hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高酸素分圧下における植物光呼吸経路の制御

本研究では[1]密閉型植物生育装置を2基を用い、65%O_2O.05%CO_2の高酸素下でC_3、C_4植物を約3週間生育させ、他の条件を等しくした21%O_2O.05%CO_2の空気中で生育したコントロ-ルの植物と比較して、光合成・光呼吸および酸素障害の防御に働く代謝系がどんな適応をするかを調べた。高酸素下では生重量当りクロロフィル量は減少するが、蛋白量に差はなかったので、酸素活性は葉抽出液の蛋白当りで比較した。C_3植物3種ではカルビン回路のFuBPホスファタ-ゼとNADPトリオ-スリン酸デヒドロゲナ-ゼは高酸素下で活性が増加したが、RuBPカルボキシラ-ゼと同オキシゲナ-ゼ活性は変わらず、両活性の比にも差はみられなかった。光呼吸グリコ-ル酸経路の酵素ではグリコ-ル酸オキシダ-ゼとヒドロキシピルビン酸デヒドロゲナ-ゼの活性が増加した。また、C_4植物2種ではC_4経路のPEPカルボキシラ-ゼ活性が明かに増加していた。さらに高酸素ストレスに適応してC_3、C_4植物共にグルタチオンレダクタ-ゼ活性が著しく増加し、ス-パ-オキシドディスムタ-ゼも増加の傾向がみられた。これに対応して、オオムギでは葉内の還元型グルタチオン含量が2倍に増加した。[2]高酸素下でも生育可能な突然変異植物の取得を目指し、EMS処理したオオムギ(C_3)とモロコシ(C_4)種子のM2芽生えを屋外に設置した密閉型植物生育装置にいれ、約75%の高酸素中太陽光下で2週間以上生存できる個体を選抜した。3年間で検定したモロコシの種子26715粒から高酸素耐性株2個体の種子が得られた。検定したオオムギ種子は35650粒に及ぶが、7個体が高酸素下で生存したものの種子は得られなかった。ただし、両植物共にアルビノ、キサンタ、ビリディス、斑入り、巻き葉、低澱粉葉、高澱粉葉などの形質変異株が得られている。現大気中より高濃度の酸素下で植物を生育させたとき、光合成・光呼吸経路の酵素がどのような適応を示すかを探索し、また高酸素下で生育可能な突然変異株を選抜することより、植物に内圧する光呼吸制御の可能性を引き出すのが本研究の究極目標である。植物材料はC_33種(オオムギ、コムギ、イネ)、C_42種(モロコシ、トウモロコシ)を用い、密閉型植物生育装置内で気相を60-65%O_2CO_2500ppmの高酸素下で約3週間生育させた。対照として光・温度条件は同じで21%O_2CO_2500ppmの通常酸素分圧下(または5%O_2の低酸素下)で植物を生育させ、両植物葉のククロフィル、蛋白量と抽出液の酵素活性を比較した。高酸素下ではクロロフィルは光酸化されて減少するが、この傾向はC_4植物に著しく、トウモロコシでは完全に黄白化した。C_3種のオオムギとコムギでもクロロフィルの減少はあるが、生重量当りの蛋白量に差はなく、高酸素下でもゆっくりと生育した。

このように植物の種類により高酸素下の耐性能力に大きな差異が見られ、また、同じ高酸素下でも共存するCO_2分圧により影響に差があることが明らかになった。C_3植物の酵素活性を生重量または蛋白量当りで比較すると、カルビン回路の酵素ではRuBPカルボキシラーゼは差がなく、FuBPホスファターゼ、NADP-GA3Pデヒドロゲナーゼは増加の傾向がみられた。光呼吸素も(カラターゼを除き)やや増加した。なお、低酸素下で生育したC_3種の酵素活性はセリン-ヒドロキシメチルトランスフェラーゼが増加した以外に変動はなかった。突然変異株と取得するために密閉型植物生育装置は、当初計画とは異なり、直射日光を利用するため屋外に新設した。突然変異誘発剤EMS処理したモロコシ種子は農水省に生育を依頼し、種子を収穫した貰ったので、目下、これを上記の生育装置内で発芽させ70-80%の高酸素下で生存するものを選抜しつつある。植物を大気中より高濃度の酸素下で生育させて、光合成・光呼吸および酸素障害の除去に関与する代謝系がどのような適応を示すかを明らかにするため、オオムギ(C_3植物)およびモロコシ(C_4植物)を65%O_2、500ppmCO_2下で約3週間生育させ、同期間21%O_2、500ppmCO_2下で生育したコントロ-ル植物と酵素活性の経時的変動をタンパク質当りで比較した。オオムギ葉ではグリコ-ル酸オキシダ-ゼやヒドメキシピルビン酸レダクタ-ゼなど光呼吸経路の酵素活性が増大するのみならず、高酸素ストレスに適応してグルタチオンレダクタ-ゼ活性が日毎に増大し、ス-パ-オキシドディスムタ-ゼ活性も増加の傾向を示した。しかし、アスコルビン酸ペルオキシダ-ゼ活性は変化が見られなかった。モロコシ葉でもグルタチオンレダクタ-ゼ活性が著しく増加し、C_4経路の酵素ではPEPカルボキシラ-ゼ活性が増加の傾向を示した。また、高酸素下で生育可能な突然変異株の取得を目指し、初年度および本年追加購入した密閉型植物生育装置を用いて、オオムギ(C_3)とモロコシ(C_4)は別々に選抜を行なった。EMS処理した種子のM2個体を70-80%O_2、200-400ppmCO_2中で太陽光下に置くと大部分は2週間以内に枯死するが、さらに1週間生存し続ける個体を選抜した。これまでに検討したモロコシの穂数は370、種子は約16300粒で、このうち高酸素耐性株と思われるもの2株が得られたので、その種子を採取できた。また本年度から選抜を始めたオオムギは450穂、種子約12000粒から、まだ高酸素耐性株は検出されていない。なお、副産物として、両植物からアルビノ・キサンタ・縞斑入り等の葉色変化や、澱粉蓄積の異常な株の取得も試みている。オオムギでは低澱粉株とアルビノ株が得られているが、後者では正常株に比べ光呼吸経路のグリコ-ル酸オキシタ-ゼ活性が約1/4に低下していた。C_3植物オオムギを高酸素(65%O_2、500ppm CO_2)条件下で約3週間生育させて、光呼吸および酸素障害の防御に働く酵素系が同期間空気中(21%O_2、500ppm CO_2)で生育したコントロ-ル植物に比べてどのような適応を示すかを調べてきた。前年度まで数種の酵素活性が増大することを明らかにしてきたが、RuBPカルボキシラ-ゼと同オキシゲナ-ゼの活性および両者の活性化には全く変動がないことが確かめられた。高酸素下で活性上昇の著しいグルタチオンレダクタ-ゼについて、同酵素を精製して抗体を作成し、蛋白レベルの変動を調べた。また、高酸素下では葉内のグルタチオン含量が2倍になり、特に還元型が増加したが、アスコルビン酸量には変動は認められなかった。さらに高酸素下で生育可能な突然変異株の取得を目指し、本年度もEMS処理したオオムギ(C_3)とモロコシ(C_4)種子のM_2芽生えから70ー80%の高酸素中太陽光下で生育できる個体の選抜を継続した。モロコシでは本年も1個体が得られ、オオムギでも高酸素下で生存したもの7個体が得られたが、いずれも空気中に戻した後の結実には至らなかった。
北方圏・積雪寒冷地域における都市公共空間のバリアフリーデザイン

