hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DEHP胎生期曝露に招来される低栄養を特徴づける遺伝子変化と生活習慣病リスク

プラスチック可塑剤であるフタル酸ジ-2-エチルヘキシル(DEHP)は、妊娠期曝露により胎仔・新生仔生仔数の減少や母獣の血漿中トリグリセライドの減少を引き起こす。また、胎生期低栄養は成長後の生活習慣病リスクに影響を与えると考えられており、DEHP曝露による低栄養環境が成長後の仔にどのような影響を与えるかを明らかにすることを目的とし解析を行った。DEHPはペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体(PPAR)αのリガンドであり、またPPARαには種差が知られていることから、野生型マウスに加え、PPARαノックアウト(KO)、ヒト型PPARαマウスを用いた。普通食群において体重はDEHP曝露による影響を受けなかったが、摂餌量は野生型およびヒト型で増加していた。血漿中レプチン濃度は離乳期の野生型マウスでDEHP曝露による有意な減少が見られた。胎生期曝露による影響を明らかにするため、授乳期のみ曝露したマウスで測定したところ、レプチンの減少は見られなかった。よって胎生期曝露によるレプチン減少が摂餌量に関与している可能性が考えられる。一方、ヒト型PPARαマウスではレプチンに影響は見られなかった。摂食行動に関わる視床下部のNeuropeptide Y(NPY)発現量はヒト型PPARαマウスで減少していた。この群では摂餌量の増加が見られており、NPYが摂食行動を調節するために変化したのかもしれない。同じく摂食行動に関わるpro-opiomelanocortinにはDEHPによる変化は見られなかった。高脂肪食摂取では摂餌量や摂食行動調節因子のDEHP曝露による影響は見られなかった。肝臓中脂質濃度は、普通食群KOマウスのトリグリセライドおよび高脂肪食群ヒト型マウスのコレステロール濃度がDEHP曝露によって上昇したが、血漿中では変化が見られなかった。PPARαと関連遺伝子の肝臓中mRNAに関しては、DEHP曝露によって普通食群野生型のDGAT2、高脂肪食群KOのMTPが上昇し、高脂肪食KOのSREBP1が減少したが、脂質濃度との関連は認められず、脂質濃度変化のメカニズムについてはさらなる検討が必要である。申請項目の測定はほぼ終了している。脂質濃度変化の減少メカニズムを明らかにするにはさらなる検討が必要である。申請項目に加え、出産後のみ曝露したマウスの実験を追加し、胎生期曝露による影響も明らかにしていく。さらなる検討が必要なものもあるが、追加実験も行い、申請項目も測定できており、おおむね順調である。成熟期の摂餌量の変化は、離乳期のレプチン濃度が関与している可能性があることや、胎生期曝露および授乳期のみ曝露マウスはPPARαやその標的遺伝子発現量が上昇する一方で、レプチンは胎生期曝露のみで減少するなどの結果から、離乳期の変化が重要であると考えられる。そこで、離乳期を中心に解析を行い、胎生期曝露と授乳期のみ曝露した仔マウスを用い、胎生期曝露による影響を明らかにする。胎生期低栄養はPPARαプロモーター領域のメチル化に変化を与えることから、これらの仔マウスのメチル化を測定する。また、メチル化によるPPARαやその標的遺伝子発現量と生活習慣病リスクとの関連についても考察していく。プラスチック可塑剤であるフタル酸ジ-2エチルヘキシル(DEHP)は、妊娠期曝露により胎仔・新生仔数の減少、母獣の低栄養を引き起こす。胎生期低栄養環境下で育った仔は生活習慣病リスクが高いといわれているが、そのほとんどが母親の食生活との関連であり、DEHPのような化学物質曝露による低栄養と生活習慣病リスクとの関連についての報告はない。化学物質曝露による毒性影響は、母や胎仔・新生仔だけではなく、次世代への影響も加味したリスク評価を行うことが必要である。本研究では、胎生期DEHP曝露仔マウスの成熟期における生活習慣病リスクについて、普通食および高脂肪食摂取後の成熟マウスを解析し、DEHPの新しい次世代影響について明らかにすることを目的とした。また、DEHPがリガンドとなるペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体PPARαの種差についても解析するため、ノックアウトマウス、ヒト型PPARαノックインマウスも用いた。DEHP曝露は、体重、脂質濃度(トリグリセライド、コレステロール)には影響を与えなかった。摂餌量に関しては、普通食群において野生型およびヒト型PPARαマウスでDEHP曝露により摂餌量は増加した。そこで、摂食行動を制御するレプチン濃度を測定したところ、DEHP曝露による変化は見られなかった。しかし、離乳期(生後21日目)におけるレプチン濃度は野生型およびヒト型PPARαマウスのDEHP曝露群で有意に減少していた。離乳期のレプチン濃度の減少が、成熟期の摂餌量の上昇を引き起こしたのかもしれない。また、ノックアウトマウスではこれらに変化が見られなかったため、胎生期DEH曝露による摂食行動への影響にはPPPARαが重要な役割を担っているのかもしれない。

DEHPはペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体(PPAR)αのリガンドであり、またPPARαには種差が知られていることから、野生型マウスに加え、PPARαノックアウト(KO)、ヒト型PPARαマウスを用いた。普通食群において体重はDEHP曝露による影響を受けなかったが、摂餌量は野生型およびヒト型で増加していた。血漿中レプチン濃度は離乳期の野生型マウスでDEHP曝露による有意な減少が見られた。胎生期曝露による影響を明らかにするため、授乳期のみ曝露したマウスで測定したところ、レプチンの減少は見られなかった。よって胎生期曝露によるレプチン減少が摂餌量に関与している可能性が考えられる。一方、ヒト型PPARαマウスではレプチンに影響は見られなかった。摂食行動に関わる視床下部のNeuropeptide Y(NPY)発現量はヒト型PPARαマウスで減少していた。この群では摂餌量の増加が見られており、NPYが摂食行動を調節するために変化したのかもしれない。同じく摂食行動に関わるpro-opiomelanocortinにはDEHPによる変化は見られなかった。高脂肪食摂取では摂餌量や摂食行動調節因子のDEHP曝露による影響は見られなかった。肝臓中脂質濃度は、普通食群KOマウスのトリグリセライドおよび高脂肪食群ヒト型マウスのコレステロール濃度がDEHP曝露によって上昇したが、血漿中では変化が見られなかった。PPARαと関連遺伝子の肝臓中mRNAに関しては、DEHP曝露によって普通食群野生型のDGAT2、高脂肪食群KOのMTPが上昇し、高脂肪食KOのSREBP1が減少したが、脂質濃度との関連は認められず、脂質濃度変化のメカニズムについてはさらなる検討が必要である。申請項目の測定はほぼ終了している。脂質濃度変化の減少メカニズムを明らかにするにはさらなる検討が必要である。申請項目に加え、出産後のみ曝露したマウスの実験を追加し、胎生期曝露による影響も明らかにしていく。さらなる検討が必要なものもあるが、追加実験も行い、申請項目も測定できており、おおむね順調である。成熟期の摂餌量の変化は、離乳期のレプチン濃度が関与している可能性があることや、胎生期曝露および授乳期のみ曝露マウスはPPARαやその標的遺伝子発現量が上昇する一方で、レプチンは胎生期曝露のみで減少するなどの結果から、離乳期の変化が重要であると考えられる。そこで、離乳期を中心に解析を行い、胎生期曝露と授乳期のみ曝露した仔マウスを用い、胎生期曝露による影響を明らかにする。胎生期低栄養はPPARαプロモーター領域のメチル化に変化を与えることから、これらの仔マウスのメチル化を測定する。また、メチル化によるPPARαやその標的遺伝子発現量と生活習慣病リスクとの関連についても考察していく。
ABC型トリブロック共重合体ミセルを鋳型とする中空金属ナノ粒子の合成

