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要支援高齢者と地域の相互関係の構築に関する基礎的研究

本研究では、要援護高齢者が地域との相互関係を築くための一つの方法として、高齢者が生活の中で「役割」を実感できるケアを行うことが重要であると考えている。本年度は、昨年度の課題として挙がった、(1)高齢者と子どもが関わるインタージェネレーションケアについて、高齢者施設の種類・規模・接合状態別に、望ましい交流を考える、(2)子どもを媒介として施設と地域の関係を築く方法を考える、(3)施設側が地域にどのようにアプローチすべきかを考える、の3点の検証を行うために研究を遂行した。まず、(1)については、昨年度に行った高齢者の「役割」作りにつながるインタージェネレーションケアの調査結果を、学会論文として発表するために分析を行うなかで、一定の方向性を確認することができた。次に、(2)(3)については、全国共生セミナー、全国宅老所フォーラム、全国校区地域福祉サミット等に積極的に参加し、日本における先進事例の把握や直面している問題について把握することができた。そして、高齢者が役割を持ちながら最期まで地域で暮らし続けるための、各種施設やコミュニティの役割や可能性について考えることにつながった。さらに、日英米の高齢期の移住の理論と実践の把握および比較のためにイギリス訪問調査を行った。各国、移住を成功させるためには、移住先に高齢者の「役割」を準備しておくことが重要であると考えていることを確認した。そのなかで、日本では、移住先の「地域コミュニティ」「地域福祉」の充実が非常に重要であり、この点が他国と異なる点であることに気付いた。本年度の活動の結果、高齢者が「持続的」に地域と関わりを持つためには、地域のあらゆる方面からのサポートと連動が必要であることがわかった。今後、高齢者と地域の「持続的」な関係を築くために、特に、「地域コミュニティ」「地域福祉」「地域医療」の協同による地域計画について考えていく。本年度は、「地域社会【double arrow】要支援高齢者」の相互関係構築の可能性を探るための基礎的研究の一年目として、主に研究を発展させるための準備調査・研究を行った。研究実施計画では、本年度は入所施設で高齢者が担っている役割を明らかにすることを計画していた。しかし、地域と高齢者の相互関係を構築する術を模索するなかで、異なる方向からのアプローチが有効ではないかと思い、当初の計画とは若干異なる視点から研究を遂行した。高齢者が生活の中に役割をもって、地域との相互関係を築くためには、まず、住み慣れた地域で最期まで住みきることができる(1)住宅と(2)ケア(サービス)と(3)地域が必要であると考えた。それらの望ましい方向を探るために研究を行った。まず、(1)住宅については、スウェーデンの住宅改修政策を実地調査し、日本とは異なる住宅改修のシステムについて把握した。次に、(2)ケア(サービス)については、高齢者の食生活を支えるサービスを対象に検討を重ね報告した(立松麻衣子、他5名:社会福祉協議会による毎日型配食サービスの地域別検討と類型化-高齢者の食関連サービスのあり方に関する研究(第2報)、日本家政学会誌、印刷中)(第13回国際家政学会・アジア、ポスター発表「The Food Distribution Service by the Social Welfare Conference -A Life Support for the Elderly.」)。さらに、(3)地域については、平成18年4月から制度化される小規模多機能ホームについて、その出発点である宅老所の実地調査を行い、またセミナーやフォーラムに参加し、これからの地域居住の可能性について検討を深めた。来年度は(3)地域に絞り、地域居住について考える。本研究では、要援護高齢者が地域との相互関係を築くための一つの方法として、要援護高齢者が生活の中で「役割」を実感できるようなケアを行うことが重要であると考えている。本年度は、特に、要援護高齢者と子どもとの関わりを促すケアによって、要援護高齢者が「役割」を実感できるのではないかという視点で調査を行った。(1)独居高齢者へのコミュニティサポートによる「役割」構築について、(2)施設高齢者へのインタージェネレーションケアによる「役割」構築について、(3)アメリカにおけるインタージェネレーションケアの理論と実践について、を把握するために訪問調査を行った。訪問調査の結果、要援護高齢者の生活に「役割」を作るためのケアは、(1)高齢者が暮らしを継続するための活動を行う、(2)高齢者と介護者との対等な関係性を作る、(3)高齢者が面倒をみる相手を作る、(4)高齢者が次世代に文化を継承する機会を作る、(5)高齢者が気持ちを癒される相手を作る、(6)高齢者が地域で暮らしていると実感できる機会を作る、という内容に分類できた。そのなかでインタージェネレーションケアは(3)(6)の取り組みに該当した。本年度の調査において把握したインタージェネレーションケアでは、`計画性と継続性のある日常生活での交流'は、高齢者と子どもの関係性を作りやすくし、高齢者・子どもにとって継続的な効果があるように見受けられた。インタージェネレーションケアでは、子どもの存在によって、高齢者は孤独や退屈を感じない生活を送ることができたり、子どもに対する自らの役割を見出すことができたりする。また、子どもは高齢者との関わりによって、高齢者を尊敬する人や教えてくれる人、遊び相手や助ける相手と捉えるようになる。要援護高齢者と子どもとの関わりを促すケアは、要援護高齢者が「役割」を実感できる方法の一つとして有効であると考える。本研究では、要援護高齢者が地域との相互関係を築くための

一つの方法として、高齢者が生活の中で「役割」を実感できるケアを行うことが重要であると考えている。本年度は、昨年度の課題として挙がった、(1)高齢者と子どもが関わるインタージェネレーションケアについて、高齢者施設の種類・規模・接合状態別に、望ましい交流を考える、(2)子どもを媒介として施設と地域の関係を築く方法を考える、(3)施設側が地域にどのようにアプローチすべきかを考える、の3点の検証を行うために研究を遂行した。まず、(1)については、昨年度に行った高齢者の「役割」作りにつながるインタージェネレーションケアの調査結果を、学会論文として発表するために分析を行うなかで、一定の方向性を確認することができた。次に、(2)(3)については、全国共生セミナー、全国宅老所フォーラム、全国校区地域福祉サミット等に積極的に参加し、日本における先進事例の把握や直面している問題について把握することができた。そして、高齢者が役割を持ちながら最期まで地域で暮らし続けるための、各種施設やコミュニティの役割や可能性について考えることにつながった。さらに、日英米の高齢期の移住の理論と実践の把握および比較のためにイギリス訪問調査を行った。各国、移住を成功させるためには、移住先に高齢者の「役割」を準備しておくことが重要であると考えていることを確認した。そのなかで、日本では、移住先の「地域コミュニティ」「地域福祉」の充実が非常に重要であり、この点が他国と異なる点であることに気付いた。本年度の活動の結果、高齢者が「持続的」に地域と関わりを持つためには、地域のあらゆる方面からのサポートと連動が必要であることがわかった。今後、高齢者と地域の「持続的」な関係を築くために、特に、「地域コミュニティ」「地域福祉」「地域医療」の協同による地域計画について考えていく。
戦後における被差別部落表象の他のマイノリティとの比較史的研究

