hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内シグナルによる神経活動と情動行動・学習の制御機構の解明

(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析:グルタミン酸(NMDA)やアデノシン刺激によりリン酸化されるリン酸化基質および変動するリン酸化部位を同定した。また、D1R-MSNおよびD2R-MSN特異的なドーパミンおよびアデノシンの作用機序を解明し、D1R-MSNからD2R-MSNへ、またはその逆への活性シフトが、主にドーパミン濃度の変化に依存するというモデルを提案した(Zhang et al. Neurochem Int. 2019)。(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用:Rho-kinaseとその基質であるMYPT1のキナーゼ・基質相互作用について解析を行い、新たにRho-kinaseとの相互作用に必要なドッキングモチーフを見出した。(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用:PKA、PKC、CaMKIIの偽基質配列を用い、光刺激依存的にキナーゼ活性を制御する分子ツールの開発に着手した。(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析:MAPKによるKCNQ2のリン酸化部位に対する抗リン酸化抗体を作製した。D1R作動薬で刺激した線条体スライスにおいてKCNQ2のリン酸化が亢進し、このリン酸化の亢進はMEK阻害剤の処置で抑制された。(5)シナプス可塑性の制御機構の解析:KClやNMDAで刺激した線条体スライスにおいてShank3のリン酸化が亢進し、そのリン酸化の亢進はRho-キナーゼ阻害剤の処置により抑制された。(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析:D1R/PKAを活性化した線条体神経細胞において転写因子Npas4やMkl2のリン酸化が亢進し、そのリン酸化はMEK阻害剤により抑制された。さらに、MAPKによるNpas4のリン酸化によりNPAS4の転写活性が増強し、報酬学習・記憶に関与することを見出した。(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析:本年度までにドーパミン(D2R)、アセチルコリン、グルタミン酸(NMDA)、アデノシン刺激でリン酸化されるリン酸化基質および変動するリン酸化部位を同定し、KANPHOSデータベースに内部データとして登録した。また、D1R-MSNおよびD2R-MSN特異的なドーパミンおよびアデノシンの作用機序を解明し、論文を発表した(Zhang et al. Neurochem Int. 2019)。(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用:Rho-KinaseのMYPT1のドッキング部位とドッキングモチーフを同定した。(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用:偽基質配列がPKA、PKC、CaMKIIのキナーゼ活性を制御することを確認した。偽基質配列とLOVを融合させることで光刺激依存的にキナーゼ活性を制御するツールの開発を進めている。(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析:MAPKによるKCNQ2のリン酸化部位(S414, S476)に対する抗リン酸化抗体を作製した。D1R作動薬で刺激した線条体スライスにおいてKCNQ2のリン酸化が亢進し、このリン酸化の亢進はMEK阻害剤の処置で抑制されることを示した。(5)シナプス可塑性の制御機構の解析:KClやNMDAで刺激した線条体スライスにおいてShank3のS551, S694, S781のリン酸化が亢進し、そのリン酸化の亢進はRho-キナーゼ阻害剤の処置により抑制されることを示した。(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析:ドーパミンがD1R/PKA/MAPKシグナルを介して、Npas4などの転写因子をリン酸化し、報酬学習・記憶を制御することを見出した。以上のように、本研究はおおむね順調に進展していると考える。(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析:引き続きアデノシン刺激によるリン酸化プロテオミクス解析を進めリン酸化基質の同定数を増やすと共に、セロトニン刺激でリン酸化されるリン酸化基質および変動するリン酸化部位を同定する。in vivoリン酸化プロテオミクス解析を遂行し、新たなリン酸化基質を同定する。(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用:引き続き、キナーゼの基質認識機構の解析およびキナーゼの活性調節・モニターツールの開発を行う。