hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本古代律令期に敷設された直線的計画道の復原的研究

3.立石について-地名「立石」または実在の立石は,駅路に関係するものが多いことは,既に本研究代表者が指定しているが,今回の調査においても数例を加えた. 4.道筋確認について-既に確認している播磨国以外では,備前・備中・備後・安芸・周防の諸国において,それぞれ条里余剰帯によって一部の駅路道筋を確認した.春期休業期間中には,南海通駅路の現地調査を実施する予定である.この他に,三菱財団の助成を受ける三丹(丹波・丹後・但馬)地方学術調査(代表,瀧川政次郎)の一環として,京都・鳥取間の山陰道駅路(丹後支路を含む)の調査を7月1724日に実施したが,大同3年に廃された三駅について新見解を得,また駅路の具体的経路についても,従来の想定とは若干異なる想定に達した.本研究2年目の本年度は、所属研究機関において1年間の国内研究を命じられたので、研究調査に専念することができた。まず、58月にかけて国土地理院において、空中写真を全国的に検索して古代道の検出に努め、また11月には大阪市立大学所蔵の1940年頃撮影の大阪市周辺の空中写真についても同様の作業を実施した。以上の作業の結果、特に古代直線道の痕跡の明瞭な地域の空中写真を購入し、交付を受けた研究費の全額をこれに当てた。以上の地域について、8月に福井・富山県下の北陸道、栃木・福島・宮城県下の東山道、10月に茨城県下の東海道、長野県下の東山道、11月に大阪・京都府下の南海道・山陽道、2・3月にかけて東京以西の東海道と南海道全線をそれぞれ踏査し、また兵庫県竜野市小犬丸遺跡(布勢駅跡)、長野県小県郡青木村・栃木県南那須町・群馬県新田町のそれぞれ推定東山道、群馬県藤岡市の名称不明の古代道遺跡などの発掘現場を見学した。これらに加えて、従来の各地での発掘結果を整理すれば、都城に連なる畿内の諸道は格別として、一般に地方道は奈良時代に12m程度、平安時代に入っては約6mの道幅を示し、『延喜式』所蔵駅路の他にも多くの古代道が存在したことがうかがわれる。これらの古代道は自然発生的な通路ではなく、土木工事を施して造成された道路である。古代道の路線想定を行う過程で、駅家間を繋ぐ駅路と群家間を連絡する伝馬の路とは本来区別さるべきことが判明したので、後者を伝路と呼ぶこととした。駅路は計画的直線路として造成されたのに対し、伝路は自然発生的通路の性格を示すことが多いと思われる。最終年度に当たるので、これまでの補足的調査と、最終のまとめ的調査と研究を実施した。1.本年度は考古学的発掘調査による古代道および推定駅家遺跡の検出が相次ぎ、古代道の規模と構造がかなり明確になった。これらの一部は我々が想定していたものが発掘によって確認されたものもあり、本研究の方法が適当であることを証明したが、また従来は全く考えられていなかった所もあって、文献に無い古代道の研究には歴史地理学と考古学との共同研究が重要な意味をもつことを示した。発掘成果を利用して奈良時代の上野・武蔵両国の東山道駅路、大宰府周辺の駅路について検討した。また、佐賀県吉野ヶ里では弥生遺跡と共に奈良・平安時代の遺跡についても再検討の機会が生じたので、佐賀平野の官道の再調査を実施して若干の新知見をえた。2.春休み期間中に東海道・南海道(土佐国を除く)の全路線、夏休み中に東山道(上野国以西)の通し調査を実施し、それぞれ一部の路線と数駅について新たな想定をし、また駅家の立地や駅路通過地の地形・水利など自然的条件に付いての理解を深めた。その他、大和・河内・摂津・伊賀・甲斐・伊豆・上総・下総・常陸・下野・越中・紀伊・越後・筑前・筑後・豊前・肥前・肥後などの古道について部分的調査を行なった。なお、現地調査は実施できなかったが、資料により陸奥・出羽・近江(北陸道)・伯耆の一部駅路の推定を行なった。3.8月24・5両日に上田市で開催された「第2回東山道サミット」に、本研究代表者は助言者として参加し総括を行なった。
男性顔の魅力規定因に関する進化心理学的検討－保身リスクが魅力知覚に及ぼす影響

本研究では男性顔におけるマスキュリニティ(男性的な印象を与える顔の特徴)が知覚者にとって"保身リスク"のシグナルであることに着目し、そうした特徴をより強く備えた顔に対する魅力評価の個人差、ならびに状況・文脈による評価の違いについて検討を加えた。これまで、顔の魅力に関する進化心理学・適応主義的アプローチでは「その性らしさ(男性らしさ/女性らしさ)」が知覚される特徴は、繁殖力のシグナルであるために、ヒト普遍的に魅力が知覚されるという仮説が提唱されてきた。しかし、実証研究を通じて男性顔のマスキュリニティについては、女性顔のフェミニニティとは異なり、必ずしも魅力が知覚されないという結果が得られてきた。先行研究では、男性顔におけるマスキュリニティに魅力が知覚されにくい原因として、繁殖力と長期的投資のトレード・オフ(マスキュリニティは持ち主の男性が短期的性戦略を取りやすいことのシグナル、すなわち"子育てに向けた長期的投資に対するリスク"のシグナルでもあること)を挙げ、一定の実証的知見が提供されてきた。しかしながらその一方で、実はマスキュリニティはヒトの社会的認知(他者の評価)において非常に重要となる、"保身リスク(身体的被害の可能性)"のシグナルでもあることが指摘できる。一連の研究を通じて、保身リスクの評価に影響する状況・文脈要因(顔写真の人物の意図)や個人差要因(保護提供者となる家族との同居や自身の身体的強靭性、潜在的な異性パートナーとの間に予期する相互作用のあり方)がマスキュリニティの高い男性顔に対する魅力評価に影響する可能性が示唆された。マスキュリニティと魅力の関係に関する先行研究モデルを発展・拡張した点が、本研究の成果と考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。顔の魅力に対する進化心理学的アプローチでは、繁殖力のシグナルに対してヒト普遍的に魅力が知覚される可能性を指摘してきた。しかし、女性の男性顔に対する魅力においては、繁殖力のシグナルである性ホルモン・マーカ(男性的な印象を与える特徴)が必ずしも魅力に寄与しない。先行研究は、男性的な特徴の女性の繁殖戦略に対する両価性;性ホルモンマーカは繁殖力というベネフィットと同時に関係性リスク(短期的性戦略の取りやすさ)のシグナルでもあるあるという観点からこの問題を説明してきた。しかし、最近、男性的な特徴は女性の繁殖戦略に対して関係性リスクだけでなく、保身リスクを伝えるシグナルでもあること、そして、後者の魅力抑制効果がより大きい可能性が議論されている。そこで本研究は、保身リスク・関係性リスクに影響を与える文脈要因・個人差要因を取り上げ、それらが男性的な特徴に対する魅力評価における差異にどのような影響を与えるかを検討した。その結果、1保身/関係性リスクを低減するような性格特性情報を付与した際、過去に親密な異性との関係性を経験したことのある女性の魅力評定においては、リスク低減情報が反映されやすい可能性が示唆された。2自己犠牲的な恋愛スタイル(リスクの受容に関わる個人差要因)をとる女性ほど、平均以上に男性的な特徴を強く備えた顔を選好する傾向が認められた。さらに、3愛着スタイル(個人の繁殖戦略/親密な異性との関係性スタイル)および特性不安・状態不安・怒り表情に対する知覚的敏感性(環境中に存在する脅威;保身リスクに対する恒常的・当座の敏感さと関連することが想定される要因)と男性的な男性顔に対する魅力評価の関連を検討した結果、『恐れ・回避』に相当する女性は男性的な特徴を選好しない可能性が示唆された。本研究は、顔の魅力知覚における普遍性と個人差を説明する統合的なモデルの確立に寄与するものと考えられる。計画に沿って実験を実施しながら、成果をまとめることができているため。

