hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ベクトル量子化による塩基配列の高速検索に関する研究

現状では、膨大なゲノムの配列データがGenBank、EMBL、DDBJなどのデータベースに蓄積されている。しかも、まだ遺伝子データベースのデータ量が指数関数的に増加している。ホモロジー検索は、進化・系統分類の解析、蛋白質の機能解析などを目的とした配列解析の最も基本的な手法の一つとなっている。現在最も頑健なアルゴリズムとして、Smith-Waterman(SW)アルゴリズムがあるが、その計算を行うことは時間的に現実的ではない。遺伝子データベースのデータ量が急速に増えている現状を考えると、さらに実行時間の大幅な増加を意味する。現状では、精度と検索速度が両立できる塩基配列の高速検索法はまだ実現されていない。本研究では、必要最小限のSWアルゴリズムによるアライメント処理と組み合わせたベクトル量子化による高精度かつ高速な塩基配列の検索手法を実現した。ゲノムの配列データは、DNAを構成する4種類の塩基G(グアニン)、A(アデニン)、T(チミン)、C(シトシン)で表現される文字列である。現在最も頑健なアルゴリズムとして、Smith-Watermanアルゴリズムがあるが、その計算を行うことは時間的に現実的ではない。本研究では、必要最小限のSmith-Watermanアルゴリズムによるアライメント処理と組み合わせたベクトル量子化による高精度かつ高速な塩基配列の検索手法を試みた。今年度の研究成果は以下のようになる。高速検索するための塩基配列の特徴量抽出手法を開発した。塩基配列のヒストグラム特徴を生成するため、従来のベクトル量子化と違い、あらかじめ64という小さいサイズの3次元塩基ベクトルとインデックス番号の参照テーブルを用意することにより、ベクトル量子化は非常に高速で実行できた。それから、各インデックス番号の使用頻度を数え、簡単に塩基配列のヒストグラム特徴を生成できた。提案するベクトル量子化による高速塩基配列検索手法の有効性を検証するため、検索範囲を減らす実験を行った。米国生物工学情報センター(NCBI)が提供している、塩基配列データを蓄積・提供している世界的な公共の塩基配列データベースであるGenBankのサブデータベースを利用し、全体162,021個(配列長400500)の塩基配列を検索するより提案手法を使って、約0.36%に当たる584個の塩基配列を検索するだけで同じ結果が得られた。Smith-Waterman手法を使って塩基配列の全体検索でかかった約2時間で、ベクトル量子化手法を加えたことによって、約0.39%に当たる約28.6秒で同じ結果を得ることができた。本研究では、必要最小限のSWアルゴリズムによるアライメント処理と組み合わせたベクトル量子化による高精度かつ高速な塩基配列の検索手法を試みた。配列の長さ不一致の対応策として、ローカル検索手法を導入し検討した。入力塩基配列を小さいサイズの塩基配列に分割し、各々の部分配列はデータベース中の塩基配列に最も似ている部分を探し出し、そこから類似度が上がらないまで左右伸長させ、部分配列の類似度を計算する。得られた各々の類似度を組み合わせて配列の総合類似度にし、あらかじめ設定した閾値と比較し、閾値を上回る塩基配列のみに対して、必要最小限のアライメント処理を行う。ローカル検索によって、配列間の似ている部分だけを照合させるので、検索のロバスト性が図れる。提案手法の有効性を検証するため、検索範囲を減らす実験を行った。世界的な公共の塩基配列データベースであるGenBankのサブデータベースを利用し、全体853,825個(配列長4002000)の塩基配列を全検索するのと比べ、提案手法を使って、約0.269%に当たる2301個の塩基配列を検索するだけで同じ結果が得られた。

SW手法を使って塩基配列の全体検索でかかった約2時間で、提案手法は約0.52%に当たる約37.4秒で同じ結果を得ることができた。また、代表的な高速手法であるBLASTにより2.78倍速くなった。
人口密集都市域における震災予測と復興手法に関する比較研究

震災は地域の社会・経済構造に深く関わっていることを明らかにするため、まず兵庫県南部地震と唐山地震について調べた。震災後の復興にも、社会・経済構造の変化にともない、人的な要素が大きい。震災と復興のプロセスを社会工学のアプローチからみつめ、以下の項目について調査を進めた。1)兵庫県南部地震における地域社会構造と震災増大との関連ここでは、地域特有の社会的背景から分析する上、建築物および人的被害を中心に神戸市および阪神地域の被害の増大に及ぼした要因を考察した。地域の社会構造が震災との関わりを明らかにした。2)兵庫県南部地震が震災後住民生活に与える影響これについて、a)震災後の人口の移動と変化、b)住家被害と人口増減の関係、c)避難所生活の実態、d)個人消費の鈍化、e)家計消費支出の変化、f)雇用の確保、g)精神的ストレスの防止などを中心に震災後住民生活に与える影響を明らかにした。3)兵庫県南部地震と唐山地震の住宅復興プロセスの比較被災者にとって住宅復興が最大の課題のひとつとなっており住宅復興が都市全体の復興のカギといえる。震災後の復興プロセスを緊急避難、応急仮設、本格復興の3段階としてとらえ兵庫県南部地震及び唐山地震について比較を行った。特に、応急仮設住宅、住宅再建を取り上げ比較した。4)震災度計量化の提案本研究では等価損失年数を定義し、兵庫県南部地震と唐山地震における神戸市と唐山市の震災状況を比較した。ここでいう等価損失年数とは震災による損害がその地域の震災前年支出の何年分に相当するかというものであり、即ち、等価損失年数(年分)=震災被害÷震災の前年支出として定義できる。具体的に、人口・ストック・フローの面から考える場合、震災直後の唐山市の震災度は神戸市の5倍にもなることが判った。本研究では、1995年阪神・淡路大震災により甚大な被害が発生した神戸市における自然・社会条件等の地域構造および震災後の地域住民への諸影響を整理した上で、震災の特徴的な側面を考察して、いくつかの結論をまとめることに至った。1)著しい被害を受けた地域では、老朽木造住宅の密集、過度の人口密集、高齢化が被害が軽微であった地域に比べ進行しており、震災前から地域が抱えていた社会的諸問題が地震という自然災害を契機に形を変えて一気に噴出し、被害増大につながったと考えられる。2)出生数超過で推移していた神戸市人口の自然動態は震災後、死亡数超過に転位した。また、他地域への疎開者が多く発生したことから神戸市の人口は震災前より約10万人減少した。この人口減少が地域社会へ与える影響としては、個人消費の低下、税収減等が考えられ、今後公表される市民経済計算等の統計資料を整理した上での評価が必要である。3)ピーク時で神戸市内の約15%の市民が避難所生活を余儀なくされ、その内67割の避難者が住宅確保、収入・仕事への不安を抱えていた。統計上からも失業者の増大は顕著にみられ、収入減による経済的困窮や将来への不安など失業者への影響は深刻なものと察せられる。復興計画において政策による就労機会拡大の促進など災害後の失業者の就労環境の整備は、個々の生活においても、また地域活性化の再建のためにも重要事項であろう。引き続き、阪神・淡路大震災で甚大な被害をうけた神戸市を対象に震災前の地域構造および震災後の諸影響の実態を把握し、震災予測の可能性を探ると共に、地域社会に最適する復興手法について提案していく。今年度は、阪神震災のデータを調査整理すると共に、唐山地震について現地調査を行った。

