hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
未知ゲノムの解読：ドラフトレベルのアセンブリ配列を改築するシステムの開発

本研究で取得したイネデータ(イルミナショートリード、PacBioロングリード)を含めた全ゲノムシークエンスリードを用いて、酵母、線虫、イネのゲノムアセンブリを構築し、そのエラー特性等の統計値を計測した。コンティグやリードのアライメント特性についての真・偽アライメント間の尤度比を利用することにより、アセンブリ中のギャップ領域を高精度で修復するツール(GMcloser)を開発した。そのほかにアセンブリ中のミスアセンブリを計測するツール(GMvalue)やアセンブリを伸張・再アセンブルするツール(Exterm)の開発を行った。イネアセンブリ配列セットを構築するために、イネ次世代シークエンシングリードを取得した。リードは、イルミナHiSeqペアードエンドリード(インサート長:500 bp)、メイトペアリード(インサート長:3 Kb、10 Kb)、およびPacBioリードを受託シークエンシング解析サービスを利用して取得した。イルミナリードに関しては、得られたリードを用いてSOAPdenovo2、Platanus、FERMI等を用いてデノボアセンブリを行った。また、イネのオーバーラップpaired-endリードについては、公共データベース(Sequence Read archive)から取得できたため、そのリードを用いてALLPATHS-LGによるアセンブリを行った。また、イネPacBioリードについては、種々のエラー修正ツール(PacBioToCA、Proovread、ECtools等)を用いてエラー修正を行い、エラー修正効率、精度等を計測した。線虫に関しては、イルミナHiSeqペアードエンドリード(インサート長:500 bp)、メイトペアリード(インサート長:2 Kb)をSequence Read Archiveから取得し、イネと同様にデノボアセンブリを行った。得られたそれぞれのアセンブリ配列セットについて、配列全長やN50値などの統計値を計測し、イネのリファレンス配列を用いてミスアセンブリ数およびミスアセンブリ部位の特性やそれらのカテゴリー集計を行った。さらに、各アセンブリセットにイルミナペアードエンドリードをアライメントし、アライメントカバレッジ特性を解析するとともに、既存のミスアセンブリ検出ツール(Reapr,、CGAL等)を用いて、ミスアセンブリ部位の推定を行い、ミスアセンブリ部位についての情報を収集した。前年度構築したイネゲノムアセンブリデータセットを含め、線虫や酵母等のゲノムアセンブリデータを用いて、リファレンス配列にアライメントを行うことにより、ミスアセンブリ部位の同定を行った。ミスアセンブルを含むアセンブリ配列セット(True contig set)とミスアセンブリを含まないアセンブリ配列セット(False contig set)に分割し、それぞれのデータセットにおけるコンティグ間のアライメントの(1)オーバーラップ配列長、(2)オーバーラップ配列相同性、および(3) paired-endリードのマッピング率(forward read, reverse readの2コンティグ間サポートマッピング率)を計測し、統計解析を行った。これらの3つの統計量について、True contig setとFalse contig set間で尤度比を算出し、積算したスコアを用いることで、ミスアセンブリを含むコンティグアライメントとミスアセンブリ含まないコンティグアライメントを精度高く識別することができた。この尤度を利用したアルゴリズムを用いて、ゲノムアセンブリに存在するギャップをコンティグや長鎖リードを用いて精度高く修復するツール(GMcloser)を開発した。GMcloserは、既存のギャップ修復ツールと比較して同等なギャップ修復効率を維持しながら、5100倍高い修復精度を示した。ゲノムアセンブリ中のミスアセンブリの数、種類、部位について計測するツール(GMvalue)を開発した。本ツールは、アセンブリ配列をリファレンスにアライメントすることでミスアセンブリ部位を同定する手法を取り、既存の同様のツールでは困難な300 Mb以上の大きなサイズのゲノムにも適用できることや、ミスアセンブリを定義、同定するための細かな設定変更が出来ることが特徴である。本研究の最終目的であるゲノムアセンブリの高精度フィニッシングパイプラインの構築において、その主要コンポーネントである高精度ギャップ修復ツール(GMcloser)を開発し、論文発表できたこと、および、アセンブリ配列中のミスアセンブリ数や部位を同定するツール(GMvalue)を開発、論文発表できたことから、本研究課題がおおむね順調に進展していると評価できる。これまでに構築したイネ、線虫、酵母のゲノムアセンブリデータを用いて、ペアードエンド短鎖リードをbwaを用いてアライメントし、コンティグアセンブリ配列中のミスアセンブリ部位に存在する特性を調査した。各タイプ(local misassembly, translocation, inversion等)のミスアセンブリ領域とミスアセンブリの無い領域間でのリードの(1)カバレッジ、(2) discordantリード(元のインサートサイズと大きく異なるリードペアやアライメントの方向がforward-reverseになっていないリードペア)の割合、(3) split(soft-clipped)リードの割合について統計的調査を行なった。その結果、(1), (2), (3)いずれの因子においてもミスアセンブリ領域とミスアセンブリの無い領域間で差が認められた。近年第3世代シークエンシング技術により得られる長鎖リードを用いたゲノムアセンブリの構築が盛んに進められており、短鎖リードを用いたアセンブリに比べて格段に長いコンティグ配列が取得されている。しかし、長鎖リードは15%程度の高いエラーを含み、このエラーが十分に修正されずにアセンブリ中に残ってしまうことが多い。長鎖リードのエラー修正効率、修正精度を調べるため、イネ、線虫、酵母の長鎖リード(PacBioリード)を用いて、既存のエラー修正ツールのエラー修正精度を調査した。

