hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
経卵伝搬性ウイルスの虫体内増殖と世代間移行に影響を与える要因の解明

羽化直後の無保毒ヒメトビウンカ成虫をRSV感染コムギ上で飼育し、獲得開始後20日まで経時的に体内ウイルス濃度を解析したところ、個体により相対濃度に大きく差が見られたが、飼育日数に従い対数的に上昇し、RSVの相対量は1000倍以上に増加した。最も高い相対濃度を示した個体は経卵伝染した成虫とほぼ同じであった。獲得開始から8日目以前は全ての個体が経卵伝染個体のウイルス濃度より低かったが、10日目以降では1430%が経卵伝染個体と同程度となった。健全ヒメトビウンカ幼虫(孵化約7日)をRSV感染コムギ上で飼育し、同様の試験を行ったところ、成虫の場合と同様に体内ウイルス濃度が飼育日数に従い対数的に上昇した。また、RSV抵抗性遺伝子(Stv-bi、stvaおよびstvb)を持つコシヒカリ同質系統を餌として発育したRSV経卵伝染ヒメトビウンカ個体群の保毒虫率を調べたところ、感受性であるコシヒカリと保毒虫率に有意差は認められず、抵抗性遺伝子の有無は保毒虫率に直接影響しないことが示された。さらに、コシヒカリ、あさひの夢、コムギ(農林61号)を用いて4世代に渡り保毒虫率の推移を調べたところ、1世代あたりの経卵伝染率は世代間でばらつきが認められるもののこれらの間で経卵伝染率に差は認められなかった。これらのことから、抵抗性品種による保毒虫率の低下は、発病株の減少により新たにRSVを獲得する個体が減少することや、経卵伝染率が100%でないことによる自然減が要因であり、抵抗性品種が直接的に保毒虫率を引き下げているわけではないことが示された。異なる宿主上で発育したヒメトビウンカ体内における増殖と経卵伝搬率の解析については、イネ縞葉枯ウイルス検出薬の問題により遅れていたが、予定どおりH29年度中に終了することが出来た。RNAi型ウイルス抵抗性イネを用いた試験については、種子増殖に成功しており、試験に供試できる予定であり、おおむね順調に進展している。RSV獲得後の日数が経卵伝搬率に与える影響の解析については、これまでに確立した手法を用いて、羽化直後の成虫をRSV感染イネ上で獲得吸汁させ、獲得開始10日後および20日後の経卵伝染率および次世代虫の体内RSV濃度を計測する。また、幼虫期にRSVを獲得した場合の経卵伝搬率を解析し、成虫獲得の場合と比較する。抵抗性誘導剤によるイネにおけるRSV増殖への影響の解析については、2017年に引き続き、アシベンゾラルSメチル(ASM)を処理したイネにおける誘導抵抗性関連遺伝子の発現を解析する。また、ASM等を処理したイネにRSVを保毒したヒメトビウンカを放飼し、RSVの感染率と植物体におけるRSV増殖への影響をリアルタイムPCRにより解析する。RNAi型ウイルス抵抗性イネによる昆虫体内RNAiの誘導の解析については、供試する組換えイネ系統の種子増殖に成功しており、これを用いてRSV保毒ヒメトビウンカを飼育し、体内のRSV濃度をリアルタイムPCRにより解析する。また、その次世代虫を継続してRNAi型ウイルス抵抗性イネ上で発育させ、体内のRSV濃度を解析する。経卵伝染によりRSVを保毒するヒメトビウンカの発育段階において、RSVがどのように維持されているかを明らかにするため、リアルタイムPCRを用いてウイルスRNA量を解析した。試験には、2012年に茨城県の縞葉枯病発生水田で採取し、累代飼育しているRSV保毒ヒメトビウンカ個体群を供試した。まず、相対定量に適したリファレンス遺伝子を決定するため、羽化0、5、10、15日後の成虫よりそれぞれRNAを抽出し、数種ハウスキーピング遺伝子の発現を解析した結果、18SリボゾームRNA遺伝子(rRNA)が比較的安定して発現しており、相対定量のためのリファレンス遺伝子として適していることが示された。次に、同個体群の孵化2、9、13、16日後の幼虫及び羽化0、7、14、21日後の成虫からRNAを抽出し、RSVの外被タンパク質領域を増幅するプライマーを用いて、体内のウイルスRNAの相対定量を行った。その結果、幼虫体内の相対ウイルス量は、その発育期間中にほとんど変わらないことが示された。幼虫の発育に伴い、総RNA量は増加しているにもかかわらず相対量が一定であることから、RSVがヒメトビウンカの生育に同調して増殖していると推察された。一方、羽化後、雌成虫体内の相対ウイルス量はほとんど変わらないが、雄成虫体内の相対ウイルス量はわずかに増加する傾向が認められた。RSVの体内相対量は、雄が雌より1.42.5倍高い結果となった。また、RSVを経卵保毒するヒメトビウンカ個体群の雌成虫の個体ごとに次世代虫を飼育し、世代間の相対ウイルス量を比較したところ、世代間差は認められなかった。経卵伝搬されたRSVのヒメトビウンカ体内における増殖の解析については、予定どおり進捗した。異なる宿主上で発育したヒメトビウンカ体内における増殖と経卵伝搬率の解析においては、解析に使用するイネ縞葉枯ウイルス検出薬のうち、平成28年8月以降に購入した試薬の活性が低下していることが判明し、実験を一時中断したが、試薬の製造元と原因を究明し、実験に支障がないことが明らかとなったため、平成29年3月に試験を再開した。