これらの調査資料を踏まえて、阪神と唐山両地震の震災と復興の比較研究によって、震災評価の新しい指標の提案に至った。比較研究では神戸市と唐山市の市勢ならびに被害概要を纏めた。両地震とも都市直下型の大規模な地震であり、発生時間もともに深夜から明け方にかけての時間帯で、就寝中に被害が大きい。両市の市勢の違いを見ると神戸市の面積が唐山市の1/2、人口が1.4倍、人口密度が2.8倍であり、唐山市の中心である唐山市区では人口密度が1.1万人/km^2で、神戸市の最も人口密度が高い長田区と同数である。神戸市の1人あたりGDPは420.3万円、唐山市の1人あたりのGNPは31.6万円であるが、唐山市は人口の構成比が全国の0.11%なのに対しGNPの構成比が0.8%と高く、中国経済の重要な都市といえる。これらの社会・経済背景の下で、唐山市の全壊世帯が神戸市の2倍だったのに対し、唐山市の死者数は神戸市の32倍にも達した。唐山市の1世帯人数が神戸市の1.7倍としても、唐山市の人的被害がかなり大きかったと言える。また、都市全体の復興のカギを握っている住宅復興について、緊急避難、応急仮説、本格復興の3段階として捉え両地震の復興プロセスを比較した。その相違が明らかであったが、これらも両市の社会・都市構造の違いによるものと分かった。以上の結果を吟味する上、神戸及唐山地震の被害のうち人的被害(人口)・直接(ストック)被害額・間接(フロー)被害額を抽出し、地震にかかる指標(等価損失年数)を用い、統合的に比較した。この指標を使うことで両地震の被害の「時代の差」という影響をとりのぞき、定量的な分析を試みた。これにより社会・都市構造の違いによる人的被害・直接被害額・間接被害額の傾向を考察できた。
生体に優しい条件下における超低圧力損失の生体物質包括ハニカムの合成

シリカをハニカムの原料とし、中性、室温以下の生体物質に優しい条件で生体物質包括型ハニカムモノリスを合成する検討を行った。まず、ハニカムが形成されるための前駆体の条件(濃度、pH、熟成度)を明らかにした。また、ハニカム開口径の範囲を200nm10μmの広い範囲で制御する技術の開発にも成功した。さらに、シリカをゼラチンと複合化させることで、中性条件でも高強度なハニカムが得られた。このハニカムは中性、室温以下で合成できるため生体物質との複合化が容易であり、これらの担体としての利用が期待できる。平成19年度は、シリカをハニカムの原料とし、中性、室温以下の生体物質に優しい条件で生体物質包括型ハニカムモノリスを合成する検討を行った。まず、様々な条件(濃度、pH、熟成度)で調製したシリカゾルもしくはシリカ湿潤ゲルを一方向凍結して得られる試料の形状を調べた。その結果、ハニカムを得るためには、ゲル化した直後の湿潤ゲルを用いる必要があることがわかった。しかし中性付近では、シリカがゲル化しないためハニカムは得られなかった。そこで、ゲル化剤を原料溶液に添加して中性付近でシリカゾルをゲル化させた。このようにして得た湿潤ゲルを一方向凍結すれば、ハニカムが得られることを見出した。また、一方向凍結の条件と、原料溶液への水溶性ポリマーの添加が試料の形状に及ぼす影響についても詳しく検討した。その結果、挿入速度を大きくする、凍結界面の温度勾配を大きくする、もしくは水溶性ポリマーを添加する、といった操作を行えば、通常はラメラ構造しか得られないような前駆体(シリカゾルなど)からでも、ハニカム構造が形成されることを見出した。さらに、これらの条件を調節することで、ハニカム開口径を200nm10μmの広い範囲で制御することに成功した。以上の結果より、中性付近でハニカムを合成するための指針が明らかとなった。一方、ハニカム壁への酵素の包括固定化についても検討を行った。酵素であるHRPを原料溶液に添加し、一方向凍結するだけで、HRPはハニカム壁に包括担持されることがわかった。平成20年度は、中性付近で高強度なハニカムを合成する検討を行った。中性のシリカゾルを単に一方向凍結させただけではハニカムは形成されず、ラメラとなる。そこで、シリカゾルに様々な添加剤を加え、粘度を調製したり、もしくはゲル化させたりすることで、ハニカムを得る努力を行った。添加剤としては、フュームドシリカ、寒天、ゼラチン、デキストラン、ポリビニルアルコールを試した。その結果、ゼラチンと複合化させた場合、最も高強度なハニカムが得られた。さらに、中性条件で合成したハニカムに関し、水を流通させた場合の圧力損失を測定した。その結果、ゼラチンと複合化させ中性で合成したハニカムは、ゼラチンと複合化せずに酸性で合成した従来のハニカムに比べて圧力損失が大きいことが判明した。そこで中性で合成したハニカムを電子顕微鏡で観察したところ、ハニカム孔内部にゼラチンが析出していることがわかった。すなわち、このゼラチンが湿潤状態では膨潤し、ハニカム孔を塞いでしまうことが圧力損失増加の原因であることを突き止めた。そこで、ハニカム孔内部へのゼラチンの析出機構に関し詳細な検討を行った。その結果、マクロ孔径を小さくする、シリカ壁内部にゼラチンが存在できる空間を確保する、等の方法を用いれば、ハニカム孔内部へのゼラチンの析出を防げることがわかった。以上の結果より、生体物質に優しい中性条件で、高強度なハニカムを合成することに成功した。
表象の種類とその認知機能に関する相互作用主義的観点からの研究

