hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多元物質フロー解析モデルの開発と随伴元素成分を考慮した鉄鋼リサイクルへの応用

鉄鋼スクラップは、発生量のほぼ全量がリサイクルされているものの、鋼材に含まれる合金元素が有効利用されているとは言えない。合金元素を有効利用できるリサイクルを促進するために、多物質・多元素を同時に考慮できる物質フロー解析のための数理モデルを開発した。開発したモデルをシナリオ分析に応用して、スクラップの分別を徹底することによる合金元素リサイクルの可能性、および、それによって節約されるエネルギーを指標としてリサイクルの質を考慮することの重要性を指摘した。本研究では、とくにわが国における使用済製品(自動車、家電など)の適正処理と素材リサイクルの促進に向けて具体的な施策を提言するために、方法論の開発と実証分析を行う。具体的には、産業連関分析の理論に基づいて物質フロー解析の手法を拡張することにより、多物質・多元素を適切に同時に考慮することのできる新しい物質フロー解析手法を開発する。また、開発した解析手法を使用済製品の適正処理と素材リサイクルについての実証分析に応用し、「適正な鉄鋼スクラップの分別回収」「随伴元素・合金元素を考慮した効率的リサイクルのための産業連携」を明らかにすることを目的とする。今年度は、(1)多数の物質、多数の元素、多数のプロセスを同時に適切に考慮し得る物質フロー解析のための数理モデルの構築、(2)数理モデルを応用した物質フロー解析用の産業連関表データベース開発のための課題抽出などを行った。(1)については、WIO-MFAモデル(廃棄物産業連関物質フロー解析モデル)を拡張することにより、本課題の主たる特徴となる数理モデルを構築した。(2)については、総務省により公表されている最新の産業連関表(平成23年表)に対応したデータベースを開発するための課題を抽出した。平成17年表に対応したデータベース開発を実施した当時と比較して、利用可能な統計データ等が限られることなどから、データベース構築のための系統的手法へのニーズは高まっている。このことを踏まえて、データベースを構成する各要素を変数として含む数理計画問題の定式化について検討を行った。さらに、動学的物質フロー解析のためのMaTraceモデルを拡張して全球規模の多地域表に適用し、鉄鋼リサイクルに関する実証分析を行った。以上の成果の一部を国際会議で発表した。本課題の遂行は、(1)多数の物質、多数の元素、多数のプロセスを同時に適切に考慮し得る物質フロー解析のための数理モデルの構築、(2)数理モデルを応用した物質フロー解析用の産業連関表データの精度向上、(3)数理モデルを応用した物質組成・元素組成の推定と鉄鋼スクラップリサイクルに関する提言等への応用、から構成される。これらのうち、当初の計画通り(1)および(2)を実施した。今年度は、(1)多数の物質、多数の元素、多数のプロセスに加えて、多数の地域と物質フロー・ストックの経年変化を考慮し得る動学的物質フロー解析のための数理モデルの構築、(2)数理モデルを応用した物質フロー解析用の産業連関表データベースの開発を、その課題抽出と並行して行った。(1)については、動学的物質フロー解析のためのMaTraceモデルを拡張し、物質ロスを評価する指標を開発して、それを全球規模の多地域表に適用し、オープンリサイクルを含む鉄鋼フロー・ストックに関する実証分析を行った成果を論文として発表した。さらに、MaTraceモデルを多数の物質、多数の元素を適切に考慮し得るモデルへと拡張して、使用済自動車を中心とする鉄鋼フロー・ストックに関して多元素を明示的に考慮した実証分析を行った。この成果の一部は、平成29年度に国際学会で発表予定である。(2)については、昨年度から引き続き、利用可能な統計データ等が減少している状況に対応した系統的手法について検討を行った。本課題を構成する分析手法開発、データベース開発、実証分析とその結果に基づく提言のうち、分析手法開発と実証分析については、当初計画したものに加えて、関連する動学的分析を含む成果が得られている。データベース開発についても、それに必要な手法開発が順調に進展している。今年度は、多数の物質、多数の元素、多数のプロセスを考慮して、物質フロー・ストックの経年変化を同定する動学的物質フロー解析のための数理モデルの構築および実証分析を行った。より具体的には、動学的物質フロー解析のためのMaTraceモデルを拡張することにより、多数の物質、多数の元素を適切に考慮し得るモデルを開発した。さらに、オープンループリサイクルにおいて生じるロスを適切に考慮した循環性の指標を提案した。

実証分析の対象は鉄鋼素材全般であり、元素はクロムとニッケルを対象とした。製品は、建築・土木を含む最終製品すべてを対象とした。使用済製品から回収されるスクラップの分別に関するいくつかのシナリオごとに、リサイクルに係る一連のプロセス(使用済製品の回収、使用済製品からのスクラップ回収、鋼材の生産、最終製品の生産)で生じるロスも明示的に考慮しつつ、クロムとニッケルのフローとストックの経年変化を評価した。この成果の一部を国際学会で発表し、また論文として発表した。鉄鋼スクラップは、発生量のほぼ全量がリサイクルされているものの、鋼材に含まれる合金元素が有効利用されているとは言えない。合金元素を有効利用できるリサイクルを促進するために、多物質・多元素を同時に考慮できる物質フロー解析のための数理モデルを開発した。開発したモデルをシナリオ分析に応用して、スクラップの分別を徹底することによる合金元素リサイクルの可能性、および、それによって節約されるエネルギーを指標としてリサイクルの質を考慮することの重要性を指摘した。データベース開発については、国内共同研究と国際共同研究、または中間結果に関するレビューを専門家に依頼するなどして精度向上を図る。この過程で、例えば産業プロセスに関する新たな専門的知見が得られた場合は、それを系統的手法に取り入れて、さらなる精度向上を行う計画である。データベース開発については、国内外の共同研究を行うなどして、そのための手法開発とデータベースの精度向上を図る。物質フロー解析手法の開発と実証分析については、当初計画に加えて動学的分析も行う計画である。計量経済学、産業連関分析、産業エコロジー、環境経済学外国旅費などについて当初見込額との相違が生じたため。外国旅費などについて当初見込額との相違が生じたため。今年度と次年度の使用計画に大きな変更を必要としないと考えられるため、次年度に主として物品費と旅費に使用する予定である。
酵素ハイブリッドによる有用糖質の新しい合成法に関する研究