その結果、調べた全てのツール(特に短鎖リードを用いたハイブリッドエラー修正ツール)では、リード中の多くのエラーを十分に修正しきれておらず、ゲノムサイズが大きいほどエラー修正率は低下し、ツールの実行時間が極度に長くなることが観察された。研究代表者の異動により、所属機関での他の研究プロジェクトに大幅に時間を取られ多忙となったため。ヘテロ接合性の高いゲノムのアセンブリは、より断片化する傾向にある。断片化されたヘテロ接合度の高いゲノムアセンブリを再アセンブルするツール(Exterm)を構築した。Extermは、各コンティグ末端領域にpaired-end short readsのアライメントを行い、得られたアライメント情報を基にしたlocal assemblyによってコンティグ末端を伸張させ、末端を伸張させたコンティグ同士をoverlap-layout-consensusアルゴリズムを用いて連結する。本過程でミスアセンブリを極力低減させるため、以下の処理を行った(1)コンティグリピート領域のマスク、(2)アライメントしたリードのフィルタリング、(3)伸張させたコンティグ配列が他のコンティグとend-to-endでアライメントされない場合、伸張させた配列の除去、(4)コンティグ同士を連結させたアセンブリ配列に再度paired-end short readsのアライメントを行い、不合理なリードペアのアライメントが認められた際、コンティグの連結を解除する。これらの処理を行わなかった時と比較すると、約95%のミスアセンブリを除去することができた。酵母、線虫、イネの種々のヘテロ接合度を導入した人工アセンブリセットおよびリアルアセンブリセットを用いてExtermの性能を計測したところ、ミスアセンブリの生成を抑えつつ、最大で13倍のN50増加を生じた。本研究で取得したイネデータ(イルミナショートリード、PacBioロングリード)を含めた全ゲノムシークエンスリードを用いて、酵母、線虫、イネのゲノムアセンブリを構築し、そのエラー特性等の統計値を計測した。コンティグやリードのアライメント特性についての真・偽アライメント間の尤度比を利用することにより、アセンブリ中のギャップ領域を高精度で修復するツール(GMcloser)を開発した。そのほかにアセンブリ中のミスアセンブリを計測するツール(GMvalue)やアセンブリを伸張・再アセンブルするツール(Exterm)の開発を行った。本研究の主要データであるイネの全てのリードデータを取得し、アセンブリ配列を構築できた。当初の計画では、イネPacBioリードは、平成27年度に取得する予定であったが、資金の前倒しにより、平成26年度内で全てのイネリードデータを取得することができた。
ドミナント・ネガティブXlim1の構築と内在性Xlim-1の機能解析

Xlim-1の転写活性化領域をショウジョウバエのホメオドメイン蛋白質engrailedの転写抑制領域と置き変えたもの(Xlim1-enR)を作成した。またXlim1-enRの両LIMドメインの2重点変異体(3m-enR)、ホメオドメイン点変異体(HDm-enR)、両LIMドメイン・ホメオドメイン3重点変異体(3mHDm-enR)を作成した。それらのmRNAを4細胞期の背側帯域に微量注入したところXlim1-enRのみ高率に頭部を欠損した胚が得られた。この表現形はマウスのLim1ホモ変異体の表現形と良く一致していることより内在性のXlim-1の機能阻害によるものであるこが予想された。またそれぞれの変異体で活性が低下したことより、LIMドメインを介する蛋白質・蛋白質相互作用とホメオドメインのDNA結合に対する競合阻害により内在性Xlim-1が阻害されたと考えられ、LIMドメインへの蛋白質の結合によるXlim-1の活性化が標的遺伝子の発現に必要であるとの仮説を支持した。しかしXlim1-enRの阻害効果の特異性を調べるため野生型Xlim-1との共発現を行ったが正常胚への回復は認められなかった。その原因としては野生型Xlim-1の過剰発現による原腸陥入の阻害等の2次的作用による胚発生の異常が考えられた。そこでアニマルキャップの系を用い調べたところ、1)Xlim-1とLdb1により引き起こされるchordinの発現がXIim1-enRで抑制されること、2)アクチビンの誘導によるchordinの発現をXlim1-enRは抑制し、野生型Xlim-1は、完全ではないが、その抑制を解除することが示された。現在GRドメインを融合させた「条件付き」ドミナント・ネガティブXlim-1(GR-Xlim1-enR)作成を行っており、これにより発生時期特異的にかつ一過性に作用させることで、より特異性を持った機能阻害が可能になるのではないかと考えている。
精神障害者の生活支援にはたす障害年金の研究

精神障害者が障害年金を受給し、さらに促進するためには、(1)精神障害者、(2)家族、(3)PSW、(4)社会保険労務士との協働システムが重要である。これらのことを、上記の(1)(4)に対する調査から実証した。精神障害者は、自由に使える金銭を得ることによって、生活を拡げることになる。加えて、彼らは主体的な暮らし方になりうる。そして研究では、多様な価値観と障害年金の意義について提言した。2009年度の研究実績としては、以下の4点を挙げたい。1.先行研究)わが国における精神障害者の生活支援を、障害年金に着眼して、研究及び実践動向からレビューした。この取り組みの意義は、これまで生活支援の要素の範囲を脱することができなかった障害年金を、生活支援の中心に位置付けた点にある。その結果、予想以上に障害年金は生活の基礎的な部分もさることながら、生活の質の部分へ充当できることがわかった。2.調査研究)(1)インタビュー調査...精神障害者・家族・社会保険労務士・支援者より、各々複数名をインフォーマントとして選任し、障害年金の意義、障害年金受給の障壁等について問うた。特に、社会保険労務士へインタビューを試みることは、これまでの先行研究では無かっただけに意義があると考えている。インタビュー結果から、精神障害者が障害年金を受給するには、ネットワークのなかから得られる部分が大きいこと等が明らかになった。(2)アンケート調査...支援者・家族を対象に実施した。その結果、家族は、支援者を頼りにしている・頼りにしたい気持ちを有していることがわかった。3.家族会等と協働したフィールドワーク)「精神障害者の障害年金支援研究会」を地域家族会の会長等と立ち上げ、様々な立場性を有している者たちと定期的に集い、障害年金の受給促進へ向けた検討や、実態調査を実施した。この研究会を結成することにより、特に家族会に属している者たちが抱いている家族の心情等に触れることができた。4.成果発表)上記の調査研究の結果等を、複数の都道府県で発表した。研究のフィードバック・意見交換という意味においても、障害年金の重要性を検討する機会になったと捉えている。2010年度の研究実績は、以下に示すよに、5つにけることができる。1.先行研究精神障害者がスティグマに翻弄されずに障害年金を受給しやすい社会のあり方を検討するために、2010年度は、英国の精神保健政策を調べた。なかでも、1997年のブレア政権以降の、普及啓発や家族支援政策の内容を吟味し、我が国への活かし方について考察を加えた。2.調査研究(1)精神障害者に対するインタビュー調査...障害年金を受給している者に対し、障害年金受給による生活の客観的変化や、主観的な気持ちの変化等について、半構造的に、グループ・個別にて実施した。(2)家族に対するアンケート調査...障害年金受給を促進するためには、どのような取り組みが必要かということについて、家族会主催の研修会に参加している約200名の家族を対象に調査した。調査結果からは、記述回答が多く、家族の実際的な思いを知ることができた。3. KJ法のA型図の作成(1) 2009年度に実施した11名の社会保険労務士に対するインタビュー調査結果(2)上記、2-(2)で実施した約200名の家族から得られた調査結果(1)については「社会保険労務士とPSWとの協働モデル」、(2)については、「家族が考える障害年金の受給促進の方途」を、KJ法のA型図にまとめ、分析を試みた。4.研究会活動「精神障害者の障害年金支援研究会」を、精神障害者、家族、PSWをはじめとする支援者等と協働し、4回実施することができた。なかでも、精神障害者による「障害年金受給による体験談」、PSWによる「障害年金受給支援の方法」は、様々な立場性を知る意味で有益であった。5.成果発表上記の調査研究の結果等を、日本精神保健福祉士協会が主催する研修会や、福岡県精神科病院協会が主催する研修会等で発表をした。2011年度の研究実績は、以下に示すように、5つに分けることができる。1.文献研究)筆者が、精神障害者の生活支援研究を1980年代後半以降に限定する根拠、及び、1980年代以前の研究についてレビューした。2.調査研究)精神障害者の生活支援活動を実践しているフィールドに行き、中心的に関わっている支援者に対して、インタビューを試み、生活支援論の構築に役立てた。また、スティグマ研究、とりわけ英国でのスティグマ研究に精通している者からインタビューを試み、わが国が取り組むべき課題の整理に役立てた。3.調査研究の考察)前年度に20名の精神障害者に対し、インタビューを実施している。その内容について分析をし、「障害年金を受給前」「障害年金の受給にあたって」「障害年金の受給後」と3段階に分けた。

