hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨髄由来肝臓修復細胞を用いた次世代型細胞遺伝子治療法の開発のた めの基盤研究

我々はこれまで骨髄細胞投与により肝線維化が改善し、骨髄細胞には肝臓を修復する機能があり、治療応用の可能性を示してきた。今回、骨髄由来Liver Repair cellの特徴を示し、ヒトでは骨髄由来間葉系細胞の有用性、マウスではマクロファージ系細胞の有用性が明らかになった。またTNF type1 receptor KOマウスやMaid KOマウスの解析により骨髄由来細胞を用いた肝修復再生過程においてTNFおよびMaidシグナルの重要性を明らかにした。Lonza社より購入したヒト骨髄単核球細胞(2M-125A)の効率的な培養方法を検討した。ウシ血清含有培地による通常培養と、無血清培地培養法を比較検討した。その結果、マウス培養結果とは異なり、少なくともヒト骨髄由来細胞の培養初期(培養皿への細胞接着)には血清が必要であることが明らかとなった。ウシ血清含有培地で3継代培養したヒト骨髄由来細胞は、FACS解析で「CD73/CD90/CD105陽性かつCD45/CD11b陰性細胞(間葉系マーカー陽性かつ血球性マーカー陰性細胞)」であることを確認した。四塩化炭素腹腔内反復投与により作成したマウス免疫不全肝硬変モデル(SCID-CCl4モデル)に、Lonzaヒト骨髄単核球細胞をウシ血清含有培地で培養した「ヒト骨髄由来細胞(CD73/CD90/CD105陽性かつCD45/CD11b陰性細胞)」を4.5x105個/匹で尾静脈投与し、その後の肝線維化の改善をシリウスレッド染色により評価した。その結果、細胞投与4週後において肝線維化は有意に抑制され、血清アルブミン値も投与後4週において有意に上昇し、肝線維溶解部に一致してMMP-9陽性細胞と間葉系マーカーであるVimentin陽性細胞の増加を確認した。以上より、ヒト骨髄由来間葉系細胞が「ヒト骨髄LR細胞」であることが強く示唆された。TNF-R1 KOマウス、Maid KOマウスをレシピエントマウスにした場合の骨髄細胞定着率、肝機能・線維化改善の検討TNF-R1 KOマウスをレシピエントにした場合で評価した。CCl4を従来の方法と同じように4週間TNF-R1 KO、Maid KOマウスに投与し、これらにGFP陽性骨髄細胞を投与する。その後1,2,3,4週目に肝臓組織を摘出し、GFP抗体による免疫染色・蛍光二重染色で骨髄細胞の定着率を評価した。Azan染色、Sirius-red染色で肝線維化の改善が確認できた。野生型マウスに四塩化炭素を腹腔内へ反復投与し肝硬変モデルの肝臓にHTVi法を用いてMaidを強制発現させるためのベクターを作成した。今後従来法(GFP陽性骨髄細胞投与)による肝機能・線維化改善効果とも比較する。昨年度に引き続き、四塩化炭素腹腔内反復投与により作成したマウス免疫不全肝硬変モデル(SCID-CCl4モデル)に、Lonzaヒト骨髄単核球細胞をウシ血清含有培地で培養した「ヒト骨髄由来細胞(CD73/CD90/CD105陽性かつCD45/CD11b陰性細胞)」を4.5x105個/匹で尾静脈投与し、その後の肝線維化の改善をシリウスレッド染色により評価した。その結果、細胞投与4週後において肝線維化は有意に抑制され、血清アルブミン値も投与後4週において有意に上昇し、肝線維溶解部に一致してMMp-9陽性細胞と間葉系マーカーであるVimentin陽性細胞の増加を確認した。これらのデータは現在論文投稿中である。共培養による線維化改善効果の解析さらに線維化との関係を解析するために、肝星細胞LI90を用いた解析を行った。LI90細胞は不死化していないため、まずtertを発現するレトロウィルスを感染させ不死化細胞を作製を試みた。LI90不死化細胞は不死化しても活性化星細胞の性質を保持していた。不死化H90細胞を用いてhMSCとの共培養を行い、コラーゲン(collal)、サイクリンD1、αSMA、HGFなどの遺伝子発現を検討した。上層に1000から5万個のhMSCを播種し、下層にLI90細胞を播種し2日目および5日自の発現を調べたが、有意な変化は認められなかった。上層と下層に分けた培養ではなく、直接接触させた培養法の検討やhMSC以外の細胞例えばマクロファージなどを用いた共培養の検討が必要であることが今後の検討課題と考えられる。TNF-R1 KOマウス、Maid KOマウスをレシピエントにした場合で評価した。

Azan染色、Sirius-red染色で肝線維化の改善が確認できた。Maid KOマウスにCCl4を4週間投与し、GFP陽性骨髄細胞を静脈投与し、肝臓組織をGFP抗体による免疫染色で評価したところ、肝臓内にGFP陽性骨髄細胞の定着を認め、Azan,Sirius Red染色で肝線維化の改善を確認した。Maid KOマウスから採取した骨髄細胞をWild miceのCCl4による肝線維化モデルに投与し、Azan,Sirius Red染色で肝線維化の評価をしたところ、改善効果を認めなかった。我々のGFP/CCl4モデルにおいて、免疫染色と蛍光二重染色でGFP陽性骨髄細胞はMaidの発現を強く認め、免疫電顕においてもMaid陽性細胞はGFP陽性骨髄細胞と同じ類円形の大型細胞であることより、移植骨髄細胞が肝臓領域に遊走し肝線維化抑制効果を示すためにMaidの発現は重要であることが確認できた。今後さらに詳細な解析を行なっていく。HTVi法を用いるためにMaidを強制発現させるベクターを作成した。今後従来のGFP/CCl4モデルに投与することでの肝機能・肝線維化抑制効果を検討していく。<マウス骨髄由来培養細胞の投与>マウス骨髄細胞をシャーレにて培養した場合、マクロファージ系細胞の増加を確認し、これらの細胞を投与により肝硬変症の改善効果を確認した。マウス系においては骨髄細胞を培養することで、よりマクロファージ系細胞が効率よく増加し肝線維化の改善効果があることが明らかになった。24年度が最終年度であるため、記入しない。Liver Repair cellの同定のため、さらに共培養での解析を継続する。これまではhMSCを用いていたが、マクロファージを用いたり培養方法の検討などを行う。また可能であれば、より人間に近いラットモデルを用いてLiver Repair cellの解析を行ってゆく。Maid KOマウスを使用することで、Wildマウスによる肝線維化モデルに骨髄細胞投与した場合と比較して、どのような違いがあるかの解析を行う。
制癌と疼痛制御を志向した含窒素天然有機化合物の全合成研究

