hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自然再生が必要な衰退林における樹木の生理生態的特性の評価

ニホンジカによる樹幹剥皮によって森林の衰退が顕著である大台ヶ原の防鹿フェンス内において,トウヒ生残木の水分生理に影響を及ぼす要因を明らかにするため,トウヒの樹液流速の測定を行った。気象要因のうち樹液流速に影響を及ぼしていたのは,全天日射量と大気飽差であり,トウヒの樹液流速の日変化パターンは全天日射量と大気飽差に類似していた。トウヒの生態的特性のうち樹液流速に正の影響を及ぼしていたのは,樹高,幹の剥皮率,辺材面積であった。トウヒ生残木は,剥皮の割合の高さを樹液流速で補償している可能性がある。大台ケ原の高標高地域に分布する針葉樹の樹皮は,過剰に増加したシカによる採食の対象となるため,そこでは針葉樹林の衰退が極めて著しい.その結果,森林に立ち枯れ木が増え,ササ原と化した場所もある.さらに,シカによる採食は後継樹となる稚樹にも及び,下層に稚樹を見つけることが容易ではなくなっている.森林の衰退は,森林が有するさまざまな機能に大きな負の影響を及ぼす恐れがあるため,衰退した森林は早急に再生させる必要がある.このような場所で森林をより自然に近い状態まで再生させるためには,トウヒをはじめとする林冠層の構成樹種を用いた自然再生手法の開発が必要である.衰退した森林において,自然再生に貢献する可能性が高い自生稚樹の生育状況を把握するために,トウヒ稚樹の生育立地ならびに成長の調査を行った.正木峠における防鹿フェンスの内外に2ヶ所ずつ設置された調査区(各100m×10m)において,稚樹の樹高,稚樹周囲のササの稈高および被度を測定した.また,ササの刈払いによる地上部除去が,トウヒ稚樹の更新を促進し,衰退林の再生に有効かどうかを検討するために,2007年以降の毎年1回周囲のササを刈り払ってきたトウヒ稚樹150個体について,樹高および直径を測定し,周囲のササの生育状況について計測を行った.なお,フェンス内外に生育するトウヒの成木を対象とした蒸発散流量の計測については,データロガーの納入が遅れたこともあり,本年度に行うことはできなかった.大台ケ原におけるトウヒなどの針葉樹の樹皮は,過剰に増加したシカによる採食の対象となり,森林の衰退が極めて著しい.森林には立ち枯れ木が増え,ササ原と化した所もみられる.さらに,シカによる採食は後継樹にも及んでおり,森林の再生が非常に困難な状況に陥っている.森林の衰退は,森林が有するさまざまな機能に大きな負の影響を及ぼす恐れがあるため,衰退した森林は早急に再生させる必要がある.このような場所で森林をより自然に近い状態まで再生させるためには,林冠層構成樹種を用いた自然再生が必要である.衰退した森林において,自然再生に貢献する可能性が高い自生稚樹の生育状況を把握するために,トウヒ稚樹の生育立地ならびに成長の調査を行った.正木峠における防鹿フェンスの内外に2ヶ所ずつ設置された調査区(各100m×10m)において,稚樹の樹高,稚樹周囲のササの稈高および被度を測定した.また,ササの刈払いによる地上部除去が,トウヒ稚樹の更新を促進し,衰退林の再生に有効かどうかを検討するために,2007年以降の毎年1回周囲のササを刈り払ってきたトウヒ稚樹150個体について,樹高および直径を測定し,周囲のササの生育状況について計測を行った.なお,フェンス内外に生育するトウヒの成木を対象に2006年と2015年の比較を行い,シカの剥皮が樹木の成長と生残に及ぼす影響を明らかにした.樹液流量の計測については,より正確に測定を行うために,センサーの数を増やすことにした.市販のセンサーは非常に高価であるため,自作が可能であり安価なグラニエセンサーを他の研究者の補助を受けて自作した.センサーは過熱するものであり,これに必要な電源を確保するため,太陽光パネルを設置し,そこからバッテリーに蓄電して,数多くのセンサーによる測定を可能な状態まで持っていった.センサーの数を増やすため,市販品のセンサーではなく,グラニエセンサーを自作したことにより時間を要した.また,増加したセンサーに必要な電源確保のため,太陽光パネルの設置など新たな作業を加えたため.紀伊半島の大台ケ原において,トウヒやウラジロモミなどの針葉樹の樹皮は,過剰なニホンジカによって摂食されやすい.このため,樹幹剥皮が原因で高木の枯死が増えることで,森林の衰退が著しい.被害の著しい場所では,森林がミヤコザサの草原と化した所もみられる.さらに,シカによる採食は後継樹にも及び,森林の再生が非常に困難な状況になっている.森林の衰退は,森林が有するさまざまな機能に大きな負の影響を及ぼす恐れがあるため,衰退した森林を早急に再生させる必要がある.このような森林をより自然に近い状態にまで再生させるためには,林冠層構成樹種を用いた自然再生が必要である.一方,鹿を排除するための防鹿柵によって,樹幹剥皮は回避できたものの,林床を高さ約80cmのミヤコザサが覆ってしまった.このため,ササによる被陰のため,樹木の実生の死亡率が高くなった.それだけではなく,ササによる水消費量の増加が,生残した成木の水利用にとって負の影響を与えることが懸念される.

さらに,柵内の生残木には,かつて受けた剥皮の痕跡が残っているものが多く,通水のうえで支障をきたしている可能性がある.そこで,防鹿柵内に生育するトウヒ成木20個体を対象に,グラニエ法による樹液流量の計測を行い,樹木の通水状況の把握を試みた.1個体当たり3つのセンサーを設置し,30秒間隔で測定した.2016年7月から同年11月まで測定を試みたが,天候不順から太陽光パネルによる電源の電圧不足,データロガーの不調が重なり,20個体について測定できたのは,8月の4日間のみに留まった.樹液流速の日変化と個体差に影響を及ぼす因子を検討した結果,樹液流速は,樹高と剥皮率による負の影響を受けることが示唆された.ニホンジカによる樹幹剥皮によって森林の衰退が顕著である大台ヶ原の防鹿フェンス内において,トウヒ生残木の水分生理に影響を及ぼす要因を明らかにするため,トウヒの樹液流速の測定を行った。気象要因のうち樹液流速に影響を及ぼしていたのは,全天日射量と大気飽差であり,トウヒの樹液流速の日変化パターンは全天日射量と大気飽差に類似していた。トウヒの生態的特性のうち樹液流速に正の影響を及ぼしていたのは,樹高,幹の剥皮率,辺材面積であった。トウヒ生残木は,剥皮の割合の高さを樹液流速で補償している可能性がある。フェンス内外に生育するトウヒの成木を対象とした蒸発散流量の測定を開始する予定であったが,環境省による許可が得られていなかったことと,計測に必要なデータロガーの納入が遅れたため.今年度,計画よりも多い20個体のトウヒにそれぞれ3本のグラニエセンサーを設置し,6月から樹液流の測定を開始する.森林生態学環境省による許可をなるべく早く取得するよう努め,また,蒸発散流量の測定を可能な限り多くの樹木を対象に行うために,センサーを自作するよう努める.樹液流量の計測については,より正確に測定を行うために,センサーの数を増やすことにした.市販のセンサーは非常に高価であるため,自作が可能であり安価なグラニエセンサーを他の研究者の補助を受けて自作した.市販センサーと自作センサーの差額などにより,次年度使用額が生じた.環境省による許可の遅れおよび研究機器の到着遅れ.計画段階よりも数多くのセンサーに増加したため,これらの配線に必要なケーブルや交換用センサーのための必要部材の購入に充てる.環境省による許可を受け,センサーなどを自作でき次第,現地において測定を開始する.
小学校の「アイヌ民族の歴史と文化」学習のための授業開発

