hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工脂質生体膜モデル・リポソ-ムの熱力学的安定性に関する研究

本研申請の高感度示差走査熱量計(Microcal社MCー2K型)を購入の後にこの装置の操作法を修得し、実験を開始した。まず、研究対象物質として実在生体膜の主成分である中性リン脂質、demyristoylphotidylーcholine(DMPC)を選び、この両親媒性分子が水の共存下で形成するベシクル(リポソ-ム)の熱力学的安定性を上述の熱量計を用いてベシクルの有するゲル一液晶相転移をモニタ-することで検討した。得られた結果を以下に記述する。1)DMPCの多重膜ベシクル(MLV)は超音波照射を施すことで大きいサイズの一重膜ベシクル(LUV)を経て小さいサイズの一重膜ベシクル(SUV)に移行する;2)この移行過程は超音波照射の時間ならびに強度や試料温度に影響される;3)熱量測定からは、MLV、LUVおよびSUVのゲル-液晶相転移に伴われる転移温度および転移エンタルピ-はともにこの順序で減少することが明らかにされた。この結果は、3種ベシクル間のゲル相のエンタルピ-が異なること、すなわち、球状表面の曲率の小さいベシクルほどDMPC分子がより密に充填した集合状態をとることが示唆される; 4)3種ベシクルのゲル相のエンタルピ-が異なることを考慮することで、試料に低温熱処理(4°C)を施すと、LUVおよびSUVは最終的にはMLVまで移行する。この結果は、3種ベシクルの熱力学的安定性はSUV<LUV<MLVの順に増大することを示す;5)これに対して、3種ベシクルを液晶温度で保持するとベシクルの形態変化はほとんど観察されない。次に、負電荷を有するdinyristoylphosphatidylglycerol(DMPG)を対象物質として選び、上述と同様の実験を行なうと、熱力学的最安定型は一重膜ベシクルであるとの結論が得られ、リン脂質が荷電を有することに基づくベシクルの熱力学的安定性の相違が確認される。これに関してのより深い知見を得るために現在、研究を続行している。1.超音波照射法によるリポソ-ムの作成Dimyristoylphosphatidylcholine(DMPC)、リン脂質の薄膜を水溶液(pH=7.4)中に懸濁させ、MLV(多重膜リポソ-ム)からUV(一枚膜の小さいサイズのリポソ-ム)への移行過程をMicrocal社のMCー2型DSC装置(科研費で購入)を用いてゲル-液晶相転移モニタ-することで追跡した。この移行過程は超音波出力、時間および試料温度に依存することが明らかになった。2.種々リポソ-ムの熱的挙動MLV,LUV(大きいサイズ1枚膜リポソ-ム)およびSUVはゲル-液晶相転移に関してそれぞれ特有の転移ピ-ク形状、転移温度および転移エンタルピ-を示す。MLVからSUVへの移行に際しては、ピ-ク形状は先鋭的なものから幅広い形状に移行し、転移温度およびエンタルピ-は共に減少する。3.リポソ-ムの熱力学的安定性上述のSUVはゲル-液晶相転移以下の温度領域では不安定でリポソ-ム間の自発的融合を繰り返し、LUVに移行する。冷却温度が-20°Cの条件下ではMLVに至る。

この冷却操作に基づくSUVからMLVの移行過程は、3種リポソ-ム間での転移温度およびエンタルピ-デ-タ-から示唆されるように、SUV、LUV、MLVの順で熱力学的安定性が増大することを示す。本研申請の高感度示差走査熱量計(Microcal社MCー2K型)を購入の後にこの装置の操作法を修得し,実験を開始した。まず,研究対象物質として実在生体膜の主成分である中性リン脂質,dimyristoylphosphatidylcholine(DMPC)を選び,この両親媒性分子が水の共存下で形成するベシクル(リポソ-ム)の熱力学的安定性を上述の熱量計を用いてベシクルの有するゲル-液晶相転移をモニタ-することで検討した。得られた結果を以下に記述する。1)DMPCの多重膜ベシクル(MLV)は超音波照射を施すことで大きいサイズの一重膜ベシクル(LUV)を経て小さいサイズの一重膜ベシクル(SUV)に移行する;2)この移行過程は超音波照射の時間ならびに強度や試料温度に影響される;3)熱量測定からは,MLV,LUVおよびSUVのゲル-液晶相転移に伴われる転移温度および転移エンタルピ-はともにこの順序で減少することが明らかにされた。この結果は,3種ベシクルのゲル相でのエンタルピ-が異なること,すなわち,球形表面の曲率の小さいベシクルほどDMPC分子がより密に充填した集合状態をとることが示唆される;4)3種ベシクルのゲル相のエンタルピ-が異なることを考慮することで,試料に低温熱処理(4°C)を施すと,LUVおよびSUVは最終的にはMLVまで移行する。この結果は,3種ベシクルの熱力学的安定性はSUV<LUV<MLVの順に増大することを示す;5)これに対して,3種ベシクルを液晶温度で保持するとベシクルの形態変化をほとんど観察されない。次に,負電荷を有するdimyristoylphosphatidylglyceroal(DMPG)を対象物質として選び,上述と同様の実験を行なうと,熱力学的最安定型は一種膜ベシクルであると結論が得られ,リン脂質が荷電を有することに基づくベシクルの熱力字的安定性の相違が確認される。これに関してのより深い知見を得るために現在,研究を続行している。
生体内における超微小電極を用いた過酸化水素の電気化学的絶対定量分析

