hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
広塩性オオメジロザメを用いた軟骨魚類における塩類細胞の機能とその制御機構の研究

軟骨魚類の塩類細胞が浸透圧調節機構に果たす役割は未だ明らかになっていない。本研究では、広塩性のオオメジロザメを実験魚とし、鰓のイオン調節機能を検証した。その結果、CLC2が軟骨魚の鰓においてCl-の取込に寄与することが示唆された。また、ECaC, PMCAが鰓塩類細胞にてCa2+調節に関わることが示された。また、近年、軟骨魚で初めて同定されたプロラクチンの機能を解明することを目的とし、プロラクチンと受容体の組織別発現解析を行った。その結果、どちらも下垂体で発現が高いことが示された。現生魚類の大部分を占める硬骨魚に比べ、魚類を構成するもうひとつの大きなグループであり、海洋生態系の高次捕食者でもある軟骨魚類については、尿素を利用するユニークな浸透圧調節を行うことが知られているが、そのイオン調節機構はほとんどわかっていない。そこで、本研究では広塩性軟骨魚であるオオメジロザメを淡水・海水に馴致し、鰓の塩類細胞に発現するイオン輸送体の動態を調べることで、軟骨魚の浸透圧調節における鰓の役割を明らかにすることを目的とした。まず、淡水・海水に馴致したオオメジロザメの鰓を用いて、RNA-seqによる発現遺伝子の網羅的な解析により、鰓で高い発現を示したイオン輸送体を塩類細胞のイオン輸送に関わる遺伝子の候補とした。これらの遺伝子について部分配列を同定した後、in situ hybridizationを行った結果、Cl-チャネル2(CLC2)とPlasma membrane Ca2+-ATPase (PMCA)が塩類細胞に特異的に発現する様子が観察された。本年度は発現細胞が多く存在するCLC2に着目した。組織別発現解析の結果からCLC2は鰓弁と鰓隔膜に強い発現が見られたが、淡水適応個体と海水適応個体の鰓での発現量に差は見られなかった。次に、隣接切片を用いてin situ hybridizationを行ったところ、CLC2はV-ATPaseを発現するB型塩類細胞に特異的に発現していた。また、免疫組織化学的染色の結果から、CLC2はB型塩類細胞の側底膜に局在している様子が観察された。B型細胞はNa+,Cl-を取り込むNCCが発現するという過去の知見とあわせて考えると、CLC2が軟骨魚類の塩類細胞においてCl-の取込みを担っていることが示唆された。本年度は研究の目的として掲げた「軟骨魚類における塩類細胞のイオン輸送機構」について研究を進め、塩類細胞に発現しているイオン輸送体を同定した。その成果については、水産学春季大会にて発表を行うことができた。以上の理由から申請者は自己評価に(2)を選択した。そこで、本研究では広塩性軟骨魚であるオオメジロザメを淡水・海水に馴致し、塩類細胞に発現するイオン輸送体の動態を調べることで、軟骨魚の浸透圧調節における鰓の役割を明らかにすることを目的とした。本年度は、前年度に行った淡水・海水に馴致したオオメジロザメの鰓のRNA-seqから得られた発現遺伝子の解析データより、鰓でCa2+の輸送に関わると考えられたepithelial Ca2+ channel (ECaC)とplasma membrane Ca2+ ATPase (PMCA)に着目した。まず、これらの遺伝子について、RNA-seqで得られた配列情報をもとにcDNAクローニングを行い、部分配列を決定した。次に、淡水・海水に馴致したオオメジロザメの12組織サンプル(視床下部、脳下垂体、鰓、心房、心室、肝臓、筋肉、胃、螺旋腸、直腸、直腸腺、腎臓)を用い、real-time PCR法により発現量を比較した。その結果、ECaCの鰓での発現量は海水に比べ淡水で有意に高い値を示した。ここから、鰓に発現するECaCがオオメジロザメの淡水適応に重要であることが示唆された。最後にin situ hybridizationを行い、ECaC、PMCAのmRNAを発現する細胞が塩類細胞の分布に似ていることが示された。以上から、ECaC、PMCAは硬骨魚と同様に塩類細胞に発現し、特にECaCはオオメジロザメが淡水に適応する際に体液中のCa2+の調節に寄与することが示唆された。次年度も引き続き、RNA-seqの結果から選ばれたオオメジロザメの塩類細胞でイオン輸送を担う遺伝子の候補について解析を進める。Na+、Cl-、Ca2+を輸送するイオン輸送体に着目した結果、候補となる遺伝子は現在14個あげられており、これらの遺伝子の発現細胞、環境水による発現量の変化を検証することで、軟骨魚類の鰓におけるイオン輸送機構全貌の解明を目指す。

また、近年、軟骨魚類にも存在することが発見されたプロラクチンについても解析を進め、軟骨魚類の浸透圧調節機構への役割の解明を目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。魚類生理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
抗腫瘍免疫の評価系としての白血病モデルの確立とその成果に基づくヒト免疫療法の強化