ポリ(スチレン-b-2-ビニルピリジン-b-エチレンオキシド)のようなABC型(非対称型)トリブロック共重合体をB、Cに選択的な溶媒に溶解すると、Aをコア、Bをシェル、Cをコロナとするミセルを形成することが知られている。本研究は、このようなコアーシェルーコロナ型高分子ミセルを鋳型とする新しい中空金属超微粒子の合成法を確立することを目的とした。平成19年度は陽イオン性ABC型トリブロック共重合体ミセルを鋳型とする中空パラジウム超微粒子の合成を試みた。【1】高分子ミセルの調製ポリ(スチレン-b-2-ビニルピリジン-b-エチレンオキシド)(略称:PS-b-PVP-b-PEO)をジメチルフォルムアミド(DMF)に溶かした後、透析法によって溶媒を段階的に水に置き換えて高分子ミセル(直径:約100nm)を得た。【2】中空パラジウム微粒子の合成前記【1】の高分子ミセル水溶液にpH5以下で前駆体PdC1_4^<2->イオンを加えてPVP層に静電結合させた。これをNaBH_4で還元して金属パラジウム層を生成させた。その後、空気雰囲気下で焼結してパラジウム微粒子を得た。得られたパラジウム微粒子を透過型電子顕微鏡で測定したところ、中空粒子ではなく、中実ナノ粒子であった。その原因は不明であるが、今後、前駆体濃度、pH、還元条件などを変化させて、中空粒子が得られるように検討を行う予定である。ABC型(非対称型)トリブロック共重合体をB、Cに選択的な溶媒に溶解すると、Aをコア、Bをシェル、Cをコロナとするミセルを形成することが知られている。例えば、ポリ(スチレン-b-2-ビニルピリジン-b-エチレンオキシド)(略称:PS-b-PVP-b-PEO)を水に溶解すると、PSをコア、PVPをシェル、PEOをコロナとするミセルを形成する。このミセルのPVPブロックに金属化合物陰イオンを結合させた後、還元あるいは適当な化学処理によってナノメーターサイズの金属層を形成させる。これを焼結あるいは有機溶媒で高分子を除去し、中空金属微粒子が得る。本研究は、(i)このようなコア-シェル-コロナ型高分子ミセルを鋳型とする新しい中空金属微粒子の合成法を確立すること、(ii)その中空微粒子の種々の応用を検討することを目的とした。本年度は陽イオン性ABC型トリブロック共重合体ミセルの調製とそれを鋳型とする中空金微粒子の合成を行った。【1】高分子ミセルの調製PS-b-PVP-b-PEOをジメチルフォルムアミド(DMF)に溶かした後、透析法によって溶媒を段階的に水に置き換えて高分子ミセル(直径:約95ナノメートル)を得た。【2】中空金微粒子の合成と特性解析前記の高分子ミセル水溶液にpH5以下でAuCl_4^-イオンを加え、PVP層に静電結合させた。これをNaBH_4で還元した後、凍結乾燥し、窒素雰囲気下で焼結して中空金微粒子を得た。得られた中空金微粒子を透過型電子顕微鏡測定で測定したところ、収率が極めて悪かった。今後はその原因を解明し、収率を上げる予定である。.昨年度はPS-b-PVP-b-PEOミセルを鋳型として中空金微粒子の合成を試みたが、所期の粒子を得ることができなかった。本年度はその続きの実験を行い、さらに中空シリカ微粒子の合成を試みた。【1】高分子ミセルの調製PS-b-PVP-b-PEOをジメチルフォルムアミド(DMF)に溶かした後、透析法によって溶媒を段階的に水に置き換えて高分子ミセル(直径:約100nm)を得た。さらに、溶液をpH4に調整してPVPブロックを陽イオン化した。【2】中空金微粒子の合成前記の高分子ミセル水溶液にAuCl_4^-イオンを加え、PVP層に静電結合させた。これを還元した後、凍結乾燥し、窒素雰囲気下で焼結して中空金微粒子を得ることを試みた。還元剤をいろいろと変えて実験を行ったが、得られたのは直径約10nmの中実粒子のみであった。よって、中空金微粒子の合成は一旦、保留することにした。【3】中空シリカ微粒子の合成と特性解析前記の高分子ミセル溶液に、シリカの前駆体であるテトラメトキシシランをミセル溶液に加え、2日間攪拌してゾルーゲル法によりシリカ層を形成させた。

次に、500°Cで4時間焼成して鋳型の高分子ミセルを取り除き、シリカの中空微粒子を得た。得られた中空シリカ微粒子を透過型電子顕微鏡測定で測定したところ、粒径は30nm、空洞径は11nm、シリカ層の厚さは10nmであった。この成果はJ.Am.Chem.Soc.誌に掲載された。ポリ(スチレン-b-2-ビニルピリジン-b-エチレンオキシド)のようなABC型(非対称型)トリブロック共重合体をB、Cに選択的な溶媒に溶解すると、Aをコア、Bをシェル、Cをコロナとするミセルを形成することが知られている。本研究は、このようなコアーシェルーコロナ型高分子ミセルを鋳型とする新しい中空金属超微粒子の合成法を確立することを目的とした。平成19年度は陽イオン性ABC型トリブロック共重合体ミセルを鋳型とする中空パラジウム超微粒子の合成を試みた。【1】高分子ミセルの調製ポリ(スチレン-b-2-ビニルピリジン-b-エチレンオキシド)(略称:PS-b-PVP-b-PEO)をジメチルフォルムアミド(DMF)に溶かした後、透析法によって溶媒を段階的に水に置き換えて高分子ミセル(直径:約100nm)を得た。【2】中空パラジウム微粒子の合成前記【1】の高分子ミセル水溶液にpH5以下で前駆体PdC1_4^<2->イオンを加えてPVP層に静電結合させた。これをNaBH_4で還元して金属パラジウム層を生成させた。その後、空気雰囲気下で焼結してパラジウム微粒子を得た。得られたパラジウム微粒子を透過型電子顕微鏡で測定したところ、中空粒子ではなく、中実ナノ粒子であった。その原因は不明であるが、今後、前駆体濃度、pH、還元条件などを変化させて、中空粒子が得られるように検討を行う予定である。
血管内皮細胞を介した歯髄組織再生制御因子の網羅的解析と再生制御システムの創出

