hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3次元構造を分解能サブμmで複製するマイクロ・メカニカル・リプロダクションの試み

本研究は、サブμmの分解能を有し、3次元構造を複製できる新しい微細転写技術、すなわち「マイクロ・メカニカル・リプロダクション」を試みる。この転写技術は主に次の3つのプロセスからなる:(1)従来のリソグラフィ技術や金型作成技術を応用した「微細な原盤の作成」、(2)従来の樹脂によるレプリカ転写技術を応用した「原盤からマスクへの複製」、(3)新しい加工原理を用いる「マスクから被加工物への複製」、である。具体的に、(a)近接場光リソグラフィ、(b)犠牲マスクエッチング、(c)射出成形と圧縮成形とを応用するレプリカ作成技術、を試みる。(a)近接場光リソグラフィは、(1)電子線リソグラフィと高速電子線エッチングによって、微細な凹凸を有する石英ガラス製の原盤を作成し、(2)この原盤にアセチルセルロースを載せて、その凹凸を有するマスクとしてレプリカをとり、(3)このマスクをプリズムに貼り付けて、マスクの凸部からもれでる近接場光によって被加工物上のレジスト(感光性樹脂)を露光させた。これを実際に試みた結果、露光光の波長の1/8にあたる幅0.05μmのラインを露光できたが、偏光および入射方向によってその露光条件が異なることがわかった。また、(b)犠牲マスクエッチングは、(1)微細平削り盤によって、三角波状の凹凸を有するニッケルメッキ膜付きアルミニウム製の原盤を作成し、(2)シリコンゴムをスピンナで塗布した被加工物を、この原盤に軽く押し付けて、シリコンゴム上に凹凸を転写させ、(3)このシリコンゴムを犠牲マスクとして高速原子線エッチングを施し、被加工物のガラス上に三角溝を有する回折格子を複製した。これを実際に試みた結果、ピッチ1μm、深さ1μmの三角溝が切削・転写できた。さらに(c)射出成形と圧縮成形とを応用するレプリカ作成技術では、(1)(b)と同様に回折格子の金型を作成し、(3)電動押出形射出成型機で射出成形だけでなく、金型に取り付けたピエゾ素子でキャビティ内を圧縮成形して、ピッチ1μm、深さ1μmの転写分解能を達成した。本研究では、サブμmの分解能を有し、3次元構造を複製できる新しい微細転写技術、すなわち「マイクロ・メカニカル・リプロダクション」を試みる。この転写技術では、微細化のためにリソグラフィ技術だけでなく、従来の切削・塑性加工・鋳造・印刷などのメカニカルな加工技術を融合して用いる。本技術は、次の3つのプロセスからなる。つまり、(1)従来のリソグラフィ技術や金型作成技術を応用した「微細な原盤の作成」、(2)従来の樹脂によるレプリカ転写技術を応用した「原盤からマスクへの複製」、(3)新しい加工原理を用いる「マスクから被加工物への複製」、である。具体的には、(a)近接場光リソグラフィ、(b)犠牲マスクエッチング、(c)再加圧式射出成形、を試みる。

平成10年度は、(a)ではレジスト膜厚と露光光偏光とを最適化して、幅50nm・ピッチl50nmのマスクから被加工物(シリコン)への複製を実現し、(b)では3角溝のピッチや傾斜角が徐々に変化する、微細な原盤を平面度30nm/lmm^2で作成し、さらに酸素の高速原子線エッチングで50nm以下の面粗さでマスクから被加工物(ガラス)へ複製できた。また、(c)では電動押出形射出成型機で再加圧するために、分解能サブμmを要求する原盤を、ピエゾ素子で可動できる金型を設計した(現在製作中)。本研究の目的は、サブμmの分解能を有し、3次元構造を複製できる新しい微細転写技術、すなわち「マイクロ・メカニカル・リプロダクション」を構築することである。この転写技術では、微細化のためにリソグラフィ技術だけでなく、従来の切削・塑性加工・鋳造・印刷などのメカニカルな加工技術を融合して用いる。本技術は、次の3つのプロセスからなる。つまり、(1)従来のリソグラフィ技術や金型作成技術を応用した「微細な原盤の作成」、(2)従来の樹脂によるレプリカ転写技術を応用した「原盤からマスクへの複製」、(3)新しい加工原理を用いる「マスクから被加工物への複製」、である。平成11年度は(2)(3)に注目した:(a)近接場光リソグラフィでは、実験だけでなく理論解析を用いて、近接場光で露光できる深さが偏光でも多少異なるが、概ね50nmであることを明らかにした。また、露光深さが50nmと浅い場合でも、さらに500nmと深く、露光像が転写される表面現像(ドライエッチング)技術を金属薄膜を積層したレプリカで検討した。(b)犠牲マスクエッチングでは、アクリル樹脂の犠牲マスク上にピッチ(約1.2μm)や傾斜角(約45度)が徐々に変化していく微細3角溝のパターンを転写し、さらにSF_6の高速原子線エッチングを照射して、同じパターンをガラス上に転写できることを実証した。(c)射出成形と圧縮成形とを応用するレプリカ作成技術では、電動押出形射出成型機を用いて、深140mm、ピッチ1μmの三角溝を転写し、サブμmの転写分解能が達成できることを実証した。本研究では、サブμmの分解能を有し、3次元構造を複製できる新しい微細転写技術、すなわち「マイクロ・メカニカル・リプロダクション」を試みる。具体的には、(a)近接場光リソグラフィ、(b)犠牲層マスクエッチング、(c)再加圧式射出成形、を試みる。平成12年度は、(a)ではTi層を用いた3層レジスト法を開発し、近接場光リソグラフィと高速原子線エッチングを組み合わせて、従来の1層のレジストでは露光深さ80nmであったものを230nmとすることができた。(b)では、従来はエッチング時の犠牲層マスクでのディンプル発生、波打ち現象が問題となっていたが、原盤を犠牲層マスクにプレスしている時にベークを行うことでこの現象を解消し、十分実用となるプロセスを確立した。(c)では、圧電素子による再加圧機構および熱流束の制御機構を備えたマイクロ金型を作成し、1ミクロンの微細構造を備えた部品も射出成形できることを確認した。
寄生蠕虫によるTh17型免疫疾患抑制機構の普遍性と特殊性の解析

近年、先進国ではアレルギー疾患あるいは自己免疫疾患の増加が報告されている。その原因を説明する有力な仮説が、衛生状態向上に伴う感染症の減少によってヒト本来の免疫システムの変調が起こり免疫疾患が増加したという説(衛生仮説)であり、これを支持する証拠も蓄積しつつある。多くの研究グループが様々な寄生虫の免疫・炎症性疾患に対する抑制効果について解析を行ってきたが、そこで解明された機構の普遍性についてはほとんどわかっていない。本研究では複数の寄生虫が同一の疾患モデルに抑制作用をもつ場合に、その抑制機構がどの程度共通しているのか、という点を遺伝子組換えマウスを用いた感染実験で明らかにしていく。
エゾタンポポにおける無融合生殖複合体の構造と形成過程

