hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
老化関連蛋白Klothoによる血管老化制御:脂肪細胞分化調節と内皮細胞保護から

1,Klothoの脂肪分化促進作用マウス線維芽細胞(3T3-L1)を脂肪細胞に分化誘導したところ、Klotho発現は早期に急激に上昇した。次に、Klotho-siRNAプラスミドを遺伝子導入し、脂肪分化を誘導したところ、PPARγ、CEBPα、β、δといった脂肪分化マーカーの発現抑制が見られた。またKlotho過剰発現プラスミドの場合は、マーカー発現が上昇し、分化促進を示した。精製Klotho蛋白を用いた場合にも、各脂肪分化マーカー発現が上昇し、Oil red O染色による脂肪分化測定においても分化が促進するという結果が確認された。以上の事からKlothoが脂肪分化早期において脂肪分化を促進する作用を有する事が示された(Endocrinology, 2006)。2,血管内皮細胞におけるKlothoの抗炎症作用Klotho蛋白の抗炎症作用についての研究を行った。炎症を惹起するTNF-αの刺激により、血管内皮細胞は、ICAM-1、VCAM-1といった接着因子の発現が上昇し、NF-・B活性が亢進する。Klotho蛋白を加えると、ICAM-1、VCAM-1の発現は低下、NF-・B活性が減弱した。またI・-Bのリン酸化も同様の変化を示した。これらの事実からKlotho蛋白は、血管内皮細胞において抗炎症作用を示し、これはNF-・B活性の抑制を介する事が明らかとなった。3,脂肪分化におけるKlothoとFGF23の作用Klothoと相互作用のあるFGF23の脂肪分化における作用について、実験を行った。3T3-L1細胞から脂肪細胞への分化時にKlothoの発現が増加するのに対して、FGF23及びその受容体の発現は低下し、またFGF23蛋白は、Klotho蛋白の脂肪分化促進作用を抑制した。この作用は、他の臓器と異なり、脂肪細胞に特異的な機能であると考えられる。老化関連蛋白klotho遺伝子のcDNAを発現ベクターに挿入し、klotho過剰発現プラスミドを作成した。またプラスミドを細胞内に遺伝子導入し、klotho蛋白を抽出した。Klothoの発現抑制のために、klotho-siRNAプラスミドを作成した。まずマウス線維芽細胞(3T3-L1)を脂肪細胞に分化誘導し、klotho発現の変化を調べたところ、早期に急激に上昇し、その後徐々に低下した。これにより、klothoが脂肪細胞分化早期になんらかの役割を有する事が示唆された。次にKlotho-siRNAプラスミドをマウス3T3-L1細胞に遺伝子導入し、脂肪分化を誘導したところ、コントロールに比べ、PPARγ、CEBPα、β、δなどの脂肪分化マーカーの抑制が見られた。またklotho過剰発現プラスミドを同様に遺伝子導入し、マーカーを調べたところ、逆に脂肪分化の促進を示す結果となった。これにより、klothoは、脂肪分化を促進する作用を有すると考えられたため、抽出したklotho蛋白を3T3-L1細胞にふりかけ、同時に脂肪分化を行ったところ、各脂肪分化マーカーの上昇、Oil red 0染色による脂肪分化促進が確認された。これらの作用は、成熟脂肪細胞に分化後には、見られなかった。以上のことからklothoが脂肪分化早期において脂肪分化を促進する作用を有することが示された。すでにこの実験結果を論文にまとめ、報告を行った(Endocrinology,2006)。またKlothoの血管内皮細胞に対する効果に関しても実験を行っており、炎症抑制効果が示唆される実験結果が得られている。1,血管内皮細胞における老化抑制蛋白Klothoの抗炎症作用

Klotho蛋白の抗炎症作用について研究を行った。TNF-α刺激により、血管内皮細胞は、ICAM-1、VCAM-1といった接着因子の発現が上昇し、NF-kb活性が亢進する。そこにKlotho蛋白を加えると、ICAM-1、VCAM-1の発現は低下、NF-kb活性が減弱した。またIk-Bのリン酸化も同様の変化を示した。これらの事実からKlotho蛋白は、血管内皮細胞において抗炎症作用を示し、これはNF-kb活性の抑制を介する事が明らかとなった。2,脂肪分化における老化抑制蛋白Klothoの役割これまでに、Klotho蛋白が脂肪分化を促進する事を示したが、klothoと相互作用のあるFGF23の脂肪分化における作用、klothoとの関係について、実験を行った。細胞実験では、3T3-L1細胞から脂肪細胞への分化時にKlothoの発現が増加するのに対して、FGF23及びその受容体の発現は低下し、またFGF23蛋白は、klotho蛋白の脂肪分化促進作用を抑制した。またKlotho蛋白は、脂肪細胞分化後においてもアディポネクチンの発現を強力に促進した。これらの作用は、他の臓器と異なり、脂肪細胞に特異的な機能であると考えられる。また生体でのこれらの作用機序を調べるために、FGF23 KOマウスとKlotho KOマウスのダブルKOマウスを作成した。
細胞の運動性を制御するシグナル伝達ネットワークの解明

