hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サイクリックヌクレチオドの瞬時的増加による心筋イオン電流増大の定量的解析

モルモットの心室筋細胞を単離し、cGMPのイオン電流に及ぼす効果について、パッチクランプ法により解析した。cGMPは、電極内灌流及びcaged化合物をパッチ電極内に詰める事により直接細胞内に投与した。心筋には、カテコラミン刺激で活性化されるC1電流が存在する。caged-cGMPを細胞内に投与し、低濃度カテコラミン刺激下に紫外光を照射したところ、C1電流振幅がさらに増大した。しかし、cGMP単独ではこの電流を活性化しなかった。次に、caged-cAMPを細胞内に投与し、紫外光照射によりcAMPを瞬時的に遊離した時の、C1電流の活性化を観察した。電流の活性化には数秒を要し、最大反応後徐々に不活化した。cAMP代謝阻害剤存在下では反応が持続する事から、電流の不活化は、遊離したcAMPが内因性の加水分酵素によって分解される事によると考えられた。数muMのcGMPを細胞内に投与しておくと、cAMPに対する反応がコントロールのそれと比較して有意に遅延した。以上の事から、哺乳類においてはcGMPは、cAMPの分解を抑制する事によりbeta受容体刺激を促進していると結論し、European Journal of Physiologyに発表した。さらに、cAMPによるC1電流活性化の反応速度について解析した。電流活性化はS字状の時間経過を示し、その後半部分は時定数1-2秒の指数関数でほぼ近似できた。この時間経過はcAMPの濃度に依存し、またフォスファターゼ阻害剤によって修飾されることから、チャネル蛋白の燐酸化過程を反映すると考えられた。この結果は現在投稿中である。
古典期ギリシア語散文の文献学的研究

ヒッポクラテスの校訂注釈本については、所期の調査を(中世写本等)を終え、校訂本文と校訂注、(ap. cr.)と解題、翻訳、および語法注を基本的には含まない、校訂上の問題についての注を主とする注釈を備えた、成果報告書を平成20年3月に印刷し、関係各方面に配布した。これは、市販されうる注釈書に限りなく近いプロトタイプと言うことができる。期間内に原稿だけでも完成する予定であった英語版については、解題の部分を平成19年8月に、グラスゴーで開かれた国際シンポジウムで発表した。幸い、出席したヒッポクラテスの専門家には好評で、平成20年8月に合衆国テキサス(オースティン)で開かれる13回国際ヒッポクラテス学会で発表するように強く勧められ、応募、発表ということが決定した。予定よりやや遅れてはいるものの、英語版も着々と進行中である。期間途中から協力をしてくれた元京都大学教授クレイク氏が。英語については全面的な協力を約束してくれているのも心強い。この協力が得られる見通しとなったのも、この研究の大きな成果の一つである、と言える。この研究と一体であるところの、日本における文献学研究の進展をめざした、『フィロロギカ』、古典文献学研究会の活動も順調で、研究期間中に5回の研究集会が実施され、2巻の年刊研究誌が発行され、3巻目も現在印刷の段階にある。理想の査読付き研究雑誌を創出するという目標も、難しい局面を迎えつつあるとは、編集委員一同の共通した実感ではあるものの着実に進展しつつある。研究分担者が将来代表者のいまなしつつあることに続くものを出す準備も着々と整いつつあると言えるであろう。『フィロロギカ』に投稿されてきた彼らの論文からそのことを確実にうかがうことができる。ギリシア・ローマの古典、特にその散文文献をめぐる文献学的な問題を明らかにする為に、研究代表者は、自ら新しい西洋古典文献学雑誌『フィロロギカ』(査読あり)を研究分担者らとともに発刊、編集委員長となった。なお、その創刊号に、ソプォクレス、エウリピデスという悲劇作家の本文批判を扱う2本の論文を発表した。また、ホメロスの本文批判に先行する問題を論じる論文を同第2号に投稿した。受理され、現在印刷中である(5月中旬発行)。また、19年6月に予定されるエリザベス・クレイク(ヒポクラテス校定者として現在世界の第一人者のひとり、現セント・アンドリュ=ス大学)と、ヒポクラテス文献学の問題を討論する国際共同研究会に向けて準備中。葛西は、イサイオスの法廷弁論の注釈付き本文を準備する為に、前4世紀の法廷弁論中に含まれる法や誓いに関する書評を2本発表した。佐野は、本共同研究と直接関わるものとしては、プラトンの対話篇でのホメロス引用の含む文献学的問題を論じる論文を『フィロロギカ』第2号に投稿した。受理され現在印刷中である。大芝は、ローマ共和制期の詩人Catullusの修正読みを提示する論文を『フィロロギカ』第2号に投稿した。受理され、現在印刷中。研究会という形の活動としては、以下のものがある。18年10月14日に、国際基督教大学で代表者と分担者が主催して『フィロロギカ』研究集会(第5回)を開催した。また、12月24日には、京都大学文学部において、京都大学文学研究科西洋古典学研究室と共催で、共同研究会を開催し、代表者分担者など3名が研究発表し、また、西洋古典学における文献学の重要性についての主張を行う講演を行った。

ヒッポクラテスの校訂注釈本については.所期の調査(写本等)を終え.校訂本文と校訂注(ap. cr.)と解題・翻訳,そして語法注を含まない.校訂に関する注釈を備えた成果報告書を平成20年3月に印刷した。市販され得る研究書の形を取る一歩前まで進んだ。英語版については.一部を平成19年8月グラスゴーで開催された国際シンポジウムで口頭発表した。なおシンポジウムに参加した.国際ヒッポクラテス学会の幹事E.クレイワ氏から.平成20年8月に米国で開催される、3年に一度の同大会で発表することが決り.予定より遅れてはいるものの着実に英語版は進行中である。この研究とある意味では一体である『フィロロギカ』も20年5月に研究誌第3号を発行すべく編集進行中である。
小選挙区比例代表並立制下における補助金配分の機能に関する分析

