hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高度好熱菌tRNAを耐熱化する硫黄化修飾機構の解明

高度好熱菌tRNAを耐熱化する働きをもつ硫黄化修飾の生合成機構の解析を行った。新規生合成因子を同定し、組換えタンパク質を用いて試験管内で反応機構を解析した。その結果この硫黄化修飾の生合成は新規中間体(チオカルボキシレート)を経由する新しいタイプのtRNA硫黄化反応系であることが判明した。この系はモリブデン補酵素やチアミンなどの硫黄を含む補酵素の生合成系と共通の祖先から進化したと考えられる。既に同定している生合成因子(IscS、SufS、TtuA、TtuB)と硫黄を含む補酵素の生合成因子との比較から新規候補因子TtuCをデータベースから同定した。TtuCの遺伝子破壊株を作成し、tRNAを解析したところ、硫黄修飾が欠損しており、TtuCが新規生合成因子であることがわかった。そこでこれらの生合成因子の組換タンパク質を調製し、試験管内でのtRNAの硫黄化反応を放射性同位体標識および質量分析法により解析した。その結果、まずTtuBはTtuCによりアデニル化された後、IscS/SufSにより遊離L-システインから活性化された硫黄原子を受け取りチオカルボキシ中間体を形成する(TtuB-COSH)。その後TtuAにより、TtuB-COSHからtRNAに硫黄原子が転移されることをあきらかにした。これまでの硫黄修飾の研究からペアスルフィド(R-COSH)中間体が硫黄修飾の生合成に関与する系が既に知られていたが、本研究はチオカルボキシ体という新規の中間体が硫黄修飾の生合成に重要な役割を果たしていることを世界に先駆けてあきらかにした(2008EMBO)。また他の生物の硫黄修飾の生合成系との比較を行うことにより、新規因子TtuDも同定した。またTtuCの遺伝子破壊株を解析したところ硫黄を含む補酵素であるモリブデン補酵素とチアミン補酵素の生合成ができないことをあきらかにした。この結果はtRNAの硫黄修飾と含硫黄補酵素の生合成系の機能的および進化的関連性を強く示唆するもので、生体内の硫黄化合物の生合成系の進化を考える上で非常に興味深い知見をあきらかにすることができた(2008EMBO)。RNA分子に多彩な機能を与える修飾塩基の生合成は未解明な部分が多く、修飾塩基の機能解析のため解明が待たれる分野である。高度好熱菌tRNAを耐熱化する働きをもつ硫黄化修飾の生合成を試験管内で解析した。本年度は生合成因子(IscS、SufS、TtuA、TtuB、TtuC)の変異型を数種類調製し解析し以下を明らかにした。まず、硫黄キャリアタンパク質TtuBのグリシン残基(65位)がTtuCとIscS(又はSufS)により硫黄化され、チオカルボキシレートTtuB-COSHが生成される。TtuCの保存されたシステイン残基(192位)は、他の硫黄化合物の生合成では必須とされているが、意外なことにtRNAの硫黄化には必須ではなく反応機構の差異があると考えられる。またTtuCの遺伝子破壊株はチアミンやモリブデン補酵素などの硫黄化合物の生合成もできない。そこでこれらの硫黄化合物の生成に用いられるTtuBとは別の3つの硫黄キャリアタンパク質の硫黄化実験とその立体構造モデルの構築により、TtuCはこれら3つのタンパク質の硫黄付加にも関与していることを明らかにした。以上の結果により生体内の硫黄化合物の生合成系の機能的、進化的関連性が強く示唆され、その分子基盤の詳細を明らかにすることができた(2008EMBO)。さらにTtuB-COSHの硫黄原子はTtuAによりtRNAに導入されるが、これまでは試験管内での反応には細胞抽出液の添加が必要であった。反応に必要な因子を探索した結果、補因子結合型のTtuAを用いると高効率で硫黄導入がおこり、新規な反応機構であることが示唆された。また細胞内でのTtuAとTtuBの転写の様式を調べた。両者はゲノム上で隣り合っており、単一のmRNAとして転写されていることをRT-PCR法により確認できた。両者の発現量が同等のレベルになるように制御されていると推測でき興味深い。
腎糸球体及びメサンギウム細胞の虚血性細胞内誘導蛋白に関する研究

1.虚血性の急性腎不全の原因のひとつとして強力な腎血管収縮物質のエンドセリンが最近注目されているが、本研究では糸球体濾過調節に関与するメサンギウム細胞に対するエンドセリンの作用について検討した。2.合成エンドセリンをラクトペルオキシダーゼ法で^<125>I標識し、ラット単離糸球体ならびにラット培養メサンギウム細胞のエンドセリン結合活性について検討した。(1)ラット単離糸球体への^<125>Iエンドセリン結合は、時間及び温度依存性で、過剰の非標識エンドセリンにより阻害されるが、アンジオテンシンII,アルギニンバゾプレシン,ジルチアゼムにより阻害されず、エンドセリンに特異的であった。37°C、20分のみかけ上の平衡条件下でのScatchard解析では二種類の結合部位の存在が示唆された。(2)ラット培養メサンギウム細胞への^<125>Iエンドセリン結合は、時間及び温度依存性で、過剰の非標識エンドセリンにより阻害されるが、アンジオテンシンII、アルギニンバゾプレシン,ニカルジピン,ジルチアゼムにより阻害されず、エンドセリンに特異的であった。4°C、22時間のみかけ上の平衡条件下でのScatchard解析では二種類の結合部位の存在が示唆された。3.エンドセリンは濃度依存性(10^<-11>10^<-7>M)にラット単離糸球体、培養メサンギウム細胞のプロスタグランジンE_2産生を増加させ、そのED_<50>値は上記のKd値とほぼ同様であった。4.メサンギウム細胞にエンドセリン受容体が存在することが明らかとなった。従って、エンドセリンによる虚血性腎傷害時にエンドセリンのメサンギウム細胞に対する作用の関与の可能性が考えられる。
高専における数学の授業改革に向けたトータル・アプローチ計画

