hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代シーケンサーとデジタルPCRを用いた食道癌患者末梢血中ctDNAの検出

またTP53遺伝子のDNA結合ドメイン(exon 2-11)領域をシーケンスする予定であるが、プライマーの設計は既にできている状況である。以上より、平成29年度に予定していた計画はほぼ達成されたとみなし、研究全体としてはおおむね順調に進展していると考える。癌患者の血液中に存在する腫瘍由来遊離DNA(ctDNA)は、腫瘍の持つ遺伝子変異を簡便に診断するための非侵襲的検査法(liquid biopsy)として注目されている。本研究では、術前治療としてDCF療法および放射線治療を行った食道癌患者の末梢血を用いて次世代シーケンサー(NGS)によるctDNAの解析を行い、術前治療および手術によるctDNAの変化を解析することで治療効果予測や再発予測のマーカーとして臨床応用することを目的とする。前年度までの成果として、当院で術前治療を行った食道癌患者5例を対象に、術前治療開始前および手術前、手術後の血液検体、手術時の切除標本の腫瘍組織検体を採取し、それぞれのDNAを抽出した。本年度はこれらのDNAを用いてTP53遺伝子をターゲットとしたNGS解析を行った。手術標本検体5例のうち、3例でTP53遺伝子変異を認めた。これら3例のうち1例において治療前血液で同部位の変異を1.97%認めたが、手術前血液では認めなかった。残りの2例においては治療前、手術前血液共に原発で認めた変異を認めなかった。平成30年度の計画としては、抽出したDNAをNGSにより解析することである。今回、当初の計画通り術前治療を行った食道癌切除症例5例に対し、切除標本検体および治療前、手術前血液より抽出したDNAをNGSにより解析を行った。結果は切除標本で5例中3例にTP53遺伝子変異を認め、それらのうち1例の治療前血液のみにおいて同部位の変異を1.97%に認めた。この結果は当初想定していた変異の検出感度を下回っており、臨床応用に向けてより高感度かつ網羅的なctDNAの解析が必要であると考えられた。そこで我々は分子バーコードを用いたNGSによるctDNA解析に着目した。現在、分子バーコードを用いたNGSの条件設定や前実験を進めている。以上より、平成30年度の計画としてはおおむね順調であり、来年度に向けての方針も定まっていると考えられる。平成29年度に収集した食道癌患者の血漿よりcfDNAを抽出し、次世代シーケンサーによりTP53遺伝子のDNA結合ドメインの変異解析を行う。また腫瘍組織検体から抽出したDNAにおいても同様の手法を用いてシーケンスを行い、腫瘍に特異的な変異であることを確認する。さらに、多くの症例に重複する変異部位が認められた場合は専用のプライマーを設計し、デジタルPCRによる解析を行う。これらの解析から得られたTP53の変異の有無や部位、変異形式とDCF治療による治療効果(RECIST、内視鏡的効果、病理組織学的効果など)やその他臨床病理学的因子との関連につき検討を行う予定である。更に、DCF治療前後におけるctDNAの割合の変化と腫瘍径、組織型、臨床病気、その他臨床病理学的因子などとの関連性についても解析する。
虚血再灌流傷害改善のために必要な環境：L-セリンの役割

本研究はアストログリアから産生されるL-セリンが脳虚血再灌流障害後に認められる神経の新生にどのように影響するかを明らかにすることを目的としていた。アストログリア特異的PHGDH欠損マウスに中大脳動脈梗塞(MCAO)を施したのちの梗塞領域の大きさにはflox/floxマウスと有意な差が認められなかった。初代培養神経細胞を用いたIn vitroの検討では、L-セリンがp70S6Kのリン酸化を促進することが確認された。p70S6Kはたんぱく質の合成を促進することで細胞増殖を刺激する因子であることから、L-セリンは神経新生を刺激する可能性が示された。脳ではアストロサイトがアミノ酸の一種であるL-セリンを合成し、常時神経細胞へと供給している。L-セリンは神経保護作用があると考えられているが、組織障害における脳内L-セリンが神経の保護作用を持つかは明らかでない。そこで本研究では脳虚血再灌流障害におけるL-セリンの役割を明らかにするため、L-セリン合成酵素コンディショナルノックアウト(PHGDH cKO)マウスのMCAOモデルを作成し、梗塞領域の大きさについて検討した。コントロールマウスとPHGDH cKOマウスを比較したところ、再韓流後20時間では梗塞体積に大きな差は認められなかった。動物飼育施設の環境変化やGFAP-Cre, flox/floxマウスの出生数により必要な動物が計画通り手に入らなかった。また、虚血再灌流モデルの作成に時間を要したため進捗が遅れている。脳虚血再灌流障害ではニューロンのエネルギーおよび酸素の枯渇による障害と再灌流後に発生する酸化ストレスによる神経細胞死が梗塞層の拡大に寄与していると考えられている。この時のアストロサイトの役割は十分に明らかにされていない。アストロサイトはニューロンへピルビン酸などのエネルギー源の供給を行なっている。また、アストロサイトからニューロンへと供給されている分子に糖源性アミノ酸の一つであるL-セリンが知られている。L-セリンはニューロンでは合成されず、脳内では主にアストロサイトが合成している。このL-セリン合成律速酵素(phosphoglycerate-dehydrogenase:PHGDH)を欠損したマウスでは脳の発達異常により胎生致死となることが知られることから、L-セリンは神経栄養因子の一つと考えられている。我々は先行する報告にてマウス中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルにおいてD-セリンが増加し梗塞拡大に寄与する一方、L-セリンもまた梗塞周囲で有意に増加することを見出した。そこでまず、L-セリンはD-セリンが誘導する神経細胞死を抑制する可能性について、初代培養神経細胞を用いて検討した。初代培養神経細胞にD-セリンを処理するとアポトーシスが誘導された。D-セリンはグルタミン酸受容体(NMDAR)のコアゴニストであることから、受容体阻害剤がアポトーシスを阻害できるか否か検証した。しかしながらNMDARの阻害剤ではアポトーシスを阻害することはできなかった。一方でL-セリンによってD-セリン誘導性アポトーシスは完全に抑制できることを発見した。このことからD-セリンはNMDAR非依存性の機序によりアポトーシスを誘導し、その経路はL-セリンによって阻害される可能性を見出した。この経路は虚血再灌流障害における神経細胞死機序に関与している可能性がある。虚血再灌流後20時間時点で梗塞体積に差がなかったことから、アストロサイトが合成するL-セリンには神経細胞死を抑制する効果は低いと考えられる。一方、脳内L-セリンの供給はアストロサイトのみならず一部は血液に由来することから、まずPHGDH cKOマウスにおいてL-セリンが増加していないことを確認する必要がある。虚血再灌流後48時間から1週間にかけて神経新生が誘導されることが知られている。したがって再灌流後48時間および1週間における新生細胞を幼若ニューロンマーカーと共染色した上で細胞数を検討する。これによりでL-セリンの神経新生への影響を検討することができる。神経科学
通俗科学小説と自然科学の普及（1850-1900）

