hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
系統進化学的アプローチによる痒み感覚の獲得およびその生理機能の統合解明

1.両生類ツメガエル知覚神経系におけるガストリン放出ペプチド(GRP)系の組織化学解析前年度行った遺伝子発現解析およびタンパク質発現解析の結果を受け、今年度は、中枢神経系におけるGRPの局在解析を行うため、成体ネッタイツメガエル(Silurana tropicalis)の脳および脊髄組織を用いて免疫組織化学解析を行った。その結果、脳ー脊髄の広域にわたり、GRP免疫陽性を示す神経軸索が密に分布していた。さらに、延髄および脊髄において、GRP免疫陽性線維や細胞体が多数観察された。以上から、両生類ネッタイツメガエル知覚神経系においてもGRP系が発現していることが示唆された。2.硬骨魚類メダカ知覚神経系におけるGRP遺伝子、アミノ酸配列の同定硬骨魚類メダカ(Oryzias latipes)のゲノム情報に基づいたバイオインフォマティックス解析によりGRP/GRP受容体のオーソログ遺伝子を単離した。得られたメダカGRP配列を既に報告されている他の脊椎動物におけるGRPホルモン前駆体の配列と多重配列アライメントを用いて解析した。その結果、今回同定したメダカのGRP配列もGRP受容体配列もこれまで報告された他の脊椎動物との高い相同性が示された。次に、GRPとGRP受容体の各臓器における発現分布をRT-PCRを用いて解析したところ、哺乳類と同様にメダカにおいてもGRPが中枢神経系と消化器系に発現し、GRP受容体は脳と脊髄で高発現することが明らかになった。また、ウエスタンブロット解析により、GRP受容体のタンパク質レベルでの発現を調べた結果、脳と脊髄において、メダカGRP受容体の予測される分子量に特異的なシグナルが確認された。以上から、メダカ脳・脊髄においてもGRP/GRP受容体ともに遺伝子およびタンパク質レベルで発現することを明らかにした。29年度が最終年度であるため、記入しない。これまでGastrin-releasing peptide(GRP)/GRP受容体系を痒みのマーカーとして着目し、齧歯類における痒み特異的神経回路の同定を行ってきた。本研究ではこれまでの研究を基盤に、各脊椎動物モデルを用い、系統学的アプローチにより「痒み感覚受容の系統進化」を解明する。H27年度は、哺乳類のうち霊長類ニホンザルと真無盲腸目スンクスの知覚神経系における痒み伝達分子GRP/GRP受容体遺伝子・ペプチド発現解析を行った。1.霊長類ニホンザルの解析これまでヒトを含む霊長類の脊髄におけるGRP関連の報告は乏しいため、本研究では、霊長類の脊髄や脳幹におけるGRP発現とその生理機能を明らかにする目的でニホンザルを用いた解析を行った。バイオインフォマティクス解析およびクローニングによりGRP遺伝子の同定を試みた結果、ニホンザルとヒトのGRPの一次構造は一致しており、GRP/GRP受容体遺伝子は霊長類間で高い相同性を示した。免疫組織化学解析の結果、脊髄後角や三叉神経知覚核においてGRP免疫陽性線維の特異的な投射がみられ、その部位でGRP受容体タンパクの発現を認めた。2.真無盲腸目スンクスの解析他の哺乳類モデル動物である齧歯類マウス・ラットとスンクスの比較組織学的解析を実施した。トルイジンブルー染色により、スンクスの脳幹アトラスを作成したところ、齧歯類マウス・ラットに比べ、スンクスの脳幹尾側部が扁平であり、三叉神経知覚核および三叉神経節が特に発達していることが分かった。免疫組織化学解析の結果、スンクス・マウス・ラットともに脊髄後角や三叉神経知覚核において、GRP免疫陽性線維の特異的な投射がみられ、その部位でGRP受容体遺伝子発現およびタンパク発現を認めた。以上の結果から、知覚神経系においてGRP/GRP受容体系が哺乳類において痒みの伝達に関与することが示唆された。今年度は哺乳類の解析を目標としており、本研究により、哺乳類のうち霊長類・真無盲腸目・齧歯類の知覚神経系においてGRP/GRP受容体系の遺伝子・ペプチド発現の同定が完了し、GRP/GRP受容体系がこれらの哺乳類において普遍的に痒みの伝達に関与することが示唆された。以上の理由から、研究はおおむね順調に進展しているものと自己評価する。1.真無盲腸目スンクス知覚神経系におけるGRP系の論文化真無盲腸目スンクスは発達した知覚神経系を有するという特徴を持つが、一次感覚ニューロンにおけるGRP発現様式と脳幹および脊髄におけるGRP受容体の発現様式は、齧歯類マウス・ラットと同様であることを前年度明らかにした。この結果をまとめて論文投稿し、Acta Histochemica et Cytochemica誌に受理された。2.霊長類ニホンザル知覚神経系におけるGRP系の解析これまでヒトを含む霊長類の脊髄におけるGRP関連の報告は乏しいため、本研究では、霊長類の脊髄におけるGRP発現とその生理機能を明らかにする目的で、ニホンザルを用いて解析を行った。今年度は、知覚神経系におけるGRP受容体の局在解析をin situ hybridization法および免疫組織化学法により実施した。その結果、GRP受容体遺伝子・タンパクともに、GRP免疫陽性線維が特異的に投射する脳幹三叉神経知覚核および脊髄後角にみられ、これらの領域が末梢の皮膚と中枢を結ぶ中継地として痒み伝達に重要であることが明らかとなった。以上の結果、霊長類の知覚神経系においてもGRP/GRP受容体系が存在することと、我々ヒトにおける痒み伝達にもGRP系が関与することが示唆された。

