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動的核偏極‐核磁気共鳴法による新規心筋梗塞診断法の開発

動的核偏極-核磁気共鳴法による心筋梗塞診断法を目指した分子プローブの開発を行っている。分子プローブを標的部位に送達する分子として、平成25年度より核酸ナノ構造体に着目し、研究を遂行している。平成26年度は引き続きがんモデルマウスを用いた体内動態評価行い、人工核酸による核酸ナノ構造体の機能を評価した。分子プローブのモデル分子として蛍光基を人工核酸に修飾してがんモデルマウスに尾静脈投与し、主要臓器への核酸ナノ構造体の集積量を評価した。その結果、投与4時間経過後に主要から蛍光を確認した。しかし、一方で、1本鎖の人工核酸を投与した場合も同様に腫瘍から蛍光が得られ、構造体形成による分子サイズの増大の影響は見られなかった。腫瘍への蓄積は分子のサイズ依存性があり、一般的に60塩基程度の1本鎖DNAはサイズが小さく腫瘍へ蓄積せずに腎臓を経由して排泄されると考えられている。そこで、1本鎖DNAと核酸ナノ構造体が同じ体内動態を示した原因を追求するため、1本鎖DNAをがんモデルマウスに投与し、投与直後の血液中のDNA量をリアルタイムPCRにより定量評価した。その結果、人工核酸を用いた場合でも1本鎖DNAは血液中ですぐに分解されてしまうことが示唆された。1本鎖DNAを投与した場合でも蛍光が腫瘍から確認されたのは、分解後、フラグメント化したDNAと蛍光基のコンジュゲートが腫瘍に集積したことを示している。本研究は、核酸の体内動態の厳密な評価法を提案し、また、短い人工核酸と分子プローブのコンジュゲートを合成することで標的疾患へと分子プローブを送達できることを示唆している。核磁気共鳴を利用した分子プローブを標的部位に送達する技術は非常に重要である。本研究で用いた人工核酸によるナノ構造体等を用いることで、分子プローブを標的へと選択的に送達することができれば、より効果的な疾病診断が可能になると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は動的核偏極-核磁気共鳴法を用いた新規心筋梗塞診断法の開発を目的とする。今年度は、まず、クレアチンリン酸と類似した小分子であるエチレンジアミン4酢酸(EDTA)の超偏極寿命を測定した。超偏極寿命の評価は、超偏極寿命と密に関係している縦緩和時間を測定することで行った。EDTAのカルボキシル基のC核の縦緩和時間を測定したところ、約10秒であった。このEDTAの縦緩和時間から、本課題で用いる分子プローブの超偏極寿命も、それほど長くないことが示唆された。次に、クレアチンリン酸の超偏極寿命を測定するため、市販されているクレアチンリン酸のカルボキシル基、グアニジル基の13C核の縦緩和時間を測定した。どちらの13C核も10秒から15秒であり、目標とした超偏極寿命には及ばなかったため、今後の課題としてプローブの超偏極寿命を長くすることが挙げられる。また、分子プローブを標的組織・細胞へと送達するための手段として、機能性核酸であるアプタマーの開発も同時に着手した。アプタマーは理論的にはどのような分子・組織に対しても取得可能であり、本課題のように心臓を標的できる既存の分子が知られていない場合でも、心臓を標的としてアプタマーを取得することが可能である。核酸の取得には試験管内進化法という手法が用いられており、且つ、本課題でとり行う心筋梗塞診断に向けて細胞、もしくは、生体組織を用いた手法が必要となる。しかし、受入研究室ではその技術が未習得であった。そこで今年度はまず既知のアプタマーで手法の構築を目指した。来年度以降、系の構築後に心臓組織へ標的可能なアプタマーの取得を目指す。本研究は、動的核偏極-核磁気共鳴法を用いて心筋梗塞診断を実現する分子プローブの開発を目的としている。昨年度までに心筋梗塞のマーカー分子であるクレアチンキナーゼにより脱リン酸化されるクレアチンリン酸を分子プローブの候補とし、重元素ラベル標識を行う予定だった炭素分子の縦緩和時間を測定したが、緩和時間が20秒弱と非常に短かった。そのため、心筋梗塞診断に用いるには不十分だと判断し、短い時間で診断が可能となるように、分子プロープを標的へと送達することが重要だと考えた。今年度は、分子プローブを標的へと送達するための手法に関して主に研究を進めた。具体的には、分子プローブに標的ターゲティングするための技術として核酸アプタマーに着目した。核酸アプタマーは配列に依存して標的分子に特異的に結合できる次世代の認識分子材料と言える。心筋梗塞、つまり、心臓へと分子プローブを送達するためには、心臓組織、もしくは、心臓由来の細胞を標的として核酸アプタマーを取得する必要がある。そこで、まず、細胞を標的として進化工学的な手法により核酸アプタマーを取得する系の構築に取り組んだ。過去に報告されている核酸アプタマーをモデルアプタマーとし、細胞を標的とした核酸アプタマーを取得する系の構築に成功したため、今後は心筋梗塞診断に有用な標的を選び、核酸アプタマーを取得予定である。一方で、核酸アプタマーが生体内でも機能するかどうかを評価している。天然分子である核酸アプタマーは生体内で免疫応答を起こしにくいことが知られているが、同時に、生体内のDNA分解酵素により分解し、すぐに排泄されてしまうことを明らかにした。