本研究では、19世紀後半に流行した自然科学を扱う通俗科学小説を認識論・教育論・美学という三つの観点から分析した。題材に関して、作家は教育的重要性だけでなく小説としての有用性から選別するとともに、多くの読者を獲得するための文学的効果(隠喩、換喩、アナロジーを使用する視覚的効果、想像的世界観)を駆使した。これらの小説はまた、科学知識だけでなく共和主義的・進歩主義的思想の教育のためにも使用された。作家らは科学的知識の通俗化の過程で自らの思想を組み込んでいったのだ。このような通俗科学小説の技法や形式は、共和国市民の教育を目指す時代背景と合致し、その後教育モデルの一つとして公教育に残っていくのである。まず日本仏語仏文学会春季大会(2015年5月)で、Jean MaceのHistoire d'une bouchee de painに関する口頭発表を行ない、以下の点を示した。1通俗科学作家が消化という主題を選ぶ理由には、生物の本質的機能という科学的重要性だけではなく、物語に容易に変換するプロセス、つまり「小説における有用性」のためであり、特に生命に関する百科事典的知識の普及を可能にする「教育的有用性」のためであること。2人間の身体が調和的な共和国の姿と重ね合わされていることから、生物学の知識はまたイデオロギー的次元を有していること。3以上から通俗科学小説家は伝播すべき知の選択する際に、伝搬すべき知の科学的価値よりもその有用性とイデオロギー側面による効果が重要視していること。この発表は論文として掲載された。また『表象と文化XII』(2015年5月)にカミーユ・フラマリオンの『ステラ』に関する論文を発表した。論点は通俗科学作家による天文学の定義と、知全体におけるこの科学の位置づけである。そこから次の事柄を示すことができた。1作家が学者であると同時に作家という側面をもつ「アストロゾフ(作家の造語=天文学者+哲学者)」を登場させ、自然科学と文学が融合している19世紀以前の知の歴史への憧憬を感じさせていること。2天文学は「宇宙における生命の科学」と定義されるが、それは大文字の「自然の科学science de la Nature」であり、自然を全体において捉えようとする総合的・包括的科学であること。3以上から通俗科学作家により自然科学が文化的なあらゆる知の分野を融合することが可能であること。一方、ヘルン(小泉八雲)研究会主催のシンポジウム(2016年2月)における口頭発表では、小泉八雲がフラマリオンの読者であったことを紹介し、フラマリオンの文学性が八雲に与えうる影響について論じた。本年度の目標は、通俗科学小説において、作家がどのような自然科学の主題を選択したのか、またそれが選ばれた理由と背景を分析することであった。具体的には三つの解釈の基準〔1科学的価値2教育的価値3文学的価値〕でもって作品を分析し、それによって自然科学における主題の選択とその背景について考察することである。この目標に従えば、次年度以降分析対象となる作品の絞り込みも可能なると考えた。先に挙げた本年度の研究実績は、この目標に十分沿うものである。Maceの作品分析では、伝播すべき科学的価値よりも、教育的・文学的価値、すなわち知の普及を効率的に行なうフィクションの効果に重点が置かれていることが分かった。一方、フラマリオンの作品分析では学者と文学者双方の側面をもつ、「アストロゾフ」が登場していることからも文学的価値が科学的価値を凌駕していることがうかがえる。もう一つ重要なことは、これらの業績から分かったイデオロギー的側面や、通俗科学作家達がこのような選択をする背景である。十九世紀後半において、科学と文学はそれ以前に比べてますます分離していき、二つの分断された文化として存在していた。一方自然科学においても、「生命科学」と「地球の科学(地学や天文学等)」に分割されていく。しかし、通俗科学小説家達はある種の保守主義によって特徴づけられている。彼らはむしろあらゆる科学が同じグループとして扱われていた十八世紀の思想や、十七世紀以降の概念である、科学だけでなく文学的教養をもつ紳士「オネット・オム」の伝統を継承している。それらをもとに、今後扱う作家が明らかになってきた。そこで行なった3月の資料収集(フランス)により、Mace、Pape-Capentier, Berthoud等の作家や十九世紀の自然科学者Henri Milne-Edwardsについて調査した。これらの成果は来年度以降発表してきたい。本年度は、通俗科学小説が学術的な知をいかにして伝搬しているのかを明らかにすることであった。そこで、まずこのジャンルで最もよく知られた作品の一つである、ジャン・マセの著作Histoire d'une bouchee de pain"とその続編を分析した(“Savoirs savants, savoirs vulgarises et ideologie chez Jean Mace",「表象と文化XIII」、2016年、pp.13-22)。この作品はダーウィンに影響を与えたアンリ・ミルヌ=エドワールの理論「生理的分業division du travail physiologique」を扱っている。報告者は分析を通じて、通俗科学小説においてアカデミックな情報を扱う際に二つの方法が採用されていることを示した。一つは、知を一般化しつつも忠実に伝えるという方法である(語彙の選択や修辞学的技術の駆使による)。一方、通俗科学小説の役割は、知の一般化に終始していない。

