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虚血性急性腎不全における細胞間接着装置の変化に関する研究

虚血性急性腎不全モデルとして、(1)腎尿細管由来培養細胞を用いて細胞内ATPを欠乏状態とする、(2)マウス左腎動脈をクランプすることにより腎血流を遮断する、の2つを用いた。上皮細胞極性形成とその維持に重要な役割を演じているE-カドヘリン(アドヘレンス・ジャンクション)は、通常120kDa蛋白として検出されるが、ATP欠乏状態の培養細胞および虚血腎では80kDa(平成12年度に発見)および35kDa(平成13年度に発見)フラグメントとして検出され、E-カドヘリンは虚血腎にて多段階で分解されることが明かとなった。この分解には未知の酵素活性が関与している可能性が示され、現在その切断部分の同定および責任酵素の同定を進めている。また、膜蛋白であるE-カドヘリンはその分解に伴って細胞内に取り込まれ、それぞれ細胞外ドメインおよび細胞内ドメインにて切断されることが判明した。さらに平成12年度には、E-カドヘリン-カテニン分子複合体は虚血の進行に伴って解離することや、完全に解離した状態の細胞はもはや虚血ストレスから回復しないことを明らかにした。一方、タイト・ジャンクション膜蛋白であるオクルジンも分解を受け、細胞内に取り込まれたが、クロージンは虚血が進行しても細胞内に取り込まれることはなく、細胞表面上でその分布を変化させた(平成13年度)。今後はギャップジャンクションやデスモゾームでもその変化を検討する予定である。急性腎不全回復期にはSrcチロシンキナーゼ活性上昇がみられるので、温度感受性v-Srcを活性化することによりジャンクション蛋白の変化をみた(以下、平成13年度)。V-Srcキナーゼによりほとんどのジャンクション構成蛋白はチロシンリン酸化を受けたが、プロテアソーム阻害薬を作用させるとそのリン酸化反応は著明に抑制された。この過程でユビキチンリガーゼ活性を持つc-Cblが著明に減少することから、v-Srcキナーゼ活性上昇に伴う一連のリン酸化反応にプロテアソームを介する蛋白分解が重要な役割を演じていることが明らかとなった。現在これらの知見を複数の論文にまとめる作業に入っている。温度感受性v-srcMDCK細胞を用いて、同細胞における細胞間接着因子のチロシンリン酸化反応を調べた。ZO-1、occludin、claudin-1(tight junction)・E-cadherin、α-catenin、β-catenin、pp120(adherens junction)およびpaxillin(focal contact)に対する特異的抗体を購入し、40°C(v-srcは不活性)にて培養した細胞を35°C(v-src活性化)にて培養し(あるいは35°Cにて培養の後、40°Cにもどして)、経時的にそれぞれの蛋白にリン酸化度や細胞骨格蛋白との結合度評価を検討した。その結果、細胞間接着因子構成蛋白はv-src活性化によりチロシンリン酸化をうけ、特にZO-1は細胞骨格蛋白との結合度が著明に低下した。v-src不活化に伴いそのリン酸化度は減少することから、現在その脱リン酸化反応速度を調べるために、同細胞にチロシン脱リン酸化酵素をウイルスベクターを用いて導入し検討している段階である。虚血性急性腎不全モデルとして、(1)腎尿細管由来培養細胞を用いて細胞内ATPを欠乏状態とする、(2)マウス左腎動脈をクランプすることにより腎血流を遮断する、の2つを前年度に引き続き用いた。

上皮細胞極性形成とその維持に重要な役割を演じているE-カドヘリン(アドヘレンス・ジャンクション)は、ATP欠乏状態の培養細胞および虚血腎にて80kDaの他に新たに35kDaのフラグメントを検出した。この分解にも未知の酵素活性が関与している可能性が示され、現在その同定をするための実験を開始している。また、80kDaフラグメントは細胞外の分解であるが、35kDaの分解は細胞内で起こることが明かとなった。一方、タイト・ジャンクション膜蛋白であるオクルジンも分解を受け、細胞内に取り込まれたが、クロージンは虚血が進行しても細胞内に取り込まれることはなく、細胞表面上でその分布を変化させた。急性腎不全回復期にはSrcチロシンキナーゼ活性上昇がみられるので、温度感受性v-Srcを活性化することによりジャンクション蛋白の変化をみた。V-Srcキナーゼによりほとんどのジャンクション構成蛋白はチロシンリン酸化を受けたが、プロテアソーム阻害薬を作用させるとそのリン酸化反応は著明に抑制された。この過程でユビキチンリガーゼ活性を持つc-Cblが著明に減少することから、v-Srcキナーゼ活性上昇に伴う一連のリン酸化反応にプロテアソームを介する蛋白分解が重要な役割を演じていることが明らかとなった。この機序がv-Srcに直接的に働くものか否かに関して検討を進めている。現在これらの知見を複数の論文にまとめる作業に入っている。
肩水金関漢簡による漢代西北交通・防衛機構の研究

