hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
褪色したカラー映画の復元と長期保存に関する基礎的研究

この再タイミング版もまた、上映企画「発掘された映画たち2018」の中で披露され、本研究成果の社会的還元を図ることができた。昨年度に株式会社IMAGICAと実施した二色式カラー映画『千人針』(三枝源次郎監督、1937年)のデジタル復元の成果、すなわち、二色式カラーシステムで再現可能な色域のみを用いて行った色再現の手法を応用し、今年度は、小津安二郎監督のカラー映画『浮草』(1959年)のデジタル復元を実施した。『浮草』の公開前年に刊行された『映画技術』(No.82)の記事「アグファカラーの色の再現性」所収の撮影データを援用し、同方式で再現可能な色域のみをグレーディング時に使用することで、小津のアグファカラーの歴史的再現を行った。前掲記事には、色の再現性テストに用いられたカラーチャートに関するデータと、そのカラーチャートをアグファカラーで撮影した結果のデータが掲載されており、そこから赤、緑、青のそれぞれの色が、アグファカラー上でどのように記録されるかを読み解いた。IMAGICAのカラーマネジメントアドバイザーである長谷川智弘氏が、このアグファカラーの特徴を分析したうえで、カラーグレーダーに助言を行い、色再現を行った結果、「空の色を黒白映画のように白っぽく」(『日刊スポーツ』1958年5月18日)という小津の狙いを明確に再現するとともに、小津のアグファカラーに特徴的な「赤」についても、抑制の利いた色合いの背景のなかに自然と溶け込ませることができた。このように、映画フィルムの物質的調査と資料調査を組み合わせた本研究は順調に推移しており、映画公開時に残された撮影データをデジタル復元に援用するという今回の試みもまた、従来のカラー映画の復元手法に新しい可能性を切り拓いたと言える。国内の現像所IMAGICA Lab.において、国立映画アーカイブの技術職員が現役時代にタイミングを担当した作品について、当該作品の撮影カメラマン立ち会いのもと、封切り時の狙い通りの色彩を再現する「再タイミング版作成プロジェクト」であるが、最終年度は、同じ作業フローが他の現像所でも実行可能かどうかを検証するため、東京現像所の現役のタイミングマンの協力を得て、当時撮影を担当された前田米造カメラマンの立会いのもとで、『お葬式』(伊丹十三監督、1984年)の再タイミング版を作成した。この結果、映画完成時のカメラマンとタイミングマンのコンビで、公開当時に限りなく近い色味を確実に再現できる事が証明された。この取り組みは、日本撮影監督協会(JSC)からも高い評価を受け、その研究成果を同団体の機関紙『映画撮影』221号に依頼論文「再タイミング版作成プロジェクト後記」の形でまとめることができた。また、本年度に東映株式会社と共同で実施した『白蛇伝』(薮下泰司監督、1958年)のデジタル復元に際しては、日本初の長編カラーアニメーション映画である本作について、現存するセル画等の原画資料を適切に分析することで、公開当時の色彩を復元することができた。1初年度に引き続き、映画フィルムの物質的調査と、綿密な資料調査を組み合わせたデジタル復元に取り組む(今年度に実施した、貴重書『パテ社の生フィルム:現像及び焼き付けの手引き』(1926年)に同封されているコマ帖の保存科学的分析を活用した復元の実施を検討する)。
効率的な抗がん剤治療を目指したPET低酸素分子イメージングと腫瘍血管の対比検討

腫瘍の増殖や進展に、血管新生は必須である。腫瘍微小環境ではvascular endothelial growthfactor (VEGF)などの血管新生刺激因子が、優勢になり血管新生が促進される。したがって、血管新生抑制は癌治療における有望な戦略のひとつと期待されている。実際臨床でも大腸癌や肺癌、腎臓癌に対して、VEGFのシグナル経路を標的としたbevacizumab,sunitinibやsorafenibなどの血管新生阻害剤が臨床応用されている。これまで、口腔癌における腫瘍血管新生、具体的にはFMISO-PETで描出される口腔癌の腫瘍微小環境内の低酸素領域と腫瘍血管密度(MVD: Micro Vessel density)との関係について検討してきた。FMISO-PETは低酸素トレーサーとして用いられてきている。本研究では実際の口腔癌患者症例のPET所見(SUVmax、TMR:tumor muscle ratioから)腫瘍血管の低酸素をイメージすることを目的している。具体的には1効果的な抗がん剤治療の介入時期(phase)2持続の必要性3予後予測が模索できることを将来的な目標にしている。口腔癌27症例にを低酸素腫瘍はFMISO-TMR>≧1.25を低酸素腫瘍、FMISO-TMR<1.25を非低酸素腫瘍に分類して研究を進めた。結果として、低酸素腫瘍(FMISO値≧1.25)でのMVDは非低酸素腫瘍(FMISO値<1.25)に比べて高い傾向にあった。低酸素腫瘍での腫瘍近傍の血管は管腔形成していない未熟な血管が多かった。今後、口腔癌MVDと臨床的所見との関係(TNM分類、stage、予後)の検討、HIF-1αとの関係の検討中である。さらに簇出(tumor budding)と腫瘍血管新生との関係についても検討を加えた。低酸素に曝された口腔癌で血管新生が旺盛な症例では、tumor buddingが多く見られるのではないか?との仮説のもと、口腔癌におけるTumor buddingと腫瘍血管新生との関連を検討した。腫瘍血管密度が高い標本でbuddingが多く見られる傾向であった。今後、症例数を重ね検討を進める予定である。腫瘍血管新生と腫瘍細胞のbuddingの関係、さらにには臨床的パラメーターとの関係について、口腔癌の切除標本も用いて検討する。腫瘍の増殖、浸潤、進行に伴い、腫瘍組織では酸素が不足し一部は低酸素(Hypoxia)に陥る。近年、18F-Fluoromisonidazole(FMISO)-PETが癌組織内の低酸素状態(hypoxia)を非侵襲的に検出できる方法として注目を集めている。しかし口腔癌におけるFMISO-PETを用いた低酸素状態(hypoxia)の評価、およびその臨床的意義についての研究はほとんどみられない。当科では2009年から北海道大学病院核医学診療科の協力のもとに、口腔癌患者にFMISO-PET検査を行い、FMISO-PETのSUV値が高値を示し低酸素であると考えられた口腔癌ではHIF-1αを高発現している症例が多いことを明らかにした(Sato. J, J Nucl Med 2013)。一方、FMISO-PETで描出される低酸素領域と腫瘍血管新生の程度を表すMVDとの関連を報告している研究はほとんどみられない。北海道大学病院歯科診療センターでFMISO-PET検索を行った口腔癌27症例について検索した。切除標本のほぼ中心部を血管内皮マーカーCD31抗体(DAKO)で免疫染色しMVDを測定した。解析にあたり、FMISO SUV値≧1.25の症例を低酸素口腔癌症例、FMISO SUV値<1.25の症例を非低酸素口腔癌症例として、MVD値とFMISO-PET SUV値との関係を検討した。1.FMISO-PETで低酸素と考えられた口腔癌症例では、非低酸素症例に比べ、微小血管密度が高いことが示された(p<0.05)。今後、口腔癌低酸素症例で血管新生が亢進している症例の血管について詳細な検索を行い、腫瘍微小環境における低酸素環境による血管新生メカニズムについて検索する予定である。口腔癌の病理切片で、CD31による免疫染色がすすみ、腫瘍血管密度の測定が順調に進んだ。