耐え難い苦痛を伴う癌が死因の上位を占める現在の日本においては、有効な制癌剤の開発は勿論のこと、患者の生活の質の向上につながる鎮痛剤の開発が強く望まれる。我々は、高反応性窒素および炭素種を駆使した有機分子の短工程高度官能基化を基盤として、抗腫瘍活性天然物agelastatin A、鎮痛活性先導化合物aphanorphineならびにそれらの誘導体の新規合成法を確立し、制癌と疼痛制御に資する優れた医薬資源の人工的獲得に成功した耐え難い苦痛を伴う癌が死因の上位を占める現在の日本においては、有効な制癌剤の開発は勿論のこと、患者の生活の質の向上につながる鎮痛剤の開発が強く望まれる。我々は、高反応性窒素および炭素種を駆使した有機分子の短工程高度官能基化を基盤として、抗腫瘍活性天然物agelastatin A、鎮痛活性先導化合物aphanorphineならびにそれらの誘導体の新規合成法を確立し、制癌と疼痛制御に資する優れた医薬資源の人工的獲得に成功した耐え難い苦痛を伴う癌が死因の上位を占める現在の日本においては、真に有効な制癌剤の開発は勿論のこと、患者の生活の質の向上につながる副作用の少ない鎮痛剤の開発が強く望まれる。我々は、高反応性窒素ラジカル種および炭素ラジカル種に着目し(J.Synth.Org.Chem.,Jpn.,2007,65,665.など)、その化学的特性を駆使した有機分子の短工程高度官能基化を基盤として、抗腫瘍活性天然物agelastatin A、鎮痛活性先導化合物aphanorphineならびに誘導体の新規合成法を確立し、制癌と疼痛制御に資する優れた医薬資源を開拓することを目的とする研究を行った。その結果、本平成19年度の研究では、独自に見出したラジカル反応を鍵としてaphanorphineの短工程全合成経路を開拓することに成功するとともに、agelastatin Aの高度に官能基化された基本骨格をもつ合成中間体の獲得に成功した。さらに、aphanorphineの合成研究における過程で、第三級アミンをはじめとする含窒素物質を一挙にアミノ酸誘導体に導くことのできる新規ラジカル反応を開発することにも成功した。このような変換反応はこれまでに知られておらず、本研究課題の主目的ぞある含窒素天然物の合成法の開発にも重要な影響を及ぼす興味深いものである(Org.Lett.,2007,9,5115.)。耐え難い苦痛を伴う癌が死因の上位を占める現在の日本においては、真に有効な制癌剤の開発は勿論のこと、患者の生活の質の向上につながる副作用の少ない鎮痛剤の開発が強く望まれている。我々は、高反応性化学種による有機分子の短工程高度官能基化を基盤として、抗腫瘍活性天然物(-)-agelastatin A、鎮痛活性先導化合物aphanorphineならびに誘導体の新規合成法を確立し、制癌と疼痛制御に資する優れた医薬資源を開拓するべく研究を行った。その結果、昨年度のaphanorphineの全合成の成功に引き続き、本平成20年度の研究では、入手容易な炭化水素'シクロペンタジエン'から有望な制癌活性海洋産アルカロイド(-)-agelastatin Aを人工合成する効率的な方法を開発することに成功した。本合成経路の鍵は、炭素と水素のみからなるシクロペンタジエンに対して酸素および窒素原子を化学的に順次導入することにより、反応性の高いアジド中間体を調製し、その加熱によって複雑な骨格を一挙に組み上げることにある。高い反応性をもった分子の性質を利用するこの合成方法によって、有害な金属化合物を多用することなく入手容易な原料から(-)-agelastatin Aならびにその誘導体を簡便に供給し、特異な構造と抗腫瘍活性の関係を詳しく調べることが可能となった。
口腔癌における転移・浸潤関連接着因子群の解析

本研究は、細胞間接着関連遺伝子群の機能解析を行うことで転移に関連した因子を解明し、臨床応用可能な転移予測診断マーカーの開発と分子標的治療による癌転移抑制法を開発することを目的とした。まず、ネットワーク解析の結果から細胞接着因子関連遺伝子群として、KCNJ2-Lin7C-CASK-βcateninネットワークを同定した。βcateninの上流に位置するKCNJ2遺伝子を発現抑制すると、結果的にβcateninの発現が増加した。さらにKCNJ2に作用する薬剤として、心室性頻脈の治療薬として臨床応用されているamiodaroneをデータベース上で同定した。この薬剤によりβcateninの発現が増強されることから、癌細胞間の接着能を高め、癌浸潤抑制に関連していることが示唆された。本研究の目的は、細胞接着因子を発現増強することにより、癌細胞間の接着能を高め、癌細胞の転移や浸潤を抑制することである。本年度は、細胞接着因子群の中でもβcateninに着目して、その発現量を増強させる遺伝子と薬物を検索した。まず、βcateninを制御する遺伝子群を調べるために、パスウエイ解析を行い、βcatenin遺伝子を中心とした遺伝子ネットワークを同定した。本ネットワーク上の主だった遺伝子群の癌細胞中における発現状態をReal-time PCR法により評価し、10種類の口腔癌細胞株において共通にβcateninの発現を抑制している系を明らかにした。その中から、特に発現状態が著しく変化している系として、KCNJ2-Lin7C-CASK-βcateninネットワークに注目した。以前の研究でLin7C遺伝子までの発現制御ネットワークの制御関係は明らかにしてあったので、KCNJ2遺伝子の機能を評価した。すなわち、KCNJ2遺伝子はLin7C遺伝子の発現を抑制する遺伝子であり、KCNJ2遺伝子発現を抑制すると下流にあるβcateninの発現が増強する可能性を検討した。すなわち、siRNAの導入によりKCNJ2遺伝子の発現を抑制して、βcatenin遺伝子の発現が増強することをReal-time PCR法とWestern blotting法によりmRNAレベルとタンパクレベルで確認した。さらに、Wound Healing Test,Invasion assayを行い、転移能および浸潤能の抑制作用を確認した。さらに、KCNJ2-Lin7C-CASK-βcateninネットワークの阻害剤を検索したところ、1種類低分子化合物を同定した。今後、薬物によるβcatenin発現増強作用の評価を行う予定である。B cateninの発現を直接コントロールする薬剤を見出すことが出来なかったので、遺伝子ネットワーク上でβcateninの1つ上流にあるCASK遺伝子に作用する薬剤を検索したが見出すことが出来なかった。次に、さらに上流にあるLin7C遺伝子に注目したが、やはり、作用薬は見つからなかった。そこで、KCNJ2-Lin7C-CASK-βcateninネットワークに注目した。KCNJ2遺伝子はLin7C遺伝子の発現を抑制する遺伝子であり、まず、KCNJ2遺伝子発現を抑制すると下流にあるβcateninの発現が増強することを検証した。また、Wound Healing Test,Invasion assayを行い、転移能および浸潤能の抑制作用を確認した。さらに、KCNJ2遺伝子に作用する薬剤としてamiodaroneをデータベース上で同定した。Amiodaroneは商品名をアンカロンといい、心筋細胞膜のkチャンネルを抑制することにより活動電位持続時間、不応期を延長して拡張型心筋症の心房細動や心室性頻脈の治療薬として、既に臨床応用されている薬物である。50mM,5mM,500mmicroMとAmiodoroneの濃度を変え、SAS-H1細胞株に作用させたところ、Lin7Cとβcateninの発現変化を調べたところ、両遺伝子の亜h津元増加が起きることを見出した。特に、50mMのAmiodaroneでは約1.6倍の発現増強が得られた。今後、さらに他の遺伝子と薬物を検索し、効率のより良い治療薬を同定する予定である。細胞間接着に重要な働きを持つβcateninを制御する遺伝子群を調べるためにパスウェイ解析により、遺伝子ネットワークを同定し、このうちKCNJ2-Lin7C-CASK-βcateninネットワークに注目した。しかし、βcateninおよび遺伝子ネットワーク上でその上流に位置するCASK遺伝子、Lin7C遺伝子に注目して作用薬剤を検索したが発見できなかった。そこで、Lin7Cの発現を抑制する遺伝子であるKCNJ2遺伝子に着目した。

