hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
構造情報を用いた手法で明らかにするリーリンシグナルとエンドサイトーシスの関係

本研究では,脳の層構造形成を司る細胞外蛋白質リーリンとその受容体を研究対象に,リーリンのエンドサイトーシス過程と細胞に取り込まれて以降の挙動を追跡することにより,リーリンが細胞表面で受容体へと結合して以降に発揮する機能の解明を目指す.具体的には,(1)リーリンの受容体によるエンドサイトーシス過程をはじめとする細胞内動態の追跡,(2)リガンド/受容体複合体の解離の生化学的解析とそれに関わるアミノ酸残基の同定をリーリンと受容体の双方について行う.さらに,(3)立体構造情報に基づいて,機能を改変したリーリンや受容体を設計し,リーリンとその受容体の細胞内での動態を人為的に制御することをも目指す.本年度も昨年度から継続して,組換えタンパク質を用いた,リーリンの受容体からの解離過程の生化学的解析に取り組んだ.昨年度に,エンドソームのpHに相当する酸性pH条件下で,リーリンの受容体から解離が促進することを見出していた.今回,リーリン受容体組換えタンパク質にアミノ酸残基特異的な化学修飾を施し,リーリン結合様式を解析した.その結果,リーリン受容体のリジン残基が,におけるリーリンの解離に関与していることが示唆された.さらに,リーリン/受容体複合体の結晶構造情報と変異体解析により,リーリンと受容体双方について,相互作用に重要なアミノ酸残基を決定した.これらの結果は,エンドサイトーシス後にエンドソームにおいて,リーリンが受容体から解離する可能性を示すとともに,そのメカニズムの生化学的基盤を明らかにするものである.リーリンが酸性pHでも解離しない受容体の設計に,活用できるものと考えられる.本研究では,脳の層構造形成を司る細胞外蛋白質リーリンとその受容体を研究対象に,リーリンのエンドサイトーシス過程と細胞に取り込まれて以降の挙動を追跡することにより,リーリンが細胞表面で受容体へと結合して以降に発揮する機能の解明を目指す.具体的には, (1)リーリンの受容体によるエンドサイトーシス過程をはじめとする細胞内動態の追跡, (2)リガンド/受容体複合体の解離の生化学的解析とそれに関わるアミノ酸残基の同定をリーリンと受容体の双方について行う.さらに, (3)立体構造情報に基づいて,機能を改変したリーリンや受容体を設計し,リーリンとその受容体の細胞内での動態を人為的に制御することをも目指す.本年度は,リーリンのエンドサイトーシス過程と細胞内動態を追跡できる実験システムの構築と,組換えタンパク質を用いた,リーリンの受容体からの解離過程の生化学的解析に取り組んだ.まず,培養細胞に, hGHを融合させたリーリン受容体遺伝子を導入し,次いで,動物細胞で発現させた組換えリーリンタンパク質を作用させ,リーリンの膜受容体への結合を蛍光顕微鏡で観察する実験系を構築した.また,リーリンとその受容体の双方について,高品質の組換えタンパク質の調整した.特に所属研究室で開発した抗体-タグシステムを用いることで,全長リーリンの調製にも成功している.調製した組換えタンパク質を用いて,様々なpH条件下における両者の結合様式をゲルろ過クロマトグラフィーで分析した.その結果,エンドソームのpHに相当する条件下では,両者が解離していることが分かった.今後は,酸性pH条件下での複合体の解離に関わるアミノ酸残基を同定することも目指す予定である.本研究では,脳の層構造形成を司る細胞外蛋白質リーリンとその受容体を研究対象に,リーリンのエンドサイトーシス過程と細胞に取り込まれて以降の挙動を追跡することにより,リーリンが細胞表面で受容体へと結合して以降に発揮する機能の解明を目指す.具体的には,(1)リーリンの受容体によるエンドサイトーシス過程をはじめとする細胞内動態の追跡,(2)リガンド/受容体複合体の解離の生化学的解析とそれに関わるアミノ酸残基の同定をリーリンと受容体の双方について行う.さらに,(3)立体構造情報に基づいて,機能を改変したリーリンや受容体を設計し,リーリンとその受容体の細胞内での動態を人為的に制御することをも目指す.本年度も昨年度から継続して,組換えタンパク質を用いた,リーリンの受容体からの解離過程の生化学的解析に取り組んだ.昨年度に,エンドソームのpHに相当する酸性pH条件下で,リーリンの受容体から解離が促進することを見出していた.今回,リーリン受容体組換えタンパク質にアミノ酸残基特異的な化学修飾を施し,リーリン結合様式を解析した.その結果,リーリン受容体のリジン残基が,におけるリーリンの解離に関与していることが示唆された.さらに,リーリン/受容体複合体の結晶構造情報と変異体解析により,リーリンと受容体双方について,相互作用に重要なアミノ酸残基を決定した.これらの結果は,エンドサイトーシス後にエンドソームにおいて,リーリンが受容体から解離する可能性を示すとともに,そのメカニズムの生化学的基盤を明らかにするものである.リーリンが酸性pHでも解離しない受容体の設計に,活用できるものと考えられる.
ＧＩＳを用いた言語の時間・空間的変化の解明－霊石県方言を中心に－