抵抗性誘導剤を処理したイネにおけるRSV増殖及びRNAi型ウイルス抵抗性イネを用いた試験については、試験条件を検討中である。羽化直後の無保毒ヒメトビウンカ成虫をRSV感染コムギ上で飼育し、獲得開始後20日まで経時的に体内ウイルス濃度を解析したところ、個体により相対濃度に大きく差が見られたが、飼育日数に従い対数的に上昇し、RSVの相対量は1000倍以上に増加した。最も高い相対濃度を示した個体は経卵伝染した成虫とほぼ同じであった。獲得開始から8日目以前は全ての個体が経卵伝染個体のウイルス濃度より低かったが、10日目以降では1430%が経卵伝染個体と同程度となった。健全ヒメトビウンカ幼虫(孵化約7日)をRSV感染コムギ上で飼育し、同様の試験を行ったところ、成虫の場合と同様に体内ウイルス濃度が飼育日数に従い対数的に上昇した。また、RSV抵抗性遺伝子(Stv-bi、stvaおよびstvb)を持つコシヒカリ同質系統を餌として発育したRSV経卵伝染ヒメトビウンカ個体群の保毒虫率を調べたところ、感受性であるコシヒカリと保毒虫率に有意差は認められず、抵抗性遺伝子の有無は保毒虫率に直接影響しないことが示された。さらに、コシヒカリ、あさひの夢、コムギ(農林61号)を用いて4世代に渡り保毒虫率の推移を調べたところ、1世代あたりの経卵伝染率は世代間でばらつきが認められるもののこれらの間で経卵伝染率に差は認められなかった。これらのことから、抵抗性品種による保毒虫率の低下は、発病株の減少により新たにRSVを獲得する個体が減少することや、経卵伝染率が100%でないことによる自然減が要因であり、抵抗性品種が直接的に保毒虫率を引き下げているわけではないことが示された。異なる宿主上で発育したヒメトビウンカ体内における増殖と経卵伝搬率の解析については、イネ縞葉枯ウイルス検出薬の問題により遅れていたが、予定どおりH29年度中に終了することが出来た。RNAi型ウイルス抵抗性イネを用いた試験については、種子増殖に成功しており、試験に供試できる予定であり、おおむね順調に進展している。異なる宿主上で発育したヒメトビウンカ体内における増殖と経卵伝搬率の解析を行う。また、成虫のRSV獲得時期が経卵伝搬に与える影響の解析のため、羽化直後の無保毒ヒメトビウンカ成虫をRSVに感染したイネ幼苗に移し、一定期間後に体内のRSV濃度をリアルタイムPCRにより計測する。幼虫時期の獲得についても同様の試験を行う。RNAi型ウイルス抵抗性イネによる昆虫体内RNAiの誘導の試験を行うためには、多量の種子が必要となるため、本遺伝子組換えイネの種子の増殖を行う。遺伝子組換えDNA実験を行う場合は、関連する法令を遵守して行う。また、実験は所内の遺伝子組換え安全委員会へ申請し、承認を得た上で行う。抵抗性誘導剤によるイネにおけるRSV増殖への影響については、アシベンゾラルSメチル(ASM)を処理したイネにおける誘導抵抗性関連遺伝子の発現を解析する。また、ASM等を処理したイネにRSVを保毒したヒメトビウンカを放飼し、RSVの感染率と植物体におけるRSV増殖への影響をリアルタイムPCRにより解析する。RSV獲得後の日数が経卵伝搬率に与える影響の解析については、これまでに確立した手法を用いて、羽化直後の成虫をRSV感染イネ上で獲得吸汁させ、獲得開始10日後および20日後の経卵伝染率および次世代虫の体内RSV濃度を計測する。また、幼虫期にRSVを獲得した場合の経卵伝搬率を解析し、成虫獲得の場合と比較する。
新蚕繭絹糸の染色性に関する研究

絹の新しい素材用として開発された極細繊度系および極太繊度系絹糸の染色性を在束種絹糸と比較検討した。1.染色性に影響すると考えられる絹糸中の灰分量は、太繊度系絹糸は他系統のものよりも生糸で0.07%、練糸で0.020.03%多く、太繊度方向への育種のため蚕体の代謝に何らかの影響を及ぼしたと考えられるが、系統間では染色性に影響するほどの差は認められなかった。2.絹糸に含まれる金属のうち最も含有量の多いカルシウムは、練糸に含まれる程度の量では染料と反応しないことが吸収スペクトル変化から認められた。しかしその5倍量、すなわち生糸に含まれる量となれば不均染性酸性染料および媒染染料と錯体を生成して沈澱を生成することが認められ、生糸の染色にこれらの染料を用いた場合、染着量の増大に寄与することが示唆された。3.均染性酸性染料による染色で染浴のpHが4以下では、細繊度系絹糸は他系統絹糸よりも1.41.6倍の染着量を示した。しかし不均染性酸性染料に対してはこのような大きな差は認められず、実験したpH域で染着量に細繊度系>太繊度系>在束種の順となることが認められた。4.繊度の異なる絹糸を同一染浴中で染色した場合、概して細繊度系絹糸の染着量が他系統絹糸よりも高く、中でも不均染性酸性染料および反応染料でその差が著しかった。太繊度系絹糸と在束種絹糸とは繊度差があまり大きくないこともありほとんど等しい染着量を示した。5.酸性染料による染着速度の比較から、細繊度系絹糸は他系統絹系よりも染色開始後1時間までの染着速度が大きく、この差が染浴のpHおよび同一染浴中からの系統間の染着量の差として示されたと考えられる。蚕品種の交雑によって新に産生された細繊度系(MK×MKII),太繊度系(N5D×N43)および少セリシン系(LS928×LS789)絹糸の染色性を在来種(N137×C137)絹糸と比較検討する目的で,昭和62年度はそれら絹糸の化学的性質の一部について調べた.染色性に関係すると考えられる灰分量は,生糸においては太繊度系が細繊度系および少セリシン系よりも0.07%,在来種よりも0.06%多く,練り糸においても太繊度系は他品種よりも0.020.03%多かった.これは繊維中に含まれる金属(Ca, Mg, Ma, K, FeおよびMn)の量が太繊度系は他品種よりも多いことに由来することが認められた.繊維中に含まれる重金属と染料との結合は,その含有量によっては金属と染料との錯体を形成し,染着量の増大と色相の変化をもたらす.このことから練り系中に含まれる量に相当する金属と酸性染料(均染性タイプ1種,ミリングタイプ2種)および金属と錯体を形成しやすい媒染染料とを溶液中で反応させ,吸収スペクトルの変化を調べた.

その結果吸収スペクトルにはほとんど変化がなく,練り系中に含まれる量の重金属(Ca, Mg, FeおよびMn)は染色性に対して影響しないことが認められた.しかし,絹糸中含有量が最も多かったCaでは,その量が5倍になればミリングタイプの染料および媒染染料では錯体生成による沈殿が認められ,練り系よりもCa量が約5倍多い生糸の染色に対しては染着量が増大することが示唆された.蚕品種の交雑によって産生された繊度の異なる絹糸(極細繊度系:繭糸繊度1.74d、極太繊度系:繭糸繊度4.24d)および対照区在束品種絹糸(繭糸繊度3.62d)の3種類の染色性を比較検討した。1.染浴のpHと酸性染料の染着量との関係から、均染性染料と不均染性染料とでは蚕品種間に若干の相違が認められたが、いずれの染料に対しても細繊度絹糸が太繊度絹糸よりも高い染着量となることが認められた。不均染性染料に対してはpH3.86.1の間の染着量は、極細繊度絹糸>極太繊度絹糸>対照区絹糸の順となった。均染性染料に対してはpH4以下の酸性染浴では、極細繊度絹糸は他繊度絹糸よりも1.41.6倍高い染着量を示したが、pH4.76.1の間ではわずかに高い染着量を示したにすぎなかった。2.繊度の異なる絹糸を交撚または交織して新素材としての活用を想定し、これら異なる繊度の絹糸を同一染浴中で染色し、その染着量および色差を調べた。その結果、比較的繊度差が小さい極太繊度絹糸と対照区絹糸の間には染着量および色差に大きな相違は認められなかった。不均染性酸性染料および反応染料による染色では、極細繊度絹糸に対する染着量が他絹糸よりもかなり高く、色差も大きくなることが認められた。3.このように極細繊度絹糸に対する染着量が高くなる理由について、染着速度から調べた結果、いずれの染料に対しても極細繊度絹糸は大きな染着速度を示すことが認められた。これは細繊度のものは単位重量当りの表面積が太繊度のものよりも大きく、それだけ染浴中の染料分子と接触する機会が大きくなるためと解釈した。また、同一染浴中からの染色で、均染性酸性染料による染着量で3種類の絹糸間に大きな差が生じなかったことは、染料のマイグレーションが大きいことによる。
前頭前野皮質に特徴的なモノアミン神経伝達制御の役割

