hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
韓国語学習者のための辞書引き支援ウェブ・アプリケーションと例文データベースの開発

高等教育における韓国語学習支援として、教室内で実践運用できるツールを開発したことが成果として挙げられる。大学の非専攻言語として、日本語母語話者に対する韓国語学習は文字の学習を終えある一定のレベルに達するまで要する時間が長かった。そのため学生者自身が学習を進めるための辞書利用に入る余裕がなかった。辞書のように学習された単語をデータ化していつでも取り出して復習ができる利点があり、必要に応じて自分だけの学習帳を作ることもできる。さらに教室内で必要な情報のみを教師が選別し、スクリーンに映すことができるという利点がある。本年度は、韓国語教育従事者チーム(研究代表の金善美が総括)とシステム開発者チーム(研究分担の神谷健一が総括)に分かれ、研究課題1として既存のスマートフォン対応辞書や機械翻訳の現状認識と教育場面における利用可能性調査に取り組み、特に平成26年度に注力する課題であった。近年、韓国語学習に関するアプリやコンテンツの数も増加傾向にあり、大学生のみならず中高生の間でも普及しつつあるLINEのようなSNS上でも、かなりの高精度の機械翻訳が無料で使えるようになっているという状況である。日本語と韓国語の言語的な距離の差を考慮に入れた上で、こうした情報端末が普及している時代においては、従来は教育現場では忌避される傾向にもあった機械翻訳などの新しいサービスの教育利用についても検討していく余地が大いにあると言える。また、現状においてこれらのサービスで実現されていない辞書引き支援との棲み分けや、これを用いた学習支援の可能性についても検討した。辞書引き支援ツールを併用すると、韓国語を日本語に翻訳して内容を理解するだけでなく、使われている用言の種類やその活用形についての知識を効率よく学習・提示できる可能性がある。研究課題2として、研究課題1および辞書引き支援システムが利用可能な場合の初級・中級授業シラバス範囲の再定義に着手、韓国語能力検定試験などで選定されている初級・中級レベルの単語を品詞分けによって再構築を行った。またシステム開発者チームは、研究課題3である研究課題2を解決するために必要なデータの拡充と辞書引きアルゴリズムの修正着手し作業を続けている。本年度は、韓国語教育従事者チーム(研究代表の金善美が総括)とシステム開発者チーム(研究分担の神谷健一が総括)に分かれ、【研究課題I】【研究課題3】の教育現場における利用可能性調査に引き続き、学習支援に用いるための支援システムとして検討、さらに具体案の構想に着手した。韓国語従事者チームは【研究課題4】である単語や例文収集のデータ入力や訳文作成を、【研究課題5】である授業パフォーマンスを視察し支援可能性を探った。システム開発者チームは【研究課題6】であるWebOCMの後続版である言語学習支援システムの辞書機能にモジュールとして搭載できるWebアプリケーションの開発を進めると同時にCALL教室以外の環境、オフラインアクセスも可能なタブレット端末での利用や、プロジェクターのみを利用し普通教室で例文データを掲示できるような用途にそれぞれ着手した。その成果として、システム開発者チームはipad用試作版を作り上げ、韓国語従事者チームが収集選別したデータを合わせ「韓国語フラッシュ型提示ツール」のを試作版を作成した。今後「韓国語フラッシュ型提示ツール」試作版を韓国語従事者チームが教室運用のため授業パフォーマンスに使用し改善を図る予定である。本研究は韓国語教育従事者チーム(研究代表者の金善美が総括)とシステム開発者チーム(研究分担者の神谷健一が総括)に分かれて活動していた。本研究の開始当初は日本語母語話者を対象とする高等教育における初・中級段階にある韓国語学習者のための辞書引き支援ツール等の開発を試みることを目的とし、Web対応授業支援システムWebOCMへの搭載を目指す研究を行っていた。外国語学習において、ある一定のレベルに到達すると一時期、学習が円滑に進むようになるが、遅かれ早かれ次の壁に立ち向かうことを余儀なくされるものであり、これらを順風満帆に乗り越えていくことが外国語学習における成功の一つの鍵であることは多くの外国語熟達者が共有する経験であるように思われる。しかし大学生が初習外国語かつ非専攻言語として韓国語を学習する場合、学習時間上の制約もあることから、英語の場合とは異なり、辞書利用の入る余地がほぼなかったと考えられる。近年ではスマートフォンで利用できる無料の辞書も登場しているが、その一方でAIを利用していると思われる機械翻訳の急激な進化に伴い、研究計画自体の見直しが必要になり、別の方向性を目指すことが適切であると考えられる状況となってしまった。韓国の研究者との意見交換なども含めた様々な模索があったものの、最終的に本研究では研究代表者の金善美と研究分担者の神谷健一の両名による授業支援システムの開発を目指すことになった。

対象としているのは同様に初級段階であるが、とりわけ2016年度以降は文字学習の支援を効率的に進めることができるデータベース利用型ツールの開発を継続して行っており、2017年3月にはe-Learning教育学会にて口頭発表『韓国語教育におけるハングルフラッシュ型提示ツールとその実践利用』を行った。最終年度である2017年度には日本韓国語教育学会での口頭発表も計画している。上述の通り、研究計画自体の見直しが必要となり、別の方向性を目指すことが適切であると考えられる状況となってしまったが、授業支援システムの開発においては当初の計画以上に進展していると考えている。また、この手法においてはプロジェクタとスクリーンという最小限の設備を用いながらも、従来型の授業とは異なり「黒板とチョークでは絶対にできない授業」の実現に成功していることから、新規性の高い授業形態であると考えている。とりわけ文字学習においては、子音14個と母音10個からなるハングルの音節について、表示・非表示や、組み合わせる位置を瞬時に表示でき、また、同じ子音であっても文字連続の際に起こる連音化や濁音化についても表示できる点は優れており、さらに語末の母音・子音によって2種類に区別される3つの助詞(が・は・を)と組み合わせた場合の連音化・濁音化についても画面上のボタンの1回の操作によって実現が可能である。さらに2017年3月にhttp://www.oit.ac.jp/ip/kamiya/kor/にて公開した改良版以降、iPadにも対応しており、授業者の自由度は一層高まったと考える。またiPadを所有する学生には自習用ツールとしての活用も見込めることから、今後の展開がますます期待できる。詳細は上記URLにて公開している資料に委ねるが、学生からの評価も非常に高い。従来このような授業支援システムを用いた研究は、学習者支援型、つまり学習者の成績がどれだけ伸びたかによって測定される傾向があったが、教員支援型の授業支援システムについての研究は緒に就いたばかりであると考えている。我々教員の経験知では、適切な授業支援システムを適切な場面で利用するだけで、教室の雰囲気は全く異なったものになる。従来型の授業支援システムの利用に関する研究ではこのダイナミズムの変化が全く無視されていたといっても過言ではない。本研究は韓国語教育従事者グループ(研究代表者の金善美が統括)とシステム開発者グループ(研究分担者の神谷健一が統括)に分かれて活動した。本研究では、開始当初の平成26年から日本語母語話者を対象とする高等教育における初・中級段階にある韓国語学習者のための辞書引き支援ツール開発を試みることで、Web対応授業支援システムWebOCMへの搭載を目指す研究を行った。したがって外国語学習において、初級の段階での学習が効果的と考えられる頻度の高い単語や文法事項の学習に焦点を絞り取捨選択を行った。高等教育における韓国語学習者の特徴として、英語とは異なる初習外国語かつ非専攻言語である点から一定のレベルに到達するまで辞書利用に入る余地がほぼなかった。
中山間地域の空間特性を考慮した復興計画に関する研究

