hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血液・循環器・消化器病の診断・治療・予防のための計算ナノバイオメカニクスの創成

(2)マラリア感染赤血球のレオロジー特性や、微小循環内の血流を、独自に開発した粒子法ベースの数値解析手法を用いて調べた。数値モデルは随時改良中であるが、今年度は感染赤血球と正常赤血球間、および感染赤血球と血管内皮細胞間の接着現象のモデル化に成功した。今後は微小流路内の見かけの粘度変化や、感染赤血球の半径方向の移動に着目し、検討する。これらの成果は、国際会議論文および英文雑誌論文として発表されている。(3)境界要素法と粒子法による赤血球モデルの改良を行なった。また、血流の解析結果の妥当性を検証するため、共焦点micro-PIVシステムを用い、PDMSマイクロ流路内の赤血球の挙動観察および速度ベクトルの計測も行った。さらに、流路内の癌細胞の挙動計測も行った。それらの成果は、国際会議論文および英文雑誌論文として発表されている。(4)微生物や腸内細菌をモデル化し、微生物が高濃度で多数存在する場合を想定した集団遊泳の大規模数値シミュレーションを行った。そして流動特性に及ぼす微生物遊泳の効果を明らかにした。(5)粒子法を用い、胃の消化物の流動解析を行った。また、小腸内に形成される腸内フローラの数理モデル化を行い、細胞スケールからマクロスケールに渡る、マルチスケールシミュレーションを開発している。第一に,微小循環系の問題に対しては,これまでに開発した微小循環モデルの計算コードを領域分割法を用いて並列化し,赤血球を数千個含む大規模計算を可能にした.1050μm程度の微小血管において計算されたみかけの粘度や血漿層厚さなどが実験値と良い一致をすることを確認した.また,マラリア感染における薬効評価のため,マラリア感染赤血球と正常赤血球,またはマラリア感染赤血球と血管内皮細胞間の接着能を変化させるモデルを導入し,感染赤血球膜表面のタンパク(例えばPfEMP1)の発現の有無による赤血球流動の変化を解析することが可能となった.さらに,血小板血栓生成の問題に応用し,病的な血栓生成によって赤血球への力学的負荷が増大する可能性が示唆された.第二に,消化器系の問題に対しては,これまでに開発した胃内容物攪拌モデルを用いて胃内容物量,姿勢,さらに食物粘度による流動変化および応力変化の詳細を明らかにした.密度や粘度の異なる食物の多相流として取り扱うモデルに発展させ,胃壁から分泌される胃液との攪拌現象の解析を可能にした.また,嚥下造影画像に基づく嚥下の患者個別モデルを開発し,姿勢や食物粘度,さらには障害の有無による嚥下過程の変化を解析することを可能にした.さらに,小腸内の消化物流動モデルを構築し,小腸内での栄養素などの物質輸送現象の詳細を明らかにした.第三に,肺循環に関連し,肺動脈の末梢側に流動抵抗を与えるモデルを構築した.これを気胸発生時の肺動脈に応用し,その際の血液の酸素化に与える影響を明らかにした.さらに,グラフィックスプロセッサ(GPU)を用いた肺内気流の患者個別モデルを新たに開発し,医療現場での応用で重要となる安価で小規模な計算機での解析環境の構築に成功した.
安定同位体比を指標とする重金属の循環過程の研究

1.目的と実績:太平洋,日本海,東支那海において,海洋表層から深層にわたる海水試科と堆積物試科を採取した.海水試科は遠心分離法または限外〓過法により粒子を分別し,堆積物試科については間隙水を採取するとともに鉱物種別に分離した.これら各種試料中のAg, Cd, Cu, Ni, Pb, Tl, Znの濃度とPbの同位体存在比を表面電離質量分析法によって測定した.これら重金属の海洋における深度分布が,表層における粒子の生成,その沈降と深層における再溶解によるところが多い(Ag, Cd, Cu, Ni, Zn). Tlは表層において粒子中に含有される割合が少さく,沈降による深層での濃縮傾向が殆ど認められない. Pbについては, 1000mまでの濃度が深層にくらべて特に高く,またその同位体存在比が表層と深層で異なることが見出された.大陸源および人為源エーロゾルの海洋のImpactを示すものと考えられる.深層水と堆積物の関係について,日本海溝とHawaiiのLoihi海底火山で検討された. Pb同位体存在比については,日本海溝においては深層水と堆積物の間に一致が見られたがLoihiにおいては深層水と堆積物間のみならず堆積物の採取深度や鉱物種類間や間隙水との間にも相違が認められた.深海底と堆積物,間隙水との物質交換・続成作用を解析するためにPbの同位体存在比を指標として使用することができることが実証された. Pbの同位体存在比は海域(太平洋・日本海・東支那海)や深度によって相違することが認められたから,重金属の濃度や溶存状態の解析結果と併せて,海洋の深層循環を検討する指標となりうる.今後資料の蓄積によって深層循環の動態解析を可能とする基礎を構築できた.1.目的と実績:太平洋,日本海,東支那海において,海洋表層から深層にわたる海水試科と堆積物試科を採取した.海水試科は遠心分離法または限外〓過法により粒子を分別し,堆積物試科については間隙水を採取するとともに鉱物種別に分離した.これら各種試料中のAg, Cd, Cu, Ni, Pb, Tl, Znの濃度とPbの同位体存在比を表面電離質量分析法によって測定した.これら重金属の海洋における深度分布が,表層における粒子の生成,その沈降と深層における再溶解によるところが多い(Ag, Cd, Cu, Ni, Zn). Tlは表層において粒子中に含有される割合が少さく,沈降による深層での濃縮傾向が殆ど認められない. Pbについては, 1000mまでの濃度が深層にくらべて特に高く,またその同位体存在比が表層と深層で異なることが見出された.大陸源および人為源エーロゾルの海洋のImpactを示すものと考えられる.深層水と堆積物の関係について,日本海溝とHawaiiのLoihi海底火山で検討された. Pb同位体存在比については,日本海溝においては深層水と堆積物の間に一致が見られたがLoihiにおいては深層水と堆積物間のみならず堆積物の採取深度や鉱物種類間や間隙水との間にも相違が認められた.深海底と堆積物,間隙水との物質交換・続成作用を解析するためにPbの同位体存在比を指標として使用することができることが実証された. Pbの同位体存在比は海域(太平洋・日本海・東支那海)や深度によって相違することが認められたから,重金属の濃度や溶存状態の解析結果と併せて,海洋の深層循環を検討する指標となりうる.今後資料の蓄積によって深層循環の動態解析を可能とする基礎を構築できた.
大量の南極宇宙塵を用いたその分類学確立にむけた研究

