hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒストン修飾を介した脳神経機能制御の解析と精神疾患モデルの開発

発現に違いが認めれた遺伝子の中から神経系で機能していると考えられる遺伝子に絞って定量RT-PCR解析を行ったところ,6個の遺伝子の発現がHP1欠損神経幹細胞で有意に亢進していた。そこでそれらの遺伝子のヒストン修飾の状態を解析したところ,5つの遺伝子でH3K27me3が低下していた。H3K27me3は抑制性マークなので,それが低下したために遺伝子発現が亢進した可能性が示唆される。これらの遺伝子のヒストン修飾とHP1をはじめてとするエピジェネティクス因子の結合を解析して,神経幹細胞の未分化/分化におけるHP1の機能を明らかにして,論文としてまとめる予定である。HP1γなどのヒストン修飾因子の脳神経における機能を明らかにするために,HP1γの脳神経特異的欠損マウスを作製した。このマウスの網羅的行動解析を行ったところ,オープンフィールドや明暗往来テストで顕著な低活動性が観察された。しかし抗うつ薬や抗不安薬の投与では,この低活動性を改善することはできなかった。一方,HP1γ欠損神経幹細胞はシャーレに接着しやすいことがわかった。神経幹細胞での遺伝子発現を比較したところ,幾つかの遺伝子の発現がHP1γ欠損において有意に亢進しており,ヒストン修飾の抑制性マークの集積が低下していた。以上からHP1γはヒストン修飾を介して遺伝子発現を制御していることが示唆された。平成26年12月に研究室を金沢大学から京都大学に引っ越したので,マウスのコロニーを一旦縮小する必要があり,実験が停滞してしまった。京都大学でのマウスコロニーも増えてきており,研究分担者2名も京都大学に移ってきたので,最終年度は目標達成に向けて研究を推進して行く。27年度が最終年度であるため、記入しない。実験動物学最終年度となるので,脳神経系特異的HP1欠損マウスに集中して研究を進めたいと考えている。セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害剤(SNRI)や覚せい剤を用いた行動薬理学的実験を進めて,行動異常の分子基盤を明らかにする。また,遺伝子発現に差が見られたセロトニン系を中心に,受容体分子の発現や脳内セロトニン濃度を解析して,HP1の標的遺伝子の同定を進める。標的遺伝子の候補についてはH3K9のメチル化などヒストン修飾の変化を解析して,HP1の直接的な関与を検討する。脳神経系特異的HP1欠損マウスについては,行動解析と遺伝子発現解析から興味深い結果が得られ順調に研究が進んでいる。脳神経系特異的KDM欠損マウスはタモキシフェンの投与条件が決まったので26年度から解析を開始する。平成26年12月に研究室を金沢大学から京都大学に引っ越したので,実験が停滞してしまった。特にマウスのコロニーを一旦縮小する必要があったので,しばらくマウスを使った実験が行えず,物品費の支出が少なくなった。また,研究室の場所が変わったので,謝金で雇用していた人を雇用できなくなった。脳神経系特異的HP1欠損マウスについては,行動解析と遺伝子発現の結果を合わせて判断し,このマウスに生じている神経系の異常について,組織学的,行動薬理的な解析を行っていく。
ENU誘発突然変異マウスを用いたミトコンドリア疾患モデルマウスの探索

我々はヒト疾患モデルや遺伝子機能解析のモデルとなる突然変異体マウスを作製するためENU(N-エチル-N-ニトロソウレア)ミュータジェネシスを行い、これまでに多くの突然変異体を見出してきた。ミトコンドリア病はミトコンドリアの機能異常を原因とする疾患の総称である。本研究はミトコンドリア機能異常個体を探索すべく新規スクリーニングの検査法を確立し、核遺伝子変異に起因するミトコンドリア疾患モデルマウスの開発を目的とした。検査対象は可視的形質探索においてミトコンドリア病の主症状である筋異常(痙攣、麻痺、歩調異常、筋力低下など)を呈した優性および劣性形質遺伝探索用の個体である。これらの個体を対象とし、新規に確立・導入したミトコンドリアの機能や形態を観察するための検査として、血中乳酸値(運動負荷前後の変動)の測定、およびミトコンドリアDNA(mtDNA)の多重欠失の検出を試みた。さらに、本疾患の診断に不可欠な筋病理解析も実施した。これまでの優性および劣性遺伝形質探索における本スクリーニングの結果、血中乳酸値に異常を呈する個体は観察されなかった。しかし、劣性遺伝形質探索の複数家系の骨格筋から、本疾患に特徴付けられる欠失mtDNAを検出することができた。今後の研究の発展をふまえ、欠失mtDNAの遺伝性を確認できた家系に関して、さらなるミトコンドリアの機能や形態解析、そして筋病理解析を行い、ミトコンドリア病の疾患モデルとしての有用性を確認している。本プロジェクトでは、ヒト疾患モデルや遺伝子機能解析のモデルとなる突然変異体マウスを作製するためENU(N-エチル-N-ニトロソウレア)ミュータジェネシスを行い、個体レベルでの大規模な網羅的表現型スクリーニングが構築し、これまでに多くの突然変異体を見出してきた。本研究は核遺伝子変異に起因したミトコンドリア機能異常を探索すべく新規スクリーニング系を確立し、ミトコンドリア疾患モデルマウスの開発を目的とする。ミトコンドリア病は細胞レベルでミトコンドリアの機能異常を本態とし、組織・臓器レベルで臨床症状を発症している病気の総称であり、(1)中枢神経系・感覚器などの所見、(2)血中乳酸値測定、(3)筋組織化学的検査、(4)遺伝子診断により診断が下される。新規スクリーニング系を導入するためには(2)と(3)を確立する必要がある。(2)血中乳酸値測定に関しては、乳酸値簡易測定キットを用いて、これまでに835週齡の血中乳酸値の水準化を図るに至った(35週齡以降も継続実施中)。現在、運動負荷後のミトコンドリア機能の観察を目的とし、強制運動装置(トレッドミル)により運動を負荷させ、その後の乳酸値を経時的に測定している。(3)筋組織化学的検査に関しては、ミトコンドリアを効率的に観察すべく最適な三筋(前脛骨筋、長指伸筋、ヒラメ筋)を凍結ブロック法により固定し、ヘマトキシリン・エオジン染色、ゴモリトリクローム変法、チトクローム酸化酵素活性、コハク酸脱水素酵素の計4種の方法により、筋線維の分類と分布、ミトコンドリアの基本構造、そして機能を観察する。これまでに300個体を超える試料を凍結保存するに至っており、染色の準備が整い次第、順次に順次に切片作製・染色を実施する予定である。

