hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルツハイマー型認知症の発症や神経細胞傷害に及ぼす蛋白質シトルリン化の病理解析

翻訳後修飾の一つであるタンパク質シトルリン化は、生理的及び疾患病理的側面を有する事象である。アルツハイマー型認知症(AD)患者の脳では、シトルリン化タンパク質が検出される。本研究では、シトルリン化タンパク質の神経細胞への影響やAD脳におけるシトルリン化タンパク質の局在性、AD患者のシトルリン化タンパク質に対する自己抗体産生の有無などを検討し、タンパク質シトルリン化とADとの関連について解析することを目的とした。シトルリン化酵素であるPAD2を用いて、シトルリン化タンパク質を作製した。また、合成シトルリン化タンパク質をマウスに免疫し、シトルリン化タンパク質特異的に反応するモノクローナル抗体を得た。シトルリン化タンパク質と抗体を用いて、シトルリン化タンパク質に対する自己抗体検出用のELISAシステムの構築を試みている。シトルリン化タンパク質が神経細胞に与える影響をラット胎仔由来の初代培養細胞を用いて解析した。その結果、シトルリン化タンパク質により細胞生存率は低下しなかった。タンパク質シトルリン化の生理的役割やADの発症や進行を明らかにする上で有用な知見が得られた。アルツハイマー型認知症(AD)患者の脳でシトルリン化タンパク質が早期に出現し、病状の進行程度に応じてその量が増加することが知られている。また、最近、申請者らはADの特徴的な病理所見である老人斑の主要構成成分であるアミロイドベータタンパク質がシトルリン化することを確認した。本研究では、シトルリン化アミロイドベータを中心にシトルリン化タンパク質の神経細胞への影響やAD脳におけるシトルリン化アミロイドベータの局在性、AD患者のシトルリン化アミロイドベータに対する自己抗体産生の有無などを検討し、タンパク質シトルリン化とADを含む認知症との関連について解析する。平成26年度は、ヒトPAD2遺伝子を発現する大腸菌からPAD2を精製し、PAD2の酵素活性を比色定量法で確認した。各種アミロイドベータの溶液に、精製したPAD2を加えて反応させた。SDS-PAGEおよび抗化学修飾シトルリン抗体を用いたウエスタン法でそれぞれのアミロイドベータのシトルリン化を確認した。現在、合成シトルリン化アミロイドベータをマウスに免疫している。また、アミロイドベータのシトルリン化が神経細胞に与える影響を、初代培養細胞を用いて検討している。シトルリン化アミロイドベータに対する抗体が平成26年度中に出来なかったため、当初の予定よりやや遅れている。研究はおおむね順調に進展している。特に研究計画の変更や解決すべき課題等はない。シトルリン化アミロイドベータに対する抗体の作製が平成26年度中に終わらなかったため。引き続き抗体作製および前年度からの研究を継続するための費用とする。
乾燥・半乾燥地域における陸面モデル・生態モデルに関するモデル間比較実験

アジアの乾燥地における気候モデルの精度向上を目指して,アジア乾燥地での観測データをフォーシングに用いた,陸面モデル・生態モデルのオフライン相互比較実験を行った.モンゴルと内モンゴルの乾燥草原の2地点を対象地点として選択し,気象観測データと,土壌や植生などの物性値を収集してデータセットを作成し,データベースとした.この地域における陸面・生態モデルの駆動データとしては,最初のものである.このデータセットを用いて,11のモデルを駆動し,得られた出力を今後の解析のためにアーカイブした.モデル出力を相互比較した結果,陸面モデル・生態モデルのアジア乾燥域における再現能力を評価することができた.本研究は,国際プロジェクトAsian Dryland Model Intercomparison Project(ADMIP)の日本側研究者による研究活動であり,ADMIPと強い連携のもとに推進された.アジアの乾燥地における気候モデルの精度向上を目指して,アジア乾燥地での観測データをフォーシングに用いた,陸面モデル・生態モデルのオフライン相互比較実験を行った.モンゴルと内モンゴルの乾燥草原の2地点を対象地点として選択し,気象観測データと,土壌や植生などの物性値を収集してデータセットを作成し,データベースとした.この地域における陸面・生態モデルの駆動データとしては,最初のものである.このデータセットを用いて,11のモデルを駆動し,得られた出力を今後の解析のためにアーカイブした.モデル出力を相互比較した結果,陸面モデル・生態モデルのアジア乾燥域における再現能力を評価することができた.本研究は,国際プロジェクトAsian Dryland Model Intercomparison Project(ADMIP)の日本側研究者による研究活動であり,ADMIPと強い連携のもとに推進された.乾燥・半乾燥地域における陸面モデル・生態モデルに関するモデル間比較実験に向けた準備・検討を行った。まず、5月23日に国立オリンピック記念青少年総合センターにおいて、研究打ち合わせを行い、課題の目的の確認、3年間の実施計画について確認するとともに、2件の話題提供を行って、国際プロジェクトとして行うモデル間比較プロジェクトADMIPの推進方針について議論をした。また、7月11-12日の間、中国北京のBeijing Expert Hotelにおいて、中国科学院のグループ、米国、オーストラリア、パキスタン、モンゴルの研究者らと国際プロジェクトADMIPのキックオフミーティングを開催し、2年間の国際プロジェクトの進行計画について、議論を行った。モデル間比較実験の目的を確認するともに、モデル適用の対象をモンゴル草原、中国の内モンゴル自治区、そして中国蘭州における3つの観測地点を選定した。また、モデル間比較実験に必要なデータを確認し、その収集方針を決定し、データの収集ととりまとめを行うデータWGを設置すること、また収集したデータのアーカイブを北西ウェールズ大学のPALSにおいて行うことを決定した。また、今後のスケジュールを確認した。このキックオフミーティングの後、比較実験へ参加するモデルを募集した結果、全世界より17の代表的な陸面モデル、生態モデルの応募があった。また、上記3つの対象地点のデータの所在を確認し、データのアーカイブ作業を開始した。参加者間のデータ交換に必要なデーターベースシステムを、京都大学工学部内に構築した(http://hywr.kuciv.kyoto-u.ac.jp/admip/)。また、モデル間比較に利用する、強制力データの整備を行った。すなわち、モンゴル国の半乾燥草原のヘルレンバヤン・ウラン(Kherlenbayan Ulaan、2003-2009)と、中国内蒙古自治区のトンギュ(Tongyu、2003-2004)の2地点について、観測データ(気温、風速、日射、水蒸気量など)を収集して整備し、データベース化した。さらに、国内外の研究者からモデル間比較研究への参加者を募り、参加モデルについて、必要な強制力データとパラメータ、主な出力値に関する情報を集約した。さらに、各モデルが、初期的な計算を行った。これらの結果を下に、7月13-15日、中国蘭州において第2回国際会議を開催した。会議においては、上記の成果の確認とともに、今後のモデル間比較の詳細計画を策定した。また、第2回会議の後、その議論の結果を受けて、強制力データおよび必要なパラメーター(アルベド、LAIなど)を再整備した。また、プロジェクトの途中経過の確認のため、12月1-2日に北海道大学において中間ミーティングを行い、作業の進捗の確認を行った。また、生態モデルの初期値作成用に必要な、長期の観測データを再解析データをベースに作成することとなった。以上の過程を経て、各モデルのデフォルト値によるモデル出力である、Stage0.5の計算を行う準備が整った。各モデルを,デフォルト値のパラメータを用いて,共通のフォーシングデータにより駆動する,Stage0.5の比較実験を参加者が実施した.また,その計算結果を,プロジェクトのサーバーにおいて,アーカイブした.この結果,中国の内モンゴルのTongyuサイトで2年間,モンゴルの半乾燥草原のKBUで5年間について,6つの陸面モデルと5つの生態モデルの様々なパラメータの出力がアーカイブされた.また,これらの結果を相互に比較することにより,初期的な解析を行った.この結果をもとに,2012年5月に米国コロラド州ラブランドにおいて第3回国際WSを開催し,モデル相互比較結果についての議論を行った.この比較実験の結果,明らかになったのは,潜熱フラックス(蒸発量)と顕熱フラックスのモデル間での差異を比べると,前者よりも後者の方が格段に大きいことが顕著であった.

