hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
線維前駆中間体の解析を基軸としたアミロイド線維の伝播性および毒性の構造基盤の解明

さらにオリゴマー段階で示す毒性発現機構にも注目し、線維前駆中間体の解析を通してアミロイド線維の伝播性と細胞毒性の発現機構をタンパク質構造の見地から明らかにすることを本研究課題の目的とする。これまでインスリン、インスリン由来ペプチド断片、アミロイドβタンパク質、トランスサイレチンを解析対象として線維前駆中間体の捕捉を試みてきた。その結果、インスリン由来ペプチド断片については線維前駆中間体が明確に蓄積するアミロイド線維形成経路が明らかとなったので、H29年度はCDとDLSを用いた時分割的な構造変化の観察を実施し線維前駆中間体が構造発達するプロセスの解析を行った。その結果、線維前駆中間体は2種類存在するが、2番目に生成する中間体のみが核を生成できるという興味深い結果を得ることができた。さらにこの線維前駆中間体はフィブリノーゲンと相互作用することにより後続のアミロイド線維形成が阻害されることも明らかになったので、中間体とフィブリノーゲンとの相互作用様式についても検討した。アミロイドβタンパク質、トランスサイレチンについても引き続き線維前駆中間体の捕捉を試み、アミロイドβタンパク質については、リポソームを用いた細胞毒性の検討も開始した。線維前駆中間体を経由したアミロイド線維形成反応に注目することで、核形成に関わるタンパク質分子の集合や構造変化の実態に近づくことが出来つつあると考えている。なかでも特定の線維前駆中間体のみが核形成に寄与するという事象の発見は、中間体の内部に核形成を促進する何らかの秩序構造が秘められる可能性を示唆する。今後、核形成する中間体としない中間体を比較することができれば、核形成時に必要なタンパク質集合構造は如何なるものかについて明らかになることが期待される。アミロイド線維は、自らの末端構造を鋳型として正常タンパク質をアミロイド構造へと変換し構造伝播する。本研究では、鋳型構造の実体および核が形成され伝播性が発揮されるまでのタンパク質構造形成メカニズムを明らかにするため、「線維前駆中間体」の存在に注目し、これを安定に蓄積させたうえで解析する。これまでに、インスリン、インスリン由来ペプチド断片、アミロイドβタンパク質、トランスサイレチンを解析対象とした線維前駆中間体の捕捉および構造的特徴の解析を試みてきた。その結果、インスリン由来ペプチド断片では、線維前駆中間体を経由した反応経路が明らかになり、CD、DLS、SAXSを用いた時分割的な構造変化を通して線維前駆中間体が構造発達するプロセスを明らかにした。また、反応条件を変えることで異なる線維前駆中間体を観察できる可能性も分かった。さらに、この線維前駆中間体がフィブリノーゲンと相互作用することによりアミロイド線維形成が阻害されるメカニズムを検討し、論文を投稿した。
小胞体経路の蛋白質選別輸送の分子機構

真核細胞において粗面小胞体の膜結合リボソームで合成される種々の蛋白質が小胞体からゴルジ装置を経て細胞表層やリソソームに移行する輸送経路を研究対象とし、1)新生ペプチドの小胞体認識機構、2)ペプチドの小胞体膜透過機構、小胞体膜への組み込み機構、3)小胞体からゴルジ装体を経て細胞表層に至る蛋白質の小胞輸送機構、4)小胞輸送においてのゴルジ体の機能、5)小胞輸送過程においての蛋白質の修飾機構、6)リソソームへの蛋白質の選別輸送機構、7)エンドサイトーシス、エキソサイトーシスの分子機構、について分担して研究した。主要な研究実績は次の通りである。1)酵母シグナル認識粒子(SRP)のSRP受容体との相互作用とGTPase活性の制御機構を変異株を用い解析した(天谷)。2)N末にシグナルアンカー配列(SA)をもつP450の膜への組み込み機構を検討し、SAに続くプロリンに富む配列の重要性を確かめた(三原)。C末に膜挿入配列をもつアルデヒド脱水素酵素の小胞体への組み込みシグナルを解析した(山本)。3)小胞体-ゴルジ体間輸送に関与するSarlpの機能を解析しGTPの加水分解が輸送小胞のゴルジ体への移行に必須であることを確かめた(中野)。Rab3Aによる小胞輸送制御を解析し、Rab3Aの標的蛋白質Rabphilin-3Aの結合蛋白質としてGTPcyclohydrolase 1を同定した(佐々木)。4)ゴルジ膜の細胞質側に局在する分子量372kDa、170kDa,99kDaの3種類の蛋白質を同定し一次構造を決定した(池原)5)外来抗原のプロセシングをCathepsin Bが行っていることを証明した(勝沼)。6)リソソームの主要膜成分LGP96がエンドソーム-リソソーム間の融合に関与する証拠を得た(姫野)。自食過程へのユビキチン系の関与を免疫電顕法で確かめた(横田)。7)内皮細胞層でのAngiotensinのトランスサイトーシスへの液胞型H^+ ATPaseの関与を確認した(高野)。小胞体から細胞表層に至るエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシス経路の蛋白質輸送の各段階について、研究代表者および研究分担者で分担して研究を進めた。1.小胞体:生合成と共役した小胞体膜に組み込まれる蛋白質について、アミノ末端に存在するシグナルアンカー配列の膜内配向を決定する構造要素を明らかにした(大村)。ラット膵外分泌腺細胞で、KDELをもつ小胞体内腔蛋白質が小胞体から輸出される現象を検討し、KDEL蛋白質がその受容体に比較し過剰合成されることが小胞体へ留置かれない原因と推定した(田代)。小胞体の膜蛋白質の小胞体への留置機構を解析し、蛋白質分子中の膜挿入部分が留置に関与していることを見出した(田代、大村)。2.小胞体ーゴルジ装置間輸送:細胞表層に輸送されるDPPIVの活性部位にアミノ酸変異を導入すると小胞体からゴルジに輸送されなくなることを見出した(池原)。酵母において、SarlpによるGTPの加水分解は小胞体よりの輸送小胞の形成には必要なく、輸送小胞のゴルジ装置への結合段階に必要なことを確かめた(中野)。3.ゴルジ装置:V-ATPアーゼの阻害剤バフィロマイシンA1がトランスゴルジ領域においての分泌顆粒の形成を阻害することを見出した(田代)。ゴルジ体へのリポソームの融和条件を検討し、融合がATPや細胞質を要求せず、ゴルジ膜の内在性蛋白質に依存することを見出した(大西)。4.リソソーム:リソソーム膜蛋白質LGP107は大きな内腔ドメインと小さな細胞質ドメインとから成るが、細胞質ドメインのアミノ酸配列を改変しCOS細胞で発現させ、この膜蛋白質のリソソームへの輸送に細胞質ドメインが必要であることを証明した(姫野)。肝細胞において、オートファゴソームとリソソームの融合を電顕観察により検討し融合過程を解析した(横田)。小胞体経路の各オルガネラの形成機構とオルガネラ間の蛋白質の選別輸送機構を研究代表者と研究分担者で分担して研究を進め、下記の研究成果を得た。成果の大半は既に論文として学会誌などに発表している。1.小胞体:小胞体膜蛋白質P-450について、小胞体に組み込まれたシグナルアンカー配列のアミノ末端が内腔側に存在することを証明し、シグナルアンカー配列に続くプロリンに富む配列が小胞体に組み込まれたP-450分子の高次構造形成に重要であることも確かめた(大村)。小胞体膜の蛋白質膜透過に関与する膜成分を透過中のペプチドとの化学架橋により検討し、9kDaの膜蛋白質を確認した(大村)。ミクロゾーム型アルデヒド脱水素酵素のC末端の疎水性アミノ酸配列が、この酵素の小胞体膜への挿入シグナルとしてだけでなく小胞体への留置シグナルとしても機能することを確かめた(田代)。P-450のシグナルアンカー配列の膜貫通領域が小胞体への留置シグナルとして機能することを確かめた(大村)。2.小胞体-ゴルジ装置間輸送:この輸送過程に関与するSarlpによるGTPの加水分解は小胞体からの輸送小胞の形成以降に必要であることを無細胞輸送系を用いて確認した。

