hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
急性期虚血性脳疾患におけるPET診断簡略化を目指した自動検出解析システムの開発

本研究では,急性期虚血性脳疾患における脳PET検査のルーチン化を目指すため,コンピュータ支援技術を利用し,既に開発した無採血簡略的検査法に組み合わせる自動検出解析システム構築を目的とした.その結果,MatlabおよびImage Jソフトを用いて,脳梗塞動物および臨床PET画像における自動関心領域設定および脳左右比の計算を加えた自動解析システムを開発できた.また,Image Jではシルビウス裂と脳梗塞領域の自動検出システムの付加にも成功した.本研究では,急性期虚血性脳疾患における脳PET検査のルーチン化を目指すため,コンピュータ支援技術を利用し,既に開発した無採血簡略的検査法に組み合わせる自動検出解析システム構築を目的とした.その結果,MatlabおよびImage Jソフトを用いて,脳梗塞動物および臨床PET画像における自動関心領域設定および脳左右比の計算を加えた自動解析システムを開発できた.また,Image Jではシルビウス裂と脳梗塞領域の自動検出システムの付加にも成功した.当該年度の研究実施計画では、急性期中大脳動脈閉塞を施した動物モデルに対し、計算技術用ソフトMATLABを使用して脳梗塞領域を自動検出解析するプログラム作成を目的とした。しかし、当施設の小動物PET装置が未だ実用化に至らず開発段階ということもあり、小動物データを使わず既に確立されているヒトのデータを用いて研究を始めることにした。我々は簡単にプログラム可能であると言われているMATLAB言語をプラットホームとして選択したが、この言語を用いて一からソフト開発を行った経験がなく基本的なプログラム手法から習得する必要があり多くの時間を費やした。また、臨床医療用画像は、通常8あるいは16ビットで構成されており、画像マトリックス数も64×64512×512まで多種多様であるので各画像に対応する画像入出力プログラム作成には非常に困難を要した。したがって、当該年度内ではヒトの脳PET画像を入出力可能な画像表示システムの構築までを可能とした。目標であった画像解析プログラムの導入は行えなかったので次年度以降の課題である。このシステムを構築開始する以前から、我々は虚血性脳疾患における無採血簡略的検査法を開発に取り組んできたわけだが、この研究の開始段階では改善の余地ある方法であった。そこで、放射性薬剤投与後の撮像方法を検討して更なる検査時間短縮化に成功した。この簡便化検査法と研究課題の自動検出解析システムを最終的に構築し組み合わせることによりPET診断の簡略化が更に向上すると思われた。本年度は、前年度に構築したシステムに対して、脳局所の関心領域(ROI)の設定および脳左右比の計算を加えた画像解析プログラムの導入を目標とした。被検者は急性期脳梗塞の中でも、梗塞発症730日程度経過した亜急性期虚血性脳疾患を対象とした。開発当初、脳の両側面に対し、単純に楕円形のROIを配置するプログラムを構築した。その後、ROI内の各ピクセル値の積算値、平均値、標準誤差、最大値、最小値等の各パラメータの算出する手法を組み込んだ。また、脳左右比を計算させる過程も加えた。ここまでの過程に関しては、未だ開発段階の小動物PET装置で撮像されたラットの脳画像においても確認できた。しかし、マウスの脳画像に関しては、装置自体の解像力の影響で画像が不鮮明であり、このプログラムの効果を確認できていない。本年度後半には、解析に不要なシルビウス裂や局所脳梗塞領域を省いてROI値を取得するプログラム開発を目指した。この開発にあたり、まずMRI画像とPET画像の適切な融合画像の作成が重要となるため多くの時間を割いた。ROI中の解析不要領域を自動的に検出するプログラムに関して、シルビウス裂の検出は3テスラMRI形態画像の頭部横断面に対し、ソーベルフィルタを用いて、エッジ強調処理を行った後、直線成分を抽出するハフ変換を利用して検出可能だと思われた。しかし、ハフ変換のプログラム構築が困難であり現在も完成には至っていない。一方、局所的陳旧性脳梗塞の検出については、造影MRI画像等の形態画像に対して、2値化を行い、閾値を1と設定して、それ以上を脳梗塞とすることで検出可能と考えられたが、脳梗塞領域が非常に小さく、被検者によっては梗塞数も多数あり、先に述べた融合画像作成の成功の有無が適切なROI値の取得に著しく影響した。したがって、本年度の最終目標であったプログラムの完成には至っておらず、特に融合画像の作成において改善の余地があり、来年度の課題であると思われた。本年度は、これまで構築してきた動物および臨床PET画像における自動関心領域(ROI)設定および脳左右比の計算を加えた画像解析プログラムの完成を目標とした。また、解析に不要なシルビウス裂や局所脳梗塞領域を省いてROI値を取得する自動検出解析システムの改良および導入を試みた。前年度まではMatlab言語を使用し、亜急性期虚血性脳疾患患者および18F-FDGのラット画像において画像解析プログラムの有用性を確認できたが、本年度は、^<18>F-FDG画像よりもノイズを多く含み、脳領域の把握が困難な^<15>Oガス投与のラット脳画像にも適用を試みた。形態情報を有するMRIとPETの融合画像の作成に多くの時間を費やし、正確に融合できるプログラムに改良したところ、手動のROI設定による脳左右比の計算結果と良く一致した。これをマウス適用したところ、脳画像が非常に小さいため画質が悪く光手動による結果と比べて差が生じた。次に、自動検出解析システムの改良を行った。

特に、前年度開発途中であったシルビウス裂や脳梗塞の検出プログラムの完成を目指したが、この検出に必要なハブ変換プログラムをMatlab言語により作成するためには多くの時間を要したので、無償かつ汎用性も高く様々なライブラリが組み込まれているImage Jを用いた開発に切り替えた。このソフトにはハフ変換プログラムが既に存在したため、ヒトMRI画像におけるシルビウス裂の検出に成功し、これをPET画像に反映させてROI中からシルビウス裂を除去するシステムを完成できた。また、同じプログラムを用いて脳梗塞領域の検出を試みたところ、非常に小さい脳梗塞領域や多数の梗塞がある場合を除き、その検出に成功した。脳梗塞モデル動物においても、脳半球の多くが梗塞領域である場合に検出できた。PET研究において迅速かつ簡便な診断および解析ツールは重要である。今後、Image JのJava言語プログラムを参考にし、Matlab言語に応用することで自動検出かつ解析が可能な新しいソフト開発が完成できると思われた。
糖質消化吸収関連遺伝子の転写調節の分子機構

