hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非線形分散型方程式の対称性と特異性による解の構造の研究

分散的な波動現象を記述するKdV方程式、非線形シュレディンガーに対し、初期値問題の適切性と解の大域可解性を研究した。特に、非線形分散型方程式の解の特異性をフーリエ空間相互作用における共鳴・非共鳴現象によって特徴付け、修正KdV方程式について一意可解性を示した。また、非線形シュレディンガー方程式の解についての大域評価の結果、不変測度空間における微分型非線形シュレディンガー方程式について大域可解性を示した。非線形分散型方程式は,分散性と非線形相互作用が共存する波動現象を記述する方程式であり,水面波,プラズマ,レーザなどの現象で現れる.その解の性質に関する研究には,関数解析,調和解析などを用いられている.本研究の目的は,主に非線形シュレディンガー方程式やKdV方程式に対して,初期値問題の可解性,解の大域的な性質に関する数学的の解明を通して,非線形分散型方程式の偏微分方程式論的な理解を深めることである.本年度は,解の大域的性質を理解するモデルとして,空間2次元以上の場合の非線形シュレディンガー方程式解を取り上げ,指数が1より大きいソボレフ空間に属する解に対して大域的ソボレフ増大ノルムの研究を行った.指数が1の場合はエネルギー空間に対応し,この場合はエネルギー保存則から解の先験評価式が得られる.一方,1より大きな指数に対しては保存則が存在せず,解の一様な大域評価式は期待されない.今回は,これまでに得られた空間2次元における3次の非線形項に対する方法を拡張し,2次の非線形項に対してもソボレフノルムが増大する解の存在を証明することに成功した.波の分散性を伴う非線形波動現象を記述する非線形分散型方程式に対して,初期値問題の可解性,解の大域的な振る舞いを研究した.分散性波動は,波の位相速度と波動エネルギーの伝播速度が振動数によって異なる.ここに,振動数の違いがどのように非線形相互作用に寄与するか調べることは重要となる.本年度は,このような研究に着目して,微分型非線形シュレディンガー方程式の解の存在定理に関する成果を得た.ソボレフ指数1/2よりも低い微分指数のソボレフ空間において,解の時間局所的先験評価式を構成し,解の存在定理を証明した.指数1/2は統計的な不変測度空間と密接に関係しており,そのような関数空間で解の存在を論じることは重要である.ここでは,波を振動数に関して分解し,振動数の違いがどのように非線形相互作用するか,そのメカニズムを非線形評価式によって解析した.非線形相互作用においては,解の特異性を特徴付ける,振動数間の共鳴場は相殺されることを見出した.ここで得られた解の一意性は,ある付加条件に下で与えることができるが,その条件が必要であるかどうかは今後の課題とした.昨年度に引き続き、1次元周期境界値条件における非線形シュレディンガー方程式について、正規分布データを含む滑らかさの低いデータの関数空間における初期値問題の適切性、及びその時間大域可解性について調べた。正規分布のデータに対しては、微分方程式の取り扱いで強力な縮小写像の原理を用いた適切性の証明法が成り立たないことは知られていたが、その時間局所解の存在定理における結果は昨年度得ることができていた。本年度は、昨年度の結果をさらに改良し、時間局所解の一意性定理と解の時間大域存在を構成することができた。技術的には、非線形項による非線形相互作用によって引き起こされる自己共鳴現象がもたらす、弱い分散性をもつ特異性がどのように時間発展するかを評価する必要がある。一意性の証明は、正規分布データの関数空間を考慮した初期値に付加条件の下、昨年度発見した評価式に加えて、ある安定性評価を構成することで示すことができた。時間大域解の存在に関する解析では、時間局所解で考察した特異性を時間大域的に評価する必要がある。証明においては、有限次元関数空間モデルを構成、及び正規分布データに対すて強力な不変測度から時間大域的評価式を得た。有限次元関数空間と本来の無限次元関数空間とを保管する解析が困難であったが、時間局所解の存在証明におけるエネルギー評価法を改良し、誤差評価をこめた摂動評価式を構成することによって解析することができた。非線形分散型方程式の初期値問題に対する解の一意存在性、及び大域可解性を研究した。波動の位相速度と波動エネルギーの群速度が異なる非線形方程式においては、振動空間において波動の共鳴が起こり、それは波動の伝播を特徴付ける特異性と考えられる。本年度は、波動の共鳴による研究方法から、空間2次元の非線形シュレディンガー方程式に対する解の存在定理を研究した。空間2次元の非線形シュレディンガー方程式に対する解の存在定理は、通常のソボレフ空間とストリッカーツ評価に由来する補助関数空間において証明されている。周期境界値条件に対する微分型非線形シュレディンガー方程式の解の一意存在定理に関する研究手法を基に、制約に必要とされた補助関数空間の排除を試みた。全空間に対しては解の平滑化作用による強力な手法がその排除を可能とするが、周期境界値条件に対しては平滑化作用はなく、良く知られていない。

解を振動数分解し、非線形相互作用による波動の特異性を非線形共鳴波動によって特徴付けた場合、非線形共鳴のメカニズムはある図形の配置とその組み合わせといった幾何学的構造を持つことが分かり、その配置は空間1次元的あるという知見が得られた。共鳴波動を除いた非共鳴波動に対する評価について、目的に応じた評価式を構成することが未解決で、残念ながら満足のいく研究成果が得られなかった。評価式の構成し、これまでに得られた微分型非線形シュレディンガー方程式に対する研究手法との融合は今後の課題とした。研究計画については、目的の結果を得ることができ順調に遂行したが、研究成果をまとめる作業は年度を越えてしまった。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画の変更はない。研究成果の取りまとめることを迅速に遂行する。
輝線銀河で探る宇宙における星生成史