現在までの研究においては保身・関係性リスクを実験的に操作することまではせず、あくまでリスクに関わる文脈要因を対呈示したり、個人差要因の測定にとどまっているため、今後は実験室研究を行い、顔の魅力近くに至るまでの因果関係について検討を行っていきたい。また、今後は国外の研究で使用しているものと同様の個人差変数を扱っていくために、学内の研究倫理審査に申請していきたい。
頭頸部扁平上皮癌における血中循環腫瘍細胞の臨床的意義

いくつかの癌腫において血中循環腫瘍細胞が治療効果予測因子、予後予測因子となることが知られている。しかし、頭頸部扁平上皮癌においては血中循環腫瘍細胞の臨床的意義はいまだ明らかとなっていない。また、従来の血中循環腫瘍細胞の研究は上皮系の細胞表面マーカーを発現する腫瘍細胞を検出している。しかし、上皮系マーカーを発現しない癌細胞のほうがより直接的に浸潤、転移とかかわっていることが今日では明らかとなっている。そのため、本研究では頭頸部扁平上皮癌における血中循環腫瘍細胞の臨床的意義を明らかにするため、上皮間葉転換を起こした腫瘍細胞、癌幹細胞を含めた血中循環腫瘍細胞の検出を試みた。頭頸部扁平上皮癌においては癌幹細胞のマーカーとしてCD44が知られているがこれを発現する腫瘍細胞を血中から検出することはできなかった。今後、新たに同定された別のマーカーを用いて実験を継続する予定である。
学習障害関連遺伝子をターゲットとした人工内耳予後予測因子に関する研究

小児先天性難聴に対しては、現在人工内耳埋め込み術が早期(1歳前後)から適応されることが多くなっている。しかし、人工内耳装用児のすべてが順調な言語発達を示すとは限らず、その言語発達には個人差が大きい。特に低年齢の人工内耳装用児でその言語発達予後を予測することは容易ではなく、より適切な手法の開発が望まれている。遺伝子診断は、従来難聴の原因を探すために主として用いられてきたが、近年では学習障害などの原因遺伝子も明らかにされており、この技術を用いて人工内耳術後の言語発達予後予測を行うことをこの研究の目標とした。当面、その予備実験として難聴のない言語発達障害児童(特異的言語発達障害)において、既に海外で報告されている言語発達に影響を与える遺伝子での変異の有無を検討した。末梢血から採取したDNAを用い、パラレルシークエンス法によって候補遺伝子(FOXP2,DYA1C1,DCDC2, KIAA0319, ROBO1)の全エクソンにおける変異を検討した。意味のある変異を検出することはできなかった。日本語話者での遺伝子変異は人種的ないしは言語的な違いにより、欧米での遺伝子変異とパターンが異なる可能性があり、まず本邦患者を元にした新たな言語発達障害関連遺伝子の解析が望まれると考えられた。
配偶者の死への適応とサクセスフルエイジングに関する縦断研究