報告者は同時に、マセがミルヌ=エドワールの思想には存在しない、共和主義者としての彼独自のイデオロギーをミルヌ=エドワールの理論を用いて教授していることを明らかにした。通俗科学小説は、科学的知だけでなくイデオロギーや倫理観を伝搬するために存在したのだ。本年度はまた、フランスでの資料参照・収集によって興味深い問題に関する分析を行った。一つは、十九世紀後半における市図書館や学校付属の図書館のカタログ分析である。これは当時流通していた通俗科学小説における主題の傾向を知るためだけでなく、一般的にどのようなカテゴリーに分類されていたかを知るためである。また、十九世紀前半の一般的な教育書のリスト作成を行った。これは十九世紀前半から後半にかけて、教育や科学的書籍に変化があるか確認するためである。これらの研究成果は今年中に発表する予定である。先にも述べたが、本年度の目標は、通俗科学小説が学術的な知をいかにして伝搬しているのかを明らかにすること、すなわち通俗科学小説における「教育的モデル」という側面を分析することであった。先に挙げた本年度の成果は、この目標に十分沿うものである。ジャン・マセの作品を通じて、報告者はアカデミックな科学の知が、作家独自の修辞的技法によって大衆に浸透するように描かれる一方で、作者自身のイデオロギー(共和主義者)もまた、普及するべき知として考慮されていることを明らかにしただけではなく、さらにはこのイデオロギーの普及において科学的知が利用されていることも証明することができたからである。本年度の計画においては、もう一つの目標があった。それは自然科学と公教育との関係を分析することである。そこで報告者は、フランスでの資料収集を通じて、学校や公共図書館で、いかなる通俗科学小説が読まれていたのか、またそれらは他の書籍と関連してどのようなカテゴリーとして認識されていたのかをすでに調査している。また、この資料収集作業を通じて、報告者が当初予想していなかった成果も得られることができた。それは十九世紀前半の教育的書籍と報告者が分析対象とする十九世紀後半の書籍を調査した際に判明したことである。十九世紀後半の通俗科学小説は、十九世紀前半の宗教的・道徳的書籍の形態を維持しつつも、その内容に関しては脱宗教化・進歩主義化が見られることだ。これらの成果に関しては、本年度中に発表する予定である。これらすべての状況を考慮したうえで、研究課題がおおむね順調に進展していると判断した。本年度は主に二つの問題体系に取り組んだ。一つは通俗科学小説における美学的問題。もう一つは通俗科学小説における多様な側面(認識論的、文化的、教育的、イデオロギー的問題)を分析し、このジャンルを生み出す条件が何か明らかにすることであった。第一の問題は、論考"Les recits de vulgarisation scientifique lecteurs etjuges de La Fontaine (1850-1900)"(『表象と文化XIV』)のなかで取り上げた。ラ・フォンテーヌの『寓話』は19世紀においてもなお、自然科学を扱う教育的文学のモデルであった。
ゴナドトロピン放出因子による顆粒膜細胞活性化の分子機構と生理的意義の検討 卵巣におけるGn-RHの産生ならびにGn-RH受容体占有の必要性

視床下部ホルモンであるゴナドトロピン放出因子(Gn-RH)が直接卵巣に働き、様々な生理作用を示すことが明らかになりつつある。しかし、顆粒膜細胞や莢膜細胞を活性化するGn-RHの濃度はnMオーダーであり、生体内におけるGn-RHの半減期と血中濃度を考慮すると、視床下部由来のGn-RHが卵巣で生理作用を発揮するとは考え難い。i)むしろ、Gn-RHが局所で産生されオートクリンあるいはパラクリン様に卵巣に作用すると考える方が自然である。そこで申請者らは、顆粒膜細胞と卵巣癌をモデルとして、この2つの可能性について解明を試みた。その結果,1)顆粒膜細胞や下垂体前葉と同様に,卵巣癌においても、Gn-RH受容体を占有すると、GTP依存性にイノシトールリン酸の産生が生じた.3)ダウンレギュレーションにともなって,細胞機能つまり,アロマターゼ活性([^3H]アンドロステンジオンからの[^3H]H_2Oの産生)や[^3H]チミジンの取り込みが抑制された。以上の結果から,卵巣癌には形質膜7回貫通型受容体(Gn-RH受容体)とGTP依存性エファクターが存在することが示された.これは,卵巣癌の増殖がGTP結合蛋白質の異常によってもたらされる可能性を示唆するものである.今後の研究に期待される.視床下部ホルモンであるゴナドトロピン放出因子(Gn-RH)が直接卵巣に働き、様々な生理作用を示すことが明らかになりつつある。以上の結果から,卵巣癌には形質膜7回貫通型受容体(Gn-RH受容体)とGTP依存性エファクターが存在することが示された.これは,卵巣癌の増殖がGTP結合蛋白質の異常によってもたらされる可能性を示唆するものである.今後の研究に期待される.(1)ヒト顆粒膜細胞をGn-RHで刺激すると,イノシトールリン脂質代謝が亢進する。Gn-RHの競合拮抗剤アンタイドでGn-RHを受容体から遊離すると,直ちにイノシトールリン脂質代謝の亢進が停止した。ここに,十分量のGn-RHを添加すると,イノシトールリン脂質代謝が再びスタートした。つまり,Gn-RHによるイノシトールリン脂質代謝の進行に,Gn-RH受容体の継続した占有が不可欠であることが明らかにされた。(2)顆粒膜細胞を,ゴナドトロピンで刺激するとアロマターゼ活性が亢進し,Gn-RHはこのゴナドトロピンの作用を阻害する。この反応系にアンタイドを加えると,Gn-RH作用が中和されアロマターゼ活性が亢進した。しかし,十分量のGn-RHを添加するとGn-RH受容体がGn-RHで再占有されて,アロマターゼ活性が著しく低下した。つまり,Gn-RHの抗ゴナドトロピン作用も受容体の持続した占有を必要とすることが示された。以上の2点から,Gn-RH作用に受容体の持続占有が不可欠であることが示された。これらのことから,視床下部由来のGn-RHが卵巣に作用するとは考え難いことが裏付けられた。むしろ,局所で産生されたGn-RHがオートクリンあるいはパラクリン様に顆粒膜細胞に作用すると考えた方が自然である。事実,(3)ヒト卵巣にGn-RHのmRNAが検出され,今後の研究へ継続された。視床下部ホルモンであるゴナドトロビン放出因子(Gn-RH)が直接卵巣に働き、様々な生理作用を示すことが明らかになりつつある。その結果,1)顆粒膜細胞や下垂体前葉と同様に、卵巣癌においても、Gn-RH受容体を占有すると、GTP依存性にイノシトールリン酸の産生が生じた.3)ダウンレギュレーションにともなって,細胞機能つまり,アロマターゼ活性([^3H]アンドロステンジオンからの[^3H]H_2Oの産生)や[^3H]チミジンの取り込みが抑制された。

以上の結果から,卵巣癌には形質膜7回貫通型受容体(Gn-RH受容体)とGTP依存性エファクターが存在することが示された.これは、卵巣癌の増殖がGTP結合蛋白質の異常によってもたらされる可能性を示唆するものである.今後の研究に期待される.
ナトリウム添加を利用した新規金属イオン分離剤の開発