(1)平成2002年度には、高専の第3学年生を対象とした解析学IIの教科書の作成を開始、以後、3年間にわたって、それを利用した授業実践を行い、解析学の授業改善に取り組んでいる。教科書は、授業の反省を踏まえ、2004年4月に完成を見ることができた。(2)本研究代表者は,数学教育にテクノロジーを導入することを目指し,クラスの生徒全員が数式処理機能を持つグラフ電卓の使用が可能になった平成12年以来,その有効性を検証してきた。これによって、数学の授業方法を根本から変えることを意図している。このプログラムでは、生徒達が自分自身で設定した問題を解決したり、自分自身の考え方を発表したり、さらに、ほかの生徒による問題解決の方法について考察してその理解を深めていくといった経験をする。本研究では、このような学生達の数学的探究活動の過程を観察し、その報告を行った。特に図形の面積と体積、曲線の長さに関する探究活動に関して、その学生達へのフィードバックに言及しながら、数学教育におけるテクノロジーの有効な活用についての提言を行った。(3)私たちの授業改善への試みはTAMS計画として、全国の高専の数学教師によって行われるようになった。TMAS計画は2003年の8月に発足宣言が行われ、翌9月にはTAMS宣言として数学教育改革に対する方針が発表され。現在では78名が参加している。その後、TAMSメンバーの有志によって、関数教材の開発と授業改善を目指した「関数とグラフの授業改革」プロジェクト、テクノロジーの有効な活用方法の紹介を目指した「テクノロジー活用カレンダーの作成」プロジェクトが計画され、現在もその活動を継続している。本研究は工学に用いられる数学の内容を考慮しながら,教授内容の精選と教材の整備,授業方法の改善,テクノロジーの活用の有効性の検証,授業評価などの総合的な授業改革を目的としている。平成14年度はその第1歩として次の研究活動を行った。(1)解析学の教科書の作成:高専第3学年・大学1年向けの教科書を作成。全26章で構成され,1週間で1章を学ぶように工夫されている。これを4人の研究分担者で授業に使用し,1駒あたりの教授内容の多寡,問題の難易度(学生の理解度),テクノロジーの活用が有効な場面などを検討する。(2)論文発表阿蘇和寿『数学の授業における学生の探究活動』(日本数学教育学会高専・大学部会論文誌,Vol.9,No.1,2002.8),澤田功『物理も数学も』(大学の物理教育,2002-2)を発表。(3)研究会のおける発表北陸地区数ナビ活用研究会(富山,福井・福井工業高等専門学校,2002.6.22),日本数学教育学会(兵庫,2002.7.31),T^3 Japan(阿蘇,東京・筑波大学付属高校,2002.8.24,25),日本物理学会(澤田,愛知,2002.9.7)数学教育の会(阿蘇,東京・学習院大学,2003.1.12),工学教育基礎セミナー(阿蘇,石川・金沢工業大学2002.1.26)において,テクノロジーを活用した授業の実践報告,数学教育と物理教育との関連,微積分教育における無限小の取り扱いに関する提案を発表。平成15年度は同学年を対象に数式処理電卓TI-89を授業に活用しながら,授業改革の実践とその検証を行う。あわせて他の科目の教材の整備を進める。トータル・アプローチ計画は工学に用いられる数学の内容を考慮しながら,教授内容の精選と教材の整備,授業方法の改善,テクノロジーの活用の有効性の検証,授業評価などの総合的な授業改革を目的としたものである。当初は石川工業高等専門学校の授業改革を目指したが,授業改革という以上,個人やひとつの学校の授業のレベルアップでは意味が薄いと考え,昨年度から,本計画を全国的な展開とすることに決めた。

昨年7月に,発起人40名を揃え「よりよい数学の授業に向けたトータル・アプローチ計画(以下、TAMS(Total Approach for better education of Mathematics and Science))」を発表、8月1日に発足宣言を行い,その後,会員は70名となった。(詳細はhttp:/www.mathnavi.org/)11月にTAMP Project 1として「関数とグラフの授業改革」が始まり,計画の立案,準備を経て,現在は教材作成とともに,授業実践に入り,現在にいたっている。この計画は「応用例から入る関数とグラフの授業」を目指したもので,同時にテクノロジーの適切な活用方法,教師と生徒の双方向のコミュニケーションの導入を期している。TAMS Project 1の参加人数は9名である。今後,さらに教材を充実させることとともに,よりよい授業のあり方を模索していく。その他,昨年度に作成した「技術者のための微分積分学」(高専第3学年を対象)の改訂、「2次の線型代数」の教材作成などを手がけている。昨年度までの実績は大きく2つに大別され、そのひとつは高専第2学年で使用する解析学の教科書の作成とそれを用いた授業実践に基づく改訂作業(平成14年度から継続)であり、もうひとつは数学の授業改革運動TAMSを全国規模で展開し授業改善に関する議論と実績を積み重ねること(平成15年度から開始)であった。平成16年度はそれらの活動を継続するとともに、TAMSにおけるプロジェクト「関数とグラフの授業改革」を立ち上げ、「具体例からはいる関数とグラフの授業」を目指した具体的な作業を開始した。このプロジェクトは平成15年11月から議論を積み重ね、平成16年度4月からテキストの作成と授業実践に入った。この活動の特長は、授業時間ごとに授業報告(授業内容、学生の様子、提出されたレポートの中の質問事項とそれから派生する教授法の問題など)がなされ、それについての質疑応答がリアルタイムに行われたことである。テキストの作成は授業と並行して行われたが、授業報告の結果やそれについての意見によって逐次改良が重ねられ、平成16年3月にはテキスト「技術者を目指す人のための関数とグラフ入門」を作成した。これは当初の計画通り、具体例をもとにしたProgram Based Learning方式を採用した。全部で20の章から成り、各章にはActivityとしてテクノロジーを用いた探求の課題を収録した。これによって、どのようにしてテクノロジーを数学の授業に用いるか、ということに対するひとつの回答が提示できたと考えている。章末にはチェックリストを掲げ、章ごとの学習の目標を明らかにしてある。このテキストの作成の意義は、それによって、何をどのように教えるべきかということを議論する踏み台ができたということである。したがって、できあがったテキスト以上の成果が、今後の議論によって生み出される可能性が出てきたといえる。授業報告は今後も続けら、さらに改良が加えられていく計画となっている。
皮膚幹細胞(SP細胞)の局在検討と単離、培化誘導法の確立および生体内での機能解析

本研究は、皮膚幹細胞を培養条件下で骨髄間葉系および造血系細胞への分化を試みると共にその分子メカニズムの解析を行い、移植実験を用いて生体内での機能解析を行うことを目的とした。平成17年度は中胚葉系への分化誘導を促進するといわれているアクチビンやBMP4などを様々な条件で皮膚幹細胞の培養液中に添加し、スフェア(幹細胞)を形成させRT-PCR法などを用いて遺伝子の発現を検討した。その結果、10ng/mlのアクチビンを添加し形成されたスフェアにおいて中胚葉系の発生初期の段階で発現するといわれているNodalの発現レベルが上がることが明らかとなった。また非上皮系のマーカーであるビメンチンの発現レベルがコントロール群と比較して上がることが明らかとなった。さらに骨髄移植への応用が可能であるか、致死量の放射線を照射したマウスの尾静脈にGFP(beta-actin promoter-enhanced GFP)マウスより取得した皮膚幹細胞を移植し、経過観察および機能解析を行った。照射後、移植していないマウスは1週間で死亡したが、皮膚幹細胞を移植したマウスは2週間生存した。そして、移植後2週間目にFlow cytometryを用いてGFP陽性細胞の割合を解析した。その結果、リンパ球において11,7%,単球において18,2%のGFP陽性細胞が確認できた。皮膚幹細胞からの骨髄間葉系細胞および造血系細胞への分化誘導にはさらなる検討が必要であると思われるが、本年度の結果から皮膚幹細胞を中胚葉系の細胞へ分化可能なこと、またさらなる検討を加えれば骨髄移植への応用をも可能であることが示唆された。
金属磁性体高周波誘導加熱による肝癌熱凝固壊死療法の開発

