hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト精子の卵活性化因子PLCzetaの合成とその臨床応用に関する研究

今後、真核細胞発現系を確立し、クローニングされているPLC全長のcDNAを組み込んだ発現ベクターを用いてリコンビナントタンパクを作出し、その生理的活性を解析する。受精の過程における「卵細胞の活性化」機構の解明は受精現象を理解する上で極めて重要である。哺乳類の受精卵では律動的な細胞内Caイオンの律動的な上昇(Ca oscillation)が「卵細胞の活性化」の引き金になっていることが推定されているが、現在のところ、精子においてどのような情報伝達経路によりCa遊離チャンネルが活性化し、また、引き起こされたCa oscillationがどのような機構により卵細胞を活性化するかについてはいまだ未解明な点が多い。現在のところ、精子の「受精」というシグナルが卵細胞内に伝達される経路として、(1)精子がCa^<2+>の導管となって細胞外のCa^<2+>が流入するという説、(2)卵細胞表面の精子受容体を介するという説、(2)精子細胞質内の「卵細胞活性化因子(sperm factor)」によるものとする説、の三つの説が提唱されてきたが、近年、卵細胞質内精子注入法(ICSI)により卵細胞が活性化するという事実から、精子細胞質内にsperm factorが存在していることは確実である。このsperm factorついての研究が世界的に進められ、2002年に初めて同定された精子に特異的に発現するphosholipase C(PLC)のアイソフォームであるPLC zeta(PLCζ)は、そのcRNAやリコンビナントタンパクをマウス卵に注入するとCa^<2+> oscillationが誘起されることから、sperm factorの本態である可能性が極めて強いものと考えられている。ヒトPLCζは、EF handsドメイン、PLCcドメインならびにC2ドメインの3つのドメインから構成されるが、現在のところこのドメインとCa^<2+> oscillationを惹起する活性(oscillogen活性)との関連は未解明である。申請者らは、ヒトPLCζのcDNAクローニングを施行し、まず、PLCcドメイン領域のcDNAを発現ベクターに組み込み、大腸菌を用いてヒトPLCζのPLCcドメインのリコンビナントタンパクを合成し、未受精卵細胞にマイクロインジェクションし、そのoscillogen活性を解析した。その結果、Ca oscillationが観察された。また、すでに真核細胞発現系を確立した。その系を用いて、クローニングされているPLC全長のcDNAを組み込んだ発現ベクターを用いてリコンビナントタンパクを作出し、臨床的応用を展望してその生理的解析を行っている。
『歴代法宝記』を中心とした禅宗思想史と教団史の研究

敦煌文書中に保存された禅宗史書『歴代法宝記』について、国内外の刊行物に計7本の論文を発表し得た。一連の考察において、『歴代法宝記』は、教団史としては「白衣」や「居士」と呼ばれる半僧半俗の修道者の増加と、儀礼や戒律にとらわれない実践のありようを背景とし、思想としてはそうした実践を「無念」の体現として積極的に意味づける思潮の中で編纂されたことを論じた。同時に本課題は、「神会語録」や『壇経』における「無念」思想が『歴代法宝記』においては前述の教団史的背景により大きく変容していたこと、また『首楞厳経』の受容史において、本書は前塵と仏性との弁別を語る際に多く『楞厳経』を引用していたことを解明した。敦煌本『六祖壇経』の校訂と訳注を完成させた。訳注作業を通じて、『壇経』およびそれと密接に関連する『神会語録』に見える「無念」の思想について、正確な理解を得ることができた。考察によれば、荷沢神会における「無念」思想は、彼の般若中道の思想を基盤としており、単純に何も思わないのではなく無念だからこそ何物にも汚染されない智慧が自在に発揮できると説くものであった。またこの「無念」の法は、出家者のみならず在家信者にも説かれていたことが確認できた。『壇経』においては、「無念を宗と為し、無相を体と無し、無住を本と為す」という成句が何度か繰り返され、「無念」が『壇経』の宗旨を表す言葉の一つとされている。この「無念」は、「無相」「無住」と並称されているように、智慧のはたらきよりは外境への執着からの解放により力点を置いたものであった。一瞬一瞬に連続する「念」を観察し、そのことによって主体客体を持つ「念」からの解放を目指すのである。本課題の研究対象である『歴代法宝記』においては、六祖慧能条にも荷沢神会条にも「無念」の語が見えず、これを彼らの思想の核心とは見なさなかったことが知られる。『法宝記』において「無念」は繰り返し説かれる概念であるから、このことは奇異に思えるが、恐らく該書の編者は『法宝記』が記録しようとする保唐無住の説く「無念」と、それに先立つ神会および慧能の「無念」とが異なることを意識しており、無住独自の説として記録することを選んだのであろう。なお、敦煌本『壇経』訳注は「新国訳大蔵経」シリーズの一冊として公刊の予定である。本研究課題の研究計画には、『歴代法宝記』の「念仏」「無念」思想についての考察が含まれていた。『歴代法宝記』の「無念」思想が、荷沢神会のそれを直接に継承するわけではないことを明らかにし、本書の「無念」思想を、「念仏」の発展かつ批判として位置づけ、また物資が不足した山寺における儀礼実践の不可能を正統化する文脈で受容されていることにも注意を向けようとしていたのである。27年度において実施した敦煌本『六祖壇経』の訳注研究と、それにともなって行った『荷沢神会』語録の検討は、上記の研究計画の半ばを遂行し、残る半ばのための着実な基礎研究となり得たと考えている。「『歴代法宝記』考ー山居修道と居士仏教ー」では、唐代中期の禅宗史書『歴代法宝記』について、そこに記録された禅僧らの伝記を検討し、次の3点を明らかにした。1、『歴代法宝記』は悟りの正統性と教団の正統性とを分離する思考を持っており、四川の禅門を正統な法系としつつ、法系上は別系統となる慧能と神会の仏法を高く評価して、四川の諸禅師とはやや異なった禅法を唱える保唐無住について法系と悟境双方の正統を担保し得た。2、彼らは「無念」の思想の元に儀礼を否定しており、その思想は経済的事情で規定通りの勤行を営むことができない山居修道のあり方を支持し、むしろそうした生活を真の仏法として意義づけるものでもあった。3、本書において半分の紙幅を割かれる保唐無住の伝記を吟味してみると、彼の開悟の師・陳楚璋は白衣の居士であり、嗣法の師・無相との仲介役にも何人かの居士が関わっていた。一方、出家得度の師・太原自在や浄衆寺無相は形式的な身分を保障するためにのみ登場するかのようである。したがって、本書の中心思想である「頓悟」は在家仏教と深く関わっており、またその傾向は本書にやや先立つ禅文献にもすでに見られた。次に「『大辯邪正経』と『六祖壇経』」においては、やはり居士仏教と関連の深い禅文献である『六祖壇経』と、敦煌文書においてしばしば『壇経』と同一の巻子に連写される偽経『大辯邪正経』とを検討した。その結果、「邪正」という概念は『涅槃経』以来の仏教経典に淵源し道教経典『妙林経』と共有していることが明らかになった。そして、「邪正」概念には仏性を「正」とする相対的な邪正と、煩悩と菩提の対立を超えた絶対の「正」とがあるが、いずれも『壇経』の中心思想である仏性と頓悟に関わり、この点から敦煌では両者が共に学習されたであろうと推測した。