細胞運動は、がんの転移やアレルギー性疾患などにおけるリンパ球の遊走など、様々な疾患と深く関連があり、このような疾患の治療において、細胞の運動性をコントロールする仕組みを解明し、その仕組みに関わる分子をターゲットとした治療法を確立することが重要であると考えられる。本研究では、細胞の運動性に関わるシグナル伝達の中心的な役割を持つRhoファミリーG蛋白質とその活性制御因子に着目し、幾つかの新たなシグナル伝達経路とその相互作用を見出した。本年度は次の2点について成果があげられた。1点目は研究実施計画1)に記載した、乳がん細胞の浸潤性に重要なEGFシグナルとEphA2-Ephexin4シグナルの相互作用の解析に関する研究において、EphA2-Ephexin4シグナルが、EGFなどの増殖因子からの刺激を受けることで、がん細胞の持つアノイキス耐性能の獲得に重要な役割を担っていることを新たに見いだした。上皮細胞は、細胞外マトリックス(ECM)に接着することで、細胞の増殖、生存が可能であり、正常な上皮細胞がECMとの接着を喪失すると、アノイキスと呼ばれるプログラム細胞死を引き起こすことが知られている。一方で、上皮組織由来のがん細胞は、アノイキースに対する耐性能を獲得しており、アノイキス耐性能はがん細胞が原発巣から他の組織へと転移していく過程で必要不可欠な機能であると考えられている。このアノイキス耐性能を誘導するシグナル伝達において、EphA2-Ephexin4を介したRhoGの活性化、さらにはその下流においてPI3キナーゼAkt経路の活性化が重要な役割を担っていることを明らかにした。この研究成果は、RhoG活性化因子Ephexin4の新たな機能の解明につながったのみなちず、がん細胞の転移に関わる分子基盤の解明に大きく貢献することが考えられる。2点目の成果は、研究実施計画3)に記載した、セマフォリン受容体Plexinによる細胞運動の制御機構の解析に関する研究において、セマフォリン受容体Plexin-D1の結合パートナーであるRnd2が、その標的分子の1つRapostlinを介して海馬神経細胞の樹状突起スパインの発達を制御していることを新たに見いだした。樹状突起シナプス後部構造体スパインは、樹状突起から突出した小さな突起状の構造体であり、シナプス後部においてほとんどの興奮性シナプス入力を受け取る。スパインは、ニューロンの発達やシナプス活動に応じて、形態を可塑的に変化させることが知られ、Rapostlinは膜輸送機構を介してスパインの発達制御に関与していることが示唆された。細胞運動は様々な疾患と深く関連があるため、細胞の運動性をコントロールする仕組みを解明し、その仕組みに関わる分子をターゲットとした治療法を確立することが重要であると考えられる。本研究では、細胞の運動性に関わるシグナル伝達経路において中心的な役割を担っているRhoファミリーの低分子量G蛋白質とその関連分子群に着目し、今年度は以下の3点の成果があった。1)Rac特異的活性化因子Dock4は、以前の我々の研究において乳がん細胞における運動性や浸潤性の促進に深く関わっていることが明らかになっている。ところが、がん細胞におけるDock4の活性制御の分子メカニズムについては不明であった。本研究ではDock4の新たな結合タンパク質として、リン脂質結合タンパクSH3YL1を同定した。SH3YL1がDock4に結合することによって、Dock4によるRacの活性化、及びがん細胞の運動性促進作用を正に制御していることが明らかになった。従って、SH3YL1がDock4によるがん細胞の運動性制御に重要であり、がんの浸潤・転移につながる機能の発揮に重要な役割を果たすことが考えられる。2)RhoファミリーGタンパク質活性制御因子の1つ、Ephexin4の新たな結合タンパク質としてScribbleを同定し、その結合をin vitroや細胞内の免疫沈降の系において確認した。さらにEphexin4による細胞運動性の促進作用に対してScribbleが負の制御していることを新たに見いだした。3)誘導因子エフリンの受容体ファミリーの1つEphA2は、特に浸潤性の高い乳がん細胞において過剰な発現が確認され、がん細胞の運動性・浸潤性と深い関わりがあると報告されている。このEphA2が別のエフリン受容体EphB6と細胞外で結合し、その機能が負に制御されていることを新たに見いだした。本研究では、細胞の運動性に関わるシグナル伝達経路において中心的な役割を担っているRhoファミリーの低分子量G蛋白質とその関連分子群に着目し、今年度は以下の2点の成果があった。1)Eph受容体ファミリーの一員であるEphA2は、多種のがんにおいて高発現が認められ、がんの進行に関与することが知られている。

過去の研究においてがんの悪性度との関連が指摘されているEphA2のS897のリン酸化がEphA2とRhoG活性化因子であるEpexin4との結合を促進することを見いだし、EphA2のS897をアラニンに置換したS897A変異体は、野生型に比べ細胞運動の促進やアノイキス耐性作用が見られず、かつRhoGを活性化できないことが明らかとなった。従って、EphA2のS897のリン酸化が、EphA2とEphexin4の結合および下流のシグナル経路の活性化に必要であり、がんの浸潤・転移につながる、がん細胞の生存や運動といった機能の発揮に重要な役割を果たすことを明らかにした。2)Rac特異的活性化因子Dock4は、これまでのゲノムワイド関連解析から自閉症、統合失調症、失読症といった神経発達障害の発症と深く関わりがあるリスク因子である可能性を示す報告が相次いでいる。本研究ではDock4が興奮性シナプス後部構造体である樹状突起スパインに局在が見られ、その形成を促進的に制御していることを見いだした。またDock4の新たな結合タンパク質としてアクチン重合制御分子cortactinを同定し、Dock4によるスパイン形成の制御にcortactinとの結合が不可欠であることを明らかにした。本研究では、細胞の運動性に関わるシグナル伝達経路において中心的な役割を担っているRhoファミリーの低分子量G蛋白質とその関連分子群に着目し、エフリンを中心とした誘導因子やEGFなどの成長因子、あるいは細胞外マトリックスなど、細胞の運動性を変化させる様々な細胞外からの刺激に対応するシグナル伝達経路を詳細に検討し、それらの相互作用を統合的に理解することで、種々の細胞の運動性を決定する分子機構を解明することを目的としている。このことをふまえて本年度は、エフリン受容体によるがん細胞の転移に関わるRhoファミリーを介したシグナル伝達の分子機構を解明したことに加えて、神経細胞における形態変化に関わるRhoファミリーのシグナルについても明らかにできたと判断したため。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究実施計画としてあげていた、RhoファミリーGタンパク質活性制御因子の結合タンパク質の探索については、本年度までにDock4についてはcortactin、またEphexin4についてはScribbleを同定し、さらに他の結合タンパク質についても現在、その機能の解析が進行しつつあるため。本年度の研究実施計画2)に記載していた、細胞の運動性を制御する新たなRhoファミリーG蛋白質活性制御因子の探索についてば、幾つかの候補分子の組織特異性は調べているものの、機能解析についてはまだ十分とはいえない。そこで、現在絞り込んでいる候補分子に関して、その発現を抑制するsiRNAを作成し、機能解析を早急に進めていく。前年度までの研究に引き続き、これまでに明らかになったRhoファミリーGタンパク質活性制御因子の1つ、Ephexin4の新たな結合タンパク質Scribbleについて、その結合をin vitroや細胞内の免疫沈降の系で確認するとともに、RhoファミリーGタンパク質の活性に対する影響を調ベる。
形式オントロジーと矛盾要因に関する研究