「急性骨髄性白血病の化学療法後寛解例に対するWT1ペプチド免疫療法の第II相臨床試験」の20例において免疫動態解析を行った。WT1ワクチン前のWT1特異的CTL頻度がGood responderで有意に高くclonalityを有することを発見し論文報告した。さらにMLL/AF9遺伝子をB6マウス造血幹細胞に導入し、新たなマウス白血病モデルを確立した。微小腫瘍量およびWT1特異的CTL反応を経時的に測定可能となり、WT1ワクチン療法に対するヘルパーペプチドの併用効果を示した。一方でヘルパーペプチド併用下ではCTLは3か月内ではexhaustせずcheckpoint阻害剤との併用効果は認めなかった。本研究は、1)ヒト臨床試験の推進およびその患者検体の免疫学的解析、2)WT1ワクチン療法評価用のマウス白血病モデルの作成および新たな免疫療法増強法の探索の2つの骨子からなる。前者に関しては、「急性骨髄性白血病の化学療法後寛解例に対するWT1ペプチド免疫療法の第II相臨床試験」において24例の症例集積にいたり、現在21症例に関する中間解析結果を論文執筆中である。また、その中間解析における好成績を元に、より治療早期から介入する「寛解導入療法により血液学的寛解となった急性骨髄性白血病に対するWT1ペプチド免疫療法のPhase1試験」を新たにに申請し症例集積を開始した。また、患者検体のWT1特異的細胞障害性T細胞の評価により、効果予測因子や治療機序が明らかとなった。これによりWT1ペプチド免疫療法が今後白血病治療のどのような局面で使用されるべきかが示された。後者に関してはin vitroにて培養可能な1クローン由来の白血病細胞の作成に成功し、マウスWT1蛋白を強制発現させることにも成功した。2×10(6)数の白血病細胞の移植により4週後には発症させることが可能であった。また、健常マウスへのWT1ワクチン療法を実施した際のマウス末梢血中のWT1特異的細胞障害性T細胞数をFACSにて経時的に検出する手法を確立した。一方、ワクチン接種部位である皮膚の樹状細胞やT細胞も取り出す手法を確立し、FACSにてその表面形質の解析を開始した。今後、白血病マウスモデルにおけるWT1ワクチン療法を実施し免疫動態の解析を行うことができ、ヒト臨床試験でのWT1ワクチン療法の強化方法につながる新たなターゲット探索を行う準備が整った。マウスモデルの作成、新規ヒト臨床試験の承認と順調に進展しておりおおむね順調に進展していると考える。本研究では、WT1ペプチドを用いた免疫療法に関し、ヒト臨床試験での検体解析に基づく知見を得るとともに、マウス白血病モデルを作成し、その免疫学的メカニズムの解析や免疫療法の効果増強の手法の確立を目指している。まず、急性骨髄性白血病の化学療法後寛解例に対するWT1ワクチンによる維持療法のプロトコルにおいて、患者の検体の解析を行い、WT1特異的CTLに関してシークエンスレベルでのクロナリティを検出した。本内容に関しては現在論文投稿中である。また、新たに寛解導入療法後よりWT1ワクチン介入を行う新たなプロトコルを作成し症例集積を開始している。次にヒト白血病遺伝子であるMLL/AF9遺伝子をマウス造血幹細胞移植に導入することによりマウス白血病細胞の作成に成功した。このマウス白血病細胞を血中より移植することにより、マウスに白血病を発症させることができた。現在、未治療群、WT1ワクチン治療群、抗PD1抗体治療群、WT1ワクチンと抗PD1抗体の併用群での治療効果を比較している。また、WT1ワクチン投与に伴うWT1接種部位皮膚、所属リンパ節、血中のそれぞれの免疫動態の解析を行っている。ワクチン投与後4-6週目に血中へのWT1特異的CTLの誘導が最も多く、その後WT1ワクチン接種を継続しても減弱していくことが明らかとなった。この傾向はヒト臨床試験検体でも同様であった。そこで、WT1ワクチン投与を継続しても4-6週目をピークに減弱していくメカニズムの解析を目指している。まずは、WT1特異的CTLのワクチン投与前、ピーク時、減弱時の質的差異を次世代シークエンサーを用いたRNAシークエンスで比較予定である。ヒト臨床試験は法案の改正に伴いモニタリングや監査の導入など手続きを要し症例集積までの時間を要したため予定よりやや遅れているが、現在1例目が無事終了し、今後の予定通りの症例集積が見込まれる。マウス実験においても、血中投与により白血病を発症させ得、かつWT1ワクチン投与にてその発症を遅らせうるマウスモデルが完成した。現在はPD1抗体との併用の評価を行っている。申請者らは「急性骨髄性白血病の化学療法後寛解例に対するWT1ペプチド免疫療法の第II相臨床試験(UMIN:000015870)」の患者検体の解析を行い、論文報告を行った(Br J Haematology, in press)。本解析によりWT1ワクチン療法前のWT1特異的CTL頻度が臨床効果と相関することを見い出した。この結果は化学療法中に誘導された抗白血病免疫をWT1ワクチン療法が増強・維持することで相乗効果的に臨床効果を導いた可能性を示唆した。また、1患者においてWT1特異的CTLを1細胞ごとにsortingし、そのTCRのCDR3regionをシークエンスレベルで解析しオリゴクロナリティの経時的変化を示した。本データは単一癌抗原由来のシークエンスレベルでのCDR3 regionのデータとして世界で初の報告である。ついで、本研究の主目的であった腫瘍免疫の評価系としてのマウス白血病モデルの作成を行った。

MLL/AF9白血病遺伝子をマウス造血幹細胞に導入しマウス白血病細胞を作成した。この白血病細胞は血液内投与にて骨髄に生着し、CD45.1/CD45.2コンジェニックマウスを用いることにより、採血にて経時的に白血病細胞数を定量することが可能となった。我々はWT1ワクチンの効果を高めうる手法としてWT1-35ヘルパーペプチド配列を同定したため、本モデルマウスを用いてその機能評価を行った。WT1-35ヘルパーペプチドはHLA classII依存性にCD4を誘導し、WT1-CTLペプチドにより誘導されるWT1特異的CTL反応を増強・維持すること分かった。また、白血病治療モデルにおいて併用ペプチド療法により生存曲線における有意な治療効果を認めた。以上の結果を2018年のキーストンシンポジウム(Cancer Immunotherapy:C5)で学会報告し、現在論文作成中である。「急性骨髄性白血病の化学療法後寛解例に対するWT1ペプチド免疫療法の第II相臨床試験」の20例において免疫動態解析を行った。WT1ワクチン前のWT1特異的CTL頻度がGood responderで有意に高くclonalityを有することを発見し論文報告した。さらにMLL/AF9遺伝子をB6マウス造血幹細胞に導入し、新たなマウス白血病モデルを確立した。微小腫瘍量およびWT1特異的CTL反応を経時的に測定可能となり、WT1ワクチン療法に対するヘルパーペプチドの併用効果を示した。一方でヘルパーペプチド併用下ではCTLは3か月内ではexhaustせずcheckpoint阻害剤との併用効果は認めなかった。「急性骨髄性白血病の化学療法後寛解例に対するWT1ペプチド免疫療法の第II相臨床試験」における中間解析の学会発表、論文発表を目指す。また、新規臨床試験「寛解導入療法により血液学的寛解となった急性骨髄性白血病に対するWT1ペプチド免疫療法のPhase1試験」における症例集積を始める。マウスモデルでは、癌ワクチンの定期接種時の抗原特異的細胞障害性T細胞数の推移に興味深い結果を得ており、その機序解明を目指す。また、白血病モデル下でのWT1ワクチン療法と抗PD1抗体や抗CTLA4抗体との併用療法のin vivoでの併用効果を吟味する。新たなヒト臨床試験プロトコルにおける症例集積、WT1特異的CTLの解析を行っていくとともに、確立したマウス白血病モデルを用い、WT1ペプチド免疫療法の効果増強手法の確立を目指していく予定である。癌免疫予定金額と1000円未満の差額のみに抑えれた。微小差額が出たため来年度に繰り越します。予定通りの支出で実験ができており継続していく。来年度の実験に使用する予定である。
戦後日本における「家」と家業経営の変容過程に関する歴史社会学的研究