これは,潜熱フラックスと顕熱フラックスで,前者のほうが地表面における乾燥に伴う蒸発抑制などの複雑な過程を伴うことから,モデル間格差が大きいという,一般的な常識とは大きく異る.これは,乾燥地においては,降水量の多くは地下水涵養や河川流出に繋がらずに地表面から蒸発する傾向がつよく,蒸発量は降水量によって強く支配されることに関係すると考えられる.その一方で,放射で地表面に与えられた熱が,顕熱フラックス(大気加熱)と赤外放射,地中伝導熱の3つに分配され,土壌の熱特性に強く依存するため,モデル間の格差が大きくなっていることとは対照的であると,考えられることが,WSにおいて議論された.また,年度後半には,地表面に関するパラメータを与えて,モデルを駆動するStage1.0の比較実験が行われ,その計算結果がアーカイブされている.今後は,これらのアーカイブ結果を更に解析し,国際的なコミュニティにフィードバックすることが重要である.東日本大震災とその後の混乱などで、研究の進捗が停滞した。つくばで開催予定の国際会議が節電対策と会場の震災被害のため開催できず、開催場所を変更した。最終年度に際して、進捗状況を改善できると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。モデル計算に用いる基礎データ作成作業が、全体のボトルネックとなっていることが認識されている。アルバイトの雇用などによって考えたい。最終年度となるので、今後の共同研究の継続の方策も議論中である。
最適軌道による航空交通管理に関する研究

国土交通省では「将来の航空交通システムに関する長期ビジョン」として「将来航空交通システムの変革に向けた協調的行動(CARATS)」を掲げている.本研究の目的は,国内定期旅客便の飛行軌跡を最適軌道の観点から分析し,消費燃料および時間を定量的に評価することで運航効率向上の可能性を示すこと,および機体相互の位置関係を分析し安全性を統計的に評価する方法を導き,最適化した飛行の安全性を示すことである.平成27年度は留学先のミュンヘン工科大学において本研究の中核をなす飛行軌道最適化の手法の比較,検討を行った.最適飛行軌道の生成には動的計画法を用いているが,量子化した格子点を結ぶことにより基準軌道として望ましくない振動が発生するなどの課題があった.そこでミュンヘン工科大学フライトシステムダイナミクス研究所の軌道最適化グループとの協力のもと,当該グループが主に使用する勾配法を用いて同一の最適軌道が得られるかを確認し,動的計画法と勾配法の性質を比較した.結果として,動的計画法の場合とよく一致する最適軌道が得られ,本研究で扱った問題では勾配法を用いて大域的最適解が得られることが明らかとなった.実際の問題を解くことで得られた具体的な知見は今後の航空交通管理の研究において実用的な最適軌道を生成する際に役立つものである.また,共同研究者より東京国際空港到着便に対する到着順序制御の方法が提案され,国土交通省航空局発表のCARATS open dataに適用することでその方法の有効性が示された.飛行軌道最適化と到着時刻最適化の組み合わせによりすべての機体が90秒以上の間隔を保持して合流点を通過しつつ燃料消費量の総和を最小化する最適軌道を生成することができた.提案手法および得られた結果は,混雑空港到着便の到着順序および到着時刻の制御を可能にする点で,到着機管理の研究において大いに役立つものである.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。国土交通省では「将来の航空交通システムに関する長期ビジョン」として「CARATS: Collaborative Actions for Renovation of Air Traffic Systems (将来航空交通システムの変革に向けた協調的行動)」という取り組みが実施されている.本研究の目的は,国内定期旅客便の飛行軌跡を最適軌道の観点から分析し,消費燃料および時間を定量的に評価することで運航効率向上の可能性を示すこと,および機体相互の位置関係を分析し安全性を統計的に評価する方法を導き,最適化した飛行の安全性を示すことである.平成26年度は共同研究先の電子航法研究所より平成24年度に提供を受けた1日分の地上監視レーダデータを用いて,羽田空港に着陸する定期旅客便に対し軌道最適化分析を行った.具体的には,地上監視レーダにて記録された定期旅客便の航跡データに欧州航空航法安全機構により開発された機体性能モデルおよび気象庁発表の客観解析気象データを適用することで飛行状態を推定し,同時に動的計画法による軌道最適化を行い両者を比較することによって運航効率を定量化した.1日の到着便数の約40%である256便に対し3つの通過FIXおよび3機種に分けて解析を行なったところ,平均して燃料消費量では約360[kg],飛行時間では約200[秒]の節約が可能であるという結果が得られた.本研究において提案した,飛行状態の推定方法および動的計画法による飛行軌道最適化からなる運航効率の客観分析手法は九州大学において独自に開発されたものである.航空交通の状況による運航効率の低下を定量的に評価することができるため今後のCARATSの研究開発において役立つものである.国土交通省では「将来の航空交通システムに関する長期ビジョン」として「将来航空交通システムの変革に向けた協調的行動(CARATS)」を掲げている.本研究の目的は,国内定期旅客便の飛行軌跡を最適軌道の観点から分析し,消費燃料および時間を定量的に評価することで運航効率向上の可能性を示すこと,および機体相互の位置関係を分析し安全性を統計的に評価する方法を導き,最適化した飛行の安全性を示すことである.平成27年度は留学先のミュンヘン工科大学において本研究の中核をなす飛行軌道最適化の手法の比較,検討を行った.最適飛行軌道の生成には動的計画法を用いているが,量子化した格子点を結ぶことにより基準軌道として望ましくない振動が発生するなどの課題があった.そこでミュンヘン工科大学フライトシステムダイナミクス研究所の軌道最適化グループとの協力のもと,当該グループが主に使用する勾配法を用いて同一の最適軌道が得られるかを確認し,動的計画法と勾配法の性質を比較した.結果として,動的計画法の場合とよく一致する最適軌道が得られ,本研究で扱った問題では勾配法を用いて大域的最適解が得られることが明らかとなった.実際の問題を解くことで得られた具体的な知見は今後の航空交通管理の研究において実用的な最適軌道を生成する際に役立つものである.また,共同研究者より東京国際空港到着便に対する到着順序制御の方法が提案され,国土交通省航空局発表のCARATS open dataに適用することでその方法の有効性が示された.飛行軌道最適化と到着時刻最適化の組み合わせによりすべての機体が90秒以上の間隔を保持して合流点を通過しつつ燃料消費量の総和を最小化する最適軌道を生成することができた.提案手法および得られた結果は,混雑空港到着便の到着順序および到着時刻の制御を可能にする点で,到着機管理の研究において大いに役立つものである.動的計画法による航空機の軌道最適化ツールを用いて東京国際空港に到着する航空機の1日分について解析し,混雑時に運航効率が低下していることを定量的に示し,国内および国外の学会で発表することができた.

