hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「脱細胞化マトリックスを用いた心臓の再生」～立体臓器構築をめざした基盤技術の確立

一方、3次元心筋組織構築においては、解剖学的空間情報が極めて重要であるが、従来法では3次元でこれらの組織の局在を観察することは困難であった。この点を解決するため、組織透明化技術(CUBIC法)を用いて心臓を観察したところ、マウス成獣心の血管、交感神経の空間分布を3次元で観察することが可能となった。(本成果は、現在論文投稿中)。成獣ラット心臓を、界面活性剤を用いて脱細胞化処理し、心臓細胞外マトリックスを作成、新生仔ラット心臓由来単離心臓構成細胞を播種し、臓器様3次元心筋組織を構築、光学マッピング法等による方法で機能・形態解析を行なった。本成果は国際生体材料科学雑誌に報告した(Yasui et al. Biomaterials. 2014; IF 8.387)。さらに、組織透明化技術を応用し、マウス心臓における冠血管走行と交感神経の分布を3次元で解析することに成功し、臓器様3次元心筋組織における形態特性の評価に利用可能な技術の確立を行った(Yokoyama et al. AHA2016他で発表。論文投稿中)。当初計画した、新生仔ラット心臓構成細胞を用いた3次元心筋組織の構築とその形態解析および機能解析研究を遂行できたため、おおむね順調に進展していると自己評価した。iPS細胞由来心筋細胞を用いた3次元心臓組織の構築と心臓構成細胞が細胞外マトリックスへの生着・生存に及ぼす関連因子の探索を行う。前者については、今後得ることが可能なiPS細胞由来心筋細胞数に対応するために、細胞外マトリックスを成獣ラット心筋ではなく、より幼若な心臓を用い、播種心筋細胞の数を減らし、研究を遂行する。後者については、血管内皮関連因子、炎症性サイトカイン、ストレス関連因子、心筋発生・成長因子の影響をQ-PCRやハイコンテンツイメージングシステム・ハイスループットスクリーニングシステム等を用い探索する。28年度が最終年度であるため、記入しない。再生医学、組織工学、循環器内科学平成26年度の業績をもとに、新生仔ラット心臓構成細胞の脱細胞化マトリックスへの生着効率をさらに高める方法について検討を行う。また、iPS細胞由来心筋細胞を脱細胞化心臓マトリックスに播種し、再細胞化心臓の機能および形態評価を行う。
消化器癌の転移機構とその治療の研究

1.昨年度までにケモカイン受容体CXCR3がヒト大腸癌細胞株DLD-1のリンパ節転移を促進することを見出していたが、本年度はCXCR3がケモカインの役割として想定されている癌細胞のリンパ節への遊走ではなく、転移先での腫瘍巣形成を促進することを明らかにした。また、ヒト大腸癌臨床検体の解析から、CXCR3の発現が、リンパ節転移との相関が知られているCXCR4の発現よりも強力な予後不良指標となることを示した。2.昨年度までに、DNAマイクロアレイを用いてColon26マウス大腸癌細胞の高転移株で発現が変動する遺伝子としてAesを同定し、この遺伝子をColon26細胞に誘導的に発現させると浸潤能、転移能がともに有意に減少することを見出していた。当該年度には、Aes遺伝子を安定発現させた大腸癌細胞をマウス直腸に同所移植すると肝臓や肺への転移が有意に減少することを示した。さらに、ルシフェラーゼレポーターを用いた解析により、AesはNotchシグナルを有意に抑制することが分かった。また、ヒト大腸癌の半数以上の症例の転移巣でAesの発現が低下していることを明らかにし、この遺伝子がヒト大腸癌の転移にも重要な役割を果たしている可能性が示唆されたので、Aesの転移抑制作用をさらに明確にするためにAes遺伝子改変マウスを作出した。3.転移の初期過程である浸潤機構を解明するため、我々の作出した腸癌自然発症モデルマウス(Apc^<Δ716>Smad4複合変異マウス)を解析した。その結果、このマウスの腺癌ではTGF-βファミリーシグナルの遮断により癌細胞におけるケモカインCCL9の発現が増加すること、その受容体CCR1を持つ未分化骨髄球が血中から浸潤先端部へと集簇することを見出した。また、これら未分化骨髄球は細胞外基質分解酵素MMP9,MMP2を産生すること、Apc^<Δ716>Smad4複合変異マウスにCcr1遺伝子の変異を導入すると未分化骨髄球の集簇が消失し癌細胞の浸潤が抑制されることを明らかにした。さらに、一部のヒト大腸癌で、浸潤先端部にCCR1とMMP9を発現する細胞が存在することを示した。本研究課題においては、消化器癌の転移、特に周辺リンパ節への転移の分子機序を明らかとし、これに関わる遺伝子の変異モデルマウスを作製し、発癌から転移までの過程を再現するモデルマウスを構築する。これを用いた解析により、化学療法による転移抑制の標的分子を同定し、新しい科学療法薬開発のための戦略を確立することを目的とする。今年度は、可移植性癌細胞を用いたマウス転移モデルにより、転移に関与する新たな因子の同定と、その作用機序の解析を中心に行なった。最近、ケモカインが走化性作用により癌転移に関与しており、特にCXCR4受容体を介したシグナルが転移に重要であることが報告された。我々も複数の癌細胞株を用いて、全ケモカイン受容体の発現プロファイルをmRNA定量により解析した結果、CXCR3の発現上昇が認められた。さらにCXCR3リガンドのIP-10あるいはMIGに対する中和抗体は、B16F10メラノーマ細胞のリンパ節転移を抑制したので、CXCR3を介したシグナルが転移に重要であることが明らかとなった。一方、リンパ節転移には新たなリンパ管新生が必要であるが、分子機序は明らかにされていない。マウス生体組織を用いて、リンパ管新生過程を経時的・形態的に解析するためにLYVE-1に対する抗体を作製した。得られた抗体を用いた免疫染色の結果、リンパ管特異的に反応したので、今後CXCR3シグナルとリンパ管新生との関係についての解析に使用する。また、癌転移にプロスタグランジン合成酵素であるCOX-2が関与している可能性が報告されている。そこで、ケモカイン産生を含めた炎症反応と転移の関係を解析する目的で、COX-2およびPGE_2合成酵素であるmPGESのトランスジェニックマウスを作製した。更に、Peutz-Jeghers氏病の原因遺伝子LKB1のマウスホモログをノックアウトしたところ、Peutz-Jeghers氏病に特有な胃や十二指腸のハマルトーマを形成したのみならず、肝臓に肝細胞癌(HCC)を発生し、その一部は肺に自然転移を起こすことを見出した。今後、これらの転移モデル、抗体、マウスモデルを用いて、転移過程に関与する分子機序を明らかにして行く。本研究課題においては、消化器癌転移の分子機序を明らかにし、これに関わる遺伝子の変異マウスを作出して発癌から転移までの過程を再現するモデルマウス実験系を構築する。この系を用いて転移抑制の標的分子を同定し、新しい化学療法薬開発のための戦略を確立することを目的とする。前年度にB16F10メラノーマ細胞のリンパ節転移がケモカイン受容体CXCR3の中和抗体で抑制されることを明らかにしたが、今年度はさらに解析を進め、CXCR3アンチセンス発現細胞を用いてCXCR3のリンパ節転移における重要性を遺伝学的に証明した。また、この系では完全フロイントアジュバントが転移を促進することから、癌の非特異的免疫療法には危険が伴う可能性が示唆された。CXCR3が多くの大腸癌細胞株で発現されていることも見出したので、今後CXCR3の大腸癌転移への関与を検討する。さらにColon26大腸癌細胞のマウス転移モデルを用いて、リンパ節及び肝臓の転移巣の細胞を再び移植することを繰り返して高転移細胞株を樹立した。