低酸素腫瘍での腫瘍近傍の血管は管腔形成していない未熟な血管が多かった。今後、口腔癌MVDと臨床的所見との関係(TNM分類、stage、予後)の検討、HIF-1αとの関係の検討中である。さらに簇出(tumor budding)と腫瘍血管新生との関係についても検討を加えた。低酸素に曝された口腔癌で血管新生が旺盛な症例では、tumor buddingが多く見られるのではないか?との仮説のもと、口腔癌におけるTumor buddingと腫瘍血管新生との関連を検討した。腫瘍血管密度が高い標本でbuddingが多く見られる傾向であった。今後、症例数を重ね検討を進める予定である。FMISO-PETの低酸素化のパラメータ値と腫瘍血管の密度が関連があることを発表した(Ohga.N 2017口腔外科学会日中口腔顎顔面外科合同シンポジウム)。本年度(H30年度)は、腫瘍血管の免疫染色(αSMA、VE-cadherin)を行い、腫瘍の未熟性とFMISO-PETとの関連について詳細に検討したい。腫瘍血管新生と腫瘍細胞のbuddingの関係、さらにには臨床的パラメーターとの関係について、口腔癌の切除標本も用いて検討する。腫瘍血管染色用の抗体を多く見積もっていたが、適正な染色条件が得られたので、抗体を予定した分より少ない量で実験を行うことができた。
アミノ酸の高度分離用天然多糖キトサン樹脂の開発

カニやエビの甲羅から抽出したキチンを脱アセチル化処理して得られるキトサンから作られるキトサン樹脂はは,超多孔構造を持っているため,従来の市販の樹脂に比べて粒子内拡散速度は速いが,吸着容量が小さいという欠点がある。筆者等は,このキトサン樹脂にポリエチレンイミン(PEI)を導入することにより,超多孔構造を維持したまま樹脂固定アミノ基濃度を高めることに成功した。分子量の1万ポリエチレンイミンを導入したPEIキトサン樹脂が最大の樹脂固定アミノ基濃度を示し,市販の陰イオン交換樹脂の23倍の値が得られた。本研究ではこのPEIキトサン樹脂のアミノ酸の分離剤としての適用の可能性について検討を加え,以下の知見を得た.(1)Lーグルタミン酸(酸性アミノ酸)はpH=3.7付近で最大吸着量を示し,pH〈2およびpH〉8ではほとんど吸着しなかった。一方,中性アミノ酸は全pH領域でほとんど吸着しないことが明かとなった。従って,PEIキトサン樹脂は酸性アミノ酸の選択的な吸着分離剤として有効であることがわかった。(2)Lーグルタミン酸の吸着等温線はLangmui式で相関出来た。各等温線はpHに強く依存し,飽和吸着量および平衡定数は,pHの関数として実験式で整理出来た。(3)Lーグルタミン酸の破過曲線を種々の条件下で測定した。Lーグルタミン酸のカラム出口濃度は,ゼロの状態が続いた後,破過が始まり,その後,入口濃度の約16%の濃度で一定値を示した。さらに時間が経過した後,出口濃度が上昇し,最終的にカラム入口濃度に達するという特異な挙動が見られた。(1)破過曲線に対する理論的検討も行い,(3)の結果を裏付ける理論破過曲線を得た。
条約法条約の体系的検討

二年間に渡り、「前文」、「条約の締結」、「留保」、「条約の暫定的適用」、「条約の遵守」、「条約と第三国」、「条約の運用停止」、「紛争解決手続」、「寄託者」、「外交関係の断絶が条約義務に及ぼす影響」、「参加権」に関する諸条文を検討した。また、日本における条約法研究の軌跡についても、詳細な検討がなされた。これらの研究によって新たに得られた知見は多数あるが、紙幅の関係上、以下の諸点のみを挙げておく。「前文」について、この前文は、条約法条約の前文であって、ある条約の作成にあたり起草すべき前文の在り方ないしその内容を示すものではない。「国の条約締結能力」について、現行条約法条約第6条の規定は、当初は二つの項を有していたが、一部の連邦国の強い反対により第2項が削除され、ようやく成立に至った条文である。「条約の暫定的適用」について、国連海洋法条約第11部実施協定が、条約の暫定的適用という条約法上の問題に、新しいプラクティスを提供し、問題を提起している。「条約の遵守」について、国内法と条約の規定が矛盾する場合、変形方式を採る国と受容方式を採る国とでは、解決方法が異なる。「条約の運用停止」について、条約法条約第57条の主要部分、すなわち条約の規定または当事国の同意がある場合には、条約の運用を停止できるという規則は、起草過程に鑑みれば、既存の国際慣習法を法典化したものと言ってもよいのではなかろうか。最後に、日本の条約法研究の軌跡について、一言述べておきたい。日本の条約法研究の足跡を辿った結果、残念ながら、日本の戦前の条約実践は、現在および将来の模範としては使えないものであることがわかった。しかし、過去の日本の実践がわれわれの模範とならないとしても、過去は捨て去るものではなく、よりよい未来のための智恵を宿すものであると考えたい。「条約の締結」、「条約の留保」、「条約の遵守」、「条約と第三国」、「条約の運用停止」、「紛争解決手続」、「寄託者」に関する諸条文を検討した。これらの研究によって新たに得られた知見としては、以下の諸点が挙げられる。「条約の締結」については、「全権委任状」と「交渉国」を検討し、前者は絶対王政時代には君主を拘束するので、重要な役割を果たしていたこと、後者は条約の起草と作成の両方に参加した国を指すことが明らかになった。「条約の留保」については、「留保」とは何かを検討し、条約法条約で規定されているのは厳密な意味での「定義」ではないが、後の実行によって幅広く支持されていることがわかった。「条約の遵守」については、国内法と条約の規定が矛盾する場合を検討し、変形方式を採る国と受容方式を採る国とでは、解決方法が異なることが明らかになった。「条約と第三国」については、「第三国」は「条約の当事国ではない国」を意味するものとして、両者を交換可能な表現とする用語法が一般的であり、条約法条約でもこの立場が踏襲されたことがわかった。「条約の運用停止」については、「条約又は当事国の同意に基づく条約の運用停止」と「多数国間の一部の当事国の間のみの合意による条約の運用停止」との棲み分けがうまくできていないのではないかとの疑問が提起された。

