hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腫瘍血管内皮細胞・マクロファージを抗血管新生ワクチンとして用いた癌免疫療法の開発

本研究は、以前、腫瘍血管を標的とする血管内皮細胞ワクチン療法の臨床的安全性および有用性を検討するために、動物モデルの検討を踏まえ、末期癌患者を対象とする臨床治験を行った。その結果、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)のワクチンは、(1)明らかな副作用を伴うことなく、(2)特異的な細胞性および液性免疫反応を誘導し、(3)再発性悪性脳腫瘍に罹患している一部の患者においては、優意な腫瘍抑制効果を発揮し得ることが判明した。研究員は、上記プロジェクトの成果を踏まえて、より有効かつ特異的な抗血管新生療法および抗腫瘍免疫療法を目指して、正常組織および腫瘍組織より分離したマクロファージの特徴について検討を進めている。今年度は、ヒト単球を用いた、腫瘍組織中のマクロファージ(TAMs)のin vitroモデルを作製し、cDNA microarrayを用いて同細胞の遺伝子発現のパターンを検索した後、Real-time PCR法を用いて、遺伝子発現の時間的変化について検討を行った。その結果、発現を測定した約3万個の遺伝子のうち、腫瘍組織中のマクロファージの数十個の遺伝子の発現が、正常マクロファージのそれとは異なることが判明した。また、ヒト大腸癌(human colorectal adenocarcinoma)細胞株あるいはヒト神経膠芽腫(human glioblastoma)細胞株を用いて誘導した腫瘍組織中のマクロファージのそれぞれの遺伝子発現パターンが異なる特徴を示したことから、腫瘍組織中のマクロファージが腫瘍の血管新生および癌免疫に及ぼす影響については、腫瘍のタイプに合わせて考える必要があると示唆された。腫瘍に特異的な遺伝子発現の特徴に関する上記の解明は、腫瘍生物学および免疫学の分野においては、有意義なものであるため、今後、新たな癌の免疫療法や腫瘍血管新生を標的とする治療法の開発に活用されると考えられる。本研究では、以前、腫瘍血管を標的とする血管内皮細胞ワクチンを動物モデルにて開発した。今年度は、同ワクチンの臨床的な安全性および有用性について検討するために、末期癌患者を対象とする臨床治験を行い、同ワクチンの投与による副作用・免疫学的反応・抗腫瘍効果の有無について検討した。その結果、以下の新知見を得ることができた。すなわち、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)のワクチンは、(1)副作用を伴うことなく、(2)特異的な細胞性および液性免疫反応を誘導し、(3)再発性悪性脳腫瘍に罹患している一部の患者では、優位な腫瘍抑制効果を発揮し得ることが判明した。研究員は、上記プロジェクトに積極的に参加し、中心的な役割を果たした。すなわち、内皮細胞ワクチンを作成し、患者の血液サンプルを用いてin vitro実験による免疫反応の評価を行い、実験的および臨床的データを解析した。また、上記プロジェクトの成果を海外の学会誌で発表した。本研究では、上記プロジェクトの成果を踏まえて、より有効かつ特異的な抗血管新生ワクチンを目指して、正常組織および腫瘍組織より分離した血管内皮細胞およびマクロファージの特徴についての検討を進めている。今年度は、検討するために必要な準備を行い、必要な技術の取得に専念した。すなわち、マウスのさまざまな正常組織(脳、大腸など)およびマウスの皮下に移植したヒト癌細胞株(大腸癌細胞株HT-29,膠芽腫細胞株U87MGなど)による腫瘍結節を用いて、セルソータによる特異的かつ効果的な細胞分離法の条件設定について検討した。また、分離した細胞の遺伝子発現パターンの解析が必要とするmRNAの分離法、BioanalyzerによるRNAの測定法、Real-time RT-PCR法、cDNA microarray法などの技術の習得を行った。来年度は、分離した血管内皮細胞およびマクロファージを上記技術により解析する予定である。本研究では、以前、腫瘍血管を標的とする血管内皮細胞ワクチンを動物モデルにて開発し、同ワクチンの臨床的な安全性および有用性について検討するために、末期癌患者を対象とする臨床治験を行った。その結果、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)のワクチンは、(1)副作用を伴うことなく、(2)特異的な細胞性および液性免疫反応を誘導し、(3)再発性悪性脳腫瘍に罹患している一部の患者では、優位な腫瘍抑制効果を発揮し得ることが判明した。今年度は、樹状細胞の有用性について検討し、また、ワクチンの標的となり得る抗原についても検討した。さらに、上記プロジェクトの成果を踏まえて、より有効な癌免疫療法を目指して、腫瘍マクロファージの特徴についての検討を進めてきた。すなわち、正常組織のモデルとしてマウスの脾臓、腫瘍組織のモデルとしては、マウスの皮下に移植したヒト癌細胞株による腫瘍結節を用いて、複数の検体より、セルソーターによるマクロファージの選択的分離を行い、得られた分離細胞よりmRNAを抽出し、Real-time RT-PCR法によりマクロファージ特異的な遺伝子の発現を測定した。来年度は、同サンプルを用いて、cDNA microarray法による測定を行い、より多くのマクロファージの特徴の解明とその臨床応用への可能性について検討する予定である。また、別のアプローチとしては、ヒトの単球を用いるin vitroモデルを作製しており、来年度は、cDNA microarray法を用いて、腫瘍内マクロファージの時間的変化の詳細について更に検討する予定である。

本研究は、以前、腫瘍血管を標的とする血管内皮細胞ワクチン療法の臨床的安全性および有用性を検討するために、動物モデルの検討を踏まえ、末期癌患者を対象とする臨床治験を行った。その結果、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)のワクチンは、(1)明らかな副作用を伴うことなく、(2)特異的な細胞性および液性免疫反応を誘導し、(3)再発性悪性脳腫瘍に罹患している一部の患者においては、優意な腫瘍抑制効果を発揮し得ることが判明した。研究員は、上記プロジェクトの成果を踏まえて、より有効かつ特異的な抗血管新生療法および抗腫瘍免疫療法を目指して、正常組織および腫瘍組織より分離したマクロファージの特徴について検討を進めている。今年度は、ヒト単球を用いた、腫瘍組織中のマクロファージ(TAMs)のin vitroモデルを作製し、cDNA microarrayを用いて同細胞の遺伝子発現のパターンを検索した後、Real-time PCR法を用いて、遺伝子発現の時間的変化について検討を行った。その結果、発現を測定した約3万個の遺伝子のうち、腫瘍組織中のマクロファージの数十個の遺伝子の発現が、正常マクロファージのそれとは異なることが判明した。また、ヒト大腸癌(human colorectal adenocarcinoma)細胞株あるいはヒト神経膠芽腫(human glioblastoma)細胞株を用いて誘導した腫瘍組織中のマクロファージのそれぞれの遺伝子発現パターンが異なる特徴を示したことから、腫瘍組織中のマクロファージが腫瘍の血管新生および癌免疫に及ぼす影響については、腫瘍のタイプに合わせて考える必要があると示唆された。腫瘍に特異的な遺伝子発現の特徴に関する上記の解明は、腫瘍生物学および免疫学の分野においては、有意義なものであるため、今後、新たな癌の免疫療法や腫瘍血管新生を標的とする治療法の開発に活用されると考えられる。
3αヒドロキシステロイド脱水素酵素の構造学的研究