(1)高周波電源、整合器高周波電源については我々は技術的に確立しているため、5kWまでの出力を安定的に供給することができる。本研究開発で製作した装置の場合、10400kHzの周波数帯域において発振可能であり、最大出力が5KWの性能を有する。整合器は水冷の導入により諸問題を解決した。即ち、「水冷」と「インダクタンス可変」という要求を満たすためバネのように伸縮するコイルを開発した。(2)生体適合性のある加熱材料長期間の生体内留置に関連して、粉末材料の安定性は考慮すべき問題であり、短期に酸化あるいは還元され他の化合物へと変化されるものは不適である。MFe_2O_4タイプ(M=金属元素)の代表的なフェライト4種類を選んで発熱特性を定性的に調べた。マグネタイト、マグネシウムフェライト、ニッケルフェライトおよび銅フェライト(M=Fe、Mg、Ni、Cu)である。これらフェライトの中でMgフェライトが非常に優れた材料であることが明らかになった。約380Khz辺りでMgフェライトは最も高い温度上昇を示し、約5分で80°Cとなった。また酸化せず生体内でも安定しており、生体適合性も最も高いと考えられた。(3)カテーテルにより腫瘍近傍まで運び、選択的に取り込ませるためにフェライトをリポソームに包埋する技術を確立した。これにより、安定したDDSが確立し、今後リポソームの修飾(荷電、抗体結合など)によりターゲッティングが完成すると考えられた。(4)ラット腫瘍モデルで、腫瘍内に留置したリポソーム包埋磁性体に対する誘導加熱により腫瘍の100%近い壊死を認めたが、腫瘍以外の磁性体集積のない部位への熱損傷などの副作用は認めず、きわめて安全かつ強力な選択的腫瘍治療となりうると考えられた。平成14年度検討目標1.生体安全性の検討:ラットに投与したMgFe2O4の経時的臓器分布と安全性を検討した。ラット、マウスにおいて212mgのマグネタイト・マグネシウムフェライトは中枢神経系、骨髄、心、腎、肝、筋肉に障害を起こさず安全に投与可能であることが確認された。2.腫瘍への到達経路の検討:直径50100nmまでの磁性体粉末が作製可能となった。これをリポソームに包埋し外側に陽電化を付加した所謂Cationic Magnetite Liposome(CML)の作製は可能になった。CMLの有用性は、それ自体陽電化をもっており腫瘍細胞のもつ陰電化に選択的に結合しやすく、さらにCMLをモノクロナール抗体のFab'部と共有結合させることで更に超選択的腫瘍選択性をもたせることが可能となる。しかし、腫瘍血管を透過し腫瘍細胞に直接接触するためにはその径が小さくなくてはならないため磁性体粉末材料の更なる縮小化を現在試みている。現在ではCMLを用いてラット尾静脈から投与し、血管内に塞栓などの合併症を起こさず血中に均等分布できるようになった。従って、今後肝動脈内投与の検討に移る予定にしている。3.加熱実験:今年最も進んだのがこの誘導加熱装置の研究で、可変周波数、出力の誘導加熱装置を共同研究と開発し、適正周波数を約370Khzであることを発見した(論文発表)。次にコイルと出力、周波数との整合をとりつつ500W,2KW,5KWと高出力のものを作製し実験を進めている。現在人体に応用可能な10KWの装置を開発中である。最終年度の15年度に向け、現在リポソームに抗腫瘍モノクロナール

抗体を結合させる実験を進めており、これが完成すると、動物の腫瘍モデルに対し抗腫瘍モノクロナール抗体付着のリポソーム包埋金属磁性体を投与することで腫瘍に対する熱凝固壊死療法が可能になると考えている。(1)高周波電源、整合器高周波電源については我々は技術的に確立しているため、5kWまでの出力を安定的に供給することができる。本研究開発で製作した装置の場合、10400kHzの周波数帯域において発振可能であり、最大出力が5KWの性能を有する。整合器は水冷の導入により諸問題を解決した。即ち、「水冷」と「インダクタンス可変」という要求を満たすためバネのように伸縮するコイルを開発した。(2)生体適合性のある加熱材料長期間の生体内留置に関連して、粉末材料の安定性は考慮すべき問題であり、短期に酸化あるいは還元され他の化合物へと変化されるものは不適である。MFe_2O_4タイプ(M=金属元素)の代表的なフェライト4種類を選んで発熱特性を定性的に調べた。マグネタイト、マグネシウムフェライト、ニッケルフェライトおよび銅フェライト(M=Fe、Mg、Ni、Cu)である。これらフェライトの中でMgフェライトが非常に優れた材料であることが明らかになった。約380Khz辺りでMgフェライトは最も高い温度上昇を示し、約5分で80°Cとなった。また酸化せず生体内でも安定しており、生体適合性も最も高いと考えられた。(3)カテーテルにより腫瘍近傍まで運び、選択的に取り込ませるためにフェライトをリポソームに包埋する技術を確立した。これにより、安定したDDSが確立し、今後リポソームの修飾(荷電、抗体結合など)によりターゲッティングが完成すると考えられた。(4)ラット腫瘍モデルで、腫瘍内に留置したリポソーム包埋磁性体に対する誘導加熱により腫瘍の100%近い壊死を認めたが、腫瘍以外の磁性体集積のない部位への熱損傷などの副作用は認めず、きわめて安全かつ強力な選択的腫瘍治療となりうると考えられた。
化学修飾グラフェンを用いた分子配向制御による有機薄膜太陽電池の高効率化