3.ゴルジ装置:プロ型前駆体蛋白質のプロセシングを行なう酵素Furinのゴルジ装置局在化シグナルを検討し、膜貫通領域よりC末端側の細胞質に露出したペプチド中にあることを見いだした(池原)。4.リソソーム:ラット肝リソソームの膜蛋白質である酸性ホスファターゼのリソソーム局在化シグナルは細胞質に露出している短かなペプチド中のGYモチーフと考えられているが、酵母細胞で発現させた場合にはGYモチーフを改変しても膜貫通ドメインさえあれば液胞膜に運ばれることが確かめられた。動物細胞と酵母では局在化シグナルが異なるようである(姫野)。カテプシン群の内在性阻害蛋白質であるシスタチンalphaの細胞内転送にCキナーゼによるリン酸化が関与することを確かめた(勝沼)。5.ペルオキシソーム:誘導剤投与で増殖した肝細胞内のペルオキシソームの膜と基質にユビキチンが高い濃度で存在することを免疫電顕法で確認し、余分なペルオキシソームの分解にはユビキチン系が関与する可能性がある(横田)。6.トランスサイトーシス:培養上皮細胞にLDL受容体を導入しLDL受容体の細胞内輸送の実験系を確立した(高野)。真核細胞において粗面小胞体の膜結合リボソームで合成される種々の蛋白質が小胞体からゴルジ装置を経て細胞表層やリソソームに移行する輸送経路を研究対象とし、1)新生ペプチドの小胞体認識機構、2)ペプチドの小胞体膜透過機構、小胞体膜への組み込み機構、3)小胞体からゴルジ装体を経て細胞表層に至る蛋白質の小胞輸送機構、4)小胞輸送においてのゴルジ体の機能、5)小胞輸送過程においての蛋白質の修飾機構、6)リソソームへの蛋白質の選別輸送機構、7)エンドサイトーシス、エキソサイトーシスの分子機構、について分担して研究した。主要な研究実績は次の通りである。1)酵母シグナル認識粒子(SRP)のSRP受容体との相互作用とGTPase活性の制御機構を変異株を用い解析した(天谷)。2)N末にシグナルアンカー配列(SA)をもつP450の膜への組み込み機構を検討し、SAに続くプロリンに富む配列の重要性を確かめた(三原)。C末に膜挿入配列をもつアルデヒド脱水素酵素の小胞体への組み込みシグナルを解析した(山本)。3)小胞体-ゴルジ体間輸送に関与するSarlpの機能を解析しGTPの加水分解が輸送小胞のゴルジ体への移行に必須であることを確かめた(中野)。Rab3Aによる小胞輸送制御を解析し、Rab3Aの標的蛋白質Rabphilin-3Aの結合蛋白質としてGTPcyclohydrolase 1を同定した(佐々木)。4)ゴルジ膜の細胞質側に局在する分子量372kDa、170kDa,99kDaの3種類の蛋白質を同定し一次構造を決定した(池原)5)外来抗原のプロセシングをCathepsin Bが行っていることを証明した(勝沼)。6)リソソームの主要膜成分LGP96がエンドソーム-リソソーム間の融合に関与する証拠を得た(姫野)。自食過程へのユビキチン系の関与を免疫電顕法で確かめた(横田)。7)内皮細胞層でのAngiotensinのトランスサイトーシスへの液胞型H^+ ATPaseの関与を確認した(高野)。
自然免疫活性化アジュバントと癌抗原蛋白を用いた新規癌ワクチンの臨床研究

北海道大学病院にて癌ワクチン治療の対象となる症例のスクリーニングを行った。食道癌症例122例,膵癌症例80例における,NY-ESO-1抗原の発現を,パラフィン切片を用いた免疫染色法によって解析した。RT-PCRによってNY-ESO-1抗原の発現が確認されている細胞株であるHEC46と,発現しないことが確認されているTE8を,それぞれSCIDマウスに移植して得られた腫瘍を,免疫染色の陽性対照および陰性対照として用いることが可能であることを確認した。食道癌症例におけるNY-ESO-1抗原の発現症例は22例であったのに対し,膵癌では発現症例は1例もみられなかった。食道癌におけるNY-ESO-1発現症例では,有意にCD4陽性リンパ球およびCD8陽性リンパ球の腫瘍への浸潤が多いことが明らかになり,さらに病期III以上の進行癌症例ではNY-ESO-1発現症例の生存率が有意に良好であることが明らかになった。さらには,CD40を発現するBリンパ球の浸潤数が多い症例は予後不良であること,FoxP3陽性リンパ球数は予後に影響しないことが明らかになった。以上をふまえ,癌抗原を標的とする癌ワクチン療法として,抗原特異的CD4陽性リンパ球およびCD8陽性リンパ球を誘導する材料を用いて臨床試験を開始した。標的は,NY-ESO-1,免疫活性化アジュバントはCpGとしたワクチンを構築した。NY-EsO-1蛋白を合衆国のLudwig研究所より,CpGをファイザー製薬より入手した。対象症例は全ての悪性腫癖とし,十分なインフォームドコンセントに基づいてエントリーを開始した。現在,4例の同意取得がなされたが,うち3例はパフォーマンスステータスが増悪し(1例は肺転移による呼吸苦増悪,2例は脊椎転移による歩行障害)治療不能となった。現在再発乳癌症例1例をエントリーしており,投与による副作用は認められていない。インフォームドコンセントの得られた癌患者より切除された組織よりmRNAを抽出、RT-PCRおよび免疫染色法を用いて癌関連遺伝子の発現をスクリーニングした。まず肺癌、食道癌症例においてNY-ESO-1、MAGE-A4遺伝子の発現を診断した。肺癌に於いては、157例の非小細胞肺癌症例に対してNY-ESO-1、MAGE-A4の遺伝子診断を施行し、それぞれ28.4%、8.3%の遺伝子発現を認めた。同時に施行したTIL (Tumor Infiltrating Lymphocyte)の検討では、抗腫瘍免疫に重要なはたらきをもつCD4+T細胞およびCD8+T細胞と腫瘍抗原発現の相関は認められなかったが双方のTILがともに多く浸潤する腫瘍は有意に予後が良好であった。早期癌症例での予後には差を認めなかったが、MAGE-A4が過剰発現しているにもかかわらず進行した癌をもつ症例は極めて予後不良であることが判明した。一方、食道癌症例122例において施行したNY-ESO-1遺伝子の発現解析では、18%の腫瘍で遺伝子発現が確認された。NY-ESO-1遺伝子を発現している腫瘍に対しては有意にCD4+T細胞およびCD8+T細胞浸潤が多く、食道癌全症例でみると、予後良好な傾向が見られた。さらに病期IIIおよびIVの進行食道癌ではNY-ESO-1遺伝子発現陽性症例は陰性症例と比較して有意に予後良好であった。これらの診断結果をもとに、切除不能・再発症例を対象として、癌ワクチンの第一相試験のエントリーを開始した。