最終年度では,これまでの2年間で検討した矛盾要因(論理的な矛盾とオントロジー的な矛盾)の提案および形式化したオントロジーの論理型言語の実用性を検討した。特に,実例による検証と数学的な証明による理論的な検証を行った。実証には,実世界で重要となるイベント知識を含んだ知識表現や推論の有用性を検証するために,法律分野(法的推論)への応用を検討した。本年度のアカデミックな研究成果として,法的推論システムの実現のために法令文のルール知識に加えて判例を描写するイベント(一回性の事象)のための表現手段を提案した。法律判例の中身は複数のイベントによって展開されており,動的な知識表現に対する矛盾とその論理的な推論を法的推論システムに取り込まなければならない。イベントは一回性・一時性を持った動作あるいはアクションであり,静的なプロパティと対比される概念である。本研究では,法的推論で現れる語彙や記述を例に用い,イベントの量化,ソート階層およびイベント間の合成と排他性を導入した知識表現とその論理型言語(イベント論理と呼ぶ)を実現した。この言語は,イベントを定数,ソート,述語および変数として見なし,イベント言明のための知識表現と推論を可能にする。さらに,法的推論システムを実現する推論メカニズムの基盤を与えるために,イベント論理に対するソート付きのタブロー計算を設計して,その反駁推論による質問応答メカニズムを設計した。人間が意図するように計算機が各データを処理するには、語彙や概念の意味定義が明示されてなければならない。それは通常、人手によって概念間の関係もしくは概念階層によるオントロジーとして記述される。そのようなオントロジーを扱うために、本研究では形式オントロジーと論理の方法論を融合した記述言語、意味論および推論体系の設計を行う。オントロジー記述言語に組み込む重要な要素として、本研究で扱う対象には、(i)2種類の矛盾要因(論理的と形式オントロジー的)、(ii)矛盾要因とオントロジー記述に関する言語の構文と意味論、および(iii)記述されたオントロジーが整合的かどうか判定するアルゴリズム、が挙げられる。本年度は、既存のオントロジー記述言語(OWLなど)を調査する一方で、本研究の特徴である形式オントロジーによる矛盾要因に関する分析と提案を行った。特に,形式オントロジーの属性分類に基づいて順序ソート論理を拡張する方法を提案した.順序ソート論理の拡張は,本質属性,非本質属性および非ソートに分類される概念を,タイプ(rigidソート),非rigidソートおよび単項述語によって区別している.さらに,この順序ソートを用いて,独立した複数の知識ベースを構築したとき,各知識ベースがrigidな属性情報を他の知識ベースから抽出できる推論(本質属性の導出と呼ぶ)を提案した.加えて,時間/状況/信念の依存性により非本質属性を細分化し,実体の可算性により非ソート属性の分類を行った.本年度では、前年度で検討した矛盾要因(論理的な矛盾とオントロジー的な矛盾)に基づいてオントロジー記述言語を形式的に設計した。具体的には,概念に関する知識表現のために,論理型言語の形式的な拡張を行った。その際,知識表現に便利な記述を許して表現力の高い言語を実現すると同時に,その知識表現から推論したり矛盾を検出したりするために形式的な意味論を与える。この意味論により、実際に概念知識や知識べ一スに矛盾を含まないかどうか、そしてどのような論理的な結論を導くことができるかを明らかにできる。本年度のアカデミックな研究成果として,上記の知識表現の考察に基づき強い否定と古典論理の否定の2つの否定演算子を導入した古典一階述語論理の形式化が挙げられる。直観主義論理において提案された強い否定は、否定文を直接的に表すのに用いることができ、その意味論は2つの充足可能性関係を用いたクリプキ・モデルによって定義されている。しかしながら、その意味解釈や充足可能性は必ずしも知識表現における否定に合致しているとは言えない。特にを強い否定、「を古典論理の否定としたとき、「の形をした二重否定(構成的な二重否定と呼ぶ)が適切に特徴づけられていない。そこで構成的な二重否定に対する意味論を提案し、2種類の否定の組合わせによる構成的な意味を特徴づけた。また、提案した意味論と公理系により強い否定と構成的な二重否定に関する知識表現の例で推論が可能なことを示した。
感応性化学種の二光子吸収特性の解明と測定評価基盤の確立

本研究では新規な感応性化学種について、その分子構造と二光子吸収特性の関係を明らかにし、応用を探索すると共に、二光子吸収を用いた化合物の応用研究の加速に資するため二光子吸収の評価が容易となる様に比較対象物質(標準物質)を整備することを目的とし、そのための学術的な基礎を確立する。平成28年度においては、新規波長可変レーザー光源の特徴を活かした新しい測定手法の検討を行い、従来手法に比べて1/3の所要時間で二光子吸収スペクトルの外形が得られるようになった。しかし、二光子吸収以外の非線形吸収が存在するかどうかの確認については、別途数波長での捕捉的な測定が必要である。また、その手法を用いて標準物質としてローダミン系色素やジフェニルアセチレン系色素について二光子吸収スペクトルを測定し、確認を行った。また、昨年度に引き続き領域内外との共同研究を積極的に進め、東北大岩本教授との共同研究により、一重項開殻性をもつσ/π共役型Si化合物の測定を行い、この新規感応性化学種が9701050 nmの幅広い波長域で二光子吸収を持つことを見出した。この波長域で得られた信号は純粋な二光子吸収から得られるものに比べて若干のずれを示し、三光子吸収の寄与も存在することも示唆された。また、イタリア、ポーランドなど海外との共同研究にも、この新しい測定手法を適用して、新規な金属錯体系やヘテロ環骨格を持つ化合物系で顕著な二光子吸収が得られることを明らかにした。さらに、新しい機能性の発現に向けて固体系での三光子吸収測定の評価手法の確率を進めた他、二光子吸収を応用した多段階多光子吸収に関する成果の論文化も進めた。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では新規な感応性化学種について、その分子構造と二光子吸収特性の関係を明らかにし、応用を探索すると共に、二光子吸収を用いた化合物の応用研究の加速に資するため分光学の非専門家でも二光子吸収の評価が容易となる様に比較対象物質(標準物質)を整備することを目的とし、そのための学術的な基礎を確立する。このため本年度は高周期典型元素を含むアザポルフィリン誘導体のより広範囲な波長域での二光子吸収スペクトルの測定を行うとともに、連携研究者の協力の下のモデル分子について量子化学計算も行った。中心金属にリン誘導体を持つアザポルフィリンは1200 nmの近赤外域まで電荷移動性と考えられる幅広い一光子吸収のピークを示すが、同じ遷移エネルギーに相当する波長での二光子吸収断面積は1500 GMと大きな値に達することが見いだされた。これに対し、中心金属がMgの場合やフリーベース体では従来のアザポルフィリン誘導体と同様強い二光子吸収は見られず、高周期典型元素であるリンを含む場合で特徴的な特性であることを明らかにした。加えて、Chichibabin型と呼ばれる分子骨格を持つ一重項中間ジラジカル性化合物について、主要骨格に関係しないと考えられる置換基を無くした新規化合物についてその二光子吸収特性を測定し、主要骨格が二光子吸収特性に支配的な寄与をもたらしているという予測を裏付ける結果を得た。また、二光子吸収スペクトル測定に用いた波長可変レーザー光源を更新したため、その波長特性や時間特性などが測定結果に及ぼす影響について繰り返し評価し、標準物質群の整備に関連する蛍光法による評価についての準備も進めた。標準物質群の整備については予定よりも遅れている一方、計画していたアザポルフィリン誘導体に加え、新規一重項中間ジラジカル性化合物の二光子吸収特性の解明が進んでいるとともに、より効率的な測定手法の確立も進んでおり、概ね順調と言える。