次世代エネルギーとしての高効率太陽電池の開発は科学の緊急課題である.我々は,原子1個分の厚さをもつグラフェン化合物を有機薄膜太陽電池に用いることにより,光電変換効率を向上させることに成功した.これは,グラフェン上において有機半導体ドナー分子の柱状結晶が成長し,アクセプター分子との界面面積が増大することで電荷分離が起こりやすくなったことによるものであり,単層のグラフェンがデバイス性能を損なうことなく活性層の構造制御に利用できることが示された.次世代エネルギーとしての高効率太陽電池の開発は科学の緊急課題である.我々は,原子1個分の厚さをもつグラフェン化合物を有機薄膜太陽電池に用いることにより,光電変換効率を向上させることに成功した.これは,グラフェン上において有機半導体ドナー分子の柱状結晶が成長し,アクセプター分子との界面面積が増大することで電荷分離が起こりやすくなったことによるものであり,単層のグラフェンがデバイス性能を損なうことなく活性層の構造制御に利用できることが示された.有機薄膜太陽電池の高効率化,特に安価かつ大面積化か容易な塗布プロセスによる太陽電池の創製は現代化学における喫緊の課題である.有機薄膜太陽電池においては,ドナー層とアクセプター層の界面面積が大きいほど効率的な電荷分離が行えるため,蒸着系において活性層のナノ柱状構造を構築する手法が研究されてきた.しかしながら,塗布プロセスにおいては,溶液からの結晶成長の制御が困難である上,結晶成長を促進する鋳型分子等が光電変換効率に影響を及ぼすと考えられるため,ナノ柱状構造を構築することには困難があった.我々は,酸化グラフェン誘導体Ph-iGO分散液を導電性ポリマーPEDOT:PSS上に塗布後熱還元することにより還元型酸化グラフェンrGOで修飾された表面を得,この表面上にベンゾポルフィリン前駆体CPを塗布後熱転換することでテトラベンゾポルフィリンBPを結晶化させ,50-150nmの高さを持つナノ結晶を成長させることに成功した.rGO層非存在下では平坦な結晶性薄膜が得られ,rGOと同様のπ平面を持つHOPG上では不均一に集合したBPナノ結晶が得られたことから,rGOが表面上に分散していることがナノカラム構造を得るために必要と考えられる.rGOは単層から数層の厚さしか持たないために電荷輸送の障壁にはならず,また得られたナノカラム構造はより広い表面積を持つことから,界面におけるキャリア生成の高効率化による光電変換効率の向上が期待される.
最高の臨界温度を示す水銀系高温超伝導体の高品質単結晶育成:超伝導機構解明への展開

本研究では、銅酸化物及び鉄ヒ素系超伝導体の合成手法の確立とその評価を行った。Hg系銅酸化物については、合成プロセスの最適化を行うことにより、HgBa2CuO5+..において、数mm2角の大きさを有する大型かつ良質の単結晶育成に成功した。また、Tc=54Kを有する酸素欠損型超伝導体LnFeAsO1-yを発見した。系統的物性評価を通して、本系の超伝導機構と結晶構造の密接な関連性を明らかにした。本研究では、最高のTcを有するHg系銅酸化物高温超伝導体HgBa2Can-1Cun02n+2(n=1-3)の大型高品質単結晶育成技術を確立することを目的として研究を行ってきた。初年度にあたる平成19年度では、以下の各事項を試み、いずれも所定の目的を達した。1.Hg系銅酸化物単結晶育成に最適な出発原料(必要次第では自作)、前駆体の調製手法の確立。BaO2、Ba(NO3)2を出発原料として試み、高純度の前駆体を作製できる条件(出発原料の組み合わせ、焼成温度、雰囲気等)を駐中津した。2.Hg0の蒸気圧を抑えるための防爆容器の開発と最適化。従来の多段型アンプル封入法を改良・進化させた、インコネル製の耐圧容器を開発し、1050°C、10気圧下における安定結晶育成を達成した。上記の実験環境を利用し、n=1の単結晶育成について、数ミリ角の大型試料の育成に成功した。又、キャリア濃度の精密制御を行うため、ポストアニーリング装置を開発し、得られた単結晶のドーピングレベルを変化させることにも成功を収めた。本研究では、Hg系銅酸化物高温超伝導体HgBa_2Ca_<n-1>Cu_nO_<2n+2>(n=1-3)の大型高品質単結晶育成技術を確立することを目的とする。平成20年度は、以下の各事項を試み、所定の目的を達成した。1.Hg系銅酸化物単結晶育成に最適な出発原料の選択と合成条件の確立。様々なバリエーションを試した結果、Hg、BaO_2、Cu、およびCuOを出発原料とする新たな単結晶育成プロセスを発見した。本手法を用いることにより、中間生成物(前駆体)作製に伴う手間と不確実性が排除され、更に、結晶育成中の酸素濃度の精密制御が可能となった。2.大型単結晶育成のための防爆容器の開発と最適化。単結晶試料の大型化を目指し、昨年度開発したインコネル製防爆容器の大容量化を行った。上記の組み合わせにより、HgBa_2CuO_<5+δ>において、数mm^2角の大きさを有する大型かつ良質の単結晶育成に成功した。得られた単結晶試料を用いた様々な研究が現在進行中であり、最高のTcを有する超伝導体物質群の物性が明らかになりつつある。又、本研究において得られた試料合成手法を、同年度に発見された鉄ヒ素系超伝導体に適用することにより、世界に先駆けて良質の試料合成に成功し、その基礎物性測定を行った。
造血幹細胞の単離と増幅

須田、三浦、金倉は、造血幹細胞におけるいくつかのシグナル伝達機構を明らかにした。幹細胞から、TIE_s、HTK、STK/RONなどの新しい受容体型チロシンキナーゼを幹細胞から、RT-PCR法によりクローニングした。殊に、TIE-1,TIE-2は、血管内皮細胞と同時に、造血幹細胞に発現していた。これらの発見により、血管内皮細胞の前駆細胞であるアンジオブラストから、造血幹細胞が発生してくる過程が解析できるようになった。また、c-Kitの機能獲得型異常により、血液細胞(肥満細胞)や腸管の特殊な細胞(カハール細胞)の自律性増殖が起きることを示した。中内は、マウス骨髄細胞のCD34^-Kit^+Sca^+LIN^-細胞とCD34^+Kit^+Sca^+LIN^-がそれぞれ、長期および短期の骨髄再建能をもつことを、移植実験で示した。CD34陰性の幹細胞がヒトの造血システムにあることも確認された。ヒト造血幹細胞・前駆細胞を対外で増幅させることは、臨床的応用の面から興味深い。中畑は、IL-6可溶性受容体とIL-6とSCFの組み合わせにより、ヒト造血前駆細胞が増幅することを示したが、幹細胞の増幅はいまだ成功していない。浅野は、ヒト造血幹細胞を解析するために、サルの幹細胞移植システムを構築した。山本は、GATAとMafの分子群が赤血球産生に関与することを、GATA-1遺伝子破壊マウスとGATAプロモーターLacZトランスジェニックマウスを用いて示した。血液幹細胞は、多分化能をもつと同時に、造血系を長期間にわたって維持する自己複製能を有すると考えられる。このような幹細胞は、血液全有核細胞10^<4-5>個に1個という極めて低頻度でしか存在しないため、その実体は明らかでなかった。本年度、細胞分離装置(FACS)の技術の応用と幹細胞特異的抗原を認識する抗体の開発により、下記のような成果を得た。(1)マウス血液幹細胞をFACSにより単離し、RT-PCR法により、新規の受容体型チロシンキナーゼを同定した。それらは、STK,TIE,TEK,HTKであり、このうち、STKとHTKの結合因子が同定された(須田)。c-kit活性化点突然変異により、造血細胞の自律性増殖および腫瘍化がおきることがあきらかとなった(金倉)。また、マウス幹細胞では、CD34発現の有無を指標とすることにより、自己複製能を有する幹細胞を、多分化能をもつ前駆細胞と区別することができた(中内、小玉)。(2)ヒト血液幹細胞の解析は、主として臍帯血を用いておこなわれた。臍帯血ことに、早期産時臍帯血は、未分化幹細胞を、相対的に多くふくむことが明かになった。(三浦)。さらに、IL-6および可溶性IL-6受容体を加えることにより、幹細胞上のgp130受容体にシグナルを入れ、多様なヒト前駆細胞の増幅に成功した(中畑)。また、マ-モセットの造血系を検討し、ヒト造血幹細胞のアッセイ系に使える見通しがたった(浅野)。(3)赤血球分化における転写制御様式の一つとして、NF-E2の転写活性化と制御は、Mafとp45の濃度平衡の変化によって行われることが明かとなった(山本)。血液幹細胞は、多分化能をもつと同時に、造血系を長期間にわたって維持するべく自己複製能を有すると考えられる。細胞分離装置(FACS)の技術の応用と幹細胞特異的抗原を認識する抗体の開発により、下記のような成果を得た。