siRNAの導入によりKCNJ2の発現を抑制したところ、βcatenin遺伝子の発現が増強することをRT-PCR法とWestern blotting法によりmRNAおよびタンパクレベルで確認した。さらに、KCNJ2遺伝子に作用する薬剤としてamiodarone, nicorandilをデータベース上で同定した。これらは、既に臨床応用されている薬物である。SAS-H1細胞株に濃度の異なるamiodaroneを作用させたところ、50mMのamiodaroneにてLin7Cとβcateninの約1.6倍の発現増加が見られた。薬剤添加培養下にin vitroにて、Wound Healing Test,Invasion assayを行ったところ、薬剤添加による浸潤能の抑制を認めた。KCNJ2作用薬であるnicorandilについて同様の実験を行い、薬剤添加によるLin7Cとβcateninの発現に差は認めなかった。以上、細胞接着因子関連遺伝子群としてKCNJ2-Lin7C-CASK-βcateninネットワークを同定した。βcateninの上流に位置するKCNJ2遺伝子を発現抑制すると、結果的にβcateninの発現が増加し、amiodaroneによりその発現が増強されることから、癌細胞間の接着能を高め、癌細胞の転移や浸潤抑制に関連していることが示唆された。HTR2C(5HT2C)に作用する薬物として、すでに臨床で他の疾患の治療薬として用いられている薬物が同定できたため、Lin7C-CASK-βcateninネットワークを制御する可能性のある候補遺伝子としてHTR2C(5HT2C)にフォーカスを絞り研究を行っている。24年度が最終年度であるため、記入しない。口腔癌由来細胞において、各薬剤を作用させて、Ln7C遺伝子、CASK遺伝子、β-catenin遺伝子(CTNNB1)の発現状態を誘導能力をreal time PCR法で評価する。同様に最終産物であるβ-cateninタンパク発現状態をWestern blotting法で確認する。以上により、Lin7C-CASK-βcateninネットワークの制御能力を薬剤ごとに評価し、最も効率的に制御できる薬剤を同定し、候補薬剤添加培養下にin vitroでWound Healing Test、Invasion assayを行い、浸潤能に関する抑制作用を評価する。
転写障害による神経細胞死の分子的定義の研究

ポリグルタミン病においては転写障害が重要なpathomechanismであることが知られている。本研究課題では、この事実を背景に転写障害が生じた場合に、どのような変化が神経細胞において生じるかを、形態学、生化学、分子生物学的な手法を用いて、総合的に解析した。先ず、RNAポリメラーゼIIの特異的な阻害剤として知られるアルファアマニチンを初代培養神経細胞の培地に加え生存曲線を検討した。結果としてアルファアマニチンによる転写抑制が神経細胞に極めて緩慢な細胞死を生じさせることが明らかになった。形態学的には、アポトーシス、ネクローシス、あるいはオートファジーの特徴は見られなかった。すなわち、核クロマチンの濃縮、断片化はなくDNA fragmentationもなかった。カスパーゼ阻害薬もこの細胞死には効果がなかった。ネクローシスのようなミトコンドリア膨張や細胞膜の破たんなどの形態変化もなく、変わりに核周囲の細胞質に空胞の形成が認められた。この空胞はマーカー蛋白の検索から小胞体であると推定された。次に、分子生物学的検索としてジーンチップを用いて、この細胞死に特異的な発現変化を示す分子をさがした。結果としてYAPがその候補として見い出された。驚いたことに、YAPには神経細胞に特異的に発現するアイソフォームがあり、これは細胞死を促進するp73の機能を阻害することがわかった。アポトーシスでは一般型のYAPがp73と協調して細胞死を促進するのに対して、本研究で発見した転写抑制性細胞死ではYAPアイソフォームが発現して細胞死を遅らせていることが想像された。ポリグルタミン病をはじめとするいくつかの神経変性疾患では転写障害の関与が強く疑われている。実際、ポリグルタミン蛋白が毒性を発揮するためには核へ移行することが必須である。また、異常ポリグルタミン蛋白は多くの転写因子および転写補助因子と結合することが知られている。さらには、最近異常蛋白(アンドロジェンレセプター)の核移行阻害薬が動物モデルに対して治療効果を持つことが明らかになり、人への臨床治療研究がすすめられている。一方で、転写障害が最終的に神経細胞死を起こしうるのか、また細胞死が起きるとしたら如何なる細胞死の形をとるのかといった問いにたいしては、驚くべきことにこれまで十分なデータが得られていない。そこで、本研究では初代培養神経細胞をRNAポリメラーゼII特異的阻害剤で処理したときに生じる細胞死について形態学的ならびに分子生物学的に解析を行っている。これまでに、特異的阻害剤処理によって半減期が5日以上の緩慢な神経細胞死が起きること、この形態変化はアポトーシス、ネクローシスのいずれの特徴も有しないこと、さらにはgenomic DNAのladder形成はおこらず、caspase活性化もなく、cytochrome c放出もないことを観察した。また、小脳神経細胞に低カリウムでアポトーシスを起こした場合を対照群として、RNAポリメラーゼII特異的阻害によって生じる分子発現変化をマイクロアレイで比較解析し、この新しい細胞死に特異的な分子変化を抽出した。この中には従来細胞死に関連が疑われている分子も含まれており、この分子がどのように機能して、非典型的細胞死に関与するのかを分子細胞生物学的に解析している。
複素解析学の理論とその応用