ドーパミン神経伝達が過剰なドーパミントランスポーター(DAT)欠損マウスにおけるプレパルス・インヒビション(PPI)の改善には前頭前野におけるドーパミンの動態が関与している可能性が考えられた。DAT欠損マウスにおけるノルエピネフリントランスポーター(NET)阻害によるPPIの改善に関与する脳部位および神経回路を明らかにするため、野生型あるいはDAT欠損マウスに選択的NET阻害剤ニソキセチンを局所投与し、PPIを測定した。前頭前野皮質へのニソキセチン局所投与でPPIは改善した。ニソキセチンの全身役与によるPPIの改善効果と前頭前野皮質の関与を調べるため神経興奮のマーカーであるc-Fosを用いて神経活性化のマッピングを行った。十分に環境に馴化させた野生型あるいはDAT欠損マウスにニソキセチンを投与し、投c-Fos抗体を用いて免疫組織化学的にc-Fos陽性細胞を計数したところ、内側前頭前野皮質ではDAT欠損マウスでニソキセチンの腹腔内投与により生食投与群と比較して有意にc-Fos陽性細胞の数が増加した。これはNET阻害剤であるニソキセチンの全身投与により前頭前野のドーパミン神経伝達が賦活され、ドーパミンの神経支配を受ける前頭前野でシナプス後細胞が活性化させることを示唆した。また、これらの結果より前頭前野へのニソキセチン局所投与においても同様な作用が働いていることが予想された。以上の結果は、選択的NET阻害剤であるニソキセチンが統合失調症の認知機能障害において機能低下が想定されている前頭前野皮質に投射するドーパミン神経を賦活し、また後シナプス細胞の錐体細胞も活性化させる働きをもつことを示唆し、統合失調症患者における認知機能障害を改善させる治療薬としての可能性を期性させる。前頭前野皮質に投射するドーパミン神経は大脳基底核への投射と比較して極めて少数であるにもかかわらず認知機能に重要な役割を担っていると考えられている。Prepulse Inhibition(PPI)は統合失調症において観察される認知機能障害の数少ない生理学的指標であり、動物モデルにおいてもヒトと同様な計測手法を用いることが可能である。我々は大脳基底核でのドーパミン神経伝達が過剰なドーパミントランスポーター(DAT)欠損マウスがPPIの障害を示し、選択的ノルエピネフリントランスポーター(NET)阻害剤であるnisoxetineの全身投与により、DAT欠損マウスにおけるPPIの改善効果にNETが関与している可能性を見出した。また、脳内微小透析法よりDAT欠損マウスへのnisoxetine全身投与時に前頭前野皮質において細胞外ドーパミンが顕著に上昇することを明らかにした。以上より同マウスにおけるPPIの改善には前頭前野におけるドーパミンの動態が関与している可能性が考えられた。DAT欠損マウスにおけるNET阻害によるPPIの改善に関与する脳部位および神経回路を明らかにするため、野生型あるいはDAT欠損マウスにnisoxetineを局所投与し、PPIを測定した。脳位固定装置を用いて内側前頭前野および側座核に局所投与用カニューレを脳の左右両側に挿入し、カニューレ挿入のPPIへの影響を調べたところ、野生型あるいはDAT欠損マウスにおいて前頭前野皮質・側坐核ともにカニューレ挿入の手術前後でPPIに影響は見られなかった。その上で側坐核へnisoxetineを局所投与したところリンゲル液投与時と比較してDAT欠損マウスのPPIに変化は見られず、有意差は認められなかった。一方、前頭前野皮質へのnisoxetine局所投与ではリンゲル液投与時と比べ、PPIは改善傾向を示した。前頭前野皮質ではDATの発現が少なく、より豊富に存在するNETが細胞外ドーパミン濃度を調節していると考えられている。以上の結果は前頭前野皮質では大脳基底核と異なる特徴的なモノアミン神経伝達の制御が認知機能に関与している可能性を示唆した。

以上の結果は、選択的NET阻害剤であるニソキセチンが統合失調症の認知機能障害において機能低下が想定されている前頭前野皮質に投射するドーパミン神経を賦活し、また後シナプス細胞の錐体細胞も活性化させる働きをもつことを示唆し、統合失調症患者における認知機能障害を改善させる治療薬としての可能性を期性させる。
多様体の幾何学

本研究は多様体の大域的性質を幾何学および解析学の立場から、各分担者が相互に協力して解明することであった。したがってその内容は比較的多岐にわたり、三つの項目に分けて研究を行って来た。昭和62ー63年度を通して得られた主要な成果は次の通りである。1.葉層構造と特異点の研究:(1).正則葉層構造に対し、葉層特異コホモロジー理論を展開した。これは特性類によるホメノミー亜群の性質の解明の基礎になる。(2).特異点をもつ葉層構造に対して、ホロノミー写像の導入とホロノミー亜群の構成を行った。局所単純とは限らない葉層構造に適用できることがこの構成の特色であり、特異点をもつ葉層のCー環の構成、その指数理論の発展への寄与が見込まれる。(3).1階常および偏微分方程式の特異解の概念を、Wジャンドル特異点によって定式化し、その開析理論を展開した。2.力学系と群作用の研究:(1).組織群の方法により、一部のヘノン写像の周期軌道を分類することが出来た。(2).局所的に、単連結な等質空間の構造をもつ多様体が商多様体となるための十分条件を見出した。3.偏微分方程式の解法の研究:(1).関数のヘッシアンとなるラドン測度の対称行列の特異点における修正可能性をしらべ、ハミルトン・ヤマビ方程式の解の特異点集合の修正可能性を示すことが出来た。(2).無限次元ボソンーフェルミオン・フォック空間におけるケーラー・ディラック作用等の指数の伝路積分表示を得た。本研究は夛様体の大域的性質を位相幾何学,微分幾何学および解析学の立場から,各分担者が相互に連絡し,協力して,しらべることにある.したがって,その内容は比輔的夛岐にわたり,次の三つに分けられる:1.葉層構造の高次元Weilコホモロジ一類によって記述されるホロノミー亜群の性質と葉層作用素環の研究. 2.夛様体上の群作用と力学系の研究. 3.特異点と偏微分方程式の解法の研究.1.微分可能葉層特異コホモロジー理論を構成した.これは,葉層Weilコホモロジー類によって葉層ホロノミー亜群のコホモロジで一構造を解明するための有力な手段となる.葉層ホロノミー亜群のコホモロジーは葉層作用素環の構造に密接に関係する.作用素環構造研究の副産物として,特種なC^〓一環のKー理論に外積べきおよび対称積べき作用素を導入することが出来た.2.閉共形平坦夛様体について,その普遍被覆夛様体の共形自己同形群における単位元の成分が自明の場合,夛様体の構造を決定した.これは,閉共形平坦夛様体における自己同形群作用を解明するものである.組認群の方法により,一部のヘノン写像の周期軌道を分類することが出来た.半ホロノミー枠束の導入により,非転移的な場合を含むGー構造の同値問題を取扱うことが可能になった.3.無限次元ボフン・フェルミオンーフォック空間にケーラー・ディラック形作用素を導入し,その指数の経路積分表示を行った.ヘッシアン測度の階数が1であるための条件を得た.ヘッシアン測度は特異点をもつ偏微分方程式の解の構成に役立つ.本研究は多様体の性質を葉層構造、特異点、作用素環および微分方程式の大域的研究を通して解明することであった。本年度の研究内容は次の三つに分けられる:1.葉層構造および特異点の研究。2.多様体の上の変換群の研究。3.微分方程式の大域解の研究。

