hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
岩手県矢巾町および滝沢村における極小微動アレー探査による浅部地盤調査

研究目的本研究は、2003年5月26日に発生した宮城県沖の地震に対してアンケート震度調査を行った岩手県矢巾町および滝沢市(H26. 1. 1滝沢村が市政執行)において、微動計4台を用いる極小微動アレー観測を行い、浅部地盤構造を推定して地震による震度と浅部地盤との関係性について明らかにすることを目的とする。研究方法観測は、微動計4台を半径60cmの円に内接する正三角形の頂点と中心に配置し、GPSによる時刻同期をして行った。矢巾町では高田地区と国道4号から東北本線矢幅駅までの地区、および矢幅駅西側の地区にて観測を実施した。観測点は26点である。滝沢市では滝沢ニュータウン周辺、土沢から室小路にかけての諸葛川沿いの地区および巣子地区にて微動観測を実施した。観測点は25点である。各観測点にて約15分間微動を測定した。また、矢巾町では5地点、滝沢市では11地点にて、半径12mのアレー観測も行った。研究結果観測された微動からレイリー波の位相速度を計算し、長尾・紺野(2002)の方法により波長15m、30m、40mのレイリー波位相速度から深度10m、20m、30mの平均S波速度(AVS10、AVS20、AVS30)を換算により求めた。矢巾町は、震度4が多い高田地区では表層S波速度が速い結果となった。矢巾駅周辺は、震度5弱が多い駅東側よりも震度5強が多い西側の方が表層S波速度が遅い結果となった。アンケート震度とAVS10とは、相関係数-0.6の負の相関があった。AVS20、AVS30も同様であった。また平成25年度奨励研究により実施した調査結果とも矛盾が無い。よって、表層地盤と基盤深度が震度に影響しているものと考えられる。滝沢市は、調査地点のほぼ全点が震度5弱であったが、微地形区分は火山山麓地と砂礫質台地とに分かれる。防災科学技術研究所による表層地盤増幅率は、砂礫質台地の方が火山山麓地よりも小さいとされている、本研究の調査地点ではAVS20、AVS30は場所による差異が生じたが、AVS10はどの地点も200m/s以下とほぼ同等であった。よって滝沢市は極浅い地盤の固さが地震時の揺れに影響しているものと考えられる。参考文献長尾・紺野(2002) :土木学会論文集、No.696/I-58、pp.225-235.研究目的本研究は、2003年5月26日に発生した宮城県沖の地震に対してアンケート震度調査を行った岩手県矢巾町および滝沢市(H26. 1. 1滝沢村が市政執行)において、微動計4台を用いる極小微動アレー観測を行い、浅部地盤構造を推定して地震による震度と浅部地盤との関係性について明らかにすることを目的とする。参考文献長尾・紺野(2002) :土木学会論文集、No.696/I-58、pp.225-235.
再燃前立腺癌に対する遺伝子治療・分子標的治療に関する基礎的研究

進行性前立腺癌がどのような機序で再燃するかは、まだはっきりしないことが多いため、我々は前立腺が感受性細胞株LNCaPからアンドロゲン非存在下でも増殖しうる細胞株LNCaP-SFとLN-REC4を樹立し、そのcharacterizationを行った。その結果、LN-REC4は血管新生が亢進していることが判明した。LNCaP-SFはアンドロゲンで逆に増殖が抑制される特徴を有していた。現在、LNCaPとLNCaP-SFを用いてアンドロゲンでの反応性の異なる遺伝子を同定中である。また、これまで、よいモデルがほとんどなかった造骨性骨転移のモデルをLNCaP-SFを用いて樹立することに成功した。造骨性転移においても破骨細胞が重要な役割を示しており、第3世代のビスフォスフォネート製剤は破骨細胞の抑制を介して、前立腺癒の溶骨性骨転移だけでなく、造骨性骨転移も抑制しうることを証明した。さらに、ビスフォスフォネート製剤は破骨細胞を介した間接的な作用だけでなく、癌細胞に対してアポトーシスの誘導や、骨でのケモカイン受容体CXCR-4の発現抑制を介した浸潤能の抑制という直接的な効果も引き起こす可能性が示唆され、第3世代のビスフォスフォネート製剤による新たな前立腺癌の骨転移予防薬という可能性が見いだされた。さらに、再燃前立腺癌において発現が亢進しているとされる癌遺伝子Her-2に対する分子標的治療薬の開発のために、分子標的治療薬を用いてのin vitro、in vivoでの抗腫瘍効果を確認した。前立腺癌の再燃機序は、まだ十分解決されておらず、再燃癌に対する決め手となる有効な治療法はない。その理由は、再燃に関与する遺伝子の情報や役割などの研究がなされていないからである。本研究は、in vivoのモデルを用いてヒト前立腺癌の再燃を再現し、再燃時に発現の増加する遺伝子、および発現の減少する遺伝子をまず同定し、さらに、その遺伝子にターゲットを絞った遺伝子治療や分子標的治療を目指している。本年度行った実験結果は以下の通りである。1.アンドロゲン感受性前立腺癌培養細胞LNCaPをオスSCIDマウスの背部に2カ所接種し、その2カ所の部位で癌細胞の発育が観察された後、一方の癌細胞を摘出し、それからRNAを抽出した。その後、マウスを去勢すると、残りの腫瘍は一旦退縮後再増殖を始めた。この腫瘍はアンドロゲン非依存性と考えられ、この腫瘍も摘出し、そこからRNAを抽出した。また、この再燃腫瘍の一部を用いてcell line化し、後の実験に用いることとした。2.アンドロゲン非依存性の確認は、in vitroではandrogenによる増殖の反応性、および、PSA prmoterを利用したluciferase assayで行った。3.去勢前に摘出したLNCaPの腫瘍からのRNAと去勢後に再燃した腫瘍からのRNAからmRNAを抽出し、cDNA microarrayをもちいて、発現に差のある遺伝子を選択し、いくつかの遺伝子のクローニングを行っている。4.前立腺癌細胞を直接マウスのtibiaに打ち込み前立腺癌の骨転移モデルを確立した。アンドロゲン感受性前立腺癌培養細胞LNCaPをオスSCIDマウスの背部に接種し、castrationしても増殖しうるアンドロゲン非依存性細胞株LNCaP-SFを樹立し、そのcharacterizationを行った。LNCaPとLNCaP-SFからRNAを抽出し、ARの発現PSAの発現等を調べた。増殖に関しては、それぞれの細胞はアンドロゲンに対して全く反対の反応を示したが、PSAの発現はともにアンドロゲンで誘導された。ARの発現レベルは二つの細胞間で明らかな差は認められなかった。現在、この二つの細胞をアンドロゲンで処理した後、RNAを抽出し、cDNA microarrayの手法を用いてアンドロゲンで誘導される遺伝子、抑制される遺伝子、あるいは反応の異なる遺伝子を同定した。それらの遺伝子の機能解析を進行中である。

