hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
担子菌からの新しい免疫抑制作用物質の探索と利用

我々は免疫作用性成分の系統的探索が従来比較的少なかった担子菌を天然素材として選び、マイトゲンによるマウス脾リンパ球増殖(幼若化)に対する抑制活性を指標にして、約40種の担子菌につき系統的に検索し、その結果、約10種の担子菌に有意な活性を見出した。そこで、本研究では活性を示した担子菌中、比較的強い活性を有するキハツタケLac-tarius flavidulus、コツブタケPisolithus finctorius、ウチワタケMicroporus flabelliformis、カイガラタケLenzites betulinaにつき各抽出エキスを活性を指標に分画し、それぞれの活性本体を単離し、化学構造を解明し、更に新しい免疫抑制剤の開発のための先導化合物としての利用を考慮し、活性発現に必要な構造要因について検討した。キハツタケからの活性成分3種はLF-1、-2、-3と仮称され、以前同菌より得られていた抗菌性物質のゲラニルフェノールであるflavidulol A及びその関連物質のflavidulol B、Cにそれぞれ同定された。コツブタケからの活性成分5種はPT-1、-2、-3、-4、-5と仮称された。PT-1、-2は以前同菌より得られていた24-methyllanosta-8,24(28)-diene-3β,22ξ-diolとpisolactone[(22S)-24-methyllanosta-8-en-22,28-epoxy-3β,-ol-28-one]にそれぞれ一致すると推定された。PT-3はpisolactoneに関連した構造を有する2種の互いに異性体関係にある新化合物の混合物であると推定された。PT-4、-5はウチワタケ、カイガラタケからの活性成分に一致し、それぞれergosterol peroxide,9(11)-dehydroergosterol peroxideであると判明した。今回得られた8種の活性成分中、既に免疫抑制活性が知られていたものはergosterol peroxideのみであり、他の7種のものは今回初めて免疫抑制活性が明らかとなった。今回得られた8種の活性成分について、それぞれ構造活性相関につき誘導体作成による活性比較等の方法により検討を行った。コンカナバリンA(Con A)やリポポリサッカライド(LPS)をマイトゲンとして増殖させたマウス脾臓リンパ球に対する抑制活性を指標に行った免疫抑制活性の検索で活性を示した約10種の担子菌中、LF-1と仮称した活性成分の単離に成功したキハツタケLactarius flavidulusにつき、更に活性成分の探索を目指した。又、LF-1の活性発現に必要な構造要因の解明を目指した。更に、同様に活性を示したウチワタケMicroporus flabelliformisについても活性本体の単離を目指した。1.キハツタケの免疫抑制活性成分についてリンパ球増殖抑制活性成分LF-1は、以前、同菌から抗菌性物質として得られていたゲラニルフェノールの一種であるflavidulol Aに一致することが判明した。又、LF-1に続いて、LF-2、-3と仮称した活性成分を単離し、これらが以前同菌から得られていたflavidulol B、Cにそれぞれ一致することが判明した。flavidulol A、B、Cが免疫抑制活性成分として単離されたのは今回が最初である。

flavidulol A、B、Cのリンパ球50%抑制濃度(IC_<50>)はCon A誘導増殖に対し8.9、4.9、36.3μg/ml、LPS誘導増殖に対し6.7、3.9、28.3μg/mlでそれぞれあった。LF-1はヒトKB細胞に対しては抑制活性を示さなかったので、LF-1のリンパ球増殖抑性活性は細胞特異性を有している。LF-1を化学反応により数種の誘導体に導いて、それらのリンパ球増殖抑制活性を測定し、LF-1のそれと比較した結果、LF-1の活性発現に必要な構造要因を明らかにした。2.ウチワタケの免疫抑制活性成分について前年度に行ったキハツタケ、ウチワタケからの免疫抑制活性成分の単離に引き続き、本年度は、先に行った系統的検索で有意な免疫抑制活性が示されたコツブタケPisolithus tinctorius、カイガラタケLenzites betulinaについて、マイトゲン刺激マウス脾リンパ球増殖(幼若化)に対する抑制活性を指標に、菌体抽出エキスを分画し、活性本体の単離、化学構造の解明、及び活性発現に必要な構造要因の検討を行った。コツブタケからの活性成分は5種で、PT-1、-2、-3、-4、-5と仮称され、それぞれの性状とスペクトルデータの詳細な検討が行われた。その結果、、PT-1、-2は以前に同菌より得られていた24-methyllanosta-8,24(28)-diene-3β,22ξ-diolとpisolactone〔(22S)-24-methyllanosta-8-en-22,28-epoxy-3β-ol-28-one]にそれぞれ一致すると推定された。PT-3はpisolactoneに関連した構造を有する2種の互いに異性体関係にある新化合物(22S,24R)-24-methyllanosta-8-en-22,28-epoxy-3β,28α-diolと(22S,24S)-24-methyllanosta-8-en-22,28-epoxy-3β,28β-diolの混合物であると推定された。又、PT-4、-5はカイガラタケから単離された活性成分に一致し、これらはそれぞれ前年度にウチワタケから単離されていたergosterol peroxide、9(11)-dehydroergosterol peroxideであると同定された。これらの5種の成分中、ergosterol peroxideは近年、担子菌Tricholoma populinumから免疫抑制活性成分としての単離が報告されているが、その他の4種の成分は今回初めて免疫抑制活性成分として得られたものである。これら5種の成分について誘導体を作成して活性を比較する等の方法により、新しい免疫抑制剤の開発のための先導化合物としての利用を考慮し、活性発現に必要な構造要因について検討を行った。
複雑な形状を持つ物体の数理的モデリングとその同定に関する研究

本研究の目的は不規則形状を持つ物体に対してそれらの幾何学的情報を数理的にモデリングし、同定するためのコンピュータアルゴリズム手法の開発であった。複雑な形状を持つ物体の数理モデルとしてフラクタル次元を導入した。フラクタルは形状の複雑さをフラクタル次元によって定量的に記述できる手法である。しかし、従来の一つのフラクタル次元ではカテゴリー分類を行う場合、高い分類精度は得られない。このため、従来のフラクタル次元とハウスドルフ次元より定義されるフラクタル特徴変数を提案し、一つのサンプルから複数の情報を得て、マハラノビス距離によって物体を同定する手法を提案した。この結果、フラクタル次元によってLSIウェーハに付着する異物の形状が数理的に表現できることが確認された。フラクタル次元を画像解析やカテゴリー分類に利用する場合、フラクタル次元が同じ種類のサンプルであってもサンプルによって値が異なるため、一つの種類の現象や形状を確定値によって表現できない問題があった。これを解決するために確率過程論よりフラクタル次元を確率的に定義し、不規則形状を持つ物体の数理モデルとして確率的フラクタル変数を定義した。さらに、最尤法による異物の同定手法を提案し、実データにより同定実験を行って確率的フラクタル変数の有効性について検証した。カテゴリー分類にフラクタル次元を用いる場合の問題が解決され、フラクタル次元を矛盾なく自然界の不規則形状物体に適用できるようになった。確率的フラクタル変数はフラクタルの概念に基づいたモデルであるにもかかわらず、異物の自己相似性については考慮に入れていない。これに対して自己相似性が認められる領域を特定し、自己相似性を考慮に入れた物体形状の数理モデルとして確率的局所フラクタル変数を定義した。これにより、同定精度を向上することが可能になった。
抗氷核活性物質、不凍蛋白質を用いた移植肺の低(氷)温保存に関する基礎的研究