1.特異点をもつ葉層構造に対して、ホロノミー写像の導入とホロノミー亜群の構成を行った。局所単純とは限らない特異葉をもつ葉層構造に適用できることが、この構成の特色である。特にリー環の双対におけるリーのポアソン構造のシンプレクティク葉層に対するホロノミー亜群を3次元直交群のリー環等について決定した。この結果は特異点をもつ葉層のC^☆-環の構成、したがってそのK-理論、指数理論の発展に寄与するものである。1階常および偏微分方程式の特異解の概念をルジャンドル特異点によって完式化し、その開折理論を展開した。基本的な同値性に関し、低余次元の範囲でその分類が手がけられ、この結果はさらに精密化されることが期待される。2.局所的に単連結なn次元等質空間の構造をもつ多様体に対し、ホロノミー群が固有不連続、自由に作用するようなその等質空間の開集合が存在して、商空間が多様体となり、余集合のハラスドルフ次元がn-2より小さいとき、与えられた多様体が商多様体と同形になるこことを示した。3.関数のヘツシアンとなるラドン測度の対称行列の階数に関する性質と、その特異点における修正可能性をしらべ、ハミルトン・ヤコビ方程式の解の特異点集合の修正可能性を示した。超対称量子力学を非多項式超ポテンシャルを持つ場合に拡大し、無限個のポテンシャル・エネルギー状態が存在することを示した。
視線を用いた非接触型次世代ヒューマンインタフェースの構築

ステレオビジョンを用いた視線計測システムおよびそれを用いたアプリケーションを構築してきた.具体的な研究成果は以下の3点である.1.ポータブル顔情報計測装置の開発ノート型コンピュータと小型カメラを用いて,人間の頭部の位置・姿勢および視線の方向をビデオレート(30Hz)で計測するシステムを構築した.このために,ノート型コンピュータのCardBus用の画像キャプチャシステムと,ステレオ画像を1枚のキャプチャカードで取り込むための小型画像多重化装置も開発した.開発したシステムを用いると,頭部の位置・姿勢については1[mm],1[deg],また視線方向については3[deg]程度の誤差で計測できる.2.非接触ポインティング・デバイス(顔マウス)の試作顔情報計測装置を用いて,画面上のマウスカーソルの動きを顔の動きにより制御するインタフェースを構築した.従来からある視線によりカーソルを制御するシステムと異なり,頭部に計測のための機器を装着する必要がないためにユーザへの身体的な負担が軽く,また目に対する赤外線照射の必要もないため安全性が高い.また,実験の結果視線を直接用いるよりも,顔の向きをカーソルの動きの制御に用いる方が,安定して画面上のボタンなどのクリックが行えることができることが明らかになった.3.視線操縦型車いすシステムの試作顔情報計測装置を用いて,顔・視線の動きにより電動車イスを操縦するシステムを試作した.このシステムで採用したインタフェースは,人が行きたい方向へ顔や視線を向けるとそちらに進むというものである.また,頭部の動きによるジェスチャを認識し,うなずくとスタート,首を振るとストップする機能も持つ.さらに,我々がこれまでに行ってきた自律移動ロボットのナビゲーション機能も組み込み,生駒市立図書館において「人をサポートする知的車いす」としての実証実験を行ってきた.これまでに多数のユーザ(子供からお年寄りまで200人以上)に試乗してもらい,操作体系としては誰でも容易に習得できるものであることを確認した.今年度は,顔と視線の方向を用いた次世代インタフェースの1つとして,電動車椅子の知能化を行った.電動車椅子は市販のものを用い,それをコンピュータからシリアル通信経由で動かせるように改造した.その上で,小型カメラとパーソナルコンピュータからなる顔・視線計測システムを車椅子上に搭載し,1時間程度のバッテリー駆動ができるようにした.顔と視線の方向を用いたインタフェースとしての基本的なインプリメンテーションは,(1)顔の向いている方向へ進む,(2)停止状態でうなずくとスタート,(3)走行状態で首を振ると停止,(4)視線の向きが顔の向きと異なる場合にはわき見をしていると判断して速度や回転半径を抑える,などである.ここで,うなずき,首振りの認識は,複数のユーザの動きを計測することでパラメータを決定した.また,わき見を判断するための顔と視線の方向の差についても,同様にユーザの挙動を計測した上で決定した.また,超音波距離センサをロボットの周囲に配置することで,壁などの障害物を検知し,たとえ顔がそちらを向いていても衝突を回避できるような機能も開発した.これにより,走行の安全性が保たれるようになった.また,以上のように構築したシステムを用い,屋内・屋外のさまざまな環境において走行実験を行った.その結果,屋内では,廊下のように狭い場所でも問題なく走行することが可能であることが分かった.また屋外では,太陽の方向によってはカメラ画像中に太陽が写りこんでしまい,画像が飽和してしまって画像処理ができなくなることが分かった.これはCCDカメラの特性であるので,カメラの配置を変更する以外には解決しようがないと思われる.しかし,それ以外には屋外でも安定した顔の認識と車椅子の操縦ができることが確認できた.ステレオビジョンを用いた視線計測システムおよびそれを用いたアプリケーションを構築してきた.具体的な研究成果は以下の3点である.1.ポータブル顔情報計測装置の開発ノート型コンピュータと小型カメラを用いて,人間の頭部の位置・姿勢および視線の方向をビデオレート(30Hz)で計測するシステムを構築した.このために,ノート型コンピュータのCardBus用の画像キャプチャシステムと,ステレオ画像を1枚のキャプチャカードで取り込むための小型画像多重化装置も開発した.開発したシステムを用いると,頭部の位置・姿勢については1[mm],1[deg],また視線方向については3[deg]程度の誤差で計測できる.2.非接触ポインティング・デバイス(顔マウス)の試作顔情報計測装置を用いて,画面上のマウスカーソルの動きを顔の動きにより制御するインタフェースを構築した.従来からある視線によりカーソルを制御するシステムと異なり,頭部に計測のための機器を装着する必要がないためにユーザへの身体的な負担が軽く,また目に対する赤外線照射の必要もないため安全性が高い.また,実験の結果視線を直接用いるよりも,顔の向きをカーソルの動きの制御に用いる方が,安定して画面上のボタンなどのクリックが行えることができることが明らかになった.3.視線操縦型車いすシステムの試作顔情報計測装置を用いて,顔・視線の動きにより電動車イスを操縦するシステムを試作した.このシステムで採用したインタフェースは,人が行きたい方向へ顔や視線を向けるとそちらに進むというものである.また,頭部の動きによるジェスチャを認識し,うなずくとスタート,首を振るとストップする機能も持つ.さらに,我々がこれまでに行ってきた自律移動ロボットのナビゲーション機能も組み込み,生駒市立図書館において「人をサポートする知的車いす」としての実証実験を行ってきた.これまでに多数のユーザ(子供からお年寄りまで200人以上)に試乗してもらい,操作体系としては誰でも容易に習得できるものであることを確認した.
CO_2-メタノール物理吸収-光電気化学的還元ハイブリッドシステムの開発