本研究では、以前我々が結晶構造を決定したPseudomonas sp. B-0831株由来3α-hydroxysteroid dehydrogenase(Ps3αHSD)の基質結合ループの運動性と反応機構との関係を明らかにするために、100 nsecの分子動力学計算を行った。シミュレーション中において、NADHが結合しているホロ型のサブユニットの構造には変化がなかったが、アポ型においては基質結合ループが大きく開く運動を観測した。これらの観測結果から、変異実験を行い、188番のThrをAlaに変異させた変異体はNADH結合における、ヘリックスの誘起性と負の協同性が失われていることを見出した。これらの結果によって、基質結合ループの構造変化がPs3αHSDにNADH結合における負の協同性の特徴をもたらしていることが示唆された。3αヒドロキシステロイド脱水素酵素の反応機構解明のために分子動力学計算によるシミュレーションを行った。初期座標は結晶構造解析から得られたダイマー中一方のモノマーにNADHが結合している構造を用いた。エネルギー最小化と平衡化後の100 nsecにおよぶシミュレーションの結果、40nsec付近でNADHの非結合型のモノマーにおいて大きな構造変化が観測できた。この構造変化は結晶構造でNADHによってαヘリックス構造が誘起された基質結合ループ部分においてのみ起こっており、他の部分の構造変化は見られなかった。この基質結合ループは2つのαヘリックス構造を弛緩させながら溶媒方向に動いており、その可動範囲の角度は60度に及ぶことが明らかになった。この結果は結晶構造の結果と矛盾せず、この基質結合ループの可動性によって結晶構造中ではdisorderとなっていたことが示唆された。一方NADHが結合していたモノマーにおいては、基質結合ループにおいてもこのような構造変化は観測できず、基質結合ループの安定な配置にNADH結合が重要な役割を果たしていることが明らかになった。このシミュレーションによって、NADHと相互作用し基質結合ループの安定な配置に関与している数残基を同定できたので、今後はこれらの変異体を作成し、その酵素反応解析や分光学的な解析によって、反応機構を追いたいと考えている。分子動力学計算の他にもNAD複合体の結晶化実験を行っており、いくつかの結晶が得られている。昨年度おこなった3αヒドロキシステロイド脱水素酵素の分子動力学計算により、補酵素(NADH)結合と非結合状態の比較から酵素の構造変化を捉えた。またこの構造変化に重要な役割を担っていると考えるいくつかのアミノ酸候補を見出した。本年度はこれらのアミノ酸候補の変異体を作成し、補酵素結合や構造変化にどのような影響があるかを調べた。それぞれの変異体の大量培養と精製系を構築後、円二色性スペクトルや蛍光測定から酵素の構造変化、活性を測定した。その結果、4種作成した変異体のうち、T177A変異体はNADH結合によるヘリックス誘起能や酵素活性が著しく減少していることを明らかにした。さらにこのT177A変異体は野生型においてみられた補酵素結合の負の協同性を失っていることも確かめた。この酵素の反応機構は補酵素が酵素にまず結合し、ヘリックス誘起の構造変化を引き起こし基質のためのポケット構造を作る。その後、基質がポケットに取り込まれ脱水素反応が起こった後リリースされると考えられている。Thr177は触媒残基ではないので、この過程の初期段階のヘリックス誘導を制御する重要なアミノ酸だと考えている。この変異体の酵素活性が落ちたことは初期段階のヘリックス誘起が酵素反応に大きく寄与していることも示唆している。このように本年度では、脱水素酵素の反応機構を明らかにするために有用な変異体T177Aを見出した。今後はこの変異体や補酵素NADとの複合体構造を解析し、この酵素反応を段階的に明らかにして行きたいと考えている。3αヒドロキシステロイド脱水素酵素の反応機構を明らかにするために、これまで分子動力学計算(MD)によって、この酵素の補酵素NADHの非結合状態における基質結合ループ部分の特徴的な構造変化を捉えた。MDシミュレーションの観察からこの構造変化に重要だと考えられるアミノ酸T75,T188,L190を推定し、それらのアラニン変異解析を行ったところ、T188A変異体はNADH結合によるヘリックス誘起能がなく、補酵素結合の負の協同性を失っていることが明らかになった。本年度はさらにこのT188A変異体の触媒活性の解析を行い、T188の重要性を調べた。その結果、T188A変異体のコール酸の酸化触媒活性は、野生型に比べ1/5の触媒活性になっていた。

次にT188A変異体のジヒドロコール酸の還元触媒活性を調べたところ、野生型の1/190の活性まで落ちていた。このように酸化反応よりも還元反応にT188Aの変異は大きく影響を与えた。おそらくNADHの結合後に起こるヘリックスへの構造変化はT188がトリガーとなって引き起こされ、それが還元反応にとって重要な役割を果たしていることが示唆された。このような局所的なループからヘリックスの構造変化が酵素の触媒活性に影響するのは稀有な例であり、1変異によってその構造変化を失ったT188A変異体を見出した意義は非常に大きい。今後は基質選択性や立体反応の選択性にこのT188がどのように影響するのか、またT188A変異体の構造解析によって反応機構の詳細について検討していきたい。この酵素は血中の胆汁酸濃度測定に使用されており、このような応用性の高い酵素の反応機構の解明は、今後の酸化還元酵素の設計等、酵素の蛋白質工学にとって重要な知見になることが期待される。
酵素的機能の発現を指向する多機能不斉触媒の開発