細胞を安定化し低温保存できる抗氷核物質(Antifreeze product, AFP)を用いた肺の低温(氷温)保存が臓器細胞保存と移植後再還流障害の抑制に及ぼす効果についてラットを用いた動物実験を行った。【対象と方法】保存液を糖分を含まないEuro-Collins(EC)液にした.EC液にブドウ糖(3.5g/100ml)を加えたものをECG液,EC液に保存効果の高いトレハロース(6.84g/100ml)を加えたものをECT液,ECG液にBacillus thuringiensis由来のAFP(200μg/ml)を加えたものをAFP液とした.250-300gのWister系ラットで心停止後、心臓と肺を取り出し,次の8群に分類した保存法で1時間および24時間保存した.各群でtrypan blue排泄・ATP, LDHによる細胞活性・病理所見による肺損傷など保存肺の組織活性を検討した.(各群n=4)1群:-1°CEC液,2群:4°CEC液,3群:-1°CECG液,4群:4°CECG液,5群:-1°CECT液,6群:4°CECT液,7群:-1°CAFP液,8群:4°CAFP液.また,250-300gのWister系ラットを用いて,3群,5群,7群で左肺同種移植を行った.移植後2時間で移植肺を摘出し,病理学的評価と乾湿重量比を測定した.(各群n=2)結果の数値は平均値で表し、Mann-Whitney Utestで比較検定した。p<0.05以下を有意差ありとした。左肺同種移植後,摘出肺の評価:病理学的には肺水腫の所見であったが3群,5群,7群で差は確認できなかった.乾湿重量比は3群,5群,7群でそれぞれ0.45,0.41,0.43と差を認めなかった.【結論】AFP添加による肺保存効果はトレハロースに比べ少ないが,特に低温での保存に有用である可能性がある.細胞を安定化し低温保存できる抗氷核物質(Antifreeze product, AFP)を用いた肺の低温(氷温)保存が臓器細胞保存と移植後再還流障害の抑制に及ぼす効果についてラットを用いた動物実験を行った。【対象と方法】保存液を糖分を含まないEuro-Collins(EC)液にした.EC液にブドウ糖(3.5g/100ml)を加えたものをECG液,EC液に保存効果の高いトレハロース(6.84g/100ml)を加えたものをECT液,ECG液にBacillus thuringiensis由来のAFP(200μg/ml)を加えたものをAFP液とした.250-300gのWister系ラットで心停止後、心臓と肺を取り出し,次の8群に分類した保存法で1時間および24時間保存した.各群でtrypan blue排泄・ATP, LDHによる細胞活性・病理所見による肺損傷など保存肺の組織活性を検討した.(各群n=4)1群:-1°CEC液,2群:4°CEC液,3群:-1°CECG液,4群:4°CECG液,5群:-1°CECT液,6群:4°CECT液,7群:-1°CAFP液,8群:4°CAFP液.また,250-300gのWister系ラットを用いて,3群,5群,7群で左肺同種移植を行った.移植後2時間で移植肺を摘出し,病理学的評価と乾湿重量比を測定した.(各群n=2)左肺同種移植後,摘出肺の評価:病理学的には肺水腫の所見であったが3群,5群,7群で差は確認できなかった.乾湿重量比は3群,5群,7群でそれぞれ0.45,0.41,0.43と差を認めなかった.【結論】AFP添加による肺保存効果はトレハロースに比べ少ないが,特に低温での保存に有用である可能性がある.細胞を安定化したまま保存温度を低くできる抗氷核多糖類を用いて肺の保存実験を行った.肺保存液としてKrebs-Henseleit(K-H)液を用いた.K-H液に100μg/mlとなるようにBacillus thuringiensis由来の抗氷核多糖類を加えたものをAFP液とした.250-300gのWister系ラットで心停止後、心臓と肺を取り出し,次の6群に分類した保存法でそれぞれを保存した.trypan blue排泄・ATP,LDHによる細胞活性・病理所見による肺損傷など保存肺の組織活性を検討した.1.4°CK-H液で1時間保存(1群)2.4°CK-H液で72時間保存(2群)3.-3°CK-H液で72時間保存(3群)4.4°CAFP液で1時間保存(4群)5.4°CAFP液で72時間保存(5群)6.-3°CAFP液で72時間保存(6群)(各群n=4)

結果細胞ATP,LDHの結果は1-6群の順に,肺ATP(μmol/mg):758.0±113.5,172.5±28.8,117.1±92.5,779.0±139.2,89.4±5.8,42.3±32.3,肺LDH(IU/g):13.6±5.0,11.9±8.0,17.0±13.5,12.4±8,1,10.1±4.0,6.9±3.9であった.肺ATPで-3°C保存群は4°C保存群に対し有意に低下していた.抗氷核多糖類添加の有無については,-3°C保存群,4°C保存群ともに有意差がなかった.同様にtrypan blue排泄能の低下・細胞浮腫などの細胞障害は-3°C保存群で4°C保存群に比べ強かったが,抗氷核多糖類添加の有無については差を認めなかった.K-H液をベースとした場合,抗氷核多糖類添加による保存効果は少ない.K-H液自体が多量の糖を含み抗氷核多糖類添加の効果を弱めている可能性がある.現在,保存液を糖分を含まないEuro-Collins液にして実験を追加している.【目的】細胞を安定化し低温保存できる抗氷核多糖類(AFP)を用いて肺の保存実験を行った.【対象と方法】前年度は,高糖濃度のKrebs-Henseleit液を肺保存液とした場合,AFP添加による保存効果は少ないことがわかり,保存液は糖分を含まないEuro-Collins(EC)液にした.EC液にブドウ糖(3.5g/100ml)を加えたものをECG液,EC液に保存効果の高いトレハロース(6.84g/100ml)を加えたものをECT液,ECG液にBacillus thuringiensis由来のAFP(200μg/ml)を加えたものをAFP液とした.250-300gのWister系ラットで心停止後、心臓と肺を取り出し,次の8群に分類した保存法で1時間および24時間保存した.各群でtrypan blue排泄・ATP,LDHによる細胞活性・病理所見による肺損傷など保存肺の組織活性を検討した.(各群n=4)1群:-1°CEC液,2群:4°CEC液,3群:-1°CECG液,4群:4°CECG液,5群:-1°CECT液,6群:4°CECT液,7群:-1°CAFP液,8群:4°CAFP液.【結論】AFP添加による肺保存効果はトレハロースに比べ少ないが,特に低温での保存に有用である可能性がある.
メタファーとメタ思考-近現代ドイツ文学の場合

