hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト細胞を用いた外因性内分泌撹乱化学物質による生体毒性評価手法の開発

試験を実施し、発癌性物質と内分泌撹乱性物質のDNAレベルでの作用機構の共通点および相違点を把握すると共に、その影響を定量的に比較するための指標とその定量方法を提示することを目指して研究を推進した。平成12年度は、特に、ヒト細胞を用いた新しい内分泌撹乱性の検出法を開発した。この試験系は、エストロゲンレセプターにエストロゲン(様)物質が結合してから、標的遺伝子が活性化するまでのプロセスを、ヒト細胞を用いて再現しようとする、いわゆるレポーターアッセイに分類される方法である。ヒト乳ガン細胞MCF-7に、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子pGL3と、エストロゲン受容体の標的遺伝子の上流にあるエストロゲン応答配列(DNA塩基配列)EREc38を3個連結したpGL3-3 EREc38を用い、また、検出感度を向上させるために、エストロゲンレセプター発現ベクターとしてpHEGO-Hygroの利用を試みた。この試験法の適用には、(1)ヒト乳ガン細胞MCF-7にpHEGO-Hygroおよびレポーター遺伝子pGL3-3 EREc38を導入し、(2)評価対象の化学物質を曝露し、(3)発光基質を添加し、(4)発光量を測定する手順を踏むことになる(マイクロプレート使用)。17βエストラジオールを用いた試験により、既に酵母を用いる試験系にやや劣る程度の感度を確認した。
胃がんのケモカインシグナルと幹細胞のクロストークを標的とする新規抗がん治療

身体を構成する臓器は、臓器ごとに異なる正常体性幹細胞により恒常性が保たれる。幹細胞は自己複製能と多分化能を有する。がん組織中にも、周辺のがん細胞を生み出すがん幹細胞があり、転移を含む腫瘍の悪性化、治療抵抗性などに重要であると示されつつある。幹細胞は単一ではなく、rapid growing, slow growingなものなど複数存在し、外部刺激に対し幹細胞が相互作用し、応答すると報告されている。脳腫瘍においてslow growingの幹細胞が腫瘍増大を促進する(Cancer cell 2012)、肺ではslow growingのAT2細胞の幹細胞機能が、AT1細胞障害時に活性化される(Nature 2014)、小腸でもslow growingのBmi1陽性幹細胞が放射線障害時にrapid growingのLgr5陽性細胞の機能を代償する(Nature 2011, Proc Natl Acad Sci U S A 2011)、胃においてslow growingのTroy陽性幹細胞が、抗がん剤によるDNA damageに対し、reserverとして機能する(Cell 2013)、等である。大腸がんや膵臓がんの現在の分子標的治療の効果が乏しい理由を、1)がん幹細胞に対する効果不十分、2)がんが生存の代償的経路を活性化させる、と考える。この考えに基づき、大腸がんのオートファジー阻害時の小胞体ストレス応答の代償的活性化を発見、両経路の阻害が効果的であることを示した(文献Sakitani K et al. 2015 BMC Cancer)。Mist1を標的とする抗がん剤治療は効果を示すが、別の胃前庭部のがん幹細胞マーカーCCK2Rが代償的に増加することを発見した。これらのことから、代償的増殖幹細胞を含めた複数のがん幹細胞を同時に標的とする新規抗がん療法の有用性が期待できると考え研究を進めている。Cxcr4とMist1はオーバーラップし、double positiveの細胞は高いcolony formation abilityを示す一方、Cxcr4とCCK2Rはオーバーラップなしであった。Mist1を標的とする治療時に代償的にがん細胞生存に働く経路・分子・タンパクの網羅的検索のためにマイクロアレイ、プロテオミクス解析等を検討する。特に、神経・血管・免疫細胞といったがん微小環境から誘導されるサイトカインに着目する。
プロセスプラズマの電子エネルギー分布関数と化学反応性の制御

半導体の微細加工プロセスで用いられるプラズマは、高度な制御性が求められている。そのために、プラズマ中の化学活性種の組成を決定する電子エネルギー分布関数が重要視されている。本研究では、プラズマ中の化学活性種と電子エネルギー分布関数の制御に関する一般的な指針を得るために、次の項目について重点的に研究を行った。(1)電子エネルギー分布関数の制御:電離電圧の異なる希ガスを混合させた時の電子エネルギー分布関数の計測を詳細に行い、バルクの電子温度は、粒子バランスから導出される電子温度とほぼ一致することを明らかにした。また電離電圧が低いガスを混合させることにより低温・低解離プラズマが生成できることを見出した。(2)化学活性種組成比の希釈ガス依存性:圧力一定の条件下において希釈ガス種を変えたときのフルオロカーボンプラズマ中のラジカル組成を出現質量分析法により計測を行い、グローバルモデルより求めたラジカル組成比と定性的に一致することを明らかにした。半導体プロセスで用いられるプラズマは、より高度な制御性が求められており、プラズマ中の化学活性種の組成を決定するエネルギー分布関数が重要視されている。本研究の目的は、プラズマ中の化学活性種と電子エネルギー分布関数の制御に関する一般的な指針を得ることであり、本年度は次の項目について重点的に研究を行った。(1)電子エネルギー分布関数計測のための機器の購入・製作:高性能の絶縁プリアンプ、A/Dコンバーターを用い再現性・信頼性の高い計測を可能とした。(2)電子エネルギー分布関数の計測と制御:異なるプラズマ生成源(表面波プラズマ、誘導結合プラズマ)を用い、電子エネルギー分布関数の違いを詳細に調べ体積加熱と表面加熱の違いを明らかにした。(3)希釈ガス依存性:混合する希ガスを、He,Ne,Ar,Kr,Xeと変化させ、電子エネルギー分布関数、電子温度の電離電圧依存性を実験及び計算から明らかにした。
関節疾患における軟骨分化機能の発現とその治療応用

