hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
情報埋め込みによる「紙とペン」の機能拡張-手書きコンテンツのサイバーメディア化-

本研究では,「紙の上の手書き」に新たな価値を付与するべく,「情報埋め込みペン」を開発した.このペンでは,ペン先のインクジェットにより,筆記時にリアルタイムに筆記者情報や筆記日時などの任意情報を埋め込むことができる.埋め込んだ情報は画像処理により復元できる.すなわち,紙の上の手書きに,計算機可読な様々な情報を埋め込むことができる.実験により,5cmの筆記に32ビット程度の情報を誤りなく埋め込めることを確認した.本研究では,「紙の上の手書き」に新たな価値を付与するべく,「情報埋め込みペン」を開発した.このペンでは,ペン先のインクジェットにより,筆記時にリアルタイムに筆記者情報や筆記日時などの任意情報を埋め込むことができる.埋め込んだ情報は画像処理により復元できる.すなわち,紙の上の手書きに,計算機可読な様々な情報を埋め込むことができる.実験により,5cmの筆記に32ビット程度の情報を誤りなく埋め込めることを確認した.「紙とペン」による手書き(手書きコンテンツ)は人類が数千年来愛用してきたメディアである。ところがこの「紙とペン」と現代を席巻するサイバーメディアとは水と油のような関係に留まっている。本研究課題では手書きコンテンツにID管理やリンクといったサイバーメディア的な機能を付加することで、その価値を飛躍的に向上させることを目的とする。そして老若男女を問わないユニバーサルインタフェースとしての活用を目指している。この目的のために、2005年度からの検討結果を踏まえながら、以下3点の研究開発を実施した。(研究実績1)情報埋め込みペン(微細インクドット等による情報埋め込みが可能なペン)のプロトタイプ実装:マイクロジェット社に極小1ノズルインクジェットノズルを特注し、単色ながらインクドット埋め込みが可能なペンが完成した。これは世界初の開発事例である。また、そのインク塗布間隔制御機能を実装した。(研究実績2)知的画像処理技術を援用した埋め込み限界に対するブレークスルー:ペン先付近の動画像をフレーム単位に分解した後に位置あわせをしながら貼り合わせる処理により、手書きコンテンツの全体形状を復元できることを確認した。その際、紙表面の模様(紙指紋)に着目することで、高精度な復元を実現した。(研究実績3)ライティングライフログにおける手書きコンテンツを手がかりとした情報検索のための基盤技術として、その手書き時に獲得される文書紙面を入力とし、事前に登録したどの紙面に手書きが為されているかを検索できる技術を開発した。「紙とペン」による手書き(手書きコンテンツ)は人類が数千年来愛用してきたメディアである。この目的のために、2005年度からの検討結果を踏まえながら、以下の研究開発を実施した。第一に、昨年度の研究経費で実装した、「情報埋め込みペン」(微細インクドット等による情報埋め込みが可能なペン)のプロトタイプを用いて、種々の実証実験を行った。具体的には、(i)紙の上に筆記する状況での情報埋め込み、およびその筆記パターンを撮影した画像からの埋め込み情報復元の実証実験を行った。(ii)微小なインクノズルの利用、ならびに情報埋め込み・復元時に生じる様々なノイズに対する耐性を高めるための誤り訂正符号の導入、の2点により埋め込み密度の向上を図った。その結果、3cm大の「@」の中に21ビットを正確に埋め込み、そして復元できることを実証した。また(iii)復元の際には筆記パターンを撮影する必要があるが、その際に通常のディジタルカメラを用いても、スキャナと同等の精度での情報が復元できることを示した。第二に、昨年度から行っているペン先画像からの筆記復元手法について、より詳細な実験を行った。この手法では、紙表面の微細構造(紙紋)の動きを用いてペン先の動きを推定し、その結果から筆記を復元する。その際に、動きボケがどのように悪影響を及ぼすかについて、定量的・定性的な評価実験を行った。そして老若男女を問わないユニバーサルインタフェースとしての活用を目指してきた。この目的の下で実施したこれまでの検討結果により、昨年度においてデータ埋め込みペンのプロトタイプ実装が完了したところであった。今年度はその実用性を高めるべく、以下の研究開発を実施した。第一は、Reed-Solomon型誤り訂正符号の導入である。データを読み取る際、ストロークインクの影響等により、埋め込んだドットが正しく読み取れない場合があるが、この誤り訂正符号の導入により、精度を各段に向上できた。具体的には、10cmの手書き線上に約50ビットを埋め込んだ場合の読み取り成功率を、46%から100%にできた。第二は、筆順復元の高精度化である。埋め込んだ情報は埋め込んだ順番すなわち筆順に従って読み取る必要がある。このため筆順復元が必要になるが。本年度はその際に埋め込んだドットの形状を利用して高精度化を図る手法を実装した。

大量のパターンで定量的評価を行ったところ、この手法を用いない場合に比べ、例えば"X"状の文字については、復元成功率を50%から100%に向上できた。第三は、ペン先にカメラをつけることでペンの動きを把握し、それをドット出力制御にフィードバックさせるための検討である。紙紋のみなら紙面に印刷された文字情報を使うハイブリッド型の動き推定法により、精度が向上できることを確認した。
二分脊椎症における排便・排尿障害の病態解明と新規予防・治療法を目指した基礎研究