そこで、人工塩基を用いるなどして生体内でも機能する核酸アプタマーの開発に取り組む予定である。動的核偏極-核磁気共鳴法による心筋梗塞診断法を目指した分子プローブの開発を行っている。分子プローブを標的部位に送達する分子として、平成25年度より核酸ナノ構造体に着目し、研究を遂行している。平成26年度は引き続きがんモデルマウスを用いた体内動態評価行い、人工核酸による核酸ナノ構造体の機能を評価した。分子プローブのモデル分子として蛍光基を人工核酸に修飾してがんモデルマウスに尾静脈投与し、主要臓器への核酸ナノ構造体の集積量を評価した。その結果、投与4時間経過後に主要から蛍光を確認した。しかし、一方で、1本鎖の人工核酸を投与した場合も同様に腫瘍から蛍光が得られ、構造体形成による分子サイズの増大の影響は見られなかった。腫瘍への蓄積は分子のサイズ依存性があり、一般的に60塩基程度の1本鎖DNAはサイズが小さく腫瘍へ蓄積せずに腎臓を経由して排泄されると考えられている。そこで、1本鎖DNAと核酸ナノ構造体が同じ体内動態を示した原因を追求するため、1本鎖DNAをがんモデルマウスに投与し、投与直後の血液中のDNA量をリアルタイムPCRにより定量評価した。その結果、人工核酸を用いた場合でも1本鎖DNAは血液中ですぐに分解されてしまうことが示唆された。1本鎖DNAを投与した場合でも蛍光が腫瘍から確認されたのは、分解後、フラグメント化したDNAと蛍光基のコンジュゲートが腫瘍に集積したことを示している。本研究は、核酸の体内動態の厳密な評価法を提案し、また、短い人工核酸と分子プローブのコンジュゲートを合成することで標的疾患へと分子プローブを送達できることを示唆している。核磁気共鳴を利用した分子プローブを標的部位に送達する技術は非常に重要である。本研究で用いた人工核酸によるナノ構造体等を用いることで、分子プローブを標的へと選択的に送達することができれば、より効果的な疾病診断が可能になると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。年度末よりHeの供給不足によるNMRの停止に伴い、超偏極に関する実験ができないでいる。しかし、当初の予定通り緩和時間測定からプローブの改善点等は導き出しており、これまでは順調に進展していると言える。動的核偏極-核磁気共鳴装置の不具合により分子プローブの開発には取り組めていないが、分子プローブを標的へと送達するための手法の開発に関しては、核酸アプタマー取得の系構築に成功しており、当初の計画以上に進んでいると言える。世界的なHeの供給不足のため動的核偏極-核磁気共鳴用のNMRが停止しており、今後も測定回数はかなり限られてくると予想される。そのため、受け入れ研究機関周辺にある熱平衡NMRで基礎評価を行いつつ、分子プローブのターゲティング能力向上を目指したアプタマーの開発を行う。今後、生体で機能する核酸アプタマーの開発を主に取り組む。過去の研究により、人工核酸を用いることで生体内での核酸アプタマーの安定性を向上可能だということは判明しているため、この過去の研究を参考に研究を進める。人工核酸を用いることで核酸アプタマーの能力が喪失する可能性もあるが、人工核酸を挿入する部位、人工核酸の数などを適宜最適化することで問題解決可能だと思われる。
キッブルバランス法の原理を応用した微小力の発生技術及び計測技術

本研究は、医療・食品、バイオテクノロジー、ナノ物質・材料等の幅広い分野で行われている微小力計測の信頼性を向上させるため、キッブルバランス法の原理を応用した電磁力による精密な微小力発生技術・計測技術の確立を目指している。本研究においては、電磁力による微小力の発生装置を設計して構成し、微小力計に対して校正を行い、校正結果の不確かさを評価する予定である。
確率過程に隨伴した一般化統計多様体の数値解析

1.n個の連続パラメータθ≡(θ_1...θ_n)で特徴づけられる(時間)離散確率過程について、一般化統計多様体を構築した。離散時間Nにおけるランダム変数X(N)に対する確率密度関数p(X,θ,N)のnパラメータ族S_N≡{p(X,θ,N)|θ∈Ω}の上に、情報幾何学の標準的方法により計量テンソルとα接続を導入した。時間が経過すると、統計多様体の時系列...S_1,S_2,...,S_N,...が生成され、これらを寄せ集めて層状の統計多様体すなわち統計多様体Sと整数の集合Zの直積空間S×Zが得られた。この一般化統計多様体S×Zの上に、Newton重力のNewton-Cartan理論並びにHiggs場を拡張ゲージ場として導入する素粒子物理学の理論に習って、異なる層同士を結ぶ拡張接続を導入し、それとα接続から拡張曲率テンソルを構成した。この新しい幾何学的方法をランダムウォークに適用し、その一般化統計多様体は双対構造を持つことを示した。2.Janyszek-Mrugala(JM)解釈「熱平衡系のRiemannスカラー曲率Rは系の不安定性の尺度」の妥当性を含め、Rの物理的意味を調べた。3次元の場合には、JM解釈はBoseおよびFermi気体のみならず、Gentileの中間統計にしたがう非ゼロ質量の理想量子気体にも適用可能であることを示した。また、これらの気体のRの特性は量子力学的交換効果によって説明できた。しかし、2次元でのWuの分数統計にしたがう非ゼロ質量の理想気体、および4次元でのゼロ質量のBose気体についてはJM解釈は成立しなかった。このような問題点を克服する、曲率Rに対する次元によらない関係式を導出した。この関係式では、熱力学的不確定関係ΔSΔT≧kT(エントピーS、温度T、Boltzmann定数k)における不確定積とその最小値との差が、α測地線に沿ったRの積分で与えられる。また、BoseおよびFermi気体についてRiemann幾何学の測地線の大域的特性を明らかにした。3.曲率の物理的役割を広くもとめて、新しい熱平衡モデルあるいは確率過程モデルの構築も同時に進めた。3つの萌芽が得られたが、幾何学的特性の研究は今後の問題として残された。(1)離散確率過程に随伴した“層状統計時空′′の“一般化曲率テンソル′′を調べた。層状統計時空は統計多様体Mと整数の集合Zの直積空間である。多様体Mは確率過程モデルを特徴づけるパラメータによって張られ、Zは離散時間に対応する。層状時空M×ZはNewton重力のNewton-Cartan理論に類似した幾何構造を持つことに着目して、離散時空に沿った接続を自然に導入できることを明らかにした。M内における通常の接続と離散時間に沿った一般化接続から、M×Z上に一般化曲率テンソルを構成した。この一般化曲率テンソルの構成では、ゲージ場の理論においてHiggs場の役割を果す拡張ゲージ場に対するKonisi-Saitoの方法を利用した。この新しい幾何学的手法をD次元立方格子上のランダムウォークに応用した。その結果、離散時間に関係した一般化曲率テンソルは任意の時間でゼロであることを示した。さらに、異なる層を結ぶ一般化接続は計量を保存しないことを示した。今後は、ステップ間に相関のあるLevyウォーク等へ応用していく計画である。(2) MaxwellとKelvin-Voigt要素から成る複雑な粘弾性物質のモデルを構築して、Riemann-Liouviklle(RL)積分を利用してこの体系が呈する不規則現象を逆問題として定式化した。つまり、観測データから不規則現象の性質を予測できる表式が逆問題としてRL積分表示の逆変換から導出されることを示した。また、複合系に対する入出力関数(ノイズ)の観測データを標本(確率変数)の実現値と見て、情報幾何学の立場で入出力関数のある特殊な汎関数を推定した。(3) Bose統計とFermi統計をつなぐ中間統計の1つであるGentile統計について、統計多様体の曲率に刻まれる量子特性を明らかにした。