本研究は、戦後における部落問題のありようを、部落問題を主題として戦後に製作・上映された映画作品を用いて明らかにした。取りあげた作品は、「破戒」、「人間みな兄弟」、「橋のない川」、「人間の街」、「家族」である。それぞれの映画をめぐって展開された論争や批判のなかに、部落解放運動や同和行政などをとりまく矛盾が投影されており、大衆的基盤をもつ映画を取りあげることで、これまでの運動史や政策史では見えなかった問題を浮き彫りにすることが可能となる。被差別部落の自画像と他者像の相克に視点を当てながら、1945年から現在までを見通して論じた。当該年度は、「橋のない川」(今井正監督作品第1部1969年・第2部1970年、東陽一監督作品1991年)の分析を中心に行い、その成果を2008年12月に行われた京都大学国際シンポジウム「変化する人種イメージ-表象から考える」において報告した。それは、その映画作品をつうじて、<見えない人種>すなわち被差別部落の人びとの表象のあり方を考察しようとするものであり、その結果、以下の結論を導き出した。すなわち今井作品は、観客がいかなる「部落民」像を抱くかという点はとりあえずさておき、もっぱら部落差別の残酷さを強調することによって人種主義を克服するという展望に立っていたのに対し、部落解放同盟が主体となって新たに制作した東作品は、作品の受容者が人種主義にとらわれることのないように、〓あたりまえ〓の日常をおくる部落民という表象を意識的につくりだし、一方で現実に存在する人種主義の眼差しを糺すべく差別のありさまを執拗に描いた。この東作品のなかにみられる、差別の徴表を取り除きあたりまえの「部落民」であることを打ち出したい、ないしはその「部落民」という境界さえもとり去りたいという意識と、他方、現実に存在する人種主義を前にそれを告発し、またそのためには「部落民」というアイデンティティが必要とされるというディレンマは、今もなお存在しつづけているのである。当該年度は、国際的なレイシズム研究との比較や、他のマイノリティの表象のありようについても、そうした国際シンポジウムの場などをつうじて行うことができた。映画製作の背景などに関する資料の悉皆調査や他のマイノリティに関する資料収集は、いまだ不十分なままとなったので、その点を次年度の課題として行いたい。当該年度は、戦後まもない1946年と1969年に上映された二つの「破戒」映画の制作の背景を、部落解放全国委員会、部落解放同盟機関紙『解放新聞』などに寄りながら調査した。またそれらがどのように受け止められたのかについても合わせて分析した。それらを踏まえつつ、二つの作品を比較し、戦後民主主義のなかで封建制打破への期待が高かった時期と、その期待も薄れ、高度経済成長期にさしかかっても部落解放が実現しない時期との部落問題の表象の仕方の違いを考察した。すなわち2つの作品をとおして、部落問題のありよう、ひいては敗戦直後と1960年代の部落問題をとりまく社会のありようを照射することでもある。では、1980年代になるとそれがどう変化していくのか。被差別部落の自己表象のありようが大きく変わるのが当該時期であり、それを映画「人間の街」をとおして分析した。この作品についても、『解放新聞』等の文献資料を収集して、制作の背景、受け止められ方を明らかにし、映像の分析を行った。「破戒」の分析結果は、本年度、京都大学人文研究所の研究会で報告予定である。当該年度は、戦後初期と1960年代に上映された映画「破戒」に関して、原作が書かれた背景、木下恵介と市川崑の2人の映画監督によってそれぞれの作品が作られた背景を詳細に調べ上げることと、それらを踏まえながら、当該時期の部落解放同盟の機関紙や雑誌などを悉皆調査しながら、それの受け止められ方を分析していく作業を行った。とりわけ「破戒」については、戦後民主主義に期待を託した木下作品にみられる楽観主義と、高度経済成長期のまっただ中にあってなお部落問題が深刻に存在するなかでの、市川作品における部落問題の描かれ方の対比を行った。後者は、繰り返し「身の素性」の克服の困難さを示す表現が登場する。また正980年代を代表する作品「人間の街」の舞台となった大阪府松原市を訪問し、出演者、関係者のインタビューを行った。それにより、自画像をつくることすら容易ではなかった戦後初期の段階から、自画像と他者像の衝突を経て、「部落民の誇り」に集約されるような自画像を打ち出すにいたった経過、ならびにその問題点を分析した。たしかに当事者が運動に立ち上がり、それを担っていく上に「誇り」は重要な役割を果たす。

しかしながら、「破戒」の中で執拗に頭をもたげる「身の素性」は「誇り」を立ち上げるだけでは必ずしも克服しえないという問題をはらんでおり、現在の解放運動や啓発などに突きつけられている問題であることを提起した。そうした作業を行いつつ、後半はこれまでの研究成果をまとめる執筆作業に時間を充て、『描かれた被差別部落』というタイトルで岩波書店から単著を刊行することができた。2011年4月27日に発刊が予定されている。
前向き出生コホート研究によるADHDの病態関連バイオマーカーの解明