整形外科領域において軟骨細胞は大きな、位置を占める。成長を含め軟骨細胞は各種ビタミン、ホルモン、サイトカインの影響を受ける。我々は現在まで軟骨型分化機能の発現を検索するため、初期にはウサギ肋軟骨より静止、成長細胞をそれぞれ分離し各種Factorの影響を検索してきた。更にそれを基本として、整形外科に於ける変形性関節症(OA)ならびに慢性関節リウマチ(RA)等の、病態を解明してきた。ヒト、サイトカインの影響を、調べる場合、ウサギならびにラット等の異種軟骨細胞では反応が修復を受け結果が全く事がある。我々は分化機能を維持しつつ永久裂能を有した軟骨細胞株の樹立に成功し、また無血清培地に於ける、継代も可能となった。更にRAに対するAdjuvant Arthritis,OAにたいして非侵襲性OA誘発モデル、又、骨折治癒モデルとして創外固定器を用いた骨欠損モデルを作成した。細胞レベルの検索として、RAに関して、この細胞株を基盤にRAに於ける軟骨細胞膜蛋白に対する抗体の検出、更に病態との関連、RA血中Faotorによる細胞外基質の破壊のバイオアッセイ形の確立(ウサギ軟骨細胞培養系では、確立した)まだ骨欠損モデルに於ける軟骨より骨細胞への分化機転を解明(bFGFによる骨折治癒機転の解明は行ない、血管増生と共に間葉系の増殖分化は確認している)一方関節症モデルとして非侵襲性の変形生関節症モデルの確立に成功しているが初期OAの細胞生物学的検知より培養細胞の結果を元により詳細な検索を行う。軟骨細胞の分化機能の発現を検索することにおいて軟骨材料の入手は困難であり、ひと以外の細胞を用いる場合サイトカインの影響は種特異性が強いものが多く、またヒト軟骨細胞の持続的な入手は困難であるわれわれの樹立した軟骨肉腫細胞株は、その点で有利であり詳細な検索が容易となる。骨欠損モデルに於けるサイトカインの影響を、主にbFGFを用いたがさらにTGFbeta、EGF等も検索し骨折治癒機転における内軟骨化のメカニズムを更に詳細に検討する。一方、RAの治療体系の確立のため細胞外基質破壊を指標としたバイオアッセイ系の確立を行なったが更にFactorのけんさくを行なう。血中特異抗原の検出を行ない現在慢性関節リウマチの治療体系は未だ確立されておらず直接の検索法は皆無に等しいが我々の方法は、一助となる。非侵襲性OAモデルにより初期のOA変化を観察でき薬物の影響等観察可能になると考えられ、将来られるであろう変形を予防するに当たっても多くの治験が得られると考えられる。軟骨細胞は、関節機能にとって中心的な存在であり、整形外科領域においても、重要な位置を占める。ヒト、サイトカインの影響を、調べる場合、ウサギならびにラット等の異種軟骨細胞では反応が修飾を受け結果が全く事がある。

我々は分化機能を維持しつつ永久分裂能を有した軟骨細胞株の樹立に成功し、また無血清培地に於ける、継代も可能となった。更にRAに対するAdjuvant Arthritis,OAにたいして非侵襲性OA誘発モデル、又、骨折治癒モデルとして創外固定器を用いた骨欠損モデルを作成した。今後は、細胞レベルの検索として、RAに関して、この細胞株を基盤にRAに於ける軟骨細胞膜蛋白に対する抗体の検出、更に病態との関連、RA血中Factorによる細胞外基質の破壊のバイオアッセイ系の確立(ウサギ軟骨細胞培養系では、確立した)また骨欠損モデルに於ける軟骨より骨細胞への分化機転を解明(bFGFによる骨折治癒機転の解明は行い、血管増生と共に間葉系の増殖分化は確認している)一方関節症モデルとして非侵襲性の変形性関節症モデルの確立に成功しているが初期OAの細胞生物学的検知より培養細胞の結果を元により詳細な検索を行う方針である。ヒト分化型軟骨肉腫より我々は世界で初めての軟骨分化機能を維持しつつ永久分裂能を持つ細胞の分離に成功したが、これらの軟骨分化機能の発現の発現様式をより詳細に検討する為、軟骨細胞のmーRNAの抽出を行った細胞の分化機能をも検討、さらに臨床例より得られた滑膜、関節液との関連をサイトカインの測面より検討し又、リウマチ様関節炎、変形性関節症における臨床検査の確立の目的で、株化軟骨細胞膜に対す血中抗体を測定し、特に軟骨細胞との直接的な検査法のなかったリウマチ様関節炎において病態を反影する検査法の樹立を試み、特異性の認める蛋白成分を検出した。更に、関節手術時採取した軟骨組織もその病態を正確に反影しており、多くの知見を得てきたが、細胞外基質の修飾を無視できず、より生理状態に近い遺伝子発現に関する研究が必要となり、mーRNAを試みた。病態を検出するProbeが今後の課題であり一方、RA血中抗体の検出においてもsample数に問題があり、より多くの症例に対し、検索を進める予定である。ヒト分化型軟骨肉腫細胞株の樹立に成功したが、現在その維持においてウシ胎児血清の影響を除く偽、無血清培地による培養条件を設定している。更にその細胞壁蛋白と、慢性リウマチの関連において、特に関節の障害程度と膜蛋白に対する抗体とが相関を示した。今后これらの抗体産生の機序、並びに中和抗体による病態の修飾に応用可能と考える。一方、骨折の治療機転や骨延長術にも軟骨型分化機能の発現が重要な位置を占めており、骨折の癒合不全における癒合促進、又骨骨延長治療法に対する効果判定に新しい知見を提供可能と考える。椎間板組織も軟骨の機能と同等な役割を行なっており、その変動は腰痛、脊髄の障害につながる。椎間板において、軟骨様機能の生化学的、生理学的解析は十分になされているとは考えられず、現在種々のモデルを用いて実験を行っているが、炎症時又、損傷時軟骨性特性、特に粘弾性に大きく影響を与える成分の変動が著しく、椎間板変性との関連で興味ある結果を得ている。
広い吸収領域を持つ高分子の開発と超分子手法を用いたバンド及ひバルク構造制御

本研究では電子ドナーと電子アクセプターを縮環させた分子を新規に開発し、これを基に有機薄膜太陽電池のためのポリマーを合成した。ジチエノナフトチアジアゾール(DTNT)とドナー性のビチオフェンを縮合させたポリマーではポリマー主鎖に非局在化したHOMOからチアジアゾール部位に局在したLUMOへのCT吸収が見られ長波長側に吸収帯が拡張された。一方、DTNTあるいはジチエノベンゾキノキサリンとアクセプター性のジケトピロロピロールを縮合させたポリマーでは吸収末端が900nmを超え、HOMO、LUMOエネルギーが太陽電池として働き得る下限となるポリマーを得ることが出来た。本研究課題は電子不足骨格を有する新規ポリマーの開発と超分子手法を用いた低分子ゲストによる物性・構造制御を目指す。本年度は電子ドナーと電子アクセプターが縮環したジチエノナフトチアジアゾールを新規に開発し、これを基にポリマーを合成した。相手に電子ドナーであるビチオフェンユニットを用いた場合、長波長側に新たな吸収帯が観測された。TD-DFT計算の結果、HOMOはポリマー主鎖に非局在化、LUMOはジチエノナフトチアジアゾール部位に局在化しており、CT吸収によって吸収帯の数が増えたことが分かった。これを用いた有機薄膜太陽電池は2.76%の変換効率を示した。相手に電子アクセプターであるジケトピロロピロールを用いた場合、吸収末端は915nm(=1.36 eV)まで伸び、HOMOのエネルギーも5.43eVとなり、狭バンドギャップかつ低HOMOのポリマーの設計指針が得られたと考えている。昨年度はアクセプター性を持つジケトピロロピロール(DPP)と新規に開発したジチエノナフトチアジアゾール(DTNT)を共重合したポリマーを用いたがLUMOのエネルギー準位が低くなりすぎたためにフラーレン誘導体(PCBM)に対し光電子移動が起こらず太陽電池として機能しなかった。本年度は昨年度の結果を受けて、DPPとの共重合したポリマーでPCBMとの組み合わせにおいて最大のエネルギー効率が得られるようなドナー性のポリマーの開発を行なった。DTNTの難溶性と低いLUMOを与える構造を改良し、1)可溶性置換基としてアルキルチオフェンを導入したDTNT-Tあるいは2)部分構造をチアジアゾール骨格からジアルキルピラジン骨格に変化させたDTBQをモノマーとして新たに開発した。これらを基に合成したポリマーDTNT-T-DPP(P1)とDTBQ-DPP(P2)はバンドギャップが1.31 eV、1.37 eVとDTNT-DPPと同程度であり、LUMOは-3.95 eV、-3.92 eVでどちらもPCBMに光電子移動が可能なエネルギー準位であった。ポリマーとPCBMが1:3の時に最高効率が得られP1、P2でそれぞれ1.46%、3.29%の光電変換効率が得られた。高分子化学当初の目的通り、アクセプター部位をポリマー主鎖から遠ざけることでCT吸収帯を新たに増やすことができた。また、高効率化に必要不可欠な狭バンドギャップかつ低HOMOのポリマーの設計指針が得られたことで、合成すべきポリマーが明確になった。狭バンドギャップかつ低HOMOのポリマーの設計指針が得られたので、それを基にさらに高い変換効率を示すポリマーの開発を行う。また、それらについてゲスト分子導入による物性・構造制御を試みる。前倒し請求により、次年度の予算が大きく削られる結果になった。研究に不自由が生じないように残った金額は次年度に使いたいと考えた。成果発表のための旅費及び消耗品の購入に充てる。
エックス線透過撮影による平安時代寄木彫像技法の発展に関する研究