試験に際しては、北海道大学病院治験センター、病理部、薬剤部の協力体制を確保した。北海道大学病院にて癌ワクチン治療の対象となる症例のスクリーニングを行った。食道癌症例122例,膵癌症例80例における,NY-ESO-1抗原の発現を,パラフィン切片を用いた免疫染色法によって解析した。RT-PCRによってNY-ESO-1抗原の発現が確認されている細胞株であるHEC46と,発言しないことが確認されているTE8を,それぞれSCIDマウスに移植して得られた腫瘍を,免疫染色の陽性対照および陰性対照として用いることが可能であることを確認した。食道癌症例におけるNY-ESO-1抗原の発現症例は22例であったのに対し,膵癌では発現症例は1例もみられなかった。食道癌におけるNY-ESO-1発現症例では,有意にCD4陽性リンパ球およびCD8陽性リンパ球の腫瘍への浸潤が多いことが明らかになり,さらに病期III以上の進行癌症例ではNY-ESO-1発現症例の生存率が有意に良好であることが明らかになった。さらには,CD40を発現するBリンパ球の浸潤数が多い症例は予後不良であること,FoxP3陽性リンパ球数は予後に影響しないことが明らかになった。以上をふまえ,癌抗原を標的とする癌ワクチン療法は,抗原特異的CD4陽性リンパ球およびCD8陽性リンパ球を誘導する材料を用いて臨床試験を開始した。標的は,NY-ESO-1,免疫活性化アジュバントはCpGとしたワクチンを構築した。NY-ESO-1蛋白を合衆国のLudwig研究所より,CpGをファイザー製薬より入手した。対象症例は全ての悪性腫瘍とし,十分なインフォームドコンセントに基づいてエントリーを開始した。現在,4例の同意取得がなされたが,うち3例はパフォーマンスステータスが増悪し(1例は肺転移による呼吸苦増悪,2例は脊椎転移による歩行障害)治療不能となった。現在再発乳癌症例1例をエントリーしており,最終的に9症例を目標として試験を継続する。
時間分解ESR法による光誘起分子内水素移動反応の中間体励起三重項種の電子構造

時間分解ESR法は、短寿命励起三重項種や光化学反応中間体常磁性種の検出と構造の研究に有用であることから、その特徴を標題の研究に応用し、新たな成果を得た。1.時間分解ESRスペクトルのS/N比改善と波形解析の高精度化。シグナルデジタイザ-(本研究費設備備品:グラフテックSD2120)を既存ESR装置に接続し、高速信号取り込みをリアルタイムで行ない、コンピュ-タ-に送り込むシステムを完成させた。これにより、信号/雑音比の改善、スペクトル波形の高精度解析処理が可能となった。2.シッフ塩基の光誘起分子内水素移動反応レ-ザ-励起分子内水素移動反応の緩和過程で生ずる励起三重項種の時間分解ESR測定を、種々のシッフ塩基について行ない、興味ある成果を得た。ナフタレン骨格をもつシッフ塩基では、水酸基の位置で反応性も大きく異なり、電子スピンはキノイド構造部分に局在することが、スペクトル解析と理論計算から明らかにされた。3.ベンゾオキサゾ-ル誘導体の光誘分子内水素移動2-(2'-ヒドロキシフェニル)ベンゾオキサゾ-ルとその関連化合物について、無リン光性励起三重項種の検出に成功し、キノイド構造が三重項状態の電子構造に重要であることを明らかにした。4.光化学反応中間体と短寿命励起三重項種の時間分解ESR研究。本研究により、三重項一三重項エネルギ-移動過程におけるスピン分極の保存、ピリジン誘導体の光化学反応初期過程と励起三重項状態の電子構造が明らかにされた。さらに、フタロシアニンの励起三重項状態の検出や芳香族カルボニル化合物の光化学反応で生成するCIDEPスペクトルに及ぼす因子を解明した。本研究により、時間分解ESR法の研究は一段と進展した。
加水分解酵素の逆反応促進技術の開発と新規オリゴ糖合成への応用