平成28年度においては、標準物質の整備に向けた評価を重点的に行っていくことに加え、昨年度に引き続き班内・班間との共同研究を進めていく。領域外との共同研究についても積極的に行い、多様な新奇感応性化学種の二光子吸収特性の解明をフェムト秒Zーscan法による実測と、可能なものについては一部理論化学的手法も援用して行うことで進める。これらの研究で得られた成果を取りまとめ、学会発表や論文化による情報発信を積極的に行っていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。
IPRの前処理による耳下腺GTP結合蛋白質の動態とアミラーゼ分泌

beta-作動薬であるイソプロテレノール(IPR)で10あるいは30分間の前処理を加えた場合にラット耳下腺からの同濃度のIPRによるアミラーゼ(A)分泌にそれぞれ見られるSuopersensitivity(S)あるいはDesensitization(D)の機序をbeta-受容体・アデニル酸シクラーゼ系の共役因子であるGTP結合蛋白質の動態との関連において追究し、下記の成果を得た。(1)耳下腺細胞膜のGTP結合能を[^<35>S]GTPgammaSを用いた結合実験で調べると、IPRによるA分泌にSが見られる時にはアデニル酸シクラーゼに対して抑制性に作用するGi蛋白質(Gi)のGTPとの結合能が対照に比して低下し、逆にA分泌にDがみられる時にはGiのGTPとの結合能が対照に比して増大していた。アデニル酸シクラーゼに対して促進性に作用するGs蛋白質(Gs)のGTPとの結合能はA分泌のSおよびD時にともに対照に比して変化は見られなかった。(2)耳下腺細胞膜のGTP結合蛋白質のADP-リボシル化能の変動とA分泌のSあるいはDとの関連性を調べると、GiのADP-リボシル化能はA分泌のS時に対照に比して低下し、D時に対照に比して増加していることが示された。GsのADP-リボシル化能にはA分泌のSおよびD時ともに対照に比して変動は見られなかった。(3)耳下腺からのA分泌にSあるいはDがみられる条件下で調整した耳下腺細胞膜蛋白質をプロテインキナーゼA(PKA)の存在下でりん酸化した後、GTP結合蛋白質とくにGiのADP・リボシル化能の変動を調べた。その結果、A分泌のD時にみられたGiのADP-リボシル化能の増大は全く認められず、対照に比して差異は認められなかった。また、A分泌のS時にみられたGiのADP-リボシル化能の抑制はりん酸化の影響を受けなかった。(4)耳下腺細胞膜蛋白質をアルカリホスファターゼで脱りん酸化した後、GiをADP-リボシル化能を調べると、脱りん酸化の程度に応じてADP-リボシル化能は著しく増強された。従って、本研究においてbeta-受容体を介する耳下腺腺房細胞の応答にGiの機能の変動、とくにこの蛋白質のリン酸レベルの変動によるADP-リボシル化能の変動が密接に連関してることが明らかにされた。
結核菌におけるNAD代謝経路の解析とその代償的経路の解明

本研究課題では主に、NAD生合成経路に関わっている抗酸菌由来酵素の機能と構造の解析を行った。その結果、大腸菌内における結核菌由来Rv0212c、Rv1901c、Rv3199c、及びRv3393の発現条件を決定するとともに、Rv3393がヌクレオシド加水分解活性を示すことを明らかにした。また、Mycobacterium smegmatis由来ホスホリボシル二リン酸合成酵素の基質結合部位の構造がヒト由来同酵素とは異なっていることを示した。さらに、結核菌由来Rv3257cとRv3308の詳細な酵素学的諸性質を決定するとともに、M. avium由来ヌクレオチド加リン酸分解酵素の立体構造を決定した。本研究課題では、大きく分けて次の2つの研究を進めることを目的としている。(1)結核菌におけるNAD生合成経路の解析:結核菌のNAD生合成経路に関わっているが詳細な機能や構造が未知のタンパク質について、その機能と構造の相関を解析する。(2) NAD合成経路の代償的経路の解明:結核菌はNAD生合成経路で重要な酵素をコードしている遺伝子(pncA)を変異させて薬剤耐性を獲得するが、このpncA変異株では代償的経路が働くことによってNADの生合成を補っていると考えられる。そこで、この代償的経路に関わっている遺伝子・タンパク質を同定してその機能や生理的な役割を明らかにする。本年度は、結核菌のNAD生合成経路に関わっているが詳細な機能や構造が未知のタンパク質であるRv0212c、Rv1901C、Rv3199c、及びRv3393について、大腸菌内での発現を試みた。その結果、Rv3393のみが可溶性タンパク質として発現した。一方、Rv0212c、Rv1901C、及びRv3199cについては、可溶性タグ(大腸菌由来シャペロン)を付加させることによって、可溶性タンパク質として発現させることが出来た。可溶性タンパク質として発現したRv3393、及び可溶性タグを付加させたRv0212cについてFPLCを用いてSDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製を行った。現在は、得られた精製タンパク質を用いた機能解析と結晶化条件のスクリーニングを行っている。一方、NAD合成経路の代償的経路を解明する目的で、抗結核薬の一つであるピラジナミドを用いた突然変異誘発によってpncA遺伝子が変異した結核菌の作製を試みた。結核菌の生育速度が非常に遅いため、本年度中にpncA変異株を取得することは出来なかった。今後も引き続き、pncA変異株の作製を進める予定である。本研究課題の採択時期が10月であり実際に研究を行った期間が半年間であったことから、pncA変異株の取得までには至らなかったが、それ以外の項目については順調に進展している。(1)結核菌のNAD生合成経路において機能未知とされているタンパク質の機能構造解析、並びに(2)ピラジナミド耐性結核菌(NAD生合成において重要な酵素であるPncAを変異させた株)において機能しているNAD生合成経路の代償的経路の解析。(1)本年度は、昨年度までに大腸菌内で可溶性タンパク質として発現させた結核菌由来Rv3393についてその酵素学的機能を解析した。その結果、Rv3393はアミノ酸配列のモチーフ解析から予想された通りヌクレオシド加水分解活性を示すことを明らかにした。また、昨年度までに可溶性タグを付加させることによって可溶性タンパク質として発現させることができた、Rv0212c、Rv1901、及びRv3199cについて付加したタグを切断する条件について検討を行った。また、関連する酵素としてMycobacterium avium由来のヌクレオチド加リン酸分解酵素の立体構造を決定した。本酵素は野生型では結晶化が困難であったが、2次構造予測でdisorder領域として予想されたN末部分(約20残基)を削除した変異型を用いることにより、結晶化を行うことが可能であった。本酵素の立体構造は結核菌由来ヌクレオチド加リン酸分解酵素の立体構造と非常に類似していた。従って、これまでに同定した結核菌由来ヌクレオチド加リン酸分解酵素の新規阻害剤は、M. avium由来ヌクレオチド加リン酸分解酵素の活性も阻害することが予想された。(2)昨年度から引き続きピラジナミドを用いた突然変異誘発によってpncA遺伝子が変異した結核菌の作出を試みた。これまでにピラジナミドに耐性を示す結核菌を複数取得することができた。本研究課題では、結核菌のNAD生合成経路において機能未知とされているタンパク質の機能構造解析、並びにNAD生合成経路の代償的経路の解析を目的としている。結核菌のNAD生合成経路において機能未知とされているタンパク質の機能解析については、Rv3393の酵素学的機能を明らかにした。また、関連するMycobacterium avium由来ヌクレオチド加リン酸分解酵素の立体構造を決定し、結核菌由来ヌクレオチド加リン酸分解酵素の立体構造との比較を行った。一方、結核菌の生育が遅いため時間がかかったものの、NAD生合成経路の代償的経路の解析に向けてピラジナミド耐性結核菌を作出することができた。以上の状況から、現在までの進捗状況についておおむね順調に進展していると判断した。