本研究の目的は、1996年以降、衆議院の選挙制度として用いられてきた小選挙区比例代表並立制下において、国庫支出金を主とする補助金の各地方自治体に対する配分を手段として利用することによって、政権の維持を可能にしてきたということを実証的に明らかにすることである。財政を拡大しにくい、一様に補助金を減らす方向である場合にあっては、政権与党に対する支持の高い地域ほどその度合いが緩やかであることが明らかとなった。したがって、補助金を手厚くする局面にとどまらず、補助金を減らす局面においても、その配分には政治的な影響がみられるということである。本研究の目的は、1996年以降、衆議院の選挙制度として用いられてきた小選挙区比例代表並立制下において、国庫支出金を主とする補助金の各地方自治体に対する配分を手段とし、政権与党の勢力拡大と政権維持を可能にしてきたということを明らかにすることである。その上で、最終的には、五五年体制以来の日本政治において、財政支出というものが政権与党の長期政権維持に寄与してきたということを実証的に明らかにしていくことである。平成18年度においては、五五年体制以降の政治状況に関する研究及び地方財政に関する研究を中心とした先行研究についての文献調査、及び、本研究の遂行上必要となるデータ((1)国政選挙結果に関連するデータ:小選挙区比例代表並立制下において行われた4回の衆議院総選挙(1996年・2000年・2003年・2005年)での各市区町村別の選挙結果データ、(2)政治家のバックグラウンドに関連するデータ:1996年の衆議院総選挙以降、小選挙区に立候補し当選、あるいは、小選挙区では落選しながらも比例代表で復活当選した議員全員の前歴・国会議員としての経歴・政党内の役職等に関するデータ、(3)補助金の配分額に関するデータ:各市区町村に対する各年度の地方交付税交付金額・特別交付税交付金額・国庫支出金額・都道府県支出金額、(4)各地方自治体の特性を示すデータ:各地方自治体の特性を示す人口統計学的データ(人口・人口構成・産業人口比等)・財政に関するデータ(財政力指数・経常収支比率・公債費負担比率・地方税収入額等)・首長の属性を示すデータ(党派・前歴等))の収集及び整理を行い、これらを用いて分析を行うための統計解析ソフトウェアの整備を行うことで、次年度以降の研究遂行に備えた。本研究の目的は、1996年以降、衆議院の選挙制度として用いられてきた小選挙区比例代表並立制下において、国庫支出金を主とする補助金の各地方自治体に対する配分を手段として利用することによって、政権与党を離れた議員を一本釣りし、与党へ引き戻すことによって政権与党の勢力を拡大し、政権の維持を可能にしてきたということを明らかにすることである。その上で、五五年体制以来の日本政治において、財政支出というものが政権与党の長期政権維持に寄与してきたということを実証的に明らかにしていくことである。平成19年度においては、平成18年度に引き続き、本研究の遂行上必要となるデータ((1)国政選挙結果に関連するデータ、(2)政治家のバックグラウンドに関連するデータ、(3)補助金の配分額に関するデータ、(4)各地方自治体の特性を示す人口統計学的データ・財政に関するデータ・首長の属性を示すデータ)の追加収集及びその入力作業を行った。その後、平成18年度から収集したデータを使用することで、与党候補者が小選挙区で当選した選挙区、与党候補者が小選挙区では落選したが比例代表で復活当選した選挙区、与党候補者が小選挙区でも比例代表でも落選した選挙区において、それぞれ補助金の配分に差異がみられるのかについてのマクロ分析を行い、補助金配分の全体的傾向を把握した。また、マクロ分析にて行った選挙区の場合分けにより、ケース・スタディに相応しい小選挙区の選定も併せて行い、次年度の研究遂行に備えた。平成20年度においては、平成18年度から平成19年度にかけて収集してきたデータをもとに分析を進めてきた。平成20年度に、各地方自治体の平成18年度決算が公表されたことから、小泉政権の下で平成16年度から平成18年度にわたって進められた三位一体の改革を切り口として、それがもたらした補助金配分の変化について分析することとした。マクロ的な単純集計の結果では、地方交付税交付金の減少した自治体が8割程度、国庫支出金の減少した自治体が5割程度、地方税の増加した自治体が3割程度となっている。本研究では、マクロ的な観点から分析するにとどまらず、各市町村をケースとして、ミクロ的な観点から分析することで、三位一体の改革のもたらした補助金配分の変化について明らかにしようとするものである。具体的には、三位一体の改革前の各地方自治体に対する補助金(地方交付税交付金及び国庫支出金)配分及び地方税と、三位一体の改革後のそれらについて比較し、小選挙区比例代表並立制の影響について検証する。

その際、過年度に収集してきた(国政選挙結果に関連するデータ、政治家のバックグラウンドに関連するデータ、補助金の配分額に関するデータ、各地方自治体の特性を示す人口統計学的データ・財政に関するデータ・首長の属性を示すデータ)を用いている。この成果については、平成21年7月の日本地域政策学会で研究報告を行う予定である。
化学修飾によって蛋白質を神経細胞表面の特定の部位に局在化させる

・GFPのC末端コレステロール修飾体の細胞への応用結果先に受けた科学研究費補助金によりインテイン蛋白質との融合蛋白質を利用した蛋白質C末端の選択的な修飾系を構築した。目的物はフラグメント縮合を通して得られるが、蛋白質変性を伴うHPLCのような精製法では、その後の巻き戻し反応が非常に困難であることが判明した。そこで縮合反応における試薬を徹底的に除去限外ろ過で除去し、細胞への添加実験のサンプルとした。本年度は懸案であったC末端をコレステロールで修飾したGFP(以下GFP-Chol)をマウス神経芽細胞であるN2aの培養液中に添加して、洗浄後蛍光顕微鏡下での観察を行った。その結果、GFP-Cho1は細胞膜表面に結合していることが確認された。一方、非修飾のGFPは洗浄時に洗い流され、同一条件下において観測できなかった。しかしながら、GFP-Cholの長時間のインキュベーションでは細胞障害がみられた。そこでこの原因を探るべく低分子の蛍光標識コレステロールの調製をおこない、同様の観察を行ったところ大きな障害は見られず、膜表面に結合することがわかった。そのためGFP-Cholにおいて観察された細胞障害は細胞膜に結合したGFPに誘起されることが示唆される。現在はこの原因を探る実験と並行してプリオン蛋白質コレステロール修飾系の応用をすすめている。プリオン蛋白質に関しては巻き戻しに関して有用な基準がないため、その異常化をもって評価を進めているが異常化を検出するにいたっていない。・GFPのC末端修飾のバリエーションの調製と修飾化合物の最適化GFP C末端チオエステル調製系を準備した。さらに、チオエステル結合になるアミノ酸としてMetを挿入したGFP・Met C末端チオエステル調製系を作出し、反応性の違いについて比較検討を行った。その結果、新たに作出した系においては、大腸菌での発現量に大差は見られなかったものの、キチンカラムへの結合、GFPの蛍光強度が前者の系に比べて弱く、また、切り出し反応は、冷却状態(4°C)でも進行した。これらのことから、Metの挿入によって融合たんぱく質の各ドメインの安定性が低下し、チオエステル調製に必要な機能を果たすことが、難しくなることがわかった。修飾化合物として、Cys・X・Chol(1)の合成を行った。ここでXは、エチレングリコール構造、Chnolはコレステロール骨格である。1とGFPチオエステルとの縮合を行った。HPLC上で縮合生成物に対応するピークが得られた。しかしながら、C末端の化学構造は現在のところ同定できていない。HPLC精製で得られた留分を細胞に添加したが、GFP由来の蛍光を検出することは出来なかった。このことは、C末端修飾GFPのリフォールディング条件を整えるか、HPLC以外の精製方法を検討する必要があることを示している。現在はこの観察に関わる条件の検討を進行させている。並行して、プリオン蛋白質チオエステル調製系を安定して供給するための系の改良をすすめている。
胸膜中皮腫発生・進展に関わるエピジェネティクス変化の病理病態解析

