hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
逐次マルチタスク学習とパターン認識への応用に関する研究

機械学習で通常用いられるベンチマークデータを用いて,固有空間モデルの誤差や識別率などを評価した.その結果,提案したアルゴリズムによって,固有空間モデルの近似誤差を最小限に抑えながら,高速に固有軸の更新を行えることを確認した.(2)識別器の追加学習,タスク変動の検知,既知・未知タスクの識別,タスク分類,知識転送の機能を有する逐次マルチタスク・パターン認識モデルを開発した.このモデルでは,タスク変動を検知すると既知・未知タスクの識別が行われ,既知タスクであれば長期記憶から対応する識別器を想起して追加学習を行う.一方,未知タスクと識別すると新しい識別器を生成し,現タスクの識別器から知識移転を行う.知識移転の効果を調べるため,機械学習のベンチマークデータをマルチタスク学習用に変更し,未知タスクに対する認識率の向上率を調べた.その結果,知識移転機能を導入することにより,高速に提案モデルの汎化能力が向上し,少ない訓練データで高い汎化能力をもつことを示した.また,単一識別器で逐次的に複数タスクを学習できるモデルを開発し,過去に学習したタスクのうち,最も類似度の高いタスクを特定し,その知識を選択的に転送する機能を付加した.その結果,単一識別器であっても,安定した学習が可能であり,選択的知識移転を導入することで,汎化能力の向上率が改善された.
社会基盤施設の健全度診断のための効率的なシステム同定手法の開発とその検証

振動系を表すシステムダイナミックスモデルを考え,予測のための基本ルールか先験情報が組み込まれたネットワークに対して構造化学習を行い,自己組織化によってダイナミクスのモデルと振動特性を同時に同定可能な新しい手法を提案した.数値実験の結果,地盤・構造システムの有する物理的な意味を損なうことなく柔軟性に富むネットワーク構造を組み立て,このネットワークを最適化することにより,構成方程式とパラメータを同時に同定可能なことが明らかになった.次に,多面型万能履歴復元力モデルを有する非線形構造系を対象に,ウェーブレット変換の適用によってその動特性を同定するアルゴリズムを提案した.同定の基本は,入力地震加速度,ノイズを含む観測応答量,パラメータに依存して計算される応答量にウェーブレット変換を適用し,評価関数を定義した上で,改訂準ニュートン法による繰り返し計算によって評価関数の最小解を得ることにある.応答計算にはルンゲ・クッタ・ギル法を,ウェーブレット変換の計算にはFFTを用いた.数値シミュレーションを行い,同定パラメータ,応答の再現性などを検討した結果,提案手法の有効性が検証できた.さらに,これまであまり解析されていない劣化履歴復元力特性を有する非線形多自由度振動系を対象に,重点的サンプリングフィルタと棄却法を用いた,より効率的な構造同定手法を提案した.数値シミュレーションを実施し,提案手法と従来手法に関する同定精度,非線形挙動の再現性を比較検討した.固有円振動数についてはどの手法も同定精度に大差がなかった.提案手法を用いれば,非線形系パラメータを高い精度で同定することが可能となった.最適同定パラメータを用いて応答量を求めた結果,提案手法は真の挙動を比較的精度良く再現できた.従来手法との対比より,提案手法の優位性,有用性が明らかになった.振動系を表すシステムダイナミックスモデルを考え,予測のための基本ルールか先験情報が組み込まれたネットワークに対して構造化学習を行い,自己組織化によってダイナミクスのモデルと振動特性を同時に同定可能な新しい手法を提案した.数値実験の結果,地盤・構造システムの有する物理的な意味を損なうことなく柔軟性に富むネットワーク構造を組み立て,このネットワークを最適化することにより,構成方程式とパラメータを同時に同定可能なことが明らかになった.次に,多面型万能履歴復元力モデルを有する非線形構造系を対象に,ウェーブレット変換の適用によってその動特性を同定するアルゴリズムを提案した.同定の基本は,入力地震加速度,ノイズを含む観測応答量,パラメータに依存して計算される応答量にウェーブレット変換を適用し,評価関数を定義した上で,改訂準ニュートン法による繰り返し計算によって評価関数の最小解を得ることにある.応答計算にはルンゲ・クッタ・ギル法を,ウェーブレット変換の計算にはFFTを用いた.数値シミュレーションを行い,同定パラメータ,応答の再現性などを検討した結果,提案手法の有効性が検証できた.さらに,これまであまり解析されていない劣化履歴復元力特性を有する非線形多自由度振動系を対象に,重点的サンプリングフィルタと棄却法を用いた,より効率的な構造同定手法を提案した.数値シミュレーションを実施し,提案手法と従来手法に関する同定精度,非線形挙動の再現性を比較検討した.固有円振動数についてはどの手法も同定精度に大差がなかった.提案手法を用いれば,非線形系パラメータを高い精度で同定することが可能となった.最適同定パラメータを用いて応答量を求めた結果,提案手法は真の挙動を比較的精度良く再現できた.従来手法との対比より,提案手法の優位性,有用性が明らかになった.本研究の目的は,社会基盤施設の健全度を診断するため,1)構造物の複雑な復元力特性を構成方程式に捉われることなく同定する手法を開発し,その適用性・安定性に関する基礎的な検討を行うとともに,2)計算の効率性・収束性などの観点において従来のパラメータ同定手法よりも優れたシステム同定アルゴリズムを提案することにある.さらには,3)これら同定手法を実際の地盤特性や構造物の経年変化・損傷度の評価に適用することにより,提案手法の検証を行うことである.本年度の上半期においてはシステム同定手法として下記に示すような手順で新アルゴリズムを提案し,それを実データに適用することにより提案手法の有効性を検討した.1)強震時に非線形な履歴挙動を示す地盤や構造物の複雑な復元力特性を,荷重-変形あるいは応力-歪関係を表す構成方程式で表現した履歴曲線で与え,構成方程式に捉われないシステム同定手法として多面型履歴モデルを用いた定式化を行った.2)システムの物理的な意味を失うことなく,柔軟性に富んだネットワーク構造を組み立て,このネットワークを最適化することにより,非線形履歴挙動を示す構成方程式ならびにパラメータを同時に同定した.本年度の下半期においては線形領域から非線形領域まで表現できる汎用性のある構成方程式(多面型履歴モデル)を明示的に与え,パラメータのみを効率的に同定する手法として3つの方法(ウェーブレット変換を用いる方法,重点的サンプリングフィルタ法,棄却法)を提案した.数値計算を実施して従来の方法(カルマンフィルタ,モンテカルロフィルタ)と比較分析することにより,提案手法の妥当性を検討した結果,手法の有用性が明らかになった.振動系を表すシステムダイナミックスモデルを考え,予測のための基本ルールか先験情報が組み込まれたネットワークに対して構造化学習を行い,自己組織化によってダイナミクスのモデルと振動特性を同時に同定可能な新しい手法を提案した.数値実験の結果,地盤・構造システムの有する物理的な意味を損なうことなく柔軟性に富むネットワーク構造を組み立て,このネットワークを最適化することにより,構成方程式とパラメータを同時に同定可能なことが明らかになった.

