hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
虚血巣特異的ドラッグ・デリバリーシステムの開発

BBBを自由に通過する特定のキャリア分子にはTAT、トランスフェリン受容体などがあり、TATの活性部位であるprotein transduction domain (PTD)と、新規に設計した脳保護薬(カスパーゼ阻害ペプチド;CasS)を結合させることで脳保護薬を効率的に脳内に移行させる新規薬剤を考案した。さらに虚血部位に薬物を選択的に到達させる機能として、Oxygen dependent degradation (ODD)を添加し、虚血巣選択的ドラッグ・デリバリーシステム(DDS)とした。ODDはhypoxia-inducible factor-1 (HIF-1)の活性部位であり、正常の酸素分圧下ではユビキチン化され、ユビキチン・プロテアゾーム系で分解処理される。PTDCasS(カスパーゼ阻害)にMyc蛋白を融合したPTD-CasS-Mycを静脈内投与し、2,8,24時間後に動物を灌流固定して抗Myc抗体による免疫組織化学を行ったところ、PTD-CasS-Mycは非虚血脳でも高率に脳内移行することが確認された。ついで、麻酔下にラット(雄性Wistar rat、200-250g)の右外頸動脈を露出して自由断端とし断端から逆行性に6Fのナイロン糸を挿入して中大脳動脈閉塞による局所脳虚血モデルを作成した。閉塞30分後にナイロン糸を抜去する虚血再灌流群、および永久留置する永久閉塞群を作成した。虚血再灌流、永久閉塞の両群において、虚血開始直後に生理食塩水に溶解したPTD-ODD-CasS (40mg/kg)、あるいは生理食塩水を静脈内投与し以下の6群(各8匹)を作成した:1.偽手術群・PTD-ODD-CasS投与群、2.偽手術群・生理食塩水投与群、3.虚血再灌流・PTD-ODD-CasS投与群、4.虚血再灌流・生理食塩水投与群、5.永久閉塞・PTD-ODD-CasS投与群、6.永久閉塞・生理食塩水投与群。虚血開始72時間後に全身を灌流し連続切片を作成し、TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium)染色を行って虚血病巣を3次元再構成し虚血病変体積を比較したところ、永久虚血群ではPTD-ODD-CasS投与の効果を認めなかったものの、虚血再灌流群では病巣の有意な縮小効果を認めた。一方、虚血条件下で静脈内投与されたPTD-ODD-Mycを抗Myc抗体免疫組織化学で検出し、薬剤の組織内分布を検討したところ、虚血再灌流、永久閉塞いずれにおいても健常側では薬剤が検出されず、好気環境下で薬剤が分解され、虚血巣特異的に薬剤が分布することが確認された。
広義原発開放隅角緑内障重症化の遺伝的要因の解明

定期的経過観察を行っている全広義POAG患者の視野検査結果をもとに緑内障重症例の判定方法を検討する。すなわち視野進行速度、HFA検査のAulhorn分類Greve変法病期、GP検査の湖崎分類病期、HFA緑内障進行判定プログラムによる検討を行った。また緑内障手術症例も重症化症例と規定できるため、同様に重症化要因として採用した。具体的には1)3回以上のHFA結果から作成したMD slopeをもとに視野進行速度の中間値を求め、前後5%の症例を除いて進行速度の速い群と遅い群に分離する方法、2)HFA検査の視野障害程度による分類、3)Aulhorn分類Greve変法の病期が1段階進行するまでの期間によって生存曲線を作成し、その中間値をもとに前後5%の症例を除いて進行速度の速い群と遅い群に分離する方法、4)GPAによる進行判定を死亡と定義した生存曲線による方法、5)緑内障手術症例を重症例と規定する方法の検討を行った。また引き続いて再現性取得実験用の症例収集を行い、数十例の広義POAGを追加することができた。全ゲノム解析から取得したジェノタイピング生データを専用サーバーに注入後、緑内障重症例の判定方法別の各SNPのジェノタイプの頻度計算を実施した。その後、コールレートやマイナーアレル頻度の厳格なフィルターを設定し、高品質なデータを抽出する。抽出されたデータについてジェノタイプおよびアレル頻度に基づくカイ二乗検定を行い、P値を算出しケース群で有意なSNPを同定した。同定された上位のSNPについては、Hardy法則への適合を検証すると共に、全てのジェノタイピングのクラスター画像をチェックし、クラスター不良のデータは排除した。全てのフィルターをクリアしたSNPについては、そのSNP周辺の染色体情報をUCSCのゲノムブラウザを用いて解析した。ほぼ計画していた通りに種々の緑内障の重症度による分類法を検討することができた。また新たな緑内障症例をサンプルとして収集することができ、合わせて臨床情報も追加が可能であった。さらにいくつかの緑内障重症例の判定方法別に各SNPのジェノタイプの頻度計算を実施することができた。HFA以外の視野情報の統合化、ならびに各判定方法から得られたSNPのジェノタイプ頻度を比較検討し、より普遍的な重症度に関連するSNPを明らかにする。具体的には1)3回以上のHFA結果から作成したMD slopeをもとに視野進行速度の中間値を求め、前後5%の症例を除いて進行速度の速い群と遅い群に分離する方法、2)HFA検査の視野障害程度による分類、3)Aulhorn分類Greve変法の病期が1段階進行するまでの期間によって生存曲線を作成し、その中間値をもとに前後5%の症例を除いて進行速度の速い群と遅い群に分離する方法、4)GPAによる進行判定を死亡と定義した生存曲線による方法の検討を行った。さらに再現性取得実験用の症例収集を行い、数十例の広義POAGを追加することができた。また全ゲノム解析から取得したジェノタイピング生データを専用サーバーに注入後、緑内障重症例の判定方法別の各SNPのジェノタイプの頻度計算を実施した。

その後、コールレートやマイナーアレル頻度の厳格なフィルターを設定し、高品質なデータを抽出する。抽出されたデータについてジェノタイプおよびアレル頻度に基づくカイ二乗検定を行い、P値を算出しケース群で有意なSNPを同定した。同定された上位のSNPについては、Hardy法則への適合を検証すると共に、全てのジェノタイピングのクラスター画像をチェックし、クラスター不良のデータは排除した。全てのフィルターをクリアしたSNPについては、そのSNP周辺の染色体情報をUCSCのゲノムブラウザを用いて解析した。ほぼ計画していた通りに種々の緑内障の重症度による分類法を検討することができた。また新たな緑内障症例をサンプルとして収集することができ、合わせて臨床情報も追加が可能であった。さらにいくつかの緑内障重症例の判定方法別に各SNPのジェノタイプの頻度計算を実施することができた。HFA以外の視野情報の統合化、ならびに各判定方法から得られたSNPのジェノタイプ頻度を比較検討し、より普遍的な重症度に関連するSNPを明らかにする。(理由)本年度に実施した緑内障重症度分類の検討が順調に進展し、ソフトウェアの更新費用ならびに消耗品費が当初の見込みよりも若干少額で済んだため。(使用計画)異なる視野検査法の統合を含めた重症度分類を検討し、重症化に寄与するSNPの重症度判定方法別の再現性を見るためのソフトウェアならびに消耗品費として適切に使用してゆきたいと考えている。
てんかんにおける低周波活動の発現機構及び脳内ネットワークの動態解明