相互作用主義の観点から認知における表象の役割を研究し、その結果、次のような成果が得られた。(1)認知には、表象を必要とするものとそうでないものとがあり、表象を必要としない認知では、主体と環境のあいだに力学的過程として記述するのがふさわしい非常に密接な相互作用がある。それにたいし、表象を必要とする認知では、表象の変形として記述するのがふさわしい過程や外界からの刺激を一定の内的状態に収束させる過程が含まれる。(2)表象には、構文論的構造を有して無数に多くの表象を形成できる記号的表象、および表象される事物が喚起するのと類似の知覚を喚起する絵画的表象、さらに複合的事象をその構成要素に分解することなく全体論的に表す分散表象の少なくとも3種類が認められる。(3)主体と環境の間の相互作用のうち、知覚や歩行などの比較的低次のものは分散表象によって可能となり、計画や推論の過程を含む比較的高次のものは記号的表象によって可能となる。また、絵画的表象は、表象される事物が喚起するのと似たような知覚を喚起することにより、擬似的な知覚経験を可能にする。(4)思考は記号的表象を含むのにたいし、知覚は分散表象を含む。それゆえ思考は合理的な推論を可能にする概念的内容をもつのにたいし、知覚はそうではない非概念的内容をもつ。その結果、知覚は思考の理由になりえないが、それでも、知覚が正しいときに、その知覚によって引き起こされる思考が真となるという意味で、知覚は思考を正当化しうる。(5)視覚、聴覚、触覚などの異なる感覚様相は異なるタイプの表象を用いて外界の事物を表象する。それゆえモリヌークス問題への答は否定的となる。しかし、異なる感覚様相の表象が同じ事物を表すとき、それらは同じ一つの概念のもとにまとめられる傾向があり、この傾向性のゆえに客観的な世界の単一性が概念的に確保される。表象にはさまざまな種類があるが、そもそもあるものが表象であるための最小の条件は何かを考察し、表象の表象たる所以を探った。認知者が対象Xに対してその表象を形成するとき、ふつうXは認知者に異なる文脈で異なる刺激を与えるにもかかわらず、認知者はつねに同じ状態を形成する。ここには多様な刺激を同一の状態に集約する一定のメカニズムがあると考えられる。そこで、あるものが表象であるための最小条件とは、そのものがそのような集約メカニズムに基づいて形成されることだと結論づけられる。表象はこのような特性のほかにも、表象から表象への変形や行動の産出への寄与などの特性をもちうるが、表象が表象であるためには最小限、集約メカニズムによる形成が必要である。次に、表象の種類およびその機能について考察した。表象には大きく分けて、言語的表象、絵画的表象、分散表象の三種類がある。言語的表象は構文論的構造をもち、形式的推論を可能にする点にその最大の特色がある。それは特定の文脈に限定されない文脈独立的な表象である。絵画的表象は、馬の絵を馬の絵として理解する能力が馬を視覚的に表象する能力に依存するように、視覚的表象に依存する。そして視覚的表象も含めて一般に知覚的表象は脳の分散表象であると考えられる。従って、絵画的表象は分散表象に依存する派生的表象である。分散表象は言語的表象に比べて文脈依存的である。

しかし、それは文脈の特異性に応じた繊細な行動を可能にする点に大きな利点がある。知覚の表象内容が信念の表象内容と同じく概念的かどうかをめぐる最近、急浮上してきた問題について考察を行い、知覚の内容が非概念的であることを論証した。信念には、ある信念を形成できる人はそれと関連のある内容をもつ信念も形成できるという体系性や、無数に多くの信念を形成できるという生産性があり、ここから信念の内容はいくつかの概念を一定の構成規則に従って組み合わせてできた概念的な内容であるといえるのにたいし、知覚の内容はそのような体系性や生産性を欠くため、概念的とはいえない。信念の内容は概念的であるため、信念は他の信念によって正当化されたり理由づけられたりするが、知覚はその内容が非概念的であるため、知覚が信念を正当化したり理由づけたりすることはない。ただし、知覚と信念の間には、知覚が真のときには、それにもとづいて形成される信念も真となるいう意味での「正当化」は成り立つ。また、知覚の「選言説」に対する批判的な考察を行った。選言説によれば、たとえば赤いリンゴが見えるということは、実在の赤いリンゴが見えるか、あるいはそうであるように思えるということにほかならない。この説は、真なる知覚の対象は実在の事物であるという常識的な直観を満足する点にもっとも大きな利点があるが、その反面、偽なる知覚の対象が何であるかがまったく不明であるという大きな難点ををかかえる。選言説は真なる知覚と偽なる知覚が共通の要素を含むという考えを錯覚論法の中核的な仮説として拒否するが、それらはやはり共通の要素、ただし感覚所与のようなものではなく、共通の表象内容をもつと見なすべきであることを論じた。相互作用主義の観点から、表象の種類と機能を研究した結果、次のような成果が得られた。(1)異なる感覚様相は異なるタイプの表象を用いて外界の事物を表象すると考えられる。生まれつき眼が見えない人はたとえば椅子を触覚的に表象することができるが(つまり触って椅子だと分かるが)、その人が視力を得て椅子を視覚的に表象できるようになったとき、その人は視覚的に表象される椅子が触覚的に表象される椅子と同じものだということに直ちには気づかないと考えられる。それに気づくようになるのは、両者のあいだの対応関係を何度か経験してからである。従って、椅子の触覚的表象と視覚的表象は異なるタイプの表象だということになる。しかし、われわれはこのように同じ事物にたいして感覚様相ごとに異なるタイプの表象を用いつつも、それらをまとめて単一の概念を形成する強い傾向がある。そのような傾向性は、客観的な世界の単一性を概念的に確保するためにわれわれに与えられたきわめて重要な能力である。(2)理論的判断は記号的表象の変形によって得られるのに対し、直観的判断は分散表象の変形によって得られる。従って、理論的判断に至る過程は意識的かつ比較的時間を要するのにたいし、直観的判断に至る過程は無意識的かつ瞬間的である。反省的均衡は理論的判断と直観的判断を照合して双方を修正しながら、両者の均衡点を探る営みであるが、反省的均衡によって良い理論が得られても、直観の役割はなくならない。直観もまた経験的学習によって改善することが可能であり、直観は理論に対してどこまでもその試金石であり続ける。
ＮＡＤＰＨオキシターゼとスタニオカルシンを用いた乳癌の新規転移マーカーの開発