次に,多面型万能履歴復元力モデルを有する非線形構造系を対象に,ウェーブレット変換の適用によってその動特性を同定するアルゴリズムを提案した.同定の基本は,入力地震加速度,ノイズを含む観測応答量,パラメータに依存して計算される応答量にウェーブレット変換を適用し,評価関数を定義した上で,改訂準ニュートン法による繰り返し計算によって評価関数の最小解を得ることにある.応答計算にはルンゲ・クッタ・ギル法を,ウェーブレット変換の計算にはFFTを用いた.数値シミュレーションを行い,同定パラメータ,応答の再現性などを検討した結果,提案手法の有効性が検証できた.さらに,これまであまり解析されていない劣化履歴復元力特性を有する非線形多自由度振動系を対象に,重点的サンプリングフィルタと棄却法を用いた,より効率的な構造同定手法を提案した.数値シミュレーションを実施し,提案手法と従来手法に関する同定精度,非線形挙動の再現性を比較検討した.固有円振動数についてはどの手法も同定精度に大差がなかった.提案手法を用いれば,非線形系パラメータを高い精度で同定することが可能となった.最適同定パラメータを用いて応答量を求めた結果,提案手法は真の挙動を比較的精度良く再現できた.従来手法との対比より,提案手法の優位性,有用性が明らかになった.
トランスジェニックスマウスに誘発された挿入突然変異動物に関する基礎的研究(プラスミドDNAの挿入と回収について)

トランスジェニックマウスに導入されたDNAフラグメントがどのような機序でマウス染色体上に組み込まれるかについて、マウス受精卵前核へマイクロインジェクションされたDNAフラグメント間の相同組換えに注目し検討した。環状プラスミドpSy14(10.6kb)を互いにオーバーラップするように3つのフラグメントに切断した。2種類あるいは3種類のフラグメントをいっしょにマウス受精卵へマイクロインジェクションし、得られたトランスジェニックマウスのゲノムDNAを解析した結果、導入DNAフラグメントはオーバーラップ領域で相同組換えを起こし、もとのpSy14プラスミドを再構築したのちマウス染色体上に組み込まれたことがわかった。オーバーラップ領域の長さは400bp程度でも高率に相同組換えが起きた。つぎに、トランスジェニックスマウスの染色体上に組み込まれたプラスミドDNAが大腸菌中に回収することができるかどうか検討した。その結果Methylation-Dependent Restriction System(MDRS)に変異を多く有する大腸菌では効率的にプラスミドDNAを回収することができた。プラスミドの回収率は、ゲノムDNAを抽出したトランスジェニックマウスラインおよび由来臓器(脳、心、肺、肝、腎、脾、精巣、皮膚および尾)により異なっていた。これはプラスミドDNAが挿入された染色体上の位置や臓器により、メチル化の程度に差があるためであると考えられた。また、カルモジュリン遺伝子を導入したトランスジェニックマウスでは、導入遺伝子の発現とメチル化状態との間に相関が見られた。微量注入法により作製されたトランスジェニックマウスでは外来遺伝子が挿入された部位の宿主遺伝子を不活化するため、トランスジェニックマウスの515%は劣性の突然変異を持つと言われている。本研究の目的は挿入突然変異動物を積極的に作出するとともに、変異遺伝子を効率的に回収する手段を検討することである。1.現在までにプラスミドDNAおよびヒトパピロ-マウイルスDNAなどを導入したトランスジェニックスマウス約30匹を作製した。これらのトランスジェニックマウスのラインを確立するため、Founderマウスより仔マウスを作出している。今後同じラインのトランスジェニックマウス同士を交配することにより導入遺伝子をホモに持つ個体を作出する予定である。これまでに作製した導入遺伝子をホモに持つ個体に関してはなんら異常は認められていないが、カルモジュリン遺伝子を導入した1ラインでは導入遺伝子をホモに持つ個体を得ることが難しいため、個体発生を正常に遂行する上に重要な遺伝子の破壊が示唆された。現在その詳細について検討中である。2.トランスジェニックマウス染色体上に挿入された外来遺伝子は通常高度にメチル化されている。したがって、プラスミドやλファ-ジDNAなど大腸菌中で発現する遺伝子はトランスフォ-メ-ションの宿主として用いられていた従来の大腸菌株では増殖が困難である。しかしHanahan博士らによりメチル化プラスミドDNAを回収可能な一連のMCR変異を持つ大腸菌株が開発された。我々は同博士よりこれらのMCR変異株の分与を受け、プラスミドDNAを導入したトランスジェニックマウスの染色体DNAより直接回収したところ、従来の宿主菌株よりも高率に回収されることがわかった。今後回収率の向上をはかり回収されたDNAの解析を行う予定である。微量注入法により作製されたトランスジェニックマウスの515%は劣性の挿入突然変異を持つと言われている。本研究の目的は変異遺伝子を効率的に回収する手段を検討することにある。1.トランスジェニックマウスの染色体上に組み込まれたプラスミドDNAは通常高度にメチル化されているため、従来の大腸菌株で調製したコンピ-テントセルへ直接回収することは困難であったが、Hanahan博士らが開発したメチル化依存性制限系の複数の遺伝子に変異を持つ大腸菌株(DH5α系)への比較的高率に回収することが可能になった。

