hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リンパ球の系列分岐・運命分岐を決定するシグナル伝達機構

胎仔肝臓中のT前駆細胞(p-T)とp-Bを細胞表面マーカーの1つpaired immunoglobulin-like receptor (PIR)を用いて分離精製することに成功した.このことによって,従来はMLPアッセイによる検出だけで定義していたp-T, p-B, p-M(これはすでにFcR^+分画に分離されていた)などの存在が確定的となった.とくに,最近では胸腺へ移行するのは共通リンパ球前駆細胞(CLPまたはp-TB)であると主張する発表があいついでいたのであるが,PIRによる分離の成功でp-Tの存在とp-Tの胸腺移行を実証することができた.一連の研究において,胸腺移行前のp-TはすべてNKおよびDCへの分化能を保存しているのに対して,p-Bはいずれへの分化能も持たない事も示された.さらに,胸腺へ移行したp-TはCD44^+CD25^<low>段階からCD44^<low>CD25^+の段階へ至る過程でNKへの分化能とDC産生能を失う事が明らかとなった.Tリンパ球の分化と選択に伴う細胞の移動機構を解析するため,胸腺器官内Tリンパ球移動を顕微鏡下で直接タイムラプス追跡する新規解析法を開発した.その結果,ケモカインのひとつCCL19が成熟Tリンパ球の胎仔胸腺移出をひきおこすことを見いだした.一方,CCL19受容体CCR7のノックアウトマウスでは,新生仔期の末梢T細胞供給数は著明に少なかった.しかし,成体CCR7ノックアウトマウスでの脾臓T細胞数は正常マウスを上回り,CCR7非依存性胸腺移出機構の存在も示された.また,正常マウス胸腺内でのCCL19は主に髄質内の血管内皮細胞や血管周囲間充織細胞に局在していた.以上の結果から,CCR7シグナルは新生仔胸腺からの成熟Tリンパ球の移出に必須であることが示された.また,CCR7リガンドは髄質の血管周辺に成熟Tリンパ球を誘引することで胸腺移出に関与することが示唆された.加えて,CCR7非依存性の胸腺移出機構の存在も示された.1個の前駆細胞からつくられたT細胞のTCR鎖の多様性を測定することにより,その前駆細胞がTCR鎖遺伝子の再構成開始までにどれくらい増殖できたかが推定できる.個々の胎仔胸腺細胞をdGuo処理FTと共培養し,αβT細胞およびγδT細胞の生成とTCRβとTCRγ遺伝子の再構成をしらべた.αβT細胞に特異的な前駆細胞(p-αβ)から生成したT細胞では多数のDJ再構成がみられ,再構成開始前に10-20個の前駆細胞がつくられることが明らかとなった.一方,p-γδ由来のクローンの多くは,あまり再構成前増殖を示さず,γδ系列への分化ではほとんど増殖を伴わないことが示された.さらに,より詳細な検討によりγδ系列への決定はαβ系列へ向かう分化のいろいろな段階で起こり得ること,およびそれぞれの方向への決定の進行はTCRの再構成の成否とは無関係であることも明らかになった.正と負の選択を起こすTCRからの信号がどのようにMKK1とMKK6の優先的活性化をもたらすのかを解析した.その結果,MKK6をリン酸化して活性化するMAPKKKのひとつASK1が負の選択における抗原レセプターシグナルに部分的に関与する一方,正の選択における抗原レセプターシグナルには関与しないことが明らかになった.幼若Tリンパ球の生死運命決定が,部分的にはRaf-1とASK1といったMAPKKKの優先的活性化によって分別されることが示され,Tリンパ球による自己・非自己識別の分子基盤のよりよき理解がもたらされた.また,Tリンパ球分化に伴う細胞移動の機構を解析するため,胸腺の器官形成や胸腺内での細胞移動を経時的に直接顕微鏡下で動画としてトレースする新規器官培養法の開発を始めた.胸腺へ移行するのはp-Tであるというわれわれの主張は,必ずしも多くの研究者の理解を得ているわけではない.HSC自身や,われわれが存在を否定しているT, B系列に共通の前駆細胞(p-TB)が移行すると主張する研究者も少なくないのである.そこで,胎仔血液中の前駆細胞についてしらべた.胎齢10.5日以後経時的にしらべた結果,血液中の前駆細胞のほとんとはp-Tであり,p-Bやp-Mはごく少数であった.また多能性を示す前駆細胞はほとんど検出されなかった.しかも,p-Tが血液中に出現するのは胎齢14日目までであり,胎仔肝臓内に存在していても血液にはほとんど移行しないことが明らかとなった.この結果は,以前フランスのグループが発表している胎仔期の胸腺へのT前駆細胞の移行は初期と1718日目の2回にわたるという結果の後半部分を否定するものである.さらに,胎齢10.5日目の胸腺原基周辺に検出される前駆細胞もp-Tであることが示され,p-Tが胸腺へ移行することは確定的となった.幼若Tリンパ球の正負選択における細胞生死の分岐シグナルを解析した結果,負の選択におけるアポトーシス誘導に必須の転写因子Nur77は,セリンスレオニンキナーゼAktによってリン酸化され、転写活性が抑えられることがわかった.

一方、AktはT細胞抗原受容体刺激により活性化され,正の選択を含むTリンパ球分化はPI3キナーゼ阻害剤により抑制された.これらの結果から,正と負の選択における生死運命分岐にAktによるNurr77のリン酸化という制御スイッチが存在することが示唆された.また,Tリンパ球の分化と選択に伴う細胞の位置認知と移動を解析するため,胸腺細胞の移動を経時的に直接顕微鏡下でトレースする新規器官培養法を関発した.この新手法を用いて胸腺にて成熟したTリンパ球の胸腺から末梢血への移出機構を解析した.その結果、ケモカインのひとつCCL19とその受容体CCR7を介したシグナルが新生仔期におけるTリンパ球の胸腺移出に必須の関与を示すことが明らかになった.また,CCR7欠損マウスでの胸腺移出の解析から、成体ではCCL19とCCR7には非依存性の胸腺移出機構も存在することが示された.胎仔肝臓中のT前駆細胞(p-T)とp-Bを細胞表面マーカーの1つpaired immunoglobulin-like receptor (PIR)を用いて分離精製することに成功した.このことによって,従来はMLPアッセイによる検出だけで定義していたp-T, p-B, p-M(これはすでにFcR^+分画に分離されていた)などの存在が確定的となった.とくに,最近では胸腺へ移行するのは共通リンパ球前駆細胞(CLPまたはp-TB)であると主張する発表があいついでいたのであるが,PIRによる分離の成功でp-Tの存在とp-Tの胸腺移行を実証することができた.一連の研究において,胸腺移行前のp-TはすべてNKおよびDCへの分化能を保存しているのに対して,p-Bはいずれへの分化能も持たない事も示された.さらに,胸腺へ移行したp-TはCD44^+CD25^<low>段階からCD44^<low>CD25^+の段階へ至る過程でNKへの分化能とDC産生能を失う事が明らかとなった.Tリンパ球の分化と選択に伴う細胞の移動機構を解析するため,胸腺器官内Tリンパ球移動を顕微鏡下で直接タイムラプス追跡する新規解析法を開発した.その結果,ケモカインのひとつCCL19が成熟Tリンパ球の胎仔胸腺移出をひきおこすことを見いだした.一方,CCL19受容体CCR7のノックアウトマウスでは,新生仔期の末梢T細胞供給数は著明に少なかった.しかし,成体CCR7ノックアウトマウスでの脾臓T細胞数は正常マウスを上回り,CCR7非依存性胸腺移出機構の存在も示された.また,正常マウス胸腺内でのCCL19は主に髄質内の血管内皮細胞や血管周囲間充織細胞に局在していた.以上の結果から,CCR7シグナルは新生仔胸腺からの成熟Tリンパ球の移出に必須であることが示された.また,CCR7リガンドは髄質の血管周辺に成熟Tリンパ球を誘引することで胸腺移出に関与することが示唆された.加えて,CCR7非依存性の胸腺移出機構の存在も示された.
脳腫瘍における遺伝子修復酵素変異と癌抑制遺伝子異常との関連