本研究は、西欧思想の核心である「メタ思考」と、従来その表現技法として従属的に考えられてきた「メタファー」の関係を理論的に再検討し、後者の前者に対する意義を起源ないし根拠として捉え直すと同時に、その具体的な事例分析を近現代のドイツ語圏テクストを中心におこなった。その結果、「メタファー」は、その表現技法的な側面の背後に、「メタ思考」を誘発しい方向付ける機能をも有しい両者の関係は階層性によってではなくい相互性から捉える必要があるという知見を得た。本年度は研究計画に従い「メタ思考」と「メタファー」の構造に関する暫定的な理論仮説を立てることを目標に研究を進めた。その際、両者を直接的に理論的研究対象とする修辞学・メタファー論等の研究史の検討のみならず、周辺領域における関連理論を幅広く取り上げ、構造の類似性等で有効性が認められるものを比較考量し、諸理論の配置を暫定的に整理した。具体的には、ヴァインリヒ等の古典的な隠喩論およびリクール等の現代的な隠喩論の「メタ思考」観点からの構造分析と比較整理、エクリチュール論・テクスト論・批評理論等の現代文芸理論に現れるメタファー現象の構造分析と理論の「メタ」性の抽出、さらには社会システム理論・認知理論・情報処理理論等の周辺領域に見られるメタファー的思考および対象に対する「メタ観察」構造の分析をおこなった。その結果、統一理論を立てるまでにはいたっていないが、共通するメタ思考の構造類型を暫定的に整理することが可能になった。また、具体的なメタファー表現作品の分析として、映画・映像・写真・絵画・アニメ等の視覚的なイメージにおけるメタファー性を取り上げ、近年の新しいデジタル・メディア技術を用いたコンピュータ処理や編集の方法が検討された。このような新たな表現処理の方向性が、美学的な領域に従来と異なるメタファー感覚あるいはメタ思考の可能性を切り開いているかという問いについては、結論を出すにはまだ不確定な要素が多く、また検討すべき課題が数多く残っており、次年度以降も継続する研究テーマとして扱うこととした。研究計画に従い、本年度は、前年度に着手した「メタ思考」と「メタファー」の関係性に対する理論的な研究をより精緻なものにすること、ならびにその具体的な現われを文学・批評・思想等のテクストから抽出し、理論的仮説の妥当性を検証することを中心テーマとして研究作業を進めた。理論的な研究に関しては、前年に引き続き、リクールをはじめとする現代隠喩論の視点を検討した。その際、メタファーがもたらす意味の二重化現象に対し、それらを「分離する」あるいは「結合する」の違いはあるにせよ、両者の境界領域の可視化を肯定的に捉え、テクストの創造性と解釈の多様性へと関連付けるといった共通の方向性が確認された。しかし、多くは自身の「観察のメタレベル化」という階層構造に対しては無自覚であり、自己関係性の構造まで踏み込んだ理論的枠組みの必要性が今後の課題となっている。他方、具体的なテクスト分析では、ブルームやカフカ等ユダヤ人作家に見られる宗教テクストとその解釈におけるメタファーの生産的役割、戦後ドイツ文学におけることばの意味の分解・再構成の実験とその方法論としてのメタファー、ロマン派から現代に至るユートピアとしての芸術コミュニティ幻想とそれを志向するテクストが孕む逃避的メタファーの機能、等が主たるテーマとなった。いずれの分析対象においても、表現形式に差異はあっても、その根底には「メタファーとメタ思考」の相互依存性が明確に認められた。ただし、先ほど挙げた自己言及構造に関しては、具体的なテクスト分析からもやはり理論的な統一性を明確にするまでには至っておらず、来年度以降の課題となっている。本年度は、研究計画に従い、平成17、18年度に暫定的に整理した「メタファー」理論および「メタ思考」理論の再検討を行うとともに、それを近現代ドイツ文学・思想に関する具体的なテクスト分析に適応し、その妥当性を個別のテーマに即して検証するという作業を中心に研究を進めた。その成果をテーマ別に挙げておく。まず、現代社会思想に関するテクスト分析(ハーバマス、ルーマン等)では、社会的コミュニケーションにおける意味転換のメカニズムがメタファー機能を重要な要素としていることが確認された。言語の同一性と非同一性の差異を調整しつつ、相互理解を目的とする公共的コミュニケーションにおいても、メタファーによる意味の偏差が極めて重要な役割を果たしており、言及対象に対する「メタレベル」の擬似的創出を可能にしていると考えられる。また、近現代文学に関するテクスト(ベンヤミン、マン等)では、未知なるものあるいは他者なるものの先行的な可視化にメタファー機能が応用されている点、またその先行的なメタファー的表現の付与がメタレベルにおける意味体系への回収に大きく寄与している点が分析結果として得られた。さらには、現代芸術理論に関するテクスト分析においては、歴史的に蓄積された意味の古層へと遡及するようなメタファー機能が認められると同時に、前衛的な芸術における伝統的な美的価値へのアンビバレントなスタンスを表現するメタファー効果も確認された。

