hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
医療処置を要する在宅療養者と支援者による災害備えチェックシートの開発

本調査は、日常のケアを担当している支援者(看護師、保健師もしくはケアマネジャー)が、我々の開発した「金沢高知式災害備えチェックシート」(K-DiPS Sheet)を用いて、53人の在宅療養者に聞き取り調査を行った。その結果、人工呼吸あるいは吸引を連続的に要する者の約半数は、避難が必要な時、避難することをあきらめるか、避難しない危険性が示された。また、停電に備えて非常用医療機器等を備えていることが、避難したいという認識に関連していた。今後は、停電により直ちに生命の危機に直面する在宅療養者らへの備えのシステムを整備する必要がある。チェックシートは、在宅療養者、家族介護者が訪問看護師やケアマネジャーなどの支援者と共同で備えを行うこととし、内容は、1属性、2ADL、3医療処置、4住環境、5物的備え、6災害に対する知識、7専門的ケア提供体制などである。平成26年度に作成した「災害備えチェックシート」を用いて、人工呼吸や吸引など生命時のために電源が必須な在宅療養者5名の協力を得て担当の専門職が災害の備えについて調査した。その後、5組の在宅療養者と家族介護者、担当の専門職、研究者で本シートの内容や必要な項目、使用方法の妥当性について協議した。さらにその結果から研究者間で再度協議し「金沢高知式災害備えチェックシート」を作成した。平成27年5月平成28年1月に、本シートを用いて、高知県高知市における電源が必須な在宅療養者と子どもの災害への備えの実態を調査した。調査結果から、金沢高知式災害備えチェックシートの修正版を作成した。本シートによる高知市での調査結果から得られた知見を、日本精神障害者リハビリテーション学会第23回高知大会の「天災は忘れられたる頃来る災害に備える地域づくり、システムづくり」のシンポジストとして参加し発表した。さらに、高知新聞より取材を受け平成28年4月10日に掲載され、中央法規出版、月刊ケアマネジャーに「電源が必要な在宅療養者への震災対応」として調査結果などが掲載された(ケアマネジャー,18(4),72-73,2016)。本調査の結果の一部を平成28年8月の日本災害看護学会第18回年次大会で発表の予定である。また、生命維持のために電源が必須な在宅療養者と子どもの備えの実態と特徴を分析中であり、海外の関連雑誌への投稿準備中である。金沢高知災害備えチェックシートは完成し、実際に地域で使用し内容の洗練化を図っているところである。高知県高知市で生命維持のために電源が必須な在宅療養者と子どもの災害への備えの実態を把握し、その結果を解析中である。多方面から反響があり今後対象者を広げ調査を行う予定で関係者と打ち合わせ中である。本研究の目的は、生命維持のために医療処置を要する在宅療養者が、支援者と共に災害の備えに取り組むことができる「災害備えチェックシート」の開発である。A県内で、「金沢高知式災害備えチェックシート」(シート)を用いて、生命維持のために電源が必須な在宅療養者と家族及び支援している訪問看護師または、ケアマネジャー53組を対象に聞き取り調査を行った。シートの内容は、基本属性、処方内容、日常生活動作、使用している医療機器、必要な医療処置、物の備え、災害に対する知識、災害時の支援体制、避難勧告・指示が発令された場合の避難意思などである。その結果、人工呼吸あるいは吸引を連続的に使用している者の約半数は、避難が必要なとき、避難することをあきらめるか、避難しない危険性が示された。在宅療養者の避難意思に影響する要因として、人工呼吸または吸引の連続的使用者は「避難したくない、避難をあきらめている」意思の者により多く、停電に備えてアンビューバッグや足踏み式吸引器などの非常用医療機器を備えている者は「支援があれば避難したい、避難したい」意思の者により多かったという結果が得られた。以上より、電源が必須な療養者は、医療処置を継続しながら避難することは容易ではないと判断していると考える。また、非常用医療機器等を備えていない者は避難をあきらめるか、避難をしたくない意思がある可能性が考えられる。在宅療養者と生活を支援している専門職が本シートにより共同で話し合いながら備えることで、在宅療養者の居場所や医療機器の使用状況、投薬など、詳細で最新の状態と備えが把握することができた。在宅療養者、家族介護者と支援者が共同で災害の備えをすることを目的とした「災害備えチェックシート」案は完成し、地域における生命維持のために医療機器を要する在宅療養者5名とその家族に実際にチェックシートを使用してもらい、その後、必要項目や使用方法などについて協議していただける予定である。すでに5名には内諾を得ており実施の準備中である。平成27年度の調査結果の一部は8月に日本災害看護学会で発表する。さらに、論文にまとめ海外の雑誌へ投稿を行う。

本シートをデジタル化してパソコンやタブレット端末で動作するアプリケーション開発について、関係機関と協議中である。また、金沢高知式災害備えチェックシートの精神障害者版及び発達障害者版の作成に着手し、在宅精神障害者の災害への備えの調査を行うよう協議中である。在宅看護学、災害看護学準備が整い次第、生命維持のために電源が必須な医療機器を要する在宅療養者とその支援者に、災害備えチェックシートを使ってもらう。その後、チェックシートの内容について療養者宅でグループインタビューを開催し、順次データ収集を行う予定である。今年中にはデータをまとめる予定である。高知市における生命維持のために電源が必須な在宅療養者と子どもの調査にあたり、調査協力者や行政との打ち合わせなどのために前倒し請求を行ったための残高である。県外でのデータ収集のために計上していた旅費が、研究協力者との日程の調整がつかず、当初の予定よりもデータ収集の回数が減ったため。引き続き高知県高知の在宅療養者と子ども及び専門職から協力を得て調査予定のために、そのための旅費などに使用する予定である。データ収集のための旅費、及び研究協力者への謝礼費、逐語録作成などの外注費等に使用する。
ミラーニューロンシステムによる認知症食行動関連障害改善法の確立