脳腫瘍患者における遺伝子修復酵素変異と癌抑制遺伝子異常との関連を検討するにあたり、まず遺伝子修復酵素であるO^6-メチルグアニンDNA-メチルトランスフェラーゼ(MGMT)の多型頻度を脳腫瘍患者白血球を用いて検討した。原発性脳腫瘍患者74例、うちglioma患者58例(low grade glioma +anaplastic glioma36例、de novo glioblastoma22例)、健常者225名のMGMT遺伝子をPCR-SSCP法にて解析した。PCRはMGMT遺伝子のエクソン3に存在する多型に特異的なプライマーを用いた。増幅されたPCR産物は、ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した。バンドの検出には銀染色法を用いた。原発性脳腫瘍全体のMGMT遺伝子型は、W/W 55例、V1/W 18例、V2/W 1例であり、健常者はそれぞれ160例、55例、1例であった(有意差なし)。glioma全体のMGMT遺伝子型は、W/Wが43例、V1/Wが14例、V2/Wが1例であり、これも有意差はなかった。しかし、de novo glioblastoma群のみで検討すると、W/W 11例、V1/W 11例で健常者と比較してV1/Wの頻度が有意に高かった。またglioma全体の中で、de novo glioblastomaにおいて有意にV1/Wが見られた。現時点で症例は少ないながらV1/W MGMT多型が、de novo glioblastoma発症のrisk factorである可能性が示唆された。さらに、悪性グリオーマにおいて高率に欠失の見られる、癌抑制遺伝子p14、p15、p16との関連を検討すべく、細胞株の選定、それらの細胞株への癌抑制遺伝子導入による遺伝子修復酵素の動態の検討を行った。残念ながら研究期間内にそれらの関連を結論付けることができなかった。しかしながら、今後もこのテーマに関する研究は続けていく予定である。脳腫瘍患者における遺伝子修復酵素変異と癌抑制遺伝子異常との関連を検討するにあたり、まず遺伝子修復酵素であるO^6-メチルグアニンDNA-メチルトランスフェラーゼ(MGMT)の多型頻1度を脳腫瘍患者白血球を用いて検討した。[対象、方法]原発性脳腫瘍患者74例・うちglioma患者58例(low grade glioma + anaplastic glioma36例、de novo glioblastoma22例)、健常者225名のMGMT遺伝子をPCR-SSCP法にて解析した。増幅されたPCR産物は94度に加熱した後、ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した。[結果]原発性脳腫瘍全体のMGMT遺伝子型は、W/W55例、V1/W18例、V2/W1例であり、健常者はそれぞれ160例、55例、1例であった(有意差なし)。しかし、de novo glioblastoma群のみで検討すると、W/W11例、V1/W11例で健常者と比較してV1/Wの頻度が有意に高かった。[結論]現時点で症例は少ないながらV1/W MGMT多型が、de novo glioblastoma発症のrisk factorである可能性が示唆された。今後このV1/W MGMT多型を有する患者群における腫瘍組織におけるMGMT蛋白発現の程度、P53、P21をはじめとする細胞周期関連遺伝子の異常・発現レベルとの関連・およびPTEN遺伝子異常との関連を検討する予定である。さらに、これら遺伝子異常と放射線・化学療法への感受性との関連も検討を行っていきたい。現時点で症例は少ないながらV1/W MGMT

多型が、de novo glioblastoma発症のrisk factorである可能性が示唆された。さらに、悪性グリオーマにおいて高率に欠失の見られる、癌抑制遺伝子p14、p15、p16との関連を検討すべく、細胞株の選定、それらの細胞株への癌抑制遺伝子導入による遺伝子修復酵素の動態の検討を行った。残念ながら研究期間内にそれらの関連を結論付けることができなかった。しかしながら、今後もこのテーマに関する研究は続けていく予定である。
都市化・少子高齢化時代の新しい墓地のあり方の検討とその活用

本研究では,東京都における事業型墓地に着目し,都市計画の視点から公営墓地と比較し,事業型墓地をコントロールしていると思われる墓地の需要・供給,行政,開発・経営について調べた結果,東京都における墓地需要に対しては,供給が追いついていないことが事業型ビジネスを拡大させる要因となっていること,行政では事業型墓地を取り締まる法律がないこと,墓地の経営については,宗教法人の名義貸しなどが行なわれ,墓地開発・経営の健全化が必要であることがわかった。また,事業型墓地の分布図を作成し,事業型墓地開発以前の土地利用の調査を行なった結果,事業型墓地の立地は,23区内で平均的なものではなく非常に偏りがあり,さらにそれらはその分布の特徴からいくつかの種類に分類できる。特に,東京23区内では北部の板橋区エリア,東部の葛飾区・江戸川区・江東区エリアには鉄鋼所や資材置き場の工場跡地に,比較的面積が大きい公園式墓地が立地する傾向があり,港区,台東区などの江戸時代から寺院が多く集まる場所には,寺院型墓地が事業型墓地へと転換したものが多いことがわかった。これらのことを踏まえて,事業型墓地の課題としては,墓地開発において行政が介入すべきであること,墓地ビジネスの健全化,都市計画による位置づけの明確化が挙げられる。また,墓地は「永続性」と「非営利性」を掲げた都市施設であり,公共性を持たせることで,都市空間に資するような空間へと導くコントロールができると考えた。
仮想通貨価格の統計的性質及びマルチフラクタル解析による時系列特性の研究