エゾタンポポの無融合生殖複合体の構造を明らかにする目的で、東北地方の21地点から150個体のエゾタンポポを採取した。また、複合体の一部と考えられたウスギタンポポを同じく東北地方の9地点から73個体採取した。9酵素13遺伝子座の酵素多型を用いてクローン分析を行い、プロイディアナライザー(フローサイトメーター)による倍数性レベルの測定をおこなった。エゾタンポポは大部分が3倍体で、1地点のみ3倍体と4倍体を含む混合集団であった。一方ウスギタンポポは、9地点中、8地点が5倍体であり、1地点のみ4倍体であった。プロイディアナライザーによる解析の結果、エゾタンポポの3倍体および4倍体は、2倍体種カントウタンポポの値から計算される1ゲノムサイズの3倍あるいは4倍となり、エゾタンポポがカントウタンポポと同一のゲノムのみを持つ倍数体であることを示した。しかしウスギタンポポは4倍体、5倍体の期待値より大きなピークインデックスを示し、ウスギタンポポが日本産2倍体種以外のゲノムを含むことが明らかになった。酵素多型分析により、エゾタンポポの3倍体は7クローン、4倍体は2クローン、ウスギタンポポの4倍体は1クローン、5倍体は3クローンから構成されていた。エゾタンポポとウスギタンポポのアイソザイム遺伝子を比較することにより、ウスギタンポポのすべてのクローンが共有し、ウスギタンポポにのみ存在する対立遺伝子が6個存在することが判明した。Skdh-a,mdh-d,sod-l-a,pgm-2-a,acn-2-c,dである。逆に、エゾタンポポにのみ存在し、しかもエゾタンポポが共有する対立遺伝子はなかった。ウスギタンポポに固有の6個の対立遺伝子のうち3個(skdh-a,mdh-d,sod-l-a)は台湾の2倍体種タカサゴタンポポに固有の対立遺伝子であることが判明しているので、ウスギタンポポはタカサゴタンポポ由来のゲノムを持つことが示唆された。エゾタンポポを中心とした倍数体タンポポの収集を、北海道九州にかけて行い、エゾタンポポ250個体に加え、5倍体1種、4倍体6種、3倍体3種を採取し、新潟大学の圃場において栽培した。この材料を用い、ポリアクリルアミド及びスターチゲル電気泳動法により、9酵素14遺伝子座について解析した。染色体の計数とアイソザイム分析の結果、以下の点が明らかになった。?エゾタンポポには、約56%の3倍体、約42%の4倍体とわずかな5倍体が含まれ、30以上のマルチローカスクローンを含んでいる。エゾタンポポのクローン間、他の倍数体種との関係を分析中である。(2)シロバナタンポポとみなして採集した九州の材料中に5倍体と4倍体の2つのクローンが存在することが判明した。4倍体クローンは外部形態的にもシロバナタンポポ(5倍体)と区別でき、新種ツクシシロタンポポとした。(3)ツクシシロタンポポを含む

4倍体種のうち、シロバナタンポポの倍数体親の条件として3条件(A.シロバナタンポポに存在して日本産2倍体にはない対立遺伝子mdh-d、sod-1-aをもつ、B.シロバナタンポポにない対立遺伝子は持たない、C.2倍体の対立遺伝子を加えればシロバナタンポポのもつ全ての対立遺伝子が満足される)を設定して分析した結果、ツクシシロタンポポがシロバナタンポポの倍数体親であることが明らかになった。また、葉緑体DNA(trnT-Fのスペーサー領域)のPCR-RFLP分析を行った結果、Msp.Taq等の5制限酵素で断片長多型が見つかり、東アジア産のタンポポは、葉緑体DNAの異なる2つのグループに分けられることが判明した。2倍体レベルでは(1)カンサイタンポポ、カントウタンポポ、シナノタンポポ等のすべての低地性日本産2倍体を含むグループと、(2)台湾のタカサゴタンポポと済州島のイワタンポポを含むグループである。倍数体では、エゾタンポポはクシバタンポポ等とともに(1)のグループに属し、シロバナタンポポ、ツクシシロタンポポ等の倍数体は、(2)に属す。エゾタンポポの1クローンと予想したナンブシロタンポポは(2)に属すので、この知見を用いてエゾタンポポ複合体の範囲を正確に特定する作業を進めている。エゾタンポポを中心とした倍数体タンポポを、9酵素14遺伝子座について電気泳動法により解析した。染色体の計数とアイソザイム分析の結果、以下の点が明らかになった。(1)エゾタンポポは、3・4・5倍体を含む50以上のマルチローカスクローンからなる。(2)これらのうち、4倍体のクローンの一部は西日本から記載された2種と同一である。(3)約40クローンからなる本州のエゾタンポポと約10クローンからなる北海道のエゾタンポポはこれまでのところクローンが異なり、両者はかなり初期に分化したものと推測される。また、葉緑体DNA(trnT-Fのスペーサー領域)のシークエンスを行った結果、東アジア産のタンポポは、葉緑体DNAの異なる2つのグループに分けられることが判明した。2倍体レベルでは(1)カンサイタンポポ等のすべての低地性日本産2倍体を含むグループと、(2)台湾のタカサゴタンポポを含むグループである。前者は828塩基、後者は863塩基とサイズが異なるだけでなく、多くの塩基配列の相違が認められた。倍数体では、エゾタンポポは(1)のグループに属し、シロバナタンポポは(2)に属す。この知見を用いてエゾタンポポ複合体の範囲を正確に特定する作業を進めた結果、エゾタンポポの1クローンと予想したナンブシロタンポポは(2)に属し、クシバタンポポ、ケンサキタンポポ、ヤマザトタンポポ、クザカイタンポポ、シコタンタンポポはエゾタンポポと同じ(1)のグループに属すことが判明した。北海道のエゾタンポポについてのデータが不十分なので、研究期間の最終年度では、再度北海道における材料の収集に努め、エゾタンポポを中心とした日本産倍数体タンポポの構造と分化の過程についてまとめる予定である。エゾタンポポの無融合生殖複合体の構造を明らかにする目的で、東北地方の21地点から150個体のエゾタンポポを採取した。また、複合体の一部と考えられたウスギタンポポを同じく東北地方の9地点から73個体採取した。9酵素13遺伝子座の酵素多型を用いてクローン分析を行い、プロイディアナライザー(フローサイトメーター)による倍数性レベルの測定をおこなった。エゾタンポポは大部分が3倍体で、1地点のみ3倍体と4倍体を含む混合集団であった。一方ウスギタンポポは、9地点中、8地点が5倍体であり、1地点のみ4倍体であった。プロイディアナライザーによる解析の結果、エゾタンポポの3倍体および4倍体は、2倍体種カントウタンポポの値から計算される
ショウジョウバエlola遺伝子産物の構造的・機能的多様性

