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コンピュータをとり入れた幼児カリキュラムの開発と実践

平成11(1999)年から3年間、「コンピュータをとり入れた幼児カリキュラムの開発と実践」を研究した。1年度はコンピュータをとり入れて幼児教育を実践する幼稚園を公募し、兵庫県揖保郡揖保川町立半田幼稚園を研究実践園として選択し、該当園に最適なコンピュータ及び周辺機器ならびに、園児達がコンピュータを操作する様子を記録する装置を保育室に設置しプリテストを実施した。2年度はカリキュラムに基づいたソフトウェアを作成し、3年度はカリキュラムの改善を行い、ソフトウェアを修正し更に作成した。研究内容については、平成13年5月29日に読売テレビの「ニューススクランブル」で放映され、また、平成13年10月31日に神戸新聞にも『園児ら野外遊びにも効果「パソコン使いやる気育成」』として報道された。また、平成13年10月31日に揖保川町立半田幼稚園において、『子どもの主体的な遊びの創造をめざして-コンピュータの有効な活用を中心に-』のテーマのもとに研究発表会を開催し、シンポジウム・公開保育を実施した。これらの実践研究を通し、該当幼稚園の保育内容と発達段階ならびに地域特性等に適合したカリキュラムを作成し、そのカリキュラムに園独自で開発したソフトウェアを効果的に組み込むことによって、幼児の活動を効果的に高められることが確かめられた。その効果の中でも、特に幼児の持つバーチャルとリアリティとのインターラクションの中で、幼児の活動面に顕著な高まりが見られた。幼児教育におけるコンピュータ利用が幼児の心身の発達にどのように影響するか、並びに、コンピュータ利用について親和性の高い幼児とは、どんな特性をもっているかを、(1)個別の発達状況のチェック(記憶、視覚認知、言語理解等)及び、(2)担任による心身の状況及び園内での行動評定(30項目の5段階SD法による独自に作成したチェックリスト)、(3)VTRによる自由保育時間でのコンピュータ利用状況等についての観察(コンピュータ使用時間、接近頻度等を指標として行動解析を行った)を実施した。初年度は、研究実践園でのカリキュラム作成と園児への効果を知るための基礎調査の二方向から進めた。実践園でのカリキュラム作成・本研究の内容とコンセプトを正しく理解して頂き、長期的な研究実践を承諾していただける候補園から、兵庫県揖保川町立幼稚園を研究実践園として選択し、教育委員会教育長に研究目的と内容を説明し協力を依頼した。その結果、半田幼稚園を中心とし、町立全4園が協力して研究体制を整えた。・幼稚園教諭、教育長、研究員による研究グループを設立し、研究の目的、方法、計画と幼稚園の現況等について相互理解を行った。その後、町立の全幼稚園を参加可能にするため、従来のカリキュラムと適合性を持つコンピュータ遊びを取り入れた、新しい年間カリキュラム作りに着手した。・次年度での実践が円滑なものになるため、開発ソフトウェアのプロトタイプを作成し、6歳児を対象にしたプリテストを行った。園児への効果を知るための基礎調査・前述のカリキュラムを行う時に、どのような環境・興味・情報処理能力を有した幼児に適しているか。また、実践の経過の中で幼児に、どのような側面で発達・成長がみられるか。(特に我々は、対人関係能力の変化について明らかにしょうとしている。)或いは、何らかのネガティブな要因があるのかを、明らかにすべく研究を計画しているが、今年度は、その基礎資料として5歳児32名に対して現在の個々の発達状況及び環境要因等について調査をおこなった。・内容として、視覚認知、動作性・巧緻性、聴覚短期記憶、言語能力の4項目を実施した。更に、手指の運動及び反応性の検査をコンピュータ画面上で行えるように作成している。また、環境要因の調査のために質問紙及び幼児の行動及び対人関係能力を調査するための教師用質問紙を作成した。来年度以降定期的に調査を繰り返し、成長・変化の動向を調査する予定である。

研究2年目では、初年度での研究をもとに「コンピュータを取り入れた保育カリキュラム」の確立と実践ならびにその記録、さらに園児への効果に関する基礎データの収集と分析を実施した。・兵庫県揖保川町教育委員会教育長、揖保川町立幼稚園3園、本研究組織メンバーで構成する計13名による研究グループの会合を4月から月平均23回にわたって開催し、カリキュラムの構成ならびにカリキュラム上で必要とするソフトウェアの内容について討議を重ねた。・幼稚園並びに地域の自然環境、季節変化、園内行事、保育内容などをテーマにした6タイトル(合計17本)のソフトウェア群を幼稚園教諭と共同開発しCD-ROMに焼き付け保育実践で使用した。・幼児の活動状況について、行動、音声、モニタ映像等を同時に記録するためのシステムを開発し、それを使用して保育実践の様子をVTR60本に記録した。このシステムについては日本保育学会第54回大会で発表する予定である。・研究成果の中間報告として、「コンピュータの有効な活用を試みて」という主題のもと、12月5日に揖保川町立半田幼稚園で研究発表会を実施した。(後援兵教委西播磨教育事務所、揖龍幼稚園教育研究会)・無線LANを利用したネットワーク環境を構成し保育カリキュラムの中に取り入れた。・本研究の成果については、日本保育学会第53回で自主シンポジウム「コンピュータを利用した保育実践事例の成果と課題」で述べた。さらに日本保育学会54回大会では合計4種の研究発表をする。・園児への効果に影響すると思われる個々の園児の発達状況(言語理解、表現、視覚認知、聴覚記憶)、環境要因(保護者の意識・家庭内の使用状況)、行動特性を調査し、発達状況については約1年の間隔で再検査を行った。次年度はコンピュータ上に作成した巧緻性・集中度等の検査も加え、園児のコンピュータとのかかわり方と背景要因との関連性を検討する。過去2年間の研究・実践をもとに最終年度として、この研究課題の完成を目指した。具体的な内容は以下のとおりである。・実践園の教諭および揖保川町教育長、ならびに揖保川町幼児教育研究カリキュラム研修会委員と年間十数回の合同研究会等を開催し、コンピュータを取り入れたカリキュラム作成内容についての構想と開発・改善指針について検討を行った。・今年のカリキュラム内容に必要なソフトウェアを開発した。開発したタイトルは、6種類であり、CD-ROMに焼き付けた。各タイトルは、数種類の関連を持ったマルチメディアソフトによって構成されている。・研究内容については、平成13年5月に読売テレビの「ニューススクランブル」で放映されるとともに、平成13年10月31日に揖保川町立半田幼稚園において、『子どもの主体的な遊びの創造をめざして-コンピュータの有効な活用を中心に-』のテーマのもとに研究発表会を開催しその成果をシンポジウムで発表するとともに、公開保育を実施した。
長距離量子通信に向けたダイヤモンド量子中継機能素子の開発

