hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経機能画像と脳損傷症例研究による言語視覚認知過程への多角的アプローチ

本研究課題においては、磁気共鳴画像(MRI)をはじめとした複数の脳機能計測法を用いて言語認知に関わる神経機構についての検討を進めてきた。まず、小川脳機能研究所と提携して行ったMRI研究では、前年度からの行動実験による予備作業で得られた言語刺激材料と刺激提示機器を用いて実際に撮像実験への応用を開始し、年度末までにのべ50名程度の健常成入を対象に画像データの収集を行った。このうち、音声聴覚認知とその抽象化過程を主題とした研究は、既にデータ収集・解析作業を概ね完遂し、平成17年6月に国際学会での発表を予定している。その他には、異種言語間で共有される抽象度の高い記憶表象に関わる皮質機能局在を解明することを目指して、2ヶ国語話者を対象にデータ収集を行い、引き続き解析作業を行っている。同時に、仏・国立衛生医学研究機関と共同で行っているMRI研究では、視覚言語の自動的な認知処理過程とその神経基盤について検討してきたが、前年度までにデータ解析及び論文執筆作業を終え、その一部を学術誌に発表した。また、これに続く研究課題として呼称課題条件下における閾下プラミングを用いて、自動的認知処理と課題条件での随意統制との相互作用について検討することとし、平成16年2月から新たに研究計画の検討に入った。これに関しては同年5月までに予備実験による検討を終え、同年9月には計16名の被験者についてデータ収集作業を同機関に出張の上で実施した。この実験データに関しては、現在も解析作業と論文執筆作業を継続している。症例研究については、医療機関との提携の問題などから当初の予想していたほどにはデータの集積が進まなかったが、その中から特に重要と思われる知見については論文発表を行った。他方、年度内には反復プライミングと経頭蓋磁気刺激を併用した皮質機能研究に新たに着手し、現在も継続している。本研究では、平成15年度から2年間の予定で、文字の視覚認知とその神経解剖学的基盤との関連をより詳細に検討することを目的して、(1)健常人を対象とした機能的磁気共鳴画像による手法と、(2)脳損傷患者を対象とした症例研究を相互補完的に行うことを計画している。(1)については、予備的作業として、マスク・プライミング法を用いた、計5種類の異なる提示条件下での単語視覚認知実験を実施した。具体的には、意味判断課題におけるマスキングされた先行刺激単語による後続の標的単語の認知への反応時間に対する影響を測定した。特に、先行刺激と標的刺激との間の意味的関連性による被験者の運動遂行反応への影響においては有意な効果を確認できたほか、音韻表象の賦活の有無や、日本語における抽象文字列表象の存在などの点については現在も解析作業を続けている。今後、これらの研究項目について目下共同作業を行っている仏・国立衛生医学研究機関のグループと近日中に検討作業を行い、16年度に磁気共鳴画像実験へと応用する予定である。この実験データの一部は、平成16年4月に開催される失読症に関する英国との国際シンポジウムで発表の予定のほか、学術誌への論文投稿も行った。(2)については、(1)で用いた実験パラダイムを局在性脳損傷による言語障害症例の症状評価へ応用し、障害されている認知過程とその病変部位との対応関係をより厳密に検討する。15年度は上記のように予備実験による基礎的データの収集が中心となったが、今後は上記の結果に基づいて、脳損傷例に適用できる実験条件の詳細(反応記録機器の選択、課題の選択、刺激の提示時間、試行回数など)を選定し、臨床応用として後頭葉ないし側頭葉領域の局在性病変を有する症例を検索したうえで、協力が得られれば実験データの収集を行っていく。各症例には、比較・対照のため一般的な医学検査・神経心理学的検査も実施する。
多階層共分散ネットワークによるオミクス間制御ファクターの解明

本年度は、前年度に続いてRNAの構造解析のデータの統合解析のためのアルゴリズムであるreactIDRの開発を行い、SHAPE-MAPやDMS-Seqなど異なるデータに対しても適用できるよう改良を行った。開発したアルゴリズムとその解析結果についての論文が、国際会議APBC2019での口頭発表に採択され、プロシーディングスが出版され、さらなる発展的な研究につながることが期待される。また、シンシナティ大学佐々木敦朗准教授らのグループとの共同研究で、グリオブラストーマにおける代謝を様々に変化させたときのトランスクリプトームの解析の結果から、変動遺伝子の共通因子を見つけることで、最終的にグリオブラストーマにおけるIMPDH遺伝子の新たな機能の発見に寄与することができ、解析結果が出版予定である。また同グループとの共同研究により、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボロームの複数のオミクス情報からそれらの共発現ネットワークの統合的な解析を行い、がん関連遺伝子の新たな制御メカニズムを共同研究者らとともに明らかにすることができた。加えて、このような複数オミクス層におけるエンリッチメント解析における事前分布と、それに基づき各サンプルごとに特異性の高い解析を行うための手法開発をコールドスプリングハーバー研究所のGillis准教授との共同研究において実施した。さらに、医療画像の分野でのオミクス情報統合において現状最大の問題である、転移学習における精度の低下を改善するために、画像特徴に含まれるバッチエフェクトや画像特徴間の相関関係などの構造パターンを次元圧縮により抽出し、転移学習の精度を最大限に維持するロバストなラジオゲノミクス手法の開発に取り組んだ。これによりラジオゲノミクス研究のさらなる発展と、画像情報以外への応用が期待される。得られた結果については近日中に学術誌に投稿する予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本年度はマルチオミクスデータの統合解析の足がかりとして、DNAシーケンサーを利用したRNA二次構造解析に対して、再現性やバッチエフェクトの問題を解決し統合的に解析するためのアルゴリズムの開発と、また時系列トランスクリプトーム・プロテオームデータの実データの解析を行った。RNAの二次構造をゲノムワイドに決定するための技術のうち、ハイスループット構造解析と呼ばれる網羅性の高い実験手法があるが、膨大なデータが多様な条件下において生み出されており異なるプラットフォーム上で解析をせざるを得なかった。そのような強い不均一性を持つハイスループット構造解析データに対して、正解構造と再現性を基準に二次構造を決定するためのアルゴリズムreactIDRの開発を行った。reactIDRにおいては、教師付き学習によるパラメータ最適化によって、不均一な実験データからも再現性の高い結論のみを抽出することを可能にし、現在論文投稿中である。次に、時系列トランスクリプトーム・プロテオームデータを統合的に解析するためのプラットフォーム開発を行った。共同研究者らによって得られたCAGE-Seq, RNA-Seq,プロテオーム,およびメタボロームの情報から、異なるオミクス層間で遺伝子の発現変動の比較を行ったところ大幅な再現性の低下が見られたが、一方で、パスウェイやオントロジーレベルでの解析を行うと、複数のオミクス層において共通で見られるものが存在することがわかった。さらにCAGE-Seqに対してMARA解析を適用することで、転写因子のアクティビティの変動と、転写因子を介したパスウェイ全体の発現変動を検出することに成功した。これらの結果から複数のオミクス層における発現データから直接エンリッチメント解析を行うための新規アルゴリズムの開発を行い、次年度以降その有効性を確認する予定である。同一のオミクス層におけるハイスループット構造解析のバッチエフェクト問題を解決するreactIDRの開発においては、精度評価及び三次元データとの比較を行い、論文化の前段階まで進めることができた。一方、多階層のオミクスデータの実データ解析においては、用いるデータによって解像度が大きく異なるため、適用予定であった精緻な共分散モデルをそのまま適用することが難しい場合があることがわかった。また、共同研究により得られた様々なデータに対して適用していく中で、オミクス解析においてはより柔軟なモデルが求められていることが明らかになった。

