hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ポリマー液体及びソフトマター中に発現する構造と熱エネルギー伝搬特性

ポリマー液体やソフトマターを対象として、その構造に発現する不均一性・非等方性に着目し、熱輸送の特異性を分子動力学シミュレーションにより解明するのが本研究の目的である。液体として界面近傍の直鎖アルカン液体、ソフトマターとして脂質二重膜を主な研究対象に選択し、固液界面近傍で層状構造を成す液体中において局所熱伝導率が振動的空間分布を示すことや、脂質二重膜中の単層膜間界面における熱抵抗が脂質分子種により異なることなどを初めて見出し、これらを例として構造と熱輸送特性の関係を議論した。ポリマー液体やソフトマターを対象として、その構造に発現する不均一性・非等方性に着目し、熱輸送の特異性を分子動力学シミュレーションにより解析するのが本研究の目的である。直鎖アルカンを液体として選択し、(a)バルク状態の液体、(b)気液界面、(c)SiO2(シリカ)固体の各種結晶面と接する固液界面について、液体の構造や吸着・移動など分子の挙動を観察し、熱輸送特性を解析する。本年度は以下の成果を得た。1.バルク液体の熱伝導解析法についての検討を完了した。アルカン分子のモデルとして広く用いられているAll-Atom (AA)モデルとUnited-Atom (UA)モデルを適用して熱伝導現象をそれぞれ再現し、熱流束を構成する各種分子熱輸送メカニズムの寄与度を比較した結果、AAモデルにおいては、分子が力学的エネルギーをもって空間中を移動することによる熱輸送の効果が大きく、分子間で分子間力の作用によりエネルギーを伝搬することによる効果が相対的に小さくなっていることが明らかとなった。気体分子運動論を念頭に比熱や拡散係数を比較することにより、AAモデルが過大な比熱を生じさせていることに問題があることがわかった。2.気液界面におけるアルカン液体の構造や分子の移動の特性を解析した。空間に固定した座標上で界面特性を計測する一般的な気液界面解析法では、界面位置が振動することにより特性が平均化され失われてしまう。本研究では、気液界面を捕獲して界面特性を観測する手法を適用し、分子の配向や自己拡散係数が界面近傍で大きく変化する様子を捉えた。3. SiO2ーアルカン界面近傍における液体構造と輸送特性について解析を進めた。固体表面の構造の違いにより液体分子の吸着・移動特性が大きく異なることや液体中の熱輸送特性が界面近傍で大きく変動することなどを見出しており、現在系統的な解析を実施している。ポリマー液体及びソフトマターを対象として、その不均一・非等方的構造を手がかりに、熱輸送の特異性とその分子スケールメカニズムを大規模な分子動力学シミュレーションを用いて解析するのが本研究の目的である。広い工学的応用が期待される系であることと、典型的な物理化学現象を観察できる普遍性をもつ系であることを考慮して計算対象を選択する必要がある。今年度は初年度として、特に固体ーポリマー液体の界面について研究を開始した。ポリマーとしては最も基本的な長鎖分子である直鎖アルカンを選択し、まず、固体表面の影響を除いた液体表面について計算系を構築し、解析を行った。今年度は特に物質輸送現象に着目し、界面近傍におけるアルカン分子の自己拡散係数を計測すると共に、分子の配向や伸長の様子など界面近傍の構造を解析して、その関係を明らかにした。アルカン液体の熱輸送を解析するための基礎研究として、バルクアルカン液体をAll-Atomモデルで模擬した計算系について熱伝導の非平衡分子動力学シミュレーションを実施し、広く用いられているUnited-Atomモデルによる結果と比較検討した。この結果、All-Atomモデルによるシミュレーションでは、United-Atomモデルでは粗視化されているC-H結合が熱エネルギーの伝搬に及ぼす影響が過大になる傾向が見い出された。本来量子化されているC-H間の伸縮振動が古典力学的に解析され、エネルギーの分配が課題になるためであると考えられる。さらに、半導体製造工程やMEMS/NEMS製作において重要なSiO2固体壁を対象として、これに接するアルカン液体の構造や輸送特性を解析するための分子動力学計算系の構築を開始して、予備的な結果を得つつある。直鎖アルカンを液体の主な解析対象として選択し、(a)バルク状態の液体、(b)気液界面、(c)応用上重要なSiO2(シリカ)固体表面と接する固液界面、の3項目について、構造や熱輸送特性を解析した。また、脂質分子が整列した二重膜に対して、熱輸送特性を解析した。3年間の研究により、以下の成果を得た。1.バルク液体の熱伝導率を解析する手法はほぼ確立されているが、分子モデルに許容される運動自由度についての議論はこれまで存在しなかった。本研究における検討により、C-H間の振動を古典力学的に解析するAll-Atomモデルが原理的に過大な比熱と熱伝導率を与えることが明らかとなった。

2.気液界面における特有の構造を観察することは、気液界面の位置が常に変動し、時間平均像では界面近傍の特性も平均化されて消失してしまうため容易ではない。本研究では、Kikugawaらの瞬時界面捕獲法(Computers and Fluids, 36, 2007)を適用し、分子の配向など特異な構造が気液界面に存在することや、自己拡散係数が界面近傍で急激に変化することなどを見出した。3.固液界面において液体分子が形成する特異な層状構造における熱輸送特性を調べた研究はほとんど存在しない。また、実用的な固体ー液体の組み合わせに対する界面熱抵抗は固液ナノシステムの総括的な熱輸送特性を支配する重要な特性である。これらの解析により、固体壁面近傍の液体中では熱伝導率が空間的に振動的な挙動を示すことなどを明らかにした。4.脂質二重膜の解析により、二重膜構造における単層膜間の界面が示す熱抵抗が、脂質尾部の鎖長の組み合わせによって異なることなどが明らかとなった。熱工学直鎖アルカンのバルク飽和液に対する解析により、All-Atomモデルによる熱伝導の分子動力学シミュレーションがもつ問題点を初めて明らかにすることができ、今後の同種のシミュレーションに対する示唆を与えると共に、本研究における分子モデル選択において指針をもつことができた。また、気液界面・固液界面の計算系を構築し、液体構造や分子の挙動を中心とした成果を得ることにより、本研究における主な研究対象について来年度に行う解析の準備を整えることができた。直鎖アルカン飽和液を対象として、その輸送特性の解析を基礎から整然と積み上げるための研究を順調に行うことができた。アルカン液体表面の解析により見い出した、固体表面の影響がないアルカン表面独自の特性は、今後実施する固液界面の解析と比較検討することにより、アルカン液体の構造と輸送特性の影響を解析するための重要な基礎となる。また、バルクアルカン液体について見い出したC-H間結合を適切に取り扱うための知見は、今後現実の現象を忠実に再現するための準備として重要であった。次年度の解析にあたっての準備として、アルカン液体ーSiO2固体壁の界面について分子系の構築をほぼ終えている。最終年度となる来年度は、固液・気液界面の構造と分子挙動について精度の高い解析結果を得て、これらに輸送特性の観点から考察を加えると共に、界面近傍領域における熱輸送特性を明らかにする。また、これらの成果から熱工学的な知見をまとめることにより、本研究を完了する。アルカン液体ーSiO2固体壁の界面については、すでに構築をほぼ完了した計算系を用いて、まず構造と物質輸送特性(液体分子の自己拡散)を解析する。前年度に完了した固体壁面の影響を除いた液体表面の構造と輸送特性の結果と比較検討し、固液界面近傍の特性を明らかにする。また、固液界面近傍で液体中に特異な構造が観測された場合には、熱輸送特性の解析を実施し、構造と熱輸送特性の関連を明らかにする。界面垂直方向の熱伝導については解析手法など見通しがついているが、界面平行方向の熱伝導については現時点ではシミュレーション手法も含めて模索中である。
骨伝導能を有する新規生体吸収性足場とヒトiPS細胞を用いた顎骨再生療法の開発