エックス線透過写真を利用しての、平安時代寄木彫像研究の本格的進展を目的とする本研究は、次の二点を主たる研究目的とする。すなわち第一には、寄木彫像作品に対するエックス線透過撮影技術の確立、第二には収集したエックス線透過写真資料を利用しての新たな研究成果を導き出すことである。第一の研究目的は、正・側二方向からの全身立体的透過撮影法を確立し、さらにその方法で東北・関東・近畿・四国・九州の各地方所在の計104点に及ぶ多量の作品について、透過撮影を実施することで、当初計画通りの達成をみた。また本研究で新たに収集されたエックス線透過写真を利用することで、従来不明のままであった京都・平等院の雲中供養菩薩像52体すべての像内内刳の実態が完全に解明されたが、これは第二の研究目的達成を意味する重要な研究成果といえる。収集した多量のエックス線透過写真資料は、すべて整理が完了し、写真資料目録を作成した。また調査・研究および研究成果の概要は、平成二年三月刊行の研究成果報告書で報告した。近畿地方所在の寄木彫像作品のエックス線透過撮影を実施し,現在までのところ40点以上の作品について,それぞれ正面全身・側面全身のエックス線透過写真を収集することが出来た.撮影フィルムはすべて現像を終え,いずれも密着方式によって焼付写真を作成し,それを継ぎ合せて,各像の正面・側面の全身像が隨時に詳察できるよう整理してある.平等院(京都)の国宝・雲中供養菩薩像は,寄木彫像の完成者である仏師定朝とその工房によって制作されたことが確かめられる重要な作例であるが,そのうち計8体の作品について,エックス線透過撮影を行った.その結果,これら一連の作品の寄木構造および内刳について,これまでの外面からの観察結果を修正補足する新しい知見が得られた.平等院の雲中供養菩薩像に次ぐ時期の寄木彫像作品である,即成院(京都)の重要文化財・来迎群像についても,計8体のエックス線透過撮影を行い,これら群像がいずれも高度に発達した寄木内刳技法からなる作品であることが,透過影像写真によって確認できた.また清涼寺(京都)の重要文化財・十大弟子像10体についてもエックス線透過撮影し,これまで十分には把握できなかった,これら10体の内刳の形状や寄木構造について,確実な写真資料を収集することができた.さらに十大弟子像のうち大迦葉尊者像の像内には巻子状の納入物が存在することも確認された.平安時代寄木技法の発達に何らかの影響を及ぼしたことが考えられる,中国宋代の木彫像作品についても,エックス線透過撮影を行い,清涼寺(京都)の国宝・釈迦如来像と清雲寺(神奈川)の観音菩薩像の透過影像写真を収集し,日本の寄木彫像作品との比較資料として活用できると考えている.東北・関東・近畿・九州各地方に所在する寄木彫像作品についてのエックス線透過撮影写真を大量に収集することができ、現在までのところ100点以上の作品について、それぞれの正面全身・側面全身のエックス線透過写真の集成を得ている。撮影フィルムはすべて現像を終え、さらに密着方式による焼付写真も作成し、各像正側二面からの全身影像が容易に観察できるように整理してある。平等院(京都)の国宝・雲中供養菩薩像は、寄木彫像技法の完成者である定朝が制作した作品であるが、本研究でそのすべて52体についてエックス線透過撮影することができた。また早くに寺外に出てこれまで所在不明であった1体分についてもエックス線透過撮影を行った。したがって本研究においては、現存する雲中供養菩薩すべての正側二面エックス線透過写真を完備したことになり、今後はこの写真資料そのものが当分野の研究を大いに資するものと期待される。なお雲中供養菩薩像のエックス線透過写真のうち一部については、平等院大観(61年10月刊、岩波書店)に図版で公表した。平等院・雲中供養菩薩像につぐ時期の定朝様作品については、11世紀末の即成院・来迎菩薩像8体と12世紀前半の安楽寿院・阿弥陀如来像のエックス線透過撮影を行い。その結果として従来から外面的観察を補足修正する新しい知見が得られた。また法隆寺聖霊院の国宝・聖徳太子像についてエックス線透過撮影を行い、本像の瞳には色ガラスが貼付されているなどの事実を発見した。

さらに12世紀後半になってあらわれる新しい技工である玉眼の作品についてもエックス線透過撮影し、中尊寺・一字金輪像・円成寺・大日如来像など初期玉眼技工像の透過影像を収集した。大分県・長安寺の太郎天像では、12世紀における地方作例についてのエックス線透過影像を得た。東北・関東・近畿・四国・九州各地方に所在する総計104点の寄木彫像作品について、エックス線透過写真を撮影収集し、すべての写真資料を研究利用できる形式に整理分類した。研究成果報告書は平成二年三月末をもって作成を完了した。
タデ科食材の免疫賦活性とアセチルコリンエステラーゼ阻害性の検討

