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豊臣政権における対キリスト教修道会交渉

このことから殉教事件が単純にキリスト教に対する日本側の弾圧に留まらず、豊臣政権内の対外交渉の構造や交渉担当者の政治的影響力が直接的に事件に影響していることを主張した。前述のとおり今年度の成果はイエズス会・フランシスコ会間の日本布教をめぐるヘゲモニー抗争に関する論文の投稿となっている。研究計画書通りスペイン・ポルトガル本国やルソン・マカオ当局と修道会の政治構造の概要の考察を行う予定であったが、海外での史料調査が延期となり、本来進めるべき史料の翻刻・翻訳作業を進めることができず、全体的な進捗に遅れをきたした。既に収集していた史料をもとに研究を続けていたこともあり、来年度の研究目標達成に影響するような遅れにはなっていないものの、二年目の研究計画としてはやや遅れていると言える。本研究の到達目標は、豊臣政権内に存在するカトリック修道会と政権との交渉に介在する人物たちの交渉における具体的な役割、また、彼らの活動の政権内における位置づけである。本年度は成果として二本の論文として投稿した。一本目は「在日フランシスコ会士と小西行長ーマルティン・デ・ラ・アセンシオンの報告書より一考察ー」と題し、フランシスコ会士アセンシオンの二通の報告書と、イエズス会士アレッサンドロ・ヴァリニャーノの反駁書などより小西氏関連のものをあげ、フランシスコ会との交渉における行長の役割について考察したものである。行長は対外交渉において自己がキリスト教徒であることを利用し、フランシスコ会士たちと自立的に交渉していたのであり、彼の存在については、「接続された歴史」の概念におけるカトリック王国に対しての「メスティソ化したエリート」であると評価できるとした。二本目は「豊臣政権の対外交渉と取次慣例」とし、修道会交渉を含めた豊臣政権における対外交渉が国内で対大名間交渉に用いられていた取次慣例の延長であったことを指摘し、論証したものである。以前から豊臣政権の「取次」の理論が対外交渉にも敷衍されていたことについては指摘していたが、史料の再検討を通じ、政権から公的な役割とされる「取次」に限らず、政権構成員の個々の知音関係を活用した取次慣例が対外交渉全般にも活用されていることを示した。豊臣政権期には「取次権の安堵」と同様のことが対外交渉においても行われ、そのために交渉相手の国別に交渉担当の領主が異なるという現象が起こり、また交渉に携わった領主の政権側からみた位置づけの違いから、近世期以降も交渉の続く朝鮮や琉球といった国々と後に断交することとなるスペイン・ポルトガルとで交渉の形態が分かれており、近世期の対外関係の基礎が豊臣政権時に成立していることを改めて指摘できるとした。前述のとおり、本年度の研究計画は海外史料の収集・翻訳とその成果の公表である。そのどちらも、現在交付申請書に記述した研究計画通りに進行している。海外史料の収集については、海外における史料調査はインディアス総合古文書館への訪問にとどまったが、デジタルアーカイブ化されていない史料を多数収集することができた。また、前掲の研究報告についても、領主層の修道会交渉を政権内の政治構造内に位置づけるという本研究の目的から鑑みても、大きな成果といえるだろう。しかし、さらなる史料的裏付けの必要性や、地域に関係無く修道会との交渉に携わる前田玄以の役割の位置づけなど、課題は数多くあるが、1年目の研究計画としてはおおむね順調に進んでいるといえる。
中山間地域農村における持続的社会形成に関する地域社会学的研究

現代日本の地域社会の持続的発展を考える上では、中山間地域農村の現状と課題の把握が欠かせない。研究代表者は2年間にわたり、岩手県八幡平市、同葛巻町、同盛岡市、同花巻市、鳥取県日南町、同日野町、同米子市、熊本県人吉市、同あさぎり町、同湯前町、宮崎県綾町、同都城市などを対象に、研究課題に関する地域社会調査を実施した。具体的には、関係する役場、地方議会等公共機関に対する聞き取り調査と、地域実践に関わる住民団体のリーダーに対する聞き取り調査、さらに地域住民の個人生活史に関する聞き取り調査である。その結果、中山間地域農村においては、広域合併後の自治体の範囲、およびその域内の各小規模自治区域の両方における集合的アイデンティティ形成に関わる住民本位の実践が非常に重要であること、また地域担当職員制度など、それを人的、税的に支援するための自治体の専門機構の構築が急がれること、住民の実践の可能性を推量する上では、彼ら一人ひとりの個人生活史に裏打ちされた合理的判断や個人主義的生活様式に注目すべきであること、集合的アイデンティティの形成については、歴史や民俗、自然環境に加えて、住民自身の生活や生業の見直しを通して、彼ら自身の誇りを回復するように構築されるのが望ましいこと。中山間地域農村をいくつか抱える広域圏の社会的交流の結節としての地方都市の再生が農村にとっても地方都市自身にとっても重要であること、リゾート開発や都市の消費市場偏重ではない、農業を中心としたスローな産業振興が、農村自身だけでなく、それを流通させ、観光基盤とする地方都市にとっても重要であることなどの知見が得られた。今後はリーダー層の地域実践を支える、地域住民総体の社会意識の構造と動態を計量社会学的に調査することと、現代日本の地域政策、農業政策の政策過程論的解明を試みたい。本年度は、事例研究対象である岩手県八幡平市旧安代町地域に2回(06年8月、07年3月)、熊本県あさぎり町旧須恵村地域・人吉市に2回(06年7月、07年2月)の現地調査を行った。現地では役場各担当課、とくに市町村合併後の住民組織再編を担当する課、および新市町における産業(とくに農業)振興を担当する課に詳細な聞き取り調査を行った。また、地域住民のうち地域活性化、とくに産業振興に貢献している方々に、家族の生活史を含めた詳細な聞き取り調査を行った。これらの調査には大学院生(博士後期課程)3名が同行し、調査の補助および資料収集にあたり、また数回研究会を行って資料・情報について検討・分析した。さらに、両地域と比較対照するため、岩手県葛巻町(67年3月)、宮崎県都城市(07年2月)にも足を延ばして、資料等を収集した。これに加えて、中山間地域問題に限らず、地域行財政、市町村合併、地域産業振興等に関する文献を購入し、研究・検討した。本年度に得られた知見は次の通りである。すなわち、合併後の新自治体では行財政上中央集権化がほぼ必至であるが、それと広域にわたる中山間地域の住民生活を持続させることとの両立が難しくなっている。この問題が、自治体支所の運営、行政区の再編、新しい住民リーダーの発掘といった課題に集約的に表れており、まだその妙手は見出されていない。また、現在の中高年の住民リーダー層は自治体行政を巻き込んで地域を活性化する能力と技術を十分に培ってきているが、後継する若年層や子育て期家族が激減しているため、そうした能力や技術の継承はまったく楽観できない。その意味で「中山間地域の持続的社会形成」については、自治体職員を含むより広域の人材・社会的資源が外挿的に動員される必要がある。

