hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ビクトリア褐炭の高度変換利用技術の開発

(2)液化反応のモデル物質による解析を行い、生成する長鎖アルカンやアルケンは芳香族カルボン酸エステルに由来することを明らかにし、その反応機構を示した。(3)ロイヤン褐炭について触煤を用いる急速熱分解とガス化でクリ-ンな気体および液体燃料の製造を試み、触煤が含酸素官能基の分解とCO_2ガス化を促進することを示した。(4)褐炭の熱分解過程での表面積、細孔構造と表面化学特性の変化を調べて熱分解条件と触煤ガス化活性との関係を明らかにし、表面含酸素官能基の役割を解明した。(5)ビクトリア褐炭から得られたチャ-を硫酸およびアンモニアで処理することによりSO_χやNO_X除去用の高機能性活性炭を製造する方法を示した。(6)核磁気共鳴熱分析法をビクトリア褐炭の加熱過程での分子構造の変化の研究に適用して固体相の他に2種の易動性相が存在することを始めて明らかにし、新しい速度論解析法を開発した。(7)核磁気共鳴熱分析法が褐炭と金属イオンや硫黄などの添加物との反応の追跡に有用であることを示した。(8)褐炭の酸素酸化生成物の分離分析に高速液体クロマトグラフィ-を用い、芳香族酸がイオン交換反応機構およびイオン対分配機構の両機構で分離されることを明らかにした。これらの成果は直接的に新しい石炭変換技術を提供するほか既に進められてきた各種の基礎的な研究と組み合わせることにより、変換方法を発展させ効率化させるのに有用である。例えば加熱に伴う分子挙動はチャ-やブリケットの製造はもちろん、液化や燃焼に対しても有用な知見を提供する。4.オ-ストラリア国内の石炭研究の情況に関する主な知見は次の通りである。(1)石炭資源としては極めて大量の埋蔵量を有し、国家の経済の基礎として充分認識されているが、オ-ストラリア国内での石炭に対する研究投資が停滞気味であり、産炭国として望ましくない状態にある。(2)オ-ストラリア内でも新しい石炭変換研究は、比較的少数の研究機関に限定され、石炭技術の大半は熱分解や燃焼などの現用技術にかかわる研究に向けられている。特に乾燥、ボイラ-燃焼時の灰分沈着が注目された。
多発性腎嚢胞の発生とその癌化に関する研究

1)透析腎の病態と嚢胞の形成:(1)長期透析を続けると小児患者では糸球体上皮に由来する細胞が増殖しembryonal hyperplasia of Bowman's capsular epitheliumが見られ、成人透析患者ではACDKを生ずる。成人のACDKに癌を発生する機序が、小児ではこのような幼若な細胞の増殖をもたらす可能性がある。(2)嚢胞壁はその抗原性から、近位のみならず遠位尿細管の性質をも示し、また特定の抗原の消失も見られた。(3)尿細管上皮の増殖にはEGF,FGF、IGF-1などが促進、TGF-βが抑制的に働くが、嚢胞液内のEGFはごく少量であり、TGF-βの多くは不活性型であった。液中のCFPAと嚢胞の大きさとに弱い相関が見られ、CFPAを持つ因子が嚢胞の増大に関与する可能性がある。(4)良好な腎機能を有している症例は、腎移植後経過年数と共に嚢胞が縮小した。2)嚢胞形成と発癌:(1)薬剤を用いたマウス嚢胞形成実験で、癌遺伝子のC-mycが一過性に出現した。(2)ras-P21抗体とレクチンを用いた検討からACDK嚢胞壁上皮には異形成化傾向が見られた。(3)嚢胞壁(液)におけるグルタオチン代謝が正常と大きく異なり、嚢胞では活性酸素毒性が発現しやすい状態が認められた。(4)癌を伴った嚢胞内液のIL-6濃度は、癌なし嚢胞より高く、腎癌増殖との関連性が示唆された。(5)ACDKに合併した腫瘍の起源は免疫組織化学的に近位尿細管であろうと推測され、組織型も良好であるが、ヒト正常近位尿細管に存在するWTL抗原は、嚢胞壁や癌組織にも認めなかった。3)疫学的・免疫学的検討:(1)透析患者の腎癌罹患率は高く、年令、性をマッチさせた一般住民と比べ6.3倍であった。特に3059歳の間で発現頻度が高かった。(2)嚢胞を伴う腎癌は全腎癌症例の4%で、男性に多く、嚢胞の種類としてはACDKや単純性、多房性腎嚢胞などが多かった。透析患者では腎癌は両側、多発性の傾向を示し、T_1以下で顆粒細胞型が多かった。(3)透析患者間ではACDK群と非ACDK群との間に細胞性免疫能の差異は認めなかった。(4)透析開始5年以下の患者では、健腎対照者にくらべ、サイトカインの産生能や細胞障害能の低下した症例が多く、癌発生促進因子として検討を要する。腎嚢胞形成のメカニズムと、嚢胞からの発癌に関与する因子について、現在以下のように研究が進められている。

1.ラットに腎嚢胞を発生させるDPAと、腎腫瘍発生因子物質で知られるEHENを併用し、嚢胞形成を示した腎組織における癌遺伝子c-myc、erb-2c、K-rasの発現について実験を進め、あわせてTNF receptorやFas抗原様蛋白の発現も検討中。(武居、小磯)2.ACDKに合併した腎癌の核DNA解析を行った結果、ACDK腎癌の全5例がdiploid patternを示した。細胞増殖状態の低いことが予想される。(津川)3.MDCK細胞をコラーゲンゲルに包理培養し、培養液にヒト腎嚢胞液を加えると、MDCK細胞が尿細管を形成することが観察された。従ってヒト腎胞液中に尿細管細胞への分化・促進因子が含まれると予想した。しかし既存の同因子である肝細胞増殖促進因子(HGF)はbioassayでは証明されていない。(斉藤)4.腎移植後の固有腎ACDKの形態学変化について、経時的にCTや超音波検査で調査中。(長谷川)5.腎の代償性肥大にも関与するとされるHGFのヒト腎嚢胞液中濃度をELISA法で測定したところ、proximaltypeの嚢胞で健常人の血中平均濃度の10倍近い高値を示し、分担研究者斉藤と異なった結果が得られた。(阿曽)6.腎嚢胞液中の抗酸化物グルタチオン(GSH)レベルとその分解酵素活性を測定し、腎発癌機構における活性酵素の影響を解析した。嚢胞腎におけるGSH濃度は低く、腎での酸化環元代謝が強く影響されていると考えられた。また制癌剤に起因する活性酵素の毒性が腎では発現しやすことも示唆された。(井上)7.嚢胞内の癌の発育に影響すると予想される各種因子のうちIL-6とFGFやEGFの測定法を検討し、各種嚢胞液を採取・存在中である。また血液透析開始前後の末梢血好中球を分離し、細胞中のIL-6-mRNAを同定する目的で、AGPO法を用いtoal RNAを抽出し保存している。(早川)(A)病態生化学、分子生物学的研究-【.encircled1.】ラットにDPA(多発生腎襄胞を高率に誘発する)とEHEN(腫瘍性病変を誘発)を投与し、腫瘍性病変と尿細管の拡張を組織学的に証明した。同時に同腎組織よりAGPC法によって全RNAを抽出し、がん遺伝子c-mycの発現変化をNorthern blot法で検討した。EHENとDPAの併用投与群において、EHENを初期に投与することで、腎c-myc発現の増強が認められた。【.encircled2.】イヌ腎上皮細胞由来のMDCK細胞をコラーゲン内で培養して襄胞形成モデルを確立した。襄胞形成促進因子としてEGF、インスリン様増殖因子-1と、ヒト腎襄胞液が同定された。後者の活性は熱、酸に不安定で前者とは異なると考えられた。【.encircled3.】癌を合併した襄胞液中には2種の癌腎細胞株の増殖を促進させる特別な増殖因子は存在しなかった。【.encircled4.】長時間作用型SODと腎指向性塩基性SODを開発した。特に後者は投与後すみやかに近位尿細管の刷子縁膜表面のプロテオグリカンに結合し、ついで細胞内に取り込まれることを確認した。腎の組織中活性酸素の消去による病態治療学的アプローチが可能となった。(B)免疫学的研究-【.encircled1.】透析開始後3年以内では患者の免疫能の低下が見られた。【.encircled2.】透析開始12時間後から患者血清IL-6の上昇する症例が見られた。患者末梢血単核細胞よりmRNAを分離し、RT-PCR法でcDNAを得、PCR反応後、内部コントロールGAPDHの増加との比較でmRNAを定量する方法を確立した。【.encircled3.】
Ｍｇ基非晶質合金を負極活物質とした高性能金属－空気電池の創製と発電制御因子の解明