(目的)タデ科食材(ヤナギタデ;鮎タデ・紅タデ)の免疫賦活性とAChE阻害活性を検討。(結果)(1)ヤナギタデはヒト好中球・単球に対し貪食促進作用及び食胞融合能による殺菌性を示し、活性酸素産生量は僅かで、免疫賦活食材として活用できることを見出した。(2)認知症予防のために、鮎タデ・紅タデのAChE阻害度をアセチルチオコリンを基質とし、生じたチオコリンをEllman法にて定量した。その結果、両方のタデにAChE阻害性を見出し、特に紅タデの水抽出物及び酢酸エチル抽出物に強いAChE阻害活性を見出した。更にタデ食メニュで介入試験(健常者n=10)を実施し、認知症の改善予防に活用できることを確認した。【目的】民間療法薬として毒消しや虫さされに利用され、刺身・鮎料理のつま等に使用されているヤナギタデの免疫賦活性について検討した。【方法】ヤナギタデ(鮎タデ・紅タデ:Polygonumhydropiper;市販品)の熱水抽出物について、ヒト好中球・単球に対する貪食活性と食胞融合能性を検討した。ヒト末梢血により分離した好中球および単球(5×10^6個/ml)をcoverslip上で90分培養し、各濃度に調製した鮎タデ・紅タデ抽出物を黄色ブドウ球菌死菌体(1×10^8個/ml)にコートし、ヒト好中球・単球を各試料に加えて、好中球の場合は37°C・60分、単球の場合は37°C・3hr incubateした。その後メタノール固定し、メチレンブルーで染色後、顕微鏡下で細胞内に貪食された菌数をカウントして貪食活性を調べた。食胞融合能の測定では、coverslip功上に吸着した好中球のライソゾームにアクリジンオレンジをプレラベルした後、鮎タデ・紅タデ抽出物を加えて貪食実験と同様に測定し、蛍光顕微鏡にて食胞融合能性を測定した。さらに、スーパーオキサイドアニオン(O_2^-)を測定し、殺菌能を調べた。【結果】ヒト好中球に対する貪食活性を調べた結果、鮎タデ・紅タデとも、濃度に依存して貪食作用を促進した。鮎タデでは、100μg/mlの濃度でコントロールに比べ3.7倍(p<0.001)、紅タデでは3.3倍(p<0.001)の貪食活性を示した。また、単球に対する貪食活性の結果、鮎タデ・紅タデとも1.4倍(80μg/ml、p<0.001)の貪食活性を示し、食胞融合能性と殺菌作用を促進することから鮎タデ・紅タデを免疫賦活食材として活用できることが認められた。【目的】高齢者は加齢と共に、免疫力の低下や記憶学習能力の低下などに伴う認知症疾患が増加し、高齢者に対する予防対策が重要視されている。筆者はH22年度において、ヤナギタデがヒト好中球・単球に対する貪食活性と食胞融合能により殺菌能を示し、スーパーオキサイドアニオン(O_2^-)の産生量もわずかで、免疫賦活食材として活用できることが認めた。H23年度では、細胞内毒素LPSおよびニコチンの毒性に対する効果を検討すると共に、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性についても検討した。【方法】ヒト好中球にニコチンまたはLPSを反応させ、各濃度のヤナギタデ(鮎タデ・紅タデ:Polygonum hydropiper;市販品)熱水抽出物を加えて、ニコチンおよびLPSに対するヤナギタデの効果を調べた。対照としてAChE阻害薬(ガランタミン)を用いて比較検討した。さらに、AChE酵素実験では基質としてヨウ化アセチルコリンを用いてAChE活性を測定し、ヤナギタデのAChE阻害作用を検討した。【結果】ヒト好中球に対する貪食作用:鮎タデ・紅タデとも顕著に貪食促進作用を示した。LPS・ニコチン・ガランタミンでは、ヒト好中球の貪食作用を減少させ、細胞障害性を示す傾向を認めた。しかし、ヒト好中球にヤナギタデ熱水抽出液を各々10分前に反応させて、ニコチンおよびガランタミンの貪食活性を調べた結果、ニコチンおよびガランタミンの毒性を完全に除去し貪食作用を促進させた。LPSにおいても同様の結果であった。AChEへの効果:AChEに対する阻害性を検討した結果、鮎タデ・紅タデは酵素阻害性を見出した。

タデ科食材ヤナギタデには、免疫賦活物質およびAChE阻害物質が存在し、認知症の改善・予防に活用できる道を開いた。【目的】高齢者は加齢と共に、免疫力の低下や記憶学習能力の低下などに伴う認知症疾患が増加し、高齢者に対する予防対策が重要視されている。アルツハイマー型認知症の治療薬の1つとしてアセチルコリンエステラーゼ(AChE)阻害物質が使用されているが、筆者は薬剤ではなく食材を用いて認知症の一次予防へと発展させ、より効率的な臨床場面での活用方法を提案することを目的とした。H2223年度において、タデ科食材(鮎タデ・紅タデ)の免疫賦活性(貪食・食胞融合能)とAChE阻害活性について検討した結果、免疫賦活物質およびAChE阻害物質を見出した。H24年度はAChEの阻害薬への効果を検討した。H25年度において認知症の一次予防に活用するために、タデ食のメニュを提案して介入実験を実施して検証した。【研究結果】1.AChE阻害活性の検討;AChE活性はアセチルチオコリンを基質とし、生じたチオコリンをEllman法にて定量し、鮎タデ・紅タデのAChE阻害作用を検討した。その結果鮎タデ・紅タデ両方に酵素阻害性を見出し、特に紅タデの水抽出物及び酢酸エチル抽出物にAChE阻害活性を認めた。鮎タデ・紅タデ食材に認知症の改善予防に活用できることを確認した。2.タデ食材の活用のメニュ提案;高齢者を対象として、鮎タデ・紅タデを用いたメニュを検討し、春・夏・秋の季節に合わせてタデ食メニュを考案し、冊子「紅タデと鮎タデで作るおいしい認知症予防レシピ集」を作成した。3.タデ食における介入試験;冊子のタデ食メニュを摂取する介入試験を試み、対照食を用いて単盲検比較試験により比較検討した。対照食およびタデ食摂取後の認知機能バランサーのソフトを用いて、見当識、注意力、記憶力、計算力、空間認識力の5項目について調べ、認知機能に対する効果を検証した。その結果、対照食よりタデ食摂取の方が効果を認め、特に計画力に顕著な効果を認めた。免疫賦活食材として認めた活性成分の構造解析は、成分を単離生成するのに時間が掛かったために、まだ成分の構造を明確にできていない。25年度が最終年度であるため、記入しない。1)ヤナギタデ(鮎タデ・紅タデ)の免疫賦活性について、英語論文投稿を行う。2)タデ食メニュの提案:タデ食(タデ6g)のメニュを考案し、介入試験を試みる。食事の前後にストループテスト(脳の活性化を評価)・内田クレペリンテストおよび血圧脈派検査測定を行って効果(作業量の効果を評価)を調べる。最初は、健常者を対象に、5日間連続してタデ食(タデ6g)を摂取する介入試験を試みるとともに、タデを全く含まない対照食を用いて、単盲検比較試験を実施する。3)高齢者への介入試験:同意を得た高齢者への介入試験を試みる。高齢者にタデ食による食事を提供して、認知症機能測定ツールソフト(Cog Health)と長谷川式簡易知能評価スケール(HDS-R)を用いて効果度を評価する。また、対照食を摂取する高齢者においても同様の介入を実施し、タデ食介入群と対照食介入群を比較検討する。
酵母発現系を用いた病原菌エフェクターの網羅的スクリーニングシステムの開発

