hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非線形エリプリメトリー法による3次非線形感受率評価法の開発

平成3年度に引きつづき以下の項目についての研究を行った。1.高繰り返しナノ秒波長可変光源を用いた高感度エリプリメトリーAO-QスイッチYAGレーザー励起のチタンサファイアレーザーを開発し,近赤外域(700nm900nm)と近紫外域(350nm450nm)で波長可変かつ高繰り返し(10KHz)のナノ秒パルス光源を得た。この光源を用いてロックイン検出を行うことにより非線形偏光変化を10^<-4>ラジアンの感度で検出できるようになった。これを用いて半導体(cucl)の励起子非線形性の評価を行った。この結果は平成4年秋の物理学会で報告した。2.ピコ秒パルス光源による時間分解非線形偏光分光法の開発半導体の共鳴吸収域では光励起によってキャリアや励起子の蓄積が生じる。3次非線形性を正しく評価する為にはこの効果の評価と除去が重要である。そこで本年は,短パレス光を用いた測定法を重点的に検討した。モードロックチタンサファイアレーザーのピコ秒パルス又はサブピコ秒パルスを2つに分岐し,一方を円偏光(又は45゚直線偏光)励起光とし他方を直線偏光プローブ光とする。励起パルスで誘起された非線形な円2色性又は光学活性をプローブ光の偏光変化として検出する。この時,ポンプ光とプローブ光に遅延を設け,系の応答を時間軸上で評価した。ロックイン検出により偏光変化検出感度10^<-3>ラジアン以下,時間分解能0.5ピコ秒以下を達成した。この方法によりZnSe励起子共鳴での3次の非線形感受平の評価を行い10^<-2>esuに及ぶことを確認した。以上の結果をもとに報文をまとめる作業を進めている。1.マルチチャンネル測光システムの整備高感度測定法の確立をめざしオプティカルマルチチャンネルアナライザ-によるマルチチャンネル測光システムを導入し偏光解析法の予備実験を行った。その結果、偏光分光スペクトルを従来の約50倍のスピ-ドで測定できることがわかった。また信号処理を行うことにより10^<-4>以下の微弱な変化を捕えることに成功した。2.オプティカルヘテロダイン法の開発これまで液体やガスの糸で報告されていたオプティカルヘテロダイン法を固体に応用し、高感度に3次非線形感受率の評価が行えることを確認した。特に実部と虚部の同時測定が可能であることを示した。現在、1のシステムと組み合わせることにより実部と虚部のスペクトルを高速かつ高感度に検出する方法について検討を進めている。3.ZnSe励起子共鳴域での3次非線形感受率の評価偏光分光法を反射型に改良し、ZnSe励起子共鳴点での3次の非線形感受率の評価を行った。その結果1×10^<-2>esu10^<-1>esuに及ぶことが明らかになった。現在2の方法による測定を行っている。4.高くり返し光源の準備検出感度を向上させる為にKHzオ-ダ-の繰り返し周波数のパルス光源の開発を行った。現有のYAGレ-ザ-では安定性に問題があったのでより高安定なレ-ザ-ヘッドに交換した。そのヘッドを本研究費で購入した。これを光源としてチタンサファイアレ-ザ-を発振させ、近赤外域で波長可変な高くり返しパルス光源を得た。現在この第2高調波をとり3の実験の追試を行っている。平成4年度はこの光源を用いて12のシステムの評価を行う。
数理モデルを用いたパンデミック・インフルエンザ・プランニングの研究

目的:individual based modelは、近年の感染症モデルとして最もパワフルなモデルであり、新型インフルエンザ対策では広く用いられている。しかしながらモデルはあくまでモデルあり、実際の人の所在、移動を表現したものではない。モデルをより現実的に近づける努力は重要であるが、それでもやはり現実性は乏しい。本研究では逆に、実際の人の所在、移動のデータからモデルを構築した。方法:1998年10-12月に実施された、首都圏在住の約88万人の1日の移動、所在が記録された抽出率約2.7%のデータを用いる。所在は、自宅、学校等の別、1648カ所のゾーンで表示され、鉄道の乗降駅、時間も記録されている。まず、このデータを用いてまず接触回数を求め、実際の社会での接触がscale freeであるかどうかを検討する。新型インフルエンザの自然史、感染性を有する期間、無症候比率、無症候の場合の感染性、受診率は先行研究によった。感染性は家庭および社会での感染性がR0=1.5になるように調整した。シミュレーションは、海外での感染者が、感染3日後に帰国、八王子の自宅に帰宅後感染性を有するとした。職場は丸の内としてJR中央線で通勤するとした。結果:無作為に抽出した638名で計測された社会,家庭,電車でのべき乗bはいずれの場合でも有意に正であった。感染者数は、最速で対応の意思決定がなされた場合の感染7日目で3032人と少ないものの、首都圏全域、特に鉄道沿線に拡散していることが明らかになった。考察:本研究で示された実際の移動データを用いての数理モデルは、現実的な対策立案に活用できるモデルを提示できたと言えよう。今後、新型インフルエンザ対策のガイドライン策定においては有用なツールになると期待される。本年度は、2005年8月に公表されたFergusonらやLonginiらの研究を受けて、日本における休校や職場閉鎖、公共交通機関の運行停止、地域封鎖の可能性を検討することができるindividual based modelを開発した。現時点では80万人規模を表現して各種政策を評価している。休校や職場閉鎖は非常に早い段階に予防的に行うのであれば効果的であるが、現状の学級閉鎖の基準である3割程度の欠席率での学級閉鎖ではまったく流行抑制効果がないこと、公共交通機関の運行停止は非常に効果的で最大30%程度の流行抑制効果があることが暫定的に明らかにされた。また、地域封鎖の可能性として、初発患者発症2日目での感染者の拡大範囲を求めた。その結果、公共交通機関での感染がなければ12kmの範囲に90%の確率で収まるが、公共交通機関での感染が中程度の場合には60%、満員電車に相当する高程度であれば30%まで低下する。このような非常に広範囲の地域を封鎖しても、公共交通機関が発達している地域での封じ込めの可能性はきわめて低いと結論付けれよう。今後の方向性として、人口密度、家族構成、移動距離、学校や職場の規模の分布をより現実に近づける、また都市間の中長距離の移動をモデル化することが必要であると思われる。また、パンデミック時におけるワクチンあるいは抗ウイルス剤の使用における優先順序に関して一般市民を対象とする調査を行い、昨年11月14日に公表された新型インフルエンザ対策行動計画とは必ずしも整合的でない結果を得た。