Trichoderma reeseiの生産する菌体外粗酵素画分から、各種クロマトグラフィ-によりキチナ-ゼを精製した。本酵素を用い20%硫安存在下、高濃度テトラ-N-アセチルキトテトラオ-スを基質として適当時間反応を行なうと約28%の収率で2糖鎖延長反応により特異的にヘキサ-N-アセチルキトヘキサオ-ス(GlcNAc_6)が生成してくることを見出した。さらにGlcNAc_6の効率的合成を行うべくニワトリ卵白リゾチ-ムを用い、30%硫安存在下キチンオリゴ糖の最小単位であるジ-N-アセチルキトビオ-スを10%基質濃度で作用させると、糖転移反応により高収率でGlcNAc_6とGlcNAc_7とが生成し、2糖から6、7糖の糖鎖延長反応が可能であることを見出した。この場合の糖鎖延長反応は反応溶媒の極生によって重合度組成を制御できることを明らかにした。糖質分解酵素の基質は一般的に親水性のためそれに対応した酵素タンパクも疎水的条件下においては不安定である。そこで本研究では還元性糖類をリゾチ-ムに修飾し親水性有機溶媒に充分耐性をもった修飾酵素の合成を試みた。即ち還元性二糖ラクト-スとリゾチ-ムのアミノ基とをNaCNBH_3存在下、シッフアミノ還元し酵素を修飾した。修飾酵素をイオン交換カラムクロマトにより精製しラクト-ス修飾率35%のリゾチ-ムを得た。修飾酵素の諸特性をNativeリゾチ-ムと比較したところ有機溶媒耐性、温度安定性などが増大した。また修飾酵素を用いた時の糖転移反応については、Native酵素のそれと反応性はなんら遜色はなく、さらに高い濃度での有機溶媒添加(ジメチルスルホキシド)での反応が可能となった。近年機能性オリゴ糖が続々見出され、その機能特性の解明と相まって有用糖質の調整は先端課題となっている。そこでリゾチームを利用した人為的制御反応下での新しいオリゴ糖の合成の開発をおこなった。ニワトリ卵白リゾチームの糖転移作用を利用し、ペンタ-N-Pセチルキトペンタオシドを供与体、P-ニトロフェニル-N-アセチルβ-D-グルコサミニドを受容体基質として1:12のモル比で2.5%基質濃度下、60%ジメチルスルホキシドを含む酢酸緩衝液(pH6.0)で30°C適当時間反応を行なうと反応経時に伴い沈澱を生じた。この沈澱を50%メタノール洗浄するだけで、クロマト操作を経ることなく直接目的物質P-ニトロフェニルペンタ-N-アセチル-β-.キトペンタオシドを高収率(供与体基質与たり46%)で分離することができた。本物質については既に人尿リゾチーム活性等の高感度測定基質として有用であることを著者は報告している。さらに本酵素を用い30%硫安存在下キチン分解酵素の最小単位であるジ-N-アセチルキトビオースを10%基質濃度を含む酢酸緩衝液(pH4.0)、70°Cで作用させた。すると高収率で生理活性オリゴ糖である6.7糖のヘキサ-N-アセチルキトヘキサオース、ヘプタ-N-アセチルキトヘプタオースとを合成できた。このように人為的反応制御下で発現する糖転位反応を利用し、新しいオリゴ糖の合成、変換法を開発することができた。これら研究成果を基盤に耐有機溶媒性の向上を目的として、リゾチームにいろいろな割合でポリエチレングリコールを導入した酵素ハイブリッドを調整した。しかしながら酵素活性は著しく減少し、さらに別な方法でのハイブリッド化を現在検討中である。

近年食品、化学さらには医薬などの分野で機能性素材としてのオリゴ糖の利用が脚光を浴びるようになっている。このような素材を効率的に合成すべくキチン分解酵素の糖転移作用を利用し有用キチンオリゴ糖の合成法を開発するとともに、目的にあった酵素反応を行なうためにリゾチ-ムをハイブリッド化し有機溶媒耐性酵素とすることを試みた。1)ニワトリ卵白リゾチ-ムの糖転移反応を利用し、ペンタ-N-アセチルギトペンタオ-スを供与体、P-ニトロフェニル-N-アセチル-β-D-グルコサミニドを受容体基質とし高濃度親水性有機溶媒存在下、人リゾチ-ム高感度測定基質であるP-ニトロフェニル-β-ペンタ-N-アセチルギトペンタオシドをカラムそうさ行うことなく、沈殿法による効率的合成法を確立した。2)Trichoderma reeseiの生産するキチナ-ゼを用い、反応系に20%硫安を添加するとテトラ-N-アセチルキトテトラオ-スを基質として糖鎖延長反応によりヘキサ-N-アセチルキトテトラオ-ス(GlcNAc_6)が、さらにリゾチ-ムより同様に3040%硫安添加するとジ-N-アセチルキトビオ-スを基質としてGlcNAc_6及びGlcNAc_7が効率よく生成してくることを見出した。このように反応系への硫安添加は、本来のリゾチ-ムの水解活性を抑え、糖転移活性を著しく増大させる効果を有していることを見出した。3)リゾチ-ムに対しラクト-スをシッフアミノ還元法により導入し、35%ラクト-ス修飾酵素を得た。本修飾酵素は親水性有機溶媒耐性能力が増大し、さらに温度安定性も幾分増大した。また修飾酵素の糖転移反応性はNative酵素のそれとそれ程遜色なかった。
光学活性スピロシランを鍵構造とする新規キラルらせん高分子の開発

本研究は,チオフェン環が縮環した5-シラスピロ[4.4]ノナン誘導体である光学活性スピロシランを新規キラル構成単位として用いたキラルらせん高分子の開発を主目的とする.光学活性スピロシラン骨格の導入により,生成する高分子は絶対配置が一義的に制御された堅固ならせん構造をとることが予想される.本年度の成果は以下のようにまとめられる.すでにスピロシランの分子内ヒドロシリル化による触媒的不斉合成,および得られた光学活性体を用いたD_4対称キラルモレキュラースクエァーの合成を前年度までに達成している.本年度は,本研究の一つの発展的展開として,スピロシランの新規キラル直交型構成素子としての有用性を示すことを目的に,自己集合によるキラルナノ組織体の構築について検討を行った.自己集合を誘起する官能基としては,いくつかのタイプの官能基が考えられるが,ここでは最も単純なカルボキシル基を用いることにした.スピロシランのsec-BuLiを用いたジリチオ化,それに続く炭酸ガスとの反応によりスピロシランジカルボン酸を得た.(S)_<Si>-スピロシランジカルボン酸の単結晶についてX線結晶構造解析を行った.結晶構造において,カルボキシル基は分子間で水素結合を介して二量化しており,また,スピロシラン骨格のチオフェン環平面とカルボキシル基のC-O-Oのなす面とはほぼ同一平面上にある.この結果,(S)_<Si>-スピロシランジカルボン酸は結晶中で4_1らせん一次元ネットワークを形成している.この容易ならせん形成は他のC_2対称軸不斉スピロ化合物の場合にはみられない特異な現象であり,その原因についても考察を行った.本研究は,チオフェン環が縮環した5-シラスピロ[4.4]ノナン誘導体である光学活性スピロシランを新規キラル構成単位として用いたキラルらせん高分子の開発を主目的とする.光学活性スピロシラン骨格の導入により,生成する高分子は絶対配置が一義的に制御された堅固ならせん構造をとることが予想される.本年度の成果は以下のようにまとめられる.すでにスピロシランの分子内ヒドロシリル化による触媒的不斉合成,および得られた光学活性体を用いたD_4対称キラルモレキュラースクエァーの合成を前年度までに達成している.本年度は,本研究の一つの発展的展開として,スピロシランの新規キラル直交型構成素子としての有用性を示すことを目的に,自己集合によるキラルナノ組織体の構築について検討を行った.自己集合を誘起する官能基としては,いくつかのタイプの官能基が考えられるが,ここでは最も単純なカルボキシル基を用いることにした.スピロシランのsec-BuLiを用いたジリチオ化,それに続く炭酸ガスとの反応によりスピロシランジカルボン酸を得た.(S)_<Si>-スピロシランジカルボン酸の単結晶についてX線結晶構造解析を行った.結晶構造において,カルボキシル基は分子間で水素結合を介して二量化しており,また,スピロシラン骨格のチオフェン環平面とカルボキシル基のC-O-Oのなす面とはほぼ同一平面上にある.この結果,(S)_<Si>-スピロシランジカルボン酸は結晶中で4_1らせん一次元ネットワークを形成している.この容易ならせん形成は他のC_2対称軸不斉スピロ化合物の場合にはみられない特異な現象であり,その原因についても考察を行った.
調和解析の掛谷問題への応用