本研究では、ダイヤモンド中の窒素空孔中心(NV中心)の周囲にある多数の同位体炭素(13C天然存在比1%)の核スピンを量子メモリーとし、伝送光子との媒介としてNV中心の電子の縮退部分系を量子ビットとして量子制御に用いて、量子中継機能素子を開発することを目的として研究を行った。課題は大きく次の3つの要素に分けた。1.量子テレポーテーション原理による光子から核スピンへの伝令付き量子メディア変換の達成、2.独自の幾何学スピンエコーを応用した核スピンからなる集積量子メモリーの選択的操作の実現、3.集積メモリーに伝送、保存された状態の決定論的な量子もつれ検出である。平成30年度は、2.集積メモリーの実現に向け、2個の炭素核スピンと結合したNV中心を用いて伝送光子から核スピン量子メモリーの量子メディア変換の実証に成功し、6個以上の炭素核スピンを選択的に制御する手法を新たに考案してシミュレーションでその実用性を示すことに成功した。また、令和元年度に実施予定であった3.量子もつれ検出に向け、NV中心に付随する窒素核スピンのシングルショット測定を実証し、量子もつれ検出の実現可能性を示した。一方で、当初の計画になかった光子とNV中心に付随する電子の量子もつれ状態生成に成功した。集積量子メモリー、量子もつれ状態生成の成果は、長距離通信に向けた量子中継器の基盤技術となる。量子メディア変換やもつれ状態生成は伝送光子と量子メモリーをつなぐための中核技術となり、集積量子メモリーは、複数ノード間のもつれ状態を保持することで量子通信路を多様化するだけでなく、ノード間の量子もつれ生成時においてバッファとして機能することで量子通信の高速化に寄与する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本研究では、情報通信、処理、計算に破壊的イノベーションを生み出す新時代の情報基盤となる長距離量子情報通信ネットワークの実現に向け、ダイヤモンド量子中継器の機能実証を目的とする。初年度はその機能の一部として、量子通信路において情報を伝送するメディアである単一光子から、量子中継地点において情報を保持するメディアとなるダイヤモンド中の単一炭素核スピン量子メモリーへ量子情報を転送(量子テレポーテーション)する量子メディア変換を実証した。核スピンは外界との磁気的な相互作用が電子スピンに比べて約千倍小さいため、環境ノイズに強いが、一方で制御性は悪く光子で直接アクセスすることが出来ない。そこで、インターフェイスとしてダイヤモンド中の単一窒素空孔(NV)中心に捕獲された制御性の良い電子を利用し、制御性の悪い核スピンに対する制御を可能にした。今回扱った同位体炭素(13C)核スピンはダイヤモンド中に天然で1.1%含まれるため、NV中心を構成する窒素の核スピンを対象にした先行研究と比べスケーラブルな集積量子メモリーを実現できるほか、電子スピンから距離が離れているため、電子スピンを介した間接的なノイズに対してもより強固な量子メモリーとなる。本実証は、量子中継における情報保持の誤り耐性や通信の多重化を見出しただけでなく、光子、電子、核子といった異なる粒子から構成されるハイブリッド量子系全体を高度な技術によって制御した数少ない実例であり、粒子ごとの長所短所をうまく活用できるハイブリッド量子系のアプリケーションとしての可能性を示した。初年度は、当初の計画通り、量子メディア変換として光子から13C核スピンへの量子テレポーテーションを実証した。具体的な手法は、電子スピンと核スピンを超微細相互作用によってもつれさせたうえで、電子軌道とスピンがスピン軌道相互作用によりもつれた準位へ光子が吸収される事象を取り出し(もつれ吸収)、条件付きの量子テレポーテーションを行うものである。我々の研究グループが以前に開発したもつれ吸収は、無磁場環境下でスピンが縮退した状況で成り立つ手法である一方で、縮退したスピン1/2の炭素核スピンを制御することが非常に困難であった。これを解決するために、電子スピンに隣り合う窒素核スピンを偏極させ、実効的な局所磁場を電子スピンに与える手法を開発した。磁場によって電子スピンの縮退準位が分裂することで、制御磁場の周波数選択による炭素核スピンの制御およびもつれ生成が可能となった。量子メディア変換後の炭素核スピンのX軸方向射影成分は入力光子の偏光角に依存して変動し、量子情報は正しく炭素核スピンに転写されていることを確認した。それぞれ用意した±X,Y,Zに対応する6つの入力量子状態の変換過程の忠実度は古典限界である66%をすべてで上回っており、量子状態(情報)に依存しない完全な量子過程であることを示した。加えて、NV中心近傍に多数存在する炭素核スピンの同時制御に向けて、常時稼働する相互作用を打ち消すダイナミカルデカップリングの手法を理論的に考案し、実験で実証した。この技術は、量子中継の目的だけでなく、量子センシングという新しいアプリケーションにおいても有用である。

平成30年度は、2.集積メモリーの実現に向け、2個の炭素核スピンと結合したNV中心を用いて伝送光子から核スピン量子メモリーの量子メディア変換の実証に成功し、6個以上の炭素核スピンを選択的に制御する手法を新たに考案してシミュレーションでその実用性を示すことに成功した。また、令和元年度に実施予定であった3.量子もつれ検出に向け、NV中心に付随する窒素核スピンのシングルショット測定を実証し、量子もつれ検出の実現可能性を示した。一方で、当初の計画になかった光子とNV中心に付随する電子の量子もつれ状態生成に成功した。集積量子メモリー、量子もつれ状態生成の成果は、長距離通信に向けた量子中継器の基盤技術となる。量子メディア変換やもつれ状態生成は伝送光子と量子メモリーをつなぐための中核技術となり、集積量子メモリーは、複数ノード間のもつれ状態を保持することで量子通信路を多様化するだけでなく、ノード間の量子もつれ生成時においてバッファとして機能することで量子通信の高速化に寄与する。本研究で得られた量子メディア変換の忠実度劣化はもつれ生成忠実度の劣化が起因しており、独自に開発したダイナミカルデカップリング技術を組み込むことやGRAPEアルゴリズムによる制御パルスの最適化を行うことで改善される。次年度は忠実度を上げることに加えて、ダイナミカルデカップリングを主軸とした複数核スピンの制御技術を確立し、集積炭素核スピン量子メモリーとしての利用を実現する。NV中心電子スピンと炭素核スピン間にはスピン間距離と配置によって決まる磁気的な超微細相互作用が働き、炭素核スピンはそれぞれ異なる速さで歳差運動を行う。これは時間とともに電子スピンと無数の炭素核スピンがもつれて量子系のコヒーレンスが散逸してしまうことを意味するが、独自に開発したダイナミカルデカップリングによって動的に相互作用を切り、コヒーレンスを保持することが出来る。ここで、ラジオ波帯の交流磁場を印可すれば、共鳴する炭素核スピンだけが個別に回転し、選択的な相互作用を生み出される。実験では、2個以上の炭素核スピンに電子スピンからコヒーレントにアクセスし、電子スピンを介して2炭素間の相関を操作するC-NOTゲートを実装することを目指す。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
広汎性発達障害の視線解析と機能画像による病態の研究