本研究では逆に、実際の人の所在、移動のデータからモデルを構築した。方法:1998年10-12月に実施された、首都圏在住の約88万人の1日の移動、所在が記録された抽出率約2.7%のデータを用いる。所在は、自宅、学校等の別、1648カ所のゾーンで表示され、鉄道の乗降駅、時間も記録されている。まず、このデータを用いてまず接触回数を求め、実際の社会での接触がscale freeであるかどうかを検討する。新型インフルエンザの自然史、感染性を有する期間、無症候比率、無症候の場合の感染性、受診率は先行研究によった。感染性は家庭および社会での感染性がR0=1.5になるように調整した。シミュレーションは、海外での感染者が、感染3日後に帰国、八王子の自宅に帰宅後感染性を有するとした。職場は丸の内としてJR中央線で通勤するとした。結果:無作為に抽出した638名で計測された社会,家庭,電車でのべき乗bはいずれの場合でも有意に正であった。感染者数は、最速で対応の意思決定がなされた場合の感染7日目で3032人と少ないものの、首都圏全域、特に鉄道沿線に拡散していることが明らかになった。考察:本研究で示された実際の移動データを用いての数理モデルは、現実的な対策立案に活用できるモデルを提示できたと言えよう。今後、新型インフルエンザ対策のガイドライン策定においては有用なツールになると期待される。
急性肝障害患者血中の広範囲なウイルスゲノムの検出法の確立

本研究では、成因不明の急性肝障害症例、すなわち明かな薬剤性、アルコール性、自己免疫性肝障害と急性期の血清抗体検査でA、B、C型ウイルス肝炎が除外された、いわゆる非A非B非C型肝炎の症例を対象とした。初めに、これら症例の保存血清を用いて、PCR法レベルで、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)の存在を否定するために、HBV-DNAに対してはmajor S領域、HCV-RNAに対して5'非翻訳領域の増幅をnested PCRにより、各々試みた。その結果、対象となった17症例でHBV-DNAは検出されなかったが、HCV-RNAが4例で検出され、C型急性肝炎であることが判明した。また、PCR法によるウイルスゲノム検出の検討はA型、B型急性肝炎症例を対照として行ったが、血中のウイルスは微量で、経過と共に急速に消失することが明かとなり、血清の採取時期と効率のよい核酸抽出法の採択が重要であることが判った。次に、非A非B非C型肝炎として絞り込まれた症例のうち、急性期の残存血清量等により2例の劇症化例を含む10例を対象に、話題となったG型肝炎と通常のHBVマーカーが検出されないサイレントB型肝炎の関与について検討を行なった。G型肝炎については5'非翻訳領域とヘリカーゼ領域でnested RT-PCR法にて検出を試みたが、全例で増幅はみられなかった。一方、サイレントB型肝炎については、major S領域では全例陰性の結果であったが、検出感度等を考慮し、プレコアを含む領域で再度nestedPCR法により検出を試みたとろ、2例の劇症化例を含む8例において増幅がみられた。よって、成因不明の急性肝障害患者血中の広範囲なウイルスゲノムの検出法の確立を目指し、ヘルペス属ウイルスのポリメラーゼ領域を中心にPCR法による解析を行う当初の計画は途中で変更されたが、それに代わりサイレントB型肝炎がその主因であることが明らかとなった。本研究では、成因不明の急性肝障害症例、すなわち明かな薬剤性、アルコール性、自己免疫性肝障害を除き、急性期の血清ウイルス抗体検査でA、B、C型肝炎および既知の肝炎ウイルス以外のウイルス性肝障害が除外された、いわゆる非A非B非C型肝炎の症例を対象とした。初めに、これら症例の保存血清を用いて、PCR法レベルで、HBVとHCVのウイルスゲノムの存在を否定するために、HBV-DNAに対してはmajor S領域、HCV-RNAに対しては5′非翻訳領域の増幅をnested PCRにより、各々試みた。その結果、対象と考えていた17症例でHBV-DANは検出されなかったが、HCV-RNAが4例で検出され、C型急性肺炎であることが判明した。よって、残りの3例の劇症化死亡例を含む13症例が、より厳密な成因不明の急性肝障害の対象症例として残った。また、PCR法によるウイルスゲノムの検討はA型、B型肝炎症例の血清を対照として行ったが、血中のウイルスは微量で、経過と共に急速に消失することが明かとなり、検討対象とする血清の採取時間と、効率のよい核酸抽出法の採択が重要であることが判明した。次に、ヘルペス属のEBウイルス、サイトメガロウイルス、単純泡疹ウイルス、帯状泡疹ウイルスのDANシークエンスデータベースのポリメラーゼ領域より、コンピュータ解析システムを用いて、共通性のある塩基配列を抽出し、多種DNAウイルス検出のためのプライマーを作成した。さらに、RNAウイルスに対しては、最近データベースに全塩基配列が登録されたG型肝炎ウイルスの塩基配列よりプライマーを作成した。今後、これらプライマーを用い対象症例の血清につき検討を行う。

平成7年度の研究により非A非B非C型肝炎として絞り込まれた症例のうち、急性期の残存血清量等により2例の劇症化死亡例を含む10例の急性肝障害症例を対象に本年度の研究を行った。本年度の研究計画として、ヘルペス属ウイルスのポリメラーゼ領域を中心に、シーケンスデータベースよりコンピューター解析を行い、得られた相同的な塩基配列よりユニバーサルなプライマーを作成し、PCR法にて解析を行う準備をしていた。その前に、最近話題となっているG型肝炎と通常のB型肝炎ウイルス(HBV)マーカーが検出されないサイレントB型肝炎の関与について検討を行う必要が生じた。そこで、G型肝炎については報告されたウイルスゲノムの全塩基配列より5'非翻訳領域とヘリカーゼ領域に各々プライマーの対を作成し、nested RT-PCR法にて検出を試みたが、いずれの症例においても増幅はみられなかった。一方、サイレントB型肝炎については、前年度HBVゲノムのmajor S領域にプライマーを作成し、PCR法により検出を試みた時には全例で陰性の結果であったが、検出感度等を考慮し、本年度はHBVゲノムのプレコア領域を含む領域にプライマーの対を作成し、nested PCR法により再度検出を試みたところ、2例の劇症化例を含む8例において増幅がみられた。さらに、PCR増幅産物を直接塩基配列決定法によりシーケンスを行い、増幅産物がHBVゲノムの配列を有することを確かめるとともに、劇症化例のうち1例において、プレコア領域の28番目のセンスコドン(TGG)がスットプコドン(TGG)へと変異していることが捕らえられた。
光共振器内でのコンプトン散乱を用いた新光源の開発研究