また、LNCaP-SFはcastrationしたscid mouseの皮下での増殖が早く、これをtibiaに直接注入することによって造骨性変化をきたす前立腺癌骨転移モデルを樹立することができた。これは別のアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株PC-3を同様にmouseのtibiaに注入したときに溶骨性変化をきたすのと対照的である。LNCaP-SFによる造骨性変化とPC-3による溶骨性変化は破骨細胞阻害物質である第3世代ビスフォスフォネートで抑制され、骨内での癌の増殖も抑制された。現在、これらの細胞を用いてこつへの浸潤の機序、造骨性変化をきたす機序を解析中である。1前年度の実験で同定された再燃前立腺癌に高発現する複数の既知の遺伝子あるいは未知の遺伝子のfull-length cDNAを強制発現させるためplasmidにサブクローニングした。2差のあった遺伝子が増殖に影響を及ぼすことを、cell countおよびWST-1 assayにより確認した。また、Boyden chamberを用いた実験で浸潤能、遊走能に影響を及ぼすことも確認した。同時に、強制発現させた細胞において癌の浸潤、転移に関連した遺伝子、即ちMMPs,カドヘリン、bFGF,VEGFの発現が変化することをRT-PCRにより確認した。さらに、scid mouseに強制発現させた細胞を移植することによって、in vivoでも増殖能を確認した。3これらの成果をもとにhTERTのプロモーターの下流に上記遺伝子の、senseあるいはantisense DNAを結合させ、細胞に導入することにより癌特異的遺伝子治療の基礎的実験を行った。このBisphosphonateの抗腫瘍効果がどうして生じるのか分子生物学的に解析した。また、Bisphosphonateと他の抗癌剤などとの併用療法も行い、どの併用治療が最も効果的かを検討した。さらに、Bisphosphonateは骨転移の増殖を抑制することが期待できるため、in vivo骨転移モデルを用いてBisphosphonateの抗腫瘍効果を検討した。5 HER-2のinhibitorを用いて前立腺癌に対する抗腫瘍効果、他の抗癌剤との併用療法の可能性を検討した。さらに、確立した骨転移モデルを用いてHER-2 inhibitorが骨転移巣にも効果があるかどうかを確認した。
障害児のリハ治療における長期ゴールの考え方-重度障害児のADL評価を手懸りにして

重症心身障害児・者の原因、機能障害、そしてADLの特徴と相互関係を把握し、WHO(1980)が提唱する障害モデルを参考として、リハビリテーションの長期目標を考えるに資する成果を得ることを目的とした。対象は滋賀県下の一重症心身障害児施設に入所している92名の入園者であり、10年で括った年代ごとの群を比較検討した。結果として、まず10歳代はそれより年長の年齢群と異なり、機能障害と能力障害の両面で明らかに重度であった。これは近年の周産期医療の進歩に伴う疾病構造の変化を反映していると考えられる。20歳代以降はADLが徐々に低下するだけでなく、ADLの各項目の相互関係が希薄になることが統計的に証明された。また20歳を超えて一部に骨格変形の進行を認め、背景に自然歴の加齢の要素以外に、こういった二次障害の影響が直接的・間接的に反映していると考えられた。座位保持能力を目的変数とした多変量解析では、10歳代では乳幼児期の機能障害と相関を示すが、20歳より年長では関連が希薄となった。つまり10歳代では生得的能力の影響がまだ強く示されるが、20歳代以降ではその影響が少なくなった。座位保持能力をADLとの関係で多変量解析をおこなうと、生得的運動・精神能力だけでなく学習の要素が示唆された。結論として、重症心身障害児・者では、若い年代は生得的能力の全般的な開花をめざし、20歳を過ぎた年代では二次障害と加齢の対策に重点を移した長期的課題を計画する必要性がある。なお現在、対象をより多くとって、この仮説の検証を試みている。対象は重症心身障害児施設に入園中の児童と成人95名である。男性53名、女性42名、年齢は2歳55歳、平均29歳。現在の運動能力は、室内歩行7名、立位2名、座位43名、そして寝たきりが42名であり、言語・非言語を問わずコミュニケーションが可能なのは21名である。調査項目は、原因疾患に関わるもの、幼少児期の発達、現在の機能障害・知的障害の現状等機能障害に関わる49項目と、FIMやリハ医学会の成人脳卒中患者のADL項目を参考にして重症児用に新たに作成した14項目である。結果をまとめるにあたり、10才以下は除いて、10才代、20才代、30才代、40才代以上の年齢によるグループごとに集約した。今回は、合計92名の主としてADLに関するまとめである。結果とまとめ:(1)10才代のADLは全体としてレベルが最も低い。自然経過と異なり、医療構造の変化が反映していると考えられる。(2)20才代から30、40才代へのADLの変化は、経年的な加齢の変化として捕らえられる。20才代が最もレベルが高い。(3)ADLの各項目の関連は、20才代に最も緊密となる。その後加齢とともに、相互関係が希薄となる。このことは、10才代を除くと、20才代にこそADLにつながる能力がもっとも相互の機能的つながりを持つことを示すと考えられる。(4)重症児・者の重要な獲得目標である座位姿勢は、起き上がりと強い関連を持ち、座位保持能力も20才代に最も高くなると推定される。重症心身障害児・者の病因、機能障害、そしてADLの特徴と相互関係を把握し、WHO(1980)が提唱する障害モデルを参考として、リハビリテーションの長期目標を考えるに資する成果を得ることを目的とした。

対象は滋賀県下の一重症心身障害児施設に入所している92名の入園者であり、10年で括った年代ごとの群を比較検討した。結果として、まず10歳代はそれより年長の年齢群と異なり、機能障害と能力障害の両面で明らかに重度であった。これは近年の周産期医療の進歩に伴う疾病構造の変化を反映していると考えられる。20歳代以降はADLが徐々に低下するだけでなく、ADLの各項目の相互関係が希薄になることが統計的に証明された。また20歳を超えて一部に骨格変形の進行を認め、背景に自然歴の加齢の要素以外に、こういった二次障害の影響が直接的・間接的に反映していると考えられた。座位保持能力を目的変数とした多変量解析では、10歳代では乳幼児期の機能障害と相関を示すが、20歳より年長では関連が希薄となった。つまり10歳代では生得的能力の影響がまだ強く示されるが、20歳代以降ではその影響が少なくなった。座位保持能力をADLとの関係で多変量解析をおこなうと、生得的運動・精神能力だけでなく学習の要素が示唆された。結論として、重症心身障害児・者では、若い年代は生得的能力の全般的な開花をめざし、20歳を過ぎた年代では二次障害と加齢の対策に重点を移した長期的課題を計画する必要性がある。なお現在、対象をより多くとって、この仮説の検証を試みている。
樹幹の病傷害に対する応答と治癒機構に関する基礎的,応用的研究