申請時に設定した研究目的のうち、「1、『歴代法宝記』と唐代中期禅宗における正統観」「2、『歴代法宝記』の「念仏」「無念」思想について」については十分な成果を得ることができ、「3、禅教団および唐代社会の変化と『歴代法宝記』」についても生産的な見通しを得ることが出来た。特に、研究目的1について教団の正統性と悟境の正統性とを分離する思考を明らかにしたことは予想以上の成果であったし、2については、目的1を踏まえたかたちで『歴代法宝記』における「無念」思想の禅思想史上の由来と無住教団の社会経済的状況との双方から検討することができた。また3については、未受戒の居士たちが頓悟思想の称揚に深く赤変わっていることを明らかにした。しかしながら、研究目的2のうち「念仏」については考察がおよばず、3についても禅教団以外の士大夫社会全体への検討を今後の課題として残してしまった。『首楞厳経』と臨済禅」(『『臨済録』研究の現在ー臨済禅師一一五〇年遠諱記念国際学会論文集』禅文化研究所、289-312頁、2017年6月)、「禅問答の誕生と公案禅・看話禅への展開」(『東アジア仏教学術論集ー日・韓・中国際仏教学術大会論文集ー』第6号、171-199頁、2018年1月)、「『付法蔵伝』とその受容ー大住聖窟二十四祖像を例としてー」(『国際禅研究』創刊号、57-73頁、横166-150頁、2018年2月)の3本の論説を発表した。『首楞厳経』と臨済禅」においては、八世紀の四川において『楞厳経』への関心が高まっており、『歴代法宝記』はその中で編纂されたことを指摘した。『歴代法宝記』では、経典・教理の否定という基本思想が、主客すなわち本性と本性ではない心理活動との弁別というやはり本書で繰り返し議論される課題と結びつけられて語られる。そうした文脈では、『楞厳経』的な思惟が『楞伽経』の引用や語彙によって記述されるのである。これは、禅思想を支える経典として、『楞伽経』に加えて『楞厳経』が存在感を増していく過渡期の現象として理解される。「禅問答の誕生と公案禅・看話禅への展開」では、有名な問答が禅門の共通知識として公案化し、また長期にわたり同じ問題に参学するのは荷沢神会語録に始まり、五代の『祖堂集』に至ると、慧忠の無情説法を解決するために多くの師に参じた洞山良价の逸話が見られ、あたかも後世の話頭に参求するような実践が行われていることを指摘した。「『付法蔵伝』とその受容ー大住聖窟二十四祖像を例としてー」では、『歴代法宝記』など禅宗燈史の西天祖統説にモデルを提供した『付法蔵伝』について、その本文は仏法の存続ではなくむしろ断絶を説いていること、本書にもとづく二十四祖像を刻む隋の大住聖窟は末法思想を主題として『付法蔵伝』の意図をよく理解していることを論じた。敦煌文書中に保存された禅宗史書『歴代法宝記』について、国内外の刊行物に計7本の論文を発表し得た。一連の考察において、『歴代法宝記』は、教団史としては「白衣」や「居士」と呼ばれる半僧半俗の修道者の増加と、儀礼や戒律にとらわれない実践のありようを背景とし、思想としてはそうした実践を「無念」の体現として積極的に意味づける思潮の中で編纂されたことを論じた。同時に本課題は、「神会語録」や『壇経』における「無念」思想が『歴代法宝記』においては前述の教団史的背景により大きく変容していたこと、また『首楞厳経』の受容史において、本書は前塵と仏性との弁別を語る際に多く『楞厳経』を引用していたことを解明した。引き続き「無念」思想についての考察を進めるが、28年度は『壇経』や神会語録の考察を踏まえて、『歴代法宝記』そのものの検討に入りたい。まずは『歴代法宝記』に先立つ禅宗史書である『楞伽師資記』『伝法宝紀』に見える「念仏」思想を検討し、それが「念」の空を観ずる「無念」思想に展開することを明らかにする。次に、『歴代法宝記』に見える戒律や儀礼に関する考え方を確認し、『法宝記』における「無念」が、山間部の寺院において規定通りの戒律や儀礼の実施が困難である状況に積極的意味を与える役割を持っていたことを論じる。
フォン・ビルブラント因子に存在する血液型糖鎖の構造と機能に関する基礎的研究

本研究はヒト・フォン・ビルブランド因子(vWF)が、ABO血液型抗原を持ち、血液型により血中濃度に差がある極めて稀な血漿糖タンパク質であることに注目し、vWFにおける糖鎖及び血液型糖鎖抗原の生理的意義の解明を目的として、濃縮血液製剤の性状、血液型別vWFの分画法、遺伝子型とvWF濃度の相関等を中心に調べた。まず、プール血漿から調製されるすべての市販第VIII因子濃縮製剤中のvWFと第VIII因子に血液型抗原が含まれ、中程度純化濃縮製剤では製剤中のvWFに、IgMやIgGが微量であるが結合していることを明らかにした。このことから、vWF上のABO血液型抗原に反応して、おそらく自然抗体由来のIgMやIgGが結合していることが予想され、今後、同じ血液型血漿由来のvWFを用いることで、より純度の高いvWFが調製できる可能性が示唆された。一方、種々のレクチンを用いて血漿糖タンパク質上の血液型物質の検出と、市販の第VIII因子濃縮製剤からの特定の血液型を持ったvWFの分画を試み、カタツムリ由来のHPAが、A型と特異的に反応し、抗A抗体と比較しても、良好な結果を与えること、HPAレクチンカラムを用いて、A型抗原に富むvWFを分離することが可能であることを示した。さらに、血液型の遺伝子型をPCRを用いて調べ、ヘテロ(A/O,B/O)とホモ)A/A,B/B)間でのvWF濃度、リストセチン、ボトロセチン凝集能を比較したところ、vWFの血中濃度のみがホモ接合体で有意に高いことを初めて明らかにした。現在、血液型とvWFのプロテアーゼ感受性の相関や、血液型の異なるドナーからの骨髄移植を受けた患者の血中vWFや亜型の血液型抗原を解析している。1)市販第VIII因子濃縮製剤について、製剤中のフォン・ビルブラント因子(vWF)にIgM又はIgGが結合しているか否かをサンドイッチELISA法を用いて調べた。コンファクトFでは微量のIgM及びIgGが、また、ヘマ-テPではIgMが検出された。高純度製剤であるヘモフィルMとクロスエイトMではいずれも検出されなかった。これらのことから、中程度純化濃縮製剤ではvWF上のABO血液型抗原に反応して、おそらく自然抗体由来のIgMやIgGが微量であるが結合していることが示唆された。2)vWF分子あたり10本含まれるSer/Thr型糖鎖にもABO血液型抗原が存在するかどうか、トリプシン分解断片を用いて調べた。トリプシンで分解して得られる52/48K断片はAsn型糖鎖一本と8本のSer/Thr型糖鎖を含んでいる。この断片をペプチド-N-グリコシダーゼFで消化すると分子量の低下とともにConAとの反応性が消失したことから、Asn型糖鎖が切断されたものと考えられた。この消化断片と抗A抗体の反応性を調べると、弱く抗A抗体と反応することがわかった。消化前後での反応性を比較すると血液型抗原量の約10%がSer/Thr型糖鎖にも存在することが明らかとなった。3)ABO血液型抗原を持つ血漿糖タンパク質のサーベイを行い、凝固第IX因子、第X因子、第V因子及びビトロネクチンについて、精製タンパク、血漿そのものを用いてウエスタンブロット、ELISAの両面から調べたが、これらには共有結合した血液型抗原はないものと結論された。一方、血漿全体を抗血液型抗体及びレクチンでサーベイすると血液型抗原を持つ未知の成分が少なくともまだ数種類は存在することが示唆された。