オレフィンの触媒的不斉エボキシ化は、光学活性医薬品の合成に有用な光学活性エボキシドを得ることができることから、創薬研究において極めて魅力的な反応の一つである。しかしながら、これまで汎用性が高く実用的なα,β-不飽和ケトンの触媒的不斉エボキシ化反応の報告はなされていない。そこで、新しいイッテルビウム錯体の調製と、これを触媒とするα,β-不飽和ケトンの触媒的不斉エボキシ化反応について検討した。不斉リガンドとして(R)-ビナフトールを選択し、Yb(O-i-Pr)_3と反応させることによりα,β-不飽和ケトンの触媒的不斉エボキシ化反応に有効な錯体調製を検討した。市販のYb(O-i-Pr)_3を用いた場合、再現性が乏しいという結果が得られたため、添加するモレキュラーシーブス4Aや、水の当量数についても精査した。その結果、乾燥したモレキュラーシーブス4Aの存在下、テトラヒド口フラン中、Yb(O-i-Pr)_3と(R)-ビナフトールを2:3の混合比で調製し、少量の水を添加すると高活性の触媒を調製できることが分かった。イッテルビウムの代わりにイットリウムを含有する触媒を調製しエボキシ化反応を行ったところ、イッテルビウム錯体とほぼ同等の不斉触媒としての機能を有することを確認した。このイットリウム触媒もNMRにおいて明瞭なピークを観測できなかったが、蒸気圧降下法による分子量測定の結果、約70000に達する分子量を持つことが分かり、非常に強く会合した超分子であることが分かった。また、cis-エノンのエボキシ化反応の場合、ビナフトールの3位にヒドロキシメチル基を導入した誘導体を用いると、cis-エボキシドが収率良く得られることも見いだした。
持続可能な地域公共施設ネットワークの維持のための公共施設再整備手法に関する研究

本年度は,昨年度までのシミュレーションモデル・数理モデルに主に基づいていた研究を発展させ、地域公共施設の再整備に取り組むためのより実証的な研究を実施した。第一に、電子自治体の推進のなか近年の自治体に急速に普及している公共施設予約システムについての研究を行った。この予約システムによれば、施設の利用目的や利用頻度などの施設需要などを精緻に把握できるため、ここから得られる情報をもとにした、新たな公共施設管理手法の開発も可能であると思われる。このため、アンケート調査により現状の予約システムの普及状況を把握し、今後の公共施設管理についての見通しをたてた。第二に、昨年度開発した競合して立地する施設と他施設との利用圏の重なりの影響を考慮した施設利用者密度の幾何学的分析手法に基づく重要構造分析モデルを実際の観測データをもって検証した。具体的には、鈴木ほか(利用者の選好に立脚した通所型高齢者施設の利用構造と配置の分析、日本建築学会大会学術講演梗概集、F-1、pp.649-650、2002)により観測された高齢者福祉施設の利用者分布の状況を、多重ボロノイ図にもとづき解析し、開発した分析手法の有用性を示した。第三に、昨年度開発した施設再配置モデルを再検討し、施設閉鎖とともに施設移転を考慮した最適配置シミュレーションにより最適な施設統廃合についての試算を行った。この際、地域の将来人口・公共施設の建築年数・公共施設の空室率の3要素のうち、いずれの要素から優先順位をつけるかにより、閉鎖・移転施設の組合せにより統廃合後の施設利用者の負担が大きく変わることを確認した。同モデルは統廃合計画の効果測定にも有用である。本年度は,まず,地域公共施設の再整備を考えるための基礎として,既存地域公共施設の利用構造を個別に精緻に把握するための需要構造分析手法開発を行った.特に貸し室等の定員のある空間を有する公共施設を取り上げ,満員による施設の利用不可能性を考慮した,基本的な利用構造推定モデルの開発を行った.この際,介在機会モデルを援用することで,競合して立地する施設を勘案し,他施設との利用圏の重なりの影響を考慮した.結果として,距離別に見れば,ある施設を最近隣施設とする利用者よりも,その施設を最近隣以遠の施設とする利用者の方が,施設までの移動距離が短くなり,当該施設の利用構造と多重ボロノイ図の関連が示唆された.次に,再整備手法モデルの構築を行った.本研究で取り上げる問題は本質的に,施設を順次建設・配置していく過程の逆をたどるものである.施設を順次建設・配置していく場合の理論的なアプローチとしては,多くの既往研究があるものの,その逆順序については未知である.そこで,まず,基本となる施設閉鎖モデルを開発した.この際,施設閉鎖計画案の評価について,逐次評価・最終評価の2通りを想定し,それぞれで最適配置案が大幅に異なることが把握できた.さらに,開発したモデルを,例として,東京都多摩市に当てはめた試算をおこなった.多摩市を取り上げる大きな理由は,申請者の研究業績により,地域コミュニティの勘案の上で欠かせない町丁目単位の詳細な人口予測結果があるためである.そこで,将来的な人口動態の変化に起因した公共施設の将来需要・公共施設の建築年数・公立学校の空室率などを最適化の判断基準とした,応用型の再整備手法モデルの開発も行った.本年度は,昨年度までのシミュレーションモデル・数理モデルに主に基づいていた研究を発展させ、地域公共施設の再整備に取り組むためのより実証的な研究を実施した。
カルネキシンおよびカルレティキュリンのノックアウトマウス作製とその機能解析

カルネキシンおよびカルレティキュリンは細胞の小胞体に局在し、膜・分泌蛋白質が成熟する過程でその品質管理に重要なレクチンシャペロンとして機能する。しかしいずれも体細胞に普遍的に発現するために、ノックアウトマウスを作製すると胚性致死もしくは生まれても発育不全のために成熟個体での機能解析を行うことは不可能であることが報告されている。そこで我々はcre/loxPシステムを用いることにより、これらのシャペロンを任意の組織や細胞・時期特異的(コンディショナル)に欠損するマウスを作製し、成熟個体でその機能解析を行うことを計画した。これまでにカルネキシンのコンディショナルノックアウトマウスのベクターを作製し、ES細胞に導入することにより、相同組換え体を得た。それらのES細胞をB6マウスの胚盤胞に注入してキメラマウスを作製し、B6マウスとの交配により生殖系列への寄与を確認した。次にCAG-creマウスとの交配により、全身でカルネキシンを欠損させた場合には、既報通りホモ欠損個体は成長不全のために殆ど成育せず、精子受精能の検討ができないことを確認した。さらに精原細胞特異的にcreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスと交配させた結果、精細胞特異的にカルネキシンを欠損するマウスを作製することに成功した。並行して行っているカルレティキュリンについても、キメラマウスの作製に成功し、B6マウスと交配からカルレティキュリンのコンディショナルノックアウトマウスの作製に成功している。しかしいずれも体細胞に普遍的に発現するために、ノックアウトマウスを作製する胚性致死もしくは生まれても発育不全のために成熟個体での機能解析を行うことは不可能であった。そこで我々は、cre/loxPシステムを用いることにより、これらのシャペロンを任意の組織や細胞・時期特異的(コンディショナル)に欠損するマウスを作製し、成熟個体でその機能解析を行うことを計画した。これまでにカルネキシンのコンディショナルノックアウトを作製するためのプラスミドベクターを構築し、ES細胞への導入を行った。PCRスクリーニングにより、相同組み換えを起こしたES細胞を得ており、現在はキメラマウスを作製している。並行してカルレティキュリンのコンディショナルノックアウトベクターを構築しているが、相同領域として必要な長腕が上手く増幅されず手間取っている。状況により、欠損させるエクソンの領域を変更するなど改善したい。また我々は精巣特異的にこれらのシャペロンをノックアウトすることを計画している。そこで、プロタミンやカルメジンプロモーターの制御下に精巣特異的にcreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスを作製した。レポーターマウスとの交配実験により、精細胞特異的にloxPサイトでの組み換えが起こることを確認している。
架空名義入札に頑健なネットワークリソース割当てのモデル化と評価