本研究は、胎児期の環境化学物質曝露が注意欠陥/多動性障害(ADHD)発症に至る機序の1つとして、DNAメチル化変化に注目し、臍帯血DNAの45万ヶ所メチル化部位(CpG部位)の網羅的解析を行った。有機フッ素化合物、フタル酸エステル類、ビスフェノールAの胎児期曝露について、多重比較補正後も統計学的に有意に関連するメチル変化部位を特定した。6歳のADHD-RS調査票で見いだされたADHD疑い群(n=245)とコントロール群(n=317)の臍帯血DNAを用いて、網羅的解析で明らかとなった曝露に起因するCpG部位を次世代シークエンサーにより解析し、メチル変化とADHDとの関連を検討している。今年度は、胎児期曝露に起因するメチル化変化部位の特定を目的に、申請者らが先行研究で行った遺伝子網羅的メチル化解析により得られた45万CpGサイトのメチル化値と妊娠中母の環境化学物質濃度との関連を解析した。環境化学物質として解析したのは、母体血中の有機フッ素化合物、フタル酸エステル類、および、臍帯血中のビスフェノールA(BPA)であり、いずれの場合も曝露濃度と統計学的に有意に関連するメチル変化を見出した。また、それらのメチル化変化部位が位置する遺伝子の中には、in vivo/vitroの実験で化学物質曝露によるmRNA発現への影響が報告されている遺伝子が含まれており、胎児期の環境化学物質曝露がメチル化への影響を介して遺伝子発現に影響を及ぼす可能性が示された。また、環境化学物質曝露によるメチル化変化と発達障害との関連を調べるため、本研究でターゲットとしているADHD、および、自閉症スペクトラム(ASD)に関連することが先行研究により示唆されている遺伝子と曝露によるメチル変化部位が位置する遺伝子とを比較した。さらに、曝露によりメチル化が変化する遺伝子の機能をデータベースを参考に調べ確認した。それらの結果、胎児期の環境化学物質曝露が発達障害・神経発達に関与する遺伝子のメチル化に影響を及ぼしていることが示された。上述の環境化学物質曝露に起因するメチル化変化領域のADHDへの影響を検討するため、前向きコホート内・症例対照(ケース:n=245,コントロール:n=317)の臍帯血DNAを用いて、曝露と関連するメチル化領域のメチル化率を次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法によ測定した。計画していた環境化学物質の中で、ダイオキシン・PCB以外の物質について45万CpGサイトのメチル化値と曝露濃度との関連を解析し、統計学的に有意に関連するメチル変化を見出すことがでた。さらに、胎児期の環境化学物質曝露が神経発達に関係する遺伝子のメチル化に影響を及ぼしていることを示し、現在、環境化学物質曝露に起因するメチル化変化領域とADHDへ関連を、前向きコホート内・症例対照研究により検討中であり、おおむね順調に進展した。環境化学物質曝露によるADHD発症の胎児期マーカーとなるDNAメチル化部位(CpG部位)を探索するため、45万ヶ所CpG部位の網羅的解析を行った。前年度に行なった臍帯血DNAのエピゲノム網羅的解析ではgenomic inflationが起こり、偽陽性率が高くなっている可能性があったため、本年度は様々な統計手法を試み、inflationを最小に抑えた手法により、有機フッ素化合物、フタル酸エステル類、ビスフェノールA(BPA)、ダイオキシン・PCB類の胎児期曝露について、多重比較補正後もそれぞれの曝露濃度と統計学的に有意に関連するメチル変化を特定した。有機フッ素化合物については、隣接するいくつかのCpG部位でメチル化変化が同時に起こっている領域をも同定した。メチル変化とADHDとの関連を検討するため、網羅的解析で明らかとなった曝露に起因するCpG部位の中から、神経系に分類される遺伝子のCpG部位、20か所を抽出し、6歳のADHD-RS調査票で見いだされたADHD疑い群(n=245)とコントロール群(n=317)の臍帯血DNAを用いて、次世代シークエンサーにより解析した。しかし、得られたメチル化率とADHD疑いとなるオッズとの有意な関連は認められなかった。この理由として、今回の次世代シーケンサーを用いたメチル化解析において、一定の信頼度を保っているかの指標となるカバレッジ数(各CpG部位配列を重ねて読んだ回数)が十分に取得できなかったこと、サンプル間でカバレッジ数がばらついてしまい外れ値が多くなってしまったことが原因の1つと考えられ、現在、再解析を行っている。また、選択したCpG部位が妥当でなかったことも考えられ、今後、解析するCpG部位の再検討が必要と考えている。1)ダイオキシン・PCBの胎児期曝露と45万CpGサイトのメチル化値との関連を解析する。

2)ADHDと環境化学物質曝露、さらにメチル化変化の影響を解析するるため、ADHDのコホート内症例対照研究、または、ADHD疑いを含むサブコホートにおいて、曝露測定とメチル化率測定をさらに進める。3)成長後のADHD症状と臍帯血DNAメチル化変化率との関連を検証した後、DNAメチル化変化からADHD発症までの経路に関わる生物学的指標をLC/MS-MSやELISA法により測定する。公衆衛生学環境化学物質曝露とDNAメチル化との関連は、すでに取得したデータをも用いて解析を行い、費用が最低限に抑えられた。また、新規に行ったDNAメチル化率の測定はパイロシークエンサーにより行う予定であったが、別の研究費による次世代シークエンサーでの測定ができたため、今年度の使用がなくなったため、次年度使用額が生じた。ADHDとの関連を検討するための曝露測定およびメチル化率の測定、生物学的指標のLC/MS-MS、または、ELISA法での測定に必要な実験用試薬品費用として使用する。
パーキンソン病発症機序における細胞骨格系タンパク質Sept4の役割解明

セプチンサブユニットSept4の特異的な時空間的発現パターンに基づいてSept4遺伝子欠損マウスを作成し、組織学的解析と網羅的行動スクリーニングによって脳構築および脳機能の障害を探索した。その結果、成熟後の音刺激に対する驚愕反応のプレパルス抑制とメタンフェタミン注射後のオープンフィールド行動の2つのパラダイムで異常を見出したことから、本マウスのドパミン神経系の異常が示唆された。そこで行動薬理学・組織学・電子顕微鏡学・細胞生物学・生化学的手法を用いた検討を重ねることにより、黒質・線条体ドパミン系の高次生理機能におけるセプチン・スカフォールド系の重要性を発見・確立した(Neuron 2007)。さらにパーキンソン病において線条体におけるSept4含有量が低下していたことから、さらに研究を進め、パーキンソン病モデルマウスでSept4を欠損させると、パーキンソン病の病態が悪化することを見出し、パーキンソン病発症においてSept4が重要な役割を果たしていることの確証を得た(Neuron 2007)。また、当該分野の主旨からは外れるが、本研究から医学・生物学的に重要な知見が派生したので付記する。本マウスが予想外の雄性不妊を呈することが判明したため、精子鞭毛内の輪状小体がセプチンの環状高次集合体(セプチンリング)であり、その破綻によって生殖機能を失うこともわかった。同時にヒトの精子無力症検体でもセプチンリングの破綻を認め、セプチン細胞骨格の臨床的意義を発見した(Dev Cell 2005)。1.Sept4遺伝子欠損マウス[Sept4(-)マウス]を作成し、パーキンソン病(PD)モデルマウスの一つである変異型ヒトαシヌクレイン(αS)(A53T)発現マウスと交配することにより、αS(A53T)/Sept4(-)マウスを作成した。本マウスの運動障害発現時期あるいは組織所見の検討を開始した。2.Sept4(-)マウスが男性不妊であることを見出した。Sept4は正常精子の中片部と尾部の境界に見られる構造的支持体である輪状小体に局在しており、Sept4が欠損することで輪状小体は消失し、大部分の精子は中片部と尾部の間で屈曲し、正常な鞭毛運動を失っていた。輪状小体が消失したことで、中片部と尾部境界部の精子径が縮小し、モータータンパク質であるキネシンが同部位に蓄積しており、このことも精子運動を阻害する一因と考えられた。ヒトの精子無力症3例にも同様の輪状小体の消失例が見出されたことから、セプチンの男性不妊症への関わりが示唆された。3.Sept4(-)マウスの精子先体反応が障害されていることを見出した。Sept4(-)マウスと、acrosin-GFP発現マウスを交配することでSept4(-)マウスの精子先体をGFPでラベルし、FACSを使用することで精子先体反応をreal-timeで観察した。Sept4(-)マウスではカルシウム流入で誘発される先体反応がほぼ消失しており、Sept4は精子先体での開口放出制御機構に関わっていると考えられた。4.精子先体での開口放出機構はシナプスで起こる開口放出機構に類似する。Sept4(-)マウス13匹、野生型マウス11匹を用い行動実験を行ったところ、Sept4(-)マウスの脳内ドパミン神経伝達異常が示唆された。組織学的にはSept4(-)マウスの側坐核におけるドパミン神経終末密度が低下し、開口放出制御分子(t-SNAREの構成分子)であるSyntaxin1とmunc-18の発現量も同部位で低下していた。以上から、Sept4は神経終末におけるドパミン開口放出機構に関与することが示唆された。その結果、幼若期の運動学習と成熟後の音刺激に対する驚愕反応のプレパルス抑制の2つのパラダイムで異常を見出した。そこで行動薬理学・組織学・電子顕微鏡学・細胞生物学・生化学的手法を用いた検討を重ねることにより、小脳発達過程におけるプルキンエ細胞や顆粒細胞に対するバーグマングリア細胞のニッシェ機能と黒質・線条体ドパミン系の高次生理機能におけるセプチン・スカフォールド系の重要性を発見・確立した(いずれも投稿中)。

