の機能回復を目指した。具体的には、細胞質内異常タンパク質がDerlin-1の機能を抑制するメカニズムを解析する中で、ERAD以外の新規機能として、小胞体ストレス時にトランスロコン(Sec61)を介した小胞体内腔へのアミノ酸輸送をDerlin-1が抑制するという現象を見いだした。この機能はDerlinファミリーに共通していたが、そのメカニズムについては未だ不明であり、今後は小胞体膜上で翻訳途中の未完成ペプチドが翻訳時分解経路へと転移される機構およびそれに関わる分子を明らかにする。
心血管アルドステロンの合成制御機構の解明

アルドステロンは水・Na保持という古典的作用以外に、心血管障害作用を有する。副腎に比べ微量だが、障害臓器局所ではアルドステロン合成酵素遺伝子(CYP11B2)発現が亢進し、その病態形成に寄与する。今回、CYP11B2プロモーターのメチル化依存性発現抑制を明らかにし、さらには、ヒト障害心筋(肥大型心筋症、高血圧性心肥大、拡張型心筋症)での、脱メチル化に伴うCYP11B2発現亢進を明らかにした。また、CYP11B2発現に関わる核内受容体(NGFIB, NURR1, NOR1, SF1)が複数のプロモーターにより発現調節され、これらプロモーターの使用頻度は、副腎、心血管で異なることを明らかにした。副腎と心血管のアルドステロン合成制御の違いにつき、2つのサブテーマで、本年度の成果を記す。1.アルドステロン合成酵素遺伝子(CYP11B2)プロモーターのDNAメチル化:プロモーター内のCREのメチル化DNA標的部位CpG(-68/-67)(CpG1),Ad5のCpG(-112/-111)(CpG2)のメチル化状態を評価した。また、CpG(-219/-218)(CpG3)も解析に加えた。アルドステロン産生腫瘍(n=9)、非アルドステロン産生腫瘍(n=5)正常副腎(n=4)、動脈(n=3)において、CpG1,2,3のメチル化比率とCYP11B2発現量と逆相関し、アルドステロン産生腫瘍では、低メチル化状態、動脈では、高メチル化状態であった。また、プロモーターアッセイでも、DNAメチル化の程度とCYP11B2プロモーター活性は逆相関した。CYP11B2プロモーター活性はメチル化依存性に抑制される。DNA-蛋白結合の検討から、メチル化により活性化因子CREBやNURR1のプロモーターへの結合が阻害され、また抑制因子のメチル化CpG結合蛋白MECP2の結合が促進されることが関与していることが判明した。また、肥大型心筋症では低メチル化状態であり、低メチル化が肥大心からのアルドステロン産生亢進に関与する可能性が示唆された。2. CYP11B2転写を活性化する核内受容体の発現調節機構;核内受容体のうち、CYP11B2活性化因子NR4Afamily (NGFIB, NURR1, NOR1)、抑制因子NR5A1 (SF-1)の遺伝子発現が複数のプロモーターにより、発現調節されることが培養細胞H295Rを用いた検討から判明した。さらに、これらのプロモーターはヒト副腎、動脈でも発現しており、特にNGFIBのプロモーター発現調節は、副腎と動脈では異なっていた。即ち、蛋白コード領域から11kb上流のプロモーターの使用頻度が、副腎では9.9%,動脈では35.5%と有意に異なることが判明した。このプロモーターのみを抑制することにより、動脈硬化巣で活性化しているCYP11B2の発現のみを特異的に抑制しうる可能性がある。これは、新たな抗動脈硬化治療開発という意味で意義がある。1.アルドステロン合成酵素遺伝子(CYP11B2)プロモーターのDNAメチル化;ヒト心筋におけるCYP11B2メチル化と遺伝子発現量の関係を明らかにすることに取り組んだ。その結果、(1)心筋でのCYP11B2プロモーターは、高メチル化状態であること、(2)メチル化の程度と遺伝子発現は逆相関すること、(3)さらには、心筋症では、低メチル化状態で、遺伝子発現も亢進していること、が判明した。低メチル化が心筋症からのアルドステロン産生亢進に関与することが強く示唆された。2.CYP11B2転写を活性化する核内受容体の発現調節機構;CYP11B2活性化因子NR4Afamily (NGFIB, NURR1, NOR1)、抑制因子NR5A1(SF-1)の複数のプロモーターが、ヒト副腎、動脈、心筋、アルドステロン産生腫瘍、心筋症心筋でも発現していることが判明した。さらには、これら核内受容体のプロモーター使用頻度は、それぞれの組織で異なることが分かった。特に、NGFIBのプロモーター使用頻度は、アルドステロン産生腫瘍と動脈で有意に異なっていた。NGFIBの作用は、アルドステロン産生腫瘍ではCYP11B2転写促進、動脈では抗動脈硬化的である。

