hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多変量推測理論の新たな展開とその応用に関する研究

本研究課題では,多変量解析モデルの推定・検定・予測・変数選択など新たら推測手法の開発とそれに伴う理論展開を行った。特に,従来の手法に欠点があったり利用可能でない場合においてそれを解決する手法の開発を目指した。中でも,(1)小地域推定の平均2乗誤差及び信頼区間の高次漸近補正,(2)連続及び離散混合モデルにおける小地域推定のベンチマーク問題の理論展開とその応用,(3)線形混合モデルの検定についてのバートレット補正と変数選択規準の開発,(4)線形判別分析に関する高次元手法の理論展開,(5)多次元母数の推定における最適性理論の新たな展開に取り組み,有用で有効な推測手法の開発を行った。本研究課題の目的は、多変量データを解析するためのモデルにおいて従来の推測手法を改良する新たな統計手法を開発し,理論的側面と数値的側面からその有効性と有用性を示すことにある。21年度は、線形混合モデルを利用した小地域推定に関していくつかの成果を得ることができた。(1)まず、小地域平均を推定するために用いられる手法に経験最良線形不偏予測量(EBLUP)がある。これは、小地域によるデータの不足を関連する地域のデータで補うことによって推定精度を高めている点で優れているわけであるが、実際、平均2乗誤差(MSE)がどの程度改善されるのかを見積もる必要がある。そこでMSEの3次の漸近不偏推定量の導出を行った。またこれに基づいた信頼区間について被覆確率が3次漸近的に信頼係数に一致するように補正したものを構成した。これは、従来の2次漸近近似の結果をより高次の漸近理論まで拡張することができることを示している。(2)線形混合モデルの変数選択基準としてAICや条件付AICが分散成分が既知の場合に提案されてきたが、これらを分散成分が未知でそれらの適当な一致推定量で置き換えられる場合に拡張した。また、経験ベイズ情報量基準なるものを提案し、その一致性を証明するとともに、真のモデルを選択するという意味で他の規準より優れていることを数値的に示した。(3)線形混合モデルについては近年広く関心を集めているが、より広い分野の研究者に理解してもらえるよう、この分野のサーベイ論文を作成した。特に、混合モデル方程式の導出、そこから最良線形不偏予測量への誘導、最尤推定量と制限最尤推定量の高次漸近展開、小地域平均のEBLUPの誤差評価と高次補正に基づいた信頼区間の構成について一連の結果をまとめた。また回帰係数ベクトルの検定に関して、尤度比検定、ワルド検定、スコア検定という代表的な検定統計量の漸近展開とバートレット補正についてまとめた。22年度に得た成果は以下の通りである。(1)線形混合モデルに説明変数の選択基準を導出した。条件付き情報量規準に関して,真のモデルを選択する意味において従来の方法より優れた変数選択基準を導出するとともに,分散成分が未知の場合への拡張も行った。また経験ベイズの考え方を導入した変数選択基準を導出し一致性を証明した。(2)多変量線形回帰モデルにおいて,データ数と変量の次元がともに大きい,いわゆる高次元の問題設定を扱い,こうした状況で相応しい赤池情報量規準を導出した。高次元の場合,共分散行列の通常の推定量が不安定になるのでリッジ型推定量を利用し,また変数どうしの線形共線性にも対処するため回帰係数ベクトルに対してもリッジ型の推定量を用いた。バイアス項を解析的に求め,得られた情報量規準の数値的な良さを調べたところ,通常のAICよりも優れていることが確かめられた。(3)平均が正に制約されているK個の正規分布の平均の和の推定問題を考えると,Kが大きいときには一般化Bayes推定量や最尤推定量がミニマックスにならない。それぞれの推定量についてミニマックス性が成り立つための必要十分条件を導出した。また許容的でミニマックスな推定量を導出するとともにいくつかの方向への拡張を行った。23年度は,線形混合モデルにおける変数選択と小地域推定に関して,パラメトリック・ブートストラップ法に基づいた手法を提案した。線形混合モデルの変数選択問題においては,AICや条件付きAICのペナルティー項(補正項)は,テイラー展開を用いて導出されるので,分散成分に関する偏微分等を含むことになり,複雑なモデルに対しては計算が困難になってしまう。そこでテイラー展開を用いる代わりにパラメトリック・ブートストラップ法を利用した簡便な方法によりペナルティー項を導出し,得られた情報量規準の2次漸近不偏性を証明した。またその有用性を数値実験により示した。

この問題(A)に関連して,経験最良線形不偏予測量(EBLUP)の平均2条誤差(MSE)の2次漸近不偏推定量と2次漸近補正をもつ信頼区間をパラメトリック・ブートストラップ法により導出し,その正当性を理論的に証明し,数値実験により有用性を示した。次に,高次元の多変量解析の中心的な話題である判別分析に関して,共分散行列のリッジ推定量を用いた線形判別分析の誤判別に対する漸近展開を導出し,リッジ推定を用いたことによる有効性を示した。また誤判別率の2次漸近不偏推定量を導出した。大標本での誤判別率の漸近展開は非常に古くから研究されてきたが,次元が高くなると近似が悪くなることが知られてきた。また次元が高くなると共分散行列の逆行列の推定が不安定になるという問題点も知られてきた。23年度に行った上述の研究結果は,これらの課題を同時に解決するものであり,数値的にも従来のものよりかなり改善されていることが示された。当該年度においては,まず,一般的な共分散行列をもつ多変量線形モデルにおいて,回帰係数ベクトルの検定問題を考察し,ワルド検定,スコア検定,尤度比検定統計量のパートレット型の2次漸近補正項を解析的に導出し,それに基づいてそれぞれの検定統計量の修正版を提案した。また補正項の推定を解析的に与えることが困難な場合にパラメトリック・ブートストラップ法に基づいた数値的手法を提案した。このモデルは,線形混合モデルを代表的なモデルとして含んでおり,その一例である枝分かれ誤差分散モデルにおいて,提案された検定法の有意水準が元来の検定手法よりかなり優れていることを数値的に示した。また,解析的に求めた2次バートレット補正に基づいた検定法に対して,それに基づいた3次のバートレット補正をパラメトリック・ブートストラップ法に基づいて構成すると,有意水準の一層の改善が得られることを示した。次に,一般的な線形混合モデルの枠組みで,一般的な平均制約と分散制約を組み入れたベンチマーク問題を考え,制約付き経験ベイズ推定量の誤差評価についてかなり一般的な結果を与えた。制約を入れることによって,一般的には,制約付き経験ベイズ推定量の誤差分散が大きくなってしまうが,平均の制約のもとでは差は2次項に現れ,分散の制約に関しては制約の入れ方によっては1次の項で差が生ずることを理論的に示した。また決定論的な視点から,制約付き経験ベイズ推定量の性質を導いた。高次元の多変量線形判別問題において,誤判別確率の2次不偏推定量を導出し,それが判別分析の変数選択手法として利用できることを示し,数値的にも優れていることを示した。またその変数選択法の最適性を理論的に示すことができた。多次元母数の最適性理論としては,母数が制約されているときの予測分布の構成法に関して,予測分布手法のミニマックス性についてかなり一般的な性質を得た。当該年度においては,(A)線形混合モデルにおける検定統計量のバートレット補正,(B)小地域推定におけるベンチマーク問題,(C)一般化線形混合モデルにおけるベンチマーク問題,(D)一般化線形混合モデルにおける変数選択問題,(E)高次元モデルにおける共分散行列のリッジ型推定,(F)多次元母数の推定における最適性理論の新たな展開,について新たな手法の提案とその理論的性質及び応用上の有用性について研究成果を得た。
ミトコンドリア障害が関与する対称性遠位末梢神経障害の治療法の検討

