hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性炎症性疾患の病態制御におけるマクロファージEPRAPの役割と診断・治療応用

EPRAPは、マクロファージにおいて、プロスタグランジンE2受容体EP4の新規細胞内ドメイン結合蛋白として同定され、炎症性刺激後のMEK-ERK経路の活性化を特異的に抑制する。本研究では、独自に開発したEPRAP遺伝子改変動物を用い、慢性炎症病態モデルにおけるEPRAPの機能を検討した。その結果、炎症性腸疾患などの発症、進展にEPRAPが極めて重要な役割を担っており、EP4-EPRAPシグナルが、難治性慢性疾患の新規の診断・治療標的となる可能性が強く示唆された。マクロファージの活性化制御は、炎症性疾患のみならず、2型糖尿病や動脈硬化性疾患、悪性腫瘍など、難治性慢性疾患の治療標的となりうる。EPRAPは、炎症性刺激後のマクロファージ活性化を負に制御する、言わば内在する「ブレーキ」に相当し、EPRAPが介在する細胞内シグナル伝達機構の解明は、マクロファージの活性化のメカニズムの理解に重要であるだけでなく、これら慢性疾患の新たな治療標的としても期待される。本研究の目的は、EP4受容体-EPRAP経路の選択的賦活化によるマクロファージ活性化制御を標的とした治療法開発のため、1EP4-EPRAP経路の活性化の指標を確立し、2EPRAP下流の標的炎症制御シグナルを、病態における重要性とともに詳細に検討することである。すでに我々は、独自に作成した遺伝子改変動物、すなわちEPRAP遺伝子欠損マウス、およびマクロファージ特異的EPRAP強制発現マウスを用いた慢性炎症モデル動物の表現型から、in vivoにおいて、マクロファージの活性化制御と病態進展におけるEPRAPの重要な役割を明らかにしている(論文投稿中)。平成26年度は、当初の研究計画通り、多数のリコンビナント・ミュータントEPRAPを作成し、それらの機能解析から、EPRAPの抗炎症作用発現に重要な翻訳後修飾部位を同定した。さらに、これら翻訳後修飾を担う酵素酵素も同定し、BLM誘発マウス肺炎症モデルなどin vivo慢性炎症モデルでの解析も並行して行った。EPRAPは、マクロファージにおいて、プロスタグランジンE2受容体であるEP4受容体の新規細胞内ドメイン結合蛋白として同定され、NF-kB1 p105との結合を介して、炎症性刺激後のMEK-ERK経路の活性化を特異的に抑制する(Minami M, et al. J Biol Chem, 2008)。EPRAPが介在する細胞内シグナル伝達機構の解明は、炎症性疾患のみならず、2型糖尿病や動脈硬化性疾患、悪性腫瘍など、難治性慢性疾患の新たな治療標的としても期待される。これまで、我々は、EPRAP遺伝子欠損マウスなど遺伝子改変動物を独自に開発し、in vivoにおけるEPRAPの機能を検討してきた。平成27年度は、これまでの研究成果をもとに、EP4シグナルによる炎症性腸疾患の進展抑制に、EPRAPが下流分子として決定的な役割を果たすことを国際誌に報告した。ここで我々は、ヒト潰瘍性大腸炎病理組織を用いて、EPRAPは病変部のマクロファージに存在するが、腸炎の重症度とEPRAP発現レベルは逆相関することを見いだした。すなわちEPRAPは、炎症性腸疾患の新規治療標的として期待されると同時に、病勢のマーカーとしても重要であることが示唆された(Nakatsuji M., et al. 2015 PLoS Genet)。さらに、in silicoの予測結果から得られたEPRAPの翻訳後修飾部位について、ミュータントEPRAPを用いた検討を加え、これら翻訳後修飾の機能的意義や修飾酵素を明らかにした(論文リバイス中)。平成26年度に引き続き、ブレオマイシン誘発肺臓炎モデルや脳内炎症モデルなど、複数の炎症疾患モデルを作成し、慢性疾患の病態生理におけるEPRAPの役割とその分子メカニズムに関する検討を進めている。平成27年度は、平成26年度以前に行った研究ツール開発などの成果に基づき、慢性炎症の病態におけるEPRAPの機能解析を深化させさせ、上述の通り、炎症性腸疾患の新規治療・診断標的として、EP4受容体-EPRAPシグナルの重要な意義について、国際誌に発表することが出来た。EP4受容体-EPRAPシグナル活性化の指標となるべきEPRAPの翻訳後修飾についても、部位の同定や機能的意義の証明など、大きな進歩が得られた。一方、当初の研究計画に示した、慢性炎症におけるEPRAPを中心とした分子間相互作用の解明、すなわちEPRAP結合蛋白の解析については、トリプシン処理後TOF MS/MSによる質量分析などプロテオーム解析を予備的に行い、いくつかの候補分子が得られたものの、Co-IPによる実証実験や、これらの分子間相互作用の生体内での機能的意義については明らかにできていない。今後はタグ付きリコンビナントEPRAP蛋白を作成し、マクロファージなど細胞lysateを用いたpull-downアッセイによる結合蛋白の同定なども視野にいれ検討を進めて行く。EPRAPは、マクロファージにおいて、プロスタグランジンE2受容体EP4の新規細胞内ドメイン結合蛋白として同定され、NF-kB1 p105との結合を介して、炎症性刺激後のMEK-ERK経路の活性化を特異的に抑制する。EPRAPが介在する細胞内シグナル伝達機構の解明は、炎症性疾患のみならず難治性慢性疾患の新たな治療標的として期待される。