本年度に同定したMYPT1のドッキングモチーフを基に、Rho-kinaseの機能抑制ペプチドや活性モニターツールの作製・評価を試みる。(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用:偽基質配列とLOVを融合させ、光刺激依存的にPKA、PKC、CaMKIIの活性を制御する分子ツールの開発を進める。(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析:KCNQ2チャネルのリン酸化修飾の役割をin vivoで明らかにするため、遺伝子編集技術を用いてKCNQ2リン酸化部位欠損変異マウスを作製し、生理解析を行う。(5)シナプス可塑性の制御機構の解析:CaMKIIの基質候補として同定したArhGAP21およびArhGAP39について抗リン酸化抗体を作製し、リン酸化の変動を解析する。

Rho-Kinaseの基質として同定したShank3に関して、リン酸化部位変異体を発現するウイルスベクターを作製し、スパイン形態やPSD95などの足場タンパク質との相互作用、AMPA型受容体やNMDA型受容体の膜上への局在を解析する。同時に、電気生理学的解析を行い、シナプス可塑性との関連も明らかにする。(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析:引き続きMAPKによるNpas4やMkl2のリン酸化による、報酬学習・記憶の制御機構を解析する。(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析:グルタミン酸(NMDA)やアデノシン刺激によりリン酸化されるリン酸化基質および変動するリン酸化部位を同定した。また、D1R-MSNおよびD2R-MSN特異的なドーパミンおよびアデノシンの作用機序を解明し、D1R-MSNからD2R-MSNへ、またはその逆への活性シフトが、主にドーパミン濃度の変化に依存するというモデルを提案した(Zhang et al. Neurochem Int. 2019)。(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用:Rho-kinaseとその基質であるMYPT1のキナーゼ・基質相互作用について解析を行い、新たにRho-kinaseとの相互作用に必要なドッキングモチーフを見出した。(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用:PKA、PKC、CaMKIIの偽基質配列を用い、光刺激依存的にキナーゼ活性を制御する分子ツールの開発に着手した。(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析:MAPKによるKCNQ2のリン酸化部位に対する抗リン酸化抗体を作製した。D1R作動薬で刺激した線条体スライスにおいてKCNQ2のリン酸化が亢進し、このリン酸化の亢進はMEK阻害剤の処置で抑制された。(5)シナプス可塑性の制御機構の解析:KClやNMDAで刺激した線条体スライスにおいてShank3のリン酸化が亢進し、そのリン酸化の亢進はRho-キナーゼ阻害剤の処置により抑制された。(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析:D1R/PKAを活性化した線条体神経細胞において転写因子Npas4やMkl2のリン酸化が亢進し、そのリン酸化はMEK阻害剤により抑制された。さらに、MAPKによるNpas4のリン酸化によりNPAS4の転写活性が増強し、報酬学習・記憶に関与することを見出した。(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析:本年度までにドーパミン(D2R)、アセチルコリン、グルタミン酸(NMDA)、アデノシン刺激でリン酸化されるリン酸化基質および変動するリン酸化部位を同定し、KANPHOSデータベースに内部データとして登録した。また、D1R-MSNおよびD2R-MSN特異的なドーパミンおよびアデノシンの作用機序を解明し、論文を発表した(Zhang et al. Neurochem Int. 2019)。(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用:Rho-KinaseのMYPT1のドッキング部位とドッキングモチーフを同定した。(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用:偽基質配列がPKA、PKC、CaMKIIのキナーゼ活性を制御することを確認した。
体育授業における動機づけ雰囲気の教育効果に関する縦断研究-生きる力に着目して-