本研究は掛谷極大関数の荷重付評価を研究することで,掛谷問題に新しい研究手法を見出そうとするものである.平成27年度から平成29年度までの研究で,一般次元における荷重付掛谷極大関数の有界性を示した.その際の荷重はreverse Holder classに属するものとする.これは1995年のWolffの結果を拡張したものとなっている.また掛谷問題と関連するHausdorff容量を一般化し,抽象的な2進立方体上で定義されたHardy-Littlewoodの極大関数の有界性を示した.さらに関連する強極大関数の荷重評価を考察し一般の荷重に対し,Fefferman-Stein型の不等式を証明した.研究計画に従い,球対称荷重付掛谷極大関数の有界性について研究を進めた.その結果,これまでの研究はreverse Holder classという一般的な枠組みで議論できることを見出し,その有界性を統一的に示すことができた.さらに,n次元における荷重付体積公式を証明することに成功し,Wolff's rangeと呼ばれる高次元における現在の最良の結果の荷重付評価を証明した.このときその不等式評価の最良性に関心がもたれるが,冪型荷重という特別な場合においてのみその評価の最良性を示すことができた.また, reverse Holder classを考察する際,一般の2進立方体で考察した点は新しい視点であると考えられる.また, Fourier制限問題と関連するSchrodinger方程式の解の平滑化評価について,平滑化評価の最適定数の別表現を与え,それを実現する臨界関数の特徴づけを得た.これにより,平滑化評価が成り立つための荷重,伝播関数などに対する十分条件を得ることに成功した.この結果は未解決問題である溝畑-竹内予想に関する新たな特徴づけを与えることもできる点は興味深いものであり,波動方程式への応用について研究を進めている.本研究は掛谷問題への調和解析の応用であるが,調和解析におけるMorrey空間の研究は著しい進歩を遂げている.この空間の解析には自然にHausdorff容量の概念が現れ,非加法的測度の性質を調べる必要がある.この研究についてHausdorff容量を用いたHardy-Littelwoodの極大関数の有界性を示した専攻研究を一般化し,抽象的な2進立方体上で定義された極大関数と,Hausdorff容量を考察し, Hardy-Littlewoodの極大関数の有界性を論じた.予定よりもわずかに早く進展しているが,残る問題について,予想した通りの結果が得られない可能性が出ている.問題点を整理し,新たな予想をたてて進める予定である.平成27年度における研究は平成28年度前半までに予定していた成果までを挙げることができており,予定していたFourier制限問題と荷重付掛谷極大関数の関係について平成28年度一年をかけて取り組むことができた.しかしながら,この問題に取り組むには多くの困難が含まれていることがわかり,研究計画の見直しを必要とした.現在は関連するいくつかの論文を解読中であり,さらに時間が必要であると予想される.これについては平成29年度の課題としてさらに時間をかけて取り組む考えである.そこで平成28年度の前半で発表した論文を再考した.これにより,強極大関数に関するFefferman-Stein型不等式を証明することができた.これは査読論文としてすでに受理されている.さらにこの研究を進めることで,直方体型の分数冪極大関数に関しても同様の不等式を証明することができた.こちらは現在投稿中である.また昨年の段階では投稿中であったreverse Holder classを考察した論文は受理されており,一定の評価を得ることができている.さらに,昨年度から取り組み始めたHausdorff容量を用いた極大関数の研究も継続しているが,最近になって荷重付Hausdorff容量の研究に取り組んでいる論文を発見した.これらの研究はまだ始まって日が浅い研究であるといえる.こちらに対しても上述のFefferman-Stein型不等式が成り立つ可能性を見出すことができており,一定の成果が上がっている.さらなる研究を急ぎ,まとまり次第論文として発表できる見込みである.平成29年度前半までに見込んでいた結果に若干の遅れがでている部分もあるが,研究計画の見直しを行い一定の成果をあげることができている.平成28年度から平成29年度までに予定していたFourier制限問題と荷重付掛谷極大関数の関係の研究は,多くの困難が含まれていることがわかり研究計画を見直した.平成29年度は大きく分けて2つの方向性で成果を得ている.(1)1つ目は荷重付Lebesgue空間における種々の極大関数のFefferman-Stein型不等式の研究である.平成28年度の前半で発表した自身の荷重理論の論文を再考し,この研究により分数冪強極大関数に関するFefferman-Stein型不等式を証明した.従来荷重に対してMuckenhouptの直方体型のA∞条件を仮定していたが,この条件を完全に排除し,最も一般的な形で証明した.こちらは現在投稿中である.また,中国の研究者と行った多重線形極大関数についても同様の研究成果を得ており,現在投稿中である.(2)2つ目はHausdorff容量を用いた極大関数の研究である.荷重付Hausdorff容量の研究に取り組んでいる海外の先行研究を再考察し, Choquet-Lorentz空間上でFefferman-Stein型不等式を示した.その際, Hausdorff次元と分数冪作用素が持つパラメータの関係はあまり調べられていなかったが,我々の研究によって完全に制御することができた.