3次元の場合には、JM解釈はBoseおよびFermi気体のみならず、Gentileの中間統計にしたがう非ゼロ質量の理想量子気体にも適用可能であることを示した。また、これらの気体のRの特性は量子力学的交換効果によって説明できた。しかし、2次元でのWuの分数統計にしたがう非ゼロ質量の理想気体、および4次元でのゼロ質量のBose気体についてはJM解釈は成立しなかった。このような問題点を克服する、曲率Rに対する次元によらない関係式を導出した。この関係式では、熱力学的不確定関係ΔSΔT≧kT(エントピーS、温度T、Boltzmann定数k)における不確定積とその最小値との差が、α測地線に沿ったRの積分で与えられる。また、BoseおよびFermi気体についてRiemann幾何学の測地線の大域的特性を明らかにした。3.曲率の物理的役割を広くもとめて、新しい熱平衡モデルあるいは確率過程モデルの構築も同時に進めた。3つの萌芽が得られたが、幾何学的特性の研究は今後の問題として残された。(1)Gentile統計に従う理想量子気体のRiemannスカラー曲率(R)を情報幾何学の方法で調べた。Gentile統計はBose統計とFermi統計をつなぐ中間統計の1つである。Rはフガシティーηと、1状態の最大許容粒子数pで決まる。最小の場合p=1はFermi-Dirac統計に対応し、上限のない場合p→∞はBose-Einstein統計に対応する。Boltzmann統計に従う理想古典気体に対する結果R=0とは対照的に、η→0において非ゼロであることを発見した: p≧2に対してR=√(2)/32、p=1に対してR=-√(2)/32。また、Rの符号と量子力学的交換相互作用との間に相関があることを見出した。さらに、JanyszekとMrugalaによって提案されたRの不安定性解釈を指示する結果を得た。(2)2次元における理想気体のスカラー曲率を情報幾何学の方法で調べた。前記の3次元の場合とは違って、2次元のスカラー曲率の振舞いをJanyszekとMrugalaによって提案された不安定性解釈よって説明することは困難であることを示した。また、スカラー曲率を比熱で表す公式を導いた。(3)確率過程の新しいモデルを求めて、人間の歩行運動を調べた。視覚と聴覚を遮蔽された人間がどのように歩くかを実験した。同じ出発点、同じ方向、同じペースで歩行しても、毎回異なる歩行軌跡が得られた。すなわち、この歩行運動は確率過程である。直線運動からのゆらぎを測定した結果、そのパワースペクトルは1/fであることを推定した。(1)離散確率過程では、時刻Nにおける確率変数Xに対する分布関数P(X,θ,N)は一般に時刻Nに陽に依存する。モデルを特徴づけるパラメータθが連続の場合、情報幾何学の方法を利用して,各時刻Nにおける確率密度関数族S_N≡{P(X,θ,N)|θ∈Ω}の中に計量テンソルと接続を定義できる。各時刻の統計多様体S_Nを積み上げることによって一般化統計多様体S≡US_Nが定義される。このような一般化統計多様体に情報幾何学の多くの概念が一般化できることを示した。特に、双対構造が存在する具体的例を構築した。(2)BoseおよびFermi-Diracの量子気体、Gentileの中間統計にしたがう量子気体、Wuの分数統計にしたがう量子気体について、熱力学量のゆらぎと熱力学的状態空間のRiemannスカラー曲率との関係を調べた。
わが国近代の都市計画と都市地域変容に関する研究

わが国近代期の都市計画関係法令およびその実施状況について資料収集,統計資料の分析を行った。1919年の都市計画法の条文および区画整理・耕地整理の規程に関する資料を収集し,都市地域の土地利用変化,建造環境の形成に関連する当時の法体系とその変化を整理した。その結果,これらは相互の関連性を欠くこと,都市的土地利用と農村的土地利用の競合に関して明確な調整の規程がないことなどが明らかとなった。また,都市年鑑などの諸統計や文献資料を収集し,1919年法による都市計画区域および用途地域,また区画整理事業が全国的にどのように実施・展開されていったのかを明らかにした。その結果,都市計画区域の指定は都市規模順位にほぼ対応して行われていったが,軍事都市など当時の社会的背景による都市機能が優越する場合があった。事例都市として取り上げた大分県別府市では,明治42(1909)年から街区改正事業が,また大正1(1912)年からは耕地整理が行われ,温泉観光地としての発達の基礎として,当時の都市計画諸制度が行政機関によって巧みに利用されてきたことが明らかになった。以上のことを通じて,近代期を通じてわが国の都市がどのような法的な制約条件のもとで発展し,諸制度がどのような意味を持っていたのか,また社会経済的条件の変化によって1968年の都市計画法改正に至った必然性が確認された。
メタボリックシンドロームにおけるサルコペニア合併の意義の検討

メタボリックシンドロームにおけるサルコペニアに関する研究は、大阪大学医学部附属病院内分泌代謝内科及び川崎病院糖尿病内分泌内科に入院した症例を対象に評価を行っている。主に筋肉量や筋力を測定するとともに代謝パラメーターや骨密度、血中アディポネクチン値などとの相関関係を解析している。現在約130名エントリーしており、今後も症例数を増やしながら解析を行っていく。末梢血遺伝子発現プロファイルの解析の1つとして、住友病院内分泌代謝内科入院症例(代謝異常非合併肥満者、耐糖能障害症例)を対象に解析を行った。本検討は、全例腹部CTによる内臓脂肪及び皮下脂肪面積を定量評価できている点において極めて精度の高いものである。結果、内臓脂肪は1,354個の遺伝子プローブの発現に影響を与えるのに対し、皮下脂肪や体格指数(BMI)は全く末梢血遺伝子発現に影響を与えなかった。また、年齢あるいは性別は、それぞれ625個、52個の遺伝子プローブ発現に影響することを示した。特に内臓脂肪蓄積に伴い、KLF10の発現が顕著に減少しており、メタボリックシンドローム発症病態における新たな分子を見出した。さらに、Gene ontology解析の結果、炎症、酸化ストレス、免疫応答、脂質代謝や糖代謝に関連する遺伝子群への影響は、内臓脂肪は約20-30%の遺伝子に影響するのに対して、皮下脂肪は3-5%しか影響を与えないことも明らかにした。以上、論文報告を行った。
報酬に基づく行動学習の計算論的モデルの確立と脳内メカニズムの解明