本年度の研究成果は以下の4点である。1.霊石県約20地点における単音節形態素の発音をデータベース化した。2.霊石県方言の音韻体系における内部差異を明らかにした。具体的には、声調については、声調の数によって5声調・6声調・7声調の3タイプに分類され、頭子音については、反り舌音の有無によって2タイプに分類され、主母音については、霊石県方言は、主母音の数によって3母音・4母音の2タイプに分類される。3.中国音韻学の枠組みに基づき、霊石県に内部差異が見られる12項目の特徴を抽出し、それらの特徴の地理分布が、霊石県北部から南部へと段階的な変化を示していることを明らかにした。12項目の特徴は、以下の中古音音類との対応関係である:(1)声調調類、(2)全濁破裂・破擦声母(有声破裂・破擦頭子音)、(3)知組三等・章組声母(歯茎硬口蓋頭子音)、(4)果摂一等韻母、(5)假摂開口三等韻母、(6)蟹摂開口一等・合口一等韻母、(7)宕摂開口一・三等韻母、(8)梗摂開口二等韻母、(9)梗摂開口三等・四等韻母、(10)咸山摂舒声韻母、(11)入声韻母、(12)歯茎閉鎖声母に後続する止・蟹摂韻母4.12項目の特徴のうち、「果摂韻母の前舌化」という現象について、交流度計算方法(交流度=人口密度×徒歩移動の利便性(伝播の中心地から一定時間内に到達可能な村数))を改善し、伝播方向を推定した。第一の改善点は、人口密度を計算する際に必要な、方言区の面積の算出方法を、より誤差の少ない方法に改めた点である。第二の改善点は、伝播の中心地との交流度だけでなく、対立する形式の中心地との交流度も考慮して伝播順序を推定した点である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の最終目標は、晋方言・汾河片方言接触地域(霊石高地)における方言の地理分布から、両方言の相互影響の歴史を解明することである。そのためには、霊石高地における言語形式の地理分布解明と、交流度(人口・地形から算出した中心地-方言区の交流難易度)に基づいて言語伝播を推定する方法論の確立が必要である。従って、本研究では(1)交流度計算方法の改善、(2)霊石県における音韻体系の全面調査、という2つの課題の解決を目的としている。(1)については予定よりも早く進捗し、平成24年度末に「交流度=人口密度×移動の利便性」という交流度計算公式を提案することができた。そのため、平成25年度は(2)を中心に取り組んだ。(2)については、まず、調査結果入力フォームの作成と、晋方言・汾河片方言間に対立が見られる音韻的特徴のリストアップを行った。そして、霊石県内の約20地点で、それぞれ400以上の単音節形態素の発音を調査し、霊石県方言の内部差異に関わる音韻的特徴9項目及びその地理分布を明らかにした。9項目の音韻的特徴は、以下の中古漢語音類との対応関係である(括弧内は中古漢語音類の再構音価) :(1)声調調類、(2)全濁破裂・破擦声母(有声破裂・破擦頭子音)、(3)知組三等・章組声母(歯茎硬口蓋頭子音)、(4)果摂開口ー等韻母(-ɑ)、(5)假摂開口三等韻母(-ίa)、(6)蟹摂開口ー等(-ɑi'-əi)・合口一等韻母(-uɑi, -uəi)、(7)宕摂箭声開口ー・三等韻母(-ɑieϦ-ίaϦ)、(8)梗摂舒声開口二等韻母(-aϦ. -æϦ)、(9)梗摂舒声開口三等(-ίaϦ, ,-ίɛϦ)・四等韻母(-ieϦ)。上記音韻的特徴のうち、(1)(2)(5)については、a)霊石県の北に隣接する晋方言と同類型、b)霊石県の南に隣接する汾河片方言と同類型、c)晋方言・汾河片方言の混合、の3類型が観察され、(4)(6)(7)(8)(9)については、a)晋方言と同類型、b)汾河片方言と同類型、の2類型が観察された。(3)については、a)晋方言と同類型、b)霊石県に隣接する地域には見られないが山西省全体に見られる類型、c)a)・b)の混合、の3類型が観察された。

3.中国音韻学の枠組みに基づき、霊石県に内部差異が見られる12項目の特徴を抽出し、それらの特徴の地理分布が、霊石県北部から南部へと段階的な変化を示していることを明らかにした。12項目の特徴は、以下の中古音音類との対応関係である:(1)声調調類、(2)全濁破裂・破擦声母(有声破裂・破擦頭子音)、(3)知組三等・章組声母(歯茎硬口蓋頭子音)、(4)果摂一等韻母、(5)假摂開口三等韻母、(6)蟹摂開口一等・合口一等韻母、(7)宕摂開口一・三等韻母、(8)梗摂開口二等韻母、(9)梗摂開口三等・四等韻母、(10)咸山摂舒声韻母、(11)入声韻母、(12)歯茎閉鎖声母に後続する止・蟹摂韻母4.12項目の特徴のうち、「果摂韻母の前舌化」という現象について、交流度計算方法(交流度=人口密度×徒歩移動の利便性(伝播の中心地から一定時間内に到達可能な村数))を改善し、伝播方向を推定した。第一の改善点は、人口密度を計算する際に必要な、方言区の面積の算出方法を、より誤差の少ない方法に改めた点である。第二の改善点は、伝播の中心地との交流度だけでなく、対立する形式の中心地との交流度も考慮して伝播順序を推定した点である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の実施計画(交流度計算方法の改善、方言調査結果を入力するための入力フォームの作成、晋方言・汾河片方言間に対立が見られる音韻的特徴のリストアップ、単音節形態素の発音調査と音韻分析)を予定通り実行し、霊石県方言の内部差異に関わる音韻的特徴9項目及びその地理分布を明らかにできたため。今後の研究の推進方策は、以下の通りである。(1)調査で明らかになった9項目の音韻的特徴について、歴史的文献・隣接地域の方言資料を基に歴史的音韻変化過程を再構し、これらの音韻的特徴が晋方言ー中原官話間の言語伝播を反映しているかを考察する。(2)言語伝播を反映していると推定される音韻的特徴について、音韻変化の順序と、「交流度(人口・地形条件から計算した交流難易度)」の順序を比較し、言語伝播があったという仮説が交流度からも支持されるか検証する。(音韻変化順序と交流度が一致すれば、中心地で起こった音韻変化が交流度の高い地域から順に伝播したという仮説が支持される。)
乾癬発症関連遺伝子群の解明と最適化治療開発への応用

乾癬は、免疫学的異常と環境要因が相互に作用し合って発症する慢性疾患である。遺伝学的解析の結果、(1)乾癬の発症には免疫反応の制御に関わる血液型のひとつであるHLA-Cw6の極めて重要である、(2)このHLAと結合するレセプターに多様性があり、そのことが乾癬治療薬の効き具合に寄与している。(3)従来からの別の乾癬治療薬(メトトレキサート)の効果と葉酸代謝に関わる酵素の遺伝子多型とが相関する、以上の点を明らかにした。1)乾癬発症関連遺伝子群の解析2)薬理遺伝学的観点からの解析(ア)メトトレキセートの有効性ならびに副作用発現の度合いは、メチレンテトラビトロ葉酸還元酵素遺伝子のエクソン4(C677T)およびエクソン7(A1298C)のSNP多型と相関を示すことを見い出した。すなわち、677番目の塩基がTであると、臨床上副作用を誘発しやすいこと、そして1298番目の塩基がCであると、メトトレキセートはより有効であること、が判明した。この点については、今後症例数を増やして臨床へ還元すべくエビデンスを確かなものにする必要性がある。(イ)ビタミンDレセプター遺伝子のSNP解析から、乾癬患者群では、FoKI制限酵素で切断したときに検出されるf=ATG、F=ACGのうち、f対立遺伝子の頻度が増加傾向を示した。fが増加するということは、ビタミンDレセプターのビタミンD_3に対する感受性が低下することが知られており、このことがケラチノサイトの文化誘導に影響を与えることが予想され、注目に値する所見である。今後HCR(ビタミンDレセプターの遺伝子発現の制御に関する)-ビタミンDレセプター遺伝子の組み合わせを解析していく必要性が出てきた。3)今後、(ア)HLA-C-HCR-TNFα、(イ)RUNX1関連SNP9、(ウ)HLA-C近傍のSNP解析、(エ)HLA-CをリガンドをするKIR、これらのハプロタイプないし遺伝子の組みあわせを検討し、ハイリスクハプロタイプの単離・同定および薬剤感受性を明らかにすることを目指す。1.乾癬発症関連遺伝子群に関わる一塩基多型解析(SNP)の結果、IL-12及びIL-23の両者に共有されるIL-12/23p40をコードする遺伝子のSNP多型において、乾癬患者群と健常者群との間で有意差がみられることが判った。しかも、乾癬多発家系を用いた連鎖解析から、乾癬との強い相関が知られているHLA-Cw*0602を含むハプロタイプHLA-A*1-B*37-Cw*0602-DRB1*10が、上記のIL-12/23p40蛋白遺伝子SNP多型と連鎖して伝播される注目すべき結果が得られた(投稿準備中)。2.乾癬治療薬の一つであるメトトレキサートに対する薬剤感受性を規定する葉酸代謝の律速酵素であるメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(MTHFR)のSNP解析から、エクソン4に相当する677番目の塩基置換(C→T)があると、全身倦怠感等の副作用を生じ易いことが判った。反対解釈をすると、677番目の塩基がC/C型のホモ接合体であると、比較的安全にメトトレキサートを用いることができるものと結論づけることができる。C/C型の遺伝子頻度は、乾癬患者60名中26名(43%)の頻度であることも判った。以上の研究成果から、乾癬の発症に寄与する候補遺伝子として、従来から主張されているHLAに加えて、新たにIL-12/23p40遺伝子多型があげられること、そして、メトトレキサートを副作用なしに安全に使用できるか否かをMTHFRのSNPを調べることで事前に予知し得ることを明らかにすることができた。
口腔がんにおける放射線誘導性細胞動態を標的とした新規放射線増感戦略の基盤構築