本研究では、災害時における中山間地域の脆弱性を明らかにしながら、どのような点に考慮すれば持続的な復興につながるのか考察することを目的とした。具体的には、新潟県中越地震における被害傾向、復興過程を整理、分析しながら、集落移転や復興基金、義援金など地域再建のためのしくみに着目した。そして復興の概念、策定方法等について考察し、地域特性に応じた復興計画について検討を行った。本研究では災害時における中山間地域の脆弱性を明らかにしながら、どのような点に考慮すれば持続的な復興につながるのか考察することを目的として、当該年度は次のようなことを行った。まず年度全体を通して新潟県中越地震の被災集落へ訪問、復興状況について現地把握を行った。また新潟県庁、市町村等行政機関において統計等関連資料の収集を行った。現地調査では、震災発生前の集落における意志決定、活動には限界がうかがわれ、新しい発想、枠組みによる取り組みが始まりつつある傾向がみられた。集落の役員を中心とした議論、意志決定から女性や若者など集落全体の声を反映させるしくみづくり、本家、分家など家制度の打破、震災直後に駆けつけたボランティアとのつながりの強化、都市交流等による新たな外部支援者の発掘などである。こうした新しい人材発掘の試みは、1月に行った台湾集集地震から復興した集落における調査でも確認された。その一方で、震災発生当時は同じ集落で生活していたものの、従来から存在する集落で現地再建を行った世帯と震災を契機に離れた世帯との心理的な距離を十分に縮めるには至っていない部分もうかがえる。こうした物理的な距離と心理的な距離との関係は阪神・淡路大震災ではあまり顕在化しなかった現象である。3年間の住宅再建状況を調べると、冬期間以外の建築着工数が多い反面、集落における復興に関する議論は冬季に活発化することがよみとれた。積雪地域等では季節について考慮したハードとソフトの復興計画、活動を検討することが必要である。本研究では災害時における中山間地域の脆弱性を明らかにしながら、どのような点に考慮すれば持続的な復興につながるのか考察することを目的として、当該年度は次のようなことを行うた。研究は新潟県中越地震の被災集落へ訪問、復興状況について現地把握を中心に行った。特に今年度は、災害発生時における義援金配分の実態と課題について把握、検討を行ってきたが、従来の広く被災者(被災世帯)への見舞金という性格からある特定の被災者層や地域等空間的な広がりに対して配分する形へ変わりつつあるとともに、被災者への行政支援制度と重複する要素のあることが明らかとなった。取り上げた地震災害の事例は、一都道府県に収まる規模が多かったものの、義援金取り扱いの根拠となっている地域防災計画における位置づけ、記載内容、実際に災害が発生した際の義援金配分などが都道府県により大きく異なっていることは、今後の発生が懸念される東海、東南海、南海地震など広域型災害が発生した際には、同じような被害状況であってもその災害義援金の配分対象、配分方法、配分金額等には被災都道府県により違いが生じる懸念がある。また大規模な災害になれば義援金募集期間も長期となり、配分機会も複数回になる。発生初期(避難生活等応急対応期)の配分内容と時間が経過した復旧期、復興期における配分内容は意味が異なってくる。迅速性を優先させて初期には統一基準による配分を行い、一定期間後は多様性を考慮した配分内容とするなど柔軟性、多様性など義援金の特性をふまえたうえで、義援金に関する固定観念の転換と復興支援制度のしくみの改善まで視野に入れた検討を行うか広範な議論が必要である。本研究でけ災害時における中山間地域の脆弱性を明らかにしながら、どのような点に考慮すれば持続的な復興につながるのか考察することを目的としている。研究方法としては新潟県中越地震の被災集落へ訪問、復興状況について現地把握を中心に行った。今年度は、主に中山間地域における災害発生時に大きな問題となる孤立集落と防災集団移転について把握、検討を行った。孤立集落の居住者からは、直後の孤立状熊から避難までの時間よりも、避難後の一時帰宅までの時間や帰村までの見通しが立たなかったことへの不安が多く聞かれた。情報機器の多重化等孤立集落の防災対策を行うだけでなく、災害発生後の孤立集落被災者への情報提供など発生後の対応が不可欠である。また、防災集団移転は、新潟県中越地震の被災地全体では約100戸が対象となったが、そのうち、早期に全戸移転が実施された集落について調査を行った。

全戸移転か実現しなかった集落もある中で、完全移転ができた要因として、ほとんどの住宅が全壊したこと、被災住宅はすべて築20年以上で全世帯とも住宅に関する債務がなかったこと、農協糸の住宅共済への全世帯加入など被災に対する補償、見舞金等がまとまってあったこと、災害前から多くの世帯でいずれは集落を離村せざるを得ない・集落は消滅する可能性があるとの認識かあったこと、集落のリーダーが早期に集団移転の意思決定を行い行政よりも先行する形で調整を行ったことなどがあげられる。このようなことから復興計画において集落移転を検討する場合には災害発生前から地域の状況を十分に把握しておくことが重要である。なお3年間の研究成果等のまとめを韓国防災学会において報告した。
前立腺癌におけるアンドロゲン受容体の分子調節機構の解明と治療標的分子の同定

