hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
解剖構造ドリブン型内視鏡手術支援手法ーコンテンツ型手術ナビゲーションへの転換

解剖学的構造空間での対応付けに基づく内視鏡手術ナビゲーション、すなわち、解剖構造ドリブン型内視鏡手術支援手法の開発とその診断治療への応用を目指し、平成30年度は「解剖構造ドリブン型内視鏡手術支援のための画像認識理解手法の開発」に関する以下の研究項目を実施した。(1) CT画像上における微細解剖認識手法の実現:腹部CT像上での微細解剖構造認識技術を開発した。腹部血管、リンパ節の自動識別に関する手法を開発した。深層学習による解剖構造高精度自動認識を行った。また、解剖構造情報を利用したリンパ節の経時変化解析を行う方法も検討した。(2)内視鏡映像からの腹腔内構造3次元復元:ステレオ内視鏡映像を用いて、腹腔内の3次元構造を推定する方法の開発を進めた。腹腔内の映像において特徴点の高精度な検出方法を開発し、画像間の3次元構造復元に利用した。内視鏡映像からの解剖構造理解の基礎となる3次元構造推定結果が得られた。(3)内視鏡映像における解剖構造自動認識手法の実現:内視鏡映像からの解剖構造自動認識の基礎手法を開発した。深層学習を用いて内視鏡映像に含まれる血管を自動認識可能とした。(4)解剖学的名称自動付与手法の開発:CT像から識別される血管と内視鏡映像から識別される血管に対して解剖学的名称を付与する方法を検討した。本年度はCT画像から抽出される血管の名称の絶対的関係、相対的関係を機械学習により取得し、自動付与を可能とした。特に深層学習によって得られた臓器情報を基に自動命名精度の向上を試みた。「解剖構造ドリブン型内視鏡手術支援のための画像認識理解手法の開発」に関する各研究項目は予定通り進展している。CT像における微細解剖認識手法の実現及び、内視鏡映像における解剖構造自動認識手法の実現では、大型の臓器から血管等の微細な臓器までを対象として、多症例からなる解剖学的構造データベースに基づく自動識別手法を深層学習により確立した。また、内視鏡映像からは画像間の特徴点位置対応関係に基づく3次元構造復元を可能とした。ここでは従来から存在する構造復元手法に対して、映像上での臓器の見えを考慮したルールを新たに導入し、高精度な構造復元を行った。多様な画像モダリティからの解剖構造認識理解手法が実現されており、今年度だけでなく今後の研究推進にも結び付く結果が得られた。解剖構造対応付けに基づく内視鏡手術支援手法の実現を行う。解剖学的構造認識結果に基づき、内視鏡手術プランニング自動生成、仮想画像と実画像の解剖構造対応付け手法の実現、内視鏡手術ナビゲーション手法の開発、解剖学的サーボイングの実現を行う。これらにより、解剖構造識別に基づく内視鏡操作の自動化を目指した研究開発を行う。解剖学的構造空間での対応付けに基づく内視鏡手術ナビゲーション、すなわち、解剖構造ドリブン型内視鏡手術支援手法の開発とその診断治療への応用を目指し、平成29年度は「解剖構造ドリブン型内視鏡手術支援の学術的概念の確立」に関する以下の研究項目を実施した。(1)解剖構造ドリブン型内視鏡手術支援の学術的概念の確立:解剖構造情報に基づいた画像統合、情報統合に必要とされる解剖学的構造表現手法、解剖構造ドリブン型内視鏡手術支援において実現すべき機能などを多面的に検討した。(2)腹部臓器形状数理表現法の検討:腹部臓器や血管の形状を数理的に表現する方法を検討した。臓器形状の変形などにも対応するため、手術操作によって生じる変形などを数理的に表現する手法を検討した。ここでは胃・膵臓がん手術を対象として、胃・膵臓周辺の血管を対象とする。血管構造はバリエーションに富むため、芯線構造の変形で血管形状の変形を表現する手法を検討した。(3)超精密局所解剖表現法の検討:胃・膵臓がん手術に関連する微細な脈管並びにリンパ節の局所解剖を表現する方法を検討する。胃・膵臓がん手術では、これらの解剖学的構造に基づき支援を行う必要がある。そのため、膵管などを含む微細脈管、支配血管との相対位置で記述されるリンパ節位置など、局所解剖を適切に記述する方法を検討した。(4)内視鏡映像アノテーションデータベースの検討と構築:解剖構造認識に機械学習の枠組みの利用などが考えられる。そのためには内視鏡映像とそのアノテーションデータベースの構築が重要である。内視鏡映像中の血管構造などをアノテーションしたデータベースを構築するソフトウエアの作成,ならびに,データベースの構築を行った。(5)局所解剖学的構造データベースの構築:胃・膵臓周辺の局所解剖学的構造を含むデータベースを構築した。「解剖構造ドリブン型内視鏡手術支援の学術的概念の確立」に関する各研究項目は予定通り進展している。腹部臓器形状数理表現法の検討及び、超精密局所解剖表現法の検討では、臓器構造から微細構造までをディープラーニングを用いたネットワーク構造及びグラフ表現で表し、高い精度でモデル化することができた。内視鏡映像アノテーションデータベースの検討と構築では、手術映像の取り扱いに適したアノテーションツールの開発を行い、データベース作成の基盤確立とデータ蓄積を行った。今後の研究推進に必要となる基盤手法とツールが整備され、今年度だけでなく今後も研究を強力に推進することが可能となった。

(1) CT画像上における微細解剖認識手法の実現:腹部CT像上での微細解剖構造認識技術を開発した。腹部血管、リンパ節の自動識別に関する手法を開発した。深層学習による解剖構造高精度自動認識を行った。また、解剖構造情報を利用したリンパ節の経時変化解析を行う方法も検討した。(2)内視鏡映像からの腹腔内構造3次元復元:ステレオ内視鏡映像を用いて、腹腔内の3次元構造を推定する方法の開発を進めた。腹腔内の映像において特徴点の高精度な検出方法を開発し、画像間の3次元構造復元に利用した。内視鏡映像からの解剖構造理解の基礎となる3次元構造推定結果が得られた。(3)内視鏡映像における解剖構造自動認識手法の実現:内視鏡映像からの解剖構造自動認識の基礎手法を開発した。深層学習を用いて内視鏡映像に含まれる血管を自動認識可能とした。(4)解剖学的名称自動付与手法の開発:CT像から識別される血管と内視鏡映像から識別される血管に対して解剖学的名称を付与する方法を検討した。本年度はCT画像から抽出される血管の名称の絶対的関係、相対的関係を機械学習により取得し、自動付与を可能とした。特に深層学習によって得られた臓器情報を基に自動命名精度の向上を試みた。「解剖構造ドリブン型内視鏡手術支援のための画像認識理解手法の開発」に関する各研究項目は予定通り進展している。CT像における微細解剖認識手法の実現及び、内視鏡映像における解剖構造自動認識手法の実現では、大型の臓器から血管等の微細な臓器までを対象として、多症例からなる解剖学的構造データベースに基づく自動識別手法を深層学習により確立した。また、内視鏡映像からは画像間の特徴点位置対応関係に基づく3次元構造復元を可能とした。ここでは従来から存在する構造復元手法に対して、映像上での臓器の見えを考慮したルールを新たに導入し、高精度な構造復元を行った。多様な画像モダリティからの解剖構造認識理解手法が実現されており、今年度だけでなく今後の研究推進にも結び付く結果が得られた。CT画像上の解剖学的構造及び微細解剖学的構造認識手法の高精度化を実現する。内視鏡映像からの解剖学的構造認識手法の性能向上も図り、解剖学的サーボイング実現に向けた高精度認識技術を確立する。また、解剖学的サーボイングに用いるロボット制御技術の検討も進めていき、手術支援のための認識及び制御技術整備を行う。解剖構造対応付けに基づく内視鏡手術支援手法の実現を行う。解剖学的構造認識結果に基づき、内視鏡手術プランニング自動生成、仮想画像と実画像の解剖構造対応付け手法の実現、内視鏡手術ナビゲーション手法の開発、解剖学的サーボイングの実現を行う。これらにより、解剖構造識別に基づく内視鏡操作の自動化を目指した研究開発を行う。
疾患モデルマウスを用いたSLC19A3欠損症の治療法の確立