「アイヌ民族の歴史と文化」学習を取り巻く学校や教育課程の現状を整理し、その課題を指摘するとともに、適切な授業実践と教材開発のためにどのように考え、何をしていくべきなのかを考察。また、アイディアを形にすべく、試案的に教材(自主研修のための自学自習教材・授業で使用するスライド素案)を作成するとともに、博物館などの生涯学習拠点と学校との連携を模索した。平成22年度は、主として学校現場および教育行政における現状把握のため道内小学校および教育委員会での聞き取り調査を志向し、近隣小学校、自治体の他、帯広・白糠方面での調査を行っている。小学校においては「アイヌ民族の歴史と文化」に関わる授業に関して、(1)学年、(2)教科(教科外活動)、(3)単元(含む配当時間と構成)、(4)本時の構成(内容と展開)、(5)授業内容(「アイヌ民族の歴史と文化」に関わる知識・技能等)を中心に聞き取りを行った。また、市町村教育委員会においては、「アイヌ民族の歴史と文化」に関する学習を所轄の学校で行うにあたっての、(1)基底カリキュラムの中での位置づけ、(2)教員の「アイヌ民族の歴史と文化」に関わる適切な知識・認識などの構築を支援するための研究会、研修会への取組み、(3)授業支援のための教材等の開発や購入、(4)授業支援のための人材の派遣等を中心に聞き取りを行なうとともに、資料の収集を行った。なお、8月29日9月6日に、カナダ東部の先住民による組織「シックスネーションズ」の人々(とくにモホークの人々)を訪れ、文化伝承や生態系保全の状況、子どもたち、若者たちと伝統文化のかかわりについて調査を行った。訪問した学校は、幼稚園、小学校、中学校までが一緒になっており、モホーク語による授業も行われ、小学生のころからモホーク語を話す子どももおり、今もなおモホーク文化が生活の中で生きていることを実感できる。学校内では随所にモホーク語の掲示やモホーク語・モホーク文化に関する教材があり、活用されていた。シックスネーションズにおいては、日常生活を含めた人々の活動の総体に、伝統文化が「息づいている」ことが強く実感され、アイヌ文化を取り巻く現状との落差も浮き彫りとなった。アイヌ文化の置かれた現状を少しずつ変えていくために、学校教育、ことに初等教育の持つ重要性を再確認することができた。平成23年度は、前年度に引き続いて学校現場および教育行政における現状把握のため、小学校、博物館および教育委員会での聞き取り調査を行った。今年度は釧路方面(釧路・阿寒湖畔・弟子屈)、オホーツク枝幸方面での調査を行なうとともに、松浦武四郎ゆかりの地である三重県松阪市の市教委、小学校、博物館においても調査を行った。博物館では近隣小学校との連携教育についてその教育内容と方法や独自教材について、また、市町村教育委員会においては、「アイヌ民族の歴史と文化」に関する学習を所轄の学校で行うにあたっての、(1)基底カリキュラムの中での位置づけ、(2)教員の「アイヌ民族の歴史と文化」に関わる適切な知識・認識などの構築を支援するための研究会、研修会への取組み、(3)授業支援のための教材等の開発や購入、(4)授業支援のための入材の派遣等を中心に聞き取り、資料を収集した。研究代表者・分担者と小学校、町教委、博物館で勤務する研究協力者4名の連携を深める目的で、年度後半期(12月>と年度末(3月)に「研究報告会」を行った。ここでは、具体的な授業の構成やそこでの考え方などの意見交換を行うとともに、本研究の社会還元のために開催する予定(平成24年11月)のシンポジウム、および最終報告書の作成に向けて具体的な形が構成できる様に過去二年間のまとめを行い、次年度の行動計画と各自の達成目標の確認を行った。前半期に当該年度交付金額が不透明になったため、調査の最適期(本務の少ない7-9月)で予定していた調査を控える事となった。結果として、大学での授業がない2-3月に調査が集中する事になったが、現場の学校では既に年度末を迎えているため、当初予定していた調査とは異なった状祝となった。遠隔地での調査に支えられる本事業の性格上、時間とお金という二要素の影響は大きく、平成23年度の場合は未曾有の大災害に対して国家的な規模での対応が求められた結果であり、本事業においては当該年度の遅れは不可避であった。本事業の最終目標として掲げている「具体的で実践可能な授業案」構成のため、研究代表者・分担者・研究協力者の各々が前半期に具体的「授業素案」を構成し、6月と9月に予定されている研究報告会を通して熟成を図る。

その後、11月に本事業主体のシンポジウムを行い本事業実践成果の社会還元を図るとともに、参加者(出席者)の意見・批判等を仰ぎつつ「授業案」の完成を志向していく。これらの「授業案」は、本事業最終報告書の中で、担当者の解説付きで活字化する予定なので、12月以降はその完成に向けて事業を動かしていく事になる。なお、本事業で重要な柱に位置づけられている、学校、博物館、教育委員会での現状把握(聞き取り)調査は、今年度も(とくに前半期に)継続して行う予定である。
下顎歯肉癌における発現分子の網羅的解析とネトリン１の関与の解明