本研究の目的は認知症に伴う食行動関連障害の予防、改善に資する知見を得ることである。そこで、本年度はもの忘れ外来受診中の5,361名の縦断データを分析し、軽度認知障害者とアルツハイマー型認知症患者で食欲低下とうつ傾向、食事の中断の有無に有意な関連があることを明らかにした。またアルツハイマー型認知症患者では、ADL、併存疾患数、抗認知症薬の服用の有無、向精神薬の服用の有無も有意に関連していることを明らかにした(Suma 2018)。次に地域在住高齢者それぞれ5,104名、7,614名を対象に行った包括健診の横断データを分析し、軽度認知障害と摂食嚥下機能障害との関連を明らかにした(Watanabe 2018, Kugimiya 2019)。地域在住高齢者3,155名を対象に行った包括健診において認知機能とアルツハイマー型認知症に関連するバイオマーカーの検査を実施した。そのうち認知症の疑いのある150名に対してMRI検査等を行いミラーニューロンシステムに関連する変化と白質病変について検討を行った。さらに軽度認知機能低下がみられる高齢者で、定期的歯科受診をしていない60人を募集し、ミラーニューロンシステムを賦活する口腔健康管理プログラムに関する8カ月間の無作為化比較対照試験(臨床研究登録UMIN000032205)を実施した。この他、5つの介護保険施設に入所中の重度認知症患者の2年間の観察調査を実施し、認知機能と食欲、自立摂食能力の低下、食行動関連障害が死亡発生と有意に関連していることを明らかにした(Mikami 2018, Sakamoto 2019)。以上の結果から認知機能の低下と摂食嚥下機能の低下は関連しており、摂食嚥下機能の維持向上は食行動関連障害とQOLを改善し、死亡発生のリスクを低下させる可能性が示唆された。本研究の目的は、次の2つの研究によって認知症に伴う食行動関連障害を改善する方法を確立することである。(1)認知症患者の孤食と食行動関連障害の状況、それらに影響する要因を経時的に調査し、孤食と食行動関連障害、認知症の状態などとの関係を明らかにする。(2)認知症患者の食行動関連障害が孤食の制限と、嚥下運動に関するミラーニューロンシステムを賦活する映像プログラムにより改善することを明らかにするとともに、患者、家族への影響についても検討する。また各種脳機能計測を行い、ミラーニューロンシステムに関する脳神経活動の機能的変化を明らかにする。平成28年度は、これまでに収集した国立長寿医療研究センターもの忘れ外来受診中の3993名のデータを集計し分析を行った(平成29年4月現在4671名のデータを収集した)。分析の結果、軽度認知障害者506名とアルツハイマー型認知症患者1,132名の孤食と食行動関連障害、認知症の状態に関連する因子について横断的に比較検討し論文を作成した。また、継続的に外来受診中の軽度認知障害者とアルツハイマー型認知症患者および、レビー小体型認知症患者170名の孤食と食行動関連障害、認知症の状態などとの関連を分析している。また、東京都健康長寿医療センターが実施した東京都I区の地域在住高齢者の包括健診において認知機能検査を実施し、MMSE21点以上26点以下の7089歳の高齢者351人のうち、かかりつけ歯科医がない54人を抽出し、うち20名に対してMRI検査と医師による認知症の診査を行った。平成29年度以降は本対象者に対してミラーニューロンシステムを賦活する映像プログラム等による介入を行っていく予定である。平成28年度は、国立長寿医療研究センターもの忘れ外来受診中の3993名のデータを集計し分析を行った(平成29年4月現在4671名のデータを収集した)。分析の結果、軽度認知障害者506名とアルツハイマー型認知症患者1,132名の孤食と食行動関連障害、認知症の状態に関連する因子について横断的に比較検討し論文「Different Factors Related to Appetite in Alzheimer's Disease and Mild Cognitive Impairment Patients」を作成した。また、レビー小体型認知症患者170名の孤食と食行動関連障害、認知症の状態などとの関連を分析し、日本老年学会にて発表する予定となっている。また、東京都I区の地域在住の70歳以上の高齢者7600人を対象に認知症に関する調査を実施し、MMSE21点以上26点以下の7089歳の高齢者351人のうち、かかりつけ歯科医がない54人を抽出し、うち20名に対してMRI検査と医師による認知症の診査を行った。国立長寿医療研究センターもの忘れ外来における横断ならびに縦断調査も順調にデータを蓄積できており、また介入調査対象者の抽出もほぼ終了した。また、東京都健康長寿医療センターにおいても地域在住高齢者の認知機能検査を実施し、介入調査の対象者の抽出もほぼ終了しており、研究計画は概ね順調に進んでいる。(2)認知症患者の食行動

関連障害が孤食の制限と、嚥下運動に関するミラーニューロンシステムを賦活する映像プログラムにより改善することを明らかにするとともに、患者、家族への影響についても検討する。また各種脳機能計測を行い、ミラーニューロンシステムに関する脳神経活動の機能的変化を明らかにする。平成29年度は、これまでに収集した国立長寿医療研究センターもの忘れ外来受診中の5,209名のデータを集計し分析を行った。軽度認知障害者とアルツハイマー型認知症患者の孤食と食行動関連障害、認知症の状態に関連する因子について横断的に比較検討した結果、食欲低下群はうつ傾向及び食事の中断の有無と有意な関連が見られた。またアルツハイマー型認知症患者ではこれらに加えADL、併存疾患数、抗認知症薬の服用の有無、向精神薬の服用の有無が有意に関連していることを明らかにした。また、愛知県O市の地域在住高齢者5000名を対象に行った包括健診の横断データを分析し、軽度認知障害者の判別に口腔機能の評価が有用であることを明らかにした。また、東京都I区の地域在住高齢者3000名を対象に行った包括健診において認知機能検査を実施し、MMSE23点以上26点以下の高齢者で、定期的歯科受診をしていない60人を募集し、前期介入群30名と後期介入群30名に分けて、ミラーニューロンシステムを賦活する映像プログラム等による無作為化比較対照試験(臨床研究登録UMIN000032205)を開始した。平成29年度も前年度に引き続き、国立長寿医療研究センターもの忘れ外来受診中の患者のデータを収集し分析を行った(平成29年9月現在5,209名のデータを収集した)。分析の結果、軽度認知障害者385名とアルツハイマー型認知症患者853名の孤食と食行動関連障害、認知症の状態に関連する因子について横断的に比較検討し論文を作成しGeriatr Gerontol Int.に受理された。また、レビー小体型認知症患者183名の孤食と食行動関連障害、認知症の状態などとの関連を分析し、軽度認知障害者、アルツハイマー型認知症患者との違いを検討するとともに、追跡調査を実施できた615名を対象に、認知機能低下と孤食と食行動関連障害の関連について縦断的な検討を行っている。また、愛知県O市の地域在住高齢者5104名を対象に行った包括健診の横断データを分析し、健常者2669名と軽度認知障害者930名の判別に口腔機能の評価が有用であることを明らかにし論文を作成しGeriatr Gerontol Int.に受理された。また、東京都I区の地域在住高齢者3000名を対象に行った包括健診において認知機能検査を実施し、MMSE23点以上26点以下の高齢者で、定期的歯科受診をしていない60人を募集し、前期介入群30名と後期介入群30名に分けて、ミラーニューロンシステムを賦活する映像プログラム等による無作為化比較対照試験(UMIN000032205)を開始した。本研究は開始2年であるが、すでに2本の英文論文が受理されており、国立長寿医療研究センターもの忘れ外来における横断ならびに縦断調査も順調にデータを蓄積できている。また、東京都健康長寿医療センターにおいてもミラーニューロンシステムを賦活する映像プログラム等による介入プログラムを開発し、無作為化比較対照試験にて検証しており、研究計画は概ね順調に進んでいると思われる。本研究の目的は認知症に伴う食行動関連障害の予防、改善に資する知見を得ることである。
ホスト-ゲスト相互作用の制御に基づく超音波応答性を示すナノゲルの開発