本研究は、がん治療における化学療法を受けている患者でみられる化学療法惹起性末梢神経障害で共通してみられる対称性遠位末梢神経障害のマウスにおけるモデルを作成し、行動学的評価法、形態学的評価法などを確立したうえで、予防薬・治療薬を開発することを目指すものである。本年度は、末梢神経障害を惹起する化学療法薬として、これまで検討してきたオキサリプラチンに次いで、パクリタキセルの検討を開始した。末梢神経障害による神経障害性疼痛は非侵害受容性の機械的刺激に対する疼痛行動により評価した。マウスにおけるモデルを作成するため、1回投与量、投与間隔、投与回数などを検討した結果、1回投与量6mg/kg、10mg/kg、20mg/kgを1日おきに、7回繰り返し投与することにより、用量依存性に末梢神経障害が徐々に発現し、投与開始4週後でピークとなり、8週後には軽快することがわかった。現在このモデルにおいて化学療法惹起性末梢神経障害の特徴であるintraepidermal nerve fiberの消失を評価している。今後このモデルを使用して、ミトコンドリア保護作用を有するペプチドであるSS-20およびSS-31の予防効果、治療効果の検討を行う。パクリタキセル惹起性末梢神経障害のマウスにおけるモデルを作成するため、1回投与量、投与間隔、投与回数などを検討する必要があり、適切なモデルを作成するのに、想定より時間がかかった。これまでに作成したパクリタキセル惹起性末梢神経障害モデルを使用して、その治療法、予防法を検討する。ミトコンドリア保護作用を有するペプチドであるSS-20およびSS-31をパクリタキセル投与開始時から持続投与することによる末梢神経障害の予防効果を検討する。さらに、末梢神経障害が確立した後、SS-20およびSS-31を一定期間投与し、その治療効果の検討を行う。SS-31はミトコンドリア保護作用の他に抗酸化作用があるため、2つのペプチドの効果の違いの可能性も検討する。本研究はがん治療における化学療法を受けている患者でみられる化学療法惹起性末梢神経障害や糖尿病患者でみられる糖尿病性末梢神経障害で共通してみられる対称性遠位末梢神経障害のマウスにおけるモデルを作成し、行動学的評価法、形態学的評価法、電気生理学的評価法などを確立したうえで、予防薬・治療薬を開発することを目指すものである。対称性遠位末梢神経障害モデルの一つとして、マウスにオキサリプラチンの繰り返し投与を行い、化学療法惹起性末梢神経障害モデルの作成を行った。マウスにオキサリプラチン10mg/kgを週1回、合計3回繰り返し腹腔内投与し、毎週投与前および最終投与1週間後にvon Freyhair試験を行い、機械的閾値を算出し、対称性遠位末梢神経障害患者でみられる機械的アロディニアの出現を評価した。オキサリプラチン投与前のマウスでは約1.0gのvon Frey hairの機械的刺激により下肢の逃避反射がみられた。この機械的閾値は、オキサリプラチンを投与するごとに低下し、3回投与した1週間後の機械的閾値は約0.2gまで低下した。これにより機械的アロディニアの出現が確認できた。また、この投与量では、マウスの体重の減少はみられず、全身状態に大きな影響はなかったことから、今後十分使用できるモデルであることも示された。当該年度はストレプトゾトシン投与による糖尿病性神経障害モデルも作成する予定であったが、次年度に行うこととした。動物実験担当の連携研究者の異動により一時実験が滞った。本研究はがん治療における化学療法を受けている患者でみられる化学療法惹起性末梢神経障害や糖尿病患者でみられる糖尿病性末梢神経障害で共通してみられる対称性遠位末梢神経障害のマウスにおけるモデルを作成し、行動学的評価法、形態学的評価法などを確立したうえで、予防薬・治療薬を開発することを目指すものである。化学療法惹起性末梢神経障害モデルとして昨年度作成したマウスにおけるオキサリプラチン繰り返し投与モデルにおける末梢神経障害に対し、ミトコンドリア保護作用を有するペプチドであるSS-20の予防効果を検討した。末梢神経障害による神経障害性疼痛は非侵害受容性の機械的刺激や冷温刺激に対する疼痛行動により評価した。また、形態学的には後肢足底のintraepidermal nerve fiberの消失で評価した。オキサリプラチンの投与期間中、SS-20を浸透圧ポンプにより持続皮下投与することにより、神経障害性疼痛による疼痛行動や後肢足底のintraepidermal nerve fiberの消失が抑制された。SS-20に用量依存性が見られた。SS-20による明らかな副作用はみられなかった。また、オキサリプラチン惹起性の神経障害性疼痛に対するSS-20の急性投与の効果を検討したが、疼痛行動に変化は見られなかった。以上の結果より、SS-20はオキサリプラチン惹起性末梢神経障害を予防できることが示された。このことは、オキサリプラチン惹起性末梢神経障害はミトコンドリア障害が関与していることを示唆した。本年度は化学療法惹起性末梢神経障害の予防法に関する成果をあげることができた。