エピジェネティクス制御機構は、がんの個性を解明する上で、ポストゲノム時代の重要な研究課題である。悪性中皮腫の病理組織の特徴である2相性、即ち上皮様構造(癌腫様構造)と肉腫様構造の共存および相互移行に着目した。病理組織標本の特定部位をサンプリングし、微小検体からDNA解析、シトシンメチル化解析を行う方法を実践し、上皮結合部位に発現するE-カドヘリンのメチル化による発現制御の解析に努めた。上皮、間葉の2相性をもたらす分子機構に関して、中皮腫と同様に2相性の組織像を特徴とする滑膜肉腫の培養細胞株を用いた検討で、cancer testis antigen遺伝子の関与の可能性を示唆する所見を得た。エピジェネティクス制御機構は、再生医療、分子標的癌治療へと展開しているポストゲノム時代の重要な研究課題である。本研究課題では、アスベスト曝露後の悪性中皮腫に焦点を当て、酸化的ストレスとDNAメチル化集積との関連について、労災病院との共同研究により,悪性中皮腫病理組織検体によるDNAメチル化の評価をめざすものである。多くの悪性中皮腫症例で見られる組織形態として、腫瘍組織の上皮様構造(癌腫様構造)と肉腫様構造の2相性をもつことに着目して、病理標本の特定部位から切り出した微量検体でのDNAメチル化検出の予検討を行った。腫瘍細胞の増殖との関連については、癌抑制遺伝子のひとつであるP16の発現、遺伝子プロモータ領域のメチル化について、組織検体の腫瘍細胞と、非腫瘍部分との比較検討を行った。腫瘍部分では、P16発現低下とメチル化高頻度がみられた。さらに、P16遺伝子プロモータのメチル化部位の特定と、酸化的ストレスとの関係について、解析を進めている。腫瘍の形態に着目した解析としては、癌腫様部分では腫癌細胞相互の細胞結合が見られE-カドヘリンが発現しているが、肉腫形態の部分では、腫瘍細胞は散在性で細胞結合がなく、E-カドヘリンの発現がない。両者の移行像も見られ、遺伝子欠失による発現低下は考えられないため、プロモータ領域のメチル化による発現抑制を念頭において、実験系を整備している。微量の組織検体を用いて、E-カドヘリン遺伝子プロモータ領域のメチル化を検出するMSP(メチル化特異的PCR)法による解析を行った。メチル化部位を特定するとともに、変化が可逆的であるかどうか、解析をすすめている。これまでのメチル化による発現制御に関する知見は、Cancersに投稿し掲載された。病理検体の組織像に基づいた解析結果は、今後、内外の学会にて報告する予定である。本研究課題では、アスベスト曝露後の悪性中皮腫に焦点を当て、酸化的ストレスとDNAメチル化集積との関連について、労災病院との共同研究により、悪性中皮腫病理組織検体によるDNAメチル化の評価をめざすものである。多くの悪性中皮腫症例で見られる組織形態として、腫瘍組織の上皮様構造(癌腫様構造)と肉腫様構造の2相性をもつことに着目して,病理標本の特定部位から切り出した微量検体でのDNAメチル化検出の予検討を行った。腫瘍細胞の増殖との関連については、癌抑制遺伝子のひとつであるP16の発現、遺伝子プロモータ領域のメチル化について、検討を行った。腫瘍の形態に関与する遺伝子の解析としては、癌腫様部分では腫瘍細胞相互の細胞結合が見られE-カドヘリンが発現しているが、肉腫形態の部分では、腫瘍細胞は散在性で細胞結合がなく、E-カドヘリンの発現がない。両者の移行像が存在することから、遺伝子欠失による発現低下よりも、プロモータ領域のメチル化による発現抑制が想定される。腫瘍の形態学的特徴に基づいて特定部位を切り出した微量検体を用いて、E-カドヘリン遺伝子プロモータ領域のメチル化を検出するMSP(メチル化特異的PCR)法を施行するとともに、メチル化部位を特定するために、bisulfite処理後のシークエンスによる解析をすすめている。さらに、アスベスト曝露歴を有する心膜原発中皮腫症例において、心膜の主病巣と、肺胸膜腫瘍部、非腫瘍部肺実質をサンプリングして解析を進めている。これまでのメチル化による発現制御に関する知見は、Cancersに掲載され、また病理組織標本からの解析方法については、検査と技術誌に報告した。エピジェネティクス制御機構は、再生医療、分子標的治療へと展開しているポストゲノム時代の重要な研究課題である。本研究課題では、アスベスト曝露後の悪性中皮腫に焦点を当てて、酸化的ストレスとDNAメチル化集積との関連についての解析するものである。

病理組織学的に中皮腫の2相性、即ち、上皮様配列を示す成分と、紡錘形肉腫様成分とが混在する特徴に着目して、中皮腫の上皮化を制御する分子機構に着目した。肉腫様部分と上皮化成分との細胞接着分子E-カドヘリン発現の比較検討を施行中である。本研究計画を遂行するために、組織標本の微小検体から効率良くDNA増幅やメチル化解析を施行する新規の方法論の検討を行なった。成果の一部は学会にて報告した。中皮腫と共通して、2相性を示す腫瘍である滑膜肉腫培養細胞株を実験モデルとして、組織2相性を制御する因子の解析を目指した。今年度は、滑膜肉腫における肉腫成分と上皮様成分とを識別する分子の探索を行った。遺伝子発現の比較検討の結果、紡錘細胞型腫瘍では、cancer/ testis antigen (CTA)に属するいくつかの遺伝子の発現が有意に高いという所見が得られ、「CTAと上皮様成分の間葉化」という新たな着眼点を見い出した。ウェスタンブロッティングによる抗体のスクリーニングを行い、肉腫様成分の培養細胞株SW982と上皮様成分の培養株HS-SY-IIとを識別可能なモノクローナル抗体について、2次元電気泳動ぼ条件設定を行い、抗原蛋白を切り出し精製に着手している。エピジェネティクス制御機構は、再生医療、分子標的治療へと展開しているポストゲノム時代の重要な研究課題である。本研究課題では、アスベスト曝露後の悪性中皮腫に焦点を当てて、酸化的ストレスとDNAメチル化集積との関連についての解析するものである。本研究計画を遂行するために、組織標本の微小検体から効率良くDNA増幅やメチル化解析を施行する方法論の検討を行なった。成果の一部は学会と論文にて報告した。中皮腫と共通して、2相性を示す腫瘍である滑膜肉腫培養細胞株を実験モデルとして、肉腫様成分からの上皮化を制御する因子の解析を目指した。今年度は、滑膜肉腫における肉腫成分と上皮化成分とを識別する抗体の探索を行った。ウェスタンブロッティングによる抗体のスクリーニングを行い、肉腫様成分の培養細胞株SW982と上皮様成分の培養株HS-SY-IIとを識別可能なモノクローナル抗体を見い出した。引き続き、2次元電気泳動を行い、抗体の認識する抗原蛋白を切り出し、詳細な分析に供する。本研究課題では、アスベスト曝露後の悪性中皮腫に焦点を当てて、酸化的ストレスとDNAメチル化集積との関連についての解析をするものである。病理組織学的に中皮腫の2相性、即ち、上皮様配列を示す部分と、紡錘形肉腫様成分とが混在する特徴に着目して、中皮腫の上皮化を制御する分子機構に着目した。肉腫様部分体と上皮化成分との細胞接着分子E-カドヘリン発現の比較検討を施行中である。本研究計画を遂行するために、組織標本の微小検体から効率良くDNA増幅やメチル化解析遂行する新規の方法論の検討を行った。
新規DNAシャフリング技術の確立と高機能タンパク質創製への利用