二分脊椎症モデルマウスを用いた組織学的検討により腸管神経系の分布異常を見出し、その腸管ではグリア細胞由来神経栄養因子GDNFの発現の変化を観察し得た。また腸管神経系の修復に関連する因子を見出すための腸管虚血再灌流実験では、再灌流後の腸管グリア細胞の増減と反発性軸索ガイダンス分子セマフォリン3Aの関連が示唆される結果を得た。二分脊椎症患者の多くは排便排尿障害に悩まされており、患者の生活の質を向上させるために、詳細な発症メカニズムを解明し、障害に対する理解を深めることが重要であると考えられている。平成26年度においては、二分脊椎症マウスモデルを作製し、排便障害に焦点を絞った解析を行った。1)生体内で神経堤細胞を可視化するために、緑色蛍光タンパク質であるVenusをSox10遺伝子に標識させたSox10-Venusマウスを用いて、全トランス型レチノイン酸(ATRA)により誘導した二分脊椎症モデルマウスを作製した。ATRAはマウスにおいて二分脊椎症と鎖肛を誘導することが知られている。また、鎖肛など肛門直腸奇形の患者には、潜在性二分脊椎症が多いと報告されており、二分脊椎症の排便障害の原因を理解するうえで有用である。2)モデルマウス胎仔から摘出した腸管を実体蛍光顕微鏡で観察し、次に組織切片での免疫染色(PGP9.5、α-SMA)を行い、直腸遠位部における腸管壁内神経細胞の評価並びに肛門部における肛門括約筋を観察した。未染色のモデルマウス腸管を用いた実体蛍光顕微鏡下での腸管神経系の観察では、直腸遠位部で正常な腸管神経系の欠如と増生した神経束と思われるVenus陽性神経線維束が確認された。免疫組織染色を用いた検討では、肛門括約筋は確認されず、腸管神経細胞の評価では神経節細胞は有意に減少していた。今回のATRAで誘導されたモデルマウスにおいて、二分脊椎症・鎖肛における腸管神経系と肛門括約筋の異常が観察できた。今後の二分脊椎症の排便障害との関係を解明するために、このモデルマウスは有用なツールとなりうると考えられた。本年度も継続して全トランス型レチノイン酸(ATRA)で誘導される、鎖肛を伴う二分脊椎症モデルマウスを用いて本課題に取り組んだ。本疾患の術後の排便機能障害は骨盤神経の障害などによる外因性の原因だけではなく、腸管神経系の形成自体にも障害がある内因性の原因・機序が影響しているか否に着目した。鎖肛患者においては二分脊椎症を伴う場合に限らず、術後の排便障害を伴う場合があり、その原因として腸管神経系の形成異常がこれまでの検討により示唆されているが、その機序は明らかではない。その原因を検討するために、腸管神経系細胞の発生を制御する重要な因子のひとつであるグリア細胞由来神経栄養因子GDNFの発現変化に焦点を絞り、GDNFとその受容体であるRETの発現を免疫染色を行い観察した。具体的な方法として、妊娠8.5日の母マウスにATRAを過剰に経口投与し、胎生15日齢で儀死させ、実体顕微鏡下で高位鎖肛を認めた胎仔をモデルマウスとし、その腸管を摘出した。また何ら異常を認めない同腹仔のマウスを正常コントロールとして用いRET/GDNFの免疫染色を行い、発現を比較した。その結果として、GDNFの受容体であるRETの発現に変化は認められなかったが、GDNFに関しては発現に差が見られる個体が認められた。この発現に変化があることがATRA過剰投与の影響によるものか、本疾患の排便機能障害に影響を与える腸管神経系の発生不良の原因を示しているのか、さらに踏み込んだ検討(遺伝子改変によるモデルマウスによる検討など)が必要であるが、今後ATRA過剰投与モデルを用いた腸管神経系発生の検討のために重要な結果であると考えている。今年度は腸管神経系の発生に関わるRET-GDNF経路に焦点を絞り、本疾患での排便機能障害に腸管神経系の発生異常がかかわる可能性について解析を行った。現状では影響することが明らかな結果が得られていないが、さらに詳細に調べることで有意な結論が得られるものと考えている。また、当初の計画で用いる予定だった先天性二分脊椎症マウスを用いる検討より、レチノイン酸過剰投与によるモデルマウス作製での検討に変更している。理由として、本疾患による排便機能障害の機序を調べる上で、まず先に簡便に作製可能なレチノイン酸誘導モデルマウスを用いて概要を検討することが必要であると判断した。セマフォリン3A(sema3A)は近年の報告で、虚血再灌流腎臓障害モデルにおいて早期に上昇することが報告されている。一方、腸管の虚血再灌流障害における神経系の変化に関する報告は極めて少ない。今年度においてはこのsema3Aに焦点を絞り、腸管グリア細胞マーカーであるSox10遺伝子に蛍光緑色タンパクVenusを標識したSox10-Venusトランスジェニックマウスを使用した腸管の虚血再灌流実験を行い、腸管神経系の変化とsema3Aの発現の関連を評価した。方法は、Sox10-Venusマウスの回腸を使用し3時間の虚血を生じさせた。その後、閉塞解除し再灌流後0, 3, 12, 24, 48, 96時間で検体を採取して抗sema3A抗体を用いて免疫染色を施行、画像解析ソフトにより発現輝度と面積を算出し発現量とした。

また神経細胞はPGP9.5陽性細胞数を評価した。グリア細胞はSox10の陽性細胞数を評価した。結果としてsema3Aは、再灌流後3,12時間の群において著明な上昇が認められた。その後は徐々に発現の低下を認め96時間の時点では、コントロールと同程度まで低下を認めた。Sox10に関しては、0, 3, 12時間の群において発現の低下が認められた。また24時間以降の群においては徐々にSox10の発現の回復を認め、96時間の群においても顕著に観察された。一方でPGP9.5に関しては細胞数が低下する傾向を認めるも、有意な差は認められなかった。以上の結果より、sema3AとSox10はいずれも再灌流障害後、早期に反応が認められ、腸管虚血再灌流障害との関連性が示唆された。またPGP9.5に関しては有意差が認められず、グリア細胞に比べ神経細胞の変化が乏しいことも同様に観察された。sema3Aが腸管虚血再灌流障害のバイオマーカーとして有用である可能性が示唆された。二分脊椎症モデルマウスを用いた組織学的検討により腸管神経系の分布異常を見出し、その腸管ではグリア細胞由来神経栄養因子GDNFの発現の変化を観察し得た。また腸管神経系の修復に関連する因子を見出すための腸管虚血再灌流実験では、再灌流後の腸管グリア細胞の増減と反発性軸索ガイダンス分子セマフォリン3Aの関連が示唆される結果を得た。二分脊椎症における排便機能障害については様々な原因が報告がされている。今回の検討では実際に神経堤細胞や末梢神経が直接蛍光タンパクで標識されたモデルマウスを作製し、形態学的観察を行ったことで実際に腸管神経系の異常を観察しえた。この腸管神経系の異常をヒルシュスプルング病のようなほかの排便機能障害を伴う疾患と腸管神経系にどのような形態学的な違いがあるかは検討する余地があるが、鎖肛を伴う二分脊椎症においての腸管神経系の異常を改めて示すことができたことは臨床的にも有用な結果であると考えている。今後の研究課題の方針は、1RET-GDNFが影響するか否かの詳細の検討(GDNFの定量評価を行うことを計画している。)2他の腸管神経系の発生に関わる因子の影響3先天性モデルマウスを用いた治療効果などを検討する予定である。小児外科学次年度においては、Pax3ノックアウトマウスを用いて、さらに特異的に二分脊椎症を発症するモデルマウスの作製と、排尿障害の原因について、今年度同様末梢神経が直接観察できるモデルマウスを作製し形態学的解析を行う予定である。
COMT不全がもたらす健康被害の分子機構解明