戦後日本の家業経営について戦前からの連続性と変化を社会学的に検討することが課題であった。事例研究として瀬戸内海の塩田地主にとっての「家」と家業経営の変容過程を追ってきたが、戦後社会にあって、技術革新と地縁・血縁ネットワークのあり方が重要な鍵を握っていたことを浮き彫りにし、もう一方で進めてきたファミリービジネス研究との接点が整理された。家業経営は、多角化した大規模な事業体の場合必ずしも一地域に限定・固定されるものではないが、拠点を置く場所のネットワークは生き残りにとって重要な意味を持っていた。技術革新については機械化等により存続を可能にした企業もあれば、他方で、伝来の方法を守ることでそれをブランド化し、生き残っている事業もある。たとえば、醤油醸造業に着目した場合、機械化してグローバル化していく事業体と、各地で伝統的な醤油樽で醸造する製法にこだわる事業体がある。こうした複数の存続戦略を射程に含んだことで多様性と重層性が明らかになった。「家」と家業経営の戦前から戦後にかけての展開を、家族と経営の両側面から捉え直す、また国際比較研究への視座を持つ、さらに「家」と女性の問題という視点も含むことがテーマであり、それらを資料研究、事例研究(インタビュー)から明らかにすることが目的であった。初年度は、戦前からの変化を追うための作業として、明治から大正・昭和にかけての日本の近代化過程における家業経営の展開過程についての資料収集と研究枠組みの検討を主に行った。資料収集は、社史・企業史や地域史からのデータの収集を、特に初年度は塩業と醤油醸造業を中心に行った。塩田開発については、いくつかの事例研究はすでに存在するものの農業や商業と比較するとまだ少ない領域であること、これまでにも自身が児島湾の野崎家の研究をしてきた蓄積があったことが理由である。醤油醸造業については、すでにかなりの先行研究が存在するものの、近世が中心であり明治期以降から昭和への変容過程を追うことが本研究課題にとって重要であること、千葉の醸造業の展開でみると、親族関係と家業経営の関連を追うことが可能になると考えられることが背景にある。研究枠組みについては、「家」を戦前から戦後を通して捉えるための方法論の検討を行った。これまで「家」と一体のものとして捉えられてきた、経営体、動産、不動産、名前、墓の要素を分解して、それぞれの変化を追うことが必要であり、「家」にかかわる意識の有り様も、何と「家」が結びつくかによって多様である。企業体を「家業」経営として見るかどうかも、同じような企業体であっても異なっているし、また同じ企業に所属していても異なっている。そのような差異を捉えるには、「家」を個々人の意識に定位して、各自のライフヒストリーや社会的文脈にそくして捉えるという立脚点に立つことが確認された。今年度は特に,以下2点に関する資料収集を集中的に行った。まずは,瀬戸内海の塩田開発地主にとっての「家」と家業経営の関連についての資料収集である。これまで,財閥等の大規模な家業経営体を中心として,農家や商家を中心に研究をすすめてきたが,家業経営の展開過程には,個々の家々の固有性に加え地域や生業による特性がある。塩田に関していうと,生産技術の開発や専売制とのかかわりを無視できない。これらの特性が,「家」の展開過程にどのような影響を及ぼしたのかを明らかにするために,瀬戸内地域を対象地として選定した。もう一点は,family businessに関する内外の文献収集である。中小企業研究における事業継承や経営戦略において,家族への関心が集まっている。家族企業を閉鎖性や保守性からのみとらえるのではなく,そのあり方を考察しようとする研究が蓄積されてきている。戦前の家業経営に関する議論と,昨今のファミリービジネス研究を直に結びつけることは危険である。しかしながら,経営と家族の関連,歴史的変動と今日的特徴を考えるという本研究の主目的にとっては,両者の議論の異同を把握することは重要である。また,比較という観点からも押さえるべき論点が内包されている。詳細な議論は,今年度収集した文献のサーベイを進めるなかで精緻化していきたいと考えているが,現在みられる事業継承戦略と,家業の存続戦略として捉えられてきた戦前の特徴を照らし合わせることが重要になってくると考えている。瀬戸内地域の塩田開発に関する「家」と経営に関する資料を収集・整理し、精読をすすめた。塩田開発における家族と経営のあり方に加えて、地域社会、そして専売制との関連が経営の方向性を決定づけている。塩業の特性と地域性、時代性、そこに家族のあり方が関わっている。

戦後の資料も収集しているので、その考察を今年度さらにすすめる。また、家業経営の戦後的展開について、インタビューに基づく事例研究をおこない、現在、記録をまとめているところである。ファミリービジネスについては、資料収集とあわせてシンポジウム、コンファレンスに参加し、内外のファミリービジネスに関する研究動向や社会的関心について討議した。今日のファミリービジネスのあり方については、主に経営学や実務者が関心を多く寄せているが、家族研究者がこれまで家業経営に関して行ってきた経営哲学や家族関係に対して課題が多いことがわかった。今日の社会経済的状況にあって、スモールビジネスやファミリービジネスを再生の鍵として注目する動きがあり、歴史と社会状況から家族経営のあり方を再度捉え直す必要性が再認識されつつある。このことは、家族研究者が歴史的視点をふまえながら、この問題にアプローチしていく重要性を物語っている。最近の研究動向からは、さらに、地域の再生というアクチュアルなテーマにとって家族企業への期待が多いこともわかった。歴史社会学的視点から、地域や経営の問題と現在の家族関係の接点を見いだしていくことは、単に歴史を明らかにすることにとどまらず、きわめて現代的な、アクチュアルな問題関心と接合しているのである。この点は、今後とも研究を深めていきたい。事例研究として瀬戸内海の塩田地主にとっての「家」と家業経営の変容過程を追ってきたが、今年度は、その展開過程において技術革新と地縁・血縁ネットワークのあり方が重要な鍵を握っていたことを浮き彫りにし、もう一方で進めてきたファミリービジネス研究との接点が整理された。家業経営は、多角化した大規模な事業体の場合必ずしも一地域に限定・固定されるものではないが、拠点を置く場所のネットワークは生き残りにとって重要な意味を持っていた。技術革新については機械化等の技術革新により存続を可能にした企業もあれば、他方で、伝来の方法を守ることでそれをブランド化し、生き残っている事業もある。たとえば、醤油醸造業に着目した場合、キッコーマンのようにグローバル化していく事業体と、各地で伝統的な醤油樽で醸造する製法にこだわる事業体がある。こうした複数の存続戦略を射程に含んだことで存続の重層性が明らかになった。また、危機に面した経営体にとって地元のネットワークは、社会的・経済的・政治的に「家」を支えていた。この点、今日のファミリービジネス研究が、地域の再生に着目する点と共通している。多くの家業経営にとっては地域との関連が重要であると同時に、地域の再生に関する議論でも地元産業や観光振興を考える上で、存続してきたファミリービジネスを再評価しようという機運がある。しかし、戦前に特徴的だった家業経営のあり方がそのまま戦後に適応したわけではない。存続している事業体は必ず変化を伴っている。その連続性と変化については、今研究ではいくつかの事例において検証できた。今後事例研究を進めて、日本社会の変動との関連づけ、国際比較へと展開していくべき基盤作りができた点が成果である。
可逆性アプローチによる高レベル放射性廃棄物（HLW）管理政策と世代間公平性