漢代西北地域に設置された関所「肩水金関」から出土した「肩水金関漢簡」に基づき、関所の機能を考察した。その中でも「致」は現在の税関申告書に相当する文書である。他の遺跡からはほとんど発見されておらず、「致」によって人や物品の出入をチェックすることが、関所の大きな特徴であるとわかった。また、近隣の軍事施設の遺跡から出土した「居延漢簡」と対照して、先行研究の再検討を行った。結果、肩水金関には軍事系統の機関である「東部」が同居し、両者は協業関係にあることが判明した。平成25年度は『肩水金関漢簡』貳が刊行されたため、その情報をデータベースに追加する作業を行った。文字情報のテキスト化ならびに画像情報の処理を完了させ、あとはデータベースソフト(ファイルメーカー)に反映させるのみとなっている。前年度に台湾・中央研究院歴史語言研究所で調査した封検(現在の封筒に相当)に関する知見を論文にまとめ、その形態変遷を論証した(平成26年度中に刊行予定)。また、使用方法や記載内容から、封検が機関間の文書のやり取りを把握するための鍵となるという認識が強まった。加えて、封検の形態変化と伝(通行証)の形態変化との関連性もあわせて論じた。『肩水金関漢簡』貳によって得られた新たな情報にもとづき、肩水金関漢簡の中に多く含まれている致(人・物品の出入申告書)について再考察した。その結果、封検に記された宛名によって、致が関所のみに宛てられたものであることが鮮明となり、関所の特徴を示す重要資料であることがより明確となった。里耶秦簡の旅行者への食料支給要請文書を分析し、県などと同じく関所においても公用の旅行者に対して食料を支給していたことが判明した。ただし、肩水金関漢簡の類似した文書との比較から、秦と前漢後半期では制度的な変化があることを指摘した。甘粛省の関所や県城などの遺跡調査を実施した。関所の遺跡である陽関は開けた場所にあり、さらに玉門関は烽燧線の結節点にあることがわかった。不法に越関されても容易に察知できる立地に設置されたものと推測される。県城遺跡においては、城壁の構造および補修状況に注意してその年代を考察すべきという知見が得られた。また、この調査で得られた成果を別地域において検証すべく、平成26年度は河南省・陝西省・四川省において調査を行うことを計画しており、具体的な調査対象を選定した。平成24年度はデータベースソフト・ファイルメーカーを利用して秦漢時代の出土簡牘史料データベースの作成に取り組み、ほぼ完了させた。文字だけでなく、簡牘の写真も合わせて掲載し、形状からの考察にも便をはかっている。データベースにもとづき、肩水金関漢簡と敦煌懸泉置漢簡の分類・比較を進めた。その結果、敦煌懸泉置漢簡あるいはその他の遺跡からはほとんど発見されていない、致と呼ばれる文書が肩水金関漢簡の中に多く含まれていることが判明した。そして、致は人や規制対象品を関所から持ち出したり、持ち込んだりする際の申告書であり、関所の主業務がそのチェックにあることが考察によって明らかとなった。加えて、肩水金関漢簡には肩水候官および通道厩という他機関の文書も紛れ込んでおり、この三つの機関が一体で運営されていたことも見えてきている。平成25年度に実施を予定している、中国西北地域調査での調査対象遺址を選定した。肩水金関遺跡は軍事管理区域に所在し、残念ながら立ち入ることができないため、その代わりとして、同じ関所の遺跡である陽関と玉門関の調査を行うこととした。さらに、google earthなどを用いて、河西回廊の交通路線に位置する漢代の県城遺跡や軍事遺跡、懸泉置を調査対象としてピックアップし、下調べを行った。台湾・中央研究院において、歴史語言研究所所蔵居延漢簡(肩水金関遺跡出土簡も含む)の調査を実施した。調査では封検と呼ばれる、現在でいうところの封筒を集中的に観察し、封検の形態変遷やそれに付随する当時の文書処理業務の実態について知見を得ることができた。事前に関連する資料を収集したうえで、河南省・陝西省・四川省において、函谷関・潼関・武関・散関・剣閣関・七盤関などの関所の遺跡、および交通関係の観点から華陰故城・商鞅邑城・漢長安城・左馮翊故城・陳倉故城・梓潼故城・昭化故城・杜鵑城・厳道古城といった都市遺跡を調査した。関所は険しい場所に位置するという感がある。しかし、実際に遺跡を見る限り、関所それ自体はおおむね開けた場所にあり、山地の入口を塞いでいるという場合がほとんどであった。しばしば戦闘の舞台となり、軍事要塞としてのイメージが先行する関所だが、平時は通行を管理する役所であったことは出土文書から明白であり、こうした立地こそがむしろ適しているといえる。また、周囲の高台には烽火台が設置され、それとの連携によって不法な通関を阻止する体制であったことが看取された。2014年度中には新たに『肩水金関漢簡』第3巻が刊行されたため、収録簡の内容分類を行った。

すでに第1巻・第2巻を検討した段階で肩水金関漢簡の中には関所の業務から逸脱し、候官や部・燧といった軍事系統の機関に属すべき文書や帳簿類が確認されていた。さらに第3巻収録簡の検討によって、肩水金関には部のレベルにあたる東部候長治所(東部燧)が同居もしくは隣接していたこと、肩水金関の長官である金関嗇夫がしばしば肩水候官の長官である肩水候の代理に任じられていたことが判明し、肩水金関漢簡の中には関所のみならず、部や候官の文書・帳簿が含まれていることが明らかとなった。2016年度は昨年度発覚した肩水金関と東部候長治所の同居関係に焦点をあて、新たに刊行された『肩水金関漢簡』第4巻を利用しながら研究を進めた。その結果、肩水候官管下においては部の名称と同名の燧は存在しないことがわかった。また、東部候長治所が肩水金関であるほか、その他の治所も騎士の営所などに同居していた可能性が高い。これにより、候長治所は管轄下のいずれかの燧に置かれ、その燧名を部の名称とするという居延漢簡に依拠した従来の定説が、肩水では当てはまらないことが明らかとなった。加えて、肩水金関=東部候長治所において、部の属吏である候史が活動していた形跡が見られる。候長と候史は治所を別にしていたとする先行研究の見解に再検討を促す結果が得られた。さらに、本来は肩水金関の業務であるはずの通関業務に、東部の吏が携わっている事例が確認された。その他、警備などの重なる職責に関しても、肩水金関と東部の協業関係がうかがわれる。これ関する論文は28年度中に発表予定である。上記以外に今年度は、特に馬の通関を取り上げて、交通機関としての関所の独自性および関所における通行規制の実態を考察した。伝・符・致という三種の主要な通行証明書類を分析し、伝と符は基本的に車・牛・馬の数量記載にとどまるが、通関専用書類である致にはそれ以外の物品についても記載され、馬に関しても非常に詳しい情報が載せられること示し、関所の物品の規制レベルが他の機関よりも高かったことを指摘した。ただし、通行許可証である伝・符・致はいずれも旅行者の出発地の県や官署で発給されるものであるため、物品通関の主導権は出発地の県や官署が持っており、正当な手続きを踏んでいれば、関所から厳しい詮索を受けることはなかったと論じた。これについてはすでにシンポジウムで発表し、また28年度に刊行される報告論集に論文が掲載されることが決まっている。漢代西北地域に設置された関所「肩水金関」から出土した「肩水金関漢簡」に基づき、関所の機能を考察した。その中でも「致」は現在の税関申告書に相当する文書である。他の遺跡からはほとんど発見されておらず、「致」によって人や物品の出入をチェックすることが、関所の大きな特徴であるとわかった。また、近隣の軍事施設の遺跡から出土した「居延漢簡」と対照して、先行研究の再検討を行った。結果、肩水金関には軍事系統の機関である「東部」が同居し、両者は協業関係にあることが判明した。本研究では、永田英正『居延漢簡の研究』において展開された、出土木簡の分類整理を通してその遺跡に置かれていた機関の業務・運営を読み取るという手法を手本とし、肩水金関漢簡を分類整理してその結果を分析することで、肩水金関の業務や運営状況を明らかにし、周囲の軍事機構との比較をする予定であった。ところが、2014年に刊行された『肩水金関漢簡』第3巻の収録簡を検討したところ、肩水金関とされるA32遺跡には金関のみならず、少なくとも東部候長治所(東部燧)が同居もしくは隣接する複合遺跡であったことが判明した。また、肩水金関の長官である金関嗇夫がしばしば肩水候官の長官である肩水候の代理に任じられていたようである。
顔面骨新生過程の顎矯正力による制御に関する分子・細胞生物学的研究