ショウジョウバエlola遺伝子は胚期における中枢および末梢神経系の形成、とくに神経軸索の正確な投射に必須な遺伝子である。本研究計画ではlola遺伝子の発現制御解析および機能解析に焦点を絞った。まず、cDNA解析によりlola遺伝子のエキソン・イントロン構造をあきらかにした。その結果、lola遺伝子は32個のエキソンから構成される巨大かつ複雑な遺伝子で、選択的スプライシングにより80種以上のmRNAアイソフォームを生じることがわかった。定常領域はタンパク間相互作用に働くBTBドメインをコードしておりく可変領域はDNA結合に関わるZnフィンガーモチーフをコードする。すなわち、20種以上のBTB/Znフィンガー型転写因子アイソフォームを産生する。RNA in situハイブリダイゼーションおよび定量的PCR解析の結果、lolaの発現がアイソフォームレベルで時空的に厳密に制御されていることがあきらかになった。また、アイソフォーム単位での機能解析の結果、夫々のアイソソフォームが機能的にも夫々に特化していることが考えられた。lola遺伝子が適切に機能するためには、選択的スプライシングの制御が適切でなければならない。選択的スプライシングの制御システムを詳細に解析したところ、lolaでは二通りのスプライシングシステム、すなわち選択的シススプライシングと選択的トランススプライシングが採用されていることがわかった。この発見は、エキソンが同方向に配向する一般的な遺伝子座においては初めてのことである。また、定常領域と可変領域は同一遺伝子座内に存在するにもかかわらず独立の転写単位として発現しているとうこともあきらかにした。ショウジョウバエlola遺伝子は、胚における神経系形成に必須な遺伝子であります。私は、この遺伝子の構造解析を目的とするプロジェクトの一端を担当しました。その結果、lola遺伝子は60kbを超える巨大な遺伝子で、選択的スプライシングによって80種以上のスプライシング・バリアント、20種以上のプロテイン・アイソフォームを生ずることが明らかにされました(Ohsako et al., submitted the revised form)。さらに私は、lolaにおける複雑な選択的スプライシング機構の解明に焦点をおいて研究を進めました。選択的スプライシングを説明するモデルとして、cis-splicingモデルおよびtrans-splicingモデルが挙げられます。前者は、pre-mRNAが転写され、そのpre-mRNA分子内でスプライシングが起こるとする古典的なモデルであります。一方後者は、スプライシングが、独立に転写された二つ以上のpre-mRNA分子間で起こるとする、ほとんど前例のないモデルであります。このmRNA trans-splicingという現象に関して数例の報告がありますが、いずれにおいても定量的な解析がなされておりません。そこで私は、mRNA trans-splicing頻度を定量的に処理することを目的として、Drosophila melanogasterの系統間一塩基多型を利用した実験を行いました。その結果、lola転写産物の多様性が、mRNA trans-splicingにより生み出されていることを強く示唆する結果を得ました。この結果は、様々な加変異系統を用いたinterallelic相補テストによっても強くサポートされました。また、lola遺伝子座の各エクソン・ユニットが独立の転写単位から構成されている可能性を強く示唆する結果を得ました。ショウジョウバエlola遺伝子は、神経軸索の誘導・維持に関わる遺伝子であります。構造解析の結果、lola遺伝子は定常エキソンおよび転写開始点を含む4個の可変エキソン、3'端の20個の可変エキソンユニットから構成され、選択的スプライシングによって80種以上のスプライシング・アイソフォーム、20種以上のタンパク・アイソフォームを生ずることが明らかされています(Ohsako et al.,2003Gene 311:59)。最近米国の研究室によって、lolaの各アイソフォームが組織特異的に複雑な発現パターンを示すことが報告されました。そこで私は、lolaにおける選択的スプライシング機構の解明に焦点をおいて研究を進め、結果としてlolaアイソフォームの発現が選択的トランス・スプライシングによって制御されているということを見出しました(Horiuchi et al.,2003 Genes & Dev.17:2496)。この発見は、同方向にエキソンが配向する遺伝子座においては初めてのこととなります。具体的には、系統間-塩基多型を利用した定量的な解析によって相同染色体間トランス・スプライシングが非常に高頻度に起きていること、エキソン特異的変異体間での相補テストによってトランス・スプライシングが機能的に意義をもつことを示しました。さらに定常エキソン領域と一部の可変エキソン領域が独立の転写ユニットであることを示唆する結果を得たことから、lolaアイソフォームの発現は転写とスプライシングの二段階で厳密かつ簡便に制御されているというモデルを提唱しました。

RNA in situハイブリダイゼーションおよび定量的PCR解析の結果、lolaの発現がアイソフォームレベルで時空的に厳密に制御されていることがあきらかになった。また、アイソフォーム単位での機能解析の結果、夫々のアイソソフォームが機能的にも夫々に特化していることが考えられた。lola遺伝子が適切に機能するためには、選択的スプライシングの制御が適切でなければならない。選択的スプライシングの制御システムを詳細に解析したところ、lolaでは二通りのスプライシングシステム、すなわち選択的シススプライシングと選択的トランススプライシングが採用されていることがわかった。この発見は、エキソンが同方向に配向する一般的な遺伝子座においては初めてのことである。また、定常領域と可変領域は同一遺伝子座内に存在するにもかかわらず独立の転写単位として発現しているとうこともあきらかにした。
熟慮的判断のための神経基盤の研究