本研究では、Mg基非晶質合金に着目し、金属ー空気電池用の新しい負極活物質の作製を試みた。種々のMg基急冷合金を作製し、Mg-Ca-Al三元合金で非晶質合金を作製可能であることを見出した。得られた急冷非晶質合金を金属ー空気電池に組み込み、その発電特性を調べた。その結果、Mg-Ca-Al急冷非晶質合金では従来材である純Mg材よりも高い放電容量が得られた。この値はリチウムイオン電池の放電容量を大幅に上回り、Mg非晶質合金が金属ー空気電池負極材としての可能性を有していることを示した。マグネシウム(Mg)は地球上に豊富に存在する。最近、地球環境・エネルギー問題の解決のため、この豊富なMg資源量に着目したMgー空気電池に期待が集まっている。本研究では、Mgー空気電池に使用する新しい負極材料としてMg基非晶質合金を検討した。Mg-Ca-Al合金やMg-Ni-Pd合金の急冷凝固薄帯を作製し、それらを負極材として用いて空気電池セルを作製してその発電量を調べた。まずMg85Ca10Al5急冷薄帯試料はX線回折法によりハローパターンのみが観察され、非晶質状態であることが確認された。また走査示差熱分析の結果、Mg85Ca10Al5非晶質合金の結晶化温度はTx=144.9°Cであった。放電量の測定では、Mg板の場合は319.2mWh/gであった。これに対してMg85Ca10Al5非晶質合金の放電容量は325.5mWh/gであり、Mg板の場合よりもわずかに放電量が上回った。Mg85Ca10Al5非晶質合金はMg含有量が85at%であるが、純Mg板(Mg100at%)よりも高い放電量を示すことが分かった。この値は一般的なリチウムイオン電池の放電容量約200mWh/gを大幅に超え、Mg電池の可能性を示すことが出来た。Mg90Ni5Pd5急冷薄帯試料の発電容量は、74.3mWh/gと極めて少なかった。目視では電解液中で著しく溶解していることが見られたので、恐らく、大部分が電解液中に放電されるなどのロスが生じたようであった。また、Mg90Ni5Pd5合金では、発電後の電解液は黒色となった。これは非常に細かい微粒子が生成されたからと思われる。X線分析を行ったところ、この黒色沈殿物はMg(OH)2と(Ni, Pd)の粒子から成ることが分かった。Mg90Ni5Pd5合金の溶解は、脱合金化によるNi、Pd金属微粒子の作製法としても有効であることが示唆された。例えば国内の鉱山にも未利用の資源が存在し、また、海水1キログラム中にもMgが1グラム以上含まれるなど、事実上、資源は無尽蔵である。本研究では、Mgー空気電池に使用する新しい負極材料としてMg基非晶質合金をターゲットとして、その組成の最適化、溶解過程の解明により優れた放電特性を有するMgー空気電池を創製することを目的としている。まずH24年度は、液体急冷法および高周波熔解鋳造法を用いて試料を作製した。液体急冷法を用いてMg-Ni-Pd非晶質合金急冷薄帯試料(厚さ50micron)を作製した。また、高周波熔解鋳造法を用いてMg-Y-CuおよびMg-Y-Cu-Pd非晶質合金丸棒(直径2mm)を作製し、電池発電試験に使用した。電解液は18wt%NaCl水溶液、空気極にはカーボンフェルトを使用した。その結果、Mg-Ni-Pd非晶質合金急冷薄帯を負極に使用した場合、約1.1Vの電圧が発生した。また、Mg-Y-Cu非晶質合金、Mg-Y-Cu-Pd非晶質合金丸棒材の場合は、2Ωの抵抗を使用したところ、それぞれ5mW、50μWの電力が発生した。Mg-Y-Cu-Pd非晶質合金試料はPdの添加効果により耐食性が向上し、溶解電流が小さくなったと考えられる。他にMg-Ca-Al合金も作製しており、現在試験遂行中である。現在までの研究においては、Mgに添加する元素の選定を軸に進めてきた。その中で耐食性を向上させる添加元素、低下させる添加元素の知識がようやく蓄積されてきたところである。

今後、負極材料としてのMg基合金の組成が最適化され、放電容量の向上に結び付くと期待している。昨年度から開始している材料探索を引き続き行い、出来るだけ負極特性に優れた非晶質合金を見出すと共に、高周波熔解鋳造法に加えてさらに今年度からは粉末ガスアトマイズ法等を用いて粉末・粒子形状サンプルを作製し、負極特性を調べる。このようにして得られた新規Mg基非晶質合金サンプルを使用し、金属ー空気電池の発電特性試験(放電試験、電流ー電圧試験など)を行う。さらに上記評価結果を受けて、正極材や電解質等の電池の他の構成要素についても検討を加える予定である。計画の変更を伴わない。次年度の研究費としては、主に金属素材や電池作製用資材などの実験に伴う消耗品(金属地金類、薬品類、ガス類、試料作製装置用消耗品、評価冶具作製)の補充が主なものである。旅費については、成果発表とともに研究者交流や情報収集を目的として、計上している。
亜鉛クロロフィルが光合成器官で機能するために必要とするタンパク質構造

