hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯の発生過程におけるShhシグナルによる静的幹細胞維持機構の解明

パラフィン切片を作製して、蛍光観察及び免疫組織化学的解析を行った。その結果、生後1日から1週では、GFP陽性細胞が歯髄全体に分布していたが、3週になると、強い蛍光のdense LRCが象牙芽細胞層及び象牙芽細胞下層に局在し、歯髄中央部のLRCの蛍光が減弱していた。Gli1陽性細胞は生後1日から5週まで髄角部に局在していた。切歯では、歯乳頭と形成端の外エナメル上皮側に多くのGFP強陽性細胞が局在し、Gli1は形成端全体に発現していた。In situハイブリダイゼーション法によるShhおよびPtch1のmRNA発現分布については、現在、解析中である。2.in vitro実験1:昨年度からの追加実験として、生後2日B6マウスの下顎切歯を取り出しTrowell法にてShh阻害剤である5E1を培地に4日間添加(26μg/ml)器官培養を行い、パラフィン切片を作成し免疫組織化学的に検索した。その結果、5EIによりShh陽性細胞は内エナメル上皮側でコントロール群より有意に減少することが明らかとなった。3.in vitro実験2:生後2日TetOP-H2B-GFP仔マウスの下顎切歯を取り出しTrowell法にてShh阻害剤である5E1を培地に4日間添加(26μg/ml)・器官培養を行い、パラフィン切片を作製した。現在、静的幹細胞と考えられるGFP陽性細胞とSox2陽性細胞について蛍光観察・免疫組織化学的に解析中である。本年度、in vivo実験については胎生期ラベリング法による探索結果を、また、in vitro実験ではB6マウスの下顎切歯を使用した培養実験結果の報告を行った。TetOP-H2B-GFPマウスによるin vitro実験結果については、次年度、報告する予定である。TetOP-H2B-GFPマウスの実験については、引き続き経時的データを増加し、胎生期ラベリング法による実験結果と比較する予定である。5E1を使用したin vitro実験については、個体数が少なかったので、個体数を増加し結果を確定する。また、同方法でTetOP-H2B-GFPマウスを使用した実験を行う予定である。TetOP-H2B-GFPマウスを使用したin vitro実験については、解析を行うことで、昨年度から行っているB6マウスによる実験結果と共に、Shhシグナルと静的幹細胞分布との関係性を検索する。in vivo実験については、TetOP-H2B-GFPマウスにおけるin situハイブリダイゼーション法によりShhとPtch1のmRNA分布を明らかにする。さらに、real-time PCRを用いてShh、Ptch1のmRNA発現の定量解析をする。共同研究者との打ち合わせおよび実験回数が予定より少なかったため、次年度使用額が生じた。実験に必要な材料費、研究成果の公表費等に使用する予定である。研究代表者所属が変更となり、器材および材料等の購入が遅れたため、次年度使用額が生じた。次年度、実験・解析等に必要な機器・材料費、研究成果の公表費等に使用する予定である。
価値観の相互影響メカニズム及び従業員の組織行動との関連：衝突を成長の機会に

本年度は、価値観の相互影響メカニズムの研究を進める上で主となる(1)企業の社会的責任を果たす理念(2)関係的と集団的自己アイデンティティ(3)共有型リーダーシップの発揮の三つに絞って考察を進め、英文論文の発表と国内外の学会での発表を行った。まず(1)の相互影響メカニズムであるが、企業の社会的責任を果たす理念に対する管理職の態度は比較的協力的であることが予想されるため、一般従業員の価値観に与える影響を重点的に分析した。周りに管理職など高い役職の人がいるほど、同じ集団で働く一般従業員への影響は大きい等の一連の仮設をリレーショナル・デモグラフィ理論を踏まえて提起した。これらの仮説は大手商社を対象とした調査データの検証で概ね証明された。(2)では関係的と集団自己のアイデンティティ構築について理論的考察を行った。個人がどのように自分の概念とアイデンティティを捉えるかは、職場の行動に影響する要因の一つとされている。関係的と集団的自己のアイデンティティとは、即ち自分のアイデンティティの中に、積極的に職場の他者、または集団そのものを取り入れることであるため、関係的アイデンティティが高いほど、従業員同士の価値観の相互影響も強くなると考えられる。一方、集団的アイデンティティが高いほど、社会的アイデンティティを介して、組織からの影響を強く受けることも予想される。(3)では共有型リーダーシップに関する理論的研究として、社会的交換理論を踏まえた共有型リーダーシップの類型を検討した。当事者意識を高めることは集団の効果的なリーダーシップ構築のために重要であるが、体系的にはまだあまり検討されていないことから、社会的交換理論を踏まえて、集団達成型、相互関与型、密着支援型という三つの類型が共有型リーダーシップの構成を検討した。初年度の計画であるモデルの構築という目標に対して、三つの側面からのモデルを構築することができた。企業理念、自己のアイデンティティとリーダーシップの側面から、それぞれ理念的価値観の相互影響メカニズムを検討したが、これらの理論分析は、今後の実証研究を進めるための土台として重要なものとなる。予定していた関西を拠点とした大手製造業企業からの聞き取り調査では、企業理念の確立と変遷、及び戦略的活動の展開の関連性に関する検討を行った。また、モデルの構築以外にも、過去の調査データを活かした実証研究も実施している。社会的責任を果たす企業理念に対する積極的な態度は従業員個人の価値観の重要な構成部分であるが、本研究のキー概念である理念的価値観と密接な関連があることを確認した。さらに、価値観の相互影響メカニズムとして、管理職など役職の高い従業員から普通の従業員に対する影響の構造的要因の検討も進んでいる。以上の成果と実施状況より、研究の進捗は概ね計画通りである。今後の研究も当初の計画通りに進める予定である。まず、初年度に提起したモデルを精査して完成度を上げ、全体のフレームワークをより明確な形で修正する。具体的には従業員同士の価値観の相互影響について、従業員のカテゴリー化を行い、分類して関係をより明確にした上で価値観の相互影響を考える。さらに、相互影響の部分に関しては、双方向的にモデルを修正して、他者からの影響だけでなく、どのように他者に影響を与えるのかという視点も加えてモデルを見直す。最後に、本研究の目的の一つである衝突がどのように成長に結びつくかという点に着目し、フレームワークを修正する予定である。初年度の研究では、価値観の相互作用メカニズムについて検討したものの、まだ衝突がどのように成長に結び付くかという重要な考察が十分でないため、この点をさらに掘り下げたい。いずれも初年度の三つの成果の延長上となるが、今後の実証研究の準備として、調査測定方法の確立を重点的に進める。先行研究を参考にすると同時に、聞き取り調査も行い、本研究のために必要な新たな測定項目を開発する。また、関東圏の企業を中心にパイロット調査と本調査を実施し、価値観の相互影響メカニズム、特に、衝突が起きる可能性が高い変化の激しい環境での内的、外的状況の変化と、そこで発生する衝突がどのように個人や組織の成長につながるかを検証する。

