hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)の新しい型別法の確立と疫学調査への応用

MRSAの感染の疫学調査,特に感染ル-トの解明には個々の分離菌株を「型別」することが要求される。この目的のためにはどの型別法が最も適当なのかを知ることを目標として,由来の明らかなMRSA分離株の96株とMSSA(メチシリン感受性黄色ブドウ球菌)の12株について,1)IDテストSPー18による生物型別,2)15種の化学療法剤に対する感受(耐性)性パタ-ンによる型別,3)パルスフィ-ルド電気泳動(PEGE)によるゲノム型別,4)プラスミドによる型別,5)ファ-ジ型別,6)コアグラ-ゼ型別を行って,それらの有用性を検討した。その結果,PFGEではSmaI消化標品の泳動パタ-ンで14種に型別されたが,MRSAの83%は1型か2型(それぞれの型で数種の亜型あり)に属した。プラスミドはMRSAの2株とMSSAの1株を除いて,供試の98%の株に1種,またはそれ以上の種類の存在が認められ,分子サイズも1.0kb40kbと広範囲にわたったが,特に93%のMRSAに24.3kbの1種の共通したプラスミドの保持が確認された。生物型は乳糖と白糖の利用様式から4種の型に大別されたが,この型別法も限られた範囲で有用である。ファ-ジ型別ではMRSAは10%の株がいずれかの型別ファ-ジ(複数)に感受性を示したのみであり,コアグラ-ゼ型別ではI型からVIII型のうち,98%の株がII型に属した。以上の知見から,MRSA感染の疫学調査のマ-カ-としては,PFGEによるゲノム解析(SmaI消化DNA),プラスミドDNA解析(特に20kb以上の分子サイズのもの),およびIDテストのSPー18による生化学的性状による型別の成績を組合せたものが,現在では最も正確であると結論されたMRSAの感染の疫学調査,特に感染ル-トの解明には個々の分離菌株を「型別」することが要求される。以上の知見から,MRSA感染の疫学調査のマ-カ-としては,PFGEによるゲノム解析(SmaI消化DNA),プラスミドDNA解析(特に20kb以上の分子サイズのもの),およびIDテストのSPー18による生化学的性状による型別の成績を組合せたものが,現在では最も正確であると結論されたMRSAの保存株および信州大学附属病院の患者,保菌者そして汚染環境由来の菌株について,それらの薬剤(化学療法剤)感受性パタ-ン,生化学的性,コアグラ-ゼ型別,バクテリオファ-ジ型別(標準ファ-ジによる溶菌試験以外に,溶原ファ-ジ誘発試験を含む),バクテリオシン産生性,プラスミド保持の有無と,その制限酵素による切断パタ-ンによる型別,さらに最近になり染色体DNAのパルス電気泳動による泳動パタ-ンによる型別を追加して,これらの個々の型別法の成績の再現性の検討も含めて,疫学調査への応用を調べた。これらの実験は進行中なので結論は得られてないが,今迄の成績からは,バクテリオシン産生性はこれを産生する株が極めて少なく,またプラスミドに関する型別はプラスミドDNAの検出に困難が伴い,あまり型別法として実用性がないことが示唆された。しかし,他の種々の型別法の成績の可能な限りの組合せは,MRSAの疫学調査に有用であることが証明されつゝある。信州大学附属病院の医療スタッフを含む約1000名についてのMRSA保菌検査を,鼻前庭部のスメア-を採取し,選択培地を使用して実施した。その結果,医師が1.5%,看護婦の3.5%について保菌者を認めた。しかし,それら以上の被検者については保菌者を検出できなかった。また,院内のMRSAの汚染状況を延べ約1,100ケ所について詳しく調べたところ,患者の行動する範囲は程度の差はあれ,汚染が証明された。

本年度は代表的なMRSAの97株と,対照としてMSSA(メチシリン感受性黄色ブドウ球菌)の11株の計108株を選定して,それらについて,1)パルスフイ-ルド電気泳動(PFGE)によるゲノム解析,2)アルカリSDS法で分離したプラスミドDNAのアガロ-ス電気泳動による解析,3)ファ-ジ型別および4)コアグラ-ゼ型別を実施した。PFGEについてはSmaI制限酵素処理標品の泳動パタ-ンにより,13(IXIII)型に分類されたが,MRSAはI型(6種の亜型を含む)に42%が,II型(8種の亜型を含む)に41%が,そして17%がその他の5種の型に属した。MSSAは1株がII型であったのを除いて,MRSAには存在しない5種の型のいずれかに属した。プラスミドは制限酵素EcoRI処理および未処理のDNAについて解析したが,MRSAとMSSAのそれぞれ1株を除いて供試の98%にその存在が認められ,その分子サイズは約1.0kbから40kbの範囲にあり,82%は2種またはそれ以上の異った分子サイズのものが存在した。最も注目すべきことは,25kbの共通したプラスミドが,93%のMRSAについて,その由来とは奥関係に証明された事実である。このプラスミドはMSSAでは1株について証明されたのみである。ファ-ジ型別はMRSAでは10%,MSSAでは72%について型別が可能であった。また,コアグラ-ゼ型別はI型VIII型のうち,II型に属するものが98%でぁあった。以上の知見と前年度に得られた成績から,MRSA感染の疫学調査のマ-カ-としては,PFGEによるゲノム解析,プラスミドDNA解析(特に20kb以上の分子サイズのもの>解析)およびIDテストのSPー18による生化学的性状による型別の成績を組合せたものが,最も正確であると結論された。
肝細胞由来の新規神経活性化因子による脳神経細胞の生存・維持作用

肝細胞から分泌される因子が老化した末梢神経の神経再生を促進するだけでなく、成熟動物の中枢の神経組織からの神経再生をも促進することを明らかにしてきた。本研究は:(1)肝細胞分泌神経再生促進因子の分離・精製を更に進め、この因子を単離しそのアミノ酸シークエンスを決定すること、(2)この因子の中枢神経系に対する作用機序を明らかにすること、を目的として行ってきた。その結果:1.肝細胞培養上清の分離精製1994年に培養上清500L集め分離精製を行いアミノ酸シークエンスの部分的決定に成功し、この因子が新規であることがほぼ確実になった(特許の関係で詳細報告は割愛)。今年度はまず1000Lの培養上清を集めることに専念し、目的の量を集めることが出来た。現在その上清中から肝由来神経活性化因子を分離精製する方法を前回の方法を元に検討中である。来年度中に因子のアミノ酸シークエンスを決定し、遺伝子クローニングを確立する基盤を作り上げることが出来た。2.肝細胞分泌因子による中枢神経神経再生促進・生存維持機構の解明:網膜からの神経再生促進作用肝由来神経活性因子は若いラット・マウスから摘出した網膜からの神経再生を促進する事はすでに明らかにしてきた。今年度は24カ月令を越えた老化したマウスから摘出した網膜に対して作用させた。此の研究の結果老化に伴い網膜の神経再生力が低下することが明らかとなり、肝由来因子を作用させたころ神経再生促進作用を示した。更に術前に患者から眼球の一部を研究に使用する許可を得て網膜を培養した。この系に肝由来神経活性化因子を作用させたところ神経再生促進作用が見られた。肝由来神経活性化因子の臨床的用に向けこの因子の同定、遺伝子クローニングと同時にその作用機序を更に解明していく予定である。
G・Ｆ・プフタの法理論における判例の位置づけについて