そこで我々は博士より菌株の分与を受け、各臓器よりDNAを分離し回収率を比較したところ、総じてDH5αMCR株(mcrA,mcrB,mcrC,mrrに変異)の方がDH5αm4株(mcrA,mcrBに変異)よりも回収率が高かった。しかし、精巣由来DNAでは逆にm4株の方がMCR株より回収率が高いか同じであった。精巣由来DNAがなぜ他の臓器由来DNAと異なった挙動を示すのか現在検討中であるが、減数分裂後のDNAが精子頭部ヘパッケ-ジングされる現象あるいは受精後の雌雄遺伝子の発現制御などとの関連が示唆される。2.マウス受精卵に導入されたDNA分子は通常head to tailにタンデムに結合し染色体上へはランダムに組み込まれるが、その機序は末だ明かでない。我々は注入DNA断片同士の組換え機序を解析するため、互いにオ-バ-ラップ領域を持つ複数のDNA断片を受精卵前核に微量注入した。その結果、それぞれのDNA断片はオ-バ-ラップ領域で相同組換えにより結合し、その後染色体上に挿入されることが解った。この相同組換えがどの程度正確に行われているかは不明であるが、少なくともオ-バ-ラップ領域中の制限酵素切断部位は無傷であり、相同組換えの正確度は高いと推察される。1.カルモジュリン遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの1ラインで、導入遺伝子の神経特異的発現に個体差がみられた。導入遺伝子はCaMII型のプロモーター領域(-294+68bp)にレポーター遺伝子としてLacZを結合したコンストラクトを用いた。これをC57BL/6マウスの受精卵へマイクロインジェクションし、トランスジェニックマウスを得た。それぞれのトランスジェニックラインの雄を野生型雌マウスと交配し、妊娠1316日に胎児を摘出し、LacZの発現をX-gal染色によって観察した。その中の1ライン(W6)の胎児では、導入遺伝子を持っているにもかかわらず、LacZを強く発現するものとしないものが存在した。これらの胎児の胎盤由来DNAを調べたところ、強い発現がみられた個体ではDNAは比較的低メチル化状態であったが、発現がみられなかったものでは著しくメチル化されていた。また成獣の尾のDNAのメチル化の状態を検討したところ、founderでは低メチル化状態であったが、世代を経るにしたがって高メチル化状態に変化していった。高メチル化状態の父親に由来する胎子を5-azacytidineによる脱メチル化を試みたが、遺伝子の発現は観られなかった。2.カルモジュリン遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの1ラインで、高率に胎子の発育中止が観られた。導入遺伝子はCaMIII型のプロモーター領域(-877+103bp)にレポーター遺伝子としてLacZを結合したコンストラクトを用いた。これをF1(C3H/He ×C57BL/6)マウスの受精卵へマイクロインジェクションし、トランスジェニックマウスを得た。その中の1ライン(T136)で胎子の半数以上に発育中止が観られ、その形質は子孫に伝達された。この形質は通常の優性あるいは劣性の致死遺伝子とは異なり、興味深い。
ＥＳＴ・ＭＳ連携解析による無脊椎動物神経ペプチドの網羅的解析

本年度は、下記の3点について研究を行なった。2. mRNA配列データを利用したナマコ体液中タンパクの網羅的解析。3.産卵誘発ペプチドを卵巣組織に作用させることで放出される二次物質の解析マナマコ周口神経および放射神経、マガキ内臓神経、アカウニ放射神経のそれぞれについて本年度測定分と過去に測定したデータを合わせて再解析を行った。その結果、各神経組織の質量分析データからそれぞれ5000から1万3000種のペプチド配列が得られた。これらのペプチド配列うち、前後にペプチド切断シグナルやアミド化シグナルの存在を指標としてmRNA配列データを利用して確認した結果、マナマコ神経組織から93種(周口神経組織57種.放射神経36種)、マガキ内臓神経節から123種、アカウニ放射神経から67種の合計283種のペプチドの前後に切断シグナルおよびアミド化シグナルが存在することを確認した。マナマコ体腔液およびポーリ氏嚢に含まれる体液中タンパク成分の網羅的解析を試みた。体液にトリクロロ酢酸を加えることで得られたタンパク沈殿物を酵素消化によりペプチド断片化した。得られたペプチド断片をnanoLC/ESI-MS/MSにより分析し、質量分析データの取得を行なった。質量分析データを次世代シーケンサーによりアセンブルされたマナマコmRNA配列データを参照しながら、ペプチド配列解析を行った。その結果、マナマコ体腔液から108種、ポーリ氏嚢に含まれる体液からは34種のタンパクの存在が示唆された。マナマコの産卵誘発ペプチドを卵巣組織に作用させることで分泌される二次物質の解析を行なった。前年度の分析により活性画分中に存在した活性ペプチド候補を合成し、活性検定試験を行なった。しかしながら、今回合成したペプチドには卵成熟活性が見られなかった。(抄録なし)本年度は、マガキ、アカウニ、マナマコのそれぞれから神経組織を採取し、神経試料を確保した。確保したアカウニ放射神経およびマガキ腹部神経節を用いて神経ペプチドの抽出を行ない、抽出物をnanoLC/ESI-MS/MSにより分析し、質量分析データの取得を行なった。mRNA分解を抑えるために、アカウニおよびマガキの神経組織は生体から採取後、速やかに凍結保存した。マナマコの神経組織は体組織中に埋没しているため、純度の高い神経組織の摘出が短時間では困難であった。そこで、神経組織近傍の組織ごと凍結保存した後、低温下(-75°C)で有機溶媒に浸漬し、組織中の水分を有機溶媒に置換した後に真空乾燥した。解剖顕微鏡下で乾燥した体組織から周辺組織を除去しながら、丁寧に神経組織を摘出したものをEST解析用の試料として用意した。マガキ内臓神経、アカウニ放射神経からメタノール-酢酸-水混合溶媒で抽出した神経抽出物をnanoLC/ESI-MS/MSで分析した。本年度に測定した質量分析結果を共同研究者により提供されたアカウニおよびマガキ神経組織ESTデータベースを参照しながら、ペプチド配列解析を行なった。その結果、マガキ内臓神経節とアカウニ放射神経の質量分析データからそれぞれ4744種、5711種のペプチド配列が得られた。これらのペプチド配列の前後にペプチド切断シグナルやアミド化シグナルが存在するかESTデータを利用して確認した結果、マガキ腹部神経節で255種、アカウニ放射神経で115種のペプチドの前後に切断シグナルおよびアミド化シグナルが存在することが確認された。今後、同様の手法を用いてマナマコ神経組織で発現しているペプチドの検出を行なう予定である。本年度は、本年度初頭までに採取して凍結保存していたマナマコ組織を凍結乾燥し、乾燥組織から周口神経および放射神経近傍組織を摘出し、神経試料を確保した。確保したマナマコ神経組織を用いて神経ペプチドの抽出を行ない、抽出物をnanoLC/ESI-MS/MSにより分析し、質量分析データの取得を行なった。マナマコ周口神経、放射神経近傍組織からメタノール-酢酸-水混合溶媒で神経ペプチドを抽出した。次に神経抽出物を還元アルキル化処理した後、nanoLC/ESI-MS/MSで分析した。測定した質量分析結果を共同研究者により提供された放射神経近傍組織ESTデータベースを参照しながら、ペプチド配列解析を行なった。その結果、マナマコ周口神経と放射神経の質量分析データからそれぞれ4505種、1904種のペプチド配列が得られた。これらのペプチド配列の前後にペプチド切断シグナルやアミド化シグナルが存在するかESTデータを利用して確認した結果、マナマコ周口神経組織で113種、放射神経で31種のペプチドの前後に切断シグナルおよびアミド化シグナルが存在することが確認した。上記の神経ペプチドの解析に加え、マナマコの産卵誘発ペプチドNGIWYamideを卵巣組織に作用させることで分泌される二次物質の解析を行なった。生理活性を指標に卵成熟や排卵活性を示した逆相HPLC分画画分をアミノ酸シーケンサーで分析した結果、4種類の活性ペプチド候補が同定した。これらの活性ペプチド候補を卵巣のESTデータベースを利用して解析すると、mRNAから翻訳後切り出しが予想されるペプチド配列と比べてC末端側が4-8残基短いペプチドであること、14種の類縁ペプチドが存在することが示唆された。質量分析によりEST配列から予測された類縁ペプチド14種類中2種の存在が確認された。今後、合成ペプチドを用いて卵巣組織に対する活性を確認する予定である。

