hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中学生のストレス耐性の向上を目指したストレスマネジメントに関する実践的研究

本研究の目的は,中学生の心理的ストレス耐性を高めることを目的として,中学校現場で実施可能なストレスマネジメントプログラムを考案し,その実施と効果の検証を行うことであった.今年度は主に以下の成果をあげた.1,ストレスマネジメントプログラムを考案し,50分×9時間分の授業指導案とワークシート等の教材を作成した.具体的な構成は,(1)導入,(2)心と身体の関連性の理解:筋弛緩法の習得,(3)ストレス状態の理解:ストレス反応,(4)ストレス源(ストレスを感じる出来事)の理解:ストレッサー,(5)ストレスを感じさせる考え方の理解:認知的評価,(6)ストレスへの対処方法の理解(1):対処方法の存在と種類,(7)ストレスへの対処方法の理解(2):対処方法の効果・選択(1),(8)ストレスへの対処方法の理解(2):対処方法の効果・選択(2),(9)まとめ:ストレスマネジメントの実践である.その際,中学校教諭数名,および心理的ストレスを専門研究領域とする研究者2名の意見に基づき,修正が複数回行われた,2.作成されたプログラムに基づいて,9時間授業1校(2年生:総合的な学習の時間),2時間授業3校(1,2,3年生:総合的な学習の時間,保健体育,道徳)でストレスマネジメントが実施された.授業後のアンケート調査から,生徒たちは授業内容に非常に関心を持ち,自己の心理的ストレスや心の健康について考える良い機会となったこと,3年生の中には高校受験期に積極的に筋弛緩法を行うなど授業内容が日常のストレスマネジメントに活かされていることが報告された.我が国では,学校場面における系統的なストレスマネジメントプログラムの開発段階である.したがって,指導案や教材を含めた本プログラムの考案は,今後のストレスマネジメントの実践を促進するものとなろう.今後の課題は,統計的な効果の検証を行いながら,より効果的なプログラムへと改訂していくことである.本研究の目的は,中学生が日常の学校生活で経験する心理的ストレスのメカニズムの解明,および効果的なストレスマネジメントプログラムの開発であった.平成13年度は,公立中学校生徒を対象として,心理的ストレスにおける重要な媒介変数に関する検討を行い,これを基に効果的なストレスマネジメントプログラムの考案を行う計画であった.具体的には,以下の検討を行い,成果を得た.(1)公立中学校生徒を対象として行われた調査データに基づき,心理的ストレス,学校不適応行動に関する諸変数の詳細な機能を検討した.その結果,中学生が経験する学校ストレッサーに対する対処行動は,生徒のストレス反応の表出に関与することが明らかにされた.また,ストレッサーに対するコントロール感が低い状態では,ストレッサーに対して積極的に対処することは,かえってストレス反応を高めるなど,ストレス反応軽減における媒介変数の詳細な役割が明らかにされた.(2)ストレスマネジメントプログラムを構成する要素の一つであるリラクセーション法の効果を確認するために,中学校の1クラスを対象として,2,3学期に朝のHRでリラクセーション法を実施した.週3日程度の割合で継続した結果,担任教師から,クラスの雰囲気が落ち着いたこと,生徒の自主性が高まったこと,コンクール発表前の緊張場面で生徒が自主的にリラクセーション法を実施して自分たちのストレスレベルを低減させていたこと等,クラス単位で継続してリラクセーション法を実施することの効果が報告された.(3)本結果と申請者がこれまでに行った研究結果とを総合して,中学生のストレス耐性の向上を目的としたストレスマネジメントプログラムを具体的に考案した.(4)上記(3)で作成されたプログラムについて,来年度ストレスマネジメントプログラムを実施予定の公立中学校教師に意見・助言を求め,プログラムの修正を行っている.本研究の目的は,中学生の心理的ストレス耐性を高めることを目的として,中学校現場で実施可能なストレスマネジメントプログラムを考案し,その実施と効果の検証を行うことであった.今年度は主に以下の成果をあげた.1,ストレスマネジメントプログラムを考案し,50分×9時間分の授業指導案とワークシート等の教材を作成した.具体的な構成は,(1)導入,(2)心と身体の関連性の理解:筋弛緩法の習得,(3)ストレス状態の理解:ストレス反応,(4)ストレス源(ストレスを感じる出来事)の理解:ストレッサー,(5)ストレスを感じさせる考え方の理解:認知的評価,(6)ストレスへの対処方法の理解(1):対処方法の存在と種類,(7)ストレスへの対処方法の理解(2):対処方法の効果・選択(1),(8)ストレスへの対処方法の理解(2):対処方法の効果・選択(2),(9)まとめ:ストレスマネジメントの実践である.その際,中学校教諭数名,および心理的ストレスを専門研究領域とする研究者2名の意見に基づき,修正が複数回行われた,2.作成されたプログラムに基づいて,9時間授業1校(2年生:総合的な学習の時間),2時間授業3校(1,2,3年生:総合的な学習の時間,保健体育,道徳)でストレスマネジメントが実施された.授業後のアンケート調査から,生徒たちは授業内容に非常に関心を持ち,自己の心理的ストレスや心の健康について考える良い機会となったこと,3年生の中には高校受験期に積極的に筋弛緩法を行うなど授業内容が日常のストレスマネジメントに活かされていることが報告された.我が国では,学校場面における系統的なストレスマネジメントプログラムの開発段階である.

したがって,指導案や教材を含めた本プログラムの考案は,今後のストレスマネジメントの実践を促進するものとなろう.今後の課題は,統計的な効果の検証を行いながら,より効果的なプログラムへと改訂していくことである.
優性遺伝型脊髄小脳変性症のハイスループット遺伝子変異探索