前立腺癌におけるアンドロゲン受容体(AR)の機能解析は、ホルモン治療(ADT)に抵抗性となる、いわゆる去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)の病態を明らかにする上で最も重要な研究課題である。我々は、ADTやCRPCへの進展の際に活性酸素や酸化ストレスが大きな役割を果たしており、この酸化ストレスによって転写因子であるTwist-1、YB-1が発現誘導され、ARの発現誘導につながる分子機序を解明した。さらに、AR共役因子の活性化や抗コレステロール薬であるスタチン、消炎鎮痛剤であるアスピリンがAR調節に与える分子機序についても新しい知見を得た。(1)酸化ストレスにおけるARの発現誘導の分子機序前立腺癌細胞株において、ADTにより、細胞内酸化ストレスが増加し、さらにこの酸化ストレス下でTwist1/YB-1経路が誘導され、ARの発現が促進されること、CRPC株で酸化ストレスが増大していることから、ADTによって生じる酸化ストレスがCRPCの機序の一つであることを明らかにした。(2)ARの共役因子とCRPCとの関連について(3)アセチル化酵素とARの関連についてアセチル化酵素であるTip60が、ARの転写共役因子であり、ARの細胞内局在に関与していることを見出した。また、韓国との共同研究により、ヒストンアセチル化阻害酵素であるProcyanidin B3がARにおけるp300依存性のアセチル化を阻害することで、前立腺癌の増殖阻害作用を増強する事を明らかにした。(4)statinによるAR発現抑制の分子機序抗コレステロール剤として広く服用されているスタチンが、ARの蛋白分解を促進することで、AR発現を抑制していること、その結果、前立腺癌の細胞増殖抑制とPSA減少効果が生じていること見いだした。これまでに複数の疫学研究からスタチンによる前立腺癌の予防効果が報告されているが、我々の研究はその分子機序の一つを明らかにしたものである。(1)Peroxiredoxin2におけるARの発現誘導の分子機序前立腺癌細胞株において、ADTにより、細胞内酸化ストレスが増加し、これがCRPCに至る原因の一つであることを昨年報告した。今回、細胞内の主要な酸化物質であるPeroxiredoxin familyの中で、Peroxiredoxin2がCRPC株で過剰発現し、これがARの活性を上昇させアンドロゲン感受性を増加させていることを明らかにした。さらに、Peroxiredoxin2は細胞質ではAR活性を高めるのに対し、核内ではAR活性を低下させるという2面性があることが判明した。CRPC細胞では、Peroxiredoxin2は核内で減少する一方、細胞質で増加しており、これがCRPC形質の獲得の機序であることを明らかにした(Free Radic Biol Med 51:78-87, 2011)。(2)転写因子YB-1とCRPCとの関連について我々は、ストレス応答性の転写因子であるYB-1が、CRPC株で高発現し、前立腺全摘標本の免疫組織学的検討で高いグリソンスコアと相関する事が明らかにした。さらに、YB-1はARの発現を誘導することで、CRPCの形質を獲得していることを明らかとし、YB-1がCRPC治療における新たな標的分子となることを報告した(Endocr Relat Cancer 2011)。PKAは様々な正常細胞や癌細胞において分化増殖に関わる重要なmediatorであるが、我々は、まずCRPC株で、PKAが活性化していることを見い出した。PKAはcAMPにより活性化されるが、phosphodiesterase 4B (PDE4B)はcAMPを加水分解するため、PDE4Bの低下がPKAの活性化に関与すると考えられている。我々は、CRPCへと進展する分子機序の一つとして、酸化ストレスによりPDE4Bの発現が低下し、その結果PKAが活性化されることを明らかにした(Prostate 2011)。前立腺がんに対するADTやCRPCへの進展の際に活性酸素や酸化ストレスが大きな役割を果たしていることを明らかにし、この酸化ストレスによって転写因子であるTwist-1、YB-1が発現誘導され、ARの発現誘導につながる分子機序を解明した。YB-1は、CRPC株で高発現し、前立腺全摘標本の免疫組織学的検討で高いグリソンスコアと相関する事が明らかにした。さらに、YB-1はARの発現を誘導することで、CRPCの形質を獲得していることを明らかとし、YB-1がCRPC治療における新たな標的分子となることを報告した。さらに、peroxiredoxin2やTip60、HP1βなどのAR共役因子の活性化、CRPCの成因の一つであり、その治療標的をなりうる事を示してきた。

抗コレステロール薬であるスタチンや、消炎鎮痛剤であるアスピリンは、主に米国で前立腺がんの化学予防薬として広く知られている薬剤であるが、この化学予防研究の予備研究として、スタチンでは、ARの蛋白分解亢進によりアンドロゲン感受性を低下させることアスピリンは、Prostaglandin受容体EP2とEP3を介したARの発現低下がその機序であることを新たに見出した。計画通り、研究を推進できている。研究内容は、H22年、H23年の2年間で、9篇の英文論文として、査読のある国際的学術雑誌に原著論文として受理されている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後も、予定通り研究を推進する。培養細胞のみではなく、アニマルモデルや臨床検体を使い、より実臨床に応用できるトランスレーショナルリサーチに発展させたい。
3Dスキャナーを用いた顔面神経麻痺後の顔面拘縮の評価方法と治療方法の開発

平成30年度の研究目的は、顔面の3Dモデルを用いて顔面拘縮で最も不快な頬部の盛り上がりの程度の評価方法を確立させることであった。そのため、健常者10例、顔面拘縮を発症し患側頬が盛り上がっている患者6例を対象に顔面の3Dモデルを作成し、頬の盛り上がりの程度を評価した。計画では健常者のみを対象としていたが、患者の頬を評価し顔面拘縮を発症した頬部がどのように変化しているか調べる必要があった。そこでまず、患者の頬の状態を患側と健側で比較した。開発した顔面固定装具を使って3Dモデルを作成し、装具上の3点を通る基準面を作製。基準面に対して垂直な平面で3Dモデルの頬を断面し、頬の厚みを測定する方法を開発した。すると、顔面拘縮を発症した患者では、患側の頬の厚みが健側と比較して厚くなっていることを確認した。そこで頬の厚みの左右差で顔面拘縮の程度が評価できると仮説を立てた。次に、患者の頬の厚みの左右差と健常者の頬の厚みの左右差を比較し、患者の頬の厚みの左右差が健常人の左右差と比較して有意に大きくなっていることを確認した。このことから、頬の厚みの左右差で顔面拘縮の程度を評価できることを明らかにした。顔面拘縮に対する一時的な治療法としてボツリヌス毒素局所投与がある。そこで、ボツリヌス毒素投与前後で、頬の厚さの患側と健側の差が有意に小さくなっていることを確認した。つまり、開発した方法でボツリヌス毒素の局所投与の顔面拘縮に対する治療効果を証明することができた。以上の結果から、3Dスキャナで作成した顔面の3Dモデルを用いて顔面拘縮の客観的な評価方法を確立させた。この結果は、平成30年顔面神経学会で報告した。また、続報を令和元年の顔面神経学会で報告する予定である。平成30年度の目標は顔面拘縮の評価方法を確立させることであった。顔面拘縮を発症した患者6例の頬の盛り上がりを患側と健側で比較し、患側の頬の厚みが大きくなっていることを明らかにした。そこで、頬の厚みの患側と健側の差をもって顔面拘縮の程度を評価できるのではないかと考えた。顔面拘縮を発症した症例の頬の厚みの患側と健側の差は5.6mm。一方健常人10例の頬の厚みの左右差の中央値は0.7mmであった。健常人の頬の厚みの差と比べると、顔面拘縮群で頬の厚みの差が有意に大きいことがあきらかになった。またこの方法を用いて、4例の患者の顔面拘縮に対してボツリヌス毒素の局所投与による治療効果を評価した。治療前と比較し治療後は頬の厚みの差は有意に改善していた。また視診上の顔面拘縮も改善していた。以上のことから、顔面拘縮の程度を評価できることがあきらかになった。予定通り顔面拘縮の評価方法を開発し、この方法でボツリヌス毒素の局所投与による治療効果も証明することができた。予定では、鼻唇溝の深さの患側と健側の比を用いて評価する予定であったが、健側の鼻唇溝の深さ(頬の厚み)が想定していたより値が小さく、健側を分母とし比を計算すると過剰に評価しばらつきが大きくなりすぎたため患側と健側の差を用いて評価することとした。予定していた評価法を少し変更したが、評価方法を決定したこと、その評価法を用いてボツリヌス毒素治療の効果を評価できたことから研究は順調に進展していると判断できる。今年度は予定通り、顔面拘縮に対するボツリヌス毒素単独治療群とボツリヌス毒素・触覚フィードバック療法群の治療効果を証明する。両群ともに10例を目標とする。治療には約1年間必要であるために、今年度中に治療を開始した症例を対象に来年度に治療効果を判定する予定である。研究結果を令和元年の顔面神経学会で報告する予定である。来年度は、治療後に触覚フィードバック療法を中止する群と継続した症例で長期成績を検討する。また、中止する群では顔面拘縮が再発するかを明らかにする。また、顔面神経麻痺後に顔面拘縮が発症してから本治療の開始するまでの期間が治療効果に与える影響を検討する予定である。