1.小腸における遺伝子発現と関連する転写補足因子(Coactivator)の検討:主要な転写補足因子として、ラットのCBP、p300、AEA70、TIF2、SRC-1のcDNAをクローニングした。CBPとp300が小腸で高い発現性を示した。2.発達に伴う糖質消化吸収関連遺伝子の発現変動と関連する転写調節因子の検討:ラットの小腸に発現している甲状腺ホルモン受容体TRα-1とTRα-2のうち、TRα-1の発現だけが生後13日から20日にかけて一過的に上昇した。これに伴い小腸の糖輸送担体(GLUT5,GLUT2,SGLT1)のmRNA量が平行して増大した。この時期にT_3を投与すると、いずれの糖輸送担体の遺伝子発現量も増大した。哺乳・離乳移行期における小腸の糖吸収関連遺伝子の発現上昇はTRα-1を介して起こる可能性が示唆された。3.核内転写因子のリン酸化・脱リン酸化調節による転写活性の変動:大腸菌で発現させたCdx-2をPKAでリン酸化したところ、ラクタ.ゼ(LPH)遺伝子転写制御領域への結合活性が低下した。Caco-2細胞におけるLPHmRNAの発現量はT_3とアデニル酸シクラーゼの活性化剤forskolinの同時投与により著しく低下した。スクラーゼ・イソマルターゼ(SI)遺伝子の転写制御領域へのCdx-2二量体の結合はPP1によるCdx-2の脱リン酸化により促進された。4.糖質消化吸収関連遺伝子発現の日内リズム形成機構の検討:ラット空腸から調製した核を用いてRun-on assayを行った。SIと糖輸送担体は転写レベルで同調した日内変動を示した。時計遺伝子per2とBMAL1は小腸でも発現し、食餌摂取のタイミングにより糖質消化吸収関連遺伝子の発現と同様に位相のシフトを示した。SI遺伝子の転写抑制因子E4BP4の発現は糖質消化吸収関連遺伝子とは逆の位相で日内変動を示した。1.小腸における遺伝子発現と関連する転写補足因子(Coactivator)のクローニング:主要な転写補足因子として、ラットのCBP、p300、AFA70、TIF2、SRC-1のcDNAをクローニングした。この中では、CBPとp300が小腸で高い発現性を示し、特にp300は小腸に強く発現するというように小腸特異的な発現性を示した。CBPおよびp300の核内レセプター結合領域とGAL4活性化ドメインの融合タンパク質発現ベクターを構築し、これを核内因子とともにヒト小腸様細胞株Caco-2にtransfectするtwo-hybrid assayの系を確立した。2.発達に伴う糖質消化吸収関連遺伝子の発現変動と関連する転写調節因子の検討:離乳前から離乳完了期のラット小腸におけるラクターゼ(LPH)の発現に及ぼす甲状腺ホルモン(T_3)の影響を検討した。小腸のLPH mRNA量は離乳開始直前に最大を示した後、離乳完了期まで徐々減少したが、この減少に伴い、小腸のCdx-2mRNA量は減少し、LPH遺伝子5'上流の転写制御エレメントへのCdx-2の結合量も減少した。離乳期のラットにT_3を投与したところ、Cdx-2mRNA量が低下し、LPH mRNA量も減少した。

従って、小腸の発達に伴うLPH遺伝子発現量の減少は、甲状腺ホルモンによる転写調節因子Cdx-2の発現量の低下およびその転写制御エレメントへの結合活性の減少によって起こるものと考えられた。3.Cdx-2のリン酸化・脱リン酸化調節による転写活性変動機構の検討:大腸菌で発現させたCdx-2をcAMP依存性プロテインキナーゼでリン酸化したところ、LPH遺伝子転写制御領域への結合活性が低下した。Caco-2細胞におけるLPH mRNAの発現量はT_3とアデニル酸シクラーゼの活性化剤forskolinの同時投与により著しく低下した。従って、LPH遺伝子の発現はリン酸化シグナルによるCdx-2のDNA結合活性の変化により制御されていることが示唆された。1.糖質消化吸収関連遺伝子の甲状腺ホルモン核内受容体(TR)を介した調節機構の検討:小腸における主要なTRサブタイプであるTR-αおよびその標的遺伝子である糖輸送担体GLUT5について、出生後の発達過程における発現変動の関連性を検討した。ラットの小腸にはTRα-1とTRα-2の2つのアイソフオームが発現していた。生後13日から20日にかけてTRα-1の発現だけが一過的に上昇し、これに伴い小腸の糖輸送担体(GLUT5,GLUT2,SGLT1)のmRNA量が平行して増大した。この時期にT_3を投与すると、いずれの糖輸送担体の遺伝子発現量もさらに増大した。分化型ヒト小腸様細胞株Caco-2でもT_3によってTRα-1とGLUT5の遺伝子発現が増大した。GAL4-TRキメラレポーターアッセイ法によりT_3による転写活性化能をTRα-1とTRα-2で比較してみたところ、TRα-1にのみ転写活性化能が見られた。従って、哺乳・離乳移行期に見られる小腸の糖吸収関連遺伝子の発現上昇はTRα-1の発現量の増大を介して起こっている可能牲が示唆された。2.糖質消化吸収関連遺伝子の日内リズム形成機構の検討:核Run-on assayにより、ラット小腸におけるスクラーゼ・イソマルターゼ複合体(SI)および糖輸送担体(GLUT5,GLUT2,SGLT1)は転写レベルで同調した日内変動を示すことが明らかになった。時計遺伝子per2およびBMAL1は小腸でも発現しており、食餌摂取のタイミングにより糖質消化吸収関連遺伝子の発現と同様に位相のシフトを示した。SI遺伝子の転写抑制因子E4BP4の発現は糖質消化吸収関連遺伝子とは逆の位相で日内変動を示した。従って、小腸における時計遺伝子群の発振するリズムがE4BP4を介して、糖質消化吸収関連遺伝子の発現量に日内変動をもたらしていることが示唆された。
マイクロ・ナノ電気穿孔法による細胞核への分子導入法の開発