本研究の目的は、常染色体優性遺伝型の脊髄小脳変性症のうち、未だ原因が不明の病型の原因を現在の技術で最も迅速と考えられるハイスループットな手法で同定することである。我々はこれまで本邦の原因不明の優性遺伝型脊髄小脳変性症を集積し、2009年にその1病型の原因を発見することが出来た。しかし未だ原因が同定されない病型(「未同定SCA」)が全SCA家系の10-20%と多数存在する。本研究では原因同定に有力な家系に絞って次世代シークエンサーとDNAマイクロアレー法を用いて原因の探索を目指した。まず家系5つについてマイクロアレーを用いて遺伝子変異が存在する候補染色体領域を限定ました。次に各家系から発症者2名ずつを選び、次世代シークエンサーを用いてエクソーム解析を行った。その結果、1つの家系ではその連鎖候補領域内に存在する遺伝子内に、発症者全員に共通する遺伝子異常を見出した。この遺伝子異常は種を越えて保存されている機能的に重要な部位の変化であり、コンピュータ予測の結果でも原因である可能性をサポートする結果を得た。しかし、この結果のみでは本家系の原因であると断定できないため、当該家系と臨床的に類似する家系を全国に募った。その結果、15家系の集積が得られた。これらについて、平成24年度ゲノム支援から支援いただき、エクソーム解析を行った。その結果、1家系に同じ遺伝子内に異常を見出した。目下、この異常が家系内で分離するかどうかを検討している。他の家系についても、遺伝子異常の探索を進めることができた。しかし、未同定SCAの家系自体が集積しづらく、原因の発見に至るためにはさらに多くの家系の集積を進めることが大きな課題の一つであることが判明した。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では原因未同定の常染色体優性遺伝性脊髄小脳変性症(以下、未同定SCAと略)の原因を解明するためにポジショナルクローニングを行った。まず、家系の規模が大きい5家系について1塩基多型(SNP)マーカーを搭載した最新鋭DNAマイクロアレー(Affymetrix Genome SNP6.0)を用いてゲノタイピングを行いソフトウエアーAllegro等を用いて連鎖解析を行った。その結果、最も大きな単一家糸で連鎖を否定できない染色体領域が4つ検出された。さらに臨床的に類似する残る3つの家系を加味すると、その領域が更に限定化された。次に東京大学ゲノムセンター(東京大学神経内科辻省次教授)の御協力を得て、5家系発症者合計10名について、全ゲノムのexome sequencingを行っていただいた。十分なカバレッジを示す有効なシークエンス解析を行うことができた.その結果、dbSNPなどの公的データベースになく、かつ翻訳領域内で非同義性置換と判断できた新しい遺伝子変化を各検体で300個程度発見した.家系ごとにその意義を検定した場合発症者に共通する遺伝子変化を探すと100個程度ずつに絞られ、さらに臨床的に共通する4家系で一致するものを探すと、2つに限定された。このうち、先の連鎖解析で連鎖が否足できない染色体領域に存在する遺伝子変化が1つあり、その意義を検証した。今年度終了時点で、多数の検体でその遺伝子変化の意義と、未同定SCAを発症する原因になるかどうかの検証を進めた。一方、未同定SCAの原因解明には、それに相当する疾患患者を増やし、より確からしい遺伝検索を行うことが必要である。我々は、当研究機関に依頼のあったSCA患者のゲノムDNAを、依頼者(当該患者)の同意を得て遺伝子解析を進めた。その結果、研究開始当初より多い50家系の集積を果たすことができた。また、その過程で新しく希少な遺伝子変異をITPR1遺伝子に同定し、日本人類遺伝学会の学会誌に誌上報告することができた。さらに、新しく発見されたSCA36遺伝子の変異も同足することができ、現在その結果は論文執筆中である。以上の経緯で未同定SCAの原因探索を進めることができた。来年度は2年度になり、更にその成果を進めて原因の道程を果たしたい。

これらについて、平成24年度ゲノム支援から支援いただき、エクソーム解析を行った。その結果、1家系に同じ遺伝子内に異常を見出した。目下、この異常が家系内で分離するかどうかを検討している。他の家系についても、遺伝子異常の探索を進めることができた。しかし、未同定SCAの家系自体が集積しづらく、原因の発見に至るためにはさらに多くの家系の集積を進めることが大きな課題の一つであることが判明した。24年度が最終年度であるため、記入しない。申請時の記載通りの進捗と言えるため。文部科学省ゲノム支援の支援などを受けて研究を促進させたい。
エルゴード理論における諸問題について

1.重み付き核の存在性とその性質について、Z.Nehariは、1950年から1952年にかけて調べている。M.Uehara and K.Anzai(1992年)は、重み付き核の極値問題、固有値問題及び一般的Nehari問題について調べた。特に、Dを解析的Jordan曲線を境界に持つ正則領域とし、重み関数を境界〓D上の正の連続関数とする。内部で正則で、Fatouのnontangential境界値を持つ関数の、重み付きHilbert空間を考える。重み付Szego核の高次導関数は、再生核となり、それらの性質を調ベることにより、重み付き核の極値問題、固有値問題及び一般的Nehari問題について調べた。2.A.Beuringは、1964年、Beuring環を構成し、その性質を調ベた。その結果を用いて、一変数の関数の場合、Fourier変換が存在するための必要十分条件を求めた。重み付き関数の族を要いて、R^n上のBeuring環を構成し、それらの性質を調べることにより、R^n上のFourier変換が存在するための必要十分条件を求めた。この結果は、投稿準備中である。
ビタミンD受容体のリガンド結合能獲得機構における分子シャペロン系の関与

ステロイドホルモンが標的細胞でその機能を発現するにはまずその受容体との結合が必要となる。グルココルチコイド受容体(GR)、プロゲステロン受容体(PR)においては、脂溶性リガンドとの結合能を獲得するためには受容体が合成された後にhsp90をはじめとする分子シャペロン系の協調作用によりステロイド結合領域の疎水性部位が開かれることが必要である。一方、ステロイドホルモン受容体に属するビタミンD受容体(VDR)がリガンドと結合する際に同様の機構が関与し、受容体の構造および機能の変化がもたらされるかは明らかではない。今回の研究ではVDRがリガンドとの結合能を獲得する過程にGRやPRにおけるのと同様な分子シャペロン系の作用機構が存在しているかどうか生化学的なアプローチを試みた。従来VDRが細胞の粗抽出液中では非常に不安定な蛋白質であると報告されてきたが、これまでの研究により、免疫沈降法で生成されたVDRは生理的温度ではリガンド結合能を失わず非常に安定であることが分かった。また、熱変性を受けてリガンド結合能が失われたVDRがウサギreticnlocyte lysate(RL)によりリガンド結合能が復元されることを示す実験系、reticulocyte lysate renaturation systemを確立し、この復元がATP依存的、K^+依存的な現象であること、また、この実験系の作用にはhsp70が必須であることを見い出した。一方、この実験系ではGRで得られた結果とは異なり、hsp90は関与していないと考えられた。さらに、RLに含まれる、hsp70以外の何らかの因子がこの系に関与しており、hsp70の機能に対し触媒的に作用することを示唆する実験結果も得た。また、実験結果からhsp70の内在性ATPaseを触媒的に活性化することが知られるhsp40がこの候補に挙げられることが強く示唆された。今後はGRやPRなどで一般的に用いられている受容体の過剰発現系を用い、さらに研究を発展させたい。よって今回、VDRがリガンドとの結合能を獲得する過程にGRやPRにおけるのと同様に分子シャペロン系の作用が関与しているかどうかを明らかにしようと試みた。私は最近、熱変性を受けてリガンド結合能が失われたVDRがウサギreticulocyte lysate(RL)によりリガンド結合能が復元されることを示す実験系、reticulocyte lysate renaturation system(RLRS)を確立し、この復元がATP依存的、K^+依存的な現象であることを見い出した。これら条件はhsp70のシャペロン活性に必須であることが知られることから、VDRに対するRLの作用に少なくともhsp70が必要であることが示唆される。そこでATPに対する親和性を利用しhsp70を選択的に除去したRLを用いて検討したところ、hsp70が除去されたRLではVDRのリガンド結合能は復元されず、精製されたhsp70の添加によって結合能が復元されたことから、このRLRSにはhsp70が必須であることがわかった。精製されたhsp70単独でもこの活性が認められたが、hsp70が除去されたRLにより相乗的効果が得られることから、RLに含まれる、hsp70以外の何らかの因子がRLRSに関与していると考えられる。