他にも、ユダヤ文学における聖典と解釈テクストの関係、メディア理論における伝達媒体そのものの意味転換作用等の分析においても、「メタファー」が「メタ思考」の基礎的な機能を担っていることが認められた。最終年度である本年度は、研究計画に基づき、平成17年度から始められた理論的な研究の成果と、平成18年から並行して進められた具体的なテクスト分析の成果を融合し、「メタファー」と「メタ思考」の関連性についての総合的な検討と評価を行った。その結果、理論的な仮説、すなわちメタファーはメタ思考の表現に表層的に寄与する「方法論・技術論」としての側面と、メタ思考を創造・誘発する「起源・原理」としての役割の二重の機能があるという仮説が、主に近現代西欧思想ならびにドイツ文学のテクスト分析によって確認された。ただし、その現れ方はテクストの性格によって明らかな傾向があり、哲学的・思想的なテクストにおいては意味の体系的同一性を確保しつつ現象の多様性を表現しようとする形で前者の機能が、美学的・文学的なテクストにおいては現象の継続の即物性に切れ目を入れ、隠された意味を明らかにしようとする挺として後者の機能が多く見られる。このような二重性は一般に言語が本来有するメディア的媒介性と密接に関連していると考えられるが、このメカニズム自体が主題化されると同時に戦略的な方法論として扱われている場合もあり、ベンヤミンの「アレゴリー的」批評理論、ブルーメンベルクの「絶対的」メタファー論、ルーマンの社会システムの意味論的構造化、ユダヤ教における聖典解釈術などにその例を認めることができる。
急性期後早期の精神障害者に対する訪問リハビリテーション介入の確立

精神障害者の地域移行および地域生活継続のためにリハビリテーション介入が重要であるが、技法が確立しているとはいえない。とくに精神科訪問リハビリテーションの実践報告は散見されるようになったが、効果検証の研究はほとんどない。本研究では、精神障害の急性期後早期から実施可能な精神科訪問リハビリテーション介入技法を開発し、その効果について検証する。この精神科訪問リハビリテーション技法が、安全に実施でき、精神障害者の社会機能を改善し、非自発的(強制)入院を減少させ、そして生活の質(QOL)の向上もたらすことを検証する。
分裂酵母に劇的な細胞死を誘導するメカニズム

分裂酵母のura4遺伝子破壊株の細胞溶解のメカニズムを調べることを目的として研究を行なった。まず、細胞溶解の引き金となっている条件を調べたところ、ウラシルの枯渇が細胞溶解を誘導する主要因であることが明らかになった。さらに細胞溶解が起こる条件下では、細胞内にOMPが蓄積していた。細胞溶解を抑圧する遺伝子変異のスクリーニングを行なった結果、pub1遺伝子の欠損がよいサプレッサーであった。Pub1はユビキチンリガーゼであり、これが欠損することにより、ウラシルトランスポーターであるFur4の局在性の変化を誘発した。そのことがPub1欠損による細胞溶解の抑圧をしている理由であると考えられる。分裂酵母Schizosaccharomycespombeのura4遺伝子を破壊した株は、ウラシル要求性を示すことや5-Fluorotic acidに耐性を持つことが知られている。Ura4タンパク質はde novo UMP合成経路において最も下流に位置しておりOrotidine-5-monophoshate(OMP)を脱炭酸反応によりUridine-5-monophoshate(UMP)に変換するOMPデカルボキシラーゼである。このura4遺伝子破壊株をYPD培地で培養した時に、定常期に達する細胞は溶解することを発見し、その原因を調べることとした。分裂酵母で見られる溶解は、出芽酵母のURA3変異株では見られないことから、何らかの代謝系の違いが考えられる。細胞溶解現象は、他種のS. japonicusにおいても観察されることから、細胞溶解はSchizosaccharomyces属特異的な現象である。まず始めに、LC-MSを用いて酵母細胞内の代謝物を測定した。その結果、YPD培地で培養したΔura4株にのみOMPが蓄積しており、出芽酵母のURA3破壊株では蓄積していないことがわかった。S. pombeと同様に細胞溶解を起こすS. japonicusにおいてはOMPの蓄積はみられた。また、ウラシルの添加によりOMPの蓄積量が減少した。細胞溶解が起こらないYE培地では、OMPの蓄積は認められていない。これらの結果より、OMPの蓄積と細胞溶解は密接に関係している可能性が示唆された。さらに、非必須遺伝子破壊株のライブラリー3400株を用いて細胞溶解の程度を評価した。これらの株はura4に変異が導入されているため、これらの株をYPD培地で培養し、アルカリフォスファターゼの酵素活性を評価することにより細胞溶解の程度を調べた。その結果、複数の株で細胞溶解が抑圧されている結果を得た。これまでに、分裂酵母Schizosaccharomyces pombeのura4遺伝子破壊株をポリペプトン含有培地であるYPD培地において培養することで劇的な細胞溶解が起こることを見出している(Yuzy Matsuo, et al, PLoS ONE 2013)。その詳細な仕組みの解明を目的として、本研究を行なった。この細胞溶解現象をカルコフラワーを用いて観察すると細胞壁の一部が弾け、その箇所より細胞の中身が流出していた。細胞溶解はura4遺伝子破壊株においてのみ観察され、同経路にある他の酵素(Ura1, Ura2, Ura3, Ura5)の変異体では観察されない。Ura4タンパク質はde novoUMP合成経路の下流に位置するOMPをUMPに変換する酵素である。それゆえに、ura4遺伝子破壊株は細胞外より取り込んだウラシルよりUMPを合成する為ウラシル要求性を示す。また、ura4遺伝子と他のura遺伝子の二重遺伝子破壊株を作製した場合細胞溶解が抑圧されることを明らかにしている。このことより、Ura4の反応の前駆体であるOMPの蓄積が細胞溶解を誘導するのではないかと考えている。実際にLC-MS/MSを用いて細胞内OMPを測定するとYPD培地で培養したura4遺伝子破壊株特異的にOMPが蓄積していることを明らかにした。OMPの蓄積はYES培地で培養した場合や野生株、他のura遺伝子を破壊した株では見られないことからOMPの蓄積が細胞溶解を誘導することを強く示唆する結果となった。細胞溶解を抑圧する他のサプレッサー変異体をライブラリーより探したところ、pub1欠損株が強い抑圧効果を示した。Pub1はユビキチンリガーゼとして、ターゲットのユビキチン化を誘導すると考えられる。そこでウラシルの取り込みに関与するFur4の挙動を調べたところ、細胞内局在が変化することを見いだした。遺伝子工学1)ポリペプトンによる細胞溶解の原因の特定を行なうことを目的として研究を行なった。ポリペプトンにより細胞溶解を引き起こすura4破壊株を遺伝的バックグラウンドとして、分裂酵母で溶解を起こさないサプレッサー変異を取得することに成功し、それらサプレッサーが同定ができた。これらの解析から、細胞溶解メカニズムを解明につながる結果が得られているので、おおむね順調に研究は進展している。2)ミトコンドリアの機能と細胞死の関係を調べることを目的として研究を行なった。