(1)マウス幹細胞では、CD34発現の有無を指標とすることにより、自己複製能をもつ幹細胞と、もたない前駆細胞と区別することができた。このマウス血液幹細胞から、新規の受容体型チロシンキナーゼをクローニングした。それらは、STK,TIE,TEK,HTKであり、このうち、STKとHTKの結合因子が同定された。幹細胞および肥満細胞に発現されるc-kit受容体の活性化点突然変異により、造血細胞の自律性増殖および腫瘍化がおきることがあきらかとなった。(2)ヒト血液幹細胞の解析は、主として臍帯血を用いておこなわれた。臍帯血ことに、早期産児臍帯血は、未分化幹細胞を、相対的に多くふくむことが明かになった。さらに、IL-6および可溶性IL-6受容体を加えることにより、幹細胞上のgp130受容体にシグナルを入れ、多様なヒト前駆細胞の増幅に成功した。また、マ-モセットの造血系を検討し、ヒト造血幹細胞のアッセイ系に応用できる見通しがたった。(3)赤血球分化における転写制御様式の一つとして、NF-E2の転写活性化と抑制は、Mafとp45の濃度平衡の変化によって行われることが明かとなった。これらの研究により、幹細胞の自己複製、分化の分子機構の解析が進展すると思われる。血液幹細胞は、多分化能をもつと同時に、造血系を長期間にわたって維持するべく自己複製能を有すると考えられる。このような幹細胞は、血液全有核細胞10^<4-5>個に1個という極めて低頻度でしか存在しないため、その実態は明らかでなかったが、細胞分離装置(FACS)の技術の応用と幹細胞特異的抗原を認識する抗体の開発により、自己複製能のある幹細胞の単離に成功した。今までに下記のような進展をみた。(1)マウス幹細胞分画(分化抗原陰性KIT陽性Sca-1陽性)では、CD34分子を発現する細胞が自己複製能をもつ幹細胞と、CD34陰性細胞が、自己複製能のない前駆細胞であることを示すことができた。TIE,TEKは、未分化幹細胞に発現されていること、TEKには、複数のリガンドが存在すること、HTKは、赤血球系前駆細胞特異的に発現されていることが明らかにされた。幹細胞および肥満細胞に発現されるc-kit受容体の活性化点突然変異の解析が進み、受容体のdimerizationの重要性機構が指摘された。IL-6および可溶性IL-6受容体、SCFの組み合わせにより、幹細胞上のgp130受容体にシグナルを入れ、ヒト前駆細胞の増幅に成功したが、幹細胞(LTC-IC)の増幅に関しては結論が得られなかった。さらに、GATA-1 KOマウスの造血を詳細に解析し、GATA-1は、赤血球の終末分化にも関与していることが明かとなった。蛍光励起細胞分離装置(FACS)の技術の進展により、血液全有核細胞10^<4-5>個に1個という極めて低頻度でしか存在しない幹細胞を単離できるようになった。
鉛ビスマス流れにおよぼす壁面濡れ性の影響

鉛ビスマス冷却型加速器駆動システムの実用化に向けて、壁面濡れ性が鉛ビスマス流動に与える影響を実験的に検討した。実験は鉛ビスマス強制流動ループおよびプール体系試験部を用いて行い、ポテンシャルプローブを用いた液相速度計測とマルチセンサープローブを用いたボイド率計測を行った。本研究では、電気的抵抗式プローブと小型電磁流速計を独自に開発し、垂直管内上昇二相流におけるボイド率分布の発達過程や液相流速分布が精度よく計測できることを示した。低流速、低ボイド率条件において、ボイド率分布と液相速度分布が壁面近傍において最大値をとる特異な現象が現れることを示した。作動流体には、鉛ビスマスと窒素ガスを用い、液温を300°C一定として、窒素ガス流量を変化させて実験を行った。実験結果から、壁面の濡れ性が悪い場合には、気泡が壁面近傍に集中し、速度分布も壁面近傍で最大値をとることがわかった。気泡塔試験部を用いた実験と解析を行い、相分布と速度分布から決まる二相流の分布定数を算出し、実験値と比較した.これらの比較から,環状流路条件では,内壁側にボイド率分布のピーク位置を仮定した解析を行う必要があることを示し、壁面濡れ性が悪い場合には,気泡が上昇過程において壁面近傍に集積する可能性があることを明らかにした。さらに、最終年度は、垂直管内の強制対流条件下における鉛ビスマス気液二相流を対象として、気泡誘起乱流を考慮した半径方向運動量輸送モデルを用いた数値解析を行ない、、壁面におけるスリップ速度を考慮すれば、実験結果を再現できる。これは、濡れ性の悪い壁面上では気泡によって濡れと乾きが繰り返しにより、時間・空間平均的に壁面上でスリップと同等の効果が生じていることを示した。壁面近傍に気泡が集中する原因は現在、究明中であるが、壁面近傍に気泡が集中し、かつ液相速度が気泡のドリフト速度よりも小さい場合には、壁面を上昇する気相により管内部の液相がせん断を受け、壁面近傍において最大値をとることが考えられる。また、壁面の濡れ性を制御した実験をプール体系試験部を用いて実施し、壁面の濡れ性により、ボイド率の気相流速依存性が影響を受けることが明らかとなった。試験部は内径100mmのステンレス円管であり、強制流動実験と同様に鉛ビスマスと窒素ガスを作動流体として用い、流体温度も300°C一定とした。実験においては、壁面の濡れ性だけではなく、試験部中心にステンレス製のインナースリーブを同心円状に挿入することにより水力相当直径も変化させた。実験結果から、濡れ性が良い場合に比べ、濡れ性が悪い場合には、ドリフト速度が上昇することがわかった。これは、強制流動実験の結果と同様、気泡の壁面への集中が原因と考えられる。液体金属の流れを中性子ラジオグラフィを用いて計測する予定であったが、使用予定である京都大学原子炉実験所の研究炉(KUR)の新規制基準対応が遅れ、実施することができなかった。しかしながら、KURは今年度に再稼働の予定であり、研究炉を用いた中性子ラジオグラフィ実験が可能と考えている。軸対称を仮定した1次元モデルによる解析を行った結果、インナースリーブの無い円筒状気泡塔実験においては、モデル計算から算出した分布パラメータは実験値とよく一致することがわかった。さらに、円筒状気泡塔実験においては、壁面の濡れ性は分布パラメータにはほとんど影響を与えないことがわかった。これは壁面面積が相対的に小さいことと壁面近傍で下降流が形成され、下降流中のボイド率が小さいことが原因と考えられる。一方、インナースリーブを挿入した実験においては、モデル計算から得られた分布パラメータは実験値を過小評価する。これは、濡れ性の変化によりボイド率分布が仮定から大きく異なることが原因と考えられる。京都大学の研究