これらは独自の手法により初めて得られた結果であり,ドイツ航空宇宙センターおよび欧州航空航法安全機構の研究者より高い評価を受けた.最適軌道を実際の運航に利用しやすい軌道にするために機体の経路角まで考慮することを提案し,動的計画法を改良した結果を米国で開催された学会にて発表した.現在,国内研究の促進につながる重要な考え方やアイディアを学ぶという目的のもとドイツのミュンヘン工科大学に留学中であり,最適制御を研究するグループの一員となってドイツの研究者が使用する他の手法と主題の動的計画法を比較する研究を遂行中である.27年度が最終年度であるため、記入しない。日本全域を覆う地上監視レーダデータを用いた全機の軌道最適化分析および相互干渉分析については,平成26年8月に国土交通省航空局より数日分のレーダデータの提供を受け,現在研究室の学生が協力して解析を進めている.全機の相互干渉分析については引き続き共同研究者が担当する予定である.複数機に対して干渉を考慮した最適化を行う場合,多くの状態量を扱う必要があり動的計画法による求解はきわめて困難であるため,複数機の同時最適化については,現在習得中であるGradient Based method(勾配法)により解決を図る.27年度が最終年度であるため、記入しない。
アンチセンス医薬品の体内動態・細胞内トラフィッキング同時制御システムの開発

近年、mRNAに相補的な配列を持つアンチセンスDNAを細胞に送り込むアプローチが、種々の難治性疾患に対する遺伝子レベルでの新しい薬物治療法として注目を集めている。現在までにin vitroにおいては優れた効果が報告されているが、in vivoでの成功例は極めて少ない。生体に投与されたアンチセンスDNAが治療効果を発現するためには、標的細胞内の細胞質あるいは核内に存在する標的分子に効率よく作用することが必要不可欠であり、これを達成することのできる方法論の確立が重要と考えられる。そこで本研究では、生体適用後、アンチセンスDNAが作用を発現するまでのプロセスを、(1)標的細胞に取り込まれるまでの体内動態過程、(2)細胞内到達後の細胞内トラフィッキングの2つの過程に分けて考え、各過程における動態のメカニズムを明らかし、これらを統一的に制御できるデリバリーシステムの確立を目指した。モデルアンチセンスDNAとして癌遺伝子c-mycに対するantisense 20-merの天然体およびphosphorothioate体を用い、全身、臓器、細胞および細胞下レベルでの動態を検討した。その結果、生体に投与されたアンチセンスDNAは速やかに分解を受けると共にポリアニオンとして肝臓および腎臓に高濃度に集積することが明らかとなった。また共焦点レーザー顕微鏡を用いた検討により、細胞内動態も明らかにすることができた。アンチセンスDNAのポリアニオンとしての性質を修飾すると共に細胞選択的なデリバリーを達成することのできるキャリアーとして正電荷高分子であるpoly (L-lysine)に直接ガラクトースおよびマンノースを結合させた糖修飾誘導体を合成し、これがアンチセンスDNAの体内動態および細胞内動態を同時に制御できる可能性が示された。現在までにin vitroにおいては優れた効果が報告されているが、in vivoでの成功例は極めて少なく、アンチセンスDNAの医薬品としての実用化にはほど遠いのが現状である。In vivoでの治療を実現するためには、様々な問題点を克服する必要があるが、なかでも重要な問題として生体適用後の挙動の問題が挙げられる。そこで本研究では、生体適用後、アンチセンスDNAが作用を発現するまでのプロセスを、(1)標的細胞に取り込まれるまでの体内動態過程、(2)細胞内到達後の細胞内トラフィッキングの2つの過程に分けて考え、各過程における挙動のメカニズムを明らかにする。得られた結果に基づき、これらを統一的に制御できるデリバリーシステムの確立を目指した。モデルアンチセンスDNAとして癌遺伝子c-mycに対するantisense 20-merの^<32>P標識体を用い、マウス静脈内投与後の体内動態を検討した結果、速やかに分解を受けると共に肝臓および腎臓に高濃度に集積することが明らかとなった。生理学的ファーマコキネティクスの手法を用いて解析したところ、それぞれの臓器における取り込みクリアランスはかなり大きな値であることが示され、これらの臓器の重要性が明らかとなった。さらに、標的癌細胞であるU937細胞および体内動態を規定すると考えられる細胞としてマクロファージを用いて取り込み実験を行い、時間、温度依存性を明らかにした。また、天然体よりphosphorothioate体の方が顕著に取り込まれることも見い出した。

そこで本研究では、生体適用後、アンチセンスDNAが作用を発現するまでのプロセスを、(1)標的細胞に取り込まれるまでの体内動態過程、(2)細胞内到達後の細胞内トラフィッキングの2つの過程に分けて考え、各過程における挙動のメカニズムを明らかにし、これらを統一的に制御できるデリバリーシステムの確立を目指す。昨年度は、アンチセンスDNAの基本的な全身レベルでの体内動態を検討した結果、速やかに分解を受けると共にポリアニオンとして肝臓および腎臓に高濃度に集積することが明らかにした。そこで本年度は、アンチセンスDNAのポリアニオンとしての性質を修飾すると共に肝臓への細胞選択的なデリバリーを達成することのできるキャリアーとして正電荷高分子であるpoly(L-lysine)に直接ガラクトースおよびマンノースを結合させた糖修飾誘導体を合成した。モデルとして癌遺伝子c-mycに対するantisense 20-merを用い、マウス静脈内投与後の臓器分布特性を検討した結果、アンチセンスDNAをこれらと静電的相互作用により複合体を形成させることにより、糖鎖認識機構に基づき肝実質細胞あるいは肝非実質細胞に選択的に送り込むことが可能であることが明らかとなった。
殺ベクター型原虫による病原体媒介蚊制御法の開発