4)血液型の遺伝子型をPCRを用いて調べ、ヘテロ(A/O,B/O)とホモ(A/A,B/B)間でのvWF濃度、リストセチン凝集能、ボトロセチン凝集能を比較したところ、vWFの血中濃度のみがヘテロに比べてホモ接合体の方が有意に高いことが初めて明らかとなった(Vox Sang.印刷中)。1、特定の血液型を持ったvWFを調製するため、種々のレクチンを用いて血漿糖タンパク質上の血液型物質の検出と、市販の第VIII因子濃縮製剤からのvWFの分画を試みた。血液型認識レクチン群の中で、カタツムリ由来のHPAが、A型と特異的に反応し、抗A抗体と比較しても、良好な結果を与えたが、他の抗AレクチンであるDBA、LBA、SBAはvWF上のA型抗原を認識しなかった。O(H)型では、UEA-I、-IIにより認識されたが、B型抗原に関しては用いたレクチンでは認識されなかった。HPAレクチンカラムを用いて、A型vWFの分画を試みたところ、第VIII因子濃縮製剤中に含まれるvWFの約25%がカラムに吸着した。この画分にはA型vWFの約65%が含まれていた。この結果は、HPAカラムを用いて、A型抗原に富むxWFを分離することが可能であることを示す。また、微量のB型抗原も検出されたが、このB型抗原はAB型vWFに由来すると考えられ、AB型ではA型B型別々のvWFが存在するというより、同一vWF分子上に両抗原をヘテロに持つことが示唆された。2、血液型とvWFのプロテアーゼ感受性の相関を探るため、まず種々のプロテアーゼに対するvWFの断片化パターンを調べた。vWFはカテプシンGやカルパインではほとんど変化しなかったが、パパインではほぼ完全に、トリプリンでは限定的な消化を受けた。生理的なカテプシンGやカルパインがほとんど効果がないのは、血流でのずり応力などの物理的な条件が重要なのかもしれない。今後、高ずり応力を含めたvWFのプロテアーゼ感受性と分解パターンを調べ、さらに血液型との相関を調べる予定である。
FKHRL1による白血病細胞増殖抑制機構

我々は慢性骨髄性白血病(CML)の原因分子BCR-ABLの特異的阻害剤であるイマチニブがなぜCML細胞にアポトーシスを誘導するのか、さらにはイマチニブ耐性をどのように克服するかいう研究テーマに取り組んできた。その研究過程のなかで、線虫の寿命関連分子DAF16のヒトオルソログFKHRL1転写因子がCML細胞ではBCR-ABLシグナル伝達系の下流に不活化された状態で存在すること、イマチニブ添加によってBCR-ABLシグナル伝達経路が遮断されるとFKHRL1は核内へと移行し、転写因子としての機能を発揮することを明らかにした。本研究ではCML細胞におけるFKHRL1の機能を明らかにするために、イマチニブ感受性CML細胞株にタモキシフェン添加によって核内に活性型FKHRL1の発現を強制的に誘導できる系を樹立し、DNAマイクロアレイ法を用いてFKHRL1の標的分子の同定を試みた。その結果、TRAILがFKHRL1の標的分子であることがわかった。イマチニブ感受性細胞株ではイマチニブ処理によってTRAILの発現が認められたが、耐性株ではイマチニブ処理によるTRAILの発現は認めなかった。さらにイマチニブ耐性株にTRAILを強制発現させると、アポトーシスが誘導された。以上よりイマチニブのCML細胞に対する殺細胞効果はFKHRL1の活性化によるTRAILの発現誘導が深く関与していることがわかった。したがってイマチニブ耐性克服にはFKHRL1の活性化およびその下流分子であるTRAILを発現させることが重要であると考えられる。
部分・間欠型床下暖房の設計・運用方法の提案