用原子炉の再稼働に伴い、液体金属の流れを中性子ラジオグラフィを用いて可視化計測することが可能となり、解析も順調に進んでいる。鉛ビスマス冷却型加速器駆動システムの実用化に向けて、壁面濡れ性が鉛ビスマス流動に与える影響を実験的に検討した。実験は鉛ビスマス強制流動ループおよびプール体系試験部を用いて行い、ポテンシャルプローブを用いた液相速度計測とマルチセンサープローブを用いたボイド率計測を行った。本研究では、電気的抵抗式プローブと小型電磁流速計を独自に開発し、垂直管内上昇二相流におけるボイド率分布の発達過程や液相流速分布が精度よく計測できることを示した。低流速、低ボイド率条件において、ボイド率分布と液相速度分布が壁面近傍において最大値をとる特異な現象が現れることを示した。作動流体には、鉛ビスマスと窒素ガスを用い、液温を300°C一定として、窒素ガス流量を変化させて実験を行った。実験結果から、壁面の濡れ性が悪い場合には、気泡が壁面近傍に集中し、速度分布も壁面近傍で最大値をとることがわかった。気泡塔試験部を用いた実験と解析を行い、相分布と速度分布から決まる二相流の分布定数を算出し、実験値と比較した.これらの比較から,環状流路条件では,内壁側にボイド率分布のピーク位置を仮定した解析を行う必要があることを示し、壁面濡れ性が悪い場合には,気泡が上昇過程において壁面近傍に集積する可能性があることを明らかにした。さらに、最終年度は、垂直管内の強制対流条件下における鉛ビスマス気液二相流を対象として、気泡誘起乱流を考慮した半径方向運動量輸送モデルを用いた数値解析を行ない、、壁面におけるスリップ速度を考慮すれば、実験結果を再現できる。これは、濡れ性の悪い壁面上では気泡によって濡れと乾きが繰り返しにより、時間・空間平均的に壁面上でスリップと同等の効果が生じていることを示した。これまでの実験結果により、壁面濡れ性が鉛ビスマス二相流に与える影響は、濡れ性が悪い場合の特異なボイド率分布であることがわかった。したがって、局所プローブを用いたボイド率分布の計測を継続する。また、接触式計測法と平行して、非接触計測法である中性子ラジオグラフィを用いて、壁面濡れ性が気泡の運動に与える影響を定量的に可視化・計測する。濡れ性が液体金属二相流に与える影響をさらに詳しく調べるために、中性子ラジオグラフィおよびボイドプローブを用いて局所ボイド率計測を継続して行う。研究炉の再稼働が間に合わなかったため、中性子ラジオグラフィを用いた可視化計測が実施できず、実験に必要な消耗品を購入しなかったため。京都大学原子炉実験所の研究炉の再稼働が間近であり、中性子を用いた実験が可能となる見込みであり、可視化計測に必要な消耗品を購入する予定である。
全能性細胞作製の試み

核移植により、胎盤を含むすべての組織になり得る全能性細胞が形成される。一方、iPS細胞やES細胞は多くの組織・細胞に分化することができるが、胎盤に分化することはできない。私達は、ES細胞と全能性を有する4細胞期胚との遺伝子発現パターンを比較し、後者で発現の高い遺伝子を選び、これらの候補遺伝子が全能性細胞のマーカーになり得るかどうかを検討した。その結果、ある遺伝子の発現レベルが高いES細胞は胚盤胞で将来胚になる内部細胞塊と将来胎盤になる栄養外胚葉の両方に分化する確率が高いことが示された。このように、本研究の結果は、体細胞から全能性細胞を作製する試みに大きなヒントを与えるものである。体細胞のリプログラミングには、Gurdonらによる核移植とYamanakaらによるiPS細胞の作製がある。前者では、胎盤を含むすべての組織になり得る全能性細胞ができ、後者では、iPS細胞はES細胞と同様に多くの組織・細胞に分化することができるが、胎盤に分化することはできない。核移植によるリプログラミングはsemi in vivoの方法であり、試験管内で体細胞から全能性細胞を作製する方法はまだ確立されていない。体細胞から全能性細胞を作製することは、生命科学分野における大きなマイルストーンである。また応用面でも、「iPS細胞からすべての体細胞に効率良く分化させることが難しい」という、再生医療分野での問題の解決にも寄与し得る。2012年にPfaffらにより、ES細胞集団には全能性細胞がごくわずか(0.5%)存在し、2つの状態が平衡状態にあることを報告された。彼らは2細胞期胚に発現するMERV(Mouse Endogenous Retrovirus)をマーカーとして、このような細胞を濃縮し、キメラマウスを作製し、胚体と胎盤の両方に分化することを示した。一方私達は卵子に多く存在するヒストンバリアントが、核移植に似たメカニズムでiPS細胞作製を促進することを報告した。本研究では、この延長として、ES細胞と、全能性を有する4細胞期胚との遺伝子発現パターンを比較し、後者で発現の高い一群の遺伝子を選び、これらの候補遺伝子が全能性細胞のマーカーになり得るかどうかを検討した。その結果、ある細胞膜タンパク質の発現レベルが高いES細胞を用いてキメラマウスを作製すると、これらの細胞は胚盤胞で将来胚になる内部細胞塊と将来胎盤になる栄養外胚葉(Trophectderm)の両方に分化する確率が高いことが示された。このように、本研究は体細胞から全能性細胞を作製する試みに大きなヒントを与えるものである。分子生物学
β-カロチン大量投与によるイシダイの抗ウイルス性に関する研究

