hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血液および喀痰中のバイオマーカー評価による肺癌の新しいスクリーニング

肺癌の早期診断および高リスク群を選別するために非侵襲的な検体を用いることの可能性を検討することを研究目的とした。研究は2つのプロジェクトに大別され、一方は血液中のp16のメチル化の検出で、もう一方はサイトメトリーによる喀痰・口腔粘膜の解析である。(方法)非小細胞肺癌症例95名および非癌症例32名血清を用い検討した。採取した血液よりDNAを抽出後、p16のmethylation変異をreal-time PCRにより定量化し求めた。(結果)非小細胞肺癌症例のp16 methylation平均値は18.6±5.09、一方、非癌症例の平均値は1.26±0.87であり有意差が認められた。これによる感度は26.3%,特異度は93.8%,診断率は43.3%, positive predictive valueは92.6%であった。(2)正常細胞のサイトメトリー解析による肺癌リスク評価(方法)肺癌患者52例および正常人54例から得られた喀痰材料、および肺癌患者69例、正常人45例から得られた口腔粘膜の正常細胞を研究対象とし高性能細胞画像解析装置を用いたサイトメトリー解析により各細胞ごとに100種類の核微細構造を定量的に評価した。(結果)癌と正常各群から得られた正常細胞の特徴を明らかにするため統計解析を行い、10項目を組み合わせることにより両群を最適に鑑別しうることが明らかになった。この結果をもとに"被験者の正常細胞から肺癌の危険性をスコア化する"プログラムのテストセット作成を行いえた。このテストセットを用いて前向きの研究が可能となった。本研究により、非侵襲的に得られた検体を用いたバイオマイカー測定が肺癌の早期診断に応用可能であることが示唆された。本年度は検体の収集と有益なバイオマーカーの候補を探索することを第1の目標とした。本研究の目的や実施要項、プライバシー保護などに関する説明文書を作成し、肺癌患者および非担癌者より非侵襲的検体(喀痰、血液、口腔粘膜細胞)を書面による十分な承諾を得て採取、収集した。検体よりDNAを抽出して次段階のバイオマーカー解析に備えるべく保存している。一方、過去10年間の論文報告を集積し、Evidence-Basedの手法を用いて肺癌診断に有効とされる遺伝子異常をバイオマーカーの候補として選別した。この段階で当初から解析予定であったp16は血液を用いた研究では報告は少ないものの癌患者に14-80%に陽性とされていた。また、この他にAPC、ERも相補的に用いることにより診断率は向上するという感触も得られたため、これらも研究に値することを確認した。この作業と平行して分光光度計で血液中のDNA濃度を測定した。現時点で約100例の解析を行ない手技的に確立した。現在までの中間解析結果では肺癌患者と正常者、あるいは進行肺癌と早期肺癌の間にDNA濃度の有意な差は認めるには至らなかった。これは腫瘍由来のDNAと血球由来のDNAが一緒に測定されたためと考えている。Methylated geneを解析することによりこの問題点は解決できると考えられ、その検証を行う予定である。p16、APC、ERは100例程度でreal time PCRを用いた解析を終了しており、現在は臨床データーと照合して閾値を設定する作業中である。(方法)非小細胞肺癌症例(腺癌66名、扁平上皮癌23名、大細胞癌6名)95名およびの非癌症例32名血清を用い検討した。

採取した血液よりDNAを抽出後、p16のmethylation変異をreal-time PCRにより半定量化し求めた。(結果)非小細胞肺癌症例のp16 methylation平均値は18.61±5.09、一方、非癌症例の平均値は、1.26±0.87であり有意差が認められた。これによる感度は26.3%,特異度は93.8%,診断率は43.3%,positive predictive valueは92.6%であった。(2)正常細胞のサイトメトリー解析による肺癌リスク評価(方法)肺癌患者52例および正常人54例から得られた喀痰材料、および肺癌患者69例、正常人45例から得られた口腔粘膜の正常細胞を研究対象とし高性能細胞画像解析装置を用いてサイトメトリー解析した。各症例1000個以上の正常細胞を計測し、各細胞ごとに100種類の核微細構造を定量的に評価した。(結果)癌および正常者から得られた正常細胞の特徴を明らかにするため統計解析を行い、10項目を組み合わせることにより両群を最も良く鑑別しうることが明らかになった。この結果をもとに"被検者の正常細胞から肺癌の危険性をスコア化する"プログラムのテストセット作成を行いえた。口腔粘膜細胞に関しては癌と非癌を75%の正確さで鑑別しえた。またサブセット解析では早期癌も進行癌と同等のスコアを示し、早期癌の検出力も十分であることが示唆された。このテストセットを用いて前向きの研究が可能となった。
正確な年齢推定に向けたアミノ酸光学異性分離カラムの作製

法医学において年齢推定は重要であり、歯のアミノ酸ラセミ化反応を利用した方法は、最も正確な年齢推定法の一つである。一般的に、ガスクロマトグラフィーを用いたアミノ酸光学異性体の分析には、β-シクロデキストリンカラムが用いられている。しかし、このカラムではアミノ酸光学異性体を高精度に分離する事は困難である。そこで本研究では、アミノ酸光学異性体を高精度に分離可能なChirasil-Valカラムを作製する事を目的とする。カラムの作製は、内面処理剤としてDPTMDS、Cyanopropyltriethoxysilane(CNPrTEOS)または3-Cyanopropyldimethoxydisilane(CNPrDEOS)で前処理後、スタティック法を用いてChirasil-Valを塗布した。カラムの評価は、n-Tridecane、アスパラギン酸(Asp)光学異性体標準試料及び歯を用いてガスクロマトグラフで行った。DPTMDS前処理カラムは、Chirasil-Valとの親和性が低く、液だれ現象が認められた。一方、CNPrTEOS及び3-CNPrDEOS前処理カラムは、Chirasil-Valとの高い親和性が認められた。特に、CNPrTEOS前処理したChirasil-Valカラムのn-Tridecane保持係数は2.035、理論段数は108348、段数/Mは4334であった。また、Asp光学異性体の分離度は2.30、保持時間は9分以内であった。これらの結果から、CNPrTEOS前処理により作成したChirasil-Valカラムは短時間で光化学異性体を高精度に分離可能であることが明らかとなった。今後、本研究で作製したChirasil-Valカラムを用いて歯のアミノ酸ラセミ化反応を分析し、正確な年齢推定を実施する予定である。
退化型準線形波動方程式の解の挙動の分類