第37、38、39、41次越冬隊によって回収された宇宙塵の研究を行った。第37および38次の試料は、ドーム基地造水槽、第39次のがやまと山脈裸氷帯、第41次のがとっつき岬裸氷帯からの宇宙塵である。これらの試料をドライあるいは冷凍状態で極地研クリーンルームへ持ち込み、宇宙塵の拾い出し作業を行うとともに、極地研に設置された低真空SEM/EDSにより非破壊で宇宙塵の同定を行い、カタログ化するとともに、岩石鉱物学手法、地球化学的手法を駆使した多様な分析的研究を行った。成果を出した主な研究手段としては、EPMA、高エネ研やSpring8での放射光施設を利用したガンドルフィーカメラによる構成鉱物とその存在比の同定、透過型電子顕微鏡、レーザーアブレーション希ガス分析、2次イオン質量分析による酸素同位体測定、放射光施設を利用したComputed Tomographyによる宇宙塵の3次元構造などが挙げられる。中でも含水珪酸塩鉱物に着目した研究から重要な結果が得られた。すなわち、南極宇宙塵の過半数はもともと含水珪酸塩鉱物からなる。一方、含水珪酸塩からなる隕石は、水質変成した炭素質コンドライトに限られ、その割合は1%程度である。この宇宙塵と隕石とに見られる含水鉱物を主体とするサンプルの量の大きな違いは、含水鉱物の脆い物性と関連していることが我々の研究から明らかになってきた。隕石との関連に着目すれば、最近落下した新しいタイプの水質変成した炭素質コンドライトに分類されたTagish Lake隕石は、南極宇宙塵と鉱物学的に共通した特徴を持つことが我々の研究により明らかになった。南極宇宙塵は少なからず南極氷床において化学風化を受けていることも本研究で初めて明らかになった。このことは古い氷床中の宇宙塵よりも、新雪中に含まれる宇宙塵が研究試料として適切であることを意味した。すなわち、ドーム基地周辺での雪中からの細織的な宇宙塵採集が最も良い試料が得られることが明らかになった。最終年度には、これまでの研究のまとめを行い、論文別刷および公開された宇宙塵のカタログ等とともに、300ページ以上の冊子を作成し本研究の報告書とした。当研究の対象とする南極宇宙塵はJARE37によるドームふじ起源のものと、JARE39がやまと山脈で採集したものである。ドームふじでは生活水を作る造水タンクの底に溜まったヘドロを持ち帰ってもらって、この中から宇宙塵を拾い出す作業を行った。これまでに230個を越す宇宙塵を分離採集することに成功した。これらについてはまずSEMによる外形記載を行った。その結果、大気圏に突入したときに受けた摩擦熱の程度によって、1;ほとんど受けていないもの、2;わずかに受けているもの、3;中程度から重度に受けているもの、4;摩擦熱によって完全に融けたものの4段階に分類できることが明らかになった。このうち2の段階のものが58%と最も多く、3が28%とそれに続く。摩擦熱の影響をほとんど受けずに、本来の形と組成を有するものはわずかに1個しか見つからなかった。平均粒径とこの分類には明瞭な関係があり、粒径が大きくなるほど、熱的影響を強く受けている傾向があることがわかった。JARE

39では、1998年の11月から12月にかけて、やまと山脈周辺の3ヶ所で総計24回、総計36トンの氷を融解して、水をろ過してその中の固形物を採集した。ろ過にはそれぞれの回で10,40,100,238μmの4種類のフィルターを用いた。総計96枚のフィルターを冷凍した状態で持ち帰り、順次解凍して固形物をフィルターから採集した。このうち5回分について、それぞれのフラックスから宇宙塵の分離採集を試みた。その結果、それぞれの40,100μmのフラックスから数10から100を越す宇宙塵を発見できた。これらは順次記載を行ってゆく予定である。今年は第39次南極観測隊がやまと山脈で氷を溶かして採集した固形粒子から微隕石様粒子の拾い出しを行った。それらは順次低真空SEMで非破壊分析を行い、微隕石を同定した。その結果1000個を越す微隕石を発見することができた。これらは順次SEMによる定性分析データとともに電子カタログ化し、公表した。微隕石はガラススフェルール、鉄スフェルール、石質スフェルール、非溶融微隕石に分けられた。このうち非溶融微隕石が最も多かった。大きさは10μmから290μmで、40μmから110μmの大きさのものが多い。サイズ分布はドームふじに比べて、粒径が小さいほうに偏っている。微隕石表面のMg/Si比を調べると、ほぼ現在堆積したドームふじ微隕石を最高に鞍かけ山、JAREIVの順に減少している。氷の年代が鞍かけ山は3万年、JAREIVは5万7千年と推定されることから年代が古くなるほどMg/Si比が小さくなることが明らかになり、この原因が氷中での風化である可能性が高いことがわかった。非溶融微隕石から、粘土鉱物で構成される微隕石が見いだされた。CIやCMタイプの炭素質隕石は粘土鉱物を含むことが知られておりこれらとの比較研究を行った。その結果この微隕石はsaponiteだけから構成され、炭素質隕石とは起源が異なることが明らかになった。昨年Tagish Lakeという新しい隕石が落下し発見された。この隕石は特異なCI隕石であることがわかってきたが、この微隕石はTagish Lale隕石と比較的似ていることが明らかになった。第39次南極観測隊がやまと山脈で氷を溶かして採集した固形粒子から微陽石様粒子の拾い出しを継続して行った。これらは順次低真空SEMで非破壊分析を行い、微隕石を同定した。その結果新たに500個を超える微隕石を発見することができた。これらはSEMによる定性分析データとともに電子カタログ化して、順次公表している。また、今年度に入って新たに持ち帰られた、第41次南極観測隊が沿岸裸氷域において氷を溶かして採集した固形粒子の初期処理を行い、微隕石様粒子の拾い出しを開始した。その結果、氷を融かした穴ごとに、微陽石様微粒子の数が極端に違うことが明らかになった。これは39次隊がやまと山脈で微隕石様粒子を採集した結果とは大きく異なっている。現在この違いが溶かした氷の年代の違いに起因するのか、あるいは採集時の技術的なことに起因しているのかの検討を進めている。微隕石は鉄スフェルール、石質スフェルール、ガラススフェルール、非溶融微隕石に分けられた。このうち非溶融微隕石はその表面の形態的な特徴から、全く溶融していないものから、部分的に溶融しているものまで、段階的に変化していることが明らかになった。
生体用形状記憶合金の研究