てんかん発作時の低周波活動(発作時DC電位)はてんかん原性のバイオマーカー候補とされるが、発現機構、発作間欠期の意義は解明されていない。緩徐なBOLD変動を利用した安静時fMRIを用いて脳内ネットワークが可視化できるようになったことから、ネットワークの観点でも低周波活動が注目されつつある。我々は、発作時にDC電位が高周波律動(HFO)と密に関連しつつも異なる発生基盤を有する可能性を示し、発作間欠期における低周波活動とHFOのカップリングの特徴を包括的に明らかにした。安静時fMRIを含めたfMRI解析により、てんかん性ネットワークを可視化し、手術によって機能的ネットワークが変容することを示した。1)てんかん焦点における広域周波数脳波解析を用いた低周波活動の記録解析:てんかん外科手術目的で頭蓋内電極を慢性留置した難治部分てんかん患者を対象として、標本化周波数1000-2000 Hz、時定数10秒で皮質脳波を記録し、視察及び時間周波数解析によって低周波活動の時間・空間的な出現様式の解析を行った。てんかん発作発現時には、低周波活動であるDC電位(グリアの関与が示唆)と高周波律動(HFO:ニューロンの高頻度発火、介在ニューロンの活動を反映)の両者が、てんかん焦点の中核領域で認められ、DC電位がHFOにしばしば先行すること、この特徴が内側側頭葉てんかんと比較して新皮質てんかんで顕著であることを明らかにした(国際学会発表Daifu et al., 2016)。発作間欠期においても、同様にDC電位様の低周波活動とHFOの相互作用について記録解析を開始した。2例の解析結果より、低周波活動とHFOの相互作用が、発作間欠期においても認められること、空間的分布は発作起始部に概ね合致していることを示した(国内学会発表大封ら、2015年)。頭蓋内電極留置期間中に、頭皮上に少数の電極を貼付して睡眠段階を同定し得た患者において、覚醒・睡眠段階で分類した皮質脳波を用いて異周波数間結合の解析を開始した。高周波数帯域の瞬時振幅と低周波数帯域の瞬時位相の相関(phase-amplitude coupling)の解析結果から、大脳皮質において徐波睡眠期に低周波と高周波数帯域の異周波数間のクロストークが強まることを示した。2)機能的MRI(fMRI)を用いた記録解析:てんかん外科手術の前に施行したfMRIで予備解析を行った。脳波と同時計測したfMRIによって、てんかん性放電の出現に一致して、てんかん焦点領域及び関連するネットワークにBOLD反応を認めうることを示した。安静時fMRIの予備解析を行い、本研究における、てんかん性ネットワーク可視化の具体的な方法(seed-based法および独立成分分析法)を決定した。てんかん焦点においてDC電位の出現様式を、HFOと比較検討することによって、てんかん病態においてグリアとニューロンが密接に関連しつつ、時系列の差から異なる役割を有す可能性を示した。発作時DC電位がHFOに先行する傾向は、内側側頭葉てんかんと比較して新皮質てんかんで顕著であった。異周波数間結合の解析を開始し、低周波活動と高周波数の活動の間にクロストークがあること、覚醒・睡眠に伴って変容があることを示した。大脳皮質領域間のネットワーク解析に応用可能な異周波数間結合の具体的な解析方法の決定、解析データの準備を終えており、予備解析を行ったfMRIとあわせて、次年度以降に予定している大脳皮質領域間のネットワーク解析の準備がおおむね完了した。1)てんかん焦点における広域周波数帯域脳波解析を用いた低周波活動の記録解析:広域周波数帯域皮質脳波の記録を継続し、視察及び時間周波数解析による低周波活動の時間・空間的な出現様式の解析を継続した。初年度は、てんかん発作発現時に低周波活動であるDC電位(グリアの関与が示唆)と高周波律動(HFO:ニューロンの高頻度発火、介在ニューロンの活動を反映)が、てんかん焦点の中核領域で認められことに加え、発作間欠期においても少数例の解析ながら同様にDC電位様の低周波活動とHFOの相互作用が認められること、その空間的分布が発作起始部に概ね合致していることを示した。多数例における解析をより効率的に進めるため、緩電位とHFOの共起を自動検出するプログラムを開発し、解析結果が視察の結果と一致することを示した(国内学会発表)。頭蓋内電極留置期間中に、頭皮上に少数の電極を貼付して睡眠段階を同定し得た患者において、覚醒・睡眠段階で分類した皮質脳波を用いた異周波数間結合の解析を継続し、高周波数帯域の瞬時振幅と低周波数帯域の瞬時位相の相関(phase-amplitude coupling)の解析結果から、大脳皮質において徐波睡眠期に低周波と高周波数帯域の異周波数間のクロストークが強まり、低周波活動の陽性変位に一致して高周波活動と結合することを示した(国内学会発表)。2)機能的MRI(fMRI)を用いた記録解析:視床下部過誤腫におけるてんかんでは、皮質下に存在する視床下部過誤腫にてんかん原性が存在し、経過に伴って様々な領域の大脳皮質が二次性にてんかん原性を獲得するとされており、8例の視床下部過誤腫患者で脳波とfMRIの同時計測を行い、大脳皮質に加えて視床下部にてんかん性放電出現に伴う賦活を認めることを明らかにした(論文発表)。安静時fMRIを用いた、てんかん患者の脳内ネットワークの解析に着手した。1)てんかん焦点における広域周波数帯域脳波解析:てんかん患者の皮質脳波でDC電位とHFOの相互作用、出現様式の差異を解析することによって、てんかん病態においてグリアとニューロンが密接に関連しつつ、異なる役割を担うことを示すことができつつある。

