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近世中期上方文学界・出版界における書物の形成に関する研究―秋里籬島を中心として―

本研究は、近世中期上方における書物の形成の在り方を、作者秋里籬島を軸に、その文化的基盤及び環境的事項の動態と相互連関から究明することが目的であり、本年度は主として、秋里籬島の名所図会作品を取り巻く上方出版界の動態に関する研究を行った。文化の中心が江戸に移りつつある時期に名所図会は上方から発して隆盛を見た書物群であり、この出版に関わる種々の板権をめぐる書肆の動向が解明すべき重要な点であった。具体的には、名所図会の出版に相板者として参入する京都の小川多左衛門と、名所図会の求板者である大坂の河内屋太助の二軒の書肆を分析した。小川多左衛門については、名所図会出版に参入する経緯、関連する出版履歴を跡付け、当該分野での立場や地位を推定し、領域・内容としては古い書物に連なりつつ表現方式の面で新しさを打ち出す書物の事業の展開に乗る書肆の動きを、過去の出版物の板権が当代の新たな利得に結びついた形であると捉えた。河内屋太助については、名所・地誌関連の求板活動が河内屋の営業史上の成長期の大きな動きであると捉え、その上での活動の展開を追跡し、板権を入手した書物群を自店の出版物として根付かせ、新板の書物では名所図会の応用企画を推し進めてこの分野に残された成長・展開の可能性を探っていく動向を明らかにした。これは創業以降、主力となる独自の開板を手掛ける過程において、自店の営業の基盤を支え、書肆としての実績を積むための活動という意味があり、殊に名所図会周辺の出版は、甚大な流行の余波により安定した業績が見込める活動と言える。以上のような書肆の動向が捉えられたことには、この時期の板権の持つ意味の一端を明らかにする意義がある。これに基づき、論文「名所図会をめぐる書肆の動向-小川多左衛門と河内屋太助」を執筆した。本年度はこのほかに、秋里籬島の初期作品について形成方法と制作事情に関する調査分析を行った。
ヒツジ胎仔造血環境下でのヒトiPS細胞由来造血幹細胞の発生機序の解明とその応用

骨髄や臍帯血を用いた造血幹細胞移植は、がん治療や細胞移植のための有効な治療手段である。造血幹細胞のドナー不足が続く近年、新たな移植細胞源としてiPS細胞の活用が期待されているものの、iPS細胞の造血幹細胞への分化誘導はいまだに難しいのが現状である。このような背景の中で申請者らは、妊娠早期のヒツジ胎仔が免疫寛容を誘導することを利用し、造血発生の場である肝臓内でヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞から造血幹細胞を分化させることに成功した(特願2015-168702)。しかしながら、ヒツジ胎仔肝臓内でのヒト造血幹細胞の産生・分化のメカニズムは明らかにできていない。そこで本研究では、(1)ヒツジ胎仔体内でのヒト中胚葉細胞の動態・変化を明らかにし、ヒツジ造血支持細胞との共培養系を用いて(2)造血幹細胞の産生・分化に寄与する因子を抽出することで、試験管内での造血幹細胞への分化誘導技術の開発を目指す。初年度は、ヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞を移植した後でヒツジ胎仔肝臓や骨髄の組織切片を作製し、汎血球マーカーであるCD45、Notch経路活性化のマーカーであるN1ICDに対する抗体を用いて免疫染色を行うことで、ヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞のヒツジ胎仔体内における動態を解析した。その結果、移植後に移植細胞ではCD45を陽性化し、Notchシグナルが活性化していることを明らかにした。また、造血発生に関与することが推測されるヒツジ胎仔組織として、肝臓、骨髄および血管内皮組織を採取し、支持細胞の初代培養ならびにこれらの不死化に成功した。ヒツジ胎仔体内でのヒトiPS細胞由来中胚葉細胞の動態解析を目的として、初年度は次の実験を行なった。ヒトiPS細胞を、6日間にわたってサイトカイン添加下でOP9ストローマ細胞と共培養し、妊娠60日齢前後(満期147日齢)のヒツジ胎仔肝臓内に移植した。移植手技は、子宮壁越しに超音波ガイド下で胎仔の肝臓を把握し、細胞を注入する方法である(Abeら, 2014, 2012, 2011, 2009)。移植1週間から2ヶ月後に、ヒツジ胎仔の肝臓および骨髄を採取し、移植前は陰性であった、CD45などの血球マーカーの発現およびN1ICDなどのNotchシグナル伝達経路活性化マーカーを免疫染色で評価し、動態および変化を捉えることを試みた。今後、リンパ球系や赤血球系などの血球系統別マーカーを用いて、分化した細胞をさらに詳しく解析していく。また、試験管内での分化誘導技術への応用を目指し、共培養系の確立を試みている。造血発生に関与することが推測されるヒツジ胎仔組織由来の造血支持細胞として、肝臓および骨髄からストローマ細胞を、臍帯静脈から血管内皮細胞の培養を試みた。その結果、肝臓および骨髄からストローマ細胞を、臍帯静脈から血管内皮細胞を培養することに成功し、さらに複数株を不死化することに成功した。上記の体内動態の解析で明らかになったマーカーを用い、ヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞と共培養を行うことで、支持細胞としての有効性を評価していく。移植1週間から2ヶ月後に、ヒツジ胎仔の肝臓および骨髄組織を用い、CD45以外のリンパ球系や赤血球系などの血球系統別マーカーによって、移植細胞から産生・分化した細胞について詳しく解析していく。また、移植前は陰性であったCD45およびN1ICDが陽性化・活性化したという結果から、これらのマーカーが下記の共培養系の指標として有効であると考えられる。今後、得られたストローマ細胞株および血管内皮細胞株を用い、ヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞と共培養を行うことで、造血系分化誘導のための支持細胞としての有効性を評価していく。

その結果、移植後に移植細胞ではCD45を陽性化し、Notchシグナルが活性化していることを明らかにした。また、造血発生に関与することが推測されるヒツジ胎仔組織として、肝臓、骨髄および血管内皮組織を採取し、支持細胞の初代培養ならびにこれらの不死化に成功した。ヒツジ胎仔体内でのヒトiPS細胞由来中胚葉細胞の動態解析を目的として、初年度は次の実験を行なった。ヒトiPS細胞を、6日間にわたってサイトカイン添加下でOP9ストローマ細胞と共培養し、妊娠60日齢前後(満期147日齢)のヒツジ胎仔肝臓内に移植した。移植手技は、子宮壁越しに超音波ガイド下で胎仔の肝臓を把握し、細胞を注入する方法である(Abeら, 2014, 2012, 2011, 2009)。移植1週間から2ヶ月後に、ヒツジ胎仔の肝臓および骨髄を採取し、移植前は陰性であった、CD45などの血球マーカーの発現およびN1ICDなどのNotchシグナル伝達経路活性化マーカーを免疫染色で評価し、動態および変化を捉えることを試みた。今後、リンパ球系や赤血球系などの血球系統別マーカーを用いて、分化した細胞をさらに詳しく解析していく。また、試験管内での分化誘導技術への応用を目指し、共培養系の確立を試みている。造血発生に関与することが推測されるヒツジ胎仔組織由来の造血支持細胞として、肝臓および骨髄からストローマ細胞を、臍帯静脈から血管内皮細胞の培養を試みた。その結果、肝臓および骨髄からストローマ細胞を、臍帯静脈から血管内皮細胞を培養することに成功し、さらに複数株を不死化することに成功した。上記の体内動態の解析で明らかになったマーカーを用い、ヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞と共培養を行うことで、支持細胞としての有効性を評価していく。移植1週間から2ヶ月後に、ヒツジ胎仔の肝臓および骨髄組織を用い、CD45以外のリンパ球系や赤血球系などの血球系統別マーカーによって、移植細胞から産生・分化した細胞について詳しく解析していく。また、移植前は陰性であったCD45およびN1ICDが陽性化・活性化したという結果から、これらのマーカーが下記の共培養系の指標として有効であると考えられる。今後、得られたストローマ細胞株および血管内皮細胞株を用い、ヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞と共培養を行うことで、造血系分化誘導のための支持細胞としての有効性を評価していく。
火災被害者における血中シアン濃度の法中毒学的および臨床中毒学的意義に関する研究

