hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エンジンを制御対象とした実機教材による動機付け

目的機械工学科の学生にはコンピュータプログラミングやマイコン制御の授業に苦手意識を持っている学生が存在する。これは授業の特性が電子・情報系寄りで、機械科の学生の興味が薄いためと考えられる。そこで、本研究では、機械科の学生が興味を持ちそうなガソリンエンジンを制御対象とした制御教材の開発を行った。内容制御対象には市販の50ccガソリンエンジンを、制御装置にはArduinoを用いた。本研究では、1)エンジンをアイドリングさせる、2)サーボモータでスロットルバルブを開閉させる、3)アクセル操作によってエンジンの回転数を上昇させる、4)エンジンの回転数を表示させる、の4つを制御できるか試みた。1)のアイドリングは、エンジンのクランクパルス入力に対して、ある一定の適当な時間燃料噴射装置を作動させることで容易に達成できた。2)はアクセルに見立てたレバーに可変抵抗器を取り付け、アナログ入力に対してサーボモータの角度制御を行った。3)はスロットル開度(サーボモータの角度)及びエンジン回転数(クランクパルスの周期)から燃料噴射量を調整するスロットルースピート方式を採った。4)はクランクパルス周期から計算したエンジン回転数を7セグメントに表示させた。成果エンジンをアイドリングさせることは極めシンプルなプログラムで達成でき、学生に与えるインパクトも大きい。電子スロットル制御は、応用として、Ecoモードとスポーツモードの切り替えやオートクルーズ制御など、現代の自動車に使われている技術を体験するができる。現代では、低燃費、低排出や自動運転の実現のため、自動車と電子制御は切り離せないものである。これらの技術背景を説明し、実際に自分のプログラムでエンジンを動かすことにより、機械科の学生にも電子制御の学習の意義と楽しさを与えることができたと考えられる。
変容過程からみた雁木町家の相隣関係と街路との相補的関係 -上越市3町の比較検討

本研究は伝統的な街路空間である〈雁木〉について、近代以降から現代までの間に、町家の更新されるなかで相隣関係が保持され、街路や主屋と一体となって相補的な空間システムが形成されてきた過程を把握することを目的とした。同じ地理的条件にあり街路景観の異なる新潟県上越市内の城下町〈高田〉、湊町〈直江津〉、街路村〈稲田〉について、それぞれの1街区を選定した(大町3丁目、裏砂山町、稲田1丁目)。街区の変容過程の分析から、雁木は屋敷内の生活に根ざしていること、雁木は住宅から道路や水路への働きかけの拠点となっていること、これにより各町の特徴的な街路景観がつくられていることを明らかにした。本研究は伝統的な街路空間である〈雁木〉について、近代以降から現代までの間に、町家の更新されるなかで相隣関係が保持され、街路や主屋と一体となって相補的な空間システムが形成されてきた過程を把握することを目的としている。平成26年度は、同じ地理的条件にあり街路景観の異なる上越市内の湊町〈直江津〉、在郷町〈稲田〉について1街区を選定した。湊町〈直江津〉については旧裏砂山町を選定し、現況の連続配置図を街区レベルで作成した。聞き取りと写真資料により1960年代の屋敷構えを街区レベルで復元した。裏砂山町通りには現在も中央に段差がある。資料と聞き取りにより、1960年まで街路中央に屋根付きの共用井戸が2か所あったこと、通りの両側の雁木下に共用井戸が1か所ずつあったことを把握した。近代の直江津における職業ごとの住戸分布から、旧裏砂山町通りには漁師と船員が居住し、専用住宅が多数を占めていたとわかった。敷地は奥行きが小さく、各戸は地尻の水路や個別の井戸を持たなかった。共用井戸の位置と近隣地縁組織の範囲とを照合し、利用と維持管理の井戸組が地縁組織と対応していることを把握した。1960年の上水道敷設により共用井戸は廃止された。一方、主屋の雁木側には個別の水道蛇口が設けられ、雁木下での野菜洗いは現在も継続している。在郷町〈稲田〉については稲田1丁目を選定した。稲田1丁目について、街路の中央に水路の流れる雁木通り両側の連続する4軒について連続配置図を作成した。空中写真と閉鎖地籍図により1950年代の当該街区の配置図を復元した。中央水路には作場道と交わる場所に橋が架けられ、西岸に洗い場が設置され樹木が並んでいたことを把握できた。1960年以降に上水道敷設と河川改修が実施されたとわかった。敷地裏側の耕地や水路の利用、中央水路と雁木利用について聞き取りと資料収集を行った。本研究は伝統的な街路空間である〈雁木〉について、近代以降に町家の更新されるなかで相隣関係が保持され、街路や主屋と一体となって相補的な空間システムが維持されてきた過程を把握することを目的としている。平成27年度は、上越市内の城下町〈高田〉のうち、直線状の雁木通りと背割水路を特徴とする大町3丁目の1街区を選定した。さらに湊町〈直江津〉と街路村〈稲田〉について連続平面図を採取し、雁木と境界に表れた相隣関係を把握した。城下町〈高田〉大町3丁目において屋敷裏側の水路と畑の利用を聞き取りし、上越市が保管する1978年の区画整理従前図から各戸の敷地裏側を含めた家屋配置を図面化し、水路利用や相隣関係に依拠する空間配置の型を把握した。湊町〈直江津〉については、前年度に選定した裏砂山町の3軒の並びについて現況連続平面図を作成し、1960年代の平面を聞き取りし、変容過程を分析した。街路村〈稲田〉については、前年度に選定した稲田1丁目について旧用水を挟んで向かい合う4軒の連続平面図を作成し、1960年代の平面を聞き取りし、変容過程を分析した。旧用水に沿いに雁行する町家の平面の出隅と入隅の利用、ならびにトオリニワと洗い場との位置関係を把握した。平成27年度当初の研究実施計画では、城下町〈高田〉における屋敷裏側の小河川の共同利用の把握と連続平面図実測対象地の選定、湊町〈直江津〉裏砂山町と農村集落〈稲田〉稲田1丁目それぞれの連続平面図に表れた相隣関係の把握、湊町〈直江津〉裏砂山町における段差のある雁木と雁木下の共用井戸の設えの把握、街路村〈稲田〉稲田1丁目における雁行する雁木と入隅と出隅の利用の把握を予定していた。いずれも達成することができた。城下町〈高田〉については、現在も雁木通りが連続し、裏側に背割水路のある大町3丁目を選定し、利用と空間配置の型を把握できた。湊町〈直江津〉裏砂山町においては、通り中央の共用井戸と各戸の井戸との使い分け、ならびに井戸組と雁木通りの対応を把握できた。〈稲田〉については、当初在郷町と位置づけたが、連続平面図とその変容過程の分析により、農業を兼ねる雁木町家の自律的な働きかけにより用水沿いの街路景観がつくられてきたとわかった。また、史料により対象とした旧用水沿い雁木通りは町立てされた稲田竪町とは異なるとわかった。これにより位置づけを街路村に修正することができた。