皮質-大脳基底核ループにおいて強化学習に基づいた行動学習・行動選択が行われており,脳幹から脳の各部に投射するドーパミンやセロトニンなどの「神経修飾物質系」がメタパラメタを調節する機能を担うという「メタ学習仮説」に基づき,ヒトを対象とする脳機能計測を用い,行動学習に関わる脳内メカニズム解明をおこなった.セロトニン操作下における報酬予測課題時の行動データ解析により,セロトニンレベルが低下していると,人は即時的な報酬予測を行うことを明らかにした論文を,神経科学の分野で代表的な査読付論文誌であるJournal of Neuroscienceに発表した(学会誌への発表2).また,カリフォルニア工科大学のJohn O'Doherty博士の下で,3テスラの機能的磁気共鳴画像法(fMRI)装置を用いた実験のデータ解析を行い,報酬を得るための行動がどのように生成されるかという,より汎用的な学習の脳内機構を調べたもので,被験者が環境から得られる報酬と自分の行動の間に因果関係があると感じた度合いによって,内側前頭前野が強く活動するという結果が得られた,この実験結果も,立て続けにJournal of Neuroscienceに発表した(学会誌への発表(1)).また,報酬予測と学習(記憶)の時間スケールの類似点から,時間遅れのある報酬に基づく過去の行動の学習メカニズムを調べるためのfMRI実験を14人の被験者に対して行い,現在データ解析中である.このように,本年度は,脳の中で実装されていると考えられる,柔軟な学習機構を明らかにするためにさまざまな学習システムを仮定し,それらにかかわる脳内機構をfMRI実験で明らかにすることができた.皮質-大脳基底核ループにおいて強化学習に基づいた行動学習・行動選択が行われており,脳幹から脳の各部に投射するドーパミンやセロトニンなどの「神経修飾物質系」がメタパラメタを調節する機能を担うという「メタ学習仮説」に基づき,ヒトを対象とする脳機能計測を用い,行動学習に関わる脳内メカニズム解明をおこなった.セロトニン操作下における脳活動の測定により,脳の並列ネットワーク上で,異なる時間スケールでの報酬予測が行われ,かつそのネットワークがセロトニンレベルによって変化することを明らかにした論文を,査読付一般紙であるPLoSONEに発表した.また,カリフォルニア工科大学のJohn O'Doherty博士の下で,3テスラの機能的磁気共鳴画像法(fMRI)装置を用いた実験を行った.この実験は,報酬を得るための行動がどのように生成されるかという,より汎用的な学習の脳内機構を調べたもので,被験者が環境から得られる報酬と自分の行動の間に因果関係があると感じた度合いによって,内側前頭前野が強く活動するという結果が得られた,この実験結果は,神経科学の分野で代表的な査読付論文誌である,Journal of Neuroscienceに投稿し,現在再投稿後の査読中である,また,報酬予測と学習(記憶)の時間スケールの類似点から,時間遅れのある報酬に基づく過去の行動の学習メカニズムを調べるためのfMRI実験を14人の被験者に対して行い,現在データ解析中である.このように,本年度は,脳の中で実装されていると考えられる,柔軟な学習機構を明らかにするために,さまざまな学習システムを仮定し,それらにかかわる脳内機構をfMRI実験で明らかにすることができた.皮質-大脳基底核ループにおいて強化学習に基づいた行動学習・行動選択が行われており,脳幹から脳の各部に投射するドーパミンやセロトニンなどの「神経修飾物質系」がメタパラメタを調節する機能を担うという「メタ学習仮説」に基づき,ヒトを対象とする脳機能計測を用い,行動学習に関わる脳内メカニズム解明をおこなった.セロトニン操作下における報酬予測課題時の行動データ解析により,セロトニンレベルが低下していると,人は即時的な報酬予測を行うことを明らかにした論文を,神経科学の分野で代表的な査読付論文誌であるJournal of Neuroscienceに発表した(学会誌への発表2).また,カリフォルニア工科大学のJohn O'Doherty博士の下で,3テスラの機能的磁気共鳴画像法(fMRI)装置を用いた実験のデータ解析を行い,報酬を得るための行動がどのように生成されるかという,より汎用的な学習の脳内機構を調べたもので,被験者が環境から得られる報酬と自分の行動の間に因果関係があると感じた度合いによって,内側前頭前野が強く活動するという結果が得られた,この実験結果も,立て続けにJournal of Neuroscienceに発表した(学会誌への発表(1)).また,報酬予測と学習(記憶)の時間スケールの類似点から,時間遅れのある報酬に基づく過去の行動の学習メカニズムを調べるためのfMRI実験を14人の被験者に対して行い,現在データ解析中である.このように,本年度は,脳の中で実装されていると考えられる,柔軟な学習機構を明らかにするためにさまざまな学習システムを仮定し,それらにかかわる脳内機構をfMRI実験で明らかにすることができた.
脂質ラフトへの局在性がカロテノイドの機能を決定する

カロテノイドの細胞内の存在位置と抗酸化機能発現の関係を知るために、カロテノイドの脂質ラフトへの局在性を明らかにすることを目的とした。用いたカロテノイドはβーカロテン、ルテチン、リコペンである。超遠心分離法ではいずれのカロテノイドともに繊維芽細胞脂質ラフト画分に分布したが、脂質ラフトに局在することを証明することはできなかった。極性アレン型カロテノイドであるフコチサンチンとネオキサンチンはβーカロテンと同様に繊維芽細胞の一重項酸素酸化反応を抑制することが明らかになった。脂質ラフトとは、コレステロールとスフィンゴ脂質に富む細胞膜中のマイクロドメインであり、細胞外から細胞内への情報伝達のプラットホームとして注目されている。脂溶性に富むカロテノイドは生体膜脂質二重層に分布することから、脂質ラフトへの局在を介してその特性に影響を与えることにより、細胞内情報伝達を調節する可能性がある。そこで、代表的な食事由来カロテノイドであるβーカロテン、ルテイン、リコペンを選択し、マウス繊維芽細胞の細胞膜における脂質ラフトへの局在性と膜脂質過酸化反応抑制および下流の情報伝達系としてのMAPキナーゼ系への影響を明らかにすることを目的とした。本年度は各カロテノイドの脂質ラフトへの局在性を以下のとおり試みた。1.一枚膜リポソームによるラフトモデルを作成して各カロテノイドを添加し、各カロテノイドのリポソームへの取り込みを検討したところ、ルテインはラフトモデル膜に取り込まれやすいことが明らかになった。2.培養細胞としてマウス繊維芽細胞NIH-3T3を用い、各フラボノイドを添加して細胞内取り込み量を検討したところ、βーカロテンが最も取り込まれやすいことが確認された。3.2.において培養後の細胞を洗浄後、密度勾配超遠心法によりラフト画分と非ラフト画分を分離した。その結果、ラフト画分に各カロテノイドが局在するパターンを示した。しかし、培養後の細胞をMethyl-beta-cyclodextrin処理によりラフト破綻させた後に、再評価してもパターンは変化しなかった。したがって、コレステロールに富むラフトにカロテノイドが局在することを証明することはできなかった。脂溶性に富むラフトは生体膜二重奏に分布することから、脂質ラフトへの局在を介してその特性に影響を与え、細胞内情報伝達系を調節する可能性がある。そこで、代表的な食事由来カロテノイドであるβーカロテン、ルテイン、リコペンを選択し、マウス繊維芽細胞の細胞膜における脂質ラフトへの局在性と膜脂質過酸化反応抑制および下流の情報伝達系としてのMAPキナーゼ系への影響を明らかにすることを試みた。前年度までに、ルテインよりもβーカロテンの方が細胞膜にとりこまれやすいが、両者ともラフトへの局在性を証明することはできなかった。そこで、本年度は極性カロテノイドに着目し、繊維芽細胞の光増感酸化反応に対するフコキサンチンとネオキサンチンの抑制作用を比較検討した。両極性カロテノイドともに、βーカロテンと同様にヘマトポルフィリンを増感剤とする光増感酸化反応で生じる過酸化脂質量を減少させた。この光増感酸化反応に由来するMAPーキナーゼを介したマトリックスメタロプロテアーゼー9(MMPー9)の発現上昇をβーカロテンは抑制したが、フコキサンチンとネオキサンチンはむしろ亢進させる傾向がみられた。一方、リポソームモデル実験により、フコキサンチン、ネオキサンチンは一重項酸素消去活性を有することを確認した。以上の結果から、両極性カロテノイドはβーカロテンと同様に繊維芽細胞の光増感酸化反応において抗酸化剤として働くが、それ自体が何らかの原因により直接的にMMPー9発現を亢進することが示唆された。したがって、極性カロテノイドの機能性評価には留意が必要である。当初予定した実験計画はほぼ実施することができた。ラフトへの局在を証明することはできなかったが、ほかの手法を導入することが必要と考えられた。農学脂質ラフトにおける過酸化コレステロール(Ch-OOH)生成量とMMP-9発現量の変化に対するカロテノイド添加の影響を追跡する。具多的には、カロテノイドを添加したマウス繊維芽細胞NIH-3T3を増感剤存在下で光照射し、照射後の細胞から既報に従って過酸化脂質量、zymographyによるMMP-9活性測定およびWestern BlotによるMMP-タンパク発現量測定を行う。各々カロテノイド添加の有無による影響を明らかにする。過酸化コレステロール(Ch-OOH)によるMMP-9発現量およびMAP-キナーゼ系の活性化に対するカロテノイドの影響を明らかにする。