本年度は、都市公共空間に関するバリアフリーデザインの先駆的手法を把握するために、特にユニバーサルデザイン概念の発祥国であるアメリカで近年高く評価されているいくつかのデザインガイドブックを中心に文献レビューを行った*。また、北方圏・積雪寒冷地域に特徴的なバリアフリーデザインの現在の課題を把握することを目的とし、その公共空間のデザインが先駆的といわれるベルリン(ドイツ)・フランクフルト(ドイツ)・フライブルク(ドイツ)・バーゼル(スイス)・チューリッヒ(スイス)の各都市を対象に、主としてトランジットモール・システムに注目しながら、車の通行を遮断したエリアでの冬期における人々の移動の連続性についての利用実態に関する視察調査を行った。その結果、主として以下の3つの知見が得られた。(1)現在の日本の都市公共空間のバリアフリーデザインとその取り組みは、ある単体の開発計画内で完結したアクセシビリティの確保にのみ焦点が当てられており、都市地域全体として将来的にバリアフリーデザインを発展させていくための長期ヴィジョンの検討が不十分である。(2)長期ヴィジョンの欠落は、多種多様な施設や交通機関相互の空間の連続性を妨げ、それらのデザインのギャップを生み出すことになり、自治体や民間からの多額の投資が効果的に都市の活性化へと繋がらない原因の一つとなっている。(3)その解決のためには、環境やニーズの時間的変化に柔軟に対応でき、地域性や都市規模に応じ最適化できるようなデザインガイドラインを、地方自治体ごとの政策レベルで構築することが重要である。本年度では主として、都市公共空間に関するバリアフリー/ユニバーサルデザインの世界的な研究動向を探るために、特にEnvironmental Design Research Association (EDRA)・International Association for People-Environment Studies (IAPS)人間-環境学会(MERA)の大会プロシーディングズを中心に、環境行動デザイン研究の文献調査を行った。また、国内における先駆的事例の現状と課題を把握するために、阪神大震災からの復興をきっかけに、バリアフリーデザインに関して設計段階から高齢者・障害者等の意見が取り入れられディテールにわたって意見が反映されたと言われる「阪急伊丹駅(兵庫県伊丹市)」の現地視察調査を行った。その結果、(1)現在の日本の都市公共空間のユニバーサルデザインとその取り組みは、プロジェクトで完結したアクセシビリティを計画・設計時点において最大限に確保し、竣工時にユニバーサルデザインを完全に達成しようとする傾向が強いこと、(2)それが逆に、多種多様な施設や交通機関相互の空間の連続性を妨げ、デザインのギャップを生み出している可能性があること、(3)その解決のためには、環境やニーズの時間的変化に柔軟に対応でき、地域性や都市規模に応じ最適化できるような、アダプタビリティを中心にそえたデザイン姿勢とその具体的内容が重要であること、という知見が得られた。次年度は、以上の初歩的な仮説をより深く検討するために、アダプタブル・デザインという観点から国内外の先駆的事例の分析を継続して行い、札幌およびミルウォーキーにおける都市滞在活動の行動観察調査を踏まえ、北方圏・積雪寒冷地域における都市公共空間のバリアフリー/ユニバーサルデザインの実現に向けてのインフラ整備方策について考察する予定である。
社会運動団体の連携と分断－ＴＭＩと福島における脱原発運動のミクロ・プロセス比較