申請者らは、間葉系幹細胞をスキャホールドとともに冠部歯髄を除去したラット臼歯歯髄腔に移植し、mineral trioxide aggregate(MTA)セメントで仮封すると、デンティンブリッジを有する歯髄組織が、約2週間で再生可能であることを報告し、歯髄組織再生の経時的な動物実験系を確立している。この実験系を用いて、間葉系幹細胞と血管内皮細胞を混合移植すると、血管新生能が亢進し組織の再生が促進されることも報告している。そこで本研究課題では、これまでの成果をさらに発展させ臨床応用への革新的技法を創成することを究極の目的として、血管内皮細胞を間葉系幹細胞と混合して移植した際に、再生組織中で特徴的に発現する「再生制御因子」を遺伝子網羅解析にて見出すとともに、同因子が血管内皮細胞、幹細胞、あるいはマクロファージの増殖、分化、活性化等に及ぼす影響を明らかにし、血管内皮細胞を介した歯髄組織再生の制御システムを見出すことを本研究の目的とする。前年度は、上記のモデルを用いた再生歯髄組織の評価と再生促進因子の解析を目的として、以下の実験を実施した。血管内皮細胞と幹細胞の共培養による歯髄組織再生制御因子の網羅的解析、ラット歯冠歯髄再生モデルを用いた血管内皮細胞の動態解析、および歯冠歯髄を除去した上顎臼歯への幹細胞添加三次元スキャホールドの埋入実験を行い以下の結果を得た。幹細胞、血管内皮細胞混合移植で組織再生が促進することを確認するとともに、GFPを遺伝子導入した血管内皮細胞が移植14日後においても新生歯髄組織内で血管を形成することを見出した。さらに歯髄幹細胞・血管内皮細胞混合移植の再生促進効果に関係のある遺伝子として、血管新生関連遺伝子(B-cell lymphoma 2、nuclear factor-kappa Bなど)が同定された。当該年の研究計画と、おおむね同様に研究は遂行された。ラット上顎第一臼歯歯冠歯髄歯髄腔に再生した歯髄組織を検索対象として、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析、そして免疫組織化学的染色法を用い細胞や神経に発現する特異的タンパク発現、そしてウェスタンブロット法を用い、歯髄組織におけるタンパク発現の解析を行っている。主な研究成果としては、骨髄幹細胞、血管内皮細胞混合移植による組織再生促進を確認するとともに、これに関連する遺伝子をマイクロアレイにて解析し、血管新生への関連が知られるB-cell lymphoma 2やnuclear factor-kappa Bを同定することができた。さらに、GFP遺伝子を導入した血管内皮細胞を移植したところ、これらが再生歯髄組織内に集積し、血管様の構造を示すことを確認し、移植された血管内皮細胞が再生組織中で生存するのみならず、血管へと再生を示す可能性が示唆された。これらの研究結果は、Stem Cell Researchなどの海外雑誌に受理された。今年度は、前年度までの解析を継続するとともに、以下の実験を実施する。a.再生歯髄組織における血管内皮細胞とマクロファージの動態の検索:再生した歯髄組織を、免疫組織学的に観察する。CD31(血管内皮細胞マーカー)、あるいはCD146(血管内皮細胞マーカー、幹細胞マーカー)を第一抗体とし、ついでCD68(マクロファージマーカー)、CCR7(M1マクロファージマーカー)、CD163(M2マクロファージマーカー)、あるいはCD206(M2マクロファージマーカー)を第二抗体として、血管内皮細胞とマクロファージとの免疫二重染色を行い、特徴的な動態を示すマクロファージ群を見出す。b.再生歯髄組織における血管内皮細胞と幹細胞の動態の検索:再生した歯髄組織を、免疫組織学的に観察する。CD31(血管内皮細胞マーカー)、あるいはCD146(血管内皮細胞マーカー、幹細胞マーカー)を第一抗体とし、ついでラット歯髄幹細胞のマーカーと考えられる8)STRO-1、あるいはMAP1Bを第二抗体として免疫二重染色を行い、血管内皮細胞と幹細胞の動態を検索し、特徴的な動態を示す幹細胞群を見出す。c.血管内皮細胞による歯髄組織再生制御因子の絞り込み実験a,bから特徴的な動態を示した細胞群を認識した一次抗体を選択して免疫染色後、免疫レーザーマイクロダイゼクションにより、血管内皮細胞と幹細胞(あるいは血管内皮細胞とマクロファージ)および陽性細胞周囲の組織をそれぞれ別々に採取し、Total RNAの抽出後、上述(実験1)のマイクロアレイシステム(ThermoFisher社)を用い各実験群において発現が特徴的に変量する遺伝子をデータ解析ソフトウェア(TAC Ver4.0,ThermoFisher社)を用いて絞り込む。

前年度は、上記のモデルを用いた再生歯髄組織の評価と再生促進因子の解析を目的として、以下の実験を実施した。血管内皮細胞と幹細胞の共培養による歯髄組織再生制御因子の網羅的解析、ラット歯冠歯髄再生モデルを用いた血管内皮細胞の動態解析、および歯冠歯髄を除去した上顎臼歯への幹細胞添加三次元スキャホールドの埋入実験を行い以下の結果を得た。幹細胞、血管内皮細胞混合移植で組織再生が促進することを確認するとともに、GFPを遺伝子導入した血管内皮細胞が移植14日後においても新生歯髄組織内で血管を形成することを見出した。さらに歯髄幹細胞・血管内皮細胞混合移植の再生促進効果に関係のある遺伝子として、血管新生関連遺伝子(B-cell lymphoma 2、nuclear factor-kappa Bなど)が同定された。当該年の研究計画と、おおむね同様に研究は遂行された。ラット上顎第一臼歯歯冠歯髄歯髄腔に再生した歯髄組織を検索対象として、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析、そして免疫組織化学的染色法を用い細胞や神経に発現する特異的タンパク発現、そしてウェスタンブロット法を用い、歯髄組織におけるタンパク発現の解析を行っている。主な研究成果としては、骨髄幹細胞、血管内皮細胞混合移植による組織再生促進を確認するとともに、これに関連する遺伝子をマイクロアレイにて解析し、血管新生への関連が知られるB-cell lymphoma 2やnuclear factor-kappa Bを同定することができた。さらに、GFP遺伝子を導入した血管内皮細胞を移植したところ、これらが再生歯髄組織内に集積し、血管様の構造を示すことを確認し、移植された血管内皮細胞が再生組織中で生存するのみならず、血管へと再生を示す可能性が示唆された。これらの研究結果は、Stem Cell Researchなどの海外雑誌に受理された。今年度は、前年度までの解析を継続するとともに、以下の実験を実施する。a.再生歯髄組織における血管内皮細胞とマクロファージの動態の検索:再生した歯髄組織を、免疫組織学的に観察する。CD31(血管内皮細胞マーカー)、あるいはCD146(血管内皮細胞マーカー、幹細胞マーカー)を第一抗体とし、ついでCD68(マクロファージマーカー)、CCR7(M1マクロファージマーカー)、CD163(M2マクロファージマーカー)、あるいはCD206(M2マクロファージマーカー)を第二抗体として、血管内皮細胞とマクロファージとの免疫二重染色を行い、特徴的な動態を示すマクロファージ群を見出す。b.再生歯髄組織における血管内皮細胞と幹細胞の動態の検索:再生した歯髄組織を、免疫組織学的に観察する。CD31(血管内皮細胞マーカー)、あるいはCD146(血管内皮細胞マーカー、幹細胞マーカー)を第一抗体とし、ついでラット歯髄幹細胞のマーカーと考えられる8)STRO-1、あるいはMAP1Bを第二抗体として免疫二重染色を行い、血管内皮細胞と幹細胞の動態を検索し、特徴的な動態を示す幹細胞群を見出す。c.血管内皮細胞による歯髄組織再生制御因子の絞り込み実験
超好熱菌の色素依存性脱水素酵素複合体の機能、構造解析と応用