等原子量比付近のTiPd合金は、B2型母相からB19型マルテンサイト相に変態し、形状記憶効果を示すことが知られているが、その変態温度は最も低い場合でも300°C以上と高温である。そこで、変態温度の低下および機械的性質の改善を目的として、生体為害性の懸然からNiを全く含有しないTiPdーCo系生体用形状記憶合金の開発を試みた。その結果、Tiー42.5m01%Pd合金のPdをCoで一部置換したTiPdーCo合金の変態温度は、Co濃度の増加と共に低下し、Tiー42.5mol%Pd合金に比べ非常に低い値を示した。Tiー31.5mol%Pdー11mol%Co合金の変態温度は50°C付近であり、Tiー42.5mol%Pd合金のPdを一部Coで置換すると変態温度が著しく低下することがわかった。また、Tiー37.5mol%Pdー5mol%Co合金では、100200°Cで熱弾性型マルテンサイト変態を生じ、形状記憶効果を示した。TiPdーCo合金を900°Cで熱処理すると、Tiー37.5mol%Pdー5mol%Co合金は軟化し、Tiー42.5mol%Pdの約1/2程度の硬さ(VHN250270)となり、CoーCr合金(Vitallium VHN 350)の鋳造体よりも軟化していることがわかった。これらの結果を基に、生体用形状合金に適する組成として、Tiー50mol%Pd合金のPdをCoで20mol%置換したTiー30mol%Pdー20mol%Co合金(VHN 220)を検討し、この組成の合金が室温で超弾性を示し、0°Cから20°C付近で明瞭な形状記憶効果を示すことを見いだした。これより、生体に適する変態温度と加工可能な硬さを有するTiPdーCo合金は、インプラント材、歯冠修復材、加工クラスプ、歯列矯正用ワイヤそして整形外科用材料などの用途を想定した生体用形状記憶合金として有望な素材であることが示唆された。
細菌べん毛モーターの回転力発生に必須な回転子-固定子間物理的相互作用の検出

細菌のべん毛モーターは、細胞膜を介したイオンの電気化学勾配を回転力に変換するナノマシンで、固定子内を共役イオンが流れる際に、回転子と固定子が相互作用して回転力が発生する。ところが、回転機構を理解する上で決定的に重要な回転子と固定子の物理的な相互作用は未だに検出されておらず、イオン流に共役した両者の結合・解離の実態は全くわかっていない。そこで、生細胞のモーター内において、できる限り長時間固定子と回転子を相互作用させ、その条件において要素間光架橋または蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)といった高感度の手法により検出することを考えた。本年度は、まず回転子と固定子のアミノ酸残基間の光架橋を、すでにこの方法が確立されている大腸菌を材料として試みた。これまでに遺伝学的解析から、固定子の細胞質側領域と回転子タンパク質FliGが静電相互作用することが知られている。この領域の複数箇所に、光反応性架橋基を持つ非天然アミノ酸(pBPA)をAmber変異を用いて部位特異的に導入した大腸菌株を作成した。これらの株が光照射前に遊泳することを確認した後、UV光を照射し、全細胞タンパク質を抽出して免疫ブロットにより固定子タンパク質の検出を行ったところ、意外なことに複数の箇所において回転子タンパク質FliGとの架橋産物が見出された。つまり遊泳培地の粘性を上げる等の、固定子-回転子間相互作用時間を長くする工夫をせずとも、架橋が見られたことになる。回転子タンパク質FliG側においても、固定子と静電相互作用することが遺伝学的に示されているアミノ酸残基にAmber変異を導入し、同様にpBPAを用いて光架橋実験を行った。するとやはり、複数箇所において、固定子タンパク質MotAと架橋するFliGを検出することができた。現在、この架橋が、モーター内で生じているのかどうかの検討を行っている。本研究は、これまで検出できなかった細菌べん毛モーターの回転子-固定子間物理的相互作用の検出を目的としている。モーターの発見から45年が経過し、顕微解析技術の進展に伴いモーターの回転計測が詳細に行われるようになったにもかかわらず、回転力発生の現場である回転子-固定子間相互作用の実態が検出できなかったのは、この相互作用が極めて短時間かつ連続的に生じる特殊な性質を持つためと考えられた。そこで本研究では、1)相互作用時間を長くする、2)高感度の検出方法を用いる、という工夫により回転子-固定子間相互作用検出が可能になるのではないかと提案した。本年度はまず、誰も試したことがなかった、in vivo部位特異的光架橋法を試みた。生物材料としてすでに光架橋実験の成功例が報告されている大腸菌を用い、まずはNa+駆動型固定子PomA/PotB複合体と回転子FliGタンパク質間における相互作用の検討を行った。最初に、固定子タンパク質PomAの細胞質側領域において、回転子FliGとの静電相互作用が示唆されているアミノ酸残基をAmberに置換し、光架橋基をもつ非天然アミノ酸pBPAを部位特異的に導入した。複数箇所にpBPAを導入し、光架橋前には運動能を保持していることを確認した後、UV光を照射し、光架橋反応を誘起した。その後、全細胞タンパク質を抽出し、固定子PomAを免疫ブロットにより検出したところ、意外なことに複数箇所でFliGとの架橋が検出された。当初、細胞懸濁液の粘度を上げて回転速度を低下させ、回転子-固定子間の相互作用時間を長くすることを考えていたが、その操作なしに架橋産物が検出された。次に、FliG側にAmber変異を導入し、同様に光架橋を行ったところ、やはり固定子タンパク質MotAとの架橋産物が検出された。以上の結果は、回転子-固定子間の物理的相互作用を初めて検出できた可能性を示している。本年度は、大腸菌を用いたin vivo部位特異的光架橋実験により、固定子-回転子間の架橋に成功した。これまで、pull down, NMR, FCSと言ったin vitroの手法で見出せなかった相互作用を検出できたことは大きな進展である。しかし、今回はプラスミドからpBPAを導入した固定子(あるいは回転子FliG)を発現させ、染色体由来の回転子FliG(あるいは固定子MotA)と架橋させており、過剰に発現させたpBPA標識タンパク質がモーター外に存在するFliG(またはMotA)と作用し架橋している可能性を否定できない。そこで、pBPA標識固定子(あるいは回転子)とintactな回転子(あるいは固定子)を同時に発現するプラスミドを構築し、全てのべん毛遺伝子を発現できない変異体に導入して、モーターが構築されない条件下において同様の光架橋実験を行う。また、当初の提案通り、モーターに高い外部負荷を与えて、外部摩擦抵抗力により回転速度を大幅に低下させ、できる限り長時間固定子と回転子を相互作用させてみる。この時、架橋が促進されるかどうかを検討し、回転中のモーター内で生じた架橋の同定を試みる。続いて、相互作用相手の同定を試みる。運動能を阻害する変異を架橋相手側に導入し、架橋効率が低下するものを探索する。なお、大腸菌の固定子MotAと回転子FliGでは、1変異により運動能が大きく低下する一方で、ビブリオ菌の固定子PomAと回転子FliGの相互作用界面は複数の変異に耐性を示すことから、Amber変異そのものによる運動能への影響を最小限にすることが可能である。