最終年度の実施した研究の成果について.杭州師範大学のYunguang Lu氏と弾性体内の密度波を記述する準線形波動方程式の弱解の存在と非存在に関する論文が出版された。この年度は、退化後の解の延長に関する研究を取り組んだ。初期時刻おいて一様に退化する初期位置を選び、正定数よりも大きな初期速度を取れば、滑らかな解の存在するということがわかった。これは退化型双曲型方程式の解の存在における新しい結果である。変数係数摩擦項を持つ空間1次元オイラーに対して、初期データに無限遠における条件を一切かさずに一定の滑らかさと有界性のみで解の存在、一意性、解の導関数の時間減衰評価を証明した。時間減衰評価は、摩擦項の効果が強くなれば減衰率が高くなるというエネルギー法で得られていた既存の結果とは、異なる新しい結果である。研究機関全体を通じて実施した研究の成果について.この研究の動機づけとなった申請者の2016年に出版された論文に興味もったYunguang Lu教授に招聘していただき中国の数学者たちとのつながりができ、研究を大きく進展させることができた。より具体的には、双曲型保存則系としての構造を持たないが、物理的に重要なエネルギー保存則を満たす準線形波動方程式について、方程式の退化が起こるための条件を決定した。その条件は、保存則系のそれとは異なっていた。これまでの論文においては、証明が特性曲線の方法に依っており、滑らかでない解を扱うことができない。杭州師範大学のYunguang Lu教授との共同研究において、ある初期値に関する強い条件のもとでの時間大域的弱解の存在と非存在を証明した。空間1次元変数係数摩擦項付きオイラー方程式の研究を開始し、これまでの研究で仮定されていた初期値の無限遠での条件を緩和もしくは完全に取り除きながら、解の爆発(特異典型性)や時間大域解の存在を証明した。1.空間1次元準線形波動方程式のコーシー問題に対して解の挙動の分類を行った。2×2双曲型保存則系で書ける弾塑性材内の密度波を記述するモデルについては、有限時間における「方程式の退化」が起こるための十分条件を与えた。「方程式の退化」とは、主要部の係数が未知関数に依存するような準線形波動方程式において、未知関数が大きく動き、波動方程式としての構造を崩す現象である。時刻0でのリーマン不変量の単調減少性を仮定した場合、初期速度の積分量に対して、有限時間における方程式の退化が起こるか否かを分ける閾値を決定した。2.時刻0でのリーマン不変量の単調減少性が時間発展に伴って伝播しつつ、保存則系の構造を持たないいつくかの方程式に対しても有限時間における「方程式の退化」が起こるための十分条件を与えた。特に保存則系としての構造が崩れたときに上述のような閾値は存在せず、リーマン不変量の単調減少性のみで有限時間での「方程式の退化」が起こるという結果を得た。3.変数係数摩擦項付き1次元圧縮性オイラーの解に対して有限時間における解の爆発が起こるための十分条件を与えた。摩擦項が時間変数にのみ依存した場合の問題は、いくつかの既存の研究の改良が行った。例えば、リーマン不変量に関する新しい評価を用いることで、初期値の空間無限遠方での挙動に関する仮定を弱めることができ、さらに摩擦項の係数の時間減衰の速さに応じて小さな初期値に対する解の爆発時刻の適切な評価も与えた。摩擦項の係数が時間と空間変数に依存する問題は、これまで全く研究がなかったが、摩擦項の係数の時間または空間減衰がある程度速い場合に摩擦項としての効果が弱まり、初期値が小さくても解の爆発が起こることが分かった。初期速度の総積分量を保存するp-systemで書けるような1次元準線形波動方程式の古典解の解析については、初期速度の総積分量が方程式の退化が起こるか否かを分ける閾値をとる場合の解の挙動の問題が残されてしまったが、実績の概要2で述べた通り、保存則系として構造が崩れた関連方程式の方程式の退化に関して、保存則系の構造の崩れが閾値の消失に繋がる興味深い結果が得られた。杭州師範大学のYunguang Lu教授がこれらの研究に興味を持ち、古典解の枠組みを弱解へと広げる研究を共同で行うにことになった。弱解の研究は、平成29年度を行う予定であったが、彼のCompensated Compactness Methodの知識のおかげで、前倒しで行えることとなった。さらに関連する方程式として、変数係数摩擦項付きオイラー方程式についても既存の結果の改良やこれまで手つかずだった問題に着手できた。よって総合的に見て、おおむね順調に進展しているといえる。1.主要部の係数が未知関数に依存するような準線形波動方程式においては、初期値のとり方などによっては、主要部の係数が零点を持ち(方程式が退化し)、滑らかな解の存在が期待できない場合がある。中国の杭州師範大学のYunguang Lu教授とともに退化する空間1次元準線形波動方程式の時間大域的な弱解の存在を、時刻0におけるリーマン不変量の単調減少性を仮定して、証明することができた。証明は、この分野ではよく知られたCompensated Compactness Methodを使うが、この結果は、当初平成30年度に取り組む予定だった問題の一部である。一方、初期時刻において、方程式が退化していなければ、滑らかな初期値に対して、滑らかな時間局所解を構成することができるが、解が大きく動いて、主要部の係数を0へと近づけ、方程式を退化させることがある。

この現象を「(有限時間における)方程式の退化」と呼ぶ。この有限時間における方程式の退化についても、特性曲線の方法が機能しないような滑らかでない解に対して使うことができる方法を見つけ、これまでの結果の拡張を行った。これらの結果は、既に論文として国際雑誌に採録が決定している。2.29年度より研究を開始した変数係数摩擦項を持つ1次元圧縮性オイラー方程式については、摩擦係数が時間にのみ依存するが減衰が遅い部分と時空間に依存するが時間について早い減衰レートを持つか、空間について早い減衰レートを持ちながら、係数自身の大きさも小さいという仮定で、解の時間大域存在と爆発を分類するような結果を得た。この結果は、現在論文を執筆中である。平成29年度に得ていた、保存則系の構造を持たないいつくかの方程式に対する有限時間における「方程式の退化」の結果と変数係数摩擦項付き1次元圧縮性オイラーの解に対する有限時間における解の爆発の結果も論文としてすでに29年度内に投稿し、受理、採録済みである。初期時刻でのリーマン不変量の単調減少性という不必要と思われる仮定をしているが、平成30年度に行う予定だった時間大域的な弱解の存在を証明することができたという点を見て、おおむね順調に進展していると言える。最終年度の実施した研究の成果について.杭州師範大学のYunguang Lu氏と弾性体内の密度波を記述する準線形波動方程式の弱解の存在と非存在に関する論文が出版された。この年度は、退化後の解の延長に関する研究を取り組んだ。初期時刻おいて一様に退化する初期位置を選び、正定数よりも大きな初期速度を取れば、滑らかな解の存在するということがわかった。これは退化型双曲型方程式の解の存在における新しい結果である。変数係数摩擦項を持つ空間1次元オイラーに対して、初期データに無限遠における条件を一切かさずに一定の滑らかさと有界性のみで解の存在、一意性、解の導関数の時間減衰評価を証明した。時間減衰評価は、摩擦項の効果が強くなれば減衰率が高くなるというエネルギー法で得られていた既存の結果とは、異なる新しい結果である。研究機関全体を通じて実施した研究の成果について.この研究の動機づけとなった申請者の2016年に出版された論文に興味もったYunguang Lu教授に招聘していただき中国の数学者たちとのつながりができ、研究を大きく進展させることができた。より具体的には、双曲型保存則系としての構造を持たないが、物理的に重要なエネルギー保存則を満たす準線形波動方程式について、方程式の退化が起こるための条件を決定した。その条件は、保存則系のそれとは異なっていた。これまでの論文においては、証明が特性曲線の方法に依っており、滑らかでない解を扱うことができない。杭州師範大学のYunguang Lu教授との共同研究において、ある初期値に関する強い条件のもとでの時間大域的弱解の存在と非存在を証明した。空間1次元変数係数摩擦項付きオイラー方程式の研究を開始し、これまでの研究で仮定されていた初期値の無限遠での条件を緩和もしくは完全に取り除きながら、解の爆発(特異典型性)や時間大域解の存在を証明した。今年度の研究は、古典解の枠組みで行われていたが、平成29年度からは、これまで得られた成果を弱解の枠組みへと広げていく。
新出簡牘資料による漢魏交替期の地域社会と地方行政システムに関する総合的研究