本研究は、乳癌の転移予測マーカーの開発を目指した。癌の転移に影響を与える因子にNADPHオキシターゼ(Nox)から産生される活性酸素があり、細胞運動能を亢進させる。一方、カルシウム調節タンパクのスタニオカルシン-1(STC-1)が腫瘍細胞で高発現している。そこで、カルシウムにより活性化されるNox5およびSTC-1の分子に着目し研究を行った。乳癌細胞にSTC-1を高発現させると運動能が亢進し、さらにマウスの肺転移能が増強した。しかしながら、Nox5を高発現させても運動能に変化はなかった。以上より、STC-1は乳癌の転移能を亢進させ、新たな転移予測マーカーとなり得ることが示唆された。腫瘍細胞の転移能に影響を及ぼす因子の一つに、NADPH Oxidase(Nox)により産生される活性酸素がある。Noxの中でも細胞内カルシウムで活性化されるのは、Nox5とDuoxのみである。一方、細胞内カルシウムを調節するStanniocalcin-1(STC-1)が、各種腫瘍細胞で高発現することが明らかとなっている。そこで、本研究ではSTC-1がNox5とDuoxを活性化させ、活性酸素の産生を高め、乳癌細胞の転移能を増強させる可能性について検討している。既に7種の乳癌細胞を対象として、細胞間で発現量の差異はみとめられるものの、全例でSTC-1、2例でNox5の発現を確認した。そこで、ヒト乳癌細胞株のMDA-MB-231を用い、全長(分泌型)STC-1発現細胞(MB231-S)を作製し、STC-1が転移能に及ぼす影響を検討した。MB231-S細胞の浸潤能は、対照細胞(MB231-M)と比べ有意に亢進した。浸潤能は、細胞増殖能、運動能、接着能や基質分解能の総和であるが、MB231-S細胞では運動能のみが高まっていた。さらに、両細胞をマウス尾静脈から投与すると、MB231-S細胞の肺転移結節数はMB231-M細胞と比較し増強した。STC-1による運動能亢進が、細胞内、細胞外あるいは両者のうち、どのシグナル伝達で起こっているのか解析するため、非分泌型STC-1発現細胞(MB231-NS)を作製し検討した。その結果、MB231-S細胞でのみ運動能の亢進がみられた。さらに、各細胞の培養上清を親細胞であるMDA-MB-231に添加すると、MB231-S細胞のそれのみが運動能を高めた。すなわち、STC-1は細胞外からのシグナル伝達を介し、運動能を亢進させることが証明された。上記の成果をClin Exp Metastasisに投稿中である。腫瘍細胞を制御する因子の一つに、NADPH Oxidase(Nox)の作用で産生される活性酸素がある。一方、細胞内カルシウムを調節するstanniocalcin (STC)が、腫瘍細胞で高発現することが報告されている。そこで、本研究ではSTCがNox5やDuoxの活性化を介し活性酸素の産生を高め、乳癌細胞の転移能を促進させる可能性について検討している。既に7種の乳癌細胞株を対象とし、細胞間で差異はみられるものの、全例でSTC、2例でNox5が発現していることを確認した。そこで、マウスでの転移モデルが確立されているMDA-MB-231細胞を用い、STCを強発現する細胞(STC)を作製し、浸潤能、運動能、増殖能、接着能および基質分解能を解析した。対照細胞(mock)と比較するとSTC細胞は、浸潤能および運動能が有意に亢進した。また、培養上清中のSTC蛋白量は、mock細胞と比較しSTC細胞で増加していた。両細胞の培養上清をMDA-MB-231に添加すると、STC細胞の培養上清は、浸潤能を著しく亢進させた。以上より、STCは、運動能亢進を介して浸潤能を高め、癌の予後規定因子である転移能獲得に重要な役割を果たしていることが明らかになった。また、作用機序の一因として、細胞外に分泌されたSTCがオートクラインおよびパラクラインに作用することが示唆された。これらの結果を基盤としマウスの転移モデルを用い、STCがin vivoで実際に転移能を亢進させるか解析を進めている。ヒトのNoxファミリーは、7つのメンバーが含まれ、種々な細胞において発現が認められる。その中でもカルシウム結合モチーフを有し、カルシウムにより活性化するものに、Nox 5、Duox 1と2がある。一方、細胞内カルシウム濃度を調整するStanniocalcin-1 (STC-1)が、各種腫瘍細胞で高発現することが明らかとなっている。そこで、本研究の目的はSTC-1によりNox 5やDuoxが活性化され、活性酸素の産生が亢進するにより、乳癌細胞の転移能を増強させる可能性について検討している。まず、7種のヒト乳癌細胞におけるSTC-1の発現は、全例で確認された。そこで、MDA-MB-231細胞を用い全長(分泌型)

STC-1発現細胞(MB231-S)を作製し、STC-1が転移能に与える影響を検討した。MB231-Sの浸潤能および運動能は、MB231-Mに比べ運動能のみに亢進が認めれられた。マウスの尾静脈から細胞を移植して肺転移結節数を比較すると、MB231-Sは有意に増強した。STC-1による運動能亢進が細胞内、細胞外あるいは両者のうち、どのシグナル伝達で起こっているかを解析するため、非分泌型STC-1発現細胞(MB231-NS)を作製して検討した。各細胞の培養上清を親細胞であるMDA-MB-231に添加すると、MB231-Sの培養上清のみで運動能が高まった。上記に成果をClin Exp Metasatsis(31:787-794,2014)に報告した。ヒト乳癌細胞のNoxファミリーの発現はNox 5で5種類、Duox 1で2種類の細胞に認められた。他のNoxファミリーの発現は、みられなかった。腫瘍細胞の転移能に影響を及ぼす因子の一つにNADPHオキシターゼ(Nox)により産生される活性酸素がある。Noxファミリーでカルシウムにより活性化されるものは、Nox5である。一方、細胞内カルシウムを調節するStanniocalcin-1(STC-1)が、腫瘍細胞で発現していることが明らかとなっている。そこで、Nox5とSTC-1が乳癌において転移能に影響を与えるか否かを検討した。さらに、Nox5およびSTC-1を指標とした乳癌の転移能を評価することができる転移マーカーの開発を目的とした。2426年度までの研究成果は、MDA-MB-231細胞にSTC-1遺伝子を導入し高発現させると、浸潤能が対照細胞と比較し有意に亢進した。また、マウスの尾静脈から移植して肺転移結節数を比較すると、対照細胞移植群より増強することをClin Exp Metastasis(31:787-784,2014)で報告した。最終年度では、1)STC-1遺伝子を導入し高発現させた細胞と対照細胞の細胞内カルシウムの変化を検討したが、両者に差異はなかった。2)Nox5を遺伝子導入し高発現させ運動能の変化を検討したが、明らかな変化は認められなかった。3)乳癌組織のNox5とSTC-1の免疫組織染色を原発巣およびリンパ節組織において検討したが、Nox5およびSTC-1の発現は確認できなかった本研究は研究期間でSTC-1が乳癌の転移能を規定している因子の一つであり、新たな転移予測マーカーとなり得る可能性を示した。しかしながら、当初予定していたNox5が乳癌の転移に影響を与える因子として同定はできなかった。今後、更なる検討が必要であると考えられる。本研究は、乳癌の転移予測マーカーの開発を目指した。癌の転移に影響を与える因子にNADPHオキシターゼ(Nox)から産生される活性酸素があり、細胞運動能を亢進させる。一方、カルシウム調節タンパクのスタニオカルシン-1(STC-1)が腫瘍細胞で高発現している。そこで、カルシウムにより活性化されるNox5およびSTC-1の分子に着目し研究を行った。乳癌細胞にSTC-1を高発現させると運動能が亢進し、さらにマウスの肺転移能が増強した。しかしながら、Nox5を高発現させても運動能に変化はなかった。以上より、STC-1は乳癌の転移能を亢進させ、新たな転移予測マーカーとなり得ることが示唆された。STC-1においては、乳癌細胞の転移に関与するメカニズムを証明した。免疫組織染色による発現検討は、STC-1の特異的な抗体を選ぶ事に時間を費やし、現在、検討中である。
遺伝子改変動物を用いた哺乳類における受精時の卵活性化機構の解析