近年、骨延長法(distraction osteogenesis)が顎顔面領域でも盛んに行われるようになり、最近では顔面骨を骨延長により自由に動けるようにした上でその延長過程を顎矯正力によりコントロールするfloating bone conceptが推奨されてきている。しかしこれまでの顔面骨における骨延長法の基礎的研究は、組織標本やX線写真を用いた形態学的検討にとどまっている。これは従来の研究がイヌ、家兎といった大型動物に限られていたため、遣伝子解析の進んでいるヒトおよびラット、マウスのデータを利用できないことが大きい。本研究で我々は分子生物学的データの豊富なラットにおける骨延長実験系の開発を行い、良好なモデル実験系を確立した。実験動物には8週齢の雄性SDラットを用い、骨延長装置は、ステンレススチール製のネジ、ナットと歯科矯正用バンドマテリアルを組み合わせて作成した。延長装置は、ラットの下顎骨体部の最後臼歯より後方に装着した。装着後3日間の待機期間をおいた後、1日に0.5mmの割合で6日間3mmの骨延長を行い、骨形成過程を延長後1ヵ月まで追跡した。その結果、肉眼的には新生骨の形成が確認され、X線撮影によっても新生骨の形成が確認された。現在、延長部の組織学的・分子生物学的解析データの整理を進めているのが現状である。平成12年度は、floating bone conceptに基づく仮骨延長法のモデル実験系の作成を試みた。すなわち、生後7週のラットを用い、臼歯部下顎骨体部において骨切りを行い、下顎骨の延長を行うことを試みた。延長装置は、ステンレススチール製の直径0.6mmのネジとそれに適合するナットを歯科矯正用バンド材料に電気溶接することにより作成した。延長装置のラット下顎骨への装着は、0.25mm歯科矯正用結紮線により結びつけることにより行った。延長は一日0.5mm、8日間行ない、この間歯科用X線フィルムを用いて、骨新生過程を観察した。また、延長開始時、延長終了時、延長終了後2週間、1カ月において、延長部近傍組織を摘出、ホルマリン固定、急速脱灰したのちへマトキシリン-エオジン染色、トルイジンブルー染色により観察した。また、一部組織は、平成13年度に行う生化学的検索用試料として凍結保存した。このほか、生後1週に片側下顎頭を切除して、片側性小下顎症ラットを作ることも試みた。こうした実験の結果、ラットの下顎骨は延長され、組織学的検索により骨新生が認められ、本実験モデルの有用性が示された。しかし、いまだ延長装置がラットに対して大きく、ラットが装置をはずそうとするため、しばしば装置の破損が生じた。従って、安定した実験結果を得るには、さらに小さな延長器の開発が必要と考えられた。一方、片側性小下顎症モデルの作成では、明らかに片側下顎骨の劣成長が認められ、切歯部がすれ違い咬合となった。現在、平成13年度に行う生化学的検索、すなわちコラーゲン、オステオポンチンなどの骨基質タンパクのmRNAの発現を検索する条件も併せて検討しているところである。これは従来の研究がイヌ、家兎といった大型動物に限られていたため、遺伝子解析の進んでいるヒトおよびラット、マウスのデータを利用できないことが大きい。本研究で我々は、分子生物学的データの豊富なラットにおける骨延長実験系の開発を行い、良好なモデル実験系を確立した。装着後3日間の待機期間をおいた後、1日に0.5mmの割合で6日間3mmの骨延長を行い、骨形成過程を延長後1ヵ月まで追跡した.

その結果、肉眼的には新生骨の形成が確認され、X線撮影によっても新生骨の形成が確認された。現在、延長部の組織学的・分子生物学的解析データの整理を進めているのが現状である。
宇宙の元素合成・拡散史解明のための磁気量子型X線カロリメータの開発

1.宇宙の化学的進化を探る上での観測的研究として、私は日本の天文衛星「すざく」を用いて銀河や銀河団とその周辺部の観測データの解析を行った。その結果、我々の銀河系と同様の渦巻き銀河NGC4258の観測結果から得られた重元素組成は我々の銀河系と非常に似ていることを示し、論文として報告した。また、これまでに観測された銀河団の重元素分布を系統的に解析し、重元素量と銀河の光度の間に相関が見られることを示唆し、国際学会で報告した。銀河団は宇宙年齢をかけて進化してきたと考えられるので、これらの結果から宇宙の化学的進化を探ることができる。さらに、銀河団をつなぐ宇宙の大規模構造を調べるために、超銀河団であるSculptor超銀河団周辺部の構造を調べた。その結果、ダークバリオンと呼ばれている未知のバリオン量に制限をつけ、国際学会で報告した。2.実験的研究として、私はマイクロカロリメータ検出器の開発には欠かせない、絶対温度100mK以下という極低温環境を実現する断熱消磁冷凍機の開発を行った。私は今年度断熱消磁冷凍機の開発を1から行った。鉄ミョウバンを用いた磁性塩カプセルを自作し、その評価を行った。評価のためにはヘリウム温度環境下(絶対温度4K)で約10Aという大電流を超伝導マグネットコイルに印加する必要があるが、それらの構築を行った。その結果、断熱消磁冷凍機をシステムとして立ち上げ、目標であった最低到達温度100mKを達成した。また今後のカロリメータ動作を見据え、磁場環境の整備のための極低温用磁気シールドを製作した。よって、今後カロリメータ動作実験に向けた環境整備が完了したと言える。
RCフレ-ム構造物の3次元弾塑性地震応答解析プログラムの開発

従来の弾塑性部材モデルにおけるM-Ф関係に、軸力変動の効果を取り込むのは、極めて繁雑でほとんど不可能に近い。しかるに、土木や建築の分野において、地震応答時の立体振動および軸力変動を無視しえない構造物が計画・設計・施工されている。斜張橋の塔や幅の狭い高層建築の柱などがその典型である。本研究では、まず要素部材の2軸のM-Ф関係を、断面内の層要素の応力-ひずみ関係より精算するサブプログラムを作成する。この妥当性を実験結果との比較より立証したあと、これを構造物全体の3次元剛性マトリックスにもちこみ、軸力変動を考慮したRCフレ-ム構造物の3次元弾塑性精算地震応答解析プログラムを開発する。以上のことより、軸力変動の大きい、RCフレ-ム構造物の塑性域における耐震安全性評価の精度を飛躍的に向上させようとするのが本研究の目的である。上記の研究目的を達成するため、本研究では、新しく開発したサブストラクチャ-ハイブリッド実験装置を用いて、組合せ応力化での地震応答載荷試験を実施するとともに、材料構成則からの理論解析法の開発に関する一連の研究を行った。また橋梁構造物の弾塑性耐震設計法や、繰返し荷重下でのRC部材の復元力特性に関するより一般的な立場からの検討も行なった。さらに修復RC部材の動的耐力の回復度をハイブリッド地震応答実験から検討した。また、1989年10月17日に発生したロマプリ-タ地震によるコンクリ-ト橋の被害概要の調査結果についても言及した。最近、土木や建築の分野において、地震応答時の立体的な振動や軸力変動の効果を無視できないコンクリート構造物が計画・設計・施工されている。本研究の目的は、2軸曲げや軸力変動を受けるコンクリート部材の弾塑性挙動を精度よくモデル化するとともに、これを構造物全体の3次元剛性マトリックスにもちこみ、RC(鉄筋コンクリート)フレーム構造物の3次元弾塑性精算地震応答解析プログラムを開発することにある。本研究では、まず変動軸力および2軸曲げが作用した場合のRC柱部材の弾塑性挙動を解明するために、静的載荷実験およびオンラインハイブリッド地震応答載荷実験を実施し、材料構成則に基づくモデルとの比較を行った。得られた主な結果は次のとおりである。1.柱模型部材断面への曲げ荷重の載荷方向を、30°および45°と回転させ、2軸応力状態での繰り返し実験を行った結果、45°の場合のじん性が若干低下することが判明した。しかしこの場合であっても、コンクリートを積極的に拘束することにより、じん性の向上を期待できる。積極的な横拘束により、エネルギー塑性率を約3程度に出来た。2.変動軸力が作用するRC柱の耐震性を判断する時、高軸力側におけるじん性、低軸力側における降伏強度および両側における剛性の差に注意する必要があり、地震応答を解析する場合においては、非対称な復元力特性を考慮しなければならない。3.ファイバーモデルを用いて理論解析より求めたモーメントー曲率関係は、上記1の実験結果を精度よく追跡した。これよりファイバーモデルを用いて、RC部材の3次元的な弾塑性モデルを作製した。さらにこのモデルを全体の地震応答計算にもち込んだ。従来の弾塑性部材モデルにおけるM-φ関係に、軸力変動の効果を取り込むのは、極めて繁雑でほとんど不可能に近い。本研究では、まず要素部材の2軸のM-φ関係を、断面内の層要素の応力-ひずみ関係より精算するサブプログラムを作成する。