本研究の目的は,次の二点である.第一は,中国各地で出土している後漢から魏晉時代の簡牘の特質を明らかにすること,第二は,その簡牘を用いて,この時代の地域社会と地方行政システムを解明することである.湖南省の長沙市で出土した長沙呉簡を主たる調査・研究の対象としたが,木簡の大型化,それと関連して地方の官府内部での白文書の広汎な利用などが明らかになった.また各種の簿籍が毎年のように作成されていた.官府の吏員は文書や簿籍の作成とその点検作業などに従事していた.1)新出魏晉簡牘のうち,枚数で最多を誇る長沙走馬楼出土の呉簡(以下,長沙呉簡)について,現地の所蔵機関である長沙簡牘博物館において2014年3月に実見調査を実施し,あわせて計測や写真撮影も行なった.実見したものは約100枚で,木牘・大木簡・木簡・竹牘・竹簡・簽牌などである.このうち,大木簡と簽牌に関しては,文字の書体や書風による作成者の員数・区別などについて突っ込んだ検討を行なった.2)最新の出土例である長沙五一広場出土の後漢簡と,益陽出土の前漢・後漢簡については,それぞれ長沙市文物考古研究所と湖南省文物考古研究所において一部を実見し,発掘担当者や管理担当者から説明を受けた.これにより,今後,長沙呉簡との比較的視点から検討を行なう必要性と可能性を確認することができた.3)西北地域については,甘粛臨沢県出土の西晉時代の編綴木簡について,甘粛省文物考古研究所において実見し,あわせて写真撮影を行なった.またこれにより,既に紹介されている釈文の不備(改行箇所など)を補訂することができた.4)同じく西北地域の出土簡牘だが,北京の古陶文明博物館に所蔵されている詳細不明の木版について実見し,あわせて写真撮影を行なった.また同博物館の関係者への聞き取りにより,その出土場所などについても情報を得ることができたほか,同博物館の収蔵状況についても確認した.1)研究対象としている新出簡牘のうち,最新刊の『長沙走馬楼三国呉簡竹簡七』に収録された簡牘については,データベース作成作業に取り組み,完成させることができた.本データベースの成果は,研究代表者・研究分担者・連携研究者・研究協力者の間で共有し,今後の研究促進に資することとする.2)2014年8月および2015年3月の二回にわたり,長沙簡牘博物館で長沙呉簡の実見・計測・撮影に従事した.また2014年8月には,湖南省チン州市・蘇仙橋遺址出土の西晋簡についても,チン州市博物館において展示されている簡を実見し,既発表の釈文を一部修正した.3)本研究組織の母体でもある長沙呉簡研究会においては,上記の調査について発表を行なって情報の共有化を図ったほか,調査の事前打ち合わせなども行なった.4)研究目的との関連で明らかになった問題は以下の通りである.a)簡牘自体に関わる問題:長沙呉簡においては,木簡と竹簡,木牘と竹牘,さらには木牘と竹簡などが同じ目的に用いられており,地方行政の場ならではと考えられる混在・混用が認められる.b)家族形態と村落構造に関わる問題:長沙呉簡の吏民簿の分析から,大家族(三族制家族)と小家族(核家族)とは,二者択一的に捉えるべきではなく,一人の人間(とくに男性)の一生は,大家族の時期と小家族の時期の双方を経ることになる.またこれらの家族からなる里は,吏民簿では五十戸から構成されているが,これはあくまでも帳簿上のことであり,里の実際の規模を示しているとは考えがたい.c)行政システムに関わる問題:地方行政の場における文書システムとしては,上行文書に「敢言之」文書と「白」文書の二種が二者間の関係性によって使い分けられていたこと,「教」は県令(国相)の指示・命令である,これが「符」などの下達文書によって伝達されたこと,また戸籍制度としては,複数の吏民簿が併用されていた.1)研究対象としている新出簡牘のうち,長沙走馬楼呉簡については,2015年8月に,長沙簡牘博物館において実見・計測・撮影に従事した.その成果については,本プロジェクトの母体でもある長沙呉簡研究会において報告を行い,情報の共有を図った.新刊の『長沙走馬楼三国呉簡竹簡捌』を得て,データベース作成の準備作業に入った.2)プロジェクト活動が3年目に入ったので,中間報告のために,2015年9月20日,東京大学本郷キャンパスにおいて,国際シンポジウム「後漢・魏晋簡牘研究の現在」を開催して4本の報告を行なった.

