hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
患者志向の頭頸部癌高精度放射線治療計画法の確立に向けた新規有害事象予測モデル構築

頭頸部癌に対する放射線治療適応症例の増加に伴い、治療後の有害事象に配慮した治療計画法の開発が急務となっている。本研究では、放射線治療後の甲状腺機能低下症、唾液分泌障害、味覚障害を対象として、既存の報告にない指標も用いた新規予測モデルを構築し、放射線治療計画法への応用を目指している。2年目までの研究成果としては下記のとおりである。1)甲状腺機能低下症初年度に、頭頸部癌に対する放射線治療を受けた患者について、放射線治療計画装置上で甲状腺の輪郭を入力して実際の治療計画と照合し、甲状腺に照射された放射線の線量分布、線量ー体積関係に関する指標を算出した。各症例について、治療後の甲状腺機能の推移を含めた臨床データと先述の線量ー体積関係指標を用いた解析を行い、甲状腺機能低下症発症の予測モデルを構築した。研究成果について論文執筆を行い現在投稿準備中である。論文執筆の過程で解析対象症例を増やし、307症例についての解析となった。今後は予測モデルを元に、甲状腺機能低下症の発症リスクを低減させる個別化放射線治療計画のための計画方法(甲状腺に照射される放射線量の制約の設定)を具体的に構築していく。2)唾液分泌障害、味覚障害頭頸部癌に対する放射線治療を受ける患者のうち、研究に協力を得られた患者について、治療期間中および治療終了後の口腔水分量測定および自覚症状に対するアンケート調査を初年度より開始し、平成31年3月末の時点で324名の患者の協力を得た。治療期間中、治療直後の急性期症状についてデータ解析を行い、口腔・大唾液腺(耳下腺および顎下腺)に照射される線量と、口腔水分量の変化、患者の自覚症状の変化(アンケート結果)の関係を解析した。今後解析結果の発表、論文化を行っていく。甲状腺機能低下症については昨年度の解析結果に加え、論文化にあたって追加解析も行い、予測モデルが構築できている。また、急性期の唾液分泌障害、味覚障害についてもデータ解析を行い、発表準備中である。治療後晩期(治療後半年以上経過後)の唾液分泌障害および味覚障害についてもデータ解析中である。ただし当院で治療を受ける臨床症例を研究対象としているため、研究対象者の体調不良・来院困難等によりデータ収集が予定通り行えない症例や、治療後の経過が思わしくなく(癌の再発や死亡)途中までしかデータ収集を行えなかった症例がありデータに一部欠損値が生じている。欠損値を念頭においた統計解析方法で追加検討を行う必要があり、データ解析に想定以上の時間を要している。甲状腺機能低下症予測モデルについては、論文採択を目指す。予測モデルに基づいた放射線治療計画手法を確立し、臨床導入する。唾液分泌障害、味覚障害については、急性期症状の予測モデルの発表、論文化を目指す。晩期症状については上述のごとく欠損値が多く、統計解析方法の再検討が必要となっている。解析手法の修正を行い、データ解析及び予測モデルの構築を目指す。本研究では、放射線治療後の甲状腺機能低下症、唾液分泌障害、味覚障害を対象として、既存の報告にない指標も用いた新規予測モデルの構築を目指している。初年度の研究成果としては下記のとおりである。1)甲状腺機能低下症頭頸部癌に対する放射線治療を受けた患者212例について解析を行った。放射線治療計画装置上で甲状腺の輪郭を入力し、実際の治療計画と照合し甲状腺に照射された放射線量の分布、線量ー体積関係に関する指標を算出した。今後、この予測モデルを元に、患者毎の甲状腺機能低下症発症リスク予測、発症リスクを低減させる個別化放射線治療計画が可能となる。2)唾液分泌障害、味覚障害頭頸部癌に対する放射線治療を受ける患者のうち、研究に協力を得られた患者について、治療期間中および治療終了後の口腔水分量測定および自覚症状に対するアンケート調査を行った。平成30年3月末の時点で266名の患者の協力を得た。治療期間中、治療直後の急性期症状についてはデータが集積してきたため、解析を開始した。放射線の線量分布、臨床データ、口腔水分量測定の結果、アンケート結果を統合的に解析中であり、唾液分泌障害・味覚障害の発症予測モデル構築を目指している。予測モデルが構築されれば、甲状腺機能低下症同様、患者毎の発症リスク予測、発症リスクを低減させる個別化放射線治療計画が可能となる。甲状腺機能低下症については予測モデルが構築できている。また、急性期の唾液分泌障害、味覚障害についても解析を開始することができている。ただし、治療後の経過が思わしくなく長期のフォローができていない患者もおり、治療後晩期の唾液分泌障害および味覚障害についての検討を行うためには、より多くの症例集積が必要である。

各症例について、治療後の甲状腺機能の推移を含めた臨床データと先述の線量ー体積関係指標を用いた解析を行い、甲状腺機能低下症発症の予測モデルを構築した。研究成果について論文執筆を行い現在投稿準備中である。論文執筆の過程で解析対象症例を増やし、307症例についての解析となった。今後は予測モデルを元に、甲状腺機能低下症の発症リスクを低減させる個別化放射線治療計画のための計画方法(甲状腺に照射される放射線量の制約の設定)を具体的に構築していく。2)唾液分泌障害、味覚障害頭頸部癌に対する放射線治療を受ける患者のうち、研究に協力を得られた患者について、治療期間中および治療終了後の口腔水分量測定および自覚症状に対するアンケート調査を初年度より開始し、平成31年3月末の時点で324名の患者の協力を得た。治療期間中、治療直後の急性期症状についてデータ解析を行い、口腔・大唾液腺(耳下腺および顎下腺)に照射される線量と、口腔水分量の変化、患者の自覚症状の変化(アンケート結果)の関係を解析した。今後解析結果の発表、論文化を行っていく。甲状腺機能低下症については昨年度の解析結果に加え、論文化にあたって追加解析も行い、予測モデルが構築できている。また、急性期の唾液分泌障害、味覚障害についてもデータ解析を行い、発表準備中である。治療後晩期(治療後半年以上経過後)の唾液分泌障害および味覚障害についてもデータ解析中である。ただし当院で治療を受ける臨床症例を研究対象としているため、研究対象者の体調不良・来院困難等によりデータ収集が予定通り行えない症例や、治療後の経過が思わしくなく(癌の再発や死亡)途中までしかデータ収集を行えなかった症例がありデータに一部欠損値が生じている。欠損値を念頭においた統計解析方法で追加検討を行う必要があり、データ解析に想定以上の時間を要している。甲状腺機能低下症については、論文化により研究成果発表を目指す。唾液分泌障害、味覚障害については、急性期の発症予測モデル構築を目指すとともに、治療後一定期間(半年後、1年後など)経過した段階での症状および回復状況についても解析を開始したいと考えている。甲状腺機能低下症予測モデルについては、論文採択を目指す。予測モデルに基づいた放射線治療計画手法を確立し、臨床導入する。唾液分泌障害、味覚障害については、急性期症状の予測モデルの発表、論文化を目指す。晩期症状については上述のごとく欠損値が多く、統計解析方法の再検討が必要となっている。解析手法の修正を行い、データ解析及び予測モデルの構築を目指す。研究用の物品が予想より安く購入できたため。また、統計解析の委託を次年度にまとめて行うこととしたため。研究計画の遅れ(統計解析方法の修正、追加のデータ解析)により、1年間の研究期間延長を申請することになった。消耗品購入費用、文献購入費用、研究会への参加費用、統計コンサルト費用や論文校正・投稿費用などどとして計上していた額を繰り越して、次年度に使用する。
診療報酬記録の再構築・再分類に基づいた肝疾患関連患者の重複疾患数の推計