本研究は、19世紀ドイツにおける歴史法学派のゲオルグ・フリードリッヒ・プフタの判例理論とその基礎にある思想を、他の論者たちと比較しながら、探求した。その成果として明らかとなったことは、プロイセンの裁判官ボルネマンや、学者のティボーは先例拘束性を肯定していたこと、これに対して、プフタは先例拘束性に対して否定的態度をとっており、その基礎には法秩序の可変性という考えがあったこと、である。平成26年度は、研究会および学会における報告と、論文の刊行を通じて、次の成果を公にした。まず、採択前に、法学部研究会(広島修道大学)において、プフタの法源論の特徴、特に判例の位置づけについて研究報告を行った(2014年5月15日)。これによって、2カ年(平成26年度と平成27年度)にわたる研究のおおまかな見取り図を提示した。次に、平成26年度の研究計画の中心となる、ティボーとサヴィニーの対立する法源論について、法典編纂の是非を問う彼らの論争を取り上げて、分析した。この内容については、愛知法理学研究会(中京大学)、法理学研究会(同志社大学)、日本法哲学会(京都大学)において報告の機会を得た。そこで有益なコメントを多数いただき、最終的には「19世紀ドイツにおける立法をめぐる思想」『修道法学』39巻2号(2015年)という形に結実した。この刊行論文においては、上記の法典論争をめぐって展開されたティボーとサヴィニーの理論を、ティボー『ドイツにおける一般民法典の必要性について』やサヴィニー『立法及び法学に対する現代の使命』(ともに1814年)を参照し、確認した。また、同時代あるいはその後の時代の論者の見解(例えば、彼らの同時代人のヘーゲルやガンス、ドイツの法典編纂史では過渡期にあたる19世紀半ばのボルネマン、法典編纂前夜にあたる19世紀後半のゾームのそれぞれの論文や著書)をも取り上げ、比較の対象を増やし、また長いタイムスパンをとることによって、ティボー、サヴィニーの思想史における位置づけについて明確にしえたと思う。これは、プフタの法源論を理解する上で前提かつ必要不可欠な作業である。これらをもとに、平成27年度には引き続いてプフタ法源論の本格的な分析に入っていく。平成27年度は、論文の刊行(1本)と、学会および研究会での報告(2回)を通じて、次の成果を公にした。まず、昨年度に刊行した拙稿「19世紀ドイツにおける立法をめぐる思想」『修道法学』39巻2号(2015年)の続編として、拙稿「19世紀プロイセン裁判所における法形成ー書面による方式主義を題材にー」(『法の理論34』成文堂、2016年2月、所収)を刊行した。本稿の目的は、書面による方式主義という具体的題材をもって、前稿で明らかにしたプロイセン司法官僚ボルネマンの裁判所中心の法源論(先例拘束性)を論証することであった。ボルネマンの先例拘束性は、本研究課題であるプフタの思想(先例拘束性の拒否)とは異なるものであり、歴史法学派の思想をより明確なものとするために、それとの比較材料を検討した。なお、次号の『法の理論35』でも、拙稿に対するコメントと、そのコメントに対する鈴木のリプライが予定されている。さらに、この内容については、2015年度日本法哲学会学術大会・A分科会(2015年11月7日土曜日、沖縄県市町村自治会館)においても報告する機会を得た。この報告では、上記の内容に加えて、歴史法学派の秩序観と、それによって規定される判例の位置づけについても言及した。本報告に対する質疑応答では、法形成・法発見等の概念的混乱、学説史的渉猟の不足、社会経済的状況と法形成との関係づけの不備等が指摘され、今後の研究課題を得ることができた。最後に、若手法哲学研究会(2016年2月26日金曜日、早稲田大学早稲田キャンパス)では、「ヴィルヘルム・アルノルトの法と社会に関する研究について」と題する報告を行った。アルノルトには歴史法学派の法源論における民族精神論を法社会学的実証研究にまで高めた功績がある。本報告では彼のプロフィールから著作の概要までをフォローし、歴史法学派の歴史的発展を跡づけた。本研究の目的は、19世紀前半ドイツの法学者G・F・プフタ(1798-1846)の法源論がもつ意味を、判例に着目しながら、明らかにすることである。平成26年度の研究は、プフタの師であるサヴィニーとその論敵ティボーの法源論の特徴を明らかにすることであった。これは、平成27年度に予定される本格的なプフタ研究のための前提作業であった。すでに研究概要で述べた通り、いくつかの研究会での報告(広島、京都、愛知)および学会報告(京都)において、本研究に対する多くの有益なコメントを得ることができた。その成果として「19世紀ドイツにおける立法をめぐる思想」『修道法学』37巻2号(2015年)を刊行することができた。

このように平成26年度においては平成27年度の作業のための足場を築くことができたので研究計画はおおむね順調に進行しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。法学、基礎法学平成27年度においては、プフタの法源論に本格的な分析を加える。主な分析対象となるテキストは、彼の全2巻におよぶ著書『慣習法論』(1827年、1837年)である。プフタはここで、基本的には慣習法の歴史と理論を中心に叙述を進めるが、同時に判例にも言及しており、その箇所を詳しく分析していく。上記の著書の他にも、彼の法学教科書や書評なども参照する。これとあわせて、プフタの法源論の独自性をより明確なものとするために、他の論者の理論をも取り上げ、プフタのそれと比較する。特に注目するのは、ティボーとベーゼラーである。具体的には、ティボー『パンデクテン法体系』(初版は1803年)やベーゼラー『民衆法と法曹法』(1843年)『ドイツ一般私法体系』(全3巻、1847ー1855年)等である。今後の研究の推進方策は、判例に関するプフタの法源論をティボーとベーゼラーの理論と比較対照すること、この比較によってプフタ法源論の特徴を析出すること、また平成26年度の研究成果を踏まえプフタとサヴィニーとの思想的関連を明らかにすることである。平成27年度の日本法哲学会での報告および専門誌への論文投稿も予定しており、これらの場を活用して、他の研究者からのアドバイスを得て、より充実した研究内容にしていく。
長期入院がん患児のディフィシル関連下痢症の予防ケアに関する教育プログラムの開発