さらに、医療画像の分野でのオミクス情報統合において現状最大の問題である、転移学習における精度の低下を改善するために、画像特徴に含まれるバッチエフェクトや画像特徴間の相関関係などの構造パターンを次元圧縮により抽出し、転移学習の精度を最大限に維持するロバストなラジオゲノミクス手法の開発に取り組んだ。これによりラジオゲノミクス研究のさらなる発展と、画像情報以外への応用が期待される。得られた結果については近日中に学術誌に投稿する予定である。今年度の実データ解析の結果に基づいて、発現データの部分だけでなく、遺伝子や代謝のネットワークのパスウェイ上など、複数のステップでのデータ統合アルゴリズムの開発を進めていく。具体的には発現量の正規化の段階でデータの統合を行う階層共分散モデルに加えて、遺伝子の発現変動をもとにした変化の大きいパスウェイなどを抽出するエンリッチメント解析や、画像データによる入力、表現系にあたるフェノタイプ・ジェノタイプの予測など、各ステップでのデータ統合を行うモデルの開発を同時に進めていく。これにより、各ステップで生み出されるノイズやバイアスの推定なども可能になるのではないかと考えられる。また、各ステップにおけるデータの粒度に応じて、フィルタリングや次元圧縮を行うための手法を適切に選択するパイプラインの構築も行う。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
牛白血病を規定するウシ主要組織適合抗原(BoLA)ハプロタイプの網羅的多型解析

本研究では、疾患との関連性が指摘されているウシ主要組織適合抗原(BoLA)クラスIIを含むBoLA全領域の次世代シークエンサーによる遺伝子解析法を開発し、これまで指摘されてきた疾患とBoLAとの相関性について、より正確に絞り込むことを可能とする事を目的として実施した。最終年度は、国内のウシのBoLA-DRB3タイピングを行い、異なるハプロタイプを有する個体10頭(DRB3*12:01/14:01, *14:01/*16:01, *16:01/*16:01, *05:03/*12:01, *02:01/*15:01, *07:01/*10:01, *07:01/*09:02, *07:01/*14:01, *11:01/*12:01,*10:01/*11:01)を選抜した。次に、次世代シークエンサーを用いてBoLA領域のターゲット・リシークエンスを実施するために、リファレンスとなるウシゲノムシークエンスとして2018年に新たに報告されたARS-UCD1.2と2004年から用いられているUMD3.1の比較を行った。さらに、BoLA領域全長をカバーするプローブ設計を、遺伝子領域のみ、あるいは遺伝子のない領域も含む全領域の二種類について行い、そのタイピング効率を比較した。最終的にBoLA領域内の疾患関連SNPを見いだすために用いる最適なターゲットリシークエンス法として、リファレンスゲノムはARS-UCD1.2を用い、遺伝子のない領域も含めた、ウシ23番染色体6.98Mbase-7.59および25.40Mbase-28.96Mbaseの領域に設定したプローブを選定した。これらのプローブを用いたターゲットリシークエンスを、10種類の遺伝子型を有する個体を用いて実施し、10頭でx70x148倍と、十分なシークエンス深度が得られた。また、得られたシークエンス情報と、サンガー法によるBoLA-DRB3遺伝子の塩基配列を比較したところ、全ての固体について正確にSNPがタイピングできていたことが確認され、本方法がBoLA領域内の疾患関連SNPの探索に適している事が示された。平成28年度は感受性および抵抗性アリルを有するウシゲノムの収集およびBoLA領域の次世代シークエンサーによるターゲットリシークエンスの条件設定を行う事を目標とした。本年度は(1)黒毛和種牛およびホルスタイン種のゲノムDNA、500頭の収集、(2)DRB3およびDQA1遺伝子のアリルタイピング、(3)収集したウシサンプルのBoLAクラスIIハプロタイプの予測、および(4)BLV抵抗性アリルであるDRB3*0902,DRB3*0701およびDRB3*1101を有する個体の収集、を目的としていた。本年度は、黒毛和種340頭およびホルスタイン種504頭より抽出したDNAを計844頭収集し、クラスIIハプロタイプおよびクラスIハプロタイプをNGS法により推定した。本サンプルより、抵抗性としてDH0902A(11/1), DH0902C(0/13), DH0701A(2/11), DH1101A(86/15), DH1101D(0/4), DH1401A(29/0), DH1401C(0/8)が検出され、感受性としてDH1501A(316/86), DH1501B(8/0), DH1601A(2/56), DH1601D(4,128)が検出された(ホルスタイン種頭数/黒毛和種頭数)。これらの個体からDH1601Dを有する個体3頭、DH1601Aを有する個体3頭、そしてDH1501Aを有する個体4頭の計10頭の黒毛和種を選抜し、全MHC領域のを含む、chr22:27,135,779-27,138,024, chr22:27,240,001-27550000およびchr23:25,155,545-31,621,350の領域にプローブを設定し、Miseqによるターゲットリシークエンスを行った。得られたデータをウシゲノムUMD3.1にアライメントし変異情報を検出するパイプラインを構築した。ウシMHCのハプロタイプ推定を行うにあたり、当初の計画であった500頭を大きく超える844頭のゲノムDNAを収集し、さらに、NGSシステムを用いる事により、より広範なアリル情報に基づいてハプロタイプを推定する事に成功した。抵抗性・感受性アリルを含むハプロタイプを計11種類収集し、その中の3種類は既にターゲットリシークエンスも実施したことから、当初の計画以上の進展を見せたと言える。これまで、ウシMHC(BoLA)領域と疾患感受性の個体差の相関性を解析するために、BoLA全体、約6M塩基対をターゲットにしてプローブを設定し、ターゲットリシークエンスを行ってきた。一方、BoLA領域は非常に多型に富み、重複遺伝子も多く存在する事から、リード長の長いMiseqによるシークエンスを行うが、十分なシークエンス深度を得るためには、コストが莫大になってしまうという欠点があった。