自動解析法の開発により多数例の解析を効率よく進める方策を立てることができた。異周波数間結合の解析を継続し、低周波活動と高周波数の活動の間にクロストークがあり、徐波睡眠期において結合が強固となり、低周波活動の特定の位相(陽性変位)に合致して高周波数活動が増強することを明らかにした。てんかん性および非てんかん性皮質による結合様式の異同を探るため標準脳座標系に患者群のデータを重畳し詳細な検討を開始するとともに、情報伝達の方向性に関する解析に着手した。2)脳内ネットワークの記録解析:大脳皮質領域間のネットワーク解析に用いる皮質脳波データの準備が完了しており、異周波数間結合など、ネットワーク解析に応用可能な方法論の改善を行った。視床下部過誤腫患者の脳波とfMRIの同時計測により、視床下部および大脳皮質に脳波変化に一致した賦活があることを示し、てんかん病態下の大脳皮質・皮質下構造物間のネットワークを可視化することができた。安静時fMRIを用いた、てんかん患者における脳内ネットワークの解析に着手した。3)病理所見との対比:切除部位の病理標本と、てんかん性の低周波活動およびHFOの分布との比較検討に着手した。1)てんかん焦点における広域周波数帯域脳波解析を用いた低周波活動の記録解析:多施設からの難治部分てんかん患者を対象に共通の方法を用いて広域周波数帯域皮質脳波解析を行った結果、てんかん発作発現に伴う低周波活動である発作時DC電位(グリアの関与が示唆)が、高周波律動(HFO:ニューロンの高頻度発火、介在ニューロンの活動を反映)に対して早期に出現することを明らかにした(国内学会発表)。既報告に合致した結果であり、発作発現時にグリアとニューロンが密接に関連しつつ異なる役割を担う可能性が示唆された。多施設における解析の過程で得られた知見をもとに広域周波数帯域脳波の記録・解析標準化案を作成した(論文発表)。頭蓋内電極留置期間中に、頭皮上に少数の電極を貼付して睡眠段階を同定し得た患者において、覚醒・睡眠段階で分類した皮質脳波を用いた異周波数間結合の解析を継続した。高周波数帯域の瞬時振幅と低周波数帯域の瞬時位相の相関解析(phase-amplitude coupling)を行い、徐波睡眠期に低周波と高周波数帯域の異周波数間結合が強まること、脳葉、てんかん原性の有無によって結合の程度、睡眠段階による結合動態が異なることを明らかにした(国際学会発表、論文準備中)。2)機能的MRI(fMRI)を用いた記録解析:視床下部過誤腫におけるてんかん患者を対象にてんかん外科手術前後の安静時fMRIの記録・解析を行った。てんかん焦点である視床下部過誤腫と大脳皮質間の機能的結合は術後に減弱する一方で、他の機能的ネットワークについては有意な相関を示すものが術後に増加しており、手術によるてんかん発作の抑制、てんかん性脳症の改善との関連性が推察された(国内学会発表)。てんかん発作時の低周波活動(発作時DC電位)はてんかん原性のバイオマーカー候補とされるが、発現機構、発作間欠期の意義は解明されていない。緩徐なBOLD変動を利用した安静時fMRIを用いて脳内ネットワークが可視化できるようになったことから、ネットワークの観点でも低周波活動が注目されつつある。
筋ジストロフィーのアンチセンス治療におけるシグナル伝達因子の動態に関する研究

私達は、Duchenne型筋ジストロフィー(以下DMD)に対する根治治療として、アンチセンスオリゴヌクレオチド(以下AS-oligo)によってエクソンスキッピングを誘導し、out-of-frame欠失をin-frame欠失に変えて遺伝情報を修正する治療法の有効性を、世界で初めて臨床的に明らかにした。本研究では、その治療法の有効性をさらに高めるために、日本人でみられる遺伝子異常を明らかにし、それに基づきAS-oligo治療のモデルシステムを構築した。さらにそのシステムにおいて、シグナル伝達因子などを解析した。AS-oligo治療の有効性を検討するうえで、個々の症例における解析が重要であることを明らかにした。Duchenne型筋ジストロフィー(以下DMD)において、筋分化に関与するMyoD、myogeninなどのシグナル伝達因子の動態が病態に関与していることが知られているが、近年、炎症・アポトーシスなど多彩な生命現象に関与するシグナル伝達因子であるNF_-KBが筋細胞の壊死・再生に関与し病気の進行に大きな影響を与えていることが注目されている。一方、私達は、DMDに対する根治治療として、アンチセンスオリゴヌクレオチド(以下AS-oligo)によってエクソンスキッピングを誘導し、out-of-frame欠失をin-frame欠失に変えて遺伝情報を修正する治療法の有効性を、世界で初めて臨床的に明らかにした。しかし、このアンチセンス治療の臨床応用を広げるためには、その効果をさらに高めることが不可欠である。本研究では、AS-oligo治療の過程におけるNF_kBを中心としたシグナル伝達因子の動態を明らかにする。DMDの治癒過程におけるNF_-KBの役割を明らかにし、さらにこれらの因子を制御することによりアンチセンス治療の効果をさらに高めることが可能となる。本年度は、そのための基礎的な検討として、ジストロフィン遺伝子エクソン8-18および46-49に欠失を有するDMD症例の筋細胞初代培養系を樹立し、アンチセンスAS-oligoを導入することによってジストロフィンの発現を誘導する系を確立した。Duchenne型筋ジストロフィー(以下DMD)において、筋分化に関与するMyoD、myogeninなどのシグナル伝達因子の動態が病態に関与していることが知られているが、近年、炎症・アポトーシスなど多彩な生命現象に関与するシグナル伝達因子であるNF-κBが筋細胞の壊死・再生に関与し病気の進行に大きな影響を与えていることが注目されている。本研究では、AS-oligo治療の過程におけるNF-κBを中心としたシグナル伝達因子の動態を明らかにする。DMDの治癒過程におけるNF-κBの役割を明らかにし、さらにこれらの因子を制御することによりアンチセンス治療の効果をさらに高めることが可能となる。本年度は、エクソン45のスキッピング誘導によってout-of-frame欠失をin-frame欠失に変換可能なDMD症例の筋培養細胞初代培養系を確立し、エクソン45のスキッピングを誘導するAS-oligoによるジストロフィンの発現を検討した。その結果、エクソンスキッピングおよびジストロフィン蛋白発現に、症例により差がみられることが明らかになった。AS-oligoの有効性の差とNF-κBなどのシグナル伝達因子の動態との関連を検討している。Duchenne型筋ジストロフィー(以下DMD)において、炎症・アポトーシスなどの生命現象に関与するシグナル伝達因子が筋細胞の壊死・再生に関与し病気の進行に大きな影響を与えていることが注目されている。本研究では、AS-oligo治療の過程におけるシグナル伝達因子の動態を明らかにする。DMDの治癒過程におけるシグナル伝達因子の役割を明らかにし、さらにこれらの因子を制御することによりアンチセンス治療の効果をさらに高めることが可能となる。本年度は昨年度より引き続き、エクソン45のスキッピング誘導によってout-of-frame欠失をin-frame欠失に変換可能なDMD症例の筋培養細胞初代培養系を確立し、エクソン45のスキッピングを誘導するAS-oligoによるジストロフィンの発現を検討した。さらにそれぞれの症例におけるシグナル伝達因子の関与を検討するために、サイトカインの動態を解析した。その結果、症例により差が大きいことが明らかになった。

このような病態の差が培養細胞系におけるAS-oligoの有効性の差に関連している可能性が考えられる。今後、この関連を明らかにし、AS-oligo治療をさらに有効にする治療戦略を検討する。
心筋エネルギー代謝に着目したファブリー心筋症の病態解明