自閉性障害、アスペルガー障害などの広汎性発達障害の主要な症状に対人的相互性の障害があるが、その基礎となるのは他者の感情を推定する表情認知の障害であると報告されている。そこで、自閉性障害、アスペルガー障害などの成人広汎性発達障害者について、健常者群と同様の表情の顔をみたときに賦活される脳部位についてfMRIを用いて解析を行って検討した。被験者は12名の成人広汎性発達障害者(平均29.8才)と12名の健常者(平均27.4才)とし、1.5TのMRI装置に仰臥位となり、ヘッドコイルに装着したミラーを通してスクリーンに投影されるHappy(H),Sad(S),Angry(A),Neutral(N)の4種の表情の顔の視覚刺激(ATR製)を見せた。得られた機能画像はSPM5を用いて解析し、H,S,A,Nの4種の表情間の脳の賦活の違いを3つの方法を用いて比較した。すなわち(1)健常群とPDD群においてHvs.N,Svs.N,A vs.Nのように、Happy,Sad,AngryからNeutralを引いた各条件で個人データの解析を行い、引き続き各条件で健常群とPDD群の群間比較を行った。(2)PDD群各個人で(H)vs(N),(S)vs(N),(A)vs(N)の条件間比較による統計画像(contrast map)を求め、次いで、条件間比較で得られたcontrast mapの各ボクセルの値と各個人のAQ-Jスコアの値との相関を求めた。さらに、(3)健常者群の賦活部位から関心領域(Region of Interest:ROI)を設定し、PDD群と比較した。(1),(2)(3)ともに、PDD群では紡錘状回(Ba逹9)、ミラーニューロン領域(Ba44)、補足運動野(Ba6)、帯状回(Ba24)において、(H),(S)の条件下でPDD群が有意な低下を示していた。「悲しみ」や「喜び」の表情でControl群とPDD群に賦活の差があることは、PDD群は相手の情動の状態を読み取る機能に障害があることを示唆し、これらの部位の機能障害あるいは、発達の遅延があることが推定された。自閉性障害、アスペルガー障害などの広汎性発達障害の主要症状に対人的相互性の障害があるが、その基礎に他者の感情を推定する表情認知の障害が報告されている。また、他者の顔を見たときに目の部分を見ることがなく、このことが自閉症などで他者と視線を合わせない特徴を表していると言われる。そこで、本研究では自閉性障害、アスペルガー障害などの成人広汎性発達障害者について、1)表情認知が困難かどうか、2)他者の顔のどの部分を見るか、を視線解析で調べ、3)同様の表情の顔をみたときに賦活される脳部位をfunctional MRI(fMRI)を用いて検討した。被験者は10名の成人広汎性発達障害者(平均29.5才)と10名の健常者(平均28.1才)とし、1.5TのMRI装置(GE社製)に仰臥位となり、ヘッドコイルに装着したミラーを通して、スクリーンに投影されるHappy(H), Sad(S), Angry(A), Neutral(N)の4種の表情の顔の視覚刺激(ATR製)で、1試行は1秒間の表情の提示とそれに続く14秒間の中心固視点の提示とし、1セッションは20試行とした。被験者は同じ表情が2回連続した時にボタンを押すように指示された。得られた機能画像はSPM5を用いて解析し、H, S, A, Nの4種の表情間の脳の賦活の違いを比較した。ボタン押しの正答率は、健常群97.3±1.8%に対して、PDD群では94.5±5.3%で有意差はなかった。(p=0.137)。fMRIは、健常群とPDD群においてH vs. N、S vs. N、Avs. Nのような条件で個人データの解析を行い、引き続き各条件で健常群とPDD群の群間比較を行った。H vs. Nでは中心前回(Ba6)、下前頭回(Ba46, 47)、内側前頭回(Ba10)で有意な賦活の群間差を認めた。S vs. Nでは下前頭回(Ba10)、Avs. Nでは下前頭回(Ba44)に有意な賦活の群間差を認めた。さらにH vs. Aでは中前頭回(Ba6, 9, 10)、H vs. Sでは上前頭回(Ba6, 8)、中前頭回(Ba6)に有意な賦活の群間差を認めた。このように表情認知による賦活には健常群と広汎性発達障害者群の間に有意な差を認めた。また、被験者は、頭部を固定してGomputer display上のhappy, sad, angry, neutralの4種の表情の顔の視覚刺激を見て、DITECT社製のView Trackerにて視線解析を行った。一つの表情の写真を6秒間提示し、顔のどの部分へ視線が動いたかをみるために顔の各部分への総停留時間を調べた。視線の部位、時間には両群間で優位の差はなく、また、同様の顔の映像を見て、1秒間で表情を正しく答えることができるかも調べたところ、視線移動の部位、表情認知の正誤には有意差がなかった。

このことから、広汎性発達障害者群では、表情認知の際に健常群と異なる脳の領域を使って対処している可能性が示唆される。自閉性障害、アスペルガー障害などの広汎性発達障害の主要な症状に対人的相互性の障害があるが、その基礎となるのは他者の感情を推定する表情認知の障害であると報告されている。そこで、自閉性障害、アスペルガー障害などの成人広汎性発達障害者について、健常者群と同様の表情の顔をみたときに賦活される脳部位についてfMRIを用いて解析を行って検討した。被験者は12名の成人広汎性発達障害者(平均29.8才)と12名の健常者(平均27.4才)とし、1.5TのMRI装置に仰臥位となり、ヘッドコイルに装着したミラーを通してスクリーンに投影されるHappy(H),Sad(S),Angry(A),Neutral(N)の4種の表情の顔の視覚刺激(ATR製)を見せた。得られた機能画像はSPM5を用いて解析し、H,S,A,Nの4種の表情間の脳の賦活の違いを3つの方法を用いて比較した。すなわち(1)健常群とPDD群においてHvs.N,Svs.N,A vs.Nのように、Happy,Sad,AngryからNeutralを引いた各条件で個人データの解析を行い、引き続き各条件で健常群とPDD群の群間比較を行った。(2)PDD群各個人で(H)vs(N),(S)vs(N),(A)vs(N)の条件間比較による統計画像(contrast map)を求め、次いで、条件間比較で得られたcontrast mapの各ボクセルの値と各個人のAQ-Jスコアの値との相関を求めた。さらに、(3)健常者群の賦活部位から関心領域(Region of Interest:ROI)を設定し、PDD群と比較した。(1),(2)(3)ともに、PDD群では紡錘状回(Ba逹9)、ミラーニューロン領域(Ba44)、補足運動野(Ba6)、帯状回(Ba24)において、(H),(S)の条件下でPDD群が有意な低下を示していた。「悲しみ」や「喜び」の表情でControl群とPDD群に賦活の差があることは、PDD群は相手の情動の状態を読み取る機能に障害があることを示唆し、これらの部位の機能障害あるいは、発達の遅延があることが推定された。
１８Ｆ標識酢酸誘導体を用いたグリア細胞エネルギー代謝機能測定への挑戦