3.両生類におけるGRP系の解析痒みの分子・機能進化を明らかにするために、両生類の解析をネッタイツメガエルを用いて行い、バイオインフォマティクス解析とクローニングにより、GRP/GRP受容体が脊椎動物間で高い相同性を示すことを明らかにした。さらに、遺伝子・タンパク質レベルでの発現解析、免疫組織化学解析により、ネッタイツメガエルの知覚神経系におけるGRP/GRP受容体局在解析を実施中で、両生類と哺乳類での相違を見出しつつある。今年度は、昨年度行った真無盲腸目と齧歯類の研究を論文化し、霊長類の研究を発展させることができ、哺乳類間での痒み伝達機構の普遍性について、研究を深めることができた。さらに、両生類の解析に着手し、GRP/GRP受容体遺伝子およびタンパク質レベルでの発現を同定し、脊椎動物における高い相同性を明らかにすることができた。さらに、両生類知覚神経系におけるGRP/GRP受容体局在解析にも着手し、両生類と哺乳類での相違を見出しつつある。1.両生類ツメガエル知覚神経系におけるガストリン放出ペプチド(GRP)系の組織化学解析前年度行った遺伝子発現解析およびタンパク質発現解析の結果を受け、今年度は、中枢神経系におけるGRPの局在解析を行うため、成体ネッタイツメガエル(Silurana tropicalis)の脳および脊髄組織を用いて免疫組織化学解析を行った。その結果、脳ー脊髄の広域にわたり、GRP免疫陽性を示す神経軸索が密に分布していた。さらに、延髄および脊髄において、GRP免疫陽性線維や細胞体が多数観察された。以上から、両生類ネッタイツメガエル知覚神経系においてもGRP系が発現していることが示唆された。2.硬骨魚類メダカ知覚神経系におけるGRP遺伝子、アミノ酸配列の同定硬骨魚類メダカ(Oryzias latipes)のゲノム情報に基づいたバイオインフォマティックス解析によりGRP/GRP受容体のオーソログ遺伝子を単離した。得られたメダカGRP配列を既に報告されている他の脊椎動物におけるGRPホルモン前駆体の配列と多重配列アライメントを用いて解析した。その結果、今回同定したメダカのGRP配列もGRP受容体配列もこれまで報告された他の脊椎動物との高い相同性が示された。次に、GRPとGRP受容体の各臓器における発現分布をRT-PCRを用いて解析したところ、哺乳類と同様にメダカにおいてもGRPが中枢神経系と消化器系に発現し、GRP受容体は脳と脊髄で高発現することが明らかになった。また、ウエスタンブロット解析により、GRP受容体のタンパク質レベルでの発現を調べた結果、脳と脊髄において、メダカGRP受容体の予測される分子量に特異的なシグナルが確認された。以上から、メダカ脳・脊髄においてもGRP/GRP受容体ともに遺伝子およびタンパク質レベルで発現することを明らかにした。H28年度は魚類・両生類のゲノムデータベースから、GRP/GRP受容体遺伝子と予測されるペプチド配列の同定を行う。同定した魚類・両生類のGRP遺伝子配列を元に、プライマーを作成し、知覚神経組織におけるGRP遺伝子発現の有無を調べる。
精密設計されたポリマーブラシに基づく刺激応答材料

本研究では、ナノシートやポリマーブラシなど、構造明確な一次元・二次元ナノオブジェクトを異方的に集積することにより、光・温度・pH・基質などの外部刺激に応答してマクロスコピックな物性をスイッチするシステムの開発を目指している。具体的な構成ユニットとして、チタン層状酸化物の単結晶を層1枚にまで剥離・水中分散した、「酸化チタンナノシート」に着目した。ナノシートの水分散液にアクリルモノマーを共存させ、外部磁場を印加した状態でラジカル重合反応によるヒドロゲル形成を行ったところ、磁場によりナノシートの向きが一義的に制御される結果、光学的・機械的性質に著しい異方性をもつヒドロゲルが得られる。昨年度までの知見として、アクリルモノマーとして、代表的水溶性モノマーであるN,N-ジメチルアクリルアミドに加え、pH応答ユニットを持つジメチルアミノプロピルアクリルアミドを用いると、系のpHに応答してナノシートの垂直方向に選択的に膨潤・収縮するヒドロゲルアクチュエータが得られることが分かっている(酸性条件では塩基性条件の45倍伸長)。今年度、このアクチュエータのさらなる構造解析と、実用を見据えた応用研究を行った。ヒドロゲルの膨潤時・収縮時のナノシート面間隔を小角X線散乱により追跡したところ、ヒドロゲルのマクロ形状の変形に対応して面間隔も増減することが明らかとなった。加えて、ヒドロゲル膨潤時に発生する応力を、磁場配向したナノシートを内包するヒドロゲル、ランダム配向したナノシートを内包するヒドロゲル、それぞれについて測定した。その結果、磁場配向したナノシートを内包するヒドロゲルは、ナノシートの垂直方向に特異的に高い応力を発生しており、その値はランダム配向したナノシートを内応するヒドロゲルのそれに比べ、10倍以上高いことが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。具体的な構成ユニットとして、チタン層状酸化物の単結晶を層1枚にまで剥離・水中分散した、'「酸化チタンナノシート」に着目した。この特異な異方的構造を機能へと結びつけるべく、アクリルモノマーとして、代表的水溶性モノマーであるN,N-イソプロピルアクリルアミドに加えて、pH応答ユニットを持つジメチルアミノプロピルアクリルアミドを用いた。その結果、pHに応じてプロトンを捕捉・放出できる三次元高分子網目の中に、規則正しい向きに配向したナノシートを埋め込んだヒドロゲルが得られた。興味深いことに、このヒドロゲルは酸性条件下において、ナノシートの垂直方向に著しく(初期長の45倍)膨潤するものの、平行方向には殆ど変化しない、極めて異方的な膨潤挙動を示すことが明らかとなった。この体積変化は、pHを酸性・アルカリ性間でスイッチすることにより、系の劣化を伴うこと何度でも繰り返すことが出来る。ナノシートが高密度の負電荷を帯びていることを考えると、ナノシート間の静電反発の強弱を、三次元高分子網目中の正電荷が相殺し、その度合いがpHに応じて変化するため、特異な異方的膨潤が達成されたと予想される。具体的な構成ユニットとして、チタン層状酸化物の単結晶を層1枚にまで剥離・水中分散した、「金属酸化物ナノシート」に着目した。昨年度まで金属酸化物ナノシートとして「酸化チタンナノシート」を用いてきたが、今年度、構成ユニットの多様化に基づく更なる機能化を志向し、「酸化ニオブナノシート」を併せて用い、その磁場配向挙動の調査、ならびにヒドロゲルへの複合化を試みた。詳細な検討の結果、「酸化ニオブナノシート」は「酸化チタンナノシート」とは全く異なる磁場配向挙動を示すことが明らかとなった。「酸化チタンナノシート」は磁場に対して垂直に配向するのに対し、「酸化ニオブナノシート」は平行に配向する。極めて興味深いことに、両者の混合物に対して磁場を印加した場合、両者は自己・非自己を見分けて自己集合することにより、巨大なドメインを作っていることが粉末X線回折ならびに蛍光共鳴エネルギー移動を用いた検討により明らかとなった。無機ナノシートの自己・非自己認識に関する研究はこれまでに例がなく、基礎科学的に興味深い現象であると同時に、これを利用した新規機能性材料の開発が期待される。