当事者意識を高めることは集団の効果的なリーダーシップ構築のために重要であるが、体系的にはまだあまり検討されていないことから、社会的交換理論を踏まえて、集団達成型、相互関与型、密着支援型という三つの類型が共有型リーダーシップの構成を検討した。初年度の計画であるモデルの構築という目標に対して、三つの側面からのモデルを構築することができた。企業理念、自己のアイデンティティとリーダーシップの側面から、それぞれ理念的価値観の相互影響メカニズムを検討したが、これらの理論分析は、今後の実証研究を進めるための土台として重要なものとなる。予定していた関西を拠点とした大手製造業企業からの聞き取り調査では、企業理念の確立と変遷、及び戦略的活動の展開の関連性に関する検討を行った。また、モデルの構築以外にも、過去の調査データを活かした実証研究も実施している。社会的責任を果たす企業理念に対する積極的な態度は従業員個人の価値観の重要な構成部分であるが、本研究のキー概念である理念的価値観と密接な関連があることを確認した。さらに、価値観の相互影響メカニズムとして、管理職など役職の高い従業員から普通の従業員に対する影響の構造的要因の検討も進んでいる。以上の成果と実施状況より、研究の進捗は概ね計画通りである。今後の研究も当初の計画通りに進める予定である。まず、初年度に提起したモデルを精査して完成度を上げ、全体のフレームワークをより明確な形で修正する。具体的には従業員同士の価値観の相互影響について、従業員のカテゴリー化を行い、分類して関係をより明確にした上で価値観の相互影響を考える。さらに、相互影響の部分に関しては、双方向的にモデルを修正して、他者からの影響だけでなく、どのように他者に影響を与えるのかという視点も加えてモデルを見直す。最後に、本研究の目的の一つである衝突がどのように成長に結びつくかという点に着目し、フレームワークを修正する予定である。初年度の研究では、価値観の相互作用メカニズムについて検討したものの、まだ衝突がどのように成長に結び付くかという重要な考察が十分でないため、この点をさらに掘り下げたい。いずれも初年度の三つの成果の延長上となるが、今後の実証研究の準備として、調査測定方法の確立を重点的に進める。先行研究を参考にすると同時に、聞き取り調査も行い、本研究のために必要な新たな測定項目を開発する。また、関東圏の企業を中心にパイロット調査と本調査を実施し、価値観の相互影響メカニズム、特に、衝突が起きる可能性が高い変化の激しい環境での内的、外的状況の変化と、そこで発生する衝突がどのように個人や組織の成長につながるかを検証する。
単一分子鎖の折り畳みによるナノ秩序構造の自己創出

本研究は、長鎖DNA分子のコイル-グロビュール転移の特性やグロビュール微細構造の安定性について実験と理論の両面から明らかにすること、更には高次構造制御の方法論の確立を目的として研究を行った。そして本共同研究において、陽イオン界面活性剤と複合体を形成した長鎖DNA分子を蛍光顕微鏡法を用いて単一鎖観察し、複合体は、アルコール濃度の増加に伴い、グロビュール(凝縮状態)からコイル(沖長状態)を経て再びグロビュールとなる、リエントラントな転移を示すことを発見した。中程度のアルコール濃度でDNAがコイル状態として存在することから、この環境はDNAにとって良溶媒であると示唆される。一方、アルコール濃度が低いとき、および高いときの双方において、グロビュール状DNAが現れることから、この環境は複合体に対して貧溶媒であると考えられる。しかしながら、高アルコール濃度において生成されたグロビュール状態のDNAは予想に反して可溶性であった。すなわち、DNA複合体にとって後者の環境というのは、可溶性から考えると良溶媒であり、高分子高次構造の点から見ると貧溶媒であると言える。この複合体の持つそのような独特な性質は、界面活性剤がグロビュール状DNA全体を被覆し、かつ凝縮状態のDNAの表面エネルギーを低くするという、ミセル形成の効果に起因すると考えられる。CTAB非存在下のアルコールによる高次構造変化と、異なるアルコール濃度における複合体のCDおよびUV分光法による観察に関する実験からも、この結論を支持する結果が得られている。又、これ以外の重要な成果としては、DNA折り畳み転移と、二重鎖融解転移間のcross talkがあげられる。これも、これまでに類を見ない新しい発見である。今年度は「単一高分子鎖の折り畳みによるナノ秩序構造の自己創出」の課題で国際共同研究を行い進展があったので、そのうちの主要な業績を報告する。本研究グループは、長鎖DNA分子のコイル-グロビュール転移の特性やグロビュール微細構造の安定性について実験と理論の両面から明らかにし、その高次構造制御の方法論の確立を目的として研究を行った。そして今回、陽イオン界面活性剤であるCTABと複合体を形成した長鎖DNA分子を蛍光顕微鏡法を用いて単一鎖観察し、DNA-CTAB複合体は、アルコール濃度の増加に伴い、グロビュール(凝縮状態)からコイル(伸長状態)を経て再びグロビュールとなる、リエントラントな転移を示すことを発見した。すなわち、DNA-CTAB複合体にとって後者の環境というのは、可溶性から考えると良溶媒であり、高分子高次構造の点から見ると貧溶媒であると言える。本国際学術研究は、長鎖DNA分子のコイル-グロービュール転移の特性やグロビュール微細構造の安定性について実験と理論の両面から明らかにすること、更には高次構造制御の方法論の確立を目的として研究を行った。昨年度の本共同研究において、陽イオン界面活性剤と複合体を形成した長鎖DNA分子を蛍光顕微鏡法を用いて単一鎖観察し、複合体は、アルコール濃度の増加に伴い、グロビュール(凝縮状態)からコイル(伸長状態)を経て再びグロビュールとなる、リエントラントな転移を示すことを発見した。