「紛争解決手続」については、条約の無効・終了といった法律的紛争の解決に調停制度を採用したり、強行規範に関する紛争を仲裁裁判に付託する可能性を排除していないことなどは評価に値するが、他方、条約の留保などをめぐる紛争は含まれないこと、司法裁判所がある多数国間条約を強行規範に抵触していると判断した場合における当該判決の効果などは、なお検討すべき点である。最後に、「寄託者」については、特に留保との関連で、今日その任務がきわめて重要な問題になってきていることが明らかにされた。「前文」、「国の条約締結能力」、「条約の暫定的適用」、「条約の遵守」、「条約の運用停止」、「寄託者」、「外交関係の断絶が条約義務に及ぼす影響」、「参加権」に関する諸条文を検討した。また、日本における条約法研究の軌跡についても、詳細な検討がなされた。これらの研究によって新たに得られた知見としては、以下の諸点が挙げられる。「前文」について、この前文は、条約法条約の前文であって、ある条約の作成にあたり起草すべき前文の在り方ないしその内容を示すものではない。「国の条約締結能力」について、現行条約法条約第6条の規定は、当初は二つの項を有していたが、一部の連邦国の強い反対により第2項が削除され、ようやく成立に至った条文である。「条約の暫定的適用」について、国連海洋法条約第11部実施協定が、条約の暫定的適用という条約法上の問題に、新しいプラクティスを提供し、問題を提起している。「条約の遵守」について、現実の国際社会では、国家が自国の国内法を根拠に、条約の「履行」を回避する可能性も少なくない。「条約の運用停止」について、条約法条約第57条の主要部分、すなわち条約の規定または当事国の同意がある場合には、条約の運用を停止できるという規則は、起草過程に鑑みれば、既存の国際慣習法を法典化したものと言ってもよいのではなかろうか。紙幅の関係上、「寄託者」、「外交関係の断絶が条約義務に及ぼす影響」、「参加権」については省略せざるを得ないが、日本の条約法研究の軌跡については、一言述べておきたい。日本の条約法研究の足跡を辿った結果、残念ながら、日本の戦前の条約実践は、現在および将来の模範としては使えないものであることがわかった。しかし、過去の日本の実践がわれわれの模範とならないとしても、過去は捨て去るものではなく、よりよい未来のための智恵を宿すものであると考えたい。
物質移動シミュレータによる有害金属アニオンの土壌汚染分布の簡易な推定手法

本研究では、有害金属類による土壌汚染の実態を簡易かつ迅速に推計するための物質移動シミュレーターを開発することを目的として、土壌中での有害金属類の主な物質移動過程を(1)沈澱・溶解、(2)浸透・拡散、(3)イオン交換・脱離に分け、それぞれでの有害金属類の平衡関係や移動速度を検討した。土壌中に存在する有害金属類の物質収支は、(1)土壌間隙水中への溶解量、(2)沈澱量、(2)土壌細孔内へのイオン交換量によって分けられる。このうち沈澱については、細孔内へのイオン交換に比べて充分に速く進行すると考え、水酸化物の溶解度を用いて各pHでの沈殿量を計算した。また、イオン交換量については、沈殿形成が起こらないpH条件および濃度条件においてイオン交換等温式を実測で求めることで、任意のpH条件および濃度条件でのイオン交換量を推算した。これらの結果をもとに、沈殿/溶解/イオン交換を考慮した物質収支式を考案して実験的に検証したところ、土壌の種類によらない溶解平衡定数を実験的に決定することで、土壌中での有害金属類の物質平衡関係をうまく表すことができた。また、有害アニオン溶液を土壌ミニカラムに通水して得られる破過曲線を多段均一層列モデルで数値解析した結果、計算値が実験データとよく一致した。以上より、土壌中での有害金属類の溶解平衡定数、イオン交換平衡定数および総括物質移動容量係数を簡単な実験を行って求めることにより、汚染分布を容易・迅速に推計できることがわかった。このほか、土壌中での有害金属類のイオン交換平衡式を8種の土壌について検討したところ、5種の有害カチオンについてはH^+やA1^<3+>の影響を受け、3種の有害アニオンについてはOH^-の影響を受けて交換量が低下することが多成分系イオン交換等温式で定量的に整理できることが明らかになった。本研究では、有害な金属・半金属類が土壌中を移動する際に重要なイオン交換平衡と溶解・沈殿平衡の物質移動モデルの構築を目的とした。平成12年度は特に、土壌環境基準が設定されているものや水性生物に対する毒性が高い金属・半金属類の中から、土壌間隙水中でカチオンになりやすいPb、Cd、Cu、Zn、Niの5種の有害金属・半金属類カチオンを対象に、全国8ヶ所から採取したイオン交換容量が大きく異なる土壌中での挙動を解析した。まず、イオン交換平衡について、土壌の種類や土壌溶出物、土壌間隙水中pHの影響を定量的に解析する多成分系イオン交換等温式を検討した。その結果、8種の土壌すべてについて、イオン交換等温線か低濃度域では両対数で直線近似でき、その直線の傾きαが土壌の種類によらず有害カチオンの種類ごとにほぼ一定となることを明らかにした。また、各有害アニオンのイオン交換量は、Mg^<2+>やCa^<2+>が土壌中に高濃度に共存してもほとんど低下しないが、Al^<3+>が多量に溶出する土壌ではAl^<3+>のイオン交換が競争的に進行するため大きく低下することがわかった。また、pHが低下してH^+が多量に存在する条件下でもイオン交換量が低下することが確認された。これに対し、Al^<3+>およびH^+などの競争的な影響を定量的に考慮した多成分系イオン交換等温式を提案し、用いた5種の有害カチオンと8種の土壌について適用できることを実証した。また、物質移動モデルについては、任意のpH、任意の濃度でのイオン交換平衡および溶解平衡を考慮した平衡モデル式を提案し、回分型の均一平衡土壌について検証実験を行った結果、1種の土壌中のPbの分配量がうまく表せることが確かめられたので、今後さらに、流通型の土壌カラムなどでも各有害カチオン、各土壌についてデータを重ね、信頼性の高い移動モデルを構築していくこととした。