ナノシートの水分散液にアクリルモノマーを共存させ、外部磁場を印加した状態でラジカル重合反応によるヒドロゲル形成を行ったところ、磁場によりナノシートの向きが一義的に制御される結果、光学的・機械的性質に著しい異方性をもつヒドロゲルが得られる。昨年度までの知見として、アクリルモノマーとして、代表的水溶性モノマーであるN,N-ジメチルアクリルアミドに加え、pH応答ユニットを持つジメチルアミノプロピルアクリルアミドを用いると、系のpHに応答してナノシートの垂直方向に選択的に膨潤・収縮するヒドロゲルアクチュエータが得られることが分かっている(酸性条件では塩基性条件の45倍伸長)。今年度、このアクチュエータのさらなる構造解析と、実用を見据えた応用研究を行った。ヒドロゲルの膨潤時・収縮時のナノシート面間隔を小角X線散乱により追跡したところ、ヒドロゲルのマクロ形状の変形に対応して面間隔も増減することが明らかとなった。加えて、ヒドロゲル膨潤時に発生する応力を、磁場配向したナノシートを内包するヒドロゲル、ランダム配向したナノシートを内包するヒドロゲル、それぞれについて測定した。その結果、磁場配向したナノシートを内包するヒドロゲルは、ナノシートの垂直方向に特異的に高い応力を発生しており、その値はランダム配向したナノシートを内応するヒドロゲルのそれに比べ、10倍以上高いことが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。ビザ申請の都合により来日が計画より遅れたことと、子供の出産のために一次帰国したことにより、研究開始当初は進展がやや遅れた。しかしながら幸運なことに、デザインしたヒドロゲルの膨潤挙動が想定外の異方性を示し、研究の方向性が短期間で定まったため、その後、順調に進展することとなった。H24年度の研究が計画以上に順調に進行したため、今年度は研究計画にない課題(構成ユニットの多様化に基づく更なる機能化)にも挑戦することが出来たため。現在、「9.研究実績の概要」に期した現象を応用した刺激応答材料への展開を試みている。類似のpH応答性ヒドロゲルは、そのすべてがポリN-イソプロピルアクリルアミドの感温相転移を利用したものであるため、限られた温度範囲でしか利用できない・応答速度が遅い・繰り返し構造変化において劣化が避けられない、などの問題点を抱えていた。これとは本質的に異なるメカニズムで駆動する本系には、様々な応用途が期待される。昨年度までの研究により、構成要素の一つであるアクリルモノマーを適切に選ぶことにより、pHなどの刺激に応答して異方的に膨潤・収縮するヒドロゲルが得られることが分かっている。今後、昨年度の成果と今年度の成果とを複合化することにより、更なる機能を付与したヒドロゲル材料の開発を目指す。
都市再生に不可欠なマイナスストックとしての土壌汚染対策の政策(経営)効果分析

この研究では、わが国の環境保全に関する基本理念とその対策を、土壌汚染に重点を置きながら、関係者や専門家にヒアリング調査、_文献調査等を通して明らかにすること、また、環境先進国と目される諸国の環境保全政策の現状を調査研究すること、それらの比較検討をし、土壌汚染対策に対する経営学的な取組の必要性を把握した上で、わが国に於ける公共団体や土地所有者等が取り得る総合対策の枠組みや在り方について研究することを目的とした。わが国に於ける環境保全は、環境基本法をベースとし、同法に基づいて策定された環境基本計画によって整合的に実施することが目指されている。地方に於ける土壌汚染対策を調査すると、環境保全に関する法的な制度が現場まで浸透しているとは言いがたい現状も窺えた。市町村には、有害物質等に関する専門技術者がいない状況もあり、現場での汚染対策実施に不安も感じられた。大気や水質の浄化が生活環境の改善のみであるめに対して、汚染土壌浄化は、生活環境改善だけでなく、土壌の持つ生産機能の回復という特性を有している。土壌汚染対策法では、土地所有者等にその汚染浄化を義務付ける制度として機能している。これは汚染浄化者にはマイナス要因の消去、他言すれば、損害賠償的な負の要因としての印象を拭えない。これでは、汚染土壌浄化者に浄化作業に対するプラスイメージを与えにくいのではないであろうか。ドイツ、オランダ、ベ'ルギーやアメリカの環境保全対策を調査すると、そこでは、国内の汚染土壌をリストアップし、その浄化の緊急性に関する優先順位を付して、国を挙げて汚染土壌の生産機能の回復に努力していることが明ちかになった。それらの国が利用している方策の中には、わが国でも導入が可能と思われる方策がいくつか存在している。それらを本提言等の中に纏めたが、例えば、汚染土壌浄化費用を利害関係人負担や受益者共同負担で行うなどの発想や財界団体と国との汚染浄化協定の締結や民事法の制度を活用した国による浄化作業の執行や民間企業等行う浄化作業に対する国の環境保全専門機関による援助システムの運用などがありた。土壌の機能的な側面に着目し、生産性を失われた士壌を放置するマイナス面を解消して、その資産回復を計った上で、その有効活用を通じて地域振興を行うなどの、土壌汚染に対する経営学的なアプローチが殊に強く印象に残った。今のところ世界の土壌汚染状況に関する研究の多くは法律学的で冨経営学的なものは余り多くないので、今後は、土壌汚染対策の実施例について経営学的な分析を深め、より実践的な提言に繋げていく所存である。平成17年度は、初年度で、研究の中間報告となる。企業活動がグローバル化し、わが国にも、多くの外国資本の企業が進出するに及び、企業活動に原因する土壌汚染が単なる国内問題でなく、世界的な視座で捉えなおす必要のある問題となったことは明らかである。土壌汚染は、大気や水質汚染なども含め、関連する用語や概念の統一を図ることも重要な課題である。