こちらは現在投稿中の専門誌から修正の報告を受けている,しかるべき調整の後受理される見込みである. Hausdorff容量による解析は掛谷予想への応用することを目標としているが,現在世界的にもまだ始まったばかりである.本年度から強極大関数のChoquet空間上での有界性について研究を開始し, min(1,d)<pという範囲で有界性が成り立つことを示した.この指数は最良であることも確認でき,現在その論文を投稿中である.本研究は掛谷極大関数の荷重付評価を研究することで,掛谷問題に新しい研究手法を見出そうとするものである.平成27年度から平成29年度までの研究で,一般次元における荷重付掛谷極大関数の有界性を示した.その際の荷重はreverse Holder classに属するものとする.これは1995年のWolffの結果を拡張したものとなっている.また掛谷問題と関連するHausdorff容量を一般化し,抽象的な2進立方体上で定義されたHardy-Littlewoodの極大関数の有界性を示した.さらに関連する強極大関数の荷重評価を考察し一般の荷重に対し,Fefferman-Stein型の不等式を証明した.今後は極大関数の有界性評価の最良性を,冪型荷重という制限を除いたときにどのように示されるかと,荷重理論におけるFourier制限問題と荷重付極大関数との関連を示すことを主たる目的として研究を進める.また来年度の研究計画にあるSchrodinger方程式,波動方程式への研究を進めるため,関連する文献を調査する.平成28年度前半までの本研究課題は概ね順調に進んでいる.28年度後半からの計画であったFourier制限問題と極大関数との関わりを明らかにすることは難問であることがわかっている.解読すべき論文でまだ終わっていないものがあり,さらに時間をかけて取り組む予定である.その後,制限問題とNikodym極大関数との関連を調べることで,制限定理との含意を示し,我々の荷重理論と制限問題との関連を明らかにする.一方で新たな研究方針を模索している.これまでの研究を踏まえ,Fefferman-Stein型不等式に関する研究を同時に推し進めたい.調和解析におけるMorrey空間の研究は著しい進歩を遂げているが,この空間の解析には自然にHausdorff容量の概念が現れ,非加法的測度の性質を調べる必要がある.昨年度の研究でHausdorff容量を用いたHardy-Littelwoodの極大関数の有界性を示した専攻研究を一般化することに成功しているが,分数冪極大関数に対しても同様の結果が示されることがわかっている.また荷重付Hausdorff容量の結果についても興味深い現象を確認している.これらの結果を精査することで重要な結果を得ることができると期待している.調和解析参加予定していた国際研究集会が日本国内で行われたため,計画していた旅費が抑えられた.
髄鞘における硫酸化糖鎖の機能解明

髄鞘はグリア細胞が軸索を何重にも取り囲んだ構造であり、神経系が正常に機能するために重要な役割を果たす。髄鞘において多くの糖蛋白質が同定されてきたが、糖鎖の役割については理解が乏しかった。我々は硫酸化N結合型糖鎖が末梢神経系髄鞘には豊富に存在することを見出した。そして、その硫酸化修飾は硫酸転移酵素GlcNAc6ST-1によるものであると突き止めた。GlcNAc6ST-1ノックアウトマウスの末梢神経系髄鞘ではN結合型糖鎖の硫酸化は見られず、髄鞘異常および軸索変性が観察された。故に、末梢神経系においてGlcNAc6ST-1はN結合型糖鎖の硫酸化を介して髄鞘形成を制御することが明らかとなった。髄鞘は絶縁体として働くだけでなく軸索と緊密な相互作用を行い神経機能を調節する。髄鞘はグリア細胞が軸索を何重にも取り囲んだ多重層構造であり、そこには多くの膜蛋白質が存在する。細胞表面に存在する殆ど全ての膜蛋白質が糖鎖修飾されていることから、髄鞘において糖鎖が重要な働きを担っていると考えられるが、糖鎖がどのような役割を果たすかは未だ理解が乏しい。今までにマウスなどの髄鞘の糖鎖解析を行い、硫酸化N結合型糖鎖が末梢神経系髄鞘には豊富に存在することを私は見出した。本研究は、末梢神経系髄鞘においてGlcNAc6ST-1により作られる硫酸化糖鎖がどのような役割を果たすのかを解き明かすことを目的とした。GlcNAc6ST-1ノックアウト(KO)マウスの末梢神経系髄鞘の糖鎖を解析した結果、N結合型糖鎖の硫酸化は見られなかった。このKOマウスを用いて有髄神経におけるGlcNAc6ST-1の役割を調べた。髄鞘が正しく形成されると、髄鞘間の隙間であるランビエ絞輪や隣接するパラノードなどの機能ドメインが形成される。パラノードマーカーであるCaspr染色を行ったところ、GlcNAc6ST-1 KOマウスではCaspr染色およびランビエ絞輪が広がっており、異常な髄鞘が観察された。軸索の断面図をトルイジンブルー染色で調べると、脱髄評価に使われる指標G-ratio(神経全体の直径に対する軸索の直径の割合)がGlcNAc6ST-1 KOマウスでは低下していた。さらに、GlcNAc6ST-1 KOマウスでは軸索変性が観察された。故に、末梢神経系においてGlcNAc6ST-1は糖蛋白質のN結合型糖鎖の硫酸化を介して髄鞘形成を制御することが示唆された。故に、平成27年度の研究計画はほぼ達成できたと考えている。硫酸転移酵素GlcNAc6ST-1により作られる硫酸化糖鎖が末梢神経系髄鞘の形成を制御していることを明らかにしつつあり、研究内容を論文として投稿するまでに至ったため。平成28年度はGlcNAc6ST-1ノックアウト(KO)マウスを用いて、硫酸転移酵素GlcNAc6ST-1により作られる硫酸化糖鎖の末梢神経系髄鞘における役割を明らかにした。連続ブロック表面走査型電子顕微鏡を用いて髄鞘の詳細な構造を観察した結果、GlcNAc6ST-1 KOマウスの坐骨神経において髄鞘異常および軸索変性が認められた。本研究で得られた知見を学術論文(Yoshimura et al., Scientific Reports, 2017)として発表し、プレスリリースを行った。故に、平成28年度の研究計画はほぼ達成できたと考えている。GlcNAc6ST-1ノックアウト(KO)

マウスを用いて、硫酸転移酵素GlcNAc6ST-1により作られる硫酸化糖鎖の末梢神経系髄鞘における役割を明らかにする。電子顕微鏡を用いてGlcNAc6ST-1 KOマウスの異常な髄鞘の詳細な構造を観察する。野生型マウスと比較してGlcNAc6ST-1 KOマウスでは末梢神経系で脱髄しやすいかどうか、また、脱髄させた際に回復が遅いかどうかを検討する。GlcNAc6ST-1 KOマウスの行動解析を行う。運動機能に着目し、足跡を記録する歩行解析や回転棒にマウスを乗せるロータロッドテストなどを行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。神経化学28年度が最終年度であるため、記入しない。
ナメクジウオにみる脳・神経-内分泌系の構造の解析

