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無名草子における引用関連文献の総合的調査と研究

鎌倉時代初期に書かれ、現存する最古の物語評論を中心とした王朝女性文化論である『無名草子』について、その引用関連の文献を総合的に調査し、文学史と文化史の中に位置づけた。従来は現存しない散逸物語などの資料とされ、その批評は、和歌的な美意識による印象批評とみなされてきたが、これを失われた王朝女性文化に固有の視点からの王朝憧憬の書物として、その特殊な位相を解明したところに特色がある。それは、この作品において取り上げられた文献の引用から見られる特徴を、女房の視点からジェンダー論として捉えるとともに、取り上げられなかった作品や歴史的また文化的な事象をも視野に置くことによって可能となった。具体的な実績としては、引用関連文献を、注釈レベルにおいて再検討することを基礎作業として、「引用関連文献年譜」「引用作品年表」「登場人物年表」を作成したことである。これによって、作品名と人名を中心とした文学史の中に、引用関連からみた『無名草子』の特質を文学史の中に位置づける基本的な視座を得ることができた。個々の文献の成立年次は確定できないものも多いし、年譜や年表としては大まかな流れを示すものであるが、王朝女房の視点により、貴族社会が崩壊したあとの<女>文化の歴史的位相が明確となる。『無名草子』という作品の表現の構造からは、序の物語における仏教的な価値評価の強さに対して、本論ではそれが弱く、失われた現実としての王朝女性文化への憧憬が価値基準となっている。これは、すでに和歌や歌集の編纂、鏡ものなど歴史物語、また説話集が男性文学として女性から簒奪されていた時代にあって、『源氏物語』を中心とした「作り物語」を王朝女性文化の中心となす伝統を示し、<物語の詩学>というべき批評原理を読むことができる。また『枕草子』以来の「草子」というジャンルを仮説することにより、「世継」や「歌語り」との関連を問う視点が拓かれた。今年度は、無名草子研究会の作業と連携しつつ、これまで個別に指摘されてきた引用関連文献を総合的に集成する作業を行い、王朝<女>文化の懐古という視点から文化的な知の体系の中に位置づける展望を得た。具体的には以下の諸点である。1、『枕草子』から『徒然草』に至る「草子」という批評文芸のジャンルを仮説し、その系譜の中に無名草子を位置づけ、『古本説話集』や『小世継』などの王朝説話の伝承などとの関連をより重視すべきことが、明らかになって来つつある。2、紫式部による源氏物語執筆の伝承として、源実朝筆という説もある善光寺大勧進所蔵の「源氏物語事書」を新資料として注目し検討したが、残念ながらこれを鎌倉時代資料とみることはむつかしく、『源氏大鏡』などへと通じる後世の系譜の中に位置づけるべきだとの結論を得た。3、無名草子における歌集の論はきわめて偏った特殊なものであるが、そこに示された藤原俊成への態度をはじめ、触れられていない『物語二百番歌合』における物語歌引用を含めた定家など御子左家との関係を総合的に探る作業を進めつつある。俊成については敬意をはらいつつ批判もあり、まして定家はいまだ権威化されることなく、王朝<女>文化の伝統の中で親しみをこめて相対化されている段階である。4、源氏物語の引用本文は「国冬本」と近く、津守家との関係が無名草子の伝来の上からも注目される。

本年度は、『無名草子』と関連する物語評論と和歌資料の調査を主として、文学史的な位置づけのための基礎的な検討を行った。『無名草子』が王朝<女>文化を「作り物語」を中心にして論じていることは明らかであるから、逆に、何を対象とせず、その判別基準が何かとい問題意識のもとに従来の研究成果を個別に再検討することとなった。安居院澄憲『源氏一品経表白』は、仏教的な文学観を前提としつつも、狂言綺語観によって『源氏物語』をはじめとする物語の罪を救済しようとする。『無名草子』に先行して、一見すると正反対の否定的な物語観を示しているが、八条院の女性を施主とした<女>文化と『源氏物語』との接点にある。『無名草子』と同時代の和歌的な物語観の資料として、『物語二百番歌合』をはじめとする藤原定家およびその父の俊成に関連する資料の検討からは、『無名草子』との共通性を多く見出せるが、異質性は弱い。とはいえ、『無名草子』における俊成と定家への親密さを前提とした批評は注目される。新たな展望としては、顕昭に代表される六条家の歌学の系譜にある上覚『和歌色葉』と、頼瑜『真俗雑記問答鈔』にみられる書目との比較である。それらは仏家における「歌書目録」といえるものだが、物語や日記を含んでいる。『無名草子』とほぼ同時代の、まったく異質な物語観がうかがえる。ジャンル論を含めた、新たな関連資料の端緒となると思われる。なお、関連資料かと期待された善光寺大勧進蔵『源氏物語事書』の著者「実朝」は、源実朝ではない僧で、時代も下る可能性が強い。鎌倉時代初期に書かれ、現存する最古の物語評論を中心とした王朝女性文化論である『無名草子』について、その引用関連の文献を総合的に調査し、文学史と文化史の中に位置づけた。従来は現存しない散逸物語などの資料とされ、その批評は、和歌的な美意識による印象批評とみなされてきたが、これを失われた王朝女性文化に固有の視点からの王朝憧憬の書物として、その特殊な位相を解明したところに特色がある。それは、この作品において取り上げられた文献の引用から見られる特徴を女房の視点からジェンダー論として捉えるとともに、取り上げられなかった作品や歴史的また文化的な事象をも視野に置くことによって可能となった。具体的な実績としては、引用関連文献を、注釈レベルにおいて再検討することを基礎作業として、作品名と人名を中心とした文学史の中に相対的に位置づけたことである。個々の文献の成立年次は確定できないものが多いし、年表としては大きな流れを示すことになるが、王朝女房の視点による貴族社会が崩壊したという歴史的位相が明確となる。『無名草子』という作品の構造からは、序の物語における仏教的な価値評価の強さに対して、本論では仏教的な価値基準はきわめて弱く、失われた現実としての王朝女性文化への憧憬が明確な価値基準となっている。これは、すでに和歌、特に歌集の編纂や鏡物などの歴史物語、また説話集が男性貴族の文学として女性から簒奪されていた時代にあって、『源氏物語』を中心とした「作り物語」を王朝女性文化の中心をなす伝統を示し、『源氏物語』をはじめとする物語の評価基準や、説話集など関連文献の引用の手法においても明確である。
中高年期うつ病の病態生理の解明-海馬歯状回神経新生現象と老年性変化の関連