申請者は妊娠高血圧腎症の遺伝子改変モデル動物を世界で初めて報告し、catechol-o-methyltransferase(COMT)不全を介したカテコール代謝異常がその原因であることを解明した。妊娠高血圧腎症とメタボリックシンドローム(Mets)は臨床的な共通点が多い。そこで、申請者はCOMT不全と結果としてのカテコール代謝不全が妊娠高血圧のみならず、メタボリックシンドロームの共通の分子機構と仮説し検討を行った。本検討では、Metsの主たる症状のうち、高血圧と耐糖能異常に関してはCOMT不全及び結果としての2-methoxyestradiol欠乏がその発症に寄与することが明らかとなった。(背景)申請者は妊娠高血圧腎症の遺伝子改変モデル動物を初めて報告し、catechol-o-methyltransferase(COMT)不全を介したカテコール代謝異常がその原因であることを解明した(Nature 2008 Kanasaki et al)。妊娠高血圧腎症とメタボリックシンドロームは病態における類似点が多い。妊娠時インスリン抵抗性を有する症例は、血糖が正常でもその後妊娠高血圧腎症発症リスクが高い、また妊娠高血圧腎症症例においてはその後の人生における糖尿病発症リスクが2倍程度高い。低COMT酵素活性遺伝子多型と妊娠高血圧腎症、高血圧、糖代謝異常、急性冠症候群との関連も報告された。そこでCOMT不全がメタボリックシンドローム・妊娠高血圧腎症に共通の分子機構であると仮説し、COMT不全がメタボリックシンドロームの病態において演じる役割を網羅的に解析する事を試みた。現時点では、COMT不全は高脂肪食や様々なストレスで惹起されうること、COMT不全の結果としての健康被害は、妊娠高血圧腎症のみならず、耐糖能異常や高血圧の分子機構において重要な役割を演じること、そのCOMT不全による健康被害は、ほとんどがCOMT不全の結果としてのcatechol代謝不全に伴うメトキシ化合物の欠乏(その中でも特に2-methoxyestradiol)に起因する可能性が示唆されている。現在更に詳細な分子機構を検討中である。「COMT不全が妊娠高血圧腎症-メタボリックシンドロームに共通の病態である」という仮説に関して、次の結果を得ている------ 1高脂肪食投与(10週)C57BL6マウスにおいて、COMT蛋白発現が有意に抑制。2-ME(高脂肪食投与6週後より4週間)は、耐糖能-脂肪肝を改善。22-MEによる耐糖能改善効果は、肝臓AMPKリン酸化と関連。3metforminを投与すると肝臓COMT蛋白が増加。metformin投与による肝臓AMPKリン酸化はCOMT阻害薬投与により抑制。4COMT siRNA投与でも高脂肪食投与マウスの耐糖能が悪化。52週間高脂肪食摂取マウスにおける2-MEによる血糖低下は、インスリン分泌増加と関連;10週高脂肪食摂取に対する4週間2-ME慢性投与では血中インスリンレベルは低下し、インスリン抵抗性が改善。6MIN-6細胞を用いて行ったin vitro検討では、2-MEによりインスリン分泌量が増加。7妊娠マウスでは、肝臓COMT蛋白発現が低下。妊娠マウスに対するCOMT阻害薬投与によりインスリン抵抗性が増加、2-ME投与はインスリン抵抗性を改善する事によりCOMT阻害薬投与による耐糖能悪化を改善。8COMT阻害薬投与によりアンギオテンシンIIに対する昇圧感受性が亢進し、2-ME投与によりその昇圧反応は抑制。2-MEの前駆物質(2-hydroxyestradiol: COMTの基質)投与ではその効果は得られない。上記結果からCOMTが様々な環境因子により発現が低下する蛋白である事、その是正が妊娠高血圧腎症-メタボリックシンドロームに共通の分子標的である可能性が示唆された。2-methoxyestradiol (2-ME)の代謝改善効果は概ねAMPK活性化にあることを昨年までに突き止めていたが、なぜ2-MEによりインスリン分泌が増加するのかその分子機構は明らかにできていなかった。今年度の検討で、2-MEによるbeta細胞からのインスリン分泌増加の分子機序には、AMPKは活性化そのものでは十分ではなく、beta細胞の生存シグナルであるPDXのリン酸化増加とMST1抑制が重要であることを明らかとした。また、COMT/2-ME不全がangiotensin IIに対する昇圧感受性を上昇させることに関して、そもそもCOMT阻害薬投与/COMT siRNA投与されたマウスではベースの血中angiotensin II濃度が低いことが明らかとなり、angiotensin II刺激のない状況においてもCOMT不全が内因性angiotensin IIに対しても感受性を高めており、angiotensin II抑制により恒常性を維持している可能性を明らかとした。「COMT不全が妊娠高血圧腎症-メタボリックシンドロームに共通の病態である」という仮説に関して以下を明らかとした。1高脂肪食投与C57BL6マウスで、COMT蛋白発現が有意に抑制。2-MEは、耐糖能-脂肪肝を改善。42週間高脂肪食摂取マウスにおける2-MEによる血糖低下は、インスリン分泌増加と関連;10週高脂肪食摂取に対する4週間2-ME慢性投与では血中インスリンレベルは低下し、インスリン抵抗性が改善。5MIN-6細胞を用いて行ったin vitro検討では、2-MEによりインスリン分泌量が増加。6MIN-6細胞における2-MEによるインスリン

分泌増加の機序にはbeta細胞の生存に関わるPDX1の活性化とアポトーシス誘導因子であるMST1の抑制が重要であり、AMPKのリン酸化は2-MEによるインスリン分泌機序において必要ではあっても十分ではなかった。7COMT阻害薬投与によりアンギオテンシンIIに対する昇圧感受性が亢進し、2-ME投与によりその昇圧反応は抑制。2-MEの前駆物質(2-hydroxyestradiol: COMTの基質)投与ではその効果は得られない。8COMT阻害薬投与によりアンギオテンシンIIに対する昇圧感受性が亢進は2-MEによるアンジオテンシンII 1型受容体発現の抑制効果の欠如に起因していた。92-MEは内因性PPAR-gamma活性を有していることが明らかとなり、COMT阻害薬投与マウスでは血中PPAR-gammma活性が低下していた。102-MEのPPAR-gamma活性は、2-MEによるアンジオテンシンII 1型受容体発現の抑制効果に必須であった。申請者は妊娠高血圧腎症の遺伝子改変モデル動物を世界で初めて報告し、catechol-o-methyltransferase(COMT)不全を介したカテコール代謝異常がその原因であることを解明した。妊娠高血圧腎症とメタボリックシンドローム(Mets)は臨床的な共通点が多い。そこで、申請者はCOMT不全と結果としてのカテコール代謝不全が妊娠高血圧のみならず、メタボリックシンドロームの共通の分子機構と仮説し検討を行った。本検討では、Metsの主たる症状のうち、高血圧と耐糖能異常に関してはCOMT不全及び結果としての2-methoxyestradiol欠乏がその発症に寄与することが明らかとなった。現時点では、COMTsiRNA投与実験も当初予想より効果的に実施できており、COMT阻害薬と同様の結果が得られている。雄マウスにおけるCOMT発現は肝臓に非常に高いことが明らかとなり、COMTsiRNA投与により肝臓COMT蛋白の有意な抑制が確認できた。しかしながら興味深いことに、肝臓ではCOMT蛋白が抑制されているにもかかわらず、他臓器ではむしろ増加している臓器もあり、1)肝臓COMT不全が耐糖能異常惹起などに重要なこと、2)肝臓におけるCOMT不全が、何らかの可溶性分子を介して多臓器におけるCOMTを制御する可能性、が示唆された。また、AMPKの肝臓における特異的ノックアウト実験を予定していたが、このようにsiRNA投与により効率的な肝臓における蛋白抑制が可能な現実を鑑みると、siRNA投与実験が1)慢性的抑制でなく、代償経路の活性化を考える必要が少ないこと、2)動物舎管理の問題、などからしてアドバンテージが有ると考えられ、現在検討中。
自然地震を用いたマグマ溜りの逆VSP探査とホログラフィー