血液腫瘍疾患で抗がん薬治療を受けた515歳の長期入院中のがん患児を対象に、糞便中の毒素検出、C. difficile分離培養、分離菌株における毒素産生パターンの同定、Polymerase chain reaction ribotypingによる解析、療養環境におけるC. difficile分布と伝播経路に関する調査をした。15名中13名からC. difficileが分離され、そのうち2名がC. difficile感染症と診断された。PCR ribotyping解析結果から、10名の患者間で4タイプの菌株が認められ、水平伝播の可能性が示唆された。長期入院がん患児の入院する小児病棟において、療養環境のC. difficileによる汚染状態を調査した。のべ502ヶ所を調べ、39ヶ所から39株、18タイプのC. difficileが分離された。血液腫瘍疾患で初めて抗腫瘍薬治療を受けた515歳の患児15名中13名から分離した19株と療養環境から分離した39株、計58株をPCR ribotypingにより、比較した結果、2名の患児の糞便からの分離菌株と療養環境からの分離菌株が一致した。療養環境から患児、患児から療養環境へとC. difficileが伝播し、がん患児においても医療関連感染を起こす可能性が示唆された。H23年度は、これまでの結果をもとに、がん患児のClostridium difficile感染症(CDI)予防のための環境整備や排泄ケア方法の検討を行った。その主な内容は、以下の通りである。がん患児や家族に対するCDI予防のための環境の清浄化として、共有スペースと専有スペースに分けて考えることが重要である。共有スペースにおいては、清掃業者や医療従事者による日常的に実施する一般的な清掃に加え、C. difficileの減数を前提にした療養環境、特に高頻度接触面やベッド周辺の床の清拭や、患児の退院時やベッド移動時には、プライバシーカーテンの洗濯や日常清掃では使用し難い、次亜塩素酸ナトリウムなどで十分な換気をしながら使用し、徹底した清掃を行うことも重要である。また、ベッド周辺等の専有スペースにおいては、家族に対し、清掃業者や看護師などの医療従事者が実施できない持ち込み物品の清拭をすることを指導することが重要である。さらに専有スペース内に設置されているポータブルトイレやその周辺の床は、患児や家族のプライバシーを尊重し、清掃業者や医療従事者による適切な清掃が重要である。さらに、小児の発達段階や付き添い家族の状況を考慮した排泄ケアや手指衛生の方法について、C. difficileの特徴を踏まえた指導が重要である。特に、手指衛生は、速乾性手指消毒薬の使用ではなく、石けんと流水による手指衛生が必要である。以上のような、患児や家族が実施するべき感染予防策を含めた、がん患児の背景を考慮した教育プログラムの構築および啓蒙が必要である。(抄録なし)
大腸菌ベロ毒素Bサブユニットによる細胞機能の阻害メカニズムの解析

アポトーシスの誘導には,細胞外からの種々の要因,すなわちFas-FasLやTNFaを介したレセプターによる刺激や薬物による刺激などが考えられているが,これらの刺激によって最終的には細胞内に存在するいくつかのプロテアーゼ群であるcaspase cascadeが活性化されて核の断片化,細胞の断片化が引き起こされることが知られている.すなわち,アポトーシスの誘導には外的な刺激に対して,アポトーシスを引き起こす新たなタンハク質,すなわちアポトーシス関連遺伝子の誘導が必須であることが種々の研究から報告されている.申請者らは腸管出血性大腸菌の産生するStxの各フラグメントをテトラサイクリン誘導プロモーターを用いた選択誘導系を用いて細胞内で直接発現させることによってアポトーシスを引き起こすことを明らかにした.従来、Stxによる細胞障害性はStxAフラグメントによるタンパク合成阻害能によって細胞障害性が誘導されると報告されてきたが、本研究において、従来細胞膜表面の糖鎖に結合するといわれていたStxBフラグメントによっても、細胞障害性が誘導されることを明らかとした。ここで報告した知見は,Stxによる細胞障害機能に関して全く新しい概念を提供するものであり,細菌感染によって,生体内の最初の防御システムである上皮細胞の破壊が重要であるとの知見を得た.さらに,申請者らはグラム陽性レンサ球菌の細胞内侵入に伴う細胞死への影響を検討するため,レンサ球菌の表層に存在する付着因子を欠失させた変異株を用いて,細胞死の誘導能について検討を加えた.A群レンサ球菌は、菌体表面に存在するMタンパク、ファイブロネクチン結合タンパクであるFタンパク、夾膜などによって宿主細胞に付着・侵入することが知られている。しかし、これらのタンパクと、細胞死誘導能については、その関連が未だ明らかとされていなかった。そこで、これらの決死塚部を用いて、細胞死誘導能について検討を加えたところ、フィブロネクチン結合タンパクを保有する菌株でのみ上皮細胞に対してアポトーシスが誘導されMタンパクのみではそのような機構は認められなかった。さらにそのごカニズムを詳細に検討したところ、ミトコンドリアからのシトクロムcの流出、およびBaxの集積が認められた。すなわち、A群レンサ球菌では細胞侵入性に伴い、ミトコンドリアの機能異常を引き起こし,カスパーゼ9を活性化することを明らかとした.腸管出血性大腸菌O157の産生するべロ毒素(Stx)は,腸管上皮細胞層の破壊を引き起こし,重篤な下痢症状を引き起こすことが知られている.StxはそのBサブユニットがGb3への結合に関与し、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ,細胞内で遊離したAサブユニットがリボソームに結合し,強力なタンパク質合成阻害作用を引き起こすことにより細胞障害を引き起こすことが様々な研究から示されてきた.アポトーシスの誘導には,細胞外からの種々の要因,すなわちFas-FasLやTNFαを介したレセプターによる刺激や薬物による刺激などが考えられているが,これらの刺激によって最終的には細胞内に存在するいくつかのプロテアーゼ(caspase cascade).我々はStxのBサブユニットをテトラサイクリン誘導プロモーターを用いた選択誘導系を用いて細胞内で直接発現させることによってアポトーシスを引き起こすことを明らかとした.アポトーシスの誘導には,細胞外からの種々の要因,すなわちFas-FasLやTNFaを介したレセプターによる刺激や薬物による刺激などが考えられているが,これらの刺激によって最終的には細胞内に存在するいくつかのプロテアーゼ群であるcaspase cascadeが活性化されて核の断片化,細胞の断片化が引き起こされることが知られている.すなわち,アポトーシスの誘導には外的な刺激に対して,アポトーシスを引き起こす新たなタンハク質,すなわちアポトーシス関連遺伝子の誘導が必須であることが種々の研究から報告されている.申請者らは腸管出血性大腸菌の産生するStxの各フラグメントをテトラサイクリン誘導プロモーターを用いた選択誘導系を用いて細胞内で直接発現させることによってアポトーシスを引き起こすことを明らかにした.従来、Stxによる細胞障害性はStxAフラグメントによるタンパク合成阻害能によって細胞障害性が誘導されると報告されてきたが、本研究において、従来細胞膜表面の糖鎖に結合するといわれていたStxBフラグメントによっても、細胞障害性が誘導されることを明らかとした。すなわち、A群レンサ球菌では細胞侵入性に伴い、ミトコンドリアの機能異常を引き起こし,カスパーゼ9を活性化することを明らかとした.
プロセス革新支援技術と日本型経営組織の融合方策に関する研究

