hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヘテロ原子の複合ラジカル反応特性を活かした高原子効率分子変換法の開発

日本において、世界的な生産量を誇る硫黄、セレンやテルルといったヘテロ原子を導入した化合物が、特異な反応性や生化学的な特性などの優れた特性を示すことが明らかとされている。そこで、これらの日本特産資源をより付加価値の高い物質へ変換する手法の開拓として、ヘテロ原子の導入を伴った新規な反応の開発は医薬学的、材料化学的、合成化学的に重要とされている。そこで、ヘテロ原子の導入を伴った高機能分子の革新的な合成プロセスの開発を目指し研究を行った。昨年度までにおいて、ヘテロ原子のラジカル反応特性を活かすことによって、不飽和結合に選択的にヘテロ原子を導入する反応の開発を行ってきた。さらに、ラジカル反応との反応性の比較を検討するために、遷移金属触媒反応を用いたヘテロ原子の導入を伴う新規反応の開発についても積極的に取り組んでおり、酸素や窒素といったヘテロ原子を有するアルケンを基質として用いることで、金属触媒を用いたアルケンへの硫黄官能基を達成することに成功した。そこで、昨年度は硫黄官能基ではなく、セレン官能基を選択的に導入する反応の構築を目指した研究を行い、内部アルケンを基質に用いた場合にパラジウム触媒がヒドロセレネーションを大きく促進する効果があることを見出した。さらに、上記の反応をきっかけとして不活性アルケンに対する遷移金属触媒を用いた付加反応についての開発を行った。金触媒は、π結合をルイス酸的に強く活性化することが知られているため、金触媒を用いた不活性アルケンのヒドロチレーションを検討した。種々の反応条件を検討し、金触媒を用いることで不活性アルケンに対するヒドロチオレーションが逆マルコフニコフ選択的に進行することを明らかにした27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。日本において、世界的な生産量を誇る硫黄、セレンやテルルといったヘテロ原子を導入した化含物が、特異な反応性や生化学的な特性などの優れた特性を示すことが明らかとされている。本年度は、ジフェニルジセレニドやジフェニルジテルリドといったヘテロ原子の光反応特性を活かすことで、不飽和結合に対してフッ素官能基(ペルフルオロアルキル基)を直裁的に導入する手法を含む一連のラジカル反応についてまとめ国際誌に投稿・掲載された。通常、導入に他段階を必要とするフッ素官能基を光照射という穏和な条件において、一段階で導入する反応を構築しその一般性を広めた。さらに、ラジカル反応との反応性を比較するために、遷移金属触媒反応を用いたヘテロ原子の導入を伴う新規反応の開発にも積極的に取り組んだ。その結果、一酸化炭素加圧条件下においてコバルト触媒を用いることで、不飽和結合に対してヘテロ原子である硫黄官能基の導入と増炭反応を一挙に行う反応を構築することに成功した。この反応では、生物活性を有する物質によく含まれるラクトン骨格を一段階で構築することができ、非常に高原子効率な反応である。この成果をまとめ国際誌に投稿・掲載された。さらに、パラジウム触媒を用いることで、不飽和結合に対してセレン官能基を同時に2つ導入する新規反応についても見出した。ハロゲン元素などの脱離基を用いない廃棄物を出さないプロセスでの反応を達成し、この成果をまとめ国際誌に投稿・掲載された。そこで、昨年度はラジカル反応との反応性の比較を検討するために、遷移金属触媒反応を用いたヘテロ原子の導入を伴う新規反応の開発に積極的に取り組んだ。ヘテロ原子の金属触媒反応はいまだ未開拓な分野であり、解決されていない問題が多数存在している。その中の一つにアルケンへの有機硫黄化合物の金属触媒的な付加反応が存在しており、私はこの課題をなんとか解決することができないかと考え取り組んだ。その結果、酸素や窒素といったヘテロ原子を有するアルケンを基質として用いることで、金属触媒を用いたアルケンへの硫黄官能基を達成することに成功した。本反応によって得られる生成物は構造中にN,S-および、O,S-アセタール構造を有していることから合成化学的にも非常に意義のある反応である。また、本反応によって得られる生成物は不斉点を有していることから、今後不斉配位子等を反応に用いることによって、不斉反応への応用が期待される。

そこで、これらの日本特産資源をより付加価値の高い物質へ変換する手法の開拓として、ヘテロ原子の導入を伴った新規な反応の開発は医薬学的、材料化学的、合成化学的に重要とされている。そこで、ヘテロ原子の導入を伴った高機能分子の革新的な合成プロセスの開発を目指し研究を行った。昨年度までにおいて、ヘテロ原子のラジカル反応特性を活かすことによって、不飽和結合に選択的にヘテロ原子を導入する反応の開発を行ってきた。さらに、ラジカル反応との反応性の比較を検討するために、遷移金属触媒反応を用いたヘテロ原子の導入を伴う新規反応の開発についても積極的に取り組んでおり、酸素や窒素といったヘテロ原子を有するアルケンを基質として用いることで、金属触媒を用いたアルケンへの硫黄官能基を達成することに成功した。そこで、昨年度は硫黄官能基ではなく、セレン官能基を選択的に導入する反応の構築を目指した研究を行い、内部アルケンを基質に用いた場合にパラジウム触媒がヒドロセレネーションを大きく促進する効果があることを見出した。さらに、上記の反応をきっかけとして不活性アルケンに対する遷移金属触媒を用いた付加反応についての開発を行った。金触媒は、π結合をルイス酸的に強く活性化することが知られているため、金触媒を用いた不活性アルケンのヒドロチレーションを検討した。種々の反応条件を検討し、金触媒を用いることで不活性アルケンに対するヒドロチオレーションが逆マルコフニコフ選択的に進行することを明らかにした当初計画していたヘテロ原子の導入を伴った、直截的な多環式複素環化合物の合成プロセスの開発を達成することはできなかった。しかし、ラジカル反応との反応性の比較を検討するために、遷移金属触媒反応を用いたヘテロ原子の導入を伴う新規反応の開発に積極的に取り組むなかで、これまで有機硫黄化合物の触媒毒の特性により、達成することが困難であるとされていたアルケンへの硫黄化合物の遷移金属触媒的な付加反応を開発することに成功した。この成果は、今まで未開拓であったアルケンへの硫黄化合物の遷移金属触媒反応という新たな分野を開拓することに繋がり、これからの化学の発展に大きく寄与するものだと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後の推進方策については、今までと同様にヘテロ原子の導入を伴った高機能分子の革新的な合成プロセスの開発を目指し引き続き研究を行う。当初の計画では、ヘテロ原子のラジカル反応特性のみに注目し研究をする予定であったが、遷移金属触媒反応にも注目し研究を行う。昨年度において、これまで困難であるとされていた、アルケンに対する硫黄官能基の付加反応を開発することで、新たな研究分野を開拓することに成功した。そこで本年度は、この研究を1つのきっかけとして、活性化されていない不活性アルケンに対する付加反応についても検討する予定である。具体的には、不飽和結合に対して特異な親和性を有する金属触媒に着目し、硫黄官能基を導入する新規反応の開発に取り組む予定である。また、硫黄以外の官能基の導入へと応用したいと考えており、現在有機セレン化合物を用いた反応についてすでに検討を進めている。当初計画していたヘテロ原子の導入を伴った簡便なキノリン骨格の構築については達成できていないが、遷移金属触媒や光反応を用いて、ヘテロ原子(硫黄、セレン、テルル、フッ素)の導入を伴ったラクトン骨格の構築や不飽和結合に対する様々な反応を多数開発することができた。
グローバルな視点からの日本の環境影響評価制度の再検討ー「国際標準」との差異の分析