本研究の目的は,配偶者との死別後の最初の数年間での回復のあり方が,その後の人生におけるサクセスフルエイジングを予測するとする仮説を明らかにすることである.調査対象者は配偶者と死別した184名の中高年者(平均年齢70.9歳,配偶者と死別後平均8ヶ月)で,死別後の16年間に3回の面接調査を行った.第2回調査は初回調査の翌年に,第3回調査は初回調査から15年後に実施し,第2回調査は136名,第3回調査は51名の対象者から回答を得た.分析は,サクセスフルエイジングの指標となる変数(安否,精神的健康,いきいき尺度)を従属変数に,死別後の回復の指標となる変数(抑うつ感及び孤独感の変化)を独立変数にしたロジスティック回帰分析と重回帰分析を行なった.抑うつ感は第2回調査時の安否を予測する有意な要因であったが,第3回調査時の安否を予測しなかった.孤独感は第3回調査時点における病気や死亡のリスク要因で,第1回調査から第2回調査にかけて上昇した場合には第3回調査時点で病気や死亡の危険があることが判明した.孤独感はまた第3回調査時の精神的健康や幸福感を予測する要因でもあった.死別後に孤独感の上昇が見られたり,孤独感が高い状態にある場合には第3回調査時の精神的健康状態が悪く,また死別後孤独感が低下する場合には第3回調査時の幸福感が高まることが判明した.以上の結果から配偶者との死別後の孤独感の回復のあり方は,その後の人生におけるサクセスフルエイジングを予測すると結論した.本研究の目的は,配偶者との死別後の最初の数年間での回復のあり方が,その後の人生におけるサクセスフルエイジングを予測するとする仮説を明らかにすることである.調査対象者は配偶者と死別した184名の中高年者(平均年齢70.9歳,配偶者と死別後平均8ヶ月)で,死別後の16年間に3回の面接調査を行った.第2回調査は初回調査の翌年に,第3回調査は初回調査から15年後に実施し,第2回調査は136名,第3回調査は51名の対象者から回答を得た.分析は,サクセスフルエイジングの指標となる変数(安否,精神的健康,いきいき尺度)を従属変数に,死別後の回復の指標となる変数(抑うつ感及び孤独感の変化)を独立変数にしたロジスティック回帰分析と重回帰分析を行なった.抑うつ感は第2回調査時の安否を予測する有意な要因であったが,第3回調査時の安否を予測しなかった.孤独感は第3回調査時点における病気や死亡のリスク要因で,第1回調査から第2回調査にかけて上昇した場合には第3回調査時点で病気や死亡の危険があることが判明した.孤独感はまた第3回調査時の精神的健康や幸福感を予測する要因でもあった.死別後に孤独感の上昇が見られたり,孤独感が高い状態にある場合には第3回調査時の精神的健康状態が悪く,また死別後孤独感が低下する場合には第3回調査時の幸福感が高まることが判明した.以上の結果から配偶者との死別後の孤独感の回復のあり方は,その後の人生におけるサクセスフルエイジングを予測すると結論した.配偶者との死別はストレスフルなライフイベントである。配偶者と死別した中高年者の死別後の長期にわたる適応過程を明らかにすることを目的に1984年に実施した初回調査の対象者に15年を隔てて追跡調査を実施した。初回調査の対象者の現住所を確認するために住民票を請求し、死亡や除票となった者を除いて調査の協力を要請する手紙を投函した。初回調査対象者184名中55名(男性11名、女性44名)に面接することができた。有効な調査票を得ることができた51名の対象者について調査結果を分析した。調査対象者の平均年齢は81.6歳(7296歳)で、そのほとんどが後期高齢者になっていた。調査対象者は、持病などの病気のために74.5%が通院していたが、主観的健康感は56.8%が良いと回答していた。日常生活では交通機関を利用して外出することは多くはなかったが(ほとんど外出しないが39.2%)、8割以上の者が家庭で何らかの役割を持ち、生活は充実していると回答していた。これらの回答から多くの対象者がサクセスフルエイジングに達しているように思われた。亡くなった配偶者を8割以上の対象者が思い出したり、考えたりすると回答していたが、そのほとんどはポジティブな感情体験であった。調査対象者の9割が配偶者の死の悲嘆から立ち直ったと回答しており、死別から長い年月を経て配偶者の死を受容するに至ったことが示された。配偶者の死への対処とサクセスフルエイジングとの関連については、初回調査のデータを合わせて分析する必要があり、現在その作業を進めているところである。本研究の研究者は、1984年に配偶者と死別した184人の男女について、死別から平均8ヶ月後に面接調査を実施し、死別後の心理的な問題を明らかにした。その後現在までに十数年の歳月を経て、配偶者の死を取り巻く社会環境はかなり変化している。例えば同居家族数の減少に加えて親族関係や近隣関係の希薄化などがあり、配偶者の死への対応が難しくなってきているように思われる。それゆえ現代における配偶者の死とその後の適応について検討することは緊急な課題であると考え、本研究は新たに配偶者と死別した人々を対象に面接調査を行い、すでに実施された旧調査と比較することを目的とした。

新調査については、1999年6月から翌年3月までの間に配偶者と死別した人で、死亡した配偶者が50歳以上の人を対象に、2000年6月から8月まで訪問面接による調査を実施し、276名の回答を得ることができた(回収率は57.3%)。新調査対象者の平均年齢は72.3歳で、旧調査対象者の71.0歳より僅かに高かったが、有意差は無かった。しかし、社会環境の変化に対応して家族形態や生存している子どもの人数等に2群間で有意差が認められた。新対象者は3世代同居者が少なくなり、一人暮らしが多く、また家族数と子ども数は少なくなっていた。死の衝撃や死別後の心理的反応については2群間で有意差はなかった。しかし、男女ともに新対象者のほうが孤独感が高かく、また日常生活の困難度は男性では2群間に差は見られないのに女性では新対象者のほうが高くなっていた。新対象者は死別の衝撃や悲嘆の大きさについては旧対象者と比べて差は認められなかったが、その後の適応に関して困難な問題があることが示唆された。配偶者の死は衝撃的な出来事であり、多くの人は悲嘆の辛さを経験する。大切な人の死の悲嘆については、死別からの経過期間がその緩和に効果的であると信じられてきたが(「日にち薬」と言われている)、その真偽を明らかにすることを本研究の目的の一つとした。昨年度、配偶者と死別後平均7.8ヶ月経過した中高年の男女276名(平均年齢72.3歳)に面接調査を実施し、配偶者と死別した中高年者の死別による衝撃の大きさと心理的な問題を明らかにした。本年度は前記の調査から約1年半後に追跡調査を行い、その後の適応状況について検討した。追跡調査は2002年の1、2月に訪問面接により実施し、192名(男性82、女性110)の対象者の協力を得た。1年半隔てた2回の調査の結果から、以下のような結果を得た。1)追跡調査で、対象者に現在の心理状況を尋ねた。死別の悲しみから「すっかり立ち直った」「かなり立ち直った」とするものが71%であった。悲しみから立ち直るために効果があった事柄についての回答では、「家族や友人の支え」r時間の経過」などの回答が過半数を占めた。2)初回調査と追跡調査の結果について、反復測定の分散分析を用いて分析を行った。追跡調査では初回調査より「悲しみ」「さびしさ」などの死別と関係の深い感情を感じる頻度は有意に減少していたが、精神的健康、心身症状など、健康や適応の状況を測定する尺度については変化は認められなかった。以上のことから、配偶者の死後2年が経過すると、悲嘆を経験することは少なくなるが、精神的健康や適応状況の面でぱほとんど改善が認められないことが判明した。配偶者と死別した人々が悲嘆を乗り越えるためには、悲嘆への対処に関わる自助努力と並んで、周囲の人々の援助が重要である。本年度は援助について焦点をあて、援助の受領とその有益性に関して調査を行なった。配偶者と死別した中高年者1194人に調査協力の依頼状を送付し、協力が得られた127名(男性34名、女性93名)に、郵送と面接を併用して調査を実施した。調査対象者の平均年齢は70.28歳であった。多くの対象者が様々な援助を受け取っていたが、回答で最も多かったのは「気遣い」で、「電話してくれた」、「話を聞いてくれた」がそれに続いていた。これらの項目への回答には有意な性差は見られなかった。有意な性差が認められたのは「相談」、「一緒にいてくれた」、「ご馳走してくれた」の3項目で、いずれも女性のほうが回答が多かった。受け取った援助が有益かどうかを調べるために、受け取った援助のうち最も役に立った援助と役に立たなかった援助を尋ねた。
インターロイキン8による表皮角化細胞の増殖・遊走機序の解明