R.sulfidophilumの光合成中心反応遺伝子の一部を薬剤耐性遺伝子に組み替えた。変異株には光合成器官合成能が見られず、反応中心遺伝子も欠失していることが確認された。(1)R.sulfidophilumの反応中心遺伝子を挿入した広宿主域プラスミドを上記R.sulfidophilum光合成反応中心欠損株に導入したところ、光合成器官合成能が回復した。(2)しかし、Acidiphilium rubrumの光合成反応中心遺伝子を挿入した広宿主域プラスミドを導入したところ、反応中心遺伝子の発現は見られなかった。lacZレポーター遺伝子を用いたmRNAの解析により、R.sulfidophilumの反応中心遺伝子の発現には上流の3つのプロモーターが働いていることが明らかになった。A.rubrumの反応中心遺伝子がR.sulfidophilum中で発現しない原因はプロモーター配列の違いによると考えられる。3で明らかとなったR.sulfidophilumのプロモーター配列をA.rubrum反応中心遺伝子に導入し形質転換を試みる必要がある。また、2(1)により、R.sulfidophilum反応中心遺伝子に対する形質転換系が確立した。亜鉛型バクテリオクロロフィルを持つA.rubrum反応中心に特異的なアミノ酸をR.sulfidophilum反応中心に導入することにより、クロロフィルと色素タンパク質間の相互作用の研究を展開する予定である。A.rubrumゲノムDNAのコスミドライブラリーを作成し、すでに得られている反応中心遺伝子をプローブとして約11kbの周辺DNA領域をクローニングした。このDNA断片の塩基配列を決定したところ、反応中心遺伝子の上流部分に他の紅色細菌と同様にバクテリオクロロフィル合成遺伝子群(bchCXYZ)が見られた。(1)各種抗生物質に対する抵抗性を調べたところ、A.rubrumはクロラムフェニコールとアンピシリンに対し感受性であった。そこでA.rubrumの反応中心遺伝子をこれらの抗生物質に対する耐性遺伝子に置き換えたプラスミドを作成し、エレクトロポレーションおよび接合伝達による遺伝子導入・相同組み替えを試みた。(2)亜鉛クロロフィルを合成しない通常の光合成細菌Rubrivivax geatinosusおよびRhodovulum sulfidophilumの反応中心遺伝子を抗生物質耐性遺伝子に置き換えたプラスミドを作成した。また、R.gelatinosusの反応中心遺伝子欠損株に広宿主域プラスミドに挿入した同菌の光合成遺伝子を導入したところ光合成機能を回復した。1の結果から、亜鉛クロロフィルを利用する好気性光合成細菌A.rubrumにおいてそれを合成する酵素遺伝子は通常の光合成細菌のものと際だった違いはないことが示唆された。2(1)で作成したプラスミドによるA.rubrum反応中心欠損株の作成は、本菌が極端な好酸性であるため困難が予想される。平行してR.gelatinosus又はR.sulfidophilum反応中心欠損株を宿主としたA.rubrum反応中心遺伝子の発現および色素近傍アミノ酸に対する変異導入を行うことで亜鉛クロロフィルと色素タンパク質問の相互作用がより効果的に研究できると思われる。
IL12遺伝子導入による癌免疫療法の基礎的研究

供与されたマウスIL12遺伝子のcDNA部分を制限酵素にて切り出しExpression vectorに組み変えた。この組み替えDNAをマウス腎癌細胞株にカルシウム沈殿法にてTransfectionし、薬剤によりSelection後、多数のTransformantを得た。おのおののTransformantの培養上清を採取、IL12分泌能をBioassayを用い検討、StableなIL12分泌細胞株を何種類か得た。得られたIL12分泌細胞株をマウスに皮下接種しその造腫瘍性につき検討した。Expression vectorのみをTransfectionしたControlの細胞株が母細胞と同様な増殖を示したのに対し、IL12分泌細胞株は同系マウスに完全拒絶された。さらに同細胞の癌ワクチンとしての有用性につき検討した。MMC処理したIL12分泌細胞株は同時に接種した母細胞の増殖を抑制した。さらに当科においてFGF2をTransfectionすることにより得られたRenCa高転移能細胞株を用いIL12分泌細胞株がワクチンとして転移を抑制するか否かについて実験を行った。この高転移能細胞株は尾静脈より投与することにより多数の肺転移巣を形成する。MMC処理したIL12分泌細胞株をワクチンとして皮下に投与することにより転移巣の数は著明に抑制された。今後、ヌードマウス、あるいは種々の抗体を用いることによりある特定の免疫担当細胞を欠損させたマウスを作製し、各種実験を行うことによりeffector cellの解析を行う予定である。
筋幹細胞の休止期を保つためのメカニズムの解明

デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、現在のところ根治治療はない。我々の目的は、筋分化を促進して筋ジストロフィーを治療することにある。筋分化の過程で副甲状腺ホルモンレセプタータイプ1(PTH1R)が重要な役割をしていることを示した。PTH1Rは副甲状腺ホルモン(PTH)のレセプターである。そこで、筋ジストロフィーのモデルマウス(mdx)にPTHを投与した。その結果、PTHを投与されたmdxは筋力及び筋組織が回復しているのが分かった。また、PTHが投与されたmdxの骨格筋では、筋収縮に関連する遺伝子の発現量が増えていた。以上の結果よりPTHは筋ジストロフィーなどの筋疾患に有効な治療法の1つである。Duchenne型筋ジストロフィーは、現在のところ根治治療はない。以前、我々はTet-Offシステムを利用して、ドキシサイクリン(Dox)を除去することにより、MyoD遺伝子を発現させることのできるマウスES細胞(ZHTc6-MyoD)を作製している。そのZHTc6-MyoDは、培養液よりDoxを除去しても、すべての細胞が筋分化するわけでなく、一部の細胞は筋衛星細胞の休止状態と同じ様に未熟の状態を保ちコロニーを形成する。ZHTc6-MyoDと分化誘導したZHTc6-MyoDのコロニーを網羅的DNAareiにより比較検討した結果、副甲状腺ホルモンレセプター1(PTH1R)がZHTc6-MyoDのコロニーでは高発現を示した。ZHTc6-MyoDの筋分化の過程でsiRNAによりPTH1Rを発現抑制すると、多くの細胞は死滅した。また、ZHTc6-MyoDの分化培地に副甲状腺ホルモン(PTH)を入れることにより、マイオチューブになる期間が2日間短縮された。筋ジストロフィーのモデルマウス(mdx)の筋組織では、PTH1Rの発現が筋衛星細胞とほぼ一致して見られた。60μg/kgのPTHをmdxに毎日注射した結果、ハンギングテストでは生食投与mdx(n=7)では49.5±44.9秒、PTH投与mdx(n-6)では132±61.6秒、100分間のトレッドミル検査では正常マウス(n=5)で1486±7.4 m、生食投与mdxでは425±190 m、PTH投与mdx(n-6)では843.6±352 mと、PTH投与群は有意の差をもって筋力の改善をみた。よって、PTHは筋分化を促進して、筋ジストロフィーなどの筋疾患に有効な治療法の1つである。この研究の目的は、筋組織にある筋線維の基である筋衛星細胞を刺激して、筋分化を促進することにより、筋ジストロフィーの治療薬の開発することにある。我々はTet-Offシステムを利用して、ドキシサイクリン(Dox)を除去することにより、MyoD遺伝子を発現させることのできるマウスES細胞(ZHTc6-MyoD)を作製している。この細胞はDoxを培地から除去することにより、高率に筋分化が可能である。そのZHTc6-MyoD細胞において、MyoDの発現がしていない未分化なZHTc6-MyoD細胞[ZHTc6-MyoD(MyoD-)細胞]と、Doxを除去してMyoDが発現しているにも関わらず未分化の状態を保っている(休止の状態)ZHTc6-MyoD細胞[ZHTc6-MyoD(MyoD+)細胞]において、網羅的DNAマイクロアレイを用いて遺伝子の発現を比較検討した結果、Aと言うタンパクに着目した。AはZHTc6-MyoD(MyoD+)細胞で高発現をしていた。ZHTc6-MyoD(MyoD-)細胞をDoxを除去して筋分化を誘導する際にsiRNAでAの発現を抑制すると筋分化を抑制され、また、ヒトの不死化された筋芽細胞をFBSの濃度を下げて分化誘導する際に、Aを刺激するとマイオチューブの形成が大きくなり、筋収縮まで分化が進むことが認められた。このことは、Aを刺激することで、筋ジストロフィーの治療薬となり得ることを示唆している。Aに関しては特許出願を予定している。そのZHTc6-MyoDの筋分化を調べた結果、副甲状腺ホルモン