桜島に於いて、予定通り広帯域地震観測と短周期地震計のアレイ観測を同時期に行った。観測期間中に桜島火山の爆発を50個程度収録した。さらに、数多くの遠地地震を収録する事ができた。このデータを基にして、いわゆるホログラフィー的手法により火山の地下構造を推定出来るのではないかと現在解析を行っている。アレイ設置期間にも、幸い一つの爆発を収録することが出来た。爆発は桜島火山の火口直下の火道内で起きていると考えられるので、この爆発を地上のアレイで観測された波形を使って物理探査の方で行われている、いわゆる逆VSP法的処理を行ってマグマ溜まりからの反射波などを検出出来る可能性がある。現在、そのための補助的解析として、センブランス法やその他のアレイ解析手法で解析を行っている。それによると、爆発の後の後続波の多くは火口の方向から来ていることがわかった。反射面を検出するに当たっては、この火口方向からくる波の影響をいかに除去するかが決めてとなり、そのための解析手法を新たに開発する必要が出てきた。当初全く予想していなかったことであるが、観測期間中に不思議な長周期(10秒)の波がしばしば見られた。いろいろ調べた結果、阿蘇山の活動が起源の長周期波がでており、西南日本の広くの場所に設置してある地震計で観測されていることがわかった。この波の原因を追究するために、今度は阿蘇山に於いて多点の広帯域地震観測を行うことが望ましく、平成6年度開始の科学研究費補助金を申請中である。
ウイルスの体内伝播様式と蔵器向性を決定する宿主プロテア-ゼの研究

大多数の被膜ウイルスにおいて、ゲノムの細胞への侵入は宿主細胞膜との融合により行われ、この活性を担うF糖蛋白は非活性前駆体から宿主プロテア-ゼによる限定切断を経て形成される。この限定切断が限られた組織でのみ起こるか、全身諸組織で起こるかは、基質切断部位の構造の違いに依存し、かつ、ウイルストロピズムを決定する一大要因である。また、各種生理的プロ蛋白質との間に見られる切断部位の構造モチ-フの著しい共通性は、細胞生物学的にも注目される。しかし、切断酵素そのものの解明が殆ど進んでいないのが現状である。我々はこの種の生体酵素の最初の例として、センダイウイルスなどを活性化する酵素をニワトリ胚から単離、精製し以下の結論を得た。本酵素は、33kdと23kdのサブユニッとからなり、中性至適phを示すカルシウム依存性セリンプロテア-ゼであり、ビタミンK依存性蛋白であるプロスロンビンファミリ-と高い相同性を示し、血液凝固第十因子そのものであることが強く示唆された。33kdサブユニットにはプロテア-ゼ活性ドメイン、23kdサブユニットにはγカルボキシグルタミン酸(Gla)残基を持つカルシウム結合ドメインが存在すると推定された。我々はさらに本酵素のcDNAと抗体を作出しニワトリ胚組織での発現の検討を作っている。これまでのところ、胚内でのウイルストロピズムは本酵素の異所性発現のみに依存していることを示唆する結果を得ている。パラミクソウイルス膜融合蛋白の非活性型前駆体を特異的開裂により活性化する宿主プロテア-ゼを単離精製することが本年度計画の中心であった。ニワトリ胚からセンダイウイルス、ニュ-カッスル病ウイルスの他に、ミクソウイルスに属するヒトインフルエンザウイルスAの膜融合蛋白の、単一アルギニン開裂サイトを切るプロテア-ゼをハイドロキシアパタイトへの吸着と溶出、Mono Q FPLC、セファクリルS200ゲル濾過を主たる方法として用いて単離精製した。その結果、(1)本酵素は33kDと23kDのサブユニットから成る55kDのヘテロダイマ-のセリンプロテア-ゼであり、(2)活性基は33kD鎖にあり、23kD鎖はγカルボキシグルタミン酸をもつCa^<2+>結合ドメインを有することが明らかとなった。(3)両鎖のN端アミノ酸配列の結果、本酵素は、ビタミンK依存性のプロスロンビン族と高い相同性があり、とくにそのうちでも、血液凝固第10因子と酷似していた。実際にも、ニワトリ血漿から単離した第10因子との直接比較においても、両者は同一分子であることが示唆された。更に、(4)本酵素は、試験管内において、従来用いられてきたトリプシンと比べ、さらに高い効率と特異性をもって、ウイルス活性化反応を行うことか判明した。ウイルスの体内伝播と臓器向性の決定に膜融合蛋白質を開裂活性化する酵素が重要な鍵を握るとされて久しい。本研究によりはじめて、その一例が示されたことになる。今後、ヒトやマウスの上気道などの自然宿主における開裂活性化酵素が何であるかを決める必要がある。大多数の被膜ウイルスにおいて、ゲノムの細胞への浸入は宿主細胞膜との融合により行われ、この活性を担うF糖蛋白は非活性前駆体から宿主プロテア-ゼによる限定切断を経て形成される。

本酵素は、33Kdと23Kdのサブユニットからなり、中性至適pHを示すカルシウム依存性セリンプロテア-ゼであり、ビタミンK依存性蛋白であるプロスロンビンファミリ-と高い相同性を示し、血液凝固第十因子そのものであることが強く示唆された。33Kdサブユニットにはプロテア-ゼ活性ドメイン、23Kdサブユニットにはγカルボキシグルタミン酸(Gla)残基を持つカルシウム結合ドメインが存在すると推定された。我々はさらに本酵素のcDNAと抗体を作出しニワトリ胚組織での発現の検討を作っている。これまでのところ、胚内でのウイルストロピズムは本酵素の異所性発現のみに依存していることを示唆する結果を得ている。
扁桃体のストレス反応に性差はあるか-小ケージ居住型のストレス反応を指標として