1)カロテノイドを添加したマウス繊維芽細胞NIH-3T3に過酸化コレステロールを添加し、一定時間培養後のMMP-9発現量をWestern Blotにて測定する。MMP-キナーゼ系としてJNK, ERK1/2およびP38のリン酸化をWestern Blotで測定する。カロテノイド添加の有無による影響を評価する。
サルモネラの遅延型炎症誘導に関与するエフェクターの機能解析

研究代表者はこれまでに、サルモネラ属細菌の病原性発現メカニズムを明らかにするため、本菌の最も重要な病原因子として知られるIII型エフェクターの機能解析を行ってきた。その結果、5つのT3SS-2エフェクターの欠失株を腸炎モデルマウスに感染させると、遅延型炎症が見られなくなることを見出し、さらにこの5つのうち炎症誘導に最も重要なエフェクターHを同定した。本研究課題ではエフェクターHの機能を解析することで、サルモネラの遅延型炎症誘導機構を明らかにする。本研究の成果により、サルモネラ属細菌の病原性発現メカニズムの理解が進み、新たな感染予防および治療法の開発に繋がるものと期待される。
CPEの網羅的薬剤耐性遺伝子の変異解析と質量分析法を組み合わせた迅速検出法

わが国が2016年に発表した薬剤耐性対策(AMR)アクションプランでは、2020年までに薬剤耐性菌として蔓延傾向にあるカルバペネム系耐性腸内細菌科細菌、特にCarbapenemase producing Enterobacteriaceae(CPE)を中心とした薬剤耐性菌検出率の低減が途上国に求められた。薬剤耐性菌の蔓延を予防するためには、細菌が保有する薬剤耐性遺伝子を網羅的に検出することが必須と言える。現在、一部の医療施設ではPCR法での薬剤耐性遺伝子を市販のキット類で検査しているが、耐性遺伝子領域に変異が存在する場合には検出できないため、変異が存在しても検出できる網羅的なプライマーの開発が必要である。また、開発途上国では残念ながら高額な遺伝子検査機器が普及していない現状にあるため、薬剤耐性菌の蔓延を防止する対策の恐れが懸念される。そこで、本研究ではCPE(カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌)をターゲットに、開発途上国でも高額な機器を必要とせず、迅速で網羅的に薬剤耐性菌遺伝子をLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)法にて検出する検査技術の構築を目的としている。1薬剤耐性遺伝子領域の塩基配列を比較解析し、変異部分が存在しても増幅可能なプライマーの設計を実施する。2開発途上国での使用においては、高額な機器を必要としない策として薬剤耐性遺伝子の増幅にヒートブロック、検出には蛍光反応を利用した目視判定でかつ簡易な検査システムを構築する。3現状の薬剤感受性試験による表現型を用いた薬剤耐性菌鑑別をより迅速に実践するため、最先端の質量分析装置でのスペクトル波形と組み合わせた薬剤耐性遺伝子の網羅的な検出技術を開発する。今回はCarbapenemase主要5ファミリーとして、KPC(Klebsiella pneumoniae arbapenemase)、NDM(New Delhi metallo-beta-lactamase)、VIM(Verona integron-encoded metallo-beta-lactamase)、OXA-48-like(Oxacillin carbapenemases-48-like)、IMP(Imipenemase metallo-beta-lactamase)に対するLAMP法のプライマー設計を行った。その後、LAMP法の測定時の最適な条件設定について検討を実施した。最初にCarbapenemase主要5ファミリー遺伝子のプライマーを用いた反応温度の比較について行った結果、VIMは65°C、NDMは63°C、KPCは65°C、OXA-48-likeは65°C、IMPは61°Cで最速反応を示した。単独のCarbapenemaseを目的とする場合は最速反応温度で行うべきであるが、Carbapenemase主要5ファミリー遺伝子を同時に検出する場合は、63°Cが最も至適温度と考える。しかし、反応温度を上げることは特異性の向上にもつながるが、プライマーのミスマッチが存在する型についてはさらに詳細な検証が必要になる。次に、LAMP法の感度について検討を行った。抽出原液の×1/10倍段階希釈系列の反応性では、測定感度はいずれのカルバペネマーゼタイプでもVIM以外は2×10*3 copies相当まで検出できた。DNA量が少ない試料については、試料中テンプレート採取時に左右されることもあり正確な評価は困難であると推察される。この事は分離株からの分析では問題とならないが今後、臨床材料を直接分析する場合は重要性を増すと考えられる。NDMとKPCについては、マルチプルアライメント結果より、全てのLAMP法プライマーと全変異型の塩基配列が一致しているため全変異型の検出が推測できる。LAMP法プライマー設計において多様化しているのがIMPである。IMPについては変異型の多さより、1セットのLAMP法プライマーでの対応は困難なためIMP全ての変異型をマルチプルアライメントの結果からグループ1からグループ3の3つのグループに分類しプライマーを設計した。この中でグループ1のプライマーセットはわが国で頻発する変異型を多く含むことと所有菌株の関係から、IMPグループ1についての検証を実施する予定である。他の、KPC、NDM、VIM、OXA-48-likeについても所有株は少ないがLAMP法を行う。また、開発途上国では残念ながら高額な遺伝子検査機器が普及していない現状にあり、薬剤耐性菌の蔓延が懸念される。薬剤耐性菌の蔓延を防止するため、高価な遺伝子検査機器を保有していない施設や国でも簡易に実施できる遺伝子検査法として、専用の機器を必要とせず、簡易・迅速に薬剤耐性遺伝子のタイプが鑑別できる遺伝子増幅法としてLAMP法の導入を考える。その方法として、増幅にヒートブロックを用い、また、検出には蛍光反応を利用して目視判定を行えるように検討予定である。医療施設において慢性疾患治療中の患者や免疫低下症患者もしくは高齢者で抗菌剤投与前患者、長期抗菌剤投与患者などは、迅速な耐性菌検査情報を必要とする。今後は抗菌剤治療に貢献できるさらなる迅速耐性菌情報の提供の試みとして、検体から直接DNA抽出を行い、LAMP法を実施する予定である。