ファブリー病はライソソーム酵素の一つが欠損しているために起こる先天性代謝疾患である。心筋細胞への基質蓄積による心筋症の発症はファブリー病患者の主な死因となっているが、基質蓄積と心筋細胞障害をつなぐ病態進展の分子機序は未解明である。申請者は、患者由来iPS心筋細胞を独自に作成し、ファブリー病においてグルコース依存性が高まっていることを見出した。この成果をもとに「ファブリー病の蓄積物が心筋エネルギー源である脂肪酸利用を障害することで心筋エネルギー代謝異常を来している」との仮説を立て、基礎、臨床の両面からファブリー心筋症の病態機序を解明し、治療標的を見出すことを目的に本研究を実施する。
免疫遺伝学研究用マウス系統の遺伝的統御に関する基礎的研究

1.研究目的免疫遺伝学は近年分子レベルの研究をも包含し、著しい発展を遂げ、癌、自己免疫病その他の難病をはじめ、医学生物学領域の多くの問題に深い係りをもつようになったが、その基盤はコンジエニック系統を中心とする遺伝的に純化された実験用マウスによって支えられている。我が国においてもこれら一群のマウス系統を用いた免疫遺伝学研究は近年大きく進展したが、これに伴ってこれら免疫遺伝学研究用マウスの基準となる系統を維持し、研究に使われる系統の特性が基準どおり正しく保持されているかどうかを監視することが、実験的研究の基礎として不可欠の要件となってきた。このため本研究ではコンジェニック系統をはじめ各種の免疫遺伝学研究用マウス系統の維持と遺伝的統御システムの設定を目標に班の活動を行った。2.研究成果免疫遺伝学研究用マウス系統としてB10,A,C3Hを遺伝的背景とするH-2コンジェニックマウス40系を維持繁殖し分譲も行った。遺伝的統御システムのための手技の検討も広範な標的に対して進められた。H-2については20種のモノクロン抗体の反応性のパタンをパネル系統を使って検定した。B細胞刺戟因子に対するB細胞の応答性もモニターの指標として検討された。Ly抗原に対する細胞障害性試験の再現性を高めるため補体の吟味や標的細胞の撰定に関する基礎的な研究が行われた。免疫グロブリン遺伝子も多型性に富むので、これを用いたモニターの方法がモノクロン抗体およびc-DNAによる制限酵素断片の大きさの多型の利用によって進められた。Ia抗原に対してもモノクロン抗体と細胞障害試験によるモニター法が検討された。H-2に連鎖する補体系の遺伝子のモニタリングな免疫学的な方法の他DNAプローブを使ったサザン法の利用が研究された。多数のLy抗原遺伝子座をモニターの対象とする可能性が検討された。受精卵の凍結保存法の検討はさらに続けられ、従来の機械手法を改良した。
カーネル密度関数の局所変形による汎用的イメージアライメント法の開発

異なる条件下で計測された2種類以上の画像を共通の座標系に変換する処理は、「イメージアライメント」と呼ばれる。医療現場や生物学周辺の研究現場においては、異なる条件下で測定した多様な実験画像を比較し定量化することは日常的に発生するタスクである。近年、イメージング技術の進歩に伴いそれらの現場において日々大量の画像データが生成されている。それらを自動/半自動的に定量化する技術の高度化は極めて重要な課題である。本研究では、カーネル密度関数の局所変形のアイディアに基づき、従来技術では困難だった血管や神経突起のような細かい構造に対しても精度良く位置合わせが可能な汎用的なイメージアライメント技術を開発した。本研究では、2次元および3次元の生物画像を想定した、汎用的なイメージアライメント法の開発を行っている。提案手法の基本的なアイディアは、カーネル密度変換により画像を連続な関数で近似することで、従来はデジタルな画像空間で行っていた位置合わせの問題を連続関数の最適化で定式化することである。さらに、自然なアライメントを実現するための拘束条件として、マルコフ確率場に基づく変形モデルを導入することである。本年度までに、2次元の生物画像を想定したアルゴリズムのプロトタイプを実装することができた。最適化のアルゴリズムとしては、当初の予定どおりEMアルゴリズムを用いている。EMアルゴリズムは収束は遅いものの、対数尤度を単調に増加させるため、既存のアライメント手法よりロバストな最適化プロセスを実現できる。2次元生物画像を用いたベンチマークテストでは、アライメント精度という点では、既存手法と同等かそれ以上の性能を実現できた。しかし、画像に欠損がある場合については、これも既存手法と同程度に精度の劣化が生じることがわかった。研究計画立案の時点では、コスト関数に体積保存などの正則化項を加えることで回避できると考えていたが、いまのところ決め手となる正則化法に到達できていない。計算速度は、1次収束であるEMアルゴリズムを用いているため元来収束が遅い仕様になっていた。しかし、変換したカーネル密度関数から確率密度に比例して一定数のピクセルをランダムサンプリングすることで、通常のEMアルゴリズムによる解法よりも大幅に計算コストを改善することができた。EMアルゴリズムが対数尤度を必ず単調に増加させることを考えると、最適化プロセスのロバストネスと収束速度をうまく両立させることができたと評価できる。一方で、最終年度で取り組む計画である3次元の生物画像に対しては、計算速度の向上にさらなる工夫が求められると予想される。今年度までに得られた成果として、アルゴリズムのプロトタイプを実装し、27年度下期の研究目標であった2次元の生物画像に対するベンチマークテストを実施する段階まで進めることができた。しかし、画像データに欠損や不明瞭な領域がある場合については、想定されていた精度の劣化が起こることがわかった。これを回避するための正則化法を検討したが、既存手法を大きく上回るようなパフォーマンスを達成することはできなかった。本研究では、生物画像を想定した汎用的なイメージアライメント法の開発を行うことを目的としている。イメージアライメントは、異なる条件下で計測された複数の画像を同一の座標系に変換することで、定量的比較を容易にする技術である。一般には、アフィン変換やBスプライン関数などで画像の変形過程をモデル化し、2種類の画像の類似性(2乗誤差など)を最小にするパラメータを推定することで、位置合わせを達成する。しかしながら、医療画像や生物画像の解析では、血管や神経突起のような細長く複雑な画像同士を比較するシーンが頻繁に発生する。このような状況では、従来のアライメント手法は正常に機能しない。そこで本研究では、カーネル密度推定によりデジタル画像を連続な関数で近似することにより、アライメント問題を連続関数の最適化問題として新しく定式化し、EMアルゴリズムに基づく安定的な最適化プロセスを実現するアライメント手法の開発を行った。前年度までに、2次元の生物画像を想定したアルゴリズムのプロトタイプの実装を完了した。今年度は、計算時間のボトルネックを解消するため、制御点のアダプティブ配置と計算に用いるピクセルの逐次サンプリングを導入した。これにより、計算時間を従来の1/3程度に抑えることができ、3次元画像への適用も視野に入った。血管や神経突起を模したテストデータを生成し、提案手法と従来手法の性能比較を行った。従来手法は、elastixやMIRTなど、広く用いられている非剛体レジストレーションライブラリから複数選択した。実験では、提案手法が既存手法と比べ、血管状の構造物に対し高い精度で位置合わせできることを示した。本研究で開発したアライメント手法の要素技術については、神経科学分野におけるプロジェクト研究やコンピュータグラフィックス分野におけるモデリング技法など、他分野の応用研究にも活用している。前述のように、画像データに欠損や不明瞭な領域がある場合には、アライメントが正常に機能しない場合がある。

