hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
通信データ列特徴量の類似性に基づいた不正アクセス逆探知方式

本研究では、専門家の解析により作られるプロファイルの完成を待たずに不正アクセスの同一性を判断し、発生源となったネットワークやノードを発見する逆探知の基礎技術の開発を目的としている。この目的を達成するための最重要事項は、健全な利用者のプライバシーを侵すことなく通信の同一性を判断するための方式の開発とし、不正アクセスの通信データの特徴を数値化する方式の開発を行った。具体的には、通信データのプロトコルヘッダ部を除いた部分をnビット毎のコードに分解し、それぞれのコードの発生頻度をヒストグラムとして表すことを行った。この結果、ある種類の不正アクセスと他の種類の不正アクセスや正常な通信との弁別が可能であることが判明した。この結果を利用し、従来とはことなる不正アクセスのシグネチャ作成方式を確立した。このシグネチャを不正アクセスの識別子として用いることにより、その発生源の逆探知を実現する可能性を見出すことが出来た。また、この識別子を利用した逆探知方式の検証実験に用いる実験ネットワークを仮想化技術を利用し構築し、複数の不正アクセスを感染させ、実際に多数のノードへ感染活動を行う様子の観測に成功することが出来た。更に、本研究で提案した不正アクセス識別子を利用した不正アクセスの逆探知システムの構築を行った。逆探知システムでは、観測した通信の種別、観測時刻、送信元、識別子の4つの情報を保持する必要があることが明らかとなった。この情報を利用し、実験ネットワークで再現し観測した不正アクセスの識別子と不正アクセス以外の通信の識別子を混在させたデータから逆探知対象の不正アクセスのみを抽出し、感染経路の再現を試みた所、MyDoomyaSWENなどの拡散型ワームの逆探知に成功し、拡散型不正アクセス逆探知の基礎技術の確立に成功した。更に、提案した識別子を利用した不正アクセス検知システムの構築も試みた。これは、従来の文字列マッチングとは異なる不正アクセスの検知を実現するもので、検知対象とする不正アクセスの種類が増加した場合でも、計算負荷の増加が従来方式と比較して、大幅に抑えられることを確認し、国際学会での発表を行った。

この結果、ある種類の不正アクセスと他の種類の不正アクセスや正常な通信との弁別が可能であることが判明した。この結果を利用し、従来とはことなる不正アクセスのシグネチャ作成方式を確立した。このシグネチャを不正アクセスの識別子として用いることにより、その発生源の逆探知を実現する可能性を見出すことが出来た。また、この識別子を利用した逆探知方式の検証実験に用いる実験ネットワークを仮想化技術を利用し構築し、複数の不正アクセスを感染させ、実際に多数のノードへ感染活動を行う様子の観測に成功することが出来た。更に、本研究で提案した不正アクセス識別子を利用した不正アクセスの逆探知システムの構築を行った。逆探知システムでは、観測した通信の種別、観測時刻、送信元、識別子の4つの情報を保持する必要があることが明らかとなった。この情報を利用し、実験ネットワークで再現し観測した不正アクセスの識別子と不正アクセス以外の通信の識別子を混在させたデータから逆探知対象の不正アクセスのみを抽出し、感染経路の再現を試みた所、My Doomya SWENなどの拡散型ワームの逆探知に成功し、拡散型不正アクセス逆探知の基礎技術の確立に成功した。
グローバル都市のスケール則 : 新たな都市地理学の定義に向けて

最終年度は、今まで行ってきた研究成果を統合し地域レベルでの応用を試みた。それらは主に下記の二つの研究からなる。一つは、Googleから入手したデータベースを活用し、複数の都市における関連事項を200年にわたる時間スケールでチャート化し、今まで量的に測的できていなかった都市の特徴を可視化することができた。本成果の論文を作成中である。また、生物多様性条約(CBD)の地域スケールでの実践となる都市のマクロレベル解析を行い、その結果は、2011年5月にJournal Biological Conservationに掲載され、過去6カ月において最もダウンロードされた25の論文のうちの一つとなっている。二つ目は、国連大学高等研究所で行われている都市開発のコベネフィット(co-benefit)に関する研究調査である。コベネフィットとは温室効果ガス及び大気中の汚染物質を同時に削減することである。本プロジェクトでは交通セクターについて研究を行った。持続的な交通システムの理論的枠組みを発展させ、複数の交通対策のシナリオ設定の為の評価ツールを開発した。本ツールは、ASIF枠組み;交通重要野削減(A)、大気汚染削減への変換(S)、燃料効率の向上(1),燃料の切り替え(F),を基に、交通の脱炭素を目指す。また、途上国の様々な統治能力を考慮し、ツールのガイドブックを作成した。2011年7月に開催されたThe International Forum for Sustainable Asia and Pacific (ISAP)inconjunction with the Asia Co-Benefit Partnershipにて本成果の発表を行った。本ツールの実証性を検証する為に、インドデリーにて事例研究を行った。2011年7月の現地調査では、市行政、交通部局、研究者、デリーメトロ会社等にインタビューを行い、データを収集した。この現地調査を通して、データ収集だけでなく、交通システムの構造及び都市への影響を把握することができた。これらの情報を活用し、ツールを使い現在および将来のコベネフィットを計算するモデル解析を行った。研究活動:2009年11月、受け入れ研究機関である東京大学で最初の発表を行った。中旬には、国立環境研究所(NIES)開催の「都市とカーボンマネージメント」国際シンポジウムに参加、後日、事務局長と研究についての意見交換を行った。また、国連大学高等研究所のニューフェローシッププレゼンテーションで発表を行った。2010年1月、東京大学で第2回の発表を行った。このセミナーでは、以前世界銀行データをもとに構成した大気汚染(PM10)の空間的明示データセットの作成と分析の概要について説明した。このデータセットは、現在都市における大気環境情報を集めた他のデータセットと共に使用される予定である。中国南部の台風活動が経済に及ぼす影響について、京都大学との共同研究も話し合われた。この研究には、空間的なデータセットのための外部ディスクドライブ装置と外部モニターが必要となる。論文:持続可能性における人口の役割についての論説が国連大学ウェブマガジンに掲載された。その他、2010年4月のアメリカ地理学者協会(AAG)年次会(ワシントンDC、米国)、10月の都市グローバル環境変化についての会議(アリゾナ州、米国)にも参加を予定しており、要約論文も提出されている。また、2010年10月に名古屋で開催される生物多様性会議に向けて、政策レポートの作成準備も進められている。設備準備:データ分析・調査研究のためのノートパソコン、英語仕様のMSオフィスソフト、ArcGISソフトなどを購入。これらのソフト購入により、1992年-2008年の夜間ライト衛星画像の拡張時系列の公開が可能となり、これらのデータは更なる分析のためのGISに処理・取り込まれ、他都市レベル統計データが集まった。集まった統計データは既存のデータや結果の比較も可能となった。他のエリアについても文献調査とデータ収集を予定している。1)アメリカ地理学会年次会における口頭発表:東京大学・国連大学高等研究所の研究者との意見交換等を基にして構築した都市開発の理論に関する発表を行った。2)都市の生態モデル分析に関する査読論文執筆:空間グリッド個体数(ランドスキャン)及びGDPデータセットを用い、都市の生態系モデル分析を行った。3)GISを用いた人口推計に関する研究:夜間サテライト照明画像による無電化人口の推計に関する既往研究を基に、地域別最小検知可能人口推計を行う研究を行い、アジア太平洋先端ネットワーク(2010年8月、ハノイ)にて研究結果を発表した(査読付国際会議論文として会報に掲載)。4)第1回都市化と地球環境変化に関する国際会議における発表:経済活動が生態系に与える長時間のストレスに関する研究を第1回都市化と地球環境変化に関する国際会議(アリゾナ)にて発表。5)都市と生物多様性に関する発表都市と生物多様性に関する指数のワークショップ(2010年7月、シンガポール)にて、都市が生物多様性へあたえる長期的影響についての専門家として出席。6)若手研究者支援活動ProSPER.Net大学ネットワークを通してアジア太平洋地域博士課程向け若手研究者スクールにおいて講師として参加。また、「第2回若手研究人材育成プログラム(2010年8月、東京)」の開催にも携わった。7)コベネフィット型都市開発へ関わる研究当該プロジェクトは大気汚染など地域開発における懸念と温室効果ガスの削減によって地球気候変動を緩和するといった2側面を同時に分析評価するもので、都市専門家として参画。8)教育活動明治学院大学の学部生に対して講演を行った。1)英国における環境問題に関して2)GIS等を用いた都市環境研究について9)メディア関連都市地域の資源生産可能性について国際連合大学のウェブマガジンへ多数投稿した。これらの記事の一部は英国の新聞にもニュースソースとして採用された。