本研究では、まずビットコイン時系列の統計的性質を調べている。これまでに、絶対値収益率のべき乗の自己相関と収益率時系列のマルチフラクタル性、実現ボラティリティ変化の時系列の一般化ハースト指数等の研究を行った。株価や為替の絶対値収益率のべき乗の自己相関では、べき指数の値が2以外の値で最大になるというテイラー効果が知られている。ビットコインの時系列についても同様の効果があるかどうかを調べたところ、べき指数の値が0.5付近で最大となることが分かり、ビットコインにもテイラー効果が存在することが分かった。また、自己相関のラグの違いによっても最大となるべき指数の値が違ってくることが分かった。収益率時系列のマルチフラクタル解析では、得られたハースト指数の時間変動から、時系列が反持続的となる期間があることが分かった。そして、反持続性は取引の流動性と関連があり、流動性が低いときは反持続性が大きくなることが分かった。ビットコインの高頻度データから日次実現ボラティリティを計算し、その変化の時系列の一般化ハースト指数を調べた。これまでに、株価等ではボラティリティ変化の時系列はハースト指数が0.5以下の反持続性を示し、一般化ハースト指数は定数値でモノフラクタルであるという研究が知られている。しかし、ビットコインのボラティリティ変化の時系列を調べたところ、一般化ハースト指数は一定ではなく、マルチフラクタル性を示すことが分かった。マルチフラクタル解析によってビットコインの時系列特性の時間変動を調べた。その結果、ビットコイン時系列は反持続性を示す期間があり、反持続性は取引の流動性と大きく関連することがわかった。この結果は論文にまとめ投稿中である。また、絶対値収益率のべき乗の自己相関を調べ、べき指数が2以外の値で相関が最大となるテイラー効果がビットコイン時系列にも存在することを確認した。この結果の論文は採択され発表済みである。その他に、ビットコインの実現ボラティリティを計算し、その変化の時系列にマルチフラクタル性が現れることを発見したが、その成果の論文も投稿中である。このように、研究は順調に進み、これまでに研究成果を3つの論文にまとめることができている。今後は、更にビットコインの性質を研究していく。特に、取引高の分布や取引高変化の時系列の性質、ボラティリティと収益率の相関、収益率と取引高時系列間の相互マルチフラクタル性等を研究する。また、ビットコイン以外の仮想通貨にも研究を広げ、それらの時系列の性質を調べ、ビットコイン時系列の性質との比較を行う。専門的知識の提供として講師を招待する予定であったが、都合が合わず招待できず、人件費に余りが生じたが、今夏に招待を予定している。
ゾル・ゲル包括法によるタンパク質分子の構造・機能解析

1.ミオグロビンのコンホメーションの固定:ミオグロビンの脱酸素状態と一酸化炭素結合状態をウエットなゾル・ゲル中に固定し,これら二つのコンホメーションの違いを酸素平衡機能の観点から調べた.一酸化炭素結合状態で固定されたミオグロビンは,ほぼ均一な酸素平衡曲線を示し,その酸素親和性(0.2mmHg)は溶液のミオグロビンの親和性(0.5mmHg)より約2倍高かった.一方,脱酸素状態で固定されたミオグロビンの酸素平衡曲線は不均一性を示し,酸素親和性の大幅に異なる3成分(0.19,0.9,44mmHgの3成分)の和で記述できることが分かった.これらの結果は,ミオグロビンの各状態中に存在するコンホメーションの分布を室温のゾル・ゲルで凍結できることを示しており,一見単純にみえる溶液中ミオグロビンの酸素平衡特性は,リガンド結合に伴うコンホメーション分布の再編から生まれることを示唆している.2.ゾル・ゲル中シトクロムcのrefolding:薄いフイルム状のゾル・ゲルに閉じこめたネイティブ状態のシトクロムcがpH1.5で酸変性する過程と,pH4.5で再び折れ畳まれる過程をヘムの光吸収スペクトル変化で追跡した.ゾル・ゲル中シトクロムcのrefolding過程は,通常の溶液中のそれと比較して数桁から10桁のオーダーで減速することが示された.特に,重合度を高くしたゾル・ゲル中ではrefoldingの中間体(いわゆるモルテングロビュール状態)を室温で長時間(数時間)捕捉することができた.3.ゾル・ゲル固定法で見つかった"酸素親和性の高いT状態ヘモグロビン"のX線構造解析を意図して,いくつかの結晶試料について構造の精密化を行っている.現在のところ,まだ目的の構造は得られていない.ヘモグロビンのT状態の酸素親和性は溶液条件に依存して50倍以上も変化するが,その構造レベルでの説明はまだない.今回,この問題をはっきりさせるため,色々な溶液条件のT状態デオキシヘモグロビン分子の構造をゾル・ゲル包括で固定し,これらの酸素平衡曲線を測定してみた.デオキシヘモグロビンが中間的な酸素親和性を示す溶液条件でヘモグロビン分子の構造を固定した場合,酸素平衡曲線は顕著な二層性を示し,T状態ヘモグロビンの中には酸素親和性の60100倍異なる二種類のコンホメーションが共存することが分かった.そして,これら二つの状態の酸素親和性の値は,従来知られているT状態の酸素親和性の上限と下限に定量的に一致した.また,酸素親和性の高い方のコンホメーションは陰イオンが存在しない溶液条件で安定化され,いったんこの条件でゾル・ゲル固定した試料に外部から有機リン酸の一つであるイノシトール六リン酸(IHP)を添加すると,ゲル中で非常にゆっくりとした酸素親和性の低いコンホメーションへの転移が観測された.これらの結果は,T状態の酸素親和性の最低値と最高値を規定する二つのコンホメーションが平衡で存在し,これらの存在比が変わることでT状態の酸素親和性変化が起こっていることを示している.今回ゲル中で見つかった"T状態の親和性の最低値を持つ状態"の酸素親和性は,デオキシヘモグロビン結晶の酸素親和性(結晶中では協同性は無い)と定量的に一致している.したがって,ヘモグロビンの"最低親和性状態"の構造は,デオキシヘモグロビンのX線結晶構造で与えられると考えるのが自然であろう.現在,ゲル中で見つかったもう一つの酸素親和性の高い方の未知のコンホメーションの構造的基盤を求めて,この状態の結晶化を試みている.1.ヘモグロビンの新規構造状態のX線結晶解析:ヘモグロビン(Hb)分子の挙動は単純なT状態とR状態の平衡で定量的に記述できないことが知られているが,その分子論的な説明はまだない.本研究ではこの問題に対する直接的なアプローチとして,多孔性ゲルにHbを閉じ込めて構造変化を凍結する方法でHbの親和性状態の数を調べる実験を行った.その結果,T状態には酸素親和性の約100倍異なる2種類のコンホメーションがあることを実験的に示した.ゲル中で見つかった"最低親和性状態"は,従来の脱酸素型Hb結晶とほぼ同じ酸素親和性を持つ.したがって,この"最低親和性状態"の構造は,従来の脱酸素型HbのX線結晶構造で与えられると考えるのが自然であろう.現在,もう一方の酸素親和性の高い方の未知の状態の結晶解析を目指して,(1)ウマの脱酸素型Hb(ヒトの脱酸素型Hbは,従来のT構造,即ち,最低親和性状態の結晶の溶解度が極めて低い),(2)C末端アミノ酸残基を切除したウマの脱酸素型Hb,(3)ウマの一酸化炭素結合型Hbとベザフィブレート(Hbの酸素親和性を下げることで知られる薬剤)との複合体の結晶化を行い,SPring-8放射光でX線回折データの収集を行った.現在,解析が進行中である.2.ゾル・ゲル中タンパク質の折れたたみ実験:通常のゾル・ゲル包括法では,ゲル中に閉じこめたタンパク質を変性させると,変性タンパク質がゲルから漏出してしまうことが明らかになった,この問題を克服するため,ゲルの細孔中に再度ゾルを浸透,ゲル化させ固定度を上げる新しい方法を考案した,現在,この固定法を用いて変性シトクロムのrefolding過程を吸収スペクトル変化で追跡する実験を行っている.