マイクロ・ナノ電気穿孔法を発展させた細胞質-核の分画技術(SINC-seq: Single-cell integratednuclear and cytoplasmic RNA sequencing)に関して検討した.この方法は,マイクロ流路に作製したオリフィスに1細胞を近接させ,そこに直流電場を印加することで,細胞膜の選択的破砕,細胞質成分の電気泳動による抽出,細胞質と核の高精度分画を実現するものである.本方法では細胞外から細胞内へ物質を輸送する場合と異なり,比較的長い時間(数十秒間)に渡って直流電場を印加する.数値解析および可視化実験から,物質導入の場合と異なり,直流電場の印加時に細胞内部で生じる輸送現象は電気泳動支配であると分かった.このことは例えばRNAの網羅解析等においては好都合であり,抽出効率におけるRNA分子の長さに依存したバイアスを生じにくいなど優れた特徴を与えることが明らかになった(under review).抽出した細胞質RNAと核RNAを用いてそれぞれ次世代シーケンシング解析を実施し,細胞質RNA -核RNAの発現における相関性について詳細に議論した.また,K562細胞を脱アセチル化阻害剤であるNaB (sodium butyrate)を含む環境で培養し,細胞のエピゲノム状態に与えた摂動が核-細胞質RNAの発現ダイナミクスへ伝搬する様子を詳細に調べた.これらの成果をGenome Biology誌に報告した(Genome Biol 2018).さらに,開発したSINC-seq法の応用展開として可逆的な細胞固定法との融合やsmall RNAシーケンシングへの適用について検討し,それらの成果を国際誌(Anal Chem 2018a, Anal Chem 2018b)において報告した.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度はA20(mouse lymphocyte), K562 (human immortalised myelogenous leukemia line)およびプライマリーサンプルを用いて電気穿孔の実施と生体高分子の膜透過性について検討した.細胞の大きさ,溶液の電気電導性等に応じて電場あるいはマイクロ流体システムのデザインを調整することでそれぞれの細胞に応じた電気穿孔条件を与えることができた.電気穿孔に続く直流電場の印可については,すべての細胞について同様の条件を与えたが,試作したマイクロ流体システムは概ね再現性良く機能することが確認できた.ただし,特に直径の大きな細胞に対して試作したマイクロ流体システムにおいて,流路断面積を増加させたことに伴い電場による流れと比較して水頭差による流れが無視できなくなり,流れの制御が困難であった.この点を改善するため,今後流路構造の最適化を行う計画である.また,2色の蛍光を同時かつ個別に計測できる光学顕微鏡システムを構築し,それぞれの蛍光を発するトレーサ粒子を用いたマイクロPIV(Particle Image Velocimetry)法を確立した.本方法は,光学系により二つの励起光の導入と二つの蛍光を同時に観察できるシステムであり,これにより,電場により誘起されるマイクロ流れのダイナミクス計測が可能になった.ここで開発した可視化技術を応用して,等速電気泳動を用いたDNA分子とマイクロビーズの反応促進技術を解析し,DNA分子およびマイクロビーズの濃縮領域における混合現象を明らかにした.本年度はマイクロ流路中に設置したトラップ構造とマイクロ流路端に接続した逆円錐状のウェルを用いてマイクロ・ナノ電気穿孔の自動化および並列化を目指した.この方法は,ウェルに投入した一細胞が重力あるいは遠心力により沈降し,液体の流動で自動的にマイクロ流路へ流入し,その後トラップ構造において捕獲されるという一連の過程を自動化する技術である.この方法をK562細胞を用いて評価したところ,90%以上の確率で生存状態の細胞を捕獲できることがわかった.また,逆円錐状のウェルはマイクロピペットの先端と容易に接続できるため,電気穿孔後の細胞の回収率を大幅に向上できた.一方,トラップ構造は細胞の捕獲に加えて電流経路の限定により局所的に電場を集中できるため,結果的に一様電場と比較して印可電圧を1/10程度にまで低減できた.以上の基盤技術検討に加えて,マイクロ流路を32ユニット並列化したマイクロ流体プレートの製作技術について検討した.前述の逆円錐状ウェルとマイクロ流路端はそれぞれ機械加工により製作した金型および微細加工により製作した鋳型を用いて製作しており,これらの一体成型のために,はめ合いを利用した位置合わせ法を考案した.本年度の検討において本製作技術により目的の構造を成型できることが確認できた一方で,鋳型の耐久性に課題があることが分かった.H28年度において本課題の解決を図る.当初の計画通り,蛍光顕微鏡を用いた可視化計測により,細胞膜を介した核酸の輸送について計測した.ここでは,SYBR Green IIを用いてRNAおよびDNAを蛍光化し,蛍光顕微鏡によりそれらの流動を計測した.また,一方で電気穿孔の前後において直流電場を与えた状態で電流を計測し,時間の経過と共にマイクロ流路内部における電解質イオンの濃度分布が変化する様子を電流計測から捉えることができることを示した.-オリフィス径と核膜に与えられる電場強度について系統的に解析を行い,それらを関係付ける近似式を開発した.近似式の妥当性を数値解析結果と比較することで検証し,その近似式で精度良く電場強度を算出できる範囲を明らかにした.

具体的には,オリフィス径が細胞膜と核膜の距離と比較して小さい場合に近似式は精度良く電場強度を予測できるのに対して,オリフィス径が前述の距離と同程度あるいは大きくなると予測精度が低下することがわかった.ただし,本研究が対象としているマイクロ・ナノ電気穿孔はオリフィス径が十分に小さいという条件を通常満たすため,近似式は本研究の対象範囲において有用であると結論づけた.-細胞周期を同定するためにHoechstを用いてDNA量を定量する光学計測システムを構築した.このシステムでは加えて三種の蛍光DNAを観察するために合計四色のLED照明を組み合わせた.蛍光DNAとして末端をFAM, Cy3およびCy5で修飾した22ntの一本鎖DNAを用い,各蛍光計測に他色の蛍光の漏れ込みがどの程度あるか評価し,それらの漏れ込みを補正する係数行列を実験的に求め,蛍光計測の定量性を高めた.-本研究ではPDMS製のマイクロ流路を使用しているが,PDMSはタンパクが非特異的に吸着しやすい材料として一般的に考えられている.しかし,核酸分子(RNAおよびDNA)の吸着性に関して定量的に評価した研究例は少なく,ここでは特にRNAのPDMSに対する吸着性を評価した.まず,RNAを蛍光色素で染色して定量する方法を試みたが,電場印可時の電気泳動を観察できるという利点がある一方で,蛍光色素自体がマイクロ流路表面に吸着して定量評価の妨げになることがわかった.そこで,RT-qPCRを併用し約101,000 pgのRNAをマイクロ流路内で電気泳動させた場合,壁面への吸着は10%程度以下であることを明らかにした.H26年度においてマイクロ電気穿孔の基本的な実験システムを構築し,マウス由来のA20細胞を用いて原理検証を達成した.これに加えて,実験システムのマイクロ流路内部における流体の流れと核酸分子の濃度を同時に計測する二色蛍光同時計測システムを構築し,その応用例として核酸のハイブリダイゼーションの加速実験を実施した.H27年度はマイクロ電気穿孔システムを改良し,逆円錐状ウェル構造およびオリフィスを有するマイクロ流路で構成する新しいチップデザインを開発し,遠心操作を活用することでウェルに滴下した一細胞を生存状態でオリフィスに捕獲する方法を確立した.また新しいチップデザインの採用により印可電圧を従来の1/10程度に低減できることが分かった.H28年度は蛍光観察システムを四色に拡張するとともに,蛍光計測の定量性を大幅に改善する補正係数行列を作成した.また,マイクロ電気穿孔システムの応用範囲を検証するため,様々な大きさを有する細胞を用いて実験を行なったところ,1040 μmの細胞で正常にシステムが動作することを確認できた.以上加えて新たな展開として,電気穿孔時に細胞から溶出する核酸分子が高い品質を有していることが予備実験から明らかとなったため,これを活用して網羅的遺伝子発現解析へ展開することを検討している.マイクロ・ナノ電気穿孔法における膜穿孔をSmoluchowski式で記述し,細胞膜における分子透過性および電気伝導性の局所的な変化を数値解析的に算出した.さらに,Nernst-Plank式により電解質イオンおよび核酸分子の流動を解析した.得られた結果から,電気穿孔により分子透過性が上昇する領域はオリフィス近傍のみであり,オリフィスの反対側ではほぼ分子透過性が変化しないことが明らかとなった.
がん検診の受診率向上のための看護支援モデルの開発