今後の実験では、大腸菌をホストとし、ビブリオ菌の固定子PomAとFliG(実際にはビブリオ菌FliGのC末端領域を持つ大腸菌FliGキメラタンパク質)を用いた光架橋実験系を用いることを考えている。細菌のべん毛モーターは、細胞膜を介したイオンの電気化学勾配を回転力に変換するナノマシンで、固定子内を共役イオンが流れる際に、回転子と固定子が相互作用して回転力が発生する。ところが、回転機構を理解する上で決定的に重要な回転子と固定子の物理的な相互作用は未だに検出されておらず、イオン流に共役した両者の結合・解離の実態は全くわかっていない。そこで、生細胞のモーター内において、できる限り長時間固定子と回転子を相互作用させ、その条件において要素間光架橋または蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)といった高感度の手法により検出することを考えた。本年度は、まず回転子と固定子のアミノ酸残基間の光架橋を、すでにこの方法が確立されている大腸菌を材料として試みた。これまでに遺伝学的解析から、固定子の細胞質側領域と回転子タンパク質FliGが静電相互作用することが知られている。この領域の複数箇所に、光反応性架橋基を持つ非天然アミノ酸(pBPA)をAmber変異を用いて部位特異的に導入した大腸菌株を作成した。これらの株が光照射前に遊泳することを確認した後、UV光を照射し、全細胞タンパク質を抽出して免疫ブロットにより固定子タンパク質の検出を行ったところ、意外なことに複数の箇所において回転子タンパク質FliGとの架橋産物が見出された。つまり遊泳培地の粘性を上げる等の、固定子-回転子間相互作用時間を長くする工夫をせずとも、架橋が見られたことになる。回転子タンパク質FliG側においても、固定子と静電相互作用することが遺伝学的に示されているアミノ酸残基にAmber変異を導入し、同様にpBPAを用いて光架橋実験を行った。するとやはり、複数箇所において、固定子タンパク質MotAと架橋するFliGを検出することができた。現在、この架橋が、モーター内で生じているのかどうかの検討を行っている。本研究は、これまで検出できなかった細菌べん毛モーターの回転子-固定子間物理的相互作用の検出を目的としている。モーターの発見から45年が経過し、顕微解析技術の進展に伴いモーターの回転計測が詳細に行われるようになったにもかかわらず、回転力発生の現場である回転子-固定子間相互作用の実態が検出できなかったのは、この相互作用が極めて短時間かつ連続的に生じる特殊な性質を持つためと考えられた。そこで本研究では、1)相互作用時間を長くする、2)高感度の検出方法を用いる、という工夫により回転子-固定子間相互作用検出が可能になるのではないかと提案した。本年度はまず、誰も試したことがなかった、in vivo部位特異的光架橋法を試みた。生物材料としてすでに光架橋実験の成功例が報告されている大腸菌を用い、まずはNa+駆動型固定子PomA/PotB複合体と回転子FliGタンパク質間における相互作用の検討を行った。最初に、固定子タンパク質PomAの細胞質側領域において、回転子FliGとの静電相互作用が示唆されているアミノ酸残基をAmberに置換し、光架橋基をもつ非天然アミノ酸pBPAを部位特異的に導入した。複数箇所にpBPAを導入し、光架橋前には運動能を保持していることを確認した後、UV光を照射し、光架橋反応を誘起した。
転写および翻訳制御による膵β細胞ストレス応答の分子機構

膵β細胞において翻訳(タンパク合成)抑制因子4E-BP1が、ストレス応答のマスター転写因子であるATF4の活性化によって発現増加することを明らかにした。また、4E-BP1欠損マウスβ細胞は、小胞体ストレスに対し脆弱になっていることを突き止めた。これらのことから、小胞体ストレス下のβ細胞では、タンパク合成を抑制しておくことが生存にとっては利であり、そのために4E-BP1の発現が誘導されるものと考えられた。膵β細胞小胞体ストレスおよび酸化ストレス応答の特徴の解明膵β細胞の小胞体ストレスおよび酸化ストレス応答を特徴づけるために、β細胞株MIN6を小胞体ストレス誘導物質タプシガルギンおよび酸化ストレス誘導物質砒素に暴露し、タンパクおよびmRNAの発現解析を行った。Integratedstress responseとして知られる共通な応答に加え、酸化ストレス下でのJNK経路の重要性が明らかとなった。また、MIN6細胞とNIH3T3繊維芽細胞を小胞体ストレス誘導物質ツニカマイシン存在下で培養し、mRNAの発現変化を解析した結果、新たな小胞体ストレス応答分子を複数個同定した。膵β細胞ストレス応答を特徴付ける個々の経路の解析ストレス応答における翻訳制御Eif4E/4E-BP1系の役割の解析:in vivoにおける小胞体ストレス下での4E-BP1の役割を検討するため、Eif4ebp1遺伝子破壊マウスとWfs1遺伝子破壊マウスを交配し、Eif4ebp1・Wfs1遺伝子二重破壊マウスを作製した。また、異常インスリン分子の小胞体での蓄積のため糖尿病を発症するAkitaマウスとEif4ebp1遺伝子破壊マウスを交配し、4E-BP1が欠損したAkitaマウスを作製した。それらの解析によって、4E-BP1による翻訳抑制機構が小胞体ストレス下でのβ細胞の生存に重要であることを明らかにした。ストレス応答におけるセリン合成系の役割の解析:ストレス下のMIN6細胞におけるセリン合成系律速酵素3-ホスホグリセリン酸脱水素酵素(PhGDH)発現増加の役割を明らかにするため、MIN6細胞においてPhGDHの過剰発現などを行い、抗酸化ストレス応答における役割を示唆する結果を得た。膵β細胞小胞体ストレスおよび酸化ストレス応答の特徴の解明昨年までに、同定した新たな小胞体ストレス応答分子の機能解析を進めている。膵β細胞株MIN6細胞は核酸の導入効率が低く、RNAi法により目的遺伝子の発現を抑制させることが容易ではない。そこで、shRNAを発現する形質転換株を作成する必要がある。しかし、長期にわたるshRNAを発現によって目的遺伝子の発現を抑制させた場合、その直接効果とともに2次的効果が加わり、しばしば実験結果の解釈が難しくなることがある。この問題を克服するためにはshRNAの発現を薬剤誘導的に短期なものとすることが望ましい。そこで、shRNAを発現させるpolIIIプロモーターにテトラサイクリン・オペレーターを組み込んだもののうちMIN6細胞での活性が十分高いものの選択を行った。また平行してTet Repressorタンパクを高発現するMIN6細胞の形質転換株を作成した。この両者を用いることによって、目的遺伝子の発現を薬剤誘導的に抑制するMIN6細胞形質転換株を得ることが可能となった。さらに、翻訳抑制因子4E-BP1の発現を11種類の培養細胞株で検討したところ、MIN6細胞以外の細胞株では、小胞体ストレスによる4E-BP1の発現亢進が認められなかった。Eif4ebp1遺伝子の様々なセグメントを組み込んだルシフェラーゼレポーターを用いた解析により、多くの培養細胞株では、ATF4によるEif4ebp1遺伝子転写活性化が小胞体ストレス下で阻害されていることが明らかとなった。また、酸化ストレスによるJNKの活性化が小胞体ストレスによるIRE1-XBP1経路の効率を修飾することを見出した。
系列特異的細胞消去法を応用した免疫細胞の生体内機能解析