平成28年度は、ブレオマイシン誘発肺臓炎モデルを用いて、in vivoにおけるEPRAPの抗炎症機能を改めて立証し、さらにミュータントEPRAPを用いた検討から、PP2AによるEPRAPの翻訳後修飾酵素(脱リン酸化)と、抗炎症作用発現における脱リン酸化の機能的意義を証明し、EPRAPが、新規治療標的であるとともに、病勢を反映するバイオマーカーとしても期待されることを明らかにした(Higuchi S., et al. J Immunol, 2016)。一方、脳内炎症モデルを用いた検討では、EPRAP遺伝子欠損による炎症抑制が認められ、脳内免疫担当細胞であるミクログリアに対しては、EPRAPは催炎症性に働くことを明らかにした(Fujikawa R., et al. Am J Pathol, 2016)。我々の研究成果から、炎症性腸疾患など難治性慢性疾患において、EP4-EPRAPシグナルが新規の診断・治療標的となる可能性が強く示唆された。今後、さらなる臨床的意義の検証や、EPRAPを標的とした創薬・体外診断薬開発への橋渡しを目指したい。EPRAPは、マクロファージにおいて、プロスタグランジンE2受容体EP4の新規細胞内ドメイン結合蛋白として同定され、炎症性刺激後のMEK-ERK経路の活性化を特異的に抑制する。本研究では、独自に開発したEPRAP遺伝子改変動物を用い、慢性炎症病態モデルにおけるEPRAPの機能を検討した。その結果、炎症性腸疾患などの発症、進展にEPRAPが極めて重要な役割を担っており、EP4-EPRAPシグナルが、難治性慢性疾患の新規の診断・治療標的となる可能性が強く示唆された。上記の通り、本研究の最初のステップであるEPRAPの翻訳後修飾について極めて順調に進展し、これらの研究成果は下記学会にて発表を行い、現在国際英文誌への投稿の最終準備段階である。また、当初の研究計画に従い、EPRAP遺伝子改変動物を用いて、2型糖尿病や動脈硬化性疾患モデルの作製も行い、並行して表現型の解析も進めている。一方、TOF MS/MSによる質量分析によるEPRAP結合蛋白の網羅的解析については試料の最終準備段階であり、下流の標的分子の同定など、in vitroでの解析と検証は現在も進行中の課題である。引き続き、がんや動脈硬化などの病態におけるEPRAPの機能について、モデル動物の表現型の比較等を通じて検討を加え、慢性疾患の病態生理におけるEPRAPの役割を、分子メカニズムとともに明らかにする。我々の研究成果から、炎症性腸疾患などにおいては、EP4受容体-EPRAPシグナルが新規の診断・治療標的となる可能性が示唆されており、ヒトの病理検体を用いたさらなる臨床的意義の検証の他、EP4-EPRAP経路の簡便な活性化指標を確立し、創薬・体外診断薬開発への橋渡しを目指す。内科学、薬理学、代謝学、炎症・免疫学次年度以降は、当初の計画に従い、EPRAPの翻訳後修飾と細胞内動態や下流標的分子との関連の解明につとめ、これらの検討を通じて、「EPRAP活性化経路」の指標確立を目指す。さらに、EPRAP遺伝子改変動物を用いて、2型糖尿病や、動脈硬化モデルにおけるEPRAPの表現型とメカニズムの解析を推進する。平成27年度は、これまでの研究成果に基づき、慢性炎症の病態におけるEPRAPの機能解析を進め、上述の通り順調な研究の進展と成果が得られた。
新規SOX9結合核蛋白質の機能解析

Sox9発現細胞からAffymetrix社GeneChipでゲノムワイドスクリーニングにより得られた未知の新規遺伝子(仮称NF-V)はII型コラーゲン遺伝子4x48bpレポーター遺伝子およびSox9遺伝子とともにC3H10T1/2細胞に共発現させた際、Sox9遺伝子のレポーター遺伝子誘導活性を増強する核タンパクである。このNF-Vの生体内での、特に軟骨細胞での機能を明らかにするため、コンディショナルアレルをもつ遺伝子改変マウスの作製を試みた。しかし、NF-Vにはsplice variantが存在して、さらにそのsplice variantは軟骨分化およびII型コラーゲン遺伝子発現に対して抑制的に作用しNF-Vの機能と拮抗する事が明らかとなった。よってNF-V特異的に遺伝子を欠失させるためのコンディショナルアレルの作製が困難であるのが現状である。Sox9転写コンプレックス構成因子の探索のため軟骨細胞に発現している遺伝子より作製した発現ライブラリーを酵母two-hybrid法によりスクリーンングした。その結果いくつかの核タンパク質を同定した。これらの核内タンパク因子はC3H10T1/2細胞を用いたSox9との共発現系においてII型コラーゲン遺伝子4x48bpレポーター遺伝子の発現を亢進した。また免疫沈降法によりSox9と結合する事も明らかとなった。現在クロマチン免疫沈降法によってSox9やNF-VとII型コラーゲン遺伝子上で結合しているかどうかを検討中である。
中国語コミュニケーション文法およびその導入のための教材・教授法の構築