2018年度はまず、前年度の検討を基に、環境影響評価(EIA)制度に係る国際標準の同定のための枠組みを作成した。すなわち、EIAに関し多数国間条約体制及び/又は多くの先進国が採用している制度・考え方等を「国際標準」と捉え、現在の日本のEIA制度において課題と考えられるいくつかの視点・側面について、国際法・規範及び他の国地域の国内(域内)法上の制度等の状況を調査するとともに、日本との比較を行うこととした。「他の国地域」としては、関係国の数や地理的な分布等を考え、米国、EU及びニュージーランドを中心とした。なお、本科研研究においては、研究対象とする「EIA制度」を、政府の意思決定に関連して環境への影響を評価する制度を広く含むものと考えている。この枠組によりメンバーで分担して調査を行い、その結果を10月に開催した研究会においてそれぞれ報告し、議論を行った。この調査・検討を踏まえて、垂直的・水平的な国際比較から見た日本のEIA制度の特徴やその背景について、2019年4-5月に開催される国際影響評価学会(IAIA)の年次大会(IAIA19)において報告を行うこととし、その申込みが受理された。以上の全体的な比較研究と並行して、EIA制度の国際的な発展の最新の状況を把握する等のため、2019年2月に開催されたUNECE越境EIA条約(エスポー条約)締約国会合に参加し、情報収集・実務専門家との意見交換等を行った。また、EIA制度の一形態ともいいうるEUの影響評価(IA)制度について、調査を進めた。国際法・外国法の調査を通じた国際標準の同定と日本制度の比較については、着実に進展しているものの、外国法(他の国・地域の法制度)の状況に関する現地調査については、文献調査に時間を要したこと等から2018年度内の実施に到らず、翌年度に実施することとなった。2019年度は、4-5月に開催されるIAIA19に出席し、本研究で行ってきた垂直的・水平的な国際比較を踏まえた、日本のEIA制度の特徴とその背景等について報告を行うとともに、EIA制度に関する国際的な議論の動向について情報収集を行う。ここで得られた知見等は、今後の研究にフィードバックしていく。また、これまでの研究では、水平方向での国際比較は文献調査のみに基づいているところ、今年度は、他の国・地域のEIA制度に関して現地調査を行い、制度の意義や実施状況についてより詳細な検討を行う。一方で、日本のEIA制度の中で、課題が多い等注目すべき一定の分野については、国際比較からの示唆を得ながらその改善・発展の方策を検討する。これらの調査研究を、国際標準の精査及びこれとの比較を踏まえた日本法のあり方の検討の深化に繋げる。これらの研究の成果については、公開での研究会を開催して報告・議論を行い、メンバー以外の参加者からも批判や助言を得て、さらに改善を図る。研究論文の執筆・公刊を行う。本研究は、近年の国際的な環境影響評価(EIA)制度の動向を踏まえてその「国際標準」を探り、これとの比較を通じて日本のEIA制度の在り方を再検討することを目的としている。1年目にあたる平成29年度はまず、研究の基本的枠組みを構築することを目標として、2回の全体研究会を開催しつつ、1)研究対象とする「EIA制度」の概念及び範囲の検討、2)国際法及び諸外国の国内法等の下でのEIA制度の状況並びに日本のEIA制度の現状と課題の把握、3)「国際標準」の意義とその同定の方法の検討、を中心に研究を行った。1)については、環境政策の一環としてのEIA制度に加え、政策評価等の他の(影響)評価制度を含めることについて検討した。2)については、資源利用の分野でのEIAに係る国際規範に関する検討、主要先進国・地域のEIA制度に関する基礎調査、等を行った。併せて、国際的な動きの影響を受けやすい面があると見られる途上国のEIA制度の状況についても、専門家から知識の提供を受けた。日本国内のEIA制度については、文献調査及び国内学会への参加を通じて動向や課題を把握するとともに、特に近年EIAとの関係で議論が多い風力発電施設にかかるゾーニングについては現地調査を行うなどにより、問題の把握等に努めた。3)については、1)2)を踏まえて、本研究における「国際標準」の概念、EIA制度の構成要素や論点のうち本研究がその「国際標準」に注目すべきもの、「国際標準」を同定するための方法、について検討を行った。本年度の研究を通じて、国際法及び各国・日本の国内法の下におけるEIA制度の現状を俯瞰し、次年度以降の本格的な国際標準の同定及び分析作業に向けた基礎を作ることができた。当初、平成29年度内に「国際標準」の同定のための具体的方法を定め、詳細調査の計画を策定する予定であったが、EIA制度については既存研究の蓄積が大きく、関連する論点も多岐にわたること等から時間を要し、平成30年度初めまで作業を継続することとなった。

「他の国地域」としては、関係国の数や地理的な分布等を考え、米国、EU及びニュージーランドを中心とした。なお、本科研研究においては、研究対象とする「EIA制度」を、政府の意思決定に関連して環境への影響を評価する制度を広く含むものと考えている。この枠組によりメンバーで分担して調査を行い、その結果を10月に開催した研究会においてそれぞれ報告し、議論を行った。この調査・検討を踏まえて、垂直的・水平的な国際比較から見た日本のEIA制度の特徴やその背景について、2019年4-5月に開催される国際影響評価学会(IAIA)の年次大会(IAIA19)において報告を行うこととし、その申込みが受理された。以上の全体的な比較研究と並行して、EIA制度の国際的な発展の最新の状況を把握する等のため、2019年2月に開催されたUNECE越境EIA条約(エスポー条約)締約国会合に参加し、情報収集・実務専門家との意見交換等を行った。また、EIA制度の一形態ともいいうるEUの影響評価(IA)制度について、調査を進めた。国際法・外国法の調査を通じた国際標準の同定と日本制度の比較については、着実に進展しているものの、外国法(他の国・地域の法制度)の状況に関する現地調査については、文献調査に時間を要したこと等から2018年度内の実施に到らず、翌年度に実施することとなった。平成30年度は、日本のEIA制度において課題となっている事項を中心に、EIA制度のいくつかの要素について、条約やその実施文書等におけるEIA関連規定及びEU・複数の先進国のEIA制度の状況に関する詳細調査を行い、これらに基づき、当該要素に係る「国際標準」の同定をめざす。条約等及び海外の国内(域内)制度の調査は、本研究のメンバーが分担して行い、調査結果の分析・考察については、メンバーが共同で行う。EIA制度全体に関する上記の研究と並行して、すでにある程度国際的な流れと日本との違いが明らかになっている個別分野におけるEIA制度や、特に国際標準からの示唆を得ての改善・発展が期待される特定種類の事業・計画等に係るEIA制度等について、個別課題として研究を行う。以上について、個々の調査・研究の進捗状況を確認しつつ、全体的な検討を効果的に進めるため、年度半ばに、メンバー全体の研究会合を開催する。2019年度は、4-5月に開催されるIAIA19に出席し、本研究で行ってきた垂直的・水平的な国際比較を踏まえた、日本のEIA制度の特徴とその背景等について報告を行うとともに、EIA制度に関する国際的な議論の動向について情報収集を行う。ここで得られた知見等は、今後の研究にフィードバックしていく。また、これまでの研究では、水平方向での国際比較は文献調査のみに基づいているところ、今年度は、他の国・地域のEIA制度に関して現地調査を行い、制度の意義や実施状況についてより詳細な検討を行う。一方で、日本のEIA制度の中で、課題が多い等注目すべき一定の分野については、国際比較からの示唆を得ながらその改善・発展の方策を検討する。これらの調査研究を、国際標準の精査及びこれとの比較を踏まえた日本法のあり方の検討の深化に繋げる。これらの研究の成果については、公開での研究会を開催して報告・議論を行い、メンバー以外の参加者からも批判や助言を得て、さらに改善を図る。研究論文の執筆・公刊を行う。
真空内四光波混合によるアクシオン探索