細胞溶解しない変異体の中には、ミトコンドリアでのATP産生に関わるものが含まれていることが分かった。これらの解析から、ミトコンドリアの機能との関連する結果が得られたので、おおむね順調に研究は進展している。3)cAMP関連の経路と細胞溶解の経路の関連性を調べることを目的として研究を行なった。細胞溶解の程度にcAMP経路の直接的な関与は認められなかったが、研究計画どおりに研究は推進できた。4)マイクロアレーを用いた細胞死関連遺伝子のスクリーニングを行なうことを計画していたが、この研究は進めることができなかった。代わりにLC-MSを用いた代謝物の解析が進み、細胞溶解時に蓄積する代謝物を同定することができたことから、研究は順調に進展した。1)細胞溶解を誘導する物質の探索を行なっていく。特に、YPD培地中のポリペプトンに含まれる細胞溶解誘導物質の探索を行なう。ポリペプトンはカゼインタンパク質を酵素処理することで得られる低分子量ペプチドと遊離アミノ酸の混合物である。しかし、ポリペプトン中には各種無機イオンなども豊富に含まれている。そこで、YPD培地と同様に細胞溶解が誘導される培地の探索を行う。2)細胞溶解はura4遺伝子破壊をYPD培地で培養した時、定常期で起こる現象である。ura4破壊株ではOMPからUMPを合成することができずウラシル要求性を示すが、外から添加したウラシルは、サルベージ経路でUMPが合成される。その時には、細胞溶解が起こらない。そこで、細胞溶解が起こる時と、起こらない時での、OMPの蓄積量をLC-MSを用いた代謝物の測定により調べていく。3)細胞溶解を起こさないサプレッサー変異体の解析を行なう。分裂酵母の非必須遺伝子破壊株3400株をBioneer社より購入し、それらの細胞溶解程度を調べている。これらの株はura4変異を有しているため直接YPD培地に培養することでスクリーニングが可能であった。その結果、ある程度予想ができていた、ura1破壊株などに加え、アクチンを介した輸送に関与する因子end4(エンドサイトーシス), myo52(ミオシン)が細胞溶解を抑圧している結果が得られている。その他、ウラシルの取り込みを制御するタンパク質、ミトコンドリア機能関与するタンパク質などの関与が示唆されたことから、これらの因子の細胞溶解への関与を今後調べていく。4)細胞溶解時に変動があるタンパク質の同定を行なう。Nano-LC-MS/MSを用いて、発現量が変動しているタンパク質の同定を試みていく。細胞溶解時に、顕著に変動しているタンパク質を調べ、どのようにそれらのタンパク質が関与していくかを調べていく。実験計画通りの使用を行なっていたが、比較的少額の次年度への繰越金が生じた。繰越金は、本年度試薬品代として使用していく。
タイトジャンクションに集積するタンパク質群の同定

TJ画分の二次元電気泳動により網羅的な解析を行っており、徹底的なスポット解析を行った。多くの既知の裏打ち蛋白質を検出する中で、いくつかの新規裏打ち蛋白質を同定した。このうち、3種類のものについて蛍光抗体染色が可能な特異的抗体を得ることができた。内在性の蛋白質の染色画像から、2種類はアドヘレンスジャンクション、1種類はタイトジャンクションに局在することがわかった。アドヘレンスジャンクションに局在する蛋白質Aに対してRNAiを用い、上皮由来MDCK細胞によるノックダウン細胞を作製し、機能解析を行っている。他の二種類に対しても順次解析を進めていく予定である。また、我々は二次元電気泳動ゲルにおいて、膜蛋白質由来のスポットを高効率に得る手法を確立し、徹底的なスポット解析を行った。TJ構成蛋白質であるクローディン、JAM、AJ構成蛋白質であるカドヘリン、ネクチンを検出した。加えて、いくつかの新規膜蛋白質を同定し、GFPタグを付けた発現ベクターを導入した上皮由来Eph4細胞の局在解析の結果、これらはいずれもAJに局在することがわかった。機能解析に不可欠な抗体作製を試みたが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも得ることが出来なかった。これらは、抗原性の低い蛋白質であると判断し、生体内での機能解析を行うために、ノックアウトマウスによる解析を進めている。二次元電気泳動ゲルにおける膜蛋白質のプロテオミクス解析に関する論文を、Biochemistryに投稿し、アクセプトされた。当研究室では、上皮細胞間バリアーを担う分子機構の解明を目指し、上皮細胞間をシールする構造であるタイトジャンクション(TJ)に注目して研究を進めている。TJは、上皮間のシール以外に上皮細胞の分化・発生・形態形成に関わるシグナルセンターの役割としても注目されており、クローディンによって形成されるTJストランドの細胞質側に集積する裏打ちタンパク質の中でそのような機能を示唆する報告がある。そこで、TJに集積するタンパク質群をとらえることで、新たなシグナル経路を解明しようと試みている。TJ画分の構成タンパク質を効率良くとらえるには、TJ画分の精製度をできるだけ高める必要があると考え、精製のステップを見直した。密度勾配遠心による分離と界面活性剤の処理について、様々なジャンクションマーカーを用いたウェスタンブロットによる検定を行い、TJ画分を得る方法の最適化を行った。次に、精製過程の各ステップをサンプルとして二次元電気泳動を行い、濃縮してくるスポットを徹底的に、マススペクトロメトリーにより解析した。同定されたタンパク質の中には、既知のジャンクションタンパク質を含んでおり、確立したシステムが十分に機能することを確認できた。その内の、未知のタンパク質について遺伝子クローニングを行い、GFPタグを融合させて発現する発現ベクターを作成した。これをマウス上皮細胞株であるEph4細胞にトランスフェクションし、細胞間接着部位に局在するかどうかを観察した。幾つかの新規タンパク質について、細胞間接着部位に局在することを見出した。TJ画分の構成タンパク質を効率良くとらえるには、TJ画分の精製炭をできるだけ高める必要があると考え、精製のステップを見直した。幾つかの新規タンパク質について、細胞間接着部位に局在することを見い出したので、これらの機能を個別に解析する予定である。現在、これらのタンパク質を認識する抗体を作成している。また、機能解析を行うためにベクター型のRNAiを行っており、十分にノックダウン効果のあるコンストラタトをスクリーニング中である。
海南島の地方文化に関する文化人類学的研究