現在、DNAマイクロアレイ及びプロテオミクスの手法で高転移株と親株とを比較し、転移に関わる分子の同定を進めている。一方、家族性大腸腺腫症のマウスモデルのApcΔ716マウスにホメオボックス転写因子Cdx2のヘテロ接合変異を導入したApcΔ716Cdx2+/-複合変異マウスを作出したところ、大腸にポリープを多発してよりヒトの疾患に近い形質を示すことを見出した。また、その機序として、Cdx2の低下がmTOR経路活性化を介して染色体の不安定性を亢進させ、LOH(loss of heterozygosity)の頻度が上昇することを示した。Cdx2の発現は大腸癌悪性化に伴い低下することが報告されており、今後Cdx2の発現低下、mTOR経路活性化による染色体異常が癌細胞の転移能獲得に果たす役割について解析を加えていく。本研究課題においては、消化器癌転移の分子機序を明らかにし、これに関わる遺伝子の変異マウスを作出して発癌から転移までの過程を再現するモデルマウス実験系を構築する。この系を用いて転移抑制の標的分子を同定し、新しい化学療法薬開発のための戦略を確立することを目的とする。前年度までにメラノーマのリンパ節転移におけるCXCR3の重要牲を証明した。今回、ヒト大腸癌臨床検体でも高頻度にCXCR3が発現していること、CXCR3の発現とリンパ節転移、進行度、予後とが有意に相関することを見出した。CXCR3の発現が低いDLD-1細胞にCXCR3を強制発現させるとchemotaxis、リンパ節転移ともに顕著に亢進した。今後、RNAi、CXCR3/CCR5のantagonist等を用いてCXCR3の大腸癌転移における役割を解析する。Colon26マウス大腸癌細胞のリンパ節及び肝臓への高転移株を樹立し、DNAマイクロアレイ法により高転移株で発現が変動する遺伝子を多数同定した。その中で転移への関与が示唆される9掴の遺伝子のcDNAを単離し高転移株あるいは親株に導入した。今後、これらの分子の浸潤、転移への寄与を検討する。前年度にCDX2の発現低下がmTORを介し染色体不安定性を亢進させることを報告した。今回、約100症例のヒト大腸癌及び胃癌組織においてCDX2の発現低下と染色体不安定性とが相関することを見出した。今後、CDX2の発現、染色体不安定性とリンパ節転移との関係について調べる。COX-2トランスジェニックマウスに発生する腫瘍ではマクロファージの浸潤と活性化が上皮細胞増殖に重要である。今回、マクロファージ浸潤にCXCL14とPGE2の相互作用が関与すること、Helicobacterなどの細菌感染が粘膜上皮細胞のToll-like受容体を介してマクロファージを活性化することを明らかにした。本研究課題では、消化器癌転移に関わる遺伝子の変異マウスを作出して発癌から転移までの過程を再現するモデルマウス実験系を構築し、転移抑制の標的分子を同定して新しい化学療法薬開発のための戦略を確立することを目的とする。(1)既にColon26マウス大腸癌細胞のリンパ節及び肝臓への高転移株を樹立し、高転移株で発現が変動する遺伝子の中で転移への関与が示唆される複数の遺伝子を同定していた。これらの分子を強制発現させたところ、一つの候補分子が大腸癌細胞の浸潤能、転移能を顕著に抑制することを見出した。今後、この分子及び関与するシグナル伝達経路の消化器癌転移における役割について詳細に解析する。
炭素同位体比曲線による上部白亜系化石年代面の有用性示標の確立

平成13,14,15年度に,北海道苫前町古丹別地域において地質調査を約二週間共同で行った.また,平成13年度には北海道穂別町,夕張市,および羽幌町の調査も行った.主要研究地域である古丹別地域では約2Kmに渡って大型化石,泥岩試料,および放射年代測定用の凝灰岩試料を採取し,同時に1/1000の縮尺の詳細なルートマップを作成した.古丹別地域では大型化石の産出は不良ではあったが,日本ではMiddle Turonianの示標種として用いられているInoceramus hobetsensisの層序的産出範囲を詳細に絞り込むことに成功したことが最大の収穫といえる.その範囲を含んで,ほぼ調査地域全体から連続的に泥岩を採取することができた.それらの泥岩は同位体分析用として,あるいは浮遊性有孔虫抽出用として系統的に金沢大学に保管されている(一部は粉末未処理状態,一部は酸処理済).分析装置の借用を依頼していた某国立大学の研究室の分析装置の調子が不良であったため,古丹別試料の分析予定は延期した.穂別地域の泥岩試料の炭素同位体比測定は平成15年度末にアメリカ・インディアナ大学に依頼して分析を行ったが,浮遊性有孔虫層序からの成果を裏付ける結果を得た.穂別地域では浮遊性有孔虫層序について大きな進展が見られた.国際的な年代示標種(Helvetoglo botruncana helvetica)とその化石帯を認定し,この種に附随して産出する国際的に認識可能な種も確認できた.少なくとも4つのMiddleLate Turonianにかけての広域分布種の,日本に於ける層位分布関係が明らかになった.その成果は,現在論文として投稿の最終段階にある.穂別地域の予察的な炭素同位体比測定の結果は,重要な種が共存して産出する鍛冶屋の沢下流部がMiddle Turonianであること(つまりUpper Turonianではない)ことを示唆している.本研究で最も力点を置いた古丹別地域の幌立沢における,初年度の成果が既に2つの公表論文として出版された(土屋ほか,2003;Hasegawa,2003).また,これまでの研究蓄積に新たに本研究で得た知見を加えた論文も複数出版された(次頁のリストを参照).平成13,14,15年度に,北海道苫前町古丹別地域において地質調査を約二週間共同で行った.また,平成13年度には北海道穂別町,夕張市,および羽幌町の調査も行った.主要研究地域である古丹別地域では約2Kmに渡って大型化石,泥岩試料,および放射年代測定用の凝灰岩試料を採取し,同時に1/1000の縮尺の詳細なルートマップを作成した.古丹別地域では大型化石の産出は不良ではあったが,日本ではMiddle Turonianの示標種として用いられているInoceramus hobetsensisの層序的産出範囲を詳細に絞り込むことに成功したことが最大の収穫といえる.その範囲を含んで,ほぼ調査地域全体から連続的に泥岩を採取することができた.それらの泥岩は同位体分析用として,あるいは浮遊性有孔虫抽出用として系統的に金沢大学に保管されている(一部は粉末未処理状態,一部は酸処理済).分析装置の借用を依頼していた某国立大学の研究室の分析装置の調子が不良であったため,古丹別試料の分析予定は延期した.穂別地域の泥岩試料の炭素同位体比測定は平成15年度末にアメリカ・インディアナ大学に依頼して分析を行ったが,浮遊性有孔虫層序からの成果を裏付ける結果を得た.穂別地域では浮遊性有孔虫層序について大きな進展が見られた.国際的な年代示標種(Helvetoglo botruncana helvetica)とその化石帯を認定し,この種に附随して産出する国際的に認識可能な種も確認できた.少なくとも4つのMiddleLate Turonianにかけての広域分布種の,日本に於ける層位分布関係が明らかになった.その成果は,現在論文として投稿の最終段階にある.穂別地域の予察的な炭素同位体比測定の結果は,重要な種が共存して産出する鍛冶屋の沢下流部がMiddle Turonianであること(つまりUpper Turonianではない)ことを示唆している.本研究で最も力点を置いた古丹別地域の幌立沢における,初年度の成果が既に2つの公表論文として出版された(土屋ほか,2003;Hasegawa,2003).また,これまでの研究蓄積に新たに本研究で得た知見を加えた論文も複数出版された(次頁のリストを参照).長谷川は国内の複数の専門家と研究打ち合わせを行った上で、2001年の夏には研究協力者を伴って北海道各地(浦河町、穂別町富内、穂別町ソウサヌシュベ、平取町振内、夕張市登川、夕張市真谷地沢、羽幌町、中頓別町および稚内市)の白亜系蝦夷層群を調査し、大型化石と泥岩試料(浮遊性有孔虫および有機炭素分析用)を採集した。それらの大型化石試料は利光によって鑑定され、従来のイノセラムス帯に区分された。泥岩試料は長谷川によって有孔虫処理を施した結果、多数の浮遊性有孔虫個体を得た。これまで日本では報告がなかった種や新種が含まれており、新属となる可能性のあるものもある。これらのデータを得た後にも複数回にわたって各専門家と打ち合わせを重ねてきた。浮遊性有孔虫のうち特に年代指標性が高いといわれてきた種はイノセラムスの示す年代とほぼ調和的で、従来のイノセラムスおよび浮遊性有孔虫年代層序区分が

