hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
NMR解析に基づくマウスフェロモンESP4の構造と受容体認識に関する研究

ESP4は、外分泌腺のうち、眼窩外涙腺、顎下腺、ハーダー腺に分泌されており、ESP1とのアミノ酸配列の相同性が高い。我々は、ESP4がESP1と異なる受容体で認識されることを示唆する結果を得ている。本研究は、ESP4の立体構造および受容体認識機構を解明し、構造生物学の観点から、受容体の厳密なリガンド識別機構を明らかにすることを目的とする。24年度はESP4受容体が存在すると考えられる膜環境に着目した。生体膜を模した膜環境を形成する化合物存在下でのESP4のNMR解析を行い、擬似的膜環境下におけるESP4の立体構造を解析した。また、ESP4と膜模倣化合物との相互作用部位についての解析も行なった。解析の結果、ESP4はヘリックスに富む立体構造をもつことを明らかにし、また膜との相互作用を示唆する成果を得た。凝集性の高いESP4蛋白質において、オリゴマー化を抑える変異体、受容体結合部位を同定するための変異体の大量調製法を確立することに成功した。年次計画の通りに、目標を達成していることから、順調に進展していると考えられる。ESP4受容体の同定に向けて、ESP4の鋤鼻神経刺激活性化能を向上する必要がある。現在、鋤鼻受容体周辺の環境に着目し、ある化合物を加えることでESP4の構造変化が生じていることを明らかにした。今後、ESP4受容体の同定および大量調製法の確立を行い、ESP4-受容体複合体の結晶構造を解明していく。
ゲノム情報利用による根機能を制御する有用遺伝子の単離と分子育種

本申請課題は、ゲノムワイドアソシエーション解析(GWAS)を用いて根の形態に関わる遺伝子を同定し、「根の形態と植物の栄養吸収・転流の関係性」を解明することを目指したものである。一昨年度までに、根系を迅速に数値化する画像解析技術を確立し、根の長さや数などの複数の形質データを取得することに成功していた。そこで本年度は、得られた複数の形質データを用いて主成分分析を行い、得られた主成分得点に基づきGWASを行った。過去の研究から、複雑形質を用いた主成分分析は、イネの複雑形質に関わる遺伝的要因の要約を可能にするとともに、GWASとの統合は、原因遺伝子の同定に有効であることが確認されている。そこで、複数の要素により構成される根系にも同手法を応用した結果、有力な候補遺伝子を同定することに成功した。さらに、候補遺伝子について形質転換体を作成することで、候補遺伝子の根系に対する効果を検証した。いくつかの候補遺伝子に関して形質転換体を作成した所、1つの候補遺伝子の形質転換体でコントロール系統に比べ、長い根が観察された。この結果より、本遺伝子がGWA解析で検出されたシグナルの原因遺伝子であると考えられた。さらに、イオノーム解析により、本解析遺伝子が植物組織内における特定の元素含量の制御にも関わっていることが明らかになった。今後、この遺伝子をより詳細に解析することで、本研究の当初の目的である「根の形態と植物の栄養吸収・転流の関係性」を解明する手がかりになると考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、イネの農業上有用な形質に関わる遺伝子を効率的に同定する手法を開発し、論文にまとめた。作物育種において農業上有用遺伝子の単離・同定は、収量の増加やそれに関わる遺伝的メカニズムを解明するために極めて重要である。ゲノムワイド関連解析(GWAS)は、これまでヒトの疾患に関わるリスク領域・遺伝子の同定や疾患のメカニズム解明に重要な貢献を果たしたが、GWASによる作物を材料とした遺伝子同定は未だ稀な状況である。そこで私と共同研究者は、GWASに用いる集団選びや解析手法を改良することにより、イネの農業有用形質に関わる遺伝子の単離・同定を試み、開花や一穂粒数などに関わる複数の新規遺伝子を同定することに成功した。本研究で用いた解析手法は、本論文で対象としなかった形質にも応用可能であり、新規遺伝子の単離・同定が加速されることが期待される。根系形質は、作物の養分吸収や乾燥耐性の観点から非常に重要な形質であるが、土壌中での観察が困難なため、研究は地上部に比べて大幅に遅れている。そこで私は、根系の観察が容易になれば、上記の論文で報告した解析手法により根系に関与する遺伝子単離を行うことができると考えた。最近、根系を迅速に数値化するRoot system architecture (RSA)と呼ばれる技術が報告された。RSAは、まず透明な容器に入れたゲル内で植物体の根系を十分発達させ、根を撮影する。次に、撮影した写真をデジタルデータへ変換し、画像解析に用いることで、根系を複数のパラメーター値として表現することができる。この手法を応用し、イネの根系形質の測定を試みた所、根の長さや数などの形質データを取得することに成功した。さらに、得られた形質データを用いたGWASにより有力な候補遺伝子を同定することが出来た。来年度は、形質転換体を作成し、候補遺伝子の根系に対する効果を検証する。研究実績の概要で述べた通り、本年度は、イネの農業上有用な形質に関わる遺伝子を効率的に同定する手法を開発し、論文にまとめ、発表することができた。また、論文で報告した手法を用いることで、根系形質に関わると思われる有力な候補遺伝子を見出すことが出来た。当初の計画では、候補遺伝子を同定するところまでが今年度までの計画だったが、現在、候補遺伝子の機能を検証するための形質転換実験をすでに進めている。以上の理由により、当初の計画以上に進展していると判断した。本年度は、日本育種学会において口頭発表により次のような内容で報告を行った。ゲノムワイド関連解析(GWAS)を行う際、集団構造に起因した偽陽性や偽陰性を抑えるため、GWASに使用する集団の構成や解析モデルを工夫する必要がある。しかしながら、集団サイズが小さい場合や原因多型が極めてマイナーアリルである場合、解析モデルを工夫しても検出力の低下は免れない場合がある。特に作物におけるGWASの場合、集団構造と形質の特徴パターンが互いに関連していることがあり、検出力の低下はとりわけ深刻である。そこで今回、2つの独立なイネ集団を用意し、GWASの反復試験を行うことで、GWASで検出されたシグナルの検証を試みた。その結果、反復試験によるGWASシグナルの検証は、信頼できるシグナルを検出するために有効であることが明らかとなった。上記の通り、GWASで信頼できるシグナルを検出可能であることが確認できたため、有用遺伝子の単離を目指し、根系形質に関するGWASを行った。一昨年度までに、根茎を迅速に数値化する画像解析技術を確立し、根の長さや数などの複数の形質データを取得することに成功している。そこで本年度は、得られた形質データを用いてGWASを行い、有力な候補遺伝子を同定した。さらに、候補遺伝子について形質転換体を作成し、候補遺伝子の根系に対する効果の検証を行った。