腫瘍や外傷などにより顎骨欠損をきたす患者は多く、顎顔面の形態と機能の喪失が問題となり、身体他部位からの自家組織移植が一般的な治療法であるが、その侵襲性は高い。そこで本助成により、われわれが顎骨再生の足場生体材料としての有用性を明らかとした3次元多孔質uHA/PDLLA複合体に、新たにiPS細胞を移植することによる治療法開発を目的とした。ヒトiPS細胞を、骨形成細胞へ誘導させ、選択的に単離・移植することを試みたが困難であった。そこで、ヒト骨髄由来幹細胞から同様に高い骨形成再生細胞を選択的に単離・移植を試みたところ、動物モデルにおいて効率的で有用な顎骨再生が得られた。新たなを知見の発表が行えた。広範囲の顎骨欠損部の回復には、自家骨移植が最も確実で頻用される再建治療法である。しかしその外科的侵襲性は高く、組織工学的手法を応用することで安全に効率的かつ効果的に顎骨再生が可能となれば、臨床的治療効果は高い。本研究は、新規に開発され解剖学的に複雑な顎顔面骨への応用を可能とする熱変形性による簡易加工性能と高い骨伝導性、生体吸収置換性、さらに機械的強度を有する骨再生の足場材料として開発された3次元多孔質非焼成ハイドロキシアパタイト配合ポリD/L乳酸(u-HA/PDLLA)複合体を用い、これに骨形成細胞への誘導を行った人工多能性幹細胞(iPS細胞)を応用し、骨再生治療法確立に向けた実験的研究を目的とした。本年度は、in vitroにおいて人工多能性幹細胞(iPS細胞)の培養安定化への環境整備を行い、Embryonic Body (胚様体; EB)を作製し、これからEBを単一細胞化しFACSを用いて骨形成に有意な細胞のソーティングを行う手技の習得をすすめるも、安定化には更なる時間をようするものと考えられた。そのため、これと並行し、in vivoでのラット顎骨に欠損(critical bone defect)を作製し、多孔質u-HA/PDLLA複合体の顎骨欠損部への移植による骨再生および修復過程に関して動物モデルの確立を行い、Micro-CTおよび組織学的検索手法を用いた骨形態及び組織学的評価を行うこととした。さらに、iPS細胞研究に先立ち、細胞移植群としてヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)(MSCとしてLNGFRおよびTHY-1の両者の発現するダブルポジティブなもの)を共同研究者らと確立し、多孔質u-HA/PDLLA複合体へ移植を行う研究群を作製し、比較検討を行った。パイロット研究の結果ではあるが、多孔質u-HA/PDLLA複合体単独群と比較し、hMSC移植群では、有意な顎骨再生と骨癒合経過が確認された。hMSCはiPS細胞同様に有益な細胞ソースであり研究を発展させる予定である。研究当初の、in vitro系での人工多能性幹細胞(iPS細胞)の培養安定化への環境整備にはさらなる時間を要するものと思われるが、in vivo系での実験を先行させ、ラット顎骨欠損モデルにおいて安定した結果が得られており、さらにヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を培養確立し、移植応用することで有用なデーターが多数得られており、おおむね順調であると考えられた。現在,低侵襲かつ効率的な顎骨再生治療が求められる.昨年度,新規3次元多孔質u-HA/PDLLA複合体(以下3D-H/PLA)が,生体活性骨伝導能と機械的強度,形態細工性から,顎骨再生足場としての有用性を証明した.本研究年度は,研究を発展させヒトiPS細胞を用いて,まず胚様体(EB)形成を経て,骨形成細胞への誘導を行い,FACSを用いてアルカリフォスファターゼ陽性細胞のみを骨芽細胞前駆細胞として研究に用いることとした.FACSによりソーティングされたALP陽性細胞の骨形成細胞としてのPhenotype検索は順調であったが,この時点でiPS細胞の維持に研究経費を大きく超越し研究の転換が必要であった.そこでヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を応用し,研究を継続した.研究にはSDラット(オス,9週齢)を用い,下顎骨に直径4mmのdefectを作製した. hMSCは,FACSを用いてLNGFRおよびTHY-1の両者を発現する,増殖能と骨形成能の高い分画を選択的に単離したhMSCを用いた.3D-H/PLAに,hMSC移植なし群,1×104個および1×105個の移植実験群,欠損のみの4群にて比較検討を行った.動物は,術後免疫不全状態(FK506 1mg/Kg/Day, ABPC連日投与)とし,2,4週間にて検体を採取し形態および組織学的に評価した.Micro-CT検索および組織学的検索評価から,2週間および4週間において,hMSC移植なし群では骨形成は遅延していたが,hMSC移植群では3D-H/PLA周囲および内部への有意な骨再生により,3D-H/PLAとの骨形成による癒合が見られた.顎骨再生足場材料としての3D-H/PLAは,骨形成細胞の増殖および分化を活性化する生体活性能を有し,さらにhMSCを移植応用することにより,効率的な顎骨再生療法開発の可能性が示唆され有用な知見が得られた.腫瘍や外傷などにより顎骨欠損をきたす患者は多く、顎顔面の形態と機能の喪失が問題となり、身体他部位からの自家組織移植が一般的な治療法であるが、その侵襲性は高い。

そこで本助成により、われわれが顎骨再生の足場生体材料としての有用性を明らかとした3次元多孔質uHA/PDLLA複合体に、新たにiPS細胞を移植することによる治療法開発を目的とした。ヒトiPS細胞を、骨形成細胞へ誘導させ、選択的に単離・移植することを試みたが困難であった。そこで、ヒト骨髄由来幹細胞から同様に高い骨形成再生細胞を選択的に単離・移植を試みたところ、動物モデルにおいて効率的で有用な顎骨再生が得られた。新たなを知見の発表が行えた。平成28年度は、in vitro系での人工多能性幹細胞(iPS細胞)研究を継続し、いったんEmbryonic Body (胚様体; EB)を作製し、これからEBを単一細胞化しFACSを用いてALP (アルカリフォスファターゼ)陽性細胞のみを選別ソーティングすることで、骨形成細胞前駆細胞のみを効率よく骨再生に利用することを継続するが、平成27年度において、多大なコストを要し課題であったことから、iPS細胞を細胞ソースに用いる予備実験を継続するが、一方で、われわれのが平成27年度にあらたに確立成功させた、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を細胞ソースとし、顎骨欠損モデルにおける有用な骨再生足場材料である多孔質u-HA/PDLLA複合体との移植による研究を発展開発することも、今後の研究の推進方策と考えられ、それらを見極めながら研究を進めていく。口腔顎顔面外科研究は予定通りに進んでおり、次年度も研究計画に準じて適切に使用する。In vitroおよびIn vivo実験系ともに、研究を多く予定しており細胞および動物実験群の両者に対する消耗品および飼育費用に多くの支出が予定される。また得られた成果について、国内外での研究成果発表および学術論文として発表を予定しているため研究遂行に研究費を多く要するものと思われ、引き続き適切に使用していく。
ソフトクリスタル化学発光系の創製と刺激応答機能の時空間制御