以下、当該研究期間である平成7年度から平成8年度に行った研究成果の概要を以下に示す。1.特に製造業に関して、現在、進行しているプロセス革新を誘導している管理方策およびシステム構築コンセプトを文献を中心に調査し、それら方策およびコンセプトがどのような製造タイプ、販売タイプに有効かを明らかにした。その結果、日本の特色として産業構造における人的資源配分から、製造部門で培ってきたジャストインタイムや小集団活動等をベースに製造業全体のプロセス革新はもちろんのこと、流通、物流業におけるプロセス革新においてもこれらの適用を拡大していくのがスムーズなプロセス革新および産業構造の転換が可能となることがわかった。2.調査企業として、製造業では松下電工、松下電産、NTN、その他では西鉄を選び、それら企業で行われているシステム構築を含めたプロセス革新等の方法論を綿密に聞き取り調査した。その結果、システムを絶対的イネブラ-としてプロセス革新を行うには情報システム部門の力の弱い日本ではほとんど不可能と言ってよく、それを打開するには組織内に新たに業務改革を専門に行う部門の新設もしくはIS部門をその機能を持つ部門への転換を図ることが日本的組織にとり合理的かつ効率的にプロセス革新を実行できることがわかった。3.特に製造業および流通業のプロセス革新をスムーズに遂行でき、それを支援するDSS構築のための枠組みとして、製販機能関係を記述するマトリックスを提言した。構築したDSSでは、それを決定機構しており、自社の目指すべき方向を入力したなら自社が目指すべきプロセス革新がなされた上で構築されるべき製販統合理想システムを提示してくれ、さらにはそのシステムに到達するために強化すべき管理技術が示唆されるものであり、今後の方針に迷う産業界にとって有用な枠組みおよびDSSであると考えている。日本の経営組織の組織構造や業務手続きの実状に即してプロセス革新を行うための新たな管理方策やシステム設計方法論を構築するために、本年度に行った主な研究と研究成果を以下に示す。1.特に製造業に関して、現在、進行しているプロセス革新を誘導している管理方策およびシステム構築コンセプトを文献を中心に調査し、個々のそれら方策およびコンセプトがどのような製造タイプ、販売タイプに有効かを明らかにした。そして、それらの分析を通して日本の特色がどこにあるかを検討した。その結果、日本の特色として産業構造における人的資源配分から、製造部門で培ってきたジャストインタイムや小集団活動等をべ-スに製造業全体のプロセス革新はもちろんのこと、流通、物流業におけるプロセス革新においてもこれらの適用を拡大していくのがスムースなプロセス革新および産業構造の転換が可能となることがわかった。2.調査企業として、製造業では松下電工、松下電産、NTN、その他では西鉄を選び、いずれも独自の考え方に基づいてプロセス革新を積極的に行っている企業であるが、それら企業で行われているシステム構築を含めたプロセス革新等の方法論を聞き取り調査によって緻密に調べた。その結果、システムを絶対的イネブラ-としてプロセス革新を行うには情報システム部門の力の弱い日本ではほとんど不可能と言ってよく、それを打開するには組織内に新たに業務改革を専門に行う部門の新設もしくは情報システム部門のその機能を持つ部門への転換を図って行うことが現状の日本的組織にとって最も合理的かつ効率的なプロセス革新を実行できることがわかった。

2.調査企業として、製造業では松下電工、松下電産、NTN、その他では西鉄を選び、それら企業で行われているシステム構築を含めたプロセス革新等の方法論を綿密に聞き取り調査した。その結果、システムを絶対的イネブラ-としてプロセス革新を行うには情報システム部門の力の弱い日本ではほとんど不可能と言ってよく、それを打開するには組織内に新たに業務改革を専門に行う部門の新設もしくはIS部門をその機能を持つ部門への転換を図ることが日本的組織にとり合理的かつ効率的にプロセス革新を実行できることがわかった。3.特に製造業および流通業のプロセス革新をスムーズに遂行でき、それを支援するDSS構築のための枠組みとして、製販機能関係を記述するマトリックスを提言した。構築したDSSでは、それを決定構築しており、自社の目指すべき方向を入力したなら自社が目指すべきプロセス革新がなされた上で構築されるべき製販統合理想システムを提示してくれ、さらにはそのシステムに到達するために強化すべき管理技術が示唆されるものであり、今後の方針に迷う産業界にとって有用な枠組みおよびDSSであると考えている。
銀行融資と不動産価格の内生的関係のマイクロデータによる分析