思考の基礎過程を調べるために、独自開発の推論課題(Pan et al., 2008)を使い、サルの脳の推論機能について調べた。その結果、1単一ニューロン活動記録から、前頭前野外側部のニューロンは推移的推論機能を反映した活動を見せたが、大脳基底核線条体にはそのような活動が見られなかった(Pan et al., 2014)。2前頭前野外側部の推移的推論機能は、カテゴリカルな処理と密接な関係があることが示された(Pan & Sakagami, 2012)。さらに3多電極同時記録による局所場電位解析から、前頭前野外側部から線条体への情報伝達が、正しい課題遂行に重要な役割を果たしていることが示唆された。意思決定には、モデルフリー型意思決定と前頭前野機能に依存するモデルベース型がある。後者は、熟慮的判断の基礎と考えられており、推論可能性、顕在性、目標志向性を特徴とする。この課題は、サルを使った神経生理学実験とヒトを被験者とするfMRI実験により、熟慮的判断の神経メカニズムを明らかにしようとするものである。以下、平成23年度に行った研究の成果を記す。1.推論課題遂行中のサルの前頭前野から単一ニューロン活動の記録を行った。前頭前野のニューロンは、刺激と関連する報酬の情報をコードするのに、カテゴリー的な処理を行っていることを明らかにした。また、前頭前野、特にその外側部のニューロンのこのような特徴が、3段論法的推論を可能にしていることも明らかにした。その成果は北米神経科学学会大会と日本神経科学学会大会で発表した。2.fMRI法を使って、報酬の予測に関連する脳活動を調べた。その結果、正の報酬の予測に関しては内側前頭前野が、負の報酬予測に関しては外側の前頭前野が関与していることが分かった。また、この時の脳活動は、刺激と連合した客観的な価値ではなく、その時々の被験者の主観と相関していた。その成果は、日本心理学会大会で発表した。3.サルに、コストベネフィット課題を学習させ、その行動分析を行った。サルは、大きなコストを払って獲得した報酬の方を、小さなコストで得られた報酬よりも過大評価するという傾向が見られた。今後、この課題遂行中のサルの脳活動を調べる予定である。平成25年度は、コスト-ベネフィット課題遂行中のサルの中脳からドーパミンニューロンの単一ニューロン活動を記録し、解析を行った。この課題では、同じ量の報酬(ジュース)を得るのに、1秒間の固視点の注視が必要な条件(コスト条件)と1秒間自由に眼球を動かしてよい条件(コントロール条件)がある。これまでの実験心理学的研究から、ヒトを含む動物は、コストの後の報酬を好む傾向があることがわかっている。この実験では、ドーパミンニューロンが、1コスト情報をコードするか、2同じ量の報酬でもコストの後の報酬により強く応答するか、について調べた。その結果、ドーパミンニューロンは、1コストを予告する刺激に対して応答を減衰させることによって、コストの情報をコードしていることが分かった。さらに、2コストの後の報酬予告刺激に対して、コストがない場合に提示される報酬予告刺激に対してよりも、強い応答を示すことが分かった。ドーパミンの報酬に対する応答は、大脳基底核などに伝えられ、報酬予測情報の形成に使われると考えられている。今回の実験では、ドーパミンニューロンが報酬予測に関わる情報(報酬予測誤差)を出力するときに、コストの情報を統合することにより、報酬予測はコストがない場合より小さくなり、実際に報酬を与えられたとき、その量が同じでも、ドーパミンニューロンがコードする報酬予測誤差は、コストの後のほうが大きくなることを示唆する結果である、と解釈された。このことは、たとえば、認知的不協和などの高度な認知機能も、ドーパミンニューロンの比較的単純な報酬予測誤差計算機能で説明しうることを示唆している。ヒトを始めとする霊長類の判断(あるいは意思決定)は、複数の神経回路によって実現されていることが明らかになってきた。皮質下の脳機能によるモデルフリー型意思決定と前頭前野機能に依存するモデルベース型意思決定である。後者は、ヒトの熟慮的判断に対応するものと考えられており、1推論可能性、2顕在性、3目標志向性を特徴とする。本プロジェクトは、サルを使った神経生理学実験とヒトを被験者とするfMRI実験により、ヒトの熟慮的判断の神経メカニズムを明らかにすることを目的とする。熟慮的判断(モデルベース型意思決定)が、前頭前野内のどのような神経回路の働きによって作り出されているかを理解するために、平成24度は、主にニホンザルを使った3つの神経生理学実験を行った。1推論課題(推論可能性の神経メカニズム):

前頭前野外側部のニューロンは、推移的推論を行うことができるが、この機能は情報の抽象化(カテゴリー機能)によって可能になっていることが示唆された。2自由/強制選択課題(意図性とそれにかかわる顕在性の神経メカニズム):局所場電位(LFP)データを使った、得ようとする報酬情報のデコーディングを行った。自由選択に関わるニューロン群と強制選択に関わるニューロン群は前頭前野内で異なっていることを示唆する結果が得られた。3コスト-ベネフィット(CB)課題(価値情報の統合にかかわる神経メカニズム):サル中脳ドーパミンニューロンから課題遂行中のニューロン活動を記録した。ドーパミンニューロンは、報酬の情報とコストの情報を統合してコードしていることがわかった。サルの単一ニューロン活動の記録実験(推論課題)とfMRIを使った報酬予測実験(正の報酬)については、十分なデータが集まったため、平成24年度中に国際誌に成果を発表できる予定である。コストベネフィット課題については、最適な実験パラメータを見出すのに時間がかかり、サルの訓練が予定より少し遅れてしまった。25年度が最終年度であるため、記入しない。ヒトを始めとする霊長類では、前頭前野機能に依存するモデルベース型意思決定に特徴がある。これがヒトの熟慮的判断を可能にするものと考えられており、1推論可能性、2顕在性、3目標志向性を特徴とする。1に関しては、前頭前野のニューロンが推移的推論機能を有しており、これは、情報の抽象化機能に依存していることを実験的に示すことができた。また自由/強制選択課題を使った実験から、外側前頭前野には自由選択課題でだけ、その目標情報を表現するニューロン群があり、作業記憶的情報保持とは異なる目標指向性の計算メカニズムがあることを示すことができた。サルを使った神経生理実験は、順調に進んでいる。これを補完する実験として、前頭前野全体のネットワーク機能をヒトで調べるfMRI研究を今後は行っていく。推論課題(サル)については、当初の予定通りに実験と解析を進めて行く予定である。コストベネフィット課題(サル)については、行動実験での結果をより明確にするために、課題の変更などが若干必要になるかもしれない。fMRIを使ったヒトの実験では、正の報酬を使った実験に加え、負の報酬を使った実験を被験者の数を増やして行う予定である。この成果をもとに、前頭前野ネットワークが持つモデルベース機能のモデルの実態を明らかにする課題の開発を行いたい。サルを使った神経生理実験により、前頭前野には、熟慮的判断の基礎を担う推論可能性、目標志向性に関係するニューロン活動があることが分かった。最終年度では、動物実験の成果を国際誌に発表すると同時に、これらの機能がどのように、より広い範囲の前頭部(前頭前野外側部、眼窩部、内側部)ネットワークの中で統合されているかをfMRI実験により調べる。また、これらの脳活動が、実際の行動や言語報告とどのような関係があるかについて検討することにより、熟慮的判断のもう一つの特徴である顕在性についても明らかにする。
Cre-Loxpシステムを用いたマイクログリアの細胞系譜解析と脳腫瘍研究への応用