火災被害者の血中シアン濃度に及ぼすメトヘモグロビン血症、死後経過時間および温度環境の影響を明らかにすることを目的とした。ペントバルビターノナトリウムで軽度に麻酔したウサギに3%亜硝酸ナトリウムまたは生理食塩液0.33ml/kgを静脈内投与し、その5分後に2%シアン化カリウム1ml/kgを筋肉内注射して死亡させた。死亡時の平均心臓血中シアン濃度はそれぞれ47.4および3.56mg/lであった。心臓を摘出し室温に放置したところ、72時間内にシアンは血液中からほぼ完全に消失したが、4°Cに保存した心臓内の血中シアンは安定であった。動物実験の結果を基に回帰式C_0=C・e^<0.0046t>(C_0 :死亡時の血中シアン濃度、C :剖検時の血中シアン濃度、t :死後経過時間)を定め、死後経過時間が848時間の焼死剖検22例の血中シアン濃度の解析を行ったところ、5例において、死亡時の血中シアン濃度が5.326.47mg/lと極めて高い値を示していたと推定された。その内3例では、総メトヘモグロビン(遊離メトヘモグロビンとシアンメトヘモグロビン)濃度の上昇が認められ、死亡時にシアンはすべてシアンメトヘモグロビンとして存在していたと考えられた。それらの一酸化炭素ヘモグロビン飽和度は54.763.0%と致死レベルに達していた。他の2例では、遊離メトヘモグロビンは検出されず、一酸化炭素ヘモグロビン飽和度も30.937.9%とさほど高くなく、死亡時にシアン中毒下にあった可能性が高いと思われた。火災被害者におけるシアン中毒の有無や程度を正しく評価するためには、1)剖検例の場合には死亡時の血中シアン濃度を本研究で得られた回帰式により定める必要性があること、および2)一酸化炭素ヘモグロビン飽和度とともにメトヘモグロビン濃度を測定する必要性のあることが明らかとなった。火災被害者の血中シアン濃度に及ぼすメトヘモグロビン血症と死後経過時間の影響を明らかにすることを目的とした。ペントバルビタールナトリウムで軽度に麻酔したウサギに3%亜硝酸ナトリウム(A群,n=3)または生理食塩水(B群,n=6)0.33ml/kgを耳静脈内に投与し、その5分後に2%シアン化カリウム1ml/kgを筋肉内注射して死亡させた。シアン化カリウムを投与する直前におけるA群およびB群の平均メトヘモグロビン量はそれぞれ6.9および0.8%であった。死亡したウサギ(B群ではn=3)について、周囲の大血管を結紮後摘出した心臓を46°Cに1時間、20-25°Cに23時間、更に4°Cに48時間放置したところ、24時間内に心臓血中シアン濃度がA群で85%、B群で46%低下した。しかし、72時間後においてもそれぞれ初期濃度の10および37%に相当する量のシアンが残留していた。一方、B群の残りの心臓(n=3)を24時間以降も4°Cに保存することなく20-25°Cに放置したところ、実験終了時までにシアンほとんど完全に消失してしまった。

火災被害者剖検15例の血中シアン濃度、一酸化炭素ヘモグロビン飽和度およびメトヘモグロビン量を測定したところ、死後経過時間が824時間の事例(n=12)でそれぞれ0.145.38mg/l、11.386.4%および1.86.60%、死後経過時間が25日の事例(n=3)でそれぞれ0.010.54mg/l、42.484.2%および7.8%であった。死体の血中シアンは、環境温度が20°C付近では3日以内にほぼ完全に消失するが、4°Cではかなり安定であること、また火災被害者では燃焼ガスの吸入によりメトヘモグロビン量が上昇し、結果的にシアンの毒性が軽減される可能性が示唆された。火災ガス吸入により形成されるメトヘモグロビン血症が血中シアン濃度に及ぼす影響について、血中シアンの安定性を考慮し詳細に検討することを目的とした。死後経過時間が848時間の焼死剖検22例の右心血を試料とした。剖検時の血中シアン濃度(C)に基づき、、死亡時の血中シアン濃度(C_0)をC_0=C・e^<0.0046t>(t:死後経過時間)により求めた。また、メトヘモグロビンの最大シアン結合量を推定するため、総メトヘモグロビン(遊離メトヘモグロビンとシアンメトヘモグロビン)濃度を求めた。シアンメトヘモグロビン濃度は、血中シアン濃度を2で除することにより求めた。5例において、死亡時の血中シアン濃度が5.326.47mg/lと極めて高い値を示していたと推定された。その内3例では、総メトヘモグロビン濃度の上昇が認められ、死亡時にシアンはすべてシアンメトヘモグロビンとして存在していたと考えられた。それらの一酸化炭素ヘモグロビン飽和度は54.763.0%と致死レベルに達していた。他の2例では、遊離メトヘモグロビンは検出されず、一酸化炭素ヘモグロビン飽和度も30.937.9%とさほど高くなく、死亡時にシアン中毒下にあった可能性が高いと思われた。遊離メトヘモグロビンが検出されなかった症例は更に2例あり、それらの一酸化炭素ヘモグロビン飽和度は1.6および9.7%と極めて低くかった。両者の死亡時の血中シアン濃度はそれぞれ0.11および1.99mg/lと推定され、後者ではシアン中毒が疑われた。他の13例の血液中から0.062.36mg/lのシアンが検出されたが、いずれの濃度も総メトヘモグロビンのシアン結合能を下回っていた。火災被害者におけるシアン中毒の正しい評価には、一酸化炭素ヘモグロビン飽和度とともにメトヘモグロビン濃度を測定する必要のあることが明らかとなった。
心拍ゆらぎを指標とした登山に対する強さの解析