生体内反応関連物質の定量分析では、局所的なサンプリングおよび組識破壊をおさえるため、直径約8ミクロンのカ-ボンファイバ-(CF)電極が用いられている。その電極を用いて、酵素反応の結果生成する過酸化水素を定量分析できる方法を確立するよう、研究を進めてきた。第一年度の研究では、CFの電気化学的基礎を追求し、定量的測定ばかりではなく、解析的に解釈することが可能であることを示した。第二年度では、その応用として、ド-パミンの代謝物であって神経細胞付近に多く存在するDOPACのCF上での電極反応挙動および過酸化水素による金属錯体の接触反応挙動に焦点を当てた。具体的には、銅フェナントロリン錯体と過酸化水素の反応速度を電気化学的に測定した。その速度は、グラッシ-カ-ボン上と焼結グラファイト上とでは異なった。最終年度には、生体中でミセル化が起こった場合、過酸化水素がどのような挙動をするか、検討した。ミセルの形成により、銅フェナントロリン錯体と過酸化水素との反応速度が大きく減少した。一方、過酸化水素を直接電極反応させる研究の展開として、オゾンの還元電流を測定することによるオゾンの定量分析を試みた。電極材料として、金・白金・種々のカ-ボンを用いたところ、シャ-プペンシルに使われている芯が、分析上最も実用的であることがわかった。残念ながらシャ-プ芯は微小電極ではないが、微小化可能・高品質管理・安価・高耐窮性等、すぐれた点が多かった。この分析法を、水電解によるオゾン発生装置に組み込んだところ、フィ-ドバック効率のよいシステムができた。カーボンファイバーを用いた非可逆波の理論を予定通りに完成した。ピーク電位差から、容易に速度論的パラメータを算出できるようにした。この手法を本研究とは別件である燃料電池システムに応用してみたところ、カーボンファイバーの特性を容易に判定できることがわかった。この成果は通産省工業技術院電総研の協力を得た。カーボンファイバーを用いて過酸化水素の電気化学的検出が可能となる条件を見出した。しかしながら、この条件はグラッシーカーボン電極を用いたものと異なり、電極を電気化学的に強く酸化する必要があった。それ故、カーボンファイバー上での過酸化水素の反応機構は未だ不明である。電極上の吸着種が反応に関与すると思われるので、吸着種の電極反応についてのモデルをたてシミュレーションをしてみたところ、それ相応の結果は得られなかった。しかしながら反応の様子が詳細に分からなくても分析上では問題とならない。過酸化水素の酸化波は与えられた条件に鈍感であったため、分析上は大変好都合であった。過酸化水素の直接酸化だけではなく、古くから知られている接触還元についても平行して研究を進めている。なお購入した設備品はデータ処理装置として、現在活動中である。生体内反応関連物質の定量分析では、局所的なサンプリング及び組織破壊の最小化のため、直径約8ミクロンのカ-ボンファイバ-(CF)電極が用いられている。その電極を用いて酵素反応の結果生成する過酸化水素を定量分析出来る方法を確立するよう、研究を進めてきた。一昨年度の研究では、CFの電気化学的基礎を追究し、定量的測定ばかりではなく解析的に解釈することが可能であることを示した。そこで本年度ではその応用として、ド-パミンの代謝物であって神経細胞付近に多く存在するDOPAC(3,4-dihydroxyphenylacetic acid)のCF上での電極反応挙動及び過酸化水素による金属錯体の接触反応挙動に焦点を当てた。燐酸緩衝溶液中で、CF・プラスチックカ-ボン(GRC)・グラッシ-カ-ボン(GC)電極を用いてDOPACのボルタモグラムを測定した。電気化学的前処理の影響をあまり受けないGRCを用いて、電極反応速度パラメタ及びDOPACの拡散計数を求めることが出来た。一方、CFでは顕著な電気化学的処理の影響を示した。

強い処理をすると、拡散的なボルタモグラムが消失して、新たな吸着波が現れた。吸着量の濃度依存性から、langmuir型の吸着等温式に従うことが分かった。飽和吸着のときは、単分子吸着と考えられた。生体内に於てDNAの失活は銅フェナントロリン錯体と過酸化水素との接触反応によるが、この反応系の速度を電気化学的に測定した。銅フェナントロリン錯体のボルタモグラムはおもに拡散律速であるが、一部吸着を伴った。過酸化水素添加による接触波の解析から、GCにおける速度は4.4dm^3mol^<-1>s^<-1>であった。銅フェナントロリン錯体の吸着固定化を目指して焼結グラファイト電極を用いた。そのボルタモグラムの電位依存性から反応種は溶液中の錯体と異なることが分かり、その不均一速度定数は溶液内均一系速度定数より大きかった。生体内反応関連物質の定量分析では、局所的なサンブリングおよび組織破壊をおさえるため、直径約8ミクロンのカ-ボンファイバ-(CF)電極が用いられている。その電極を用いて、酵素反応の結果生成する過酸化水素を定量分析できる方法を確立するよう、研究を進めてきた。第一年度の研究では、CFの電気化学的基礎を追求し、定量的測定ばかりではなく、解析的に解釈することが可能であることを示した。第二年度では、その応用として、ド-パミンの代謝物であって神経細胞付近に多く存在するDOPACのCF上での電極反応挙動および過酸化水素による金属錯体の接触反応挙動に焦点を当てた。具体的には、銅フェナントロリン錯体と過酸化水素の反応速度を電気化学的に測定した。その速度は、グラッシ-カ-ボン上と焼結グラフィイト上とでは異なった。最終年度には、生体中でミセル化が起こった場合、過酸化水素がどのような挙動をするか、検討した。ミセルの形成により、銅フェナントロリン錯体と過酸化水素との反応速度が大きく減少した。一方、過酸化水素を直接電極反応させる研究の展開として、オゾンの還元電流を測定することによるオゾンの定量分析を試みた。電極材料として、金・白金・種々のカ-ボンを用いたところ、シャ-ププンシルに使われている芯が、分析上最も実用的であることがわかった。残念ながらシャ-ブ芯は微小電極ではないが、微小化可能・高品質管理・安価・高耐窮性等、すぐれた点が多かった。この分析法を、水電解によるオゾン発生装置に組み込んだところ、フィ-ドバック効率のよいシステムができた。
新たな古環境評価指標構築を目指した鍾乳石・石筍包有物中の希ガス同位体分析法の開発

前年度までに、古大気保持試料としての石筍からの希ガス抽出と生成および四重極質量分析計による迅速な希ガス元素組成分析が可能になった。石筍試料中の過剰大気成分を除く水包有物溶存希ガス成分は20-30°Cでの溶解度と矛盾しないこを確認した。本年度においてはさらに、このシステムをテクタイトや火山ガラスなど包有物として古大気を保持している試料の分析にまで応用することを試みた。海南島産のテクタイトを真空中で破砕し形成当時に保持されたであろう希ガスの元素比を分析した。軽希ガスであるネオンは拡散によって選択的に気泡中に濃集しており、その特徴はミョンノン型のテクタイトに特有の物であることがわかった。今後は気泡の体積などを精密に見積もる手法を確立し.保持されている古大気の全圧を見積もることにより、テクタイト形成条件の制約などを得ることが出来ると期待される。このように、本研究を通じて確立した石筍をはじめとする水包有物や気泡中のガス抽出と生成および分析技術を用いることによって、試料が形成しそれら包有物を得た時代の地球表層の環境や試料の形成環境に関する見地を得ることができることを示すことが出来たと考えている。石筍や鍾乳石に存在する水包有物中の大気起源の希ガスの存在量や各希ガス間の存在量比は周囲の温度環境を反映しているはずである。いわゆる「希ガス温度計」は地下帯水層水を対象に古環境のプロキシとして広く用いられている(例えば、Kipfer, et. al.,2002による総説など)。石筍には形成時に取り込まれた化石水が包有物として保持されおり、もしそこに溶け込んでいる希ガス量の分析が可能になれば世界各地の試料から様々な年代の古気温情報を得ることができる可能性がある。本研究課題は、石筍包有物中の微量水中の希ガス濃度の精密測定の手法を確立し、鍾乳石が果たして希ガス温度計に適した試料であるかどうか、詳細な検討を行う。本年度は、まず、分析システムの構築を目指して実験システムの整備および試料の分析を行った。既存の分析システムに絶対圧の精密測定を可能にするキャパシタンスマノメーターを導入した。予備実験では真空破砕法で石筍1グラムから放出されるガスの全圧が0.01トールを超える場合があることが分かった。そのほとんどがH20であることが推定されるため、破砕直後の精密な全圧測定は試料から放出された水の半定量値を与えると期待される。フランス産のいくつかの石筍試料の希ガス分析を四重極質量分析計を用いて行った結果、その希ガス同位体組成は大気と変わらないことが分かった。元素存在度は元素分析を起こしていない大気と、重い希ガスに富む大気成分の混合物であることが明らかになり、後者の元素組成からは温度情報を読み取ることが出来るかもしれない。関連する分析手法の開発に関する論文を発表すると共に、学会発表を行った。
癌遺伝子の発現異常にもとづく、膀胱癌における悪性度の再分類と治療法の確立の研究