歯肉癌組織において腫瘍が発現する分子を免疫染色法で調べたところ、MICA/MICBの陽性度が高かった。また、netrin-1の骨代謝における機能を調べたところ、骨芽細胞分化を抑制し、破骨細胞分化を促進させた。歯肉癌組織においてはMICA/MICBが腫瘍の進展に、またnetrin-1が骨破壊に関与している可能性が示唆される。下顎歯肉癌は、下顎骨への浸潤形式により手術方法が決定されるため、癌浸潤がどこまですすんでいるかを診断することは非常に重要である。下顎歯肉癌において発現する分子によって、重症度・進行度の分類が可能かどうかを検討するために、これまで下顎歯肉癌患者の手術で切除した検体4例において組織学的検討を行った。癌に関わる分子として、ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, VCAM-1, N-Cadherin, E-Cadherin, MICA/Bについて注目した。下顎歯肉癌検体において、これらのタンパク質の局在を調べるために免疫染色を行ったところ、検体の正常歯肉の領域に比較して歯肉癌の領域ではE-Cadherin, MICA/Bの発現が増強されていた。癌には血管新生が重要であり、血管内皮細胞より産生されるnetrin-1が癌の進行・骨吸収に関係するかどうかを細胞レベルで検討する目的で、マウス脳からnetrin-1のcDNAを抽出して遺伝子を環状DNA(プラスミド)に挿入するクローニングというものを行った。昨年度、netrin-1のクローニングを行い、プラスミド(pNtn1)の作製に成功した。本年度はnetrin-1が癌の骨吸収に関係するかを調べるため、細胞レベルでの実験を行った。骨分化を促進するBMPはnetrinの受容体に作用することが知られているため、BMP(BMP-2またはBMP-4)存在下でのnetrin-1の骨芽細胞に対する作用を解析した。BMP-4を強制発現させた骨芽細胞にrecombinant netrin-1を作用させたところ、ALP発現の低下を引き起こすことが分かった。骨芽細胞にpNtn1を遺伝子導入したところ、ALPおよびcollagen 1A発現が低下した。また、骨芽細胞にどのnetrin受容体が発現しているのかを検討したところ、neogenin 1, Unc5b, ADORA2Bが発現していることが明らかとなった。一方で、昨年度と同様に20例ほどの検体でE-CadherinおよびMICA/MICBの発現を免疫染色で検討したところ、すべての検体でMICA/MICBの発現を確認した。歯肉癌組織におけるnetrinの発現が当初の予想より弱いためそれ以外の分子の発現についても調査を要するため。また高発現分子とnetrin-1との関連性についても今後明らかにする必要がある点。昨年度、netrin-1が骨芽細胞のALP発現を低下させること、骨芽細胞にはnetrin受容体のうち、neogenin 1, Unc5b, ADORA2Bが発現していることを見出した。そこで、neog enin1, Unc5b, ADORA2Bそれぞれの受容体をノックダウンさせた骨芽細胞にnetrin-1を作用させた場合、ALP発現がどうなるかを検討した。まず、骨芽細胞にneogenin1, Unc5b, ADORA2Bそれぞれの受容体をノックダウンさせたところ、mRNAレベルで各受容体の遺伝子発現が低下していた。次に、ne ogenin 1, Unc5b, ADORA2Bそれぞれの受容体をノックダウンしてnetrin -1を作用させたところ、ALP発現は低下していた。ところが、neogenin 1, Unc5bの組合せ、Unc5b, ADORA2Bの組合せ、neogenin1, ADORA2Bの組合せで各2つの受容体を同時にノックダウンしたところ、ALP発現は低下せずにコントロールと比較して変化がなかった。このことから、netrin-1によるALP発現の調節はneogenin 1, Unc5b, ADORA2Bのいずれかの受容体の2つの組み合わせが必須であることが示唆された。netrin-1の解析についてクローニングを行ったが、細胞実験を開始できていないため。今後はBMP-4存在下、neogenin1, Unc5b, ADORA2Bそれぞれの受容体をノックダウンさせた骨芽細胞にnetrin-1を作用させた場合、ALP発現はどうなるかを検討する。また、netrin-1が骨芽細胞のRANKL発現を誘導するかどうかも検討する。一方で、MICA/MICBが歯肉癌細胞株に発現しているかどうかを調べ、発現していた場合、強制発現により歯肉癌細胞がRANKLあるいはnetrin-1を誘導するかどうかを調べる。頭頸部癌生化学実験関係の消耗品の使用が、必要と見込んだ金額よりも少なく済んだため。組織学関係の消耗品が必要と見込んだ金額よりも少なく済んだため。翌年度の実験では生化学実験の消耗品費用に充てる予定である。翌年度の実験では、生化学実験の消耗品の費用として計上する。
ヘルペスウィルス再活性化による抗腫瘍効果の機序とその最適化点の解明

サイトメガロウィルス再活性化と造血幹細胞移植後の再発抑制効果に関する研究は、世界中から報告があるが、その機序に関しては未だ明らかとなっていない。サイトメガロウィルス特異的T細胞、NK細胞、γδT細胞などが関与しているとの報告もあるが、様々な細胞分画に関して系統だって解析された研究は未だない。本研究では、サイトメガロウィルスによる抗腫瘍効果の担い手がどの細胞分画であるのかを明らかにすることを目的としており、そのためサイトメガロウィルスの再活性化時に起こる細胞分画の変化の解析を開始した。研究代表者の施設のみならず、関東の研究協力施設において、造血幹細胞移植を行う症例を対象として、移植前1回と生着後から移植後100日までの週1回血液を採取し、定量PCR検査にて、サイトメガロウィルス再活性化の有無を調べた。また同時に、血液細胞を用いて、FACS解析にて各種細胞分画(CD4陽性細胞、CD8陽性細胞、CMV特異的CD4細胞、CMV特異的CD8細胞、制御性T細胞、NKT細胞、NK細胞)および、各細胞におけるPD-1あるいはPD-L1の発現の解析を行った。かなり詳細の細胞分画の解析を行っているため、細胞数の少ない分画では評価が難しい部分があるが、症例の蓄積を図って最終解析を行う予定である。移植後100日以内で再活性化が起こる前に再発した症例では、その時点で解析を終了とした。研究代表者の施設異動のため、倫理委員会への再審査や研究環境の再設定に時間がかかり、症例の蓄積が遅れているため、再活性化症例として50症例を目標として、今後症例数の蓄積を行っていく。所属施設の変更もあり、倫理審査など研究遂行のための準備に時間がかかったため。現時点で行っている検体採取および解析を継続していく。症例数を増やすために、研究協力施設を増やす予定である。本年度は所属施設の異動があり、研究実施が思うように進まなかったため、研究費が繰り越しとなった。研究協力施設を増やすことにより、遅れている検体収集を増やしていく予定である。
鉛直・水平二方向同時加振性能を有するドラム型遠心装置の試作

