hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プラナリア生殖様式転換は共生細菌がコントロールしているのか？

プラナリアの無性個体が有性個体へと転換する(有性化)過程では雌雄同体性の生殖器官が秩序だって発達する。これまでに有性化の初期段階である卵巣の発達を誘導する物質としてトリプトファン(Trp)が同定されている。また、Trpは無性個体に比べて有性個体に多く含まれることも明らかになっている。我々は、必須アミノ酸であるトリプトファンの体内濃度が有性化に伴い増加する原因として共生細菌の関与を予想した。本研究では、抗生物質処理の実験から、有性化初期の卵巣形成に細菌が必要であることが示唆された。さらに、細菌種の解析から、特定の細菌種の割合が有性化に伴って増加することが示唆された。無性プラナリアに有性プラナリアを餌として与えることで有性化を誘導できる。本研究ではプラナリアの有性化と共生細菌との関係を調べることを目的としている。有性化と細菌との関係を調べるために、有性化過程において抗生物質処理する実験を行った。抗生物質としては幅広い細菌に対するオキシテトラサイクリンを用いた。有性種イズミオオウズムシとオキシテトラサイクリンを混合した餌を無性プラナリアに与えて2週間経過した時点で外部形態を観察した所、実験群において卵巣の発達した個体の割合が有意に低かった。また、交接器官の発達した個体の割合については有意差が無かったが低い傾向が認められた。この結果は、抗生物質処理が、有性化初期における卵巣形成を阻害することを示唆している。次に有性化過程後期への影響を見るために、有性種の投餌無しでも有性化が進行するステージ3個体(全部で5ステージ)に対してオキシテトラサイクリン処理を行った。その結果、実験群では、過剰に卵巣対が形成される個体が多く見られた。以上のように、抗生物質処理が、有性化初期においては卵巣形成の阻害に、逆に有性化後期では卵巣形成の促進へと影響することが明らかになった。今後、抗生物質処理により細菌が減少しているのか確認する必要がある。次に、プラナリアの組織中での細菌の分布を調べるために、グラム染色を試みた。しかしながら、プラナリア組織中のバックグラウンドの染色が強く、細菌の存在を確認できなかった。また、交接器官の発達した個体の割合については有性差が無かったが低い傾向が認められた。次に有性化後期への影響を見るために、有性種の投餌無しでも有性化が進行するステージ3個体(全5ステージ中)に対してオキシテトラサイクリン処理を行った。以上の結果より、抗生物質処理が、有性化初期においては卵巣形成の阻害に、逆に有性化後期では卵巣形成の促進へと影響することが明らかになった。さらに、プラナリアのメタボローム解析を行い、無性個体に比べて有性個体に多く含まれている物質として抗菌物質のラウリン酸を同定した。無性個体にラウリン酸を給餌した所、卵巣が発達した。興味深いことに卵巣分化に対して、ラウリン酸はテトラサイクリンと逆の効果を示した。しかしながら、テトラサイクリンは有性化条件下での実験であり、無性個体に処理をしたラウリン酸の実験とは条件が異なる。今後は有性化条件下でラウリン酸を処理する実験を行い、真意を見極めたい。本研究においてはプラナリアの有性化と共生細菌との関係を調べることを目的としている。抗生物質としては幅広い細菌に効果があるオキシテトラサイクリンを用いた。抗生物質処理しながら有性化をかけて2週間後に外部形態を観察した所、実験群において卵巣の発達した個体の割合が有意に低下した。また、交接器官の発達した個体の割合も有意差は認められなかったものの実験群で低下した。これらの結果は、抗生物質処理が、有性化初期におこる卵巣形成を阻害することを示唆している。次に有性化後期への影響を調べるために、有性個体の投餌なしでも自律的に有性化が進行するステージ3(全5ステージ中)の個体に抗生物質処理を行った。以上の結果より、抗生物質処理が、有性化後期では卵巣形成の促進を促すことが示唆された。以上より、細菌の有性化への関与の可能性が考えられたため、プラナリア個体内の細菌を明らかにすることにした。無性および有性プラナリアからDNAを抽出し、原核生物のリボソームDNAを特異的に増幅させるプライマーを用いて、PCRを行った。

PCR産物を次世代シーケンサーによって配列解析し、無性および有性プラナリアに存在する細菌の種類を調べた。OTU解析の結果、スピロプラズマに配列類似性の高い菌種の割合が無性と比べて有性では顕著に増加することがわかった。スピロプラズマはハエの卵子に感染し、子孫の性比を制御することが知られている。菌種の同定のためにはさらなる解析が必要であるが、プラナリアにおいてもスピロプラズマが生殖細胞形成に影響を与えるのかは非常に興味深い。プラナリアの無性個体が有性個体へと転換する(有性化)過程では雌雄同体性の生殖器官が秩序だって発達する。これまでに有性化の初期段階である卵巣の発達を誘導する物質としてトリプトファン(Trp)が同定されている。また、Trpは無性個体に比べて有性個体に多く含まれることも明らかになっている。我々は、必須アミノ酸であるトリプトファンの体内濃度が有性化に伴い増加する原因として共生細菌の関与を予想した。本研究では、抗生物質処理の実験から、有性化初期の卵巣形成に細菌が必要であることが示唆された。さらに、細菌種の解析から、特定の細菌種の割合が有性化に伴って増加することが示唆された。2種の抗菌物質が有性化へ影響があることから細菌が有性化に関与することが示唆された。しかしながら、プラナリアがどのような細菌を保持しているのか、細菌の振る舞いがどのように有性化に影響するのかについては、未だに不明である。グラム染色による細菌の分布と、次世代シーケンサーを用いた細菌種の同定を進めていきたい。発生・生殖生物学プラナリア個体中の細菌群を明らかにするために、Takara社に委託して次世代シーケンサーを用いた16S rRNA領域DNAの網羅的な配列解析を行う。すでに細菌のリボソームDNAを増幅するプライマーはお手元に用意できたので、PCR反応の精製物をTakara社へ送付する作業を取りかかる。出て来た配列データを元に、BLASTサーチを行い、細菌群や種を特定する。グラム染色についても未だに成功していない。自作の試薬を用いた方法も検討する。抗生物質による有性化への影響が外部形態レベルで確認されたことは望ましい結果である。さらに組織レベルでの解析を進め、影響について詳細に調べたい。グラム染色に関しては今回BD社のキットを用いたが、上手く染色されなかった。今後、キットを用いた条件検討を行うと共に別の方法を検討する必要がある。初年度に行えなかったプラナリア個体中の細菌の探索については次年度から取りかかりたい。今年度に予定していた次世代シーケンサーによる細菌群の網羅的解析を次年度に行うことにしたため。抗生物質の有性化への影響を組織レベルで観察する。グラム染色法について、キットを用いた染色と共に、自作の試薬を用いて手法も検討する。プラナリア個体中の細菌群を明らかにするために、Takara社に委託して次世代シーケンサーを用いた16S rRNA領域DNAの網羅的な配列解析を行う。配列データを元に、BLASTサーチを行い、細菌群や種を特定する。次世代シーケンサーによる細菌群の網羅的解析を実施する。次年度に予定以上の物品費の使用が見込まれたため。学校の業務に使用するパソコンを学外へ持ち出すことが禁止されたため、学会発表に用いるノートパソコンの購入にあてる。
実社会に即した安定マッチング問題の定式化とその解法研究