膀胱癌患者12名の臨床病変部より、手術中に癌組織を採取し、そこよりDNAおよびRNAの抽出を行った。このうち3名は、採取した組織量が少ないため、解析に必要な充分量のDNAあるいはRNAを抽出できなかった。又特に悪性度の高い患者では、充分量の組織が採取しにくく、研究目的のひとつである悪性度の変化と癌遺伝子の発現への相関を検討するためには、まだ充分な症例数にいたっていない。その対策として、より多くの癌組織が得られる可能性の高い、腎盂・尿管癌のうち、移行上皮癌症例にも対象を拡大して検討し、現在数名より癌組織を得ている。実際に癌組織より抽出できるRNA量は、60100μg程度のため、これをくり返して使用する目的で、ゲル電気泳動により分離したRNAを、ナイロンメンブレンに移して検討している。さらに、より多くのRNAを抽出できる方法の検討と、癌遺伝子の発現の有無を確認する方法のうち、放射性物質を使用しないで可能な方法を検討中である。同時に、病理学的悪性度分類による臨床治療成績の検討を行って、分子生物学的レベルでの異常との関連について比較検討を行う準備をすすめている。
LPS刺激によりマクロファージ内で誘導されるplastinリン酸化経路の解析

1.65-kDaリン酸化蛋白質(pp65)の遺伝子クローニングと全塩基配列の決定:(1)pp65の精製法は既に確立し、報告した。精製pp65をリシルエンドペプチダーゼで分解して得た二つのペプチドのアミノ酸配列を決定し、この配列を基に、すべての可能なコドンを含むDNAを合成した。(2)このオリゴDNAをプローブとし、一方、マクロファージのmRNAから逆転写酵素を用いて作製したcDNAライブラリをテンプレートとして、PCR(polymerase chain reaction)法で二つのペプチド間のDNAを増幅した。この増幅DNAをプローブとしてノーザンブロット解析を施行した。pp65をコードしているmRNAは、マクロファージの他、T細胞やB細胞などのリンパ球、骨髄細胞、胸腺などに認められた。あわせて、抗pp65抗体を用いたウエスタンブロット法を行い、pp65蛋白質の発現は骨髄や胸腺では少なく、成熟造血系細胞で多いことを明らかにした。(3)上記増幅DNAをプラスミドに組み込み、ジデオキシ法でシークエンスした。次にこれを基に、ダイレクトシークエンス法にてpp65 cDNAの全塩基配列を決定した。得られた配列を、データベースで既知の配列と照合すると、ヒトL-plastinという最近Linらによって報告された新種の蛋白質と高い相同性があり、マウスのL-plastinであるとが確定した。2.pp65をリン酸化する蛋白質リン酸化酵素(PK)の同定:(1)pp65のリン酸化アミノ酸の種類を高圧濾紙電気泳動で決定すると、セリンであった。(2)[^<32>P]-正リン酸でラベルし、LPSで刺激したマクロファージからpp65を精製し、^<32>P-セリンを含むペプチドを分離した。^<32>Pで強くラベルされるペプチドは一つで、そのアミノ酸配列を決定した。(3)その配列(Lys-Ile-Ser^*-Phe-Asp-Glu-Phe)を既知のPKがリン酸化するモチーフ配列と比較するとcAMP依存性PK(Lys-X-Ser^*)、プロテインキナーゼC(Lys-X-Ser^*)、カゼインキナーゼII(Ser^*-X-X-Glu)などがpp65をリン酸化するPK侯補となるが、前後の配列を総合的に考えると、カゼインキナーゼIIが最も可能性が高いと考えられ、この点についてさらに詳しく検討する予定である。(1)LPS刺激持異的にリン酸化される65-kDaの基質蛋白質(PP65)の部分アミノ酸配列は、既に決定されている。この配列を基にオリゴDNAを合成し、マクロファージ(Mφ)mRNA由来のcDNAを鋳型として用いたPCR法によりPP65をコードする遺伝子断片を増幅し、そのDNA配列(約300bp)を決定した。この配列はヒトのl-プラスチンとアミノ酸レベルで約95%の高い相同性があり、マウスにおけるプラスチンであることが確定した。

プラスチンは、Ca^<2+>結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、アクチン結合ドメインをもつユニークな蛋白質で、ヒト線維芽細胞の癌化に伴って出現する蛋白質として注目され、最近同定された新種の蛋白質である。ヒトT細胞をIL-2で刺激した時にリン酸化されることも、最近明らかにされた。LPS刺激でこの蛋白質が特異的にリン酸化されることは、LPSのシグナル伝達を明らかにする上で重要な手がかりになると考えられ、興味深い。(2)次に、PP65をリン酸化するプロティンキナーゼ(PKE:Protein Kinases induced by endotoxin)について検討した。LPS刺激Mφの蛋白質をSDS-PAGEで分画し、PVDF膜に転写後、7Mグアニジンで復元し、膜上でリン酸化反応を行った(renaturation kinase assag)。この方法で、82-55-,45-KDaの分子量をもつ少なくとも3種類のPKEがLPS刺激によって活性化されることが明らかになった。複数のリン酸化酵素の関与を証明した報告はこれまでなかった。このうちのどれがPP65をリン酸化するのかはまだ明らかではないが、既知の代表的キナーゼとは異なるようである。LPS刺激によって複数のPKEが活性化されること、そしてそれからが多くの基質をリン酸化することは、LPSの多彩な生物活性を説明する根拠となるかもしれない。そのうちのPP65は一次構造が決定され、ユニークな機能をもつことが明らかにされた。1.65-kDaリン酸化蛋白質(pp65)の遺伝子クローニングと全塩基配列の決定:(1)pp65の精製法は既に確立し、報告した。精製pp65をリシルエンドペプチダーゼで分解して得た二つのペプチドのアミノ酸配列を決定し、この配列を基に、すべての可能なコドンを含むDNAを合成した。(2)このオリゴDNAをプローブとし、一方、マクロファージのmRNAから逆転写酵素を用いて作製したcDNAライブラリをテンプレートとして、PCR(polymerase chain reaction)法で二つのペプチド間のDNAを増幅した。この増幅DNAをプローブとしてノーザンブロット解析を施行した。pp65をコードしているmRNAは、マクロファージの他、T細胞やB細胞などのリンパ球、骨髄細胞、胸腺などに認められた。あわせて、抗pp65抗体を用いたウエスタンブロット法を行い、pp65蛋白質の発現は骨髄や胸腺では少なく、成熟造血系細胞で多いことを明らかにした。(3)上記増幅DNAをプラスミドに組み込み、ジデオキシ法でシークエンスした。次にこれを基に、ダイレクトシークエンス法にてpp65cDNAの全塩基配列を決定した。得られた配列を、データベースで既知の配列と照合すると、ヒトL-plastinという最近Linらによって報告された新種の蛋白質と高い相同性があり、マウスのL-plastinであることが確定した。2.pp65をリン酸化する蛋白質リン酸化酵素(PK)の同定:(1)pp65のリン酸化アミノ酸の種類を高圧濾紙電気泳動で決定すると、セリンであった。(2)[^<32>p]-正リン酸でラベルし、LPSで刺激したマクロファージから電気泳動で決定する32^P-セリンを含むペプチドを分離した。
肝臓に存在する特殊なリンパ球による免疫調節