2017年度は前年度からの課題を引き継ぎ、次の二点を中心に研究を進めた。第一に、社会運動のあり方を規定する文化、国家構造、そして社会関係資がどのように感情の表出、また共有に影響するか検討するため、日米の事例に加え、第三の事例であるチェルノブイリ原子力発電所事故が起きたウクライナでの現地調査を行った。チェルノブイリ原子力発電所事故が発生した当時のウクライナは、ソビエト連邦の一部であり、共産主義国家であった。国家が市民社会に強く介入する場合、個人の感情の表出また共有はどのように行われるのか、もしくは行われないのか。共同調査者のEkatherina Zhukova(Lund大学)の協力を得て、2017年10月1日7日の期間中、事故当時、そして現在も原子力発電所近くに住み続ける地元住民、計8人に対し通訳を通じインタビューを行った。現在、それらのインタビューデータを分析し、共同調査者との共著論文を執筆予定である。第二に、新たな分析手法としてKHCoderによるテキスト分析を試みた。これまでの研究では、感情の種類、また表出や共有のあり方の観察分析を行ってきた。しかし、主観的かつ複雑な感情をどのように客観的に測定し、可視化するか、またどのように実証するかに対し大きな課題が残った。本研究ではKhCoderでのテキスト分析を通じ感情の測定、また可視化を試みた。KhCoderとはテキスト型(文章型)データを統計的に分析するためのフリーソフトウェアである。日米の事例における住民会議の書き起こし、また当時のインタビュー記録などをKhCoderで分析することによって、感情の実証を行えるのではないかと考える。現在、分析中であり、5th Joint Seminar on Urban Study for Young Scholarsにて分析結果を発表予定である(2018年5月)。29年度が最終年度であるため、記入しない。2015年度は、社会運動における感情に着目し、研究を進め、その成果を学術論文と国外学会発表にて発表した。社会運動における感情は「非合理的」な要素と見なされ、分析的には軽視され続けていた1970年代と比べ、今では多くの研究者がその重要性を十分に認識し、議論に取り入れ始めている。しかし、その議論は多くの場合、重要性を主張するものにとどまり、なぜ重要なのかの説明が不足している。このような課題を受け、フレーム論と感情を融合させることにより、感情がどのように運動を生起させるかの説明を行った。1979年アメリカにおけるスリーマイル原子力発電所事故と2011年、日本における福島第一原子力発電所事故の際に起きた、脱原発運動の日米比較を扱い"Collective Emotion"の論文を執筆した(査読有り)。現在の研究の進歩状況は、おおむね順調に進展していると判断する。当初の計画において、一年目の最大の目標は福島において調査票調査を実施することであった。また調査票調査を通し、スリーマイル(Walsh 1983)と比較可能なデータを獲得することによって、日米の比較研究を質的分析のみならず、さらに量的分析から進めることが1年目における終着点であった。当初の計画と比べ、おおむね順調に進展していると判断する理由として、以下の2点が挙げられる。(1)調査票調査の実施と発表:最大の目標であった調査票調査を行うことができ、さらに4つの国外発表を行うことができたため。国外での口頭発表を通じ、いくつかの重要なアドバイスをオーデイエンスからいただくこともできた。それらのコメントに基づき、さらに研究構想を膨らますことができた。(2)論文の発表:調査に基づき、発表だけでなく論文も発表することができたため。調査もとに、"Collective Emotion: An Unexplored Dimension in Framing Process in Social Movements".というタイトルで論文を発表した(査読有り)。2016年度は前年度からの課題を引き継ぎ、社会運動における感情文化に着目し、研究を進め、その成果を学術論文と国外学会発表にて発表した。前年度の2015年度では、フレーム論と感情を融合させることにより、感情共有がどのように運動を生起させるかの説明を行った。2015年度に提示した議論は、これまで不明瞭であったフレーム論においてどのように運動団体間がフレーム認識を一致させるかについて検討することができた。しかし、大きな課題も残った。すなわち、なぜ事例として検討したスリーマイルの脱原発運動では、感情共有ができたにも関わらず、福島の脱原発運動では感情共有がなされなかったのという問いである。この課題を受け、2016年度は新たに感情文化という視点からの説明を試みた。感情文化の視点を日米の脱原発運動の事例に応用した場合、スリーマイルの脱原発運動では感情共有がなされ、福島の脱原発運動では感情共有がなされなかった理由について、下記の仮説を導くことができる。仮説1:個人主義的なアメリカでのスリーマイルの脱原発運動では、怒りを表現することは正当な権利と見なされた。そのため、怒りを表現することが容易であった。仮説2:集団主義的な日本での福島の脱原発運動では、怒りを表現することは、集団内の調和を乱すため、また権威を脅かすため、避けられた。そのため、怒りを表現することが困難であった。現時点では、上記仮説に対する完全な検証が終了している訳ではないが、日米の脱原発運動に関してすでに収集したデータが一定の支持を示している。上記の分析をもとに研究報告書を執筆した。また、日本社会学会にて、さらに英語でThe 4th International Conference of East Asian Young Scholarsにて口頭発表を行った。

現在の研究の進歩状況は、「おおむね順調に進展している」と判断する。当初の計画では、文化的要素を新たに取り入れることが最大の目標であった。今年度は昨年の課題を引き継ぎ、新たに感情文化という視点を分析の中で取り組むことができたことが研究における大きな進歩であった。文化的側面を検討することによって、なぜ事例として検討したスリーマイルの脱原発運動では、感情共有ができたにも関わらず、福島の脱原発運動では感情共有がなされなかったのという問に対し、新しい解釈を提示することができた。2017年度は前年度からの課題を引き継ぎ、次の二点を中心に研究を進めた。第一に、社会運動のあり方を規定する文化、国家構造、そして社会関係資がどのように感情の表出、また共有に影響するか検討するため、日米の事例に加え、第三の事例であるチェルノブイリ原子力発電所事故が起きたウクライナでの現地調査を行った。チェルノブイリ原子力発電所事故が発生した当時のウクライナは、ソビエト連邦の一部であり、共産主義国家であった。国家が市民社会に強く介入する場合、個人の感情の表出また共有はどのように行われるのか、もしくは行われないのか。共同調査者のEkatherina Zhukova(Lund大学)の協力を得て、2017年10月1日7日の期間中、事故当時、そして現在も原子力発電所近くに住み続ける地元住民、計8人に対し通訳を通じインタビューを行った。現在、それらのインタビューデータを分析し、共同調査者との共著論文を執筆予定である。第二に、新たな分析手法としてKHCoderによるテキスト分析を試みた。これまでの研究では、感情の種類、また表出や共有のあり方の観察分析を行ってきた。しかし、主観的かつ複雑な感情をどのように客観的に測定し、可視化するか、またどのように実証するかに対し大きな課題が残った。本研究ではKhCoderでのテキスト分析を通じ感情の測定、また可視化を試みた。KhCoderとはテキスト型(文章型)データを統計的に分析するためのフリーソフトウェアである。日米の事例における住民会議の書き起こし、また当時のインタビュー記録などをKhCoderで分析することによって、感情の実証を行えるのではないかと考える。現在、分析中であり、5th Joint Seminar on Urban Study for Young Scholarsにて分析結果を発表予定である(2018年5月)。今後の課題としては、文化的要素を新たに取り入れることを検討している。日米における感情表出の違いを比較研究する際に、背後にある文化を無視することはできない。例えば、アメリカでは公の場において、怒りを表現することは正当な権利であると捉えられるのに対し、日本では「大人げない」などとタブー視する可能性がある。感情的規範を取り入れることによって、研究分析の厚みを増すことが期待できる。
トランスシアリダーゼファミリーの構造と機能の多様性と原虫生活環における役割り