本年度は、末梢神経障害を惹起する化学療法薬として、これまで検討してきたオキサリプラチンに次いで、パクリタキセルの検討を開始した。末梢神経障害による神経障害性疼痛は非侵害受容性の機械的刺激に対する疼痛行動により評価した。マウスにおけるモデルを作成するため、1回投与量、投与間隔、投与回数などを検討した結果、1回投与量6mg/kg、10mg/kg、20mg/kgを1日おきに、7回繰り返し投与することにより、用量依存性に末梢神経障害が徐々に発現し、投与開始4週後でピークとなり、8週後には軽快することがわかった。現在このモデルにおいて化学療法惹起性末梢神経障害の特徴であるintraepidermal nerve fiberの消失を評価している。今後このモデルを使用して、ミトコンドリア保護作用を有するペプチドであるSS-20およびSS-31の予防効果、治療効果の検討を行う。パクリタキセル惹起性末梢神経障害のマウスにおけるモデルを作成するため、1回投与量、投与間隔、投与回数などを検討する必要があり、適切なモデルを作成するのに、想定より時間がかかった。対称性遠位末梢神経障害モデルとして、オキサリプラチンによる化学療法惹起性神経障害モデルとストレプトゾトシンによる糖尿病性末梢神経障害モデル作成を確立させると同時に、それらの行動学的評価、形態学的評価、電気生理学的評価の方法を確定し、ミトコンドリア保護薬による治療の可能性を探る。次年度は確立した化学療法惹起性末梢神経障害の治療法の検討、および糖尿病性末梢神経障害のモデル作成を進めていく。これまでに作成したパクリタキセル惹起性末梢神経障害モデルを使用して、その治療法、予防法を検討する。ミトコンドリア保護作用を有するペプチドであるSS-20およびSS-31をパクリタキセル投与開始時から持続投与することによる末梢神経障害の予防効果を検討する。さらに、末梢神経障害が確立した後、SS-20およびSS-31を一定期間投与し、その治療効果の検討を行う。SS-31はミトコンドリア保護作用の他に抗酸化作用があるため、2つのペプチドの効果の違いの可能性も検討する。動物実験担当の連携研究者の異動により一時実験が滞ったため、予定のモデル作成が一部実行できなかった。当初の計画と研究の実施の順番を変えたため、一部の経費が必要となるのが、来年度以降となった。当該年度に行う予定であった一部の実験が行えなかったため、次年度に繰り越しとした。次年度は、当該年度に実行できなかったモデル作成を行うと同時に、次年度に予定している、形態学的評価、電気生理学的評価を行う。
癌細胞-宿主相互作用に基づく大腸癌転移に関わる因子の解明

今回の検討により、以下の点の解明ができた。大腸癌の血行性転移においては癌先進部のマクロファージを定量し、それが同時性肝転移群と異時性肝転移群両方とも、転移なし群より少数であることが判明し、よって癌先進部のマクロファージは転移に抑制的であると判断した。そのメカニズムとしては、癌細胞に対する直接的な影響も推定され、これらマクロファージ表面にはFas ligand陽性、mRNAも陽性で、FasLによるアポトーシス誘導の関与が想定された。実際に、マクロファージによる腫瘍細胞貧食像が確認され、上記のメカニズムを支持していた。これら癌先進部に集簇するマクロファージはB7-2,MHC classII, ICAM-1などが陽性であり、樹状細胞に近い形質を発現しているので、これらがリンパ節に遊走してゆけば、樹状細胞に分化する可能性があり、これら細胞を介してT細胞を抗原特異的に刺激し、抗腫瘍免疫反応との連動が想定された。実際、大腸癌の癌胞巣内に浸潤したCD8陽性リンパ球はがん患者の生存率を良くする因子であることも多変量解析にて確認した。これら宿主の反応を考慮することにより、ヒト臨床癌の悪性度をよりきめ細やかに規定することが可能となる。今後はこの観点からさらなる解明をめざしたい。本年度は大腸癌の血行性転移を規定する因子の同定を目的として、以下の検討をおこなった。検討症例としては、転移の生じたときの状祝を探る目的で異時性血行転移群をとりあげた(62症例)。コントロールは同時期に手術となった進行癌で5年以上再発・転移のないものである(72症例)。パラフィンブロックからの酵素抗体法でマトリックス分解酵素のうちのMMP-9(gelatinase B),urokinase-type plasminogen activator receptor(uPAR),CD68(マクロファージマーカ)を染色し、それぞれ定量表現をおこない、上記二群間で比較検討した。検討部位はいずれも陽性細胞の集簇する癌の先進部(tumor-host interface)である。【結果】MMP-9とCD68の陽性細胞の数とも異時性転移群で有意に低く、uPARには差をみとめなかった。【考察】すでに我々が明らかにしているように、MMP-9陽性細胞は好中球とマクロファージである。よってMMP-9が低いことはこれら細胞の少なさを意味する。一方uPAR陽性細胞には差が無かったことは、その陽性細胞の主体がマクロファージであることを考えると矛盾している。これは血行性転移群では線維芽細胞を主体にuPAR陽性細胞が出現しているためであることが判明した。MMP-9,uPARとも癌の浸潤転移論から考察されてきた。しかし、本研究によりそれらが宿主反応性細胞に由来する場合、癌の進展に対して逆相関することを示している。ことにマクロファージの血行性転移への抑制効果が推測された。これまでの大腸がん先進部に分布するマクロファージの血行性転移に関する抑制的役割の本質をさらに追及するため、以下の研究を実施した。すなわち、これらマクロファージが直接あるいは間接的に抗原提示細胞として機能している場合は、なんらかのエフェクター細胞が予想される。すでに我々は、それが腫瘍内に浸潤したCD8陽性T細胞であることをしめしている。これをさらに追求した。材料は連続200例の大腸がん手術摘出例である。フォルマリン固定、パラフィン包埋ブロックである。これを用い、CD8を染色した。癌内部、および癌先進部に分布するこれら細胞を顕微鏡200倍視野に接眼マイクロメータをおき、その中の陽性細胞数を定量した。それら定量値は中央値で二群わけし、生存率との関係を単変量と多変量解析でしらべた。ほかに調べた因子はステージ、癌の浸潤パターン、マクロファージの分布である。[結果]癌内部に浸潤したCD8陽性T細胞は単変量、多変量解析ともに有意となり、独立予後因子であるとみなされた。癌先進部に分布するCD8陽性T細胞は単変量解析では有意であったが、多変量では有意にならず、ステージに吸収されたと推定される。

また癌先進部マクロファージは生存率に影響をあたえなかった。[考察]前回は血行転移を抑制する因子と考えた癌先進部のマクロファージは何ら生存率に影響をあたえなかった。大腸がん患者の生存を大きく左右するのがこの異時性血行転移であることを考えると不思議でもある。これは機能分子はB7-2といった補助刺激分子であり、今回測定したのはCD68というラインゾーム関連分子であるという差がでたのかもしれない。また、われわれの当初の報告では大腸がんあ中に浸潤したCD8陽性T細胞は多ければ多いほど生存率を良くすると考えたが、これは支持されなかった。なぜなら、より浸潤T細胞の値が大である平均値わけでは、多変量解析では有意ではなかったからである。今回症例数をふやし、また患者のフォローアップデータをみなおし、より詳細な検討の結果、大腸がんでは癌内部に浸潤したCD8陽性T細胞の数は独立予後因子であることをみいだし、腫瘍免疫の存在を大きく示した。今後の問題としては、機能の解明である。今回の検討により、以下の点の解明ができた。大腸癌の血行性転移においては癌先進部のマクロファージを定量し、それが同時性肝転移群と異時性肝転移群両方とも、転移なし群より少数であることが判明し、よって癌先進部のマクロファージは転移に抑制的であると判断した。そのメカニズムとしては、癌細胞に対する直接的な影響も推定され、これらマクロファージ表面にはFas ligand陽性、mRNAも陽性で、FasLによるアポトーシス誘導の関与が想定された。実際に、マクロファージによる腫瘍細胞貧食像が確認され、上記のメカニズムを支持していた。これら癌先進部に集簇するマクロファージはB7-2、MHC classII, ICAM-1などが陽性であり、樹状細胞に近い形質を発現しているので、これらがリンパ節に遊走してゆけば、樹状細胞に分化する可能性があり、これら細胞を介してT細胞を抗原特異的に刺激し、坑腫瘍免疫反応との連動が想定された。実際、大腸癌の癌胞巣内に浸潤したCD8陽性リンパ球はがん患者の生存率を良くする因子であることも多変量解析にて確認した。これら宿主の反応を考慮することにより、ヒト臨床癌の悪性度をよりきめ細やかに規定することが可能となる。
中・高校生集団における歯周疾患の疫学的解析-特に交絡因子の検討-