本研究の目的は、脳・神経-内分泌系が、脊椎動物への進化の過程でどのような構造上および物質的な変化をしてきたかを推測し、脊椎動物が本来持っている基本的な脳・神経-内分泌系を進化の側面から研究することである。無脊椎動物のなかで最も脊椎動物に近縁であるナメクジウオに注目し、その内分泌調節機構を遺伝子の解析で進めた。ナメクジウオの神経管のEST(Established sequence tag)解析をおこない、ナメクジウオの脳・神経に存在する内分泌物質をはじめとする遺伝子の探索をおこなった。RFアミド、神経ペプチドY、カルシトニンなどの神経ペプチド、ステロイド代謝酵素P450scc、P450c17、17α-20β-HSDの遺伝子が得られ、それらの局在をin situハイブリダイゼーション法で明らかにした。いずれの遺伝子も系統樹では脊椎動物の下に位置した。プロゲステロンは、神経管での存在も免疫染色法で確認した。ステロイド代謝酵素で遺伝子を得られなかった3β-HSDとアロマテースは、免疫染色法で生殖腺での局在を明らかにした。一方、プロゲステロン、エストラジオール-17β、テストステロンの脊椎動物では代表的な性ステロイドの存在を生殖腺で確認し、RIA法で定量した。また、光受容細胞の遺伝子をクローニングし、神経管・脳での局在およびその吸収スペクトルを調べて、ナメクジウオでは神経細胞が光受容の機能に大きくかかわることを明らかとした。このように、生殖を司る光刺激-光受容-脳・神経系-生殖腺で働く神経・内分泌系のさまざまな物質と機能を明らかにすることができた。この研究成果は多くが未発表で解析途中であるが、脊椎動物への生体情報処理機構の進化の解明が期待されている。平成15年度はナクジウオの神経管500個体分から作成したライブラリーをEST解析した結果をまとめ、さらに数種の遺伝子についてより詳細に研究を進めた。ESTは7,863個のcDNAの配列を読み、3,108個の遺伝子が何らかのホモログであった。コピー数の大きいものはFerritin、Tubulin、Calmodulin、Keratinであった。Ferritinが多いことは神経管の特徴であるといえる。神経管特有な遺伝子で内分泌調節にも重要な役割を持つ遺伝子としては、Annexin、GABA-A receptor、ILP receptor、Amyloid、RFamide、Neuropeptide Y、Calcitoninなどが見られた。その数が少ないことは、発現の少なさを反映しているものと考えられる。材料は筋肉をわずかに含むのみで神経管だけであり、その遺伝子のプロファイルはナメクジウオの神経管での遺伝子発現をある程度反映している。また、P450代謝酵素がステロイド代謝に関係するグループについて得られ、神経管にいわゆるニューロステロイドが存在する可能性が得られた。ホヤのゲノムからはP450代謝酵素およびエストロゲン受容体が得られておらず、ナメクジウオが脊椎動物に進化上さらに近い証拠の一つになろう。ナメクジウオの生殖腺にもステロイド代謝系が存在するはずであり、ナメクジウオの卵巣と精巣で性ステロイドを同定するために、RIAで測定してみたところ、プロゲステロン、エストロゲンが両器官に存在した。アンドロゲンは非常に低かったが、テストステロン抗体では測定できないテストステロン代謝物が主たるアンドロゲンである可能性がある。繁殖期と非繁殖期との差が認められた。平成16年度はこれらの結果から神経管の内分泌系ペプチドおよび生殖を制御するペプチドに焦点を絞ることにする。

本研究の目的は、脳・神経-内分泌系が、脊椎動物への進化の過程でどのような構造上および物質的な変化をしてきたかを推測し、脊椎動物に本来備わる基本的な脳・神経-内分泌系を明らかとすることである。そのため、無脊椎動物のうちで最も脊椎動物に系統的に近縁であるナメクジウオを材料とした。ナメクジウオは脊椎動物の祖先として、そのユニークな系統上の位置付けが注目されているが、内分泌調節にかかわると考えられる神経ペプチド、タンパク質ホルモンの遺伝子の存在はまだよくわかっていない。そこで、ナメクジウオの神経管を集めてEST(Established sequence tag)解析をおこない、EST遺伝子配列と既知遺伝子の配列との相同からナメクジウオの脳・神経に存在する内分泌物質の遺伝子探索をおこなった。結果は、RFamide、Neuropeptide Yなどの神経ペプチド、ステロイド代謝酵素のうち、P450scc、P450c17、17α-20β-hydroxysteroid dehydrogenaseの酵素の存在が明らかとなった。しかし、脊椎動物の下垂体ホルモンに相同なホルモンは見つからず、GnRHのような視床下部ホルモンも見つからなかった。次に、得られた内分泌関連物質の遺伝子が発現する部位をIn situ hybridization法で調べた。その結果、RFamideは神経管に無数に存在する色素杯の周囲の小型神経細胞に発現するとともに、脳部分背側のJoseph細胞に発現した。Neuropeptide Yは神経管の神経細胞に多数発現するが、背根部分には発現しなかった。ステロイド代謝酵素は発現が弱く、発現量が少ない可能性が考えられる。以上から、ナメクジウオの脳・神経-内分泌系は、脊椎動物と類似の神経ペプチドおよび脳ステロイドの存在が明らかとなり、祖先型神経ペプチドおよび脳ステロイドの神経活動での重要性が示唆された。
芸術概念を超えて:日本とイタリアにおける文化財思想の比較美学的考察

研究計画として立てられたのは次の4つのプランである。1.日本とイタリアにおける「文化財」概念の比較。2.美術館・博物館の現状。3.修復・保存の理論と実践。4.茶道や生け花などのパフォーマティヴな芸術の人類学的で美学的な意味。明治・大正期から日本は西洋の美術館・博物館の制度や思想を導入してきたが、興味深い対照は、たとえば次の点であることが明らかとなった。つまり、日本において、陶磁器や漆器、織物や紙製品などといった工芸品に対しても、絵画や彫刻とほぼ同等の価値付けが与えられ、展示や保存・修復が計画されているということである。このことは、西洋の「芸術」概念との明らかな差異を示している。西洋において「芸術」は、ルネサンス以来「デッサン(ディゼーニョ)」という根本理念に基づく知的で創造的な活動として確立されてきた。ここからは、手仕事は除外される。日本において、いわゆる「デッサン」に対応するものは詩歌と結びつくものとして捉えられ、寺院や家屋を飾る装飾からは区別されてきたと考えられる。これはおそらく中国に由来するであろう。ところが、美術館はこれらの対象を一律に収集してきた。ここに日本の特徴と面白さが存するように思われる。建造物に関していうなら、西洋では時代様式の観念が極めて強いため、修復もその理念に準じているが、日本では、こうした様式概念が希薄であったように思われる。このことが、建物の保存や修復にどれだけ影響しているかは今後の課題となる。明治・大正期から日本は西洋の美術館・博物館の制度や思想を導入してきたが、興味深い対照は、たとえば次の点あることが明らかとなった。つまり、日本において、陶磁器や漆器、織物や紙製品などといった工芸品に対しても、絵画や彫刻とほぼ同等の価値付けだ与えられ、展示や保存・修復が計画されているということである。
岩石の風化における化学的過程と物理的過程の相互作用