本年度は岩手県八幡平市に3回(07年8月,07年12月,08年2月),熊本県あさぎり町・人吉市に3回(07年8月,07年12月,08年3月)の現地調査を行った。これに加えて鳥取県米子市,日南町にも補充調査を行った(07年10月)。さらに上記調査に連動させて宮崎県綾町(07年12月),岩手県盛岡市・花巻市(08年3月)にも補充調査を行った。現地では自治体の住民組織再編担当課と産業振興担当課に政策についての聞き取り調査を行った。これらの調査には大学院生2名(各調査1名)が同行し,調査の補助および資料収集にあたった。これに加えて地域産業振興等に関する文献を購入し,研究・検討した。本年度に得られた知見は次の通りである。すなわち,合併後の自治体では行財政上の中央集権化と効率化が必至だが,それとは別に住民の生活実態や生活意識に根付いた範囲での行政運営が不可欠である。その範囲は少子高齢化によって急速に弱体化している近隣関係より大きい必要があり,またその運営には自治体職員の継続的かつ専門的な関与が不可欠である。またこの範囲を住民の生活意識に強く根付かせるために,その範囲で地域アイデンティティを育成する仕掛け(祭りなどのイベントや成人教育などの持続的活動)が必要である。これは従来地域の自然環境や伝統文化によることが多かったが,住民の自身への誇りと地域への愛着を回復するためには,彼ら自身をアイデンティティの源泉とするような仕掛けが有効である。その意味で,彼らの生業や生活(具体的には農林漁業)を単なる経済的価値だけて計らずに振興する産業政策が必要であり,外からの企業誘致や観光振興も,それと連動する必要がある。以上の成果を調査地自治体および住民に報告し,討論の機会を持てたことも本研究の成果といえる。
分子育種への応用に向けた植物ミトコンドリア多様性の基礎的解析

期間全体を通し本研究課題では、ミトコンドリア形態変異体の単離、ミトコンドリア脂質の解析、ミトコンドリアの組織内分化の観察により、ミトコンドリア多様性の生理的意義を解明することを目的としていた。第1に、ミトコンドリア形態に関わる遺伝子スクリーニング、及び、ミトコンドリア脂質の逆遺伝学的な解析では、全く異なる二つの解析手法にもかかわらず、幸運にも、双方で関連し合うと推測される因子を発見することが出来た。具体的には、後者において、動物および酵母のミトコンドリアでリン脂質の脂肪酸交換反応を担う酵素遺伝子のホモログをシロイヌナズナで同定した。そして、その遺伝子破壊植物体は、ミトコンドリアに局在するリン脂質であるカルジオリピンの変異体と同様に、ミトコンドリアの形態が変化した。一方、前者の解析で、ミトコンドリアが不揃いな変異体の原因遺伝子を同定したところ、原因遺伝子はミトコンドリアに局在するα/β加水分解酵素であり、特に保存された領域で脂質分解酵素と類似していた。そこで、前者及び後者の変異体でリピドーム解析を行ったところ、ミトコンドリアに局在されるとされる脂質で増減が見られた。また、その変化パターンは両変異体間で正反対であった。以上の結果から、動物においても未解明の、ミトコンドリアにおける形態と脂肪酸転移反応との密接な関係を植物で発見することができた。第2に、ミトコンドリアの組織内ごとの違いやミトコンドリア関連因子の遺伝子発現を解析することで、ミトコンドリアが激しくその形を変える組織内の部位を発見した。また、ミトコンドリア分裂や配置が異常な変異体ではそれらの器官が正常に機能しなかった。さらに、それらの器官の変異体ではミトコンドリアの形態応答が異常であった。以上の解析の結果、これまでほぼ未解明のミトコンドリアの形態が植物体機能に果たす役割について推測する手がかりを得た。(抄録なし)ミトコンドリアは共生起源の細胞内小器官で多くの物質生産に関わり、植物においてハイブリッド種子の生産を容易にする細胞質雄性不稔(CMS)にも深く関与するため、農作物を含む植物の育種研究において基礎的かつ重要な研究対象である。植物におけるミトコンドリア研究はこれまで、呼吸やmtDNA、ストレス応答などに関するものが中心であったが、近年では、ミトコンドリア形態がミトコンドリアの機能を読み解く鍵として、動物や酵母ではその生理的意義について解析が進んでいる。しかし、植物でのその動態の研究は端緒についたばかりであるため、本申請課題では、ミトコンドリアの組織内分化の観察、生育不全のミトコンドリア形態変異体の単離、ミトコンドリア脂質の解析を通して、ミトコンドリア多様性の生理的意義を明らかにすることを目的としている。本年度はまず植物体内のそれぞれの組織間におけるミトコンドリア形態の多様性を記述するために、各種ミトコンドリア蛍光標識ラインの作出の準備を行った。その結果、従来から使用するミトコンドリア内膜の蛍光マーカーの他に、ミトコンドリア外膜を蛍光標識するためのベクター等を作出した。また、一過的発現系においてこれらがミトコンドリア形態を著しく変化させることなくミトコンドリアを観察できることを確認した。今後、恒常的な蛍光標識発現ラインを作出することで、植物体組織間でのミトコンドリア形態の多様性について明らかにしていきたい。また、ミトコンドリア形態の生理的意義を明らかにするため、ミトコンドリア形態が異常な変異体の中から生育に異常があるものについて単離し、現在原因遺伝子の同定を行っている。さらに、脂質とミトコンドリアの関係を明らかにするため、ミトコンドリアを構成する膜脂質であるカルジオリピンの欠損変異体やその他の変異株についてもミトコンドリア形態に関わる蛋白質の可視化ラインを作出している。本研究課題では、ミトコンドリアの組織内分化の観察、生育不全のミトコンドリア形態変異体の単離、ミトコンドリア脂質の解析を通して、ミトコンドリア多様性の生理的意義を明らかにすることを目的としている。ミトコンドリア形態の生理的意義の解明のため、ミトコンドリアの組織内分化の観察を行った。その結果、ミトコンドリアが激しくその形を変える植物ホルモン条件や組織内の部位があるとの予備的な結果を得た。また、ミトコンドリア分裂や配置が異常な変異体では、その組織がうまく機能していなかった。今後さらに検討を進めたい。生育に関わるミトコンドリア形態に関わる遺伝子を特定するため、変異体のラインについてラフマッピングおよび次世代シークエンサーを用いた解析を行い、EMSで導入されうる変異と同様の変異を原因遺伝子が存在すると思われる領域に発見した。現在、この変異がミトコンドリア形態異常の原因遺伝子であるか、相補実験を行っている。さらに、脂質とミトコンドリアの関係を解明するため、ミトコンドリアを構成する膜脂質であるカルジオリピン欠損変異体やその他の変異株についても引き続きミトコンドリア可視化ラインを作出した。特にカルジオリピンがミトコンドリア融合に与える影響について、野生型およびカルジオリピン欠損変異体でミトコンドリア融合頻度を詳細に測定した。それらの結果、カルジオリピンはミトコンドリア外膜の融合には関与せず、内膜の分裂および内膜の融合に重要な役割を果たしていた。これまでミトコンドリア外膜の融合測定系などミトコンドリアの二重膜に着目したミトコンドリア形態の解析は植物で報告されておらず、また、ミトコンドリア融合が欠損した変異体も植物では初めての報告となる可能性がある。