光共振器内での逆コンプトン散乱を用いた高エネルギー光源の開発研究を行った。基礎研究として波長1μm,パワー500mWのCWレーザーからの光を高性能光共振器に蓄積し(蓄積パワー1kW),75kV,10mAの電子ビームとを衝突させる実験行った。この実験により本方式の原理実証が確認された。実験においては、電子ビームとレーザー光は150°の角度で衝突させた。電子ビーム電流量,レーザー光のパワーを変化させ,スケーリング則を実験的に求めた。又,レーザーを共振器に同調させた時と同調させない時の比較を行った。散乱光の分光は狭帯域干渉フィルターで行なった。これまでの問題点は、測定のS/Nの改善とミラーの劣化の防止であった。真空系を増強して相互作用チャンバー内の真空度を10^<-7>Torrレベルに改善した。これによりCW大電流電子ビームにより励起された酸素、窒素分子からの発光が散乱光を抑制でき、S/Nが10倍以上改善された。また、共振器内に蓄積されたCW-kWレベルのレーザーによるミラーへのμmレベルの埃の焼き付けも抑制することができた。得られた実験結果を一次元のコンプトン散乱モデルと比較し,モデルの妥当性を検討し,電子ビーム発散角依存性やレーザー光くっかん分布等の三次元効果の影響を考慮した。スケーリング則から実用化に必要な装置パラメーターを検討し、電子ビームのエネルギーを上げたときのγ線源としての効率やスペクトル輝度の評価を行った。
標的環境を特異的に認識して機能を発揮する光機能性分子の開発と応用

複雑な生命現象の解析には、細胞や動物が生きている状態で標的となる分子の挙動を解析・操作することが必須である。このような研究を行うために、蛍光プローブや増感剤を始めとする「光機能性分子」がこれまでに数多く開発されてきたが、これらの分子を実際の細胞に適用する場合、プローブ自身の局在に由来するバックグラウンドのシグナル(=環境感受性)がしばしば問題となっていた。研究代表者は、蛍光性ランタノイド錯体における光誘起電子移動という物理化学的な現象を適切に制御することにより、適切な環境下でのみシグナルを発する"intellige"な光機能性分子の開発ができれば、この問題が解決されるのではないかと考え研究を行った。具体的には、可視光領域に吸収・蛍光を有する代表的な蛍光団の一つであるBODIPY誘導体と、ランタノイド錯体(DTPA-Ln)とをアミド結合を介して直接結合させた化合物を各種合成し、それらの蛍光特性について検討を行った。これらの化合物は、研究代表者がこれまでに開発を行ってきた錯体と比較して強い蛍光を有しており、生物応用への可能性が期待される。更に、測定溶媒を変化させた実験から、BODIPY由来の蛍光とランタノイドイオン由来の蛍光との比が環境に応じて変化する場合があることが明らかとなり、適切な環境下においてのみシグナルが変化する錯体の開発に向けて有意義な知見が得られた。このような分子に開する報告はこれまでに無く、光機能性分子の新たな展開に向けた画期的な研究成果であると考えられる。
紫外光,過剰光エネルギーによる光合成阻害とその防御の分子機構

植物の生育にとって必須の太陽光には、光合成を阻害する400nm以下の紫外光(UV)が含まれ、また光合成に有効な可視光もCO_2固定反応に利用できるより高い照度の太陽光は活性酸素を生成するように作用し、光合成の光阻害をもたらす原因となる。本研究では植物の葉肉細胞がUVまたは過剰の可視光の照射を受けた時に生ずる光阻害、これを防御する機構について研究し、以下の点を明らかにした。1)Ascorbate peroxidase(APX)が活性酸素による最初の標的分子となること、2)光障害抑制に機能していると推定されるゼーター・クリスタリン・ファミリーの蛋白質(Z-Cr)についてその生化学的反応。さらに過剰発現したタバコでの生理機能。3)アスコルビン酸ラジカルをアスコルピン酸に還元するMonodehydroascorbate radical reductase(MDAR)が酸化ストレスで生じやすいフェノキシ・ラジカルの還元をも触媒すること。4)UC照射によって400-600nmに紫外励起によって蛍光を発する成分の合成誘導、これらの蛍光性成分の細胞内局在性。5)C4植物の維管束細胞葉緑体での循環的電子伝達反応をP700の酸化還元反応から解析し、その特性。6)1重項興起酸素分子(^1O_2)を検出、定量する蛍光試薬を開発し、生葉で^1O_2が葉緑体でのみ生成すること。7)葉緑体での活性酸素消去系であるWater-waterサイクルが過剰光エネルギーを消去している機能について、最近の研究を陸上植物と藻類とについてまとめ、サンゴとの共生藻類Zooxanthelleの光阻害がWater-waterサイクルによって防御されること。紫外光による光合成阻害とその防御ハンガリー科学アカデミー、Hideg博士を福山大学に招聘し、紫外光・強光による一重項酸素分子(^1O_2)の葉緑体での発生について共同研究を行った。共焦点レーザー顕微鏡、Hideg博士の開発した^1O_2放出蛍光試薬を用い、初めて生葉で^1O_2が光によって生成していることを解明した。光呼吸による過剰電子処理機構を持たないC_4植物トウモロコシについて、CO_2吸収とクロロフィル蛍光の測定によってW-Wサイクルの寄与を定量化しようとしている。また、W-Wサイクルの寄与の大きいと考えられるサンゴの褐虫藻について、Shick博士との共同研究をモナコの海洋研究所で行っている。強光適応酵素、ゼーター・クリスタリン様タンパク質(P1)の機能P1は強光で発現するが機能は明らかでない。P1を大腸菌で発現させ、精製酵素についてこれがdiamideを含むアゾ化合物を還元するデヒドロゲナーゼであることを解明した。本研究では植物の葉肉細胞がUVまたは過剰の可視光の照射を受けた時に生ずる光阻害、これを防御する機構について研究した。1)UV照射によって400-600nmに紫外励起によって蛍光を発する成分の合成が誘導されることを示し、これらの蛍光性成分の細胞内局在性を示した。これらの成分は紫外光フィルターの機能をもつと考えられる。2)C4植物の維管束細胞葉緑体での循環的電子伝達反応をP700の酸化還元反応から解析し、わずかに含まれる半化学系II、さらにMalate, Ascorbateによって誘導されることを明らかにした。3)1重項励起酸素分子(^1O_2)を検出、定量する蛍光試薬を開発し、生葉では強光照射によって^1O_2が葉緑体でのみ生成すること、UV照射によってはあまり生成しないこと証明した。4)葉緑体での活性

酸素消去系であるWater-waterサイクルが過剰光エネルギーを消去している機能について、最近の研究を陸上植物と藻類とについてまとめ、サンゴとの共生藻類Zooxanthelleの光阻害がWater-waterサイクルによって防御されることを証明した。また、water-waterサイクルが充分に機能できない時、光化学系Iが光化学系IIより先に失活することを証明した。
EC-SODのプロモーターの領域の解析