肝炎ウイルス由来の肝疾患関連患者の重複疾患の分布・頻度を病因別に明らかにすることを目的とした。健保組合に属する3,462,296人が有する2014-2016年における診療報酬記録77,773,235件を解析対象として肝疾患関連疾患病名を持つ患者の全レセプトを抽出した。抽出したレセプトを患者ごとに診療年月順に並べ、肝疾患病因/病態を分類した。対象3,462,296人のうち肝疾患レセプトを有する患者は251,951人、うち0-64歳は229,654人であった。229,654人中B型肝炎関連疾患患者は5,492人、C型肝炎関連患者は4,668人であった。健保組合に属する本人及び家族3,462,296人のうち0-64歳2,735,751人を分母とした2014-2016年の3年期間有病率は10万人対でB型肝炎関連疾患では200.8、C型肝炎関連疾患では170.6であった。0-64歳のB型肝炎関連疾患5,492人の重複疾患の頻度が多い3疾患はK29:胃炎及び十二指腸炎(24.3%)、E78:リポたんぱく<蛋白>代謝障害及びその他の脂(質)血症(21.3%)、J30:血管運動性鼻炎及びアレルギー性鼻炎<鼻アレルギー>(21.1%)であった。0-64歳のC型肝炎関連疾患4,668人の重複疾患の頻度が多い3疾患はK29:胃炎及び十二指腸炎(30.5%)、J30:血管運動性鼻炎及びアレルギー性鼻炎<鼻アレルギー>(28.1%)、I10:本態性(原発性<一次性>)高血圧(症)(27.8%)であった。重複疾患から対応する診療科を推定し、医療機関を受診している0-64歳のB型肝炎関連疾患を有する患者が、どの診療科に該当する重複疾患を持つか集計した結果、内科(慢性疾患)が69%と最も高く、耳鼻科が42%であり、同じくC型肝炎関連疾患患者では内科(慢性疾患)が74%と最も高く、耳鼻科が48%であった。当教室ではこれまで診療報酬記録を用いて2008-2010年における肝疾患関連患者数の推計を行なってきた(Hep Res 2015;45:1228-1240.)。本研究では診療報酬記録を再構築・再分類することによって2014-2016年において、我が国における肝疾患関連患者数を推計すること、および、診療報酬記録を用いて我が国における肝炎ウイルス由来の肝疾患関連患者の重複疾患の分布・頻度を病因別に明らかにすることを目的とした。健康保険組合に属する3,462,296人が有する2014-2016年における診療報酬記録77,773,235件を解析対象として肝疾患関連疾患病名を持つ患者の全レセプトを抽出した。抽出したレセプトデータから同一患者のデータを診療年月順に並べ、診療行為・薬剤の情報から疑診例及び検査目的のものを除いた。また、複数の記載がある標準病名をもとに再構築を行い、各患者の全期間のレセプトデータを考慮した上で、患者ごと標準病名から再分類コード名(肝炎ウイルスに関するコード名はウイルス肝炎のキャリア、慢性肝炎、肝硬変、肝癌、急性肝炎、脂肪肝とし、病因別に集計可能とした。)を1つ決定し、2014-2016年における3年期間有病率をそれぞれの疾患ごとに性・年齢階級別に算出した。対象3,462,296人のうち、HBV関連患者数は9,067人、HCV関連患者数は4,668人であった。HBV・HCV関連患者の持つ全レセプトから重複疾患をICD10大分類別に集計した。ICD10大分類別にみた重複疾患の頻度上位3位はHBV・HCV共に「呼吸器系の疾患」、「内分泌、栄養および代謝疾患」、「筋骨格系および結合組織の疾患」であった。診療報酬記録データベースから肝疾患関連患者の全診療報酬記録を抽出する。診療報酬記録には疑診例・検査目的のデータが含まれており、精度を上げるために除外する必要が有る。このため、診療報酬記録データベースをそのまま集計するのではなく、患者ごとに肝疾患関連疾患情報を下記の手順で再構築・再分類を行う。再構築・再分類は本研究の最も時間を要する作業である。より精度の向上を試みる予定ではあるが、基本的にH29年度内に再構築・再分類を完了することができた。

229,654人中B型肝炎関連疾患患者は5,492人、C型肝炎関連患者は4,668人であった。健保組合に属する本人及び家族3,462,296人のうち0-64歳2,735,751人を分母とした2014-2016年の3年期間有病率は10万人対でB型肝炎関連疾患では200.8、C型肝炎関連疾患では170.6であった。0-64歳のB型肝炎関連疾患5,492人の重複疾患の頻度が多い3疾患はK29:胃炎及び十二指腸炎(24.3%)、E78:リポたんぱく<蛋白>代謝障害及びその他の脂(質)血症(21.3%)、J30:血管運動性鼻炎及びアレルギー性鼻炎<鼻アレルギー>(21.1%)であった。0-64歳のC型肝炎関連疾患4,668人の重複疾患の頻度が多い3疾患はK29:胃炎及び十二指腸炎(30.5%)、J30:血管運動性鼻炎及びアレルギー性鼻炎<鼻アレルギー>(28.1%)、I10:本態性(原発性<一次性>)高血圧(症)(27.8%)であった。重複疾患から対応する診療科を推定し、医療機関を受診している0-64歳のB型肝炎関連疾患を有する患者が、どの診療科に該当する重複疾患を持つか集計した結果、内科(慢性疾患)が69%と最も高く、耳鼻科が42%であり、同じくC型肝炎関連疾患患者では内科(慢性疾患)が74%と最も高く、耳鼻科が48%であった。今回、レセプトから再分類した患者の病名のうちには、実際には検査のみであると考えられるものがいると考えられ、今後より精度を上げた解析を行う予定である。H29年度の解析では、HBV・HCV関連患者の持つ全レセプトから重複疾患をICD10大分類別に集計した。ICD10大分類別にみた重複疾患の頻度上位3位はHBV・HCV共に「呼吸器系の疾患」、「内分泌、栄養および代謝疾患」、「筋骨格系および結合組織の疾患」であった。また、今後は詳しく有病期間を考慮して、糖尿病、慢性腎症等具体的な疾病名の重複を調べる予定である。100,800円のデータ抽出料の支払いが今年度行われなかったため。次年度に行われるため、今後の計画に支障はない。
重症感染症におけるNOの細胞保護作用と障害作用の分岐点に関する研究