本研究課題において、本年度は結核菌を含む抗酸菌のNAD生合成経路に関わるタンパク質の機能構造解析を主な目的として以下の研究を行った。1)Mycobacterium smegmatis由来ホスホリボシル二リン酸合成酵素(PRPP合成酵素)の立体構造解析;PRPP合成酵素は、NADの生合成において重要な基質の1つであるPRPPを合成する酵素である。X線結晶構造解析によって決定した抗酸菌M. smegmatis由来PRPP合成酵素の立体構造情報を用いて、ADPなどの基質とのドッキングシミュレーション解析を行い、その結果についてヒト由来PRPP合成酵素と比較した。その結果、M. smegmatis由来PRPP合成酵素の立体構造の全体構造はヒト由来PRPP合成酵素の立体構造と非常によく似ていたが、基質結合部位の構造には両酵素の間で差があることを見出した。特に、M. smegmatis由来PRPP合成酵素の基質結合部にのみヒスチジン残基が存在しており、基質の結合に大きく関わっていることが示唆された。2)結核菌由来ホスホマンノムターゼの機能解析; 2種類の結核菌由来ホスホマンノムターゼ(Rv3257cタンパク質とRv3308タンパク質)の詳細な酵素学的諸性質を決定した。その結果、Rv3308タンパク質はマンノース1リン酸に加えてグルコース1リン酸も基質として利用可能であるのに対して、Rv3257cタンパク質はマンノース1リン酸への基質特異性が非常に高いことが示された。また、Rv3257cタンパク質の至適pHが中性付近であったのに対して、Rv3308タンパク質の至適pHは酸性側に偏っていることが示唆された。したがって、結核菌の菌体内ではRv3308タンパク質よりもRv3257cタンパク質がホスホマンノムターゼとして機能していることが推測された。本研究課題では主に、NAD生合成経路に関わっている抗酸菌由来酵素の機能と構造の解析を行った。その結果、大腸菌内における結核菌由来Rv0212c、Rv1901c、Rv3199c、及びRv3393の発現条件を決定するとともに、Rv3393がヌクレオシド加水分解活性を示すことを明らかにした。また、Mycobacterium smegmatis由来ホスホリボシル二リン酸合成酵素の基質結合部位の構造がヒト由来同酵素とは異なっていることを示した。さらに、結核菌由来Rv3257cとRv3308の詳細な酵素学的諸性質を決定するとともに、M. avium由来ヌクレオチド加リン酸分解酵素の立体構造を決定した。結核菌のNAD生合成経路に関わっているが詳細な機能や構造が未知のタンパク質であるRv0212c、Rv1901C、Rv3199c、及びRv3393について、HPLC等を用いて機能を解析するとともに、X線結晶構造解析によって立体構造を決定する。得られた立体構造情報を基にアミノ酸置換体等を作製してその機能を調べることにより、標的タンパク質の機能構造相関解析を行う。本研究課題で作製したpncA変異株について、リアルタイムPCRや二次元電気泳動、質量分析計などを用いた解析を行うことにより、NAD生合成経路の代償として働いている遺伝子・タンパク質を明らかにする。
光学的核スピンエンジニアリングと局在スピン操作