安定マッチング問題とは、各男性が女性を、同様に各女性が男性を順序付けした希望リストを提出し、それに基づき「安定性」と呼ばれる性質を持つマッチングを求める問題である。本問題は、研修医の病院配属をはじめ、様々な配属問題に利用されている。本研究では、応用を視野に入れた本問題の様々なバリエーションを提案し、それらに対するアルゴリズムの開発や計算困難性・近似困難性の証明を行なった。安定マッチング問題は、選好に基づいて安定なマッチングを求める問題であり、研修医配属をはじめとする様々な場面で利用されてきている。本研究の目的は、利用が想定される様々な局面に合わせた定式化をし、それらの問題に対する効率の良いアルゴリズム開発や、計算困難性の検討を行うことである。当初計画で上げていた課題は、以下のとおりである。(1)同順位と不完全リストを許す安定結婚問題の近似度。(2)柔軟な定員枠を持つ病院/研修医配属問題。(3)複数人部屋安定ルームメイト問題。(4)希望リストの偽装による効果。(5)より良い安定マッチングの探索。安定マッチング問題を、実用上の配属問題に拡張し、それら拡張された問題に対する効率の良いアルゴリズムの構築や、問題の複雑さを検討するのが、本研究の目的である。平成20年度の研究では、主に以下の結果が得られた。安定ルームメイト問題は学生を2人ずつの組に分割する問題であるが、3人ずつに分割する問題の計算複雑性を示した。この結果は、AAAC2008にて発表した。研修医配属問題は、病院と研修医の間の安定マッチング問題であり、病院が指定した配属枠の上限を超えないだけの研修医を割り当てることができる。本研究では、病院に最低限必要な研修医数も指定できるように拡張した問題を提案した。この問題に対する多項式時間アルゴリズム、近似アルゴリズム、および計算複雑さの結果を得た。この結果は、MATCH-UP 2008で発表した。本研究の目的は、安定マッチング問題を応用に応じた様々な局面へ拡張して定式化し直し、効率のよいアルゴリズム開発や計算量解析を行うものである。交付申請書に記載の研究実施計画では、本年度は(1)同順位と不完全リストを許す問題、(2)病院/研修医問題への定員枠の採用を主に行う予定であった。(2)については、今年度は目立った進展がなかった。(1)の「同順位と不完全リストを許す問題」に関しては、これまでの最良の近似度が1.5であったのを、片側に同順位を許すことにより1.47に改良できるという見通しを示した。これまで使われた組み合わせ的なアルゴリズムでは限界があり、先行研究には1.5より改良はできないだろうという予想もあった。本研究では整数計画問題に定式化し、それを線形計画問題に緩和し、その最適解を組み合わせ的なアルゴリズムのヒントにするという新しい手法を用いた。改良の度合いはわずかながら、本成果は新しい手法を提案し、また、上記の予想の反例を示したことになり、本問題の今後の改良の可能性を示唆したことになり、大きな意義があると言える。また、同順位を許さない安定マッチング問題に対して、最大サイズでより安定なマッチングを求めるという最適化問題が、先行研究により提案されていた。希望リストの長さが2の場合は多項式時間で解け、3以上の場合はNP困難になる、また、長さが制限されていない場合は近似困難になるということが知られていた。従って、長さが定数の場合に近似可能か否かが未解決となっていた。本研究において、長さが3以上であれば近似困難という結果を示した。これにより、希望リストの長さをパラメータとした場合に対し、この問題に対して決着を付けたことになる。安定マッチング問題は,同数(n)の男女と各人の異性に対する希望リストが与えられたときに,安定なマッチングを求める問題である.マッチングMにおいて,ペアになっていない男性mと女性wに対し,「mはMでの相手よりもwを好み,wはMでの相手よりもmを好む」の両方が成り立つとき,(m,w)をMのブロッキングペアという.ブロッキングペアを持たないマッチングが安定マッチングである.希望リストに同順位を許し,かつリストが不完全で良い場合,最大サイズの安定マッチングを求める問題はNP困難であることが知られている.この問題に対しては,これまで近似度の上下限に対する数多くの研究がなされてきており,これまで最良の近似度は1.5であった.本研究では,片方の性のみに同順位が許された部分問題に対して,この近似度を25/17(〓1.47)に改良した.改良の度合は僅かであるが,この部分問題でさえ1.5の壁を破れるか否かは大きな未解決問題であったので,本結果はインパクトを与える貢献となった.改良にあたっては,以下のアイデアを用いた.既存の1.5-近似アルゴリズムは,プロポーズ型のアルゴリズムであり,あるルールに従って女性側がプロポーズしてきた男性の採否を決定する.

本研究では,問題を整数計画問題として定式化し,その線形緩和問題の最適解をプロポーズ型アルゴリズム上での女性の選択のヒントとして利用することにより,改息を達成した.安定マッチング問題では、男性集合と女性集合があり、各人が異性に対する希望リストを持っている。そのリストに基づいて「安定性」という性質を満たすマッチングを求める問題である。男性と女性を、病院と研修医、研究室と大学生などと考えると、世の中の様々なマッチング問題に利用できる問題である。本研究の目的は、そのような、実際に利用される場面に応じた定式化を行ない、それに対する効率の良いアルゴリズムを開発することである。本年度は以下の結果を得た。1.学生を研究プロジェクトに配属させる安定マッチング問題が、過去に提案されていた。この問題では、安定マッチングが複数ある場合、それぞれのサイズが異なる可能性がある。本問題では、最大マッチングの探索がNP困難であること、及び、微小な正定数εに対して1+ε倍の近似も難しいことが知られていた。また、2倍の近似アルゴリズムも既に知られていた。本研究では、1.5倍の近似アルゴリズムを与えるとともに、21/19倍近似が困難であることを示した。2.Gale-Shapleyアルゴリズムによって求められる安定マッチングは、男性側にとって極端に有利となる「男性最適性」と呼ばれる性質を満たす。これを利用し、例えば研修医配属においては、立場の弱い研修医側に有利な配属を求める方式が、通常採られている。しかし、入力によってはこの性質を生かせず、研修医最適安定マッチングであっても研修医側にかなり悪い結果となってしまうことがあり得る。このような場合でも、出来るだけ研修医に有利な結果をもたらすように希望リストを調整するという問題を考えた。その結果、最大の利益をもたらす調整方法を求めるのが0(n^{3})時間で、また、少しでも利益を得られる調整方法があるか否かを判定する問題が0(n^{2})時間で解けることを示した。ここでnは研修医の数である。3.研修医の病院医配属問題においては、各病院は受け入れ可能な研修医数の上限を指定する。しかし、通常は上限の和が全研修医数よりもかなり多いため、1人も配属されない病院が生じてしまう。これにより、医者や研修医の都市部への集中が起こり、郊外における医師不足の問題を引き起こしている。本研究では、この問題を解消するため、病院が受け入れ最低人数も指定できるモデルを提案した。また、この変更により安定なマッチングが存在しない可能性が出てくるという問題点を指摘した上で、これを解消するため「できるだけ安定な」マッチングを求める問題を提案し、それに対する近似アルゴリズムを与えた。
体幹ベルト付下肢装具歩行における立脚支持と遊脚制御機構の解明