そこで、本年度は、多検体のシークエンスを行うために、シークエンス領域をよりコンパクトにすることを目的として、牛白血病ウイルス(BLV)感染前およびBLV感染後のMHC領域内の遺伝子発現をRNA-seqによって解析する事で、各遺伝子の発現の有無の調査を行った。PCR-Sequence Based Typing法を用いてウシ主要組織適合遺伝子複合体(BoLA)-DRB3、BoLA-DQA1を、SNP1およびSNP2をタイピングし、牛白血病プロウイルス量を増加させるアレルであるBoLA-DRB3*1601:DQA1*12011:SNP1*A、SNP2*Aをホモで有する黒毛和種5頭について、BLV感染牛由来白血球を静脈内注射して感染させ、そのプロウイルス量の増加をCoCoMo-qPCR法で測定し、全ウシ遺伝子のmRNAの発現を次世代シークエンサーを用いて解析した。BLVと相関するMHC領域をより効率的に検出するため、RNA seqをもちいて発現解析を行い、重要と思われる遺伝子領域の推定を可能とした。本成果に基づき現在プローブを設計中で有り、この課題の目標達成に大きく近づいたと考えられる。本研究では、疾患との関連性が指摘されているウシ主要組織適合抗原(BoLA)クラスIIを含むBoLA全領域の次世代シークエンサーによる遺伝子解析法を開発し、これまで指摘されてきた疾患とBoLAとの相関性について、より正確に絞り込むことを可能とする事を目的として実施した。最終年度は、国内のウシのBoLA-DRB3タイピングを行い、異なるハプロタイプを有する個体10頭(DRB3*12:01/14:01, *14:01/*16:01, *16:01/*16:01, *05:03/*12:01, *02:01/*15:01, *07:01/*10:01, *07:01/*09:02, *07:01/*14:01, *11:01/*12:01,*10:01/*11:01)を選抜した。次に、次世代シークエンサーを用いてBoLA領域のターゲット・リシークエンスを実施するために、リファレンスとなるウシゲノムシークエンスとして2018年に新たに報告されたARS-UCD1.2と2004年から用いられているUMD3.1の比較を行った。さらに、BoLA領域全長をカバーするプローブ設計を、遺伝子領域のみ、あるいは遺伝子のない領域も含む全領域の二種類について行い、そのタイピング効率を比較した。最終的にBoLA領域内の疾患関連SNPを見いだすために用いる最適なターゲットリシークエンス法として、リファレンスゲノムはARS-UCD1.2を用い、遺伝子のない領域も含めた、ウシ23番染色体6.98Mbase-7.59および25.40Mbase-28.96Mbaseの領域に設定したプローブを選定した。これらのプローブを用いたターゲットリシークエンスを、10種類の遺伝子型を有する個体を用いて実施し、10頭でx70x148倍と、十分なシークエンス深度が得られた。また、得られたシークエンス情報と、サンガー法によるBoLA-DRB3遺伝子の塩基配列を比較したところ、全ての固体について正確にSNPがタイピングできていたことが確認され、本方法がBoLA領域内の疾患関連SNPの探索に適している事が示された。本年度で実施したNGSによるターゲットリシークエンス手法を、既に見つかった残りの8種類のハプロタイプに関しても実施し、その変異解析を実施する。また、ウシゲノムの収集は継続し、新たな感受性・抵抗性アリルを有するハプロタイプが検出されれば、それらについても解析する。BLV感染にともない発現変動するMHC遺伝子や、感染前および感染後に発現しているMHC遺伝子の情報をもとに、MHC領域の中で、特に重要な領域を絞り込み、相関解析を実施するためにもっとも有用なプローブセットを構築する。
膠原繊維を考慮した皮下組織の３次元力学構造の解明と高感度柔軟触覚センサへの応用