口腔領域は摂食嚥下や発語、審美など多くの機能を担っているため、治療後のquality of lifeを維持するという観点からも放射線治療のような非侵襲的治療法の応用は非常に有意義と考えられる。放射線治療を増感させる上で薬剤との併用は有効な一手であり、近年の新薬開発の盛り上がりにより、放射線増感剤の早期開発も期待されるところである。しかしながら、これまでに開発が進められてきた薬剤の多くにおいて、経済的問題や副作用などのために未だ臨床応用には至っていないという点は新薬開発の困難性を物語っている。そこで本研究では、既に他疾患に実用化されている機能既知薬が応用できれば、実用化に至る諸問題が軽減できると考え、本学で有する機能既知薬ライブラリーを利用し、腫瘍細胞特異的に放射線増感効果を示す化合物を探索することを目指し、研究を進めている。化合物探索には、化合物ライブラリースクリーニングを行い、細胞周期を指標として解析した。腫瘍細胞の多くは、癌抑制遺伝子であるp53に変異または欠損が生じており、そうした細胞に放射線を照射すると主にG2/Mチェックポイントが活性化され、G2アレストが生じる。このG2アレストはDNA修復と関連していることが知られており、G2アレストに異常を生じさせた場合、一般的には増感効果を示すと考えられている。さらに、私達は、細胞周期を可視化するシステムとしてFucciを応用することで放射線照射後のG2アレストをその蛍光動態から把握することに成功している。そこで、Fucciを化合物ライブラリースクリーニングと組み合わせることにより、放射線照射単独と比較して、異なるG2アレスト動態を誘導した化合物を抽出することを試みた。その結果、放射線単独とは異なる動態を示した十数種類の化合物を同定することに成功しており、それらを一次候補化合物とし、現在、さらなる確認を進めている。一次スクリーニングとしてハイスループット機器を用い、数千サンプルにおけるFucciによる蛍光分布を自動的に計算させるシステムを構築したが、初めての導入だったため、その解析方法や分布の算出方法のセットアップに予定よりも時間がかかったため、当初の計画と比較してやや遅れていると判断した。一次スクリーニングでは、単一濃度でのみ解析を行ったので、抽出された十数種類の一次候補化合物についてはさらに濃度を振り分けた上で、放射線照射後の細胞周期動態に濃度依存的な変化が生じるかを確認する。また、フローサイトメトリーや顕微鏡観察などのように一次スクリーニングとは異なる解析方法でも放射線照射単独とは異なるG2アレスト動態が誘導されるかを確認する。一次スクリーニングで用いた化合物ライブラリーは本学生体材料研究所より提供されるが、さらなる確認のためには新たに購入する必要があり、その場合に一次スクリーニングとは異なる結果が生じる可能性が考えられる。その結果の相違が、化合物の由来によるのか、それとも解析方法の違いによるかは熟慮する必要がある。化合物そのものによる問題か否かを解決するためには、提供元の生体材料研究所とも協力し、質量分析の実施等も含めて、一次スクリーニングで使用したものと購入したもので違いがないかを明らかにする。

一次スクリーニングで用いた化合物ライブラリーは本学生体材料研究所より提供されるが、さらなる確認のためには新たに購入する必要があり、その場合に一次スクリーニングとは異なる結果が生じる可能性が考えられる。その結果の相違が、化合物の由来によるのか、それとも解析方法の違いによるかは熟慮する必要がある。化合物そのものによる問題か否かを解決するためには、提供元の生体材料研究所とも協力し、質量分析の実施等も含めて、一次スクリーニングで使用したものと購入したもので違いがないかを明らかにする。
癌・免疫疾患発症とシグナル異常：STAT3とNFーκBを中心として

生体の恒常性の維持にはサイトカインの存在が不可欠であり、中でも炎症性サイトカイン、インターロイキン6(IL-6)の異常産生やシグナル異常は癌、自己免疫疾患の発症に深く関与している。申請者はIL-6のシグナル分子STAT3の活性化及び活性化制御に関与する多くの分子を同定し、機能解析を行ってきた。本研究ではSTAT3と炎症応答を制御するNF-kappaBとの機能的相互作用の解析を中心に生体内STAT3制御法の確立を目指し、本年度は以下の研究を行った。1.STAT3結合蛋白のSTAT3機能への影響解析これまでSTAT3制御因子としてY14を同定したが、Y14がNF-kappaBの活性制御にも関与する新規機能分子であることを明らかにした(論文投稿中)。2.STAT3とNF-kappaBとのクロストークを指標にしたSTAT3制御機構の解析これまで核内蛋白KAP1がSTAT3、NF-kappaB、p300等と相互作用し、TNF/NF-kappaB依存的な炎症性サイトカインIL-6の遺伝子発現を制御することを見い出し報告したが、今回STAT3によるNF-kappaB活性化調節にSTAT3のセリンリン酸化が関与することを明らかにした。3.STAT3結合蛋白の新規機能解析STAT3の活性化を制御するSTAT3結合蛋白STAP-2が免疫系T細胞の活性化細胞死やCML慢性骨髄性白血病の原因蛋白BCR-ABLの活性化に関与することも明らかにした。さらに植物性イソフラボンが免疫系細胞においてSTAT3の活性化を誘導し、炎症性サイトカイン産生を増強することも世界で初めて明らかにした。STAT3制御蛋白がNF-κBの機能調節に関与することを世界的レベルの雑誌に報告することができ、現在も引き続き研究は進んでおり、いくつかの論文はすでに投稿中であり、発表できることを確信している。STAT3制御蛋白がNF-κBの機能調節に関与については主に細胞レベルでの解析が中心であるが、より生体内での機能解析を進めるために遺伝子改変マウスの作成やin vivoでの動物実験等を充実させていく予定である。本研究ではSTAT3とIL-6産生を制御するNF-κBとの機能的相互作用の解析を中心に生体内STAT3制御法の確立を目指し、本年度は以下の研究を行った。1.STAT3結合蛋白のSTAT3機能への影響解析ZIPKがIL-6によって誘導されるSTAT3転写活性化を増強することを明らかにし、あらたなZIPK結合蛋白としてNLKを同定し、報告した。さらに、STAT3制御因子としてY14を同定したが、Y14がNF-κBの活性制御にも関与することが明らかにした。2.STAT3核内制御蛋白のNF-κBとのクロストークを指標にしたSTAT3制御機構の解析STAT3をベイトにした酵母two-hybrid法にてSTAT3結合蛋白として核内コリプレサーKAP1を同定し、KAP1の遺伝子ノックダウンにより、KAP1がSTAT3のセリン酸化を制御し、STAT3核内制御蛋白として機能することを報告したが、さらに、KAP1がSTAT3,NF-κB,p300等と相互作用し、TNF/NF-κB依存的な炎症性サイトカインIL-6の遺伝子発現を制御することを見い出し,報告した。3.STAT3蛋白の量的制御機構の機能解析STAT3分解に関与する新規E3リガーゼとしてPDLIM2を同定した。PDLIM2はNF-κBとの機能的相互作用が発見されていたが、核内においてSTAT3と結合し、STAT3をユビキチン化し、蛋白分解を促進することを報告した。STAT3のユビキチン化酵素の同定は世界初である。3.STAT3結合蛋白の新規機能解析STAT3の活性化を制御するSTAT3結合蛋白STAP-2が免疫系T細胞の活性化

