hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水酸化カルシウムスラリーを用いたチタンインプラントへの骨誘導性能付与

チタンインプラント周囲の骨形成を促進できる表面処理方法として、プラズマ溶射法によるハイドロキシアパタイト皮膜形成が実用化されているが、臨床においては、皮膜の剥離や溶解などの問題点も指摘されている。我々は、水酸化カルシウム(Ca(OH)_2)粉末と水を混練することにより調整したスラリー状処理剤中にチタン基材を埋没させ、そのまま加熱処理するという簡便な処理プロセスを用いることにより、その表面に骨形成の促進を期待できるチタン酸カルシウム皮膜を形成出来ることを明らかにした。本研究では、このプロセスにおける処理条件の最適化をおこない、さらに、小動物内における骨形成を評価した。最初にスラリー処理における熱処理温度が、形成皮膜に与える影響を調査した。600°C以上でチタン基材を処理した場合、その表面に、結晶化したチタン酸カルシウム皮膜を形成され、擬似体液液中において、リン酸カルシウムを迅速に析出できることがわかった。一方、処理温度を上げると二酸化チタンの厚膜が同時に形成し、皮膜の密着強度が低下する。次に、Ca(OH)_2スラリーにナトリウムイオンを混合させ、皮膜の生体適合性の向上を試みた。1MのNaOHまたはNaCl水溶液を用いてスラリーを調整すると、その表面に、チタン酸カルシウムとチタン酸ナトリウムの混合皮膜が形成され、リン酸カルシウム析出性能は向上するが、半面、形成する皮膜は厚く、機械的強度に劣ること示唆された。最後に、Ca(OH)_2粉末と水を混練したスラリーを用いて、熱処理温度600°Cで処理したチタンを、ラットに埋入して、その周囲組織を観察した。7日後、周囲組織では、活性な新生骨形成が観察され、新生骨の一部は試料と直接接していることがわかった。平成20年度においては、形成された被覆層の分析および擬似体液中での性能評価を行うことで、チタンの骨形成性能向上に最適な処理条件の見極めをおこなった。処理パラメータとして、(1)スラリー作製条件、(2)スラリーへのイオン添加、(3)熱処理条件、について検討した。検討の結果、(1)水酸化カルシウム粉末1gに対して蒸留水1mLを混合して作製したものが、処理剤として最適であること、(2)蒸留水を混合して作製したスラリーを用いると、チタン表面にチタン酸カルシウムが形成するが、Naイオンを含むスラリーで処理をおこなうと、チタン表面にチタン酸カルシウムとチタン酸ナトリウムの混合層が形成すること、(3)チタン酸カルシウムとチタン酸ナトリウムの混合層を持つチタン材料は、擬似体液中においてハイドロキシアパタイトを迅速に形成するが、表面被覆層の密着強度が弱いため処理層が剥離する可能性があり、生体材料としては不適であること、(4)熱処理条件としては、600°C以上が必要条件であり、650°Cが好適であること。また、処理温度を上げ過ぎると界面に二酸化チタンが形成するため、被覆層の密着強度が低下する恐れがあること、以上を明らかにすることが出来た。これらの成果は、今後の研究遂行において必要不可欠な基本的データであり、この成果を基に、平成21年度の研究を遂行し、本技術を実用化可能な医療技術として押し上げていくことを目指す。平成21年度は、スラリー状処理剤にチタン基材を埋入した後におこなう熱処理条件の影響を詳細に調べた。まず、熱処理温度を広範囲に変化させ、その結果として得られる皮膜の構造を種々の表面分析法を用いて明らかにした。さらに、作製されたこれら皮膜の生体活性、タンパク吸着挙動および耐食性を調べることで、種々の特性を併せ持つ、実用化に好適な処理温度の決定を試みた。検討の結果、(1)

処理温度600°C以上で、結晶化したチタン酸カルシウム(CT)皮膜を作製できること、(2)熱処理温度を上昇させると、CT皮膜の膜厚が増加すること、(3)熱処理温度700°C以上では、表面形状が粗くなること、(4)CT皮膜はチタンの生体活性を向上させるが、その性能は熱処理温度に依存しないこと、(5)CT皮膜は表面におけるタンパク吸着を抑制出来、その抑制効果は熱処理温度に依存しないこと、(5)CT皮膜はチタンの耐食性を向上できるが、熱処理温度800°Cでは耐食皮膜が不安定になること、(6)(1)(5)の結果から考察すると熱処理条件は650°C程度が好適であること、以上を明らかにした。これらの成果は、今後の研究遂行において必要不可欠な基本的データであり、この成果を基に、平成22年度の研究も遂行し、本技術を実用化可能な医療技術として押し上げていくことを目指す平成22年度は、水酸化カルシウムおよびハイドロキシアパタイトと蒸留水を混練して調整したスラリー状処理剤にチタン基材を埋没させて、大気中で熱処理することで形成した生体活性皮膜を有するチタン材料に関して、(1)調整の用いるハイドロキシアパタイト粉末の形状が処理皮膜の形成に与える影響を調べた、(2)熱処理温度が皮膜の形成および密着強度に与える影響を調べた、(3)ウイスター系ラットの大腿骨内に埋入し、埋没1週および4週後に屠殺した後、材料周辺組織を光学顕微鏡で観察することで、その骨形成性能を評価した。検討の結果、(1)皮膜を効率的に形成するためには、調整に用いる粉末の「比表面積」が重要であり、比表面積70m2/g以上のものを用いると良好な皮膜を形成することが出来る、また、この粉末で調整したスラリーで作製した試料は、擬似体液中においてリン酸カルシウムを1日以内に析出できる。(2)処理における熱処理温度を650°C以上に上昇させると、処理剤からの熱拡散が促進され、膜厚が厚い皮膜を形成することができる。しかし、膜厚が厚くなっても、擬似体液中におけるリン酸カルシウム析出性能は向上しない。また、皮膜が厚くなると密着強度は低下する。熱処理温度を500°C以下に設定すると、熱拡散が不十分となり、皮膜が形成しない。これらの実験結果から、本処理に最適な熱処理温度は、650°Cであると決定した。(3)スラリー処理を施したチタン材料は、ラット大腿骨内において、処理を施していないチタン材料よりも、迅速、かつ良好に骨を形成できた。この結果より、スラリー処理により、チタンの骨形成性能を促進できることが明らかとなった。以上の検討結果より、我々が開発したスラリーを用いた新表面処理により、医療用チタン材料に、骨形成性能を簡便付与できることが明らかとなった。
学校危機予防教育におけるスクールリーダーとチームの在り方に関する研究