問題なかったことを示唆している。しかし、浮遊性有孔虫のうち、年代指標性がこれまで強調されてこなかった種のうち8種は、従来知られていた層序的産出範囲よりも上位の地層から確認され、ヨーロッパなどとは異時性を持っていることが示唆された。これまで北海道の蝦夷層群において大型化石による年代層序と浮遊性有孔虫による年代層序が食い違うという問題が指摘されてきたが、これは、浮遊性有孔虫による年代層序決定の際にこのような異時性を持った種を用いてきたことに由来する可能性がある。すなわち、年代指標性の高いとされる種の産出が不良であるチューロニアンからサントニアンにかけて年代決定にしばしば用いられてきたWhiteinella, Archaeoglobigerina, Hedbergellaの複数種,Praeglobotruncana gibba, Dicarinella imbricataおよびDicarinella canaliculataなどは、北西太平洋における最終産出層準は従来知られていたよりも後の時代まで延びる。これらの種の最終産出(LO)は国際対比には使えないことが明らかとなった。本年度は主要な地質調査を行った.調査地は北海道の羽幌,古丹別および穂別地域である.約20日間の調査で,特に古丹別地域に重点を置いた.そこでは35m間隔で同位体比測定用の試料を採取した.また,露頭から産出する,破片も含む全ての大型化石を鑑定し,1/1000のルートマップを作成した.約50試料について,信州大学の質量分析装置で炭素同位体比の分析を行ったが,装置の調子不良により,来年度の再測定が必要である.穂別地域では浮遊性有孔虫化石を良好に産出し,特に年代指標性が高いと思われる,KS21/22境界を確認した.また,炭素同位体比の分析(信州大学の装置を借用)から,その境界付近に炭素同位体比ピークがあることが分かったが,古丹別地域や大夕張地域の過去の研究でも類似のピークが認められている.それは最近ヨーロッパで広域対比可能なものとして議論されているものと同一である可能性が高い.さらに調査が必要である.羽幌地域では,各イノセラムス帯内で有孔虫用の試料を採取し,有孔虫殻の炭素・酸素同位体比を測定した.その結果,ほぼオリジナルな値を残している試料が多いこと,C02をメタンに還元するバクテリアの活動があったこと,当時の海水温が表層で26度,海底で18度程度であったことなどが示唆されている.また,試料中に含まれる有機物を最新の設備で同定するため,カナダ地質調査所を訪問した.ここでは,レーザー照射走査蛍光顕微鏡などを使用し,含まれている有機物を観察した.過去二年に引き続いて,北海道苫前町古丹別地域において地質調査を約二週間共同で行った.同地域では1/1000の縮尺のルートマップを作成した.また北海道穂別町でも調査を行った.古丹別地域では大型化石の産出は不良ではあったが,日本ではMiddle Turonianの示標種として用いられているInoceramus hobetsensisの層序的産出範囲を詳細に絞り込むことに成功したことが最大の収穫といえる.その範囲を含んで,ほぼ調査地域全体から連続的に泥岩を採取することができた.それらの泥岩は同位体分析用として,あるいは浮遊性有孔虫抽出用として系統的に金沢大学に保管されている(一部は粉末未処理状態,一部は酸処理済)。分析装置の借用を依頼していた某国立大学の研究室の分析装置の調子が不良であったため,古丹別試料の分析予定は延期した.一部は本年度末(3月)にアメリカ・インディアナ大学で分析を行う予定である.
ウィラード・リビーがノーベル化学賞を受賞して半世紀、放射性炭素濃度の計測は様々な分野で発展してきた。しかし加速器質量分析計は、巨大で高額、専属技術者が不可欠で、潤沢な研究資金を持つ研究機関しか所有できない。21世紀はフォトニクスの時代と言われるように、光計測技術の発展は目覚ましい。特に半導体レーザーの技術革新は質量分析計を凌駕する同位体分子種の高感度レーザー分光計測を可能にした。ベンチトップで安価なレーザー分光技術で14C計測が実現すれば、小規模の研究施設でも計測可能となり、飛躍的に研究の裾野が広がる。本課題では最先端のレーザー分光技術を駆使して「新しい14Cの超高感度分光法」の開拓に挑戦する。
エビ類の生活史戦略と遺伝的多様性の関係を探る-クロザコエビ属をモデルとして-