次に、患者の頬の厚みの左右差と健常者の頬の厚みの左右差を比較し、患者の頬の厚みの左右差が健常人の左右差と比較して有意に大きくなっていることを確認した。このことから、頬の厚みの左右差で顔面拘縮の程度を評価できることを明らかにした。顔面拘縮に対する一時的な治療法としてボツリヌス毒素局所投与がある。そこで、ボツリヌス毒素投与前後で、頬の厚さの患側と健側の差が有意に小さくなっていることを確認した。つまり、開発した方法でボツリヌス毒素の局所投与の顔面拘縮に対する治療効果を証明することができた。以上の結果から、3Dスキャナで作成した顔面の3Dモデルを用いて顔面拘縮の客観的な評価方法を確立させた。この結果は、平成30年顔面神経学会で報告した。また、続報を令和元年の顔面神経学会で報告する予定である。平成30年度の目標は顔面拘縮の評価方法を確立させることであった。顔面拘縮を発症した患者6例の頬の盛り上がりを患側と健側で比較し、患側の頬の厚みが大きくなっていることを明らかにした。そこで、頬の厚みの患側と健側の差をもって顔面拘縮の程度を評価できるのではないかと考えた。顔面拘縮を発症した症例の頬の厚みの患側と健側の差は5.6mm。一方健常人10例の頬の厚みの左右差の中央値は0.7mmであった。健常人の頬の厚みの差と比べると、顔面拘縮群で頬の厚みの差が有意に大きいことがあきらかになった。またこの方法を用いて、4例の患者の顔面拘縮に対してボツリヌス毒素の局所投与による治療効果を評価した。治療前と比較し治療後は頬の厚みの差は有意に改善していた。また視診上の顔面拘縮も改善していた。以上のことから、顔面拘縮の程度を評価できることがあきらかになった。予定通り顔面拘縮の評価方法を開発し、この方法でボツリヌス毒素の局所投与による治療効果も証明することができた。予定では、鼻唇溝の深さの患側と健側の比を用いて評価する予定であったが、健側の鼻唇溝の深さ(頬の厚み)が想定していたより値が小さく、健側を分母とし比を計算すると過剰に評価しばらつきが大きくなりすぎたため患側と健側の差を用いて評価することとした。予定していた評価法を少し変更したが、評価方法を決定したこと、その評価法を用いてボツリヌス毒素治療の効果を評価できたことから研究は順調に進展していると判断できる。今年度は予定通り、顔面拘縮に対するボツリヌス毒素単独治療群とボツリヌス毒素・触覚フィードバック療法群の治療効果を証明する。両群ともに10例を目標とする。治療には約1年間必要であるために、今年度中に治療を開始した症例を対象に来年度に治療効果を判定する予定である。研究結果を令和元年の顔面神経学会で報告する予定である。来年度は、治療後に触覚フィードバック療法を中止する群と継続した症例で長期成績を検討する。また、中止する群では顔面拘縮が再発するかを明らかにする。また、顔面神経麻痺後に顔面拘縮が発症してから本治療の開始するまでの期間が治療効果に与える影響を検討する予定である。筋電計を購入予定であったが、教室保有のものを使用できたため。また、前もって購入していた3Dモデルを解析するためのソフトである3DReshaperを使用していたが、解析用パソコンの機能の問題、症例数の増加などにより解析に時間がかかり研究の進行に影響を与えるため、より高性能な解析用パソコンと解析ソフト3Dreshaperを購入する予定である。
プラズマ粒子制御のための壁面ポンプの開発研究

水素を効率的に排気するためにプラズマ真空容器に設置する壁面ポンプの一種、カーボンシートポンプの開発実験を行った。カーボンシートを購入し、そのポンプ性能を確認した。プラズマはグロウ放電が可能な真空容器を用いて水素放電を行い、電場で加速された水素イオンがカーボンシートに捕獲され、ポンプとして働くことを確認した。カーボンシートは次第に水素が飽和してポンプ性能が落ちていくが、これはカーボンシートを加熱することで、飽和した水素原子を吐き出して、再び使用出来るというのが当初の予測であった。今回それが正しいことも確認した。加熱はカーボンシートに電流を流すことで行われ、700°C以上加熱することで水素が離脱することも確認した。離脱するガスも質量分析器で測定し、確かに水素が吐き出されていることを確認した。但し実際は純粋な水素だけでなく、カーボンシートの炭素と反応して出来たメタンの形で出てくる水素も存在する。ところで、大型のプラズマ閉じ込め装置に設置する場合、特にLHDのように超伝導磁石を使用した装置に使用する場合、再生時の熱が取り付けた壁にダメ-ジを与える可能性があることが判明した。このため熱が集中しない取り付け方法の検討も行い、熱輻射板をカーボンシートと壁の間に入れることが効果的であることが判明した。ポンプ性能の実験では、定性的には過去に行われたビームを用いた実験とよい一致が見られたが、定量的には今回の実験の方がビームを用いた実験よりも多くの水素を捕獲しているように見える。この原因はおそらくカーボンシートの表面が平滑ではなく、非常に細かな凹凸があり、実効的には見た目以上の表面積を持つためと考えられ、現在電子顕微鏡写真を撮影し、表面状態を調べることを計画中である。
ゲノム編集技術を用いた染色体大領域欠失AML/MDSモデルマウスの作製