超好熱菌由来のアミノ酸や有機酸などの種々の還元物質を電子供与体(基質)とし、ジクロロフェノールインドフェノールなどの人工色素を電子受容体とする色素依存性脱水素酵素複合体の生化学、分子生物学的機能解析とX線結晶構造解析と、そのバイオセンサーや酵素燃料電池への応用開発を行った。その結果、これまで不分明であった色素依存性アミノ酸脱水素酵素機能と構造の解明に大きな成果を見出した。また、超好熱菌由来の安定性の高い色素依存性脱水素酵素を素子とする電気化学的検出が可能な新規アミノ酸センサーの開発に成功した。さらに、色素依存性L-プロリン脱水素酵素を素子とする新規なプロリン酵素電池の開発に成功した。色素依存性脱水素酵素は、人工の色素であるジクロフェノールインドフェノールの存在下でアミノ酸や有機酸などを酸化する反応を触媒する一群の酵素である。これらの酵素は、膜結合性であったり、複雑な複合体構造をとるものが多く、一般に極めて不安定である。本研究では、高い安定性が期待できる超好熱菌由来の酵素複合体の機能・構造を解析し、新規応用面を開拓することを目的としている。本年度は、昨年度までに我々が発見し、遺伝子のクローニング、大腸菌での生産に成功している超好熱菌Thermococcus profundusの4種の異なるサブユニット成分(αβγδ)からなる4量体構造のL-プロリン脱水素酵素複合体(4量体PDH)と超好熱菌Pyrococcus horikoshiiの2種の異なるサブユニットからなる8量体構造をとる(α4β4)のプロリン脱水素酵素複合体(8量体PLDH)について、機能の詳細と講造解析を進めた.まず、T.profundus4量体PDHに関しては、X繍造解析を進めるために結晶の作製を行った。様々な結晶化条件を検討したが、回折データが得られるような良好な結晶を所得するには現在のところ至っていない。今後、類似の酵素複合体がゲノム構造からP.furiosusなど他の超好熱菌にも存在するので、生物起源の異なる酵素を調製し、結晶化を検討する。また、各サブユニットを個別に発現、精製に成功したので、それぞれの構造解析を進める。さらに本酵素を素子とする電極型センサーの開発結果を論文として発表した。一方、P.horikoshii由来の8量体PDHは、4量体酵素よりも耐熱性が高いので、これを利用するより耐久型L-プロリン測定用バイオセンサーの製作を現在進めている。さらに、色素依存性のD-乳酸脱水素酵素をSulfolobus tokodaiiに発見し、その精製と性質の解析、大腸菌での遺伝子クローニングに成功した(現在論文投稿準備中)。今後、この酵素による食品鮮度測定用D-乳酸バイオセンサーの開発を検討する予定である。アミノ酸や有機酸などの電子供与体と色素のジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)などの間の酸化還元反応を触媒する一群の色素依存性脱水素酵素は、一般に安定性が低く、機能開発が遅れているが、バイオセンサーなどへの新規応用が期待できる。本研究では、高い安定性が期待できる超好熱菌や高度好熱菌由来の酵素を探索し、機能と構造の解析、及び応用開発を進めた。本年度の成果として、超好熱菌SulfolobustokodaiiにDCIP依存性のD-乳酸脱水素酵素(D-LDH)を見出し、細胞抽出液からクロマトグラフィを用いて、高度に精製することに成功した。この酵素の補酵素としてHPLCによりFADを同定した。この酵素は、高い耐熱性(80°Cまで安定)、広範囲のpH領域(pH6.510)での高い安定性、D-乳酸に高い特異性などの特徴を明らかにし、D-乳酸測定用バイオセンサー素子として有用性が高いことを示した。この酵素のN末端アミノ酸の25残基の配列を決定し、ゲノム情報からこの酵素遺伝子としてSTO649遺伝子を見出した。この遺伝子を大腸菌でクローニングし、大腸菌で発現に成功し、発現酵素の組換え体大腸菌からの簡便な精製法を確立した。この酵素の全アミノ酸配列を決定し、相同性検索から、Archeoglobus fulgidusのグリコール酸酸化酵素と最大の相同性(39%)を示し、同じ菌のD-乳酸脱水素酵素とは、より低い相同性(32%)を示した。これにより、本酵素が新規D-LDHであることが明らかになった(成果はJBBに投稿、掲載予定)。次に、既に機能を明らかにしている膜結合性のD-プロリン脱水素酵素の応用として、本酵素を用いるD-アミノ酸測定用の電気化学的バイオセンサーの開発に成功した。このセンサーは、膜結合性の脱水素酵素を素子として、D-アミノ酸を電気化学的に測定できる点で、最初の例であり、高い新規性を有する。この成果については、現在学術論文に投稿し、採択に向け再審査中である。

電子供与体と人工色素ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)などを電子受容体とするアミノ酸や有機酸などフラビン含有色素依存性脱水素酵素は、安定性が低いために精製や機能解析が遅れているが、酵素電極素子として、バイオセンサーなどへの新しい応用が期待できる。そこで超好熱菌や高度好熱菌の生産する耐熱性酵素のゲノム情報と活性測定法によって検索し、新酵素を発見して、それらの生化学的機能や高次構造の解明を行う。また、酵素機能電極型バイオセンサーの開発を進めることを主な目的とした。本年度は、(1)超好熱菌のL-プロリン脱水素酵素のL・プロリンから4種の酵素成分(α,β,γ,δサブユニット)への電子伝達の機構解析を進め、L-プロリンからNADへの電子伝達が可能であることを見出す成果を得た。(2)超好熱菌Pyrobaculamcalidifondisに新規な2量体構造のL-プロリン脱水素酵素を発見した。また色素依存性D-プロリン脱水素酵素を素子とするD-アミノ酸の電気化学的測定法を開発した。特にその過程で酵素の固定化法として溶液状態の寒天と耐熱性酵素を高速回転させ回転体上でフィルム上に固定する新規方法を開発した。(3)スクリーニングにより細胞抽出液に酵素活性を検出している超好熱菌SulfolobustokodaiiのD-乳酸脱水素酵素の機能解析、遺伝子クローニング、一次構造の決定、相同性解析などから、新規酵素であることを発見した。(4)高度好熱菌Bacillus sp.DSM406菌に新規色素依存性L-グルタミン酸脱水素酵素を発見した。これら新規酵素の発見は、色素依存性脱水素酵素の生理的機能、構造、応用開発において、きわめて重要な研究成果である。
加齢による褐色脂肪細胞の減少メカニズムの解明