超音波応答型ドラッグデリバリーシステムを指向してシクロデキストリン(CD)を高分子ネットワーク内に含むゲル微粒子を創製し超音波に対する応答性を評価した。CDを高分子ネットワーク内に含むキトサンナノ粒子(CD架橋型ナノ粒子)とCDをグラフト化しただけのCDグラフト化キトサンからなるナノ粒子(比較ナノ粒子)を合成し、モデル薬物を用いて超音波応答性を評価した。その結果、比較ナノ粒子は、超音波照射の有無で放出挙動に変化は見られなかったが、CD架橋型ナノ粒子は、遅延放出効果を示すことが分かった。また、本研究において得られたCDグラフト化キトサンと抗がん剤を複合化したナノ粒子を調製することにも成功した。(1)シクロデキストリンを架橋点に有するナノゲル及び比較実験用ナノゲルの創製低分子量のキトサンを主鎖にいて、シクロデキストリン(CD)を高分子ネットワーク内に含む構造を有するナノゲル(CD架橋型ナノゲル)の調製を行った。β-CD架橋剤として多置換のカルボキシメチル化β-CDを調製し、キトサンとの脱水縮合反応を行った。ここでは、β-CD架橋剤のカルボキシメチル基の置換度や原料比(キトサン/β-CD架橋剤)を変え、粒径の制御を検討した。その結果、平均置換度を3に調整したβ-CD架橋剤を用いて、同重量のキトサンと脱水縮合反応を行うことで、平均粒径が約100 nmの目的のナノゲルが得られることが分かった。また、比較実験用のナノゲル調製に用いるβ-CDグラフトキトサンも1置換のカルボキシメチル化β-CDを用いて同様に脱水縮合反応を行うことで得られた。このβ-CDグラフトキトサンとトリポリリン酸とを複合化することで、目的の比較実験用ナノゲルが得られることも確認した。また、α-, γ-CDを用いても、β-CDを用いる系と同様にナノゲルが得られることも分かった。(2)包接能力の確認抗がん剤であるドキソルビシンを用いて包接能力の確認を行った。その結果、調製したナノゲルは全て、α-,β-, γ-CDと同程度の包接能力を有していることが確認された。特に、γ-CD架橋型ナノゲルが良好にドキソルビシンと包接錯体を形成した。超音波応答型DDSを指向してシクロデキストリン(CD)を高分子ネットワーク内に含むゲル微粒子を創製し超音波に対する応答性を評価した。ナノ粒子形成が期待できる低分子量のキトサン(16 kDa)を三置換のカルボキシメチル化CD (CD架橋剤)で架橋することで、CDを高分子ネットワーク内に含むナノ粒子(CD架橋型キトサンナノ粒子)が得られた。CDをグラフト化しただけのCD複合化キトサンとトリポリリン酸の複合化によって比較サンプルも調製した。ローダミン6Gをモデル薬物に用いて超音波応答性を評価した結果、超音波照射を行わないブランクでは、1.5時間後にモデル薬物の放出が終了するのに対して、超音波照射を行うと、約4倍の遅延放出効果を示すことが分かった。一方で、CDをグラフト化しただけの比較サンプルでは、遅延放出効果は確認されなかった。これらの結果から、CDを分子内に含む高分子ネットワークに超音波照射を行うと、錯体がより安定化すること示唆された。さらに、CDグラフト化キトサンのがん治療への応用を指向して、包接を利用して抗がん剤であるドキソルビシンとの複合化を行った。その結果、ガンマ-シクロデキストリングラフト化キトサンは、包接を介してドキソルビシンと複合体を形成することが明らかになった。トリポリリン酸を用いて複合体をナノ粒子化することで、包接とイオン結合を介してドキソルビシンとの結合が強化されることが分かった。本年度の目標であった『シクロデキストリンを架橋点に有するナノゲル及び比較実験用ナノゲルの創製』と『調製したナノゲルの包接能力の確認』は達成された。材料創製は、β-CDでのみを行う予定であったが、今後、より多くの知見を得るために、α-, γ-CDにおいても行い、当初の予定よりも多くの材料の創製に成功した。以上のことから、当初の計画通りおおむね順調に進展していると言える。高分子化学超音波応答性を証明するために、γ-CD架橋型ナノゲルの超音波照射下におけるドキソルビシンの放出速度と自然放出速度を比較する。また、分子構造の効果を明確にするために、比較実験用ナノゲルの放出挙動も検討する。また、超音波照射下におけるナノゲルへのドキソルビシンへの吸着量を測定し、吸着等温線から相互作用の強さを表す数値である結合定数を算出する。さらに、蛍光測定による結合定数の測定も検討し、多角的に超音波照射が結合定数に与える影響を評価する。
運動学習の脳内メカニズムの解明