マラリア感染において、肝臓に多く存在し、原虫の排除に重要であるNKT細胞やCD8+T細胞を欠如するマウスにマラリア原虫を感染させたところ、NK細胞やγδT細胞がマラリア排除に重要であることが分かった。その中でも特にγδT細胞が不可欠なエフェクターであることを明らかにした。また、新生児期、加齢期や自己免疫性肝炎発症後しばらくして、独特な自己抗体を産生するB細胞が増殖してくることを明らかにし、それらの細胞の特性について検討した。肝臓は、末梢のリンパ臓器とは大きく異なるリンパ球分布を示し、これら肝臓特異的なリンパ球は、肝炎などの肝障害、癌の肝転移、肝臓における感染症、肝再生、免疫寛容など、多くの免役現象に関与している。肝臓は、消化・代謝臓器としてのみならず、免疫臓器として注目されている。これらの背景をもとに研究を進めたところ、平成19年度は、以下の研究成果が得られた。MHC class Iの構成成分であるβ2-microglobulin欠如したマウス(以下β2-m KOマウス)にマラリアを感染させた。これまでの報告では、マラリア感染には、CD8^+ T細胞が重要な役割を果たしていることが明らかにされており、CD8^+ T細胞を欠如するβ2-m KOマウスは、マラリア感染に対して感受性が高いことが予想されたが、これらた反し、実際にマラリアを感染させたととろ、野生型マウスと同様に、感染後約1ヶ月でマラリアを排除できることが明らかになった。つまり、CD8^+T細胞は、マラリア感染においては、不可欠ではないことが明らかになった。では、どのような細胞群がマラリア感染のエフェクターになっているのかを解析したところ、NK細胞やγδT細胞が、特に肝臓において増加しており、しかも、これら細胞群は活性化していることが明らかになった。つまり、肝臓に存在する自然免疫に重要なリンパ球であるNK細胞とγδT細胞が、マラリア感染に重要な役割をはたしていたのである。この結果は、Immunology 122;201-210,2007.に発表した。肝臓は、末梢のリンパ臓器とは大きく異なるリンパ球分布を示し、これら肝臓特異的なリンパ球は肝炎などの肝障害、癌の肝転移、肝臓における感染症、肝再生、免疫寛容など、多くの免疫現象に関与している。肝臓は消化・代謝臓器としてのみならず、免疫臓器として注目されている。これらの背景をもとに研究を進めたところ、平成20年度は、以下の研究成果が得られた。正常なadultマウスの末梢免疫臓器のB細胞は主にB220^<high>であるが、新生児や老齢マウスではunconventionalなB220^<low>B細胞の割合が増加していることが分かった。そこで我々は、新生児期や老齢期において、肝臓・脾臓及び骨髄に出現するB220^<low>B細胞の解析を行い、この細胞が自己抗体産生細胞であることを明らかにし、報告した。また、Concanavalin A(Con A)誘導性の自己免疫性肝炎モデルマウスを用い、肝炎の病態について解析した。Con A投与による自己抗体産生のピークは初期(3日目)と後期(14日目)に分かれており、後期ではB220^<low>B細胞が出現しており、そのB220^<low>B細胞がlgGの自己抗体を産生していることが明らかになった。この自己抗体は直接肝障害に影響するものではないことが示唆されたが、後期ピーク時に胸腺外分化T細胞及びNKT細胞が増加することから、この自己抗体の産生には胸腺外分化T細胞やNKT細胞の関与が考えられた。
質量イメージングによるAGEｓ/RAGEシグナルに関連した歯髄内石灰化機構の解明

糖化による歯への影響を調べるためこれまでヒトの抜去歯を用いて象牙質コラーゲン中の糖化最終産物AGEs(Advanced Glycation End products)の分布評価等を行ってきた。ヒトでは無治療で血糖値をコントロールせず放置することや、健康な歯を抜歯して調査することは不可能であることから、ラットを用いた研究を進めた。免疫組織染色では2型糖尿病モデルラットとワイルドタイプのラットと比較して、2型糖尿病モデルラットの臼歯歯髄側にAGEsが多く存在することがわかった。ヒトの糖尿病患者で頻繁にみられる、歯髄内結石もまた本研究で用いた2型糖尿病モデルラットの臼歯中にも頻繁に認められることがマイクロCTを用いた実験により明らかになった。ここまでの結果を60回歯科基礎医学会にて発表した。またAGEsのシグナル伝達に関わるAGEs受容体RAGE(Receptor of AGEs)もAGEsに沿って多く存在することがわかった。ラット尾腱コラーゲン中にも糖尿病モデルラットにより多くのAGEsが蓄積していることが認められた。RAGEの標品としてラットの肺抽出物からRAGEを精製おこなった。ラットの臼歯の薄切片を電導スライドガラスに固定し、代表的なAGEsであるペントシジンをターゲット分子としてMALDI-FT-ICR-MS、質量イメージングを行ったところ、分布状態の詳細はイオン化レベルが低かったため明らかにできなかったものの、2型糖尿病モデルラットの臼歯により多くのAGEsがあることが検出された。2型糖尿病モデルラットを用いた系においてもヒトと同様なAGEsの蓄積、分布が認められ、歯髄内結石も多く発生することがわかった。また(糖化最終産物)/RAGE(AGEs受容体)のシグナル伝達系のそれぞれの因子の精製、抽出に成功しており、糖化が生体に及ぼす影響を時間の時間変化を追う材料が揃った。また、質量イメージングにおいては、ラットの臼歯試料中のAGEsの存在を示すことができた。質量イメージングの感度をあげるため、コラーゲン中でクロスリンクを形成しているAGEsのイオン化条件の検討やまたラット臼歯薄切片の作成法を凍結切片を用いるなど試料作製の条件検討をする。またAGEs受容体(RAGE)の大量精製、純化を行いイオン化条件を検討し、AGEs、RAGEの動的な分布変化を測定し、ラット臼歯またラット尾腱、血管等他の組織に関してもAGEs/RAGEシグナル伝達系のメカニズムの解明にあたる。研究が順調に進み、消耗品等物品の購入額が当初予定していた額よりも少額に収まったため。
哺乳動物細胞のミトコンドリア融合・分裂の制御と個体における生理的意義