レセプター1(PTH1R)が未分化の筋細胞に発現していることを示し、副甲状腺ホルモン(PTH)は筋分化を誘導する可能性を示した。よって、PTHは筋ジストロフィーなどの治療に応用可能であることを示唆した。今年度は筋ジストロフィーのモデルマウス(mdx)にPTHを投与した骨格筋と投与していない骨格筋よりRNAを抽出して、それぞれの骨格筋の中のRNAの発現をGneChip mouse Gne 2.0 ST array(フィルジェン)を用いて比較した。PTH投与群で、有意の差を持って1.5倍以上の増加した発現を認めた遺伝子のpathwayは、骨格筋の収縮に関わる遺伝子でmyosin heavy chainのMyh3, 7, tropomyosinのTpm3, Troponin-TのTnnt1,2, troponin-1のTnni1, Troponin-CのTnnc1, Myosin light chainのmyl2, 3であった。これらの結果より、PTHが筋の収縮に関するタンパクを増やし筋力を増加させている可能性を示した。また、osteoclast関連の遺伝子ではosteopontin, Catepsin Kが上昇していた。これらはPTHを投与することにより増加することが考えられる。また、PTHの骨吸収の際に破骨細胞が放出する酸によりTGF-βは活性されるが、その関連タンパクでTnbs1, Spp1, Fosの増加も認めた。しかし、骨格筋の分化に関する遺伝子の増加はmyogenin以外に認めなかった。今後、PTHR1のノックアウトマウスの解析などにより、PTHの骨格筋への影響を調べ、筋ジストロフィーなどの筋力低下にたいする治療の有効性を検討していきたい。再生医療in Vitroおよびin vivoにおいて、副甲状腺ホルモンが筋分化を促進することを証明した。平成25年度は熊本大学と特許を申請しており、学会発表、論文の公開ができなかった。しかし、ようやく特許に関しては、既に出願済みの状態となり、今後、論文の公開や学会での発表をすすめていきたい。平成25年度は海外などでの学会発表を予定していたが、以上の理由で出来なかった。また、委託研究も業者が受付を延期しており、その分の予算も残ってしまった。Aと言うタンパクに着目し、研究を進めている。in vitroでは、筋芽細胞を用いて、Aが筋の発生に関与することが解明された。また、このAに関しては、筋細胞の成長に関わる報告は今までなく、世界で初めての報告となる。DNAアレイでの他の候補遺伝子も調べる予定であったが、Aによりこの研究の目的である筋細胞への分化促進作用を認めたため、Aだけの研究成果となる。今後、筋疾患の治療の可能性が示唆された。副甲状腺ホルモン(PTH)が、どのようなパスウェイで筋分化を促進しているのかを研究してくと同時に、筋ジストロフィーの治療にPTHが臨床応用可能かどうかについての検討をすすめる。具体的には、新たな予算を獲得して、以下のことを予定している。1、副甲状腺1型受容体のコンディショナルノックアウトマウスの作製(ノックアウトマウスは胎生致死)2、上記のマウスを使用して、副甲状腺がどのような経路で骨格筋の分化に関わっているのか解析する。3、臨床応用に向けて、医師指導治験、もしくは製薬会社との共同研究をを模索する。
対人サービスロボットのための優しい軌道生成に関する検討