そして、その段階ごとに、インタビューで得られた語りをカテゴリー化した。4.研究会活動)精神障害者、家族、支援者、社会保険労務士等、様々な立場性の者と、メーリングリストを用いた情報収集、及び、2011年度は1回であったが名古屋で研究会を実施した。5.成果発表)日本精神保健福祉士学会、やどかりの里、日本精神保健福祉士協会の研修会で発表した。本年度は、4年間の研究の最終年度であった。そのようなこともあり、全体的な研究のまとめを意識しながら研究に取り組んだ。なかでも、研究実績としては、以下の4点を挙げることができる。1点目は、精神障害者の障害年金受給を拡げるための方途して、重要な社会資源として捉えていた家族のストレングスについて、昨年度までに学術論文として投稿していたものが、公表されたことである。研究の客観性のような視点から、論文の修正を求められていたものを、吟味し、加筆修正することによって、査読論文として掲載された。2点目は、精神障害者の障害年金受給の阻害要因を明らかにするとともに、その解消に向けての急先鋒として、PSWを位置付けた。PSWの専門的な支援を通して、精神障害者の障害年金受給が促進されると共に、精神障害者の暮らしが向上するのではないかという考えについて、学会発表をした。3点目は、障害年金に着眼した精神障害者の生活支援論を提示することができた、というものである。これまで、精神障害者、家族、PSW、社会保険労務士を対象に調査を実施してきた。これらの研究活動を通して、四者の協働的支援のあり方をはじめ、研究代表者のオリジナルの論を展開したものを論文としてまとめ、公表することができた。4点目は、精神障害者、家族、PSW、社会保険労務士等、7名を対象にしてインタビューを実施した。それらの内容を、フォーマル・インフォーマルな人的社会資源の代表的な意見としてまとめた。そして、これらの7名の語りを象徴的な意見として活用しつつ、これまで4年間にわたり取り組んできた研究成果を、序章と終章を別にして、6章立ての著書として刊行することができた。これまでの研究活動では、精神障害者、家族、PSW、社会保険労務士からのインタビュー調査を実施し、分析及び考察を加える段階まできている。複数の調査を組み合わせるなかで、障害年金が精神障害者の生活支援にはたす機能や役割が明確になりつつある。これらのことを、論文にすることもできている。24年度が最終年度であるため、記入しない。精神障害者が障害年金を受給するうえでの阻害要因等を、一定程度明らかにすることができている。また、障害年金に着眼した精神障害者の生活支援論についても、これまでの調査活動等を通して、骨格ができつつある。そのようなことから、最終年となる2012年度は、これまでの調査活動の分析及び考察を深める。加えて、本研究は、具体的な解決方法を提示することを当初より目指していた。そのようなことからも、筆者が考察した成果を提示し、それについて、精神障害者、家族、PSW、社会保険労務士等から意見をもらい、実践的な研究成果を最終的に提言したいと考えている。
中枢シナプス細胞骨格異常が引き起こす記憶情報処理障害に関する研究

神経回路の記憶情報処理に際し、中枢シナプスの動的・可塑的変化が重要な役割を果たしている事はほぼ明らかであり、シナプスにおいてはスパインの形態変化や受容体の再配分なども起きていると考えられる。我々は記憶情報処理障害のあるアルツハイマー病脳においてはシナプスに異常があるのではないかと考え、アクチン結合蛋白ドレブリンおよびシナプス小胞に特異的な蛋白SVP38の各々に対する抗体を用いて、正常老化脳とアルツハイマー病脳の海馬の免疫組織化学を行なった。するとアルツハイマー病脳ではシナプス小脳に特異的な蛋白SVP38にたいする抗体染色では異状は発見されず、アクチン結合蛋白ドレブリンに対する抗体染色でその染色性の消失を発見した。このドレブリンの消失はウェスタンブロッティングによってもたしかめられた。ラット成熟脳におけるアクチン結合蛋白ドレブリンの樹状突起への局在がすでに報告されていたが、まずこの局在を包埋後の免疫染色の電顕像、シナプトゾーム画分の免疫染色の電顕像、培養細胞にシナプスを形成させたときの免疫染色像により確認した。次にアルツハイマー病脳のスパインにおけるドレブリンの量を調節するする因子の同定を試みるために、まず培養系を用いてドレブリンの調節因子を探した。その結果(1)ドレブリンの胎児型から成熟型への変換は活動依存性に起こること、(2)リン酸化酵素阻害薬K252aにより発現が特異的に押さえられること、(3)神経栄養因子によりその発現が制御されている可能性があることを発見した。
頸部貼付型プローブを用いた新しい微小栓子診断法の研究