細胞死やCML慢性骨髄性白血病の原因蛋白BCR-ABLの活性化に関与することも明らかにした。さらに植物性イソフラボンが免疫系細胞においてSTAT3の活性化を誘導し、炎症性サイトカイン産生を増強することも世界で初めて明らかにした。STAT3制御蛋白がNF-κBの機能調節に関与することを世界的レベルの雑誌に報告することができ、現在も引き続き研究は進んでおり、論文発表できることを確信している。STAT3制御蛋白がNF-κBの機能調節に関与することを世界的レベルの雑誌に報告することができ、現在も引き続き研究は進んでおり、いくつかの論文はすでに投稿中であり、発表できることを確信している。STAT3制御蛋白がNF-κBの機能調節に関与については主に細胞レベルでの解析が中心であるが、より生体内での機能解析を進めるために動物実験等を充実させたい。STAT3制御蛋白がNF-κBの機能調節に関与については主に細胞レベルでの解析が中心であるが、より生体内での機能解析を進めるために遺伝子改変マウスの作成やin vivoでの動物実験等を充実させていく予定である。
HIV感染ライフサイクルに必須な細胞因子の同定および新しい抗HIV薬の標的探索

HIV-1の複製は宿主側の因子に依存するが、現在までのところそのような因子の報告は限られている。発現クローニング方法の使用で、私たちは、感染に感受性のある293T細胞からHIV-1の感染に抵抗性の、しかしマウス白血病ウイルス(MLV)には感受性のある、C611、およびYD4という2つの変異細胞クローンを樹立した。定量的PCR(qPCR)研究から、C611細胞には逆転写の完成前のpost-entry blockがあること、一方、YD4細胞ではウイルスDNAが核に入るものの、宿主細胞DNAヘインテグレーションされないことがわかった。変異細胞と親細胞の間の融合によりHIV-1の感染性が回復したことから、これらのブロックの遺伝子の表現型は遺伝的に劣性であるように見えた。これまでに知られている蛋白因子を補っても感染性が回復しなかったことから、この変異細胞はHIV-1感染の新しい補助因子を特定するために有用であると期待される。このほかに別のアプローチから実験を行い、HIV-1感染に促進的、または抑制的に作用する3つの新たなホスト側の要素を見つけた。それらはHIV-1ライフサイクルの上で早期に感染促進的に働くArp2/3であり、また霊長類レンチウイルスとワクシニアウイルスIMV感染を負に調節、NAF-1、およびHEXIM1であった。CXCR4拮抗物質に関しては、in vitroの研究による候補化合物の選別を終了し、ネズミモデルを使用することでin vivo研究も行った。それらの中では、KRH-3955は現時点で最も良いと考えられ、その論文化が進められている。従来の抗HIVの治療標的であるウイルス側酵素と異なり、ウイルスの細胞内での複製及びその病原性(細胞致死効果)に必要な細胞側因子を同定することで、新しい治療標的の探索をめざす。さらに動物感染モデルの作製を試みる。もう一方のアプローチとして、すでに同定されているユニークな細胞側因子であるHIVのコレセプターを標的とし、しかも経口投与可能な低分子アンタゴニストを開発する。1)HIV侵入後に生存可能な変異細胞の樹立の試みを行った。ウイルスの細胞侵入を100%保証し感染効率をモニターするために、HIV遺伝子のenv領域に欠損を持ち、nef部分にEGFP遺伝子を組み込んで、VSV-Gでpseudotypeとしたウイルスを293T細胞で作製した。このウイルスをヒトT細胞株に高M.O.I.で感染させると感染細胞が数日間で完全に死滅することがわかったので、あらかじめHIV-1高感受性ヒトT細胞株、MT-4細胞、にフレームシフト変異誘起剤ICR-191で複数回処理した細胞プールにウイルスを作用させたのち、生存細胞を増殖させる試みを行った。これにより、大多数の細胞が死滅する中、少数の生き残りを観察することが出来、ここまでは予定通りであった。この後、ウイルスへの抵抗性を確認するためとウイルスの侵入もれによる細胞生存を除外する目的で、このウイルス感染をさらに数回行ってなお生存する細胞を樹立する試みた。今のところ理由は不明であるが非常に高いM.O.I.でも感染を免れる細胞が存在することが問題となっている。そこで現在は細胞数の快復を待たずに頻回のウイルスchallengeを行い、変異細胞のclonesを分離する試みを行っているところである。本法では研究の特色・独創性の項でも述べたように、HIV-1耐性clonesの分離はそのまま研究全体の成功をもかなりの部分で約束することになるので、現在その分離に全力を傾注しているところである。2)KRH-1636をリード化合物とした多数の誘導体の化学合成を行い、試験管内の抗HIV-1アッセイを実施。その詳細なメカニズムの解析を行った。CXCR4アンタゴニストとして、すでに見出しているKRH-1636をリード化合物としてその周辺物質の誘導体の化学合成を行い、将来の実用化を想定した薬物の絞り込みをおこなった。