アルドステロン産生腫瘍で活性が高く、動脈において活性の低い、プロモーターのみを抑制することにより、動脈でのNGFIBの機能を保持しつつ、アルドステロン産生腫瘍のみでCYP11B2の発現を抑制しうる可能性がある。これらの知見は、病的状態(アルドステロン産生腫瘍、心筋症)におけるアルドステロン産生の制御する新規治療への足がかりとなる。本年度は、心筋症、肥大心、不全心でCYP11B2プロモーターの脱メチル化が生じる機構を探るべく、転写因子の過剰発現により脱メチル化を誘導できるかどうか取り組む。アルドステロンは水・Na保持という古典的作用以外に、心血管障害作用を有する。アルドステロンは高血圧症、糖尿病、メタボリック症候群などにともなう心、腎、脳などの臓器障害に関連する。副腎に比べ微量だが、障害臓器局所ではアルドステロン合成酵素遺伝子(CYP11B2)発現が亢進し、局所でのアルドステロン産生が臓器障害の形成に寄与する。我々は、ラット心肥大形成に心局所でのアルドステロン産生亢進が関与することを示してきた。今回、ヒトCYP11B2プロモーター活性がDNAメチル化依存性に抑制されることを明らかにし、さらには、ヒト障害心筋(肥大型心筋症、高血圧性心肥大、拡張型心筋症)での、脱メチル化に伴うCYP11B2発現亢進を明らかにした。以上のことから、ヒト心筋障害の病態でも、心局所でのアルドステロン産生亢進が関与する可能性が示された。また、CYP11B2発現に関わる核内受容体(NGFIB,NURR1,NOR1,SF1)が複数のプロモーターにより発現調節され、これらプロモーターの使用頻度は、副腎、心血管で異なることを明らかにした。NGFIBのプロモーター使用様式は、アルドステロン産生腫瘍(APA)と動脈では有意に異なっていた。NGFIBは抗動脈硬化作用を有することが知られる。APA特異的NGFIBプロモーターのみを抑制することにより、動脈でのNGFIB発現を保持しつつ、APAからのアルドステロン産生を抑制する治療が可能となるかもしれない。
南アジアにおける「地域」ガバナンスとしての共同森林経営に関する地理学的研究

共同森林経営(JFM)は、1990年代から世界に広まった住民参加型の森林管理手法の一つである。本研究では、インド、ネパールにおいてその実態を明らかにした。確かに森林率の上昇など、JFMは量的・面的な成果をあげている。しかし、住民の多様性、成果至上主義のため森林経営自体が手段化するなど、広範な地域でのガバナンスの可能性が減退している。特に、国立公園など管理の行き届いた森林とそれ以外の対照は顕著である。本年度は、研究計画に沿って、南インド、北インド、ネパールでの現地調査を実施した。その成果・知見は以下のとおりである。南インドでは、カルナータカ州マイソール県フンスール郡内において、ここ50年間に森林減退が見られた地域内の集落(約50ヶ村)を対象として、開村以降の歴史(古老を中心とした生活史インタビュー)について調査した。その結果、住民による自発的開墾と州政府による社会政策の結果として森林減退が生じたことが明らかになった。また、同州とタミル・ナードゥ州の州境地域において、ターマリック生産地の拡大と森林管理との関係について調査を実施した。北インドでは、シャリスカトラ保護区(ラジャスタン州)の集落において植林事業と共同森林経営の関係についてヒアリング調査を実施した(予備調査)。ネパールでは、山岳地域(ラスワ郡シャブル村)において、幹線道路建設や中国人との共存との圧力がある中にあって、コミュニティフォレストの位置づけを検討した。また、ネパール政府観光局のプロジェクトやJICAプロジェクト(「地方行政強化を通じた流域向上プロジェクト(PWMLGP)」)との連携も行った。これらの調査は、次年度の本調査に向けての予備調査としての位置づけにある。今年度は、研究の枠組みや方法論について、国際会議への参加やワークショップの開催などに心がけた。また、ルーマニアでの国際会議では、東ヨーロッパにおいてみられる森林荒廃と森林管理に関する試みについて、南アジアの経験を踏まえて、意見交換を行った。本年度は、以下の通り、各地での現地調査に加えて、全体会合を実施した。1)現地調査:木本は、昨年度に引き続き、南・西インドでの調査を実施した。南インドでは、アルン・ダス(マイソール大)とともに、バンディープール野生動物保護区において、指定部族の集落を調査した。また、西インドでは、R.B.シン(デリー大)とともに、シャリスカトラ保護区での本調査を実施した。アッサムでは、ラマン(コットン大)が森林調査を実施した。