本研究はインターロイキン8(IL-8)による表皮角化細胞の遊走・増殖機構を解明することである。とくにIL-8によるEGFレセプターの活性化機構にHB-EGFを中心としたEGFレセプターリガンドのshedding(膜型細胞成長因子が酵素により遊離型に変換される機構)がいかに関与しているかについての検討を行った。表皮角化細胞を無血清培養にて培養し、リコンビナントIL-8を添加し、細胞がどの程度遊走するかについてBoyden chamber法を用いて検討したところ、0.3ng/mlの濃度で最大3倍の細胞遊走亢進が認められた。この濃度で細胞を刺激し、蛋白を回収し、EGFレセプターのリン酸化が起こっているかについて抗リン酸化EGFレセプター抗体を用いてウェスタンブロット法で検討した。IL-8を0.3ng/mlの濃度になるように培養液に添加後15分後にはEGFレセプターのリン酸化が認められた。次ぎにこのリン酸化がEGFレセプターリガンドのsheddingにより引き起こされている可能性を検討するため、あらかじめADAMインヒビター(EGFレセプターリガンドのsheddingを起こす酵素として知られている)で処理した後の細胞遊走能を検討したところ、約30%の抑制がみられた。さらに同様の実験をHB-EGF中和抗体、EGFレセプター中和抗体、CRM197(HB-EGF inhibitor),AG1478(EGFレセプターキナーゼインヒビター)でそれぞれ前処理した後の細胞遊走能を検討したところ、すべて約30%の抑制が認められた。以上の結果より、IL-8による細胞遊走の約30%はEGFレセプターの活性化により引き起こされ、そのほとんどは内因性の膜型HB-EGFが酵素により遊離することによるものであることが明かとなった。表皮角化細胞におけるインターロイキン8の作用を検討した。インターロイキン8により表皮角化細胞の遊走が促進されることが確認された。このときに表皮成長因子受容体のリン酸化が起こっていることを確認した。さらに表皮成長因子のリン酸化阻害薬を前投与すると、インターロイキン8による表皮角化細胞の遊走が70%ほど抑制された。すなわち、インターロイキン8による表皮角化細胞の遊走化機構には表皮成長因子受容体の活性化が関与していることがわかった。そこで、このインターロイキン8による表皮成長因子受容体のリン酸化の機構を解析すると、1)ヘパリン結合表皮成長因子様成長因子の膜結合型から遊離型への変換阻害薬でインターロイキン8による表皮成長因子受容体のリン酸化が抑制されること、2)ヘパリン結合表皮成長因子様成長因子の中和抗体でインターロイキン8による表皮成長因子受容体のリン酸化が抑制されること、が確認された。さらにこれらのヘパリン結合表皮成長因子様成長因子の活性阻害により、インターロイキン8による表皮角化細胞の遊走が阻害された。すなわちインターロイキン8による表皮角化細胞の遊走は、ヘパリン結合表皮成長因子様成長因子の膜結合型から遊離型とそれに伴う表皮成長因子受容体のリン酸化・活性化が重要な働きをしていることが示唆された。
アルツハイマー病の発症と進行を説明する脳内ターゲット分子の探索

アルツハイマー病脳の2大特徴である老人斑と神経原線維変化を指標にして分類された71人の凍結脳(嗅内野、側頭葉、前頭葉)の213箇所からRNAを抽出した。エクソンアレイ法によるmRNA半定量、次世代シークエンサーによる非翻訳RNA解析を行い、健康脳から病巣の進展に伴って変動する8種類のmRNAおよび5種類の非翻訳RNAを同定した。リスクSNPがイントロンや遺伝子の外にあることを理解するために、SK-N-SHならびにU-251を用いて、染色体上離れた遺伝子間相互作用を検出するゲノム高次構造解析のTethered Conformation Capture法の基盤技術を確立した。研究目的:多くの病気と同じようにアルツハイマー病(AD)は、個人ゲノムの多様性を背景に発症すると考えられ、SNPをベースとした大規模ゲノムワイド関連解析(GWAS : Genome-wide Association Study)が行われた。その結果、リスクSNPのほとんどはイントロンや遺伝子間にあることから、そのリスク領域のゲノム科学的な意味づけが不明である。GWASのリスク領域とAD発症それに続く病気進行に直接関与する機能遺伝子の同定を、従来の方法に加えて核内ゲノム高次構造から解明する戦術を立てた。本研究の最終目的は、リスクSNP(または領域)のゲノム機能から、正常発病進行過程を説明するターゲット分子を同定することである。研究実施計画:受精後個人ゲノム配列は変わらないが、加齢や生活習慣などの体内外環境の影響を受けて、ADを発症する。正常ADに移行する神経細胞と正常機能を維持している神経細胞核内では、リスク領域(SNP)とAD発症遺伝子は異なる高次構造をとると仮説を立てた。それを証明するために、H24年度はChromsome Confomation Capture-Sequence (3C-Seq)法を導入し、(1)培養細胞系で染色体ゲノム上の離れた遺伝子(群)を同定する技術の確立、(2)ヒト凍結脳から調製した神経細胞核内ゲノムの高次構造解析を行う。意義・重要性:GWASで発見されたリスク領域は、タンパク構造自体に変異を与えることは少ない。本研究は、リスク領域が直接制御する遺伝子は離れている(異なる染色体を含む)ことを証明する点に意義がある。受精後個人ゲノム配列は変わらないので、加齢や生活習慣などの体内外環境の影響を受けて核内ゲノム高次構造が変化し、加齢につれてアルツハイマー病(AD)を発症すると考えられる。ADの発症と進行に関連する遺伝的危険因子の存在が推定され、SNPをベースとした大規模ゲノムワイド関連解析(GWAS:Genome-wide Association Study)が行われてきた。その結果、700を超えるリスクSNPのほとんどがイントロンや遺伝子間にあることから、そのゲノム科学的意味づけの理解が困難となっている。そこで本研究では、リスク領域は核内ゲノム高次構造を介して機能遺伝子と相互作用すると仮説を立て、正常発病重症の病勢進行過程を説明するターゲット分子を同定する。H25年度は、Chromosome Conformation Capture-Sequence (3C-Seq)法を改良したTethered Conformation Capture(TCC)法を用いて、培養細胞核内ゲノム高次構造を解析し、染色体上を離れた遺伝子間相互作用を証明した。また神経病理学的に診断されたヒト凍結脳における遺伝子発現解析を行い、時間経過とともに解剖学的に病巣が進展する特徴的なAD脳の変動遺伝子を同定した。孤発性アルツハイマー病のリスク遺伝子の多くは、大規模GWAS (Genome-wide association study)で同定されたSNPの近傍とされている。しかし、そのSNPの殆どがイントロンか遺伝子間にあるため、生物学的意味が不明である。そこで、アルツハイマー病の発症や進行を説明するために、脳組織における遺伝子発現状態を直接解析する研究をおこなった。アルツハイマー病の2大特徴である老人斑と神経原線維変化を指標に、正常、中等度、重度の段階が病理学的にBraak分類される。Braak分類された脳の3カ所からRNAを抽出し、エクソンアレイ法によるmRNA半定量、ならびに次世代シークエンサーとRT-PCR法によるノンコーディングRNA解析をおこなった。71人の3カ所脳部位で健康脳から重症脳へ病巣の進展に伴って遺伝子発現量が変動するmRNAを8種類同定し,これらは大きく4つのクラスターに分けられ,相互に関連することが示唆された。つづいて行なったノンコーディングRNA解析では、脳病巣を反映するsmall RNAのうち有意に変動する候補マイクロRNAを数個見いだした。我々の生データおよび公開データベースを参照に、染色体上離れたイントロンと変動遺伝子との相互作用ならびにタンパクータンパク相互作用について情報学的に解析を行った。生物学的証明は今後の課題であるが、一つの方法として、培養細胞系を用いて分子生物学実験を行う。