老年性変化、特に神経原線維変化と老年期うつ病の関連を調べる目的で、変異(R406W)ヒト型タウを前脳神経細胞の軸索内に発現(内在性の約20%量)しているトランスジェニックマウス(TGマウス)を製作し解析した。この変異タウはヒトにおいてアルツハイマー病様の家族性前頭側頭型痴呆を生じ、加えて発症前に抑うつ症状を頻繁に出現させることが報告されている。一部のTGマウスは、19ヶ月齢以降になると海馬を中心に神経原線維様変化を示すようになる(Tatebayashi et al., 2002, PNAS, 99:13896)。3-21ヶ月齢のTGマウスを用いて、うつ関連行動を検討したところ、強制水泳で無動時間の有意な延長を認めた(Tatebayashi et al., 2004,Neurobiol Ag, 25:S249;Egashira et al., 2005, Brain Res, 1059:7)。この異常は、情動記憶異常(Fear conditioning)の出現と相関しており、出現時期に雌雄差が認められた。また異常の程度と導入遺伝子量に正相関が認められた。電無生理学的に検討するとTGマウスでLTP発生後のピークの低下が有意に早く、前シナプスにおける伝達物質の枯渇、すなわち軸索輸送の障害が生じている可能性が示唆された。われわれはタウのGSK3betaによる生理的リン酸化が軸索輸送に必要なことを見出し報告している(Tatebayashi et al., 2004, J Cell Sci, 117:1653)。そこで変異(R406W)によるタウの生理的リン酸化への影響を調べた。R406W変異はSer404のリン酸化を阻害することでGSK3betaによるPHF1サイトの生理的リン酸化を阻害することが判明した(Tatebayashi et al., 2006, FASEB J, 20:762)。まとめると、タウのR406W変異はタウの生理的リン酸化を阻害することで軸索輸送に障害を起こし、うつ病関連の行動異常をTGマウスに生じている可能性が示唆された。このマウスの海馬における神経新生は現在検討中である。海馬歯状回神経新生現象と老年性変化の関連を調べる目的で以下の動物実験を継続中である。1)マウスの片側脳の海馬傍回をイポテン酸で不可逆的に破壊し、36ヶ月放置後、神経新生が破壊側、反対側でどの様に影響を受けるか検討を行っている。2)うつ病のモデル動物としてマウスに12ヶ月間に渡り慢性ストレスを与える実験系を確立し、神経新生に対する影響を検討している。3)慢性ストレスモデルも含め神経新生が減少する動物モデル系を用いて海馬傍回の貫通路起始細胞に対する影響を生化学的、組織学的に検討している。4)脳老化のモデルとしてR406Wタウを過剰発現しているトランスジェニックマウスを解析し、月齢依存性にうつ病様の異常行動(強制水泳における無動時間の延長)が出現する事、さらに電気生理学的検討を行いシナプス増強時に特異的異常を示す事を発見している。

現在、うつ病様症状と神経新生との相関を検討中である。これらに実験から老年性変化の海馬歯状回神経新生現象への影響、さらにはうつ症状への影響を検討する事が可能と考えている。海馬歯状回神経新生現象と老年性変化の関連を臨床的に調べる目的で、臨床共同研究を当初予定の都立松沢病院に加え、国立長寿医療センター、行動・心理療法科(精神科)とも行う事とし、現在症例を募集中である。倫理関係の承認は対象機関で取得済みである。十分数、症例が集まり次第、解析を開始する予走であるが、髄液の採取は現在難航しており、何らかの計画変更が必要となる可能性がある。老年性変化、特に神経原線維変化と老年期うつ病の関連を調べる目的で、変異(R406W)ヒト型タウを前脳神経細胞の軸索内に発現(内在性の約20%量)しているトランスジェニックマウス(TGマウス)を製作し解析した。この変異タウはヒトにおいてアルツハイマー病様の家族性前頭側頭型痴呆を生じ、加えて発症前に抑うつ症状を頻繁に出現させることが報告されている。一部のTGマウスは、19ヶ月齢以降になると海馬を中心に神経原線維様変化を示すようになる(Tatebayashi et al., 2002, PNAS, 99:13896)。321ヶ月齢のTGマウスを用いて、うつ関連行動を検討したところ、強制水泳で無動時間の有意な延長を認めた(Tatebayashi et al., 2004,Neurobiol Ag,25:S249;Egashira et al., 2005, Brain Res, 1059:7)。この異常は、情動記憶異常(Fear conditioning)の出現と相関しており、出現時期に雌雄差が認められた。また異常の程度と導入遺伝子量に正相関が認められた。電気生理学的に検討するとTGマウスでLTP発生後のピークの低下が有意に早く、前シナプスにおける伝達物質の枯渇、すなわち軸索輸送の障害が生じている可能性が示唆された。われわれは以前に、タウのGSK3betaによる生理的リン酸化が軸索輸送に必要なことを見出し報告している(Tatebayashi et al., 2004, J Cell Sci, 117:1653)。そこで変異(R406W)によるタウの生理的リン酸化への影響を調べた。R406W変異はSer404のリン酸化を阻害することでGSK3betaによるPHF1サイトの生理的リン酸化を阻害することが判明した(Tatebayashi et al., 2006, FASEB J, in press)。まとめると、タウのR406W変異はタウの生理的リン酸化を阻害することで軸索輸送に障害を起こし、うつ病関連の行動異常をTGマウスに生じている可能性が示唆された。このマウスの海馬における神経新生は現在検討中である。
好熱菌宿主染色体への出入が温度で制御できる新しいベクタープラスミドの造成と応用