近年、大気中の二酸化炭素濃度(CO2)の増加に伴い、地球温暖化が懸念されてきている。したがって、CO2の変換技術の開発が急務であり、電気化学的手法、特に太陽エネルギーを直接利用できる可能性のあるp型半導体電極を用いた光電気化学的が極めて有望な方法の一つとなっている。p型半導体電極を用いたCO2の光電気化学的還元は、これまで水溶液中でほとんど行われてきており、CO2の分離回収法で物理吸収液として用いられているメタノール溶媒中では行われていない。メタノールを用いたCO2の分離回収プロセスはRectisol法と呼ばれ、これまで70基以上の工業プラントの実績があるため、このRectisolプロセスと光電気化学的還元プロセスを組み合わせることができれば、実用化に向けて大きく前進すると思われる。このような背景から、本研究では各種p型半導体電極を用いたメタノール溶媒中のCO2の光電気化学的還元を行った。さらに、半導体電極表面に金属を修飾し、還元効率の向上を図った。光電気化学的還元には、アノード室とカソード室をイオン交換膜で仕切ったパイレックスガラス製H型セルを用いた。作用電極にはp-Si、p-GaAs、p-InPを用いた。対極にはPtを、参照電極にはKCl飽和Ag/AgCl電極を使用した。主な還元生成物は、COとギ酸が得られた。CO生成の順序はp-InP>p-GaAs>p-Siであり、ギ酸生成の順序はp-Si>p-GaAs>p-InPであった。メタノール溶媒中では、p-InPが最もCO2の還元に有効でありで、最適条件下でCO2の総還元効率は55.6%に達し、水素生成は23.4%まで抑制された。生成物選択性や還元効率の向上を目的とし、p-InP表面に金属(Ag、Au、Cu、Ni、Pb、Pd)を担持し、CO2の光電気化学的還元への効果を調べた。金属を担持したp-InP電極では、電気化学的還元おける担持金属の電極触媒特性と類似していた。電気化学的還元で炭化水素類を生成するCu電極は、一酸化炭素が主生成物となり炭化水素類は生成しなかった。Ag、Au、Pdでは一酸化炭素が主生成物となり、特にAgは一酸化炭素の電流効率が80.4%まで向上した。Pbを担持すると、ギ酸の電流効率が向上した。Niを担持すると、担持した他の金属では得られなかった炭化水素類が微量ながら生成した。p型半導体電極(InP,Si,GaAs)を用いて、メタノール溶媒における炭酸ガスの電気化学的還元を行った。還元生成物として、COやギ酸が得られた。従来のメタノール溶媒を用いた炭酸ガスの電気化学的還元と比較して、光エネルギーを利用して分だけ、投入する電気エネルギーが少なくてすみ、メタノール溶媒でも、光電気化学的還元が進行することが分かった。温度を低下させると、水素の電流効率は抑制され、炭酸ガスの電気化学的還元が進行することが分かった。p-InP電極を用いると、COの電球効率が40%以上得られたが、p-Si電極を用いるとギ酸が20%以上の電球効率で得られることが分かった。水溶液系の半導体電極を用いた光電気化学的還元では、水素の電流効率が70%程度と非常に高い値が報告されているが、本メタノール溶媒を用いた光電気化学的還元法では、水素の発生効率が20%以下であり、非常に水素発生が抑制される結果となった。p-InP電極における電位の影響では、電位を卑にするとCOと水素の電流効率が増加する傾向が得られた。また、ギ酸に関しては、電位を貴にすると増加する傾向が得られた。p-Si電極では、電位を貴にすると水素の電流効率が減少し、ギ酸の電流効率が増加する傾向が得られた。光還元電流は、-1.0V付近から流れ始めており、光を照射しない場合はほとんど還元電流は流れず、光エネルギーの利用が大きいことが示唆された。電解は50Cで行っており、電極の劣化や表面の悪化は特に観測することができなかった。これは、メタノール溶媒中では炭素に起因する不純物が電極表面に付着しにくいことが考えられ、メタノール溶媒中では、通常の水溶液中でおこる電極劣化が起こりにくく、実際の工業プラントへの応用が水溶液中より行いやすいこと考えられた。電流密度は数mA程度であり、実際の産業化に向けて反応速度の向上が今後の課題として挙げられた。

光電気化学的還元には、アノード室とカソード室をイオン交換膜で仕切ったパイレックスガラス製H型セルを用いた。作用電極にはp-Si、p-GaAs、p-InPを用いた。対極にはPtを、参照電極にはKCl飽和Ag/AgCl電極を使用した。主な還元生成物は、COとギ酸が得られた。CO生成の順序はp-InP>p-GaAs>p-Siであり、ギ酸生成の順序はp-Si>p-GaAs>p-InPであった。メタノール溶媒中では、p-InPが最もCO2の還元に有効でありで、最適条件下でCO2の総還元効率は55.6%に達し、水素生成は23.4%まで抑制された。生成物選択性や還元効率の向上を目的とし、p-InP表面に金属(Ag、Au、Cu、Ni、Pb、Pd)を担持し、CO2の光電気化学的還元への効果を調べた。金属を担持したp-InP電極では、電気化学的還元おける担持金属の電極触媒特性と類似していた。電気化学的還元で炭化水素類を生成するCu電極は、一酸化炭素が主生成物となり炭化水素類は生成しなかった。Ag、Au、Pdでは一酸化炭素が主生成物となり、特にAgは一酸化炭素の電流効率が80.4%まで向上した。Pbを担持すると、ギ酸の電流効率が向上した。Niを担持すると、担持した他の金属では得られなかった炭化水素類が微量ながら生成した。
介護老人保健施設における終末期ケアの質の評価と課題