脱ブチルした、Cone構造でlower rim側のdista1位にスペーサー長の異なるカルボキシル基を有する、3種類の交差カルボン酸型カリックス[4]アレーン誘導体(酢酸-酢酸、酪酸-酢酸、及び吉草酸-酪酸)を合成した。これらを酸雰囲気下、トリオキサンを用いてメチレン架橋し、目的のメチレン架橋型の樹脂を調製した。これらの樹脂によるナトリウム非添加・添加系での2価金属イオン(鉛、銅、コバルト、亜鉛)の吸着挙動について検討した。ナトリウム添加系での吸着は、ナトリウム非添加系での吸着よりもわずかに高pH領域で起こることが明らかとなった。前年度調製した含浸樹脂の場合と比較して、劇的なナトリウムの添加効果は観察できなかったが、交差型の樹脂では、すべて酢酸基のものよりも吸着率が低下しなかった。また、メチレン架橋時にカリックスアレーンとトリオキサンの混合比を1:5から1:1にすることで、さらに吸着率の維持ができた。含浸樹脂よりもメチレン架橋樹脂のナトリウム添加効果が小さい理由として、ナトリウムの吸着そのものが乏しいことが挙げられる。本実験条件下で、両樹脂の吸着pH領域には1程度の差がある。今回用いたカリックス[4]アレーン誘導体を抽出実験の配位子として用いた場合、極めて高い親和性が観察されたが、イオン交換樹脂として用いる場合、含浸樹脂では高い親和性を示すが、メチレン架橋型樹脂では乏しい親和性しか示さない。含浸樹脂ではカリックス[4]アレーン誘導体がそのまま抽出剤として含浸されるため、樹脂内で比較的自由度を持ち、抽出剤としての挙動を維持できる。しかし、メチレン架橋型の樹脂では、合成の際に密に架橋すれば、ナトリウムに対して最適なカリックスアレーンの環構造が維持されずにひずみが生じてしまい、結果として抽出剤として用いた際の挙動を維持できなくなると考えられる。従って、架橋度を変えるためにカリックスアレーンとトリオキサンの混合比を変化させることによって、カリックスアレーンの環構造を維持できたと考えられる。今後、カリックス[4]アレーン誘導体の環構造を維持したイオン交換樹脂が開発できれば、ナトリウムに対して高い親和性を示し、結果として優れた共抽出挙動を示すと考えられる。Cone構造でlower rim側のdistal位にスペーサー長の異なったカルボキシル基を有する、3種類の交差カルボン酸型カリックス[4]アレーン誘導体(酢酸-酢酸、酪酸-酢酸、及び吉草酸-酪酸)を合成し、多孔性樹脂であるAmberlite XAD-7に1:4の割合で含浸した。調製したこれらの樹脂によるナトリウム非添加・添加系での金属イオンの吸着挙動について検討した。これらの樹脂によるナトリウム添加系での2価金属イオン(銅、コバルト、亜鉛)の吸着は、ナトリウム非添加系での吸着よりも低pH領域で起こることが明らかとなった。すなわち、0.05mol dm^<-3>程度の低濃度のナトリウムを添加するだけで、3つの吸着剤の吸着能力は向上した。以前の抽出に関する研究結果から予想されるように、ナトリウムと他金属との共抽出(吸着実験の場合では、共錯形成)機構によるものであると考えられる。酢酸-酢酸型の樹脂では、吸着能力の向上の度合いは添加するナトリウムイオン濃度に依存することが明らかとなった。これは共抽出を起こすのに不可欠なナトリウムと阻害を起こすナトリウムの両方が存在することを示唆していると考えられる。また、少量のナトリウムの添加でも鉛イオンの吸着が阻害された。これは、鉛の錯形成が吸着能力を向上させるのに必要なナトリウムの配位位置と同じサイトで取り込まれるためであると考えられる。また、3種の樹脂の分離挙動について比較すると、スペーサー長が長くなることでNaとCu間の立体反発が解消されるため、分離性能に影響すると考えられる。例えば、銅とコバルトの分離については、最適なスペーサー長は酪酸基を有するものであった。また、スペーサー長の変化は金属イオン間の立体反発に影響するだけでなく、金属イオンの配位数や形状、錯体の化学量論などに影響を受けるため、分離に関してはより詳細な検討が必要である。

含浸樹脂ではカリックス[4]アレーン誘導体がそのまま抽出剤として含浸されるため、樹脂内で比較的自由度を持ち、抽出剤としての挙動を維持できる。しかし、メチレン架橋型の樹脂では、合成の際に密に架橋すれば、ナトリウムに対して最適なカリックスアレーンの環構造が維持されずにひずみが生じてしまい、結果として抽出剤として用いた際の挙動を維持できなくなると考えられる。従って、架橋度を変えるためにカリックスアレーンとトリオキサンの混合比を変化させることによって、カリックスアレーンの環構造を維持できたと考えられる。今後、カリックス[4]アレーン誘導体の環構造を維持したイオン交換樹脂が開発できれば、ナトリウムに対して高い親和性を示し、結果として優れた共抽出挙動を示すと考えられる。
絶滅動物の復活を目指した革新的技術開発