(社)日本理学療法士協会が報告した脳卒中診療ガイドライン(2011年)では,装具療法についてエビデンスの高い研究が多数紹介されている.その中で,新しい装具である体幹ベルト付下肢装具(CVAid)は,高い治療効果(推奨グレードA,エビデンスレベル2)があると紹介されている.先行研究では,脳卒中片麻痺者を対象にCVAid装着歩行時のエネルギー消費量の計測を行っているが,装具の機能や特性については言及していない.このようにCVAidに関する先行研究が希少な中で,ガイドラインでは,エビデンスが高く紹介されているのが実情である.CVAidは,脳卒中片麻痺者の歩行速度を向上させるために開発された装具である.CVAidの特徴は,弾性の体幹ベルトとストラップで下肢を吊り上げており,ベルトの弾性を利用して,麻痺側下肢の振り出しを補助している.一般的に脳卒中片麻痺者が使用する短下肢装具(AFO)は,プラスチック製AFOが利用されている.プラスチック製AFOは,歩行時に亢進する麻痺側下肢の筋緊張(痙性)に対して,足関節が底背屈0度に固定されるため,立脚相の膝折れ防止には役立っているが,振り出し時に足趾が床面に接触してしまい転倒のリスクを伴ってしまう.しかし,CVAidは,立脚相における体重の支持機能だけでなく,弾性ベルトを利用した遊脚相の振り出しにも効果を発揮できる画期的な装具である.そこで,CVAidの立脚相と遊脚相の機能を力学的手法で明らかにすることができれば,今後,CVAidの原理を応用した様々な装具が開発され,脳卒中片麻痺者の歩行能力向上に寄与できると考えた.初年度は,健常成人を対象にして三次元動作解析装置(VICON Nexus:本学所有)と体幹2点歩行動揺計(今回申請)を使用して,CVAidを装着した歩行時における身体特性を力学的手法で明らかにすることができた.CVAidは,体幹ベルトとストラップの張力の大きさで,歩行時の遊脚相の振り出しの速度が変化する.つまり,体幹ベルトの張力の設定が,CVAidの機能発揮に重要なポイントになる.そのため,CVAid装着時に体幹ベルトの張力を各被験者で統一しなければならない.本研究を実施するために,はじめに体幹ベルトおよび下肢のストラップの弾性張力を計測するテンションメーター(今回申請)の製作に着手し完成した.次年度は,脳卒中片麻痺者(10名)を対象にして三次元動作解析装置と体幹2点歩行動揺計を使用して,CVAidを装着した歩行時における身体特性を力学的手法で明らかにすることができた.特に脳卒中片麻痺者では,麻痺の程度により歩行能力が異なるため,体幹ベルトの張力設定を変化させながら,最適な張力値の模索を行った.体幹2点歩行動揺計は,体幹部とCVAid装着側下肢に装着し,遊脚相の下肢の振り出しの加速度を計測する.これにより,力学的側面からCVAidの遊脚相の下肢の振り出しの制御機能について明らかにすることができた.今年度は,筋電図装置(本学所有)を使用して,CVAidを装着した歩行時における下肢筋の筋活動を筋電図学的手法で明らかにする予定である.これまでに我々は,歩行中の下肢の筋電図解析を行ってきた(若手研究B:2005-2007年:課題番号17700462)(相馬:日本義肢装具学会誌:2006).健常者の歩行の遊脚相では,下肢を振り子のように振り出すため,下肢の筋活動はみられない.しかし,脳卒中片麻痺者は,麻痺の重症度により麻痺側下肢の筋緊張が変化する.特に筋緊張が亢進している場合は,大腿四頭筋,下腿三頭筋などの抗重力筋の筋活動が増加し,振り出しが困難となる.そこでCVAidを装着することで振り出しが補助されるため,大腿四頭筋,下腿三頭筋などの筋活動が軽減されると考えられる.この下肢筋の筋活動の変化について筋電図装置(本学所有)を用いて計測する予定である.この結果からCVAidの装着が,下肢筋の筋活動の減少(抑制)につながり,脳卒中片麻痺者の歩行能力を向上させると考えられる.(社)日本理学療法士協会が報告した脳卒中診療ガイドライン(2011年)では,装具療法についてエビデンスの高い研究が多数紹介されている.その中で,新しい装具である体幹ベルト付下肢装具(CVAid)は,高い治療効果(推奨グレードA,エビデンスレベル2)があると紹介されている.先行研究では,脳卒中患者を対象にCVAid装着歩行時のエネルギー消費量の計測を行っているが,装具の機能や特性については言及していない.このようにCVAidに関する先行研究が希少な中で,ガイドラインでは,エビデンスが高く紹介されているのが実情である.CVAidは,脳卒中患者の歩行速度を向上させるために開発された装具である.CVAidの特徴は,弾性の体幹ベルトとストラップで下肢を吊り上げており,ベルトの弾性を利用して,麻痺側下肢の振り出しを補助している.一般的に脳卒中患者が使用する短下肢装具(AFO)は,プラスチック製AFOが利用されている.