3.産卵誘発ペプチドを卵巣組織に作用させることで放出される二次物質の解析マナマコ周口神経および放射神経、マガキ内臓神経、アカウニ放射神経のそれぞれについて本年度測定分と過去に測定したデータを合わせて再解析を行った。その結果、各神経組織の質量分析データからそれぞれ5000から1万3000種のペプチド配列が得られた。これらのペプチド配列うち、前後にペプチド切断シグナルやアミド化シグナルの存在を指標としてmRNA配列データを利用して確認した結果、マナマコ神経組織から93種(周口神経組織57種.放射神経36種)、マガキ内臓神経節から123種、アカウニ放射神経から67種の合計283種のペプチドの前後に切断シグナルおよびアミド化シグナルが存在することを確認した。マナマコ体腔液およびポーリ氏嚢に含まれる体液中タンパク成分の網羅的解析を試みた。体液にトリクロロ酢酸を加えることで得られたタンパク沈殿物を酵素消化によりペプチド断片化した。得られたペプチド断片をnanoLC/ESI-MS/MSにより分析し、質量分析データの取得を行なった。質量分析データを次世代シーケンサーによりアセンブルされたマナマコmRNA配列データを参照しながら、ペプチド配列解析を行った。その結果、マナマコ体腔液から108種、ポーリ氏嚢に含まれる体液からは34種のタンパクの存在が示唆された。マナマコの産卵誘発ペプチドを卵巣組織に作用させることで分泌される二次物質の解析を行なった。前年度の分析により活性画分中に存在した活性ペプチド候補を合成し、活性検定試験を行なった。しかしながら、今回合成したペプチドには卵成熟活性が見られなかった。研究計画に則して、本年度の目的であるアカウニおよびマガキ神経組織からそれぞれ255種、115種の神経発現ペプチド候補を選定できたため、当初の研究計画どおり、おおむね順調に進展しているといえる。質量分析の故障によって約5か月間の分析不能となり、大幅な遅延が予想されたが、本年度の目的であるマナマコ周口神経および放射神経からそれぞれ113種、31種の神経発現ペプチド候補を挙げることができた。マガキおよびアカウニ神経ペプチドの適切な活性検定法が確立できていないため、当初の研究計画より遅れているといえる。今後は、従来の手法を用いて、マガキおよびアカウニの質量分析データの積み増しを行なう。マナマコについては、質量分析用試料を確保および質量分析データの取得を行ない、共同研究者によるマナマコ神経組織ESTデータベース構築に備える。ESTデータベースを参照した質量分析によるペプチド配列解析により見出された神経ペプチドを精査し、生理作用検定に供する候補ペプチドを選定する。今後は、卵成熟活性による活性検定法が確立されているナマコを中心にして研究を進める。ESTデータと質量分析を用いた分析の利点を生かし、産卵誘発ペプチドを作用させた際に放出される二次物質などの神経ペプチド以外についても分析を行なう。
抗がん剤の細胞内代謝および代謝修飾による効果増強と耐性克服に関する研究

[はじめに]Methotrexate(MTX)耐性克服を目的として、新しい葉酸代謝拮抗剤であるtrimetrexate(TMQ)とCB3717の薬剤に関して、K562白血病細胞およびMTX耐性K562/MTX細胞を標的としてその抗腫瘍効果を調べ、MTXと比較した。また正常ヒト骨髄球系前駆細胞(CFUーG)に対する細胞毒性も検討した。さらにl型leucovorin(lーLV)投与によるこれら腫瘍細胞の細胞障害減弱と骨髄細胞レスキュ-の程度を検討した。[方法]K562とMTX耐性K562/MTX細胞(2x10^3/ml)を10^<ー8>M10^<ー3>M MTX TMQまたはCB3717とともに24時間培養した。その後lーLV(日本レダリ-)を最終濃度で10^<ー6>M10^<ー3>M添加し、メチルセルロ-ス(0.8%)を加えて5日間培養し、cloning efficiencyを比較した。正常ヒト骨髄(BM)単核細胞(2x10^5/ml)も抗癌剤と共に24時間培養し、その後lーLVとコロニ-刺激因子(GーCSF、10ng/ml、中外製薬)を添加してさらに14日間培養後、コロニ-形成能(CFUーG)を計数した。[結果]K562細胞とK562/MTX細胞に対するIC_<50>と比較すると、MTXでは100倍以上の耐性が認められたが、TMQとCB3717ではそれぞれ1.5倍、2.2倍であり、耐性度は著明に減少した。骨髄細胞はいずれの抗癌剤に対しても強い耐性を示した。lーLV添加によって腫瘍細胞においてもレスキュ-効果が認められた。K562細胞についてみると、約95%の細胞障害性を示す10^<ー7>M MTXに10^<ー4>MlーLVを添加した場合、40.3%+7.1%にまでcloning efficiencyは回復した。TNQとCB3717における回復率はやや低かった(15.1%+5.0%と27.4%+10.8%)。MTX耐性のK562/MTX細胞ではlーLVレスキュ-率はK562細胞に比較して有意に高かった。骨髄(BM)CFUーGについてみると、MTX耐性を克服する高濃度のMTX、TMQ、CB3717いずれの薬剤に対しても、lーLVは50%以上のレスキュ-率を示した。[結論]TMQ、CB3717はいずれもMTX耐性克服に有効と思われた。一方、lーLV添加により、腫瘍細胞も種々の程度でレスキュ-されることが知れた。BM細胞に対するlーLVのレスキュ-効果は高濃度のTMQやCB3717に対しても強く認められ、以上の結果から、適当な薬剤投与量と投与時間を配慮すれば、TMQやCB3717はlーLVの併用でMTX耐性克服に有効と思われる。[結論]

TMQ、CB3717はいずれもMTX耐性克服に有効と思われた。一方、lーLV添加により、腫瘍細胞も種々の程度でレスキュ-されることが知れた。BM細胞に対するlーLVのレスキュ-効果は高濃度のTMQやCB3717に対しても強く認められ、以上の結果から、適当な薬剤投与量と投与時間を配慮すれば、TMQやCB3717はlーLVの併用でMTX耐性克服に有効と思われる。
ガリウム砒素基板上に作製したセレン化鉄薄膜の磁気特性制御