高レベル放射性廃棄物の地層処分政策に対する社会的合意形成が困難な最大の要因は、現在世代と将来世代との間におけるリスク負担と政策選択権の配分をどのようにすることが公平なのかという、世代間公平性問題の解が一義的でないことである。本研究は、1990年代以降、国際社会において活発に議論されているHLW管理政策における可逆性アプローチについて、日本や欧米の研究動向を詳細に調査研究する。また、異なる立場の専門家(知の三角測量)と多世代の市民を包摂した熟議の「場」(HLW市民会議)を形成し、社会的受容性論から政策選択の要因分析を行い、可逆性アプローチによる2つの世代間公平性原理の統合の可能性を検討する。
複数被験者の眼球運動同時計測環境の開発と視線検知型英語学習プログラムへの応用

本研究では,言語刺激に対する読み時間や反応時間の計測などこれまで実験室内に限られていたデータ収集をクラウドソーシングで行う手法を取り入れ,検証に値する信頼性の高いデータを多くの被験者から効率的に収集し,そのデータについて一般化線形混合モデルなどの統計解析モデルを用いた分析を行うことで言語処理にどのような情報が利用され,どこまで詳細な統語構造予測及び意味解釈が行われているのかを明らかにした.母語話者日本人英語学習者が英語を理解する際の動詞の下位範疇化情報の影響と音声文理解におけるプロソディー情報の使い方について,読み時間や視覚刺激への注視タイミングといった行動指標から得られるデータの分析により,第一言語に比べて様々な変数が複雑に関与する第二言語・外国語の理解では,文理解プロセス適用される文処理モデルがどのように異なるかについて検証を行った.中でも統語的プライミングの手法を用いた動詞の下位範疇化情報の影響を調べた実験からは,動詞を見た時点で起きる予測とその予測とは異なる情報のインプットの差から統語構造への学習が起きるというerror-based learningの解釈が第二言語の文処理モデルにおいても適用されることを示した.さらに,情報の信頼性(reliability)が文構造予測プロセスにどう影響を与えるかという観点から,発話音声における情報のreliabilityを操作し,統語分析におけるプロソディー情報への依存度が情報のreliabilityによってどう変化するのかについての検証を行った.このプロジェクトの成果として,発話音声に特有の情報であるプロソディーに見られる様々なバリエーションを聞き手がいかに考慮し,有意味な情報を導き出しているのかについて母語話者と第二言語学習者の理解の両方で新しい知見が得られた.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。(1)海外研究協力者との共同研究により、ポータブル式の眼球運動測定装置を用いて得られたデータの信頼性を検証するために必要な実験室固定型の眼球運動計測装置を用いた実験を行った。具体的には、日本人英語学習者と英語母語話者における英語文処理処理を検証するため、(a-f)のような英語関係節文を読む際に、意味情報と語順がどのように文理解に影響するかを眼球運動計測実験により明らかにした。(2)国内研究協力者との共同研究において、ポータブル式眼球運動計測装置(Tobii Pro X2-30)を用いた実験を実施した。実験では、特有言語における話者の言語習慣が認知構造を形成する要因となりうるかについて検証するため、ビジュアルワールドパラダイム手法を用い、英語の語順が英語母語話者の周辺認知の記憶に与える影響について発話をしている際の画面上の視線の動きの計測を行った。上記研究実績の概要(1)に記述の実験により得られた研究成果については、2016年9月に国際会議で発表を行う予定であり、現在ジャーナルに投稿するための論文を執筆中である。また、研究実績の概要(2)に記述の実験についても、主要部後置型言語である日本語を母語とする被験者と対象に同じ実験を実施する準備を進めている。以上から、本研究課題はおおむね順調に進展していると言える。本年度の研究では、日本語を含む複数の異なる言語を母語とする英語学習者の言語情報の使い方が英語母語話者とどのように異なるかについての検証を行うため、日本語、中国語、スペイン語、ポルトガル語を母語とする英語学習者のグループを対象にプロソディー情報が統語構造分析に与える影響を調べる眼球運動計測実験を行なった。実験では、音声と同時にスクリーン上に提示される絵への注視パターンを分析する視覚世界パラダイムを用い、"Tap the frog with the flower."のようなPP attachment ambiguityによる構造的曖昧性を伴う文の解釈において、前置詞句内にの名詞に置かれた対比的プロソディー(e.g., Tapthe frog wiht the FLOWER)と視覚情報として与えられた文脈情報の交互作用を検証した。予測されるパターンとして、対比的プロソディーが学習者の統語分析に用いられるのであれば、文脈内に道具(flower)に対する対比となる物がある場合には,`flower'に置かれた強調は動詞を修飾する情報として解釈される(i.e., Tap thefrog by using the flower)のに対し文脈内に動作の対象となる名詞(frog)への対比がある場合には、`flower'に置かれた強調は名詞句を修飾する情報として解釈される(i.e., Tap the frog that has the flower)と考えられる。眼球運動パターンの分析として英語母語話者のデータについての分析が完了しており、英語母語話者の結果からは、前置詞句内にの名詞に置かれた対比的プロソディーは文脈内のコントラストを強調するキューとして用いられることが示される一方、コントラストを強調する対比的プロソディーは、コントラストを構成するエンティティーがinanimateの時よりもanimateの時の方がより強い影響を持つことが示された。当初は日本語母語話者と英語母語話者の比較のみを行う予定であったが、母語の影響を考慮する上で中国語、スペイン語、ポルトガル語を母語とする英語学習者のデータの比較が可能となったことから、当初の見込み以上の発展が期待できる。また、異なる機械を用いた眼球運動計測データの比較についても、ポータブル型眼球運動計測装置を用いた実験の準備が進んでいることから、おおむね順調に進展していると言える。本年度の研究では、昨年度に続き日本語を含む複数の異なる言語を母語とする英語学習者の言語情報の使い方について英語母語話者との違いを明らかにする検証を行った。さらに、異なる種類のプロソディー