プラスチック製AFOは,歩行時に亢進する麻痺側下肢の筋緊張(痙性)に対して,足関節が底背屈0度に固定されるため,立脚相の膝折れ防止には役立っているが,振り出し時に足趾が床面に接触してしまい転倒のリスクを伴ってしまう.しかし,CVAidは,立脚相における体重の支持機能だけでなく,弾性ベルトを利用した遊脚相の振り出しにも効果を発揮できる画期的な装具である.そこで,CVAidの立脚相と遊脚相の機能を力学的手法で明らかにすることができれば,今後,CVAidの原理を応用した様々な装具が開発され,脳卒中患者の歩行能力向上に寄与できると考えた.初年度は,三次元動作解析装置(VICON Nexus:本学所有)と体幹2点歩行動揺計(今回申請)を使用して,CVAidを装着した歩行時における身体特性を力学的手法で明らかにすることができた.CVAidは,体幹ベルトとストラップの張力の大きさで,歩行時の遊脚相の振り出しの速度が変化する.つまり,体幹ベルトの張力の設定が,CVAidの機能発揮に重要なポイントになる.そのため,CVAid装着時に体幹ベルトの張力を各被験者で統一しなければならない.本研究を実施するために,はじめに体幹ベルトおよび下肢のストラップの弾性張力を計測するテンションメーター(今回申請)の製作に着手し完成した.その後,健常者を対象に三次元動作解析装置と加速度計を同期させて計測を行い,信頼性と妥当性の検討を行った.今後は脳卒中患者を対象に計測を行う計画をしている.特に脳卒中患者では,麻痺の程度により歩行能力が異なるため,体幹ベルトの張力設定を変化させながら,最適な張力値の探求を行う.体幹2点歩行動揺計は,体幹部とCVAid装着側下肢に装着し,遊脚相の下肢の振り出しの加速度を計測する.これにより,力学的側面からCVAidの遊脚相の下肢の振り出しの制御機能について明らかにすることができると考えている.(社)日本理学療法士協会が報告した脳卒中診療ガイドライン(2011年)では,装具療法についてエビデンスの高い研究が多数紹介されている.その中で,新しい装具である体幹ベルト付下肢装具(CVAid)は,高い治療効果(推奨グレードA,エビデンスレベル2)があると紹介されている.先行研究では,脳卒中片麻痺者を対象にCVAid装着歩行時のエネルギー消費量の計測を行っているが,装具の機能や特性については言及していない.このようにCVAidに関する先行研究が希少な中で,ガイドラインでは,エビデンスが高く紹介されているのが実情である.CVAidは,脳卒中片麻痺者の歩行速度を向上させるために開発された装具である.CVAidの特徴は,弾性の体幹ベルトとストラップで下肢を吊り上げており,ベルトの弾性を利用して,麻痺側下肢の振り出しを補助している.一般的に脳卒中片麻痺者が使用する短下肢装具(AFO)は,プラスチック製AFOが利用されている.プラスチック製AFOは,歩行時に亢進する麻痺側下肢の筋緊張(痙性)に対して,足関節が底背屈0度に固定されるため,立脚相の膝折れ防止には役立っているが,振り出し時に足趾が床面に接触してしまい転倒のリスクを伴ってしまう.しかし,CVAidは,立脚相における体重の支持機能だけでなく,弾性ベルトを利用した遊脚相の振り出しにも効果を発揮できる画期的な装具である.そこで,CVAidの立脚相と遊脚相の機能を力学的手法で明らかにすることができれば,今後,CVAidの原理を応用した様々な装具が開発され,脳卒中片麻痺者の歩行能力向上に寄与できると考えた.初年度は,健常成人を対象にして三次元動作解析装置(VICON Nexus:本学所有)と体幹2点歩行動揺計(今回申請)を使用して,CVAidを装着した歩行時における身体特性を力学的手法で明らかにすることができた.CVAidは,体幹ベルトとストラップの張力の大きさで,歩行時の遊脚相の振り出しの速度が変化する.つまり,体幹ベルトの張力の設定が,CVAidの機能発揮に重要なポイントになる.
新規スクリーニング法を用いた変形性膝関節症治療薬の開発

Col2-GFP-ATDC5システムによる2500種類の低分子化合物スクリーニングの結果、軟骨分化促進化合物としてTD-198946(TD)を同定した。OA治療候補薬として、TD-198946の効果を見る為に、マウスOAモデル(予防モデルもしくは治療モデル)の膝関節腔内に注射を行ったところ、膝関節軟骨組織の修復と破壊抑制に効果があることが示唆された。TDのターゲット分子を探索するためにDNAマイクロアレイと直接の標的分子を探索するためにLC-MSMS解析を行い、in vitroでの作用メカニズムの解析を行った。TD-198946はRunx1の発現を上昇させ、軟骨分化を促進させることがわかった。前年度に、2型コラーゲンの発現を上昇させ、基質合成を促進し、軟骨組織を再生誘導する機能を持った化合物に絞ったので、今年度は同定した化合物の関節軟骨再生誘導の分子メカニズムを詳細に解析した。同定した化合物はマウス関節軟骨細胞、ヒト関節軟骨細胞を再分化させ、2型コラーゲンmRNA発現を上げ、軟骨基質合成を積極的に行うことができることが示された。今年度は変形性膝関節症モデルマウスを用いた関節軟骨再生誘導化合物の治療効果の検討を行った。用いた変形性膝関節症モデルマウス(Osteoarthritis Cartilage 13:632,2005)は、8週齢雄のマウスの内側側副靱帯の切離と内側半月板の切除を施行するもので、ヒトと同様に脛骨内側中央部の関節軟骨荷重部に膝OAが経時的に発症・進展することが分かっている。OA誘発手術後8週でほぼすべての野生型マウスの膝にOAが発症していることを確認しているので、術直後と術後4Wより、野生型マウスの膝関節腔内に前年度に同定し、最適化した濃度の化合物を局所投与し、膝OAに対する治療効果、発症の進展の影響を組織学的解析で検討した。組織学的評価基準(Osteoarthritis Cartilage 14:13,2006)で評価した結果、化合物投与群では非投与群(生理食塩水投与)に比べて、OAの病態進行が抑えられていることが示された。また、COL10A1、MMP-13、VEGFなど肥大分化、石灰化マーカーの発現を免疫組織化学染色法により検出した結果、化合物投与群ではこれらのマーカーの発現が非投与群に比べて発現が弱く、軟骨組織破壊が抑制されていることが示された。(1)大規模低分子化合物のスクリーニング大量スクリーニングをより簡便にするべく新規軟骨分化モニタリングシステムであるCol2-GFPシステム(軟骨細胞特異的に発現する2型コラーゲンプロモーター断片(Col2)の下流にクラゲの発光蛋白(GFP)遺伝子を組み込んだ合成遺伝子で、この遺伝子が導入された細胞は軟骨細胞に分化するとGFPの蛍光を発する。本遺伝子が組み込まれた細胞(前軟骨細胞株ATDC5)をセンサーとして、軟骨細胞分化をGFP蛍光を指標にリアルタイムで簡便かつ非侵襲的にモニタリングすることができる。)を用いて、低分子化合物ライブラリーのスクリーニング(約5000種類)を行い、GFPの蛍光を指標に軟骨分化を強力に誘導する低分子化合物を数種類同定した。(2)同定した化合物の軟骨分化作用機序をin vitroで解析同定した数種類の軟骨分化誘導候補低分子化合物の最適濃度の検討のため、マウス、イヌ、ヒト関節軟骨細胞を用いて、in vitro解析を行った。具体的にはこれらの細胞に1)でヒットした化合物を種々の濃度で曝露し、培養1週間でmRNAを回収し、リアルタイムPCR法で軟骨分化マーカーである2型コラーゲンやアグリカン、肥大分化マーカーである10型コラーゲンを解析し、基質合成能をトルイジンブルー・アルシアンブルー染色で評価した。肥大化をおこさず(10型コラーゲンの発現を上昇させない)、2型コラーゲンの発現を上昇させ、基質合成を促進し、軟骨組織を再生誘導する機能を持った化合物に絞りこみ、関節軟骨再生誘導化合物とする。現在、そのための詳細な解析を行っている。変形性膝関節症モデルマウスを用いた関節軟骨再生誘導化合物の治療効果の検討を行った。確立したマウス膝OAモデルを用いた(Osteoarthritis Cartilage 13:632,2005)。このモデルは8週齢雄のマウスの内側側副靱帯の切離と内側半月板の切除を施行するもので、ヒトと同様に脛骨内側中央部の関節軟骨荷重部に膝OAが経時的に発症・進展することが分かっている。