本研究では、ソフトクリスタル化学発光系の創製と刺激応答発現、作用機序解明と時空間制御を目指す。具体的に、項目1として結晶化学発光を示す反応系の構築とその分子機構解明、学理確立を図る。項目2では、外部刺激に応答した格子エネルギーの空間伝播が実現可能なソフトクリスタルを創製し、その作用機序の解明を行う。両項目を踏まえ、超高感度刺激応答材料の機能開拓への展開を図る。項目1については、結晶内での化学発光の検討に適した反応基質として、アダマンタン構造を有する3系統の安定ジオキセタン誘導体の合成経路を最適化し、有機合成を達成した。これらを用いて結晶試料の加熱による化学発光観測の実験基盤を構築した。結晶内での化学発光反応を追跡し、解析した結果、エネルギー移動、結晶構造依存型反応性、励起分子の関わる分子間相互作用に関する結晶特有の化学発光特性を見出すに至った。これらの知見の論文発表準備を進めつつ、新たな現象の起源に関する検討を深め、学理の構築を進めている。さらに架橋型過酸化物由来の化学発光について反応追跡する実験基盤を整えた。化学発光基質に連結する蛍光色素として、生物発光体を模倣した化合物を系統的に合成し、結晶状態での蛍光性を調整するための分子設計指針を見出した。項目2では、結晶中での励起分子挙動を顕微鏡と時間分解分光法で精密観測する体制を整えている。観測系構築で用いる試料として、固体状態で強発光性を示す卑金属錯体の発光材料が、結晶多形により多様な発光色調を示すことを見出し、特許出願を果たした。この試料を用いて、錯体の集合様式と励起分子挙動の相関に関する知見を得るために上記観測を進めた。発光性ベイポクロミズムに関しては、ソフトクリスタル内部において光が誘起する微小な構造変化に応じて発光特性が著しく変化することを見出し、論文発表の準備を進めている。ソフトクリスタル化学発光系を構築するための安定ジオキセタン誘導体と架橋型過酸化物の合成経路を確立でき、全グループの発光基質を用いて、結晶状態での化学発光特性を検討する基盤を整えることができた。実際に、発光基質の化学発光追跡から、結晶特有の化学発光特性を見出した。発光基質と合成中間体の反応性、安定性、単離精製法についてのノウハウに関する知見に加え、結晶中での化学発光に関する知見が加わったことで、ソフトクリスタル化学発光系の学理の探求に適した基質設計指針の具体化と改善が可能となり、新たな分子設計に基づく研究推進が可能となった。また、基本的な化学発光反応の追跡は、結晶試料の加熱による発光観測で行われる。試料加熱装置と、紫外可視領域および近赤外領域を観測できる2台の光検出器を組み合わせた化学発光観測系を構築して、反応追跡体制を整えた。これにより結晶特有の化学発光特性の探索が定常的に進められるようになった。一方、ソフトクリスタル化学発光の精密観測では、結晶を高い空間分解能で観察し、かつ、時間発展する発光のうち化学発光成分のみを抽出した上で、時間分解分光観測する必要がある。微弱な化学発光系の場合、分光に伴う検出強度の低下が空間分解能に深刻な影響を及ぼすことも予想される。そこで、主に高エネルギー発光(青色)を示す化学発光種から、近傍のソフトクリスタル発光系へのエネルギー移動により低エネルギー発光(緑色や橙色)として観測できれば、発光の再吸収や自己消光等の問題が回避できる上、超解像顕微鏡での観測も容易になる。そのために、エネルギー移動発光に有利な低エネルギーd-d遷移に基づく発光を示し、結晶多形により緑色や橙色の発光を示すマンガン錯体分子性結晶を見出した。その発光機構の解明は、領域内のX線分析の専門家との共同研究によって進行している。以上より、おおむね順調に進展していると判断した。3系統の安定ジオキセタン誘導体と架橋型過酸化物による発光基質の系統的な分子構造改変を行い、結晶中での反応性と分子集積構造、発光特性について、相互の相関性に関する情報を収集して、ソフトクリスタル化学発光系のさらなる開拓と分子機構の解明を進め、学理構築を進める。発光性金属錯体を用いた電子移動化学発光系の検討を深めると共に、発光基質への適切な側鎖導入により刺激応答性の付与に着手する。結晶特有の化学発光特性は、溶液中での基本的な化学発光と結晶状態での化学発光の比較から明らかとなる。可視紫外領域と近赤外領域のそれぞれで発光する基質について、結晶状態の加熱と刺激付与に応じた発光観測を進める。これらの発光測定装置をすでに組み立てているが、反応の温度依存性などを追跡しやすくするための試料室の改良を進める。結晶特有の化学発光特性の評価では、反応進行度と発光性の相関を正確に追跡する必要がある。そのため、化学発光観測に加え、反応進行に伴う結晶状態の顕微鏡観察と熱分析、粉末X線回折観測を組合せた検討について、領域内の共同研究体制を活用して進める。また、新規に見出したマンガン錯体分子性結晶は、結晶溶媒の出入りで発光色が可逆的に変化する発光性ベイポクロミズムを示す。この性質を利用して、有機溶媒蒸気下や共存下による化学発光分子とのエネルギー移動過程への影響や、ソフトクリスタルの構造ダイナミクスと共役したエネルギー移動ダイナミクスについて検討を進める。さらに、予備実験で、多核銅錯体分子性結晶が可逆的な発光性ベイポクロミズム現象を示し、その溶媒の吸脱着が、いずれも秒単位で起こることを見出している。