本研究では,ネットワーク上の各リソースを市場原理に基づいて公平かつ効率的に割り当てるプロトコルを,その実装に向けて評価することを目的とする.P2Pや分散センサネットワークなどのアドホックなネットワークにおけるデータ転送では,個々のノードの所有者や規格が異なる.この場合,各ノードにデータを適切に転送するための誘因(報酬)を考慮しなければならない.この報酬の決定にはしばしばオークションプロトコルが用いられる.しかし従来のプロトコルでは,あるノードが架空のノードを用いるか他ノードと共謀することで,不正に報酬を獲得できることを示した.この場合、理論的にもっとも優れているVickrey-Clarke-Grovesプロトコル(VCG)でも、不正行為は防げない。本研究では、さらに、選択されうる経路を所有しているエージェントの数に応じたペナルティをVCGに適用し、Reserve-Costプロトコル(RC)を提案し、このプロトコルが架空名義を用いた操作の影響を受けないことを理論的に明らかにした。計算機上に再現した小世界ネットワークに対して、提案プロトコルを評価し、VCGに対して約6080%の効率性を達成することも示した。また実際のネットワークでは,各ノードでオークションなど取得可能な情報に基づいてどこからデータを受ける(送る)べきかを決定する必要がある.これは,入札可能な対象(サーバなど)が複数あるときに,適切な入札箇所をある程度推定することに相当する.しかし、ネットワークの資源割当てのように非常にたくさんの要求が同時に起こり、かつ多くの地点から独立に処理をする必要がある.このような状況で資源割り当てプロトコルで見られる現象の解析も行った。それぞれが合理的に判断をすると全体の効率が落ちる現象があり、このために揺らぎや学習を導入することが一定の効果を上げることを示した。本研究では,ネットワークリソースを市場原理(オークション)に基づいて公平かつ効率的に割り当てるプロトコルを,その実装に向けて評価することを目的とする.特に今年度は,その基礎的検討を行った.P2Pや分散センサネットワークなどのアドホックなネットワークにおけるデータ転送では,個々の端末(ノード)はその所有者や規格が異なることが起こりうる.この場合,各ノードにデータを適切に転送するための誘因(報酬)を考慮しなければならない.このような報酬の決定にはしばしばオークションプロトコルが用いられる.そこで従来のプロトコルでは,あるノードが架空のノードを用いる,または他ノードと共謀することで,不正に報酬を獲得できることを明らかにした.一方で,これまで担当者らが設計してきたプロトコルの適用の検討を続けている.アドホックネットワークにおけるデータ転送では,経路探索と報酬の設定の両方を扱わなければならない.従来プロトコルでは単に経路探索を最適化することを前提にできたが,本研究が想定する不正行為のもとで最適な経路決定を達成することは不可能となる.このため,これまで開発してきたプロトコルが利用可能な準最適な経路決定方法が必要となることがわかった.また実際のネットワークでは,各ノードで取得可能な情報に基づいてどこからデータを受け取るべきか(送るべきか)を決定する必要がある.これは,入札可能な対象(サーバなど)が複数あるときに,適切な入札箇所をある程度推定することに相当する.今期は,このような想定の下,推定戦略やその学習方法により,効率性を求めた集中もしくは公平性のための負荷分散が行われることがわかってきた.さらに,トラフィックの変動要因を導入した実験を試みがさらに必要であることも分かってきた.本研究では、ネットワークリソースを市場原理(オークション)に基づいて公平かつ効率的に割り当てるプロトコルを、その実装に向けて評価することを目的とする。特に今年度は、具体的なプロトコルの設計に取り組んだ。P2Pや分散センサネットワークなどにおけるデータ転送では、個々の端末(ノード)はその所有者や規格が異なることが起こりうるため、各ノードにデータを適切に転送するための誘因(報酬)を考慮する必要がある。このような報酬の決定にはしばしばオークションプロトコルが用いられる。しかし、従来のプロトコルでは、あるノードが架空のノードを用いたり、他ノードと共謀することで、不正に報酬を増加しうる。

この場合、理論的にもっとも優れているVickrey-Clarke-Grovesプロトコル(VCG)でも、不正行為は防げない。そこで、選択されうる経路を所有しているエージェントの数に応じたペナルティをVCGに適用し、Reserve-Costプロトコル(RC)を提案し、このプロトコルが架空名義を用いた操作の影響を受けないことを理論的に明らかにした。さらに計算機上に再現した小世界ネットワークに対して、提案プロトコルを評価し、VCGに対して約6080%の効率性を達成することを示した。これに関連して、架空の名義を用いた不正行為に頑健なオークションプロトコルや協力ゲームの解概念に関する研究を学術論文および国際会議にて発表した。またネットワークの資源割当てのように非常にたくさんの要求が同時に起こり、かつ多くの地点から独立に処理をする必要がある場合において、このような資源割り当てプロトコルで見られる現象の解析も行った。それぞれが合理的に判断をすると全体の効率が落ちる現象があり、このために揺らぎや学習を導入することが一定の効果を上げることを示した。
ヒト単球および骨髄巨核球による血液凝固・線溶・血小板因子の産生、分泌に関する研究