脳由来と思えるマイクロRNAが血液中で比較的安定に存在するので、その利点を生かしてアルツハイマー病の病勢をモニターする血液バイオマーカーとしての診断価値が期待される。臨床検体を用いて検証実験を開始するめどが立った。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経分子遺伝学26年度が最終年度であるため、記入しない。培養細胞系を用いて神経細胞特異的な転写調節機構をゲノム高次構造から解明する研究を推進している。神経細胞由来SK-N-SHならびにグリア細胞由来U-251MGにおいて、高発現および低発現遺伝子をエクソンアレイによって選ぶことができた。次に、基礎研究として既報の遺伝子を元に3C実験を行い追試し、解析技術をほぼ確立できたので、我々の注目する遺伝子に応用する段階に進んだ。染色体上は離れた転写調節機構をゲノム高次構造から解明するTethered Conformation Capture(TCC)法の基盤技術を培養細胞系で確立した。つぎに細胞特異的遺伝子発現を解明するために、神経細胞由来SK-N-SHならびにグリア細胞由来U-251MGにおいて、それぞれの細胞で高発現または低発現する遺伝子群をエクソンアレイによって選び、それらの核内相互作用を解析した。3Cの基本的技術は目途が立ったので、高発現/低発現の遺伝子とキメラを形成する遺伝子制御ゲノム配列を同定する。TCC法の基本技術を確立したので、細胞ごとに変動する高発現/低発現遺伝子群と染色体上離れた遺伝子(ゲノム領域)とキメラを形成する遺伝子制御配列を同定する。既存のデータベースを用いて転写制御領域と相互作用する機能遺伝子群との関連をコンピューター上で抽出し、高度な情報学を駆使して実験から得られるAD脳の変動遺伝子生データを評価する。初年度は培養細胞系による分析技術の確立を主として行った。ゲノム調製、ゲノム切断、キメラ遺伝子作製,次世代シークエンサーによるデータ取得などの条件検討の結果確立した方法にしたがって研究を加速するために、2年目以降は技術補佐員を雇用する経費に一部を当てる。培養細胞でTCC解析を継続すると共に、次世代シークエンサーによる凍結脳由来のDNA/RNA解析ならびに遺伝子発現の網羅的解析を遂行する。H25年度までに確立したTCC解析、遺伝子プロファイリングを実施するために検体数を増やし、信頼性の高いデータ取得を行う。主として次世代シークエンサーによる凍結脳由来のDNA/RNA解析および培養細胞試薬を購入する。DNA/RNA抽出と濃度測定、品質管理、ゲノム調製、ゲノム切断、キメラ遺伝子作製、等の業務を担当する技術補佐員を雇用する経費に一部を当てる。
音と譜を一元的に理解する音楽情報受容センサ

音楽情報は、器楽演奏や歌唱のような音響データと楽譜のような図形データで表現され、パターン認識や知識工学・人工知能にとって興味深いものである。本年度は、音響データの認識である採譜と音楽理解への足がかりとなる単旋律への和音付けを行った。採譜においては、単旋律の歌唱を対象とし、利用できる知識・規則について検討した。楽曲は時間軸方向に変化する音の流れと周波数軸方向に変向に変化する音階構造により成り立っている。そこでまず楽曲のパワーの変化をもとに拍子を求め、最短音符を決定する。これに基づき各音符の高さ(周波数)を求める。音高同定を精度よく行うために複素スペクトルを用いた方法を考案した。また同時に連続音符のセグメンテーションも行う。こうして得られた結果から音高のヒストグラムを求めることにより調子を判定し、音楽的に正しくない部分に対して修正を行ない、楽譜化、データベース化する。単旋律への和音づけにおいては、先ず単旋律のデータベースを作成した。このデータベースでは、楽曲をツリー構造に解析し、複音の表現も可能なようになっている。このデータベースには小学校の音楽の教科書に出ているような曲を中心に80曲程度入力されている。このデータベース内の曲から、まず曲の調子を決定し、心理的に知覚される拍を分離する。楽曲にある規則を用いて和音候補を求める。和音進行の決定では、楽式と呼ばれる規則及び推移率を用いる。以上、本年度は単旋律の採譜と和音付けについて行った。採譜においては楽典を積極的に用いることにより、従来より大幅な計算時間の短縮が可能となった。和音付けにおいては童謡を対象にしたが、結果において音楽的には間違いではないが、別の和音の方がよいという部分があり、明確な理由付けが不可能な点があることも判明した。
食品成分の生体内代謝物をプローブとした生理機能の動的解析