宇宙の暗黒物質源となり得るアクシオン的な未知の素粒子を2色レーザーを同軸上で混合することにより探索した。この探索は、一色目のレーザー光により未知粒子を生成し、同時に2色目のレーザー光により誘導崩壊させる手法「真空内四光波混合」に基づいている。探索の結果、統計的に有意な信号が得られなかった。この探索結果は、2つの論文として出版した。最初の探索結果は、この独創的な手法に基づく史上初の試みに相当する。QCDラグランジアンのCP対称性は、QCDの非摂導真空構造(θ真空)を色濃く反映している。θ真空の位相値は、元来、任意でよい(CP非保存)にも関わらず、実世界では、極めて良い精度でゼロ(CP保存)となっている。このため自発的に位相値をゼロに収斂させる機構が必要となる。アクシオン場は、このために予言された南部・ゴールドストンボゾン(NGB)である。アクシオン場は、その質量に依っては、暗黒物質の有力な候補になり得る。これまでレーザー場と静磁場を用いてアクシオンの生成と崩壊を観測する手法や太陽内でインコヒーレントに生成されるアクシオンを地上の磁場を用いて崩壊させる方法を常套手段として探索が行われてきた。本研究では、静磁場を用いない新しい測定手法として、真空中で2色のレーザー光を集光し、真空起因の四光波混合過程の観測により、アクシオン(擬スカラー)場の地上探索を実施することを目的として、第1に、真空内四光波混合光を検知するための光電子増倍管からのアナログ波形自体を、高時間分解能かつ100Hz以上のレート(ぺデスタル事象取り込みのため)で記録できる読み出しシステムの導入した。第2に、基本波ωを水中に集光し、校正用の広波長域のコヒーレント光を非線形光学効果により生成し、四光波混合光に相当する(2-u)ω(ただし、0<u<1)付近を選び出し校正用光源を作り出すことに成功した。この光源を探索用の光学系に同期させられるように組み込み、単一光子に対する光学系全体を含む検出効率の決定が可能となっている。第3に、焦点の極近傍のみを覆う小型の真空容器を製作し、残余原子起因のバックグラウンド四光波混合光の検出に成功した。その上で、原子起因バックグランド光を抑制しつつ、信号光である(2-u)ω光を、比較的調整が容易なスカラー場の場合の結合様式を要求した探索データを取得することに成功した。京都大学化学研究所内の共同研究者が運用するレーザー施設にて、原子起因の四光波混合過程を定量化する準備を進めた。並行して、統計的に有意にスカラー場が観測されなかった広島で行われたパイロット探索の結果に基づき、未知スカラー場と光子の質量ー結合関係において本探索手法により棄却できる領域を算出した。弱いレーザー場によるパイロット探索ながら、世界初の探索結果を査読付き論文として出版することに成功した。加えて、特に欧州で勃興している近未来のレーザーの高強度化計画を踏まえて、この手法に基づく未知のsub-eV弱結合共鳴場探索の展望を論文化した。θ真空の位相値は、元来、任意でよいにも関わらず、実世界では極めて良い精度でゼロとなっている。アクシオン場はこのために導入されたPeccei-Quinn対称性の破れに伴う質量ゼロの南部・ゴールドストンボゾン(NGB)である。アクシオン場は、擬NGB化を通じて質量を持ち得るが、その質量によっては暗黒物資の有力な候補と成り得る。これまでレーザーと静磁場を用いてアクシオンの生成・崩壊を観測する手法や太陽内で生成されるアクシオンを地上の磁場を用いて崩壊させる方法を常套手段として探索が行われてきた。本研究では、真空中で2色のレーザー光を集光し、真空起因の四光波混合光の観測により、軽い暗黒物質源となり得るアクシオンの地上探索を実施した。これまでに構築した真空容器内のレーザー集光系において、生成用光波(800nm)と崩壊誘導用光波(1064nm)のレーザーを同軸上で混合し、真空内四光波混合光の探索を実施した。その際、研究分担者が運用するレーザーシステムで得られる生成用レーザー光強度を2段階に用いて探索を試みた。比較的弱い初段階のレーザー強度による探索では、真空内四光波混合光が統計的に有意に見出されなかった結果を得た。この結果から、アクシオン場と光子との結合に対する上限値を、アクシオン場の質量の関数として見積り、論文として出版することに成功した。初段階の探索システムにより、残余原子起因の背景光の圧力依存性の定量化にも成功した。その結果、2段階目の最高強度レーザーによる探索には、真空系の根本的なアップグレードが必須であることが判明した。これらの経験を通じて、背景光の抑制方法の確立とその実践のために必要とされる研究課題を具体化することに成功した。

原子起因の四光波混合の定量化は小型の真空容器を用いて比較的残余ガス圧力の高い状態下で成功した。その結果、より高いレーザー強度環境下における原子起因の背景光に対する見積りが可能となった。しかし、レーザーのさらなる高強度化に備えて必要とされる到達真空度を達成するための大型の真空容器デザインを決定するのに相当な時間を要し、結果的に真空容器部品全体の年度内納品が間に合わなくなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。素粒子・原子核・レーザー実験27年度6月までに真空容器全体の納品が完了するため、納品終了後直ちにレーザーを高強度化した状態でより感度の高い探索を実施する。25年度当初の研究計画の9割は予定どおり達成できたため。擬スカラー場であるアクシオン場の探索には、生成用のレーザー場に特殊な偏光組み合わせを導入する必要がある。今後は、そのための偏光制御系を構築して、スカラー場探索と同様に擬スカラー場探索を、比較的弱いレーザー場を用いて実施する。その後、レーザー強度をさらに3桁程度上げ、再度、バックグランドの定量化を進めた上で、より弱結合に対する感度の高い本格的な探索実験を実施する。
細胞内リン酸化シグナル網羅的解析のためのペプチド固定化酸化チタンチップの開発