最近、白血球、血小板や血管内皮細胞が止血および血栓形成・溶解に積極的に関与することが知られてきた。特にこれらの細胞が、種々の生理的あるいは病的刺戟に反応して色々な因子を産生、分泌することが注目されているが、その詳細は明らかでない。本研究は、当教室で樹立したユニ-クなヒト骨髄巨核球株(MEG-01)とヒト単球株(NOMO-1)とを巨核球と単球のモデルとして、凝固・線溶・血小板因子の産生、分泌機構を解明することを目的とする。1.MEG-01による凝固・線溶・血小板因子の産生、分泌10^<-7>Mのphorbol ester(TPA)添加により形態学的に成熟巨核球へと分化成熟するとともに、フィブリノゲン、von Willebrand因子、第XIII因子A.β-トロンボグロブリン(β-TG)、プラスミノゲンアクチベ-タインヒビタ-1(PAI-1)、プラスミノゲンアクチベ-タインヒビタ-2(PAI-2)の産生、分泌が増加することを認めた。一方、インタ-ロイキンはPAI-1とPAI-2分泌には全く影響しなかった。またCAMP刺戟により、抗血栓性物質であるトロンボモジュリン発現が著名に増加することを明らかにした。Nonthern blot法によってもmRNAの増大を認めた。また、MEG-01はtransforming growthfactor-βを産生分泌することを見い出した。2.NOMO-1による凝固・線溶因子の産生分泌TPA、lipidA、ビタミンD_3などの添加により、炎症や免疫反応に関与するインタ-ロイキン1や線溶因子のプラスミノゲンアクチベ-タを分泌することを明らかにした。またD-ダイマ-によりインタ-ロイキン1分泌が増加することは、線溶と免疫・炎症とを結ぶ新しい経路として興味深い最近、白血球、血小板や血管内皮細胞が止血および血栓形成・溶解に積極的に関与することが知られてきた。またD-ダイマ-によりインタ-ロイキン1分泌が増加することは、線溶と免疫・炎症とを結ぶ新しい経路として興味深い線溶系活性化の制御に重要な役割を果たすプラスミノゲンアクチベークチンヒビター(PAI)には性質のことなる3種類のものがあることが知られている。このうちPAIー1は血中の大部分が血小板に存在するが、その産生部位は不明である。我々はすでに蛍光抗体法によりPAIー1が骨髄巨核球に存在することを見ているが、今回ヒトの骨髄巨核芽球細胞株(MEGー01)を用いてその産生を証明した。MEGー01細胞を1%BSA含有RPMI1640培地にて培産すると、少量のPAIー1細胞破壊液および培産上清中にELISA法により検出できる。次に細胞を10^<-7>Mphorbol esterにて成熟型に分化誘導すると、PAIー1産生は著るしく増加した。同時に未刺激細胞にはみられなかったPAIー2の産生もはじまった。一方インターロイキン添加では、MEGー01細胞のPAI産生に変化はみられなかった。またMEGー01細胞は、トロンボモジュリン(TM)を産生することがTMのcPNAを用いたNorthern blot法により証明された。以前我々は本細胞株がプロラインS(PS)を産生分泌することを報告しており(Blood 70:301、1987)、骨髄巨核球が血液凝固反応の制御に重要な役割を果すことを示唆する。さらに巨核球のモデルとしてMEGー01を用い、血小板特異蛋白βーTGが産生分泌されることを明らかとした。βーTGの産生はMEGー01の分化成熟と共に増加することは興味深い。1.cAMPによるMEG-01のトロンボモジュリン発現の調節

トロンボモジュリン(TM)は、血管内皮細胞表面に存在する糖蛋白で、血中に生成したトロンビンと結合して複合体を形成し、プロテインCの活性化を促進する働きにより、血液凝固の制御に重要な役割りを果すものである。我々およびSuzukiらは以前、TMが血小板、骨髄巨核球、MEG-01に存在することを報告した。本年度は、MEG-01を用いて、細胞内cAMP濃度を高める物質は、TM発現を増加させることを見い出した。すなわち、3mMのdibutyryl cAMP添加により48時間後にはTM活性が約15倍に上昇した。同様にforskolin、プロスタグランジンE_1、8BrcAMPによってもTM活性の311倍の上昇が観察された。さらにNorthern blot法により、TMのmRNAが時間とともに爆発的に増大することが示された。TMの発現は従来から内毒素やインタ-ロイキン1によりdown-regulationをうけることが知られているが、TM発現をup-regulationする物質としてはcAMPが最初でする。尚、同様な現象を他の細胞株(HEL)や血管内皮細胞にも認めている。2.D-ダイマ-によるNOMO-1のインタ-ロイキン1産生の調節線溶亢迫時に血中に出現するD-ダイマ-によりNOMO-1が形態学的により成熟型に変化すると共に、インタ-ロイキン1、ウロキナ-ゼ型プラスミノゲンアクチベ-タ-,プラスミノゲンアクチベ-タ-インヒビタ-2(PAI+2)の分泌を促進することを見い出した。この現象は、線溶反応と免疫・炎症とを結合新しい経路として興味深い。
食道癌における発癌/抑制に関与するmicroRNAの同定とその機能解析

本研究では食道癌におけるmicroRNA(miRNA)の発現パターンを解析し、発癌または癌抑制に関与するmiRNAの同定を試み、死亡率の低減を目指すための予防や早期発見法への応用に貢献できることを目的とした。食道癌臨床検体と食道癌細胞株についてマイクロアレイを用いて787種のmiRNAのスクリーニングを行った。その結果、腫瘍特異的または腫瘍分化度特異的に発現レベルの異なるいくつかのmiRNAを同定することができた。食道癌の発癌に関与するmiRNAを同定するために19年度は以下の実験を行った。1.臨床3検体と細胞株9種(高中低分化型各3種)についてのマイクロアレイ解(787種)(1)臨床検体はインフォームドコンセントの得られたそれぞれ患者の腫瘍組織と正常組織から抽出したRNAを用いて解析を行った。その結果から臨床3検体間で共通に増減しているmicroRNA(miRNA)は見られなかった。しかしいずれかの2検体で腫瘍組織特異的に発現が増加しているもの4種、低下しているもの5種が確認された。(2)細胞株9種では高・中・低分化型をそれぞれ比較することにより発現の増減を確認した。高分化型をリファレンスにした場合、発現が増加しているものはそれぞれ中分化型で9種、低分化型で11種が確認された。この中には共通して発現が増加しているmiRNAがあることから、脱分化に関与している可能性が示唆される。また中分化型をリファレンスにした場合、低分化型で増加しているmiRNAは3種であった。2.定量PCRキット{TaqMan MicroRNA Assays}を用いたスクリーニング臨床5検体について行った結果、腫瘍組織特異的に発現の増減しているmiRNAを確認することができた。しかしマイクロアレイ解析の787種のmiRNAをカバーすることが出来なかったので、マイクロアレイ解析と全て同じ結果とはならなかった。今後の予定として、変動の確認されたmiRNAについてそれらの標的遺伝子の検索とその機能解析をしていきたいと考えている。本研究では食道癌におけるmiRNAの発現パターンを解析し、死亡率の低減を目指すための予防や早期発見法への応用、さらには食道癌の発癌または癌抑制に関与するmiRNAを同定した上で機能解析を行い遺伝子治療への応用を目的とし、食道癌患者3検体の腫瘍細胞(T)と正常細胞(N)から抽出したRNA、および分化度の違う食道癌9細胞株(高中低分化型3種類ずつ)RNAを用いてmiRNA(787種類)の比較解析をそれぞれ行った。その結果、臨床検体においては腫瘍細胞に共通してmiR92a-2*, miR155*, miR193b*, miR508-3pが増加し、miR142-3p, miR150, miR380, miR140-3p, miR886-3pが減少していることが分かった。食道癌9細胞株の比較では、同一分化型間でもmiRNAの発現パターンが異なっていることが確認された。また高分化型に対して中分化型と低分化型の比較では、中分化型においてlet7b, miR29a, miR196a, miR9, miR9*, miR148b, miR335, miR422a, 29b-2*が、低分化型においてlet7b, miR23a,miR29a, miR96, miR98, let7i, miR23b, miR339-5p, miR660, miR92-2*, miR520c, miR1225-5pが高発現していた。この結果からlet7b, miR29aが悪性度に影響している可能性が考えられた。これらのmiRNAとLOHおよびCGHとは優位な相関が見られなかった。このことから染色体異常ではなく、これらの変動しているmiRNAが食道癌発生に関与していると考えられる。これらmiRNAの標的遺伝子をバイオインフォマティクスにおいて検索すると、1つのmiRNAに対して数千もの標的遺伝子候補が挙げられる。これらの候補遺伝子すべてについて機能解析を行うのは非現実的であると考えたので、実際にmiRNAと物理的相互作用をしている標的遺伝子を捕まえる方法を考える必要がある。現在、Ago抗体あるいは化学修飾したmiRNAを用いたpull-down法、またmiRNAを細胞に導入し発現変化の見られるタンパク質の質量分析によって候補遺伝子を探索する試みをしている。
CO_2選択再循環とNOx還元によるコージェネレーションエンジンシステムの排気浄化