基礎断熱住宅の床下空間をエアコンの温風で暖めてその上に床暖房のような床面放射型の暖房環境をつくる床下暖房について、ヒートショック防止上必要な空間の床下のみを必要な時間のみ暖房する部分・間欠型とする場合の設計・運用方法を提案した。設計方法としては、熱源に必要な最大暖房能力を、居室の設定温度や外気温、住宅の断熱性能、基礎部断熱材の熱抵抗、地盤の熱伝導率、許容する予熱時間、1日24時間のうち暖房を入れる時間の割合、朝の暖房開始時間から推定する式を作成した。運用方法としては、予熱に必要な時間の計算式を提案した。本研究は、基礎断熱住宅の床下空間をエアコンの温風で暖める床下暖房について、ヒートショック防止上必要な空間の床下のみを在宅時のみ暖房する、部分・間欠型床下暖房の設計・運用方法を提案することを目的としている。設計方法としては、地盤表面および基礎の適切な断熱厚さ、床下エアコンの暖房能力の選定方法、床下の気流制御方法を提案し、運用方法としては、外気温や隣接空間の暖房状況に応じた予熱時間の算定方法を提案する予定である。平成27年度は、これらの検討に用いることができる数値計算モデルを作成し、その妥当性確認の比較対象とするための地盤も含めた縮小模型実験を行った。数値計算モデルは、床下内部と外気はそれぞれ1質点とし、基礎壁体内は1次元熱伝導、地盤内部は3次元熱伝導としたものを前進型有限差分法で解くモデルを作成した。縮小模型実験は、モルタルで作成した幅400mm、奥行400mm、深さ50mmの縮小地盤の上に、アクリル板で作成した幅200mm、奥行200mm、高さ50mmの縮小床下空間を載せたもので実施した。床下の地盤表面には厚さ5mmの断熱材を敷いた。床下に設置したニクロム線に通電することで床下内部の温度を上昇させ、床下と地盤内部の温度、床下から地盤表面の断熱材や基礎各部への熱流を測定した。また、各部の熱伝達率と、実験に用いたモルタル、アクリル板、地盤表面断熱材の熱伝導率、密度、比熱を別途測定し、数値計算に反映させた。縮小模型実験の各部初期温度、外気温度、床下発熱量を入力条件として数値計算モデルで床下および地盤内部温度の時間変化を計算した結果、各部の温度は概ね再現されており、数値計算モデルの妥当性が確認された。当初の計画では、床下を複数のゾーンとし、各ゾーン間の移流を換気回路網計算で取り扱う数値計算モデルを作成する予定であったが、平成27年度は床下を1つのゾーンとした数値計算モデルを作成した。これは、隣接ゾーンが全て外気である条件が最も必要断熱厚さ、必要暖房能力が大きくなる条件であるため、平成28年度に行う予定の地盤表面および基礎の断熱厚さの検討や、床下エアコンの暖房能力の選定方法の検討のためには、床下は1つのゾーンで十分であったためである。しかし、平成29年度に行う予定の隣接空間の暖房状況などに応じた予熱時間の検討のためには、床下を複数のゾーンとして計算できる数値計算モデルが必要であるため、そのためのモデルを平成28年度に作成する予定である。平成28年度は、平成27年度に作成し模型実験との比較により妥当性を確認した数値計算モデルを用いて「床下エアコンの暖房能力の選定方法の検討」を行った。床下エアコンの必要最大暖房能力は、床下から床面を通じて1階に流れる熱と地盤への熱損失の和の最大値となる。前者の熱は床の熱貫流率などを用いて容易に算定することができるが、後者の熱は熱流の多次元性と地盤の熱容量の大きさのため数値計算に頼る必要があった。そこで、一般の住宅設計者でも地盤への熱損失を算定できるようにするため、まず24時間連続運転の場合の地盤への熱損失を「居室設定温度、外気温度、住宅断熱性能、基礎部熱抵抗、地盤熱伝導率」から推定する式を作成した。そして、地盤への熱損失は間欠型の方が24時間連続型よりも大きくなると考えられるため、24時間連続運転型の熱損失に対する間欠運転型の熱損失の比率を「許容する予熱時間の長さ」と「暖房スケジュール」から推定する式を作成した。この際、暖房スケジュールを1日(24時間)のうち暖房を入れる時間の割合で指標化することにより、適切な評価ができることを明らかにした。また、床下気流制御方法の検討に数値流体解析よりも計算時間が短い換気回路網計算を用いても適切な解が得られるか検討したが、短時間で床下温度が大きく変化するような場合には換気回路網計算では適切な解が得られないことを明らかにした。当初の計画では、平成28年度は、1地盤表面および基礎の断熱厚さ(熱抵抗)、2床下エアコンの暖房能力の選定方法、3床下気流制御方法、の3つについて検討する予定であったが、実際は、特定の断熱厚さ(基礎部熱抵抗)における2の検討と、3の検討の準備のみを行ったため「やや遅れている」とした。2に関する基礎の断熱厚さの影響や1、3については、平成29年度に検討する予定である。

本研究は基礎断熱住宅の床下空間をエアコンの温風で暖める床下暖房について、ヒートショック防止上必要な床下のみを在宅時のみ暖房する、部分・間欠型床下暖房の設計・運用方法を提案することを目的として行った。平成27年度は、検討に用いる数値計算モデルを作成し、地盤も含めた縮小模型実験との比較によりその妥当性を確認した。平成28年度と平成29年度は、平成27年度に作成した数値計算モデルを使用して、最大熱負荷の算定法を検討した。床下に供給された熱は、床面を通じて1階に流れる熱と基礎・地盤を通じて外気に流れる熱に分かれ、前者の熱は床の熱貫流率等を用いた式で算定することができるが、後者の熱は熱流の多次元性と地盤の熱容量の大きさのため数値計算に頼る必要があった。そこで、一般の住宅設計者でも部分・間欠型床下暖房の設計ができるように、床下から基礎・地盤への最大熱損失を推定する式を作成した。まず24時間連続運転の場合の地盤への最大熱損失を「居室設定温度、外気温度、住宅断熱性能、基礎部断熱材熱抵抗、地盤熱伝導率」から推定する式を作成し、その熱損失に対する間欠運転の場合の最大熱損失の比率を「土間表面断熱材の熱抵抗」と「許容する予熱時間」、「1日(24時間)のうち暖房を入れる時間の割合」、「朝の暖房開始時刻」から推定する式を作成した。この式によって推定された比率の誤差はー6%から+12%の範囲内であった。24時間連続運転の場合の最大熱損失の推定値にこの比率の推定値を乗じることで、間欠運転の場合の最大熱損失を推定することができる。また、運用方法として、比率の推定式を変形した予熱時間の算定式を提案した。基礎断熱住宅の床下空間をエアコンの温風で暖めてその上に床暖房のような床面放射型の暖房環境をつくる床下暖房について、ヒートショック防止上必要な空間の床下のみを必要な時間のみ暖房する部分・間欠型とする場合の設計・運用方法を提案した。設計方法としては、熱源に必要な最大暖房能力を、居室の設定温度や外気温、住宅の断熱性能、基礎部断熱材の熱抵抗、地盤の熱伝導率、許容する予熱時間、1日24時間のうち暖房を入れる時間の割合、朝の暖房開始時間から推定する式を作成した。運用方法としては、予熱に必要な時間の計算式を提案した。平成28年度は、平成27年度に作成した数値計算モデルを用いて、地盤表面および基礎の断熱厚さ(熱抵抗)の検討、床下エアコンの暖房能力の選定方法の検討を行う。さらに、廊下やトイレなどの狭小空間の床下にエアコンの温風が十分に行きわたるようにするための床下気流制御方法の検討を数値流体解析(CFD)を用いて行う。平成29年度は、外気温、暖房開始時の地盤温度、隣接空間の暖房状況に応じた予熱時間の算定方法を検討する。平成29年度は、平成28年度に提案した間欠型の床下暖房時の床下から地盤への熱損失の推定式について、基礎部熱抵抗と予熱時間との関係を確認し、推定式の妥当性検証および推定精度向上のための改善を行う。また、その結果を踏まえて、費用対効果が最大となる基礎部熱抵抗を提案する。さらに、入浴時のみ浴室の床下を暖めるための気流制御方法と、外気温や暖房開始時の地盤温度、隣接空間の暖房状況等に応じた予熱時間の算定方法について検討する。建築環境工学(熱・空気)消耗品等で端数が生じたため。消耗品等で端数が生じたため。平成27年度の残額を含め、平成28年度も交付申請時の計画通りに予算を執行する予定である。平成28年度の残額を含め、平成29年度も交付申請時の計画通りに予算を執行する予定である。
ヒトへの異種心移植を成功させるための核移植を用いたドナーブタの作成