褐色脂肪細胞は熱を産生し、エネルギー消費量を増やすことで肥満や糖代謝を改善する。褐色脂肪細胞は加齢と共に減少し、その減少は肥満と糖代謝異常に関連することが示唆されている。加齢に伴い、何故褐色脂肪細胞が減少するかそのメカニズムの多くは不明である。本研究では、褐色脂肪前駆細胞の増殖・分化による褐色脂肪細胞の再生機構について解析し、加齢による褐色脂肪細胞の減少機序を解明する。本研究によって得られる知見は、加齢に伴う褐色脂肪細胞の減少を認める高齢者の肥満・糖尿病に対する新規治療に繋がる可能性が期待される。
国際ネットワークを重視した小中高一貫英語教育システムの構築-国語力強化と連携して

本科研の目的は、学習者の認知発達・興味・有用性を重視したテクストを使用し、ICTと人間教師(日本人と外国人)が有機的に連携し、クリティカルに思考し、論理的に自らの考え・意見・報告事項などをプレゼンテーション(説明、説得、描写、弁明)できるコミュニケーション能力を、母語としての日本語と外国語としての英語を連携させて養成するための基礎的研究を行なうことにあった。H20.3に発表された新指導要領の内容は本科研の次の結論とも合致し、本研究の成果の妥当性の証左と考える。(1)小中高一貫の英語教育において英語の語彙力は重要な柱のひとつである。幅広いジャンルのコンテクストとともに興味や有用感をもって学ばれる必要がある。(2)すべての教科は実生活との関連を重視し、学習者が学びの共同体の一員として学べるような環境を提供することで、クリティカルに思考し論理的に発信できる学習者を生み出す。(3)批判し吟味する力、内容について解釈したり推理したり、構成・構造・表現をメタ的に把握する力など、論理的・批判的思考力に関わる力の多くは、母語により基礎が築かれ外国語へも転移しうるが、ある一定の英語力を有す学習者においては、外国語から日本語への転移もありうる。限られた例ではあるが、帰国子女への調査、小中高での実践研究、先行文献調査などで確認できた。国語と英語の連携の重要性を示す結果である。(4)外国語学習は言語そのものに意識を向けさせることからメタ認知を育て、母語としての日本語を客観的に見つめ直す機会ともなる。メタ認知がすぐれている幼児・児童は母語の発達も早いという海外の研究結果からも、小学校英語の母語習得への寄与は大きい。(5)小学校英語ではALTやICT(CD、DVD、iPodなど)の活用により、できる限り自然な英語の音声のインプット中心の活動を増やす必要がある。特に良質のALT確保が困難な状況ではICT活用が必須である。1研究の目的本科研の目的は、国際ネットワーク(e-learning)と人間教師(日本人、外国人)を有機的に連携させて,英語と日本語によるコミュニケーション能力を養成するための小中高一貫の言語教育システムを構築することにある。全人教育を視野に入れ,学習初期の段階から学習者の認知発達,興味,有用性を重視した教材を使用して,テクストの論理的な分析・解釈・説明・鑑賞・発表を行なえるコミュニケーション・スキルの養成を目指す.2平成16年度の実施報告平成16年度は研究の初年度であることから,小中高の英語教育と国語教育の実態調査,言語運用能力養成に関する問題点の把握,関連する分野の先行研究を調査するとともに,英語教育,国語教育,バイリンガル教育,発達心理学,言語習得,教育工学を専門とする研究分担者間で,研究の目的を達成するためのリサーチデザインについて活発な意見交換を行った.合わせて教育現場の意見を得るために,小中高の英語と国語の教師(研究協力者)も参加する勉強会を開催した.

具体的にはバイリンガル教育の中島は二言語同時習得の立場から小・中学生の国語力(母語)と英語力発達との関係について調査し、二言語が同時に伸びる諸条件と二言語とも低迷する諸条件についての研究を,国語教育の寺井は国語教育の現場に密着した「メタコミュニケーション能力の育成」に関する研究を,発達心理の岩田は幼児の因果性の発話に関する言語発達研究を,英語教育,言語習得,教育工学担当の椎名,ボズウェル,吉成は,英語の物語を教育工学的手法を用いて提示したのちに正確な理解と鑑賞をさせ,自らの考えを論理的に説明・発表して学習者どうし相互に評価しあえるようなコンピュータシステムの開発研究を行っている.さらに学習者の反応をリアルタイムに提示し記録する教育支援システムの開発研究も開始し,平成17年度に学会での口頭発表を予定している.本科研の目的は、IT活用や人間教師(日本人、外国人)の有機的連携により、学習者の認知発達,興味,有用性を重視したテクストを使用して、論理的に分析・解釈・説明・鑑賞・発表を行なえるコミュニケーションスキルを、母語としての日本語と外国語としての英語において養成することにある。本研究は「母語と外国語は認知・学力面で相互に補完して育成される」というカミンズの二言語共有説(1980)に理論面で依拠しているものの、カミンズが研究対象とした言語研究は主に英語とフランス語であるため、果たして日本語と英語というまったく言語構造や音韻体系の異なる言語間においても補完性があるかどうかは研究が十分には行われていない。そこで平成17年度はイギリスのマンチェスターにある日本語補習校に通う日本人の小中高生の日本語と英語使用について授業参観を通して観察した。平成18年度も継続して質的研究を行う予定である。さらにマンチェスターでは母語としての英語をいかに効果的に指導するかについてナショナルカリキュラムの実践授業を参観した結果、日本での英語教育と国語教育にも生かすべき多くの知見が得られた。IT活用については、小学生英語の基礎部分として重要な語彙力養成に役立つPCを利用したシステムの開発を行い、「学習者の反応をリアルタイムに提示し記録する教育支援システムの開発□英語の絵単語集を活用した小学校授業への応用」として題して外国語教育メディア学会にて発表した。英語と日本語が共有する「ことばの力」については広島県が先進的な実験授業を小中高において平成17年度9月より導入していることから、実践校を視察して研究報告を受けた。本科研の目指す言語スキル養成のためには大きな知見を得たうえ、広島県教育庁指導課からも依頼を受けてその結果分析を協力することになった。本科研の目的は、母語としての日本語力(国語力)と外国語としての英語力育成を連携して指導することにより、クリティカルな思考による聴解と読解、分析と解釈を経て、論理的に自らの考えや意見、報告事項などをプレゼンテーション(説明、説得、描写、弁明など)できるコミュニケーションスキルの育成方法を探ることにある。「ことばの力」の育成において、日本語と英語の語彙力・文法力増強の必要性は論を待たないが、それと同時に本研究では、論理的な発信力の育成には、レトリックに関する研究に基づいて、ことばの指導に「言語技術トレーニング」という視点も含めることが重要であると認識している。言語技術はともすると無味乾燥なトレーニングと解釈されがちであるが、本研究では、実生活との関連を重視しながら情操面の育成をも視野に入れ、学習者の認知発達、興味、有用性に留意した内容の、幅広いジャンルのテクストを使用して、IT活用や人間教師(日本人、外国人)の有機的連携、学習者間の協調学習を重視した指導方法と教材開発を試みている。
高血圧性心不全の発症機序と病態生理学的特徴に関する生理学的及び生化学的研究