現在、先進国では約16%ものカップルが不妊に悩まされており、社会的関心を呼んでいる。不妊原因として卵活性化不全が近年注目されている。卵活性化とは、停止していた未受精卵の細胞周期が受精刺激により再開する現象であり、個体発生に必要不可欠である。哺乳類では、受精時に精子由来の活性化因子(SOAF)により、卵内でCa2+濃度の反復性の上昇(Ca2+オシレーション)が起きる。このCa2+変化により卵活性化が誘発されると考えられているが、そこに関わる因子や詳細な機序については不明な点が多い。特にSOAFについては、複数の候補分子が挙げられているが、決定的な証拠はない。そこで本研究課題では、SOAFの候補分子を欠損する遺伝子改変マウスを作製し、精子の卵活性化能について検証を行うことで、SOAFの正体を明らかにすることを目的とした。今年度は初年度に得られた遺伝子改変マウスを使い、その精子の卵活性化能について、詳細な解析を行った。遺伝子改変個体から採取した精子を顕微授精に供し、SOAF候補遺伝子を欠損した精子の卵活性化能や受精卵のCa2+濃度変化を検証した。体外受精も行い、受精後の卵内Ca2+濃度変化およびその下流の反応である透明帯の硬化の様子を観察した。また、卵活性化異常を示す受精卵については、人為的卵活性化を誘導することでその不妊を救済することに成功した。更に、本研究課題を行うために有用な技術である受精卵のライブイメージングについては、卵活性化時の卵内Ca2+濃度変動を低毒性に観察し、観察後の胚から産仔を得ることに成功した。また、Ca2+濃度変化と同時に、その下流の現象である表層反応を観察し、両者の量的関係性を明らかにした。これらの成果について、査読付国際学術誌で発表している(Satouh and Nozawa et al., Biol Reprod, 2017)。28年度が最終年度であるため、記入しない。現在、先進国では7組に1組ものカップルが不妊に悩まされており、社会問題にもなっている。近年注目されている不妊の原因として卵活性化不全が挙げられる。卵活性化とは、停止していた卵の細胞周期が受精後に再開することを言い、生命発生の始まりとなるステップである。受精時に精子が持ち込む活性化因子(SOAF)により、卵内でカルシウム濃度の反復性の上昇(カルシウムオシレーション)が起きるが、そこに関わる因子や詳細なメカニズムについては不明な点が多い。特にSOAFについては、いくつかの候補分子が挙げられているが、決定的な証拠は示されていない。そこで本研究では、SOAFの候補分子を欠損する遺伝子改変マウスを作製し、精子の卵活性化能について検証を行うことで、SOAFの正体を明らかにする。さらに、機能ドメインの役割についても解析し、受精から細胞周期再開に至る卵活性化のメカニズム解明を目指す。初年度は、遺伝子改変マウスの作製および妊孕性解析を中心に研究を進めた。まず、受精における精子由来の卵活性化因子(Sperm-borne oocyte-activating factor: SOAF)の候補分子の遺伝子改変個体の作製に取り組み、計画通り複数系統の遺伝子改変マウスの樹立に成功した。また、本研究課題を遂行するに当たり、有用な技術となる卵活性化メカニズムを対象とした低侵襲性ライブイメージングの実験系の確立に成功した(論文投稿準備中)。これを用いて、SOAF候補であったPAWPのノックアウトマウス精子の卵活性化能が野生型と差がないことを明らかにした(Satouh et al, Biol Reprod, 2015)。初年度に計画していたSOAF候補分子の遺伝子改変マウスの作製に成功し、妊孕性や生殖機能への影響を解析することができた。

また、Ca2+濃度変化と同時に、その下流の現象である表層反応を観察し、両者の量的関係性を明らかにした。これらの成果について、査読付国際学術誌で発表している(Satouh and Nozawa et al., Biol Reprod, 2017)。今後も計画通りに進行していく。また、研究成果をまとめ論文投稿を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。
消防士の熱中症防止のための装具開発

消防士の熱中症を予防するためのヒートストレスアラームを開発・実証データを収集し、実際の火災現場での実用可能性を検討するために東京消防庁にヒアリングをした。その結果、さまざまな課題が提示される一方でその有用性も示唆された。一方で、換気型消防服の場合、粉塵や火炎による影響を防ぐための手立てを講じたが、粉塵や火炎による熱傷の可能性の完全な除去が難しかった。したがって、水冷服による体温調整システムを検証し、密閉系における体温調整の可能性について再検討した。本研究の目的は,「消防活動の作業性能と安全性を第一とし,衣服内気候の制御をする様なヒートストレス緩和策を取り入れた消防員装具を開発するとともに,着用者の皮膚温および体温,心拍数等をモニタリングし,リスクを回避する様なヒートストレスアラームを開発することによって消火活動中の消防士への負荷の低減を確認すること」である.本年度は、当研究室における実験環境の整備と行うとともに、(1)ヒートストレスアラームの開発に関する研究、(2)消防員装具着用時の熱収支モデルの検討と水冷服による実験に取り組んだ。すなわち、実験環境の整備としては、簡易人工気候室およびサーモビューアを研究室内に導入し、環境の温熱制御と可視化を可能にした。また、(1)に関して、皮膚温および心拍センサーから消火活動中の消防士の生態情報を収集し、無線LANにより指揮官および指揮所にデータを転送するシステムの試作モデルを作成し、被験者実験により実験室レヴェルでの生体情報のフィードバックに関するデータを収集した。また、(2)に関して、着衣実験データから高温環境下における消防士の体温上昇を予測することを試みるとともに、熱中症を予防するのに必要な熱量を予測した。次に重松製作所製の水冷服を活用して30°C・60%環境時における消防員装具着用時被験者の熱冷却の可能性について検討した。(1)および(2)に関しては、それぞれ研究論文を作成し、近日中に投稿する予定である。また、今後について(1)は実験室およびフィールド実験を継続し、(2)については今までの換気型消防服および頭部冷却システムも含めて再検証する。本研究の目的は、「消防活動の作業性能と安全性を第一とし、衣服内気候の制御をするようなヒートストレス緩和策をとりいれた消防員装具を開発するとともに、着用者の皮膚温および体温、心拍数等をモニタリングし、リスクを回避するようなヒートストレスアラームを開発することによって消火活動中の消防士への負荷の低減を確認することである。」本年度は、平成22年度に整備した環境において、水冷服による体温抑制実験を継続して実施し、6名の被実者を対象に運動時体温抑制効果を確認した。これは、換気服などの外気導入型の場合にフィルターを取り付けて煤煙の除去を試みたものの完全な煤煙抑制には至らなかったために、再度、内部循環型である水冷服に視点を当てたためである。一方でヒートストレスアラームについては、平成22年度作成したヒートストレスアラームにHRセンサーおよび加速度計を組み込んだ試作ヒートストレスアラームver.2を作成し、高温・運動負荷時における被験者の生体データの収集を試みた。さらに、この試作ヒートストレスアラームを東京消防庁にヒアリングにいき、現場レベルで使用が可能か否かの確認をおこなった。これに関しては、コスト面や現場での生体モニターの管理者を配置する状況が難しい点で、即利用は難しいものの5年度や10年後を見据えた場合には必要であるだろうというコメントが得られた。本研究は、消防員装具に視点を当てた研究であるが、被爆環境における防護服など、密閉型衣服に共通する問題点あるので今後も問題解決に向けた取り組みが重要である。本研究の目的は、ヒートストレス緩和策をとりいれた消防員装具の開発と着用者の生体情報をモニタリングし、リスクを回避するようなヒートストレスアラームの開発である。平成22年度は、簡易人工気候室およびサーモビューアを研究室内に導入し、環境の温熱制御と可視化を可能にした。また、皮膚温および心拍センサーから消火活動中の消防士の生態情報を収集し、無線LANにより指揮官および指揮所にデータを転送するシステムの試作モデルを作成し、被験者実験により実験室での生体情報のフィードバックに関するデータを収集した。さらに、着衣実験データから高温環境下における消防士の体温上昇を予測することを試みるとともに、熱中症を予防するのに必要な熱量を予測した。次に水冷服の熱冷却の可能性について検討した。平成23年度は、水冷服による体温抑制実験を継続して実施し、6名の被実者を対象に運動時体温抑制効果を確認した。