木本植物の樹幹の樹脂分泌とジャスモン酸木本植物の樹幹における樹枝分泌にはエチレンとともにジャスモン酸が関与していることが明らかになった。ジャスモン酸(methyl jasmonate)処理によって樹脂道の分化と樹脂分泌が促進された樹種は、広葉樹ではウコギ科(Araliaceae),バラ科(Rosaseae)およびウルシ科(Anacardiaceae)の樹種であった。また針葉樹ではヒノキ科(Cupressaceae)のヒノキ(Chamaecyparis obtusa)とヒノキアスナロ(Thujosis dolabrata)およびスギ科(Taxodiaceae)のスギ(Cryptomeria japonica)であった。ヒノキおよびヒノキアスナロの漏脂病発症におけるエチレン、ジャスモン酸、およびサリチル酸の生理作用ヒノキおよびヒノキアスナロの漏脂病発症におけるCistella japonicaの関与を確認した。また傷害部ではエチレンおよびジャスモン酸が樹脂道分化及び樹脂分泌に重要な役割を果たしていることを認めた。しかし無傷の樹皮ではジャスモン酸およびエチレンの存在下でサリチル酸が極めて顕著な樹脂道分化及び樹脂分泌の促進作用を持つことが明らかとなった。ヒノキではサリチル酸ナトリウム(SA-Na)0.01%、エチレン(Et)1%、およびプロヒドロジャスモン(Pro-JA)1%の混合処理によって、樹脂流出量、樹脂道の断面積ともに顕著に増加することが確認された。ヒノキアスナロではサリチル酸メチル(SA-Me)0.01%とEt1%およびジャスモン酸メチル(JA-Me)1%と組み合わせで促進効果が認められた。この結果、比較的低濃度のサリチル酸が、エチレン及びジャスモン酸の存在下で樹脂道の分化、樹脂分泌を促進することがわかった。1.広葉樹の樹脂分泌:広葉樹12種(ブナ、シラカンバ、ウリハダカエデ、コシアブラ、クリ、ミズナラ、ウワミズザクラ、キハダ、ケヤキ、アメリカフウ、キョウチクトウ、カクレミノ、ウルシ)の幹の傷害部にJA-Me処理を行い、樹種間の比較を行った。この結果、カクレミノ、コシアブラのウコギ科、バラ科のウワミズザクラ、ウルシ科のウルシでのみ、樹脂分泌が促進された。2.ウルシの樹脂分泌:石川県輪島市近郊に植栽されているウルシを用いて、幹に対しJA-Meラノリンペーストをさまざまな方法で処理し、漆液を掻き取り、定量した。これらの結果、JA-Me処理は樹液の溢泌を顕著に促進したが、エスレルの効果は小さかった。3.針葉樹の樹脂分泌:針葉樹6種(ヒノキ、ヒバ、スギ、カラマツ、イチイ、クロマツ)の傷害部の樹脂分泌におけるジャスモン酸、エチレン、およびジャスモン酸に拮抗する物質であるサリチル酸(SA)の影響を調べた。この結果、マツ科を除く樹種で処理区の樹脂流出量が対照区を上回った。4.ヒノキ・アテの樹脂分泌(漏脂病との関連):ヒノキを用い、JA-Me、ジャスモン酸プロピル(JA-Pro)、サリチル酸(SA)、Et、JA-Me+SA、JA-Me+Et処理を行った。さらに2004年、石川県輪島市のアテ造林地においてJA-Me、IB, SAに対する反応の品種間差を調べた。これらの結果、JA-Me、Et、JA-Me+Et処理で樹脂分泌が促進された。また樹脂道の形成はJA-MeおよびEtの双方で促進された。一方、SA1%、およびJAMe1%+サリチル酸1%で分泌は抑制される傾向が認められた。アテの樹脂分泌もJA-Me処理によって促進された。なお、ヒノキを用いてJA-Me処理とエチレン放出との関係も調べたが、JA-Meはエチレン生成を促進しなかった。

健全なアテを用いて、樹脂道形成と樹脂分泌におけるサリチル酸の役割をエチレンおよびジャスモン酸の生理作用との比較から検討した。実験にはエチレンの発生剤であるエスレル(Et)、ジャスモン酸(JA, methyl jasmonate)、サリチル酸(SA, salicylicacid-Na)をラノリンに希釈してペーストを作り、約30年生アテの無傷の樹幹に塗布した。処理区は6区で、それぞれ1%Et、5%JA、5%SA、1%Etと5%SAとの混合(Et+SA)、5%JAと5%SAとの混合(JA+SA)、およびラノリンのみの対照区とした。ペースト塗布は2005年4月29日、6月17日、および8月5日の3時期に行った。供試木は処理区ごとに3個体を選び、1個体に付き3ヶ所、計9ヶ所にペーストを塗布した。処理2ヵ月後に樹皮を皮ポンチで採取して組織の横断切片を作成し、サフラニンとファストグリーンによる二重染色法を行ってスライドグラスに封入し、永久プレパラートを作成した。これらのプレパラートを用いて、1mm^2あたりの樹脂道数と面積を計測した。また樹皮採取傷からの樹脂流出量については11月に肉眼による観察を行い、流出量の多寡を0から5の6段階で評価した。この結果、1mm^2あたりの樹脂道数と面積は、サリチル酸とエスレルの混合処理(Et+SA)によってどの時期においても顕著に増加することが明らかになった。さらに樹脂流出量についてみると、4月の処理ではEt+SA及びJA+SAが対照区に対して有意に樹脂分泌を促進するようであった。6月はEt+SA及びJA処理の効果が対照区に対して有意に大きかった。一方8月での処理は顕著な樹脂分泌促進効果が認められなかった。以上の結果、サリチル酸はエチレンの存在下で顕著な樹脂道分化および樹脂分泌の促進を誘起する可能性が高いことが考察された。この成果の一部は、1回の国際学会、2回の国内学会で発表した。(材料と方法)実験には挿し木31年生ヒノキアスナロ(マアテ)、および実生30年生ヒノキを用いた。・ヒノキアスナロ:薬剤はサリチル酸ナトリウム(SA-Na)0.01,0.1,1%、あるいはサリチル酸メチル(SA-Me)0.01,0.1,1%をそれぞれ単独またはエチレン発生剤エスレル(Et)1%、およびジャスモン酸メチル(JA-Me)1%と組み合わせて調整した。それぞれのペーストは無傷の樹幹表面の径約2cmの範囲に塗布し、アルミホイルとガムテープで被覆した。処理は2006年5月910日に行った。樹脂道の組織観察のための試料採取は約4週間経過後の6月3日に行った。樹皮組織の横断切片を作成し、2mm^2あたりの樹脂道数と面積を計測した。また樹皮採取傷からの樹脂流出量については10月15に流下した樹脂の長さを測定することによって評価した。・ヒノキ:薬剤はSA-Na0.01,0.1,1%、あるいはSA-MeO.01,0.1,1%をそれぞれ単独またはEt1%、およびジャスモン酸の生理作用を持つプロヒドロジャスモン(Pro-JA,ジャスモメート:日本ゼオン)1%と組み合わせて調整した。実験方法はヒノキアスナロと同様である。処理は2006年7月1416日に行った。試料採取は約5週間経過後の8月20日に行った。
複合微生物系の機能を利用した高度水処理技術の体系化とその評価