トレハラーゼはトレハロースを加水分解する.本研究では,トレハラーゼ改変酵素と特殊化合物(βフッ化グルコース)を用いて,加水分解の逆反応によりトレハロースを高効率で合成させることに成功した.変異酵素として,塩基触媒変異体,および塩基触媒および加水分解の基質の水分子に影響を与えるアミノ酸残基変異体を用いた.何れも反応速度は野生型に比べ低下したが,特に,後者の合成効率が高く, 60%程度の収率を示した.トレハラーゼはトレハロースを加水分解する.本研究では,トレハラーゼ改変酵素と特殊化合物(βフッ化グルコース)を用いて,加水分解の逆反応によりトレハロースを高効率で合成させることに成功した.変異酵素として,塩基触媒変異体,および塩基触媒および加水分解の基質の水分子に影響を与えるアミノ酸残基変異体を用いた.何れも反応速度は野生型に比べ低下したが,特に,後者の合成効率が高く, 60%程度の収率を示した.膨大な種類を有するオリゴ糖や配糖体には新規機能開拓の可能性が高く,まずはオリゴ糖の合成が望まれる.本研究は,アノマー反転型酵素による効率的なオリゴ糖合成反応系開発を目的とする.平成19年度には大腸菌トレハラーゼを用いて以下を実施した.1.逆反応を強化した反応系の開発に関して,(1)触媒アミノ酸の同定,(2)塩基触媒変異酵素とフッ化糖の組み合わせによる合成反応の確立,を行った.(1)相同アミノ酸配列群に保存される酸性アミノ酸6残基の変異酵素6種をそれぞれ作出し,うち3変異酵素が特に著しい活性低下を示した.このうちの1つは,トレハロースよりもαフッ化グルコース(良い脱離基を有する)を良い基質とし,また反応速度定数(反応効率)の高pH側へのシフトを示し,酸触媒を決定された.塩基触媒は,残り2変異酵素のうち,実際にβフッ化糖からの逆反応触媒により決定された.これらの残基は,平成19年4月に発表されたトレハラーゼの立体構造の結果と矛盾せず,また,(α/α)_6バレル構造をとる他の糖質関連酵素と同じトポロジー上の配置が確認された.(2)βフッ化グルコースを用いると逆反応の効率が上がる.しかし,野生型酵素では,逆反応により合成されたトレハロースはただちに加水分解されるために,βフッ化グルコース(およびグルコース)を高濃度として逆反応の速度を高くしないとトレハロースは確認できなかった.これに対し,触媒塩基変異酵素は,効率よくトレハロース合成を触媒し,また合成されたトレハロースは加水分解されずに蓄積した.2.特異性改変に関して.合成反応においてグルコース以外はβフッ化グルコースの受容体にならず,基質特異性の厳密性が示された.膨大な種類を有するオリゴ糖や配糖体には新規機能開発の可能性が高く,まずはオリゴ糖の合成が望まれる.本研究は,アノマー反転型加水分解酵素を用いた高効率オリゴ糖合成反応系の開発を目的とする.平成20年度には大腸菌トレハラーゼを用いて, (1)塩基触媒のpKaの改変, (2)高効率逆反応(オリゴ糖合成反応)系の確立,を実施した.実施内容を以下に示す.一般塩基触媒(Glu),これと水素結合すると予想されるTyr,および基質に結合しかつ加水分解基質の水分子にも間接的に結合する残基(Asp)に注目し,変異酵素(各Glu→Gin, Tyr→Phe. Asp→Asn)を調製・精製し,精密に解析した.変異酵素のトレハロース加水分解のpH依存性は大きく変化し, pKelが一般塩基変異酵素で1. 3pH単位, Asp変異酵素では4pH単位増加した.すなわち,塩基触媒のpKaが増加し,逆反応に適した解離状態になったと予想された.いずれの変異酵素も活性を大きく失い,トレハロースに対するκ_<cat>は野生型の10^<-4>-10^<-6>倍であった,これに対して逆反応(25mMグルコースとβフッ化グルコースからフッ素の遊離反応)の速度(κ_<cat>)は低下しつつも10_<-2>倍程度にとどまった.すなわち, κ_<cat>の比率で,逆反応が野生型より70-1900倍高くなった.一定条件(94mMβフッ化グルコース, 42mMグルコースを基質とし, 20°C, pH6, 40時間まで)でトレハロース合成反応を行った. βフッ化グルコースの自発的分解により生成するグルコースも含めて全量がトレハロースになるときの収率を100%として,野生型酵素ではトレハロースがほとんど蓄積しないのに対し,塩基触媒変異酵素では収率8. 6%, TyrおよびAsp変異酵素はそれぞれ68%, 59%と高効率でトレハロースを合成した.
２光子励起顕微鏡を用いた網膜および視神経疾患における眼球深部動態観察

多光子励起顕微鏡を用いて、マウスの眼球深部組織の生体観察を行うことを目的とし、まず、野生型マウスを用い、尾静脈から注入する薬剤の投与法について網膜伸展標本を作成して条件検討を行った。次に、多光子励起顕微鏡を用いて実際に視神経の生体観察を行うため、マウスの視神経を露出させるための手法を固定台も含めて検討した。マウス網膜および視神経の生体観察のための条件検討として、野生型マウスを用いた。使用薬剤は、核染色を行うためのHoechst3334、血管染色ためのQtracker655もしくはrhodaminedextran(60kD以上)、アストロサイトのマーカーとしてsulforhodamine101を主に用いた。最初に、若齢マウスを用いて週齢によって体重あたりに全身投与できる薬剤の量を確認した。まず、自家加工を施した30G針を用いて尾静脈より血管を確保し、目的の薬剤を順次投与した。検討項目は、(1)各薬剤が単独で染色される時間と投与量との関係、(2)複数の薬剤をそれぞれ時間差で投与し多重染色を行うための投与量と時間配分、(3)複数の薬剤を混合して投与する場合の各薬剤の投与量で、それぞれ条件を振りながら一つ一つ確認して最適な投与法を現在も検討中である。また、アストロサイトの観察には、GFAP-eGFPトランスジェニックマウスも用いて、sulforhodamine101による染色像と比較する予定であるが、動物舎内の感染汚染のため、GFAP-eGFPトランスジェニックマウスはしばらく使用できなくなり、改めて熊本大学生命資源研究・支援センター動物資源開発研究部門より凍結胚を購入し、系統を維持を再開した。おおむね順調であるが、動物舎で感染症が2度にわたり発生したため長期間マウスの飼育が不可能となった。そのため、GFAP-eGFPマウスを維持することが出来なくなり、支障を来した。GFAP-eGFPマウスが使用できるようになるまでは、野生型マウスを用いて生体観察可能な条件を検討し、2光子励起顕微鏡を用いて観察する。2光子励起顕微鏡を用いた眼球深部観察の系の確立にはもう少し時間を要するものと予想される。動物舎が感染で汚染され長期間使用不可能となったため、実験中止を余儀なくされたため。今年度は、可能な実験からスタートする。
π-電子系と構造相転移をともなう表面との相互作用に関する研究

平成14年度は平面型π-電子系としてペンタセンについて研究をした。ペンタセンはキャリアの移動度が高く、有機FETとして有望な物質の一つとして応用面から盛んに研究されている。研究代表者はなぜ移動度が高いかについて議論するためにはペンタセンの電子状態を調べることが不可欠であると考え、低速反射型電子エネルギー損失分光(LEELS)を用いてその電子構造を明らかにし、エネルギーダイアグラムを作成した。LEELSは選択則が光学的な測定とは違い、双極子遷移のみならず、単極子や四重極子といった遷移も観測可能であり、またスピンフリップをともなった遷移も観測可能である。研究代表者は初めてペンタセンの三重項励起子を直接観測することに成功した。これはLEELSがスピンフリップをともなった遷移を観測した一例である。これまでにペンタセンのエピタキシャル膜の作成に成功したという報告は皆無であり、唯一、走査トンネル顕微鏡観察によりペンタセンがCu(110)表面上では1次元配列するという結果が報告されている。研究代表者は反射高速電子線回折(RHEED)を用いてCu(110)表面上ペンタセン薄膜の構造を明らかにするとともに、ペンタセン薄膜の電子状態を調べることによってCu(110)表面とペンタセン薄膜の相互作用を明らかにすることを目的に研究を行った。構造に関してはRHEED観察により、[001]方向でペンタセンが2nmの間隔で配列し、それと垂直方向ではCu-Cu原子間距離の2倍に配列することが確認された。Cu(110)表面とペンタセン薄膜の相互作用に関してはLEELSをはじめとした電子分光によってその相互作用が調べられつつある。
Na^+/HCO_3^-共輸送体遺伝子変異と近位尿細管性アシドーシスとの関連性の解明