平成9-10年度には本助成により、次の5つの内容に関し研究を行った。(1) α-gal knock out Pigの作成開発を目的とし、α-gal epitopeを欠損したブタのcell lineを樹立することをめざした。Materialはブタ内皮細胞由来のcell lineとし、ネオマイシン耐性遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子を結合させることによって、selectionする事を試みた。しかし、現時点では、α-Galのknock outには至っていない。(2)ラットの摘出心に対し4°C、60分という条件下でアデノウイルスをベクターとしてEx Vivo遺伝子導入を行い同系ラットに移植した。その結果、安全にかつ効率よく導入できることを示した。(3) EB-Virus episomal Vectorと、conventionalなplasmid vectorを用いGene Gunによる遺伝子導入実験を行った。その結果、EBV-vectorでは最長6週間発現し、他臓器での影響はなかった。以上よりGene Gun法による心臓へのin vivo遺伝子導入は有用な方法と考えられ、EBV-vectorは、導入するプラスミドの発現持続に関与することが考えられた。(5)ブタ-イヌの異種移植モデルにて凍結保存大動脈弁の移植実験をおこなった。光学顕微鏡所見・走査電子顕微鏡による検索の結果、異種大動脈弁は凍結保存することにより免疫原性が低下すると考えられ、凍結保存法の変更と確立などにより、臨床応用も可能であると予想された。平成9年度には本助成により、次の3つの内容に関し研究を行った。(1)ブタの細胞におけるα1-3 galactosyltransferase knockoutの研究:α1-3 galactosyltransferaseの中央部分約300bpを制限酵素で欠失させ、それにネオマイシン耐性遺伝子とHSV-Ekを組み込んだRecombinant Plasmid Vectorを用いてネオマイシン耐性遺伝子を結合させ、3'末端にはチミジンキナーゼ遺伝子を結合させる。この遺伝子をブタのcell lineに導入し、ネオマイシン及びガンシクロビルを添加した培養細胞液内で両薬剤耐性細胞をクローニングし、サザンブロットによりα1-3 galactosyltransferaseの欠失を確認、IB4 lectinによるFACS analysis、ヒトのserumに対するcytotoxicityの検討を予定している。現在のところ最適なベクターを作成中であり、まだノックアウトには至っていない。(2)ラット心臓移植におけるEx Vivo遺伝子導入:ラットの摘出心に対し4°C、60分という条件下でアデノウイルスをベクターとしてEx Vivo遺伝子導入を行い同系ラットに移植した。(3)遺伝子銃法によるIn Vivo遺伝子導入:non-vira1な遺伝子導入法として遺伝子銃法があるが、本法で心臓へのIn Vivo遺伝子導入を行った報告は未だない。そこで、ラットの心臓に対し本法にて遺伝子導入を行った。その結果、導入が可能であっただけでなく1ヶ月後でも発現が持続していた。現在さらに長期の発現を検討中である。平成10年度には本助成により、次の4つの内容に関し研究を行った。(1)ブタの細胞におけるα1-3galactosyltransferase knockoutの研究:α-gal knock out Pigの作成開発を目的とし、α-gal epitopeを欠損したブタのcell lineを樹立することをめざした。(2)Gene Gun法によるIn Vivo遺伝子導入に関する研究:EB-Virusepisomal Vectorと、conventionalなplasmid vectorを用い遺伝子導入実験を行った。その結果、EBV-vectorでは最長6週間発現した。また、他臓器に導入遺伝子は検出されなかった。(3)ラットに対するEB-Virus episomal Vectorを用いたIn Vivo及びIn vitro遺伝子導入に関する研究:導入後

短期間ではEBV-vectorの方がいずれの培養細胞においても有意に酵素活性が高く、in vivoの検討にてもEBV-vectorの方が強く発現していた。以上より、導入後短期間において、EBV-vectorはより強く発現させうることが判明した。(4)凍結保存異種大動脈弁、臨床使用の可能性についての実験的検討:ブタ-イヌの異種移植モデルにて凍結保存大動脈弁の移植実験をおこなった。光学顕微鏡所見・走査電子顕微鏡による検索の結果、異種大動脈弁は凍結保存することにより免疫原性が低下すると考えられ、凍結保存法の変更と確立などにより、臨床応用も可能であると予想された。
ヘルペスウイルスICP0と相互作用する宿主因子によるウイルス制御機構の解明

単純ヘルペスウイルスは宿主に潜伏感染するためウイルスを標的とする現行の治療薬では根治が不可能である.そのため宿主因子をターゲットとした新たな治療薬の開発が重要である.これまでに申請者らは単純ヘルペスウイルスICP0と相互作用する宿主因子RanBP10を同定している.またRanBP10はICP0と同様にウイルスゲノムのクロマチンリモデリングを介した遺伝子発現制御を担うことを明らかにした.ICP0とRanBP10の感染細胞における相互作用は共免疫沈降と蛍光抗体法により確認済みであるが,これらの相互作用が直接的なのかどうかは明らかになっていない.そこでpull-down assayを行うためにICP0とRanBP10のタンパク質を大腸菌で発現・精製しようと試みた.しかしどちらのタンパク質も発現・精製できなかったため,現在はバキュロウイルスを用いてこれらのタンパク質の発現・精製を試みている.RanBP10は宿主転写コアクチベーターであることが知られているが,その機能に関してはほとんど報告がない.そこで本研究ではRanBP10の機能をさらに解明するために,ICP0が相互作用しうる宿主因子とRanBP10の関連性を解析した.まずこれらの宿主因子のノックアウト細胞を作製し,野生型ウイルスとICP0欠損変異ウイルスの増殖を観察した.RanBP10ノックアウト細胞にICP0欠損変異ウイルスを感染させた際にウイルスの増殖が20倍以上低下した.すなわちICP0欠損時にRanBP10がウイルスの増殖に重要であることが明らかとなった.またRanBP10と同様の作用を有する新たな宿主因子を同定した.今回同定された宿主因子の役割をもとにRanBP10の機能がさらに解明できることが期待される.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
「極右」政党の政権参加と政策伝換-オーストリアにおける年金・医療保険製度改革