水中で岩石に球を繰り返し衝突させる実験を行い,化学風化(溶解)と物理風化(粒子の分離)の進み方を調べた.硬さ(Leeb硬さ)が異なる3つの砂岩について測定された重量減少速度(物理風化速度+化学風化速度)は,硬さが大きくなるにつれて減少した.岩石の溶解により水中に溶出した元素の濃度から算出した化学風化量と比べて,物理風化量は約4-371倍多く,硬さが小さな岩石ほど相対的に物理風化の寄与が大きかった.水中で岩石に球を繰り返し衝突させる実験を行い,化学風化(溶解)と物理風化(粒子の分離)の進み方を調べた.硬さ(Leeb硬さ)が異なる3つの砂岩について測定された重量減少速度(物理風化速度+化学風化速度)は,硬さが大きくなるにつれて減少した.岩石の溶解により水中に溶出した元素の濃度から算出した化学風化量と比べて,物理風化量は約4-371倍多く,硬さが小さな岩石ほど相対的に物理風化の寄与が大きかった.岩石の風化は,化学的過程(化学風化)と物理的過程(物理風化)の相互作用の結果として進行する.砂岩は鉱物粒子や岩片が固結して構成されており,その風化は,[1]粒界の溶解(化学風化),[2]保持できなくなった粒子の分離(物理風化),というプロセスの繰り返しで進行すると考えられる.全体の風化における化学風化と物理風化の寄与を比較するために,フォンテーヌブロー砂岩(フランス産,F砂岩)とベレア砂岩(アメリカ産,B砂岩)を用いて,風化実験を行った.F砂岩は粒径約0.3mmでほぼ100%石英からなり,B砂岩は粒径約0.2mmで石英約90%,その他(長石、粘土等)約10%からなる.B砂岩と比べると,F砂岩の方が脆く、粒子が分離しやすい.これらの砂岩試料を整形して純水中に浸し,波や水の流れの効果を模擬するために反応容器を振とうしながら(18rpm),25°Cで2ヶ月間反応させた.試料からの溶解(化学風化)により,反応時間と共に溶液中の溶存元素濃度が増加した.この溶解量を求めるために,溶液をときどき採取してSi,Ca等の溶存元素濃度を測定した.また,試料からの鉱物粒子の分離(物理風化)により、反応時間と共に容器の底に落ちている粒子の量が増加した.この粒子の分離量を求めるために,反応終了後に粒子を回収して秤量した.その結果,2ヶ月間の砂岩の単位外形面積当たりの元素の溶解(化学風化)量は、F砂岩で0.01mg cm^<-2>,B砂岩で0.3mg cm^<-2>であった.また,粒子の分離(物理風化)量は,F砂岩で0.3mg cm^<-2>,B砂岩で0.1mg cm^<-2>であった.したがって,粒子が分離しやすいF砂岩については物理風化の寄与が大きく,粒子が分離しにくいB砂岩については化学風化の寄与が大きいことが明らかになった.岩石表面に水滴が落ちる箇所では,凹みが出来ている様子がしばしば観察される.これは水の作用による岩石の風化現象であり,鉱物粒子の粒界の溶解(化学風化)と,粒子の分離(物理風化)の複雑な相互作用の結果として進行すると考えられる.本年度は,このような岩石への水の滴下による風化現象を模擬した実験を行った.試料には,フォンテーヌブロー砂岩(フランス産,F砂岩,粒径:約300μm)と,ベレア砂岩(アメリカ産,B砂岩,粒径:約200μ)を用いた.内径6cmのアクリル製の筒を直立させて,筒内の下方に成形した砂岩試料を固定し,高さ50cmの位置から水を流して試料表面に滴下させた.試料に当たった水は筒の底部にたまり,それを再びポンプで吸い上げて試料に滴下することで,水が循環するようにした.実験開始後,溶解が進行し,溶存元素濃度が上昇した.この濃度の変化から,化学風化量を求めた.また,実験前後の試料の重量変化彙(物理風化+化学風化)から化学風化量を差し引くことで,物理風化量を求めた.それぞれの岩石について,25°Cで約2週間風化実験を行った結果,各試料の単位外形面積当たりの溶解(化学風化)量は,F砂岩で0.03mgcm^<-2>,B砂岩で0.1mgcm^<-2>であった.また,粒子の分離(物理風化)量は,F砂岩で0.5mgcm^<-2>,B砂岩で0.4mgcm^<-2>であった.B砂岩と比べると,F砂岩の方が脆く粒子が分離しやすいことを反映して,F砂岩の方が物理風化の寄与が大きい.また,特にB砂岩については,溶解量の大部分をCaとMgが占めており,それらの塩の溶解により鉱物粒子同士の結合が弱化し,その後粒子が分離するというプロセスの繰り返しで風化が進んでいる可能性が考えられる.岩石の風化は,物理的過程と化学的過程の複雑な相互作用の結果として進行する.本年度は,河川において転動した岩石等との衝突によって岩石の風化が進む現象に着目して,化学風化(溶解)と物理風化(粒子の分離)の進み方を調べる実験を行った.

実験には,硬さが異なる同一産地の3つの砂岩(Berea砂岩,アメリカ)を用いた.リバウンド式硬度計で測定した各岩石の平均の硬さ(Leeb硬さ)は,硬い方から順に644 HL,541 HL,407 HLであった.これらの岩石を21 mm×16 mm×5 mmの大きさに整形し,水中で岩石にナイロン被覆鉄球(直径19 mm)を繰り返し衝突させて,岩石の重量および水中の溶存元素濃度の時間変化を測定した.25°Cにおいて222日間行った実験によって得られた平均の重量減少速度(物理風化速度+化学風化速度)は,硬い岩石ほど小さく,岩石の硬さと重量減少速度との間には指数関数的な関係が見られた.一方,造岩鉱物の溶解によって,時間の経過と共に溶液中のCa,Mg,Si等の元素濃度が増加した.この溶存元素濃度の時間変化から,化学風化速度を算出した.その結果,実験期間中の全体の物理風化量は化学風化量と比べて約4370倍多く,硬さが小さい岩石ほど相対的に物理風化の寄与が大きくなった.また,化学風化速度の変動幅に比べて,物理風化速度の変動幅が大きい傾向が見られた.これらの知見は,河川等における岩石の風化の進み方,および溶存元素と鉱物粒子の輸送の量的関係を考える上で有用と考えられる.前年度・今年度の研究で,実験手法の整備を行い,静的条件,波がかかる条件,水滴が当たる条件,pHを変えた条件など,様々な環境条件での物理風化・化学風化実験を行った結果,実験データはおおむね揃いつつある.来年度は,これらの結果を基にさらに改良を加えた実験を行い,全体をまとめる予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。化学風化速度と物理風化速度の比較という点では,すでにおおむね傾向を把握できる実験データが得られている.しかし,これまでの風化実験においては,はっきりと試料の外形の変化が視認できる程度の風化量が得られていない.今年度は,風化量を上げるための工夫を行う.具体的には,水の滴下を模擬した実験において,水を滴下させる高さを上げる,流速を上げるなどを行って,試料に与える衝撃を増やす.その上で,試料の3次元形状の変化を定量的に評価し,浸食の広がり方の特徴を調べる。また,衝撃の強さと物理風化速度・化学風化速度の相関についても検討する.これらの結果を元に,化学風化と物理風化の相互作用のメカニズムや速度を総合的に解釈する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
CXCL1を介した膀胱癌微小環境制御機構とそれに伴う腔内再発・進展機序の解明