2018年度は以下の研究に着手した。(1)スクールリーダーにおける危機予防の認知:学校危機予防の重要性が指摘される中、教員らがチームを組んで円滑に実施するにあたって学校運営の重要な役割を果たすスクールリーダーである学校長を対象とする認識の実態を明らかにした研究はない。そこで、学校危機予防に対する考え方と対応の理解、教員への指示について質問紙調査を実施した。(2)継続実施を可能とする予防教育におけるチームとしての在り方:予防教育が継続的に実践されている学校のスクールリーダーの予防教育に対する知識と対応、学校組織の構築について面接調査を実施した。また、コーディネーターの予防教育に関する考えや実施の工夫などについても面接調査を行った。その結果を分析し、学会等で発表する予定である。(3)継続実施を目指す予防教育の導入:学校長や管理職のリーダーシップ、そしてチームのコーディネーションをする教員へのコンサルテーションのもと、学校危機予防に向け、生徒の安全・安心やソーシャルスキルをベースラインにとってソーシャルエモーショナルラーニングを実施し、その教育効果を検討した。その結果、他者の情動に対する評価と認識が向上し、集団において他者を受容できるようになることが明らかとなった。この結果については学会で発表する予定である。(4)社会的活動への還元:学術領域以外においても社会的活動における成果としていじめ予防や情報モラル教育のための講座を行った。(5)予防教育を実施するにあたって、管理職の考え方や組織・支援体制の在り方を学校に定着させる視点から書籍や雑誌に書いた。研究計画で申請を予定した通り、ほぼすべてに着手し順調に進めている状況にある。2018年度に実施したことを2019年の学会で発表するためエントリーを行い、また、昨年には書籍や雑誌で研究の成果として書いている。もう少し進展させたいことは、実態調査と面接調査の分析結果に基づき、予防教育の定着に向けた導入や実践方法の仕様を明らかにし、その知見に基づいてコンサルテーションを行い、継続実施を可能とするスクールリーダーや管理職、組織の構築やチームとしての対応について、予防教育の継続実施や定着までを実現したいと考える。そこで、予防教育の導入・実施・定着における要因を整理し、カリキュラムマネジメントに向けた予防教育モデルを提示するため、具体的なガイドラインが明らかにできるよう実施したい。8月の学校心理学会、9月教育心理学会で発表する予定で、この近辺で研究計画を練る研究日を設ける。それまでに1年目の調査研究をまとめ、定着に関するスクールリーダーやコーディネートする担当者を対象とする面接のインタビューガイドの作成と同時に、協力校における実践を継続で行う。また、各学校の実践例を具体的にまとめていく中から、連携が実践されている場合は誰がどのようにつないでいくのか、定着はどこの段階で定着になり得るのか等を検討していきたい。この成果を次年度以降の研究として、実践が定着していくためのひな型、教材、さらには各学校のニーズや状況にあったプランを提供できるよう検討し、一般化できるような成果の出し方を考えている。

また、各学校の実践例を具体的にまとめていく中から、連携が実践されている場合は誰がどのようにつないでいくのか、定着はどこの段階で定着になり得るのか等を検討していきたい。この成果を次年度以降の研究として、実践が定着していくためのひな型、教材、さらには各学校のニーズや状況にあったプランを提供できるよう検討し、一般化できるような成果の出し方を考えている。2018年度に校長を対象に調査・分析において、調査依頼や調査がメールで行われ郵送代がかからなかったことに加えて、回答期間が予定の時期より遅くなったため、解析の時期は年度をまたいで行うこととした。そのため、未使用額が生じた。このため、解析を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。
視覚障害者の芸術鑑賞における触覚を介した形態認識と情緒に関する研究

本研究は、美術展示において視覚障害者が作品を味わう上で、形態認識の他に情緒性に働きかけるためにはどのような「配慮」を行うべきかという鑑賞環境としてのニーズを明らかにすることを目的としている。方法として、彫刻作品・立体作品を触れて鑑賞することについて、被験者パターン、作品パターン、支援パターンを組み合わせた鑑賞実験による調査を行い、形状認識の成績や、味わいにおける作品への肯定感などを調査する。それらのデータをまとめ、視覚障害者に適した鑑賞用レプリカのスケールサイズや、素材・質感の違いによるそれぞれの味わいの効果、音声ガイドの有効的な運用方法について明らかにしたいと考えている。
長期増強作用がキンドリング動物で広範な脳領域に拡延していく機構-Current source density analysis(電流密度解析法)による研究-

キンドリング刺激による長期増強作用(LTP)や脳波の後発射の全般化の機序を調べるためラット(または兎)の扁桃核にキンドリング刺激(10H_z、100パルスの矩形波)を与え、その刺激前と刺激後で嗅内野皮質に垂直に刺入したタングステン電極で50-100μm毎に単発刺激に対する反応に応じた電場電位を記録し、電流源密度(CSD)解析法により各部位でのシナプス電流の変化とキンドリングの発達の関係を明らかにした。なお刺激電極は前もって麻酔下で刺入し歯科用セメントで固定しておいた。キンドリング刺激前の電場電位は大脳皮質では検出されず海馬では通常電極刺入の全経路を通じて初期の陰性波(頂点潜時、約1420msec)に続く陽性波(頂点潜時、約2030msec)であったが嗅内野に電極がはいると最初は小さな陰性-陽性波であった反応が、ある深さで最大振幅(潜時、約1016msec)を示し、さらに深くなると陽性-陰性波にその位相を逆転した。後発射の増強や前身痙攣などのキンドリング効果発現後には嗅内野のみならず海馬の全ての部位で反応振幅が増大した。海馬では電場電位としては全て陰性-陽性波であったが、CSD解析を行なうと約100250μmの間隔をおいて主としてシナプス電流の流入源を示す部位、流出源を示す部位が層状構造をなしているのが明白になった。キンドリング獲得後は主たる流入源ならびに流出源の最大電流密度が約1.52.5倍に増大し、電場電位にくらべ各流入源、流出源ともにその始まり及び頂点の潜時がきわめて明白になり、海馬(特に浅層部)での密度曲線の頂点潜時が著明に短縮することがわかった。各記録部位の組織学的検索のため実験終了後の脳固定標本を保存しているが、その結果をCSD解析で得られた結果と比較検討すれば扁桃核から嗅内野を経て海馬にLTPが全般化していくプロセスを組織構造との関係から明白に出来る。
多目的型ICAI作成支援知識ベースシステムの研究