研究実施計画の役割分担に従って,下記の研究成果がえられた。1.解析学分野の研究(1)研究代表者山本裕陸は極値的長さの連続性についてある一定の成果が得られ,まとめを行っている途中である。(2)研究分担者新関章三は測度空間(OMEGA,F,mu)から導かれる距離空間(F,d)の完備性が測度有限mu(OMEGA)<∞の場合のみならず測度無限の場合にも成立する事を示し,松田と共著で論文として発表した。また実数の連続性に関する7つの命題の同等性について証明を与え,佐々木と共著で論文として投稿中である。2.統計学分野の研究研究分担者野間口謙太郎は分散行列がある特殊な3重対角である時のn次元象限確率の母関数を導き示した。その成果は論文として投稿中である。3.幾何学分野の研究研究分担者逸見豊はAn-空間の射影空間の構成を改良し,外積An空間の研究に応用し,論文としてまとめHiroshima.Math.Jに掲載予定である。
軟骨の破壊と軟骨細胞分化に及ぼすIL-6の作用に関する研究

1.関節軟骨細胞に対するIL-6の作用生後4週齢のニュージーランドウサギの膝関節より分離した関節軟骨細胞を、直径6mmのコラーゲンコートプレートに1.5万個播種し、10%牛胎仔血清を含むαMEM培地にて培養した。培養系のコンフルエント後、0.01ng/mlから1ng/mlのIL-6を24時間添加して細胞増殖とプロテオグリカン(PG)合成に対する影響を検討した。この結果1ng/mlのIL-6は^3HチミジンのDNAへの取り込みを、コントロールの70%に、^<35>S硫酸のグリコサミノグリカンへの取り込みをコントロールの58%に抑制した。コンフルエントより24時間、^<35>S硫酸にてグリコサミノグリカンをプレラベルしPGの分解に対するIL-1βとIL-6の作用について検討した。プレラベル後より8日間、1pg/mlのIL-1βを添加すると培地中へのPGの放出が亢進し、細胞層のPG量はコントロールの52%に低下した。単独で10pg/mlのIL-6を添加してもPG分解に影響しなかったが、IL-1βとの同時添加で、IL-6βのPG分解を促進し、添加8日後のPG量はコントロールの45%に減少した。2.成長板軟骨細胞に対するIL-6の作用ウサギ肋軟骨より成長板軟骨細胞を分離し、上記と同様に培養した。培養成長板軟骨細胞に対するIL-6を検討したところ、0.01ng/mlから10ng/mlのIL-6は成長板軟骨細胞の増殖とPG産生に影響することなく、濃度依存性にALPase活性を促進(1ng/mlのIL-6でコントロールの1.7倍)することが判明した。次に、コンフルエントより28日間、各濃度のIL-6を添加して、^<45>Caの細胞外基質不溶画分への取り込みを測定したところ、10ng/mlのIL-6は^<45>Caの取り込みをコントロールの1.6倍に増加し、細胞外基質のカルシウム含量はコントロールの1.2倍に増加した。
南イランにおける更新世人類の拡散に関する研究

イラン南部地域は、ネアンデルタール型人類の分布の東の境界を探る上において重要な地域であるが、先史学的調査の蓄積は未だ多くない。1976年の京都大学池田次郎教授を代表とする調査隊は、ファルス県アルセンジャン地域において遺跡分布調査を実施し、多数の有望な遣跡を発見している。だがこの調査は、直後のイラン政変のために中断していた。近年、イラン政府は外国調査隊を受け入れる姿勢に変わりつつある。そこで本研究は、先の京大隊調査の継続を目指して調査を進めた。17、18年度を通じ、先の分布調査で発見したいくつかの重要遺跡について現状確認を進め、本格的な発掘調査の可能性を検討した。この30年の間にアルセンジャン地域の市街地は大きく拡大し、大幅な道路整備なども進められていたが、そのために破壊された遺跡はないようである。だが重要な遺跡の直近において水利工事が進行しているケースなどもあり、遺跡の保護対策や緊急調査の必要性が認められた。1976年の分布調査において約6000点の石器および土器資料が採集された。17年度の調査において、この時に採集した資料が、搬入したままの状態でイラン国立博物館の倉庫に保管されていることが確認できた。そこで18年度、アルセンジャン地域における洪積世石器類の概要を把握する目的で、その内の約300点について詳細な観察と実測図の製作を行なった。その成果として、この地域には、少なくとも中期旧石器時代から新石器時代に至る石器が分布していることが確認できた。いくつかの重要遺跡では中期旧石器時代から新石器時代までの連続した堆積層が残されている可能性が確認できた。そしてこれらの成果をペルシャ語の石器カタログ集としてまとめた。このカタログの出版により、アルセンジャン地域の先史学的重要性が世界に広く認知され、また今後の本格的な遺跡調査の実現に繋がると期待される。1977年、京都大学池田次郎教授を代表とする調査隊は、南イラン・ファルス県アルセンジャン地域において旧石器時代の遺跡分布調査を行い、多数の有望な遺跡を発見し、多数の遺物を採集した。しかし直後に起きたイスラム革命によって、それ以後の調査は中断したままになっていた。この調査の再開と継続を目指し、分担者の常木教授は数年前よりイラン考古学局と交渉し、遺跡調査の許可が出る見通しを得ていた。だが昨年5月の大統領選挙によってイランの政治体勢に変化が生じ、そのあおりを受けて調査許可の認可が大幅に遅れた。平成18年2月西田と常木は、イラン考古学局の局長と再度直接交渉を行い、「筑波大学から提出された発掘許可申請を全力で支援するとの確約を得た。認可され次第直ちに調査隊を派遣するため、調査費の繰り越し処置を行い待機した。だが5月、それまで交渉相手であるイラン考古学局長が更迭され、発掘調査許可の取得の見通しは再び不透明な状態となった。平成18年2月のイラン訪問の際、イラン国立博物館を訪問し、1977年の調査で採集した5000点以上の石器資料の保管状況を調査した所、およそ30年前に我々が博物館に委託したそのままの状熊で保管されていることが判明した。この資料は、南イランにおける先史時代状況の概略を示してくれる貴重な資料である。この石器資料の存在を広く学会に紹介するためにも、また本研究を進めるにも、この石器資料について早急に分析を進める必要がある。南イラン、ファルス県では現在、イラン政府の要請に基づく遺跡緊急調査が大規模に実施されている。イラン政府主体のこのプロジェクトには諸外国研究者の参加が認められており、日本からの調査隊も活動している。