登山の生体負担の程度をどのような生理学的指標によって表現するかについては不明な点が多い。たとえば,日欧のエベレスト登山隊など,一流登山家の最大酸素摂取量が50ー60 ml/kg/min程度である例も多く,平地での体力指標をそのまま準用できないようである。本研究では,登山時の生体負担を評価する試みのひとつとして,また,山の環境で現実的に測定可能な非侵襲的な手法として,心拍変動(HRV)を測定対象した。他方,HRVはこれまでの自験結果や先行研究においては,高地の低酸素の環境では,HRVのパワー・スペクトル(FFT)がしばしば検出不可能な水準にまで減少し,解析ができない事例も多く見られていた。そこで本研究は, HRVの非線形解析のひとつであるDFA (detrended fluctuation analysis)法に着目して,低酸素環境下の身体運動に対する生体負担の定量性を評価にするとともに,高地での運動に本法が適用可能であるかを明らかにするために,山岳ランナーを対象としたトレイルラン・タイムトライアルレースにおけるHRVのDFA解析結果と持久的体力指標と連関を調査し,HRVの非線形解析による測定結果が山に対する強さの指標のひとつになりうるか検討を加えた。その結果,低酸素環境において,DFA法によるスケーリング指数α1は,運動開始とともに上昇し,中等度の強度の運動中に極大値を示した。また,α1の極大値は,環境酸素濃度依存的に低負荷側に移行する,すなわち,酸素濃度が低くなるにつれ,より低い負荷でα1が低下を示すことが明らかとなった。フィールドにおいて,α1の安静値からの差分は,富士登山タイムアタックの時間と正の相関,OBLAと負の相関をする傾向にあったことから,山に対する強さを表す有力な指標になる可能性が示唆された。「研究の目的」低酸素環境における自律神経系の影響は,HRV(心拍変動)を用いて多く解析されてきているが,ほとんどが高度3,000mよりも高い標高のデータである。急性高山病は,個人差はあるものの,人によっては1,500m程度でも,急性高山病の症状である頭痛を訴える人が出ることから,3,000mよりも下の高度での生体機能の変化を検出することに価値があると考えられる。本研究では常圧低酸素室を用いた実験で3,000 mよりも低い酸素濃度についてHRVをサンプリングし,特に非線形解析を用いて生体負担を精査した。「今年度の研究方法」実験は5日に分け,25°Cに設定した低酸素室(1日目:19.7 %, 2日目:14.6 %,15.6 %,3日目:18.7 %,19.2 %,4日目:16.6 %,17.5%,5日目:14.3 %,15.1 %)にて,仰臥位10分,起立6分の心拍変動測定をPolar v800で測定した。指標として,SampEn,Detrended fractual analysis(α1),Shannon Entropy(ShEn)を算出した。仰臥位においてはRMSSD (時間領域)HF(周波数領域)およびでは変化は認められなかった。同様にLF/HFの変化も認められなかったが,SampEnは仰臥位において低酸素になるにつれ上昇する傾向を認めた。一般的に高地では交感神経が活性化し、副交感神経活動が低下するとされる。「今年度の結果」以上の結果,自立神経に対する影響は,3,000m級の高度までは,低酸素の影響が軽微であるが,心拍の複雑性を高める適応(SampEn)が生じていると考えられた。今後,環境変化,低圧であることの影響について実地踏査を含め検討を進める。登山が生体に及ぼす効果については,低酸素環境であることのみならず,低圧,温度差,紫外線,複合的な筋収縮様式などが含まれるため,実地調査によらないと有用・有意義な研究成果を得られない。本研究では,低酸素ストレスと酸化ストレスのかかる環境での身体運動という登山の運動様式に着目し,1一般者を対象に,富士登山全行程にわたり,HRV法を用いて自律神経機能を評価する,2トレイルランナーと一般者について,HRVの特徴を検出することを通して,“登山に対する強さ"を定量する。フィールドには,単独峰として標高との関係を示しやすく,整備された登山道を有する日本一の山として,主として富士山を対象とする。28年度は,その基礎的な資料収集(低酸素自体の生体負担調査)をおこなったもので,低酸素以外の環境因子の関与を明確にするために,28年度のデータをもとに実地踏査にあたっていく予定である。自律神経や生体応答の健全性を評価するために,心拍変動解析が評価されてきた。またこれらを登山に適用して,登山時の生体負荷を評価した報告も多くみられる。他方,高地では,心拍変動スペクトル(FFT)の低周波成分(LF)および高周波成分(HF)のパワーが減少し,検出不可能になるという事象もみられていた。そこで実験1として心拍変動にたいして非線形解析を適用することによって,低酸素環境における生体情報を定量評価し,さらに実験2として高地での運動に適用させた。心拍変動は,SD1,SD2,ShanEn,SampEnなどによる評価を行ったが,最終的に常に安定した数値の得られたDFA (Detrended Fluctuation Analysis)法を採用(α1値)することとした(Kubios V.3.0)。

(実験1)一般健常者5名(22.6 ±0.9歳,170.9 ±8.5cm,67.1 ±10.1kg)を対象に,20.94 % (0 m)、17.38 % (1,500 m)、15.28 % (2,500 m)、14.23 % (3,000 m)、13.40 % (3,500 m)および12.56 % (4,000 m相当)の低酸素環境(Hypoxico:エベレストサミットII)を実験室内に設定(室温22°C、湿度50%)し,自転車エルゴメータを用い50Wから25Wずつ(各5分) 200Wに至る漸増負荷運動を行わせた。心電図のR-R間隔は,仰臥位安静時および運動中,Polar V800により連続測定した。(実験2)経験を積んだトレイルランランナー6名を対象に,富士山御殿場口5合目から8合目を往復するトレイルランレースの前後(安静仰臥位)およびラン中のα1値を評価した。レース中は,解析範囲を3分間とし,2分ごとずらして移動平均をとった。(実験1)運動中のα1は,Haulataら(2003)の先行研究と同様100から125W付近までは1を越え,その後負荷上昇にともなって低下するスタイルを示したが, 20.94%設定時が一番高く,低酸素環境ではほぼ酸素濃度依存的に低くなることが明らかになった。(実験2)トレイルランレース中,α1はほぼ一定に推移した。各ランナーの安静値のα1と運動中の平均値の差分(Δα1)を評価すると,ランニングタイムとの間に有意な相関が得られた。すなわち,ランニングタイムが短い(速い)ランナーほど,安静値からのα1の変動が少ないことが示されており,本研究によって,低酸素環境/高地において,DFA法により生体負荷を定量評価できることが示された。登山の生体負担の程度をどのような生理学的指標によって表現するかについては不明な点が多い。たとえば,日欧のエベレスト登山隊など,一流登山家の最大酸素摂取量が50ー60 ml/kg/min程度である例も多く,平地での体力指標をそのまま準用できないようである。本研究では,登山時の生体負担を評価する試みのひとつとして,また,山の環境で現実的に測定可能な非侵襲的な手法として,心拍変動(HRV)を測定対象した。他方,HRVはこれまでの自験結果や先行研究においては,高地の低酸素の環境では,HRVのパワー・スペクトル(FFT)がしばしば検出不可能な水準にまで減少し,解析ができない事例も多く見られていた。そこで本研究は, HRVの非線形解析のひとつであるDFA (detrended fluctuation analysis)法に着目して,低酸素環境下の身体運動に対する生体負担の定量性を評価にするとともに,高地での運動に本法が適用可能であるかを明らかにするために,山岳ランナーを対象としたトレイルラン・タイムトライアルレースにおけるHRVのDFA解析結果と持久的体力指標と連関を調査し,HRVの非線形解析による測定結果が山に対する強さの指標のひとつになりうるか検討を加えた。その結果,低酸素環境において,DFA法によるスケーリング指数α1は,運動開始とともに上昇し,中等度の強度の運動中に極大値を示した。また,α1の極大値は,環境酸素濃度依存的に低負荷側に移行する,すなわち,酸素濃度が低くなるにつれ,より低い負荷でα1が低下を示すことが明らかとなった。フィールドにおいて,α1の安静値からの差分は,富士登山タイムアタックの時間と正の相関,OBLAと負の相関をする傾向にあったことから,山に対する強さを表す有力な指標になる可能性が示唆された。
機能性複合酸化物研削屑の浮選分離に関する基礎的研究