その上で、本研究は、「土地取引と土壌汚染問題への対応」(国土交通省監修、財団法人土地総合研究所編集)や「土壌汚染-その総合的対策」(財団法人民間都市開発推進機構都市研究センター監修)などの報告書が提起した問題点を起点として調査研究し、わが国並びに外国、殊に土壌汚染問題に先進的に対応している諸国、の状況を研究し、わが国における土壌汚染対策の現状とその課題を明らかにし、今後の政策に経営的観点からの提言をする。今年度は、土壌汚染を巡る用語や基本的事項や土壌汚染研究の現状の検討と、土壌汚染に対する国や地方自治体の対応状況に関する資料や情報の収集を行った。それらを、わが国の土壌汚染対策法等に盛られた土壌汚染に係わるコンセプトを中軸として、土壌汚染対策先進国と看做される各国の現状を把握して、わが国の現状と比較検討すべく、資料収集と関係研究者との共同研究のコネクションを築くよう心がけた。ドイツの連邦土壌保護法を中心としたドイツにおける土壌汚染対策の資料収集と分析を行い、在日外国大使館や在外日本大使館等の協力を得て、ベルギー王国とオランダ王国に係わる土壌汚染対策に関係する官庁・担当者並びに大学の研究者との繋がりが構築できた。来年度は、これらの外国の協力者との情報交換を通じて、欧州の土壌汚染対策を具体的に研究すると同時に、今年度取材できなかったアメリカ、イギリスやフランスの実情、またわが国の各地に見られる土壌汚染問題に係わる取引等の実態をも調査研究して、本研究の目的を達成したい。この研究では、わが国の環境保全に関する基本理念とその対策を、土壌汚染対策に重点を置きながら、関係者や専門家へのヒアリングや文献等の調査を通して明らかにすること、また、環境先進国と目される諸国の環境保全政策の現状を調査研究すること、それらの比較検討をし、土壌汚染対策に対する経営学的な取組の必要性を把握した上で、わが国に於ける公共団体や土地所有者等が取り得る総合対策の枠組みや在り方について研究することを目的とした。わが国に於ける環境保全は、環境基本法をベースとし、同法に基づいて策定された環境基本計画によって整合的に実施することが目指されている。地方に於ける土壌汚染対策を調査すると、環境保全に関する法的な制度が現場まで浸透しているとは言いがたい現状も窺えた。市町村には、有害物質等に関する専門技術者がいない状況もあり、現場での汚染対策実施に不安も感じられた。汚染大気や汚濁水質の浄化は生活環境改善となるが、それのみなのに対して、土壌汚染浄化はそれに加え生産機能の回復となる特性を有している。土壌汚染対策法は土地所有者等にその汚染浄化を義務付ける制度として機能している。これは汚染浄化者にはマイナス要因の消去、別言すれば、損害賠償的な負の清算としての印象を拭えない。土壌汚染浄化する者にプラスイメージが描きにくいのである。ドイツ、オランダ、ベルギーやアメリカの環境保全対策を調査すると、そこでは、国内の汚染土壌浄化にその緊急性から優先順位をつけて、国を挙げて土壌の生産機能の回復に努力していることが明らかになった。その方策として、わが国でも導入が可能と思われる浄化手法がいくつか存在した。
植物免疫におけるセロトニンの受容・情報伝達の解明

セロトニンは、動物では神経伝達物質として知られているが、植物における機能は殆ど明らかになっていない。我々は、イネからセロトニン合成酵素遺伝子を同定し、セロトニンが防御反応に関わっていることを明らかにした。本研究により、シロイヌナズナにおいて、セロトニンが、防御遺伝子の発現、カロースの形成、MAPKの活性化などの免疫応答を誘導することが明らかになり、セロトニンが免疫誘導因子として機能していることが明らかになった。植物免疫反応におけるセロトニンの機能を明らかにするため、イネのセロトニン合成酵素であるSLを過剰発現する形質転換シロイヌナズナを作成した。しかし、免疫応答に関して、SLの過剰発現による顕著な影響は見られなかった。そこで、シロイヌナズナを用いて、セロトニンによって誘導される免疫応答を詳細に解析した。シロイヌナズナの葉に、セロトニンとその前駆体であるトリプタミンを処理し、防御反応の1つであるカロースの蓄積を解析した。その結果、セロトニンによってカロースの蓄積が誘導されるが、トリプタミンでは誘導されないことがわかった。さらに、セロトニンを植物体に処理に、防御遺伝子の発現を解析した。その結果、防御遺伝子として知られているPR1やPR2の発現がセロトニンによって誘導されるが、トリプタミンによっては誘導されないことがわかった。また、植物免疫応答においては、MAPKの活性化が重要な役割を果たしていることが知られている。そこで、セロトニンとトリプタミンに応答したMAPKの活性化を調べた。その結果、セロトニンとトリプタミンの両方の処理においてMAPKの活性化が誘導されるが、トリプタミンではMAPKの活性化が一過的であるのに対し、セロトニンでは持続的にMAPKが活性化されていることがわかった。このように、セロトニンにより、複合的な免疫応答が協調的に誘導されることがわかった。このことは、セロトニンが植物の免疫活性化因子として機能していることを強く示唆している。セロトニン応答を視覚的にモニターできる植物体を作成するため、セロトニンに応答して発現を誘導するシロイヌナズナの遺伝子のプロモーターを単離し、その下流でルシフェラーゼを発現させるコンストラクトを作成した。セロトニンに応答する10種類のプロモーターについて、多数の形質転換体を作出し、T2世代でホモ系統を作出した。様々なセロトニンの処理条件を検討し、変異体のスクリーニングに適した処理条件を得た。さらに、個々の系統について、詳細にセロトニンに応答したルシフェラーゼ発光を解析し、その結果、セロトニンに応答してルシフェラーゼを発光する複数の系統を得ることができた。また、セロトニンを介した免疫応答を解析するために、イネのセロトニン合成酵素であるSLを過剰発現する形質転換体を作出した。DEX誘導系あるいはCaMV35Sプロモーターの制御下で、SLを発現させるコンストラクトを作成し、シロイヌナズナに導入した。さらに、得られた植物体からホモ系統を作出し、SL遺伝子が発現していることを確認した。今後、これらの植物体を用いて、セロトニンに応答した免疫応答を解析する予定である。ルシフェラーゼに応答する遺伝子のプロモーターを単離し、その制御下でルシフェラーゼを発光させる植物体を得ることに成功した。さらに、その後代から、ホモ系統を確立することができた。さらに、変異体のスクリーニングに適した様々な処理条件を決定することに成功した。また、セロトニンに応答した免疫応答を解析するため、セロトニン合成酵素遺伝子を導入したシロイヌナズナを作出することに成功した。セロトニン応答に異常を示す変異体のスクリーニングを行うため、セロトニン応答性プロモーターの下流でルシフェラーゼを発光する植物体の中で、スクリーニングに最も適した系統を選抜し、突然変異誘発剤であるEMS(ethyl methanesulfonate)で処理を行う。EMS処理した種子から5000系統のM1世代を育成し、M2種子を得る。約200系統のM2種子をプールとして、変異体のスクリーニングを行う。播種後数週間の植物体にセロトニン処理を行い、ルシフェラーゼ発光を解析することで、セロトニン応答を調べ、セロトニンに対する応答が減少、あるいは増加した変異体を単離する。SL発現形質転換体を解析し、SLタンパク質の発現によるセロトニン量の増加を解析する。また、防御遺伝子の発現などを調べ、セロトニン量の増加により免疫応答が活性化されているかを調べる。さらに、これらの形質転換体に病原菌を感染させ、セロトニンによって誘導される抵抗性を解析する。セロトニンに応答する遺伝子のプロモーターの制御下でルシフェラーゼを発光させる多数の植物体を作出したが、個々の遺伝子が複雑な発現制御によりコントロールされていることが明らかとなり、変異体のスクリーニングに適したラインの確立およびセロトニンの処理条件の決定に、想定より多くの時間を要した。しかし、その分、セロトニン応答遺伝子について多くの情報を得ることができた。