本研究は,体育授業における動機づけ雰囲気,目標志向性,生きる力の3変数間の因果関係について検討を行うことを目的とした.研究1では,体育授業における動機づけ雰囲気に関する基礎データを整理した.研究2では,中学生と高校生を対象に2ヵ月間のインターバルを取りながら1年間にわたり5回調査を実施した.主な結果は以下の通りである.(1)熟達雰囲気と協同雰囲気は,生きる力と正の因果関係を示した.(2)熟達雰囲気と協同雰囲気は,課題志向性を介して,生きる力と正の因果関係を示しており,循環的に高まることが確認された.以上のことから,生きる力を育成するためには,熟達雰囲気と協同雰囲気が重要になることが示唆された.学校体育授業では,チャレンジ活動や課題解決活動など子どもの主体性を重視した活動が豊富な体育授業を通した「生きる力」の養成が求められている.しかし,体育授業には指導法や評価法,クラス志向の違いから熟達雰囲気や成績雰囲気のように様相の異なる動機づけ雰囲気(学習雰囲気)が存在する.そのため,どのような学習雰囲気が「生きる力」の養成に効果的なのかを厳密に検討することが急務である.また検討の際には,因果関係に対して説得力のある説明ができる縦断研究の必要性が高まっている.そこで本研究では,縦断研究のアプローチから,体育授業における動機づけ雰囲気と生きる力の因果関係について検討することを目的とする.本研究の意義は,体育授業における動機づけ雰囲気と生きる力の因果関係を解明するために縦断研究に挑戦するところにある.これにより様相の異なる授業雰囲気がどのようなプロセスによって生きる力を喚起させるのかを検討することができ,体育授業における動機づけ雰囲気研究に新たな教育効果の示唆をもたらすのではないかと考えている.また,生きる力を育む体育授業の学習雰囲気の在り方を発達段階別に検討し,その特徴を明確にできるところも新奇的な点と考えている.このような発達段階別に体育授業における動機づけ雰囲気と生きる力の連続的な関係を解明する点は,教育現場に実際的な知見を示すことができ,生きる力の養成指導への一助になることが期待される.本年度は,体育授業における動機づけ雰囲気の中でもクラスメイトによって作り出される学習雰囲気を強く認知していることが体育への期待度や生きる力を高める可能性があることを確認した.本研究の目的は,縦断研究のアプローチから,体育授業における動機づけ雰囲気と生きる力の因果関係について検討することである.本研究の目的を遂行するにあたり,平成27年度は,次年度研究へのスムーズな移行に必要な過程であり,1予備研究として体育授業における動機づけ雰囲気と生きる力の変数間の位置づけを検討すること,2縦断研究に必要になる中学生および高校生の体育授業における動機づけ雰囲気と生きる力の認知的評価に関する縦断データを1年間かけて収集することの2点を行った.まず1については,生きる力とも関連するスポーツの効果に対する期待と体育授業における動機づけ雰囲気との関係についての論文を学術雑誌に掲載した.また体育授業における動機づけ雰囲気と生きる力の関係について学会発表を行った.続いて2については,縦断データの収集を完了したが,データ入力することにやや遅れが生じている.体育授業は,健やかな心身の育成を目指しており,自ら立てた目標や困難な課題にチャレンジする活動や仲間と意見を交えながら課題解決する活動など子どもたちが主体的に取り組む場面が豊富にある.そのことから生きる力の養成に有用な教育活動の一つとして注目されている.しかし,体育授業では何に価値を置いた指導(努力や出来栄え)なのか,どのような評価基準(絶対的・相対的評価)なのか,どのような志向(記録更新好みか競争好み)なのかなど様相の異なる授業雰囲気が存在する.これらのことから,どのような様相の授業雰囲気が,生きる力の養成に関わるのかを厳密に検討していくことが必要と言える.以上のことから,本研究は,縦断研究のアプローチから,体育授業における動機づけ雰囲気と生きる力の因果関係について検討することを目的に進めている.特に,様相の異なる体育授業の雰囲気がどのようなプロセスによって生きる力を喚起させるのかを解明するために縦断研究に挑戦しているところは新奇的な点である.また,生きる力を育む体育授業の学習雰囲気の在り方を発達段階別に検討することによって,その中学生や高校生の特徴を明確にできる.このような発達段階別に体育授業における動機づけ雰囲気と生きる力の連続的な関係を解明する点は,教育現場に実際的な知見を示すことができ,生きる力の養成指導への一助になることが期待される.これまでに,体育授業における動機づけ雰囲気の中でもクラスメイトによって作り出される学習雰囲気を強く認知していることが体育への期待度や生きる力を高める可能性があることを中学生を中心に確認している.また本年度は,高校生を中心に,動機づけ雰囲気および目標志向性が体育授業での満足感や生きる力に及ぼす影響について検討し,生徒が満足だと感じる体育授業は熟達雰囲気によてつくられており,その満足感は生きる力と密接に関連していることを確認した.データ解析に大幅な時間を費やしたことにより,やや研究に遅れが生じ,十分な成果発表を行うことができなかった.現在,データは整い,全ての解析は完了しているため,今年度は,成果発表を中心に行う予定である.体育授業は,健やかな心身の育成を目指しており,自ら立てた目標や困難な課題にチャレンジする活動や仲間と意見を交えながら課題解決する活動などが豊富にあるため,子どもたちの生きる力を養成する教育活動の一つとして注目されている.