情報が第二言語学習者の文処理に与える影響を明らかにするため、新しい実験として"Tap the frog with the flower."のようなPP attachment ambguityによる構造的曖昧性を伴う文の解釈におけるprosodic boundary(プロソディー境界)の影響を調べる実験を行った。実験では(1a, b)のような文を使用した(%はプロソディー境界の位置を示す)。英語母語話者と日本人英語学習者の眼球パターンからは、両方のグループにおいてプロソディー境界が文構造分析に使われることが示された。特に興味深い結果として、英語母語話者においてプロソディー情報は文構造プロセスにおいて予測的に使われるのに対し、日本人英語学習者においては予測的な使われ方が観測されなかった。さらに、フィラー文のプロソディー情報のreliabilityを操作した結果、プロソディーがunreliableなときにはターゲット文の処理においてもプロソディー情報を使う度合いが低くなることが明らかとなった。これまでの研究から文理解には言語使用者がそれまで積み重ねてきた統計情報が用いられることが明らかとなっているが、本実験により、長期的に積み重ねられた言語経験による統計的情報のみならず、限られた環境下における短期的かつspeaker-specificな統計的情報が即時に文構造処理に影響を与えることが示された。当初は日本語母語話者と英語母語話者の比較のみを行う予定であったが、中国語、スペイン語、ポルトガル語を母語とする英語学習者のデータの比較が可能となったことから母語の影響についてより詳細な検証が可能になった。さらに、プロソディーの影響について異なる複数のプロソディー情報を用いた実験を行っていることからも、第二言語理解における文処理プロセスを明らかにする研究としては順調に進展している。その一方で、ポータブル型眼球運動計測装置を用いた実験については、データ収集を行なった大学の倫理委員会の許可がおりずデータを公表できない状態にあるため、実験室固定型の眼球運動計測装置との比較が難しい状況にある。本研究では,言語刺激に対する読み時間や反応時間の計測などこれまで実験室内に限られていたデータ収集をクラウドソーシングで行う手法を取り入れ,検証に値する信頼性の高いデータを多くの被験者から効率的に収集し,そのデータについて一般化線形混合モデルなどの統計解析モデルを用いた分析を行うことで言語処理にどのような情報が利用され,どこまで詳細な統語構造予測及び意味解釈が行われているのかを明らかにした.母語話者日本人英語学習者が英語を理解する際の動詞の下位範疇化情報の影響と音声文理解におけるプロソディー情報の使い方について,読み時間や視覚刺激への注視タイミングといった行動指標から得られるデータの分析により,第一言語に比べて様々な変数が複雑に関与する第二言語・外国語の理解では,文理解プロセス適用される文処理モデルがどのように異なるかについて検証を行った.
アミノ酸誘起による炭酸カルシウム相変態現象の解析

1.結晶成長及び結晶性評価成長温度が室温、50°Cともにアミノ酸は炭酸カルシウムに取り込まれることがわかった。特に非荷電極性及び酸性アミノ酸は高濃度に分配され、室温ではバテライト、高温ではアラゴナイトの成長を促進した。また、バテライト及びアラゴナイト比率は結晶中のアミノ酸濃度とともに上昇することがわかった。一方、非極性及び塩基性アミノ酸では,低濃度領域ではカルサイトだけが形成されてたが,高濃度ではバテライトが形成されることがわかった.これらのX線回折ピークは粉末パターンと一致し,優位に成長した面は確認されなかった.2.相転移に伴う熱パラメーター示差走査熱量測定で、450°C付近にバテライトからカルサイト、410°C付近にアラゴナイトからカルサイトへの相転移に伴う発熱ピークが検出された。これらの相転移温度は、含まれているアミノ酸の温度によって異なっており、無添加試料の相転移温度よりも高く、アミノ酸の融点(分解温度)との相関が認められた。3.炭酸カルシウムとアミノ酸の結合モデルMOPAC/PM3法及びZINDO法を用いた,アミノ酸とカルシウムの分子軌道および静電ポテンシャルの理論計算結果から,非極性,非荷電極性,酸性アミノ酸の場合、アミノ基の窒素イオンと炭酸カルシウム結晶表面の炭酸イオンの酵素との間に共有結合をする可能性が導かれた。3.まとめアミノ酸分子は、炭酸カルシウムと比較的安定な結合を形成して、本来は熱的に不安定なバテライトまたはアラゴナイト構造を安定化し、結晶形成後は、取り込まれたアミノ酸が分解することにより本来の熱的安定相であるカルサイトへ相転移すると考えられる。1.結晶成長及び結晶性評価カルサイト形成条件下で水溶液中に生体構成アミノ酸13種類(非極性:Ala;L-Val;L-Leu;L-Pro,非荷電極性:Gly;L-Ser;L-Thr-;L-Asn;L-Gln,酸性:L-Asp;L-Glu,塩基性:L-Lys;L-Arg)を0.515mol%含有させ炭酸カルシウムを結晶成長させた.非荷電極性及び酸性アミノ酸の場合,共存するアミノ酸濃度上昇とともにバテライト比率が増加し90%以上にも達した.一方,非極性及び塩基性アミノ酸では,低濃度領域ではカルサイトだけが形成されたが,高濃度ではバテライトが形成されることがわかった.これらのX線回折ピークは粉末パターンと一致し,優位に成長した面は確認されなかった.また,バテライトビークの線幅がカルサイトよりも3倍以上広いこと及びSEM像から得られた結晶粒径より,バテライトはカルサイトに比べ結晶性が悪いと推測される.2.相転移に伴う熱パラメーター示差走査熱量測定(DSC)により,バテライトを含む試料では450°C付近に発熱ピークが観察された.このピーク温度前後でバテライトからカルサイトヘ相転移していることから,この発熱ピークはバテライトの相転移に伴うものであると考えられる.解析の結果,それぞれの試料の転移温度とその試料に含まれているアミノ酸自体の融解(分解)温度には相関が認められた.3.まとめ非荷電極性及び酸性アミノ酸は低濃度でもカルサイト形成を阻害し,熱的に不安定なバテライト構造を安定化することがわかった.非極性及び塩基性アミノ酸においても高濃度になれば,同様にバテライト形成が促進された.また,バテライト結晶の中に取り込まれたアミノ酸が分解することによりバテライト構造を不安定化し,カルサイトへの相転移を誘導すると考えられる.さらに結晶中に取り込まれたアミノ酸濃度の変動を調べることにより,転移エントロピーの詳細な解析を行う予定である.1.結晶構造、結晶性、アミノ酸濃度13種類の生体構成アミノ酸を共存させ,50°Cのアラゴナイト形成条件下で炭酸カルシウムを結晶成長させた。