それを回避するための正則化を検討しているが、決め手になる方法で辿り着いていない。しかしながら、本研究を遂行する上で、正則化を工夫するより、欠損している領域(あるいは細胞など)を、実際には存在しないダミーオブジェクトで補完する方法を導入することで、根本的な解決につながるのではないかという着想を得た。それを実現するためには、一方の画像に欠損している領域がある場合に、自然なアライメントを実現するためのダミーオブジェクトの最適な配置を求める問題を解かなければならない。より具体的なアイディアとしては、ダミーオブジェクトの形状や配置位置を確率的に変化させ、結果的に自然なアライメントができるかどうかを尤度として評価する。その際、ダミーオブジェクトの個数をどのように決めるかという問題があるが、例えば、Reversible Jump MCMCのように、事後分布の次元を可変にしたサンプリングアルゴリズムを用いることで解決できると考えられる。ここで、厳密にはサンプリングを行う度に(尤度を計算する度に)アライメントの問題を解くことになるが、それでは計算コストがかかり過ぎてしまう。そこで、オプティカルフローのような線形計画問題あるいは2次計画問題で代用できる特徴を抽出し、自然なアライメントを実現できるかどうかの指標とする。データ欠損がある場合のダミーオブジェクトの最適配置を問題を解く手法を構築できれば、本研究で扱うアライメント問題のみならず、多細胞トラッキングや、細胞分裂の自動検出など、バイオイメージ解析で幅広く応用できる基礎技術が構築できると期待できる。データサイエンス、統計的機械学習、計算統計成果を発表する上で使用する数式編集ソフトウェアを購入予定であったが、会計の事務的な手違いにより会計処理の期日までに発注を終えることが難しい事態が生じた。ただ、同ソフトウェアの試用版が、期間限定(1ヶ月)で無償で使用可能であったため、購入は次年度に持ち越すこととした。購入予定でった数式編集ソフトウェアを予定通り購入し、それ以外の次年度の予算についても予定通り使用する予定である。
トーラスSOLプラズマにおける非拡散的熱・粒子輸送と非平衡放射ダイナミクスの解明

国際核融合実験炉計画(ITER)のスタートを契機に、核融合エネルギー実用化が現実味を帯びてくる中で、ITERや次世代デモ炉へ向けての重要課題も明らかになりつつある。本研究が深く関わる炉内プラズマの熱・粒子制御はその中枢に位置する。稼働中の大型プラズマ実験装置ですら放電持続時間は数十秒に留まり、準定常下でのプラズマー壁相互作用(PWI)や非接触プラズマ関連物理の基礎研究はNAGDISに代表される直線型装置で行われてきた。しかし、環状磁場閉じ込め装置における、磁力線の曲率、磁場強度勾配、プラズマ対向壁と磁力線との浅い交差角などは直線型には備わっていない。本研究では、トーラス型境界領域プラズマ試験装置の高性能化、デモ炉へ向けての超高熱流プラズマ生成の展望を開くこと、また、第一壁への負荷を決めるBlobs等の非拡散的輸送過程の解明、更には非接触プラズマ形成と深く関わる非平衡放射ダイナミクスを明らかにすることにある。まず、トーラスプラズマ生成に関してはRFジュール放電により電子密度n_e≧10^<18>m^<-3>,電子温度T_e≧10eVの高熱流大容量プラズマが得られた。また、熱陰極を用いた直流放電においてはn_e≧10^<18>m^<-3>,T^e≧10eV,T_e≒2eVの高密度トーラス周回プラズマが得られ、周回に沿って電離プラズマから再結合プラズマに移る、非接触プラズマをトーラス環境下で定常的に得られた点は重要である。一方、大気圧マイクロ波ヘリウム・ジェット放電を安定に点火する手法を見出し、空気の混入しない気密容器に導入し、著しく密度の高い超高熱流プラズマ実現への可能性を示した実績も大きい。プラズマ揺動の統計的解析においては確率密度分布関数PDFとそのモーメントそしてウエーブレット変換を駆使して、可能な限り物理的意味のある結果が導かれるよう努めた。その結果、Blobsの速度分布関数の外向き方向へのシフトを議論することができ、トカマクプラズマにおける回転ヘリカル摂動磁場の効果を明らかにした。更に、多くのプラズマ実験装置においてマルチフラクタル特性の共通性から、長時間・長距離相関(記憶効果)がプラズマ異常輸送との関連で検討された。共同研究者Rosmej教授の衝突輻射コードSOPHIAを用いて、複数ヘリウム発光原子線の強度比からプラズマ・パラメータを評価する際の放射捕獲の影響を明らかにすると共に、それを克服する発光線の新しい組み合わせを提案することができた。また、この際、発光線の時間変化の特性時間に関しても検討を行った。コンパクト(大半径R=34cm,水平幅2a=18cm,垂直幅2b=28cm)ながら長い磁力線を有するトロイダル・ダイバータ模擬試験装置において、フェライト変圧器を用いて200kHz前後の駆動周波数のRFジュール放電により水素プラズマを生成することが出来た。プラズマ密度neを投入電力Pinで規格化した、投入電力あたりのプラズマ密度ne/Pinで見ると、水素ガス圧力としては0.03-0.05