従来の好熱菌宿主ベクター系(pTBシリーズ生育上限60°C)に比べ,更に高温で安定な変異プラスミドpTRA90(6.7MDa, Kw^r, Tc^r,上限63°C)及び変異プラスミド保持株の高温培養によって得た挿入を有するプラスミドpTRZ90(7.9MDa, Kw^r, Tc^r上限65°C)を取得した.両プラスミドは, pTRA919(3.9MDa, Kw^r), pTRZ919(5.1MDa, Kw^r)に小型化され,それぞれ同様の熱安定性を示した.小型プラスミドの詳細な制限酵素切断点地図を作成し,断片交換により変異と挿入の位置を限定した.変異部位はカナマイシン不活化酵素(KNTase)をコードする遺伝子(kan)のAvaII断片内に限定(460bp)され,塩基配列決定によりKan遺伝子の304番目のGがAにトランジションしていることが判り,アミノ酸残基もGln102→Lysに置換していた.別途酵素熱定性が向上していることも示され,同置換が安定化に寄与していると結論した.挿入位置は,プラスミドの複製に関与する領域のすぐ上流で,大きさは1902bpと推定された.又サザンハイブリダイゼーションにより挿入領域が宿主(Bacillus stearothermophilus)染色体DNA由来であることが判明し,プラスミド上のこの領域と,染色体DNAとの相同性が,プラスミド安定化の原因であると考えられた.また,変異と挿入は共存させることにより,相乗的にプラスミド安定化に寄与することも明らかとなった.次に得られた安定なプラスミドpTRZ90にB.stearothermophilus CU21由来耐熱性α-アミラーゼ遺伝子をクローン化し小型化したpZAM26(8.5MDa, Kw^r, amyT^+)を作製し,プラスミド安定性とアミラーゼ生産性を比較した.その結果pZAM26は64°Cでも100%のプラスミド保持率を示し,アミラーゼ生産性もpTBシリーズに比べ, 53°Cでほぼ同じ, 57°Cで約2倍, 62°Cでは, pTBシリーズでは生育不能に対し, pZAM26保持株は57°Cと同様の生産能を示した.このことより,本プラスミドは,高温環境下におけるタンパク質安定生産に有効なものであると結論した.従来の好熱菌宿主ベクター系(pTBシリーズ生育上限60°C)に比べ,更に高温で安定な変異プラスミドpTRA90(6.7MDa, Kw^r, Tc^r,上限63°C)及び変異プラスミド保持株の高温培養によって得た挿入を有するプラスミドpTRZ90(7.9MDa, Kw^r, Tc^r上限65°C)を取得した.両プラスミドは, pTRA919(3.9MDa, Kw^r), pTRZ919(5.1MDa, Kw^r)に小型化され,それぞれ同様の熱安定性を示した.小型プラスミドの詳細な制限酵素切断点地図を作成し,断片交換により変異と挿入の位置を限定した.変異部位はカナマイシン不活化酵素(KNTase)をコードする遺伝子(kan)のAvaII断片内に限定(460bp)され,塩基配列決定によりKan遺伝子の304番目のGがAにトランジションしていることが判り,アミノ酸残基もGln102→Lysに置換していた.別途酵素熱定性が向上していることも示され,同置換が安定化に寄与していると結論した.挿入位置は,プラスミドの複製に関与する領域のすぐ上流で,大きさは1902bpと推定された.又サザンハイブリダイゼーションにより挿入領域が宿主(Bacillus stearothermophilus)染色体DNA由来であることが判明し,プラスミド上のこの領域と,染色体DNAとの相同性が,プラスミド安定化の原因であると考えられた.また,変異と挿入は共存させることにより,相乗的にプラスミド安定化に寄与することも明らかとなった.次に得られた安定なプラスミドpTRZ90にB.stearothermophilus CU21由来耐熱性α-アミラーゼ遺伝子をクローン化し小型化したpZAM26(8.5MDa, Kw^r, amyT^+)を作製し,プラスミド安定性とアミラーゼ生産性を比較した.その結果pZAM26は64°Cでも100%のプラスミド保持率を示し,アミラーゼ生産性もpTBシリーズに比べ, 53°Cでほぼ同じ, 57°Cで約2倍, 62°Cでは, pTBシリーズでは生育不能に対し, pZAM26保持株は57°Cと同様の生産能を示した.このことより,本プラスミドは,高温環境下におけるタンパク質安定生産に有効なものであると結論した.従来の好熱菌宿主ベクター系(pTBシリーズ生育上限60°C)に比べ更に高温で安定な変異プラスミドpTRA90(6.7MDa,【Km^r】,【Tc^r】,上限63°C)及び変異プラスミド保持株の高温培養によって得た挿入を有するプラスミドpTRZ90(7.9MDa,【Km^r】,【Tc^r】,上限65°C)を取得した。

両プラスミドは、小型化されpTRA919(3.9MDa,【Km^r】),pTRZ919(51MDa,【Km^r】)となり、それぞれ同様の熱安定性を示した。小型プラスミドの詳細な制限酵素切断点地図を作成し、断片交換により変異と挿入の位置を限定した。変異部位はカナマイシン不活化酵素(KNTase)をコードする遺伝子(kan)のAva【II】断片内に限定(460bp)され、塩基配列決定によりkan遺伝子の304番目のGがAにトランジションしていることが判り、アミノ酸残基もGIn102→Lysに置換していた。別途酵素熱安定性が向上していることも示され、同置換が安定化に寄与していると結論した。挿入位置は、プラスミドの複製に関与する領域のすぐ上流であり大きさは1902bpと推定された。又サザンハイブリダイゼーションにより挿入領域が宿主(Bacillus stearothermophilus)染色体DNA由来であることが判明し、プラスミド上のこの領域と、染色体DNAとの相同性が、プラスミド安定化の原因であると考えられた。また、変異と挿入は共存させることにより、相乗的にプラスミド安定化に寄与することも明らかとなった。次に得られた安定なプラスミドpTRZ90にB stearothermophilus CU21由来耐熱性α-アミラーゼ遺伝子をクローン化し小型化したpZAM2685MDa(【Km^r】,amy【T^+】)を作製し、プラスミド安定性とアミラーゼ生産性を比較した。その結果pZAM26は、64°Cでも100%のプラスミド保持率を示し、アミラーゼ生産性もpTBシリーズに比べ、53°Cでほぼ同じ、57°Cで約2倍、62°CではpTBシリーズでは生育不能に対し、pZAM26保持株は57°Cと同様の生産能を示した。このことより、本プラスミドは、高温環境下におけるタンパク質安定生産に有効なものであると結論した。
次世代ナノデバイス開発に向けたGe表面酸化反応の制御と極薄絶縁膜の形成技術