チアミントランスポーター(SLC19A3)は、膜を6回貫通する膜貫通型タンパク質であり、特に小腸上部の微絨毛の刷子縁に多く発現しており、摂取したチアミンの体内への取り込みに重要な役割を行っている。SLC19A3欠損症(THMD2; OMIM607483)は常染色体劣性疾患で、その変異の種類により、乳児期に発症する重症の症例から青年期に発症しウエルニッケ様症状を呈する軽症の症例まで様々な症状が見られる。我々は、出生後に急速に脳萎縮が進行し、著しい発達障害が見られた症例よりSLC19A3遺伝子のホモ接合性変異(E320Q)を同定して報告した(Yamada et al., 2010)。SLC19A3欠損症では発症早期に大量のチアミンを経静脈投与することが有効な治療法であるが、チアミンの投与により発症時の脳病態がどのように改善されるかは未だ十分に解明されていない。そこで、本年度は、チアミン制限餌で飼育したKOマウス脳を免疫組織学的手法を用いて継時的に解析を行った。KOマウスをチアミン制限餌で飼育すると、2日間の飼育では免疫染色で脳に異常は見られなかった。しかし、3日間の飼育で、視床にアストロサイト活性化、ミクログリア出現と血管内皮細胞のICAM-1発現が出現し、6日間の飼育では、視床に著しいアストロサイトの活性化、ミクログリアの増加と活性化、ICAM-1発現の上昇と神経細胞死が見られた。2日間チアミン制限餌で飼育した後に高チアミン餌を開始すると半数のKOマウスが生存するので、チアミン制限餌の2日以内に高チアミン餌を開始することは、アストロサイト、ミクログリアの活性化と血管内皮細胞の異常を改善し、神経細胞死が軽減されると考えられる。上記の初期脳異常所見を改善する、チアミン以外の薬物の同定が患者の急性症状を改善すると期待される。チアミン制限餌で飼育したSLC19A3のKOマウス脳を免疫組織学的手法を用いて継時的に解析し、3日目より視床にアストロサイト活性化、ミクログリア出現と血管内皮細胞のICAM-1発現が出現するのを明らかにした。6日間の飼育では、視床に著しいアストロサイトの活性化、ミクログリアの増加と活性化、ICAM-1発現の上昇と神経細胞死が見られた。以上、本年度はSLC19A3欠損症の疾患モデルマウスを用いて、チアミン制限食にしてからのマウス脳の変化を病理学的あるいは生化学的手法を用いて経時的に解析し、本マウスの初期病態が明らかになった。平成30年度の研究により、SLC19A3欠損症の疾患モデルマウスを用いて、チアミン制限食にしてからの3日目から初期の脳病態が起こることが明らかになった。そこで、本年度はチアミン制限食にしてから初期病変が出現する以前の2日間にミノマイシンやN-アセチルシステイン(NAC)などの様々な薬剤を投与し、SLC19A3欠損症患者の症状を改善し、後遺症を軽減するチアミン以外の薬の同定を行う。SLC19A3遺伝子はチアミントランスポータ2をコードし、SLC19A3欠損症はチアミン代謝機能不全症候群2(THMD2; OMIM 607483)とも呼ばれる常染色体劣性遺伝の神経変性疾患である。我々は本邦の家族性SLC19A3欠損症の患者からE320Q変異を同定し、誌上で報告した。本変異と同じ変異を有するホモ接合型Slc19a3 E314Qノックイン(KI)マウスを作製後、ホモ接合性Slc19a3ノックアウト(KO)マウスは購入して、本研究を行った。両マウスは通常の餌であるCE2(チアミン:1.71mg / 100g食物)で飼育すると半年以上、何の所見も見られなかったが、チアミン量を約1/3にしたチアミン制限餌(チアミン:0.60mg / 100g食餌)で飼育するとKIマウスとKOマウスは、それぞれ30および12日以内に死亡し、血液および脳のチアミン濃度は野生型マウスに比べて著しく低下していた。視床のSMTとVAL領域に急性神経変性とアストログリオーシスが見られた。これらの所見は、ピリチアミン注射とチアミン欠乏食で作製されるチアミン欠乏マウスのいくつかの特徴を有し、THMD2の主な原因がチアミンピロリン酸(TPP)欠損であることを示唆している。次に、高用量チアミン餌の治療効果の解析を行った。チアミン制限餌で飼育後に従来の食餌(CE2)に戻すと、全てのKOマウスが死亡した。一方、チアミン制限餌の後に高チアミン食(チアミン:8.50mg / 100g食物)に変更するとKOマウスの半数以上が生存した。しかし、この生き残ったマウスの餌を高チアミン食からCE2に戻すと、一部のKOマウスは死亡した。これらの結果は、高チアミン食で治療後にチアミンを減少する場合は、再発を防ぐために慎重に行わなければならないことを示している。以上の研究結果はPLoS Oneで発表した。研究代表者らが作製したSLC19A3欠損症の疾患モデルマウスを用いて、チアミン欠乏時の脳の病態解明を行い、PLoS Oneに発表した。