Pa近辺が最適であることが明らかにされた。5kW程度のRF入力によりne=2.5x10^17m^-3,Te=5-10eVの大容量水素プラズマが得られた。さらに投入RF電力密度を格段に増加するため、固体リミターにより水平方向幅を3cmに狭めた場合には、ne0=0.8-1.0x10^18m^-3,Te=5-10eVの高密度プラズマの生成に成功した。ne/Pinのガス圧力依存性などは簡単な1次元の数値解析モデルにより結果をほぼ再現することができ、その成果は第10回核融合装置における周辺プラズマ理論に関する国際ワークショップ(PET 2005)において発表され、学術雑誌Contributions to PlasmaPhysicsに掲載が認められ、現在印刷中である。今年度はプラズマ生成用RFインバータ電源を30kW(220V-150A)に増力し、プラズマの高熱流化を計ったところ、重水素ガス(0.1-0.2Pa)にて、ピーク密度ne0=1.0x10^18m^-3,Te=7-15eVの大容量高熱流重水素プラズマの生成に成功した。まだ、1次側から見た負荷抵抗が2.0 Ohmと最適値(1.5 Ohm)よりやや高いことやガス圧力の最適化を行っていないので、今後フェライト変圧器のコンパクト化による磁気抵抗の減少と漏れ磁束の低減、並びに1次と2次の巻き数比の調整により投入電力をより有効にプラズマの高熱流化に使われるよう最適化する予定である。その他、磁場電源の整備、非拡散的輸送観測のための高速撮像カメラと分光系の充実を図った。非拡散輸送に関しては露国クルチャトフ研究所Budaev博士と共に種々の核融合装置周辺プラズマにおいて観測される超拡散(superdiffusion)とマルチフラクタル性について論じ、平成18年4月になるが、学術誌Nucl.Fusionに掲載される予定。また、動的エルゴディックダイバータ(DED)による揺動制御についても同様である。一方、非平衡放射に関しては非接触プラズマにおける放射スペクトルの強度分布を説明するためには輸送の効果を考慮しなければならないことを仏国マルセイユ大学Rosmej教授と共に明らかにした。コンパクト(大半径R=34cm,水平幅2a=18cm,垂直高さ2b=28cm)ながら長い磁力線長を有するトロイダル・ダイバータ模擬試験装置において、フェライト変圧器を用いて200kHz前後の駆動周波のRFジュール放電とLaB6陰極を用いた直流放電により高密度重水素プラズマを生成することができた。RFジュール放電の場合、n_c/P_<in>ガス圧力依存性に関しては簡単な1次元の数値解析モデルにより、その傾向をほぼ再現することができ、物理的意味づけを与えた。その成果は第10回核融合装置における周辺プラズマ理論に関する国際ワークショップ(PET 2005)において発表され、学術雑誌Contributions to Plasma Physicsに公表された。RFジュール放電に用いるプラズマ生成用インバータ電源(30kW,220V-150A)の負荷インピーダンスを電源のそれに近づけるべく、フェライト変圧器の巻き数比を調整して最適化を図った。
C.elesarsを用いたドーパ性神経伝達を担う分子群の同定

一つの生体内活性物質の役割を,分子的基盤のもとに明らかにすることは生命科学における最重要課題である.本計画の目的は,1.ドーパ非感受性線虫の遺伝学的解析による“ドーパ受容体及びシグナル伝達分子"のクローニング及び2.ドーパトランスポーターの発現クローニングである.主要成果は以下の2点である.1.線虫実験系:すでに線虫をドーバを含むプレートに置いた際に生ずる一定の行動学的応答を指標に同応答を示さない変異株,dpa 1-9の9つを単離した(平成9年度成果).ドーバ非感受性変異株の表現型の解析:遺伝学的解析を確実に行う為,dpa変異株の野生株との最も顕著な表現型の相違を検討した.従来までの検討の結果(1)dpa 3は3 M fructoseに対する忌避反応低下を示した.(2)dpa 1-9はNa^+走化性の異常を示した.この表現型を指標にすでにdpa 1-9を野生株とそれぞれ4回づつ交配させ,遺伝学的に純化した.(3)dpaの表現型は知覚神経異常であるとの推定をもとに,神経伝達物質の放出に関わる分子synaptotagminの変異体unc-3と,dpaとの2重変異体の作成により表現型が顕在化するか否かを検討した.そのうちdpa 2,7,8とunc-3との2重変異体は,いずれもdauer幼虫形成に異常が生ずることが判明した.ドーパ変異株の遺伝子座解析:表現型(2)を指標に,dpa 2,7は染色体IV,dpa 8は染色体IIIに存在すると推定された.2.ドーパトランスポーター発現系の確立すでに,ウサギ小腸上皮細胞からのmRNA注入アフリカツメガエル卵母細胞において非注入卵に比し,約5倍程度の有意なNa^+-依存性の[^<14>C]-L-DOPA取り込み活性を確認した.同ドーパ取り込み活性のKm値は約20-30uM,また,他の中性大型アミノ酸であるTyrosine,phenylalanine,塩基性アミノ酸lysineなどにより取り込みが阻害された.同取り込みは外液Na^+に依存性,Cl-に非依存性であった.ウサギ小腸上皮mRNAのサイズによる分取を終了し,その最も高い取り込み活性をになう分画を同定した.この分画は中性アミノ酸取り込みアクチベーターrBATのサイズと一致した.ウサギrBATが同取り込み活性に関与するかを検討した.アンチセンスrBATをウサギ小腸上皮mRNAとともにco-injectionすると,ドーパ取り込みは著しく抑制された.従って,ウサギ小腸上皮mRNA由来ドーパ取り込み活性にはrBATが必須因子として関与することが判明した.現在,rBATによって活性化されるトランスポーターそのものを同定すべく、解析を進行中である.一つの生体内活性物質の役割を,分子的基盤のもとに明らかにすることは生命科学における最重要課題である.本計画の目的は,1.ドーパ非感受性線虫の遺伝学的解析による“ドーパ受容体及びシグナル伝達分子"のクローニング及び2.ドーパトランスポーターの発現クローニングである.主要成果は以下の2点である.1.線虫実験系:すでに線虫をドーバを含むプレートに置いた際に生ずる一定の行動学的応答を指標に同応答を示さない変異株,dpa 1-9の9つを単離した(平成9年度成果).ドーバ非感受性変異株の表現型の解析:遺伝学的解析を確実に行う為,dpa変異株の野生株との最も顕著な表現型の相違を検討した.従来までの検討の結果(1)dpa 3は3 M fructoseに対する忌避反応低下を示した.(2)dpa 1-9はNa^+走化性の異常を示した.この表現型を指標にすでにdpa 1-9を野生株とそれぞれ4回づつ交配させ,遺伝学的に純化した.(3)dpaの表現型は知覚神経異常であるとの推定をもとに,神経伝達物質の放出に関わる分子synaptotagminの変異体unc-3と,dpaとの2重変異体の作成により表現型が顕在化するか否かを検討した.そのうちdpa 2,7,8とunc-3との2重変異体は,いずれもdauer幼虫形成に異常が生ずることが判明した.ドーパ変異株の遺伝子座解析:表現型(2)を指標に,dpa 2,7は染色体IV,dpa 8は染色体IIIに存在すると推定された.2.ドーパトランスポーター発現系の確立すでに,ウサギ小腸上皮細胞からのmRNA注入アフリカツメガエル卵母細胞において非注入卵に比し,約5倍程度の有意なNa^+-依存性の[^<14>C]-L-DOPA取り込み活性を確認した.同ドーパ取り込み活性のKm値は約20-30uM,また,他の中性大型アミノ酸であるTyrosine,phenylalanine,塩基性アミノ酸lysineなどにより取り込みが阻害された.同取り込みは外液Na^+に依存性,Cl-に非依存性であった.ウサギ小腸上皮mRNAのサイズによる分取を終了し,その最も高い取り込み活性をになう分画を同定した.この分画は中性アミノ酸取り込みアクチベーターrBATのサイズと一致した.ウサギrBATが同取り込み活性に関与するかを検討した.アンチセンスrBATをウサギ小腸上皮mRNAとともにco-injectionすると,ドーパ取り込みは著しく抑制された.従って,ウサギ小腸上皮mRNA由来ドーパ取り込み活性にはrBATが必須因子として関与することが判明した.現在,rBATによって活性化されるトランスポーター