以上のことより、軸力変動の大きい、RCフレ-ム構造物の塑性域における耐震安全性評価の精度を飛躍的に向上させようとするきが本研究の目的である。上記の研究目的を達成するため、本研究では、新しく開発したサブストラクチャ-ハイブリッド実験装置を用いて、組合せ応力化での地震応答載荷試験を実施するとともに、材料構成則からの理論解析法の開発に関する一連の研究を行なった。また橋梁構造物の弾塑性耐震設計法や、繰返し荷重下でのRC部材の復元力特性に関するより一般的な立場からの検討も行なった。さらに修復RC部材の動的耐力の回復度をハイブリッド地震応答実験から検討した。また、1989年10月17日に発生したロマプリ-タ地震によるコンクリ-ト橋の被害概要の調査結果についても言及した。
「北海道語」の形成過程に関する研究

この研究は明治初年までに北海道各地の海岸地帯に既に形成された第一次共通語〈平山輝雄氏のいわれる安東語〉の形成と、その後開拓・移住の展開、移住者の増加・定住に伴う変容過程を調査研究しようとした。しかし、三年間の頭初計画は実質一年五か月程度に短縮されたので第三次共通語形成過程以下は割愛し、上記の第二次から第三次の祖語変容過程で大きな影響を与えたと考えられる明治期初等国語教育の展開過程をも一つの柱として調査研究することとした。1.第一次共通語は平山氏の指摘される如く開拓移民が北海道全域の海岸線に鮭,鰊,昆布等の収獲をもとめて入稼・定住し集落形成と共に、彼等の出身地たる東北地方北部、裏日本各地の方言が混交し第一次共通語として成立,定着していったものと考えられる。2.明治8年、上記海岸地方,一部奥地の河川流域,士族移住地などで簡易な初年学校が設置され、恣意的教材によるヨミ,カキを中心とした国語教育が開始された。このとき直接児童に接し教授活動を展開した教員の出身地も、前述移住民達の出身地と同じ者が大多数を占めていた。このことから各地方言が混在しながら教場で使用され、また発言,表記法等の教授が行われた。こうして「安東語」は逐次第二次共通語に変形されていく。3.北海道に於ける計画的開拓,殖民の展開過程で学校教育では明治十年代の開拓使本庁,函館支庁制定「小学生徒心得」及び三十年代の文部省刊「北海道用尋常小学読本」の教材としての使用があった。これら教材は全国共通の言語,発音を示したが教場での実態は教員出身地方言による教授が行われた。この段階で内陸部開拓の進行と共に第三次共通語が形成定着したと推定される。北海道・東京を除く府県では日常生活で当該地域方言と標準語の併用があるが北海道ではそれがないため、学校教育展開に伴い第一次共通語→第三次共通語と変形していくのが一大特色である。
Through-space相互作用を介した分極効果と分子間水素結合に関する研究

本年度は、既知の方法により2,6-ジブロモアントラセン1を合成し、これにベンザイン誘導体を反応させトリプチセン骨格を形成した後、順次官能基変換を行う方法を検討した。1に対し4-ニトロアントラニル酸より発生させたニトロベンザインを反応させ、2,6-ジブロモ-14-ニトロトリプチセン2(72%)を得た。2のニトロ基を還元してアミノ体3とし、3のアミノ基のジメチル化を行った後、BuLiによるリチオ化に引き続き二酸化炭素との反応を行うことにより目的物の一つである2-NN-ジメチルアミノトリプチセン-6,14-ジカルボン酸4(24%)を得た。一方、1と無置換のベンザインとの反応により2,6-ジブロモトリプチセン5(77%)を得た。5を一等量のBuLiと反応させた後、これにホウ酸トリメチル、過酸化水素を作用させモノヒドロキシル体とした。これをt-ブチルジメチルシリル基で保護し、一等量のBuLiによるリチオ化を行い、生じた陰イオンと二酸化炭素を反応させカルボン酸とし、これより脱保護をすることにより2-ヒドロキシトリプチセン-6-カルボン酸6(10%)を得た。さらに、2-アミノ-6,14-ジブロモトリプチセン3に対しジアゾ化、加水分解を行いヒドロキシ体7とし、これよりヒドロキシル基の保護、リチオ化、カルボキシル基の導入、脱保護により2-ヒドロキシトリプチセン-6,14-ジカルボン酸8(5%)を合成した。以上述べてきたように、本年度は目的とするトリプチセン誘導体のうち4、6及び8を合成した。いずれもpu11型置換基が電子吸引性(π-アクセプター性)が比較的弱いカルボキシル基であることから、三者ともthrough-space相互作用が関与したと考えられるような効果は各種スペクトルに観測されていない。4は無色固体として得られたが、酢酸、DMSO等の強極性溶媒には溶解するものの、単結晶を与えにくい。空気中で次第に酸化され褐色を呈する。一方、6は安定な無色固体であるが、これも種々の溶媒に対する溶解度が低く、また単結晶を与えにくい。8に関しても6と同様であった。
糖尿病の病態による冠微小循環機能障害の検討:微小循環機能改善へのアプローチ

本年度の研究実施計画本年度は冠細小動脈の内皮機能、アンギオテンシンレセプターを介する血管拡張に対する糖尿病の病態の影響を調べた。それぞれのラットの摘出心から顕微鏡下に冠細小動脈を切除し、両端にマイクロピペットを挿入、Videomicroscope法により血管内径の変化を観察した。先ずアセチルコリンによる冠細小動脈の内皮機能を調べた。次にアンギオテンシンタイプ1レセプター阻害剤投与下にアンギオテンシンII、またはCGP42112A(アンギオテンシンタイプ2レセプター刺激薬)による血管内径の変化を観察した。さらにアンギオテンシンIIによる血管拡張に対するPD123319(アンギオテンシンタイプ2レセプター阻害薬)、LNAMEの効果を調べた。またニトロプルシドによる血管内径の変化も観察した。アセチルコリンによる冠細小動脈拡張はOLETFにおいて減弱していた。アンギオテンシンIIおよびCGP42112A拡張はOLETFにおいて亢進していた。PD123319、LNAMEはアンギオテンシンIIの拡張作用を減弱した。ニトロプルシドによる拡張はOLETF、LETOにおいて同等であった。これらの結果よりアンギオテンシンタイプ2レセプターによる冠細小動脈拡張はNOを介しており、2型糖尿病の病態において亢進していることが示唆された。
河道計画から見た河川構造物の健全度の評価に関する研究