トリパノソーマ原虫が原因となっている南アメリカシャーガス病、アフリカ睡眠病にはともに、有効な治療薬もワクチンもない。これらの原虫には他の生物種には存在しない酵素、トランスシアリダーゼ(TS)が存在し感染に重要な役割をしている。それぞれの原虫のTSの構造解析、発現調節、局在と機能解析を行い、これら蛋白質やその作用を受ける分子の役割りを調べた。1)遺伝子組換えTSの大腸菌での発現効率、安定性がよくなかったが、E.coli BL21-Slを用いることで、効率良くTSを発現させることが出来た。2)アフリカトリパノソーマの病原体T. bruceiのGPIアンカー蛋白質が出来ない変異体では、媒介昆虫ツェツェの中腸内での生存に大きな影響を受けているが、その原因がTSであることを明らかにすることができた。3)T.cruziに感染したマウスの心筋をTS特異的な抗体で染めると、感染細胞と周辺の非感染細胞が反応することが認められる。TSがT.cruziの細胞侵入に際して直接に宿主細胞との接着に働いている可能性、様々の細胞の状況を変化させて侵入を容易にするように働いている可能性、さらにその宿主細胞の変化が病態と関連している可能性が示唆された。5)T.cruziのTSは、C末端領域に12アミノ酸リピート配列を持つものと持たないものの2種類あり、リピートを有しないタイプの解析を行った。一部のみが機能タンパク質を与えること、それはGPIアンカーを介して原虫表面に発現されているという結果を得た。トランスシアリダーゼ(TS)は寄生性のトリパノソーマ原虫に特徴的に検出される酵素で,糖複合体末端のシアル酸を遊離させるシアリダーゼ活性とともに、そのシアル酸を他の糖鎖末端ガラクトース受容体に転移させるトランスファー活性も示す。シャガス病の病原原虫Trypanosomacruziでは,trypomastigote型で高い活性が検出され、シアル酸を受け取った原黒表面受容体は、原虫の宿主細胞への侵入過程に重要であることが示されてきている。TSは多くの遺伝子ファミリーからなり、その50%以上は酵素活性を示さない生成物を与えるが、それらの役割は明らかになっていない。またこの酵素は原虫表面で働くとともに血流中にも分泌され、種々の宿主細胞と相互作用していることが予測される。にれらの疑問にアプローチする一つの方法は、精製した活性型、不活性型の酵素を、種々の宿主細胞に働かせて応答を見るこどである。今年度、まずTSの発現と精製方法を確立した。数年間大腸菌での発現を試みてきたが、発現量が少ない、TSを発現する大腸菌が不安定であるなどの、問題で精製を試みることも出来ていなかった。NaClで発現を誘導する大腸菌E.coli BL21-SI(DE3)株を使用することで発現量と安定性の問題を解決することが出来た。続いて硫安沈殿、DEAE陰イオン交換クロマト、Ni-NTAアフイニテイークロマト、PhenylミSepharose疎水クロマトの組み合わせで酵素を精製したす活性を示さない遺伝子産物との立体構造上の違いをNMR、CD, X腺結晶解析の物理化学的手法で検出出来ないかと期待している。また、精製した組換え蛋白質や種々のフラグメントは、宿主細胞・蛋白質との相互作用を調べ、シャガス病の病態に関連する手がかり、ある種の細胞への活性化や抑制が見うれないかと期待して調べている。トランスシアリダーゼ(TS)は寄生性のトリパノソーマ原虫に特徴的に検出される酵素で、糖複合体末端のシアル酸を遊離させるシアリダーゼ活性とともに、そのシアル酸を他の糖鎖末端ガラクトース受容体に転移させるトランスグリコシダーゼ活性も示す。シャガス病の病原原虫Trypanosoma

cruziでは、trypomastigoteで高い活性が検出され、シアル酸を受け取った原虫表面受容体は、原虫の宿主細胞への侵入過程に重要であることが示されてきている。TSは多くの遺伝子ファミリーからなり、その50%以上は酵素活性を示さない生成物を与えるが、それらの役割は明らかになっていない。またこの酵素は原虫表面で働くとともに血流中にも分泌され、種々の宿主細胞と相互作用していることが予測される。昨年度に確立した方法を用いて、活性型、不活性型のTS、あるいはその部分的なフラグメントを量を増やして発現、精製しており、種々の宿主細胞、蛋白質との相互作用、ある種の細胞への活性化や抑制効果、シャガス病の病態との関連へ研究を進めていく。一方、T.cruzi epimasdgoteのstationary phaseでtrypomastigoteとは異なるTSが発現しているという報告がなされ、我々はその候補遺伝子ファミリーもクローニングしており、両方のTSの組換え体を作成して局在を調べた。原虫のepimastigoteで発現しているTSは膜に局在して培地中に分泌されないと報告されていたのであるが、種々の組換え体を作成して調べたところ、そのタイプのTSも分泌されるという結果が得られた。すなわち、epimastigoteで発現しているTSは分泌されているが酵素活性を示すものはなくて培地中には検出されず、そのstationaly phaseではtrypomastigoteと同じタイプの遺伝子が発現して活性が検出された、と理解することが出来ると考えている。
膀胱保存を目的とした浸潤性膀胱癌に対する動注化学療法と陽子線療法の併用の研究

1.臨床研究;(1)下殿動注と放射線(一部に陽子線追加照射を含む)療法:この治療法を16症例に行い、13例に浸潤度の低下を認めた。尚、膀胱全摘を拒否した5症例中、1例のみ再発した。また膀胱全摘を施行した11例中3例死亡したが、膀胱癌死は1例のみであった。以上の結果を踏まえ、次のような治療法を行った。(2)内腸骨動注と放射線の併用:局所に限局した浸潤性膀胱癌に対し、CDDPとMTXを内腸骨動脈より動注と放射線と腫瘍部のみへの陽子線を追加し、膀胱を保存する治療法に転換した。1992年12月末日までに21症例に本療法を行い、19例(90.5%)にCRを得た。また膀胱を保存したのは18例で、このうち2例は他の原因で死亡し、2例は膀胱内再発しその内の1例は膀胱全摘を施行した。1例肺転移を認めたため転移巣の切除を行った。残りの膀胱保存13例は、まだ観察期間が短いものの再発を認めていない。したがって本療法は非常に効果的であり、膀胱を保存できるものと思われる。但し今後さらに症例の積み重ねと、長期の観察を必要とする。2.基礎研究:マウス膀胱発癌を化学療法と陽子線療法後の膀胱保存のモデルとして用い、前癌状態に対するCDDPと陽子線の効果を検討した。85頭のC3H/He雌マウスに0.05%のBBNを飲料水として10週間与えた。その1週間後にマウスを5群に分け、CDDP単独投与群、陽子線単独投与群、CDDPと陽子線併用群、対照群とした。実験開始より30週間後にマウスを屠殺して、膀胱の発癌率を比較した。その結果、陽子線単独照射群(4-16,25%)、CDDPと陽子線の併用群(6/13,46%)発癌率は、対照群(15/18,83%)に比べて、有意に低かった。この結果は、臨床での膀胱保存療法の有用性を支持するものと思われる。1.臨床研究:(1)対象と方法.原則として組織学的にG3あるいは浸潤癌(T2ー3)であって、転移の無い膀胱癌患者16症例を対象とした。治療は、抗癌剤CDDPの下殿動注と放射線の併用を行い、主に近接効果を検討した。効果は臨床診断での浸潤度と、全摘後の病理組織所見で比較した。なお全摘が施行できなかった症例はTURによる病理組織所見を用いた。また陽子線の追加照射は5例について行った。(2)結果.浸潤度の低下は16例中13例に認め、うち7例には癌組織の消失を認めた。合併症あるいは拒否により全摘を行なわなかったのは5例であるが、2例のみ癌の残存があるもののそれぞれ10ヶ月、8ヶ月と元気に生存している。なお陽子線は5症例に追加照射したが、全例生存していて、うち3例は膀胱を保存している。なお2症例死亡したが、他の原因で死亡したものである。以上良好な結果を得ているので、更に症例のつみかさねと陽子線の導入を積極的に図る予定である。