ゲル中で観測される折れたたみ過程は,溶液中のそれと比較して数桁のオーダーで減速していることが示されている.1.ミオグロビンのコンホメーションの固定:ミオグロビンの脱酸素状態と一酸化炭素結合状態をウエットなゾル・ゲル中に固定し,これら二つのコンホメーションの違いを酸素平衡機能の観点から調べた.一酸化炭素結合状態で固定されたミオグロビンは,ほぼ均一な酸素平衡曲線を示し,その酸素親和性(0.2mmHg)は溶液のミオグロビンの親和性(0.5mmHg)より約2倍高かった.一方,脱酸素状態で固定されたミオグロビンの酸素平衡曲線は不均一性を示し,酸素親和性の大幅に異なる3成分(0.19,0.9,44mmHgの3成分)の和で記述できることが分かった.これらの結果は,ミオグロビンの各状態中に存在するコンホメーションの分布を室温のゾル・ゲルで凍結できることを示しており,一見単純にみえる溶液中ミオグロビンの酸素平衡特性は,リガンド結合に伴うコンホメーション分布の再編から生まれることを示唆している.2.ゾル・ゲル中シトクロムcのrefolding:薄いフイルム状のゾル・ゲルに閉じこめたネイティブ状態のシトクロムcがpH1.5で酸変性する過程と,pH4.5で再び折れ畳まれる過程をヘムの光吸収スペクトル変化で追跡した.ゾル・ゲル中シトクロムcのrefolding過程は,通常の溶液中のそれと比較して数桁から10桁のオーダーで減速することが示された.特に,重合度を高くしたゾル・ゲル中ではrefoldingの中間体(いわゆるモルテングロビュール状態)を室温で長時間(数時間)捕捉することができた.3.ゾル・ゲル固定法で見つかった"酸素親和性の高いT状態ヘモグロビン"のX線構造解析を意図して,いくつかの結晶試料について構造の精密化を行っている.現在のところ,まだ目的の構造は得られていない.
軟骨表層細胞の分化誘導と異方性を有する軟骨再生

軟骨欠損の修復過程で、少数出現する表層細胞をラベルしてcell lineageを追跡するために、コンディショナルKOマウス(Prg4CreER;R26YFP)の膝関節の大腿骨滑車に軟骨欠損(punch penetration)を作成した。2週または6週でタモキシフェンtamを投与し、周囲表層部と欠損部(部分的に出現する表層細胞)のgenetic labelingを開始した。まず欠損作成後の経時的経過で、修復組織の形態学的変化の確認を行った結果、一般的なマウスモデルでの軟骨全層欠損修復過程と同じく、2-4週の経過で欠損部を充填する間葉系組織と、深部にわずかに軟骨組織形成を認めた。さらに、個体によるばらつきは多いものの、4-8週の経過で欠損部内の修復軟骨組織の増大と線維性修復の混在、深部では軟骨下骨への改変を認めた。また表層軟骨層の再生が比較的良好な個体では、表層から中間層での軟骨再生の程度も良好で、欠損中央部での軟骨再生厚も多い傾向があった。そこで欠損作成6週後にtam投与した個体を中心に、周囲および新規に出現した表層細胞のlineage解析を開始している。また組織学的修復と軟骨細胞数・密度・部位の対比解析を予備的に行ったところ、8週までに比較的良好な表層細胞層の形成があるものでは、表層細胞層に加えて、表層に近い欠損部内にもCD73やPrg4陽性細胞が、ごく少数ではあるが認められた。12週までの経過で、限られた数のマウスの解析では、これらのわずかの陽性細胞も認められなくなった。比較的良好な表層再生を認めたものに限って、表層内にはPrg4陽性細胞が残存していた。
古DNA、形態情報を用いた先史時代琉球列島への家畜ブタ導入経路の解明