これらの個体を対象とし、新規に確立・導入したミトコンドリアの機能や形態を観察するための検査として、血中乳酸値(運動負荷前後の変動)の測定、およびミトコンドリアDNA(mtDNA)の多重欠失の検出を試みた。さらに、本疾患の診断に不可欠な筋病理解析も実施した。これまでの優性および劣性遺伝形質探索における本スクリーニングの結果、血中乳酸値に異常を呈する個体は観察されなかった。しかし、劣性遺伝形質探索の複数家系の骨格筋から、本疾患に特徴付けられる欠失mtDNAを検出することができた。今後の研究の発展をふまえ、欠失mtDNAの遺伝性を確認できた家系に関して、さらなるミトコンドリアの機能や形態解析、そして筋病理解析を行い、ミトコンドリア病の疾患モデルとしての有用性を確認している。
遠赤外フ-リエ分光による強誘電相転移機構の移行についての研究

ソフトフォノンが観測され典型的な変位型と考えられる強誘電体のなかに,規則・不規則型特有の誘電臨界緩和(critical slowingーdown)が観測されるものが見出されてきた。このような相転移を行なう典型的な強誘電体Li_2Ge_7O_<15>(以下LGOと略す)の相転移機構を解明するためにはソフトフォノンと緩和型モ-ドの両者を同時に観測することが重要である。ラマン散乱や誘電分散測定の結果から,10cm^<-1>以下の波数領域までのスペクトルが必要不可欠である。このため赤外フ-リエ分光計の改良を行なった。干渉計を振幅分割方式と偏光分割方式の複合型にすることにより,測定波数を遠赤外からミリ波領域まで拡張することが可能になった。この装置を用いて,LGOの赤外吸収スペクトルの温度依存性の詳細を測定した。常誘電相および強誘電相においてソフトフォノンが確認でき,この結果はラマン散乱等の結果とよい一致をみた。これまでの結果から,LGOの強誘電相転移にはフォノンと緩和型モ-ドのふたつの独立したモ-ドが関与していることが明らかになった。最近,低温で自発分極の符号が逆転することが見出された。これは結晶格子中に方向の異なる2種類の分極が存在していることを示し,ソフトフォノンのみでは説明できない。今後は,遠赤外からミリ波領域で高性能な検出器を導入し,ソフトフォノンと緩和型モ-ドを同時に測定し移乗の様子を直接観測したい。さらに,結晶構造の変化とこれらのモ-ドとの関係を定量的に解明したい。相転移機構の移行は限られた一部の強誘電体のみの問題ではなく本質的に一般的なものであると考えられるのでこのことを明らかにして行きたい。さらには,強誘電体の形態がバルク単結晶から単結晶薄膜そしてクラスタ-へと変わるとき,格子振動とりわけ相転移に関与するソフトフォノンがどの様になるかを観測し,相転移機構の移行を含む動力学を解明して行きたい。ソフトフォノンが観測され変異型相転移を行なうと考えられてきた強誘電体のなかに規則・不規則型特有の誘電臨界緩和を示すものが見出されてきた。相転移機構が変異型から規則・不規則型へと移行するとき、ソフトフォノンがそのまま過減衰して疑緩和型モ-ドへと移り変わるのか、別の自由度として緩和型モ-ドが存在し、ソフト化という性質のみの移乗が起こっているのかは重要な問題である。本研究はソフトフォノンと緩和型モ-ドの両者を、特別に開発した赤外フ-リェ分光計により同時に測定し、相転移機構の移行を観測しようとするものである。本年度は本研究費により光学用クライオスタット(クライオミニD105)を購入した。このクライオスタットと自作した透過用高温炉を使用して、強誘電体Li GeOの遠赤外透過スペクトルの温度依存性を測定し、ソフトフォノンの詳細をしらべた。常誘電相において最低振動数を持つB uフォノンが高温側から転移点に近づくにつれてソフト化してゆくことが確認された。この結果はラマン散乱等の測定結果とよい一致を示している。

これらの結果は第7回国際強誘電体会議(Saarbrucken,1989年8月)で発表し、Ferroelectricsに議事録として刊行される予定である。最近の誘電分散測定の結果から、転移機構の移行は数波数以下の領域で観測されると推測される。フォノンと緩和型モ-ドの両者を同時に観測するには、より低波数での測定が望まれる。干渉計の改良と低波数領域で高性能な検出器を導入することにより、ソフトモ-ドの移行または移乗を直接観測する計画である。強誘電体Li_2Ge_7O_<15>(以下LGOと略す)は,ソフトフォノンが観測され典型的な変位型と考えられてきたが,規則・不規則型特有の誘電臨界緩和(critical slowingーdown)が観測された。このような特異な相転移の転移機構を解明するためにはソフトフォノンと緩和型モ-ドの両者を同時に観測することが重要である。このため今年度は昨年度に引き続き,赤外フ-リエ分光計の改良を行なった。干渉計を振幅分割方式と偏光分割方式の複合型にすることにより,測定波数を赤外からミリ波領域まで拡張することが可能になった。この装置と新に導入したシリコン・ガリウムボロメ-タを用いて,LGOの赤外吸収スペクトルを4cm^<ー1>まで測定した。スペクトルの温度依存性の詳細から常誘電相および強誘電相においてソフトフォノンが確認でき,この結果はラマン散乱等の結果とよい一致をみた。これまでの結果から,LGOの強誘電相転移にはフォノンと緩和型モ-ドのふたつの独立したモ-ドが関与していることが明らかになった。今後は,遠赤外からミリ波領域で高性能な検出器を導入し,ソフトフォノンと緩和型モ-ドを同時に測定しモ-ドのソフト化の移乗の様子を直接観測したい。さらに,結晶構造の変化とこれらのモ-ドとの関係を定量的に解明したい。相転移機構の移行は限られた一部の強誘電体のみの問題ではなく本質的に全ての構造相転移に一般的なものであると考えられるのでこのことを明らかにして行きたい。
認知的徒弟制によるプレゼンテーションスキル向上支援環境