2.基礎的研究:マウスの浸潤性膀胱癌のモデルを用い、陽子線20Gy1回照射の効果の検討を行った。その結果、照射を行った群の3週間後の平均膀胱重量(〓腫瘍重量)は67.7mgであって、照射を行なわなかった対照群(120.6mg)や照射開始時の対照群(110.0mg)に比べて、有意に重量が軽かった。また浸潤度でそれぞれの群を比較した。深部浸潤癌の頻度は、照射群で8/18(45%)であって、対照群の14/17(83%)に比べて有意に頻度が低かった。以上の結果20Gyの陽子線の照射はマウス膀胱癌の治療として有効であり、ヒトの膀胱癌に対しても有用な治療であることが示唆された。1、臨床研究:(1)下殿動注と放射線(一部に陽子線追加照射を含む)療法:この治療法を16症例に行い、13例に浸潤度の低下を認めた。尚、膀胱全摘を拒否した5症例中、1例のみ再発した。また膀胱全摘を施行した11例中3例死亡したが、膀胱癌死は1例のみであった。(2)以上の結果をふまえ、局所に限局した浸潤性膀胱癌に対し、CDDPとMTXを内腸骨動脈より動注と放射線と腫瘍部のみへの陽子線を追加し、膀胱を保存する治療法に転換した。現在までに14症例に本療法を行い、13例にCRを得、全例膀胱を保存した。この内2例は他の原因で死亡し、1例は膀胱内再発のため膀胱全摘を施行した。残りの10例は、まだ観察期間が短いものの再発を認めていない。したがって本療法は非常に効果的であり、膀胱を保存できると思われる。ただし、今後さらに症例の積み重ねと、長期の観察を必要とする。2、基礎的研究:マウス膀胱発癌を化学療法と陽子線療法後の膀胱保存のモデルとして用い、前癌状能に対するCDDPと陽子線の効果を検討した。85頭のC3H/He雌マウスに0.05%のBBNを飲料水として10週間与えた。その1週間後にマウスを5群に分け、CDDP単独投与群、陽子線単独投与群、CDDPと陽子線併用群、対照群とした。そして実験開始より30週間後にマウスを屠殺して、膀胱の発癌率を比較した。その結果、陽子線単独照射群(4/16,25%),CDDPと陽子線の併用群(6/13,46%)発癌率は、対照群(15/18,83%)に比べて、有意に低くかった。この結果は、臨床における膀胱保存療法の有用性を支持するものと思われる。【目的】浸潤性膀胱癌の標準的治療法は、膀胱全摘とそれに伴う尿路変更術である。しかし患者の高齢化に伴い、合併する他の疾患や全身状態が悪いために、手術が不可能な症例も少なくない。またQuolity of Lifeの観点から、尿路変更についても再考が必要である。したがって局所浸潤性膀胱癌(T2,T3)に対して、膀胱を保存する治療法の検討を開始した。【対象と方法】1990年8月より1992年12月までの約2年5ヵ月間に、T2ないしT2かつNO MOの浸潤性膀胱癌21例を対象とした。CDDP50mg/m^2、MTX30mg/m^2を3週間に1回の割合で合計3回、両側の内腸骨動脈より約2時間かけて動注した。またこれと併行して1回1.8Gyずつ合計41.4Gyの照射を、小骨盤腔に行なった。治療終了の3週間後に、CTおよび生検にて、治療効果の判定を行なった。そしてCRを得た場合には、主病巣ないしそれがあった部位に限局して33Gyの陽子線ないしX線の追加照射を行なった。CRを得られなかった症例は、膀胱全摘を行なうことを原則とした。【結果】CRを得た症例は19/21(90.5%)であった。すなわち非CR(PR)は2例のみで、1例は全摘を行なったが、5ヵ月後に他因死した。もう1例は、経過観察中に癌組織が消失し、17ヵ月後もNEDである。
ミツバチに収穫ダンスを踊らせなかったら何が起こるか

研究計画を申請したときは、4編の英文報告書のときと同じ実験場を予定していたが、計画が採択されたときに、使用不可となり、実験場の探索・選定に多大な時間と労力が費やされ、三度にわたる実験場の変遷を余儀なくされた。そして、各実験場の条件の違いに翻弄されて、計画した「収穫ダンスの阻止」には至らなかった。さらに一部の成果は別プロジェクトで予定されている特許申請に深く関係し、公表できずに現在に至っている。ミツバチは巣内で尻振りダンスを踊り、ダンスに含まれている距離と方向の情報を伝達しあっている。この「ダンス言語仮説」は研究者の間ではほぼ事実として認められているが、本研究では、この仮説に疑問を持ち、ダンスに含まれる情報が伝達されていないことを示すデータ採取を模索している。収穫ダンスを観察する巣箱と、距離を伸ばしていく餌場を設置する実験場は、従来通り兵庫県立人と自然の博物館のジーンファームを予定していたが、23年度に入ってすぐに使用不可となり、23年度は新しい実験場の探索・検討を余儀なくされた。24年度も前半はその影響を受け、なかなか計画した実験に入ることができなかった。24年度の35月は二郎イチゴ農家のビニールハウスを借りることが出来たので、16箇所の餌場にビデオ撮影装置を設置したりしながら、より適切な実験場を探ってみた。幸い、神戸大学工学部の地下に未使用のトンネルがあることを突き止め、1年間借用が認められたので、ビデオ撮影装置をビニールハウスから地下トンネルに移動し、個体マーク(背番号の貼り付け)のついた働きバチを観察巣箱に導入した。23年度はビルの一室という閉鎖空間でセイヨウミツバチを半年間、飼養が可能だったので、それを予備実験とみなして、地下トンネルではすぐに観察巣箱を設置したが、トンネル内の照明にミツバチたちはうまく飛翔することができず、出て行った個体は観察巣箱に戻ることが出来なかった。各餌場に設置している豆球のワット数をいろいろ変えてみたが、通常の実験が出来る環境には程遠いことがわかった。ミツバチは収穫ダンスという「ダンス言語」をもっているので、それで仲間同士で情報を伝達し合い、スムーズな社会生活を営んでいると信じられている。本研究は、たかだか100万程度の脳細胞しかもたないミツバチという昆虫にとって「情報の伝達」といった知的な活動は不可能ではないか、という疑問に端を発している。申請後から交付決定までの間に、研究計画に不可欠な実験場が次々と使用不可となり、計画変更を余儀なくされ、新たな実験場の探索・検討に多大な時間が費やされた。二度にわたる計画変更の末、1完全閉鎖空間のビルの一室での実験、2建物内の通路につくった簡易ビニールハウスのトンネルでの実験、をする計画だった。1は既存の施設なので実現したが、2は一からつくらねばならないため、いろいろな困難が伴い、最終的にはイチゴ農家が使用しているビニールハウス(5x35m)を借りることになった。しかし、ビニール張りをはじめとする様々な準備が必要で、23年度内では実験可能なところまでは到達できなかった。したがって、研究成果は1の計画のみである。しかしながら、この研究成果は、一企業と神戸大学と兵庫県立大学との三者で協定を結んだプロジェクトの実験施設を借用したため、そのプロジェクトで予定されている特許申請に深く関わっており、公表は見合わせる必要がある(理由を記述した調書を添付)。「ミツバチは刺す昆虫で危険」という一般的な解釈により予定していた実験場が使用不可となり、新たな実験場を探索し検討することに、多大な労力が費やされたため。現在、ビニールハウスにて準備が整い、データが取れる寸前になっているが、天候・風雨の影響を簡単に受けてしまうので、生きた働きバチを多数使用し、ビデオの監視カメラなどの精密機器を使用する本研究の実験環境としては不向きな点が多い。そのため、ビニールハウスの準備を進めながら、新たな実験場を探していた。その結果、途中登場して使用不可になった「地下トンネル」近い実験場が見つかり、現在、使用許可を申請中で、許可がおり次第、移転する。新たな地下トンネルは、神戸大学工学部所有のもので、ビニールハウスで準備してきた機器がすべて使用でき、しかも天候の影響を受けにくい環境にある。申請当初は、研究補助員+トランシーバーを用いた従来型の観察方式を考えていたため、「人件費・謝金」はどうしても必要なものだった。しかし、多くの観察点を採用していくとなると、「人件費・謝金」ではまったく賄い切れず、最新式のビデオ監視カメラ方式に切り替えざるをえなくなった。その結果、「人件費・謝金」は当該年度ではゼロとなり、多数の精密機器を購入することになった。この新方式切り替えの影響で、次年度も、「人件費・謝金」は最小限度にとどめ、多くを「ビデオ監視カメラ方式」を強化する機器の購入に充てる予定である。
小臼歯群の咬合関係と顎口腔機能との関連性について