さらに、RLに含まれる、hsp70以外の何らかの因子がこの系に関与しており、hsp70の機能に対し触媒的に作用することを示唆する実験結果も得た。また、実験結果からhsp70の内在性ATPaseを触媒的に活性化することが知られるhsp40がこの候補に挙げられることが強く示唆された。今後はGRやPRなどで一般的に用いられている受容体の過剰発現系を用い、さらに研究を発展させたい。
細胞内標的ペプチドベクターの開発と細胞内送達のリアルタイム追跡

近年、HIV-1 Tat由来の塩基性ペプチドをはじめとした様々ペプチドを細胞内移送ベクターとして用いることにより、様々な物質を細胞内に導入できることが分かった。本研究では細胞内に移行する細胞透過ベクターペプチドをリアルタイムに観察し、核やミトコンドリアといった細胞内器官局在化ペプチドとのハイブリダイゼーションによる細胞内での動態変化に関して検討を行った。共焦点顕微鏡により、生細胞へのアルギニンペプチドの取り込みを追跡した結果、細胞内ではR8ペプチドは主としてエンドソームに保持された形で観察され、微小管伸長を阻害するノコダゾール存在下に取り込みが阻害されることから、微小管が細胞内移行に重要であることが分かったが、サイトゾルに移行したペプチドを効果的に観察することは出来なかった。しかし、血清非存在下、あるいはペプチド濃度を上げることにより、多くのペプチドがサイトゾルに効果的に放出されることが明らかとなった。核やミトコンドリア移行シグナルペプチドと細胞内移行ベクターとのハイブリッドペプチドの調製を行い、前者が細胞内移行ベクターのみの場合に比べて効果的に核に集積したのに対し、後者においては顕著なミトコンドリアへの集積は見られなかった。アルギニンペプチドとミトコンドリア局在化ペプチドの間を細胞内で開裂可能なジスルフィド結合で架橋した場合もミトコンドリアへの局在は見られず、このシグナルペプチドは細胞内で蛋白質として発現した場合のみ有効であることが分かった。本研究遂行にあたり、研究協力者の英国・カディフ大学A.T.Jones博士とハンガリー科学アカデミーFerenc Hudecz教授を招聘し、薬物処理条件下での生細胞観察に関して、ならびに抗ガン剤の細胞内送達と観察に関して観察技法を習得した。近年、HIV-1 Tat由来の塩基性ペプチドをはじめとした様々ペプチドが効率的に細胞膜を透過することが明らかとなり、これを細胞内移送ベクターとして用いることにより様々な物質を細胞内に導入できることが分かった。本研究は、(1)蛍光顕微鏡を利用したリアルタイムイメージングにより、細胞内に移行する細胞透過ベクターペプチドの挙動を追跡する系を確立し、(2)ペプチドベクターとシグナルペプチドのハイブリッド体を調製し、ハイブリダイゼーションにより細胞内での動態がどのように変化するかに関しての情報を得、(3)ペプチド配列などに検討を加え、目的の細胞内器官(特に転写制御や遺伝子送達を目指して核へ、抗ガン剤などの送達を目指してミトコンドリアへ)に効率的に送達される系を開発することを目的としている。(1)、(2)に関して、HIV-1 Tatペプチドならびにオクタアルギニン(R8)の生細胞への導入を行い、細胞内取り込み過程におけるリアルタイム観察に成功した。細胞内ではR8ペプチドは主としてエンドソームに保持された形で観察され、微小管伸長を阻害するノコダゾール存在下に取り込みが阻害されることから、微小管が細胞内移行に重要であることが分かった。さらに現在、細胞質内に移行したペプチドベクターの詳細なモニタリングを可能とするように、スプリット型の緑色蛍光タンパク質(EGFP)を調製し、一方の断片を細胞内にあらかじめ発現させておき、他方を細胞外から導入することにより細胞内でのみ蛍光を発する系の樹立を試みている。(3)に関しては、核やミトコンドリア移行シグナルペプチドと細胞内移行ベクターとのハイブリッドペプチドを調製し、これらが、ある程度の割合でこれらの器官に集積することを確認しており、現在、局在をさらに高めることを検討している。近年、HIV-1 Tat由来の塩基性ペプチドをはじめとした様々ペプチドが効率的に細胞膜を透過することが明らかとなり、これを細胞内移送ベクターとして用いることにより、様々な物質を細胞内に導入できることが分かった。本研究に於いては蛍光顕微鏡を利用したリアルタイム観察により、細胞内に移行する細胞透過ベクターペプチドの挙動を検討するとともに、核やミトコンドリアといった細胞内器官局在化ペプチドとのハイブリダイゼーションにより細胞内での動態がどのように変化するかに関しての検討を行った。

共焦点顕微鏡により、生細胞へのアルギニンペプチドの取り込みを追跡した結果、大部分のペプチドがエンドサイトーシスにより取り込まれ、エンドソームの観察には成功したものの、サイトゾルに移行したペプチドを効果的に観察することは出来なかった。しかし、血清非存在下、あるいはペプチド濃度を上げることにより、多くのペプチドがサイトゾルに効果的に放出されることが明らかとなった。核局在化シグナルペプチドを付加したアルギニンペプチドがアルギニンペプチドのみの場合に比べて効果的に核に集積したのに対し、ミトコンドリア局在化ペプチドを付加したアルギニンペプチドの顕著なミトコンドリアへの集積は見られなかった。アルギニンペプチドとミトコンドリア局在化ペプチドの間を細胞内で開裂可能なジスルフィド結合で架橋した場合もミトコンドリアへの局在は見られず、このシグナルペプチドは細胞内で蛋白質として発現した場合のみ有効であることが分かった。本研究遂行にあたり、英国・カディフ大学薬学部A.T.Jones博士と薬物処理条件下での生細胞観察に関して、また、ハンガリー科学アカデミーFerenc Hudecz教授と抗ガン剤の細胞内送達と観察に関しての共同研究を進め、これらの外国人共同研究者を招聘して観察技法を習得した。
マスト細胞上の細胞接着因子の解析