2002年2月に取得済みのSDSS1044+0125フィールドのすばるSprime-Camの画像データに基づいて強帯域フィルターNB816、及び中間帯域フィルターIA827を用いたライマンα輝線銀河探査の過程で見つかった、より低赤方偏移側の輝線強度の大きい輝線銀河55個についての研究をさらに深めた。測光的赤方偏移によって求められたlikelihoodの分布を用いることでこれらの輝線天体を、赤方偏移0.21からの0.26のHα輝線銀河、赤方偏移0.63から0.0.68のHβまたは[OIII]輝線銀河、赤方偏移1.18から1.20の【OII】輝線銀河の3種類に分類した。さらにその分類の確からしさに応じて2つのグループに分けることで、数密度や輝線等価幅の分布をさらに詳細に調べた。この結果をSDSSサーベイのデータに存在する近傍の同種の輝線銀河との比較をした結果、[OII]輝線銀河の数密度が近傍に比べて大きいことが分かった。これは赤方偏移1から0の間の銀河における星形成の進化を反映していると考えられる。この成果についてはPublications of the Astronomical Society of Japanに論文を投稿し、第58巻1号に掲載された。また、2004年2月に取得済みのNB816データ、すばる望遠鏡のアーカイブで公開されているNB816のデータ、及びGOODSのプロジェクトとしてハッブル宇宙望遠鏡によって撮られた広帯域データを使用して、南北二つのGOODSフィールドにおける赤方偏移5.7のライマンα輝線銀河探査を行った。この探査の結果、北のフィールドでは10個、南のフィールドからは4個のライマンα輝線銀河候補を見つけ出すことが出来た。ハッブル宇宙望遠鏡による高空間分解能の画像が存在するライマンα輝線銀河のサンプルは当時の銀河の様子を知る上で非常に有用である。これらの星形成率などの性質について調べ、年齢が1億歳以下の比較的若い銀河が多く含まれている可能性があることを示した。この研究の成果についてはThe Astrophysical Journalに論文を投稿し第638巻第2集に掲載された。平成15年度は前年度までに得られていたデータの解析とそこから得られた結果の発表、さらに、新たな観測データの取得を行った。すばる望遠鏡主焦点カメラ(Suprime-Cam)によって既に得られていた、SDSS高赤方偏移クエーサーフィールド周辺の狭帯域フィルターのデータを用いて赤方偏移5.7のライマンα輝線銀河探査を行った。その結果、20のライマンα輝線銀河の候補を探し出すのに成功した。それらのサンプルを用いてライマンα輝線の光度関数を求める試みを行った。この試みによりは当時の宇宙にどれだけの星が作られていたかの見積りに新たな値を与えることができた。この結果はThe Astronomical Journal誌に投稿し、採択された。さらに、この研究結果は9月に愛媛大学で行われた日本天文学会秋季年会において口頭発表を行った。また、同じデータから中間帯域フィルターを用いた赤方偏移5.8のライマンα輝線銀河探査も行い、2つの帯域の異なるフィルターセットの測光データからライマンα輝線銀河のより精確な赤方偏移が推定出来ることを示した。この結果は、名古屋大学で行われた日本天文学会春季年会においてポスター講演で発表し、また、PASJに論文として現在投稿中である。これらの研究で得られたライマンα輝線銀河候補についてはGEMINI望遠鏡による分光観測が予定されている。この観測によって赤方偏移5.7のライマンα輝線銀河の更なる詳しい性質が明らかに出来ると期待される。また、2月には新たに4つのフィールドについて、Suprime-Camで狭帯域フィルターでの撮像観測を行った。平成16年度中にはこれらのデータから赤方偏移5.7のライマンα輝線銀河を探し出してその性質が観測フィールドごとの違い等の研究を進め、早い段階で結果を出す予定である。2002年2月に取得済みのSDSS1044+0125フィールドのすばるSprime-Camの画像データに基づいて中間帯域フィルター、IA827、を用いた赤方偏移5.8のライマンα輝線銀河探査を行った。この探査の結果4つのライマンα輝線銀河候補を同定することができた(ただし、内3つは既に狭帯域フィルター、NB816を用いた探査で同定されていた天体であった)。また、この研究から、狭帯域フィルター、と中間帯域フィルターとを組み合わせることで、ライマンα輝線天体の輝線等価幅、赤方偏移の情報をより精度よく見積もることができることが示された。この成果は2004年8月にPASJ誌に掲載された。さらに、このデータセットでライマンα輝線天体の探査の過程で見つかった輝線強度の大きい、より低赤方偏移側の輝線銀河55個について研究を行っている。測光的赤方偏移の手法を用いることでこれらの輝線天体のうち、赤方偏移0.21からの0.26のHα輝線銀河が14個、赤方偏移0.63から0.0.68のHβまたは[OIII]輝線銀河が24個、赤方偏移1.18から1.20の[OII]輝線銀河が17個であることが分かった。数密度や光度関数をSDSSサーベイのデータに存在する近傍の同種の輝線銀河との比較をした結果、大きな差がないことが分かった。

この成果については現在論文を執筆中である。また、2004年2月および2005年2月に取得した5つのフィールドのSprime-Camの広帯域バンドおよびNB816の画像データを解析中である。このうち一つのフィールドのデータについてはすでに解析を終えており、このデータから赤方偏移5.7のライマンα輝線銀河候補を50個発見しており、その最終的な確認を行っている段階である。2002年2月に取得済みのSDSS1044+0125フィールドのすばるSprime-Camの画像データに基づいて強帯域フィルターNB816、及び中間帯域フィルターIA827を用いたライマンα輝線銀河探査の過程で見つかった、より低赤方偏移側の輝線強度の大きい輝線銀河55個についての研究をさらに深めた。測光的赤方偏移によって求められたlikelihoodの分布を用いることでこれらの輝線天体を、赤方偏移0.21からの0.26のHα輝線銀河、赤方偏移0.63から0.0.68のHβまたは[OIII]輝線銀河、赤方偏移1.18から1.20の【OII】輝線銀河の3種類に分類した。さらにその分類の確からしさに応じて2つのグループに分けることで、数密度や輝線等価幅の分布をさらに詳細に調べた。この結果をSDSSサーベイのデータに存在する近傍の同種の輝線銀河との比較をした結果、[OII]輝線銀河の数密度が近傍に比べて大きいことが分かった。これは赤方偏移1から0の間の銀河における星形成の進化を反映していると考えられる。この成果についてはPublications of the Astronomical Society of Japanに論文を投稿し、第58巻1号に掲載された。また、2004年2月に取得済みのNB816データ、すばる望遠鏡のアーカイブで公開されているNB816のデータ、及びGOODSのプロジェクトとしてハッブル宇宙望遠鏡によって撮られた広帯域データを使用して、南北二つのGOODSフィールドにおける赤方偏移5.7のライマンα輝線銀河探査を行った。この探査の結果、北のフィールドでは10個、南のフィールドからは4個のライマンα輝線銀河候補を見つけ出すことが出来た。ハッブル宇宙望遠鏡による高空間分解能の画像が存在するライマンα輝線銀河のサンプルは当時の銀河の様子を知る上で非常に有用である。これらの星形成率などの性質について調べ、年齢が1億歳以下の比較的若い銀河が多く含まれている可能性があることを示した。この研究の成果についてはThe Astrophysical Journalに論文を投稿し第638巻第2集に掲載された。
骨組織の発生、代謝に対する肝細胞増殖因子/上皮細胞分散因子(HGF/SF)の影響-フェチュインの発現調節を中心として-