さらに、この試作ヒートストレスアラームを東京消防庁にヒアリングにいき、コスト面や現場での生体モニターの管理者を配置する状況が難しい点で、即利用は難しいものの5年度や10年後を見据えた場合には必要であるだろうというコメントが得られた。平成24年度は、補足データを収集するとともに3年間の研究成果をまとめている。被爆環境における防護服など、密閉型衣服に共通する問題点あるので今後も問題解決に向けた取り組みが重要である。装具開発については、検討事項が多いものの、ヒートストレスアラームについては現段階での完成を終えているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、消防員装具に視点を当てた研究であるが、被爆環境における防護服など、密閉型衣服に共通する問題点あるので今後も問題解決に向けた取り組みが重要である。ただし、消防現場の協力が難しく、そこを解決することが重要である。
近代ガラスの国産化と輸入の実態解明に向けた基礎研究－出遺遺物の科学分析を中心に－

本研究では、東京都渋谷区千駄ヶ谷五丁目遺跡第3次調査から出土した近代ガラス製品について、自然科学的な手法によって化学組成を求め、材質的な見地から輸入品と国産品といった生産地推定を行なうための基礎的データの取得を目指した。分析対象は、本遺跡第140号遺構から出土した1880年代前半のガラス製品で、輸入品と推測される板ガラス、国産と推測されるランプ火屋、生産地が不明の雑器類など、近代日本で西洋式ガラス製造が開始された初期の重要な資料である。まず、基礎作業として計測と写真撮影を行い、資料の記録化を行なった。その上で、エネルギー分散型蛍光X線分析装置を用い、定性分析を行なった。その結果、板ガラスと火屋は全てソーダ石灰ガラスであったが、Pb、Mn、Asなど微量元素のX線強度に差異が認められた。また、容器類は鉛ガラスとソーダ石灰ガラスに分類された。さらに比較検討するため、蛍光X線分析による定量分析を行なった。分析の結果、ソーダ石灰ガラスでは、主成分元素であるSiO_2、CaO、Na_2Oの濃度によって板ガラス群と火屋・雑器群の2グループに分類された。両者の化学組成は、板ガラス群はCaOが15%程度、Na_2Oが10%程度に対し、火屋・雑器群はCaOが10%未満、Na_2Oが15%程度と化学組成に明確な差異が認められた。この化学組成の差異は、ガラス生産地における原料やその調合の違いや、溶融設備などの影響(溶融温度が異なり、原料の調合も変化する)もあると考えられ、生産地を推定する基礎データとなるものである。本結果では、板ガラスと火屋・雑記では明確にガラスの化学組成が異なり、生産地が異なる可能性が高いことが明らかとなった。一方、火屋と雑器類(ソーダ石灰ガラス)では化学組成が類似しており、同一産地での製造も想定される結果となった。以上の結果から近代ガラス製品の生産地推定に向けた基礎的なデータを得ることができた。今後も研究を継続し、産地推定だけではなく、文献調査の成果も加味しながら近代ガラスの技術的の特性についても詳らかにしたい。
開発・安全保障の連結ー人の移動をめぐるＥＵ対外政策分析への応用

本研究は、冷戦後にみられる紛争への対応の中で提唱された安全保障と開発の連結をテーマとして取り上げる。安全保障・開発の連結は、今日の世界では人の移動(難民・移民)への対応において、問題となっている。先進各国は一方では人の移動が肯定的に取り上げられているSDGs推進を謳い、他方現実には安全保障を優先した政策を推進している。こうしたギャップは、「開発問題化」と「安全保障問題化」という2つの力学のせめぎ合いの結果としてとらえられる。本研究では、人の移動が対外政策の焦点に浮上している欧州連合(EU)のトランジット国・送出国に対する対外政策を事例研究に取り上げることで課題に応えようとするものである。
多階層制御による有機半導体材料の高機能化