ストレスに曝露されると生体には様々なストレス反応が生じる。内分泌性のストレス反応として,副腎皮質ホルモン(CS)分泌反応がよく知られているが、脳内においても様々な神経性のストレス反応が見られる。雌雄のラットを用いてin vivoマイクロダイアリシス法により検討したところ、平成14年度は拘束ストレス後に見られる海馬体内アセチルコリン(ACh)分泌反応は、雄性が雌性より大であること、また、扁桃体内ドーパミン分泌反応とセロトニン分泌反応は、雌性が雄性より大であることを初めて確認した。また、平成15度は二週間以上前に性腺摘除を行った雌雄のラットを用い、性腺ステロイドホルモンが拘束ストレス後に見られる海馬体内ACh分泌反応にどの様な役割を持つのかについて解析した。雌雄共に、性腺摘除は海馬体内ACh分泌反応を強く減弱したが、卵巣摘除ラットへのエストロジェン処置や精巣摘除ラットへのテストステロン処置により、海馬体内ACh分泌反応が回復することを見いだした。以上より、海馬体内ACh分泌反応の維持には、性腺ステロイドホルモンが必要不可欠であることが明らかとなった。小ケージ居住型のストレスが雌雄のラットにどの様な影響を持つのかについても解析を進めた。通常の円筒型飼育ケージ(直径35cm)または小ケージ(直径19cm)で4日間飼育し、24時間の海馬体内ACh分泌動態、血中CS濃度への影響を検討した。血中CS濃度には、小ケージ飼育による影響は雌雄共に見られなかった。一方、通常の大ケージ飼育では雌雄共に海馬体内ACh分泌は明期に低く、暗期に高い日内変動を示したが、明期に対する暗期の増加率は、雄性においてのみ低下した。以上より、小ケージ居住型のストレスは、雌雄の血中CS濃度とその日内変動には影響しないが、雄性ラットの海馬体内ACh分泌動態に強く影響することが明らかとなった。生体に見られる内分泌性のストレス反応として、副腎皮質ホルモン(CS)分泌反応がよく知られているが、脳内においても様々なストレス反応が見られる。本研究では雌雄のラットを用い、CS分泌反応における性差を確認すると共に、脳内ストレス反応の性差の有無を明らかにする。通常の円筒型飼育ケージ(直径35cm)でラットを飼育し、in vivoマイクロダイアリシス法を用いて検討したところ、雌雄共に緊縛ストレス直後に海馬体内アセチルコリン(ACh)分泌量が速やかに増加した後、徐々に低下したが、雌性ラットにおけるACh分泌反応は、雄性ラットよりも小さいことが判明し、一方、CS分泌反応は雄性よりも雌性で大きく、これらストレス反応の性差が明らかとなった。また、環境因子がこれらストレス反応の性差に及ぼす影響を検討するため、雌雄のラットを4日間小ケージ(直径19cm)で飼育し、同様に上記のストレス反応について検討した。その結果、小ケージ飼育は雄性ラットにおけるACh分泌反応を減弱させたが、雌性ラットにおけるACh分泌反応には影響せず、小ケージ型のストレス反応にも性差が認められることも判明した。緊縛ストレスが、扁桃体外側基底部におけるドーパミン(DA)分泌やセロトニン(5HT)分泌に及ぼす影響やその性差についても、通常の円筒型飼育ケージ(直径35cm)でラットを飼育し、in vivoマイクロダイアリシス法を用いて検討した。

その結果、DAについては、緊縛前の値と比べ、雄性ラットでは緊縛中、緊縛後に渡り有意な分泌反応が認められなかったが、雌性ラットでは緊縛開始直後より分泌が上昇して、緊縛解放までに分泌は速やかに低下して、明確なDA分泌反応が認められることが判明した。また、緊縛ストレスへの5HT分泌反応は、雌雄共に認められた。緊縛開始直後より5HT分泌が上昇し、緊縛解放後には5HT分泌が低下したが、雌性でより強い5HT分泌反応が認められることが明らかになった。ストレスに曝露されると生体には様々なストレス反応が生じる。内分泌性のストレス反応として、副腎皮質ホルモン(CS)分泌反応がよく知られているが、脳内においても様々な神経性のストレス反応が見られる。昨年度は拘束ストレス後に見られる海馬体内におけるアセチルコリン(ACh)分泌反応や、扁桃体内ドーパミン分泌反応とセロトニン分泌反応に性差が見られることを初めて確認した。今年度は二週間以上前に性腺摘除を行った雌雄のラットを用い、性腺ステロイドホルモンが拘束ストレス後に見られる海馬体内ACh分泌反応にどの様な役割を持つのかについて、in vivoマイクロダイアリシス法により解析した。雌雄共に、性腺摘除は海馬体内ACh分泌反応を強く減弱したが、卵巣摘除ラットへのエストロジェン処置や精巣摘除ラットへのテストステロン処置により、海馬体内ACh分泌反応が回復することを見いだした。以上より、海馬体内ACh分泌反応の維持には、性腺ステロイドホルモンが必要不可欠であることが明らかとなった。また、小ケージ居住型のストレスが雌雄のラットにどの様な影響を持つのかについても解析を進めた。通常の円筒型飼育ケージ(直径35cm)または小ケージ(直径19cm)で4日間飼育し、24時間の海馬体内ACh分泌動態、血中CS濃度への影響を検討した。血中CS濃度には、小ケージ飼育による影響は雌雄共に見られなかった。一方、通常の大ケージ飼育では雌雄共に海馬体内ACh分泌は明期に低く、暗期に高い日内変動を示したが、明期に対する暗期の増加率は、雄性においてのみ低下した。以上より、小ケージ居住型のストレスは、雌雄の血中CS濃度とその日内変動には影響しないが、雄性ラットの海馬体内ACh分泌動態に、特に強く影響することが明らかになった。
大スパン空間構造物の耐震性能診断法と改修・補強法に関する調査研究

計画実績の概要は下記の通りである。(1)共同調査と研究会開催1)日本建築学会構造委員会シェル空間構造運営委員会のメンバーの中から同運営委員会傘下の小委員会主査を中心として約20名の共同研究グループを構成し、当該の研究課題の調査に当たった。メンバーの殆どは各地域で学校体育館などの大スパン建築物の耐震診断と耐震改修の評定に加わった経験も持つほか、実施設計に携わった経験を持つ民間技術者もこの研究会に参加した。2)上記の研究グループのメンバーが参加しての研究会を2006年7月と2007年1月の2回行った。1回目には耐震診断・改修を手がけている民間技術者の診断・改修の経験に基づく現状報告と建築研究所の技術者による体育館の地震被害と診断・改修の問題点について報告を受け、意見交換を行った。また、2回目には体育館などの大スパン建築物の耐震設計・診断・改修の現状の問題点について、大学研究者による研究発表を行い、これに基づいて今後の体育館などの建築物の耐震設計・診断・改修のあるべき方向性について検討を行った。(2)調査結果の分析(1)の結果を受けて、体育館建築で実際に耐震診断・改修を受けた建物のデータに基づいて動的弾塑性構造解析を行い、「屋内運動場等の耐震性能診断基準・平成18年度版(文部科学省文教施設企画部編)」に示されている、略算法ならびに精算法による結果とを比較検討した。その結果、略算法、精算法のいずれの手法にも適用が適切な体育館の規模と構造形式があること、通常行われている屋根面の水平剛性確保の方法が過大補強となる場合があることなどが明らかになり、今後の研究に委ねられるべきいくつかの問題点が明らかとなった。
地震波干渉法の理論的背景に関する研究と浅層地盤探査への応用