本研究は6つのサブテーマを設けて進めている。1.各研究課題の成果(1)生物学的栄養塩除去プロセス:有機物として酢酸またはプロピオン酸のみを基質として嫌気好気式活性汚泥プロセスを運転し、微生物相の変化をPCR-DGGE法で追跡した。リン除去の良好な運転期間におけるバンドのうちいくつかはRhodocyclus属のものとして同定された。また、脱窒性脱リン細菌を積極的に用いた水処理プロセスを開発し、脱窒性脱リンの活性を60%程度にまで高めることができた。(2)地球温暖化ガス排出の抑制:実下水を用いた循環プロセスにおいて、前年度観察された脱窒時の突発的な亜酸化窒素の多量発生について、更に検討した。連続的な亜酸化窒素と酸化還元電位の測定結果から、このような発生は、例外なく酸化還元電位が300mV以上の水準にまで高くなっている場合に生じることが明らかになった。これらのことから、酸化還元電位が多量な亜酸化窒素の生成を警告する指標になることがわかった。ただし、酸化還元電位が高い場合に常に亜酸化窒素が生成するわけではなかった。多量の下水を意図的に希釈して流入させる実験を行ったところ比較的多量の亜酸化窒素発生が見られたことから、合流式下水道において降雨時に希薄な下水が流入することが亜酸化窒素の大量発生に繋がる恐れがあることが示唆された。(3)資源回収型水処理プロセスの開発:余剰汚泥を用いたPHA生産では、実下水を用いたパイロットプラントを運転し、プロセスの運転条件やPHA生産の反応条件が活性汚泥によるPHA生産に与える影響について検討した。特に生産反応におけるpHと有機酸の濃度が大きな影響を及ぼすこと、影響の程度は水中の非解離の酢酸の濃度に依存するらしいことがわかった。(4)余剰汚泥排出抑制型水処理システム:活性汚泥法で生じる余剰汚泥を可溶化して曝気槽に戻すことにより、発生汚泥量を削減するシステムの実現可能性について検討した。可溶化法として、熱処理・酸またはアルカリ処理・中温消化を検討し、消化汚泥循環率制御により最大85%の発生汚泥量削減に成功した。また汚泥発生のないプロセスができる可能性も確認できた。メンブレンバイオリアクターでは、SRTを長くすれば余剰汚泥をゼロにできるが、高負荷運転時における膜ファウリングの問題を微生物生態系を利用して制御する方法を実験的に検討し、微小後生動物を安定して維持する運転条件を明らかにした。膜面に棲息する貧毛類は、膜面付着汚泥量を顕著に減少させ、膜ファウリングの進行を抑制することを定量的に明らかにした。(5)新しい浄水技術の評価および健康関連微生物の挙動解明:陰電荷膜を用いたウイルス濃縮法を開発し、海水から高い回収率でウイルスを回収することができた。夏の海水浴場からエンテロウイルス、冬の東京湾からノーウォークウイルスを検出した。紫外線照射によって、藻類の増殖抑制の効果が残存していることを明らかにした。その主要因子として、紫外線強度、有機物、金属イオンの影響を調べた。玉川パイロットプラントにおいて、生物濾過を導入することによって膜の閉塞が抑制できることを実験的に検証した。また、二酸化チタン光触媒を用いた高度酸化処理において、光強度、触媒面積、撹拌強度、pHなどによる反応速度への影響を定量的に解明した。(6)複合微生物系解析技術の開発:複合微生物系解析の基礎技術の開発:活性汚泥中微生物群集のもつ亜硝酸還元酵素をコードするnirSおよびnirKの多様性を解析するために、PCR-DGGE法の適用を試みた。混合プライマーの使用をさけることにより、PCR-DGGE法を機能遺伝子の解析に適用することができることが示された。フローサイトメトリーを用いて貧栄養の付着性微生物を測定する手法を開発した。染色剤の選定、超音波による前処理方法の確立、およびフローサイトにおける蛍光波長のみを計測の対象とした。ウイルスの精製法として、ゲル濾過法を適用し、塩素消費物質を除去してウイルスを80%以上回収する方法を開発した。また、ウイルスを限外濾過膜によって効率的に脱塩する手法を開発した。2.研究拠点の形成本年度は、内外の研究者との学術的交流を深め本研究の成果を発表するために、国際シンポジウム(招聘外国講師5名、招聘国内講師14名、参加者計266名)を行った。1.各研究課題下記の5つの研究課題をおこなっている。(1).生物学的リン除去プロセス生物学的リン除去プロセスに関する研究では、プロセス中の微生物の化学分類学的および遺伝子分類学的な動態解析手法を構築することを目的として研究を行った。本年度特に力を注いだのは活性汚泥中の微生物群をスライドグラス上に固定し、それに対してリボソーマルRNAを標的とする蛍光標識遺伝子プローブを作用させる、いわるゆるFISH法の適用性の検討である。FISH法を用いることにより、活性汚泥中の微生物相を単離・培養することなくあるがままに解明することが可能であることを確認することができた。(2).生物学的窒素除去プロセス硝化脱窒同時進行型のプロセス2基を運転し、硝化・脱窒過程における亜酸化窒素の挙動を解析した。窒素の安定同位体(^<15>N)を用いたトレーサー実験により、亜酸化窒素の発生の起源(硝化過程か脱窒過程か)を特定することができる。本年度はそのための実験手法についてほぼ確立した。