そのため、今年度末に予定した変異原処理を次年度に行うため、その経費を繰り越した、また、それに伴って、植物の遺伝子発現の解析経費の一部およびルシフェラーゼ発光での解析経費の一部を次年度に繰り越した。
皮膚免疫におけるリンパ管の役割

皮膚免疫におけるリンパ管の役割を、接触皮膚炎とケモカインの産生の二つの面から検討した。リンパ潅流に異常のあるマウスでは接触皮膚炎が増強しているが、主に惹起相に原因があり、リンパ管が炎症反応を鎮静化させる排水溝として重要であることが示唆された。またリンパ潅流に異常があっても、感作部位である皮膚において抗原提示が行われている証拠は得られず、樹状細胞の遊走もしくは抗原の所属リンパ節への流入が遅延していることが示唆された。リンパ管内皮細胞からのCCL21の発現制御に関しては、oncostatin MがErkのリン酸化を介してCCL21産生の増強を増強することが示された。Erkのリン酸化を阻害するMAPK inhibitorを抗原感作24時間前に注射したところ、接触皮膚炎が減弱したことから、接触皮膚炎の治療に有効である可能性が示された。平成19年度は、皮膚免疫におけるリンパ管の役割を、in vivo, in vitro両方の系を用いて検討した。In vivoの系では、リンパ灌流に障害のあるマウス(k-cyclinマウス)を用い、接触皮膚炎におけるリンパ管の役割を解析した。アレルゲンによる過敏性接触皮膚炎反応は、リンパ灌流に障害があるk-cyclinマウスのほうが強いことを前年度までに示したが、クロトンオイルによる一次刺激反応も、k-cyclinマウスの方が増強していた。これは炎症の種類には関係なく、リンパ管が炎症反応を鎮静化させる排水溝として重要であることを示唆している。また抗原で感作した後の所属リンパ節では、野生型マウスではT細胞の増殖が盛んで、リンパ濾胞構造が崩れていたが、k-cyclinマウスではリンパ濾胞が保たれていた。k-cyclinマウスにおいてリンパ節外で抗原提示が行われている可能性を示唆する所見と考えた。In vitroの系ではリンパ管内皮細胞を種々のサイトカインで刺激し、樹状細胞のリンパ節への遊走に重要なCCL21の発現制御を検討した。IL-6ファミリーであるIL-6, oncostatin M, IL-31のうち、oncostatin Mだけがリンパ管内皮細胞からのCCL21産生を増強した。またシグナル伝達の解析では、oncostatin MによるErkのリン酸化が、IL-6,IL-31と比べて著しく強く、またErkのリン酸化を阻害する薬剤によってリンパ管内皮細胞からのCCL21産生の増強が抑制されることにより、このシグナル伝達系が今後の治療のターゲットとして考えられた。平成20年度は、皮膚免疫におけるリンパ管の役割を、接触皮膚炎とケモカインの産生の二つの面から検討した。まず、リンパ灌流に障害のあるマウス(k-cyclinマウス)を用い、接触皮膚炎におけるリンパ管の役割を解析した。k-cyclinマウスでは皮膚において抗原提示がなされている可能性を検討したが、経時的に組織学検討をおこなった結果、皮膚でのリンパ濾胞の形成を認めず、抗原提示を受けて増殖している細胞も検出できなかった。感作相において抗原塗布24時間後に塗布部の皮膚を除去したところ、野生型マウスでは接触皮膚炎は減弱しなかったが、k-cyclinマウスでは減弱していた。抗原塗布48時間後に抗原塗布部を除去した場合は、k-cyclinマウス、野生型マウスいずれも接触皮膚炎反応は減弱していなかった。従って野生型マウスでは感作1日以内に樹状細胞がリンパ節に遊走して感作が成立するが、リンパ潅流に異常のあるk-cyclinマウスでは、樹状細胞の遊走が遅れていて1日から2日かかることが示唆された。以上よりリンパ管に異常がある場合、樹状細胞がリンパ節に緩徐に遊走して抗原提示を行っており、皮膚において抗原提示が行われている可能性は低いと考えられた。ケモカインの産生に関しては、vitroにおいてリンパ管内皮細胞からのCCL21産生を抑制するMAPK inhibitorが、vivoにおいても有効であるかを検討した。MAPK inhibitorをマウスの皮膚に注射し、24時間後にmRNAを抽出したところ、CCL21の発現が減弱していた。また抗原感作24時間前にMAPK inhibitorを注射したところ、接触皮膚炎が減弱した。以上よりMAPK inhibitorを抗原感作部位に投与することは、接触皮膚炎の治療に有効である可能性が示された。
LR構文解析向き属性文法に基づく実用的なコンパイラ生成系の研究

1.研究の目的コンパイラの分野では、従来意味解析の定式化が遅れていたが、属性文法の提案以来、属性文法の記述からコンパイラを生成する研究が盛んになった。我々はその中の一つとして、LR構文解析と同時に意味解析の行えるECLR属性文法を提案し、それによる生成系を試作してきた。本研究はそれを実用的なシステムに高めることを目的とする。2.コンパイア生成系の改良試作ずみの旧版生成系で、ISO規格Pascalの意味解析を記述した所、記述量と属性評価の効率に改善すべき点のあることが判明した。(1)コピー規則の記述:前述のPascalの記述では、属性評価式の73%がコピー規則であった。そこで、コピー規則を2つの類型に分類し、単純なコピーは「transfer属性名,...」,縫い糸型のコピーは、「thread属性名,...」と記述できるようにした。これにより属性評価式の行数が20%減少し、書き易さも大巾に向上した。(2)局所属性:文法記号ではなく構文規則に付随する属性として局所属性を導入した。これは属性文法の関数性、単一代入性を満たしている。これにより、属性評価式間の共通部分式の記述が一回ですみ、属性評価の効率も向上する。属性評価式の行数は、7%減少した。(3)その他:同値類をなす相続属性の指定、文脈条件の記述法も改善し、全体として構文・意味規則部2941行中695行(23%)の減少をみた。3.今後の課題記述量については、純粋な属性文法の範囲内でほぼ所期の目的を達成したが、属性評価の効率の向上と、属性文法に基づくコンパイラ開発のためのプログラミング環境の整備が課題である。
動的共有結合を利用した架橋液晶高分子における粘弾性光制御