1.研究目的腎の重要な役割の一つに体液のpHの恒常性を保つこと(酸塩基平衡)がある。私の所属していたグループでは先に、酸塩基平衡の先天的障害である近位尿細管性アシドーシス(pRTA)に様々な症状を合併する症例を報告した(Pediatr.Nephrol.8:70-1,1994.)。我々は、Na^+/HCO_3^-共輸送体(NBC)の異常が本疾患の原因であると推定し、正常型と患者型NBCの機能を比較することによりその仮説を証明した。今年度はNBCの生理的役割とpRTAの病態をさらに詳しく解明するため、正常型と患者型NBCの濃度依存性(kinetics)の比較検討を行った。2.研究法方ヒト腎臓cDNA libraryからNBC cDNAを単離し、得られた正常型ヒトNBC cDNAに対して一塩基置換を行い、患者変異遺伝子と相同なcDNAを作成した。アフリカツメガエル卵母細胞に正常型および患者型NBC cRNAを発現させ、Na^+、HCO_3^-共輸送に伴う細胞膜電流を観察することにより機能を比較した。そして、Na^+,HCO_3^-の濃度の変化による電流の大きさの変化を検討した。3.結果アフリカツメガエル卵母細胞発現系において、Na^+、HCO_3^-共輸送に伴う電流を比較した。患者に認められた2種類の変異により、電流は各々正常型の27%、3.0%に低下した。正常型と2種類の変異型の150Naは各々HCO_3^-10mMで、38.8、27.2、37.0mMであった。4.考察変異型NBCのが正常型よりもむしろ低値であったことより、その機能低下は基質親和性ではなく容量の低下のためであると考えられた。この知見を日本薬理学会、日本腎臓学会で発表した。我々は独自の臨床的観察から、NBCの異常がpRTAの原因であると推定し、昨年度からの研究によりそれを証明することができた。今回の研究がNBCの生理的役割、pRTAの病態の解明の一助となることを期待する。1.研究目的腎の重要な役割の一つに体液のpHを一定の範囲に保つこと(酸塩基平衡)がある。私の所属していたグループでは先に、酸塩基平衡の先天的である近位尿細管性アシドーシス(pRTA)に様々な症状を合併する一女児例を報告した(Pediatr.Nephrol.8:70-1,1994)。我々は腎近位尿細管に存在するNa^+/HCO_3^-共輸送体(NBC)の異常が本疾患の原因であると推定し、その仮説を証明することを目的として研究を開始した。2.研究方法既に報告されているヒトNBCの塩基配列をもとに、ヒト腎臓cDNA libraryからNBCcDNAを単離した。得られた正常ヒトNBCcDNAに対して一塩基置換を行い、患者変異NBC遺伝子と相同なcDNAを作製した。正常型および患者型NBCcDNAを培養細胞(ECV304)に発現させ、BCECFを用いた細胞内pH測定系により、細胞内pH変動に対する反応を比較した。また、アフリカツメガエル卵母細胞に正常型NBCおよび患者型NBCcRNAを発現させ、Na^+,HCO_3^-共輸送に伴う細胞膜電流を観察することにより機能を比較した。3.結果NBCを発現させた培養細胞の、酸負荷からの細胞内pHの回復速度を測定した。2種類の変異により、回復速度はそれぞれ正常型の55%、57%となった。アフリカツメガエル卵母細胞発現系において、Na^+/3HCO_3^-共輸送に伴う電流を比較した。同じ変異により電流はそれぞれ正常型の27%、3.0%に低下した(p<0.005)。4.考察及び今後の課題我々は独自の臨床的観察から、NBCの異常がpRTAの原因であると推定したが、患者型NBCの機能低下を示すことにより、この仮説を証明することができた。pRTAの成因を分子生物学的に明らかにした世界最初の報告として、海外の学術誌に成果を発表した(次項)。現在、NBCの生理的役割とpRTAの病態を更に詳しく解明するため、正常型と患者型NBCのkinetics、電位依存性の比較検討を行っている。

3.結果アフリカツメガエル卵母細胞発現系において、Na^+、HCO_3^-共輸送に伴う電流を比較した。患者に認められた2種類の変異により、電流は各々正常型の27%、3.0%に低下した。正常型と2種類の変異型の150Naは各々HCO_3^-10mMで、38.8、27.2、37.0mMであった。4.考察変異型NBCのが正常型よりもむしろ低値であったことより、その機能低下は基質親和性ではなく容量の低下のためであると考えられた。この知見を日本薬理学会、日本腎臓学会で発表した。我々は独自の臨床的観察から、NBCの異常がpRTAの原因であると推定し、昨年度からの研究によりそれを証明することができた。今回の研究がNBCの生理的役割、pRTAの病態の解明の一助となることを期待する。
青斑核由来ノルアドレナリンによる膀胱機能の調節機構

パーキンソン病などの錐体外路系疾患や老人性痴呆などにおいて,中枢の各種アミンニューロンに変性がみられ,排尿障害をおこすことから,ノルアドレナリン産生ニューロンから成る青斑核が排尿に関し重要な役割を演じていることが考えられ,このことを明らかにするため,アルファクロラロースネコを用いて研究を行った.青斑核を電気刺激すると膀胱内在は上昇し,この内圧上昇は,下部腰髄域の脊髄腔内に投与したフェントラミンおよびα_1遮断薬のプラゾシンにより制御された.しかし,この内圧上昇は同様にして投与したα_2遮断薬のコヒンビンおよびβ遮断薬のプロプラノロールによっては抑制されなかった.レセルピンを実験の24時間前に投与してカテュールアシンを枯渇した動物においては,青斑核を刺激しても膀胱内圧の上昇は認められず,レードーパを静注した後に青斑核を刺激した場合に膀胱内圧は上昇した.この内圧上昇もプラゾミンの脊髄腔内投与により抑制された.また,青斑核刺激による膀胱の内圧上昇は頚髓切断により遮断された.さらに,膀胱内に生理的食塩水を注入し,内圧を上昇させた時におこる自発性の膀胱収縮は,脊髄腔内へプラゾシンを投与した時,および頚髄を切断した時には消失した.仙髄の排尿中枢において,青斑核を刺激した時には,潜時5070msecにてスパイクを発射するニューロンが見い出された.これらの研究成績から,膀胱内在が上昇した時,この情報が脊髄から上行して,直接あるいは間接に青斑核に達し,このノルアドレナリンニューロンが仙髄外側部のニューロンにあるα_1受容体を介して活性化し,骨盤神経の刺激となって膀胱を収縮させる,と結論された.パーキンソン病などの錐体外路系疾患や老人性痴呆などにおいて,中枢の各種アミンニューロンに変性がみられ,排尿障害をおこすことから,ノルアドレナリン産生ニューロンから成る青斑核が排尿に関し重要な役割を演じていることが考えられ,このことを明らかにするため,アルファクロラロースネコを用いて研究を行った.青斑核を電気刺激すると膀胱内在は上昇し,この内圧上昇は,下部腰髄域の脊髄腔内に投与したフェントラミンおよびα_1遮断薬のプラゾシンにより制御された.しかし,この内圧上昇は同様にして投与したα_2遮断薬のコヒンビンおよびβ遮断薬のプロプラノロールによっては抑制されなかった.レセルピンを実験の24時間前に投与してカテュールアシンを枯渇した動物においては,青斑核を刺激しても膀胱内圧の上昇は認められず,レードーパを静注した後に青斑核を刺激した場合に膀胱内圧は上昇した.この内圧上昇もプラゾミンの脊髄腔内投与により抑制された.また,青斑核刺激による膀胱の内圧上昇は頚髓切断により遮断された.さらに,膀胱内に生理的食塩水を注入し,内圧を上昇させた時におこる自発性の膀胱収縮は,脊髄腔内へプラゾシンを投与した時,および頚髄を切断した時には消失した.仙髄の排尿中枢において,青斑核を刺激した時には,潜時5070msecにてスパイクを発射するニューロンが見い出された.これらの研究成績から,膀胱内在が上昇した時,この情報が脊髄から上行して,直接あるいは間接に青斑核に達し,このノルアドレナリンニューロンが仙髄外側部のニューロンにあるα_1受容体を介して活性化し,骨盤神経の刺激となって膀胱を収縮させる,と結論された.
高等動物の脳神経系におけるキシロース含有N型糖鎖の高次機能発現メカニズムの解明