対人サービスロボットがサービスを受ける人に優しい印象や何らかの感情を伝えることができる動作軌道の生成を目的とした.まず,3つの感情(平静,親しみ,怒り)に対応したものの差し出し動作の計測実験を行い,感情に付随する動作特徴を抽出した.つぎに動作特徴と動作印象との関係づけを行い,人間のコミュニケーション能力について考察した.日常動作のひとつである,「他人への物の差し出し」を研究対象として実験を行った.まず,人間の感情に付随して表れる動作特徴を抽出するために動作計測実験を行った.つぎに,動作計測実験の動作者映像に対する主観評価実験を実施し,動作特徴と動作印象とはどのような関係にあるか調べた.さらに,異なる文化的背景をもつ日本人,フランス人の2グループに対して同様の実験を行い比較した.動作計測実験では平静,親しみ,怒りの各感情に対応した「人への物の差し出し」について計測を行った.動作解析の結果,動作の所要時間,物持ち上げと置く動作の所要時間比,高さ方向の最高変位,物を差し出す方向の最大速度,終端速度が動作者の感情に付随して現れる動作特徴である.人間動作に対する主観評価実験から,親しみ,怒り印象はともに,終端速度と強く関係していることが明らかになった.感情の伝わる動作を生成するには,運動条件として,親しみ印象を与えたいときには,全体の動作速度をゆっくりにし,終端速度を小さく.怒りのときには,与えたい印象の強さによって,動作軌道が全く異なり,適度に怒り印象を与えたいときは,終端速度はさほど大きくないが,物を持ち上げる高さを低くし,直線的な動作軌道にする.強い怒り印象を与えたいときは,物を高く持ち上げ,叩きつけるように置く,終端速度の大きな動作を行う.ロボット動作に対する主観評価実験からは,感情が伝わりやすい2者間の位置関係で動作を行うことが,感情を伝えるためにはより効果的である.対人サービスロボットがサービスを受ける人に優しい印象や何らかの感情を伝えることができる動作軌道の生成を目的とした.まず,3つの感情(平静,親しみ,怒り)に対応したものの差し出し動作の計測実験を行い,感情に付随する動作特徴を抽出した.つぎに動作特徴と動作印象との関係づけを行い,人間のコミュニケーション能力について考察した.日常動作のひとつである,「他人への物の差し出し」を研究対象として実験を行った.まず,人間の感情に付随して表れる動作特徴を抽出するために動作計測実験を行った.つぎに,動作計測実験の動作者映像に対する主観評価実験を実施し,動作特徴と動作印象とはどのような関係にあるか調べた.さらに,異なる文化的背景をもつ日本人,フランス人の2グループに対して同様の実験を行い比較した.動作計測実験では平静,親しみ,怒りの各感情に対応した「人への物の差し出し」について計測を行った.動作解析の結果,動作の所要時間,物持ち上げと置く動作の所要時間比,高さ方向の最高変位,物を差し出す方向の最大速度,終端速度が動作者の感情に付随して現れる動作特徴である.人間動作に対する主観評価実験から,親しみ,怒り印象はともに,終端速度と強く関係していることが明らかになった.感情の伝わる動作を生成するには,運動条件として,親しみ印象を与えたいときには,全体の動作速度をゆっくりにし,終端速度を小さく.怒りのときには,与えたい印象の強さによって,動作軌道が全く異なり,適度に怒り印象を与えたいときは,終端速度はさほど大きくないが,物を持ち上げる高さを低くし,直線的な動作軌道にする.強い怒り印象を与えたいときは,物を高く持ち上げ,叩きつけるように置く,終端速度の大きな動作を行う.ロボット動作に対する主観評価実験からは,感情が伝わりやすい2者間の位置関係で動作を行うことが,感情を伝えるためにはより効果的である.少子高齢化の加速を受け,深刻化する介護者不足の問題に対処するため,ロボットの導入が期待されている.よりよい対人サービスをロボットが行うためには,ロボット使用者とロボットとの円滑なコミュニケーションが重要である.本研究ではロボット動作でヒトに感情を伝えるというコミュニケーションの実現をめざし,ロボットのどのような運動軌道が望ましいかを調べるとともに,日本人とフランス人という文化的背景が異なる2つのグループを対象に実験を行った.実験対象は3つの感情(平静,親しみ,怒り)に対応する他人への物の差し出し動作とした.3次元運動解析装置を用い,ヒトの上肢運動の特徴抽出を行ったところ,得られた特徴をよりよく表すには,物の運動軌跡を計測すればよいことを明らかにし,各感情に付随する運動の特徴を抽出した.動作計測実験から日本人とフランス人では,動作の終端速度など感情に付随する動作特徴は共通であるが,親しみの表出動作傾向には大きな違いがあることを明らかにした.

日本人では多くの場合,物を高く上げる,山型の動作軌道によって親しみを表現するが,フランス人では比較的平坦な動作軌道を用いる.また,人間動作に対する主観評価実験では,2グループ間に共通して,怒りの印象は動作全体の速度および終端速度と関係がある一方,親しみ印象と物を持ち上げる高さとの関係は文化的差異により違いがあることを示した.さらに,日本人の動作特徴を反映したロボット動作の主観評価実験を行い,2者の位置関係の違いは動作印象に影響すること,また,ロボット動作にヒトのもつ動作特徴を盛り込むことで,感情が伝わりやすくなることを明らかにし,本研究で得られた動作特徴をロボット動作の生成時に反映することの有効性を示した.以上の結果をもとに,今後は対人サービスロボットが優しい感情を抱かせる軌道を検討していく.少子高齢化の加速を受け,深刻化する介護者不足の問題に対処するため,ロボットの導入が期待されている.よりよいサービスをロボットが行うためには,ロボット使用者とロボットとの円滑なコミュニケーションが重要となる.本研究ではロボット動作で人に感情を伝えるというコミュニケーションの実現をめざし,ロボットの運動軌跡が人間にどのような印象を与えるか調べるとともに,どのような運動軌道が望ましいかを検討した.まず,動作の特徴抽出実験において,物の差し出し動作を例にとり,「平静」,「親しみ」「怒り」の3つの感情をもって両前の他人に物を差し出す動作を分析した.動作計測実験から,動作の最高変位,終端速度に感情が表れることを明らかにした.また,動作を正面から録画したVTRを主観評価させたところ,怒りの印象は動作全体の速度および終端速度と関係があることも明らかとなった.ロボット動作で人に感情を伝えるというコミュニケーション実現を目指し,日本人とフランス人という文化的背景が異なる2つのグループを対象に動作計測実験,主観評価実験を行い,2つのグループ間の相違を明らかにした.両グループに共通して,怒りの印象は動作全体の速度および終端速度と関係がある一方,親しみ印象と物を持ち上げる高さとの関係は文化の差異により違いがあることを示した.日本人の動作特徴を反映したロボット動作(CG)の主観評価実験において,物を差し出す者,受ける者の位置関係の違いは動作印象に影響を及ぼすことか明らかとなった.これらの知見は今後,対人サービスロボットの利用における軌道生成やロボットとヒトの位置関係を決める際の指針を与えるものである.
超高効率太陽電池に向けたビスマスサーファクタントと希釈ビスマスIII－V族混晶の研究

400°C以下という低温成長が必要になるGaAs_<1-x>Bi_x混晶において、その品質の劣化が懸念されている。当該年度は、高品質な希釈ビスマスIII-V族半導体半金属混晶GaAs_<1-x>Bi_xの成長およびそれを用いたデバイス応用に着Hして、研究を進めた。分子線エピタキシー法を用いてBi組成14.8%までのGaAs_<1-x>Bi_x結晶を成長した。成長時のV/IIIフラックス比などの成長条件を最適化することで、0.95eVまでの禁制帯幅を有するGaAs_<1-x>Bi_x (x≦9.5%)結晶において、室温における発光強度の劣化は無かった。また、発光強度は低下したものの0.85eVの禁制帯幅を有するGaAs_<1-x>Bi_x(x=11.7%)の試料から、1460nmでの室温での発光を得た。高分解X線回折法による構造評価においても、GaAs_<1-x>Bi_x(x≦14.8%)層に由来する明瞭な干渉縞が観測され、各ピーク強度もシミュレーション結果と一致した。これは、Bi原子の極端な偏析などは無く、急峻な界面が得られていることを示している。次に、当該材料を用いたデバイス製作を試みた。GaAs_<1-x>Bi_xを活性層とした、レーザダイオードを製作し、Bi組成4%の試料から1045nmでの電流注入によるレーザ発振を実現した。低温成長にもかかわらず、Bi原子が持つサーファクタント効果によって、希釈ビスマスIII-V族半導体半金属混晶GaAs_<1-x>Bi_xが高い品質を有することを実証した。今後、太陽電池などのデバイスへの応用が期待できる。当該年度の成果は、高品質のGaAS_<1-x>Bi_xを成長可能であり、デバイス応用が可能であることを実証した。いまだ、基礎研究段階にあった当該分野のデバイス応用への大きな足掛かりとなるものである。(抄録なし)本研究では、希釈ビスマスIII-V族半導体GaAsBiを用いて高効率な多接合太陽電池を実現することを最終目的としている。分子線エピタキシー法を用いてGaAsBi結晶を成長する際には、400°C以下という低温成長が必要になる。通常、低温成長の半導体結晶には多量の結晶欠陥が導入され、移動度や発光特性などの劣化が懸念される。当該年度は、ホール効果測定を用いてGaAsBi結晶の正孔移動度を評価した。本研究において、成長温度と成長時のAsおよびBiフラックス量などの成長条件を最適化することで、Bi原子が持つサーファクタント効果を最大限に発揮させた。成長条件を最適化した1.2eVの禁制帯幅を有するGaAsBi結晶において電子および正孔移動度の大幅な劣化は見られず、GaAsと同程度の高い移動度が得られた。低温成長にも関わらず、成長条件を最適化し、Bi原子が持つサーファクタント効果を最大限に発揮することで、移動度の劣化が無い高品質なGaAsBi結晶が得られることが明確になった。次に、多接合型太陽電池に必要不可欠なGaAs/GaAsBiヘテロ界面の電気的特性を評価した。多量の界面準位の存在は素子の特性を大幅に劣化させる原因となる。分子線エピタキシー法を用いてGaAs/p-GaAsBiヘテロ構造を成長し、アドミタンス法によってGaAs/GaAsBiヘテロ界面の界面準位密度が8×10^<11>cm^<-2>eV^<-1>であることを明らかにした。さらに、GaAsとGaAsBiの成長表面の電子構造を考慮し、GaAs層とGaAsBi層の間に、Bi含有率を徐々に変化させた層を導入することで、界面準位密度を半減させることに成功した。