これに対して,日本・中国・台湾・韓国の4人のコメンテーターから外部評価を受けた.シンポジウムの総説では,後漢(とくにその後半期ないしは2世紀以降)や魏晋・五胡十六国時代の研究は,もはや簡牘への関心なくしては成り立たないこと,甘粛臨澤西晋簡の紀年は313年で,朝鮮半島の楽浪・帯方両郡がそれぞれ高句麗・百済に陥落した年であること,すなわち,涼州の張掖郡臨澤県で,簡牘がなお地方行政の場で用いられていたとすれば,同じ西晋の支配下にあった平州の楽浪郡や帯方郡でも簡牘が地方行政の場で用いられていた可能性がきわめて高いこと,そのような簡牘をベースとした行政システムが高句麗や百済,ひいては新羅に移入されたと考えるべきであることなどが述べられた.3)研究目的との関連で明らかになった問題は以下の通りである.a)長沙走馬楼呉簡の吏民簿については,作成主体は郷であり里ではないこと(ただし,里の責任において原本が作成されたこと),b)地方長官の指示・命令である「教」は,長沙走馬楼呉簡のみならず5世紀半ばの吐魯番文書にも見られること,また「賜教」という成語は,さらに韓国・慶州出土の新羅木簡にも継承されていること,この木簡は吏読の最初期の事例とされてきたが,「賜」は丁寧語の接尾詞とは言えないことなどである.新出簡牘のうち,最大の史料群である長沙走馬楼呉簡のうち,『長沙走馬楼三国呉簡竹簡伍』と同『竹簡陸』の刊行が遅れており,データベース化も,これを用いた研究も目処が立っていないが,それ以外はおおむね順調に進展している.本研究課題にとって最終年度であったため,2016年8月に中国・湖南省長沙市で開催された紀念走馬楼三国呉簡発現二十周年長沙簡牘研究国際学術研討会において研究代表者・研究分担者ら5名が今までの研究成果を報告した.これ以外には,連携研究者がペーパーを提出したほか,開会挨拶を行ない,2名の海外共同研究者も報告や総評を担当した.研究組織の母体である日本・長沙呉簡研究会(研究代表者が幹事,連携研究者が代表を務める)が,この国際学会の協弁単位に名を連ねた.また学会における研究報告は,中国で刊行が予定されている論文集に全て掲載されることになっている.またさらに2016年12月には,最後の補充調査を長沙市の長沙簡牘博物館において実施した.調査には,研究代表者・研究分担者・研究協力者・海外共同研究者7名が参加した.この調査の結果などは,2017年3月に冊子体で刊行した研究成果報告書に掲載することができた.これを配布したり,またその電子媒体を公表することにより(主として中国・韓国・台湾の研究機関と研究者に対して),研究成果を広く周知することができた.その他にも,研究代表者が韓国の木簡学会において招待講演を行なったり,分担者が中国の秦漢魏晉南北朝史国際学術研討会や国内の中国水利史研究会大会で報告を行なったりして成果の発信に努めた.母体となった長沙呉簡研究会の例会は年間5回開催し,外部からの報告も行なわれた.活動のもう一つの柱であるデータベースの作成については,最新刊の『長沙走馬楼三国呉簡竹簡[捌]』所收の簡牘について,分担して作成に取り組み,2016年10月に完成したが,公開までには至っていない.本研究の目的は,次の二点である.第一は,中国各地で出土している後漢から魏晉時代の簡牘の特質を明らかにすること,第二は,その簡牘を用いて,この時代の地域社会と地方行政システムを解明することである.湖南省の長沙市で出土した長沙呉簡を主たる調査・研究の対象としたが,木簡の大型化,それと関連して地方の官府内部での白文書の広汎な利用などが明らかになった.また各種の簿籍が毎年のように作成されていた.官府の吏員は文書や簿籍の作成とその点検作業などに従事していた.研究対象としている簡牘を収蔵・展示している湖南省博物館が改修のため休館に入っており,充分な閲覧調査ができていないが,それ以外はおおむね順調に進展している.1)『長沙走馬楼出土三国呉簡竹簡捌』のデータベースを2016年夏までに完成させ,研究に活用する.また同じく新刊の『長沙五一広場東漢簡牘選釈』についても,同様な対応の可能性を見当する.2)2016年度は最終年度なので,2016年8月27・28日に予定されている「紀念長沙走馬楼三国呉簡出土20周年国際学術研討会」(長沙市人民政府・故宮博物館主弁,長沙市)にペーパーを提出する.3)最終成果を論集
ゴーシェ病モデルマウスを用いたケミカルシャペロン療法の開発に関する研究

Gaucher病の中枢神経症状に有効な治療法はない。Gaucher病の原因酵素GBAのF213I変異は低分子化合物N-octyl-β-alienamine(NOV)によって活性化されることを見出し、中枢神経症状の治療のためのケミカルシャロン療法の樹立を目指している。F213I変異を持つマウスの作成し、中枢神経系の治療実験を行うことを目指したが、F213I蛋白質を発現するマウスを得ることが出来なかった。正常マウスへのNOVの経口投与実験を行い、NOVは安全で、脳を含む臓器のGBA活性を上昇させることを確認した。ゴーシェ病の中枢神経系症状の治療法開発を目的として、脳内へ移行可能な低分子化合物で、変異したβ-グルコシダーゼ(GBA)を活性化できる化合物の開発と臨床応用を目的としている(ケミカルシャペロン療法の開発)。これまでに、N-octyl-β-valienamine(NOV)が培養細胞レベルで、F231I、N188S、G202R、N370S変異を活性化することを見出した。今年度、正常マウスにNOVを経口投与した時、1週間の投与で明らかな毒性なく、脳を含む組織に移行し、正常のGBA活性を増加させることを明らかにした。動物レベルでの治療効果の確認のためにはF213I変異など、NOVで活性化させる変異を持つマウスの作成が必要であり、GBAノックアウトマウスへF213Iの導入を試みてきたが現在まで、マウスの作成には成功していない。一方、NOV以外の化合物のスクリーニングをスペインのセビリア研究所と共同で行い、二環系SP^2-アザ糖がNOV同様にF231I、N188S、G202R、N370S変異を活性化することを見出し、スペイン国内特許を請願した(P200802988)。低分子化合物N-octyl-β-valienamine(NOV)は、ゴーシェ病の原因酵素であるグルコセレブロシダーゼの変異の中で、一部のミスセンス変異酵素の活性を上昇させることを報告した。この変異酵素の活性上昇は、NOVが、変異酵素に結合し、その折り畳み構造を変化させて安定化するシャペロンとして働くと考えてきた。NOVは脳内移行可能で、ゴーシェ病の中枢神経症状に有効である可能性があり、本研究の成果は、ライソゾーム病中枢神経症状治療薬の開発出来る可能性があり、変異酸性β-グルコシダーゼに対するケミカルシャペロン療法の開発を目指した基礎的研究を行うことを目的とする。21年度は、NOV以外の新規のケミカルシャペロンの開発のために、新たにスペインのセビリア大学と共同して新規化合物のスクリーニングを行い、二環系ノジリマイシン(Luan Z, et al., ChemBioChem 2009)が新たなシャペロンとなることを明らかにし、N188S、F213I、N370S、G202R、N120W変異に対しては有効で、日本人ゴーシェ病2-3型の20%の中枢神経症状の治療薬となることを確認した(Luan Z. et al., Blood Cells Mol Dis 2010)。20年度21年度にかけ、アメリカNIHで作成されたグルコセレブロシダーゼノックアウトマウスとヒトグルコセレブロシダーゼcDNAにF213I変異を導入したトランスジェニックマウスを作成し、交配によってマウスグルコセレブロシダーゼノックアウト/ヒトF213Iグルコセレブロシダーゼを発現するマウスを作成したが、変異F213I変異を発現するマウスを作成出来なかった。この原因は明らかではないが、マウス細胞へ導入したF213IcDNAが産生する酵素蛋白質がライソゾームへ移動しないことが確認され、導入された遺伝子の発現に異常を来している可能性が考えられた。ゴーシェ病モデルマウスの作成については作製方法などの戦術の転換が必要になっている。2004年我々はF213I変異を持つゴーシェ病患者線維芽線維芽細胞のβ-glucocerebrosidase (β-Glu)の活性がN-octyl-β-valienamine (NOV)存在下で安定化し、ライソゾーム内の酵素蛋白量を増加させ、蓄積物質であるグルコシルセラミドを減少させ、変異酵素を活性化させるシャペロンとなることを見出した。その後、2007年にはNOVはβ-Gluの活性部位のN188S、G202R、F213I、G202R、N370S変異の活性を上昇させることを確認し、2010(Luan Z, et al.Blood Cell Mol Dis, 2010 ; Luan Z, et al., Brain Dev 2010)にはR120Wも活性が増強されること、正常マウスの脳の活性を挙げることを確認した。