そのものを同定すべく、解析を進行中である.一つの生体内活性物質の役割を,分子的基盤のもとに明らかにすることは生命科学における最重要課題の一つである.1950年代から,ドーパの作用及びパーキンソン病における効果はドーパ脱炭酸酵素によるドパミン(DA)ヘの変換によると信じられてきた.これに反して,我々は国内外を通じて初めて1986年に,「ドーパそのものが伝達物質である」との作業仮説を提起し,その検証を進めてきた.次なる核心的課題はドーパシグナルを担う分子,ことに"ドーパ受容体"及びその下流域に存在する機能分子の同定にある.本研究の動機は,線虫(Caenorhabditis elegans)をドーパ及びDAを含むプレートに置き,その行動変化を比較・観察した結果,線虫の行動に対しドーパはDAとは異なる効果を示すことを見い出したことにある.本計画年度における主要な成果は以下の2点である.1)変異誘発物質エチルメタンスルフォン酸を処理した線虫のF2個体2000のスクリーニングから,ドーパ応答を欠失した線虫変異株dpa-19(dopa response abnormality)を単離した.現在,上記1)において単離した線虫変異株9つの遣伝子マッピングを継続中である.さらに,変異部位がある程度絞られた段階において,本研究助成により新たに購入した倒立型顕微鏡を用い,コスミドクローンによるレスキュー実験を行う予定である.一方,上記2)に関して,ウサギ小腸上皮polyA^+RNA注入卵における,Na^+イオン依存的L-[14C]ドーパの取り込み活性の性格を詳細に検討しつつあり,その結果は未だ同定に至っていないアミノ酸トランスポーター分子の一つである可能性を示している(Ishii et al.,1998).一つの生体内活性物質の役割を,分子的基盤のもとに明らかにすることは生命科学における最重要課題である.本年度研究計画の中心的研究課題は,昨年に引き続き1.ドーパ非感受性線虫の遺伝学的解析による“ドーパ受容体及びシグナル伝達分子"のクローニング及び2.ドーパトランスポーターの発現クローニングである.本計画年度における主要な成果は以下の2点である.1.線虫(Caenorhabditis elegans)実験系:すでに線虫をドーパを含むプレートに置いた際に生ずる一定の行動学的応答を指標に同応答を示さない変異株,dpa 1-9の9つを単離した(平成9年度成果).本年度成果は,ドーパ非感受性変異株の表現型の解析:遺伝学的解析を確実に行う為,dpa変異株の野生株との最も顕著な表現型の相違を検討した.従来までの検討の結果(1)dpa3は3M fructoseに対する忌避反応低下を示した.(2)dpa 1・9はNa^+走化性の異常を示した.この表現型を指標にすでにdpa1・9を野生株とそれぞれ4回づつ交配させ,遺伝学的に純化した. (3)dpaの表現型は知覚神経異常であるとの推定をもとに,神経伝達物質の放出に関わる分子synaptotagminの変異体unc-3と,dpaとの2重変異体の作成により表現型が顕在化するか否かを検討した.そのうちdpa2,7,8とunc-3との2重変異体は,いずれもdauer幼虫形成に異常が生ずることが判明した.ドーパ変異株の遺伝子座解析:現在進行中である.表現型(2)を指標に,dpa2,7は染色体IV,dpa8は染色体IIIに存在すると推定された.2.ドーパトランスポーター発現系の確立
日本語分析技術の総合的向上と自己修正型教師の養成を目的とした訓練方法に関する研究

日本語分析手順((1)例文作成、(2)正用例文の具体的な解釈、(3)解釈結果の言語特徴への抽象化)に関する明示的指導の影響を調べるため、非日本語教師である日本語母語話者に対し効果実験を行った。被験者は日本人大学生16名で、被験者ごとに実験を個別に行った。このうち半数の実験群には、日本語分析課題に先立ち、プレゼンテーションソフトで作成した明示的教示を情報端末で与えた。それに続き、教示内容に関して例題を用い練習を行った。こうした指導の後に被験者は日本語分析課題として類義語分析を行い、その内容を筆記回答でまとめる。回答を点数化し明示的指導の効果を調べた結果、実験群と統制群とでは記述内容の具体性に違いが見られたものの、類義語の弁別的特徴に関する説明の分量と明瞭さには大きな違いが見られなかった。実験後のインタビューでは、例文作成および例文解釈は円滑に行われる一方で、例文作成から言語特徴分析へという手順の移行が円滑に行われなかったことがうかがえた。また、実験群の被験者は、例文解釈により例文内容を具体的に把握できていたが、それを言語特徴とする回答が多かった。今回の実験結果から、明示的教示によって例文作成の手順と例文解釈の必要性に関する十分な理解を促せるといえる。しかし、日本語分析手順の指導では、分析手順に慣れるまでに十分な練習をさらに設定する必要がある。さらに、分析行動の問題点などを客観的に把握し、適切な指示や説明を練習中に行うといった、第三者の支援が必要と考えられる。これらの手順を組み込み、分析者が自身の分析手順を客観視できるような指導の検討が課題として残った。今年度は、例文作成行動と例文分析行動に焦点を当て、非教師の日本語母語話者にとってストラテジー指導(教示と適用練習)による意識化と実際の運用が困難な分析行動を探った。日本人大学生10名を対象に、探索的な予備調査を個別に行い、調査での課題終了後には分析手順や教示の理解についての内省報告を被調査者に課してその聞き取りを行った。予備調査における被調査者への課題は類義副詞の分析で、その分析過程の発話を録音した発話データをプロトコル分析法で分析した。さらに実験後の内省報告から、教示と適用練習のわかりにくさや困難さ、例文作成を促されて日本語分析を行った際に被調査者が感じる困難さを中心に調べた。その結果、第一に適用練習において例文作成と例文分析が連動しにくいこと、第二に類義副詞の特徴の抽象化と例文作成が連動しにくいこと、第三に教示や分析課題で「例文」という用語により例文作成を求められると被調査者が『より適切で模範的な文を作らなければならない』と理解し緊張を感じ、自由な例文作成が制限されることが明らかとなった。以上のように教示や適用練習で被調査者がつまずく点が把握でき、教示や訓練の枠組みを作成する際の基礎資料が得られた。予備調査における被調査者の類義副詞分析の結果と照らし合わせる作業とともに来年度前半も継続し、実験で被験者に課す日本語分析課題の到達目標と評価基準を作成する。前年度に行った探索的調査(被調査者:大学生10名)で収集したプロトコルデータと内省報告データを用いて、非教師の日本語母語話者にとって遂行困難な日本語分析行動を整理し、意識化や補強の必要なものを抽出した。特に、"例文作成→例文分析→言語特徴への抽象化"という基本的な日本語分析手順のうち、『例文分析』に見られる特徴や問題点を整理した。その結果、作られた非文を検討することで情報を得るという分析行動が、日本語母語話者にとって困難度の高いことがわかった。そこで、教員養成の初期段階においては、非文ではなく正用文となる例文を優先的かつ積極的かつ利用しながら日本語分析を進めていくということを、被養成者となる日本語母語話者に習熟させるべき『目標分析行動』と考えるべきである。また、日本語分析行動に関する日本語母語話者への明示的指導の効果について実験で検討する計画だが、実験に先立ち、分析課題とする日本語の選定とその特徴整理を行った。日本語は、「つい/うっかり/思わず」の類義語3語と、「ゆっくり/ゆったり/のんびり」の類義語3語である。そして、辞書や参考図書などを用いて類義語群の弁別的特徴を整理し、特徴リストを作成した。特徴リストは、実験で被験者が行った類義語分析の結果を得点化するために用いるものである。また特徴リストについては、日本語教師2名の協力を得て、リスト中の特徴記述に関する妥当性や点数化作業の問題点などを点検した。