インテグリンファミリーに属する多くの接着分子が同定され、白血球上に発現されている分子は、その接着機能により白血球の遊走だけでなく、活性化による機能発現を調節するシグナル伝達分子としても機能していることが明らかになってきた。このような接着分子を介した細胞活性化の解析は主にT細胞を用いてなされ、ヘルパーT細胞におけるサイトカインの産生、あるいはキラーT細胞における脱顆粒反応等への関与が明らかにされている。マスト細胞の高親和性IgE受容体(FcεRI)を介した活性化は、そのシグナル伝達様式や、それによる脱顆粒反応、さらにはTNF、IL-3等のサイトカイン産生が誘導されることなど、T細胞の抗原受容体を介した活性化に類似している点が多く、T細胞の活性化と同様に、マスト細胞の活性化もまた、種々の接着分子を介したシグナルにより調節されていることが予想された。そこで、今回我々は、ラットマスト細胞におけるフィブロネクチン受容体の発現とその機能について検討した。ラット好塩基球性白血病細胞株(RBL-2H3)及びPMA刺激下におけるラット腹腔マスト細胞(RPMC)は、フィブロネクチン(FN)、ヴィトロネクチン(VN)、及びフィブリノーゲン(FB)に強く結合した。これらのマスト細胞上には、フィブロネクチン受容体として機能するインテグリン分子として、VLA-4,VLA-5,ヴィトロネクチン受容体(VNR)の発現を認めた。これらのマスト細胞とFNとの結合は、今回新たに作製した抗VLA-α4(MRα4-1)、α5(HMα5-1)、VNR(HMβ3-1)、抗体及びCS-1ペプチド(VLA-4主要結合部位)、RGDペプチド(VLA-5、VNR主要結合部位)の添加により阻害された。FN、コラーゲン(CL)、BSA、poly-L-lysinをコートしたプレート上でIgEと結合したRBL-2H3細胞を抗IgE抗体より活性化すると、FNをコートしたプレート上では、その他をコートしたプレートに比し著明な脱顆粒の亢進が認められた。この増強効果は、抗インテグリン抗体であるMRα4-1、HMα5-1、HMβ3-1、及びCS-1ペプチド、RGDペプチドの添加により阻害された。この結果から、VLA-4、VLA-5、VNRといったインテグリン分子を介したFNへの結合は、高親和性IgE受容体(FcεRI)を介したマスト細胞の活性化を増強することが明らかになった。同様な機序は、生体内においても、FN等の細胞外マトリックス(ECN)に富む粘膜あるいは組織内に存在するマスト細胞の反応性を高めることに寄与していることが予想され、このことは、マスト細胞のFNへの結合を阻害する抗インテグリン抗体であるMRα4-1、HMα5-1、HMβ3-1の皮下への前投与によりPassive cutaneous anaphy laxis(PCA)反応が著名に抑制されたことから実証された。この結果からラットマスト細胞上に発現しているFN受容体インテグリンは、in virto及びin vivoどちらかにおいてもマスト細胞の活性化の調節において重要な役割を果していることが示唆された。

この結果から、VLA-4、VLA-5、VNRといったインテグリン分子を介したFNへの結合は、高親和性IgE受容体(FcεRI)を介したマスト細胞の活性化を増強することが明らかになった。同様な機序は、生体内においても、FN等の細胞外マトリックス(ECN)に富む粘膜あるいは組織内に存在するマスト細胞の反応性を高めることに寄与していることが予想され、このことは、マスト細胞のFNへの結合を阻害する抗インテグリン抗体であるMRα4-1、HMα5-1、HMβ3-1の皮下への前投与によりPassive cutaneous anaphy laxis(PCA)反応が著名に抑制されたことから実証された。この結果からラットマスト細胞上に発現しているFN受容体インテグリンは、in virto及びin vivoどちらかにおいてもマスト細胞の活性化の調節において重要な役割を果していることが示唆された。1.ラットマスト細胞のECM接着性ラット好塩基球性白血病株RBL-2H3はフィブロネクチン(FN)、ビトロネクチン(VN)に強く接着するが、ラミニン(LM)、コラーゲン(CL)には接着しない。一方ラット腹腔マスト細胞(RPMC)は未刺激では、いずれのFCMとも接着しないが、短時間(37°,30分)のPMA刺激によりFN,VN,FBに強く接着する他、LMにも弱く接着した。この結果は、未刺激のT細胞と同様に未刺激のマスト細胞上のECM受容体インテグリンは非活性型で存在し、PMC等による細胞の活性化により活性型に転換する親和性の調節機序がマスト細胞上へも存在することを示す。2.ラットマスト細胞上のFN受容体の発現FN受容体として働くインテグリンとして、VLA-3,4,5が知られているがFACS解析によりRBL-2H3,RPMC上にVLA-4,5,VNRの発現が確認され、特にVLA-4とVNRの三者を介してFNに接着していることが示唆された。3.FNへの接着によるラットマスト細胞活性化の調節FN,CL,或いは、BSAをコートしたプレート上でIgEを結合したRBL-2H3細胞を抗IgE抗体より活性化すると、FNをコートしたプレート上ではCL,BSAに比して著明な脱顆粒をみとめた。この増強効果は、VLA-4,FNの接着阻害するCS-1ペプチド,VLA-5,RGDペプチドで阻害された。また抗VLA-4抗体によっても阻害された。インテグリンファミリーに属する多くの接着分子が同定され、白血球上に発現されているこれらの分子は、その接着機能により白血球の遊走能だけでなく、活性化による機能発現を調節するシグナル伝達因子としても機能していることが明らかとなってきた。マスト細胞の高親和性IgE受容体(FcεRI)を介した活性化は、そのシグナル伝達様式や、それによる脱顆粒反応、サイトカイン類誘導など、T細胞の抗原受容体を介した活性化に類似している点が多い。そこで我々は、接着分子の1つであるフィブロネクチン受容体の発現と機能について、ラットマウス細胞を用いて実験をおこなった。ラット好塩基球性白血病細胞株(RBL-2H3)、及びPMA刺激下におけるラット腹腔マスト細胞(RPMC)は、フィブロネクチン(FN)、ヴィトロネクチン(VN)及び、フィブリノーゲン(FB)に強く結合した。また、これらのマスト細胞上には、フィブロネクチン受容体として機能するイングリン分子としてVLA-4,5,ヴィトロネクチン受容体(VNR)の発現を認めた。
対テロ武力行使における必要性・均衡性原則が与える武力行使法規範間の影響関係の研究