コミュニカティブな中国語の能力を身につけるためには、どのような知識・スキルを身につけるべきかを、社会言語学、語用論、機能言語学、中間言語研究、異文化コミュニケーションなどの観点から具体的に指摘し、現在の中国語教育で取りあげられている学習項目は、それらのうちの重要な点ですらカバーできていないことを指摘した。そして、それらの指摘を教授法の構築や教材の開発に生かす道筋を明らかにした。「コミュニケーション能力を育成するための中国語教育」を目標に,当研究課題の研究者がこれまでに行なってきた研究を,さらに推進した。植村は,コミュニケーション機能や表現意図を中心とした文型一覧表を作成すべく英語教育の成果なども取り入れ,試作を進めた。鈴木は,コミュニケーションゴールからのバックワードデザインという手法で授業をデザインした結果,文型の定着度にどのような改善が見られたかを,実地に検証した。中西は,文型の選択がもたらす表現意図の相違と学習者にとっての難易度(構造の複雑さ)および「より自然な表現」という観点から,複数の言語現象を分析した。西は,社会言語学的観点から,中国語においてポライトネスストラテジーの選択が決定される尺度を,日本語のそれと対照し,その両者の間に明らかな違いのあることを明らかにする研究を行った。年度末に,以上の成果をまとめて発表し,ディカッションを行う公開ワークショップを開催した。このワークショップ『コミュニケーションのための「文法」を考える』では,初級段階の学習者の言語体系に関する知識で,どこまで表現意図の違いやポライトネスの違いを表現することが可能か,両者に齟齬がある場合,どちらをどう優先すべきかなどについて,参会者も交えて討論を行なった。このワークショップは多くの参加者を集め,当課題の研究者は,当課題が中国語教育関係者および中国語学関係者にとって重要な課題であることを再認識することができた。山崎は,このワークショップに関係する資料を含む当研究課題に関する情報を集約したウェブサイト『中国語コミュニケーション文法を考える』を開設・公開した。現在は,このウェブサイトへの情報の蓄積と,前述の公開ワークショップ参会者に定期的に情報提供メールを送信することにより,「中国語コミュニケーション文法」に関心をもつ研究者・教育者のコミュニティを作り上げることを目指している。当初の研究計画では、最終年度に、前2年間の研究成果を総合して、教育・教材への応用を試みる予定であった。しかし、研究組織内の検討により、「具体的な教材をイメージしたほうが基礎的な研究も進めやすい」という方向性が確認されたこと、また、初年度のワークショップの参会者から「教育の現場への応用例について具体的なプランを知りたい」という意見が多く寄せられたこともあり、今年度は、「日本の大学で広く使われている教科書」を素材にし、それを個々の授業の目的にどう適応させていくかというテーマ(Textbooka daptation)に取り組むこととなった。そして、その取り組みの成果を、中国語教育学会公開ワークショッップ「中国語教科書調理法-教科書を教材にするために」という催しで公表した。ここでは、メンバーがそれぞれ、自己のアプローチの特徴を端的に提示できるように、自分で選択した市販の教科書を素材にした「自由研究」と、メンバー全員が、同じ教科書の同じ個所を素材にして、それぞれのアプローチの違いを明示する「課題研究」とを公表し、さらにポスターセッションの場を設け、参会者と時間をかけて議論をした。なお、当研究組織による公開ワークショップは、前年度は中国語教育学会関西地区研究会の一環として行なわれたが、その意義が学会に評価され、今年度は学会公認の全国規模の行事として開催することができた。このワークショップの成果は、次の3つの認識を参会者と共有できたことである:(1)教科書に合わせて授業をするのではなく、授業の目的に合わせて教科書を作り替えるのが効果的な教授法である、(2)コミュニケーション能力の育成を目指す授業であっても、適切な目標設定とタスクの設定により、言語構造に関する知識をおろそかにせずに済む、(3)教師が適切な教材の準備と誘導を行なえば、学習者の自律的な学習を引き出すことが可能である。『中国語教育の基盤の再設計にむけて』と題する公開ワークショップを行い(2013年3月9日、早稲田奉仕園)、メンバーのそれぞれが当課題の研究期間の成果の中でも、特に斯界と共有したい成果を選んで、トーク形式で発表と参加者との討論を行った。発表題目は、「目標分解と学習要素設定のシステムー遠隔ゴールから直近ゴールへ」(山崎)、「ルーブリックによる評価の波及効果」(植村)、「テキスト・授業の中にいかに文化理解を盛り込むか」(中西)、「呼称からみた中国語コミュニケーション・ルールー「上下」・「親疎」のものさしをいかに使うか」(西)である。この発表の要旨は当課題の成果発表と共有のために開設した専用ウェブサイト『中国語コミュニケーション文法を考える』(http://www2.itc.kansai-u.ac.jp/ymzknk/kome/)で見ることができる。このワークショップの翌日、メンバーだけで会合をもち、当研究課題の成果を集成した企画中の図書『中国語教育の基盤の再設計』の内容について討論した。

また、今後、この研究課題のもと、メンバーそれぞれがどのように研究を進めていくべきか、また、その成果を共有し斯界に広く問うための発表形式としてのセミナー開催について、意見を交換した。また、研究期間全体を通じての成果として、メンバーそれぞれがどのような分野で、コミュニケーション能力の育成を重視する中国語教育に貢献していけるのかという方向性が明らかになった。その方向とは、バックワードデザインによる教材設計のシステム化(山崎)、同デザインによる新しいタイプの授業・ルーブリックによるパフォーマンス評価の効果検証(植村)、レアリアを用いた文化理解授業の設計(中西)、同デザインの理論的妥当性と学習効果の検証(鈴木)、語用論的・社会言語学的視点による中国語教育の構想(西)、などである。当初の計画では、平成22年度・23年度は、研究組織のうち、中西・西が主に、学習者に必要な知識を機能文法的・語用論的観点から整理し、鈴木がそれを学習者自身に発見させる方略を考え、植村・山崎が、その教育への応用を考案する計画であり、そして、最終年度の24年度に全員で授業のデザインと教材のデザインに取り組む予定であった。しかし、授業のデザインと教材のデザインを目標に置いてこれらの作業を進めたほうがより合目的的であるとの判断から、2年目の23年度から、全員で教育への応用に取り組むことを決定し、3月に、その成果を10件の成果として、公開ワークショップで発表することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。公開ワークショップの参会者から、当研究組織の研究成果を、時間をかけて吟味し、研究組織のメンバーと意見を交わしたいという要望が寄せられ、その声は、年度ごとに強くなっている。これまで、長時間の公開ワークショップを開催してきたが、それだけでは、成果の共有と公開にはまだ不十分ということであろう。最終年度は、メンバーが個別に各地でセミナー形式の成果公開を行なうなどの方策も検討し、今後(=研究期間終了後)の活動方針を定めたい。
日本人、中国人卵巣癌組織Heterogeneiety発現プロフィールの検討