人工ヌクレアーゼを用いて、7q-の3つの責任遺伝子候補Miki, CG-NAP, Samd9Lをヘテロ欠失させた、新規AML/MDSモデルマウスの作製を試みた。CRISPR/Cas9プラスミドDNAを環状のまま受精卵前核へ注入する手法を用いたところ、目的配列の高い切断効率が得られ、単一遺伝子の遺伝子欠失マウスの作出に成功した。さらに複数遺伝子の同時ヘテロ欠失マウスの作出は、細胞毒性の問題から現在手法を変えて継続しており、解析結果が待たれる。AMLやMDSで見られる染色体異常のうち、-5/5q-、-7/7q-、20q-などのモノソミーや染色体大領域欠損では、染色体上の広い範囲にまたがる複数の遺伝子の片アレル欠失に伴うハプロ不全が病態促進に深く関与する可能性が示され注目されている。本研究では人工ヌクレアーゼ技術であるCRISPR/Casシステムを用いて、7番染色体長腕欠失(7q-)の近接する4つの責任遺伝子Samd9L, Samd9, Miki, CG-NAP、及びその周辺領域のヘテロ欠損マウスを作製し解析することにより、7q-がMDSやAMLの発病を促進するメカニズムを解明することを目的とする。まず始めにCRISPR/Casシステムの確立のため、Centrin-1をコードするCetn1遺伝子を導入したCRISPR/Casプラスミドをin vitroの系で切断効率を評価したのち、C57BL/6マウスの受精卵前核にマイクロインジェクションしCent1遺伝子欠損マウスの作出を試みた。その結果2匹のCent1遺伝子欠損マウスが得られ、遺伝子配列を確認したところ、それぞれCetn1遺伝子座に2塩基と15塩基のdeletion変異が生じており、CRISPR/Casシステムが正常に立ち上がったことを確認した。続いてMikiとCG-NAPのCRISPR/Casプラスミドを作製し、C57BL/6マウスもしくはSamd9Lホモ欠失マウスの受精卵にマイクロインジェクションを行い、現在CG-NAP遺伝子欠損マウスとSamd9L/Miki遺伝子欠損マウスの作製が進行している。骨髄異形成症候群(MDS)は、染色体数の増減と、エピゲノム変化や遺伝子点突然変異の蓄積とを背景に発症する疾患で、血液細胞の強い形態異常を特徴とする。このため、責任遺伝子候補を欠損させたMDSモデルマウスを作製するには、異なる複数の遺伝子欠損マウスを交配する必要があり、多大な労力を要する。本研究は、人工ヌクレアーゼを用いて7番染色体長腕欠失(7q-)のモデルマウスを作製する目的として、欠失部位に存在する4責任遺伝子(Samd9L, Samd9, Miki, CG-NAP)及びその周辺領域のヘテロ欠損マウスを作製し、解析することを目的とする。前年度にポジティブコントロールを用いてマウス受精卵でCRISPR/Casシステムが正常に立ち上がったことが確認できたため、続いてMikiとCG-NAPのCRISPR/Casプラスミドを作製し、C57BL/6マウスもしくはSamd9Lホモ欠失マウスの受精卵にマイクロインジェクションを行い、CG-NAP遺伝子欠失マウスとSamd9L/Miki欠失マウスの作製を試みた。しかし、CRISPR/CasプラスミドのDNA毒性の影響が強く、目的マウスの産出が叶わなかったため、crRNAとtracrRNA、Cas9タンパクをインジェクションする方法を立ち上げ、作製した。また並行して、染色体大領域欠失マウスモデルの作製に挑戦した。ヒトで同定した共通微小欠失領域に対応する、MikiとSamd9Lの全ゲノム領域を含む約230kbの領域の両端にCRISPRプラスミドを設計し、マウス受精卵前核に共導入し作出を試みたが、当初計画していた数10kb単位のdelの挿入は極めて頻度が低く、またloxP配列を挿入する手法もloxP配列の一部が挿入されるのみで、技術的に難航した。現在目的領域を欠失させたES細胞を用いて、染色体大領域ヘテロ欠失マウス作出を試みている。今年度はCRISPR/Casシステムの立ち上げを行ったところ、2匹のCetn1遺伝子欠損マウスの作出に成功し、システムが正常に動くことを確認した。しかし200個以上のC57BL/6マウスの受精卵にインジェクションを行ったにもかかわらず得られた産仔はCetn1遺伝子欠損マウス2匹のみで、変異は高効率に挿入されているが得られる産仔の数が少ないため想定以上の時間を要することが分かり、効率よく産仔を得るための実験系の至適化を行う必要があった。そこでCetn1以外に数個の遺伝子のCRISPR/Casプラスミドを作製し、精製方法や受精卵へのプラスミド注入量、またレシピエントマウスへの受精卵移植方法などの手技的な調整を行うとともに、オフターゲット変異の挿入解析を進めた。

条件検討が必要となる動物実験を優先させた結果、CG-NAP遺伝子欠損マウスとSamd9L/Miki遺伝子欠損マウスの解析に遅れが見られるが、CRISPR/Casプラスミドの作成やインジェクションは進んでおり、遅れながらも研究は進んでいると考えられる。血液腫瘍学、発生生物学今後は作出した(1)CG-NAP遺伝子欠損マウスとSamd9L/Miki遺伝子欠損マウスの解析を進めるとともに、並行してSamd9L/Miki/CG-NAP遺伝子欠損マウスの作製と(2)7番染色体大領域欠失マウスモデルの作製を進める。(1) CG-NAP遺伝子欠損マウスは血液細胞で小核や多核、異型性細胞の発生が推測されることから、骨髄細胞を用いてα-Tubulinとγ-Tubulinの免疫蛍光染色を行い、分裂細胞の中心体成熟と紡錘糸の伸長を確認し、分裂異常の有無を調べる。また定期的に末梢血・骨髄像を観察しながら長期観察を行い、白血病発症への関与について検討する。加えて、移植実験とコロニーアッセイにより、造血幹細胞の分化・増殖能を検討する。Samd9L/Miki遺伝子欠損マウスとSamd9L/Miki/CG-NAP遺伝子欠損マウスについては、Samd9L遺伝子欠損単独で発症するMDSの発症速度や発症頻度、表現型に影響を及ぼすかどうか確認するとともに、造血幹細胞の特性についてフローサイトメトリー解析や移植マウスモデルの作製を行い検討を進める。(2)染色体大領域欠失(7q-)マウスモデルの作製については、欠失させたい領域の両端にそれぞれ設計した2つのCRISPR/Casプラスミドをマウス受精卵前核に同時にマイクロインジェクションすることを計画していたが、現在の手法では作出が困難であることが予想されるため、CRISPR/CasプラスミドをgRNAにしたのちインジェクションする手法に切り替えて欠失効率を検討する。並行して、マウスだけではなく白血病細胞株であるHL-60細胞とヒトiPS細胞でCRISPR/Casシステムによる7番染色体の大領域欠失モデルを作製する。今年度はCRISPR/Casシステムの立ち上げが想定以上に困難で手技的な調整を進めた結果、CG-NAP遺伝子欠損マウスとSamd9L/Miki遺伝子欠損マウスの解析に遅れが生じたことから、想定していた遺伝子改変マウスの解析に使用する予定であったフローサイトメトリーや免疫蛍光染色に使用する抗体などの消耗品の購入の遅れや、成果発表を予定していたで海外学会への不参加により未使用額が生じた。CG-NAP遺伝子欠損マウスの解析を進めるためには、造血細胞の分裂期の中心体成熟と紡錘糸の伸長確認と、分裂異常の有無を調べる必要があるため、α-Tubulinとγ-Tubulinの抗体の購入やFISHプローブキットを購入する必要がある。Samd9L/Miki遺伝子欠損マウスとSamd9L/Miki/CG-NAP遺伝子欠損マウスの解析では、造血幹細胞の特性を検討するためのフローサイトメトリー染色試薬や、骨髄移植モデル作製のためのサイトカインや造血細胞培養試薬、トランスフェクション試薬、レシピエントC57B6マウスを購入する必要がある。さらに、染色体大領域欠失モデルの作製に伴う特殊な細胞培養試薬やプラスミドを購入する必要がある。また、これらの研究で得られた結果を学会等で発表するために旅費や学会参加費が必要となる。
変動する資源の管理システムと種苗放流計画に関する数理学的研究