Siよりも優れたキャリアー移動度のGeは、次世代ナノデバイス材料の候補である。本研究では、放射光精密光電子分光と分子線によって、Ge酸化物の形成制御に必要な反応パラメターおよび特異な反応現象の発見を目指した。当初の予想通り、酸素分子線によってサーマルガスと異なる酸化状態が実現することが明らかとなった。また、Ge酸化では、形成される酸化物の酸化価数状態やその並進エネルギー依存性が、Siと大きく異なることが分かった。さらに、Si(100)表面酸化の比較実験において、30年来その存在が否定されてきた分子状吸着酸素の観測に成功した。本研究は、ナノスケール表面反応制御の重要な知見と確信している。スマートフォン等に見られるように最新の情報通信関連機器の発展は目覚しく、それに伴い基幹となる超大規模集積回路(ULSI)中の基本素子である金属-絶縁膜-半導体電界効果トランジスタの更なる高性能(小型・高機能・省電力)化が必須となっている。ポストシリコン技術の一つとしてチャネル材料にSiより移動度などで優れたGeを利用することが注目されている。しかし、その利用にはGe表面に高品質なGe酸化膜を形成することが不可欠である。本研究では、超音速分子線技術を用いて酸素分子の並進エネルギーを選択(最大2.3eV)することで、熱反応では実現できない酸素とGeの化学結合状態を選択的に制御した酸化膜形成とそのメカニズムの解明に挑戦している。典型的な低指数面であるGe(100)2x1およびGe(111)c(2x8)清浄表面に対して、GeO脱離が無視できる室温酸化の条件を調べた。放射光を光源とする光電子分光を用いた"その場"観察によって、酸素曝露の条件では両表面とも酸化価数が2価にとどまることを明らかにした。この結果は、これまでSi表面酸化と同じと考えられてきたGe表面の酸化に対する常識を覆す画期的な実験結果であるとともに、Ge表面の特異性を示す極めて重要な知見となった。さらに、酸素分子の並進エネルギーを2.3eV程度に増加することによって、酸素吸着量の促進とともに形成される酸化物の構造に違いが現れることを明らかにし、極薄Ge酸化膜の形成機構の詳細に明らかにできた。これらの成果は、Geを利用した次世代デバイスの作成における表面ナノプロセス開発に対して重要な知見となる。スマートフォン等の情報通信関連機器の発展は著しい。それらを支える超大規模集積回路中の金属-絶縁膜-半導体電界効果トランジスタに対しては、更なる高性能(小型・高機能・省電力)化が必須であり、その実現に向けてチャネル材料としてGeが注目されている。しかしながら、その利用には、Ge表面に高品質なGe酸化膜を効率的に形成することが、それらのデバイスを実現する上で不可欠である。本研究では、超音速分子線技術を用いて、酸素分子の並進エネルギーを選択することで、熱反応では実現できない酸素とGeの化学結合状態を選択的に制御した酸化膜形成法の確立に挑戦する。放射光を光源とする光電子分光によって酸化膜の化学結合状態を識別することで、次世代ナノデバイスプロセスに向けた極薄Ge酸化膜の最適作成条件を原子スケールで決定する。本研究では、Ge単結晶低指数表面の酸化反応という未解明の基礎的側面に着目し、その知見を利用したナノレベルの表面酸化制御法の確立を目指し以下の基盤研究を推進してきた。(1)高輝度・高エネルギー分解能放射光を利用したリアルタイム光電子分光の高精度化の実現。(2)超音速酸素分子線によって酸素分子の並進エネルギーを制御し、Ge単結晶の低指数表面[(100)、(111)]酸化に及ぼす影響を調べた。具体的には、酸素吸着量、酸化物の化学結合状態とそれらの酸化時間との相関を放射光リアルタイム光電子分光で明らかにした。(3)超高真空実験に加えて大気酸化との比較をすることで、Si単結晶表面とは異なるGe単結晶表面に特異な酸化現象を明らかにした。以上の研究成果から、酸素分子の並進エネルギーによるGe単結晶表面酸化反応の制御に必要な最適反応条件を決定する基礎データを得た。初年度では、超高真空中において作成したGe(100)2x1およびGe(111)c(2x8)清浄表面の酸素分子による室温酸化の放射光リアルタイム光電子分光観察法の確立と高度化を達成し、酸化物の詳細な化学状態分析を実現した。両表面ともに酸化価数が2価にとどまるという、Si酸化では観られない大変ユニークな結果を得ることに成功した。さらに、酸素分子の並進運動エネルギーによって、酸素吸着量の増加効果や面方位に依存した飽和酸化物の違いを明らかにできた。昨年度では、Ge(100)2x1清浄表面の大気中での室温酸化によって形成される酸化物の化学状態分析を行い、超高真空中への酸素分子の導入による酸化と異なる酸化価数状態を明らかにできた。その酸化物の生成は、数カ月という長い時間の大気暴露によって実現することなど、Ge酸化の理解が深まった。さらに、超高真空中でのSi(100)2x1室温酸化を実施し、分子吸着種などを経由した酸化反応ダイナミクスの詳細も、Ge(100)との一連の比較実験から明らかになりつつある。このように、Geを次世代ナノデバイスに応用するうえで極めて重要な表面酸化物の原子レベルのキネティクス、ダイナミクスの物理化学の詳細を明らかにできた。放射光施設において極めて限定された実験マシンタイムにおいて、当初予定した、酸化物の化学状態、酸化の進行に伴うその変化、基板面方位に依存した酸化過程と生成物の違いを明らかにできたことから、概ね順調に進展していると判断している。

スマートフォンなどの情報端末機器の発展は目覚ましく、一昔前のパソコンを凌駕し、その高性能かつ高機能化にとって、Siを基本材料とする金属-絶縁体-半導体電界効果トランジスター(MOS-FET)の微細化は必須となっている。微細化にともない酸化膜の厚さは数原子層に達するとともに、キャリアー移動度がより大きな材料をチャネル層に利用することが提唱されている。Geは、Siより優れたキャリアー移動度を有することから、その代替えが模索されている。このようなSiとGeのハイブリッドデバイスにおいても、Ge酸化膜の化学状態の理解は重要であるが、その原子レベルの分析は十分に行われていない。本研究では、Ge単結晶低指数面の酸素分子による酸化を放射光光電子分光によってその場分析し高品質な絶縁膜材料プロセスのデザインルールの基礎からの構築である。酸化時間に伴う吸着量および酸化状態の変化から、生成酸化物の時間発展および生成過程を明らかにした。さらに、並進エネルギーで引き起こされる新規吸着反応プロセスや反応サイトの違い(反応選択性)を見出した。最終年度では、結晶構造の似たSi(100)2x1表面の室温酸化と比較した。Siでは4価の酸化状態が実現するが、Geでは2価にとどまる。そして、Si(111)7x7表面酸化での発見からおよそ30年間その存在が否定されてきた分子状化学吸着酸素を放射光リアルタイム光電子分光で捉えることに成功した。この分子状吸着酸素は、所謂、清浄表面の前駆的吸着状態ではなく、酸素原子を2個有する状態まで酸化した最表面Si原子との結合(吸着状態)であることが分かった。以上、SiとGe酸化プロセスの理解からプロセスデザインの指針を得た。これらの一連の研究を通じて開発した放射光光電子分光による精密化学状態分析および解析技術を他の半導体や金属材料の表面・界面の反応分析に応用し技術の普及を行った。Siよりも優れたキャリアー移動度のGeは、次世代ナノデバイス材料の候補である。本研究では、放射光精密光電子分光と分子線によって、Ge酸化物の形成制御に必要な反応パラメターおよび特異な反応現象の発見を目指した。当初の予想通り、酸素分子線によってサーマルガスと異なる酸化状態が実現することが明らかとなった。また、Ge酸化では、形成される酸化物の酸化価数状態やその並進エネルギー依存性が、Siと大きく異なることが分かった。さらに、Si(100)表面酸化の比較実験において、30年来その存在が否定されてきた分子状吸着酸素の観測に成功した。本研究は、ナノスケール表面反応制御の重要な知見と確信している。当初の期待通り、超音速酸素分子線による酸素吸着量あるいは酸化速度の増加などの酸化促進現象を見出すとともに、Ge(100)2x1表面に対しては反応サイトを特定することができた。Ge(111)c(2x8)表面に関しては、並進エネルギーによる吸着促進の閾エネルギーを明らかにするとともに、Siや他に固体表面ではこれまでに報告が無い並進エネルギーによる酸化価数変化も捉えることに成功した。
地球的環境変化に対する高度技術社会の脆弱性と適応性の比較研究ー持続的発展の為のリスク評価の枠組みと国際比較分析