本研究では、大学などの研究グループにおけるプレゼンテーションに着目し、認知的徒弟制に基づいてプレゼンテーションドキュメント作成スキルの向上を図る支援環境を構築した。特に、研究グループ内に蓄積されたドキュメント群から典型的な意味的構造(プレゼンテーションスキーマ)を抽出し、それを足場として既存のドキュメントを「学ぶ(読む)」・「聞く」文脈、および新たなドキュメントを「作る(書く)」文脈で、個々のドキュメントの意味的構造を構成する経験を積ませることでシステマティックにスキルアップを図る支援技術を設計・開発した。大学などの研究グループにおけるプレゼンテーションを題材に、認知的徒弟制に基づいてプレゼンテーションドキュメント作成スキルの向上支援環境を構築するために、平成23年度はドキュメントの意味的構造(プレゼンテーションセマンティクス)を表現する手法,および研究グループ内に蓄積されたドキュメントのモデルとなるセマンティクス(プレゼンテーションスキーマ)を足場として、セマンティクス構成経験を積ませることでスキルアップを図る基本的なメカニズムを開発した。具体的には、次の(1)(3)を行った。(1)プレゼンテーションセマンティクスの表現とスキーマ抽出メカニズムの開発:論理的なプレゼンテーションた関する研究動向を調査した上で、プレゼンテーションドキュメントに対するメタデータを用いてプレゼンテーションセマンティクスを表現する方法を開発した。また、研究グループに蓄積されたドキュメントに対するメタデータの付与およびセマンティクスの同定を支援するメカニズムを開発し、ドキュメント群からプレゼンテーションスキーマを抽出するメカニズムを開発した。(2)スキル習得支援メカニズムの開発:プレゼンテーションスキーマを足場としてプレゼンテーションドキュメント作成スキルの習得を支援する基本的なメカニズムを開発した。本メカニズムは、認知的徒弟制に基づいて設計されており、スキーマの理解支援、ドキュメントに内在するセマンティクスのスキーマを足場とした構成支援、構成したセマンティクスとスキーマの比較による自己評価支援、典型的な研究文脈でスキーマ適用支援から構成されている。(3)予備実験:(2)で開発したメカニズムを研究グループ内の大学生、大学院生に利用さぜる予備的な実験を行い、その結果を踏まえてプレゼンテーションセマンティクス構成支援の有効性を検証し、主にプレゼンテーションセマンティクス表現およびスキーマ表現の見直しを行った。認知的徒弟制に基づいてプレゼンテーションドキュメント作成スキルの向上支援環境を構築するために、平成25年度は前年度までに開発してきたプレゼンテーションスキルアップ支援システムの有効性評価に基づく洗練とシステムの活用方法を検討した。具体的には、次の13を行った。1.有効性評価実験の実施:前年度に引き続き、研究グループ内の大学生、大学院生にプレゼンテーションスキルアップ支援システムを中期的に利用させて、プレゼンテーションスキーマを基盤としたスキルアップ支援の有効性を確かめた。特に、研究グループ内に蓄積されたドキュメントを「学ぶ」・「聞く」文脈においてプレゼンテーションセマンティクスを構成する経験が、ドキュメントを「作る」スキルの向上に与える影響を調査した。その結果、研究初学者に対して、「学ぶ」・「聞く」ことの経験がドキュメント作成スキルに転移する可能性が確認された。また、他の研究グループに蓄積されたプレゼンテーションドキュメント群からスキーマを分析・表現してスキルアップ支援システムに組み込むことで、支援システムのユーザビリティおよびスキルアップ支援のスケーラビリティを調査した。その結果、他の研究グループでも同様のスキルアップ支援の実施可能性を確認した。2.プレゼンテーションスキルアップ支援システムの洗練:1の結果に基づいて、特定の研究グループによらない汎用的なスキーマの表現方法を検討するとともに、学習者のスキルレベルに応じた適応的支援を開発した。適応的支援では、構成されたプレゼンテーションセマンティクスを診断する機能、および診断に基づいて修正点を指摘する機能を実現した。3.システム活用方法の検討:様々な研究グループから本支援システムを活用できるように、研究グループごとのプレゼンテーションスキーマ表現支援および研究グループごとのスキル習得・向上支援を実施する枠組みを検討した。大学などの研究グループにおけるプレゼンテーションを題材に、認知的徒弟制に基づいてプレゼンテーションドキュメント作成スキルの向上支援環境を構築するために、平成24年度はスキル習得支援のために開発してきた基本メカニズムの洗練、および基本メカニズムを統合したスキルアップ支援システムを開発した。1.スキル習得支援メカニズムの洗練:研究グループ内に蓄積されたドキュメントから抽出した典型的な意味的構造(プレゼンテーションスキーマ)を足場としてドキュメントを作成するスキルの習得を支援する基本メカニズムの利用可能性、有効性を調べるケーススタディを実施した。そして、その結果に基づいて支援メカニズムを洗練した。2.システマティックなスキルアップ支援システムの開発:基本的な支援メカニズムを統合し、研究初心者がプレゼンテーションドキュメントの意味的構造(セマンティクス)を構成するスキルをシステマティックに高めるシステムを開発した。本システムでは、既存のドキュメントを「学ぶ(読む)」・「聞く」文脈だけでなく、新たなドキュメントを「作る(書く)」文脈でもスキーマを足場としてセマンティクスを構成する場を提供する。また、学習者のスキルレベルに応じてセマンティクス構成文脈を変更することができ、構成に行き詰まりが生じた場合は適宜基本支援メカニズムである自己評価支援などを提供することができる。3.有効性評価

実験:2で開発したシステムを研究グループ内の大学生、大学院生に利用させる実験を行い、セマンティクス構成スキルの向上への影響を調査した。また、中期的にシステムを利用させてスキルアップ支援の有効性を検証した。これらの結果から、主に学習者のスキルレベルに応じたセマンティクス構成文脈の設定方法を検討し、研究グループごとのスキーマ表現方法を見直した。プレゼンテーションセマンティクス表現からスキーマを足場としたプレゼンテーションドキュメント作成スキル習得支援まで,ほぼ計画通りに研究を進めることができたが、予備実験では開発した習得支援メカニズムがスキル向上を促すことができない場合もあることを確認している。また、その主な原因がプレゼンテーションセマンティクス表現にあること、および個々の学習者への適応がないことを見いだしている。これらの点を踏まえて、いかにスキル習得支援メカニズムを洗練すべきか,特に適応的な支援のあり方についても知見を得ている。このように、研究はほぼ計画通りに進捗していることから、現在までの達成度を(2)と判断した。25年度が最終年度であるため、記入しない。基本的なスキル習得支援メカニズムの洗練、およびスキルアップ支援システムの開発は、ほぼ計画通り進めることができたが、有効性評価実験におけるシステム利用実験は長期的とはならず中期的な利用にとどまった。しかしながら、この実験を通して、学習者のスキルレベルに合わせてセマンティクスを構成する文脈(ドキュメントを「学ぶ」・「聞く」・「作る」)を設定することがスキルアップにとって重要であるという知見を得た。このようなスキルレベルに応じた支援は、長期的なシステム利用でより顕著になると考えられ、支援システムによるスキル向上支援の有効性を高める上で不可欠なものであるとの認識を得ている。以上のことから、現在までの達成度を2と判断した。予備実験の結果得られたスキル習得における問題点をより明確にすることが重要であるとの認識にたち、まず開発した習得支援の基本メカニズムの利用可能性,有用性を調査するケーススタディを実施して,各メカニズムの洗練を進める.また,これらの基本メカニズムを統合して、研究初心者に対して段階的にセマンティクス構成スキルの向上を図るシステムを開発するとともに、真正な研究活動において既存のドキュメントを「読む」・「聞く」ことからはじめ、徐々に新規ドキュメントを「書く」ことでスキルアップを図る手法を検討する。
強度干渉による広波長域コヒーレント・インコヒーレントフェムト秒パルス光の研究