しかしNOVはその供給に限界があり、2010年(Luan Z, et al.Chembiochem 2010)にはスペインのグループとの共同で、二環型糖化合物が同じ様にシャペロン活性を有することを明らかにした。これらの低分子化合物は現在まで有効な治療法のないゴーシェ病の中枢神経症状に有効である可能性がある。カナダのグループは去痰剤ムコソルバンとして市販されているAmbroxolの中枢神経系への有効性を確認するためN188S変異を持つ進行性ミオクローヌスてんかんの症状を有するゴーシェ病患者への投与を開始して中枢神経系症状への効果の確認を行っている。
膀胱癌の尿中マーカーと治療標的としてのRANTES・MCP-1の可能性探究

健常人と膀胱癌患者の尿中RANTESの濃度を比較し、膀胱癌患者の尿中RANTESの濃度が有意に上昇していることが確認できた。また比較的悪性度の低い膀胱癌でも有意な上昇を認めていることから、膀胱癌の早期発見につながる新たな腫瘍マーカーとしての可能性が示唆されたと同時に、尿細胞診などの低浸襲な検査と組み合わせることによって、より腫瘍マーカーとしての感度、特異度を増幅させられる可能性が出てきた。また、膀胱癌の悪性度、浸潤度と尿中RANTESの濃度も相関関係にあった。さらにRANTESの主な受容体であるCCR5の膀胱癌組織における免疫染色でも染色度と膀胱癌の浸潤度は極めてよく相関したことから、RANTESやCCR5は膀胱癌の進行過程において重要は役割を果たしている可能性が示唆された。我々は以前に膀胱癌の発癌、浸潤にPTEN-PI3K-AKT経路が寄与している可能性が高いことを示したが、この経路の活性化には、外部からの成長因子やサイトカインといった入力が不可欠である。サイトカインも尿中には十分含まれていると考えられ、これらの入力が刺激となって膀胱癌の浸潤、あるいは転移が加速される原因の一つになっている可能性がある。特に炎症性サイトカインのうち、RANTES(CCL5)やMCP-1(CCL2)は、癌細胞から分泌されて、腫瘍細胞自身のmotilityを高めるだけではなく、腫瘍細胞にとって都合のよい微小環境を作りあげることが報告されている。膀胱癌においても、慢性の尿路感染症は膀胱癌発癌のリスクファクターであり、長期間の尿中の炎症性サイトカインの曝露により発癌や癌の浸潤、転移過程にも関与している可能性は高いと考えられる。22年度の研究では、まず健常人と膀胱癌患者の尿中RANTESの濃度を比較し、膀胱癌患者の尿中RANTESの濃度が有意に上昇していることが確認できた。また比較的悪性度の低い膀胱癌でも有意な上昇を認めていることから、膀胱癌の早期発見につながる新たな腫瘍マーカーとしての可能性が示唆された。今年度の研究では、健常人と膀胱癌患者の尿中RANTESの濃度を比較し、膀胱癌患者の尿中RANTESの濃度が有意に上昇していることが確認できた。また、膀胱癌の悪性度、浸潤度と尿中RANTESの濃度の関連においても相関関係を認めた。さらにRANTESの主な受容体であるCCR5の膀胱癌組織における免疫染色でも染色度と膀胱癌の浸潤度は極めてよく相関したことから、RANTESやCCR5は膀胱癌の早期発見につながる新たな腫瘍マーカーとなりうる可能性のみならず、膀胱癌の悪性度(浸潤癌への移行、転移のし易さなど)を示すマーカーともなりうる可能性が示唆された。
Mir-195 rescue B cell development independently of transcription factor in EBF KO hematopoietic progenitor cells

今まで、細胞運命、分化の決定は転写因子に依存すると考えられてきた。特に血液の分野であるB細胞の分化初期にEBF1転写因子が非常に大事だという考えがありました。EBF1転写因子なしでB細胞分化を全体に解除する考えもありました。転写因子以外である非コードRNAの一つmiRNAがfine tunerであることも考えられてきた。そこで、EBF1転写因子なしに解除したB細胞分化はmiR-195が本研究で包括的に明らかにしまし、確かに解除しB細胞分化をmiR-195が誘導することを見出した。血液内科学
ブドウ球菌由来表皮剥脱毒素ファミリーの同定および皮膚感染症における作用機序の解析