現在、一部の医療施設ではPCR法での薬剤耐性遺伝子を市販のキット類で検査しているが、耐性遺伝子領域に変異が存在する場合には検出できないため、変異が存在しても検出できる網羅的なプライマーの開発が必要である。また、開発途上国では残念ながら高額な遺伝子検査機器が普及していない現状にあるため、薬剤耐性菌の蔓延を防止する対策の恐れが懸念される。そこで、本研究ではCPE(カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌)をターゲットに、開発途上国でも高額な機器を必要とせず、迅速で網羅的に薬剤耐性菌遺伝子をLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)法にて検出する検査技術の構築を目的としている。1薬剤耐性遺伝子領域の塩基配列を比較解析し、変異部分が存在しても増幅可能なプライマーの設計を実施する。2開発途上国での使用においては、高額な機器を必要としない策として薬剤耐性遺伝子の増幅にヒートブロック、検出には蛍光反応を利用した目視判定でかつ簡易な検査システムを構築する。3現状の薬剤感受性試験による表現型を用いた薬剤耐性菌鑑別をより迅速に実践するため、最先端の質量分析装置でのスペクトル波形と組み合わせた薬剤耐性遺伝子の網羅的な検出技術を開発する。今回はCarbapenemase主要5ファミリーとして、KPC(Klebsiella pneumoniae arbapenemase)、NDM(New Delhi metallo-beta-lactamase)、VIM(Verona integron-encoded metallo-beta-lactamase)、OXA-48-like(Oxacillin carbapenemases-48-like)、IMP(Imipenemase metallo-beta-lactamase)に対するLAMP法のプライマー設計を行った。その後、LAMP法の測定時の最適な条件設定について検討を実施した。最初にCarbapenemase主要5ファミリー遺伝子のプライマーを用いた反応温度の比較について行った結果、VIMは65°C、NDMは63°C、KPCは65°C、OXA-48-likeは65°C、IMPは61°Cで最速反応を示した。単独のCarbapenemaseを目的とする場合は最速反応温度で行うべきであるが、Carbapenemase主要5ファミリー遺伝子を同時に検出する場合は、63°Cが最も至適温度と考える。しかし、反応温度を上げることは特異性の向上にもつながるが、プライマーのミスマッチが存在する型についてはさらに詳細な検証が必要になる。次に、LAMP法の感度について検討を行った。抽出原液の×1/10倍段階希釈系列の反応性では、測定感度はいずれのカルバペネマーゼタイプでもVIM以外は2×10*3 copies相当まで検出できた。DNA量が少ない試料については、試料中テンプレート採取時に左右されることもあり正確な評価は困難であると推察される。この事は分離株からの分析では問題とならないが今後、臨床材料を直接分析する場合は重要性を増すと考えられる。
ウシ筋肉内脂肪細胞分化における揮発性脂肪酸の役割の解明

本研究はウシ筋肉内脂肪細胞分化における揮発性脂肪酸の影響を明らかにすることを目的としている。平成30年度は、平成29年度より継続している分化初期における揮発性脂肪酸である酢酸とプロピオン酸の影響の比較に焦点を絞り研究展開した。その結果、中性脂肪蓄積量は酢酸よりもプロピオン酸の方が増加させた。また、脂肪酸分化関連遺伝子発現量においても、酢酸よりもプロピオン酸の方が増加させた。更に、グルコースを細胞外から細胞内へ取り込む作用を持つグルコース輸送体について、インスリン感受性であるグルコース輸送体4遺伝子とインスリン非依存性であるグルコース輸送体1遺伝子の発現量を比較した。その結果、両者への酢酸およびプロピオン酸の影響は異なる傾向を示した。以上の知見は、酢酸とプロピオン酸がウシ筋肉内脂肪細胞分化に与える影響の経路が異なっている可能性を示唆した。平成30年度は、ウシ筋肉内脂肪細胞分化初期における酢酸とプロピオン酸の影響について比較することに焦点を当て、研究展開した。その結果、「研究実績の概要」に示したような知見を得た。これまでに実施した解析の再現性実験をおこなう。更に酢酸とプロピオン酸の脂肪細胞分化初期の役割について、グルコースおよびインスリンの作用も考慮に入れた研究を展開する。そして最終年度である本年度にて、揮発性脂肪酸である酢酸とプロピオン酸のウシ筋肉内脂肪細胞分化における役割について考察したい。本研究はウシ筋肉内脂肪細胞分化における揮発性脂肪酸の影響を明らかにすることを目的とした。麻生ら(1995)によって樹立された黒毛和種筋肉内脂肪前駆細胞株の提供を受け使用した。本年度は分化誘導時に揮発性脂肪酸(酢酸、プロピオン酸、酪酸)を添加し、揮発性脂肪酸の受容体であるG protein-coupled receptor (GPCR) 41およびGPCR 43遺伝子発現量の経時的(分化誘導後0日、3日、6日、9日、12日)および分化誘導後6日目における各揮発性脂肪酸の各濃度(0 mM、10 mM、50もしくは100 mM)による動態を測定した。脂肪細胞分化の指標は、中性脂肪含量とした。1ウシ筋肉内脂肪細胞におけるGPCR41およびGPCR43遺伝子の相対的発現量を測定する手法を確立することに時間を費やした。今後更なる改良を実施する予定である。現在、平成28年度に遂行した実験を継続して実施している。2平成28年度の研究実施計画に記載している各揮発性脂肪酸の組み合わせによる遺伝子発現解析を実施出来なかった。今後実施する。平成28年度は揮発性脂肪酸の受容体であるG protein-coupled receptor (GPCR) 41およびGPCR 43遺伝子発現に着目し研究を推進した。しかしながら、それら発現量が少なくその動態を明らかにすることは難しいと判断した。これは、揮発性脂肪酸は受容体を介したシグナル伝達ではなく輸送体などによる取り込みにより、細胞内でその役割を担っている可能性を示唆した。よって本年度は研究計画を変更し、揮発性脂肪酸で牛ルーメン内において多く産生される酢酸とプロピオン酸(0, 5, 10, 25, 50 mM)が分化誘導後初期(0, 1, 3, 6日目)にどのような影響を及ぼすかを明らかにすることとした。その結果、酢酸とプロピオン酸は脂肪酸合成関連遺伝子発現量を濃度依存的に増加させた。これは、筋肉内脂肪細胞分化の初期に揮発性脂肪酸が脂肪酸合成経路に関与していることを示唆した。研究実績の概要にも示したが、これまでの研究成果よりウシ筋肉内脂肪細胞におけるGPCR41およびGPCR43遺伝子発現量が低いことから、研究計画を変更した。そのために時間を要してしまった。しかしながら、ウシ筋肉内脂肪細胞分化初期における揮発性脂肪酸である酢酸とプロピオン酸の重要性について示すことができた。平成28年度に実施したGPCR41およびGPCR43遺伝子発現量の経時的および各濃度による実験の再現性解析を実施する。更に、揮発性脂肪酸の組み合わせによる遺伝子発現解析をおこなう。平成29年度後半には、計画書の通り、GPCR41およびGPCR43遺伝子のノックダウン解析を予定している。平成29年度に実施した解析の再現性実験と脂肪酸組成の測定を実施する。