ヒト膀胱癌細胞のCXCL1強制発現株、shRNAによるノックダウン株を作製し、膀胱粘膜下に接種する同所移植モデルを作成したが、腫瘍形成能や筋層浸潤能の差は確認できなかった。
自己免疫網膜症の分子解析とバイオマーカー探索による新しい診断法の開発

本研究計画の目的は、自己免疫網膜症患者血清が認識する網膜特異抗原タンパク質をプロテオーム解析法により網羅的に同定し、その発症機構を分子レベルで解明することにある。また、同定された抗原タンパク質に対する患者血清中の抗体価の変動と病態変化について検討し、バイオマーカーとしての有用性を検証する。現在までに、既知の抗原タンパクを含め13個の抗原タンパク質をクローニングした。105例の患者血清についてこれらの抗原タンパク質との反応性を検討した。7例以上の患者血清が認識する6種類の抗原蛋白(既知の抗原を含め)を見出し、エピトープ解析のために、抗原タンパクの欠失変異体を作製している。また、本研究で同定された抗原蛋白および既知の自己免疫網膜症に関する自己抗原蛋白を用いたプロテインチップ等を作製し、患者血清の網膜特異抗原を同定するとともにその抗体価を定量的に分析する系を構築し、自己免疫網膜症の新しい診断法を確立しようとする研究計画である。ヒト抗原遺伝子のcDNAクローニングと大腸菌発現組換えタンパク質による抗原タンパクの同定を行った。プロテオーム解析により推定された抗原タンパク質について、ヒト網膜由来のRNAから調整されたMarathon-Ready cDNA(クロンテック社)を用いて抗原タンパクの全翻訳領域を含むcDNA断片をPCR法により増幅し、大腸菌発現ベクターに挿入し、ヒト由来の網膜特異抗原タンパクを大腸菌に産生させた。この組換えタンパクをHis-Tagアフィニティカラムを用いて精製し、ウエスタンブロットの試料とした。現在までに、既知の抗原タンパクを含め10個の抗原タンパク質をクローニングした。81例の患者血清についてこれらの抗原タンパク質との反応性を検討した。複数の患者血清が認識する5種類の抗原蛋白(既知の抗原を含め)を見出した。その中で7例の患者血清が認識する抗原蛋白について、欠損変異組換え蛋白を作製し、エピトープ検索を行っている。10個の網膜抗原タンパクをクローニングすることが出来、その内の2種類の抗原タンパクについてエピトープ解析を開始しており、ほぼ順調に研究を進めることができた。また、同定された抗原タンパク質をバイオマーカーとしての有用性を検討し、新しい診断法の開発を目指すことにある。本年度は、新たに視細胞以外の細胞で特異的に発現している2種類の抗原タンパク質を見出し、クローニングおよび組換え蛋白の調整を行っている。現在までに、既知の抗原タンパクを含め12個の抗原タンパク質をクローニングした。平成27年度から新たに16例の患者血清が集められ、97例以上の患者血清についてこれらの抗原タンパク質との反応性を検討した。複数の患者血清が認識する6種類の抗原蛋白(既知の抗原を含め)を見出し、エピトープ解析のために、抗原タンパクの欠失変異体を作製している。エピトープ領域を狭めることができた抗原タンパクについては合成ペプチドを用いて、エピトープの詳細な解析を行っている。これまでに、12個の網膜抗原タンパクをクローニングすることが出来、ほぼ順調に研究を進めることができた。また、本年度新たにクローニングした抗原タンパクは分子量が80kDa以上の大きなタンパクであったため、従来の発現ベクターでの蛋白発現が得られなかったので、種々の発現ベクター系を試し、大量産生系を確立することが出来た。また、同定された抗原タンパク質に対する患者血清中の抗体価の変動と病態変化について検討し、バイオマーカーとしての有用性を検証するとともに、新しい診断法の開発を目指すことにある。新たに視細胞以外の細胞で特異的に発現している3種類の抗原タンパク質を見出し、クローニングおよび組換え蛋白の調整を行っている。平成27年度から新たに24例の患者血清が集められ、105例以上の患者血清についてこれらの抗原タンパク質との反応性を検討した。

1例ではあるが、特定の抗原タンパク質に対する異常に高い抗体価(32,000倍希釈)を示し、生命予後の悪い症例が見られた。通常、癌関連網膜症では生命予後は比確的緩やかであることが知られており、抗体価と生命予後の関係について精査する予定である。本研究計画の目的は、自己免疫網膜症患者血清が認識する網膜特異抗原タンパク質をプロテオーム解析法により網羅的に同定し、その発症機構を分子レベルで解明することにある。また、同定された抗原タンパク質に対する患者血清中の抗体価の変動と病態変化について検討し、バイオマーカーとしての有用性を検証する。現在までに、既知の抗原タンパクを含め13個の抗原タンパク質をクローニングした。105例の患者血清についてこれらの抗原タンパク質との反応性を検討した。7例以上の患者血清が認識する6種類の抗原蛋白(既知の抗原を含め)を見出し、エピトープ解析のために、抗原タンパクの欠失変異体を作製している。これまでに80例以上の患者血清についてウエスタンブロット法、免疫染色法およびOCTによる検討を行って来た。そのなかで、錐体細胞、色素上皮細胞、ミューラー細胞特異的抗原を認識する血清を見いだしている。このような抗原タンパク質の同定は未だ成されていない。プロテオーム解析により特異的な抗原タンパク質の同定を進める。また、新たに同定された抗原タンパクについて、エピトープの探索・同定およびそのエピトープを含む合成ペプチドを用いたELISA法の確立等を行い、抗体価と病態の進行度との比較検討を行う。これまでに90例以上の患者血清についてウエスタンブロット法、免疫染色法およびOCTによる検討を行って来た。そのなかで、錐体細胞、色素上皮細胞、ミューラー細胞や双極細胞などで特異的に発現している抗原を認識する血清を見いだしている。また、新たに同定された抗原タンパクについて、エピトープの探索およびそのエピトープを含む合成ペプチドによるELISA法を確立し、抗体価と病態の進行度との比較検討を行う。眼科学エピトープの検索により、予想より複数のエピトープの存在が示唆され、合成ペプチドの作製費用が次年度多くなることが予想されたため、次年度に繰り越すこととした。当初、抗体を購入予定であったが、他の試薬等の高騰により購入できなかったので、基金の残額を次年度に繰り越すことにした。平成28年度請求額と合わせて、主に以下のような消耗品(試薬等)に使用する。エピトープの部位決定に必要な合成ペプチドの作製費用として50万円を予定している。平成27年度と同様に、抗原タンパクの同定のために必要なシークエンスグレイドの蛋白分解酵素やLC-MS用高純度試薬およびキャピラリー分析カラム等の経費として40万円を予定している。
網膜神経節細胞の細胞死の阻止と視神経再生の促進