OA誘発手術後8週でほぼすべての野生型マウスの膝にOAが発症していることを確認している(Osteoarthritis Cartilage 13:632,2005)ので、術後8週より、野生型マウスの膝関節腔内に前年度、in vitroで検討した軟骨分化誘導能を持つヒット化合物Xを5日おきに膝関節腔に10μl局所投与し、膝OAに対する治療効果、発症の進展の影響を組織学的解析で検討した。また、COL10A1、MMP-13、VEGFなど肥大分化、軟骨破壊マーカーの発現をISHにて確認したところ、これらの変性マーカーの発現を抑制することが示唆された。軟骨代謝学変形性関節症モデルマウスは既に確立されて、手術手技も安定しており、同定した化合物を投与する実験の準備ができていたため、迅速に進めることができた。さらに評価方法や組織学的解析のツールが揃っていたので、当初の計画より早めに結果を得ることができた。大量スクリーニングのためのツールを確立していたために、低分子化合物ライブラリーのスクリーニングを迅速に進められ、数種類の化合物を候補薬として、同定することができた。イヌ、ヒトの関節軟骨細胞株も連携研究先の協力のもと、入手できたため、in vitroの解析をすぐに開始することができた。臨床応用を目指した治療薬の開発のため、同定した化合物の直接的ターゲット分子の探索を行う。分子メカニズムを明らかにするため、トランスクリプトームおよびプロテオーム解析を行う。軟骨細胞に化合物を曝露し、Total RNAを回収後、cDNAマイクロアレイを行い、遺伝子発現プロファイルを取得する。同様に、化合物を曝露した細胞からタンパク質を抽出し、プロテインアレイ、二次元電気泳動および液体クロマトグラフ質量分析計(LC/MS)を用いて、タンパク質発現プロファイルを取得する。これらの解析によって得られる情報は軟骨分化のメカニズム、関節軟骨に必須の遺伝子、タンパクを知る鍵にもなることが予想される。臨床応用を目指した治療薬の開発のため、関節軟骨再生誘導候補化合物が、特に変性したヒト関節軟骨細胞を再分化させ、2型コラーゲンmRNA発現を上げ、軟骨基質合成を積極的に行うことができるか、正常軟骨細胞との比較検討を行う。その結果、より軟骨再分化誘導能が高い化合物の分子メカニズム解析を行う。メカニズムがある程度明らかになった段階で、確立したマウス膝OAモデルを用い、OA手術後8週より、野生型マウスの膝関節腔内に最適化した濃度の化合物を局所投与し、膝OAに対する治療効果、発症の進展の影響を組織学的解析で検討する。今年度までの解析であるマウス飼育や組織解析は既に自施設で行えるため、予定よりも実験物品費の支出が少なかった。これらの解析は通常の解析よりも費用がかかるため、前年度分の未使用金を用いていく予定である。H25年度はヒト軟骨細胞に関節軟骨再生誘導候補化合物を曝露し、Total RNAを回収後、cDNAマイクロアレイを行い、遺伝子発現プロファイルを取得する。
プロテアーゼの立体構造形成過程におけるプロテアーゼインヒビターの関与

ズブチリシンのプロペプチドは、成熟体領域の立体構造形成を促進する分子内シャペロン活性のみならず、C末端領域でズブチリシンに結合して阻害活性を示すことがわかっている。それ自身では立体構造を持たないものの、Ala47→Phe、Gly13→Ile、Val65→Ileの変異を逐次導入すると、立体構造を形成すると共にプロテアーゼインヒビターとしての活性が向上する。本研究ではプロズブチリシンにこれらのアミノ酸置換を導入し、これらの立体構造形成速度を測定し分子シャペロン活性の変化を調べた。その結果、これらの変異が導入されるにつれプロズブチリシンの立体構造形成が速くなり、分子内シャペロンとしての機能も向上していることが明らかとなった。一方、プロペプチドに相同性のある2種類のプロテアーゼインヒビターYIB2およびPOIA1は、野生型ではズブチリシンに対して一時阻害の現象を示すものの、プロペプチドに合わせるべくC末端6残基を置換すると、ズブチリシンに対する阻害活性および抵抗性が大きく上昇することが明らかとなり、プロペプチド同様C末端領域でプロテアーゼに結合することにより阻害活性を示すユニークなプロテアーゼインヒビターであることが明らかとなった。これらC末端6残基を置換したYIB2およびPOIA1をズブチリシン成熟体のN末端に融合し、変性状態からの巻き戻しが起こるか否か調べた。その結果、円二色性スペクトルから融合蛋白質は二次構造を形成することが明らかになると共に、ズブチリシンSer221→Cys変異体との融合蛋白質ではインヒビター領域と成熟体領域の間のペプチド結合の切断が起こることがわかり、活性部位を含めたズブチリシン成熟体領域の立体構造が形成していることが判明した。これらの結果は、プロペプチド同様C末端領域でズブチリシンに結合するインヒビターであるYIB2およびPOIA1は、分子シャペロンとしても機能し得ることが明らかとなった。ズブチリシンのプロペプチドは、成熟体部分の立体構造形成に必要な分子内シャペロンとして機能する他、プロテアーゼインヒビター活性も持ち合わせていることがわかっている。構造的にはそれ単独では立体構造を持たないものの、ズブチリシンと複合体形成すると立体構造を形成するという点でユニークである。本研究では、申請者のこれまでの研究から、プロペプチド単独でも立体構造を形成させることが可能なAla47→Phe+Gly13→Ile+Val65→Ileの三重変異およびこの変異の基となる一重および二重変異をプロズブチリシンに導入し、得られた各変異体の巻き戻り過程について調べた。塩酸グアニジンで変性後、溶液で希釈し、立体構造形成に伴うTrpの蛍光強度の上昇を速度論的に解析した。その結果Ala47→Phe、Gly13→Ileと変異を導入するに従い、巻き戻り速度が速くなり、野生型では20分以上かかっていた過程が、三重変異体では数分以内に終了することが明らかとなった。そして中間体の存在も示唆された。一方、プロペプチドに相同性を示す酵母プロテアーゼBインヒビターおよびヒラタケプロテアーゼAインヒビターについては、大腸菌の最適コドンに合わせて遺伝子を化学合成し、大腸菌を用いた発現系を構築した。野生型インヒビターについて、ズブチリシンに対する阻害作用を調べたところ、両インヒビター共に、ズブチリシンのインキュベーション時間の経過と共に阻害活性が低下していく一時阻害剤であることが明らかとなった。そこで、C末端領域がプロテアーゼとの結合部位であるプロペプチドに合わせるべくインヒビターのC末端6残基を置換したところ、ズブチリシンに対する阻害活性が飛躍的に上昇すると共に分解されにくくなることがわかり、プロペプチド同様、C末端領域が機能部位であると考えられた。