本研究では、光触媒や太陽電池として利用されている酸化チタンのセルフクリーニング機能に着目し、これを基板として用いることで、基板そのものが非特異的吸着物除去能を有するペプチドアレイを開発し、プロテインキナーゼ活性の網羅的解析技術確立に向けての有効性を示すことを目的とする。具体的には夾雑物除去能の高い酸化チタン基板の作製方法、基質ペプチド固定化方法などを検討した。まず酸化チタン薄膜を塗布した基板へのペプチド固定化方法の検討を行った。ここでは、ポリアクリル酸による基質ペプチドの固定化を試みた。これは酸化チタンがカルボキシ基とエステル結合を形成することを利用した方法である。蛍光標識したポリアクリル酸溶液を酸化チタン基板あるいはガラス基板にスポットし、超音波洗浄を数回繰り返したのちアレイスキャナーにて観察したところ、酸化チタン基板においてのみ強い蛍光が観察され固定化されていることが確認できた。次に、タンパク質の非特異的吸着抑制効果について検討した。ここでは蛍光標識したタンパク質を基板に吸着し、水洗浄操作の前後でアレイスキャナーにより吸着量を測定した。ガラスと酸化チタン基板で比較したところ、酸化チタン基板では吸着したタンパク質の大部分を水洗浄のみで除去できることが示され、酸化チタン基板の利点を示すことができた。具体的には夾雑物除去能の高い酸化チタン基板の作製方法の確立、基質ペプチド固定化方法の確立、および基板上でのリン酸化反応速度などを検討し、定量的な評価が可能か評価していく。今年度の研究実施計画に基づき、ゾルゲル法を用いて酸化チタン基板を作製した。この基板は紫外線照射により表面が超親水化した。また前駆体溶液の組成を変えることにより、非常に滑らかな表面を持つ基板を作製できた。続いて、基質ペプチドの固定化方法について検討した。ここでは当初の予定を変更して、ポリアクリル酸による基質ペプチドの固定化を試みた。現在、ポリアクリル酸へ基質ペプチドを導入しているところである。最後に、タンパク質の非特異的吸着量を測定する手法を検討した。ここではシアノ酢酸を用いて夾雑物を修飾し、IR測定によるシアノ基の定量結果から夾雑物の固定化量を評価する手法について検討した。その結果、基板上への固定化量を見積もることはできたものの、感度の面で問題が残った。今後は蛍光物質を修飾し非特異的吸着物の吸着量を見積もる手法を検討していく。今年度の研究実施計画に基づき、酸化チタン薄膜を塗布した基板へのペプチド固定化方法の検討を行った。ガラスと酸化チタン基板で比較したところ、酸化チタン基板では吸着したタンパク質の大部分を水洗浄のみで除去できることが示された。最後に市販のプロテインキナーゼを用いて、基板上でリン酸化反応を試みた。

リン酸基と選択的に結合する部位を持つ蛍光物質を用いて検出を試みたところ、微弱ではあるがペプチド固定化部位から蛍光が観察された。ただしバックグランド蛍光が高かったため、リン酸化反応が進行したと断定する結果は得られなかった。今後は測定条件の最適化が必要である。
尿路平滑筋幹細胞の創出と尿道括約筋再生のための基盤的研究

尿失禁は尿が不随意に漏れる状態であり、社会的・身体的に問題となる状態と定義され、本邦でも多くの患者が存在する。本申請研究では、人工多能性幹細胞等による尿道括約筋機能再生を目指した基盤的研究を行なった。複数の条件下において、尿道括約筋幹細胞候補株を誘導することができた。その一部の細胞株では、免疫組織学的染色により平滑筋細胞マーカーの発現を確認した。本年度は、ヒトiPS細胞を平滑筋細胞へ分化させる一つの方法として,レチノイン酸(Retinoic acid:RA)をiPS細胞に添加する方法を試みた。ヒトiPS細胞に対し,RA添加後7日目10日目にはRT-PCRにて平滑筋に特異的に発現するマーカーであるSmooth Muscle Actin (SMA)の発現を確認することができた。Myocardin,Myosin Heavy Chain (MHC)などのSMA以外の平滑筋マーカーを免疫組織的染色により確認することにより,ヒトiPS細胞を用いた平滑筋細胞への分化誘導実験を実施している。しかしながら,iPS細胞を患部に直接移植する方法では,機能を回復させるだけの十分量の平滑筋細胞に分化させることができず,その効率性に問題があることが予想されるため,我々はiPS細胞から自律増殖能を有する尿路平滑筋幹細胞(平滑筋細胞再生に必要な,自律的自己増殖能を持つ幹細胞)の樹立を目指し,研究を遂行中である。本年度は、レチノイン酸(Retinoic acid:RA)をiPS細胞に添加することにより,ヒトiPS細胞を平滑筋細胞へ分化させることに成功した。RA添加後10日目にはRT-PCRで平滑筋特異的マーカーであるSmooth Muscle Actin (SMA)の発現を確認し,免疫組織的染色でMyosin Heavy Chain ,Myocardin,(MHC)などSMA以外の平滑筋マーカーも確認し,ヒトiPS細胞の平滑筋細胞への分化誘導を証明した。平滑筋への分化過程の中で,自律増殖能を有する尿路平滑筋幹細胞(平滑筋細胞再生に必要な,自律的自己増殖能を持つ幹細胞)の存在が予見される細胞コロニーを認めた。尿路平滑筋幹細胞の樹立により,量的,質的に効率よい尿道平滑筋括約細胞の再生が可能となり,得られた十分量の平滑筋細胞移植により,生体での括約筋機能回復が可能となる。現在,myocardin promoterが平滑筋分化への重要な役割を担っていると考えており,myocardin promoterの発現を強力に誘導することにより,尿路平滑筋幹細胞を発見するための研究を遂行中である。我々は,排尿筋ならびに尿道括約筋機能再生を目指している。既に,iPS細胞から平滑筋細胞への分化誘導は成功している。効率のよい平滑筋細胞の再生のために,尿路平滑筋幹細胞株の樹立を目指しており,そのためにmyocardin promoterが重要な役割を担うと考えており,現在,研究は順調に遂行できている。本年度は、ヒトiPS細胞を平滑筋細胞へ,分化させることにほぼ成功した。その一つの方法として, Retinoic acidを使用する実験系を確立することが出来た。ヒトiPS細胞から平滑筋細胞への分化は,MyocardinやSmooth Muscle Actin (SMA),Myosin Heavy Chain (MHC)などをマーカーとして,PCR法,免疫組織学的染色法で,それらの発現をみることにより,分化誘導を確認した。その誘導過程で,尿道括約筋再生,ならびに実用化にに大きな役割を果たすと考える尿路平滑筋幹細胞の存在が推測されるコロニー群を分離し得た。我々が独自に開発した組織幹細胞特異的に,強力に遺伝子発現を可能にする特許技術を駆使して,その分離精度を高めるべく,重症難治性尿失禁に対する尿道括約筋再生へ向けて研究を遂行中である。我々は,排尿筋ならびに尿道括約筋機能再生を目的としている。その最初の一歩として,ヒトiPS細胞を平滑筋細胞へ分化させる一つの方法として,レチノイン酸(Retinoic acid:RA)をiPS細胞に添加する方法を試み成功した。現在,研究はおおむね順調に進んでおり,今後も研究計画書に沿って,研究を遂行する。泌尿器科学現在,研究は順調に進展しており,今後も研究計画調書に則り,研究を遂行する。物品を予定より安価に購入できたため,未使用額が生じた。次年度支払い請求分に本年度未使用分をあてがい,有効適正に研究を遂行する予定である。次年度支払い請求分に本年度未使用分をあてがい,引き続き研究計画に基づき有効に適正に使用する。
小児白血病発症におけるチロシンホスファターゼPTPICの分子生物学的検討