フィラリアやデング熱ウイルスなどの病原体は蚊などの昆虫によって媒介される。したがってこれらの感染症の制圧には、媒介昆虫を淘汰することが最も重要である。約100年あまりのあいだ、DDT・ピレスロイドなどの殺虫剤が蚊の撲滅のため使用されてきた。しかしながら、現在でも蚊によって媒介される感染症によって年間数十万人もの命が失われている。以上のことから既存の殺虫剤に依存しない全く新規の媒介昆虫コントロール法が必要であることは明白である。そこで本研究では、蚊によって媒介されるマラリア原虫をモデルとして、昆虫毒性ペプチド遺伝子を導入し蚊を殺滅する、全く新たな概念に基づく媒介昆虫制御法の開発を目的とする。
光合成酸化ストレスへの対処機構の進化による細胞内共生成立過程の解明

細胞内共生による葉緑体の成立は、真核細胞による光合成細胞の捕食、一時的保持(盗葉緑体;任意共生)、恒久的保持(絶対共生)の順に進行したと考えられている。共生体光合成は宿主細胞の成長増殖に必要である一方、高濃度の活性酸素種を発生し宿主にダメージを与える。従って細胞内共生成立には、宿主真核細胞による共生体光合成毒性への対処機構の発達が必須であったと推定される。本研究では、共生の各段階にある生物を用い、宿主細胞が共生体光合成による酸化ストレスにどの様に対処しながら増殖するのか、宿主細胞が、共生体への無機塩類供給とそれに伴う光合成活性調節機構をどの様な方法でどの程度行えるようになっているかを明らかにする。これらの結果を統合し、光合成毒性への対処、宿主による光合成活性制御という視点から、自然界における真核細胞の光合成戦略の多様性と、細胞内共生の進化機構を解明することを目的とする。本年度は各対象生物について、藻食アメーバ(我々が湿地より単離したNaegleria sp.)と藻類餌の無菌無機培地共培養系、盗葉緑体性渦鞭毛虫(Nusuttodinium poecilochrom)と藻類餌の無菌無機培地共培養系、ミドリゾウリムシ(Paramecium bursaria)の無菌無機培養系を確立し、前年度に整備したゲノム情報を基盤に、捕食者または宿主の、共生体または被食者の光合成に対するトランスクリプトームの変動を解析した。その結果、光合成に応答して、藻食アメーバにおいては、細胞内の被食者数を減少させる、盗葉緑体性渦鞭毛虫及びミドリゾウリムシにおいては、共生体への窒素源供給が促進する可能性が見いだされた。藻類捕食、盗葉緑体(一時的な共生)、任意共生関係に関して、共生体または被食者の光合成に対応するためのトランスクリプトーム変動情報(宿主及び共生体、被食者を除く)が得られ、計画通りに研究が進んだ。1.これまでの研究により単細胞藻類を捕食するアメーバ群3系統において、餌から生じる光合成酸化ストレスに対処していると考えられる共通の遺伝子が見つかった。2019年度は当該遺伝子産物の機能をin vitro及びin vivoの両面から解析し、当該遺伝子の進化と光合成酸化ストレスへの対処機構の獲得の関係を明らかにする。2.これまでの研究により、盗葉緑体性渦鞭毛虫が、一時的に共生する藻類細胞に無機窒素源を供給するための遺伝子群が見つかった。2019年度は当該遺伝子産物の細胞内局在を明らかにするとともに、宿主である渦鞭毛虫による細胞外からの無機窒素源の吸収と共生体への供給、共生体の維持の関係を解析する。本年度は、藻食アメーバ(我々が湿地より単離したNaegleria sp.)と藻類餌の無菌無機培地共培養系、盗葉緑体性渦鞭毛虫(Nusuttodinium poecilochrom)と藻類餌の無菌無機培地共培養系、ミドリゾウリムシ(Paramecium bursaria)の無菌無機培養系を確立し、至適光強度を決定することが出来た。さらに、今後のRNA-seqによる明暗条件でのトランスクリプトーム比較用のリファレンスとなる、餌・共生体と宿主を区別したmRNAコンテティグ配列を取得することが出来た。これらに加えて、光合成性と従属栄養性の切り替えが可能な真核藻類(Chlamydomonas eustigma)のゲノム配列を決定した。藻類捕食、盗葉緑体(一時的な共生)、任意共生関係に関して、それぞれの無菌無機培養系を滞りなく確立することに成功した。藻類捕食、盗葉緑体に関しては、藻類餌との二員培養のための捕食者と餌の最適比率も決定することが出来た。今後の解析の基盤となる各餌・共生体及び各宿主のmRNAシーケンス及び光合成性・従属栄養性が可変な真核藻類のゲノム情報が得られ、計画通りに研究が進んだ。

これらの結果を統合し、光合成毒性への対処、宿主による光合成活性制御という視点から、自然界における真核細胞の光合成戦略の多様性と、細胞内共生の進化機構を解明することを目的とする。本年度は各対象生物について、藻食アメーバ(我々が湿地より単離したNaegleria sp.)と藻類餌の無菌無機培地共培養系、盗葉緑体性渦鞭毛虫(Nusuttodinium poecilochrom)と藻類餌の無菌無機培地共培養系、ミドリゾウリムシ(Paramecium bursaria)の無菌無機培養系を確立し、前年度に整備したゲノム情報を基盤に、捕食者または宿主の、共生体または被食者の光合成に対するトランスクリプトームの変動を解析した。その結果、光合成に応答して、藻食アメーバにおいては、細胞内の被食者数を減少させる、盗葉緑体性渦鞭毛虫及びミドリゾウリムシにおいては、共生体への窒素源供給が促進する可能性が見いだされた。藻類捕食、盗葉緑体(一時的な共生)、任意共生関係に関して、共生体または被食者の光合成に対応するためのトランスクリプトーム変動情報(宿主及び共生体、被食者を除く)が得られ、計画通りに研究が進んだ。藻類捕食、盗葉緑体(一時的な共生)、任意共生関係に関して、これまでに確立した培養系を用いて、暗所と明所(光合成阻害剤有りと無し)での餌・共生体及び宿主のトランスクリプトームを比較し、宿主の光合成酸化ストレス軽減法及び対処法に関する知見を得る。これと並行して、培地中の無機窒素源の種類と濃度を変化させ、各捕食・共生関係における窒素源のやり取りと光合成の関係を解析する。1.これまでの研究により単細胞藻類を捕食するアメーバ群3系統において、餌から生じる光合成酸化ストレスに対処していると考えられる共通の遺伝子が見つかった。2019年度は当該遺伝子産物の機能をin vitro及びin vivoの両面から解析し、当該遺伝子の進化と光合成酸化ストレスへの対処機構の獲得の関係を明らかにする。2.これまでの研究により、盗葉緑体性渦鞭毛虫が、一時的に共生する藻類細胞に無機窒素源を供給するための遺伝子群が見つかった。2019年度は当該遺伝子産物の細胞内局在を明らかにするとともに、宿主である渦鞭毛虫による細胞外からの無機窒素源の吸収と共生体への供給、共生体の維持の関係を解析する。
粒子コードを用いた大気圧・高周波プラズマの構造解析(シース領域を構成する粒子群の振る舞いとその制御パラメータの診断)