本研究は、領域統治能力を欠いた領域に所在するテロリストに対する武力行使に伴う必要性・均衡性原則の評価基準を明確化し、武力行使の開始の合法性を評価する国際法と武力行使中の行為態様を評価する国際法の適用関係または相互影響関係を位相に応じて分析し体系化を行うものであった。その結果、テロリストへの武力紛争法の適用の困難さを前提に、伝統的な正当化根拠としての自衛権に依拠して正当化する事例が多いが、その「武力攻撃」の発生時期および攻撃主体の概念は柔軟に解釈され拡大された分、攻撃対象の選定といった識別や無差別攻撃の禁止という武力紛争法の規範が自衛権の必要性・均衡性原則の基準として機能していることを導出した。初年度にあたる2013年度は、国際法における武力行使を規制する武力行使の開始の合法性を評価するjus ad bellumと武力紛争法であるjus in belloの相互独立性とその相互影響関係に関する先行研究を分析・検証した。具体的内容として、武力行使に関する国際裁判所の判決の再検討を行った。国際司法裁判所におけるニカラグア事件、核兵器使用・威嚇合法性に関する勧告的意見、オイル・プラットフォーム事件、コンゴ・ウガンダ軍事活動事件の判決理由、各裁判官の個別及び反対意見、ならびに各国の申述書を中心に、その論理構造を検討した。そのうえで、両法体系間の関係を1980年代に論じた先駆的研究を行ったC.Greenwoodの学説分析も踏まえて、今後の研究遂行の方向性を確認した。その結果として得られた、今後の研究上の意義および重要性として、上記検討における国際社会における集権化、具体的には国際連合の有する国際集団安全保障体制がどのように機能しているか、そしてそれに対してjus ad bellumとjus in belloとの関係にいかなる影響を与えているのかという視座も不可欠であるということが明らかになった。すなわち、前述のGreenwoodの先行研究は、米ソ冷戦構造の中で安全保障理事会が拒否権により十分な機能を果たすことが困難であった国際情勢を背景としていた。したがって、その学説が冷戦構造の終焉後の1990年代以降の安保理による武力行使を伴う国際紛争への対処については想定されておらず、それゆえ、イスラエル・パレスチナ間の紛争やアフガニスタン戦争といった現代的紛争に対する国連安保理決議の検討がなされなければならない。そのような国家実行および国連の実践の実証的分析をも重視した分析の重要性が明らかになった。今年度は、テロリズムに対する自衛権に基づく武力行使に関して、とりわけアフガニスタンに対する武力行使に焦点を合わせて事例研究を行った。そこでは、米国等の有志連合による2001年のアフガニスタン攻撃以降、国連安全保障理事会の関与により、武力行使の根拠が変更されることで、その行使態様基準にも変化が生じたことを明らかにすることができた。すなわち、jus ad bellumという武力行使の合法性を規律する規範とjus in belloという武力紛争法の相互関係を見出すことが可能となった。その際の必要性・均衡性原則の解釈・適用においては、軍指令の検討から、安保理決議によるOEF(不朽の自由作戦)とISAF(国際治安支援部隊)の協働化措置の結果として、そこには自衛権に内在する行使態様規制要素である必要性・均衡性原則が導入され、同原則がjus ad bellumのみならず、武力紛争中においても適用されることが明らかにされた。このjus ad bellum上の行使態様規制が、安保理決議という特別の規範を介在することにより、武力紛争中の当事者の行為に規範的に統制を及ぼし、それゆえ、jus ad bellumが敵対行為を規制するjus in belloを補完する機能を果たしていると結論することができる。今年度は、昨年度に引き続き、テロリズムに対する自衛権に基づく武力行使に関する事例研究を行うとともに、昨年度のリサーチ結果を前提にして、自衛権概念をテロリストに対処する武力行使に特化して「時間的・主体的位相」という独自の分析枠組みを用いて検討をおこなった。イスラエル、パレスチナ、アフガニスタンやイラクおよび私的集団であるアルカイダが国境を越えてネットワークで活動している地域におけるこれまでのテロリスト(テロリスト集団・組織)に対する武力行使事例を具体的に詳細に取り上げて、領域統治能力欠如の領域国およびそこに所在するテロリストに対する武力行使に伴う必要性・均衡性原則の評価基準を析出し、行使態様規制の機能を担う同原則がjus ad bellumとjus in belloの関係性にいかなる影響を与えるかを明らかにすることを目的とした。テロリズムに対処する際の自衛権行使は、本研究の分析枠組みにおける研究から、必須要件である「武力攻撃の発生」要件概念が、時間的にも主体的に拡張されて解釈される明白な国家実行が存在していることが明らかになった。それに伴い、必要性および均衡性要件も柔軟に解釈される傾向が見いだされた。

当初予定していた海外研究機関での調査は、先方の都合等で実施することができなかった。しかしながら、それ以外の点では、当初の計画に従って行われている。国際法学今年度の研究活動は、とくにアフガニスタンの事例研究に限られた。したがって、今後は、それ以外非国家主体によるテロリズム事例にも対象を拡大することが必要であると認識している。そうすることで、国際法上の武力行使における必要性・均衡性原則を一般化して評価することが今後の課題である。交付申請書に記載した「研究の目的」および「研究実施計画」に沿って、滞りなく進んでいるため。第一に、平成25年度及び平成26年度に実施予定であった海外での調査研究に関して、先方受け入れ機関および研究代表者の日程調整が不調に終わったため、出張を実施できない状況が生じた。しかし、予定の海外調査は本研究と密に関連する研究者との意見交換であり、本研究の遂行に不可欠であるため、他の費目に充当することなく確保していたためである。第二に、研究遂行に必要な図書の刊行時期が遅れ、納品が年度内に間に合わないものが多数あったためである。平成26年度は、前年度の研究を踏まえて、各論的に領域統治能力を欠く領域国やテロリズムに対する武力行使に絞り、必要性・均衡性原則の判断基準を明らかにする。その際の研究方法の工夫として、従来は個別に論じられてきた「時間的」・「主体的」位相を、必要性・均衡性原則の観点から体系的に論じる。なお、現在までの研究課程において、追加的に検討が必要な論点もあることが明らかになった。それについては、次年度の研究遂行の中で扱うことを予定している。第一に、応募申請書類で申請したとおり、ヨーロッパおよび米国におけるそれぞれの受入機関と確実に連絡を取り、本研究課題の調査研究および資料収集のための研究出張を計画している。また、研究の遂行にあたり、適宜必要となる国内および海外への研究出張にも未使用額の配分を予定している。第二に、研究遂行に必要な図書の購入を行うとともに、それらの調査研究を遂行するにあたって必要となる消耗品に未使用額を支出する予定である。研究遂行に当たり、購入した書籍や論文の研究を第一に行うことが必要と考えられたため、次年度使用額が生じた。また、当初予定していた研究出張についても、出席を予定していたカンファレンスが先方の予定でキャンセルになったため、支出することが不可能となった。上記理由により、今年度は、当初交付申請書に記載した内容での支出を予定している。また、研究出張についても、原則として申請内容の通りで変更はないが、前年度分の研究予定内容に関連する出張も計画に加える予定である。
ヒト胎児脳神経系、骨格器系の多元計算解剖学的解析