系列特異的細胞消去法による免疫細胞の機能解析のシステムを立ち上げるためのモデルスタディとして、これまで機能解析がほとんど進んでいない好塩基球を標的とした好塩基球欠損マウスの樹立を目標に研究を進めた。前年度の研究で、BACクローン上で相同組み換え技術を応用して、好塩基球特異的に発現しているプロテアーゼmMCP-8をコードする遺伝子の蛋白コード領域をジフテリア毒素遺伝子あるいは緑色蛍光色素(GFP)遺伝子に置換したコンストラクトを作製した。本年度は、緑色蛍光色素遺伝子に置換したコンストラクトをマウス受精卵に導入し、BACトランスジェニックマウスの樹立を試みた。生まれてきた子マウスの尾DNAの解析から、低頻度ながら、BAC由来遺伝子が組み込まれた子マウス数匹を得た。それらのマウスの末梢血をフローサイトメトリーで解析したところ、いずれのマウスにおいてもCD49b陽性FcεRI陽性の好塩基球におけるGFPの発現が確認されなかった。そこで、mMCP-8遺伝子を含む別のBACクローンを用いて、GFP置換コンストラクトを作製しなおした。このコンストラクトをin vitroでマウス骨髄細胞に導入したところ、好塩基球特異的にGFPが発現されることが確認された。そこでこのコンストラクトをマウス受精卵に導入したところ、生まれてきた子マウスの一部で、末梢血中の好塩基球におけるGFPの発現が確認された。現在、この好塩基球GFP陽性マウスの子孫を育成中であり、これらのマウスで好塩基球特異的なGFP発現が再度確認されれば、GFPの代わりにジフテリア毒素遺伝子を組み込んだBACコンストラクトを作製して、マウス受精卵に導入する予定である。DNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析ならびにRT-PCRによる個々の遺伝子の発現解析から、プロテアーゼの一種であるMMCP-8をコードする遺伝子がマウス好塩基球に特異的に発現していることが判明したので、MMCP-8遺伝子の蛋白コード領域をジフテリア毒素遺伝子あるいは緑色蛍光色素遺伝子に置換したコンストラクトを作製した。すなわち、MMCP-8遺伝子を含むマウス染色体断片(約200kbのBACクローン)を組み込んだ大腸菌を用いて、相同組み換え技術により、染色体断片上のMMCP-8遺伝子の開始コドンの直後にジフテリア毒素遺伝子あるいは緑色蛍光色素遺伝子を置換・挿入した。薬剤耐性により組み換え体をもった大腸菌を選別し、さらにDNAシークエンスにより計画通りの相同組み換えをおこしたクローンをスクリーニングし、最終組み換え産物を得た。MMCP-8遺伝子を含む3種類の異なるBACから3種類のコンストラクトを構築した。緑色蛍光色素遺伝子に置換したコンストラクトをin vitroでマウス骨髄細胞に導入したところ、3種のうちひとつのコンストラクトで好塩基球特異的に緑色蛍光色素が発現されることが確認された。そこで、このコンストラクトならびにジフテリア毒素遺伝子に置換したコンストラクトをマウス受精卵に注入し、トランスジェニックマウスのスクリーニングをおこなっている。
骨誘導の際にみられる特殊な石灰化現象が示す硬組織の石灰化機構

骨誘導因子による骨誘導過程にみられる特殊な石灰化現象であるAcellular Mineral Deposition (AMD)の形成機構およびその石灰化物が球状を呈する理由についての知見が得られた。本研究において我々は、AMDは移植後3日目より物理化学的現象によって起こることを明らかにした。さらに形態学的解析によりその石灰化の形態はコラーゲンの束の形態によって決まることを明らかにした。つまり、コラーゲン性の石灰化はコラーゲンの太い束が明瞭に残存するのに対して、球状石灰化の場合はコラーゲンの形態が不明瞭で、束は細く、方向性も一定しないことが明らかになった。また、歯胚の脱灰象牙質においてもまったく同様に、石灰化の形態とコラーゲンの形態との相関関係が明らかになった。しかも、象牙前室では石灰化が認められず、類骨や象牙前室のような非石灰化層の基質は石灰化層の基質とは、物理化学的石灰化に対して異なった反応を示すことが実験的に明らかとなった。これらのことを考慮して硬組織形成機構としてのMatrix Transforming Theoryを提唱する。この理論により類骨や象牙前質の様な非石灰化組織の存在意義が明らかになった。現在、AMDの形成を抑制する類骨や象牙前質中の蛋白質の検索を行っている。また、op/opマウスに関しては、全身の骨格標本の計測および組織学的観察から、膜性骨化よりも軟骨内骨化が強く抑制されていることが明らかになった。特に、肥大軟骨から骨芽細胞への変換と骨芽細胞の分化が著しく阻害されていた。さらに、軟骨基質に由来する特殊な石灰化過程が存在することが明らかになった。現在、微細構造学的にこれらの点について検討を行っている。主に骨誘導の際にみられる特殊な石灰化現象であるAcellular Mineral Deposition(AMD)の形成機構および球状石灰化の形成についての知見が得られた。我々はすでに、AMDは移植後3日目より物理化学的現象によって起こることを明らかにしている。今回さらにその石灰化の形態はコラーゲンの束の形態によって決まることが明らかとなった。これらのことを考慮して硬組織形成機構としてのMatrix Transforming Theoryを提唱した。