Heガスを用いて発生させた高周波プラズマのバルク部とシース部での発光スペクトルの違いを光スペクトラムアナライザにより測定した。ガス圧力が13気圧の場合、電極表面に薄く発生するシース部からの発光スペクトルには、バルク部の発光スペクトルよりも強度の強い、多種の線スペクトルが見られ、シース領域が非常に活性であることが推測された。中性He原子からの特徴的な発光スペクトルが何本も観測され(388nml,501nm,587nm,706nm)、それらの波長に対応したバンドパスフィルタを用いて、時空間分解発光分光像を観測した。電極は銅を用い、電極間隔は1mmとして、発光励起種の違いによる発光分布を観察した。501.57nm(3^1P→2^1S)および587.56nm(3^3D→2^33P)の発光像には、プラズマバルク部にも発光が現れているが、706.52nm(3^3S→2^3P)では観測されなかった。587.56nmと706.52nmとでは、発光に際して落ちてゆく下準位が同じであるにもかかわらず、発光分布が異なっていた。両者の間には励起エネルギーにほとんど差がないので、それぞれの励起過程、励起断面積の違いが如実に現れたといえる。装置系の分光感度特性を校正し、相対比較した場合、放射寿命の長い準位からの発光である388.86nm(3^3P→2^3S)は、発光強度の時間変化が少なく、放射寿命の短い準位からの発光である587.56nm(3^3D→2^3P)は、高周波電界の変化を反映した。He高周波プラズマの時間積分発光像を、ガス圧力を変化させて観測した結果、ガス圧力の増加に伴って、電極付近に形成されているシース部の発光強度が増加し、この領域が厚さが狭くなってゆくことがわかった。これは、プラズマ中の活性な領域が、電極近傍により局在化することを意味し、プラズマCVD、大気圧プラズマCVDにとっては、好都合の現象といえる。また、1気圧以上のガス圧力の場合には、プラズマのバルク領域にも発光が現れてくることがわかった。通常の低圧プラズマでは、この様な現象は観測されないので、大気圧以上のプラズマに特有の現象といえる。電極材質に銅(導電体)とアルミナ(絶縁体)を用いた場合の、銅電極では、電極近傍にシース部の強い発光が生じており、活性なプラズマ領域が繰り返し生成されていると考えられる。これに対して、アルミナ電極の場合には、シース領域の幅が広く、また発光強度が弱くなった。これは、絶縁体のチャージアップ効果が原因となり、プラズマ部に印加される正味の高周波電圧が減少したためと考えられる。He大気圧・高周波プラズマの発生条件のうち、電極間隔を変化させた観測結果では、シース部の厚みに変化はなく、バルク部(左右のシース部に挟まれた中央の暗部)の厚みが変化するだけであった。この結果からも、大気圧・高周波プラズマの主要部分は電極表面近傍のシース部であることがわかった。これらの項目を検討する出発点となった、流体モデル=局所電界近似法によるシミュレーションを行なった。この結果は、定性的に大気圧・高周波プラズマの時空間分解発光分光計測結果を説明できているので以下に報告する。圧力が異なる場合の、He高周波プラズマ中の電界強度の時空間分布を求めた。駆動周波数150MHzの1周期分の変化を観察したところ、時間的にsin波である電界で電極を駆動したところ、プラズマ中の電界の時間変化と駆動電界の時間変化との位相差、電極近傍に発生する強い電界を持つ部分、ガス圧力をあげることによるシース部の厚さの減少、などが確認できた。また、電極間隔を変化させたところ、実験結果から推測されるように、電界の弱いバルク部の長さが変化したのみで、シース部には変化は見られなかった。本研究では、容量結合型の大気圧・高周波プラズマ中の(1)構成粒子(イオン、電子、励起状態の中性粒子)のエネルギー分布の時空間分解データ、(2)シース部の構造と振る舞いを、外部から制御可能なプラズマ発生条件(電極サイズ、電極材質、電極間隔、駆動周波数、ガス圧力、投入電力等)をパラメータとした計算機シミュレーションにより明らかにすることを目的としている。本年度は、大気圧・高周波プラズマ中では特に重要と考えられる(1)粒子間の相互作用(各種衝突励起過程)、(2)成膜反応を支配する高励起状態の中性原子の振る舞いを時空間分解してシミュレートするためには欠かせない、プラズマガス粒子(He,SF_6,CF_4など)の各種衝突・励起過程に関する衝突断面積データの調査・収集を行ない、また適当なシミュレーション技法についての調査、検討を行った。この結果、大気圧・高周波Heプラズマ中で支配的と思われる、He準安定粒子の生成、消滅過程に関する衝突断面積データをほぼ収集することが出来、他のガス粒子についても現在収集中である。これらのデータを元に、大気圧・高周波の状況下におけるプラズマ粒子の輸送係数を決定すべく、計算機によるボツルマン方程式の解法プログラムを現在、作成中である。次年度は、このプログラムにより計算される、電界強度やガス圧力に依存したプラズマ粒子の輸送係数を組み込んだ流体コードの開発を行ない、実験で発生しているプラズマ中の粒子群の振る舞いと外部パラメータとの関係を明らかにする。具体的には、実験から吸収分光計測により得られる準安定粒子数密度の空間分布データなどと対応させてコードの評価を行なう。