Physical modelingは地盤工学において近年著しい進歩を遂げている分野の一つである。そのなかで、ドラム型遠心装置は、ビーム型遠心装置にない利点があり、その利用の検討が進められている。研究代表者は、2つのドラム型遠心を試作し、1991年以来ケンブリッジ大学と共同して地盤工学教育用の小型ドラム型遠心装置を開発し、1994年以降広島大学で稼動している。本研究は、直径1.2mのドラム型遠心装置を東京工業大学に設置し稼動確認をするとともに、遠心場で水平・鉛直振動を与える装置の開発を目指したものである。本研究による研究実績は、ドラム型遠心装置内で模型地盤の作成方法の開発および多様な載荷装置を開発したことである。模型地盤作成方法では、砂地盤、不撹乱試料、粘土地盤、サンドコンパクションで改良された粘土地盤、ベントナイト層と砂層の互層地盤の5種類の多様な模型地盤作成方法を開発・確立した。載荷装置としては、引き抜き・貫入試験装置、波動発生装置による試験法を開発・確立した。地震動作成方法として、代表者が開発した水平方向加振装置作成の経験をベースに、ビーム型遠心で開発されたバンピーロードシステムのドラム型版として、ドラム回転中に容器部分にあたる遠心チャンネルに衝撃を与えることで地盤内に多様な上下振動成分を負荷する装置を試作したほか、多様なコンセプトを提示した。しかし、ドラム型遠心の回転エネルギーに対して、打撃による遠心チャンネルへの入力エネルギーは十分でなく、本方式では、十分鉛直振動を付与することができなかった。本研究は鉛直・水平二方向同時加振性能を有するドラム型遠心装置の試作し、その性能を確認することが主題である。研究初年度では、ドラム型遠心装置の設計・試作に集中した。試作された装置は、直径1.20m、幅0.2mの円筒回転容器が脱着可能な回転盤を有した軸を持ち、最大480Gまで遠心加速度を容器に付与することが出来、原型寸法で長さ1800m、幅100m、深さ150m程度の長大な面積と大深度の有する地盤の応力状態を再現可能な装置である。当初申請予算の削減により回転容器、コントロール装置は別途研究予算を用いて制作した。これにより研究次年度より加振装置の開発に専念できる環境が整った。併せて、代表者が広島大学に導入設置した既設の直径0.8mのドラム型遠心装置を用いて、加振システムの構造について検討を加えた。検討したのは、震動板の機械的な打撃による方法、モータの回転運動を震動運動に変換する方法、および落体による衝撃による方法である。そこで最も安定的に震動運動が得られたのは、モータを用いた方法であり、これを用いて液体の加振を行う予備的実験をおこない、これが砂質地盤の水平方向加振時の液状化挙動の研究に活用できることが判明した。今後、落体による鉛直加振との複合システムにより鉛直・水平両方向加振が可能となることが期待される。平成9年度は,昨年度導入したドラム型遠心装置の運転開始から,短期・長期運転時の温度の安定性等の性能確認までおこなった.導入直後から回転動力モーター及びそのインバータ-に問題があり,最大回転数(850r.p.m)まで上昇させることができなかった.そのため本来ならば,本年度中に行う予定であった加振装置を製作を延期し,装置の基本的性能の確認と計測装置の開発を中心に行った.動力モーターについては,遠心装置本体の振動の抑制及びインバータ-の設定を変更することにより,短時間で目標遠心加速度場となるまで回転数を上昇させることができるようになった.これについては,ほぼ同時期にドラム型遠心装置を導入した西オーストラリア大学との議論と,代表者が広島大学で既に導入設置した小型遠心装置の経験が非常に役に立った.その後、長期運転時の回転・温度の安定性について検討した.これは模型地盤を回転容器内に堆積させた後の圧密に必要な時間を考え,24時間連続運転を行い,その振動及び温度変化を測定した.

その結果,回転数はほぼ一定値であるが,温度については前半の12時間で徐々に上昇し,その後一定値となることが分かった.この温度の上昇は実験上問題とならない範囲であり,実験が安定して行える条件であることを確認した.現在は、回転容器の加振システムの開発を行っており,来年度には振動実験を行う環境が整う予定である.平成10年度は,遠心模型実験装置の排水経路および計測用スリップリングの整備を行った.これにより,地盤内に設置したセンサーによる計測が可能となった.また,振動実験を行うにあたり,既存のビーム型遠心模型実験装置を用いて,模型め寸法の影響を比較するための補強土斜面の実験を行った.その結果得られた結果を以下に示す.1)補強材敷設長さが短くなると、補強領域が一体化し、この部分の滑動およびせん断変形によって水平変位が決まる。2)敷設長さを長くすると、補強領域の滑動およびせん断変形を抑制するが、敷設間隔には依存しない。3)敷設長さの短い場合、敷設間隔を密にすることにより、補強歯域の局所的なせん断変形を抑制する。4)振動中、補強領域では水平変位が卓越し、未補強領域では補強領域の水平変位による落ち込みが見られる。5)補強領域と未補強領域の境界背後で最大の沈下を生じる。
大脳高次視覚領における視覚・内眼筋運動連関の神経機構についての研究

本研究では焦点調節(内眼筋運動)について、その手掛り刺激から制御パラメ-タを得る過程で、ネコ大脳高次視覚領の1つ(外側上シルビウス領、LSA)が果たす役割について研究を行った。実験には記録・刺激用チェンバ-を装着したネコを用いた。ケタミンで導入、笑気麻酔下でガラミンで不動化し、眼の屈折力を赤外線オプトメ-タ、瞳孔面積を赤外線瞳孔計を用いた記録した。ニュ-ロン活動の記録・脳内微小刺激にはダングステン電極を用いた。結果は次の通りであった。(1)自発性の焦点調節に先行して活動するLSAニュ-ロン(焦点調節ニュ-ロン)の60%でその活動と屈折力増加の立上り速度との間に有意な相関が認められた。(2)動物に接近・離反する視覚対象の動きに選択性を持つ視覚ニュ-ロン群の25%は焦点調節ニュ-ロンであった。(3)本研究経費で制作した視覚刺激装置を用い、視標の接近・離反運動に含まれる視覚刺激要素を分離した結果、焦点調節ニュ-ロンは視標の大きさ変化に応答し、両眼視差の変化には応じなかった。前者は焦点調節の動的要素を引き起こす重要な手掛り刺激であり、従ってこれらのLSA焦点調節ニュ-ロン群は焦点調節系における視覚・運動連関の接点の1つであると結論した。(4)脳内微小刺激と解剖学的標識を組合せ、LSA内焦点調節領域から瞳孔領域に到る機能的結合を示した。以上の結果から、LSAは自己とその周囲空間との相対的位置関係の視覚的分析のみではなく、焦点調節にかかわる視覚情報が運動系へ受け渡される過程、すなわち視覚・内眼筋運動連関に寄与することが示された。
微小環境構築による乳歯歯髄幹細胞(SHED)の動態制御と口蓋裂骨再生治療への応用