従来の地震学においては,地球内部の不均質構造により生成される多重散乱波は「ノイズ」として除去されることが多かった.しかし近年,地震波干渉法と呼ばれる手法が出現して以降,これらは「ノイズ」ではなく極めて有益な「信号」であることが理解されつつある.本研究では,多重散乱波と地震波干渉法に関する基礎的な理解を深めるとともに,それを用いた浅層地盤構造の推定手法の構築と適用,さらに地盤構造の時間変化の検出に成功し,多重散乱波と地震波干渉法の有効性を一層高めることができた.従来の地震学においては,地球内部の不均質構造により生成される多重散乱波は「ノイズ」として除去されることが多かった.しかし近年,地震波干渉法と呼ばれる手法が出現して以降,これらは「ノイズ」ではなく極めて有益な「信号」であることが理解されつつある.本研究では,多重散乱波と地震波干渉法に関する基礎的な理解を深めるとともに,それを用いた浅層地盤構造の推定手法の構築と適用,さらに地盤構造の時間変化の検出に成功し,多重散乱波と地震波干渉法の有効性を一層高めることができた.本研究では,常時微動や地震コーダ波の相互相関解析や自己相関解析(地震波干渉法)により,強震動評価に重要な浅層地盤構造の新しい推定手法の構築を目指し,理論的証明とデータ解析を行うことを目的としている.今年度は以下の課題を実施した.・地震波干渉法が厳密に成立するには,場がエネルギー等分配状態を満たす必要がある.エネルギー等分配が成立しているかどうかを確認するため,近似的ではあるが簡便な手法として,ひとつの観測点における地震波形の上下・東西・南北の3成分へのエネルギー分配(粒子軌跡)を用いる手法を提案した.・宮城県牡鹿半島において,口径約500m,平均間隔約150mの7台の強震計からなる稠密アレイ観測を継続した.・アレイの観測点間での地震波形の相関(類似性)を表すセンブランスという指標があり,従来は1成分のデータにしか適用できなかったが,近年3成分データにも適用できる指標が発表された.研究代表者は,数値シミュレーションにより,この指標を牡鹿半島のアレイデータに適用できるかどうかを検討した.その結果, 3成分を用いた指標は,従来の指標よりも安定していることが明らかになった。宮城県牡鹿半島において,口径約500m,平均間隔約150mの7台の強震計からなる稠密アレイ観測を実施しているが,本年度も継続して実施し,良質の地震観測記録が蓄積された.しかし,実施計画に記したように,それらの記録に地震波干渉法を適用してグリーン関数を抽出するまでには至らなかった.実施計画の通り,Kik-netデータに干渉法を適用することを念頭に入れ,それに即した地震波干渉法の理論モデルの構築を試みた.具体的には,水平成層構造の地表と地中にある観測点に,スカラー(SH)平面波が斜め下方から入射する場合の証明を行った.その結果,2観測点間の波動場の相互相関関数の時間積分が,グリーン関数と震源時間関数との畳みこみに比例することが明らかになった.その際,スローネスが帯域制限されること,鉛直方向のスローネスが重みとしてかかることが重要である.この研究により,Nakahara(2006, Geophys. J. Int.)による鉛直下方入射の場合の証明を拡張できたことになる.地震波干渉法の成立条件として,エネルギー等分配あるいはエネルギーの安定化と呼ばれる状態がある.どの程度の時間でこの状態へ遷移するのかについて,実施計画の通り,近地地震の波形記録の粒子軌跡を用いて検討した.その結果,直達S波走時の1.5倍程度の経過時間でエネルギーの安定化に達していることが明らかになった.今後,このエネルギー安定化状態は,浅部地盤の地震波速度構造の推定に利用できるものと考えている.実施計画には記していないが,微動の連続記録に地震波干渉法を適用することにより,浅部地盤構造の時間変化を常時監視する手法を,2004年新潟県中越地震の震源域付近にある6観測点に適用した.その結果,本震の発生に伴い,全観測点で,最大0.5%程度の地震波速度低下が検出された.その要因としては,強震動による浅部地盤の損傷や断層運動による周囲の破砕などが考えられる.この成果は,アメリカ地球物理学会誌に掲載された.・宮城県牡鹿半島において,口径約500m,平均間隔約150mの7台の強震計からなる稠密アレイ観測を継続し,データを収集した.地震波干渉法による地盤構造推定について着手した.・地震波干渉法の成立条件にかかわるエネルギー等分配について,近地地震の波形記録の粒子軌跡を用いて検討した.その結果,直達S波走時の1.5倍程度の経過時間で粒子軌跡が安定化していることが明らかになった.また粒子軌跡は,水平成層構造における表面波,実体波を含めたエネルギー等分配を仮定した理論計算により,うまく説明できることが分かった.これは地震コーダ波において,エネルギー等分配が成立していると考えてもよいことを意味する.・2005年福岡県西方沖地震の震源域における1観測点の微動データに地震波干渉法を適用し,観測点周辺の地震波速度が本震に伴って約1.5%低下したことを発見した.

その要因としては,強震動による浅部地盤の損傷が考えられる.以下の2つの成果は,当初の研究実施計画になかったものである.・2次元無限等方散乱媒質において,等方震源からのP波,S波のエネルギー伝播を輻射伝達理論に基づき定式化した.直達項と1次散乱項は解析的に,2次以上の多重散乱項は数値計算で評価できる.この定式化を用いて,エネルギー等分配の証拠となるP波,S波のエネルギー平衡を考察した.その結果,ポアッソン媒質における平衡状態でS波エネルギーはP波の3倍となること,遷移時間はP波とS波の変換散乱係数に依存することが明らかになった.・地震波エンベロープの統計的ゆらぎが仲上m分布に従うことが近年明らかになった.そこで,エンベロープ振幅のゆらぎを特徴づけるm値を,最尤法により推定する手法を新たに開発した.またその手法を近地地震のコーダ波に適用することにより,m値は平均として1であることを初めて発見した.
肺サーファクタント蛋白質とトル様受容体を利用した呼吸器の生体防御システム