Heガスを用いて発生させた高周波プラズマのバルク部とシース部での発光スペクトルの違いを光スペクトラムアナライザにより測定した。ガス圧力が13気圧の場合、電極表面に薄く発生するシース部からの発光スペクトルには、バルク部の発光スペクトルよりも強度の強い、多種の線スペクトルが見られ、シース領域が非常に活性であることが推測された。中性He原子からの特徴的な発光スペクトルが何本も観測され(388nml,501nm,587nm,706nm)、それらの波長に対応したバンドパスフィルタを用いて、時空間分解発光分光像を観測した。電極は銅を用い、電極間隔は1mmとして、発光励起種の違いによる発光分布を観察した。501.57nm(3^1P→2^1S)および587.56nm(3^3D→2^33P)の発光像には、プラズマバルク部にも発光が現れているが、706.52nm(3^3S→2^3P)では観測されなかった。587.56nmと706.52nmとでは、発光に際して落ちてゆく下準位が同じであるにもかかわらず、発光分布が異なっていた。両者の間には励起エネルギーにほとんど差がないので、それぞれの励起過程、励起断面積の違いが如実に現れたといえる。装置系の分光感度特性を校正し、相対比較した場合、放射寿命の長い準位からの発光である388.86nm(3^3P→2^3S)は、発光強度の時間変化が少なく、放射寿命の短い準位からの発光である587.56nm(3^3D→2^3P)は、高周波電界の変化を反映した。He高周波プラズマの時間積分発光像を、ガス圧力を変化させて観測した結果、ガス圧力の増加に伴って、電極付近に形成されているシース部の発光強度が増加し、この領域が厚さが狭くなってゆくことがわかった。これは、プラズマ中の活性な領域が、電極近傍により局在化することを意味し、プラズマCVD、大気圧プラズマCVDにとっては、好都合の現象といえる。また、1気圧以上のガス圧力の場合には、プラズマのバルク領域にも発光が現れてくることがわかった。通常の低圧プラズマでは、この様な現象は観測されないので、大気圧以上のプラズマに特有の現象といえる。電極材質に銅(導電体)とアルミナ(絶縁体)を用いた場合の、銅電極では、電極近傍にシース部の強い発光が生じており、活性なプラズマ領域が繰り返し生成されていると考えられる。これに対して、アルミナ電極の場合には、シース領域の幅が広く、また発光強度が弱くなった。これは、絶縁体のチャージアップ効果が原因となり、プラズマ部に印加される正味の高周波電圧が減少したためと考えられる。He大気圧・高周波プラズマの発生条件のうち、電極間隔を変化させた観測結果では、シース部の厚みに変化はなく、バルク部(左右のシース部に挟まれた中央の暗部)の厚みが変化するだけであった。この結果からも、大気圧・高周波プラズマの主要部分は電極表面近傍のシース部であることがわかった。これらの項目を検討する出発点となった、流体モデル=局所電界近似法によるシミュレーションを行なった。この結果は、定性的に大気圧・高周波プラズマの時空間分解発光分光計測結果を説明できているので以下に報告する。圧力が異なる場合の、He高周波プラズマ中の電界強度の時空間分布を求めた。
小胞体ストレス応答系の選択的誘導による炎症性疾患の新規治療戦略の開発

我々はこれまでに、小胞体ストレス応答がC/EBPβの発現とAktの脱リン酸化を誘導することでNF-kBの活性化を抑制しうることを見出している。そこで、ラット尿細管上皮細胞(NRK-52E細胞)を用い、小胞体ストレス応答の主要3経路(PERK経路、ATF6経路、IRE1経路)のうち、どの経路がC/EBPβの発現やAktの脱リン酸化の誘導に重要であるか検討を行った。また小胞体ストレス誘導剤としてサブチラーゼ・サイトトキシン(SubAB)を使用した。NRK-52E細胞をSubABで刺激した場合、C/EBPβの遺伝子発現が選択的に誘導された。このSubABによるC/EBPβの誘導に、小胞体ストレス応答のどの経路が関与するのかを明らかにするため、NRK-52E細胞にPERK、ATF6、IRE1のdominant-negativemutantを個別に遺伝子導入し、SubABで刺激を行った。その結果、ATF6を阻害した場合にのみ、SubABによるC/EBPの誘導が抑制された。また、ATF6の阻害剤であるAEBSFでNRK-52E細胞を処理し、SubABで刺激した際にも転写因子としてのCEBP活性誘導の抑制が認められた。次に、NRK-52E細胞をSubABで刺激した場合、3時間後に一過的なAktのリン酸化レベルの上昇が観察されたが、その後そのレベルは徐々に減衰し、9時間以降にはベースのレベルよりも低値を示した。我々は、SubABによるAktの一過的なリン酸化レベルの上昇が、小胞体ストレス応答のATF6経路を介することを明らかにしている。したがって、後期段階で起こるAktのリン酸化レベルの低下も、ATF6経路が関与しているのではないかと考えた。そこで、NRK-52E細胞をATF6経路の阻害剤であるAEBSFで前処理し、SubABにより刺激を行ったところAktのリン酸化レベルの減少が著しく抑制された。また、SubABによるAktの脱リン酸化にはmTORC1の一過的なリン酸化の誘導が関与していた。さらにATF6のsiRNAを恒常的に発現する安定細胞株(iATF6αMEFs)を用いた実験においても上記結果と同様な現象が観察された。これらの結果は、小胞体ストレスによるC/EBPβの発現とAktの脱リン酸化の誘導には、ATF6経路が重要な役割を果たしていることを示唆するものである。
悪性黒色腫細胞の浸潤・転移に及ぼす神経ペプチド:α-MSHの影響

我々は以前に、神経ペプチド:α-Melanocyte Stimulating Hormone(α-MSH)がB16-BL6細胞の基底膜浸潤を抑制すること、その作用機序として主に細胞の運動性を阻害することを見い出した。本研究では、α-MSHによる細胞運動阻害機序の解析およびこの癌細胞のマウスにおける組織浸潤と肺転移に及ぼすα-MSHの生理的役割について検討した。1.α-MSHのよる細胞運動阻害機序の解析...α-MSHは、B16-BL6細胞からの自己分泌型細胞運動促進因子(AMF)の産生を2倍以上促進したが、細胞膜上のAMF receptorの発現量には影響を与えなかった。一方、B16-BL6細胞の培養上清中に細胞運動阻害活性が認められ、この活性は細胞のα-MSH処理で約2倍に増強された。以上の結果より、α-MSHによる細胞運動阻害機序としては、用いた癌細胞由来のAMFの産生阻害あるいはAMF receptorの発現抑制というよりはむしろ、自己分泌型細胞運動阻害因子の分泌の促進である可能性が示唆された。2.α-MSHの細胞運動阻害における細胞内情報伝達機構の解析...B16-BL6細胞において、アデニル酸シクラーゼの活性化剤およびその阻害剤を用いた実験より、α-MSHによる細胞運動の阻害に細胞内cAMPの上昇が関与していることを示された。3.B16-BL6細胞のマウスにおける組織浸潤と肺転移に及ぼすα-MSHの生理的役割...B16-BL6細胞の実験的肺転移はα-MSHとの同時投与により50%以上抑制された。マウスの自然肺転移実験において、α-MSHレセプターアンタゴニストの腫瘍内投与により、原発腫瘍の組織浸潤が促進されるとともに、この癌細胞の肺転移が有意に増加した。一方、過剰量のα-MSH投与により、原発腫瘍の組織浸潤および肺転移が著明に抑制された。以上の結果より、担癌状態での生体防御におけるα-MSHの重要性が示唆された。現在、上述のすべての結果を3部に分けて投稿準備中である。
定性時空間推論の体系の構築とその応用に関する研究