脳神経・感覚器系、四肢・骨格器系等の形成が行われる発生時期で、高解像度の立体情報を撮像しうる受精後12週まで(CRL<100mm)のヒト胎児を対象に、研究期間以前のものを含めMRI約100例,位相CT約100例の画像取得が終了し、定量的、統計学的な解析が十分可能な例数を確保した。標本ごとにMRI等の二次元画像上で予め定めた解剖学的基準点を同定しその座標を取得し、これら座標をもとに諸器官の位置や形状のみならず,トポロジー特徴や機能特徴なども対象に標準化像の作成、また、各個体像までの偏差も含めた経時的変化を表現するモデル化をすすめた。脳神経系、視覚器のデータは、清水班と協力して時空間統計モデルを作成した。具体的にはヒト胚子期後期(CS18-CS23,n=5)の脳実質、脳室、脈絡叢をデータとして用いた。胸郭では、CS18-23の29例の位相CT画像を用いた。第1-12肋骨対それぞれを分離したn=348例について、各肋骨の形状変化を、プロクラクテス法、主成分分析を用いて検討した。PCA-1,PCA-2の寄与率は76.3%,16.4%と高く、形状の変化の殆どを説明できた。PC1, PC2の変化は高い関連性があり、4次元多項式で近似可能で、その近傍に各肋骨のPC-1, PC-2値は位置した。各肋骨は、発生時にとりうる共通の変化しうる形(common sequences)が存在し、それがどの時期、何番目の肋骨であっても大きくはずれることはない。そして、common sequencesのどの段階であるかによって、肋骨の形状を表すことができることがわかった。骨盤、大腿骨、肩甲骨についても、解剖学的座標を多数取得し、発生に伴う変化を検討した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。私たちは、世界最大のヒト胚子コレクション(Kyoto Collection)由来の立体情報(MRI,位相CT等)を用いて、ヒト器官形成期(約5-10週)の諸器官の形態形成についてデータを蓄積、報告し一定の成果をあげている。これらは、諸器官についての立体的形態と計測を中心に基礎的なデータを蓄積したものである。同手法は、上記の古典的な組織形態学的アプローチの限界を回避でき、全身を網羅的に観察することを可能にした。次の段階として、多元計算解剖学的手法を加え解析を進めることとした。本年度は、まず、四肢骨格器系のうち胸郭領域を主たる解析対象とし、肋骨、椎体の形状をもとに、胚子期の胸郭の形状の変化を検討した。Carnegie stage (CS)17-23計36体のヒト胚子を対象に,MRI,位相CTを用いて高解像度の画像を取得した。84箇所/標本の3次元座標を肋骨、椎体上に設定し、CSごとの基本的な形態学、形態計測学的検討を行った。さらに、主成分分析も行った。第1主成分は、胸郭の体積の増加、肋骨先端の伸長であった(寄与率94.0%)。第2主成分は、CS20, 21に特徴的にみられる胸骨下部の突出と、その後CS23にかけて増大する肋骨の形状変化、肋骨側方背部の屈曲、後方への突出であった。骨格器系として、骨盤、大腿骨についても同様の検討を開始し、現在解析中である。MRI,位相CT画像については画像取得を継続して行っており、また、より高解像度の画像取得のための検討を継続することで、解析対象例の充実化を計っている。昨年、われわれはヒト胚子CS17-CS23について、骨格器のひとつとして胸郭を選択しその形状変化を座標点を1個体84点行い検討した。主成分分析を行い、胚子期の胸郭形成の特徴を抽出し得た。骨盤、大腿骨等骨格器の他の部位についても検討を開始しており、次年度には解析結果を提示できる見込みである。

PC1, PC2の変化は高い関連性があり、4次元多項式で近似可能で、その近傍に各肋骨のPC-1, PC-2値は位置した。各肋骨は、発生時にとりうる共通の変化しうる形(common sequences)が存在し、それがどの時期、何番目の肋骨であっても大きくはずれることはない。そして、common sequencesのどの段階であるかによって、肋骨の形状を表すことができることがわかった。骨盤、大腿骨、肩甲骨についても、解剖学的座標を多数取得し、発生に伴う変化を検討した。昨年、われわれはヒト胚子CS17-CS23について、骨格器のひとつとして胸郭を選択しその形状変化を座標点を1個体84点行い検討した。今年度は、観察時期を胎児期初期まで延長すること、体幹部(腹部、骨盤部)にも座標点をおいてその変化をみるとともに、主たる内部器官の形状情報も加えより高次の解析を行う。体幹部の形状変化には、それをもたらす要因があると考えられ、その要因のひとつとして内部諸器官の発生成長は重要ではないかと考えており、それを立証したいと考える。また、脳神経・感覚器系についても、すでにこれまで解析してきた立体情報を活用し、同様の解析を進める。具体的には、標本ごとに立体像を参考に、MRI等の二次元画像上で予め定めた解剖学的基準点を同定しその座標を取得していく。基準点の選定としては、整形外科領域の計測方法、胎児エコーの計測法等を参考にすることで、応用しやすいようにする。検討手順として、機能解剖学的な領域(脳神経、視覚器、聴覚器、運動器等)、発生解剖学的領域(神経頭蓋、内蔵頭蓋、咽頭弓、軟骨化中心、骨化中心等)それぞれの原基からの形成過程ごとに分けて解析を行い、それぞれの関連付けを行う平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
「文豪」夏目漱石像と岩波文化の研究：小林勇旧蔵『漱石全集』編纂関連資料を用いて

本研究は、1924・1935年版『漱石全集』を中心に、岩波茂雄・小林勇旧蔵『漱石全集』編纂関連資料を整理・撮影して分析し、その編纂過程の実態を解明する。それにより、書籍の廉売、文芸学術の普及・大衆化が進んだ時代に、「文豪」漱石像と岩波文化がどのように支え合って形成したかを明らかにする。とりわけ、学者かつ作家という「文豪」漱石像を描く岩波書店や小宮豊隆の編集意図が、「学問」の香りを消費しようとする大衆読者の欲望と合致して、高級文化というイメージを形成したことを論証する。また、192030年代の英文学研究者らの著述を参考に、近代文学研究の成立と文学全集編纂との関わりを検討する。
ベルリンの区合併と区民発案・区民投票制度―行政の効率化と住民自治の充実