研究代表者らによるKurashima, Mizunaga, Odaki and Watanabe (2013)では、東京23区の土地取引の成約価格と融資金額のマッチングデータを用い、不動産融資(LTV)が不動産価格(面積単価、地域と年で調整済み)を引き上げる効果があることを示した。この研究では、不動産担保融資を得て不動産を購入するケースで、LTVを10%ポイント引き上げると、購入価格が15%上昇することが示された。この研究は、マイクロデータを用いて因果関係の方向性を識別した最初の分析である。しかしながら、このKurashima, Mizunaga, Odaki and Watanabe (2013)の不十分な点としては、不動産の個別性を十分にコントロールできていないために、仮に価格に影響する属性がLTVと相関していれば、見せかけの相関が観測され、バイアスを生じることとなる。このため2018年度においては、個別不動産の価格に影響する立地条件や法令上の規制のへドニック変数として、土地計画、前面道路、接道、用途規制、防火規制、また駅からの距離、鉄道路線、都心へのアクセスといった変数を個別のレコードの変数に加えて検討を続けた。また、不動産担保融資が不動産価格を変化させる、という方向の因果関係や、「不動産融資に影響するが不動産価格には直接影響しない操作変数」となりえる事象を発見するため、国内外で、過去に特徴ある不動産価格変動や、制度変化、外国からの不動産投資の急増などの条件変化を生じた地域のアネクドータルで自然実験的な事例を観察した。2018年度においては、個別不動産の価格に影響する立地条件や法令上の規制のへドニック変数を個別のレコードの変数に加えて検討を続けた。また、不動産担保融資が不動産価格を変化させる因果関係や、分析の操作変数となりえる事象を発見するため、国内外のアネクドータルで自然実験的な事例を観察した。しかしながら、別途延長申請書に記載した事情のため、2018年度はデータ分析と現地調査に十分な時間を割くことができなかったため、研究に多少の遅れを生じ、研究期間を2019年度まで延長する申請をした。研究期間の延長により2019年度が最終年度となる。2019年度は、これまでに作成したヘドニックデータを付与したマイクロデータによる分析を行い、特に操作変数の外生性についての検討を深めながらモデルの係数の推計を行う。また政策や自然災害によるショックや、外的な資金流入、資金流出が不動産市況に及ぼしてきた影響について、内外の典型的事例を観察し、モデルの理論的な妥当性と、さらなる改善の余地について検討を行う。初年度は、Kurashima, Mizunaga, Odaki and Watanabe (2013)において構築した土地取引のマイクロデータを拡充し、このデータを用いて不動産融資(LTV)が不動産価格に及ぼす影響をより高度に分析した。土地取引のマイクロデータは、1985年から最新時点に至る東京都23区内の土地売買に関し、1不動産売買成約データ、2設定抵当権データ、3金融機関データ、の3つを各取引レコードにマッチングさせて構築した。1不動産売買成約データとして収集する変数は、売買年月日、売買価格、物件の住所と地番、売り手の属性、買い手の属性、道路付け(共有私道の有無等)、用途地域、最寄り駅名、駅からの距離、容積率等である。データの構築に当たっては、この情報は通常はアクセスが困難であるが、本研究においては研究協力者(水永)の保有する売買成約価格データを用いた。2担保データとして収集する変数は、売買年月日、設定抵当額、抵当の種類(根抵当ダミー、共同担保ダミー)、融資金融機関名、借り手情報(法人、個人、金融機関関連企業等)、抵当権実行状況(完済、売却、競売等)である。データの構築にあたっては、不動産売買成約データの物件の登記簿甲欄乙欄の記録を用いる。また、住宅公庫(住宅機構)への債権譲渡についても変数を作成した。このデータを用い、不動産取引価格(区・年平均調整済み)を、銀行融資(LTV)で回帰した。内生性を除去するために、根抵当ダミーと、共同抵当ダミーを用いた操作変数を用いた。研究代表者及び研究分担者らによるKurashima, Mizunaga, Odaki and Watanabe (2013)は、東京23区の土地取引の成約価格と融資金額のマッチングデータを用い、操作変数法によって逆方向の因果関係から識別しつつ、不動産融資(LTV)が不動産価格(平米単価、地域と年で調整済み)を引き上げる効果があることを示した。この研究では、不動産担保融資を得て不動産を購入するケースで、LTVを10%ポイント引き上げると購入価格が15%上昇することが示された。この研究は、マイクロデータを用いて因果関係の方向性を識別した最初の分析であり、各国の中央銀行等からの照会、招待講演等の依頼を多く受けているところである。しかしながら、このKurashima, Mizunaga, Odaki and Watanabe (2013)の不十分な点としては、不動産の個別性を十分にコントロールしていないため、仮に価格に影響する属性がLTVと相関する場合にはバイアスを生じる、といった問題を有している。このため27年度においては、不動産担保融資が行なわれるメカニズムと、不動産担保融資が不動産価格を上昇させるメカニズムについて(量質ともに少ない)既存の文献を調査するとともに、国内外で、過去に不動産バブルを生じた地域のアネクドータルな事例を調べ、理論モデルに不完全性や非合理性を導入する可能性について、検討を進めた。

27年度においては、23区の土地を対象としたマッチングデータの分析をより正確なものとするための操作変数についての検証を進めるとともに、理論モデルに不完全性や非合理性を導入する可能性について、検討を進めている。研究代表者らによるKurashima, Mizunaga, Odaki and Watanabe (2013)では、東京23区の土地取引の成約価格と融資金額のマッチングデータを用い、捜査変数方によって逆方向の因果関係から識別しつつ、不動産融資(LTV)が不動産価格(面積単価、地域と年で調整済み)を引き上げる効果があることを示した。この研究では、不動産担保融資を得て不動産を購入するケースで、LTVを10%ポイント引き上げると、購入価格が15%上昇することが示された。この研究は、マイクロデータを用いて因果関係の方向性を識別した最初の分析であり、各国の中央銀行党からの紹介、招待講演等の依頼も受けてきている。しかしながら、このKurashima, Mizunaga, Odaki and Watanabe (2013)の不十分な点としては、不動産の個別性を十分にコントロールできていないために、仮に価格に影響する属性がLTVと相関していれば、見せかけの相関が観測され、バイアスを生じる。このため28年度においては、東京23区のデータによるこれまでの操作変数方による識別を用いた分析を一段落させるとともに、ヘドニック変数を追加する方法について検討した。また、不動産担保融資が不動産価格を上昇させるメカニズムの文献調査と並行しつつ、国内外で、過去に不動産バブルを生じた地域のアネクドータル、自然実験的な事例を調べ、理論モデルの問題点を検討した。28年度は、東京23区の土地を対象とした分析を一段落させるとともに、不動産価格の急変動が起こった地域の実例から、従来の理論では十分に説明しきれていない、融資の影響力の大きさを観察した。しかしながら、このKurashima, Mizunaga, Odaki and Watanabe (2013)の不十分な点としては、不動産の個別性を十分にコントロールできていないために、仮に価格に影響する属性がLTVと相関していれば、見せかけの相関が観測され、バイアスを生じることとなる。このため29年度においては、東京23区のデータによるこれまでの操作変数方による識別を用いた分析を一段落させるとともに、ヘドニック変数を追加することとして、個別不動産の価格に影響する立地条件や法令上の規制のデータを収集し、マイクロデータに付加した。
iPS新細胞を用いたアルツハイマー型痴呆症における神経再生治療研究