潜在的に顎機能異常をもつ者、とくに片側性の顎関節クリック有雑音者を対象にした、プレスケールによる咬合診査を行った。先に調査した健常者と検比較、検討したところ、以下の知見を得た。1.咬合接触点数では、六臼歯部において健常者と有雑音者の雑音側では有意な差が示された。咬合接触では片側歯列全体と小臼歯部咬合力では片側歯列全体と小臼歯部において健常者と有雑音者の雑音側とでは有意な差が示された。2.有雑音者における非雑音側と雑音側との比較においては、咬合接触点、咬合接触面積、咬合力のいずれも、片側歯列全体、小臼歯部、大臼歯部で有意な差が示されなかった。これらのことから、健常者に比較して有雑音者では、咬頭嵌合位における咬合接触状態が不安定であり、その結果が顎機能を表出する咬合力の低下として認められた。有雑音者における雑音側と非雑音側とでは、咬合接触状態に差が示されなかったことから、片側のクリック有雑音者におても両側に咬合機能の低下が及んでいるものと考えられた。今後は顎機能異常者についても調査を行い、咬合接触状態と病態との関連について検討を行う。健常有歯顎者を対象とし,小白歯群の咬合接触状態の検査を行った.ブラックシリコーンを用いた最大咬みしめ時における上下顎小白歯群の咬合接触状態は,その接触の様相に様々なパターンが存在した。周一の被験者群について,顎機能の診査の一助になるものとして,デンタルプレスケールによる咬合診査を行った.オクルーザーを用いた.咬合力分布についての診査では健常な有歯顎者では、左右の歯列における咬合力分布の比は,10%以内であることが既に報告されているが,ブラックシリコーンによる小白歯群の咬合接触様相と,咬合力分布については何らかの相関がみられると思われ,検討中である。健常有歯顎者における咬合接触状態と小白歯群のもつ機能との関連も示唆され,MKGによる顎運動との関連についても検討を行う予定である。一方,顎機能に異常をもつ被験者については,まず健常者群と比較した咬合接触様相との差異について検討を行い,不良な接触点等と改善した結果,顎機能に変化が現れるかどうか,検討をする予定である.潜在的に顎機能異常をもつ者、とくに片側性の顎関節クリック有雑音者を対象にした、プレスケールによる咬合診査を行った。
実践的な中長距離走のランニング技術の測定・評価法の確立