前年度までの研究成果を受け、本年度は以下の検討を行った。1.優れたn型半導体骨格であるNTIの合成上の問題点を克服するため、昨年度開発した二つのCH結合活性化反応(NDIの選択的モノハロゲン化、及びNTIチオフェンα位の直接アリール化)のうち、後者の直接アリールの適用範囲を明らかにし、多様なNTI誘導体の合成を行った。このうち、複数のNTIユニットを三次元的に配置した新規な誘導体の開発もにも成功し、NTIユニットの数と物性、配向性、結晶性の相関を得た。また、これら新規分子を用いることで、現状で5%程度の光電変換効率の太陽電池が得られている。2.アセンジチオフェン系の結晶構造制御に関し、π拡張分子に関して結晶構造と移動度との相関を明らかにしただけでなく、分子構造を含セレン系にも拡張した。単結晶構造解析と単結晶トランジスタを用いる構造物性相関研究に加え、今年度、Hirshfeld表面解析とSymmetry Adapted Perturbation Theory計算を取り入れ、分子構造と結晶構造の相関を検討した。その結果、アセンジカルコゲノフェン系の結晶構造制御に関して分子間相互作用に関する定量的な知見を得た。この考えを他の分子骨格系にも拡張したところ、実際に結晶構造が系統的に変化することを見出した。3.-4.3 eVもの高いHOMOを持ちながら比較的安定なn型ドープ材料を開発した。その安定性は、分子内に回転の自由度をもつことが関連することが示唆された。また、この新規ドーパントにより代表的なn型ポリマーであるN2200のドープを行い、物性評価も行うことが出来た。このほか、種々のDNTT誘導体化のための鍵中間体の開発、光学活性分岐アルキル基導入のための試薬の開発、更には非平面有機半導体のための基本骨格の開発など、多くの多階層制御のための基本分子群を得ることに成功している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は有機合成化学を基盤に有機半導体材料の開発と有機トランジスタ、有機薄膜太陽電池などへの応用を行ってきた中で、従来の枠に囚われない未踏有機半導体骨格の探索、及び、それらの構造、電子状態を活かしつつ材料へと展開すること、さらには、薄膜中での材料の高次構造を制御することの重要性を認識してきた。これを受け,本研究では未踏有機半導体骨格の開発に焦点を当て、それらの設計・合成・応用を行うことを第一の目的とする。次に,薄膜中の分子配列、配向を分子設計の段階で制御することを目指す。本研究では、分子設計、精密有機合成、単結晶構造解析、薄膜構造解析、デバイス作製評価の異なる手法を用い研究を進めていき、最終的には、未踏骨格開発と高次構造の制御と共に、高性能トランジスタや有機薄膜太陽電池の実現に資する有機半導体の開発を行うことを目指している。初年度の平成27年度は、新規なn型未踏有機半導体骨格を標的分子として合成を中心に研究に着手し、既開発のナフトジチオフェンジイミド(NDTI)の簡便合成法と誘導体化法の開発、新規骨格であるナフトチオフェンイミド(NTI)の開発と応用展開、さらにはアセンジチオフェンジオンの開発など、当初標的としていた骨格の合成を達成した。また、従来から検討していたナフトビスチアジアゾール(NTz)、及びナフトビスオキサジアゾール(NOz)の開発と応用についても検討し、有機薄膜太陽電池において高い効率を実現するに至っている。一方、有機半導体分子の構造をもとに分子配列を制御する試みにも着手しており、NDTIへの選択的な置換基の導入により二次元的分子配列を実現し、電界効果トランジスタにおいて高い電子移動度が得られることなどを明らかにしている。これらの成果は、論文として学術誌に報告し、また、学会等でも広く発表する中で高い評価を得ている。今年度、新規なn型未踏有機半導体骨格を標的分子として合成研究に着手し、1)既に開発していたナフトジチオフェンジイミド(NDTI)誘導体の簡便合成法と修飾法の開発、2)一連のアセンジチオフェンジオンの合成、電子状態解析、およびポリマー半導体への展開、3)ナフトチオフェンジイミド(NTI)の現実的な合成法の開発、4)ナフトビス-オキサジアゾール、セレナジアゾールの開発とポリマー半導体への展開、などの未踏半導体骨格の開発と展開について実施することが出来た。以上はいずれも当初今年度に合成を計画した骨格であり、さらに、これらの未踏半導体骨格を用いた材料の薄膜構造の制御を試みについても成果を得た。例えば、1) NDTI骨格に塩素を導入することで分子間相互作用の様式を変化させ、材料の電子構造を擬二次元的にすることで、移動度を一桁以上改善し、大気中で安定なn型FETで移動度0.8 cm2/Vsを達成、2)既に開発していたp型半導体であるDNTTの可溶性と結晶性を両立できる分子修飾法を見出し、塗布トランジスタにより2.0 cm2/Vsを超える移動度を実現、3) NDTIを基盤として、低LUMO半導体ポリマーを開発。さらに可溶性アルキル基の形状を変化せることで、薄膜での電界効果移動度、電子ドープ後の伝導度、熱電特性が大きく変化、など、今後研究を進めていくうえで重要な知見である。

申請者は有機合成化学を基盤に有機半導体材料の開発と有機トランジスタ、有機薄膜太陽電池などへの応用を行ってきた中で、従来の枠に囚われない未踏有機半導体骨格の探索、及びそれらの構造、電子状態を活かしつつ材料へと展開する事、薄膜中での材料の高次構造を制御する事の重要性を認識してきた。これを受け、本研究では未踏有機半導体骨格の開発に焦点を当て、それらの設計・合成・応用を行うことを第一の目的とする。次に、薄膜中の分子配列、配向を分子設計の段階で制御することを目指す。本研究では、分子設計、精密有機合成、単結晶構造解析、薄膜構造解析、デバイス作製評価の異なる手法を用い研究を進めていき、最終的には、未踏骨格開発と高次構造の制御と共に、高性能トランジスタや有機薄膜太陽電池の実現に資する有機半導体の開発を行うことを目指している。昨年開発に成功した未踏n型有機半導体骨格であるナフトチオフェンイミド(NTI)の応用展開について検討し、分子の形を変化させることで薄膜(固体)状態における結晶性や分子配向を制御しトランジスタや太陽電池応用に適した材料の開発を行った(論文発表済)。一方、p型有機半導体骨格であるチエノアセン系の分子配列制御を試みる為、ベンゾジチオフェンをモデル化合物として置換基の導入を位置選択的に行った。その結果、チオアルキル基をチオフェンβ位に導入することで、通常のアセンやチエノアセン半導体では実現が困難なルブレンに類似した結晶構造となることを見出した。さらに、基板上での分子配向も結晶構造に影響を受けることが示唆され、単結晶トランジスタにおいてルブレン型結晶構造を持ち、side-on型の配向の誘導体が高い移動度を示すことが明らかとなった。これらに加え、DNTTへの汎用的な置換基導入のための合成法開拓など、高次構造制御のための方法論、及びそれらを実現するための合成手法の開発などを行った。昨年度に引き続き、n型、及びp型の半導体骨格を用い高次構造の制御を達成するために、1) n型半導体骨格であるナフトジチオフェンジイミド(NDTI)、及びナフトチオフェンジイミド(NTI)の大量合成法の開発と様々な分子修飾の実現、2) p型骨格であるベンゾジチオフェン(BDT)、及び、ナフトジチオフェンへ(NDT)への選択的硫黄置換基の導入法の開発と結晶構造制御法の開発、3)ジナフトチエノチオフェン(DNTT)への選択的かつ多様な置換基導入のための、鍵中間体の開発、などの研究を実施した。これらの合成的な進展により、複数個のNTI部位を分子内に導入した新規n型半導体の開発に成功し、その分子形状に応じて適した用途があることを見出した。即ち、シンプルな二量体構造では結晶性の薄膜を与え、高移動度かつ大気中安定なn型トランジスタに適した材料となる一方で、3個、または4個のNTI部を平面型、またはスピロ型に導入した誘導体では有機薄膜太陽電池におけるn型有機半導体として適したものとなることを見出した。これらに加え、p型半導体における結晶構造、及び配向制御を置換基の選択的導入により実現することに本格的に着手し、チオメチル基、及び類似のアルキルチオ置換基の導入が効果的であることを見出した。BDT、NDTなどの典型的なチエノアセンp型半導体骨格において、チオフェン環α位にチオメチル基を導入することで、ヘリンボーン型からルブレン様の“pitched pi-stack"構造になり、また、基板上でside-on型に配列することを確認した。現状で単結晶トランジスタにおける移動度への影響は限定的(一桁程度向上)であるものの、今後の分子配向制御の手法として有望と考えている。
日本における高等教育市場の構造分析と最適教育政策