つまり、コラーゲン性の石灰化はコラーゲンの太い束が明瞭に残存するのに対して、球状石灰化の場合はコラーゲンの形態が不明瞭で、束は細く、方向性も一定しないことが明らかになった。また、歯胚の脱灰象牙質においてもまったく同様に、石灰化の形態とコラーゲンの形態との相関関係が明らかになった。しかも、象牙前室では石灰化が認められず、類骨や象牙前室のような非石灰化層の基質は石灰化層の基質とは、物理化学的石灰化に対して異なった反応を示すことが実験的に明らかとなった。これらのことを考慮して硬組織形成機構としてのMatrix Transforming Theoryを提唱する。この理論により類骨や象牙前質の様な非石灰化組織の存在意義が明らかになった。この結果については、第99回日本解剖学会総会、The 3rd World Congress for Oral Implantlogy、歯科基礎医学会賞受賞講演、International Association for Dental Research、第37回歯科基礎医学会総会にて報告し、現在論文投稿準備中である。さらに現在、このAMDの形成を抑制する類骨や象牙前質中の蛋白質の探索を行っている。また、op/opマウスに関しては、全身の骨格標本の計測および組織学的観察から、膜性骨化よりも軟骨内骨化が強く抑制されていることが明らかになった。特に、肥大軟骨から骨芽細胞への変換と骨芽細胞の分化が著しく阻害されていた。さらに、軟骨基質に由来する特殊な石灰化過程が存在することが明らかになった。この結果はDentistry in Japan,Vol.32,3-8,1995にて発表し、第100回日本解剖学会にて報告している。現在、微細構造学的にこれらの点について検討を行っている。
作物種子のバクテリゼーションによる土壌伝染病防除に関する研究

北大圃場土および北農試圃場土に生育するテンサイの根面微生物相を経時的に測定、比較した。温室でポット栽培したテンサイの根面微生物は、発芽後3週目まで増加しつづけ、その後はほぼ一定菌数を保った。菌類、放線菌、細菌、Pseudomonas,Bacillus,Agrobacteriumは両土壌間でほとんど差がなかった。Fluorescent Pseudomonasは農試土で多かった。農試土で紙筒育苗後、両圃場に移植し、1カ月毎に根面微生物を測定したが、温室実験の結果とほぼ同様であった。この場合にはFluorescent Pseudomonasの菌数にも大差はなかった。これらから1026菌株を分離し、テンサイ苗立枯病菌と培地上で対峙培養して、抗菌性を調べた。抗菌性を示す菌の割合は農試上で高かった。いずれにしても、立枯病菌に抗菌性の微生物は両土壌のテンサイの全生育期間中根面に存在し、いつでも分離できることがわかった。抗菌性細菌の多くはfluorescent Pseudomonasで、次いでnon-fluorescent Pseudomonas,Bacillusであった。1026株のうちAphanomyces cochlioidesに抗菌性のものは145株(14%)で、明瞭な阻止帯を形成し、何らかの抗菌性物質の存在が示唆された。A.cochlioidesに抗菌性の細菌の多くはPythium spp.,Rhizoctonia spp.に対しても抗菌性を示した。抗菌性の強い細菌47株を選び、これらをテンサイ種子に接種して紙筒に播種、4週間栽培して、発芽、生育、苗立枯を調べた。バクテリゼーションによって、発芽の促進されるもの、茎葉重の増加するもの、根重の増加するもの、この両者の増加するもの、苗立枯の減少するものなどがあった。発芽促進効果のあるものは、立枯病率が低かった。細菌のなかにはテンサイの生育を阻害するものもあった。本実験での立枯病防除効果は、主としてPythiumに対するもので、生育初期の効果が重要であった。発芽促進、生育促進、立枯病抑制に効果のある細菌12株を最終的に選択したが、その多くはfluorescent Pseudomonasであった。
ABCA1蛋白を介した細胞コレステロール輸送の制御

(1)ABCA1蛋白の活性制御機構:ABCA1蛋白を介するアポ蛋白A-1への細胞のcholesterol effluxは、カベオラと呼ばれるコレステロールに富んだ細胞膜構造を起点とし、この現象がPDGF (platelet-derived growthfactor;血小板由来増殖因子)によって活性化することを、光及び放射標識コレステロールアナログのカベオリンへのクロスリンク法を用いて示した。(2)マクロファージ泡沫細胞の形成機構:ABCA1遺伝子の発現上昇を担う転写因子であるLXRの内因性リガンドの同定のためには、酸化ステロールの高感度定量法を開発する必要がある。この目的のために、コレステロール及び酸化ステロールの電極酸化還元反応を検討し、その電気化学検出法開発への応用を試みた。予備的検討では、従来の誘導体化やコレステロール酸化酵素を一切使うことなく、コレステロール分子自身の酸化による、新しい検出法の開発が可能であることが示唆されている。【1】ヒトABCA1プロモーターのクローニングとその調節機構細胞生物学的手法を用いて、アポ蛋白A-1による細胞コレステロール引き抜き現象は、第一段階のリン脂質の引き抜きと、それに引き続くコレステロール引き抜きの、2つの段階から構成されることを示唆した(Biochemistry 39,14113-14120)。現在、cholesterol effluxの機構について、生化学的手法並びに放射標識したコレステロール誘導体を用いて更に詳細に検討している。
近代日本における欧米の先進土木技術の導入状況に関する実証的研究

平成1517年度の3年間にわたり、1)海外の現地調査と、2)国内外の資料収集とその分析を実施するとともに、新たな近代土木遺産の選定を行った。1)については、明治中期以降の日本の土木技術に大きな影響を与えたアメリカで、特に影響度の強いと思われる20件程度の橋、運河、ダムを選定し、現地調査を行うことで、技術史構築に関わる貴重な情報を収集できた。また、南樺太(サハリン)において日本技術者が手がけたダムの現状調査を行い、重要な情報を得た。最後に、ヨーロッパ近代の、防波堤、吊橋、コンクリート橋を調査し、それらの実態を掌握することで、該当する分野の技術史の構築に役立てることができた。2)の国内外のデータについては、ダム、港湾、吊橋、コンクリート橋の資料収集を積極的に進めた。ます、ダムに関して、世界アメリカ近代以降の日本につながる一連の流れを整理し、重力式(直線、曲線)、アーチ式、バットレス式にわけて、戦前の各種論文・文献をもとに、「技術の発達の必然性と取捨選択」について概略を把握できた。その中で、これまで古写真からわが国最初のアンバーセン式ダムと思われていたものが、実はマルティプルアーチダムであったことも確認できた。一方、港湾に関しては、防波堤や岸壁などの主要施設において急速に普及したケーソン工法に焦点を当てた。そして、欧米から導入された技術が、日本の環境に合わせて改良され、昭和10年代には世界でもトップレベルになっていたことを明らかにした。さらに、19世紀の吊橋とコンクリート橋に関しては、国内外の技術が、吊橋とコンクリート橋では、異なった経緯で発展していったことを確認した。最後に、近代土木遺産リストについて、ダムの技術評価に関わる記述を充実させるとともに、ケーソン式港湾施設に関わる新規データを追加することができた。近代日本の国造りにあたり欧米先進国から導入された士木技術が、(1)当時の世界の技術発達史上どのようなレベル・位置付けにあり、(2)その技術が日本国内でどのように受容され継承されていったか、また、それによって(3)個々の土木遺産の技術評価はどう変化するか、などについて明らかにしようとする、ことが研究の目的であった。初年度である平成15年度に実施したことは、大きく、a)海外の現地調査と、b)国内の資料収集とその一次分析の2つに分けることができる。まず、a)については、明治中期以降の日本の土木技術に大きな影響を与えたアメリカで、特に影響度の強い(相関性の高い)と思われる20件程度の歴史的土木構造物(橋、運河、ダム)をリストアップし、実際に現地を調査することで技術史構築に関わる大きなヒントを得ることができた。また、b)の国内データについては、ダム、水道、港湾関連の資料(古書の購入と古論文のコピー)収集を積極的に実施した(コピーのためには全国各地の図書館を多数訪れた)。その中で、まず、ダムに関して、世界のダム発達史アメリカのダム発達史近代以降の日本のダム発達史につながる一連の流れを整理し、特に、日本のダム技術史に関しては、重力式(直線、曲線)、アーチ式、バットレス式にわけて、戦前の各種論文・文献をもとに「技術の発達の必然性と取捨選択」について概略を把握することができた。これについては3本の学術論文を既発表、1本を準備中である。また、港湾と上水道に関して、時代の流れと技術の間にある大きな相関をつかむ作業を続けてきた。この中から、港湾に関しては1本の学術論文を準備中である。当初予定していた橋(吊橋)、トンネルについては、平成16年度の課題として準備を進めている。