1.糞から採取した体細胞核からクローン作出を試みた結果、多くのクローン1細胞期胚のDNAには深刻なダメージが生じ、核膜形成も不完全であることが明らかとなった。だが、糞からの核の採取方法の改善により正常な核を有するクローン胚の割合は約10%まで改善できた。さらに、正常なクローン胚の核を連続核移植の技術を用いて2回初期化させた結果、約20%まで正常なクローン胚の割合を高めることができ、初めて初期発生まで進めることに成功した(Kamimura et al., Sci. Rep. 2018)。まだ初期発生までしか成功していないが、今後の研究次第ではクローン産仔作出の可能性を示すことができた。毛皮からのクローン作出実験では、毛皮由来の核を効率よく回収する方法を検討したが、まだ成功していない。2.精子の室温保存技術の開発については、従来技術では短期間しか室温保存出来なかった理由が、真空であるはずのアンプルビンに空気が混入していたためであることを突き止めた。そこで空気の除去を目的にアンプルビン内へ除湿剤や脱酸素剤を加え、さらに非破壊検査技術を導入し高真空のアンプルビンを選び出すことで、ついに1年以上室温の机の引き出しの中にしまっておいたアンプルビンから多数の産仔を得ることに成功した(Kamada et al., Sci. Rep. 2018)。この成果は多数の新聞やWebで取り上げられた。この実験では精子に対して何も凍結乾燥保護剤を使用せずに行ったが、トレハロースは凍結乾燥保護剤として有効であるという報告がある。そこでトレハロースの最適濃度および作用点など調べた結果、トレハロースは凍結乾燥処理それ自体の保護効果はないが、保存中のダメージを軽減することがわかった。特に0.5Mのトレハロースは近交系の精子に対して、有意に出産率の成績を改善することが明らかとなった(投稿中)。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は研究代表者が責任著者の論文を2本発表することが出来た。1つは尿に含まれる細胞からクローンマウスを作り出すことに成功した論文であり(Mizutani et al., Scientific Reports)、この成果は主要な全国紙およびNHKなどのテレビで広く報道された。尿を利用すれば動物の体を傷つけることなくドナー細胞を回収できることを示しており、野生動物や絶滅危惧種への応用が期待できる。現在は排尿から時間のたった古い尿由来細胞からクローンの作成を試みている。2本目は、初期化促進のための新しい技術開発として、ドナー核を未受精卵に2回移植する連続核移植に初めて成功した論文である(Wakayama S. et al., Cellular Reprogramming)。ドナー核を未受精卵の初期化因子に長時間触れさせて初期化を促進することを目的としたが、通常のドナー細胞に対しては成功率を改善する効果は見られなかった。しかし卵子細胞質内でDNA修復が行われることから、我々はダメージを受け通常の方法ではクローンを作りだすことが出来ないドナー細胞に対して効果があると考えており、現在この技術をもとに糞由来細胞核からのクローンマウス作出を試みている。また研究分担者が責任著者として、膣垢細胞から個体を傷つけずに細胞を回収してクローンマウスを作出することにも成功している(Kuwayama et al., Theriogenology)。染色体移植技術については、技術の簡略化と再現性を高める基礎研究を進めているが、まだ最適条件を見つけ出すことに成功していない。それ以外のテーマについても試行錯誤を繰り返しながら技術の開発を進めている。3年計画の1年が経過した段階で、全体の1/3には到達していないため「やや遅れている」の区分を選んだが、Nature姉妹誌(Scientific Reports)に掲載された論文(尿細胞からのクローンマウス作出)は日本だけでなく海外でもメディアで紹介されたことからもわかる通り、比較的インパクトの高い成果だった。この論文により、絶滅危惧種の体を傷つけずにクローン個体を作り出す可能性が初めて示された。また、初期化の促進、クローン技術の改善に関しても、論文を1本発表することが出来た。ほかに、本科研費のテーマの一環となる共同研究の論文もいくつか発表出来た。したがって論文数的にはある程度の成果が得られた年度だったと思われる。しかし最大の目標としている染色体の1本移植技術の確立に関しては、さまざまな予備実験を行っているが、期待する成果は得られていない。これは当初から予想された範囲内ではあるが、ブレイクスルーを得るために今後も予備実験を行っていく。これ以外のテーマについても様々な予備実験が行われている。今年度は、クローンマウスの研究において念願だったF1以外の卵子からのクローン作出に成功した(Tanabe et al., Reproduction 2017)。最も安く購入できるICR系統の卵子が利用可能となっただけでなく、系統間で卵子の初期化能力を比較することが可能となった。また、核の保存限界を明らかにする研究では、国際宇宙ステーション内で宇宙放射線に長期間曝したフリーズドライ精子であっても顕微授精によって産仔を得ることが可能であり、精子核に対するDNA損傷はわずかであることを初めて証明した(Wakayama S. et al., PNAS 2017)。この成果は主要な全国紙およびNHKなどのテレビで報道されただけでなく、海外でも広く紹介された。またこの研究において、ダメージを受けた精子核は卵子内で修復されていることを明らかにした。

糞由来細胞核からのクローンマウス作出の試みでは、安定した核の採取に成功し、卵子内で移植した核のDNA修復が確認されたが(投稿中)、現時点で初期発生には成功していない。一方、活性化した卵子内の核の変化および初期化については、今まで生きたまま観察することは出来なかったが、今回我々は、zFLAPという新技術を開発し、生きたままダメージを与えずに核の変化を観察することに成功した(Ooga & Wakayama PlosOne 2017)。核移植や胚移植のためには、卵子や胚を保護するだけでなく顕微操作において卵子や胚を固定するために透明帯が不可欠である。そこで、人工卵子が作出できた場合のために、人工透明帯の開発を行ったところ、アガロースで作られたカプセルであれば透明帯の代替品となることを明らかにした(Nagatomo et al., Scientific Reports 2017)。3年計画の2年が経過した段階で、単一染色体移植実験以外は順調あるいは予想を上回った成果がでているため、全体的に見ればおおむね順調に成果が出ていると判断した。なかでもPNASに掲載された論文(Wakayama et al., 2017)は、イギリスのガーディアン紙やアメリカのナショナルジオグラフィック誌で紹介されるなど、国際的に高く評価された。クローン技術の基礎研究に関しては、これまで不可能だったF1以外のマウス系統の卵子からクローンマウスを作ることに成功した(Tanabe et al., Reproduction 2017)。また、糞由来細胞の核移植に関する基本技術も開発出来たが、初期発生にはほとんど成功していない(投稿中)。受精直後の核の初期化状態を生きたまま観察する技術の開発にも成功した(Ooga et al., Plos One 2017)。人工卵子の顕微操作を可能にするためには人工透明帯の開発が不可欠である。そこで様々な代替品を検討した結果、アガロースを材料としたカプセルが人工透明帯として最適なことを突き止めた(Nagatomo et al., Sci. Reports 2017)。ほかに、本研究で確立した技術を用いた共同研究では、Nature誌やJ. Cell Science誌などいくつかの一流紙に論文を発表することが出来た。したがって今年度は論文の質と量的にはかなり高い成果が得られた年だったと思われる。1.糞から採取した体細胞核からクローン作出を試みた結果、多くのクローン1細胞期胚のDNAには深刻なダメージが生じ、核膜形成も不完全であることが明らかとなった。だが、糞からの核の採取方法の改善により正常な核を有するクローン胚の割合は約10%まで改善できた。さらに、正常なクローン胚の核を連続核移植の技術を用いて2回初期化させた結果、約20%まで正常なクローン胚の割合を高めることができ、初めて初期発生まで進めることに成功した(Kamimura et al., Sci. Rep. 2018)。まだ初期発生までしか成功していないが、今後の研究次第ではクローン産仔作出の可能性を示すことができた。毛皮からのクローン作出実験では、毛皮由来の核を効率よく回収する方法を検討したが、まだ成功していない。
アジア太平洋地域の環境モニタリングにむけた地図・空中写真・気象観測資料の集成