本研究の目的は、日本における高等教育市場の構造を経済学的及び心理学的に分析し、そこから得られる知見によって高等教育政策の最適化問題を新たな側面から分析することにある。供給者の生産構造分析には、データの利用可能性に関して強い制約を強いられる従来の計測方法ではなく、費用と生産の双対性によって導かれるインプット距離関数に重点をおく。需要者の大学選択行動分析においては、経済学的分析手法に心理学分野の学問的成果を有機的に取り込んだ理論モデルの構築が必要である。研究期間1年目は、まず生産構造分析に関しては、過去の研究課題(15K03435)で取り組んだインプット距離関数の分析方法を整理し、それと同じの方法で本研究の関数推計が可能かどうか、検証の準備を始めた。需要者の大学選択行動に関しては、基本的な従来型の内生的経済成長モデルに教育選好を内生変数として導入したシンプルな大学選択モデルを作成した。さらに心理学分野の知見を深めるため、必要な文献や論文・資料の収集を行った。具体的には、心理学分野の、判断による選好順序と意思決定による選好順序は必ずしも同じではなく逆転するケースがあるとされる選好逆転現象(preference reversal phenomenon)を本研究での経済理論モデルに取り込むために、顕著性仮説(prominence hypothesis)を前提とした状況即応的重みづけモデル(contingent weighting model)等に関連した知識の蓄積を目指した。これは来年度以降も継続して取り組んでいく。他に継続課題を抱えていたため、そちらにかなりの時間を割いてしまった。今年度からは取り組む課題が本件のみのため、当初の予定通り、本研究に専念する.本研究の目的は、日本における高等教育市場の構造を経済学的及び心理学的に分析し、そこから得られる知見によって高等教育政策の最適化問題を新たな側面から分析することにある。今年度からは取り組む課題が本件のみのため、当初の予定通り、本研究に専念する.他の継続課題の研究に時間を使ってしまったため、本研究予算を使用することができなかった。今年度から集中的に本研究に取り組み、当初の使用計画にそって実施する。
血友病A遺伝子治療に関する基礎的研究-第VIII因子サブユニットの発現と再構成-

第VIII因子cDNAのうちH鎖およびL鎖に相当する約2kbのcDNAをそれぞれ作成し、発現ベクターpNeoIG502に別々に組み込んだ後、CHO(Chinese Hamster Ovary)細胞に遺伝子導入し、H鎖およびL鎖の各サブユニットを発現させた。発現した第VIII因子サブユニットを培養上清中でCaCl_2もしくはMnCl_2の存在下で再構成させた後、凝固1段法および合成発色基質法にて第VIII因子活性を、抗ヒト第VIII因子モノクローナル抗体を用いたサブユニット特異ELISA(Emzyme-linked immunosorbentassay)により第VIII因子抗原量を測定した。それによると、L鎖サブユニットは0.020.04U/mlとわずかながら発現が認められたが、H鎖サブユニットの発現および第VIII因子凝固活性は全く認められなかった。そのため遺伝子導入効率がより優れているとおもわれるアデノウイルスベクターに変更しCHO細胞を標的細胞として再度発現実験を行った。その結果、培養上清中のL鎖サブユニットは0.10.2U/mlの発現が認められたが、H鎖サブユニットの発現および第VIII因子凝固活性はほとんど認められなかった。現在、使用するベクターをレトロウイルスベクターやアデノ関連ウイルスベクターに、標的細胞をヘパトーマ細胞(HepG2)や皮膚線維芽細胞、マウス筋芽細胞に変更し、遺伝子導入効率、導入遺伝子の安定性および遺伝子発現効率について検討中である。血友病犬をモデルとした遺伝子治療を行うにあたり、ヒト第VIII因子とイヌ第VIII因子の生物学的活性および構造上の相違を明らかにすべく基礎的研究を行った。1.凝固一段法を用いたヒトおよびイヌ第VIII因子活性の測定正常イヌ75匹から得られた血漿を用いて測定したプロトロンビン時間は平均6.7秒(正常ヒト対照1013秒)、また部分トロンボプラスチン時間は平均10.5秒(正常ヒト対照3035秒)とヒトに比してイヌの凝固能は亢進していることが予想された。続いて正常イヌプール血漿中のイヌ第VIII因子活性を測定したところ正常ヒト第VIII因子のほぼ10倍の活性を有していることが明らかになった。2.抗ヒト第VIII因子抗体を用いたイヌ第VIII因子のヒト第VIII因子に対するcross-reactivityの解析ヒト第VIII因子H鎖44kDaフラグメントを認識する同種抗体のヒト第VIII因子に対するイヌ第VIII因子のcross-ractivityは1039%。同じくL鎖72kDaフラグメントを認識する同種抗体では125157%であった。H鎖54kDaおよび44kDaフラグメントを認識するモノクローナル抗体のcross-reactivityはそれぞれ、2.7%および0%であった。一方、L鎖のうちA3ドメインおよびC2ドメインを認識するモノクローナル抗体のcross-reactivityはそれぞれ、0%および130%であった。これらの結果より、イヌ第VIII因子はひと第VIII因子に比してH鎖A1、A2およびL鎖A3ドメインの相同性は低く、L鎖C2ドメインの相同性が高いことが明らかとなった。発現された第VIII因子サブユニットはそれぞれH鎖A2ドメインを認識するモノクローナル抗体JR8およびL鎖C2ドメインを認識するモノクローナル抗体NMC-VIII/5を用いて10mMEDTA存在下で免疫純化した後、サブユニット特異ELISA(Emzyme-linked immunosorbent assay)により解析した。それによると、L鎖サブユニットは0.020.04U/mlとわずかながら発現が認められたが、H鎖サブユニットの発現は全く認められなかった。

その結果、培養上清中のL鎖サブユニットは0.10.2U/mlの発現が認められたが、H鎖サブユニットの発現はほとんど認められなかった。現在、使用するベクターをレトロウイルスベクターやアデノ関連ウイルスベクターに、標的細胞をヘパトーマ細胞(HepG2)や皮膚線維芽細胞、マウス筋芽細胞に変更し、遺伝子導入効率、導入遺伝子の安定性および遺伝子発現効率について検討中である。