NOには細胞障害性と保護性との二面性がある。エンドトキシン(LPS)やTNF投与後のNOについても、障害性と細胞保護作用の報告がある。その分岐点となる機構は何かを解明する報告はないため、これに迫ることを目的として実験を行った。保護作用についてLPSによる細胞傷害性がNOにより抑制されるかを検討した。1)ラット遊離肝細胞にLPSとその増感剤(Actinomycin D)を加えて障害性を確認した。2)これにiNOS阻害剤を投与するとさらに死亡率が増加した。3) NO産生剤であるS-nitroso-N-acctylpenicillamine(SNAP)2mMの追加投与で死亡率は著減し、DNA断片化も抑制された。4)ミトコンドリアの電子伝達阻害剤であるロテノン、アンチマイシンAで活性酸素種産生が減少し、DNA断片化は抑制された。5)ミトコンドリアの電子伝達で産生される活性酸素種はNO産生剤であるSNAP投与で抑制された。6)以上より、電子伝達系で産生される活性酸素がDNA断片化に関与し、NOが防御的役割を果たしていることが判明した。細胞障害性について、予備的実験の当初において上記の遊離肝細胞にLPSとその増感剤(Actinomycin D)を加えて、SNAP2mMと培養した場合には抑制されていた死亡率が、14mMのSNAP添加では死亡率は亢進する傾向がみられた。しかしその後、予備実験を精力的に繰り返したものの、本実験を行うに足るデータは得られず、NOの濃度差による二面性を説明するには至っていない。1)200g前後の雄性Wistar系ラットにET 3mg,5mgを腹腔内投与し、8時間、16時間後にラットを犠死せしめ、既存の方法にしたがい遊離肝細胞を作成した。NOの影響を検討するため、ETと同時にL-NAME40mg/kgを腹腔内投与した群を作成した。2)ETの増感剤であるactinomycin D(0.5μg/ml)投与後のcell viabilityを検討したところ、培養6時間後にはET群で68%が死亡し、ET+S-NAME群では89%が死亡した。3)iNOS阻害剤にて死亡率が増加したことから、培養系にNO産生剤である2mMSNAPを添加したところ、著明に死亡率が抑制された。4)その際のDNA-fragmentationについて検討したところ、L-NAME投与にてDNA-fragmentationは4倍に増加し、SNAP投与にてそのDNA-fragmentationは抑制された。5)しかも、DNA-fragmentationはSNAPの変わりに投与した電子伝達系阻害剤であるrotenone,antimycin Aにて同様に抑制された。6)dehidrorhodamine 123およびhydroethidineを用いて電子伝達系にて産生される活性酸素種に関して検討したところ、L-NAME投与にて活性酸素種は著明に増加した。この酸素種はSNAP,rotenone,antimycin Aにて抑制された。以上より、現在、電子伝達系で産生される活性酸素がDNA-fragmentationに大きく関与し、NOが防御的役割を成していることが判明した。前年度の研究においてNOがapoptosis発生制御に拘わっていることが判明した。しかし、NOはそれ自身、障害性を発揮するため、apoptosis発生制御と細胞障害性に関して検討した。1) 200g前後の雄性Wistar系ラットにEndotoxin(ET)5mgを腹腔内投与し、8時間、16時間後にラットを犠死せしめ、既存の方法にしたがい遊離肝細胞を作成した。3)以前の研究にて活性酸素種はmitochondriaのpore openingをもたらし、apoptosisまたnecrosjsを発生することを確認していることから、14mMSNAP添加の際のmitochondriaのpore openingについて検討した。

SNAP添加直後よりmitochondria膜の膨化が始まり、その後mitochondria内のCa^<2+>の流失、^<14>C-sucroseのmiitochondria内への流入、すなわちmitochondria inner membrane permeability transitionが発生した。5)このinner membrane permeability transition発生もしくは呼吸能低下は鉄キレート剤、Ca^<2+>キレート剤では抑制されなかった。一酸化窒素(NO)には細胞障害性と保護作用の二面性があるが、細胞保護作用については主としてin vivoの実験で多くの報告がある。一方、細胞障害性に関してはNOがミトコンドリア障害、肝蛋白合成阻害、またP450の活性を低下させるなどの報告がある。これまでに私どもは同じ実験モデルにおいてもNOにはその量的な差異によってアポトーシス抑制作用と細胞障害作用があることをとくにラット分離肝細胞において報告してきた。今回はNOのアポトーシス抑制作用について、量的差異のみならず、NOの発生時期、発生状況がアポトーシス発生にどのようにかかわるかを検討した。アポトーシスはTNFで誘発し、その感受性を高めるためにactinomycin Dを投与した。NOドナーとしてS-Nitroso-N-acetylpenicillamine(SNAP)を投与方法を種々変更してマウス線維芽細胞に投与してNOの発生(投与)状況がアポトーシスをどのように抑制するか、また、否かを検討した。その結果、SNAPの投与量を0.01mMから2mMまで増加する間はアポトーシスは濃度依存性に段階的に抑制されたが、SNAPを14mMまで増加して大量のNOを発生させた場合にはかえってアポトーシスが促進された。また、SNAPはTNF投与後、2時間以内に投与しなければ、DNAの損傷が進行して、もはや有効と思われる濃度のNOを発生させてもアポトーシスは抑制されなかった。今回の検討は線維芽細胞の細胞障害を遊離してきたLDHを指標として測定したために、それがアポトーシスに依るものなのか、ネクローシスに依るものなのかの鑑別を行うに至らなかった。今後。研究の機会があれば、この点や、同様の現象が肝細胞でも認められるのかなどについて研究を行いたい。
単一細胞レベルにおける上皮輸送機能の解明