本研究は,これまで申請者が二光子の同時計数法によって行なってきたフェムト秒の光のパルス幅測定が,二つの検出器からの光電流の積によっても可能であるかを実験的に検討するものである.光電流を数値化して積を計算する方式の強度干渉装置を組み立て,モード同期チタン・サファイヤ-レーザーのパルス幅測定を行なった.結果は光のパルス幅測定はできず,コヒーレンス時間のみが測れることを示した.これは一面,ヤングの干渉実験をやっていると考えると当然である.しかし,このコヒーレンス時間τ_cはによって定義されるもので,スペクトル幅の逆数τ^1_cとパルス幅τ_pによって決まっている.そこで,強度干渉の場合,τ^1_cを大きくするような工夫をすれば,τ_pが測れるという推測ができる.すなわち,スペクトル幅を狭くすればパルス幅が得られると予想される.これが可能なら,二光子の同時計数法でやっていたようなτ_cとτ_pの二重構造のディップでなく,τ_pのみを分離した測定ができる.これは大きな進歩になる.今後の実験でこの推測の検証をすることが要請されることになった.本研究は,これまで申請者が二光子の同時計数法によって行なってきたフェムト秒の光のパルス幅測定が,二つの検出器からの光電流の積によっても可能であるかを実験的に検討するものである.光電流を数値化して積を計算する方式の強度干渉装置を組み立て,モード同期チタン・サファイヤ-レーザーのパルス幅測定を行なった.結果は光のパルス幅測定はできず,コヒーレンス時間のみが測れることを示した.これは一面,ヤングの干渉実験をやっていると考えると当然である.しかし,このコヒーレンス時間τ_cはによって定義されるもので,スペクトル幅の逆数τ^1_cとパルス幅τ_pによって決まっている.そこで,強度干渉の場合,τ^1_cを大きくするような工夫をすれば,τ_pが測れるという推測ができる.すなわち,スペクトル幅を狭くすればパルス幅が得られると予想される.これが可能なら,二光子の同時計数法でやっていたようなτ_cとτ_pの二重構造のディップでなく,τ_pのみを分離した測定ができる.これは大きな進歩になる.今後の実験でこの推測の検証をすることが要請されることになった.本研究は,これまで申請者が二光子の同時計数法によって行なってきたフェムト秒の光のパルス幅測定を,光電流の強さの積によって行なおうとするものである.被測定光が強ければ,この方法によってその光子数の2乗以上の倍率で短時間の測定が可能になることが期待できる.この強度干渉法によって,従来の二光子干渉法が実験室における測定法として完成することになる.検出電流を数値化して積を計算する方式の強度干渉装置を組み立て,モード同期チタン・サファイアレーザーの基本波のパルス幅を測定した.検出器には2個の高速Siフォトダイオードを用い,モード同期パルス列の10^<-6>秒間の平均値をデジタイズして、計算機に取り込んで,それらの積を計算しながら干渉計を掃引した.2個のダイオードからの出力は,干渉計の二つの光路間の位相差を反映して,強度の反転した信号になることを確認した.これらの積を計算した結果,二光子計数測定による強度干渉と同じことができることが証明された.研究の第2年度では,広い禁止帯を持つ固体中の不純物あるいは微粒子からの紫外域の短寿命蛍光の測定およびチタン・サファイアレーザー光の2次高調波のパルス幅測定を行いたい.併せて,紫外や軟X線のフェムト秒パルスの直接測定法の開発も考慮したい.本研究は,これまで申請者が二光子の同時計数法によって行なってきたフェムト秒の光のパルス幅測定が,二つの検出器からの光電流の積によっても可能であるかを実験的に検討するものである.光電流を数値化して積を計算する方式の強度干渉装置を組み立て,モード同期チタン・サファイヤ-レーザーのパルス幅測定を行なった.結果は光のパルス幅測定はできず,コヒーレンス時間のみが測れることを示した.これは一面,ヤングの干渉実験をやっていると考えると当然である.しかし,このコヒーレンス時間τ_Cは1/τ^2_C≡1/τ′^2_C+1/τ^2_Pによって定義されるもので,スペクトル幅の逆数τ′_Cとパルス幅τpによって決まっている.そこで,強度干渉の場合,τ′^2_Cを大きくするような工夫をすれば,τ^2_Pが測れるという推測ができる.すなわち,スペクトル幅を狭くすればパルス幅が得られると予想される.これが可能なら,二光子の同時計数法でやっていたようなτ_cとτ_pの二重構造のディップでなく,τ_pのみを分離した測定ができる.これは大きな進歩になる.今後の実験でこの推測の検証をすることが要請されることになった.
水田雑草における除草剤抵抗性個体出現頻度の推定