本研究では、日本海深海部に分布するクロザコエビ属3種(浅い方から順に、ヒメクロザコエビArgis hozawai、クロザコエビA.lar、トゲザコエビA.toyamaesis)を対象として、集団遺伝学的手法により種間の海域間分散能力を比較することを目的とした。ヒメクロザコエビとクロザコエビは小卵多産型で北太平洋海域まで広く分布するのに対し、トゲザコエビは大卵少産型で日本海固有種である。このような生態学的知見から、深海に分布する種ほど流れが穏やかな環境に適応し、大卵少産型で海域間分散能力が低く、結果として種の分布域も狭くなるという仮説を立てた。研究方法としては、まず、ミトコンドリアDNAで普遍的に使われているCOI遺伝子を調べ、遺伝的多様性の全体像を把握した。次に、タンパク質非コード領域であり、塩基置換が特に多いControl Regionという領域に、PCR用プライマーを設計し、集団遺伝学的解析を行った。COI遺伝子による主な研究成果としては、中層(水深200-250m)に分布しているクロザコエビの遺伝的系群識別である。クロザコエビは、日本海・西部太平洋・東部太平洋の3つのグループに別れたので、海域ごとに独享に資源管理する必要があると考えられる。次に、Control regionを調べたところ、深海に分布するトゲザコエビでは、海域間の分散が制限されていた(φ_<ST>=0.0743,P<0.01)のに対して、より浅海に分布するクロザコエビでは、高い分散能力が示唆された(φ_<ST>=0.0016,P=0.45)。これは、両種の卵サイズ変異とも対応しており、河川生態系で考えられている生活史戦略が日本海深海部でも当てはまる可能性が考えられた。本研究は、クロザコエビ属を用いた事例研究であるが、日本海深海部の生物相解明の萌芽的研究となることが期待される。本研究は、当初2年間の研究計画を立てており、1年目にミトコンドリアDNAのCOI遺伝子で全体の傾向を捉え、2年目に高感度なControl Regionを調べることで、海域間の遺伝子流動を種間比較することを目的としていた。思いのほか順調に研究が進み、当初より早い1年間で研究を完了することができた。研究成果としては、浅海性・小卵多産型の種は遺伝子流動が大きいのに対して、深海性・大卵少産型の種は遺伝子流動が制限されるという予定通りの結果を得た。さらに、クロザコエビArgis larについては、日本海・西部太平洋・東部太平洋の3つのグループに系群識別できるという、資源管理上重要な知見も得ることができた。本研究は、クロザコエビ属のみの事例研究であるため、他の深海生物にも見られる生活史戦略かどうかは、複数の生物種を比較する今後の研究が待たれる。また、本研究では、分子マーカーとしてミトコンドリアDNAを扱っているが、ミトコンドリアDNAは母系遺伝をするため、雌の移動のみを評価していることになる。従って、今度は、マイクロサテライト多型などの核DNAを解析し、ミトコンドリアDNAの結果と照合して、雄と雌両方の移動性を評価していくべきであると考える。思いのほか

順調に研究が進み、当初より早い1年間で研究を完了することができた。研究成果としては、浅海性・小卵多産型の種は遺伝子流動が大きいのに対して、深海性・大卵少産型の種は遺伝子流動が制限されるという予定通りの結果を得た。さらに、クロザコエビArgis larについては、日本海・西部太平洋・東部太平洋の3つのグループに系群識別できるという、資源管理上重要な知見も得ることができた。本研究は、クロザコエビ属のみの事例研究であるため、他の深海生物にも見られる生活史戦略かどうかは、複数の生物種を比較する今後の研究が待たれる。また、本研究では、分子マーカーとしてミトコンドリアDNAを扱っているが、ミトコンドリアDNAは母系遺伝をするため、雌の移動のみを評価していることになる。従って、今度は、マイクロサテライト多型などの核DNAを解析し、ミトコンドリアDNAの結果と照合して、雄と雌両方の移動性を評価していくべきであると考える。
農産物流通における電子商取引の可能性に関する研究

本研究では,既存データ・資料の分析とインターネット通信販売を導入している農業法人に対する聞き取り調査の結果から,農家におけるインターネット通信販売の現状と可能性,限界について検討した。その結果,次のことが明らかとなった。事例とした農家では,インターネット通信販売は,補助的な販売形態となっており,従来の通販の追加的な受注手段として位置づけられる。また,農家がインターネット通販を導入するにあたっては,労働力やインターネットやパソコンに関する知識や技術力などが課題となっている。本年度は,農産物のインターネット通信販売の成功要因に関する分析を行った。分析の対象は法人形態で農業を営む農業法人である。全国の農業法人に対して実施したアンケート調査の分析の結果,以下のことが明らかとなった。ネット通販を導入する農業法人は,2000年以降,増加し続けている。多くの農業法人にとってのネット通販は追加的な受注手段であり,補助的な販売形態と位置づけられる。農業法人におけるインターネット通信販売の導入は,顧客の増加や年齢層の拡大,顧客の地理的範囲の拡大などにはつながりやすいが,売上や利益の増加に結びつきにくい。しかしながら,売上や利益を上げている農業法人も存在している。どのような条件を持つ農業法人がインターインターネット通信販売で成功するのかを分析するために,ロジスティック回帰分析を実施した。具体的には,インターネット通信販売導入後に売上か利益か利益率が増加した法人をインターネット通信販売で成功した法人として,成功要因の分析を行った。その結果,売上高の規模や通販経験の有無,通販・インターネット通信販売の経験年数,取扱品目の違いなどは,インターネット通信販売の成功に対して有意な関連がみられなかったが,1戸からなる農業法人の方が複数戸からなる農業法人よりインターネット通信販売で売上や利益を上げる確率が高いことが明らかとなった。今後もインターネット通信販売を導入する産地が増えることが予想されるが,技術的な問題や収益性の問題が農業法人におけるインターネット通信販売拡大の阻害要因となっていることが明らかとなった。本年度は,インターネット通信販売を導入している農産物産地での聞き取り調査とその内容の分析を中心に研究を行った。昨年度の研究結果を踏まえて,農家1戸で法人化している小規模な農家を研究対象とした。聞き取り調査の内容から,農家におけるインターネット通信販売の現状と可能性,限界について検討した結果,次のことが明らかとなった。農家には,インターネット通信販売を導入することによって,新しい顧客層を取り込むことができたり,通信販売による売上が徐々に増えているという効果が生まれているが,その効果は限定的である。すなわち,インターネット通信販売による売上は数パーセント程度であり,補助的な販売形態となっている。さらに,農家がインターネット通販を導入するにあたっては次のような問題があることが明らかとなった。ひとつは技術的な課題である。高齢化した農家では,ウェブサイトの構築等を業者に委託したり,息子が経営に加わったことを契機にインターネット通信販売を導入していることから,インターネット通信販売を導入するための技術が不足している可能性が指摘できる。もう1つは,労働力不足の問題である。繁忙期には,収穫や出荷等の作業で多忙となるため,消費者に個別対応するインターネット通信販売の業務を行う時間が確保できていない。そのため,インターネット通信販売に注力できていない。3つ目は,ウェブサイトの認知度向上の難しさである。ウェブサイトを開設してもアクセス数が伸びないために,インターネット経由の注文数が増えない。
先天性ケトン体代謝異常症の研究：欠損細胞株の樹立と変異酵素発現実験系の確立