(1)ランダムな資源変動下で長期間の平均漁獲量を最大化するにはCESがよいことが提示されている。変動が周期性をもったり時系列的に相関をもつ場合は,解析が不十分で不明な点が多い。不明である。様々な年変動下でのいくつかの漁獲方針が資源保護と漁獲量増加に及ぼす効果を試算し,最適な管理システムを模索する。(2)資源変動を引き起こす要因として,(ア)親魚1尾あたり産卵量あるいは密度依存的死亡が起こる前の稚仔の生残率の変動,(イ)生残率の密度依存性の強さの変動,(ウ)密度依存的死亡が起こった後の稚仔の生残率の変動,の3つを考える。それぞれの場合について「変動が小さい場合についての線型近似による解析」と「変動が大きい場合も含めての数値実験」の2つを実施する。再生産関係については,Beverton-Holt式とRicker式の2つについて検討した。(3)資源変動や管理システム,放流計画のための情報を得るには調査研究のコストが必要で,規制実施にもコストが伴う。また「最適システム」の近傍には,大きく劣らない「適当システム」が多数あると予想される。本研究の課題では,利用できる情報や調節できる要素が限定されていることが管理の効果に及ぼす影響にも注目した。(4)資源変動を導入したシミュレーションの結果,漁獲率一定方策の%SPRであるF_<35‰>が妥当であることが判明した。資源管理と種苗放流に関連して,繁殖価による相互比較を数魚種について実施した。不明である。
軟X線ミクロ可視化とLBM解析によるPEFC電極構造とフラッディング現象の解明

固体高分子形燃料電池(PEFC)の高性能化,低コスト化のためには,内部で反応物質の輸送を担う電極の性能向上が不可欠であり,電極内で凝縮水が生成されること(フラッディング現象)による物質輸送抵抗の増加が性能低下の大きな要因と考えられている.そのため,具体的に電極内のどの領域で水分が凝縮・滞留することが性能低下を引き起こすのかを明らかにすることにより,物質輸送に基づく電極構造の設計指針を提示することが重要である.そこで本研究では,PEFC電極構造とフラッディング現象の関係について,実験及び数値解析より明らかにすることを目的とした.触媒層形成プロセスにおいて,塗布厚さと白金担持カーボン・非担持カーボン混合比を形成パラメーターとすることにより,触媒層厚さ及び白金担持量をそれぞれ独立した構造パラメーターとして触媒層を作製し,性能評価を行った.これより,触媒層薄膜化により抵抗過電圧が低減される一方,低白金化によっては抵抗過電圧及び濃度過電圧が増加することが示された.性能解析より,これらの過電圧増加による性能低下は触媒層内における局所の物質輸送フラックスの増加及び白金周囲における局所フラッディングの影響であると考えられる.以上の電極内の抵抗因子に加えて,軟X線を用いた水分可視化計測より電極の多孔質積層構造の層間に液水が滞留することが示唆されており,更なる酸素輸送の抵抗因子となることが予想されることから,層間の構造解析を行いモデル化し,格子ボルツマン法(LBM)を用いた物質輸送解析を行った.これより,層間にクラック(隙間)が生じており,ここに液水がフィルム状に滞留することにより,ガス輸送が著しく阻害されることが明らかになった.これらの電極内及び電極層間における物質輸送抵抗因子の抽出・評価は,最適な電極構造設計に向けて重要な知見であると考えらえる.固体高分子形燃料電池(PEFC)の高性能化,低コスト化のためには,内部で反応物質の輸送を担う電極の性能向上が不可欠であり,電極内で凝縮水が生成されること(フラッディング現象)による物質輸送抵抗の増加が性能低下の大きな要因と考えられている.そのため,具体的に電極内のどの領域で水分が凝縮・滞留することが性能低下を引き起こすのかを明らかにすることにより,物質輸送に基づく電極構造の設計指針を提示することが重要である.そこで本研究では,PEFC電極構造とフラッディング現象の関係について,実験及び数値解析より明らかにすることを目的とした.触媒層形成プロセスにおいて,塗布厚さと白金担持カーボン・非担持カーボン混合比を形成パラメーターとすることにより,触媒層厚さ及び白金担持量をそれぞれ独立した構造パラメーターとして触媒層を作製し,性能評価を行った.これより,触媒層薄膜化により抵抗過電圧が低減される一方,低白金化によっては抵抗過電圧及び濃度過電圧が増加することが示された.性能解析より,これらの過電圧増加による性能低下は触媒層内における局所の物質輸送フラックスの増加及び白金周囲における局所フラッディングの影響であると考えられる.以上の電極内の抵抗因子に加えて,軟X線を用いた水分可視化計測より電極の多孔質積層構造の層間に液水が滞留することが示唆されており,更なる酸素輸送の抵抗因子となることが予想されることから,層間の構造解析を行いモデル化し,格子ボルツマン法(LBM)を用いた物質輸送解析を行った.これより,層間にクラック(隙間)が生じており,ここに液水がフィルム状に滞留することにより,ガス輸送が著しく阻害されることが明らかになった.これらの電極内及び電極層間における物質輸送抵抗因子の抽出・評価は,最適な電極構造設計に向けて重要な知見であると考えらえる.
骨形成因子(BMP)による骨・軟骨誘導の担体に関する実験的検討