骨組織の発生に肝細胞増殖因子(HGF/SF)がどのように関っているかを明らかにするため、骨組織を発生する部位におけるHGFとその受容体であるc-Metの発現を検討した。また本研究の遂行に伴い、HGF/SFは舌の発生・分化にも関与していることが明らかとなったので、これについても検討した。まず、将来骨組織が多くを占める胎生10日のマウス胚の前肢、後肢、体節、及び第一鰓弓に、HGF/SFとc-Metが発現していることを、RT-PCR法により確認した。次に、RNAプローブを用いたホールマウントin situハイブリダイゼーションにより、胎生10日から16日のマウス胚の上記各組織に、両遺伝子の強い発現を認めた。特にc-Metの発現部位は、将来骨化する部分と多くの部分で一致しており、HGF/SFが骨組織の分化を調節しているということを示唆する結果を得た。しかし、フェチュインの発現はいずれの時期でも認められなかった。そこで、下顎骨及び舌に分化する第一鰓弓に注目し、胎生10日マウス胚の第一鰓弓を無血清のBGJb培地で120時間培養して、HGF/SF及びc-Metの発現を検討したところ、c-Metの発現部位と下顎骨相当部の一部が一致することを認めた。また、筋特異的転写因子であるmyoD、myogenin及びmyf5遺伝子全てが舌相当部に発現することを認めた。さらに、培地に組換え体ヒトHGF/SFを50ng/ml加えて120時間培養したところ、舌はコントロールに比べてやや大きく成長すること、及び舌筋の増殖の活発な部位とc-metの発現部位がほぼ一致することを認めた。以上の結果は、発生段階の舌でHGF/SFがパラクリン的に筋の分化を抑制すると同時に、舌の筋芽細胞の増殖に促進的に働いていることを示すものである。さらに我々は、HGF/SFがgelatinaseを介する筋芽細胞の遊走を促進していることを示唆する結果を得ており、現在詳細に検討中である。また、上記の結果の他に、フェチュインがPTHによる骨吸収を促進すること、及び胎生期ラットのneocortexの発生と発育に関与していることを明らかにし、発表した。骨組織の発生に肝細胞増殖因子(HGF)が関っているか否か確認するため、骨組織を発生する部位におけるHGFとその受容体であるc-Metの発現を検討した。すなわち、胎生10日のマウス胚より、将来骨組織が多くを占める前肢、後肢、体節、及び第一鰓弓を得て、HGFとc-Metが発現しているか否かをRT-PCR法により検討したところ、両遺伝子ともに発現していることを確認した。次に、HGFとc-MetのmRNAレベルでの立体的な発現パターンを検討するため、digoxygeninでラベルしたRNAプローブを作成し、胎生10日から16日のマウス胚をホールマウントin situハイブリダイゼーション法で検討したところ、両遺伝子の発現に若干の時期的な差異はあるものの、前肢、後肢、体節、及び第一鰓弓に強い発現を認めた。

特にc-Metの発現部位は、将来骨化する部分と多くの部分で一致しているものの、未分化間葉系細胞を軟骨細胞や骨芽細胞へ誘導することで知られる、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-βファミリーである骨形成タンパク(bone morphogenetic protein;BMP)-2、BMP-4、BMP-7のいずれの発現部位とも異なっており、HGFがこれらの細胞増殖因子とともにに骨組織の分化を調節しているということを示唆する結果を得た。そこで、下顎骨に分化する第一鰓弓に注目し、胎生10日のマウス胚の第一鰓弓を無血清のBGJB培地で144時間培養し、in situハイブリダイゼーション法でHGFとc-MetのmRNAレベルの発現を検討したところ、両遺伝子ともに染色はin vivoよりも薄いが、c-Metの発現部位と下顎骨相当部の一部が一致していた。今後は、第一鰓弓をヒト組換え体HGFの存在下で培養し、TGF-βファミリー及びフェチュインの発現の動向を検討する予定である。前年度の結果を踏まえ、胎生10日のマウス胚の第一鰓弓を無血清のBGJB培地で120時間培養し、HGFとその受容体であるc-Met、及び筋特異的転写因子であるmyoD、myogenin、myf5のdigoxygeninラベルしたRNAプローブを作製して、ホールマウントin situハイブリダイゼーションにより、これらの遺伝子のmRNAレベルでの三次元的な発現部位を検討したところ、すべての遺伝子がin vivoの時よりも弱くであるが、舌相当部に発現が認められた。さらに、培地に組換え体ヒトHGFを50ng/ml加えて、120時間培養したところ、舌はコントロールに比べてやや大きく成長した。次に、5-buromo-2'-deoxyuridine(BrdU)の取り込みにより、この時期の舌の増殖部位を検討したところ、BrdUを取り込んだ増殖の活発な部位とc-metの発現部位がほぼ一致していた。また、これらの遺伝子の舌内部での局在をマウス胎生12日の舌の50μm切片をin situハイブリダイゼーションにより確認したところ、HGFとc-metの発現部位はわずかにずれており、HGFはパラクライン的に働いていることが示唆された。さらにc-metとmyoD、myogenin、myf5は未分化な外舌筋に分化する部分で完全に発現部位が一致しており、舌筋の分化、増殖にHGFが深く関わっていると考えられた。以上の結果は、HGFが舌筋の増殖に促進的に働いていることを示すものであり、分化にも深い関わりがあることを示唆するものである。また、今年度は上記の結果の他に、フェチュインがPTHによる骨吸収を促進することを、フェチュインが胎生期の脳の発達に関与していることを明らかにし、それぞれ発表した。前年度までの研究により、HGF/SFは舌の発生にも関与していることが明らかになったため、本年度は主としてこれについて検討し、以下のことを明らかにした。マウス胎生12日の舌におけるHGF/SF、HGF/SFの受容体であるc-met、及び筋特異的転写因子myo Dの発現局在をin situ hybridization法により検討したところ、c-metとmyo Dの舌筋部での発現は明らかに一致しており、HGF/SFが舌筋の発生に深く関わっていることが示唆された。次に、HGF/SFが直接、筋芽細胞にどのように働いているかを、マウス培養筋芽細胞C2C12を用いて検討した。すなわち、C2C12細胞をDME培地で培養し、DNA合成能を測定したところ、ヒト組換え体HGF/SF(rhHGF)の添加により有意に増加した。
ケモゲノミクスを用いた子宮頸癌に対する個別化治療の開発