運動学習では、運動の誤差情報を用いて次の運動を変化させることが重要な役割を果たしている。腕の到達運動では誤差情報への変換に小脳でのLTDが本当に関与しているかは明らかにされていない。本研究では、リーチング運動遂行時のサルのニューロン活動を、小脳皮質登上線維の入力源である赤核から記録し、運動の誤差情報の時空間的特性を解析・比較することにより、小脳が誤差情報への変換・保持に関与しているかを明らかにする。この研究により、運動学習の脳内メカニズムを解明でき、効果的なリハビリテーション方の開発に寄与できると考えられる。ニホンザルに視覚誘導性リーチング課題を訓練し、課題遂行時の単一ニューロン活動を小脳の入力源である小細胞性赤核から記録し、運動の誤差情報をコードしているニューロンが存在しているかどうかを検証する。また、運動終了時に誤差情報をコードしているニューロン活動が記録された際に、その部位を運動終了時に微小電気刺激することにより次の試行での運動の誤差の増加が生じるかを解析する。その結果、赤核のニューロンは運動開始時に運動の標的位置の情報を、運動終了後に運動の誤差情報をコードしていることを明らかにした、この結果、赤核の出力先である小脳のプルキンエ細胞の複雑スパイクの結果と一致していた。また運動終了後に微小電気刺激を行うとニューロンの誤差情報の最適方向の反対側に誤差が増加した。これらの結果は、大脳皮質ー赤核ー小脳皮質の経路が運動誤差の修正に関与していることを示唆している。本研究は、分担研究者である大阪大学大学院生命機能研究科北澤茂教授との連携のもとで実施された。また、本研究の動物実験は日本学術会議が定める「動物実験の適正な実施に関する基本指針」に従って行われた。また本研究は、大阪大学大学院生命機能研究科動物実験倫理審査委員会の承認を受けて行われた。腕の到達運動では大脳皮質の運動野に終点の誤差情報が入力し、次の試行まで運動を修正させる方向を保持しているが、このような持続的な誤差情報への変換に小脳でのLTDが本当に関与しているかは明らかにされていない。本研究では、リーチング運動遂行時のサルのニューロン活動を、小脳皮質登上線維の入力源である赤核、小脳の出力源である小脳歯状核から記録し、運動の誤差情報の時空間的特性を解析・比較することにより、小脳が持続的な誤差情報への変換・保持に関与しているかを明らかにする。運動の誤差情報の持続的な情報への変換過程への小脳の役割を明らかにするために、ニホンザルに視覚誘導性リーチング課題を訓練し、課題遂行時の単一ニューロン活動を小脳の入力源である小細胞性赤核、小脳の出力源である小脳歯状核から記録し、運動の誤差情報をコードしているニューロンが存在しているかどうか、またその誤差情報の時間特性を検証する。平成28年度には、小細胞性赤核、小脳歯状核から神経細胞活動の記録を行うサルに対して視覚誘導性リーリング課題の訓練を行い、記録の準備を整えた。なお、本研究は連携研究者である大阪大学大学院生命機能研究科北澤茂教授との連携のもとで実施された。当初の計画では、平成28年度内に、新規に導入した2頭のニホンザルに視覚誘導性リーチング課題を訓練し、訓練終了後、小細胞性赤核の細胞活動記録用のシリンダーを取り付ける手術を行い、小細胞性赤核のニューロン活動の記録および刺激実験を開始する予定であった。しかしながら、サルの導入が予定していたよりも遅れた事、また課題の訓練には34ヶ月を要すると考えられたが、予定以上に時間がかかったことから、平成28年度内に視覚誘導性リーチング課題の訓練が終了しなかった。このため平成28年度内に記録・刺激実験を開始することが出来なかった。しかし平成29年5月現在、サルの訓練はほぼ終了しているため、6月から記録・刺激実験を開始できる予定である。

また、運動終了時に誤差情報をコードしているニューロン活動が記録された際に、その部位を運動終了時に微小電気刺激することにより次の試行での運動の誤差の増加が生じるかを解析する。平成29年度には、サルに対して視覚誘導性リーリング課題の訓練を行い、小細胞性赤核から神経細胞活動の記録を行った。なお、本研究は、分担研究者である大阪大学大学院生命機能研究科北澤茂教授との連携のもとで実施された。本研究の動物実験は日本学術会議が定める「動物実験の適正な実施に関する基本指針」に従って行われた。また本研究は、大阪大学大学院生命機能研究科動物実験倫理審査委員会の承認を受けて行われた。当初の計画では、平成29年度内に、新規に導入した2頭のニホンザルに視覚誘導性リーチング課題を訓練し、訓練終了後、小細胞性赤核の細胞活動記録用のシリンダーを取り付ける手術を行い、小細胞性赤核のニューロン活動の記録および刺激実験を開始する予定であった。小細胞性赤核の神経細胞活動を記録した結果、運動の誤差情報をコードしているニューロンが存在していることが明らかになった。運動終了時に誤差情報をコードしているニューロン活動が記録された際に、その部位を運動終了時に微小電気刺激することにより次の試行での運動の誤差の増加が生じるかを解析した結果、運動野と同様に誤差情報の最適方向と反対側に運動の誤差が生じた。この結果は、運動の誤差情報が小細胞性赤核を介して小脳皮質の登上線維に運動の誤差情報が送られていることを示唆している。運動学習では、運動の誤差情報を用いて次の運動を変化させることが重要な役割を果たしている。腕の到達運動では誤差情報への変換に小脳でのLTDが本当に関与しているかは明らかにされていない。本研究では、リーチング運動遂行時のサルのニューロン活動を、小脳皮質登上線維の入力源である赤核から記録し、運動の誤差情報の時空間的特性を解析・比較することにより、小脳が誤差情報への変換・保持に関与しているかを明らかにする。この研究により、運動学習の脳内メカニズムを解明でき、効果的なリハビリテーション方の開発に寄与できると考えられる。ニホンザルに視覚誘導性リーチング課題を訓練し、課題遂行時の単一ニューロン活動を小脳の入力源である小細胞性赤核から記録し、運動の誤差情報をコードしているニューロンが存在しているかどうかを検証する。その結果、赤核のニューロンは運動開始時に運動の標的位置の情報を、運動終了後に運動の誤差情報をコードしていることを明らかにした、この結果、赤核の出力先である小脳のプルキンエ細胞の複雑スパイクの結果と一致していた。また運動終了後に微小電気刺激を行うとニューロンの誤差情報の最適方向の反対側に誤差が増加した。これらの結果は、大脳皮質ー赤核ー小脳皮質の経路が運動誤差の修正に関与していることを示唆している。本研究は、分担研究者である大阪大学大学院生命機能研究科北澤茂教授との連携のもとで実施された。また、本研究の動物実験は日本学術会議が定める「動物実験の適正な実施に関する基本指針」に従って行われた。
Junキナーゼ(JNK)を分子標的とした大動脈瘤退縮療法の開発

腹部大動脈瘤罹患率は本邦においても増加傾向にあるが、外科手術が唯一の治療法である現状では、破裂死亡数の大幅な減少は期待できないため、病態解明と、より理想的な治療法開発が急務である。最近我々は、代表的ストレス応答分子c-Jun N-ternimal kinase(JNK)が、ヒト大動脈瘤において著明に活性化していることを見出し、その標的遺伝子を全ゲノム的に探索した。その結果、JNKは、MMP-9活性亢進と細胞外マトリクス産生低下を同時にもたらし、細胞外基質代謝を崩壊の方向に統合的に制御するキー分子であることを発見し、JNKこそが大動脈瘤治療における理想的な標的分子と考えるに至った。初年度の研究で、塩化カルシウム惹起慢性炎症による大動脈瘤モデル、次年度はApoEノックアウトマウスにアンジオテンシンIIを持続投与することにより形成される大動脈瘤を動物モデルとして用いて、JNK阻害により効果的に大動脈瘤形成を予防できるのみならず、一旦完成した大動脈瘤の退縮をも達成できることを証明した。最終年度は、JNKノックアウトマウスを用いて大動脈発症におけるJNKの役割を検討した。JNK1ノックアウトマウスおよびJNK2ノックアウトマウスの大動脈を塩化カルシウムで処置したところ、JNK2ノックアウトでのみ大動脈瘤形成が阻止されたことから、JNK2が大動脈瘤発症に重要な役割を演じていることが示された。さらにリジン酸化酵素による細胞外マトリクス安定化が炎症シグナルを抑制するとの新知見を得た。腹部大動脈瘤罹患率は本邦においても増加傾向にあるが、、外科手術が唯一の治療法である現状では、破裂死亡数の大幅な減少は期待できないため、病態解明と、より理想的な治療法開発が急務である。(1)JNK阻害による瘤形成抑制(予防効果)マウスの腎動脈下腹部大動脈を、0.5M CaCl_2で15分間処理することにより大動脈瘤を作成し、特異的JNK阻害薬SP600125を連日皮下投与した。術後10週目にJNK阻害による動脈瘤の予防効果を評価した。定量的大動脈形態計測と組織標本解析により、JNK阻害による大動脈瘤形成の予防効果を確認した。(2)JNK阻害による瘤の退縮(退縮効果)CaCl_2処置後6週目まで飼育し、10MHzリニアプローブによる血管エコーで動脈瘤形成を評価した。瘤径に差がない2群を設定した後に、JNK阻害薬またはバッファーのみを6週間連日皮下投与した。定量的大動脈形態計測と組織標本解析により、JNK阻害による大動脈瘤形成の退縮効果を確認した。最近我々は、代表的ストレス応答分子c-Jun N-ternimal kinase (JNK)が、ヒト大動脈瘤において著明に活性化していることを見出し、その標的遺伝子を全ゲノム的に探索した。初年度の研究で、塩化カルシウム惹起慢性炎症による大動脈瘤モデルにおいて、JNK阻害により効果的に大動脈瘤形成を予防できるのみならず、一旦完成した大動脈瘤の退縮をも達成できることを証明した。