ミトコンドリアは細胞内で融合と分裂を繰り返しながらそのバランスの基に形態を動的に維持している。我々は哺乳動物ミトコンドリアの融合と分裂を制御するGTPase及びその関連因子を同定・解析することで分子理解を進めている。一方、分裂因子Drp1の遺伝子欠損マウスを構築し解析することにより、個体の発生・分化における生理的意義の解明を目指して研究を行っている。その結果、心筋の形成・機能維持におけるミトコンドリアダイナミクスの機能や、卵形成・成熟におけるミトコンドリア分裂の機能を明らかにした。さらに、ミトコンドリアの融合と分裂のバランスの制御の分子機構の解明や、新規関連因子の同定を進めることができた。ミトコンドリアは細胞内で融合と分裂を繰り返しながらその形態を維持しているが、その制御の分子機構及び個体における意義にはまだ不明な点が多い。これまでに、哺乳動物のミトコンドリア融合・分裂を制御するGTPase及びその関連因子を同定・解析することで分子理解を進め、また分裂因子Drp1の欠損マウスを構築することで発生・分化における生理機能を明らかにしてきている。そこでこれまでの研究基盤を基にして、融合・分裂の実行及びその制御の分子機構の更なる詳細解析を進め、また発生・分化、さらにはミトコンドリアの関わる多様な病態の新視点理解を進展させることを目指して研究を進めている。今回、哺乳動物ミトコンドリアの動的構造変化の全容を理解するため、分裂因子Drp1の条件欠損マウスを構築し、組織形成・発生における生理機能を解析したところ、ミトコンドリア分裂の新たな特性を見出すことができた。まず心筋の形成・機能維持におけるミトコンドリアダイナミクスの機能を解析したところ、心形成期にはDrp1の発現量が一過的に極めて高くなること、筋特異的KOマウスを構築すると生後1週間で心筋機能不全により致死となることを見出した。KO心筋では核様体の分布に大きな変化が見られ、その結果、心筋細胞内でのエネルギー供給が不十分となることで新機能不全となることが明らかになった。さらに卵母細胞特異的Creを用いて卵形成・成熟におけるミトコンドリア分裂の機能を解析したところ、雌は不妊となること、卵巣内で卵母細胞が成熟異常となることを見出した。ミトコンドリアのみならずERも大きな構造変化を起こすことから卵子のオルガネラ再編成に重要な機能を持つことがわかった。その中でも、ATPaseドメインを持つミトコンドリア内膜貫通タンパク質、ATAD3はmtDNAや脂質と関連していると考えられているが、その機能詳細は不明な点が多く残されている。今回、ATAD3に結合する因子としてCcdc56を同定した。Ccdc56の発現抑制細胞は、ミトコンドリアネットワークが活性化され、Drp1のミトコンドリア局在性が減少していた。また、ミトコンドリア呼吸鎖複合体IVの不全から、ミトコンドリア形態変化が誘導されていることが明らかになった。これらの結果から、ミトコンドリアの活性と形態制御の関係の一端が明らかになった。今回、ミトコンドリアの動的構造変化の全容を理解するため、新規因子を同定しその分子詳細を解析したところ、ミトコンドリア形態制御の新たな知見を得ることができた。我々はミトコンドリアの機能と形態維持に重要な機能を持つ因子、ATAD3について解析を進めている。ATAD3はATPaseドメインを持つミトコンドリア内膜貫通タンパク質であり、mtDNAや脂質との関連が報告されている。今回、ATAD3に結合する因子として新たにCcdc56を同定した。Ccdc56はミトコンドリア内膜に局在し、内膜を貫通して存在していた。Ccdc56の遺伝子発現抑制を行ったところ、ミトコンドリア形態の大きな変動が見られた。この細胞では、ミトコンドリアが長くなりネットワーク構造が活性化されていた。そこでミトコンドリア分裂に機能するGTPaseであるDrp1を観察したところ、そのミトコンドリア局在性が減少していた。このCcdc56の抑制細胞では、ミトコンドリア呼吸鎖複合体IV (COX)のアセンブリーが不全となっており、それがミトコンドリア形態変化を引き起こしていることが分かった。これらの結果から、ミトコンドリア呼吸鎖形成とミトコンドリア形態制御は関連していることが明らかになった。また、これらの分子解析に加えて、マウス遺伝学的解析を行い、神経・心筋・肝臓等におけるミトコンドリアダイナミクスの意義の理解を進めることができた。このミトコンドリアのダイナミックな形態変化が、様々な生命現象の制御に関与していることが明らかになりつつある。我々は、哺乳動物のミトコンドリア融合・分裂を制御するGTPase及びその関連因子を同定・解析することで分子理解を進めている。

一方、分裂因子Drp1の遺伝子欠損マウスを構築・解析することで、発生・分化における生理的意義を明らかにしてきた。本年度の研究では特に、これまで理解があまり進められてこなかった、ミトコンドリアの融合と分裂のバランスの制御の分子機構に着目して研究を行った。ミトコンドリアの融合と分裂の制御の分子機構を調べる目的で、Drp1を抑制した時の細胞応答を解析した。ミトコンドリア分裂因子Drp1をRNAiで抑制し、あるいはゲノム編集により遺伝子欠損させたHeLa細胞を構築した。これらの細胞のタンパク質をウェスタンブロットで、またmRNAをRT-PCRで観察し、変動因子を探した。すると、Mfn1, Mfn2, OPA1等のミトコンドリア融合に関わるタンパク質群に発現量の大きな減少が見られた。この時、RNAの発現量は大きな変動は見られなかった。さらに詳細解析を行うと、Mfnタンパク質群はユビキチンプロテアソーム系で分解されており、一方OPA1はミトコンドリア内の膜内プロテアーゼOma1により分解されていることが分かった。これらのことから、ミトコンドリア形態のバランス制御には様々なタンパク質分解系が関与していることが明らかになった。ミトコンドリアの融合と分裂による動的変化の制御の分子機構を調べる目的で、融合に必須な因子Drp1を抑制した細胞の応答を解析し変動因子を探しところ、Mfn1, Mfn2, OPA1等のミトコンドリア融合に関わるタンパク質群のうち、Mfnタンパク質群はユビキチンプロテアソーム系で分解されており、一方OPA1はミトコンドリア内の膜内プロテアーゼにより分解されることが分かった。今年はこの融合と分裂のバランスの制御に関わる因子群の詳細解析を行うことで、これまでに知られていなかったミトコンドリアの形態バランスを制御する分子機構の一端を明らかにすることができた。またこの成果はGenes to Cell誌に報告することができた。ミトコンドリアは細胞内で融合と分裂を繰り返しながらそのバランスの基に形態を動的に維持している。このミトコンドリアのダイナミックな形態変化が、様々な生命現象の制御に関与していることが明らかになりつつある。我々は、哺乳動物のミトコンドリア融合・分裂を制御するGTPase及びその関連因子を同定・解析することで分子理解を進めている。一方、分裂因子Drp1の遺伝子欠損マウスを構築・解析することにより、発生・分化における生理的意義を明らかにすることを目指して研究を行ってきた。本年までに、マウスを用いたミトコンドリアの融合と分裂の制御の分子機構に着目して研究を行った。新規マウス系列の構築も進み、その解析を進めることができた。また一方、並行して進めていたsiRNAを用いた遺伝子スクリーニングの実験系もほぼ条件が確立し、本格的に因子同定・解析を進めるステージに至った。我々は哺乳動物ミトコンドリアの融合と分裂を制御するGTPase及びその関連因子を同定・解析することで分子理解を進めている。一方、分裂因子Drp1の遺伝子欠損マウスを構築し解析することにより、個体の発生・分化における生理的意義の解明を目指して研究を行っている。
偏微分方程式の解の空間臨界点と零点の挙動