近年、介護老人保健施設(以下、老健と示す)でも終末期を迎える入所者が増加している。しかし終末期ケアの判断基準とケアの方針が未確立であることが指摘されており、終末期ケアの内容は施設の裁量によるところが大きいという現状がある。そこで老健における終末期ケアの質を保証するためにも、終末期ケアの質を評価する指標が必要であると考えた。その第1段階として平成22年度に、文献検討から作成した老健における終末期ケアの質評価指標案の適切性および重要性について検討した。平成23年度は、第1段階で作成した質評価指標案の実施可能性と選定した項目の妥当性を検討した。調査方法は自記式質問紙法で、対象は終末期ケアを実施している老健1,000施設を無作為に抽出し、看護主任または老健において経験豊富な看護職1施設1名に回答を依頼した。質問内容は、第1段階で作成した指標項目についての実施状況(1=全くしていない5=必ずしている)と重要性の認識(1=あまり重要でない5=非常に重要である)について尋ねた。さらに指標項目の妥当性を検討する目的で施設の管理体制11項目について構造評価を行った。その結果、指標項目の重要性は71個項目全ての平均値が4以上であり「重要である」と認識されていた。実施状況は34項目の平均値が4以上で項目のケア内容を「おおむね」実施していた。また選定された指標項目の妥当性を検討するために、終末期ケアの実施状況71項目の合計得点と施設の管理体制で「はい」と回答した項目数についてSpearmanの順位相関係数を算出した結果、0.52(p<0.01)であった。全指標項目が「重要である」と認識されており、施設の管理体制が整備されているほどケア項目の実施率も高かったため妥当な項目が選定できたと考えられた。その第1段階として文献検討から作成した老健における終末期ケアの質評価指標案の適切性および重要性について検討した。1.調査方法は文献検討から作成した老健における高齢者の終末期ケアの質評価指標案について、デルファイ法による質問紙調査で指標を修正・洗練した。2.デルファイ法のパネルのメンバーは老人看護専門看護師22名および終末期ケアについて学会や雑誌等で発表している老健の看護管理者23名とした。3.質問内容は文献検討から作成した指標の適切性および重要性について指標別に5段階(1=あまり適切/重要でない、2=どちらかと言えば適切/重要でない、3=やや適切/重要である、4=適切/重要である、5=非常に適切/重要である)で評価を依頼し、指標内容の過不足等を自由記述で求めた。その結果、多くのの指標項目の適切性および重要性が高く評価された。しかしCNSと老健看護管理者を比較すると、老健看護管理者の方が低く評価した項目が多かったため、実施可能性は低い可能性が示唆された。今後、老健の一般スタッフを対象とした調査で実施可能性を検討することが課題である。
双極子追跡法と機能的近赤外分光法を併用した前庭刺激に対する脳高次機能の研究

全頭型NIRS測定装置(島津製作所OMN-3000)および脳波計(Biosemi社)を組み合わせ、前庭刺激より誘発されためまい感覚中の脳波(EEG)及び機能的近赤外線分光法(fNIRS)を同時記録・解析するための統合システムを構築した。同システムを用い、37°Cのエアカロリック刺激と24°Cの冷刺激を交互に行い、EEGおよびNIRSを同時記録した。NIRS測定では、脳の広範な領域で冷温刺激開始後数分持続する血流変化が認められた。頭頂部、側頭部の血流反応は刺激後、酸素化ヘモグロビン(OxyHb)が上昇する傾向が認められ、前頭部を中心に刺激直後OxyHbが減少した後にめまい感の出現と共に上昇する2相性パターンを示す被験者が6人中5人で観察された。次にGeneral Linear Modelを用いた脳賦活の統計検定を行った。多くの被験者で共通して有意な血流変化を示した脳領域は中心前回、下前頭回弁蓋部、前頭極、中心後回、縁上回、上頭頂小葉、上側頭回など脳の広範な領域に認められ、これまでの脳機能画像研究で指摘されたカロリック刺激で賦活化される脳領域に比べ、脳深部以外はほぼ一致していた。脳波解析に関しては、周波数解析を施行したところ、頭頂部電極を中心にθ波のバースト状の出現とθパワーの上昇が認められ、カロリック冷刺激に伴うめまい感に伴う脳の活動を反映している可能性が示唆された。今回の研究によって、fNIRS及びEEG同時期録システムが、めまい・平衡障害における大脳皮質の活動を検出できることが証明され、今後のめまいの診断・治療効果などの判定など臨床応用の可能性が大いに期待されるものと考える。前庭刺激による大脳皮質の活動を明らかにすることを目的に、全頭型NIRS測定装置(島津製作所OMN-3000)および脳波計(Biosemi社)を組み合わせ、galvanic vestibular stimulation(GVS)時の酸素化・脱酸素化ヘモグロビン(Hb)濃度および脳波の同時計測を試みた。成人被験者に全頭型NIRS(108ch)および脳波(32ch)測定用キャップ(島津製作所製)を装着した。測定は、刺激時間30秒間および休止時間60秒間を1サイクルとするGVSを計20サイクル行った。GVSは脳波への影響を考慮し、刺激持続時間25ms、100msの2条件とした。刺激強度は0.5mA、刺激頻度は2Hz、経乳様突起間刺激(右陽極)で行った。NIRSデータは各刺激サイクルを加算平均し、脳波データは各GVS毎のデータを加算平均した。結果として、GVS開始後数十秒後に頭頂部から後頭部にかけて酸化Hbが上昇する傾向が認められ、刺激の持続時間が長いほど酸化Hbも増加している印象であった。今後被験者を増やすと共に、NIRSデータを被験者頭部3DMRI画像にスーパーインポーズし、実際の脳活動領域を検討したいと考えている。脳波に関しては、GVSによる脳波への直流電流の混入の影響が大きく、25ms、100ms共に加算波形を検討したが、誘発反応と思われる電位変化は確認できなかった。今後、電気的ノイズの除去が可能かどうか、また他の前庭刺激条件下でのNIRSおよび脳波記録も検討する必要があると考える。前庭刺激による大脳皮質の活動を明らかにすることを目的に、全頭型NIRS測定装置(島津製作所OMN-3000)および脳波計(Biosemi社)を組み合わせ、caloric vestibular stimulation(CVS)時の酸素化(OxyHb)・脱酸素化ヘモグロビン(DeoxyHb)濃度および脳波の同時計測を行った。成人男性被験者

5名に全頭型NIRS(108ch)および脳波(32ch)測定用キャップ(島津製作所製)を装着した。実験は閉眼下に行い、CVSは全員右耳に行った。測定は、対象刺激として37°CのCVSを1分間、休止期間4分間の計5分間、冷温刺激として24°CのCVSを1分間、休止期間4分間を各1サイクルとした。対象刺激と冷温刺激のCVSを各56サイクルずつ行った。被験者がCVSによって前庭感覚を自覚した際には、その開始と終了時にボタンを押すように指示した。脳波以外に水平方向の眼球運動及び心電図を記録した。NIRS測定では、脳の広範な領域で冷温刺激開始後数分持続する血流変化が認められた。頭頂部、側頭部の血流反応は刺激後OxyHbが上昇する傾向が認められた。前頭部では刺激直後後OxyHbが減少した後上昇する2相性パターンを示す被験者が多く観察された。後頭部では一定の傾向が見られなかった。次にGeneral Linear Modelを用いた脳賦活の統計検定を行った。被験者5人中4人以上に共通して有意な血流変化が認められた部位は、右前頭葉弁蓋部及び中前頭回周辺、右頭頂葉周辺、左縁上回周辺など、脳の広範な領域に認められた。脳波解析に関しては、CVSの場合、冷温刺激による嘔気症状のため頻回に行なえず56サイクルが限界であったこと、冷温刺激の開始から刺激が消失するまでの時間が長く続くこと、等の理由から、加算平均法による解析ができなかったため、周波数解析的アプローチを検討中である。
微生物による天然ステロールの有用ステロイドへの変換