本研究は空間データの記号表現と推論の枠組みを提案するものである.特に,2次元のオブジェクトに前後関係や相対的高さの概念が付随するような空間データを対象としてそれらを定性的に扱う仕組みを考察した.その結果以下の成果を得た.表示に関する要求が付随されている矩形を基本図形とし,与えられた複数の基本図形に対してすべての表示に関する要求を満たすような重ね合わせ方を見つける矩形推論システムを完成させ,実装するとともに推論方法の正当性を示した.また,相対的高さをもつ図形データ上で定性シミュレーションを行う手法を提案した.さらに,3次元オブジェクト同士の相対的位置関係表現の時系列が与えられたとき,そこで生起したイベントを抽出する方法を示した.本研究は空間データの記号表現と推論の枠組みを提案するものである.特に,2次元のオブジェクトに前後関係や相対的高さの概念が付随するような空間データを対象としてそれらを定性的に扱う仕組みを考察した.その結果以下の成果を得た.表示に関する要求が付随されている矩形を基本図形とし,与えられた複数の基本図形に対してすべての表示に関する要求を満たすような重ね合わせ方を見つける矩形推論システムを完成させ,実装するとともに推論方法の正当性を示した.また,相対的高さをもつ図形データ上で定性シミュレーションを行う手法を提案した.さらに,3次元オブジェクト同士の相対的位置関係表現の時系列が与えられたとき,そこで生起したイベントを抽出する方法を示した.本研究は,従来数値データとして定量的に扱われていた図形や画像などの空間データおよびその時間的な変化を,記号表現により定性的に扱う新しいモデルを提案し,そのモデルに基づいた高速で高度な推論力を持つソフトウェアの実現を目指すものであり,本年度は主に以下の研究を行った.1.矩形推論システム矩形推論の枠組みの拡張を行った.前年度作成した矩形推論システムの対象とするパターンの制約条件を緩和した,さらに,表示部分を明示した定性的矩形の集合に対して,それらの表示要求を満たすような配置を導出するアルゴリズムを構築し,矩形推論システムとしてPrologおよびJAVA言語で実装した,また,本システムと他の定性空間推論システムを比較し,表現力の相違,互いの表現の変換,両者の統合方法についても検討した.2.定性時空間シミュレーションシステム定性的に表現された単体または複数のオブジェクトの空間データに対して,オブジェクト間の空間的制約条件や動作の連続性をもとに,これらの時間的な変化を予測し定性シミュレーションを行うシステム作成のため,特性を含めたオブジェクトの表現方法について考察した.3.定性空間表現によって記述された表現の列に対する推論方法定性空間表現によって記述された2つの状態表現を与えたとき,それらの間で行われた操作や変化の規則を推論する,時相論理に基づく手法について検討した.前年度作成した矩形推論システムの拡張と時空間推論の枠組みの提供を行った研究成果は以下の通りである。1.矩形推論システムの拡張矩形推論システムは表示部分に関する属性を付加した矩形を単位とし,表示すべき部分がすべて表示され,そうでない部分は隠されるような重ね合わせ方に関する推論をするものであり,前年度基本部分を作成している.本年度は,対象とする単位矩形のパターンの制約条件を緩和することで表現方法および推論方法を拡張し,プロトタイプシステムを作成した.さらに,はめ込みと埋め込みの2種類重ねあわせ方それぞれの特徴について理論的考察も行った.2.定性時空間シミュレーションシステムの開発3次元データの表現方法について検討した.その結果,研究室で開発したPLCA表現に点の相対的な高さの情報を加えた拡張表現を提案し,その表現の上でのシミュレーションシステムを開発した.3.定性空間推論表現によって記述された表現の列に対する推論方法の提案動作をRCCの列として定義する。定性空間表現の1つであるRCCを使って空間データを表現し,それらの列が与えられたどき,生起イベントを抽出する方法を提案した.この方法をバスケットボールの試合の動画データに応用し,方法の妥当性,有効性を検討した.3次元データを対象としその特徴をとらえて機械的に扱えるような定性時空間推論について研究を行った.1. 3次元データを対象とする枠組みの検討:前年度の研究で3次元データを扱う定性時空間推論の枠組みとして,研究室で開発したPLCA表現に点の相対的な高さの情報を加えたものと,領域のとり方を工夫することでオブジェクトの相対的位置関係にもとづくRCC表現をそのまま適用する方法の2つについて問題点や適用可能な範囲について明確化した.また,9boxという新たな表現方法の利用についてもあわせて考察した.2.高さ情報をもつ空間データ上の推論システムの構築:前年度開発した,PLCA表現に点の相対的な高さの情報を加えた表現およびその上での推論システムは,シミュレーションの際に相対的な長さや大きさの扱いが煩雑であったため,この部分を改良した表現を提案し,その上での推論システムを構築して実装した.また,この表現の妥当性や与えられた表現に対応する空間が存在するかどうか決定するアルゴリズムや制約充足問題との関連についても考察した.3.定性空間表現の列に対する推論方法の確立と評価:前年度の検討結果をもとに,オブジェクトの動く方向や時間的な前後関係から観測方向から見えない部分について推論する方法を与えた.また,この結果を利用して,動作をRCCの表現の列として定義し動画データから生起イベントを抽出する方法を提案した.

この方法をバスケットボールの試合の動画データに応用し評価を行った.当初の2つの目的のうち,定性空間推論の応用の可能性を示すという点は,矩形推論の枠組みの提案およびそのプロトタイプシステムを作成したことで,マルチウィンドウの自動配置という応用の可能性を示すことができた.もう1つの目的である時間的変化を伴う空間データを扱う枠組みの提供については,定性空間表現としてよく知られた記述方法を使ってイベントを記述する方法を提案し動画を使って事例研究を行ったことから基本的な枠組みは提供できた.24年度が最終年度であるため、記入しない。マルチウィンドウの自動配置システムについては学習やインタフェースに関してもかなり検討が必要だが,定性空間推論という本テーマからはずれるため実際のシステムつくりはしない.時間的変化を伴う空間データの扱いについては,本年度提案した枠組みをもとにもっと汎用性のあるものを提案し応用についても検討する.システム評価を行う入力画像の処理の専門家と共同研究ができればよいが,無理な場合は画像処理ツールの利用や半手作業での入力データの準備を行うことで対処する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
新規癌特異的糖鎖抗原の腫瘍マーカーとしての応用