大腸菌ssb変異体の高頻度欠失突然変異誘発能を利用した新規in vivo DNAシャフリング系を構築した。宿主としてはssb-3変異株にrpsL変異を導入し、ストレプトマイシン(Sm)耐性を獲得した大腸菌株を用い、シャフリングの標的遺伝子としては、2種類の放線菌(K6株およびTH-2株)ホスホリパーゼD(PLD)遺伝子を用いた。2つのPLD遺伝子をタンデムに並べ、さらにPLD遺伝子間に野生型(Sm感受性)rpsL遺伝子およびゲンタマイシン耐性遺伝子を挿入したプラスミドを構築し、これを用いてin vivo DNAシャフリングを試みた。その結果、rpsLのプラスミドからの脱落に伴う、宿主のSm耐性への復帰を指標とすることで、標的遺伝子を発現させず、かつ簡便にキメラ形成を検出可能であることを見出した。この特徴は、宿主に対して毒性をもつ蛋白質への応用において有利である。また、ssb-3変異株でのキメラ形成頻度はssb野生株の1000倍以上であり、ssb-3変異株を用いる優位性を確認できた。Sm耐性復帰株のPLD遺伝子を解析した結果、キメラ形成は親遺伝子間の短い相同配列部分で起きており、多様性をもったキメラPLD遺伝子群が得られた。それらのキメラPLDを発現・精製した後、耐熱性を比較することで、耐熱性に寄与するアミノ酸残基を探索した。その結果、PLDの426および433番目のアミノ酸残基が耐熱性に関与しており、それらの残基がTH-2株型の場合よりもK6株型の場合のほうが耐熱性が向上することを見出した。また、TH-2株PLDのこれらの位置にK6株型の残基を導入することでTH-2株PLDの耐熱性を向上させることに成功した。これらの結果から、このin vivo DNAシャフリング系は、蛋白質の機能解析や機能向上に有用であると考えられる。
インフルエンザ菌の気道上皮細胞内寄生と細胞傷害性T細胞応答の解析

無莢膜型インフルエンザ菌(NTHi)の気道上皮細胞内に侵入することをヒト気道上皮細胞株であるBEAS-2B細胞株を用いて確認し、NTHiの細胞内侵入の分子機構について研究をおこなった。その結果、NTHiは、ビトロネクチンに付着することを確認した。この付着はNTHiのプロテインEの84-108番目のアミノ酸からなるペプチドの前処理で阻害された。この阻害の程度はペプチド濃度依存的であった。同様にNTHiのBEAS-2B細胞内への侵入もペプチドの濃度依存的に阻害された。このことからNTHiの気道上皮細胞への侵入は、宿主のビトロネクチン、NTHiのプロテインEが関与した過程であることが明らかとなった。NTHiの気道上皮内侵入・寄生および再活性化機構の解明NTHiの気道上皮細胞内寄生の確認をおこなった。NTHiの気道上皮細胞内に侵入することをヒト気道上皮細胞株であるBEAS-2B細胞株を用いて確認した。NTHi菌株として、ATCC保存株2種(ATCC19418, NCTC8143)および浜松医科大学附属病院臨床分離株数種(HUSM0195, HUSM0481他)を用いた。NTHi菌株をLIVE/DEAD BacLight細菌染色キット(Molecular Probes社)を用い生きたまま染色した後、BEAS-2B細胞に感染させその局在を経時的に、蛍光顕微鏡(BIOREVO BZ-9000; Keyence社)を用いて観察した。NTHi菌の細胞内局在を確認するため、感染細胞の食胞(ファゴゾーム)をLysoTracker試薬(Molecular Probes社)を用いて染色した。細胞内の生存細菌数は、NTHi感染細胞を回収しそれをチョコレート寒天平板培地にプレーティングすること(平板プレート法)により計測した。NTHiを感染後、細胞外の細菌は細胞内浸透生のない抗菌薬であるゲンタマイシンで殺菌した。平成26年度にNTHiの気道上皮細胞内に侵入することをヒト気道上皮細胞株であるBEAS-2B細胞株を用いて確認した。平成27年度は、細胞内侵入の分子機構について研究をおこなった。NTHi菌株として、ATCC保存株1種(ATCC19418)および浜松医科大学附属病院臨床分離株1種(HUSM0481)を用いた。BEAS-2B細胞にNTHiを感染させた2時間後に、ゲンタマイシン処理にて細胞外細菌を殺滅した。蛍光染色後の顕微鏡観察にて、細胞内侵入菌数を計数した。また細胞内の生存細菌数は、NTHi感染細胞を回収しそれをチョコレート寒天平板培地に塗布して1晩培養後のコロニー数を計数することでも評価した(平板プレート法)。またビトロネクチンが、NTHiの細胞表面への付着、細胞内侵入に関与していることを確認するため、プラスチックプレートにコートしたビトロネクチンにNTHiが付着するか検討した。この付着はNTHiのプロテインEの84-108番目のアミノ酸からなるペプチド(PE84-108)の前処理で阻害された。この阻害の程度はPE84-108ペプチドの濃度依存的であった。同様に、NTHiのBEAS-2B細胞内への侵入も、PE84-108ペプチドの濃度依存的に阻害された。このことから、NTHiの気道上皮細胞への侵入は、宿主のビトロネクチン、NTHiのプロテインEが関与した過程であることが明らかとなった。これまで、NTHi (Nontypeable Haemophilus influenzae;無莢膜型インフルエンザ菌)の気道上皮細胞内に侵入することをヒト気道上皮細胞株であるBEAS-2B細胞株を用いて確認し、NTHiの細胞内侵入の分子機構について研究をおこなった。NTHiのBEAS-2B細胞内への侵入も、PE84-108ペプチドの濃度依存的に阻害された。これらの結果より、NTHiの気道上皮細胞への侵入は、宿主のビトロネクチン、NTHiのプロテインEが関与した過程であることが明らかとなった。平成28年度は、引き続き、いくつかの臨床分離株について、各菌株の、細胞内侵入の分子機構、および菌体の種々の性状(菌体表面の疎水性、菌体凝集体形成能、バイオフィルム形成能等)について検討した。NTHi菌株の性状は以下の通りであった。液体培地内でほとんどの菌株は菌体凝集体を形成し3時間もすると試験管底にたまる性質があった。液体培地に1.5M NaClを加えると、菌体凝集体の形成能は減弱した。このことは、菌体凝集体の形成に菌体表面の電荷が関与していることを意味している。菌体表面の疎水性をヘキサデカンを用いて検討したところ、すべての菌株で疎水性は低かった。