研削屑中に含まれるガドリニウム・ガリウム・ガ-ネット(GGG)、イットリウム・アルミニウム・ガ-ネット(YAG)およびニオブ酸リチウム(LN)をドデシルアミン酢酸塩(DAA)を捕収剤とした浮選により研磨剤であるグリ-ンカ-ボランダム(GC)から分離することの可能性について検討した。得られた結果は以下のとおりである。1.硝酸カリウムを含む溶液中で測定されたGGG、YAGおよびLNの等電点はそれぞれpH7.3、7.5および2.8である。2.GGGおよびYAGの浮遊性は表面が負に荷電しているアルカリ性で高く、正に荷電している酸性で低いが、硫酸、蓚酸イオンが存在すると、これらの多価陰イオンがGGGおよびYAGの表面に特異吸着して、DAAの吸着量を増加させるために、GGGおよびYAGの浮遊性は酸性領域でも高くなる。3.GCの浮遊性は中性ないしアルカリ性で高く、酸性において若干低下し、多価陰イオンの存在によって影響されない。しかし、GCの浮遊性はとうもろこし澱粉の存在によって、特に酸性で著しく抑制される。4.硫酸あるいは蓚酸でpHを2以下にし、とうもろこし澱粉によってGCの浮遊を抑制すると、GGGあるいはYAGを選択的に浮選分離することができる。5.LNの浮遊性は多価陰イオンによって活性化されないが、弗化物イオンによって活性化され、酸性領域でLNの高い浮遊率が得られる。LNの活性剤として弗化カリウム、GCの抑制剤としてとうもろこし澱粉を用いると、pH24の範囲でLNとGCの浮選分離が行なわれる。研削屑中に含まれるガドリニウム・ガリウム・ガ-ネット(GGG)をドデシルアミン酢酸塩(DAA)を捕収剤とした浮選により研削剤であるグリ-ンカ-ボランダム(GC)からの分離の可能性について検討した結果をまとめると以下のとおりである。1.支持電解質として1×10^<ー2>mol/dm^3のKNO_3を用いて測定されたGGGのゼ-タ電位はpHが約7分で零、それよりアルカリ側で負、酸性側で正の値をとるが、GCのそれは測定pH範囲ではすべて負の値である。2.DAAによるGGGの浮遊性はアルカリ性で高く、酸性で低く、一方、GCのそれは強酸性、弱アルカリ性を除く広いpH範囲で高い浮遊性を示し、DAAによるこれらの表面疎水性化はDAAの静電気的吸着によるものと解釈される。3.DAAによるGGGの浮遊性は硫酸イオンあるいは燐酸イオンの存在により著しく影響を受ける。すなわち硫酸イオンの存在によりpH3以下で、燐酸イオンの存在によりpH48でGGGの高い浮遊率が得られるようになる。燐酸イオンの場合はその濃度を10mol/dm^3以上にすると、pH1の強酸性でもGGGの高い浮遊率が得られる。4.DAAを捕収剤として用いて、硫酸酸性あるいは燐酸酸性でGGGを浮遊させて分離する場合、GCの抑制剤として澱粉が効果的である。この場合可溶性澱粉よりもとうもろこし澱粉の方がGCに対し強い抑制効果を示す。5.以上の結果から、GGGとGCの混合物に対して浮選分離を試みた結果、期待されるような結果が得られた。研削屑中に含まれるイットリウム・アルミニウム・ガ-ネット(YAG)およびニオブ酸リチウム(LN)をドデシルアミン酢酸塩(DAA)を捕収剤とした浮選により研磨剤であるグリ-ンカ-ボランダム(GC)から分離することの可能性について検討した。1.硝酸カリウムを含む溶液中で測定されたYAGおよびLNの等電点はそれぞれpH7.5および2.8である。

2.YAGの浮遊性は表面が負に荷電しているアルカリ性で高く、正に荷電している酸性で低く、DAAによるYAG表面の疎水化はDAAの静電的吸着によるものと解釈される。3.硫酸、蓚酸イオンが存在するとき、YAGの浮遊性は強酸性領域でも高くなる。これはこれら多価陰イオンのYAG表面への特異吸着に起因する。蓚酸イオンの場合は、YAGのゼ-タ電位を正から負に逆転させ、DAAとの静電的作用により、硫酸イオンの場合は特異吸着した硫酸イオンとDAAの化学的相互作用によりDAAの吸着量を増加させるためである。4.硫酸あるいは蓚酸でpHを2以下にし、とうもろこし澱粉によってGCの浮遊を抑制すると、YAGを選択的に浮選分離することができる。この場合、硫酸よりも蓚酸の方が分離性が良好である。5.LNの浮遊性は中性ないしアルカリ性pH領域で高く、強酸性pH領域で急激に低下する。LNは多価陰イオンによって活性化されないが、弗化物イオンによって活性化され、強酸性pH領域でも高い浮遊率が得られる。6.LNの活性剤として弗化カリウム、GCの抑制剤としてとうもろこし澱粉を用いると、pH24の範囲でLNとGCの浮選分離が行なわれる。
わが国スポーツ文化に対する日本文化の規定性に関する社会学的研究