本研究では,架橋液晶高分子に光照射により運動を誘起し,高分子材料表面において多様な仕事をするアクチュエーターを開発するとともに,光照射によって材料の粘弾性を制御できる新しいソフトマテリアルを創製することを目的としている。本年度は,従来の化学結合により架橋を施した架橋液晶高分子にフォトクロミック分子の吸収波長である紫外光を照射すると,フォトクロミック分子の異性化に伴い,材料の弾性率が低下することを見いだした。またこの弾性率の減少は,架橋液晶高分子の配向方向に大きく依存することが分かった。熱機械分析装置を用いた弾性率の評価では,高分子フィルム全体を伸張させ,印加荷重とひずみから算出する。しかしながら,フォトクロミック分子を導入した架橋液晶高分子に紫外光を照射すると,光はフィルムの膜厚方向に強度分布を持つ。その結果,フォトクロミック分子の異性化率に変化が生じ,フィルム表面での物性とバルクでの物性が異なることが予想される。そこで高分子フィルム表面における弾性率をAFMを用いて評価した。弾性率が既知のカンチレバーを用い,高分子フィルムを押し込む際の押し込み量とカンチレバーのたわみから表面の弾性率を算出することができる。バルクの弾性率とフィルム表面の弾性率を比較すると,平行配向フィルムでは比較的同程度の値を示すことが明らかとなった。また,AFMを用いた弾性率評価は,局所的な光照射による物性変化を検出することができるため非常に有用な方法である。さらに,垂直配向フィルムの弾性率を評価したところ,バルクの弾性率と大きく異なることが明らかとなった。これらの結果から,架橋液晶高分子フィルムでは弾性率が初期配向に依存し,バルクと表面で物性が異なることを見いだした。
多機能ジーンエクスプレッサーを用いた次世代微生物検査システムの研究

平成23年3月11日に発生した東日本大震災により、研究遂行に欠かせない機器である多機能ジーンエキスプレッサーGENOMELAB GeXP(以下GeXP)が損壊する被害を受けた。当初は、平成23年9月頃までに修理が完了する予定であったが、その修理には想定していたより多額の費用がかかることが判明し、今後の使用再開の目途が立たない状況となった。そのため平成23年度は、当初予定していたGeXPを用いた研究自体は行えなかったものの、病原微生物の遺伝子的同定および薬剤感受性を検討するため、以下の2つの研究を行った。(1)感染性心内膜炎の起炎菌についての遺伝子的な菌の同定(2)抗菌薬の薬剤感受性測定方法の違いによる感受性結果の乖離についての研究上記研究(1)では、従来の培養同定法では正確な同定が困難な症例に対して16SリボゾーマルRNAを用いた遺伝子的な菌同定を行い、研究内容を直接医療の現場にフィードバックすることができた。具体的には、Grapu/icatella adiacensという培養同定が困難な菌による心内膜炎症例3例(東北大学病院)の診断において、血液培養分離株および手術時の心臓弁組織検体を用いて16SリボゾーマルRNA遺伝子に基づいた原因菌の正確な同定を行った。このような微生物の遺伝子的同定法は、抗菌薬治療がすでに開始され培養検査で検出できない場合においても手術検体から同定可能であり、菌の正確な同定に基づいた抗菌薬の適正使用にもつながる重要な検査方法であると考えられた。また研究(2)については、院内感染の重要な原因菌であるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対して、その薬剤感受性方法の違いによりバンコマイシンやテイコプラニンなど一部の抗菌薬の感受性結果に乖離が生じることが判明し、今後薬剤耐性菌に対する有効な治療法を確立していく上で重要な知見が得られた。
近世吉田神社社家・鈴鹿家文書の調査と研究

本研究は、江戸時代に「神祇管領長上」として全国の神社・神職を支配した吉田神社において、その実務を担当し、また大嘗祭・新嘗祭など朝廷祭祀にも直接関与した、鈴鹿家について、現在ご当主のもとに伝来している資料(以下、鈴鹿家文書とする。文書以外に、絵図・モノもある)の整理・目録化を行い、内容を分析・検討することにより、鈴鹿家文書の史料的位置、吉田神社・鈴鹿家が果たした役割を明らかにすることを目的とした。研究代表者の若松は、数名の研究協力者と、鈴鹿家文書のうち、鈴鹿家の「江戸下り」(毎年23月頃江戸に行き将軍に拝謁)関係史料約2000点と、幕末明治期の資料約450点について、整理と調査を行った。中性紙封筒への袋詰めは完了したが、目録化は約1000点にとどまり、残りの作業は今後の課題となった。また、鈴鹿家文書の伝来などについて各地に出張調査を行い、およその状況を把握することができた。研究分担者の加茂は、研究協力者の岡田芳幸と共に、鈴鹿家の宮廷祭祀関係資料について、月1回のペースで所蔵者宅を訪れ、一点毎の資料調書作成とデジタルカメラによる撮影、中性紙封筒への整理・保管という基礎作業を行い、全554点の資料調査を終了させ、「鈴鹿家所蔵大嘗祭・新嘗祭資料目録(第一次)」(平成17年8月。A4判126頁)をまとめた。これにより、かつて鳥越憲三郎・有坂隆道・島田竜雄編『大嘗祭史料鈴鹿家文書』(柏書房、平成2年)において紹介された96点を大きく超える数の学界初見資料の伝襲が確認され、鈴鹿家宮廷祭祀関係資料(大嘗祭・新嘗祭・神嘗祭など)の全貌が初めて明らかになったのである。また、資料調査にもとづく論考も数編発表した。なお、上記の目録作成後、所蔵者の鈴鹿長雄氏から、加茂の本務校である皇學館大学神道博物館へ同家所蔵資料の寄託申し入れをいただき、平成17年12月、鈴鹿家文書が皇學館大学に寄託された。文書以外に、絵図・モノもある)の整理・目録化を行い、内容を分析・検討することにより、鈴鹿家文書の史料的位置、吉田神社・鈴鹿家が果たした役割を明らかにすることを目的としている。本年度、研究代表者の若松は、同家所蔵・未整理の年頭江戸下りの儀関係史料約二千点について、関西の若手研究者・大学院生の協力を得、整理を進めた。一点ごとに内容を確認しつつ、中性紙封筒に入れたが、虫喰の多いもの、難解な書状が多く、作業は難航している。それでも、史料の全体像は把握でき、鈴鹿家が江戸でもったネットワークなどが具体的にわかりつつある。また鈴鹿家文書の伝来について、愛媛大学附属図書館鈴鹿文庫・宮内庁書陵部などで出張調査を行った。