本研究は,サル指標本の観察から皮下組織の膠原繊維の分布を3次元的に明らかにし,立体構造を求め,その力学的構造原理を明らかにし,さらにその原理を基に,皮下組織に分布するパチニ小体を反映した柔軟で高感度な触覚センサを開発することを目的としている.本年度は,3次元的構造理解を深めるために,マイクロCTによる撮影方法を再検討し,詳細なサル指内部構造の3次元構築を行い解析した.昨年度まで,サル指に対して,マイクロCTによる内部撮影と膠原繊維を特定可能な連続切片標本を用いた3次元把握を行なっていたが,詳細かつ正確な構造理解までには至っていなかった.そこで本年度は,マイクロCTによる撮影方法について再検討し,指全体をヨードで染色する方法を試みた.その結果,マイクロCT画像について,脂肪や膠原繊維などの内部組織に関するコントラストを向上させることができ,画像解析ソフトを用いて内部構造の3次元構築を行うことができた.特に,切片標本との比較も行い,ヨード染色により特定される組織を確認し,また,構造的特徴から、内部組織の中でも,表皮,骨,血管,脂肪組織の構築を行った.その結果,指先や指表面には脂肪組織がほとんど存在しないが,末節骨の周辺には脂肪組織が多数存在していること,指の深部(末節骨の下部)には大きな脂肪組織の塊が多く存在する傾向にあることがわかった.指の表皮付近から末節骨付近の間では,脂肪組織の割合が増加し,膠原線維の割合は減少していく傾向があり,指先の皮膚変形における非線形性との関連が考察された.これらの知見を基に,昨年度開発した触覚センサを改良すればさらなる感度向上が期待される.本研究は,サル指標本の観察から皮下組織の膠原繊維の分布を3次元的に明らかにし,立体構造を求め,その力学的構造原理を明らかにし,さらにその原理を基に,皮下組織に分布するパチニ小体を反映した柔軟で高感度な触覚センサを開発することを目的とする.本年度は,サル指の連続断面切片の顕微鏡画像およびマイクロCT画像を元にした皮下組織構造の3次元的把握と構築,知見を元にした触覚センサの構造のモデル解析と試作を行った.連続断面切片では,アザン染色により膠原繊維を特定し,また,マイクロCTではコントラストから,画像処理により脂肪組織,パチニ小体の3次元分布を求め,皮下組織の3次元構造の把握と構築を試みている.特に体積の範囲や集合の仕方に注目し解析を行っている.触覚センサでは,膠原繊維が表層側から末節骨に向かって分布している観察結果を元に,表層側から深い位置にあるセンサ素子部分に向かって樹脂で模擬した繊維が集約するような構造を準備し,これを柔軟な弾性体に埋め込んだモデルを試作した.有限要素法によるモデル解析も並行し,その結果では,均一なモデルと比べ,繊維構造を埋め込んだモデルが,高周波の振動に対し,良好に反映する傾向を示すことが確認できた.3Dプリンターを用いて繊維を製作し,歪みゲージをセンサ素子として貼り付け,これをウレタンゲルに埋め込んだ試作した実モデルにおいても,比較用に製作した均一な実モデルと比較すると,繊維を加えることで,高周波の振動が深い位置まで伝達し,大きなセンサ出力を得られることが確認できた.当初の計画のように,顕微鏡画像とマイクロCT画像の両面から3次元構造把握の検討が進められており,また,知見を元にした触覚センサの試作も進み,良好な結果を得られ基本的方向性が見出せていることから,おおむね順調に進展している.本研究は,サル指標本の観察から皮下組織の膠原繊維の分布を3次元的に明らかにし,立体構造を求め,その力学的構造原理を明らかにし,さらにその原理を基に,皮下組織に分布するパチニ小体を反映した柔軟で高感度な触覚センサを開発することを目的としている.本年度は,3次元的構造理解を深めるために,マイクロCTによる撮影方法を再検討し,詳細なサル指内部構造の3次元構築を行い解析した.昨年度まで,サル指に対して,マイクロCTによる内部撮影と膠原繊維を特定可能な連続切片標本を用いた3次元把握を行なっていたが,詳細かつ正確な構造理解までには至っていなかった.そこで本年度は,マイクロCTによる撮影方法について再検討し,指全体をヨードで染色する方法を試みた.その結果,マイクロCT画像について,脂肪や膠原繊維などの内部組織に関するコントラストを向上させることができ,画像解析ソフトを用いて内部構造の3次元構築を行うことができた.特に,切片標本との比較も行い,ヨード染色により特定される組織を確認し,また,構造的特徴から、内部組織の中でも,表皮,骨,血管,脂肪組織の構築を行った.その結果,指先や指表面には脂肪組織がほとんど存在しないが,末節骨の周辺には脂肪組織が多数存在していること,指の深部(末節骨の下部)には大きな脂肪組織の塊が多く存在する傾向にあることがわかった.指の表皮付近から末節骨付近の間では,脂肪組織の割合が増加し,膠原線維の割合は減少していく傾向があり,指先の皮膚変形における非線形性との関連が考察された.これらの知見を基に,昨年度開発した触覚センサを改良すればさらなる感度向上が期待される.3次元立体構築をさらに進め,体積の範囲や集合の仕方を詳細に分析することで,モデル構築と力学的効果を明らかにする.触覚センサについては,平成29年度の試作および有限要素法解析を発展させ,繊維構造の形状や物性値の調整により,柔軟性などの構造的特徴と時空間的感度を設計可能にする.解析用ソフトに必要な経費が抑えられたため,次年度使用額が生じた.

一方で,触覚センサの試作が進んでおり,当初の予定より実モデルを多く製作することで,有限要素法モデルの改善やよりセンサの応用範囲を広げることが期待できるため,この材料費や電子部品費に計上する.
心房細動モデルを用いた心房筋におけるチャネル分子背景の加齢性変化の解析

心房細動は加齢と共に発症率が上がる最も頻度の高い不整脈であり、脳梗塞や心筋梗塞等のリスク要因になるため臨床的に非常に重大な疾患である。本研究では心房細動誘発モデルを作製しその有用性及び心房細動の分子機序を、電気生理学的及び分子生物学的手法を用いて検討した。この結果、経食道頻回刺激により老齢ほど心房細動モデルを作製しやすく、分子レベルではヒトと共通する発症メカニズムを持っていること、さらに心房に加齢依存的に発現しているIKAChチャネルが心房細動の発生に大きく関与していることが明らかになった。また心房細動の持続に重要であるとされるギャップ結合は、本モデルにおいては関与が小さいことが示唆された。心房細動は加齢とともに発生率が上がる代表的な不整脈であり脳梗塞、心筋梗塞等の様々な病態のリスク要因である。しかしながらその発症機序の詳細は未だに不明な点が多く、その一因として小型実験動物を用いた心房細動モデル動物が作成しにくい点にある。本研究は実験動物として広く普及するラットを用いて心房細動を誘導し、その際に加齢性に発現量に変化が見られるチャネル分子を中心にその分布と心電図との対応関係を解析することによって心房細動の発症機序を分子レベルで理解することを目的としている。前年度は経食道電極を用いての頻回刺激により作製した心房細動モデルラットの有用性を検討した。この結果、ヒトの心房細動と共通する発症メカニズムを持っており老齢動物において心房細動が起きやすい器質があることが示唆された。本年度は、前年度で得られた心房におけるカリウムチャネル発現の結果をもとに、加齢に伴う発現量の変化が個体レベルで心房細動の発生にどのように関わっているのかを検討するため、心房細動誘発ラットにおいて薬理学的方法論による心房細動誘発の抑制における効果を検討した。その結果、心房に加齢依存的に発現しているIKAChチャネルの特異的遮断薬であるテルチアピンは濃度依存性に心房細動の誘発を抑制することが明らかになった。これに対し、IKurチャネルの特異的遮断薬DPO-1は抑制作用がみられなかった。このことから頻回刺激心房細動モデルラットにおいてIKAchが心房細動の発生に深く関与している可能性が示唆された。また、老齢群においてもテルチアピンが若齢群と同様の遮断効果をもたらした。今後加齢に伴うIKAchのチャネル特性の変化についてより詳細な研究が必要であることが重要であり、これらの成果は心房細動の機序解明のための大きな一歩になると考えられる。心房細動は加齢性に依存して発生率が上がる代表的な不整脈であり二次的に脳梗塞や心筋梗塞等を引き起こすことが多いため、臨床的に非常に重要な疾患である。しかしながらその発症機序の詳細は多くの点で明らかになっていない。このため、小型実験モデル動物を用いた研究が待ち望まれている。本研究はラットを用いて心房細動を誘導し、その際に加齢性に発現量に変化が見られるチャネル分子を中心にその分布と心電図との対応関係を解析することによって心房細動の発症機序を分子レベルで理解することを目的としている。これまで、経食道電極を用いての頻回刺激により作製した心房細動モデルラットの有用性を検討し、この動物モデルがヒトの心房細動と共通する発症メカニズムを持っており老齢動物において心房細動が起きやすい器質があること、さらに心房に加齢依存的に発現しているIKAChチャネルが心房細動の発生に大きく関与している可能性が示唆された。本年度はIKAChチャネルの薬理作用の検討を終えた後、心房細動発症のもう一つの重要なファクターと考えられているギャップ結合が関与する可能性を検討した。心房に発現しているコネキシン40、43、45はギャップ結合を構成するが、この発現量を解析したところコネキシン43のみ加齢依存性に減少することが明らかになった。しかしながらギャップ結合を特異的に阻害するカルベノキソロンを静脈内投与した後に経食道頻回刺激を行って心房細動を誘発したところ、その発症率及び持続時間に全く影響を与えなかった。これらのことから、心房細動を誘発するとされるリエントリーと呼ばれる興奮旋回は、本モデルにおいてはギャップ結合とは別の機構で起こっていることが示唆された。この結果は学術論文に投稿中である。現在行っている心房細動と糖尿病との関連の検討を含め、これらの成果は心房細動の機序解明に大きく役立ち、将来的に臨床応用への可能性を拓くものと考えられる。心房細動は加齢に伴って発生率が上がる代表的な不整脈であり心不全のみならず脳梗塞等の様々な病態のリスク要因となり得る。しかしながらその発症機序の詳細は不明である。