本研究が対象としているアルセンジャン地域との比較資料を得る目的で、そこに本研究の研究分担者と研究協力者を派遣した。イラン南部地域は、ネアンデルタール型人類の分布の東の境界を探る上において重要な地域であるが、先史学的調査の蓄積は未だ多くない。1976年の京都大学池田次郎教授を代表とする調査隊は、ファルス県アルセンジャン地域において遺跡分布調査を実施し、多数の有望な遺跡を発見している。だがこの調査は、直後のイラン政変のために中断していた。近年、イラン政府は外国調査隊を受け入れる姿勢に変わりつつある。そこで本研究は、先の京大隊調査の継続を目指して調査を進めた。17、18年度を通じ、先の分布調査で発見したいくつかの重要遺跡について現状確認を進め、本格的な発掘調査の可能性を検討した。この30年の間にアルセンジャン地域の市街地は大きく拡大し、大幅な道路整備なども進められていたが、そのために破壊された遺跡はないようである。だが重要な遺跡の直近において水利工事が進行しているケースなどもあり、遺跡の保護対策や緊急調査の必要性が認められた。1976年の分布調査において約6000点の石器および土器資料が採集された。17年度の調査において、この時に採集した資料が、搬入したままの状態でイラン国立博物館の倉庫に保管されていることが確認できた。そこで18年度、アルセンジャン地域における洪積世石器類の概要を把握する目的で、その内の約300点について詳細な観察と実測図の製作を行なった。その成果として、この地域には、少なくとも中期旧石器時代から新石器時代に至る石器が分布しているごとが確認できた。いくつかの重要遺跡では中期旧石器時代から新石器時代までの連続した堆積層が残されている可能性が確認できた。そしてこれらの成果をペルシャ語の石器カタログ集としてまとめた。このカタログの出版により、アルセンジャン地域の先史学的重要性が世界に広く認知され、また今後の本格的な遺跡調査の実現に繋がると期待される。
自然宿主を用いたシャーガス病の宿主・臓器“非”特異性の解明

本研究は研究開始当初の予定を変更し、シャーガス病の多様な病態の根幹となる「慢性化」の原因として病原原虫Trypanosoma cruziの“休眠"を仮定し、その分子基盤を目指した。T. cruziの休眠現象については、Iraluらが尿素分解酵素ウレアーゼによってシスト様の形態が誘導されたと報告しているのみである(Nature 204:486, 1964)。本研究によって、ウレアーゼに混入していたレクチンの一種コンカナバリンA(ConA)がシスト形成を誘導する本体であること、ConAによって原虫内部に空胞が生じ、細胞実質でオルガネラの分裂と娘細胞の形成が進むことを発見した。本研究は、寄生原虫Trypanosoma cruziの感染によって引き起こされるシャーガス病を、人類との歴史の浅い、未だに未適応の段階にある新興感染症として位置づけ、自然宿主モデルを用いてシャーガス病の病態・症状の多様性および人獣共通感染症としての特徴を理解することを目的とする。本年度は、本症流行地の南米に生息し長い年月にわたってT.cruziと共進化を遂げてきた自然宿主コウモリにおけるT.cruziの感染ダイナミクスについて解析するため、2012年11月に現地に渡り野外調査を実施した。今回の調査では採集されたコウモリは4匹と少なかったが、うち1匹で抗T.cruzi抗体価が陽性となり現在DNAの検出に基づく解析を進めている。野生動物であるコウモリの採集の可否はさまざまな自然条件に左右されるため、また、予備実験として、平成25年度に予定していたルシフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現するT.cruziの作製を実施した。T.cruziでは遺伝的に異なる6系統が存在することが知られているが、予備実験を進めた結果、6系統のうち5系統でルシフェラーゼ発現T.cruziおよびコントロールとして緑色蛍光タンパク(EGFP)発現原虫株を樹立することができた。遺伝的背景がそれぞれ異なる原虫系統およびマウス系統の組み合わせによって特定の臓器特異性や感染動態を示す感染モデルが得られる可能性がある。すなわち、ヒトシャーガス病の実験モデルを世界に先駆けて樹立することが期待できる。今後は研究をさらに進め、得られた複数系統の遺伝子組換え原虫と、異なるマウス系統を組み合わせて大規模な感染実験を行なう。本年度はルシフェラーゼ遺伝子(luc2)を恒常的に発現するT. cruziの作製を進め、遺伝的に異なる6系統の原虫のうち5系統でluc2発現T. cruziおよびコントロールとして緑色蛍光タンパク(EGFP)発現原虫クローン株を樹立することができた。in vitroの発光検出システムでは原虫数が101,000,000の範囲でルシフェラーゼの発光量と定量性を示すことを確認した。また、感染臓器における原虫の定量的検出のためにはリアルタイムPCRを用いた定量的DNA解析が必要となる。そこで、luc2発現T. cruziよりゲノムDNAを抽出し、これを鋳型にした定量PCRを実施した。これまで定量PCRに用いられているプライマーセットは検出感度を向上させるために多コピー/ゲノムとして存在するものが多く用いられているが、この場合原虫株間でコピー数が異なるために感染強度を株間で直接比較することができない。そこで1コピー/ゲノムのDNA配列を標的とした標的としたプライマーセット(P2α)を用いてリアルタイムPCRを行ない、定量性を確認した。また、より高感度の検出が必要な場合を想定し、ゲノム当たり>10,000コピー存在するマイクロサテライト配列を標的とした定量PCRを実施し、各株におけるコピー数を明らかにした。一方、作製した組換え原虫は昆虫型で哺乳類細胞への感染性はないため、メタサイクリック型に転換させた後哺乳類細胞感染系の樹立を進めているが、一部の系統では感染はするものの細胞内増殖型から血流型への転換が起こりにくいことが明らかとなり、現在感染系の改良を行なっている。シャーガス病の多様な病態のなかでも慢性化は最も重要な臨床的特徴であり、数年数十年にわたる無症状期間を経て、感染者のおよそ3040%で心筋症、巨大結腸・巨大食道を発症し、突然死やQOLの重大な低下を引き起こす。しかし、原虫がなぜ持続感染し続けるのかに関しては全く不明である。そこで本年度は、T. cruziの生活環に新たに「休眠体(嚢子)」の存在を仮定し、研究を実施した。これまでにT.cruziにおいて尿素分解酵素ウレアーゼの存在下でepimastigote(昆虫型原虫)から嚢子が誘導されたとの古い報告があり(Nature 204, 1964)、最初にその再現性を確認した。蛍光タンパクDsRedを恒常的に発現するT.cruziを作製し、嚢子形成過程をリアルタイムで観察した。ウレアーゼ処理後1日後には原虫は球状に膨大し、内部に空胞様の構造を認めるようになった。