本総合研究では、胃、小腸、大腸、腎、脾、ダ液腺、涙腺等、種々の機能を有する上皮細胞の生理機能及びその機構解明にむけて、単一細胞レベルでの研究方法を確立することをめざした。研究期間は昭和62年度、63年度の2年間であった。これまでのように、細胞全体を平均化した情報を得るのではなく、1個の細胞内におけるメッセンジャーの分布-例えばCa^<2+>、イノシトール燐酸、H^+、cAMP等-を測定し、細胞内に局在化して存在する能動輸送機能子-例えばポンプ、イオンチャネル、キァリア、アンチポーター-の作用制御に、班員の研究は集中してなされた。この目的の為に、蛍光画像解析、パッチクランプ、イオン選択性微少電極、モノクローナル抗体等の新技術が動員された。この2年間に、単一細胞レベルの研究は格段に進歩した。胃酸分泌細胞内におけるCa^<2+>、H^+濃度分布(田代、岡田、竹口)が明らかにされた。大腸における酸分泌機構(鈴木、竹口)がH,K-ATPaseによることが明らかになった。膵アミラーゼ分泌細胞におけるCa^<2+>の動員(菅野)、二次性・三次性の吸収機構と細胞表面のpH分布(星)、分泌腺におけるCl^-チャネル・アンチポータ(西山)、腎における多様な分泌・吸収と能動機能因子の分布(今井、藤本)等々多くの成果が得られた。各年度に班会議を行った(富山及び京都)。班員以外の研究者の参加を得た(それぞれ、50人、90人)。班員以外にも、本研究課題に興味を有する研究者が急速に増加していることがわかった。単一細胞内の構造・機能を知ることは、今後生化学・生理学・組織学・生物物理学にまたがる新しい境界領域分野(学院領域)の研究として、大いに発展することは疑問の余地のないことである。本総合研究は、その新潮流のはじめとして大いに活躍したといえよう。種々の上皮細胞の生理機能及びその機構解明にむけて,単一細胞レベルの研究方法を確立し,研究を新たな次元で展開することが本研究の目的である.研究期間は2年間で,本年は第一年目である.代表者竹口は胃酸分泌のH^+ポンプであるH,KーATPaseには,塩酸分泌に必要なC1^-チャンネルもそなわっていることを,単クローン抗体を作製することにより示した.即ち,単クローン抗体HK2032は,H,K-ATPaseの酵素活性を阻害すると同時にC1^-チャンネルも阻害した.また別な単クローン抗体HK4001はHKーATPaseの酵素活性を完全に阻害することができた.今後,これらの抗体を細胞レべルにおいてパッチクランプ法と組みあわせて研究を行う.今担研究者星は小腸刷子縁膜での小分子ペプチドでの能動的吸収機構はH^+との共輸送であり,H^+/ペプチドの連結比が2であることを示した.この輸送の駆動力は刷子縁膜に存在するNa^+/H^+逆輸送による細胞内アルカリ化とH^+の分泌,上皮細胞表面のコートとムチンによる細胞表面の局所酵性pH層の維持によることを明確にした.分担研究者田代は細胞の蛍光画像解析法を用いて,胃壁細胞の静止時およびガストソン刺激時の細胞内Ca^<2+>動態を調べた.またイノシトール三燐酸に対する応答も解析した.他の分担研究者の実績については,字数制限の為,省略する.

パッチクランプ法をこれまでに手がけているのは,西山,岡田,北里,今井(正),藤本,星,竹口である.蛍光画像解析法も急速に拡がりつつあり,これまでに手がけているのは,田代,岡田,藤本,竹口である.これらの新しい方法論導入の必要性・その意義について,班員の理解が深まりつつある.また,これらの方法を使った新しい結果が次々と出されてきていることが,本年度の班会議(昭和63年1月,富山)において明らかになった.本総合研究班では、胃、小腸、大腸、腎、膵、ダ液腺、涙腺等、種々の機能を有する上皮細胞の生理機能及びその機構解明にむけて、単一細胞レベルの研究方法を確立することにある。本年は2年目でかつ最終年である。これまでのように細胞全体を平均化した情報を得るのではなく、1個の細胞内におけるメッセンジャーの分布--例えばCa^<2+>,イノシトール燐酸, H^+, CAMP等--を測定し、細胞内に局在化して存在化する能動輸送機能子--例えばポンプ,イオンチャネル,キャリア,アンチポーターの作用制御に、班員の研究は集中してなされた。谷口は胃酸分泌のH^+ポンプであるH、K-ATPasaの類似H、K-ATPaseが大腸後半にも存在することを示し、酸文泌細胞内がアルカリ化すること、その細胞内pH分布が複雑な様相を示すことを蛍光画像解析によって示した。菅野はエネルギー代謝状態とCa^<2+>との関連を膵細胞で明らかにした。西山は、消化腺細胞におけるCI^-チャネルやアンチポーターの局在を明らかにした。今井は腎における分泌・吸収機能が部位において異なることを、異なる能動輸送機能子の分布より明らかにした。星は小腸吸収細胞表面における局在化したpH酸性層の存在を明らかにし、吸収機能との関連を示した。田代は胃主細胞や壁細胞における刺激に応じた細胞内Ca^<2+>動員を画像解析を使って明らかにした〓岡田は小腸細胞における細胞体積調節に関与するイオンチャネル群の存在とその調節機構の存在を示した。蛍光画像解析法やパッチクランプ法を単一細胞レベルにおいて使用することは、本研究2年目において急速にポピュラーになった。これらの方法を使った新しい成果が次々と出されてきたことが、本年度の班会議(昭和63年10月)において明らかになった。
次世代の新規除草剤候補物質の探索と作用機構の解明