本研究では先史時代の琉球列島へ「いつ、どこに、どこから」イノシシもしくは家畜ブタ(Sus scrofa、以下イノシシ属と省略)が導入されていたのか解明するため、これまでに琉球列島や周辺地域の遺跡から出土したイノシシ属骨のancient DNA解析と形態解析を行ってきた。この結果、琉球列島に生息する野生のリュウキュウイノシシ(S.s.riukiuanus)とは形態・遺伝的に別系統と考えられる個体が沖縄島の野国貝塚群や宮古島のアラフ遺跡と長墓遺跡で確認された。本解析結果より、1)先史時代に琉球列島へ人類がイノシシ属を外部から導入していた、2)先史時代の琉球列島では複数系統の野生イノシシが混在していた、という2仮説が考えられた。これらの仮説の検証には、琉球列島の野生イノシシの起源を解明する必要がある。そこで本年度は野生のリュウキュウイノシシ資料の数及び採取地域を増加させたDNA解析やシミュレーション推定を行った。全7島に生息するリュウキュウイノシシのうち6島由来の113個体を解析した結果、これらは全て遺伝的に近縁であり、遺跡資料で確認されたような他のイノシシ属系統と近縁な個体は現生集団からは検出されなかった。またシミュレーションによる推定の結果、複数のイノシシ系統が先史時代に生息していた可能性は極めて低い事が示された。これらの解析結果より琉球列島に生息する野生のリュウキュウイノシシは1つの祖先系統に由来すると考えられ、先史時代の琉球列島では人類によるイノシシ属の外部導入が既に生じていた可能性が高い事が示された。また、出土遺物の類似性や近隣諸地域のイノシシ属の遺伝的特徴との比較から、複数の導入経路が存在した事も推察された。先行研究で充分に解析されてこなかった現生リュウキュウイノシシ資料のDNA解析を行う事で、先史時代の琉球列島にイノシシ属が導入されていた可能性をより高い精度で論じる事ができた。ただしリュウキュウイノシシの生息地域の1つである請島の資料に関しては2013年3月に資料を確保したため現在解析中である。本解析の終了後、結果を論文にまとめ投稿する。先史時代の琉球列島にイノシシ属が導入されていた可能性をより詳細に探るためには、遺跡資料解析数のさらなる蓄積が必要である。また先史時代のイノシシ属の導入・拡散経路をより細かく検討するためには、アジアのイノシシ属系統をさらに詳細に識別できるような生物系統地理学的研究が必要であり、今後は形態的特徴や複数のDNAマーカーを融合するような新たな手法を開発する。本研究では先史時代の琉球列島へ「いつ、どこに、どこから」イノシシもしくは家畜ブタ(以下イノシシ属と省略)が導入されていたのか解明するため、琉球列島や周辺地域の遺跡から出土したイノシシ属骨のancientDNA(以下古DNAと省略)・形態解析を行う。本年度は石垣島大田原遺跡と神田貝塚、宮古島長墓遺跡といった琉球列島南部圏の遺跡資料を採取し、これまでに得た宮古島アラフ遺跡資料と共に解析した。この結果、琉球列島に生息する野生のリュウキュウイノシシ(Sus scrofo riukiuanus)とは遺伝的に別系統と考えられる個体がアラフ遺跡と長墓遺跡で複数確認された。また遺跡資料の比較に有用であるリュウキュウイノシシに関するフィールド調査を実施し、奄美大島(78個体)、沖縄本島(404個体)、徳之島(30個体)の資料を採取した。さらに国立科学博物館所蔵のリュウキュウイノシシ資料(全6島、224個体)、フィリピンのイノシシ属資料(13個体)、海南島イノシシ属資料(22個体)についてもサンプリングを行い、これらの一部を解析した。全7島の生息地のうち6島のリュウキュウイノシシを解析した結果これらは全て遺伝的に近縁であり、リュウキュウイノシシは単一の母集団に由来する野生イノシシ系統であると推察された。上述した現生・遺跡資料の解析結果から、琉球列島南部圏ではアラフ遺跡や長墓遺跡が利用されていた約2000年前に、野生のリュウキュウイノシシとは別系統のイノシシ属が外部から導入されていた可能性が推察された。研究成果は「第65回日本人類学会大会」等で発表し、日本人類学会からは「若手会員大会発表賞」を受賞した。また沖縄本島の野国貝塚群から出土したイノシシ属骨資料を中心とした古DNA・形態解析の結果をまとめた論文を学術雑誌「Anthropological Science」誌にて発表した。

全7島に生息するリュウキュウイノシシのうち6島由来の113個体を解析した結果、これらは全て遺伝的に近縁であり、遺跡資料で確認されたような他のイノシシ属系統と近縁な個体は現生集団からは検出されなかった。またシミュレーションによる推定の結果、複数のイノシシ系統が先史時代に生息していた可能性は極めて低い事が示された。これらの解析結果より琉球列島に生息する野生のリュウキュウイノシシは1つの祖先系統に由来すると考えられ、先史時代の琉球列島では人類によるイノシシ属の外部導入が既に生じていた可能性が高い事が示された。また、出土遺物の類似性や近隣諸地域のイノシシ属の遺伝的特徴との比較から、複数の導入経路が存在した事も推察された。当初の計画ではリュウキュウイノシシの起源や遺伝的変異幅について初年度に論文投稿を行う予定であったが、生息地の1つである請島のイノシシ猟の結果が悪く、サンプリングが行えなかった。しかし琉球列島の遺跡資料については順調に解析が進んでいるほか、海外の現生資料に関しても国立科学博物館所蔵のイノシシ属骨資料からDNAサンプリングを完了している。これまでに行った沖縄本島野国貝塚群の資料に関する解析結果をまとめた投稿論文も受理され、研究はおおむね順調に進展している。先行研究で充分に解析されてこなかった現生リュウキュウイノシシ資料のDNA解析を行う事で、先史時代の琉球列島にイノシシ属が導入されていた可能性をより高い精度で論じる事ができた。ただしリュウキュウイノシシの生息地域の1つである請島の資料に関しては2013年3月に資料を確保したため現在解析中である。本解析の終了後、結果を論文にまとめ投稿する。請島の現生リュウキュウイノシシについてDNAサンプリングを行う必要がある。これに関しては毎年のイノシシ猟のみでなく、猟師が過去に狩猟して保存している骨資料も対象としたフィールド調査が必要である。初年度のフィールド調査を通じて得られた協力関係を最大限に活かし、DNAサンプリングを成功させる。今後は現生リュウキュウイノシシの起源や遺伝的変異幅に関する研究成果を論文にまとめ「Journal of Molecular Evolution」誌に投稿する。また琉球列島南部圏の遺跡資料の解析結果は国際学術誌「International Journal of Evolutionary Biology」誌に投稿準備中であり、これを進めると共に今後は海外の遺跡・現生資料についても解析を行う。先史時代の琉球列島にイノシシ属が導入されていた可能性をより詳細に探るためには、遺跡資料解析数のさらなる蓄積が必要である。また先史時代のイノシシ属の導入・拡散経路をより細かく検討するためには、アジアのイノシシ属系統をさらに詳細に識別できるような生物系統地理学的研究が必要であり、今後は形態的特徴や複数のDNAマーカーを融合するような新たな手法を開発する。
魚類を用いて生息水域を評価する試み