我々は、大腸癌、膵臓癌の糖脂質の詳細な構造解析を行った結果、ルイス型血液型が陰性の人に特異的に発現する癌特異的糖鎖抗原Sialyl Type1H(ST1H)の存在を発見した。本研究の目的は、ST1Hを特異的に認識する単クローン抗体を作成し、ヒト血清でのST1H抗原量を測定するELISA系を構築し、腫瘍マーカーとしての有用性を評価することである。昨年度は合成した糖脂質ST1Hをマウス免疫し、定法に従ってハイブリドーマを得た。ELISA法を用いてスクリーニングを行い、ST1Hを特異的に認識するが、他の異性体ST2H, Sialyl Lex, Sialyl Leaをほとんど認識しない単クローン抗体を11種類を得た。そのうちの9クローンがIgGで2クローンがIgMであった。今年度は、免疫組織化学を用いて、これらのクローンをさらに検討した。サンプルには、ST1Hの発現が確認されているルイス型陰性の大腸癌組織、正常大腸組織を用いた。これらの凍結切片を作成し、アセトンあるいは、4%パラフォルムアルデヒドなどで固定後、11種類のハイブリドーマの上清と反応させ、通常のABC法にて発色させた。免疫染色のコントロールとしてSLeA抗体を用いた。SLea抗体は、ルイス陽性(Le+)の患者の大腸癌で陽性シグナルを認めるものの、ルイス陰性(Le-)の患者の大腸癌では、陽性シグナルが観察されなかった。このことは、染色方法に問題がないことを示す。一方、ST1Hのモノクローナル抗体である、23D11は、本来なら、ルイス陰性(Le-)の患者の大腸癌で陽性シグナルが観察されるはずであるが、固定法などをいろいろ検討したが、陽性シグナルは観察されなかった。23D11以外の10種類の抗体も、同様であった。昨年度までに、合成した糖脂質ST1Hをマウスに免疫し、定法に従ってハイブリドーマを得た。ELISA法を用いてスクリーニングを行い、ST1Hを特異的に認識するが、他の異性体ST2H, Sialyl Lex, Sialyl Leaをほとんど認識しない単クローン抗体を11種類得た。免疫組織化学を用いて、これらのクローンをさらに検討した。ST1Hのモノクローナル抗体である、23D11は、本来なら、ルイス陰性(Le-)の患者の大腸癌で陽性シグナルが観察されるはずであるが、固定法などをいろいろ検討したが、陽性シグナルは観察されなかった。今年度は、免疫原をST1H陽性の大腸癌細胞に変更し、再度、マウスに免疫し、定法に従ってハイブリドーマを得た。2000クローンを、ELISA法を用いてスクリーニングした。その結果、ST1Hは認識するが、異性体であるST2Hをほとんど認識しないクローンを2種類得た。今後は、これらのクローンを詳細に解析する必要がある。そこで初年度はST1Hを特異的に認識する単クローン抗体の作成を試みた。糖脂質ST1Hを含む糖鎖抗原はリポソーム法で作成し、Balb/cマウスに免疫した。1回の免疫につき35microgramのST1Hを使用した。1週間間隔で、3-5度の免疫後、マウスより脾細胞を調整し、PEG法を用いてミエローマ細胞と融合させた。ミエローマ細胞はP3-X63Ag8.653を用いた。HAT培地で培養し、10日後にコロニーを確認し、培養上清をスクリーニングに供した。スクリーニング法はELISA法を用いた。具体的には合成した糖脂質を20ng/wellで96穴プレートに固相化した。Negative controlとしてST1Hと異性体であるST2H, Sialyl Lex, Sialyl Leaをプレートに固相化したものも作成した。培養上清を加えて反応後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスImmunoglobulinを反応させ、TMBペルオキシダーゼ発色基質キットを用いて発色させた。約3000クローンのスクリーニングが終了した。ELISAにてST1Hを特異的に認識するが、他の異性体ST2H, Sialyl Lex, Sialyl Leaをほとんど認識しない単クローン抗体を11種類を得た。今後はこれらのクローンを免疫組織学法などを用いてその特性をさらに検討する必要がある。

今年度の実施計画は、出来上がった単クローン抗体の性状を詳細に検討することであった。昨年度の作成された単クローン抗体11種類の性状を詳細に解析した。ELISAの系では、11クローンすべてにおいて、ST1Hは認識するが、他の異性体(ST2H, SLex, SLea)は全く認識しないため、特異性が高いと思われた。しかし、免疫組織化学法で、検討すると、ST1Hの発現が確認されている大腸癌において、その発現を検出することが出来なかった。固定法などいろいろと検討したが、同様であった。実施計画に沿った検討は十分実施したと判断する。今年度の実施計画は、ST1Hを特異的に認識する単クローン抗体の作成であった。実施計画どおりに、合成したST1Hをマウスに免疫し、3000を超えるハイブリドーマを作成した。ELISAでスクリーニングした結果、11種類の単クローン抗体を得た。当初の目的は達成できたものと考える。またこれらの単クローン抗体はELISAにおいて、ST1Hは認識するが、他の異性体(ST2H, SLex, Slea)は全く認識しないため、特異性が高いと思われる。昨年度の得られた11種類の抗ST1H単クローン抗体は、合成したST1H糖脂質を免疫原に用いた。当然であるが、ELISAでは、この合成ST1Hを特異的に認識する抗体は得られた。しかし、実際の組織では、免疫組織化学法で検出すことができなかった。今後は、免疫原を変更して、再度、ST1Hに対する単クローン抗体の作成を試みる。具体的には、免疫原に合成ST1Hを用いるのではなくST1Hが発現している大腸癌細胞を用いる。その細胞をアジュバントと混合させ、マウスに免疫する。合成ST1Hは、抗体のELISAでのスクリーニングに使用する。得られた11種類の特性を精査する必要がある。これらはELISA系においてはST1Hを特異的に認識するが、生体内の実際のST1Hを認識するか否かは不明である。そこで、得られた11種類の単クローン抗体を精製し、実験に供する。そのため、ハイブリドーマのマウス腹腔内投与、あるいは大量培養などの方法により、抗体を大量産生させる。その後、ptotein Gカラム(IgG)あるいはゲルろ過法(IgM)などを用いて抗体を精製する。その抗体を用いて、ST1Hが発現している大腸癌の組織を免疫染色し、生体内のST1Hに反応するか否かを検討する。生体内のST1Hに反応する場合は、血清のELISA系の確立を目指す。消耗品として、試薬類、チューブ、プレート類など、100万円程度予定している。備品としては、抗体などをストックするフリーザーが不足している為、フリーザー(SANYO MDF-U538D)45万円の購入を予定している。また、成果を学会、論文で発表する為、旅費10万円程度、論文投稿費用など10万円程度を予定している。