そこで行動薬理学・組織学・電子顕微鏡学・細胞生物学・生化学的手法を用いた検討を重ねることにより、黒質・線条体ドパミン系の高次生理機能におけるセプチン・スカフォールド系の重要性を発見・確立した(Neuron 2007)。さらにパーキンソン病において線条体におけるSept4含有量が低下していたことから、さらに研究を進め、パーキンソン病モデルマウスでSept4を欠損させると、パーキンソン病の病態が悪化することを見出し、パーキンソン病発症においてSept4が重要な役割を果たしていることの確証を得た(Neuron 2007)。また、当該分野の主旨からは外れるが、本研究から医学・生物学的に重要な知見が派生したので付記する。本マウスが予想外の雄性不妊を呈することが判明したため、精子鞭毛内の輪状小体がセプチンの環状高次集合体(セプチンリング)であり、その破綻によって生殖機能を失うこともわかった。同時にヒトの精子無力症検体でもセプチンリングの破綻を認め、セプチン細胞骨格の臨床的意義を発見した(Dev Cell 2005)。
膀胱癌の生物学的多様性-癌遺伝子/癌抑制遺伝子との関連解析-

新たに樹立した膀胱癌細胞株(JMSU1)をlimiting dilutionによるクローニングにて、いくつかのクローンを単離し、膀胱癌クローンを樹立した。それらクローンの性状解析を行った。クローン毎で倍加時間は様々であった。in vitroでの細胞形態の観察では紡錘形から矩形と多様な形態を呈した。造腫瘍性に関しては、クローン毎で造腫瘍性は異なっていた。H&E染色では何れのクローンも親株と同様にGrade3移行上皮癌の組織像を呈していた。粘液染色や免疫組織染色(サイトケラチン、ビメンチン)ではクローン毎に明らかな差異を見出せなかった。Fingerprint解析を行ったところ、すべてのクローンは親株と同一のパターンを示し、contaminationのないことを確認した。PCR-SSCP法にて、p53遺伝子(Exon5-9)、Ha-ras遺伝子(Exon1-2)、Ki-ras遺伝子(Exon1-2)の変異の有無を各クローンで検討し、異常があれば直接塩基配列決定法でその変異を同定した。すべてのクローンで、p53遺伝子のExon8に突然変異が認められたが、Ha-ras遺伝子とKi-ras遺伝子に変異は検出されなかった。p53遺伝子の変異は、codon280のAGA→ACA(Arg→Thr)であり、すべてのクローンに共通していた。浸潤能をin vitroinvasion assayにて評価比較したところ、各クローンの浸潤度は様々で浸潤能に多様性が認められた。以上より、我々の樹立したクローンには生物学的多様性が確認されたが、p53遺伝子、Ha-ras遺伝子、Ki-ras遺伝子に関しては同様の遺伝子型を示し、クローンの由来が単一であることが示唆された。また、樹立クローンは、膀胱癌の生物学的多様性の研究モデルとして有用であるといえよう。それらクローンの性状解析として以下の点を検討した。in vitroでの倍加時間を色素排除法による細胞数カウントにて評価した。造腫瘍性に関しては、ヌードマウスあるいはSCIDにクローンを皮下移植し、造腫瘍性を観察するとともに、得られた腫瘍の組織学的検索を行った。クローン毎で造腫瘍性は異なり、SCIDのみで造腫瘍性が確認されたクローンもあった。これらクローンのindividualityの検討のために、Fingerprint解析を行ったところ、すべてのクローンは親株と同一のパターンを示し、contaminationのないことを確認した。以上より、われわれの樹立したクローンはJMSU1由来であり、in vitroでの倍加時間や細胞形態、in vivoにおける造腫瘍性において多様性を示すことが確認された。癌遺伝子としてHa-rasとKi-ras遺伝子を、癌抑制遺伝子としてp53遺伝子の解析を行った。すなわち、PCR-SSCP法にて、p53遺伝子(Exon5-9)、Ha-ras遺伝子(Exon1-2)、Ki-ras遺伝子(Exon1-2)の変異の有無を各クローンで検討し、異常があれば直接塩基配列決定法でその変異を同定した。

すべてのクローンで、p53遺伝子のExon8に突然変異が認められたが、Ha-ras遺伝子とKi-ras遺伝子に変異は検出されなかった。p53遺伝子の変異は、codon280のAGA→ACA(Arg→Thr)であり、すべてのクローンに共通していた。また、親株が浸潤性膀胱癌であったことから、各クローンの浸潤能をin vitro invasion assayにて評価比較した。Transwell^<TM>のpolycarbonate membraneにMatrigel^<TM>をコーティングし、上層に細胞浮遊液を下層に培養液を加え、48時間培養した。下層に浸潤した細胞をトリプシン処理後、細胞を回収しMTTassayで浸潤度を評価した。各クローンの浸潤度は様々で浸潤能に多様性が認められた。以上より、われわれの樹立したクローンには生物学的多様性が確認されたが、p53遺伝子、Ha-ras遺伝子、Ki-ras遺伝子に関しては同様の遺伝子型を示し、クローンの由来が単一であることが示唆された。
特発性歯痛発症への前頭前野の機能変調の影響に関する研究