本年度得られた実験データの範囲では、硝酸起源の亜酸化窒素がほとんどであり、無酸素条件下だけでなく好気条件下でも脱窒により亜酸化窒素が発生するという結果であった。(3).排水からの有価物の回収廃水から回収可能な有価物として、生物分解性プラスチックであるポリヒドロキシアルカノエイト(RHA)に注目して検討を行っている。本年度は嫌気好気法の変法の一つである窒素リン同時除去法の汚泥を用いて硝酸を電子受容対としたPHA生産の可能性について検討した。その結果、酸素ではなく硝酸を電子受容体としてもPHA生産を行いうることがわかったが、PHAの生成速度は好気条件下の半分程度であった。一方、光合成非イオウ細菌(R.sphaeroides)による排水からのPHAおよびタンパク質の生産の可能性については、硫化物濃度、通気条件、および光照射条件について検討を行った。硫化物については10mgS/l程度でも増殖に悪影響を与えること、微量な通気でも菌体のPHA含量が低下することが明らかになった。(4).高効率水処理用膜分離バイオリアクターの開発実験室規模、および実際に稼働している膜分離活性汚泥プロセスについて、硝化・脱窒活性、ATP含量、脱水素酵素活性、および、原生動物等の大型微生物を含めた微生物種構成について基礎的な検討を行った。一般の活性汚泥法に比べ、膜分離活性汚泥法では微小動物叢が不安定であり、特定の微小動物が数多く、しかも大きな変動とともに計数されることがわかった。また、ATP含量や脱水素酵素活性の測定から、膜分離バイオリアクターでは汚泥単位量あたりの微生物活性が通常の活性汚泥法に比べて低いことが明らかになった。(5).病原ウイルスの挙動解析と水の再利用のための消毒法の評価本年度は大腸菌ファージQβを用いてMPN-PCR法によるウイルスの定量的検出の検討、およびそこで開発された定量法を用いて各種消毒法の消毒効率を評価する際の基礎データの取得を行った。MPN-PCR法ではオーダー程度の定量性が得られることがわかった。一方、塩素消毒や紫外線消毒をしたときのウイルスの不活化速度をMPN-PCR法と従来のプラーク法で比較した場合、PCR法ではプラーク陰性のQβを陽性と検出してしまうことがわかった。PCR法は様々なウイルスの検出に有効な方法であるが、消毒効率の検討のためにPCR法を用いるためには更なる検討が必要である。2.研究拠点の形成本年度は全体計画として、拠点形成に必要な基盤整備のための一年であると位置づけて、設備・備品の購入と整備を行うとともに、研究者の派遣・招聘を通じて国内・海外の関連する研究者とのネットワークの構築をはかった。内外の研究者との学術的交流を深めるために、海外から四名の講師を招聘し、ワークショップを行った。ワークショップでは学内からの参加者約40名の他、外部からは大学・研究機関・企業・自治体等の研究者約80名が参加し、活発な議論が交わされた。本研究は6つのサブテーマを設けて進めている。1.各研究課題の成果(1)生物学的栄養塩除去プロセス:生物学的リン除去活性汚泥をクローニング法により解析し、特定の群に属するクローンを多数得た。混合微生物系からポリリン酸蓄積細菌を選択的に回収するために、密度差遠心分離法を導入した。また、活性汚泥から16株のバクテリオファージを得た。
知能認識システムを含む自動きさげ盤の開発

きさげ作業は,高精度なすべり案内面を仕上げうることから,旋盤のベッドなどの加工には不可欠な手仕上げ加工法である.近年,わが国では技術の海外移転にともない熟練技術者不足が叫ばれており,その対策が緊急課題となっている.そこで,本研究では,熟練作業者が行う作業工程の自動化を試みた.本研究で試作した自動きさげ盤は大型位置決めステージ,加工工具,CCDカメラ,コンピュータおよび制御装置によって構成される.あらかじめ光明丹を塗布してすりあわせを行ったきさげ加工面をCCDカメラによって撮影し,得られた画像を処理してその濃度分布から加工すべき位置を求める.そしてその位置に加工工具を位置決めして,加工をほどこす.加工装置本体は3自由度直交座標型の大型ステージで,高精度なボールねじとサーボモータから構成された直動機構をXYZの3方向に組み合わせたものである.加工工具としては熟練作業者が使う工具と同様なものを用い,CCDカメラとしてはカラーのものを用いた.まず,"赤当たり"の認識を行い,数10μmレベルの比較的粗い加工を実施する.次に"黒当たり"の認識を行い,数μm程度の高精度な加工を行う.これらはすべてコンピュータプログラムによって制御され,知的な自動化が実現されている.最終的に仕上がったきさげ面の加工精度をまた,摺動実験,表面解析から評価したろころ,本装置で仕上げられた仕上げ面はは平面度で6μm,1インチ四方におけるあたりの数は9個程度で,JIS2級程度の水準であった.きさげ作業は,高精度なすべり案内面を仕上げうることから,旋盤のベッドなどの加工には不可欠な手仕上げ加工法である.近年,わが国では技術の海外移転にともない熟練技術者不足が叫ばれており,その対策が緊急課題となっている.そこで,本研究では,熟練作業者が行う作業工程の自動化を試みた.本研究で試作した自動きさげ盤は大型位置決めステージ,加工工具,CCDカメラ,コンピュータおよび制御装置によって構成される.あらかじめ光明丹を塗布してすりあわせを行ったきさげ加工面をCCDカメラによって撮影し,得られた画像を処理してその濃度分布から加工すべき位置を求める.そしてその位置に加工工具を位置決めして,加工をほどこす.加工装置本体は3自由度直交座標型の大型ステージで,高精度なボールねじとサーボモータから構成された直動機構をXYZの3方向に組み合わせたものである.加工工具としては熟練作業者が使う工具と同様なものを用い,CCDカメラとしてはカラーのものを用いた.まず,"赤当たり"の認識を行い,数10μmレベルの比較的粗い加工を実施する.次に"黒当たり"の認識を行い,数μm程度の高精度な加工を行う.これらはすべてコンピュータプログラムによって制御され,知的な自動化が実現されている.最終的に仕上がったきさげ面の加工精度をまた,摺動実験,表面解析から評価したろころ,本装置で仕上げられた仕上げ面はは平面度で6μm,1インチ四方におけるあたりの数は9個程度で,JIS2級程度の水準であった.きさげ作業は,高精度なすべり案内面を仕上げうることから,旋盤のベッドなどの加工には不可欠な手仕上げ加工法である.近年,わが国では技術の海外移転にともない熟練技術者不足が叫ばれており,その対策が緊急課題となっている.そこで,本研究では,自動きさげ盤の開発を目的として,特に今年度は以下の2つの課題に着手した.1.研削形きさげ加工ユニットの開発研削方式のきさげ加工ユニットを開発し,その性能を調べた.熟練作業者の加工精度に匹敵する加工精度と,良好な加工痕形状を得ることができた.加工時の動力は垂直水平方向ともに10N以下と非常に小さく,また,熱の発生も極めて少ないことから,研削熱の発生は極めて少ないと考えられる.以上のことから,本ユニットで仕上げたきさげ面を案内面として用いた場合,残留ひずみが少なく,経年変化の少なくすくことが可能と考えられる.2.CCDカメラを用いてきさげ仕上げ面の評価方法の開発一方,きさげ仕上げ面はこれまで具体的な評価方法が確立していないことから,本研究ではCCDカメラを用いてきさげ仕上げ面の評価方法の開発を行った.従来から当たり面の認識に使われる画像処理の手法にキャラクタリゼーションの概念を導入し,1.グラフィックによる定性的評価,2.負荷特性による機能的評価,3.突起検出による幾何学形状の評価,の3手法について実用の可能性を検証した.結果として,いずれの手法もきさげ仕上げ面の評価を適切に行うことができた.また,CCDカメラを測定器として用いた場合,0.4μmの深さを色彩情報から認識することができ,これもきさげ仕上げ面の測定制度としては実用的であるといえる.きさげ作業は,高精度なすべり案内面を仕上げうることから,旋盤のベッドなどの加工には不可欠な手仕上げ加工法である.近年,わが国では技術の海外移転にともない熟練技術者不足が叫ばれており,その対策が緊急課題となっている.そこで,本研究では,自動きさげ盤の開発を目的として,特に今年度は以下の2つの課題に着手した.1.自動きさげ作業の実施CCDカメラ,大型の位置決めテーブル,加工工具からなる自動きさげ盤を構成し,熟練作業者が行う作業工程の自動化を試みた.まず,"赤当たり"の認識を行い,数10μmレベルの比較的粗い加工を実施する.次に"黒当たり"の認識を行い,数μm程度の高精度な加工を行う.これらはすべてコンピュータプログラムによって制御され,知的な自動化が実現されている.