1つの候補遺伝子についてCrispr-cas技術によりノックアウト系統を作成した所、コントロール系統に比べ、長い根が観察された。この結果から、今回注目した遺伝子は、根系形質を制御する有力な候補遺伝子であると結論した。研究実績の概要で述べた通り、本年度は、GWASで反復試験を行うことの重要性を明らかにし、学会にて報告を行った。今後、報告した手法を用いることで、根系形質に関わる信頼性の高い有力なGWASシグナルを検出できると想定される。さらに、これまでの解析で選抜された候補遺伝子について、本年度は、形質転換体による機能の検証を行った。その結果、予測通り根の長さに違いが見られた。当初の計画では、候補遺伝子を予測するところまでが今年度までの計画だったため、すでに当初の計画以上の結果が得られている。現在は、他の候補遺伝子に関しても、機能を検証するための形質転換実験を行っている。以上の理由により、当初の計画以上に進展していると判断した。本申請課題は、ゲノムワイドアソシエーション解析(GWAS)を用いて根の形態に関わる遺伝子を同定し、「根の形態と植物の栄養吸収・転流の関係性」を解明することを目指したものである。一昨年度までに、根系を迅速に数値化する画像解析技術を確立し、根の長さや数などの複数の形質データを取得することに成功していた。そこで本年度は、得られた複数の形質データを用いて主成分分析を行い、得られた主成分得点に基づきGWASを行った。過去の研究から、複雑形質を用いた主成分分析は、イネの複雑形質に関わる遺伝的要因の要約を可能にするとともに、GWASとの統合は、原因遺伝子の同定に有効であることが確認されている。そこで、複数の要素により構成される根系にも同手法を応用した結果、有力な候補遺伝子を同定することに成功した。さらに、候補遺伝子について形質転換体を作成することで、候補遺伝子の根系に対する効果を検証した。いくつかの候補遺伝子に関して形質転換体を作成した所、1つの候補遺伝子の形質転換体でコントロール系統に比べ、長い根が観察された。この結果より、本遺伝子がGWA解析で検出されたシグナルの原因遺伝子であると考えられた。さらに、イオノーム解析により、本解析遺伝子が植物組織内における特定の元素含量の制御にも関わっていることが明らかになった。今後、この遺伝子をより詳細に解析することで、本研究の当初の目的である「根の形態と植物の栄養吸収・転流の関係性」を解明する手がかりになると考えられる。来年度は、形質転換体を作成し、候補遺伝子の根系に対する効果を検証する。また、前年に引き続き計測を行い、複数年の根系データを取得する。これらを用いてGWASを行い候補領域の再現性を確認する。さらに得られたデータから環境変動程度を見積もり、根系に関する遺伝率を算出する。安定的に検出された候補領域については、LDブロック解析、ボックスプロット解析、ゲノムブラウザ等を用いた解析により候補遺伝子予測を行う。さらに、前年までに特定した候補遺伝子もしくは候補領域と各種元素含量データを用いて有意な相関関係を統計的手法により解析し、元素吸収機構のネットワーク構築を試みる。来年度は、前年に引き続き計測を行い、複数年の根系データを取得する。
癌リンパ節転移におけるリンパ管新生因子の機能解析と役割に関する基礎的研究

動物および臨床検体を用いた実験の結果,悪性腫瘍の治療では腫瘍増大を抑えると同時に転移抑制を考慮した治療,つまり血管新生とリンパ管新生の両者を標的とした治療が必要であることが明らかになった.またリンパ節転移のみならず,微小転移にもリンパ管新生が関与していること,癌幹細胞マーカーや一部のケモカインもリンパ節転移と関連があることが示された.癌治療を行う上でリンパ管新生および血管新生を標的とすることは臨床上も現実的であり,標的分子としてVEGF-D, VEGFR-2, VEGFR-3が有用であることが示された.動物および臨床検体を用いた実験の結果,悪性腫瘍の治療では腫瘍増大を抑えると同時に転移抑制を考慮した治療,つまり血管新生とリンパ管新生の両者を標的とした治療が必要であることが明らかになった.またリンパ節転移のみならず,微小転移にもリンパ管新生が関与していること,癌幹細胞マーカーや一部のケモカインもリンパ節転移と関連があることが示された.癌治療を行う上でリンパ管新生および血管新生を標的とすることは臨床上も現実的であり,標的分子としてVEGF-D, VEGFR-2, VEGFR-3が有用であることが示された.Vascular endothelial growthfactor (VEGF)-DおよびそのレセプターであるVEGFR-2,VEGFR-3に対する中和抗体を用いたマウス実験を行い,in vivoにおける血管新生,リンパ管新生について検討を行った.まずVEGF-D導入ヒト腫瘍細胞をマウスに接種したリンパ節転移モデルを作製し,抗VEGFR-2,抗VEGFR-3,抗VEGF-D抗体による治療効果を比較した.また腫瘍組織のPECAM-1,LYVE-1による免疫組織染色を行うことで腫瘍血管新生,リンパ管新生を評価した.その結果,以下の知見が得られた.1)VEGF-D導入により腫瘍組織の血管新生,リンパ管新生を誘導,リンパ節転移が促進された.2)抗VEGFR-3あるいは抗VEGF-D抗体による治療では腫瘍の縮小効果は不十分であったが,リンパ管新生,リンパ節転移は抑制された.3)抗VEGFR-2抗体による治療では腫瘍増大を抑制できたが,リンパ節転移に対する効果は乏しかった.4)抗VEGFR-3抗体と抗VEGFR-2抗体の併用により腫瘍増大およびリンパ節転移の両方が十分に抑制された.5)抗VEGFR-2抗体のみの治療では腫瘍に対する縮小効果は認めたものの腫瘍中のLYVE-1発現密度はむしろ上昇した.以上のことから悪性腫瘍の治療では腫瘍増大を抑えると同時に転移抑制を考慮した治療,つまり血管新生とリンパ管新生の両者を標的とした治療が必要であることがわかった.新生リンパ管,新生血管それぞれのマーカーであるLYVE-1,PECAM-1の発現とVEGF family receptorであるVEGFR-2,VEGFR-3の同一切片での発現をみるためにImmunofluorescence Double Immunostainingを行った.その結果,抗VEGFR-2抗体単独では腫瘍内LYVE-1の発現密度が上昇していたのに対し,抗VEGFR-3抗体投与ではLYVE-1発現密度が低下していた.以上のことから,1)抗VEGFR-2抗体投与により腫瘍縮小が得られ新生リンパ管数の絶対数は減少するものの,リンパ管密度はむしろ上昇するためリンパ節転移を完全には抑制しきらないこと,2)抗VEGFR-3抗体は新生リンパ管数,リンパ管密度ともに抑制するために完全にリンパ節転移を抑制しうることがわかった.さらに臨床検体を用いた研究ではリンパ節転移のみならず,初期段階である微小転移にもリンパ管新生が関与していること,癌幹細胞マーカーであるCDI33がVEGF-C発現,リンパ節転移と関連が認められるとともに,ケモカインの一つであるCXCL12発現もリンパ節転移と関連があることが示された.本研究により癌治療を行う上でリンパ管新生および血管新生を標的とすることは臨床上も現実的であり,その際のターゲットとしてVEGF-D, VEGFR-2,VEGFR-3が有用であることが示された.
ヘテロ二量体化ロイシンジッパー法によるタンパク質の細胞内運搬技術の開発