今年度は高脂血症と高血圧を基礎病態とする大動脈瘤モデルについて、検討を行った。ApoEノックアウトマウスにアンジオテンシンIIを持続投与することにより形成される大動脈瘤を動物モデルとして用いた。アンジオテンシンII持続投与の4週間後には腎動脈直上に大動脈瘤形成を認めた。その後さらに8週間経過しても瘤径に変化は無かったため、アンジオテンシンII投与後4週間の時点で大動脈瘤は完成したものと考えられた。この大動脈瘤が完成した時点でJNK阻害薬の投与を開始したところ、8週間後には大動脈径は、ほぼ元のサイズにまで縮小したことから、JNK阻害の治療的有効性が、高脂血症、高血圧を基礎病態とする大動脈瘤モデルでも証明された。腹部大動脈瘤罹患率は本邦においても増加傾向にあるが、外科手術が唯一の治療法である現状では、破裂死亡数の大幅な減少は期待できないため、病態解明と、より理想的な治療法開発が急務である。最近我々は、代表的ストレス応答分子c-Jun N-terminal kinase(JNK)が、ヒト大動脈瘤において著明に活性化していることを見出し、その標的遺伝子を全ゲノム的に探索した。その結果、JNKは、MMP-9活性亢進と細胞外マトリクス産生低下を同時にもたらし、細胞外基質代謝を崩壊の方向に統合的に制御するキー分子であることを発見し、JNKこそが大動脈瘤治療における理想的な標的分子と考えるに至った。初年度の研究で、塩化カルシウム惹起慢性炎症による大動脈瘤モデル、次年度はApoEノックアウトマウスにアンジオテンシンIIを持続投与することにより形成される大動脈瘤を動物モデルとして用いて、JNK阻害により効果的に大動脈瘤形成を予防できるのみならず、一旦完成した大動脈瘤の退縮をも達成できることを証明した。今年度は、JNKノックアウトマウスを用いて大動脈発症におけるJNKの役割を検討した。JNK1ノックアウトマウスおよびJNK2ノックアウトマウスの大動脈を塩化カルシウムで処置したところ、JNK2ノックアウトでのみ大動脈瘤形成が阻止されたことから、JNK2が大動脈瘤発症に重要な役割を演じていることが示された。さらにリジン酸化酵素による細胞外マトリクス安定化が炎症シグナルを抑制するとの新知見を得た。
学校問題等に対応できる学校・地域連携型コミュニティスクールの英・米実態調査

学校問題と地域の教育力低下の解決を、英・米コミュニティスクールの実態調査で求める。■平成11年度は、英国調査とRIBAのYorke氏招へい、平成12年度は米国調査と米国大会での情報入手と関係者の連携を構築した。■平成11年度英国13校調査と7校1日利用調査・教育停滞の改善-1994年以降地方教育当局の活性化とコミュニティスクール育成。・学校区の廃止-生徒の学校選択を保証し、学校魅力化を促す。この結果、学校公開や地域への教育サービスが充実。・学校独自の運営-各校は、選ばれた15人前後のGovernorを置き、人事、財政、コミュニティ、カリキュラム、懲罰等の委員会を設け、校長を支援。委員会が、地域への事業を決定。・地方教育当局からの独立-国の直接補助を得るGrant-mainteined Schoolは、Governorsを中心に、地域の学校を造る。・学校施設の利用体制-Care Taker(維持・管理者)が、開放時の鍵の管理等を行う。■平成12年度米国18校調査・学校区の無い学校-Chartered School(公立を離れ国の直接補助)等は学校区が無い。・地域で造る学校-地域の意見で学校形態や運営を決定する方式の学校。・ファミリールーム・クリニック・事務局スペース等の設置-改装等で必要な諸室を設置。・体験型メディアセンターの設置-4校が学習に効果的なセンターを持ち、内1校は展示の豊富な大規模ミュージアム内に学校を設置。・センターと呼ぶ学校-個性化の中で情報通信設備等を充実、地域に開放し、センターと呼ぶ。研究協力者のMr.YorkeとFax等で事前に協議を重ねた上で、平成11年8月19日30日までMr.Yorkeに日本に滞在をいただき、英国のコミュニティスクールの主にSchool Governorの役割について協議した。その結果にもとづき、平成11年11月6日29日の24日間英国に滞在し、12校のコミュニティスクールの実態調査を行った。調査はコミュニティスクールを訪問し、校長、School Govenorの代表者、地域解放担当者からそれぞれ話をうかがい、School Governorの役割、校長との関係、地域解放との関係等について実態の報告をうけた。その結果(1)生徒が通学と学校内で問題を起こした場合、学校が扱い、内容によって校長が処分を決めるが、生徒又は父兄がその処分に納得できない場合にはSchoolGovernorの委員会で処分の妥当性を審査する仕組みがあること、(2)SchoolGovernorは、20人程度で構成され、教育行政の関係者、議員、先生の代表者、父兄の代表者、学校事務の代表者等で構成され多くは民主的な手続きの選挙で選ばれること、(3)SchoolGovernorには34の委員会が設けられ、カリキュラム、財政、教員等の人事、施設、処分の審査等の機能を持ち、校長を補佐していること、(4)SchoolGovernorの委員は無報酬で協力していること、(5)コミュニティスクールによってSchool Governorの役割に地域開放に関することも入っている場合があるが、少数であること等を明らかにした。さらに平成12年2月24日3月5日まで再度英国を訪問し、上記のコミュニティスクールから5校を選択し、朝から夜までのコミュニティスクールの活動状況を視察し、校長及び教師と生徒の授業の仕方と両者の活発なかかわり方を明らかにした。今後さらに詳細な分析を行い、学校問題が生じない仕組と生じた場合の対処の仕組を明らかにする。平成12年度米国18校の調査の内容と成果・米国の政府と州の目指す方向-米国コミュニテー連合等からヒアリングを行い、Chartered School(公立から離れ、国から補助)等、学校の多様化を図つている。学校区は維持されているが、学校区を持たない場合も有る。・住民参加の学校の造り方-地域独自の学校を造るために住民参加方式を採った学校を調査した。