本研究は、アジア太平洋の環境変動のモニターにむけて、旧日本軍作製の地図・空中写真・気象観測記録を集成する。資料を多く収蔵するアメリカ議会図書館で資料調査を6回行い、日本軍将校が朝鮮半島や中国大陸で作製した手書き原図を大量に発見した。空中写真については、一部目録を作製した。館内各所に分散する気象資料は、部分的な目録作製にとどまった。他方、国内所在の外邦図の書誌的データの整備、新規のデジタル化画像により、デジタルアーカイブの改善につとめた。くわえて日本国際地図学会でシンポジウムを開催し、関係者の外邦図に対する理解を得た。なお、本研究に対し、日本国際地図学会・日本地理学会より賞が授与された。初年度にあたり、研究打ち合わせのための集会を2007年6月に御茶の水女子大学で開催するほか、外国人研究者を交えた研究会を2回(2007年10月[大阪大学]と2008年2月[立正大学大崎校舎」)開催し、研究発表ならびに情報の交換を行った。また、資料調査を国立公文書館・国立国会図書館(東京)、アメリカ議会図書館・アメリカ国立公文書館(ワシントン)などで行った。さらに戦前期に日本軍作製のアジア太平地域の地図(外邦図)の概況を研究した高木菊三郎旧蔵の資料を購入した。以上の結果、つぎのような成果が得られた。1)戦前期までの地図や空中写真に対する関心は韓国や台湾でも高まっており、今後海外の研究者との連携をさらにつよめる必要がある。2)終戦直後に行われた、参謀本部からの外邦図の持ち出しは、東北大学関係者によるものと東大関係者によるものがあり、前者が先行しておこなわれた。3)アメリカ議会図書館で、旧日本軍将校が明治10年代に朝鮮半島や中国大陸で行った秘密測量の原図が大量に発見された。今後も調査し、目録を作成する必要がある。4)第二次世界大戦期の中国大陸やミクロネシアの気象資料は、アメリカ議会図書館にかなり所蔵されているが、集成されておらず、今後長期的に探索する必要がある。5)アメリカ国立公文書館の空中写真の利用は、2008年4月以降急速に改善される予定。6)高木菊三郎旧蔵の資料は、中国大陸における外邦図作製を概観するのに不可欠なもので、今後その研究をすすめるとともに、ウェブ上に公開する必要がある。本年度の研究実施計画(7項目)について、下記のように成果を得た。(1)外邦図目録の整備については、『国外地図目録』のうち、旧日本領についてエクセル入力を終了した。(2)外邦図デジタルアーカイブの管理と拡充については、お茶の水女子大学所蔵図のデジタル化を進めるとともに、これまでの成果を論文にまとめ、学会誌に掲載した。(3)米議会図書館所蔵資料の調査を2度にわたって実施し、とくに1880年代の日本軍将校による、朝鮮半島と中国大陸の都市と主要交通路の測量原図について目録作成と写真撮影を行った。その他日本軍が撮影した空中写真と気象観測資料についても調査した。(4)米国立公文書館の空中写真の調査では、マイクロフィルム化した標定図の購入を予定していたが、公文書館側の準備が遅れ、この完成を待つことにした。(5)景観変動研究への地図・空中写真の応用については、グーグルアースを利用して複数時点の地図の簡便な比較法を検討した。(6)綜合地理研究会資料の調査を進め、その成果を学会誌に掲載した。(7)日本国際地図学会大会におけるシンポジウム(2008年8月)では、本研究参加者が主体となり、6つの研究発表と綜合討論を行い、多数の参加者を得た。さらに研究成果公開促進費(学術図書)の採択を受け、これまでの研究成果を集成する『近代日本の地図作製とアジア太平洋地域:「外邦図」へのアプローチ』(大阪大学出版会、5013頁、2009年)を刊行した。現在までのところ、地図については順調に研究が進行しているが、今後は空中写真および気象観測資料に重点を移し、環境や景観の変化の研究におけるその応用例を示したい。平成21年度は、5月に研究集会を行うほか、9月と3月にアメリカ議会図書館で資料調査を行い、特に1880年代に朝鮮半島と中国大陸で測量を行った日本軍将校の手描き原図の調査をほぼ完了した。これをふまえ、「1880年代の日本軍将校による朝鮮半島の地図作製:アメリカ議会図書館所蔵図の検討」ならびに「朝鮮末における日本参謀本部の将校の韓半島の偵察と地図作製」(韓文)を日韓両国の学会誌に掲載した。また、本研究と並行して構築してきた「外邦図デジタルアーカイブ」について人間文化機構の情報資源共有化研究会などでの発表を求められたので、これに協力した。

なお、年度末になり、本研究を含む外邦図研究をおこなってきた「外邦図研究グループ」が日本国際地図学会特別賞を受賞したほか、同グループが平成21年2月に刊行した『近代日本の地図作製とアジア太平洋地域:「外邦図」へのアプローチ』の編者、小林茂(本研究代表者)が日本地理学会優秀賞を受賞した。平成22年度は前年度からの繰越金により、戦中期に活動した京都の地政学グループ(綜合地理研究会)に関連する資料の編集と刊行をおこなった。新出資料(京都大学文書館蔵)の解読と入力にくわえ、それまで解読・入力していた資料の校訂、地政学グループのメンバーの遺族への協力依頼、さらにそれらをふまえた解説の執筆をおこない、『日本地政学の組織と活動-綜合地理研究会と皇戦会』として刊行した。このグループが外邦図を使った研究活動を行ったか検討したが、ほとんど使用しなかったことが明らかとなった。また、地政学グループのメンバーの遺族より、京都大学文書館にまだ収蔵されていない資料があるとの申し出を受け、その調査をおこなうとともに、このうちとくに重要なものについて解説を付し、印刷した。
自己写真撮影法による自己表現の比較文化的研究-「オート・フォトグラフィー」-

この研究は、日本文化に関する文化心理学理論に対する批判から出発した。現在主流の北山忍らの相互依存的自己論(Markus and Kitayama,1991など)は、ブルーナーの「ナラティヴ理論」(Bruner,1990)を背景にしていると思われる。すなわち、ある文化・社会に属する個々人は、その社会で交換されている「ものがたり」や「言い回し」や世論などに影響されながら自分を語ることによって、社会的なアイデンティティーを構成していくという考え方である。そこで、これまでの研究においては言語的なデータだけ注目され、日本人は言葉で自己卑下し、自分の個性を言語的にアピールしないから、日本人には「独立的な自己」も「セルフ・エスティーム」(自尊感情)の欲求もないという極端的な結論がなされている。一方、本研究は、アメリカ人と日本人の非言語的自己表現、すなわち「自分が誰であるのか」を表す自己撮影写真を比較した。そこで、日本人の自己撮影写真がアメリカ人のそれより操作されていて、肯定的だという事が証明された。このことは、アメリカ人は自分の言語的自己表現の中で自分のよい面を見せようし、自己高揚するのに対して、日本人は自分自身の視覚的自己表現の中でポーズをとったり自分のよい面を見せようとして表現を操作したりして自己高揚することを示していると考えられる。また、それぞれの社会の中心的なメディア・コミューニケーション・チャネルを考えると、アメリカの文化は言語的な「ナラティブ」(「聖書」哲学的思想、「ポリシー」)で伝わっているのに対して、日本人文化は環境と非言語的コミュニーケーション(「以心伝心」「家」「風土」「場」)で伝わっていると思われる。この理論は、メディアの文化差を示すことによって、アメリカと欧米文化の基本的な心理構造の共通性を強調しているものである。去年収集したデータ分析を行ってから、今年8月に台湾のアジア・社会心理学会で研究発表して、現在論文執筆中。Leuers and Sonoda 1999によって示されたように、日本人と比べて欧米人はTST(20答法)において自己高揚的な自己記述を行う。この実験の目的は、上記の知見に対して、日本人は「自分が誰であるのかを表す20枚をとってください」というTPT(20枚・自己写真撮影法)において自己高揚的な自己写真を撮るという仮設を実証することであった。この研究が始まる前に、日本で写真をとってもらって、データを集めてあった。この研究においてアメリカ側のデータを揃えるために、ニューヨーク州のユニオン大学の47人のアメリカ人被験者に写真を撮ってもらった。また、写真についてのTSTも記述してもらった。現在、分析の最初の段階では、実験の仮説が実証された。日本人の写真は、整っておリポーズされて、よい面だけを見せていたのに対して、アメリカ人の写真はポーズをとっておれず、ありのままを見せていた。また、日本人の写真はアメリカ人の写真より、本人の自己像が多く撮られていた。写真の分析から、日本人の写真は相対的に自己高揚的だという解釈ができた。途中結果を1998年10月、日本心理学会(東京学芸大学において)で発表した。最終結果を1999年7月、アジア社会心理学会で(アカデミキ力・シニカ・台湾において)発表する予定である。
タバコ煙中低分子化合物による細胞傷害メカニズムの解明と無毒化タバコ作製の試み