最終年度は、今まで行ってきた研究成果を統合し地域レベルでの応用を試みた。それらは主に下記の二つの研究からなる。一つは、Googleから入手したデータベースを活用し、複数の都市における関連事項を200年にわたる時間スケールでチャート化し、今まで量的に測的できていなかった都市の特徴を可視化することができた。本成果の論文を作成中である。また、生物多様性条約(CBD)の地域スケールでの実践となる都市のマクロレベル解析を行い、その結果は、2011年5月にJournal Biological Conservationに掲載され、過去6カ月において最もダウンロードされた25の論文のうちの一つとなっている。二つ目は、国連大学高等研究所で行われている都市開発のコベネフィット(co-benefit)に関する研究調査である。コベネフィットとは温室効果ガス及び大気中の汚染物質を同時に削減することである。本プロジェクトでは交通セクターについて研究を行った。持続的な交通システムの理論的枠組みを発展させ、複数の交通対策のシナリオ設定の為の評価ツールを開発した。本ツールは、ASIF枠組み;交通重要野削減(A)、大気汚染削減への変換(S)、燃料効率の向上(1),燃料の切り替え(F),を基に、交通の脱炭素を目指す。また、途上国の様々な統治能力を考慮し、ツールのガイドブックを作成した。2011年7月に開催されたThe International Forum for Sustainable Asia and Pacific (ISAP)inconjunction with the Asia Co-Benefit Partnershipにて本成果の発表を行った。本ツールの実証性を検証する為に、インドデリーにて事例研究を行った。2011年7月の現地調査では、市行政、交通部局、研究者、デリーメトロ会社等にインタビューを行い、データを収集した。この現地調査を通して、データ収集だけでなく、交通システムの構造及び都市への影響を把握することができた。これらの情報を活用し、ツールを使い現在および将来のコベネフィットを計算するモデル解析を行った。
形態学的診断が困難な中枢神経疾患の生化学マーカーの探索

アルツハイマー病(AD)は認知症と脳萎縮を示すが、脳萎縮を示す病期には神経細胞の多くが死滅しており、この病気からの回復は困難である。従って、脳萎縮が起こる以前の早期診断法が求められている。我々は、髄液に特徴的な糖鎖を持つ糖タンパク質を17種類見出した。イムノブロット法にてADマーカーとしてのスクリーニングを行ったが、良い結果は得られなかった。糖タンパク質は、同じタンパク質が複数の糖鎖を持つ(糖鎖アイソフォーム)ことが多いが、イムノブロット法では糖鎖アイソフォームは区別されない。最近、我々は糖鎖アイソフォームを簡便に区別する方法を開発した。この方法を用いてスクリーニングを続ける予定である。髄液中の一群のタンパク質が、血清では見られないユニークな糖鎖修飾を受けていることを見出した。これらの“髄液型"糖タンパク質は中枢神経系で生合成されていると考えられるため、中枢疾患マーカーになることが期待された。本研究では、これらの分子のアルツハイマー病マーカーとしての可能性を検討している。具体的には、“髄液型"糖タンパク質の中から、(1)アルツハイマー病と他の認知症で差のあるものを見出すこと(鑑別診断マーカー)、(2)コントロールから前病変である軽度認知症障害を経て、アルツハイマー病へと進行するにつれ変化するマーカーを同定すること(進行度マーカー)、(3)見出されたマーカーのハイスループット・スクリーニング法を開発すること、の3点を目標とした。共同研究の実績がある10医療機関で、臨床診断が確定した認知症関連疾患の患者から採取された髄液について検討を行い、以下の成果が得られた。(1)認知症の鑑別診断マーカーについては、髄液型トランスフェリンにより、特発性正常圧水頭症とその他の認知症(アルツハイマー病、軽度認知症、前頭葉側頭葉型認知症、レビー小体型認知症など)が鑑別可能であることが示された。(2)平成24年度までのスクリーニングでは、アルツハイマー病の進行度マーカーは見出されなかった。(3)タンパク質部分は同じであるが、糖鎖(マーカー)部分のみが異なる糖鎖アイソフォームを、ハイスループットでスクリーニング可能な測定方法の開発を行った。例えば髄液型トランスフェリンの測定では、平成23年度には1020 sample/dayであったのが、平成24年度では60 sample/hのハイスループットが達成され、臨床応用が可能なレベルとなった(特願2012-178722、投稿準備中)。我々は、髄液中の一群のタンパク質が、血清では見られないユニークな糖鎖修飾を受けていることを見出した。これらの“髄液型"糖タンパク質は中枢神経系で生合成されていると考えられたため、中枢疾患マーカーになることが期待された。本研究では、これらの分子のアルツハイマー病マーカーとしての可能性を検討し、有望なマーカーを見出した。髄液中における新規マーカーはアルツハイマー病で有意の上昇を示した(p = 0.00017)。本年度は、糖鎖アイソフォームのハイスループット測定法として、糖鎖結合性タンパク質であるレクチンと抗体を組み合わせた新規測定方法を開発した。いわゆる“もの忘れ外来"を受診する患者は、認知障害の程度により、(i)正常域、(ii)軽度認知障害(Mild Cognitive Impairment: MCI)、(iii)アルツハイマー病(AD)の3段階に分類される。これらの患者を年余にわたって観察すると、正常域から軽度認知障害、さらにはアルツハイマー病へと進行する例があるため、見出された新規診断マーカーが進行度マーカーとなり得るか否かを検討する予定である。この実証のためには、MCIからADに進行したグループ、および数年以上MCIに留まったグループの2群の解析が必要であるが、共同研究者より髄液試料を収集中である。製薬会社によりアルツハイマー病治療薬が開発され臨床試験が行われたが、有効性は実証されなかった。7080%の神経細胞が死滅したAD状態(MRI上脳萎縮が認められる)からの回復は難しいと考えられる。治療薬は、神経細胞死が軽度(例えばMCI)の時期に投与されるべきである。しかし、現状ではアルツハイマー病の早期診断は難しい。本研究によって見出された新規マーカーが早期診断に応用され、治療開始の早期化に貢献できることが期待される。髄液中の一群のタンパク質が、血清では見られないユニークな糖鎖修飾を受けていることを見いだした。これらの"髄液型"糖タンパク質は中枢神経系で生合成されていると考えられるため、中枢疾患マーカーになることが期待された。本研究では、これらの分子のアルツハイマー病マーカーとしての可能性を検討する。具体的には、"髄液型"糖タンパク質の中から、