近代日本の国造りにあたり欧米先進国から導入された土木技術が、(1)当時の世界の技術発達史上どのようなレベル・位置付けにあり、(2)その技術が日本国内でどのように受容され継承されていったか、また、それによって(3)個々の土木遺産の技術評価はどう変化するか、などについて明らかにしようとする、ことが研究の目的であった。2年目である平成16年度に実施したことは、大きく、a)海外の現地調査と、b)国内の資料収集とその一次分析の2つに分けることができる。まず、a)については、戦前、日本の外地であった南樺太(現・サハリン)において、日本技術者が手がけた土木構造物(ダム、港湾、鉄道)をリストアップし、実際に現地を調査することで技術史構築に関わる大きな情報を得ることができた。具体的には、これまで資料(古写真)からわが国最初のアンバーセン式バットレスダムと思われていたダムが、実際にはマルティプルアーチダムであったことを現地で確認し、わが国では唯一のRCによる同形式であることが判明した。また、b)の国内データについては、古書の購入や全国各地の図書館を訪れ、港湾、ダム関連の資料収集を積極的に実施し、時代の流れと技術の間にある大きな相関をつかむ作業を行ってきた。港湾に関しては、明治後期から昭和戦前期を対象として、特に防波堤や岸壁などの主要施設の工事において急速に普及したケーソン工法に焦点を当てた。その中で、欧米から導入された技術が日本の環境に合わせて改良され、昭和10年代には世界でもトップレベルになっていたことを明らかにした。これに関しては1本の学術論文を準備中である。ダムに関しては、これまでほとんど明らかにされてこなかった潅漑用ダムと砂防ダムに着目し、他の分野と比べてコンクリート化の遅れた要因を探索中である。なお、当初予定していた橋梁(吊橋)、トンネルについては、平成17年度の課題として準備を進めている。この研究テーマに関して、最終年度となる平成17年度に実施したことは、a)海外の現地調査(科学研究費ではなく運営費交付金で実施)、b)国内外の資料収集と分析、c)研究成果報告書の作成、の3つに分けることができる。まず、a)については、費用の関係から、運営費交付金で実施したが、内容的には、本研究を補強するものであり、ヨーロッパの近代に構築された、防波堤、吊橋、コンクリート橋を調査した。それにより、初期の防波堤、斜張橋と分岐する境界線上にある吊橋、初期の量塊コンクリート橋の実態を掌握し、当該分野の技術史の構築に役立てることができた。また、b)の国内外のデータについては、19世紀の吊橋とコンクリート橋に関わる海外のデータ、及び、明治大正期における同種の構造物に関わる資料の収集を図り、海外の技術とわが国の技術が、前者(吊橋)と後者(コンクリート橋)では、異なった経緯で発展していったことを確認した。
社会調査の困難状況に対応するコンピュータ支援型複合モード調査法の実装

2018年度は,2019年度以降に予定している調査方法論的実査や多文化共生に関する複合モード社会調査の準備期間である。7月半ばに第1回研究会を開催して当初の計画・調査設計の再検討を開始した。日本でどの様な新規の調査方法が試行できるかの具体的検討の為に,社会調査の現場についての調査会社ヒアリングを8月に轟と杉野で実施し,実践的可能性についての理解を深めた。これは特に方法論的実査の再設計に関して重要である。また杉野は欧州社会調査学会主催のビッグデータと社会調査に関する研究大会(10月スペイン)に参加し,ビッグデータ時代におけるヨーロッパでのプライバシー保護の状況や公的登録情報・SNS発信情報と社会調査情報の関連付け,標本リクルート誤差とデータ符号化誤差の合計としてみる「一般化された総調査誤差枠組」などについて情報を収集した。2019年1月には尾嶋・平沢・杉野でミラノ大学の政治科学者を訪問し,最新のイタリア選挙調査の変容や社会科学的調査の現状について情報収集を行ってきた。また前身科研での調査データの分析結果を国際学会(2019年7月)で報告する計画を策定し,分析を進めている。その他,轟は関連科研で若者ウェブ調査を実施して登録モニターウェブ調査についての検討を進め,杉野は別科研プロジェクトで弁護士に対する複合モード調査を実施して,複合モード運用についての分析を行っている(その一部は2019年6月の国内学会で報告予定)。更に,更に別科研で実施した法社会学的な全国調査のデータ修正作業を主導し,データハンドリングについての手法を開発しつつ,その応用として項目無回答についての分析に着手した。実査を行っていない為本経費で実施した調査データを用いた学会報告や論文等はないが,関連プロジェクトのデータ分析の学会報告や,社会調査方法論を含めた社会科学方法論についての編著書収録論文刊行は行った。2019年度に方法論的研究の為の実査,2020年度に多文化共生等を内容とする社会調査を行う計画で,まずは方法論的調査研究について検討を行ってきたが,一般の人々の協力傾向や,社会調査の実施に関わる電話・自宅訪問等に関する文化的環境の特性と云った日本の社会調査環境,調査会社の(ICT機器や面接調査員などの)標準設備や新規の調査方法に関する経験と意向,そして予算制約などから,革新的な方法での実査の実現可能性について再検討を行う必要が強まった。日本国内でも学会や他の調査研究プロジェクトだけでなく学術会議などの動向も踏まえて調査方法の実験的研究課題を明らかに,外国に関しても,つい最近になって従来型世論調査からウェブ調査に転換したイタリア選挙世論調査の状況をヒアリングするなどして,方法論的実査への示唆を得るなどの活動を行ってきた。それに伴い,方法論的調査の検討が2019年度に入ってからとなり,実施時期が2019年末2020年第1四半期になると思われる。2019年8月までに,社会調査会社の現状視察やヒアリングなども行って実施可能性を見極めながら,方法論的実査の具体的な設計を進める。2019年度の第1回研究会を6月2日3日に予定している。そこでの検討に基づきつつ,夏の終わりから秋頃に,研究倫理審査,調査実施委託先の入札などを行い,年末以降の年度内に方法論的実査を実施する計画である。その間,7月にクロアチアで開催される欧州社会調査学会でこれまでの研究成果の一部を発表すると同時に,欧米での社会調査研究の先端的知見を収集して方法論的実査へのヒントとする。それ以外にも可能であれば海外視察を行い,特に世界的にも重要性を増しているウェブ調査に関連して最新情勢を研究して方法論的実査設計に活かす事を検討する。