このほか、土壌中での有害金属類のイオン交換平衡式を8種の土壌について検討したところ、5種の有害カチオンについてはH^+やA1^<3+>の影響を受け、3種の有害アニオンについてはOH^-の影響を受けて交換量が低下することが多成分系イオン交換等温式で定量的に整理できることが明らかになった。
高血圧性心筋症の病態に関連する遺伝子群の解明

高血圧性心肥大とそれに引き続き起こる心不全は,高血圧における重要な合併症であり,高血圧性心筋症とよばれ二次的に心筋の収縮不全をきたす。我々は昨年度までに,心筋に強く発現する分泌型サイトカイン様遺伝子(仮称:DSS-10)のアミノ酸置換を伴う変異(Thr326Ile)が,高血圧性心筋症患者に有意に高い頻度(22.2% vs 0.2%,p=0.0003)で見出され,酵母2ハイブリッド法による検討でT-cap蛋白への結合親和性が野生型に比して変異型で約45%低下することを見出した。本年は,変異DSS-10の機能変化を明確にすることを目的として以下の検討を行った。食塩感受性ダール高血圧ラットを用いて,早期の心肥大あるいは心不全期の左心室心筋よりtotal RNAを抽出し,real timePCRでDSS-10遺伝子の発現を定量した結果,心肥大/心不全早期に各々約1.6倍/1.3倍に増加していた。一方,COS培養細胞にFlag tag-T-capとGFP tag DSS-10を共発現させ,抗Flag抗体で免疫沈降し,抗GFP抗体で発色させるWestern Blotを行った。野生型DSS-10蛋白は特異的にT-capと結合し,変異型DSS-10は野生型に比して結合親和性が約40%低下しており,酵母2ハイブリッド実験系と同様の結果が得られた。また,T-capと共発現させた際の細胞内に存在する変異型DSS-10蛋白発現量は野生型に比して低かった。これらのことから,変異型DSS-10遺伝子産物はT-capへの結合が低下し,心筋内への貯留が起きず,より細胞外に分泌されやすいことが示唆された。高血圧性心肥大とそれに引き続き起こる心不全は,高血圧における重要な合併症である。そこで,心肥大,心不全の病態形成に関する遺伝子群とその構造,機能上の多様性を解明することを目的として,以下の研究を行った。高血圧心肥大/心不全モデルとして,食塩感受性高血圧ラット(DSS)に高濃度食塩を負荷して作成した高血圧性肥大心,それに引き続いて観察される不全心と,正常リッターメイト心との間で量に差のある遺伝子の単離をDNAチップを用いて解析した。約8800個の遺伝子のうち,心肥大期に比して,心不全期に3倍以上あるいは1/3以下に発現量が変化する遺伝子は872個あり、その上位の23個の遺伝子について,チップで得られた発現量変化の妥当性を,real time PCRにより再確認した。次に,発現量変化が大きくかつ機能未知の遺伝子89個について,ラットの諸臓器から抽出したtotal RNAを鋳型に,半定量的なRT-PCRを行い,組織分布特異性を11の臓器について検討した。その結果,大多数の遺伝子は発現の組織特異性を認めなかったが,ほぼ心筋のみに発現するサイトカイン(仮称:DSS-10),心筋と脳,肺に発現する転写因子,心筋と骨格筋にのみ発現するホルモン代謝に関与すると思われる脱水素酵素様遺伝子,の3つを同定した。これらはいずれも心肥大,心不全における機能や動態がこれまで知られていなかったものである。ついで,ゲノムデータベース上で各々のヒトホモログの存在を確認し,さらにゲノムの構造を決定し得た。次に,インフォームドコンセントが得られた拡張型心筋症患者93人を対象に,各々の遺伝子のexonを中心にSSCPを用いて遺伝子多型を検索し,アミノ酸置換を伴うものも含めて複数の多型を見出した。それらの患者集団中の頻度は,一般集団96人中の頻度とほぼ同程度であった。しかしながら,DSS-10遺伝子のコドン326番目のスレオニンがイソロイシンへ置換する多型(T326I)は,高血圧を伴う拡張型心筋症患者6人のうち2人に認められるも,対照集団629人の2人にしか認められなかった。このことは,本変異が高血圧性拡張型心筋症と有意に相関することを示唆する(P=0.0004)。なお,DSS-10の326番目のコドンは,マウス,ラットのホモログで保存されていることから機能上重要と考えられ,現在変異による機能変化の有無を解析している。

野生型DSS-10蛋白は特異的にT-capと結合し,変異型DSS-10は野生型に比して結合親和性が約40%低下しており,酵母2ハイブリッド実験系と同様の結果が得られた。また,T-capと共発現させた際の細胞内に存在する変異型DSS-10蛋白発現量は野生型に比して低かった。これらのことから,変異型DSS-10遺伝子産物はT-capへの結合が低下し,心筋内への貯留が起きず,より細胞外に分泌されやすいことが示唆された。
神経回路網の形成に関与するラット海馬由来成長因子の神経化学的研究

我々はラット胎児脳の初代培養系を用い、成熟ラット脳の抽出液を培養液中に添加することにより、神経細胞の生存を促進する因子につき検討を加えた。胎生16日令のラット大脳半球を分散した後poly-L-lysineでコーティングしたカバースリップを用い、15%FCSを含むMEM培地で911日間培養した。その後Neurofilament(NF)に対する坑体を用い免疫組織化学的に神経細胞を同定してみると、神経細胞の数は極めて少なかった。一方培養液中に生後4週令のラット大脳抽出液を添加すると多数の神経細胞が生存しており、脳抽出液中には神経細胞の生存を促進する因子が存佐することが示唆された。次にこの因子が脳のいかなる部位で高いかを検討した結果、海馬を含む脳幹部に高いことが明らかとなった。更に中隔核から海馬への入力線維であるfimbria farnixを切断することにより、海馬由来因子の活性がいかに変化するかをみてみると、切断後14日目をピークに活性が上昇することが明らかとなった。このことは本因子が通常では海馬から中隔核へ逆行性に輸送されていることを示唆しいる。fimbria fornix切断後1日目と14日目の海馬抽出液中のガングリオシドについて検討してみると、GD1a,GM4には全く差はみられなかったが、GT16は約2倍に増加していた。しかしながらGT16培養液中に添加しても神経細胞の生存を大進する効果はみられなかった。このことからfimbria farnix切断後14日目をピークに上昇する成長因子はガングリオシドでは説明されず、恐れく蛋白性の因子が関与しているものと孝えられた。最後に1日日目と14日目の抽出液中の蛋白を2次元電気泳動により比較解析した、多くのバレドは両者の間で差異は認められなかったが、分子量12万、pI46の領域の蛋白が14日目のものでやや増加している傾向が認められた。
Th17とは異なるIL－17産生細胞の炎症性疾患における役割の解析