原虫の核、キネトプラストキネトプラスト、鞭毛は外殻の内壁に沿ってそれぞれ分裂し、数日後にはそれらが集合して個々の娘細胞が空胞内に遊離する様子が観察された。嚢子は室温で2週間以上安定であり、内部の娘細胞の運動性も維持されていた。原虫はウレアーゼのほかにコンカナバリンA存在下でも嚢子を形成することが明らかとなり、嚢子化がグルコースまたはマンノース付加タンパクを介したシグナル伝達によって誘導されることが示唆された。コンカナバリンAを除去すると娘細胞は嚢胞から脱出し分裂を開始することから、嚢子形成は糖鎖依存性のシグナルに依存することが明らかとなった。本研究は研究開始当初の予定を変更し、シャーガス病の多様な病態の根幹となる「慢性化」の原因として病原原虫Trypanosoma cruziの“休眠"を仮定し、その分子基盤を目指した。T. cruziの休眠現象については、Iraluらが尿素分解酵素ウレアーゼによってシスト様の形態が誘導されたと報告しているのみである(Nature 204:486, 1964)。本研究によって、T. cruziの新たな形態が再確認され、これが生活環の中で何らかの生物学的意義を持つ可能性が示された。また、ウレアーゼに混入していたレクチンの一種コンカナバリンA(ConA)がシスト形成を誘導する本体であること、ConAによって原虫内部に空胞が生じ、細胞実質でオルガネラの分裂と娘細胞の形成が進むことを発見した。予備実験では、ConA以外の市販レクチン14種はシスト形成を誘導できないことから、ConAのみが認識するα-D-グルコースを介してシストが誘導されることが強く示唆された。また、ConAが結合する原虫因子としてtubulinおよびシステインプロテアーゼの一種cruzipainが予備的に行なったプロテオーム解析から示唆されている。シスト形成の生物学的意義としては、多くの昆虫寄生性トリパノソーマが生活環の中でシスト段階を持つこと、T. cruziについても昆虫ー昆虫伝播が知られていること、および哺乳類体内での持続感染に貢献している可能性があること、等が想定される。今後の研究としては昆虫および哺乳類宿主体内において本形態を見いだし、その分子機序を明らかにする必要がある。本研究によって、ウレアーゼに混入していたレクチンの一種コンカナバリンA(ConA)がシスト形成を誘導する本体であること、ConAによって原虫内部に空胞が生じ、細胞実質でオルガネラの分裂と娘細胞の形成が進むことを発見した。平成26年度に予定していた、自然宿主コウモリと実験宿主マウスにおける感染動態の比較については、平成25年度以降今日までベネズエラの政情不安が続き渡航できない状況にあるが、予備実験ではコウモリのほぼ全臓器から原虫が検出され、また妊娠コウモリの胎児からも原虫が検出されている。
膵の多段階発癌に対する制御機構に関する研究

研究成果のまとめ膵多段階発癌におけるDNA異常の解析と発癌機構および発癌抑制機構について分子レベルから生体レベルまで総合的に研究を行い以下の成果を得た。ハムスター膵発癌過程においてK-ras遺伝子変異は発癌早期に生じる遺伝子異常であること、p53遺伝子異常は膵癌の進展とともに生じる発癌後期の異常であることが示された。また、膵液により膵発癌性ニトロサミンが特異的に活性化されることより、この発癌系において膵液の関与の重要性が指摘された。膵発癌抑制物質として、DNAアルキル化の抑制剤とされているphenethyl isothiocyanateがBOPによるハムスター膵発癌を抑制することが見いだされた。生物学的に、ハムスター膵管病変は末梢膵管に発生したものの方が中枢膵管に発生したものより増殖能の高いことが示された。イヌにおいても膵発癌実験系がほぼ確立された。ヒト膵癌においては、その発生と進展にK-ras遺伝子やp53遺伝子以外にもp16遺伝子などのDNA異常の関与が示唆され、また膵癌細胞株において未知領域のDNAに異常があることが見いだされ、この領域の遺伝子の検索が進められている。膵管癌以外の組織型の腫瘍のDNA異常についても成果は蓄積されつつある。また、ヒト膵癌の肝転移に関与すると考えられる血管内皮細胞の開裂を促進する新たな糖蛋白の存在が示唆された。膵癌の存在診断において膵液よりのK-ras遺伝子変異の検出は早期診断には有効といえないことが明らかにされた。これら本年度の成果は膵癌克服のための貴重な情報となりうるものである。
胎児新生児における好中球機能に関する研究−好中球減少性細菌感染症を中心として−

今回好中球減少性新生児細菌感染症の病態生理及び治療方法について平成9年度科学研究費を用いて検討を続けており今までに次のような結論を得た。まず、好中球数に最も影響を与える因子であるG-CSFに注目し、細菌感染症における血中G-CSF濃度の測定及び検討をおこなった。その結果、細菌感染症すべての症例で血中G-CSF濃度は上昇しており、特に好中球減少性細菌感染症では非好中球減少性細菌感染症に比し上昇していた。また、近年好中球減少性新生児細菌感染症に対し外因性G-CSFの投与が試みられており、その効果について論じられている。我々は外因性G-CSFを投与した症例の血中G-CSF濃度の推移と好中球数の変化を検討した。外因性G-CSF投与前の血中G-CSF濃度が10^5pg/ml以上を呈している症例は、外因性G-CSF投与後も血中G-CSF濃度は上昇せず、好中球数の上昇も認められなかった。これらのことより、未熟児新生児好中球減少性細菌感染症における血中G-CSF濃度の上昇には1989年にWatariらが報告したようなフィードバック機構が関与している可能性が示唆された。そこで、未熟児新生児期は成人に比しG-CSFレセプターの数が少ないか或いはリカンドに対する親和性が低いのではないかと考え、核医学を用いたG-CSFレセプターの測定を開始している。現在、統計学的有意差を認めるまでの検査結果を得ることができていないが、在胎週数が若いほどG-CSFレセプターの発現は少ない傾向を認めた。今後、どのような症例に特にG-CSFレセプターの発現が少ないのか更に研究を続けていく。
日英バイリンガルの言語習得と喪失メカニズム探索fNIRS研究

日英バイリンガルの英語習得と喪失メカニズム解明を、言語側面と脳賦活の両面から行う研究である。英語習得データは英語圏在住で現地校に通いながら土曜日本語補習校にも通学する日本人児童・生徒から、英語の保持・喪失データは国内の英語保持教室に通う小中高帰国生から収集する。研究当初2年間で横断データ、それ以降は縦断データを収集し、言語習得・喪失メカニズムの一般化モデルを模索する。英語の口頭・書記データに加えて脳賦活データも収集する。表象言語とアルファベット言語の組み合わせである日英バイリンガル対象に、英語習得と喪失メカニズムを言語面・脳コネクトーム面から探る。
抽出操作における分子集合素子という新しい概念の創出