各菌株の、プラスチック(ポリスチレン)表面へのバイオフィルム形成能を検討したところ、菌株によってバイオフィルム形成能に違いがあった。平成28年度は、永田、榎本の学内の研究以外の業務が多忙であり、研究に十分時間がとれなかった。また大学院生の池田が学外の病院勤務となり研究の進行が遅れた。細胞培養に必要なCO2インキュベーターの調子が悪く、細胞培養、および細菌の感染実験等がスムーズに進行しなかった。NTHiの気道上皮内侵入・寄生および再活性化機構の解明NTHiの気道上皮細胞内侵入機構の解明をおこなった。これまで、NTHi (Nontypeable Haemophilus influenzae;無莢膜型インフルエンザ菌)の気道上皮細胞内に侵入することをヒト気道上皮細胞株であるBEAS-2B細胞株を用いて確認し、NTHiの細胞内侵入の分子機構について研究をおこなった。BEAS-2B細胞にNTHiを感染させた2時間後に、ゲンタマイシン処理にて細胞外細菌を殺滅した。蛍光染色後の顕微鏡観察にて、細胞内侵入菌数を計数した。またビトロネクチンが、NTHiの細胞表面への付着、細胞内侵入に関与していることを確認するため、プラスチックプレートにコートしたビトロネクチンにNTHiが付着するか検討した。この付着はNTHiのプロテインEの84-108番目のアミノ酸からなるペプチド(PE84-108)の前処理で阻害された。NTHiのBEAS-2B細胞内への侵入も、PE84-108ペプチドの濃度依存的に阻害された。これらの結果より、NTHiの気道上皮細胞への侵入は、宿主のビトロネクチン、NTHiのプロテインEが関与した過程であることが明らかとなった。平成29年度は、引き続き、いくつかの臨床分離株について、各菌株の、細胞内侵入の分子機構、および菌体の種々の性状(菌体表面の疎水性、菌体凝集体形成能、バイオフィルム形成能等)について検討した。NTHi菌株の性状は以下の通りであった。液体培地内でほとんどの菌株は菌体凝集体を形成し3時間もすると試験管底にたまる性質があった。液体培地に1.5M NaClを加えると、菌体凝集体の形成能は減弱した。このことは、菌体凝集体の形成に菌体表面の電荷が関与していることを意味している。菌体表面の疎水性をヘキサデカンを用いて検討したところ、すべての菌株で疎水性は低かった。無莢膜型インフルエンザ菌(NTHi)の気道上皮細胞内に侵入することをヒト気道上皮細胞株であるBEAS-2B細胞株を用いて確認し、NTHiの細胞内侵入の分子機構について研究をおこなった。その結果、NTHiは、ビトロネクチンに付着することを確認した。この付着はNTHiのプロテインEの84-108番目のアミノ酸からなるペプチドの前処理で阻害された。この阻害の程度はペプチド濃度依存的であった。同様にNTHiのBEAS-2B細胞内への侵入もペプチドの濃度依存的に阻害された。このことからNTHiの気道上皮細胞への侵入は、宿主のビトロネクチン、NTHiのプロテインEが関与した過程であることが明らかとなった。NTHi菌株(ATCC19418, HUSM0195, HUSM0481)が、BEAS-2B細胞内に侵入することを確認した。その細胞内侵入のメカニズムについて検討した。
リン酸化ＴＤＰ－４３病理に準拠した「ＡＬＳからみたＡＬＳのための病型分類」の提唱

孤発性筋萎縮性側索硬化症の96連続剖検例を対象に、抗リン酸化TDP-43(pTDP-43)抗体を用いて大脳皮質を免疫組織化学的に検討した。これらの症例は海馬歯状回顆粒細胞における陽性細胞質内封入体を欠く群(ALS-C: n = 63)とそれを有する群(n = 33)に二分された。さらに、後者の33例は側頭葉新皮質における顆粒状、点状の変性神経突起の多寡により2群(ALS-T/few DNs: n=22; ALS-T/many DNs: n = 11))に分類された。各群の臨床病理所見を考慮すると、これら3群は個々にpTDP-43の脳内・細胞内局在が異なる独立した亜群であるとみなされた。目的:ALSの大脳皮質においてリン酸化TDP-43(pTDP-43)陽性組織像の詳細な検討はなされておらず、これを解析し臨床像との関連を検討した。方法:孤発性ALS連続剖検例128例から、TDP-43陰性の2例と検索困難な15例を除き111例を対象とした。Nishihiraら(2008)のALS分類に従い、海馬歯状回にpTDP-43陽性神経細胞質内封入体(NCI)を欠くType 1(78例)とそれを有するType 2(33例)に分類した。Type 2について、側頭葉皮質におけるpTDP-43陽性の変性神経突起(DN)の出現に注目して分類し、臨床像や組織像、生化学的特性との関連を検討した。結果:Type 2の33例のうち22例では、DNは少数であり(scarce DN: DN-S群)、他の11例では多数のDNに加えthreadsなど多彩な陽性所見が認められた(abundant DN: DN-S群)。両群ともNCIが種々の程度に認められた。DN-A群はDN-S群に比し罹病期間が有意に短かった。組織学的には、DN-A群では下位運動ニューロン脱落は軽度で、レンズ核に顆粒状のpTDP-43陽性像が高率に認められた。生化学的解析では、断片型pTDP-43の出現様式に両群間で明らかな相違は認められなかった。結論:ALSの大脳皮質ではpTDP-43陽性組織像は多彩であり、NCIとDNの出現量は症例ごとに異なっていた。DNの多寡で症例を分類すると、臨床的、組織学的な相違が認められた。DN-A群では下位運動ニューロン脱落が軽度であるにも拘らず、早期に死に至っていた。この群では、神経細胞死以前に機能障害をきたしている可能性が考えられた。昨年に引き続き、リン酸化TDP-43 (pTDP-43)病理に準拠した「ALSからみたALSのための病型分類」の提唱に至る研究を遂行した。そこでは、対象ALS剖検例の厳選(pTDP-43陰性例、検索困難な例、さらに大脳皮質や基底核に病変を有する例の除外)、さらに検索部位、検索方法の改善、追加を行った。目的:筋萎縮性側索硬化症(ALS)の大脳皮質及び皮質下灰白質(淡蒼球と被殻)におけるリン酸化TDP-43 (pTDP-43)陽性組織像の詳細な検討を行い、臨床像との関連を統計学的に解析した。結果:臨床的には、ALS-Cでは認知症の合併は極めてまれであった。また、ALS-T/many DNsは他の2群に比し生命予後が不良であった。一方、組織学的にはALS-T/many DNs群では下位運動ニューロンの脱落が軽く、大脳皮質と同様に淡蒼球と被殻にも無数の顆粒状や点状のpTDP-43陽性構造を高率に認めた。免疫蛍光二重染色による検討では、これらは神経樹状突起棘への蓄積であると考えられた。結論:各群の罹病期間や運動ニューロン脱落の程度を考慮すると、疾患の進行に伴いALS-CからALS-T/few DNsへ、あるいはALS-T/few DNsからAS-T/many DNsへの移行は考え難く、むしろ、これら3群はpTDP-43の脳内および細胞内局在が異なる独立した亜群であるとみなされた。計画通りに研究は進展し、筋萎縮性側索硬化症のTDP-43皮質組織像の多様性と臨床病理および生化学的解析結果との関連を示すことができた。神経病理学ALSの大脳皮質についてさらに詳細な検討を行う。