初年度で確認できた、頸部血管で安定して右左シャントのスクリーニング検査を行える解析結果は、論文をJNSという雑誌に投稿し、採択となり2018年に発刊された。昨年度と同様に、経頭蓋超音波と同時に右左シャント検索をする研究を中心に行った。経頭蓋超音波で側頭骨ウインドウが良好な症例で、入院時のスクリーニング検査で右左シャントが陽性の症例が対象となり、解析対象の症例は延べ35例で延長期間中に新規に10例追加となった。2018年10月から大学院生が研究協力者となり、症例のリクルートが進んだ。全体35例の結果としては、昨年度までの結果と同様にコントラスト剤由来の微小栓子(cMES)数は全検査とバルサルバ負荷なしで頸部血管で検索の方が経頭蓋超音波より有意に多かった。一方、バルサルバ負荷あり検査では頸部血管での検索の方が経頭蓋超音波よりcMES数は多かったが、一部の症例ではバルサルバ負荷時に血流波形が不明瞭となった。この理由としてはバルサルバ負荷時のアーチファクトによる影響が考えられ、固定方法などの対策が課題として残った。症例数は大学院生の協力により順調に増えたが、全体の計画としては予定数に達しなかった。対象患者の条件を満たす症例が限定されてしまうことも症例数が増えない理由と考えられ、研究期間終了後も50症例を目標に研究を継続することとした。一方で、脳梗塞の原因検索のために、症例ベースでの研究を5例で行った。頚部血管での微小栓子の検索が病態と治療効果判定に有用であった症例を、日本栓子検出と治療学会で症例報告として発表した。また、研究期間外となるが,もう1例の症例報告を予定している。右左シャント検索としては、経頭蓋超音波と同時に行う検査の前に、頸部血管のみで安定して右左シャントのスクリーニング検査を行えるかを検証し,その後に確実にシャントが陽性になると考えられる大きな卵円孔開存症例に検査を施行した。経頭蓋超音波を同時に施行するため、更に側頭骨ウインドウが良好な例をピックアップした。右左シャントスクリーニングは、60症例で頸部血管において施行した。経食道心臓超音波で卵円孔開存を認めた症例では、頸部血管では感度60%、特異度90%で同定可能であった。特に、大きな卵円孔開存の症例の検出率が小さな卵円孔開存症例より高かった。経頭蓋超音波と同時に行う検査において、確実に陽性となる症例に絞ったため、8例の患者と症例数はやや少なめであった。全ての症例において頸部でのコントラスト剤由来の微小栓子の数の方が経頭蓋超音波を用いて中大脳動脈で捉えた微小栓子の数よりも多かった。これは、頸部を通過しても頭蓋内血管には到達しないコントラスト剤由来の微小栓子があることが理由と考えられる。頭蓋内まで到達する栓子は、頸動脈と中大脳動脈でほぼ同時に出現することが確認できた。バルサルバ負荷のタイミングやコントラスト静注のタイミングについては従来の手順で問題ないと考えられる。心原性脳塞栓症における微小栓子モニタリングは、5例で行った。いずれも微小栓子は認められなかった。予定では発症48時間以内の発症早期と1週間後、2週間後にモニタリングを行うことにしていたが、発症48時間以内の早期に検査を施行できない場合が多く、発症早期の検査体制を充実させる必要があると考えられる。右左シャント検索においては、経食道心臓超音波で大きな卵円孔開存が存在し、更に経頭蓋超音波で中大脳動脈血流波形が測定可能な症例を抽出したため、対象症例数が限定されてしまい、少数の検索しかできなかった。心原性脳塞栓症の入院早期のモニタリングができなかった。夜間や休日を含めた検査体制が整っておらず、早期の検査のタイミングの調整が困難であった。頸部血管で安定して右左シャントのスクリーニング検査を行えることを昨年度の研究で確認できたため(現在、論文投稿中)、今年度は経頭蓋超音波と同時に右左シャント検索をする研究を中心に行った。経頭蓋超音波で側頭骨ウインドウが良好な症例で、入院時のスクリーニング検査で右左シャントが陽性の症例が対象となるため、解析対象の症例は19例であった。結果としては、19例の患者(男性17例、年齢平均値60歳)の76検査を解析した。コントラスト剤由来の微小栓子(cMES)数は全76検査(497 vs.399、p=0.02)とバルサルバ負荷なし19検査(103 vs. 70、p=0.04)で頸部血管で検索の方が経頭蓋超音波より有意に多かった。一方、バルサルバ負荷あり56検査では頸部血管での検索の方が経頭蓋超音波よりcMES数は多い傾向であったが有意差はなかった(394 vs. 329、p=0.09)。頸部血管における右左シャント検索は、経頭蓋超音波よりもcMES検出数が多く、臨床的に有用である。一方、バルサルバ負荷時の検索でcMESの数は多いものの有意差がつかなかったのは、バルサルバ負荷時の波形減弱や頸部の動きによるアーチファクトの影響が考えられ、今後はこれらの対策が必要と考えられる。心原性脳塞栓症における微小栓子モニタリングは4例で行ったが、いずれも栓子シグナルは認められなかった。

昨年度同様、発症48時間以内の早期に検査を施行できない症例が多いことが課題であった。経頭蓋超音波と頸部血管での右左シャント同時検索の研究では、経頭蓋超音波で側頭骨ウインドウが良好な症例で、入院時のスクリーニング検査で右左シャントが陽性の症例が対象となるため、対象症例が限定され、当初の計画より少数での解析しかできなかった。心原性脳塞栓症での微小栓子モニタリングでは、昨年度同様に夜間や休日を含めた検査体制の整備がうまく調整できなかったことが理由と考えられた。初年度で確認できた、頸部血管で安定して右左シャントのスクリーニング検査を行える解析結果は、論文をJNSという雑誌に投稿し、指摘事項を修正した後に現在再投稿し結果待ちである。昨年度から引き続き、経頭蓋超音波と同時に右左シャント検索をする研究を中心に行った。経頭蓋超音波で側頭骨ウインドウが良好な症例で、入院時のスクリーニング検査で右左シャントが陽性の症例が対象となり、解析対象の症例は延べ25例であった(今年度は新規に6例追加)。全体25例の結果としては、昨年度と同様にコントラスト剤由来の微小栓子(cMES)数は全検査とバルサルバ負荷なしで頸部血管で検索の方が経頭蓋超音波より有意に多かった。一方、バルサルバ負荷あり検査では頸部血管での検索の方が経頭蓋超音波よりcMES数は多い傾向であったが有意差はなかった。この理由としてはバルサルバ負荷時のアーチファクトによる影響が考えられ、固定方法などの対策が必要と考えた。昨年度から症例数の伸びが6例と少ないことが課題であった。日常診療の合間で行う試験のため、検査日程の調整がうまくできないことが問題となった。また、対象患者の条件を満たす症例が限定されてしまうことも症例数が増えない理由と考えられた。このため、研究期間を1年間延長することとした。一方で、脳梗塞の原因検索のために、症例ベースでの使用を4例で行った。頚部血管での微小栓子の検索が病態解明に有用であり、日本栓子検出と治療学会で有用性を症例報告として発表した。また、外来などの日常診療業務により検査可能日が限定されてしまうことも要因と考えられた。心原性脳塞栓症での微小栓子モニタリングでは、昨年度同様に夜間や休日を含めた検査体制の整備がうまく調整できなかったことが理由と考えられたが、必要性の高い症例においては検査が可能であった。しかし、連続例での検索や同一症例での経時間的な解析は上述の理由で困難であった。初年度で確認できた、頸部血管で安定して右左シャントのスクリーニング検査を行える解析結果は、論文をJNSという雑誌に投稿し、採択となり2018年に発刊された。昨年度と同様に、経頭蓋超音波と同時に右左シャント検索をする研究を中心に行った。経頭蓋超音波で側頭骨ウインドウが良好な症例で、入院時のスクリーニング検査で右左シャントが陽性の症例が対象となり、解析対象の症例は延べ35例で延長期間中に新規に10例追加となった。2018年10月から大学院生が研究協力者となり、症例のリクルートが進んだ。全体35例の結果としては、昨年度までの結果と同様にコントラスト剤由来の微小栓子(cMES)数は全検査とバルサルバ負荷なしで頸部血管で検索の方が経頭蓋超音波より有意に多かった。
石灰化大動脈弁狭窄症の発症抑制における長寿遺伝子Sirt-1の役割解明