口腔顔面領域は慢性疼痛が発症しやすい部位である。慢性疼痛(Chronic pain,CP)は器質的な異常がない、あるいは組織損傷が治癒したにもにもかかわらず遷延するいたみである。CPに苦しむ人は決して少なくなく、歯痛(顔面痛)を訴えて歯科を受診する患者の17%がCPであるとの報告もある。CPに苦しむ患者は持続する憂鬱な痛みのために日常生活活動が低下し、家族や社会から疎外され,著しいQOL低下を被るとともに社会的にも大きな損失である。しかし、CPの治療法は全く確立されておらず、患者は効果のない治療を受け続けているか、痛みからの解放を諦めているのが現状である。痛み刺激によって起こる感覚的な痛みは脳の感覚受容野で認識される。痛み刺激が加わると感覚的伝導路のみではなく、その他の高次脳が同時に活動し,感覚的刺激を修飾する。国際疼痛学会は、痛みを「不快な感覚的・情動的な体験」と定義している。つまり、痛みとは単なる感覚ではなく、不安、怒り、嫌悪、恐怖などの情動面をも有している。事実、慢性疼痛患者は感覚的な刺激がなくても、不安、緊張、恐怖などの情動ストレスのみによって痛みを感じることがある。情動的な痛みには高次脳である,扁桃体,前帯状回,島皮質の活動亢進が深く関与しており,感覚的な痛みの情報を修飾する。特に扁桃体の活動は痛みの情動面を高めるため,過剰な活動は生体の防御機構として必要とされる以上の強い痛みを生み出すことになる。扁桃体の過剰活動を感知し,それを抑制するブレーキの機能を持つのが背外側前頭前野(dorsolateral prefrontal cortex, DLPFC)である。つまり, DLPFCの機能が低下した患者では感覚的な痛み刺激がなくとも痛みが起こることとなる。その痛みは時に鮮烈で,また持続性の憂鬱な痛みである。CP患者ではDLPFCの機能が低下していることがわかった.特発性歯痛(ideopatic toothache;IT)は口腔顔面領域の慢性疼痛の一つである。ITの発症機序は未だ明らかにされおらず、治療法もないのが現状である。ITの痛みは通常、ヒト以外の動物にはみられない。ヒトのみのITが起こる理由として、高度に発達した高次脳機能の変調が関与していると推察される。本研究はヒトのヒトたる所以である前頭用連合野にある前頭前野のに注目した。大脳辺縁系は恐怖や怒り、嫌悪、愛着、喜び、悲しみなどの情動の中枢である。痛みも不快な情動体験と定義されており、痛みの処理、修飾にも大脳辺縁系が深く関与すると予測される。大脳辺縁系は負荷されたストレスの快・不快を判断し情動が生じると同時に、その活動変化は前頭前野に伝えられる。前頭前野は大脳辺縁系活動をコントロールするより高次脳であり、過度の反応を抑制する働きを持つ。うつ病、PTSDは日常生活における繰り返される強いストレスによる前頭前野の疲弊化が原因とされる。IT患者の多くは痛みが起こる以前に心理的な強いストレスを被っている。平成28年度は慢性疼痛の発症に心理ストレスが関与する可能性を検討した。ラットに拘束水浸ストレス(拘束ケースに固定し胸骨中央部まで20°Cの水に3時間浸す)を7日間負荷してストレスモデルを作製した。その後、坐骨神経を4箇所を絹糸を用いて緩徐に結紮し、ラット足底部の慢性疼痛を発症させた。この動物モデルの足底部に疼痛刺激を加え、疼痛関連行動を測定し疼痛閾値を測定した結果、ストレス負荷モデルでは有意に疼痛閾値が低いことがわかった。以上より、ITを含めた慢性疼痛疾患には心理ストレスが関与する可能性が示唆された。28年度は心理ストレス負荷が前頭前野活動の機能を変調させることを明らかにする目的で研究を進めた。心理ストレスが負荷された生体は大脳辺縁系、特に扁桃体の異常な活動亢進を招く。この時、過剰な活動を抑制するために、さらに高次脳である前頭前野の活動が亢進し大脳辺縁系に抑制的に働く。心理ストレスを負荷した動物モデルの疼痛閾値が低下したことで、心理ストレスが慢性疼痛の発症に大きく関与していることが明らかとなった。心理ストレス負荷動物モデルに疼痛刺激を加え、前頭前野の活動状態をマイクロダイアリシスによる前頭前野の神経伝達物質を測定することで評価すること、セロトニン、ドーパミン、アドレナリンのどの神経伝達物質が関与しているかを明らかにすることまでを28年度の目標としていたが、そこまでは到達していない。しかし、既に心理ストレスモデルに疼痛刺激を加えたときの前頭前野の細胞外液のサンプリングは終了しており、分析を残すのみである。分析は余裕をもって1日1サンプルの分析でも1ヶ月以内で終了することが可能である。サンプル分析の結果によっては他の神経伝達物質の検討も必要となるが、既に心理ストレス動物モデルの作製法、サンプリングシステムの構築は完成しており多くの時間は必要としない。従って、本研究は概ね順調に進展していると予測される。慢性疼痛の発現機序への上位中枢の機能変調が関与を検討した。特に霊長類で飛躍的に発達した前頭前野に注目した。特に平成29年度はあらかじめ水浸ストレスを1週間にわたって加え心理的に疲弊させたラット(ストレスラット)熱によるの痛み刺激閾値(痛みと認識する刺激強さ)が低下していることが明らかになった。

通常では痛みと認識しない刺激で痛みを感じたり、軽度の痛みを誘発する程度の刺激でも強い痛みを感じてしまう状態にあった。また、疼痛刺激を加えたときの前頭前野の活動を脳内神経伝達物質であるセロトニン、ノルアドレナリン、ドーパミンの細胞での濃度を検討したところ、水浸ストレスを加えないラット(非ストレスラット)では全ての神経伝達物質の増加が認められたのに対して、ストレスラットではいずれの神経伝達物質も非ストレスラットと比較して分泌量が有意に低下しており、疼痛刺激に対する前頭前野の反応が緩慢であることがわかった。従って、前頭前野は過度な痛み刺激を抑制する機構に関与している可能性があり、前頭前野の機能不全は慢性疼痛に深く関与する可能性が示唆された。29年度は引き続き、特発性歯(顔面)痛(idopatic orofacial pain、IOP)の患者の疼痛閾値を温度刺激によって測定し健常成人と比較検討した。結果、顔面部での疼痛閾値は健常成人が46.2±1.2(平均±標準偏差)°Cであったのに対してIOP群では42.1±2.3°Cと有意に低下していた。また、この傾向は三叉神経領域のみでなく、四肢の脊髄神経領域でも同様であった。この2つの事実より、IOP患者の痛み発現、維持には前頭前野の機能不全が深く関与している可能性があると考えられる。慢性疼痛患者は精神疾患や複雑な心理社会的状況を有しており、慢性疼痛の発現機序に情動が少なからず関与することが推察される。ストレスラットモデルを用いた動物実験により、心理的ストレスが疼痛閾値を低下させることが明らかとなった。その原因として前頭前野の機能低下が疑われる結果を得た。前頭前野は霊長類で著しく発達した高次脳である。慢性疼痛は人間によく発症することより、当初は前頭前野の異常興奮が起こることを予測したが、実際には機能低下が起こっていることが明らかになった。従って、前頭前野の痛みに対する反応としては痛みにブレーキをかける抑制的な方向に働くとの仮説を立てることができる。予測と逆の結果ではあったが、実験の内容、方向性には何ら影響はしない。口腔顔面領域は慢性疼痛が発症しやすい部位である。慢性疼痛(Chronic pain,CP)は器質的な異常がない、あるいは組織損傷が治癒したにもにもかかわらず遷延するいたみである。CPに苦しむ人は決して少なくなく、歯痛(顔面痛)を訴えて歯科を受診する患者の17%がCPであるとの報告もある。CPに苦しむ患者は持続する憂鬱な痛みのために日常生活活動が低下し、家族や社会から疎外され,著しいQOL低下を被るとともに社会的にも大きな損失である。しかし、CPの治療法は全く確立されておらず、患者は効果のない治療を受け続けているか、痛みからの解放を諦めているのが現状である。痛み刺激によって起こる感覚的な痛みは脳の感覚受容野で認識される。痛み刺激が加わると感覚的伝導路のみではなく、その他の高次脳が同時に活動し,感覚的刺激を修飾する。国際疼痛学会は、痛みを「不快な感覚的・情動的な体験」と定義している。つまり、痛みとは単なる感覚ではなく、不安、怒り、嫌悪、恐怖などの情動面をも有している。事実、慢性疼痛患者は感覚的な刺激がなくても、不安、緊張、恐怖などの情動ストレスのみによって痛みを感じることがある。
極低温電子顕微鏡による細菌べん毛モーターと蛋白質輸送装置の像構造解析