CaAs基板上に作製したFeSe薄膜の磁気特性を詳細に解析した。(1) FeSe薄膜の作製にはセレン化法を用いた。作製方法・作製条件や、得られたFeSe薄膜の構造評価、磁気特性評価の結果などに関する詳細は既に平成9年度実績報告書で報告済みである。(2)平成10年度はGaAs(001)基板上に作製したFe薄膜のセレン化によりFeSe薄膜が形成される過程における、磁気特性や結晶粒径を検討した。その結果、・セレン化が進に伴い(セレン化率の増加に伴い)、走査型電子顕微鏡(SEM)で試料表面を観察することにより計算されるFeSe薄膜の多結晶粒径は、増加することが明らかとなった。セレン化率が10%以下の領域では粒径は100nm程度、セレン化率80%では700nm程度の粒径であった。・振動型磁力計(VSM)により測定した試料の飽和磁化、Ms[emu/cc]はセレン化率の増加に伴い減少するが、Fe1原子当たりの飽和磁化は一定であることが明らかとなった。(3)本研究課題の遂行により得られた成果を以下にまとまる。・セレン化法を用いることにより、FeSe薄膜の作製が可能であることを見出し、また、作製条件を確立した。・得られたFeSe薄膜は、膜の深さ方向に対してFe/Seの構成組成比が一定であり、セレン化過程が単なるSe原子の拡散ではなく、FeSe化合物を形成する過程であることを初めて明らかにした。・FeSe薄膜の磁気特性評価により、飽和磁化、保磁力、面内異方性、面内/垂直方向異方性、及び、これらのセレン化過程における変化を明らかにした。セレン化法を用いたFeSe薄膜の作製と得られた試料の構造評価,磁気特性評価を行った.1.真空蒸着法によりGaAs基板上に作製したFe薄膜を分子線エピタキシ-装置内でセレン化処理した.基板温度380度以上においてセレン化が確認され,FeSe薄膜を作製することに成功した.2.オージェ電子分光法により,得られたFeSe薄膜における膜深さ方向のFe,Se各原子の濃度を調べた.その結果,膜中の含有Fe/Se組成比は一定であり、セレン化過程が単なるSe原子の拡散現象ではなく,化合物を形成する過程であることが明らかとなった.このFe/Se組成比はエネルギー分散X線分光法(EDX)より,2/3,あるいは1/3であることがわかり,これらの試料では,バルクのFeSeで安定とされているFe_3Se_4やFe_7Se_8とは異なる構造を有することを示唆している.2.走査型電子顕微鏡(SEM)による試料表面観察より,得られたFeSe薄膜は多結晶であること,その多結晶粒はセレン化時間が長いほど大きくなることが明らかとなった.3.振動型磁力計(VSM)によりFeSe薄膜の磁化曲線を測定したところ,飽和磁化は120eμ/cm^3であった.また,面内及び,面内/垂直方向の磁気異方性は極めて弱いことが明らかとなった.これらの研究成果をもとに,平成10年度はX線回折等を用いたFeSe薄膜の詳細な構造解析や,結晶配向性と磁気異方性の関係,薄膜作製条件による磁気特性の制御,などを行う予定である.CaAs基板上に作製したFeSe薄膜の磁気特性を詳細に解析した。
糖尿病性骨粗鬆症におけるモノカルボン酸トランスポーターの役割の解明

MCT1はユビキタスに発現する膜輸送タンパク質で、解糖系の最終産物であるピルビン酸をミトコンドリアに取り込みATPを産生する。マウス初代培養骨芽細胞および筋芽細胞株C2C12細胞をBMP2で刺激する骨芽細胞分化誘導系において、siRNAによるMCT1発現抑制は骨芽細胞分化マーカーであるアルカリホスファターゼの発現を低下させた。また、C2C12細胞においてBMPシグナル伝達経路であるSmadの活性化がMCT1 siRNAによって抑制された。以上の結果から、MCT1には膜輸送のみならず遺伝子発現調節とそれに基づく細胞分化の制御という、新しい機能があることが明らかとなった。本研究の目的は、糖尿病等の糖代謝異常疾患に続発して生じる二次性骨粗鬆症の病態形成におけるモノカルボン酸トランスポーター(monocarboxylate transporter:MCT)の役割を明らかにし、MCTを標的とした新たな骨粗鬆症の予防・治療方法の開発の可能性を探ることにある。平成25年度は、筋芽細胞株C2C12細胞を用いてMCTを介したエネルギー代謝が骨芽細胞分化を調節する機序について解析した。C2C12細胞は、骨形成タンパクであるBMP-2の刺激によってアルカリホスファターゼ(ALP)陽性の骨芽細胞様細胞へと分化する。前年度の研究結果から、BMP-2で刺激したC2C12細胞のALP陽性細胞数は低グルコース環境下では著しく減少し、BMP誘導性骨芽細胞分化にはグルコース代謝が必要である可能性が考えられた。また、通常のグルコース濃度でも、MCTサブタイプの一つであるMCT-1を抑制するとALP陽性細胞数が減少したため、MCT-1の基質である乳酸を培地に添加したところ、乳酸の濃度依存的にALP陽性細胞数は増加した。また、低グルコース環境下において著しく減少したALP陽性細胞数も、高濃度の乳酸の添加によって回復した。MCT-1のsiRNAはこれらの乳酸の作用を抑制した。このことから、MCT-1を介した乳酸の膜輸送がBMP-2刺激による骨芽細胞分化誘導に必要である可能性が示唆された。本研究の目的は、糖尿病などの糖代謝異常疾患に続発して生じる二次性骨粗鬆症の病態形成におけるモノカルボン酸トランスポータ(monocarboxylate transporter:MCT)の役割を明らかにし、MCTを標的とした新たな骨粗鬆症の予防・治療方法の開発の可能性を探ることにある。平成24年度は培養骨芽細胞を用いて、MCTによる骨芽細胞分化調節メカニズムについて解析した。MCTは細胞膜・ミトコンドリア内膜に分布するタンパク質で14種類のサブタイプが報告されている。マウス頭頂骨より単離した初代培養マウス骨芽細胞およびBMP-2で骨芽細胞分化を誘導できるマウス筋芽細胞株C2C12細胞を用いて、MCTサブタイプのmRNA発現をRT-PCR法により比較解析したところ、両者においてMCT-1のmRNAが安定して発現していた。糖尿病などの糖代謝異常疾患のin vitro実験モデルとして、マウス初代培養骨芽細胞および筋芽細胞株C2C12細胞を培地中のグルコース濃度を変えて培養した。筋芽細胞株C2C12細胞は低グルコース環境において、BMP-2刺激後のアルカリホスファターゼ(ALP)陽性細胞の出現が強く抑制された。この時のALP mRNA発現をRT-PCR法で解析したところ、低グルコース環境ではALP mRNA発現は抑制されていた。また、siRNAを用いてMCT-1 mRNA発現を抑制したC2C12細胞では低グルコース環境だけでなく、通常のグルコース濃度においてもBMP-2刺激後のALP陽性細胞の出現は強く抑制された。このことから、BMP-2刺激による骨芽細胞分化誘導には一定量のグルコース濃度が必要であり、その代謝産物がMCT-1を介し骨芽細胞分化に関与すると考えられた。本年度の研究から、BMP-2を用いたC2C12細胞の骨芽細胞分化誘導において、培地中のグルコース濃度が非常に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。糖尿病に代表される糖代謝異常疾患に続発して生じる骨粗鬆症などの骨代謝疾患の原因が骨芽細胞のグルコース代謝の変化によるものであるとの仮説が裏付けられたと考えられる。また、細胞質における解糖系からミトコンドリアにおける好気呼吸への中心的な輸送経路であるMCT-1の存在も骨芽細胞分化に必要であることも明らかとなった。これらの今年度に得られた知見は国内の学会で発表し、一定の評価を得たと認識している。