われわれは化学療法剤耐性患者、感受性患者を選別し、500種類の遺伝子についてcDNAマクロアレイ解析を行い、68種の遺伝子発現の変化を新たに見いだした。さらに卵巣癌細胞株2008を親株としたTaxol耐性株を樹立し、cDNAマイクロアレイで9121遺伝子をスクリーニングした。前述の68遺伝子とオーバーラップする3遺伝子について卵巣癌手術検体を用い、さらにスクリーニングした。卵巣癌手術検体はレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより癌組織および正常卵巣上皮をそれぞれ抽出し、シングルアダプターを用いたT7 based amplificationによりRNAを増幅した後、RT-PCRにより発現変化を検討した。その結果、basic transcription element binding protein(BTEB1)遺伝子がタキソール耐性患者癌組織で正常卵巣上皮に比較し発現の増強が認められた。BTEB1遺伝子はさらに卵巣癌細胞株2008にトランスフェクションし、タキソールに対する耐性が増強することが確認された。またこのトランスフェクタントと2008の遺伝子発現変化をcDNAマイクロアレイで確認している。またわれわれはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより癌組織および正常卵巣上皮をそれぞれ抽出し、シングルアダプターを用いたT7 based amplificationによりRNAを増幅した後、cDNAマイクロアレイ解折を行う系を確立した。この方法によりさらなる精度の向上を目指し、臨床病理病態を反映させる組織型、grade、進行期、抗がん剤耐性の有無に細分化した発現プロフィールを検索している。特に粘液性卵巣癌では正常卵巣上皮、腺種、境界悪性、癌領域が混在する腫瘍組織があり、卵巣癌の多段階発がんに関する遺伝子をスクリーニングするにはいい検体となる。現在このような症例を収集してレーザーキャプチャーマイクロダイセクション-cDNAマイクロアレイを用いスクリーニングしている。われわれは卵巣がん手術検体の正常組織、がん組織を用い、9121種類の遺伝子のcDNAマイクロアレイ解析を行い、がん組織において55種の発現増強遺伝子、48種の発現減弱遺伝子を検出した。さらに漿液性卵巣がんおよび粘液性卵巣がんにおいて116種の遺伝子発現の変化を見いだした。さらにシスプラチン感受性、耐性卵巣がん細胞株を用いてdifferential displayを行い、ヒートショック蛋白75(mtHSP75)を単離し、ヒートショック蛋白ファミリーをRT-PCR,ウエスタンブロット解析したところヒートショック蛋白27が卵巣がんのシスプラチン耐性機構に関与している可能性を見いだし、トランスフェクションアッセイでシスプラチンに対する抵抗性が上昇し、アポトーシスが抑制された。さらにシスプラチン感受性、耐性細胞株および卵巣がん化学療法剤耐性患者、感受性患者を選別し、555種類の遺伝子についてcDNAマクロアレイ解析を行い、68種類の遺伝子発現の変化を新たに見いだした。しかしながら手術検体を用いるcDNAアレイにおいては、手術検体の保存状態、組織中のheterogeneietyの問題、正常卵巣組織といってもその成分はほとんど間質であり上皮性卵巣がんの真のコントロールは正常卵巣上皮である点などを改善しなくてはいけない。そこでわれわれはRNA laterで保存後、OCTコンパウンドで保存し、Laser Capture Microdissection(LCMD)を用い、正常卵巣上皮細胞を1000細胞以上収集し、さらにがん組織も同様にLCMDにより同じ組織型の領域をmicrodissectし、RNAを抽出、T7 based amplificationを行い、cDNAマイクロアレイ解析に供している。現在われわれは日本人、中国人の卵巣がんの化学療法剤感受性、耐性の診断、悪性度の診断、早期診断、予後の把握、個人に適した治療法の選択に寄与できる遺伝子を患者正常卵巣上皮細胞をコントロールとしたcDNAアレイ解析により明らかにし、卵巣がんの個性診断オリジナルのcDNAチップを開発する予定である。われわれは化学療法剤耐性患者、感受性患者を選別し、500種類の遺伝子についてcDNAマクロアレイ解析を行い、4倍以上発現変化のある68種の遺伝子を見いだした。さらに卵巣癌細胞株2008を親株とし2種類のTaxol耐性株を樹立し、cDNAマイクロアレイで9121遺伝子をスクリーニングした。前述の68遺伝子とオーバーラップする

3遺伝子について卵巣癌手術検体を用い、さらにスクリーニングした。卵巣癌手術検体はレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより癌組織および正常卵巣上皮をそれぞれ抽出し、シングルアダプターを用いたT7 based amplificationによりRNAを増幅した後、RT-PCRにより発現変化を検討した。その結果、basic transcription element binding protein(BTEB1)遺伝子がタキソール耐性患者癌組織で正常卵巣上皮に比較し発現の増強が認められた。BTEB1 cDNAを卵巣癌細胞株2008にトランスフェクションし、タキソールに対する耐性が4倍以上増強することが確認された。またこのトランスフェクタントと2008の遺伝子発現変化をcDNAマイクロアレイで確認している。またわれわれはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより癌組織および正常卵巣上皮をそれぞれ抽出し、シングルアダプターを用いたT7 based amplificationによりRNAを増幅した後、cDNAマイクロアレイ解析を行う系を確立した。この方法によりさらなる精度の向上を目指し、臨床病理病態を反映させる組織型、grade、進行期、抗がん剤耐性の有無に細分化した発現プロフィールを検索している。特に粘液性卵巣癌では正常卵巣上皮、腺種、境界悪性、癌領域が混在する腫瘍組織があり、卵巣癌の多段階発がんに関する遺伝子をスクリーニングするには理想的な検体となる。現在このような症例を収集してレーザーキャプチャーマイクロダイセクション-cDNAマイクロアレイを用いスクリーニングしている。
表層凍結斜面崩壊メカニズムの地盤工学的解析に基づく東欧校倉木造教会堂保存の研究

本研究は東欧に残る校倉造木造教会堂の保存のために、その主な損傷を引き起こしている原因と思われる凍土の凍結融解による斜面崩壊のメカニズムを明らかにし、不等沈下や地すべりがもたらす木造教会堂の損傷の過程およびその対策について研究する。木造教会堂の建つ地盤にボーリングを行い、土壌解析や観測井を用いたモニタリング計測を行う、これらの地盤環境の計測から、凍土の凍結融解作用による斜面崩壊の過程を地盤工学的に明らかにし、斜面崩壊に対応した木造教会堂の保存対策や修理方針を策定する。
p進多重ゼータ値の研究

昨年度より執筆中であったp進多重ゼータ値とp進多重ポリログの淡中圏論的解釈についての論文またAmir Jafari氏との共同研究を行い論文Grothendieck-Teichmuller群の定義式(3式)であるpentagon equationから二つのhexagon equationsが導かれるという結果を得て論文.これらに関する結果を、名古屋大学多元数理科学研究科の解析数論セミナー、東北大学における夏の学校「多重ゼータ値とモティーフ」およびポーランドの研究集会「Arithemtic Algebraic Geometry」にて研究発表を行った。今年7月には英国Durhan大学のHerbert Gangl氏を科研費を使って招聘をし、研究討議を盛んに行った。同月、花村昌樹氏(東北大)、寺杣友秀氏(東大数理)、山崎隆雄氏(東北大)とともに東北大学において、夏の学校「多重ゼータ値とモティーフ」を開催した。モティーフ論、ポリログ、多重ゼータ値について盛んに討議が行えた。平成16年9月から平成17年8月にかけてプリンストンの高等研究所に長期海外出張をしプリンストンを拠点にして全米名地に赴き研究を行った。同研究所で出会ったA.Jafuri氏と共同研究を2つ行った。一つ目の共同研究はBlock-Krizにより提出された混合Tateモチーフの圏内にはある種の条件のもとでは反復積分が定めるモチーフが存在することを示したことである。二つ目の共同研究は、私が博士論文で提唱したP進多重ゼータ値に対してgeneralized doulde shufflerelationsとregularization relationsが成り立つことを示したことである.これにより2002年Arizona Winter SchoolでP.Oeligne氏により提出された問題が肯定的に解決された。これらの結果等を以下の研究集会・セミナーにて発表を行った。平成17.9.15-21.セルビア・モンテネグロ共和国物理学研究所における「第2回国際P進数理物理学会議」10.21.アメリカ合衆国ジョーンズホプキンス大学における「整数論セミナー」10.26.アメリカ合衆国デューク大学における「ホッジ理論セミナー」12.5.-9.京都大学数理解析研究所における「代数的整数論とその周辺研究集会」12.19.-22.東京大学数理科学研究科における「モチーフの勉強会」18.1.5.-8.韓国大田KAISAにおける「日韓数論共同セミナー」1.23.-27.京都大学数理解析研究所における「保型表現・L関数・周期研究集会」2.22.名古屋大学多元数理科学研究科における「整数論セミナー」'The doubleshuffle relations for p-adic multiple zeta values'も完全に書き終えた。これはその成立が非自明とされていたp進多重ゼータ値に対するdouble shuffle relationsが成り立つことを示したことである。証明にはDeligneのtangential basepointの概念を高次次への拡張したものを用いている。またAmir Jafari氏との共同研究を行い論文昨年度より執筆中であったp進多重ゼータ値とp進多重ポリログの淡中圏論的解釈についての論文またAmir Jafari氏との共同研究を行い論文Grothendieck-Teichmuller群の定義式(3式)であるpentagon equationから二つのhexagon equationsが導かれるという結果を得て論文.これらに関する結果を、名古屋大学多元数理科学研究科の解析数論セミナー、東北大学における夏の学校「多重ゼータ値とモティーフ」およびポーランドの研究集会「Arithemtic Algebraic Geometry」にて研究発表を行った。
有機／無機複合化による無害な天然色素ベースの高耐久性マルチカラー色材の創製