本研究の目的は、スポーツが普及・発展していく過程において、日本文化がいかなる影響を及ぼしてきたかということを、現実のスポーツ場面における行動様式やスポーツ観、スポーツ規範の内面化のレベルにおいて明らかにすることである。そのために、スポーツの構成要素として、「身体性」、「遊戯性」、「競争性」をとりあげ、スポーツ文化の制度的・構造的側面からは「スポーツ規範」、「スポーツ組織」、「スポーツ行動様式」及び「スポーツ観」をとりあげて、スポーツ文化の理念型を構築した。そしてスポーツ文化の理念型に基づいて予備調査を行い、最終年度には本調査を実施し、現実のスポーツ場面において、日本文化がいかなる影響を及ぼしているのかを実証的に明らかにした。結果の概要は以下の通りである。1)価値意識については、伝統的な「精神主義」、「修養主義」等が内在している。2)行動様式については、上意下達がみられるが、若年層ほどこの傾向は弱い。3)規範については、集団規範を守り、「和」を求める意識が形成されている。4)組織については、組織への従属心が強いという特徴がみられる。5)自己中心主義については、若年層ほど、「自己形成」を強く肯定している。6)自己信頼主義については、男性の方が、自律的態度を肯定する意見が強い。7)対人関係の手段視については、否定的であり、「間人」主義的な傾向がみられる。8)相互依存主義については、全体的な調和を求める意見が支配的である。9)信頼主義に関しては、お互いが誠意を持てば成立するという意見が強い。10)対人関係の本質視については「縁」を大事にする傾向が強くみられる。本研究の目的は、わが国で、スポーツが普及・発展していく過程において、日本文化がスポーツに対してどのような影響を及ぼし、また日本文化と融合するなかで、わが国のスポーツはいかなる性格や特性を形成するに至ったかということを明らかにすることである。つまり、「日本文化とスポーツの関係性」を明確化しようとする試みである。スポーツの構成要素としては、最もミクロなレベルで「身体性」、「遊戯性」、「競争性」をとりあげ、スポーツ文化の制度的・構造的側面としては、「スポーツ規範」、「スポーツ組織」、「スポーツ行動様式」および「スポーツ観」をとりあげて、スポーツ文化の理念型を構築した。ここでいう「スポーツ文化の理念型」とは、「スポーツの意味体系-シンボルシステム」にほかならず、スポーツの行為システム、社会システムと相互に連関し合って一環を成しているものであるが、それらとは明確に峻別されるべき抽象化された概念的構成物なのである。その具体的内容として、(1)認知的関心の優位な、観念的・信念的意味をもつシンボルとしてのスポーツ技術や知識、(2)カセクシス的関心の優位な、表出的意味をもつシンボルとしてのスポーツ観、(3)評価的関心の優位な、価値志向的意味をもつシンボルとしてのスポーツ規範(ルールやマナー)を有するのである。このそれぞれの具体的内容の考察は、スポーツ文化がシンボルとして存在することによって、スポーツの意味や価値が伝達され、スポーツ行動という具体的な行動のコミュニケーションを成立・安定化させることが可能になり、観察可能なものとして分析されうるのである。したがって、来年度は、本年度構築した「スポーツ文化の理念型」に基づいて、「身体性」、「遊戯性」、「競争性」を、その中に内在させている「スポーツ行動」について実証的に研究を進めていくことにする。本研究の目的は、第一義的には、「日本文化とスポーツの関係性」を明らかにすることである。その際、スポーツの構成要素とスポーツの制度的・構造的側面に着目し、それぞれの項目に関わる日本文化のスポーツに対する影響や規定性を考察することにした。スポーツの構成要素として「身体性」、「遊戯性」、「競争性」を取り上げ、制度的・構造的側面として「スポーツ規範」、「スポーツ組織」、「スポーツ観」、「スポーツ行動様式」を取り上げた。

そして、スポーツにおける日本的特徴や日本文化の規定性が具体的なスポーツ場面やスポーツ行動様式およびスポーツ観にどのように反映しているのかを実証的に明らかにしようとした。その結果、現在までのところで得られている主な知見は次の通りである。1.「身体性」、「遊戯性」、「競争性」のそれぞれの項目については、「競技型」と「レクリエーション型」の間では有為な差がみられるが(p<0.01)、「中間型」と「レクリエーション型」の間では「身体性」に差がみられるだけであった(p<0.05)。2.「スポーツ規範」については、「競技型」の同調度が高く、「中間型」と「レクリエーション型」では、余り厳格でない緩やかな「規範」を望む傾向が強い(p<0.05)。3.スポーツ行動様式については、「競技型」は、形や技術に固執する傾向がみられ、「中間型」と「レクリエーション型」では自分に合ったスタイルを望む傾向が強い(p<0.05)。本年度は、研究の最終年度であり、前年度まで構築してきた近代スポーツの理念型と我が国のスポーツ文化との乖離を計るための予備調査に基づいて、「わが国のスポーツ文化に対する日本文化の規定性に関する社会学的研究」の本調査を実施した。調査対象は、福岡市体育協会加盟のスポーツクラブ員であり、配布数は600、回収数は392、有効回答は378であり、有効集計率は63.0%であった。スポーツの構成要素である、「身体性」、「遊戯性」、「競争性」とスポーツ文化の構成要素である「スポーツ観」、「スポーツ行動様式」、「スポーツ規範」をとりあげてスポーツ場面における日本的特性を明らかにすることによって、日本文化のスポーツへの規定性を実証的に究明した。その結果の一部にしか過ぎないが、「伝統的価値意識」、「伝統的行動様式」、「伝統的規範」のそれぞれにおいて、これまでに指摘されている「日本人論」の特徴が性別、年齢を問わず表れており、やや若い世代においてその特徴がポイント的に下回っているということであった。つまり、スポーツの世界でも、日常の世界でも、ある程度「伝統的な事柄」は守っていかなければならないという回答が、スポーツクラブ員には特徴的にみられた。ただ、スポーツの理念型の乖離で言うと、「身体性」に重点を置く傾向が顕著であり、「遊戯性」や「競争性」に対しては、年齢や競技キャリアによって差がみられ、一般的な傾向は明らかにならなかった.
オレフィンの精密重合に高性能を発揮する担持型遷移金属錯体触媒の設計・創製