チアミントランスポーター(SLC19A3)は、膜を6回貫通する膜貫通型タンパク質であり、特に小腸上部の微絨毛の刷子縁に多く発現しており、摂取したチアミンの体内への取り込みに重要な役割を行っている。SLC19A3欠損症(THMD2; OMIM607483)は常染色体劣性疾患で、その変異の種類により、乳児期に発症する重症の症例から青年期に発症しウエルニッケ様症状を呈する軽症の症例まで様々な症状が見られる。我々は、出生後に急速に脳萎縮が進行し、著しい発達障害が見られた症例よりSLC19A3遺伝子のホモ接合性変異(E320Q)を同定して報告した(Yamada et al., 2010)。SLC19A3欠損症では発症早期に大量のチアミンを経静脈投与することが有効な治療法であるが、チアミンの投与により発症時の脳病態がどのように改善されるかは未だ十分に解明されていない。そこで、本年度は、チアミン制限餌で飼育したKOマウス脳を免疫組織学的手法を用いて継時的に解析を行った。KOマウスをチアミン制限餌で飼育すると、2日間の飼育では免疫染色で脳に異常は見られなかった。しかし、3日間の飼育で、視床にアストロサイト活性化、ミクログリア出現と血管内皮細胞のICAM-1発現が出現し、6日間の飼育では、視床に著しいアストロサイトの活性化、ミクログリアの増加と活性化、ICAM-1発現の上昇と神経細胞死が見られた。2日間チアミン制限餌で飼育した後に高チアミン餌を開始すると半数のKOマウスが生存するので、チアミン制限餌の2日以内に高チアミン餌を開始することは、アストロサイト、ミクログリアの活性化と血管内皮細胞の異常を改善し、神経細胞死が軽減されると考えられる。上記の初期脳異常所見を改善する、チアミン以外の薬物の同定が患者の急性症状を改善すると期待される。チアミン制限餌で飼育したSLC19A3のKOマウス脳を免疫組織学的手法を用いて継時的に解析し、3日目より視床にアストロサイト活性化、ミクログリア出現と血管内皮細胞のICAM-1発現が出現するのを明らかにした。6日間の飼育では、視床に著しいアストロサイトの活性化、ミクログリアの増加と活性化、ICAM-1発現の上昇と神経細胞死が見られた。以上、本年度はSLC19A3欠損症の疾患モデルマウスを用いて、チアミン制限食にしてからのマウス脳の変化を病理学的あるいは生化学的手法を用いて経時的に解析し、本マウスの初期病態が明らかになった。SLC19A3欠損症の剖検例では、昨年度の本研究成果と同様に脳の神経変性とアストログリオーシスが報告されている。しかし、発症直前と発症直後の病態は不明である。今後、SLC19A3欠損症の疾患モデルマウスを用いて、チアミン制限食にしてからのマウス脳の変化を病理学的あるいは生化学的手法を用いて経時的に解析し、本マウスの初期病態を明らかにする。初期の病態が明らかになれば、次に本モデルマウスを用いて、初期の病態を改善する候補薬の同定を行う。以上、SLC19A3欠損症患者の症状を改善し、後遺症を軽減するチアミン以外の薬の同定を行う。平成30年度の研究により、SLC19A3欠損症の疾患モデルマウスを用いて、チアミン制限食にしてからの3日目から初期の脳病態が起こることが明らかになった。そこで、本年度はチアミン制限食にしてから初期病変が出現する以前の2日間にミノマイシンやN-アセチルシステイン(NAC)などの様々な薬剤を投与し、SLC19A3欠損症患者の症状を改善し、後遺症を軽減するチアミン以外の薬の同定を行う。1.初年度に研究成果(論文発表)が出た。2.次年度、大量の脳の病理学的、生化学的解析が必要である。以上より、次年度にさらなる成果を出すために、初年度の研究費の一部を次年度に残した。
上顎発癌モデル開発に関する研究

平成4年度は上顎癌の誘発実験を行った。第1の方法として27ゲージ針をハムスター左眼窩下孔より上顎洞に刺入し0.5%9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene(DMBA)を25μl(125μg),週1回で10週間注入した。対照には溶媒であるdimethyl sulfoxide(DMSO)のみを投与した。20週の時点で腫瘍の有無につき観察し結果,対照では12匹のすべての動物で鼻腔・上顎洞に腫瘍形成を認めなかったが,DMBA注入群では11/12(92%)に腫瘍の形成が認められた。組織学的には扁平上皮癌8,腺癌2,乳頭腫2であった。第2の方法として2%DMBAをオキシセルロースを挿入した上顎洞に40μl(800μg)一回投与した。16週後において,8/11(73%)で左頬部に腫瘍を認めたが,これらは肉腫であった。第3の方法はDEN4mgを皮下に週1回で10週間投与するものであり,20週での腫瘍形成頻度は6/20(30%)で扁平上皮癌1,腺癌2,未分化癌2,乳頭腫1であった。以上より,0.5%DMBAの上顎洞内注入にて,ヒト癌に近似した上顎扁平上皮癌を誘発できることが明らかとなった。しかし,この方法では20週以上の実験期間を要するため,平成5年度では約14週で実験を終了できるハムスター口腔粘膜癌実験系を用いて,顎下腺摘出とepidermal growthfactor(EGF)の粘膜局所投与の影響を検討した。すなわち,0.5%DMBAを週2回ハムスター頬嚢に6週間塗布し,その1週後に半数の動物には顎下腺摘出手術を,残りの半数には模擬手術を行った。術後1週後より週3回EGF10μg/kg/体重を両側の頬嚢粘膜に6週間塗布した。対照としてはEGF調製用の基剤を用いた。この系では胃にも腫瘍が誘発されるため,頬嚢と前胃について観察した結果,腫瘍数はEGF塗布により有意に増加することが明らかとなった。組織学的に頬嚢腫瘍は乳頭腫と扁平上皮癌であったが,癌と乳頭腫の比率はEGF投与で増加しなかった。そのためEGFは頬嚢での乳頭腫形成を促進するものと考えられた。上顎発癌モデルの開発を目標として実験を行い、以下の結果が得られた。1.9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene(DMBA)の5%溶液を溶媒としてdimethyl sulfoxide(DMSO)を用いて調製し、25μl(1.25mg)を週1回エーテル麻酔下に、雄シリアンハムスターの左眼窩下孔より上顎洞内へ投与した。対照にはDMSOのみを投与した。DMBAを10あるいは20週投与し、実験開始より30週で実験を終了したが、その間4匹が死亡した。