本研究の全体構想は、再生医療における細胞の供給源として、高い増殖能および多分化能を有し、歯科治療で比較的容易に入手可能な乳歯歯髄幹細胞由来間葉系幹細胞(SHED)の有効性を明らかにし、口腔および顎顔面領域の骨再生医療に応用することを目指した検討を行うことであった。平成28年度では、SHEDの骨再生関連特性の検討を目的とした、骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)や歯髄由来間葉系幹細胞(DPSCs)との比較検討の結果、いずれも同等の骨分化能を有していることが明らかとなった。平成29年度では、再生組織の微小環境の変化を明らかにするため、BALB/c-nuマウス骨欠損部へのSHED/CAP担体移植を行った。μCTによる評価では、SHED移植群では対照群と比較して有意な骨再生が認められ、BMSCs群、DPSCs群に比較してより高い骨再生傾向が認められた。平成30年度では、動物実験による検討を継続して行った。BALB/c-nuマウス骨欠損部へのSHED/CAP担体移植後、蛍光標識したMSCsをラット血管へ投与したところ、MSCsの移植部への集積が明らかとなった。さらに、経時的検討を行ったところ、蛍光標識MSCsは、移植後15日で移植直後に比較して約30%にまで減少することが明らかとなった。また、再生骨体積率は、SHED群、hDPSCs群、hBMSCs群、対照群の順に大きな値を示した。細胞を移植した3群と対照群との間にはそれぞれ有意差は認められたが、3群間には有意差は認められなかった。SHEDの高い増殖能と骨再生能が明らかとなり、骨再生治療に有用であることが示唆された。本研究の全体構想は、再生医療の細胞供給源として、高い増殖能および多分化能を有し、歯科治療において比較的容易に入手できる乳歯歯髄由来間葉系幹細胞(SHED)の有効性を明らかにし、口腔領域の骨再生医療に応用することを目指した検討を行うことである。平成28年度の研究計画では、SHEDの特性を検討した。蛍光免疫染色法により、オステオカルシン、アグリカンおよびFABP4の発色が観察され、骨分化、軟骨分化および脂肪分化が確認された。また、幹細胞の骨芽細胞分化能について、骨分化マーカー発現の経時的変化を調べた結果、高い分化能を有していることが明らかとなった。また、アルカリフォスファターゼ活性の変化においても、同様の結果が示された。しかし、骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)および歯髄由来間葉系幹細胞(DPSCs)と比較して有意差は認められなかった。これまでの検討により、SHEDはBMSCsやDPSCsなどと比較して高い増殖能を有している一方、分化能についてはほぼ同等の能力であるという特性が明らかになったことは、再生医療への応用を目指した今後の研究計画のために極めて有意義な成果であると考えられる。また、炭酸アパタイト未焼結担体を免疫不全マウス頭頂骨に作製した骨欠損部に移植し、幹細胞の動態を検討するための条件検討を行い、モデルを確立した。来年度の動物実験計画が円滑に行われる可能性が高まったことは重要なことである。今後の実験動物を用いた検討では、SHED移植の至適条件の探索を併せて行う必要がある。当初計画通りに、今年度の研究計画に沿った培養実験を実施した。動物実験は免疫不全マウスを用いたモデル作製に多くの条件検討を要したが、安定した条件を確立できた。本研究の全体構想は、再生医療における細胞の供給源として、高い増殖能および多分化能を有し、歯科治療において比較的容易に入手可能な乳歯歯髄幹細胞由来間葉系幹細胞(SHED)の有効性を明らかにし、口腔および顎顔面領域の骨再生医療に応用することを目指した検討を行うことである。平成28年度では、骨再生に関連したSHEDの特性を検討することを目的として、骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)や歯髄由来間葉系幹細胞(DPSCs)との比較検討を行った結果、これらと同等の骨分化能を有していることが明らかとなった。さらに、平成29年度では、再生初期の担体の吸収と、これに続く新生骨の形成を評価することにより、再生組織の微小環境の変化を明らかにするため、ラットを用いた骨再生実験を行った。NOD-SCIDマウス骨欠損部へのSHED/p-CAP担体移植による骨再生を検討した結果、μCTによる評価ではSHED移植群において対照群と比較して有意な骨再生が認められ、BMSCs群、DPSCs群に比較してより高い骨再生が見られる傾向が認められたものの、有意差は認められなかった。また、HE染色の結果においてもSHED群では骨細胞の封入を伴う成熟した層板骨が髄膜に沿って認められた。一方、MT染色では髄膜側に沿ってコラーゲン線維の分布が認められ、骨組織の形成が明らかとなった。コラーゲン線維および類骨の面積率では、SHED群、BMSCs群、DPSCs群、対照群の順に大きい値を示した。当初計画通りに、今年度の研究計画に沿った免疫不全ラット動物実験を実施した。その結果、SHED移植群において、対照群に比較して有意に高い骨再生が認められたことにより、SHEDの高い骨誘導能が実証された。間葉系幹細胞の蛍光標識について予備実験を行い、経時的検討を行う準備を完了した。

本研究の全体構想は、再生医療における細胞の供給源として、高い増殖能および多分化能を有し、歯科治療で比較的容易に入手可能な乳歯歯髄幹細胞由来間葉系幹細胞(SHED)の有効性を明らかにし、口腔および顎顔面領域の骨再生医療に応用することを目指した検討を行うことであった。平成28年度では、SHEDの骨再生関連特性の検討を目的とした、骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)や歯髄由来間葉系幹細胞(DPSCs)との比較検討の結果、いずれも同等の骨分化能を有していることが明らかとなった。平成29年度では、再生組織の微小環境の変化を明らかにするため、BALB/c-nuマウス骨欠損部へのSHED/CAP担体移植を行った。μCTによる評価では、SHED移植群では対照群と比較して有意な骨再生が認められ、BMSCs群、DPSCs群に比較してより高い骨再生傾向が認められた。平成30年度では、動物実験による検討を継続して行った。BALB/c-nuマウス骨欠損部へのSHED/CAP担体移植後、蛍光標識したMSCsをラット血管へ投与したところ、MSCsの移植部への集積が明らかとなった。さらに、経時的検討を行ったところ、蛍光標識MSCsは、移植後15日で移植直後に比較して約30%にまで減少することが明らかとなった。また、再生骨体積率は、SHED群、hDPSCs群、hBMSCs群、対照群の順に大きな値を示した。細胞を移植した3群と対照群との間にはそれぞれ有意差は認められたが、3群間には有意差は認められなかった。SHEDの高い増殖能と骨再生能が明らかとなり、骨再生治療に有用であることが示唆された。平成29年度では、これまでに検討したSHEDやCAPの至適条件を適用して、免疫不全マウス頭頂骨欠損モデルを用いた骨再生の検討を行う。平成30年度では、これまでに得られたデータを元に、動物実験による検討を継続して行う。蛍光標識した間葉系幹細胞の血管への投与後の、移植部への集積動態を検証するとともに、CAP担体の吸収とこれに続く骨再生との関連性を明らかにする。再生骨への歯の移動を想定した実験により、歯の移動に伴う再生骨の組織変化について検討を行う。条件検討のための動物実験の必要性(理由)これまで得られた結果に基づいて、さらなる動物実験を中心とした予備的な検討を行ったことが、次年度使用額97030円が生じた理由である。(使用計画)次年度における試薬、実験動物、器具の購入次年度における試薬、実験動物の購入
看護組織における行動センサ解析を用いたコミュニケーションに関する経営学的研究