近年、水域環境には微量の化学汚染物質が存在していることが知られている。しかし従来の機器分析による水質の化学的汚染指標のみでは、こうした毒性を評価することは難しい。これまで我々はニシキゴイ肝膵臓中のメタロチオネイン(MT)量、チトクロームP450量、ヘムオキシゲナーゼ(HO)活性、及び各種薬物代謝酵素活性を測定し、これらの総合的な考察から水質汚染の状況を反映できることを示唆してきた。本研究では魚類MT並びにP450アイソザイムの一つのCYP1AをmRNAレベルで調査し、この結果が環境汚染を知る手がかりと成り得るか検討した。実験魚として入手易い金魚を使用し、環境化学物質として、カドミウムC(d)、イソサフロール(ISA)及び界面活性剤を用いた。Cdにより金魚肝膵臓、鰓ともにMTmRNAを誘導したが、鰓は肝膵臓よりもより低濃度で誘導した。またCYP1AmRNAの誘導は肝膵臓では若干認められたものの鰓では使用した濃度での誘導は認められなかった。一方、ISAは肝膵臓、鰓ともにMTmRNAの誘導は認められなかったが、CYP1AmRNAの誘導は肝膵臓、鰓ともに誘導した。この時、鰓は肝膵臓よりもより低濃度で誘導を認めた。さらに、ISAとCdを併用暴露させたところ、MTmRNAの誘導は肝膵臓、鰓ともに単独曝露とほぼ同様の結果を示し、CYP1AmRNA誘導はCdを併用しても肝膵臓、鰓ともにISA単独曝露と差は認められなかった。界面活性剤(SDS,Emulgen913)ではMTmRNA、CYP1AmRNAともに誘導され、肝膵臓より鰓への影響がより大きかった。本研究の結果から、魚類の薬物代謝酵素の動態をmRNAで評価し、環境汚染物質の水域環境の指標に用いようとするとき、代謝の主な器官である肝膵臓のみではなく鰓も指標として非常に有用であることが明らかとなった。特に鰓でのmRNAの動態は肝膵臓より低濃度で惹起し、環境水中の汚染物質のように非常に低濃度の汚染をより迅速に評価できることが明らかとなった。また経時的な検討結果から、短時間での化学物質の曝露試験には鰓、長時間での試験では肝膵臓のmRNAの結果を用いることが有用であることが示唆された。
鞭毛形成マスターレギュレーターFlhD4C2による代謝制御機構の解明

大腸菌の鞭毛形成のマスターレギュレーターであるFlhD4C2に着目し、FlhD4C2の新規制御遺伝子の探索および、生長環境に応じたFlhD4C2支配下遺伝子の転写変動を観察した。FlhD4C2のゲノム上での結合領域の同定に成功し、また、栄養源の遷移時に、FlhD4C2が鞭毛形成関連遺伝子だけではなく、複数の代謝酵素遺伝子の発現制御に関与していることを明らかとした。これにより、如何にして細胞内代謝と鞭毛形成を共役させているか、その増殖形態を選択していく過程を明らかした。環境中の微生物は栄養源の遷移を量・質ともに正確に感知し、それら栄養源に細胞内代謝を最適化することで環境変化に適応している。この適応機構には増殖形態の変化を伴い、その代表的な例として、鞭毛形成・バイオフィルム形成がある。この両形態はbistable(双安定性)な関係性にあり、細胞集団中の個々の細胞は生長環境に応じて、そのどちらの増殖形態を選択するか常に迫られている。本研究では大腸菌の鞭毛形成マスターレギュレーターFlhD4C2に着目し、Genomic SELEX法を用いた網羅的解析により同定した新規FlhD4C2制御候補遺伝子群の解析と、栄養源の遷移に伴ったこれら遺伝子群の動態を解析することにより、生長環境を感知しながら生き残り戦略を選択していく過程の全体像の把握を目指し、実施したものである。初年度はまず、鞭毛形成マスターレギュレーターFlhD4C、2バイオ・バイオフィルム形成マスターレギュレーターCsgDの両者の転写発現が双安定性の関係にあるかどうか再検証するため、各Promoterの下流にsfGFPを融合したレポータープラスミッドを作製し、LB培地において増殖フェイズに応じて、1細胞レベルでflhDC及びcsgDの発現誘導を比較・検討した。その結果、時期特異的な発現のbistabilityを確認することができた。また、合成培地において各培地成分を変動させることで、これら遺伝子の発現変動に影響を与える栄養源の同定を試みている。また、この構築したレポータープラスミッドを元に、Genomic SELEX法を用いて同定した新規FlhD4C2制御候補遺伝子群の発現変動を、一細胞レベルで解析中である。一細胞レベルでの転写変動観測系の構築により、flhDC及びcsgDの転写活性化時期の同定及び、その発現レベルに多様性があることを見いだすことができた。Genomic SELEX法を用いて同定した新規FlhD4C2制御候補遺伝子群の多くは中央代謝系に関与する遺伝子であり、これら遺伝子群の転写制御には既に複数の転写制御因子が関与していることが報告されている。そのため、各制御候補遺伝子において、FlhD4C2による転写制御が決定的に作用する時期を同定するのに多くの時間をかけることとなった。一方、これら遺伝子群に関して、一細胞レベルでの転写変動を検証することで、当初想定できていなかった新たな知見も得つつある。本年度は、同定した新規FlhD4C2制御候補遺伝子群に関して、ゲルシフトアッセイにより、そのPromoterへの結合強度を比較することで、FlhD4C2による転写制御の強度を比較・検討した。また本系を用いて、FlhD4C2に作用するリガンドの探索も行ない、詳細な制御機構の解明を目指した。新規FlhD4C2制御候補遺伝子群の多くは中央代謝系に関与する遺伝子が多く、flhDC欠失により、中央代謝系への影響が伺える。この点に関して、合成培地に添加する炭素源・窒素源等を変化させた場合に、生育に対してどのような変化が起きるか、野生株とflhD破壊株を用いて比較・検討を行った。前年度に構築した一細胞レベルでの転写変動計測系を用いた解析系の結果を、上記の結果に組み込めるか検討を行っている。ゲルシフトアッセイにより、新規FlhD4C2制御候補遺伝子のPromoterへの結合強度を比較し、結合する領域をある程度絞ることができた。また、各PromoterによってFlhD4C2の結合強度が大きく異なることがわかった。これらPromoter付近には既存のFlhD4C2結合配列は存在しない。今年度得られた結果をもとに、現在新奇のFlhD4C2結合配列の推定を進めている。flhD破壊株は、合成培地において合成培地に添加する炭素源・窒素源等を変化させた場合に、生育への影響が大きく異なることが明らかとなりつつある。各培地条件での新規FlhD4C2制御候補遺伝子の発現変動の解析結果と合わせ、なぜ生育への影響が大きく異なるのか、その理解を進めている。