臨床上みられる高血圧性心不全の病態は複雑で単に圧負荷による肥大とその破綻の結果であるとは言い難い.体液性因子や神経性因子など種々の要因の関与が推測されるにとどまり,発症機序との関連についての明らかな知見は見あたらない.今回は自然発症高血圧ラット(SHR)を用いて降圧剤による肥大の退縮を検討し,次に高血圧肥大心,退縮心および正常心のポンプ機能と予備力を測定し高血圧性心不全の発症機序を検討した.2)そこでcaptopril(CP)を3週間, SHRとWKYに経口投与し対照群にはvehicleを投与した. SHRでは降圧と心重量の低下が認められたがWKYでは有意の変化はなかった.次にエーテル麻酔下において開胸し,大動脈に装着した電磁流量計で心拍出量を,経左房的に挿入したカニューレで左室拡張末期圧(EDP)を測定しながら40me/kg分の速さで全血を用い急速容量負荷を行ない一回心拍出量とEDPから心ポンプ機能の重要な指標である心機能曲線を求め比較検討した. SHRとWKYの治療群・対照群のそれぞれの心機能曲線はほぼ一致し有意差を認めなかった.しかし降圧した退縮心(SHR)の後負荷(血圧)を対照群に一致させると,その心機能曲線は有意に右下方に移動しポンプ機能の低下を認めた.以上の結果より高血圧心の肥大と退縮は単に圧負荷のみならず他の要因の関与の大きいことが明らかとなった.また高血圧肥大心,退縮心および正常心のポンプ機能は差がないが容量負荷,圧負荷に対する予備力は退縮心で低下しており,心不全に移行しやすい状態にあることが示唆された.臨床上みられる高血圧性心不全の病態は複雑で単に圧負荷による肥大とその破綻の結果であるとは言い難い.体液性因子や神経性因子など種々の要因の関与が推測されるにとどまり,発症機序との関連についての明らかな知見は見あたらない.今回は自然発症高血圧ラット(SHR)を用いて降圧剤による肥大の退縮を検討し,次に高血圧肥大心,退縮心および正常心のポンプ機能と予備力を測定し高血圧性心不全の発症機序を検討した.2)そこでcaptopril(CP)を3週間, SHRとWKYに経口投与し対照群にはvehicleを投与した. SHRでは降圧と心重量の低下が認められたがWKYでは有意の変化はなかった.次にエーテル麻酔下において開胸し,大動脈に装着した電磁流量計で心拍出量を,経左房的に挿入したカニューレで左室拡張末期圧(EDP)を測定しながら40me/kg分の速さで全血を用い急速容量負荷を行ない一回心拍出量とEDPから心ポンプ機能の重要な指標である心機能曲線を求め比較検討した. SHRとWKYの治療群・対照群のそれぞれの心機能曲線はほぼ一致し有意差を認めなかった.しかし降圧した退縮心(SHR)の後負荷(血圧)を対照群に一致させると,その心機能曲線は有意に右下方に移動しポンプ機能の低下を認めた.以上の結果より高血圧心の肥大と退縮は単に圧負荷のみならず他の要因の関与の大きいことが明らかとなった.また高血圧肥大心,退縮心および正常心のポンプ機能は差がないが容量負荷,圧負荷に対する予備力は退縮心で低下しており,心不全に移行しやすい状態にあることが示唆された.従来より高血圧肥大心は圧負荷の良いモデルであり、その終局は心不全であると孝えられている。近年は各種降圧剤の開発に伴いその様式が複雑化している一方、治療による高血圧心の肥大と退縮が論議されている。しかしながらそのことが心機能の点からはたして良いことなのか否かに、又心不全との関連はどうかについて定まった考えはない。外来治療中の患者に心エコー法で左室又は心室中隔が15mm以上を示す高血圧症20例について平均2年の降圧治療によりその肥大がどうなったかについて検討した。心エコー法のsensitivityを考えて3mm以上の変化を有意とすると退縮は6例(pw15.4±1.1→11.8±1.1,IVS15.5±1.1→13.5±1.4mm,p<0.01)不変例12例(pw15.1±2.7→14.8±2.8,IVS17.5±3.5→17.0±3.5mm,n.s.)より肥大例2例(pw15.0±2.1→17.5±7.8,IVS16.5±2.1→20.0±2.8mm)であった。収縮能の指標であるfractional snorteningをみると退縮例では32.8±9.2→38.9±5.2%(p<0.01)と改善していたが、不変例では31.8±6.2→32.0±9.1%,肥大例では42.6±3.6→43.8±2.7%と変化なく、高血圧心の肥大は降圧治療法にて退縮し、収縮能が改善されることが示唆された。次にSHRとWKYにアンジオテンシン【I】変換酵素阻害剤カプトリル(cp)を4週間服用させるとSHRでは心重量が3.30±0.01→2.61±0.01mg/g(p<0.01)と退縮を示しWKYでは不変であった。

カプトリル服用群と対照群のそれぞれに麻酔開胸下で心拍出量を動脈にかけた電磁流量計で又左房から左室に挿入したチューブでLVEDPを測定し40m1/kg/分のスピードで急速容量負荷を行いLVEDPとSVから心機能曲線を求め比較した。SHRとWKYの治療群・対照群の4つの曲線は有意差を示さなかった。しかし、カプトリル投与により心筋肥大の退縮した群に後負荷としての血圧を対照群に一致させる為下行大動脈にsnareをかけた群では心機能曲線は有意に右下方に移動した。このことより治療により降圧し、退縮した群は、圧上昇に伴い、心不全に陥り易い可能性が考えられた。
食餌同調性概日ペースメーカーによる食欲・行動・末梢臓器機能の調節