研究成果の概要(和文):本研究では,単一量子ナノ構造での光注入局在スピンのリザーバである核スピン集団の分極率や分極方向等を制御する核スピンエンジニアリングを確立し,局在スピン操作に積極的に利用することを目的としている.特に以下に示すこれまでに報告例のない新たな成果を得た.発光スペクトルの直交偏光成分の同時検出系を構築し,InAlAs自己集合量子ドットにおいて,零磁場下で0.8 Tもの核磁場が形成されることを見出し,電子スピンが作る有効磁場とそれにより形成される核磁場との関係を明らかにした.また歪による核四極子磁場が結晶成長方向から傾いている場合,核スピン緩和の機構になることを実証した.固体での局在電子スピンを利用した量子情報処理研究において,電子スピンー核スピン間相互作用の理解と制御が不可欠であることが分かってきた.本研究では,これまでの光誘起核スピン分極研究の成果をさらに発展させ,単一量子リング・ドットでの核スピンエンジニアリングを確立し,長期目標としての量子メモリへの発展に貢献することを目的としている.本年度は,(1)超微細相互作用支援光学遷移を利用した核スピン光ポンピング技術の研究および(2)正孔スピンへの核スピン分極の影響の定量的評価を行った.(1)(2)の実験的な研究部分では,狭い電子または正孔のゼーマン分裂幅に比較して,十分狭いスペクトル幅を持つ単一周波数CW波長可変レーザーが不可欠であり,本科研費により新規購入した.しかし納品後に判明した不備により検収が大幅に遅れ,(1), (2)ともに現状では十分な実験データの蓄積は行えておらず,H26年度も引き続き実験的研究を行う.そのためH25年度においては,(2)は主に理論計算により研究を行い,電子スピンへの核スピン分極ゆらぎの実験データとの比較及び正孔スピンへの核スピン分極ゆらぎの効果を計算により評価した.これらの結果は学術論文(J. Appl. Phys. 113, 203511 (2013))に掲載されるとともに,国際会議で口頭発表し,同分野の研究者から注目された.またH27年度に予定しているg因子制御の予備実験として(3)核磁場を利用した電子・正孔g因子の個別評価と発光の偏光状態測定を重点的に行った.多数の単一量子リングにおいて,励起子g因子と正孔g因子に強い相関を見出し,電子・正孔のg因子を独立して評価しただけでなく正孔g因子について価電子帯のバンド混合の影響との関連まで含めて議論した.この成果はApplied Physics Express (APEX)に掲載可となった.固体での局在電子スピンを利用した量子情報処理研究において,電子・正孔スピンー核スピン間相互作用(超微細相互作用)の理解と制御が不可欠であることが分かってきた.本研究では,これまでの光誘起核スピン分極研究の成果をさらに発展させ,単一量子リング・ドットでの核スピンエンジニアリングを確立し,長期目標としての量子メモリへの発展に貢献することを目的としている.H26年度は,以下の項目において研究を行い,成果を得た.(1) In(Ga)As量子リングにおける正孔および電子面直g因子の個別測定,正孔g因子と歪誘起価電子帯混合度との相関,およびその理論計算等を行い,正孔g因子の分散領域を示した.この成果は,核スピンとの相互作用の少ない正孔スピンの任意制御にとって重要であり,学術論文誌に発表した.H27年度においては電子・正孔面内g因子異方性を中心に測定を継続し,データを蓄積する.(2) g因子やスピンコヒーレンス測定およびスピン制御に有効である時間分解カー回転分光法の感度上げる努力をするとともに,核スピンの影響の少ないCdTe量子井戸において,数mTの核磁場を検出することに成功し,II-VI系半導体の核スピン分極の影響がIII-V系(InAsなど)に比較して1000倍程度弱いことを確認するとともに手法の有効性を示した.また負の荷電励起子(負のトリオン)生成のダイナミクスがスピン歳差運動の初期位相に与える影響を解明した.これらの成果も複数の学術論文に発表した.(3)超微細相互作用支援光学遷移を利用した核スピン光ポンピング技術の研究に関しては,核の電気四重極子の効果が効いていることが分かってきたので,引き続きH27年度も研究を継続する.これにより電子スピン反転を伴わない核スピンポンピングができる可能性が出てきた.まずは単一ドット・リングのハンル効果からそれらを実証する予定である.固体での局在電子スピンを利用した量子情報処理研究において,電子・正孔スピンー核スピン間相互作用(超微細相互作用)の理解と制御が不可欠であることが分かってきた.本研究では,これまでの光誘起核スピン分極研究の成果をさらに発展させ,単一量子リング・ドットでの核スピンエンジニアリングを確立し,長期目標としての量子メモリへの発展に貢献することを目的としている.H27年度は,以下の項目において研究を行い,成果を得た.(1)低温,Voigt配置で試料回転が可能となる様にクライオスタットの改造を行い,In(Ga)As量子リングでの電子・正孔面内g因子の測定,およびその理論計算等を行い,正孔g因子の強い異方性を明確に示した.正孔g因子,形状,歪の3つの異方性軸の関係について重要な知見が得られたので学術論文誌に投稿準備をしている.

(2)核スピン光ポンピング技術の研究に関しては,核の電気四重極子の効果が大きいことが分かってきたので,このテーマについて,零磁場での核磁場検出およびハンルカーブ測定による面内核磁場の検出,さらに核スピン拡散測定を行った.これらを通じて,核四極子効果が大きく物性に聞いていることが判明した.外部磁場がなければ,通常核スピン分極は形成されないはずだが,円偏光によりスピン選択励起を行うと零磁場でも0.8 Tの相当する巨大な核磁場が観測された.ハンルカーブ測定では,異常に幅の広いサーカステント型のカーブが観測され,面内核磁場が形成されていることを実験的に明らかにした.これらの形成メカニズムは未だ不明な部分があるが,核四極子効果による有効磁場(歪の方向と一致)方向に核スピンを安定化させる機能がなければ説明できない.また核スピン拡散測定では,同じ試料の異なる量子ドットで,拡散定数が1桁近く異なる結果が得られ,不等間隔となる核四極子分裂が核スピン拡散を抑制することを示唆している.核スピンの影響の大きな電子スピンよりも,相互作用の小さい正孔スピンを量子演算等に用いるという流れが数年程前から本研究分野で明らかになってきており,タイムリーに成果が出せ,国際会議等でも発表が注目された.海外の大学との共同研究により,理論シュミュレーションとの比較と面直・面内g因子の精密測定が行えるようになり,この項目については概ね順調に進んでいる.これらの結果を学術誌に投稿準備中であり,地味な研究ではあるがこれまでにない知見を含んでいる.核の電気四重極子の効果についても,かなり詳細な実験が行えるようになってきたので,H28年度においては数多くの量子ドット・リングで測定を行い,データ蓄積を行う.固体での局在スピンを利用した量子情報処理研究において,電子・正孔ー核スピン間相互作用の理解と制御が不可欠である.本研究では,これまでの光誘起核スピン分極研究の成果を更に発展させ,単一量子ナノ構造での光注入局在スピンのリザーバである核スピン集団の分極率や分極方向等を制御する核スピンエンジニアリングを確立し,局在スピン操作に積極的に利用することを目的としている.H28年度は,以下の項目において研究を行い,これまでに報告例のない新たな成果を得た.(1)面内核磁場形成機構の解明:発光スペクトルの直交偏光成分の同時検出系を構築し,InAlAs自己集合量子ドットにおいて,零磁場下での核磁場形成を詳細に調べた.円偏光励起により意図せずとも0.8 Tに及ぶ大きな核磁場がKnight Fieldによる核スピン冷却により形成され,また歪による核四極子磁場が結晶成長方向から傾いている場合,核スピン緩和の機構になることを実証し,それらの成果を学術論文に報告した.(2)正孔面内g因子異方性の観測とVBMとの相関を調査:残留歪と閉じ込めポテンシャルの異方性が価電子帯混合および正孔g因子に与える影響を吟味し,その成果を学術論文に報告した.また残留歪を内包しない液滴成長QDでの歪印加がg因子制御には有望であると分かってきたので,InAlAsQD試料と並行して,液滴成長GaAsQD試料の磁気発光特性の調査を行った.(3)外部歪印加デバイスの作製:1,2の両課題において,歪はキーパラメータであるため,それを実験的に制御するためにピエゾ素子を用いた外部歪印加デバイスの作製を行った.現状ではQD試料の接着方法に改善の必要があり,ピラー構造試料の電極中への埋め込みや,PMMAなどレジスト材料を用いた固定方法の開発など,基板研磨を必要としない接着方法の開発を検討中である.
腎尿細管に発現するSMP30の機能と腎疾患への関与