中枢神経変性疾患の変性過程で、グリア細胞の異常な活性化が起こることが報告され、グリア細胞機能をイメージングするプローブの開発が期待されている。そこで、グリア細胞のエネルギー基質である酢酸の18F標識誘導体がグリア細胞のエネルギー代謝を測定可能か検討した。培養細胞を用いた検討で、18F標識フルオロ酢酸がアストロサイトに集積することを明らかとした。ラットを用いたPETイメージング実験を行った結果、18F標識フルオロ酢酸は投与早期から脳内に集積し、その後滞留することが認められた。このことより18F標識フルオロ酢酸を用いて、脳内グリア細胞のエネルギー代謝を測定できる可能性が示された。中枢神経変性疾患の変性過程で、グリア細胞の異常な活性化が起こり、そこから放出される様々な物質が神経細胞の変性に関与していることが報告され、グリア細胞機能をイメージングするプローブの開発が期待されている。そこで本研究では、グリア細胞のエネルギー基質である酢酸の18F標識誘導体がグリア細胞のエネルギー代謝を測定可能か検討することを目的とする。まずアストロサイトおよびミクログリアを培養して、18F標識フルオロ酢酸の細胞内集積を検討した。その結果、18F標識フルオロ酢酸添加60分後のミクログリアへの放射能集積はほとんど認められなかった。さらにリポポリサッカライドを添加することによって活性化したミクログリアへの18F標識フルオロ酢酸の集積を同様に検討したが、活性化ミクログリアへの集積も観察されなかった。一方アストロサイトへの18F標識フルオロ酢酸の集積を検討したところ、添加60分後に4.15 ±1.14 %ID/mg proteinの集積が認められた。以上の結果より、18F標識フルオロ酢酸はアストロサイトへ集積することが示唆された。ついでラットを用いて18F標識フルオロ酢酸のPETイメージング実験を行った。18F標識フルオロ酢酸は投与早期から脳内に集積し、その集積が維持されることが認められた。一方、血中放射能のクリアランスは速いことも観察された。このことより18F標識フルオロ酢酸を用いて、脳内グリア細胞機能、特にアストロサイトの機能をイメージングできる可能性が示された。そこで本研究では、グリア細胞のエネルギー基質である酢酸の18F標識誘導体(F-18標識フルオロ酢酸およびF-18標識エチルフルオロ酢酸)がグリア細胞のエネルギー代謝を測定可能か検討することを目的とする。本年度は、まずラット胎仔からのグリア細胞、マイクログリア細胞、神経細胞を取り出し初代培養細胞の調製方法を習得を目的とし、培養を行える環境を整えた。現在、初代培養細胞の調製を試みているが、一部の細胞で培養条件を検討中である。手技を習得するのにまだ時間を要する可能性がある。またF-18標識フルオロ酢酸の安定供給可能なを合成方法を開発した。このF-18標識フルオロ酢酸を用いて、ラットにおけるPET撮像実験を行った。その結果、微量ではあるがF-18標識フルオロ酢酸が脳内に集積することを見いだした。ただし、個体により集積値にバラツキが認められ、血中の代謝物を解析したところ、個体間で代謝物のプロファイルが異なる事を見いだした。この事は、PETを撮像する前の個体のエネルギー状態を反映している可能性もあり、絶食の必要性などを検討しているところである。また代謝物の解析方法についても、現在最適化を行っているところである。初代培養細胞の調製手技の習得に予想以上に時間がかかっている。ただし研究代表者のグループでは初めての試みなので、計画の段階から調製手技の習得には時間がかかることを考慮して、研究計画を立てていたので、大きな遅れにはなっていない。また次年度に予定していたPET撮像実験を一部分前倒しして行っているので、トータルとしての遅れはそれほど多くないと考えている。本年度も、培養手技の習得は引き続き行うが、あまりに時間がかかる場合は高価ではあるが市販の培養細胞を購入して、集積メカニズムの解明行う。具体的には、半減期の長い[14C]FAおよび[14C]EFAを用いた初代培養細胞における取込実験を行い、これらのプローブが神経細胞ではなくアストラサイトあるいはミクログリアに集積するのか、またその集積メカニズムについて検討する。次いで、ラットにおけるARG実験にて静脈投与された[14C]FAおよび[14C]EFAが脳内でどのような局在性を持って集積し、その集積がアストロサイトあるいはミクログリア特異的であるかどうかを免疫組織染色と組み合わせることにより検討する。その後、ラットを用いたオートラジオグラフィー実験により、脳内の詳細なフルオロ酢酸誘導体の集積分布を検討する。

さらに昨年度から行っているPET撮像実験を引き続き行い、グリア細胞のエネルギー代謝の測定手法を確立する。次いで、病態モデル動物を用いて同様の実験を行い、病態時のグリア細胞のエネルギー代謝が変化するかを検討する。次年度も、実験に必要な消耗品の購入に大部分の研究費を充てる計画である。具体的には、放射性リガンドである[14C]FAおよび[14C]EFAは酢酸誘導体の初代培養細胞への集積量の検討およびラットでのオートラジオグラフィー実験に必要である。細胞実験に必要な消耗品として、フラスコ、プレート、培地、血清、その他必要試薬を計上している。これらの消耗品は、初代培養細胞を用いた実験を遂行するために必要である。動物実験では、雄性SDラットおよび妊娠14日以降のSD妊娠ラットの使用を予定している。旅費に関しては、国内学会1回を情報収集や成果発表を目的に計上している。これらの出張費は本研究を遂行するための情報収集および成果報告の意味から考えても必要最低限の回数であると考える。
心血管病の発症・進展を予知する新規バイオマーカーの開発