しかし、MCT-1が輸送する物質はグルコースではなく乳酸やピルビン酸などのモノカルボン酸であるため、グルコースとMCT-1を結びつける代謝産物が何であるかは今のところ不明であり、現在解析を続けている。また、in vitroにおける実験系では一定の結果が得られているが、糖尿病などの疾患モデル動物を用いたin vivoにおける実験系では、未だ十分な知見が得られていない。次年度は引き続き、骨芽細胞分化に影響を及ぼすグルコース代謝産物の探索をするとともに、モデル動物におけるグルコース代謝産物と骨代謝回転の変化について解析を行う予定である。MCT-1を介し、骨芽細胞分化を促進させる物質の探索を引き続き試みる。解糖系の中心的経路であるエムデン・マイヤーホフ経路を始め、エントナー・ドウドロフ経路、ペントースリン酸経路、メチルグリオキサール経路などの傍流とされる経路で生じる中間代謝産物を、BMP-2でC2C12細胞を刺激し骨芽細胞分化を誘導するin vitro実験系に添加し、アルカリホスファターゼ活性ならびに骨芽細胞分化マーカーの遺伝子発現に及ぼす変化を解析する。また、高グルコース環境下と低グルコース環境化におけるBMP-2刺激後の細胞内シグナル伝達経路の活性化の違いについてWestern blot法で解析する。in vitro実験系で骨芽細胞分化が変化した物質について糖尿病モデルマウスあるいは骨粗鬆症モデルマウスなどの疾患モデル動物に投与し、グルコース代謝産物のin vivoにおける骨代謝状態改善効果について検討する。また、上記の実験で得られたグルコース代謝産物とともにMCT-1阻害剤を糖尿病モデル動物に投与し、骨代謝状態を変化について組織学的に解析を行う。消耗品としては次のように、各種物品および動物を購入する。MCT-1阻害剤あるいはグルコース代謝産物を投与する糖尿病モデルマウスならびに野生型マウスが必要となる。そのため、マウスの購入および飼育のための経費を必要とする。また、in vitroの細胞培養実験を行うために、培地、血清および抗生物質などの添加物や細胞培養皿などの器具を購入する必要がある。骨芽細胞分化を誘導するためのサイトカインであるBMP-2、MCT-1の阻害剤ならびにMCT-1の遺伝子発現を抑制するsiRNAを購入する。骨芽細胞分化マーカーの遺伝子発現を解析するためにRNA抽出試薬、逆転写酵素、RT-PCR試薬、電気泳動用試薬および器具が必要である。細胞内シグナル伝達の変化をWestern blotで解析するために各種抗体や発光試薬を購入する。また、研究結果を発表し、かつ情報を収集するために国内学会に参加する旅費を必要とする。
高度成長期地域公害教育史に関する研究

本研究では、三重県四日市市を対象地域として、高度成長期に地域の中でどのように公害教育が実践されたのかを明らかにすることを目的とした。本研究では、第一に母親たちによる二次訴訟と養護学校建設運動の展開とそこで営まれた学習活動について調査し、養護学校義務制が実現するまでの過渡期における養護学校建設運動の困難性とその中で発生した二次訴訟準備の展開について明らかにした。第二に、すでに公害による健康被害が発生している中でも、四日市市の社会教育政策が勤労青年対策に重点を置いて展開されたことを明らかにした。2013年度は概ね以下の三点について取り組んだ。(1)公害教育の現状把握を行った。現在、全国に公害資料館等が建設されており、2013年12月には「公害資料館連携フォーラム」が新潟で行われ、新潟、熊本、三重、大阪など全国で公害教育に取り組む実践家が一堂に介した。このように全国各地の公害資料館が一堂に介し、現状を交流しあう取組は初めての試みであり、本フォーラムの分科会「公害資料を活用した公害・環境教育にむけて」に参加し、現在取り組まれている公害教育の課題などの現状を把握した。また、2013年11月には大阪で開催された「ポスト3.11社会の環境教育について考える」に参加し、西淀川で取り組まれている公害教育の歴史と現状について情報収集を行った。(2)病弱教育史についての調査を行なった。昨年度の四日市における公害教育史の調査では、「公害から子どもを守る母の会」の実践について調査・報告を行ったが、母の会の取り組みの中に養護学校建設運動があり、その運動の展開と日本における病弱教育の政策的な動向との関わりがあることが昨年度の調査で明らかになった。そのため、今年度は母の会の運動をより立体的にみるために、病弱教育史についての調査を行なうことにした。病弱教育史は教育史研究の中でも蓄積の薄い研究分野であるが、2000年に『日本病弱教育史』という冊子がまとめられている。本冊子を基に、日本の病弱教育史の動向と三重県の病弱教育史の動向について把握した。(3)社会教育学習・実践論の理論的な検討を行った。約30年の社会教育学習・実践論の動向について「要求・必要」論の動向を中心に日本社会教育学会の年報を基にたどった。本研究の目的は、高度成長期の三重県四日市市を事例に、経済成長と生存権のせめぎあいが民衆意識にいかなる影響を与えたのか、またそれに対し、地域レベルでいかなる教育政策が展開され、民衆意識に働きかける公害教育実践が行われたのかを明らかにすることである。特に、2012年度は、高度成長期の四日市市における社会教育政策の展開を明らかにすることを研究課題として設定し、地区市民センターに残された資料の収集と分析を行うよう予定していた。しかし、2012年度は当初の予定を変更し、70年代初頭に展開された四日市二次訴訟の運動とその中で営まれた学習活動に関する調査を実施した。予定を変更した理由として、2012年が四日市大気汚染訴訟の判決からちょうど40年目に当たり、地元四日市の中から裁判に関する歴史の掘りおこしを求める声があがったことが挙げられる。二次訴訟にかかわる学習活動については次年度以降の予定にもともと組み込まれており、前倒しする形で研究課題を変更した。2012年度に取り組んだ調査内容は、(1)四日市公害を記録する活動に長年取り組まれてきた沢井余志郎氏へのインタビュー、(2)四日市市立図書館地域資料室に保存されている二次訴訟関連の資料調査・収集、(3)地元紙『伊勢新聞』での四日市公害に関する報道内容の調査と資料収集である。調査の中で二次訴訟が公害児童の母親たちによって担われていたことが明らかになったため、特に(2)や(3)では公害児童に関する資料調査・収集も並行して行った。また、その成果は、日本社会教育学会第59回大会(北海道教育大学釧路校)で「四日市大気汚染訴訟下における公害から子どもを守る塩浜母の会の運動ーその展開と帰結」と題して報告するとともに、四日市住民の学習会においても報告した。本研究は、高度成長期に公害という形で「経済発展と福祉の相克」が色濃く表れた地域である三重県四日市市を事例に、経済成長と生存権のせめぎあいの中での民衆の意識形成と公害教育実践の展開について明らかにすることを目的としている。本研究では、(1)高度成長期における地域開発の展開と社会教育政策の展開の関連、(2)高度成長期の四日市市塩浜地区磯津における地域開発の影響と生活の変化、(3)地域開発下の公害教育実践が民衆の意識に与えた影響という三つの柱を立てて調査に取り組んでいるが、2014年度は主に(2)に関わる調査に取り組むことができた。2014年度は、「四日市公害と環境未来館」の開設に伴い、年度途中から環境学習センター公害資料室が使用できなくなるという大きな制約に見舞われたが、四日市市立図書館地域資料室に所蔵されている新聞記事等を用いて、60年代以降の四日市における地域課題や教育課題について調査を進めることができた。1960年には四日市市は海の水質汚濁によって「くさい魚」問題に直面しているが、当時は「災害」というと公害ではなく伊勢湾台風が大きな問題として取りあげられていること、四日市市では60年代初頭には受験等の学校における競争が課題として取りあげられていたことをつかむことができた。特に後者の問題については、60年代初頭に策定された四日市市教育計画の内容の検討と関わる内容であり、今後さらに掘り下げることが必要である。