既存の発光性ベイポクロミズムに比べて前例のない超高速現象であることから、ドミノ倒し的構造相転移が起きている可能性があり、その機構解明を領域内の共同研究体制を活用して進める。本研究では、ソフトクリスタル化学発光系の創製と刺激応答発現、作用機序解明と時空間制御を目指す。具体的に、項目1では、結晶化学発光を示す反応系の構築とその分子機構解明、学理確立を図る。項目2では、外部刺激に応答した格子エネルギーの空間伝播が実現可能なソフトクリスタルを創製し、その作用機序の解明を行う。以上より、超高感度刺激応答材料の機能開拓への展開を図る。項目1では、結晶内での化学発光が期待される反応基質として、アダマンタン構造を含む3系統の安定ジオキセタン類および二環性過酸化物の有機合成を進めた。結晶構造制御に働く側鎖の導入が有効であり、置換フェニル基、縮環芳香族、蛍光色素の側鎖導入を検討した。その結果、1系統について縮環芳香族側鎖に有する安定ジオキセタン誘導体を合成し、エネルギー移動による結晶特有の化学発光特性が確認できた。残りの発光基質についても、安定性の保持、単離法の確立、溶解度の改善への指針を固めることができ、合成経路の最適化に至った。側鎖用の蛍光色素として、ホタル発光体に基づく高効率蛍光を示す色素を合成し、溶液中の高効率蛍光を示す分子設計指針を確立し、結晶中でも蛍光性を保持するための要因を見出した。項目2では、格子エネルギーが互いに僅かに異なる金属錯体分子性結晶について、それらの近接したポテンシャル極小値を外部因子によって昇降させることでマクロな構造変化を引き起こせば、結晶相の相互変換が可能になると考えた。特に、配位子場分裂の微小変化に鋭敏に応答して発光特性が変化する系に着目した。その結果、発光性ベイポクロミズムを示す新しい金属錯体分子性結晶系を見出し、その結晶化制御により、これまで困難とされてきた「結晶多形のほぼ完全な作り分け」に成功すると共に、それらの発光が互いに補色関係にある大きな色度の違いを示すことを見出した。ソフトクリスタル化学発光系の候補となる3系統の安定ジオキセタン類および二環性過酸化物の有機合成を開始し、発光基質のすべてのグループにおける合成経路を一通り確認することができた。この合成を通じて発光基質及び合成中間体の反応性、安定性、溶解度の調整法および単離精製法についてのノウハウを蓄積でき、今後の基質合成における研究推進の基盤を固めることができた。発光基質グループの1系統については結晶状態での化学発光の観測に成功した。本基質は結晶の過熱により紫外可視領域に発光を示す。この発光観測を行うため、結晶加熱しながら発光計測できる測定装置を立ち上げ、測定条件の工夫すべきポイントについての経験を蓄積できた。今後は全ての系統での多様な発光基質を合成し、それらのソフトクリスタル化学発光の観測を行ってゆく。それら観測条件を最適化するための基盤を築くことができた。外部刺激に応答した格子エネルギーの空間伝播を実現するための金属錯体として、外部刺激で誘起された配位子場分裂の微小変化を発光特性変化で観測できる金属錯体の合成に成功した。この成果により、ソフトクリスタル発光に最適な錯体設計の指針が得られ、併せて本金属錯体を用いた、学理探求に向けた格子エネルギーの空間伝播の観測実験の基盤を築くことができた。
連関解析を利用したイネいもち病菌抵抗性関連遺伝子の単離

1.イネもみ枯れ細菌病は、近年、水稲栽培において大きな問題となっている。そこで、イネもみ枯れ細菌病菌をイネに感染する実験系を確立した。さらに、イネもみ枯れ細菌病のIII型分泌システムを利用して、外来タンパク質をイネに導入する実験系を確立した。2.イネ品種20系統にイネもみ枯れ細菌病を接種し、感受性について差を示す系統を選抜した。品種「ひとめぼれ」はイネもみ枯れ細菌病に高度の抵抗性を示すのに対し、外国イネに感受性の高い品種を見いだした。そこで、「ひとめぼれ」と外国イネ間で交配後育成したRecomibinant Inbred Lines(RILs)を用いて、イネもみ枯れ細菌病抵抗性遺伝子の座上位置を同定するために、QTL解析を開始した。有用なQTLが同定できた場合には、直接品種母本として活用する。3.「ひとめぼれ」矮性変異体をインド稲と交配し、F2を得た。これらの分離個体を用いて、原因遺伝子のマッピングを進め、200Kb未満の領域に絞り込んだ。現在、突然変異体の全ゲノム解析により、候補SNPを同定し、原因遺伝子候補を同定する作業を進めている。候補遺伝子が同定できた場合には、相補性試験を実施し、原因遺伝子を単離する。さらに遺伝子機能について解析する。イネもみ枯れ細菌病菌のIII型分泌システムにより、いもち病菌エフェクター候補をイネ細胞に導入し、エフェクター効果を調査する。さらに、イネのもみ枯れ細菌病菌抵抗性QTLを同定する。ひとめぼれ矮生突然変異体の原因遺伝子を同定する。これらについて、すべて論文として公表する。さらに、イネもみ枯れ細菌病のIII型分泌システムを利用して、外来タンパク質をイネに導入する実験系の確立に取り組んだ。現在までに、予備実験として、ベンサミアナタバコに感染させたイネもみ枯れ細菌病において、いもち病菌エフェクタータンパク質AVR-Pikを発現させることに成功した。今後、イネを材料にして、この実験系が確立できれば、イネいち病菌のエフェクターをイネ細胞内に導入して反応を観察する実験に使用する予定である。2.「ひとめぼれ」突然変異系統群の中から、イネもみ枯れ細菌病に抵抗性を示す突然変異系統を選抜した。現在までに、3系統が得られた。今後、突然変異系統を「ひとめぼれ」に戻し交雑し、F2において次世代シーケンサーによる全ゲノム解析を行い、原因遺伝子同定の作業を進める。突然変異系統の抵抗性に実用性があるかどうかを検討し、有用な場合には、直接品種母本として活用する。3.「ひとめぼれ」突然変異系統群の中から、矮性変異体を単離した。これらの系統をインド稲と交配し、F2を得た。これらの分離個体を用いて、原因遺伝子のマッピングを進め、それぞれ200Kb未満の領域に絞り込んだ。今後、突然変異体の全ゲノム解析により、候補SNPを同定し、原因遺伝子候補を同定する。さらに、相補性試験を実施し、原因遺伝子を単離する。
疎水性相互作用を利用した高機能性分子による細胞内分子のリアルタイム機能制御

MGIP_3のCALI用プローブとしての有効性を検討するために,モルモットの平滑筋組織を用いてCALIを行った.組織標本にMGIP_3を添加しレーザーを照射すると,IP_3によるCa^<2+>放出活性に抑制がみられた.この時、Ca^<2+>ストアへのCa^<2+>取り込み速度やストアからのCa^<2+>漏出速度に変化はみられなかった.一方何も添加しない時,高濃度のIP_3をMGIP_3とに添加した時(競合阻害),CMGやMGIP_3'を添加した時にはレーザー照射による不活性化は起こらなかった.次に,光学系を再構築し,シングルセルレベルでレーザー照射できる系を作製した.この結果,レーザーを照射した細胞内のIP_3受容体のみ不活化することに成功した.以上の実験から,合成小分子プローブ2bを用いたCALIにより,IP_3受容体の機能を特異的に抑制できる事が示された.合成小分子CALIの成功はこれがはじめてであり,生体内分子の機能解明の手段として非常に有用となる事が期待される.MGIP_3のCALI用プローブとしての有効性を検討するために,モルモットの平滑筋組織を用いてCALIを行った.組織標本にMGIP_3を添加しレーザーを照射すると,IP_3によるCa^<2+>放出活性に抑制がみられた.この時、Ca^<2+>ストアへのCa^<2+>取り込み速度やストアからのCa^<2+>漏出速度に変化はみられなかった.一方何も添加しない時,高濃度のIP_3をMGIP_3とに添加した時(競合阻害),CMGやMGIP_3'を添加した時にはレーザー照射による不活性化は起こらなかった.次に,光学系を再構築し,シングルセルレベルでレーザー照射できる系を作製した.この結果,レーザーを照射した細胞内のIP_3受容体のみ不活化することに成功した.以上の実験から,合成小分子プローブ2bを用いたCALIにより,IP_3受容体の機能を特異的に抑制できる事が示された.合成小分子CALIの成功はこれがはじめてであり,生体内分子の機能解明の手段として非常に有用となる事が期待される.
沿岸・汽水域生態系における人間活動の影響評価：地域的知識の活用