本研究では、酵母発現系を用いたChlamydophila pneumoniae(C.pneumoniae)エフェクターの網羅的スクリーニングシステムの開発を目的に研究を行った。Tet-offプロモーターにより発現の調節が可能である酵母発現ベクターに組込んだアレイライブラリーを作製し、酵母の増殖抑制を指標にC.pneumoniae J138株機能未知遺伝子456個について、エフェクター分子の探索を試みた。このシステムにおいてエフェクターとして既に報告されているサルモネラエフェクター分子SopE2、エルシニアエフェクター分子YopEが酵母に対して増殖抑制を示し、このシステムが病原菌の種を超えたエフェクター分子の網羅的スクリーニングシステムとして機能することを確認している。そこで、C.pneumoniae機能未知遺伝子について解析を行ったところ、62個の増殖抑制を示すエフェクター候補分子を見いだすことに成功した(Biosci Biotechnol Biochem. 73 : 2261-2267, 2009)。またカルボキシペプチダーゼY-インベルターゼ融合蛋白質を用いた小胞輸送系の異常を検出するスクリーニングシステムも開発しており、現在このシステムを用いて小胞輸送に影響するエフェクター分子の同定を行っている。これらのスクリーニングシステムは分子遺伝学的手法が乏しく現在まで病原因子の特定がほとんどなされていないC.pneumoniaeの感染戦略を明らかにするうえで、その突破口なることが期待される。本研究により開発したシステムは多数の病原菌において活用できる汎用性を備えたシステムであり、今後さらに様々な病原菌へ適用することで、その感染戦略を明らかし、エフェクター分子を標的とした新たな分子標的薬剤の開発に繋がることが見込まれる。肺炎クラミジアは、市中肺炎の主要な原因菌であり、また、動脈硬化や喘息など多彩な病態への関与が示唆されている。肺炎クラミジア全ゲノム配列決定により、ゲノム中にはIII型分泌装置という病原因子であるエフェクターを宿主細胞内に注入するためのタンパク質構造体遺伝子が存在することが明らかになり、本菌が他の病原菌同様に感染時に宿主細胞内ヘエフェクター分子を注入していることが予測された。本研究では、酵母発現系を用い、ゲノム情報をもとに肺炎クラミジアエフェクター分子を網羅的にスクリーニングするシステムを開発し、得られたエフェクター分子の機能解析から本菌の感染戦略を理解することを目的とした。本年度は、以下の項目について行った。1)エフェクター機能をアッセイするための酵母細胞株の分子育種:細胞内寄生菌の多くは宿主のエンドソーム機能を阻害するが知られている。エンドソーム機能に異常が生じた場合のみ細胞外にマーカーを分泌し、コロニーの発色によりアッセイできる酵母を分子遺伝学的に作製した。2)酵母発現ベクター系の構築:肺炎クラミジア遺伝子の誘導発現ベクターを構築した。3)肺炎クラミジア整列遺伝子ライブラリーの構築:肺炎クラミジアグノム情報を元に、機能未知遺伝子約500個を選び出し、現在までに283クローンのPCRによる増幅の確認し、136クローンをベクターにクローン化した。今後は、ライブラリーを完成させ、構築したシステムを用いてスクリーニングを行い、肺炎クラミジアエフェクター分子を同定及び解析する予定である。1)肺炎クラミジア整列遺伝子ライブラリーの構築:肺炎クラミジア機能未知遺伝子538個を酵母発現ベクターに組込み肺炎クラミジア整列遺伝子ライブラリーの作製を完了した。2)酵母発現系による肺炎クラミジアエフェクター候補遺伝子のスクリーニング:上記において作製した整列遺伝子ライブラリーを網羅的に酵母に形質転換し、酵母の増殖抑制および液胞タンパク質マーカーの分泌を指標として、これまでに242遺伝子についてスクリーニングを行い、現在までに約15遺伝子について酵母増殖抑制を確認し、これらを肺炎クラミジアエフェクター候補遺伝子とした。3)エフェクター候補タンパク質の大腸菌での発現:上記スクリーニングにより得られたエフェクター候補タンパク質とGSTまたはMBPと融合タンパク質を大腸菌で発現させ、抗体作製のための抗原の調製を行った。またカルボキシペプチダーゼY-

インベルターゼ融合蛋白質を用いた小胞輸送系の異常を検出するスクリーニングシステムも開発しており、現在このシステムを用いて小胞輸送に影響するエフェクター分子の同定を行っている。これらのスクリーニングシステムは分子遺伝学的手法が乏しく現在まで病原因子の特定がほとんどなされていないC.pneumoniaeの感染戦略を明らかにするうえで、その突破口なることが期待される。本研究により開発したシステムは多数の病原菌において活用できる汎用性を備えたシステムであり、今後さらに様々な病原菌へ適用することで、その感染戦略を明らかし、エフェクター分子を標的とした新たな分子標的薬剤の開発に繋がることが見込まれる。
陸上植物の変動光への馴化と遠赤色光の役割：プロトン駆動力調節による光合成の最適化

野外植物の曝される光はその強度が激しく変動しており、変動光は葉緑体の光化学系Iを阻害する。光化学系Iを保護する機構を複数持っている野生型でも変動光処理によって光化学系Iが障害を受ける。ところが、変動光の背景光に野外光に含まれるのと同じ程度の遠赤色光を加えると、光阻害はほぼ完全に抑えられた。光合成酸素発生や二酸化炭素固定に直接関与しない遠赤色光は、変動光下の光合成を促進することも示されている。本研究は、光合成を駆動しない遠赤色光が光化学系Iのみを駆動することで、どのような機構で光合成装置の保護や光合成促進に寄与しているのか、徹底解明に取り組んでいる。
氷温域における魚介類の貯蔵と魚肉中での酵素反応