本研究は中胚葉由来のマイクログリアや骨髄細胞の多分可能の解明や脳腫瘍や脳梗塞といった脳疾患への関与をCre-loxPシステムを利用したトランスジェニック(TG)マウスを用いて個体レベルで明らにすることを目指した。1:神経系前駆細胞集団への文化能を有するマクロファージ系細胞の個体レベルにおける探索まず個体レベルでマイクログリア(または同じ細胞系譜である血球系細胞)が多分化能力を持つか検討した。全身性にGFP(緑色蛍光蛋白質)を発現ずるTgラットの骨髄を放射線照射した正常ラットに移植し、骨髄細胞定着後(2ヶ月後)に中大脳動脈閉塞を行った。その結果、GFP陽性細胞は基底膜・細胞外基質を分解する酵素ヘパラナーゼにより虚血中心部に集属するとともに、アストロサイトマーカー(グリア線維由来酸性タンパク質)を発現するGFP陽性細胞が認められた。また他の細胞も大部分がオリゴデンドロサイト前駆細胞マーカー(NG2)を共発現していた。さらには外科的に摘出したヒト・グリオーマ組織を各種幹細胞マーカーで染色すると、骨髄細胞マーカーが新生血管特異的に認められた。以上の結果から脳疾患病態にマイクログリアや骨髄細胞が深く関与し、マイクログリア系細胞が多分可能を有する可能性を示唆するものである。2:マイクログリア系細胞特異的にCre酵素を発現するlba1-Creマウスの作製構築したlba1-Creベクター(マイクログリア系細胞特異的遺伝子lba1プロモーター直下にCre遺伝子)をマウス受精卵に顕微注入し、3系統のTGマウスを得た。しかしマイクログリア特異的にCre酵素を発現する系統は得らえず、引き続きTGマウスの作製を行っている。lba1-Cre-TGマウスを樹立後、Cre酵素が働いた細胞はGFPの緑色蛍光を発するマウスCAG-CAT-GFPとの交配こよりマイクログリアの細胞系譜などを検討する。本研究は中胚葉由来のマイクログリアが神経外胚葉系細胞へ分化可能である我々の発見に基づき、その詳細な分化メカニズムをCre-loxPシステムを利用したトランスジェニックマウスを用い、個体レベルで明らかにすることを目指したものである。本年度は以下の2項目について検討した。1:神経系前駆細胞集団への分化能を有するマクロファージ系細胞の個体レベルにおける探索個体レベルでマイクログリア(あるいは同じ細胞系譜である血球系細胞)が神経外胚葉系細胞への分化能力を持ちうるか、ラット中大脳動脈一次閉塞モデルを作成し、マイクログリア系細胞の挙動を調べた。虚血中心部のマイクログリアそのものは予想外にもアポトーシスにより死に至ったが、興味深いことに末梢より血球系細胞が多数浸潤し、それらの細胞がオリゴデンドロサイト前駆細胞で発現が認められるマーカー分子(NG2)とマイクログリアマーカー(Iba1)の両方を発現していることを見いだした。この細胞浸潤には基底膜・細胞外基質を分解する酵素のヘパラナーゼが重要な役割を果たしていた。この細胞群を単離し培養したところ神経細胞等への分化が認められ、我々が以前マイクログリアを用いて報告した結果を強く裏付ける発見であった。2:マイクログリア・マクロファージ特異的にCre酵素を発現するlba1-Creマウスの作製Cre酵素をマイクログリア・マクロファージ特異的に発現させるためマイクログリア・マクロファージ特異的に発現する遺伝子Iba1のプロモーター直下にCre遺伝子をつないだIba1-Creベクターを構築した。このプラスミドをCOS7細胞とマクロファージ系細胞株THP-1細胞に発現させ、THP-1細胞特異的にCre酵素が発現することを確認した。現在C57BL/6とBDF1の受精卵(一細胞期)にIba1-Creベクターを顕微注入し、ファウンダーマウスを作成中である。Iba1-Creトランスジェニックマウスを樹立したのち、Cre酵素が働いた細胞はGFPの緑色蛍光を発するレポーターマウスCAG-CAT-GFPマウス(大阪大学医学部・宮崎教授より供与)との交配によりマイクログリアの細胞系譜を検討する。しかしマイクログリア

特異的にCre酵素を発現する系統は得らえず、引き続きTGマウスの作製を行っている。lba1-Cre-TGマウスを樹立後、Cre酵素が働いた細胞はGFPの緑色蛍光を発するマウスCAG-CAT-GFPとの交配こよりマイクログリアの細胞系譜などを検討する。
東南アジア史のメタナラティブをめぐる総合的研究―国民国家の物語・ジェンダー・近代

当該研究期間を通じた作業と成果は次の通り。(1)現地語の史資料収集と整理:3年間にわたり活発に海外調査を実施した結果、それぞれのテーマに応じて、相当の現地語史料が蓄積された。(2)他分野の専門家との研究交流:年に3回程度のペースで他地域/他分野の気鋭の専門家を招いた研究会(勉強会+中間報告会)を実施した。その範囲は、中央ユーラシア、フランス、日本、中国、インドなど幅広く、ディシプリンも美術史、文学、文化入類学など多岐にわたった。それぞれの領域における最新の研究成果と課題を伺い、討論を通して、歴史研究におけるメタナラティブという問題に関する理解を深めた。(3)各メンバー(含研究協力者)は上記の史料収集と討論を踏まえ、以下の論考を成果として示した。「タートの『解放』をめぐって-シャム近代史の一メタナラティブ」(小泉順子)、「緬方医学史をめぐるメタナラティブ研究」(土佐桂子)、「マレー人田舎教師の再生産-戦前期英領マラヤにおける師範学校教育とアイデンティティ形成」(左右田直規)、「無辜の民-イギリス将校が作ったカレン-」(伊東利勝)、「イサーン(東北タイ)」史の生成」(飯島明子)「カルティニ像の変遷-神話誕生の背景」(小林寧子)、「ビルマ語散文仏教テクスト"Yasavaddhana Vattu"(『称誉増大物語』1619)再考-「文学」作品というナラティブが形成されるまで」(原田正美)、「ベトナムフェミニズムの確立-ベトナム戦争とジェンダーに関する一考察」(片山須美子)、「19世紀ジャワのイスラームの一様態-19世紀の歴史叙述と比較しながら-」(菅原由美)。初年度たる本年度は、現地語史料の収集とメンバー間の共通理解構築の年と位置づけ、以下の活動を実施した。まず現地語史料収集では、小泉順子が2001年8月にタイを訪れ、国立公文書館、国立古文書部および主要大学図書館にて、19世紀末から20世紀初頭の経済思想に関わる史料調査を実施した。また土佐桂子は2001年9月、ビルマのカレン州で、ウェイザー信仰と歴史認識に関する聞き取り調査を実施し、飯島明子は2002年2月にラオスで年代記貝葉文書史料調査を、同じく2002年2-3月に伊東利勝もビルマで貝葉文書の形で残されるビルマ年代記を調査した。さらに青山亨は古典ジャワ文学を相対化するために、2002年3月カンボジアで海外調査を実施した。この他、研究協力者・原田正美も2001年8月および2002年2月の2回にわたりビルマを訪れ、精力的に貝葉文書仏教文学史料を収集した。なおマイクロフィルムの形で収集した史料は、順次購入したリーダープリンターを使ってプリントアウトをして整理する作業を進めつつある。またメタナラティブをめぐる共通理解を深め、統一のとれたアウトプットをつくるべく、国内研究会も2001年10月、2002年2月、3月と3回にわたり実施した。それぞれの研究会では、「ジェンダー」、「民族」という切り口からそれぞれ史料を分析する実験的な試みを通じて相互理解をはかりつつ、他地域の最先端の研究者を招いて勉強会も開催した。2001年10月の研究会では、日本、韓国、フランスを研究する3人の美術史学者から、ジェンダー、美術、コロニアリズムをめぐるテーマで報告をいただいた。また2002年2月の研究会では、インドのジェンダー研究をめぐる歴史学、社会学、人類学における最新成果を、3月には、東南アジア政治学研究のメタナラティブについて、外部の専門家を招いてご報告いただいた。今年度は昨年度の作業を発展的に継承し、以下の2つの作業を進めた。