高齢人口の増加に伴い心不全患者が急増しており、その重要な原因の1つに大動脈弁狭窄症(AS)の増加が挙げられる。ASの危険因子は動脈硬化と共通するが、ASの半数は動脈硬化を合併せず、脂質低下療法を含めAS進行抑制に有効な薬物療法がない。長寿遺伝子として知られるSirt-1は加齢が関与する疾患の発症抑制に関与することが報告されている。しかしASの進行とSirt-1の関係は未だ不明である。本研究では、石灰化AS発生抑制におけるSirt-1の役割を、細胞実験及び動物実験を用い解明し、新しい治療法の開発を目指す。
ビニル付加・開環重合間の交差生長反応を実現するカチオン共重合系の創出

本研究では,異なる重合系を融合させたビニル付加・開環カチオン同時共重合系の構築を目的とした。適切な置換基をもつオキシランを用いたビニルエーテルとの共重合系の開発,β位にメチル基をもつグリシジルエーテルを用いた機能性異種共重合体の設計,ビニル付加・開環共重合における交差生長反応の頻度制御,一方向の交差生長反応で進行するビニル付加・開環・カルボニル付加同時カチオン三元共重合系の開発,アルコキシ基転位を伴うアルコキシオキシランとビニルエーテルのカチオン共重合,ビニルモノマーと環状アセタールの制御カチオン共重合,ビニルエーテルと環状エステルのビニル付加カチオン・配位開環同時共重合系の開発などを行った。本研究では,異なる重合系を融合させたビニル付加・開環カチオン同時共重合系を構築することを目的とし,本年度は主に(1)ビニルモノマーとオキシランの共重合における交差生長反応に必要な要素の解明,(2)ビニルモノマーと環状ホルマールの制御カチオン共重合系の構築の2つのテーマに沿って研究を行った。(1)では,オキシランから生成するオキソニウムイオン生長種の開環により生成しうる炭素カチオン種の構造が,ビニルエーテルとの共重合における交差生長反応の頻度に影響を与えることがわかった。すなわち,より安定な炭素カチオン種を生成するような側鎖置換基を有するオキシランを用いることで,より高頻度に炭素カチオン生長種が生成したため,ビニルエーテルへの交差生長反応が高頻度に起こったと考えられる。さらに,エステルやエーテルなどの弱いルイス塩基が交差生長反応の頻度に影響を与えることもわかった。これらの弱いルイス塩基は,オキソニウムイオン生長種を求核的に攻撃することで,炭素カチオン種への開環を促進したと考えられる。また,アルコキシ基を有するオキシランを用いてビニルエーテルとの共重合を行うと,アルコキシ基の転位を伴った特異な機構により反応が進行して共重合体が生成することも見出した。(2)では,1,3-ジオキセパンを環状ホルマールとして用い,SnCl4と酢酸エチルを組み合わせた開始剤系を設計し,適切な溶媒・温度条件下で反応を行うことで,ビニルエーテルとの制御カチオン共重合が進行することを見出した。このとき,適切な反応性を有するビニルエーテルを組み合わせることが両モノマー間の交差生長反応が進行するために重要であり,とくに2-クロロエチルビニルエーテルが有効であることがわかった。本研究では,ビニル付加・開環同時カチオン共重合系の構築を目的としている。本年度は主に,(1)ビニルモノマーと環状アセタールの制御カチオン共重合系の構築,(2)ケトンを第三成分として用いた,ビニル付加・開環・カルボニル付加同時カチオン三元共重合系の開発,(3)ビニル付加カチオン重合と配位開環重合を組み合わせた系の開発の3つのテーマに沿って研究を行った。(1)では,昨年度見出した1,3-ジオキセパンを環状アセタールとして用いた制御共重合系に加え,2-メチル-1,3-ジオキソランおよび1,3-ジオキソランを用いた系を設計した。とくに2-メチル-1,3-ジオキソランを用いた系では,第二級炭素カチオン種の生成および低い単独重合性のため,2-クロロエチルビニルエーテルとの共重合が非常に制御されることを見出した。(2)では,一般にはモノマーとして用いられることのない脂肪族ケトンが,ビニルエーテルおよびオキシランと組み合わせることでモノマーとしてはたらき,ポリマー鎖に組み込まれることを見出した。とくに,適切なオキシランを用いることで,一方向のみの交差生長反応からなる特異な三元共重合が進行することがわかった。(3)では,ビニルエーテルの制御カチオン重合とε-カプロラクトンの配位開環重合が同一系中で進行し,しかもビニルエーテル生長末端のアルコキシ交換機構により,グラフト型の共重合体が生成することを見出した。ZrやHfを用いることで,単一触媒で両反応が進行する系も設計した。本年度の目的として主に3つのテーマを掲げたが,いずれも順調に進行し,意義深い結果が多く得られたと考えられる。本年度はおもに,(1)オキシランの置換基がビニルエーテルとのビニル付加・開環同時カチオン共重合系に及ぼす影響の検討,(2)種々の環状アセタールを用いたビニルモノマーとの制御カチオン共重合系の設計,(3)ビニル付加カチオン重合と配位開環重合が同時に進行する新しいタイプの共重合系の開発の3つのテーマに沿って研究を進めた。(1)では,電子求引性基であるアルコキシ基やクロロ基を有するオキシランと種々のビニルエーテルのカチオン共重合を行い,交差生長反応を伴う重合が進行するために重要な要素について検討した。電子求引性基によってオキシランモノマーの反応性が低下するため,それに応じて反応性の小さいビニルエーテルを組み合わせることで,効率的な共重合が進行することがわかった。(2)では,環状アセタールの環員数および置換基がビニルモノマーとのカチオン共重合挙動に及ぼす影響について検討した。