TDP-43病理像としてpTDP-43陽性神経細胞質内封入体(NCI)に加え、pTDP-43陽性グリア細胞質内封入体(GCI)の存在が知られているが、それらの出現の相互の関連性についてはこれまで何ら検討されていない。そこで、in situ hybridizationと免疫組織化学の2重標識法を用いて、ALS大脳皮質におけるpTDP-43陽性封入体を有している神経細胞およびグリア細胞の数を定量的に評価し、Nishihiraら(2008)のALS分類(Type 1 & Type 2)における大脳皮質のリン酸化TDP-43陽性組織像の形成にNCIとGCIがどのように関与しているのかを解析する。研究は順調に推移したが、消耗品の使用が予定より少なかった。また、謝金は発生しなかった。本年度に節約できた研究費は、今後、予定より増加が見込まれる消耗品、旅費、謝金等に使用する予定である。
マイクロ波プラズマによる共役pi電子結合を有する半導電性高分子膜の開発に関する研究

本研究では、PVCやPANの優れた製膜性を保持しつつ、それらの膜表面に共役系をマイクロ波プラズマ処理により瞬時に形成させ半導電性膜の可能性について追及することを目的とする。自作のマイクロ波放電システムを用いて、種々のキャリヤ-ガスを放電させ、そのグロー内にPVC膜置いて、膜表面で脱HCL反応を生じさせた結果、膜表面に共役炭素結合が形成していることを、IR、ラマンスペクトルならびに蛍光測定より確認できた。この共役結合の生成は、放電処理時間とマイクロ波発生器からの距離に大きく依存することが明らかとなった。また、光を用いてPCV膜表面に共役結合を形成させる手法に比べて、本研究の方法は、きわめて短時間で共役結合を形成させることが可能であることが明らかになった。この共役結合の形成過程を検討するために、放電時間、電圧、プラズマグローの圧力を変えて、プラズマ照射で得られた発光をマルチチャンネル測光により観測した結果、CHやC2フラッグメントに帰属できる反応活性種の検出に成功し、この結果から、PVC表面がプラズマ処理によって分解し、これらの反応活性種が生成していることが明らかになった。
ヒマラヤ山脈の上昇・削剥・冷却史とモンスーン変動史の研究

高度変成岩ナップ先端部の研究から,変成帯下部とその下の延性剪断帯MCTゾーンの最高圧力・温度は,各々11kb/720°Cと8kb/580°Cであり,約100km北のナップのルートゾーンと変わらないことが判明した。従って,変成帯は2216Maに急激に上昇する前,ほぼ水平な状態にあったこと,又その北端はチベットの中部地殻を成し,変成帯はアジア大陸の下に沈み込んだインド亜大陸の上部地殻がデラミネーションして形成されたことを示唆する。この1510Maのナップの運動に先行して,低度変成岩ナップがMCTに沿って2016Maに上昇・削剥されたことが,前縁盆地堆積物の重鉱物組成分析から判明した。(1)変成岩ナップの研究:東ネパールのDhankuta地域を中心にナップの先端部において,MCTとその下位の高温延性剪断帯MCTzoneの地質調査と岩石試料採取を行った。MCTの上盤と下盤,および下盤を成すKuncha層に貫入した花崗岩類から試料を精選し,ジルコンを抽出しレーザーICPMassを使ってU-Pb年代を測定した。その結果,以下の4つの新しい事実を発見した。(1)上盤の高度片麻岩類は2017Maに熱イベントを破り,明瞭な鉛ロスを生じている。(2)下盤の珪岩や片岩には鉛ロスは認められず,1917億年の年代ピークを持つ。また全ての試料は16億年より若い年代を示さない。すなわち16億以降は全く熱のイベントを被っていない。(3)Kuncha層に貫入した花崗岩類は,1819億年の結晶化年代を示す。また変成・変形した眼球片麻岩類は,2517Maに熱履歴を被っている。(4)変成岩ナップに覆われた中新世の蛇行河川堆積物Dumri層中の砕屑性ジルコンには,若い熱履歴は認められないが,FT年代は1110Maと若く,300°C程度の熱の影響を受けている事が明らかとなった。これらの事実は,MCTを境に供給源を異にしたジルコン粒子を含む岩石が接しており,これまで問題になっていたMCTの位置をジルコンのU-Pb年代を基に決定できることを示している。またDumri層中のジルコンにはKuncha層と同じ年代・熱履歴を持つ粒子は含まれておらず,同層堆積中には,Kuncha層は地表に露出していなかった可能性が高い。(2)シワリーク層群の研究:西ネパールのタンセン-ブトワール地域で,シワリーク層群の調査を行い,重鉱物分析用の試料を組織的に採集した。特に砂岩の性質が変化する10Ma前後を中心に約50試料を採取することができた。また本調査によって,10Ma頃に侵食され礫岩層が形成されている事が判明した。ヒマラヤの高度変成岩ナップの先端部と,その下位の低度変成岩から成るKunchaナップに挟まれた剪断帯MCTzoneの変成度は,藍晶石帯から十字石帯,ザクロ石帯へMCTからの距離が増加するほど低くなる。泥質片岩中の石英脈は,南フェルゲンツの延性変形を受けおり,藍晶石帯では,石英脈中に藍晶石が少量の斜長石と伴に含まれる。ザクロ石と藍晶石は石英脈の直近でのみ粗粒であり,藍晶石は石英脈の周囲にのみ産しており,石英脈を形成した流体の活動が藍晶石帯の変成ピーク前後に起き、Si、Al、Na、Caが流体中に含まれ運搬されたことを示す。この流体活動の温度圧力条件は約8kbar,600°Cと見積もられた。石英脈は変成作用の昇温期とピーク変成時に,系外から流入した流体の証拠である。また片理面を切って貫入する電気石脈の存在は,ピーク変成以降も含ホウ素流体の流入が続いたことを示す。電気石の極間のCa/Na分配から,その形成温度は約530-590°Cと推定された。このような流体の起源は,各変成分帯の構造的下位に存在する,低変成度の変堆積岩類に求められる。大量の石英脈や電気石濃集帯の存在は,MCTに沿う変成帯の上昇時に,MCTzoneの流体圧が高く,それによってナップ下底の摩擦抵抗を減少させ,ナップの運動を促進した可能性を示唆する。