申請者は、病気の治療を目的として、細胞内に機能性タンパク質や機能性ペプチドを運搬する方法の開発を目指している。今回申請者は、オートファジー誘導ペプチド(Beclin 1)とヘテロ二量体化ロイシンジッパーペプチド(LzK)を連結させた。また、細胞内運搬ペプチドとLzKの対となるペプチド(LzE)を連結させた。これらのペプチドは混ぜると、Beclin 1が細胞内に運搬され、オートファジーを誘導できた。本研究では、タンパク質(またはペプチド)を細胞内に運搬し、そのタンパク質(またはペプチド)の機能を保持できる新しい細胞内デリバリー法に関して研究を進めている。本年度は、オートファジーを誘導することが知られているBeclin-1タンパク質の部分ペプチド(Beclin-1ペプチド)がオートファジーを誘導することが報告されたので、そのペプチドについて本システムが有効がどうかについて評価した。具体的には、Beclin-1部分ペプチドにヘテロ二量体化ロイシンジッパーの片方を連結させ、また細胞内運搬ペプチド(CPP)にもう一方のヘテロ二量体化ロイシンジッパーを連結したコンジュゲートらを合成した。これらのペプチドを混合し、HeLa細胞にインキュベートすることでうまく細胞内にBeclin-1ペプチドが運搬され、オートファジーを誘導することがわかった。一方でBeclin-1ペプチドに直接CPPを連結したコンジュゲートでは、Beclin-1ペプチドが細胞内に運搬されることが確認されたものの、オートファジー以外の細胞死が顕著に生じることから、Beclin-1ペプチドの機能が十分に発揮できていないことがわかった。本年度の結果により、本システムによる細胞内デリバリー法は従来法と比較して、有効にそのペプチドの機能を保持できることがわかった。前年度、本システムにより機能性ペプチドの細胞内運搬に成功したので、本年度は本システムによるタンパク質の細胞内運搬について検討した。用いたタンパク質はp53タンパク質であり、p53とヘテロ二量体化ロイシンジッパーの片方とを融合させることに成功した。前年度に合成が確立した細胞内運搬ペプチド(CPP)ともう片方のヘテロ二量体化ロイシンジッパーの連結体を作成し、先ほどのタンパク質の融合体と混ぜ合わせて、細胞増殖試験を行ったところ、本システムにおいて明確な細胞増殖抑制効果が示された。一方で、同じ条件でp53とCPPとの融合体で細胞増殖試験を行ったところ、そのような細胞増殖抑制効果は認められなかった。これらの結果より本システムの有用性が実証された。我々は上記の実験と同じくして、タンパク質の一種であるNanogとヘテロ二量体化ロイシンジッパーの連結体の作成を試みている。また、このNanogの本システムによる細胞内運搬および細胞内での機能を評価するために、蛍光発光を用いた検出システムの作成に成功した。最後に我々はヘテロ二量体化ロイシンジッパーの代わりにペプチド核酸(PNA)を用いた機能性ペプチドの細胞内運搬についても試みた。PNAは9量体程度の長さでは、機能性ペプチドとCPPとをハイブリッド化させないことが明らかとなった。また、PNAは12量体程度の長さになると機能性ペプチド(Beclin-1)をそのまま細胞内に運搬する結果が得られ、PNAによる本システムのさらなる改善が必要であることが明らかとなった。本研究では、タンパク質(またはペプチド)を細胞内に運搬し、そのタンパク質(またはペプチド)の機能を保持できる新しい細胞内デリバリー法に関しての研究を進めている。前年度は、p53タンパク質と細胞内運搬ペプチド(以下CPP)とを本法により連結することに成功し、さらに細胞増殖抑制効果を確認できた。そこで今年度は、この運搬法によるp53の核内での遺伝子発現について確認を行なったが、明確な結果を得るまでに至らなかった。現在、この核内での遺伝子発現の確認のためのシステムを再構築している。また、動物実験を試みたが、同様に明確な結果を得ることができなかったため、再度、細胞実験から動物実験に最適な条件を検討中である。Nanogタンパク質とヘテロ二量体化ロイシンジッパーの合成は成功したので、今後、このタンパク質に関しての本法の有用性を確認していきたい。また、我々は将来的に本法に利用するために新しい機能性ペプチドとしてマイクロRNAを検出できるペプチド核酸ビーコンをCPPを用いて細胞内に運搬することを実施した(これはジスルフィド結合による連結により行った。将来この部分をヘテロ二量体化ロイシンジッパーに変更したい)。このペプチドは、miRNA検出時の蛍光発光が弱いため、今後、蛍光基-消光基の組み合わせを検討していく。前年度の今後の研究の推進方策に従い、調査できている。p53を用いたシステムにおいて、機能性ペプチドのときと同様に本システムの有用性が確認できたことは本研究に大きな意味をもたらした。生物有機化学ここまでの研究成果を引き続き進展させるため、p53タンパク質についてさらに詳細な評価を行なう。

Nanogタンパク質についてもヘテロ二量体化ロイシンジッパーとの融合体の作成を成功させ、評価に移る予定である。本年度の研究により、本システムの有用性(ペプチドをその機能を有効に保持した状態で運搬できる)が明らかとなった。本結果は重要であり、さらに他の機能性ペプチドでも調査を続けたい。一方で、タンパク質については現在実験中であるため、今後はタンパク質についても同様の調査を行いたい。当該ロイシンジッパーペプチドにおいて、その化合物の精製のためのHPLC分取が予定以上に時間がかかり、そのための費用を使わなかった。本年度は、タンパク質として転写因子の一種である、p53やNr4a2といったタンパク質を本システムにより細胞内デリバリーできるかについて調査する。またBeclin-1部分ペプチドについてもヘテロ二量体化ロイシンジッパー以外のハイブリッドシステムを用いて同様の効果が得られるかを調査する予定である。上記のHPLCの分取は本年度の5月中までに実施可能となったので、その当該費用を使用する。当該ロイシンジッパーシステムにおいて、大腸菌でのタンパク質の発現を行っており、その条件検討が進められている。そのため全ての費用を使わなかった。大腸菌でのタンパク質の発現の条件検討を行い、さらに細胞培養まで行うことで当該費用を使用する。
診療報酬制度の経済分析