1.護岸裏込め土砂の吸い出し機構に関する研究洪水時における堤防護岸の破壊例には、護岸裏込め土砂の吸い出しに起因するものが多く見られる。本研究では、裏込め土砂の吸い出しには、護岸前面における強度の変動水圧の作用が大きく影響していることに着目し、変動水圧と土砂の吸い出しとの関係を実験的・理論的に検討し、裏込め砂層内の水圧分布の時間的に及ぼす変動水圧の影響を明らかにし、これによる土砂の吸い出し現象を確めた。さらに、こうした効果が不浸透性護岸の法尻よりの吸い出し現象に顕著であることも明らかにし、こうした現象を抑制するための対策の提案も行った。2.橋脚周辺の局所洗堀現象に関する研究従来の橋脚周辺の局所洗堀モデルにおいて不明確であった洗堀の進行過程に伴う渦スケールの変化を実験的に検討し、洗堀深に対してほぼ線型に変化することを明らかにした。さらに、こうした洗堀の解析モデルを混合砂に適用し、その基本的特性の検討を行い、従来の洗堀深の予測式に用いられるべき杭径についてその基準を与えるとともに、混合砂の粒度分布による洗堀深の遁減の効果を明らかにし、洗堀防護対策の指標を提示した。3.河道弯曲部における河床変動に関する研究自然河川の一般的な平面形状である蛇行形状の特性である水衝部の位置を予測することは、平面形状と流れ、流れの流砂運動との位相差により、極めて困難である。本研究では、一様弯曲流路での流下方向への流れの発達過程を考慮し、流れの非平衡性を取り入れたモデルを構成するとともに、流砂の確率モデルとの組合わせにより河床の時間的変化を記述することが可能となり、1.,2.を考慮することにより、河川の動態を反映した河道計画の基礎的知見が得られた。
薬物依存に関係する新しいタンパクの生理機能の解明

本年度は、依存性薬物メタンフェタミン(METH)の投与によりマウス脳の側坐核において発現が有意に増加する因子として同定された新規機能分子'shati'および'piccolo'について、神経系における機能及び薬物依存に対する関与を、神経化学的、行動実験的手法をそれぞれ用い検証した。shatiに関して免疫組織染色法による解析を行ったところ、グリア細胞ではなく神経細胞に局在していることが判明し、さらに各種受容体拮抗薬を用いた薬理学的解析により、METHによるshatiの発現増加はドパミンD1及びD2受容体を介して生じることが明らかとなった。また、前年度までに報告しているshatiのドパミン再取り込み促進効果はTNF-αの放出を介し発現していることが培養細胞を用いた実験により明らかとなり、shatiのMETH依存形成に対する抑制機能の根底にある分子機序が明らかとなった。piccoloに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成し、脳室内投与することでpiccolo遺伝子のノックダウンを行ったところ、モリス水迷路試験において空間認知記憶の障害が認められた。また、海馬のCA1領域を用いた電気生理学的な解析においてはLTPの低下が認められた。さらに、マイクロダイアリシス法により,piccoloノックダウンマウスでは高カリウム刺激後のグルタミン酸の放出量の低下が認められた。以上の結果は、piccoloがグルタミン酸の放出制御により海馬依存的な学習・記憶に関与していることを示す結果であり、METHが惹起する空間作業記憶障害に関与している可能性が示唆された。今後はさらに、遺伝子組み換え動物を用い、行動学的、神経化学的な解析を通して、shatiやpiccoloの依存形成メカニズムへの関与を解明し、薬物依存形成機構の解明と治療薬の開発に繋げたい。薬物依存の形成に寄与すると考えられるいくつかの遺伝子が報告されている。薬物依存の形成は多くのファクターが複雑に絡み合い、未知の遺伝子が関与している可能性も高い。我々はcDNAサブトラクション法を用いて覚せい剤であるメタンフェタミンを連続投与したマウス脳において、2つの新規遺伝子ピッコロとshatiを見出した。平成18年度に行った遺伝子配列にもとづいて作成したアンチセンスヌクレオチドを脳に注入してタンパクの発現を減少させたマウスの実験では、いずれも覚せい剤による場所嗜好性や自発運動の亢進作用を増強したことにより、これらの遺伝子は薬物依存形成を抑制することを報告している。さらにこれらは、ドパミントランスポーターの機能を著しく低下させることも見出した。19年度はこれらの遺伝子を過剰発現させたマウスの作成に着手した。マウスを作成するにあたっては、胎生期のマウス脳で遺伝子が過剰発現するシステムを用いた。それぞれの遺伝子ごとに約10系統の繁殖をはじめており、胎児期での発現量が高いマウスを系統的に選びだし、現在は選択した系統のマウスを用いて、場所嗜好性や行動量測定などの行動薬理学的な実験の計画を立てている。ピッコロについては神経伝達物質の遊離に深く関わっていることが示唆されていることから、過剰発現マウスにおけるアセチルコリン、ドパミン、グルタミン酸などの遊離量をin vivoマイクロダイアイリシス法で検討し、神経障害への関与について検討する予定である覚せい剤や麻薬による薬物依存は大きな社会問題であるが、治療法がほとんど確立されていないのが現状である。依存形成の鍵となる機能分子を同定するために、メタンフェタミン(METH)を連続投与した時の運動量亢進作用に過感受性を示したマウス脳の側坐核から取り出したmRNAを用いて、cDNAサブストラクション法によって、新規機能分子`shati'および`piccolo'を同定した。Shatiおよびpiccoloがどのように薬物依存に関与しているかを、行動実験的、神経化学的手法で検証した。マウス脳室内にshati-、およびpiccolo-アンチセンス(shati-,piccolo-AS)を注入すると、shati-およびpiccolo-スクランブルオリゴヌクレオチド(shati-,piccolo-SC)を注入されたマウスと比べて、shatiおよびpiccoloの発現レベルが有意に抑制された。METHをマウスに皮下投与すると、自発運動量が亢進し、5日間連続投与することで、METHに対する反応性(運動量)が増加し、逆耐性が形成された。また、METHの連続投与によって場所嗜好性が形成された。Shati-, piccolo-AS群では、SC群および人工脳脊髄液群と比較して、自発運動量亢進、逆耐性、および場所嗜好性の形成が有意に増強された。神経化学的解析から、shatiは、腫瘍壊死因子を介してドパミン再取り込みを促進することによって、piccoloは、C_2Aドメインが膜ホスファジルイノシトール4,5-ニリン酸と結合し、シナッブス膜上でのドパミントランスボーターの発現を維持することによって、メタンフェタミンによって引き起こされるドパミン再取り込みの低下を抑制し、その結果シナップス間隙のドパミン量を減少させ、METH依存形成を抑制していることを明らかにした。今後、shatiやpiccoloの依存形成メカニズムへの関与を詳細に解明することが、薬物依存形成機構の解明と治療薬の開発に繋がると考えられる。