頭部はホルマリン固定・脱灰後、鼻腔・上顎洞全額断面を出し腫瘍の有無を観察した。次にパラフィン包埋し、切片を作製してH-E染色を行った。DMSO投与の9匹では、鼻腔・上顎洞に腫瘍はみられなかった。DMBAの10回投与群では4/7(57%)に、20回投与群では、4/4(100%)に腫瘍が認められた。これらは、中等度あるいは高度分化型の扁平上皮癌であった。2.diethylnitrosamine(DEN)による腫瘍誘発にも24匹の動物を用い、2%DENの200μl(4mg)を週1回、10週間皮下投与した。10週間放置し、鼻腔・上顎洞での腫瘍形成につき検索した結果、生残した23匹の6匹(26%)に鼻腔・上顎洞腫瘍が認められた。これらは、未分化癌、神経上皮腫であった。以上より、DMBAの上顎洞内投与法は、鼻腔・上顎洞の扁平上皮癌誘発には、従来のDENの皮下投与法よりも優れていると考えられた。ヒトの上顎洞癌の大部分が扁平上皮癌であることから、ヒトの癌と類似しており、この系を用い各種物質のプロモーター活性を検討することも可能になると思われる。微生物としてヘルペスウイルス(HSV)は発癌との関連性が強く、続いてHSVと鼻腔・上顎発癌との関係を追求する方針である。そこで、本研究に関連して、HSVの粘膜感染の実験を行い、HSVと基底膜の接合にヘパランサルフェイトが重要な役割を果たすことも明らかとした。平成4年度は上顎癌の誘発実験を行った。第1の方法として27ゲージ針をハムスター左眼窩下孔より上顎洞に刺入し0.5%9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene(DMBA)を25μl(125μg),週1回で10週間注入した。対照には溶媒であるdimethyl sulfoxide(DMSO)のみを投与した。20週の時点で腫瘍の有無につき観察し結果,対照では12匹のすべての動物で鼻腔・上顎洞に腫瘍形成を認めなかったが,DMBA注入群では11/12(92%)に腫瘍の形成が認められた。組織学的には扁平上皮癌8,腺癌2,乳頭腫2であった。第2の方法として2%DMBAをオキシセルロースを挿入した上顎洞に40μl(800μg)一回投与した。16週後において,8/11(73%)で左頬部に腫瘍を認めたが,これらは肉腫であった。第3の方法はDEN4mgを皮下に週1回で10週間投与するものであり,20週での腫瘍形成頻度は6/20(30%)で扁平上皮癌1,腺癌2,未分化癌2,乳頭腫1であった。以上より,0.5%DMBAの上顎洞内注入にて,ヒト癌に近似した上顎扁平上皮癌を誘発できることが明らかとなった。しかし,この方法では20週以上の実験期間を要するため,平成5年度では約14週で実験を終了できるハムスター口腔粘膜癌実験系を用いて,顎下腺摘出とepidermal growthfactor(EGF)の粘膜局所投与の影響を検討した。すなわち,0.5%DMBAを週2回ハムスター頬嚢に6週間塗布し,その1週後に半数の動物には顎下腺摘出手術を,残りの半数には模擬手術を行った。術後1週後より週3回EGF10μg/kg/体重を両側の頬嚢粘膜に6週間塗布した。対照としてはEGF調製用の基剤を用いた。この系では胃にも腫瘍が誘発されるため,頬嚢と前胃について観察した結果,腫瘍数はEGF塗布により有意に増加することが明らかとなった。組織学的に頬嚢腫瘍は乳頭腫と扁平上皮癌であったが,癌と乳頭腫の比率はEGF投与で増加しなかった。そのためEGFは頬嚢での乳頭腫形成を促進するものと考えられた。
好冷細菌ゲノムの全塩基配列解読と低温適応に関与する遺伝子の解析、好冷酵素の探索

1.南極海水から単離した好冷細菌Shewanella sp. Ac10の全ゲノム解析を行った。ゲノムサイズは4.5Mbp、ORF数は約4,800であった。2.4°Cで生育したShewanella sp. Ac10において、Escherichia coliのコールドショックタンパク質CspAのホモログが高生産されていることを明らかにした。3.Shewanella sp. Ac10のコラゲナーゼ遺伝子の発現系を構築し、酵素の諸性質を明らかにした。4.Shewanella sp. Ac10の形質転換法を確立するとともに、本菌で機能するプロモーターを単離し、発現ベクターを構築した。5.シベリアの永久凍土から、4°Cで生育し、37°Cで生育しない好冷細菌Acinetobacter sp. DWC6を単離した。本菌は、脂質分解酵素を分泌し、培地中のトリグリセリドなどを低温で効率よく分解した。本菌は低温環境での廃水処理に有用と考えられた。6.Acinetobacter sp. DWC6から、脂肪酸ビニルエステルを良好な基質とする低温活性脂質分解酵素の遺伝子を単離した。ビニルエステルをアシル供与体とするエステル交換反応によってエステルを合成する上で有用な酵素であると考えられた。7.Acinetobacter sp. DWC6から、エステラーゼリパゼジャミリー内のESTグループに属する低温活性エステラーゼをコードする遺伝子を単離した。1.シベリアの永久凍土から単離した好冷細菌Acinetobacter sp. DWC6を宿主とするベクターを構築した。プラスミドpWH1266から、Acinetobacter属で機能するoriを含むDNA断片を切り出し、これをpUC118、pBR322に組込み、大腸菌とAcinetobacter sp. DWC6の両者で複製可能なシャトルベクター(それぞれpUAE1、pBAE1)を構築した。エレクトロポレーションの条件を至適化し、pUAE1を用いた場合、3XlO^6pfuの効率でAcinetobacter sp. DWC6を形質転換する方法を確立した。得られた形質転換体は、4°Cでアンピシリンを含む培地に生育し、アンピシリン耐性遺伝子が低温環境においても選択マーカーとして機能し、プラスミドが安定に保持されることが示された。2. Acinetobacter sp. DWC6が生産する脂質分解酵素の特性を明らかにした。本菌は、大豆油などのトリグリセリドを、低温で効率よく分解した。培養上清から部分精製したリパーゼは4°Cにおいて、至適温度である20°Cにおける活性の57%の活性を示した。本酵素は8-16の炭素鎖長のアシル基をもつエチルエステルに広く作用した。3.南極海水から単離した好冷細菌Shewanella sp. AclOを4°Cと16°Cで培養し、菌体に含まれるタンパク質を二次元電気泳動で解析した結果、4°Cで特異的に発現するタンパク質が見いだされた。N末端アミノ酸配列解析を行い、さらに遺伝子の構造を調べた結果、Iron-regulated protein Aとの相同性が示された。1.南極海水から単離した好冷細菌Shewanella sp.Ac10の全ゲノム解析を行った。ゲノムサイズは4.5Mbp、ORF数は約4800であった。2.Shewanella sp.Ac10を4°Cと18°Cで培養し、菌体内タンパク質を二次元電気泳動で比較した結果、iron-regulated protein Aと相同性を示すタンパク質が、4°Cで特異的に生産されることを見いだした。本タンパク質の遺伝子上流にはプロモーターと推定される配列が2カ所存在した。これらをβ-ラクタマーゼ遺伝子上流に接続し、ベクターに挿入してShewanella sp.Ac10に導入した結果、菌体はアンピシリン耐性を示した。これらの配列はプロモーターとしての機能を有し、Shewanella sp.Ac10を宿主とした外来タンパク質生産システムの構築に利用できることが示された。3.シベリア土壌から単離した好冷細菌Acinetobacter sp.strain no.