初年度は我々がクローニングしたヒトSMP30を規定するcDNAを用いて組換え蛋白を作製した。遺伝子移入し発現させた組換え蛋白の分子量は24KDaであり用いたcDNAから推定されるものと一致した。次に組換え蛋白を可溶化して家兎に免疫し抗体を得た。この抗体を用いて正常の腎臓組織を免疫染色したところ,ヒトの腎尿細管では遠位尿細管に陽性所見が認められた。このSMP30は細胞内カルシウムの移動・代謝に関与しておりヒトではカルシウム代謝が最も活発な部位は遠位尿細管である事実に対応する所見である。さらに作製した組換え蛋白はアミノ末端にpelBリーダー配列を付加しており容易に可溶化が可能であり,次年度ヒト血清中のSMP30の鋭敏な測定法の開発を行った。モノクロナール抗体を3株樹立しWestern hybridization法における抗体の特異性を確認し,蛍光抗体法で組織学的検討を行ないポリクロナール抗体と同様の結果を得た。これらの点から作製したモノクロナール抗体はヒトSMP30特異的と考えられた。次にモノクロナール抗体と可溶化された組換え蛋白を用いてヒトSMP30の微量測定法の確立を行った。ELISA法によるヒト血清中のSMP30量の測定が可能となった。正常健常者血清中のSMP30量は平均5pg/mlであることがわかった。最大のSMP30の産生臓器である肝臓の各種疾患では正常と比較して有意の増加を示した。現在,各種腎疾患でのSMP30の血清動態の解析を進めている。今後肝臓・腎臓疾患の新しいパラメーターになる可能性がある。今年度は我々がクローニングしたヒトSMP30を規定するcDNAを用いて組換え蛋白を作製した。ヒトSMP30cDNA(pHSMP6)を大腸菌発現ベクターpET22bに組み込み大腸菌BL21に遺伝子移入を行なった。IPTGを大腸菌培養液に加え組換え蛋白を発現させた。組換え蛋白の分子量は24kDaであり用いたcDNAから推定されるものと一致した。この抗体を用いて正常の腎組織を免疫染色したところ、ヒトの腎尿細管では遠位尿細管に陽性所見が認められた。この結果はラットの腎組織を用いた場合に近位尿細管が染色されるという現象とは異なり興味ある所見である。また今回作製した抗体はWestern hybridizationに用いるには適当な抗体であった。今回作製した組換え蛋白はアミノ末端にpelBリーダー配列を付加しており容易に可溶化が可能であった。この可溶化蛋白とヒトSMP30に対するモノクローナル抗体を用いてELISA法による微量定量法を開発している。今年度はヒトSMP30組換え蛋白及びその抗体の作製を行ない良好な結果を得たので来年度は疾患の解析に応用したいと考えている。昨年度作製したヒトSMP30の組換え蛋白を用いてモノクローナル抗体を3株樹立した。これらのモノクローナル抗体を用いてヒト血清中のSMP30の鋭敏な測定法を開発した。これらのモノクローナル抗体はWestern hybridization法における抗体の特異性を確認した。蛍光抗体法への応用においても昨年度に家兎を用いて作製したポリクローナル抗体を用いたと同様の結果が得られた。これらの点から今回作製したモノクローナル抗体はヒトSMP30特異的と考えられた。次にモノクローナル抗体と可溶化された組換え蛋白を用いてヒトSMP30の微量測定法の開発を試みた。その結果ELISA法によりヒト血清中のSMP30量を測定することが可能になった。この方法により正常健康者血清中のSMP30量は平均5pg/mlであることがわかった。

最大のSMP30産生臓器である肝臓の各種疾患においては正常値と比較して有意の増加を示した。現在、各種腎疾患患者血清の解析を進めている。この測定法は今後肝臓・腎臓疾患の新しいパラメーターとなる可能性があり臨床症状との関連の解析必要となっている。
Aiを用いた2D超音波プローブのフリーハンド3D化システムの開発

本研究ではCTやMRIのような3D超音波開発を目指す。フリーハンド操作において2D超音波を用いて3D化を行うために、光学式センサーを用いた3D化補助装置を開発する。光学式センサーを用いたとしても微妙な画像のずれが生じるため、AIを用いた画像補正システムを開発する。さらにフリーハンド操作においては画像の重なりが生じてしまうため、通常の三次元ではなく角度を含めた6次元空間に画像を配備することで重なり問題の解消を目指す。また角度を含んだ6次元空間内で腱や靭帯などの異方向性を持った組織分類が可能かどうかを検討する。最後に本システムを用いて質を落とさずに超音波検査時間の短縮が可能かどうかを検討する。
スタチン類のアポトーシス誘導作用を介した免疫抑制作用機序の解析

【目的】スタチン類はHMG-CoA還元酵素抑制によるコレステロール低下作用以外にも様々な多面的効果(pleiotropic effect)を持ち、近年、免疫抑制作用を有することが注目されている。我々はスタチン類の免疫抑制作用の機序をアポトーシス誘導作用の観点から研究を進め、脂溶性スタチンのフルバスタチンは活性化T細胞と培養RA滑膜細胞に対してアポトーシス誘導能を有し、その機序としてprotein prenylation阻害に基づくことを見出した。今回はスタチン類がループスモデルマウス(MRL-lpr/lpr)に対して治療効果を示すか否かを検討した。【結果】既に自己免疫病を発症している生後4か月齢のMRL-lpr/lprマウス計60匹をコントロール群、フルバスタチン投与群(10mg/kg)、副腎皮質ステロイド投与群(10mg/kg)の3群に分け、週3回腹腔内継続投与した。(1)投与開始4か月後の生存率:コントロール(C)群(50%)、フルバスタチン(F)投与群(55%)、副腎皮質ステロイド(S)投与群(90%)(2)尿所見:C群1.3±0.4、F群0.4±0.2、S群0.6±0.2(3)血清抗ds-DNA抗体価(EU):C群62.9±24.9、F群178.6±88.6、S群17.7±5.3(4)血清INF-γ(ng/ml):C群45.1±12.7、F群34.4±5.7、S群16.0±3.9【考察】今回のフルバスタチン投与実験(投与量と期間)では蛋白尿減少作用を認めたが、長期的生存率は上昇させなかった。血清抗ds-DNA抗体価はフルバスタチン投与群では逆に上昇傾向であった。スタチンには薬剤誘発性ループスの症例報告もあり、全身性エリテマトーデス(SLE)患者に投与する場合には注意を要すると考えられた。【臨床への応用】リウマチ膠原病患者は動脈硬化を合併しやすいことが報告されている。スタチン類がその抗動脈硬化作用に加えて、免疫調節作用をも有していれば、リウマチ膠原病に対する新たな治療薬となり得ることが期待される。【方法】既に自己免疫病を発症している生後4か月齢のMRL-lpr/lprマウス計80匹をコントロール(非投与)群、Fluvastatin 10mg/kgと100mg/kg投与群、副腎皮質ステロイド薬(メチルプレドニゾロン)投与群(10mg/kg)の4群に分け、週3回腹腔内投与を施行した。【考察】投与2か月後の結果ではあるが、FluvastatinはMRL-lpr/lprループスマウスに対して治療効果を示し、全身性エリテマトーデスに対する新しい補助的な治療法となりうることが示唆された。【方法】既に自己免疫病を発症している生後4か月齢のMRL-lpr/lprマウス計80匹をコントロール(非投与)