変異原で処理してからHIVによる細胞死に抵抗性を示す細胞を樹立する試みでは、調べたT細胞株の中でもっとも容易に感染・死滅するMT4を選択した。HIVに曝露したのち約一干万個の未処理MT4細胞がウイルス遺伝子を発現して細胞死に陥る実験条件は、M.O.I.10以上のHIV pseudovirusを連日3回感染させることによって定めた。約四千万個のMT4細胞に6回の変異原処理をを行って生存細胞集団が得られ、それらのゲノムをPCR法で調べたところ、HIVプロウイルスを持つプールと持たないプールがあった。しかしそのいずれもが再度のHIV感染によってほとんどが死滅し、再現性をもってHIVによる細胞死に抵抗性を示す変異細胞はまだ樹立されていない。その一方で、ヒト単球系潜伏感染細胞であるJ22細胞および293T細胞からMT4と同様のスクリーニングを経てHIV感染による細胞死に抵抗性の細胞株が得られた。J22から得られた細胞クローンはマウス白血病ウイルスに対しても感染抵抗性を示し、293T細胞から得られた細胞は親株とほぼ同程度のマウス白血病ウイルスへの感染性を示した。CXCR4アンタゴニストの研究では、KRH1636がラットでの経口ならびに静脈内投与で血中濃度においてdose responseが見られなかった。このことは肝臓での薬物の蓄積性を示唆したため、さらにKRH1636をプロトタイプとしてその誘導性を53種類作成し、KRH1636の問題点の解決に努めた。その結果、T-2731, T-2652と名付けた2種の誘導体を新たに見出した。これらの物質は抗HIV活性については1万倍を越える化学療法係数を維持しながら、問題となっていた経口吸収性と血中での短時間での分解という難点がほほ解決され、高経口吸収性で血中持続時間の長い薬物であることがわかった。1)抗HIVの治療標的となりうる細胞側因子の同定われわれはこれにつき主として2つのアプローチを行っている。以下、それぞれについて示す。1)変異原処理によるHIV抵抗性変異細胞の単離HIVによる細胞死の抵抗性を示す変異細胞を樹立する試みでは、約四千万個のMT4細胞に6回の変異原処理を行って生存細胞集団が得られ、それらのゲノムをPCR法で調べたところ、HIVプロウイルスを持つプールと持たないプールがあった。しかしそのいずれもが再度のHIV感染によってほとんどが死滅し、再現性をもってHIVによる細胞死に抵抗性を示す変異細胞はまだ樹立されなかった。一方、ヒト単球系潜伏感染細胞であるJ22HL-60から得られた細胞クローンJN2はMOI 30という条件下でのpseudotype HIV感染に対しても抵抗性で、同時にマウス白血病ウイルスに対しても感染抵抗性を示した。Steady stateならびにTNFによるウイルス誘導を行うとこのクローンは親細胞と変わりがないことから、プロウイルスからの遺伝子発現には異常がないものと考えられた。次にAlu-LTR PCRにより、プロウイルスDNAのintegrationを検討したところ、親細胞に比較して、JN2では特異的バンドのintensityが弱かった。このことからJN2細胞ではプロウイルスのコピーが少ないことを示唆された。
ロボットの意識に関する基礎的研究

本研究では、意識に基づいた行動の制御方式を提案した。従来のロボット行動制御においては認識・計画といった高水準の思考と実行が分離されている。すなわち、環境理解や意志決定は計画時になされ、実行時は単に計画された軌道をトレースするという形態を取る。これは実行時に意識が途切れることを意味する。本研究では、環境認識と動作計画を高速化し、作業の実行制御ループにそれらを挿入することを試みた。それによりあたかも人間が意識を持つように、常に環境状況を念頭においた行動制御を行なうことを可能にした。具体的には、認識・計画と実行が蜜に結合し、実時間(1/10秒程度)で認識・計画と行動のサイクルを繰り返す制御系を構成した。実験のために小型全方向移動ロボットを開発した。実験では、移動ロボッは動的にその位置を変化させる障害物を避けながらゴールまで移動する仕事を行なった。実験の結果、移動ロボットにはかなりの移動誤差が含まれ、障害物はランダムに動いているにもかかわらず、ほとんど失敗なくゴールに到達した。高速な環境認識を可能にするビジョンとしてマークベーストビジョンを提案し開発した。マークとバ-コードの組からなる標識を物体に貼付することにより、3次元空間において任意の数の21/2次元物体が存在する環境を認識できることを示した。以上、動的な環境で大域的な動作計画を行いつつ行動を制御し得た例はこれまでなく、本研究が最初に示したと言うことができる。ロボットの意識を、「与えられたミッションの遂行と自らの存在のために必要な知覚機能と実時間での状況理解と意思決定を行う機能」と定義し、自律移動ロボットを例題とし基礎実験を行った。机上に数個の多角形障害物を置き、その間を多角形のロボットがゴールまで移動する問題を設定した。障害物は位置が変化するので、予め決めておいた動作を実行するだけではミッションを遂行することができない。また、従来の移動ロボットのように局所的な環境認識に依存するのではローカルミニマムに陥りこれもミッションを果たすことができない。しかし人間は確実にそのようなミッションはこなす。この場合の人間の意識に相当する働きを実現することを試みた。まず認識機能に関して、ロボットの世界で、意味にある物体にはすべてマークを貼付するというアプローチをとった。マークは円形バ-コード状のもので14種類作成した。このマークをビデオレート(33m sec)で認識するマークベーストビジョンを開発した。各物体に対応し外形形状やマークの物体上の位置等の情報を含むモデルを準備した。以上により、環境中の全ての物体の形状、位置姿勢はビデオレートで認識されるようになった。次に目標位置に到達するための動作計画を高速で実行するアルゴリズムを考案し、1秒程度で大域的動作計画を行うシステムを作った。これは、解があれば必ず解き、解がない場合は、そのことを正しく認識する。以上の認識機能と計画機能を統合し、変化する環境でも極めてロバストにミッションを遂行するロボットを実現した。このロボットの挙動を観察すると、ある種の意識の存在を感じさせる。このシステムを使った意識研究の検討を行った。並行して、音響センサデータの処理システムを作った。意識に基づいた行動の制御方式を提案した。すなわち従来のロボット行動の制御は計画と実行が分離されており、環境理解や意志決定は計画時になされ、実行時は単に計画された軌道をトレースするという形態を取る。本研究では、環境認識を高速化することによりあたかも人間が意識を持つように常に環境状態を頭にいれた行動制御をおこなう。具体的には、認識・計画と実行が蜜に結合し、実時間(1秒程度)で計画と行動のサイクルを繰り返す制御体系を構成した。この目的のため、認識系と計画系が実時間で結合され、ロボットを画面上でシミュレートした行動システムを開発した。このシステムを用いて、動的に変化する環境で、ロボットを目標点まで移動させる問題を実行させた。