本研究では、食欲・食物探索活動と食物摂取のタイミングを合わせ、限られた食餌機会を有効に利用するための第2の概日ペースメーカー「食餌同調性概日ペースメーカー」の神経基盤の解明を進めるとともに、食餌同調性概日ペースメーカーによる末梢臓器機能の調節様式を明らかにすることを目的した。食餌同調性概日ペースメーカー存在部位の絞り込みでは、SCNを除いた視床下部で特異的にBmal1(概日分子時計に必須の因子)を欠損したマウスを作製し、その食餌同調性概日行動リズムを検討した。しかし、用いたCreドライバーマウス自体で食餌同調性の食物探索行動が顕著に減弱してしまい、視床下部特異的Bmal1欠損の影響を調べることができなかった。また、以前我々は、視床下部背内側核緻密部を食餌同調性概日ペースメーカーの座と提唱したが、当該領域に特異的にCreを発現するトランスジェニックマウスを見出した。SCN以外の脳領域でBmal1を欠損したマウスでは給餌時刻に合わせた食物探索活動や摂食が著しく減少する。この「脳内食餌同調性概日ペースメーカーを特異的に欠損したモデルマウス」を用いて、諸臓器に内在する末梢概日時計を脳内食餌同調性概日ペースメーカーが調節する可能性について検討し、胃内在性概日時計の食餌への同調を促進することを明らかにした。しかしながらこのモデルマウスにおいて、グレリン血中濃度の食餌性同調性概日リズムについては異常が観察されなかった。脳内の食餌同調性概日ペースメーカーは餌探索活動や食欲などの脳機能を制御する一方で、末梢臓器機能の調節には大きな役割は果たさない可能性が考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、食欲・食物探索活動と食物摂取のタイミングを合わせ、限られた食餌機会を有効に利用するための第2の概日ペースメーカー「食餌同調性概日ペースメーカー」の神経基盤の解明を進めるとともに、食餌同調性概日ペースメーカーによる末梢臓器機能の調節様式を明らかにすることを目的とする。本年度は、これまでに予備的な結果を得ていた、「脳内食餌同調性概日ペースメーカーが、胃に内在する概日時計が食餌のタイミングに速やかに同調するために重要である」との結論を、実験数を増やすことで確定した。また、脳内食餌同調性概日ペースメーカーが欠損すると、胃から分泌される空腹ホルモン・グレリンや他の摂食・エネルギー代謝関連ホルモンの、食餌の同調した産生・分泌リズムにどの様な影響が現れるか検討したが、有意な影響は観測できなかった。さらに食餌同調性概日ペースメーカーの神経基盤を明らかにする目的で、視交叉上核を除く視床下部全域、あるいは視床下部背内側核(食餌同調性概日ペースメーカーの候補領域)で概日時計周期を延長させたマウスを作製した。食事のタイミングや睡眠時間等の生活習慣と肥満やメタボリックシンドロームとの関連について最近様々な報告がされている。本研究の成果により新たな食欲調節機構の神経・分子基盤が明らかになり、また様々な食習慣・生活スタイルにおける健康上のリスク、さらにはその効果的な対処方法の検討につながると期待できる。ほぼ研究計画の通りに、研究が進んでいる。本年度より作製を始めた、視床下部全域、あるいは視床下部背内側核で概日時計周期を延長させたマウスにおける、食餌同調性概日リズムを詳細に検討する。異常が見つかれば、さらに概日時計周期を操作する脳領域を限定し、食餌同調性概日ペースメーカーの存在部位を絞り込む。
表面提示型蛍光タンパク質によるがん幹細胞の複重可視化とその応用

がん幹細胞の存在が、がん治療後の再発や転移に大きく関わってくるため、がん幹細胞を標的とする治療法および診断法の開発が求められている。治療法および診断法を開発するためには、がん幹細胞の特性を解析しなければならない。しかし、がん幹細胞は不均一ながん細胞集団に非常に少ない割合でしか含まれていないため、効率良く単離できたとしてもその解析には困難を要する。それは、培養により純粋な細胞集団として増殖維持させることが極めて困難であるからである(特性の解析には大量の細胞数が必要)。前回、がん幹細胞を選択的に強く蛍光標識し、単離することに成功したが、純粋ながん幹細胞として得られる数量が非常に少ないため、分子細胞生物学的手技による細胞特性の解析にはやはり困難を要した(培養により増殖させると分化により性質が変化する)。この問題を解決するために今回、単一の性質を示すがん幹細胞をクローン化し、増殖させるためのコンストラクトを開発した。幹細胞に選択的に発現しているCD133遺伝子を選択し、このプロモーター制御下に薬剤耐性遺伝子(ハイグロマイシン性遺伝子)を挿入した新規コンストラクトを作製した。前立腺がん細胞株PC3にトランスフェクションし、ハイグロマイシン添加培地により増殖してくる細胞群を得た。さらに、シングルセルクローニングを行い、最終的に4種のクローンを得る事に成功した。いずれもCD133を高レベルに発現維持していることを確認した。形態は、球形で浮遊性に富んだ性質を示した。また、親株に比較して非常に転移能が高い事も動物実験より判明した。これらの細胞は、抗生物質添加培地で培養している限り、同じ特性を示すため(分化の方向に進むと抗生物質により淘汰される)、がん幹細胞の特性解析において非常に有用な材料となりうることが大いに期待された。一方、各種がん細胞株を検索し、CD133を高率に(90%以上)発現しているがん細胞株を同定した。この細胞は非常に心性であり、高度の転移・浸潤能をもつ。本細胞株は自然に幹細胞様特性を獲得したがん細胞の形質を抑制する研究や、CD133遺伝子発現調節の解析に好適である。1.表面提示型蛍光タンパク質発現細胞の調整平成20年度はCD133、Nanog-2、-8のプロモーターを表面提示カセット(膜貫通ドメイン付加GFP)に組み込んで各種がん細胞(SH-SY5Y、MCF-7、Huh7)に発現させたところ、期待していた通りの細胞表面蛍光が得られなかった。CMVプロモーターを用いても一部の細胞にしか強力な発現を認めず、またGFPのシグナルが細胞膜ではなく細胞内小胞に限局していた。このことからGFP融合タンパク質は発現するものの、表面提示カセットの膜貫通ドメインが期待通りに機能しないため細胞膜への移行ができないと考えられた。この問題を克服するために現在コンストラクト改良と遺伝子導入する細胞についても検討を進めている。そのため研究計画が開始当初よりやや遅れて進行しており、平成21年度の実施計画も研究の目的と照らし合わせた上で重要と考えられるものを中心とする形に一部変更した。2.本システムの動作確認CD133(CD133プロモーター)-GFP-TM(膜貫通ドメイン付加GFP)コンストラクトを導入したSH-SY5Yの場合、GFP蛍光はあまり強くはなかったが検出できる程度に認めた。そこでCD133の発現とGFP蛍光が相関するかどうかを確認するために、遺伝子導入細胞から安定導入クローンを樹立した。樹立した安定導入クローン細胞のCD133タンパク質の発現を赤色蛍光色素を結合したモノクローナル抗体により検出させ、フローサイトメトリーによりGFP蛍光との相関を確認した。その結果、きちんと相関を認めたクローンと相関が認められなかったクローンの両方が存在しており、今後の実験を進める上で遺伝子導入細胞のクローン間の差を念頭に入れる必要性が示された。

これらの細胞は、抗生物質添加培地で培養している限り、同じ特性を示すため(分化の方向に進むと抗生物質により淘汰される)、がん幹細胞の特性解析において非常に有用な材料となりうることが大いに期待された。一方、各種がん細胞株を検索し、CD133を高率に(90%以上)発現しているがん細胞株を同定した。この細胞は非常に心性であり、高度の転移・浸潤能をもつ。本細胞株は自然に幹細胞様特性を獲得したがん細胞の形質を抑制する研究や、CD133遺伝子発現調節の解析に好適である。
分子進化学的手法によるC型肝炎ウイルスの遺伝子分類とその臨床応用