アミノ酸無添加試料の結晶構造は,カルサイトとアラゴナイトともに約50%の比率を示したが,L-Ala(非極性アミノ酸),Gly,L-Gln(非荷電極性アミノ酸),L-Asp,L-Glu(酸性アミノ酸)を共存させた場合,アラゴナイト比が7590%程度に上昇した。また,すべての試料中にバテライトは検出されなかった。熱平衡状態で無いため結晶中へのアミノ酸分配率は一定しないが,Gly,L-Asn,L-Thr,L-Asp,L-Gluは,0.030.14mol%の高い分配率を示した。また,同種類のアミノ酸では結晶中のアミノ酸濃度が高いほどアラゴナイト比率が高くなり,取り込まれたアミノ酸はアラゴナイト形成を促進することがわかった。SEM像から,カルサイト結晶は数10μmの滑らかな表面を持つ菱面体であった。一方,アラゴナイト結晶の粒径は10μmであり、その構造は1×5μmの針状結晶が束になって2方向へ延びたユニークな特徴を示した。2.再結晶過程と相転位結晶熟成時間とともに,アラゴナイトはカルサイトに再結晶し,試料中のアミノ酸濃度も減少した.DSC測定では,400°C付近にアラゴナイトからカルサイトヘの相転移に伴う発熱ピークが出現した.Aspドープ以外の試料では,無添加試料よりも大きい相転移エンタルピーを示した.3.炭酸カルシウムとアミノ酸の結合モデルMOPAC/PM3法,ZINDO法による,アミノ酸と炭酸カルシウムの分子軌道および静電ポテンシャルの理論計算と実験結果から,炭酸カルシウムとアミノ酸の結合形成のモデルを提案した。
体幹部機能が前十字靭帯損傷予防に及ぼす影響

本研究は体幹部の安定化や姿勢矯正の非接触性前十字靭帯(ACL)損傷リスクに及ぼす影響を検証した。実験1では片脚着地中の体幹の姿勢矯正、実験2では8週間の体幹トレーニングをそれぞれ行い、それら介入の片脚着地中のバイオメカニクス的変数への影響を検証した。その結果、実験1では姿勢矯正により片脚着地中のバイオメカニクス的変数がACL損傷リスクを低下させる方向へ変化したが、実験2においては有意なトレーニング効果は示されたものの、同様のバイオメカニクス的変化は見られなかった。以上の結果から、ACL損傷予防のためには体幹トレーニングを行うだけでなく、減速動作中の姿勢矯正も同時に指導するべきであるといえる。本年度は、2種類の体幹トレーニングを行い、それが体幹の安定性に与える影響とドロップジャンプや着地中の下肢のバイオメカニクスに及ぼす影響を検証することを目的として実験が行われた。被験者は運動習慣のある女性30名を用いた。被験者は、姿勢保持系の体幹トレーニングを行う群、クランチなどの腰椎や股関節の屈曲ー伸展を伴う体幹トレーニングを行う群、そして統制群の3群に各10名づつランダムに分け、8週間の介入研究を行った。トレーニング前後において、最大体幹筋力測定及びジャンプや着地動作中の各身体セグメントの運動学的、動力学的データや筋電図測定を行った。その結果、トレーニング効果は、体幹の筋活動の変化や最大筋力の向上度合いなどにおいて各トレーニングにおいて特異的であることが明確となった。本実験は、体幹の最大の安定性のメカニズムをIn Vivoにより検証した初めてのものであり、本研究結果は体幹の安定性獲得のメカニズムに関しても新たな知見を与えると考えられる。これらの体幹の安定性に関わるトレーニング効果の相違が、動作中の下肢のバイオメカニクスにどのように影響をおよぼし、ひいては非接触性前十字靱帯損傷の危険性にどのように影響を与えるかに関しては、本年度分析する予定である。平成25年度は平成24年度に行った異なる種類の体幹トレーニングが片脚着地動作中の下肢の運動学的・動力学的変数に及ぼす影響を検証した実験結果を更に詳細に分析した。健康な女性30名が実験に参加し、姿勢保持系の体幹トレーニングを行う群(CS群)、非バリスティックな伸張-短縮サイクル系の体幹トレーニングを行う群(NB群)、統制群(C群)にそれぞれ10名ずつランダムに分けられた。2組の実験群は異なる体幹トレーニングをそれぞれ8週間行い、その前後で最大体幹筋力測定及び片脚着地動作中のバイオメカニクス的測定を行った。最大体幹筋力測定は3種類の最大体幹筋力測定装置を用いて行われ、体幹の最大筋力及び表面筋電図測定を行った。検証の結果、実験群においては、CS群においてのみ有意に最大体幹筋力の向上や体幹部の共収縮状態が向上する効果がみられ、体幹の安定性向上を示す有意なトレーニング効果が認められた。他の2群においては、体幹トレーニング効果を示す有意な変化は見られなかった。しかし、全ての群において片脚着地時における運動学的・動力学的変数を検証したところ、非接触性前十字靭帯(ACL)損傷メカニズムに関わる変数に有意な変化は認められなかった。本研究の結果から、ただ単に体幹トレーニングを行うのみでは非接触性ACL損傷予防の効果は期待できないと考えられる。しかし、前年度の実験において、実験中に体幹の安定性やアラインメントを矯正する介入を行い着地動作などを行わせたところ、矢状面における着地動作中の股関節仕事量の向上や膝関節仕事量の減少などが認められたことから、体幹トレーニングと併せて実際の動作中の姿勢向上などの指導を行えば、より効率的にACL損傷予防につながる効果が見られる可能性がある。しかし、これに関しては今後の課題である。本研究における結果の一部は平成26年度以降に開催される学会において発表される予定である。本研究は非接触性前十字靱帯(ACL)損傷が最も生じる片脚着地において、体幹部のアラインメントやその安定化がどの様にACLの損傷予防に貢献し得るのかについて検証することを目的として実験が行われた。平成23年度は20名の女性被験者よりデータ収集を完遂した(内2人からのデータはノイズが確認されたため除外)。被験者は介入なしの統制条件、ドローインにより体幹の安定性向上を図る実験条件1、ドローインに加え背中に棒をあてがい体幹の安定性及びアラインメントを矯正する実験条件2において、片脚ジャンプ-片脚着地、30cmの台高からのドロップ片脚着地、両足ドロップジャンプを地面反力計上で行った。これらの動作中の各セグメントの位置及び方向データは3次元動作解析システムにより収集された。その他、アラインメントや最大体幹筋力データなども収集された。平成23年度はこれら収集されたデータのうち、ドロップ片脚着地の矢上面のデータを分析し、ACL損傷リスクとの関連性を検討した。