6の遺伝子ライブラリーを、Escherichia coli C600を宿主として構築し、トリブチリンを含む寒天培地でのハロ形成を指標としてスクリーニングした結果、3種の脂質分解酵素遺伝子を単離することができた。この内の一つは、amidasesignature familyに属し、種々のエステルを加水分解する活性を示した。別の一つはβ-ケトアジピン酸エノールラクトンヒドロラーゼと相同性を示し、種々のビニルエステルを低温で効率よく加水分解する活性を示した。4.β-ラクタマーゼ遺伝子をレポーターとするAcinetobacter sp.strain no.6用のプロモータープローブベクターを構築した。スクリーニングを行い、プロモーターを含む164bpの遺伝子断片を取得した。
局所温度平衡状態の代数的定式化

平成9年度は,論文[2]で超対称性に関して見出した新しいタイプの対称性自滅spontaneous symmetry collapseの物理的・数学的本性を解明するため,熱力学的相とそれを特徴づける秩序変数,表現代数のcenterと系の対称性との間の整合的理解を目指す基礎作業を行なった。それにより,centerのspectrum,central ergodictiyやcenterに収束する物理量の近似列等を扱う手法に関する重要な知見を得,大偏差原理の視点から量子確率・確率過程論の諸概念がGoldstone定理や低エネルギー定理の応用に際して有効に働くことがわかった。論文[3]でその一部を報告したが,量子論的大偏差原理に関する幾つかの問題点を現在検討中である。平成10年度は,前半Gottingen科学アカデミーの招待でGottingen大学に.Gauss Professorとして滞在し, Profs.D.Buchholz,H.Roosと標記課題に関する研究討論を行う一方,対称性自滅のパターン分類に取り組み,幾つかの重要な成果を得た[5]。後者は冒頭の課題への一つの答で,対称性自滅の可能な全てのパターンを枚挙し分類することで[2]の結果を広い視野から捉え直したものである。前者は,その基本的枠組の概要を数理研研究集会「量子情報と量子力オスの数理」で報告し,現在共著論文を準備中である。要点は,任意の状態を,時空各点の微小近傍内の局所的物理量の適当な族を通じてKMS状態の集合上に写像し,当該状態を種々のKMS状態の統計的混合として表すことによって温度平衡概念を拡張するもので,局所平衡概念の新しい定式化である。これには,massless free scalar fieldを用いた局所温度状態の非自明な例がある。ここから熱力学・量子統計力学の一般相対論的拡張も可能となる。平成10年秋にはLausanne大学数学研究所Prof.S.Maumaryの招待を受けて,BRSコホモロジーを代数的・ホモロジー代数的観点から捉え直す研究討論を行い,論文作成作業を現在継続中である。論文(Buchholz-0jima)で,真空以外のあらゆる空間並進状態において,超対称性が回復の可能性の全くない対称性自滅の新しいパターンSpontaneous Symmetry Collapseを破ることを見出したが,この仕事により,熱力学的相(phase)の概念とそれを特徴づける秩序変数,表現代数の中心と系の対称性との間の整合的理解の重要性が明らかになった。9-10月の期間prof.Buchholzらの招待により,ウィーンErwin Schroedinger研究所で開催されたInternational Workshop on Local Quantum Physicsに参加し,同教授やDoplicher・Roberts両教授を含む多数の研究者との研究討論を行う中で,中心のspectrum,エルゴード性や中心に収束する物理量の近似列等を系統的に取り扱う手法に関する重要なアイディアを得た。帰国後独力でそれを発展させることにより,確率的ゆらぎを統制する大偏差原理の量子論的拡張によって,Kolmogorov-Sinai, Connes-Narnhofer-Thirring dynamical entropyをはじめとする量子確率論,量子確率過程の基本的諸概念が,対称性自滅に関するGoldstone定理や多粒子状態・凝縮状態へそれを一般化した種々の低エネルギー定理の系統的応用に際して極めて有効に働くことが,その後の申請者の研究を通じて明らかになってきた。現在,これらの成果をまとめた論文を準備中である。この間,2回の外国出張と交通事故による怪我のために国内出張の機会を失ったが,国外から多くの優秀なvisitorsに恵まれて,有益な討論を行うことができた。

平成10年度の前半は,Gottingen科学アカデミーからGauss Professorとしての招待を受けてGottingen大学理論物理学研究所に滞在し,そこに所属するProf.D.BuchholzおよびProf.H.Roosと標記の課題に関して集中的な研究討論を行う一方,対称性の破れのパターン分類の課題に独立に取り組み,幾つかの重要な成果を得た。前者については基本的な枠組は出来上がり,その概要を本年2月,京大数理解析で開催された研究集会「量子情報と量子カオスの数理」で報告したが,細部における詰めの作業が必要で,共著論文完成のための作業を現在継続中である。キーになるのは,時空各点の微小近傍で定義された局所的物理量の適当な族を用いて,任意に与えられた状態を可能なすべての相対論的KMS状態の集合上に写像することによって,各点毎の逆)温度あるいはその確率分布を定め,当該状態を種々のKMS状態の統計的混合として表することで温度平衡概念を拡張するもので,局所平衡概念の全く新しい定式化である。これは単なる抽象的定義ではなく,例えばmassless free scalar fieldを用いて局所温度状態の非自明な例が構成できる。これにより,熱力学・量子統計力学の一般相対論的拡張も可能となる。論文3では超対称性に関する対称性自滅の新しいパターンSpontaneous Symmetry Collapseを見出したBuchholz-Ojimaの結果を,対称性の破れの可能なパターンすべてを枚挙し,分類することによってより広い視野から捉え直したものである。これについては,ドイツのBerlin自由大学理学部,Hamburg大学第二理論物理学研究所,Gottingen大学理論物理学研究所,フランスBourgogne大学理学部,スイスのLausanne大学理学部および広島大学理学部等でセミナー講演を行った。平成10年秋にはLausanne大学数学研究所のProf.S.Maumaryより招待を受け,ゲージ理論におけるBRSコホモロジーを一般的なだい代数的・ホモロジー代数的観点から捉え直す研究討論を行い,共著論文作成のための共同作業を現在継続中である。
一次相転移を示す銅基合金における相分解と不規則化の競合

本研究では主に、Cuー39at%Pt合金,Cuー25at%Pt合金とCuーNiーSn合金について研究を進めた。最初の合金では不規則化と相分解反応、次の合金では周期的逆位相境界が焼鈍過程に及ぼす影響を明らかにすることを目的とし、最後の合金ではスピノ-ダル分解が先行し規則化が誘発される合金の例としてとりあげた。得られた主な結果は次のとおりである。1.L1_1規則化したCuー39at%Pt合金を(L1_1+A1)領域で焼鈍すると、その焼鈍温度が均質系の規則化温度より高い場合は一旦ほとんど不規則化するが、低い場合は粒界から不規則化が進行することが確かめられた。これは(L1_1+A1)領域内に準安定な規則ー不規則転移線が存在していることを示している。2.Cuー25at%Pt合金のL1_<2ーs>→L1_2への転移過程において、周期的逆位相境界はヘアピン型配列が後退することにより消滅することが確かめられた。そのヘアピン形状の形成プロセスとして、隣接する逆位相境界が接する場合、熱的な逆位相境界を介する場合、などがあることを示唆する逆位相境界構造も観察された。3.時間依存型ギンツブルグ・ランダウ展開による速度方程式を応用して周期的逆位相境界の挙動をシミュレ-ションを試みた。規則化エネルギ-と界面エネルギ-に適当な値を与えることにより、周期的逆位相境界の実際の挙動を非常によく再現できることが確かめられた。4.CuーNiーSn合金の焼鈍によるスピノ-ダル分解はNi組成が高いほど速い。濃度波の波長および振幅およびプロフィルの変化を明らかにした。また、焼鈍初期にはDO_<22>型規則格子反射が電子回折パタ-ンに現れる。低Ni組成合金では焼鈍によりDO_<22>は発達するが、高Ni組成ではL1_2型規則格子に変化する。本年度は主として、Cuー39.2at%Pt合金における相分解過程について研究を進めた。まず、低温に保持してL1_1相に規則化させた後(L1_1+A1)共存温度領域で焼鈍した試料についてX線回析実験と電子顕微鏡観察を行った。特に、X線回析線位置から規則ドメイン内の規則度を精度よく求める解析方法を確立し、それにより焼鈍過程を詳細に議論した。その結果、次の結論が得られた。1.(L1_1+A1)共存領域内のある特定の温度(T_c)より低い温度で焼鈍した場合、L1_1バリアント境界などにA1相が析出することによって相分解は進行する。この場合、L1_1相内規則度はまずわずかに減少した後、やや増加する。これに対して、T_Cより高い場合は一旦殆どA1相にまで不規則化したのち、新たにL1_1相が析出してくる。そのため、T_cの上下では焼鈍温度がわずかに違うだけで、最終的な合金組織は大きく異なってくる。2.T_cを不規則相と規則相の自由エネルギ-が等しくなる温度、すなわち転移温度、と見なすと、本研究で明らかになった焼鈍過程の特異性は、合金系の自由エネルギ-を考慮することによって説明できる。合金系の自由エネルギ-を組成と規則度の関数としてGinzburg形の式で表示して、焼鈍過程を検討することを試みた。低温焼鈍(<T_c)ではA1相が析出する前にスピノ-