本研究では、IL-17、およびT細胞依存的に自己免疫性関節炎を自然発症するIL-1レセプターアンタゴニスト(Ra)欠損(KO)マウスを用い、Th17細胞以外のIL-17産生細胞の病態形成における役割を明らかにし、炎症性疾患における新たな分子機構を解明することを目的とした。これまでの研究から、IL-1RaKOにおける関節病変部位ではTh17細胞よりγδT細胞が主要なIL-17産生細胞であること、nudeマウスとの交配や抗γδTCR抗体を用いた解析によりγδT細胞が病態形成に深く関与していることを明らかにしてきた。当該年度では、IL-17 KO-IL-1RaKOのCD4陽性T細胞をnudeマウスに移植し、Th17細胞は存在しないが、レシピエント由来の胸腺外分化したIL-17産生性γδT細胞(γδ17細胞)が存在するようなマウスを作製したところ、関節炎を発症することを見出した。発症したマウスのIL_17産生の全てはγδT細胞が担っており、レシピエントのIL-17を欠損させたところ発症率が低下したことから、γδ17細胞が発症に重要であること、また、Th17細胞は発症に必ずしも必要ではないことがわかった。しかしながら、IL-1Ra KO由来γδT細胞を単独でSCIDマウスへ移植したところ、関節炎の発症は認められず、γδT細胞とCD4陽性T細胞を同時に移植することが発症に必須であることがわかった。これらの結果から、CD4陽性T細胞が臓器特異性を決定し、γδ17細胞が炎症の増幅を行っているという新たな関節炎発症メカニズムが示唆された。本研究で得られた知見は、病気の理解に貢献できるだけでなく、新たな治療法の確立につながることが期待される。また、関節リウマチだけでなく他のIL-17依存的な炎症性疾患でも同様のメカニズムが働いていることが考えられるため、今後の炎症性疾患の理解に大きく貢献できる可能性がある。本研究では、IL-17、およびT細胞依存的に自己免疫性関節炎を自然発症するIL-1レセプターアンタゴニスト(Ra)欠損(KO)マウスを用い、Th17細胞以外のIL-17産生細胞におけるIL-17産生メカニズム・病態形成における役割を明らかにし、炎症性疾患における新たな分子機構を解明することを目的とした。これまでの研究から、CD4^+T細胞、および非Th17細胞のうちγδT細胞がIL-1Ra KOマウスの関節炎発症において病原性を有していることが明らかとなっていた。しかしながら、Th17細胞との分化誘導機構や病態形成における役割の相違など不明な点は多く残されていた。当該年度は、CD4+T細胞、γδT細胞をscid/scidマウスへ移植したところ、それぞれ単独では関節炎を発症せず、両者の存在が必要であることを明らかにした。γδT細胞を単独で移植した際は、関節局所にIL-17産生細胞は存在しなかったが、CD4+T細胞を同時に移植することによりIL-17産生性γδT細胞(γδ17細胞)の関節への集積が認められた。これらの結果はCD4^+T細胞が臓器特異性を決定し、γδ17細胞が炎症の増幅を行っているという新たな関節炎発症メカニズムを示している。その一方で、胸腺由来のT細胞は存在しないが、胸腺外分化したγδT細胞は存在するようなヌードマウスとIL-1Ra KOマウスを掛けあわせたところ、関節炎を発症し、γδ17細胞が顕著に増加していたことから、関節でIL-1の過剰発現があるときにはCD4^+T細胞の関与なしにγδ17細胞だけで関節炎を発症する事が示唆された。このことは、たとえCD4^+T細胞が自己抗原を認識しなくても、感染やIL-1関連遺伝子の変異等によりIL-1が異常に産生されただけで関節炎を発症しうる可能性を示している。本研究で得られた知見は、関節リウマチという病気の理解に貢献できるだけでなく、新たな治療法の確立につながることが期待される。発症したマウスのIL_17

産生の全てはγδT細胞が担っており、レシピエントのIL-17を欠損させたところ発症率が低下したことから、γδ17細胞が発症に重要であること、また、Th17細胞は発症に必ずしも必要ではないことがわかった。しかしながら、IL-1Ra KO由来γδT細胞を単独でSCIDマウスへ移植したところ、関節炎の発症は認められず、γδT細胞とCD4陽性T細胞を同時に移植することが発症に必須であることがわかった。これらの結果から、CD4陽性T細胞が臓器特異性を決定し、γδ17細胞が炎症の増幅を行っているという新たな関節炎発症メカニズムが示唆された。本研究で得られた知見は、病気の理解に貢献できるだけでなく、新たな治療法の確立につながることが期待される。また、関節リウマチだけでなく他のIL-17依存的な炎症性疾患でも同様のメカニズムが働いていることが考えられるため、今後の炎症性疾患の理解に大きく貢献できる可能性がある。各種遺伝子欠損マウスを用いて当初予想しなかった現象を見出しており、特に、IL-17産生性(c)^<TM>T細胞による関節炎発症メカニズムは、これまでの概念と異なる極めてインパクトの高いものであるため。また、最近は腸炎の発症においても新たなメカニズムを示唆するデータが出てきており、オリジナリティ、インパクト共に高い研究に発展すると考えられるため。これまで、IL-1Ra KO-nu/nuマウスは関節炎だけでなく、腸管炎症を併発することから、腸管由来のγδT細胞がIL-17を過剰に産生することにより腸管炎症をも引き起こすのではないかと考えていた。この仮説を検証するために、γδT細胞が存在しないRag2 KOマウスとIL-1Ra KOマウスを掛けあわせたところ(IL-1Ra KO-Rag2 KOマウス)、予想に反して腸管炎症は抑制されなかった。IL-1Ra KO-Rag2 KOマウスの腸管では、Rag2 KOマウスに比べてIL-17が増加傾向にあった。よって、新規IL-17産生性自然免疫細胞が腸管炎症の発症に関与している可能性が考えられる。また、非ヌードマウス、非Rag2 KOマウス背景のIL-1Ra KOマウスでは腸管炎症が起こらないことから、T細胞による腸管免疫寛容メカニズムが働いていると考えられる。本年度はIL-1Ra KO-Rag2 KOマウスやIL-17 KOマウスを用いて腸管炎症における病態形成、免疫寛容メカニズムを解明しようと考えている。また、腸内細菌やIL-1の過剰シグナルと腸管炎症の関係性についても検討する。
強磁場中の液体分子配向と分子間相互作用の研究