(1)アルツハイマー病と他の認知症で差のあるものを見出すこと(鑑別診断マーカー)、(2)コントロールから前病変である軽度認知症障害を経て、アルツハイマー病へと進行するにつれ変化するマーカーを同定すること(進行度マーカー)、(3)見出されたマーカーのハイスループット・スクリーニング法を開発すること、の3点を目標とした。共同研究の実績がある10医療機関で、臨床診断が確定した認知症関連疾患の患者から採取された髄液について検討を行い、以下の成果が得られた。(1)認知症の鑑別診断マーカーについては、髄液型トランスフェリンにより、特発性正常圧水頭症とその他の認知症(アルツハイマー病、軽度認知症、前頭葉側頭葉型認知症、レビー小体型認知症など)が鑑別可能であることが示された。(2)平成23年度の研究では、アルツハイマー病の進行度マーカーは見出されなかった。(3)タンパク質部分は同じであるが、糖鎖(マーカー)部分のみが異なる糖鎖アイソフォームを、ハイスループットでスクリーニング可能な新しい測定原理を見出した。当初の目的のうち、認知症の鑑別診断マーカーについては、特発性正常圧水頭症と他の認知症の鑑別診断マーカーを見出すことができた。しかし、アルツハイマー病に特徴的な進行度マーカーは未だ見出されていない。平成24年度の研究成果である、トランスフェリン糖鎖アイソフォームの新規測定原理の発見は、我々独自のユニークなものであり、今後の応用展開が期待され、十分な達成度が得られたものと考えている。平成23年度の研究成果である、トランスフェリン糖鎖アイソフォームの測定原理の発見は、我々独自のユニークなものであり、今後の応用展開が期待され、十分な達成度が得られたものと考えている。アルツハイマー病の進行度マーカーについては、今後もスクリーニングを続ける。したがって、当初の目標を平成25年度も継続する。また、トランスフェリン糖鎖アイソフォームの測定法の完成を目指す。マーカー候補のスクリーニングについては平成23年度のみの成果であり、今後もスクリーニングを続けることによって、アルツハイマー病の進行度マーカーの発見が期待される。したがって、当初の目標を平成24年度以降も継続する。本研究は、多数の分子を対象としてスクリーニングを行う研究であることから、実験補助員の雇用を計画している。また、タンパク質分子の糖鎖をマーカーとする研究であることから、タンパク質部分に対する抗体および糖鎖部分を認識するレクチンなどの試薬を購入する。さらに、ハイスループット用スクリーニングでは、マイクロタイタープレートなどのプラスチック器具を購入する。その他、成果を発表するため学会参加旅費を支出する。また、論文発表の費用も支出する予定である。
C_4光合成遺伝子の転写制御機構に関する研究

C4光合成回路を構成する遺伝子の一つであるPdk(ホスホエノールピルビン酸Piジキナーゼ)遺伝子は、C4植物であるトウモロコシばかりでなくイネ、C3植物にもその構造が類似した遺伝子が存在する。Pdk遺伝子は1つの遺伝子から2つの転写産物を産生する(葉緑体型、細胞質型)。イネの細胞質型Pdk遺伝子のプロモーター領域をGUS(β-グルクロニダーゼ)遺伝子とつなげたコンストラクトをトウモロコシプロトプラストに導入すると、高い活性がみられたのに対し、葉緑体型Pdk遺伝子プロモーターはイネ由来のものはトウモロコシ由来ものに比べ約4倍GUS活性が低かった。さらにトウモロコシの葉緑体型Pdk遺伝子プロモーター::GUSコンストラクトをイネに導入すると、GUSの発現は葉肉細胞特異的さらに光依存的に高い発現を示した。このことからC3植物からC4植物へはシス領域が進化し、イネ葉肉細胞にもトウモロコシのPdk遺伝子の細胞特異的、光依存的発現を引き起こすのに十分な転写制御系が存在していることを示している。これらの結果から、トウモロコシゲノムをイネに導入すれば、組織特異的に高い発現をすることが予想された。実際にトウモロコシのPpc(ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ)遺伝子をイネに導入した結果、野性株に比べ約30_7100倍もの活性をもつ個体が得られた。(1)C3植物(イネ)よりC4光合成酵素の一つであるピルビン酸Piジキナーゼ(PPDK)遺伝子を単離し、そのプロモーター領域をクローン化した。その塩基配列をC4植物(トウモロコシ)のPPDK遺伝子のそれと比較したところ、類似した領域とそうではない領域が存在していることがわかった。(2)トウモロコシPPDK遺伝子のプロモーター配列を5'末端から削除したプロモーター断片を準備し、これらのプロモーター断片とGUS遺伝子を結合したキメラ遺伝子を作成した。これらのキメラ遺伝子をトウモロコシの葉肉細胞にエレクトロポレーションにより導入してGUS活性を測定することによりプロモーターの活性の強さを測定したところ、トウモロコシPPDK遺伝子の高いレベルの発現には-174から-83までの領域が重要であることがわかった。イネの細胞質型Pdk遺伝子のプロモーター領域をGUS(β-グルクロニダーゼ)遺伝子とつなげたコンストラクトをトウモロコシプロトプラストに導入すると、高い活性がみられたのに対し、葉緑体型Pdk遺伝子プロモーターはイネ由来のものはトウモロコシ由来のものに比べ約4倍GUS活性が低かった。実際にトウモロコシのPpc(ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ)遺伝子をイネに導入した結果、野生株に比べ約30-100倍もの活性をもつ個体が得られた。
リボヌクレアーゼPによる基質認識と動的tRNAの検索