貯蔵中に魚肉中で進行する諸変化、とくに筋肉中の酵素の作用による諸変化に及ぼす貯蔵温度の影響を検討し、近年注目を集めている氷温貯蔵や半凍結貯蔵の有効性と限界を明らかにするのが、本研究の目的である。昭和60・61年の研究成果はつぎのようにまとめられる。1.イノシン酸分解速度と貯蔵温度イノシン酸の分解は主として5'-ヌクレオチダーゼによって起こり、その分解程度すなわちK値は魚肉の品質指標として定評がある。魚肉貯蔵中のイノシン酸分解のArrheniusプロットを求めたところ、魚肉の氷結点と、魚種に固有の0°C以上の特定温度とで、同プロットに折れ曲がり点が認められ、それぞれの折れ曲がり温度以下で、見掛けの活性化エネルギーが不連続に急増した。凍結防止剤や界面活性剤の利用、脂質の熱分析などによって、魚肉の氷結点付近での同プロットの折れ曲がりの原因は水の氷結、0°C以上の特定温度での折れ曲がりの原因はミクロソーム中の膜脂質の相転移によると推論した。2.その他諸成分の変化速度と貯蔵温度魚肉の脂質の酵素的加水分解,魚肉蛋白質の塩溶性の変化,魚肉保水性や細胞状態の変化などについて、貯蔵温度の影響を検討したところ、これらの諸変化は、上記のK値変化の場合と違って、0°C以下で強く抑制されるとは限らなかった。脂質の分解,保水性の喪失,細胞の変形などは、-4°Cにおいては、0°Cにおけるより速やかに進行した。したがって、半凍結貯蔵における魚肉品質保持期間はK値の測定結果から推論されている期間よりかなり短いと考えられる。そして、半凍結貯蔵魚の品質は、K値より肉質や脂質の変化によって、より強く規定されると判断した。
ヒスタミンの超高感度HPLCエキシマー蛍光法の開発と、臨床・神経科学研究への実用

ヒスタミン関連化合物の高感度かつ高選択的なエキシマー蛍光誘導体化HPLC定量法の開発を行い,いくつかの実試料分析に対する成果を含め,以下に示す結果が得られた。1.基礎検討による最適化:蛍光試薬の合成・スクリーニング,誘導体化条件及びHPLC条件の最適化を行い,ヒスタミン分析に関する基礎的検討を行った。さらに従来法との比較を含め,本分析法を十分にバリデートし,本法は従来の最高感度の方法より高感度で,かつ高選択的な分析法であることが確認された。2.実試料分析(1):本法のヒト尿中ヒスタミン計測への適用について検討したところ,尿1μL中のヒスタミンが簡便かつ高精度に定量され,その定量結果は複雑な前処理を必要とする文献値と良く一致していた。3.実試料分析(2):本法をラット血漿及び組織中ヒスタミンの定量に応用したところ,極めて簡便な前処理操作との組合せでラット血漿及び組織(臓器ホモジネート)中のヒスタミン計測が可能となった。4.実試料分析(3):本法をラット脳微小透析試料中ヒスタミン分析に応用したところ,前処理操作を行うことなく透析液(1μL/minで10分間)中のヒスタミン計測が可能となった。さらに各種薬物と脳内ヒスタミンレベルとの相関も容易に調べることができ,神経薬理分野における極めて有益な方法論となった。5.ヒスチジンとの同時計測:ヒスタミンとその前駆物質であるヒスチジンとの同時分析について基礎的検討を行い,各種条件を最適化により,エキシマー蛍光法によるヒスタミン及びヒスチジンの同時分析が可能なった。以上の結果から,本誘導体化法がヒスタミン関連化合物に対する簡便,高感度及び高選択的定量法であることが示された。本法がさらに臨床診断,神経薬理等の研究へ展開していくことを期待する。ヒスタミンに対する高感度かつ高選択的なエキシマー蛍光誘導体化HPLC定量法の開発を行った。標準物質を用いたモデル実験で以下の成果が得られた。1.最適誘導体化試薬の選択:市販及び合成したピレン構造を有する誘導体化試薬でヒスタミンをラベル化して,エキシマー蛍光発現の効率を精査した。最も発エキシマー蛍光効率に優れたピレン試薬4-(1-pyrene)butylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester(PSE)を見いだした。またPSEとの反応により,ヒスタミンはジピレン誘導体構造のみを形成し,モノピレン誘導体とはなりえないことが確認された。2.誘導体化反応及びHPLC分離条件の最適化:選択したピレン試薬PSEについて,誘導体化反応条件の最適化を行った。比較的簡便な操作のみで,ヒスタミンのエキシマー蛍光誘導体化が可能であった。さらに,そのエキシマー蛍光誘導体のHPLC分離条件の最適化を行い,関連化合物とのベースライン分離分析を可能とした。3.分析バリデーションの確認:この方法論を,特に特異性及び感度の観点から詳細に検討し,バリデートするとともに従来法との比較を行った。標準物質を用いたモデル実験において,本法は従来の最高感度の方法より高感度で,かつ高選択的な分析法であることが確認された。特に,生体中の他のアミノ酸関連化合物の妨害を受けない極めて特異的な分析法であることが示唆された。以上の結果から,本誘導体化法がヒスタミンに対する簡便,高感度及び高選択的定量法であることが示された。

これにより,本法の様々な実試料分析についての有用性及びその臨床・神経科学研究への展開が大いに期待される。ヒスタミンに対する高感度かつ高選択的なエキシマー蛍光誘導体化HPLC定量法の開発を行った。昨年度に実施した標準物質を用いた基礎的検討の結果を踏まえた研究により,以下の成果が得られた。1.従来法との比較:昨年度構築した分析法を,感度,選択性,簡便性などについて従来のヒスタミン分析法と比較検討したところ,エキシマー蛍光誘導体化によるヒスタミン分析は従来法をはるかに凌ぐ性能を有していた。本誘導体化法が様々な実試料分析に対して極めて有用であることが示唆された。2.実試料分析への適用(1):本誘導体化法をラット血漿及び各種臓器中ヒスタミン分析に応用したところ,極めて簡便な前処理操作との組合せでラット血漿(あるいは臓器ホモジネート)中のヒスタミン計測が可能となった。アレルギー疾患関連の研究分野において有益な方法論が構築された。3.実試料分析への適用(2):本誘導体化法をラット脳微小透析試料中ヒスタミン分析に応用したところ,前処理操作を行うことなく透析液中のヒスタミン計測が可能となった。各種薬物と脳内ヒスタミンレベルとの相関も容易に調べることができた。神経薬理分野における極めて有益な方法論が構築された。4.ヒスチジンとの同時計測:ヒスタミンの前駆物質であるヒスチジンとの同時分析について基礎的検討を行った。各種条件を最適化することで,エキシマー蛍光誘導体化法によるヒスタミン及びヒスチジンの高選択的同時分析が可能となった。神経薬理並びに食品管理における有益な方法論が構築された。以上の結果から,本誘導体化法がヒスタミン関連化合物に対する簡便,高感度及び高選択的定量法であることが示された。本研究内容の一部として,いくつかの代表的な実試料分析への適用について検討を行ったが,本法がさらに臨床診断,神経薬理等の研究へ展開していくことを期待する。
新規非アルコール性脂肪肝バイオマーカーとしての血清micrio-RNAの評価