行動センサ技術(電子バッジ)を用いて大学病院の看護師のコミュニケーションを測定し、会話量や経路、境界連結者の推定に成功した。1管理業務を担う看護師(師長・主任)は病棟内外でのコミュニケーション活動に大きな影響を与えていること、2男性看護師がより多くの看護師と連携を図る傾向があること、3アサーティブ得点の中得点者は高得点者と低得点者のコミュニケーション経路を繋ぐキーパーソンになり得ることを明らかにした。本研究を通じて、コミュニケーションの可視化が、看護組織の活性化とチーム医療の実現、有効な人事評価とジョブローテーションに繋がる可能性を示した。成果は看護組織の発展のために広く社会に発信している。平成26年度は、病棟内コミュニケーション変数(コミュニケーションの経路、時間、量、場所)を客観的に評価し、医療業務のパフォーマンス変数(協働作業認識、チームワーク、医療安全文化、インシデント数、職務満足度、職業性ストレス等)との関連について統計学的根拠を示すことを目的に、1大学総合病院(産婦人科、26名)、1大学単科病院(精神科、33名)の各1病棟に所属する看護師を対象に行動センサを用いたコミュニケーションの評価(14日間)と医療業務パフォーマンスを評価する質問紙調査が実施された。B大学単科病院については、看護組織におけるフェイス・トゥ・フェイスのコミュニケーション・チャネル、ソーシャル・シグナルに関する解析が行われた。とりわけ、調査期間中の一日当たりのコミュニケーション量と全勤務時間のコミュニケーションの総量を基にしたコミュニケーション頻度に着目し、病棟内の看護師間ネットワークと人間関係に関する分析を実施した。その結果、精神科病棟のコミュニケーションにおいては男性看護師が管理職、スタッフ看護師の双方に対し強い影響力を有すること、看護師長や主任看護師の重要性と同時にベテラン看護師が重要であることが示唆された。また、一日当たりのコミュニケーション量に着目した場合、より個々人の緊密な結びつきを示すコミュニケーション・ネットワークが示され、2週間のコミュニケーション総量に着目した場合、人間関係が明瞭かつ如実に浮かび上がることが明らかになった。行動センサを用いた調査手法を確立し、今後のコミュニケーションの客観的評価に関する研究への先鞭をつけたことに本研究の一定の意義がある。さらには、看護師長や主任看護師など管理職の看護師が、看護組織の活性化に重要な役割を果たすことがコミュニケーション・ネットワークに対する客観的評価により示唆されたことは、コミュニケーション研究の大きな前進である。平成27年度は平成26年度に調査を実施した大学病院精神科病棟(30名:男性16名、女性14名)と大学病院産科病棟(26名:助産師21名、看護師5名)のキーパーソン(主に管理職者)に対し、得られた結果を適切に解釈するための面接調査を実施した。さらに、各病院で研究成果報告会を開催し、2病棟の調査結果を現場に還元した。研究協力者のうち希望者には個人フィードバックシートを作成して手渡した。そこで報告した主な研究成果は次の4点である:1男性看護師がコミュニケーション経路を繋ぐキーパーソンであったこと、2アサーティブ得点の高得点者と低得点者がそれぞれコミュニケーションネットワークを構築する傾向があったこと、3アサーティブ得点の中得点者が高得点者と低得点者のコミュニケーション経路を繋ぐキーパーソンであった、4アサーティブ得点の高い者のコミュニケーション量は中程度であること。これに加え、平成27年度は大学病院外科病棟(29名:女性29名)を対象とするコミュニケーション測定と質問票調査を実施した。外科病棟のデータは平成28年度の成果発表に向けて現在解析中であるが、平成28年度前半には精神科病棟や産科病棟との差異を検証し、外科病棟への研究成果報告会と個人フィードバックシートの返却を行う予定である。これまで実施した精神科病棟、産科病棟、外科病棟の調査を通して、医療機関を対象に行動センサによるコミュニケーション測定を実施するためのガイドラインも整備されつつある。以上の研究成果をもとに、平成28年度は「行動センサを用いた病院内コミュニケーションの評価マニュアル(研究者向け)」と「病院内コミュニケーションの改善マニュアル(実務者向け)」の開発を行う予定である。平成27年度は精神科病棟と産科病棟病のコミュニケーションで重要な役割を担っていると判断されたキーパーソン(主に管理職者)への半構造化面接を実施したことにより、平成26年度中に予定されていた調査を終えることができた。さらに、当初の研究計画に従い、外科病棟を対象とするコミュニケーションの測定と質問票調査を完了することができた。外科病棟のキーパーソンに対する半構造化面接は平成28年度前半に終える予定である。なお、コミュニケーション測定に使用する行動センサと赤外線ビーコン、専用PCのリース費が高騰したため、サンプルサイズの削減(1病棟分の調査)を余儀なくされたが、本研究の目的を達成するために必要となる最低限のデータは既に確保できたため、現在までの達成度は概ね順調であると判断した。平成28年度は、平成26年度と27年度に実施した大学病院精神科病棟(30名:男性16名、女性14名)と大学病院産科病棟(26名:助産師21名、看護師5名)を対象にした、行動センサを用いたコミュニケーション評価と医療業務パフォーマンスを評価する質問紙調査、そして得られた結果を適切に解釈するための面接調査によって得られた知見の社会的還元に努めた。

具体的には、「行動センサによるコミュニケーション測定を実施するためのガイドライン(研究者・実務者向け)」、「行動センサを用いた病院内コミュニケーションの評価マニュアル(研究者向け)」、「病院内コミュニケーションの改善マニュアル(実務者向け)」をまとめ、国内外の学会における公開シンポジウムや研究発表、地方自治体での市民講座(東京都や千葉県、神奈川県などを中心に多数)や、全国の国公私立病院の看護師研修会での講師を務めることで、看護組織・医療組織の発展のために本研究の成果を社会に発信した。行動センサ技術(電子バッジ)を用いて大学病院の看護師のコミュニケーションを測定し、会話量や経路、境界連結者の推定に成功した。1管理業務を担う看護師(師長・主任)は病棟内外でのコミュニケーション活動に大きな影響を与えていること、2男性看護師がより多くの看護師と連携を図る傾向があること、3アサーティブ得点の中得点者は高得点者と低得点者のコミュニケーション経路を繋ぐキーパーソンになり得ることを明らかにした。本研究を通じて、コミュニケーションの可視化が、看護組織の活性化とチーム医療の実現、有効な人事評価とジョブローテーションに繋がる可能性を示した。成果は看護組織の発展のために広く社会に発信している。平成26年度は当初の研究計画通り、予備調査と1大学総合病院における本調査が実施された。大学単科病院を対象とした予備調査においては、行動センサを用いたコミュニケーションの安全な測定方法および測定バイアスの検討を行った。行動センサの着衣への取り付け方法などにおいて若干の修正があったものの、概ね計画した手法を用いた調査の実施が可能であることが示された。1大学病院を対象とした調査では、行動センサを用いた2週間のコミュニケーション測定、質問票調査が実施された。当初研究計画においては、キーパーソンに対する半構造化面接調査と多重役割マップ調査が平成26年度中に実施される予定であった。しかし、行動センサにより評価されたコミュニケーション変数の解析においては、解析の視点によりキーパーソンが異なることが明らかになったため、多様な視点からコミュニケーション・ネットワーク、コミュニケーション・チャネルの解析によるエビデンスを蓄積したうえで面接対象者の選定を行うこととした。平成26年度終了時点において、本研究は面接調査(多重役割マップを含む)を除き、概ね順調に進捗しており、今年度に予定する2度の行動センサを用いた調査の計画も順調に進められている。今年度は予定する2病棟での行動センサによるコミュニケーション評価をつつがなく進めることが第一の課題である。その調査を終了次第、コミュニケーション変数と医療業務パフォーマンスに関するデータ解析、コミュニケーション・ネットワークにおけるキーパーソンとベストチームの特徴を示すためのデータ解析に着手する。平成28年度は、これまで(平成26年度から27年度)の研究成果を統合し、行動センサ評価を用いたコミュニケーションの測定および評価手法に関する「病院内コミュニケーションの改善マニュアル(実務者向け)」と「行動センサによるコミュニケーションの評価マニュアル(研究者向け)」の開発に着手する。マニュアルの開発にあたっては、実用性や現場の即応性を高めるために、協力医療機関の看護部長、調査対象病棟の師長、経営学、医学、看護学、統計解析の専門家によるディスカッションを複数回実施する予定である。
ラミニンα4鎖G領域のヘパリン結合領域の解析