本課題はオレフィンの精密重合のための新しい固定化遷移金属錯体触媒の設計・創製で、具体的には「リビング重合により"ポリマー末端に配位子を導入する"ことを特徴とした新しい担持遷移金属触媒の創製」を主目的としている。主な成果は以下の通りである。申請者らが確立したMo錯体触媒を用いるノルボルネンのリビング開環メタセシス重合によるポリマー末端への官能基化手法により、置換フェノキシ配位子を有するポリノルボルネンを合成、ついで同ポリマーを配位子とするチタン錯体(A)を合成・同定した。また比較例として、ポリスチレン側鎖にフェノキシ配位子を有するチタン錯体(B)を合成・同定した。触媒Aはエチレン重合に高い触媒活性を示し、活性へのフェノキシ配位子上の置換基効果や得られるポリマーの分子量は、非担持型の錯体触媒での結果とほぼ同等であった。末端担持型触媒Aでは活性への側鎖長の効果は見られなかったが、側鎖担持型触媒Bではポリマー鎖あたりのチタン含量が増加すると活性が顕著に低下し、生成ポリマーの分子量分布も多峰性となった。フェノキシ基の2,6-位を^iPrとした触媒Aは、エチレンと1-ヘキセンとの共重合に極めて顕著な活性を示し、得られるポリマーの分子量やその分布、1-ヘキセン含量やポリマーのミクロ構造は同条件下での非担持型の錯体触媒での結果とほぼ同一であった。また、この共重合における配位子上の置換基効果も同じで、非担持型の錯体触媒の特徴を保持できた。現在学術論文を投稿中であり、詳細な結果を投稿準備中である。(平成18年度の国際会議での発表は2件)この手法を通じて均質な反応場を形成でき、錯体触媒本来の特徴(高活性・高選択性)を保持することが達成できた。この研究が錯体触媒の固定化の有用な新手法となることを提案できた。本課題はオレフィンの精密重合のための新しい固定化遷移金属錯体触媒の設計・創製で、具体的には「リビング重合により"ポリマー末端に配位子を導入する"ことを特徴とした新しい担持遷移金属触媒の創製」や「カーボンナノチューブやフラーレンの表面への錯体触媒の固定化」を目的としている。この手法により均質な反応場を形成でき、錯体触媒本来の特徴(高活性・高選択性)が発現可能となると期待している。平成17年度の主な成果は以下の通りである。申請者らが既に確立したMo-カルベン錯体触媒を開始剤としたノルボルネンのリビング開環メタセシス重合手法を利用して、ポリマー末端にフェノキシ配位子を有するポリノルボルネンを合成・同定した。さらに同ポリマーを配位子とするフェノキシ配位チタン錯体(A)を合成・同定した。また、比較例として、スチレンとアセトキシスチレンとの(アニオン)共重合、次いで水酸基化でスチレン/ヒドロキシスチレン共重合体を合成し、さらにチタン化合物との反応によりポリマー側鎖にフェノキシ配位子を有するチタン錯体(B)を合成・同定した。触媒Aによるエチレン重合では触媒活性への側鎖長の顕著な効果は見られなかったが、触媒Bではポリマー鎖あたりのチタン含量が増加すると触媒活性が顕著に低下した。また、エチレンと1-ヘキセンとの共重合における重合挙動も、AとBで大きな違いが見られた。(2005年12月にアジアポリオレフィンワークショップで発表、2006年7月にTOCATで発表予定)現在、フェノキシ配位子の最適化と同定手法の確立に注力しており、今後各種重合反応を検討することで、この触媒の特長を明らかにする予定である。また、各種有機合成反応への利用も試みるつもりである。(平成18年度の国際会議での発表は2件)

この手法を通じて均質な反応場を形成でき、錯体触媒本来の特徴(高活性・高選択性)を保持することが達成できた。この研究が錯体触媒の固定化の有用な新手法となることを提案できた。
日本人における２型糖尿病の遺伝的背景・成因を考慮した個別化予防システムの構築

本研究の目的は、個々の2型糖尿病の発症パターンを早期に予測するため、2型糖尿病の主要な成因であるインスリン分泌能低下とインスリン抵抗性を予測するための遺伝的リスクスコア(Genetic risk score: GRS)を構築し、GRSによる2型糖尿病発症パターンの分類を行うことと、これらGRSが2型糖尿病発症に及ぼす影響は、どのような生活習慣・身体特性を有する者において弱まるかを明らかにすることである。本年度は、2型糖尿病の既往歴のない中高齢者において、昨年度までに構築したインスリン分泌能低下を予測する遺伝的リスクスコア(insulin secretion-GRS [IS-GRS])とインスリン分泌能および空腹時血糖値との関連は、全身持久力が高い者において弱まるかどうか、また、それらの関連はBMIが低い者においても認められるかどうかを明らかにすることを目的として研究を行った。2型糖尿病の既往歴のない中高齢者882名を対象とした横断研究を行った。IS-GRSはインスリン分泌能との関連が報告されている20個のSNPより求めた。全身持久力は最大酸素摂取量の測定により評価した。BMIの中央値(BMI = 22.6 kg/m2)で対象者を高BMI群と低BMI群に分類し、それぞれの群において解析を行った。その結果、高BMI群においてIS-GRSと全身持久力との間に有意な交互作用が認められ、全身持久力が低い者においてはIS-GRSとインスリン分泌能および空腹時血糖値との間に有意な関連が認められたが、全身持久力が高い者においてはこれらの関連は認められなかった。しかし、低BMI群においてこれらの交互作用は認められなかった。以上の結果より、インスリン分泌能と空腹時血糖値に及ぼす遺伝要因の影響は、BMIが低い者においては高い全身持久力を有していても弱まらない可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年度は、2つの独立したコホートにおいてインスリン分泌能低下を予測するGRSを構築し、GRSと糖代謝指標ならびに肥満指標との関連を明らかにすることを目的として研究を行った。対象は、2つの疫学コホートの参加者計1068名とした(コホートA:n=486、年齡50.6±10.4歳;コホートB:n=582、年齡54.2±9.6歳)とした。インスリン分泌能のGRSを構築するため、インスリン分泌能低下との関連が報告されている13個の遺伝子座における代表的なSNPを分析し、各SNPにおけるリスクアレルを合計することによりGRSを求めた。年齡と性別を共変量とした偏相関分析の結果、両コホートにおいて、インスリン分泌能のGRSは空腹時血糖値およびヘモグロビンA1cと有意な正の相関を示し、インスリン分泌能の指標であるHOMA-βとは負の相関を示した。さらに、GRSと各肥満指標との相関関係を調べた結果、コホートBにおいて、GRSはBMIおよび腹囲と有意な負の相関を示した。2つのコホートで得られた結果についてメタ解析を行った結果、本研究で構築したGRSは、BMI、腹囲および体脂肪率と負に相関することが明らかになった。1000名以上の被験者を対象としてインスリン分泌能に関わる13個のSNPを分析し、それらのSNPから構築されたGRSが、2つの独立したコホートの両方において、空腹時血糖値、ヘモグロビンA1cおよびインスリン分泌能に関連することを明らかにすることができたため。また、本研究で構築したインスリン分泌能のGRSは、2型糖尿病のリスクファクターである肥満指標とは負に関連するという、新しい知見を得ることができたため。平成29年度は、昨年度に構築したインスリン分泌能低下を予測する遺伝的リスクスコア(insulin secretion-genetic risk score[IS-GRS])を改良し、糖代謝指標との関連を再検討するとともに、IS-GRSと境界型糖尿病・2型糖尿病発症との関連の強さは、肥満者と非肥満者で異なるかどうかを検討した。また、IS-GRSが高い者と低い者において、境界型糖尿病・2型糖尿病発症に及ぼす肥満の影響が異なるかどうかを検討した。さらに、インスリン抵抗性を予測するinsulin resistance-GRS(IR-GRS)を構築し、糖代謝指標および境界型糖尿病・2型糖尿病発症との関連を検討した。中高齢男女946名を対象とした横断研究を実施した。インスリン分泌能に関連する20個の一塩基多型(SNP)を分析し、リスクアレルの保有数を合計してIS-GRSを求めた。同様に、インスリン抵抗性に関連する6個のSNPを分析してIR-GRSを求めた。IS-GRSと空腹時血糖値およびヘモグロビンA1cとの間に有意な正の関連が、インスリン分泌能の指標であるHOMA-βとの間に有意な負の関連が認められた。