次世代の除草剤の開発に繋がる知見を得ることを目的として、薬用植物や熱帯、亜熱帯性の植物種から高い植物成育抑制活性を有する新規の生理活性物質の探索を行った。その結果、植物に対して非常に高い成育抑制活性を有する化合物類を見出した。それらやその類縁化合物について植物体内での作用機構の検討を行った。オイカルボン、ヒノキチオール、クミンアルデヒド、オクチルアセテートの4つの化合物については、植物体内で活性酸素の過剰生成を誘発し、酸化障害を引き起こすことが植物の生育抑制に繋がっているものと推察された。しかしながら、活性酸素の過剰生成のメカニズムは、それぞれの化合物で異なることが示唆された。二次代謝産物を多く含む薬用植物や熱帯性の植物種の採集と高い植物成長促進または抑制活性を有する揮発性物質を産生する植物種の探索した結果、クミンやシュクシャ、カルダモン等、約10種の薬用植物で、レタスに対する高い生育抑制活性があることがわかった。そこで、それらの植物種から放出される揮発性物質をGC-MSにて同定したところ、主にクミンからβ-ピネン、クミンアルデヒド、シュクシャからカンフェン、ボルネオール、カルダモンからα-ピネン、1,8-シネオール等の揮発性物質が同定された。それらの揮発性物質の標品を用いた植物生育抑制活性試験を実施した結果、特にクミンアルデヒドがレタスに対して強い生育抑制活性を持っていることがわかった。クミンアルデヒドは、植物生育抑制活性や作用に関する報告が殆どないことや、さらに香料として既に用いられていることからも、今後の新規のより安全な農薬開発の可能性を考える上でも興味深い化合物であると思われた。そこで、次にクミンアルデヒドの作用特性についての検討を行うことにした。クミンアルデヒドの選択作用性の検討として作物種・雑草種を含めた12種の植物を供試植物として植物生育抑制活性を比較した。その結果、トウモロコシでは、クミンアルデヒドの生育抑制効果は低いことが示された。また、クミンアルデヒドは、タマネギ(感受性)の根部において、死細胞の増加、活性酸素発生、酸化傷害を誘発することが示されたことから、クミンアルデヒドの植物生育抑制作用には活性酸素が関与している可能性が考えられた。しかし、作用機構の詳細については次年度も引き続き検討を行う予定である。昨年度までの結果から、クミン種子から発生するクミンアルデヒドに高い植物生育抑制活性が認められたこと、また、タマネギ根部への処理で、死細胞数の増加、活性酸素の発生、脂質過酸化の増大が認められたこと等が明らかとなったが、死細胞数の増大が認められた低濃度域においては、必ずしも活性酸素(ROS)の発生増大は検出されなかった。そこで、本年度は、より検出感度の高い共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いて、クミンアルデヒド処理によりROSの発生が増大する濃度域の再検討を実施した。その結果、クミンアルデヒド処理後のタマネギ根部において、死細胞数が増大し始める低濃度域から、ROSが増大していることが明らかとなった。また同じ濃度域から細胞分裂指数の低下していることも明らかとなった。さらに、ROS発生が認められた濃度以上になるとプログラム細胞死も増大していた。これらの結果から、クミンアルデヒドのタマネギ根部での植物生育抑制作用にはROSが関与しており、ROSによって細胞分裂の停止やプログラム細胞死等も引き起こされている可能性が示唆された。また、これまで報告者らは、ウスバサイシンから発生するオイカルボンも高い植物生育抑制活性があることを報告してきたが、さらに、オイカルボン処理後に変動するイネタンパク質の解析(プロテオーム解析)も実施した。その結果、主にフラボノイド合成に関わるタンパク質が減少し、ストレス応答性タンパク質の増大がみられた。また、発現が増大したタンパク質の中に、ROS発生に関与するシュウ酸酸化酵素(OxO)やリグニン合成に関与するシンナミルアルコール脱水素酵素が見出された。また、実際にオイカルボン処理後にOxO活性が増大することが酵素レベルでも確認された。これらの結果から、OxO活性の増大がオイカルボン処理によるROS発生増大の一要因になっている可能性が示唆された。最終年度では、植物成長抑制活性の高い二次代謝産物であるヒノキチオールとオクチルアセテートの植物成育抑制機構の解析を実施した。まず、ヒノキチオールでは、イネ幼植物体を用いたプロテオーム解析を実施した。ヒノキチオールを処理するとタンパク質合成や解毒代謝に関わるタンパク質が減少し、特に活性酸素の解毒酵素であるペルオキシダーゼ(POX)やスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の減少が認められた。また、イネ根部でのヒノキチオールによる成育抑制作用は、H2O2の増加により細胞膜の脂質過酸化やDNA傷害によるプログラム細胞死(PCD)が引き起こされることによると推測された。さらに酵素活性試験からH2O2の増加の要因として抗酸化酵素活性の減少によるそれらの消去能の低下が示唆された。また、オクチルアセテートによる植物成育抑制機構の解析では、イネ根部とタバコ培養細胞を用いた検討を行った。その結果、オクチルアセテートは、O2-の過剰生成を誘発し、PCDと細胞分裂停止および膜脂質の過酸化が起こっていたことから、植物の成育抑制はO2-の過剰発生に起因している可能性が示唆された。本研究課題の3年間の研究を通し、様々な植物種から高い植物成育抑制活性を有する揮発性物質を同定し、それらとその類縁化合物の植物成育抑制機構を推定した。

この中で、オイカルボン、クミンアルデヒド、オクチルアセテート、ヒノキチオールの4つの化合物は、いずれも活性酸素の過剰生成を誘発するという共通点が見出された。これらの化合物は、いずれも化学構造中に電子吸引性の高いカルボニル基を有しており、この化学構造が植物体内での活性酸素の過剰発生の要因になっている可能性も示唆された。このような化学構造と植物体内での作用性における知見は、今後の新規薬剤開発に向けての有用な情報となりうるものと考えられる。次世代の除草剤の開発に繋がる知見を得ることを目的として、薬用植物や熱帯、亜熱帯性の植物種から高い植物成育抑制活性を有する新規の生理活性物質の探索を行った。その結果、植物に対して非常に高い成育抑制活性を有する化合物類を見出した。それらやその類縁化合物について植物体内での作用機構の検討を行った。オイカルボン、ヒノキチオール、クミンアルデヒド、オクチルアセテートの4つの化合物については、植物体内で活性酸素の過剰生成を誘発し、酸化障害を引き起こすことが植物の生育抑制に繋がっているものと推察された。しかしながら、活性酸素の過剰生成のメカニズムは、それぞれの化合物で異なることが示唆された。平成26年度に計画していた研究は、ほぼ順調に実施することができ、成果が得られているため。農学さらに有用な天然の除草剤候補化合物を見出すため、揮発性物質に絞らずに幅広く化合物の探索と作用性の検討を実施したいと考えている。平成25年度に計画していた研究は、ほぼ順調に実施することができたため。さらに有用な候補化合物も多く見出すために、二次代謝産物の多い熱帯性の植物種も幅広く用いて、それらから放出される揮発性物質の探索も実施する予定である。
神経伝達物質に応答して蛍光を発する新規細胞型センサー