しかし,体育授業には様相の異なる授業雰囲気が存在しており,それらが生きる力の養成にどのように関わるのかを厳密に検討していくことが必要である.以上のことから,本研究は,縦断研究のアプローチから,体育授業における動機づけ雰囲気と生きる力の因果関係について検討することを目的に進めた.目的を遂行するに先立ち,横断的データから体育授業における動機づけ雰囲気に関する様々な基礎となる資料を蓄積した.例えば,これまでに体育授業における動機づけ雰囲気の中でもクラスメイトによって作り出される学習雰囲気を強く認知していることが体育への期待度を高めること,生徒が満足だと感じる体育授業は熟達雰囲気によてつくられており,その満足感は生きる力と密接に関連していることなどを明らかにしている.最終年度は,1年間を通して収集した縦断的データを整理した.そして体育授業における動機づけ雰囲気,目標志向性,生きる力の因果関係の推定を交差効果モデルを用いて検討した.その結果,体育授業の熟達雰囲気(努力に価値が置かれ熟達に至る過程が重視される雰囲気)や協同雰囲気(仲間との協同体験に価値が置かれ生徒間の相互作用が重視される雰囲気)が生徒の生きる力養成に影響を与えていることを確認した.一方で成績雰囲気(能力に価値が置かれ競争を通しての達成が重視される雰囲気)は生きる力の向上を阻害する要因の一つであることを確認した.本研究は,体育授業における動機づけ雰囲気,目標志向性,生きる力の3変数間の因果関係について検討を行うことを目的とした.研究1では,体育授業における動機づけ雰囲気に関する基礎データを整理した.研究2では,中学生と高校生を対象に2ヵ月間のインターバルを取りながら1年間にわたり5回調査を実施した.主な結果は以下の通りである.(1)熟達雰囲気と協同雰囲気は,生きる力と正の因果関係を示した.(2)熟達雰囲気と協同雰囲気は,課題志向性を介して,生きる力と正の因果関係を示しており,循環的に高まることが確認された.以上のことから,生きる力を育成するためには,熟達雰囲気と協同雰囲気が重要になることが示唆された.平成28年度は,体育授業における動機づけ雰囲気が生きる力養成に与える影響について前年度に収集した縦断データを多母集団同時分析によって検討することと,研究成果を整理し,それに基づいて,生きる力養成に効果的な指導の視点や学習雰囲気の在り方の観点など体育授業での実践内容および教師のかかわり方について提案することの2点を中心に行っていく.なお,平成27年度,予定していたデータ入力を迅速に進めていくため,人的資源の有効活用に努めたい.平成28年度は,1体育授業における動機づけ雰囲気が生きる力に与える影響について収集した縦断データの解析と2生きる力養成に効果的な体育学習の在り方について検討し,それら成果公表を行う予定であった.1については年度内に完了したが,2については当初の予定からやや遅れた.今年度は2の生きる力の養成に効果的な体育学習の在り方について,これまでの成果に基づいて公表し,研究の完了を目指す.体育心理学平成27年度予定していたデータ収集は順調に行なうことができたが,データ入力に遅れが生じている.その理由として申請者の職場移動があり,当初予定していた研究協力者の確保が困難になり人件費を使用することができなかった.