本研究においては、中学生および高校生の歯周疾患状態について疫学的調査を実施し、その現状を把握すると共に、歯周疾患に関与する因子について、口腔内環境因子、個人特性(知識、行動、経験、関心度など)の因子および心理学的因子を抽出して、特に、交絡因子という立場から解析を試みた。1.中学生の疫学的解析:埼玉県下私立中学校生徒232名について調査、解析した。PMA indexの平均値は、1年生2.24、2年生2.04、3年生1.72と、学年が進むにつれてその値は減少した。OHI-Sの値をみると、3年生が最も低い値を示しておりPMAindexの値と一致した。DMFT indexの値では、1年生2.67本、2年生2.85本、3年生5.56本となり、3年生が高い値を示しているが、この原因はF歯の増加にあり治療に対する積極的行動とも考えられた。2.高校生の疫学的解析:埼玉県下私立高等学校生徒142名(1・2年生)について調査、解析した。PMAindexの値は、1年生4.10、2年生3.65と2年生で少ない値を示していた。OHI-Sの値をみると、1年生0.49、2年生0.38とPMAindexの値と一致して2年生で低い値を示した。DMFTindexの値では、1年生5.20本、2年生6.65本と2年生で増加しているが、その主たる内訳はF歯の増加であった。3.歯周疾患に関連する交絡因子に関する検討:中学生、高校生の生徒の歯周疾患の現症把握から、直接的には歯口清掃状態と関連しているように推察された。このような状況に関して、交絡因子と考え得る因子としては、中学生では、口臭や出血に対しての意識や健康との影響を考えることがあげられ、対人的意識の向上が歯科保健行動へ移行している可能性が示唆された。一方、高校生では、出血に対する現症認識力の影響が存在するようであった。心理学的には、MASによる低不安群でPMA-indexの値が低くなる傾向が認められた。健康行動と現症およびその交絡因子についてさらに検討を行いたい。我が国では, 10歳以上の男女の90%以上に何らかの歯周疾患が認められると言われている.近年,成人を対象にした疫学調査は多いが中学生及び高校生を対象にした研究は比較的少ない.そこで本研究では初年度として埼玉県下の私立中学校の生徒234名(1年生;83名, 2年生;75名, 3年生;76名)を対象として歯周疾患罹患状態はPMAindex及びCPITNを用いて評価した.同時にう蝕経験についてもDMFTindexを用いて評価すると共に,歯口清掃状態(OHI-S)とサリバスターBldを用いた唾液中潜血量についても評価を行った.その結果, PMAindexの平均値は各々1年生2.24, 2年生1.86及び3年生1.72と減少傾向を示した.この結果と同様にCPITNについても学年が進むにつれて値が減少し,又,サリバスターBldの結果からも多量出血を示す者が減少して行くことが判明した.これらの歯周状態の改善は,歯口清掃状態の改善によるものと推察された.すなわち, OHI-Sの平均値をみると1年生で0.97, 2年生で1.04を示したが3年生では0.88と低い値を示していた.一方,う蝕経験についてみると, DMFTindexの平均値において1年生2.65本, 2年生2.84本及び3年生5.59本と3年生で極めて高くなっていることが示された.この内訳をみると圧倒的にF歯が増加しており, Grade別ではC_1が増加していた.このことは, 1年生から2年生にかけての口腔環境に問題があってう蝕が発生したものの, 3年生で自分の健康に関する関心度が高まることにより処置率の向上が認められたものと推察された.関心度については同時に実施したアンケート調査により,学年が進むにつれ「歯は健康に余り関係しない」と答えた者が減少して行くことからも推察しうると思われる.心理的要因は,交絡因子として非常に重要であるが教育・知識度との関連も強いと考えられる.高校生に同様の試みを実施し分析することでより明らかな交絡因子を把握したい.本研究においては、中学生および高校生の歯周疾患状態について疫学的調査を実施し、その現状を把握すると共に、歯周疾患に関与する因子について、口腔内環境因子、個人特性(知識、行動、経験、関心度など)の因子および心理学的因子を抽出して、特に、交絡因子という立場から解析を試みた。

DMFTindexの値では、1年生5.20本、2年生6.65本と2年生で増加しているが、その主たる内訳はF歯の増加であった。3.歯周疾患に関連する交絡因子に関する検討:中学生、高校生の生徒の歯周疾患の現症把握から、直接的には歯口清掃状態と関連しているように推察された。このような状況に関して、交絡因子と考え得る因子としては、中学生では、口臭や出血に対しての意識や健康との影響を考えることがあげられ、対人的意識の向上が歯科保健行動へ移行している可能性が示唆された。一方、高校生では、出血に対する現症認識力の影響が存在するようであった。心理学的には、MASによる低不安群でPMA-indexの値が低くなる傾向が認められた。健康行動と現症およびその交絡因子についてさらに検討を行いたい。我が国では、10歳以上の男女の90%以上に何らかの歯周疾患が認められると言われている。近年、成人を対象にした疫学調査は多いが、中学生および高校生を対象にした調査・研究は比較的少ない。そこで、本研究では、昭和62年度に埼玉県下私立中学校生徒を対象に調査した。本年度は、高校生142名(1年生79名、2年生63名)を対象として歯周疾患罹患状態をPMAindexおよびCPI-TNを用いて評価した。同時に、DMFTindex、唾液潜血試験、OHIーSについて評価した。さらに、歯科質問調査票と心理テストとしてCMI、YーG、MASを実施し個人特性の評価を実施した。その結果、PMAindexの平均値は各々1年生4.10、2年生3.65と2年生で減少を示した。この結果と同様に、CPI-TNにおいても2年生ではコード2以上を示す生徒が1年生の約1/2を示した。また、唾液潜血試験においても、2年生で多量出血を示す者が減少した。これら2年生での歯周状態の良好さは、歯口清掃状態の良否にあると推察された。すなわち、OHI-Sの平均値をみると1年生で0.49、2年生で0.38となっていた。一方、う蝕経験をDMFTindexでみると、1年生5.20本、2年生6.65本と2年生で高くなっているが、その原因はF歯の増加にあった。このような状態がいかなる因子によって規定されているものかについて、歯科質問票による個人の知識、行動、経験などの特性因子と心理学的特性について解析を実施した。OHIーSの低いことが現症との直接的因子とすれば、その状態をつくり出している個人の特性、すなわち間接的因子と考え得る事項は、出血に対する現症認識と1年生に比べ若干知識があることであり、意外と意識や関心度と言った動機づけ的要素での相違は認められなかった。さらに、心理学的要素として、MASによる不安欠度を検討した結果、低不安群でPMAindexが低い値となっており、歯科保健行動に何らかの影響を与えていると考えられた。
食道閉鎖症モデルの作成および再生医療を応用した食道再建術の開発