本研究は実験動物として広く普及するラットを用いて心房細動を誘導し、その際に加齢性に発現量に変化が見られるチャネル分子を中心にその分布と心電図との対応関係を解析することによって不整脈の発症機序を分子レベルで理解することを目的としている。本年度は経食道電極カテーテルを用いて頻回刺激を行うことによって心房細動モデルラットを作製しこの心房細動の性質を検討した。この結果、老齢ラットは若齢ラットに比べ心房細動の誘発率が高くその持続時間も有意に長かった。またアミオダロンによって心房細動の誘発は濃度依存的に抑制された。これらの結果から経食道カテーテル刺激法によって引き起こされる心房細動はヒトの心房細動と共通する発症メカニズムを持っており老齢動物において心房細動が起きやすい器質があることが示唆された。次に不整脈発生の大きな要因である活動電位再分極過程の延長に関与すると考えられる各種のカリウムチャネルの発現量解析を行った。この結果、IKr、IKs、Itoチャネルに関しては老齢ラットと若齢ラットとの間で有意な差が観察されなかった。また心房に特異的に発現するIKurも老齢ラットと若齢ラットにおける差は見られず、他の遅延整流性カリウムチャネルと比較して発現量がわずかにしか見られなかったことから、ラット心房の活動電位再分極相において寄与が少ないことが示唆された。これに対してIKAChは老齢ラット右心房では増加し、老齢ラット左心房では減少していたことから、心房細動を始めとする加齢性の不整脈発症に関与していることが示唆された。モデル動物の有用性と加齢に伴う特徴を明らかにしたこれらの成果は心房細動の機序解明のための大きな一歩になると考えられる。本年度の研究も予定をおおむね達成したと考えられる。この理由として、前年度に達成したこと、すなわち1経食道カテーテル法によって誘発されたラット心房細動の性質を明らかにし2心房内に特異的に発現するIKurやIKAChを中心とした発現解析で得られた結果を踏まえた上で、本年度は3薬理学的方法論を用いた心房細動の制御を目標としたことがほぼ達成されたからである。具体的には、加齢依存性に心房に発現するIKAChの特異的阻害薬であるテルチアピンによる心房細動の抑制効果が濃度依存的に観察されたこと、また老齢ラットにおいても若齢と同様の抑制効果が観察されたこと、さらには心房のみに発現するIKurの特異的阻害薬であるDPO-1の効果が見られなかったことから、心房細動の誘発にはIKAChが強く関与していることが示唆された。現在は4病態モデルを用いた解析も始めており、一例として心房細動の発症率と正の相関を示す糖尿病が与える影響を調べるため、糖尿病モデルラットを作製してその機序に関する検討を行っている最中である。本年度の研究は予定をおおむね達成したと考えられる。この理由として申請時の本年度研究計画として、(1)ラットにおいて誘発される心房細動の詳細な検討、(2)加齢に伴う不整脈基盤の検討、(3)薬理学的方法論を用いた心房細動の制御を目標としたが、(1)、(2)に関しては経食道カテーテル法によって誘発された心房細動の性質、及び活動電位再分極過程に関与する各種カリウムチャネル、特に心房内に特異的に発現するIKur、IKAChを中心としてその発現量を解析したことによってほぼ達成されたことによる。
ジステンパーウイルスの宿主決定機関に関する研究

本研究の目的はイヌジステンパーウイルス(CDV)の種特異性を規定する機構の解明、及び近年の宿主域拡大と流行の原因を解明することである。近年、これまでワクチンでコントロールされてきたCDV感染が世界的に増加してきている。我々はこれまでCDV感染犬から多くのCDVを野外分離を行いその性状を血清学的、免疫学的、遺伝学的に検討してきた。Haemagglutinin蛋白質の遣伝子解析では、近年の流行株では糖鎖修飾可能部位が増加していること、H遺伝子のrestriction fragment length polymorphism解析からワクチン株や旧型株とは異なる新型株に属することが明らかになった。また、モノクローナル抗体を用いた交差試験により、流行株ではH蛋白の中和エピトープの少なくとも一つが変異していると考えられた。次に分離した野外株の一つであるY荷a株の全塩基配列を決定して、CDVでのリバースジェネッティクス系の開発を行い、組み換えCDVの回収に成功した。用いたCDV発現プラスミドには、各遺伝子間に特異的な制限酵素認識配列を導入してあり、将来的に構成蛋白遣伝子の欠如や組み換えに使用でき、組み換えCDVを用いた研究が可能になった。野生動物における疫学調査では、血清学的な研究で日本近海に生息する海棲哺乳類でモービリウイルスの感染があることを示した。また近年カスピ海でのアザラシの大量死の原因がモービリウイルス感染であったことを示唆した。日本の野生タヌキからウイルスの分離に成功し、血清学的な調査とともに遣伝子解析も行うことができた。H蛋白のアミノ酸配列の解析では、近年イヌから分離された野外株と4個だけ異なっていたため、イヌからの伝播が示唆された。近年の野外分離株3株について、ワクチン株(Onderstepoort株)を対照としてH蛋白およびF蛋白解析を行った。H蛋白の分子量はOnderstepoort株が78kDa、野外株は84kDaと異なったが、糖鎖付加を阻止すると、全株とも68kDaを示した。アミノ酸配列解析では、N-linkの糖鎖付加可能部位がOnderstepoort株では4ヶ所、野外株は9ヶ所であった。一方、F蛋白の分子量は、Onderstepport株と野生株の間に顕著な差はみられず、アミノ酸配列解析では、機能部位は全て保存されていた。以上の結果から、H蛋白性状の異なるCDVの存在が示唆された。さらに、他のCDV株との遺伝的距離を比較したところ、日本で分離した3株間の相同性は高く1つの群を形成し、日本の野外株と外国の野外株との相同性も高く、これらの野外株は1つの大きな群を形成した。しかし、全野外株とワクチン株との相同性は低く別の群を形成したことから、ワクチン株とは異なる野外株の世界的な流行が示唆された。抗H蛋白モノクローナル抗体(MAb)を用いて各ウイルス株との反応性を検討した。1977年の野外株を免疫原として、ワクチン株に対する中和活性を指標に作製されたMAb7種から、免疫沈降法によりH蛋白を認識するものを3種同定した(JD-5、JD-7、JD-11)。これらの抗体と従来の抗H蛋白MAb1種(d-7)を用いて、ワクチン株および近年の野外株との反応性を比較した。d-7、JD-5、JD-11は蛍光抗体法、免疫沈降法および中和活性において全ての株とよく反応したが、JD-7はワクチン株と高く、野外株とは低い反応性を示した。この結果は、近年の野外株において、H蛋白のJD-7認識部位に変異が起こっている可能性を示唆している。また、H蛋白遺伝子の欠損クローンを作製し、抗H蛋白MAbの抗原認識部位を検索した。