また、揮発性脂肪酸(酢酸とプロピオン酸)の脂肪細胞分化初期の役割について、脂肪酸合成関連遺伝子、脂肪細胞分化関連遺伝子、グルコース取り込みに関わる遺伝子の発現量と中性脂肪蓄積量および脂肪酸組成などの詳細な評価を検討している。更に、揮発性脂肪酸の輸送体遺伝子に着目した解析も考慮する。これまでに実施した解析の再現性実験をおこなう。更に酢酸とプロピオン酸の脂肪細胞分化初期の役割について、グルコースおよびインスリンの作用も考慮に入れた研究を展開する。そして最終年度である本年度にて、揮発性脂肪酸である酢酸とプロピオン酸のウシ筋肉内脂肪細胞分化における役割について考察したい。「現在までの進捗状況」に記述したような理由から研究の進捗状況が遅れていることにより、平成29年度において平成28年度の研究計画に使用予定であった研究費も執行する。GPCR41およびGPCR43に着目した研究(siRNA解析など)を変更したため、次年度使用額が生じた。実験計画変更に応じて、平成29年度以降の研究計画に使用予定であった研究費を執行する。細胞培養や遺伝子発現量解析などの消耗品に使用する。平成30年度までに遂行できなかった「今後の研究の推進方策」で記した研究を展開したいため、次年度使用額が生じた。細胞培養、中性脂肪蓄積量の測定、遺伝子発現量解析などに必要な消耗品に使用する。遺伝子発現解析およびノックダウン解析に使用する消耗品や試薬を購入する予定である。
13世紀のアンジュー帝国とその遺産に関する国制史研究--中世の英仏関係史論

従来の一国完結史観で捉えたイングランドやフランスの王国史を乗り越え、13世紀西欧世界の権力構造の中での、アンジュー帝国の果たした役割を検証した。イングランド在住諸侯は共同体を結成し、イングランド国王としてのプランタジネット家と共同で王国統治を担う体制を構築した。フランスでは現地領主や都市が相互に抗争して共同体を結成し得ず、カペー家の王は侯、伯と個別に封建契約を結んで自衛した。王家は北仏のごく一部しか直接統治しなかった。プランタジネット、カペー両家はフランス、ブリテン島の諸侯の帰属を取り付けるために競合した。中世の「帝国」を、諸侯や都市の核権力への帰属心をキーワードに説明し得ることを実証した。平成20年度には研究計画で述べた論点の整理と資料の解読に重点を置いた。代表者朝治は124852年のシモン・ド・モンフォールによるガスコーニュ統治が、アンジュー帝国の遺産経営における役割の歴史的意義を問い、それまで希薄だったアンジュー家当主と現地領主間の封建的主従契約の確立努力であったことを結論し、学会で発表した。分担者渡辺はフランス王家による封臣との合意形成のメカニズムを分析し、口頭発表した。分担者加藤はエドワード1世期にアンジュー家がガスコーニュ統治を封建制を実質化する方向で安定させようとしていたことを現地史料館物文書分析を通じて研究し、口頭発表した。これら三者の研究結果により、13世紀には英仏両王家とも、ガスコーニュ統治においては、封建的主従関係を主たる権力確立手段としようとしていたこと、そして現地領主は彼ら相互間では共同体的な秩序を形成し得ておらず、外部の上級権力に介入され、また彼らもその介入を利用して、利権を得ようとしていたことを突き止めた。大阪と東京でそれぞれ1回ずつ研究会を開催し、若手研究者の育成に努力した。その結果、院生の花房秀一がノルマンディ公領について、上田耕造がブルボン公領について、そして横井川雄介がガスコーニュ領主とカペー家との関係について、従来の通説を越えようとする研究をなしえた。また小野賢一は聖界領主のラントフリーデ的秩序形成について新しい見解を打ち出した。さらに研究協力者の青谷秀紀はフランドル諸都市のカペー家とアンジュー家との権力関係について通時的にたどり、複数の論点を抽出した。朝治、加藤が外国旅費を活用して英仏の文書館で史料を転写した。それらはいずれもファイル化され、相互に利用可能となった。論文集の執筆計画についても分担を決めるなど、具体化しつつある。朝治が論文「シモン・ド・モンフォールのガスコーニュ統治」において、プランタジネット家によるガスコーニュ領有方針と、ガスコーニュ・セネシャルであるシモン・ド・モンフォールによる統治策とを比較し、この二つが全く異なることを史料に基づいて実証した。従来の教科書的説明では、イングランド王国が大陸に植民地を有し、そこの土地と人民を支配収奪したのに対して、フランス国王がガスコーニュ奪回を目指してイングランド国王と戦ったという図式が見られた。朝治論文は現地の領主や都市政府のプランタジネット家への帰属心が、カペー家への帰属心を上回っていたことを実例を挙げて述べ、この地が植民地などではないことを結論した。この結論はマルコム・ヴェイルの想定する英仏関係の構図と軌を一にするものであり、中世英仏関係史研究の新しい方向を示している。加藤の「バスティード」論文はガスコーニュ現地領主による新都市建設の歴史的意義を実証した。渡辺の騎士や封建制に関する二編の論文は、王国形成における王権と意義と同時に、封建制の積極的意義を認め、封建領主による現地支配の重要性を説いた。これら三者の論考は、本研究が志向する欧米の新しい研究動向を反映した英仏関係史を描くという方針を、実現したものである。中村敦子の12世紀チェスター伯領に関する詳細な研究は、ノルマン征服という歴史的事件を一過性の衝撃とは見なさず、ノルマン王家とその封臣たちとによるイングランド封建国家建設の開始点を見なす、アングロ・ノルマン王国論の基礎的研究である。一方、横井川はガスコーニュの現地領主の帰属心を上訴事例を詳細に調べることによって調査し、花房はノルマンディー現地領主の対力ペー王家関係を調査し一面的な従属関係ではなかったことを突き止めた。さらに上田は14,15世紀のブルボン公による現地支配がフランス王国の国制において占める役割について新解釈を打ち出した。研究期間の最終年度にあたる今年度は、研究会を2度、6月と12月に開催し、各回ごとに研究報告と教科書執筆計画討論をした。1115世紀の英仏関係に関する欧文文献の紹介とコメントを加藤が、また英国の王国共同体とフランスの諸侯国家的国制について朝治が6月に報告した。