その結果、実験条件1と2では、ACL損傷が最も生じやすいと考えられている接地から最大地面反力及び最大膝伸展モーメント発生時までの股関節屈曲可動域が統制条件と比較し有意に増大し、最大膝伸展モーメントは統制条件と比較し有意に減少した。また、同区間の負の股関節仕事量及び股関節総仕事量も有意に増大することが認められた。以上の結果は体幹の安定性を高め体幹アラインメントを矯正することは、片脚着地時の膝関節への負荷の減少や安定性の向上に貢献し、ACL損傷リスクを低減する可能性があることが示唆された。これらの結果は15th European Society of Sports Traumatology Knee Surgery and ArthroscopyCongressにおいて発表された。2年目に予定された実験は全て完了することができた。実験器具の故障やその他の実験による使用状況などにより、初年度の研究に関しては被験者数名程度からデータをとる必要があるが、予定としては7月までには完了する予定である。ただ、可能な限りデータ分析も同時進行で行っているため、進展状況は順調であると考えている。平成23年度は科学研究費の交付確定が遅れたため、プロジェクトの開始時期が遅れたことと、データ収集時に3次元動作解析システムが故障し、アメリカ合衆国の本社へ修理の為送り届けなければならなかったなど、時間的ロスが生じた。これらの理由により、当初は男性被験者からも平成23年度中にデータを集める予定であったが、女性被験者からのみしかデータ収集を行うことができなかった。男性被験者からのデータ収集は、平成24年度のプロジェクトと並行して遂行される予定である。これまで採取したバイオメカニクス的データなどの分析を行い、学会発表や論文作成&投稿の準備を行う。平成24年度は2種類の体幹トレーニングを行うことが片脚動作中の下肢の運動学的・動力学的パラメーター及び非接触性ACL損傷リスクへ及ぼす影響を検証する。具体的には、トレーニグを行わない統制群、姿勢保持の要素を含むコアスタビライゼーショントレーニングを行う実験群1、そしてクランチなどの低強度で非バリスティックな伸長-短縮サイクル運動による体幹トレーニグを行う実験群2において、トレーニグ効果の有無や片脚着地中の下肢のバイオメカニクスに及ぼす影響を検証する。平成23年度に男性と女性は体幹の神経筋制御様式が異なる可能性が示されたため、平成24年度は女性被験者のみを用いて実験を行う。合計30名の女性被験者を用いる。また、平成23年度のプロジェクトにおいて収集しきれなかった男性被験者からのデータも継続して収集を続け、7月までにデータ収集を完了させる。繰越金は、消耗品の購入や残りの被験者や験者への謝金に使用される。本年度はこれまでの実験データを分析することが目的のため、そのための分析ソフトなどを購入する予定である。平成24年度の研究費は被験者や験者への謝礼金、研究発表の為の渡航費、そして、表面筋電図の電極などの消耗品などに使用される。平成23年度からの繰越金(\150,737-)は、平成24年度に継続して行われる平成23年度分の実験に参加する男性被験者や験者への謝礼金として使用される。
客観的運動予備能評価に基づいた高齢患者の全身麻酔リスク解析

高齢者、心血管系合併症を有する患者、フレイル状態の患者が全身麻酔下に手術を受ける際の術後合併症のリスクは術前の運動予備能と逆相関することが知られている。しかし、現時点での活動度評価は主観的かつ患者の自己申告に依存しており、客観的な活動度評価の確立が望まれる状況にある。本研究では高リスク手術患者を対象として術前の運動負荷後の酸素消費量と入院後の活動度および全身麻酔中の酸素消費量の関連を検討することを目的とする。申請者および申請者と同一の組織に属する研究分担者2名からなる研究組織をもって研究を実施する。
腸内細菌によるエキソソームを介した生体機能調節機構の解明

本研究では、腸内細菌による生体調節機構におけるエキソソームの役割を明らかにすることを目的として、無菌マウスとSPFマウスの血液由来エキソソームの構成成分と機能を比較した。その結果、無菌マウスとSPFマウスの血液由来エキソソームに含まれるmicroRNAの種類に違いがあることが判明した。さらに、無菌マウスとSPFマウスの血液由来エキソソームのマウスへの移入により、臓器特異的に遺伝子発現が変動することが明らかになった。以上より、腸内細菌がエキソソームの構成成分を変動させること、また、腸内細菌がエキソソームを介して臓器の遺伝子発現を制御している可能性が示された。腸管内に生息する腸内細菌は生体機能において重要な役割を果たしている。例えば、腸内細菌が存在しない無菌マウスにおいては腸管免疫系の発達が悪く、経口免疫寛容も誘導されにくい。一方で、プロバイオティクス研究にみられるように、体外から新たに微生物を投与することで生体の機能を調節できることも明らかになってきている。申請者も、プロバイオティクスの投与がマウス血液中の抗体応答を変化させることや、経口免疫寛容を強化することを明らかにしている。しかしながら、これまでのところ、腸内細菌やプロバイオティクスが腸管局所からどのようにして全身の免疫機能を制御しているかについては明らかになっていない。本研究では、最近、細胞間の情報伝達に関与することが報告された、分泌膜小胞「エキソソーム」に着目し、腸内細菌による腸管を介した生体機能の調節におけるエキソソームの果たす役割を解明することを目的として、腸内細菌を欠損する無菌マウスを用いた検討を行った。無菌マウスとSPFマウスの血液を採取し、エキソソーム濃縮用試薬を用いてエキソソームを抽出したところ、エキソソームの量が、SPFマウスと無菌マウスで異なっていた。さらに、エキソソームからmicroRNAを精製し、比較解析したところ、SPFマウスと無菌マウスにおいて血清エキソソームに含まれるmiRNAの割合が異なることが明らかになった。これらのことは、腸内細菌が血清中のエキソソームに影響を与えていることを示唆している。今後は、SPFマウスと無菌マウスからの血清エキソソームの移入試験を行い、それによる遺伝子発現制御の評価を行う予定である。また、SPFマウスと無菌マウスにそれぞれオボアルブミンを投与して得られる血清由来エキソソームの経口免疫寛容誘導能を移入試験を行い明らかにする。しかしながらこれまでのところ、腸内細菌がどのようにして全身の免疫機能を制御しているかについては明らかになっていない。本研究では、細胞間の情報伝達に関与することで知られる、分泌膜小胞「エキソソーム」に着目し、腸内細菌によるエキソソームの制御と、腸内細菌による生体機能の調節機構におけるエキソソームの役割を明らかにすることを目的に、腸内細菌を欠損した無菌マウスと腸内細菌を有するSPFマウスの血清由来エキソソームを精製し、その構成成分およびその機能を解析した。平成25年度は、無菌マウスとSPFマウスの血清由来エキソソーム中に含まれるmicroRNAのマイクロアレイ解析を実施し、microRNAの種類に違いがあることを明らかにしている。平成26年度は、無菌マウスとSPFマウスの血清由来エキソソームの機能を解析するため、それぞれのエキソソームを別のSPFマウスに移入し、肝臓および脾臓の遺伝子発現の変化をマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。その結果、肝臓および脾臓において、エキソソームの移入によりmRNA発現に差が生じることが明らかになった。肝臓では脂質代謝や免疫関連遺伝子群の発現に差が認められた。また、興味深いことに、エキソソームの移入により肝臓および脾臓で発現量に差が生じた遺伝子は臓器ごとで異なっていた。これらの結果から、腸内細菌はエキソソームを介して、組織特異的に遺伝子発現を制御している可能性が示唆された。以上より、腸内細菌叢の有無により、血清エキソソームの量および構成成分に違いが生じること、また、血清エキソソームが臓器の遺伝子発現を制御しており、腸内細菌叢の有無によりその制御が異なることを明らかにした。以上より、血清由来エキソソームが腸内細菌による生体調節機構の一端を担ってる可能性が示唆された。食品免疫学平成25年度の実験計画のうち、1.無菌マウスとSPFマウスのエキソソーム中miRNAの比較解析については実施し、腸内細菌によって血清中エキソソームに含まれるmiRNAの割合が異なることを明らかにした。