この研究は、海南島北西部のたん州・臨高地域に併存してきた方言/言語集団それぞれの文化的特徴と、それらの間の境界維持メカニズムを、フィールドワークに基づいて解明することにある。海南島が文化的に複雑なのは、単にリーやミャオなどの少数民族が住んでいるためばかりではなく、その漢族住民の中にも多様な地方文化が見られることに由来する。われわれは2002年と2003年にたん州話、軍話、客家話、臨高話の話者のコミュニティーを調査し、また白話、海南話、普通話、黎話の話者についても関連する資料を収集した。近年、特にここ230年来の生活様式の変化は著しいものがあるが、各方言集団の間の境界は未だに保たれており、また独自の祖先祭祀の様態や婚姻習俗なども20世紀の後期まで維持されてきたことが明らかになった。異なる方言集団間には多くの通婚が存在し、また自分の母語以外にも2,3の方言を話せるのは同地域では一般的である。このような通婚や多言語使用の状況は、近年にわかに生じた現象ではない。同姓者による宗親会活動は、異なる方言集団間をつなぐ重要な役割を果たしてきたように見える。しかし、このような異なる方言集団間の密接な相互接触にもかかわらず、住民間の言語的・文化的な多様性が保たれたことは注目に値する。その一方で、少なくとも現時点では、こうした方言集団はいずれも厳密な意味でのエスニック・グループとは見なし得ない。なぜならば、住民たちは居住地、出身地、言語的または文化的近縁性など、状況に応じて多様な要素を援用しながら自分たちのアイデンティティーを語るからである。本年度は、研究代表者の瀬川と、分担者の塚田が10月11月に海南島西北部の〓州市、臨高県地域で地方文化の情況についての概況調査を行った。調査地域は、〓州市藍洋鎮藍洋村・南羅村(客家話使用、黎族・漢族客家雑居地域)、〓州市木堂鎮来山村・梁屋村、〓州市三都鎮漾月村(〓州村話使用、漢族〓州人居住地域)、〓州市中和鎮(軍話使用、漢族講軍話人居住地域)、臨高県城、臨高県新盈鎮、臨高県調楼鎮(臨高話使用、漢族臨高人居住地域)である。これにより、同地域における複雑な地方文化・方言・民族集団の分布状態についての一定の理解を得ることができた。また、不落夫家、宗族活動、年中行事その他、伝統習俗の残存情況についても、概況を把握することができた。〓州市地域では、共通言語として〓州話が広く使用されつつも、客家話、軍話等の言語コミュニティーは維持されている。他方、海南島全体として共通語の地位にある海南話はほとんど通用していない。〓州話は軍話話者側からは「村話」と呼ばれている。臨高県ではチワン語と共通性の高い臨高話が流通しているが、ここでは〓州話も海南話もあまり通用しない。若者宿の風習は現在は廃れているが、〓州話地域と臨高話地域に共通して存在しつつも、その行われ方に差異があったことが確認できた。このようにパッチ状に言語・地方文化の分布する状況は、華南全域でも特に著しい事例であり、今後その成立背景や維持のメカニズムについて調査を行うに十分な対象であることが確認された。また、地方志を中心に、海南島関連の文献資料を収集し、同島の地方文化について考察するための基礎知識の獲得に務めた。来年度は、今年度の基礎の上に、さらにテーマと地域を絞った調査と、併せて南部の三亜市崖城鎮地域の調査を行う予定である。

本年度は、昨年度の概況調査の基礎のもとに、研究代表者の瀬川が11月に海南島西北部の〓州市で地方文化の情況についての調査を行った。調査地域は、〓州市中和鎮小高地村、同鎮霊春村、〓州市光村鎮泊潮村、〓州市三都鎮顔塘下村、〓州市洋浦港区夏蘭村である。小高地村では、十数家族の家族構成と家庭内使用言語、通婚関係などについて詳細なデータを収集し、軍話、村話等の多方言使用的な状況と異方言話者グループ間の通婚関係などを具体的に把握することができた。また、霊春村では方言使用状況、宗族活動、隣村との械闘などについての情報を得た。また臨高県との協会部に位置する漁村・泊潮村では、臨高県との交流状況、使用方言などについて調査した。また顔塘下村では昨年度概況調査の際に訪問した日本軍政時代の通訳をした老人を再訪問し、そのライフヒストリーを収集するとともに、同村の羊氏一族の族譜を閲覧する機会を得た。また工業開発区内に組み入れられた漁村・夏蘭村では、伝統的な祭祀儀礼や宗族活動とその現在的な変化について情報を得た。さらに、地方志をはじめとする海南島関連の文献資料を収集、閲覧し、同島の地方文化について考察するための知識の獲得に務めた。本年度の実地調査では、通訳並びに資料収集補助のために雇用した現地スタッフの協力のもとに、収集された資料は膨大であるが、その大部分は現在までのところ未整理となっている。来年度は、現地スタッフの協力のもとにこれまでのデータを整理分析し、報告書を完成させる予定である。本年度は、一昨年度ならびに昨年度の調査結果を踏まえ、そのデータ整理と分析を行った。すなわち、瀬川は海南島〓州・臨高地域の言語ならびに地方文化の分布状況概況を整理するとともに、〓州話話者の村落である〓州市木堂鎮来山村・梁屋村、三都鎮漾月村、中和鎮霊春村、軍話話者の居住地域である〓州市中和鎮市街、同鎮小高地村、臨高話話者の居住地域である臨高県城、同県新盈鎮および調楼鎮、客家話話者の村落である〓州市藍洋鎮藍洋村および同鎮南羅村等について、その言語、民俗文化に関する報告論文を執筆した。また塚田は、同じく一昨年度の現地調査に基づき、臨高県における民俗文化ならびに移住伝承についての分析を行い、報告論文を作成した。さらに、一昨年度、昨年度の現地調査に同行し、現地の文化社会についての調査協力と専門的知識の供与を受けた広東省民族研究所・馬建〓所長ならびに張淑苹研究員を日本に招聘し、海南島に関する文献資料調査を共同で実施するとともに、〓州人の社会習俗等に関する資料論文の執筆・提供を受けた。さらに、昨年度の現地調査時に協力を得たフランス高等社会科学院中国研究所のJoel Thoraval研究員を日本に招聘し、同じく共同の文献資料調査と学術的意見交換を行った。そして同氏からは〓州人の宗教儀礼に関する資料論文の執筆・提供を受けた。これらを総合して、代表者である瀬川は報告書をとりまとめた。なお、同報告書は次年度以降、公開用にリライトした上で、市販書として出版する予定となっている。
腫瘍内血管分布と増殖細胞との相関に関する基礎研究