PTP1C(最近SHP-1に統一されたので以下SHP-1)はチロシンホスファターゼの一つで、細胞増殖に関する造血細胞の細胞内シグナル伝達において重要な役割を演じていることが明らかになりつつある。今回、EPO依存性白血病細胞株をモデルにして、SHP-1と血球増殖分化との関係をとくに赤血球造血に焦点をしぼり解析した。エリスロポエチン(EPO)依存性白血病細胞株UT-7とその亜株でより赤芽球系へ分化したUT-7/EPO、EPO刺激で赤芽球系へ分化するUT-7/GM間における比較から、UT-7/EPOはEPOに対して最も感受性が高く、SHP-1の発現はほとんどなく、EPOレセプター(EPOR)の発現は高いことを見いだした。また、UT-7/GMをEPO存在下で赤芽球系へ分化誘導したところ、週を追うごとに赤芽球分化の指標であるγ-グロビンやEPORの発現量が多くなり、一方、SHP-1の発現量は減少した。これに伴い、EPO感受性も増加した。これらのことから、赤芽球系への分化に伴うEPO感受性の変化はEPORのみならずSHP-1の発現量の変化も深く関与していることが示唆された。次に赤芽球分化に伴うEPOの感受性の変化がSHP-1の発現量に依存しているか否かを解析した。ヒト正常骨髄細胞から分離した単核球をFACSを用いて、より未分化なCD34(+)glycophorinA(-)群とより赤芽球系へ分化したCD34(-)glycophorinA(+)群とに分け、これら2群におけるSHP-1の発現をFACSを用いて解析した。より未分化なCD34(+)glycophorinA(-)群ではSHP-1の発現が高く、より赤芽球系へ分化したCD34(-)glycophorinA(+)群ではそれに比べてSHP-1の発現が低いことがわかった。すなわち正常骨髄細胞においても未分化な細胞から赤芽球系へと分化するにつれて、SHP-1の発現が低下することが明らかになった。したがって赤芽球分化に伴うEPO感受性の変化にはEPO受容体だけでなくSHP-1の発現量の変化が深く関与していることが示唆された。本研究では赤芽球分化に伴うエリスロポエチン感受性の変化がPTPlCの発現量に依存しているかどうかを解析し、正常赤血球造血におけるPTPlCの役割を明らかにする事を目的とした。(1)正常骨髄細胞でのPTPlCの発現ヒトの正常骨髄細胞を採取し、単核球に分離する。FACSを用いて、より未分化なCD34(+)、glycophorinA(-)群とより赤芽球系へ分化したCD34(-)、glycophorinA(+)群とに分ける。これらの2群におけるPTPlCの発現をFACSを用いて解析する。〈結果〉正常骨髄細胞においてはFACSによる解析の結果、より未分化なCD34(+)、glycophorinA(-)群ではPTPlCの発現が高く、より赤芽球系へ分化したCD34(-)、glycophorinA(+)群ではそれに比べてPTPlCの発現が低いことがわかった。つまり、正常骨髄細胞においても未分化な細胞から赤芽球系へ分化するにつれて、PTPlCの発現が低下することが明らかになった。このことが赤芽球系への分化に関与していると予想される。(2)PTPlC強制発現によるUT-7/EPOのエリスロポエチンに対する影響wild type PTPlC cDNAとmutant PTPlC cDNAを発現ベクターに組み込み、エリスロポエチンに対して高感受性を示すUT-7/EPOにそれぞれ遺伝子導入し、強制発現させる。これらの細胞における、エリスロポエチンに対する感受性をMTT法を用いて解析する。〈結果〉現在様々なベクターにPTPlC遺伝子を組み込んで、electroporation法で遺伝子導入を行っている。

より未分化なCD34(+)glycophorinA(-)群ではSHP-1の発現が高く、より赤芽球系へ分化したCD34(-)glycophorinA(+)群ではそれに比べてSHP-1の発現が低いことがわかった。すなわち正常骨髄細胞においても未分化な細胞から赤芽球系へと分化するにつれて、SHP-1の発現が低下することが明らかになった。したがって赤芽球分化に伴うEPO感受性の変化にはEPO受容体だけでなくSHP-1の発現量の変化が深く関与していることが示唆された。
ローマ元首政期の皇帝とイタリア地方都市