平成26年度において,本研究プロジェクトでは以下の研究を行った.第3に,第2研究から派生した研究である混合寡占市場における垂直的・水平的差別化行動の分析を行った研究であるが,先行研究の調査と基本モデルの構築を行った.現在は,基本モデルの拡張に関する分析を行っている.また,これらの研究と並行し,本研究プロジェクトの進行に必要な研究報告を行ってもらうため,他大学の大学院生を3名招聘した.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は主に3点の研究を行った。1点目として、情報の非対称性が存在する下での最適な診療報酬制度について理論的に分析を行った。この研究によって、重症患者に対する診療拒否に伴う費用(治療の遅れ、病院間の移動費用など)が小さい場合は、医療機関にこの重症患者を診療拒否させる診療報酬体系の方が、重症患者の治療にかかる追加的な支払いを行う診療報酬体系よりも効率的であるということを示した。この結果は、強い政策的インプリケーションを持っている。現在、日本で導入されている診療報酬体系では、原則的に全ての疾病において治療にかかる費用を保険者(医療保険運営者)は支払う制度となっている。しかし、この分析結果によれば、疾病によって差別的な診療報酬の支払い制度を導入することによって、この制度の効率性が改善することが見込まれる。2点目として、利他的な医療機関(金銭的な利潤だけでなく、患者の利益が効用に加わっている医療機関)が、治療の質について競争を行っている状況下での最適な診療報酬体系について分析を行った。このような効用関数をもっ医療機関の仮定をおいた分析は、いくつか先行研究が見られるが、私は、この利他性が医療機関の間で異なるとき、より利他的な病院ほど治療の質を下げる可能性があるということを理論的に示した。3点目として、医療用医薬品の広告規制に関する理論分析を行った。日本では、製薬メーカーによる医療用医薬品の広告が規制されているが、米国においては、一定の規制があるものの日本と比較すると多くの広告が許容されている。そこで、医療機関を軸とする競争の下での最適な広告規制について理論分析を行った。本研究プロジェクトは,診療報酬制度やその周辺領域についてミクロ経済学の理論(主に産業組織論・契約理論等)を応用し制度設計分析を行うものである.本研究プロジェクトでは,以下の2研究を行った.第1に,患者のコストに関する情報が非対称である場合において(病院には観察可能であるが,保険者には観察不能),病院が診療拒否を行い得る場合の最適な診療報酬制度(出来報酬制度と定額報酬制度の比較)について分析を行った.この研究結果によれば,特定の状況下(例えば,診療拒否を行える私立病院の数が多いとき,診療報酬の支払いコストが小さいとき,高コストの患者の割合が少ないとき)においては,患者の診療拒否を行わせるような診療報酬制度(固定報酬制度)を採ることによって社会厚生が改善することを示した.平成25年度においては,国内の学会・研究会において2回報告を行い,海外の学会・研究会において1回の報告を行った.その際に得られたコメントを基に論文の改訂を行い,平成25年12月にディスカッションペーパー(大阪大学社会経済研究所発行)として研究成果を公表した.第2に,水平的に差別化された病院(例えば病院の立地が異なる場合)が治療の質に関して競争を行っている場合の最適な診療報酬制度について研究を行った.ここで,病院は利他性に関して異質性を持っているものと仮定する.この仮定は,例えば公立病院のような地域に医療サービスを提供する役割を持った病院と,私立病院のような金銭的な利潤を最大化するような病院とが競争を行っている状況を分析するためである.このような状況においては,診療報酬を高くしすぎると,過剰な水平的差別化を行う可能性があるということを示した.平成25年度においては,国内の研究会で1回の報告を行い,現在論文の改定を行っている.平成26年度において,本研究プロジェクトでは以下の研究を行った.第3に,第2研究から派生した研究である混合寡占市場における垂直的・水平的差別化行動の分析を行った研究であるが,先行研究の調査と基本モデルの構築を行った.現在は,基本モデルの拡張に関する分析を行っている.また,これらの研究と並行し,本研究プロジェクトの進行に必要な研究報告を行ってもらうため,他大学の大学院生を3名招聘した.26年度が最終年度であるため、記入しない。申請当初の研究計画とほぼ同じ研究の進捗であるから.平成26年度以降は,以下の研究を行う予定である.第1に,上で述べた非対称情報下の診療拒否問題の研究プロジェクトを学術誌に投稿し,差読者のコメントを基に更に論文の改訂を行う.その後,学術誌に掲載されるまで論文の投稿を行い続ける.第2に,上で述べた病院間競争の研究に関して国内外の研究会・学会で研究報告を行い,論文の改訂を続ける.そして,平成27年度中にディスカッションペーパーとして研究成果の公開をする.第3に,病院間競争の研究から派生した研究プロジェクトとして,混合寡占市場で水平的・垂直的競争を行っている状況における最適な補助金政策,価格規制問題について研究を行う.第4に,医療用医薬品(患者が使用するにあたって医師の処方箋を要する医薬品)の広告に関する研究を行う.現在の日本においては,医療用医薬品を一般消費者に対して広告を行うことは禁じられているが,米国や欧州の一部の国においては許容されている.この広告規制の制度設計に関する研究を行う.26年度が最終年度であるため、記入しない。

当初予定していた研究計画と、実際の研究実績がほぼ一致しているため、おおむね順調に研究が進展しているものと評価できる。先に述べた3点の研究を更に発展させる。第1研究については、ディスカッションペーパーを通じて研究成果を公開する。第2研究については、理論モデルを更に発展させ、平成25年9月をめどに研究成果を公開する。第3研究については、平成25年9月をめどに基本モデルを完成させ、平成26年9月をめどに研究成果を公開する。
シロイヌナズナのインプリント遺伝子活性化におけるクロマチン機能とDNA脱メチル化