JD-5およびJD-7は反応性が低く抗原部位の検索は出来なかったが、d-7およびJD-11はH蛋白全長遺伝子の発現系とは強く反応し、欠損クローンのそれとは反応しなかった。この結果から、この2種のMAbはH蛋白遺伝子の1609ー1836番目か、またはこの部分を必要とする高次構造によって表れる部位を認識していると考えられた。本研究の目的はイヌジステンパーウイルス(CDV)を月いて種特異性を規定する機構の解明、および近年の宿主域拡大と流行の原因を解明することである。本年度は以下の成果を得た。(1)野生動物での血清疫学調査を行った結果、海生哺乳類では、日本近海の鰭足類では現在でも1割程度の抗体陽性率を認めたが抗体価の低下から流行は起こっていないと推定された。バイカル湖、カスピ海のアザラシでも陽性を認め、これら地域でも流行のあったことを明らかにした。また日本の野生タヌキでの発症例からウイルスの分離に成功し、そのウイルスの蛋白および遺伝子の性状解析を行った結果、犬での野外流行のCDV株の感染であることを証明し、さらにその由来を考祭した。(2)転写・複製機構および各遺伝子の機能を解明する目的で、リバースジェネティックスの開発を行っている。本年度は、ミニジェノム系の開発を進め、リーダー、トレーラーを同定し、それらとともにルシフェラーゼ遺伝子をT7のプロモーターの下流に挿入したプラスミドを構築した。また必須のN.P,L遺伝子をクローニングし、その発現プラスミドも構築した。これら遺伝子は塩基配列を決定し、その性状解析を行った。さらに、未解明であったCDV野外株のM遺伝子の配列も決定し、これによりCDV野外株の全塩基配列(約15kbp)の決定を終えた。また、将来的に構造遺伝子の可変が可能なように、各構造遺伝子間に特異的な制限酵素認識配列を人為的に構築し、全ゲノム遺伝子をプラスミドに構築することに成功した。これによって、リバースジェネティックスの完成は間近となったので、次年度はこれを完成させ、転写・複製に重要な役割を果たす遺伝子部分の同定や種特異性に関与するウイルス構造遺伝子の同定を行う予定である。本研究の目的はイヌジステンパーウイルス(CDV)を用いた種特異性を規定する機構の解明、および近年の宿主域拡大と流行の原因の解明をすることである。(1)CDVの流行において全ての流行株が新型のウイルス株に変異したのか否か,またワクチン接種の直後に発症した個体において原因ウイルスがワクチン株の病原性復帰であるか新型ウイルスが新たに感染したことによるのかは重要な問題である。そこでこの問題に答えかつ流行ウイルスの分布状況を簡便に調査するために,制限酵素切断パターンの多型性による診断法(Restriction fragment length polymorphism;RFLP)を開発した。(2)CDVの新型流行株のH遺伝子上に糖鎖付加可能部位がワクチン株では4ヶ所であるのに対し,9ヶ所に増加していることを示していた。H遺伝子に変異を導入することによって実際の糖鎖付加部位を解析したところ、2,3,4,5,6番目で糖鎖修飾がなされており、そのうち3番目の糖鎖はやや性状の異なる可能性が示唆された。(3)さらに、野生動物への伝播状況を把握するための海棲および陸棲哺乳類の血清疫学調査も継続して行った。
精神分裂病の記憶障害の統合的解析―事象関連電位と認知心理・自覚症状に注目して―

本研究は、統合失調症(精神分裂病)の記憶機能に注目し、これが統合失調症の病態といかなる関わりがあるかを明らかにするために行った。報告者の研究により統合失調症では、記憶や言語機能を反映する事象関連電位反復効果に異常があることが見いだされているが、今回は特にこの反復効果が、統合失調症に特徴的である思考障害の基盤にある認知神経異常として現れると考え実験を行った。対象は、健常対照者10名、統合失調症患者19名で、患者はDSM-IVの基準を満たし、検査時には寛解期にあった。いずれの被検者に対しても研究について書面でのインフォームドコンセント行った。思考障害の評価にはホルツマンらの思考障害評価尺度を用いた。統合失調症患者は、この尺度に基づき思考障害群9名と非思考障害群10名に分けられた。反復効果課題施行中の事象関連電位が測定された。刺激は、かな二文字からなる単語で、標的は動物を意味する単語、非標的はそれ以外の単語を用いた。非標的の半分は初回提示の後に反復され、その半分は直後に反復される直後反復で、残り半分は平均5単語おいて反復される遅延反復であった。思考障害群では、有効な反復効果は認められず効果の大きさは刺激提示後300-500ミリ秒の平均振幅で健常群と比べ有意に減弱した。非思考障害群は部分的に反復効果を認め、効果の大きさは健常者と思考障害群との中間であった。反復効果の頭皮分布は、思考障害群では健常群や非思考障害群で認められる正中有意の分布を示さなかった。反復効果は、記憶や言語などの認知機能と関わりが深いことが知られており、特に刺激提示後400ミリ秒近辺の電位はN400成分と関わりが深いことが知られている。本研究の結果、思考障害を有する統合失調症患者では、N400の調整機構が障害されており、記憶や言語と関わる認知機能が思考障害の基盤にある可能性が指摘される。本研究は、精神分裂病の記憶機能に関して生理学的、認知心理学的、自覚的症状指標とを組み合わせ統合的な解析を行うものである。本年度は、まず健常者を対象に記憶に関わる事象関連電位指標を用いた二つの実験を行った。実験1:同意の得られた健常対象者12名を対象に事象関連電位の測定を行った。実験は、漢字とかなの文字刺激を比較するもので、事象関連電位の単語反復効果への影響を評価した。実験の結果、かなは漢字より陰性の電位を表し、直後反復の早期成分では、かなの方が漢字よりも反復効果が大きかった。これはかなと漢字の違いが反復効果に影響したものと解釈された。実験2:反復効果に対する刺激の提示時間の影響を見るために、同意の得られた健常対象者12名を対象に150ms、300ms、600ms、の3つの提示時間での比較を行った。結果、提示時間が延長するにしたがい、反復効果が減弱することが分かった。これは提示する刺激が反復効果に干渉するためと考えられた。また、精神分裂病者に対しては予備的な実験を行っている段階であるが、現在以下の実験を行っている。実験3:精神分裂病患者に対して、(1)記憶評価のためのバッテリーテスト(想起・再認記憶評価、潜在・顕小記憶評価、ウィスコンシン・カード・ソーティング・テスト等を含む)の施行と、(2)Bonn大学基底症状尺度の施行、(3)一般的な精神症状評価(簡易症状評価尺度、陽性・陰性症状評価尺度)や知能検査等の施行を行い、症例を増やしているところである。