前者に関してはEC-SOD発現の細胞特異性をプロモーター領域のメチル化によって説明可能であるか否かを検討した。EC-SODを発現していないHepG2、血管内皮細胞、HEK293細胞に脱メチル化剤(5-aza-2-deoxycytidine)存在下で培養を行った。しかしながら種々の条件下で検討を行ったものの、EC-SOD蛋白の発現は認められなかった。又同時にBisulfite sequence法を用いてEC-SOD promoter領域におけるCpG配列のメチル化についても検討したが、これについても一定の傾向は確認できなかった。後者に関しては特定したPromoter領域にCREB、AP-1結合配列が認められたことよりまずcyclic AMP及びPMAで刺激を行いpromoter活性が上昇する否か検討した。Cyclic AMP刺激では濃度及び細胞種を変えた検討においても有意な所見は認めなかったが、PMA刺激では50nM存在下でpromoter活性の上昇を認めた。さらにAP-1発現Vectorとのco-transfectionによってもEC-S0D promoter活性の上昇を認めた。用いた約300bpのEC-SOD promoter領域DNAには推定されるAP-1結合配列が3箇所認められており、どの領域が強く関与しているのかをDNA mutation及びgel shift assayを用いて検討する予定としている。現在までHuman EC-SODのpromoter領域に関する報告は全く認められていない。しかしmRNAtranscription start siteの推定は、1994年にFolz RJらがprimer extension法を用いて報告しており(Folz RJ.et al., Genomics. 1994 Jul 1;22(1):162-71.)、またNCBI(National Center for Biotechnology Information)に別のmRNA transcription start siteが登録されている。そこでこの二つの報告に基き、各々の5'上流領域のDNA配列約200bpをPCR法にて増幅し、liciferase発現Vector(pGL3 Basic, Promega)に組み込みpromoter活性をもつか否かを検証した。得られたplasmidはEC-SOD蛋白を発現しているVascular smooth muscle cell、Fibroblast、Hela cell及び、発現していないHepG2 cell、HEK293 cellにtransfectionを行ったが、明らかなpromoter活性を得ることが出来なかった。このことより報告のあるmRNAtranscription start siteの推定は誤っている可能性があると考えた。そこでより正確なmRNA transcription start siteの推定が可能であるOligo-capping法で検討したところ、以前の報告とは異なった結果を得た。この結果を基にその5'上流領域のDNA配列をPCR法にて増幅し、luciferase発現Vectorに組み込み、同様にFibroblastにTransfection行ったところ強いpromoter活性を確認することができた。主たるPromoter活性はおよそ200bpのDNA領域に認められ、EC-SOD蛋白を発現していない機構について検討する予定である。
ホットウォール法による強磁性化合物薄膜の半導体基板への成長と評価

磁性体-半導体ハイブリッドデバイスへの応用を目的として、GaAs及びSi半導体基板上に、結晶構造、化学結合の異なるMnSbの結晶成長を行った。成長法としては、装置が安価でメンテナンスも容易なホットウォールエピタキシ-法を採用し、成長法を確立するとともに薄膜の成長条件依存性、薄膜構造を明らかにした。GaAs(100)基板を用いた成長においてSb/Mn供給比をSb過剰下において1に近い領域で成長した場合に平坦なMnSb/GaAs界面を有するエピタキシャル薄膜が得られる事が分かった。このときMnSbの成長方位は(101^^-1)であり、C軸の傾き方位の異なる2つのドメインが成長する。しかし、オフ基板の使用によりドメインの一つの成長が抑制され単結晶薄膜が得られる事が分かった。GaAs(111)面状にはMnSb(0001)薄膜が成長する。GaAs(111)B面に成長したMnSb薄膜はGaAs(111)A面のそれよりも結晶性の良好な薄膜が得られた。これは、(111)A面上ではMn原子はMn及びSb双方と結合するため良好なC面成長が得られないのに対し(111)B面上ではAs原子はMnのみとしか結合しないためである。Si(111)基板上への成長に関しては低い基板温度、Sb過剰下でMnを十分に供給した場合に、薄く平坦なMnSi(111)薄膜を中間層として良好な単結晶MnSbエピタキシャル薄膜が成長できる事が分かった。
凍結過程における岩石－間隙水系の熱拡散率変化挙動に及ぼす間隙構造の影響

本研究では,凍結過程における飽和含水岩石の熱拡散率に及ぼす間隙のサイズ・形状の影響について検討した。その結果,飽和含水岩石の熱拡散率に及ぼす間隙水の影響は,「粘土鉱物中の水」と「鉱物粒子間の水」で異なり,鉱物粒子間に存在する水の凍結は飽和岩石の熱拡散率温度依存性に大きな影響を及ぼすが,粘土鉱物に保有される水(具体的には,吸着水,層間水,および体質水)は熱拡散率の温度依存性に関与しないことを明らかにした。さらに,粘土鉱物に保有される水の凍結の有無について検討を行ったが,それについては明確な結論を得ることができなかった。低温液化燃料の岩盤内貯蔵方式の設計や積雪寒冷地における岩盤斜面の長期安定性評価など,岩盤の熱伝導解析では水や氷が内在する岩盤の熱拡散率を把握する必要がある。本研究の目的は,凍結過程における飽和岩石の熱拡散率に及ぼす間隙のサイズ形状の影響を明らかにすることである。本研究課題は(1)から(4)の4項目から成る。平成26年度は(1)間隙構造の異なる岩石の凍結過程における熱拡散率の変化挙動と,(3)間隙構造の異なる岩石の凍結過程における力学物性の変化に関して研究を実施した。具体的に(1)に関しては,孔(μmオーダー)を主とするベレア砂岩について0-100°Cの温度範囲で熱拡散率を計測し,既に測定を終えている細孔(nmオーダー)を主とする荻野凝灰岩と,孔と細孔が混在する来待砂岩とを比較検討した。(3)に関しては,飽和含水状態のベレア砂岩の0-170°Cの温度範囲における一軸圧縮強さ・圧裂引張強さを計測し,既に測定を終えている来待砂岩の結果と比較検討した。それらの結果より以下の知見を得た。(1)に関しては,飽和ベレア砂岩の熱拡散率は,常温から-30°Cに冷却すると急増し,その後-100°C付近まで線形的に増加する挙動を示す。低温下における熱拡散率の温度依存性は,間隙率の小さいベレア砂岩(12.8%)の方が来待砂岩(20.2%)よりも大きい。(3)に関しては,飽和ベレア砂岩の一軸圧縮強さは供試体温度の低下にともない線形的に増加する挙動を示し,圧裂引張強さは室温から-50°Cにかけて急増し,その後-170°Cまで増加する挙動を示す。低温下における強度の温度依存性は,間隙率の小さいベレア砂岩の方が来待砂岩よりも小さい。(1)・(3)の結果は,凍結過程における飽和岩石の熱拡散率に及ぼす影響について,間隙のサイズ形状のほかに間隙の占める割合(間隙率)についての検討が必要であることを示唆している。本研究課題は間隙構造の異なる岩石を供試体とし,(1)凍結過程における熱拡散率の測定,(2)間隙構造の観察,(3)凍結過程における強度の測定,(4)2粒子分散型複合材料と仮定する熱拡散率推定式の導出,の4項目から成る。平成27年度は下記を実施した。(2)に関して3供試岩石を走査型電子顕微鏡(SEM)により観察したところ,ベレア砂岩(間隙率12.8%)は主に砂粒子からなり,間隙は砂粒子の隙間に多数存在すること,荻野凝灰岩(28.7%)は主に粘土鉱物からなり,間隙は倍率200倍では観察できないこと,来待砂岩(20.2%)は粘土鉱物で覆われた砂粒子からなり,間隙はごく少数しか確認出来ないこと,を明らかにした。(3)に関して飽和含水状態の荻野凝灰岩の凍結過程(0-170°C)における一軸圧縮強さを計測したところ,一軸圧縮強さは供試体温度の低下にともない指数関数的に増加(-170°Cで約9.5倍)する挙動を示すこと,-170°Cにおける一軸圧縮強さ(約290MPa)は乾燥凝灰岩(約90MPa)と氷(約10MPa)の複合材料(和)では説明できないこと,を明らかにした。既に測定を終えている冷却時の荻野凝灰岩の熱拡散率には温度依存性が見られないことから間隙水凍結の有無が不明であったが,(3)の結果より間隙水は凍結していると結論することができた。しかしながら,粘土鉱物を主体とする荻野凝灰岩の低温物性については,(2)の結果より鉱物と間隙水の複合体としてでは無く別の物質に変化したと仮定して,その挙動を捉える必要性があることが示唆された。平成27年度は,(1)間隙構造の異なる岩石の凍結過程における熱拡散率の変化挙動に関しては姫神花崗岩の計測,(2)間隙構造の異なる岩石の間隙構造の分析としてSEM観察や水銀ポロシメータによる間隙径分布の計測,(3)間隙構造の異なる岩石の凍結過程における力学物性として荻野凝灰岩の一軸圧縮強さと圧裂引張強さの計測,を計画していた。