私たちは,現在のtRNAは、重複した2つのステムループから構造変化を起こして生じてきたものではないかという仮説をたて,tRNAの起源を推論しようとしている。現在のtRNAの中には,重複した2つのステムループ構造をもつ形に変化するtRNAが存在する。それは、キイロショウジョウバエのイニシエータ-メチオニンtRNAで,数年前,私たちは,このtRNAがM1 RNA(大腸菌のRNase Pの触媒RNA)により丁度真ん中付近でほぼ半分に切断されるという異常なプロセシング(ハイパープロセシング)を受けることからこの構造を見いだした。昨年度までの研究で,バリン,アラニン,ヒスチジンのtRNAが構造変化を起こすtRNAの候補として上げられた。本年度、この3種のtRNA遺伝子を調製し,それぞれ単独でハイパープロセシング反応を解析したところ,バリンtRNAはハイパープロセスされなかったがアラニンとヒスチジンtRNAは非常に効率よくハイパープロセスされることがわかった。さらに,これらの実験の途上,キイロショウジョウバエの2SリボソームRNAもM1 RNAによりハイパープロセスされることがわかった。解析の結果,2SリボソームRNAの二分子が会合し,それがM1 RNAの基質となっていることが明らかとなった。さらに,本年度,大腸菌と枯草菌のRNase Pのタンパク質サブユニットの遺伝子を発現ベクターに組み込み、そのタンパク質を調製することに成功した。また,意外にも,大腸菌のタンパク質サブユニットがイニシエータ-メチオニンtRNAのハイパープロセシングを活性化することが明らかになった。今後RNase Pの基質認識やタンパク質サブユニットの機能,特にハイパープロセシングにおける機能を解析し,tRNAの県本構造とは何か,すなわちtRNAの起源を明らかにしていきたい。
モワット－ウィルソン症候群原因遺伝子ＳＩＰ１の脳組織とその機能構築における役割

(1)SIP1-EGFPレポーターノックインマウスを作製し、SIP1の脳における発現領域、発現細胞を詳細に解析し検討した。(2)モワットウィルソン症候群モデルマウスの作製を検討するために、コンディショナルノックアウト法を用いて、de novo型の変異モデルマウスを作出し、近交系マウスのgenetic backgroundを有した形でその表現型を検討した。(3)種々のCreマウスを用いて、脳神経細胞においてSIP1を欠失させ、その表現型をみることで、脳におけるSIP1の機能について検討した。(1)SIP1の発現領域の解析モワット・ウィルソン症候群における精神運動発達遅滞の病因の解明を目指して、SIP1の脳内における発現部位の特定を行った。SIP1の遺伝子座にin-frameでGFPを挿入したレポーターノックインマウスを用いて解析を行った。GFP抗体によって検出されるSIP1の発現は、新生仔の海馬、大脳皮質、小脳等で見られ、脳梁や海馬采のオリゴデンドロサイト、縫線核のセロトニン神経などでも確認された。現在、このSIP1の脳における発現解析の結果を発表すべく論文をまとめているところであり、本年度中に公表出来る予定である。Mowat-Wilson syndromeの発症機構を知るために、この症候群のモデルマウスを使った解析は有効である。その有力な候補としてSip1遺伝子変異マウスが挙げられるが、これまでは系統維持されたSip1変異マウスを用いて解析が行われてきた。しかしMowat-Wilson syndromeは、多くがde novo型のSip1遺伝子の突然変異により生じる。そこで、新規にde novo型のSip1変異マウスを作製する系を立ち上げた。恒常的にCreを発現するCAG-Cre TgマウスとSip1+/floxマウスを掛け合わせ、受精卵の段階でSip1ヘテロ変異をde novoに生じさせた。この系を用いて生まれてきたSIP1ヘテロ欠損マウスに関して、ヒトの症例と比較しながら解析を行っているが、頭蓋骨や脳梁形成に関して、ヒトと類似した表現型が観察され始めている。これらの点について、現在詳細に解析中である。GFP抗体によって検出されるSIP1の発現は、新生仔の海馬、大脳皮質、嗅球、小脳等で見られ、さらに側脳室で生じた新生神経細胞が嗅球へ向かうrostral migratery streamに沿った発現や、脳梁や海馬采のオリゴデンドロサイト、縫線核のセロトニン神経などでも確認された。本結果は雑誌Genesisに投稿し、2014年1月号に掲載された。そこで、オスの精子で発現するProtamin-Creマウスを用いて、新規にde novo型のSip1変異マウスを作製する系を立ち上げた。これらの点について、現在詳細に解析中である(1)SIP1-EGFPレポーターノックインマウスを作製し、SIP1の脳における発現領域、発現細胞を詳細に解析し検討した。(2)Mowat-Wilson syndromeのモデルマウスの作製と解析Mowat-Wilson syndromeの発症機構を知るために、この症候群のモデルマウスを使った解析は有効である。

この系を用いて生まれてきたSIP1ヘテロ欠損マウスに関して現在解析中である。本年度は前年度の研究を継続して行った。SIP1 floxマウスを用いて、成体の脳における機能を知る目的で、次のCreマウスと交配し、SIP1コンディショナルノックアウトマウスの作製を行った。(1)神経細胞に分化した細胞でcreを発現するtau-creマウスと交配し、まず胎生18.5日における脳における形態的な影響があるかどうか検討を行った。しかしながらこの過程において、tau-creマウスのcreの発現が、少なくともオスの生殖細胞において発現することがわかり、tau-cre遺伝子をオスを通して交配した場合、全身でSIP1が欠損することがわかった。現在はメスを通して交配させた場合は神経細胞特異的であるのかを検討しているところであり、確認できれば、メスを通してtau-creマウスとの交配を開始する予定である。(2)タモキシフェン存在下で興奮神経細胞でcreが働くようになる、CamKII-creERT2マウスと交配し、成体脳におけるSIP1の機能を検討する。成体脳においてはSIP1は主に海馬錐体細胞での発現が強く、海馬でのSIP1の機能を検討することになる。現在、その形態的影響があるのかどうか観察しているところである。分子生物学解析に必要な各マウス系統の入手と繁殖に時間を要してしまった点がもっとも大きい点である。解析に必要な各マウス系統の入手と繁殖に時間を要してしまった点がもっとも大きい点である。また、それらの交配の際に、SIP1コンディショナルKO用のSIP1floxヘテロマウスの妊娠率や正常出産率等の低さが問題になった点もあり、今後この点に関する、対策が必要である。(1)SIP1の発現部位の詳細な解析に関しては、SIP1ーEGFPマウスを利用しながら、今後、周生期以降の発達段階や成体における発現分布を調べる。またこれらのSIP1発現細胞の分化におけるSIP1の役割について解析を行い、モワット・ウィルソン症候群の病態との関わりについて明らかにしたいと考えている。発現に関しては論文をまとめて発表する予定である。(2)de novo型SIP1ヘテロ欠損マウスを、解析に充分な個体数を用意し、ヒトのモワットウィルソン症候群の患者の症状と比較して、マウスにおいても同様(あるいは類似)の表現型が観察されるかどうか検討する。注目すべき表現型については、その発症のメカニズムに関して解析を行う。1)SIP1の発現部位の詳細な解析に関してはだいたいの解析が終わり、その結果は論文として発表した。今後はこのマウス由来の細胞でクロマチン免疫沈降法を用いることで、より精度の高いSIP1の標的遺伝子の探索を行うことができると期待できる。
GLCCI1遺伝子多型解析を用いた統一吸入指導箋による呼吸機能の改善に関する研究