これは、Bi原子の極端な偏析などは無く、急峻な界面が得られていることを示している。次に、当該材料を用いたデバイス製作を試みた。GaAs_<1-x>Bi_xを活性層とした、レーザダイオードを製作し、Bi組成4%の試料から1045nmでの電流注入によるレーザ発振を実現した。低温成長にもかかわらず、Bi原子が持つサーファクタント効果によって、希釈ビスマスIII-V族半導体半金属混晶GaAs_<1-x>Bi_xが高い品質を有することを実証した。今後、太陽電池などのデバイスへの応用が期待できる。当該年度の成果は、高品質のGaAS_<1-x>Bi_xを成長可能であり、デバイス応用が可能であることを実証した。いまだ、基礎研究段階にあった当該分野のデバイス応用への大きな足掛かりとなるものである。成長条件を丹念に最適化することで、当初の予定通り、キャリア移動度の観点からBi原子が持つサーファクタント効果を実証し、GaAsと同程度のキャリア移動度を有する高品質なGaAsBi結晶が得られるようになった。本年度の研究から明らかにした最適な条件を用いて成長した高品質なGaAsBr結晶の光吸収特性を測定する。光吸収特性の結果を基に、GaAs_<1-x>Bi_x太陽電池の構造を設計し、分子線エピタキシー装置を用いてGaAs1覗Bi,太陽電池を製作する。製作したGaAs_<1-x>Bi_x太陽電池の電流電圧特性の温度依存性を測定する。(抄録なし)
塩基性、酸性リン脂質によるDNA複製開始タンパクDnaAの活性制御機構の解明

細菌のDNA複製開始は、DnaAの活性により厳密に制御されている。これまでにin vitroで、酸性リン脂質はDnaAを再活性化することが報告されており、また、我々の研究の結果から、塩基性リン脂質であるリジルフォスファチジルグリセロール(LPG)がこのin vitroの再活性化を阻害することが見出されていた。しかし、これまでにin vivoにおいては、証拠がほとんど得られていなかった。平成16年度に私は、LPGの欠損株では、細胞の分離過程に異常がみられるがDNA複製には異常が見られないという結果を得た。この結果は、LPGがDnaAの活性に影響をあたえるという我々の仮説を支持しない。この結果の解釈として、我々は、染色体のDNA複製には、リン脂質以外にも、DnaAの合成量変化やDNAのメチル化の程度など、別の複数の要因が関与しているため、LPG欠損の効果は他の制御系により代償されていると考えた。そこで17年度では、染色体上の複製開始部位をプラスミドにのせたoriCプラスミドに着目し、このプラスミドの複製がリン脂質により影響をうけるか検討した。その結果、LPG欠損株では、oriCプラスミドのコピー数が増加していることを見い出した。さらに我々は、LPG欠損によるコピー数増加が、DnaAの再活性化阻害によるのかを検討した。活性型のDnaAは、DnaAの再活性化、もしくはDnaAの新規合成により生じる。もしLPGの効果がDnaAの再活性化阻害ならば、DnaAの新規合成を抑えた時にその効果が明瞭になると予想される。そこでDnaAの新規合成を抑えた条件で、oriCプラスミドのコピー数を調べたところ、我々の予想どおり、LPG欠損株でのコピー数の上昇がさらに明瞭になった。これらの知見は、LPGがin vivoでもDnaAの再活性化阻害に働くことを示唆している。これまでに私は、黄色ブドウ球菌の持つ塩基性リン脂質lysylphosphatidylglycerol(LPG)が、in vitroでDNA複製開始タンパクDnaAの再活性化を阻害することを見出していた。そこで私は、in vivoでもLPGはDnaAの活性制御に働くかどうかを検討するため、LPG合成酵素MprFを破壊した変異株の表現型を解析した。昨年度までに私は、LPG欠損株は高温感受性を示し細胞分裂が阻害されていること、そして、この温度感受性はマルチコピーdnaAにより部分的に抑圧されることを見出していた。大腸菌のDnaAの変異株にはDNA複製開始の異常にともなって、細胞分裂に異常を示すものがあることが知られていることから、私はLPG欠損株の細胞分裂阻害も、DnaAの活性の異常によると予想した。本年度では、この点を検討するため、LPG欠損株のDnaA活性、すなわちDNA複製開始に異常があるか検討した。その結果、LPG欠損株のDNA複製開始には異常が認められなかった。また、LPG欠損株の温度感受性の抑圧には、マルチコピーdnaAの複製開始活性は必要ではなく、膜結合ドメインが必要であることが明らかになった。当初の予想と反して、これらの結果は、LPG欠損株での温度感受性や細胞分裂異常は、DnaAのDNA複製開始活性とは関係がないことを示唆している。それではなぜ、LPG欠損株では高温で細胞分裂ができなくなるのか。次に私は、この点を解明することを試みた。その結果、LPG欠損株では、細胞質や細胞膜の分離は終了しているが、細胞壁の分離ができていないことを明らかにした。細胞壁の分離には、ペプチドグリカン分解酵素が必要であるが、LPG欠損株ではこの分解酵素活性が低下していた。したがって、LPGはDNA複製開始には必要でないが、細胞分裂の最後の過程である細胞壁の分離に重要な役割を持つことが初めて明らかになった。

そこでDnaAの新規合成を抑えた条件で、oriCプラスミドのコピー数を調べたところ、我々の予想どおり、LPG欠損株でのコピー数の上昇がさらに明瞭になった。これらの知見は、LPGがin vivoでもDnaAの再活性化阻害に働くことを示唆している。
バイオ・医療応用に向けた磁気分画法による磁気ナノ粒子の最適化