高い総合エネルギーを有するコージェネレーションシステムは,エネルギーの有利用と環境保全の観点から,重要な位置を占めている.民生用小規模システムでは,熱効率が高く,CO_2排出量が少ないディーゼル機関が多く利用されているが,NOxや黒煙の排気が問題となっている.NOxの低減には,燃料噴射時間を遅延して燃焼を抑制したり,排気ガスを再循環させたりすることがあるが,これらは,黒煙の悪化させる.このため,本研究ではコージェネレーション用ディーゼル機関のNOxと黒煙の低減を目的として,排気ガス中のCO_2を水蒸気の共存下で選択的に回収して,これを吸気に再循環するとともに,燃焼室内のNOx低減効果を増大を図るシステムを検討した.初めに,小型反応装置を用いて炭酸カリウムK_2CO_3により二酸化炭素の吸着及び放出実験を行った.実験では,長さ300mm,直径φ20mmで100°Cに保温した反応管に酸化カリウム含んだ活性炭(300gK_2CO_3/1000gCarbon)を組み込んだ.ここに,ディーゼル排気を模擬して,水蒸気を含んだ二酸化炭素・窒素混合ガス(11.8%CO_2)を100°Cまで加熱した後反応管に導入し,反応管を通過したガスのCO_2濃度を計測することにより,CO_2吸着に及ぼすガス流量,反応管温度,水蒸気濃度および酸化カリウム量の影響について調べた.その結果,本装置では吸着できるCO_2量は,理論値の6070%で比較的に高いCO_2吸着量が得られた.またCO_2の吸着量は反応管の温度によって左右され,100°Cで最大吸着量が得られる.水蒸気濃度の影響については,無水分の条件ではCO_2吸着量が小さく,水分14%付近で最大CO_2吸着量を示した.次に二酸化炭素の放出について調べるため水蒸気を70%を含んだ窒素ガスを用いてCO_2の放出に及ぼすガス流量および温度について調べた.その結果,ガス温度が200°C付近では,ガス流量が高いほど高いCO_2放出量が得られた.上記の研究からディーゼル機関の排気ガス中のCO_2の吸着と放出が可能とわかった.次に直接噴射式ディーゼル機関の吸入空気に二酸化炭素を導入して,CO_2選択排気循環について調べた.その結果,二酸化炭素を3%導入することによって黒煙の悪化がなく大幅なNOx低減が得られた.高い総合エネルギーを有するコージェネレーションシステムは,エネルギーの有利用と環境保全の観点から,重要な位置を占めている.民生用小規模システムでは,熱効率が高く,CO_2排出量が少ないディーゼル機関が多く利用されているが,NOxや黒煙の排気が問題となっている.NOxの低減には,燃料噴射時間を遅延して燃焼を抑制したり,排気ガスを再循環させたりすることがあるが,これらは,黒煙の悪化させる.このため,本研究ではコージェネレーション用ディーゼル機関のNOxと黒煙の低減を目的として,排気ガス中のCO_2を水蒸気の共存下で選択的に回収して,これを吸気に再循環するとともに,燃焼室内のNOx低減効果を増大を図るシステムを検討した.初めに,小型反応装置を用いて炭酸カリウムK_2CO_3により二酸化炭素の吸着及び放出実験を行った.実験では,長さ300mm,直径φ20mmで100°Cに保温した反応管に酸化カリウム含んだ活性炭(300gK_2CO_3/1000gCarbon)を組み込んだ.ここに,ディーゼル排気を模擬して,水蒸気を含んだ二酸化炭素・窒素混合ガス(11.8%CO_2)を100°Cまで加熱した後反応管に導入し,反応管を通過したガスのCO_2濃度を計測することにより,CO_2吸着に及ぼすガス流量,反応管温度,水蒸気濃度および酸化カリウム量の影響について調べた.その結果,本装置では吸着できるCO_2量は,理論値の6070%で比較的に高いCO_2吸着量が得られた.またCO_2の吸着量は反応管の温度によって左右され,100°Cで最大吸着量が得られる.水蒸気濃度の影響については,無水分の条件ではCO_2吸着量が小さく,水分14%付近で最大CO_2吸着量を示した.次に二酸化炭素の放出について調べるため水蒸気を70%を含んだ窒素ガスを用いてCO_2の放出に及ぼすガス流量および温度について調べた.その結果,ガス温度が200°C付近では,ガス流量が高いほど高いCO_2放出量が得られた.上記の研究からディーゼル機関の排気ガス中のCO_2の吸着と放出が可能とわかった.次に直接噴射式ディーゼル機関の吸入空気に二酸化炭素を導入して,CO_2選択排気循環について調べた.その結果,二酸化炭素を3%導入することによって黒煙の悪化がなく大幅なNOx低減が得られた.高い総合エネルギー効率を有するコージェネレーションシステムは,エネルギーの有効利用と環境保全の観点から,重要な位置を占めている.民生用小規模システムでは,熱効率が高く,CO_2排出量が少ないディーゼル機関が多く利用されているが,NO_Xや黒煙の排出が問題となっている.NO_Xの低減には,燃料噴射時期を遅延して燃焼を抑制したり,排気ガスを再循環させたりすることが有効であるが,これらは,黒煙の悪化を招くだけでなく,燃焼ガスによる機関内部の腐食が避けられない.このため,本研究では,コージェネレーション用ディーゼル機関のNO_Xと黒煙の低減を目的として,排気ガス中のCO_2を水蒸気の共存下で選択的に回収して,これを吸気に再循環するとともに,燃焼室内でのNO_X還元によりNO_X低減効果の増大を図るシステムを検討している.今年度はまず,小型反応装置を用いて炭酸カリウムK_2CO_3により二酸化炭素の吸収実験を行った.