アルツハイマー型痴呆症などの中枢神経系の脱落による疾患は、未だに根治療法が存在しない。そこで、本研究では、iPS細胞による中枢神経再生療法の実現に向けて、分化させたiPS細胞から神経幹細胞を効率よく純化させる方法論を構築した。人工多能性幹細胞(iPS細胞)を用いた研究では、未分化な状態から目的の細胞へと分化させるステップが必要と考えられるが、全ての細胞を単一の細胞群へと分化させる方法は未だに開発されていない。申請者はこれまでに、神経幹細胞において、赤色蛍光タンパク質DsRedと薬剤耐性遺伝子(BSD)の両タンパク質がIRES (internal ribosomal entry site)を介してバイシストロニックに発現するマウスiPS細胞を樹立しており、抗生物質Blasticidin S (BcdS)の添加により、神経幹細胞を純化できることを示唆している。しかしながら、詳細な検討を行った結果、構築した遺伝子から発現するDsRedとBSDの発現量には相関がみとめられなかったため、BSDの発現を赤色蛍光でモニターできるよう改良を加えた。具体的には、DsRedとBSDを自己開裂ペプチド(2Aペプチド)で繋いだ遺伝子を新たに構築し、本遺伝子がゲノムに組み込まれたiPS細胞株を樹立した。その際、piggyBacトランスポゾンを利用した遺伝子導入法を採用したことで、iPS安定発現細胞を、従来の約10倍高い効率で作製できた。樹立したiPS細胞株を神経細胞へと分化誘導させ、DsRedの蛍光とBSDの発現量を経時的に調べた結果、両タンパク質の発現量に相関がみとめられた。本細胞を分化させた後、抗生物質Blasticidin Sを添加し、Nestin抗体を用いた免疫染色を行った結果、Nestin陽性の神経幹細胞が効率よく純化されることを確認した。人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、ES細胞を治療に応用する際の拒絶反応や倫理的問題を解消し、再生医療への応用が期待されている。一方で、iPS細胞を分化させると、多くの細胞種が混在するため、目的となるターゲット細胞を純化する過程が必須となる。特に、両生能力が低いことが知られている中枢神経系は、iPS細胞を用いた細胞療法の重要なターゲットと考えられている。そこで、神経幹細胞をターゲット細胞のモデルとし、薬剤耐性遺伝子を神経幹細胞に特異的に発現させ、薬剤選択を利用してターゲット細胞を純化させる方法を考えた。まず、神経幹細胞特異的エンハンサーとして知られているNestinの2番目のイントロン領域をクローニングし、その機能をルシフェラーゼアッセイにより確認した。その結果、本領域に含まれる257bpの領域が、Nestin陽性細胞株におけるエンハンサー機能を担っており、ルシフェラーゼの発現量を約5倍増加させた。さらに、257bpの領域を2つ繋げたタンデム型エンハンサーでは、ルシフェラーゼの遺伝子発現量が約10倍となり、相加的に上昇した。次に、Hsv-tkプロモーターとタンデム型エンハンサーの下流でDsRedとBlasticidin S耐性遺伝子(Bsd)を同時に発現するコンストラクト(N257x2HB2AD)を構築し、piggyBacトランスポゾンを利用してiPS細胞のゲノムへ効率的に導入した。樹立した安定発現株(iPS(N257x2HB2AD)を、神経系へと分化させ、分化14日目から20日目まで、Blasticidin Sを添加したところ、約10%の神経幹細胞の純化が見られた。以上より、薬剤選択を利用して、分化させたiPS細胞から神経幹細胞を効率的に純化できることが示され、アルツハイマーやパーキンソンなどの中枢神経系の再生医療への応用が期待される。
環境試料ノンターゲット分析のための不活性ガスを用いたソフトイオン化法の研究

今年度は、昨年度の課題であった測定データの再現性を改善するために、装置の基礎データを蓄積し、ハードウェアの特徴を詳細に調べることで、再現性の高いデータをとるための条件を確立した。具体的には、イオン源温度の設定値と実測値の差、試薬ガスの種類・流量、イオン源温度による真空度の変化、チューニングの有無による感度の変化等のデータ取りを行い、本装置において再現性の高いデータ取りが可能となる測定条件を決めた。次に、決定した条件を用いて、試薬ガスの種類と流量(0.13.5 mL/min)、イオン源温度(設定OFF,200°C,280°C)、イオン化電圧(20150 eV)等、ソフトイオン化に関わる様々なパラメーターを変化させ、有機ハロゲン化合物混合標準溶液を測定した。試薬ガスは、不活性ガス(Ar, He)のほか、化学イオン化法の試薬ガスとして一般的に使われているメタン(CH4)を用いた測定も行った。得られた各化合物の質量スペクトルを詳細に解析し、分子イオン(負イオン)の強度を調べた結果、不活性ガスを用いたソフトイオン化では、イオン源温度が分子イオン強度に大きな影響を及ぼすことがわかり、イオン源の温度設定をOFF(測定中の実測値:約80190°C)にした際に、PCB209やOCDF、OCDDなどの高塩素化体の分子イオン強度がもっとも高くなることが明らかとなった。得られた最適条件をGC×GC-HRTOFMSによるハウスダスト粗抽出液分析に試験的に適用し、環境試料ノンターゲット分析における不活性ガスによるソフトイオン化法の有効性を確認した。今年度は、昨年度の課題として挙げていた測定データの再現性を改善することが出来た。決定した条件を用いて、ソフトイオン化に関わる様々なパラメーターを変化させ、約50種類の条件で有機ハロゲン化合物混合標準溶液を測定し、有機ハロゲン化合物の分子イオンの強度を調べた結果、不活性ガス(Ar, He)を用いたソフトイオン化では、イオン源温度が分子イオン強度に大きな影響を及ぼすことがわかり、イオン源の温度設定をOFFにした際に、もっとも高塩素化体の分子イオン強度が高くなることが明らかとなった。得られた不活性ガス(Ar)によるソフトイオン化の最適条件をGC×GC-HRTOFMSによるハウスダスト粗抽出液分析に試験的に適用し、その有用性を評価するとともに、学会発表を行った。今年度は、不活性ガスによるソフトイオン化条件の検討を行い、得られた最適条件1つをGC×GC-HRTOFMSによるハウスダスト粗抽出液分析に試験的に適用した。今後は、3種類の試薬ガス(Ar, He, CH4)を用いて、それぞれの最適条件を用いてハウスダスト粗抽出液を測定する。従来の電子イオン化(EI)法でも同様の試料を測定し、各データを比較しながら詳細にデータ解析を行うことで、各イオン化法の特徴を理解し、環境試料ノンターゲット分析における目的に応じた活用方法を整理する。また有機ハロゲン化合物混合標準溶液とハウスダスト粗抽出液の測定データを比較し、環境試料マトリックスがソフトイオン化の感度や安定性、耐久性等に与える影響を調べる。本研究では、従来のターゲット分析では見逃してきた可能性のある「リスク懸念物質の捕捉」や「毒性物質スクリーニング」、「複合影響評価」にも利用可能なGC×GC-HRTOFMSによる包括的かつ超高感度なノンターゲット分析手法構築の一環として、新たに不活性ガスによるソフトイオン化法を検討し、環境試料中に存在する有機ハロゲン化合物の分子イオンの包括的超高感度検出の実現を目的とする。本年度は、不活性ガスの中でも比較的安価で入手しやすいアルゴンとヘリウムを用いて、ソフトイオン化測定条件の基礎検討を行った。比較のために、化学イオン化法の試薬ガスとして一般的に使われているメタンを用いた測定も行った。本研究は、GC×GC-HRTOFMSを用いたノンターゲット分析におけるソフトイオン化法の適用を目的としているが、GC×GCは、高分離を得るために測定時間が長く、通常のGC分析の2倍程度かかるため、本年度の基礎検討については、GC-HRTOFMSでの検討を行い時間の短縮を図った。試薬ガス流量、カラム流量、イオン源温度、電子加速電圧等、ソフトイオン化に関わる様々なパラメーターを変化させ、有機ハロゲン化合物混合標準溶液を測定し、得られた各化合物の質量スペクトルを詳細に解析した。具体的には、フラグメントイオンを含めた全イオンに対する分子イオンの相対強度(フラグメンテーションが起きない場合は約100%)、電子イオン化(EI)法で得られた分子イオンとソフトイオン化で得られた分子イオンの強度比、分子イオンのマスクロマトグラム上の各ピークのシグナルノイズ比(S/N比)や再現性などを算出し、各イオン化パラメーターの最適な組み合わせを検討した。当初の計画では、今年度中に各試薬ガスにおけるソフトイオン化法の最適条件を決定する予定だったが、ハードウェア上の弱点に起因するデータの再現性の低さが問題となり、最適条件を絞り込むことが出来なかった。この点は、来年度以降ハードウェアの特徴を詳細に調査したうえで、再現性の高い最適条件を1つに絞り込みたい。