我々は、タバコ煙ガス相に含まれる細胞傷害性因子として、不飽和カルボニル化合物であるアクロレイン・メチルビニルケトン・シクロペンテノンの同定に成功した。しかしながら、これらの化合物による細胞傷害の分子機構は不明である。そこで本年度は、不飽和カルボニル化合物による細胞傷害の分子機構の解明に向け、タンパク質のカルボニル化の検出方法の確立を試みた。不飽和カルボニル化合物で処理した細胞から、免疫沈降法によってタンパク質を精製した。精製したタンパク質のカルボニル化の有無を、Aldehyde Reactive Probe(ARP)で検出した。条件検討の結果、免疫沈降にあたっては、細胞の可溶化にNP-40バッファーを用いることで良好な結果が得られることが判明した。この確立した手法を用いてPKC、STIM1、GAPDHなどのタンパク質が不飽和カルボニル化合物によるカルボニル化修飾を受けることを見出した。不飽和カルボニル化合物による細胞傷害を抑制できる化合物を見出すため、ハイスループットかつ定量的な細胞傷害の評価方法の確立を試みた。細胞膜傷害に伴って細胞内に取り込まれるPropidium iodide(PI)の蛍光を、フローサイトメトリーを用いて評価したところ、不飽和カルボニル化合物の濃度、及び処理時間依存的な反応関係が得られた。本手法は、酸化還元反応等、他の化学反応や酵素反応の影響を殆ど受けなかったことから、不飽和カルボニル化合物による細胞傷害の抑制物質のスクリーニングに適した手法であると考えられる。
副腎皮質刺激ホルモン受容体遺伝子の組織特異的転写調節機構の解明

1.副腎特異的エンハンサー領域の決定pGV-lucにβアクチンプロモーターを組み込んだヘクター(βApGV-luc)に5上流ゲノムDNAを3側より順次欠質させた変異DNAや中間配列を欠質させたDNA断片を結合させ、Y-1細胞に遺伝子導入しルシフェラーゼ活性を測定することによりエンハンサー領域を決定した。副腎やY-1細胞より精製した核抽出物を用いて、エンハンサー活性を持つ領域に対してDNaselフットプリント法やゲルシフト解析、位置指定変異導入法により確定した。2.副腎特異的転写因子のクローニング決定した塩基配列をプローブとして副腎mRNAより作製した発現cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより副腎特異的転写因子をクローニングした。副腎皮質刺激ホルモン受容体(ACTH-R)遺伝子の第一エクソンをプローブとして、NIH3T3細胞より作製したゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られたファージクローンをマッピングした。プローブ配列を含むDNA断片(EcoRI/SacI0.8kb)およびその直上流に位置するDNA断片(EcoRI/EcoRI2.2kb)に関して塩基配列決定し、並行して、マウス副腎より得たmRNAを鋳型にプライマー伸長法を施行した。その結果、124bpに亘り4つの転写開始点が存在すること、塩基配列決定により得られた情報と併せ、いづれの転写開始点上流にもTATA box,、GC boxおよびCAAT配列は存在しないことを明らかにした。次に、第一エクソンと転写開始点上流約2kbを含むDNA断片に関して、5'側DNAを欠失させた種々の長さをもつDNA断片を作製し、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を有するベクターに挿入し、遺伝子導入実験を行った。導入細胞として、マウス副腎細胞株であるY-1細胞と対照としてマウス線維芽細胞株であるNIH3T3細胞を用いた。予備実験結果から最下流転写開始点上流195bp内に副腎特異的発現調節領域が存在することが明らかになった。また、最下流転写開始点上流195bpに関して、さらに詳細に欠失変異体導入ベクターを作製し、ルシフェラーゼ活性を検討したところ、最下流転写開始点上流62bp内に最小プロモーター領域が存在すること、5'上流から2つの転写開始点の近接領域にはプロモーター活性を有さないことが判明した。
局所配列の物理化学に着目したタンパク質の立体構造予測の研究