成熟哺乳動物の網膜神経節細胞(RGC)の軸索である視神経線維は、切断されたら再生しないが、末梢神経系の環境では再生する。しかしながら軸索を再生したRGCの数は平均2%前後で、形や色を識別する機能を回復するのに不十分である。本研究では再生RGCの数を増加させ、軸索伸長速度を増加させる手段を検討した。1.軸索切断されたRGCの生存RGCの生存を促進する手段を調べるための基礎データとして、視神経切断後RGCタイプによる生存を調べた。β細胞が急速に死滅するのに対し、α細胞は軸索切断に対する高い耐性を持つことがわかった。さらに早期のβ細胞死はアポトーシスによることがわかった。2.軸索切断されたRGCの生存促進RGCの生存は軸索再生の前提であり、生存を促進することによって再生RGCの数が増えると考えられる。いくつかの神経栄養因子を眼球内に注入し、生存促進効果を調べた。さらにforskolin(cAMP合成酵素の促進剤)の添加で効果の増強を調べた。その結果、BDNF、CNTFとforskolinの組み合わせが最も高い効果を持つことを見い出した。また緑内障治療薬のnipradilolも同様の生存促進効果を認めた。いずれの場合もβ細胞の細胞死阻止に対して最も効果が高かった。さらにラットでは断端に電気刺激をすることでRGCの生存を促進できることを示した。この方法はコンタクトレンズ電極を使用することで、臨床応用が可能である。3.軸索再生速度の推測切断された軸索は3日後に末梢神経に伸長することがわかった。再生視神経線維の最速伸長速度を、平均1.1mm/日と推算した。α細胞の伸長速度が1.4mm/日で、最も高かった。4.軸索再生促進視神経切断時にBCF眼球内投与したところ、再生細胞数を3倍(6週)から4倍(4週)にすることができた。Nipradilolは再生細胞数を増加するとともに、最速軸索再生速度を1.7mm/日に促進することが明らかになった。移植末梢神経内に軸索を再生した、網膜神経節細胞の数を増加させるためには、1)軸索を切断されても生存している細胞の数を増加させて再生のチャンスを増加させる、2)生存細胞の軸索伸長を促進させる、3)軸索伸長を阻害する物質を中和する、の3つが有効な方法と考えられる。今年度は生存細胞を増加させる手段を見いだし、軸索再生が促進されるかどうか調べた。最も効果的な神経栄養因子の組み合わせを知るために、視神経切断直後、神経栄養因子を単独で1μg眼球内に注入した。14日後に中心野の細胞密度とそれぞれの細胞タイプの割合を、左右の網膜で比較して、軸索を再生したα細胞、β細胞、その他の細胞の数を類推した。脳由来栄養因子(BDNF),毛様体栄養因子(CNTF),グリア細胞由来栄養因子(GDNF)の投与で、生存細胞数が優位に多かった。次にこれらの神経栄養因子と環状AMP合成酵素の活性を高めるforskolinを眼球内に注入し、その効果を調べた。BDNF、CNTF、forskolinを同時に眼球内投与すると(BCF投与)、β細胞の生存を促進し、50%の細胞が生存していた(無注入では10%)。次にBCF投与の軸索再生促進効果を調べた。

末梢神経を視神経断端に移植した直後、BCFを注入した網膜では再生細胞が10379±5087(N=6)であったが、BCF投与しない網膜では3252±458(N=6)と、BCF注入によって再生細胞が約3倍増加していた。しかしBCFを再度投与しても、移植3日後投与では再生細胞数が10821±3091(N=3)、7日後投与では7942±3708(N=3)と、増強効果は認められなかった。さらにBCF投与網膜の再生細胞数は、α細胞数は1.7倍、β細胞数は3.4倍、その他の細胞数は1.9倍と、特にβ細胞の軸索再生を促進した。1.軸索伸長速度の推測末梢神経移植で軸索を再生した,ネコ網膜神経節細胞(RGC)の数は5千以下である.再生細胞数を増やす手段の一つとして,再生軸索の伸長速度の促進が考えられ,そのための基礎データとして軸索伸長速度を推測した.視神経断端に末梢神経を自家移植して4,6,8週後に,接合部から10mmと20mmの部位に異なった蛍光色素を注入して,再生RGCを標識した.10mm以上軸索を再生したRGCの数の増加は,6週でほぼ止まった.10mmと20mmに注入した蛍光色素で標識されたRGCの二重標識の割合のグラフから,再生速度は最速:1.3mm/日,最遅:0.27mm/日,の値が推算された,RGCのタイプによる再生速度を推測したところ,α細胞の軸索再生速度が高い可能性が示唆された.Neumglycan C(NGC)は,我々がラット脳から単離した,神経組織に特異的なコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである.網膜を含む幼若期の中枢神経系において,NGCが神経細胞体と線維に,一過性に発現することをが報告されている.ネコ視神経再生時におけるNGCの発現を調べた.視神経切断端に末梢神経を自家移植して8週後,移植末梢神経にdextran-蛍光色素を注入し,軸索を再生したRGCsを標識した.3日後に潅流固定して網膜と移植神経を剖出した.網膜および移植神経の凍結切片と網膜伸展標本を,NGCコアたんぱく質に対する抗体で免疫染色した.軸索を再生したRGCsおよび再生軸索線維に,NGCの発現が特異的に認められた.これまでのところNGC発現RGCsの細胞体の大きさの分布に特に傾向は認められなかった.【結論】軸索再生時にもNGCが発現され,たんぱく分子が両生軸索に輸送されることが明らかになった.1.Nipradilolによる軸索再生の促進昨年度はネコ網膜神経節細胞(RGC)の軸索伸長速度を推測し、平均1.1mm/日を得た。この実験系を用いて軸索再生の促進方法を求めた。緑内障治療薬のnipradilol (10^<-7>モル)を眼球内注入することによる神経保護作用を検討、生存細胞数を軸索切断後7日で1.4倍、14日で2.6倍にすることができた。Nipradilolの眼球内投与は軸索再生速度も促進した。再生細胞総数は9177(4週後)および12,384(6週後)と、注入しない場合より3倍から4倍に増えていた(4週後で2139および6週後で3678)。さらにnipradilol投与網膜では、二重標識率から推測した軸索再生速度は1.7mm/日で、伸長速度も促進されることがわかった。2.電気刺激による生存促進ラット視神経断端に電気的に刺激すると、網膜神経節細胞の生存が促進することを見いだした。