次に、決定した条件を用いて、試薬ガスの種類と流量(0.13.5 mL/min)、イオン源温度(設定OFF,200°C,280°C)、イオン化電圧(20150 eV)等、ソフトイオン化に関わる様々なパラメーターを変化させ、有機ハロゲン化合物混合標準溶液を測定した。試薬ガスは、不活性ガス(Ar, He)のほか、化学イオン化法の試薬ガスとして一般的に使われているメタン(CH4)を用いた測定も行った。得られた各化合物の質量スペクトルを詳細に解析し、分子イオン(負イオン)の強度を調べた結果、不活性ガスを用いたソフトイオン化では、イオン源温度が分子イオン強度に大きな影響を及ぼすことがわかり、イオン源の温度設定をOFF(測定中の実測値:約80190°C)にした際に、PCB209やOCDF、OCDDなどの高塩素化体の分子イオン強度がもっとも高くなることが明らかとなった。得られた最適条件をGC×GC-HRTOFMSによるハウスダスト粗抽出液分析に試験的に適用し、環境試料ノンターゲット分析における不活性ガスによるソフトイオン化法の有効性を確認した。今年度は、昨年度の課題として挙げていた測定データの再現性を改善することが出来た。決定した条件を用いて、ソフトイオン化に関わる様々なパラメーターを変化させ、約50種類の条件で有機ハロゲン化合物混合標準溶液を測定し、有機ハロゲン化合物の分子イオンの強度を調べた結果、不活性ガス(Ar, He)を用いたソフトイオン化では、イオン源温度が分子イオン強度に大きな影響を及ぼすことがわかり、イオン源の温度設定をOFFにした際に、もっとも高塩素化体の分子イオン強度が高くなることが明らかとなった。得られた不活性ガス(Ar)によるソフトイオン化の最適条件をGC×GC-HRTOFMSによるハウスダスト粗抽出液分析に試験的に適用し、その有用性を評価するとともに、学会発表を行った。有機ハロゲン化合物混合標準溶液を用いたソフトイオン化法の最適条件が決まり次第、環境試料マトリックスがソフトイオン化の感度や安定性、耐久性等に与える影響を調べる。具体的には、有機ハロゲン化合物を添加した環境試料抽出液(土壌、大気粒子など)を用意し、決定した最適条件にて繰り返し測定を行い、データを詳細に解析する。また従来のメタンを用いた測定も行い、同様にデータを解析し、本手法の優位性を確認する。今年度は、不活性ガスによるソフトイオン化条件の検討を行い、得られた最適条件1つをGC×GC-HRTOFMSによるハウスダスト粗抽出液分析に試験的に適用した。今後は、3種類の試薬ガス(Ar, He, CH4)を用いて、それぞれの最適条件を用いてハウスダスト粗抽出液を測定する。従来の電子イオン化(EI)法でも同様の試料を測定し、各データを比較しながら詳細にデータ解析を行うことで、各イオン化法の特徴を理解し、環境試料ノンターゲット分析における目的に応じた活用方法を整理する。また有機ハロゲン化合物混合標準溶液とハウスダスト粗抽出液の測定データを比較し、環境試料マトリックスがソフトイオン化の感度や安定性、耐久性等に与える影響を調べる。初年度は、当初の研究計画より進捗が遅れていたため、もともと本年度に予定していた国際学会での発表を延期した。その結果、本年度は旅費の使用額が予定よりも少なくなった。
わが国のコウモリにおける病原性バルトネラの生態解明と分離株の簡易同定法の開発

今年度は,2013年に和歌山県で捕獲したユビナガコウモリ50頭,2017年と2018年に北海道で捕獲したキタクビワコウモリ123頭からBartonellaの分離を試みるとともに,分離株のgltA領域に基づく系統解析を行った。さらに,コウモリから採取した外部寄生虫種を同定するとともに,Bartonellaの分離・検出を試みた。Bartonellaはユビナガコウモリの24%(12/50)から分離された。ユビナガコウモリにはクモバエNycteribia allotopa (N=10)とPenicilidia jenyncii (N=18),ならびに既存種にないNycteribia sp. (N=24)が寄生しており,Bartonella DNA保有率はそれぞれ20%(2/10),0,16.7%(4/24)であった。一方,キタクビワコウモリの26%(32/123)からBartonellaが分離され,その外部寄生虫はコウモリノミ(N=178)とコウモリトコジラミ(N=2)であった。コウモリノミ1検体(0.6%;1/178)からBartonellaが分離され,77検体(43.2%;77/178)からBartonella DNAが検出された。一方,トコジラミからはBartonellaは検出されなかった。分離株の系統解析では,ユビナガコウモリ属固有のBartonella,クビワコウモリ属固有のBartonellaならびにそれぞれのコウモリには新たな系統のBartonellaが分布していることが明らかになった。今年度の研究から,わが国のユビナガコウモリとキタクビワコウモリには,それぞれ2系統のBartonellaが分布しており,ユビナガコウモリではNycteribia属のクモバエが,キタクビワコウモリではコウモリノミがBartonella属菌の伝播に関与している可能性が示唆された。わが国のコウモリにおける病原性バルトネラの生態解明と分離株の簡易同定法の開発を目的として,平成30年度は国内の2カ所で2種類のコウモリ(ユビナガコウモリ50頭,キタクビワコウモリ123頭)を捕獲することができた。捕獲したコウモリからBartonella属菌の分離を行うとともに分離株については,gltA領域に基づく系統解析とgltAとrpoB領域に基づく相同性解析を行った。また,コウモリにおけるBartonellaのベクターを明らかにするため,コウモリの外部寄生虫についても,形態学的およびチトクロームオキシダーゼI領域の塩基配列から外部寄生虫種を同定するとともにBartonellaの分離を試みた。さらに,ssrA領域を対象としたrealtime-PCR,gltA領域を対象としたconventional-PCRによってコウモリの外部寄生虫からBartonella DNAの検出も継続して行っている。これらの研究はおおむね順調に進展している。現在,新たなコウモリの捕獲候補地を探索中であり,次年度以降の研究に向けた準備を進めている。さらに,本研究で得られたコウモリおよび外部寄生虫由来分離株と既存のBartonellaを用い,gyrB遺伝子配列に基づいた簡易菌種同定法の開発を進めている。平成31年度は,引き続き他の地域においてコウモリを捕獲しBartonella属菌の分離を試みる予定である。これまでに検討したユビナガコウモリ,キタクビワコウモリに加え,過去に検討されていない洞窟等を棲家とするモモジロコウモリ(Myotis spp.)やキクガシラコウモリ(Rhinolophus spp.),住家性コウモリの一種であるアブラコウモリ(Pipistrellus abramus)についても同様の手法を用いてBartonellaの分離と分離株の解析を行う予定である。さらに,さまざまなコウモリの外部寄生虫についてもBartonellaの分離,そのDNAの検出を試みるとともに,コウモリ分離株と寄生虫分離株の遺伝子性情を比較検討することによって,コウモリ種毎にどのような外部寄生虫がBartonella属菌を媒介するベクターとなっているかを明らかにしていく。一方,これまでにコウモリから分離した4系統のBartonella属菌は,新種である可能性が示唆されたことから,次世代シーケンサーMiseqとロングリードシーケンサーであるNanopore MinIONを組み合わせて分離株の全ゲノム解析を行う予定である。解析した全ゲノムの中から,病原性因子であるBartonella effector proteinsをコードするBeps遺伝子と宿主特異性を決定するTrw遺伝子を解析し,コウモリ由来Bartonellaのヒトに対する病原性,感染性の検討を行う予定である。