植物のインプリント遺伝子がどのようにDNA脱メチル化を受け、どのように片一方の対立遺伝子のみが活性化されるかは多くの部分が不明である。この過程では、DNA脱メチル化を受ける領域の認識・決定、クロマチンリモデリング、ヒストン修飾、塩基除去修復系によるDNA脱メチル化、転写のステップ等が少なくとも考えられる。しかしながら、これらがどのような順番で制御されるかに関してさえ未だ不明である。本研究では、シロイヌナズナを用いて、DNAメチル化を伴って遺伝子発現不活化状態にあるFWAインプリント遺伝子をモデルにこれらの問題に切り込むことを目的としている。FWAはDNAの脱メチル化を受ける時期と細胞、シスエレメント等、多くが明らかになっている数少ないモデル遺伝子である。これまでに、インプリント遺伝子FWAの遺伝子発現を指標にして、ゲノムインプリンティングの制御に関わる変異体を複数単離している。外国人特別研究員のDiana Buzasさんの解析から、alac4変異体は受精前の中央細胞においてFWA-GFPリポーターを活性化できないとともに、他のインプリント遺伝子も活性化できないため、インプリンティングの確立に深く関わる因子と考えられる。また、原因遺伝子は、人から酵母まで保存されているが、その機能が未解明な低分子タンパク質をコードする遺伝子が原因であることを明らかにしている。さらにALAC4遺伝子が中央細胞や胚乳を取り囲む細胞層で強く発現することなどを明らかにしつつある。インプリント遺伝子がどのようにDNA脱メチル化を受け、どのように片一方の対立遺伝子のみが活性化されるかは殆ど明らかになっていない。この過程では、DNA脱メチル化を受ける領域の認識・決定、クロマチンリモデリング、ヒストン修飾、塩基除去修復系によるDNA脱メチル化のステップが考えられるが、これらがどのような順番に起こるかも不明である。本研究では、シロイヌナズナ植物を用いて、DNAメチル化を伴って遺伝子不活化状態にあるFWAインプリント遺伝子をモデルにこれらの問題に切り込むことを目的としている。昨年度後半より特別研究員がスタートした解析から、m035変異体は受精前の中央細胞においてFWA-GFPリポーターを活性化できないとともに、受精後の胚乳でも遺伝子発現抑制状態はエピジェネティックに受け継がれることが明らかになった。また、DNAメチル化を認識し切断するMcrBC制限酵素による解析から、胚乳におけるFWAプロモーター部位のDNA脱メチル化に影響することも明らかになっている。m035変異体の表現形にも予備的な解析を加え、受精後の初期胚並びに初期胚乳に多面的な表現形を生じることを明らかにた。原因遺伝子座に関しても、およそ100kbの領域に狭められている、さらに連鎖解析により領域を絞るとともに、候補遺伝子の配列決定により変異部位を特定することが可能と考えられる。インプリント遺伝子がどのようにDNA脱メチル化を受け、どのように片一方の対立遺伝子のみが活性化されるかは多くの部分が不明である。この過程では、DNA脱メチル化を受ける領域の認識・決定、クロマチンリモデリング、ヒストン修飾、塩基除去修復系によるDNA脱メチル化、転写のステップ等が少なくとも考えられるが、これらがどのような順番で制御されるかに関してさえ未だ不明である。FWAはDNAの脱メチル化を受ける時期と細胞、シスエレメント等、多くが明らかになっている数少ない遺伝子である。1昨年度後半より外国人特別研究員がスタートした解析から、alac4変異体は受精前の中央細胞においてFWA-GFPリポーターを活性化できないとともに、受精後の胚乳では多面的な胚乳、胚発生不全を生じることを明らかにしている。また、原因遺伝子も、人から酵母まで保存されているが、その機能が未解明なタンパク質をコードする遺伝子に変異があることを明らかにし、野生型ゲノムで表現型を相補することも確認している。さらに予備的に、ALAC4遺伝子が中央細胞や胚乳を取り囲む細胞層で発現することなどを明らかにしつつある。
自己免疫疾患に関連する脱リン酸化酵素のT細胞における機能解析

本研究では、自己免疫疾患の関連分子である脱リン酸化酵素、PTPN22(Lyp)およびPTPN2(TCPTP)、の機能解析を行った。PTPN22はT細胞活性化の開始点であるT細胞受容体(TCR)ミクロクラスターに、ネガティブフィードバックらしく30秒程度の遅れを持って集合した。マススペクトルを用いた結合分子探索では、既知のCskに加えて、STS-1, PSTPIPなどホスファターゼ関連分子が同定された。それら分子もTCRミクロクラスターに集合したので、PTPN22とネガティブコンプレックスを形成しTCR活性化を抑制すると考えられた。GWASでI型糖尿病等と高く相関したSNPS産物であるPTPN22(R619W)変異体は、CskやSTS-1との結合が弱く、TCRミクロクラスターへの集合も減少した事から、ネガティブコンプレックスが自己免疫性疾患の鍵となる事が推察された。一方、PTPN2は核や小胞体に局在し、細胞膜と接する様子は観察されず、TCRやサイトカイン受容体近傍で機能すると考えられてきたイメージを覆した。PTPN2欠損T細胞の遺伝子発現パターンを解析した所、既知のIFNgに加え、多くのサイトカインやケモカインの発現が上昇し、結合分子探査ではimportinなど基本的な細胞機能に関わる分子が検出された。従ってPTPN2は受容体から離れた場所で広いターゲットに作用すると考えられ、引き続き研究課題としている。PTPN22およびPTPN2欠損マウスのT細胞を並行して解析した結果、両者の共通点として、炎症性であるIL-6、IFNg、CCL3、CCL4の産生が亢進し炎症を起こしやすい性質が予測された。一方で抑制性サイトカインIL-10も上昇した事から、抑制された炎症が持続的に継続し自己免疫性疾患の発症に至る、というモデルが想定された。これらの考察は今後の研究に繋げる。研究計画[1]-1 T細胞接着や活性化における、自己免疫疾患関連分子、PTPN2、PTPN22、PTPN22(R620W)など脱リン酸化酵素の生細胞内の動態から分子機構を解明するため、まず、PTPN2f/fあるいはPTPN22f/fマウスをCD4-CreおよびTCRトランスジェニックマウスと掛け合わせてT細胞特異的な欠損マウスを得た。人工脂質膜を用いた実験系でT細胞受容体の分子動態を観察したところ、PTPN2KOあるいはPTPN22KOT細胞で変化は認めなかった。PTPN2, PTPN22自身について解析した所、PTPN2は核か小胞体に局在しTCRには集まらなかった。PTPN22は細胞質に存在し活性化に応じて、しかし30秒程度の遅れを持ってTCRのクラスターに集合した。一方、PTPN22(R620W)はTCRのクラスターに集合しなかった。PTPN22の結合分子であるCskの解析と合わせて、活性化に応じて先にTCRに集合したCskがPTPN22を呼び寄せるが、Cskと結合できない変異体であるPTPN22(R620W)は呼び寄せられない、という仕組みを明らかにした。研究計画[2] 129系統のT細胞特異的PTPN2-/-及びPTPN22-/-マウスを作成し、自己免疫疾患の自然発症機構を明らかにすることを目指しているが、129系統への戻し交配を8回終えた。マウスの作成、解析、ともに順調に進んでいる。特に[1]-2マススペクトルで新規結合分子を同定する実験は予想以上に早く終了し優秀なデータを得た。強いて言えばイメージングの実験は、新規に同定された分子も含めてスピードを上げて進めたいところだが、手間のかかる実験なのでやむを得ない。今後、マウス個体レベルの実験では予期せぬ事態に遭遇する可能性があるので、現状に甘んずること無く進めていく。研究計画[1] PTPN22(Lyp)およびPTPN2(TCPTP)の細胞内動態を観察した。PTPN2は核や小胞体に局在して活性化部位に優位に集まる事はなく、PTPN22およびPTPN2の欠損によってTCRクラスターに変化が現れる事もなかった。しかしPTPN22はTCRミクロクラスターに共局在するクラスターを形成した。PTPN22のクラスター形成は30秒程度の遅れを持っており、ネガティブフィードバックとして機能していることが示唆された。また、PTPN22-strep-tagノックインT細胞を用いて、沈降反応とマススペクトル解析を行い、PSTPIPなどの結合分子を同定した。興味深いことに、同定された分子の多くはホスファターゼ関連分子であり、それらはPTPN22と一緒にクラスターとなってTCRミクロクラスターに集合したことから、PTPN22を含むネガティブコンプレックスが形成されていることが明らかになった。並行してT細胞活性化に依存した遺伝子発現パターンなどを解析した所、PTPN2欠損T細胞において、これまで報告があったIFNgのみならず、多くのサイトカインやケモカインの発現が上昇していた。研究計画[2]上記で解明した細胞内機構について生体内での意義を検証するため、PTPN22およびPTPN2のT細胞特異的欠損マウスを自己免疫疾患に感受性の高い129系統に戻し交配した。PTPN