子宮頸癌に対して細胞株を用いた基礎研究および患者サンプルを用いた臨床研究を行った。術前化学療法(NAC)にて腫瘍が縮小した群と、縮小しなかった群で、手術検体のケモゲノミクス解析にて感受性signatureを抽出すると共に、患者血清の遺伝子多型解析にてUGT1A1の意義を見出した。また、リンパ節転移を伴う症例ではTGF-bシグナル経路が亢進しており、pSMAD3の特殊染色パターンが転移好性のバイオマーカーとして有効であることを示した。NACおよび手術療法の妥当性について自験例と多施設共同研究にて安全性を示すと共に、腫瘍活性をMRI画像で評価するラジオミクス解析を進めた。平成26年度はまず、1子宮頸癌の化学療法感受性signatureを実際に取ることができるのか、化学療法で腫瘍が縮小した群と、縮小しなかった群で、手術検体のマイクロアレイ解析を行った。また患者血清の遺伝子多型解析を行い、腫瘍縮小効果に差があることも見出した。この研究成果については現在、論文投稿中である。子宮頸癌では化学療法感受性だけではなく、腫瘍浸潤能も予後に大きくかかわる。そこで、2リンパ節転移を来す症例に特異的に発現するがん関連シグナルを検討したところ、TGF-bシグナル経路が亢進していることと、腫瘍辺縁部のpSMAD3の特殊染色パターンが転移好性のバイオマーカーとして有効であることを見出し、論文発表した(論文1)。さらにTGF-bのサブシグナルであるBMPシグナルが卵巣癌の増殖にかかわり、治療ターゲットになることも論文発表した。この成果は、子宮頸癌の転移抑制療法にも活用できると期待できる(論文2)。ひと口に子宮頸癌と言っても、組織型だけでなく組織亜型も異なる。組織亜型ごとの悪性性格signatureを明らかにするためにはまず、その病態を明らかにする必要がある。そこで、3子宮頸部扁平上皮癌の一亜型である乳頭状増殖型扁平上皮癌の予後を後方視的に検討し、この亜型が比較的予後良好であり化学療法にも感受性を示すことを明らかにして、論文発表した(論文3)。子宮頸癌は、若年女性に数多く見られる疾患で妊娠中に遭遇することも稀ではない。妊娠中期に診断された患者が挙児を諦めることなく妊娠期間の延長を図るには化学療法を行うしかないが、本邦ではまだまとまったデータはない。これまでに経験した妊娠中の子宮頸癌患者のうち、化学療法を施行し生児を得た症例をまとめ、その病態・経過について論文報告した(論文4)。妊娠中でも化学療法を行いえるsignatureの解明機序につながることが期待される。平成27年度は、研究分担者が主導した多施設調査研究にて、初期子宮頸癌に対する縮小治療の妥当性を検証して報告した(論文1,2)。自験例についてもNAC-手術治療の妥当性を検証し、論文投稿準備を行った。さらに個々の症例でNACの奏功性を予測するために手術検体のマイクロアレイ解析および患者血清の遺伝子多型解析を行い、腫瘍縮小効果の差について論文報告した(論文3)。子宮頸癌では化学療法感受性だけではなく、手術完遂度も重要な予後因子となり、時に周辺臓器も同時に切除する骨盤除臓術が必要となるが、骨盤除臓術は周術期合併症が多く、施行に逡巡する施設も少なくない。自験例を振り返り治療成績が良い事、合併症を減らす方策があることを論文報告したところ(論文4)、日常診療に与えるインパクトが大きいとして、近畿産婦人科学会の学術奨励賞を受賞した。子宮頸癌の化学療法感受性を予測する手段として遺伝子解析を日常臨床で行うのは難しい。そこで、日常診療で用いられているMRI画像を用いた機能解析を放射線科と共同で行った。この結果、初回治療前の腫瘍の細胞密度・腫瘍活性が予後とかかわり、MRIである程度、予測することが可能であり、治療後の効果も検出できることを論文報告した(論文5,6)。本年度は臨床データの集積および細胞株を用いた遺伝子解析により、さまざまな病態を示す子宮頸癌の亜型を解明した。次年度はさらに機能解析を進め、成果をまとめて発表する予定である。平成28年度は前年度までの成果を裏付ける目的で、さまざまな化学療法が行われている自経験例の後方視的検討を重ねた。CPT-11とNDPを用いた術前化学療法を動注化学療法後の手術完遂度と比較検討し、治療奏功性は変わらず、副作用が動注化学療法や同時放射線化学療法よりも少なかったことから、CPT-11とNDPを用いた術前化学療法の妥当性を報告した(論文1)。安全性が示されたことで、治療対象を治療効果が高いものに絞ることができれば、個別化治療への道が拓ける。すなわち、前年までに報告した術前に治療効果を予測する前臨床的解析と組み合わせることで、さらにこの併用療法の妥当性を上げられることが期待される。また近年、CPT-11とNDP以外に奏功性の高い化学療法としてPTXおよびCBDCAの併用療法があるが、その奏功性にかかわる因子として治療前の貧血状態や前治療からの間隔があることを、日本臨床腫瘍グループ(JCOG)での多施設共同研究の参加施設として報告した(論文2)。さらに、PTXとCBDCAの併用療法から副作用による治療脱落を防ぎ、適切な治療効果を得るために制吐剤を活用する必要性について報告し(論文4)、ベバシズマブをさらに追加する治療経験についても卵巣癌症例を含め自験例をまとめて報告した(論文5)。化学療法の継続にあたっては、治療効果の評価も一つの重要な因子である。

腫瘍内の活性をMRI画像で検討する目的でdiffusion強調画像の有用性を検討し、画像的バイオマーカーの検出に至ったことも報告した(論文3)。子宮頸癌に対して細胞株を用いた基礎研究および患者サンプルを用いた臨床研究を行った。術前化学療法(NAC)にて腫瘍が縮小した群と、縮小しなかった群で、手術検体のケモゲノミクス解析にて感受性signatureを抽出すると共に、患者血清の遺伝子多型解析にてUGT1A1の意義を見出した。また、リンパ節転移を伴う症例ではTGF-bシグナル経路が亢進しており、pSMAD3の特殊染色パターンが転移好性のバイオマーカーとして有効であることを示した。NACおよび手術療法の妥当性について自験例と多施設共同研究にて安全性を示すと共に、腫瘍活性をMRI画像で評価するラジオミクス解析を進めた。本年度は臨床データの集積により、さまざまな病態を示す子宮頸癌の亜型を解明した。一方で、細胞株を用いた培養実験にて化学療法感受性や浸潤能を評価する手技を安定させ、マイクロアレイ解析も行った。これにより次年度以降には、本年度に明らかになったそれぞれの亜型を比較解析することで、ジェネティックに病態の違いを解析することが可能となった。本年度は最終成果を論文報告として発表し、その成果の上で患者検体を用いた前向き試験が行えるよう、研究を進める予定である。産婦人科本年度は平成27年度と平成28年度に行う予定であった研究の一部が前倒しで終了した。次年度はまず1の成果を論文報告として発表し、その成果の上で患者検体を用いた前向き試験が行えるよう、研究を進める予定である。本年度は臨床データの集積および細胞株を用いた遺伝子解析により、さまざまな病態を示す子宮頸癌の亜型を解明した。次年度はさらに機能解析を進め、成果をまとめて発表する予定である。次年度は最終成果を論文報告として発表し、その成果の上で患者検体を用いた前向き試験が行えるよう、研究を進める予定である。本年度は平成27年度と平成28年度に行う予定であった研究の一部が前倒しで終了した。
冠状動脈の発生と遺伝-冠状動脈の奇形は遺伝するか