ケトン体代謝異常症の病態の解明をこれまで行ってきた。本研究ではこれまでに発現実験系と活性測定系を確立しているβケトチオラーゼ欠損症、サクシニル-CoA;3-ケト酸CoAトランスフェラーゼ欠損症に加えて、既に患者遺伝子変異を同定しているHMG-CoA合成酵素(HMGCS2)欠損症、HMG-CoAリアーゼ(HMGCL)欠損症,まだ症例のない3-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素(3HBD)、モノカルボン酸トランスポーター1(MCT1)の原因酵素のcDNAの発現実験系を確立し、これまで同定した変異について評価、発表することと,新たな疾患が発見されたときにいち早く解析出来る様準備しておくことを目的とする.1昨年度はHMGCS2の発現系の構築をヒト細胞培養系で確立したが、発現量が少なく変異体の評価が出来なかった。昨年度は大腸菌での蛋白発現、酵素精製系に変更して解析を進めてきた。大腸菌の系で発現した蛋白を部分精製し、活性を測定する系を構築でき、患者で見られた変異を持つ蛋白が残存活性がほとんどないことを証明できた。現在その再現性を確認中である。3-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素(3HBD)についてはノックアウトマウスのfetal fibroblastsからcell lineを確立しており、この欠損細胞を用いて発現系の構築が可能となった。MCT1についてはこれまでのところCRISPHER/Cas9形を用いて欠損細胞株を得ようとしたがまだ欠損したクローンが得られていない。今後も引き続き解析を進めて行く予定である。申請者はこれまで先天性ケトン体代謝異常症、特にβ-ケトチオラーゼ(T2)欠損症、サクシニル-CoA:3-ケト酸CoAトランスフェラーゼ(SCOT)欠損症の臨床と病態解明の研究を行ってきた。本研究では、既に患者遺伝子変異を同定しているHMG-CoA合成酵素(HMGCS)欠損症、まだ症例のない3-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素(3HBD)、モノカルボン酸トランスポーター1(MCT1)の原因酵素のcDNAの発現実験系を確立し、これまで同定した変異について評価、発表することと,新たな疾患が発見されたときにいち早く解析出来る様準備しておくことを目的とする.本年度はHMGCSの発現系の構築を中心に行った。基本的にヒト線維芽細胞においてはHMGCS欠損患者由来でなくてもHMGCSの発現がないことからβ-ケトチオラーゼ欠損症欠損SV40-transformedcell lineが発現系細胞として使えることが明らかになった。Wild-typeおよび4つの同定した遺伝子変異ベクタをpCAGGSにて構築も終了し、発現実験を行ったが予想よりタンパク発現が少なく、Wild-typeと変異体で差を明らかにできず現在検討を加えている。また3HBD欠損細胞は、3HBDノックアウトマウスのfetal fibroblastsを樹立中である。MCT1欠損細胞は現在CRISPR-Cas9系でノックアウトを試みている。アセトアセチル-CoA合成酵素欠損症(AACS)については既に共同研究者が発現系を確立しており、今回の研究であらたに構築する必要性はなくなった。計画通り進んできたが、最終段階でなぜHMGCSの発現が弱いのかまだ解決できていない。ほかの2つのタンパクについては欠損細胞を作成中であり、予定通りである。ケトン体代謝異常症の病態の解明において本研究では、既に患者遺伝子変異を同定しているHMG-CoA合成酵素(HMGCS)欠損症、HMG-CoAリアーゼ(HMGCL)欠損症,まだ症例のない3-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素(3HBD)、モノカルボン酸トランスポーター1(MCT1)の原因酵素のcDNAの発現実験系を確立し、これまで同定した変異について評価、発表することと,新たな疾患が発見されたときにいち早く解析出来る様準備しておくことを目的とする.昨年度度はHMGCSの発現系の構築を細胞培養系で確立したが、発現量が少なく変異体の評価が出来なかった。細胞質のHMGCS1の活性の影響、アセトアセチル-CoAを基質とする他の酵素活性の影響をなくすための活性測定系g複雑であった。本年度は大腸菌での蛋白発現、酵素精製系に変更して解析を進めてきた。酵素たんぱくの精製までは成功しているが、まだ活性が十分に測定できず、検討を加えている。また3HBD欠損細胞は、マウスのfetal fibroblastsを樹立できた。HMGCSの発現系は予想外に活性を測定するのが難しく、大きく方法を動物細胞発現系から大腸菌発現系に変更して進めているが、まだ予想される酵素活性を検出出来ておらず、さらに検討が必要なためにやや遅れているという評価をしている。3HBD欠損細胞はマウス線維芽細胞で確立できており、MCT1の欠損細胞を作成中である.ケトン体代謝異常症の病態の解明をこれまで行ってきた。本研究ではこれまでに発現実験系と活性測定系を確立しているβケトチオラーゼ欠損症、サクシニル-CoA;3-ケト酸CoAトランスフェラーゼ欠損症に加えて、既に患者遺伝子変異を同定しているHMG-CoA合成酵素(HMGCS2)欠損症、HMG-CoAリアーゼ(HMGCL)欠損症,まだ症例のない3-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素(3HBD)、モノカルボン酸トランスポーター1(MCT1)の原因酵素のcDNAの発現実験系を確立し、これまで同定した変異について評価、発表することと,新たな疾患が発見されたときにいち早く解析出来る様準備しておくことを目的とする.

1昨年度はHMGCS2の発現系の構築をヒト細胞培養系で確立したが、発現量が少なく変異体の評価が出来なかった。昨年度は大腸菌での蛋白発現、酵素精製系に変更して解析を進めてきた。大腸菌の系で発現した蛋白を部分精製し、活性を測定する系を構築でき、患者で見られた変異を持つ蛋白が残存活性がほとんどないことを証明できた。現在その再現性を確認中である。3-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素(3HBD)についてはノックアウトマウスのfetal fibroblastsからcell lineを確立しており、この欠損細胞を用いて発現系の構築が可能となった。MCT1についてはこれまでのところCRISPHER/Cas9形を用いて欠損細胞株を得ようとしたがまだ欠損したクローンが得られていない。今後も引き続き解析を進めて行く予定である。HMGCS発現系について、もう一度発現ベクター内のHMGCS cDNAの配列のチェックから見直す。これまでの経験から発現がこのタンパクのみ低いというのは考えにくい。MCT1の欠損細胞はCRISPR-Cas9系でノックアウトを試みているが、MCT1の発現を確認するイムノブロットの感度が低いためこちらの工夫も今後の発現系確立のために必要と考えている。現時点で欠損症患者がいるのはHMGCS欠損症であり、その変異の評価を行うのが最も重要な点である。HMGCS発現系について、大腸菌での蛋白発現までは出来ており、活性測定方の工夫を行う。MCT1の欠損細胞はCRISPR-Cas9系でノックアウトを試みているが、MCT1の発現を確認するイムノブロットの感度が低いため培養条件なども今後の発現系確立のために必要と考えている。端数が生じたため。平成30年度に消耗品費として使用する平成29年度の予定と併せて活用する。
重力理論検証の視点での天文単位の永年変化問題の究明