ゲノム編集技術を用い、ゲノム不安定性に与えるクロマチン構造の役割を解明する

放射線や化学変異原により誘発される遺伝的不安定性は、発ガン等長い潜伏期を経て発症する生体影響には極めて重要な要因である。その要因は何らかの損傷メモリーと考えられているが、その実体は明らかでない。エピジェネティック変化が損傷メモリーに関与しているかを検証できる実験系の構築を目指した。損傷により誘発される遺伝的不安定性を検出する系としてCRISPRを利用し、特定のゲノム領域に二重鎖切断を誘発し、マイクロサテライト不安定性を検出する系を確立した。損傷メモリーの形成・維持に関与すると考えられる遺伝子群の変異体のうちレスキューの必要なATR、DNA-PKcsについてはレスキュー用のBACの作製を行った。放射線や化学変異原により誘発される遺伝的不安定性は興味深い現象であり、発ガン等長い潜伏期を経て発症する生体影響には極めて重要な要因である。何らかの「損傷メモリー」が遺伝的不安定性誘発の要因と考えられているが、その実体は明らかでない。本申請では、1)ゲノム編集技術を用いゲノムの特定領域に損傷を導入し、2)導入損傷により誘発される不安定性の検出をゲノム上に散在する標的配列で行う系を確立する。更に3)損傷導入領域・変異検出領域において、「損傷メモリー」の有力な候補である「ゲノムDNAやクロマチンの修飾」を解析し、「損傷メモリー」の実体を明らかにする。これに加えp53, ATM, ATR, DNA-PKcs等の損傷応答遺伝子変異体による解析を行い、「損傷メモリー」形成・維持に関わる経路の同定を行う。そのために、まず損傷導入によりマイクロサテライト不安定性の誘導を検出できるかどうか検討した。損傷の導入はγ線により行った。成熟オス個体に2Gy、4Gyのγ線を照射し、照射後、導入変異を固定するため2週間置いたのち、未処理のメスと交配して得られたF1個体ゲノムDNAについて、9番染色体上のマイクロサテライト領域、15か所について解析を行った。野生型(HdrR)では線量依存的にマイクロサテライト不安定性が増加することが確認された。また、p53変異体(186番目のチロシンが終止コドンに置換している)でも行った。その結果、非照射個体では野生型と同等の変異頻度を示したが、ガンマ線照射により野生型よりも高頻度にマイクロサテライト不安定性が誘導されていることがわかった。放射線や化学変異原により誘発される遺伝的不安定性は興味深い現象であり、発がん等長い潜伏期を経て発症する生体影響には極めて重要な要因である。何らかの損傷メモリーが遺伝的不安定性誘発の要因と考えられるが、その実体は明らかでない。本申請では、ゲノム編集技術を用いゲノムの特定領域に損傷を導入し、導入損傷により誘発される不安定性の検出をゲノム上に散在する標的配列で行う系を確立する。損傷導入領域・変異検出領域において、損傷メモリーの有力な候補であるゲノムDNAやクロマチンの修飾を解析し、損傷メモリーの実体を明らかにする。これに加え損傷応答遺伝子変異体による解析を行い、損傷メモリー形成・維持に関わる経路の同定を行う。損傷応答遺伝子p53、ATM、ATR、DNA-PKcsの変異体については既に作製しており、これまでに、p53変異体は生存可能で妊性があり、ATM変異体は生存可能であるが不妊不稔、ATR変異体は正常孵化するが、孵化後一ヶ月までに死亡することを確認していた。DNA-PKcsについて同様の確認を行った。その結果、DNA-PKcs変異体は孵化後2-3か月目までは正常に生育するが、その後成魚になるまでにそのほとんどが死亡することが確認された。また生き残った成魚(今回得られたのはメスのみ)は妊性を有しており得られた胚は正常に発生することが確認された。これらの結果より、ATR、DNA-PKcsについては変異個体を解析するために野生型遺伝子によるレスキューを行う必要があり、本年度はDNA-PKcsレスキュー用のBACコンストラクションをrecombineering法で行った。このとき、レスキュー後さらに任意の組織、細胞でノックアウトできるようにDNA-PKcsの遺伝子領域をloxPではさみこみ、DNA-PKcsが抜けたあとGFPが発現し始めることで欠失が確認できるよう工夫している。何らかの損傷メモリーが関与すると考えられるが、その実体は明らかでない。損傷応答遺伝子p53,ATM,ATR,DNA-PKcsの変異体については既に作製しており、このうち成魚まで生育しない、もしくはし難いATR,DNA-PKcsについてはレスキュー用BACの作製を行った。