本研究は伝統的な街路空間である〈雁木〉について、近代以降に町家の更新される中で相隣関係が保持され、街路や主屋と一体となって相補的な空間システムが維持されてきた過程を把握することを目的としている。年度当初に予定していた4項目について実測調査とデータの図面化を進めた。まず城下町〈高田〉で大町3丁目の連続する3軒の平面図を作成した。前年度に入手した1978年区画整理従前図と比較し変容過程を把握した。つぎに連続立面図を作成した。隣家の更新に伴い側面の高窓から屋根上の天窓への変更によりチャノマの光環境を確保する過程と相隣関係を記述できた。湊町〈直江津〉や街路村〈稲田〉の雁木町家にも高窓からの採光を確認した。第三に、祭礼時の雁木空間の設えと住民の行動場面を連続平面図と断面図に記述した。3つの雁木通において、雁木柱が公私境界であることを示す設えと行動場面が共通していた。第四に、3つの町の相隣関係と相補的関係を比較した。道路側と後ろ側の両方に住居から働きかけがなされた結果、各地区の特徴的な街路景観がつくられていることを把握した。連携研究者が進める中国広州市の騎楼の調査結果と比較した。街区レベルで道路と住宅の関連に注目すると建築形態も住まい方も大きく異なっていた。私領域に属する雁木空間が都市の構成要素として公共性を獲得する根拠として、屋敷構えの要素が並びをなすことにより居住環境を確保する構成を屋敷ゾーンごとに持つ点、雁木の開放性が居住者の道路や屋根への働きかけをもたらしている点を把握した。研究代表者は研究成果を平成28年6月から7月にIAPSで発表し、8月に建築学会大会で報告した。平成29年1月に上越市からの招待により同市職員を対象に報告した。平成29年3月6日と3月7日に連携研究者とともに上越市の町家交流館高田小町において地域の住民と上越市担当課職員を対象に成果報告会を実施した。本研究は伝統的な街路空間である〈雁木〉について、近代以降から現代までの間に、町家の更新されるなかで相隣関係が保持され、街路や主屋と一体となって相補的な空間システムが形成されてきた過程を把握することを目的とした。同じ地理的条件にあり街路景観の異なる新潟県上越市内の城下町〈高田〉、湊町〈直江津〉、街路村〈稲田〉について、それぞれの1街区を選定した(大町3丁目、裏砂山町、稲田1丁目)。街区の変容過程の分析から、雁木は屋敷内の生活に根ざしていること、雁木は住宅から道路や水路への働きかけの拠点となっていること、これにより各町の特徴的な街路景観がつくられていることを明らかにした。平成26年度当初の研究実施計画では、同じ地理的条件にあり街路景観の異なる上越市内の城下町〈高田〉、湊町〈直江津〉、在郷町〈稲田〉の1街区を調査対象として選定する予定としていた。湊町〈直江津〉について裏砂山町、在郷町〈稲田〉について稲田1丁目を選定し、現況の街区について連続的な配置図を実測し、聞き取りから1960年代の街路の共用空間を復元できた。平成26年度当初の研究実施計画では、近世から近代にかけての主たる生業や町内の範囲を把握する予定としていた。湊町〈直江津〉裏砂山町については漁師と船員、在郷町〈稲田〉稲田1丁目については農家が多かったことを把握できた。これら町に特徴的な生業の住戸についてはその位置を把握できた。平成26年度当初の研究実施計画では、1960年代の配置図と地形断面図を復元し、現況と比較することにより、敷地と街路側共用空間との相補的関係を把握する予定としていた。1950年代以降の道路拡幅や上水道敷設事業の影響を把握する予定としていた。湊町〈直江津〉裏砂山町については、現在と1960年代の配置図と地形断面図を復元し、比較することができた。
体育科における「教師のプロ意識」調査票の開発に関する実証的研究

本研究の目的は、体育分野で卓越した教師と言われる方々のプロ意識を導出すること、導出したプロ意識を実際の体育授業場面で表現するためにはどうすればいいのかを優れた教師(態度得点の高い教師)を対象に、実証的に検証すること、導出したプロ意識の伝達可能性を文献学的に検討することの3点を研究課題として取り組んだ。その結果、優れた教師に共通した意識として、子どもを探る「子ども理解」に関わったプロ意識の高いことを導出した。また、こうしたプロ意識を学ぶステップとして、まずは「見ること」、次に「観ること」が教師のキャリア発達のステージであることが明らかになってきた。昨年度の研究の中で、作成した「教師のプロ意識」調査票では、他教師から対象教師に向けての「他者評価」と、インタビュー調査を用いた教師の「自己概念」の導出に困難性があったという課題が残った。そこで本年度は、研究課題1「教師のプロ意識」調査票の開発過程の継続を中心に行った。昨年度の研究成果を踏まえて、「自己概念」「専門技能」「他者認知」を体育授業に当てはめた結果、「反省得点」「運動技能」「態度得点」からの三点分析法を用いれば測定可能ではないかという仮説を導出した。つまり、研究課題2の実施ではなく、上記の学習成果そのものが教師のプロ意識を反映しているという仮説を導出した。具体的には、12名の教師を対象に,一単元に渡って体育授業を実践してもらい、「反省得点」「運動技能」「態度得点」それぞれを得点化し順位をつけた。その後,Spearmanの順位相関係数を算出した。その結果、いずれの関係も有意(P<.01)な正の相関関係にあった。とりわけ,反省得点と運動技能との間に高い相関関係(r=+.710)が認められた。つまり、教師が体育授業に力を入れて取り組むことで子どもの運動技能が向上し、結果的に子「他者認知」の態度得点が高まる関係にあることがわかった。これらより、「反省得点」「運動技能」「態度得点」からの三点分析法を用いる方法は、「教師のプロ意識」測定法として応用可能であるものと考えた。そこで、「教師のプロ意識」測定法の結果と体育授業中の教師行動との関係性の検討を新たに設定し、実施した。具体的には、6名の教師を対象に、調査を実施した。その結果、「教師のプロ意識」測定法によって算出した順位の高い上位群の教師(3名)の方がそうでない教師(3名)よりもマネジメント行動の時間が少なく(上位群:13.1%、下位群:23.2%)、プロ意識の高い教師ほど体育授業前の準備が整備されていたことがわかった。本年度は,(1)プロ意識を構成する「自己概念」「専門技能」「他者認知」(トンプソン,1971)それぞれの要素を測定・評価する方法を作成すること,(2)小学校教師を対象に,先の「自己概念」をはじめとする3つの観点それぞれを測定・評価し,3つの評価結果の相関関係を検討することで,「教師のプロ意識」調査票を開発することを試みた。すなわち,小学校教師とその同僚を対象に,本人へのインタビューから「自己概念」を,子どもの学習成果(パフォーマンス)から「専門技能」を,他教師の評価から「他者認知」を,それぞれ測定・評価した。このとき,「他者認知」について,すべての学校現場で実施を試みたが,調査対象校の先生方と相談・検討した結果,測定実施に困難な教師も存在した。また,学習成果(パフォーマンス)も測定の条件を統一する目的から,今年度は「水泳」教材に限定して実施した。その結果,(i)「自己概念」「他者認知」の2つの観点は,いずれも5段階で評価可能であったこと,(ii)「他者認知」と「専門技能」に正の相関関係が認められたこと,(iii)「自己概念」「専門技能」「他者認知」のいずれも,経験年数や性差といったコンテキスト要因の影響は受けていないこと,をそれぞれ導出した。このとき,「自己概念」はいずれの観点とも相関関係は認められなかった。これには,事例数が少なかったこと,作成したインタビュー内容が理解しにくいものになっていたこと,が課題として考えられた。今後,作成した3つの観点それぞれに修正を加え,再度,開発を試みる必要性があった。いずれにしても,導出した結果から,教師のキャリア発達を担保していくためには,挫折や成功した体験など豊富な経験を獲得していくこと,研究会などに積極的に参加し専門的な知識を獲得していくこと,子どもの学習成果を高める実践的指導力を高めていくこと,が重要であるものと考えられた。本研究の目的は、体育科における「教師のプロ意識」を調査し、卓越した実践者たちの有したプロ意識は伝達可能なのかを学校現場の授業を対象に検討することにあった。