本研究は、肺コレクチンのサーファクタント蛋白質(SP-AとSP-D)およびToll様受容体(TLR)による感染防御と炎症制御の機構を解明し、これらの蛋白質分子を利用した病態肺治療への応用を目指してその基盤確立を目的として遂行されている。以下に研究成果を要約する。1.SP-AとSP-DがTLR2とTLR4、および、MD-2に結合することを見いだした。特に、SP-AはTLR4/MD-2発現細胞に対するsmooth LPSの結合を阻止し、LPS惹起炎症を抑制した。SP-Aの機能ドメインは糖鎖認識領域(CRD)であるが、コラーゲン様領域を除去したCRF(collagenase-resistant fragment)は、TLR4に対する結合親和性が著明に低下しており、LPS惹起炎症抑制効果も認められなかったので、18量体からなるSP-Aの多量体構造が機能発現に重要であることが示された。SP-DもLPS惹起炎症反応を挿制することが示されたが、SP-Aと異なり、血清型の異なるsmooth LPSとrough LPS両者の惹起する炎症を抑制した。SP-A/SP-Dキメラ体による検討から、SP-Dの炎症抑制機能の発現には長いコラーゲン様領域を有するSPのの十字架様構造が重要であることが示された。2.TLR4N末端側のGlu24-Lys47領域がMD-2結合部位であることを明らかにした。また、組換え可溶型TLR4蛋白質(sTLR4)と可溶型MD-2(sMD-2)がエンドトキシン惹起肺炎症を抑制できることをマウスモデルを用いて証明した。4.SP-AとSP-Dは非定型抗酸菌(M.avium)に結合し、菌体の凝集を惹起することを見いだした。SP-Dの方がより強い凝集活性を示した。M.avium結合におけるSP-Dのリガンドはリポアラビノマンナン(LAM)であるが、SP-AのリガンドはLAM以外の脂質画分に存在するとことが明らかとなった。本研究は、肺サーファクタント蛋白質AとD (SP-AとSP-D)およびTol1様受容体(TLR)による感染防御と炎症制御の機構を解明し、これらの蛋白質分子を利用した病態肺治療法の基盤の確立を目的として遂行されている。以下に、本年度の研究成果を要約する。1.SP-AとSP-Dが、ともに、TLR2とTLR4の細胞外ドメインに蛋白質問相互作用によって結合することを明らかにした。特にSP-AはTLR4/MD-2発現細胞に対するsmooth LPSの結合を阻止し、LPS惹起細胞応答を抑制した。2.SP-Aのコラーゲン様構造に着目し、コラーゲン様領域に存在するGly-X-Y繰り返しの中断(kink)のないコラーゲン様領域を持つSP-A cDNAを作成し、組換え蛋白質を発現させて、ロータリーシャドウ法による電子顕微鏡で観察したところ、このSP-Aは花束様構造(Y構造)をとらず、bendを持たないV字型の18量体を呈しており、リン脂質リポソームの凝集能が野生型に比較して低下していた。また、コラーゲン様領域を除去したSP-A (CRF : collagenase-resistant fragment)は、TLR4に対する結合親和性が600倍低下しており、LPS惹起炎症抑制効果もほとんど認められなかった。

以上の結果は、SP-Aのコラーゲン様領域がその機能発現にきわめて重要であることを示している。3.TLR4細胞外ドメインのN末端側に着目し、TLR4 Glu24-Lys47領域に相当する合成ペプチド(TLR4ペプチド)を作成し、組換え可溶型MD-2(sMD-2)に対する結合性を調べたところ、TLR4ペプチドはMD-2に濃度依存性に結合し、組換え可溶型TLR4細胞外ドメイン(sTLR4)とsMD-2との結合を阻止した。さらに、TLR4ペプチドは、TLR4トランスフェクト細胞でのLPS惹起NF-kappaB活性化とIL-8分泌を有意に抑制した。以上の結果は、TLR4細胞外ドメインN末端側のGlu24-Lys47領域がMD-2結合部位であることを示している。5.LPSのマウスへの経気管内投与によるエンドトキシン惹起肺炎症モデルで、LPSと同時にsTLR4/sMD-2を投与すると、LPS惹起肺炎症で認められていた肺組織の出血、細胞浸潤が消失し、ほぼ正常肺の組織像となった。また、マウスのBALF中の好中球数とTNF-alpha濃度は、sTLR4/sMD-2の投与によって有意に抑制された。以上の結果は、これらの組換え蛋白がエンドトキシン惹起肺炎症の抑制に応用可能であることを示している。肺コレクチンのサーファクタント蛋白質(SP-AとSP-D)およびToll様受容体(TLR)による感染防御と炎症制御の機構を解明し、これらの蛋白質分子を利用した病態肺治療への応用を目指してその基盤確立を目的として遂行されている。以下に本年度の研究成果を要約する。1.SP-DがMD-2に結合することを見いだした。SP-D-MD-2相互作用は、カルシウム依存性で、SP-Dの糖鎖認識領域(CRD)を介することによるが、MD-2変異体およびグリコペプチダーゼF処理MD-2との結合性により、SP-Dは蛋白質間相互作用によってMD-2に結合することが明らかにされた。2.SP-Dは、肺胞マクロファージからのLPS惹起TNF-alpha分泌を有意に抑制した。SP-Aと違って、異なるserotypeであるsmooth LPSとrough LPS両者の惹起する炎症反応を抑制した。N末端側とコラーゲン様ドメインをSP-Aと置換したSP-A/SP-Dキメラ体を用いた検討で、機能ドメインはSP-DのCRDであるが、SP-Dによるrough LPS惹起炎症反応抑制効果はSP-Dの十字架様多量体構造が重要であることが示された。この結果と一致して、ネック領域とCRDから成るコラゲナーゼ処理SP-D(CRF)は、MD-2とTLR4に対する結合親和性が低下しており、LPS惹起炎症抑制効果も著しく減弱していた。3.SP-AとSP-Dは、非定型抗酸菌(M. avium)に結合した。SP-Dの結合はリポアラビノマンナン(LAM)で抑制されたが、SP-Aの結合は抑制されなかったので、M. aviumにおけるSP-DのリガンドはLAMであるが、SP-AリガンドはLAM以外の分子であると考えられた。M. aviumの脂質抽出画分がSP-Aの結合を阻止したので、M. aviumの脂質がSP-Aのリガンドであると考えられる。また、肺コレクチンは、M. avium菌体の凝集活性も有していた。4.TLR4の変異体(TLR4C88A)は単独では複合型N型糖鎖を付加できず、細胞表面に発現できないが、MD-2存在下では細胞表面に発現し、LPSシグナルを伝達した。この結果は、MD-2がTLR4の細胞表面発現に重要であることを示しており、組換え可溶型MD-2の有用性が示唆された。
滑膜細胞におけるグルコサミンのターゲット分子の同定とその分子メカニズム