さらに、生物全体で、カルジオリピンが単独でミトコンドリアの融合及び分裂の両方に関与することが示された初めての報告となる可能性がある。期間全体を通し本研究課題では、ミトコンドリア形態変異体の単離、ミトコンドリア脂質の解析、ミトコンドリアの組織内分化の観察により、ミトコンドリア多様性の生理的意義を解明することを目的としていた。第1に、ミトコンドリア形態に関わる遺伝子スクリーニング、及び、ミトコンドリア脂質の逆遺伝学的な解析では、全く異なる二つの解析手法にもかかわらず、幸運にも、双方で関連し合うと推測される因子を発見することが出来た。具体的には、後者において、動物および酵母のミトコンドリアでリン脂質の脂肪酸交換反応を担う酵素遺伝子のホモログをシロイヌナズナで同定した。そして、その遺伝子破壊植物体は、ミトコンドリアに局在するリン脂質であるカルジオリピンの変異体と同様に、ミトコンドリアの形態が変化した。一方、前者の解析で、ミトコンドリアが不揃いな変異体の原因遺伝子を同定したところ、原因遺伝子はミトコンドリアに局在するα/β加水分解酵素であり、特に保存された領域で脂質分解酵素と類似していた。そこで、前者及び後者の変異体でリピドーム解析を行ったところ、ミトコンドリアに局在されるとされる脂質で増減が見られた。また、その変化パターンは両変異体間で正反対であった。以上の結果から、動物においても未解明の、ミトコンドリアにおける形態と脂肪酸転移反応との密接な関係を植物で発見することができた。第2に、ミトコンドリアの組織内ごとの違いやミトコンドリア関連因子の遺伝子発現を解析することで、ミトコンドリアが激しくその形を変える組織内の部位を発見した。また、ミトコンドリア分裂や配置が異常な変異体ではそれらの器官が正常に機能しなかった。さらに、それらの器官の変異体ではミトコンドリアの形態応答が異常であった。以上の解析の結果、これまでほぼ未解明のミトコンドリアの形態が植物体機能に果たす役割について推測する手がかりを得た。受け入れ研究室所蔵の変異体ラインを活用することにより、変異原処理等のスクリーニング工程を省くことが出来たため。研究の目的に記載した、(1)植物ミトコンドリア多様性の観察、(2)育種への応用に向けた植物におけるミトコンドリア融合変異体の単離、(3)CL関連変異体のさらなる解析について、それぞれ、(1)今後の解析が期待される期待以上の成果、(2)期待した融合の変異体は得られていないものの新規遺伝子の記述という概ね順調な結果、(3)期待以上の成果が得られているため。今後もほぼ計画の通り研究を進めていく。昨年の予定通り今後も研究を推進し、成果を発表する。(抄録なし)
マイクロサテライト不安定性標的遺伝子MBD4変異と大腸がん薬物療法の感受性変化

大腸がんに対する薬物感受性について以下の内容を明らかにした。(1)変異型ヒトMBD4組換え蛋白は、dsDNAに組み入れられた5FUの認識能が野生型より高かった。(2)変異型および野生型MBD4安定発現大腸がん細胞株を樹立させ、それぞれに5FUを投与したところ、変異型MBD4発現株において5FUの感受性が高まった。(3)変異型MBD4発現大腸がん細胞における5FU投与によって、G2/M arrestを経て細胞死が誘導された。大腸がんの発育進展の原因のひとつであるマイクロサテライト不安定性(MSI)により誘導されるDNAグリコシラーゼmethyl-CpG bindingdomain protein 4 (MBD4)のフレームシフト変異が、大腸がん化学療法のKey Drugである5FU系薬剤に対する大腸がん細胞の感受性をどのように変化させるかを解明すること、また、大腸がん細胞内での変異型MBD4の発現が5FU系薬剤投与下におけるMBD4の下流の塩基除去修復(Base Excision Repair; BER)経路に与える影響を解析することにより、5FU系ベースの薬物療法の治療効果向上のための標的分子を探ることを目的として研究を行っている。今年度は以下のことが判明した。1変異型MBD4がDNAに取り込まれた5FUに対して高親和性であった。2変異型MBD4がDNAミスマッチ修復蛋白のDNA中の5FUに対する認識、親和性を阻害した。3変異型MBD4発現大腸癌細胞株を樹立した。4樹立したMBD4発現大腸癌細胞株では、S phase arrestを介して5FUに対する感受性を高めた。大腸がん患者の5FU感受性を確認することは安全に有効な大腸がん薬物療法を推進する上で重要であり、その中でマイクロサテライト不安定性およびDNAミスマッチ修復機構にかかわりのあるMBD4変異についての病態、治療感受性解析は今後も重要になる可能性があり、来年度以降は臨床データと照らし合わせたトランスレーショナルな検討を行う予定である。平成26年度は以下について検討した。1)5FU投与下での変異型MBD4のDNA Damage Response (DDR)およびhMLH1への関与;hMLH1が発現していない大腸がん細胞株HCT116および正常なhMLH1遺伝子の存在する第3番染色体が人工的に導入されhMLH1が発現している大腸がん細胞株HCT116+ch3にそれぞれ野生型MBD4発現プラスミドを導入し、5FUを投与したところ、hMLH1発現株と同様、変異型MBD4発現株で細胞障害度が高かった。すなわち、変異型MBD4の影響はhMLH1発現状況に依存しないことが判明した。2)臨床サンプルを用いた、MBD4変異の有無による大腸がん患者の5FUに対する効果の影響;MBD4変異がDNAミスマッチ修復(MMR)異常を呈する大腸がんの26-43%で存在しているという臨床的事実と、申請者がすでに予備データに示し、本研究で解明する変異型MBD4と5FUに対する感受性変化に関しての臨床的意義を検討するために、以下の方法で実験を行うために現在患より同意を取得後に大腸がん組織および正常大腸粘膜からのDNAを抽出する作業を行っている。1.過去に5FUベース薬物療法を施行した大腸がん症例において、治療前に採取された大腸がん組織およびその近傍の正常組織からDNAを抽出し、PCR-SSCP法およびダイレクトシーケンス法によりMBD4変異の有無を確認し、MBD4変異なし群とMBD4変異あり群の2群に分ける。2.2群間において、5FUベース薬物療法に対する治療効果をretrospectiveに比較検討する。この作業および解析は平成27年度も継続の予定である。本研究は、大腸がんの発育進展の原因のひとつであるマイクロサテライト不安定性(MSI)により誘導されるDNAグリコシラーゼmethyl-CpG bindingdomain protein 4 (MBD4)のフレームシフト変異が、大腸がん化学療法の薬剤に対する感受性をどのように変化させるかを解明することを目的としている。また、大腸がん細胞内での変異型MBD4の発現が抗がん薬投与下におけるMBD4の下流の塩基除去修復(Base Excision Repair; BER)経路に与える影響を解析することにより、薬物療法の治療効果向上のための標的分子を探ることも目的とした。平成26年度までには以下のことが判明した。1)変異型MBD4蛋白はDNA中の5FUへの親和性が高い。2)変異型MBD4発現HCT116細胞は5FUへの感受性が高い。さらに続いて平成27年度には、以下のことが判明した。3)トリフルリジン(FTD)の感受性はDNAミスマッチ修復異常の有無に関わらず同様の感受性がある、4)FTDの感受性は5FU長期暴露後に生じた耐性細胞株において感受性が高い、4)FTDの感受性は変異型MBD4発現細胞に感受性がより高い。5)FTDの暴露によって、変異型MBD4発現細胞はG2/M停止を経て細胞死に至る。今後臨床例での確認を行う予定である。同意を取得作業および検体数が少ないため、来年度も引き続き該当症例については同意の取得を行っていく。