市区町村が実施する大腸がん検診の継続受診者と継続未受診者を比較し、大腸がん検診受診の意思決定および受診行動の影響要因を明らかにすることを目的に、X市の市民を対象に郵送法による自記式質問紙調査を実施した。まず、質問紙の作成は、Championの(1)大腸がん罹患の可能性の認識と(2)大腸がんの深刻さの認識、(3)大腸がん検診の有効性の認識、(4)大腸がん検診の負担の認識、およびDolanらの(5)大腸がん・大腸がん検診の知識に関する質問項目を使用することとした。これらの項目の使用については、開発者から許可を得、日本語に翻訳し用いた。他の質問項目は(6)属性、(7)既往歴および家族歴、(8)過去の大腸がん検診受診歴とその結果、(9)健康に関する相談相手、(10)受診行動へのきっかけ、(11)受診行動への障害とした。作成した質問紙の内容妥当性を検証するため、対象者と同条件である10人を対象にプレテストを実施し、得られたコメントを基に項目の修正を行い質問紙を完成させた。完成した質問紙を4069歳のX市国民健康保険加入者36,000人の内、X市が実施する大腸がん健診を3年連続で受診している360人および3年連続で受診していない500人を無作為抽出した計860人の対象者に郵送した。対象者の選定、質問紙の発送にあたっては、X市の個人情報保護審査会および福井大学医学部倫理審査委員会の承認を得た後に実施した。質問紙を発送した対象者860人中、本調査への参加に協力が得られたのは403人であった。現在、回収したデータの入力、分析中である。
地方都市住民のライフスタイルと身体活動に関する研究

地方都市に在住・在勤している人々を対象として,日常の生活における身体活動の実際と,身体活動に関する意識,近隣環境要因,社会的環境要因との関連を明らかにし,ライフスタイルの特徴に応じた身体活動量増加・維持のための支援方法を検討することを目的に,無記名・自己記入式調査を行った.調査は平成28年度に実施し,平成29年度にはデータ分析を行い一部を報告した.平成30年度にはさらに分析を追加した.勤労者1990人(回収550人)を対象とした調査の分析では,行動変容ステージ(意識的に身体を動かすことを実行している/していない)と,歩数計装着の有無,歩く速度,通勤手段,近隣歩行環境要因との関連について検討した.近隣歩行環境要因の中で,意識して身体を動かしていることと有意な関連がみられたものは,「近所を歩くときれいな街並みや景色,目を引く建物など,興味をひかれるものがたくさんある」,「近所に公園・ウォーキング道路がある」と認識していることであった.近隣環境を肯定的に捉えている人の方が,意識的に身体を動かしている傾向がみられ,身体活動量の増加・維持に向けた健康づくり支援に,環境要因の活用可能性が示唆された.高年齢者(定年退職者等)604人(回収341人)を対象とした調査の分析では,自覚的健康感(自分自身が健康だと感じているか)と身体活動,近隣環境要因,社会的環境要因との関連性について検討した.健康だと感じていることには,歩く速度が速いこと,および「近所の人たちはお互いに連帯感を持っている」と認識していることが有意に関連していた.社会的環境要因が身体活動に影響していることが先行研究では報告されているが,本研究の対象者では同様の関連がみられなかった.しかし社会的環境要因と自覚的健康感には関連がみられ,健康づくり支援を考える上で,身体活動とともに社会的環境要因が重要な要因であることが示唆された.本研究の目的は、地方都市における若年層中高年層の身体活動量について把握し、年齢層やライフスタイルによる身体活動の特徴、環境要因との関連を明らかにし、ライフスタイルの特徴に応じた身体活動量増加・維持のためのポピュレーション・アプローチの方策を明らかにすることである。平成27年度は、加速度計(ライフコーダ)による身体活動量計測値と身体活動に関する質問紙調査(国際標準化身体活動質問票: IPAQ)を用いた身体活動量推定値との相関を検討し質問紙の妥当性を確認すること、加速度計装着中の身体活動量、行動および意識の変化について明らかにすること、ライフスタイルや環境要因に関する質問項目の回答状況を確認することを目的に、T市住民およびT市に勤務する20歳代60歳代の方を対象として調査を行った。調査は協力の得られた方29人を対象に、10日間の加速度計の装着と装着前後の質問紙調査への記入を依頼した。身体活動量については、加速度計による計測期間中の一日の平均歩数は7773歩、運動量は199.3kcal、総消費量は1811.0kcal、7日間の合計エクササイズ値は13.4メッツ・時であった(明らかに無効と思われる計測値をのぞく暫定値)。身体活動量は加速度計の計測値よりもIPAQの推定値の方が高く、これまでの先行研究と同様の傾向であった。加速度計装着中の活動については、加速度計を装着すると意識して歩数などを見る人は多かったが、普段よりもよく動いたという人は少なかった。今回の対象者は意識的に身体を動かすことをすでに実行している人がほぼ半数おり、意識が高い集団であったと思われる。1年目の研究計画に基づき、地方都市の生活者である地域住民29人を対象として、ライフコーダと質問紙を用いた身体活動量の測定を実施することができた。予定人数を下回っていたが、現在、収集したデータから身体活動量推定値の妥当性について検討している。今後さらにデータをクリーニングして分析し、検討を進めていく予定である。質問紙の各質問項目については、回答の状況や協力者の反応から、回答のしやすさなどについては確認することができた。質問紙の妥当性検討を行い、2年目以後に予定している質問紙調査の準備を進めている。本研究の目的は,地方都市における若年層中高年層の身体活動量について把握し,年齢層やライフスタイルによる身体活動の特徴,環境要因との関連を明らかにし,地域やライフスタイルの特徴に応じた身体活動量増加・維持のための方策を検討することである.平成28年度は地方都市であるA市に在勤する勤労者およびA市に在住する定年退職者等の高年齢者を対象に質問紙調査を行った.質問項目は,日常生活における身体活動,身体活動に関する意識・行動,地域環境認知項目,性別,年齢,身長,体重,職業,居住地域,現病歴,自覚的健康感等である.勤労者では1990人中550人より回答を得た.勤労者の9割以上が車での通勤であり,仕事中6時間以上座っている人は4割程度であった.余暇時間の活動では,7割弱の人が中等度の生活活動,4割程度の人が中等度のスポーツ・運動を行っていた.高年齢者では604人中,341人より回答を得た.身体活動のうち歩行に着目すると,高年齢者の約9割が10分以上続けて歩くことがあり,そのうち約半数は歩行の頻度が週に5日以上であった.