平成25年度10月より、国立大学法人北海道大学大学院農学研究院から農業・食品産業技術総合研究機構・畜産草地研究所に転職したため、研究環境が変わったことにより研究推進に遅れが生じ、2.エキソソーム移入による肝臓および脾臓のmRNA発現解析については、次年度に検討することとした。無菌マウスとSPFマウスの血清由来エキソソームのmiRNAを比較したところ、含まれるmiRNAの存在割合が異なることが明らかになったことから、エキソソームによる遺伝子発現制御が腸内細菌の影響を受けている可能性が示唆される。そこで今後は、無菌マウスとSPFマウスからの血清由来エキソソームをマウスにそれぞれ移入し、それらによる遺伝子発現制御を評価する。また、無菌マウスとSPFマウスにそれぞれオボアルブミンを投与して得られる血清由来エキソソームの経口免疫寛容誘導能を移入試験を行い明らかにする。平成25年度の実験計画のうち、2.エキソソーム移入による肝臓および脾臓のmRNA発現解析については、期間途中に転職したため、研究環境が変わり実施できなかった。一方で、無菌マウスとSPFマウスの血清由来エキソソームのmiRNAの比較解析から、含まれるmiRNAの存在割合が異なることが明らかになっており、エキソソームによる遺伝子発現制御が腸内細菌の影響を受けている可能性が示唆される。そこで、エキソソームの移入試験については次年度に実施したい。無菌マウスとSPFマウスからの血清由来エキソソームをマウスにそれぞれ移入し、それらによる遺伝子発現制御を評価する。
細胞工学的改変ミクログリアによる中枢神経系疾患の治療・診断に関する研究

我々は,enhanced green fluorecent protein(eGFP)発現遺伝子を導入したマウス胚性幹細胞(ES細胞)からマイクログリアの分化誘導法を確立した(J.Neuroimmunol.2005,160,210-218).マイクログリアへの分化誘導は,神経細胞誘導法である5-STEP法を一部改変した.Embryoid Body(EB)にbFGFを添加し,その後付着培養する際にGM-CSFを添加することによりマイクログリアを誘導した.FACS解析によりCD45^<low>,Mac1^+の細胞をマイクログリアとし,CD45^<hi>,Mac1^+の細胞をマクロファージとしたところ,誘導細胞はそれぞれ17%と2%であった.誘導マイクログリアのMHC,共刺激分子や接着分子の発現をFACSで解析すると,MHC class I, class II分子を発現しており,共刺激分子であるCD80,CD86やCD40の発現が認められた.また,IFN-g刺激によりMHC class IIとCD40の発現上昇もみとめられた.接着分子の発現は,脾臓マクロファージと比べほとんどが低く,CD31のみが高かった.また正常マウス尾静脈に誘導マイクログリアを移植すると,血液脳関門を通り抜け海馬,脳梁に移植細胞が遊走する事が確認された.しかし末梢の組織では,移植細胞はほとんど検出されなかった.さらに誘導マイクログリアを同様にグリオーマモデルマウスに移植すると,腫瘍組織に多数の移植細胞が確認された.この特性を利用して,細胞工学的改変ミクログリアによる中枢神経系疾患の治療法を開発している.我々は、enhanced green fluorecent protein(eGFP)発現遺伝子を導入したマウス胚性幹細胞(ES細胞)からマイクログリアの分化誘導を試みた。マウスES細胞から胚様体を形成させITSFn培地で培養した後、bFGF存在下N2培地で培養すると、神経系の細胞と共にマイクログリアを分化誘導できた。その後、GM-CSFを添加することで、マイクログリアを増殖させ、密度勾配法にてマイクログリアの濃縮に成功した。ES細胞由来のマイクログリアは、CD45^<low>でMac1^+であり、貪食能を有しており、LPSやIFN-γ刺激によりMHC class IIの発現上昇が認められ、初代培養のマイクログリアと酷似した表現形を示した。また、このES細胞由来マイクログリアをマウスの尾静脈に注入すると、海馬、脳梁、大脳皮質などの脳実質内にのみ確認された。注入されたマイクログリアは末梢組織で検出されないことから、脳実質内に特異的に遊走する事が推測された。一方、マクロファージを同様に尾静脈より注入すると、末梢組織でのみ検出された。これらの結果から、マイクログリアには、血液脳関門(BBB)を通り抜ける為の何らかのメカニズムが存在することが推測された為、マイクログリアとマクロファージの表面抗原の違いを解析したところ、BBBの通り抜けに関与するであろう分子を同定した。本研究より、マウスES細胞より機能的なマイクログリアが誘導可能で、このES細胞由来のマイクログリアは、BBBを通り抜け脳実質内に遊走する事が確認された(manuscript in preparation)。この特性を利用して、細胞工学的改変ミクログリアによる中枢神経系疾患に対する治療法の開発を展開していく予定である。我々は,enhanced green fluorecent protein(eGFP)発現遺伝子を導入したマウス胚性幹細胞(ES細胞)からマイクログリアの分化誘導法を確立した(J.Neuroimmunol.2005,160,210-218).マイクログリアへの分化誘導は,神経細胞誘導法である5-STEP法を一部改変した.Embryoid Body(EB)にbFGFを添加し,その後付着培養する際にGM-CSFを添加することによりマイクログリアを誘導した.FACS解析によりCD45^<low>,Mac1^+の細胞をマイクログリアとし,CD45^<hi>,Mac1^+の細胞をマクロファージとしたところ,誘導細胞はそれぞれ17%と2%であった.誘導マイクログリアのMHC,共刺激分子や接着分子の発現をFACSで解析すると,MHC class I, class II分子を発現しており,共刺激分子であるCD80,CD86やCD40の発現が認められた.また,IFN-g刺激によりMHC class IIとCD40の発現上昇もみとめられた.接着分子の発現は,脾臓マクロファージと比べほとんどが低く,CD31のみが高かった.また正常マウス尾静脈に誘導マイクログリアを移植すると,血液脳関門を通り抜け海馬,脳梁に移植細胞が遊走する事が確認された.しかし末梢の組織では,移植細胞はほとんど検出されなかった.さらに誘導マイクログリアを同様にグリオーマモデルマウスに移植すると,腫瘍組織に多数の移植細胞が確認された.この特性を利用して,細胞工学的改変ミクログリアによる中枢神経系疾患の治療法を開発している.