1.N次元ユークリッド空間の領域Ωにおいて、正定数を初期値とした熱方程式の初期斉次Dirichlet問題を考える。Ωの部分領域Dで内部円錐条件およびD^^-⊂Ωを満たすものを考える。このとき、解の一つの等温面∂Dが時刻について不変であるときどのようなことが起こっているかという問題について、次の2つの定理を得た。(i)Ωが外部球面条件を満たす有界領域または外部領域の場合、もし∂Dが不変な等温面ならば、∂Ωは一つの球面に限る。(ii)Ωを一様な外部球面条件を満たす非有界領域とする。また、空でない∂Ωの部分開集合でΩの外向き法線方向についての主曲率がすべて非負なものが存在し、さらに∂Ωは任意の半径の(N-1)次元球上のグラフをその一部に含むとする。このとき、もし∂Dが不変な等温面ならば、∂Ωは1つの超平面か2つの平行な超平面のどちらかに限る。2.熱方程式の解のホットスポットに関して、ChamberlandとSiegel(1997)の予想がある。ユークリッド空間の原点を含む有界領域Ωにおいて初期斉次Dirichlet問題を考え、初期値として正定数を与えるとき、その予想は、『もし原点が常にホットスポットならば、領域Ωは、直交群のあるessentialな部分群Gの作用について不変である。』というものである。この予想について、空間次元が2のとき、次の4つの定理を得た。(i)Ωを三角形とするとき、もし原点が常にホットスポットならば、Ωは原点を中心とする正三角形に限る。(ii)Ωを凸四角形とするとき、もし原点が常にホットスポットならば、Ωは原点を中心とする平行四辺形に限る。(iii)もし原点が常にホットスポットならば、Ωは凹四角形ではない。(iv)Ωを凸m多角形(m=5,6)で、原点を中心とした内接円がすべての辺に接すると仮定する。このとき、もし原点が常にホットスポットならば、m=5のときΩは正五角形に限り、m=6のときΩは角度π/3,(2π)/3,πのどれかの回転対称性をもつ。』というものである。1.一般次元の球面および双曲空間上の熱方程式の初期値問題に対して、解が不変な空間臨界点をもつことと初期値がその点についてバランス法則を満たすこととが同値であることを示した。また、有界領域における初期斉次デリクレ境界値問題において測地球や点対称な領域の不変な空間臨界点による特徴付けを得た。2.熱方程式の解のホットスポット(各時刻において解の最大値を与える点)に関して、ChamberlandとSiegel(1997)の予想がある。ユークリッド空間の原点を含む有界凸領域Ωにおいて初期-斉次デリクレ問題を考え、初期値として正定数を与えるとき、その予想は、『もし原点が常にホットスポットならば、領域Ωは、直交群のあるessentialな部分群Gの作用について不変である』というものである。この予想について、空間次元が2のとき、つぎの2つの肯定的定理を得た。(a)有界凸領域Ωを三角形に限るとき、もし原点が常にホットスポットならば、領域Ωは、原点を中心とする正三角形に限る。

(b)有界凸領域Ωを凸四角形に限るとき、もし原点が常にホットスポットならば、領域Ωは、原点を中心とする平行四辺形に限る。3.熱方程式の解の等温面に関して、Klamkin(1964)の予想があった。ユークリッド空間の有界領域Ωにおいて初期斉次デリクレ問題を考え、初期値として正定数を与えるとき、この予想は、『もし各時刻で等温面たちが、全体として時刻について不変ならば、Ωは球に限る。』というものであったが、これはAlessandrini(1990)によって肯定的に解決された。そこで、一つの等温面が時刻について不変であるときどのようなことが起こっているかという問題が生ずる。このことについて、『上記の初期斉次デリクレ問題を有界凸領域Ω上で考える時、もし一つの等温面が時刻について不変であるならば、Ωは球に限る。』という定理を得た。1.熱方程式の解の等温面に関して、Klamkin (1964)の予想があった。』というものであったが、これはAlessandrini (1990)によって肯定的に解決された。このことについて、上記の初期斉次デリクレ問題において、有界領域Ωが外部球面条件を満たし、Ωの真部分領域Dが内部円錐条件をみたすとき、『もし∂Dが時刻について不変な等温面であるならば、Ωは球に限る。』という定理を得た。これは前年度に得たΩが凸領域である場合の最終的な一般化に当たる。2.熱方程式の解のホットスポット(各時刻において解の最大値を与える点)に関して、ChamberlandとSiegel (1997)の予想がある。ユークリッド空間の原点を含む有界凸領域Ωにおいて初期斉次デリクレ問題を考え、初期値として正定数を与えるとき、その予想は、『もし原点が常にホットスポットならば、領域Ωは、直交群のあるessentialな部分群Gの作用について不変である。』というものである。この予想について、一般の有界領域Ωにおいて原点が常にホットスポットであるための新しい必要条件を与えた。これは原点を中心とした領域Ωの内接球面とその接点の集合と接点での∂Ωの主曲率に関する幾何学的な条件である。1.N次元ユークリッド空間の非有界領域Ωにおいて、正定数を初期値とした熱方程式の初期斉次Dirichlet問題を考える。Ωの部分領域Dで内部円錐条件およびD^^-⊂Ωを満たすものを考える。このとき、解の一つの等温面∂Dが時刻について不変であるときどのようなことが起こっているかという問題について、次の2つの定理を得た。(i)Ωが外部球面条件を満たす外部領域の場合、もし∂Dが時刻について不変な等温面ならば、∂Ωは一つの球面に限る。(ii)Ωを一様な外部球面条件を満たす非有界領域とする。また、空でない∂Ωの部分開集合でΩの外向き法線方向についての主曲率がすべて非負なものが存在し、さらに∂Ωは任意の半径の(N-1)次元球上のグラフをその部に含むとする。このとき、もし∂Dが不変な等温面ならば、∂Ωは1つの超平面か2つの平行な超平面のどちらかに限る。2.熱方程式の解のホットスポットに関して、ChamberlandとSiegel(1997)の予想がある。ユークリッド空間の原点を含む
Pr元素を含む化合物中のPrの核スピン緩和