これらの関連性は、昨年度に構築した13個のSNPからなるIS-GRSと糖代謝指標との関連性より強固であった。BMIが25未満の非肥満者においては、IS-GRSと境界型糖尿病・2型糖尿病発症との間に有意な関連が認められたが、BMIが25以上の肥満者においては有意な関連は認められなかった。IS-GRSが低い者と高い者の両方において、BMIは境界型糖尿病・2型糖尿病の発症と有意に関連していた。IR-GRSとインスリン抵抗性の指標であるHOMA-IRおよびヘモグロビンA1cとの間に有意な正の関連が認められたが、空腹時血糖値および境界型糖尿病・2型糖尿病発症との間に有意な関連は認められなかった。本年度の研究により、1)インスリン分泌能低下の遺伝的リスクが境界型糖尿病・2型糖尿病発症に及ぼす影響は、特に非肥満者において強いこと、2)インスリン分泌能低下の遺伝的リスクの大小に関わらず、BMIの増加が境界型糖尿病・2型糖尿病発症リスクを高めること、3)インスリン抵抗性の遺伝的リスクは境界型糖尿病・2型糖尿病発症とは関連しないことを明らかにできたが、当初予定していた遺伝素因と生活習慣・身体特性の相互作用の解析や、縦断データの解析に着手することができなかったため。本研究の目的は、個々の2型糖尿病の発症パターンを早期に予測するため、2型糖尿病の主要な成因であるインスリン分泌能低下とインスリン抵抗性を予測するための遺伝的リスクスコア(Genetic risk score: GRS)を構築し、GRSによる2型糖尿病発症パターンの分類を行うことと、これらGRSが2型糖尿病発症に及ぼす影響は、どのような生活習慣・身体特性を有する者において弱まるかを明らかにすることである。本年度は、2型糖尿病の既往歴のない中高齢者において、昨年度までに構築したインスリン分泌能低下を予測する遺伝的リスクスコア(insulin secretion-GRS [IS-GRS])とインスリン分泌能および空腹時血糖値との関連は、全身持久力が高い者において弱まるかどうか、また、それらの関連はBMIが低い者においても認められるかどうかを明らかにすることを目的として研究を行った。2型糖尿病の既往歴のない中高齢者882名を対象とした横断研究を行った。IS-GRSはインスリン分泌能との関連が報告されている20個のSNPより求めた。全身持久力は最大酸素摂取量の測定により評価した。BMIの中央値(BMI = 22.6 kg/m2)で対象者を高BMI群と低BMI群に分類し、それぞれの群において解析を行った。その結果、高BMI群においてIS-GRSと全身持久力との間に有意な交互作用が認められ、全身持久力が低い者においてはIS-GRSとインスリン分泌能および空腹時血糖値との間に有意な関連が認められたが、全身持久力が高い者においてはこれらの関連は認められなかった。しかし、低BMI群においてこれらの交互作用は認められなかった。以上の結果より、インスリン分泌能と空腹時血糖値に及ぼす遺伝要因の影響は、BMIが低い者においては高い全身持久力を有していても弱まらない可能性が示唆された。本年度の研究により、遺伝的にインスリン分泌能が低い者は、むしろ2型糖尿病の主要な危険因子である肥満のリスクは低い可能性が示唆されたため、来年度はサンプルサイズを1500名まで増やし、DXAにより測定した部位別の脂肪量や除脂肪量、MRIにより測定した内臓脂肪面積など、より詳細な体組成とGRSとの関連を検討する。
調整力の構造解明のための動的平衡性の検討と測定課題の作成

自己の身体をうまくコントロールする能力である調整力の基盤要素としての動的平衡性(運動中の平衡維持能力)に着目し、移動系運動をベースとした動的平衡性課題を作成することを目的として、2018年度は既存項目(幼児の運動能力調査項目である両足連続跳び越し)における動作分析と本研究の課題作成に向けた予備調査を実施した。1)両足連続跳び越しにおける動作分析以前より検討を続けている幼児を対象とした両足連続跳び越しについて、時間的および空間的変動に焦点をあてた動作分析を行った。動作過程に着目した動作分析の結果、各跳び越し動作の両足踏切と両足着地の成就(両足同時性)が時間的・空間的変動と敏捷性に影響していると考えられ、動作過程を客観的に評価していくことの重要性も示唆された。2)両足連続跳躍を用いた予備調査幼児を対象とした両足連続跳び越しについての検討を参考に、調整力トレーニングに用いられるラダー(梯子状のトレーニング用具)を用いた規定間隔(50cm)での両足連続跳躍(10回の跳躍での前方移動)を測定課題として設定した。この測定課題を用いて、中学生男子を対象とした予備調査を行った。全体動作時間とあわせて各跳躍の時間的変動や姿勢変化について分析した結果、正確かつ迅速な両足連続跳躍という課題要求に対して複数の姿勢パターンが観察され、全体動作時間が短い被験者は、各跳躍の滞空および接地時間の時間的変動が小さく、全跳躍を通して下肢関節を屈曲させた重心の低い姿勢を維持する傾向がみられた。本研究の目的は調整力の基盤要素としての動的平衡性に着目し、移動系運動をベースとした動的平衡性課題を作成することである。全体的な計画としては、前方移動を含む既存項目を基にした予備調査より発達的変容の検討も可能な測定課題を作成、作成した測定課題を用いて本調査を実施していく。初年度である2018年度の計画は動的平衡課題の作成に向けた予備調査であったが、実際に既存項目を基にした両足連続跳躍を用いた予備調査の実施と動作過程の変動や姿勢変化等を中心とした動作分析を行った。よって、初年度は概ね計画通りに進めることができたといえる。引き続き初年度の予備調査を継続するが、2019年度は特に発達的変容に焦点をあて、幼児から中高生までを対象として両足連続跳躍を用いた測定を実施する。具体的には協力を依頼している連携機関での予備調査の実施、初年度と同様に全体動作時間の測定に加えて、対象者の全体動作を撮影し、各年代の動作特性について分析を進めていく予定である。交付決定額に応じて購入する物品を再検討した結果、申請時よりも物品を減らしたため端数の残額が生じた。この残額については翌年度分と合わせて測定調査の実施に必要な消耗品や旅費に使用する予定である。
膵癌に対する癌幹細胞を標的とした免疫療法の開発