1.サブ領域G4のどのアミノ酸がヘパリン結合活性に影響を与えるか?一年目から継続して行なったサブ領域G4内のヘパリン結合に関与するアミノ酸を部位突然変異法により探索し、申請者は四つのアミノ酸R1520,K1531,K1533,K1539が結合に関与するという結果を得た(Yamashita et al.,J Mol Biol,2004)。2.サブ領域G45の三次元構造の解析一年目から継続して行なったサブ領域G4-5の三次元構造解析は、解析に最適な結晶を得る事ができなかった。3.生体内にヘパリン結合性ラミニンα4鎖G領域分解産物は存在するか?大量にマウス血清を採取できなかったという問題点も残るが、申請者らが解析した結果ではマウス血清中にラミニンα4鎖G領域分解産物は存在していなかった。4.高ヘパリン結合性ラミニンα4鎖G領域が癌細胞の浸潤・転移にもたらす影響の解析申請者は、ラミニンα4鎖G領域を構成するサブ領域G1からG5をGST融合蛋白として作製しHuman fibrosarcoma HT1080細胞への接着を解析した。その結果、G4にのみ強い細胞接着活性が存在し、その結合はヘパリン添加、細胞のヘパリチナーゼ酵素処理により激減した。また、G4に結合する細胞受容体を解析した結果、ヘパラン硫酸プロテオグリカンの一つであるシンデカン-4であるという結果を得た(現在、投稿中)。1、サブ領域G4のどのアミノ酸がヘパリン結合活性に影響を与えるか?申請者は、現在までにラミニンα4鎖G領域のサブ領域G4をGST融合タンパクとして大腸菌に発現させた。発現させたタンパク質は予想どうりヘパリン結合活性を持つことを確認した。さらにG4内のヘパリン結合に関わると考えられる27種類の塩基性アミノ酸を部位突然変異によりアラニンに置換した変異体タンパク質を作製した。これらのタンパク質は、SDS-PAGE電気泳動とα4鎖G領域Polyclonal抗体を用いたWestern blotを行い確認した。現在これらの27種類の変異体タンパク質のヘパリン結合活性への影響を調べている最中である。2、サブ領域G45の三次元構造の解析申請者は、現在までにサブ領域G45を哺乳類細胞に発現させるためのプラスミド(pEFneoα4G4-5)を作製し、CHO細胞DHFR遺伝子欠損株にDHFR遺伝子と共発現させG418,MTXにより安定発現株を選別しG45タンパク質を大量に発現、分泌する細胞を確立した。この細胞の培養上清からヘパリンカラム、ゲルろ過カラムにより結晶化に使用できる混合物を含まないG45タンパクを精製した。このタンパク質は、SDS-PAGE電気泳動、α4鎖G領域Polyclonal抗体を用いたWestern blot、N末端アミノ酸シークエンスを行い確認した。また、G45タンパク質を用いて抗G45polyclonal抗体を作製した。現在、Hampton reserch社の結晶化キットを用いたHanging drop法により結晶化を試みている。
イソプロテレノ-ルで誘導される唾液腺システインプロテア-ゼ阻害物質に関する研究

我々が発見したラットシスタチンS(RCS)は、ファミリ-2シスタチンに属するシステイン阻害物質である。(1)RSCはシステインプロテア-ゼであるパパイン(阻害定数:0.1nM)とフィシン(阻害定数:0.2nM)を競合的に強く阻害し、ブロメラインとカテプシンCを部分的に阻害した。セリンプロテア-ゼであるサリプシンとカリクレインは阻害しなかった。(2)RSCの分子内の2個のジスルフィド結合は、活性に必須であった。一分子のRSCは、一分子のプロテア-ゼと結合してプロテア-ゼ活性を阻害することが明らかとなった。(3)RSCのpH安定性(pH112の溶液で1時間処理)と熱安定性(100°C、1時間処理)は、非常に高いことが明らかとなった。(4)感染にシステインプロテア-ゼが関与する細菌等(口腔内常在細菌等総計18種)に対する抗菌活性を調べた結果、歯周病の病原菌であるBacteroides gingivalisの発育を殺菌的に抑制することを発見した(ディスク拡散法:最小有効量;75μg/ディスク)。(5)ラットに交感神経βー受容体作動薬であるイソプロテレノ-ルを投与すると、顎下腺の肥大・増殖に伴って大量のRSCが誘導されるが、何故このような生体応答が生じるのかは不明であった。植物由来のシステインプロテア-ゼであるパパイン(パパイア)をラットの口腔内に投与すると、投与量と投与日数に依存的に、顎下腺の肥大・増殖を伴う大量のRSCが誘導されることを発見した。この生体応答に対するプロテア-ゼの特異性を検討した結果、イチジクに存在するフィシン(システインプロテア-ゼ)と膵臓で産生されるトリプシン(セリンプロテア-ゼ)にも同様な作用が認められた。ラット顎下腺の肥大・増殖に伴って大量のRSCが誘導される現象は、植物および動物に含有されるプロテア-ゼの侵襲に対する一つの生体防御機構であることを解明した。我々が発見したラット唾液腺シスタチンS(RCS)は、シスタチンス-パ-ファミリ-2型に分類されるシステインプロテア-ゼ阻害物質である。そこで各種システインプロテア-ゼに対するRCSの阻害特性を明らかにするため、阻害形式、50%阻害濃度の測定を行った。シスタチンス-パ-ファミリ-に分類されるタンパク性阻害物質のpH及び熱安定性は高いと報告されているので、RCSの熱及びpH安定性を検討した。RCSはパパイン、フィシンを強く阻害した。反応速度の逆数と基質(BenzoylーDLーarginineーpーnitroanilide)の逆数をプロットするLineweaverーBurk及び反応速度の逆数とRCSの濃度をプロットするDixonの式で解析した結果、その阻害形式は拮抗的であると考えられた。パパイン、フィシン及びブロメラインに対する50%阻害濃度は各々、2.1μg/ml、7.1μg/ml、>42.7μg/mlと測定された。この阻害物質はカテプシンB、カリクレインに対して阻害活性を示さなかった。RCS分子内の2箇所のSーS結合を還元剤で開裂後、モノヨ-ド酢酸でSーカルボキシルメチル化すると、阻害活性は殆ど消失した。