本研究では,生細胞の形質膜中に存在する受容体蛋白質を用い,同受容体の神経伝達物質の結合に伴う構造変化を検出する方法を開発すると共に,それを利用した新規細胞型センサーの開発を行った.1.受容体蛋白質として神経伝達物質のアドレナリンに対する受容体(β_2AR)を用いた.C末ループの71残基を欠損させたβ_2ARのC末端にCFP,そして第三細胞内ループ内に重ヒ素化蛍光色素FlAsHが結合するCCPGCC配列を導入した遺伝子を作成した(β_2AR229C:FP,β_2AR238CFP,β_2AR250CFP).各遺伝子をHEK293細胞に発現させた後,FlAsHで標識したところ,β_2AR250CFPにおいてCFP-FlAsH間のFRET効率が最大の値を示した.さらに,β_2AR250CFPでは,アドレナリンを添加するとFRET効率が減少し,続いて,阻害剤のICI 118,551を添加するとFRET効率の減少がおさまり,神経伝達物質に応答性を示すことが分かった.以上より,細胞型センサーの開発に成功した(投稿中).2.基板上の任意の位置に細胞を配置する技術の開発を行った.この目的のために,光分解性保護基を有する単分子膜で修飾したガラス基板を用いた.この基板に細胞接着を抑制するウシ血清アルブミンをコートした後に,光照射すると,アルブミンが表面より解離することを見出した.続いて,細胞接着を促進するフィブロネクチンを添加すると,フィブロネクチンが光照射領域に選択的に吸着し,細胞接着面が形成されること分かった.この方法を用い,一細胞を基板上の任意の位置に配置することに成功した(JACS).1,2に基づき,様々な神経伝達物質に対する細胞型センサーを集積化することで,極微少量の神経伝達物質をリアルタイムで網羅解析することが可能になると期待される.本研究課題で開発を目差している神経伝達物質に対するセンサーは,細胞膜上に存在する受容体蛋白質を環境感受性重ヒ素化蛍光色素で標識することによって作製する.このセンサーは,(I)神経伝達物質の受容体蛋白質への結合(II)受容体蛋白質の構造変化(III)構造変化に伴う蛍光色素の環境変化(IV)環境変化に応じた色素の蛍光強度/波長変化,という情報変換プロセスを介する検出原理に基づく.このプロセスにおいて,(II)(IV)がセンサーの検出感度に大きく影響するステップであり検討対象となる.まず,上述のプロセス(III)に対する検討を行った.神経伝達物質のアドレナリンに対する受容体のC末に重ヒ素化蛍光色素が結合するサイトである4Cys motifとGFPを連結したリコンビナント蛋白質を作成した.環境感受性重ヒ素化色素BArNileは細胞内でこの蛋白質を標識したが,アドレナリンの結合による蛍光変化は観察できなかった.引き続き4Cys motifの導入箇所の検討を行っている.続いて,上述のプロセス(IV)を改善すべく,環境感受性を向上した重ヒ素化蛍光色素の開発を目指した.フルオレセインの蛍光量子効率が安息香酸部位の電子状態変化に大きく依存することに着目し,フルオレセイン重ヒ素化物の安息香酸部位に別の蛍光色素を連結した(mansyl FlAsH)を合成した.この分子の環境感受性を評価すべくカルモデュリンの構造変化の検出に用いたところ,今までの重ヒ素化蛍光色素より高感度の構造変化を検出できることが分かった.分子軌道計算から,光電子移動(PET)に基づく蛍光スイッチングを行っており,同分子がタンパク質一般の構造変化を高感度に検出できることが示唆された(Anal. Sci. 20 : 273-278(2004)).現在,この分子を細胞内で利用するための条件検討を行っている.本研究では,生細胞の形質膜中に存在する受容体蛋白質を用い,同受容体の神経伝達物質の結合に伴う構造変化を検出する方法を開発すると共に,それを利用した新規細胞型センサーの開発を行った.1.受容体蛋白質として神経伝達物質のアドレナリンに対する受容体(β_2AR)を用いた.C末ループの71残基を欠損させたβ_2ARのC末端にCFP,そして第三細胞内ループ内に重ヒ素化蛍光色素FlAsHが結合するCCPGCC配列を導入した遺伝子を作成した(β_2AR229C:FP,β_2AR238CFP,β_2AR250CFP).各遺伝子をHEK293細胞に発現させた後,FlAsHで標識したところ,β_2AR250CFPにおいてCFP-FlAsH間のFRET効率が最大の値を示した.さらに,β_2AR250CFPでは,アドレナリンを添加するとFRET効率が減少し,続いて,阻害剤のICI 118,551を添加するとFRET効率の減少がおさまり,神経伝達物質に応答性を示すことが分かった.以上より,細胞型センサーの開発に成功した(投稿中).2.基板上の任意の位置に細胞を配置する技術の開発を行った.この目的のために,光分解性保護基を有する単分子膜で修飾したガラス基板を用いた.この基板に細胞接着を抑制するウシ血清アルブミンをコートした後に,光照射すると,アルブミンが表面より解離することを見出した.続いて,細胞接着を促進するフィブロネクチンを添加すると,フィブロネクチンが光照射領域に選択的に吸着し,細胞接着面が形成されること分かった.

この方法を用い,一細胞を基板上の任意の位置に配置することに成功した(JACS).1,2に基づき,様々な神経伝達物質に対する細胞型センサーを集積化することで,極微少量の神経伝達物質をリアルタイムで網羅解析することが可能になると期待される.
耐故障性を考慮した適応ルーティングネットワークに関する研究