以上の結果から、生長環境の栄養状態に応じて、FlhD4C2が中央代謝系の遺伝子群の発現を制御とその効果に関して明らかにできつつあり、FlhD4C2を中心に据えた時に見えてくる、栄養源遷移時における生き残り戦略が理解できつつある。一方で、FlhD4C2の質的な制御機構の解明に関しては、計画通り進んでいない。環境中の微生物は生育環境の変化に伴い、変動する栄養源の遷移を質的・量的に正確に感知し、細胞内代謝を最適化することで環境変化に適応している。この適応機構には増殖形態の変化を伴い、その代表的な例として、鞭毛形成・バイオフィルム形成がある。この両形態はbistable(双安定性)な関係性にあり、細胞集団中の個々の細胞は生長環境に応じて、そのどちらの増殖形態を選択するか常に迫られている。これまで、生育環境に応じた細胞内代謝制御および増殖形態制御は個別の議論として研究されてきたため、両制御間における協調的関係性に関しては不明な点が多くあった。本研究課題では大腸菌の鞭毛形成マスターレギュレーターFlhD4C2に着目し、Genomic SELEX法を用いた網羅的解析により同定した新規FlhD4C2制御候補遺伝子群の解析と、栄養源の遷移に伴ったこれら遺伝子群の動態を解析することにより、生長環境を感知しながら生き残り戦略を選択していく過程の全体像の把握を目指し、実施したものである。初年度・2年度は、新規に同定したFlhD4C2制御候補遺伝子に対するFlhD4C2の影響をIn vitro (EMSA)・In vivo(ノーザン解析及びsGFPを用いたレポーターアッセイ系)の両面から検証を行った。また、新規FlhD4C2制御候補遺伝子群の多くは中央代謝系に関与する遺伝子が多く、flhDC欠失により、中央代謝系への影響が伺える。この点に関して、合成培地に添加する炭素源・窒素源等を変化させた場合に、生育に対してどのような変化が起きるか、野生株とflhD破壊株を用いて比較・検討を行った。この結果を元に、最終年度は生育環境の変化に応じた細胞内の転写制御変動にFlhD4C2がどのように影響を与えているか再検証するため、wt及びflhD破壊株における網羅的な遺伝子発現解析をRNA-seq解析を用いて行い、新規FlhD4C2制御候補遺伝子の同定を行った。大腸菌の鞭毛形成のマスターレギュレーターであるFlhD4C2に着目し、FlhD4C2の新規制御遺伝子の探索および、生長環境に応じたFlhD4C2支配下遺伝子の転写変動を観察した。FlhD4C2のゲノム上での結合領域の同定に成功し、また、栄養源の遷移時に、FlhD4C2が鞭毛形成関連遺伝子だけではなく、複数の代謝酵素遺伝子の発現制御に関与していることを明らかとした。これにより、如何にして細胞内代謝と鞭毛形成を共役させているか、その増殖形態を選択していく過程を明らかした。今年度の計画を継続するとともに、新規FlhD4C2制御候補遺伝子群のうち、機能道の転写因子に関して解析対象とし、転写因子間のヒレラルキー性に関しても検証していく予定である。昨年度・今年度の計画のうち、達成できなかったものに関して継続して研究を行う。FlhD4C2制御遺伝子に関する理解は進んだが、自身の制御機構に関して今後重点的に解析を行い、理解に努める。応用微生物成果を海外英文誌に投稿するための準備をしていたが、論文の実験を含む改訂を要し、今年度投稿することができなかったために予定した掲載料分が残額となった。
血管新生抑制作用を有する食品機能成分の多機能性の解明と応用研究

ヒトの健康に役立つ効果が示されている食品機能成分に共通する生理機能として血管新生抑制作用がある。また、血管新生抑制作用を有する食品機能成分は多彩な生理作用を示す。本研究では、その多機能性を示す作用機構について分子レベルで検討をした。その結果、遺伝子発現・細胞情報伝達系・オートファジーに影響を与えることが多機能性と関連していることを明らかにした。また、経口摂取によっても老化に伴う脳機能の低下に対して保護作用があることを動物実験モデルで示した。疫学研究や実験研究により、ヒトの健康維持に役立つ食品機能成分に共通する生理作用として、血管新生抑制作用が示されている。また、脳疾患予防に血管新生抑制物質が有効であることも明らかになりつつある。一方、血管新生抑制作用を有する食品機能成分がどのようにして様々な疾病のリスクを下げるのかについては未解明のままである。そこで、本研究では、その作用機序解明と血管新生抑制成分の脳疾患予防効果の可能性について以下の研究を遂行した。・血管新生抑制作用を有する食品機能成分及びその誘導体をヒト血管内皮細胞に暴露し、変動する遺伝子数種類について定量RT-PCR法により、またタンパク質発現量はウエスタンブロット法により定量した。更に、幾つかの遺伝子についてはRNAi法による発現抑制実験を行った。その結果、同じ血管新生抑制作用を有する食品成分でも、分子レベルでの作用機序は異なる可能性が示唆された。また、これらの成分によって発現が変動する遺伝子は血管新生との関連性も示された。今後は、分子レベルでの作用の違いと生理機能の差について検討する必要がある。・血管新生抑制作用を有する食品成分及びその誘導体の神経細胞保護効果について検討を行った。実験に用いた細胞はSH-SY5Y細胞で、この細胞に酸化ストレス及び神経毒を暴露し、その保護効果を検討した。興味深いことに、酸化ストレスに対しては強い保護作用を示した成分でも、神経毒に対しては保護作用を示さなかった。一方、神経細胞に対する保護作用を示さない成分もあり、血管新生抑制作用と脳保護作用の関連性について更に検討を進める予定である。ヒトの健康維持に役立つことが期待されている多くの食品機能成分に共通する生理作用として、血管新生抑制作用が示されている。しかし、血管新生抑制作用を有する食品成分がどのようにして疾病のリスクを下げるのかは十分に解明されていないことから、その作用機構について分子細胞レベルで検討した。また、そのような食品機能成分は、近年社会的問題となっている高齢者の脳疾患のリスクも下げる効果が期待されていることから、脳機能保護効果の可能性について動物実験で検討を進めた。・血管新生抑制作用を有する主要な食品機能成分の血管内皮細胞への影響を遺伝子発現の変動で検討した。その結果、興味深い遺伝子変動が見られたことから、RNAi法によって血管内皮細胞における機能評価を行った。また、細胞の代謝系への影響も示されたことから、神経細胞株を用いて細胞の低栄養に対する保護効果を検討した。これらの実験から、血管新生に関連する遺伝子への影響だけでなく、細胞の代謝系にも影響を与え、細胞保護効果をもたらすことが明らかとなった。また、虚血性脳疾患モデルで脳機能保護作用を示す食品機能成分が血管新生抑制作用を持つことも明らかにし、血管新生抑制作用と脳機能保護との関連性を示すことができた。・血管新生抑制作用を有する食品機能成分のin vivoでの効果を検討するため、老化促進マウスを用いて検討を開始した。機能成分を含む抽出液を飲料とした群と水を飲料とした対照群を飼育し、定期的に行動科学実験を行った。その結果、対照群に比べ抽出液を摂取している群の方が、脳機能を維持している可能性が示唆される結果が得られた。経口投与による効果の可能性が示唆されたことは、実生活への応用を考える上で意義深いといえる。これまでの研究により、血管新生抑制作用を持つ食品機能成分が多彩な生理機能を示すのは、血管新生関連遺伝子だけでなく、様々な遺伝子の発現に影響を与えている結果であることが示されている。なかでも、高齢化社会を迎え、高齢者に多い脳疾患のリスクを下げる作用が示唆されたローズマリーに含まれるカルノシン酸について、細胞を用いた神経細胞保護作用機構と老化促進マウスを用いたin vivoモデルでの経口摂取による有効性の評価を行った。酸化ストレス・飢餓・神経毒に対するカルノシン酸の神経細胞保護作用について、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞を用いて検討したところ、酸化ストレスと飢餓に対する耐性をもたらすことが明らかとなった。また、その作用機構として、オートファジー活性化作用が関与していることを明らかにした。この結果は、遺伝子発現解析の結果から推察されていた細胞内の代謝系の変化とも一致しており、カルノシン酸によるこれらの細胞内代謝の変化が細胞保護的に働くことを示すことができた。なお、カルノシン酸の細胞保護効果には細胞内情報伝達系(PI3K/Akt, MEK/ERK)への作用も重要であることを示すことができた。カルノシン酸を含むローズマリー抽出液を経口投与した老化促進マウス(SAM)は、老化初期ではMorris水迷路