本研究では、神経系におけるキシロース含有糖鎖が関与する分子間ネットワークを明らかにすることを通じてこの糖鎖の担う機能の解明を目指している。本年度はまずin situハイブリダイゼッションにより、aer61およびago61のmRNAはともにマウスの大脳、海馬、小脳に発現量が多く、また特にニューロンに発現していることが明らかとなった。今後、これらの遺伝子発現が多い部位に着目して糖鎖分析を行うことにより、キシロース含有糖鎖を探索する予定である。この2つのキシロース転移酵素様タンパク質のin vitro反応におけるキシロース転移活性を評価した。基質分子として、N型糖鎖の生合成過程に存在する一連の糖鎖を2-アミノピリジン誘導体を調製した。しかしながら現状では、大腸菌および動物細胞を用いて発現させたリコンビナントキシロース転移酵素様タンパク質の活性は検出できていない。酵素活性を持つには他のコファクター存在が考えられるため、今後これらキシロース転移酵素様タンパク質を導入した細胞に発現している糖鎖の構造を解析することにより、この酵素の活性評価を行う予定である。さらにはaer61およびago61の遺伝子欠損マウスを樹立した。aer61の遺伝子欠損ホモマウスは正常に生まれてくるのに対し、ago61の遺伝子欠損ホモマウスは胎生致死であることを明らかにした。今後、ago61遺伝子欠損マウス胎生致死の原因を明らかにすることで、キシロース含有糖鎖の機能を明らかにしていく予定である。
立体規則性高分子をテンプレートとする光応答性ポルフィリン集積体の構築

植物の光捕集装置や光電荷分離装置に見られるように、光機能性分子を空間的に秩序を持って配置することにより高度な機能を発現させることが出来る。このようなシステムを構築するもっとも直接的な方法として、合成化学的に種々のマルチポルフィリン化合物が合成され、その光誘起電荷分離能などが検証されている。しかし、これらのマルチポルフィリン化合物は精緻を極めた多段階有機合成により成立しているため、実用を目指した大量合成には適用困難である。また、緻密なシステムを構築している生態系においてもクロロフィル等の光機能性分子は必ず生体高分子のマトリックスの中に埋め込まれる形で組織化され利用されている。このような観点から、機能性分子を適切に配置し集積させる機能を有する高分子系の構築を試みた。(1)カルボキシル基を有するポルフィリン(TPP-p-COOH)とレセプター分子との水素結合形成カルボキシル基に相補的に水素結合を形成し得る6-アセトアミノニコチン酸を有する1,4-ジヨードベンゼンとTPP-p-COOHの相互作用を^1HNMR滴定により定量的に評価した。得られた滴定曲線より、結合定数Kが0.109mM^<-1>であることを明らかにした。(2)レセプター分子を側鎖に持つポリフェニレンエチニレンの合成平成14年度に行なった合成経路の探索の知見を活かして、平成15年度においてレセプター分子を結合した1,4-ジヨードモノマーはヒドロキノンジメチルエーテルから5段階で合成することに成功した。またコモノマーである1,4-ジエチニルベンゼンはヒドロキノンから4段階で合成した。これらのモノマーの重合をPd(PPh_3)_4およびPd_2dba_3CHCl_3錯体を用いた薗頭-萩原カップリングによる重合を行い、レセプター分子を側鎖に持つポリフェニレンエチニレンを合成することに成功した。得られた重合体は約10^4以下の分子量を持つオリゴマーであり、ポリフェニレンエチニレン骨格に由来する電子吸収および発光スペクトルを示した。植物は効率的な光合成プロセスを実現するために、高い秩序性をもってポルフィリン分子を集積させたシステムを構築し、光励起状態の長寿命化、続く光誘起電荷分離を実現している。このポルフィリン分子集積体による光応答機能と光合成反応の中心における連続電子移動反応は、理論的見地だけでなく、新規光機能性材料への応用という実用的な観点からも非常に興味深い。特に人工光合成系の構築に関しては、ありとあらゆる立体配置のマルチポルフィリン化合物が合成され、その光誘起電荷分離能などを検証している。本年度はこのようなポルフィリン集積体に秩序構造を付与するために、その集積の場となりうる均一オリゴマーもしくは立体規則性を有する高分子の合成経路を検討した。(1)レセプター分子とTPP-p-COOHの相互作用まずはじめにカルボキシル基に相補的に水素結合を形成することが期待できる6-アミノニコチン酸誘導体とTPP-p-COOHの相互作用を^1HNMRにより検討した。CDCl_3中、室温で測定した^1HNMRは6-アミノニコチン酸誘導体のアミドプロトンに由来するピークがTPP-p-COOHの添加とともに明確に低磁場シフトを起し、合成した6-アミノニコチン酸誘導体がTPP-p-COOHのレセプターとして働くことを確認した。(2)レセプター分子を側鎖に持つポリフェニレンエチニレンの合成レセプター分子を側鎖に持つポリフェニレンエチニレンの合成を目指して、まず6-アミノニコチン酸に2,5-ジヨードヒドロキノンへの結合の足がかりとなる連結部位をエステル結合で導入した。この化合物に対して常法に従いエーテル結合による2,5-ジヨードハイドロキノンへの接続を試みたが、溶解性の問題とレセプター分子の性質上、強塩基を使用できないため、このルートでの合成は非常に困難であることが明らかとなった。現在、2,5-ジヨードヒドロキノン側から先に連結部をエーテル結合で導入する経路を試みている。(2)レセプター分子を側鎖に持つポリフェニレンエチニレンの合成

平成14年度に行なった合成経路の探索の知見を活かして、平成15年度においてレセプター分子を結合した1,4-ジヨードモノマーはヒドロキノンジメチルエーテルから5段階で合成することに成功した。またコモノマーである1,4-ジエチニルベンゼンはヒドロキノンから4段階で合成した。これらのモノマーの重合をPd(PPh_3)_4およびPd_2dba_3CHCl_3錯体を用いた薗頭-萩原カップリングによる重合を行い、レセプター分子を側鎖に持つポリフェニレンエチニレンを合成することに成功した。得られた重合体は約10^4以下の分子量を持つオリゴマーであり、ポリフェニレンエチニレン骨格に由来する電子吸収および発光スペクトルを示した。
遺伝子発現量を基盤とした黒毛和種の不飽和脂肪酸に関与する遺伝子の探索