一方,トコジラミからはBartonellaは検出されなかった。分離株の系統解析では,ユビナガコウモリ属固有のBartonella,クビワコウモリ属固有のBartonellaならびにそれぞれのコウモリには新たな系統のBartonellaが分布していることが明らかになった。今年度の研究から,わが国のユビナガコウモリとキタクビワコウモリには,それぞれ2系統のBartonellaが分布しており,ユビナガコウモリではNycteribia属のクモバエが,キタクビワコウモリではコウモリノミがBartonella属菌の伝播に関与している可能性が示唆された。わが国のコウモリにおける病原性バルトネラの生態解明と分離株の簡易同定法の開発を目的として,平成30年度は国内の2カ所で2種類のコウモリ(ユビナガコウモリ50頭,キタクビワコウモリ123頭)を捕獲することができた。捕獲したコウモリからBartonella属菌の分離を行うとともに分離株については,gltA領域に基づく系統解析とgltAとrpoB領域に基づく相同性解析を行った。また,コウモリにおけるBartonellaのベクターを明らかにするため,コウモリの外部寄生虫についても,形態学的およびチトクロームオキシダーゼI領域の塩基配列から外部寄生虫種を同定するとともにBartonellaの分離を試みた。さらに,ssrA領域を対象としたrealtime-PCR,gltA領域を対象としたconventional-PCRによってコウモリの外部寄生虫からBartonella DNAの検出も継続して行っている。これらの研究はおおむね順調に進展している。現在,新たなコウモリの捕獲候補地を探索中であり,次年度以降の研究に向けた準備を進めている。さらに,本研究で得られたコウモリおよび外部寄生虫由来分離株と既存のBartonellaを用い,gyrB遺伝子配列に基づいた簡易菌種同定法の開発を進めている。平成31年度は,引き続き他の地域においてコウモリを捕獲しBartonella属菌の分離を試みる予定である。これまでに検討したユビナガコウモリ,キタクビワコウモリに加え,過去に検討されていない洞窟等を棲家とするモモジロコウモリ(Myotis spp.)やキクガシラコウモリ(Rhinolophus spp.),住家性コウモリの一種であるアブラコウモリ(Pipistrellus abramus)についても同様の手法を用いてBartonellaの分離と分離株の解析を行う予定である。さらに,さまざまなコウモリの外部寄生虫についてもBartonellaの分離,そのDNAの検出を試みるとともに,コウモリ分離株と寄生虫分離株の遺伝子性情を比較検討することによって,コウモリ種毎にどのような外部寄生虫がBartonella属菌を媒介するベクターとなっているかを明らかにしていく。
プロテアソーム活性化因子の分子集合機構の解明

本研究では、プロテアソームの分子集合機構を時空間的に理解することを最終目標としている。既知のプロテアソーム特異的シャペロンはプロテアソーム中間体に一過的に結合する性質であるため、1年目である今年度はプロテアソームの一過性結合因子の同定を試みた。ネイティブ質量分析法により出芽酵母26Sプロテアソームの構成量比と中間体の解析を行ったところ、19S制御因子複合体の基底部を構成するサブユニットRpn1を含むプロテアソーム中間体より脱ユビキチン化酵素Ubp6が新たに同定された。確認のため、アフィニティー精製したプロテアソームをショ糖密度勾配遠心法により分画しウェスタンブロット解析したこところ、プロテアソーム中間体を含むフラクションにUbp6が同定された。Ubp6がプロテアソームの分子集合に関与しているか検討するため、既知のプロテアソーム特異的シャペロンとの多重変異株を作製した。温度感受性を試験したところ、多重変異株において高温で相加的な成長遅延が見られたためUBP6はプロテアソームの分子集合を正に制御している可能性が示唆された。ネイティブ電気泳動-in gel蛍光イメージングで複合体形成能を解析したところ、多重変異株において26Sプロテアソームおよびプロテアソーム中間体の形成が顕著に低下していた。これらの結果から、Ubp6がプロテアソーム中間体に結合することにより非特異的に結合するユビキチン化タンパク質を排除するという仮説を立てた。UBP6の欠損株からプロテアソームを精製し、ショ糖密度勾配遠心-ウェスタンブロット解析したところプロテアソーム中間体を含むフラクションにユビキチン化タンパク質の蓄積が見られた。リコンビナントのUbp6を加えてインキュベートしたところ、ユビキチン化基質の蓄積は解消された。プロテアソームの分子集合にUbp6の活性が必要なのかを検討するため、変異体であるubp6 C118Aを多重変異株に戻したところ温度感受性を抑制することが出来なかった。これらからUbp6がプロテアソーム中間体に結合し、活性依存的にユビキチン化基質の結合を排除することでプロテアソームの分子集合を保護するという新たな機構が明らかとなった。平成23年度で辞退のため、平成24年度以降は実施せず平成23年度で辞退のため、平成24年度以降は実施せず本研究では、プロテアソームの分子集合機構を時空間的に理解することを最終目標としている。平成23年度で辞退のため、平成24年度以降は実施せず平成23年度で辞退のため、平成24年度以降は実施せず