海洋沿岸域と汽水域は、歴史的な人間活動により生息地の劣化と消失が著しい生態系である。従来、生息地の劣化と消失が生物に与える影響は、主に20世紀以降、生態学的手法で評価されてきた。一方、地域知(古文書・地域伝承など)は過去の生息地や生物相に関する情報を少なからず含んでいるが、これらの情報が生態学者に活用された事例はほとんどなかった。本研究では、人間活動に基づく沿岸域の生息地の改変が生物に与えた影響の評価を、地域知を積極的に活用して行うことを目的とした。地域知が豊富に残る三方五湖(福井県)と錦江湾(鹿児島県)をモデルサイトに選定し、初年度(2018年)は、過去の沿岸生息地に関する地域知の調査とデータベース化を行った。歴史情報は郷土資料(県史・市史・町史)と古文書集を主なソースとし、近年の情報は公開されている論文や報告書をソースとした。三方五湖では防災(洪水対策)を目的とした地形改変が生息環境の改変と生息地の消失に結びついている事例が多かった。1662年の大地震後に行われた河川改修では約200ha(全水表面積の15.6%)の沿岸域が田地化により消失し、1974年の洪水後に行われた護岸化工事では、湖岸延長の約80%が垂直護岸化した。いずれの場合も漁場の縮小を伴っていた。また、1934年に行われた河川改修は湖水の高塩分化を引き起こし、これに伴い上流側の3湖沼では汽水性生物が分布域を拡大した。一方、錦江湾の鹿児島市エリアでは江戸時代(1600年代)以降、産業用地(塩田や工業団地など)の造成を目的とした埋立ての事例が多かった。江戸時代の埋立ては城下を中心に行われたが、明治以降は埋立て地が旧城下外に拡大し、昭和時代の中期以降になると沿岸生息地の消失が急速に進んだ。以上より、両サイトともに、人間活動に基づく沿岸生息地の消失は1600年代以降に著しくなったことが示唆された。計画のとおり、2018年度は三方五湖と錦江湾で地域知調査を行い、1600年代以降の人間活動に基づく沿岸域と汽水域の生息地の消失と改変、および、これに伴う沿岸環境と生物相の変化に関する主要な情報を収集することができた。得られた情報のデータベース化も進行中である。予定どおり、次年度(2019年)も人間活動に基づく沿岸生息地の消失・改変とこれに伴う沿岸環境と生物相の変化に関する歴史情報の調査を継続し、収集した情報のデータベース化を進める。加えて、収集したデータを活用して、人間活動に基づく沿岸環境の改変が生物に与えた影響の評価を開始する。最終年度(2020年)には、今日の生態系保全に活用可能な地域知の社会実装を試みる予定である。

加えて、収集したデータを活用して、人間活動に基づく沿岸環境の改変が生物に与えた影響の評価を開始する。最終年度(2020年)には、今日の生態系保全に活用可能な地域知の社会実装を試みる予定である。研究補助員の選定に時間を要したため、十分な作業時間を確保することができず、当初に予定していた補助作業を完了することができなかった。次年度は、前年度に完了できなかった作業を追加して研究補助員を雇用する。
高次イプチセンの合成と機能開拓

機能性π共役系分子としてペンタセン類は一重項分裂など独特な物性を基盤とする有機材料への応用が可能である。申請者らはこれまでイソベンゾフランを高反応性合成ブロックとして用いることにより、置換ペンタセン誘導体など様々な多環式芳香族化合物を自在に構築してきた。本研究ではプロペラ型イソベンゾフランの選択的官能基変換を行い新規三次元ヘテロアセン類の合成および機能開拓を目指す。具体的には、イプチセンの非対称化による多様な合成ブロックの開発し、高次イプチセンの合成および物性評価を行う。本研究により開発される新規三次元π共役分子の光化学・電気化学的物性を応用し、未来有機機能性材料の創製への展開が期待される。
海産渦鞭毛藻類のシストの休眠に関する研究

1.岩手県大船渡湾において周年にわたって環境要因の測定、渦鞭毛藻Protogonyaulax tamarensisとP.catenellaの游泳細胞・接合子の計数ならびに垂下式トラップによるシストの採集を行った。両種はそれぞれ主に46月と811月に発生していたが、出現時の両種の細胞密度と各環境要因との間には、一次回帰分析では有意な関係は見られなかった。この原因としては、両種の増殖が種固有の生物学的要因により強く左右されていることが考えられた。2.採集されたシストを材料として、その発芽特性を温度条件ならびに保存期間との関係から検討したところ、保存期間が長くなるにつれて培養開始後発芽するまでの日数の変異幅が小さくなる傾向が認められた。これは、採集時にはその成熟程度に個体差のあったシストが、保存期間の経過に伴ってある成熟段階まで成熟し、その段階で停止しているためであると考えられた。この変化と同時に、発芽のモードが認められるまでの実験開始後の日数が、保存の長期化に伴って短くなる傾向が認められた。全体の発芽率は保存の長期化に伴い増加し、保存温度が高い程発芽率の急増する日数は短かかった。3.微分干渉顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いて、発芽に至るまでのシスト内の形態の変化を観察した。56月に採集したシストは、10月には大型の赤色体が全く見られなくなり、デンプン粒も大きくなると共にシストの帯状部分のみに認められるようになっていた。この変化と同時にシストの両長端の部分が褐色を呈してくることが確認された。10月以降には色素体が形成され、シストの外壁と原形質の間に隙間ができていた。4.発芽実験の結果からみると、実験開始時の色素体の有無により発芽時期に差がみられ、色素体が形成されている場合には発芽に要する日数は02日と極めて短かかった。発芽に至る日数が短かくなり始める時期は、色素体がシスト内に形成され始める時期と一致していた。岩手県大船渡湾と和歌山県田辺湾で渦鞭毛藻Protogonyaulaxの発生した58月に海中にトラップを垂下することにより,P.tamarensisとP.catenellaのシストを多量に採集することができた.この両種のシストの発芽能力の獲得時期を培養実験により調べた結果,前者は能力獲得まで数ヶ月間の休眠期間を有するのに対し,後者は休眠期間が明らかでなく,形成後直ちに発芽可能となることがわかった. 6月21日に大船渡湾で採集したシスト及びそのシストから得られた培養株の栄養細胞とテンポラリーシストを材料として,通常光学顕微鏡と蛍光顕微鏡により細胞内組識の差異について観察を行ったところ以下の緒点が認められた. 1.栄養細胞とテンポラリーシストには球状あるいは棒状の色素体が細胞中心から放射状に配列しているが,休眠期間にあるシストには色素体が認められない. 2.栄養細胞とテンポラリーシストには細胞中央に大きな核が認められるが,シストでは小さく位置も不鮮明である.3.シストは発芽能力の獲得に伴って全体が褐色を帯び,発芽直前には多数の色素体が形成されると共に,核が大きく明暸になる.