本年度も研究は順調に進展したが、その中でも重要な成果としてDNA折り畳み転移と、二重鎖融解転移間のcross talkを明らかにしたことがあげられる。2重ラセンDNAは、温度上昇に伴い、一本鎖に解離し、これは一般にヘリックスーコイル転移、あるいは融解転移と呼ばれてきた。全長100塩基対以下の程度のサイズのDNAの融解転移については過去、詳細な研究が行われており、塩基組成との関連も解明されてきている。しかしながら、細胞内に存在するDNAは全長がcmのオーダーであり、このような長鎖DNAの融解挙動については不明な点が多く残されている。今回、DNAが折り畳まれた状態では、融解転移が阻止されることを蛍光顕微鏡およびCDを用いた実験により、明らかにすることができた。さらに、DNAの脱凝縮転移とDNAの脱凝縮転移と、ヘリックスからコイルへの融解転移は協同的に生じることも見い出した。細胞が遺伝子発現するにあたって、2重ラセンの融解は必要不可欠なプロセスであることから、今回の発見は、生命科学の発展にも大きく貢献するものと期待できる。
慢性関節リウマチ特異的間質(ナース)細胞による骨関節破壊機序の分子生物学の解明

我々は,慢性関節リウマチ(RA)の骨髄に注目し、異常な骨髄球系細胞を認め、またこれらの細胞を抱きこみ、増殖維持させる間質(ナース)細胞を骨髄および滑膜より樹立した。本研究において、このRAの病巣形成に重要な役割を果たしていると考えられるナース細胞について検討をした。ナース細胞特異的遺伝子(NSR1,#4-14)をクローニングし、遺伝子構造を決定した。またナース細胞依存的に培養されるB細胞の産生している抗体の一つがelongation factor1 alphaを認識する自己抗体であることが判明した。RA由来関節液培養から前破骨細胞を得て、それらが組換えヒトIL-3,7,GM-CSF添加により破骨細胞様細胞へ分化誘導されること、末梢血CD14陽性単核球もナース細胞との共培養により前駆細胞に誘導されることなどを示した。この破骨細胞様細胞は象牙切片上での吸収窩を形成等、各種の破骨細胞の機能を示すと共に、MMP-1,2,3,9,14の他、CathepsinB,D,K等の遺伝子発現が確認され各種細胞外マトリックス分解酵素の産生により、骨軟骨破壊に関与していることが示唆された。また、ナース細胞単独もしくはB細胞や骨髄から得られた単核細胞(MNC)を用いたヒト軟骨上での培養系をSCIDマウス皮下に移植し、一ヶ月後に取り出した後組織切片を作成し、軟骨破壊について検討した。ナース細胞単独でも関節軟骨への浸潤は認められたが、B細胞やMNCとの共培養で浸潤は増強された。ナース細胞の対照として用いた皮膚線維芽細胞単独では浸潤は認められず、B細胞やMNCとの共培養でも浸潤は軽度であった。以上のようにナース細胞は直接および間接的に骨・軟骨破壊に関与することが証明され、RAの骨・関節破壊に重要な役割をはたしていることが示唆された。我々は、慢性関節リウマチの主病巣として骨髄に注目し異常な骨髄球系細胞を認め、またこれらの細胞を抱きこみ(pseudoemperipolesis)、増殖維持させる間質細胞(ナース)細胞を骨髄および髄膜より樹立した。ナース細胞は異常な免疫系細胞に働きかけ分化増殖させ、種々のサイトカインの産生を促進させるとともに、自らもサイトカインの他ヒアルロン酸やmatrix metalloproteinaseなどを産生し、直接関節破壊に関与していると考えられている。本年度はナース細胞の特性およびナース細胞が重要な役割を果たしていると考えられるRA組織破壊について更に検討を加えた。ナース細胞の特性の解析では、ナース細胞から新規2種類のスカベンジャーレセプター様遺伝子(NSRI,♯4-14)をクローニングし、その遺伝子構造を解明した。また、これまでにRA患者の病変局所のB細胞は抗原を認識していることが示唆されていたが、その抗原の一つがelongation factorl alphaであることが判明した。RAにおける組織破壊の解明では、RA由来関節液培養により前駆破骨細胞を得て、それらは組換えヒトIL-3,7,GM-CSF添加もしくはヒト末梢血PHA刺激培養上清のみで破骨細胞へ分化誘導されることを確認した。末梢血CD14陽性単核球もナース細胞との共培養により前駆破骨細胞に誘導された。また、ナース細胞はB細胞との共培養下において象牙切片に吸収窩を形成することが確認され、これらの細胞がRA組織破壊に重要な役割を果たしていると考えられる。病理組織学的検討では、RAでは滑膜および軟骨下骨の双方でカテプシンB、Lを発現するマイクロファージが存在し、一部はカテプシンK、MMP9も発現していた。

破骨細胞はカテプシンK,MMP9を強く発現していた。これらの発現はOAの組織では著名ではなかった。我々は、慢性関節リウマチ(RA)の骨髄に注目し、異常な骨髄球系細胞を認め、またこれらの細胞を抱きこみ、増殖維持させる間質(ナース)細胞を骨髄および滑膜より樹立した。前年度に、ナース細胞特異的遺伝子(NSR1,#4-14)をクローニングした。また、RA由来関節液培養から前破骨細胞を得て、それらが組換えヒトIL-3,7,GM-CSF添加により破骨細胞様細胞へ分化誘導されること、末梢血CD14陽性単核球もナース細胞との共培養により前駆細胞に誘導されることなどを示し、RA骨破壊におけるナース細胞の重要性を確認した。本年度は上記の方法で得られたRA関節液由来前駆細胞から分化誘導された破骨細胞様細胞の特性解析のため、各種蛋白分解酵素の遺伝子発現を解析した。現在までに破骨細胞様細胞からはMMP-1,2,3,9,14の他、CathepsinB,D,K等の遺伝子発現が確認され、RA関節中の破骨細胞様細胞は各種細胞外マトリックス分解酵素産生により軟骨破壊にも関与していることが示唆された。また、ナース細胞単独もしくはB細胞や骨髄から得られた単核細胞(MNC)を用いたヒト軟骨上での培養系をSCIDマウス皮下に移植し、一ヶ月後に取り出した後組織切片を作成し、軟骨破壊について検討した。ナース細胞単独でも関節軟骨への浸潤は認められたが、B細胞やMNCとの共培養で浸潤は増強された。ナース細胞の対照として用いた皮膚線維芽細胞単独では浸潤は認められず、B細胞やMNCとの共培養でも浸潤は軽度であった。以上のようにナース細胞は直接および間接的に軟骨破壊に関与することが証明され、RAの骨・関節破壊に重要な役割をはたしていることが示唆された。
気づかせ方の違いと気づきの強化の仕方の違いが気づきの保持に及ぼす影響の研究