即ち、RCS分子内の2箇所のSーS結合は阻害活性発現に必須であることが明らかとなった。パパインとRCSの結合モル比は、複合体架橋物のSDSーPAGEの成績から、1と結論した。RCSのpH及び熱安定性を測定した結果、そのパパイン阻害活性はpH112の範囲での処理(37°C、1時間)で殆ど低下しなかった。また、熱に対しても安定で、100°Cで5分間(pH310)処理ではまったく失活せず、pH7の溶液中では100°Cで1時間の加熱処理でも50%以上の阻害活性が残存していた。しかしながら、同条件でpH3及び10の溶液中で処理すると、阻害活性は10%前後に低下した。我々が発見したラットシスタチンS(RCS)は、ファミリ-2シスタチンに属するシステイン阻害物質である。(1)ラットでは、生後46週令の限定された時期に、顎下腺内のRSCのレベルが上昇する。この原因を明らかにするため、腺内のRSC親和性のプロテア-ゼの同定を試みたが、成功しなかった。(2)cーHaーras蛋白質はシステインプロテア-ゼ阻害活性とGTP結合を持つ。その一次構造はRSCとホモロジ-が高いので、RSCのGTP結合活性を調べたが、活性は認められなかった。(3)RSCは、ファミリ-2シスタチンに属する卵白シスタチンとオリザシスタチンが持つ抗ウイルス活性と、卵白シスタチンが持つ3T3線維芽細胞増殖作用を示さなかった。(4)感染にシステインプロテア-ゼが関与する細菌/カビ(口腔内常在細菌等総計18種)に対する抗菌活性を調べた結果、歯周病の病原菌であるBacteroides gingivalisの発育を殺菌的に抑制することを発見した(ディスク拡散法:最小有効量;75μg/ディスク)。(5)ラットに交感神経βー受容体作動薬であるイソプロテレノ-ルを投与すると、顎下腺の肥大・増殖に伴って大量のRSCが誘導されるが、何故このような生体応答が生じるのかは不明であった。植物由来のシステインプロテア-ゼであるパパイン(パパイア)をラットの口腔内に投与すると、投与量と投与日数に依存的に、顎下腺の肥大・増殖を伴う大量のRSCが誘導されることを発見した。この生体応答に対するプロテア-ゼの特異性を検討した結果、イチジクに存在するフィシン(システインプロテア-ゼ」と膵臓で産生されるトリプシン(セリンプロテア-ゼ)にも同様な作用が認められた。ラット顎下腺の肥大・増殖に伴って大量のRSCが誘導される現象は、植物および動物に含有されるプロテア-ゼの侵襲に対する一つの生体防御機構であることを解明した。
肺がん脳転移に対する非ステロイド系抗炎症薬による免疫学的予防法の確立

肺がんに対する治療成績向上に伴い転移性脳腫瘍の罹患率が増加している。近年がん増殖・浸潤・転移における免疫系の関わりが明らかとなりつつあり、NSAIDの長期投与によるがん死亡率低下が報告された。近年我々は、脳腫瘍発生初期において骨髄由来抑制細胞(MDSC)がCCL2/CXCL12ケモカイン依存性に病変部に集積し、発症のトリガーとなり、かつNSAIDによりCOX-2阻害によりMDSC抑制および脳腫瘍発生抑制しうることを示してきた。それらの知見を元に、本研究では、特に肺がん転移性脳腫瘍発症におけるMDSCの影響を、マウスによる非臨床研究およびヒト臨床研究の両面から評価した。がん患者の約10 %が転移性脳腫瘍を発症するとされ、肺がんを原発とするものが最も多い。以前の研究より、原発性脳腫瘍および転移性脳腫瘍発生においては炎症細胞の一種である骨髄由来抑制細胞(MDSC)がCCL2/CXCL12ケモカイン依存性に病変部に集積し、発症のトリガーとなることが示唆されている。そこで本研究では、肺がん転移性脳腫瘍発症におけるMDSCの影響を、マウスおよびヒト検体を用いて評価した。マウス動物実験は以下のように行った。まずC57B6野生型マウスおよび同系肺がん細胞株を用い、移植型転移性脳腫瘍モデルおよび血行型転移モデルを作製した。一部のマウスでは細胞移植前よりアスピリンを経口投与あるいは抗Gr-1抗体を行った。生存率および腫瘍生着率、フローサイトメトリーによる腫瘍組織内の免疫細胞浸潤、腫瘍微小環境におけるサイトカイン/ケモカイン等を評価した。その結果、アスピリン継続投与により脳腫瘍生着率の著明な低下および生存率上昇が確認された。また腫瘍形成したマウス脳腫瘍組織内に浸潤する免疫細胞をフローサイトメトリーにて解析したところ、MDSCの著明な集積低下を認めた。さらにアスピリン治療群の腫瘍組織内では、CCL2およびCXCL12ケモカインの発現低下がみられ、かつ抗Gr-1抗体投与によるMDSC除去マウスでは著明な生存率上昇がみられた。さらに健常人および肺がんの既往がある脳腫瘍症例より末梢血細胞(PBMC)を採取した。PBMCよりCD14+CD15-HLA-DRlowの分画よりmRNAを抽出しDNAマイクロアレイを行った。臨床検査項目は、年齢、性別、腫瘍組織系、脳腫瘍サイズ、脳腫瘍組織系(直達手術症例)、NSAID服用歴などとした。その結果、肺がん転移性脳腫瘍症例では健常人と比較し、末梢血中のMDSC増加がみられた。また転移性脳腫瘍症例のMDSCではCD276 (B7-H3)の発現上昇がみられ、かつNSAID服用歴との統計学的有意な相関もみられた。がん治療において転移性脳病変が臨床上の大きな問題となっているにも関わらず、これらに対しては現在においても直達手術あるいは放射線治療が行われるのみである。しかしこれらの治療法の侵襲度・副作用は無視しえず、治療に関連して高頻度に神経症状が出現しうる。そこで本研究では、がん抗原ワクチンをベースとしたがん特異的免疫治療にNSAIDを併用することで、転移性脳腫瘍に対する効果的な予防法の確立を試みる。今回申請する研究計画は、1)これまで十分注力されていなかった転移性脳腫瘍の予防を試みること、2)疫学研究の結果を分子生物学的・免疫学的に検証すること、3)世界で広く用いられ、近年再注目されている薬剤NSAIDを用いることで、速やかな臨床応用が期待できることを目的としている。その中で平成24年度はマイクロRNA miR-146aの腫瘍形成および免疫抑制機構への影響について評価を試み、大変有意義な結果を得た。平成24年度は野生型C57B6Jおよび同バックグラウンドB/T細胞依存的miR-146a欠損マウスを入手し、SPF環境下で系統維持した。次いでSBトランスポゾンおよびトランスポーズ型がん遺伝子(NRas・shP53・EgfrvIII)をコードするプラスミドを生後0-2日の新生児マウス脳室内に注入し、腫瘍形成を確認した。平成24年度はこれらの脳腫瘍組織の解析を主として行った。野生型C57B6Jおよび同バックグラウンドB/T細胞依存的miR-146a欠損マウスを入手し、SPF環境下で系統維持した。Sleeping Beauty (SB)トランスポゾン誘導型マウスグリオーマモデルの作製SBトランスポゾンおよびトランスポーズ型がん遺伝子(NRas・shP53・EgfrvIII)をコードするプラスミドを生後0-2日の新生児マウス脳室内に注入した。生体遺伝子導入にはInVivoJet-PEIを用いた。miR-146a欠損マウスにおいてもSBトランスポゾン誘導型グリオーマは誘導された。これらをルミノイメージで測定した。