抗癌剤投与に当たり、腫瘍への薬剤到達性は非常に重要であるが、これは血管の分布に大きく左右されると考えられる。また増殖細胞の数、分布は薬剤が効果的に投与されるため重要である。そこで腫瘍内血管分布と増殖細胞の分布との関連を検討した。基礎研究としてヌードマウスに人癌を移植し、0.5-0.8cm径になった時点で切片を作成し、免疫染色(PCN.UPA PA1-1)を行った。臨床的な研究として患者の検体の切片を作成し、同様に免疫染色(PCNA,UPA PA1-1)を行い、放射線照射後の患者のsurvivalとの対比して検討した。人癌(舌)19例について行った。放射線照射後の血管分布は腫瘍の種類によって異なり、偏平上皮癌(S.C.C.)と繊維肉腫(Fib.)では差が見られた。S.C.C.は照射直後に血管分布が急激に減少し、14日目から再増殖が見られた。一方、Fib.は照射直後に血管の破壊が見られるが7日目から再増殖が始まり、回復してくる像が監察された。患者の検体の免疫染色では、染色性の強弱の染色された細胞の比率により、3つのscoreに分け検討を行った。0%→0.130%→1.31100%→2と設定し、患者の予後と比較検討した。その結果、PCNAとPA1-1はほぼ同様の結果がえられ、中間の130%の染色率の患者の予後が良いことが判明した。UPNに関しては染色性による予後に差が見られなかった。今後検体数並びに免疫染色の抗体数を増やし、免疫染色によって患者の予後の判定基準になりうるかどうかを検討したい。放射線治療後の腫瘍内血管の変化は、以前から臨床的に問題となっている。そこで放射線治療と薬剤投与との間隔ならびに薬剤投与のタイミングに関係した腫瘍内血管分布と腫瘍内増殖細胞との関連性について検討し、放射線照射後の薬剤到達性に腫瘍内血管分布と増殖細胞の分布がどのように関連しているかについて検討している。その概要として、基礎的な研究と臨床に近い研究に分け、検討を行っており、前者では実験腫瘍を用いて、WHT/Htマウスに移植し、その後切片標本を作成し、35種の抗体(PCNA,PAI,U-PA等)により免疫染色を行い、増殖細胞の分布を検討している。同時に蛍光色素を腫瘍血管内に注入し蛍光顕微鏡で腫瘍内血管分布の観察と検討を行っている。後者では患者の献体を用いて、BALB/cヌードマウス背中に移植し、直径が約8mmになった時点で、上記同様の方法で腫瘍内血管分布並びに増殖細胞の分布の検討を行っている。加えて、ヌウドマウスに移植した患者の献体の形態学的にミクロの面から、どのような血管構築をしているかを観察するために血管鋳型を作製し、走査型電子顕微鏡で観察、検討している。現在、基礎的な研究では、切片の作製、蛍光色素による血管分布の観察、免疫染色による増殖細胞の分布の観察を行っている。患者の献体を用いた臨床的な研究では、種々の症例の患者さんからの献体を集め献体数を増やしている最中である。また放射線照射後の献体ではどの様に変化するのかを検討すると共に、基礎研究のdataと照らし合わせて検討する予定である。

基礎研究としてヌードマウスに人癌を移植し、0.5-0.8cm径になった時点で切片を作成し、免疫染色(PCNA,UPA,PAI-1)を行った。臨床的な研究として患者の検体の切片を作成し、同様に免疫染色(PCNA,UPA,PAI-1)を行い、放射線照射後の患者のsurvivalとの対比して検討した。人癌(舌)19例について行った。放射線照射後の血管分布は腫瘍の種類によって異なり、偏平上皮癌(S.C.C)と繊維肉腫(Fib.)では差が見られた。S.C.C.は照射直後に血管分布が急激に減少し、14日目から再増殖が見られた。一方、Fib.は照射直後に血管の破壊が見られるが7日目から再増殖が始まり、回復してくる像が観察された。患者の検体の免疫染色では、染色性の強弱の染色された細胞の比率により、3つのscoreに分け検討を行った。0%→0,130%→1,31100%→2と設定し、患者の予後と比較検討した。その結果、PCNAとPAI-1はほぼ同様の結果がえられ、中間の130%の染色率の患者の予後が良いことが判明した。UPAに関しては染色性による予後に差が見られなかった。今後検体数並びに免疫染色の抗体数を増やし、免疫染色によって患者の予後の判定基準になりうるかどうかを検討したい。
4位置換インドールの簡便合成法と生理活性物質合成への応用

インドールを母核とする化合物群は生理活性物質の宝庫と言われている.特に,4位に置換基を有するインドール誘導体の中には顕著な生物活性を示すものが数多く知られている.しかし,4位置換インドール類の合成は他のインドール誘導体のそれに比べてやや困難であるため,これら化合物群の新しい合成法の開発は現在でも,有機合成における重要な課題の一つとされている.筆者らは本研究で,N-(phenylsulfonyl)pyrroleより合成した7-(4-chlorolhenylthio)-6,7-dihydro-1-(phenylsulfonyl)indol-4(5H)-one(1)が4位に酸素,硫黄,および炭素原子を有するインドール類の有用な共通合成中間体となることを見出し,本法を用いることにより数種の生理活性物質を合成することに成功した.以下にその概要を述べる.1.インドロン(1)をp-トルエンスルホン酸存在下アルコール類と反応させると,4-アルコキシインドール類で高収率が得られた.本法は,降圧,抗不整脈薬であるピンドロールのラセミ体および(S)-(-)-体の合成に応用することができた.2.インドロン(1)を三フッ化ほう素存在下チオールと反応させると,4位に硫黄原子を有するインドール類が高収率で得られた.本法は,抗菌活性を有する含硫インドールアルカロイド(±)-chuangxinmycinの合成に応用することができた.3.インドロン(1)に有機マグネシウムまたは有機リチウム化合物を反応させ,次いで,生じたアルコール成績体を適当な脱水条件下処理すると,4位にアルキル基,アルケニル基およびアルキニル基を有するインドール類が好収率で得られた.インドールを母核とする化合物群は生理活性物質の宝庫と言われている.特に,4位に置換基を有するインドール誘導体の中には顕著な生物活性を示すものが数多く知られている.しかし,4位置換インドール類の合成は他のインドール誘導体のそれに比べてやや困難であるため,これら化合物群の新しい合成法の開発は現在でも,有機合成における重要な課題の一つとされている.筆者らは本研究で,N-(phenylsulfonyl)pyrroleより合成した7-(4-chlorolhenylthio)-6,7-dihydro-1-(phenylsulfonyl)indol-4(5H)-one(1)が4位に酸素,硫黄,および炭素原子を有するインドール類の有用な共通合成中間体となることを見出し,本法を用いることにより数種の生理活性物質を合成することに成功した.以下にその概要を述べる.1.インドロン(1)をp-トルエンスルホン酸存在下アルコール類と反応させると,4-アルコキシインドール類で高収率が得られた.本法は,降圧,抗不整脈薬であるピンドロールのラセミ体および(S)-(-)-体の合成に応用することができた.2.インドロン(1)を三フッ化ほう素存在下チオールと反応させると,4位に硫黄原子を有するインドール類が高収率で得られた.本法は,抗菌活性を有する含硫インドールアルカロイド(±)-chuangxinmycinの合成に応用することができた.3.インドロン(1)に有機マグネシウムまたは有機リチウム化合物を反応させ,次いで,生じたアルコール成績体を適当な脱水条件下処理すると,4位にアルキル基,アルケニル基およびアルキニル基を有するインドール類が好収率で得られた.
走査型粘弾性顕微鏡による高分子表面分子運動特性の評価