天然色素を種々の無機ホストと複合化し,安定性を向上させることが可能であることを確認した。疎水性の天然色素であるβカロテンに対し,層状構造を持つ粘土を無機ホストに用いた。層間空間を界面活性剤で予めイオン交換した有機修飾粘土を用いると,色素分子と無機ホストとの間に強い疎水性相互作用が働き,容易な操作で多量の色素が複合化され,得られる複合体の着色度の向上が実現できた。シリカ骨格内に3価の金属を含んだメソポーラスシリカを無機ホストに用いた場合,骨格内金属イオンが固体酸点として働き,βカロテン分子と相互作用して青色化した。可視光に対するβカロテンの安定性は青色化した状態でも劣ることはなかった。実施計画に従い,天然色素と無機ホストとの複合体を調製し,それらについて種々の安定性向上の評価を実施した。βカロテンとメソポーラスシリカとの複合体について詳しく検討を行った結果,無機材料との複合化は,光に対する耐久性のみならず,加熱時の色素の安定性向上にも効果を示すことが分かった。得られた複合体における色素の存在状態を解析したところ,ホストであるメソポーラスシリカが3価の金属イオンを含有する場合に,金属イオンが色素分子の吸着サイトとして働いて,色素分子は細孔の深くまで吸着されることが分かった。このときに色素の安定化効果も最も大きかったことから,無機材料によるシールド効果が安定性向上に大きな寄与をしていることを確認した。粘土層間を界面活性剤でイオン交換した有機修飾粘土を用いて,疎水性の天然色素を物理混合で複合化できることを確認した。簡易なボールミルを使用して物理混合する際の最適条件を決定し,課題であった複合体調製の再現性を得ることが出来た。物理混合の際,わずかの溶媒を加えることで複合化の効率が大きく上がることが分かったが,これは微量の溶媒が色素粉末から分子を引き離し,続いて有機修飾粘土の層間にスムーズに移行させる働きをしているためであることを明らかとした。この知見を元に,それぞれ性質の異なる天然色素に対して加える溶媒について最適なものを予測し,実際にそれらが複合化に効果的であることを確認した。βカロテンとメソポーラスシリカとの複合体について,加熱時の安定性を詳細に検討し,複合化によって内包する色素の耐熱性向上も実現できることを確認した。安定化効果は色素が細孔内に取り込まれる場合に強く発現し,また吸着サイトとして金属イオンを導入すると安定性向上の効果も高まることから,色素分子は細孔内の比較的深くまで侵入していることが推測された。また,物理混合による色素複合体の調製方法について,最適条件の決定に至った。以上の通り,概ね当初の実施計画に沿ったものであった。実施計画に従い,天然色素βカロテンと種々の無機ホストとの複合体の作製を行い,それらについて安定性向上の評価を行いつつ,複合体の発色の制御について検討を行った。βカロテンとメソポーラスシリカとの複合体について,メソポーラスシリカの細孔内に3価の金属イオンが含まれる際に色調が青色系統に大きく変化することを確認した。この色調変化は,細孔内に含有する金属イオンの種類によって程度が異なった。種々の3価金属イオンがシリカ骨格中に含まれる場合には固体酸性質が発現し,その酸強度が強いほどβカロテンの光吸収波長の長波長シフトが生じる傾向が見られた。メソポーラスシリカ以外の固体酸とβカロテンとの複合化による色調変化や,種々の酸性溶媒との反応による吸収波長シフトの検討結果より,βカロテン分子の色調変化を及ぼすような酸との相互作用の機序について,可能性の高いモデルを提案した。粘土層間を界面活性剤で修飾し,適した溶媒をごく微量添加することにより,簡便な方法で疎水性のβカロテンを粘土層間に複合化する技術を確立した。アルキル鎖の長さや本数の異なるいくつかの種類の界面活性剤を使用して,粘土層間の疎水環境の比較を行った。粘土層間の空間に適切なアルキル鎖密度を提供する界面活性剤分子を用いることで,有機修飾粘土粉末とβカロテン色素粉末どうしの物理混合により,層間へのβカロテンの取り込みを促進することが可能であることを示した。βカロテンとメソポーラスシリカとの複合化による,色素の発色制御についての検討結果より,色変化の要因について一定の知見を得た。仮説を立てて立証する段階まで進んでおり,進行は順調と言える。層間を有機修飾することによるβカロテン複合体の作成技術について,無機ホストの修飾方法を含め,最適な条件の探索を概ね完了した。これにより,第3成分添加による色調制御の基礎が整えられたことから,進行は順調と言える。前年度までに天然色素βカロテンと有機修飾粘土との複合化の手法をほぼ確立したことから,本手法を他の種類のカロテノイド系色素に適用できるか検討した。カロテノイド色素の種類により物性が異なり,それに応じて複合化に用いる添加剤を変更する必要があることが分かったが,基本的な複合化方法はカロテノイドの種類によらず有効であることを見出した。一方,金属含有メソポーラスシリカとβカロテンを複合化することで,色素の色調が黄色系統から青色系統へ大きく変化する現象は,ホスト側の固体酸性が大きく寄与することを前年度までに解明している。そこで本年度は金属含有メソポーラスシリカ以外の固体酸と複合化させてβカロテンの色調を制御できるか試験したところ,種々の固体酸性質を示す無機固体材料との複合化でそれぞれ期待通りの色変化を観測できた。