本研究の主な成果は以下の通りである。1.Detour-UDと呼ぶ耐故障・適応ルーティングアルゴリズムを提案した。Detour-UDは、k-aryn-cubeネットワークの定型性を活用して適応ルーティングによる高性能通信を実現するとともに、故障によってネットワークの定型性が失われても対応可能なデッドロック回復ルーティングをサポートすることに特徴を有する。2.低オーバヘッドな動的ネットワーク再構成プロトコルを提案した。提案プロトコルは、ネットワーク中に故障が発生してもユーザメッセージのネットワークへの注入を停止する必要がない。故障によって配送不能となるメッセージは、ルーティング関数違反となる出力チャネルを要求するメッセージを識別して排出する。3.ネットワークが自律的に通信負荷やその偏りを検出するとともに、故障の有無などの状況に応じて通信パケットの注入抑制や非最短経路を用いた輻輳回避を実現する自動チューニング機構を提案した。4.設計したルーティングアルゴリズムと動的ネットワーク再構成プロトコルをサポートするネットワークシミュレータをC++言語を用いて作成した。また、ネットワークの通信性能自動チューニング機構を評価できるようにシミュレータを改良した。5.作成したシミュレータを用いて、Detour-UDとその動的ネットワーク再構成プロトコルの有効性を確認した。Detour-UDは、無故障状態及び通信リンクやノードに故障が生じた場合の双方で高性能通信を維持する。また、提案した動的ネットワーク再構成プロトコルは、ネットワーク再構成処理中、再構成後ともに高スループット、低レイテンシの通信性能を示す。さらに、ネットワークの自動チューニング機構はネットワーク飽和を防止するとともに、動的故障や通信パターンと負荷に応じて良好な通信性能を維持することに有効であることを示した。本研究では、新しい適応ルーティング・アルゴリズムとしてDetour-UDを提案し、それを実現するルータチップの設計と評価を行った。Detour-UDは、k-ary n-cubeネットワーク用の定型ルーティングアルゴリズムとup^*/down^*ルーティングに基づく非定型ネットワーク用のアルゴリズムをサポートすることにより、通信性能を犠牲にすることなく任意数/任意形状の故障に対してデッドロックフリーなメッセージ通信を実現する。・HDLによるルータの記述と動作検証Detour-UD適応ルータをハードウェア記述言語Verilog-HDLにより設計した。また、LSI設計ツールを利用してシミュレーションによる動作検証と論理合成によるハードウェアコストの評価を行った。・通信性能の評価Verilog-HDLのシミュレータを利用し、10×10(100ノード)の2次元トーラスネットワークに対する無故障及び有故障のそれぞれの場合についてバンド幅と通信遅延(レイテンシ)時間を評価した。その結果Detour-UDは、よく知られた最短経路ベースの完全適応ルータ並の通信性能と従来の耐故障ルータよりも高い耐故障能力を有することを確認した。また、必要なハードウェア量と回路の動作速度はトレードオフの関係にあるが、Detour-UDの仮想チャネル数に対する必要要件は物理チャネル当たり2本と小さく、ルーティング自由度を上げやすいという利点を持つ。本研究では、17年度に並列分散処理計算機用k-ary n-cubeネットワークの動的故障に対応する適応ルーティングアルゴリズムDetour-UDの設計とシミュレーションによる評価を行った。1.動的ネットワーク再構成アルゴリズムの設計並列分散処理計算機ネットワークを構成する一部のハードウェア構成要素(ノードや通信チャネル)が動的に故障した場合、システムがそれを検知してネットワークから故障部位を隔離し、正常なネットワーク領域のみで計算を継続できるようにする。従来Autonetなどで実現されている静的な方式は、一度ネットワーク上のすべてのメッセージを破棄するため、大規模なネットワークではあまり効率的ではない。そこで、故障によってデッドロックを引き起こすような必要最小限のメッセージのみ破棄/再送をサポートし、それ以外のメッセージは破棄することなく通信処理を継続できるネットワーク再構成アルゴリズムを設計した。2.シミュレータの作成設計したネットワーク再構成アルゴリズムの動作確認と性能評価を目的としたシミュレータをC++言語を用いて作成した。3.プロトコルの評価作成したシミュレータを用いて、選択的メッセージ破棄/再送の動的ネットワーク再構成プロトコルの有効性を確認した。

実験により、提案方式はネットワーク再構成処理中、再構成後ともに高スループット、低レイテンシの通信性能を示すことがわかった。17年度は、我々が提案したk-ary n-cubeネットワーク用の耐故障・適応ルーティングアルゴリズムDetour-UDを用いて動的ネットワーク再構成プロトコルを提案し、シミュレーションによってその有効性を評価した。また、故障状態など実行時の情報を利用して、ネットワーク自体が通信性能をチューニングする機能を提案した。1.動的ネットワーク再構成プロトコルの提案並列分散処理計算機ネットワークを構成する一部のハードウェア構成要素(ノードや通信チャネル)が動的に故障した場合、システムがそれを検知してネットワークから故障部位を隔離し、正常なネットワーク領域のみで計算を継続できるようにする。このとき、故障によってデッドロックを引き起こすような必要最小限のメッセージのみネットワークから排出し、それ以外のメッセージは通信処理を継続できるようにする。排出すべきメッセージは、ヘッダの存在するノードの入出力チャネル間の関係が、用いるデッドロック回復ルーティングアルゴリズム制約に違反するものに限定する。2.シミュレータの作成・改良設計した動的ネットワーク再構成プロトコルと、比較用に従来の静的ネットワーク再構成(故障検出と共にメッセージ通信を停止する方式)をサポートしたネットワークシミュレータをC++言語を用いて作成した。また、ネットワークの通信性能自動チューニング機構を評価できるようにシミュレータを改良した。3.実験による評価作成したシミュレータを用いて、提案する動的ネットワーク再構成プロトコルの有効性を確認した。また、ネットワークの自動チューニング機構はネットワーク飽和を防止するとともに、動的故障や通信パターンと負荷に応じて良好な通信性能を維持することに有効であることを示した。
Experiences at the Edge of Science and Religion: a Comparative Research on Exorcism in Contemporary Japan, Italy and Austria

現代イタリア、オーストリアと日本における憑依と除霊についての資料研究・フィールドワークを実施した。イタリアでの調査は8月、9月上旬と3月、日本での調査は2月、8月と9月に実施した。イタリアでの調査はローマカトリックの悪魔祓いに注目し、エクソシストへのインタービューと中部イタリアにある教会で悪魔祓いでの参与観察を行った。主に悪魔に憑りつかれている一人の女性に対する悪魔祓いに年に34回参加した。現在、彼女との共著が執筆中だ。日本での調査は特に徳島県三好市にある賢見神社に着目した。ご祈祷を受けた150人位に対してインタービューを行った。研究成果は国際的に発表され、現在注目を集めつつある。文化人類学
糖尿病および肥満治療に有用な創薬シーズの探索研究