具体的には、教師のプロ意識を「自己概念」「専門技能」「他者認知」(トンプソン,1971)それぞれの要素より測定・評価する方法の作成を目指していた。ところが、研究を推進していくプロセスの中で「他者認知」と「専門技能」とが必ずしも一致しないことが明らかになってきた。これより、教師のプロ意識を測定することの意義は低いものと考えられた。そこで今回、斎藤喜博などの体育分野で卓越した教師と言われる方々のプロ意識を導出すること、導出したプロ意識を実際の体育授業場面で表現するためにはどうすればいいのかを優れた教師(態度得点の高い教師)を対象に、実証的に検証すること、導出したプロ意識の伝達可能性を文献学的に検討することの3点を研究課題として取り組んだ。その結果、優れた教師に共通した意識として、子どもを探る「子ども理解」に関わったプロ意識の高いことを導出した。また、こうしたプロ意識を学ぶステップとして、まずは「見ること」、次に「観ること」が重要になってくることが明らかになってきた。現在、小学校教育現場では「運動を知らない教師」がほとんどであると言われている。こうした現状は、子どもたちの真正な願い(上手くなりたい)を沈殿化させてしまうものであり、「子ども理解」とは程遠い教師行動である。そこで、教師としてキャリア発達し優れた教師へと成長していくためには、まずは子どもを見て、見えていなかったものが見えるようになることが重要になってくることが、本研究より明らかになってきた。その上で、観ることが出来るようになることであった。以上の研究実績を挙げることができた。なお、これらの研究実績は、著書2冊にまとめさせて頂いた。教師教育昨年度は、予定していた研究仮説とは異なる結果が導出されたこと、研究方法として困難性が認められたことといった課題が残っていた。こうした課題を解決するために、新たな観点より検討・調査していく方法として「反省得点」「運動技能」「態度得点」からの三点分析法を提案した。この方法は、主観的な情報となるインタビュー調査の結果分析よりも効率的で客観的に測定可能な方法に変えることができた。その結果、「教師のプロ意識」測定法として応用可能であるという成果を導出することができた。合わせて、今年度は昨年度に人事異動等の理由で調査できなかった先生方にも新天地で協力頂くことが可能になったことで、「教師のプロ意識」測定法の結果と体育授業中の教師行動との関係性の検討を新たに設定し、実施することまで可能になった。こうした理由より、当初挙げていた研究課題2まで順調に進展させることが出来た。学校人事や学級経営等の理由により,当初,予定していた調査対象者を大幅に削減することを求められた。とりわけ,学校長や各学校で研究部を担当していた教師の異動により,前年度に調査依頼をしていた内容を再度,依頼にいくことを求められるなど,研究当初に予定していなかったことが生起した。これにより,「自己概念」「専門技能」「他者認知」の各測定観点を作成するための十分な先行研究の概観が遅れることとなった。なかでも,「自己概念」と「他者認知」については,アンケート調査とインタビュー法を用いて行うため,そこで取り扱うデータは教師の主観的な情報の切り取りになってしまう危険性が高かった。これより,収集したデータに対していかに客観的根拠を担保していくかは十分な先行研究の概観に求められることとなるが,先の理由によってここに十分な時間の確保をさくことが今年度は困難であった。
因果推論における意識的過程と無意識的過程の相互作用

本研究の目的は、密度バイアスや因果マルコフ条件の逸脱といった不合理な判断に焦点を当て、因果推論における意識的過程と無意識的過程の相互作用を検討することであった。一見相容れない合理的な認知モデルと不合理的な判断の関係を調べることで、合理的な判断と不合理な判断がそれぞれどのように生じているか解明することを目指した。当初の予定では密度バイアスと因果マルコフ条件の逸脱の2種類の現象を扱うことを予定していたが、昨年度の段階で連続変数を対象とした因果推論において密度バイアスが生じないことが明らかとなり、本年度は変数の性質が因果推論に及ぼす影響について検討した。原因事象と結果事象の組み合わせを繰り返し提示し、実験参加者に因果関係の強さを判断させる実験課題において、因果関係の性質や変数の統計的性質を操作した。抑制的因果関係においても変数の性質に応じて密度バイアスの出現が変化するか検討したところ、発生的因果関係と同様に連続変数を対象とした場合には密度バイアスが消失することが明らかとなった。二値変数と連続変数の統計的性質の違いとして変数の分散が挙げられる。連続変数を対象とした因果推論の実験事態において結果事象の分散を操作したところ、因果効果の判断に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。これらの実験結果について新たなモデルを構築し、説明を試みているところである。研究成果については学会発表や論文投稿を行い、理論と実験の両側面から検討していく必要がある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。因果推論に対するベイズ的アプローチでは、思考の合理的側面に焦点が当てられ、不合理な判断の発生プロセスや思考の無意識的過程の役割は明らかになっていない。本研究では、密度バイアス(density bias)と因果マルコフ条件の逸脱(Markov violation)という2つの不合理な判断に焦点を当て、因果推論における意識的過程と無意識的過程の相互作用を検討する。一見相容れない合理的な認知モデルと不合理的な判断の関係を調べることで、合理的な判断と不合理な判断がそれぞれどのように生じているかを明らかにする。平成29年度は密度バイアスについて実験を実施した。原因事象と結果事象の組み合わせを繰り返し提示し、実験参加者に因果関係の強さを判断させる実験課題において、原因となる変数の性質を二値変数や連続変数に操作した。実験の結果、連続変数の場合には密度バイアスが生じないことが明らかになった。一部の実験をクラウドソーシングで実施することに変更したため、その準備に時間が掛かってしまった。オンライン実験と実験室実験を並行して進めているため、遅れを取り戻すことは十分に可能である。平成30年度は因果マルコフ条件の逸脱について実験的検討を行う予定である。推論の意識的過程と無意識的過程について様々な実験操作を行い、両過程の相互作用を明らかにする。また、平成30年度は最終年度であるため、上記の実験の実施に加えて研究の総括を行う。
マッデン・ジュリアン振動に海面水温分布が果たす役割の理解とそれに基づく温暖化予想