4.蛍光顕微鏡による観察にはB2(励起光の主波長495nm)とG(同546nm)が有効であり,波長の短いUV(同365nm),V(同405nm),BV(同436nm)では発色が弱く適さないことがわかった. 5.B2による観察ではシストは赤色粒だけが黄色く発色するが,栄養細胞とテンポラリーシストでは色素体が赤く発色し,その中に大きな12個の,あるいは小さな多数の黄色色素粒が認められた.6.Gによる観察ではシストは赤色粒だけが赤く発色し,栄養細胞とテンポラリーシストでは色素体が赤く発色していることが認められた.7.シストの成熟に伴い,シスト細胞内にB2及びGで発色する色素体が除々に形成され,発芽直前には栄養細胞とほとんど差のない状態になることがわかった.1.岩手県大船渡湾において周年にわたって環境要因の測定、渦鞭毛藻Protogonyaular tamarensisとP.cate nellaの遊泳細胞・接合子の計数ならびに垂下式トラップによるシストの採集を行った。両積はそれぞれ主に46月と811月に発生していたが、出現時の両積の細胞密度と各環境要因との間には、一次回帰分析では有意な関係は見られなかった。この原因としては、両種の増殖が種固有の生物学的要因により強く左右されていることが考えられた。2.採集されたシストを材料として、その発芽特性を温度条件ならびに保存期間との関係から検討したところ、保存期間が長くなるにつれて培養開始後発芽するまでの日数の変異幅が小さくなる傾向が認められた。これは、採集時にはその成熟程度に固体差のあったシストが、保存期間の経過に伴ってある成熟段階まで成熟し、その段階で停止しているためであると考えられた。この変化と同時に、発芽のモードが認められるまでの実験開始後の日数が、保存の長期化に伴って短くなる傾向が認められた。全体の発芽率は保存の長期化に伴い増加し、保存温度が高い程発芽率の急造する日数は短かった。3.微分干渉顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いて、発芽に至るまでのシスト内の形態の変化を観察した。56月に採集したシストは、10月には大型の赤色体が全く見られなくなり、デンプン粉も大きくなると共にシストの帯状部分のみに認められるようになっていた。この変化と同時にシストの両長端の部分が褐色を呈してくることが確認された。10月以降には色素体が形成され、シストの外壁と原形質の間に隙間ができていた。4.発芽実験の結果からみると、実験開始時の色素体の有無により発芽時期に差がみられ、色素体が形成されている場合には発芽に要する日数は02日と極めて短かかった。発芽に至る日数が短かくなり始める時期は、色素体がシスト内に形成され始める時期と一致していた。
情報活用能力の学習モデルに基づく普通教科「情報」の教材開発支援システム

本研究は、普通教科「情報」の指導モデルを構築し、教師を支援するシステムを開発することを目的とした。その際、情報の科学的な理解を支えるために、「情報的な見方・考え方」を指導することを提案した。そして、問題解決、表現・コミュニケーション、情報モラルの3つの分野で具体的な指導計画や教材を開発し、学習効果を検証した。また、指導に必要な教材を開発するためのシステムや教師教育のカリキュラムも開発した。具体的な成果は、以下の通りである。(1).「問題解決力」分野については、検討した指導計画や教材を用いて東工大工学部附属工高で試行授業を行った。また、得られた生徒の反応を分析し、「情報的な見方・考え方」の習得状況を評価する方法を検討して、教授活動ゲームを改良した教材開発環境と具体的教材を開発した。さらに、同様の教材を教員が開発できるようになるための指導法を検討したり、教師教育用のCD-ROM教材を開発した。(2).「表現・コミュニケーション能力」分野でも、問題解決力分野と同様のアプローチで教授活動ゲームを用いた教材の開発を行った。開発した教材は、調査データを表計算ソフトで分析しながら、プレゼンテーションやレポートにまとめるという課題である。また、これらの課題を行う前提として、「知識・理解」や「技能・表現」に関する個別学習教材も教授活動ゲームで開発した。(3).「情報モラル」分野については、「情報的な見方・考え方」を「合理的判断の知識」という形に置き換え、それと、「道徳的規範知識」「情報技術に関する知識」という「道徳的判断のための3種の知識」を組み合わせて適切な判断ができるように指導する方法を開発した。また、開発した指導法が、既存の「事例提示に基づく指導法」より効果的であることを比較検証して確認した。(4).以上に加え、評価問題データベースとBBSを核とした教材開発支援システムを開発した。本研究の目的は、普通教科「情報」の望ましい指導モデルを構築し、それに基づく教師支援システム、特に教材開発支援に焦点を当てたシステムを開発することである。今年度は、問題解決力と情報モラルの2つの能力に焦点を当て、それらを高める上で、情報技術の理解や情報的な見方・考え方が果たす役割を明らかにすることを目的に、実際に指導法を検討し、その指導に必要な教材を開発して、実践を行った。実践は、東京工業大学工学部附属工業高校で、「情報技術基礎」の授業時数を40時程度使って行った。問題解決力については、「情報B」の内容(1)(3)ア、および(4)アまでの内容を扱った。動機付けのための導入実習→「情報的な見方・考え方」を指導する座学→定着実習という基本的な指導スタイルをとり、知識や技能を教え込むより、「情報的な見方・考え方」を育成する指導を重視することで、問題解決に生徒が主体的に取り組み、代替案を工夫・発想しようとする傾向が見られるようになった。指導の効果は、毎回のワークシートなどを分析し、今後、より詳細に検討する必要がある。情報モラルについては、補講期間に1時限で行った。本研究では、松田の提案する「3種の知識の組み合わせによる情報モラル指導法」をとることを想定し、まず、これまでの他の実践で扱われてきた情報モラル課題を分析し、「合理的判断の知識」の枠組みを提案した。また、情報モラル課題に対する高校生の判断傾向を事前調査し、提案した「合理的判断の知識」の枠組みにそって、高校生が理解・納得しやすいように、課題を選択し、指導計画や教材を開発して、実践した。