設備として購入した超音波ホモジナイザーは、大腸菌に発現させた各蛋白質の調製の際に、頻繁に用いている。ズブチリシンのプロペプチドは、成熟体部分の立体構造形成に必要な分子内シャペロンとして機能する他、C末端領域でズブチリシンに結合し阻害することがわかっている。プロペプチドに相同性のあるプロテアーゼインヒビターである酵母プロテアーゼBインヒビター2(YIB2)およびヒラタケプロテアーゼAインヒビター1(POIA1)のC末端6残基をプロペプチドに合わせるように置換すると、ズブチリシンに対する結合能および抵抗性が大きく上昇することから、プロペプチド同様C末端領域でズブチリシンに結合する阻害様式を示すものと考えられた。そこでYIB2のC末端残基AsnのみをTyrに置換した変異体、およびC末端6残基を置換した変異体からC末端のTyrを取り除いた変異体を作成したところ、これらの変異体はズブチリシンに対する阻害活性が低下し、さらに一時阻害の現象を示すように変化した。またYIB2のC末端のみを置換した変異体の方が阻害活性が強かった。これらのことから、ズブチリシンとの結合には特にC末端残基の寄与が大きいこと、プロテアーゼに対する結合能と抵抗性の間には高い相関関係があることが明らかとなった。一方、これらのインヒビターが分子シャペロンとして機能するか調べるために、活性残基Ser221をAlaあるいはCysに置換したズブチリシンのN末端に、C末端6残基を置換したYIB2あるいはPOIA1を融合した蛋白質を作成し、変性状態からの巻き戻しを行った。その結果、円二色性スペクトルからこれらの融合蛋白質は二次構造を形成することがわかり、またズブチリシンSer221→Cys変異体との融合蛋白質では、インヒビター領域と成熟体領域の間のペプチド結合の切断が起こり、活性部位を含めたズブチリシン成熟体領域の立体構造が形成していることが明らかとなった。すなわち、これらのインヒビターはズブチリシンに対する分子内シャペロンとして機能することがわかった。
デザイナーの構想力を生かしたビジネスデスバレー克服方法研究

ビジネスデスバレーにおけるデザイナーの構想力活用についての調査研究の結論として、従来の開発パターンにおける袋小路を、デザイン思考により多元化できることが明らかになった。そのパターンとして大きく3つの手法がある。この手法の発見は、デザイナーだけではなく今後の開発の武器になると思われる。本年度は先行研究のレビューを主に行った。調査に向かう前に以下の三点((1)そもそもデスバレーとはどのような現象なのか、(2)どうなればデスバレーを克服できたと判断していいのか、(3)どのようなマネジメントをすれば、それを克服できると考えられてきたのか)を明らかにしておく必要があるためである。レビューの概略は以下の事が言える。(1)デスバレーの種類は多様が大きく2つに分けられる。1つは、「技術はすでにあるものの、それをどう使えばいいのかが分からない」という問題を扱っているのに対し、2つは「そもそも、どんな技術を開発すべきかが分からない」という問題を取り扱っている点で、違いがある。また、先行研究からは、業界によっても、デスバレーの捉え方が異なっていることが窺えた。(2)「既存研究では、どうなればデスバレーを克服できたと判断してきたのか」については、判断基準には定性的な指標(ex.インタビューイの主観による判断)と、定量的な指標(ex.営業利益/研究開発)があるということである。なお、いずれの判断指標を採用するのかで、分析単位も異なることが窺えた。(3)「先行研究では、どのようなマネジメントをすれば、それを克服できると考えられてきたのか」について、先行研究で共通しているのは、デスバレーを越えるには「ビジョン」が重要になるということが明らかになってきた。現在は、レビューを通じてデスバレーの種類の整理を行い、その地図(マップ)を作成すると同時に、デザイナーが絡んだデスバレーの超克事例(そう窺えるもの)を収集し、その地図上にプロットしている段階にある。現時点で集まった事例は、ソニー放送局用ENGカメラの開発事例、東芝の電球型蛍光灯の開発事例、シャープのビューカムの開発事例などである。このような作業は様々な種類のデスバレーのうち、どの領域にデザイナーが絡んだ成功事例が多くみられるのかを明らかにすること(つまり、研究目的(3)の解明)を目的としている。2009年度以降行う作業としては、次の二つを中心に行いたい。一つは、「調査対象の絞り込み」であり、もう一つは、メカニズム解明のためのケースの深堀りである。以上の絞り込みをしていく予定である。既存のデスバレー研究では、「研究サイドにビジネス知識を持たせると同時に、事業部サイドにも高度な技術知識と市場翻訳能力を持たせることが、技術統合・移転の際に重要になる」旨を明らかにしてきたが、どうすればそれらの知識や能力を身につけることが出来るのかまでは明らかにしてこなかった。そこで、本研究では、既存研究がこれまで注目してきた、開発プロジェクトのリーダーが掲げるビジョンやエンジニアが持つビジネス知識そのものではなく、それらのビジョンや知識に影響を与える要因やメカニズムについて注目し、研究・開発中の新しい技術やビジネスのアイデアについての相互理解を促進し、デスバレーを克服するための新たな方法(説明変数)として、デザイナーの活用方法について研究する。社内における研究と事業をデザイナーの構想力によって結びつけるための取組みに注目したい。同じ組織内の活動でありながら効果的な融合が難しい複数の要素を、デザイナーの構想力というフィルターを通すことで、実行力のある提案として活用していくためのマネジメントについて研究する。一般に、デスバレー(死の谷)とは、「研究開発プロセスの上流と下流の間において、その流れを断ち切るボトルネックあるいは断絶点」のことをいう(榊原,2005)。ただ、日本企業にフォーカスした場合、特に問題視されているデスバレーとは、「研究も開発も結構きちんとやっているのに、収益性の高い製品や事業が生まれない」(藤本,2003)ことである。つまり、言い換えれば、研究開発に基づいて構築された技術力が必ずしもその企業の経営成果に結びついていないことが問題視されているのである。例えば、東芝はiPodに似たプレーヤーやグーグルのような検索エンジンを米国勢が席巻する前に商品化したが、使い勝手の問題から主導権を握ることが出来なかった(日本経済新聞2007年9月30日)。このように日本企業の多くは、先端部品で先頭を走りながら、世界の消費者に受け入れられる最終製品が生み出せていない。そこで、本研究では、それを克服するための一つの手立てとして、デザイナーの構想力の活用に注目する。本年度は科研費用研究の最終年度であるので、インタビューの他、まとめの作業を行った。数社の成功事例研と失敗究等を整理してみると、ビジネスデスバレーが生じる企業や開発プロセスには特定の理由が存在することが徐々に判明してきた。それは、複雑な組織体制でのプロセスの中でバリューある仕事を結果として創出するには、そのプロセスの在り方がキーになってくる。ビジネスの通常プロセスにおいて、効率的な方法は以下の様である。イシューを見極め、仮説を立てる。そのイシューには良いイシューとよくないイシューが存在する。良いイシューは本質的、深い仮説がある。このイシュー特定のためには変数を削り、視覚化、最終形からたどる。