膵癌患者癌細胞から樹立した細胞株を用いて、独自培養法により癌幹細胞様細胞を誘導することに成功した。これらの癌幹細胞様細胞は、癌幹細胞マーカー発現が親株と比較して亢進し、腫瘍形成能の亢進も見られた。さらに、親株と誘導膵癌幹細胞様細胞とについて、網羅的発現解析から誘導膵癌幹細胞様細胞における発現亢進タンパクを同定した。上記の発現亢進は、CD44 variantの発現とも関連し、ヒト膵癌臨床サンプルを用いての免疫組織染色解析から、膵癌幹細胞特異的タンパク候補の発現強度が、腫瘍径とともに膵癌患者の独立した予後規定因子であることを明らかとした。本研究は、癌幹細胞(CSC)を標的とした新たな診断・治療法を確立することを目的としている。当科で樹立したヒト膵癌細胞株(親株)を当科で開発した培養液を用い培養した。この方法で得られた細胞を、表面マーカーの発現、マウス腫瘍形成能、遺伝子発現について親株と比較した。Bio-Plexを用いて、親株とCSCの細胞内シグナル伝達の違い、培養液中のサイトカイン、ケモカインの違いを探索した。膵癌幹細胞とされるCD24+/CD44+/ESA+細胞の割合が親株で約0.6%であったが、当科特殊培養液により33.8%に増加した。免疫不全マウスで1,000個にて腫瘍形成能を確認した。間葉系マーカーであるVIM,FN1,SNAIL1,SLUG,ZEB1,SIP1遺伝子発現が癌よりも高く、上皮間葉転換(EMT)を起こしていることが示唆された。幹細胞のマーカーであるKIT,ALDHIA遺伝子発現も認め、幹細胞様性質を獲得していた。CSCの培養液にはG-CSF,IL-1beta,GM-CSF,IL-15,VEGF,IL-8,RANTES,IP-10,IL-7がより多く、親株の培養液にはIL-1ra,BasicFGF,IL-17,PDGF-BB,IL-2,IL-5が認められた。TGF-βは誘導されたCSCを維持している培養液中で高かった。細胞内シグナル伝達ではERK1/2、IGF-IR、NF-kB、p-53、STAT3のリン酸化(活性化)を測定し、親株とCSCで差があったものは、NF-kB,p-53,STAT3の3遺伝子でありいずれも親株において高い活性化が認められた。これらの結果から、CSCの特性をさらに探究することでCSCの診断・治療のターゲットを探索する。癌幹細胞は転移や治療抵抗性を示すことに大きく関与しているため近年注目されている。これまで癌治療のターゲットは文字通り癌であったため、その後の再発、転移が防げなかった可能性が有り、この癌幹細胞に対する治療法の確立は急務である。ところが、現在行われている癌の治療は、癌幹細胞の特性から転用しがたいことから、癌幹細胞を直接ターゲットとした免疫療法の開発を行うこととした。癌幹細胞の研究の困難な点は、癌組織中の癌幹細胞の割合が少ないため、多くの癌幹細胞を研究することが難しいことにある。我々は組織や癌細胞株からの癌幹細胞の誘導や長期培養が可能な独自のテクニックを開発(特許申請中)しており、この分野での研究に対して大きなアドバンテージを有している。本研究の目的は、これまで培ってきた新規タンパクの同定(プロテオミクス解析)やcDNAマイクロアレイによる遺伝子検索の豊富な経験を生かし、難治性の膵癌治療成績向上を目的に、膵癌幹細胞に対する免疫療法のターゲットを見出し、次世代型免疫療法を開発することである。これまでに、膵癌患者の癌細胞から当科にて樹立した細胞株(YPK2及びYPK5)から、独自培養法により癌幹細胞様細胞(YPK2-Lm及びYPK5-Lm)を誘導することに成功している。これにより、培養細胞集団から膵癌幹細胞集団について約100倍の濃縮が可能となった。これらの癌幹細胞様細胞は、癌幹細胞マーカーの一つであるCD44 variant, CD24, CD44, and ESAの発現及びALDH活性がそれぞれの親株と比較して亢進していた。さらに、上記癌幹細胞様細胞においてマウスへの移植実験から腫瘍形成能の亢進も見られた。これら、親株と誘導膵癌幹細胞様細胞とについて、網羅的発現解析結果(cDNAマイクロアレイ、二次元電気泳動、及びMALDI TOF/TOF MS)から誘導膵癌幹細胞様細胞における発現亢進が認められた2つの候補分子(タンパク)に絞って解析を進めた。これらの誘導膵癌幹細胞様細胞における発現亢進は、フローサイトメトリー解析においても再確認され、また、それらの発現はCD44 variantの発現と関連していた。

さらに、ヒト膵癌臨床サンプルを用いての免疫組織染色解析から、膵癌幹細胞特異的タンパク候補である上記2つの内一つの発現強度が、腫瘍径とともに膵癌患者の独立した予後規定因子であることを明らかとした。以上の結果から、上記のタンパクは、膵癌免疫療法のターゲットとなりうる膵癌幹細胞特異的タンパクであることが示唆された。この標的タンパクについて、免疫学的に反応性が高いペプチドの同定を膵癌患者PBMCを用いてのELISPOTアッセイにより検討を試みたが、膵癌患者PBMCは他癌腫患者PBMCと比較して免疫学的反応性が低く、実験条件の改良が必要であった。抗原刺激回数を増やすことで実験条件の改善が見られたことから、今後、免疫療法に適した抗原ペプチドの同定を進めていく。26年度が最終年度であるため、記入しない。消化器外科学26年度が最終年度であるため、記入しない。当科で開発した培養液によりヒト膵癌細胞株よりsphere細胞を誘導し、その細胞をLamininコートしたdishにて培養することにより、多数のCSCを誘導できる技術を開発した。CSCである証明として、表面マーカーの解析を行い、CSCが親株に比較して豊富に含まれていることを確認した。さらに、1,000個のCSCを免疫不全マウスに移植し、生着することを確認した。以上より、膵癌のCSC誘導については予定通り達成した。CSCの遺伝子解析および培養液の解析を行い、CSCの特徴や微小環境について探索し、重要な治験を得ることが出来た。これらの結果により、CSCの網羅的遺伝子解析および蛋白解析が確実に行える。膵癌幹細胞の誘導及び培養法を確立できたため、この技術を基に、膵癌幹細胞特異的新規遺伝子、蛋白的検索を行い、免疫学的主要癌抗原(immunodominant antigen)の検索を行う。われわれが得意としてきたマイクロアレイ(Cancer Res, 2002年: Oncogene, 2003年: LANCET, 2003年: LANCET, 2004年:LANCET, 2005年)と新規蛋白同定(Proteomics. 2005: Proteomics. 2006)の技術と蓄積した知識を駆使することで、癌幹細胞特異的抗原の同定を行っている。現在膵癌幹細胞とその親株の膵癌細胞株それぞれ2種類ずつ計4検体よりmRNAを抽出しマイクロアレイ解析を行っている。プロテオミクス解析に関してもそれぞれ同じ細胞の蛋白に対し二次元電気泳動を行い、ゲル間のディファレンシャル解析(スポットの定量解析)をGE社のImageMasterを使用して行った。ここで癌細胞と癌幹細胞で差が出たもの12スポットに関して、現在MALDI tof/tof型の質量分析計で分析を行っている。A.癌との共通抗原及び癌幹細胞特異的抗原の同定膵癌幹細胞の誘導及び培養法を確立できたため、この技術を基に、膵癌幹細胞特異的新規遺伝子(恒富亮一)、蛋白的検索(藏満保宏)を行い、免疫学的主要癌抗原(immunodominant antigen)の検索を行う。われわれが得意としてきたマイクロアレイ(CancerRes,2002年:Oncogene,2003年:LANCET,2003年:LANCET,2004年:LANCET,2005年)と新規蛋白同定(Proteomics. 2005 : Proteomics. 2006)の技術と蓄積した知識を駆使することで、癌幹細胞特異的抗原の同定を行う(浜本義彦)。B.同定した膵癌幹細胞