本研究は、黒毛和種の脂肪中の一価不飽和脂肪酸(MUFA)割合に影響を与える遺伝子を特定し、遺伝的改良に寄与することを目的として実施した。肥育牛のサンプルから遺伝子発現量とMUFA割合を測定したところ、5つの遺伝子で0.39から0.56の正の相関を得た。そのうち、SPP1、FABP4およびFADS2の3つの遺伝子を対象として、転写開始領域の遺伝的変異を探索したところ、4つの一塩基多型を検出することができた。FADS2の多型は皮下脂肪の厚さ、推定歩留およびミリスチン酸、FABP4の多型は枝肉重量、脂肪交雑およびリノール酸に有意な効果を与えていることが明らかとなり、選抜指標としての利用が期待される。黒毛和種の育種改良は、脂肪交雑の追求から脂肪酸組成の改善へとシフトしつつある。本研究はバイオプシーにより採取した黒毛和種の遺伝子発現量を基盤として一価不飽和脂肪酸(MUFA)割合に影響を与える遺伝子を特定することを目的として実施している。平成24年度はリアルタイムPCRによる遺伝子発現量とMUFA割合の関連性を検討し、FABP4、FGF1、MMP14、SCDおよびSPP1の5つの遺伝子でそれぞれ0.39、0.56、0.41、0.47および0.40の中程度の正の相関係数が得られた。平成25年度は、このうちSPP1に着目し、SPP1遺伝子のプロモータ領域における多型探索を塩基配列決定により行った。その結果、3490A/Gおよび3492A/Gの2つの一塩基多型を検出することができた。これらの多型に関し、全国から収集した黒毛和種肥育牛446頭の遺伝子型判定を行った。3490A/GではAおよびG遺伝子の頻度はそれぞれ0.10および0.90であり、AA型は検出できなかった。一方3492A/GではAおよびG遺伝子の頻度はそれぞれ0.72および0.28となった。これら遺伝子型の多型と経済形質の関連性をTukey-KramerのHSD検定により調査したところ、これらの多型がもつ効果は、体脂肪の脂肪酸組成や一般枝肉形質において有意なものではなかった。本研究はバイオプシーにより黒毛和種の生体組織を採取し、遺伝子発現量を基盤として一価不飽和脂肪酸(MUFA)割合に影響を与える遺伝子を特定することを目的として実施している。日本各地から集められた黒毛和種集団を高MUFA群と低MUFA群に分け、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行った結果、SPP1、LEP、MMP14、IGF1、FGF1、FGF2などの脂肪酸代謝に関与すると考えられる遺伝子の発現量に群間で違いが認められた。これらの遺伝子を対象として、マイクロアレイによる発現量とリアルタイムPCRによる発現量による比較を行ったところ、たとえば高MUFA群と低MUFA群との間に5.58倍の発現差が見られたSPP1では0.87の有意な相関係数が得られた。一方、FGF1およびMMP14では0.39(P = 0.07)および0.35(P = 0.10)の相関となり、群間の発現量にSPP1ほどの差がなかった遺伝子では発現解析における誤差の影響が示唆された。しかしながら相関係数はいずれも中程度の正であり、マイクロアレイとリアルタイムPCRの整合性を否定するものではなかった。さらに別の黒毛和種集団を用いてリアルタイムPCRによる発現量とMUFA割合の関係を調査したところ、FGF1、MMP14およびSPP1の3つの遺伝子で0.56、0.41および0.40の中程度の正の相関係数が得られた。これらの遺伝子はMUFA割合に影響を与える候補遺伝子としてより詳細な検討が必要であると考えられた。現在の我が国の牛肉市場において最も重要な経済形質は脂肪交雑であり、関係者は過去数十年の間に世界にも類をみないほど確固とした改良体制を築き上げ、脂肪交雑には十分な改良が加えられた。近年は健康志向と風味の向上という視点から、脂肪酸組成をはじめとした脂肪の「質」を高め、黒毛和種に新たな価値を付与する取り組みに生産者の期待が高まっている。このような中、本研究はバイオプシーにより採取した黒毛和種の遺伝子発現量を基盤として一価不飽和脂肪酸(MUFA)割合に影響を与える遺伝子を特定することを目的として実施したものである。平成24年度はリアルタイムPCRによる遺伝子発現量とMUFA割合を調査し、FABP4、FGF1、MMP14、SCDおよびSPP1の5つの遺伝子で発現量とMUFA割合の間に0.39から0.56の正の相関を得た。

平成25年度はこのうちのSPP1に着目し、プロモータ領域における多型探索を行った結果、2つの一塩基多型を発見した。しかし集団解析を行ったところ、これらの多型は体脂肪の脂肪酸組成や一般枝肉形質において有意な効果をもつものではなかった。平成25年度から最終年度である平成26年度にかけてはFABP4とFADS2の2つの遺伝子を対象にプロモータ領域の多型探索を行い、合計で3個所の一塩基多型を検出するに至った。これらすべての多型は転写因子結合部位に影響を与え遺伝子発現量に差異をもたらすものと考えられた。集団解析の結果、FADS2の多型は皮下脂肪の厚さ、推定歩留およびミリスチン酸、FABP4の多型は枝肉重量、脂肪交雑およびリノール酸に有意な影響を与えていることが明らかとなった。FABP4の多型は相加的な遺伝様式を示さず、かつMUFAには有意な効果を有さなかったが、FADS2の多型は黒毛和種の一般的な経済形質に関する選抜マーカーとして活用できる可能性が示唆された。家畜育種学候補遺伝子の調節領域に対する多型探索を行い、黒毛和種の集団で多型を確認することができたため。また、平成25年度以降に計画していた「検出多型を用いた生産現場集団に対するMUFA関連解析」にも着手し、多型と脂肪酸組成との関連も検討できたため。平成24年度に計画していた項目のうち、「網羅的発現解析による候補遺伝子の選出」と「リアルタイムPCRによる候補遺伝子の発現検証」はおおむね終了している。また別集団を用いた「新規サンプルを用いた発現解析」についても3つの遺伝子については検討を開始できたため。平成26年度は、SPP1と同様の方法をその他の遺伝子にも適用する。さらに集団解析による多型の効果の推定を行い、黒毛和種のMUFA改良のための選抜指標として、有効か否かを検討する。平成24年度はFGF1、MMP14およびSPP1の3つの遺伝子について検討を行ったが、その他の候補遺伝子についても同様の検討を行い、リアルタイムPCRによる発現量とMUFA割合の関連性を調査する。関連性が認められた遺伝子については、プロモータ領域に関する情報を収集し、小規模な集団を用いた当該領域のシーケンス解析により多型を探索する。多型の存在が確認できれば、頭数を拡大した集団解析に移行する。平成25年度に使用予定の研究費は、前年度の未使用額5万円を加えた155万円である。このうち63万円は実験における試薬や消耗品に使用する。平成25年度は多型を探索するシーケンス解析や集団解析が中心となることから、それらに関する酵素試薬などを購入する。リアルタイムPCRでの発現解析用としてRNA抽出用試薬や逆転写酵素も購入する。また、PCRの利用が増加することから50万円をサーマルサイクラーの購入に充てる。その他、研究打合せおよび成果発表のために国内外の旅費と論文投稿関係費用として42万円を計上している。平成26年度は探索した多型の集団解析を計画していることから、同上の試薬類などが購入の対象となる予定である。
CVDダイヤモンドコーティングされた複雑形状面のメカノケミカルポリッシング