このとき、レスキュー後さらに任意の組織、細胞でノックアウトできるようにそれぞれの遺伝子領域をloxPではさみ、Creの発現により遺伝子領域が抜けたあとGFPが発現し始めるようにして確認できるよう工夫した。損傷導入部位でのエピジェネティック変化/クロマチン構造変化を検出するために、まずEGFPを1コピー持つtransgenicメダカ胚(in vivo系)、及び胚由来培養細胞に対しEGFPに対するCRISPRを作用させ、DSBが起きた周辺(EGFPの周辺)と周辺外のマイクロサテライトの変化を見ることにした。

我々はこれまでにγ線によりマイクロサテライト不安定性が高頻度に検出される領域を同定しており、この高頻度領域と低頻度領域とでDSBによるエピジェネティックな変化を比較することによりマイクロサテライト不安定性との相関を明らかにしたいと考えた。EGFPに効率よく作用するCRISPRが作成できた。放射線や化学変異原により誘発される遺伝的不安定性は、発ガン等長い潜伏期を経て発症する生体影響には極めて重要な要因である。その要因は何らかの損傷メモリーと考えられているが、その実体は明らかでない。エピジェネティック変化が損傷メモリーに関与しているかを検証できる実験系の構築を目指した。損傷により誘発される遺伝的不安定性を検出する系としてCRISPRを利用し、特定のゲノム領域に二重鎖切断を誘発し、マイクロサテライト不安定性を検出する系を確立した。損傷メモリーの形成・維持に関与すると考えられる遺伝子群の変異体のうちレスキューの必要なATR、DNA-PKcsについてはレスキュー用のBACの作製を行った。1)メダカにおけるマイクロサテライト不安定性の検出系の確立、特定ゲノム配列に損傷を導入する系については昨年度の報告通り順調に進んでいる。2)損傷メモリーの形成・維持に関わりがあると考えられる損傷応答遺伝子群の変異体は作製できており、致死もしくは安定して変異体を得ることができない系統に関しては野生型遺伝子を導入してレスキューする系を準備中で、順調に進んでいる。3)損傷導入部位でのエピジェネティック変化の検出、クロマチン構造変化の検出系の確立についてはやや遅れている。以上のことを総合して、おおむね順調に進展していると判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。分子放射線生物学昨年度に引き続き、DNA-PKcs変異体レスキュー用BACの作製を行う。またATR変異体レスキュー用BACの作製を開始する。特定ゲノム配列に損傷を導入する系については、人工ヌクレアーゼを導入した個体の作成をおこなう。この時、組み換え修復等を塩基配列で確認できるよう近交系間のゲノム配列を検索し、二重鎖切断導入カ所を決定する。損傷導入部位でのエピジェネティック変化の検出/クロマチン構造変化の検出するために、DNAの修飾としてはメチル化を、またヒストン修飾についてはヒストンH3の9番目のリジンのメチル化(H3K9me)を解析する。またこれに加え、局所的にヘテロクロマチン化しているかどうかの確認をHP1抗体によるChIP Asseyにより行う。そのための手法の条件検定を行う。特にHP1に関しては、市販の抗体がメダカHP1にCrossReactするかどうかのチェックを行い、場合によってはメダカHP1抗体を作製する。1)メダカにおけるマイクロサテライト不安定性の検出系の確立については、野生型、p53変異体でγ線によるマイクロサテライト不安定性の誘発頻度を確認しており順調に進んでいる。
精神科作業療法のための適応機能評価尺度の開発

我々は、国内外の文献や全国の精神科施設から収集した133尺度の項目分類により、患者の適応機能に関連した3領域(ADL、対人関係、個人的要因)を2段階の手続きで行う2段階OT評価理論を提案した。評価の2段階とは、OT場面での患者の適応機能評価と実社会のなかで患者が示しうる適応機能評価である。そして、この理論に基づいてOT場面観察評価尺度(O尺度)と社会適応機能評価尺度(S尺度)から成る精神科OT評価システム(ASPOT)を作成した。この尺度を用い、13施設のOTRに患者の評定を依頼し184名分の資料を得、基準関連妥当性と併存的妥当性を検討した。