・フルサービス・スクールの発見-新しいタイプのコミュニテースクールを発見し、9校を調査した。それは(1)放課後の授業、(2)医療、(3)両親教育、(4)食事、(5)成人教育等を、学校と別の組織が財団等から補助を得て行い学校は活動の部屋等を提供する。また、学校が直接に補助を得て実施する場合もある。大都市の問題地域に多いこれらの学校は、このタイプを採用することで、成績も向上、地域環境も改善し、明るい顔で学んでいる。・フルサービス・スクールに必要な所室-ファミリールーム、診療所、事務局スペース、倉庫等がそれぞれ必要な場所に設置されている。・体験型メディアセンターの設置-18校中4校は、児童・生徒に学習に興味を持たせるためのメディアセンターを持ち、特に1校は、既存の大規模なミュージアム及びミーユジアムビレッジの中に改装して設けた学校で、豊富な展示品に刺激を受けて学習していた。・センターと呼ぶ専門性の高い学校-情報通信設備を充実し、積極的に学習に用い、地域にも開放する学校をスクールと呼ばず、センターとよんでいる。
歯周靭帯の再生を主軸にした新規歯周再生療法の開発

ヒト歯根膜細胞に伸展力を負荷したところ発現量の増加した216個の遺伝子のうち、Wntを歯周靭帯の再生を促進する因子として検出した。歯根膜細胞においてWnt5a刺激により分化関連遺伝子発現が上昇し、運動能が促進した。また、Far-western法および質量分析法を用いて、Wntと結合する細胞外基質蛋白質Nidogen-1を同定した。二相分離法の結果、Nidogen-1と結合したWntは親水相に分画された。Nidogen-1とWnt3aを混和後、細胞に刺激したところ、Wnt3a刺激依存性のシグナル伝達が促進した。歯周靭帯の再生あるいは維持において、咬合時に負荷される機械的刺激(圧迫力および伸展力)が重要な役割を果たしていると考えられている。そこで申請者らは、伸展力をうけた歯根膜細胞が歯周靱帯の再生あるいは維持に重要な因子を発現しているという仮説を立てた。本研究では、ヒトプライマリー歯根膜細胞において、伸展力を負荷することによって発現が上昇する遺伝子の中から歯周靭帯再生促進因子について明らかにし、これを治療薬として臨床応用に繋げていくことを目的としている。まず、4種のヒトプライマリー歯根膜細胞に線維芽細胞伸展装置システム(STREX社)を用いて伸展力を負荷した。過去の報告(J Dent Res.2011 Feb;90(2):181-5.)と同様に、108%の伸展力を1時間負荷したところ、それぞれの細胞において、Angiotensinogen(AGT)およびAlkaline Phosphatase(ALP)mRNA発現量が上昇したものの、その程度は無刺激群と比較して2倍程度であった。そこで、伸展力に関与する遺伝子をより多く抽出するために、伸展刺激時間を延長した。3時間の伸展刺激を行ったものの、AGTおよびALP mRNA発現量は無刺激群の2倍程度であった。そこで、108%の伸展力を1時間負荷増加した歯根膜細胞から抽出し、精製したmRNAを用いてマイクロアレイ法をおこない、伸展力の負荷により発現量の増加した遺伝子を216個検出した。今後、これらの遺伝子の発現について伸展力を負荷した群および無刺激群において比較し、遺伝子の機能について明らかにしていく予定である。今回得られた遺伝子群の中には生理的条件下において機能を果たしている遺伝子が含まれている可能性と考えられ、今後の研究を遂行することによって歯周靱帯の再生あるいは維持に重要な遺伝子を検出できるものと考えられる。歯周靭帯の再生あるいは維持には、咬合時に負荷される機械的刺激(圧迫力および伸展力)が重要な役割を果たしていると考えられている。そこで申請者らは、機械的刺激を受けた歯根膜細胞が、歯周靱帯の再生あるいは維持に重要な因子を発現しているという仮説を立てた。このような因子について明らかにするために本研究では、機械的刺激として伸展力に着目し、この伸展力が負荷されたヒトプライマリー歯根膜細胞において発現が上昇する因子を検出し、その中から、歯周靭帯の再生を促進する能力を有した因子を歯周靱帯再生促進因子として明らかにする、ことを目的としている。4種のヒトプライマリー歯根膜細胞に線維芽細胞伸展装置システム(STREX社)を用いて108%の伸展力を1時間負荷した。負荷した群と負荷を加えていない群の歯根膜細胞から抽出し、精製したmRNAを用いてマイクロアレイ法をおこない、伸展力の負荷により発現量の増加した遺伝子を216個検出した。検出遺伝子群の中でWntの発現上昇を認めたことから、伸展力の負荷によりWntシグナル伝達が活性化されていることが示唆された。Wntは、細胞の増殖・分化・運動等を制御する分泌性蛋白質である。そこでWntが歯根膜細胞の運動能に与える影響、さらに歯周靭帯基質内にWntと結合し、その活性を調節する細胞外基質蛋白質が存在することを想定し、その単離を行った。Boydenチャンバー法を用いた実験系の結果、Wntが歯根膜細胞の運動能を促進することが明らかとなった。次に腫瘍細胞から調整した細胞外基質蛋白質の中でWntと結合する蛋白質をスクリーニングした。Far-western法を用いて、Wntが結合している細胞外基質蛋白質を検出し、その蛋白質を質量分析法にて同定した。これらの結果は、歯周靭帯において機械的刺激がWntを介して歯根膜細胞の再生・維持を制御する可能性と、さらに歯周靭帯に豊富に存在する細胞外基質がWntの作用を制御するという新たな機構の端緒を示した。そこで4種のヒトプライマリー歯根