アゼナ、アメリカアゼナ、タケトアゼナ、アゼトウガラシの4種のアゼトウガラシ属水田雑草では、イヌホタルイと同じく少なくとも2種類のアセト乳酸合成酵素(ALS)遺伝子が存在した。また、近年スルホニルウレア系除草剤(SU剤)抵抗性が確認されたオモダカには1種のALS遺伝子が存在した。収集したイヌホタルイの抵抗性バイオタイプにおけるALS遺伝子の変異点を調べたところ、Pro197部位でアミノ酸がSerに置換する変異(Pro197Ser変異)が最も多く見つかり、またアゼトウガラシ属水田雑草とオモダカでもPro197Ser変異が最も多く見つかったことから、草種にかかわらずPro197Ser変異の頻度が高いことが示唆される結果であった。SU剤処理歴のない試験水田に生育するイヌホタルイ集団に対してSU剤処理を行った結果、2004年には水田1で2個体、水田2で6個体、2005年には水田3で6個体の抵抗性個体が得られ、この試験水田のイヌホタルイにおける抵抗性個体発生頻度は7.4×10^<-6>と推定された。ALS変異部位ではALS1のPro197Ser変異をもつ場合が高く、3.3×10^<-6>の推定頻度で存在した。他の変異遺伝子はこの1/31/8程度であり、Pro197Ser変異が比較的多いという上記の結果に対応するものであった。年あたり塩基サイトあたりの自然突然変異率は4.7×10^<-9>と推定されており、一旦集団に固定された突然変異遺伝子の集団内頻度は、そのfitnessに従って決まると考えられている。本試験結果は自然集団で少なくとも7.4×10^<-6>程度まで頻度が上昇することを示しており、現場のイヌホタルイの自然集団の抵抗性遺伝子の頻度は10^<-9>から10^<-6>の範囲にあるものと予想される。こうした頻度の違いを既存の数理モデルにあてはめると、抵抗性個体の蔓延に要する期間は5年から7年と予想された。イヌホタルイおよびアゼトウガラシ属水田雑草の集団の収集の収集について,公立農業研究機関を中心に土壌又は植物体の送付を依頼し,秋田県と岩手県では,実際に6月7月にかけて雑草発生の多い水田を中心に土壌及び植物体を採取した。その結果,全国7県から送付されたイヌホタルイ及びアゼトウガラシ属水田雑草の約33集団が集まり,少なくとも10集団が抵抗性であった。また,岩手県と秋田県で採取したイヌホタルイ及びアゼトウガラシ属水田雑草の42集団を検定した結果では24集団に抵抗性個体が見られた。イヌホタルイについてスルホニルウレア系除草剤の作用点にあたるアセト乳酸合成酵素(ALS)遺伝子を解析したところ,イヌホタルイには2種類のALS遺伝子があり,それぞれ1144bp,1095bpの異なる長さのイントロンを持つ,約3.2kbpの遺伝子であることが判明した。DNA塩基配列から類推されるアミノ酸配列は,ともに645個のアミノ酸からなるタンパク質で互いに98.3%の相同性を示した。各系統のALS遺伝子の変異部位を調べたところ,抵抗性系統のほとんどは,どちらかのALS遺伝子のドメインAのPro部位に変異が見られた。唯一,秋田県本荘市で採取した抵抗性系統にドメインBのTrp部位に変異が見られた。イヌホタルイのドメインBのTrp部位は今まで日本の水田雑草に見つかっておらず,スルホニルウレア系除草剤以外のALS阻害型除草剤にも抵抗性を示すことが知られていることから,農業現場の抵抗性対策にとって重要な知見となった。アゼトウガラシ属水国雑草についてALS遺伝子を解析したところ,アゼナ,アメリカアゼナ,タケトアゼナ,アゼトウガラシの4草種とも,イントロンが1つ挿入された構造のALS遺伝子を持つことが明らかとなった。イヌホタルイについて宮城県の7集団,福岡県の5集団,岩手県の2集団を現地から採取して検定したところ,感受性と抵抗性が混在した集団が各県から1集団ずつ得られた。この集団の感受性個体は抵抗性個体が出現した母集団と考えることができ、出現頻度の異なる集団の遺伝的背景の解析に用いることができる。これらの集団について、抵抗性変異を誘導するアセト乳酸合成酵素(ALS)遺伝子を解析したところ、抵抗性集団はすべてPro197部位の変異が抵抗性を引き起こしていた。しかし、その変異は必ずしも同じものではなく、SerやLeuなど様々なアミノ酸への置換が認められた。また、中立的遺伝変異の蓄積を調べるため、ALS遺伝子のイントロン部位を比較したところ、835bp中の7箇所に多型が認められた。今後は、こうした多型解析に加えて集団内の遺伝的多様度の解析を進め、各集団の遺伝的背景と抵抗性個体出現頻度の関係を明らかにする。自然集団における抵抗性遺伝子の頻度を調査するため、スルホニルウレア系除草剤の使用歴のない水田(1a、2筆)のイヌホタルイ集団に対してスルホニルウレア系除草剤を処理し、水田1で2個体,水田2で6個体の抵抗性個体を得た。これらのALS遺伝子を解析したところ,7個体がPro197Ser変異であり,1個体がTrp574Leu変異であった。各変異はヘテロの状態になっており、このイヌホタルイ集団における抵抗性遺伝子の頻度は、Pro197Ser変異遺伝子で3.1×10-5、Trp574Leu変異遺伝子で4.8×10-6と算出された。

この値を既報のモデルにあてはめたところ、この集団にSU剤処理を続ければ、どちらの遺伝子も4年後には集団の8割以上が抵抗性個体に置き換わると推定され、かなり早い時期に抵抗性が顕在化すると考えられた。今後はこの自然集団と上記の抵抗性集団との遺伝的差異を明らかにし、集団の遺伝的背景と抵抗性個体出現頻度との関係の解析を試みる。アゼナ、アメリカアゼナ、タケトアゼナ、アゼトウガラシの4種のアゼトウガラシ属水田雑草では、イヌホタルイと同じく少なくとも2種類のアセト乳酸合成酵素(ALS)遺伝子が存在した。また、近年スルホニルウレア系除草剤(SU剤)抵抗性が確認されたオモダカには1種のALS遺伝子が存在した。収集したイヌホタルイの抵抗性バイオタイプにおけるALS遺伝子の変異点を調べたところ、Pro197部位でアミノ酸がSerに置換する変異(Pro197Ser変異)が最も多く見つかり、またアゼトウガラシ属水田雑草とオモダカでもPro197Ser変異が最も多く見つかったことから、草種にかかわらずPro197Ser変異の頻度が高いことが示唆される結果であった。SU剤処理歴のない試験水田に生育するイヌホタルイ集団に対してSU剤処理を行った結果、2004年には水田1で2個体、水田2で6個体、2005年には水田3で6個体の抵抗性個体が得られ、この試験水田のイヌホタルイにおける抵抗性個体発生頻度は7.4×10^<-6>と推定された。ALS変異部位ではALS1のPro197Ser変異をもつ場合が高く、3.3×10^<-6>の推定頻度で存在した。他の変異遺伝子はこの1/31/8程度であり、Pro197Ser変異が比較的多いという上記の結果に対応するものであった。年あたり塩基サイトあたりの自然突然変異率は4.7×10^<-9>と推定されており、一旦集団に固定された突然変異遺伝子の集団内頻度は、そのfitnessに従って決まると考えられている。本試験結果は自然集団で少なくとも7.4×10^<-6>程度まで頻度が上昇することを示しており、現場のイヌホタルイの自然集団の抵抗性遺伝子の頻度は10^<-9>から10^<-6>の範囲にあるものと予想される。こうした頻度の違いを既存の数理モデルにあてはめると、抵抗性個体の蔓延に要する期間は5年から7年と予想された。
造影MRIにおける大動脈壁の造影と肺癌の大動脈浸潤診断の新しい評価法に関する研究