本年度は中間報告的なものを書くにとどまったが、次年度以降、さらに史料の整理・目録化を進め、明治大学刑事博物館・大和文華館などでも調査を行い、成果をまとめたい。一方、研究分担者の加茂は、岡田芳幸氏の協力を得、大嘗祭・新嘗祭関係資料について、一点ごとの調書作成(法量・形状・内容確認)とデジタルカメラによる撮影を実施し、全体総量の内七割について基礎作業を終え、中性紙封筒に保管・整理した。デジタルデータはパソコンに保存した。また、天理大学附属図書館吉田文庫、京都大学附属図書館などに出張して関連資料を調査し、鈴鹿家所蔵大嘗会資料のなかでも白眉の一品「貞享四年〔丁卯〕十一月十六日〔辛卯〕大嘗会悠紀殿御手水具〔并〕神膳等儲居案図」(巻子装、彩色)について、注記・奥書などの考証を行い、同絵図の作成・書写・伝来の経緯と資料的価値を明らかにする論文を執筆した。本研究は、江戸時代に「神祇管領長上」として全国の神社・神職を支配した吉田神社において、その実務を担当し、また大嘗祭・新嘗祭など朝廷祭祀にも直接関与した、鈴鹿家について、現在ご当主のもとに伝来している資料(以下、鈴鹿家文書とする。文書以外に、絵図・モノもある)の整理・目録化を行い、内容を分析・検討することにより、鈴鹿家文書の史料的位置、吉田神社・鈴鹿家が果たした役割を明らかにすることを目的としている。3年計画の2年目に当る本年度、研究代表者の若松は、上記の鈴鹿家文書とかつては同一史料群であったと想定される明治大学博物館所蔵の吉田神社鈴鹿家文書の調査を優先して進めた。こちらには、江戸下向関係以外にも、宗教・土地・年貢など、様々な内容の資料が合計約4000点あり、このうち、本研究と特に関連の深いもの、重要なものについて、マイクロフィルムなどでの収集を行った。なお、鈴鹿家所蔵・未整理の年頭江戸下りの儀関係史料の整理はあまり進められず、作業を最終年度に持ち越すことになった。一方、研究分担者の加茂正典は、岡田芳幸氏の助力を得て、前年度に引き続き、鈴鹿家所蔵の大嘗祭・新嘗祭関係史資料の悉皆調査を月一回のペースで進め、同家所蔵の大嘗祭・新嘗祭関係史資料約350点についての基礎データ収集をほぼ完了した。具体的には、史資料一点毎の法量・内容確認、デジタルカメラによる写真撮影、そして、中性紙封筒への保管と仮ナンバー付与の作業を実施した。そして、同調査の過程で気付き得た史料を基に次の2本の論文を発表した。(1)加茂正典「鈴鹿家所蔵『万治二年九月十一日神嘗祭使王卜串(うらぐし)』考証」(笠井昌昭編『文化史学の挑戦』、思文閣出版、平成17年3月)。(2)同「貞享四年東山天皇大嘗祭抜穂使考証」(『皇學館大学神道研究所紀要』21輯、平成17年3月、105-117pp)。文書以外に、絵図・モノもある)の整理・目録化を行い、内容を分析・検討することにより、鈴鹿家文書の史料的位置、吉田神社・鈴鹿家が果たした役割を明らかにすることを目的とした。3年計画の最終年度にあたる本年度、研究代表者の若松は、中性紙封筒に入れ終わった江戸下り関係資料について目録化を進めるとともに、幕末維新期の資料について封筒入れを行った。前者については点数が多く、目録化は全体の半数の約1000点にとどまった。残りの整理は今後の課題であるが、鈴鹿家文書の伝来などについては、新たな知見をえることができた。
共役ボリラジカル超分子をホスト分子とした有機ラジカル包接と化学磁気メモリー

本研究では、超分子的に集積した高スピン共役ポリラジカルをホストとして、有機ラジカルゲストの包接のON/OFFによりその磁化を制御することで、化学的に記録できる磁気メモリーの実現を狙っている。この目的を達成するために、以下の手順で実施している。「高スピン共役ポリラジカルホストを設計および合成する。」「有機ラジカルゲスト分子の最適化と包接条件の探索および得られた包接体の磁気的性質を探索する。」本年度は、以下の項目について明らかにした。1.共役ポリラジカルホストの探索およびその超分子組織体構造の決定安定ラジカル骨格のガルビノキシル骨格を有するポリ(1,3-フェニレンエチニレン)誘導体を合成した。酢酸エチル中で中空のフォルダマー構造を形成することを明らかにした。ガルビノキシル残基を有するフェニルアセチレンモノマーと、これに光学活性基を導入したモノマーとの共重合を経て片巻らせん構造に安定ラジカルが導入されたポリラジカルが合成できた。また、共重合組成により主鎖らせんの巻き方向を制御できることが明らかとなった。2.アントラセン超分子の有機ラジカル包接およびその磁気的性質ゲストフリーの9,10-ビス(3,5-ジヒドロキシフェニル)アントラセン(BPAnt)結晶を安定ニトロキシラジカル類のジクロロメタン溶液に浸漬させて超分子包接体をそれぞれ調製した。t-ブチルフェニルニトロキシドは濃縮状態では不安定であったが,BPAntに包接することで磁気測定が可能となった。包接比0.80のTANOLでは、一次元ハイゼンベルグモデルに従う弱い反強磁性であったのに対し、包接比1.47のTANOLでは,単純な一次元モデルあるいはキュリー-ワイス則では表せない磁気挙動を示しており、部分的に二量化したスピン結合を含む磁気構造を示唆した。一方、フェニルニトロニルニトロキシドはかさ高いため、効率よく包接されなかった。1.高スピン共役ポリラジカルホストとしての単分散ポリ(9,10-アントリレンエチニレン)誘導体の合成側鎖にフェノール残基を有する9-(3-ヒドロキシ-3-メチルブチニル)-10-ブロモアントラセン誘導体をPd(PPh_3)_4触媒存在下重合させた。超分子的組織化を確実なものとするためリサイクル分取GPCを用い、大量かつ単分散のポリマーを精製した。効率的なポリラジカル合成法を検討するために、得られたオリゴマーのフェノレートアニオンの電気化学特性を明らかにした。2.アントラセン超分子に包接された安定ラジカルの磁気特性ゲストフリーの9,10-ビス(3,5-ジヒドロキシフェニル)アントラセン(BPAnt)結晶を安定ニトロキシラジカル類のジクロロメタン溶液に浸漬させて超分子包接体をそれぞれ調製した。それぞれのラジカルはBPAntに対し12等量で包接されることが熱重量分析から明らかとなった。包接比0.80のTANOLでは、一次元ハイゼンベルグモデルに従う弱い反強磁性(J=-1.3cm^<-1>)であり、同様に一次元ハイゼンベルグモデルに従うTANOL結晶(J=-6.9cm^<-1>)と比べて小さなJ値となった。これは、包接させることでTANOL分子間の距離が5.78Åから約7.8Åに拡がったことに起因している。

包接比0.80のTANOLでは、一次元ハイゼンベルグモデルに従う弱い反強磁性であったのに対し、包接比1.47のTANOLでは,単純な一次元モデルあるいはキュリー-ワイス則では表せない磁気挙動を示しており、部分的に二量化したスピン結合を含む磁気構造を示唆した。一方、フェニルニトロニルニトロキシドはかさ高いため、効率よく包接されなかった。
神経免疫性疾患におけるγδT細胞の増殖因子及びαβT細胞の相互作用について