本年度は、水疱性膿痂疹あるいはブドウ球菌性熱傷様皮膚症侯群(SSSS)における表皮内水疱が、黄色ブドウ球菌由来表皮剥脱毒素(ET)によるDsg1の切断のみにより生じるか、あるいは切断後のDsg1を含むデスモソーム構成蛋白の細胞内移動が重要となるか検討した。新生仔マウスにETAを投与し、投与後におけるデスモソーム構成蛋白の経時的な細胞内動態を蛍光抗体法により観察した。その結果ETA投与マウスにおいて、投与後約30分よりDsg1切断端のN末端側が角化細胞膜表面から消失したのに続き、投与後60分よりマウス表皮上層に病理組織学的な水疱が観察された。水疱に面した角化細胞の一部では、ETA投与後60分よりDsg1切断端のC末端側が細胞質内に認められたが、多くの角化細胞ではDsg1のC末端側が水疱面の角化細胞膜上に残存した。また水疱に面した角化細胞では、Dsg1と共発現する接着蛋白デスモコリン1、さらにデスモソームの細胞内蛋白であるプラコグロビンやデスモプラキンもまた、水疱面の角化細胞膜上に残存した。さらにETA投与後60分において、透過型電子顕微鏡を用いた観察により半割デスモソームが水疱面の角化細胞膜上に認められた(Nishifuji et al. manuscript in preparation)。以上の一連の結果より、水疱性膿痂疹やSSSSにおいては、ETによるDsg1の切断が表皮内水疱の直接的な原因となる可能性が示唆され、これらの疾患における水疱形成機序を紬胞レベルで説明することが可能となった。今後は表皮剥脱毒素ファミリーとDsg1との結合様式について、結晶構造解析ならびに生化学的手法を用いた解析が行われると共に、ET-Dsg 1間の酵素基質反応を特異的に阻害する皮膚感染症の新規治療法が開発されることが期待された。本年度は、水庖性膿痂疹やブドウ球菌性熱傷様症候群の原因となる黄色ブドウ球菌由来表皮剥脱毒素(ET)について、新たなET遺伝子の検出を試みたと共に、ETと新規DsgであるDsg4との反応性について検討を行った。さらにブタ膿痂疹の原因となるS.hyicus由来表皮剥脱毒素Exhの水庖形成機序に関する検討も行った。まず皮膚感染症の患者から分離された黄色ブドウ球菌株より、ETに類似した翻訳アミノ酸配列をもつセリンプロテアーゼ遺伝子を1種同定した。そしてこの遺伝子を元に大腸菌発現系で作成した組換え蛋白が、新生仔マウスに投与後48時間で表皮内水庖を形成すると共に、バキュロウイルス発現系で作成したヒトおよびマウスDsg1細胞外領域の組換え蛋白とin vitroで24時間反応させたところ、Dsg1を特異的に消化することを確認した。次に、新規に同定された表皮細胞間接着蛋白であるDsg4が、Dsg1と同様ETの標的となるか解析した。その結果、既知の3種のET(ETA、ETB、ETD)は、ヒトおよびマウスDsg4細胞外領域の組換え蛋白をin vitroで消化しないことを証明した。この事実を元に、Dsg4が既知のDsgとは異なり、表皮において表皮細胞間接着以外の何らかの役割を有する可能性を提唱した(J CIin Invest:114)。さらに本年度は、S.hyicus由来Exhの、ブタにおける水庖形成機序について検討を行った。4種のExh(ExhA, ExhB, ExhC, ExhD)の組換え毒素を大腸菌の発現系で作成し、これをブタ皮膚の凍結切片とin vitroで反応させてDsgの染色性の変化を蛍光抗体法により確認した。その結果4種のExhが、抗Dsg1抗体をもつヒト落葉状天庖瘡患者血清の染色性を特異的に消失させたことから、本疾患がヒト膿痂疹と同一の病態発症機序を有する可能性を示唆した。本年度は、水疱性膿痂疹やブドウ球菌性熱傷様症候群の病因となる黄色ブドウ球菌由来表皮剥脱毒素(ET)について、ETにより切断されたデスモグレイン(Dsg)1のin vivoにおける細胞内動態と水疱形成との関連を検討した。また豚滲出性表皮炎の病因となるS.hyicus由来表皮剥脱毒素Exhが、様々な動物種由来のDsg1をin vitroで切断できるか検討を行った。ETAを投与した新生仔マウスの皮膚を経時的に採取し、マウス表皮におけるDsg1の細胞内動態を蛍光抗体法により観察した。その結果マウス皮膚において、ETAにより切断されたDsg1の"切り株"が水疱形成後も角化細胞膜表面に残存したことから、膿痂疹ではETによるDsg1の切断が水疱形成の直接的な原因となる可能性を示唆した。次に、S.hyicus由来ExhがブタDsg1の細胞外領域を直接切断するか検討を行った。ブタDsg1のcDNAクローニングを行い、ブタDsg1細胞外領域の組換え蛋白をバキュロウイルス発現系により作成した。さらに作成した組換えブタDsg1が、in vitroで4種のExhによりin vitroで直接切断されたことから、豚滲出性表皮炎がヒト膿痂疹と同一の病態発症機序を有する可能性を示唆した。(Vet Dermatol 16:315-323,2005)さらに本年度は、Exhが様々な動物種由来のDsg1を切断しうるか検討した。

4種のExhを、ヒト、マウスならびにイヌDsg1の組換え蛋白とin vitroで反応させたところ、マウスDsg1αおよびDsg1βがExhAおよびExhCにより切断されたのに対し、ExhBとEXhDでは切断されなかった。さらにマウスDsg1γとイヌDsg1は、いずれのExhによっても切断されなかったことから、表皮剥脱毒素が極めて狭い基質特異性を示すプロテアーゼである可能性を示唆した(Microb Pathog 39:171-176,2005)。来年度は表皮剥脱毒素ファミリーとDsg1との反応動態について、結晶構造解析ならびに生化学的手法を用いてさらに解析するとともに、ETの発現調節機構についても解析を行う予定である。本年度は、水疱性膿痂疹あるいはブドウ球菌性熱傷様皮膚症侯群(SSSS)における表皮内水疱が、黄色ブドウ球菌由来表皮剥脱毒素(ET)によるDsg1の切断のみにより生じるか、あるいは切断後のDsg1を含むデスモソーム構成蛋白の細胞内移動が重要となるか検討した。新生仔マウスにETAを投与し、投与後におけるデスモソーム構成蛋白の経時的な細胞内動態を蛍光抗体法により観察した。その結果ETA投与マウスにおいて、投与後約30分よりDsg1切断端のN末端側が角化細胞膜表面から消失したのに続き、投与後60分よりマウス表皮上層に病理組織学的な水疱が観察された。水疱に面した角化細胞の一部では、ETA投与後60分よりDsg1切断端のC末端側が細胞質内に認められたが、多くの角化細胞ではDsg1のC末端側が水疱面の角化細胞膜上に残存した。また水疱に面した角化細胞では、Dsg1と共発現する接着蛋白デスモコリン1、さらにデスモソームの細胞内蛋白であるプラコグロビンやデスモプラキンもまた、水疱面の角化細胞膜上に残存した。さらにETA投与後60分において、透過型電子顕微鏡を用いた観察により半割デスモソームが水疱面の角化細胞膜上に認められた(Nishifuji et al. manuscript in preparation)。以上の一連の結果より、水疱性膿痂疹やSSSSにおいては、ETによるDsg1の切断が表皮内水疱の直接的な原因となる可能性が示唆され、これらの疾患における水疱形成機序を紬胞レベルで説明することが可能となった。今後は表皮剥脱毒素ファミリーとDsg1との結合様式について、結晶構造解析ならびに生化学的手法を用いた解析が行われると共に、ET-Dsg 1間の酵素基質反応を特異的に阻害する皮膚感染症の新規治療法が開発されることが期待された。
再生細骨材を用いたソイル-セメントコンクリートに関する研究