【目的】造影MRIにおける大動脈壁の造影と肺癌の大動脈浸潤の評価法に関する研究。【方法】正常例として、下行大動脈周囲に病変のない24例を対象として、造影前後のMRIの下行大動脈壁とその周囲の造影所見を検討した。腫瘍の大動脈浸潤診断の評価対象として、肺癌10例(手術例6例、剖検例4例)の造影MRI所見とこれらの病理所見とを対比検討した。1.5T超伝導装置を用い、造影剤はGd-DTPAで、造影前後のSE法のT1強調横断像で評価した。【結果】正常例では、24例中21例で造影前に下行大動脈およびその周囲が1/2周以上低信号を示しており、造影後この低信号帯は、21例全例で高信号帯として造影された。残る3例は、造影前から下行大動脈壁およびその周囲がほぼ全周性に高信号帯としてみられた。病変例による検討では、大動豚に接する肺癌10例のうち、下行大動脈とその周囲が全周性に高度に造影された5例は、いずれも大動脈からの剥離が可能で、腫瘍と大動脈の間には臓側胸膜が保たれていた。大動脈壁周囲の高度な造影効果がみられなかった5例中4例は、大動脈との剥離が困難で浸潤がみられた。残り1例では、用手剥離が可能で浸潤が確認できなかった。【結論】1)造影MRIでは、正常の下行大動脈壁およびその周囲は高頻度に高信号に造影される。2)大動脈に接する肺癌症例で、造影MRIで下行大動脈壁およびその周囲が高信号に造影される場合は、肺癌の大動脈浸潤陰性の指標になり得る。
三角格子・正方格子を持つ遷移金属カルコゲナイド化合物の特異な軌道状態と超伝導

本研究は三角格子・正方格子を持つ遷移金属カルコゲナイド化合物の電子状態を光電子分光などの様々な手法を用いて軌道状態と超伝導の関連を調べることが目的である。平成27年度は三角格子を持つ遷移金属カルコゲナイドIrTe2の低温相において、表面に由来する一次元的な電子状態を発見した。IrTe2の低温相ではIr及びTeの電荷軌道整列に伴い、IrTe2面から傾いた擬二次元的な電子状態が理論的には予測されていた。低温相のバルク成分は理論的な予言と一致しており、新たに発見した1次元的な表面状態は、この擬2次元面と表面が交錯することによって形成されていると考えられる。さらに超伝導を示すIr1-xPtxTe2については世界最高分解能を有するレーザー角度分解光電子分光装置を用いてTc=3.1Kの超伝導ギャップの直接観測に成功した。超伝導ギャップは二枚のフェルミ面が近づくところで顕著な異方性を示しており、これらはIrないしTeの強いスピン・軌道相互作用に由来する特殊な超伝導状態である可能性を示唆している。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は三角格子系Ir_<1-x>Pt_xTe_2及び正方格子系Fe_<1-y>TM_ySe_<1-x>T_x (TM=Mn, Ru, CO, Ni, Cu, Zn)などの系について研究を行った。三角格子を持つIr_<1-x>Pt_xTe_2は構造相転移及び超伝導を示す物質である。構造相転移や超伝導の起源を明らかにするために角度分解光電子分光を行い、三次元的なフェルミ面の観測を行った。その結果、非置換試料(x=0.00)については構造相転移前後で明瞭な軌道対称性の破れを観測した。一方、Pt置換した超伝導試料(x=0.05)は完全に構造相転移が消失しており、この系においても同様の測定を行った結果、構造相転移に起因する軌道対称性の破れは観測されなかった。これらの結果は高温相の安定化が超伝導の出現に重要であることを示している。また、スピン軌道相互作用が重要であるという示唆的な結果も得られた。これらの結果についてはJournal on the Physical Society of Japan, Physical Review Bに掲載されている。正方格子を持つFe_<1-y>TM_ySe_<1-x>Te_xは超伝導と構造相転移及び反強磁性を示す物質である。様々な遷移金属置換や配位子置換による電子状態への影響を調べるため、角度分解光電子分光、X線光電子分光、X線吸収分光を行った。その結果、遷移金属置換により特異な電子状態の変化を観測した。平成26年度は三角格子系IrTe2とその類似物質である超伝導体Au1-xPtxTe2、及び正方格子系FeSeの関連物質であるAFe2Ch3(A=Ba,Cs,Ch=S,Se)について研究を行った。角度分解光電子分光及び位置分解光電子分光を用い、低温相における特異な電子状態の観測に成功した。一方、Au1-xPtxTe2については、Jahn-Teller歪みに起因する価数状態を明らかにし、Te 3dの吸収端からTe 5pホールを示唆する結果が得られた。これはこの系の超格子構造形成にはTe 5pホールが重要な役割を果たしていること示している。これらの結果については国内の研究会で発表を行い、Au1-xPtxTe2については既にPhysical Review Bで掲載されている。X線吸収分光、X線及びHe放電管を用いた光電子分光を行った。A=Csのとき、期待される価数状態に反してFe 2pの内殻構造は鋭く、一方、A=Baの際は肩構造を持つ内殻構造が観測された。この結果は前者においてSeサイトに電子が局在しており、後者については遍歴的な成分と局在的な成分が共存することに起因する結果であると考えられる。これらの結果については、既にPhysical Review Bで掲載されている。

超伝導ギャップは二枚のフェルミ面が近づくところで顕著な異方性を示しており、これらはIrないしTeの強いスピン・軌道相互作用に由来する特殊な超伝導状態である可能性を示唆している。三角格子系についてはIrTe2の類似物質Au1-xPtxTe2と比較を行い、Ir5d又はAu5dとTe 5pの軌道縮退と超格子構造との関係について重要な知見を得ることができた。また、正方格子系についてはFeSeの関連物質であるAFe2Ch3(A=Ba,Cs,Ch=S,Se)の電子構造を初めて観測し、遍歴的な電子と磁性を担う局在的な電子が共存する特異な電子状態であることを明らかにすることができた。これは遷移金属カルコゲナイド化合物における軌道自由度と超伝導との関係解明に貢献する結果であると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。Tc3.1KのIr1-xPtxTe2について極低温超高分解能角度分解光電子分光測定を行い、超伝導ギャップの直接観測を行うことで超伝導の起源を解明する。また、強いスピン軌道相互作用の効果が期待されるため、スピン分解光電子分光測定を行い、超伝導発現とスピン軌道相互作用の関係性について明らかにする。そしてこれまで得られた成果に基づいて投稿論文及び博士論文を作成する。三角格子系については構造相転移に起因する電子状態の変化や置換効果を調べ、その結果について投稿論文として発表することができた。正方格子系については遷移金属置換効果が系にどのように影響するのか明らかにすることができた。Ir_<1-x>Pt_xTe_2については特に超伝導の起源を直接的に探るためには超伝導ギャップの直接観測が必要である。超伝導転移温度が3.1Kであることから十分な冷却と高分解能を持つ装置で角度分解光電子分光測定を行う必要がある。Fe_<1-y>TM_ySe_<1-x>Te_xについては遷移金属置換における異方性が期待されるため、フェルミ準位近傍の角度分解光電子分光をより詳細に行い、遷移金属置換による異方性について解析する。
粉体流抵抗力物理の統一的理解