本年度は、地球規模の環境変化に伴う高度技術社会への影響とその対応策の比較を次のような研究課題を中心として行った。1)高度技術社会における経済生態系のリスク分析への枠組みの構築:環境資源の変化に伴うさまざまな被害のリスクを軽減し、かつ管理する人間社会の応答を社会システムの脆弱性と適応性という概念から分析するリスク評価の方法論の構築を試みた。すなわち、技術・環境リスクへの産業技術社会の応答を分析するには、現代の産業社会と地球環境系の相互関係を定義してシステム論的に再構成することが必要となる。このために、第1段階として経済系と生態系の外乱に対する社会の応答の原理を(i)経済系の効用と効率の最大化要求,(ii)生態系の物質・エネルギ-収支の恒常性の要求,と規定して全体の相互関係を多元的なモデルとして構築し、システムの「脆弱性と適応性」のリスク評価の枠組みを作成した。2)国際社会における資源利用と保全のリスク分析(日本海沿岸モデル):人間社会の応答の具体的な事例の実証分析を行なうために、環境・資源問題として国際性と地域性の特徴を兼ねそなえた地域である日本海沿岸を設定して地域社会の応答の実証的分析に着手した。日本海地域は今後の日本経済発展の鍵を握る地域の一つであり,しかも、環日本海経済圏を国際的に構成し得る地域である。しかし、資源環境問題としては、地球的気候変化の影響を大きく受ける可能性のある閉鎖性海域である。長期的な日本海沿岸諸国の経済発展の戦略シナリオに立って、日本海沿岸域の持続的発展と適切な環境保全の在り方を探るために、地域経済・生態系モデルの作成のための予備的な分析と関連する資料・デ-タの収集を行った。
小児骨髄異形成症候群における発症関連遺伝子のメチル化による発現調節異常の解析

若年性骨髄単球性白血病(JMML)におけるp15のエピジェネテイックコードによる遺伝子発現の制御機構を検討した。GM-CSFとSCF刺激により産生されたDay7の骨髄系細胞は、正常対照においては40%-70%の頻度で全例にp15遺伝子のメチル化がみられたが、JMML患者の骨髄CD34陽性細胞から産生されたDay7細胞のp15遺伝子は6例中、すべての例でほぼすべてのCpG部位が非メチル化状態を示した。p15 mRNAの発現をreal-time PCR法を用いて検討したところ、JMML患者において有意に高い発現が認められた。培養7日目の細胞内のDNAメチル化酵素(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)の発現量についても、real-time PCR法を用いて定量した。DNMT1とDNMT3aの発現はJMML患者において有意に高かった。DNMT3bは正常対照ではほとんど発現は認められず、JMML例でもわずかな発現にとどまった。正常対照の培養7日目の細胞においてヒストンH3とヒストンH4のアセチル化とともに、9番目のリジンのメチル化を有するヒストンH3が検出された。一方、JMMLでもヒストンH3とヒストンH4はアセチル化していたが、9番目のリジンのメチル化を有するヒストンH3は検出されなかった。このことは、JMMLではp15遺伝子の転写が活性化状態にあることを裏付けていた。これらのことから、JMMLにおけるエピジェネテイックコードによる遺伝子発現の制御異常が示唆された。また、本症における診断基準の1つとなっているGM-CSF hypersensitivityはウイルス感染でも認められるとの報告があるが、メチル化の有無を同時に解析することはより正確な診断を下す上で有用であると思われた。骨髄異形成症候群(MDS)は、血球減少と形態異常により診断される原因不明の造血障害である。最近、若年型慢性骨髄性白血病(JMML)は、小児におけるMDSの1型と考えられるようになった。近年、メチル化などエピジェネティクスを介した遺伝子発現の調節機構が注目され、生命現象や疾病の発症に関与していることが明らかとなってきた。すなわち、CpG islandが豊富なプロモーター領域を有する遺伝子において、シトシンのメチル化が生じると、転写因子がDNAに結合しにくくなり、転写は阻害される。われわれは骨髄系細胞の増殖過程において、細胞周期調節遺伝子であるp15のプロモーター領域のメチル化が重要な役割を演じていることを報告した。そこで、JMML症例におけるエピジェネティクな異常の有無を検討した。CD34陽性細胞と培養7日目の細胞からDNAを抽出し、sodium bisulfite処理を行った。p15遺伝子のプロモーター領域におけるCpGを含まない部分(メチル化を受けない領域)にプライマーを設定しPCRを行い、得られたPCR産物をクローニングし、各々20クローンについてsequenceを行い、メチル化率とパターンを比較した。CD34陽性細胞を分離しp15のメチル化を検討したところ、6症例中、5例においては低メチル化状態であった。GM-CSFで培養し7日目のメチル化状態を検討したところ、正常骨髄細胞では5070%の割合でメチル化が誘導されたが、JMMLではすべての症例が低メチル化状態であった。急性骨髄性白血病ではDNMTsの過剰発現がメチル化に関与していることが報告されていることから、培養7日目においてDNMTsの発現を検討した。DNMT1はGAPDHで補正すると過剰発現が観察されたが、PCNAの増殖の指標で補正すると有意差は消失した。DNMT3a,3bは正常、JMMLともに非常に低発現であった。