「明示的な意味指導(教師が意味を提示):Answer」・「暗示的な意味推測(学習者が文脈から意味を推測):Context」・「両指導の組み合わせ(推測後に意味を提示):Context+ Answer」という気づかせ方の違いと、「気づきのみ」・「インプット処理(学習者が気づいた語を含む文章を和訳):Input」・「アウトプット処理(学習者が気づいた語を使って自由英作文):Output」という気づきの強化の仕方の違いが、未知語の意味の保持(解読)と未知語の保持(符号化)に及ぼす影響について、以下の仮説をもとに実験を行った。1.気づきの強化としての活動を与えた方が、そうした活動がない場合よりも、より多くの目標単語の保持につながる。2.文脈と意味の両方を与えた方が、どちらかのみの場合よりも、より多くの目標単語の保持につながる。(1)文脈を与えることと気づきの強化を与えることはそれぞれ、より多くの単語の保持につながる。(2)文脈をその単語の意味と組み合わせて与えることと文脈を強化のタイプの組み合わせて与えることが、文脈と強化のそれぞれの効果を最大限に引き出すことにつながる。(3)未知語の解読に比べて、未知語の符号化に対する文脈、意味の提示、強化の効果は極めて少ない。「直接的な意味指導(教師が意味を提示):Answer」・「文脈による意味推測(学習者が文脈から意味を推測):Context」という気づかせ方と、「気づきのみ」・「推測後の直接的な意味指導」・「インプット処理(学習者が気づいた語を含む文章を和訳):Input」という気づきの強化の仕方の関係が、未知語の意味の保持に及ぼす影響について、以下の仮説をもとに実験を行った。1.文脈とインプットの両方を与えた方が、どちらかのみを与えるよりも、より多くの目標単語の保持につながる。2.インプットを与えた方が、文脈を与えるよりも、より多くの目標単語の保持につながる。3.文脈と意味の両方を与えた方が、どちらかのみを与えるよりも、より多くの目標単語の保持につながる。4.文脈を与えた方が、意味を与えるよりも、より多くの目標単語の保持につながる。5.気づき後にインプットを与えた方が、気づきのみよりも、より多くの目標単語の保持につながる。まず9種類の目標単語と6組の被験者グループを設定した。そして、プリテストを与え、その後グループ毎に異なる6種類の教育的介入(CAI: Contxt + Answer + Input, CA, C, CI, A, AI)を施した。そして、介入の直後と1週間後にテスト(リスト上の目標単語の意味を記入)を与えた。分析の結果、次の4点がわかった。(1)直接的な意味指導に比べて、文脈による意味推測による気づきの方が、より多くの単語の保持につながる。(2)気づきのみに比べて、インプット処理による気づきの強化の方が、より多くの単語の保持につながる。(3)推測のみに比べて、推測後の意味指導の方が、直後はより多くの単語の保持につながる。しかし、1週間後には、両者の差はなくなる。(4)文脈による意味推測、推測後の直接的な意味指導、そして、インプット処理という3つすべてを与える教育的介入(CAI)は、直後には一番多くの単語の保持につながる。しかし、1週間後には、直接的な意味指導のみ(A)以外の教育的介入との差はなくなる。
口腔癌の抗癌剤および放射線耐性に関与するエピゲノム異常の解明と個別化治療への応用

口腔扁平上皮癌(OSCC)における抗癌剤/放射線耐性は効果的な癌治療を妨げる重要な因子である。エピゲノムを用いた癌の診断や治療反応性の予測は様々な癌で研究されているが、OSCCの抗癌剤/放射線耐性に関してはほとんど報告がない。そこで、本研究ではOSCCの抗癌剤/放射線耐性に関連するエピゲノム異常を解明し、エピゲノムプロファイルに基づいた新たな診断法の開発を目指すことを目的とした。臨床検体を用いたDNAメチル化解析によりMGMT、TFAP2E、DAPK1のDNAメチル化は化学放射線療法の治療効果との相関が見られ、OSCCの抗癌剤感受性や放射線感受性を予測するマーカーとなり得る可能性が示唆された。今年度は抗癌剤耐性および放射線耐性口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞株におけるエピゲノムの異常の解析を行う予定としていたため、まずは抗癌剤耐性に関与するDNAメチル化異常の解析を行った。当所属分野では5FU-耐性OSCC細胞株(SAS/FR2、Ca9-22/FR2)を有しているため、同細胞株と親株を用いて、DNAメチル化アレイ解析を行った。その結果、抗癌剤耐性に関与してDNAメチル化状態が変化している遺伝子がいくつか認められた。続いてそれらの遺伝子の発現を過去に行っていた遺伝子発現アレイのデータと照らし合わせると、高メチル化遺伝子では発現が低下しているものがみられた。また、放射性耐性OSCC細胞株においても親株と共に遺伝子発現アレイ解析を施行した結果、5FU-耐性と共通して発現が低下している遺伝子が抽出された。今後は放射線耐性株についてもメチル化アレイ解析を実施し、発現低下がある遺伝子の発現機構に関してDNAメチル化状態との関連性について解析する予定である。続いて、エピジェネティクス治療薬によるエピゲノムの変化と抗癌剤感受性の検討を行った。DNA脱メチル化剤である5-aza-2'-deoxycytidine(5-aza-dC)、ヒストンメチル化酵素阻害剤であるDZnep、BRD4阻害であるJQ1を用いて解析を行った。それぞれの阻害剤でOSCC細胞株による細胞増殖の検討を行った結果、濃度依存的に細胞増殖が抑制された。5-aza-dCおよびJQ-1を用いて、5-FUに対する抗癌剤感受性試験を行った結果、5-FU耐性株において抗癌剤耐性が緩和される結果が得られた。JQ-1はヒストンのアセチル化リジンを認識し、そこに結合するBRD4を阻害するため、抗癌剤耐性に関与する遺伝子について、BRD4の結合の変化をChIPアッセイによって今後する予定である。今年度は前年度からの実験の継続としてOSCC細胞株での抗癌剤/放射線耐性に関連する遺伝子群の高次エピゲノムの解析を進め、さらにOSCCにおけるエピゲノム・プロファイルとその臨床的意義の解析を中心に研究を遂行した。まず、細胞株においては放射線耐性のOSCC細胞株を用いて、次世代シークエンサーを使用し、網羅的DNAメチル化解析(RRBS法)を行った。その結果、放射線耐性株においては、親株と比較し、多くの遺伝子にてDNAメチル化の変化が認められた。また、5-FU耐性のOSCC細胞株で得られていた結果と共通した遺伝子も含まれていた。ヒストン修飾の解析については、H3K27のアセチル化に着目し、OSCC細胞株を用いてゲノムワイドでのヒストン修飾状態をChIP-seq法にて解析した。また、耐性関連遺伝子や転移に関連する遺伝子についてChIPアッセイにおいてもH3K27アセチル化の変化を確認した。さらにエピゲノム治療薬においての解析では5-aza-2'-deoxycytidine(5-aza-dC)、JQ-1にて5-FUに対する抗癌剤感受性試験を行った結果、5-FU耐性株において抗癌剤耐性が緩和される結果が得られた。JO-1はH3K27アセチル化を認識し、その部位へのBRD4の結合を阻害するため、ChIPアッセイにおいてその結合を確認した。続いて、細胞株において得られていた耐性関連遺伝子について、治療前の生検組織を用いてDNAメチル化解析をMSP法を用いて行った。その結果、5-FU併用の術前化学放射線療法の治療効果とMGMT、TFAP2EのDNAメチル化状態に関連が認められた。これらの結果はエピゲノムプロファイルに基づいた癌の個性診断への応用が期待でき、個別化治療の実現に向けてさらなる解析を進めていきたいと考えている。今年度は抗癌剤耐性および放射線耐性口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞株におけるエピゲノムの異常の解析を行う予定としていたため、抗癌剤/放射線耐性に関与するDNAメチル化異常の解析および遺伝子発現解析を施行した。また、エピジェネティクス治療薬によるエピゲノムの変化と抗癌剤感受性の検討については、各種阻害剤を用いて実験を実施しており、おおむね研究計画に応じた実験の遂行ができたと思われる。