磁性ナノ粒子を用いた医療バイオ応用に関する研究が盛んに行われている。その中に、癌などの疾病領域を高感度・高分解能に検出する磁気粒子イメージング、および磁性ナノ粒子のヒステリシス損による熱により、癌細胞のみを選択的に死滅させる磁気的ハイパーサーミアがある。これらの実現のためには、高検出感度化、選択的に癌細胞だけを死滅させるための高効率化が必要不可欠である。本年度は、世界で唯一体内での使用が認可されているリゾビストと呼ばれる磁性ナノ粒子サンプルをベースに磁気分画を行った。磁気分画によって得られた磁性ナノ粒子サンプルを用いて、磁気粒子イメージングで信号として用いられる、磁性ナノ粒子の第三高調波磁化を測定した。磁気分画を行ったサンプルでは、オリジナルの磁性ナノ粒子サンプルと比較して、3倍程度の磁化信号が得られることを確認した。また、ハイパーサーミアで用いられる、ヒステリシス損も大きくなることを確認した。また、磁性ナノ粒子を医療応用する場合、磁性ナノ粒子の周辺温度や、粘度によって磁性ナノ粒子の磁化特性が一般的には変化することが知られている。これらのパラメータが磁化特性に及ぼす影響を定量的に調べることは応用上非常に重要になる。例えば、磁気粒子イメージングにおいては、磁化信号の強度は、疾病領域の定量性に影響を及ぼす。本年度は、まず、磁性ナノ粒子の磁化特性の粘度依存性についての基礎研究を行った。得られた成果を論文投稿中である。磁気分画により、高性能な磁性ナノ粒子サンプルの作成を行うことができた。H30年度にひきつづき、磁気分画を行い、高性能化および磁気分画の安定性・再現性の確認を行う。また、磁性ナノ粒子の体内利用を想定し、磁気分画を行った磁性ナノ粒子サンプルを用いて、磁性ナノ粒子の高調波特性(磁気粒子イメージングにおける磁化信号)の粘度依存性や温度依存性などを明らかにする。
動物細胞における温度センサーの探索と低温刺激応答シグナル伝達系の解明

哺乳動物は、体内の温度がほぼ一定に保たれ、細胞を取り囲む環境は極めて安定に維持されている。しかし、哺乳動物においても、直接外界に接する皮膚、気管などは、生理的環境下で細胞が体温より低い温度にさらされる機会が存在する。このような温度変化を感知し応答する細胞内シグナル伝達系は、ほとんど解析されていない。本研究では、動物培養細胞細胞を25°Cの低温刺激にさらすとリン酸化が強く誘導されることが知られているチロシンキナーゼACK1の機能解析を中心に、低温に対する細胞応答のメカニズムの解明を進めた。しかし、哺乳動物の場合でも、生理的環境下で細胞が体温より低い温度にさらされる機会が存在する。とくに直接外界に接する皮膚、気管などは体温より低い状態に存在することがある。本年度は、昨年度に引き続き、動物培養細胞細胞を25°Cの低温刺激にさらすとリン酸化が強く誘導されることが知られているチロシンキナーゼACK1の機能解析を進めた。ACK1は、Rhoファミリー低分子量GTP結合蛋白質Cdc42の標的分子として知られている。一方、ACK1は、アダプター分子であるGrb2と結合し、種々のチロシンキナーゼ型細胞膜受容体と会合することも知られている。したがって、ACK1のリン酸化及び活性化を引き起こす上流のシグナル伝達メカニズムとしては、Cdc42を介する系と介さない系が想定される。25°Cの低温刺激に応答したACK1のリン酸化誘導におけるCdc42の役割は明らかにされていないので、この点を明らかにするための解析を進めた。まず、ヒト胎児腎由来HEK293細胞のCdc42を効率よくノックダウンするsiRNA配列を検索し、これを用いてCdc42をノックダウンした細胞での25°Cの低温刺激に応答したACK1のリン酸化を検討した。一方、25°Cの低温刺激に応答したCdc42の活性化を検証するために、プルダウン法とオーバーレイ法によるCdc42の活性化(GTP結合型の増加)検出法の条件検討を行った。次に、生理的に低温刺激にさらされるマウス皮膚の初代培養細胞を用いて、25°Cの低温刺激に応答したACK1のリン酸化を検討した。さらにこの系でのCdc42の関与など、ACK1のリン酸化を誘導するメカニズムの解析も進めた。とくに直接外界に接する皮膚、気管、腸管などは体温より低い状態に存在することが多い。本年度は、細胞を25°Cの低温刺激にさらすとリン酸化が強く誘導されることが知られているチロシンキナーゼACK1の機能解析を進めた。ACK1は多数のドメインからなる多機能性蛋白質である。現在、これらのドメインの変異体を複数作成し、培養細胞系に遺伝子導入した後、低温刺激に応答したチロシンリン酸化を検討している。それにより、このシグナル伝達に必要なドメインの同定を目指している。例えば、CRIBドメインには活性型Cdc42が結合するが、このドメインのCdc42結合能を喪失した変異体の解析から、低温刺激応答シグナル伝達へのCdc42の関与を検討している。さらに、ACK1に直接結合する分子として、Grb2、Nck、p130CASなどのアダプター、クラスリン、各種受容体型チロシンキナーゼ、E3ユビキチンリガーゼなどが知られている。現在、これらのシグナル伝達分子を個別にあるいは組み合わせてRNAi法により発現抑制し、ACK1の低温刺激応答性チロシンリン酸化への影響を検討している。また、ACK1の基質として、セリン・トレオニンキナーゼAkt、アンドロゲン受容体、グアニンヌクレオチド交換因子Dbl、癌抑制遺伝子産物Wwox、Wiskott- Aldrichi syndrome proteinなどが知られている。低温刺激に応答したこれらの基質蛋白質のチロシンリン酸化の有無を解析している。新設の研究室であるため、研究設備の整備に時間を要した。また、研究に参加する大学院生の数が、当初の予想より少なかった。当初の研究計画に沿って、チロシンキナーゼACK1の温度センサーとしての機能解析を進めるとともに、低温刺激でチロシンリン酸化される蛋白質の網羅的解析も開始する。また、ack1遺伝子ノックアウトマウスでの検証の準備も進める。平成24年度の当該研究の開始が遅れたため、当初計画に比べて研究の進捗がやや遅れているため、次年度に使用する予定の研究費が発生した。
神経細胞死の位置特異的情報の獲得とマイクロドメインの寄与の解明