群、Fluvastatin 10mg/kgと100mg/kg投与群、副腎皮質ステロイド薬(メチルプレドニゾロン)投与群(10mg/kg)の4群に分け、週3回腹腔内投与を施行した。【考察】長期投与の結果では、FluvastatinはMRL-lpr/lprループスマウスに対して、生存率、血清学的所見および腎臓の病理学的所見などから明らかな治療効果を示さなかった。
自覚症の絵シンボル化-日本語を解しない在日外国人の受療コミュニケーション支援-

1.韓国人児童学生の自覚症表現韓国人の児童・学生50名を対象にパ-ツ提示法と自由描画法により、基本的な10種類の自覚症状について、イメージの実態を把握した。日本人学生50名についても同様の方法でイメージの実態を把握し、両者を比較した。イメージ形成の際の各パ-ツへの重点の置き方に関し、一部の自覚症状では集団間に差が見られたが全体的には似た傾向であった。2.事例研究「絵による頭痛問診票の試作」ある内科の医師を研究協力者として、その医師が頭痛を診断するのに必要な情報を系統的に聞き取り、認識を可視化する作業を進めた。5回の面接の結果、頭痛の診断情報は10項目にわたって視覚化された。この最初にヴァージョンをさらに改変した結果、'頭痛を描こう'が完成れた。これを82名のアメリカ人学生と120名の日本人学生に評価してもらった結果、平均的にはアメリカ人学生の5%、日本人学生の10%が、文字よりもグラフィックスを好むことが明らかになった。共通シンボル問診票の試作と評価自覚症状につき、特に以下の4要因(1.質的把握、2.部位的把握、3.痛みの同定、4.経過の把握)を対象に、シンボル、グラフィックスによって可視化を試みた。検討を進めた結果、問診票の記入者が限定されたシンボルを活用して、能動的に自己表現して行く形式にたどりついた。長崎大学保健管理センターの協力の下に、センターを受診する患者(学生が中心;n=43)の初診時にこの問診票を使用してもらい、有用性を評価した。およそ44%の受診者は、この方式の問診票によって、自分が訴えにくいことを表現できたと答えた。本研究の目的は、自覚症状を絵シンボル化することにより、受療コミュニケーションを支援することにある。平成5年度は個別の自覚症状について、適切な絵シンボル化を行うための基礎的な検討を続けた。1.イメージをシンボル化する調査法の開発:自覚症イメージ視覚化のために三種類の調査法を開発した。〓既成イメージ選択法;各自覚症に対応する略画を3つ用意する。被験者はそのうち一つを選択する。〓手がかり法;5群の視覚的手がかり(体シルエット、手位置、顔表情、環境、時間と量)を示す。被験者は手がかりを組み合わせて自覚症視覚化を試みる。〓自由描画法;手がかりなしに、被験者は白紙上に自覚症イメージを描く。2.調査による素材シンボルの収集:韓国籍の学生50名を対象として、イメージ調査を行った。〓既成イメージ選択法の場合;27種類の自覚症中11については、3つの既成イメージのうち1つが対象者の70%以上に支持された。しかし他の自覚症では回答が分散し、イメージに多様性が強いことが示唆された。〓手がかり法の場合;[痛み]の場合は[顔表情]を、[下痢]の場合は[環境を]、[動悸息切れ]の場合は[手の位置]が、有効な手がかりとして半数以上の対象者に選択された。〓自由描画法の場合;回答の誘導を行わない点で自由描画法はすぐれているが、手がかり等ない場合、はたして対象者が描がけるのか、という問題がある。しかし実際に行ってみると、無回答者は殆ど見あたらなかった。各自覚症に共通した傾向として、小学生では顔を中心とした表現が目だったが、中学生と高校生では全身をより丁寧に描き、その時の状況を描いた例も多く認められた。大学生の描き方は、中高生に比較して単純化し、象徴的な表現も多く認められた。1.自覚症シンボルの形成

韓国人の学生50名を対象にパ-ツ提示法と自由描画法により、基本的な10種類の自覚症状について、イメージの実態を把握した。日本人学生50名についても同様の方法でイメージ実態を把握し、両者を比較した。イメージ形成の際の各パ-ツへの重点の置き方に関し、一部の自覚症状では集団間に差が見られたが全体的には似た傾向であった。2.共通シンボル問診票の試作自覚症状につき、特に以下の4要因(1.質的把握、2.部位的把握、3.痛みの同定、4.経過の把握)を対象に、シンボル、グラフィックスによって可視化を試みた。具体的な自覚症を表すシンボルは、すでに収集・作成したものを用いたが、そのシンボルの認識の容易さを考慮した構造的な提示方法は未開発であったため、この項で検討した。多様な状況を想定した上で、シンボルだけですべての健康状況を示そうとすると、何ページにも渡る多数のシンボルが必要となるが、シンボル数が多すぎると一瞥しただけで理解することは困難になり、コミュニケーションの活性化も期待できない。検討を進めた結果、問診票の記入者が限定されたシンボルを活用して、能動的に自己表現して行く形式にたどりついた。4回ほどの改訂の後、A4用紙1枚に最小限の情報をすべて盛り込むことができた。3.共通シンボル問診票の評価長崎大学保健管理センターの協力の下に、センターを受診する患者(学生)の初診時にこの問診票を使用してもらい、有用性を評価した。およそ30%の受診者は、この方式の問診票によって、自分が訴えにくいことを表現できたと答えた。