ダル的に相分離する可能性も考えられたが、規則相の自由エネルギ-曲線が組成に対して上に凸になる領域は現れず、また実際に電子顕微鏡観察によっても積極的にスピノ-ダル分解を示す結果は得られなかった。これでの研究で、L1_1からA1相が析出する場合は、バリアント境界などが核発生位置となることが確かめられてた。さらに逆位相境界の働きも非常に興味深いので、合金試料の組成、焼鈍温度を変えての実験を計画している。本年度は主に、Cuー25at%Pt合金とCuーNiーSn合金について研究を進めた。前者は周期的逆位相境界が焼鈍過程に及ぼす影響を明らかにすることを目的とし、後者ではスピノ-ダル分解が先行し規則化が誘発される合金の例としてとりあげられた。得られた主な結果は次のとおりである。1.Cuー25at%Pt合金において、Ll_<2ーs>→Ll_2への転移過程における周期的逆位相境界の形態変化を電子顕微鏡を用いて観察した。その結果、周期的逆位相境界はヘアピン型配列を形成し、それが後退することにより消滅することが確かめられた。そのヘアピン形状の形成プロセスとして、隣接する逆位相境界が接する場合、熱的な逆位相境界を介する場合、などがあることを示唆する逆位相境界構造も観察された。2.時間依存型ギンツブルグ・ランダウ展開による速度方程式を応用して周期的逆位相境界の挙動をシミュレ-ションを試みた。逆位相境界での規則度の変化の不連続性を考慮するために、界面エネルギ-の項を規則度の傾きに比例する項と規則度の2乗に比例する項とを考えた。規則化エネルギ-と界面エネルギ-に適当な値を与えることにより、周期的逆位相境界の実際の挙動を非常によく再現できることが確かめられた。3.CuーNiーSn合金の焼鈍によるスピノ-ダル分解はNi組成が高いほど速い。濃度波の波長および振幅およびプロフィルの変化を明らかにした。4.焼鈍初期にはDO_<22>型規則格子反射が電子回折パタ-ンに現れる。低Ni組成合金では焼鈍によりDO_<22>は発達するが、高Ni組成ではLl_2型規則格子に変化する。
細胞極性形成に伴うゴルジ体のトポバイオジェネシスの分子メカニズムの研究

セミインタクト極性細胞内で、細胞周期依存的なのゴルジ体の小胞化・リアッセンブリー過程の再構成系を確立した。まず、ゴルジ体局在化シグナルを持つ膜蛋白質とGFPとの融合蛋白質を恒常的に発現しているMDCK細胞株を樹立した。ポリカーボネートトランスウエル上で培養したこのMDCK細胞をストレプトリシンO(SLO)で処理し、形質膜を部分的に透過性にしたセミインタクト細胞を作成した。この細胞に、イリマキノン(IQ)を作用させ、ゴルジ体を小胞化させた(IQ依存的小胞化過程)。次に、IQをよく洗い流し、新たに外部よりL5178Y細胞の細胞質とエネルギー再生系(ATP再生系)を加えて小胞化したゴルジ体の核周囲へのリアッセンブリーを再構成した(リアッセンブリー過程)。この再構成系を用い、小胞化過程・リアッセンブリー過程それぞれを2つの素過程にdissectionすることに成功した。次に、それぞれの過程のキネティックスを解析するため「morphometric analysis法」を開発し、中間状態としてゴルジ体が大きめの小胞に分裂し、細胞質中に分散する状態(punctated Golgi membarane)を同定できた、また、それぞれの素過程に必要な因子・阻害剤を検索した結果、ゴルジ体の小胞化前期過程には三量体G蛋白質、リアッセンブリー後期過程にはsmall GTP結合蛋白質の関与を示唆する結果を得た。セミインタクトMDCK細胞に、M期カエル卵抽出液を用いることによってもIQの場合と同様にゴルジ体を小胞化させることに成功した。この過程も、2つの素過程にdissectionできATP再生系を必要とすることが判った。また細胞分裂時に活性化されるキナーゼに対する阻害剤を用いた実験より、過程前期はMAPキナーゼキナーゼ(MEK)が、そして過程後期にはcdc2キナーゼが段階的に効いていることが判った。この再構成系の確立によって、今後、ゴルジ体の細胞周期依存的なグイナミクスの研究とそれぞれの素過程に必要な因子の検索が可能になった。ニューロンや上皮細胞などに見られる細胞極性形成メカニズムの解明は、個々の細胞の発生・分化のメカニズム解明に必須であるばかりか、細胞間相互作用を通し、固体の形態形成の分子論的基礎を与える重要な課題でもある。本研究では、上皮細胞における細胞極性形成の初期過程の細胞生化学的指標として、M期に小胞化したゴルジ体のリアッセンブリーする細胞内の「位置」に注目し、その「位置」決定因子を探索するためのアッセイ系を確立した。培養MDCK細胞に海綿代謝物イリマキノン(IQ)を可逆的に作用させることにより、細胞周期依存的なゴルジ体の小胞化・再集合現象を再構成できる。抗生物質ストレプトリシン0(SL0)により、形質膜を部分的に透過性にしたセミインタクト細胞を調製した。この状態で細胞質を洗い流し、新たに外部よりL5178Y細胞より調製した細胞質とエネルギー再生系(ATP再生系など)を加えて、種々の条件でインキュベーションし、ゴルジ体のリアッセンブリーを誘起させることに成功した。このリアッセンブリーは、タキソ-ルで安定化させた微小管が必要であり、イリマキノン洗浄後、30分以内に核周辺領域にゴルジ体の一部の最初の集積体(Golji nucleating structure : GNS)が観察された。その後、この構造体を核にしてゴルジ体が成長していくことがわかった。このGNSのpositioningに関与する細胞質成分を同定するため、本アッセイ系が有用であることがわかった。