消化器内科学今後は今までに培養細胞を用いて判明した結果が臨床的にどのように反映されているかの検討を行う予定である。以下のことが今年度明らかになった1.変異型MBD4のDNA中の5FU認識除去能の検討:1変異型MBD4がDNAに取り込まれた5FUに対して高親和性である2変異型MBD4がDNAミスマッチ修復蛋白のDNA中の5FUに対する認識、親和性を阻害する。2.変異型MBD4存在下での5FU系薬剤感受性変化の検討1変異型MBD4発現大腸癌細胞株を樹立した。2樹立したMBD4発現大腸癌細胞株では、S phase arrestを介して5FUに対する感受性を高める。ほぼ計画通りの進行状況かと思われる。DNA中の5FUが野生型MBD4に認識除去されその結果PARP1を含む下流のBER経路が活性されることが推測されるが、変異型MBD4では、5FU投与後に下流のBER経路が活性化されないことが予測される。このことを踏まえ、(1)野生型および変異型MBD4安定発現細胞株にそれぞれ5FUを投与後、細胞を回収し蛋白を抽出する。得られた蛋白をWestern Blot法を用いてBER経路に重要な役割を果たす分子群の発現を比較検討する。(2)PARP阻害剤と5FUとの併用投与による細胞障害度が変異型MBD4の発現の有無で変化するのか否か、野生型および変異型MBD4安定発現細胞株を用いてMTS assayおよびClonogenic Assayで比較検討する。5FU系薬剤投与によるDDR経路の活性化に野生型MBD4の発現が必須なのか、さらに変異型MBD4がDDR経路の活性化に影響を及ぼすのかは不明である。また、野生型MBD4はhMLH1と結合し、その結合部位は野生型MBD4のC末端に存在する。すなわち理論上はC末端の欠損している変異型MBD4とhMLH1は結合しないがこの理論を検証した実際の報告はない。これらの背景より、(1)野生型および変異型MBD4安定発現細胞株にそれぞれ5FUを投与後、WesternBlot法を用いてDDR経路に重要な役割を果たす分子群の発現パターンを比較検討する。(2)hMLH1が発現していない大腸がん細胞株HCT116およびhMLH1が発現している大腸がん細胞株HCT116+ch3にそれぞれ野生型MBD4発現プラスミドを導入し、5FU投与下での細胞障害度の違いを比較する。(3)HAタグ付き野生型および変異型MBD4発現プラスミドをそれぞれ遺伝子導入したMSI陰性大腸がん細胞株から抽出した核蛋白と抗HAタグ抗体を使用して免疫沈降を行いWestern Blot法で確認する。
C型肝炎ウイルスNS遺伝子のリバビリン併用インターフェロン療法への影響

リバビリン併用インターフェロン(IFN)療法は、従来のIFN単独療法に比べGenotype 1Bの高ウイルス症例に対しても有効とされている。これまでIFN単独療法の有効率とHCVのNS遺伝子の変異に相関があることが知られているが、リバビリン併用IFN療法とNS5Aの変異の関係は明らかではない。Genotype 1Bで高ウイルスのC型慢性肝炎34例において、リバビリン併用IFN療法を24週間行い、有効率とNS5Aの変異の関係を検討した。治療終了時点でのALT正常化は24例(70.6%)に見られたが、治療終了24週後の最終的な有効率は6例(17.6%)であった。NS5Aの変異と有効率の関係を見てみると、有効例はすべてNS5Aに変異を持った症例であった。NS5Aの変異数は有効例で平均4.5個で、無効例の平均1.1に比べ優位に変異数が多かった。また、ウイルス量は、有効例と無効例の間に差は無かった。以上より、リバビリン併用IFN療法においてもNS5Aの変異が有効率と密接に関わっている事が示された。現在、HCVのcDNAレプリコンを用いた研究が多く発表され、HCVの基礎的研究が進められている。我々は、元来人工補助肝臓システムとして開発された3次元高密度培養装置であるラジアルフロー型バイオリアクター(バイオット株式会社)に着目した。本システムの特徴は、肝細胞をより生体に近い条件で培養できる点である。本システムを用いる事で、培養細胞へのウイルス感染とウイルス増殖さらに感染性のあるウイルス粒子の放出が期待された。我々は、このシステムを使ってHuh-7細胞を用いたHCVの感染実験を行うべく準備を進めた。3次元高密度培養には、5mlのハイドロキシアパタイトビーズを担体に用いた。5×10^6個のHuh-7細胞をメディウムに添加し培養すると、約4週間に渡って培養され、細胞密度は1×10^8個/mlとなった。他施設では、HepG2細胞を用いてアルブミンやAFPの産生も確認されている。また、HCVのcDNAレプリコンを3次元高密度培養で培養したHuh-7細胞に添加すると、NS蛋白の発現が確認されている。我々の施設では、残念ながら未だHCVの感染やウイルス蛋白の検出には至っておらず、今後の検討課題である。また、cDNAレプリコン以外にもレトロウイルスを用いた系や、動物モデルの作成が急がれている。本システムを用いる事で、培養細胞へのウイルス感染とウイルス増殖さらに感染性のあるウイルス粒子の放出が期待される。現在我々は、このシステムを使ってHuh-7細胞とHepG2細胞を用いたHCVの感染実験を行うべく準備を進めている。

現在、HCVのcDNAレプリコンを用いた研究が多く発表され、HCVの基礎的研究が進められている。我々は、元来人工補助肝臓システムとして開発された3次元高密度培養装置であるラジアルフロー型バイオリアクター(バイオット株式会社)に着目した。本システムの特徴は、肝細胞をより生体に近い条件で培養できる点である。本システムを用いる事で、培養細胞へのウイルス感染とウイルス増殖さらに感染性のあるウイルス粒子の放出が期待された。我々は、このシステムを使ってHuh-7細胞を用いたHCVの感染実験を行うべく準備を進めた。3次元高密度培養には、5mlのハイドロキシアパタイトビーズを担体に用いた。5×10^6個のHuh-7細胞をメディウムに添加し培養すると、約4週間に渡って培養され、細胞密度は1×10^8個/mlとなった。他施設では、HepG2細胞を用いてアルブミンやAFPの産生も確認されている。また、HCVのcDNAレプリコンを3次元高密度培養で培養したHuh-7細胞に添加すると、NS蛋白の発現が確認されている。我々の施設では、残念ながら未だHCVの感染やウイルス蛋白の検出には至っておらず、今後の検討課題である。
DNA修復機構の、逆遺伝学的手法(ニワトリ細胞株とメダカ)による機能解析