本研究は、単一培養細胞における細胞死の位置特異的情報について細胞内のマイクロドメインの寄与について検討するためにマイクロシステムの構築とその応用を目的とした。マイクロ流体デバイスによって、孤立化した複数の単一細胞を非侵襲的に捕獲およびその場所での微小培養を実現し、層流による局所的な薬液曝露による細胞死誘発刺激の負荷を行ったところ、細胞核付近でアポトーシスのエフェクターカスパーゼである活性型Caspase-3の発現を誘発するためには、細胞突起部のマイクロドメインに限局したストレス負荷で充分であることを確認した。本研究は細胞死の詳細なメカニズムについて、単一細胞レベルでの検討を行うものである。そのために本年度は開発したマイクロデバイスの最適化とライブイメージング等による細胞内イベントの可視化を行うために、まず細胞体や突起部のパターニングを実現すべく、デバイス底面形状の改善を行った。培養皿底面にpolydimethylsiloxane (PDMS)を200 umの細胞体部と5 um幅の突起部が並んだ形状を施したシートをマウントさせることで培養デバイスを作製した。この培養皿上にPC12細胞を播種・培養し、NGFを含んだ培養液により分化させることで突起伸長を誘発させたところ、突起伸長を狙ったマイクログルーブに沿った突起伸長が認められたことにより、今年度に新規開発した培養皿は、神経様細胞のパターニングを実現するものであり、本研究における細胞体部と突起部のパターニングを施した微小培養に資するものであると考えられた。また本年度は、単一細胞における細胞内イベントの可視化を目的としたライブイメージングの検討も行った。本研究における検討対象はストレス誘発性の細胞死であることから、その経過にCaspaseの活性化を含むことが予想される。そこで昨年度の検討結果を踏まえて、本年度はCaspaseの活性化に伴い色彩変化を生じる蛍光プローブを用いることで、活性化Caspaseの細胞内での位置情報獲得の実現性を検討した。蛍光タンパク質のGFPとAlexaを擁した蛍光プローブにおいてCaspase-3の活性化誘発性に部位離脱的にFRET関連様で蛍光色を変化させる細胞内蛍光プローブを用いたところ、Sturosporine (2uM)暴露によるストレス誘発性の細胞内変化をモニタリング可能であることが確認された。本研究では、単一の培養細胞における細胞死の位置特異的情報を獲得することを目的として、適したマイクロシステムの開発とそれを利用した検討を行っている。これまでに、マイクロ流体システムを用いた薬液曝露の実験系と培養皿の底面を有機化合物で修飾することによる培養細胞の生育位置や形態をパターニングする実験系を、当該研究の目的に沿って最適化することを試みてきた。本年度の目的は、それらを用いて細胞死の位置情報を単一細胞レベルで獲得することである。前年度同様に、生体適合性の高い高分子であるpolydimethylsiloxaneを固化・成形することによって、単一細胞の捕獲・培養を可能にするデバイス内に微小環境を形成した。本デバイス内では、複数個の単一細胞を空間的に孤立化させて培養することができるので、これらに神経成長因子を暴露させることで突起伸展を誘発させ、突起伸長を経時的に観察した。形成した微小環境内で充分な長さの突起を観察した後、層流を形成させた薬液投与、すなわち細胞死を誘発させることが知られるStaurosporine(2 uM)を用いて、突起の先端部から細胞体に向かうマイクロドメインに薬液および細胞培養液を同時暴露させることで細胞に及ぼされる影響を観察した。用いたStaurosporineは細胞内でアポトーシス性の細胞死を惹起させ、その過程でカスパーゼ3の活性化を誘導することを確認したことから、マイクロデバイス内への誘導を試みたところ、本デバイス内での微小環境においても、従来の培養皿における細胞死の過程に沿った変化が観察された。そして、マイクロドメインに限局させた薬液暴露を施すことによって、細胞体におけるエフェクターカスパーゼであるカスパーゼ3の活性化を観察できたことから、細胞全体の運命を決める因子の活性化に対して細胞の部分的なマイクロドメインに限局した寄与が示唆された。本研究では、単一細胞における細胞生物学的検討を行うためのマイクロデバイスの最適化を行い細胞死の詳細なメカニズムの解明を試みることから、まずは通常の培養皿において培養細胞にストレスを与えることによる細胞死誘発の条件を検討した。そして、培養したPC12細胞にNGF暴露を施すことにより突起伸長を誘発した系においてStaurosporine(2 uM)の投与が有意にアポトーシスを誘導することを確認した。本研究で用いるマイクロ流体デバイスは、ガラス底のディッシュにpolydimethylsiloxane(PDMS)により作製したレプリカをマウントさせた構造をもち、内部のデザインとして直線状のメインチャネル(幅100 um)と細胞のハンドリングを行う半円筒状のマイクロチャンバー(断面の直径100 um)を配したものとした。

これを倒立顕微鏡のステージ上に簡易型インキュベーターを設置し、その中で顕微鏡観察下での培養細胞の挙動をCCDカメラを用いて経時的に観察した。このようなマイクロ流体システムを用いることにより、細胞懸濁液から複数の単一細胞の非侵襲的な捕獲・培養を効率よく実行することが可能であった。単一細胞ハンドリングとしてPC12細胞を用いて行い、デバイス内での微小培養中に神経成長因子の暴露により突起伸長制御を行った。また、オルガネライメージングとして、生細胞の核染色にHoechist33342、ミトコンドリア染色にMitotracker、アクチン染色にはPhalloidinを用いた可視化を実行した。さらに、Staurosporine(2 uM)を暴露させることにより、アポトーシスのエフェクターカスパーゼとされるCaspase-3, 7の細胞内発現を認めた。この結果は、当該システムが単一細胞の解析に適していることを示し、細胞死関連の情報獲得を可能とすることを期待させるものである。本研究では、単一培養細胞における細胞死の位置特異的情報の獲得に向けたマイクロシステムの構築とその応用を目的とするものである。本年度は、得られた情報の整理とそれに基づいたシステムの最適化を行った。本研究で使用しているマイクロデバイスは、生体適合性の高い高分子化合物polydimethylsiloxaneを固化・成形することで、デバイス内に細胞培養関連の微小環境を形成したものである。これは、複数個の単一細胞を空間的に孤立させた状態で非侵襲的な捕獲とその場所での微小培養を実現するものであり、デバイス内のデザインはこれまでにも検討を重ねたものである。初年度より継続的に細胞生物学関連領域のデザインの最適化を試みたところ、10の5乗個レベルの孤立化細胞を培養液の微小流とともにデバイス内に注入することで、孤立化した単一細胞の捕獲がほぼ確実に行えることが再現でき、また、捕獲細胞が神経成長因子により形態変化を生じ突起を伸長する過程が再現可能であった。さらに、デバイス内の微小環境において充分な突起長に伸長させた後に層流による位置特異的な薬液曝露を行うとともに培養細胞の細胞死に至る細胞内シグナルの可視化も行えることを確認した。蛍光プローブを用いたライブイメージングによりStaurosporine曝露が及ぼす影響の検討では、活性型Caspase-3に対してFRET関連様に蛍光色を変化させるGFP・Alexaの蛍光プローブを用いることで薬液曝露のストレス誘発性に蛍光色を変化させることを確認した。また、細胞死に至るストレスが細胞内の位置特異的に生じせしめられているかの検討では、ストレス負荷が細胞核付近での活性型Caspase-3発現を誘発するためには突起部のマイクロドメインに限局した薬液刺激で充分であること、および、刺激領域から細胞体への細胞死情報の伝達が必要であることが明らかになった。