多目的型ICAIシステムを構築するためには,(1)各分野ごとに問題を解決するための問題解決器の設定(2)問題解決器に与えるドメインに関する知識及びそのメタ知識の付与(3)学生の理解状況を推測するための学生モデルの構築(4)教示を円滑化するためのインタフェースの作成が必要である.本研究では特に(2)(3)について,基本的研究を行なった.一般にICAIシステムを知識工学の手法を用いて実現をしようとすると,学習対象の問題を解くためのドメイン知識と,それに対応して学生が誤って用いると思われるバグに関する知識の整備が必要といわれている.しかし,バグに関する知識を集収し,学生がどの時点で誤った知識を用いたか推測することは非常に困難な問題である.発想を変えて,正しく問題を解くために必要な指針を教示してやることにより,誤った知識の適用を未然に防ぐようなシステム構築をめざした方が,多目的型ICAIの構築が容易となる.しかしながら,問題解決のノウハウ的知識を人間が与えることは決して容易でないため,システムが実際の例題を解く際に得た体験を一般化した技法をノウハウとして学習者に教示させることが必要となる.この目的を達成するために説明に基づく学習法を用いた戦略学習システムを作成した.また学生モデルとして,学生の理解状況をより適格に把握するものとして真理維持機構(TMS)を用いるのが望ましいため, TMSを作成した.多目的型ICAIシステムを構築するためには,(1)各分野ごとに問題を解決するための問題解決器の設定(2)問題解決器に与えるドメインに関する知識及びそのメタ知識の付与(3)学生の理解状況を推測するための学生モデルの構築(4)教示を円滑化するためのインタフェースの作成が必要である.本研究では特に(2)(3)について,基本的研究を行なった.一般にICAIシステムを知識工学の手法を用いて実現をしようとすると,学習対象の問題を解くためのドメイン知識と,それに対応して学生が誤って用いると思われるバグに関する知識の整備が必要といわれている.しかし,バグに関する知識を集収し,学生がどの時点で誤った知識を用いたか推測することは非常に困難な問題である.発想を変えて,正しく問題を解くために必要な指針を教示してやることにより,誤った知識の適用を未然に防ぐようなシステム構築をめざした方が,多目的型ICAIの構築が容易となる.しかしながら,問題解決のノウハウ的知識を人間が与えることは決して容易でないため,システムが実際の例題を解く際に得た体験を一般化した技法をノウハウとして学習者に教示させることが必要となる.この目的を達成するために説明に基づく学習法を用いた戦略学習システムを作成した.また学生モデルとして,学生の理解状況をより適格に把握するものとして真理維持機構(TMS)を用いるのが望ましいため, TMSを作成した.作成支援システムの枠組として、エキスパートシステムの枠組を利用した横型の前向きプロダクションシステムを作成し、ICAI記述システムとして機能しうるか否か調査した。具体例として一次方程式などの数式処理を扱った。まずシステム自身が方程式を自力で解けるためには、数式処理に必要な項の変形規則と、その規則をいかに適用するかに関する規則を含んだ問題解決能力が必要である。いま1つは、学習者が問題解決に用いた変形規則を推測し、学習者の誤りを訂正する機能である。どの変形ルールをどのような状況で使うべきかという制御の問題は、従来最初からシステムに与えるのが一般的手法であった。本研究ではこれを、学習の教示者として経験をつんだ教師から自動抽出する方法について考察した。教師の示した解法を模倣する規則の適用系列を探索し、適用系列を一般化することにより、あるクラスの問題を解く一般手法をシステムがまず学習する、しかる後、システムは同じクラスの問題を学習者に提示し、学習者の行動を分析する。この分析にあたっては、教師の解法分析と同じ手法が適用できるが、どうしても説明のつかない解系列に出あうなら、そこで学習者は誤っていることになる。そこでシステムは学習者に誤りを指摘すると同時に、そこから正しい解系列へ接続しうる部分解系列を探索し、それを学習者に提示することによって、学習者の犯す誤りに適応的に対処することができるようになった。
コレステロール代謝異常によるアルツハイマー疾患発症の解析

アルツハイマー型認知症(AD)の原因因子とされる脳内アミロイドβの沈着がコレステロール酸化代謝物のひとつである24S-ヒドロキシコレステロール(24S-HC)の脳内増加によって抑制される可能性が報告されてきた。その中、NCEH1欠損マウスの脳では野生型マウス脳に比べて24S-HCが有意に増加していた。そこで、NCEH1が脳内24S-HC量を規定することにより脳内アミロイドβの沈着を制御する可能性を検討した。アミロイドβ沈着やタウ蛋白の過剰なリン酸化による神経細胞死はAD発症の一因となるが、脳内24S-HCも神経細胞死を誘発する。そこで細胞実験ではACAT1阻害剤およびNCEH1阻害剤と24S-HCをSH-SY5Y細胞に作用させ、TUNEL染色法及びMTT assayにて細胞死を評価した。その結果、ACAT1阻害剤では24S-HCが誘発する細胞死を有意に抑制した。また、細胞内24S-HC含量をLC-MS/MSを用いて測定した結果、ACAT1阻害剤添加ではfree体が、NCEH1阻害剤添加ではester体が有意に増加した。次いでACAT1阻害剤及びNCEH1阻害剤の24S-HC添加時におけるAPP産生タンパク(APP、ADAM10、BACE-1、PS-1)への影響をwestern-blotting法にて評価した結果、24S-HC添加時に見られたAPPタンパクの発現増加は阻害剤添加では影響を与えなかった。さらに、ELISA法にてAβ分泌への影響を評価した結果、24S-HC添加時に見られたAβ1-40及びAβ1-42分泌低下はACAT1阻害剤でのみ抑制された。動物実験ではNCEH1欠損APP oligomer過剰発現マウスを樹立した。本マウス(10ヶ月齢)の脳切片を作製し、免疫組織化学染色法にてAβoligomerの蓄積を現在評価している。当初の研究計画ではADモデルマウス(3XTg-ADマウス)とNCEH1欠損マウスを交配させ、NCEH1欠損ADモデルマウスを初年度に樹立する予定だったが、交配マウスの作成期間短縮を目的に、他のADモデルマウス(APP oligomer Tgマウス)を交配に使用する計画にした。APP oligomer Tgマウス導入にあたり、凍結精子からの受精胚作成・移植を行ったが、着床は認められたが妊娠の維持がされず、胚盤胞期までの発生状態を確認し、再度IVFによる受精胚の生産後、胚移植と凍結保存を行い、個体作成を行った為に動物実験に遅延が生じた。ADモデルマウスの個体作成に遅延が生じ、その解析も延期されたため、次年度使用額が生じた。中性コレステロールエステル水解酵素(NCEH1)を発現するマウス臓器(特に脳、心臓、腎臓、副腎)のオキシステロール類をLC-MS/MSを用いて定量した結果、NCEH1欠損マウスの脳では野生型マウス脳に比べて24S-HCが有意に増加していた。また、記憶を司る脳海馬領域におけるACAT1およびNCEH1の発現量をreal-time PCRを用いて腹腔マクロファージ(MPM)と比較した結果、海馬ではACAT1, NCEH1ともにMPMよりも発現量が高かった。そこで、NCEH1が脳内24S-HC量を規定することにより脳内アミロイドβの沈着を制御する可能性を動物実験及び細胞実験で検討した。動物実験では、初年度にADモデルマウス(3XTg-ADマウス)とNCEH1欠損マウスを交配させ、NCEH1欠損ADモデルマウスを作成する計画だったが、マウス導入が遅れ、現在マウス導入中である。アミロイドβ沈着やタウ蛋白の過剰なリン酸化による神経細胞死はAD発症の一因となるが、脳内24S-HCも神経細胞死を誘発することから、細胞実験ではACAT1阻害剤およびNCEH1阻害剤と24S-HCをヒト神経芽細胞(SH-SY5Y細胞)に作用させ、TUNEL染色法及びMTT assayにて細胞死を評価した。その結果、ACAT1阻害剤では24S-HCが誘発する細胞死を有意に抑制したが、NCEH1阻害剤では有意な影響は見られなかった。また、細胞内24S-HC含量をLC-MS/MSを用いて測定した結果、ACAT1阻害剤添加時にはfree体が、NCEH1阻害剤添加時にはester体の有意な増加が見られた。ADモデルマウス(3XTg-ADマウス)とNCEH1欠損マウスを交配させ、NCEH1欠損ADモデルマウスを初年度に樹立する予定だったが、3XTg-ADマウスとNCEH1欠損マウスとの交配マウスの作成期間の短縮を目的に、他のADモデルマウス(APPsw Tg)を交配に使用する計画にした。ADモデルマウス導入にあたり、凍結精子からの受精胚作成・移植を行ったが、着床は認められたが妊娠の維持がされなかった。現在、胚盤胞期までの発生状態を確認し、再度IVFによる受精胚の生産後、胚移植と凍結保存を行い、個体作成を継続する予定である。その中、NCEH