【目的】本研究では、統一吸入指導箋を用いて吸入指導を行った患者において、肺機能、ピークフロー値、QOLスコア(ACT、ATAQ)などが改善するかどうか、またGLCCI1遺伝子多型を有する患者においてはどの程度改善するかを解析することを目的とする。【研究方法】吸入デバイス毎の統一吸入指導箋を作成し、保険薬局での吸入指導の内容を、医師にフィードバックする吸入連携システムを構築した。患者を統一吸入指導箋(A群)または製薬会社資材(B群)にランダムに分け、A群では吸入手技や薬効に関する理解などについて、統一吸入指導箋に基づき保険薬局薬剤師が評価を行い、指導内容を医師にFax送信した。B群では製薬会社資材を用いた吸入指導を行った。両群でピークフロー値、患者自己記入式のQOLスコアなどを観察前、指導開始後3か月で比較した。【結果・考察】統一吸入指導箋による試験:観察前と3か月後の患者自己記入式のQOLスコア《患者満足度/医療者とのコミュニケーション領域》において、A群ではB群に比べQOLスコアの改善を示した。ピークフロー値に関して両群に有意な差は見られなかった。以上のことより、統一吸入指導箋を用いた場合、患者の治療に対する満足度や、医療者とのコミュニケーションなどの点に関して満足度を向上させる可能性が示唆された。GLCCI1遺伝子多型の測定:全血サンプルからQIAamp[○!R]Blood Kit (QIAGEN社)を用いてDNAを抽出し、GLCCI1遺伝子多型をDirect Sequence法を用いて解析している。
口頭発表における質疑応答コミュニケーション能力の養成に関する基礎的研究

留学生及び日本人学生が行う口頭発表場面での質疑応答について、意識調査と会話データの分析からその特徴と課題を検討した。発表者が抱える困難点としては、質問意図が不明、あるいは未知語が表出した際の対応や、質問者への躊躇などが挙げられた。また、会話データの分析からは、会話の滞りから回復に向け、聞き返しによる発表者の積極的な態度が見られる反面、沈黙や言いよどみの場面では、質問者が全面的に主導する様子が見られた。発表者側が質疑応答をより能動的な時間とするためには、アサーティブなコミュニケーションの必要性が示唆された。本研究は、口頭発表時における質疑応答のコミュニケーションについて、日本語教育の観点から実態を分析し、問題点等を明らかにすることを目的としている。平成24年度は、口頭発表データの収集・整理を継続するととともに、前年に収集したデータについて分析し、その成果を3本の論文にまとめた。論文1[「日本語による口頭発表時の質疑応答に対する留学生の意識と態度ー修士課程を1年経過した留学生の事例から」『小出記念日本語教育研究会論文集』]修士課程を1年経過した留学生に対し、個人別態度構造分析(以下、PAC分析)を行い、質疑応答に対する意識と態度を分析した。その結果、日常的な会話には問題のない留学生でもアカデミックな場面での対応には大きな壁があり、強い葛藤を繰り返していることや、上級者であっても、誤解を回避するために誰かが用いた表現をなぞって説明していることがわかり、一見問題がないように見える場合でも改善すべき問題が潜んでいることを明らかにした。論文2[「口頭発表時の質疑応答に対する理工系留学生の意識と態度ー日本人学生との比較を通した質的分析ー山形大学紀要(教育科学)]修士課程修了直前の日本人学生と留学生にPAC分析を行った。留学生には日本語に関わる要因と専門の内容に関わる要因とを日本滞在の時間経過とともに段階的に切り離して捉えている事例や、回答の誤りや適切な回答が不可能と判断すると、対話を切り上げる態度を示す事例などの特徴が見られた。また、企業との関わりまでには意識が及んでいないことも窺えた。論文3[投稿修正中]より長い研究生活を送る博士課程の日本人学生及び留学生に対し、発表に対する捉え方やその変容を明らかにすべく、グループインタビューを行った。その結果、発表することの意義や困惑点については共通点が見られたが、留学生は初対面の質問者による多様性に苦慮する様子が見られた。平成25年度は、収集した実際の口頭発表時の質疑応答場面について、文字化した資料および映像をもとに分析を行い、特徴を検討した。当初、コミュニケーション・ストラテジーに焦点を当て、研究を進めることを計画していたが、留学生と同様に日本人学生の発表においても発表者と質問者が会話の話題を円滑に継続できないことがしばしば見受けられた。情報や思考の差異は、留学生、日本人学生いずれの場合でも質問者との間に起こりうることと捉え、発表者と質問者が互いの差異にどのように対応し、会話を継続させていくのかを考察することがより重要であると考えた。そこで、質疑応答時の会話の流れにおいて、コミュニケーション・ブレイクダウンの発生から、不明な点を修復し、元の会話に回復するまでの一連の会話(second sequence)について、会話分析の手法を参考に、分析した。対象とした口頭発表は、発表者が学生、質問者が教員という構図であったため、教室活動におけるIRF(Initiation-Response-Follow up)構造と一見類似していた。しかし、発表内容そのものに関する情報に関しては、発表者である学生がより詳細に理解していることも多く、Follow-up部分の言語表現はあくまでも一質問者が理解できたことを示す「了解」で終結した。よって、研究発表会においては、発表者である学生が、発表に対する責任者としてその場に臨んでいることがわかる。また、その一方で、コミュニケーション・ブレイクダウン時、学生がどの点が理解を阻害しているのかを示すことができないと、質問者である教員が会話の回復に向けて、言い換えを行ったり、一つ一つ確認作業を行いながら、質問の回答を得ようとする様子が見られた。発表者である学生がより積極的にかかわるためには、アサーションコミュニケーション等の視点から教育が必要であることが示唆された。本研究の目的は、アカデミックな口頭発表時の質疑応答コミュニケーションについてその問題点、及び、必要なコミュニケーションストラテジーや言語表現を明らかにし、コミュニケーション能力養成のための基礎的資料を構築することにある。今年度は研究1年目であることから、分析・検討を行なうための準備として、以下の3点を行なった。まず、関連する研究分野の先行研究について文献調査を行なった。対象としたのは、コミュニケーション・ブレイクに関する研究、コミュニケーション・ストラテジーに関する研究、外国語を用いることに対する言語不安に関する研究、ダイアローグに関する研究、発表活動に関する日本語指導に関する研究、そして、既に市販されている教科書である。