ネパールでは、辰己が、ネパール山岳地域のランタン国立公園において、政府主導の森林管理と集落を基盤とした相互扶助的な活動を基盤とした森林管理の調査を行い、それらの管理形態の比較を行った。また、ナレンドラ(トリブバン大)は、山地地域のダルチョウキ村での調査を通して、NGOや行政が主導的な森林管理から地域主体の森林管理への移行による地元リーダーの変化や住民の参加形態について分析を行った。平野地域の森林管理については、チトワン郡にて関係者への聞き取り調査と資料収集を行った。2)学会報告:木本は、GHNRM(インドネシア)、IGU(チリ)、日本地理学会(首都大)で、辰己は、西日本社会学会(島根大)で口頭発表を行った。特に、本年度は、11月(FMaRG、マイソール大)と2月(デカン地理学会と共催)、本プロジェクトの会合として二度のシンポジウムを開催した。特に、後者では、インドの研究者らと意見交換を得て、今後の研究の展開に道筋をつけることができた。本年度は、研究最終年度として、各地で追加の現地調査を行うとともにまとめの口頭発表を行った。南インドでは、カルナータカ州南部のナガラホレ国立公園周辺部において集落調査を実施した。森林ガバナンスの可能性は、森林近郊に居住する住民が森林管理に参加可能か否かについて伝統の有無やルールの遵守を論点とすることに先立って、森林近郊という地域そのものがどのように形成されてきたのかが重要である。北インドでは、ラジャスタン州サリスカ国立公園周辺において集落調査を実施し、共同森林経営(JFM)の実施が個々の集落の範囲に留まっており、複数集落もしくは国立公園を含む広範な地域において実施されていないこと、その原因が集落の多様性(特に居住歴・理由)によることなどを確認した。デラドゥン地域(ウッタラーカンド州)の調査では、JFMが成功しない理由は、コミュニケーション上の問題や女性の不参加であり、過放牧や政治的介入などの理由を上回っていることを確認した。ネパールでは、シバプリとランタン国立公園周辺の集落で比較調査を実施した。土砂崩れ、違法伐採などが恒常的な課題であり、直接的・短期的見返りのないプログラムの参加率は少なく、森林管理そのものを直接の目的とするのではなく、寺院建設などの具体的プロジェクトによって意識の向上や集落活動の活性化を図ることによって、住民の参画が望めることが確認できた。本研究では、ガバナンスの「地域」的文脈について、個々の集落を越えて、より広範な「地域」での調査を実施した。

個々の集落で実践されている成功例であったもより広範なガバナンスの可能性がなければ持続性にもとる場合が多い。ガバメントからガバナンスへと喧伝されて久しいが、今後の政府(行政)の役割は、「地域」的文脈を踏まえ、個々のガバナンスが可能となる環境づくりにあると言えよう。本研究の主たる目的の一つである、方法的枠組みの検証については、おおよその目処が立った。現地調査において、統計データの処理が遅れがちであるが、一方で広範な範囲で、つまり個別集落の調査を超えて「地域」範囲での現地調査を行うことができており、最終年度に向けて、順調に推移しているものと評価している。当初予定していたグループミーティングについては、ラジャスタン、ネパールにおいて一部実施できているが、十分とは言えない。特に、直接的な利害に関わる問題については当事者の不利益になることも多く、踏み込んだ質問を差し控えざるを得ない。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究組織全体で、一貫したフレームワークに基づいた成果を出すことができるか否かが課題となる。最終年度は追加調査に加えて、英文での成果の出版を予定している。また、それに並行して、日本地理学会でのシンポジウムも予定しており、それらに十分に反映できるようにしたい。
気相反応による多成分ナノクラスターの合成とその顕微鏡観察ならびに光物性の解明

気相クラスターの有する新奇な機能性を利用したナノデバイスの創成を目的し、単一組成のクラスターを固体表面上に集積・デザイン手法の開発ならびにそれらの機能性を評価する実験システムを考案してきた。固体基板としては金属基板をはじめ、可視光透過性の透明電極としてデバイスに広く使用されているITOならびに酸化スズといった金属酸化物の利用をも可能とした。デバイス製作するうえで、下地基板の多様性は極めて重要であり、これによりクラスターの有する磁気特性、光学特性さらには触媒特性を活かした多様なデバイスを創成するが可能となる。一方で、気相クラスターは生成量が極めて少なく、その検出には高感度化が強く望まれるため、表面増強分光法の開発も同時に行った。クラスター蒸着基板に対し、溶液中レーザー蒸発法にて合成した金ナノ粒子を予め塗布したところ、赤外吸収分光の増強効果が確認され、固体基板に担持した微量クラスターの高感度検出に成功した。