膜細胞に線維芽細胞伸展装置システム(STREX社)を用いて伸展力の負荷により発現量の増加した遺伝子を216個検出した。それらの検出遺伝子群の中でWntの発現上昇を認めたことから、伸展力の負荷によりWntシグナル伝達が活性化されていることが示唆された。Wntは、細胞の分化・運動等を制御する分泌性蛋白質であり、細胞外基質に結合しやすい特徴を有している。そこでWntが歯根膜細胞の分化・運動能に与える影響について検討し、さらに歯周靭帯は細胞外基質が豊富であるので、Wntと結合し、その活性を調節する細胞外基質蛋白質が存在することを想定し、その単離を行った。Wnt5a刺激により歯根膜細胞において分化関連遺伝子であるα-SMAおよびperiostinの遺伝子発現が上昇した。創傷治癒アッセイを用いてWnt5aが歯根膜細胞の運動能を促進することが明らかとなった。次に調整した細胞外基質蛋白質の中でWntと結合する蛋白質をスクリーニングした。Far-western法を用いて、Wntと結合する細胞外基質蛋白質を検出し、質量分析法にてNidogen-1を同定した。Wntは脂質修飾および糖鎖修飾をうけており、疎水性の特徴を有している。二相分離法の結果、Nidogen-1は親水相に分画され、Nidogen-1と結合したWntは親水相に分画された。また、Nidogen-1とWnt3aを混和後、細胞に刺激したところ、Wnt3a刺激依存性の受容体LRP6のリン酸化レベルおよび標的遺伝子Axin2の遺伝子発現が上昇した。以上の結果より、Wntが歯根膜細胞の分化・運動能を促進すること、細胞外基質がWntの生化学的特徴や作用を制御することが明らかとなった。マイクロアレイ法を用いて検出した遺伝子の中から、Wntに焦点を絞った研究を行ったところ、Wntが歯根膜細胞の運動能を促進すること、Wntと結合する細胞外基質蛋白質を明らかにできたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。Wntと細胞外基質蛋白質が結合することにより、Wntシグナル伝達に与える影響について検討する。精製Wntおよび精製細胞外基質蛋白質を用いた検討を行う。計画通りにならなかった場合、Wntおよび細胞外基質タンパク質を強制発現した細胞を用いて検討すること、Wntシグナル伝達が発育に影響を与えることが明らかとなっているアフリカツメガエルを用いた実験系を計画している。
上顎歯槽部骨延長に伴う周辺組織再構築と高気圧酸素療法との関連

高気圧酸素適用下で歯槽骨延長を行った結果、高気圧酸素非適用群と比較して延長部位での骨化促進や血管の新生が認められた。このことから高気圧酸素を歯槽骨延長に適用した場合、その延長部位での骨化促進、血管新生にを高める可能性が示唆された。<目的>骨延長術は顎顔面領域においても治療に広く用いられている。しかし、骨延長術では骨硬化に長期の固定が必要となる点は臨床的に大きな問題である。高気圧酸素療法(HBO)は主に虚血性疾患の治療に用いられ、近年では、口唇口蓋裂患者に対して行われる上顎骨延長術後にも適用されているが、その科学的根拠は必ずしも十分ではないのが現状である。イヌの口唇口蓋裂モデルを用いて、高気圧酸素治療が骨延長術後の治癒促進に作用するという仮説に関して検証を試みた。<方法>左側口蓋に人工的に作製した骨欠損部へ向かって犬歯を含む移動骨片を近心に移動させて骨延長を行った。3匹のイヌに対して骨延長を行った直後から20日間にわたる高気圧酸素療法を行った。一方、骨延長のみ施行した残り3匹は対照群(control group)として用いた。移動骨片の犬歯歯髄血流をレーザードップラー血流計を用いて100日間測定した。100日目に屠殺した後、pQCTを用いて放射線学的分析や、組織形態計測学的な評価を行った。<結果>高気圧酸素に暴露した群は対照群と比較して、30日早くもとの血流値に回復した(p<0.05)。高気圧酸素に暴露した群は対照群と比べ皮質骨塩量密度も有意に高かった(p<0.05)。組織形態計測学的分析を用いて調べた結果、新生骨領域は高気圧酸素に暴露した群は対照群と比較して大きかった(p<0.05)。Peripheral quantitativecomputed tomography(pQCT)による骨塩量密度測定の結果では高気圧酸素療法群の測定範囲内の石灰化領域は対照群と比べて大きかったが、右側ではほぼ同じであった。左側の皮質骨領域に関して、骨塩量密度と骨面積、骨塩量は高気圧酸素療法群の方が対照群と比べて有意に大きかった(p<0.05)。これらの結果から、高気圧酸素療法は骨延長法における固定期間を短縮できる可能性が示唆された。<目的>骨延長術及び高気圧酸素療法(HBO)は顎顔面領域においても治療に広く用いられている。高気圧酸素療法(HBO)は主に虚血性疾患の治療に用いられ、近年では、口唇口蓋裂患者に対して行われる上顎骨延長術後にも適用されているが、歯の移動に対するHBOの効果やその作用メカニズムはあまり解明されてないのが現状である。そこでイヌの口唇口蓋裂モデルを用いて、骨延長術部位への歯の移動の際にHBOが与える影響に関して検証を試みた。5匹のイヌは実験群として骨延長を行った直後から20日間にわたるHBOを行った。一方、残り5匹は対照群(control group)としてHBOを適用しなかった。両群ともに延長直後から延長部位に向って第二前臼歯を牽引した。150日目に屠殺した後、pQCTを用いて放射線学的な分析や、組織形態計測学的な評価を行った。<結果>高気圧酸素に暴露した群は対照群と比較して、皮質骨塩量密度も有意に高かった(p<0.05)。Peripheral quantitativecomputed tomography (pQCT)による骨塩量密度測定の結果では高気圧酸素療法群の測定範囲内の石灰化領域は対照群と比べて大きかったが、右側ではほぼ同じであった。これらの結果から、高気圧酸素療法は骨延長部位への歯の移動に対して影響を及ぼし、移動歯歯根周囲における骨化や血管新生を促進する可能性が示唆された。
標的型メールによる意図的脅威に対する体験型学習教材の開発

近年、標的型メールによる標的型攻撃によって重大な情報セキュリティインシデントが発生している。一方で、高校生の間では電子メールは主なコミュニケーションツールになっていない状況から、標的型メールのリスクを認識していないことが見受けられる。そこで、本研究では、次世代を担う高校生が標的型メールによるインシデントへの適切な対応ができるようにするために、体験学習型のeラーニング教材を開発し、授業実践を通じてその効果について検証することを目的とした。まず、次のような3つの学習機能を持たせた標的型メールによる意図的脅威を安全に学習できるeラーニング教材を開発した。それは、第1に標的型メールに対する基礎的な学習から、クイズ形式によるばらまき型の標的型メールの判別や、シナリオに基づいた企業活動からばらまき型以外の標的型メールを判別させる。第2にeラーニング教材におけるSNS機能を活用して、標的型メールに対してどのように対応すればよいかというテーマで情報共有させる。第3に実際に発生したインシデントに関する資料を提示してケーススタディができるようにした。次に、このような教材を用いた授業実践により、生徒の情報セキュリティインシデント対応能力を育成することに寄与していた。具体的には、標的型メールに対する安易な判断をせずに、アドレス、本文や添付ファイルなどの電子メールの構成要素から慎重に観察することと、自らの立場や状況などを考慮した上での適切な対応ができるようになった。さらに、こうした対応能力の向上とSNS機能による双方向の情報共有によって情報セキュリティ意識が形成され、標的型メールによる標的型攻撃に対する予防的な事前対策の重要性を把握させることができた。
炎症関連転写因子活性化測定法開発による全身性炎症反応症候群の病態迅速診断