22欠損の場合は自発的な皮膚炎がとても低い(5%以下)頻度でみられた。一方、PTPN2の場合はT細胞特異的欠損であるにも関わらず、生後1-4週間で死亡してしまい、原因を解析中である。また、研究対象として自然発症では制御が困難であるため、B6系統欠損マウスを用いてコラーゲン誘発性関節炎モデルなどを開始している。申請書の内容以上の成果が得られており進展している。しかし動物モデル実験だけは動物の事情によって遅れた部分もあるので、概ね順調とした。本研究では、自己免疫疾患の関連分子である脱リン酸化酵素、PTPN22(Lyp)およびPTPN2(TCPTP)、の機能解析を行った。PTPN22はT細胞活性化の開始点であるT細胞受容体(TCR)ミクロクラスターに、ネガティブフィードバックらしく30秒程度の遅れを持って集合した。マススペクトルを用いた結合分子探索では、既知のCskに加えて、STS-1, PSTPIPなどホスファターゼ関連分子が同定された。それら分子もTCRミクロクラスターに集合したので、PTPN22とネガティブコンプレックスを形成しTCR活性化を抑制すると考えられた。GWASでI型糖尿病等と高く相関したSNPS産物であるPTPN22(R619W)変異体は、CskやSTS-1との結合が弱く、TCRミクロクラスターへの集合も減少した事から、ネガティブコンプレックスが自己免疫性疾患の鍵となる事が推察された。一方、PTPN2は核や小胞体に局在し、細胞膜と接する様子は観察されず、TCRやサイトカイン受容体近傍で機能すると考えられてきたイメージを覆した。PTPN2欠損T細胞の遺伝子発現パターンを解析した所、既知のIFNgに加え、多くのサイトカインやケモカインの発現が上昇し、結合分子探査ではimportinなど基本的な細胞機能に関わる分子が検出された。従ってPTPN2は受容体から離れた場所で広いターゲットに作用すると考えられ、引き続き研究課題としている。PTPN22およびPTPN2欠損マウスのT細胞を並行して解析した結果、両者の共通点として、炎症性であるIL-6、IFNg、CCL3、CCL4の産生が亢進し炎症を起こしやすい性質が予測された。一方で抑制性サイトカインIL-10も上昇した事から、抑制された炎症が持続的に継続し自己免疫性疾患の発症に至る、というモデルが想定された。これらの考察は今後の研究に繋げる。今後はマウスレベルの解析がメインになるよう推移させていく予定である。T細胞特異的PTPN2あるいはPTPN22欠損マウスは、今の所自己免疫疾患を自然発症はしていないが、10回以上の戻し交配を終えた129系統で観察する他、アジュバンド投与など自然に近い形で疾病を誘導する予定である。早めに疾患モデルや条件を決め、T細胞特異的PTPN2あるいはPTPN22欠損マウスを効率よく使用する事が重要だと考えている。研究計画[1] PTPN22を含むネガティブコンプレックスについて追求する。
脳損傷モデルラットを用いたキヌレニン酸髄注による神経保護作用に関する研究

Rose Bengalを用いたPITモデルに対するGene Chipを用いて神経組織のRNA expression profilingをhierarchical clusteringした結果から、グリシン受容体、グルタミン酸受容体、FGFreceptor4,insulin-like growthfactor 1,カスペース、カルシュウムチャンネル遺伝子などの発現が麻痺の回復に重要な役割を果たしていることがわかった。免疫染色の結果、損傷周囲にはグルタミン酸受容体の発現が、健側の感覚運動野にはグリシン受容体の発現の確認ができた。また、このモデルの麻痺の回復には、損傷周囲の感覚運動野の影響のほうが、健側の感覚運動野よりも麻痺の回復に強く寄与していることがわかった。また、このモデルの麻痺回復は最初のダイナミックな麻痺の回復とその後の巧緻性調整に関わる麻痺の回復の分けられることが予想された。キヌレニン酸は最初のダイナミックな麻痺の回復改善に関与している可能性が示唆されたが巧緻性調整に関わる麻痺の回復に関与していないことがわかった。可塑性が考えられる場所には、遺伝子の発現が認められたが、growth-promotingなのかgrowth-inhibitoryに働くのか不明である。よって、キヌレニン酸の神経保護作用を考察する前に、2D-PAGEとPMF analysisを用いて、脳損傷後、麻痺の回復にかかわる皮質のタンパク発現を経時的におこない、PITの麻痺の回復には、GFAP,Stathmin,Laminin,Apo Eが重要な関与をしていることが考えられた。共通して言えることは、星細胞が関与しているのではないかと予想される。PITおけるGFAPはアストロサイトの細胞骨格の動態を制御することにより、神経回路の可塑性にかかわる可能性が示唆された。Rose Bengalを用いたPIT (Photochemically Induced Thrombosis Causing Focal Cerebral Ischemia)モデルに対するGene Chipを用いて神経組織のRNA expression profilingをhierarchical clusteringした結果から、グリシン受容体、グルタミン酸受容体、fibroblast growth factor receptor 4, insulin-like growthfactor 1,カスペース、カルシュウムチャンネル遺伝子などの発現が麻痺の回復に重要な役割を果たしていることがわかった。グリシン受容体、グルタミン酸受容体の実際の発現を見るために、anti-glutamate receptor Ab anti-glycine receptor Abを使用して、免疫染色を行った。その結果、損傷周囲にはグルタミン酸受容体の発現が、健側の感覚運動野にはグリシン受容体の発現の確認ができた。また、このモデルの麻痺の回復には、損傷周囲と健側の感覚運動野の機能が重要な役割を果たしているが、右の感覚運動野にPITを生じさせ、麻痺が回復したあとに今度は、左の感覚運動野にPITを生じさせ麻痺の回復具合を検討した結果から、損傷周囲の感覚運動野の影響のほうが、健側の感覚運動野よりも麻痺の回復に強く寄与していることがわかった。キヌレニン酸は最初のダイナミックな麻痺の回復改善に関与している可能性が示唆された。Rose Bengalを用いたPIT(Photochemically Induced Thrombosis Causing Focal Cerebral Ischemia)モデルの麻痺回復は最初のダイナミックな麻痺の回復とその後の巧緻性調整に関わる麻痺の回復の分けられることが予想された。キヌレニン酸は最初のダイナミックな麻痺の回復改善に関与している可能性が示唆されたが、1990年代後半よりグルタミン酸あるいはグリシン受容体アンタゴニストを用いた薬物が開発され、いくつものランダム化二重盲検試験が実施された結果と同様で巧緻性調整に関わる麻痺の回復に関与していないことがわかった。