有機液体分子の反磁性帯磁率異方性を大阪大学超強磁場実験施設のパルス強磁場を閉いて測定し、液体分子間相互作用に関する情報を得た。反磁性帯磁率は非常に小さく測定困難であるが、磁場の2乗に比例するため、パルス超強磁場とコットン・ムートン効果を利用し、さらに本科研費で購入した広帯域パルス増幅器等の測定器を組合せることにより感度とS/Nの向上をはかることができる。理論的解析の結果、磁気複屈折と反磁性帯磁率は1対1の対応を示し、その温度依存性は言わゆるキュリー・ワイス則に従うことが判った。このキュリー・ワイス温度は液体分子間に働く四重極相互作用の大きさを反映する量である。17種類の有機液体とその混合液を用いて測定した結果ごく一般的に液体の反磁性帯磁率にはキュリー・ワイス則が適用でき、分子間相互作用の情報が得られた。例えば、ベンゼン,クロルベンゼン,ニトロベンゼンのキュリー・ワイス定数はそれぞれ0,145,165Kであり、この順に相互作用が強くなっている。混合液を用いた実験では、異種分子間の相互作用が求められることが、理論的、実験的に明らかにされた。例えばベンゼン-ニトロベンゼン間には160Kもの強い相互作用が働いている。一方異方性のほとんどない四塩化炭素とベンゼンとの混合液では相互作用が0となる理論解析結果とは大きく異なる実験結果が得られた。即ちわずか10%の四塩化炭素を混入することでキュリー・ワイス定数が0→150Kにも上昇する。このことは混合液中にクラスターが形成されると考えることにより説明される。このように分子配向による反磁性帯磁率の測定は液体の構造の情報まで与えてくれるものである。
新しいウシ凍結精液技術の開発に向けた子宮内の精子認識と炎症反応メカニズムの解明

乳牛の受胎・分娩は乳生産の基本的な生物現象であり、100%子宮内への凍結精液による人工授精(AI)でおこなわれる。凍結精液技術は,融解後の精子正常性のみ着眼されてきたが、融解した精子+凍結液が子宮に及ぼす影響は全く考慮されてこなかった。本研究は凍結精液の子宮内免疫応答を模倣した新規バイオアッセイを活用し、受胎率向上に向けて炎症を緩和する低刺激性の人工授精溶液の開発基盤を示すことを目的として、1)子宮上皮細胞の精子認識機構の解明とその抑制、2)精液希釈液の再評価とX/Y分離精子への応用、の段階的な実証を行う。平成30年度の研究実績の要点を列記すると、1)ウシ子宮上皮細胞(BOEC)培養系において、人工授精用の凍結精液から得た精子の誘導する急性の炎症反応の分子メカニズムを探った。特に、BOECの精子センシングには、グラム陰性および陽性菌の内毒素を認識して炎症を誘導するTLR2/4が大きく関わっていることを実験的に初めて示した。2)ウシ子宮小片の器官培養系を確立して、ビデオ観察を含む視覚的証拠を収集した。その結果、精子は子宮上皮の平面には付着せず、子宮内に均質に0.2-0.3 mm間隔で存在する子宮腺に侵入して、腺内の上皮のTNFAタンパク発現と同時に組織全体の炎症性の遺伝子発現群を誘導することを発見した。これは実際にウシの人工授精直後に子宮内で起こる炎症反応の最初のスイッチであることが示唆された。以上、ウシ子宮の精子センシングの分子と生理メカニズムの検証が進んだ。平成30年度の計画の子宮内の上皮細胞と精子との分子的および生理的相互作用の重要な部分の詳細な検証が進んだ。2つの異なる子宮上皮のバイオアッセイ系を駆使したアプローチは、生体内の複雑な相互関係の展望を得るのに有効であることを示すことができた。進捗状況を以下に示す。1.ウシ子宮内免疫環境は、授精された精子によって、より強いTh1型(炎症性)に誘導され、そのセンシングには病原体認識と同様のTLR2/4が活用されている事実を実験的に示した。2.新規のウシ子宮小片のビデオ観察を含む器官培養系を確立して、視覚的証拠を収集した。その結果、精子は子宮腺だけに侵入して、腺内の上皮の急性炎症反応を誘導して、極めて早い組織全体の炎症反応のスイッチであることが示唆された。3.生体モデルを用いて、ウシ凍結精液の子宮内への人工授精の直後の子宮内免疫環境を観察するための方法論をほぼ確立することができた。これを活用して、次年度のTLR2アンタゴニスト投与による子宮内の人工授精後の炎症反応への抑制作用の検証に進みたい。以上の成果は国際専門誌に1報の原著論文として発表し、学会でも報告した(1つは優秀発表賞)。これらの状況から、「おおむね順調に進展している」と判断した。上述のごとく成果は順調に上がっている。令和元年度は、以下に主眼を置いて進める予定である。1.ウシへの人工授精時にTLR2アンタゴニスト同時投与し、その後の子宮内炎症反応を、カテーテル潅流とバイオプシーで得た試料を解析し、抑制を実証する。さらに、実験牛は過剰排卵させて人工授精7日目に子宮灌流で初期胚を回収して、その発育ステージと遺伝子発現などについて詳細に解析する。この検証で、このアプローチが技術開発に展開できるかを探る。2.新鮮な子宮の組織片を用いた新しいex-vivo系でXY分離精子(広島大・島田教授より供与)との相互作用を初めて検証し、子宮の免疫システムが、XとY精子を認識できるかに切り込む。特にXY分離精子と上皮細胞とのクロストークを、精子の運動性も加えて詳細に観察し、その場の免疫環境への情報伝達の実際を検証する予定である。

以上、ウシ子宮の精子センシングの分子と生理メカニズムの検証が進んだ。平成30年度の計画の子宮内の上皮細胞と精子との分子的および生理的相互作用の重要な部分の詳細な検証が進んだ。2つの異なる子宮上皮のバイオアッセイ系を駆使したアプローチは、生体内の複雑な相互関係の展望を得るのに有効であることを示すことができた。進捗状況を以下に示す。1.ウシ子宮内免疫環境は、授精された精子によって、より強いTh1型(炎症性)に誘導され、そのセンシングには病原体認識と同様のTLR2/4が活用されている事実を実験的に示した。2.新規のウシ子宮小片のビデオ観察を含む器官培養系を確立して、視覚的証拠を収集した。その結果、精子は子宮腺だけに侵入して、腺内の上皮の急性炎症反応を誘導して、極めて早い組織全体の炎症反応のスイッチであることが示唆された。3.生体モデルを用いて、ウシ凍結精液の子宮内への人工授精の直後の子宮内免疫環境を観察するための方法論をほぼ確立することができた。これを活用して、次年度のTLR2アンタゴニスト投与による子宮内の人工授精後の炎症反応への抑制作用の検証に進みたい。以上の成果は国際専門誌に1報の原著論文として発表し、学会でも報告した(1つは優秀発表賞)。これらの状況から、「おおむね順調に進展している」と判断した。上述のごとく成果は順調に上がっている。令和元年度は、以下に主眼を置いて進める予定である。1.ウシへの人工授精時にTLR2アンタゴニスト同時投与し、その後の子宮内炎症反応を、カテーテル潅流とバイオプシーで得た試料を解析し、抑制を実証する。さらに、実験牛は過剰排卵させて人工授精7日目に子宮灌流で初期胚を回収して、その発育ステージと遺伝子発現などについて詳細に解析する。この検証で、このアプローチが技術開発に展開できるかを探る。2.新鮮な子宮の組織片を用いた新しいex-vivo系でXY分離精子(広島大・島田教授より供与)との相互作用を初めて検証し、子宮の免疫システムが、XとY精子を認識できるかに切り込む。特にXY分離精子と上皮細胞とのクロストークを、精子の運動性も加えて詳細に観察し、その場の免疫環境への情報伝達の実際を検証する予定である。効率的な経費使用ができ、予想を超えた研究成果が得られたため。加えて次年度の研究計画の実施に経費が必要なため。
アジア・イスラーム圏における民主化過程とNGOの役割に関する比較研究