本研究では、肺高血圧症患者、安定狭心症患者、急性冠症候群(急性心筋梗塞・不安定狭心症)患者、慢性心不全(Stage C-D)患者、急性心不全患者を対象として、Rhoキナーゼ活性測定法を確立し、疾患臓器局所および末梢血におけるRhoキナーゼ活性の検討を行った。各心血管病において、疾患臓器局所および末梢血においてRhoキナーゼ活性が亢進していることが明らかとなり、新たな治療戦略となり得ることが示唆された。【目的】本研究は、末梢血中のRhoキナーゼ活性が、代表的な心血管病である肺高血圧症・虚血性心疾患(安定狭心症・急性冠症候群)・心不全(慢性心不全・急性心不全)の発症・進展・重症度を反映するマーカーとなり得るか否かを検討するものである。【方法】Rhoキナーゼ活性測定方法は、まず末梢血から白血球を単離し、タンパクを抽出する。次いでWestern blotting法によりRhoキナーゼの基質であるP-MBSおよびT-MBSの発現を検討し、その比(P-MBS/T-MBS比)をRhoキナーゼ活性と定義する。本研究は短期的には3年で終了するが、510年といった長期観察も可能であるため、将来的にはRhoキナーゼ阻害薬が心血管病に与える影響も検討し、心血管病のマーカーとしてのRhoキナーゼ活性の意義と併せ、その臨床的意義を検討する。【中間結果】今回の中間解析により、肺高血圧症、急性心不全および慢性心不全においてRhoキナーゼ活性が亢進していることが明らかとなり、肺高血圧症ではコントロールの約1.5倍、急性心不全および慢性心不全ではコントロールの約2倍の活性があることを認めた。しかしながら、肺循環血行動態および体循環血行動態とRhoキナーゼ活性の相関は非常に弱いため、Rhoキナーゼの活性化は心不全の発症そのものに関与している可能性があると考える。また虚血性心疾患でもRhoキナーゼ活性の亢進を確認している。平成22年度は、Rhoキナーゼ活性の程度と、心不全および心筋虚血の重症度および予後との相関関係を検討する予定である。我々はそのテクニック、人員を有しており、研究施設および実験設備もすでに揃っている。本臨床研究の肺高血圧症・虚血性心疾患(安定狭心症・急性冠症候群)、心不全(慢性心不全・急性心不全)における研究を開始しており、下記の中間結果を得ている。本研究は短期的には3年で終了するが、510年といった長期観察も可能である。将来的にはRhoキナーゼ阻害薬が心血管病に与える影響も検討し、心血管病のマーカーとしてのRhoキナーゼ活性の意義と併せ、その臨床的意義を検討する。【中間結果】これまでの結果では、肺高血圧症、虚血性心疾患でもRhoキナーゼ活性の亢進を認めた。また急性心不全および慢性心不全においてRhoキナーゼ活性が亢進していることを明らかにし、現在、重症度および予後との相関関係を検討している。本研究では、肺高血圧症患者・虚血性心疾患(安定狭心症・急性冠症候群)患者・心不全(慢性心不全・急性心不全)患者における末梢血のRhoキナーゼ活性を検討した。【結果】肺高血圧症・虚血性心疾患(安定狭心症・急性冠症候群)、心不全(慢性心不全・急性心不全)という心血管病において、Rhoキナーゼ活性の亢進を認めた。また急性心不全の急性期では、1週後の安定期に比し、有意にRhoキナーゼ活性が亢進していることも明らかにした。慢性心不全においては、Rhoキナーゼ活性は様々な心血行動態の指標やBNPなどの重症度とも相関しなかった。

【結語】Rhoキナーゼ活性は様々な心血管病において亢進していた。また慢性心不全においては、既存の指標と異なり、新たな心不全のマーカーとなり得る可能性が示唆された。本研究は短期的には3年で終了するが、510年といった長期観察も可能であり、現在長期観察を開始したところである。
吸収性材料による脊椎固定術に関する実験的研究

当該研究の目的は、不安定脊柱に即時安定性を与え、しかも骨癒合成立時には生理的骨組織の剛性を持つ脊柱再建法として吸収性材料をもちいた椎体間ケージ,ならびに人工椎間板の初期固定のための吸収性材料による固定ピンの開発とそれらの有用性の確認・検討である.研究1.高強度生体活性吸収性ケージを用いた椎体間固定に関する実験未焼結のハイドロキシアパタイトとポリ-L-乳酸1を均一に混合し,特殊な圧縮形成(鍛造整形)により,羊腰椎用の高強度の生体活性・生体内吸収性椎体間ケージ(以下HA/PLLAケージ)を作成した.成羊26頭にHA/PLLAケージを用いて一椎間の後方進入腰椎椎体間固定を行った.8頭に自家腸骨ブロック,8頭に局所海綿を充填したカーボンケージ,10頭に局所海綿を充填したHA/PLLAケージを椎体間に各2個移植した.チタン製椎弓根スクリューによる内固定を併用した.120日後に屠殺し内固定金属を抜去した後,単純X線撮影,冠状断CT撮影を行った.またケージ周辺の状態を組織学的に検討した.HA/PLLAケージの骨癒合はカーボンケージより良好で,周辺骨との間の繊維性組織の介在は少なかった.前後屈・左右モーメントを負荷し2方向写真撮影で椎間可動域,剛性値を計測した.HA/PLLAケージによる再建椎間は自家骨置換と同様の椎間剛性を呈した.研究2.吸収性ピンによる人工椎間板の初期固定性に関する生体力学実験三次元編み物構造をした人頚椎用人工椎間板の初期固定のための吸収性ピン(以下HA/PLLAピン)を作成し,人死体頚椎のC5-6椎間で椎間板を切除し,非損傷椎,人工椎間板置換,腸骨移植,腸骨移植+前方プレート固定の順に力学試験を行った.試験は前後屈,左右側屈,左右軸回旋のモーメントの負荷試験とした.吸収性ピン使用による人工椎間板の初期固定は良好で,非損傷椎に近似した椎間剛性を呈した.また人工椎間板置換モデルの可動域は腸骨移植,腸骨移植+前方プレート固定より良好な可動性を示した.当該研究の目的は、不安定脊柱に即時安定性を与え、しかも骨癒合成立時には生理的骨組織の剛性を持つ脊柱再建法として吸収性材料をもちいた椎体間ケージ,ならびに人工椎間板の初期固定のための吸収性材料による固定ピンの開発とそれらの有用性の確認・検討である.研究1.高強度生体活性吸収性ケージを用いた椎体間固定に関する実験未焼結のハイドロキシアパタイトとポリ-L-乳酸1を均一に混合し,特殊な圧縮形成(鍛造整形)により,羊腰椎用の高強度の生体活性・生体内吸収性椎体間ケージ(以下HA/PLLAケージ)を作成した.成羊26頭にHA/PLLAケージを用いて一椎間の後方進入腰椎椎体間固定を行った.8頭に自家腸骨ブロック,8頭に局所海綿を充填したカーボンケージ,10頭に局所海綿を充填したHA/PLLAケージを椎体間に各2個移植した.チタン製椎弓根スクリューによる内固定を併用した.120日後に屠殺し内固定金属を抜去した後,単純X線撮影,冠状断CT撮影を行った.またケージ周辺の状態を組織学的に検討した.HA/PLLAケージの骨癒合はカーボンケージより良好で,周辺骨との間の繊維性組織の介在は少なかった.前後屈・左右モーメントを負荷し2方向写真撮影で椎間可動域,剛性値を計測した.HA/PLLAケージによる再建椎間は自家骨置換と同様の椎間剛性を呈した.研究2.吸収性ピンによる人工椎間板の初期固定性に関する生体力学実験三次元編み物構造をした人頚椎用人工椎間板の初期固定のための吸収性ピン(以下HA/PLLAピン)を作成し,人死体頚椎のC5-6椎間で椎間板を切除し,非損傷椎,人工椎間板置換,腸骨移植,腸骨移植+前方プレート固定の順に力学試験を行った.試験は前後屈,左右側屈,左右軸回旋のモーメントの負荷試験とした.吸収性ピン使用による人工椎間板の初期固定は良好で,非損傷椎に近似した椎間剛性を呈した.また人工椎間板置換モデルの可動域は腸骨移植,腸骨移植+前方プレート固定より良好な可動性を示した.現在,脊椎固定材料には金属材料が使用されているが,金属材料による固定の結果の高すぎる剛性が隣接の非固定椎間にもたらす様々な弊害が問題となっている.当該研究は、不安定脊柱に即時安定性を与え、しかも骨癒合成立時には生理的骨組織の剛性を持つ脊柱の再建を目指すものである。非荷重部や関節内での骨折治療を中心に、臨床応用されている吸収性骨接合材ポリ-L-乳酸骨接合材(以下PLLA)を素材とする脊椎固定器具を作成し,その力学的特性と脊椎固定術に応用した際の生体内でのPLLAの変化と動態特性、移植骨の骨癒合過程とその力学的特性を評価することにある。本年度は実験用(成羊腰椎用)の椎体間置換材料(ボックス型ケージ)を設計し,作製した.ボックス型ケージは比較実験を行う既成のカーボンケージと同形状とした.さらに作成したケージの力学的強度試験を行い,圧縮荷重に十分耐えることを確認した.ついで成羊を用い腰椎用PLLAケージで腰椎の椎間板を置換するIn vivoの実験を開始した.