この再構成系の確立によって、今後、ゴルジ体の細胞周期依存的なグイナミクスの研究とそれぞれの素過程に必要な因子の検索が可能になった。
乳癌骨転移の成立・進展における低酸素および転写因子HIF-1alphaの役割

本研究では、乳癌組織における酸素分圧および転写因子HlF-1αの発現と骨転移との関連を解明することを目的として、以下の検討を行った。1.骨転移巣における低酸素およびHIF-1α発現ヒト乳癌細胞を用いた骨転移動物モデルによる検討で、骨転移巣における低酸素領域の存在が明らかにされ、その部位に一致して乳癌細胞おけるHIF-1αの発現が認められた。2.乳癌の骨転移に対する低酸素の関与(1)低酸素特異的活性化タンパクの応用低酸素細胞特異的にアポトーシスを誘導する融合タンパク(TOP3)を作成した。TOP3はin vitroにおいて低酸素下の乳癌細胞特異的にアポトーシスを誘導し、さらには、マウス骨転移モデルにおいて骨転移形成を有意に抑制した。(2)in vitroにおける低酸素の骨芽細胞、破骨細胞に対する作用低酸素が骨芽細胞分化を抑制する一方、破骨細胞分化に対しては促進的に作用することが示された。3.乳癌の骨転移に対するHlF-1αの関与(1)乳癌細胞における低酸素によるHIF-1αの発現誘導In vitroにおいて低酸素が乳癌細胞のHIF-1α発現を誘導することが確認された。(2)恒常活性化型およびドミナントネガティブ型HIF-1α過剰発現乳癌細胞株の樹立とその性状解析乳癌の骨転移に対するHlF-1αの関与を検討するために、恒常活性化型およびドミナントネガティブ型HIF-1α過剰発現株を樹立した。これらの骨転移形成能について、マウス骨転移モデルを用い比較検討したところ、恒常活性型HIF-1α過剰発現株では骨転移形成が促進され、一方、ドミナントネガティブ型HIF-1α過剰発現株では骨転移形成の抑制が認められた。乳癌組織における酸素分圧および転写因子HIF-1αの発現と骨転移との関連を解明することを目的として、本年度は主として以下の検討を行った。この結果から、骨転移における低酸素およびHIF-1αの関連が推測された。さらにTOP3がin vitroにおいて低酸素下の乳癌細胞特異的にアポトーシスを誘導することを確認した。3.乳癌の骨転移に対するHIF-1αの関与(1)乳癌細胞における低酸素によるHIF-1αの発現誘導In vitroにおいて低酸素が乳癌細胞のHIF-1α発現を誘導することが確認された。(2)恒常活性化型およびドミナントネガティブ型HIF-1α過剰発現乳癌細胞株の樹立とその性状解析次年度は、今回得られた所見を踏まえ、in vivoでの検証を中心とした検討を進めていく予定である。乳癌組織における酸素分圧および転写因子HIF-1αの発現と骨転移との関連を解明することを目的として、昨年度の結果を踏まえ、本年度は主として以下の検討を行った。1.乳癌の骨転移に対する低酸素の関与昨年度作成した、低酸素特異的にアポトーシスを引き起こす融合タンパク(TAT-ODD-Procaspase3:TOP3)の骨転移に対する作用を、マウス骨転移モデルを用い検討したところ、TOP3は用量依存的に骨転移形成を抑制した。

2.乳癌の骨転移に対するHIF-1αの関与HIF-1αの骨転移に対する作用をin vivoで検討するために、昨年樹立した恒常活性型およびドミナントネガティブ型HIF-1α過剰発現乳癌細胞の骨転移形成能について、マウス骨転移モデルを用い比較検討した。その結果、恒常活性型HIF-1α過剰発現株では骨転移形成が促進され、一方、ドミナントネガティブ型HIF-1a過剰発現株では骨転移形成の抑制が認められた。(1)低酸素を標的とした分子の骨転移に対する作用上記1で述べたようにTOP3が骨転移形成を抑制したことから、低酸素を標的とした骨転移治療に用いられる候補分子の一つと成り得ることが示唆された。(2)HIF-1を標的とした分子の骨転移に対する作用HIF-1の活性を阻害するとされる分子の一つとして、YC-1の作用について検討したところ、YC-1は低酸素により誘導されるHIF-1αの発現を抑制した。さらには、骨転移動物モデルにおいて骨転移形成を有意に抑制した。よって、YC-1のHIF-1を標的とした骨転移治療における有効性が示唆された。
Ｎａ／Ｃａ交換輸送が胎児・新生児の動脈管と末梢肺動脈の血管緊張度にはたす役割

(1)Na/Ca交換体Slc8A1、A2、A3の3つのmemberとも動脈管、肺動脈で発現していた。発現量の多いのはA1とA3で、A2は少なかった。(2)Slc8A1は動脈管、肺動脈とも発達に伴いやや減少したが、心室筋での著しい変化は見られなかった。一方A3は発達に伴いやや増加した。(3)免疫染色では動脈管、肺動脈で最もよく染まったのはA3で続いてA1であった。A2は染まらなかった。(4)Slc8A1をHEK293細胞への導入させることができた。(5)パッチクランプ法により導入したSlc8A1からNa/Ca交換輸送電流を測定することができたが、各種条件下での電流測定はできなかった。平成24年度ではクローニングしたNa+/Ca2+交換輸送体(Slc8A1)をHEK293細胞の発現させ電気生理学手法への応用を試みた。以下概略を示す.【背景】Ca2+電流ならびに筋小胞体の役割は成獣に比較して未熟心筋では小さい.一方,Na+/Ca2+交換輸送電流は成獣と比較すると大きく,Ca2+電流・筋小胞体の役割を補っている.言い換えればNa+/Ca2+交換体は未熟心筋における心機能維持のため重要な役割を演じていると考えられている.その後未成熟な動物から新鮮な細胞を分離することの困難さも加わり,胎仔・新生仔など未成熟な動物の細胞を用いてのNa+/Ca2+交換輸送体に関する研究は十分にはなされていない.そこで今回分子生物学的手法と電気生理学的手法を用いて未熟細胞のNa+/Ca2+交換輸送体に関する研究を立てた.【目的】胎仔・新生仔の細胞からクローニングしたNa+/Ca2+交換輸送体(Slc8A1)から電流を測定する手法を確立すること.【方法】家兎胎仔の心臓からクローニングしたSlc8A1をpB1-CMV2ベクターに挿入しHEK293細胞に導入させ,GFPと共発現させた.GFPを目標にパッチクランプ法を用いNa+/Ca2+交換輸送電流を測定した.電流測定上の諸条件(液の組成,パルス条件など)は従来から報告されている方法に従って行った.【結果】Slc8A1とGFPを供発現させたHEK293細胞からNa+/Ca2+交換輸送電流を測定することができた.【考察】培養細胞を用いてNa+/Ca2+交換輸送電流が測定できることが確認された意義は大きい.今後酸素濃度の違いによる変化,各種薬剤存在下での変化など実験条件を変え検討していく.さらに動脈管・末梢肺動脈などの血管平滑筋からクローニングしたNa+/Ca2+交換輸送体についても検討を加えていく.本研究は研究代表者が行ってきた研究のひとつで、細胞内外のCa2+調節に重要な役割を演じているNa/Ca交換輸送電流が発達に伴い大きく変化することに着目し、成熟児と未熟児で収縮度が異なる血管組織である動脈管の収縮機転おいてNa/Ca交換輸送体がどのような役割を演じているのか研究するものである。平成23年度には主として分子生物学的研究を、平成24,25年度には免疫染色ならびに電気生理学的研究を行った。研究成果:Na+/Ca2+交換輸送体(Solute carrierfamily 8 (Slc8A), member1, 2, 3)mRNA発現量の発達に伴う変化につき検討した。Sla8A1及び8A3は成獣の心臓で最も高発現しており、Slc8A2はまったくBGレベルであった。胎仔及び新生仔の動脈管・肺動脈・大動脈では、全般にSlc8A1が8A2や8A3より高発現であった。以上より、胎仔や新生仔の動脈管・肺動脈・大動脈においては、Slc8A1がSlc8A2やSlc8A3に比べて高発現であり、加えて動脈管においてはさらに高発現であることから、Na+/Ca2+交換輸送体Slc8A1が胎仔・新生仔の動脈管の血管緊張に関与している可能性が示された。動脈管組織の免疫蛍光染色で最も良く染まったのはSLC8aA3で、SLC8A1が続いた。SLC8A2はほとんど染まらなかった。パッチクランプ法では、クローニングしたSlc8A1とGFPを共発現させたHEK293細胞からNa+/Ca2+交換輸送電流を測定することができた。今後の課題:動脈管の特異的機序である酸素による収縮機転にNa/Ca交換輸送体がどのように関与しているかさらに検討を加えていく。(5)パッチクランプ法により導入したSlc8A1からNa/Ca交換