我々は、これまで金属イオンをはじめアミノ酸や核酸さらにはタンパク質などの抽出分離に関する研究を展開してきた。その結果,単一の分子では抽出能力がない分子(主に界面活性分子)を,特定の配列で組織化させることによって,新たな抽出能力が発現することを見いだした。本研究では,これまで抽出という単位操作において使用されてきた単一の抽出試薬とは異なり,認識ターゲットに対して高い抽出能および選択性を有するような分子集合試薬(複数の分子が集合してはじめて抽出能力を発揮するような分離素子)を開発した。その有用性をDNAの選択的抽出をモデルとして検証した。本研究は,これまで抽出という単位操作において使用されてきた単一の抽出試薬とは異なり,認識ターゲットに対して高い抽出能および選択性を有するような分子集合試薬(複数の分子が集合してはじめて抽出能力を発揮するような分子集合素子)を開発するものである。本年度は,タンパク質及びDNAを抽出するという目的に合致する分子集合系の構築を試みた。分子体を特にDNAの認識素子として利用するために、分子設計に基づき新たな界面活性剤(核酸誘導体)を合成した。特にDNAの表面電荷と相互作用を行うイオン性部位の構造と有機溶媒への溶解性を高めるための疎水基の分子構造の選択が、DNAの抽出分離機能を向上させるための重要なポイントとなった。界面活性剤の親水部に1本鎖型のDNA配列を導入すると,それに対応する相補的なDNAのみを選択的に抽出できることが明らかとなった(Chem.Comm.の表紙として採用)。さらに,イオン液体中にクラウンエーテルを溶解させることによって,アミノ基を有するタンパク質チトクロムcが,選択的に抽出できることを示した。この場合,およそ20個のクラウンエーテルが協同的に作用し,タンパク質の水相からイオン液体相への移動を可能にしたものと推察される。タンパク質表面のアミノ酸を改変することによって,抽出のドライビングフォースが,クラウンエーテルとアミノ基の親和力に基づくものであることを明らかにした。我々は、単一の分子では、水中のタンパク質はまったく抽出できないが、有機相中に逆ミセルという分子集合体を形成させるとタンパク質の抽出が可能となることを明らかにした。そのドライビングフォースは、主に、タンパク質の表面電荷と界面活性剤親水部の電荷による相互作用であることを明らかにした。特に、タンパク質抽出のために合成したオレイルジリン酸(DOLPA)は、様々なタンパク質に対して、高い抽出能力を示した。また、有機溶媒に変わる新たな溶媒として、疎水性の高いイオン液体に注目し、その中で安定な逆ミセル(マイクロエマルション)を形成させることに成功した。イオン液体中に形成させた逆ミセルは、有機溶媒よりもさらに安定に酵素やタンパク質を内部に保持できることを、リパーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼを用いて明らかにした。さらに近年、RNAやアプタマーが創薬のターゲットとして注目されている。薬として特定配列のDNAやRNAを用いる場合、これらを大量に合成する必要があり、また合成されたものを大量精製する技術が必要になる。そこで、我々はそれら生体分子の分離場としてタンパク質抽出等に用いられる逆ミセルの利用を考えた。逆ミセル抽出は容易にスケールアップが可能で大量精製に適している。この抽出系において配列選択的なDNA・RNA抽出が可能ならば、RNA創薬・アプタマー創薬における精製技術として利用できると考えた。本研究ではDNA鎖にオレイル基を結合させたDNA界面活性剤を抽出剤として合成し、DNAの相補鎖認識能を抽出の駆動力とすることで配列選択的なDNA抽出を達成した。
琉球列島産遺存固有植物の系統地理学的解析

固有種を中心に琉球列島産のガガイモ科植物の染色体数の算定を行った.中琉球固有のヒメイヨカズラ(ガガイモ科)の外部形態と分子系統樹を解析し,この種はこれまで考えられていたイケマ属ではなく,オオカモメヅル属に属し,遺存固有種的な性質を多く持つ種であることを示した.琉球列島内で著しい種内倍数性を示す琉球列島固有種のミヤコジシバリ(キク科)は,雑種起源であること,その起源は複数回あることを分子系統学的な手法で証明し,ミヤコジシバリの著しい種内倍数性は琉球列島の地史と深い関わりがあり,遺存固有種的な性質を示すことを細胞地理学的に示した.アカネ科のサツマイナモリ属とボチョウジ属の染色体数を算定し,琉球列島固有のアマミイナモリは近縁なサツマイナモリの倍数体起源であることを明らかにした.分子系統学的な解析により,アマミイナモリは日本および台湾産のサツマイナモリよりも系統的に古い時代に分化した遺存固有種であることが判った.琉球列島産のヒサカキ属の分子系統学的な解析の結果,中琉球固有のクニガミヒサカキは,日本産ヒサカキ属では最も遺存的な種であり,クニガミヒサカキと同種とする見解がある南琉球固有のヤエヤマヒサカキは,クニガミヒサカキとは明瞭に異なる独立種であること,中琉球固有のマメヒサカキは,ハマヒサカキから派生した新固有の分類群であることが判った.日本では沖縄島北部にのみ産するイワヒバ科ツルカタヒバと,その異名とされることもある沖縄島固有のコクラマゴケ,沖縄島から近年日本新産として報告されたミタニクラマゴケの形態を観察した.その結果,ミタニクラマゴケはコクラマゴケにすぎないこと,ツルカタヒバとコクラマゴケは連続的に変異し,現段階では区別できないことが判った.固有種を中心に琉球列島産のガガイモ科植物の染色体数の算定を行った.中琉球固有のヒメイヨカズラ(ガガイモ科)の外部形態と分子系統樹を解析し,この種はこれまで考えられていたイケマ属ではなく,オオカモメヅル属に属し,遺存固有種的な性質を多く持つ種であることを示した.琉球列島内で著しい種内倍数性を示す琉球列島固有種のミヤコジシバリ(キク科)は,雑種起源であること,その起源は複数回あることを分子系統学的な手法で証明し,ミヤコジシバリの著しい種内倍数性は琉球列島の地史と深い関わりがあり,遺存固有種的な性質を示すことを細胞地理学的に示した.アカネ科のサツマイナモリ属とボチョウジ属の染色体数を算定し,琉球列島固有のアマミイナモリは近縁なサツマイナモリの倍数体起源であることを明らかにした.分子系統学的な解析により,アマミイナモリは日本および台湾産のサツマイナモリよりも系統的に古い時代に分化した遺存固有種であることが判った.琉球列島産のヒサカキ属の分子系統学的な解析の結果,中琉球固有のクニガミヒサカキは,日本産ヒサカキ属では最も遺存的な種であり,クニガミヒサカキと同種とする見解がある南琉球固有のヤエヤマヒサカキは,クニガミヒサカキとは明瞭に異なる独立種であること,中琉球固有のマメヒサカキは,ハマヒサカキから派生した新固有の分類群であることが判った.日本では沖縄島北部にのみ産するイワヒバ科ツルカタヒバと,その異名とされることもある沖縄島固有のコクラマゴケ,沖縄島から近年日本新産として報告されたミタニクラマゴケの形態を観察した.その結果,ミタニクラマゴケはコクラマゴケにすぎないこと,ツルカタヒバとコクラマゴケは連続的に変異し,現段階では区別できないことが判った.研究の初年度であるため,琉球列島の固有植物を中心に研究材料の検討と収集を中心に行った.今年度は,遺存固有種としで分子系統地理学的な解析を行う予定のヤエヤマスミレ(スミレ科)とコケタンポポ(キク科)の実験材料の収集と外部形態の観察を行った.次年度は分子系統地理学的な研究を進める.その他,今年度に購入したラン科植物のマイクロフィッシュを用いて,次年度にはラン科植物相の分類の再検討を行うとともに,遺存固有種の絞り込みを行う.固有種を中心に琉球列島産のガガイモ科植物の染色体数の算定を行った(雑誌論文4).琉球列島内で著しい種内倍数性を示す琉球列島固有種のミヤコジシバリ(キク科)は,雑種起源であること,その起源は複数回あるごとを分子系統学的な手法で証明した。(雑誌文献5).