粉体はその離散性ゆえにバルク(集団)としても通常の流体や固体とは異なる挙動を示す.そのため,粉体挙動の基礎的理解はまだ十分ではない.粉体の基礎理解を深めるために,本研究では特に粉体の作る抵抗力に注目することとした.最近になり,いくつかの研究グループが独立に粉体抵抗力についての実験を行い,それぞれに独立な結果を得ているが,それらは未だ統一的に理解されている状態にはない.以上のような状況を鑑み,本研究では「粉体と液滴の衝突」と「粉体層への固体塊低速侵入による抵抗力と壁圧力」という二種類の実験を行った.前者の実験から,これまで発見されなかった新たなクレーター形状を液滴と粉体の衝突により複数種発見することに成功した.更に,クレーター径の従うスケーリング則を無次元量を用いて見出し,現象を支配する基礎物理を解明した.一方,後者の実験より,低速の固体塊侵入により粉体層が作る抵抗力と壁圧力の関係を表す非線形なスケーリング則を導出した.このスケーリング則より,粉体中の圧力伝播の非線形性が粉体粒子境界での減衰や散逸の効果によりもたらされることを示すことに成功した.これらの実験により,粉体抵抗力の基礎物理的理解を深めることが出来たと言える.粉体はその離散性ゆえにバルク(集団)としても通常の流体や固体とは異なる挙動を示す.そのため,粉体挙動の基礎的理解はまだ十分ではない.粉体の基礎理解を深めるために,本研究では特に粉体の作る抵抗力に注目することとした.最近になり,いくつかの研究グループが独立に粉体抵抗力についての実験を行い,それぞれに独立な結果を得ているが,それらは未だ統一的に理解されている状態にはない.以上のような状況を鑑み,本研究では「粉体と液滴の衝突」と「粉体層への固体塊低速侵入による抵抗力と壁圧力」という二種類の実験を行った.前者の実験から,これまで発見されなかった新たなクレーター形状を液滴と粉体の衝突により複数種発見することに成功した.更に,クレーター径の従うスケーリング則を無次元量を用いて見出し,現象を支配する基礎物理を解明した.一方,後者の実験より,低速の固体塊侵入により粉体層が作る抵抗力と壁圧力の関係を表す非線形なスケーリング則を導出した.このスケーリング則より,粉体中の圧力伝播の非線形性が粉体粒子境界での減衰や散逸の効果によりもたらされることを示すことに成功した.これらの実験により,粉体抵抗力の基礎物理的理解を深めることが出来たと言える.粒径が数ミクロン程度の非球形粒子から構成される粉体層に水滴を落下させ,粉体層に形成されるクレーターの形状と衝突のダイナミクスを測定する実験系を構築し,系統的にデータを取得した.従来の研究では粉体層に固体弾を衝突させた場合のクレーター形成ダイナミクスが惑星科学との関連からも関心が持たれ盛んに研究されてきた.しかしながら,粉体と水滴の衝突は流体と粉体の相互作用という産業応用上非常に重要な問題でありながらこれまで研究されて来なかった.水滴と粉体の衝突を詳しく調べることにより,粉体の基礎物性を明らかにすることと,応用展開の礎を築くことを目標に実験および解析を行った.水滴の衝突速度と粉体層の粒径を変化させ,衝突の様子を高速度カメラで撮影し,形成されたクレーターの形状をレーザー変位計を用いたシステムで測定した.それらのデータを元に衝突を特徴付ける時間スケールおよび長さスケールを画像解析的手法から算出した.得られた長さスケール(特にクレーター径)は次元解析により議論され,衝突慣性と表面張力を特徴付けるウェーバー数によりスケールされることを明らかにした.得られた結果について学会等で発表を行い今後の課題等について議論を行った.また,粉体層を積層させて固体塊を侵入させた場合の抵抗力および粉体層壁面での応力状態を計測するシステムについても実験系の構築を行った.一般の材料試験器と圧力センサーを用いてそれぞれを計測できることを確認し,系統的データ取得の準備が整った.今後,データ取得・解析を行い,粉体物理を議論していきたいと考えている.前年度に続き,粉体層に液滴を衝突させた場合に起こる粉体層変形の実験および解析を行った.特に今年度は昨年度得られた「粒径ミクロン程度の粉体層と水滴の衝突実験」の結果の解析および解釈を行い,成果を論文にまとめ発表した.続いて,衝突液滴として水以外にエタノール,グリセリンを用いて液滴表面張力や粘性の効果を系統的実験により調べた.更に,粉体層粒子についても粒子形状や粒子の大きさ,表面の濡れ特性等を変化させそれらの物性が衝突現象に及ぼす影響を実験的に明らかにした.具体的には,衝突により形成されるクレーターの特徴的長さスケールと衝突と液滴侵入を特徴付ける時間スケールを計測し,その物理機構について議論を行った.結果として時間スケールは粘性に強く依存する一方で長さスケールは粘性にあまり依存しないことが分かった.これらの網羅的実験および解析の結果についても論文発表を行い,学会研究会等においても積極的に発表を行った.論文や学会の発表を通した議論の中で粉体粒子のミクロな濡れ特性等を測定することが(本研究の目的の範囲を越えるものであるが)重要な今後の課題として浮き彫りとなった.また,粉体層にゆっくりと固体塊を侵入させた場合の抵抗力と応力の容器壁への伝播の様子についても実験およびデータ解析を行った.

特に容器壁への応力伝播の様式についてデータ解析を進め,簡単なスケーリングにより容器壁応力状態を統一的に記述出来ることを発見した,現在は主にガラスビーズ層における一回の押し込み実験の結果について解析を行っているが,このスケーリング解析の普遍性を調べるためにサイクル押し込み実験や粉体の種類を変化させた場合の実験を行い,全体の解析をまとめて成果を発表することは次年度の課題となる.本年度は研究期間の最終年度にあたることもあり,これまでに行った研究成果のまとめと統一的理解および成果の発表とに特に注力した.まず,研究期間の特に前半に集中し実施した液滴と粉体層の衝突による変形実験については,粉体・液滴両方の物理的特性を系統的に変化させて得られた結果を論文にまとめて発表を行った.その後,続いて行った固体塊の粉体層への低速陥入実験についても,そのスケーリング特性について解析と議論を深め,結果を論文にて発表した.特に粉体層内での圧力伝播則として比較的シンプルなスケーリング則を実験的に見出すことに成功し,そのスケーリングの非線形性が粉体粒子の接触境界の存在と深く関係することを明らかにした.これは粉体における非線形性と離散性をつなぎ合わせる概念になり得る結果である.一方で粉体粒子の接触境界で実際にどのような物理過程が起こっているかについては,本実験では明らかにすることが出来なかったが(本研究計画の範囲外の事項であった),今後はそのようなミクロスコピックなアプローチも重要となることが発展的課題として見出された.これらの結果については今年度のいくつかの学会・研究会においても講演発表を行った.今年度は特に国際研究会での発表に重点を置き,論文出版も合わせて国内外に広く結果を発表することに留意した.また,低速陥入実験では,サンプルの準備方法や粉体粒子形状'繰り返し負荷などの網羅的実験の結果についても実験・解析を進め,スケーリング則(特に指数)が,それら詳細には依存しないことを明らかにした.この結果についても論文が受理をされた(印刷中).本研究全体を通して,2種類の実験・解析を行い,それぞれに粉体の基礎物理特性(特に抵抗力則)をいくつか明らかにすることが出来,当初計画は十分達成されたと考えている.
近赤外カメラとDPD法による水凍結過程における微小氷粒子の運動メカニズムの解明