実験は腰椎の正側X線撮影後,全身麻酔下で腰椎に後方から進入し,腰椎の後方を横突起まで展開して椎間関節と椎間板を切除してmotion segmentを不安定化する.ついで成羊腰椎用ケージで椎間板置換し,椎弓根スクリュー固定するものである。腰椎の後側方から左右各一個のケージを挿入して椎間板置換を行った.対照として腸骨稜と現在臨床的に使用されているカーボンケージによる椎間板置換固定の2グループを作った.両ケージの中空部分には腸骨片を詰めた.初期固定性獲得のため椎弓根スクリュー固定により椎間固定した.今後,検体数を増やし、移植骨塊の経時的な組織学、力学的特性の推移を検討し、PLLAケージの椎体間固定に及ぼす影響を明らかにする予定である。当該研究は、不安定脊柱に即時安定性を与え、しかも骨癒合成立時には生理的骨組織の剛性を持つ脊柱の再建を目指すものである。未焼結のハイドロキシアパタイトと吸収ポリ-L-乳酸骨接合材(以下HA/PLLA)を混合した素材による脊椎固定器具を作成し,その力学的特性と脊椎固定術に応用した際の生体内でのPLLAの変化と固定椎間の動態特性、移植骨の骨癒合過程とその力学的特性を評価することにある。本年度は,成羊26頭を用い,昨年度に作製した実験用(成羊腰椎用)の椎体間置換材料(ボックス型ケージ)により腰椎の椎間板を置換するIn vivoの実験を開始実施した.実験は腰椎の正側X線撮影後,全身麻酔下で腰椎に後方から進入し,腰椎の後方を横突起まで展開して椎間関節と椎間板を切除してmotion segmentを不安定化する.ついで成羊腰椎用ケージで椎間板置換し,椎弓根スクリュー固定した。腰椎の後側方から左右各一個のケージを挿入して椎間板置換を行った.対照として腸骨稜と現在臨床的に使用されているカーボンケージによる椎間板置換固定の2グループを作った.初期固定性獲得のため椎弓根スクリュー個定により椎間固定した.置換手術の120日後に屠殺し,組織標本を作成し,ケージと椎体界面の接合状態を観察した.さらに椎間可動域,剛性値を測定した.椎間の骨癒合は2群とも全例でえられた.可動域,剛性値は群間で有意差はなかった.今後,検体数を増やし、移植骨塊の経時的な組織学、力学的特性の推移を検討し、HA/PLLAケージの椎体間固定に及ぼす影響を明らかにする予定である。さらにHA/PLLAによる椎体スパイクを作成し,人工椎間板の初期固定性をたかめる方法の実験を開始した.これは可動性を温存した脊柱再建術である人工椎間板の開発と連動するものである.当該研究は、不安定脊柱に即時安定性を与え、しかも骨癒合成立時には生理的骨組織の剛性を持つ脊柱の再建を目指すものである。未焼結のハイドロキシアパタイトと吸収ポリ-L-乳酸骨接合材(以下HA/PLLA)を混合した素材による脊椎固定器具を作成し,その力学的特性と脊椎固定術に応用した際の生体内でのPLLAの変化と固定椎間の動態特性、移植骨の骨癒合過程とその力学的特性を評価し臨床使用上の有用性を検討することにある。昨年度までの研究では置換材の癒合範囲と固定椎間の剛性値に正の相関のあることが解明された.本年度の研究では、他の置換材料と比較することによりHA/PLLAケージの有用性を検討する目的で、実験用(成羊腰椎用)の椎体間置換材料(ボックス型ケージ)により腰椎の椎間板を置換するIn vivoの実験を実施した.成羊26頭に1椎間後方進入椎体間固定を施行した.うち8頭は自家腸骨ブロックで、8頭は局所海綿骨を充填したカーボンケージで、10頭は局所海綿骨を充填したHA/PLLAケージで椎体間を置換した.単純レントゲン、CTで置換椎の癒合状態を評価し、さらに力学的実験により、癒合椎の力学的評価を行った.
ダイヤモンド遷移金属炭化物複合材の作製