養殖イシダイの魚体内においてγ-INF,mφの免疫防御機構の存在を検討するため、養殖イシダイの脾臓細胞をコンカナバリンAセファーロース4Bと共に48時間培養しその上清によるmφ活性化を検討し、以下の結果を得た。2)イシダイCon.A培養上清を、ホ乳類でγ-INF失活処理とされている熱(56°C)或いは、酸(pH2)処理をおこなったところ、mφの活性化が消失した。3)イシダイCon.A培養上清の腹腔mφ活性化の種特異性をマウス腹腔mφを用いて、検討したところ、マウスmφ活性化能を持たず、イシダイCon.A培養上清の種特異性が存在した。以上のことより、養殖イシダイ脾臓細胞中のリンパ球は、Con.Aで培養するとγ-IFNを産生すると推察され、イシダイの魚体内でγ-INF,mφの免疫防御機構の存在が示唆された。続いて、孵化直後の養殖イシダイを種々のβ-カロチン大量添加餌料(β-カロチン強化ワムシとβ-カロチン強化モイストペレット5,000μg/100g)で12カ月間飼育し、抗ウイルス性を示すγ-IFNを中心とした免疫増強機構を検討し、以下の結果を得た。1)β-カロチン強化群のイシダイ脾臓リンパ球はコンカナバリンA存在下で対照に比較して高いγ-IFN産生を示した。2)β-カロチン強化モイストペレット(25,000μg/100g)で12カ月飼育した群の羊赤血球を抗原とする抗体産生は、β-カロチン大量投与群が無添加の対照群より高かった。3)β-カロチン強化群の腹腔mφの不活化酵母に対する非特異的貧食能は対照群より上昇していた。3)両群の飼育期間中のヘマトクリット・ヘモグロビン・血清蛋白値に有為な差は認められなかった。また、大量投与に伴う阻害等は認められなかった。以上のことから、イシダイ養殖にβ-カロチン大量添加餌料を用いることで、ウイルスなどの感染症に抵抗力のある魚を生産する方策が提示された。養殖イシダイをβ-カロチン大量添加餌料(β-カロチン強化ワムシとβ-カロチン強化モイストペレット25,000μg/100g)で6カ月間飼育し,γ-IFNを中心とした免疫増強機構を検討し、以下の結果を得た。イシダイ脾臓リンパ球はフィトヘムアグリチニン、コンカナバリンA存在下で幼若化反応を起こし、アラマ-ブルーの取り込みからみた細胞増殖はβ-カロチン大量投与群が無添加群に比較して高かった。両群の脾臓リンパ球をコンカナバリンAセファロースで培養し、上清中のγ-IFN産生量をマクロファージの貧食能とペルオキダーゼ活性のから測定したところ、β-カロチン大量投与群が無添加群に比較してγ-IFNを多量に産生していた。

両群から腹腔マクロファージを調製し、その不活化酵母とオプソナイズド羊赤血球に対する貧食能を測定したところ、β-カロチン大量投与群の貧食能が無添加の対照群より高かった。両群の飼育期間中の成長はほぼ同程度であり、β-カロチン大量投与に伴う成長阻害等は見られず、ヘマトクリット・ヘモグロビン・血清蛋白値にも有為な差は認められなかった。上記検討項目と並行して初期餌料のワムシにたいするβ-カロチンの添加を油脂酵母・海産クロレラ・ユ-グレナ等に施してワムシの体内カロチノイド量を測定したところ、海産クロレラにβ-カロチンを添加して培養したワムシの体内カロチノイド量が最も高かった。孵化直後の養殖イシダイを種々のβ-カロチン大量添加餌料(β-カロチン強化ワムシとβ-カロチン強化モイストペレット25,000μg/100g)で12カ月間飼育し,抗ウイルス性を示すγ-IFNを中心とした免疫増強機構を検討し、以下の結果を得た。孵化後13日より約1ヵ月間、1トン当たり0.6gのβ-カロチンを強化したワムシで飼育したイシダイ稚魚の脾臓リンパ球はコンカナバリンA、ポ-クウィド-マイト-ゲン、リポポリサッカライド等の幼若化誘導因子存在下で、無添加群及び1トン当たり60g強化群に比較して高い幼若化反応を起こした。両群の脾臓リンパ球上清中のγ-IFN産生量をマクロファージの貧食能とペルオキシダーゼ活性のから測定したところ、1トン当たり0.6g β-カロチン強化群が他の群に比較してγ-IFNを多量に産生していた。β-カロチン強化モイストペレット(25,000μg/100g)で12カ月飼育した群の羊赤血球を抗原とする抗体産生は、β-カロチン大量投与群が無添加の対照群より高かった。両群の飼育期間中のヘマトクリット・ヘモグロビン・血清蛋白値に有為な差は認められなかった。また、血液中β-カロチン量は大量投与群が若干高値を呈し、さらに大量投与に伴う阻害等は認められなかった。上記検討と並行して初期餌料のワムシに対するβ-カロチン強化の条件を検討したところ、海産クロレラにβ-カロチンを添加し、室温(2025°C)で35時間の培養がワムシの体内カロチノイド量の点で最も良好であった。
酸化的DNA障害を認識する高等真核生物由来の修復酵素

本研究では、オリゴヌクレオチドに対する酸化損傷の導入法の開発を行うとともに、これを基質として高等動物由来DNA修復酵素の酵素特性の解析を行った。1酵素基質合成thymineglycol(TG)は、チミンを1ケ所だけ含むオリゴヌクレオチドを過マンガン酸カリウムで酸化することにより導入した。目的とする生成物(19TG)は、逆相HPLC及びゲル濾過により精製した。次に、19TGのアルカリ処理により、ureaを含むオリゴヌクレオチド(19UREA)を調製した。2酵素特性の解析最近クローニングされたマウスのendonucleaseIIIホモログ(mNth1)の酵素特性の解析を行った。[^3H]TGを導入したM13DNAとmNth1をインキュベートすると、放射活性がDNAからリリースされ、HPLC分析により遊離のTGであることを確認した。19TG及び19UREAを基質としてmNth1を作用させると、TGおよびureaの3'側でβ脱離した生成物が確認された。以上の結果は、mNth1がendonucleaseIIIと同様に酸化的なピリミジン塩基損傷の修復に関わる酵素であり、同一タンパク質内にN-グリコシラーゼとAPリアーゼ活性をもつことを示している。
歯槽骨再建・再構築を目的とした歯科用生体材料の開発

平成13年度実験概要4週齡ウサギ骨髄より未分化間葉系細胞を採取し、アパセラム上で増殖させた。予備実験において、アパセラム中に未分化間葉系細胞が侵入していくことをMTS assayにて確認している。つぎに、アパセラムに接着、伸展した未分化間葉系細胞にDexamethasone、β-Glycerophosphate、ascorbic acidを添加し骨に分化誘導させたもの、またはさせなかったものを、それぞれアパセラムとともに5週齡のヌードマウスに移植した。移植8週後に軟X線撮影およびパラフィン切片作製(HE染色)を行った。その結果、,HE染色にて未分化間葉系細胞を骨に分化させ移植した場合には、骨芽細胞様の組織が観察された。軟X線の観察においても分化させ移植した場合の方が、分化させなかった場合と比較して不透過像の幅は大きかった。一方、コラーゲン含有ハイドロキシアパタイトを担体として未分化間葉系細胞とともにヌードマウスへの移植実験を行ったが、移植後、4週より吸収が認められた。これは、コラーゲン含有ハイドロキシアパタイトは担体としての強度に問題があったものと考えられる。さらなる改良が必要と思われる。本年度の研究結果より、骨髄より未分化間葉系細胞とアパセラムの組み合わせによって、顎堤を再構築するティッシュエンジニアリングの可能性が示唆された。次年度は、さらに骨の強度や、骨形成後の吸収について詳細に検討する予定です。
Aralar欠損マウス脳における細胞学的化学的構築の形態学的解析