近年,過冷却を促進し,水の凍結を遅らせることができる表面加工技術が開発され,この表面の工学的な応用(例えば飛行機の翼に本加工を施し燃費を向上させるなど),ならびに食品製造技術への応用(例えば細胞を壊さない冷凍技術の開発など)に注目が集まっているが,その凍結メカニズムには未解明な部分が多い.本研究は,過冷却水の凍結現象の中でも,凍結開始直後に現れる微小な氷粒子の運動を観察することで,同運動が過冷却水の凍結現象そのものに及ぼす影響を解明するものである.近年,過冷却を促進し,水の凍結を遅らせることができる表面加工技術が開発され,この表面の工学的な応用(例えば飛行機の翼に本加工を施し燃費を向上させるなど),ならびに食品製造技術への応用(例えば細胞を壊さない冷凍技術の開発など)に注目が集まっているが,その凍結メカニズムには未解明な部分が多い.本研究は,過冷却水の凍結現象の中でも,凍結開始直後に現れる微小な氷粒子の運動を観察することで,同運動が過冷却水の凍結現象そのものに及ぼす影響を解明するものである.
分子内時計としてのタンパク質脱アミド反応と分子・細胞の老化

アスパラギン残基(Asn)の脱アミド反応は,酵素等の関与しない,純粋な化学反応で生じるタンパク質の翻訳後変化である.現在では,ほとんどのタンパク質に生理的条件下で時間のみに依存して生じることが知られている.細胞老化における,そのいわば分子内時計としての役割と影響を明らかにするために,赤血球膜タンパク質protein4.1とankyrinの脱アミド部位を決定するとともに,脱アミド組み換え体タンパク質を作製して機能の変化を検討した.Protein4.1のプロテアーゼ消化断片ペプチドの質量分析,アミノ酸組成・配列解析により,Asn502とAsn478の2カ所で脱アミドが生じていることが明らかになった.このうち、Asn502の脱アミド反応は赤血球の加齢・老化にともなって極めてゆっくりと進行する反応であり、実際の分子量変化が1.0でしかないにも関わらず,電気泳動上移動位置の明瞭な変化(2,000)を起こすことが判明した.この結果は,脱アミド組み換え体の発現実験で確認した.脱アミドを受けた分子と受けていない分子とでは,特に脱アミド部位の近傍でトリプシン感受性部位に相違が認められ,分子構造が変化したものと推定された.しかし,膜骨格タンパク質群を除去した赤血球膜への結合能に関する限り,両者に有意の差は認められなかった.Ankyrinについては,そのN-末ドメインの特徴的なANKリピート構造中の2番目と8番目の配列に脱アミドが生じていることが明らかになった.現在,その機能的変化を検討中である,アスパラギン残基(Asn)の脱アミド反応は,酵素等の関与しない,純粋な化学反応で生じるタンパク質の翻訳後変化である.現在では,ほとんどのタンパク質に生理的条件下で時間のみに依存して生じることが知られている.細胞老化における,そのいわば分子内時計としての役割と影響を明らかにするために,赤血球膜タンパク質protein4.1とankyrinの脱アミド部位を決定するとともに,脱アミド組み換え体タンパク質を作製して機能の変化を検討した.Protein4.1のプロテアーゼ消化断片ペプチドの質量分析,アミノ酸組成・配列解析により,Asn502とAsn478の2カ所で脱アミドが生じていることが明らかになった.このうち、Asn502の脱アミド反応は赤血球の加齢・老化にともなって極めてゆっくりと進行する反応であり、実際の分子量変化が1.0でしかないにも関わらず,電気泳動上移動位置の明瞭な変化(2,000)を起こすことが判明した.この結果は,脱アミド組み換え体の発現実験で確認した.脱アミドを受けた分子と受けていない分子とでは,特に脱アミド部位の近傍でトリプシン感受性部位に相違が認められ,分子構造が変化したものと推定された.しかし,膜骨格タンパク質群を除去した赤血球膜への結合能に関する限り,両者に有意の差は認められなかった.Ankyrinについては,そのN-末ドメインの特徴的なANKリピート構造中の2番目と8番目の配列に脱アミドが生じていることが明らかになった.現在,その機能的変化を検討中である,当初計画にしたがい以下を実施した。1.ヒト赤血球膜からアンキリンを調製し、N-末端ドメインを単離した。2.N-末端ドマインのプロテアーゼ消化断片をHPLCにて単離・精製し、現在、個々のペプチどについてFAB-MASS解析を行うとともに、Asn-Asp変換が生じていると予想されるペプチドについてアミノ酸配列分析を進めている。しかし、幾つもの脱アミノ反応中間産物が混在しているらしく、解析が比較的困難である。既に、1箇所については、明確に脱アミド反応を認めたものの他のAsn-Gly部位については未定である。アンキリンN-末端ドメインの単離が予想以上に困難であったため、研究全般が当初計画よりもやや遅れている。また、上述のような難題が生じているため、ひとつの打開策として、ケミカルな手法による脱アミド部位同定を計画している。本研究の目的は,脱アミド反応がタンパク質の構造と機能に及ぼす影響をモデルタンパク質(赤血球膜のプロテイン4.1とアンキリン)を用いて検証することである.昨年度の成果を基に,本年度は下記の研究を行った.1.赤血球の比重分画を行い,幼若赤血球,老化赤血球からそれぞれ4.1b-richあるいは,4.1a-richなプロテイン4.1を調製,プロテアーゼ消化断片ペプチドのHPLC分析により,4.1aと4.1bとで切断されやすい部位が異なること,即ち分子の立体構造に相違があることが判明した.2.上記の構造上の相違は,4.1脱アミド部位(Asn502)の近傍にあることが,各ペプチドのアミノ酸配列分析から推定された.3.アンキリンの限定分解ペプチドのアミノ酸配列分析から,N-末端ドメインの中に存在する多くのAsn-Gly配列中2番目と8番目のAsnがAsn→Aspの脱アミド反応を受けていると推定された.Asn-Ala配列の脱アミドは未同定である.4.現在,変異アンキリンを作製中であり,mutantが得られたならば,band3,あるいはspectrinへの結合をwild typeのそれと比較・検討する予定である.