細菌べん毛は回転モーターとらせん繊維型プロペラなどで構成される超分子ナノマシンである。本研究は、回転モーターでタンパク質輸送装置でもあるべん毛基部体で、未だに多くが不明な構成タンパク質の立体構造と配置と相互作用を解明し、基部体の動作機構を明らかにするのが目的である。加速電圧300 kVの電子線には直径1ミクロンのサルモネラ菌は厚すぎて透過しづらいため、クライオ電子線トモグラフィーの解像度は10 nm以下に留まり、基部体の詳細な構造を見ることができない。そこで、FtsZの大量発現により直径0.4ミクロン程のミニ細胞を効率よく作成する条件を確立し、分解能を4 nm程度にまで向上させた。それぞれのミニ細胞には12本のべん毛と共に病原性因子分泌装置が複数見られた。両者はその構成蛋白質のアミノ酸配列相同性の高さと立体構造の類似性により、ともにIII型蛋白質輸送装置と呼ばれている。数多くのミニ細胞のトモグラムからべん毛基部体と病原性因子分泌装置の立体像を数十個抽出してそれぞれの平均像を求めた結果、これまで誰も見たことのなかったIII型蛋白質輸送に関わる複合体装置の細胞質側の立体構造が詳細に見え、両者の共通性と違いが明らかになった。また、大量発現系から精製したべん毛構成蛋白質のX線結晶解析により、べん毛蛋白質輸送に関わるFliH/I複合体とFliPのペリプラズムドメイン、そしてべん毛基部体ロッド蛋白質FlgGの結晶構造解析が完了した。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、回転モーターでありべん毛蛋白質輸送装置でもあるべん毛基部体の動作機構の解明のため、未だに多くが不明な基部体構成蛋白質間の相互作用形態を明らかにすることである。機能状態では基部体に弱く結合し、あるいは結合解離を繰り返してさまざまな機能を発現するが、基部体の単離精製によって解離するためその相互作用部位や形態がまったく不明な蛋白質が複数存在し、動作機構の解明を妨げている。そういった蛋白質あるいはその安定結合変異体を大量発現系から単離精製し、別に単離精製した基部体に付加してより大きな複合体を再構成し、極低温電子顕微鏡による単粒子像解析法やトモグラフィー方によりその立体構造を解析することにより、基部体と各蛋白質分子の相互作用形態を詳細に解析して、トルク発生、蛋白質輸送、自己構築制御などのしくみの解明を目指す。本年度は、べん毛構造の自己構築に必須なべん毛蛋白質輸送装置の構成蛋白質のうち、細胞質内で輸送基質を結合し、6つの膜貫通型蛋白質からなる輸送ゲートとの結合解離を繰り返すことで高い輸送効率を支える3つの細胞質性蛋白質FliH,FliI,FliJについて研究を進め、FliI-FliJの特異的な相互作用を解明した。2007年に解明したFliIの結晶構造はF_1-ATPaseのα/βサブユニットとの意外なほど高い相同性を示したが、本年度にFliJの結晶構造が解けて、γサブユニットとそっくりであるという予想外の結果を得た。さらに、FliIの形成する六量体リング構造とFliJの相互作用を電子顕微鏡で観察したところ、細長いコイルドコイル構造のFliJがFliI六量体リングの中心に突き刺さって結合するようすが、F_1-ATPaseのα_3β_3γ複合体とほぼそっくりであることが明らかとなった。輸送ゲートはプロトン駆動力をエネルギー源とし、輸送基質蛋白質を結合したFliH-I-J複合体がこのゲートに結合解離を繰り返すことで高効率の蛋白質輸送を行うことは2008年に解明しており、それを考慮すると、ゲートを含む輸送装置全体の構造がF_oF_1-ATP合成酵素のそれとそっくりであるという、遺伝学的にも極めて興味深い発見につながった。1)昨年度に引き続き、輸送効率を上げるFliH_2FliI複合体、固定子でプロトンチャネルでもあるMotA_4MotB_2複合体、あるいはそのホモログであるMotP_4MotS_2複合体、MotBのC末端側にありペリプラズム領域でペプチドグリカン層や基部体に結合すると考えられているMotBc、輸送ゲートを構成する膜蛋白質(FlhA, FIhB ,FIiO, FIiP, FliQ, FliR)などを、それぞれ大量共発現系から精製し、x線結晶解析や低温電子顕微鏡像解析による構造解析を目指してきた。MotP_4MotS_2複合体とFliPのペリプラズムドメインについては結晶が得られたので、その解析に向けて結晶の質の改善を進めている。FIiH_<C2>FIiI複合体の結晶構造については現在精密化を進めている。2)野生株から精製したべん毛基部体や、構成蛋白質の部分欠損により変化した基部体の構造についての低温電子顕微鏡による解析では、画像解析法の工夫により分解能が向上し、X線結晶解析で得られている分子モデルのドッキング精度が向上し、より信頼性の高いモデルの構築が可能になりつつある。3)野生型サルモネラ菌は直径1ミクロンで、その凍結試料は加速電圧300kVの電子線にとっても厚すぎて透過しづらく、電子線クライオトモグラフィーによるべん毛基部体の解析は到達解像度が10nm以下に留まる。そこで、細胞分裂に関わるFtsZを大量発現させて直径0.4ミクロン以下のミニセルと呼ばれる細胞を大量に作成する条件を確立し、べん毛の数を増やす遺伝学的工夫も加えることで、複数のべん毛を有するミニセルの産生条件を確立した。