輸送電流を測定することができたが、各種条件下での電流測定はできなかった。[背景]Na+/Ca2+交換輸送体は、細胞膜における1Ca2+と3Na+の交換輸送を担い、心筋細胞においてその収縮・拡張機構に大きな役割を演じる。Na+/Ca2+交換輸送電流は、新生仔において成獣の34倍大きく、発達に伴い大きく変動する。胎仔・新生仔の動脈管・肺動脈のNa+/Ca2+交換輸送が血管緊張度に果たす役割についての研究はまだない。[目的]Na+/Ca2+交換輸送体(Solute carrierfamily 8 (Slc8A), member1, 2, 3) mRNA発現量の発達に伴う変化を検討すること。[方法]家兎胎仔(妊娠21, 27, 30日)及び生後2日の新生仔の主肺動脈・動脈管・下行大動脈、並びに成獣の主肺動脈・大動脈・心臓・肺からtotal RNAを抽出し、逆転写反応によりcDNAを調製した。Slc8A1, 2, 3 mRNAの発現量をreal-time PCR法により定量し、リボソーマルRNA 18Sを内部標準として各試料を比較した。[結果]Sla8A1及び8A3は成獣の心臓で最も高発現であり、Slc8A2はまったくBGレベルであった。胎仔及び新生仔の動脈管・肺動脈・大動脈では、全般にSlc8A1が8A2や8A3より高発現であった。Slc8A1と8A2は肺動脈・大動脈より動脈管で高く、胎仔の成熟に従って発現量はやや低下した。Slc8A3は胎仔肺動脈や動脈管より大動脈で高い傾向があり、成熟するにつれて増加した。[結論]胎仔や新生仔のこれら3血管においては、Slc8A1がSlc8A2やSlc8A3に比べて高発現であり、加えて動脈管においてより高発現であることから、Na+/Ca2+交換輸送体Slc8A1が胎仔・新生仔の動脈管の血管緊張に関与している可能性が示された。当初の研究計画では,平成23年度の研究は主として分子生物学的研究を中心に平成24年度では電気生理学的研究を研究の中心におき研究計画を立てている.平成24年度の研究では達成できなかった項目もあるが概ね順調に運んでいると考えている.<理由>1.Na+/Ca2+交換輸送体(Slc8A)memberのうちSlc8A1とSlc8A2をGFPとHEK293細胞に共発現させることができた.しかしながら,Slc8A2はHEK293細胞に共発現させることができなかった.2.Slc8A1を発現させたHEK293細胞を用いて,Na+/Ca2+交換輸送電流を測定することができた.3.研究成果を第48回日本小児循環器学会(平成24年7月:京都),第116回日本小児科学会(平成25年4月:広島)で報告することができた.平成23年度の研究は主として分子生物学的アプローチを中心に行う計画を立て、概ね達成できたと考えている(研究成果の概要参照)。1.家兎胎児(21日、23日、30日)、新生仔(日令2)、成獣から動脈管、肺動脈、大動脈の血管組織を摘出した。2.摘出した血管組織からScl8A1,2,3のmRNAの発現量を測定した。3.各組織間、各発達、Slc8Aのmember間での発現量の違いを比較した。4.Scl8A1のクローンとGFPをHEK293細胞に供発現させることに成功した。なお、研究成果の一部を第48回日本小児循環器学会(平成24年7月:京都)で報告予定である。
分裂装置内微小管の動的映像化による染色体移動機構の解明

有糸分裂の際の染色体移動機構を解明することを目的として、移動の原動力を任っている微小管を高輝度暗視野光学顕微鏡と超高感度ビデオカメラを使って動的に映像記録し、溶液中の個々の微小管についてその成長(重合)短縮(脱重合)過程を解析した。その結果、1)見かけの定常状態においては個々の微小管の長さは一定ではなく、成長と短縮をくりかえしていること。2)【Ca^(++)】存在下では短縮相と休止相があり、やはり個々の微小管はこれらの2相間を相互変換していることが明らかになった。3)細胞外に分画された中心体を核として微小管を成長させた場合にも、微小管の動的不安定性が観察された。染色体移動機構の解明にこれらの事〓は深く関係している。1.微小管結合タンパク質(【MAP_S】)を含くまない精製微小管溶液中には、重合中と脱重合中の微小管が共存していた。この現象は従来の重合反応論では説明不能である。各微小管はこの重合・脱重合の2相間を可逆的に相互変換していた。2.従来の溶液全体の測定では微小管は【Ca^(++)】存在下で持続的に脱重合されるとされてきたが、映像代により短縮期と休止期があり、【Ca^(++)】濃度の上昇にともなって休止期の時間的存在確率が減り、その結果脱重合速度が速くなっていた。3.上記の動的不安定性は【MAP_S】を加えることによって抑制され、微小管は定常状態において一定長を保持するようになった。4.動的不安定性が紡錬体微小管においても見られる現象であるかどうかは、残念ながら我々の暗視野蛍光システムでも観察不能であった。しかし分画した中心体微小管も典形的な動的不安定性を示した。これらの結果を総合すれば、【MAP_S】によって安定化された微小管が何らかのシグナルによって【MAP_S】を不活化し、微小管が脱重相に相転移することにより染色体を中心体の方向に引っぱり、移動させるモデルは大変有力であると考えられる。