KrasinskyとBrumbergによる惑星レーダーおよび惑星探査機の軌道解析データの解析に基づいて報告された1世紀あたり約15 ±4メートルの天文単位の永年的変化問題を重力理論検証の視点で考察を行った。この問題解決のために、(a)太陽系内ダークマター密度の時間変化を記述するアインシュタイン方程式の近似解を求めた、(b)時間依存する時空内における光・信号の伝播をSyngeのWorld functionに基づくTime transfer functionにより計算する手法を示した、(c)非一様宇宙モデルとして注目されるLTBモデルに基づく惑星摂動力を求め、この惑星運動への効果を評価した、(d)角運動量保存則に基づく天文単位の永年変化問題解決のシナリオを提案した。太陽系内における高精度観測データは重力理論の検証にとっても有益で,今の所アインシュタインの理論を支持している.一方,観測精度の向上により既存の理論的枠組では説明が困難な事例が報告されており.我々は天文単位の永年的変化に関心を寄せている.この現象がどのような要因によって引き起こされているか明らかではないが,重力の性質と何らかの関係がある可能性ある.この問題の解明を目指し以下の研究を行なった.1.角運動量保存則に基づく地球・月間の潮汐加速の理論を太陽・惑星系に応用し天文単位の永年的変化について一つの可能性を提示した太陽内での潮汐相互作用を仮定し.報告されたdAU=dt=15[m/世紀]の値を用い太陽の質量放出に伴う慣性モーメントの変化の寄与を調べた.特に太陽系の内惑星領域のみで天文単位の増加が起こっていると仮定した場合,天文単位の永年変化が説明可能である事を示した.2.太陽系内のダークマターの存在から天文単位の永年的変化が説明可能か調べるために,太陽重力とダークマターがある場合の近似メトリックを導出し,このメトリックを元にレーダー信号の時間遅れと信号の周波数シフトについて考察した.さらにダークマター密度の時間変動と天文単位の永年的変化との関係を調べ,天体暦と矛盾しない現実的ダークマター密度の元では報告された天文単位の増加を説明できない事を示した.3.ダークエネルギーの導入なしに宇宙の加速膨張を説明しようという取り組みの一つに宇宙の非一様性の立場からの護論があり,代表的なモデルにLemaitre-Tolman-Bondi解がある.この時空内での粒子軌道を考察し,天体が重力的に束縛されている系においてこのモデルに起因する宇宙論的効果について考察した.その結果非一様性に起因する効果では天文単位の永年変化を説明できない事を示した.太陽系内の高精度位置天文観測データを解析する上で,光の湾曲,重力による時間遅れ、無線リンクの周波数変化といった信号伝播モデルの精密化が必要です。通常は光のヌル測地線方程式を積分する事で解が求められていますが,この方法では高次の相対論的効果や時空が時間依存する場合,ヌル測地線方程式を解くことは大変難しくなります。しかし最近Le Poncin-Lafitte et al. (2004), Tey ssandier and Le Poncin-Lafitte (2008)がSyngeのWorld functionを元にしたTime transfer functionという新たなアプローチを確立し,ヌル測地線方程式を直接積分する場合と比べ,特に2次以降の高次のポスト・ニュートン/ポスト・ミンコフスキー補正を含む場合の計算量が劇的に軽減される事を示しました.彼らの定式化そのものはメトリックが時間に依存する場合を含めた,一般的な表現が与えられてはいるものの,彼ら自身は実際に時間依存する場合の解を求めた訳ではありません.時間依存する時空としてSchwarzschild時空とFLRW宇宙モデルを融合したようなMcVittieモデルを採用し,この時空内を伝播する光・信号の時間遅れを計算し.信号伝播における宇宙論的効果をより正確に評価しする事に成功しました.この結果を天文単位の永年変化へ応用し,宇宙膨張による時間依存する効果は観測された天文単位の時間変化量$d{\rmAU}/dt=15\pm 4$[m/世紀]に比べて約9桁小さい効果である事を示しました.天文単位の1世紀あたり約15mの永年的(時間的)変化の原因を重力理論の検証という視点から検証している。近年、天文単位の永年的変化やパイオニア探査機の異常加速問題等、一般相対論の枠組みでさえ説明出来ない位置天文学的な問題が浮上している。一方、宇宙論におけるダーク・エネルギーやダーク・マター問題は重力の性質と深く関わっているようにも見える。したがって、様々な物理・天文観測の中でもっとも高精度を誇る太陽系内の位置天文観測データを用いて重力理論を検証する事が重要と思われる。

本年度の研究では、天文単位とその時間変化量を決定する上で重要な役割を果たす光の伝播を記述する光差方程式に対して、時間にあらわに依存する効果である宇宙膨張効果を、Syngeのworld functionに基づくTime transfer functionを用いて解の時間依存性をしっかり保持した形で計算・定式化することに成功し、宇宙膨張によって引き起こされる天文単位の増加量を見積もることが可能になった。その結果、宇宙膨張によって生じる時間変化量は観測された実際の天文単位の永年変化量に比べて9桁小さい効果でしかないことを明らかにした。さらに近年、宇宙の加速膨張をダーク・エネルギーの導入なしに説明する取り組みとして宇宙の非一様性に基づく議論も活発になっている。これまで太陽系のような局所的に重力で束縛された系に対して一様・等方モデルの寄与は議論されてきたが、非一様性がどのように影響するかの議論はなされていなかった。そこで、局所重力束縛系に宇宙の非一様性がどのように寄与するかをLemaitre-Tolman-Bondi宇宙モデルを用いて評価した。その結果、一様・等方モデルから導かれる既知の効果に加え、LTBモデルによる補正効果が現れ、原理的には観測による制限が可能であることを示した。しかし、天文単位の永年的変化を考える場合、この補正は極めて小さな効果である事が分かった。さらに、宇宙定数の検証に関して、その光の運動への寄与を考察し、Λが測地線方程式と光子軌道の双方に現れる事、しかしΛの効果はインパクトパラメータの定義に完全に取り込まれる事、そして宇宙論的レンズ方程式へのΛの寄与はangular diameter distanceに完全に吸収される事を示した。Krasinsky and Brumberg (2004)で報告された天文単位の永年変化問題について考察を継続した.本年度は,理論的な側面で現在考慮されていないいくつかの要因について議論した.1つは宇宙膨張効果のうちで,非一様な宇宙モデルによる寄与が太陽系の惑星運動に対してどのような影響を及ぼすのかについてである.非一様宇宙モデルとしてLemaitre-Tolman-Bondiモデル(LTBモデル)を用いて,惑星運動方程式への影響を調べた.その結果,一様等方モデルにより現れる効果(摂動)に加えて,非一様モデル固有の効果を導きだす事が出来た.Krasinskyらの論文では,天文単位の永年的変化を引き起こす1つの可能性として,宇宙の非一様効果があげられてはいたが,我々の研究では,非一様効果を考慮しても,観測データの再解析で得られた天文単位の永年的変化を説明する事は困難であった.ただ,LTBモデルは背景時空の動径方向の非一様性を課すことは出来るが,時空モデルとしては球対称を仮定するため,角度方向の密度分布にムラがある場合は考慮する事が出来ず,この点は今後の検討課題の1つであろうと思われる.もう1つの宇宙論的背景として,宇宙定数Λにより誘発される近日点移動について再考察を行った.光に対するΛの寄与と異なり,宇宙定数Λが近日点移動を引き起こす事は以前より知られていた.しかし,導かれる近日点移動量の公式が文献によって2つ存在し,どちらの式が正当性があるのかははっきりしていなかった.
歯科用合金の腐食モニタリングシステムの設計