その結果、環境中の障害物をどのように動かしても、解のある場合は正しく目標点まで到達し、解のない場合は、そのことを知り停止する行動をとることが示された。環境認識を容易化するための方式として、マークを用いる方法を考案しているが、これまでのマークはその数が限定され、複雑な環境は扱えないという欠点があった。そこで、新たに、マークとバ-コードを組み合わせたマ-コードと呼ぶパターンを使い、数にほとんど制限のない方法を開拓した。実験的にも安定して機能することを示した。以上、動的な環境で大域的な動作計画を行いつつ行動を制御し得た例はこれまでなく、本研究が最初に示したと言うことができる。本研究では、意識に基づいた行動の制御方式を提案した。従来のロボット行動制御においては認識・計画といった高水準の思考と実行が分離されている。すなわち、環境理解や意志決定は計画時になされ、実行時は単に計画された軌道をトレースするという形態をとる。これは実行時に意識が途切れることを意味する。本研究では、環境認識と動作計画を高速化し、作業の実行制御ループにそれらを挿入することを試みた。それによりあたかも人間が意識を持つように、常に環境状況を念頭においた行動制御を行うことを可能にした。具体的には、認識・計画と実行が密に結合し、実時間(1/10秒程度)で認識・計画と行動のサイクルを繰り返す制御系を構成した。実験のために小型全方向移動ロボットを開発した。実験では、移動ロボットは動的にその位置を変化させる障害物を避けながらゴールまで移動する仕事を行った。実験の結果、移動ロボットにはかなりの移動誤差が含まれ、障害物はランダムに動いているにもかかわらず、ほとんど失敗なくゴールに到達した。高速な環境認識を可能にするビジョンとしてマークベーストビジョンを提案し開発した。マークとバ-コードの組からなる標識を物体に貼付することにより、3次元空間において任意の数の21/2次元物体が存在する環境を認識できることを示した。
炎症からの発癌。潰瘍性大腸炎からの大腸癌発癌機序の分子遺伝子学的解析

我々は潰瘍性大腸炎を母地として発症した大腸癌患者の非癌炎症部と癌部におけるmRNA発現をdifferential dysplay法を用いて検討し両者間で発現に差を認める遺伝子をスクリーニングした。現在までに34本をsubcloningし塩基配列を決定しているがこの中で1型および2型IFNで誘導されるIFN inducible gene 1-8Uが潰瘍性大腸炎を母地とした癌組織に強発現していることを確認した。さらに同遺伝子はsporadicな大腸癌および大腸癌細胞株にも発現し、正常大腸粘膜にはほとんど発現のないことも判明した。同遺伝子が潰瘍性大腸炎における慢性炎症から大腸癌発癌過程へどのように関与しているかを臨床的に検討するため、潰瘍性大腸炎患者の大腸粘膜における同遺伝子の発現をみたところ、いわゆるリスクファクターとされる炎症所見の激しい潰瘍性大腸炎患者に発現し、良好にコントロールされた緩解患者では発現が有為に減少していた。この結果はCancerResearch59,5927-5931,December1,1999に発表された。潰瘍性大腸炎では大腸粘膜は持続的にIFNγやinterleukinなどの炎症性サイトカインに曝露され続けておりこのことが発癌に大きく関わっていると考えられているが、慢性炎症から発癌にいたる機構は解明されておらず、そのリスクファクターの選別も臨床経過に頼るしかないのが現状である。そこで我々は現在、同遺伝子が潰瘍性大腸炎患者における発癌のpredictive markerとなりうるかをprospectiveに観察するとともに、in vitroにおいて同遺伝子が細胞周期や細胞増殖能に与える影響を検討中である。我々は潰瘍性大腸炎を母地として発症した大腸癌患者の非癌炎症部と癌部におけるmRNA発現をdifferential display法を用いて検討し両者間で発現に差を認める遺伝子をスクリーニングした。現在までに34本をsubcloningし塩基配列を決定しているがこの中で1型および2型IFNで誘導されるIFN inducible genel-8Uが潰瘍性大腸炎を母地とした癌組織に強発現していることを確認した。そこで我々は現在、同遺伝子が潰瘍性大腸炎患者における発癌のpredictivemarkerとなりうるかをprospectiveに観察するとともに、in vitroにおいて同遺伝子が細胞周期や細胞増殖能に与える影響を検討中である。<学会発表〉日本消化器病学会総会1997年4月日本癌学会総会1997年9月全米消化器病学会1997年5月日本消化器病学会パネルディスカッション1998年11月大腸肛門病学会シンポジウム1998年10月我々は潰瘍性大腸炎を母地として発症した大腸癌患者の非癌炎症部と癌部におけるmRNA発現をdifferential dysplay法を用いて検討し両者間で発現に差を認める遺伝子をスクリーニングした。
小児肝移植後の分子生物学的手法によるＥＢウィルス感染診断と至適免疫抑制療法の開発

小児生体肝移植後のEBV感染頻度は高く,進行すれば致死率の高いPTLDを発症する.そこで,EBV感染からPTLDへの進展を予防し,かつ拒絶反応に対する至適免疫抑制状態のモニタリング法としてCD4+Tリンパ球のATP活性値の測定の有用性について検討した.ImmuKnow値によるEBV感染状態及び免疫抑制状態の評価に関する有用性は限定的であった.EBV感染の診断において乳幼児における血液サンプルの採取には患児の苦痛と充分なサンプル量を得ることができない場合も少なくないため,唾液の採取による定性的EBV-PCRによる非侵襲的なスクリーニング法の開発を試みた20名の患児にて唾液中EBVを検出した.国立成育医療センターでは,2005年11月より2014年3月までに270例の小児生体肝移植術を施行しました.不顕性感染を含めて152例(56.3%)が移植後にEBVの定量的PCR解析にて陽性を示したため,免疫抑制剤の減量を行うことによりPTLDの発症を1例も認めていない.一方で免疫抑制剤の減量は拒絶反応の出現につながることを常に考慮しなくてはならず至適な免疫抑制療法を施行するためのモニタリング方法が必要である.1.免疫抑制剤の血中濃度以外の新しいパラメーターとして感染リンパ球に対する細胞障害性T細胞活性の測定による患児免疫状態を評価.小児肝移植後におけるCD4陽性リンパ球ATP活性値の推移について検討した.EBV-PCR定量検査にて2.4×10E3copies/mcgDNA以上のゲノムが検出された場合EBV感染ありと定義した.感染・拒絶がなく安定した肝機能を示した際のIK値のinterquartile rangeは85-297 ATP ng/mlであり成人でのrangeより低いことが示された.成人肝移植例ではIK値は感染状態で低値をとり,拒絶反応状態で高値となると報告されているが,今回の我々の検討では小児肝移植例でのEBV感染107例ではIK値が逆に有意に高値をとることが判明した.2. EBV感染の診断において乳幼児における血液サンプルの採取には患児の苦痛と充分なサンプル量を得ることができない場合も少なくないため,唾液の採取による定性的EBV-PCRによる非侵襲的なスクリーニング法の開発.血球中EBV-PCR検査にて10×10E4copies/mcgDNA以上のゲノムが検出された12症例に関して唾液中のEBV-PCR検査にてEBVゲノムが検出することが可能であった.小児生体肝移植後のEBV感染頻度は高く,進行すれば致死率の高いPTLDを発症する.そこで,EBV感染からPTLDへの進展を予防し,かつ拒絶反応に対する至適免疫抑制状態のモニタリング法としてCD4+Tリンパ球のATP活性値の測定の有用性について検討した.ImmuKnow値によるEBV感染状態及び免疫抑制状態の評価に関する有用性は限定的であった.EBV感染の診断において乳幼児における血液サンプルの採取には患児の苦痛と充分なサンプル量を得ることができない場合も少なくないため,唾液の採取による定性的EBV-PCRによる非侵襲的なスクリーニング法の開発を試みた20名の患児にて唾液中EBVを検出した.国立成育医療センターで施行した175例の小児生体肝移植術において不顕性感染を含めて55.4%が移植後にEBVの定量PCR解析にて陽性を示したため,免疫抑制剤の減量を行うことによりPTLDの発症を1例も認めていない.一方で免疫抑制剤の減量は拒絶反応の出現につながることを常に考慮しなくてはならず至適な免疫抑制療法をするためのモニタリング方法が必要である.1.小児における免疫抑制剤の血中濃度以外の新しいパラメーターとしてCD4+T細胞のATP活性を測定した.成人固形臓器移植術後における免疫状態の指標として,CD4陽性リンパ球ATP活性を評価した報告によるとATP活性が225ng/ml以下では免疫状態が低下した状態で感染のリスクが高まり,525ng/mlでは免疫状態が強くなり拒絶のリスクが高まるとされている.当院で小児生体肝移植を行った患児51名において拒絶・感染状態にない安定状態でCD4+T細胞ATP活性を測定したところ83-294ng/mlと成人に比較して低値をとることが判明した.またEBVの定量的PCR法にてEBVのDNA検出量とCD4+T細胞ATP活性値,急性細胞性拒絶反応とCD4+T細胞ATP活性値との間に有意な相関関係は認められなかった.2. EBV感染の診断において乳幼児における血液サンプルの採取には患児の苦痛と充分なサンプル量を得ることができない場合も少なくないため,口腔粘膜擦過および唾液の採取による定性的あるいは定量的EBV-PCRによる非侵襲的なスクリーニング法の可能性について検討した.当院で小児生体肝移植を行った患児4名において,口腔粘膜擦過および唾液をサンプルとした定量的PCR法にてEBV DNA量を測定したところ3名でEBV DNAが検出され,いずれも血中よりも高いゲノム量を示したことから,今後サンプル数を増やして検証していく方針である.国立成育医療研究センターでは2005年11月より2015年3月までに330例の小児生体肝移植術を施行しました.不顕性感染を含めて185例(56.1%)が移植後にEBVの定量的PCR解析にて陽性を示し,免疫抑制剤の減量によりPTLD(移植後リンパ球増殖症)の発症を1例も認めていない.一方で免疫抑制剤の減量は拒絶反応の出現につながることを常に考慮しなくてはならず至適な免疫抑制療法を施行するためのモニタリング方法が必要である.