2019年度に方法論的研究の為の実査,2020年度に多文化共生等を内容とする社会調査を行う計画で,まずは方法論的調査研究について検討を行ってきたが,一般の人々の協力傾向や,社会調査の実施に関わる電話・自宅訪問等に関する文化的環境の特性と云った日本の社会調査環境,調査会社の(ICT機器や面接調査員などの)標準設備や新規の調査方法に関する経験と意向,そして予算制約などから,革新的な方法での実査の実現可能性について再検討を行う必要が強まった。日本国内でも学会や他の調査研究プロジェクトだけでなく学術会議などの動向も踏まえて調査方法の実験的研究課題を明らかに,外国に関しても,つい最近になって従来型世論調査からウェブ調査に転換したイタリア選挙世論調査の状況をヒアリングするなどして,方法論的実査への示唆を得るなどの活動を行ってきた。それに伴い,方法論的調査の検討が2019年度に入ってからとなり,実施時期が2019年末2020年第1四半期になると思われる。2019年8月までに,社会調査会社の現状視察やヒアリングなども行って実施可能性を見極めながら,方法論的実査の具体的な設計を進める。2019年度の第1回研究会を6月2日3日に予定している。そこでの検討に基づきつつ,夏の終わりから秋頃に,研究倫理審査,調査実施委託先の入札などを行い,年末以降の年度内に方法論的実査を実施する計画である。その間,7月にクロアチアで開催される欧州社会調査学会でこれまでの研究成果の一部を発表すると同時に,欧米での社会調査研究の先端的知見を収集して方法論的実査へのヒントとする。それ以外にも可能であれば海外視察を行い,特に世界的にも重要性を増しているウェブ調査に関連して最新情勢を研究して方法論的実査設計に活かす事を検討する。
小児口腔における歯周病原性細菌の伝播と定着にプラーク構成多糖が及ぼす影響の解明

小児口腔内での歯周病原性細菌の伝播や定着に、多糖(フルクタン)分解酵素が関与することを解明するためグラム陰性菌のフルクタン分解酵素の性状解析を行った。続いて、小児および母親の口腔内からの歯周病原性細菌の検出をPCR法を用いて行った。小児の歯周疾患は主に歯肉炎であり骨破壊を伴う歯周炎は稀である。しかしながら成人の歯周疾患をもたらす歯周病原性細菌は小児のプラークからも検出され、小児期に感染していることが報告されている。これらの菌はプラーク中からも検出されることからプラークから増殖のための栄養源の得ていることは推測されるが詳細は不明である。申請者らは歯周病原性グラム陰性菌の一部が多糖分解能をもち、プラークを構成する多糖を栄養源として利用することを明らかにした。そこで、歯周病原性細菌の口腔内への初期定着にこの多糖分解能が関わるのではないかと推測した。本研究では妊娠期・出産後の母親とその子供を対象として歯周病原性細菌の口腔内への定着時期および初期定着における多糖分解酵素の関与を解明することを最終目標としている。本年度は歯周病原性細菌であるPrevotella属に着目しP.loescheiiのフルクタン分解能の解析を行ったので報告する。P.loescheiiは糖無添加時よりもフルクタン特にレバン添加時で菌の濁度が高く、菌の培養上清中に分泌されるフルクタン分解酵素は、レバンに対する基質特異性が高かった。しかしながら既知のフルクタン分解酵素遺伝子をもとに組換えフルクタン分解酵素を精製し解析したところ、イヌリンに対する基質特異性が高かった。このことからP.loescheiiは今回解析したフルクタン分解酵素の他にもフルクタンを分解する酵素をもつことが示唆された。また、小児口腔における歯周病原性細菌の伝播と菌の定着を解明するため本年度は小児から採取するサンプルの選択、採取時期および採取方法を検討している。サンプルは唾液を用い、採取時期としては新生児期、離乳食開始前期、乳切歯萌出期、一歳児期の4回とし同一対象者から継続的にサンプルを採取する予定である。小児の歯周疾患は主に不潔性の歯肉炎や萌出性の歯肉炎であり、骨破壊を伴う歯周炎は稀である。成人の歯周疾患をもたらす歯周病原性細菌は小児からも検出され、小児期に感染していることが報告されている。しかしながら、歯周病原性細菌の伝播と菌の定着については不明である。今年度は妊娠期・出産後の母親とその子供を対象として歯周病原性細菌の口腔内への定着時期についての解明を目的とした。まず妊娠期・出産後の母親とその子供から口腔内の歯周病原性細菌を採取するため、サンプルとして唾液を使用した。唾液を選択した理由として乳児期からのサンプル採取を行う必要があり無歯顎の時期が含まれることが要因となっている。子供のサンプルの採取時期は1新生児期(0か月)2離乳食開始前期(3,4か月)3乳切歯萌出期(6か月)41歳児期とした。出産後の母親とその子供から継続的にサンプル採取を行っているのは現在13組であり、同一の対象者から少なくとも1から4の2期間を継続して採取することを条件とした。歯周病原性細菌の検出は、唾液中の細菌DNAの精製を行いPCR法を用いて行った。今回検出を行った歯周病原性細菌の一つであるPrevotella intermediaは、子供において無歯顎期から検出され継続して検出されるものと、継続して検出されないもの、全く検出されないものと様々であった。今回対象とした子供において、歯周病原性細菌の感染は認められるが、定着には至っていないことが示唆された。低年齢児の口腔内における歯周病原性細菌の検出を行うため、当初の予定を変更し唾液をサンプルとして採取することにした。さらに必要量の唾液を採取することが困難であり唾液の採取方法を再度検討したため研究がやや遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。サンプルとして使用する唾液の採取方法が確立できたので、研究協力施設において母親とその子供の唾液を経時的に採取しリアルタイムPCR法を用いて歯周病原生性細菌の細菌量を定量する。さらに歯周病原性細菌の母子伝播および定着時期を解明する予定である。