調査や実践の結果、情報モラル判断に3種の知識の考え方をあてはめて考えることが適当であること、提案した枠組みにそって判断の指導をすることが効果的であることが検証できた。本研究の目的は、普通教科「情報」の望ましい指導モデルを構築し、それに基づく教師支援システム、特に教材開発支援に焦点を当てたシステムを開発することである。今年度は、昨年度に行った実践授業の成果をふまえ、まず、授業設計や教材開発に役立つようなCD-ROM教材を開発し、提供した。また、これを教職課程の「情報科教育法」の授業で活用し、有効性を検討した。その一方で、「情報的な見方・考え方」の習得に着目した評価方法や、それを支援するシステムの開発を検討した。「情報的な見方・考え方」は単に暗記しているだけでは問題解決に役立たない。したがって、その習得の程度を評価するには、与えられた課題解決を行う過程でそれらをどれだけ活用できたかを見る必要がある。その際、課題解決過程のプロトコル情報を簡便に収集・分析する方法が必要になる。本研究では、シミュレーション&ゲーミング手法を活用してその評価を行うことを考え、「情報」の授業実践でよく扱われている課題の中から、「合宿先の予約課題」と「プレゼンテーション作成課題」を具体的な教材例として、それらの課題に限定せずにある程度汎用に利用できるWebベースの授業実施支援システムを開発した。実際に、当該システムを用いた授業を実践し、「情報的な見方・考え方」の習得の程度を評価可能なこと、システムを用いた授業を行うことで、「レポート作成の困難度意識」の軽減に役立つことを確認した。さらに、情報モラルの指導についても、「3種の知識」による指導法と「事例中心」の指導法とを学習者の道徳的規範知識の習得程度や提示する教材例との交互作用に着目しながら比較するとともに、ゲーミング手法を活用した教材開発の準備を行った。今年度は研究最終年度であり、これまでの研究成果を整理・体系化しながら、高等学校現場や教員養成の場に研究成果を普及させるための方策等を検討した。具体的には、以下のことを行った。1.「問題解決力」分野については、平成13年度に東工大工学部附属工高で行った授業実践の課題を分析し、教授活動ゲームを用いて「情報的な見方・考え方」の習得状況を評価できるようにするための問題解決過程のモデル化を行った。また、その結果に基づき、情報Bの(1)ア、(3)アについて、具体的な教材の開発と評価実験を行った。2.さらに、1の課題分析・教材開発のモデルを情報科教育法の授業で学生に指導し、「情報的な見方・考え方」に着目した教材設計ができるようになることを確認した。3.「表現・コミュニケーション能力」分野についても、問題解決力分野と同様のアプローチで教授活動ゲームを用いた教材の開発を行った。具体的に開発した教材は、調査・実験データを表計算ソフトウェアを用いて分析しながら、プレゼンテーションやレポートにまとめるという課題である。また、これらの課題を行う前提として、「知識・理解」や「技能・表現」に関する評価・助言を行うための個別学習教材も教授活動ゲームで開発した。
脳における神経伝達物質受容体の定量的局在解析と遺伝子改変動物の作製

GABA_A受容体のgamma2サブユニットを生体の脳で可視化し、その分子数を計測するために、まずどのようなタグを付加したgamma2サブユニットが検出に有利でかつ機能の阻害がないかを検討した。昨年度は、GABAA受容体の機能と局在をin vitroの系で調べるために、gamma2サブユニットノックアウト動物からの海馬の初代培養細胞のGABA_A受容体のクラスター化の障害とそのレスキューについての実験を行った。正常動物からの培養では、GABA_A受容体はシナプスと思われる点状のクラスターを多数形成したが、gamma2サブユニットノックアウト動物からの培養では、明瞭なクラスターが失われていた。これに対してlentivirusを使ってgamma2サブユニットを発現させると、点状のクラスターを復活させることができた。現在、5種類のタグを導入したgamma2サブユニットを発現させるlentivirusの作成が終了し、クラスター形成をレスキューできるかどうかを検討中である。また、同じlentivirusをin vivoの脳内に注入し、検出できるかどうかを検討したところ、GFP単体では良好な蛍光標識を認めたものの、GFPを付加したgamma2サブユニットを発現させたものでは、蛍光が非常に弱く現在プロモーターを換えて検討中である。ただクラスタリングが回復するかどうかは、GFPの免疫染色で確認することが可能となった。電気生理学的なGABAA受容体チャネル活性の検証は、充分な蛍光量が得られるコンストラストを行い、正常な性質を確認した上で遺伝子改変動物の作製を開始する予定である。GABAA受容体のgamma2サブユニットを生体の脳で可視化し、その分子数を計測するためにまずタグを付加したgamma2サブユニットの機能とシナプス局在について検討し、正常な機能が保たれている事を確認した上で遺伝子改変動物の作製を行う。このために今年度は、GABAA受容体の機能と局在をin vitroの系で調べるために、gamma2サブユニットノックアウト動物からの海馬の初代培養細胞のGABAA受容体のクラスター化の障害とそのレスキューについての実験を行った。正常動物からの培養では、GABAA受容体はシナプスと思われる点状のクラスターを多数形成したが、gamma2サブユニットノックアウト動物からの培養では、明瞭なクラスターが失われていた。現在、複数のタグを導入したgamma2サブユニットを発現させるためのlentivirus vectorを構築中であり、これをノックアウト動物からの培養に感染させる事によって、クラスタリングが回復するかどうかを検討している。来年度はレスキューされた融合gamma2サブユニットを用いて、電気生理学的なGABAA受容体チャネル活性の検証を行い、正常な性質を確認した上で遺伝子改変動物の作製を開始するよていである。
喉頭の化学受容細胞－神経複合体による呼吸防御反射機構の解明