難治性新生児疾患である先天性食道閉鎖症Gross A型の新たな治療法の開発を目的として、ウサギを用いたレチノイン酸過剰投与による食道閉鎖症の中動物モデルの作成を試みた。異なる妊娠日数、薬剤投与量で、オールトランスレチノイン酸40,80, 120mg/kg、13-シスレチノイン酸20mg/kgを単回投与した。オールトランスレチノイン酸120mg/kgを投与した母獣に2匹の胎仔溶解を認めたが、他の胎仔には外表奇形や食道閉鎖症を認めなかった。レチノイン酸は、少量の薬剤を連日投与する事で奇形発生が報告されているが、今回の研究からは単回投与では明らかな奇形を得られなかった。動物疾患モデル作成のための情報収集と基礎実験の開始。投与薬剤の材形の再検討と至適濃度の検討。具体的にはレチノイン酸の投与量と薬剤濃度の調整をin vitroで行い、検討した。【目的】レチノイン酸の過剰投与によるウサギ食道閉鎖モデルの作成を試みた。【方法】異なる妊娠日数(1014日目)の雌ウサギに過剰のレチノイン酸を経口で単回投与し、妊娠満期に帝王切開により胎仔摘出した。胎仔を開胸、開腹し、食道閉鎖症、気管食道瘻の有無を検索した。妊娠ウサギは、58月齢のNZW雌ウサギを交配後8日目以降で入手した。レチノイン酸は、オールトランスレチノイン酸、13-シスレチノイン酸を投与量を変えて用いた。【結果】それぞれ異なる妊娠日数、薬剤投与量で、9匹にオールトランスレチノイン酸40,80, 120mg/kg、3匹に13-シスレチノイン酸20mg/kgを単回投与した。妊娠率は8/12(66.7%)、薬剤投与直後に原因不明で死亡した母獣1匹あり、7匹の母獣から1匹あたり512匹の胎仔を摘出した。オールトランスレチノイン酸120mg/kgを投与した母獣に2匹の胎仔溶解を認めたが、他の胎仔には外表奇形や食道閉鎖を認めなかった。【まとめ】レチノイン酸は、今回の実験結果からは単回投与では明らかな奇形を得られなかった。今後、より少量の薬剤の連日投与での奇形発生について研究を進めていく。本研究の目的である、小児外科の代表的疾患である難治性A型食道閉鎖症の食道-食道吻合に再生医療を用いた治療法確立を目指し、催奇形性物質であるRetinoic Acid(RA)を妊娠9日目(E9)に過剰投与して直腸肛門奇形マウスを作成を試みる予定であった。Retinoic acid単独投与食道閉鎖症ウサギコロニーの確立従来から所属施設にて行ってきた鎖肛モデルの作成方法に準じて食道閉鎖症ウサギの作成を以下の実施計画に基づき試みる予定であった。生後8ヶ月目のNZWの雌雄を交配させ、交尾12時間後の受精時を妊娠0日と定める。食道閉鎖症を誘導するため、20mg/kg、50mg/kg、80mg/kg、100mg/kgの4通りでRAをsesame oilを溶媒として妊娠10、11、12、13、14日目のウサギの腹腔内に過剰投与する。妊娠25日目から30日目に妊娠ウサギを犠牲死させ、実体顕微鏡(ニコン製:SMZーU)下にそれぞれの子宮より胎仔を摘出し、さらに胎仔を開胸して食道閉鎖症の有無を確認する。これらのデータを解析し、食道閉鎖症モデルウサギ作成に対するRAの至適投与量並びに投与日を検討する。実際には、所属施設の異動に伴い、各種申請の再提出や資格再取得に時間と労力を必要とし、平成23年度は研究を実施通りに進める事は、極めて困難であった。研究環境の変更に伴う準備の遅れ。ウサギを用いた動物実験を開始するにあたり、実験環境が変更となったことに伴う基本的な実験動物の購入および取り扱いや環境整備を含めた準備段階の遅れが生じ、その調整に時間を要した。最大の理由は異動に伴う所属施設の変更、実験・研究体制の変更を余儀なくされたことである。すでに動物疾患モデルの作成を開始しており、次年度に研究を遂行していく。実験動物購入をはじめとして、具体的に予備実験あるいは基礎実験を開始している。異動に伴う資格の再取得、分配される基金の繰り越しなどを完了し、平成24年度は新しい研究機関にて研究を進めていく。研究分担者とは、密に連携を取りながら研究内容を一部分担して進めていく予定である。実験動物の購入、試薬やその他の備品の購入を行い、具体的に年度始めよりスムースに開始予定である。
脊髄くも膜下投与によるケタミンの鎮痛機序に関する研究

ケタミンは静脈麻酔薬として用いられているが、作用機序は明確ではない。中枢神経の興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸のNMDAリセプタに対するケタミンのアンタゴニストとしての作用が、その麻酔作用に関連があるという報告がある。ケタミンを脊髄くも膜下腔に投与しその鎮痛作用とNMDAリセプタとの関係を調べた。ウレタン麻酔下にラットのくも膜下腔にカテーテルを挿入し、脊髄損傷や運動麻痺のないことを確認し、以下の実験を行った。ラットを10匹ずつ2群に分けた。1群は生理食塩水を投与しその後1%ケタミンを投与した。2群はNMDA(2nmol)投与した後に1%ケタミンを投与した。それぞれの量は10ulとし、その後生理食塩水10ulでフラッシュした。それぞれの薬物を投与した後にtail-flick testを行なった。tail-flick latencyは1群の生理食塩水(コントロール)4.0±0.2secケタミン投与後5.8±0.4secで有意に延長した。2群のNMDA投与後3.2±0.5secケタミン投与後3.8±0.4secでNMDAの前投与によりケタミンの鎮痛効果は抑制された。脊髄くも膜下腔投与によるケタミンの鎮痛効果は、NMDAレセプタのアンタゴニストとしての作用によることが示唆された。
大型構造物の劣化損傷度評価のためのワイヤレスセンサネットワーク