PrCo_5、Pr_2Fe_<14>B、Pr_xGd_<1-x>Ni、Sm_xGd_<1-x>Niに対して、1.4K4.2Kまでの温度範囲で、^<141>Prと^<147>Smの核スピン・スピン緩和時間T_2を測定した。いずれの化合物においても温度が高くなるに従いスピン・スピン緩和時間は短くなる。例えば、PrCo_5では1.4Kで4.2μsecであるが4.2Kでは2.1μsecとなる。このことは測定しているT_2にスピン・格子緩和時間T_1が効いていることを意味している。Pr_xGd_<1-x>NiではNMR信号は弱く、T_2の測定はx=0.2、0.35の場合について行った。1.4Kにおいて、それぞれ5μsec、3μsecである。これらはSm_<0.2>Gd_<0.8>Niの^<147>SmのT_2の1/20から1/30にあたる。観測している信号が-1/2【tautomer】1/2遷移に対応するものと仮定して、T_1/T_2=(I+1/2)^2の関係からT_1を見積もった。その結果、T_1TはPrCo_5で110Kμsec、Pr_xGd_<1-x>Niで50KμsecPr_2Fe_<14>Bの2種類のサイトfとgでそれぞれ900Kμsecと300Kμsecが得られた。これはfとgサイトの環境の違いによるものと考えられる。1.NMRスペクトルアルゴンアーク溶解炉で作製した試料について、^<141>Prでは2700MHzから3800MHzの範囲で、^<147>Smについては550610MHzの範囲でNMRスペクトルを観測した。これらの化合物中でPrとSmの磁気モーメントはそれぞれ2.60μ_Bと求められ、これらは各自由イオン値の81%と96%である。Smの磁気モーメントは磁化測定で求められていた値よりはるかに大きく、自由イオン値に近い値である。このことはSmNiの磁気構造がnon-collinearになっており、見かけ上磁気モーメントが小さくなっていると考えられる。2.核スピン・スピン緩和Pr_XGd_<1-X>Ni(X=0.2,0.5)中の^<141>Prと、Sm_XGd_<1-X>Ni(x=0.2,0.5)中の^<147>Smについて1.4Kと4.2Kで、それぞれのスペクトルのピークの位置で測定した。いずれの場合もスピンエコー信号の減衰は単一指数関数で表される。1.4Kでの結果は^<141>Prで3μsec、一方、^<147>Smでは110μsecと^<141>Prに比べて約30倍も長い。濃度の違いについて、特に大きな違いはなかった。PrCo_5については、同じく1.4Kで3.5μsecと同じ程度の値である。Pr_<0.2>Gd_<0.8>NiとPrCo_5の磁気秩序転移点Tcはそれぞれ60、920Kと大きくなるがT_2は同程度であり、Tcの違いによらず、T_2が短くなっている。3.まとめ(1)^<141>Prの核スピン・スピン緩和時間は他の核のものに比べて非常に短い。(2)SmNi中のSmの磁気モーメントは自由イオン値に近くSmNiの磁気構造はnon-collinearな構造であると考えられる。PrCo_5、Pr_2Fe_<14>B、

Pr_xGd_<1-x>Ni、Sm_xGd_<1-x>Niに対して、1.4K4.2Kまでの温度範囲で、^<141>Prと^<147>Smの核スピン・スピン緩和時間T_2を測定した。いずれの化合物においても温度が高くなるに従いスピン・スピン緩和時間は短くなる。例えば、PrCo_5では1.4Kで4.2μsecであるが4.2Kでは2.1μsecとなる。このことは測定しているT_2にスピン・格子緩和時間T_1が効いていることを意味しているPr_xGdGd_<1-x>NiではNMR信号は弱く、T_2の測定はx=0.2、0.35の場合について行った。1.4Kにおいて、それぞれ5μsec、3μsecである。これらはSm_<0.2>Gd _<0.8>Niの^<147>SmのT_2の1/20から1/30にあたる。観測している信号が-1/2【tautomer】1/2遷移に対応するものと仮定して、T_1/T_2=(I+1)^2の関係からT_1を見積もった。その結果、T_1TはPrCo_5で110Kμsec、Pr_xGd_<1-x>Niで50KμsecPr_xFe_<14>Bの2種類のサイトfとgでそれぞれ900Kμsecと300Kμsecが得られた。これはfとgサイトの環境の違いによるものと考えられる。
医療安全の観点から見た日本の感染症コンサルテーションの臨床アウトカムへの効果

2000年の初頭より米国において医療安全、患者予後の観点からの感染症コンサルテーションの有用性は指摘されていた。米国では感染症医における感染症診療は極めて一般的であるが、日本では必ずしもそうでないことから日本における感染症医の役割を明確にすることが目的であり、感染症コンサルテーション終了後から退院までの感染症の発生や、抗菌薬治療における有害事象の発生を見ることも目的としている。
市街地運転支援のための潜在的危険要因の行動予測に基づく経路計画システムの構築