5員環の1,3-ジオキソランの2-位にメチル基を2つ有する環状アセタールをおもに検討し,無置換およびメチル一置換の環状アセタールに比べて非常に高い反応性をもつこと,単独重合性が無いため交互に近い共重合体が生成したことなどを見出した。(3)では,ビニルエーテルとε-カプロラクトンのそれぞれビニル付加カチオン重合と配位開環重合が同時に進行する新しいタイプの共重合系を構築した。HfCl4とHf(OBu)4を適切な量比で組み合わせることで,独立した生長反応が進行する一方,活性点で一時的に組み合わさることでアルコキシ基交換反応が起こり,グラフト共重合体が生成した。同程度な速度での両モノマーの重合と効率的なアルコキシ基交換葉能が起こる反応条件を設計することがとくに重要であった。本年度の目的として主に3つのテーマについて検討を進めたところ,いずれも順調に進行し,興味深い結果が多く得られたと考えられる。本研究では,ビニル付加・開環同時カチオン共重合系の構築を目的としている。本年度はおもに,(1)種々のオキシランを用いたビニルモノマーとのビニル付加・開環カチオン共重合の検討,(2)種々の環状アセタールを用いた制御カチオン共重合系の設計,(3)ビニル付加・配位開環同時共重合系の構築の3つのテーマにそって研究を進めた。(1)では,異種共重合体への機能付与の例として,オキシエチレン鎖を有するオキシランを設計してアルキルビニルエーテルと共重合を行い,生成した共重合体が水中で温度応答性を発現することを示した。また,オレフィンの酸化反応により種々の置換基をもつオキシランを合成し共重合を検討したところ,第三級炭素カチオンを生成しうる構造でも置換基によっては交差生長反応が進行しないことがわかった。(2)では,さらに多様な置換基・環員数の環状アセタールを設計し,ビニルモノマーとの制御カチオン共重合を検討した。具体的には,五,六,七員環で2-位にメチル基を0,1,2つ有する一連の環状アセタールを用い,2-クロロエチルビニルエーテルとの共重合を系統的に検討した。そして,環員数および置換基が交差生長反応の有無・頻度に及ぼす効果について考察した。(3)では,前年度までに構築してきたビニルエーテルと環状エステルのビニル付加・配位開環同時共重合系において,ビニルエーテルの側鎖構造やルイス酸触媒の中心金属が重合挙動に及ぼす効果について明らかとした。とくに,2-メトキシエチルビニルエーテルを用いると,Tiを中心金属とする触媒系により生長末端アセタールでのアルコキシ基交換が高頻度に起こり,非常に高いグラフト密度を有するグラフト共重合体が得られることを見出した。本研究では,異なる重合系を融合させたビニル付加・開環カチオン同時共重合系の構築を目的とした。適切な置換基をもつオキシランを用いたビニルエーテルとの共重合系の開発,β位にメチル基をもつグリシジルエーテルを用いた機能性異種共重合体の設計,ビニル付加・開環共重合における交差生長反応の頻度制御,一方向の交差生長反応で進行するビニル付加・開環・カルボニル付加同時カチオン三元共重合系の開発,アルコキシ基転位を伴うアルコキシオキシランとビニルエーテルのカチオン共重合,ビニルモノマーと環状アセタールの制御カチオン共重合,ビニルエーテルと環状エステルのビニル付加カチオン・配位開環同時共重合系の開発などを行った。
芥川龍之介・菊池寛共訳『アリス物語』・『ピーターパン』に関する基礎的研究

芥川龍之介・菊池寛共訳『アリス物語』および『ピーターパン』は、興文社と文藝春秋社による『小学生全集』シリーズの一環として刊行された。この<共訳>は、『不思議の国のアリス』の文豪訳などとして好事家の関心を引いてきたが、これまで芥川あるいは菊池の訳業として両作が取り上げられることはほとんどなかった。本研究では<共訳>の分担や翻訳の特徴について明らかにし、創作童話の発表や『小学生全集』を刊行など、児童文学の普及にも貢献してきた芥川・菊池の功績の中で、両作をどう捉えるべきか明らかにしたい。また、この二作を一般読者が親しめる形で普及したい。
細胞診を応用した犬の汎固形腫瘍に対する新規診断法の確立

細胞診は採取した細胞をスライドグラス上に伸展し、染色するだけで病変の評価が可能であることから、ベッドサイドにおける病変の迅速診断や外科的切除のマージン判定を目的として、人医学領域だけでなく小動物臨床領域においても極めて良く用いられる臨床検査法の1つである。細胞診では病理組織学検査とは異なり、注射針で採取されたサンプルを用いても検査可能なため、被検動物への侵襲性が低く、臨床現場で容易に実施できる。また細胞診では、病理組織学的検査に比べ個々の細胞形態が観察し易く、主に細胞形態と集簇性によって、病変部位に浸潤する細胞の由来特定、また腫瘍病変か否かを判断する。しかしながら実際のところ、正常細胞と形態が酷似する高分化癌や、炎症病巣との鑑別が困難な間葉系腫瘍など、細胞の形態観察のみでは病変を判断することが困難な病変も少なくない。そのため実用頻度が高い割には、細胞診断医の主観と経験に委ねられた診断法とも言える。本研究では、より客観性の高い細胞診断法として、新たに同定した犬の汎固形腫瘍マーカーを、細胞診塗抹上で免疫染色によりこれを検出し、さらに同サンプルから抽出されたDNAをもとにマイクロサテライト不安定解析を行う事で、犬の汎固形腫瘍に対するより客観性の高い細胞診断法を確立させることを目標とするものである。はじめに、実際に臨床サンプルを用いて解析を行うためには、病変部位から採取された細胞を、細胞診可能な状況下で長期保存する必要性が想定された。そのため、獣医学領域では使用実績のない液状化細胞診塗抹標本の有用性、また細胞診塗抹を対象とした免疫染色の条件設定を試みた。先ず始めに犬メラノーマ細胞株(KK47、L、CH1)を用い、液状化細胞診(TACAS,MBDシステムを用いて常法通り塗抹標本を作成し、メラノーマ細胞に特異的な抗体を用いた免疫染色を実施することで液状化細胞診の有用性、またその条件設定を検討した。その結果、液状化細胞診を利用する事で、一定期間内保存した細胞であっても元の細胞形態が保持され、また免疫染色において観察可能な細胞診塗抹を作製する事が可能である事が分かった。これらの検討を踏まえ、実際の症例から採取した胸水(中皮細胞)、肥満細胞腫(肥満細胞)を用いて液状化細胞診を行なったところ、免疫染色を実施するには十分な塗抹標本が作製可能なことが明らかとなった。細胞診は採取した細胞をスライドグラス上に伸展し、染色するだけで病変の評価が可能であることから、小動物臨床領域においても極めて良く用いられる臨床検査法であるだけでなく、注射針で採取されたサンプルであっても充分検査可能なため、被検者への侵襲性が低く、容易に実施できる検査法である。細胞診では病理組織学的検査に比べ個々の細胞形態が観察し易いことから、細胞形態と集簇性によって、細胞の由来と腫瘍病変か否かを判断していく。しかしながら実際のところ、正常細胞と形態が酷似する高分化癌や炎症病巣との鑑別が困難な間葉系腫瘍など、細胞の形態観察のみでは病変を判断することが困難な病変も少なくない。そのため実用頻度が高い割には診断医の主観と経験に委ねられた診断法である。そこで本研究ではより客観性の高い細胞診断法として、新たに同定する犬の汎固形腫瘍マーカーを用いた免疫染色と、マイクロサテライト不安定解析とを組み合わせた犬の汎固形腫瘍に対する細胞診断法を確立させることを目標としている。また本研究では、細胞診可能な状況下での細胞長期保存(数週間程度)も検討する必要がある。そのため平成23年度は予備的研究として、液状化細胞診塗抹標本による免疫染色の条件設定を試みた。先ず始めに犬のメラノーマ細胞株(KK47、L、CH1)を用い、液状化細胞診のシステムを用いて塗抹標本を作成し、既存の抗体を用いた免疫染色を実施することで液状化細胞診の有用性、またその条件設定を検討した。その結果、液状化細胞診を利用する事で、数週間程度であれば保存した細胞であっても形態観察可能な細胞診塗抹を作製する事が可能であり、さらに免疫染色が実施可能である事が分かった。これらの検討を踏まえ、実際の症例から採取した細胞(胸水、肥満細胞腫)を用いて液状化細胞診を行なったところ、有効に免疫染色を実施することが可能であった。