意識的に身体を動かしている人は,勤労者で約3割,高年齢者では約6割であり,内容はどちらも散歩・ウォーキングが多かった.ふだんから歩数計などをつけている人は勤労者で約1割,高年齢者では約3割であった.今回の調査では,意識の高い人やすでに行動をしている人がより多く質問紙に回答・返送している可能性があり,対象集団の偏りを考慮しなくてはならない.しかし回答者の中では身体の動かし方や意識の持ち方などにばらつきがあり,今後は身体活動と身体活動に関する意識と行動,および近隣環境要因との関連や,健康観,ソーシャル・キャピタルとの関連等について分析を進めていく予定である.平成28年度(2年目)の研究計画に基づき,質問紙の作成,関係機関との調整,研究倫理審査の申請等を行い,質問紙調査を行った.調査は平成28年11月12月にかけて,地方都市であるA市に在勤する勤労者,およびA市に在住する高年齢者を対象として実施した.回収後に集計を行い,結果の概要についてまとめ,研究協力機関に報告した.また,平成27年度(1年目)に収集したデータのクリーニングを引き続き行った.しかしデータ分析,研究成果発表まで進めることができなかった.地方都市に在住・在勤している人々を対象として,日常の生活(通勤,仕事,余暇等)における身体活動の実際と,身体活動に関する意識,居住地域の利便性(安全性や歩きやすさ等)や近隣の社会的環境との関連を明らかにし,ライフスタイルの特徴に応じた身体活動量増加・維持のための支援方法を検討することを目的に,無記名・自己記入式調査を行った.調査は平成28年度に実施し,平成29年度には,データ分析・まとめを行った.勤労者1990人(回収550人)を対象とした調査の分析では,余暇時間の身体活動に着目した.余暇時間の身体活動は,性別,年齢により異なる傾向がみられた.中等度のスポーツ・運動は高年齢層で多く,強い強度のスポーツ・運動は若年層で多い傾向がみられ,男女別では男性のほうが多く実施していた.生活活動については,中等度の生活活動は女性で多かった.余暇時間のスポーツ・運動の実施の有無は,行動変容ステージ,自覚的健康感,歩数計装着,歩く速さ,近隣歩行環境要因と有意な関連がみられたが,生活活動については有意な関連はみられなかった.高年齢者(定年退職者等)604人(回収341人)を対象とした調査の分析では,国際標準化身体活動質問票(IPAQ日本語版)を用いた身体活動量,および歩行時間に着目した.身体活動量と歩行時間は,自覚的健康感,歩数計装着,歩く速さと有意な関連がみられた.身体活動量および歩行時間と近隣環境要因との関連性はみられたが,勤労者の場合とは異なっていた.今回の分析では,身体活動と近隣地域環境の特徴の認知等の関連がみられ,身体活動の高い群では居住地域の利便性や徒歩環境等の項目を肯定的に認知している傾向がみられた.これは先行研究と同様の傾向であり,身体活動量の増加・維持に向けた健康づくり支援に,環境要因の活用可能性が示されたと考える.データ分析について,当初予定していた分析を年度内に終えられず,補助機関延長を申請し承認された.地方都市に在住・在勤している人々を対象として,日常の生活における身体活動の実際と,身体活動に関する意識,近隣環境要因,社会的環境要因との関連を明らかにし,ライフスタイルの特徴に応じた身体活動量増加・維持のための支援方法を検討することを目的に,無記名・自己記入式調査を行った.調査は平成28年度に実施し,平成29年度にはデータ分析を行い一部を報告した.
計算機相互結合網に適したグラフ構造の構成と解析及びその応用

ハイパーキューブ、de Bruijnダイグラフ、Kautzダイグラフに関して、Cayleyグラフ及びCayley cosetグラフの性質に関する研究で新しい結果を得た。de Bruijnダイグラフ、Kautzダイグラフ上でのマルチソースブロードキャスティングの問題を定義し、そのアルゴリズムを提案した。グラフの支配集合及び次数列についての新しい結果を得た。平成21年度における研究成果を発表論文に従って説明する。1.k-degree CayleyグラフはCayleyグラフであるという事実の裏づけがこれまではっきりとは与えられていなかったが、具体的な群と生成元を示すことにより裏づけを与えた。3.互換によって生成されるCayleyグラフのbipancyclicityについて述べた。4.KautzグラフはCayley cosetグラフであることはわかっていたが、どのような群のCayley cosetグラフであるかは特殊な場合にしかわかっていなかった。この論文では、全てのKautzグラフに対するCayley cosetグラフを与える群と生成元を構成し、この問題を解決した。5.cube-conncted cycleの本型埋め込みおける最小のページ数はこれまで知られていなかったが、全てのcube-connected cyclesが3ページに埋め込むことが可能であることを示し、解決した。コンピュータネットワーク等における情報散布問題において、複数個の情報源ノードからの情報散布を扱うマルチソースブロードキャスティングの我々の一連の研究において、本年度はKautzダイグラフ上での情報源の個数を増加させ、d**2個までの情報源のもとで効率良く情報を散布するアルゴリズムを設計し提案した。アルゴリズムを設計するためにKautzダイグラフに埋め込まれた2-cycle rooted treeというtreeとサイクルを合わせた構造体を用いている。Cycle-rooted treeは一連のマルチソースブロードキャスティングの研究で中心的な役割を果たしている。ハイパーキューブに関してはCayleyグラフとしての生成元集合を(0,1)行列を使って特徴付けすることができた。この結果を使ってハイパーキューブのいくつかのグラフ積による表現とCayleyグラフとしての生成元集合の対応を見出した。また、生成元行列の逆行列である生成元行列とそのグラフ積の表現を特定の形の生成元行列に対して見出した。ハイパーキューブを実際に使うためにはラベリングが重要である。多くのラベリングがありうるが、規則的なラベリングとしてCayleyグラフ表現によるラベリングについて検討した。学会報告の順に従って、説明する。1.有向グラフ(ダイグラフ)の支配集合についての研究を行った.支配集合問題とは,ネットワーク上の各ノードが隣りあうノードからサービスを受けることができるように,ネットワーク上へ資源を配置することと対応する.有向グラフの双方向支配集合という問題は,これまであまり研究されていない比較的新しい問題である.その中で,対象をラウンドダイグラフと呼ばれるグラフへ限定し,その最適な支配集合を求める効率的なアルゴリズムを設計し,その成果を発表することができた.その後,頂点が重みを持つラウンドダイグラフでの最小重み双方向支配集合を求めるアルゴリズムへ拡張した.この成果は論文としてまとめ,現在投稿中である.2.次数集合についての研究を行った.グラフの次数とは,頂点に接続する辺の数であり,それらを並べた数列は次数列として定義される.グラフが与えられたとき,次数列はすぐに決定されるが,非負整数の数列が与えられたとき,その数列がグラフをもつかどうかは調べる必要がある.次数集合とは,非負整数の集合を与えたとき,集合の要素である数を次数とする頂点のグラフが存在するときをいう.すべての非負整数の集合は,次数集合であることは知られている.しかし,頂点数を最小に限定しても,複数のグラフが存在する.本研究では,頂点数を最小に限定したとき,すべての次数列を生成する方法を与えた.特に,集合の要素数が3以下のとき,すべての次数列を簡単に与えることができる.集合の要素数が4以上のときは,次数列となる候補の数の上界を与えた.現在,この成果を論文とするべく,準備中である.
大動脈の弾性線維再生の研究