さらに,無機ホストに対していくつかの酸性物質を添加することで,この色変化の度合いを調節できる兆候を得た。このことは,酸強度および酸量の調整によりβカロテンの発色を任意に制御可能であることを意味する。しかし,色調変化後のβカロテン色素の安定性はまだ満足できるものではなく,また有機溶剤との混合による色素溶出も見られたため,本研究課題で開発した複合材料をプラスチックに混入し着色剤として利用するには至らなかった。複合化したβカロテンの安定性向上と無機ホストへの堅固な固定化の課題が,解決を要するものとして残った。天然色素を種々の無機ホストと複合化し,安定性を向上させることが可能であることを確認した。疎水性の天然色素であるβカロテンに対し,層状構造を持つ粘土を無機ホストに用いた。層間空間を界面活性剤で予めイオン交換した有機修飾粘土を用いると,色素分子と無機ホストとの間に強い疎水性相互作用が働き,容易な操作で多量の色素が複合化され,得られる複合体の着色度の向上が実現できた。シリカ骨格内に3価の金属を含んだメソポーラスシリカを無機ホストに用いた場合,骨格内金属イオンが固体酸点として働き,βカロテン分子と相互作用して青色化した。可視光に対するβカロテンの安定性は青色化した状態でも劣ることはなかった。色素分子の取り込みが安定化に効果を示すことから,色素分子と強い相互作用をする無機ホスト材料の作成を行う。必要に応じて,既存の材料に有機修飾等を行い,色素分子との親和性をより高める。得られた新規複合体について耐光性および耐熱性の評価を実施する。また,色素と無機ホストとの間の相互作用による色素の発色制御について検討を行う。発色変化した状態の色素分子を各種分光法で観測し,色変化の要因を解明する。無機ホストとの複合化による色素の発色変化の検討結果,および天然色素分子の無機ホストへの最適な複合化条件の検討結果を踏まえて,任意の色を示す複合体のより簡便な作成方法および条件を検討する。併せて,色調制御に用いる技術が色素の安定性維持に与える影響を調査する。また,各種分光法を用いて,複合化がもたらす色変化の要因についてさらに明確にする。光機能化学本年度の研究では色素複合体の耐熱性評価を優先させた。このため耐光性評価に用いる光源装置の購入に緊急性がなく,次年度使用額を生じた。また加熱装置や粉体混合装置について工夫の結果,当初予定より安価な機器で同等の性能を得ることができた。主として,定量実験に先んじて定性的な分析を実施するため,購入予定の装置(加熱装置・光照射装置ほか)について,精度の劣る既設のものや,より安価で簡便なものを仮に使用して研究を遂行したため,次年度使用額が生じた。耐光性測定を行うための光源の購入を計画しているので,次年度使用額を優先して割り当てる予定である。研究計画の完遂のために,より精密な複合体試料調製および安定性評価分析を行うための装置および器具・試薬等の購入に充当する予定である。
一回膜貫通型受容体のシグナル伝達の構造基盤

生体中において一回膜貫通型受容体は種々の局面で重要な役割を果たしている。例えば免疫において微生物など病原体の構成成分は一回膜貫通型受容体であるToll-like receptors (TLRs)などの病原体センサーによって認識され様々な免疫応答を引き起こす。これら一回膜貫通型受容体は、様々な病気の治療薬のターゲットとされている。しかし、一回膜貫通型受容体の機能発現機構は主に細胞外のシグナル受容ドメインと細胞内のシグナル伝達ドメイン個別に研究されてきた。そのため、細胞外ドメインと細胞内ドメインの間で細胞膜を介してどのような協働性が存在してシグナルが伝達されるのかに関する実験的証拠があまりにも乏しいため、現状では前者と後者の間の関連性はほとんど憶測の域を出ない。本課題では,主に全長の受容体を用いてこの細胞外ドメインと細胞内ドメインの協働性を構造生物学的に明らかにし、真の意味でのリガンド認識とシグナル伝達機構を明らかにすることを目的とする。上記を達成するために、今年度はTLR全長の電顕解析に向けた試料調製に取り組んだ。特にTLR3全長に関して、ナノディスクに再構成する条件の検討を詳細に行った。その結果、1つのナノディスクに対して1分子のTLR3全長を再構成することに成功した。また再構成した試料について、ネガティブ染色電顕観察とクライオ電顕観察を進めた。また、再構成した試料についてリガンドが結合することを確認している。今後、さらに検討を進め、TLR全長の構造解析を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。TLR3に関して、界面活性剤で可溶化した高純度精製試料調製に成功し、溶液中でTLR3全長のリガンド依存的な二量体化が確認できた。引き続きナノディスクへの再構成条件の検討を進めた。試料を評価するために、ゲルろ過とSDS-PAGEだけでなく、ネガティブ染色した電顕像を確認しつつ進めることで、より電顕解析に適した単分散性の高い試料調製を目指す。TLR3に関して、界面活性剤で可溶化した高純度精製試料調製に成功し、溶液中でTLR3全長のリガンド依存的な二量体化が確認できたため。ナノディスクへの再構成条件を検討し、比較的高効率で再構成される条件を見出しつつあるため。ナノディスクへTLR3全長の再構成条件をさらに検討する。研究室ホームページ
バウンドするボールの聴覚的空間定位:視覚ハンディキャップテニス選手を対象として