しかしながら,(1)に関しては姫神花崗岩の熱拡散率の計測を,(2)に関しては水銀ポロシメータによる間隙径分布の計測を,(3)に関しては荻野凝灰岩の圧裂引張強さの計測を,それぞれ実施できていない。以上より,本研究課題の達成度はやや遅れていると判断した。低温液化燃料の岩盤内貯蔵方式の設計や積雪寒冷地における岩盤斜面の長期安定性評価など,岩盤の熱伝導解析では水や氷が内在する岩盤の熱拡散率を把握する必要がある。本研究の目的は,凍結過程における飽和岩石の熱拡散率に及ぼす間隙のサイズ形状の影響を明らかにすることである。本研究課題は間隙構造の異なる岩石を供試体とし,(1)凍結過程における熱拡散率の測定,(2)間隙構造の観察,(3)凍結過程における強度の測定,(4)2粒子分散型複合材料と仮定する熱拡散率推定式の導出,の4項目から成る。平成28年度は下記を実施した。(1)に関して,間隙率1%未満の花崗岩の凍結過程(0-100°C)における熱拡散率を測定したところ,飽和花崗岩の熱拡散率は,常温からー20°C付近までに大きな変化は見らないこと,ー20°C付近からー85°C付近へと冷却していくと熱拡散率は微増すること,さらに,飽和花崗岩と乾燥花崗岩の違いに関係なく,冷却過程における熱拡散率の変化挙動には違いがみられないこと,を明らかした。また(3)に関して,飽和含水状態の荻野凝灰岩の凍結過程(0-170°C)における圧裂引張強さを計測したところ,圧裂引張強さは供試体温度の低下にともないほぼ上に凸の曲線を描きながら緩やかに増加(-170°Cで室温の約6倍)する挙動を示すこと,-170°Cにおける圧裂引張強さ(約19.4MPa)は乾燥凝灰岩(約11.8MPa)と氷(約1MPa)の複合材料(11.8MPaと1.0 MPaの和)では説明できないこと,さらに,本結果と平成27年度に実施した結果より飽和凝灰岩中の間隙水はその大部分が凍結していない可能性も否定できないこと,を明らかにした。以上の結果より,凍結過程における飽和岩石の熱拡散率は,鉱物粒子間に存在する間隙水の体積に支配されること,粘土鉱物間に間隙水には関与されないこと示した。本研究では,凍結過程における飽和含水岩石の熱拡散率に及ぼす間隙のサイズ・形状の影響について検討した。その結果,飽和含水岩石の熱拡散率に及ぼす間隙水の影響は,「粘土鉱物中の水」と「鉱物粒子間の水」で異なり,鉱物粒子間に存在する水の凍結は飽和岩石の熱拡散率温度依存性に大きな影響を及ぼすが,粘土鉱物に保有される水(具体的には,吸着水,層間水,および体質水)は熱拡散率の温度依存性に関与しないことを明らかにした。さらに,粘土鉱物に保有される水の凍結の有無について検討を行ったが,それについては明確な結論を得ることができなかった。平成26年度は(1)間隙構造の異なる岩石の凍結過程における熱拡散率の変化挙動について,ベレア砂岩と姫神花崗岩の0-100°Cの温度範囲での熱拡散率を計測し,凍結過程における飽和岩石の熱拡散率変化挙動を明らかにする計画であった。しかし,姫神花崗岩についてはまだ計測を行っていない。また,実験装置運用上の理由で,平成27年度以降に実施する予定であった(3)間隙構造の異なる岩石の凍結過程における力学物性の変化について,飽和含水状態のベレア砂岩の0-170°Cの温度範囲における一軸圧縮強さ・圧裂引張強さを平成26年度に計測した。以上,遅れている実験と前倒しして実施した実験があることから,本研究課題の達成度は概ね順調に進展していると判断した。本研究課題は(1)から(4)の4項目から成る。(1)間隙構造の異なる岩石の凍結過程における熱拡散率の変化挙動に関して,今年度やり残した飽和含水状態の姫神花崗岩について0-100°Cの温度範囲で熱拡散率を測定する。次に,
ホモタリズム実用酵母育種法の開発と高温エタノール発酵への応用