1.単冠状動脈奇形の発生についての遺伝的実験では,我々が見出した右冠状動脈口欠損奇形を有する系統マウス(ddv系に属する)を用いて交配実験を続けた.その結果,両親とも同奇形である場合,雄親のみ奇形である場合,雌親のみ奇形である場合,両親とも奇形を有しない場合,それぞれ奇形仔の出現頻度は60%,45%,40%,20%である.これは15世代までのものを平均したものである.このことから,単冠状動脈奇形は遺伝することが明らかとなった.雌雄での出現頻度の差が認められないことから伴性遺伝ではないと考えられる.また, 16世代以降になるとマウスの妊娠率が急に低下してきたため,この遺伝子のcondensationは困難になってしまった.2.我々の見出したマウスの冠状動脈high takeoffの特異性を調べるためにC3H/He,DBA/2,CBA,BALB/c,C57BL/6の5系統のマウスについてその存在を検討した.その結果, C57BL/6系マウスにのみ右冠状動脈開口部の異常高位いわゆるhigh takeoffがあることがわかった.そこでC57BL/6と右冠状動脈口が正常位にあるBALB/cとの交配実験を行ない同奇形の遺伝性について検討した. F1(5週令)での右冠状動脈の開口部位の高さを写真上で測定し,平均値を比較した結果, BALB/cの高さよりわずかに高いことが明らかになった(P<0.01)またBALB/cでは出現しえない明らかなhigh takeoffと認められる個体が約12%に出現する.この遺伝形式についての解明には更にF2以後について実験を行うことが必要である.1.後冠状動脈の奇形の遺伝性について:交配実験(ddYマウス)によるF1では、両親とも後冠状動脈を有する場合,雄親のみ有する場合,雌親のみ有する場合,両親ともに有していない場合で、後冠状動脈の出現頻度はそれぞれ67%,45%,46%,20%であった。従って後冠状動脈の出現は明らかに遺伝しており、また、これは伴性遺伝ではないことが明らかとなった。この系について交配実験を進め、F4で約71%、F5では3回の出産で85%(6/8,7/7,9/9)の高頻度に後冠状動脈の出現を見たつがいを得ることが出来た。2.単冠状動脈奇形の遺伝性について:単冠状動脈奇形仔を高頻度に出産したddYマウスの一つがいから、親の形質に基づく選択的繁殖を始め、現在、12世代目に至っている。出現頻度は世代と共に増加する傾向にあり、80%以上の奇形仔を出産するつがいを得ている。現在までの交配結果を総合すると、単冠状動脈奇形仔の出現頻度は、両親とも奇形である場合,雄親のみ奇形である場合,雌親のみ奇形である場合,両親とも奇形を有しない場合,それぞれ、奇形仔の出現頻度は、60%,50%,40%,20%である。このことから単冠状動脈奇形は遺伝することが明らかであり、それは伴性遺伝ではないと考えられる。3.右冠状動脈のhigh takeoff奇形の遺伝性について:この実験は62年度に行う予定である。2の実験の一部は解剖学会九州地方会(61年11月)で発表済である。1.単冠状動脈奇形の発生についての遺伝的実験では,我々が見出した右冠状動脈口欠損奇形を有する系統マウス(ddv系に属する)を用いて交配実験を続けた.その結果,両親とも同奇形である場合,雄親のみ奇形である場合,雌親のみ奇形である場合,両親とも奇形を有しない場合,それぞれ奇形仔の出現頻度は60%,45%,40%,20%である.これは15世代までのものを平均したものである.このことから,単冠状動脈奇形は遺伝することが明らかとなった.雌雄での出現頻度の差が認められないことから伴性遺伝ではないと考えられる.また, 16世代以降になるとマウスの妊娠率が急に低下してきたため,この遺伝子のcondensationは困難になってしまった.2.我々の見出したマウスの冠状動脈high takeoffの特異性を調べるためにC3H/He,DBA/2,CBA,BALB/c,C57BL/6の5系統のマウスについてその存在を検討した.その結果, C57BL/6系マウスにのみ右冠状動脈開口部の異常高位いわゆるhigh takeoffがあることがわかった.そこでC57BL/6と右冠状動脈口が正常位にあるBALB/cとの交配実験を行ない同奇形の遺伝性について検討した. F1(5週令)での右冠状動脈の開口部位の高さを写真上で測定し,平均値を比較した結果, BALB/cの高さよりわずかに高いことが明らかになった(P<0.01)またBALB/cでは出現しえない明らかなhigh takeoffと認められる個体が約12%に出現する.この遺伝形式についての解明には更にF2以後について実験を行うことが必要である.
テラビット・スピニック・データステレ-ジの基礎検討