年齢、治療形態、入院期間、症状の重篤度を基準に患者を分類しASPOT得点を比較したところ、症状が重篤な患者ほど、外来患者よりも入院患者の方が、入院期間が長いほど、高齢になると、ほとんどの下位尺度が低得点で、逆に問題行動は高得点だった。また、O尺度とCOTE、S尺度と精神障害者ケアアセスメントには有意な相関が見られ、測定内容が類似している下位尺度間は特に高い相関が見られた.この結果はASPOTの妥当性を支持するものである。次に、11施設に対し、同一患者に対して2名のOTRがASPOTを用いて評定するよう依頼し、100名分の資料を得た。下位尺度ごとのα係数は発展的ADLだけが.63だが、それ以外は全て.7以上で、2名の評定者間の相関係数も全て中程度以上の有意な相関であった。さらに、5施設に対し、同一患者に同じ評定者が約1ヶ月の間をおいて2回の評定を行うよう依頼し、24名分の資料を得た。2回の評定の下位尺度得点の相関は全て.8以上だった。この結果は、ASPOTの信頼性を支持するものである。さらに、下位尺度項目を減らしたASPOT簡易版を作成し、高い信頼性と妥当性が得られた。この他、評定者バイアスの要因やOTの効果について検討を行った。2段階OT評価理論に基づいて作成した尺度ASOPT(渥美・大渕、2002)を用い、作業療法(OT)で患者が示す適応行動の分析を試みているが、本年度は自己効力感の高い患者ほどOT場面において適応行動が高く評価されるかを検討した。精神科入院患者60名に自己効力感を自己評定させ、彼らが参加した2週間後のOT行動をOTRと患者自身に評定させた。自己効力感の測定は成田ら(1995)をもとに9項目作成した。作業遂行評価では山根(1997)をもとに、他者評価用には認知、自己制御、動機づけ、対人関係、運動機能の5側面を評価する19項目を、自己評価用には自己制御、動機づけ、対人関係と成果の10項目を作成した。社会適応機能評価ではADL、対人関係、個人的要因、問題行動を評価するASPOTのO尺度(64項目)を用いてOTRに評定させた。他者評定は5段階(1-5)、自己評定は3段階(1-3)である。自己効力感の平均値はやや低めだつた(2.78)。他者評価尺度の得点は2名のOTRの平均とした。作業遂行他者評価では動機付けと対人関係が自己効力感と正の相関を示し、ASPOT O

尺度ではADL(発展)、対人関係(基礎)、対人関係(発展)が自己効力感と正の相関を、問題行動(精神と身体)が負の相関を示した。他者評価に用いたほとんどの下位尺度が予測された方向で自己効力感と関連していたことから、患者の自己効力感がOTの効果を促進する心理的要因であると推論できる。一方、作業遂行自己評価は他者評価とも自己効力感と全く相関が見られず、患者の作業自己評価は信頼性が低いことがうかがわれる。また、作業遂行の他者評価とASPOT O尺度の間には全下位尺度間に全て有意な相関が見られたことは(-.24.70,p<.01)、OTRがOT場面での作業遂行の量と質を考慮に入れて患者の社会適応機能を評価していることを示唆している。我々はASPOT(渥美・大渕、2002)を用い、OTで精神障害者が示す適応行動の分析を試みているが、本年度は精神障害者に対するOTの効果と作業活動の違いを検討した。精神科OTを実施している入院患者64名について、7名の作業療法士(OTR)を2名ずつペアにし、同じOT場面での各患者の行動を観察し、患者の適応機能水準をASPOT・O尺度を用いて独立に評定させた。評定は4回実施し、2回目の評定は1回目の評定後1月以内に、3回目の評定はその2月後、4回目は更にその1月以内に実施した。O尺度は5段階(1-5)で高得点が高機能を示す。評定者のペアは1回目と2回目、3回目と4回目を同一とした。この他に調査期間中各患者がOTで行った作業活動の種類も収集した。評定時の作業活動は34種目で、手工芸が多く、スポーツ、音楽、書道、ゲームなどであった。2名のOTRが評定した4回のO尺度の評定について、ADL(基礎的)(発展的)、対人関係(基礎的)(発展的)、精神的機能、身体的機能、問題行動(対人関係)(精神的機能)の8領域で、1回目の評定の平均値と24回目の評定の平均値を比較したところ、以下の4群が見いだされた。1)改善群:、OT実施期間中、概ね適応機能の向上が見られた患者。2)悪化群:全体として、OT実施期間において適応機能が低下した患者。3)不変群:評定値の変化がほとんどなく、適応機能に顕著な変動が見られなかった患者。4)その他:尺度得点の変化が不規則で、特定のパターンがみられなかった患者。