さらに金ナノ粒子表面をチオール分子により保護することで、局所的なナノ粒子-クラスター間の化学的相互作用を低減することも可能とした。本研究で標的とした有機金属クラスターの機能性としては、磁気特性、光特性、さらには水素吸着特性が期待されているが、近年の再生可能エネルギー問題の重要性を加味し、本年度はクラスターの水素吸着特性に関して詳細な検証を行った。その結果、クラスターを構成する遷移金属の種類を変化させることで、水素の吸着量が劇的に変化することが見出され、さらにその吸着量は遷移金属の価電子数に大きく影響することを実験的に初めて立証することに成功した。高質量の気相合成クラスターイオンを超高感度に検出するシステムを構築した。検出システムは主にマイクロチャネルプレート(MCP)、シンチレータ、光導波路(合成石英管)ならびに光電子倍増管(PMT)により構築され、入射イオンをMCPへ衝突させ2次電子を生成し、さらにシンチレータにより光子へと変換したのち、光導波路を介して光子を大気中に搭載されたPMTにて検出することで高感度化を実現した。標的イオンとして金原子(質量数:197)を用いて検出感度の評価を行った結果、市販のMCPイオン検出器と比較し、約800倍もの感度を有することが確認された。一般に、イオン検出器の感度は高質量になるにつれて低下するが、高い速度をもたせて検出器表面に衝突させることで、高質量種においてもその検出感度を飛躍的に向上できることが知られている。本研究では、検出部の各電極の耐電圧値を20-40kVとして設計を行った結果、10keVを超える運動エネルギーにて検出面と衝突させることが可能であり、100000Daを超える高質量の気相化合物に対する高感度イオン検出へ展開できると考えられる。さらに本研究では、気相化学種の光物性を検証する実験システムの構築の一環として、可視光透過性基板へ気相化学種を担持する手法を確立した。可視光透過性基板としてITO膜ならびにルチル型SnO_2(110)基板を使用し、有機単分子膜マトリクスで化学修飾したのちに気相合成した有機金属クラスターをマトリクス単離した。その結果、基板上で配向性が発現し、さらにSnO_2(110)基板に単離したクラスターのおいては、室温領域においてマトリクス単離が達成され、高い熱的安定性を有することが明らかとなった。単離クラスターの熱的安定性は有機分子マトリクスの熱物性(相転移過程)に相関しており、マトリクスの下地基板であるITO、SnO_2の表面形態の差異が、クラスターの熱的安定性に寄与していることが示唆された。気相クラスターの新奇な機能性を利用したナノデバイスを創成するにあたり、単一組成の化学種を効率的に固体基板上へ蒸着する方法論の開拓が強く望まれており、その装置開発の一環として、本年度はクラスターイオンを高効率に透過する質量選別システムを構築した。気相合成したクラスターイオンを効率的に固体基板へ伝送するためには、クラスタービームの空間制御が極めて重要である。本研究では、四重極子を質量分析器として活用し、クラスタービーム軸に対する四重極子のアライメントを自在に制御できる真空構成機器を開発した。これにより質量選別したクラスターを高いイオン透過率で効率的に固体基板へ伝送・蒸着することを可能とした。さらに気相合成した有機金属クラスターを化学結合を介して自己組織化単分子膜上へ固定化する方法論を見出した。特にアニリン配位子と遷移金属からなるサンドイッチ錯体をカルボキシ末端単分子膜へ衝突反応させることで、強固なアミド結合を介した新規クラスター担持法を確立した。またクラスター担持基板に対して水素分子吸着特性を検証し、遷移金属-アニリンサンドイッチ錯体が約200Kの低温域において高い吸着反応性を有することが確認された。さらに吸着した水素分子は解離吸着していることと考えられ、錯体と水素分子の強い相互作用は、水素原子から遷移金属の空軌道への電荷移動に起因すると示唆された。

一方で、気相クラスターは生成量が極めて少なく、その検出には高感度化が強く望まれるため、表面増強分光法の開発も同時に行った。クラスター蒸着基板に対し、溶液中レーザー蒸発法にて合成した金ナノ粒子を予め塗布したところ、赤外吸収分光の増強効果が確認され、固体基板に担持した微量クラスターの高感度検出に成功した。さらに金ナノ粒子表面をチオール分子により保護することで、局所的なナノ粒子-クラスター間の化学的相互作用を低減することも可能とした。本研究で標的とした有機金属クラスターの機能性としては、磁気特性、光特性、さらには水素吸着特性が期待されているが、近年の再生可能エネルギー問題の重要性を加味し、本年度はクラスターの水素吸着特性に関して詳細な検証を行った。その結果、クラスターを構成する遷移金属の種類を変化させることで、水素の吸着量が劇的に変化することが見出され、さらにその吸着量は遷移金属の価電子数に大きく影響することを実験的に初めて立証することに成功した。