本研究の結果、思考障害を有する統合失調症患者では、N400の調整機構が障害されており、記憶や言語と関わる認知機能が思考障害の基盤にある可能性が指摘される。
顆粒球・マクロファージの機能分化の機構とその異常に関する基礎的・臨床的研究

正常ヒト末梢血顆粒球を用いて、スーパーオキサイド(【O(_2^ー)】)産生、細胞膜電位変化(脱分極)及び細胞内遊離【Ca^(2+)】濃度に及ぼすリコンビナントヒト顆粒球コロニー刺激因子(γhG-CSF)の影響を検討した。あわせて、骨髄異形成症候群(MDS)患者末梢血顆粒球の【O(_2^ー)】産生能を検討し、また、【O(_2^ー)】産生に及ぼすγhG-CSFの影響を検討した。代謝誘導物質として、遊走因子N-ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン(FMLP)を用いた。これらの実験から以下の事項を明らかにすることができた。1、γhG-CSFは、顆粒球に直接作用して細胞内【Ca^(2+)】を一過性に上昇させた。しかし、【O(_2^_)】産生及び膜電位変化を誘導することはできなかった。最大活性は25ng/mlであった。2、顆粒球をγhG-CSFで前処理すると、FMLPにより誘導される【O(_2^ー)】産生及び膜電位変化は、それぞれ2-3倍及び1.5倍強くなった。37°C、5-10分の前処理でほぼ最大の効果が認められ、また、25ng/mlγhG-CSFで最大活性が認められた。これらの実験結果から、γhG-CSFは、細胞内遊離【Ca^(2+)】濃度を一過性に上昇させ、【Ca^(2+)】依存性の細胞内代謝変化を介して、顆粒球機能を亢進させると考えられた。3、MDS患者11例について【O(_2^ー)】産生能を検討すると、7例で低下が認められ、2例は正常範囲内であり、2例ではむしろ亢進していた。更に、γhG-CSFによる【O(_2^ー)】産生の増強効果を検討すると、9例で有意の増強が認められたが、【O(_2^ー)】産生能の低下が認められた2例では、γhG-CSFによる増強が認められなかった。これらの実験結果から、顆粒球機能の点からみると、MDSの病態は様々であると考えられた。また、多くの症例でγhG-CSFによる顆粒球機能の亢進作用が認められた。このことは、顆粒球機能低下により易感染傾向を示すMDS患者に対する臨床応用の可能性を示唆するものである。
骨髄由来抑制細胞を利用した自己免疫疾患の新規治療

MDSC (myeloid-derived suppressor cell)は単球と好中球の表現型を持つ免疫抑制性の細胞集団である。申請者はMDSCがSKG関節炎マウスにおいて関節炎を抑制することを見出した。マウス骨髄細胞を取り出すと、ほとんどがMDSCである。これにGM-CSFを添加すると樹状細胞へ分化する。分化する前のMDSCは免疫抑制的であるが、分化した樹状細胞はT細胞を刺激する炎症性樹状細胞である。従ってMDSCが炎症性樹状細胞に分化しないように制御することは免疫治療につながると考えた。申請者は細胞の代謝制御に着目し様々な代謝制御剤を用いて、下記を明らかにした。a.骨髄MDSCはGM-CSF存在下で培養すると樹状細胞に分化し、T細胞を活性化する。代謝を制御する薬剤を添加して、MDSCから樹状細胞への分化と機能への影響をFACSで検討した。特にmTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤に着目して検討した。b.mTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤存在下では、MDSCは樹状細胞への分化が抑制された。GM-CSFで培養後の細胞はT細胞を刺激したが、両者存在下で培養した細胞はT細胞刺激能が落ちていた。この理由としてPD-L1の上昇、TGFの増加などが考えられた。両者を併用すると相乗効果が認められ、よりMDSCが増えた。さらにmTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤はT細胞増殖を抑制し、相乗効果を認めた。またmTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤はTH17細胞への分化を抑制した。c.生体内での効果を検討するために、上記2剤を関節炎モデルマウスに投与したところ、単剤でも関節炎抑制効果が認められたが、併用療法でさらに関節炎を抑制した。両者を投与すると脾臓のTH17細胞数を著明に減らした。またGlutamine代謝阻害剤は脾臓におけるMDSCを有意に減少させた。mTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤がMDSCから樹状細胞への分化を抑制することを明らかにした。さらに両者を関節炎モデルマウスに投与すると関節炎抑制効果を認めた。これまでに得られた結果からは代謝拮抗剤(調節剤)により免疫病態を改善できることを示している。今後の検討課題は、代謝制御がT細胞を含めた免疫細胞に及ぼす影響を分子レベルで解析すること、膠原病患者での免疫細胞での代謝を解析すること、である。マウス骨髄細胞を取り出すと、ほとんどがMDSCの表現型である。これにGM-CSFを添加すると樹状細胞へと分化する。分化制御に関わる因子として細胞の代謝の制御に注目した。現在までに、代謝制御剤を用いて、下記のことを明らかにした。a.骨髄MDSCはGM-CSF存在下で培養すると樹状細胞に分化し、T細胞を活性化するようになる。どのような代謝経路が樹状細胞分化に必要であり、MDSCの維持に必要かを明らかにするために、解糖系、グルタミノリシス、酸化的リン酸化、mTOR系、AMPKなどを制御する薬剤を添加して、MDSCから樹状細胞への分化(CD11bとCD11c)と機能(CD80/86、PDL-1、など)への影響をFACSで検討した。mTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤に注目して検討した。b.mTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤存在下で、MDSCは樹状細胞への分化が抑制された。加えて、両者を併用すると相乗効果が認められ、よりMDSCが増えることが見出された。またmTOR阻害剤存在下で培養したMDSCはT細胞増殖を抑制した。この理由としてPDL-1の上昇、TGFβの増加などが考えられた。c.生体内での効果を検討するために、mTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤を関節炎モデルマウスに投与したところ、単剤でも関節炎抑制効果が認められたが、併用療法でさらに関節炎を抑制した。MDSC(myeloid-derived suppressor cell)は単球と好中球の表現型を持つ免疫抑制性の細胞集団である。マウス骨髄細胞はほとんどがMDSCである。申請者は細胞の代謝制御に注目し様々な代謝制御剤を用いて、下記のことを明らかにした。