本研究では、構造ヘルスモニタリングのためのワイヤレスセンサネットワークの構築を目的に、まず、各センサの小型・無線化を目指した。損傷記憶スマートパッチについては、耐環境性と現場での扱いやすさを考慮して、センサ形状やパッケージの変更を行った。また、ACM型腐食センサについては、より小型で低消費電力の計測装置を開発した。次に、近距離無線通信規格を利用して、各センサを互いに無線で接続することで、疲労と腐食の同時監視が可能なワイヤレスセンサネットワークの構築を行った。本年度は前年度に引き続き、ワイヤレス疲労損傷スマートパッチのうち、き裂進展計測システムの設計を行った。この計測部は本システムにおいて重要な技術である。このスマートパッチの目的は繰返し回数、応力振幅、最大応力を推定すること、そしてそれら推定した値と対象物の応力振幅と破断繰返し回数の関係から対象物の疲労損傷度を見積もることである。メリットとして配線が必要ないこと、定期検査のときに短時間でパッチを回収できること、そして単体で疲労損傷度を見積もるのに必要な繰返し回数、応力振幅が得られ、さらに最大応力を推定することができることが挙げられる。そこで、損傷記憶の理論的考察を行い、センサ出力から損傷度を評価する手法について検討した。次に、き裂進展計測システムの開発を行った。疲労損傷記憶センサ形状の最適設計のために、センサの寸法、導入き裂長さについて、有限要素法コードを利用して設計を行った。また、またき裂進展長さが測定しやすい、最適な合金系および寸法の選択を行った。さらにこれを工学的に実現するための成膜プロセスについて検討することにより、高感度のセンサの開発が実現できた。さらに、腐食センサであるACMセンサのワイヤレス化に取り組んだ。ZigBeをもとにした疲労センサおよび腐食センサの出力が同時計測可能なインターネットシステムが構築できた。これらのシステムを用いて、奄美大島および宮古島における橋梁の劣化モニタリングが実現できた。本年度はまず、ワイヤレス疲労損傷スマートパッチのうち、き裂進展計測システムの設計を行った。そこで、損傷記憶の理論的考察を行った。一般に疲労負荷を受けるときのき裂進展挙動は応力拡大係数範囲とき裂進展速度の関係で表すことができ、特に第二段階の関係はパリスの式で与えられる。このパリスの式を積分することによって、一定応力振幅の繰返し回数とき裂長さの関数を得た。この関係を利用して繰返し回数を推定する手法についてその精度について検討した。また、スマートパッチのセンサとして用いるために薄い純銅試験片のき裂進展挙動を調べた。き裂進展挙動の厚さ、最大応力、応力比による違いがあることがわかった。これらき裂進展特性を用いてき裂長さと繰返し回数の関係を得ることができた。一方、き裂進展挙動のばらつきは避けられない問題であるので、き裂進展挙動のばらつきを統計的に解析することでばらつきを評価した。さらにばらつきに影響を及ぼす要因について調べることでばらつきの小さいセンサを作製する指針について検討した。当初の予定である疲労の際の応力振幅および繰り返し回数を測定する原理について十分考察をすることができた。また、計測の際に生ずる誤差の原因を特定することができ、それによりセンサ材料の選定へフィードバックすることができた。疲労損傷スマートパッチに関してはセンサの特性の確認できたので、腐食をモニタリングするためのACMセンサについて検討を行う。さらに、計測の無線化を可能にするワイヤレスセンサネットワークの構築を目指す。物品費として、RFID計測開発システム・スタータキット、試験片加工費等として100万円使用する。また、フィールドでの計測および学会発表の旅費として、30万円使用する。さらに、実験補助として30万円の謝金を使用する予定である。
膵ラ氏島機能制御機構における膵由来インクレチン分泌の生理的意義の解明

膵GLP-1の生理的意義解明のため、ラット膵単独灌流と膵ラ氏島免疫染色を施行し、糖尿病GKラットα細胞からのGLP-1分泌亢進、GLP-1R発現、Exendin-4刺激によるGLP-1の分泌亢進、cAMP依存性インスリン分泌亢進を確認した。またGLP-1, GLP-1R, endosome markerの3重染色よりGLP-1/GLP-1Rのendosome形成を明らかにした。以上より、糖尿病膵ラ氏島細胞でのautocrine作用によるGLP-1Rシグナル増強機構の存在が示唆された。非糖尿病ラットでは同様の機構は存在せず、糖尿病の膵ラ氏島機能不全に対する組織修復機構である可能性が想定された。我々は既に非糖尿病げっ歯類の膵ラ氏島α細胞からGLP-1が脈動性に分泌し、消化管GLP-1と異なりExendin-4(Ex4), IBMXにより分泌刺激を受けないことを報告した(第56回日本糖尿病年次学術集会、EASD 2013)。一方、膵α細胞におけるGLP-1受容体(GLP-1R)発現の有無については賛否両論あり結論は得られていない。そこで本年度は、糖尿病モデルラット膵α細胞からのGLP-1分泌様式およびGLP-1R局在の相違性を明らかにするとともにGLP-1Rの機能性について検討を進めた。方法として、GKラット, streptozotocin (STZ)投与Wistarラットを使用した。対照にSTZ非投与Wistarラットを用いた。膵単独環流によりEx4, IBMX存在下でinsulin, glucagon, GLP-1分泌か反応を検討した。また膵ラ氏島免疫染色でGLP-1Rの局在を検討し、endosome染色による可視化を試みた。その結果、GKラットでは25週齢でcAMP依存性GLP-1分泌亢進を認めた。また25週齢GKとSTZ投与WistarラットにおいてEx4刺激によるGLP-1、glucagonの分泌亢進とともにinsulin分泌亢進を認めた。それに伴いglucagon分泌は抑制され、GLP-1によるinsulinを介するglucagon分泌抑制作用が示唆された。GLP-1, GLP-1Rは各種endozome関連マーカーと共局性のあるpuncture構造としてinsulin産生細胞(β細胞)のみならずGLP-1産生細胞(α細胞)にもみとめられた。すなわち糖尿病ラットのα細胞ではGLP-1Rが発現しており、GLP-1と結合後、βArrestin2と結合しinternalizationによりendosomeを形成したと考えられた。この結果、糖尿病ラットα細胞においてautocrine作用によるGLP-1分泌亢進と受容体を介するシグナル増幅機構の存在が示唆された。糖尿病の代謝異常に膵ラ氏島機能不全が深く関与するが、本研究の目的は膵由来インクレチンの生理的意義を明らかにするとともに膵ラ氏島機能制御における役割および糖尿病における膵ラ氏島機能不全との関連性を解明することにある。申請者らは、これまでに非糖尿病ラット膵ラ氏島α細胞からGLP-1が脈動性に分泌すること、糖尿病モデルラット膵α細胞のGLP-1分泌様式及びGLP-1受容体(GLP-1R)の局在、GLP-1Rの機能についても検討してきた。これまでの結果は、糖尿病ラット膵α細胞においてautocrine作用によるGLP-1分泌亢進とGLP-1Rを介するシグナル増幅機構を示唆するものであった。今回、糖尿病および非糖尿病モデルラット膵α細胞からのGLP-1分泌様式およびGLP-1R局在の相違性を明らかにするとともにGLP-1Rの機能性について検討を試みた。その結果、GKラットの糖尿病未発症の状態では非糖尿病ラットと同様に、GLP-1分泌亢進は見られないが、糖尿病発症後ではcAMP依存性のインスリン分泌亢進を認めた。また糖尿病ラット膵α細胞では機能するGLP-1Rの発現を認め、GLP-1刺激によりglucagon, GLP-1分泌を促進させるというautocrine機構が存在することも明らかにした。これらの成果を第58回日本糖尿病学会年次学術集会において口演発表した。今後、GIPを含めた膵由来インクレチンの生理的役割について、更に詳細に検討を加えてゆく予定である。膵ラ氏島機能制御におけるインクレチンの役割は大きいと考えられるが、その詳細な機構については、不明な点が多かった。申請者らは、糖尿病という病的状態においてのみ、膵α細胞GLP-1分泌亢進とGLP-1Rの発現が見られることを初めて明らかにした。また受容体はGLP-1との結合後、endosomeを形成することから、機能的に働いていることも明らかにされた。既に確立した膵α細胞のGLP-1受容体(GLP-1R)の局在をendosomeの3重染色法による解析手法を用いて、本年度は糖尿病モデルラット膵α細胞のGLP=1Rの局在と機能、さらにはGIP/GIP受容体の発現を解析し、GLP-1/GLP-1受容体との相違性を検討した。