効率的な高温エタノール発酵への応用を目的として醸造酵母に多く存在するホモタリズム酵母の育種法を確立し、以下の結果を得た。1.高温(40°C)でのエタノール発酵に優れたエタノール耐性酵母として球磨焼酎モロミから分離されたSaccharomyces cerevisiae1200とフィリピンのライスワインから分離されたS.cerevisiae(uvarum)var.inulyticusを選出した。3.したがって、S.cerevisiae1200の単胞子とS.cerevisiae var.inulyticusの一倍体栄養細胞とをミクロマニピュレータを用いてspore to cell mating法により交雑し、接合株二株を得た。2株のうちMate2が40°Cでの発酵速度、エタノール耐性がともに親株より優れ、34日間で11%(v/v)のエタノールを生成した。4.この育種法を用いて、ヘテロタリックな清酒酵母協会9号とホモタリックなワイン酵母OC+2との交雑株を取得し、特徴的な酒質をもつ吟醸酒を創製した。一方、上記ライブラリーから高温耐性遺伝子を選択するため、宿主としてH.polymorpha CK-1から温度感受性変異株を取得した。以上のホモタリズム酵母の直接接合による育種方法は栄養要求性などの遺伝標識のための変異を必要とせず、S.cerevisiae1200の高いエタノール耐性とS.cerevisiae var.inulyticusの速い発酵速度を併せもつ雑種株を育成した。
超高感度電荷センサである単一電子素子を用いた磁束量子検出法の4.2K動作実証

超伝導リング内の磁束量子の検出には,高感度磁気センサである超伝導量子干渉素子が用いられるが,予めこれを集積チップ上に作りこむ必要があり,またその専有面積が大きいという問題があった。本研究では,超小型かつ超高感度電荷センサである単一電子素子を用いた磁束量子検出を試みた。超伝導チップ上に単一磁束量子論理回路を作製し,その上に単一電子素子を作製した。単一磁束量子論理回路の超伝導体にはニオブを,単一電子素子の微小島電極には金ナノ粒子を用いた。これらの個別要素については,外部発表に結び付く結果が得られた。超伝導チップ上に作製した単一電子素子の感度が不十分だったため,単一磁束量子検出には至らなかった。本研究課題では,超伝導リング内の磁束量子の有無を,後付けした単一電子素子で検出することを目標としている。平成27年度においては,まず,それぞれの回路・素子を安定して作製・動作させることを目指した。超伝導回路については,超伝導ニオブ集積回路の試作・測定を通した動作検証を行った。測定温度は液体ヘリウム温度とした。磁束量子伝搬制御を基本とした,単一磁束量子の繰り返し周波数変調や,単一磁束量子の順次読み出しメモリ回路について,動作の検証に成功した。単一電子素子については,数値計算による特性向上の検討,および金ナノ粒子を用いた単一電子素子の作製と特性評価を行った。数値計算による特性向上については,単一電子トランジスタの前段に単一電子箱を設けることで入出力特性が改善されること,さらに単一電子箱を2段接続することで読み出し確率が向上すること(確率共鳴)を確認した。一方,金ナノ粒子を用いた単一電子素子の作製については,数百ナノメートルという比較的大きな寸法の電極上に金ナノ粒子を散布するだけでパーコレーションに似た電流パスが形成され,液体ヘリウム温度はもちろんのこと,液体窒素温度や室温にて帯電効果が発現することを見出した。本研究課題の目標達成のためには,超伝導ニオブ集積回路上に単一電子素子を作製することが必要である。現時点では,単一電子素子の歩留まりが低いという課題が浮上している。超伝導ニオブ集積回路側においても,単一電子素子の追加作製に向けた設計に不具合が見つかっている。後者については,その修正は比較的容易であるが,前者については,何らかの工夫が必要である。現在,リソグラフィ工程を追加したプロセスを試行している。「研究実績の概要」に記載したように,超伝導回路と単一電子素子それぞれの作製についてはおおよそ予定通りに進んでおり,研究成果発表もできている。ただし,単一電子素子作製の歩留まりが低いことから,超伝導回路上への単一電子素子の作製には,何らかの工夫を加える必要があると思われる。このことから,進捗状況としては「(2)おおむね順調に進展している」と判断した。本研究課題では,超伝導リング内の磁束量子の有無を,後付けした単一電子素子で検出することを目標とした。研究期間2年目の平成28年度では,まず単一電子素子の作製方法の確立を目指した。数百ナノメートルという比較的大きな寸法の電極上に金ナノ粒子を散布することでパーコレーションに似た電流パスを形成し,単一電子素子を作製したところ,ゲート電圧に応じてソース・ドレイン電極間の抵抗が変化する三端子素子動作が確認された。作製方法によって,容量結合ゲート型の特性や抵抗結合ゲート型の特性が得られ,最高動作温度として室温動作も確認された。また,散布する金ナノ粒子については,あえて大小2種類の寸法を混ぜることで,「大きな帯電効果」と「小さな抵抗」という相反する特性の両立を改善することができた。年度の後半では,「磁束量子の有無を単一電子素子で検出する」という本研究課題の目標を実現すべく,超伝導ニオブ集積回路上に金ナノ粒子散布法を用いて単一電子素子の作製を試みた。超伝導ニオブ集積回路については,前年度の設計の不具合を修正し,超伝導回路の配線と,その上に作製する単一電子素子との配線とが同時に可能となるレイアウトを実現した。試作初期においては,単一電子素子と外部回路との間の電気的接触がとれないという問題が生じたが,単一電子素子の電極作製プロセスを改良することで解決された。最終的には,超伝導ニオブ集積回路上に複数の単一電子素子を作製し,その特性を液体ヘリウム温度で測定するに至った。残念なことに,単一電子素子そのものの特性にはクーロン閉塞が現れたものの,ゲート電圧に対する応答が弱く,磁束量子の有無を検出するには至らなかった。解決すべき課題としては,ゲート電圧への感度向上を目指したレイアウトの実現,および,単一電子素子の歩留まりの向上が挙げられる。基本的には,交付申請書に記した「平成28年度の研究実施計画」に従って実施する。超伝導回路については,単一電子素子の追加作製に備えた設計を見直す。

最初に試みる「単一磁束量子論理回路側にディジタル状態を電圧に変換する機構を設けた回路」については,それほど困難ではないと考えている。一方,「電圧変換機構を介さない回路」については,いくつかのアイディアを試すことになる。単一電子素子の作製については,「リソグラフィ工程を追加したプロセス」を中心として,歩留まり向上を図る。また,超伝導回路上に素子を作製し,その特性を測定する際,「単一磁束量子を検出しているのか,超伝導回路への入力信号を検出しているのか」を判別できる機構を設ける。電子工学平成27年度にて生じた「次年度使用額」の8割は,産業技術総合研究所での超伝導集積チップ試作費用が当初予測よりも下回ったことによるものである。また,チップ試作に必要な消耗品の一部(電子ビームレジスト等)の購入を先送りしたことも次年度使用額が生じた原因となる。平成28年度においては,試作費用が値上がりする旨の連絡を受けている。また平成27年度にて研究成果が得られていることから,当初予定よりも外部発表の機会が多くなる見込まれる。これらに「次年度使用額」を使用する予定である。これら以外については,当初の計画通りの使用を予定している。なお,超伝導チップ試作費の費目は,当初想定していた「物品費」ではなく「その他」に分類されることになったため,「物品費」の額が少なく,「その他」の額が多くなっている。
新しい高機能荷電粒子トラップのプラズマ科学的基礎研究