血清micro-RNA-122(miR-122)が、非アルコール性脂肪肝(NAFLD)の新たな臨床検査のバイオマーカーとなる可能性について評価した。高脂肪食を与えたNAFLDのモデル動物を作製して、発症過程(2、6、10週間)におけるmiR-122と関連物質の経時的変化を測定した。その結果、本実験のNAFLD発症条件は緩和であった。現在のNAFLDのバイオマーカーである血清アミノトランスフェラーゼ活性は上昇しないにも関わらず、血清miR-122は脂肪投与後2、6、10週間に顕著に上昇した。血清miR-122は、早期NAFLDの優れた新たなバイオマーカーになり得る可能性が示唆された。1)非アルコール性脂肪肝(NAFLD)モデル動物の作成前段階の研究において、ヒト対象の横断的研究で非アルコール性脂肪肝の程度と血清microRNA(miR)との間に関連が見られたことから、この研究においては疾患の発症過程での血清miRの変動を経時的に捉えるため、最初に疾患モデル動物の作成を行った。動物はSDラットを用い高脂肪食(エネルギー比35%)を負荷し、負荷前、2、6、10週の4点での経時的変化を追った。また通常食摂取のラットを対照群とした。2)病態解析とmiRの変動体重は実験開始1週間より高脂肪食負荷は通常食に比べて有意に増加していた。血清中の中性脂肪と肝組織中の中性脂肪は、実験開始後2週後より終了時まで対照に比べ有意に上昇していた。肝組織のオイルレッド染色の結果では、2週の時点では高脂肪食群で若干の脂肪蓄積が確認されたのみであったが、6週以降は明らかに確認された。肝臓の障害の程度を示す血清ALTは開始後から終了する10週まで全てにおいて差はなかった。以上の結果から、35%高脂肪食負荷により明らかに肝組織中に中性脂肪が蓄積したことが確認されたが、血清ALTは明らかな上昇が見られなく、一般的な血液スクリーニング検査では検出が出来ない非アルコール性の脂肪肝モデルが作成できたと考えられた。また血清中のmiRは線虫のmiR-39で、組織中はU6で標準化を行うreal-time RT-PCR法を用いたmiR定量法の測定条件の検討を行い測定法の確立を行った。この方法で血清中のmiR-122を測定した結果、2週の時点で既にmiR-122は有意に上昇しており、10週の時点では対照に比べて8倍多く増加していた。これはmiR-122がごく早期に非アルコール性脂肪肝を検出できる可能性を示していることが確認されたNFLDの住民健診受診者を対象としたコホート研究において、血清miRNA-122が優位に上昇することを報告した。そこで血清miRNA-122のNAFLD診断マーカーとしての可能性の検証のために、ラットに高脂肪食を投与して脂肪肝を誘発させたNAFLDモデル動物を作製と、血清および組織mi-RNA定量法の測定法を確立し、本モデル動物においても投与2週に血清miRNA-122が上昇するとの予備結果を見出した。また、病態の進展とmiRNAの関連を明らかにすることを目的として、経時的にmiRNAの変化と他の生化学的マーカーとの相関性について研究した。その結果、投与後2週以降、高脂肪食(HF)群では血清および肝組織中TGが対照(C)群に比べて有意に増加した。またオイルレッドO染色では6週以降のHF群において肝臓に明らかな脂肪滴の形成が見られ、高脂肪食投与により脂肪肝が形成されていたことが再確認された。ALTは2週以降でHF群の方がC群に比べ上昇傾向にあったが有意差は無かった。血清中のmiRNA-122は投与前に比べてC群は10週まで変化しなかったのに対し、HF群では2週の時点で有意に上昇した。また血清中miRNA-122と他の生化学マーカーとの間の関連を調べている。また、血清miR-122はTGおよび肝組織中LPOとの高い相関がみられたことから、TGに関わる脂質代謝と酸化ストレスとの関連も解析していく。メタボリックシンドロームと深く関わる非アルコール性脂肪肝(NAFLD)で、ヒト血清mi-RNA-122が有意に上昇した。そこで本研究では、血清micro-RNA-122(miR-122)がNAFLDの新たな臨床検査のバイオマーカーとなり得る可能性について評価した。高脂肪食を与えたNAFLDのモデル動物(ラット)を作製して、発症過程(2、6、10週間)の血清、肝組織を採取して、関連するパラメーターやmiR-122を測定し病態解析を行なった。その結果、高脂肪食を2-10週間投与したラット群(HFD)は、通常食投与ラット群(Control)に比べて、高脂肪食摂取2週以降に体重、肝総脂質、肝・血清中性脂肪が有意に上昇した。また、HFDの肝組織はオイルレッドO染色が陽性となり、肝への脂肪蓄積が観察された。しかし、ALT、ASTは両群とも変動しなかった。それに対して、血清miR-122はHFD群で2週以後Controlに比べて顕著に上昇(約5倍)し、6、10週ではさらに上昇した。最終年度は、血清miR-122と肝TGやと肝LPOとの間の相関性が共に有意であるとの成果が得られ、血清miR-122の上昇が肝脂肪に関わる可能性が示唆された。

本研究の結果から、本NAFLD発症モデルは現在のバイオマーカーであるALTが上昇せず肝変性や炎症が起こる前の緩和な状態であるにも関わらず、血清miR-122は脂肪投与後早期に上昇したことから、血清miR-122は、早期NAFLDの優れた新たなバイオマーカーになり得る可能性が示唆された。血清micro-RNA-122(miR-122)が、非アルコール性脂肪肝(NAFLD)の新たな臨床検査のバイオマーカーとなる可能性について評価した。高脂肪食を与えたNAFLDのモデル動物を作製して、発症過程(2、6、10週間)におけるmiR-122と関連物質の経時的変化を測定した。その結果、本実験のNAFLD発症条件は緩和であった。現在のNAFLDのバイオマーカーである血清アミノトランスフェラーゼ活性は上昇しないにも関わらず、血清miR-122は脂肪投与後2、6、10週間に顕著に上昇した。血清miR-122は、早期NAFLDの優れた新たなバイオマーカーになり得る可能性が示唆された。平成26年度の本研究はおおむね順調に進展し、ほぼその目的を達成した。臨床検査学研究計画書に基づいて進めていく。血清中miRNA-122と他の生化学マーカーとの間の関連や脂質代謝と酸化ストレスとの関連も解析していく。当初には25年度中にmiRが非アルコール性脂肪肝の早期のバイオマーカーとして証明しうる動物実験モデルを作成し、血清中と肝組織中の生化学パラメーターや、肝組織の組織学的な変化を経時的に分析するまでを行うことを計画していた。しかし、同時並行して行っていた血清中および肝組織中のreal-time RT-PCR法の当研究室での立ち上げがスムーズに行われたため、26年度に計画していたmiR-122の測定までも実施することができた。よって、ここまでの結果を2013年10月にバリで行われた13th Asia-Pacific Federation for当該年度は研究計画に沿ってほぼ実施したが、ごく一部未実施があり、その分を次年度に実施するため次年度使用額が生じた。平成25年度はNAFLDモデルラットの作成と血清miRNAの測定を中心に進めた。平成26年度は作成したモデルラットの各種パラメーターや組織中のmiRNAの解析し、バイオマーカーとしてのmiR-122がNAFLDの発症・進展機序にどのように関連しているかを明らかにしていく。必要であれば肝組織由来の培養細胞を用いて、脂肪肝状態を再現し、その上清中と細胞内でのmiRの変動機序を調べる。前年度のごく一部の未実施分を実施して使用する計画である。前年度は研究計画に沿ってほぼ実施したが、ごく一部未実施がありその分を次年度に実施するため次年度使用額が生じた。
酸性霧の成分分析と酸性化機構の解明