リサイクル法の施行にともないコンクリート廃材としての再生細骨材の有効利用を、建物を新築する際に発生する建設発生土の活用方法と合わせて提案する事を目的として実験研究した。実験は、平成5年度に土の物理試験、再生細骨材の物理試験、再生細骨材を用いたソイルセメントコンクリートの調合・強度試験・収縮試験(平成5年度平成6年度に実施)を計画・実施、平成6年度は再生細骨材-土-結合材系コンクリートの調合・設計方法を確立するため、コンクリート工学と同様に水-セメント比に基ずいた調合・設計を行うための土、再生細骨材および土と再生細骨材の混合したものの表乾状態を判定する方法を計画・実験研究した。土は産地・性状の異なる6種類、再生細骨材は1種類、結合材(安定材)はセメントの他に高炉水砕スラグ、フライアッシュ、石膏、石炭などの混和材を使用した。結果は、再生細骨材と土の混合割合と強度および密度との関係から、土の種類の違いによって強度発現が異なること、再生細骨材と土の混合割合が0.2/0.80.5/0.5で最大強度が得られること、セメントの代替として各種混和材を使う場合に土の種類によって使い分けをする必要があること、ソイルセメントコンクリートは水の有効水量的な考えが成立し、コンクリート工学同様に扱えること、また、材令と体積変化との関係から、養生方法により収縮ひずみ、体積減少率が異なる。等々の結果より、再生細骨材は土と合わせ考えることによりその有効利用が可能であり、土、再生細骨材ともに表乾状態を判定することが出来ることから調合・設計ができるとの結論を得た。コンクリート廃材から再生粗骨材を製造する際に発生する5mm以下の微粉(再生細骨材)を新築の際発生する残土の利用と合わせて活用する方法の実験研究を行った。平成5年度の研究実施計画に基づき成果を項目別にまとめると以下のようになる。1.土の物理試験再生細骨材と混合して用いる産地・性状の異なる3種類の土(岩手ローム、関東ローム、海成粘土)の粒度、比重、比表面積、含水比、吸水率、pH、強熱減量、SEMなどの試験を行った。2.再生細骨材の物理試験1種類の再生細骨材について比重、粉度分布、吸水率などの試験を行った。ソイルセメントコンクリートの調合に必要な土および再生細骨材の吸水率については、研究代表者らが提案している乾燥加速度法により求めた。3.再生細骨材を用いたソイルセメントコンクリートの調合・強度試験C/Wを0.6,0.8,1.0、フロー値を200±20(mm)一定として再生細骨材と土との混合割合を変えた調合・強度試験を行った。セメント単味を結合材として使用した場合の結果から、「土の種類の違いにより強度発現は異なる。」「C/Wの違いにより強度発現は異なる。」「強度が最大になる再生細骨材と土との混合割合は土の種類の違いにより異なる。」などの新しい知見を得た。更に、これらの結果を利用して、再生細骨材と土との混合割合を0.5/0.5とし、セメントの代替として3%石膏入り高炉水砕スラグを使った場合および消石灰入りフライアッシュを使った場合の強度発現試験を行った。以上の強度試験より再生細骨材と建設残土の有効な活用法を確認することができた。弾性係数は実験を継続中である。4.収縮試験調合を変えた場合のソイルセメントコンクリートについて、phi5×h10(cm)、10×10×40(cm)の供試体を作製し、質量変化および乾燥収縮を現在試験中。(弾性係数と合わせ結果は平成6年8月頃になる予定。)

計画の「1.平成5年度から継続中の、高炉水砕スラグ、フライアッシュ等の混和材をセメントの代替として使用した場合のソイルセメントコンクリートの強度および収縮試験」について、強度試験は3種類の土を使って土と再生細骨材の混合割合を0.5/0.5とし、セメントと高炉水砕スラグとの混合割合、セメントとフライアッシュとの混合割合を変え、材令、安定材-水比をパラメータとして試験した。その結果、強度発現は、土の種類、安定材-水比、セメントと混和材の違いで異なることが判った。収縮試験は3種類の土を使って土と再生細骨材の混合割合を0.75/0.25、0.5/0.5とし4×4×16cmの供試体を作製し、セメントと混和材、安定材-水比、養生の違いをパラメータとして収縮ひずみ、質量減少率について試験した。その結果、土の種類の違い、安定材-水比、養生の違いにより、収縮ひずみ、質量減少率ともに異なることが判った。計画の「2.データ整理」については、平成5年度からの「使用土の物理試験」、「再生細骨材の物理試験」、「再生細骨材を用いたソイルセメントコンクリートの調合・強度試験」の結果の整理を現在進行中。計画の「3.再生細骨材-土-結合材系コンクリートの調合・設計方法の確立」については、コンクリート工学における調合・設計は、水-セメント比を基本としているが、ソイルセメントコンクリートの調合・設計も同様に行えるように、土、再生細骨材、土と再生細骨材の混合したものゝ表乾状態を判定する試験法を研究し、この結果に基ずいて、水セメント比と強度との関係が一次の関数で表せることを示した。なお、コンクリート塊から再生細骨材を製造する際に1次、2次処理をする場合、0.075mm以下の微粉が多量発生する。この微粉も再生細骨材と同様有効利用する方法について考え、安定材をセメントの代替としてスラグ、フライアッツシュ、石膏、石灰等を使い、更に土の含水量を調整するための減水剤を使うなどして、土と混合する方法を中心として現在実験研究中であり、良い成果が得られるものと確信する。
物質生産モデルを基礎とした温帯域森林生態系モデルの開発とその検証

水俣の照葉樹林を対象とした温帯域森林生態系モデルを作った.このモデルはすでに開発されている熱帯多雨林モデルを拡張したものである.すなわち,熱帯多雨林では,気温や光強度の季節変化を年中一定のものとして, 1年をサイクルタイムとして計算を行なったが,温帯を対象とするには気温や光強度の季節変化を無視する訳にはいかない.さらには,これらの環境要因の季節変化にともなって,個葉の光合成・呼吸活性などの生理要因も季節変化するので,これらの季節変化特性も組み入れた.水俣の照葉樹林に関しては,すでにIBPの研究の一環として,総合的な森林生態系研究が多くの生態学者が参加して行なわれ,その成果を集大成した報告書(JIBP Synthesis vol.18, 1978)が印刷されている.そこで,今回のモデルにははこの報告書にある多くの実測データを最大限に取り込んだ.まず,今回のモデルのサイクルタイムを1ケ月とした.そこで,毎月の気温と日積算日射量の実測データを黒岩(1966)の理論式に入力して,剰余生産力を求めた.茎や根の呼吸速度は毎月の気温の関数として計算した.リターフォールに関しては実測値を参照して,葉については5月に,茎については10月に極大になるように,配分した.植物体各部分の月別成長もリターフォールに似た取り扱いとした.このようにして決めたモデルを走らせ, 100年の森林動態をシミュレートした.今回の温帯モデルも前回の熱帯多雨林モデルと同様な現存量と各種炭素フラックスの経年変化を示したが,定常状態に達する時間はかなり長くなった.このようにして得られた照葉樹林の各種現存量や炭素フラックスの推定値は,実測値とよくあった.以上の成果をまとめて,報告書を印刷した.水俣の照葉樹林を対象とした温帯域森林生態系モデルを作った.このモデルはすでに開発されている熱帯多雨林モデルを拡張したものである.すなわち,熱帯多雨林では,気温や光強度の季節変化を年中一定のものとして, 1年をサイクルタイムとして計算を行なったが,温帯を対象とするには気温や光強度の季節変化を無視する訳にはいかない.さらには,これらの環境要因の季節変化にともなって,個葉の光合成・呼吸活性などの生理要因も季節変化するので,これらの季節変化特性も組み入れた.水俣の照葉樹林に関しては,すでにIBPの研究の一環として,総合的な森林生態系研究が多くの生態学者が参加して行なわれ,その成果を集大成した報告書(JIBP Synthesis vol.18, 1978)が印刷されている.そこで,今回のモデルにははこの報告書にある多くの実測データを最大限に取り込んだ.まず,今回のモデルのサイクルタイムを1ケ月とした.そこで,毎月の気温と日積算日射量の実測データを黒岩(1966)の理論式に入力して,剰余生産力を求めた.茎や根の呼吸速度は毎月の気温の関数として計算した.リターフォールに関しては実測値を参照して,葉については5月に,茎については10月に極大になるように,配分した.植物体各部分の月別成長もリターフォールに似た取り扱いとした.このようにして決めたモデルを走らせ, 100年の森林動態をシミュレートした.今回の温帯モデルも前回の熱帯多雨林モデルと同様な現存量と各種炭素フラックスの経年変化を示したが,定常状態に達する時間はかなり長くなった.このようにして得られた照葉樹林の各種現存量や炭素フラックスの推定値は,実測値とよくあった.以上の成果をまとめて,報告書を印刷した.この研究の目的は、森林の生長のメカニズムを物質生産の観点から明らかにするために、物質生産モデルを基礎とした森林生態系モデルを開発することである。特に今回は、温帯域の森林を対象にしている。当初の計画通り、モデル計算を迅速に行なうために、マイクロコンピュータ(PC98VM2)を購入し、モデル計算に活用している。さらに、このコンピュータにストリーマ付固定ディスク装置を取り付けて、プログラムやデータを数多く記憶させている。今年度購入したこれらの備品を活用して、モデル計算を行たった。まず、熱帯とは大きく異なる光環境が温帯の生産力にどのような影響を及ぼし得るかの検討を行なった。その結果、日最大照度は熱帯よりも低い温帯において、夏の日長の長いことが、温帯の生産力に大きな効果を持ち得ることが明らかとなった。従って、一日あたりの光エネルギーとしては熱帯と同じであっても、比較的弱い光が長時間あたる温帯において、植物の生産には非常に効果的なことが分かった。続いて、この温帯における効率的な生産力が、暖温帯の常緑広葉樹林の生長にとって、どのような意義があるかを、温帯林を対照とした森林生態系モデルを作って、現在検討中である。
医薬応用をめざしたプロスタノイドと受容体サブタイプによる疾患形成の分子基盤研究