調査の結果、本研究で対象とするアカデミックな日本語使用の場面においては、未だ十分な分析が行なわれていないことがわかった。次に、口頭発表者である大学院生の意識調査を3種実施した。一つは、日本人学生250名を主対象として実施した口頭発表の困難点に関する質問紙調査である。二つ目は、日本人博士課程に在籍する学生に対して行なったグループ面接である。三つ目は、24年度にまたがって留学生を主対象に行なっているPAC分析による調査である。23年度はデータ収集で時間切れとなったが、順次、文字起こしを進め、分析を進める予定である。そして、平成23年度の最も外せない活動に、8月と2月の修士論文発表会での口頭発表及び質疑応答のデータ収集があったが、理工系分野の専攻に協力を得ることができ、20名のデータを収集することができた。さらに、本人による発表時のビデオ視聴を介した刺激回想法による意識についても調査を行なった。以上、平成23年度は、本格的に分析を始める平成24年度に向けて必要となる関連分野の情報の整理、及び、データ収集を中心に研究を遂行した。本研究は、意識・態度面からの分析と、録画収集したデータを用いた分析からに大きく分かれ、その両輪から問題点を総合的に捉えるものである。前者については「研究実績の概要」で述べたとおり、成果を論文の形でまとめることができた。これにより、研究対象である発表者にとっての問題は、日本人学生とも共通する部分があると同時に、それぞれの日本語力や、質問者との対応への意識によりさまざまな様相を見せることがわかった。また、困惑する問題としては、的外れな質問や、対人関係にかかわるもの、及び、理解はできたが説明や回答が困難と判断した場合にどう対応するかといった点に集約できることがわかり、どの点に焦点を当てて研究を進めればよいかが明確となった。今後は、実際に質疑応答時にどのような言語行動が行われているのかについて、分析を進めていくが、口頭発表のデータ収集についてはすでに終えており、録音・録画したデータの文字化及び整理が終わり次第、ミスコミュニケーションやコミュニケーションブレイクダウン、アサーティブなコミュニケーションに関わる問題点について、分析を進める予定である。平成23年度については、計画していた文献調査、質疑応答の行動に関わる意識調査、質疑応答場面のデータ収集の三つを予定どおり実施することができた。文献調査について23年度は日本国内の研究状況の確認が主だったため、平成24年度は海外における文献を収集し、現時点での全体像を整理する。質疑応答の行動に関わる意識調査については、現在、調査した回答用紙を電子データの形に入力を終えたところである。今後は、困難点を過去の調査結果との検証も含め、因子分析による分析を行なう予定である。質疑応答場面のデータ収集については、協力の依頼説明や同意書の依頼に少々時間を要したが、協力の理解を得ることができ、無事データを収集することができた。本研究の目的は、口頭発表時の質疑応答コミュニケーション能力を養成するための第一段階として基礎資料を構築することにある。
マウスB細胞腫瘍モデルを用いたNotchシグナル活性化の意義の解明

B細胞リンパ腫は国内外で頻度の高い悪性リンパ腫であるが、現在行われている抗がん剤とリツキシマブの併用療法では依然難治性症例が存在し、新規薬剤の導入による治療成績の向上が望まれる。その一方で、遺伝子発現プロファイリングや網羅的遺伝子解析により、B細胞リンパ腫の各病型の特徴や遺伝子異常に関する情報は蓄積されつつあるが、それらをいかに病態理解につなげ、治療応用していくかについては今後の大きな課題となっている。B細胞リンパ腫において、Notch1, 2の活性化を生じる遺伝子異常は様々な病型で認められることが報告されている。我々は、Notch1活性化が一部の成熟B細胞で恒常的に高発現するコンディショナルトランスジェニックマウスを作出し解析した結果、Notch1活性化B細胞は個体内のT細胞をTh2や制御性T細胞優位にすることを示した。またヒトのDLBCLのデータベース解析において、Notch1の活性化プロフィルはCD8+T細胞/Treg細胞比と逆相関することが判明した。本内容は論文にて発表を行った(Blood Advances 2018;2(18):2282-2295)。こうした研究背景に基づき、ヒトB細胞リンパ腫における腫瘍微小環境およびそれに関わる要因を明らかにすることは、リンパ腫の治療開発の上で極めて重要であると考え、B細胞リンパ腫の腫瘍微小環境を左右する他の要因に関しても検索を行った。その結果、新たにCCL17がB細胞リンパ腫の腫瘍微小環境に関わる要因の一つであることを見出した。ある小分子化合物でB細胞リンパ腫株全般でCCL17の発現が顕著に誘導され、CCL17の発現上昇はT細胞の動員作用を持つことが示された。我々はこれまでのマウス研究において、成熟B細胞におけるNotch1の高発現が腫瘍微小環境に深く関わることを明らかにした。Notch1シグナルの活性化を生じる異常はDLBCLの約2割に存在するが、その脱制御の機序から、Notchシグナルを抑制すること自体による治療はやや難しいと判断した。実際に、Notchシグナル阻害薬のB細胞リンパ腫に対する臨床試験が海外で行われているが、多くの場合シグナル阻害薬の作用点よりも下流に遺伝子異常が存在するため、十分な治療効果は認められていない。そこで、B細胞リンパ腫の腫瘍微小環境を標的とした治療を探索する目的で、免疫微小環境を修飾する別の因子を検索することとした。我々は11種類のB細胞リンパ腫株を用いた検討において、ある小分子化合物がこれら全てのCCL17(TARC)の発現を上昇させることを見出した。CCL17はCCR4陽性T細胞を動員するケモカインであり、悪性リンパ腫ではホジキンリンパ腫のHodgkin/Reed-Sternberg細胞に特徴的に高発現し、T細胞豊富な腫瘍微小環境をもたらすことが知られる。CCR4は制御性T細胞に最も高く発現しているが、CCL17は広範なT細胞の細胞遊走ももたらすことが示唆された。また、ヒトの濾胞性リンパ腫およびDLBCLのデータベース解析では、CCL17の発現レベルは制御性T細胞、CD4陽性T細胞だけでなくCD8陽性T細胞豊富な腫瘍微小環境とも相関することが示された。当初計画していた内容通りではないが、研究内容の工夫を行い新たな知見が得られており、研究は概ね順調に進展していると判断している。B細胞リンパ腫におけるCCL17の発現制御機構の解明を目指す。CCL17の発現を制御する小分子化合物はエピゲノム修飾薬であり、B細胞リンパ腫細胞株が背景に持つシグナルとの相乗作用がCCL17の発現制御に関わると推測しており、それらの関連性を明らかにする。一方、CCL17の高発現がもたらす治療への影響について明らかにしたいと考えている。CCL17はCCR4陽性制御性T細胞の遊走をもたらすケモカインであるが、必ずしも予後不良因子とはされておらず、悪性黒色腫においてはむしろ予後良好因子として報告されている(Journal of Clinical Immunology 2009;29(5):657&#8211;664)。免疫療法を行う上で腫瘍微小環境におけるT細胞の存在が重要であることが知られるが、CCL17がヒトのB細胞リンパ腫のデータベース解析においてT細胞豊富な免疫微小環境と強く相関することが示されたことから、CCL17の発現誘導は免疫療法を効果的に行う上で有用である可能性があると推測している。CCL17が高発現していることが知られるホジキンリンパ腫では、免疫チェックポイント阻害薬の有効性の高い疾患であることから、B細胞リンパ腫におけるCCL17の薬剤による誘導と免疫チェックポイント阻害薬との併用が相乗作用を持つ可能性を推測し、生体モデルにおいて検証を行いたいと考えている。こうした免疫改変作用を持つ薬剤による治療は、免疫異常を呈するNotch1関連リンパ腫などの治療にも応用できるのではないかと期待している。我々は、Notch1活性化が一部の成熟B細胞で恒常的に高発現するコンディショナル