(1)骨梁のみならず骨髄、血管様組織が誘導形成された。その形成量は、BMPの用量(2,10,50μg)に依存していた。CL-Iの単独埋入(controls)では、骨は誘導されなかった。(2)骨誘導が確認されたが、結果集計は未検討未発表である。また、CL-IIの単独埋入(controls)では、骨は誘導されなかった。(3)pHAP pelletの周囲や孔内に骨梁や血管様組織がみられ、その形成量はBMPの用量(2,10、50μg)に依存性であった。pHAPの単独埋入(controls)では、骨は誘導されず、pHAP周囲と孔内への未分化間葉系細胞の侵入のみがみられた。また、今期は、担体間の比較検討は行っていない。骨形成因子(BMP)と共に、担体としてatelopeptide type I collagen(CL)を用い、ラット虚血下腿筋肉内および挙上広背筋弁内に埋入し、その3週後の埋入物の検討を行った。結果:(1)BMP埋入群では、骨梁のみならず骨髄、血管様組織が誘導形成された。CLの単独埋入(controls)では、骨は誘導されなかった。(2)BMP埋入群では骨誘導が確認されたが、埋入物中央にはCLの残存領域が認められた。(3)BMPの用量(2,10,50μg)に関わらず軟骨誘導は認められなかった。(4)BMP埋入群、対照群ともに炎症性の反応はみられなかった。骨形式因子のrhBMP-2あるいはrxBMP-4/7heterodimerと担体としてatelopeptide type I collagenを用い、ラット下腿筋肉内に埋入し、その3週後の埋入物を放射線学的、組織学的に検討を行った。結果:(1)rhBMP-2埋入群の組織学的所見では、旺盛な骨梁と骨髄、血管様組織が誘導形成されていた。その骨梁の形成量は、rxBMP-4/7heterodimer群に勝っていた。(2)rhBMP-2埋入群の軟X線写真の画像解析で、骨陰影の領域、透過性共にrxBMP-4/7heterodimer埋入群に勝っており、骨誘導量が多かった。(3)両群で軟骨誘導は認められなかった。(4)両BMP埋入群ともに炎症性の反応はみられなかった。原著論文・著書:(1)「体液性因子による骨・血管相互作用BMPファミリーとTGF-βファミリー」別所和久、藤村和磨、楠木健司、飯塚忠彦;Clinical Calcium 7:1190-1194,1997.
多機能分子CaMによるCaチャネル制御の構造的基盤の解明

カルシウム結合蛋白質カルモジュリン(CaM)とカルシウムを透過するCaチャネルの制御機構に関して研究を行った。カルシウムフリーのapoCaMとCaチャネル断片(電位依存性L型)に対して行い、構造的基盤を明らかにすることを試みた。変異型apoCaMを用いてチャネルとapoCaMの複合体結晶を得るべくスクリーニングを行い、幾つかの結晶を得ることに成功している。再現性と解析を進める必要がある。また、細胞内カルシウムに依存したCaMとチャネルの相互作用を観測するため、Fura-2とFRETの準同時計測システムの開発を行った。この方法により、カルシウム依存的なCaMのチャネルに対する作用を細胞内にて精度の高く観察することが可能になってきた。広くカルシウムシグナルと関連した生理的な研究に使用されるものと期待される。細胞の興奮メカニズムの機能を明らかにすることを目的として、細胞内カルシウムの動員に関与する分子、特に広範囲の細胞に発現しているカルシウム結合蛋白質カルモジュリン(CaM)とカルシウムを透過するイオンチャネルとの相互作用について、機能とその構造に関する研究している。我々はカルシウム結合型のCa^<2+>CaMと電位依存性CaチャネルのCaM結合部位であるIQモチーフとの断片的複合体のX線結晶構造解析に成功し、分子シュミレーションとの組み合わせから、新たな機能と構造の関連性を見出した(Mori et.al.,Structure 2008)。本年度は、この方法論をカルシウムフリーのapoCaMとCaチャネル断片(電位依存性L型)に対して行い、構造的基盤を明らかにすることを試みた。得られた結晶は分解能3.0Aで回折像を得、報告されていたapoCaMの構造を元に、分子置換法を用いその位相を決定した。解析の結果、apoCaMは二量体を形成していた。しかしCaチャネルの断片を同定するには至らなかった。このことはapoCaMがチャネルに対して強い結合定数を持っているにもかかわらず、複合体は安定構造を取りにくいことを示唆するもので、結晶を得るため上で障害の一つであると考えた。そこで新たに結晶を得るため、カルシウムと常に結合しない機能的安定性を人為的に加えた変異型apoCaMを用いてスクリーニングを行っている。CaMとチャネルの細胞内での相互作用を観測するため、細胞内FRET(CFP,YFP融合Protein)法を用いた予備的実験を行った。細胞内カルシウム依存的なCaMの作用を観測するため、新たにFRETによる相互作用と細胞内カルシウムの同時計測システムを開発している。このシステムを用いて、カルシウム依存的なCaMのチャネルに対する作用を細胞内で観察することが可能になってきた。今後、CaM-チャネル結合との関連性について、機能的側面からの検討を加える予定である。細胞の興奮メカニズムの機能を明らかにすることを目的として、細胞内カルシウムの動員に関与する分子、特に広範囲の細胞に発現しているカルシウム結合蛋白質カルモジュリン(CaM)とカルシウムを透過するCaチャネルの制御機構に関して研究を行った。CaチャネルのCaM結合部位であるIQモチーフとCa^<2+>CaMの断片的複合体のX線結晶構造解析に成功し、分子シュミレーションとの組み合わせから、新たな機能と構造の関連性を見出した。このことから、カルシウムフリーのapoCaMとCaチャネル断片(電位依存性L型)に対して行い、構造的基盤を明らかにすることを試みた。分子置換法を用いてその構造を決定したが、解析の結果、結晶はapoCaMの二量体を形成のみで、Caチャネルの断片を同定するには至らなかった。そこで、変異型apoCaMを用いてチャネルとapoCaMの複合体結晶を得るべくスクリーニングを行った。幾つかの結晶が得られているが、構造解析には至っていない。一方、細胞内カルシウム濃度に依存したCaMとチャネルの細胞内での相互作用を観測するため、新たにFRETによる相互作用と細胞内カルシウムの準同時計測システムを開発した(Semi-simultaneous Imagingsystem)。本手法により、カルシウム依存的なCaMのチャネルに対する作用を細胞内で観察することが可能になってきた。その結果、イオンチャネルーCaM複合体におけるカルシウム感受性はイオンチャネルごとに大きく異なっていることが新たに明らかになった。現在、本手法論に関する論文を作成中である。また、応用的であるイオンチャネル-CaMの感受性については更に生理的機能との関連性について研究を進める必要がある。
シスプラチン耐性に関与する蛋白、遺伝子の同定及びクローニング