一方Kunchaナップの起源を明らかにする目的で砕屑性ジルコンのU-Pb年代測定を行ない,Kuncha層は約1918億年前,Naudanda層は約1817.7億年前の堆積物から成り,カナダや北中国の下部原生界に対比されること,また約19億年前の超大陸コロンビアの分裂に伴い形成されたことが判明した。ナップに覆われたレッサーヒマラヤの現地性の原生界には変成雲母が生成し,砕屑性ジルコンは鉛ロスを被っており,ナップは被覆した時少なくとも350°C以上を保持していたことを示す。東ネパールのナップ前縁部で地質調査を行い,MCT zoneの詳細な地質図を作成し,この剪断帯の構成岩石がKuncha層であることを確認した。またこれまでMCTは延性剪断帯のため,その位置の認定について問題が指摘されてきたが,ナップの基底から初めてMCTの露頭を発見し,著しく脆性破壊した13mの断層帯を伴っていることを明らかにした。これは即ち,変成帯が地表に出現してから100km以上オーバースラストしたナップの下底は,低温下で破壊されていることを意味する。またMCTは通常の断層のように平面をなさず,波曲していることが明らかになった。さらにMCT zone中のトレモラ閃石と陽起石の球顆状結晶を使って歪み解析を行い,扁平化はしているが伸長しておらず,歪みの多くはMCTに沿う断層帯に集中していたことが判明した。MCT zoneの変成岩の鏡下観察の結果,緑泥石帯から十字石、藍晶石帯に亘ることが判明し,変成分帯できることが分かった。一方MCTとMBTに挟まれたヒマラヤの前縁山地の地質調査によって,この地帯が逆転翼をもつ過褶曲していることを明らかにした。さらにKunchaナップの前縁部は,そのルートゾーンに比べ変成度が格段に低いことが分かった。MCT zone中のマイロナイト化した花崗岩とKuncha nappeの上部の石英砂岩に含まれるジルコンのU-Pb年代測定を行った。その結果,前者は約18億年,後者は17.6億年より若いことが分かった。一方,MCT直上の片麻岩のジルコンのU-Pb年代分布は610億年前に幅広いピークを持ち、MCTの上盤と下盤では年代と起源が異なることが判明した。古カトマンズ湖のボーリングコア最上部の花粉分析,有機分析,粘土鉱物の分析結果を総合的に検討した結果,約1.2万年前の寒冷期であるヤンガードリアス期を含んでいることが判明した。変成岩ナップの研究については,ジルコンのU-Pb年代による高温熱履歴の研究が非常に有効である事が判明した。得られた4つの新事実は国際的な視点から見ても意義があり,現在Island Arc誌特集号に論文投稿準備中である。また同じジルコン粒子について低い閉鎖温度を持つFT年代を測定する事で,300°C程度の低温での熱履歴を検出できる事を明らかにすることができた。このように複数の年代測定を同じ試料に適用するによって,幅広い温度と年代範囲の履歴を明らかにする有効性を示すことができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題で行なった調査・研究の重要な成果は以下の4つである。(1)変成岩ナップ中の花崗岩の年齢は約18.5億年であるが,ヒマラヤ造山運動の過程で再流動しマイロナイト化し,その程度に応じてPbロスが生じており,その年代のピークは17Maであった。(2)Kunchaナップ中の花崗岩は16億年前以降中新世まで熱履歴を被っていない。(3)レッサーヒマラヤ帯の10,000mを超える地層は,約19億年前の大陸のリフト形成とそれに引き続く非活動的縁辺で形成されたものであり,カナダの前期原生代の地層群と対比される。(4)変成岩ナップはナップの先端と表面から北方および内部に向かって徐々に冷却し、その等温線の後退速度は約1cm/yと推定される。これらの成果を国際会議(第27回Himalaya-Karakoram-Tibet Workshop)で講演し,高い評価を得た。またそれらをまとめた論文2編が国際誌に受理された。
環境に適応するための高次行動を制御する神経生理機構のシステム的理解

社会環境への適応のメカニズムを明らかにするため,コオロギの闘争経験に基づく行動の選択の神経メカニズムを調査したところ,脳内の一酸化窒素・生体アミン系の働きが重要であることを突き止めた.また,行動と神経修飾機構を説明するモデルを構築し,シミュレーション実験と行動検定によりモデルの妥当性を検証した.その結果,個体間相互作用による部状態を更新するメカニズムが社会適応の実現に重要であることを明らかにした.社会環境への適応のメカニズムを明らかにするため,コオロギの闘争経験に基づく行動の選択の神経メカニズムを調査したところ,脳内の一酸化窒素・生体アミン系の働きが重要であることを突き止めた.また,行動と神経修飾機構を説明するモデルを構築し,シミュレーション実験と行動検定によりモデルの妥当性を検証した.その結果,個体間相互作用による部状態を更新するメカニズムが社会適応の実現に重要であることを明らかにした.動機づけによる行動の修飾,階層的ルールに基づく行動の選択・決定の神経機構を解明すると共に,生物学実験から得られた結果を,システム工学グループとの連携による数理シミュレーションを用いて再現することで,動物の個体識別・個体間相互作用・コミュニケーションなど社会的性発現に関わる高次脳機能の神経生理機構の基本原理を理解することをめざしている.コオロギやカイコなど昆虫のフェロモン行動の発現機構と,他個体との接触や経験に伴う行動パターンの実時間選択の神経機構を生理学・行動学的手法で解析するとともにシステム工学グループとデータを共有することで数理シミュレーションによる解析を進めている.コオロギの群行動について,行動学実験をC02班のメンバーと行い,その結果を基にシミュレーションモデルを生成してもらった.現時点では,密度効果が昆虫の行動発現にいかに影響するかの行動実験データ収集をし,モデルの評価を進めている.コオロギの喧嘩行動や,雄カイコガの雌探索行動のようなフェロモン行動発現にかかわる神経機構を解明するため,神経生理学実験を同時に進めている.フェロモンに対する応答は定型的な行動が多いが,他個体との相互作用(接触,喧嘩,交尾経験)により行動発現の修飾・切替えが起こる.この神経生理機構解明に向け,フェロモン情報処理にかかわる神経細胞の同定と得られた結果のデータベース化を進めている.特に,一酸化窒素(NO)が,フェロモン情報処理にかかわることから,分子生物学的方法と,組織化学的な方法により,脳内のNO合成酵素(NOS)の発現について調査を進めている.NOSをコードする部分塩基配列の決定にも成功している.社会をひとつの環境要因として捉え,社会適応の神経基盤を解明するため,コミュニケーション行動のひとつであるフェロモン行動を題材に,フェロモン情報処理機構,行動発現機構について行動学的な実験と生理学的な実験をコオロギやカイコを用いて行った.フェロモンにより発現するカイコガの匂い源定位行動と,コオロギの喧嘩行動を対象として,行動の解発閾値や行動パターンが社会的な経験,概日リズム,異種感覚情報などの内的または外的な状況に依存して変容し,行動発現が調節される機構を神経行動学的に分析してきた.カイコガでは,フェロモンに対する感度が,フェロモンの短期的な経験により低下し(慣れ),また他の一般臭により脱慣れし感度が回復することを見出した.この説慣れはフェロモン暴露後の時間に依存することが示唆された.一方,昆虫の適応行動と環境との相互作用を評価するため,ロボット上の昆虫が自ら操縦を行う「昆虫操縦型ロボット」というアプローチを提案し,ロボットの試作を行った.これは,昆虫を含むロボットそのものを一つの「身体」とみなすことで,人為的な身体の操作を可能にするものである.コオロギでは,これまで喧嘩行動の発現機構にNO/cGMPが関与することが明らかにした.一方,生体アミン,特にオクトパミンが喧嘩行動の調節にかかわることが示唆されていた.そこで,NOシグナルが脳内アミン系をどのように修飾するのかを生化学的に調査したところ,NOは,特に脳内のオクトパミンレベルの調整にかかわることが判明し,また,このNO/アミン系が喧嘩行動の発現の切り換えにかかわることが示唆された.個体間相互作用による行動発現や行動切り換えの神経機構について工学系のグループと連携し動的モデリングおよび計算機シミュレーションと生物学的評価を進めている.動物が構築する社会は,生物が進化の過程で獲得したひとつの適応機構といえる.そこで,社会をひとつの環境要因として捉えることで,動物の社会適応能の発現の神経基盤について研究を進めている.昆虫のフェロモン行動は,同一種における個体同士のコミュニケーション行動のひとつである.コオロギとカイコを題材にフェロモン行動発現の神経機構について行動学的な実験と生理学的な実験を行った.クロコオロギの闘争行動を対象とした研究では,社会的な経験にもとづいて起こる行動選択の神経メカニズムについて研究した.その結果,フェロモン情報の処理にかかわる脳内の神経細胞間の接続様式や,ユニット構造のネットワーク接続様式を明らかにした.また,フェロモン行動が社会的な経験により調整されることを行動学的な実験から示した.また,闘争後の脳内アミンの変動について明らかにし,これらの成果をもとに工学グループとの共同で生成したモデルを再検討した.カイコガを題材とした研究では,内的または外的な環境要因に依存して,行動発現が調節される神経生理機構について研究した.フェロモン源探索行動におけるカイコガの迅速な適応能を調べるために,二輪式の昆虫操縦型ロボットを開発し,ロボットのモータゲインを人為的に操作することで,それに対するカイコガの適応能力を評価した.これにより,本能行動であるフェロモン源定位行動中の雄カイコガが,視覚フィードバックを用いた補償を行うことを示した.