炭化ジルコニュウム(ZrC)の微粉末試料を400500°C、酸素分圧416kPaで部分酸化すると六方晶ダイヤモンドを微量にち含む炭素がZrO_2と共に生成することを見いだした。従って、このZrCの部分酸化を利用することによってダイヤモンド-ZrC複合材を作製し、さらに、この手法を他の炭化物へ適用すると標題の研究へと展開できるので、ダイヤモンドを含む炭素の析出過程を検討すると共に標題の研究を遂行した。その結果、次の知見が得られた。1.FZ法で育成したZrC単結晶を(100)で切り出し、その研磨した鏡面を酸素分圧2.6kPa、温度500,550,600°Cで酸化した。酸化試料の切断面の電子顕微鏡観察、EPMA分析の結果、生成層としてZrCに密着して炭素を多量に含む密なZrO_2の層とクラックが多数入ったZrO_2層の2層が生成することが分かった。前者における炭素量は30100mol%にも達した。2.この炭素が析出したZrO_2層の厚さは時間によらず一定で、500,550,600°Cで、それぞれ、1,2,3μmとなった。3.HfCの微粉末試料を480600°Cで酸化した結果、HfO_2と共にi、またはアモルファスカーボンが生成したのでHfCの場合もダイヤモンドの生成の可能性が考えられた。そこで、HfC単結晶をZrCの場合と同様に酸化した結果、HfCに密着した炭素を多量に含むち密なHfO_2層が生成し、その厚さは温度、酸素分圧によらず一定で25μmであった。以上の結果から、ZrC,HfCを酸化すると厚さが15μmの炭素を非常に多く含む酸化物層が生成することが明かとなった。この層中の炭素を電子線回折法で同定すべく試料の作製を行ったが、極めて硬い炭化物結晶と非常に柔らかい炭素を含む酸化物層とのイオンエッチングの度合の大きな差により試料作製は困難を極め末だ成功していない。この電顕用試料作製の成否が上記の層中におけるダイヤモンドの生成を決定できる重要な鍵となるので、現在、鋭意試料作製を続行している。1.ZrC微粒子を酸素分圧1.3-16kPa、温度400-600°Cで所定の酸化率まで酸化し、この試料の電子線回折の結果に基づき、六方晶ダイヤモンドの生成領域を求めた。六方晶ダイヤモンドは、酸化生成物である酸化ジルコニウムと共に生成し、主に酸素分圧2.6kPa,温度400-550°Cで生成し、温度が600°C以上になると酸化が進行し生成物は全て酸化ジルコニュウムとなった。酸化試料のラマン分光測定の結果、結晶性の低い酸化ジルコニュウムと共に無定形の炭素が析出することが分かった。

2.FZ法により育成した単結晶ZrCの酸化実験を酸素分圧2.6kPa、温度450°Cで行い、その試料の断面の走査電子顕微鏡観察とX線マイクロアナライザ-による酸素、ジルコニュウム、炭素の分析の結果、酸化物層と炭化ジルコニュウム層の間に約1μmの厚さで炭素の薄層が存在することが分かった。このことから、ZrCの酸化により酸化ジルコニュウムが生成するがこの層が酸素の拡散に対する障壁となり、ZrC/ZrO2界面における酸素濃度が低くなり、ZrCのC成分まで酸化出来ず無定型炭素が析出したものと考えられる。この際に、無定型炭素とともに六方晶ダイヤモンドが生成したのであろう。3.ZrCと同じ遷移金属炭化物であるTiCの酸化を酸素分圧4-16kPa、温度360-600°Cで行い、ZrCと同様にダイヤモンドの生成するか否か検討した。その結果、TiCの酸化は拡散が律速となり進行するが拡散層がチタンの低級酸化物であるため、この酸化物のアナタ-ゼへの結晶化とそれに伴うクラッキングが拡散層で生じる。この結果、酸素のアナタ-ゼ層中での拡散の抵抗がなくなりTiCの酸化が充分進み炭素の析出が起きないことが分かった。炭化ジルコニュウム(ZrC)と炭化ハフニュウム(HfC)の単結晶試料を所定の酸素分圧、温度で酸化することによって、六方晶ダイヤモンドを含む炭素膜を直接ZrC,HfCの上に生成させ、ダイヤモンド-遷移金属炭化物複合材を作製することを試みた。1.ZrC微粉末試料を酸素分圧2.6kPa、460°Cで酸化し、その試料のレーザーラマン分光分析を行った結果、i-もしくはアモルファスカーボンがZrO_2と共に生成することが分かった。しかしながら、ダイヤモンドに相当するピークは上記の炭素のピークがブロードで大きいため検出できなかった。2.FZ法で育成した単結晶ZrCの(100)面で切り出し、その鏡面研磨した面を酸素分圧2.6kPa,温度500,550,600°Cで0200h酸化した。酸化試料を切断し、その面の走査型電子顕微鏡による生成相の形態観察、背面反射法による組成像の観察さらにEPMAによる酸素、炭素、Zr元素の定量分析を行った。(1)各温度で酸化した試料共に、生成相ZrO_2はZrCに密着したち密なクラックのない中間層(M層)とクラックの多数入ったZ層の2層から成り立っていることが分かった。(2)このM層中には炭素がZrO_21molに対して30100mol%も含まれており、Z層へ向かって緩やかな濃度勾配を示した。また、Z層中にも炭素が残存していた。(3)このM層の厚さは、500,550,600°Cでは1,2,3μmと一定の値となった。3.HfC単結晶についても、28kPa、500900°Cで酸化し同様な手順で酸化層の電子顕微鏡観察とEPMA分析を行った。その結果、酸素分圧、温度によらずHfCに密着して炭素を多量に含む厚さ25μmのHfO_2層とクラックが多数入ったHfO_2層が生成することが分かった。
疾患特異的iPS細胞を用いた3次元創薬プラットフォームの構築

iPS細胞技術は、根本治療薬がない神経・精神疾患のin vitro創薬研究に応用され成果を上げつつ有る。in vitro系においても、細胞外の足場環境と細胞接着因子シグナルなど実験条件を、より生理的環境に近づけるために、3次元細胞培養の重要性が指摘されている。神経疾患研究においても、平面培養下における神経細胞のみを対象するのではなく、様々な細胞が本来の位置情報を有している3次元モデルを導入することでより精緻な病態および創薬研究が出来ると考え、研究を進めた。平成29年度は、ヒトiPS細胞から、3次元神経組織を分化誘導する技術を開発することを目的として、ヒトiPS細胞から純粋な神経細胞集団を構築する技術を安定させることに成功し、最終的にアルツハイマー病の創薬スクリーニングプラットフォームの開発、及びこれを用いた既存薬ライブラリのスクリーニングを経て、アルツハイマー病のAβ治療薬候補を同定するに至った(Kondo et al. Cell Reports 2017)。均一な細胞集団を構築し、アルツハイマー病の創薬スクリーニングにも成功し、導出したiPS細胞由来神経細胞の品質が3次元培養法開発に適した高品質の細胞集団であることを示すことに成功した。一方で、3次元構築された細胞集団を顕微鏡で観察する際に、蛍光散乱の結果ある深度以上の微細構造観察が困難であることが判明し、次年度以降この問題の解決に取り組む予定である。より高深度の微細構造を観察するために、適切な顕微鏡光学系の検討と、細胞ラベル法の改善に取り組む。さらに、見出したアルツハイマー病表現系を修飾できることを見出している、βsecretase阻害薬やγsecretase修飾薬などを用いた薬効評価についても進めていく。培養細胞のスケールを適切なレベルに最適化し、維持培養に関わる消耗品を最小限に抑えることで、コスト削減を行った。平成30年度以降に行う、光学系の最適化、細胞ラベル法の最適化には、当初計画よりも大きいコストがかかることが明らかとなったため、この点をクリアするために有用な運用をすることが出来る。
肝細胞癌に対するMAGE-1遺伝子産物ターゲットとした特異的免疫療法