(1)専門領域、テーマに応じ、史料収集、整理を進め、研究課題を絞り込む。(2)歴史のメタナラティブに関する理論的研究と共通理解を深める。まず史料収集として以下の海外調査を実施した。小泉順子は2002年9月と2003年2月に、タイ近代史におけるジェンダーと経済をめぐるメタナラティブに関する調査を実施。小林寧子氏も、2002年8月から9月にかけてインドネシアにおけるイスラームフェミニズム運動に関する調査を実施した。また土佐桂子氏は2003年2月に、ミャンマーにて宗教と医術をめぐる文献調査を、飯島明子氏も同年2月チェンマイ年代記写本文献収集・調査を実施した。また研究協力者、片山須美子氏と原田正美氏も、それぞれ2002年8月から9月にかけて、ベトナム労働党婦女連合資料調査、ビルマ語仏教文献に関する調査を実施した。各自収集した史料の分析を進め、マイクロフィルム史料は順次プリントアウトして整理している。一方理論的理解を深めるため、他地域の気鋭の専門家をお招きした研究会(勉強会+中間報告会)も以下の通り実施した。2002年7月には、ハルオ・シラネ、鈴木登美両氏(コロンビア大学)から「日本における古典カノン形成とカリキュラムの歴史的変遷」「<日本近代文学史>構築におけるジャンルとジェンダーの関係」と題するお話をうかがい、10月には楊海英氏(静岡大学)から「西夏の歴史を回族が受継ぐモンゴルと回族の関係における<歴史>の投影について」お話いただいた。さらに11月にはアルンラット・ウィチェンケーォ氏(京大東南アジア研究センター)から「北部タイの貝葉文書とタイ史研究について」というテーマでご報告いただき、2003年1月には、吉澤誠一郎氏(東京大学大学院)より「中国ナショナリズムの論じ方」というタイトルでお話をいただいた。最終年度にあたり、次の作業を実施した。(1)現地語の史資料収集と整理の継続(2)成果のまとめに向けた個別研究の深化と共通理解の形成現地語資史料収集作業のため活発に海外調査を実施した。小泉順子は2003年9月と翌3月20世紀初頭の債務奴隷や労働契約に関するタイ語公文書史料を収集。飯島明子氏、小林寧子氏は年8月から9月にかけて、各々タイ・ラオス、インドネシアにおいて資料調査を実施した。さらに研究協力者片山須美子氏も、2003年夏と2004年2月の2度にわたりベトナムで労働党および婦女連合関係の資料を読み、原田正美氏も2003年12月末にビルマで仏教文学関係の史料収集を実施した。一方、理論的な理解を深め、共通理解を形成するために、他地域の気鋭の専門家を招いた研究会(勉強会+中間報告会)も、昨年度に引き続き実施した。7月には小松久男氏(東京大学大学院人文社会系研究科教授)より「中央ユーラシア研究の現状と課題」題した報告を伺い、また10月には長谷川まゆ帆氏(東京大学大学院総合文化研究科)に「フランスにおける女性史研究の現在20世紀初頭のタイピストの誕生とそのジェンダー化をめぐって」お話いただいた。さらに最終的な報告に向け、研究分担者・協力者からも、「ヒンドゥー・ジャワ期におけるテクストの「期待の地平線」」(青山亨)「カレンの発見」(伊東利勝)「ビルマ前近代における現地語散文仏教文献について-Yasavaddhana Vatthu(称誉増大物語)の事例から-」(原田正美)について報告した。「19世紀ジャワ史とイスラム-宗教テキスト分析を通して-」(菅原由美)
四面体型歪みを導入した遷移金属錯体による分子状酸素活性化

生体内における酸素の運用は、酸素運搬や物質代謝だけでなく、光合成と呼吸鎖における水の酸化還元反応も含まれる。その機能の中心的な役割を担う金属周りの構造に注目すると、これらの中心金属周りの構造は、しばしば四面体型のような歪んだ構造である。このように蛋白質内では通常の低分子金属錯体と異なり、ペプチド骨格や水素結合によって強制的に安定化された特殊な配位構造が中心金属周りに施されている。本研究では、生体内の金属活性中心が行う酸素分子の活性化の人工的な再現を、第1配位圏における構造規制の制御によって行うことを目的とした。ここで簡単なネットワーク構造を骨格に有する配位子(-)-Sparteine(Sp)を用いて、金属酵素活性中心に見られるような捻じれた配位空間を構築することにした。Spの構造異性体のひとつであるα-Spを用いた銅(I)アセトニトリル錯体[Cu^I(α-Sp)(CH_3CN)]SbF_6(1)は、-80°Cのジクロロメタン中で酸素と混合すると速やかに反応し、対応する銅(III)ビス-μ-オキソ種を生成した。次に、銅(I)錯体1は、安息香酸イオン(Bz)の様な架橋型配位子を共存させて、-80°Cのアセトン中で酸素と混合すると、μ-パーオキソ種である[Cu^<II>_2(α-Sp)(μ-η^2:η^2-O_2)(Bz)]^+(2)を生成することが分かった。このカルボン酸による架橋構造を有するμ-パーオキソ種はさらに高原子価であるビス-μ-オキソ種の前駆体であり、そのカルボン酸の脱離により酸素分子の活性化は段階的に進むという概念が得られた。以上の成果は、二核非ヘム鉄オキシゲナーゼの反応機構に非常に関連が深いので、さらに発展して[Fe^<II>(Sp)(Bz)_2](3)についてもshunt pathを使った検討を行い、第一段階の初歩的な結果も得られた。四面体型歪みを導入するジアミン型配位子としては(-)-Sparteine(Sp)とその構造異性体を用いた。Spはジアミン間をメチレン鎖で何重にも架橋した構造で、金属が配位する事によってアダマンタン型構造を形成し、固定されたロンペアの配向によって中心金属にTetrahedral構造を強制する事が可能な配位子である。Spとその構造異性体を用いて合成したbis(μ-O)型銅(III)錯体は銅中心が四面体型に捻れを制御することが可能で、これまでに報告された平面四角形型構造ものと比較して分光学的性質が系統的に大きく変化した。またSpのbis(μ-O)型銅(III)錯体の生成速度は他の銅-酸素錯体の生成速度に比べて異常に速く、組織化した配位子骨格によって金属錯体の構造変化を規制し、反応の活性化エネルギーを制御することに成功した。さらにSpの構造異性体を用いて合成した銅-酸素錯体は架橋配位子の影響を受けてμ-η^2:η^2型peroxo二核銅(II)錯体でを形成し、架橋配位子の脱離によってbis(μ-O)型銅(III)錯体の生成することが分かった。このことはある種のバクテリアに含まれるメタンモノオキシゲナーゼ(MMO)の高原子価金属-酸素活性中間体であるCompoundQ(Fe^<IV>_2(μ-O)_2)生成の本質と大きく関わっており、そのような反応活性中間体の制御につながる興味深い結果である。このように平面四配位型構造を有するbis(μ-O)型銅(III)錯体に四面体型の歪みを導入することにより、その性質に劇的な変化が起こることから、これを他の遷移金属系に応用することは非常に興味深い。他の遷移金属イオンのSpとその構造異性体を用いた金属錯体の合成にかなり進んでおり、第一遷移金属の中では鉄、コバルト、ニッケル、亜鉛の錯体の合成に成功し、その単結晶X線構造解析と各種分光学的性質、電気化学的性質ならびに磁気的性質の測定を行った。今後はこららの遷移金属の系においてM_2(μ-O)_2型構造に四面体型の歪みを導入しその効果を検証する。このような擬四面体型構造は非ヘム鉄酸化酵素ではしばしば見られ、電子移動を担うブルー銅蛋白質でよく知られた構造であるが、合成した低分子錯体では非常に珍しい構造である。Spとその構造異性体を用いた銅(I)アセトニトリル錯体[Cu^I(X)(CH_3CN)_n]