抗がん治療は、放射線のように,染色体DNAを損傷し、細胞自殺を誘導するものが多い。この理由から、各修復因子の機能を解析することは、抗がん治療の効果を増大させることに役立つ。機能解析には、逆遺伝学的解析が有効である。我々は、ニワトリDT40細胞とメダカというユニークな逆遺伝学的実験手法を開発した。DT40の解析から、我々は、ユビキチン化、DNAポリメラーゼ、BRCA1/2の機能解析に貢献した。DNA修復機構の、逆遺伝学的手法(ニワトリ細胞株とメダカ)による機能解析研究実績の概要:(1)メダカの遺伝子破壊実験系を樹立野生型のオスのメダカ100匹をエチルニトロソウレア(ENU、点変異導入化合物)処理した。そのオスを健康なメスと交配して得られたF1(5760匹)から精子と染色体DNAとを取り、共に半永久的に凍結保存した。F1のDNAを解析し、EMUが1/300Kbの頻度で点変異を導入していることを確認した。これまでにp53,Bloom helicaseなど合計5種類の遺伝子をヌル破壊できた。(2)p53欠損メダカの表現型解析放射線照射後に、アポプトーシスが大きく遅れ、p21遺伝子の発現誘導がかからなかった。野生型メダカでは6カ月齢まで腫瘍の発生は極めて稀であるのに対し、p53欠損メダカでは3カ月齢までに50匹中2匹でリンパ系の腫瘍が発生した。(3)ニワトリDT40細胞株を使ったシスプラチンによるDNA損傷の修復機序の解析合計35種類の遺伝子をそれぞれ破壊した株を使って、クロスリンカー化合物に対する感受性を系統的に解析した。その結果、損傷乗り越えポリメラーゼ(Polz)、ファンコニ貧血原因遺伝子、相同組み換えがDNA修復に重要であることが解明できた。(4)NOのDNA毒性を検出するアッセイ系の樹立野生型DT40細胞に影響を与えないNO濃度で、Polz欠損株は染色体断裂を多発することを見い出した.我々は、ニワトリB細胞株(DT40)とメダカとを使った逆遺伝学的解析によって、ゲノム維持機構と、X線やトポイソメラーゼ阻害薬、シスプラチンなどDNA損傷を誘導するタイプの抗がん治療の作用機序(がん細胞側の、治療に対する耐性化機構)とを研究している。遺伝子破壊メダカを生産するシステムを樹立した(研究発表の6番目)。従来、100万円の予算を使い脊椎動物で遺伝子破壊できるのはマウスだけだったが、メダカがその第2の脊椎モデル動物になった。メダカでは、ES細胞がないので、ゼブラフィッシュで開発された飽和変異という手法を用いる。ただしゼブラフィッシュでは、遺伝子破壊にかかるコストがメダカより1桁高い。10種類の遺伝子破壊メダカを作製した。このうちp53欠損メダカは、様々な種類の固形腫瘍が生じた(研究発表の6番目)。一方、Loss of Heterozygosityを高頻度で起こす劣性遺伝病の原因遺伝子、Bloom helicaseの欠損メダカは、相同組み換えの後期ステップの異常が原因と考えられる精子形成不全の表現型を示した。ちなみに、マウスのBloom helicase欠損は、胎生致死であり、Bloom病患者との表現型の違いの原因は不明である。DT40細胞から、14種類あるDNAポリメラーゼの各遺伝子破壊細胞株を作製・解析中である。相同組み換えを含むDNA修復には、DNA合成のステップがあるが、どのDNAポリメラーゼがどの修復経路に関与しているかは、ほとんど未解明である。我々は、Polhが相同組み換えと損傷乗り越えとに関与すること、PolQが酸素ラジカルで発生した塩基損傷の除去修復と損傷乗り越えとに関与することを、それぞれMol Cellに発表した(Kawamoto et al. 2005;研究発表の5番目)。現在、ポリメラーゼの多重遺伝子破壊を実施中である。#プロテオソーム阻害剤の抗ガン作用機序の解明(Murakawa, et. al., Cancer Res. 2007)我々は、Mol Cell 2007年に、E2ユビキチンリガーゼ、Ubc13が相同組み換えに関与していることを報告した。Ubc13の作用機序を解明する為に、プロテオソームが相同組み換えに関与するか否かを解析した。その結果、Ubc13と同じステップ(DNA切断端から単鎖を形成するステップ)でプロテオソームが相同組み換えを促進することがわかった。相同組み換えは、抗がん剤、シスプラチンやカンプトテシン処理によって生じたDNA損傷を修復する。よって、これらの抗がん剤とプロテオソーム阻害剤とを併用すると、抗がん剤の作用を増強できる。#P53依存性の、精子DNAにおける変異抑制の解明メダカやゼブラフィッシュでは、ES細胞がない。

そこで、遺伝子破壊の為には、メダカが死なない最大濃度の変異誘導剤(ENU)で♂を処理し、大量の変異を精子DNAに誘導(飽和変異)したあと、♀と交配する。そして、たくさんのF1(5700匹)のDNAと精子とを凍結保管し、その5700匹のなかで、解析したい遺伝子が破壊された個体を、5700匹の各DNAをPCR→塩基配列決定によって捜す。我々は、p53遺伝子破壊メダカを作製し、それが高発がんであることを確認した。p53は、大量のDNA損傷を持つ細胞に、アポプトーシスを誘導したり、複製をブロックすることによって、変異の直積を防止しているはずである。ただし、それを証明した研究はない。この問題を解決する為に、我々は、野生型とp53欠損のメダカ♂を、それぞれENUで処理し、生存率を調べた。その結果、p53欠損メダカは野生型よりもENU耐性であることがわかった。これから、飽和変異♂と健康な♀から生じたF1の変異誘導率を解析予定である。相同組み換えは、DNA修復反応であり、必ず、DNA損傷から開始される。相同組み換えを開始させるDNA損傷については、1重鎖ギャップと2重鎖切断とが想定されていた。そして、2重鎖切断が相同親み換えを開始することは、証明されていたが、1重鎖ギャップが相同組み換えを開始できるか否かは謎であった。我々は、ニワトリ抗体遺伝子の相同組み換えによる多様化は、1重鎖ギャップによって開始されることを証明した。そしてNBS1は、1重鎖ギャップの幅を拡げることによって、相同組み換えを促進することを示した。抗がん剤、シスプラチンが複製をブロックしたときに、2重鎖切断のみならず、1重鎖ギャップが大量に形成される。NBS1は、このギャップを修復するのに重要であることが示唆された。放射線治療によって2重鎖切断が生じると、ATMなどのキナーゼが活性化され、最終的に細胞死などが誘導される。イギリスのグループが、ATMの基質の1つとしてCEP63を単離した。我々は、彼等との共同研究として、CEP63の機能解析を実施し、CEP63が放射線照射によって生じるM期カタストロフィーの防止に重要な役割を持つことを解明した。発表論文では、我々の教室のタイ人院生が第2著者になった。#メダカの遺伝子破壊の効率化1遺伝子破壊に100万円の費用がかかる。基生研と共同して、次世代シークエンサーを用い、遺伝子破壊の費用を低下させる為の努力を行なっている。(1-1) CTIPの機能解析CTIPは、BRCA1(家族性乳がん原因遺伝子で相同組み換えに関与)と結合する。CTIP完全欠損細胞とBRCA1と結合できないCTIP S332A発現細胞とを作った。そしてCTIPが、BRCA1依存的およびBRCA1非依存的に機能するDNA修復をそれぞれ解明することを試みた。以下の2点を解明した:(i)CTIPがBRCA1非依存的に相同組換えの最初のステップに機能する。(ii)CTIPがBRCA1依存的に、トポイソメラーゼポイズンと呼ばれる抗がん治療薬によって生じた2重鎖切断(切断端にトポイソメラーゼが共有結合)を修復するのに特異的に関与(共有結合したポリペプチドを除去)する。この研究成果は、PLoSGeneticsに発表した。SSB1-/-細胞とSSB2-/-細胞とをそれぞれ作製した。これからSSB1-/-/SSB2-/-
高機能高品質ソフトウェアの基礎理論