本研究では、変形して曲面形状にフィットすることができるステンレス製ブラシ工具を用いることでメカノケミカル研磨が可能であることを実験により明らかにした。さらに種々の実験条件下において詳しい研磨特性の評価を行った。本研究は、金型など複雑な形状を有するCVDダイヤモンドコーティング面に対応可能な研磨技術を新たに開発することを目指している。初年度は、CVDダイヤモンド膜のメカノケミカルポリッシングの研磨特性の検証のため、基本的な実験を行った。まず、ステンレス製のディスク状回転研磨工具を用いて実験を行った。その結果、約2000m/minの摺動速度においてCVDダイヤモンド膜を表面粗さ0.3μmRz以下に仕上げられることを確認した。しかし、回転研磨工具の半径方向の回転振れ等により回転研磨工具が研磨面上で跳ね上がる現象が発生し、CVDダイヤモンド膜の所々に剥離・チッピングが生じた。そのため、研磨面への過度な衝撃を避けるために、回転研磨工具をディスク状のものから緩衝性の高いブラシ状のものに変更し、同様の実験を行った。その結果、CVDダイヤモンド膜に剥離・チッピングを生じることなく、CVDダイヤモンド膜表面の凸部から徐々に研磨されていく様子が確認された。しかし、CVDダイヤモンド膜表面の半分ほどの面積が平滑化されたところ(半分ほど平滑化されていない凹部が残った状態)で著しく研磨速度が低下する現象が生じた。これは、研磨面が平滑化して摩擦抵抗が下がったことで、研磨面と回転研磨工具の摩擦による発熱量が小さくなり、ダイヤモンドと回転研磨工具材料の熱化学反応に必要な温度に至らなくなったことが原因と考えられる。特に、ブラシ状回転研磨工具を用いる場合には研磨面への押し付け圧力が小さくなるため、この影響が顕著に生じるものと考えられ、次年度の研究実施に向けて、解決すべき課題が明らかになった。前年度に続き、ステンレス製ブラシ工具を用いてCVDダイヤモンドのメカノケミカル研磨を試みた。スピンドルの回転数を変えてブラシ工具の周速度を1445m/min、2168m/min、2890m/minとし、荷重を1Nおよび2Nとして実験を行った結果、工具の周速度もしくは荷重が大きくなるほど、研磨速度が増加することを確認した。また、平滑化された研磨面積の比率が80%に達するまでの時間を各研磨条件ごとに計算して定量的に比較した結果、荷重が1Nの時よりも2Nの時の方が周速度の増加に対する研磨速度の上昇が顕著であることを明らかにした。ブラシ工具を用いて全面が平滑化されるまで研磨した後のCVDダイヤモンドの表面粗さは、今回実験した範囲ではどの加工条件においても0.5μmRz以下が実現されていることを確認した。さらに、研磨速度の向上の試みとして、熱風機による加工部の加熱補助の効果について検討を行った。加工条件を荷重2N、周速度2890m/minとし、熱風機による熱風温度を200°C、400°C、600°Cとして実験を行った結果、200°Cの場合には特に研磨速度上昇の効果は見られず、熱風温度600°Cの場合には高温下の工具材料の強度低下に起因すると思われる凝着の発生により研磨が困難となった。一方、熱風温度400°Cにおいては、研磨を困難にする程の凝着は発生せず、研磨速度の上昇を確認した。最後に微粒のゴム砥石を用いて仕上げ研磨することで、メカノケミカル研磨で問題となる研磨面に残留する金属凝着物の除去が可能であることを確認した。
ジャワ島土壌に見つかった特異なスメクタイトに関する研究

ジャワ島西部の赤黄色土壌の心土(深さ1746cm)の粘土画分に、特異なX線回折図の特徴を示すスメクタイト様鉱物の存在が示唆されたので、その鉱物特性を調べて明らかにした。粘土画分のX線回折図では、Mg飽和の風乾粘土試料で15.51Åに中心をもつ幅広い回折線(16.37Å14.61Åの範囲)と7.53Å付近に回折線を示した。そして、同Mg飽和試料のグリセロール飽和処理試料では、20.55Åに膨潤し移行した回折線と10.057.53Åにかけての幅広い回折線を示した。他方、K飽和の風乾粘土試料のX線回折図では、11.87Å(12.81Å11.95Åの範囲)の回折線が7.53Åの回折線にかけての幅広い回折線を示した。そして、同K飽和試料の105550°Cの加熱処理試料では、加熱温度が高まるにつれて7.53Å付近の回折線は550°Cの加熱処理後に消失し、その幅広い回折線が10.05Åに移行する特徴を示した。ホルムアマイド処理では、7.53Åの回折線は10.05Åの回折線へ膨潤し移行して、ハロイサイトの存在を示唆した。7.53Åの回折線は、5MNaOH溶解処理後では消失し、Mg飽和の風乾粘土試料で明瞭な15.51Åの回折線が残存した。ハロイサイトの存在は、5MNaOH溶解処理後の溶解成分のケイバン比が約2を示したことからも示唆された。また、5MNaOH溶解処理後のX線回折図では、K飽和の風乾粘土試料の11.87Åの回折線に代わり、13.49Åの回折線が認められた。粉末試料のX線回折図では、060面の回折線は1.50Åを示し、2八面体構造のスメクタイトの存在を示唆した。そしてGreene-Kelly分析試験ではバイデライトの存在を示唆した。以上の鉱物学的および化学的特徴から、ジャワ島土壌に見つかった特異なスメクタイト様鉱物は、ハロイサイト/バイデライト混合層鉱物であると考えられた。ジャワ島西部の赤黄色土の心土(深さ1746cm)の粘土画分に、X線回折図のMg飽和風乾処理で15.51Åを示し、グリセロール処理で19.21Åに膨潤し、K飽和で12.81Åから11.95Åに回折線が続き、550°Cの加熱処理で9.83Åに完全に移行し、通常のスメクタイトの特徴と異なる特異な鉱物の存在が示された。その粘土画分から粗粘土(粒径2.0-0.2μm)と細粘土(粒径0.2μm以下)を採取し、対照粘土として、粘土鉱物組成が既知の前兼久:月布(1:1)混合粘土、前兼久:棚原(1:1)混合粘土を調整した。