ミヤコジシバリの種内倍数性は,琉球列島の地史と深い関わりがある可能性があり,この問題については今後も分子系統地理学的な解析を行う.アカネ科のサツマイナモリ属とボチョウジ属の染色体数を算定し,琉球列島固有のアマミイナモリは近縁なサツマイナモリの倍数体起源であることを明らかにした(雑誌文献6).また,植物相に関する既存の文献資料を整理して,その内容を概観し(雑誌論文3),琉球列島の遺存固有種の起源についてふたつの可能性があることを議論した(図書1).琉球列島中部と南部では数少ない活火山の硫黄鳥島の植物相と植生を初めて報告し,遺存固有種と見なせる種が少数ではあるが自生していることを示すとともに,植物相の起源について考察を加えた(雑誌論文1・2).今年度は研究の2年目となるため,琉球列島の固有植物を中心に研究材料の検討と収集を行うと共に,前年度に収集した材料をもとにヤエヤマスミレ(スミレ科)とコケタンポポ(キク科)の分子系統地理学的な研究を行った.その成果は現在解析中で,次年度に論文として公表する予定である.昨年度に購入したラン科植物のマイクロフィッシュを用いて,ラン科植物相の分類の再検討を行った.遺存固有種としてシュスラン属とオニノヤガラ属の数種を選び,次年度に解析が可能であるか検討を進める.昨年度に,琉球列島固有のミヤコジシバリ(キク科)は雑種起源であること,その起源は複数回あることを分子系統学的な手法で証明した(雑誌文献1)が,今年度はミヤコジシバリの著しい種内倍数性は琉球列島の地史と深い関わりがあり,遺存固有種的な性質を示すことを細胞地理学的に示した(雑誌文献4).前年度に,アカネ科のサツマイナモリ属とボチョウジ属の染色体数の算定をした際に,琉球列島中部固有のアマミイナモリは近縁なサツマイナモリの倍数体起源であることを明らかにした(雑誌文献2)が,今年度の分子系統学的な解析により,アマミイナモリは日本および台湾産のサツマイナモリよりも系統的に古い時代に分化した遺存固有種であることが判った.琉球列島中部に固有のヒメイヨカズラ(ガガイモ科)の外部形態と分子系統樹を解析し,この種はこれまで考えられていたイケマ属ではなく,オオカモメヅル属に属し,遺存固有種的な性質を多く持つ種であることを示した(雑誌文献4).琉球列島では唯一大陸棚上に位置し,遺存固有種と思われる多数の植物種を産する尖閣諸島の魚釣島は,増殖した野生化ヤギの食害により植物相と植生が大きく破壊されており,緊急な保全対策が必要であることを論じた(雑誌文献3).日本では琉球列島中部に限って産し,遺存種的な分布パターンを示すツルカタヒバとミタニクラマゴケ(イワヒバ科)の形態的変異と分布域を調査し,両者は同一種であることを明らかにした(雑誌文献6).琉球列島と小笠原諸島に産する絶滅の恐れのある植物40種(遺存固有種と見なされる種を含む)の形態・分布・学術的価値について論じた(図書1).中琉球の遺存固有と思われる幾つかの分類群について分子系統学的解析をおこなった。スミレ科ヤクシマスミレ類では、沖縄島産ヤクシマスミレと石垣島・西表島産ヤエヤマスミレからなる系統(沖縄・八重山グループ)と、奄美諸島・屋久島産ヤクシマスミレからなる系統(奄美・屋久島グループ)の分化が、吐〓喇海峡や慶良間海峡が成立する以前である約170万年前の更新世前期に起こったことが示唆された。外群の染色体基本数がx=10であるのに対し、分子系統樹上でミヤマスミレ節の基部に位置するヤクシマスミレ類やアマミスミレの染色体基本数はx=11、派生的なクレードに位置するミヤマスミレ節の他の分類群ではx=12であることから、祖先的な染色体数x=11を持つグループが琉球列島に遺存的に存在し、この中からx=12を持つ分類群が派生してきたものと推定される。アカネ科サツマイナモリの変種であり中琉球固有のアマミイナモリでは、アマミイナモリが基本変種サツマイナモリとは独立のクラスターを形成することが明かとなった。アマミイナモリは中琉球において生じた倍数化によって形成された新固有ではなく、サツマイナモリとは独立に琉球列島に侵入して取り残された、遺存的な分類群である可能性が示された。また、ツバキ科ハマヒサカキの変種で中琉球に固有のマメヒサカキは山地雲霧林のみに生育し、形態的にも基本変種と大きく異なることから、系統的に独立した群である可能性も考えられたが、分子系統学的解析の結果からは、マメヒサカキがハマヒサカキの中から単系統的に派生した群である可能性が示唆された。日本では沖縄島北部にのみ産するイワヒバ科ツルカタヒバと、その異名とされることもある沖縄島固有のコクラマゴケ、沖縄島から近年日本新産として報告されたミタニクラマゴケの形態を観察した。