最終的に仕上がったきさげ面の加工精度は平面度で6μm,1インチ四方におけるあたりの数は9個程度で,JIS2級程度の水準であった.2.きさげ仕上げ面の評価方法の開発加工機によって仕上げられたきさげ面の評価方法について検討した.ここでは,(1)画像処理による当たり数の測定,(2)平面度の2点から総合的に評価することとした.(1)について,パソコン,CCDカメラ,イメージキャプチャーからなる画像処理系を構築した.取得された評価面の画像は証明ムラの除去,二値化,膨張,縮退,ラベリングなどの処理をほどこされ,単位インチあたりの凸部(当たり)の数がカウントされる.(2)について,定盤基準による平面度測定系を構築した,これは,高精度定盤,電気マイクロメータ,支持台からなり,プログラムによる平面補正を用いて高精度に平面度を測定することができる.
頭頸部腫瘍の穿刺吸引細胞診における細胞診断学及び免疫組織化学的研究

本研究の目的は、細胞診で推定診断を行うための確実な細胞採取法の確立と、鑑別診断を目的とした細胞像の検討にあった。前者に関しては簡便なディスポーザブル型の細胞吸引器の開発とその使用法の確立が計画され、満足する結果が得られた。本器は従来のディスポーザブル注射筒を使用する方法と比べ、1.小型で患者の恐怖心が少ない。2.前準備が簡単である。3.細胞の採取量が多い。また針生検器具を改良したために、4.組織塊として採取されることも多く種々の標本作製法が利用できるなどの特徴を持ち、実際の臨床面だけでなく、動物実験においても充分利用価値があることが実証された。しかし術者によって若干細胞採取量に違いがあるため今後は本器の手技の普及を計画したい。後者については、唾液腺腫瘍を主体に穿刺吸引された細胞の疾患別観察とデータ処理が行われ、各々の腫瘍の特徴的な細胞像、鑑別すべき疾患とその鑑別法についてチャートを作製し日常業務に応用している。また腫瘍別に順次学会発表を行い、現在も続行中である。このチャートを使用すれば唾液腺腫瘍のほぼ80%が推定診断可能であった。ただし腺リンパ腫を除いた他の単形性腫瘍など少数例も含まれるため今後も症例を増やし検討する必要がある。唾液腺以外の疾患例えば顎骨内腫瘍、頸部腫瘤などから採取された細胞についても検討を行ったが、若干の歯原性腫瘍や嚢胞、転移性癌、悪性リンパ腫などに効果があった。これらは一括して発表の予定である。免疫組織化学的手法も数種の唾液腺腫瘍細胞塊や嚢胞内容液に応用したが、節状構造の鑑別やplasmacytoid cellの識別あるいは腫瘍細胞の検出に有効であった。しかし組織起源に言及できる所見には乏しかった。これは抗体の数に比して検体が少ないためで多数の標本を作る必要があり、今後の課題といえる。免疫電顕についても例数が少なく同様である。
ス-パ-オキシドディスムタ-ゼ遺伝子の光および酸素ストレスによる発現制御

ホウレン草葉に対し光処理したところ、SODのうち銅・亜鉛型SOD(Cu/ZnーSOD)のみが光に依存して発現することがわかった。そこで、ホウレン草葉に対するcDNAライブラリ-を構築しSOD1,SOD2のcDNAを同定し、その全長塩基配列を決定した。一方、酸素ストレスとしては、ス-パ-オキシド(O^-_2)発生剤であるパラコ-ト処理を行ない、その結果得られた耐性タバコカルスが特殊なSOD発現パタ-ンを示すことを明らかにした。なお、イネについては、登熟期種子に対するcDNAライブラリ-を構築した。これよりホウレン草Cu/ZnーSODcDNAをプロ-ブとして2種類のイネ細胞質型Cu/ZnーSODcDNAを同定し、その全長塩基配列を決定した。さらに、イネ核DNAライブラリ-より2種類の遺伝子を単離しその構造解析を行なった。その結果、イネ細胞質型Cu/ZnーSOD遺伝子は、いずれも、7ヶのイントロンで分断された8ヶのエキソンから構造されていることが判明した。このうち第一イントロンは5'の非翻訳配列中に存在する特殊な例であった。この5'非翻訳配列中のイントロンの存在およびイントロンによる翻訳領域の分断パタ-ンは他の生物のSOD遺伝子構造とは全く異なっており、植物におけるSOD遺伝子構造と発現制御の特殊性が示された。なお、本研究により初めて植物のSOD遺伝子構造が明らかにされた。
ネット上の医療・健康情報の健全な利活用を可能にするヘルスリテラシー支援環境