【京都大学グループの成果】1.受容体遺伝子欠損による各プロスタノイド受容体の病態機能評価: 4種類のEPサブタイプ受容体欠損マウスを作製し、それらを用いて受容体の生理機能を評価した。その結果、EP2はApcノックアウトマウスにおける大腸ポリープの形成時にCOX-2に由来して産生されるPGE2が作用する主たるPGE受容体であることを明らかにし、その作用機序としてVEGF産生亢進、COX-2誘導のポジティブフィードバック亢進が示唆された。またEP4はデキストラン硫酸投与による大腸炎モデルにおいて、上皮再生の亢進作用、白血球及びリンパ球の活性化抑制作用により、炎症抑制作用を発揮することを明らかにした。2.プロスタノイド受容体EP3による新しい情報伝達系: EP3受容体は従来、Giタンパクと共役し、細胞内cAMP濃度上昇を抑制すると考えられてきた。ところで、EP3にはC末端のみ異なる複数のイソフォームが存在するが、これらイソフォームはアゴニスト依存的なGiの活性化効率が異なる点が指摘されてきた。今回、我々は、COS細胞に発現したEP3受容体が他のGs活性に対してこれを亢進させる機能を有することを発見し、この機能はC末端の構造によらず全てのイソフォームにおいて同様に認められたことから、EP3の生理機能の一端を担う可能性が考えられた。【小野薬品工業(株)研究所グループの成果】3.4種類あるPGE2受容体サブタイプの遺伝子クロンを発現させた動物細胞を用いて、従来困難とされていたEP4受容体に特異的な遮断薬を開発した。代表的な化合物として、ONO-AE2-227、ONO-AE3-208を発見した。これら薬物は、その選択性において既知物質をはるかに凌ぐ。本研究の目的は、プロスタノイド受容体欠損マウスを用いた種々の病態形成におけるプロスタノイドの役割の解明と受容体選択的な薬物の開発である。本年度の研究実施計画に基づき、下記の知見を得た。1)プロスタノイド受容体特異アンタゴニストの作製4種類のPGE受容体サブタイプcDNAを発現させた細胞を用い、リガンド結合親和性とG蛋白活性化能とを指標に、受容体選択的なアゴニストを開発することに成功した。2)受容体遺伝子欠損による各プロスタノイド受容体の生理機能評価(1)オボアルブミン誘発マウス喘息モデル:DP欠損マウスにおいては病態の緩和を、EP3欠損マウスにおいては病態の増悪を認めた。このことから、アレルギー性喘息において、PGD_2は促進因子として、PGE_2は防御因子としてそれぞれ機能することがわかった。(2)デキストラン硫酸(DSS)大腸炎モデル:DSS大腸炎モデルにおいてEP4欠損マウスのみが顕著な増悪を示すこと、および野生型マウスのDSS大腸炎に対して、選択的EP4アゴニストが治療効果を有することを明らかにした。3)腹腔浸潤好中球のサイトカイン産生の解析Gs共役型のEP2およびEP4受容体サブタイプの腹腔浸潤好中球でのはたらきを調べた。その結果、PGE_2はLPS刺激によるTNF-α産生を抑制しIL-6産生を促進すること、また、前者はEP4により、後者はEP2により主に制御されていることを見いだした。4)分娩誘導に関与するシクロオキシゲナーゼ(COX)の解析分娩時の子宮収縮に関与するPG産生がどのタイプのシクロオキシゲナーゼによってなされているのかを、PGF_<2α>受容体FP欠損マウスを用いて検討し、COX-2であることを明らかにした。【京都大学グループの成果】(1)プロスタノイド受容体EP3による新しい情報伝達系:EP3受容体は、従来、Giタンパクと共役し、細胞内cAMP濃度上昇を抑制すると考えられてきた。

ところで、EP3にはC末端のみ異なる複数のイソフォームが存在するが、これらイソフォームは、アゴニスト依存的なGiの活性化効率が異なる点が指摘されてきた。今回、我々は、COS細胞に発現したEP3受容体が、他のGs活性に対して、これを亢進させる機能を有することを発見し、この機能はC末端の構造によらず、全てのイソフォームにおいて同様に認められたことから、EP3の生理機能の一端を担う可能性が考えられた。(2)受容体遺伝子欠損による各プロスタノイド受容体の病態機能評価:4種類のEPサブタイプ受容体欠損マウスを作製し、それらを用いて受容体の生理機能を評価した。その結果、EP2はApcノックアウトマウスにおける大腸ポリープの形成時にCOX-2に由来して産生されるPGE2が作用する主たるPGE受容体であることを明らかにし、その作用機序としてVEGF産生亢進、COX-2誘導のポジティブフィードバック亢進が示唆された。また、EP4はデキストラン硫酸投与による大腸炎モデルにおいて、上皮再生の亢進作用、白血球及びリンパ球の活性化抑制作用により、炎症抑制作用を発揮することを明らかにした。【小野薬品工業(株)研究所グループの成果】(3)4種類あるPGE2受容体サブタイプの遺伝子クロンを発現させた動物細胞を用いて、従来困難とされていたEP4受容体に特異的な遮断薬を開発した。代表的な化合物として、ONO-AE2-227、ONO-AE3-208を発見した。これら薬物は、その選択性において既知物質をはるかに凌ぐ。