本年度は、追加調査として、属州都市の様子を見ようとトルコのローマ都市を見学し、イタリア・ミラノにおける国際学会でこの科研費の研究の報告をした。以下はこの報告の要旨である。帝政初期後半、五賢帝時代のトライアーヌス帝以降、ローマはイタリア地方都市の自治に財政面で介入してくる。皇帝が任命するcuratorreipublicaeの地方都市への派遣である。このような中央ローマの地方都市への介入が地方都市を衰退させ、さらにはローマ帝国を衰退させた原因である、と言われてきた。私はここで、時期を限定し、curator rei publicae出現以前、帝政初期前半の中央ローマとイタリア地方都市の関係を見てみた。イタリア地方都市は中央ローマの政治に係わることをやめ、自己完結的な目的、公共施設の建築に邁進した。この時期のイタリア地方都市における公共事業の多さがそのことを物語っている。すなわち、都市の外観をローマにまねて美化することに関心を集中させた。イタリア地方都市の多くは、この時期、建築ブームとなっていた。一方、中央ローマは、ローマの政治決定能力を一身に集中させ、その過程で政治的に高度化された皇帝の地位を巡る権力闘争に明け暮れることになる。この時期の第一級史料を提供するポンペイを例に取ると、都市は中央ローマに様々な形で接近を試みる。それは都市が中央ローマを単に公共事業の資金提供者としか見ていないのであって、中央ローマの政治に参加しようというのではなかった。本年度は、ポンペイ、ミラノ、ローマ、その他北イタリア都市の研究を中心に行った。その際、スペインのローマ都市を比較の対象とした。スペインは他の属州に比べローマ化がきわめて早くから行われ、都市の建設、公共建築物の整備もかなり早い時期に始まっている。スペインと比べイタリア都市のローマ化は思ったほど早くない。同盟市戦争後、イタリア都市は一斉に都市の整備にエネルギーをそそぐ。この時代は、ローマ史では一般に「内乱の一世紀」と呼ばれ、内乱の打ち続く混乱の時代と理解されるが、イタリア地方都市のレベルでは、建築ブームの時代である。イタリア都市内部の社会に目を向けると、共和政末期から解放奴隷の社会進出が目覚しい。碑文から同職組合の幹部などに解放奴隷出身者が就任している例が多数見られる。今回のイタリア・スペイン調査において、ミラノ市立博物館館長・アルスラン博士、ミラノ大学教授・サルトーリ博士などと意見を交換することが出来た。最近豊かな成果を上げているイタリア考古学を援用し、中間的まとめをすると、共和政末期から元首政期の時代、イタリア地方都市は一見、都市ローマの政治状況とかなり異なる姿をあらわしているように見える。平成13年度はイタリア地方都市から見たローマ社会像を再構成することをテーマとし,そのため,ローマの一地方都市ポンペイの社会の実態解明をめざした。ポンペイには都市の政治を支配した数十の有力家門や,また,アウグストゥスの祭祀を差配するアウグスターレスと呼ばれた解放奴隷層が確認されている。都市郊外に数十残る豪華な墳墓の内,少なくとも十以上が解放奴隷出身の家続のものであることが知られている。解放奴隷層の社会進出と商工業の発達は密接に考えなければならない。ローマ経済の大問題である商工業の発達をどの程度に見るか,という点について,ポンペイの事例はこの問題の再検討を迫っている。考古学資料と碑分資料により数代にわたる家族の歴史が再構成できた。ポンペイ内の社会ばかりでなく,ポンペイとローマの関係も重要である。ポンペイから,ローマ中央の元老院に入った人物は確認されていない。有力家門はローマ全体の身分からいえば騎士身分であったろう。とすればポンペイはきわめて標準的なイタリア地方都市であったと見ることが出来る。特に他のイタリア都市と比べてローマと結びつきが強いとはいえない。

フィンランドの研究者カステロンによれば,ポンペイの有力家門はローマとの関係(ローマの有力者,例えば皇帝との個人的関係)から勢力を伸ばせたと考えるが,私の分析では明確にそのような結論は導き出せなかった。また,ポンペイにおいて,今までの調査を補完する追加の調査を実施した。今年度はポンペイ以外のイタリア地方都市および、より大きな比較を目指し、イタリアとは異なる属州都市についての現在までの研究状況を調査した。属州とイタリアの行政面での差異は属州総督の有無であった。イタリア都市は直接、ローマの共和政時代からの政務官の支配下にあり、その政務官の上に元老院と皇帝がいる構図だった。総じてイタリア都市へのローマの介入は少なく、有るとすれば元老院がその主体だったが、おおむねイタリア各都市の自治に都市行政はゆだねられていた。都市自治の担い手は、共和政期のローマのように、市民の参加する民会、都市有力者の集まりである市参事会、それに都市の行政と担当する一年任期の都市政務官であった。このような都市ローマに似た都市の外観および都市行政組織は同盟市戦争(前90年-前88年)後、徐々に、まずイタリアに、それから属州に定着したものである。ローマ共和政末期から元首政期はイタリア地方都市にとっては、中央ローマのような都市外観を得ようとした建築ブームの時期であったと言えよう。ところで、中央ローマの皇帝とイタリア地方都市の人的つながりについてであるが、皇帝は名誉職としてある都市の保護者あるいは都市政務官に就くことはあるが,これは形式的なもので、実質的にその都市が他の都市より政治的に優遇された例はあまり見受けられない。元首政期のイタリア都市はローマの平和(PAX ROMANA)の下、ローマとは距離をおいて、各都市が積極的に都市の建築にせいをだしている様子がうかがえる。本年度は、追加調査として、属州都市の様子を見ようとトルコのローマ都市を見学し、イタリア・ミラノにおける国際学会でこの科研費の研究の報告をした。以下はこの報告の要旨である。帝政初期後半、五賢帝時代のトライアーヌス帝以降、ローマはイタリア地方都市の自治に財政面で介入してくる。皇帝が任命するcuratorreipublicaeの地方都市への派遣である。このような中央ローマの地方都市への介入が地方都市を衰退させ、さらにはローマ帝国を衰退させた原因である、と言われてきた。私はここで、時期を限定し、curator rei publicae出現以前、帝政初期前半の中央ローマとイタリア地方都市の関係を見てみた。イタリア地方都市は中央ローマの政治に係わることをやめ、自己完結的な目的、公共施設の建築に邁進した。この時期のイタリア地方都市における公共事業の多さがそのことを物語っている。すなわち、都市の外観をローマにまねて美化することに関心を集中させた。イタリア地方都市の多くは、この時期、建築ブームとなっていた。一方、中央ローマは、ローマの政治決定能力を一身に集中させ、その過程で政治的に高度化された皇帝の地位を巡る権力闘争に明け暮れることになる。この時期の第一級史料を提供するポンペイを例に取ると、都市は中央ローマに様々な形で接近を試みる。
糖尿病性腎症の関与する蛋白のプロテオーム解析-特にTGF-βの新規標的分子の検索