平成30年度も,鹿屋体育大学スポーツパフォーマンス研究センター(以後,SPセンター)を活用した中長距離走のランニング技術の測定法・評価法の研究を推進した.具体的にはSPセンターの50mフォースプレート走路および人工芝フィールドに約170mの周回路を作り,その周回路を走りながら,7つの走速度帯(遅いjog,速いjog,Lactate Threshold域での走行,Onset of Blood Lactate Accumulation域の走行,レースペースでの走行を2種類,スパート)での走行のピッチとストライドの変化,および地面反力のデータを収集した.被検者は,鹿屋体育大学陸上競技部で中長距離を専門とする選手16名(男子9名,女子7名),およびU20世界選手権女子3000mで優勝した選手1名,ならびに日本選手権女子1500mにも出場するジュニア選手1名の計18名であった.平成30年度は,平成29年度のデータから評価法の試案をする期間であったが,そのデータからこれまで以上の有用なデータの評価が行えず,未だ分析を行っている最中である.しかしながら,平成30年度には女子トップ選手のデータ取得(測定)が行えたことから,そのデータとの比較等で,新たな視点で評価法を探りたい.その他,モーションキャプチャは即時的なフィードバックが行いづらいことから,そのトップ選手からフォースプレートデータと実際のランニング技術を視覚的に確認したいとのことで,高画質のビデオ撮影をもとにしたフィードバックを行った.被検者の選手たちからは,おおむね好評を得ていることから,今後評価法の中に取り入れていくことを検討する.また,中距離選手の測定法として,新たに50mフォースプレート走路上を往復する形(70mシャトル走)での方法を試行した.今後この方法も模索していく.平成30年度に予定していたランニング技術の評価法の試案(どのデータをどのように評価するか)が完成できず,現在は当初からあるピッチとストライドの変化(関係)と,地面反力のデータのみで評価を行っている.平成30年度にトップ選手の測定が行え,そのデータを取得できたことから,さらに分析を進め,評価法を確立する.平成29年度,平成30年度で得られたデータをさらに分析し,まずは中長距離走のランニング技術の評価法を確立することが重要であると考える.また,測定法に関しては,高画質の映像をどのように撮影すれば,より選手へのフィードバック(評価)に良いのかを検討したい.本研究は,鹿屋体育大学スポーツパフォーマンス研究棟(以後SPLab)での中長距離走のランニング技術を測定・評価する方法を構築するものである。平成29年度は,大学陸上競技中長距離選手16名(男子8名、女子8名)を対象に,測定方法の検証のため,従来から実施されていた直走路での測定とSPLab内に周回コースを作った形での測定を実施し,比較した。なお,測定の際の走速度は,ゆっくりのjog(スローjog),速めのjog(ファストjog),LT(Lactate Threshold)レベルのランニング(LT走),OBLA(Onset of Blood Lactate Accumulation)レベルのランニング(OBLA走),3000mもしくは5000mの試合速度でのランニング(Race Pace走1),800mもしくは1500mのレースペースでのランニング(Race Pace走2),レースでのスパート時レベルのランニング(スパート走)の7段階のスピードでの走行を,約50m区間,各試技2回ずつ実施させた。また,それぞれの走速度の確認のため,時計での確認,ポイント(50m)毎でのタイムの読み上げ等の方法を試した。そして,最終的にはモーションキャプチャ(ナック社製Mac3D System)も測定内容に導入する方法も模索した。その他,選手の走行感覚を調査するため,アンケート用紙を作成し,記入させた。その結果,周回での測定およびタイムの読み上げによるペースの確認が,最も効果的に測定できる可能性が窺えた。ただし,モーションキャプチャを組み込む場合,その測定値により周回のカーブがきつくなりすぎることから,その対策を考えた測定方法を,今後検討する必要があると考えられた。計画していた直走路での測定と周回を作成しての測定が実施できた。また,モーションキャプチャを導入しての測定も実施できた。そして,それぞれの比較検討(分析)を現在行っている。よって,1年目の研究課題である測定方法の検討までに至っていることから「おおむね順調に進展している」と判断する。平成30年度も,鹿屋体育大学スポーツパフォーマンス研究センター(以後,SPセンター)を活用した中長距離走のランニング技術の測定法・評価法の研究を推進した.具体的にはSPセンターの50mフォースプレート走路および人工芝フィールドに約170mの周回路を作り,その周回路を走りながら,7つの走速度帯(遅いjog,速いjog,Lactate Threshold域での走行,Onset of Blood Lactate Accumulation域の走行,レースペースでの走行を2種類,スパート)での走行のピッチとストライドの変化,および地面反力のデータを収集した.被検者は,鹿屋体育大学陸上競技部で中長距離を専門とする選手16名(男子9名,女子7名),およびU20世界選手権女子3000mで優勝した選手1名,ならびに日本選手権女子1500mにも出場するジュニア選手1名の計18名であった.

平成30年度は,平成29年度のデータから評価法の試案をする期間であったが,そのデータからこれまで以上の有用なデータの評価が行えず,未だ分析を行っている最中である.しかしながら,平成30年度には女子トップ選手のデータ取得(測定)が行えたことから,そのデータとの比較等で,新たな視点で評価法を探りたい.その他,モーションキャプチャは即時的なフィードバックが行いづらいことから,そのトップ選手からフォースプレートデータと実際のランニング技術を視覚的に確認したいとのことで,高画質のビデオ撮影をもとにしたフィードバックを行った.被検者の選手たちからは,おおむね好評を得ていることから,今後評価法の中に取り入れていくことを検討する.また,中距離選手の測定法として,新たに50mフォースプレート走路上を往復する形(70mシャトル走)での方法を試行した.今後この方法も模索していく.平成30年度に予定していたランニング技術の評価法の試案(どのデータをどのように評価するか)が完成できず,現在は当初からあるピッチとストライドの変化(関係)と,地面反力のデータのみで評価を行っている.平成30年度にトップ選手の測定が行え,そのデータを取得できたことから,さらに分析を進め,評価法を確立する.今後(平成30年度)は,平成29年度に検討した測定方法で測定を実施し,そのデータをもとに,SPLabを活用した中長距離走のランニング技術の評価方法を検討する。そこから,SPLabを活用した中長距離走のランニング技術の簡易な評価シートを試案する。平成29年度,平成30年度で得られたデータをさらに分析し,まずは中長距離走のランニング技術の評価法を確立することが重要であると考える.また,測定法に関しては,高画質の映像をどのように撮影すれば,より選手へのフィードバック(評価)に良いのかを検討したい.測定被験者の怪我により数回分の測定が実施できず,その分の被験者謝金が生じなかったため。また,研究発表および情報収集で参加する予定であったランニング学会に,データ収集・分析の遅れおよび大学業務のため参加できなかったことから,次年度使用額が生じた。使用計画は,日本トップクラスの選手(被験者)の測定の旅費と謝金に使用する予定である。まず,ランニング技術の評価法が完成できず,学会発表に至らず,学会参加に対する旅費が発生しなかったことが挙げられる.また,当初の測定実施(回数)が,被検者の都合(怪我等)により少なくなったことから,その謝金や検者のアルバイト料等の人件費が抑えられたためである.次年度使用額は,次年度の測定回数を増やすほか,可能であれば学会発表の回数も増やせればと考える.
胚盤胞補完法を用いた機能的な造血幹細胞への分化誘導法の開発