1.昨年度の研究にて免疫抑制剤の血中濃度以外の新しいパラメーターとして感染リンパ球に対する細胞障害性T細胞活性の測定による患児免疫状態を評価.小児生体肝移植後におけるCD4陽性リンパ球ATP活性値の推移について検討した.EBV-PCR定量検査にて2.4×10E3copies/mcgDNA以上のゲノムが検出された場合EBV感染ありと定義した.今回の我々の検討では小児肝移植例でのEBV感染107例ではIK値が逆に有意に高値をとることを論文化した.2. EBV感染の診断において乳幼児における血液サンプルの採取には患児の苦痛と充分なサンプル量を得ることができない場合も少なくないため,唾液の採取による定性的EBV-PCRによる非侵襲的なスクリーニング法の開発.昨年度は血球中EBV-PCR検査にて10×10E4copies/mcgDNA以上のゲノムが検出された12症例に関して唾液中のEBV-PCR検査にてEBVゲノムが検出することが可能であったことを明らかにしたが,今年度は移植後早期の段階で唾液検体のゲノム数の検出能について42検体で検証を行った.血球中EBVゲノム数>10×10E2 copies/mcgDNAを陽性と設定した場合,唾液検体についてはゲノム検出されたものを陽性とすると感度50%,特異度66%であった.移植外科1.移植後レシピエントの血液サンプルを用いた定量的EBV-PCR検査を施行しゲノム数の変化を追跡する.同時に唾液により得られたサンプルを用いた定量的EBV-PCR検査を施行し症例の蓄積ができている.2. T細胞をはじめとする免疫細胞表面抗原の発現解析をImmuKnow値の測定およびフロー・サイトメトリー(FCM)法を用いて,CTL活性のモニタリングにより免疫抑制剤投与量の調節を行い,EBV感染症による移植後リンパ球増殖性疾患に罹患した患児は一人もいない.1.移植後レシピエントの血液サンプルを用いた定量的EBV-PCR検査を施行しゲノム数の変化を追跡する.同時に口腔粘膜擦過および唾液により得られたサンプルを用いた定性的EBV-PCR検査を施行し症例の蓄積ができている.2. T細胞をはじめとする免疫細胞表面抗原の発現解析をフロー・サイトメトリー(FCM)法を用いて,CTL活性のモニタリングにより免疫抑制剤投与量の調節を行い,EBV感染症による移植後リンパ球増殖性疾患に罹患した患児は一人もいない.従来のカルシニューリン阻害薬の血中濃度のモニタリングに加えて,EBV-PCRのゲノム数,フロー・サイトメトリーを新規マーカーとしてカルシニューリン阻害薬を個々の症例毎に調節し,EBV感染状態の変化,その他の感染症発生頻度,T-cellのsubsetのプロファイリングにつき検討する.唾液の採取方法の改良,検討が課題である.唾液によりえられたサンプルの定量的EBV-PCR検査法の検出率と血液中の定量的EBV-PCR検査の結果とを比較検討し,唾液サンプルによるスクリーニングの可能性の検証を継続する.
チタノセン錯体を合成素子として活用する高度鎖状立体化学制御