高機能高品質ソフトウェアの基礎理論に関して,次のような研究を行った。[1]プログラムのモデルと論理に関する研究(担当:伊藤)並列プログラムにおける同時並列性を表現するための理論モデルと論理体系についての研究を行った。結合律を満す並列合成だけでなく,結合律を満さない並列合成をも有する強力な並列プロセス計算σー計算の提案を行った。また,代数的ペトリネットを提案し,プロセスとネットの関係を明らかにした。[2]プログラムの論理と証明に関する研究(担当:佐藤)構成的数学の体系RPTに基づき,構成的プログラミングを実践するための一連のシステムを計算機上に構築し,それを用いて実際に証明を構成することを試みた。[3]プログラミングと証明に関する研究(担当:萩谷)例による証明とプログラミングに関するヒュ-リスティック戦略について研究を深めた。また,構成的体系CCの証明チェッカを開発した。[4]プログラムの証明論と型理論に関する研究(担当:林)論理的仕様からの構成的プログラム抽出のための型理論ATTを改良したATTTという型理論を設計し,その理論的性質について研究を行った。[5]並列プログラミングパラダイムに関する研究(担当:萩原)並列・分散アルゴリズムのためのプログラミングパラダイムを確立する研究の一環として,並列計算モデルのアルゴリズム・アニメ-ション・システムAASをいくつかの計算モデルに対して試作し,改良も行った。また,超立方体状ネットワ-クでの置装ル-ティングに対し決定性アルゴリズムと確率アルゴリズムをシミュレ-ションにより評価した。
刑事弁護の理論と実践的課題についての研究

わが国における刑事弁護は、明治初年に治罪法(1880年)によって近代的な刑事手続が導入されると同時に制度確立への第一歩を踏み出すことになった。とはいえ、公判段階(治罪法、旧々刑訴法)だけか、せいぜい予審段階になって(旧刑訴法)選任が認められていただけであり、官選弁護も限定されていた。これに対して、戦後改革は、日本国憲法34条、37条によって、被疑者段階からの弁護人依頼権を保障し、被告人に限定のない弁護士による国選弁護権を保障することになった。しかし、現行刑訴法が、被疑者段階からの弁護人「選任」権を保障したにとどまるかのような規定を置き、複疑者段階の国選弁護の規定を置かなかったこともあって、被疑者段階での弁護人選任率は、確たる統計数値はないものの低率にとどまっていたことは間違いない。そのことが、自白偏重捜査を消極的にであれ支えていた。それゆえ、学説は早くから当事者主義刑事訴訟法理論の体係化とともに、解釈論として被疑者段階の弁護権の伸張を主張してきた。自由接見交通の原則と取調立会権であり、その実効性を担保するための憲法の解釈可能性を前提とした被疑者国選弁護の導入である。これらの主張は、司法の危機といわれた司法状況の展開と弁護士の状況から生まれた「刑事弁護離れ」によって実践的には顧みられなかった。しかし、死刑確定囚4人までもが無罪であったというわが国の刑事手続の実情の打開に刑事弁護の充実・強化が不可欠であるとの認識の広がりが、日弁連刑事弁護センタ-を発足させ、当番弁護士制度を生むことになった。本研究は、このような状況変化までの経緯を総括し、その上で憲法34条、37条を基礎とした、刑事手続の全場面での弁護人の援助を可能にする解釈論を追求したものであり、その可能性を示している。本年度は、理論的再検討の現実的基盤の有無、及び弁護活動の実践的可能性の限界を確認するため、わが国における刑事弁護の実情を、実証的、総合的に把握することに力点をおいてきた。具体的には、第一に、現実に進行している事件における弁護活動の実情を、記録によるだけでなく、法延傍聴や弁護団会議への出席等によって把握しようとした。対象とした事件としては、最高裁で死刑判決が破棄され、名古屋高裁に差し戻されていた山中事件、福井地裁で一審無罪になった前川事件、再審請求棄却決定に対する異議審の審理が名古屋高裁で行われている名張事件、最高裁で上告が棄却され死刑が確定した諸橋事件、そのほかに起訴前弁護活動が注目を集めた名古屋バラバラ殺人事件、金沢保険金「殺人」事件等がある。第二に、1990年4月に発足した日弁連の刑事弁護センタ-の活動状況について調査を行った。第三に、弁護士会として刑事弁護の充実を目指す動きが全国的に広がっているが、その最先端をいっている福岡県弁護士会が1990年12月から開始させた当番弁護士制の実情についても調査した。以上の調査研究により、刑事弁護の実践主体である弁護士、弁護士会の刑事弁護の充実へ向けた体制づくりが本格化してきていることが明らかになった。しかし他方で、理論的に弁護活動の法的可能範囲を確認する作業が遅れており、警察・検察、裁判所によって形成されてきた不動な慣行に十分対抗できていない。そこで、憲法制定過程にまで遡った刑事弁護に対する要求内容を確認する作業もはじめている。さらに、起訴前弁護を中心にわが国よりはるかに進んだ刑事弁護が行われているアメリカ、イギリスについて検討を開始した。