本研究では、より客観性の高い細胞診断法として、新たに同定した犬の汎固形腫瘍マーカーを、細胞診塗抹上で免疫染色によりこれを検出し、さらに同サンプルから抽出されたDNAをもとにマイクロサテライト不安定解析を行う事で、犬の汎固形腫瘍に対するより客観性の高い細胞診断法を確立させることを目標とするものである。はじめに、実際に臨床サンプルを用いて解析を行うためには、病変部位から採取された細胞を、細胞診可能な状況下で長期保存する必要性が想定された。そのため、獣医学領域では使用実績のない液状化細胞診塗抹標本の有用性、また細胞診塗抹を対象とした免疫染色の条件設定を試みた。先ず始めに犬メラノーマ細胞株(KK47、L、CH1)を用い、液状化細胞診(TACAS,MBDシステムを用いて常法通り塗抹標本を作成し、メラノーマ細胞に特異的な抗体を用いた免疫染色を実施することで液状化細胞診の有用性、またその条件設定を検討した。その結果、液状化細胞診を利用する事で、一定期間内保存した細胞であっても元の細胞形態が保持され、また免疫染色において観察可能な細胞診塗抹を作製する事が可能である事が分かった。これらの検討を踏まえ、実際の症例から採取した胸水(中皮細胞)、肥満細胞腫(肥満細胞)を用いて液状化細胞診を行なったところ、免疫染色を実施するには十分な塗抹標本が作製可能なことが明らかとなった。該当年度には当大学附属動物医療センターに来院した担癌犬から外科的に切除された固形癌(上皮系腫瘍、非上皮系腫瘍)を採取し、マイクロアレイならびにマイクロサテライト不安定性解析を実施する予定であったが、マイクロアレイ法からサブトラクション解析への方法の変更を現在考慮している。その場合、当初の計画よりも多くのサンプル採取が必要となるため、非腫瘍部位を含む腫瘍サンプル採取は目標数に至っていない。そのため後に実施予定であった液状化細胞診を用いた免疫染色に関する条件設定を先に実施するに至った。腫瘍検体の採取を引き続き行ない、マイクロアレイ法もしくはサブトラクション法による腫瘍マーカーの検索、ならびにマイクロサテライト不安定性解析を進めることを目標とする。目標とするサンプルが得られない場合には、申請者が凍結保存する症例由来腫瘍サンプルを用いてサブトラクション法による検索を実施することとする。その場合、多数の症例から採取された複数の腫瘍サンプルをtest群として、また多数の症例から採取された複数の非腫瘍サンプルをcontrol群としてサブトラクション解析を実施する事で、腫瘍マーカー候補遺伝子が検出可能と思われる。該当年度には当大学附属動物医療センターに来院した担癌犬から外科的に切除された固形癌を採取し、マイクロアレイならびにマイクロサテライト不安定性解析を実施する予定であったが、当初予定していただけの腫瘍サンプルが収集出来ておらず、研究計画の前後を入れ替えたため、次年度への繰り越しが生じることとなった。次年度はマイクロアレイ解析(もしくはサブトラクション解析)、マイクロサテライト解析、抗体の購入への使用を想定している。
C型肝炎ウイルス感染に対する細胞障害性T細胞応答の研究