「現在気候における海面水温とMJOの関係を理解すること」「将来気候における海面水温パターン予想の多様性に基づき,地球温暖化下におけるMJOおよびそれのもたらす異常気象の将来予想の不確かさを把握すること」の2点を目的としていた本計画だが,1年目である当該年度は特に前者に取り組んだ。まず,海面水温の東西勾配が大きな役割を果たす大気循環であるウォーカー循環について,そのインド洋上の下降流における特異性を理論的考察によって理解した。具体的には,まず数式を用いた理論的考察によって,ウォーカー循環におけるインド洋上の下降流を実現するためには,鉛直伝播する大気の波が必要であることが示唆された。またこれは,気候データの解析によって乾燥静的エネルギーの収支の見積もりを行い,エネルギー的な考察を行うことによっても確かめられた。この下降流がMJOの発生に重要な役割を果たす可能性があると考えている。さらにこの下降流については,現象を理想化して,物理的考察を助ける簡易な数式で記述することができた。これらの結果は,論文を執筆し始められる状態にある。今後は理論の検証のために,NICAM等の気候モデルを用いた数値実験を行うこと,およびこの波活動がMJOの発生メカニズムに直接的に寄与している証拠を探る計画である。また平成30年7月,理論構築と海面水温データ解析の過程において,中緯度気候の長期変動が当初想定していた熱帯遠隔影響を主原因とするだけでなく,中緯度海面水温と偏西風の結合系としてのふるまいに積極的に影響される可能性を発見した。そのため,当初の計画とは異なるものの,この結合系としてのふるまいを詳細に調べることが,海面水温が我が国の異常気象に与える影響を明らかにするためにより本質的だと考えて解析を進めた。その結果については,現在1件の国際学会発表,および1件の国内学会発表の予定がある。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
対称空間内の部分多様体及びその様々な曲率流に沿う時間発展の研究

平成30年度は、主に、次の2つの研究を推進させた。1.ある条件下で、非コンパクト型対称空間内の余次元2以上の実解析的な等径部分多様体の等質性定理を導いた。その証明方法は次の通りである。元の等径部分多様体の複素化の無限次元アンチーケーラー空間へのリフトが、あるバナッハリー群等長作用により等質であることを示し、さらにそのバナッハリー群作用から元の等径部分多様体を軌道にもつ非コンパクト型対称空間へのリー群等長作用を構成するという方法である。また、より強い条件下で、非コンパクト型対称空間内の余次元3以上の滑らかな等径部分多様体の等質性定理を導いた。その等径部分多様体に付随する球面型の位相的Titsビルディングを構成し、ビルディング理論を用いてその等径部分多様体が外の空間の対称空間のイソトロピー作用の主軌道であることを導出するという方法である。この研究結果をまとめた論文は、既にOsaka Journal of Mathematicsに掲載されることが決定されている。2.概自由なヒルベルトリー群作用を備えた可分なヒルベルト空間内のその群作用に関して不変な超曲面を発する正則化された平均曲率流を調べ、その初期超曲面が水平凸である場合に、ある条件下でその群作用のある軌道に崩壊することを示した。さらに、その結果のゲージ理論への応用として、コンパクト4次元リーマン多様体上のコンパクト半単純リー群を構造群にもつ主バンドルの自己双対接続のモジュライ空間の特異点の流れを利用した分析に関する研究を創始した。研究実績の概要欄に記述した通り、おおむね順調に研究を推進させることができた。研究実績の概要欄に記述した、概自由なヒルベルトリー群作用を備えた可分なヒルベルト空間内のその群作用に関して不変な超曲面を発する正則化された平均曲率流の崩壊定理のゲージ理論への更なる応用結果を導出したいと考えている。次年度に国内出張、外国出張がいくつか控えているため。
一次繊毛形成を制御する新規Ｒａｂの探索と機能解析

本年度はまず、一次繊毛(シリア)形成を制御する新規候補Rabの探索を行った。ヒト網膜色素上皮に由来するhTERT-RPE1細胞を用いて、ヒトに存在する全てのRabに対する網羅的なノックダウンスクリーニングを行った結果、候補分子としてRab34を同定することに成功した。次に、hTERT-RPE1細胞を用いてRab34のノックアウト細胞株を作製したところ、Rab34のノックダウンと同様に一次繊毛形成の抑制が観察された。この一次繊毛形成の抑制はRab34の再発現により回復することから、オフターゲット効果によるものではないことが確認できた。他の細胞種でもRab34が一次繊毛形成に関与するのか、さらにマウス胚性繊維芽細胞(NIH-3T3)及びイヌ腎臓尿細管上皮細胞株(MDCK-II)を用いて検討した。その結果、NIH-3T3細胞でのみRab34のノックアウトによる一次繊毛形成の抑制が観察された。以上の結果から、Rab34はhTERT-RPE1細胞やNIH-3T3細胞のような極性を持たない細胞での一次繊毛形成に関与していることが示唆される。次に、Rab34のノックアウト細胞株を用いて一次繊毛形成以外の細胞機能への影響を確認したところ、細胞小器官の形態や、細胞周期、細胞増殖を制御するmTORC1の活性には異常が見られなかったことから、Rab34のノックアウトによる一次繊毛形成の抑制は副次的なものではないと考えられた。最後に、Rab34の下流で働くエフェクター分子の探索も行い、その候補の一つであるRILPのノックアウトにより一次繊毛形成が抑制されるという結果も得られている。以上の結果から、RILPはRab34と協調して一次繊毛形成を制御する可能性が極めて高いと考えられる。一次繊毛(シリア)形成を制御する新規候補Rabを探索するため、ヒト網膜色素上皮に由来するhTERT- RPE1細胞を用いて網羅的なノックダウンスクリーニングを行い、候補分子としてRab34を同定することに成功した。hTERT-RPE1細胞を用いてRab34のノックアウト細胞株を作製したところ、Rab34のノックダウンと同様に一次繊毛形成の抑制が観察された。この一次繊毛形成の抑制はRab34の再発現により消失することから、オフターゲット効果によるものではないことが確認できた。さらに、Rab34の下流で働くエフェクター分子の探索も行い、その候補の一つであるRILPのノックアウトにより一次繊毛形成が抑制されるという結果も得られている。以上の結果から、RILPはRab34と協調して一次繊毛形成を制御する可能性が極めて高いと考えられ、期待以上の研究の進展があったと判断できる。これまでの研究で、一次繊毛は幾つかの段階を経て形成されることが明らかになっている。そこで、Rab34が一次繊毛形成のどの段階に関与しているのかを明らかにするため、Rab34のノックアウト細胞株を用いて、既存の一次繊毛形成時に働くタンパク質のうち、IFT20、IFT88、CP110、CEP83の局在を観察した。これまでの解析では、野生型細胞とRab34ノックアウト細胞の間でこれらのタンパク質の局在には変化が見られていないことから、Rab34はこれらのタンパク質が関与する段階よりも後期の段階に関与している可能性が高いと考えられる。引き続き、一次繊毛形成の後期の段階で働くタンパク質についても検討を行う予定である。また、Rab34の下流で働くエフェクター分子を同定するため、既報のRab34エフェクター候補分子であるFolliculinのノックダウン、RILPとRILP-L2のノックアウトを行った。その結果、Folliculinのノックダウン及びRILP-L2のノックアウトでは一次繊毛は正常に形成されたのに対し、RILPのノックアウト細胞株では一次繊毛形成の抑制が観察された。以上の結果から、RILPがRab34と協調して一次繊毛形成を制御する可能性が高いと考えられ、両者の結合の一次繊毛形成における重要性について次年度以降も解析を続ける予定である。