さらに,神経系単体の機能評価を可能にする脳-機械融合システムを開発した.また,雄カイコガの匂い源探索行動を対象に,シミュレーションを行い神経系単体の活動を行動司令信号として用いることの妥当性を検証し,神経活動計測系を搭載した実機械の実環境中での走行実験を行った.多くの生物は,刻一刻と変化する環境に応じて状況に応じた行動を選択し発現することで適応してきた.生物が構築する社会は,環境要因のひとつとみなすことができる.個体が複数集まり集団や社会を構築すると,動物は,その社会環境に応じて適応的に行動を発現する.この動物に特有の,社会適応の機能を司る神経生理機構を明らかにするため,昆虫のクロコオロギを実験対象として,社会行動のひとつである闘争行動を題材にして研究を進めている.コオロギの闘争行動は,体表のフェロモン物質により解発されるフェロモン行動のひとつである.直翅目昆虫のクロコオロギで見られる闘争行動の発現機構を理解するため,フェロモン情報の処理にかかわる脳内の神経細胞間の接続様式や,ネットワーク接続様式について,昨年に引き続き詳細に調べた.また,コオロギの攻撃行動を誘発するフェロモン候補物質の同定と有機合成を行った.クロコオロギの闘争行動では,勝敗の結果が社会的な経験として,その後の行動選択を左右する.この過程でみられる行動選択を司る神経生理機構を理解するため,闘争経験により変容する神経生理機構にについて,一酸化窒素シグナル系とオクトパミン系の働きに注目し,行動薬理学的な実験を進めた.個体間相互作用による行動発現や行動選択の神経機構の研究から得られた知見を用いて,工学研究グループと共同で動的モデルを構築し,そのシミュレーションを行い妥当性の検討と生物学研究による検証を進めている.社会は行動発現を拘束するひとつの環境要因として捉えられる.動物が刻々と変化する社会環境下において,実時間で状況に応じた行動を発現する基盤となる神経メカニズムについて,クロコオロギの闘争行動を題材に研究した.コオロギの闘争行動は,体表のフェロモン物質を受容すると誘発される.まず,攻撃行動を誘発する化学物質の同定し,また,フェロモン情報処理にかかわる脳領域の構造を解剖学的に調べた.コオロギの攻撃性は,闘争での勝敗経験により変化する.負け経験により攻撃から忌避へと行動が切り替わるメカニズムに神経修飾物質の働きが重要であることを明らかにした.特に,NO/cGMPシグナル系が,闘争行動が終結する前の段階で機能的に働くことが重要であることを示した.一方,生体アミン類のオクトパミン(OA)も闘争行動の発現に深く関与する.脳内におけるNOとOAの働きを調べたところ,NOは,OAの作用を抑制する働きをもち,攻撃行動を抑え,特に,敗者では忌避行動の発現に関与することが示唆された.すなわち,NOとOAが脳で協調的に働くことで,攻撃性を調節するのだと考えられる.個体間相互作用による行動の発現について,行動学実験と生理学実験の結果から得られた知見を用いて,動的システムモデルを構築した.行動モデルと神経生理モデルのシミュレーション実験を行い妥当性の検討と行動学実験による検証を行った.
内視鏡的粘膜切除術とセンチネルリンパ節転移に対する遺伝子治療による早期胃癌治療

日本の胃癌治療は世界で最も進んでおり、他の消化器癌にさきがけて治療ガイドラインも公表されている。これからの胃癌治療は個別でかつ低侵襲が求められる。今後急速に進む高齢化に伴い合併症で胃癌手術困難な症例、手術侵襲によりQOLの著しい低下が懸念される症例の増加が予想される。早期癌を全て低侵襲な内視鏡下に治療できれば、Stage分類別胃癌治療に新しいツールを提供できる。これまでの実験から、内視鏡下に自殺遺伝子をアデノウイルスベクターで(Ad. HSV-TK)穿刺針を用い原発巣に導入すると、速やかに遺伝子が胃所属リンパ節に流れることが判明し、その後ガンシクロビルを静注すると治療8日目までに、所属リンパ節の完全な変性が生じた。遺伝子治療により原発巣の変性が約一ヶ月を要するのに比し、リンパ節変性は早期に組織変性を起こす。この際、センチネルリンパ節にまず遺伝子が導入されるが、どの程度の量の遺伝子(pfu)の投与で何群の所属リンパ節にまで遺伝子が導入されるかといった、ヒトへの臨床応用で必要となるデータの収集を開始した。更に、高力価かつ高用量のAd. HSV-TK投与ガンシクロビル治療では肝障害にも注意を払う必要があり、肝障害を起こさず目的のリンパ節への遺伝子導入が可能となるドーズを設定中である。