実験では,長さ300mm,直径φ20mmで100°Cに保温した反応管に炭酸カリウム含んだ活性炭(300gK_2CO_3/1000gCarbon)を組み込んだ.ここに,ディーゼル排気を模擬して,水蒸気を含んだ二酸化炭素・窒素混合ガス(11.8%CO_2)を100°Cまで加熱した後反応管に導入し,反応管を通過したガスのCO_2濃度を計測することにより,ガス流量とCO_2吸収量の関係を明らかにした.その結果,本研究で用いた化学的吸収法は,二酸化炭素を吸収する性能を持っており,その吸収量はガス流量の増加とともに低下することを示した.また,急速圧縮装置を用いた実験で,過濃高乱流燃焼場で熱分解炭化水素によるNO_X還元反応が存在することを示した.今後は,CO_2の吸収および回収に及ぼす導入ガスの温度,水分量,CO_2濃度などの影饗を調べるとともに,本技術をディーゼル機関へ適用し,NO_Xと黒煙の低減を図る.コージェネレーションシステムは,エネルギーの有利用と環境保全の観点から,重要な位置を占めている.民生用小規模システムでは,熱効率が高く,CO_2排出量が少ないディーゼル機関が多く利用されているが,NOxや黒煙の排気が問題となっている.NOxの低減には,燃料噴射時間を遅延して燃焼を抑制したり,排気ガスを再循環させたりすることがあるが,これらは,黒煙の悪化させる.このため,本研究ではコージェネレーション用ディーゼル機関のNOxと黒煙の低減を目的として,排気ガス中のCO_2を水蒸気の共存下で選択的に回収して,これを吸気に再循環するとともに,燃焼室内のNOx低減効果を増大を図るシステムを検討した.平成13年度では,前年度の予備実験の結果をもとにして,新小型反応装置を用いて炭酸カリウムK_2CO_3により二酸化炭素の吸着及び放出実験を行った.実験では,長さ300mm,直径φ20mmで100°Cに保温した反応管に酸化カリウム含んだ活性炭(300gK_2CO_3/1000gCarbon)を組み込んだ.ここに,ディーゼル排気を模擬して,水蒸気を含んだ二酸化炭素・窒素混合ガス(11.8%CO_2)を100°Cまで加熱した後反応管に導入し,反応管を通過したガスのCO_2濃度を計測することにより,CO_2吸着に及ぼすガス流量,反応管温度,水蒸気濃度および酸化カリウム量の影響について調べた.その結果,本装置では吸着できるCO_2量は,理論値の6070%で比較的に高いCO_2吸着量が得られた.またCO_2の吸着量は反応管の温度によって左右され,100°Cで最大吸着量が得られる.水蒸気濃度の影響については,無水分の条件ではCO_2吸着量が小さく,水分14%付近で最大CO_2吸着量を示した.次に二酸化炭素の放出について調べるため水蒸気を70%を含んだ窒素ガスを用いてCO_2の放出に及ぼすガス流量および温度について調べた.その結果,ガス温度が200°C付近では,ガス流量が高いほど高いCO_2放出量が得られた.上記の研究からディーゼル機関の排気ガス中のCO_2の吸着と放出が可能とわかった.次に,直接噴射式ディーゼル機関の吸入空気に二酸化炭素を導入して,CO_2選択排気循環について調べた.その結果,二酸化炭素を3%導入することによって黒煙の悪化がなく大幅なNOx低減が得られた.
エンバク冠さび病における品種特異的抵抗性遺伝子発現の分子機構解析

エンバク冠さび病における品種特異的抵抗性発現における活性酸素の役割、およびPRタンパクや認識情報伝達遺伝子のクローニングとその制御機構の解析を目標に研究を行った。その結果、1)オートムギ(IowaX469)の抵抗性発現を始動する特異的エリシター・Victorinによる処理葉のλ-ZAP cDNA Libraryを作成し、cDNALibraryからクローンのシーケンスを行い、トウモロコシやイネのHeat shock protein70、ジャガイモのwound-induced gene-win1,イネのchilling-inducible gene、またコムギのzincfinger protein 1などストレス応答反応に関与する遺伝子のホモログの高いクローンを得た。2)本病の品種特異的抵抗性の発現に伴って誘導されるキチナーゼを純化、単離し、そのN末端のアミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列と植物キチナーゼの保存アミノ酸配列に基づいたプライマーを合成し、PCRにより既存のキチナーゼ遺伝子とハイブリダイズする増幅断片を得た。これらの増幅断片を順次クローニングして塩基配列の決定したところ、キチナーゼ遺伝子をクローニングした。3)オートムギを冠さび病感染、エリシターであるVictorinおよびキチンおよびキトサンオリゴマー(6量体)で処理すると、活性酸素を含む電子供与体と反応して不溶性のブルーフォルマザンを形成するニトロブルーテトラゾリウムに陽性で、電子供与体のスカベンジャーであるTironで処理すると活性酸素の放出は抑制されファイトアレキシン生産も抑制された。また、4)エリシター処理細胞の死にはアポトーシス現象のDNAラダー化が誘導されることが判明し、アポトーシスの誘導は特異的エリシター・Victorinの感受性品種に特異的であり、キチンおよびキトサンの各オリゴマーによる抵抗性反応、また非親和性および親和性菌の接種にパラレルに応答することを確認した。エンバク冠さび病におけるアポトーシスの制御遺伝子が本病の抵抗性発現を制御する可能性が示唆された。エンバク(Pe-2遺伝子保有)を特異的エリシターで処理するとファイトアレキシン,アベナルミンが産出されるが,活性酸素のスカベンジャーで処理するとアベナルミン合成が抑制された。また,非親和性菌感染葉におけるアベナルミン生産も同じスカベンジャーてその合成が阻害され,対抗性発現に伴うアベナルミン生産には活性酸素の放出が内的エリシターとして作用することが示唆された。また,活性酸素の過酸化水素への変換を触媒するSOD(スーパーオキサイドディスムターゼ)のゲル上での検出法について検討し,SODを明確にゲル上で検出できるようになった。これを用いて,各エリシター,感染葉における活性酸素の生産について検討する予定である。また,エンバクのPR蛋白質であるキチナーゼのクローニングも行っており,他のイネ科植物のキチナーゼとホモロジーの高いものが〓〓精製中である。また,同キチナーゼをエンバク冠さび菌に処理して遊離したキチンオリゴマー画分(45,6量体)は品種特異的なエリシター活性を示すことが判明した。今後これらエリシターの化学構造を明らかにする予定である。