血液凝固線溶系の修飾による骨折治癒の促進

血液凝固線溶系の修飾による骨折治癒の促進をゴールとして実験を行った。まずプラスミノーゲン蛋白を欠損したマウスを、プラスミノーゲンヘテロマウスを掛け合わせることにより作成し、生後8週の時点で大腿骨の骨折術+骨接合術(髄内釘法)を行った。コントロールとしてヘテロマウスを掛け合わせて作成できたワイルドタイプマウスを使用した。さらにアンチセンス療法として、α2Anti-Plasminのアンチセンスを用いて、プラスミノーゲンヘテロマウスならびに野生型マウスに、アンチセンス療法を術前より行い、プラスミン活性をあげた状態で骨折させた。まずレントゲンを用いて後3日、5日、7日、10日、14日と5ポイントで撮影を行い、骨折の修復程度を野生型と比較した。さらに各ポイントにて骨折大腿骨を摘出し、ホルマリン固定ののち組織切片とした。結果として、レントゲンでは野生型は予想通りの骨折の治癒過程を示した。プラスミノーゲンヘテロマウスに関しては、骨折部中心に異所性骨化を形成したものの、骨折の治癒過程としては野生型と相違ないように見えた。現在組織切片にて解析中である。またノックアウトマウスは異所性骨化が顕著で、骨折の治癒過程も遅れているように見えた。さらにアンチセンス療法を行った、野生型マウス、ならびにヘテロマウスに関しては、レントゲン上で明らかな違いが判らなかった。現在病理組織で解析中であり、今後なんらかの結果が分かるかもしれない。今後病理組織だけでなく、新生血管などの状態に関しても検証していきたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。我々が行ってきた今までの研究から、フィブリンの沈着だけでなくフィブリンを溶解する線溶系タンパクが、フィブリン溶解だけではない作用によっても骨折治癒を促進するのではないかという仮説を立てた。本研究では骨折治癒促進に向けて、形成されたフィブリンを溶解する線溶系タンパクである`プラスミン'の活性を高めることで、骨折治癒促進が期待できるのではないかと考え、プラスミン活性を高める薬剤の骨折治癒における有用性とその安全性を検証する。それらを踏まえ、現在In vitroの実験を主に行っている。(メカニズムの検証)i)Fibrin Migration Assay:TranswellChamberを用いてフィブリンで覆ったメンブレンに細胞を播種し、その状態で線溶系活性有無でCultureし、その細胞のMigrationを定性定量評価を行っている。Migrationした細胞をクリスタルバイオレットにて染色、その後一定量のTween入りPBSで脱色し、プレートリーダーにて吸光度を測定する。今回の実験においては内皮細胞系のセルラインを用いている。現在プレリミナリーな結果であるが、Fibrinメンブレンのうち、Fibrin濃度が高い膜において、細胞の通過が阻害されている(すなわち吸光度が低い)という結果が得られており、やはりFibrinが細胞のMigrationを阻害している印象であった。ii)Metatarsal Culture:血管新生評価として、出生間もないマウスより中足骨を採取し、線溶系活性有無具体的にはプラスミンの添加の有無の条件下で24well Dishで2週間Cultureする。フォルマリンにて固定した後CD31免疫染色し、血管新生の差を評価する。プレリミナリーであるが、固定後CD31で染色できることが確認できた。さらにPCソフトを用いてそれを定量化できることが分かった。なおIn vivoの実験に関しては目下モデルを確立させ、CTなどでの評価を検討している。In vivoでの血管造影が海外で使用していた試薬と違うせいか、確立できていない。具体的には、骨折仮骨ににおける血管増生を検証するため、サクリファイスする際に血管造影を行い、その後画像検査するのだが、血管造影剤が途中で漏れる、凝固するなどの事象が多く発生しており、In vivoの検証がなかなかできていない。血管造影の造影剤を変更、さらにサクリファイス方法を変更するなどトラブルシューティングを行っている。

徐々に安定した造影剤注入が可能になってきており、今後確立できると思われる。さらにIn vitroに関してはこれまで通り進めていく予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。