1。59年度および60年度に合成したC-24-カルボン酸のアナログのステロイドについて、Mycobacterium sp.NRRL3805にてコレステロールおよびシトステロールを種々の条件(添加量、添加のタイミング、培地組成等)にて培養したが、培養生成物のGLC分折において、ごく微量のC-22-アルコール体を含む2-3の側鎖が一部切断されたと考えられる生成物がみられるだけで(今田幸男、新田一誠、発酵と工業、38、1117(1980)参照)、目的とするC-24-カルボン酸を蓄積することは出来なかった。この結果は、本側鎖切断反応の最初のステップ、即ち、C-26-水酸化がフィードバック的に抑えられるためと考えられる。これらの化合物の本反応における阻害のステップを明らかにするために無細胞系での実験を行っている。2。本反応のメカニズムを更にくわしく調べるために、C-25位の立体化学のはっきりしたステロイドC-26-カルボン酸類を合成した。これらの立体配置の決まった基質を上記Mycobaterium spから調製した無細胞系でインキュベインションしたところ、25位の立体化学は区別されることなく(1),(2)共にC-24カルボン酸に変換された。また、シトステロール型側鎖のカルボン酸(3),(4)は、25R体(3)がより良い収率でC-24カルボン酸を与えた。1。2。本研究は、安価な天然ステロールを微生物により、種々の生理活性ステロイド類の合成原料として有用なステロイドに変換することを目的としたものであり、そのために、新たに考案したステロイド系阻害剤を用いて微生物による天然ステロールの代謝を制御し、代謝中間体を得るという方法を採り、昨年度に合成した化合物に更に本年度に合成した化合物を加えて阻害作用を比較した。1.24,24-ジフルオロ【C_(25)】カルボン酸メチルエステル(6)を合成した。その合成法は(5)の合成法に習った。又、(1)の4-エン-3-オン体を合成した。これらの化合物の詳しい代謝阻害作用について右表に示す。なお微生物としてMycobacterium sp.NRRL-3805を用いコレステロールを基質とした。2.更にシトステロールを基質として培養を行ない、ほぼ同じ阻害結果を得た。3.培養液中に微量ながらいくつかの側鎖の切断されたステロイド(このうち1つは22-アルコールと決定)が見い出されたのでこれらの構造について検討している。
がん細胞の浸潤・転移における小胞輸送の役割の解明

がん細胞の浸潤・転移においては、上皮細胞の細胞間接着の形成・分解が重要な役割を果たしている。細胞間接着の形成・分解は、細胞間接着分子の小胞輸送を介した細胞膜への輸送や細胞膜からの取り込みとリサイクリングによりダイナミックに制御されていると考えられる。本研究では、細胞間接着の形成・分解の制御機構を明らかにする目的で、京都大学の月田先生のグループが発見したタイトジャンクション(TJ)を構成する細胞間接着分子クローディンに注目し、その小胞輸送について研究を進め、以下の成果を得た。1.極性を有する上皮細胞の基底側膜蛋白質であるLDL受容体(LDLR)と頂端側膜蛋白質である神経栄養因子受容体(p75NTR)の小胞体からゴルジ体を経て細胞膜に至る小胞輸送の過程について非極性細胞を用いて生化学的に解析できるアッセイ系がすでに他のグループにより確立されており、LDLRとp75NTRがそれぞれ異なる輸送小胞によって運ばれることが証明されている。本研究では、この系を応用し、クローディンが新しく合成され、ゴルジ体で輸送小胞に積み込まれて細胞膜に運ばれる過程を定量的に解析できるアッセイ系の開発に成功した。2.このアッセイ系を用い、小胞輸送の制御分子群Rabファミリーのメンバーで、TJに局在することが報告されているRab13とRab3Bは、各々クローディンとLDLRの細胞膜への輸送を制御し、ともにp75NTRの細胞膜への輸送には関与しないことを明らかにした。Rabの小胞輸送に対する特異性から考えると、これらの結果から、クローディンは基底側膜蛋白質LDLRと頂端側膜蛋白質p75NTRとは異なった輸送小胞にのって運ばれていることが予想され、今後クローディンの輸送に関わるRab13の作用機構の解明が重要であると考えられた。このように、本研究は予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成できた。
オートファジーは血管石灰化を抑制するか？