蛋白レベルからはシスプラチン50倍耐性株で親株と比較して明らかに2本のバンドの増強が認められ、逆に1本のバンドの減弱と1本の消失が認められた。しかしながら特異的バンドの抽出は他種類の蛋白が混在して困難であった。薬剤耐性にはグルタチオンによる解毒の関与が報告されている。そこで我々はグルタチオンカラムでまづ蛋白をグルタチオン結合蛋白だけにした後に、電気泳動した。その結果、複数のバンドの消失や増強を認め現在アミノ酸分析中である。卵巣癌細胞株(NOS2)とそのシスプラチン耐性株(NOS2CR2)を大量培養し、各々グルタチオンカラムによりグルタチオン結合蛋白を抽出した。NOS2CRに特異的に認められたバンドを切り出しアミノ酸配列を調べた。その結果最も濃いバンドはグルタチオン-S-トランスフェラーゼであった。またその他のバンドも抽出しアミノ酸配列を調べたが蛋白が修飾されており従来の方法ではアミノ酸配列を決定できなかった。これらのバンドは薄いため十分な量が採取できなかった。さらに大量培養し同定する必要がある。一方、プラチナ系抗癌剤としてはシスプラチン以外にカルボプラチンとアクプラが市販されておりカルボプラチン耐性株(NOS2CBR)を作成しプラチナ系抗癌剤(シスプラチン、カルボプラチン、アクプラ、NK121、DWA2114R、SCT-078)だけでなく他の一般的抗癌剤との交叉耐性を調べた。NOS2CBRはカルボプラチンに対して4.1倍耐性でシスプラチン、アクプラにそれぞれ5.7、5.1倍の交叉耐性を示した。一方、NOS2CR2はシスプラチンに16.3倍、カルボプラチンに10.4倍、アクプラに12.5倍の交叉耐性であった。即ち、プラチナ系耐性株は薬剤は異なっても同系の薬剤に対して強い交叉耐性を有しており、同一の耐性機序が働いているものと考えられる。卵巣癌は化学療法施行中や再発症例での抗癌剤耐性腫瘍の出現が最大の問題点である。我々の耐性株は約50倍の耐性を獲得し、世界的にみても強力な耐性度を示している。現在、このバンドを抽出中であるが、絶対量が少なく、大量培養を繰り返して精製に努めている。一方、分子生物学的アプローチではsubtraction hybridizationにより多数のコロニーが拾えている。これらのコロニーを各々培養してcDNAを精製中である。一方、シスプラチン以外にもプラチナ系抗癌剤が開発されており、それらの耐性株を作製することによりプラチナ系抗癌剤に対する耐性機序の解明に努めている。現在までに作製した耐性株はカルボプラチン4.1倍、DWA6.0倍である。これらの耐性株を使用してプラチナ系抗癌剤を含む各種抗癌剤に対する交叉耐性を調べたところ、シスプラチン、カルボプラチン、254-Sは相互に中等度の交叉耐性を示しているがシスプラチン耐性株及びカルボプラチン耐性株に対してNK121とDWAは交叉耐性が少なく、臨床的にも再発症例や耐性症例に期待される。現在、更にこれらの細胞株を用いて耐性機序に関与すると考えられているグルタチオンSトランスフェラーゼや細胞内の各種薬剤濃度を検討中である。卵巣癌は化学治療法施行中や再発症例での抗癌剤耐性腫瘍の出現が最大の問題点である。

我々の耐性株は約50倍の耐性を獲得し、世界的に見ても強力な耐性度を示している。蛋白レベルからはシスプラチン50倍耐性株で親株と比較して明らかに2本のバンドの増強が認められ、逆に1本のバンドの減弱と1本の消失が認められた。しかしながら特異的バンドの抽出は他種類の蛋白が混在して困難であった。薬剤耐性にはグルタチオンによる解毒の関与が報告されている。そこで我々はグルタチオンカラムでまづ蛋白をグルタチオン結合蛋白だけにした後に、電気泳動した。その結果、副数のバンドの消失や増強を認め現在アミノ酸分析中である。一方、シスプラチン以外にもプラチナ系抗癌剤が開発されており、それらの耐性株を作製することによりプラチナ系抗癌剤に対する耐性機序の解明に努めている。現在までに作製した耐性株はカルボプラチン4.1倍、DWA6.0倍である。これらの耐性株においてプラチナ系抗癌剤の細胞濃度を測定したことろ、細胞内濃度と耐性度に相関関係を認め、細胞膜におる透過性が耐性機序の一つであると考えられた。スプラチン耐性株及びカルボプラチン耐性株に対してNK121とDWAは交叉耐性が少なく、臨床的にも再発症例や耐性症例に期待される。現在、更にこれらの細胞株を用いて耐性機序に関与すると考えられているグルタチオンSトランスフェラーゼを検討中である。しかしながら特異的バンドの抽出は多種類の蛋白が混在して困難であった。卵巣癌細胞株(NOS2)とそのシスプラチン耐性株(NOS2CR2)を大量培養し、各々グルタチオンカラムによりグルタチオン結合蛋白を抽出した。NOS2CRに特異的に認められたバンドを切り出しアミノ酸配列を調べた。その結果最も濃いバンドはグルタチオン-S-トランスフェラーゼであった。またその他のバンドも抽出しアミノ酸配列を調べたが蛋白が修飾されており従来の方法ではアミノ酸配列を決定できなかった。これらのバンドは薄いため十分な量が採取できなかった。さらに大量培養し同定する必要がある。一方、プラチナ系抗癌剤としてはシスプラチン以外にカルボプラチンとアクプラが市販されておりカルボプラチン耐性株(NOS2CBR)を作成しプラチナ系抗癌剤(シスプラチン、カルボプラチン、アクプラ、NK121、DWA2114R、SCT-078)だけでなく他の一般的抗癌剤との交叉耐性を調べた。NOS2CBRはカルボプラチンに対して4.1倍耐性でシスプラチン、アクプラにそれぞれ5.7、5.1倍の交叉耐性を示した。一方、NOS2CR2はシスプラチンに16.3倍、カルボプラチンに10.4倍、アクプラに12.5倍の交叉耐性であった。即ち、プラチナ系耐性株は薬剤は異なっても同系の薬剤に対して強い交叉耐性を有しており、同一の耐性機序が働いているものと考えられる。
ライム病ボレリアの病原遺伝子転写制御機構の解明

ライム病ボレリアの菌体表層には数種類の主要表層抗原(Osp)が存在している。この内OspCについて、ボレリア感染マウスでは感染初期からOspCに対する抗体価が高レベルであること、病原性株でのみOspCが発現していること、OspCの発現量低下は遺伝子の転写レベルに起因すること、さらには病原性株と非病原性株ではOspC遺伝子(ospC)プロモーター領域近傍の塩基配列に相違がないことから、OspCが病原因子の一つであること、ospCにトランスに働く転写制御因子が存在することが考えられた。そこで、ospCの発現調節に関与する因子を検出するために、ospCのプロモーター上流を含む領域をリポーター遺伝子に結合したプラスミド(pHK1,pHK2)を構築し、これにプラスミドpSU18に構築したボレリアゲノムライブラリーを宿主大腸菌に追加、レポーター活性から、ospCの発現調節に関与する因子を含むと考えられるボレリア由来のDNA断片2,185bpを得、塩基配列を決定した。さらに大腸菌中において、このDNA断片によりospC転写活性が上昇するためには、ospC上流に存在する重複逆位繰り返し構造を含む187bpが必要であることを明らかにした。今後はゲルシフトアッセイ、フインガープリンテイングなどの方法により、このDNA断片に含まれている転写制御因子の機能をより詳細に解明する。