その結果、1)オートムギ(IowaX469)の抵抗性発現を始動する特異的エリシター・Victorinによる処理葉のλ-ZAP cDNA Libraryを作成し、cDNA Libraryからクローンのシーケンスを行い、トウモロコシやイネのHeat Shock protein70、ジャガイモのwound-induced gene-win1,イネのchilling-inducible gene、またコムギのzincfinger protein 1などストレス応答反応に関与する遺伝子のホモログの高いクローンを得た。2)本病の品種特異的抵抗性の発現に伴って誘導されるキチナーゼを純化、単離し、そのN末端のアミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列と植物キチナーゼの保存アミノ酸配列に基づいたプライマーを合成し、PCRにより既存のキチナーゼ遺伝子とハイブリダイズする増幅断片を得た。これらの増幅断片を順次クローニングして塩基配列の決定したところ、キチナーゼ遺伝子をクローニングした。3)オートムギを冠さび病感染、エリシターであるVictorinおよびキチンおよびキトサンオリゴマー(6畳体)で処理すると、活性酸素を含む電子供与体と反応して不溶性のブルーフォルマザンを形成するニトロブルーテトラゾリウムに陽性で、電子供与体のスカベンジャーであるTironで処理すると活性酸素の放出は抑制されファイトアレキシン生産も抑制された。また、4)エリシター処理細胞の死にはアポトーシス現象のDNAラダー化が誘導されることが判明し、アポトーシスの誘導は特異的エリシター・Victorinの感受性品種に特異的であり、キチンおよびキトサンの各オリゴマーによる抵抗性反応、また非親和性および親和性菌の接種にパラレルに応答することを確認した。エンバク冠さび病におけるアポトーシスの制御遺伝子が本病の抵抗性発現を制御する可能性が示唆された。
腸上皮細胞の寿命を制御する分子基盤の解明

個々の組織を形成する細胞はそれぞれ固有の寿命をもつことが知られているが、細胞ごとに異なる寿命制御の機構についてはほとんど明らかにされていない。そこで研究代表者は、身体の中でも比較的短命な腸上皮細胞をモデルとして用い、細胞外・細胞内の両面から腸上皮細胞の寿命制御機構の分子基盤について明らかにすることを目的とした研究を進めた。本年度、研究代表者は腸上皮細胞の寿命制御を行う細胞外因子の探索を進め、そのような因子の一つとしてリゾホスファチジン酸(LPA)を見出した。具体的には、LPAがマウス小腸から単離培養した腸オルガノイドの成長を促進させることや、腸上皮細胞の増殖、分化を促進することを見出した。一方、研究代表者は昨年度までに腸上皮細胞の寿命制御を行う細胞内因子としてmTORC1に注目してきており、腸上皮細胞でのTsc2欠損によって誘導されるmTORC1の活性化がマウス小腸上皮細胞の短命化及び分化の異常を誘導する可能性を見出していた。そこで本年度は、mTORC1がマウス大腸上皮細胞の寿命も制御するか否かについて解析を進めた。具体的には腸上皮細胞特異的Tsc2ノックアウトマウスの大腸を対象とした解析を進め、mTORC1が大腸上皮細胞の寿命を制御することを見出した。また、大腸上皮細胞のmTORC1活性は小腸上皮細胞とは異なる細胞内シグナル伝達経路をコントロールしており、それが大腸上皮細胞の寿命を制御する可能性も見出した。さらに、mTORC1による大腸上皮細胞の寿命制御が腸炎のなりやすさを左右する可能性も見出した。そこで研究代表者は、腸上皮細胞をモデルとして用い、細胞外・細胞内の両面から腸上皮細胞の寿命制御機構の分子基盤について明らかにすることを目的とした研究を進めている。研究代表者は本研究の開始前までに、腸内細菌の産生する短鎖脂肪酸が腸上皮細胞の寿命を短命化している可能性を見出していた。そこで本年度は、腸オルガノイド培養系を用いることにより、短鎖脂肪酸が腸上皮細胞のどのような細胞内シグナルに影響を与えるかについて評価を行った。その結果、腸上皮細胞において短鎖脂肪酸はMAPK(mitogen-activated protein kinase)の活性化を誘導することを明らかにした。一方で、短鎖脂肪酸以外の腸内容物も腸上皮細胞の寿命を制御している可能性がある。そこで本年度はそのような物質の同定を試みた。現在、腸内容物をゲル濾過クロマトグラフィーによって分画し、どの画分に腸上皮細胞の寿命を制御する因子が含まれているかについて絞り込みを進めている。さらに研究代表者は、これまでに腸上皮細胞特異的Tsc2ノックアウトマウスの解析により腸上皮細胞でのTsc2欠損によって誘導されるmTORC1の活性化が腸上皮細胞の短命化を促進する可能性も見出していた。そこで本年度は腸上皮細胞特異的Tsc2ノックアウトマウスについてさらに詳細な解析を進めた。その結果、Tsc2の欠損した腸上皮細胞はターンオーバーが促進することによって短命化すると同時に、分化の異常も生じていることを明らかにした。申請時に予定していた研究内容を順調に進めることが出来、得られた研究成果を論文及び学会で公表することが出来たため。また、更なる研究成果の公表に向けた端緒となる実験結果を現時点で得ているため。本年度、研究代表者は腸上皮細胞の寿命制御を行う細胞外因子を同定すべく、各種クロマトグラフィーの組み合わせによってマウス腸内容物を分画し、腸上皮細胞の寿命を制御する因子が濃縮された画分を得た。現在、この画分について質量分析を行うことで腸上皮細胞の寿命制御を行う細胞外因子の同定を試みている。一方、研究代表者は昨年度までに腸上皮細胞の寿命制御を行う細胞内因子としてmTORC1に注目してきており、これまでに腸上皮細胞特異的Tsc2ノックアウトマウスの解析により、腸上皮細胞でのTsc2欠損によって誘導されるmTORC1の活性化が小腸上皮細胞の短命化及び分化の異常を誘導する可能性を見出していた。そこで本年度は、腸上皮細胞特異的Tsc2ノックアウトマウスから単離培養した腸オルガノイドの解析を行った。その結果、野生型マウス由来の腸オルガノイドに比べ、腸上皮細胞特異的Tsc2ノックアウトマウス由来の腸オルガノイドは成長が著しく早いことが明らかとなった。また、この成長促進はmTORC1活性に対する阻害剤ラパマイシンにより、顕著に抑制されることも明らかにした。さらに、本研究の開始時まで常在細菌が腸上皮細胞の寿命を制御していることを見出しており、本年度は常在細菌と腸上皮細胞のmTORC1活性の関係性についても解析を進めたが、その過程でマウスの常在細菌が成体マウス脳での神経新生も制御していることを見出した。申請時に予定していた研究内容を順調に進めることが出来、更なる研究の進展が期待できる研究成果を得ているため。