弾性線維は肺や動脈、皮膚などの伸び縮みする組織に豊富に存在し、これら臓器が生理的役割を果たすために重要な弾力を組織にもたらしている。長く、弾性線維は再生せず、老化に伴って劣化するのみであると考えられてきた。本研究では、近年発見された弾性線維構成タンパク質に着目し、これらが弾性線維形成に果たす役割の解明を試みた。特にfibulin-4が弾性線維形成を促進する分子メカニズムを明らかにすることができた。A:具体的内容1) DANCEを切断するプロテアーゼの検索:DANCEは分泌後にアミノ末端の一部が切断されて切断型DANCEとなり、弾性線維誘導能を失う。野生型マウスの組織抽出蛋白をウェスタンブロットすると、皮膚組織において切断型DANCEが最も多い。そこで、野生型マウスの皮膚をホモジナイズし、8M尿素中で1週間インキュベートすることで弾性組織内のタンパク質の抽出を試みた。この組織抽出物を全長型DANCEの安定発現293T細胞株の培養上清に添加してDANCE切断活性を検討したが、不純物などの影響で成功しなかった。2) LTBP2の弾性線維再生能力の検討:LTBP2について、既報のノックアウトマウスは胎生致死であった。このため、LTBP2は生体において重要な働きがあるとされていた。今回、申請者らが新たに作成したコンディショナルノックアウトマウスを用いた解析によって、LTBP2を全身でノックアウトしても致死ではないことが分かった。このマウスは外観上野生型マウスと大きな違いはなく、皮膚や大動脈の弾力も損なわれていなかった。3) Fibulin-4の弾性線維再生についての検討:Fibulin-4のノックアウトマウスは弾性線維が形成されていない。このメカニズムについて検討し、Fibulin-4がエラスチンの架橋酵素であるリジルオキシダーゼと相互作用することで弾性線維形成を誘導する可能性が示唆された。B:意義、重要性LTBP2はこれまでの報告から胎生早期に重要であるとされてきたが、今回の結果により異なる可能性が示唆された。また、Fibulin-4が弾性線維を形成するメカニズムの一端を解き明かしており、組織弾力の再生へとつながる知見が得られた。老化に伴ってこの弾性線維は劣化していくが、これを再生する方法はまだ実現していない。本研究では、これまでに明らかになっている弾性線維形成の分子メカニズムを基に、弾性線維再生のための新たな知見を得ることを目的とした。A:具体的内容完全長のDANCEタンパクは、培養線維芽細胞に添加した場合に弾性線維形成を誘導する。その一方で、DANCEタンパクは分泌後にアミノ末端の一部が切断されて切断型DANCEとなり、この切断型DANCEは弾性線維誘導能を失う。このため、マウス皮膚の抽出物からDANCEを切断する活性を持つプロテアーゼを同定しようと試みたが、プロテアーゼの同定には至らなかった。並行して、プロセッシングによってDANCEがどのようなメカニズムで弾性線維形成能を失うのかを検討した。弾性線維において発現しているいくつかのタンパク質との結合を、切断型と全長型のDANCEの間で比較したところ、切断型のほうが全長型より弱く結合するものを見出した。この結合力の差のために、切断型DANCEは弾性線維形成能を失っている可能性が示唆された。また、Fibulin-4やLTBP-2などの弾性線維構成タンパクの遺伝子改変マウスを用い、弾性線維の形成異常についての解析も行った。B:意義、重要性DANCEのプロセッシングの結果としてDANCEの持つ弾性線維形成能がどのようなメカニズムで失われるのかを明らかにすることができた。老化に伴って切断型DANCEの割合が増加することを勘案すると、弾性線維再生のために理解することが重要な細胞生物学的側面の一つであると考えられる。
炎症性皮膚疾患における好中球アポトーシスの検討

今回、各種炎症性皮膚疾患での好中球の自律的アポトーシスの促進、遅延の有無を検討した。方法)正常人、炎症性皮膚疾患としてBehcet病患者から末梢多形核白血球分画をFicoll-Conray比重遠心法にて分離後、10%FCS RPMI1640にて培養を行い、経時的に採取。アポトーシスした好中球の割合の検出を行った。結果)正常人よりの末梢多形核白血球分画での自律的アポトーシス光顕的観察にてアポトーシスした多形核白血球を検出した所、12時間後にて50%の自律的アポトーシスを認め、72時間後には100%の自律的アポトーシスを認めた。DNA ladder形成も同様に12時間後より認められた。72時間後には生細胞数が減少し、自律的アポトーシス後に多形核白血球は自己融解したと推測された。しかし、TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling(TANEL法)にての検討では4時間後より自律的アポトーシスを認め、その後、経時的に増加し、16時間後に100%の自律的アポトーシスを認めた。TANEL法は光顕的観察より鋭敏にアポトーシスを検出しうると示された。また、この方法による検討では自律的アポトーシスを起こした多形核白血球が貧食されている形態が認められ、アポトーシスを起こした細胞の排除の可能性が推測された。Behcet病患者よりの末梢多形核白血球分画での自律的アポトーシス光顕的観察にて12時間後にて100%の自律的アポトーシスを認めた。同様に72時間後には100%の自律的アポトーシスを認め、生細胞数が減少し、自律的アポトーシス後に多形核白血球は自己融解したと推測された。炎症性皮膚疾患としてBehcet病では好中球機能の亢進が報告されているが、その機能亢進により自律的アポトーシスの促進の可能性が示された。
遺伝子組換え作物に起因する遺伝子汚染の評価法に関する研究