代表者等は、従来のトラックバイトラック方式による記録密度や転送レートの限界を打破するために、複数のサブミクロン幅超狭トラック記録と2次元信号処理と組み合わせるマルチトラック並列記録方式をベースとする高速高密度スピニックストレージシステムの検討を行っている。平成7年度は集積型並列記録ヘッドと並列信号処理方式のアウトラインを固め、平成8年度は具体的なデバイスの研究に入って高分解能ヘッドユニットの設計・試作に着手した。本年度はこの試作ヘッドを完成させその記録能力を評価し、スピニックストレージの研究を進展させた。本年度は、薄膜導体励磁型単磁極ヘッドを実用性の高い浮上ヘッドスライダと組み合わせて試作を完了した。このヘッドユニットは従来の10倍程度の高記録感度を達成するとともに、2_nH以下という極めて低いインダクタンスを示し高速転送レートを実現できるものであった。磁気抵抗効果型ヘッドの検討も継続して行い、微分型の等化を行うことで、従来方式の2倍近い線密度を確認した。この結果は理論的にも実証しており、実験的・理論的に単磁極ヘッドと磁気抵抗効果ヘッドによる優れた垂直記録再生特性を明らかにした。また、昨年度までにスーパーコンピュータによる3次元シミュレーションにより示されていた単磁極ヘッドのトラック端の高分解能性も上記の浮上型の新ヘッドで実験的に確認した。以上の成果から、垂直磁気記録により100Gbit/inch^2の超高面密度が記録可能なことが示され、超高密度スピックストレージの可能性を理論的にも証明できた。従来のトラックバイトラック方式による記録密度や転送レートの限界を打破するために、複数のサブミクロン幅超狭トラックをトラック方向への情報の相関を持たせて、2次元信号処理と組み合わせるマルチトラック並列記録方式をベースとする高速高密度スピニックストレージシステムの実現を目標に検討を行なっている。平成7年度は、サブミクロントラック幅垂直磁気記録を発展させ、テラビット級スピニックストレージシステムを達成するために、その基礎となる集積型並列記録ヘッド及び並列信号処理方式を検討した。まず、システムの重要な要素デバイスであるアレイ型単磁極ヘッドの単一ユニットでの最適化を実験とコンピュータシミュレーションから図り、主磁極に近接してリターン磁路を形成するとともに薄膜導体励磁部の高さを低くすることで感度を一桁程度向上できることを明らかにした。この結果を用いて、2ユニットの記録ヘッドをリソグラフィを用いて試作した。本ヘッドは薄膜導体を記録磁極間にそれぞれ単層で配置して独立励磁が可能であり、同時に著しい単磁路化から高記録再生感度を利点とすることが実験と理論から分かった。また、サブミクロントラック幅の記録が各ユニットで独立に記録可能なことを記録再生特性から確認した。同時に、磁気力顕微鏡で実際にサブミクロン幅で記録トラックが形成され、各々が干渉なく記録されることを確認した。この記録面密度は15Gbits/inch^2に相当する高密度である。信号処理方式には、従来のストレージシステムとは大きく異なる多値パ-シャルレスポンスを用いた並列記録再生方式を検討し、マルチトラック並列記録一括再生に有効であることを理論的に検証した。また、実際の2トラック並列のヘッドディスク系を用いて記録再生の実験を行ない、信号の復調が可能なことを実証した。代表者等は、従来のトラックバイトラック方式による記録密度や転送レートの限界を打破するために、複数のサブミクロン幅超狭トラック記録と2次元信号処理と組み合わせるマルチトラック並列記録方式をベースとする高速高密度スピニックトレージシステムの検討を行なっている。平成7年度は、集積型並列記録ヘッドと並列信号処理方式のアウトラインを固めているので、本年度は具体的なデバイスの研究に入り、まず単一ヘッドユニツトの設計・試作を開始した。本年度は、昨年度の結果を用いるとともにコンピュータシミュレーションによる詳細な解析を加えて設計を行ない、薄膜導体励磁単磁極ヘッドを実用性の高い浮上ヘッドスライダと組み合わせて試作を進めている。また、再生用に高感度・高分解能磁気抵抗効果型ヘッド(MRヘッド)の検討も開始し、垂直記録用として単磁極型の書き込みユニツト持つヘッドを試作し、その優れた感度と分解能を測定で示した。

一方、このMRヘッド出力を微分型の等化を行なうことで、従来方式の2倍近い線密度を確認した。この結果は理論的にも実証しており、実験的・理論的にMRヘッド再生に対する垂直記録再生特性を明らかにしつつある。また、サブミクロントラック幅記録の記録状態をスーパーコンピュータによる3次元シミュレーションを用いて解析を行ない、二層膜媒体垂直磁気記録ではトラック端での記録磁界の漏れが極めて少なく、狭トラック幅記録を達成できる能力がここでも示された。このシミュレーションは従来解析が必ずしも容易ではなかった媒体ノイズと媒体物性定数の関係を明らかにでき、高分解能・低ノイズ媒体の設計指針を与えた。さらに、垂直時機記録により100Gbit/inch^2の超高面密度が記録可能なことも示され、スピニックストレージの可能性を理論的に証明できた。代表者等は、従来のトラックバイトラック方式による記録密度や転送レートの限界を打破するために、複数のサブミクロン幅超狭トラック記録と2次元信号処理と組み合わせるマルチトラック並列記録方式をベースとする高速高密度スピニックストレージシステムの検討を行なっている。平成7年度は集積型並列記録ヘッドと並列信号処理方式のアウトラインを固め、平成8年度は具体的なデバイスの研究に入って高分解能ヘッドユニットの設計・試作を着手した。本年度はこの試作ヘッドを完成させその記録能力を評価し、スピニックストレージの研究を進展させた。本年度は、薄膜導体励磁型単磁極ヘッドを実用性の高い浮上ヘッドスライダと組み合わせて試作を完了した。このヘッドユニットは従来の10倍程度の高記録感度を達成するとともに、2nH以下という極めて低いインダクタンスを示し高速転送レートを実現できるものであった。磁気抵抗効果型ヘッドの検討も継続して行い、微分型の等化を行なうことで、従来方式の2倍近い線密度を確認した。この結果は理論的にも実証しており、実験的・理論的に単磁極ヘッドと磁気抵抗効果ヘッドによる優れた垂直記録再生特性を明らかにした。また、昨年までにスーパーコンピュータにより3次元シュミレーションにより示されていた単磁極ヘッドのトラック端の高分解能性も上記の浮上型の新ヘッドで実験的に確認した。以上の成果から、垂直磁気記録により100Gbit/inch^2の超高面密度が記録可能なことが示され、超高密度スピニックストレージの可能性を理論的にも実験的にも証明できた。
顕微ラマン分光法を用いた医薬品製剤中の一次粒子イメージング法の開発