以上のことか、7日目の低メチル化状態をメチル化酵素で説明するのは困難であり、他の原因を検討中である。若年性骨髄単球性白血病(JMML)におけるp15のエピジェネテイックコードによる遺伝子発現の制御機構を検討した。GM-CSFとSCF刺激により産生されたDay7の骨髄系細胞は、正常対照においては40%-70%の頻度で全例にp15遺伝子のメチル化がみられたが、JMML患者の骨髄CD34陽性細胞から産生されたDay7細胞のp15遺伝子は6例中、すべての例でほぼすべてのCpG部位が非メチル化状態を示した。p15 mRNAの発現をreal-time PCR法を用いて検討したところ、JMML患者において有意に高い発現が認められた。培養7日目の細胞内のDNAメチル化酵素(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)の発現量についても、real-time PCR法を用いて定量した。DNMT1とDNMT3aの発現はJMML患者において有意に高かった。DNMT3bは正常対照ではほとんど発現は認められず、JMML例でもわずかな発現にとどまった。正常対照の培養7日目の細胞においてヒストンH3とヒストンH4のアセチル化とともに、9番目のリジンのメチル化を有するヒストンH3が検出された。一方、JMMLでもヒストンH3とヒストンH4はアセチル化していたが、9番目のリジンのメチル化を有するヒストンH3は検出されなかった。このことは、JMMLではp15遺伝子の転写が活性化状態にあることを裏付けていた。これらのことから、JMMLにおけるエピジェネテイックコードによる遺伝子発現の制御異常が示唆された。また、本症における診断基準の1つとなっているGM-CSF hypersensitivityはウイルス感染でも認められるとの報告があるが、メチル化の有無を同時に解析することはより正確な診断を下す上で有用であると思われた。
高等植物の光シグナルによる個体サイズ制御機構の解明

暗黒下で光形態形成し、光照射下で矮化するシロイヌナズナのcop1変異体は、茎細胞の伸長と茎頂分裂組織の細胞増殖が抑制されていた。cop1変異体の矮化を抑制するサプレッサー変異体emc1,2,3の解析により、cop1変異による暗黒下での光形態形成と光照射下での矮化が独立した遺伝的経路で制御されていること、emc1,2,3変異はcop1変異による茎頂分裂組織の細胞分裂の停止を抑制することで花茎を伸長させることがわかった。emc1の原因遺伝子はインポーチンβ様タンパク質をコードしており、核膜孔を介した核と細胞質間の分子輸送に働く輸送レセプターであるカリオフェリンとして働いている可能性が示唆された。シロイヌナズナでは暗黒下でも光形態形成する変異体として単離されたcop変異体の多くが、光照射下では矮化し、頂芽優勢を喪失する。従って、これらのCOP因子は芽生えの光形態形成だけでなく、発生後期の生長制御にも大きく関わっていると推測される。しかし、cop変異体の完全欠損アリルは芽生えの段階で生育を停止する致死形質を示すことが多いことから発生後期に現れる現象の解析に用いる事は難しく、COP9シグナロソームをはじめとして、精力的に進められている芽生え期のCOP因子の生化学的・分子生物学的な解析に比べ、芽生え以降の発生におけるCOP因子の役割についてはあまり研究が成されていない。そこで、植物の発生後期におけるCOP因子の役割を解明することで、光シグナルによる植物の個体サイズの制御カスケードを明らかにできると考え、E3リガーゼとしてプロテアソームによる特異的なタンパク質の分解に関与するCOP1の弱い変異アリルから、矮化を弱めるサプレッサー変異体を単離した。cop1-6変異体の種子にEMSによる変異原処理を行い、M2およびM3世代にて主茎の長さを指標に約30系統の矮化サプレッサー変異体を選抜した。次世代で形質の再現性を確認し、稔性が高い系統の中から独立した変異由来と推測される3系統を選び、以降の解析を行うことにした。これらのサプレッサー変異体はcop1変異体の光照射下での特徴である、ロゼット葉が小さく葉柄が短い、アントシアニンが蓄積するなどの形質を維持している一方で、頂芽優勢の復帰、花成の遅延など、系統ごとに特徴ある表現型を示した。これは、COP1がE3リガーゼとして多くの標的タンパク質を持ち、多面的な役割を持っていることと一致する。次年度はこれらのサプレッサー変異体の原因遺伝子の単離を行い、光シグナルカスケードにおけるCOP1との関係を探る。シロイヌナズナの暗黒下でも光形態形成する変異体cop1は、光照射下では矮性形質を示し、頂芽優勢を喪失する。本研究は、cop1変異体の矮化機構を解析することで、光シグナルによる植物の個体サイズの制御機構を明らかにすることを目的とする。今年度はこれまでに単離したcop1変異体の矮化を抑制するサプレッサー変異体のうち、花茎がcop1変異体の2倍以上に伸長する3系統(emc1,emc2,emc3)について解析を進めた。遺伝解析の結果、emc1,2,3変異体はそれぞれ1遺伝子座由来の劣性変異であることがわかった。暗所での光形態形成や明所でのアントシアニンの蓄積、葉が小さくなるといったcop1変異によって引き起こされる表現型を維持していることから、これらの表現型に関わる遺伝的経路とは独立した経路がemc変異による矮化抑制に働いている可能性が示唆された。cop1変異体の花茎細胞を走査型電顕を用いて観察したところ、cop1の花茎は野生型(Co1)に比べ細胞の縦方向(長軸側)が短いことがわかった。cop1変異体の花茎は10個程度の花をつけると小さな花様器官または頂端花を形成して生育を停止することから、COP1は細胞の伸長と茎頂分裂組織の分裂能の維持の両方に働いていると推測された。emc1,2,3変異体の花茎細胞は、縦方向の長さがcop1とほとんど変わらなかったことから、これらのemc変異はcop1変異による茎頂分裂組織の細胞分裂の停止を抑制することで花茎を伸長させることがわかった。染色体マッピングによりemc1変異を含むゲノム領域を第1染色体上腕部の約2.1Mbの領域に狭めた。今後はホールゲノムシークエンスを行い、変異部位を同定する。暗黒下でも光形態形成するシロイヌナズナのcop1変異体は、光照射下では草丈が低くなる矮化を示す。cop1の矮化は細胞伸長の抑制と茎頂分裂組織の早期の細胞増殖の停止により引き起こされる。