1欠損マウスの脳では野生型マウス脳に比べて24S-HCが有意に増加していた。そこで、NCEH1が脳内24S-HC量を規定することにより脳内アミロイドβの沈着を制御する可能性を検討した。当初の研究計画ではADモデルマウス(3XTg-ADマウス)とNCEH1欠損マウスを交配させ、NCEH1欠損ADモデルマウスを初年度に樹立する予定だったが、交配マウスの作成期間短縮を目的に、他のADモデルマウス(APP oligomer Tgマウス)を交配に使用する計画にした。APP oligomer Tgマウス導入にあたり、凍結精子からの受精胚作成・移植を行ったが、着床は認められたが妊娠の維持がされず、胚盤胞期までの発生状態を確認し、再度IVFによる受精胚の生産後、胚移植と凍結保存を行い、個体作成を行った為に動物実験に遅延が生じた。アルツハイマー型認知症(AD)の原因因子とされる脳内アミロイドβの沈着がコレステロール酸化代謝物のひとつである24S-ヒドロキシコレステロール(24S-HC)の脳内増加によって抑制される可能性が報告されてきた。その中、NCEH1欠損マウスの脳では野生型マウス脳に比べて24S-HCが有意に増加していた。アミロイドβ沈着やタウ蛋白の過剰なリン酸化による神経細胞死はAD発症の一因となるが、脳内24S-HCも神経細胞死を誘発する。そこで細胞実験ではACAT1阻害剤およびNCEH1阻害剤と24S-HCをSH-SY5Y細胞に作用させ、TUNEL染色法及びMTT assayにて細胞死を評価した。その結果、ACAT1阻害剤では24S-HCが誘発する細胞死を有意に抑制した。また、細胞内24S-HC含量をLC-MS/MSを用いて測定した結果、ACAT1阻害剤添加ではfree体が、NCEH1阻害剤添加ではester体が有意に増加した。次いでACAT1阻害剤及びNCEH1阻害剤の24S-HC添加時におけるAPP産生タンパク(APP、ADAM10、BACE-1、PS-1)への影響をwestern-blotting法にて評価した結果、24S-HC添加時に見られたAPPタンパクの発現増加は阻害剤添加では影響を与えなかった。さらに、ELISA法にてAβ分泌への影響を評価した結果、24S-HC添加時に見られたAβ1-40及びAβ1-42分泌低下はACAT1阻害剤でのみ抑制された。動物実験ではNCEH1欠損APP oligomer過剰発現マウスを樹立した。本マウス(10ヶ月齢)の脳切片を作製し、免疫組織化学染色法にてAβoligomerの蓄積を現在評価している。
CaMKIIはシナプスでタンパク質を集積させ活性化するハブとして機能する