喉頭の化学受容細胞ー神経複合体の形態と機能を明らかにするために、免疫組織化学、カルシウムイメージングおよび呼吸反射実験を行った。喉頭粘膜のGNAT3陽性化学受容細胞は、孤在性に分布するもの、味蕾様の細胞集塊を形成するものに大別でき、P2X3陽性神経終末が接するのが観察された。生理学的には、キニーネにより一過性の細胞内Ca2+の上昇が記録され、喉頭粘膜へのキニーネによる刺激によって分時呼吸回数が減少した。この呼吸抑制反射は、両側の前喉頭神経切断により消失した。以上の結果から、喉頭の化学受容細胞は少なくとも苦み刺激で反応し、前喉頭神経を介して呼吸抑制反射を行う感覚受容器として働くことがわかった。実験動物としてラットを用い、喉頭粘膜における化学受容細胞の形態とその神経支配について検索した。その結果、喉頭粘膜にはα-gustducin陽性の孤在性化学受容細胞とSNAP25陽性の神経内分泌細胞の2種類の細胞が存在していることが明らかとなった。また、喉頭蓋および披裂喉頭蓋ひだ付近の重層扁平上皮の部分では、両細胞がクラスターを形成し、味蕾様構造を形成することがわかった。これらの感覚神経支配を検討したところ、いずれもcalcitonin gene-related peptide (CGRP)およびsubstance P (SP)陽性の細い神経終末と接触していること、P2X3 ATP受容体陽性の軸索末端部が扁平に拡がる神経終末に囲まれることがわかった。これらの神経は、孤在性に分布する細胞においても味蕾様構造においても分布が認められた。CGRP陽性神経終末およびSP陽性神経終末は侵害受容に関与する迷走神経由来のC線維と考えられた。一方で、P2X3陽性神経終末は化学受容細胞が分泌するATPによって興奮することが予測され、化学受容細胞が受容する刺激を中枢に伝達する際にATPが重要な役割を有することが示唆された。さらに、ATP陽性神経終末の軸索末端部には小胞性グルタミン酸トランスポーター(vGLUT1、vGLUT2、vGLUT3)が存在することが判明し、P2X3陽性神経終末は求心性のみならず遠心性に化学受容細胞を含む上皮細胞の機能を調節していることが示唆された。さらに、声門下腔には、微絨毛蛋白の一種であるvillin陽性の散在性細胞が多く認められた。Villin陽性細胞の性質は十分明らかになっていないが、CGRP陽性神経終末およびSP陽性神経終末との接触が認められることから感覚上皮細胞のサブクラスである可能性がある。平成27年度に、喉頭粘膜における形態学的分類と化学受容細胞ー神経複合体としての神経化学的特徴を明らかにして論文等で公表することができた。これらの形態学的解析の途上で、これまでに孤在性化学受容細胞と同一視されていたvillin陽性の刷子細胞が喉頭粘膜では全く異種の細胞であることがわかり、化学受容細胞であるか否かの検討を含めてさらに形態学的解析を進めることとした。化学受容細胞のカルシウムイメージングでは、形態学的解析により化学受容細胞が披裂軟骨を覆う粘膜に多く存在することを基に、同部位のスライスイメージングを行なうこととした。ラットを腹大動脈で放血殺後披裂軟骨部を剪刀で切り出し、マイクロスライサーを用いて100 μmの厚さのスライス標本を作製した。寒天包埋を行なうことにより、効果的に試料作成することが可能であった。これらの標本にFluo-4, AMを負荷して共焦点レーザー顕微鏡でタイムラプス記録を行なった。予備実験として、鼻粘膜呼吸部および気管粘膜の化学受容細胞での報告を参考として、刺激物質としての有力候補である苦味物質に対する反応性を検討した。スライス標本に1mMのキニーネ(苦味物質)を添加したところ、標本上にいくつかの細胞で細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を認めた。しかしながら、今回のイメージング実験の条件では細胞のサブクラスを同定するには解像度が十分でないこと、免疫組織化学による細胞同定では抗体浸透が十分でないことがわかり、細胞同定法にはさらに工夫が必要であるという課題が残った。電気生理学的実験では、生体の活動を記録するための予備実験を行なった。高感度増幅器を用いて、ステンレス双極電極による前喉頭神経の記録、圧電センサによる呼吸および心拍の記録、双極針電極による肋間筋筋電図の記録、大腿動脈カニューレによる血圧の記録が可能であることを確認した。前年度に引き続き、ラット喉頭粘膜の化学受容細胞の形態を詳細に検討した。喉頭粘膜上皮に分布する孤在性化学受容細胞、神経内分泌細胞および刷子細胞の免疫組織化学的特性を検索したところ、それぞれGNAT3、SNAP25およびVillinに対する抗体に対し陽性を示した。GNAT3陽性化学受容細胞は、管腔および基底部に向けた細胞質突起を有し、突起の一部が上皮表面に面していた。また、GNAT3陽性化学受容細胞PLCβ2およびIP3 receptor, type3に陽性を示した。SNAP25陽性神経内分泌細胞は細長い頂上部突起を有し、一部の細胞は5HTまたはCGRPに陽性だった。これらのことから、ラット喉頭粘膜の化学受容細胞はGNAT3陽性を示し、神経内分泌細胞および刷子細胞とは免疫組織化学的に完全に区別される独立した細胞群であることがわかった。さらに、GNAT3陽性細胞をホールマウント標本で観察したところ、GNAT3陽性SCCは、喉頭蓋喉頭面に広く分布し、披裂軟骨声帯突起を覆う粘膜

上皮に多かった。また、SCCには全ての細胞に共通して管腔側に伸長する突起が存在し、その突起の他には長い突起は持たないもの、基底部に細長い突起を1-2本伸ばすもの、細かく分岐した突起を持つものなど、多様な形態をもつものが認められた。また、SCCには核周囲や細胞質突起と接触する扁平なP2X3陽性神経終末や、細胞に巻きつく細い数珠状のCGRP陽性神経終末が観察された。また、カルシウムイメージングにより、喉頭粘膜上皮の苦み物質(キニーネ)に対する反応性を検索した。粘膜上皮中の一部の細胞でキニーネにより細胞内カルシウムイオン濃度が一過性に増加することがわかった。反応を示す細胞の多くは、細胞質突起に乏しい単純な形態をしていた。平成28年度の実験では、ホールマウント標本の作製と免疫組織化学、共焦点レーザー顕微鏡による観察により、喉頭粘膜では孤在性化学受容細胞、神経内分泌細胞および刷子細胞という全く性質を異にする三種の細胞が散在していることがわかった。また、孤在性化学受容細胞および神経内分泌細胞では、P2X3陽性神経終末が密に分布することから、ATPを介した信号伝達があると予測された。一方で、消化管に分布する刷子細胞に類似するタフト細胞は化学受容よりもむしろ免疫に関与することが報告されており、刷子細胞に対する神経分布が少ないことから、形態学的には化学受容能を有する可能性は低いと判断された。カルシウムイメージングでは標本の作製を改良し、スライサーを用いずに剪刃で粘膜を切り出し、コラゲナーゼによって前処理することにより効果的な実験が実現した。この工夫によって精度が高く再現性の良い実験が実現した。キニーネによって細胞内カルシウムを増加させる上皮細胞の免疫組織化学的同定では、蛍光抗体法を酵素抗体法に変更することで染色が可能となったが、酵素消化により上皮細胞間の接着が弱くなり細胞形態が保持できていないという問題点が明らかになった。さらに改良を要する。電気生理学的実験では、気管呼吸下で喉頭への刺激を行うことが可能となった。喉頭粘膜へのキニーネ刺激により、スパイロメトリーによる呼吸パラメータ、心電図、喉頭筋の筋電図の変化を取得する実験を開始している。一方で、ステンレス双極電極による前喉頭神経の記録は技術的に安定していない。喉頭の化学受容細胞ー神経複合体は、化学受容細胞と求心性神経終末で構成される感覚受容器である。本研究では、免疫組織化学的手法で喉頭粘膜に存在する化学受容細胞の形態、分布および感覚神経支配を明らかにするとともに、カルシウムイメージングと呼吸反射実験によって喉頭化学受容細胞ー神経複合体の機能的意義を解明することを目的とした。喉頭粘膜の化学受容細胞は、舌味蕾のII型細胞のマーカーであるGNAT3に対して陽性反応を示し、孤在性に分布するもの、味蕾様の細胞集塊を形成するものに大別できた。このうち、孤在性化学受容器は喉頭蓋軟骨および披裂軟骨を覆う粘膜に多く、側方にのびる2-3本の細長い突起を有するものと側方の突起が乏しいものが存在した。味蕾様構造は喉頭蓋辺縁部および披裂喉頭蓋ヒダに存在し、GNAT