よって、キヌレニン酸の神経保護作用を考察する前に、2D-PAGEとPMFanalysisを用いて、脳損傷後、麻痺の回復にかかわる皮質のタンパク発現を経時的におこない、どの遺伝子がgrowth-promotingなのかgrowth-inhibitoryに働くのかを考察する。PITの麻痺の回復には、Glial fibrillary acidic protein(GFAP),Stathmin,Laminin,Apo Eが重要な関与をしていることが考えられた。共通して言えることは、星細胞が関与しているのではないかと予想される。PITおけるGFAPはアストロサイトの細胞骨格の動態を制御することにより、神経回路の可塑性にかかわる可能性が示唆された。
汎用的刺激応答性材料の設計と不斉結晶のメカノクロミズム

メカノクロミズムとは、機械的刺激によって発光色が変化する現象であり、現在極めて活発に研究が行われている。申請者はこれまでに、種々のアリール金イソシアニド錯体を合成し、前例のない特徴を有するメカノクロミック材料を開発しており、この分野で顕著な成果を挙げてきた。その研究の過程で、不斉結晶を形成するアキラル金錯体が興味深いメカノクロミズム特性を示すことを見出し、本研究を想起した。アキラルな金錯体の結晶構造が、光学活性な不斉の相である場合、機械的刺激やその他の外部刺激を与えることで、結晶相の示すキラリティを反転や、on/offの切り替えが期待できる点が魅力であり、キラル光学特性の切り替えを試みる。
中国雲南省白族(ペー族)の白文(ペー文)の分析と解読法の確立

本研究では、中国の少数民族の一つである白族が自民族語を漢字で書き写す表記体系である「白文」の表記体系を解明しようとしたものである。そしてこの問題について、現代白族の間に伝わる民間芸能である「大本曲」テキストをもとに考察し、表記体系の一端を明らかにし、今後の白族研究の問題点を指摘した。22年7月26日から9月8日まで、中国雲南省での調査を行う。計画では、すでに出版されている白文資料をもとに調査を実施するつもりであった。しかし調査の過程で、現在でも大理地方白族の間で「大本曲」と呼ばれる民間芸能が行われている事を確認した。このため調査の対象を「大本曲」台本中の白文に定めることにした。それは「大本曲」の台本が、内容・量ともに非常に整備されており、白文標記の考察のためには、条件が整っていたためである。また現在民間において実際に使用されているという点でも、学術的価値が高いと判断した。調査方法自体は、研究計画の通り、白文資料をテキスト化し、一つ一つの白文語彙を抽出してデータベースの作成に着手した。すでにテキスト化は完了している。さら台本をもとにインフォーマントに演じてもらい、これを録音・撮影した。録音した音声資料をもとに、テキスト化した白文資料に国際音声記号(IPA)を付した。「大本曲」という芸能自体すでに消失する恐れがあるため、音声・映像・国際音声記号で記録する必要があると判断したためである。さらに23年1月24日から3月1日まで、二度目の雲南での調査を行った。前回の調査と同様、民間芸能の従事者について、テキストの翻訳・使用語彙の抽出を行いつつ、IPAを振る作業を継続中である。大本曲は、ひとつの台本を数時間、あるいは数昼夜かけて歌うため、文章の量が膨大である。さらに当初の予定にはなかった音声・映像を記録し、IPAを付す作業が加わった。これらの作業を含めて、全体の計画のほぼ50%が完了している。23年度は翻訳・語彙抽出及びIPAを付す作業に重点をおき、計画を遂行していく。平成22年8月及び平成23年3月に中国雲南省で調査を行う。昨年度に続き、大理白族の間に伝わる民間芸能「大本曲」とそのテキストをもとに白族の言葉を漢字で表記する白文の表記規範について考察おこなった。昨年からの調査成果をもとに2011年9月に「中国雲南省大理白族の「大本曲」の概説と紹介-テキストを中心に-」を『國學院雑誌』において発表した。同文において大本曲の概要を紹介するとともに大本曲テキスト読み上げの過程から、白族が用いる漢語の声調規範が同地方漢族の漢語方言とも異なることを指摘した。この声調規範については、これまでの研究でも指摘されることはなかった。しかも、この漢語の声調規範の発見によって、大本曲テキストの整理及びテキストの表記規範の解明に一定の進展をみた。これまでの調査では大本曲テキスト『秦香蓮』のテキスト化、翻訳、国際音声記号を付すという作業を行った。本テキストをもとにした聞き取り・打ち込み・翻訳・語彙集の作成は、3度にわたるインフォーマントに対する確認作業を経て、ほぼ完成しており、来年度に向けて発表を予定している。また平成23年3月の調査では、これまで調査を行っていた『秦香蓮』テキストとは、同名の演目ながら異なる系統の『秦香蓮』テキストに対する聞き取り調査も行った。それは同一演目間における、複数のテキスト間での表記を比較することにより、白文の表記規範についての一層の理解が進むものと考えたからである。テキスト間における比較作業については、来年度いっぱいまで継続を予定している。平成24年8月13日から29日にかけて雲南省での調査をおこなう。具体的な活動としては、以下のとおりである。1.研究協力者である雲南大学副教授の楊文輝氏とともに、すでに入力及び翻訳済みの資料及び語彙集の最終的なチェックを行った。特にテキスト及び語彙集に付した国際音声記号に関して、入念にチェックを加えた。2.また調査地においては、現地の民間芸能人の王祥氏らの協力を仰ぎ、大本曲の実演を行ってもらいこれを記録した。3.さらに王祥氏より、未記録の大本曲の台本を借り出し、これを写真撮影する。4.大本曲の伴奏に用いられる三弦(中国三味線)の演奏方法について、元・大本曲芸人の黄永亮氏に協力を仰ぎ、聞き取りを行い、記録をした。上記「1.」について、研究代表者と楊文輝氏との間で、白語(ペー語)の発音体系の捉え方に若干、意見の相違がみられた。このため、作成したテキストの修正が必要となった。正確を期すために、残念ながら、白文資料そのものの成果発表については24年度中には見送ることにした。国内においては、現地調査前にテキスト資料を作成する作業を行った。また帰国後、楊文輝氏と検討した結果をふまえて、テキスト作成の最終チェックを行った。当初の目的である白文(ペー文)テキストのテキスト化

・翻訳・語彙集の作成に加えて、国際音声記号を付す作業がすでに完成しており、最終年度(24年度)には確実に研究成果を発表できると考えられるため。これに加えて、当初の予定には入れていなかった周辺テキストとの比較作業がすでに行われているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。まとまった白文テキストの翻訳作業がほぼ完了し、現在は周辺資料との比較検討を行っている。次年度については整理した資料の発表とともに、これら資料間の比較検討を進めていく。現在整理を行っているテキストの周辺には、このほかにも大量の白文資料が存在している。今後はこれら史料群を可能な限り記録・保存する作業を進めていく必要がある。
原発性線毛運動不全症の診断精度向上に関する研究