本研究では、高感度の表面分子運動特性評価法としての走査型粘弾性顕微鏡を開発し、高分子固体表面の分子運動特性の評価を行った。高分子固体の表面動的粘弾性測定は原子間力顕微鏡(AFM)を利用した動的ナノインデンテーション法に基づき行なった。有機固体表面の粘弾性関数を評価するために表面構造を制御した有機シラン混合単分子膜をモデル表面として用いた。本研究で開発した走査型粘弾性顕微鏡により、相分離構造を有する有機シラン混合単分子膜表面の粘弾性関数の二次元マッピングに成功した。また、(ポリスチレン/ポリビニルメチルエーテル)(PS/PVME)ブレンド系についてもAFMでは明確に識別することのできないドメインとマトリクスの界面をnmオーダーの分角能で評価できることが明らかとなった。一方、走査型粘弾性顕微鏡を用いて、単分散ポリスチレン(PS)及びポリメタクリン酸メチル(PMMA)表面の動的貯蔵弾性率,E',および損失正接,tanδ,の分子量依存性を評価した。分子量約40k以上のPS表面はガラス状態であり、分子量が約40k以下になると、E'は分子量ともに低下し、まや、tanδは増加した。表面でのE'及びtanδの値より、分子量約40k以下のPS固体膜表面は、室温においてさえもガラス-ゴム転移状態あるいはゴム状態であることが明らかとなった。また、PMMA表面においても分子量約45k以下の試料では、分子量とともにE'は低下し、tanδは増加した。これらの結果から、分子量が低い場合には高分子固体表面の分子鎖熱運動性はバルク試料のそれよりも高いことが明らかとなった。以上から、本研究で開発した走査型粘弾性顕微鏡は高分子表面分子運動特性評価法として極めて有効であることが明らかとなった。
口腔環境が口腔がんの悪性化・上皮間葉移行を誘導する機構の解明

口腔がんの腫瘍周囲環境が腫瘍の発生、増殖、浸潤、転移等の悪性化に関与する因子を検索することを目的に研究を行った。副甲状腺関連タンパクPTHrPは乳がんや前立腺癌の骨転移において重要な役割を果たすことが知られている。口腔がん細胞でもPTHrPが高発現していることを我々は見いだした。さらに実際の口腔がん患者でPTHrP陽性率と腫瘍の転移・再発に有意な相関があることも明らかにした。腫瘍間質に存在する線維芽細胞は腫瘍血管と同様に正常細胞とは異なった形質を発現していることが報告され、cancer-associate d fibroblast (CAF)と称されている。口腔領域に発生する粘表皮がんで検索したところ、PTHrPを高発現する粘表皮がんの中間細胞集にCAFが多くみられ、さらに新生血管が豊富に存在し、PTHrP発現腫瘍細胞の悪性形質との関連が示唆された。線維芽細胞株MRC5をPTHr P高発現細胞株HSC2の上清を加えたMRC5では明らかな増殖活性の亢進がみられた。PTHrPsiRNA導入HSC2細胞ではPTHrPのmRNA発現が低下していることが示され、PTHrPノックダウンHSC2細胞培養上清を加えたMRC5細胞は増殖活性の減弱がみられた。さらに通常培養ではαS MAの発現がほとんどみられないMRC5、DP31、DP36をPTHrP産生癌細胞上清で培養したところ、線維芽細胞株でαSMAの発現が亢進することがWestern blotであきらかになり、PTHrPによる周囲間質に存在する線維芽細胞のがん関連線維芽細胞(CAF)への誘導効果が示された。腫瘍間質に存在する線維芽細胞は腫瘍血管と同様に正常細胞とは異なった形質を発現していることが報告され、cancer-associated fibroblast (CAF)と称されている。線維芽細胞株MRC5をPTHrP高発現細胞株HSC2の上清を加えたMRC5では明らかな増殖活性の亢進がみられた。さらに通常培養ではαSMAの発現がほとんどみられないMRC5、DP31、DP36をPTHrP産生癌細胞上清で培養したところ、線維芽細胞株でαSMAの発現が亢進することがWestern blotであきらかになり、PTHrPによる周囲間質に存在する線維芽細胞のがん関連線維芽細胞(CAF)への誘導効果が示された。研究計画に沿って、概ね順調に研究は進行しており、論文発表3件、学会発表を3回行っている。口腔環境とがんの悪性形質との関連性について、異なった環境で増殖した腫瘍間の遺伝子発現の差をDNAマイクロアレイにより検索し、Western blotならびに蛍光免疫染色で確認を行う。さらに、EMTが生じているかどうかについて、E-cadherin、N-cadherin、Vimentinの発現をWestern blotおよび免疫染色で比較検討する。

次いで、TWIST、SNAILなどの転写因子の発現について検討する。Wntシグナル伝達系についてβカテニンの細胞内蓄積の有無について検索し、細胞内にβカテニンの蓄積がみられる場合はユビキチン化の有無を検討する。北海道大学病院歯科診療センターを受診し、扁平上皮がんと診断された患者からの試験切除標本ならびに手術摘出材料からタンパクおよびRNAを抽出し、病理組織学的ならびに臨床的に腫瘍の悪性度を判定し。悪性度とRANKL発現が実際に相関しているかどうかをWestern blot、real-time RT-PCR法および免疫染色で確認する。口腔環境下でRANKLを誘導する受容体に対する阻害剤を作用させ、その阻害効果を検証する。JAK/STAT系を発現している細胞ではリン酸化阻害剤と中和抗体を用いて阻害効果を検討し、ケモカイン受容体型やWntシグナル伝達系に対してはsiRNAによる抑制効果を実験的に行い、口腔がん細胞において最も抗腫瘍効果を示した阻害剤と受容体の組み合せを選定する。さらに、ヌードマウス、あるいはウサギに口腔がん細胞を移植し、培養条件下で明らかになった受容体阻害剤を投与し、in vivo imagingの手法を用いて各種阻害剤の効果を比較検討し、臨床応用への道を探る。研究計画の一部が次年度にかけて行うことになったため、繰越金が発生した。本年度に一括して使用する予定である。