神経細胞のシナプスには多数のタンパク質が密集し複雑なシグナル経路を形成しているが、なぜ密集するのか、なぜ複雑な経路が破綻しないのかわかっていない。主要なシナプスタンパク質のカルシウム/カルモデュリン依存性キナーゼII(CaMKII)はキナーゼでありながらもキナーゼらしからぬ、構造タンパク質に類似した特徴も持っている。そこで我々はCaMKIIのキナーゼと構造タンパク質の二面性が、多数のタンパク質をシナプスに密集させ、同時に複雑なシグナル経路を制御している、いわばハブのような役割を果たしているという仮説を立てた。本研究はこの仮説を証明することでシナプスの構造と性質を明らかにし記憶・学習・疾患の解明に貢献することを目的としている。CaMKIIのシナプス後肥厚(PSD)における役割を探るため、FRET技術を用いてPSDのCaMKIIの活性を測定したところ、半数近くのCaMKII分子が活性化状態にあることが明らかになった。そこでCaMKIIの阻害剤を用いて下流基質のリン酸化状態を観察したところ、徐々にリン酸化を失っていくことが分かった。これらのことは、CaMKIIが定常状態のシナプスにおいてシグナル伝達を制御していることを示している。そこでPSDにおけるCaMKIIの結合パートナーを質量分析により網羅的に探索したところ、既知の結合パートナーを含む多数の蛋白質が同定された。これらの蛋白質とCaMKIIの結合は生化学的手法によっても確認された。この結合の生理的意義を調べるため、香港科技大学との共同研究のもと、人工PSDを用いた。これは精製したPSDタンパク質を混合していくことでPSDと似た性質を持つ構造体をin vitroで作成する手法である。CaMKIIの存在下でカルシウムを添加しCaMKIIを活性化させたところ、PSDの顕著な拡大が見られた。このことは本研究の仮説であるCaMKIIの構造的役割を強く示唆している。SA1:T-site変異CaMKIIのアフィニティーカラムを用いて質量分析により神経細胞抽出物からT-site特異的な結合タンパク質を同定する。SA2:生化学・遺伝子改変手法により結合の確認、結合部位の同定、結合の結果として基質のリン酸化およびCaMKII活性の測定を行う。SA3:二光子顕微鏡下の海馬スライスを用いシナプス構造に摂動を与えるため単一スパインにLTPを誘導するグルタミン酸脱ケージ化手法を主軸とし、GFPを融合した候補タンパク質がLTP誘導によりスパインへ集積すること、その集積がCaMKIIに依存すること、T-site変異CaMKIIに候補タンパク質を集積させる能力が無いことを確かめる。さらにFRET FLIMにより結合を証明し、結合部位を欠損させた候補タンパク質を用いてこの結合がスパインの拡大と維持に必須であることを証明する。本研究は、シナプス構造の革新的なモデルとシナプス可塑性の新たなメカニズムを提案しつつ、CaMKIIの不自然な量の多さ・特徴的構造・無意味にも見える局在変化・高すぎる定常活性といった謎を合理的に説明するものである。将来的には、この新しいモデルの特性を利用し、創薬ターゲットの提案につなげていきたい。SA1CaMKII T-site結合因子の網羅的探索:これまで我々はTIAM1とLIMK1の2つのアクチン制御経路にある情報伝達因子がいずれもCaMKII T-siteに結合し、活性化されることを示した。そこで本研究では網羅的にCaMKII T-siteに結合できるタンパク質を探索した。ラット海馬のPSD画分から野生型もしくはT-site変異体のI205K変異体のCaMKIIを用いて結合タンパク質を取得し、質量分析を行なった。その結果、既知の結合タンパク質であるNR2Bをはじめ、足場タンパク質として知られるDLGファミリー、その結合タンパク質であるDLGAPファミリーやSynGAPやShankなど神経疾患とかかわりの深いタンパク質がCaMKIIのt-site結合タンパク質として同定された。SA2同定された分子のCaMKIIによる機能調節: SA1で同定されたタンパク質群をproteomicsならびにinformaticsの手法により順位付けし、信頼性の高いタンパク質についてcDNAを入手し、哺乳細胞発現ベクターを構築した。CoIPによる実験でDLGやSynGAPと有意に結合することが示された。また、CaMKIIのリン酸化基質を網羅的に探索するためCaMKIIに特異的な阻害剤を処理したサンプルを質量分析で解析した。CaMKIIによりリン酸化されるタンパク質の中には結合タンパク質として同定されていたものも多い。SA3同定された分子のCaMKII結合によるシナプスへの集積およびその集積がシナプス構造変化(構造的LTP)に必須である証明:SA2により期待のできる候補分子が複数挙がってきている。シナプス機能に重要であることが既に分かっているSynGAPとCaMKIIの結合をFRETFLIMにより観察したところ、LTP誘導によりこれらの分子は速やかかつ強力に結合することが示された。

主要なシナプスタンパク質のカルシウム/カルモデュリン依存性キナーゼII(CaMKII)はキナーゼでありながらもキナーゼらしからぬ、構造タンパク質に類似した特徴も持っている。そこで我々はCaMKIIのキナーゼと構造タンパク質の二面性が、多数のタンパク質をシナプスに密集させ、同時に複雑なシグナル経路を制御している、いわばハブのような役割を果たしているという仮説を立てた。本研究はこの仮説を証明することでシナプスの構造と性質を明らかにし記憶・学習・疾患の解明に貢献することを目的としている。CaMKIIのシナプス後肥厚(PSD)における役割を探るため、FRET技術を用いてPSDのCaMKIIの活性を測定したところ、半数近くのCaMKII分子が活性化状態にあることが明らかになった。そこでCaMKIIの阻害剤を用いて下流基質のリン酸化状態を観察したところ、徐々にリン酸化を失っていくことが分かった。これらのことは、CaMKIIが定常状態のシナプスにおいてシグナル伝達を制御していることを示している。そこでPSDにおけるCaMKIIの結合パートナーを質量分析により網羅的に探索したところ、既知の結合パートナーを含む多数の蛋白質が同定された。これらの蛋白質とCaMKIIの結合は生化学的手法によっても確認された。この結合の生理的意義を調べるため、香港科技大学との共同研究のもと、人工PSDを用いた。これは精製したPSDタンパク質を混合していくことでPSDと似た性質を持つ構造体をin vitroで作成する手法である。CaMKIIの存在下でカルシウムを添加しCaMKIIを活性化させたところ、PSDの顕著な拡大が見られた。このことは本研究の仮説であるCaMKIIの構造的役割を強く示唆している。SA2同定された分子のCaMKIIによる機能調節:CaMKIIとの結合が候補タンパク質の機能変化を誘導するかどうかについて、候補タンパク質単独およびCaMKII存在下で活性を測定する。CaMKIIによる活性化が認められれば、それがT-site相互作用によるのか、またリン酸化を介するのかをCaMKIIのI205K変異体やキナーゼ活性がないK42R変異体で検討する。候補タンパク質側のT-siteとの相互作用をしない変異体を用い、CaMKIIが結合しなくなる事を示す。SA3同定された分子のCaMKII結合によるシナプスへの集積およびその集積がシナプス構造変化(構造的LTP)に必須である証明:引き続きFRET-FLIMを用いてLTP誘導時の候補タンパク質とCaMKIIの結合を観察していく。特に、SA2によって同定された、結合タンパク質でありかつリン酸化基質でもあるような候補はPSDにおけるCaMKIIのハブ機能と密接にかかわっていると考えられるため、優先的に解析を進めていきたい。
位相差X線CTと数値流体解析による小児肺静脈狭窄病変の病態解明