特にmTOR阻害剤とGlutamnine代謝阻害剤に注目して検討した。b.mTOR阻害剤とGlutamnine代謝阻害剤存在下ではMDSCは樹状細胞への分化が抑制された。GM-CSFで培養後の細胞はT細胞を刺激したが、両者存在下で培養した細胞はT細胞刺激能が落ちていた。この理由としてPD-L1の上昇、TGFの増加などが考えられた。両者を併用すると、相乗効果が認められ、よりMDSCが増えた。さらにmTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤はT細胞増殖を抑制し、相乗効果を認めた。またmTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤は、TH17細胞への分化を抑制した。c.生体内での効果を検討するために、上記2剤を関節炎モデルマウスに投与したところ、単剤でも関節炎抑制効果が認められたが、併用療法で完全に関節炎を抑制した。両者を投与すると脾臓のTH17細胞数を著明に減らした。またGlutamine代謝阻害剤は脾臓におけるMDSCを有意に減少させた。mTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤がMDSCから樹状細胞への分化を抑制することを明らかにした。さらに両者を関節炎モデルマウスに投与すると関節炎抑制効果を認めた。MDSC (myeloid-derived suppressor cell)は単球と好中球の表現型を持つ免疫抑制性の細胞集団である。申請者はMDSCがSKG関節炎マウスにおいて関節炎を抑制することを見出した。マウス骨髄細胞を取り出すと、ほとんどがMDSCである。これにGM-CSFを添加すると樹状細胞へ分化する。分化する前のMDSCは免疫抑制的であるが、分化した樹状細胞はT細胞を刺激する炎症性樹状細胞である。従ってMDSCが炎症性樹状細胞に分化しないように制御することは免疫治療につながると考えた。申請者は細胞の代謝制御に着目し様々な代謝制御剤を用いて、下記を明らかにした。a.骨髄MDSCはGM-CSF存在下で培養すると樹状細胞に分化し、T細胞を活性化する。代謝を制御する薬剤を添加して、MDSCから樹状細胞への分化と機能への影響をFACSで検討した。特にmTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤に着目して検討した。b.mTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤存在下では、MDSCは樹状細胞への分化が抑制された。両者を併用すると相乗効果が認められ、よりMDSCが増えた。またmTOR阻害剤とGlutamine代謝阻害剤はTH17細胞への分化を抑制した。c.生体内での効果を検討するために、上記2剤を関節炎モデルマウスに投与したところ、単剤でも関節炎抑制効果が認められたが、併用療法でさらに関節炎を抑制した。
一酸化窒素による細胞内微量元素分布の変動が肝細胞がん増殖に与える影響に関する研究

消化器由来の培養細胞として、ラット正常胃粘膜由来のRGM-1と、ヒト胃がん由来のMKN-45を用いた。1)各群の細胞数の倍加時間を測定し、一定時間でのBrdUの取り込み量を生体蛍光顕微鏡と画像処理装置を組み合わせた装置で測定しDNA複製速度を比較したところ、正常胃粘膜細胞であるRGM-1と胃がん由来MKN-45細胞との間に有意な差を認めなかった。2)細胞内NO, ONOO-濃度をNO特異的蛍光指示薬DAF2DAおよび活性酸素種蛍光指示薬HPF/APFの組み合わせで得られる細胞の蛍光を上記測定装置によって計測したところ、胃がん細胞由来のMKN-45において、有意に双方の蛍光強度の上昇を認めた。がん細胞において細胞内NO・ONOO-量が上昇していることが確認された。3)細胞内iNOS,SOD発現を抗iNOS,抗Zn/Cu-SODモノクローナル抗体で免疫組織学的に検討したところ、RGM-1ではともに発現が認められなかった。4)核におけるRibonuleotide Reductase(RNR)発現を抗RNRモノクローナル抗体で免疫組織学的染色し確認したが、両細胞間で明らかな差は認められなかった。核分画を抽出して同様の実験を行ったが、有意差を認めなかった。5)ヘマトヘミン-59Feを用い、細胞培養液中に存在する鉄の取り込み量がRGM-1細胞とMKN-45細胞で差があるのか検討したが、鉄取り込み量に有意差は認められなかった。本研究に先立ち、正常胃粘膜培養細胞系RGM-1に発がん物質MNNGを曝露することによって、がん様変異株RGK-1の樹立に成功した(特願2005-22954)。同株はRGM-1に備えられない腫瘍形成能、非足場依存性、移動能を有する株である。本年度はこのがん・正常間の比較検討が可能なRGM-1/RGK-1を用いて、細胞内の鉄の動態とNOとの関係を検討した。ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリンに^<59>Fe(II)をキレートし、放射性ヘマトヘミンならびにヘミンを作製した。これらの放射性其質を上述の細胞培養系に投与したところ、1)ヘミン、ヘマトヘミン双方でがん優位な取り込みを認め、2)さらに双方でがん細胞有意な排出の低下を認めた。排出に関して、ヘマトヘミンのほうが正常/がん比の乖離が大きかった。これらの細胞を低張液に曝露して破砕し、膜、細胞質、ミトコンドリア、核分画に単離し、液体シンチレーターで放射線量を測定したところ、がんでは核への取り込みが有意に高かった。また、正常で膜分画に放射性が見られ、脂溶性であるヘミンの非特異的付着を示唆すると考えられた。これらの結果は、がんの特異的鉄代謝=核に鉄を能動的に輸送することを示唆していた。細胞内NOおよび活性酸素を蛍光指示薬DAF2DAを用いて測定したところがんで双方が高値を示した。さらにNO供与体SNAPの投与はがんにおける細胞内の核特異的鉄取り込みを促進したが、正常では認められなかった。以上のことからがんでは特異的にNOによって鉄の細胞内分布が制御されている可能性が示唆された。