臨床的に本症が疑われる患者21名を対象に、電子顕微鏡にて100本あるいはそれに近い多数の線毛を観察することにより、10名の患者で明らかな線毛構造の異常を見出した。また、臨床的に本症が疑われる患者21名を対象に遺伝子検査を行い、4名で病的変異と考えられる遺伝子変異を見出した。具体的には、ダイニン外腕の欠損がみられる男児にDNAH5の複合ヘテロ変異が、ダイニン外腕欠損のみられる同胞例でDNAI1のホモの変異が、構造上異常のない男児にDNAH11にヘテロのミスセンス変異がみられた。これら4つの変異は全て既知遺伝子であったが、新規変異であり、日本人に特有の遺伝子変異と考えられた。臨床症状から原発性線毛運動不全症が疑われる患者6名につき検討した。鼻腔一酸化窒素濃度の測定、電子顕微鏡による線毛の構造異常の検討、遺伝子検索を行った。鼻腔一酸化窒素は本症の患者では低値を示すとされており、非侵襲的に短時間で測定できるためスクリーニングとして有用である。測定はATS/ERS標準法に従い、EcoMedics社製ANALYZER CLD 88を用いて測定したところ、6例中4例で著しい低値を示した。電子顕微鏡検査による線毛の構造異常の検討は、下鼻甲介より鼻粘膜生検を行った。6例中5名でダイニン腕の短縮あるいは消失を認めた。原発性線毛運動不全症の診断には電子顕微鏡検査と遺伝子検査が必要であり、スクリーニングには鼻腔一酸化窒素の測定が有用といわれている。本症を正確かつ効果的に診断するために、関連した分野で研究協力体制を構築した。臨床症状から本症が疑われる患者において鼻腔一酸化窒素で著しい低値を示した患者について電子顕微鏡検査と遺伝子検査を行った。線毛の電子顕微鏡検査においては一人の患者につき100本あるいはそれに近い多数の線毛を観察することにより、10名の患者で明らかな線毛の構造異常を見出した。また、21名の患者で遺伝子検査を行い、そのうち1名で複合ヘテロ変異を、2名でホモの変異を、1名でヘテロ変異を見出すことができた。具体的には、ダイニン外腕の欠損がみられる男児にc.5983C>T:p.Arg1995Ter(参照配列NM_001369.2)のナンセンス変異とc.9101_9101delG:p.Gly3034ValfsX22(参照配列NM_001369.2)のフレームシフト変異の複合ヘテロ変異がみられた。ダイニン外腕の欠損がみられる同胞例で、DNAI1にc.1417G>A:p.Cys388Tyr(参照配列NM_012144.3)のホモの変異がみられた。電子顕微鏡にて特に構造異常のみられない一例で、DNAH11にc.12712C>A : p.Leu4238Ile(参照配列NM_001277115.1)のヘテロのミスセンス変異がみられた。今回見つかった4つの変異は全て既知遺伝子ではあったが、新規変異であり、日本人に特有の遺伝子変異と考えられた。耳鼻咽喉・頭頸部外科これまで臨床症状から原発性線毛運動不全症が疑われる患者6名につき、鼻腔一酸化窒素濃度の測定、電子顕微鏡による線毛の構造異常の検討、遺伝子検索を行うことができた。鼻腔一酸化窒素濃度と電子顕微鏡による線毛の構造異常の検討については明らかな結果を得ることができた。しかし、遺伝子解析については、スクリーニングとしておこなった2つの遺伝子には明らかな病的変異を見いだせず、現在エクソーム解析中である。エクソーム解析では個々の症例についてreference geneと比べて多くの差異がみられた。しかしながら、これらのうちどれが真の病的変異であるかの絞り込みが今後必要になってくる。このためには他の領域で同様の遺伝性疾患の遺伝子解析を行っている専門家の意見を聞き、絞り込みを行う予定である。また、今後症例数を増やして鼻腔一酸化窒素濃度の測定、電子顕微鏡による線毛の構造異常の検討、遺伝子検索を行っていく。
臨床応用に向けた長期保存可能なバイオ型人工肝臓の開発研究

1.迅速肝細胞スフェロイド作成法の検討ハイブリッド型人工肝臓モジュールの機能中心として肝細胞スフェロイドの迅速大量作成を目的に、前年に引き続きスフェロイド作成実験を行った。実験数を重ね、EGTA,Ca2+無添加灌流分離法で得られた肝細胞を旋回培養すると6時間後には約80%の肝細胞がスフェロイドを形成することが判明した。また、予備実験において、ブタ肝細胞ではラットに比べ10倍の細胞濃度でも6時間でスフェロイドが形成される知見を得ている。2.ラット肝細胞スフェロイドの凍結実験上記迅速肝細胞スフェロイド作成法で作成したラット肝細胞スフェロイドを凍結保存した。凍結プロトコールは以前報告したものに、若干の変更を加え以下の条件で行った。凍結保護剤(10% DMSO,10% FCS添加L-15培地)に浮遊させた肝細胞スフェロイドを室温で20分静置し、プログラミングフリーザーにて、-5.5°Cにてsuper coolingし着氷後15分間維持した。その後、1°C/minにて-40°Cまで冷却し、-80°Cのdeep freezerに保存した。10日以内に37°C恒温漕にて急速解凍し、急激な浸透圧差が生じないよう、段階的希釈にて凍結保護剤を取り除いた。解凍前後の位相差顕微鏡像、残存LDH量、尿素合成能、残存LDH量、アルブミン産生量を比較検討した。作成直後の肝細胞スフェロイドは球状で一部bleb形成を認め、凍結保護剤浸透中もblebが残るスフェロイドの表面が皺状になった。解凍後はスフェロイドの形態は維持されていたが、こうしたblebが消失していた。残存LDH量は解凍後約27%まで低下しその後も漸減傾向にあった。尿素合成能は解凍直後は約50%程度あったが、漸減し、解凍後24時間では約18%まで低下した。アルブミン産生量は、解凍後24時間で約200分の1と著明に低下していた。今回の凍結保存実験では、不可逆的な細胞死が生じていることが判明した。その理由として、肝細胞スフェロイド自体にblebが存在し、凍結解凍で破壊され、損傷した膜構造が回復できないままの状態であることが推察された。しかし、蛋白合成に関しては期待できないが解毒に関しては短時間であれば使用可能であると考えられた。よりクオリティーの高いスフェロイドを用いて今後検討を要すると考えられた。3.肝細胞スフェロイドの培養環境の検討静置培養では肝細胞スフェロイドは培養早期に尿素合成能が低下していくことが判明したが、コラーゲンゲルを用いた培養環境では高機能を長期に維持することが判明した。大量の肝細胞を充填した人工肝の開発を目的として今年度は以下の実験を行った。