以上の結果から、Rab34はhTERT-RPE1細胞やNIH-3T3細胞のような極性を持たない細胞での一次繊毛形成に関与していることが示唆される。次に、Rab34のノックアウト細胞株を用いて一次繊毛形成以外の細胞機能への影響を確認したところ、細胞小器官の形態や、細胞周期、細胞増殖を制御するmTORC1の活性には異常が見られなかったことから、Rab34のノックアウトによる一次繊毛形成の抑制は副次的なものではないと考えられた。最後に、Rab34の下流で働くエフェクター分子の探索も行い、その候補の一つであるRILPのノックアウトにより一次繊毛形成が抑制されるという結果も得られている。以上の結果から、RILPはRab34と協調して一次繊毛形成を制御する可能性が極めて高いと考えられる。一次繊毛(シリア)形成を制御する新規候補Rabを探索するため、ヒト網膜色素上皮に由来するhTERT- RPE1細胞を用いて網羅的なノックダウンスクリーニングを行い、候補分子としてRab34を同定することに成功した。hTERT-RPE1細胞を用いてRab34のノックアウト細胞株を作製したところ、Rab34のノックダウンと同様に一次繊毛形成の抑制が観察された。この一次繊毛形成の抑制はRab34の再発現により消失することから、オフターゲット効果によるものではないことが確認できた。さらに、Rab34の下流で働くエフェクター分子の探索も行い、その候補の一つであるRILPのノックアウトにより一次繊毛形成が抑制されるという結果も得られている。以上の結果から、RILPはRab34と協調して一次繊毛形成を制御する可能性が極めて高いと考えられ、期待以上の研究の進展があったと判断できる。これまでの研究で、一次繊毛は幾つかの段階を経て形成されることが明らかになっている。そこで、Rab34が一次繊毛形成のどの段階に関与しているのかを明らかにするため、Rab34のノックアウト細胞株を用いて、既存の一次繊毛形成時に働くタンパク質のうち、IFT20、IFT88、CP110、CEP83の局在を観察した。これまでの解析では、野生型細胞とRab34ノックアウト細胞の間でこれらのタンパク質の局在には変化が見られていないことから、Rab34はこれらのタンパク質が関与する段階よりも後期の段階に関与している可能性が高いと考えられる。引き続き、一次繊毛形成の後期の段階で働くタンパク質についても検討を行う予定である。また、Rab34の下流で働くエフェクター分子を同定するため、既報のRab34エフェクター候補分子であるFolliculinのノックダウン、RILPとRILP-L2のノックアウトを行った。その結果、Folliculinのノックダウン及びRILP-L2のノックアウトでは一次繊毛は正常に形成されたのに対し、RILPのノックアウト細胞株では一次繊毛形成の抑制が観察された。以上の結果から、RILPがRab34と協調して一次繊毛形成を制御する可能性が高いと考えられ、両者の結合の一次繊毛形成における重要性について次年度以降も解析を続ける予定である。
強双曲型方程式において弱零条件の果たす役割の解明

強双曲型方程式に対する2次の非線型摂動を研究対象とする。非線型波動方程式に対しては,その解の大域挙動を解析するにあたり,零枠と呼ばれる座標系やそれに付随する解の時間減衰度を基準とした解の分解などの解析手法が整備されてきた。そこで,これらの手法を強双曲型の方程式系に対しても適用できる形式に拡張し,解の主要部が満たす偏微分方程式系を導出し,その大域可解性に係る条件として弱零条件を導入する。更に,その条件の下で真空中のアインシュタイン方程式のBSSN形式における大域可解性を示す。また,物質場を伴うアインシュタイン方程式についても解析を進め,強重力場を発生源とする時空間における特異性を調べる。
3次元的接着環境下でのがん増殖メカニズムと細胞外分泌小胞によるその制御機構の解析