【目的】平成15年度までに市販ダイズ加工品の89.7%から組換え遺伝子が検出されるもののその含有率は0.1%程度と、我国の消費流通過程に遺伝子組換え作物が薄く広く浸透しつつある実態を明らかにし、平成16年度は遺伝子組換え作物に起因する遺伝子汚染の実態を明らかにすべく基礎情報として、除草剤耐性組換えダイズRoundup Ready 40-3-2系統の導入遺伝子の変異出現の事実を確認し、さらにそのうちの一箇所に、表現系に影響を与える致命的なSNPが出現している可能性を指摘した。本年度は本研究の最終目的でもある遺伝子水平伝播の実証を得たので報告する。【方法】まずGMダイズRoundup Ready 40-3-2系統の栽培経験がある土壌および同GMダイズを飼料とした家畜の飼育土壌を日本各地計19箇所から採取し、細菌および真菌の分離を試みた。次に除草剤グリホサートによる選抜を繰り返し、得られたグリホサート耐性株から組換えDNAのPCR法による検出を行い、増幅断片の配列決定を行った。さらにこれら微生物株のrDNA解析をして種レベルの同定を行うとともに、昨年度作製に成功していた特異抗体を駆使して、Western-blot法による組換え遺伝子の発現解析を行った。【結果】採取土壌飼料中に生存していた9.8x10^9CFUの微生物株を対象にグリホサートによる選抜を行ったところ、51株のグリホサート耐性株を得た。これらのうち22株からGMダイズ由来の組換え遺伝子が検出された。PCR増幅断片の塩基配列はすべて決定したが、それらのうち14株の配列はGMダイズの人工的連結部位配列と完全に一致した。すなわちこの時点で遺伝子水平伝播の確証が得られた。さらにこれら14株中で組換え遺伝子が発現しているかを確かめたところ、2株で特異抗体に染色される想定サイズのバンドが観察された。これらの結果は、植物体から環境微生物への組換え遺伝子水平伝播の事実を始めて証明しただけでなく、その一部は発現していることを示している。また本研究で行ったプロセスは、除草剤によるセレクションステップを導入することにより、今まで検出できなかった超低頻度の遺伝子伝播をも評価可能とした成果であった。【目的】近年遺伝子組換え作物の総作付け面積および流通量は増加の一途をたどり、今日我国においても同作物の"意図せざる混入"を阻止することは不可能になったとされている。しかしその実態を詳細に調査した報告例は意外に少なく、逐次変化している現状を的確に把握するという意味からも、即時的なデータの蓄積が必要と考える。そこで本研究では市販のダイズ加工品を対象に遺伝子組換えダイズ混入の実態調査を行ったので報告する。【方法】埼玉県内のスーパーマーケットで購入したダイズ製品35品目を対象にJAS分析試験ハンドブック遺伝子組換え食品検査・分析マニュアルに従って各ダイズ製品からDNAを抽出後、定性的および定量的PCR法によりモンサント社製除草剤耐性ダイズの特異的領域RRS(121bp)の増幅を行った。同時に内部標準としてダイズ内在性レクチン遺伝子Le1(118bp)の増幅も行い、陽性対照としてはGMダイズ陽性コントロールプラスミド(ニッポンジーン)を用いた。なお定量検査においても一定の定量性を確保するため、鋳型DNA量を100ng/100μlに固定し、特異的領域のアガロースゲル電気泳動におけるシグナル強度が内部標準のシグナル強度と同等以上の場合に+++、内部標準のシグナル強度の1/2以上1未満の場合は++、1/2未満の場合は+と判定した。【結果】供試35品目の82.9%にあたる29品目が有効検査品目であった。このうち26品目から組換え遺伝子が検出され、検出率は89.7%にのぼった。さらに陽性26品日中76.9%にあたる20品目が「遺伝子組換えでない」と表記してあり、「有機」と表記してある1品目からも組換え遺伝子が検出された。次に定性検査において+++と判定された水煮ダイズ製品1品目およびきな粉製品1品目と「有機」と表記されながら++と判定された乾燥ダイズ製品1品目の計3品目を対象に定性検査を行った結果、水煮ダイズ製品およびきな粉製品の組換え遺伝子含有率は0.1%、乾燥ダイズ製品では0.05%であった。以上の結果より、流通過程に遺伝子組換え作物が薄く、広く浸透しつつある実態が明かとなった。【目的】平成15年度までに市販ダイズ加工品の実に89.7%から組換え遺伝子が検出されるもののその含有率は0.1%程度と、我国の消費流通過程に遺伝子組換え作物が薄く広く浸透しつつある実態を明らかにすることができた。そこで本年度は遺伝子組換え作物に起因する遺伝子汚染の実態を明らかにすべく基礎情報として、現在最も流通および作付け量の多いモンサント社製除草剤耐性組換えダイズRoundup Ready 40-3-2系統中に導入されている遺伝子の解析と遺伝子汚染評価法確立のためのツールの一つとして、人工的連結部の遺伝子産物のみを認識する特異抗体の作製に着手し、それらについての成果が得られたので報告する。【方法】除草剤耐性EPSPS遺伝子を含む2,485bpにわたる組換え遺伝子の全長をnt -281,316およびnt 1,2092,457となるよう重複する2本のPCR断片としてTOPO TA PCR cloning vector (Invitrogen)

上にクローニングし、vector armのM13+およびM13-配列を起点として、相補鎖的にシークエンシングを行った。PCRの鋳型として用いたダイズは、あらかじめイムノクロマト法(GENETIC ID)で組換え遺伝子の保有を確認した。特異抗体の作製にあたっては、人工的連結部の予想アミノ酸配列(39aa)の内部システインをアセトアミド基でブロックし、C末端にKeyholelympet hemocyanin (KLH)を付加した合成ペプチド(7.2mg/100μl)を同量のアジュバント(TiterMax Gold, CysRx)とよく混合して5週齢マウスに接種後、2週間毎3回の追加免疫を行った。【結果】今回我々が明らかにした塩基配列(DDBJ accession number ; AB209952として登録済)をモンサント社のPatent中に一部公開されている配列と比較したところ、nt 1,111,1,391,1,480および2,406の位置にSNPsを見い出した。これらはいずれもアミノ酸置換を起こし、nt 1,111,1,391,1,480はEPSPS遺伝子の翻訳領域内、nt 2,406はEPSPS genecassette隣接のリピート配列内に位置していた。特にnt 1,111SNPはArgからCysへのアミノ酸置換を引き起こし、EPSPSの除草剤(グリホサート)との親和性に重大な影響を与える部位であった。これらの結果は組換え遺伝子の可変性を示すものであった。さらに作製した抗体の高い特異性は、Western-blot法で証明された。【目的】平成15年度までに市販ダイズ加工品の89.7%から組換え遺伝子が検出されるもののその含有率は0.1%程度と、我国の消費流通過程に遺伝子組換え作物が薄く広く浸透しつつある実態を明らかにし、平成16年度は遺伝子組換え作物に起因する遺伝子汚染の実態を明らかにすべく基礎情報として、除草剤耐性組換えダイズRoundup Ready 40-3-2系統の導入遺伝子の変異出現の事実を確認し、さらにそのうちの一箇所に、表現系に影響を与える致命的なSNPが出現している可能性を指摘した。本年度は本研究の最終目的でもある遺伝子水平伝播の実証を得たので報告する。【方法】まずGMダイズRoundup Ready 40-3-2系統の栽培経験がある土壌および同GMダイズを飼料とした家畜の飼育土壌を日本各地計19箇所から採取し、細菌および真菌の分離を試みた。次に除草剤グリホサートによる選抜を繰り返し、得られたグリホサート耐性株から組換えDNAのPCR法による検出を行い、増幅断片の配列決定を行った。さらにこれら微生物株のrDNA解析をして種レベルの同定を行うとともに、昨年度作製に成功していた特異抗体を駆使して、Western-blot法による組換え遺伝子の発現解析を行った。【結果】採取土壌飼料中に生存していた9.8x10^9CFUの微生物株を対象にグリホサートによる選抜を行ったところ、51株のグリホサート耐性株を得た。これらのうち22株からGMダイズ由来の組換え遺伝子が検出された。
個々人の腫瘍マーカ検出システムの確立