平成29年度までの研究で、ラマン分光法を用いたフェニトインの原薬一次粒子イメージングを行う手法を確立していた。しかしここまでの成果では、この手法がフェニトイン限定的なものである可能性が否めないので、平成30年度は他の薬物についても同様の手法が適用可能であることを示す必要があった。当初予定ではカルバマゼピンを扱う予定であったが、予想外の結晶多形の出現によりラマンスペクトルの解釈が困難となったため、結晶多形が報告されていないシロスタゾールを解析対象とした。フェニトインの場合と同様の手法で顕微ラマン分光法による原薬一次粒子イメージングを行ったところ、シロスタゾールでも良好な一次粒子形状が可視化できることがわかった。再結晶シロスタゾール原薬を乳鉢粉砕およびボールミル粉砕し、ふるいを用いて分級したものについて原薬一次粒子イメージングを行ったところ、乳鉢粉砕では分級レベルに応じた粒子径の一次粒子が得られていたのに対し、ボールミル粉砕では微小一次粒子の凝集塊が得られていた。これはフェニトインの場合と同様の結果であったが、この原薬を製剤化し溶出試験を行ったところ、フェニトインではどちらの粉砕方法でも溶出速度は同程度であったのに対し、シロスタゾールではボールミル粉砕のほうが有意に溶出速度は大きくなっていた。この結果から、フェニトインでは凝集塊径が溶出挙動に大きく寄与しているのに対し、シロスタゾールでは一次粒子径の影響が大きいことが分かった。この知見は本研究によって開発した原薬一次粒子イメージング法なくしては得られることのできなかったものであり、種々の薬物について原薬形状と溶出挙動を正確に理解する上で、研究期間全体を通した本研究の成果は大きな貢献を残したものであると考えられる。なお、本研究期間全体を総括した研究成果については、ICORS 2018(Jeju, Korea)にて口頭発表を行った。平成28年度には、これまでに当研究室で結晶構造やラマンスペクトル情報を十分に蓄積しているフェニトインを材料とし、研究目的としている原薬凝集塊中の一次粒子イメージングが実現可能な手法であることを明確にした。再結晶させたフェニトインを粉砕し分級することにより、各種粒子径のフェニトイン原薬を調製し、これらの粉末試料に対して直線偏光をもつ入射レーザー光を照射しながらラマンイメージングを行った。フェニトインの結晶軸方向と入射レーザーの偏光面のなす角度によってラマンスペクトルパターンが変化することについてはすでに当研究室で調査済みであり、その際の基本となるラマンスペクトル、つまり入射光の偏光面が結晶軸のa軸、b軸、c軸と平行になるときのラマンスペクトルを標準スペクトルとして、イメージングデータの解析を行った。その結果、当初の研究計画で予想した通り、フェニトインの凝集塊中の一次粒子形状が画像として得られることがわかった。これは一次粒子の境界面において、入射光の偏光面に対する結晶軸の方向が大きく変化することによるものと考えられる。この手法を応用し、フェニトイン製剤(アレビアチン錠100 mgおよびヒダントール錠100 mg)中におけるフェニトインの一次粒子形状のイメージングを成功させ、各種添加剤が共存する製剤中においても原薬一次粒子形状のイメージングが可能であることを示すことができた。なお、これらの成果については、日本薬剤学会第31年会(2016年5月、岐阜)、およびThe 1st Workshop for Japan-Korea Young Scientists on Pharmaceutics(2016年6月、京都)において発表した。当初の研究計画の通り、平成28年度にはフェニトインを材料とし、ラマンイメージングを応用して原薬凝集塊中の一次粒子イメージングが可能であることを示すことができた。また製剤中でのフェニトイン一次粒子イメージングについても、2社の市販製剤を用いて検証することができた。平成28年度の研究計画に挙げていたイメージング画像から画像解析ソフトウエアにより粒度分布測定を行うこと、また、市販製剤ではなく、調製したフェニトインの各種粒子径の原薬を用いたモデル製剤を自前で調製し、これに対してフェニトインの一次粒子イメージングを行うことの2点については、現在精力的に取り組んでいる状況であるが、まだ具体的な成果はあがっていない。一方で、平成30年度の研究計画としていた一次粒子イメージングと溶出挙動との関連性の調査に関しては、平成28年度中に簡易版の溶出試験装置を研究室に導入し、調製した各種粒子径のフェニトイン原薬の溶出速度測定をすでに実行している。以上のことを勘案して、本研究課題はおおむね順調に進展しているものと考える。これまでに手法をほぼ確立させた製剤中の原薬一次粒子のラマンイメージング法について、平成29年度は当初計画の通り、自前で調製した各種粒子径のフェニトイン原薬を用いたモデル製剤を作成し、それらの製剤中のフェニトイン原薬一次粒子イメージングを行った。フェニトイン原薬は再結晶した結晶から粉砕および分級によって得たが、その際の粉砕工程で二つの異なる手法(乳鉢粉砕およびボールミル粉砕)を用いた。分級した原薬について本研究で確立させた原薬一次粒子イメージングを行うと、同じ粒子径に分級される原薬でも、粉砕方法によって一次粒子形状が全く異なることがわかった。乳鉢粉砕では一次粒子の大きさによって分級されていたが、ボールミル粉砕では細かい一次粒子が凝集した凝集塊の大きさによって分級されていた。

これらの原薬を用いてモデル製剤を作成し、製剤化後の一次粒子イメージングを行うと、やはり原薬調製段階と同様に、ボールミル粉砕原薬では製剤中に小粒子の凝集体が散在している様子が見られた。その後、各種モデル製剤について、当初は平成30年度の研究計画としていた溶出挙動の調査を行った。その結果、興味深いことに、製剤からの原薬溶出速度は、原薬一次粒子よりも凝集塊の大きさに依存していることがわかった。乳鉢粉砕とボールミル粉砕で、原薬段階で同じ粒子サイズに分級された原薬を用いて作成した製剤では、ほぼ同様の溶出挙動を示した。ボールミル粉砕原薬では小粒子の凝集体のサイズによって分級されているにもかかわらず、その製剤の溶出挙動が乳鉢粉砕の製剤と同等であったことは、原薬の粉砕・分級と溶出挙動との関係性に重要な示唆を与えるものであり、本研究で確立した原薬一次粒子イメージング法なくしては得られなかった結果であると言える。この研究成果については、平成30年度に学術論文(現在執筆中)と各種学会発表において広く発信していく予定である。当初計画では、平成29年度はフェニトイン以外の原薬について本研究の原薬一次粒子イメージングが適用可能かを判断する計画であった。研究実績の概要の欄に記述したように、平成29年度にはフェニトインを用いた実験に関して非常に興味深い知見が次々と得られ始めたため、本来ならば平成30年度に計画していた溶出挙動調査を早々に実行し、フェニトイン製剤における一次粒子イメージングの重要性に関する研究を深く掘り下げることに重心を置いた。その結果、フェニトイン以外の原薬での一次粒子イメージングについては、大きな進展は得られなかったが、メトホルミン塩酸塩およびカルバマゼピンについて同様の一次粒子イメージングが応用可能であることを確認することはできた。このような点から、研究期間内の全体計画を鑑みたとき、現在までの進捗状況はおおむね順調であると判断される。なお、フェニトインおよびメトホルミン塩酸塩については、一次粒子イメージングの基準となる3つの標準ラマンスペクトル、つまり結晶格子のa、b、c軸のそれぞれと励起レーザーの偏光方向とが平行となるときのラマンスペクトルを、X線単結晶構造解析の結果をもとに得ていた。このようにして3つの標準スペクトルを得るのは非常に手間と時間がかかるため、カルバマゼピンを用いた事例においては、ラマンイメージング測定時に得られた多数のスペクトルデータ群から、標準スペクトルとして最も適当と考えられるものを、統計学的手法を駆使して抽出してくる試みを行っている。これについてはまだ完全に手法を確立している状態ではないが、初期検討としては十分良好な成果を収めている状況にある。平成30年度はこの手法の確立についても進めていきたいと考えている。平成29年度までの研究で、ラマン分光法を用いたフェニトインの原薬一次粒子イメージングを行う手法を確立していた。しかしここまでの成果では、この手法がフェニトイン限定的なものである可能性が否めないので、平成30年度は他の薬物についても同様の手法が適用可能であることを示す必要があった。当初予定ではカルバマゼピンを扱う予定であったが、予想外の結晶多形の出現によりラマンスペクトルの解釈が困難となったため、結晶多形が報告されていないシロスタゾールを解析対象とした。
アクチン線維束構造の協同性と滑り運動発現