われわれはアジア・イスラーム圏(パキスタン・バングラデシュ・インドネシア・マレーシア)を中心に、民主化過程とNGOの役割について研究を行ってきた。具体的には、アジア・イスラーム圏における民主化(選挙の実施など)の進展や市民社会の形成状況から、各国のNGOの役割や実態までを3年に及んで検討を重ねてきた。その結果、次の点が明らかになった。(1)国内の政治・経済状況や国際情勢の変化およびグローバル化は民主化の進展や市民社会の形成、およびNGOの役割に大きな影響を与えている。パキスタンにおいては、ハムダルド財団やエーディー財団などの全国組織のNGOから地方のNGOまでを視野に入れて調査を行った。バングラデシュでは、1998年のブラフマン・バリア市での独立式典への襲撃事件を事例に取り上げ、民主化過程とNGOの問題を明らかにした。インドネシアでは、地方分権化が進む地方自治体とNGOの関係を法的側面を中心に調査を行った。マレーシアでは、主にマレー系コミュニティのイスラーム系NGOを中心に調査を行った。民主主義と市民社会(NGO)の関連は、現代国際社会が直面する理論的・実践的課題の一つであり、これまで多くの研究がなされてきた。しかし、イスラーム圏の民主化と市民社会(NGO)の関連は未解明の領域が多く、とくに、アジアのイスラーム圏の研究は緒についたばかりである。本研究の成果は、その点で有意義で知的実践的貢献をなすと思われる。本研究では、アジア・イスラーム圏(パキスタン、バングラデシュ、インドネシア、マレーシア)を中心に、文献調査および現地調査を段階的に行いながら、イスラーム、民主化、NGOという3つのキーワードを軸に議論を進め、共通の枠組み作りに時間を割いてきた。その作業は以下の2つの点に集約される。a.イスラーム、民主化、NGOの3つのキーワードをどのように関連づけるのかという問題である。その1つの方法として、パキスタン、バングラデシュ、インドネシア、マレーシアの各国を、イスラームと民主化、民主化とNGO、NGOと民主化というようにそれぞれのキーワードを対置させて具体的に論じてみるというものである。b.イスラーム、民主化、NGO、それぞれの動向を、各国のどのような領域から考察すべきなのかという問題である。その1つの方法として、政治的領域と社会的領域、国レベルと地方レベルとに分類し、それぞれの領域・レベルからイスラーム化、民主化、NGOの動向を探ろうというものである。現在、こうした共通の枠組みに基づいて、パキスタンとバングラデシュで得た資料や現地調査を整理し、再検討している段階である。次年度には、インドネシアとマレーシアで現地調査を行い、枠組みの精緻化ならびに各国との比較研究を進めたいと考えている。本研究は、アジア・イスラーム圏(パキスタン、バングラデシュ、インドネシア、マレーシア)を中心に、民主化過程とNGOの役割に関して段階的に現地調査を行いながら、共通の枠組み作りを軸に比較研究を試みようとしてきた。しかし、その作業が進むにつれ、むしろアジア・イスラーム圏の国々の独自のあり様がクローズアップされ、研究計画も修正を余儀なくされた。そこで、作業としては以下の2つに重点を置いて行うことにした。a.民主化とNGOの分析的概念については共通理解を前提とするが、民主化とNGOの実態についてはパキスタン、バングラデシュ、インドネシア、マレーシアのそれぞれの国のコンテクストから考察し、さらにそれぞれの国の相違点から民主化とNGOの問題点を明らかにしていく。b.選挙実施という民主化過程の観点から国レベル・地方レベルとNGOとの関係、イスラーム組織とNGOとの関係を明らかにしていく。さらに国際情勢(テロ)や国内情勢(選挙や民族問題)の変化がNGOのあり方や役割にどのような影響を与えているのかを念頭に入れながら分析を行う。現在、パキスタン、バングラデッシュ、インドネシア、マレーシアでの現地調査やそこで得た資料を整理し、再検討している段階である。次年度は最終年度になるため、民主化とNGOについての共通理解に基づき、上記の2つの点を念頭に入れながら、再度現地調査を行い最終報告書としてまとめたいと考えている。われわれはアジア・イスラーム圏(パキスタン・バングラデシュ・インドネシア・マレーシア)を中心に、民主化過程とNGOの役割について、文献調査を継続しながら、段階的に現地調査を行ってきた。

年に数回、研究会を実施し、アジア・イスラーム圏のNGOの役割をその国独自の政治・経済的状況や歴史、国際情勢を念頭に入れながら研究報告を重ねてきた。そこで、以下の2点に重点をおいて作業を行うことを確認した。(1)選挙実施という民主化の過程において、民主主義の理念や市民社会が実現されているのかを検証する。同時に、アフガニスタンやイラクの情勢の変化およびグローバル化が民主化過程にどのような影響を与えているのかについても検証する。(2)(1)を念頭に入れながら、NGOの実態および役割について、それぞれの国のコンテクストから考察し、その国独特のNGOの役割を析出すると同時に問題点も明らかにする。平成16年度は、マレーシアとバングラデシュにおいて現地調査を行った。マレーシアでは、マラヤ大学を中心に文献調査を行うと同時に、イスラーム系政党(PAS)の支配州であるマレー半島東岸のNGOを中心に面接調査を実施した。バングラデシュでは、各種NGO団体(プロシカ、BRAC、グラミン銀行など)、イスラーム団体、大学や研究機関(ダッカ大学、バングラ学院など)、政府機関(宗教省、NGO局、イスラーム財団など)、および政治団体(BNP、アワミ連盟、JIなど)を訪れて資料収集、および意見交換を行った。今年度は、研究の最終年度にあたるため、これまで行ってきた議論を整理し、また段階的に行ってきた文献調査や現地調査、および現地で得た資料などを整理・分析し、最終報告書としてまとめあげている。
腸管特殊上皮Ｍ細胞成熟過程における転写制御機構の解析