so whatを繰り返しながら実際の分析を資料を集めながら進める、本質的でシンプルな最終形を創造し、視覚化した論理的でシンプルなストーリーを磨いていく必要がある。このようなプロセスが多くの成功事例を導き出している要因と言える。この複雑な成功プロセスの中で視覚化、変数の削除、シンプルな最終形、そして、視覚化した論理的でシンプルなストーリーの部分で、デザイナーの視覚化能力、調整能力、概念化能力、媒体的な役割、そして総合的なシステム能力が役に立つ。特にSONYのプロ用機器がよい事例である。また、これをスムーズに行うためには、組織内の位置付けとオフィスでのレイアウト等などの配慮が非常に大事であると言える。今回の研究によってデザイナーの能力分析と成功した事例の共通要因プロセスを明らかにすることができたことは今後のビジネスとビジネス学に大いに影響があると思われる。
児童虐待予防に向けた周産期からの家庭訪問プログラムの開発と有効性の検討

1.家庭訪問プログラムの作成パウエル(Powell,1993)が述べている家庭訪問プログラムの構成要素(プログラム提供対象家庭、プログラムの組み合わせ、家庭訪問の目的、家庭訪問の頻度、家庭訪問の評価方法等)を検討しプログラムを作成した。訪問計画は、医療機関から保健センターに連絡後1か月以内に1回、4か月健診までに1-2回、その後1歳半までに2-3回の訪問である。2.家庭訪問プログラムの実施平成17年度・18年度に医療機関で出産し、親の承諾を得て保健センターに連絡票が送られてきた事例に家庭訪問を実施した。ケース数は64事例(双子3組)であり、児の出生時の平均体重は2921.9g、第一子が40名(59.7%)であった。母親の年齢は19歳以下が14名(21.9%)、シングルが11名(17.2%)であった。医療機関からの連絡の時期は、妊娠中が38名(59.4%)、出産後が26名(40.6%)であった。紹介理由は、若年、経済的問題、育児不安・うつ傾向などであった。紹介時期別では、妊娠中は若年や経済的問題が多く、出産後は育児不安・うつ傾向が多かった。保健師は妊娠中に連絡があった38名中21名(55.3%)に家庭訪問を実施していた。出産後は50名(78.1%)に平均2.1回の家庭訪問を行っていた。3.実施したプログラムの評価医療機関と連携することにより保健センターからだけで支援が難しい若年の母親への支援は実施しやすくなっていた。しかし、経済的問題がある場合は、家庭訪問できない割合が高く、親の成育歴や家庭環境の複雑さが予測された。また、家庭訪問は地域の母子保健システムを活用し、親との関係づくりに焦点をあてたものであったため、作成したプログラムにそって進めていくことが難しかった。今後、地域で活用できかつ虐待予防に効果的な家庭訪問の方法について検討していく必要がある。1.文献検討および研究地域の選定地域における虐待予防を考えていく際に、地域の乳幼児健診以前に把握でき、対象者とかかわりをもてる時期として周産期への対応が注目されてきている。しかし我が国では、周産期そのものに焦点をあてた研究は多いが、その時期を児童虐待予防として捉え、医療医機関と地域の連携を目指した研究はほとんどない。海外文献では、脆弱な家族(vulnerable families)に対する家庭訪問の効果が研究されている(Kearney.M.H.;2000,Duggan.A.;2000,Nardi.D.A.;1999)。また、英国ではヘルスビジターが地域の母子に対して個別的な支援を行っている。そのなかではペアレンティングを中心とした支援がおこなわれている(Malone.Mary;2000)。これらの文献から新たなプログラムを開発するにあたってペアレンティングを中核に考えていくことが必要である。研究対象地区としては、今まで母子保健計画策定等に加わり、地域の状況や保健師の活動がより理解できているI市、H市、D市を選定しそれらの地域における周産期への活動の実情を把握しているところである。I市では医療機関と連携し、地域での母親への取り組みが行われつつある。そのなかでvulnerable familiesとして位置づけているのは若年で出産した親、精神疾患をもつ親である。