胚盤胞補完法は特定の臓器を欠損する動物の胚盤胞に多能性幹細胞を移植し、目的の細胞および臓器を作製するものであるが、現在の技術では目的とする臓器以外においてもキメラが形成されるという問題点が存在する。異種の胚発生を利用しヒト多能性幹細胞からヒト造血幹細胞のみを作成することが可能となれば、造血幹細胞移植の新たなソースとして臨床応用が期待されるだけでなく、胚盤胞補完法による臓器の作出における問題克服の契機となることが期待される。多能性幹細胞の分化を特定の方向に誘導する目的で、HoxB4を発現するES細胞をマウスの胚盤胞に注入したところ、末梢血においてはES細胞由来の血液細胞が確認されたが、体毛以外の内臓などではES細胞由来の細胞がほとんど確認されなかった。これにより、ES細胞の分化を限定的なものに誘導できうることが示された。造血幹細胞の発生および機能維持のためには、周囲の微小環境からのシグナルが必須である。異種間ではシグナル分子と細胞表面レセプター間での交差反応性の問題が存在するため、胚盤胞補完法を用いて造血幹細胞を作成する際には、異種の体内で造血幹細胞がその機能を維持することが可能かを確認する必要がある。免疫不全マウスにヒト造血幹細胞を移植し作成した造血系ヒト化マウスは、長期にわたりヒト造血を維持し、ヒト造血幹細胞はマウス骨髄においても休眠状態で存在した。また造血系ヒト化マウスの骨髄において、ヒト造血幹/前駆細胞がマウス造血幹細胞の休眠状態を維持する造血幹細胞ニッチに存在することが確認され、休眠状態の維持にはTGFβシグナルが重要な働きをすることが示された。これらの結果から、ヒト造血幹/前駆細胞は異種であるマウスの骨髄微小環境を用いてその機能を維持することが可能であることが示され、胚盤胞補完法による異種の体内でのヒト造血幹細胞の作成につながる成果であると考えられる。(抄録なし)多能性幹細胞から生体内で目的の細胞および臓器を作成する方法として、胚盤胞補完法が期待されている。これは臓器を欠損する動物の胚盤胞に多能性幹細胞を移植し目的の細胞および臓器を作製するものであるが、現在の技術では目的とする臓器以外においてもキメラが形成されるという点が問題存在するため、この技術の応用が困難となっている。胚発生を利用し造血幹細胞を含む血液細胞のみを作成ことが可能であれば、その臨床応用が期待されるだけでなく、胚盤胞補完法による他臓器作出における問題克服の糸口となることが期待される。これにより、ES細胞の分化を限定的なものに誘導できうることが示唆された。また特定の細胞の発生および生存のためには、増殖因子などの液性因子や周囲の微小環境からのサポートが必須である。このため、異種の体内で目的とするヒトの細胞の生存が可能かを確認する必要がある。免疫不全マウスにヒトの造血幹前駆細胞を移植することにより、ヒトの造血を長期に維持するヒト化マウスを作成することが可能である。このマウスを詳細に解析した結果、移植されたヒト造血幹前駆細胞がマウス骨髄においても休眠状態で存在し、その維持にはマウス造血幹細胞と同様にp57の発現やFOXO3aの核移行が関与していることが示唆された。またヒト化マウスの骨髄を免疫染色した結果、マウスの造血幹細胞ニッチにヒト造血幹前駆細胞が存在することが確認され、ヒト造血幹前駆細胞は異種であるマウスの骨髄微小環境を用いてその細胞機能を維持していることが示唆された。また造血系ヒト化

マウスの骨髄において、ヒト造血幹/前駆細胞がマウス造血幹細胞の休眠状態を維持する造血幹細胞ニッチに存在することが確認され、休眠状態の維持にはTGFβシグナルが重要な働きをすることが示された。これらの結果から、ヒト造血幹/前駆細胞は異種であるマウスの骨髄微小環境を用いてその機能を維持することが可能であることが示され、胚盤胞補完法による異種の体内でのヒト造血幹細胞の作成につながる成果であると考えられる。研究成果を順調に積み重ねており、現在論文投稿準備中であるため。特に異種における造血幹細胞ニッチに関して研究成果が蓄積している。異種で共通する造血幹細胞ニッチに関する知見は興味深く、また今後の臨床応用につながる可能性があるため、さらに研究を加速させていく。同時にこれらの知見を胚盤胞補完法に応用させる必要がある。(抄録なし)
ブタ卵の活性化に伴う表層顆粒反応と透明帯反応の生理・生化学的検討

本研究は,体外成熟ブタ卵に直流パルス刺激を与え,括性化後の表層顆粒の開裂と透明帯構成糖タンパクの経時的な変化について検討した。尚,表層顆粒の開裂は10μg/mlFITC標識AHG-Lectinで染色後,共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。一方,透明帯反応に伴う透明帯糖タンパクの変化は,卵細胞質を完全に除去した透明帯にビオチン標識処理を施し,個々の透明帯をSDS-PAGEで泳働した後,ECL法で検出した。更に,透明帯構成糖タンパクの変化に伴う透明帯硬化現象も0.1%タンパク分解酵素(プロテアーゼ)処理による透明帯の消化時間の差異により明らかにした。成熟卵の表層顆粒は卵細胞膜直下に連続的な単層を形成しており,この卵の透明帯にはZP1,ZP2ならびにZP3の三種類の糖タンパクが認められた。一方,活性化刺激を与えた卵においては表層顆粒開裂の進行に伴いFITC蛍光度の減少と,ZP1とZP2のバンドの消失が観察された。しかし,ブタ卵の活性化後における表層顆粒の開裂には長時間を要し,活性化刺激1時間後に9%の卵で完全な表層顆粒の開裂が初めて確認された。同様に,ZP1とZP2の糖タンパクの消失として認められる透明帯の完全な変性には活性化刺激後3.5時間を要した。また,この透明帯構成糖タンパクの変性に伴ってタンパク分解酵素に対する抵抗性も著しく増加した。以上の結果より,活性化後,ブタ卵が表層顆粒の開裂に伴う透明帯反応を完了するには長時間の培養が必要であることが明らかとなった。このことがブタ卵における体外受精での多精子侵入率の著しい増加に関与していると推定された。本研究は,体外成熟ブタ卵を直流パルス法で活性化させ,表層顆粒の開裂と透明帯反応を個々の卵で観察すると共に,両現象に対する細胞外および細胞内Ca^<2+>除去の影響をCa^<2+>キレート剤(EGTA,BAPTA-AM)を用いて検討した。尚,表層顆粒の変化は10μg/ml FITC標識AHG-Lectinで染色後,共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。一方,透明帯反応に伴う透明帯糖タンパク質の変化は,替え刃で透明帯の一部に切れ目を入れた後,卵細胞質を完全に除去した個々の透明帯にNHS-LC-Biotin II処理を施し,SDS-PAGEで泳働した後,ECL法でバンドの移動度を観察することで検討した。さらに,両結果を画像解析ソフトによりそれぞれ数値化することで,表層顆粒の開裂および透明帯反応の進行度合を明らかにした。活性化刺激により,活性化卵においては表層顆粒の開裂に伴うFITC蛍光光度の顕著な減少が観察された。しかし,EGTA区の47%卵が,またBAPTA区の43%卵が,それぞれ成熟卵と同じ蛍光光度を示した。また,ブタ卵では活性化に伴い透明帯を構成する糖タンパク質の内,ZP1(82kDa)量が著しく減少することが明らかとなった。このことは,これまでマウス卵で報告されているZP2からZP2fへの変化とは異なった結果であり,ブタ卵の透明帯反応に伴う糖タンパク質の変化においてマウス卵との相違が確認された。さらに,この透明帯反応に伴うZP1の減少は,EGTA区とBAPTA区で有意に抑制された。以上の結果から,透明帯反応に伴う透明帯糖タンパク質の変化が一個の卵子を用いてECL法により解析できることが明確にされた。また,ブタ卵の活性化に伴う表層顆粒の開裂および透明帯反応には細胞外ならびに細胞内の両Ca^<2+>が密接に関与していることが明らかとなった。