しかし、データ不十分な項目や抗癌剤/放射線耐性に関与するヒストン修飾状態の解析など現在遂行中の実験もあるため、今後さらに実験を重ね、口腔癌の抗癌剤および放射線耐性に関与するエピゲノム異常について解明したいと考えている。口腔外科今後はOSCCの抗癌剤/放射線耐性に関連する遺伝子群の高次エピゲノムの解析およびOSCCにおけるエピゲノム・プロファイルとその臨床的意義の解析を中心に解析を進めていく予定である。OSCC組織の解析としては当所属分野に保管している臨床検体の内、治療前の生検時のサンプルを用い、OSCC組織における耐性関連遺伝子群についてDNAメチル化解析、クロマチン構造の解析を遂行していく予定である。またより簡便で低侵襲な診断法の開発を目指して、唾液や血清よりDNAを抽出し、耐性関連遺伝子群のDNAメチル化状態を解析し、細胞株やOSCC組織の結果と比較検討を行っていきたいと考えている。これらの解析結果を基にOSCC組織におけるエピジェネティックな特徴ごとにエピゲノムプロファイリングを行い、臨床病理学的特徴と併せその臨床学的意義を解明する。臨床病理学的特徴としては、TNM分類、Stage分類、浸潤様式、再発・後発転移の有無、生存、術前治療の治療効果(抗癌剤、放射線感受性)等の項目について検討を行う。以上の検討により、本研究の目的である口腔癌の抗癌剤および放射線耐性に関与するエピゲノム異常を解明し、エピゲノムプロファイルに基づいた癌の個性診断の確立と個別化治療への実現を目指したいと考えている。DNA抽出、細胞培養等に使用する消耗品の納期が間に合わなかったため、次年度分へ繰り越した。DNA抽出、細胞培養に使用する消耗品を購入予定である。
第二言語習得者の音声知覚力（音韻修復能力）の発達

平成28年度の研究活動では、日本学術振興会に提出済みの年次計画の通り、「音声の全体を崩し、その崩れた音声を(知覚上で)修復して聞く能力を見る実験(文レベル)」を行った。具体的には、音声波形全体を、音声の開始地点から、一定の短い時間区間(例: 50 ms)ごとに切り分け、それぞれの区間を時間軸上で反転させて、再度連結させた「時間反転音声(locally time-reversed speech)」を用いて音声聴取実験を行った。実験用の刺激音作成にあたっては、文レベルの英語音声を使用した。その際、一つの音声文に対して、6種類の時間反転音声(10, 30, 50, 70, 90, 110 ms)を作成した。この「時間反転音声」上には、オリジナルの音声波形の情報は全く存在しないが(=物理的に元の音響信号の時間配列が存在しない音声)、そのような音声が、英語の母語話者・第二言語習得者にどのように聴取されるかを調査した。実験の結果、母語話者の方が、第二言語習得者よりも、時間反転音声を知覚上で修復できることがわかった。また、時間反転区間が比較的短ければ(例:10 ms)、音声の明瞭度が保たれるが、時間反転区間が長くなるにつれて(例:110 ms)、音声の明瞭度が低下することがわかった。音響的に崩れた音声を知覚上で補完するためには、トップダウンの言語的な情報と、ボトムアップの音響的な情報が組み合わされて統合されると考えられるが、トップダウンの情報処理においては、言語の習熟度が高ければ高いほど、崩れた音声を修復できると考えられる。一方で、言語の「習熟度が高い」とは何を指すのか、については、今後も検証していかなければならない。言語の習熟度の定義の仕方、測り方を考えると同時に、「(特定の指標に基づく)習熟度」と「音声知覚力」の関係について、より詳しく調べていくことは、今後の大事な課題である。28年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度の研究活動では、日本学術振興会に提出済みの研究計画に沿って、英語母語話者・第二言語習得者の音韻修復(崩れた音声を脳が修復して聞く能力)について研究を行った。具体的には、(1)音声の一部を崩し、その崩れた音声を修復して聞く能力を見る実験(音素レベル)と、(2)音声の全体を崩し、その崩れた音声を修復して聞く能力を見る実験(単語レベル)を行った。音声の一部を崩し、その崩れた音声を修復して聞く能力を見る実験(音素レベル)では、英単語内の一音素(/m/, /n/, /l/, /r/)を削除し、そこに雑音を挿入した。音声の全体を崩し、その崩れた音声を修復して聞く能力を見る実験(単語レベル)では、英単語の音声全体を一定の短い時間区間に切り分けて、その一つ一つを時間軸方向に反転させ、再度連結させた「時間反転音声」を作成した。実験の結果、母語話者も第二言語習得者も、崩れた音声を知覚上で修復して聞いていることがわかった。例えば、音声の一部を削除して雑音を挿入した場合は、削除された音声が、知覚上で修復され、はっきりと聴取された。また、「削除された鼻音(/m/, /n/)」は、「削除された流音(/l/, /r/)」よりも、はっきりと知覚された。更に、音声全体を一定の時間区間に切り分けて、その一つ一つを反転し、連結させた場合も、その一つ一つの時間反転区間が短いと、音声の明瞭度が保たれた。ただし、母語話者と第二言語習得者の音韻修復力には大きな差があり、言語習熟度が高いほど、崩れた音声が修復されやすいと考えられる。翻って、英語教育の観点から音韻修復を考えると、英語の語彙や表現を、「音声と共に」学ぶ重要性が示唆される。多様な英語の発音を公共放送で聞くなど、音韻修復の練習をする大切さも示唆される。現在までの研究は、当初の計画通り、おおむね順調に進展している。平成27年度は、日本学術振興会に提出済みの年次計画に沿って、日本人の英語学習者(第二言語習得者)を対象に、音素・単語レベルで音韻修復の実験を行った。音素レベルでの音韻修復実験では、単語内の一音素を削除して雑音を挿入し、削除された音素が知覚上で修復されて聞こえるかを調べた。単語レベルでの音韻修復実験では、単語全体を一定の時間区間に切り分け、その一つ一つを時間軸方向に反転させ、再度連結した「時間反転音声」を用意し、単語全体が知覚上で修復されて聞こえるかを調べた。実験結果から、英語音声の一部・全体が崩れた場合は、音響的なボトムアップ処理と言語的なトップダウン処理を組み合わせて、音声が修復されることがわかった。また、母語話者と第二言語習得者は、音響的なボトムアップ処理においては、同じような知覚処理を見せるが、言語的なトップダウン処理においては、異なった知覚処理を見せることがわかってきた。即ち、音響的なボトムアップ処理には、言語習熟度は介在しないが、言語的なトップダウン処理には、言語習熟度が大きく関与すると考えられる。