H市、D市においてもそれらの対象への支援の状況把握を継続して行っていく予定である。2.ペアレンティング概念の明確化文献検討から導き出されたペアレンティングについて、明らかにしていくために、今年度は全国の保健所で実施されているペアレンティングプログラムについての実態調査を行った。対象としている親の問題としては、『明らかな虐待行為』10.7%5,『虐待の疑い・ハイリスク』48.8%、『強度の育児不安』40.5%、『その他の育児問題』17.9%と予防的観点から、虐待の疑いや強度の育児不安を対象にしていることが明らかになった。また、グループの目的としては、『親の成長』、『虐待予防』、『親自らの気づき』、『共感・支え合い』というのが多く、親自身に焦点をあてたプログラムが実施されている。内容では、『自由に話す』73.8%、『テーマを決めて話す』16.7%、『ワークを入れる』11.9%とプログラムを決めていないのが多かった。グループの評価は『している』60.5%、『していない』39.5%であったが、具体的な評価方法はまだ手探りの状態であることが示された。これらの研究実績を踏まえ、介入のためのペアレンティングプログラムの開発、研究実施地域の調整を行っていく予定である。本研究は、周産期に医療機関から連絡があった養育問題がハイリスクである対象者に対して、地域の母子保健活動を中心的に行っている市町村保健師が出産直後から母親への継続した支援を実施し、親子関係の良好な発展を図ることにより不適切な養育行動を予防し、児童虐待における世代間連鎖を絶ちきることをめざす。2年目の研究活動として、H市での虐待事例の検討会の立ち上げ、I市、D市における周産期の医療機関と地域の連携状況の把握、周産期の家庭訪問で実施できるペアレンティングプログラム開発に向けたペアレンティングプログラム実施機関での実態調査を行った。1.H市虐待事例検討会:平成16年8月から平成17年3月までに4回、6事例の検討を行った。いずれも保健師が継続的に支援を行っている虐待のケースである。子どもの年齢はいずれも幼児であり、母親に対人関係の問題があり、保健師は虐待を認識しつつ関わりにくさを感じていた。検討会の参加者は市保健センター保健師、保健所保健師、臨床心理士、大学教員(研究者)である。事例検討をとおして、支援のために必要な情報収集の方法(母親、子どもとも)や子どもへの具体的かかわり方の母親へ指導方法、母親への支援の進め方などが検討され、虐待への支援の共通認識の基盤ができつつある。今後も定期的な検討会を継続していく予定である。2.I市、D市における周産期の支援状況の把握:I市では、医療機関からハイリスクとして10代、精神疾患がある、育児不安が強い、シングル、未熟児等について連絡があり、保健センター保健師が訪問活動をおこなっている。現在の課題は医療機関から連絡を受ける際のハイリスクの基準、家庭訪問時にどのような情報収集、支援(ペアレンティングを促す)をおこなうのかを保健師間で統一していく必要があることなどが明らかにされた。3.ペアレンティングプログラムに関する実態調査:全国の7か所の保健所の実施状況とオーストラリアのトリプルP(前向き子育て)、アメリカ合衆国で開発されたアクティブペアレンティングについて聞き取り調査をおこなった。いずれも幼児期を対象にしたプログラムであり、周産期からのペアレンティングプログラムについてはさらに文献検討等を継続していく必要がある。
CRISPR/Cas9を用いた疾患モデルオルガノイドの樹立と変異解析手法の開発

CFTRが関わる上皮膜を介したイオン輸送機能全体を正確に測定可能なオルガノイドモデルを用いて、日本人型CFTR変異蛋白の機能を簡便に測定する疾患モデルの樹立を目的とした。マウスCftrゲノム152kbを全長組換えベクターに置き換えたヘテロノックインマウスES細胞から、キメラマウスを得た。キメラマウスを交配したが、ノックインマウスは得られなかった。マウス膵導管細胞のオルガノイドを樹立するために、実態顕微鏡でマウス膵導管細胞を単離し、オルガノイド培養条件で培養を行った。既報の消化管オルガノイドの培養条件によって、マウス膵導管細胞からもオルガノイドが樹立され、培養、継代が可能であった。1,遺伝子組換え用ベクターコンストラクトの構築:マウスcftr遺伝子は、全27エクソンがゲノム上に152kbpにわたって存在している。平成28年度は、片アレルのcftr全エクソンを欠損するcftrノックアウトマウスのヘテロ接合体を作成するため、cftrを除くためのベクターを図1の様に作成した。cftrはエクソン1に翻訳開始点が存在するため蛋白コード領域に蛍光蛋白Emeraldを挿入した。Emeraldの3'側にはES細胞セレクション用pGKneoカセットを挿入する。guide RNAをcftr遺伝子の5'、3'側の2箇所に設計した。2,マウスES細胞株への遺伝子組換えベクターの導入と組換えES細胞の選別:作成したノックアウト用ベクターは、マウスES細胞株にリポフェクション法で遺伝子導入し、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術でcftrノックアウト用ES細胞を作成した。3,マウス胚盤胞へのマイクロインジェクションとキメラマウスの作成:得られた組換えES細胞は、熊本大学生命資源研究支援センターに送付し、研究協力者である動物資源開発研究部門竹田直樹助教に組換えES細胞の胚盤胞へのinjectionを依頼した。キメラマウスが産まれ次第、慶應義塾大学に輸送する。平成28年度は、cftr全エクソン欠損ヘテロ接合体マウスを作成するための、準備期間であった。すでに遺伝子組み換えマウスES細胞は、共同研究先の熊本大学生物資源センターに送付済みであり、マウス胚盤胞にインジェクションが行われている。予定では、本年6月ごろにも遺伝子組み換えマウスが入手可能であり、順調に進捗している。近年体性幹細胞の培養方法として、オルガノイド培養技術が開発された。オルガノイドは、採取した臓器由来の上皮構造を残したまま培養可能であり、ミニ臓器とも考えられる。本研究では、オルガノイド培養技術と最新のCRISPR/Cas9ゲノム編集技術を併用することで、嚢胞線維症(CF)の疾患モデルオルガノイドを簡便且つ、多数同時に樹立する技術を開発し、ラージスケールで変異遺伝子の機能解析、薬剤スクリーニング等に使用可能な新しい膜タンパク機能解析手法の開発を目標とした。各組織由来オルガノイドにcftr遺伝子変異を導入するための準備として、ゲノム上に152kbpにわたって存在するcftr遺伝子全エクソン領域を除いたKOマウスのヘテロ接合体を、CRISPR/Cas9技術で作成する。このマウスでは、片アレルのcftr遺伝子が全エクソン領域で削除されているため、野生型(WT)cftrアレルを1つだけ持つ。平成28年度は、マウスの片アレルでcftrゲノム全長を欠くマウスを作出するための、ベクターコンストラクトの作成と、遺伝子組換えES細胞の作成を行った。その結果、4クローンの遺伝子組換えES細胞株を取得することができた。平成29年度には、これらのクローンを使って遺伝子組換えマウス個体の作出を行ったところ、複数のキメラマウスが作出された。これらのキメラマウスから、片アレルでcftrゲノム全長を欠くヘテロ接合体の作出を試みたが、合計20以上のキメラマウスから生殖細胞系列にゲノム欠失が入らなかった。現在、ES細胞のスクリーニングを再開しており、遺伝子組換えES細胞が得られ次第、マウスの個体作出を行う予定である。今年度は、研究分担者竹田よりマウスが送られてき次第、マウスの交配とコロニーを樹立し、得られるヘテロ接合体マウスの膵臓より腸管オルガノイドを作成する予定である。さらに、オルガノイドが作成されれば、当初の研究計画通りオルガノイドに変異を導入する技術を確立する。膵生理学研究分担者名古屋大学石黒の研究グループでは、ノックインマウスを作成したあと、腸管オルガノイドを作成する。そのため平成28年度分の研究資金は、平成29年度に使用する。今年度に作成されるノックインマウスのオルガノイド樹立および機能解析に使用する。