TGF-βのシグナル伝達分子Smadが明らかにされ、当初はSmadがTGF-βのシグナルのほとんどを伝えるものと予想されたが、Smad以外にも、TAK-1-TAB-1系、MAPK系など、多くのシグナル伝達系がTGF-β受容体の下流に位置することがわかった。TGF-βの標的遺伝子及び蛋白が細胞の種類や条件によって異なり、さらに糖尿病性腎症や糸球体腎炎のような病的状態におけるTGF-□のシグナル伝達に関しては、複数の分子が複雑に関与する可能性があり、また未知なる分子も関与することであろうと予想される。糖尿病性腎症の発症及び進展過程では、高血糖の他、酸化ストレス、AGE(糖化最終産物)、アンギオテンシンII(Ang-II)、ポリオール代謝経路などが重要であるが、そのいずれもがTGF-βをメデエーターとして糸球体硬化や間質線維化に関与することが明らかにされている.TGF-βは上記の代謝異常の主なメデエーターと考えられるが、糖代謝そのものに影響を与えるものではない.糖尿病性腎症の進展過程では糖尿病の代謝異常に関与するメデエーターとTGF-βの作用発現に介在するメデエーターは重複するものとそうでないものがあると予想される.プロテオーム解析、すなわち、機能蛋白を含む蛋白の発現パターンの変化を読みとることで新規の標的蛋白を同定が可能となってきたため、この手法により、新たなTGF-βの標的蛋白分子の同定のため、主に糖尿病性腎症を対照として研究を行った.培養メサンジウム細胞をAGE存在下で培養を行い、細胞内に活性酸素の増加を認めた、さらにこれはAng-IIの産生増加をもたらし、これがTGF-βの産生と分泌を増加させた。この結果、Smad蛋白が活性化され、細胞外基質タンパクであるファイブロネクチンの産生を遺伝子レベル・蛋白質レベルで増強する一方、基質分解を抑制するPAI-1の産生を促進した。この結果より、AGEがAng-IIを介してTGF-β/Smadを介して糖尿病性腎症に寄与することが明らかになった。さらに培養平滑筋細胞において、TGF-βは、Smad4のリン酸化及びSmad4を介してPAI-1の産生を増強することを明らかにした。この系を用いて、AGEやTGF-□に関連する標的分子を明らかにしていくTGF-βのシグナル伝達分子Smadが明らかにされ、当初はSmadがTGF-βのシグナルのほとんどを伝えるものと予想されたが、Smad以外にも、TAK-1-TAB-1系、MAPK系など、多くのシグナル伝達系がTGF-β受容体の下流に位置することがわかった。この系を用いて、AGEやTGF-□に関連する標的分子を明らかにしていく糟尿病性腎症の発症及び進展過程では、高血糖の他、酸化ストレス、AGE(糖化最終産物)、アシギオテンシンII(Ang-II)、ポリオール代謝経路などが重要であるが、そのいずれもがTGF-βをメデエーターとして糸球体硬化や間質線維化に関与することが明らかにされている.TGF-βは上記の代謝異常の主なメデエーターと考えられるが、糖代謝そのものに影響を与えるものではない.

糖尿病性腎症の進展過程では糖尿病の代謝異常に関与するメデエーターとTGF-βの作用発現に介在するメデエーターは重複するものとそうでないものがあると予想される.プロテオーム解析、すなわち、機能蛋白を含む蛋白の発現パターンの変化を読みとることで新規の標的蛋白を同定が可能となってきたため、この手法により、新たなTGF-βの標的蛋白分子の同定のため、主に糖尿病性腎症を対照として研究を行った.培養メサンジウム細胞たは糸球体上皮細胞、尿細管上皮細胞をTGF-β・AGE・Ang-II・高グルコース存在下で培養し、細胞質内または核内より計時的に蛋白を抽出、この抽出蛋白を蛋白分解酵素で処理し電気泳動を行い、発現蛋白の比較検討を行った。得られた蛋白を、非特異的分子、TGF-β特異的蛋白分子、糖尿病性腎症特異的蛋白分子と考え、未知の蛋白分子について遺伝子解析・アミノ酸分析を行った。糖尿病性腎症の発症及び進展過程では、高血糖の他、酸化ストレス、AGE(糖化最終産物)、アンギオテンシンII(Ang-II)、ポリオール代謝経路などが重要であるが、そのいずれもがTGFβをメデエーターとして糸球体硬化や間質線維化に関与することが明らかにされている.TGF-βは上記の代謝異常の主なメデエーターと考えられるが、糖代謝そのものに影響を与えるものではない、糖尿病性腎症の進展過程では糖尿病の代謝異常に関与するメデエーターとTGF-βの作用発現に介在するメデエーターは重複するものとそうでないものがあると予想される.プロテオーム解析、すなわち、機能蛋白を含む蛋白の発現パターンの変化を読みとることで新規の標的蛋白を同定が可能となってきたため、この手法により、新たなTGF-βの標的蛋白分子の同定のため、主に糖尿病性腎症を対照として研究を行った.培養メサンジウム細胞をAGE存在下で培養を行い、細胞内に活性酸素の増加を認めた、さらにこれはAng-IIの産生増加をもたらし、これがTGF-βの産生と分泌を増加させた。この結果、Smad蛋白が活性化され、細胞外基質タンパクであるファイブロネクチンの産生を遺伝子レベル・蛋白質レベルで増強する一方、基質分解を抑制するPAI-1の産生を促進した。この結果より、AGEがAng-IIを介してTGF-β-Smadを介して糖尿病性腎症に寄与することが明らかになった。この系を用いて、AGEやTGF-βの標的分子を明らかにしていく。糖尿病性腎症の発症及び進展過程では、高血糖の他、酸化ストレス、AGE(糖化最終産物)、アンギオテンシンII(Ang-II)、ポリオール代謝経路などが重要であるが、そのいずれもがTGF-βをメデエーターとして糸球体硬化や間質線維化に関与する。TGF-βは上記の代謝異常の主なメデエーターと考えられるが、糖代謝そのものに影響を与えるものではない.糖尿病性腎症の進展過程では糖尿病の代謝異常に関与するメデエーターとTGF-βの作用発現に介在するメデエーターは重複するものとそうでないものがあると予想される。機能蛋白を含む蛋白の発現パターンの変化を読みとるプロテオーム解析によって、新規の標的蛋白を同定することが可能となってきた。培養メサンジウム細胞を用いて、AGE-Ang-II-TGF-β-Smadという系を介して、細胞肥大、基質タンパク(ファイブロネクチンなど)、PAI-1の産生といった、糖尿病性腎症における糸球体硬化形成に寄与することを明らかにした。引き続き、TGF-βの下流域にある分子の検索を行っている。一方、慢性腎不全患者では、Ang-II受容体拮抗薬(ARB)が、その進行に関連することが明らかにされている。慢性腎不全患者では、血漿TGF-β濃度が腎不全の進行とともに増大することから、ARBの血漿TGF-β濃度に対する影響を検討したところ、ARB開始12週間後に、その低下を認めた。
NMRとX線小角散乱によるクロコウジカビ酸性プロテアーゼAの折れたたみ機構の解析

クロコウジカビA.nigerが分泌する酸性プロテアーゼAは、基質特異性、阻害剤に対する反応性等の性質が、従来のペプシン型酵素とは著しく異なる。intact酵素の分子量は22,000で、軽鎖(39残基)と重鎖(173残基)の2本鎖が非共有結合的に結合している。プロテアーゼAは酸性では安定であるが、中性以上のpHで不可逆的に変性し軽鎖と重鎖が解離する。本研究では、プロテアーゼAの水溶液中の構造、中性変性中間状態ならびに変性過程の解析を行ない、プロテアーゼAの折れたたみ機構を明らかにするためにNMRスペクトルとX線小角散乱の測定を行った。本酵素のpH変性について種々の方法を用いて、詳細な解析を行った結果、変性の中点pHはNMRで6.6,CDで6.1、HPLCで6.0とNMRがCDやHPLCに比べて約0.4高かった。NMRとCDによる変性中点pHの差については、変性中間体の存在が現在唯一の整合的な解釈であるが、その構造的特徴も側鎖の3次構造が天然状態に保たれたまま主鎖の2次構造は壊れている、というモルテングロビュールとは逆の性状を有している。動的構造を解析するために^<13>C,^<15>Nラベル蛋白質を調製し、多核3次元NMRスペクトルを測定して解析を行っている。また、酸性から弱アルカリ性の種々のpHでX線小角散乱の測定を行った。その結果Kratky plotから、(1)pH4.5ではfolded structure、pH6.75や7.0ではunfolded stateである、(2)pH6.2では完全なfolded stateでもunfolded stateでもない中間的な状態である、ことが分かった。pH6.2のKratky plotは、モルテングロビュール状態の特徴と似てはいるが、本蛋白質の場合この特徴は、側鎖の3次構造が天然状態に保たれたまま主鎖の2次構造は壊れているために生じたと考えられる。
身体および接触対象への映像重畳投影が触質感知覚に及ぼす影響の解明