本研究は、がん細胞が浸潤・転移の過程で置かれる3次元的接着環境に適応し、増殖する機構の解明を目的とした。本研究で作製した3次元環境適応株は、親株と比較して、定常状態でのSTAT3リン酸化の亢進とこの下流で発現制御を受けるアポトーシス抑制因子Bcl-xの発現上昇、MMP-9やCathepsin Lなどのプロテアーゼの発現亢進とHAI-1/2などの数種類のプロテアーゼ阻害因子の発現抑制が認められた。従って、MKN7株の3次元的足場環境への適応制御は、STAT3シグナルを介したアポトーシス抑制とプロテアーゼ分解による細胞外環境のリモデリングなどが関与することが示唆された。本年度は、立体的足場環境下での増殖性が低いMKN7細胞を親株として作製した三次元環境での増殖性が高い三次元適応株において、親株と比較してリン酸化レベルが異なるタンパク質を探索する方法を確立するために、SLIAC法による培養細胞の安定同位体標識ととPhos-tagアガロースによるリン酸化タンパク質の単離を組み合わせた手法の導入を試みた。SILAC法による培養細胞の安定同位体標識は、親株に発現するタンパク質を12C-リジン、三次元適応株に発現するタンパク質を13C-リジンとするために、市販されているSILAC標識キット(Pierce SILAC Protein Quantitation Kit-DMEM、Thermo Scientific)を用いて、各株を培養して標識した。これと平行して、Phos-tagアガロースによるリン酸化タンパク質の精製条件の検討も行った。親株と三次元適応株からそれぞれphos-tagアガロースを用いてリン酸化タンパク質をプルダウンし、両サンプル間でのリン酸化タンパク質の差を、SDS-PAGWEと抗チロシンリン酸化タンパク質抗体を用いて比較したが、現在までに顕著な違いを見出してはいない。細胞可溶化液の調製条件、プルダウン条件の検討等が今後必要と考えられる。本年度は、三次元適応株で特異的に変化しているタンパク質発現およびタンパク質リン酸化の同定を試みるために、種々のタンパク質リン酸化およびプロテアーゼ発現プロファイル解析を行った。同解析では、膜受容体のリン酸化、MAPK関連分子のリン酸化、細胞ストレス関連分子の発現、アポトーシス関連分子の発現、プロテアーゼ/プロテアーゼ阻害因子の発現をそれぞれプロファイルするために、種々のProteome Profilerアレイキット(R&D systems製)を用いて解析した。さらに、三次元適応株で特異的にリン酸化レベルが変動する分子を網羅的に同定するために、リン酸化タンパク質の精製法として、Phos-tagによる精製法の確立を行った。本年度は高分化型胃がん由来MKN7細胞(MKN7-親株)とこれから作製した三次元適応株(MKN7-3D株)、低分化型胃がん由来MKN45細胞(MKN45-親株)とこれらか作製した三次元適応株(MKN45-3D)を用いて、三次元適応株で特異的に発現が亢進あるいはリン酸化が亢進しているタンパク質のスクリーニグを行った。スクリーニングにはProteome profiler (R&D)を用いて、細胞膜受容体型キナーゼのリン酸化(49種)、非受容体型キナーゼのリン酸化(43種)、細胞ストレス関連分子の発現(26種)、がん関連因子の発現(84種)、プロテアーゼ/プロテアーゼ阻害タンパク質の発現(34種/32種)について、親株と3D株間での差を解析した。この結果、MAPK関連因子など、3D株でリン酸化あるいは発現が上昇しているタンパク質が同定された。また3D株の性状解析の結果、MKN7では3D環境での継続培養によって、上皮細胞の特性が消失しており、不可逆的な間葉転換が生じていることが認められた。さらに、3D株から分泌される細胞外分泌小胞の性状を明らかにするために、これでMKN7親株を処理し、悪性化の誘導が認められるかを解析したが、大きな変化は認められなかった。この分泌小胞の性状解析は今後の課題である。リン酸化タンパク質の網羅的精製法の確立が予定より遅れている。タンパク質の抽出、Phos-tagにリン酸化タンパク質を結合させる条件、同tagからタンパク質を溶出する各条件のさらなる検討が必要である。一方で、当初予定していなかったProteome Profilerを用いた解析を導入したことにより、この方法を用いた三次元適応株に特異的な分子の同定が期待できる状況になってきている。がんの細胞生物学現在の方策を継続する。リン酸化タンパク質を精製・濃縮するためのより詳細な条件検討が必要となったため。購入予定の試薬が在庫切れとなっており、年度内の入手が困難であったため。現在はphos-

tagアガロースを用いたリン酸化タンパク質の調製法を用いているが、抗体を用いた免疫沈降法や二次元電気泳動法による精製等も検討していく。購入を予定していた試薬購入に充当する。
セルロース系多糖のナノtoメゾ領域の新規構造制御とモダン機能の解析

セルロース及び関連多糖を対象に、それらのナノメゾ領域(10^<-9>10^<-7>mのオーダー)の微細構造を化学修飾や複合化によって制御し、モダンな先進機能を発現する新たな材料としての用途展開を図った。形状記憶-回復機能や難燃機能を示すセルロース誘導体、生分解性の制御が可能なセルロース及びキチンの分子複合材料、イオン雰囲気の電場制御で色彩や透明性が変化するセルロース誘導体の液晶材料、セルロースナノ繊維で強化した高性能高分子材料などを設計、試作しえた。セルロース系多糖の新規誘導体、グラフト共重合体、および液晶を主対象として、ナノメゾ領域の構造制御とモダン機能の開拓を行い、以下の成果を得た。1.ヘテロ元素含有新規誘導体セルロースアセテート(CA)を出発に、側鎖末端に易架橋性のメルカプト基を有するエステル誘導体を調製し、酸化還元処理によってゾル-ゲル可逆転移を示すゲル材料および形状記憶-回復するフィルム材料を設計・試作しえた。また、セルロースプロピオネートを出発に、リン酸エステル基を側鎖導入した各種誘導体を調製し熱重量分析を行った。難燃性材料あるいは難燃化剤としての有用性を例示しえた。2.グラフト共重合体CA並びにセルロースブチレート(CB)を幹鎖とし易生分解性のポリカプロラクトンを枝鎖とするグラフト共重合体を幅広い組成に渡って合成した。共重合組成と熱物性の相関、結晶化挙動と高次構造の発達に及ぼす幹/枝鎖間の相溶性の効果、および酵素加水分解挙動についてデータ集積を行い、両グラフト系とも成形加工性を備えた新規生分解性材料となりうることを示した。3.液晶(1)分子性液晶:ヒドロキシプロピルセルロース/水系液晶に各種イミダゾリウム塩を共存させ、コレステリック周期構造とLCST相分離温度に及ぼすカチオン種と対アニオンの効果を系統的に分離評価した。液晶の呈色や白濁度は共存イオンの種類と濃度によって容易に制御しうることとなった。一方、アミノ多糖キトサンのフェニルカルバメート誘導体を高置換度で合成し、ジメチルホルムアミドなどの高極性溶媒中における液晶相挙動を明らかにした。コレステリック構造の整然さ、引いては選択反射色の鮮明度は、フェニルカルバモイル基の平均連鎖長に鋭敏に依存することが判明した。(2)ナノクリスタルの液晶:セルロース繊維を硫酸処理して得られたナノクリスタル(ミクロフィブリル)を重合性モノマー中に懸濁させ、UV光照射によって異方性相を重合マトリックス内に固定化することに成功した。次年度に向けて、異方性相を磁場配向させて固定化するための装置の試作も行った。セルロース並びに関連多糖の新規誘導体、グラフト・ブレンド体、および液晶系を主対象にナノメゾ領域の構造制御とモダン機能の解析を行い、以下の成果を得た。1.ヘテロ元素含有新規誘導体置換基分布の異なる2種のセルロースプロピオネートを対象に、残存水酸基を各種のリン酸(チオ)エステルで修飾し、熱特性・難燃化効果の違いを比較考察した。2・3位のリン酸化に比べて6位リン酸化はより高い難燃機能を発現しうることが判明した。前年度に調製したSH基を側鎖末端に有するセルロースアセテート(CA)誘導体の形状記憶-回復機能のメカニズムを精査解明するとともに、チオール-エン重合による新規多糖誘導体の架橋試料の合成法を検討した。2.グラフト・ブレンド体CA並びにセルロースブチレート(CB)を幹鎖としポリカプロラクトン(PCL)を枝鎖とする2種のグラフト共重合体について、分子運動性とリパーゼによる酵素分解特性を比較考察した。幹/枝が相溶なCB-graft-PCLではブチリル基と枝鎖PCLが協調的に運動すること、幹/枝が非相溶且つブロック的構造を有するCA-graft-PCLではPCL成分の選択的酵素分解が進行して特異な表面モルホロジーが発現すること、等を見出した。関連研究として、アシル化多糖/PCLブレンド系の相溶性に及ぼす側鎖長と置換度の効果を明確化した。3.液晶系(1)分子性液晶:イミダゾリウム塩を共存させたヒドロキシプロピルセルロース/水系コレステリック液晶を対象に、選択光反射に基づく呈色とLCST型相分離に基づく白濁挙動を外部電界によって制御することに成功した。関連して、フェニルカルバメート化キチン・キトサンの合成と置換度解析を行い、一部の試料についてイオン液体を溶媒とした液晶の形成を確認した。(2)ナノクリスタルの液晶:セルロースナノクリスタル(CNC)のコレステリック液晶相を重合ポリマーマトリックス中に固定化した新規複合体の動的粘弾性測定を行い、熱及び力学物性におけるCNC液晶相の補強効果を実証した。また、該液晶相を磁場配向させる実験条件を設定しえた。セルロース系多糖の新規誘導体、グラフト・ブレンド体、および液晶系を主対象に、ナノメゾ領域の構造制御とモダン機能の解析を行い、先進材料としての有用性を示唆する以下の成果を得た。