本研究では,人間の優れた空間知覚能力に関する新しい知見として,たった3回のバウンド音がもたらす聴覚情報だけでボールの軌道を予測して,ラケット正確に打ち返すというブラインドテニス選手のスキルに着目し,優れた空間定位(ボールの軌道を正確に予測・同定すること)に関する検討をおこなった.第1実験では,熟練選手のフォアハンドストローク動作に関する3次元動作解析を行った.2バウンドしたボールを正確に打ち返す動作を分析対象とした結果,選手は1バウンド直後には動作を開始し始め,ボールが2バウンドする前に,ボールの落下位置を予測して,予期的に動作を開始していることを明らかにした.第2-3実験では,ブラインドテニスボールのバウンド位置に対する空間定位の正確性について検討した.ブラインドテニス熟練者,初心者,および晴眼者の3群が参加した.第2実験では2バウンド目にボールが落下した位置を右足のつま先で同定してもらった.その結果,熟練者・初心者ともに晴眼者よりも落下位置の定位が正確であったが,熟練者と初心者の間には有意差がなかった.しかし第3実験において,2バウンド後のボールをラケットで打ってもらった結果,熟練者は初心者よりも正確にラケットで捉えることができた.従って,熟練選手が優れているのは,バウンドするボールに対して正確に動作をする知覚運動協応能力であることが示唆された第4-5実験として,ブラインドテニス経験が,テニス以外の日常環境におけるおいても優れた空間定位能力を見せるかについて検討した.近位(50cm)および遠位(3m)における音源定位能力を測定した結果,視覚障害者は晴眼者に比べて近位における空間定位の成績が良かった.しかしながら,ブラインドテニス経験の有無による違いは見られなかった.10m直進時の左右への絶対偏寄量についても同様の結果であった。以上のことから,プラインドテニス経験者が優れた聴覚的空間定位を発揮できるのは,ブラインドテニス環境に限定されており,日常環境への波及は少ないと結論付けた本研究では,人間の優れた空間知覚能力に関する新しい知見として,たった3回のバウンド音がもたらす聴覚情報だけでボールの軌道を予測して,ラケット正確に打ち返すというブラインドテニス選手のスキルに着目し,優れた空間定位(ボールの軌道を正確に予測・同定すること)に関する検討をおこなった.第1-2実験では,ブラインドテニスボールのバウンド位置に対する空間定位の正確性について検討した(実験担当者:樋口).ブラインドテニス熟練者,初心者,および晴眼者の3群が参加した.第1実験では2バウンド目にボールが落下した位置を右足のつま先で同定してもらった.その結果,熟練者・初心者ともに晴眼者よりも落下位置の定位が正確であったが,熟練者と初心者の間には有意差がなかった.よってこの能力をブラインドテニス経験に起因することはできなかった.しかし第2実験において,2バウンド後のボールをラケットで打ってもらった結果,熟練者は初心者よりも正確にラケットで捉えることができた.従って,ブラインドテニス選手が優れているのは,バウンドするボールに対して正確に動作をする知覚運動協応能力であることが示唆された.第3実験では,ブラインドテニスの経験が日常生活にも良い波及効果をもたらすかを検討するため,視覚障害者の聴覚空間における定位能力について検討した(実験担当者:池田・信太).ブラインドテニス経験のある視覚障害者13名に対して,対象者から50cmならびに3m離れた前方・後方・右側方・左側方の位置で電子音を鳴らし,音源位置の定位をしてもらった.その結果,50cm離れた位置では,前方・後方の音源定位の正答率が側方に比べて低く,3m離れた位置では位置による正答率の違いは認められなかった.また,個人差が大きかったことから,ブラインドテニス経験の関連については慎重な検討が必要と考えられた.本研究では,人間の優れた空間知覚能力に関する新しい知見として,たった3回のバウンド音がもたらす聴覚情報だけでボールの軌道を予測して,ラケット正確に打ち返すというブラインドテニス選手のスキルに着目し,優れた空間定位(ボールの軌道を正確に予測・同定すること)に関する検討をおこなった.第1実験では,熟練選手のフォアハンドストローク動作に関する3次元動作解析を行った.2バウンドしたボールを正確に打ち返す動作を分析対象とした結果,選手は1バウンド直後には動作を開始し始め,ボールが2バウンドする前に,ボールの落下位置を予測して,予期的に動作を開始していることを明らかにした.第2-3実験では,ブラインドテニスボールのバウンド位置に対する空間定位の正確性について検討した.ブラインドテニス熟練者,初心者,および晴眼者の3群が参加した.第2実験では2バウンド目にボールが落下した位置を右足のつま先で同定してもらった.その結果,熟練者・初心者ともに晴眼者よりも落下位置の定位が正確であったが,熟練者と初心者の間には有意差がなかった.しかし第3実験において,2バウンド後のボールをラケットで打ってもらった結果,熟練者は初心者よりも正確にラケットで捉えることができた.従って,熟練選手が優れているのは,バウンドするボールに対して正確に動作をする知覚運動協応能力であることが示唆された第4-5実験として,ブラインドテニス経験が,テニス以外の日常環境におけるおいても優れた空間定位能力を見せるかについて検討した.近位(50cm)および遠位(3m)における音源定位能力を測定した結果,視覚障害者は晴眼者に比べて近位における空間定位の成績が良かった.しかしながら,ブラインドテニス経験の有無による違いは見られなかった.10m直進時の左右への絶対偏寄量についても同様の結果であった。

以上のことから,プラインドテニス経験者が優れた聴覚的空間定位を発揮できるのは,ブラインドテニス環境に限定されており,日常環境への波及は少ないと結論付けた
細胞系譜の特定と遺伝子機能の解析に基づいた、イモリ心筋再生様式の解明