M細胞で発現する転写因子Sox8の解析を引き続き進めた。イメージサイトメトリー法によって、Sox8はM細胞の分化初期から後期まで一定の発現量を維持していた。一方で、転写因子SpiBは分化初期に発現が強く、その後発現が減少していた。これらの結果からSox8とSpi-Bの機能は異なると想定された。トランスクリプトーム解析ではSpi-B欠損マウスのパイエル板濾胞上皮において低下する分子が359種であったのに対して、Sox8では114種であった。そのうち41の遺伝子が共通していた。共通する遺伝子にはM細胞後期に発現するGP2が含まれていた。Sox8欠損マウスではGP2の発現低下に加えて、成熟度を示す1陰窩からの距離、2物質の取り込み能の低下が認められたため、Sox8はM細胞の成熟に必要な分子であると考えられた。またSpi-B欠損マウスにおいてもSox8陽性細胞が認められたこと、逆にSox8欠損によってもSpi-Bが認められたこと、Sox8,Spi-Bのプロモーター領域に転写因子RelBが結合することから、両者はRelBによって制御されていると考えられた。クロマチン免疫沈降法によってSox8はGP2のプロモーター領域に結合すること、Sox8強制発現がGP2のプロモーター領域の活性化を誘導することからSox8はGP2を直接制御していることが明らかになった。一方でSpi-BはGP2プロモーター領域への結合が認められなかった。Sox8欠損マウスではパイエル板の抗体産生に関わるリンパ球数の低下が認められた。さらに離乳期における分泌型IgA抗体産生が低下していた。マウス新生仔は母乳に含まれるIgAにより腸管免疫系が保証されているが、離乳後は空白時間を生じさせないため自ら分泌型IgA抗体を産生する必要がある。Sox8によるM細胞の成熟が離乳期のIgA抗体産生の確立に重要であることを示している。2016年度までの研究からM細胞が発現する転写因子2種類を新たに見いだした。2017年度はそのうちの転写因子Aについて解析を進めた。腸管の濾胞上皮細胞は陰窩底部の上皮幹細胞から分化する。既報のM細胞転写因子SpiBはM細胞の分化の初期段階で機能する分子であり、組織化学解析では増殖帯の付近の陰窩上部で発現が認められる。転写因子AはSpiBと同様な部位での発現が認められ、分化初期に働く転写因子であると想定された。転写因子Aの遺伝子欠損マウスを導入しM細胞の性状解析を行った。電子顕微鏡による解析では欠損マウスの濾胞上皮ではアポトーシスに特有のクロマチンの凝集を持つ細胞が多く認められた。さらに、欠損マウスにおいてはM細胞の後期発現分子であるGP2の濾胞上皮におけるmRNA量が1/100以下に低下していた。免疫組織染色による解析によってタンパク質レベルでもGP2が検出できないことを確認している。それに対して、M細胞分化の初期に働く分子、SpiB、Tnfaip2などの数種類についての発現解析を行ったところ、いずれもおよそ1/2に発現量が減少していたものの、GP2ほどの発現量低下は認められなかった。免疫組織染色ではこれらのM細胞初期発現分子は濾胞上皮の半ばまで確認できた。陰窩から分化したM細胞が押し出されるようにして濾胞上皮頂部へと移動していくことを考慮すると、転写因子Aの欠損マウスでは成熟M細胞になる前にアポトーシスによって除去されていると想定された。

欠損マウスの解析は進んだものの、転写因子Aに関しての分子生物学的解析が予定通りには進まなかった。腸管のリンパ濾胞上皮に存在するM細胞は、高分子の管腔内抗原を取り込む能力を持ち、粘膜免疫応答の開始に働く細胞である。申請者のこれまでの研究からM細胞は段階的な成熟過程を経ることで、最終的に抗原取り込み能力を獲得することを明らかにしている。28年度は濾胞上皮のmRNAデータベースから、発現量の高い転写因子候補をピックアップし、in situ hybiridization法によりmRNAの発現部位の同定を行った。その結果、2つの転写因子A、BがM細胞発現分子であるTnfaip2とGp2の発現部位と一致していた。濾胞上皮は絨毛上皮細胞と同様に陰窩基底部の組織幹細胞から分化、増殖し押し出されるようにして、濾胞頂部もしくは絨毛頂部へと移動していく。転写因子A、Bともに濾胞陰窩の増殖帯近傍から濾胞の頂部にかけての発現が認められることから、M細胞分化初期から後期にかけて継続して発現する分子であると想定された。このことは、初期の転写因子Spi-Bとも発現部位が一致することからも確認できた。転写因子A、Bについて免疫抗血清を用いて免疫組織染色を行ったところ、タンパク質レベルにおいても両者のM細胞における発現、細胞核への局在が確認できた。M細胞は腸管以外の粘膜組織にも存在する。マウスの鼻腔奥の鼻咽頭関連リンパ組織はヒト扁桃に相当するリンパ性器官である。鼻咽頭関連リンパ組織における転写因子Aの免疫染色を行ったところ、M細胞における発現が確認できた。このことから、転写因子Aは腸管に限定されず粘膜組織全般に共通するM細胞発現分子であると考えられる。これまで、M細胞分化を制御する転写因子はRelBとSpiBが知られているのみであった。本研究によって、より詳細なM細胞分化制御機構が明らかになると期待される。免疫組織染色に適した免疫抗血清の作製に成功し、タンパク質レベルでの解析が行えたことで、詳細な解析が行えるようになった。さらに、転写因子Aについては欠損マウスの導入を行い、機能解析を開始することができている。転写因子Aについての分子生物学的解析を進める。作成した免疫血清は免疫組織染色には適していたものの、生化学的解析に応用するためには、血清のままではなくアフィニティー精製を行う、もしくはモノクローナル抗体の作成を試みるなどの工夫が必要である。欠損マウスの解析は継続し、粘膜免疫応答、腸内環境の維持へと与える影響を明らかにしていく。欠損マウスの機能解析を行い、M細胞分化における転写因子Aの役割を明らかにする。作成した免疫抗血清を用いて、転写因子AのChiP-seq解析、ゲルシフトアッセイなどにより、転写制御部位、標的遺伝子の解析を進める。端数として758円の残高が生じた。次年度の物品費として使用する予定である。人件費として見積もっていた3月分の予算が、予定より出勤数が減ったため余った。次年度の消耗品で使用する予定