本研究の目的は、「極右」政党を組み込んで新たに登場した右派連合政権の年金・医療保険制度改革において、「極右」政党が独自に果たしたインパクトを、オーストリアの国民党・自由党連合政権の政策転換を事例に、ドイツなどの社会民主主義政党が政権の基軸に座る諸国との比較のなかで確定することである。今年度は、シュッセル政権第2期の4年間の改革の実施経過を跡付けるとともに、合計6年間の総体としての福祉制度改革のプロセスを明らかにし、左翼政権主導で90年代に同様の課題にとりくんだドイツとの比較で位置づけることで、オーストリアにおける制度改革の独自性と「極右」政党が果たした固有のインパクトを確定することに取り組んだ。1.第一に、保守政党と「極右」政党との政策的な近接性が再確認された。自由党の独自性は、移民政策や文化政策において特徴的に示されてきたが、「年金・医療保険制度改革」においては、独自の包括的なプランを提示できなかった。このことは、政権政策としては、「ネオリベラル政策」と「家族の価値」という国民党の構想がその主導的な役割を果たしたことを意味するが、他方で、(大連合政権と比較して)政府内の政策的凝集性を高めた。2.「既得権益」批判を党勢拡大の最大の源泉としてきた「極右」政党は、社会団体との関係を重視して大胆な政策転換を躊躇しがちな国民党に対し、連合与党内部から圧力をかけ続け、また、国民党もその圧力を時に利用して改革を推進した。すなわち、「極右」政党の政権参加とそれによる右派連合政権の成立によって、連合政権内の凝集性が獲得され、既存の利益構造の大胆な組み換えが、よりラディカルな福祉制度改革へと結びついたといえよう。本研究の柱のひとつであったドイツなど、左派主導で福祉制度改革を進めた諸国との比較分析は、今年度中には十分に展開できなかった。今後の課題としたい。本研究最大の目的は、「極右」政党を組み込んで新たに登場した右派連合政権によって近年実現しつつある年金・医療保険制度改革において、「極右」政党独自が果たした独自のインパクトを、ドイツなど社会民主主義政党が政権の基軸に座る諸国との比較の中で確定することにある。本年度は、2000年にオーストリアで成立した右派連合政権の年金・医療保険制度改革について、政権成立後から2002年の前倒し選挙まで、時系列的に跡付けた。それによって明らかになったのは、1、第一に、保守政党と「極右」政党との政策的な近接性であった。「極右」政党は、移民政策や文化政策でその突出した独自性を示してきたが、年金・医療保険制度において、独自の包括的な改革プランを提示することはできなかった。その近接性は、年金・医療保険制度における「ネオリベラル政策」と「家族」という二つの柱にみてとることができる。政策上の焦点は、「個人化」への圧力と「家族」の価値をいかに守っていくかという二つの価値観の間の刷り合わせとして理解することが可能である。2、しかしながら第二に、右派連合政権の年金・医療保険制度改革の実現プロセスのなかで、「右翼」政党が果たした役割は無視できない。それは、年金・医療保険制度改革のプロセスのなかで、「右翼」政党が、社会団体との関係を重視してこなかった、あるいは意図的に避けてきたことと関連している。そのため、ネオリベラルな政策の推進にさいして、「右翼」政党は、社会団体との長年にわたる利害関係から大胆な政策転換を躊躇する中道与党を連合与党として外から圧力をかけてきた。政府もこの圧力を政策実現に利用した。3、右派連立政権は、「右翼」政党を政権内部に取り込んだことによって、よりラディカルな政策転換を可能にした。そして、伝統的な「家族」の価値をその政策転換のひとつの軸にすることが、両党の合意の基礎として、政策上も連合戦略上も重要な役割を果たしていることが明らかになった。

すなわち、「極右」政党の政権参加とそれによる右派連合政権の成立によって、連合政権内の凝集性が獲得され、既存の利益構造の大胆な組み換えが、よりラディカルな福祉制度改革へと結びついたといえよう。本研究の柱のひとつであったドイツなど、左派主導で福祉制度改革を進めた諸国との比較分析は、今年度中には十分に展開できなかった。今後の課題としたい。
高連結度グラフとその応用

縮約法は連結度の高いグラフの性質を調べる際に有力な道具となる。本年度はこの縮約法を用いて、グラフのサイクル分布に関する問題の解決を試みた。またグラフに関する数学上の成果を情報科学の他分野に応用することも試みた。その研究実績は以下の通りである。グラフのサイクル分布に関してLesniakは、最小次数が3以上であるグラフには長さが4の倍数になるサイクルが存在するだろうと予想した。本研究代表者はDean、Lesniakらと共にこの予想を解決した。この際、背理法の議論により、まず頂点数最小の反例の性質を調べ、そのグラフの連結度が高いことを導いた。そして縮約法により、矛盾を導いた。すなわちこの証明において縮約法は中心的な役割を果たした。今のところ縮約法を用いない証明は知られていないので、縮約法の有用性がここにおいても示されたことになる。また本研究代表者は、グラフが非自明な誘導木に分解されるための必要十分条件を導いた。この証明においても縮約法は中心的な役割を果たしている。証明は構成的であり、この結果はグラフを効率的に木に分解するアルゴリズムも与えている。さらに本研究代表者は、グラフの性質を秘密共有法とよばれる暗号法の1つに応用することに成功した。秘密共有法とは、1つの秘密情報を断片に分割して管理し、その1部が漏洩しても秘密そのものの機密性が保たれるようにする技術である。本代表者は、以前にもこの分野の研究を行ったが、今回はグラフの性質を使って、その時よりも効率の良い秘密共有法を構築した。
保育所と幼稚園における地域に開かれた保育プログラムと子育て支援機能に関する研究