「より少なくして、よりたくさんを(weniger ist mehr)!」をスローガンに行われたベルリンの同じ人口規模の区への区合併は、各区の行政サービスの比較を容易にし、良質な行政サービスの提供、職員数の適正化、「住みやすい区」として住民から選ばれることを目指す地域の増加に結び付いた。ベルリンにおける区民発議・区民投票制度は、住民参加が盛んな州と比べると、区民発議の数も少なく、投票率も低いのが現状である。しかし、身近な問題に関する区民発議がきっかけとなり、住民投票が成立しなくても、住民の要求が実現する例もある。区民発議・区民投票制度は住民の意思に基づく政治・行政を生みだす道具となっている。本研究は、ベルリンの区合併(2001年)と区民発案・区民投票制度導入(2006年)の成果や問題点を検証することによって、現在、検討が加えられている東京23特別区や政令指定都市における区制度改革、区レベルでの住民自治のあり方を考察しようとするものである。「都区制度のあり方検討会」等において、東京都は区合併を伴う行政改革を提案しており、また、「大阪都構想」や「三大都市(横浜市・大阪市・名古屋市)を都市州に」という提案もなされている。本研究の目的は、都市州である首都ベルリンにおける区の行政改革、区民発案・区民投票制度導入という住民自治の充実施策を検討することにより日本における大都市制度改革論議に寄与することである。本年度までに、区合併を含む行政改革、区民発案・区民投票制度導入の過程に関して、ベルリンと日本国内の図書館などに所蔵されている資料をおおむね収集することができた。また、ベルリン市内の区民発案・区民投票の実例に関しては、ベルリンにある「Mehr Demokratie e.V.」の事務所を訪れるなどして調査を行った。ベルリン市内12区の区長と区議会などに対する郵送によるアンケート調査の下調べもおおむね終了することができた。9月に国政選挙が行われるドイツでは、海賊党と「Mehr Demokratie e.V.」が国民投票制度の導入を争点にする動きがあり、直接民主制に関する関心が高まっている。日本でも原子力発電所の再稼働の是非を問う住民投票の直接請求運動が各地で行われたり、日本の大都市の区とほぼ同規模の都市型の自治体である小平市で、東京都内で初めての直接請求による住民投票がおこなわれたりしたことで、住民投票に注目が集まっている。このようなドイツと日本、両国における動きの中で、とくに区民投票に関する部分における本研究の意義が計画時より大きなものとなっているのは間違いない。本研究は、ドイツの首都であるベルリンにおいて実施された区合併(2001年)と区民発案・区民投票制度の導入(2006年)の成果や問題点を検証することによって、東京における都区制度改革、政令指定都市における区への権限移譲、地域内分権を中心とした制度改革、大阪府や大阪市が目指している「大阪都構想」などの日本における大都市制度改革をめぐる議論に資することを目的としていた。そこで、大都市における区レベルにおける住民自治、区民投票制度のあり方や問題点を「行政の効率化」と「住民に身近な区制度の充実」をセットとし、「より少なくすることは、より多くすることである!」をモットーに区合併や行政改革、都市州政府から区役所への権限移譲、区民発議・区民投票制度改革を実施したベルリンの事例に関する研究論文や行政資料の収集、住民運動団体へのヒアリングなどを行うことで、日本の制度との比較も含めた考察を実施した。本研究に取り組んでいる3年の間に、とくに「大阪都構想」の是非をめぐる議論を受けて、大都市制度改革に関する議論が活発になり、政令指定都市における区制度をめぐる法改正が実施されることとなった。また、東京・大阪・新潟などでの原子力発電所再稼働の是非を問う住民投票条例制定を求める直接請求運動が行われたり、東京都小平市における都道建設問題をめぐる住民投票の実施が全国的に脚光を浴びるなど、市町村合併の動きが収束して以降沈静化していた住民投票が再び注目され、活用されるようになった。現在も全国各地で大型公共施設建設の是非を問う住民投票を求める動きがあり、常設型住民投票条例の制定事例も増加している中、本研究の重要性は高まっているように思う。2012年度の日本公共政策学会、2013年度の日本政治学会でおもに区民投票制度についての発表を行ったが、今後、さらに本研究の成果をいくつかの論文としてまとめる予定である。

「都区のあり方検討委員会」等において、東京都は区合併を伴う行政改革を提案しており、また、「大阪都構想」や「三大都市(横浜市・大阪市・名古屋市)を都市州に」という提案もなされている。都市州である首都ベルリンにおける区の行政改革、区民発案・区民投票制度導入という住民自治の充実施策を検討することにより日本における大都市制度改革論議に寄与することを目的とする。まず、区合併を含む行政改革、区民発案・区民投票制度導入に関するベルリンの行政資料、法改正をめぐるベルリン市議会や区議会の議事録、論文、新聞報道等を用いて、区合併を含む行政改革、区民発案・区民投票制度導入の過程とその効果を明らかにする。おもにベルリン州立中央図書館ベルリン研究センターの所蔵資料を活用するが、資料では明らかにならない点、当初予定された効果が得られているかに関しては、行政改革担当職員へのインタビュー調査を行う。次に、区合併と区民発案・区民投票制度導入の効果について、ベルリン市内12区の区長と区議会のすべての会派代表者に対して郵送によるアンケート調査を行い、改革に関する評価、さらなる改革案についての意見を集約する。その上で、日本の大都市における区合併、区民発案・区民投票の導入の可能性を探りたい。本年度までに、区合併を含む行政改革、区民発案・区民投票制度導入の過程に関して、ベルリン州立中央図書館ベルリン研究センターと地方自治研究センター、ベルリンフンボルト大学図書館、日本の国会図書館、各大学図書館などの所蔵資料をおおむね収集することができた。資料では明らかにならない点について、とくにベルリン市内の区民発案・区民投票の実例に関しては、ベルリン市内の区役所やベルリンにある「Mehr Demokratie e.V.」の事務所を訪れるなどして調査を行った。区合併と区民発案・区民投票制度導入の効果についてのベルリン市内12区の区長と区議会に対する郵送によるアンケート調査の送付先を確定するなどの下調べもおおむね終了することができた。6月に行われた日本公共政策学会の発表と長野県短期大学紀要論文では、本研究の成果の一部を公にすることができた。本年度は資料収集と、来年度以降の調査の準備をすることを予定していた。日本国内で入手できる文献・資料に関しては、国立国会図書館や東京都内の大学図書館等で、ドイツ国内でしか入手できない資料に関しては、夏休み期間中にベルリンに滞在し、ベルリン州立中央図書館ベルリン研究センターやベルリン・フンボルト大学図書館等で収集することができた。まず、これまでの調査を踏まえ、「ベルリンの区民投票」に関して9月に行われる日本政治学会で発表を行う。また、来年度に予定している本研究全体をまとめた論文の発表に向け、本格的に論文の執筆を始めるとともに、最終的な調査を進めて行く予定である。夏までは、これまで収集した資料をもとに論文の執筆作業を進める。それを踏まえて、秋にベルリン市内各区の区長、ベルリン州議会、区議会各会派へのアンケート調査を実施する。分析を豊かにするために、3月にふたたびベルリンを訪れ、会派事務所等でのインタビュー調査も行う予定である。日本国内における大都市制度改革や住民投票に関する動きにも、引き続き注目していきたい。平成23年度中の予備調査を踏まえ、ベルリン市内各区の区長、ベルリン州議会、区議会各会派へのアンケート調査票を作成し、郵送によるアンケート調査を平成24年度前半に実施する予定であったが、準備が整っていない。
聴覚前庭系に発現するカルシウムチャネルの機能とその薬理学的制御に関する包括的解析