本年度は、昨年度に引続き、第一に、理論的再検討の現実的基盤の有無、及び弁護活動の実践的可能性の限界を確認するため、わが国における刑事弁護の実情を、実証的、総合的に把握する作業を継続してきた。方法としては、記録による調査・分析、法延傍聴、弁護人の準備活動状況の観察等を行ってきた。また、日本弁護士連合会が一昨年(平成2年)4月1日に発足させた刑事弁護センタ-の活動状況についての調査、同じく一昨年12月1日から福岡県弁護士会が全国に先駆けて実施したいわゆる待機制(ロタ制)当番弁護士の実施状況の調査を行ってきた。その結果、起訴前段階を中心に、憲法、刑訴法の解釈・運用によって可能な弁護権の行使が、全体としてはなお不十分な状況にあること。しかし、全国的な当番弁護士制の実施によって事態打開への現実的基盤が急速に整いつつあることを確認することができた。第二に、第一の作業を基礎に、従前のわが国における憲法、刑事訴訟法理論上の刑事弁護の位置づけを整理し、明確にするとともに、その意味と問題点について検討してきた。その際、諸外国、特にわが国でこの間急速に展開している当番弁護士発祥の地であるイギリスの制度を中心に刑事弁護制度の歴史的展開の経緯と現在の実情について、主として文献に依拠しながら整理・検討してきた。そして、憲法が被疑者の身柄拘束直後から弁護権を保障し、その実効性を確保するために、被疑者国選をも想定していると考えられること。イギリス等でも紆余曲折はあったものの、身柄拘束直後から十全な弁護権が保障されていることなどを確認した。そして、最後に、実践的に可能な刑事弁護の課題を明かにしながら、捜査、公訴、公判、上訴、再審等手続全般にわたって、弁護権を中核とし、基礎とする刑訴法理論の体系化を展望し、新たな解釈可能性を追求してきた。
牛白血病ウイルスの垂直伝播と発症リスクに関する研究

畜産の生産性を向上させるためには、慢性感染症対策が欠かせない。牛白血病ウイルスの感染を原因とする牛白血病は、現在、日本の畜産現場で最も被害が大きい慢性感染症の1つであるが、ワクチン、治療薬がなく、感染および発症を防ぐには地道な対策が必要となる。本研究では、牛白血病ウイルスの垂直感染に着目した。垂直感染は感染期間が長くなるため、牛白血病の発症との関連が疑われる。本研究の結果、400 copies/10 ngを超える牛では、有意に垂直感染の確率が高いことを明らかにした。本研究の結果、垂直感染を防ぐためには、感染ウイルス量を測定し、感染ウイルス量の多い牛を可能な限り、繁殖に用いないことが重要である。平成26年度は、牛白血病ウイルス感染母牛から生まれた新生子牛の血液を採材し、牛白血病ウイルスの垂直感染の確率およびリスク因子に関する解析を行った。牛白血病ウイルスに感染していた母牛129頭から生まれた子牛のうち、14頭(10.8%)で胎盤感染が、10頭(7.7%)で産道感染が認められた。計18.6%で子牛への胎盤および産道感染が起きたことになり、これは4-6%で垂直伝播するとした過去の報告と比べても高い値となった。次いで、胎盤・産道感染におけるリスク因子を明らかにするため、母牛の感染ウイルス量、分娩介助の有無、子牛の品種、母牛の出産回数と胎盤・産道感染との相関を比較した。母牛の感染ウイルス量と胎盤・産道感染の相関を比較したところ、感染ウイルス量の増加に比例して、胎盤・産道感染の確率が増加した。また、10 ngの抽出ゲノム中、牛白血病ウイルスの感染コピー数が400 copies未満の群では胎盤・産道感染の起こる確率が9.4%(9/95)であったのに対し、それ以上の群では48.2%(14/29)であった(P<0.01)。このことから、母牛の感染ウイルス量が産道・胎盤感染の重要なリスク因子であることが明らかとなった。続いて、分娩介助の有無、子牛の品種、母牛の出産回数と胎盤・産道感染との相関を解析したが、有意な違い認められなかった。牛白血病ウイルスは主に水平感染で伝播する。そのため、感染牛の隔離、衛生対策が農場内での感染を防ぐために重要である。いっぽうで、感染率を下げるためには、非感染牛を増やす必要がある。繁殖母牛の感染ウイルス量を把握し、感染ウイルス量に基づいた更新計画、分娩計画を立てることが、非感染牛の増加につながる。なお、本研究成果はThe Veterinary Record誌に筆頭著者として発表した。平成27年度は前年度の研究成果である感染ウイルス量をベースにした牛白血病ウイルス(以下、BLV)対策を活用し、地域レベルでのBLV対策を行った。宮崎県A地区におけるBLV感染状況と感染ウイルス量、各農場で分布するウイルスの遺伝子型を解析した結果、A地区の感染率は4.9%であること、感染ウイルス量が少ない牛が長期間(30ヶ月)に渡って感染源とはならないこと、農場間距離に依らずに各農場で異なる遺伝子型のBLVが分布することが明らかになった。この結果は、感染ウイルス量の高い牛に対する感染対策がより効率的であることやBLVが農場間伝播するのではなく、感染した牛の導入によって広がることを示す貴重な知見である。なお、本研究成果をJournal of Veterinary Medicine誌に筆頭著者として発表した。また、BLVの感染ウイルス量と感染牛の予後との相関解析を行った。BLV感染ウイルス量が多い牛が感染源となること、免疫機能が低下することなどはすでに報告があるが、その牛の予後についてはわかっていない。現在、解析を終了し、感染ウイルス量が多い牛では感染ウイルス量が少ない牛と比較して有意に事故率が高いことが明らかになった。この結果はBLV感染症の被害が牛白血病の発症だけに限らない貴重な情報である。本研究成果については、現在、論文にまとめている段階で、平成28年度中の発表を予定している。前年度に牛白血病ウイルスに垂直感染した牛の予後を解析する予定であったが、飼養中の牛が多く、解析をするにはもう少し時間を置いたほうがいいと判断し、本年度は地域レベルでのBLV対策に関する研究を主に行った。当初の計画通り、3年目に垂直感染した牛の発症リスク解析を行えるため、本研究は順調に進展している。平成28年度は、平成27年度の研究成果である地域レベルでの牛白血病対策を、対象地域をさらに宮崎県内全体に拡大して行った。平成26年度に感染ウイルス量が少ない牛は、垂直感染の感染源とならないことを明らにしたが、感染ウイルス量が少ない牛と多い牛を決定する要因は明確ではなかった。本研究では、宿主が保有する抵抗性遺伝子DRA*0902に着目し、約10%の牛がこの遺伝子を保有すること、保有する牛がほぼ100%の確率で感染ウイルス量を20 copies/50 ng以下に制御できることを明らかにした。本研究成果はJournal of Veterinary Medicine誌に投稿済で審査中である。また、宮崎県内各地で同定した牛白血病ウイルス遺伝子を用いて、侵入経路の推定、病原性や発症との関連性を明らかにするため、ウイルスのenv遺伝子をターゲットした遺伝子型タイピングを行った。本研究の結果、発症率との明確な関係は不明なままであったが、遺伝子型I型が宮崎県内では、そのほとんどを占めることを明らかにした。