A保育園とB幼稚園において実施されている保育プログラムについて、その実践のようすを観察、記録すると同時に、情報公開をメディア(「通信」)により実施してきた。特に、A保育園の「通信」の作成にあたっては、単なる「お便り」や「園だより」に終わらないよう設備備品を十分に活用したビジュアル化を図った。「通信」による定期的な情報の提供を実施後、「通信」が果たす役割について、夫婦間・母子間・父子間のそれぞれのコミュニケーションへの影響度から探るため、保護者を対象に質問紙法による調査を実施した。5段階評定による調査結果の分析と、コミュニケーションの様相や保育プログラムに対する意見・感想の検討から以下のことが明らかになった。1.80%前後の父母が、「通信」が子どもとの交流の上で役に立っていると評価した。2.父母(夫婦)間のコミュニケーションへの影響度も、肯定的な回答が父母共にに80%以上だった。3.父親の方が子どもや妻とのコミュニケーションの有効な媒体として「通信」が働いていた。4.「通信」により地域に開かれた保育プログラムそのものへの理解が深められ、取り組みのねらいなど十分に把握した上で全面的に賛同する父母の態度がみとめられ、ますます園と家庭との相互理解の絆が深まっていることがわかった。以上のように、園からの情報提供を通して、家庭の中でのコミュニケーションが活性化し、それがより深い園と家庭との信頼関係へとつながるという、相互に支え合う関係性がみとめられた。そのことは、子どもたちの発達を保障する場(園も家庭も)がますます充実するという意味において、情報の提供が子育て支援機能を十分に果たしうるといえる。今後は、新しく開園した本学附属保育園においてさらに継続検討すると同時に、動画による情報公開の実践的研究も進めていきたい。本年度は、典型的な衛星都市にあるA保育園とB幼稚園を対象として、まず地域に開かれた保育プログラムの実践に関する検討をおこなった。その上で、実践された保育活動についての情報の公開を試みた。A保育園は地域に所在する施設の高齢者や高齢障害者との交流を保育のバリエーションとして取り入れており、B幼稚園は地域における未就園児とのふれあいの場を平常保育の時間内で定期的に設けている。いずれも本来の目的は、在園児の豊かな社会性や人間性の育成であり、心豊かな子どもたちに育ってほしいという願いのもとに実施されているプログラムである。ここでは、この活動のようすを観察、記録するとともに、そこで得た保育活動に関する情報をいかに公開するかという検討をおこなった。具体的には、メディアによる公開を試みた。特に、A保育園においては記録した画像を使用し、パーソナルコンピューターによる『あいの/のびのび・ふれあい通信』の作成を実施した。作成にあたっては、公開内容や公開対象に関する現場の保育者との十分な連携、と同時に単なる「お便り」や「園だより」に終わらないよう、設備備品を十分に活用したビジュアル化の2点について、実践的な検討を試みた。保育者や保護者の声をもとに改善を試みながら、『あいの/のびのび・ふれあい通信』は第6号を発行した。現在、公開した情報に対する調査を実施中であり、今後はそれらの分析をとおして、情報の提供と子育て支援の関連性についてさらに検討するものである。

5段階評定による調査結果の分析と、コミュニケーションの様相や保育プログラムに対する意見・感想の検討から以下のことが明らかになった。1.80%前後の父母が、「通信」が子どもとの交流の上で役に立っていると評価した。2.父母(夫婦)間のコミュニケーションへの影響度も、肯定的な回答が父母共にに80%以上だった。3.父親の方が子どもや妻とのコミュニケーションの有効な媒体として「通信」が働いていた。4.「通信」により地域に開かれた保育プログラムそのものへの理解が深められ、取り組みのねらいなど十分に把握した上で全面的に賛同する父母の態度がみとめられ、ますます園と家庭との相互理解の絆が深まっていることがわかった。以上のように、園からの情報提供を通して、家庭の中でのコミュニケーションが活性化し、それがより深い園と家庭との信頼関係へとつながるという、相互に支え合う関係性がみとめられた。そのことは、子どもたちの発達を保障する場(園も家庭も)がますます充実するという意味において、情報の提供が子育て支援機能を十分に果たしうるといえる。今後は、新しく開園した本学附属保育園においてさらに継続検討すると同時に、動画による情報公開の実践的研究も進めていきたい。
双極性パルスパワー電源を用いた高効率気体分解処理

双極性パルスパワーを用いた高効率気体分解処理について,放電処理の原理およびその有用性の実証を目指して2年間研究を実施した。初年度には,波高値60kV,200nsの双極性パルスを発生できる電源装置をもつ気体放電処理システムを構築した。本装置を用いて,放電処理の基礎資料を得るために,NOx処理実験を行なった。NOx(N_2希釈のNOガス)を流量2l/minで放電処理容器へ給気し,これと同期して種々の繰返し周波数で双極性パルスを印加した。これにより,繰返し周波数10Hzの時に,NOx除去率85%を得た。これは十分実用に耐え得る値である。さらに、双極性パルスによるNOx処理の有効性について検討を行なうために,等しい入力電力を持つ単極性パルスを用いた場合の放電処理実験を行なった。しかしながら,今回の実験では双極性パルスよりも単極性パルスの方がNOx除去率は高い値を示した。これは、双極性パルス上で正電位から負電位への極性反転に60nsを要しており,この時間中に正電圧印加時に生成された電子の多くが再結合してしまった,すなわち,本来電子の拡散を目論んで印加した負電圧の効果が現れなかったためと考えられる。引き続き第2年度には,NOx処理実験の結果をふまえて,光学観測による放電処理プロセスの解明を試みた。光学観測には,高速度カメラを用い,電極の軸上および横方向でのプラズマからの発光を撮影した。一連の観測結果から,パルス幅が50nsから100nsの電圧を印加する方法が最もエネルギー効率が高いことが明らかとなった。しかしながら,今回の実験では,双極性パルスの負極性部分による電子の拡散効果が現れなかったため,当初予測していた結果が得られなかった。今後は,電源やパルス波形の最適化などを行い,双極性パルスによるNOx処理について再検討する必要があると考えられる。双極性パルスパワーを用いた高効率気体分解処理について,放電処理の原理およびその有用性の実証のために,2ヶ年の予定で研究を実施した。研究初年度の本年は,まず,実験設備の構築を行なった。気体放電処理容器として,既存の円筒形容器の中心部に直径0.2mmのタングステン製内部電極を装着し,処理対象気体の給・排気システムを設置した。また,双極性パルスパワー電源システムを設計・製作した。双極性パルス電圧の発生は,20m長の同軸ケーブルを用いたケーブル放電により行なった。生成したパルス電圧は昇圧用スタックにより昇圧され,気体処理装置の電極へ印加される。双極性パルス電源システムの特性試験を行なった結果,波高値60kV, 200nsの双極性パルスを得た。次に,放電処理の基礎資料を得るために,NOx処理実験を行なった。

これは、双極性パルス上で正電位から負電位への極性反転に60nsを要しており,この時間中に正電圧印加時に生成された電子の多くが再結合してしまった,すなわち,本来電子の拡散を目論んで印加した負電圧の効果が現れなかったためと考えられる。今後は,双極性パルス波形の改良,VOC処理への応用の第1段階としてトリクロロエチレンの分解処理計測,および,放電プラズマの観測による放電処理プロセスの解明を行なう。双極性パルスパワーを用いた高効率気体分解処理について,放電処理の原理およびその有用性の実証のために,2ヶ年の予定で研究を実施した。本年度は,研究初年度に行ったNOx処理実験の結果をふまえて,光学観測による放電処理プロセスの解明を試みた。実験には初年度同様,気体放電処理容器の中心部に直径0.2mmのタングステン製内部電極を装着し,波高値60kV,200nsの双極性パルスおよびこれと等しい入力電力を持つ単極性パルスを印加した。また,気体処理室へはNOx(N_2希釈のNOガス)を流量2l/minで給気した。光学観測には,高速度カメラを用い,電極の軸上および横方向でのプラズマからの発光を撮影した。基本的に,プラズマからの発光は,プラズマ中の電子とイオンの再結合や励起分子が基底状態へ遷移することで起こる。この光の強度は,電子・イオン・励起分子の密度が大きいほど強くなるため,光の強度が強い領域は等価的にラジカルの密度も高くなり,結果としてNOx処理が行われやすくなる。一連の観測結果から,1.電圧印加後,50nsから100nsまでの間にストリーマが外部電極に到達し,放電がガス処理室全体で起こった。2.電圧印加後100ns以降は,放電光が減衰し,中心電極近傍でのみコロナ放電が観測された。3.1および2より,パルス幅が50nsから100nsの電圧を印加する方法が最もエネルギー効率が高い。4.双極性パルスの負極性部分では弱いコロナ放電が起こっている。そのため,負極性部部分でのNOx処理への寄与は明確には現れなかった。今回の実験では,双極性パルスの負極性部分による電子の拡散効果が現れなかったため,当初予測していた結果が得られなかった。しかしながら,電源やパルス波形の最適化などを行い,双極性パルスによるNOx処理について再検討する必要があると考えられる。
鉄酸化独立栄養細菌が優先する微生物群集は深海底下に存在するか？