29年度が最終年度であるため、記入しない。
リピドキナーゼの分子生物学的・遺伝子組織化学的研究

PI3-Kには基質特異性からI,II,III型があり、そのII型で肝臓に特異的に発現する分子種のcDNA cloningに成功した。これは肝臓切除後に発現が増強する特徴を示し、肝臓再生過程に深く関与することが示唆された。共同研究者のL.C.Cantleyが別件で来日した際に本学に立ち寄ってもらい、この新分子種の機能について研究討論し、その細胞生物学的解析を分担して遂行すべくcDNA供与を行い、その半年後に共同解析進展をめざして共同研究者の阪上洋行がL.C.Cantleyのもとに短期出張した。また、我々が1997年に哺乳類で初めて分子同定・発表したCDP-diacylglycerol synthase(CDS)及びPI代謝経路でその次に反応を触媒するphosphatidylinositol synthase(PIS)(他者が同定発表)の両者の脳内遺伝子発現局在を解析・発表し、共同研究者のJ.A.Glomsetと後藤薫と三人が仙台に会して、既に発表してきたdiacylglycerol kinase(DGK)サブタイプの発現との組織特異的関連性について討論し今後の研究戦略を練った。一方、脂肪酸結合蛋白分子については共同研究者のF.Spenerと大和田祐二を研究室相互訪問させて最新の世界情報を入手したうえで、大和田と近藤が皮膚型分子の遺伝子ノックアウトマウスの作成に着手した。またphosphatidate phosphatase(PAP)の特異な脳内発現局在についても発表し、さらにphospholipase D(PLD)の分子同定をしたM.A.Frohmanは本共同研究者の野沢義則の紹介で来日して研究打ち合わせをし、その脳内遺伝子発現解析を遂行して間もなく発表予定である。ジアシルグリセロール(DG)キナーゼについて、研究分担者W.J.van Blitterswijkと共同でラットとヒトの新分子種θ型を遺伝子クローニングにより固定して、脳内発現局在と活性特性を明らかにして別紙の如く欧文誌に発表した。また、DGキナーゼで生成されるフォスファチジン酸を代謝するCDP-DGシンターゼの分子構造を脊椎動物で初めて当研究室で独自に解明して欧文誌に発表した。分担者の後藤薫が同じく分担者のJ.A.Glomsetの研究室に3ヶ月滞在して、アラキドン酸特異DGキナーゼの抗体を作成して、免疫組織化学的解析をサル網膜と脳で行った。さらに、フォスフォリパーゼA1の遺伝子工学的解析を指導すると共に、膜リン脂質の質的・量的変化の解析実験法を習得した。昨年度までに我々が脊椎動物ではじめてのPl4キナーゼ2分子種の分子構造を発表したが、その所見をもとに、Pl3キナーゼのうちで肝臓にのみ発現して肝臓再生時に発現増強する新分子種を遺伝子クローニングにより同定して、その内容は欧文誌に印刷中である。研究分担者D.M.Huntを訪ねて、リピドキナ-分子多様性と発現調節の解析戦略を討論し、我々が解析発表したラットPl4-キナーゼのcDNAを用いて、ヒト相同分子をとりだし、そのゲノム解析を開始させた。目下radiation hybrid mappingを遂行中である。分担者L.C.CantleyにはラットPl4-キナーゼcDNAを提供して、かれらが独自で部分シークエンスを解析発表したヒト同類酵素と機能的異同を比較検討している。リピドキナーゼの機能的重要性のさらなる解析発展をめざして、脂肪酸結合蛋白の細胞内機能を研究しているF.Spenperから特異抗体を提供してもらい脳内分布を蛋白と遺伝子レベルで解析して、リピドキナーゼのとの異同を検討中である。さらに、副腎髄質細胞と脳神経細胞の発生・機能的関連性を追及しているG.D.Pappasを当研究室に招いて、研究成果の相互交換討論をおこなった。

分担者の野沢義則はオハイオとケースウエスタンリザ-ブ大学に出張して、リピドキナーゼの分子遺伝学的解析について彼我の研究所見を比較検討して、今後の新展開に役立てようとする。我々が1996年に世界に先駆けて分子同定・発表した哺乳類ラットのphosphatidy1inositol 4-kinase(PI4-K)alpha(230kDa)とbeta(92kDa)の染色体地図上での位置同定を共同研究者であるD.M.Hunt(London)に依頼して開始した。しかし、その解析進展している最中、データベース検索によりこのヒト・ホモログの同定とその染色体位置が外国から先行・報告された{chromosome 1q12-22forPI4K(acc no.P37297)and22q11 forPI4Kalpha(acc no.P342356}ので、この共同研究は中断せざるを得なかった。一方、PI3-Kには基質特異性からI,II,III型があり、そのII型で肝臓に特異的に発現する分子種のcDNAcloningに成功した。これは肝臓切除後に発現が増強する特徴を示し、肝臓再生過程に深く関与することが示唆された。共同研究者のL.C.Cantleyが別件で来日した際に本学に立ち寄ってもらい、この新分子種の機能について研究討論し、その細胞生物学的解析を分担して遂行すべくcDNA供与を行い、その半年後に共同解析進展をめざして共同研究者の阪上洋行がL.C.Cantleyのもとに短期出張した。また、我々が1997年に哺乳類で初めて分子同定・発表したCDP-diacylglycerolsynthase(CDS)及びPI代謝経路でその次に反応を触媒するphosphatidy linositol synthase(PIS) (他者が同定発表)の両者の脳内遺伝子発現局在を解析・発表し、共同研究者のJ.A.Glomsetと後藤薫と三人が仙台に会して、既に発表してきたdiacylglycerol kinase(DGK)サブタイプの発現との組織特異的関連性について討論し今後の研究戦略を練った。一方、脂肪酸結合蛋白分子については共同研究者のF.Spenerと大和田祐二を研究室相互訪問させて最新の世界情報を入手したうえで、大和田と近藤が皮膚型分子の遺伝子ノックアウトマウスの作成に着手した。またphosphatidate phosphatase(PAP)の特異な脳内発現局在についても発表し、さらにphospholipase D(PLD)の分子同定をしたM.A.Frohmanは本共同研究者の野沢義則の紹介で来日して研究打ち合わせをし、その脳内遺伝子発現解析を遂行して間もなく発表予定である。