再生研究のモデル動物であるイモリを用いて、遺伝的ラベルによる細胞系譜追跡実験系を初めて確立した。そしてイモリの心臓再生過程では、既存の心筋細胞が増殖することを明らかにした。次に、イモリではTALENを用いた遺伝子ノックアウトが効率よく起こること、熱誘導型のプロモーターと赤外線レーザーを用いた局所的な遺伝子発現誘導系が機能することを報告した。さらに、より詳細な遺伝子の機能解析を可能とするために、コンディショナルノックアウトイモリの作製に向けたゲノム編集技術の技術的な基盤を整備した。本研究の目的はイモリ心筋組織の再生に寄与する細胞の特定と、再生過程を制御する遺伝子の同定、およびその機能の解明にある。この目的達成の為に、次の4項目、(1)再生過程に於ける細胞系譜追跡の為の遺伝的ラベル法の確立、(2)遺伝的ラベルを駆使した細胞系譜の追跡による、再生心筋組織に対する寄与の特定、(3)再生時・細胞種特異的な遺伝子破壊(コンディショナルノックアウト)法と遺伝子発現誘導法の確立、(4)コンディショナルノックアウトや遺伝子発現誘導を介した、心筋再生における遺伝子機能の解析、を計画した。これらのうち、本年度は(1)と(2)を推進した。まず、(1)の遺伝的ラベル法の確立については、心筋細胞を遺伝的にラベルできるイモリを多数作製し、性成熟まで飼育している。さらに現在はそれらの個体を交配させて得たF1世代のイモリ育成中である。これにより、細胞をより均一、安定的にラベルすることが可能になった。現在は最適なタモキシフェン処理条件の検討を進めている。(2)の細胞系譜の追跡と心筋組織に対する寄与の特定については、心筋細胞を特異的にラベルできるトランスジェニックイモリを作製できたことから、既存の心筋細胞のラベルと追跡実験に着手して、予備的結果を得ている。現在は心内皮細胞と心外皮細胞をラベルする為のプロモーターを検討中である。これらに加えて、次年度に予定されるコンディショナルノックアウトの作製に必要なTALENを用いた遺伝子破壊実験を実施し、その結果を原著論文として発表した。イモリ心筋組織の再生に寄与する細胞の特定と、再生過程を制御する遺伝子の同定、さらにその機能を解明することが本研究の目的である。目的達成に向けて(1)再生過程に於ける細胞系譜追跡の為の遺伝的ラベル法の確立、(2)遺伝的ラベルを駆使した細胞系譜の追跡による、再生心筋組織に対する寄与の特定、(3)再生時・細胞種特異的な遺伝子破壊(コンディショナルノックアウト)法と遺伝子発現誘導法の確立、(4)コンディショナルノックアウトや遺伝子発現誘導を介した、心筋再生における遺伝子機能の解析、の4項目を計画している。これらのうち、平成26年度は主に(3)にある再生時・細胞種特異的な遺伝子破壊(コンディショナルノックアウト)法の確立を推進した。実際に破壊を目指す遺伝子に対するTALENを作製して、それを使用する為の条件検討を終えた。さらにコンディショナルノックアウトイモリの作製に必須のloxPの挿入方法に関しては、昨年度に予備実験を行った1本鎖オリゴDNAを用いる方法と、ドナーベクターを用いる方法の2つについて挿入効率の比較を行った。加えて、昨年度目標通りの成果を達成した(1)及び(2)において作製したトランスジェニックイモリを使用しすることで、(4)にある心臓再生の実験に着手した。その結果、イモリの心臓再生過程では分化した心筋細胞が増殖することを示す結果を得た。これらの研究成果に関連して、招待講演2件を含む10件の学会発表と、著書(分担)の執筆2件を行った。本研究の目的はイモリ心筋組織の再生に寄与する細胞の特定と、再生過程を制御する遺伝子の同定、さらにその機能を解明することである。そのために(1)再生過程に置ける細胞系譜追跡のためのラベル法の確立、(2)遺伝的ラベルを駆使した細胞系譜の追跡による、再生心筋組織に対する寄与の特定、(3)再生時期・細胞種特異的な遺伝子破壊(コンディショナルノックアウト)法と遺伝子発現誘導法の確立、(4)コンディショナルノックアウトや遺伝子発現誘導を介した、心筋再生における遺伝子機能の解析を計画している。これまでの研究の進展をふまえ、平成27年度は、昨年度に引き続き(3)および(4)を重点的に行った。コンディショナルノックアウトイモリの作製に関しては他のグループによって発表されたTAL-Pitch法を試み、イモリにも有効であることを示したことで、(4)の解析に不可欠な細胞周期制御因子のコンディショナルノックアウトイモリ作製に着手できた。その結果、目的とする遺伝子のイントロン領域に対してloxP配列を挿入可能であることを示した。また、横山仁、森下善弘、亀井保博らと共同で遺伝子の発現誘導法としてイモリを用いたIR-LEGO法を構築した(論文発表済み)。さらに、イモリの心臓再生過程における心筋細胞の増殖パターンの詳細を明らかにした。この結果は本計画の(1)および(2)を補完するものであり、これらの結果を合わせて現在論文の投稿準備を進めている。当該年度の研究成果をもとに、原著論文(査読あり)を1報と和文総説(査読なし)を2報発表した。また、共同研究を含め4件以上の学会・研究会における研究発表を行った。うち3件は招待講演の演者をつとめた。

次に、イモリではTALENを用いた遺伝子ノックアウトが効率よく起こること、熱誘導型のプロモーターと赤外線レーザーを用いた局所的な遺伝子発現誘導系が機能することを報告した。さらに、より詳細な遺伝子の機能解析を可能とするために、コンディショナルノックアウトイモリの作製に向けたゲノム編集技術の技術的な基盤を整備した。本申請において計画された4研究項目のうち、1番目と2番目の項目については昨年度までにほぼ終了している。3項目にあげた、コンディショナルノックアウトイモリに関しては、作製に向けた条件検討を、実際に破壊実験の対象となる遺伝子座について行うことができた。また再生時期、細胞種特異的な遺伝子発現誘導法の確立に関しては、昨年度までに作製したトランスジェニックイモリを成体まで飼育した上でタモキシフェン処理を行い、心筋細胞特異的にGFPの発現誘導を行った。これらのイモリに対して、心臓の再生実験を行い、その再生過程の解析に着手した。この心臓再生実験は、4番目の研究項目の一部でもある。最終年度を前にすべての研究項目に着手できていることから、計画全体としては概ね順調に進展していると言える。再生生物学本研究が概ね順調に進行している状況をふまえ、最終年度はコンディショナルノックアウトイモリの作製を特に重点的に推進する。この際、イモリゲノムの切断部位に対するloxP配列の挿入が起こる確立(頻度)が重要なファクターとなることがこれまでの研究で示されつつある昨年度までは1本鎖オリゴDNAを用いる方法と、ドナーベクターを用いる方法の2つを試みてきたが、加えて今年度は広島大学の鈴木らのグループによって開発されたTAL-PICH法も導入することで、研究を推進する。心筋再生における遺伝子機能の解析についても、これまでに確立してきた実験系を駆使することで、目標の達成を目指す。とくに今年度は、イモリ心筋細胞の増殖にとって不可欠な機能を持つと考えられるCyclin D遺伝子について、その再生時における発現機構解明を目指す。昨年度の計画に基づいて実施された2つの研究項目のうち、(1)再生過程に於ける細胞系譜追跡の為の遺伝的ラベル法の確立については、当初の計画通り、心筋細胞を遺伝的にラベルする方法を確立できた。さらに、それらのイモリから多数の子孫を得て、系統化を進めるとともに、26年度以降の研究推進に向けた基盤を整備することができた。2番目の項目である遺伝的ラベルを駆使した細胞系譜の追跡による、再生心筋組織に対する寄与の特定については、前項(1)において心筋細胞を特異的にラベルする方法が確立できたことから、実際の細胞系譜追跡実験を開始して、イモリの心臓再生時において既存の心筋細胞が増殖を行っていることを強く指示するデータを取得することができた。心内皮細胞と心外皮細胞をラベルできるイモリの作製に関しては、26年度もラベルに適した遺伝子プロモーターの検討を継続して行っていく必要が有る。これらに加えて、26年度に計画されていたTALEN法を用いたコンディショナルノックアウトイモリ作製の実験に着手した。特に、遺伝子のコンディショナルノックアウトに不可欠なloxP組替え