本研究は、大気汚染を中心とする深刻な公害被害に見舞われた三重県四日市市に焦点を当てて、高度成長期の公害教育史の一端を明らかにしようという研究である。2015年度に取り組んだ主な調査は次の通りである。第一に、本研究開始時から続けてきた1960年代70年代初頭における四日市市の社会教育の実態に関する調査である。社会教育は、社会政策の教育的必要から生まれてきたとされており、社会問題の発生と固く結びついて営まれることがある。高度成長期の社会教育政策・実践史には、教育と福祉をどのように結びつけようとしたのかが現れていると考えられ、その一端を当時の公報などを用いながら明らかにするための調査に取り組んだ。第二に、当時の公害患者の生活史を明らかにすることを目的に、60-70年代に公害患者として幼少期を過ごした方に対するヒアリングを行った。これまでにもさまざまな公害患者の証言などは残されてきているが、当時子どもとして生活をしてきた方のヒアリングはあまり行われていない。今回はお一方から小学校時の生活を中心にヒアリングを行い、その生活の一端を明らかにすることができた。また、補足の調査として、当時の四日市の学校教育における公害対策についても学校史を用いて調査を行なった。研究期間全体を通じて、これまで研究されてこなかった高度成長期の四日市市における社会教育政策の展開と地域で実践された公害教育の展開、また公害の中で生活をしてきた公害患者の生活史の一端を明らかにすることができた。これは社会教育研究、環境教育研究ではまだ明らかにされてこなかったことであり、高度成長期公害教育史研究や社会教育史研究を進める上で、重要な成果である。本研究では、三重県四日市市を対象地域として、高度成長期に地域の中でどのように公害教育が実践されたのかを明らかにすることを目的とした。本研究では、第一に母親たちによる二次訴訟と養護学校建設運動の展開とそこで営まれた学習活動について調査し、養護学校義務制が実現するまでの過渡期における養護学校建設運動の困難性とその中で発生した二次訴訟準備の展開について明らかにした。第二に、すでに公害による健康被害が発生している中でも、四日市市の社会教育政策が勤労青年対策に重点を置いて展開されたことを明らかにした。2014年度は四日市公害と環境未来館開設準備に伴い環境学習センター公害資料室など、資料調査を行なう上での制約が生じたため、予定していた調査を行なうことができなかった。社会教育論2014年度に予定していてできなかった資料収集や関係者インタビューを行う。すでに、インタビュー対象者にはインタビューの実施を依頼し、承諾を得ているため実施し、4年間の調査結果を基に研究をまとめる。研究以外の雑務に時間を費やしたこともあり、2013年度に計画していた磯津寺子屋に関わった教員へのインタビュー等の関係者へのインタビューや関連する資料の収集などに取り組むことができなかった。2012年度は当初の予定を変更したものの、二度の調査を実施することができ、その成果を学会において発表することができたため、おおむね順調ということができる。ただし、以下の点について、さらなる調査が必要である。
視床運動核から皮質パルブアルブミン陽性ニューロンへの出力を形態学的に解析する

ラット大脳皮質運動関連領野への視床入力には、視床前腹側核-外側腹側核(VA-VL)と内側腹側核(VM)からのものが存在する。我々は以前に、VA-VL核はさらにinhibitory input-dominant zone (IZ)とexcitatory subcortical input-dominant zone (EZ)に分けられ、小脳からの情報はEZを経由し、基底核情報はIZを介して皮質に伝達されることを示し、さらにIZとEZで皮質投射様式が異なることを明らかにした。本研究では、IZと同様に基底核情報を担うVMについて検討し、1) VMには運動関連領野に主として投射するニューロンと、前頭前野に強く投射するニューロンの2群が存在する、2) VMニューロンの軸索の78%が皮質1層に分布したが、これはIZニューロンの54%よりも高率である、などの所見を得た。次に、高次運動関連領野と考えられる前頭前野と関連が深い、背内側核(MD)について調べた結果、57-97%の軸索が前頭前野の中間層に分布した。さらに、運動性視床核のニューロンから皮質パルブアルブミン陽性インターニューロンに対するシナプス入力の解析を行ったところ、一部の終末様構造が実際にシナプス結合の形成が可能なほど近接している部位が見つかった。本研究は、1個の視床ニューロンの軸索から大脳皮質の「ある機能グループ」に属するニューロン群の樹状突起へのシナプス結合特性を網羅的、形態学的に解析し、その構造的特徴を読み解き、機能を推測することを目的として行っている。まず、「ある機能グループ」を、パルブアルブミン陽性のfast spikingインターニューロン(PVニューロン)と設定した。そのため、PVニューロンの樹状突起をすべて可視化する必要があるが、これは当研究室で開発されたトランスジェニック動物、"PVマウス"を利用することで達成した。このPVマウスは、PVニューロンの樹状突起と細胞体が特異的に、完全にGFPにより標識されているので、抗GFP抗体により免疫染色を行うことで、PVニューロンの樹状突起と細胞体が特異的に可視化できる。次に、単一の視床ニューロンを軸索末端まで完全に可視化することが必要だが、これには遺伝子改変シンドビスウイルスを用いた。この遺伝子改変シンドビスウイルスは、感染した細胞に膜移行性シグナル付きの赤色蛍光タンパク(RFP)を強制発現させ、感染細胞を軸索末端まで完全にRFP標識する。単一の視床ニューロンがウイルスに感染したサンプルを作製するため、適切に希釈したウイルス液をマウス視床に注入する実験を何度も行ったが、サンプルが得られる効率が悪く、予定どおり研究が進まなかった。サンプルが得られる効率が悪いのは、マウスの脳のサイズが小さく目標の視床VA-VL核やVM核に正確に針を入れることが難しいためである。そこで研究方法を変更し、PVマウスの脳のスライス標本を作製し、細胞内記録・染色法を用いて単一ニューロンを可視化することにした。この手法で単一の皮質錐体ニューロンの標識に成功し、錐体ニューロンからPVニューロンへの情報入力の解析を行い、成果が得られつつあり、学会、論文発表の準備中である。そのため、PVニューロンの樹状突起をすべて可視化する必要があるが、これは当研究室で開発されたトランスジェニック動物、"PVマウス"を利用することで達成できる。このPVマウスは、PVニューロンの樹状突起と細胞体が特異的に、完全にGFPにより標識されているので、抗GFP抗体により免疫染色を行う事で、PVニューロンの樹状突起と細胞体が容易に、しかも特異的に可視化できる。次に、単一の視床ニューロンを軸索末端まで完全に可視化することが必要だが、これには遺伝子改変シンドビスウイルスを用いて実験を行っている。