Aralarは,脳や骨格筋に特異的に発現するミトコンドリア内膜局在のCa依存性アスパラギン酸・グルタミン酸輸送体で,この生理的役割は,1)ミトコンドリアから細胞質へのアスパラギン酸の供給,2)Malate aspartateshuttleの一員として細胞質NADH還元当量のミトコンドリアへの輸送をおこなうこと,などである.Gene-trap methodによるaralarノックアウト(aralar-KO)マウスにおいては,発育障害や全身性振戦,運動機能障害などがおこり,硬直性の痙攣を引き起こし生後20日目ぐらいに死亡する.生後18日目から20日目のaralar-KOと野生型の脳について髄鞘染色を施し,比較検討すると,aralar-KOマウスでは,大脳皮質や脳梁,内包,視床などで強い髄鞘形成不全が認められた.しかしながら,細胞構築については,野生型とノックアウトとの間においては,ノックアウトで大脳新皮質が薄いことや側脳室が拡張することなど以外においては,顕著な有意差を観察することはできなかった.免疫組織化学的に野生型とノックアウトの脳のbasic myelin protein(MBP)を調べ,比較すると,まったく髄鞘染色の結果と同じく,大脳皮質や脳梁,内包,視床などで野生型に比べてノックアウトでMBP様免疫反応陽性の神経線維が減少していた.髄鞘形成不全の要因のひとっには,myelin lipidの前駆物質であるN-acetylaspartateやaspartateの産生量がaralar-KOマウスで減少するためと考えられる.さらに,免疫組織化学法によって各種の神経活性物質の動態をノックアウトと野生型の脳についておこない,比較検討した.その結果,野生型と比較してaralar-KOマウスでは,海馬や歯状回におけるグルタメイト受容体様免疫反応が増加,オレキシン作動性神経細胞でc-Fosタンパク質を発現している割合が増加,脳幹におけるセロトニン作動性神経細胞体の数の減少,などが観察された。脳や骨格筋に特異的に発現するミトコンドリア内膜局在のカルシウム結合性アスパラギン酸・グルタミン酸輸送体(AGC)であるAralarをノックアウトしたマウス(Aralar-KOマウス)を作製した。このマウスの脳における細胞学的化学的構築について形態学的解析を試みるために、本年度では、1)ニッスル染色や髄鞘染色による組織学的研究、2)calbindin D-28kやトリプトファン水酸化酵素などに対する一次抗体を使用する免疫組織化学法による神経細胞の構築、3)myelin basicproteinやoligodendrocyteに対する一次抗体を使用する免疫組織化学法による髄鞘の構築、について調べた。その結果、Aralar-KOマウスでは、1)脳全体の発育障害が認めら、野生型に比べて、脳の大きさが小さく、大脳皮質の厚さが薄くなり、脳室が拡張するなどの特徴が観察された、2)野生型に比べて脳全体の髄鞘形成が不良となっていたが、特に、延髄や橋に比べて大脳や間脳における髄鞘形成が一段と強く障害された、3)髄鞘形成が強く障害された部位においてmyelin basicproteinの形成の低下やoligodendrocyteの発育不良あるいは障害が観察された、などの研究結果を得た。また、予備的な結果であるが、中脳や延髄におけるトリプトファン水酸化酵素を含有する神経細胞(セロトニン作動性神経細胞)の数が、野生型に比べて、Aralar-KOマウスだけでなく、ヘテロのマウスでも減少するとの観察結果を得て、さらに定量的な検索を試みている。

脳や骨格筋に特異的に発現するミトコンドリア内膜局在のカルシウム結合性アスパラギン酸・グルタミン酸輸送体(AGC)であるAralarをノックアウトしたマウス(Aralar-KOマウス)について、昨年度に得られた研究成果の一部を論文にまとめ、公表した(J.C.B.,2005)。すなわち、Aralar-KOマウス脳においては、顕著な細胞学的構築の異常は認められないが、髄鞘形成不全が脳の各部位に認められることを報告した。さらに、この髄鞘形成不全の原因としては、脳における髄鞘の脂質の成分であるgalactosyl cerebroside量の低下によることを明らかにした。本年度に取り組んだ研究としては、Aralar-KOマウス脳における細胞学的構築の顕著な変化が認められないために、特異な化学物質を含有する神経細胞の数や分布に関して、免疫組織化学法を使用し、野生型、ヘテロ型、ノックアウトのそれぞれについて比較検討した。そのなかで、大脳皮質を構成するcalbidin D-28k含有神経細胞の数や分布様式については、野生型とヘテロ型との間において顕著な変化を認めることができなかった。さらに、オレキシン含有神経細胞に関しても、野生型とヘテロ型との間における有意な相違を認めることができなかった。今年度までの研究において野生型とヘテロ型との間における有意な相違を観察できたのは、セロトニン作動性神経細胞のみで、野生型に比べてヘテロ型において神経細胞の数が減少していた。本年度に取り組んだ研究としては、脳や骨格筋に特異的に発現するミトコンドリア内膜局在のカルシウム結合性アスパラギン酸・グルタミン酸輸送体(AGC)であるAralarをノックアウトしたマウス(Aralar-KOマウス)およびヘテロ型と野生型について、昨年度に引き続き、各種の生理活性物質を特異的に含む神経細胞の分布様式をPAP法による免疫組織化学的研究法を使い検索した。一酸化窒素合成酵素(NOS)を一次抗体として使い免疫組織化学的に検索した結果では、NOS様免疫陽性神経細胞の分布様式や数においても、ヘテロ型と野生型との間における顕著な有意差を現時点では認めることができなかった。黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)を一次抗体として使い免疫組織化学的に検索した現時点での結果でも、Aralar-KOマウスやヘテロ型、野生型におけるLHRH様免疫陽性神経細胞の分布様式や数において著明な有意差を観察することができなかった。副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRF)を一次抗体として使い免疫組織化学的検索に基づく、CRF様免疫陽性神経細胞の分布様式や数においても、Aralar-KOマウスやヘテロ型、野生型における顕著な有意差を現時点では見いだすことはできなかった。今年度までの研究においても、Aralar-KOやヘテロ型、野生型のマウスにおける、特定の神経細胞における顕著な変化は、セロトニン作動性神経細胞群以外には見いだせなかった。