アリルチタノセン、アルキリデンチタノセン、チタナサイクルなどの各種チタノセン錯体を合成素子として活用することにより、連続するキラル中心を持つ鎖状系及び高度多重結合系の立体選択的構築法を開発した。本年度はアリルチタノセン、アレニルチタノセン、チタナシクロペンテンの反応性について検討し、以下の成果を得た。1.アリルチタノセンの反応による第三級anti-ホモアリルアルコールの合成---各種の置換基を持つアリル化合物から誘導されるアリルチタノセンと環状エノンとの反応を行い、相当する第三級ホモアリルアルコールが高ジアステレオ選択的に得られた。2.熱力学的に安定なアリルチタノセンの生成過程を利用する三連続不斉中心の高立体選択的構築---不斉中心を持つアリルスルフィド誘導体に二価チタノセンを作用させることによりアリルチタノセンを調製し、非対称ケトンを作用させたところ極めて高い立体選択性で三連続不斉中心を持つ第三級ホモアリルアルコールが得られた。α位に不斉中心を持つケトンを用いることにより、四連続不斉中心の立体化学の制御に成功した。3.プロパルジル化合物から生成するアレニルチタノセンの反応を利用するsyn-ホモアリルアルコールの合成---γ-シリルプロパルジルカーボネートの還元的チタン化により調製されるアレニルチタノセンにケトンを作用させることによりsyn体のホモプロパルジルアルコールが得られた。引き続く脱シリル化と三重結合の部分還元により、syn体のホモアリルアルコールに誘導することができた。4.チタナシクロペンテンを経由する不飽和化合物の立体選択的合成---アルキン、アクリル酸エステル、二価チタノセンの[2+2+1]付加環化により生成するチタナシクロペンテンに二価チタノセンとカルボニル化合物を作用させることによりγ,δ-不飽和エステルが立体選択的に得られた。Z-アルケニルスルホン、末端アレン、二価チタノセンの[2+2+1]付加環化では、生成したチタナシクロペンテンからβ脱離が進行し、加水分解の後にE,Z体の1,4-ジエンが立体選択的に生成した。本年度はアリルチタノセン、四、五員環チタナサイクルの反応性について検討し、以下の成果を得た。1.アリルチタノセンの反応による第三級anti-ホモアリルアルコールの合成-α位にベンジルジメチルシリル基を持つアリルスルフィドとカルボニル化合物の反応により、anti-(E)体のδ-シリルホモアリルアルコールが完全に位置および立体選択的に、また高ジアステレオ選択的に得られた。生成物であるホモアリルアルコールはパラジウム(0)により触媒される、または銅(II)塩により促進される有機ハロゲン化物とのカップリング反応により多置換ホモアリルアルコールに変換することができた。アリルチタノセンと環状エノンとの反応のジアステレオ選択性がアリルチタノセンの置換基とエノンの館員数に依存することを明らかにした。2.14族元素を含むチタナシクロブタンの合成と反応性の解明-フェニルチオメチル基が二個あるいは四個置換したシランおよびゲルマンに二価チタノセンを作用させることにより、14族元素を含むチタナシクロブタンが得られた。重水素との反応の結果から、これらチタナサイクルがジアニオン等価体としての反応性を持つことが確認された。3.チタナシクロペンテンを経由する不飽和化合物の立体選択的合成-(Z)-アルケニルスルホン、ヘテロ原子置換アレン、二価チタノセンの[2+2+1]付加環化で生成したチタナシクロペンテンからのβ脱離と加水分解により、(E,Z)-体のジエニルアミンおよびジエニルホスホナートが立体選択的に生成した。4.チタナシクロブテンを経由するジエニルシラン類の合成-チタンシリルメチリデン錯体とアルキンの反応によるチタナシクロブテンの生成とそのβ脱離によりジエニルシランが立体選択的に生成した。アルキンとしてシリルアセチレン誘導体を用いた場合には高い位置選択性が発現した。本年度はアリルチタノセン及びチタンカルベン錯体を利用する立体化学制御について研究し、以下の成果を得た。1)アリルチタノセンとα位にキラル中心を持つケトンの反応による三連続不斉中心の立体選択的な構築法を開発した。生成するホモアリルアルコールの立体化学はFelkin-Anhモデルで説明される立体化学を持つことが判った。反応の立体選択性は高く、特にα位に置換基を持つシクロヘキサノンとの反応では単一の立体異性体が得られた。2)アリルチタノセンと環状共役エノンの反応により得られるシクロアルケノールの立体化学を単結晶X線構造解析により詳細に検討し、アルキル基が置換したアリルチタノセンとフェニル基が置換したアリルチタノセンの反応で生成するシクロアルケノールの立体化学が異なることを明らかにした。3)γ,γ-二置換アリルスルフィドのチタノセン(mの反応は立体特異的に進行し、生成したアリルチタノセンとケトンの反応によりanti体とsyn体の連続する二つの四級炭素を持つホモアリルアルコールをそれぞれ立体選択的に合成することに成功した。

4)β位にシリル基が置換したチタンカルベン錯体とケイ素置換アルキンの反応によるケイ素置換共役ジエンの立体選択的合成について検討し、位置異性体の混合物が立体選択的に生成することを見出した。さらにベンジルジメチルシリル基が置換したアルケンの銅(I)塩により促進されるアルキル化反応を新たに開発し、上述の反応と組み合わせ用いることによる新規不飽和化合物の立体選択的合成法を開発した。5)アルケニルカルベン錯体とα,β-不飽和エステルの反応による共役トリエンの合成法を開発した。アルケニルカルベン錯体及び不飽和エステル由来の二重結合は立体保持で、新たに生成する二重結合はZの立体化学を持つ立体異性体が優先的に生成した。反応をシリルエステルに拡張することにより、エノールシリルエーテルを合成することができた。
血小板における脂質メディエーター輸送体の同定と機能解析

スフィンゴシン1-リン酸(S1P)は血小板に高濃度に蓄積されており、刺激に応答して細胞外へと放出される脂質メディエーターである。S1Pの放出過程についてはほとんど明らかとなっていない。そこで、血小板に発現するS1P分泌輸送体の同定を目指して研究を行った。巨核芽球性の培養細胞であるMEG-01細胞はDNA合成阻害剤であるアフィジコリンで処理することにより、Platelet-Like Particle(PLP)という血小板に類似した分子を産生するという報告があったため、PLPからのS1Pの放出を調べたところ、血小板と同様にトロンビン刺激依存的なS1Pの放出が観察された。そこで、PLPを血小板のモデルとし、PLPに発現するS1P輸送体の同定を試みた。まず、血小板での阻害剤を用いた生化学的解析によりABC輸送体とリン脂質スクランブラーゼ(PLSCR)が候補として見出されていたので、MEG-01細胞に発現するABC輸送体とPLSCRをreal time-PCRにより調べた。その結果、13遺伝子の発現が確認されたが、このうち細胞内膜系に発現していると報告のある遺伝子を除いた10遺伝子についてsiRNAを用意し、発現抑制を行った。各候補遺伝子の発現を抑制した後にPLPの産生を誘導し、PLPからのS1P輸送活性を測定した。abcg2の発現を抑制したところ、約30%程度放出を抑制する遺伝子が得られた。スフィンゴシン1-リン酸(S1P)は細胞膜の構成成分であるスフィンゴミエリンから合成される脂質メディエーターで血小板に高濃度に蓄積されており、刺激に応答して細胞外へと放出される。S1Pの生合成過程や受容体に結合した後のシグナル伝達についてはよく研究されているが、放出過程についてはほとんど明らかとなっていない。血小板は、巨核球の細胞質がちぎられて産生されるため核を持っておらず、分子生物学的解析が困難である。そこで、巨核芽球性の培養細胞であるMEG-01細胞を用いて解析を行った。MEG-01細胞はDNA合成阻害剤であるアフィジコリンで処理することにより、Platelet-Like Particle(PLP)という血小板に類似した分子を産生するという報告があったため、PLPからのS1Pの放出を調べたところ、血小板と同様にトロンビン刺激依存的なS1Pの放出が観察された。約30%程度放出を抑制する遺伝子が得られたが、現在再現性の確認を行っている。今回得られた遺伝子が血小板におけるS1P輸送体であることをKOマウスなどを用いて更に解析する予定である。