本研究は、NF-κBを中心とした炎症関連転写因子を病院検査室で測定できる技術を開発することにより、炎症性サイトカイン産生亢進状態を網羅的に予測できるシステムを構築することにより、致死率の極めて高い全身性炎症反応症候群(SIRS)の発症を予測することが到達目標である。2年間の研究成果の概略を以下に示す。1)炎症性サイトカイン異常産生とNF-κB活性化亢進の関連:マウスマクロファージにグラム陰性菌体成分LPSを添加するとその受容体であるTLR4からシグナルが伝わりNF-κB活性化を介して、グラム陽性菌体成分PGの受容体であるTLR2発現が誘導される。この結果はグラム陽性・陰性菌複合感染にNF-κB活性化が関与することを示している。2)NF-κB定量測定用ELISA開発:NF-κB結合コンセンサス配列を有する結合特異性の最も高いプローブを作成した。3末をビオチン化しマイクロプレート上に固着した。本プレート上に核蛋白を添加しNF-κBp50またはp65抗体と反応後発色反応にて定量化した。リコンビナント蛋白を用い本ELISA法では6.25ngまで測定可能であった。3)NF-κB定量測定用ELISAシステムによるNF-κB活性化とIL-6経時解析:ヒト末梢血単核球にPHA/PMAを刺激すると、刺激30分で核内NF-κBp50が上昇(OD値が0.3から1.6)、しかしIL-6産生はこの時点では確認できなかった。しかし、刺激4時間でIL-6産生上昇(OD値が30分で0.12から4時間で0.41)が確認され、NF-κB活性化がIL-6産生に先行することを確認した。4)NF-κB定量測定用ELISAシステムによる健常者リンパ球核内NF-κB量の基準範囲設定:インフォームドコンセントが得られた健常者(28人)リンパ球核蛋白で測定した。その結果p50ELISAで3名が0.01ng/μgで残り25名は0.005ng/μg以下の測定限界以下、p65ELISAでは28名全例がOD値0.1以下の測定限界を示し、健常人はほとんど核内へNF-κBが移行していないことが推定できた。5)表面プラズモン法(SPR)を利用した高感度測定法の特異性検討:健常者の核内NF-κB量がELISA測定限度以下の0.01ng/核蛋白(μg)以下に存在することより、さらに高感度化を実現するためSPR法応用を検討した。HeLa細胞にTNF激した核蛋白で検討した結果、0.001ng/μgまでシグナルが得られたが、NF-κBとのプローブ競合反応試験にて、非特異的反応が強く,高感度に伴う特異性低下が課題となった。以上、臨床検査領域で炎症性サイトカイン産生を予測するための転写因子NF-κB活性化測定には、0.001ng/μg以下まで直線性を示す高感度測定系とその特異性が保障される新しい測定技術導入開発をすすめる必要があることが明らかとなり、現在、新しい1分子計測法を用いた測定法を検討中である。その結果

p50ELISAで3名が0.01ng/μgで残り25名は0.005ng/μg以下の測定限界以下、p65ELISAでは28名全例がOD値0.1以下の測定限界を示し、健常人はほとんど核内へNF-κBが移行していないことが推定できた。5)表面プラズモン法(SPR)を利用した高感度測定法の特異性検討:健常者の核内NF-κB量がELISA測定限度以下の0.01ng/核蛋白(μg)以下に存在することより、さらに高感度化を実現するためSPR法応用を検討した。HeLa細胞にTNF激した核蛋白で検討した結果、0.001ng/μgまでシグナルが得られたが、NF-κBとのプローブ競合反応試験にて、非特異的反応が強く,高感度に伴う特異性低下が課題となった。以上、臨床検査領域で炎症性サイトカイン産生を予測するための転写因子NF-κB活性化測定には、0.001ng/μg以下まで直線性を示す高感度測定系とその特異性が保障される新しい測定技術導入開発をすすめる必要があることが明らかとなり、現在、新しい1分子計測法を用いた測定法を検討中である。全身性反応症候群(以下SIRSと略する)は現代医学でも救命が困難な病態である。本研究はその病因である炎症性サイトカイン発現異常を総括的かつ迅速に把握できる検査法を開発しSIRSの救命率向上に寄与することを目的とする。そこでSIRSの病因に関与する転写因子を1分子レベルで測定できる測定法を開発する。平成17年度の研究成果を以下に述べる。1.炎症性サイトカインストームと転写因子NF-κBの関係:マウスマクロファージにLPSを添加するとグラム陽性菌の受容体であるTLR2発現が誘導される。グラム陰性菌とグラム陽性菌の複合感染ではNF-κB異常活性亢進が関与することを明らかにした。2.特異的NF-κB結合プローブと結合条件決定:NF-κB結合コンセンサスシーケンスはGGGACTTTCであるがその前後配列で特異性が決定される。最終的に最も特異性の高いプローブ:AGCTTCAGAGGGGACTTTCCGAGAGTACTGを決定し合成した。3.NF-κBp50測定用ELISAシステムの構築:2)で得られた特異性の高いプローブの3末をビオチン化し、96穴プレート上に固着した。本プレートに細胞核蛋白を添加し、NF-κBp50 1次抗体と2次抗体を反応させ発色反応による吸光度で解析した。本ELISA法はp50リコンビナント蛋白6.25ngまで測定可能であり、HeLa細胞核蛋白の検討では総蛋白5μgから30μgまでOD値との間にR^2=0.9862の相関があった。4.表面共鳴プラズモン法(SPR)を用いたNF-κB高感度・迅速測定法開発SPRのセンサーチップ金表面に2)で作成したNF-κBプローブを固定した。フローチャンネルに核蛋白を流すとこのプローブにNF-κBが結合する。一定の角度・波長をプリズムに照射すると屈曲した光が金表面に当たり、屈折率の変化で反射光にずれが生じる。本方法でNF-κBは5ngまで測定が可能となり15分で結果を出すことが可能となった。以上、SPR法を基盤にしたNF-κB高感度・迅速検査法の開発まで到達した。本方法により測定感度に対しては到達目標に達したが、特異性に問題が残ること測定誤差範囲も広いことから平成18年度はこの問題点解決に向けた研究が中心となる。