光シグナルによる草丈の制御機構の解明を目的に、cop1の矮化が抑制されるサプレッサー変異体emcを単離し、解析を行った。emc1変異は、cop1変異による茎頂分裂組織の早すぎる細胞分裂の停止を抑制した。cop1変異体は矮化と共に頂芽優勢を喪失し、枝分かれが増加する。emc1変異体は矮化が抑制されても枝分かれの増加形質は維持されたことから、草丈の制御と枝分かれの制御は異なる経路で働いている可能性が示唆された。また、emc1は暗所での光形態形成能を維持したことから、cop1の暗所での光形態形成と矮化経路は独立していることがわかった。高速シークエンサーを用いた染色体マッピングにより同定したemc1の原因遺伝子は、幅広い生物種で保存されているアルマジロリピートドメインを持ち、核膜孔を介した核と細胞質間の分子輸送に働く輸送レセプターであるインポーチンβファミリータンパク質をコードしていた。シロイヌナズナでは、同じファミリーに属する遺伝子が17個存在する。ファミリー遺伝子には、EMC1と同様に欠損により形態形成に異常が生じるHSTなどの遺伝子が存在するが、EMC1の詳細な解析は報告されていない。ヒトゲノムとの相同解析により、EMC1はtRNAやSUMOタンパク質などの核内外への輸送に働く可能性が示唆された。EMC1のT-DNAタグライン(emc1-t1)とcop1の二重変異体は矮化が抑制されたことから、EMC1の欠損がcop1の矮化を抑制することが明らかになった。所属研究室の異動に伴い植物の栽培環境が変わり、変異体の選抜や表現型確認のための栽培条件を検討しなおさなければならなかったため。25年度が最終年度であるため、記入しない。単離したcop1の矮化サプレッサー変異体のうち、解析を進めている3系統がすべて、矮化以外のcop1変異体特異的な表現型を維持していることから、変異遺伝子はCOP1の直接の下流(標的因子)ではない可能性が高いと推測し、変異遺伝子の単離に免疫沈降法を用いないことにした。かわりに、Ler7による戻し交雑を5回行ったcop1/Ler系統を用いたポジショナルクローニングと並行して、サプレッサー変異体に親株であるcop1変異体を1回戻し交雑をしたF2/F3植物を用いて、EMS変異をマーカーとして次世代シークエンサーによる遺伝子同定を試みる。
整凸多面体のCayley分解を巡る構造解析及び関連する諸問題の解決

本研究課題の目的は、整凸多面体のCayley分解の組合せ論的構造の解析、および、関連する諸問題の解決である。最終目標は、Cayley分解の完全解決、および、Cayley分解とEhrhart多項式の関連性の完全解明である。平成30年度の具体的に取り組むこととしては、様々な整凸多面体に関する計算実験の実施、及び、最新の研究結果と専門知識の情報収集があげられる。上記の「研究実績の概要」で述べた通り、平成30年度の研究により、平成29年度の研究成果をさらに一般化することに成功した。確実に研究が進展していると言える。平成30年度の研究により、具体的な整凸多面体のクラスであるsymmetric edge polytopeのEhrhart多項式に関する詳細な研究が完成した。それらの研究成果を踏まえ、今後は、本研究課題の核である「Cayley予想」との関連について更なる研究を継続して行う。平成29年度の具体的な研究課題の1つとしては、特殊な条件下での整凸多面体のCayley分解の考察、および、具体例の計算などが挙げられる。Cayley予想が成立しない反例が存在するとすれば、そのような反例は「次数」の小さい整凸多面体であろう、と予想していた。そこで、整凸多面体の「次数」と呼ばれる不変量に注目して研究を行った。その結果、次元を固定したときに次数が最も小さくなる整単体の構造を完全に特徴付けることに成功し、その副産物として、Cayley予想の反例の構成に成功した。その研究成果は、単著論文“Lattice simplices of maximal dimension with a given degree"にまとめており、すでに採録決定済みである。本研究課題の最終目標の1つに「Cayley予想の完全解決」を挙げていたが、平成29年度の研究により、Cayley予想の反例を発見することに成功した。つまり、予想されていたCayley分解の成分数の下限が正しくないことが判明した。加えて、Cayley予想が成立しない反例を系統的に構成することにも成功しているので、最適な下限の候補も見つけることにも成功している。これらの研究成果は、単著論文“Lattice simplices of maximal dimension with a given degree"にまとめており、すでに採録決定済みである。これは当初の計画以上の研究の進展である。平成29年度の研究により、当初のCayley予想の反例を構成することに成功し、さらにその反例を用いて当初のCayley予想で予想されていたCayley分解の成分数の下限を修正することで、新たなCayley予想を提唱した。その予想は論文“Lattice simplices of maximal dimension with a given degree"においても記載している。今後は、自ら提唱した修正版Cayley予想の完全解決に向けて研究を進める。同時に、本研究課題のもう1つの最終目標である「整凸多面体のCayley分解とEhrhart多項式の関連性の解明」にも努める。年度をまたぐ出張を行ったため、平成29年度分の旅費の一部を次年度に回し、次年度の予算から計上した。
摂食亢進ホルモン・グレリンを介したエストロゲンの高脂肪食誘発性肥満予防作用

体重に関する女性特有の問題として、閉経後肥満や摂食障害による低体重、および月経前症候群による体重増加などがあげられるが、この背景には女性ホルモンであるエストロゲンの関与が考えられる。本研究では、エストロゲンの高脂肪食誘発性肥満抑制作用のメカニズム解明のために摂食亢進ペプチドであるグレリンに着目した。エストロゲンがグレリンのもつ摂食亢進作用のどこに・どのように影響するのかを明らかにする。本研究の実施により、一生涯に渡る女性の体重管理を通じた健康増進に、新たな知見を与えることが期待される。
アポトーシス誘導後の断片化DNAの修復