グルコサミン(GlcN)は、変形性関節症の症状緩和のためサプリメントとして使用され、それには滑膜炎症の抑制が関与すると考えられている。本研究では、GlcNの炎症抑制メカニズムについて検討した。GlcNは炎症性サイトカインIL-8の産生を抑制し、それには転写因子Sp1のO-N-アセチルグルコサミン(O-GlcNAc)修飾が関与することがわかった。そして、GlcNはSp1をO-GlcNAcすることで、その転写活性を低下し、また核内量を減少させる結果が得られた。したがってGlcNは、Sp1のO-GlcNAc修飾を介してIL-8産生を抑制することで抗炎症作用を発揮している可能性が推測された。本研究は、グルコサミンが抗炎症作用を発揮するメカニズムを調べるため、グルコサミンでおこるタンパク質の糖鎖付加[O-N-アセチルグルコサミン(O-GlcNAc)修飾)]に着目し研究を進めている。平成24年度は、滑膜細胞においてグルコサミンでO-GlcNAc修飾されるタンパク質の同定とその役割について検討し、以下の結果が得られた。1.滑膜細胞株MH7Aから、グルコサミンでO-GlcNAc修飾されるタンパク質が多数検出された。その中に炎症性サイトカイン遺伝子の転写を調節する転写因子Sp1が含まれていた。Sp1に着目しグルコサミンによる影響を調べると、グルコサミンは滑膜細胞におけるSp1発現量を約1.4倍増加し、Sp1のO-GlcNAc修飾を約1.7倍増加することがわかった。2.グルコサミンは炎症性サイトカインIL-8の遺伝子発現やタンパク産生を抑制したが、O-GlcNAc修飾阻害剤はグルコサミンによるIL-8産生の抑制作用を消失させた。またSp1阻害剤は滑膜細胞からのIL-8産生を抑制した。以上の結果から、グルコサミンはタンパク質のO-GlcNAc修飾を介して炎症惹起に関わるIL-8産生を抑制し、それにはSp1で制御される遺伝子の転写が関与している可能性が推測された。これまで多くのO-GlcNAc修飾タンパク質が同定されているが、グルコサミンでO-GlcNAc修飾されるタンパク質はほとんど知られていない。本研究では複数のO-GlcNAc修飾タンパク質を同定することができた。現在、Sp1に着目して研究を進めているが、ほかのO-GlcNAc修飾タンパク質もグルコサミンの作用発現に関与する可能性が考えられる。従って、本研究で同定されたO-GlcNAc修飾タンパク質は、グルコサミンの作用機序解明のための手掛かりになると思われる。本研究はグルコサミンによる変形性関節症(OA)の症状緩和作用メカニズムについて、グルコサミンで誘導されるタンパク質の糖鎖付加[O-N-アセチルグルコサミン(O-GlcNAc)修飾)]に着目し研究を進めている。そしてこれまでに、滑膜細胞においてグルコサミンは炎症惹起に関わる種々の炎症性サイトカイン産生を抑制すること、特にインターロイキン(IL)-8のmRNA発現およびタンパク産生の抑制は、グルコサミンによるSp1のO-GlcNAc修飾の亢進が関与することを報告した。平成25年度は、Sp1の機能がグルコサミンでおこるO-GlcNAc修飾によりどのように調節されているのか、その分子メカニズムを中心に検討した。滑膜細胞株MH7AをグルコサミンおよびO-GlcNAc修飾阻害剤で処理し、1Sp1のmRNA発現レベル、2Sp1タンパク質の発現レベル、3Sp1のDNA結合能、4Sp1の転写活性に影響を及ぼすcofactorとの結合および、5Sp1の細胞内局在を調べた。その結果、グルコサミンはSp1の細胞内局在に影響し核内Sp1量を減少させることがわかった。そしてこの作用はO-GlcNAc修飾阻害剤により消失した。したがって、グルコサミンは核内のSp1量をO-GlcNAc修飾することで減少させ、IL-8mRNAレベルやIL-8産生を抑制している可能性が推測された。グルコサミンは、変形性関節症(OA)の症状緩和作用をもつが、どのような機構でグルコサミンが働いているのか不明である。本研究ではグルコサミンによりおこるO-GlcNAc修飾されるタンパク質や、発現が影響される遺伝子を同定し、これら分子のOAにおける役割を調べることを目的としている。そして平成23年度は、以下の結果を得た。1)ヒト正常滑膜細胞、滑膜肉腫細胞株SW982および関節リウマチ患者滑膜細胞株MH7Aを用いて基礎検討を行った。

その結果、MH7A細胞をグルコサミン処理すると、再現性良く炎症性サイトカインIL-8の産生が低下し、タンパク質のO-GlcNAc修飾が増加した。そして、O-GlcNAc修飾阻害剤alloxanを併用すると、O-GlcNAc修飾の低下とともに、IL-8産生も回復した。従って以降の実験にMH7Aを用いた。2)MH7A細胞の遺伝子発現に対するグルコサミンとalloxanの影響をDNA-マイクロアレイで調べた。その結果、グルコサミンで2倍以上発現が上昇した遺伝子は53種類、1/2以下に減少した遺伝子が41種類あった。また、炎症性サイトカイン(IL-6、IL-8,、IL-24、TNF-α)や、炎症関連伝子の発現がグルコサミンで影響された。そしてalloxanの作用は遺伝子の種類により様々であった。3)グルコサミンによりO-GlcNAc修飾が増加するタンパク質を免疫沈降/SDS-PAGEで解析した。その結果、グルコサミンにより複数のタンパク質のO-GlcNAc修飾が増加した。現在、これらタンパク質を質量分析にて同定中である。今後、同定されたタンパク質がグルコサミンのOA改善作用にどう関与しているかを解明する。これまでの研究成果から、グルコサミンは、滑膜培養細胞において、転写因子Sp1の糖化修飾(O-N-アセチルグルコサミン修飾、O-GlcNAc修飾)を促進することで炎症性サイトカインIL-8の産生を抑制すること、そして、それには核内Sp1量の変化が関与していることを報告した。平成26年度はそのメカニズムについてさらに検討を加えた。まず、滑膜培養細胞MH7A細胞におけるSp1の細胞内局在を調べると、多くは核内に存在していた。そしてグルコサミン処理することで、核内のSp1量は減少したが、O-GlcNAc修飾を阻害するアロキサンは、グルコサミンの核内Sp1量の減少作用を消失した。Sp1は核ー細胞質間を移行することが知られているが、グルコサミンはこの移行には影響しなかった。次にSp1の分解に関わるプロテアソーム活性を調べると、グルコサミンは核内のプロテアソーム活性を幾分低下させた。さらに、Sp1の転写活性を調べると、グルコサミンは転写活性を抑制し、この抑制効果はアロキサンの前処理によって一部消失した。このようにグルコサミンは転写因子Sp1のO-GlcNAc修飾を亢進することで、核内のSp1量やその転写活性能を調節し、その結果、IL-8遺伝子の転写を抑制してIL-8産生量を低下させることが推測された。生化学平成24年度では、グルコサミンでO-GlcNAc修飾されるタンパク質の機能について滑膜細胞を用いたin vitro系で調べる計画を立てた。しかしグルコサミンでO-GlcNAc修飾されるタンパク質が数多く検出された。そのためいくつかのタンパク質を選び、O-GlcNAc修飾されることを確認した後、研究対象とするタンパク質を決定した。そのための確認実験に時間を要したため、いくぶん研究進度が遅れた。現在、滑膜細胞を用いてO-GlcNAc修飾タンパク質の発現を変化させた時の細胞機能の変化や、炎症刺激におけるO-GlcNAc修飾タンパク質の動態変化を検討中である。転写因子Sp1の機能に対するグルコサミンによるO-GlcNAc修飾の影響について、細胞・分子レベルで検討を進めている。研究を進めるには多種類の抗体を用いる必要があるが、その実験条件を確立するのに時間を要した。
敗血症診療体制樹立～地域特性を活かした敗血症診療ネットワーク構築からの試み～

本研究では、1)地域における敗血症診療の実態を明らかとし、2)この結果に基づき教育ツール・診療支援モジュール開発など地域での敗血症診療支援を行い、3)最終的に地域特性を加味した敗血症診療ネットワークを樹立し、敗血症診療の質を向上させることを目的としている。本研究は、これまでに解明されていなかった地域における敗血症診療の問題点を浮き彫りにするのみならず、敗血症診療の質向上のための一手法となり、新たなエビデンス発信に至るものと考えられる。