【背景・目的】われわれは,肝細胞癌に高率(80%)にMAGE-1遺伝子の発現がみられることを報告した.本研究の目的は,MAGE遺伝子産物をターゲットとした肝細胞癌特異的な免疫療法の臨床応用が可能であるかどうか検討するものである.【方法・結果】肝切除術が施行された原発性肝癌症例を対象とし,腫瘍組織よりmRNAを抽出し,β-actinの発現を確認した後,異なるExon間にPrimerを設定し,RT-PCR法によりMAGE-1,2,3遺伝子の発現を観察した.また,肝臓由来の細胞株でも同様の検討を行った.肝癌組織で高率にMAGE-1および-3遺伝子の発現が確認された.切除肝あるいは生検肝を用い,免疫組織学的方法によりMAGE遺伝子産物の発現の検討を行っている.抗原特異的免疫療法を行うためには,MAGE-1蛋白のT細胞エピトープを明らかにし,エピトープペプチドによるその反応性を検討することが重要である.MAGE-1蛋白のエピトープは、現在のところHLAA1でしか明らかにされていないため,別に研究を進めている原発性胆汁性肝硬変の抗原エピトープ特異的T細胞を用いて,自己抗原エパトープ・ペプチドのアナログペプチドに対するT細胞応答性を解析中である.【今後の計画】患者と同一のHLA classI抗原を有した細胞株にMAGE-1遺伝子を導入し,mRNAおよび蛋白レベルでのMAGE-1遺伝子の発現をRT-PCR法およびサザンブロッティング法で確認する.さらに,患者から採取したTリンパ球を,HLA class I matched MAGE-1陽性細胞株をfeederとして培養し,51Crリリース法を用い,feederとして用いた細胞に特異的な細胞障害活性を検討中である.(本研究は13年度途中で研究代表者石橋大海異動のため林田一洋が継続)われわれは,肝細胞癌に高率(80%)にMAGE-1遺伝子の発現がみられることを報告した.本研究の目的は,MAGE遺伝子産物をターゲットとした肝細胞癌特異的な免疫療法の臨床応用が可能であるかどうか検討するものである.肝切除術が施行された原発性肝癌症例を対象とし,腫瘍組織よりmRNAを抽出し,β-actinの発現を確認した後,異なるExon間にPrimerを設定し,RT-PCR法によりMAGE-1,2,3遺伝子の発現を観察した.また,肝臓由来の細胞株でも同様の検討を行った.肝癌組織で高率にMAGE-1および-3遺伝子の発現が確認された.切除肝あるいは生検肝を用い,免疫組織学的方法によりMAGE遺伝子産物の発現の検討を行っている.抗原特異的免疫療法を行うためには,MAGE-1蛋白のT細胞エピトープを明らかにし,エピトープペプチドによるその反応性を検討することが重要である.MAGE-1蛋白のエピトープは,現在のところHLA A1でしか明らかにされていないため,別に研究を進めている原発性胆汁性肝硬変の抗原エピトープ特異的T細胞を用いて,自己抗原エピトープ・ペプチドのアナログペプチドに対するT細胞応答性を解析している.【背景・目的】われわれは,肝細胞癌に高率(80%)にMAGE-1遺伝子の発現がみられることを報告した.本研究の目的は,MAGE遺伝子産物をターゲットとした肝細胞癌特異的な免疫療法の臨床応用が可能であるかどうか検討するものである.【方法・結果】肝切除術が施行された原発性肝癌症例を対象とし,腫瘍組織よりmRNAを抽出し,β-actinの発現を確認した後,異なるExon間にPrimerを設定し,RT-PCR法によりMAGE-1,2,3遺伝子の発現を観察した.また,肝臓由来の細胞株でも同様の検討を行った.肝癌組織で高率にMAGE-1および-3遺伝子の発現が確認された.切除肝あるいは生検肝を用い,免疫組織学的方法によりMAGE遺伝子産物の発現の検討を行っている.抗原特異的免疫療法を行うためには,MAGE-1蛋白のT細胞エピトープを明らかにし,エピトープペプチドによるその反応性を検討することが重要である.MAGE-1蛋白のエピトープは、現在のところHLAA1でしか明らかにされていないため,別に研究を進めている原発性胆汁性肝硬変の抗原エピトープ特異的T細胞を用いて,自己抗原エピトープ・ペプチドのアナログペプチドに対するT細胞応答性を解析中である.【今後の計画】【背景・目的】われわれは,肝細胞癌に高率(80%)にMAGE-1遺伝子の発現がみられることを報告した.本研究の目的は,MAGE遺伝子産物をターゲットとした肝細胞癌特異的な免疫療法の臨床応用が可能であるかどうか検討するものである.【方法・結果】肝切除術が施行された原発性肝癌症例を対象とし,腫瘍組織よりmRNAを抽出し,β-actinの発現を確認した後,異なるExon間にPrimerを設定し,RT-PCR法によりMAGE-1,2,3遺伝子の発現を観察した.また,肝臓由来の細胞株でも同様の検討を行った.肝癌組織で高率にMAGE-1および-3遺伝子の発現が確認された.切除肝あるいは生検肝を用い,免疫組織学的方法によりMAGE遺伝子産物の発現の検討を行っている.抗原特異的免疫療法を行うためには,MAGE-1蛋白のT細胞エピトープを明らかにし,エピトープペプチドによるその反応性を検討することが重要である.

MAGE-1蛋白のエピトープは、現在のところHLAA1でしか明らかにされていないため,別に研究を進めている原発性胆汁性肝硬変の抗原エピトープ特異的T細胞を用いて,自己抗原エパトープ・ペプチドのアナログペプチドに対するT細胞応答性を解析中である.【今後の計画】患者と同一のHLA classI抗原を有した細胞株にMAGE-1遺伝子を導入し,mRNAおよび蛋白レベルでのMAGE-1遺伝子の発現をRT-PCR法およびサザンブロッティング法で確認する.さらに,患者から採取したTリンパ球を,HLA class I matched MAGE-1陽性細胞株をfeederとして培養し,51Crリリース法を用い,feederとして用いた細胞に特異的な細胞障害活性を検討中である.(本研究は13年度途中で研究代表者石橋大海異動のため林田一洋が継続)