我々は腸上皮内リンパ球(IEL)の機能を調べる目的で、抗CD3抗体投与で、小腸(十二指腸、空腸)絨毛上皮にDNA断片化を伴うアポトーシスが誘導されることを見いだした。DNA断片化を起こした小腸上皮は、抗体投与後約4時間で管腔に剥離し、絨毛全長にアポトーシスが誘導されたにもかかわらず、約半分は剥離せずに残る。剥離せずに残った小腸絨毛上皮細胞は、TUNEL陰性となる。本研究は、抗CD3抗体投与で引き起こされる小腸絨毛上皮細胞のDNA断片化が実際に修復されるのかどうか、を確認することが目的である。本年度の実施結果:(1)抗CD3抗体投与により小腸絨毛上皮細胞にDNA断片化が繰り返し引き起こされることを確認した。(2)TUNEL染色がうまくいかず、時間が取られた。(3)ブロモデオキシウリジン(BrdU)を3-4日間連続投与した実験で、抗体投与後(2-4時間後に)剥離したのちに残存した絨毛上皮はBrdUをきれいに取り込んでおり、抗体投与以前から存在した上皮であることが証明できた。(4)しかも、残存した絨毛上皮細胞はすべてTUNEL染色陰性となる。(3)の結果と併せると、抗体投与後、剥離せずに残存した絨毛上皮細胞では一度は断片化したDNAが修復されたことを強く示唆する状況証拠が得られた。我々は腸上皮内リンパ球(IEL)の機能を調べる目的で、抗CD3抗体を投与すると、小腸絨毛の基部から先端までの上皮にDNA断片化を伴うアポトーシスが誘導されることを見いだした。DNA断片化を起こした腸上皮は、抗CD3抗体投与後約4時間で管腔に剥離し、絨毛は短くなるが、絨毛全長にわたってアポトーシスが誘導されたにもかかわらず、約半分は剥離せずに残る。本研究では、生体内に抗CD3抗体投与で引き起こされる小腸絨毛上皮細胞のDNA断片化が、修復、あるいは再結合が起こるのかどうか、を見極めることが目的である。本年度の成果:1.小腸での現象をさらに詳細に解析した。(1)抗CD3抗体投与により引き起こされる小腸絨毛上皮細胞のDNA断片化にはTNFは関与せず、パーフォリンが関与する。(2)TNFは小腸絨毛上皮細胞の剥離に関与する。2.小腸での断片化後のDNAは確かに修復されるという確証を得た。(1)ブロモデオキシウリジンを投与すると、残存したと考えられる絨毛上皮細胞は、絨毛の陰窩から急速に再生したものではないことがわかる。(2)抗CD3抗体投与しても小腸絨毛上皮細胞が剥離しないことがわかっているTNFレセプターIノックアウト(KO)マウスに抗CD3抗体を投与すると、約30分後に小腸絨毛全長にわたる上皮細胞にDNA断片化が誘導される。このKOマウスでは、投与後4時間経っても腸上皮の剥離が起こらず、絨毛の長さにも変化がなく、この時点で、腸上皮はすべてTUNEL陰性(DNA断片化なし=DNA断片化の修復)となった。来年度は、この修復・再結合過程に働く酵素系などの解析を進めて、断片化されたDNAの修復機構を明らかにしたい。
歯の発生過程におけるShhシグナルによる静的幹細胞維持機構の解明

本研究は、歯の発生過程におけるShhシグナルと静的幹細胞維持機構、エナメル芽細胞分化との関係ならびにShhシグナルの役割を解明することを目的とする。平成30年度では、以下の研究結果が得られた。1.TetOP-H2B-GFPマウス(胎生14.5日または15.5日にドキシサイクリン投与)を用いたin vivo実験:生後1日5週齢の上顎第一臼歯・生後3週齢の切歯パラフィン切片を作製して、蛍光観察及び免疫組織化学的解析を行った。その結果、生後1日から1週では、GFP陽性細胞が歯髄全体に分布していたが、3週になると、強い蛍光のdense LRCが象牙芽細胞層及び象牙芽細胞下層に局在し、歯髄中央部のLRCの蛍光が減弱していた。Gli1陽性細胞は生後1日から5週まで髄角部に局在していた。切歯では、歯乳頭と形成端の外エナメル上皮側に多くのGFP強陽性細胞が局在し、Gli1は形成端全体に発現していた。In situハイブリダイゼーション法によるShhおよびPtch1のmRNA発現分布については、現在、解析中である。2.in vitro実験1:昨年度からの追加実験として、生後2日B6マウスの下顎切歯を取り出しTrowell法にてShh阻害剤である5E1を培地に4日間添加(26μg/ml)器官培養を行い、パラフィン切片を作成し免疫組織化学的に検索した。その結果、5EIによりShh陽性細胞は内エナメル上皮側でコントロール群より有意に減少することが明らかとなった。3.in vitro実験2:生後2日TetOP-H2B-GFP仔マウスの下顎切歯を取り出しTrowell法にてShh阻害剤である5E1を培地に4日間添加(26μg/ml)・器官培養を行い、パラフィン切片を作製した。現在、静的幹細胞と考えられるGFP陽性細胞とSox2陽性細胞について蛍光観察・免疫組織化学的に解析中である。本年度、in vivo実験については胎生期ラベリング法による探索結果を、また、in vitro実験ではB6マウスの下顎切歯を使用した培養実験結果の報告を行った。TetOP-H2B-GFPマウスによるin vitro実験結果については、次年度、報告する予定である。TetOP-H2B-GFPマウスを使用したin vitro実験については、解析を行うことで、昨年度から行っているB6マウスによる実験結果と共に、Shhシグナルと静的幹細胞分布との関係性を検索する。in vivo実験については、TetOP-H2B-GFPマウスにおけるin situハイブリダイゼーション法によりShhとPtch1のmRNA分布を明らかにする。さらに、real-time PCRを用いてShh、Ptch1のmRNA発現の定量解析をする。平成29年度では、以下の研究結果が得られた。1.胎生期ラベリング法による検索:3週齢切歯において静的幹細胞と考えられるdense LRCsが歯乳頭と形成端の外エナメル上皮に局在し、Gli1およびPtch1を共発現していた。また、臼歯では、生後1日で多くのdense LRCsが歯髄中央部に分布し、成長に伴い減少、Gli1陽性細胞が2週以降で歯髄中央部に、Ptch1陽性細胞が3週以降に歯髄中央部で局在した。また、Shh-mRNA発現は、切歯では内エナメル上皮に発現し、臼歯では生後1日で内エナメル上皮に、3日以降で象牙芽細胞と歯髄にシフトする、などの結果から、静的幹細胞と思われるdense LRCsとShhシグナルの関与が示唆された(Cell Tissue Res. 369(3), 497-512, 2017)。2.TetOP-H2B-GFPマウスによる検索:現在、生後1日から5週齢までのパラフィン切片を作製し、静的幹細胞と考えられるGFP陽性細胞とGli1発現について解析中である。3.in vitro実験:生後2日仔マウスの下顎切歯を取り出しTrowell法にてShh阻害剤である5E1を培地に4日間添加(26μg/ml)器官培養を行い、パラフィン切片を作成し、免疫化学的に解析を行った。その結果、5EIにより細胞アポトーシスは形成端、間葉ともに増加、Sox2陽性細胞は形成端でコントロール群より少ない傾向がみられた。さらに、Shh陽性細胞は内エナメル上皮側でコントロール群より少ない傾向がみられた。胎生期ラベリング法による実験では、本年度、Shhシグナルと静的幹細胞維持機構結果の報告を行った。TetOP-H2B-GFPマウスによる実験では、P1P5Wの標本を作成し解析中である。5E1を使用したin vitro実験については、平成30年度にTetOP-H2B-GFPマウスを使用して行う予定であり、その前段階として平成29年度はICRマウスを使用して行った。1.TetOP-H2B-GFPマウス(胎生14.5日または15.5日にドキシサイクリン投与)を用いたin vivo実験:生後1日5週齢の上顎第一臼歯・生後3週齢の切歯