歯科用合金の腐食による損傷の推定を目的として、腐食状況を系統的に測定できるシステムの設計を試みた。測定手法としては、電気化学測定法を選択した。さらにその内のクーロスタット法を、実際の測定手法として選択した。この測定法を腐食モニタリングシステムとして用いるためには、フルコンピュータ制御による装置が必要であるため、SEIKO EG&G(プリンストンアプライド・リサーチ)のポテンショガルバノスタットModel283を購入して現有のIBMパーソナルコンピュータに接続し、SEIKO EG&G(プリンストンアプライド・リサーチ)の既製ソフトウェアにて制御を行なえる測定装置の設計を行なった。しかし、既製ソフトウェアにては、クーロスタット法の測定制御が十分でなかったため、ソフトウェアの改良を行なった。しかし、その改良は製作上の問題で困難を極めたため、メーカー(SEIKO EG&G)にソフトウェア改良を依頼した。現段階では、メーカー側からの改良に関する解答を得ていない。そこで、他の測定手法の応用を検討した。クーロスタット法に変わる、腐食モニタリングシステムへの応用ができる電気化学的測定法として、ポテンショスタティック法を選択した。実際に、各種歯科用合金を用いてポテンショスタティック法にて測定を行なってみたところ、実験結果の表1に示したように、人工唾液中でのイオウイオンとの腐食反応の感度に順位付けをすることができた。この結果から、ポテンショスタティック法が腐食モニタリングシステムとして、応用可能であると考えられる。さらに、この方法の使用が十分であるかを検討するためには、得られた測定結果の校正と確認が必要である。また、ポテンショスタティック法も測定操作は簡便であるが、クーロスタット法に比べ測定時間が長いという欠点を持つ。そこでクーロスタット法測定のためのソフトウエア改良が行なえたならば、当初の目的どおり、その腐食モニタリングシステムへの応用を試みたい。生体材料である歯科用合金は、充分な耐食性を有することが必要十分条件である。しかし、口腔内環境は複雑で個人差もあり、in vitroにおいてそれをシミュレーションして実験を行なうことは、大変な困難をきわめる。本研究は、口腔内の腐食による歯科用合金の損傷の推定を目的として、腐食状況を系統的に測定できるシステムを設計するものである。その測定法には、専門的な測定技術を必要とせず短時間に測定できる、ク-ロスタット法の応用を考えた。ク-ロスタット法は、一定の電気量を金属試験片に瞬時に与え、過電圧の経時変化を追跡することにより、腐食に関与する各種のパラメータを求める方法である。この方法をモニタリングシステムとして実用化するためには、コンデンサ容量や充電電圧の自動設定、および測定データの自動解析化をはかる必要がある。データ解析には複雑な演算があるため、測定精度を上げるためにもデータ処理には、パーソナルコンピュータを必要とする。本年度予算にてプリンストン・アプライド・リサーチのModel283ポテンショ/ガルバノスタット,およびその測定用ソフトウェアを購入したことによって、フルコンピューターコントロールによる測定システムの設計ができた。また、クロースタット法による測定のための試料電極,参照電極および対極に関する電極系の設計もできた。しかし、測定データの自動解析化をはかるためには、購入のソフトウェアに手を加え、工夫を凝らす必要があり、モニタリングシステムの校正には至らなかった。次年度の課題として、上記事項の検討と予備実験を行なう予定である。

ク-ロスタット法は、一定の電気量を金属試験片に瞬時に与え、過電圧の経時変化を追跡することにより、腐食に関与する各種のパラメータを求める方法である。この方法をモニタリングシステムとして実用化するためには、コンデンサ容量や充電電圧の自動設定、および測定データの自動解析化をはかる必要がある。データ解析には複雑な演算があるため、測定精度を上げるためにもデータ処理には、パーソナルコンピュータの導入を必要とする。昨年度申請の予算にてプリンストン・アプライド・リサーチのModel283ポテンショ/ガルバノスタット、およびその測定用ソフトウェアを購入したことによって、フルコンピューターコントロールによる測定システムの設計ができた。またク-ロスタット法による測定のための試料電極、参照電極および対極に関する電極系の設計もでききた。本年度予算にて、昨年購入のソフトウェアに手を加え、測定データの自動解析を計る工夫を凝らした。続いて、予備実験を行ったが、実際の市販の歯科用合金を用いるまでには至らなかったし、質量損の測定を行ないモニタリングシステムの再校正も今後必要である。現時点までにおいては、充分に実用可能を考えられるシステムの設計ができた。
ヌタウナギの生殖内分泌機構の解明