SbF_6(X=α-Sp(1),Sp(2),β-Sp(3),n=1 or 2)は、-80°Cのジクロロメタン中で酸素と混合すると速やかに反応し、対応する銅(III)ビス-μ-オキソ種を生成した(λ_<max>=321343,430433nm, v^<16>O_2(v^<18>O_2)=623636(600603)cm^<-1>)。これまで銅(II)クロライド錯体[Cu^<II>(X)(Cl)_2](X=α-Sp(4),Sp(5),β-Sp(6))の単結晶X線構造解析の結果から、窒素配位平面と塩化物イオン配位平面の成す二面角はそれぞれ59゚(4),6473゚(5),87゚(6)となっており、この順で平面四角形構造からの捻じれが大きくなり四面体型に近づくことが分かっている。生成したビス-μ-オキソ種[Cu^<III>_2(X)(μ-O)_2]^<2+>では、β-Spを用いた場合に最もLMCTが低エネルギーシフトし、Cu^<III>_2(μ-O)_2由来のラマンシフトが最も高エネルギーに観測された。これらの結果は、Spとその構造異性体による"歪み"が、その銅中心に効果を及ぼしていると考えられる。またそのような捻じれた四面体型歪みを有する銅中心が、1)その比較的高い酸化還元電位を持つ、ならびに2)予想される一般的なd軌道による安定化エネルギーが小さい、ということなどに反して、高原子価のオキソ金属錯体の生成に適していることを示している。一方、α-Spを用いた銅(I)アセトニトリル錯体[Cu^I(α-Sp)(CH_3CN)]SbF_6は、安息香酸イオン(Bz)の様な外因性の架橋型配位子を共存させて、-80°Cのアセトン中で酸素と混合すると、μ-パーオキソ種である[Cu^<II>_2(α-Sp)(μ-η^2:η^2-O_2)(Bz)]^+を生成することが分かった(λ_<max>=372,746nm, v^<16>O_2(v^<18>O_2)=752(714)cm^<-1>)。これに強酸を添加したところ、対応するビス-μ-オキソ種である[Cu^<III>_2(α-Sp)(μ-O)_2]^<2+>を生成した。これにより、カルボン酸による架橋構造を有するμ-パーオキソ種はさらに高原子価であるビス-μ-オキソ種の前駆体であり、そのカルボン酸の脱離により酸素分子の活性化は段階的に進むと考えられる。このことはribonucleotide reductaseやメタンモノオキシゲナーゼなどの四面体型歪みを有する活性中心にも当てはまると考えられる。生体内における酸素の運用は、酸素運搬や物質代謝だけでなく、光合成と呼吸鎖における水の酸化還元反応も含まれる。その機能の中心的な役割を担う金属周りの構造に注目すると、これらの中心金属周りの構造は、しばしば四面体型のような歪んだ構造である。このように蛋白質内では通常の低分子金属錯体と異なり、ペプチド骨格や水素結合によって強制的に安定化された特殊な配位構造が中心金属周りに施されている。本研究では、生体内の金属活性中心が行う酸素分子の活性化の人工的な再現を、第1配位圏における構造規制の制御によって行うことを目的とした。ここで簡単なネットワーク構造を骨格に有する配位子(-)-Sparteine(Sp)を用いて、金属酵素活性中心に見られるような捻じれた配位空間を構築することにした。Spの構造異性体のひとつであるα-Spを用いた銅(I)アセトニトリル錯体[Cu^I(α-Sp)(CH_3CN)]SbF_6(1)は、-80°Cのジクロロメタン中で酸素と混合すると速やかに反応し、対応する銅(III)ビス-μ-オキソ種を生成した。次に、銅(I)錯体1は、安息香酸イオン(Bz)の様な架橋型配位子を共存させて、-80°Cのアセトン中で酸素と混合すると、μ-パーオキソ種である[Cu^<II>_2(α-Sp)(μ-η^2:η^2-O_2)(Bz)]^+(2)を生成することが分かった。
高次神経機能制御に関わるncRNA機能の解明