本研究では、肺静脈狭窄部位が位相差X線CTで1どの様な組織密度で観察されるのか、2組織密度は免疫染色所見とどの様に対応するのか(細胞分布との対応はどうか)、3組織密度と壁ずり応力(WSS)との関連はどうかを明らかにする。これにより、肺静脈狭窄の発症の起因とされる4筋線維芽細胞の分布とWSSの関連を明らかにし、より根治性の高い治療法を開発することを目的とする。本年度は、1については共同研究施設から得られた肺静脈狭窄病変以外の心標本(エブスタイン奇形・房室中隔欠損・大動脈弁狭窄症など)を用いてSPring-8にて撮像を行い、左心房-肺静脈接合部の特徴について観察を行った。また、上記疾患の特異な刺激伝導系の走行を可視化することに成功し、これらの成果については日本心臓血管外科学会・日本胸部外科学会において発表を行った。3については当院で撮影された肺静脈狭窄病変の患者のMD-CTから肺静脈狭窄部を立体構築し、ANSYS Academic Research CFD(ANSYS Inc)を用いて流体力学的にWSS及びstream lineを作成した。これについては今年度の日本心臓血管外科学会などにおいて報告予定である。また、左心房への肺静脈還流血流量の経食道心エコー検査による定量的評価について研究を行い、PV-VTIが肺血流に相関し肺血流量の有用な指標であることをEACTS(欧州胸部外科学会)において発表し、発表内容は論文掲載された。SPring-8での撮影は年に2回に限られており、また肺静脈狭窄病変の心標本は非常に希少であるため撮影の機会が想定されていたよりも少なかった。しかし、肺静脈以外の位相差X線CT撮影が順調に進んでおり、これまでに報告の無かった心奇形の撮影技術と読影は確立出来たとと考えている。また、ANSYS CFDでの肺静脈及び左房接合部での血流の可視化とWSSなどの測定も通常のMD-CTから作成された3次元モデルから行っているが、対象が小児であり血管口径が非常に小さく測定誤差が生じている。これについては今後、位相差X線CTでより精度の高いモデルを作成することで解決できると考えている。肺静脈狭窄病変の心標本で位相差X線CTの撮影を行い、肺静脈狭窄病変部位の精密な形態・血管壁構造の観察を今年度行う予定である。これにより作成された3次元モデルを用いてANSYSCFDにより肺静脈狭窄病変部位での血流をstream lineを構築して観察し、血管壁への壁ずり応力(WSS)分布についても研究を行い、当初の仮説であるWSSが肺静脈狭窄病変の進行に関与しているかの検証を行う。共同研究者らと位相差X線CTを用いて複雑心奇形の刺激伝導系の詳細な検討を行い、学会及び論文発表を行った。また、先天性心疾患において肺静脈狭窄と同様の進行性血管病変を有する大動脈縮窄症における動脈管組織迷入の範囲などを免疫組織学的な所見と比較し同様に発表を行った。肺静脈狭窄病変は比較的頻度が低く標本も貴重であるため、まず今年度は当施設で経験した過去の肺静脈狭窄病変の通常のCT画像を用いて三次元した画像を元にSTL化を行い、汎用流体解析ソフトウェアANSYS Academic Research CFD(ANSYS Inc, Tokyo, Japan)を用いて数値流体解析(computed fluid dynamics: CFD)を行い、肺静脈の血流を可視化するとともに壁ずり応力分布(WSS)とstream lineを作成する研究から開始している。複雑心奇形の小児の肺静脈狭窄は口径も小さく通常のCTではSTL化が困難であったが、他施設などからCT撮像条件や解析方法などの情報を得て徐々に描出・可視化が可能となった。次年度は位相差X線CTでのより詳細な画像を用いてこれまでに経験し確立した手法からCFD解析を行う予定である。複雑心奇形の小児の肺静脈狭窄は口径も小さく通常のCTではSTL化が困難であったが、他施設などから情報を得て徐々に解析が可能となった。このデータをもとに現在CFD解析を行っている状態である。

本年度は、1については共同研究施設から得られた肺静脈狭窄病変以外の心標本(エブスタイン奇形・房室中隔欠損・大動脈弁狭窄症など)を用いてSPring-8にて撮像を行い、左心房-肺静脈接合部の特徴について観察を行った。また、上記疾患の特異な刺激伝導系の走行を可視化することに成功し、これらの成果については日本心臓血管外科学会・日本胸部外科学会において発表を行った。3については当院で撮影された肺静脈狭窄病変の患者のMD-CTから肺静脈狭窄部を立体構築し、ANSYS Academic Research CFD(ANSYS Inc)を用いて流体力学的にWSS及びstream lineを作成した。これについては今年度の日本心臓血管外科学会などにおいて報告予定である。また、左心房への肺静脈還流血流量の経食道心エコー検査による定量的評価について研究を行い、PV-VTIが肺血流に相関し肺血流量の有用な指標であることをEACTS(欧州胸部外科学会)において発表し、発表内容は論文掲載された。SPring-8での撮影は年に2回に限られており、また肺静脈狭窄病変の心標本は非常に希少であるため撮影の機会が想定されていたよりも少なかった。しかし、肺静脈以外の位相差X線CT撮影が順調に進んでおり、これまでに報告の無かった心奇形の撮影技術と読影は確立出来たとと考えている。また、ANSYS CFDでの肺静脈及び左房接合部での血流の可視化とWSSなどの測定も通常のMD-CTから作成された3次元モデルから行っているが、対象が小児であり血管口径が非常に小さく測定誤差が生じている。これについては今後、位相差X線CTでより精度の高いモデルを作成することで解決できると考えている。Spring-8内の中尺ビームラインから得られる放射光の先端に位相差X線CT装置を設置し、放射光を利用した位相差画像を検出する。(10%ホルマリン固定,標本サイズ: 38mm x 38mm x 45mm:; X線出力25 keV)位相差X線CTから得られた肺静脈狭窄部の肥厚内膜内の組織密度(Mass Density)と免疫染色切片所見との3次元的な符合性を比較検討する。これにより筋線維芽細胞・膠原繊維・弾性線維が位相差X線CTでどの様な組織密度で描出されるかを確認する。特に筋線維芽細胞の増生が肺静脈狭窄に大きく関与していることがこれまでに判明しているため、筋線維芽細胞の組織密度に着目して測定・比較を行う。さらに得られた3D画像からANSYS Academic Research CFDを用いて狭窄部に加わるWSSなどを測定する。肺静脈狭窄病変の心標本で位相差X線CTの撮影を行い、肺静脈狭窄病変部位の精密な形態・血管壁構造の観察を今年度行う予定である。これにより作成された3次元モデルを用いてANSYSCFDにより肺静脈狭窄病変部位での血流をstream lineを構築して観察し、血管壁への壁ずり応力(WSS)分布についても研究を行い、当初の仮説であるWSSが肺静脈狭窄病変の進行に関与しているかの検証を行う。平成29年度は対象疾患が希少であるため、実際の標本の切片化や撮像よりも先にANSYSを用いたCFDモデル作成を行うことが必須であると考えられたため、解析用ソフトとPCのみを購入し、計上しておいた免疫染色などの試薬を購入しなかった。
ペプチド抗癌剤の物理理論に基づく高速探索法の開発