この遺伝子改変シンドビスウイルスは、感染した細胞に膜移行性シグナル付きの赤色蛍光タンパク(RFP)を強制発現させるため、感染細胞は軸索末端まで完全にRFPにより標識される。ウイルス液を適切に希釈し、マウス視床に注入する事で、単一の視床ニューロンを完全に可視化する。現在は、PVマウスに様々な濃度に希釈したウイルス液を注入し、単一ニューロン標識に最適なウイルス液の濃度、液量を決定しているところである。また、GFP標識されたPVニューロンの樹状突起、およびRFP標識された視床ニューロンの軸索を抗GFP抗体と抗RFP抗体をもちいて、明視野二重染色するプロトコールも完成しつつある。PVニューロンの樹状突起の可視化に関しては、すでにトランスジェニックマウスが開発済みなので、達成できている。後は、単一のマウス視床ニューロンの軸索の可視化であるが、遺伝子改変シンドビスウイルスを用いることで、達成できる。実際に、ウイルス液をマウスに注入し、視床のニューロンが感染する事は確認済みである。現在は単一の視床ニューロンに感染させるために最適なウイルス液の濃度、注入液量を決定するための予備実験を実施しているところで、もうすぐプロトコールが完成する。まず、シンドビスウイルスの注入の最適条件を決定する。最適なウイルス液の濃度、注入液量が決定し、また染色のプロトコールが決定すれば、あとは実験の回数を重ねていき、必要なサンプル数を集める予定である。また、サンプルが得られた暁には、ニューロルシダを用いて、軸索の三次元再構築やアポジション(シナプスを形成している可能性のある部位)の分布の解析など、詳細な形態解析を行う予定である。もし、最適条件でも、単一の視床ニューロンの標識が効率よく行えず、サンプルが得られない場合はjuxtacellular recordingなど、他の単ーニューロン標識法の使用を試みる。一般試薬、遺伝子改変シンドビスウイルスベクターの作製に必要な試薬類の購入、免疫染色に必要な抗体などの購入に使用する。また、トランスジェニックマウスの維持に必要な経費の支払いも行う。得られた成果を学会や論文で発表するのに必要な経費にも使用する。
硬変肝切除後の肝再生に果たすグルタミンと肝細胞成長因子の役割

肝硬変ラットで肝細胞成長因子(HGF)の肝再生への効果を検討してきたが、有意な効果は得られなかった。HGFが肝細胞に作用する際、グルカゴンがco-mit-ogenとして働くという報告に注目して、HGFとグルカゴンのラット肝再生に及ぼす効果と糖代謝異常下の肝再生を検討した。1.HGFとグルカゴンのラット肝再生に及ぼす効果:体重250300gのWistar系雄性ラットに対してHiggins and Andersonの方法に準じて70%肝切除を行い、肝切除のみを施行した群(A群)、肝切除後グルカゴンを皮下投与した群(B群)、肝切除後HGFを門脈内投与した群(C群)、肝切除後グルカゴンの皮下投与とHGFの門脈内内投与を併用した群(D群)の4群に分け肝再生能を検討した。グルカゴンは0.1mg/kgの量を肝切除直後から12時間間隔で4回投与した。HGFの門脈内投与は、肝切除6時間後に再開腹し腸間膜静脈内に4μg/kgのHGFを直接注入することによって行った。肝再生能の指標として残肝DNA含量およびproliferating cell nuclear antign (PCNA)陽性細胞率を測定した。B群ではA群と比較し肝切除48時間後の全肝当たりのDNA含量は有意に増加していた(12.04±3.25(mean±SD)mg vs8.26±1.68mg,p<0.05)。PCNA陽性細胞率は両群間に有意差を認めなかった。しかしDNA含量はA群とC群の間に有意差はなく、B群とD群の間にも有意差は認められず、今回使用した量のHGFでは肝再生促進作用、グルカゴンとの協調作用は証明できなかった。2.糖代謝異常下、ラット肝再生に及ぼすグルカゴンの効果:Streptozotocin 60mg/kgを尾静脈から投与し、ラット膵におけるβ細胞を選択的に破壊した。このラットに対して、70%肝切除を行いグルカゴン皮下投与の肝再生に及ぼす効果を検討した。グルカゴンを皮下投与した群の全肝当たりのDNA含量は10.11±1.65mgであり、投与しなかった群の6.33±0.94mg(p<0.01)に比べて有意に高かった。Wistar系雄性ラットに70%肝切除を施行後3群に分け、それぞれ高濃度分岐鎖アミノ酸輸液、それにグルタミンを付加した輸液、さらに0.01mu/kg/分の速度で肝細胞成長因子を投与した。肝再生の指標として肝組織オルニチン脱炭酸酵素活性を測定すると同時に、肝細胞障害の指標として肝組織過酸化脂質、血清GOT、GPT、LDH、ならびに血中過酸化脂質を測定した。一部のラットでは血中遊離脂肪酸も測定した。またICGクリアランスメータを用いて色素排泄能も検討に加えた。さらに、一部のラットは犠牲死させ肝の組織学的検討を行った。肝再生重量および肝組織オルニチン脱炭素酵素活性は3群間で有意差は認められなかった。