本研究の目的は,四重極の交流電場と直流電場を重畳させた統合場が,時間平均されると,全方向において内向きとなる性質を利用したイオントラップの動作特性をプラズマ科学的につまびらかにし,高性能のトラップへの発展を試みるため,基礎的なデータベースを作るところにあった.1.第1号機を用いた実験においてはイオン密度は当初予想より遙かに低くて高々10000個/CC程度との評価に至った.そこで電流検出法から,マイクロチャンネルプレート(MCP)による増幅を入れた粒子計数法に切り替えて,検出感度の向上を目指したが,1段増幅では不十分であった.特に必須要素である高周波電場のノイズに混入を凌ぐほどの信号増幅が必要であった。2.実験の一方で高速計算機GRAPE-6を用いて実験と同じ3次元空間でシミュレーションを行った.その結果、主路線とした四重極高周波による閉じ込め方法は少なくとも数ms以上の時間に渡りイオンを保持できることが期待され,計測技術が向上すれば,目的達成に進展可能であると判断された。3.このような検証により基本に立ち返って着実な実験を積み重ねることの重要性を確認した.まずイオンの検出を最優先課題と位置づけ,単純な空間構造で剛性の高い2号機を設計し新規に作成した.新装置ではイオン生成と電気的な閉じ込め操作,それにイオン計測をそれぞれ,モジュール化した.イオンはまずBe-Cuターゲットに当てて二次電子に変換のあと2段マイクロチャンネルプレートで増幅後,粒々として計数することにした.しかも検出位置は2箇所に増やしイオンの検出確率を改善した.更に閉じ込め空間には複探針を導入して,イオン生成の確認も行える構造に改善した.この2年間の実験計画も終わりに近づき,当初の予想より遙かに難しい課題であることを体験した.しかし,この活動を通じて協力者である院生の技術も向上したし,実験装置の改善も大幅に進行した.高機能トラップに対するプラズマ科学的検討は,萌芽研究を出発点としてこれから本格化する.本研究は,金山によって考案され原子スケールの構造を形成するための基本ブロックとなるクラスター成長に利用された新方式のイオントラップ(金山トラップと呼ぶ.1995年に論文公開.)において,イオンの空間電荷効果が支配的となった場合の特性を実験的に検証することを第1の課題とし,閉じ込められた荷電粒子の高密度化と制御性の高度化を第2の課題とするものである.その基本的な構造は直流の引力と交流電場による斥力を重畳して,閉じ込めポテンシャルを形成するところにある.原型では4本の中心電極に四重極の交流定常波を励起しているが,本研究の試作機では,一方向に回転する双極電場を励起する機能を付加した.このほか外部電極となる円筒壁は周方向に8片に分割し,周方向に回転する電場を重畳する機能と,分布制御のノブとして電極の軸方向に平行な磁場を重畳できる機能を加えた.加えて,イオン密度の空間分布を観測するために検出器のアレイを取り付けた.最初の実験では,アルゴンイオンの電流の計測により閉じ込め時間を評価する方法を採用した.1μA以上を検出範囲とするこの計測法では,1ms以上閉じ込められるイオンは検出されていない.この感度に対するイオン密度は10^4cm^<-3>程度と評価される.これは実効的なポテンシャル井戸の深さ(1V以下)にほぼ対応するので,密度の限界であるとの判断が可能である.しかし手製の回路で発生した4チャンネル高周波電場のわずかな不揃いなど対称性の不足に因る可能性もあるため,制御系統の改善と,電流計測からはるかに感度の高い粒子計数方式への切り替え作業を進めている.その一方において,純実験的アプローチでは見えにくい過程を把握するため,シミュレーションによる解析を立ち上げた.重力系の研究用に開発された計算機GRAPE-6コードを活用して,高周波の中におかれた荷電粒子の自己場の寄与を評価し,実験指針の設定に利用する.本研究の目的は,四重極の交流電場と直流電場を重畳させた統合場が,時間平均されると,全方向において内向きとなる性質を利用したイオントラップの動作特性をプラズマ科学的につまびらかにし,高性能のトラップへの発展を試みるため,基礎的なデータベースを作るところにあった.1.第1号機を用いた実験においてはイオン密度は当初予想より遙かに低くて高々10000個/CC程度との評価に至った.そこで電流検出法から,マイクロチャンネルプレート(MCP)による増幅を入れた粒子計数法に切り替えて,検出感度の向上を目指したが,1段増幅では不十分であった.特に必須要素である高周波電場のノイズに混入を凌ぐほどの信号増幅が必要であった。3.このような検証により基本に立ち返って着実な実験を積み重ねることの重要性を確認した.まずイオンの検出を最優先課題と位置づけ,単純な空間構造で剛性の高い2号機を設計し新規に作成した.新装置ではイオン生成と電気的な閉じ込め操作,それにイオン計測をそれぞれ,モジュール化した.イオンはまずBe-Cuターゲットに当てて二次電子に変換のあと2段マイクロチャンネルプレートで増幅後,粒々として計数することにした.しかも検出位置は2箇所に増やしイオンの検出確率を改善した.更に閉じ込め空間には複探針を導入して,イオン生成の確認も行える構造に改善した.

この2年間の実験計画も終わりに近づき,当初の予想より遙かに難しい課題であることを体験した.しかし,この活動を通じて協力者である院生の技術も向上したし,実験装置の改善も大幅に進行した.高機能トラップに対するプラズマ科学的検討は,萌芽研究を出発点としてこれから本格化する.
大腸がんリンパ節転移の分子機構の解明及びリンパ節転移術前予測マーカーの開発