平成27年度の研究結果は、前年度(平成26年度)に行った英語母語話者の実験結果と対比させる形で論文に纏め、国際ジャーナル誌に投稿し、更に、国際学会でも口頭発表とポスター発表を行った。平成28年度の研究活動では、日本学術振興会に提出済みの年次計画の通り、「音声の全体を崩し、その崩れた音声を(知覚上で)修復して聞く能力を見る実験(文レベル)」を行った。具体的には、音声波形全体を、音声の開始地点から、一定の短い時間区間(例: 50 ms)ごとに切り分け、それぞれの区間を時間軸上で反転させて、再度連結させた「時間反転音声(locally time-reversed speech)」を用いて音声聴取実験を行った。実験用の刺激音作成にあたっては、文レベルの英語音声を使用した。その際、一つの音声文に対して、6種類の時間反転音声(10, 30, 50, 70, 90, 110 ms)を作成した。この「時間反転音声」上には、オリジナルの音声波形の情報は全く存在しないが(=物理的に元の音響信号の時間配列が存在しない音声)、そのような音声が、英語の母語話者・第二言語習得者にどのように聴取されるかを調査した。実験の結果、母語話者の方が、第二言語習得者よりも、時間反転音声を知覚上で修復できることがわかった。また、時間反転区間が比較的短ければ(例:10 ms)、音声の明瞭度が保たれるが、時間反転区間が長くなるにつれて(例:110 ms)、音声の明瞭度が低下することがわかった。音響的に崩れた音声を知覚上で補完するためには、トップダウンの言語的な情報と、ボトムアップの音響的な情報が組み合わされて統合されると考えられるが、トップダウンの情報処理においては、言語の習熟度が高ければ高いほど、崩れた音声を修復できると考えられる。一方で、言語の「習熟度が高い」とは何を指すのか、については、今後も検証していかなければならない。言語の習熟度の定義の仕方、測り方を考えると同時に、「(特定の指標に基づく)習熟度」と「音声知覚力」の関係について、より詳しく調べていくことは、今後の大事な課題である。今後の研究の推進方策としては、日本学術振興会に提出済みの年次計画の通り、「音声の全体を崩し、その崩れた音声を修復して聞く能力を見る実験(文レベル)」を行う予定である。同時に、博士課程の1年目、2年目の実験結果と対比させながら分析を行い、博士論文の執筆や、研究結果の公表を行う予定である。平成28年度に計画している「音声の全体を崩し、その崩れた音声を修復して聞く能力を見る実験(文レベル)」では、英語音声全体(英文)を一定の短い時間区間に切り分けて、その一つ一つを時間軸方向に反転させ、再度連結させた「時間反転音声」を作成する。時間反転音声(物理的には元の音響信号の時間配列が存在しない音声)が、どのように知覚上で修復され、聞こえるのかについて更に詳しく調べていく。特に、音素・単語・文コンテクストなどの情報が、どのように音韻修復に関わっているのかを検討したい。更に、英語母語話者と第二言語習得者の音韻修復における共通点と相違点も明らかにしていきたい。そして、その結果は、博士論文やジャーナル論文として纏めると共に、国際学会でも発表していきたい。28年度が最終年度であるため、記入しない。
front-to-front型に配置された２つの金属ヒドリド種によるCO2の還元