H30年度は,リスク顕在化予測手法の構築として,ヒヤリハット事例を体系的に分類し,データベース化するためのシステムの構築,および,交通ヒヤリハット事例に対する確率論的モデルを用いた分析法を開発した.その概要を以下で説明する.(1)交通ヒヤリハットデータベースの構築東京農工大学保有するヒヤリハットデータベースシステムは,低速であり計算機による事故事例の解析が困難であるという課題があった.これを解決するために,Ontologyに基づく新たな交通事故形態分析法を提案した.本研究により,ソフトウェアからのアクセスが容易であり,従来法に比べ30倍以上高速にデータ検索が可能なシステムを実装した.また,20台の新たなドライブレコーダーをタクシーに設置し,本データベースのための事例収集を実施中である.(2)事故リスクを指標とした車両運動パラメータの特徴抽出手法の構築ヒヤリハット事例などから車両の運動パラメータを抽出した際に,そのパラメータとリスク指標との関連性を解析することができれば,ヒヤリハット前の行動から,リスク指標を推定することが可能になる.具体的には,運動パラメータとリスク指標の組を収集し,混合ガウスモデルにより近似する.そして,走行中の車両から得られた運動パラメータのみを固定値として,マルコフ連鎖モンテカルロ法に基づくデータサンプリングを行うことで,リスク指標の期待値を推定する.この方法は,特定の運転行動や運動モデルに依存しないという特徴があり,様々な場面に広く適用でき,かつ,結果は同じスケールをもつリスク指標の期待値であることから,汎用性が高い.ヒヤリハットデータベースの構築が完了し,既存のシステムからのデータ移行や,新規システムを用いたデータ収集が順調に実施できている.また,事故が顕在化した際の事象であるヒヤリハット事例を用いて,その事故リスク値を運転行動データから推定することを可能にしたことは,本研究課題の目的である潜在的な事故要因が顕在化する確率を推定するモデルを構築する際の基盤技術として有用である.以上の理由から,研究はおおむね順調に進展していると評価した.リスク顕在化予測モデル構築不安全行動(見通しの悪い交差点からの飛び出しや強引な割込み)に至るまでの交通参加者の状態をマルコフ決定過程モデルにより記述し,ヒヤリハットデータベースに含まれる実事例に適用することで,その発生確率と要因(環境要因との相関性)を推定する.実環境における評価交通環境要因から潜在リスクの顕在化確率を推定することで,減速などを自動的に実施する車両を実装し,市街地において走行実験を行うことで評価する.平成29年度は「典型事故事例辞書の構築」および、交通シミュレーションによる「事故回避モデルの検証」を実施した。典型事故事例辞書の構築法として、事故につながる危険場面を約13万件収録したヒヤリハットデータベースに含まれる、事故事例を記述するためのアノテーションデータを交通オントロジーモデルにより表現する方式を開発した。本交通オントロジーモデルに対して、事故事例を検索するための方式およびシステムを実装することで、車両の右左折などの主体的な運転行動を入力することで、事故を生じさせる対象者の種別と行動の出現頻度を1ミリ秒以下で検索することを可能にした。これは、走行中の車両上の計算機により、今後発生する事故を予測する機能を実現するために十分な速度である。また、本交通オントロジーモデルに基づき前述のヒヤリハットデータベースのデータベース構造を改修し、特に、交通参加者の行動を「単路から交差点に進入した」等の時系列で記述する方式(従来は「交差点で発生した」という地点情報のみ)に改めることで、事故事例の説明能力を向上させることに成功した。事故回避モデルの検証では、「先行車追従」「対向車道譲り」「駐車車両追越し」「交差点停止」「交差点通過」「交差点右左折」の7種の場面に対応する、理論的事故回避ドライバモデルを設計し、交通シミュレータ上で本モデルの評価試験を実施した。具体的には、実存する市街地の総延長4kmの地図情報(道路ネットワーク)を用いて、40台の仮想車両を用いたシミュレーションを実施した。その結果、試験開始から200時間、事故を生じさせることなく走行を継続することに成功した。典型事故事例辞書の構築に関しては、事故事例を高速に検索するシステムを実装し、リアルタイムに事故の発生頻度を集計できることが確認できた。これは、年度当初計画で示した、事故全体の95%をカバーする事故場面に該当するかどうかを識別するシステムに相当するものであり、目標を達成できた。本システムの実現にあたり、ヒヤリハットデータベースに含まれるアノテーションデータを交通オントロジーモデルに変換し、新たなデータベースシステムの開発を実施できたことから、交通オントロジーモデルの妥当性を検証できたものと考える。事故回避モデルの検証では、前述した7種の運転場面に対して、理論的事故回避ドライバモデルを設計し、シミュレーション試験により200時間事故を生じさせないことが確認できたことから、目標を達成できたと考える。ただし、歩行者や自転車といった市街地運転時に重要となる対象者のモデル化に関しては、平成30年度に行う「リスク顕在化予測手法」を実装する必要があり、試験対象にできていない。シミュレーションシステムの実装は完了していることから、リスク顕在化予測手法の構築により、より現実に近い試験環境でのシミュレーション試験を速やかに実施できる見込みであり、研究の実施に支障はない。H30年度は,リスク顕在化予測手法の構築として,ヒヤリハット事例を体系的に分類し,データベース化するためのシステムの構築,および,交通ヒヤリハット事例に対する確率論的モデルを用いた分析法を開発した.その概要を以下で説明する.(1)交通ヒヤリハットデータベースの構築東京農工大学保有するヒヤリハットデータベースシステムは,低速であり計算機による事故事例の解析が困難であるという課題があった.

これを解決するために,Ontologyに基づく新たな交通事故形態分析法を提案した.本研究により,ソフトウェアからのアクセスが容易であり,従来法に比べ30倍以上高速にデータ検索が可能なシステムを実装した.また,20台の新たなドライブレコーダーをタクシーに設置し,本データベースのための事例収集を実施中である.(2)事故リスクを指標とした車両運動パラメータの特徴抽出手法の構築ヒヤリハット事例などから車両の運動パラメータを抽出した際に,そのパラメータとリスク指標との関連性を解析することができれば,ヒヤリハット前の行動から,リスク指標を推定することが可能になる.具体的には,運動パラメータとリスク指標の組を収集し,混合ガウスモデルにより近似する.そして,走行中の車両から得られた運動パラメータのみを固定値として,マルコフ連鎖モンテカルロ法に基づくデータサンプリングを行うことで,リスク指標の期待値を推定する.この方法は,特定の運転行動や運動モデルに依存しないという特徴があり,様々な場面に広く適用でき,かつ,結果は同じスケールをもつリスク指標の期待値であることから,汎用性が高い.ヒヤリハットデータベースの構築が完了し,既存のシステムからのデータ移行や,新規システムを用いたデータ収集が順調に実施できている.また,事故が顕在化した際の事象であるヒヤリハット事例を用いて,その事故リスク値を運転行動データから推定することを可能にしたことは,本研究課題の目的である潜在的な事故要因が顕在化する確率を推定するモデルを構築する際の基盤技術として有用である.以上の理由から,研究はおおむね順調に進展していると評価した.平成30年度に行う研究では、ドライブレコーダにより500時間以上の市街地運転行動データを収集する計画が含まれている。本データ収集には数か月の期間を要することが予測されるので、平成30年3月末より8台の車両に対してデータ収集機器を設置し、データ収集開始している。これにより、平成30年7月末までにはデータの収集、および、交通オントロジーモデルに基づくアノテーション作業が完了する見込みである。次に、「リスク顕在化予測手法の構築」では、既存のヒヤリハットデータベース、および、上記で述べた新規運転行動データを用いて、「飛び出しを行う歩行者」や「急な進路変更を行う車両」といった、事故発生の要因となる行動を起こしてしまうドライバの意思決定をモデル化する試みを行う。その際に、マルコフ決定過程モデルを用いた新たなドライモデルを構築する計画を立てている。平成29年度中に、マルコフ決定過程モデルに基づくドライモデルは自動運転システムに対する応用などが学会等で発表されており、事故を起こしてしまう人間の行動を記述する方法としても妥当であるという当初の設計に疑義は生じていない。また、マルコフ決定過程モデルを用いた運転行動記述の研究は進展していることから、これらの知見を用いて研究を効率的に行うことができると考えられる。