shatiに関して免疫組織染色法による解析を行ったところ、グリア細胞ではなく神経細胞に局在していることが判明し、さらに各種受容体拮抗薬を用いた薬理学的解析により、METHによるshatiの発現増加はドパミンD1及びD2受容体を介して生じることが明らかとなった。また、前年度までに報告しているshatiのドパミン再取り込み促進効果はTNF-αの放出を介し発現していることが培養細胞を用いた実験により明らかとなり、shatiのMETH依存形成に対する抑制機能の根底にある分子機序が明らかとなった。piccoloに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成し、脳室内投与することでpiccolo遺伝子のノックダウンを行ったところ、モリス水迷路試験において空間認知記憶の障害が認められた。また、海馬のCA1領域を用いた電気生理学的な解析においてはLTPの低下が認められた。さらに、マイクロダイアリシス法により,piccoloノックダウンマウスでは高カリウム刺激後のグルタミン酸の放出量の低下が認められた。以上の結果は、piccoloがグルタミン酸の放出制御により海馬依存的な学習・記憶に関与していることを示す結果であり、METHが惹起する空間作業記憶障害に関与している可能性が示唆された。今後はさらに、遺伝子組み換え動物を用い、行動学的、神経化学的な解析を通して、shatiやpiccoloの依存形成メカニズムへの関与を解明し、薬物依存形成機構の解明と治療薬の開発に繋げたい。
遺伝子改変加齢黄斑変性モデルマウスを用いた青色光刺激による網膜機能・病態の解析

網膜へ到達する可視光のうち青色光により視細胞が障害され加齢黄斑変性の発症が誘導される可能性があることがこれまで疫学調査およびin vitroで報告されてきた。白内障手術により水晶体を摘出することで、低波長領域の光が網膜へ到達しうるが、in vivoでの影響はよくわかっていない。我々は、本研究の中で、新規眼内レンズ挿入マウスモデルを開発し、このモデルを用いて紫外線領域に加え可視光のうち青色波長領域(400-500nm)を抑制すると光障害から網膜が保護されることをin vivoで明らかにした。いくつかの疫学調査および培養実験結果から網膜へ到達する可視光のうちの青色光により視細胞および網膜色素上皮が障害され、加齢黄斑変性の発症が誘導される可能性があることが示されている。申請者の所属する研究室では、最近新たに、遺伝子異常により視細胞が脱落する動物(SOD-1-/-mice)を発見し、報告した(Hashizume et. al.Am J Pathol 2008)。申請者が知る限りにおいては、これまで遺伝子改変網膜変性モデル動物を用いた、刺激波長光の違いによる表現型解析はない。そこで、可視光のうち青色光付近の低波長光ではより酸化ストレスがより亢進し、SOD-1-/-miceで見られる表現型が亢進するという仮説を立て、分光透過率の異なるフィルターを通してこの動物を刺激し、その表現型を解析している。Hashizume論文で使用したSOD-1-/-マウスはC57B6/J backgroundであるが、有色素マウスであるC57B6/Jは光刺激による視細胞死、A2E産生に対して耐性であることが知られている(Wenzel et al.J Neurosci 2001, Kim et al.Proc Natl Acad Sci USA 2004)。よって白色マウスである耐性のないICRマウスとback crossを行った。平成20年度の研究成果としてにてICR backomdのSOD-1-/-マウスの作成に成功した。今後は、このICR backgroundのマウスを用いて、野生型マウスとSOD-1-/-マウスの表現型の比較、および照射する波長の違いによる表現型の変化を解析していく.いくつかの疫学調査および培養実験結果から網膜へ到達する可視光のうちの青色光により視細胞および網膜色素上皮が障害され、加齢黄斑変性の発症が誘導される可能性があることが示されている。申請者の所属する研究室では、最近新たに、遺伝子異常により視細胞が脱落する動物(SOD-1^<-/->mice)を発見し、報告した(Hashizume et al.Am J Pathol 2008)。そこで、可視光のうち青色光付近の低波長光ではより酸化ストレスがより亢進し、SOD-1^<-/->miceで見られる表現型が亢進するという仮説を立て、白色マウスである耐性のないICRマウスとback crossを行い、ICR backgroundのSOD-1^<-/->マウスの作成し、分光透過率の異なるフィルターを通してこの動物を刺激し、その表現型を解析している。一方、80歳以上で100%罹患する白内障の唯一の根本治療は手術加療であるが、水晶体を除去する白内障手術後に網膜を障害しうる紫外線および青色光が網膜に到達するようになる。現在白内障手術で用いられているIOL(intraocular lens;眼内レンズ)はすべて紫外線がカットされるようデザインされている。紫外線がカットされても網膜に到達する青色光により網膜が障害される可能性がある。我々は進行中の上記研究に加えて、新規マウスIOL挿入モデルを用い、挿入するIOLの分光透過率の違いにより青色光の網膜障害を証明した(Kurihara et al.Mol Vis 2009)。
肺血管幹細胞の同定と肺血管発生における分子機構の解明