その結果、GKラットの糖尿病未発症期では非糖尿病ラットと同様に、GLP-1分泌亢進は見られず、糖尿病発症後にGLP-1分泌とともにcAMP依存性のインスリン分泌亢進を認めた。また膵α細胞に機能するGLP-1Rの発現を認め、GLP-1刺激によりglucagon, GLP-1分泌を促進させた。すなわち糖尿病という病的状態においてのみ、膵α細胞GLP-1分泌亢進とGLP-1Rの発現が見られることを初めて解明した。また受容体はGLP-1との結合後、endosomeを形成することから、機能的に働いていることも明らかにした。また糖尿病状態のglucagon産生細胞でのみにGIP発現が確認されたが、GLP-1との共存は認めなかった。一方、endosomeにはGLP=1/GLP-1RとGIP/GIPRが共存し、large endosomeを形成した。以上より糖尿病状態では膵由来のGLP-1とGIPがそれぞれの受容体を介して機能し、互いに協調して膵ラ氏島機能維持に寄与している可能性が示された。膵GLP-1の生理的意義解明のため、ラット膵単独灌流と膵ラ氏島免疫染色を施行し、糖尿病GKラットα細胞からのGLP-1分泌亢進、GLP-1R発現、Exendin-4刺激によるGLP-1の分泌亢進、cAMP依存性インスリン分泌亢進を確認した。またGLP-1, GLP-1R, endosome markerの3重染色よりGLP-1/GLP-1Rのendosome形成を明らかにした。以上より、糖尿病膵ラ氏島細胞でのautocrine作用によるGLP-1Rシグナル増強機構の存在が示唆された。非糖尿病ラットでは同様の機構は存在せず、糖尿病の膵ラ氏島機能不全に対する組織修復機構である可能性が想定された。膵ラ氏島におけるインクレチンの役割は大きいが、そのメカニズムの詳細については殆ど解明されていなかった。申請者等は、膵ラ氏島α細胞からのGLP-1分泌を発見し、その意義の解明を進めてきた。この1年間の研究成果として、まず糖尿病状態では膵α細胞GLP-1分泌にautocrine機構が存在することを明らかにした。さらに機能するGLP-1Rが存在することを確認するため、endosome染色による可視化を試み、GLP-1, GLP-1Rに対する2抗体とendosome関連マーカーであるβArrestin2,EEA-1, Rab11, Rab7の1抗体を組み合わせて3重染色をし、Alexa 405, 488, 594結合二次抗体を使用し共焦点顕微鏡でクロストークを排除してGLP-1Rとの共局性を明らかにした。この成果は、これまで困難であったGLP-1Rの存在と機能解析に大きな進展をもたらすものと考えている。今後は、膵ラ氏島機能制御におけるインクレチンの役割を統合的に解明するため、糖尿病膵α細胞GLP-1分泌のsutocrine機構と、膵α細胞由来GLP-1のparacrineの詳細解明により、膵ラ氏島の機能と細胞の分化にどのように関わるかについて検討を進める予定である。またGIPの役割についても検討を行いたい。医歯薬学これまでの研究により、糖尿病ラット膵α細胞では機能するGLP-1Rの発現を認め、GLP-1刺激によりglucagon, GLP-1分泌を促進させるというautocrine機構の存在が明らかになった。この結果は、糖尿病における奇異性glucagon分泌亢進にはα細胞におけるGLP-1R刺激が関与する可能性を思わせるものであった。今後は。
計算論的行動計測技術に基づく顔と身体表現における物理的対面の機能とその障害の解明

12者間会話中における物理的対面機能の分析:相手と向き合う角度(0度、180度)により、ウェアラブルデバイス(FaceLooks)により計測された物理的対面、及びビデオコーディングによって計測されたアイコンタクトの生起頻度がどのように異なるか、定型発達成人18名を対象とした実験を行った。その結果、正面に座る条件(0度)に比べ、横に座る条件(180度)において、物理的対面の生起頻度が少ないことを明らかにした。2発展的な研究1:視点を低く変換するデバイス、CHILDHOODを用いた実験を行った。A.視点変換による対人距離の知覚変容:定型発達成人9名を対象として、視点の高低、及び姿勢によって、パーソナルスペースの知覚がどのように変化するか、実験的検討を行った。その結果、視点を低く変換することにより、不快に感じる対人距離が通常の視点の高さよりも広くなることが明らかになった。B.視点変換により対人動作の変容:定型発達成人15名を対象として、視点を低く変換し、リアルタイムで目の前の人と握手する条件と、視点を低く変換した状態で録画された目の前の人と握手する条件で、握手時のリーチング動作がどのように変化するか、検討した。その結果、リアルタイム条件で、リーチングする動作がより高くなることが明らかになった。3発展的な研究2:米国フィラデルフィア小児病院・自閉症研究センター及びセイント・ジョゼフ大学・キニー自閉症教育・支援センターと共同で、対人接触を計測するウェアラブルデバイス、EnhancedTouchを用い、自閉スペクトラム症児の対人接触を自動フィードバックすることによって物理的対面が増加できるかについて、検討を開始した。物理的対面の機能的役割解析についての実験実施は順調であり、視点変換装置を利用した研究の実施や、米国との共同研究を開始するなど、当初の計画以上に進展している。本研究を効果的に進めるため、研究の主眼を前述の(1)物理的対面計測デバイス、(2)視点変換デバイス、(3)対人接触計測デバイスを用いた研究として明確に設定し、(4)視線推定技術の活用を加えた物理的対面の検討も開始する。また、工学者と研究の進捗状況を確認しながら研究を進めることによって、研究上の問題を解決する体制が整っている。なお、計画に遅れが生じた場合は,原因や問題点を共有し,協力研究者との討議により要因の解決を進めていく。
SLE患者抗核抗体による遺伝子スクリーニング:抗原の分子生物学的研究と臨床応用