1.ヘテロ元素含有新規誘導体セルロースアセテート(CA)を出発に、側鎖末端にメルカプト基を有する誘導体CA-MAを調製した。CA-MAにチオール-エン重合を適用し、相溶状態が良好で力学物性に優れるCA/ポリメタクリル酸メチル系相互侵入網目(IPN)の構築に成功した。一方、前年度調製のリン酸(チオ)エステル置換セルロースプロピオネート誘導体について、難燃機能の発現メカニズムを赤外分光・元素分析等のデータを補完して精査しえた。2.グラフト・ブレンド体CAを幹鎖としポリL乳酸を枝鎖としたグラフト共重合体について、等温熱処理による結晶化と高次構造形成過程をX線回折・誘電分散測定により定量解析した。同グラフト体のフィルムの延伸に伴う分子配向挙動と光学異方性の解析評価にも成功した。その他、セルロース系多糖のブレンドによる物性改変を行った。3.液晶系(1)分子性液晶:キトサンフェニルカルバメート(CtsPC)のリオトロピック液晶に及ぼすイオン液体の添加効果を評価した。また、CtsPCを高濃度で溶解しコレステリック相を誘起するイオン液体を見出した。(2)ナノクリスタルの液晶:セルロースナノクリスタル(CNC)を重合性モノマー/水中に懸濁して得られる異方性相を静磁場や回転磁場の印加によってモノドメインのコレステリック相や一軸配向ネマチック相とし、これらを重合固定することに成功した。CNCの配向ナノフィラーとしての強化機能も例証しえた。
マイクロナノ基板を用いたEMTを介さない膵管腺癌の浸潤・転移のダイナミクス解析

ほとんどの膵癌は膵管上皮から発生、充実性腫瘤を形成して浸潤・転移を起こしやすい膵管腺癌(PDAC)である。PDAC細胞の浸潤・転移は、癌化した細胞が上皮間葉転換(EMT)することによって誘導されると考えられてきた。最近、膵癌モデルであるKPCマウスにさらにEMT誘導遺伝子であるSnailまたはTwistを欠損させたKPCマウスにおいても、PDACの浸潤・転移がKPCマウスと変わらず誘導されることが報告された(Nature, 527, 2015, Nature, 547, 2017)。これらの結果は、PDAC腫瘍細胞にはEMTを介さないアグレッシブな浸潤・転移のメカニズムが存在することを示唆されており、極めて悪性度の高いPDACの病態理解への根本的な大きな変革が要求されている(Nature, 547, 2017)。申請者らは、EMTを起こす前段階の上皮形質を保ったPDAC細胞がダイナミックな組織運動極性を持った癌細胞集合体組織(微小腫瘍)への自発的分化を誘導するマイクロナノ基板を発明(特願2017-725121)した。これにより、in vitroにてアグレッシブな挙動を示すPDAC微小腫瘍のライブイメージングが可能となり、上皮形質のままPDAC細胞が集団化し、一つの組織として、あたかも飢えた多細胞生物のように這えずり伸張する様子をライブで捉えることに成功した。このダイナミクスに関わるであろう細胞集団(組織)としての、未知なるEMTを介さないPDACの浸潤・転移機序を明らかにし、それに関わる分子メカニズムを解明することは、次世代の革新的なPDAC治療法の開発につながると考えられる。本研究では、その分子機序を解明することにより、EMTを介さない浸潤・転移機序を明らかし、その革新的な視点からPDAC治療のための新規標的因子を探る。今年度は、膵癌細胞の細胞集団化による難治性に関する論文とマイクロナノ基板の論文を発表し、マイクロナノ基板の発明については、国内外で広く報道された。今年度は、マイクロナノ基板の発明に関する論文を発表し反響を得た。また、国内外で広く報道され、産学連携への繋がりが期待された。上皮間葉転換(EMT)の段階別の膵癌細胞株を用いて、膵微小腫瘍組織の形態やダイナミクスに違いがあるかどうかを検討し、論文投稿中である。今後は、既存抗がん剤暴露における膵癌微小腫瘍組織の難治性に関わるダイナミクスをマイクロナノ基板を用いて検討する。
ＤＮＡ異常メチル化ｉｎ　ｖｉｖｏ検出系の開発