幹細胞表面マーカーSca-1陽性かつ血管内皮細胞表面マーカーCD31陽性細胞が、肺血管幹細胞であるという仮説のもとにマウス成獣肺を用いて以下の研究を行った。研究初年度、2年目に引き続き、8週齢の成獣マウスを用いて、Sca-1陽性・CD31陽性細胞の時間空間的発現様式の解析を行った。マウスの肺組織切片標本をSca-1およびCD31抗体を用いて二重免疫組織化学染色し、発現パターンの解析を繰り返し行った。Sca-1陽性・CD31陽性細胞は、肺胞壁および肺胞間の血管壁に発現し、肺血管幹細胞の分布として矛盾ないものと考えられた。血管内皮細胞マーカーであるvWFの抗体を用いてさらに共染色を行ったところ、Sca-1陽性・CD31陽性細胞の一部に共発現していた。これらの抗体を用いた蛍光ソーティング(FACS)により、マウス肺組織から分離されたSca-1陽性・CD31陽性細胞は約20%を占め、その他Sca-1陽性・CD31陰性細胞が約10%、Sca-1陰性・CD31陽性細胞が約1%認められた。単離したSca-1陽性・CD31陽性細胞は培養後、樹枝状の管腔構造へ分化した。管腔形成は血管内皮細胞分化の指標であり、イメージングソフトを用いて、形成された管腔数をカウントし比較した。Sca-1陽性・CD31陽性細胞では培養細胞数に比例して管腔構造の増加が観察されたが、Sca-1陰性・CD31陽性細胞の培養では、さらに多くの管腔構造を認めた。Sca-1は肺血管幹細胞に発現している可能性があるが、マウス成獣肺では、むしろ血管内皮細胞の血管新生を抑制する機能があると考えられた。マウス胎仔、成獣肺を用いて、細胞表面マーカーSca-1陽性・CD31陽性細胞が、肺血管幹細胞であるという仮説の下に研究を行った。研究初年度として、(1)マウス胎生期から成獣までの肺組織におけるSca-1陽性・CD31陽性細胞の時間空間的発現様式を明らかにすること、(2)マウス胎生期から成獣までの肺組織を用いて、細胞表面マーカーの蛍光ソーティング(FACS)により、Sca-1+CD31+細胞を単離し、肺血管幹細胞候補を特定することについて解析を行った。(1)については、胎生14.5日のマウス胎仔肺と、生後2日、成獣マウスの肺の新鮮凍結切片、パラフォルムアルデヒド固定のパラフィン切片を用いて、肺血管幹細胞マーカーとしてSca-1を、血管内皮細胞マーカーとしてCD31、Flk1、Tie2、VE-Cadherin、vWFを、血管平滑筋マーカーとしてαSMA、線維芽細胞マーカーとしてvimentinを選択し、これらに対する1次抗体と蛍光2次抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。抗Sca-1抗体とのこれらのマーカー抗体を用いた2重染色を行い、抗Sca-1抗体陽性細胞は、一部血管内皮に、大部分は肺胞壁、肺間質に発現していることが判明した。発現は、胎生14.5日、成獣よりも生後2日の切片で多く認められた。これらの細胞集団を単離するため、最もSca-1発現が認められた生後2日のマウス肺分散細胞に対して、抗Sca-1抗体および抗CD31陽性細胞を蛍光2次抗体で標識し、蛍光細胞をセルソーターで選別することを複数回行い、目的とするSca-1陽性・CD31陽性細胞の単離を試みた。現在実験を行った範囲では、当該細胞はごく少数の回収にとどまり、得られた細胞集団を培養し、機能解析する段階には至っていない。免疫組織化学染色の至適条件の決定に時間を要した。当初、マウス肺の新鮮凍結切片を用いたが、凍結切片では免疫反応の過程で肺胞壁の破壊が多く、パラフィン切片を用いることとした。また、抗Sca-1抗体の蛍光シグナルが微弱であったため、パラフィン切片熱処理や、トリプシン処理による抗原賦活化、ビオチン、アビジン複合体法によるシグナル増幅、抗体濃度調整を行い、種々の組み合わせで予備実験を繰り返す必要が生じ、当初の計画よりもかなりの時間を要した。現在までのところ1/100濃度のビオチンでラベルし、1/1000濃度のストレプトアビジンでシグナル増幅を行うと、蛍光の検出感度が高まることが判明した。しかし、同じ条件ではFACSによるSca-1陽性・CD31陽性細胞の回収の効率が悪く、さらにシグナル増幅法を検討する必要がある。研究初年度では、胎生14.5日のマウス胎仔肺や生後2日のマウス幼若肺を用いてSca-1陽性・CD31陽性細胞を免疫組織化学染色により観察したが、安定した結果が得られなかったため、今年度は8週齢の成獣を用いて、Sca-1陽性・CD31陽性細胞の時間空間的発現様式、および蛍光ソーティング(FACS)により単離したSca-1+CD31+細胞を培養し、血管内皮細胞分化の指標である管腔形成,をイメージングソフトにより観察した。Sca-1陽性細胞は、肺胞壁および肺胞間の血管壁に発現していた。血管内皮細胞マーカーであるvWFは、Sca-1と一部共発現していた。

FACSによりSca-1陽性・CD31陽性細胞は約20%、Sca-1陽性・CD31陰性細胞は約10%、Sca-1陰性・CD31陽性細胞は.約1%認められ、単離したSca-1陽性・CD31陽性細胞は培養後、樹枝状の管腔構造への分化が観察された。この分化は培養細胞数に比例して増加した。一方、Sca-1陰性・CD31陽性細胞の培養では、Sca-1陽性・CD31陽性細胞と比較して、同じ細胞数でも管腔形成が明らかに多く観察された。また、Sca-1陽性、CD31陰性細胞は培養により、培養皿に固着し、線維芽細胞様の外観を呈した。以上の所見から、Sca-1は肺血管幹細胞に発現している可能性があるが、マウス成獣では、むしろCD31陽性細胞、すなわち血管内皮細胞の血管新生を抑制する機能があると考えられた。マウス胎仔肺やマウス幼若肺において抗Sca-1抗体を用いた免疫組織化学染色の蛍光シグナルが安定せず、Sca-1発現の胎生期から生後早期の観察が困難で、胎仔、幼若肺組織からSca-1陽性細胞を単離することが困難であったことが最大の理由と考えられる。TSA-Plusキットを用いたcatalyzed reporter deposition法など、他の研究で実績のあるシグナル増幅システムを用いで染色を行ったが、明らかな改善を認めなかった。マウス成獣肺では安定した蛍光シグナルが得られたため、Sca-1は幹細胞マーカーではあるが、むしろ生後に発現が増加する蛋白質であるため、胎生期の肺における追跡が困難である可能性がある。また、当初Sca-1は肺血管への分化を促進すると考えていたが、培養実験ではむしろ分化を抑制する結果が得られたことも遅れの原因である。Sca-1の肺血管発生における機能が、成獣と胎仔で異なっている可能性が考えられる。幹細胞表面マーカーSca-1陽性かつ血管内皮細胞表面マーカーCD31陽性細胞が、肺血管幹細胞であるという仮説のもとにマウス成獣肺を用いて以下の研究を行った。研究初年度、2年目に引き続き、8週齢の成獣マウスを用いて、Sca-1陽性・CD31陽性細胞の時間空間的発現様式の解析を行った。マウスの肺組織切片標本をSca-1およびCD31抗体を用いて二重免疫組織化学染色し、発現パターンの解析を繰り返し行った。Sca-1陽性・CD31陽性細胞は、肺胞壁および肺胞間の血管壁に発現し、肺血管幹細胞の分布として矛盾ないものと考えられた。血管内皮細胞マーカーであるvWFの抗体を用いてさらに共染色を行ったところ、Sca-1陽性・CD31陽性細胞の一部に共発現していた。これらの抗体を用いた蛍光ソーティング(FACS)により、マウス肺組織から分離されたSca-1陽性・CD31陽性細胞は約20%を占め、その他Sca-1陽性・CD31陰性細胞が約10%、Sca-1陰性・CD31陽性細胞が約1%認められた。単離したSca-1陽性・CD31陽性細胞は培養後、樹枝状の管腔構造へ分化した。管腔形成は血管内皮細胞分化の指標であり、イメージングソフトを用いて、形成された管腔数をカウントし比較した。Sca-1陽性・CD31陽性細胞では培養細胞数に比例して管腔構造の増加が観察されたが、Sca-1陰性・CD31陽性細胞の培養では、さらに多くの管腔構造を認めた。Sca-1は肺血管幹細胞に発現している可能性があるが、マウス成獣肺では、むしろ血管内皮細胞の血管新生を抑制する機能があると考えられた。
放射光単色X線超高分解能CTを用いたヒト肺末梢組織3-D構造の研究