試験などで脳機能保護効果が見られたが、後期では明確な効果は確認できなかった。また、高純度のカルノシン酸を投与したSAMにおいては、老化の初期以降でも脳機能保護効果が示された。さらに、脳について組織化学的に検討したところ、カルノシン酸摂取群では一部で神経細胞死の抑制が見られたことから、カルノシン酸の経口投与は脳機能保護的に働く可能性が示唆された。血管新生抑制作用を有する食品機能成分の作用機構については、完全には解明されていない。その一端を明らかにできたことは、本年度の目標を達成したと考えられる。また、動物実験によう脳機能保護についても研究が進んでいることから、研究計画は順調に進んでいるといえる。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画はおおむね順調に進んでいるので、今後も当初の計画どおり進める予定である。また、遺伝子発現解析では見出せない新規作用機構を示す結果が得られており、計画以上の成果が期待できる可能性がある。更に、血管新生抑制作用を有する食品機能成分の新規生理作用も明らかにできたことから、今後、本研究の成果を発展させる方向性も得られた。
コンテクスト応答型警告システムの地区全体への導入効果評価手法

本研究は、一般道と高速道路を対象に、2008年度に広島地区で行ったITS公道実証実験データおよび2009年度に行ったプローブ走行データとSP調査データを用いて、コンテクスト応答型警告システムによる地区全体の交通安全改善効果の総合評価を行った。また、今後同システムを導入するにあたっての課題を整理し、それら課題を克服するための推進体制について提案した。本研究は,一般道と高速道路を対象に,広島地区で行われる公道実験データなどを用いて,多様なコンテクストに応じた,ITSを含めた安全施策の地区全体(エリアワイド)の効果分析を行い,得られた結果をもとにガイドラインの作成とワークショップを開催することでコンテクスト応答型警告(CRW)システムの推進体制づくりとプロセスを確立することを最終目的としている.本年度の成果を以下のようにまとめる.1.過年度に広島市内で行った走行実験データを用いて,提供された車内警告情報が時間の経過とともに忘却されるという人間の記憶特性を組み入れた運転者の走行危険性モデルを開発した.開発したモデルは,従来のモデルと比べて説明力が向上すること,そして,情報提供の効果をより適切に評価できることが確認された.2.NEXCO西日本(株)から提供を受けた交通事故統計データとIC区間別交通量データを用いて,高速道路におけるトリップ長をドライバーの疲労の代理指標として交通事故発生と損害程度のモデルをそれぞれ構築し,トリップ長が交通事故発生確率に影響を及ぼすものの,事故の損害程度に影響を及ぼさないことを明らかにした.3.産官学の連携体制のもと,2009年2月9日から22日まで広島市内の国道2号を対象に,クレスト部に設置された路側情報板から前方車両の存在を知らせる情報の有無による運転挙動の変化の計測を目的に,さらに2月23日から3月1日まで山陽自動車道志和IC広島IC間を対象に速度超過警告情報の有無による運転挙動の違いの計測を目的とした走行実験を行った.従来のドライバーの運転挙動情報以外に,生体信号収録装置を被験者に装着してもらい,運転中の脳波,眼球運動,心電図,呼吸も計測した.走行危険性については,高速道路を対象に行った集計分析の結果,生体情報による評価が運転挙動のみからの評価と異なる傾向を示すこと,特に雨天時において危険度が高い区間特性を明らかにした.本研究は,一般道と高速道路を対象に,広島地区で行われる公道実験データなどを用いて,多様なコンテクストに応じた,ITSを含めた安全施策の地区全体(エリアワイド)の効果分析を行い,得られた結果をもとにガイドラインの作成とワークショップを開催することでコンテクスト応答型警告(CRW)システムの推進体制づくりとプロセスを確立することを最終目的としている.本年度の成果を以下のようにまとめる.1.過年度に広島市内で行った走行実験データを用いて,心拍数や脳波などの生体情報を取り入れた車内警告情報および路側傾向情報が運転者の走行行動に及ぼす影響を評価した.生体情報を用いて精神的負荷決定モデルを開発し評価を行った結果,情報提供がドライバーのストレスを抑制する働きがあることを確認した.2.事故多発交差点が連続している国道2号線を対象に実施したウェブ型SP調査(800サンプル)を実施し,事故多発交差点が連続している道路区間における情報板の設置方法,車内型と路側型警告情報の提供効果の比較を行った.SP調査の結果,危険な交差点すべてに情報板を設置しても,最も安全な走行に結びつくとは限らないことが分かった.3.産官学の連携体制のもと,2009年12月9日にITS市民学習会を開催した.ITS利用者の立場からJAFMATE編集部の立川薫氏を招いた講演会「ITSは私たちを幸せにしてくれますか?」,前年度に実施した公道実証実験の装置を体験するITS実験車両の試乗会,および広島地域の各種ITSの取り組みを紹介するパネル展示会を行い,次の段階のITSの課題を明確にした.本研究は、危険な合流部や交差点が連続する交通事故危険箇所区間あるいは交通事故危険地区の全体を対象として、複数の安全対策を同時に実施し、相互作用効果を計測すること、走行実験による実験においてドライバーの生体情報に着目したITS導入効果の分析を行った。具体的には、2008年度に広島地区で実施した公道実験データを用いて、学術的・学際的な視点から、1)CRWシステムによる地区全体の交通事故削減効果の総合評価、2)CRWシステムの導入方法の提案を行った。1)については、CRWシステムに関する公道実証実験の評価(実験方法、システムの構成と性能、実装パフォーマンスなど)を引き続き行うとともに、昨年度までに実施した調査データ(走行実験とSP調査)を活用し、走行危険性や生体情報などを用いたシステムの導入効果の評価方法を開発した。同時に、地域全体に導入する場合の交通事故削減効果を評価した。2)については、今までの評価結果(モデル分析による評価、市民ワークショップによる評価、協議会による評価など)をもとに、CRWシステムを今後地域全体に導入するにあたっての課題を整理すると同時に、それら課題を克服するための方法を提案した。