近年自己免疫疾患の血清には通常抗体の出来難い生理的に重要な生体成分に抗体が産生され,その機能解析に有力な手段となっている.私達はSLE患者血清を用いて,牛網膜由来の発現型CDNAライブラリーをスクリーニングし,抗体と反応するハイブリッド蛋白を産生しているクローンを1個得,更にこれと相同な,全コーディング領域を含む人胎盤由来のCDNAクローンも得た.塩基配列から,蛋白質の全一次構造を推定した.データベースによる検索から相同な配列は見い出されず,類似の遺伝子はまだ報告されていないと考えられる.また牛と人の両遺伝子で比較出来るアミノ酸配列中,唯1ヶ所を除いて全て同一であった.このように良く保存された遺伝子には重要な生理的機能が考えられる.そこで上記中発現型CDNAクローンから大腸菌で作らせた融合蛋白質を精製単離し,これを抗原としてポリクローナルとモノクローナル抗体を作成した.培養細胞を蛍光抗体法で染めると核が特異的に染色され,推定された一次構造に核内分布に関与するアミノ酸配列の存在と合わせ,これは核抗原遺伝子と考えられる.そこで融合蛋白質に対する抗体価を約250の自己免疫疾患の患者血清についてELISA法で調べた結果,抗体価の分布が既にKi抗原として知られている核抗原のそれと良く一致することが明らかとなった.また高崎氏より分与されたKi抗原と融合蛋白をウエスタン法によるイムノブロットで調べると,いづれの抗体を用いても共に主蛋白バンドが抗体と反応した.またAH130細胞を^<35>S-メチオニンでラベルし,その細胞抽出液から抗体を用いて精製されるラベルされた蛋白質はKiとほぼ同じ分子量を示し,非ラベルの融合蛋白で特異的に競合される.従ってこの遺伝子はKi抗原の遺伝子か,少なくとも抗原性に共通性のある類似の遺伝子であると考えられる. Ki抗原の遺伝子の単離は未だ報告されていない.近年自己免疫疾患の血清には通常抗体の出来難い生理的に重要な生体成分に抗体が産生され,その機能解析に有力な手段となっている.私達はSLE患者血清を用いて,牛網膜由来の発現型CDNAライブラリーをスクリーニングし,抗体と反応するハイブリッド蛋白を産生しているクローンを1個得,更にこれと相同な,全コーディング領域を含む人胎盤由来のCDNAクローンも得た.塩基配列から,蛋白質の全一次構造を推定した.データベースによる検索から相同な配列は見い出されず,類似の遺伝子はまだ報告されていないと考えられる.また牛と人の両遺伝子で比較出来るアミノ酸配列中,唯1ヶ所を除いて全て同一であった.このように良く保存された遺伝子には重要な生理的機能が考えられる.そこで上記中発現型CDNAクローンから大腸菌で作らせた融合蛋白質を精製単離し,これを抗原としてポリクローナルとモノクローナル抗体を作成した.培養細胞を蛍光抗体法で染めると核が特異的に染色され,推定された一次構造に核内分布に関与するアミノ酸配列の存在と合わせ,これは核抗原遺伝子と考えられる.そこで融合蛋白質に対する抗体価を約250の自己免疫疾患の患者血清についてELISA法で調べた結果,抗体価の分布が既にKi抗原として知られている核抗原のそれと良く一致することが明らかとなった.また高崎氏より分与されたKi抗原と融合蛋白をウエスタン法によるイムノブロットで調べると,いづれの抗体を用いても共に主蛋白バンドが抗体と反応した.またAH130細胞を^<35>S-メチオニンでラベルし,その細胞抽出液から抗体を用いて精製されるラベルされた蛋白質はKiとほぼ同じ分子量を示し,非ラベルの融合蛋白で特異的に競合される.従ってこの遺伝子はKi抗原の遺伝子か,少なくとも抗原性に共通性のある類似の遺伝子であると考えられる. Ki抗原の遺伝子の単離は未だ報告されていない.全身性紅斑性エリテマトーデス(SLE)の患者血清中に生理学的に重要な生体物質(cyclin,topoisomerase,splicosomeの構成蛋白等)にたいする抗体が検出されその機能研究に利用されているが、患者血清は量的に限られ、monospecificでない。私達は未知の生理学的に重要と考えられる遺伝子を、SLE抗体を用いてクローニングすることに成功した。牛網膜由来の発現型cDNAライブラリーをSLE患者血清をプローブとしてスクリーニングし、抗体と反応するハイブリド蛋白を産生しているクローンを1個得、更にこれと相同な、全コーデイング領域を含む人胎盤由来のcDNAクローンも得た。塩基配列決定による解析から、タンパク質の全一次構造を推定した。又既に登録されているデータベースによる検索から、相同な配列は見いだされなかった。Southern解析の結果から単ーコピーの遺伝子で、哺乳類のみならず,酵母、シヨウジヨウバエにも相同な配列が検出された。従って、この遺伝子は系統発生的にも良く保存され、重要な機能を担っているものと推定される。SV40のT抗原などに見られる核内分布に関与する配列が見られるので、核タンパク質の遺伝子と予想された。上記の牛発現型cDNAクローンをもちいて大陽菌で作らせたタンパク質を精製し、ウサギで抗体を作成し、培養細胞を蛍光抗体法で染めた結果細胞核が特異的に染色され、このタンパク質が予想通り、核内に存在することを明らかにした。そこで、このタンパク質を核抗原X(NA-X)と仮に命名した。以上、私達はSLE患者血清中に抗体が産生されている未知の、おそらく生理的重要と思われる核蛋白質にたいする遺伝子をクローニングすることができ、それに対応するタンパク質のmonospecific抗体を動物で作成することができた。

現在この単離された遺伝子と抗体を用いてその機能を明らかにすると共に多数の自己免疫疾患血清との反応性を調べ、診断への有用性を検討しつつある。