内耳遺伝子の網羅的解析の結果、内耳での新たなカルシウム制御機構の候補としてカルシウム感知受容体を同定し、その発現確認、機能解析を行った。カルシウム感知受容体は腎、副甲状腺組織における機能については先行研究があり、これらを参考に蛋白レベルでの発現確認を行った。まず、ウエスタンブロッティング法を用いて、質量の分析を行ったところ、概ね他の臓器に発現する蛋白と類似の質量をもつことが判明した。抽出法を調整し、質量に対する糖鎖などの影響の検討も行ったが、類似の結果を得た。次に、同じ抗体を用いて免疫組織化学法による分布の検討を行ったところ、らせん靭帯を中心とした領域における発現を同定した。免疫組織化学法の結果を確認するために定量的PCRを用いて遺伝子量測定を行ったが、微量な反応が検出されたものの、コントロールに用いたactinに比較して検出サイクル差が大きな、相対的に少量の遺伝子量であることを示唆する結果であった。内耳の細胞レベルでの発現を確認したことから、次に、その機能の検討を行うこととした。本研究の一部として内耳を用いた効率的な薬剤評価システムの確立を目指したが、困難であったことから断念し、外リンパ液に直接、高濃度の薬液を少量、時間をかけて投与する方法へと切り替えた。その結果安定した結果が得られることが判明した。内耳への阻害薬投与では聴力の変化が見られた。また、カルシウムイメージングによる確認実験を行うべく、共同研究施設にある共焦点レーザー顕微鏡の設定を進めている。また、ノックアウト動物の作成を行っている。内耳に発現するチャネルの解析であるが、内耳は細胞の集合が一つの機能をもつ、すなわち合包体として機能することから、総体としての解析が必要となり、分子機能の評価にはin vivoでの機能評価が必要不可欠である。一方で、内耳を操作・評価する手段はそれほど確立されておらず、困難がある。例として、内耳、らせん靭帯のカルシウムイメージングによる機能解析は過去に報告がなく、プロトコールの確立が必要であった。研究協力者の助言。支援を得て研究を推進する予定である。本研究はカルシウムチャネルの蝸牛内での分布を検討し、その機能を検討し、可能なら薬理学的な制御の方法を見出すことを目標とする。この目標のため、第一に、内耳に分布するカルシウムチャネルを遺伝子レベルで検索することを目的とした。当初、マウス内耳のレーザーダイセクションによる部位特異的な遺伝子の採取を目指したが、mRNAの濃度が不足することが判明し、蝸牛全体の採取に切り替え、遺伝子同定を行った。その結果、新たな遺伝子が蝸牛らせん靭帯を中心に発現することを確認した。モノクローナル抗体を用いてマウスでの蛋白レベルでの発現を免疫染色を用いて確認したところ、非特異的反応の問題が生じたため、動物種をラットに変更した。ラットでの免疫組織学的検討を行ったところ、特定のタイプのらせん靭帯に発現することが明らかとなった。また、その蛋白分子量は、他の臓器のものとほぼ同じであり、発現は生後1週ではほぼ検出できず、成長とともにその発現が増強し、生後4週程度まで成長すると、強く発現することが明らかとなった。そのため、生後6週のラットを用いて、その機能を薬理学的に検討することとした。機能解析のためまず、内耳内に薬液を注入しながら術中モニタリングにより聴力を測定するシステムを構築した。耳包を開放し、正演奏を露出、同部よりガラス管を用いて薬液を注入するシステムを構築した。耳包の開放とともに数十dBの聴力閾値上昇が生じたため、その対策として、手術法の改良を行った。また、投与量、速度の検討を行い、DMSOの投与では閾値上昇のないことを確認した。陽性コントロールとして、1Mカドミウム溶液の注入を行い、聴力閾値が速やかに20dB程度上昇することを確認した。今後は投与装置の内液を交換することで、多数の薬剤を短時間で交換するシステムの構築を目指す予定である。技術的な問題から計画を変更しているが、新規遺伝子の同定とその分布の確認に成功しており、概ね順調に推移していると考えている。

また、カルシウムイメージングによる確認実験を行うべく、共同研究施設にある共焦点レーザー顕微鏡の設定を進めている。また、ノックアウト動物の作成を行っている。内耳に発現するチャネルの解析であるが、内耳は細胞の集合が一つの機能をもつ、すなわち合包体として機能することから、総体としての解析が必要となり、分子機能の評価にはin vivoでの機能評価が必要不可欠である。一方で、内耳を操作・評価する手段はそれほど確立されておらず、困難がある。例として、内耳、らせん靭帯のカルシウムイメージングによる機能解析は過去に報告がなく、プロトコールの確立が必要であった。カルシウムチャネルをターゲットとして内耳におけるカルシウムシグナリングに関連する分子の網羅的解析を行った。当初の計画では、内耳切片のレーザーダイセクションを用いて組織特異的な遺伝子抽出を行う予定であった。しかしながら、本法では採取される遺伝子量が網羅的な遺伝子解析を行うのに不十分であることが判明した。そのため、内耳全体の組織を顕微鏡下に切り分け、遺伝子を抽出、検討することとした。その結果、他臓器ではカルシウム制御に重要な役割を果たす分子であるが、内耳における発現は過去に報告のないカルシウム制御因子を発現した。免疫組織化学法による分布検討では、らせん靭帯を中心とした領域における発現を同定した。また、ウエスタンブロッティング法を用いて、質量の分析を行ったところ、概ね他の臓器に発現する蛋白と類似の質量をもつことが判明した。抽出法を調整し、質量に対する糖鎖などの影響の検討も行ったが、類似の結果を得た。定量的PCRを用いて遺伝子量測定を行ったが、微量な反応が検出されたものの、コントロールに用いたactinに比較して検出サイクル差が大きな、相対的に少量の遺伝子量であることを示唆する結果であった。これらの結果を踏まえ、機能的な検討を行うこととした。本研究の一部として内耳を用いた効率的な薬剤評価システムの確立を目指したが、困難であったことから断念し、外リンパ液に直接、高濃度の薬液を少量、時間をかけて投与する方法へと切り替えた。その結果安定した結果が得られることが判明したことから、この方法で検討を進める予定である。本研究の目的である、薬理学的な聴力修飾という点で、順調に進展がみられている。現在のところ、予定はしていないがさらなる技術的な困難が生じた場合には、他の研究室や企業に必要が生じた場合には技術的な支援を求める。研究協力者の助言。支援を得て研究を推進する予定である。本研究に関連した専門的な知見や実験技術を保有する本学薬学研究科や生理学研究所と連携し、検討を行っていく。