タンパク質の立体構造構築原理を理解するために、また、構造予測の精度向上のために、タンパク質の局所構造に着目した研究を行った。特に、タンパク質の局所構造を表現する新しいモデルとしてゴーストウォーターモデルという陰溶媒モデルを導入し、そのモデルの開発と改良、構造予測のベンチマークテストを行った。大規模ベンチマークの結果、タンパク質の局所構造はそれ単独で取り出しても比較的安定であることが多いことわかった。現時点で最も有力なタンパク質立体構造予測法として知られているフラグメントアセンブリ法に関する基礎的、応用的の両方の観点から研究を行った。基礎的観点からの研究としては10残基程度のフラグメント構造を物理化学的に予測するための新しい溶媒モデルを構築した。このモデルはデータベース解析からタンパク質の中の極性基はほとんど100%水素結合しているということがわかっているので、水分子を陽に考慮しなくとも、これが実現されるように工夫されたモデルである。未だに改良の余地は多々あるが、このモデルを用いてタンパク質立体構造予測コンテストCASP8のいくつかの問題に対して予測構造を提出したところ、よい予測であった例がいくつかあり、今後の改良に期待が持てる結果が得られた。用研究として、フォールディング経路が実験的によく調べられてるタンパク質であるprotein Gとsh3に対して、フラグメンアセンブリ法を用いた自由エネルギー局面の解析からフォールディング経路を計算し、定量的によく再現していることが確認され、さらに実験では観察不可能はミクロな状態に関する情報が提供できることを示した。さらに、アロステリック反応を示す典型的なタンパク質であるカルモジュリンのアロステリック反応を理解するために、カルモジュリンN末端ドメインの構造変化をフラグメントアセンブリ法で記述することにも成功した。この計算からアロステリック反応に重要な働きをしている残基を特定できた。現時点で最も有力なタンパク質立体構造予測法として知られているフラグメントアセンブリ法の予測精度向上と立体構造構築原理の理解のために、局所構造の物理化学に着目した観点から研究を行った。具体的にはフラグメントアセンブリで使われる10残基程度のフラグメント構造を物理化学的に予測するための新しい溶媒モデル"ゴーストウォーターモデル"の構築と改良を行った。このモデルを用いて局所構造予測と局所構造の天然構造安定性評価をおこなったところ、水を考慮しないモデルと比べるとゴーストウォーターの導入によって飛躍的に予測精度が向上した。また、このモデルはもともと局所構造予測のために開発されたものであるが、タンパク質の全体構造の安定性評価としてのベンチマークテストを行ったところ良好な結果を得た。中でも、97%配列が一致しているにも関わらず構造が全く異なるタンパク質に対しても、我々が開発した手法では正しく構造を選択することに成功し、この方法の有効性を確認できた。他方、このような局所構造から全体構造を構築するアプローチの限界と問題点を洗い出すために大規模ベンチマークを行ったところ、局所構造としては極めてめずらしい形の構造が天然構造にあるようなターゲットに対しては、フラグメントアセンブリ法では限界があることが明らかとなった。このような問題を解決するために、フラグメントアセンブリ法とは逆の発想のアルゴリズム、すなわち大局的構造から局所構造が決まる、という方法論の開発に着手した。予備的なベンチマークではフラグメントアセンブリ法では予測が難しかったβシートタンパク質に対していくつか良好な予測結果を得た。
革新的な三次元培養装置を用いた血管化ヒト膵島再構成法の開発

本研究では、膵B細胞による膵島組織の創出を目指し、模擬微小重力発生装置を応用した回転培地装置を用いてMIN6細胞株から膵B細胞スフェロイドの大量創出技術を確立した。条件検討により任意のサイズの膵B細胞スフェロイドを多数創出可能な条件を見出した。得られた膵B細胞スフェロイドは2次元培養群と比較し、高いグルコース応答能、インスリン発現を示した。さらに、糖尿病モデルマウスへ移植した結果、持続的な血糖値下降効果が認められた。以上、本研究により、膵島移植に応用することの可能な血管化されたヒト膵島の創出に向けた細胞操作の基盤技術を開発した。マウスを対象とした検討においてb細胞株を用いることにより膵島スフェロイドが創出可能であることを既に確認していることから、米国ベイラー大学医学部松本慎一教授との共同研究(予定)によりヒト分離膵島を輸入し、これらの検体からヒトb細胞株を樹立することでヒト膵島スフェロイドの創出へ向けた準備を進めた。すなわt、機能的ヒト膵β細胞株は存在しないため、新たにヒト膵β細胞株を樹立することを目的として、細胞株樹立のためのレンチウイルスベクターの構築を行った。この際、複数のタンパク質を発現させるために複数のウイルスを導入するのではなく一つのウイルスからポリシストロニックに複数のタンパク質(最大4個程度)を発現させることのできる2Aシステムを用いることで、複数のウイルスを感染する場合よりも遺伝子変異の可能性が少ない膵β細胞株を樹立することを意図した。今後、、本ベクターを用いて膵β細胞の維持に重要なBmil遺伝子と共にTert、βカテニン等を導入し、効率の良い細胞株樹立に最適な導入遺伝子の組み合わせを探索する予定である。ヒト膵島の血管化を目的として、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)とヒト間葉系幹細胞(hMSC)を用いて、I型コラーゲンゲル包埋三次元培養によるヒト微小血管ネットワークの再構築を行った。すなわち、ゲル包埋した細胞をNOD/scidマウスのクラニアルウインドウ内に移植することにより、生体内でのヒト微小血管ネットワークの再構築を試みた。ゲル移植後のマウスにRhodamin-Dextranを静注し蛍光顕微鏡下にて観察することで、再構築された微小血管ネットワーク構造における血流動態解析を実施した。クラニアルウインドウ内に再構築されたヒト微小血管ネットワーク構造はhMSCに裏打ちされたHUVECから構成され、移植後有効な血流を伴って維持されることが示された。ヒト膵島の血管化を目的として、ヒト膀帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)とヒト間葉系幹細胞(hMSC)を用いて、I型コラーゲンゲル包埋三次元培養によるヒト微小血管ネットワークの再構築を行い、さらに膵β細胞株の混合移植による血管化膵島スフェロイドの創出を試みた。すなわち、ゲル包埋した複数の細胞(血管内皮細胞、間葉系幹細胞、膵β細胞)をNOD/scidマウスのクラニアルウインドウ内に混合移植することにより、生体内でのヒト血管構造を有した膵島様組織の再構築を試みた。その結果、クラニアルウインドウ内にヒト血管構造を有する膵島様組織を再構築することが可能であった。しかしながら、HUVECとhMSCを用いたヒト血管網は長期間にわたり生体内で維持されるにもかかわらず、膵β細胞株との混合移植の場合には、一時的に血管構造を有する膵島様組織が再構築されるにもかかわらず、それらの長期維持が困難であることが判明した。血管系との相互作用により適切な組織構造をとるためには、幹細胞等の未分化な細胞を用いる必要があることが示唆されることから、今後、この点について検討を進める方針とした。マウスを対象とした検討において膵β細胞株を用いることにより膵島スフェロイドがin vitroで創出可能であることを既に確認していることから、米国ベイラー大学医学部松本慎一教授との共同研究によりヒト分離膵島を輸入し、これらの検体からヒト膵β細胞株を樹立することでヒト膵島スフェロイドを創出することを試みた。すなわち、現時点において機能的なヒト膵β細胞株は存在しないため、新たにヒト膵β細胞株を樹立することを試みた。遺伝子導入には、プライマリー細胞への導入効率が高く、かつ、安全の高いセンダイウイルスベクターを用いた。本ベクターを用いてSV40、hTert、c-Mycを導入し、効率の良い細胞株樹立に最適な導入遺伝子の組み合わせを探索した。その結果、SV40とhTertおよびc-MycとhTertの組み合わせが、膵島より分離したヒト膵β細胞の増殖活性を上昇させることが判明した。今後、これらのヒト膵β細胞をクローニングすることにより、機能的なヒト膵β細胞株を樹立する予定である。前年度に我々が開発したヒト血管ネットワーク再構成技術を用いて、ヒト血管内皮細胞・間葉系幹細胞の存在下で膵β細胞の三次元培養を実施した。