回答を点数化し明示的指導の効果を調べた結果、実験群と統制群とでは記述内容の具体性に違いが見られたものの、類義語の弁別的特徴に関する説明の分量と明瞭さには大きな違いが見られなかった。実験後のインタビューでは、例文作成および例文解釈は円滑に行われる一方で、例文作成から言語特徴分析へという手順の移行が円滑に行われなかったことがうかがえた。また、実験群の被験者は、例文解釈により例文内容を具体的に把握できていたが、それを言語特徴とする回答が多かった。今回の実験結果から、明示的教示によって例文作成の手順と例文解釈の必要性に関する十分な理解を促せるといえる。しかし、日本語分析手順の指導では、分析手順に慣れるまでに十分な練習をさらに設定する必要がある。さらに、分析行動の問題点などを客観的に把握し、適切な指示や説明を練習中に行うといった、第三者の支援が必要と考えられる。これらの手順を組み込み、分析者が自身の分析手順を客観視できるような指導の検討が課題として残った。
膵β細胞再生における分子機構と膵nestin発現細胞の病態生理的意義に関する研究

(方法・結果)膵β細胞再生モデルのstreptozotocin投与β細胞再生ラットを用いて、Taqman PCRでNGN3の遺伝子発現は非常に低く、再生モデルで特に変化が認められなかった。in situ hybridization法で胎生期の中枢神経系ではNGN3の発現が認められるのに対して、生後の膵臓では正常ラット、およびstreptozotocin投与β細胞再生ラットで認められなかった。nestinはGFP蛍光による検討、抗GFP抗体による検討で、streptozotocin投与β細胞再生ラットおよび正常ラットの膵で血管内皮細胞に発現していた。生後に、Notch2LacZノックインマウスの検討、および、抗Notch2抗体による免疫組織化学の検討で、Notch2は膵管細胞で主に発現していた。(考察)生後の膵ではNGN3の発現は認められず、生後のβ細胞再生でのNGN3の意義は不明である。生後の膵でのnestinの局在の検討では、血管内皮細胞であることが明らかになり、内胚葉由来であるβ細胞の前駆細胞として、nestin発現細胞が考えにくいことが明らかになった。膵内分泌細胞の前駆細胞の由来については、未解明な点が多いが、その有力な仮説の一つとして、膵管細胞に由来すると言う説がある。本研究の成果により、Notch2発現細胞が、膵β細胞の前駆細胞である可能性が明らかになった。現在、膵組織特異的Notch2遺伝子欠損マウスを用いてβ細胞発生分化におけるNotch2の意義を検討している。(目的)β細胞は内胚葉由来であるが、β細胞と神経細胞の分化の類似性が指摘されている。nestinは神経幹細胞のマーカーであるが、最近、膵nestin発現細胞は、β細胞前駆細胞である可能性が指摘されている。本研究では、膵β細胞再生モデルで、β細胞の胎生期の発生分化に関与するNeurogenin 3 (NGN3)の意義を検討し、また膵におけるnestin発現細胞を検討した。nestinはGFP蛍光による検討、抗GFP抗体によるGFPの発現の検討で、streptozotocin投与β細胞再生ラットのみならず、正常ラット膵とラ氏島とラ氏島以外の部分で発現していた。HE染色で膵での発現細胞は血管内皮細胞と思われたので、von Willebrand factorによる免染を行い、同一の細胞で発現していた。NestinGFPトランスジェニックマウスの膵組織をdisperseして、膵組織由来細胞の約1割以上で、FACS陽性であった。(考察)生後の膵ではNGN3の発現は認められず、生後のβ細胞再生におけるNerugongein 3の意義は不明である。生後の膵でのnestinの局在の検討では、血管内皮細胞であることが明らかになった。血管内皮細胞が中胚葉由来であるのに対して、β細胞が内胚葉由来であるので、nestin陽性細胞がβ細胞の前駆細胞である可能性に関して、一部の細胞がそうである可能性が完全に否定される訳はないが、大半の細胞はそうではないことが明らかになった。現在、他のβ細胞の幹細胞に特有の候補分子の発現の検討を行っている。我々は昨年度の報告書で、神経幹細胞のマーカーのnestin発現を検討し、主に血管内皮で発現していることを明らかにし、膵のnestin発現細胞の少なくとも大半が、β細胞の前駆細胞でないことを示した。

神経系の分化で重要なneurogenin(ngn) familyの中のngn3がβ細胞の胎生期の発生分化で重要であることは既に明らかになっているが、我々は昨年度、生後の膵、及び生後の膵の再生におけるngn3の意義を検討し、生後の膵において、正常、および再生で、ともに有意の発現を認めないことを明らかにした。Nestinとngn3以外の分子として、ngn3の分子シグナルの上流の分子であるnotch2に今回着目して、その発現分布を検討した。Notch2を含めて、Notch familyの分子は、神経系・血球系で、細胞の未分化能の維持に関与することが知られている。(方法・結果)生後のNotch2LacZノックインマウスを用いて、膵におけるNotch2を検討したところ、Notch2は、膵管細胞で主に発現していた。さらに、生後のマウスを用いて抗Notch2抗体による免疫組織化学の検討を行ったところ、やはり、膵管で、その発現が認められた。(考察)膵内分泌細胞の前駆細胞の由来については、未解明な点が多いが、その有力な仮説の一つとして、膵管細胞に由来すると言う説がある。本研究の成果により、Notch2発現細胞が、膵β細胞の前駆細胞である可能性が明らかになった。