トランスジェニックマウスを作出し解析した結果、Notch1活性化B細胞は個体内のT細胞をTh2や制御性T細胞優位にすることを示した。またヒトのDLBCLのデータベース解析において、Notch1の活性化プロフィルはCD8+T細胞/Treg細胞比と逆相関することが判明した。本内容は論文にて発表を行った(Blood Advances 2018;2(18):2282-2295)。こうした研究背景に基づき、ヒトB細胞リンパ腫における腫瘍微小環境およびそれに関わる要因を明らかにすることは、リンパ腫の治療開発の上で極めて重要であると考え、B細胞リンパ腫の腫瘍微小環境を左右する他の要因に関しても検索を行った。その結果、新たにCCL17がB細胞リンパ腫の腫瘍微小環境に関わる要因の一つであることを見出した。ある小分子化合物でB細胞リンパ腫株全般でCCL17の発現が顕著に誘導され、CCL17の発現上昇はT細胞の動員作用を持つことが示された。我々はこれまでのマウス研究において、成熟B細胞におけるNotch1の高発現が腫瘍微小環境に深く関わることを明らかにした。Notch1シグナルの活性化を生じる異常はDLBCLの約2割に存在するが、その脱制御の機序から、Notchシグナルを抑制すること自体による治療はやや難しいと判断した。実際に、Notchシグナル阻害薬のB細胞リンパ腫に対する臨床試験が海外で行われているが、多くの場合シグナル阻害薬の作用点よりも下流に遺伝子異常が存在するため、十分な治療効果は認められていない。そこで、B細胞リンパ腫の腫瘍微小環境を標的とした治療を探索する目的で、免疫微小環境を修飾する別の因子を検索することとした。我々は11種類のB細胞リンパ腫株を用いた検討において、ある小分子化合物がこれら全てのCCL17(TARC)の発現を上昇させることを見出した。CCL17はCCR4陽性T細胞を動員するケモカインであり、悪性リンパ腫ではホジキンリンパ腫のHodgkin/Reed-Sternberg細胞に特徴的に高発現し、T細胞豊富な腫瘍微小環境をもたらすことが知られる。CCR4は制御性T細胞に最も高く発現しているが、CCL17は広範なT細胞の細胞遊走ももたらすことが示唆された。また、ヒトの濾胞性リンパ腫およびDLBCLのデータベース解析では、CCL17の発現レベルは制御性T細胞、CD4陽性T細胞だけでなくCD8陽性T細胞豊富な腫瘍微小環境とも相関することが示された。当初計画していた内容通りではないが、研究内容の工夫を行い新たな知見が得られており、研究は概ね順調に進展していると判断している。B細胞リンパ腫におけるCCL17の発現制御機構の解明を目指す。CCL17の発現を制御する小分子化合物はエピゲノム修飾薬であり、B細胞リンパ腫細胞株が背景に持つシグナルとの相乗作用がCCL17の発現制御に関わると推測しており、それらの関連性を明らかにする。一方、CCL17の高発現がもたらす治療への影響について明らかにしたいと考えている。
液中原子間力顕微鏡による揺動する分子鎖の３次元立体構造のサブナノスケール計測