代謝産物をプローブとして機能性食品成分の高感度モニタリングを行うための基盤的研究として、本年度は、昨年度に引き続き、in vitro、in vivoでの血管内皮実験モデルを用いた新規食品機能性解析法の確立を行うとともに、昨年度作成に成功した食品成分代謝産物の特異的モノクローナル抗体、標的蛋白質および標的アミノ酸残基のラベル化を可能とする食品成分の標識化合物を用いて、食品機能成分代謝物の血管内皮における新規生理作用を検討した。1)昨年度に作成に成功したイソチオシアネート抱合体-タンパク質付加体をハプテンとした抗ハプテンモノクローナル抗体の特異性と交差性を検証した。その結果、本抗体はイソチオシアネート-タンパク質複合体を特異的に認識することを証明し、これまでに例が少ない食品機能成分の免疫化学的検出及び定量法確立に向けての生物学的確証を得ることができた。2)昨年度、作成した、フェノールカルボン酸-bio'tin化誘導体を用いて、ポリフェノール修飾タンパク質の特異的検出を免疫化学及び分析化学的手法を駆使して行った。その結果、培養細胞での実験から、細胞骨格タンパク質であるアクチン及び、アクチン結合タンパク質Keaplへのフェノールカルボン酸による特異的修飾を見出し、第2相薬物代謝酵素遺伝子発現メカニズムへの関与といった、食品代謝産物の機能性における分子基盤に関する知見を得た。3)血管内皮は消化吸収後、食品成分代謝物の影響を受ける組織として重要であり、それらを評価する実験系の構築は生体内での生理機能の動的解析に必須である。本年度も、米国Illinois大学シカゴ校、Dr.M.Ushio-Fukaiの研究室に赴き、研究を行った。昨年度開発した、マウス及びヒト初代培養細胞を用いた増殖因子誘導性細胞内シグナルのモニタリング法を用い、活性酸素や求電子性食品因子の標的となりうる脱リン酸化酵素を同定し、血管新生過程における負の制御因子としての役割を正解に先駆けて発見した(投稿中)。また、フラボノイドの有する潜在的プロオキシダント作用を評価し、アピゲニンが細胞内に活性酸素をペルオキシダーゼ依存的に生成し、アポト7シスシグナルを負に制御していることを明らかにした。食品由来の機能性成分であるベンジルイソチオシアネート(BITC)やカテコール型フラボノイドの代謝産物をプローブとして機能性食品成分の高感度モニタリングを行うための基盤的研究を行った。BITCの機能性発現に化学構造に由来する求電子性が重要であることはこれまで知られていたが、細胞内小器官であり、アポトーシス誘導シグナルの情報伝達に重要な役割を果たしているミトコンドリアの機能をBITCが修飾し、その作用に求電子反応性が重要であることを明らかにした。求電子性を有するBITCやフェニルイソチオシアネートは、ミトコンドリアの呼吸を阻害するだけでなく、膜電位の低下やシトクロームcの放出を誘導したが、求電子性を持たないメチルチオカルバメート誘導体は全く不活性であった。また、BITCの効果はシクロスポリンAによって中和されたが、抗酸化剤によっては解除できなかった。この一連の研究から、生体内での主要な代謝産物であり、求電子性を持たないグルタチオン抱合体自身は不活性であることを支持するだけでなく、ミトコンドリアにおける分子標的が感受性の高いシステイン残基を有するタンパク質であり、その候補として、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼが潜在的標的であることを強く示唆することが出来た。その一方で、様々なシグナル伝達に関与し、食品成分との相互作用も報告されているα-トコフェロールの細胞内シグナル伝達への影響を調べたところ、α-トコフェロールはカスパーゼ-3遺伝子発現を増強することを見出し、今後の検討課題として新たに、食品成分によるアポトーシスシグナルとのクロストークを動的に解析することを想定するに至った。本年度は、食品成分代謝産物の特異的モノクローナル抗体作成に加えて、標的蛋白質および標的アミノ酸残基のラベル化を目指した、食品成分の標識化合物の合成を行った。また、生理機能の動的解析を効率的に行うことを目的として、in vitro、in vivoでの血管内皮実験モデルを構築するとともに、食品機能成分代謝物の血管内皮における新規生理作用を検討した。まず、抗体作成に関して、前年度に引き続き、キャリアタンパク質としてkeyhole limpet hemocyaninを用い、付加体をハプテンとした抗ハプテンモノクローナル抗体の作成に成功し、モノクローナル抗体産生細胞株を樹立した。一方、食品成分の標的蛋白質、標的アミノ酸残基のラベル化を目的として、食品成分のbiotin化誘導体の合成を試み、ペプチド合成に用いられる試薬を応用してこれに成功した。このbiotin化物が、免疫化学及びそれに準ずる手法にて特異的検出が可能であることを確認した。血管内皮は消化吸収後、食品成分代謝物の影響を受ける組織として重要であり、それらを評価する実験系の構築は生体内での生理機能の動的解析に必須である。そこで、本実験系の構築を短期間且つ効率的に行う目的で、米国Illinois大学シカゴ校、Dr.M.Ushio-Fukaiの研究室に赴き、研究を行った。その結果、ラット及びヒト初代培養細胞を用いた増殖因子誘導性細胞内シグナルのモニタリング手法を新たに取得し、リン酸化シグナルだけでなく、酸化ストレスシグナルの簡易検出法の構築に成功した。また、パパイヤ由来イソチオシアネート(ITC)の機能性に関する研究を行い、ある種のITCが増殖細胞特異的にアポトーシスを誘導することを証明し、p53がその制御に重要であることを世界に先駆けて報告した。

代謝産物をプローブとして機能性食品成分の高感度モニタリングを行うための基盤的研究として、本年度は、昨年度に引き続き、in vitro、in vivoでの血管内皮実験モデルを用いた新規食品機能性解析法の確立を行うとともに、昨年度作成に成功した食品成分代謝産物の特異的モノクローナル抗体、標的蛋白質および標的アミノ酸残基のラベル化を可能とする食品成分の標識化合物を用いて、食品機能成分代謝物の血管内皮における新規生理作用を検討した。1)昨年度に作成に成功したイソチオシアネート抱合体-タンパク質付加体をハプテンとした抗ハプテンモノクローナル抗体の特異性と交差性を検証した。その結果、本抗体はイソチオシアネート-タンパク質複合体を特異的に認識することを証明し、これまでに例が少ない食品機能成分の免疫化学的検出及び定量法確立に向けての生物学的確証を得ることができた。2)昨年度、作成した、フェノールカルボン酸-bio'tin化誘導体を用いて、ポリフェノール修飾タンパク質の特異的検出を免疫化学及び分析化学的手法を駆使して行った。その結果、培養細胞での実験から、細胞骨格タンパク質であるアクチン及び、アクチン結合タンパク質Keaplへのフェノールカルボン酸による特異的修飾を見出し、第2相薬物代謝酵素遺伝子発現メカニズムへの関与といった、食品代謝産物の機能性における分子基盤に関する知見を得た。3)血管内皮は消化吸収後、食品成分代謝物の影響を受ける組織として重要であり、それらを評価する実験系の構築は生体内での生理機能の動的解析に必須である。本年度も、米国Illinois大学シカゴ校、Dr.M.Ushio-Fukaiの研究室に赴き、研究を行った。昨年度開発した、マウス及びヒト初代培養細胞を用いた増殖因子誘導性細胞内シグナルのモニタリング法を用い、活性酸素や求電子性食品因子の標的となりうる脱リン酸化酵素を同定し、血管新生過程における負の制御因子としての役割を正解に先駆けて発見した(投稿中)。また、フラボノイドの有する潜在的プロオキシダント作用を評価し、アピゲニンが細胞内に活性酸素をペルオキシダーゼ依存的に生成し、アポト7シスシグナルを負に制御していることを明らかにした。
環境中の細菌捕食性原生生物群集の増殖特性定量法の開発と実証