海洋性の鉄酸化菌を含む分類群Zetaproteobacteriaは、巨大海底下微生物生態系の成り立ちや、地球規模での物質循環を理解する上でのキープレーヤーと予想されている。しかしながら、その代謝機能や海底下における分布範囲などの具体的な情報は皆無に等しい。本研究では、(1)海底下におけるZetaproteobacteriaの分布範囲および存在量、(2)Zetaproteobacteriaに属する微生物種の生理学的特徴、の2点を明らかにすることを目的とした。南部マリアナトラフにて採取した硫化物コアを分析試料とし、平成24年度までに、1本のコアの異なる深度3点の試料について、微生物群集構造解析が完了している。平成25年度は、別の地点で採取したコア1本の異なる深度4点の試料からDNAを抽出した。計7つのサブ試料を対象に、パイロシークエンシング法等による微生物群集解析を行った。その結果、深度1 m程度の部位からは鉄/硫黄酸化菌群のZetaproteobacteriaやChromatialesが検出され、より深い部位からは鉄/硫酸還元菌群のNitrospiraeやDeltaprteobacteriaが検出された。これらの細菌に由来すると予想される硫黄酸化/硫酸還元や炭酸固定に関わる遺伝子も検出された。以上の結果から、海底下の硫化物構造体内部では、硫化鉄をエネルギー源とした微生物生態系が成り立っており、そこでは種々の細菌によって駆動される硫黄と鉄の循環系が存在することが示唆された。加えて、鉄酸化菌の効率的な分離培養方法を考案した。試験的に同培養法を用いて、陸上試料から螺旋状の構造体を産出する新規の淡水性鉄酸化菌の培養に成功した。しかしながらコア試料からのZetaproteobacteriaの培養には至っていない。本研究で得られた成果は学会にて発表し、国際誌に投稿中/公開済みである。海洋性の鉄酸化独立栄養細菌を含む微生物分類群Zetaproteobacteriaが2007年に新たに提唱された。この分類群は、巨大海底下微生物生態系の成り立ちや、地球規模での物質循環を理解する上でのキープレーヤーとされている。本研究では、(1)海底下におけるZetaproteobacteriaの分布範囲および存在量、(2)Zetaproteobacteriaに属する微生物種の生理学的特徴、の2点を明らかにすることを目的とする。平成24年度に行ったことは以下の通りである。南部マリアナトラフ海底熱水域にて海底掘削装置を用いて採取した岩石コアを分析試料とし、各岩石コア試料の深度方向に適宜間隔をあけ、それぞれの一部分からDNAを抽出した。抽出したDNAを鋳型として、バクテリア及びアーキアを標的にした16S rRNA遺伝子プライマーを用いてPCRを行った。いくつかの試料において、遺伝子断片の増幅が確認された。1つのコア試料に焦点を絞り、3つの異なる深度の部分から得られたPCR増副産物をクローニングし、塩基配列決定まで行った。その結果、深度ごとに異なる微生物群集が存在することが明らかとなった。Zetaproteobacteriaは深度1m以上からは検出されなかった。海底下のZetaproteobacteriaの分布範囲を知る上で重要なデータである。この結果はAGU Fall Meeting 2012でポスター発表し、現在論文を投稿中である。また、岩石コア試料に鉄酸化菌がいるかどうかを視覚的に確認する必要がでてきたため、米国デラウェア大学のChan研究室に短期留学し、岩石コア試料の電子顕微鏡観察を行った。その結果、鉄酸化菌が産出したと予想される構造体の観察に成功した。既に一年目にして、一部のコア試料の16S rRNA遺伝子解析結果がまとまっており、学会発表および論文投稿までこぎ着けた。

この解析結果から、海底下におけるZetaproteobacteriaの分布範囲に関する重要な知見を得ることができた。DNA抽出はほぼすべての岩石コア試料について完了し、バクテリアとアーキアの16S rRNA遺伝子のPCR増幅までは完了しているが、配列決定まで進められたのは一部の試料にとどまっている。炭酸固定遺伝子を標的にしたPCRまでには至っていない。培養においては、現在までのところGammaproteobacteriaのHalomonasやMarinobacterの増殖は確認できたが、Zetaproteobacteriaの増殖は確認されていない。よって、当初の予定からはやや遅れていると判断せざるを得ない。まずは、16S rRNA遺伝子解析および炭酸固定遺伝子解析を完了させる。そのために、次世代シーケンサーを用いた配列解析を新たに取り入れる。その後、定量PCRおよびFISHを行い、Zetaproteobacteriaの存在量と分布範囲を決定する。平成24年度で得られた結果から、分離培養は深度の深い岩石コア試料からは難しいと判断し、海底面付近の試料に限定して培養を試みる。既に端緒的ではあるが、鉄酸化菌に特徴的ならせん状の構造体を産出する微生物の集積培養に成功しているため、この微生物の分離にまずは集中する。分離できた場合は、次世代シーケンサーを用いたゲノム解析まで行うことで、定量PCRやFISHで用いるプローブ・プライマーの設計に必要な配列情報を得る。標的とする遺伝子は、炭酸固定遺伝子と鉄酸化酵素遺伝子である。分離の生理学的特徴も合わせて決定する。また培養には新鮮な試料が必要であるため、海底面の試料を新たに採取して、Zetaproteobacteriaの分離培養を行う。平成24年度未使用額が生じたのは、本年度において研究室の移転があり、実験室の環境が整うまでしばらく時間がかかり、その間は研究を進めることができず、当初の予定通りに実験を行うことができなかったためである。平成25年度の研究費は、(1)従来通りのPCRクローン解析に必要となる試薬及び機器使用料、(2)次世代シーケンサー解析を用いた個々の遺伝子解析およびゲノム解析に必要となる試薬及び機器使用料、(3)定量PCRおよびFISHで用いるプライマーやプローブの作成料、(4)分離培養に必要となる試薬や消耗品、(5)試料採取および研究成果発表に必要となる旅費に用いる予定である。