本研究は関東平野南西部に位置する丹沢山塊の東端、大山と関東平野北部の赤城山で酸性化した霧水を採取し、その成分分析と酸性化機構を解明することを目的としている。今回この研究において新たに、高い酸性度の霧が関東平野南西部で頻繁に発生することが観測された。試料の霧水は、大山阿夫利神社下社(標高700m)と赤城山山頂付近で採取した。試料の分析は電導度とpHのほか、主なイオン(Cl^-,NO^-_3,SO^<2->_4,Na^+,K^+,Ca^<2+>,Mg^<2+>,NH^+_4)について行った。赤城山においては本年、天候の影響で採取予定期間に充分な霧水の採取ができなかったが、大山は梅雨の時期に頻繁に霧が発生し、多くの試料が得られた。分析の結果、1988年7月13日から7月29日まで連続採取して得られた大山の試料霧水計57個のpHは2.93から5.40に分布し、平均値は3.67という高い酸性度を示した。また、霧水中の酸と塩の総濃度はほとんどの試料で1mM以上であって、雨水のデータと比していずれの成分も平均して10倍以上高い値であった。これまで報告された赤城山等内陸部での霧水成分分析結果と比較すると、大山が相模湾から15kmの距離に位置してエアロゾル中の金属イオンによる緩衝作用が小さいためか、陽イオン中でプロトンの占める割合が大きい。硝酸濃度と硫酸濃度の相関を調べると、ほとんどの霧水試料は当量比でおよそ1対1の割合であり、硫酸濃度が硝酸濃度の当量比で3倍以上である雨水の場合と大きく異なり、強い酸性化にはNO_×xの影響が大きいことが示された。この観測結果より関東平野全域での酸性霧の発生が予想され、頻繁に霧が発生する森林等での環境影響の早急の把握が必要であろう。さらに、霧の酸性化機構と酸性化に影響する要因は複雑であり、今後さらに解明されなければならない。
酸素原子によって安定化された活性反応中間体の高次利用

酸素原子によって安定化されたカチオン反応種を用いる新手法の開発を目指して、Beckmann開裂中間体を利用する反応と、ジオキセニウムカチオンを利用する反応について、研究計画に従い行った。Beckmann開裂中間体の高次利用を目指した反応として、我々が見出した基礎反応の立体化学への応用について検討し、シクロアルカノンオキシム-1,2-アセトニドの開裂反応により、環上に固定されたカチオン中間体を生成させ、立体選択的な炭素種導入反応に成功した。更に、本法を用いて松喰虫の集合フェロモンである(±)-endo-brevicominおよび幼若フェロモン合成の鍵中間体の立体選択的合成に成功した。また、開裂中間体を光学活性アセタールとして捕捉し、ついで求核剤をジアステレオ選択的に導入することにも成功し、環状の光学不活性なオキシム類から光学活性な鎖状のω-シアノアルコール類を得るという新規な不斉合成反応の開発にも成功した。本法は、α-(R)-lipoic酸の形式合成に利用できた。一方、種々のトリオール類とオルトエステル類とを塩化メチレン中、酸条件下に反応させると、ジオキセニウムカチオン中間体を経て、種々の多置換テトラヒドロフランおよびテトラヒドロピラン類がone-potで高収率で得られることを明らかにした。更に、天然に存在する糖由来の光学活性多価アルコールを用いて検討し、これらの高極性ポリオール類は、塩化メチレンには溶解しないが、塩化メチレン/メタノールの混合溶媒を用いて反応を行うことにより、容易に収率良く環状エーテルを得ることに成功した。本反応は、操作が簡便で、水酸基を保護することなく、様々な環状エーテルを得ることができる有用な方法である。本法を用いて、強い腫瘍細胞抑制作用を有するアセトゲニン類の一種である、ロリニアスタチン1のテトラヒドロフラン環部分の合成に成功した。申請者は活性な反応中間体の高次利用という概念に基づき研究を行っているが、本研究では主として酸素原子によって安定化されたカチオン反応種を用いる新手法の開発を目指して、Beckmann開裂中間体を利用する反応と、ジオキセニウムカチオンを利用する反応について、研究計画に従い行った。Beckmann開裂中間体の高次利用を目指した反応としては、シクロアルカノンオキシム-1,2-アセトニドの開裂反応により、環上に固定されたカチオン中間体を生成させ、立体選択的な炭素種導入反応に成功した。また、開裂中間体を光学活性アセタールとして捕据し、ついで求核剤をジアステレオ選択的に導入することにも成功し、環状の光学不活性なオキシム類から光学活性な鎖状のω-シアノアルコール類を得るという新規な不斉合成反応の開発にも成功した。一方、種々のトリオール類とオルトエステル類との酸条件下での反応により、ジオキセニウムカチオン中間体を経て、種々の多置換テトラヒドロフランおよびテトラヒドロピラン類がone-potで高収率で得られることを明らかにした。以上、カチオン反応種を用いる新手法の開発を目的として、立案した2年間のそれぞれの2つの研究計画にたいし、平成5年度の研究経過については、上に述べたように、ほぼ計画どおり進行している。

Beckmann開裂中間体の高次利用を目指した反応として、我々が見出した基礎反応の不斉合成への応用について検討し、既に、ラセミのα-アルコキシケトオキシム類のルイス酸処理により生成する開裂中間体を、光学活性アセタールとして捕捉し、ついで求核剤をジアステレオ選択的に導入する、新規な不斉合成反応の開発にも成功した。本年度は、ラセミのα-アルコキシケトオキシム類を、キラルなルイス酸条件下に反応させ、ついで求核剤をエナンチオ選択的に導入する、不斉触媒反応について検討したが、まだ高い不斉収率は得られておらず、更に検討中である。一方、種々のトリオール類とオルトエステル類とを塩化メチレン中、酸条件下に反応させると、ジオキセニウムカチオン中間体を経て、種々の多置換テトラヒドロフランおよびテトラヒドロピラン類がone-potで高収率で得られることを明らかにした。本年度はさらにその応用性の拡張を目指して、天然に存在する糖由来の光学活性多価アルコールを用いて検討した。これらの高極性ポリオール類は、塩化メチレンには溶解しないが、塩化メチレン/メタノールの混合溶媒を用いて反応を行うことにより、容易に収率良く環状エーテルを得ることに成功した。本反応は、操作が簡便で、水酸基を保護することなく、様々な環状エーテルを得ることができる有用な方法である。本法を用いて、強い腫瘍細胞抑制作用を有するアセトゲニン類の一種である、ロリニアスタチン1のテトラヒドロフラン環部分の合成に成功した。