水圏生態系の微生物ループにおいて細菌捕食性原生生物が原核生物を摂餌することで輸送される有機物量を見積もるための新しい手法開発と現場環境での実証が本研究の目的である。現場環境に即した見積もりを導出するためには、環境中に生息する微生物を用いて、室内培養実験による再現性の高い実験により捕食に関する生理を試験することが重要である。H30年度は、H29年度に若狭湾に面する海水湖(日向湖)から単離培養した原生生物3種類(アメーバ様細胞1株,鞭毛虫様細胞2株)を対象に、系統的位置を決定するとともに、蛍光ビーズを用いた捕食速度実験を実施した。18S rRNA遺伝子配列を決定し分子系統を調べたところ、原生生物3種はBicosoecida科, Vannella属, Neobodo属であった。また、蛍光ビーズを餌とした捕食速度を、3種類の粒子径(0.1, 0.5, 1.0 micro m)で比較したところ、いずれの原生生物も0.5 micro mのビーズを最も多く捕食した(2.4-13.5 beads/cell/h)。さらに、3種間で蛍光ビーズの取り込み速度は有意に異なり、Vannella属、Neobodo属、Bicosoecida科の順に高かった。また、最も捕食速度の高かったVannella属のみ食胞内に複数(2-4個)のビーズを取り込んでおり、原生生物の種類または捕食形態により餌粒子の取り込み速度が異なることが明らかとなった。また、現場海水中の細菌捕食性原生生物の網羅的な群集構造解析は若狭湾にて実施した。若狭湾より餌となる原核微生物の単離株(10種類)も取得した。当初の予定では環境中から単離培養した原生生物の増殖生理を明らかにし、摂食活性を計測する予定であった。そのために、原生生物と原核生物の二者培養系を確立し、安定した餌細菌を供給する計画であったが、本年度は二者培養系の確立には至らなかった。一方で、蛍光ビーズを餌として原生生物に与えることで捕食速度を計測たところ、既往値と概ね一致する結果が得られ、増殖活性に関する知見は蓄積しつつある。初年度に予定していた「生物生産の高い自然環境中の細菌捕食性原生生物の網羅的解析」を若狭湾で実施し、必要な試料は収集済である。そのため、当初の計画と比較してやや遅れている。H30年度に若狭湾にて採集した試料を分析し「生物生産の高い自然環境中の細菌捕食性原生生物の網羅的解析」を実施する。また、単離培養した原生生物と原核生物を用いて、二者培養系を確立し、餌となる細菌と摂餌者である原生生物の増殖生理試験と原生生物の細菌捕食活性の計測を生理学的試験を実施する。最終的に餌である原核生物のDNAをBrdUで標識し、どの程度が原生生物に移行するかを計測し、輸送される有機物量を見積もる予定である。現場環境に即した見積もりを導出するためには、環境中に生息する微生物を用いて、水温や餌試料濃度などの環境要因を制御した再現性の高い室内培養実験を実施することが重要である。まずH29年度は、実験室内培養実験に使用する原生生物と原核生物を環境中から単離し、培養株を確立するための実験を実施した。海水湖(福井県日向湖)の表層水から、キャピラリー法を用いて3種類の異なる原生生物単離株(アメーバ様細胞1株,鞭毛虫様細胞2株)と希釈培養法と画線法を組み合わせて2株の原核生物単離株(Pseudomonas sp., Vibrio sp.)の確立に成功した。単離培養された鞭毛虫様原生生物の内1株は、18S rRNA遺伝子配列を決定し、分子系統を調べたところ、Bicosoecida目に属したものの既存の単離培養株とは類似せず、新規系統であることが示唆された。本培養株の増殖速度を調べたところ4.8±1.1cells/dayであり、培養実験を行うのに十分な増殖速度であることが判明した。原核生物に特異的な抗生物質を異なる濃度で添加して培養することで、原生生物単離株の無菌化を試みたがいずれの単離株においても原核生物を取り除くことはできなかった。また、当初予定していた三陸沖海域での実施は、複数年連続して春季ブルーム期の調査航海(A-line航海)に参加することが困難となったため、もう一つの調査実施予定地であった日向湖に変更することとなった。そのため、現場海水中の細菌捕食性原生生物の網羅的な群集構造解析はH30年度に実施する予定である。初年度では1餌となる細菌の単離培養、2細菌捕食性原生生物の網羅的な群集解析、3細菌捕食性原生生物の集積と単離培養を予定し、生物生産が高い三陸沖海域と養殖場を有する海水湖(福井県日向湖)において実験する計画であった。しかし、2017年度は東北区水産研究センター(独立研究開発教育法人総合水産研究センター)が実施する、三陸沖の観測定線モニタリング航海(Aライン航海)に乗船することができなかったため、海水試料の提供を受けて上記実験の1と3のみを実施したが、単離培養株の確率には至らなかった。

その後、調査地を日向湖に絞って研究を実施したが上記2の実験を実施することができなかった。一方で、当初H30年度に予定していた「生物生産の高い自然環境由来の細菌捕食性原生生物の単離培養」をほぼ終えているため、進捗状況は順調である。水圏生態系の微生物ループにおいて細菌捕食性原生生物が原核生物を摂餌することで輸送される有機物量を見積もるための新しい手法開発と現場環境での実証が本研究の目的である。現場環境に即した見積もりを導出するためには、環境中に生息する微生物を用いて、室内培養実験による再現性の高い実験により捕食に関する生理を試験することが重要である。H30年度は、H29年度に若狭湾に面する海水湖(日向湖)から単離培養した原生生物3種類(アメーバ様細胞1株,鞭毛虫様細胞2株)を対象に、系統的位置を決定するとともに、蛍光ビーズを用いた捕食速度実験を実施した。18S rRNA遺伝子配列を決定し分子系統を調べたところ、原生生物3種はBicosoecida科, Vannella属, Neobodo属であった。また、蛍光ビーズを餌とした捕食速度を、3種類の粒子径(0.1, 0.5, 1.0 micro m)で比較したところ、いずれの原生生物も0.5 micro mのビーズを最も多く捕食した(2.4-13.5 beads/cell/h)。さらに、3種間で蛍光ビーズの取り込み速度は有意に異なり、Vannella属、Neobodo属、Bicosoecida科の順に高かった。また、最も捕食速度の高かったVannella属のみ食胞内に複数(2-4個)のビーズを取り込んでおり、原生生物の種類または捕食形態により餌粒子の取り込み速度が異なることが明らかとなった。また、現場海水中の細菌捕食性原生生物の網羅的な群集構造解析は若狭湾にて実施した。若狭湾より餌となる原核微生物の単離株(10種類)も取得した。当初の予定では環境中から単離培養した原生生物の増殖生理を明らかにし、摂食活性を計測する予定であった。そのために、原生生物と原核生物の二者培養系を確立し、安定した餌細菌を供給する計画であったが、本年度は二者培養系の確立には至らなかった。一方で、蛍光ビーズを餌として原生生物に与えることで捕食速度を計測たところ、既往値と概ね一致する結果が得られ、増殖活性に関する知見は蓄積しつつある。初年度に予定していた「生物生産の高い自然環境中の細菌捕食性原生生物の網羅的解析」を若狭湾で実施し、必要な試料は収集済である。そのため、当初の計画と比較してやや遅れている。H29年度に実施できなかった項目である「細菌捕食性原生生物の網羅的な群集解析」を日向湖において実施する。一方、当初H30年度に予定していた「生物生産の高い自然環境由来の細菌捕食性原生生物の単離培養」を終えているため、得られた複数種の細菌捕食性原生生物単離株を用いて、餌となる細菌と摂餌者である原生生物の増殖生理試験と原生生物の細菌捕食活性の計測を生理学的試験を実施する。H30年度に若狭湾にて採集した試料を分析し「生物生産の高い自然環境中の細菌捕食性原生生物の網羅的解析」を実施する。また、単離培養した原生生物と原核生物を用いて、二者培養系を確立し、餌となる細菌と摂餌者である原生生物の増殖生理試験と原生生物の細菌捕食活性の計測を生理学的試験を実施する。最終的に餌である原核生物のDNAをBrdUで標識し、どの程度が原生生物に移行するかを計測し、輸送される有機物量を見積もる予定である。
種内多様性研究と細胞培養による植物二次代謝多様化誘導因子の解明