クロヌタウナギの視床下部ー下垂体ー生殖腺軸について調べた。その結果、生殖腺の発達に相関して、下垂体のGTH量と性ステロイド合成の律速酵素であるCYP11AmRNA量がともに増加すること、性ステロイドホルモン投与によりGTH分泌が抑制されること、視床下部因子であるPQRFアミドペプチド投与によりGTHのRNA量が増加することなどから、ヌタウナギ段階で視床下部-下垂体-生殖腺軸が確立していることが明らかとなった。新潟県沿岸の海水温の異常上昇により、年間を通じて材料のクロヌタウナギがほとんど入手できなかったため、新規の研究の多くが次年度に持ち越しとなった。主な成果として、1)クロヌタウナギの血中ステロイドホルモン動態をエストロジェンのみならず、テストステロンとプロゲステロンについても雌雄とも幼弱期から生殖腺の発達段階に応じて調べ、学術雑誌に投稿した。2)エストロジェンとテストステロンのそれそれをクロヌタウナギに投与して、下垂体の生殖腺刺激ホルモン(GTH)のα鎖とβ鎖の両方の蛋白量とmRNA量の変化を調べた。エストロジェン投与により、GTHの蛋白量はα鎖とβ鎖の両方とも顕著な増加を示したが、テストステロン投与では有意な変化が見られなかった。一方、GTHのmRNA量は、エストロジェン投与により顕著な変化がみられず、テストステロン投与により有意に減少した。これらの結果から、エストロジェン投与によるGTH蛋白量の増加は下垂体からのGTHの分泌が抑制されたためであり、テストステロン投与によるGTH mRNA量の減少は、GTHの生産と分泌の両方が抑制されたためと示唆された。これらの成果をまとめ、学術雑誌に投稿した。3)前年度の研究で、クロヌタウナギの精巣cDNAライブラリーからコレステロール側鎖切断酵素(CYP11A)の遺伝子をクローニングし、そのmRNA発現量が卵巣の発達段階と相関して増加することを明らかにした。今年度の成果として、CYP11AのmRNA発現量が精巣の発達段階とも相関して増加することを明らかにするとともに、生殖腺内でのCYP11AのmRNAの発現部位をin situ hybridizationにより調べた。その結果、CYP11A mRNAは、精巣では間細胞に強発現し、卵巣では莢膜細胞に強発現と顆粒膜細胞に弱発現していることが明らかとなった。前年度までの研究で、クロヌタウナギの精巣cDNAライブラリーからコレステロール側鎖切断酵素(CYP11A)の遺伝子をクローニングし、そのmRNA発現量が雌雄とも生殖腺の発達段階と相関して増加すること、及びCYP11A mRNAの発現部位をin situ hybridizationにより調べ、予備的な結果を得たことを報告した。今年度、さらに詳しく調べた結果、CYP11A mRNAは、精巣では間細胞と管状境界細胞の両方で、卵巣では莢膜細胞で発現していることが明らかになった。さらに、クロヌタウナギGTHを加えて培養した精巣では、有意にCYP11Aの遺伝子発現が上昇することを確認し、学術雑誌に投稿した。本研究で雌ではCYP11AmRNAの発現動態と血中エストラジオール動態に正の相関が見られるのに対し、雄ではCYP11AmRNAの発現動態と血中エストラジオールやテストステロン動態に相関性がみられないことから、雄では未知のアンドロジェンを主要性ホルモンとしていることが示唆された。一方、ヌタウナギのGnRHを含む新規視床下部ペプチドの単離をめざして、MALDI-TOF-MS分析法で得た有力な候補について免疫組織化学により調べたが、新規ペプチドの同定には至らなかった。また、当初予定していたヌタウナギのGTH遺伝子の構造解析についても、成果をあげるまでに至らなかった。この3年間の研究を通じて、エストロジェン投与がGTH分泌を抑制すること、視床下部の新規PQRFamideペプチドがGTHmRNAの発現を促進することなどの成果を上げることができた。また、ヌタウナギの生殖腺における性ステロイド合成部位を特定することができた。これらの結果は、高等脊椎動物と同等であることから、脊椎動物は進化の初期段階で下垂体を獲得すると同時に、視床下部ー下垂体ー生殖腺軸を確立したものと考えられる。科学研究費補助金の配分が2回分割となったことから、当初予定していた遺伝子の網羅的大量解析(EST)は他経費で行われた。EST用経費は物品購入費と旅費に充当された。研究は、ほぼ交付申請書に記載された内容に沿って行われた。1)ヌタウナギの性ステロイドホルモン合成酵素群について、新たに3500クローンのEST解析を行ったが、性ステロイドホルモン合成酵素に関連した新たなクローンは得られなかった。一方、生殖腺におけるコレステロール側鎖切断酵素(CYP11A)のmRNA発現量の詳細な変化が明らかとなった。すなわち、卵黄形成前の卵では非常に低く、卵黄形成と相関して上昇するが、退化卵胞では卵黄形成前と同程度に低いことから、退化卵胞でのホルモン生産量も低いことが示唆された。

2)ヌタウナギにエストロジェンを投与し、1日後と2日後に調べると、GTHβ鎖mRNA発現量は1日後では対照群と差がみられないものの、2日後では有意に上昇していた。一方、GTHα鎖mRNA発現量には、1日後も2日後も変化が見られなかった。これまでの成果とあわせて、エストロジェンの下垂体に対する負のフィードバック作用はGTHの生産抑制には働いておらず、分泌抑制に働いていることが強く示唆された。3)ヌタウナギの下垂体の視床下部支配を調べる目的で、各種視床下部ペプチドを免疫組織化学、生化学的検索、MALDI-TOF-MS分析等により調べた。その結果、ヌタウナギの視床下部にPQRFaペプチドならびに新規RFaペプチドが存在していること、器官培養下の下垂体にPQRFaペプチドを投与すると、GTHβ鎖のmRNA量が用量依存的に増加すること、PQRFa含有ニューロンの神経終末が視床下部漏斗核に分布する血管に終わることなどが明らかとなった。ヌタウナギの生殖内分泌系については、これまで情報が乏しく、機能的な視床下部ー下垂体ー生殖腺軸は存在しないと考えられてきた。ヌタウナギが機能的な生殖腺刺激ホルモン(GTH)をもつことを示した私たちの最近の研究(PNAS, 2010)を端緒に、ヌタウナギの生殖内分泌系の研究が始まったところである。本研究で、視床下部ホルモンの一つであるPQRFaペプチド投与により下垂体のGTH mRNA発現量が用量反応的に上昇したことと、PQRFaペプチドの神経終末が視床下部内の血管に終末を作ることから、ヌタウナギのGTH機能が視床下部支配を受けていること(Osugi et al., Endocrinology,2011)、エストロジェンの血中動態が生殖腺の発達段階と相関して増加すること(投稿中)、GTHの生産・分泌が視床下部を介して性ステロイドホルモンにより抑制的に調節されていること(投稿中)などが明らかとなり、ヌタウナギの視床下部ー下垂体ー生殖腺軸の全体像が理解できるまでに至ったことはきわめて大きな成果である。ヌタウナギの生殖内分泌系については、これまで、機能的な視床下部ー下垂体ー生殖腺軸は存在しないと考えられてきた。本研究で、エストロジェンの血中濃度ならびに性ステロイドホルモン合成酵素の発現動態が生殖腺の発達段階や下垂体GTHのmRNA発現量やタンパク量と強い相関性を持つことが明らかになり、また性ステロイドホルモンの負のフィードバック作用についても明確な知見を得た。さらに、視床下部の下垂体GTH支配についても新たな知見を集めている。以上のように、研究は着実な進展をみせている。性ステロイドホルモン合成酵素群のEST解析は、期待した成果をあげることができなかったが、幸いにもステロイド合成酵素群全体の律速酵素であるCYP11A遺伝子がクローニングできたので、この酵素を手がかりに、ヌタウナギの精巣培養系に組替えGTHを投与することにより、ヌタウナギGTHのステロイド産生における機能を理解する。また、ヌタウナギの副腎皮質相当組織の同定や脳でのニューロステロイドの発現動態などを明らかにする。現在、ヌタウナギの視床下部の生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)は同定されていない。