滑り運動とカップルしたアクチン線維の構造変化を捕らえる事を目的として本研究を行った。アクチン線維を滑らせるモ-タ-蛋白質ミオシンは、種、組織、細胞等に依りその性質を異にする。平滑筋ミオシンにおいては、軽鎖リン酸化が運動発現に必須うである事を示した。平滑筋構成蛋白質カルデスモンは、アクチン線維に結合し、アクトミオシンATPア-ゼ活性を抑制する。しかし、in vitro運動観察の過程で、低濃度カルデスモンは、むしろ滑り運動を活性化し速度を速める事を見いだした。粘菌にもカルデスモン様蛋白質の存在を見つけ、同様に低濃度でアクトミオシンATPア-ゼ活性、滑り運動を活性化し、高濃度で抑制する。未だ生理的役割は明かでないが、アクチン線維にリンクした調節蛋白質であり、細胞運動のメカニズムを考える上で重要である。車軸藻における原形質流動を担うモ-タ-蛋白質は、in vitro運動法により筋肉由来アクチン線維を用いる事によりアッセイ出来る事を示した。このモ-タ-蛋白質は約60um/s,筋肉ミオシンの10倍の速度でアクチン線維を滑らせる。車軸藻モ-タ-蛋白質ー車軸藻ミオシンーは滑り速度に見合って、筋肉アクトミオシンの10倍の高いATPア-ゼ活性を示すであろうか。ミオシン頭部首振りによる滑り運動の分子メカニズムのモデルの検証に格好の試料と言える。更に、このモ-タ-蛋白質は筋肉ミオシンでは殆ど滑らせることの出来ないプロテア-ゼ(proteinase K,subtilisin)消化アクチンも、未消化アクチンと同様の速度で滑らせることを見いだした。この事実は、車軸藻モ-タ-蛋白質はアクチン結合部位を、筋肉ミオシンとは全く異にし、異なった分子メカニズムで化学エネルギ-を滑り運動のエネルギ-へ変換していることを示唆する。如何なる分子メカニズムに依っているのであろうか。何れにせよ、この車軸藻ミオシンの単離精製が急務である。
犬バベシア症に対するアトバコンを中心とした多剤併用療法の確立

本研究では、犬バベシア症の原因であるBabesia gibsoniに対してアトバコン(ATV)をより効果的に使用するためのエビデンスを確立することを目的として、申請者がこれまでに確立した野生型およびATV耐性培養株を用いて(1) ATV標的部位と推測されるミトコンドリア機能の解析、(2)分子生物学的解析、(3)多剤に対する薬剤感受性、(4) ATVおよび併用薬剤の相互作用についての評価を行い、これらの結果をもとに(5) ATVおよびproguanil製剤(Malarone(R))の急性期B. gibsoni感染症に対する治療効果の評価を行った。その結果、原虫ATV耐性発現はミトコンドリアCYTb遺伝子における一塩基多形121Iの関与によるものであることが強く疑われ、さらにこの多型を有する原虫はATV以外の薬剤に対して交差耐性を示さないことが明らかとなった。またATVおよび他剤との併用は原虫増殖に対して相乗相加作用を示し、Malarone(R)は急性期B. gibsoni感染動物に対して高い治療効果を示すことが明らかとなった。本研究は、これまでに確立した野生型およびアトバコン(ATV)耐性Babesia gisboni培養株を用いて、犬B.gibsoni感染症に対するATVを中心とした多剤併用療法の確立を目指すものである。本年度は両培養株の(1)ミトコンドリア機能についての解析、(2)分子生物学的な特徴の評価、(3)薬剤感受性の評価を実施した。(1)両培養株のATP産生能についてルシフェラーゼ発酵法によって評価したところ、原虫増殖に伴うATP産生増加は確認されなかった。この結果は他の原虫においてこれまで報告された結果と異なるものであり、酸素濃度を含む培養条件の違いに起因する可能性が考えられる。そのためミトコンドリア機能についての新たな評価方法として、原虫ミトコンドリア酵素であるDehydroorotate dehydrogenase (DHODH)に着目し、液体クロマトグラフィーを用いた原虫由来DHODH活性の測定系を確立した。今後この測定系を用いて両培養株におけるDHODH活性を比較する予定である。(2)ATV耐性株におけるミトコンドリア遺伝子(COX1,COX3およびcytb)の塩基配列を確認した結果、cytbにおける一塩基多形(M121I)以外にアミノ酸置換を伴う遺伝子変異は確認されなかった。続いてallele-specificreal-time PCR法によるM121I原虫の定量法を確立した。これによる解析の結果、ATV耐性培養株におけるM121I原虫は約99%以上の割合で存在することが明らかとなった(論文投稿中)。(3)両培養株に対する複数薬剤の感受性を評価した結果、ATVに対しては野生株の約6倍の感受性低下を示した。一方ジミナゼンアセチュレート、ドキシサイクリン、アジスロマイシン、クリンダマイシン、プログアニルに対する感受性は野生株と有意な差は認められなかった。今後は、両培養株におけるDHODH活性の評価、さらにATVを含む各種薬剤がこれに与える影響を評価する。その上でATVと他の薬剤を併用した場合の相互作用についてin vitroおよびin vivoで評価を実施する予定である。本研究は、これまでに確立した野生型およびアトバコン(ATV)耐性Babesia gibsoni培養株を用いて、犬B. gibsoni感染症に対するATVを中心とした多剤併用療法の確立を目指すものである。本年度は(1)in vitroにおけるATVと他剤との相互作用についての検討を行い、(2)さらに感染動物に対するアトバコンと多剤の併用療法の試みを実施した。(1)野生型およびATV耐性B.gibsoni培養株に対してATVと、Diminazene aceturate, Azithromycin, Doxycycline, Clindamycin, Proguanilの相互作用を確認したところ、いずれも相乗相加作用が認められ、明らかな拮抗作用を示すものはなかった。(2)(1)の結果を受け、ATVおよびProguanilの合剤であるMaralone^[〇!R](GraxoSmithCline)を、実験的に感染を成立させた犬に10日間投与し、その治療効果および副作用発現の有無について検討を行った。その結果、急性期および慢性期犬B. gibsoni染症に対して本薬剤は速やかな治療効果を有することが示された。またMaralone^[〇!R]は犬に対して強い副作用は示さず、安全に使用できることが確認された。

しかし、すべての犬において治療終了後に原虫の再出現、ATV耐性の発現が確認された。犬B. gibsoni感染症に対するMaralone^[〇!R]の治療効果を検討した研究はこれまでに報告されておらず、本薬剤は今後臨床現場における急性期犬B. gibsoni感染症の治療薬剤として新たな選択肢となる可能性がある。しかし本薬剤による短期間の治療では再発やATV耐性発現の問題が残り、今後これに対する対策を検討する必要がある。