DNAメチル化異常を誘発する因子に関する知見は限られている。本研究は、異常メチル化をin vivoで検出する系を開発することを目的とした。プロモーターCpGアイランドの下流にLacI遺伝子を挿入したベクター及びlacOの下流にEGFP遺伝子を挿入したベクターを、ヒト大腸がん細胞株へ安定に導入した。この細胞は、ヌードマウス皮下での移植腫瘍形成過程で、プロモーターの異常メチル化と共に緑色蛍光を誘導した。緑色蛍光を誘導しなかった腫瘍では異常メチル化は起っていなかった。以上より、構築した細胞株は異常メチル化を検出できる可能性があり、今後この原理を用いたトランスジェニックマウスの作製が期待できる。DNAメチル化異常はがん等のヒト疾患に関与しているが、その誘発因子に関する知見は限られている。メチル化異常誘発に炎症細胞が深く関与しており、新規メチル化異常誘発要因の同定には、炎症細胞等を含む間質細胞と上皮細胞の相互作用を加味したin vivo検出系の構築が必要である。本研究では、異常メチル化を検出するトランスジェニックマウスを開発することを目的とした。平成24年度は、1)メチル化検出のマーカーのためのプロモーター領域CpGアイランド(CGI)選定、2)ベクター構築、3)培養細胞への導入までを行なった。当初は、マーカーとしてマウス大腸粘膜でメチル化され易いプロモーター領域CGIを用いる予定だったが、昨年度の解析で同定できなかった。マウスはヒトと比べメチル化されている遺伝子数が少なく、またゲノム全体のCGI密度も低いことから、マーカーに適したCGIを同定することが困難であると予測された。従って、ヒト遺伝子のCGIを用いることに変更した。すでに、ヒト大腸上皮細胞で容易にメチル化され、メチル化状態と下流遺伝子の発現状態とに良好な相関関係があり、尚かつ、下流遺伝子の転写レベルが高いCGIとしてUCHL1プロモーター領域CGIを同定している(Okochi-takada, Int. J. Cancer, 2006)。このCGIをマーカーに用いることとした。プロモーターの下流にLacI翻訳領域を挿入したLacI発現ベクター、及び、lacO-EGFP発現ベクターを構築した。レポーター遺伝子は、FACSによりメチル化された細胞を分離できるようにするため、緑色蛍光蛋白を産生するEGFP遺伝子を用いた。まず、lacO-EGFP発現ベクターを培養細胞に導入、緑色蛍光強度が高いクローンを分離、さらにこの細胞へLacI発現ベクターを導入し、緑色蛍光が消失したクローンを数系統分離した。平成24年度までに、1)メチル化検出のマーカーのためのプロモーター領域CpGアイランド(CGI)選定、2)このCGIの下流にLacI翻訳領域を挿入したLacI発現ベクター、及び、lacO-EGFP発現ベクターの構築、3)培養細胞への二種のベクター導入を行ない、適したクローンを数系統分離した。平成25年度は、作製した細胞株が検出系として作動するか否かの評価をした。DNAメチル化を誘発する薬剤が存在しないため、評価は、細胞を1)様々な培養条件下で長期間培養する、2)ヌードマウス皮下に移植腫瘍を形成させる、の二種の実験で行った。1)では、培養条件を栄養不良・過剰にして数種の条件で行ったが、50回継代を繰り返してもメチル化は誘発せず、評価できなかった。一方、2)は腫瘍形成過程で生じる炎症細胞等のメチル化誘発への関与を期待したものだったが、実際、マウスのin vivo蛍光イメージングで移植腫瘍の一部で緑色蛍光が観察された。腫瘍片の初代培養細胞では緑色蛍光を有した細胞が認められ、それらの細胞でプロモーターCGIにメチル化が誘発されていた。緑色蛍光が観察されなかった腫瘍では、メチル化は誘発されていなかった。以上より、構築した細胞株はメチル化の誘発を緑色蛍光として検出できると判定した。本研究で構築した細胞株はDNAメチル化誘発を検出できる系である可能性があり、今後、トランスジェニックマウス作製への応用が期待できる。DNAメチル化異常はがんなどのヒト疾患に関与しているが、その誘発因子に関する知見は限られている。メチル化異常誘発に炎症細胞の関与が重要視されており、新規メチル化異常誘発要因の同定には、炎症細胞等を含む間質細胞と上皮細胞の相互作用を加味したin vivo検出系の構築が必要である。本研究では、異常メチル化を検出するトランスジェニックマウスを開発することを目的とする。23年度は、メチル化検出のマーカーのためのプロモーター領域CpGアイランド(CGI)を選定することを目標とした。

まず、検出系の有効性検証に用いるマウス潰瘍性大腸炎モデルにおいて、異常メチル化が誘発されやすいCGIの同定を試みた。雄Balb/cマウスにazoxymethane(AOM, 10 mg/kg,腹腔内1回投与)、及び、dextran sodium sulfate (DSS, 1.5w/v,飲料水1週間投与)により15週後に大腸がんを誘発、摘出した。Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP)-CGIマイクロアレイ法によるゲノム網羅的メチル化解析により、大腸がんでメチル化されるCGIを15個分離した。しかし、これらは遺伝子内、5'上流域または3'下流域に存在し、プロモーターに存在するものは一つも同定されなかった。この結果の理由として、まず、ヒト大腸がんと比較して、マウス大腸がんではメチル化異常が誘発されるCGIの数が極めて少ないことが考えられる。また、今回用いたMeDIP-CGIマイクロアレイ法が定量性に乏しいことも関与している可能性がある。近年、MeDIP-seq法等の定量性に富むメチル化解析法が開発されており、今後、これらの手法を用いて、再度メチル化異常が誘発されやすいプロモーター領域CGIの同定を試みる。研究方法を一部変更したため、予定よりも遅れていた計画を立て直すことができた。しかし、ヒトの遺伝子プロモーターCGIがマウスの体内において、ヒトと同様に機能しない可能性も考えられるため、in vitroでの動作確認を十分に行なう必要がある。ヒトの大腸がんと比較し、マウスの大腸がんではDNAメチル化が誘発され易いプロモーター領域CpGアイランド(CGI)の数が予想以上に少なく、検出のマーカーとなり得るプロモーターが予定通りに同定されなかった。その理由として、ヒトと異なり、マウスではメチル化された遺伝子が少ないこと、また、今回用いたMeDIP-CGIマイクロアレイ法が定量性に乏しいことが考えられる。ベクターを導入した細胞のクローン数系統で、IPTGの添加により、レポーター遺伝子が発現してくるクローンを同定する。さらにそれらのクローンにおいて、構築したベクターが実際にDNAメチル化誘発の刺激に対して反応するか否かを、1)培養細胞株を用いたin vitroの系、及び、2)ヌードマウス皮下に移植したゼノグラフトモデルの系の、二通りの系で確認する。まず、in vitroでベクターを導入した細胞株に、ピロリ菌感染者のヒト胃粘膜から分離した炎症細胞を添加し、共培養する。ピロリ菌感染者の胃粘膜では強力にDNA高メチル化が誘発されており、炎症細胞が異常メチル化誘発に重要であることが知られている。従って、本研究で構築した細胞株においてメチル化を誘発する可能性は高い。
糖脂質リモデリングによる蛋白質のソーティング機構

細胞内における蛋白質の輸送異常はさまざまな疾患と結びついており、その機構の解明は極めて重要である。モデル生物である酵母において、GPI (glycosylphosphatidylinositol)アンカー蛋白質は小胞体でスフィンゴ脂質依存的に選別され、また、選別にはGPIの脂質リモデリングとグリカンリモデリングの両方が必要であることが知られている。しかし、両リモデリングの関係性や生物学的意義については不明である。本研究では、GPIアンカー蛋白質の選別輸送におけるリモデリングの作用メカニズムと生理的意義を解明する。