この試料に電子線クライオトモグラフィーを適用し、細胞中で動作中のべん毛基部体、すなわち固定子や輸送装置が結合して動作中の基部体の立体構造解析を可能にした。細菌べん毛は回転モーターとらせん繊維型プロペラなどで構成される超分子ナノマシンである。本研究は、回転モーターでタンパク質輸送装置でもあるべん毛基部体で、未だに多くが不明な構成タンパク質の立体構造と配置と相互作用を解明し、基部体の動作機構を明らかにするのが目的である。加速電圧300 kVの電子線には直径1ミクロンのサルモネラ菌は厚すぎて透過しづらいため、クライオ電子線トモグラフィーの解像度は10 nm以下に留まり、基部体の詳細な構造を見ることができない。そこで、FtsZの大量発現により直径0.4ミクロン程のミニ細胞を効率よく作成する条件を確立し、分解能を4 nm程度にまで向上させた。それぞれのミニ細胞には12本のべん毛と共に病原性因子分泌装置が複数見られた。両者はその構成蛋白質のアミノ酸配列相同性の高さと立体構造の類似性により、ともにIII型蛋白質輸送装置と呼ばれている。数多くのミニ細胞のトモグラムからべん毛基部体と病原性因子分泌装置の立体像を数十個抽出してそれぞれの平均像を求めた結果、これまで誰も見たことのなかったIII型蛋白質輸送に関わる複合体装置の細胞質側の立体構造が詳細に見え、両者の共通性と違いが明らかになった。また、大量発現系から精製したべん毛構成蛋白質のX線結晶解析により、べん毛蛋白質輸送に関わるFliH/I複合体とFliPのペリプラズムドメイン、そしてべん毛基部体ロッド蛋白質FlgGの結晶構造解析が完了した。本研究は、回転モーターでタンパク質輸送装置でもあるべん毛基部体で、未だに多くが不明な構成タンパク質の配置と相互作用を解明し、基部体の動作機構を明らかにするのが目的である。しかし、FtsZの大量発現により直径0.4ミクロン程のミニ細胞を効率よく作成する条件を確立したので、分解能を4 nm程度にまで向上させることが可能になった。ミニ細胞も12本のべん毛を持ち、野生型に近い運動能を持つため、完全な機能状態でべん毛基部体の立体構造観察が可能になり、実際に固定子や輸送装置の結合の様子を観察することに成功した。また、サルモネラ菌の10倍高速で泳ぐ磁性細菌MO-1の秘密が、水平連結六方七連という特殊なべん毛モーターの構造にあることもトモグラフィーにより解明した。一方で、タンパク質輸送効率を上げるFliH/I、固定子でプロトンチャネルでもあるMotA/BやMotPS、輸送ゲートを構成する膜タンパク質などを大量共発現系から精製し、X線結晶解析やクライオ電子顕微鏡像解析により構造解析を進めた。FliH/I複合体については結晶構造が、FliPのペリプラズムドメインについては良好な結晶が得られた。相同性の高いフックとロッドを構成するFlgEとFlgGのアミノ酸配列比較で、FlgGにしか存在しない配列をFlgEに挿入することで、フックをロッドのように真っ直ぐで固い構造にすることにも成功。べん毛軸構造の各部で必要に応じて異なる力学的性質を実現するメカニズムを明らかにした。
落葉果樹の休眠制御機構の解明-樹体ジョイント法を利用した新規解析法

地球温暖化が引き起こす落葉果樹の休眠打破の不良や不時開花などの問題解決を目的に「樹体ジョイント仕立て」を応用し,休眠打破剤による休眠芽への影響が養水分の通導が行われると思われる接ぎ木された隣接樹の芽の休眠に及ぼす影響について調査を行った。その結果,休眠打破剤の処理を行った樹から連結された樹への,ジョイント部を通した刺激の伝達が認められたため,落葉果樹の芽の休眠打破に関して,休眠芽の外部の器官も影響を与えていると考えられた。地球温暖化が引き起こす、休眠打破の不良や不時開花などの問題解決を目的に新規の栽培技術「ジョイント整枝法」を応用し、落葉果樹における自発休眠覚醒の制御機構に関して既存の方法とは異なったアプローチを試みた。休眠打破剤(シアナミド)による休眠打破への影響について、直接処理を行う樹に加え、ジョイント仕立てにより、隣接樹と養水分の通導が行われる接ぎ木された個体に及ぼされる影響について調査を行った。ニホンナシ'幸水'の自発休眠打破に必要とされる休眠要求量の約75%である600CHの低温に遭遇させた実験樹に、休眠打破剤による処理を行った樹においては明らかに萌芽が促進されており、その効果は花芽において顕著であった。先端樹のみに打破剤を処理したユニットにおいて、直接は打破処理を行っていない連結された基部樹の花芽の萌芽が遅延する傾向があり、すでに休眠打破された樹による連結された樹への影響が認められた。一方、同一樹の葉芽に関しては反対に萌芽が促進されており、花芽と葉芽では異なった休眠製御機構が存在すると考えられる。なお基部側の樹のみ打破処理を行った場合、先端部への影響はあまり認められなかったため、連結の方向による極性があるものと考えられる。また、同じバラ科のモモ'勘助白桃'において芽内の水の動態把握の目的で、花芽内部の組織ごとの水チャネルの遺伝子発現パターンを調査したところ、PIP1は自発休眠打破後、休眠芽基部におい芽上部よりも先に発現量の増加が見られ、着生する枝から休眠芽下部へ、水の移動がしやすい状態になっていることが示唆された。次年度にはニホンナシにおいて同様の解析を行いたい。また、冬季のニホンナシ芽中の糖の解析を行ったところ、主要な糖はソルビトールとスクロースであり、休眠覚醒から萌芽までに、それまでに蓄積された含量が減少していくことが認められた。地球温暖化が引き起こす、休眠打破の不良や不時開花などの問題解決を目的に新規技術「ジョィント整枝法を応用し、落葉果樹における自発休眠覚醒の制御機構に関して既存の方法とは裏なったアプローチを試みた。休眠打破剤(シアナミド)による休眠打破への影響について、直接処理を行う樹に加え、ジョイント仕立てにより、隣接樹と養水分の通導が行われる連結された樹体に及ぼされるについて調査を行った。昨年度は、約80%の自発休眠打破に必要な休眠要求量を与えた、温室内萌芽を促進させたが、本年度はジョイント整枝法により連結されたニホンナシ'幸水'ポット植え樹に対し、自然条件下で必要とされる休眠要求量を十分に与えた実験樹を用いて、休眠打破剤(シアナミド剤)による処理を行った。前年に2連、および3連に接ぎ木を行い連結したジョイント樹のうち、2連のユニットに関しては先端または基部側の樹体にのみに、3連のユニットについては中間の樹体にのみ休眠打破処理を行った。休眠打破剤の処理を行った樹においては、対照区に比べ明らかに萌芽が促進されており、その効果は昨年度と同様に花芽において顕著であった。基部樹のみに打破剤を処理したユニットにおいて、直接は打破処理を行っていない同-ユニットの連結された先端樹の花芽の萌芽が、対照区のユニットの先端樹に比べ促進する傾向があり、萌芽促進に関して隣接樹から連結された樹への影響が認められた。しかし前年度においてはむしろ先端部から基部樹への方向により強く処理の効果が及ぼされていたため、連結の影響が伝達しやすい方向性やその影響の大小は、必ずしも一定方向ではないことが示された。この点については、実験年によって傾向が異なり、また接ぎ木部における樹体や維管束のつながり度合いの相違等の影響も考えられ、さらに今後解析を進めたい。休眠打破の不良や不時開花などの問題解決を目的に、休眠打破した樹に連結した非休眠打破樹への養水分の移動に伴う影響等を明らかにするため試験を行った。