【目的】C型肝炎ウイルス(HCV)の分類は各種存在し現在混乱状態にある。そこで、HCVの遺伝子の変異度を利用して分子系統樹を作製し、分子系統樹からHCVの分類を試みた。【対象と方法】5′non-coding(5′UTR),core,E1,NS5領域の分子系統樹をneighborjoining法で作成した。解析に使用したHCV株は計658株である。各領域のtypeとsubtypeを明確にするため、各領域毎にtype内とsubtype内の変異度を計算し、その平均(M)と標準偏差(SD)を算出し、M+2SD以内をsubtypeとし、それ以上をtypeとした。【結果】作成された系統樹から、core領域では6つのtypeとと32のsubtype、E1領域では6つのtypeと27のsubtypc、NS5領域では6つのtypeと30のsubtypeに分類された。5′UTR領域の系統樹では、type1とtype6の株がclusteringし両者を分類できず、また、type4も完全に2つの分類された。これらの系統樹からHCVは6つのtypeの少なくとも37のsubtypeに分類された。また、core,E1,NS5各領域のtypeとsubtypeの変異度のM±2SDはどの領域でもoverlapするためにtypeとsubtypeを明確に分類することはできなかった。【考案】core,E1,NS5領域ではHCVは、6つのtypeと37のsubtypeに分けられたが、5′UTR領域ではtypeすら分類出来なかった。さらに、分子系統樹上でclusteringしている株でも、特にtype3,4,6に含まれるHCV株の変異度は、既知のsubtypeの変異度より大きった。このことは、現在使用されている分類法ではtypeとsubtypeを明確に区別することが出来ないことを意味している。さらに、このことは新たに分離したHCV株の分類する際に混乱を生ずることを意味し、今後早急に新しい分類が必要であると思われた。【結語】HCVの分類は、今後臨床的な側面も考慮した新たな分類が必要であると思われた。
シームレスＭＲ画像誘導手術を可能とするハイブリッドナビゲーション法の研究

通常の高磁場MR装置と磁石近傍で動作するMR対応穿刺支援ロボットを用いた新たな画像誘導手術システムを開発した。このシステムでは、MR画像撮像後、磁石外で位置合わせの操作なしに直ちにロボットを操作して標的を追尾し、穿刺ルートに沿った再構成MR画像を表示させ、標的への安全で最適な穿刺ルートの選択が可能であった。また穿刺後は、針の位置と方向の情報を記録し、磁石内で、位置決め画像なしに即座に穿刺結果を確認することができた。こうして、対象を磁石内外に移動してもシームレスなMR画像誘導手術が実現した。本年度は、第一に、通常の臨床診断用のMR装置において手術ナビゲーションを実現できるよう、研究協力者であるGEヘルスケアのHaque博士の協力を得て、外部の電磁式位置センサ(EndoScout)の情報によってMRシステムの撮像面(中心位置と傾斜角度)をインタラクティブに制御することのできるソフトウェア環境を外部PCに整備した。また、MR装置で撮像した画像を直ちに外部コンピュータに転送し、新たに開発を進めているナビゲーションソフトウェア上に表示できる環境を整備した。PCは磁石室内に設置できないので、こうしたナビゲーション画像をMR画像にノイズを与えることなく磁石室内でモニターできるよう、シールドされたMR対応液晶モニターや光ファイバーによる画像伝送システムを導入し、手術ナビゲーションを実現するためのインフラを整備し、ノイズ対策などの周辺設備の調整を行った。またEndoScoutの精度を向上させるため、研究用のパルスプログラムを導入し、撮像条件の最適化を図った。本研究課題であるシームレスなナビゲーションを実現するために、光学式の位置センサ(Polaris)を導入し、MR磁石の内と外(磁石近傍)のMR環境下での基本性能の評価、ノイズ対策、位置情報の磁石室外への伝送方法について検討したPolarisのための反射球と小型のEndoScoutセンサを固定した独自ハイブリッド型のハンドピースを複数個製作し、それらの誤差評価、最適のデザイン、設置方法と設置位置、検出カメラの設置固定法についての検討を行っている。ソフト面では2つのセンサからの位置情報のキャリブレーションと統合を行うべく開発を進めているとともに、ハード面ではオープンMRシステムで使用していた非磁性で設定したターゲットを追尾するロボットをこのプロジェクトでも使用できるよう整備と改造を行っているところである。本研究は、高磁場磁気共鳴(MR)装置を利用し、IN and OUT方式であっても、レジストレーションなどの煩雑な操作なしに、シームレスに簡便な低侵襲手術を行うことのできる手術ナビゲーションシステムを開発することを目的とする。昨年度までに、指定したターゲットを自動追尾するロボットを磁石近傍で使用し、安定かつ正確に標的に照準を合わせ、穿刺経路に沿った再構成MR画像を表示することにより、障害物のない安全な穿刺経路を容易に選択できるシステムを構築した。今年度は、様々の方向からの穿刺を無理なく実行できるよう、穿刺対象を移動・回転させても、ベッドに取り付けたセンサにより、再度のキャリブレーションなしに、直ちに操作を再開することを可能とする、モーションコンペンゼーションの機能を追加した。新しいベッドの位置でも、穿刺の誤差は許容範囲内で、システムの利便性は向上した。この成果は第9回アジアコンピュータ外科学会で発表し、Best Paper Awardを受賞し、高い評価を得た。当初、動物実験を計画していたが、現状のシステムでは、穿刺はナビゲーションの結果を信じてブラインドで行わねばならず、穿刺結果を判定するためには、その都度、動物に穿刺針を留置したままでマグネット内へ移動して撮像を行う必要があった。ロボットからの情報により、撮像はシームレスに行えるとはいえ、このようなシステムは明らかに不十分なもので、有効に利用するためには、穿刺針の位置をリアルタイムにモニターする必要があるとの考えに至った。そこで予定を変更し、タブレット型の超音波診断装置を導入し、現状のMR装置近傍のロボット設置場所で正常に動作することを確認し、再構成MR画像と超音波画像の両者を併用するナビゲーションシステムの実現に向けた基礎的検討を行い、良好な結果を得た。この成果は特許として出願した(特願2014-30656)。2年目にあたる24年度は、初年度に導入した光学式の位置センサ(Polaris)と、マグネット内で使用する電磁式位置センサ(EndoScout)を統合したナビゲーションソフトウェアを外部PC上に開発することに取り組むとともに、以前の科研費のプロジェクトで開発した、指定したターゲットを非磁性の超音波モーターを使って、自動追尾するオープンMRシステム用の穿刺支援ロボットをこの研究プロジェクトのために改造した。その結果、磁石内で精細な3D撮像を行って、ターゲットの位置座標を得た後、対象物を磁石外に引出し、この穿刺支援ロボットを使用してシームレスなナビゲーションを行い、指定したターゲットの自動追尾を実現した。ハンドピースの方向を変化させるとロボットの台座が移動して正確にターゲットに照準を合わせるとともに、直ちに穿刺経路に沿った直交