肥満症および糖尿病は、患者のQOLを大きく損なうだけでなく、脳梗塞・網膜症・腎症などといった重大疾患の要因となるリスクの高い疾患である。また、肥満症や糖尿病とそれらが誘発する慢性疾患は、医療費の増加の大きな要因にもなっていることから、身体的・経済的両面からその予防・治療が重要な課題となっている。そこで本研究では、肥満症および糖尿病の予防・治療に有効な新たな医薬シーズと創薬標的分子の開発を目的とする。そのために天然物エキスから抗肥満・抗糖尿病活性を見出し、その活性物質の単離・構造解析・作用メカニズム解析までを行う。特に本研究では、線虫やカイコといった高等生物を疾患モデルとして用いることで、人に対して効果を示す可能性の高い医薬シーズの探索を目指す。C. elegansを用いた脂肪蓄積抑制物質の評価法は、まず、C. elegansの成虫を水酸化ナトリウムと次亜塩素酸に浸けることにより、その受精卵を取り出す。続いて、孵化した幼虫を飢餓状態におくことで生長速度を同調させ、NGM寒天上で大腸菌(OP50)を用いて培養することで生育段階を揃えた成虫を得た。Glucose添加によって、脂肪蓄積することがこれまでに明らかとなっており、成長阻害の見られなかった5mM Glucoseを含む寒天培地上にサンプル、餌の大腸菌と共に成虫を添加し48時間後に蓄積脂肪量を蛍光顕微鏡を用いて定量した。これまでに本手法を用いて約70種の生薬サンプルを試験し、3種の生薬(No.16,67,72)に活性が認められた。中でも、No.16はコントロール群の脂肪蓄積量の1/5程度にまで減少していることが明らかとなった。線虫を用いた脂肪蓄積抑制物質の探索については、特に問題であった脂肪蓄積量の定量も解決したことにより、活性試験方法も確立でき、これまでに活性の認められた3種の生薬について、生物活性物質の探索を進めていく予定である。別の生物モデルであるカイコを用いた生物活性物質の探索については再現性が乏しく、現在種々検討中である。しかしながら、線虫を用いた抗肥満活性物質の探索については、今後は申請者の主たるテーマである成分探索を行うため、おおむね順調に進展しているといえる。平成30年度に当研究室保有の天然資源ライブラリーからスクリーニングを行い、これまでに脂肪蓄積抑制活性の認められた生薬3種について、令和元年度はNo.16から各種クロマトグラフィーを用いて活性成分の探索を行い、質量分析や核磁気共鳴装置などを用いた各種物理化学データの解析をもとに、その化学構造を決定する予定である。またカイコについては、糖尿病モデルに最適なカイコを今後の検討の中から見出していく。また生物活性物質の同定ができれば、作用メカニズム解析にも着手する予定である。単離・構造解析される活性物質の中には、その作用メカニズムが未解明のものが含まれると予想される、そのような活性物質の作用メカニズムを解析することは、その活性物質をそのまま利用していく上で重要なだけでなく、新たな創薬標的分子の発見という、創薬の観点から極めて重要な知見が得られる可能性を秘めている。作用メカニズムの解析は、単離された化合物やその類縁化合物に関する過去の報告や、in vivo試験の結果をもとに予想をたて、RT-PCRやWestern Blottingなどを通して検証していく予定である。特に本研究では、線虫やカイコといった高等生物を疾患モデルとして用いることで、人に対して効果を示す可能性の高い医薬シーズの探索を目的としている。平成29年度では当研究室に保有する800種近くの植物サンプルについて、抗糖化抑制活性を試験し、80%阻害率(終濃度:100ug/ml)を示すエキス19種の同定を行い、そのうち100ug/mlにおいて89%阻害を示したクロタキカズラ(Hosiea japonica Makino)の蔓の成分探索に着手した。クロタキカズラは名は最初の発見地高知県の黒滝山に由来する。近畿地方以西の本州、四国、九州の山地の林内に生える日本原産の植物である。これまでに各種カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、3種のフェニルプロパノイド化合物、1種のアルカロイド、1種のジテルペンなどを単離し、物理化学データより構造決定を済ませ、またそれらについて抗糖化抑制活性試験を行ったところ、フェニルプロパノイド類に活性が確認できた。カイコを用いた活性試験を行う前段階として、抗糖化抑制活性について800種近いスクリーニング試験から、阻害率の高い植物を19種に絞り、その中でもこれまで薬理作用や含有化合物が未詳であったクロタキカズラについての成分探索を行い、活性化合物を単離・構造決定できたため、おおむね順調に進んでいるといえる。これらの成果を学術論文としてまとめ、国際的な学術誌に投稿中である。

また、肥満症や糖尿病とそれらが誘発する慢性疾患は、医療費の増加の大きな要因にもなっていることから、身体的・経済的両面からその予防・治療が重要な課題となっている。そこで本研究では、肥満症および糖尿病の予防・治療に有効な新たな医薬シーズと創薬標的分子の開発を目的とする。そのために天然物エキスから抗肥満・抗糖尿病活性を見出し、その活性物質の単離・構造解析・作用メカニズム解析までを行う。特に本研究では、線虫やカイコといった高等生物を疾患モデルとして用いることで、人に対して効果を示す可能性の高い医薬シーズの探索を目指す。C. elegansを用いた脂肪蓄積抑制物質の評価法は、まず、C. elegansの成虫を水酸化ナトリウムと次亜塩素酸に浸けることにより、その受精卵を取り出す。続いて、孵化した幼虫を飢餓状態におくことで生長速度を同調させ、NGM寒天上で大腸菌(OP50)を用いて培養することで生育段階を揃えた成虫を得た。Glucose添加によって、脂肪蓄積することがこれまでに明らかとなっており、成長阻害の見られなかった5mM Glucoseを含む寒天培地上にサンプル、餌の大腸菌と共に成虫を添加し48時間後に蓄積脂肪量を蛍光顕微鏡を用いて定量した。これまでに本手法を用いて約70種の生薬サンプルを試験し、3種の生薬(No.16,67,72)に活性が認められた。中でも、No.16はコントロール群の脂肪蓄積量の1/5程度にまで減少していることが明らかとなった。線虫を用いた脂肪蓄積抑制物質の探索については、特に問題であった脂肪蓄積量の定量も解決したことにより、活性試験方法も確立でき、これまでに活性の認められた3種の生薬について、生物活性物質の探索を進めていく予定である。別の生物モデルであるカイコを用いた生物活性物質の探索については再現性が乏しく、現在種々検討中である。しかしながら、線虫を用いた抗肥満活性物質の探索については、今後は申請者の主たるテーマである成分探索を行うため、おおむね順調に進展しているといえる。線虫やカイコといった高等生物を疾患モデルとして用いることで、人に対して効果を示す可能性の高い医薬シーズの探索を目標としていることから、今後はカイコを用いて活性試験を行い、実際に人に対して効果があるかどうかを検討していく予定である。また、抗糖化抑制活性だけでなく、αグルコシダーゼ活性も検討し、活性サンプルからの抗糖尿病に効果のある医薬リード化合物を探索するとともに、抗肥満活性については3T3-L1細胞を用いた試験を行い、活性の認められた化合物についてはC.elegansを使って脂肪蓄積抑制活性試験を検討する。平成30年度に当研究室保有の天然資源ライブラリーからスクリーニングを行い、これまでに脂肪蓄積抑制活性の認められた生薬3種について、令和元年度はNo.16から各種クロマトグラフィーを用いて活性成分の探索を行い、質量分析や核磁気共鳴装置などを用いた各種物理化学データの解析をもとに、その化学構造を決定する予定である。またカイコについては、糖尿病モデルに最適なカイコを今後の検討の中から見出していく。また生物活性物質の同定ができれば、作用メカニズム解析にも着手する予定である。