Calciprotein particle (CPP)はヒト血管平滑筋細胞(SMC)のオートファジーを効率よく誘導した。Atg7をノックダウンしたSMCでは、高リン濃度やCPPによる石灰化が軽減していた。その機序の一つとして、骨芽細胞様の形質転換に関与する遺伝子の発現を調べたが、コントロールとノックダウンで変化はなかった。またマウス大動脈を剖出し、ex vivoで培養した際に高リン濃度にすると、中膜の石灰化が誘導できた一方、CPPでは高率に外膜の石灰化が生じ、中膜の石灰化は起きなかった。現在平滑筋細胞特異的にAtg7を欠損したマウスを用いて、大動脈のex vivo培養を開始した。高リン濃度の培地、もしくは高リン、高カルシウム培地から作成したCarciprotein particle(CPP)を精製して、培地に添加し、ヒト血管平滑筋細胞の石灰化を調べている。CPPでは高率に短時間で平滑筋細胞が石灰化することを確認し、オートファジーの抑制で石灰化が抑制されることを見出した。しかし、その背景にはオートファジーを抑制すると、CPPによる平滑筋細胞死が亢進するため、CPPを添加したときの石灰化がオートファジー抑制平滑筋細胞では減少しているように観察されることがわかった。またCPPによるインフラマソームの活性化が示唆されているが、そこにオートファジーが関与するかはわかっていない。まずはマクロファージ培養細胞を用いて、CPPによってインフラマソームが活性化し、IL-1betaの分泌が起きることを確認した。次にオートファジーを抑制したマクロファージからのIL-1betaの分泌が低下するデータを得たので、現在再現性を確認している。マクロファージで確認された現象を血管平滑筋細胞でも観察されるかを確認する予定である。カルシウムリン結晶のひとつ、Calciprotein particle(CPP)によって、ヒト平滑筋培養細胞が短期間で効率に石灰化することを証明した。ヒト平滑筋培養細胞において、薬剤やsiRNAでオートファジーを抑制した場合、CPPによる石灰化が亢進することがわかった。マウスの大動脈を摘出し、ex vivoで培養し、CPPを添加した場合も大動脈に石灰化が起きることが分かった。ヒト平滑筋細胞培養での石灰化実験の再現性をとるのに時間を要した。またマウス実験計画書承認や搬入に時間を要したため。オートファジー必須遺伝子であるAtg7をノックダウンした血管平滑筋細胞では、高リン濃度やCalciprotein particle (CPP)によって生じる石灰化が軽減していた。その原因を探るため、骨芽細胞様に形質転換する時に誘導される遺伝子群(RUNX2, BMP2)などの発現変化を調べたが、コントロールとノックダウンで変化はなかった。またマウス大動脈を剖出し、ex vivoで培養した際に高リン濃度にすると、中膜の石灰化が誘導できた。このex vivo培養系にCPPを加えると、高率に外膜の石灰化が生じ、中膜の石灰化が誘導できなかった。現在Atg7 flox/floxマウスとSM22alpha-Creマウスを交配している。平滑筋細胞特異的にAtg7を欠損したマウスを用いて、大動脈のex vivo培養を開始したところである。これらの結果は日本腎臓学会の口演で「Calciprotein particleによる血管石灰化におけるオートファジーの役割」というタイトルで発表した。血管平滑筋細胞の石灰化とオートファジーの関係が証明された後に、SM22alpha-Cre/Atg7 floxKOマウスを用いて、石灰化モデルを作り、解析する予定であるが、vitroの確固たるデータが得られないため、マウスの実験に取り組めていない。マウスを使用する動物実験申請やマウス施設の準備はできている。平滑筋細胞特異的CreをもつAtg7 floxマウスから、大動脈を摘出し、ex vivoの培養系でオートファジーを平滑筋細胞で欠損すると、石灰化が抑制されることを証明する。またそのメカニズムもex vivoで証明していく。腎臓病学、分子生物学平滑筋細胞に限らず、そのほかの血管構成細胞(内皮細胞、線維芽細胞)を用いて、血管石灰化のプロセスとオートファジーのかかわりを明らかにしたい。vitroでは平滑筋細胞の実験が効率的に進んでいないので、マクロファージや血管内皮細胞に変えて、CPPによる細胞の石灰化や炎症反応、細胞死におけるオートファジーの役割を明らかにしたい。そしてマウスを用いたvivoの実験でも確認をしたい。SM22alpha-Cre以外でも、必要に応じてコンディショナルノックアウトマウスを作成するためのCreマウスを購入する予定である。
オレアノール酸グルコシドをリード化合物とした新規抗メチル水銀薬の開発

我々は前年度に、オレアノール酸(OA)のC3位にグルコースが結合したサポニン誘導体であるOA 3-グルコシド(OA3Glu)がin vivoにおいてMeHgの臓器蓄積を抑制すること、MeHgによる神経伝達障害を軽減することを示し、OA3Gluが抗メチル水銀(MeHg)活性を持つ化合物として見出した。前年度よりOAに結合する糖の部位(C3位、C28位)や糖の種類(グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、フルクトース等)の異なるサポニン誘導体を合成したため、本年度はこれら化合物の抗MeHg活性の評価を進めた。まず、OA3GluとはOAに結合する糖の部位が異なるOA 28-グルコシド、OA 3,28-グルコシド、さらに骨格であるOAについてMeHg毒性抑制作用をin vitroにおいて検討した。Caco-2細胞にMeHgをばく露し細胞内MeHg量を測定し、さらにMTTアッセイにより細胞生存率を測定したところ、これらの化合物はOA3Gluとは異なりMeHgの細胞内取り込み、およびMeHgによる細胞死をほとんど抑制しなかった。このことからOAのC3位への糖の結合が抗MeHg活性に重要であることが示唆されたため、次にOAのC3位に結合する糖の種類が異なるOA 3-ガラクトシド、OA 3-マンノシド、OA 3-キシロシド、OA 3-フルクトシドについて抗MeHg活性をOA3Gluと比較した。MTTアッセイによりMeHgによる細胞死に対するこれらの化合物の効果を検討したところ、OA 3-ガラクトシドは、OA3Gluと同程度の細胞死抑制が認められた一方で、OA 3-マンノシド、OA 3-キシロシド、OA 3-フルクトシドは活性が弱かった。以上より、OAサポニン誘導体は、OAのC3位にグルコースもしくはガラクトースが結合することで高い抗MeHg活性を示すことが示唆された。我々は、オレアノール酸(OA)のC3位にグルコースが結合したサポニン誘導体であるOA 3-グルコシド(OA3Glu)を、抗メチル水銀(MeHg)活性を持つ化合物として見出している。本研究ではまず、OA3Gluのin vivoにおけるMeHg毒性抑制作用の検証を行った。以前の検討で、比較的低濃度のMeHg (1.0 mg/kg)を、マウスに投与した際、OA3Gluは種々の臓器における水銀蓄積量を減少させたため、本研究では高濃度(2.5, 5.0 mg/kg)のMeHgばく露に対するOA3Gluの効果を検討した。週5回、4週間にわたりマウスにOA3Gluを前投与し、その1時間後に2.5, 5.0 mg/kgのMeHgを経口投与したところ、2.5, 5.0 mg/kgどちらのMeHg投与群においても、MeHg投与により生じた運動障害がOA3Gluの前投与により軽減する傾向が認められた。また、5.0 mg/kg MeHg投与群において、OA3Gluの前投与により生存期間の延長が認められた。さらに、投与終了後に脳スライス標本を作製し、興奮性シナプス後電位(fEPSP)を測定したところ、2.5 mg/kg MeHg投与群において低下していたfEPSPが、OA3Glu前投与によりコントロール群と同程度まで回復した。以上の結果よりOA3Gluはin vivoにおいてMeHgによる神経障害を軽減させる作用を持つことが示唆された。また、OAに結合する糖の部位(C3位、C28位)や糖の種類(グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、フルクトース等)の異なるサポニン誘導体を合成し、これら化合物の抗MeHg活性の評価に着手した。本年度は抗メチル水銀(MeHg)作用が認められているオレアノール酸3-グルコシド(OA3Glu)の、in vivoにおけるMeHg毒性抑制効果の検証尾を進めた。また、OA3Gluをリード化合物とした抗MeHg薬の創薬を目指し、オレアノール酸のサポニン誘導体について抗MeHg活性の評価に着手した。いずれも概ね計画通りに進行している。

MTTアッセイによりMeHgによる細胞死に対するこれらの化合物の効果を検討したところ、OA 3-ガラクトシドは、OA3Gluと同程度の細胞死抑制が認められた一方で、OA 3-マンノシド、OA 3-キシロシド、OA 3-フルクトシドは活性が弱かった。以上より、OAサポニン誘導体は、OAのC3位にグルコースもしくはガラクトースが結合することで高い抗MeHg活性を示すことが示唆された。平成30年度は、in vivoにおいても抗MeHg作用が認められたOA3Gluに関して、その作用機序の解析を行う。また、新たにオレアノール酸サポニン誘導体に関して抗MeHg活性の評価を進め、活性が認められた化合物に関してin vitro, in vivoにおいてその作用を検証していく。