昨年度に引き続き休眠打破剤(シアナミド)による休眠打破への影響について、直接処理を行う樹から、ジョイント仕立てにより隣接樹と養水分の通導が行われる連結された樹体に及ぼされる影響について調査を行った。本年度も自然条件下で必要とされる休眠要求量を十分に与えた実験樹を用いて、休眠打破剤(シアナミド剤)による処理を行った。前年と同様に2連および3連に接ぎ木を行い連結したジョイント樹のうち、2連のユニットに関しては先端または基部側の樹体にのみに、3連のユニットについては中間の樹体にのみ休眠打破剤処理を行った。休眠打破剤の処理を行った樹の葉芽において対照区に比べ萌芽が促進されていたが、昨年度と比べその効果が小さい傾向であった。くわえて昨年度および一昨年度と異なり、同一ユニット内の休眠打破剤処理を行った樹から連結された隣接樹への萌芽促進効果の伝達が明確ではなかった。これは休眠打破剤を処理した樹に対する萌芽促進処理の効果が小さかったことが、要因になっていると思われる。また、本年はニホンナシの萌芽時期において、非常に寒暖の差が著しい気象条件が連日にわたって繰り返されたため、休眠打破剤の萌芽促進処理の効果が現れにくい環境条件であった可能性もある。今回の試験においては「ジョイント整枝法」を応用し、落葉果樹における自発休眠覚醒の制御機構に関して既存の方法とは異なったアプローチを試みたが、萌芽促進処理した樹に連結した非休眠打破樹への養水分の移動に伴う影響の伝達傾向が、過去3年間の試験を行った年によって異なってしまった。これは接ぎ木部における維管束のつながり度合いや、試験中の環境条件が影響していることが考えられ、より詳細に試験を行うためにはこれらの点について改善を行う必要があると考える。
直腸癌に対する手術前化学放射線治療の至適投与法と臨床例での検証

局所進行直腸癌に対して,放射線治療の条件を同一にすると,5-FUのprodrugであるUFTを併用する化学放射線療法の方が腫瘍の縮小率は有意に高かった.治療前の生検標本を用いて,放射線療法において良好な治療効果を予測できる因子は,AI陽性,p53染色陰性,p21染色陽性,組織型が高分化型であったが,化学放射線療法においてはAI陽性のみであり,効果予測因子は放射線療法と化学放射線療法とで異なっていた.また化学放射線療法においては,放射線単独の療法で腫瘍の縮小が軽度であったAI陰性,P21染色陰性および中分化型の症例での縮小が増加し,各々AI陽性,P21染色陽性,高分化腺癌との間に縮小率の差が無くなった.治療開始前の生検標本で,5-FUの代謝酵素であるTS,DPD,TP.OPRTのmRNA発現から,放射線,化学放射線療法の効果予測が可能か否かを検討したが,TSのmRNAが低値の例では組織学的な効果は有意に高度であったが,その他臨床的に実用可能な指標は見つからなかった.局所進行直腸癌に対して,放射線治療の条件を同一にすると,5-FUのprodrugであるUFTを併用する化学放射線療法の方が腫瘍の縮小率は有意に高かった.治療前の生検標本を用いて,放射線療法において良好な治療効果を予測できる因子は,AI陽性,p53染色陰性,p21染色陽性,組織型が高分化型であったが,化学放射線療法においてはAI陽性のみであり,効果予測因子は放射線療法と化学放射線療法とで異なっていた.また化学放射線療法においては,放射線単独の療法で腫瘍の縮小が軽度であったAI陰性,P21染色陰性および中分化型の症例での縮小が増加し,各々AI陽性,P21染色陽性,高分化腺癌との間に縮小率の差が無くなった.治療開始前の生検標本で,5-FUの代謝酵素であるTS,DPD,TP.OPRTのmRNA発現から,放射線,化学放射線療法の効果予測が可能か否かを検討したが,TSのmRNAが低値の例では組織学的な効果は有意に高度であったが,その他臨床的に実用可能な指標は見つからなかった.(1)核酸代謝酵素mRNA発現の検討5-FU系抗癌剤の効果と副作用に密接に関連している核酸関連酵素(TS, DPD, OPRT, TP)の各mRNAの発現を,治療開始前および化学放射線治療開始1週間後の生検標本,および手術標本のパラフィン包埋標本からレーザー光を用いて腫瘍組織を選択的に切り出して測定した.その結果放射線照射にUFTを併用した22例では,TS, DPD, OPRT, TPのmRNA発現には有意の変動は認められなかったが,UFT+CPT-11を併用した23例では,治療開始前に比し治療開始1週間後にはTS, DPD, OPRT, TPのmRNA発現はいずれも有意に増加し,化学放射線治療後2週間後の手術時にはいずれも低下した.(2)免疫組織化学での検討術前に放射線のみで治療した場合には,P53染色陰性,P21染色陽性,apoptosis陽性例で腫瘍縮小率が有意に高率で,これらは高感受性因子と考えられた.UFTを用いた放射線化学療法ではapoptosis陽性が,UFT+CPT-11を併用した放射線化学療法ではapoptosis陽性に加えてP21染色陽性が高感受性因子であり,併用する化学療法レジメンにより差が認められた.(3)併用する5-FU系抗癌剤の投与方法に関する実験的検討(1)術前放射線/化学放射線治療の効果と予後の検討1991年以降,術前に放射線/化学放射線治療を行い,2週間後に手術を行った144例の患者の切除標本における組織学的な効果を,Dworak分類(Dworak O, et al. Int J Colorect Dis 1997:12:19), Tumor Regression Grade : TRG (Mandard AM, et al. Cancer 1994:73:2680),および日本の大腸癌取扱い規約に従って評価した.化学放射線の効果が著明であったDworak分類でGrade 3/4,TRG分類でGrade 1/2,大腸癌取扱い規約でGrade 2/3,および組織学的な効果が腫瘍の面積の90%以上におよぶ症例は各々19例,17例,18例,17例であり,個々の症例に関しては診断基準間で差は見られたが,大部分の症例での評価は,どの診断基準を用いても同じであることが明らかになった.予後を放射線/化学放射線治療の効果別に比較すると,Dworak分類,TRG分類,日本の大腸癌取扱い規約いずれを用いても,組織学的に効果が著明な症例は,それ以外の症例に比し,有意に無再発生存率,生存率が良好であった.再発形式に関しては,局所再発は164例中5例(3%)であり,同期間内に手術のみで治療された中下部直腸腺癌69例での局所再発13例(19%)と比較して有意に低率であった.(2)併用する5-FU系抗癌剤の投与方法に関する実験的検討ヌードマウス下肢に移植されたヒト結腸癌細胞株KM20CにTS-1(FTとして8mg/kg)を14日間連日経口投与した.TS-1に5Gy1回照射または8Gy分割照射(2Gy/日)を併用した化学放射線療法を施行し腫瘍増殖曲線を求めた.化学療法単独では効果が僅かな低用量(4mg/kg)のTS-1でもTS-1/5Gy治療では腫瘍増殖抑制効果が得られ用量依存的であった.TS-1(4,8mg/kg)