本研究では,フェロセンが2重に架橋したジホスフィンキレートをbuilding blockとして大環状型やC字型の配位子を合成し、これらを鋳型としてfront-to-front型の反応場をもつ2核金属錯体の合成を行ってきた。このジホスフィンキレートの機能を明らかにする過程で、キレートに結合したシリル基(R=CH2SiMe3)のSi-C(sp3)結合が活性化される反応を見出した。リン上にCH2SiMe3基を有する配位子と1当量のPt(PPh3)3より、反応活性な3配位の16電子錯体が生成する。この錯体をTHF中で還流すると脱SiMe3反応が進行しリン上がMe基となった配位子へ変換された。さらに興味深いことに脱離したSiMe3はMe3SiOHを経てポリシロキサンとなることが明らかとなった。このシラノールからポリシロキサンができる反応は上記の配位子が配位した白金錯体が触媒となっていると考えられ、鎖状ポリシロキサンMe3SiO(SIMe2O)nSiMe3(n=0,1,2,・・)だけでなく、環状ポリシロキサン(SiMe2O)n(n=3,4,5,・・・)も生成した。従って、出発配位子のCH2SiMe3基の4つのSi-C(sp3)結合のうち2つが切断されるという前例のない反応を見出した。また、本課題に関連するCO2の還元では、BH3を用いた反応においてNaBH4を加えると高収率で(CH3OBO)3が得られることを昨年度報告したが、本年度はこの反応機構の解明を目指した結果、NaBH4の代わりにHCOONaを用いてもほぼ同収率で(CH3BO)3が得られることが明らかとなり、ホウ酸のギ酸エステルを介してCO2がCH3Oへ還元される機構を報告した。26年度が最終年度であるため、記入しない。CO2の還元反応は、現在盛んに研究されているが、そのほとんどはギ酸までにとどまっており、ギ酸をさらに還元しメタノールに変換できる系は限られている。通常還元には、金属ヒドリド種が用いられる。本プロジェクトでは、複数の金属ヒドリド種が1つのCO2分子と相互作用できる反応場を構築することによって、CO2をメタノールあるいはその等価体へ誘導することを目指した。目的の反応場を実現するためには、複数の金属活性中心を集積できる配位子が必要である。1.C字型4座リン配位子による多核反応場構築大環状4座リン配位子に比べて配位子骨格の立体的自由度を高めることを目的として、C字型の4座配位子を新たに合成した。フェロセンで2重に架橋した2座リン配位子に対して、rigidなジベンゾフランを骨格としたモノホスフィンアームを結合させ4座配位子を得た。この配位子の錯体形成能を調べるため、Ag(I)をプローブとして錯体合成を行ったところ、大環状配位子の場合と同様に内部空間に複数の金属を取り込んだ錯体を生成することが、X線解析により明らかとなった。新たに合成したC字型の4座配位子は、高い立体的自由度をもち、金属間の距離を反応基質に併せてフィットせることが可能と期待される。2.BH3.THFを用いたCO2の高効率還元金属錯体触媒を用いてBH3.THFを還元剤としてCO2をメトキシ化合物へ誘導する反応を開発する過程で、金属触媒の代わりに0.5mol%程度のNaBH4を用いても高収率でCO2とBH3.THFを(CH3OBO)3へ誘導できることを見出した。

また、本課題に関連するCO2の還元では、BH3を用いた反応においてNaBH4を加えると高収率で(CH3OBO)3が得られることを昨年度報告したが、本年度はこの反応機構の解明を目指した結果、NaBH4の代わりにHCOONaを用いてもほぼ同収率で(CH3BO)3が得られることが明らかとなり、ホウ酸のギ酸エステルを介してCO2がCH3Oへ還元される機構を報告した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本プロジェクトでは、複数の金属ヒドリド種が1つのCO2分子と相互作用できる反応場を構築することによって、CO2をメタノールあるいはその等価体へ誘導することを目指した。通常の還元では、ギ酸で還元が留まってしまうが、研究の結果、NaBH4を添加することによってメトキシ化合物であるトリメトキシボロキシン(CH3OBO)3へ誘導できることを見出した。1.C字型4座リン配位子による多核反応場構築新たに合成したC字型の4座配位子は、高い立体的自由度をもち、金属間の距離を反応基質に併せてフィットせることが可能と期待されるので、これを用いたCO2の触媒的還元反応を行う。2.BH3.THFを用いたCO2の高効率還元BH3.THFを還元剤としてCO2をを(CH3OBO)3へ誘導できることを見出した。この反応では、CO2と当量のBH3が必要であるので、生じるホウ酸エステルから、メタノールを分離するとともに、ホウ酸誘導体からBH3を再生させる方法を検討する
前立腺癌におけるStreptococcus anginosusの関与

St.anginosusが食道癌に特異的に感染することより、前立腺癌においてStreptococcus属をふくめてあらゆる細菌の感染の関与をPCR法にて調べた。もっとも前立腺炎の起因菌となる大腸菌は前立腺癌組織(Pca)9例、前立腺肥大症(BPH)9例、正常前立腺組織(N)3例いずれからも検出されなかった。ついでStreptococcus属を含め、あらゆる細菌を増やすPrimerを設定し、PCRを行い、それらPCR産物をシークエンス解析し、菌腫の同定を行った。Pca5例、BPH2例がPCR法で陽性であった。Pca5例はすべて低分化前立腺癌症例であった。それらのシークエンス解析の結果は全ての症例にStreptococcus属の2種類以上のStreptococcus属の混合感染あり、St.bovisはPcaのみから検出されることが判明した。St.anginosusは全例に認めた。St.bovisは大腸癌との関係の報告があり、興味深い菌腫である。ついで培養前立腺癌細胞であるPC3にStreptococcusが感染できるか実験した。Streptococcsは培養細胞中に入れると時間依存的に細胞内に取り込まれることが判明した。その後、前立腺癌細胞内で持続的に存在し続けた。次いで、大腸菌を感染させたが持続的に細胞に感染する事はなかった。これらのことはStreptococcusが前立腺癌の発生、癌の進展などに関与してる可能性をしめしているものと考えられる。今後は感染の成立した細胞における、遺伝子発現の変化などを研究していく予定である。Streptococcus anginosus(S.anginosus)が食道、胃がんにおいて高頻度に検出することが報告された。Streptococcusは前立腺炎の起因菌であり、前立腺がんと前立腺炎はともに前立腺の辺縁領域を好発部位としている。そこで、前立腺がんと細菌感染の関係をPCR法を用いて検討した。対象は前立腺がん7例(低分化がん3例、中分化がん2例、高分化がん2例)、非がん9例(前立腺肥大8例、正常1例)である。それぞれの組織よりDNAを抽出。細菌に普遍的に存在する16S ribosomalgeneにS.anginosusに特異的なprimerとStreptococcus属を含めあらゆる菌を増幅するprimerの2種を設定し抽出したDNAを鋳型にPCR法による解析を行った。さらに後者のPCR産物をクローニングしシークエンス解析を行い一つの症例で10クローン以上の塩基配列を決定した。それら塩基配列をDNAデーターベースと比較した。その結果3例の前立腺がん症例と1例の前立腺肥大症例に両者による増幅を認めた。これらのがん症例はすべて低分化がんであった。がん症例ではS.salivarius(3/3症例、12/73クローン)、S.infantarius/bovis(2/3、14/73)、Enterococcus faecium(2/3、22/73)など、前立腺肥大症例ではS.salivarius、S.parasanguis、S.oralisなどが検出された。S.anginosusを含めStreptococcusは非がん部に比べがん部、特に低分化がんに高頻度に存在し、またがん部のみに存在する菌種もあり、前立腺がんとも何らかの関係を有する可能性が示唆された。
アミド・ブレンステッド酸共触媒系におけるアルデヒド及びケトンの変換反応の開発