また12月には西岡がスコットランドと英仏関係について通時的に論点を概観した。これによって3年間で英仏を核とする二つの帝国的構造の併存と競争の状況が明らかになった。二つの核となる権力体は、それぞれイギリス、フランスだけではなく、周辺のスコットランド、アイルランド、ウェールズ、フランドル、ピレネー諸地域、イベリア半島にも影響力を及ぼしたことが明らかになった。他方、それらの地域の権力体も核権力への帰属を求めつつ、利益を引きだそうとした。プランタジネット家とカペー・ヴァロワ家とは「自国」だけでなく、皇帝権や教皇権を利用しつつ、周辺地域の帰属心を取り付ける競争を繰り返して、戦争を続けた。同時にこれらの成果を大学生向け教科書として刊行する当初の計画を実行に移した。出版社の同意を得て、全体構想を決め、執筆分担、執筆要項、執筆時期などを既に確定した。3年間のこの研究会に参加した教員と大学院生、学位取得者合計12名が協力して、「帝国的国制」の政治、経済、文化、外交、戦争、共同体、などを分担執筆する。これによって、中世英仏関係史を学生.にも理解させることが出来る、わが国では最初の教科書を生みだす。研究会としては今後も地域を拡大して、また人員を増やして、研究を継続する予定である。
C型インフルエンザウイルスCM2タンパク質の細胞質領域がウイルス増殖に及ぼす影響

C型インフルエンザウイルス(C型ウイルス)のCM2 (115アミノ酸)は、エンベロープに存在する膜タンパク質であり塩素イオンチャネル活性と水素イオンの透過性を示す。また、CM2はウイルス増殖に必須であり、ウイルスゲノムのウイルス粒子への取り込み(パッケージング)及び脱殻の過程に関与する。申請者はこれまでに、108位のSer (S108)をAlaに置換したCM2 (CM2 S108A)を持つウイルス様粒子(VLP)を細胞に感染させると、その細胞内のレポーター(GFP)遺伝子発現が低下することを明らかにした(未発表)。申請者らは、この実験系におけるレポーター遺伝子の発現低下は脱殻の抑制によることを報告していることから、S108は脱殻に関与すると示唆され、ウイルス増殖に関与する可能性が考えられた。今年度は、CM2のS108がウイルス増殖に影響を及ぼす可能性について、組換えウイルスを作製して増殖実験を行い、その真否を明らかにすることにした。CM2 S108Aを持つ組換えウイルスを293T細胞で作製し、この培養上清を発育鶏卵の羊膜腔内に接種した。4日後に回収した羊水のHA試験は陽性であったことから、組換えウイルスが回収できたと判断した。したがって、この配列はウイルス増殖に必須ではないことが考えられた。次に、この変異ウイルスと野生型ウイルスをMDCK細胞に接種し、継時的に回収した培養上清中の各ウイルス量をHA試験およびプラーク法で定量した。その結果、変異ウイルスは野生型ウイルスと同様の効率で増殖したことから、S108はウイルス増殖には関与しないことが明らかとなった。C型インフルエンザウイルス(C型ウイルス)のCM2 (115アミノ酸)はIII型膜タンパク質であり、短い細胞外領域(1-23位)と膜貫通領域(24-46位)、長い細胞質領域(47-115位)から構成される。当教室では、CM2がウイルス増殖に必須であることや、ウイルスゲノムのウイルス粒子への取り込み(パッケージング)及び脱殻の過程に関与することを明らかにした。CM2は塩素イオンチャネル活性と水素イオンの透過性を示す。これらの活性にはCM2の4量体形成が必須であると考えられている。最近、申請者はCM2の細胞質領域の73-75位の配列が4量体の形成効率や糖鎖の成熟に関与することを明らかにした。平成28年度は、この配列がウイルス増殖に及ぼす影響を解析することを目的とした。まず、73-75位をAlaに置換した変異CM2 (CM2 Ala 73-75)を持つ組換えウイルスを作製し野生型ウイルスと増殖を比較したところ、変異ウイルスで増殖能の低下が認められた。次に、ウイルス増殖過程のどの段階が障害されているかを明らかにするため、C型ウイルスと同じ構造を持ち、内部に1本のレポーター遺伝子(GFP-vRNA)を持つウイルス様粒子(VLP)を作製し、ゲノムのパッケージングについて解析した。CM2 Ala 73-75を持つVLPの産生量に差は認められなかった。VLP中のGFP-vRNA量は野生型より少し減少したが有意差は認められなかった。一方、ウイルス粒子及びVLPに取り込まれたCM2をウェスタンブロット法で解析したところ、量体形成は野生型と同様だったが、CM2の量は減少していた。従って、73-75位の変異によりCM2の糖鎖成熟や細胞膜への輸送が抑制されウイルス粒子へのCM2の取り込み量が減少し、その結果CM2の機能が抑制されてウイルス増殖能が低下する可能性が示唆された。平成28年度は、CM2の細胞質領域の73-75位の配列がウイルスの増殖に影響を及ぼすか否かについて解析し、増殖メカニズムに及ぼす影響の解析に着手する事が目標であった。まず、CM2の73-75位のアミノ酸配列を変異させた組換えウイルスを作製し、この配列がウイルス増殖に関与することを明らかにした。次に、同変異CM2を持つVLPを作製し、この配列がウイルスゲノムのパッケージングには大きな影響を及ぼさないことを明らかにした。さらに、これらの解析過程で、この配列はCM2のウイルス粒子への取り込みに関与することを示唆する結果を得た。以上の通り、当該年度の目標はほぼ達成できたことから、概ね順調に進展していると判断した。C型インフルエンザウイルス(C型ウイルス)のエンベロープに存在するCM2 (115アミノ酸)は、III型膜タンパク質であり塩素イオンチャネル活性と水素イオンの透過性を示す。また、CM2はウイルス増殖に必須でありウイルスゲノムのウイルス粒子への取り込み(パッケージング)及び脱殻の過程に関与する。申請者は、CM2の細胞質領域(47-115位)の73-75位の配列が4量体の形成効率や糖鎖の成熟に関与することを明らかにした。本研究の目的は、この配列がウイルス増殖に及ぼす影響を明らかにすることである。昨年度は、73-75位のアミノ酸の変異によりウイルス増殖能が低下すること、この配列はゲノムのパッケージング大きな影響を及ぼさないこと、上記変異によりウイルス粒子へのCM2の取り込み量が減少することを明らかにした。平成29年度は、CM2の細胞質領域の73-75位のアミノ酸がウイルス増殖の侵入から脱殻の過程に及ぼす影響を解析した。まず、CM2の73-75位のアミノ酸配列を変異させたCM2を持ち、さらに1本のレポーター遺伝子(GFP-vRNA)を持つウイルス様粒子(VLP)を作製した。