われわれは腫瘍マーカの検出の確立のために、癌患者の唾液と血清のタンパク質の解析を行った。唾液中のタンパク質も血清のタンパク質の解析も確かな定量的解析結果を得ることができなかった。これらの検体を用いた有効な検出方法について検討する必要性があった。われわれは唾液の検討には特有な分子の遺伝子の存在をRT-PCR法にて検出する方法がよいと考えた。血清の解析では特定の分子を泳動したウエスタンブロット法が有用であると考えた。口腔癌の特性を考えると、目に早える領域につき、癌の存在よりも転移の有無や浸潤・転移能を有する細胞の検出が有用であると考えた。組織は検出する部位によって発現様式が異なっていたので、癌細胞株の性状の検討により転移に関連する分子の検討を行った。すなわち、同所性移植法にて浸潤・転移能に差がある舌癌細胞株のタンパク質の発現をiTRAQ法を用いてプロテオーム解析を行った。アミノ酸の配列より同定できたタンパク質は163個であり、高転移性癌細胞にて発現の高いタンパク質は29分子、発現が低いタンパク質は47分子同定できた。さらにこれらの癌細胞株に対し、54525個のアレイを用いたマイクロアレイ解析を行ったところ、高転移性癌細胞株に強発現する遺伝子は既知遺伝子が186分子、未知遺伝子が137分子であった。高転移性癌細胞株にて発現が非常に低い遺伝子は既知の遺伝子147分子、未知の遺伝子が241分子であった。また、高転移性癌細胞株を使用した動物実験モデル系を用い、抗転移薬(エンドスタチン)がリンパ節転移を抑制することを明らかにし、その機構に血管内皮細胞増殖因子VEGF-C、とVEGF-Dが関与している可能性があること、また、臨床の組織に近い状態とするために、heterogeneousな癌細胞の動物モデル系を作製し、高転移性癌細胞の増殖進展に癌修復遺伝子human Mut T homolog protein 1(hMTH1)のタンパク質が関与している可能性を見出した。これらの分子も有用な分子の可能性が考えられた。現在有用な分子の絞込みを行っている。これらの簡易型解析システムにより腫瘍マーカや創薬の開発に有用な情報を与えてくれる可能性が考えられた。初年度につき検体の準備と手技の確立に重点をおいた。検体は口腔癌細胞株とその上清ならびに経時的な(治療前後,完治,再発)患者の唾液と血清である。癌細胞株に関しては当科で樹立した口腔癌細胞株のクローニングをした後,ヌードマウスに同所性移植することにより転移性癌細胞株か非転移性癌細胞株かの性状を明らかにした。購入した口腔癌細胞株(3種類)も同様の手法にて転移性か非転移性かを明らかにした。従来我々は舌癌の動物モデル系しか行ってなかったが,今回歯肉癌の動物モデル糸を確立した。また新たに癌細胞株を2種類樹立した。これらの癌細胞株とその上清のプロテオーム解析を行った。二次元電気泳動法の解析ソフトに問題点があったので,銀染色法を併用し改善させた。先ずウェスタンブロット法にて解析可能なタンパク質を同定した。同定できなかったタンパク質に対し,現在質量分析法にて解析を行っている。

唾液のプロテオーム解析は食べ物の影響を克服するために,我々の唾液(絶食時・歯磨剤使用時と使用しない状態での歯磨き後の状態・食後うがいのみの状態)を使用し,二次元電気泳動法による解析を行い,検体採取時の条件ならびに食べ物により出現するタンパク質のバンドを検証した。現在この条件のもとに経時的に患者の唾液を集めているところである。また患者の経過時的血清を採取し,上記癌細胞株にて同定したタンバタ質の血清中の発現を検討しているところである。腫瘍マーカ検出のため、患者の経時的な(治療前後、完全、再発)唾液と血清ならび口腔癌細胞株とその上清におけるタンパク質の発現解析を行っている。唾液に関しては癌非罹患者(我々の唾液)にて食べものの影響を回避できる状態の条件決めを行い、その状態にて癌患者の唾液を採取しているが、担癌状態では口腔内の清掃が十分できない場合があり、食べ物の影響を避けることが困難である可能性があった。血清に関しては検出感度等に問題があり,タンパク質を検知できる場合とできない場合があるため、検出したい分子を選定し,その発現を解析する検出方法等を検討しているところである。経時的な検体における発現の相違を検出するため、検体の集積を行っている状態である。癌細胞株は今年度新しく3種類(原発巣とその転移巣,原発巣)樹立し,現在クロニングを行っている。当科樹立ならびに購入した舌癌細胞株を用い,同所性移植にて浸潤・転移能に相違がある癌細胞株間において,転移性癌細胞株と非転移性癌細胞間でのタンパク質の発現の相違を,まず二次元電気泳動後銀染色にてスポットを検出し,スクリニングした。検出感度がよい場合とよくない場合があり,解析の安定性が懸念されるので,かなりの回数を重ねているところである。また得られたスポットの相違を質量分析法にて解析したところ,かなりの分子が得られたためその分子の再現性をウェスタンブロット法等にて検討し,ケラチン14,16やデスモゾム構成分子(デスモコリン3,デスモグレイン2)等の分子検出し他の分子の同定を行っている。癌細胞株の上清での解析を行い,同様に再現性の検討を行っている。腫瘍マーカ検出のため、患者の経時的な(治療前後、完全、再発)血清ならび口腔癌細胞株(同所性移植法にて頸部リンパ節転移性癌細胞株、非転移性癌細胞株)、ヒト原発癌組織、転移巣、正常と考えられる口腔粘膜組織におけるプロテオーム解析(二次元電気泳動、質量分析法)を行った。血清は上記方法では検出感度が悪いため、解析方法を検討する必要性があった。癌細胞株や組織での検出感度はほぼ問題なかった。ただし、原発巣の組織では、同一患者の検体においてでも、採取部位により発現が異なっていた。口腔癌の腫瘍マーカの有用性を考えると、原発巣は目に見える領域につき、転移の有無を検知できる腫瘍マーカが重要ではないかと考えられる。我々は上記方法やマイクロアレイ解析によって得られた結果より、転移関連候補分子として、ムチンや細胞骨格関連分子、転写因子、シグナル伝達分子、癌遺伝子を同定した。また、転移性癌細胞に発現が低い分子として、細胞骨格関連分子、免疫系に関与する分子、転写因子、細胞周期、アポトーシス関連分子、シグナル伝達分子を同定した。また未知の遺伝子も検出した。