次世代抗癌剤候補としてペプチド製剤への期待が高まりつつあるが、わずか10残基のペプチドであっても10兆を超える組み合わせがあるので、実験のみによる創薬は困難かつ高コストである。そこで本課題では、ペプチド抗癌剤候補を物理理論に基づいて高速に探索する手法を開発する。このために、「生体分子同士の結合の駆動力を詳細に解析するための方法論(統計力学理論+分子シミュレーション)」および「物理理論のエッセンスを抽出した自由エネルギー関数」を駆使する。具体的には、抗腫瘍蛋白質p53の働きを阻害する蛋白質MDM2に結合して、MDM2を無効化する新規抗癌剤候補ペプチドの理論的設計・実験による合成に取り組む。
超高圧下における新充填スクッテルダイト化合物の物質開発

充填スクッテルダイト化合物は組成により異方的超伝導、重い電子系的振舞、金属-絶縁体転移、多極子転移など様々な異常物性を示すことが知られている。この変化に富んだ物性はこの系の結晶構造の特異性、電子構造の特異性及び希土類4f電子の不安定性に起因していると考えられている。本研究では新充填スクッテルダイト化合物を高圧合成法により作成し、その基礎物性を評価することにより、この系に特有な異常物性を浮き彫りにさせ、新物質開発を通して物性物理学の新分野を開拓することを目的とする。本申請により購入した超高圧合成装置(室蘭工業大学、平成16年2月設置)を用いて、圧力範囲520GPa、温度範囲6001600°Cにおいて新充填スクッテルダイト化合物の合成を行った。その結果、重希土類元素のHo,Er,Tm,Yb及びYを含む充填スクッテルダイト化合物の合成に成功した。重希土類元素を含む充填スクッテルダイト化合物の試料合成は極めて難しく、合成したバルク試料の一部分だけが単一相となる場合も少なくない、このような試料の微小領域の評価には本申請で購入した湾曲IP X線装置が不可欠であった。また、二元系のCoP_3、RhP_3に希土類元素を部分的に充填した系Ln_xCo_4P_<12>、Ln_xRh_4P_<12>(Ln=希土類元素)の合成も試みた。その結果、いくつかの試料の合成に成功し、超伝導など興味深い現象を見出した。La_xRh_4P_<12>はLaの充填率が100%に近い試料の合成に成功し、充填スクッテルダイト化合物で最も転移温度の高い超伝導体(T_c=18K)であることが分かった。充填スクッテルダイト化合物は一般式MT_4X_<12>(M=希土類元素など、T=Fe,Ru,Os、X=プニコゲン元素)で表され、異方的超伝導、四極子転移など強相関系特有の興味深い物性を示す。これらは軽希土類を含む充填スクッテルダイト化合物である。我々は高圧合成法を用いて、重希土類の入る新スクッテルダイト化合物の合成を試み、新物質開発に成功した。Fe系のLnFe_4P_<12>(Ln=Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Yb,Lu,Y)を系統的に高温、高圧下で合成し、これらの物性を研究した。ここで、Gd,Tb,Dy,Ho,Er化合物は強磁性、Lu,Y化合物は超伝導、Tm,Ybは常磁性で、価数揺動する可能性があることを見出した。Ru系では、LnRu_4P_<12>(Ln=Gd,Tb,Y)の3種類しか合成できていない。Gd,Tb化合物は反強磁性体になり、Fe系やOs系化合物とは異なる振舞いをした。YRu_4P_<12>は9K付近で超伝導状態に転移した。Os系ではLnOs_4P_<12>(Ln=Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Y)の新スクッテルダイト化合物を合成した。Eu,Gd,Tbの化合物は強磁性、Smの化合物は反強磁性を示す。、Dy,Ho化合物は常磁性で、Fe系化合物と異なっている。YT_4P_<12>(T=Fe,Ru,Os)は3つとも超伝導を示し、これらのT_cはLaT_4P_<12>(T=Fe,Ru,Os)よりもすべての化合物で高い。スクッテルダイトにはTX_3(T=Co,Rh,Ir ; X=プニコゲン元素)で表される2成分系の化合物も知られている。TX_3は欠陥構造をもつので、そこに金属原子を充填することができる。我々はCoP_3及びRhP_3に希土類元素を高温高圧下でドープし、NdCo_4P_<12>,やLaRh_4P_<12>などを合成した。4GPa下で合成した時、NdやLaの充填率は5060%である。NdCo_4P_<12>は反強磁性、LaRh_4P_<12>では超伝導になることを発見した。特にLaRh_4P_<12>のT_cは18Kに達し、スクッテルダイト化合物の中では言うままでもなく、金属リン化物の中で最もT_cが高い。さらに金属元素の充填率を上げるには超高圧下での合成が重要になる。

本申請により購入した超高圧合成装置(室蘭工業大学、平成16年2月設置)を用いて、圧力範囲520GPa、温度範囲6001600°Cにおいて新充填スクッテルダイト化合物の合成を行った。その結果、重希土類元素のHo,Er,Tm,Yb及びYを含む充填スクッテルダイト化合物の合成に成功した。重希土類元素を含む充填スクッテルダイト化合物の試料合成は極めて難しく、合成したバルク試料の一部分だけが単一相となる場合も少なくない、このような試料の微小領域の評価には本申請で購入した湾曲IP X線装置が不可欠であった。また、二元系のCoP_3、RhP_3に希土類元素を部分的に充填した系Ln_xCo_4P_<12>、Ln_xRh_4P_<12>(Ln=希土類元素)の合成も試みた。その結果、いくつかの試料の合成に成功し、超伝導など興味深い現象を見出した。La_xRh_4P_<12>はLaの充填率が100%に近い試料の合成に成功し、充填スクッテルダイト化合物で最も転移温度の高い超伝導体(T_c=18K)であることが分かった。
テロメア・テロメラ-ゼ活性から見た卵巣機能の評価