トランスクリプトーム解析により、真核生物では膨大な数の長鎖ノンコーディングRNA(long noncoding RNA: lncRNA)が存在することが明らかにされている。これらのlncRNAのほとんどは機能未知のRNA分子であり、現在でもその体系的な理解はほとんど進んでいない。本研究の目的は、中枢神経系に発現するlncRNAの詳細な解析を行うことで、中枢神経系で機能するRNAの「作動エレメント」を同定し、高次神経機能を制御するncRNAタクソンを確立することにある。これを踏まえ、今年度は以下の研究を行った。前年度までに、ショウジョウバエ近縁種のゲノム配列の比較により、lobe-less遺伝子には近縁種間で特に保存性の高い領域(conserved region:CR)が5箇所存在し、それ以外の領域の保存性が極めて低いことが明らかにしている。そこで上記のCR領域について、5箇所の領域のみを含むトランスジーン(lol-CR)および5箇所全てを欠損しているトランスジーン(lol-ΔCR)を発現する系統を作成してlol変異系統に導入し、表現型の回復を指標とした解析を行ったところ、lol-CRにはほとんど活性が見られず、またlol-ΔCRは野生型lol全長を含むトランスジーン(lol-FL)と同等の活性を保持していた。これらの結果から、lolの遺伝子活性には少なくともCR領域のみでは不十分であることが明らかになった。次にlol遺伝子の転写領域を約1kbの4つの領域に分断し、それぞれの領域を欠損したトランスジーン(lol-Δ1Δ4)を作成して同様の解析を行ったところ、lol-Δ2のみが遺伝子活性の減少を示した。今後はこの領域について詳細な解析を行うことにより、LOL RNAの活性を担う作動エレメントを同定することが可能になると期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。大規模なトランスクリプトーム解析により、ヒトでは約9,600,マウスでは5,500,ショウジョウバエでは5,000個以上の長鎖ncRNA (long noncoding RNA: lncRNA)が同定されているが、これらのlncRNAのほとんどは機能未知のRNA分子であり、その体系的な理解は全く進んでいない。特に、多数報告されている神経系特異的なlncRNAについては、神経活動と密接な関係にある可能性が指摘されているものの、ほとんどは解析されないまま手つかずの状態にある。本研究では、LOL RNAをモデル系として、中枢神経において機能するlncRNAの「作動エレメント」を同定し、その情報をもとに他の神経系特異的lncRNAの解析を進める。また、LOLと物理的に相互作用するタンパク質因子を同定し、その作動装置の構成要素および形成機構とその機能を明らかにする。現在までに、ショウジョウバエLobe-less RNA(LOL RNA)をモデルとして神経系におけるlncRNAの解析を進めており、lncRNAが神経回路形成において重要な役割を果たしていること、Lobe-less RNAがPolycomb複合体の構成因子を強い遺伝学的作用を示すこと、2,000個以上の多数の遺伝子について発現制御に関与していることを明らかにしている。今年度は以下の結果を得た。a)脚成虫原基の形態形成を指標に、lobe-less遺伝子とクロマチン再構成複合体PRC1のサブユニットをコードする遺伝子との相互作用を解析し、PolycombおよびPosterior sexcombs遺伝子を同定した。PolycombあるいはPosterior sex comb遺伝子の単独の変異のみを持つ個体は、中脚から前脚への穏やかなホメオティックトランスフォーメーションが観察されるが、その遺伝学的浸透度は10%以下である。また、lobe-less単独の変異のみを持つ個体は中脚に異常を示さない。一方、lobe-lessとこれら遺伝子の二重変異体においては、ほぼ完全な中脚のトランスフォーメーションが起こり、遺伝学的浸透度も5%まで上昇した。これらの結果はLobe-l ess RNAとPRC1が遺伝学的に強く相互作用していると解釈され、これらの因子が細胞内で強調的に働いていることを強く示唆するものである。b )超解像顕微鏡を用いた観察から、Lobe-less RNAが核内に特異的に局在しており、核内では多数のドット上の構造を形成していることが明らかとなった。c)ショウジョウバエ近縁種のゲノム配列の比較により、系統学的に非常に近い種においてはlobe-less遺伝子と思われる保存性の高い領域が存在するものの、通常のタンパク質遺伝子に比べると非常に進化速度が速いことが明らかとなった。また、特に保存性の高い領域が5箇所存在し、それ以外の領域の保存性が極めて低いことが明らかとなった。これらの配列はショウジョウバエ属のみに見られることから、Lobe-less RNAがタクソン特異的な機能を担っている可能性が示された。当初の研究計画には以下の項目が挙げられている。(1)ショウジョウバエLobe-less RNAと遺伝学的に相互作用する因子のスクリーニング(2) Lobe-less RNAと物理的に相互作用する因子の同定(4)高次神経機能を制御するlncRNAタクソンの確立

このうち、(1), (3)については順調に進行しており、最も難航すると予想された(2)については、(1)で得られた結果に基づいてさらなる解析が必要である。現時点でLobe-less RNAが核内で特異的な局在を示すことが明らかとなっており、この局在を指標とした研究の展開にも期待したい。(3)に関しては、Lobe-less RNAが進化的に保存された配列を含むことを明らかにしており、このRNA配列の機能を明らかにすることで、飛躍的な進展を遂げる可能性がある。以上の状況から、本研究はおおむね順調に進展していると言える。今年度は主としてlobe-less変異体のトランスクリプトーム解析を行い、以下の結果を得た。a)野生型およびlol変異系統の、胚発生中期、胚発生後期、1令幼虫、雌雄成虫頭部より、それぞれ2サンプル以上のRNAを調製してライブラリを作成し、各1000万リード以上の塩基配列を得た。野生型とlol変異系統との比較では、lol遺伝子が強く発現する胚発生中期において、最も顕著な遺伝子発現の違いが見られ、7千個の遺伝子について有意な変動があった。また、これらの発現変動を示す遺伝子(DEG)のうち、2倍以上の発現変動があったものは約2千個であった。c) lol遺伝子座において、ショウジョウバエ近縁種のゲノムで保存されている5箇所の領域について、個々の領域をそれぞれ欠損しているトランスジーンや5箇所全てを欠損しているトランスジーンを発現する系統を確立した。また、これら5箇所の領域のみを含むトランスジーンを発現する系統も合わせて作成した。これらの系統については現在解析中である。当初の研究計画は以下の通りである。(1)ショウジョウバエLobe-less RNAと遺伝学的に相互作用する因子のスクリーニング(2) Lobe-less RNAと物理的に相互作用する因子の同定(4)高次神経機能を制御するlncRNAタクソンの確立このうち、(1)については非常に順調に進行している。lol変異体のトランスクリプトーム解析がおおむね終了し、LOL RNAにより制御される多数の遺伝子が明らかになっており、これらの遺伝子の機能低下がlol変異体の表現型の原因と考えられる。(3)に関しては、Lobe-less RNAが進化的に保存された配列を欠失した系統や、保存された配列のみを含む系統を確率しており、その解析を進める予定である。(2)についてはやや難航しているが、(3)により得られた情報を元に、LOL RNAと相互作用するRNA結合タンパク質を検索することで進展が期待できる。前年度より引き続き、長鎖ノンコーディングRNAをコードするlobe-less(lol)遺伝子について解析を行った。CRIPR-Cas9システムによるゲノム編集技術を用いて、lolプロモーター領域を欠いたノックアウト系統を計4種作成した。また、4.25 kbのlobe-less被転写領域を含む、5.4 kbあるいは10.5 kbのゲノム領域を欠失させ、その代わりにPax6エンハンサー下でRFP ORFを発現するノックイン系統を作成した。