【目的】γδT細胞レセプターを発現しているγδT細胞は、MSの脱髄巣でheat shock proteinとともに表出しており、またMS患者の末梢血や髄液でγδT細胞が増加していることが報告されておりMSの病因との関連が示唆されている。MSにおけるの末梢血のγδT細胞の増殖因子及びにαβT細胞との相互作用について検討を行った。【対象】MS患者12例(平均年齢31.0【+-】5.8)と健常対照7例(平均年齢33.5【+-】11.3)。【方法】1。末梢血より単核球を分離、IL-2(100U/ml)を含む培養液で短期培養を行い、γδT細胞%=(TCRδ-1^+CD3^+/CD3^+)X100、CD25(IL-2 receptor αchain)、CD122(IL-2 receptor βchain)の発現の有無をフローサイトメーターを用い検討した。2。限界希釈法を用いIL-2反応性γδT細胞とIL-2反応性αβT細胞の頻度を比較した。3。MBP特異的T細胞に対する末梢血中γδT細胞の反応性の有無をみるため非刺激時および活性化MBP株と末梢単核球の混合培養を行いCD25とCD122の発現の有無を検討した。【結果と考察】1。IL-2に反応するγδT細胞%について、健常対照群は培養7日目に10.4%、MS患者群は18.2%で有意差はなかったがMS患者群でγδT細胞%が高値を示す例があり、そのTCRはVγ9+Vδ2+であった。またγδT細胞のCD25の発現はαβT細胞のそれより高かった。2。限界希釈法を用いIL-2反応性γδT細胞とIL-2反応性αβT細胞の頻度を比較、その結果γδT細胞は4.2-100x10^<-4>、αβT細胞は1.4-4.8x10^<-4>とIL-2反応性の頻度はγδT細胞の方が高かった。3。抗原刺激により活性化したMBP反応性T細胞と末梢血単核球を混合培養したときγδT細胞とCD25の発現は増加したが、非刺激MBP反応性T細胞ではこれらの増加はみられなかった。以上から、γδT細胞はIL-2反応性T細胞が多く、抗原特異的T細胞により刺激され増殖することからこれらγδT細胞は免疫系を修飾し、そのネットワークに関与している可能性が考えられた。【方法】1。2。3。【結果と考察】1。2。3。
遺伝子デリバリー技術の医療応用に重要な長期タンパク質発現系の開発・治療展開

In vivo遺伝子導入技術は、遺伝子治療やヒト遺伝子の機能解析、病態モデル動物開発に繋がる。本研究では、染色体の特定部位への遺伝子挿入を利用した安全な長期遺伝子発現系の構築と押圧や吸引力を利用した新規臓器特異的導入法の開発に成功した。これらの長期発現ベクターや核酸導入法は、難治性疾患治療に対する核酸医薬を用いた新規治療戦略の開発に向けて有益な基礎的知見となることが期待される。In vivo遺伝子導入技術は、遺伝子治療、遺伝子機能解析、並びに病態モデル動物開発に繋がることから重要である。そのためには、種々の臓器/細胞に対する外来遺伝子の長期発現系の構築が必要である。phiC31インテグラーゼは、プラスミド上のattB配列と染色体上のpseudo attP配列を特異的に認識し、この配列間で組込みを起こすため、従来の組込み手法と比べ、安全面で優れる。本年度は、phiC31インテグラーゼ発現プラスミド(pCMV-int)に加え、血清を用いた簡便なin vivo長期遺伝子発現の評価法の確立を目的に、attBサイトを含み分泌型タンパクのGaussia luciferaseを発現するpDNAの構築(pORF-GLuc/attB)を行った。ハイドロダイナミクス法により各pDNAをマウス肝臓へ導入し、血清中Gaussialuciferase量を測定したところ、120日間に渡る安定した遺伝子発現の持続が認められた。また、この遺伝子がマウス染色体上のpseudo attPサイトに組み込まれていることを確認し、phiC31 integrase発現pDNAによる長期遺伝子発現の最適な投与条件の構築に成功した。次に、得られた条件をもとに、遺伝子発現と薬理効果の相関関係の評価を試みた。次に、hHGF発現プラスミド(pORF-hHGF/attB)を構築した。先に最適化された条件で投与したところ、肝臓におけるHGFの発現持続化が認められ、また、HGFがゲノムDNA上のpseudo attP配列への組込まれていることを確認した。最後に、腎臓への遺伝子導入法として組織押圧核酸導入法のメカニズムの解明を行ったところ、組織押圧によりプラスミドDNAの腎臓への取り込みが増大し、また、腎臓での転写因子AP-1やNFκBの活性化が本法による効率的遺伝子発現に寄与していることを明らかにした。本研究の目的は、小動物を用いた遺伝子機能解析や遺伝子治療を目的とした遺伝子発現の長期化ならびに臓器特異的な遺伝子導入法の開発である。初年度は、肝線維化抑制効果のあるHGFをphiC31 integraseベクターを構築し、ハイドロダイナミクス法によりマウス肝臓で長期発現を確認した。そこで本年度は、phiC31 integraseシステムを用いた肝線維症に対する遺伝子治療の薬理学的効果の評価と組織吸引デバイスを用いた新しい臓器特異的な遺伝子導入法の開発を行った。まず、phiC31 integrase認識部位(attB)を含むhHGF発現プラスミド(pORF-hHGF/attB)を用いて、phiC31 integrase発現プラスミド(pCMV-int)との混合溶液を、ハイドロダイナミクス法によりマウス肝臓に導入した。続いて、四塩化炭素の腹腔内への繰り返し投与により肝線維症モデルマウスを作製し、本手法による治療効果を、数種類の線維化マーカーのmRNA量の測定、及びAzan染色により評価した。その結果、肝線維症モデルマウスでは、対照のマウスと比較してHGFの維持発現量がやや低かったものの、HGF長期発現による線維化抑制の傾向が、線維化マーカーのmRNA量及びAzan染色から確認された。また、肝臓や腎臓へのnaked核酸導入を目的に、昨年度までに開発した臓器特異的遺伝子発現制御が可能な組織核酸押圧導入法の原理を基に、腹腔内内視鏡先端に搭載可能な新規デバイスとして、組織吸引デバイスを新たに開発し、肝臓や腎臓表面を吸引することで血管内に投与されたnaked核酸(pCMV-Luc)の組織吸引部位への高効率な遺伝子導入が可能であることを明らかにした。これらのベクターや核酸導入法は、長期的な臓器での遺伝子発現制御の実現に向けて有益な基礎的知見となることが期待される。