【目的】放射光単色X線超高分解CT(SRCT)より得られるボリューム・データを用い、ヒト肺末梢の立体構築を非破壊的に作成し、末梢気道構造を形態学的に理解することを目的とした。【方法】正常の剖検肺をHeitzman法で伸展固定し、小葉中心部を含む直径約6mm、高さ約20mmの円柱状試料を作成した。大型放射光施設(SPring-8、兵庫県)に設置されたSRCTシステムを用い、正常肺試料のSRCT像(空間分解能約10μm)を作成した。このSRCTを連続性に重積しボリューム・データを構築し、ワーク・ステーション(Sun SPARCstation)上で肺末梢空間の3-D構築を行った。また、preliminalyな実験として、連続したおよそ100コマの3-D像を連続して表示することで、肺末梢空間領域での気体の移動を動画で表示することを試みた。【結果】末梢空間領域で気流および拡散として気体が移動する様子を動画として表示できた。また末梢気道および気腔の特徴がいくつか明らかになった。終末細気管支から呼吸細気管支へ移行する部位で最狭窄部位を認め、そのすぐ末梢では気道が拡張し、膨大部を形成していた。また、拡散による気体移動様式に合理性をもたらすかのように、膨大部より複数の呼吸細気管支が放射状に分岐していた。末梢気道の計測を行い、その結果、終末細気管支径390-450μm、呼吸細気管支径450-500μm、肺胞道径560-780μm、肺胞径170-280μm、であった。【結語】SRCTボリューム・データより構築される立体構造を用いることで、ヒト肺末梢気道の解剖学的構造が新たに明らかにされる可能性があり、非破壊的にヒト肺末梢気道の形態学的な観察および解析が可能になると考えられた。【結果】正常試料の肺末梢空間構造を終末細気管支領域から肺胞領域に至るまで詳細に表示し得た。また、1つの試料では反回枝の存在を確認した。【結語】SRCTボリューム・データより構築される立体構造を用いることで、非破壊的にヒト肺末梢気道の形態学的な観察および解析が可能になると考えられた。【国内学会での発表】平成14年4月第61回日本医学放射線学会総会、第42回日本呼吸器学会総会にて平成13年度研究における成果を発表する予定です。【国際学会での発表】平成13年11月第87回北米放射線学会(シカゴ、アメリカ)にて平成13年度研究における成果の一部を発表しました。また、平成14年5月第98回米国胸部学会(アトランタ、アメリカ)にて平成13年度研究における成果を発表する予定です。【方法】

正常の剖検肺をHeitzman法で伸展固定し、小葉中心部を含む直径約6mm、高さ約20mmの円柱状試料を作成した。大型放射光施設(SPring-8、兵庫県)に設置されたSRCTシステムを用い、正常肺試料のSRCT像(空間分解能約10μm)を作成した。このSRCTを連続性に重積しボリューム・データを構築し、ワーク・ステーシヨン(Sun SPARCstation)上で肺宋梢空間の3-D構築を行った。また、preliminaryな実験として、連続したおよそ100コマの3-D像を連続して表示することで、肺末梢空間領域での気体の移動を動画で表示することを試みた。【結果】末梢空間領域で気流および拡散として気体が移動する様子を動画として表示できた。また末梢気道および気腔の特徴がいくつか明らかになった。終末細気管支から呼吸細気管支へ移行する部位で最狭窄部位を認め、そのすぐ末梢では気道が拡張し、膨大部を形成していた。また、拡散による気体移動様式に合理性をもたらすかのように、膨大部より複数の呼吸細気管支が放射状に分岐していた。末梢気道の計測を行い、その結果、終末細気管支径390-450μm、呼吸細気管支径450-500μm、肺胞道経560-780μm、肺胞径170-280μm、であった。【結語】SRCTボリューム・データより構築される立体構造を用いることで、ヒト肺抹梢気道の解剖学的構造が新たに明らかにされる可能性があり、非破壊的にヒト肺抹消気道の形態学的な観察および解析が可能になると考えられた。
オ-ストラリア熱帯海域の好気性光合成細菌の採集・分離と比較生理学的研究

1.研究の目的:日本以外では報告されていない好気性光合成細菌が日本以外でも存在するかどうかを調べるために,オ-ストラリア沿岸の数ヶ所を選んだ。この理由は,日本の好気性光合成細菌は海洋細菌が多いからである。2.研究の方法:海水・藻類などを採集し,減菌海水でホモジナイズし,10倍段階で希釈後,0.1mlを寒天培地にまいて25°C10日間暗所で生育させ,着色コロニ-をピックアップして純粋培養する。純粋培養液からバクテリオクロロフィル(Bchl)を抽出し定量する。光化学反応の測定は生菌又は細胞無抽出液を用いて通常の方法でおこなった。海水の塩濃度はサリノメ-タ-を用いて測定する。3.研究の結果:(1)分布:オ-ストラリアの東西南北の主要な都市の近郊沿岸で採集をおこなった。具体的地点は,ダ-ウィン近郊,アデレ-ド近郊,タスマニア島,シャ-ク湾,パ-ス近郊,タウンズヒル近郊,ブリスベン近郊である。アデレ-ド近郊を除き,すべての地点で,海藻,海草,ストロマトライト,その附着物,海水,砂などから高い瀕度(全従属栄養細菌の%,多い時には約50%に達した。ストロストライトは高い塩濃度に生育しているが,このストロマトライトにも高瀕度で存在した。しかしスポンジやサンゴ礁には存在しなかった。さらに,アデレ-ド附近の内陸の塩湖にも存在しなかった。オ-ストラリア海洋研究所の採集地点では夏と冬に標品を採集できたが,冬の季節で藻類の種類が多く生長中の標品から多数の好気性光合成細菌が採集された。東海岸に比べ西海岸での出現瀕度が著しく高かった。この原因については明らかではないが,西海岸の採集地点の塩濃度が高く,好気性光合成細菌は高濃度に適していることも考えられる。アデレ-ド近郊では全く採集できなかったが,この原因についても不明である。平成2年に,南オ-ストラリアに大雨が降り,このため大量に淡水が沿岸に流れ出し,沿岸の塩濃度を著しく低下させた。我々もこのことを実測しているので,低塩濃度のため当該菌が一時的に死滅したとも考えられる。(2)生理・生化学的特性:単離された菌は約300株であるが,すべてオレンジ又はピンク色を有していた。生菌の吸収スペクトルは370,590,800,850870nmにBchlのinvivoの吸収帯を示し,500nm附近にカロチノイドに由来するバンドを示した。Bchlの含量は高々1nmol/mg乾燥菌体であり,これは日本で発見された好気性光合成細菌の場合の1/31/5である。オ-ストラリアの菌は一般にBchlの含量が低いのが特徴である。このことは好気性光合成細菌はより好気的環境に適応しつつある紅色非イオウ細菌てあるという仮説の傍証である。ほとんどすべての株は嫌気的条件下で光合成的に生育は出来なかった。暗所で好気的に生育した生菌,または無抽出物は,好気的条件下でのみ,光化学活性,たとえば反応中心やチトクロ-ムの可逆的光酸化反応を示した。いくつかの株は脱窒反応を示した。またそれぞれの株が暗所で最適な塩濃度で生育することが示された。結論的にまとめるならば,オ-ストラリアの沿岸には日本で発見された好気性光合成細菌と極めて類似した菌が高瀕度で存在していた。今後すべきことは,これらの株のリボゾ-ムRNAの塩基配列を調べて,糸統分類学的位置づけをおこなうことであろう。