テロメラ-ゼ活性は1994年にテロメラーゼ反応産物をPCR法にて増幅して検出するTRAP法が発表されて以来、様々な組織及び細胞で測定されるようになった。テロメラーゼ活性の強い細胞は、不死化能、無限増殖能を獲得した細胞と考えられている。癌組織では癌の診断および治療への応用にむけ多くの研究が進められている。しかし高度に増殖能を有する生殖細胞に関しての研究、とくに卵胞発育、卵の受精および胚発育の過程において、テロメラーゼ活性がどのように関与するかについては、ほとんど研究されていない。今回、テロメラーゼ活性と卵、および胚の発育過程との関連について検討した。まず卵を取り囲む卵丘顆粒膜細胞、及び卵胞壁を内側から囲む壁側顆粒膜細胞に着目し、体外受精の採卵時に個々の卵胞ごと個別採卵を行い、採取されたヒト卵丘顆粒膜細胞及び壁側顆粒膜細胞のテロメラーゼ活性の存在の有無と、もし存在するとすればその部位による発現の差が存在するかについて、TRAP(stretch PCR)法を用いて測定した。今回の検討ではヒト卵丘顆粒膜細胞及び壁側顆粒膜細胞には、常にテロメラーゼ活性が存在する事が明らかとなったが、顆粒膜細胞の部位による活性の差は認められなかった。卵及び胚におけるテロメラーゼ活性の測定は、倫理的にヒトの卵・胚を用いる事が不可能なため、マウス卵を用いて行った。PMSG及びHCGにて過排卵処理を行ったマウスを用い、matingしなかったマウスより未受精卵を、matingしたマウスより受精卵を各stageで回収した。その結果テロメラーゼ活性は未受精卵で活性が高く、受精卵はstageが進むにつれて活性が低下した。しかし胞胚期になると活性が上昇した。今回の研究では、発育した卵胞の卵・顆粒膜細胞の両者にテロメラーゼ活性が存在し、かつテロメラーゼ活性は卵の受精・胚発育の過程で変動する事が明らかとなった。細胞の老化や癌化にテロメア、テロメアーゼが深く関与することが報告され、とくに癌の悪性度とテロメアーゼ活性が相関することが、種々の癌細胞で報告されるようになった。また、正常の細胞のうちでも生殖細胞である、精巣や卵巣においてもテロメアーゼ活性が認められている。そこで本研究では卵胞の発育の主成分である顆粒膜細胞にテロメアーゼ活性が存在するか、またテロメアーゼ活性が、卵胞の発育にどのような影響を及ぼしているのかについて検討する。まず、ヒトの体外受精治療時に得られる顆粒膜細胞にテロメアーゼ活性が存在するかについて検討した。ヒト体外受精の採卵時に得られた卵胞液をパーコルグラディエント法にかけて血球成分を取り除き、壁側顆粒膜細胞を採取した。卵-卵丘塊から26G針を用い機械的に卵丘顆粒膜細胞を採取した。これらの細胞はPBS(-)にて2回洗浄し、顆粒膜細胞のテロメアーゼ活性を測定した。1.テロメアーゼの抽出:顆粒膜細胞ペレットを1×CHAPS溶解液を用いて抽出し、30分間氷上で30分間インキュベートし、4°C、12000gで20分間遠心し、上清を用いた。2.反応混合物の調整:1アッセイ当たり、10×TRAPバッファー5.0μ1、50×dNTPs混合物1.0μ1、TSプライマー1.0μ1、TRAPプライマー混合物1.0μ1、Taqポリメラーゼ0.4μ1、dH_2O39.6μ1を氷上にて混合し、サンプルをそれぞれ2μ1ずつ加えた。3.テロメアーゼ伸長反応:30°C,30分間インキュベートした。4.PCR増幅:94°C30秒、60°C30秒、72°C30秒の3ステップにて40サイクルおこなった。5.12.5%ポリアクルアミドゲル電気泳動およびデータ解析:ロ-ディング色素をサンプルに加え、そのうちの25μ1をゲルにアプライし、500Vで1時間泳動した。その後エチディウムブロマイドで10分間染色し、画像解析装置にて解析を行った。以上より卵丘顆粒膜細胞、壁側顆粒膜細胞の両細胞にテロメアーゼ活性を認めた。体外受精で採取される卵胞の顆粒膜細胞は卵胞発育の方向に向いた顆粒膜細胞であり、この細胞にテロメアーゼ活性を認めたことは、テロメアーゼ活性を用いて、卵胞の発育閉鎖の機序を明らかにできる可能性が示しており、今後さらに卵胞の発育閉鎖とテロメアーゼ活性との関連について検討する。

まず卵を取り囲む卵丘顆粒膜細胞、及び卵胞壁を内側から囲む壁側顆粒膜細胞に着目し、体外受精の採卵時に個々の卵胞ごと個別採卵を行い、採取されたヒト卵丘顆粒膜細胞及び壁側顆粒膜細胞のテロメラーゼ活性の存在の有無と、もし存在するとすればその部位による発現の差が存在するかについて、TRAP(stretch PCR)法を用いて測定した。今回の検討ではヒト卵丘顆粒膜細胞及び壁側顆粒膜細胞には、常にテロメラーゼ活性が存在する事が明らかとなったが、顆粒膜細胞の部位による活性の差は認められなかった。卵及び胚におけるテロメラーゼ活性の測定は、倫理的にヒトの卵・胚を用いる事が不可能なため、マウス卵を用いて行った。PMSG及びHCGにて過排卵処理を行ったマウスを用い、matingしなかったマウスより未受精卵を、matingしたマウスより受精卵を各stageで回収した。その結果テロメラーゼ活性は未受精卵で活性が高く、受精卵はstageが進むにつれて活性が低下した。しかし胞胚期になると活性が上昇した。今回の研究では、発育した卵胞の卵・顆粒膜細胞の両者にテロメラーゼ活性が存在し、かつテロメラーゼ活性は卵の受精・胚発育の過程で変動する事が明らかとなった。テロメラーゼ活性は1994年にテロメラーゼ反応産物をPCR法にて増幅して検出するTRAP法が発表されて以来、様々な組織及び細胞で測定されるようになった。テロメラーゼ活性の強い細胞は、不死化能、無限増殖能を獲得した細胞と考えられている。癌組織では癌の診断および治療への応用にむけ多くの研究が進められている。しかし高度に増殖能を有する生殖細胞に関しての研究、とくに卵胞発育、卵の受精および胚発育の過程において、テロメラーゼ活性がどのように関与するかについては、ほとんど研究されていない。今回、テロメラーゼ活性と卵、および胚の発育過程との関連について検討した。今回の検討ではヒト卵丘顆粒膜細胞及び壁側顆粒膜細胞には、常にテロメラーゼ活性が存在する事が明らとなったが、顆粒膜細胞の部位による活性の差は認められなかった。今回の研究では、発育した卵胞の卵・顆粒膜細胞の両者にテロメラーゼ活性が存在し、かつテロメラーゼ活性は卵の受精・胚発育の過程で変動する事が明かとなった。