始めに目的遺伝子のノックアウト(KO)細胞の樹立を行った。細胞はSW480及びSW620を使用した。KO対象遺伝子はFas及びXIAPで、CRISPR Cas9によりKOを行った。Lipofection法ではKO効率が著しく低かった為、最終的にElectroporation法で行った。その結果KO効率は、SW480でFasは約15%、XIAPは約10%、SW620でそれぞれ510%程度であった。上記4種類のKO処理した細胞群からSingle Cell Screeningを行う為、それぞれ96 well plate 4枚ずつに1cell/wellになるように播き、後日1colonyのwellを6well plateに継代した。その後80%confluentになったものを1/20を継代、19/20を以下の分析に使用した。これらの細胞からGenomを抽出、PCR、clean up後、DNA sequencingを行って、homoでKOされている細胞をKO細胞として、in vivo転移実験に使用した。in vivo転移実験では、Balb/c nu/nu 5週齢雌マウスをチャールズリバー社から購入して使用した。SW480及びSW620のWT、樹立したKO細胞を5×105 cellsずつマウスに尾静脈注射により移植した。2週間後、SW480及びSW620のWTにのみ骨盤及び小腸のリンパ節と考えられる場所に転移巣をそれぞれ1つ確認され(所見)、4週間後には同様にWTにのみ小腸、大腸、骨盤、胃壁のリンパ節と考えられる場所に数個の転移巣が、5週間後にはWTにのみ腸、大腸、骨盤、胃壁のリンパ節と考えられる場所に数個の転移巣が、左肺と右肺にも転移巣と疑われるものが観察された。以上の結果からFas、XIAPが大腸癌のリンパ節転移に重要な役割を果たしていることが示唆された。本研究では、大腸がんリンパ節転移の分子機構の解明を目的としている。申請者らがこれまでに発見したリンパ節転移に関わる候補遺伝子をsingle及びmultiでknock out (KO)した細胞株を樹立し、mouseを用いた実験により転移の状態及び細胞の遺伝子的背景を明らかにすることが目的である。今年度はKO株の樹立が主な目的である。使用する細胞株は当初microRNAの発現の観点から、HT29及びDLD1の使用を考えていたが、リンパ転移がんから樹立されたSW620を用いる方がより直接的で効果的であろうという議論になり、こちらを使用することとした。CRISPR Cas9systemを用いFas, XIAP, mTOR, HIF1a,IGF1RのKOを試みた。CRISPR Cas9systemでは、Cas9のmRNAとtarget geneのDNAの一部を含むguide RNAを細胞にトランスフェクションするが、SW620のKOに関する報告は少なく、トランスフェクション効率が低いことが理由の一つだと考えられる。我々の研究においても、lipofection法、複数のelectroporation法を試みているが、高効率でのトランスフェクションが実現できていない。しかし低効率ながらFasのKOは実現できており、現在single cell screeningを行っている。他の遺伝子に関しては、guide RNAの設計の見直し、複数の装置におけるそれぞれのelectroporationの条件検討を行っている。当初の予定からすると遅れを生じているが、KO細胞の樹立に最も時間を要することは予想されており、現状の遅れは想定の範囲内で今年度中にカバーできると考えている。同時にmouseを使った実験に関しても、研究協力者の六車先生と検討を開始しており、KO株樹立後効率良くin vivo実験に入れるように準備中である。遅延の最大の理由は、使用した細胞へのCas9のmRNAとtarget geneのDNAの一部を含むguide RNAのトランスフェクション効率が予想以上に低く、KO条件検討に時間を擁していることである。また遺伝子によってはトランスフェクション効率だけではなく、CRISPR Cas9によるKOメカニズムの一部である遺伝子の切断が、うまく働いていないと考えられるものもあり、その遺伝子に関してはguide RNAの設計に苦慮している点も遅延の理由となっている。検討パラメーターも多いため、遅れを取り戻すためにもう少し時間が必要であるが、条件が見つかれば遅れを取り戻すだけのスピードアップは可能だと考えている。

2週間後、SW480及びSW620のWTにのみ骨盤及び小腸のリンパ節と考えられる場所に転移巣をそれぞれ1つ確認され(所見)、4週間後には同様にWTにのみ小腸、大腸、骨盤、胃壁のリンパ節と考えられる場所に数個の転移巣が、5週間後にはWTにのみ腸、大腸、骨盤、胃壁のリンパ節と考えられる場所に数個の転移巣が、左肺と右肺にも転移巣と疑われるものが観察された。以上の結果からFas、XIAPが大腸癌のリンパ節転移に重要な役割を果たしていることが示唆された。基本的には当初の計画と変更する点はない。遅延の回復に対しては、guide RNAの設計、トランスフェクション方法及び条件の検討が主な検討項目であるが、パラメーターが非常に多いため、目的物をトランスフェクションする前の予備実験段階で、GFP遺伝子など視覚的に確認しやすいものをトランスフェクションして、トランスフェクション条件を更に詳細に検討する。その後遺伝子によっては複数のguide RNAを設計し、同時並行的にトランスフェクションを行う条件を増やすことで、遅延を取り戻していきたいと考えている。どうしてもうまく行かない場合は、細胞の種類を変更することも視野に入れているが、以後の実験のことを考えて、現在のところSW620を使用する方針を変更する予定はない。また遺伝子の転移に対する影響のin vivoでの検討に関しては、優先順位をつけて段階的に進めていきたいと考えている。従って、本年度後半にはin vivoとex vivoの検討を同時に進める時期があることが推測されるが、対応可能だと考えている。またそのように進めることで、万一遅延が100%回復できなかった場合でも、目標の達成率を上げ、効果的に次の展開につなげていけると考えている。ほぼ全額使用したが、今年度最終段階で購入予定であった低額消耗品が納期の都合で入手できなかったため、余剰を生じる結果となってしまった。次年度初期段階の実験において必要な消耗品の購入によって、使用する予定である。
抗Tac抗体を用いた成人T細胞白血病治療法の開発

まず、抗Tac抗体産生ハイブリドーマ細胞を、マウス腹腔に接種して得られた腹水より、硫安塩析沈殿,ゲル濾過,イオン交換クロマトグラフィーにより抗体を精製した。精製抗Tac抗体に、イムノトキシンの1つであるリシンのA鎖を結合させ、リシンA鎖結合抗Tac抗体を作製し、その細胞傷害性を検討した。Hut102細胞などの、IL-2レセプターを多数発現しているHTLV-I感染培養細胞株では、リシンA鎖結合抗Tac抗体存在下に72時間培養すると、対照と比べて生細胞は1/10に減少し、細胞の蛋白合成に対しても80-90%の阻害がみられた。これに対し、IL-2レセプターを発現していない細胞株に対しては、明らかな細胞傷害作用は認められなかった。ATL患者末梢血白血病細胞では、そのIL-2レセプター発現は軽度中等度であった。調べた10例のうち4例においては、リシンA鎖結合抗Tac抗体は、軽度中等度の蛋白合成阻害を示したが、その他の例では、阻害効果は低いか認められなかった。正常PHA刺激リンパ球に対しては、細胞がIL-2レセプターを発現しているにもかかわらず、細胞傷害作用はほとんど認められなかった。これらの結果より、リシンA鎖結合抗Tac抗体は、HTLV-I感染細胞株,ATL患者白血病細胞に対し、選択的に細胞傷害作用を及ぼし、実際の治療にも使用しうる可能性が示されたが、実際のATL患者白血病細胞では、満足しうる傷害効果の認められないものも少なからず存在し、今後、抗体に結合させる物質や、IL-2レセプター発現増強方法等につき、検討する余地が残されている。動物実験に関しては、ATL細胞の実験動物内での増殖が困難であった。これは、従来より報告されている結果と同じで、現在、良い実験動物モデルをつくる作業を継続して行っている。