光学活性なアミン触媒由来のエナミン中間体と求電子剤との反応は、アルデヒドまたはケトンを立体選択的に変換する上で強力な手法となっている。特にプロリンに代表されるように、アミン触媒とブレンステッド酸触媒が協同的に機能する反応系が盛んに研究されている。しかし、アミン触媒の高い塩基性のために同時に利用できる酸触媒の酸性度は限られており、そのことが求電子剤の適用範囲を限定していた。その一方で、アミドはアミンと比較して求核性が低いことから、対応する活性種であるエナミドの求核性も低く、触媒としての利用例もない。このような背景のもと、本研究ではアミドの温和な塩基性及び求核性に着目し、従来のアミン触媒が機能しないような強酸性条件においても、アルデヒド及びケトンを活性化できる触媒系を確立を目指している。昨年度に取り組んだ不斉触媒反応においては、反応条件化で生成物がラセミ化するという問題点があった。そこで本年度は求核剤としてα位が2置換のアルデヒド、触媒としてはベンズアミドなどの1級アミドを用いて反応条件を検討した。また昨年度と同様に求電子剤としては、ジフェニルメタノールから酸性条件下で生じるカルボカチオンを利用した。しかしながら、このアルデヒドとアミド触媒の組み合わせでは、対応するエナミドの形成が極めて遅く、アミドは触媒として機能しなかった。また、アミド以外にカルバメートやウレア、スルホンアミドなども検討したが、触媒としては機能しなかった。生成物のエノール化に伴う、ラセミ化を防ぐことを目的として、α位が2置換のアルデヒドを原料として用いたところ、立体障害が大きくなったためか、活性種であるエナミドの形成が極めて遅くなった。少量のエナミドでも円滑に反応を進行させるために、ジフェニルメタノールの芳香環上に電子供与基を導入して、系中で発生するカルボカチオンの安定性を向上させたが、この場合、エノールから直接反応が進行してしまうため、アミドは触媒としては機能しなかった。一級アミドを用いることで、アミド触媒側の立体障害を小さくして、エナミドの形成を加速させようとしたが、この試みも上手くいかなかった。これまでの結果から、強酸性条件下においてはアミドは触媒としては機能していないと考えられる。しかしながら、アルデヒドから生じたエノールが直接カルボカチオンと反応するという知見が得られている。そこで、当初の研究計画からは外れるが、光学活性な酸触媒のみを用いて、求核剤であるアルデヒドの活性化と、ジアリールメチルアルコールからのカルボカチオンの生成、及び付加反応における立体化学の制御に取り組む。本年度は、種々のアミド及びその類縁体の触媒としての活性を評価し、更に不斉触媒化を試みた。まず初めに、ブレンステッド酸触媒存在下、ジフェニルメタノール由来のカルボカチオンをアルキル化剤とするヒドロシンナムアルデヒドのα位アルキル化反応をモデル反応として、アミド、カルバメート等窒素上に電子吸引基を有する種々のアミン触媒を検討した。その結果、2-ピロリジノンを触媒として用いたときに、目的生成物が中程度の収率で得られた。次に、種々の光学活性な環状2級アミド触媒を用いて本反応の不斉化を試みた。しかしながら、生成物を高いエナンチオ選択性で得ることはできなかった本年度は、種々のアミド及びその類縁体の触媒としての活性を評価し、更に不斉触媒化を試みた。しかしながら、生成物を高いエナンチオ選択性で得ることはできなかった。

このような背景のもと、本研究ではアミドの温和な塩基性及び求核性に着目し、従来のアミン触媒が機能しないような強酸性条件においても、アルデヒド及びケトンを活性化できる触媒系を確立を目指している。昨年度に取り組んだ不斉触媒反応においては、反応条件化で生成物がラセミ化するという問題点があった。そこで本年度は求核剤としてα位が2置換のアルデヒド、触媒としてはベンズアミドなどの1級アミドを用いて反応条件を検討した。また昨年度と同様に求電子剤としては、ジフェニルメタノールから酸性条件下で生じるカルボカチオンを利用した。しかしながら、このアルデヒドとアミド触媒の組み合わせでは、対応するエナミドの形成が極めて遅く、アミドは触媒として機能しなかった。また、アミド以外にカルバメートやウレア、スルホンアミドなども検討したが、触媒としては機能しなかった。生成物のエノール化に伴う、ラセミ化を防ぐことを目的として、α位が2置換のアルデヒドを原料として用いたところ、立体障害が大きくなったためか、活性種であるエナミドの形成が極めて遅くなった。少量のエナミドでも円滑に反応を進行させるために、ジフェニルメタノールの芳香環上に電子供与基を導入して、系中で発生するカルボカチオンの安定性を向上させたが、この場合、エノールから直接反応が進行してしまうため、アミドは触媒としては機能しなかった。一級アミドを用いることで、アミド触媒側の立体障害を小さくして、エナミドの形成を加速させようとしたが、この試みも上手くいかなかった。現時点で高エナンチオ選択的な反応を実現できていないのは、強酸性条件下における、生成物のラセミ化が原因であると考えられる。そこで、次年度はキラルなブレンステッド酸触媒とキラルなアミド触媒を組み合わせることで、高エナンチオ選択的な反応の実現に取り組む。また、現在の反応系では生成物のアルデヒドはα水素を有している。従って、酸性条件下でエノールへの異性化を経てラセミ化が進行してしまうと考えられる。基質としてα位が3置換炭素となっているアルデヒドを用いる場合、生成物のα位は4置換炭素となるため上述のようなラセミ化は進行しないと考えられる。従って、今後そのような基質をこれまでに構築してきた反応系に適用する。これまでの結果から、強酸性条件下においてはアミドは触媒としては機能していないと考えられる。しかしながら、アルデヒドから生じたエノールが直接カルボカチオンと反応するという知見が得られている。そこで、当初の研究計画からは外れるが、光学活性な酸触媒のみを用いて、求核剤であるアルデヒドの活性化と、ジアリールメチルアルコールからのカルボカチオンの生成、及び付加反応における立体化学の制御に取り組む。