C型肝炎ウイルス(HCV)感染は高頻度に持続感染に移行し,慢性肝炎,肝硬変と進展し,肝癌を生じる.新たなHCV感染は医療器具のディスポーザブル化,血液製剤のHCV検査の導入により激減し,インターフェロンをベースにした治療によりC型慢性肝炎患者においてウイルスの排除も可能になった.しかし,治療に反応しない患者も依然として存在し,新しい治療戦略の開発が必要である.その一つとしてHCV感染細胞を認識・傷害し,ウイルス排除に働く細胞障害性T細胞(CTL)の応答を利用した治療法の可能性がある.私達は,まずHCV全体に対するCTL応答を評価する方法を開発した.この方法を用いてC型慢性肝炎患者のインターフェロン治療時のHCV特異的CTL応答の経時的変化を検討し,ウイルスの減少に伴いCTL応答は低下するが,一時的に治療を中断すると,ウイルスの再増加に伴いCTL応答が増強することを明らかにし,HCV排除にCTLが重要な役割を果たしていることを証明した.また,将来のペプチドワクチンへの利用を目的に,HLA-A24への結合モチーフを有する合成HCVペプチドと全HCV蛋白をカバーする合成ペプチドを用いて,特異的なCTLは抗原刺激によりIFN-γを産生することを利用したELISpotアッセイにより,16種類の新たなHCV特異的CTL抗原エピトープを同定した.更に,HCV抗原ペプチド-HLA-A24-Igダイマーを作製し,C型慢性肝炎患者末梢血中に存在するHCV特異的CTLは一般に活性化の程度が低く,分化度は様々であり.CTL応答が抑制されていることを明らかにした.C型肝炎ウイルス(HCV)感染は高頻度に持続感染に移行し,慢性肝炎,肝硬変と進展し,肝癌を生じる.新たなHCV感染は医療器具のディスポーザブル化,血液製剤のHCV検査の導入により激減し,インターフェロンをベースにした治療によりC型慢性肝炎患者においてウイルスの排除も可能になった.しかし,治療に反応しない患者も依然として存在し,新しい治療戦略の開発が必要である.その一つとしてHCV感染細胞を認識・傷害し,ウイルス排除に働く細胞障害性T細胞(CTL)の応答を利用した治療法の可能性がある.私達は,まずHCV全体に対するCTL応答を評価する方法を開発した.この方法を用いてC型慢性肝炎患者のインターフェロン治療時のHCV特異的CTL応答の経時的変化を検討し,ウイルスの減少に伴いCTL応答は低下するが,一時的に治療を中断すると,ウイルスの再増加に伴いCTL応答が増強することを明らかにし,HCV排除にCTLが重要な役割を果たしていることを証明した.また,将来のペプチドワクチンへの利用を目的に,HLA-A24への結合モチーフを有する合成HCVペプチドと全HCV蛋白をカバーする合成ペプチドを用いて,特異的なCTLは抗原刺激によりIFN-γを産生することを利用したELISpotアッセイにより,16種類の新たなHCV特異的CTL抗原エピトープを同定した.更に,HCV抗原ペプチド-HLA-A24-Igダイマーを作製し,C型慢性肝炎患者末梢血中に存在するHCV特異的CTLは一般に活性化の程度が低く,分化度は様々であり.CTL応答が抑制されていることを明らかにした.1.インターフェロン治療を受けるC型慢性肝炎患者3例でインターフェロン治療開始投与開始後4週後に4週間の投与休止期間を設けることによるHCV蛋白全体に対する細胞障害性T細胞(CTL)応答への影響を検討した.対照として4例で揖投与休止期間を設けず,CTL応答の経時的変化を検討した.C型慢性肝炎患者のHCV蛋白全体に対するCTL応答は健常対照群と比べ,差がないか軽度上昇であった.CTL応答が高くない症例ではCTL活性はインターフェロンのウイルス量の低下に伴い,一旦上昇し,ウイルス陰性が続くと再び低値に戻った.一方,治療開始前にCTL応答が比較的高かった症例はインターフェロン投与1か月後にはCTL応答は低下し,3か月後に高値に戻ったのちに再び低下した.治療休止を行った3例中2例は治療前CTL活性は高く,インターフェロン開始4週後にはCTL活性は抑制されたが,治療休止によりウイルが再増加すると共にCTL活性は上昇し,CTL応答の増強が認められた.増強したCTL活性はウイルス陰性が長く続くと低下した.2.C型急性肝炎患者5例と感染が最近のC型慢性肝炎患者4例の末梢血CD8陽性T細胞を日本人に多いHLA-A24への結合モチーフを有する合成HCVペプチドで刺激し,インターフェロンγ産生を指標にすることにより5例の患者で11種類の新たなHCV特異的CTLのエピトープを同定した.しかし,HLA-A24拘束性HCLのエピトープはこの内の1種類だけであり,HLA-A24拘束性CTLエピトープには免疫学的に優位な抗原エピトープが存在しない可能性が考えられる.現在,HCV蛋白全体をカバーし,10アミノ酸ずつオーバーラップする20アミノ酸のペプチドでHCV特異的CTLの新たなエピトープを更に探索している.C型肝炎ウイルス(HCV)特異的細胞障害性T細胞(CTL)応答を詳細に検討すると共に、CTL応答を利用した新たな治療戦略を開発するためには、できるだけ多数のHCV特異的CTLエピトープを同定する必要がある。私達は全HCV蛋白をカバーし、10アミノ酸ずつオーバーラップする400種類の15あるいは20アミノ酸のペプチドを合成し、マクロファージを抗原提示細胞として、まず20種類ずつ混合したペプチド混合物でC型急性肝炎患者末梢血単核球のCD8陽性細胞を刺激し、IFN-γ産生細胞を算定することによりHCV

特異的CTLエピトープをスクリーニングした。反応が陽性の場合は個々のペプチドで再度刺激してエピトープの同定を行った。今回はHLA-A*0207、2601、B*3501、4601、Cw*0102、0303の患者とHLA-A*2402、3303、B*4403、5401、Cw*0803、1403の患者の末梢血CD8陽性細胞を用いた。前者ではHCV NS3 1527-1546とHCV NS5B 2591-2605に、後者ではHCV E1 332-351、NS3 1638-1656、NS5B 2591-2605にCTLエピトープが存在することが明らかになった。これらCTLエピトープの内HCV NS3 1531-1539は既知のHLA-B35拘束性CTLのエピトープを含み、かつ患者もHLA-B*3501を有することから同一のエピトープをみている可能性が高い。2人の患者の両者で同定されたHCV NS5B 2594-2602には既知のHLA-A*0201拘束性CTLのエピトープが含まれるが、両患者ともHLA-A*0201は有さず、かつHLA class I分子は全異なることからHCV NS5B 2594-2602には新たな2種類のエピトープが含まれる可能性が高い。日本人におけるHCV特異的CTLエピトープのlibraryを作る目的で,新しいCTLエピトープの同定を試みた.CTLエピトープは全HCV蛋白をカバーし,10アミノ酸ずつオーバーラップする401種類の15あるいは20アミノ酸のペプチドを20種類ずつ(1組のみ21種類)混合し,3名のC型急性肝炎患者末梢血単核球のCD8陽性細胞を,マクロファージを抗原提示細胞として混合ペプチドで刺激し,IFN-γ産生細胞を算定することによりスクリーニングした.反応が陽性の場合は個々のペプチドで再度刺激して,エピトープの同定を行った.その結果,今回新たにHLA-A^*2602,3101,B^*5101,5102,Cw^*1402,1502を有する患者でHCV NS3 1367-1386,HLA-A^*2402,B^*0702,5201,Cw^*0702,1202を有する患者でHCV E2 604-618,HLA-A^*1101,3101,B^*6701,5101,Cw^*0702,1401を有する患者でHCV NS5A 2284-2303がHCV特異的CTLの抗原エピトープであることが明らかになった.また,先に同定したHLA-A24拘束性CTLのエピトープであるHCV NS5A 2280-2288ペプチド-HLA-A24-Ig dimerとリンパ球の分化マーカーを用いた末梢血リンパ球のFACS解析により,C型慢性肝炎患者の血中に存在するHCV特異的CTLはこれまでの報告と異なり,比較的分化度が進んだメモリー細胞とエフェクター細胞が多いことが判明した.
輝尽発光現象を利用した電子やイオンの二次元センサの開発とトンネル物性への応用

本年度も、輝尽発光現象を利用したFEMおよびFIM像記録媒体の開発を目指して研究を遂行した。得られた成果を以下に列挙すると(1)FEMおよびFIM像の二次元イメージセンサとして、現在、唯一利用が可能であるBaFBr:Euを用いたイメージングプレートの問題点を明らかにし、BaFBr:Euに優る記録媒体としてKBr:Eu蛍光体を見いだし、そのPSL特性を評価するとともに、イメージセンサ媒体として十分利用が可能であることを明らかにした。(2)昨年度の研究でSrS:Eu,Sm蛍光体がイメージセンサ媒体として有望であることを見いだした。本年度は、この媒体ならびに同じII-VI族化合物蛍光体であるCaS:Eu,Sm蛍光体さらにはこれらの2つの蛍光体の混晶だるCa_xSr_<1-x>S:Eu,Sm蛍光体についてもイメージセンサ媒体としての特性の評価を行い、いずれも媒体として利用が可能であることを明らかにできた。研究助成は本年度で終わりであるが、今後、上記の蛍光体を媒体として用いたFEM及びFIM像イメージセンサを開発し、トンネル物性解明のツールとして応用する所存であります。