この情報は、今後の県内における牛白血病対策に有用なものになると思われる。なお、本研究成果はJournal of Veterinary Medicine誌に報告した。これまでの結果から、感染ウイルス量が一定以下の牛が水平および垂直感染の感染源とならないことがわかってきた。本法を利用するためにはリアルタイムPCRによる定量が必要となる。しかし、リアルタイムPCRは検査機械および消耗品が高価なこともあり、より安価な機械および消耗品で実施できる必要がある。本年は、その同定法の開発を開始した。今後は、この開発にも力を入れていきたい。畜産の生産性を向上させるためには、慢性感染症対策が欠かせない。牛白血病ウイルスの感染を原因とする牛白血病は、現在、日本の畜産現場で最も被害が大きい慢性感染症の1つであるが、ワクチン、治療薬がなく、感染および発症を防ぐには地道な対策が必要となる。本研究では、牛白血病ウイルスの垂直感染に着目した。垂直感染は感染期間が長くなるため、牛白血病の発症との関連が疑われる。本研究の結果、400 copies/10 ngを超える牛では、有意に垂直感染の確率が高いことを明らかにした。本研究の結果、垂直感染を防ぐためには、感染ウイルス量を測定し、感染ウイルス量の多い牛を可能な限り、繁殖に用いないことが重要である。牛白血病ウイルスの垂直感染の確率およびリスク因子の解析を当初の予定を上回る期間で終了し、誌上発表することができた。また、本研究の過程でウイルスの水平伝播に関するデータも集めることができたことから、農場における感染源の推定に関する研究成果をまとめ、The Journal of Veterinary Medical Science誌に投稿した(平成27年4月、採用決定)。今後は牛白血病ウイルスに垂直感染した牛の予後を解析する。垂直感染と発症リスクとの間に相関があることはヒトの腫瘍ウイルス感染症で知られているが、BLV感染症では感染経路と発症リスクとの相関は明らかになっていない。また、BLVの垂直感染が、近年、増加が示唆されている若齢牛での牛白血病増加の一因であるのかについても検討する。獣医感染症学今後は牛白血病ウイルスに垂直感染した牛の予後評価を行い、垂直伝播と発症との相関を解析する。具体的には増加している若齢の発症牛の解析を中心に行う。現在、解析を行っている6ヶ月齢の発症牛では、ウイルス遺伝子に大きな脱落が認められた。感染性分子クローンの作製などを通じて、この脱落による影響を評価する。また、発症との関連を探るため、垂直伝播したウイルスにどの程度変異が導入されるのかを解析する。研究は概ね順調に進んでいるが、実験で使用する消耗品がキャンペーン価格等、割安で購入できたために使用額が1割程度当初の予定より余った。研究が順調に進んでいることから追加実験を予定している。
急激な血糖変動によるラットの異常行動に関する栄養学的検討

うつ病と低血糖症状は類似していることが報告されている。また糖尿病および耐糖能異常患者ではうつ病の合併が多く見られ、さらにうつ病患者においても糖尿病や耐糖能異常が合併しやすいことが報告されている。本研究では耐糖能異常および糖代謝異常に伴う、気分障害等の精神神経疾患発症メカニズムを解明するために、うつ病患者の血糖変動や気分症状等への影響と、急激な血糖変動を誘起させたラットの行動変化と内分泌への影響について検討した。その結果、うつ病患者では耐糖能異常と低血糖時の中枢神経症状がみられたが、血糖変動させたラットでは異常行動や内分泌への大きな影響は見られなかった。本年度は、主にヒトでの観察研究を行った。研究の同意が得られ、糖尿病診断基準に合致する者を除外した健常者6名、気分障害患者12名の計18名を対象に、約12時間の絶食下で、身体計測、安静時代謝量、気分症状、低血糖症状、抑うつ症状を評価し、採血を行った後に75gのグルコースを負荷し、30-300分後に体温・血圧・脈拍の測定、気分症状・低血糖症状の評価、採血、採尿を行った。グルコース負荷前血液より、グルコース、HbA1c、インスリン、血清脂質、アディポネクチン、レプチン、8-OHdGを測定し、グルコース負荷後血液より、グルコース、インスリンを測定した。身体の栄養状況は、安静時代謝量、身体活動量、食事調査で評価した。対象者の属性は、健常群は男性2名、女性4名で、平均年齢は40.3±11歳、気分障害群は男性4名、女性8名で、平均年齢は46.1±13歳だった。解析結果より、血糖値は健常群に対して気分障害群において有意に高値で推移した。酸化ストレスマーカーである血中8-OHdGは、健常群に対して気分障害群で有意に高値を示した。低血糖症状と気分症状の経時変化では、気分症状は両群ともあまり大きな変化はみられなかったが、低血糖症状の中枢神経症状でのみ、健常群に対して気分障害群において、有意に高値で推移した。中枢神経症状10項目のうち、「集中できない」、「だるい」、「しゃべりづらい」の項目で、健常群に対して気分障害群で高値を示した。気分障害群には、薬物治療を行っている者と行っていない者が含まれているが、いずれも同様の結果が見られたことから、本研究結果への薬物の影響は除外できることが示唆された。今回の試験では被験者数が非常に少ないため、被験者数を増やして検討する必要があるが、現段階では、気分障害患者は健常者より食後の血糖値が上がりやすく、血糖変動も大きいため、空腹時血糖値だけでなく、グルコース負荷試験による血糖測定の必要性が示唆された。前年度の結果より、気分障害患者は血糖値が上がりやすかったことから、実験1ではラットに毎日定時に経口よりグルコース負荷を行い、1か月後のラットの行動観察と経口グルコース負荷試験(OGTT)、インスリン負荷試験(ITT)を行って、ラットの異常行動と耐糖能を検討した。OGTT及びITTにおいて、グルコース負荷群ではインスリン抵抗性がみられたが、オープンフィールドによる行動試験においては、両群に大きな差はみられなかった。前年度の研究結果より、血糖値の上がりやすい気分障害患者の食生活を検討したところ、糖質および脂質の摂取過剰がみとめられたことから、実験2では高脂肪・高ショ糖食でラットを1カ月間飼育し、毎日定時に経口よりグルコース負荷を行い、検討を行った。OGTT、ITTにおいて、グルコース負荷群では著しいインスリン抵抗性がみられたが、行動試験においては両群に大きな差はみられなかった。実験1と2より、異常行動を誘起させるにはさらに激しい血糖変動必要があると考えられたため、実験3では腹腔よりグルコースおよびインスリンを、毎日交互に投与して1ヶ月飼育し検討を行った。OGTTでは両群に差はみられなかったが、ITTにおいて負荷群ではインスリン抵抗性がみられた。しかしながら、血漿中のインスリンレベルは、グルコース負荷前、負荷後15分、負荷後120分のいずれにおいても、有意な差がみられなかった。行動試験においては投与群ではフィールド中央を横切るなどのわずかな特殊行動がみられた。実験3の結果から、インスリン負荷によって血糖値を低下させた場合、血中へのインスリン分泌量は増加しないことが示唆され、さらにラットの異常行動は、血中へのインスリン過剰によって引き起こされる低血糖による可能性が考えられた。臨床栄養学ヒトでの観察研究の結果より、血糖値の急激な変化による明確な異常行動が観察できず、さらに研究機関の異動が生じたため、ヒト研究のみ実施し、動物実験による詳細な検討を行うことができなかったが、患者からの食事調査を行うことはできた。