(i)Web上の様々な医療・健康情報の間に潜在的に存在する同意、対立、根拠等の隠れた論理的関係を同定する言論間関係認識技術を研究開発した。(ii) (i)の要素技術として、大規模言語データからの知識獲得、述語項構造解析の洗練、仮説推論の高速化と機械学習に関する研究に取り組んだ。(iii) (i)(ii)の技術をソーシャルメディア上の情報に対する信頼性分析に応用し、ソーシャルメディア分析のケーススタディを行った。(iv)ネット調査を行い、批判的思考態度や教育歴がヘルスリテラシーを高め、適切なネット上の医療・健康、食品安全性に関する情報の利活用を促進していることを明らかにした。本研究では,ネットユーザの情報信憑性判断を支援し,その能力を育成するヘルスリテラシー支援環境の研究開発を行うもので,本年度は次の3つの研究項目に取り組んだ.(A)相対言論空間生成(乾,岡崎,渡邉)・医療・健康情報に関連するWeb文書を数百万ページの規模で収集したドメインコーパスを用意し,これと医療関連知識ベースであるライフサイエンス辞書を用いて,種々の言語解析モジュールを医療・健康情報ドメインにチューニングした.・ドメインコーパスの一部に文脈情報や言明間関係を人手で付与した注釈付きコーパスを作成した.これにより,文脈処理や言明間関係の仕様を医療・健康情報ドメインに適応させる.得られた注釈付きコーパスは,今後モデルの訓練・評価用データとして用いる予定である.・現在の文間関係認識モジュールを医療・健康情報ドメインにチューニングする.(B)ヘルスリテラシー支援環境(乾,楠見)・ドメインチューニングした文間関係認識モジュールをベースに想定し,ヘルスリテラシー支援環境の基本設計を行った.(C)ヘルスリテラシーの支援・教育方法(楠見)・一般市民および患者・家族を対象とする大規模なネット行動調査を行うための種々の準備を行った.本年度は次の3つの研究課題にて、それぞれ下記の研究開発を実施した。(A)相対言論空間生成(乾、岡崎、渡邉)第1に、言明間関係認識の個々の要素モジュールについて処理速度および精度の両面から見直し、全体に高速化・高精度化をはかった。また、一部の処理を並列化、非同期化し、耐規模性を向上させた。第2に、自然言語文の意味解析を頑健化するための意味の分散表現に関する研究、言明間の関係をより精緻に解析することを目的とした述語論理ベースの推論機構に関する研究をすすめた。言語処理学会第20回年次大会最優秀賞、優秀賞、若手優秀賞を受賞した。(B)ヘルスリテラシー支援環境(乾、楠見)上述の文間関係認識エンジンをベースにして、ヘルスリテラシー支援環境のプロトタイプシステムの設計・開発を進めた。大規模なマイクロブログデータ集合に対して情報間の論理的関係をモニタリングし、いくつかの方法で可視化する機構を実現した。これをベースに、マイクロブログ上の意見や情報の流れを分析するケーススタディを実施した。言語処理学会2013年度論文賞、および第26回日本リスク研究学会年次大会優秀発表論文賞を受賞した。(C)ヘルスリテラシーの支援・教育方法(楠見)被災県と首都圏の合計877名の20-60代の成人男女に対してネット調査を行い、福島原発事故による放射線リスクに関するネット上の情報を利活用の実態、情報源の信頼性,食品の放射能汚染へのリスク認知と態度、不安、放射能や科学に関する知識(放射能リスクリテラシー)、メディアリテラシー幸福感、批判的思考態度などについて尋ねた。その結果,批判的思考態度が放射能リスクリテラシー、メディアリテラシーと適切なネット上の情報の利活用を促進していることを明らかにした。本年度は次の3つの研究課題て、それぞれ下記の研究開発を実施した。(A)相対言論空間生成(乾、岡崎、渡邉)第1に、マイクロブログデータを対象として言明間関係や種々の意味的注釈情報を人手で付与した言論マップコーパスを作成した。ウェブの一般文を対象とした従来の言論マップの言明間関係の定義を見直し、「イソジンは放射能予防に効果があるというのはまったくのデマ。」のようなマイクロブログに特徴的に出現する言語表現に対応できるようにした。第2に、従来の言論マップ生成システム(言明間関係認識モジュール)の個々の要素モジュールについて処理速度および精度の両面から見直し、全体に高速化・高精度化をはかった。第3に、上記技術を適用し、大規模なマイクロブログデータ集合に対して情報間の論理的関係をモニタリングする機構を部分的に実現した。(B)ヘルスリテラシー支援環境(乾、楠見)上述の文間関係認識モジュールをベースにして、ヘルスリテラシー支援環境のプロトタイプシステムの設計・開発を進めた。(C)ヘルスリテラシーの支援・教育方法(楠見)

被災県,首都圏,関西圏で,合計1500名の20-60代の成人男女に対してネット調査を行い,ネット上の医療や健康情報を利活用の実態,ネットの情報に基づく薬や健康法の効果の判断の仕方(ヘルスリテラシー),医療への満足度,幸福感,被災経験,批判的思考態度などについて尋ねた。その結果,批判的思考態度がヘルスリテラシーを高め,適切なネット上の医療・健康情報の利活用を促進していることを明らかにした。最終年度となる本年度は次の3つの研究課題において下記の研究開発を実施した。1.相対言論空間生成(乾、岡崎)第1に、言明間関係認識の個々の要素モジュールについて処理速度および精度の両面から見直し、全体に高速化・高精度化をはかった。また、一部の処理を並列化、非同期化し、耐規模性を向上させた。第2に、自然言語文の意味解析を頑健化するための意味の分散表現に関する研究、言明間の関係をより精緻に解析することを目的とした述語論理ベースの推論機構に関する研究を進めた。言語処理学会2014年度最優秀論文賞、同学会第21回年次大会最優秀賞を受賞した。2.ヘルスリテラシー支援環境(乾、楠見)上述の文間関係認識エンジンをベースにして、ヘルスリテラシー支援環境のプロトタイプシステムを開発した。大規模なマイクロブログデータ集合に対して情報間の論理的関係をモニタリングし、いくつかの方法で可視化する機構を実現した。これをベースに、マイクロブログ上の意見や情報の流れを分析するケーススタディを実施した。国際会議AMT2014で最優秀論文賞を受賞した。3.ヘルスリテラシーの支援・教育方法(楠見)全国の2069歳の男女市民1000人に対してネット調査を行い,ネット上の医療や健康,食品安全性情報を利活用の実態と信頼性評価,健康情報TV番組視聴,ネットの情報に基づく薬や健康法の効果の判断の仕方や食品安全性の知識(ヘルスリテラシー),医療への満足度,食品のリスク認知や好み,批判的思考態度などについて尋ねた。その結果,批判的思考態度や教育歴が,ヘルスリテラシーを高め,適切なネット上の医療・健康,食品安全性に関する情報の利活用を促進していることを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。自然言語処理26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画通り,(A)相対言論空間,(B)ヘルスリテラシー支援環境,(C)ヘルスリテラシーの支援・教育方法の3項目において,いずれも有意味な進捗を見た.(B)と(C)は研究分担者との連携方法の調整に若干時間を要したため,計画より若干遅れ気味であるが,(A)については計画以上に進捗しているため,おおむね順調に進展していると考える.当初計画通り、(A)相対言論空間生成、(B)ヘルスリテラシー支援環境、(C)ヘルスリテラシーの支援・教育方法の3項目において、いずれも有意味な進捗を得ている。(A)の基盤的研究と(B)の応用的研究の両方において、言語処理学会、日本リスク研究学会から合わせて5件の受賞があり、高い評価を受けている。当初計画通り、(A)相対言論空間、(B)ヘルスリテラシー支援環境、(C)
ヒトFoF1-ATP合成酵素の機能制御機構の解明