本研究では液中3D-SFMを用いてタンパク質の末端部位のようなナノスケールの分子鎖(ナノ分子鎖)を1分子レベルで計測する手法を確立することを目的とした。昨年度までにナノ分子鎖の空間分布を制御したモデル構造を構築するため、任意の分子鎖を簡易な方法で導入できる自己組織化膜の調製方法を検討してきた。本年度はその自己組織化膜を用いて実際にナノ分子鎖を導入することを試みた。反応性の高い官能基を有する三脚分子で形成した周期性の高い自己組織化膜に対し、ナノ分子鎖としてアルキル鎖を導入して調製したナノ分子鎖構造モデルを液中3D-SFMで計測した。その結果、マイカなどの結晶表面に比較して長距離から斥力を受けていることがわかり、これは試料表面が大きく熱揺動していることを示している。またxz断面には特徴的な斥力のコントラストが観察された。これまでにOEG-SAMとOH-SAMで形成したナノ分子鎖モデルを3D-SFMで計測してきたが、取得した3次元力分布像には揺動するOEG鎖が斥力で可視化された。このことからxz断面に可視化された斥力のコントラストは揺動するアルキル鎖の空間分布に起因すると考えられる。三脚分子にアルキル鎖を導入して構築したナノ分子鎖モデルを3D-SFM計測した結果から、ペプチドなど様々なナノ分子鎖を導入し計測できることが強く示唆された。本研究結果よりタンパク質表面で揺動する末端部位の立体構造の理解に大きな進展をもたらすことが望まれ、さらにバイオセンサやポリマブラシなど固液界面に存在する様々なナノ分子鎖の立体構造や空間分布を計測することでそれらの感度や性能を分子レベルで評価することも期待される。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、タンパク質/水界面で揺動するナノスケールの末端部位(分子鎖)の3次元分布を計測する3D-SFM手法を確立することである。これに対し本年度は以下のことに取り組んだ。1. 3D-SFMによってナノ分子鎖を定量的に計測できるか検証するための評価モデルの調製方法を検討した。まずナノ分子鎖としてオリゴエチレングリコール末端自己組織化膜(OEG-SAM)を用い、ベースにOH末端自己組織化膜(OH-SAM)を用いた評価モデルを考えた。孤立分子鎖の観察が可能な分子鎖密度になるよう調製方法を検討し、液中3D-SFM計測を行った。その結果、ベースについてはOH-SAMの周期構造がサブナノスケールで可視化され、ナノ分子鎖については大きく傾いた状態で揺らいでいるEG鎖の可視化に成功した。2. 3D-SFM計測および3次元データ解析プログラム開発の検討を行った。3次元の周波数シフト情報や力情報を可視化するソフトウェアにより、孤立したOEG分子鎖の構造やダイナミクスの議論が可能になった。またOEG鎖の変形を議論するため、力情報をエネルギー情報に変換する解析プログラムの開発を行っている。3. SN比が低く力感度の高いカンチレバーであるAC55(Olympus)による高分解能計測を考えた。しかしAC55はカンチレバーの励振効率が低いという問題があったため、光熱変換層をカンチレバーに導入することを検討した。その結果、励振効率が約3倍に向上し、表面構造および水和構造が高分解能計測され、得られる力情報のノイズも減少した。光熱変換層を導入したAC55によるナノ分子鎖の高分解能計測が期待される。以上の結果により、3D-SFMがナノスケールの分子鎖を計測および解析できることを実証し、高分解能計測を検討することで、最終目的であるタンパク質末端部位の3D-SFM計測の可能性を示せた。本年度はナノ分子鎖構造の3D-SFM計測に対する定量性評価モデルの構築を検討し、計測に応じて必要なAFM技術開発を行った。またこれまでに3D-SFM計測で取得したヘキサエチレングリコール(EG6)末端とヒドロキシ末端の混合自己組織化膜の力分布像を理解することを目的に、分子動力学法を用いた動的過程シミュレーションを行った。まずナノ分子鎖の空間分布を制御したモデル構造を構築するため、クリックケミストリー法を用いて任意のナノ分子鎖を表面に修飾可能な自己組織化構造を検討した。アルキン末端を有する三脚分子をそれぞれ調製して液中FM-AFM計測を行った結果、非常に周期性の高い表面構造を形成することを分子スケールで初めて明らかにした。クリック反応による分子構造の変化を一分子スケールで計測できる可能性を示す非常に重要な結果を得た。次に前年度に検討していた高感度カンチレバーの励振効率向上を目指した光熱変換層導入については、光熱変換層の形成手順について詳細に検討し、再現性良く高効率な光熱変換を実現する条件を見出した。長時間安定性や原子分解能FM-AFM観察への影響を調べた結果、数時間の液中イメージングでも励振効率は低下せず、安定に原子分解能イメージングが可能であることがわかり、光熱変換層の実用化に至った。さらに、3D-SFM計測によって得られた力分布像は搖動するナノ分子鎖の運動をどのように反映しているのか、その可視化メカニズムを理解するため探針先端に働く相互作用力について分子動力学法によるシミュレーションを行った。算出した相互作用力分布の特徴は3D-SFM像と良く一致しており、3D-SFM像の力分布はEG6鎖の存在確率密度を反映していることが強く示唆された。

またこの結果は、探針走査による影響をシミュレーションを用いて見積もることができる可能性を示している。本年度は新たな空間分布制御モデルの構築に取り組み、足場となる自己組織化膜の分子分解能観察に成功した。より自由に表面修飾できるモデル構築が可能になることで今後の進展が期待できる。また前年度に提案した光熱励振法の励振効率を向上させる光熱変換層をより詳細に検討し、実用化した。さらに分子動力学法を用いたシミュレーションを用いて算出した力分布像と実際の3D-SFM計測結果と比較し検証を行った。以上の研究成果により順調に進展しているといえる。本研究では液中3D-SFMを用いてタンパク質の末端部位のようなナノスケールの分子鎖(ナノ分子鎖)を1分子レベルで計測する手法を確立することを目的とした。昨年度までにナノ分子鎖の空間分布を制御したモデル構造を構築するため、任意の分子鎖を簡易な方法で導入できる自己組織化膜の調製方法を検討してきた。本年度はその自己組織化膜を用いて実際にナノ分子鎖を導入することを試みた。反応性の高い官能基を有する三脚分子で形成した周期性の高い自己組織化膜に対し、ナノ分子鎖としてアルキル鎖を導入して調製したナノ分子鎖構造モデルを液中3D-SFMで計測した。その結果、マイカなどの結晶表面に比較して長距離から斥力を受けていることがわかり、これは試料表面が大きく熱揺動していることを示している。またxz断面には特徴的な斥力のコントラストが観察された。これまでにOEG-SAMとOH-SAMで形成したナノ分子鎖モデルを3D-SFMで計測してきたが、取得した3次元力分布像には揺動するOEG鎖が斥力で可視化された。このことからxz断面に可視化された斥力のコントラストは揺動するアルキル鎖の空間分布に起因すると考えられる。三脚分子にアルキル鎖を導入して構築したナノ分子鎖モデルを3D-SFM計測した結果から、ペプチドなど様々なナノ分子鎖を導入し計測できることが強く示唆された。本研究結果よりタンパク質表面で揺動する末端部位の立体構造の理解に大きな進展をもたらすことが望まれ、さらにバイオセンサやポリマブラシなど固液界面に存在する様々なナノ分子鎖の立体構造や空間分布を計測することでそれらの感度や性能を分子レベルで評価することも期待される。3D-SFMによって孤立したOEG鎖をサブナノスケールで可視化できることを実証し、その計測および解析に必要なプログラムや高感度カンチレバーの開発を実現できたため。立体配置を制御した評価モデルについては合成が必要なため評価計測にいたっていないが、合成システムを立ち上げたため、来年度の課題として取り組む。新たなナノ分子鎖モデル構造を用いて、空間制御モデルやより実際の系に近いペプチドモデルを構築して計測を行い、3D-SFMによるナノ分子鎖計測の定量性を評価する。またシミュレーションについては水分子を含んだ系で計算を行うのは申請者のみでは困難であるため、その専門の研究者との連携を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。立体配置の違いを計測可能か検証する評価モデルの構築と計測を行い、実際の系に近いペプチド鎖モデルの3次元計測についても検討する。またMDシミュレーションによる計算結果とAFM測定結果を比較し、探針走査による影響を見積もる。