各地に広く分布する高等植物を1つの種につき複数試料,生育地域別に採集し,LC-MS分析および成分の分離・精製を行うことによって種内多様性を有する幾つかの種を見出した.このうちEupatorium heterophyllumは主要成分の異なる3つの成分タイプに分類することができ,これは別途実施した遺伝子解析の結果に基づくクラスター分類の結果とよく対応した.種内多様性が見られた植物からのカルス誘導にも成功したので,異なる成分タイプの野生個体に由来するカルスを用いた成分と培養条件との関連性の検討に着手した.本研究の全体構想は,野生植物が産生する二次代謝産物に種内多様性が生じるメカニズムを解明・制御することによって,潜在的な有用物質産生能を最大限に引き出し,創薬へ貢献することである.多様化の鍵となる因子を突き止めるためのアプローチとして,野生個体の中から実際に同一種内で成分組成の大きく異なるものを複数試料入手して人工培養に付することを企図し,平成26年度は,それに適した試料の採集,成分分析,ならびに細胞培養条件の検討を行った.試料の採集は長崎県,大分県,高知県,徳島県にて行い,Eupatorium属,Ligularia属,Farfugium属植物を得た.また,長野県産,北海道産および中国産のEupatorium属植物を別途入手した.それぞれLC-MSにて成分分析を行ったところ,本邦産のE. glehniiおよび中国産のE. heterophyllumの種内多様性が顕著であった.前者は以前の報告を支持するものであり,後者については初の知見である.そこで個別の試料について成分の分離・精製を行った結果,主要成分の組成が大きく異なる3種の成分タイプが存在することを見出した.また,F. japonicumは今回採集した試料間での違いは見られなかったが,過去の文献にて報告されている成分組成とは異なっており,種内多様性の存在が示唆された.以上の成分研究において,計26種の新物質を単離・構造決定した.成分分析と平行して培養条件を検討した.まず,採集した植物試料の各部位からカルス誘導を試みた.その結果,MS培地に最終濃度5μMのオーキシン(2,4-D)と0.5μMのサイトカイニン(BAP)を添加した場合においてE. glehniiの茎とF. japonicumの葉からカルスが誘導された.カルス抽出物のLC-MS分析と液体培養の条件について検討中である.野生植物の産生成分には多くの場合種内多様性が存在し,同じ種であっても異なる集団間あるいは異なる個体間では成分組成も異なる.このメカニズムを解明し,植物由来天然物のバリエーション拡大に応用することを目的として,平成27年度は,Eupatorium属およびFarfugium属植物を中心とした種内多様性研究と植物細胞培養を行った.前年度までにE. heterophyllumにおいて3種のケモタイプの存在を見出したが,地理的環境との相関は認められなかった.そこで,3箇所の塩基配列(核のITS領域,葉緑体のatpB-rbcL領域およびtrnL-rpl32領域)を解析し,クラスター分析を行ったところ,分類結果はケモタイプとよく一致した.さらに,本植物10試料より得た計21種の新規化合物について細胞毒性活性試験を行い,うち2種がHL-60細胞に対してpositive controlのマイトマイシンCに匹敵する活性を示した.いずれの化合物もマイナーなケモタイプの試料より微量成分として得られたものであった.一方,F. japonicumからは8種の新規セスキテルペノイドを得た.このうち1種は1つの試料の主成分であり,種内多様性を評価する上での重要な指標化合物になり得ると考えられた.本成分の変動に関与する因子の同定のため,F. japonicumから誘導したカルスの各種条件下での培養に着手した.その他,本邦各地にて採集した3種のEupatorium属植物(いずれも成分報告例なし)から8種の新物質を得るなど,研究期間を通じて49種の新規化合物を含む計150の化合物を単離した.各地に広く分布する高等植物を1つの種につき複数試料,生育地域別に採集し,LC-MS分析および成分の分離・精製を行うことによって種内多様性を有する幾つかの種を見出した.このうちEupatorium heterophyllumは主要成分の異なる3つの成分タイプに分類することができ,これは別途実施した遺伝子解析の結果に基づくクラスター分類の結果とよく対応した.種内多様性が見られた植物からのカルス誘導にも成功したので,異なる成分タイプの野生個体に由来するカルスを用いた成分と培養条件との関連性の検討に着手した.平成26年度計画として記載した試料採集,成分分析,カルス誘導を予定通り達成しており,平成27年度計画についてはEupatorium属植物を中心に検討できると考えられる.詳細な成分分析によって,種内多様性に関する新たな知見が得られ,多数の新物質も単離・構造決定した.他属植物でも同様に種内多様性の大きな試料を確保したいところである.また,細胞培養の条件について,現在カルス誘導まで56週間を要しており,さらなる最適化を検討中である.天然物化学引き続き当初計画に従い,平成27年度は成分組成の異なる野生個体から得た細胞を人工培養し,培養細胞と野生個体との産生成分の比較を行う.さらに,培養条件を変化させていった場合の成分組成を追跡し,成分組成の決定に関わる主要な因子を同定する.一方,フィールドでの試料採集および成分分析も継続し,Eupatorium属以外で種内多様性が顕著な種の探索を行う.