本研究ではヒトF1-ATPase (F1)と高い構造類似性を持つウシF1の大量生産システム、顕微鏡一分子回転観察システム、X線結晶構造解析システムを確立した。そして寿命伸長効果や生活習慣病の改善効果が報告されているレスベラトロールをモデル阻害剤として、ウシF1の機能に与える影響を顕微鏡一分子観察とX線結晶構造解析により明らかにした。分析の結果、レスベラトロールはF1の回転軸と固定子の間に結合し、生成物リン酸の結合の素過程進行を阻害することによりATPの合成反応を阻害している事が示唆された。この結果は、今後の哺乳類の生体エネルギーシステムの人為的機能調節の研究の理論的基盤となると考えられる。組み換え体ヒトF1の大腸菌内での発現量は低いため、まずは発現量が高いウシF1を使用する事とした。ウシF1は、触媒サブユニットの配列が99%ヒトF1と同一であり、ヒトF1と高度に類似の特性を持っていると考えられる。初年度(平成27年度)では、本研究課題を遂行する上で必要な更なる分析法の確立を検討し、ウシF1のX線結晶構造解析のシステムの確立に成功した。そこで本研究では、計画していた顕微鏡一分子観察に加え、X線結晶構造解析を行う事により、回転と分子構造の両面からF1の機能調節機構の解明を行う事とした。顕微鏡一分子観察では、まず世界で初めてウシF1の回転の直接観察に成功した。次に、レスベラトロールによるF1の阻害機構を分析した。その結果、レスベラトロールはF1の加水分解待ちの角度である90度とATP結合待ちの120度で回転を停止させる事が判明した。特に、長時間の停止は90度付近で発生する事から、少なくともレスベラトロールの阻害機構の一つは、90度でのATP加水分解待ちの分子状態を固定する事である事が示唆された。更にウシF1のX線結晶構造解析を行った。まず様々な結晶化条件をサーチし、F1の回転子の角度が、リン酸解離待ちである65度、リン酸解離中間体である75度、リン酸解離後の加水分解待ちである90度である結晶の結晶化条件と、その結晶構造を決定する事に成功した。そして、これらの結晶にソーキングによりレスベラトロールを導入し、F1-レスベラトロール複合体の結晶構造の決定を試みた。その結果、レスベラトロールは、65度の構造にも弱く結合できるが、主に90度の分子状態に強く(高い占有率で)結合する事が判明した。この結果から、上記の一分子回転解析から得られた結果と同様に、レスベラトロールはF1の加水分解待ちの分子状態を固定するという阻害機構が、分子構造の点からも示唆された。ウシF1を優先使用して研究を行ったことにより、研究の進行速度が一気に高まる結果に繋がった。また本研究でウシF1のX線結晶構造解析システムを確立したことは、本研究課題だけでなく、今後の哺乳類F1の研究を考える上でも非常に意義の大きい成果と言える。なぜならこのシステムを用いる事により、65度、75度、90度の3つの分子構造を詳細に分析が可能となったためである。この言わば、この「角度分割X線構造解析」を用いる事により、これら3状態への阻害剤の結合の有無・結合様式・結合による構造変化などを、原子レベルで詳細に明らかにすることが可能となった。また顕微鏡一分子解析も、レスベラトロールによるウシF1の阻害(回転の停止)を、酵素反応の素過程に対応付けて解明する事に成功した。更に、上記角度分割構造解析システムを活用する事により、その阻害状態を原子レベルで明らかにすると共に、角度依存的なレスベラトロールの結合能がγR260残基の側鎖の角度依存的な構造変化により引き起こされることも明らかにする事ができた。また、α-ケトグルタル酸の解析も進めており、部分的ではあるが、一分子解析・X線構造解析共にデーターが出始めている。本研究課題である「阻害剤による哺乳類F1の機能調節機構の解明」という観点から、研究は順調に進展していると自己評価している。初年度では、ヒトF1と99%(触媒サブユニット)のアミノ酸配列相同性を持つウシF1を用いる事により、研究が大きく進展したが、第二年度でもウシF1を用いる事により大きな進展が見られた。初年度では、まず顕微鏡一分子解析により、阻害剤(レスベラトロールなど)によりウシF1の機能がどのように阻害されるかを、顕微鏡を用いた一分子回転観察により分析し、その阻害様式の決定に成功した。さらにウシF1の結晶構造解析システムを立ち上げ、阻害剤との複合体の結晶構造を決定することにより、阻害剤がウシF1に与える影響を、立体構造的にディスカッションが出来るようになった。しかし、立ち上がった結晶構造解析システムには今だ改善の余地があり、更なる分解能の向上や、応用的な分析法を確立する必要があった。そこで第二年度では、ウシF1の回転制御機構を詳細に明らかにしその制御機構を議論する為に、ウシF1のX線結晶構造解析の更なる発展を試みた。まず結晶化・凍結の条件検討を行い、より分解能が高い構造を得る事に成功した。さらに、ウシF1の結晶が、結晶成長後に外部からチオリン酸を導入(もしくは除去)する事により、回転軸を回転させる事が可能であるが判明した。驚くべき事に、ウシF1の結晶はこの操作により崩壊しない。そこでリン酸(実験ではチオリン酸)の結合

・解離による約25度の回転を結晶中で発生させ、さまざまな回転中間体構造の同定、さらにはリン酸が解離していく様子のスナップショットを時分割結晶構造で明らかにする分析システムの確立に成功した。その結果、リン酸結合・解離による回転力発生の仕組みを原子レベルの構造変化の連続的な流れで明らかにする事に成功し、回転とその制御機構を理解するための理論的基盤が入手された。第二度の研究のうち、進展著しい結晶構造解析に関してを中心に述べます。初年度に行った通常のX線結晶構造解析の手法により、生成物リン酸(実験ではチオリン酸)の解離前後の構造と、その中間体構造が得られた。しかし結晶化条件よっては、リン酸結合部位に硫酸イオンが結合しているなどの問題があった。そこで様々な塩を検討し、硫酸フリーの条件で結晶を得る事に成功した。さらに様々な条件検討の結果、溶液中のチオリン酸の有無のみの違いによりリン酸解離前と後の構造を得る事に成功し、立体構造の微小な違いを、リン酸の有無のみの違いに起因するものとして議論出来ようになった。そしてこれら新旧の結晶化条件から得られた結晶の分析条件(凍結条件など)をさらに突き詰める事により、全体的に分解能を向上させることに成功し、最大1.842.0Aの構造も複数得る事にも成功した。また同時に、ウシF1の結晶は結晶を崩壊させる事なく、結晶中の回転子を回転させる事が出来るという興味深い特性がある事を見出した。そこで、得られた結晶にチオリン酸を様々な濃度でソーキングした結果、回転中間体を複数入手する事に成功した。また、チオリン酸が結合している結晶をスタート材料に、チオリン酸除去後の時間を変えて分析する事により、時間が経過するにつれチオリン酸が外れながらF1の回転子が回転して行く様子が中間体の結晶構造により明らかになった(全て前構造決定)。これらの時分割結晶構造解析から得られた中間体構造は、先に行った通常の結晶構造解析法により得られた回転中間体と、類似のものが複数得られた。この結果は、この時分割法により得られた中間体構造が正しく回転中間体を観測している事を示唆している。この結果により、初年度に得られたレスベラトロールなどの阻害剤の結合部位が、回転に伴いどのように変化していくかが明らかになり、詳細な議論が可能となった。本研究ではヒトF1-ATPase (F1)と高い構造類似性を持つウシF1の大量生産システム、顕微鏡一分子回転観察システム、X線結晶構造解析システムを確立した。そして寿命伸長効果や生活習慣病の改善効果が報告されているレスベラトロールをモデル阻害剤として、ウシF1の機能に与える影響を顕微鏡一分子観察とX線結晶構造解析により明らかにした。分析の結果、レスベラトロールはF1の回転軸と固定子の間に結合し、生成物リン酸の結合の素過程進行を阻害することによりATPの合成反応を阻害している事が示唆された。この結果は、今後の哺乳類の生体エネルギーシステムの人為的機能調節の研究の理論的基盤となると考えられる。第一年度の研究により、レスベラトロールによるウシF1の機能制御機構を、顕微鏡一分子解析と角度分割X線結晶構造解析による明らかにすることに成功した。この分析システムは汎用性が高く、様々な阻害剤に対して使用する事ができると考えられる。そこで第2年度以降は、これら分析システムをα-ケトグルタル酸に適用する。