症例分析では、例えば、改善群に分類された統合失調症の60代男性患者の場合は、研究期間中のOT活動において比較的活動性の高い複数の作業種目を自主的に選択し、これに参加していた。我々が開発したASPOT(渥美・大渕、2002)を用い、作業療法(OT)場面で患者が示す適応行動の分析を試みている。複数の作業療法士(OTR)が同じ患者の適応機能を評定すると、評定者間にずれが生じるが、その原因は明らかではない。そこで本年度は、ASPOTを用い、精神科領域においてOTR間に判断のずれを生じさせる評定者バイアスの要因を検討し、あわせて、ずれが生じやすい適応機能について探った。文献調査により、評定者バイアスの要因としては評定者の経験度と性格特性などがある。また、行動から推論する必要がある精神機能や対人交流技能などに判断のずれが生じやすいと仮定した。精神科医療施設に入院している67名の患者に対し、7名のOTRが2人1組となり、同一の患者に対して同一のOT場面を行動観察し、ASPOT・S尺度を用い適応機能を独立に評定するよう依頼した。評定は同一患者に約3ヶ月のインターバルをおいて2回評定させた。評定者を経験年数によって2群にわけたところ、経験少群と多群のペアで評定をおこなっていた患者は1回目評定で36名、2回目は35名だったので、そのデータを分析に使用した。その結果、経験の長いOTRは1回目よりも2回目に患者の機能を高く評定したが、経験の短いOTRではこうした変化はなかった。
ゼオライト膜による水を含む高温気体からの水素分離

一般的に認識されている無機系ガス分離膜の分離機構はKnudsen拡散に基づくもので、その分離係数は大きいものではない。しかし近年、溶解-拡散機構や分子飾によるガス分離性が無機薄膜においても存在することが確認され、そのような特性を持つ無機膜の調整法が種々報告されている。合成ゼオライト膜もそのひとつであり、非極性の混合ガス系ではKnudsen拡散による分離を上回る分離係数を示すという報告例がある。本研究では、高温の水素-水-臭化水素混合ガスから水素を連続的に分離するゼオライト膜の開発を目的として研究を行った。今年度は、1.多孔質支持体への合成ゼオライト膜の坦持、2.合成ゼオライト膜のガス透過性と分離性の評価、3.高温のH_2O-HBr系雰囲気下での耐食性の評価などの項目について検討し、23の知見を得た。アルミナ管へのZSM-5の坦持条件は仕込み液の組成、量、反応温度が重要な因子であった。反応時間は1時間でも合成することが確認できたが、反応時間を24時間程度行うことにより緻密な膜が製膜できることが確認された。ZSM-5を坦持しただけではゼオライト結晶間の隙間からの透過流量が大きく分離を行うにはさらに表面処理が必要である。高温におけるHBrに対する耐食性はZSM-5自体にはあるが、支持体のアルミナがHBrによって侵食されて、ゼオライトとアルミナの接合部分に破壊が起こり、分離膜としての機能を著しく低下させることを知った。今後は、シール材についても再検討するものとし、また同時に高温でのHBrを含む混合ガスからの水素の透過分離特性についても評価する。その後にゼオライト結晶間の隙間を制御して、分離特性に対するその影響について検討する。また、分離膜のHBrの侵食についてはさらに検討する。
LAK細胞による殺細胞効果のin vitroならびにin vivoにおける解析

C57BL/6マウスにBI6メラノーマ細胞を皮下移植し,移植10日後よりヒトのrccombinant lnterlcukin2(rIL-2)で活性化したマウス脾細胞,いわゆるLAK細胞を5日間静注し脾瘍の増殖抑制効果を, LAK細胞投与群と非投与群で比較検討した.また, LAK細胞の転移抑制効果をみるため高転移株であるB16-F10メラノーマ細胞を5×10^4個静注し20日後の肺転移巣数を, LAK細胞を静脈内へadoptivo transferした群と非投与群で比較し効果について検した.更にLAK細胞をadoptivo transferした当日より5日間連続でrIL-2IX10^3Uを腹腔内投与し,非投与群との転移抑制効果を比較した.また培養I-10細胞にLAK細胞を加え,メラノーマ細胞の^3H-TdR取り込みを検討した.腫瘍移植20日後の腫瘍重量をLAK細胞非投与群と比較検討したところ,いずれも40-50%の抑制を認めた.転移抑制効果については20日後のマウス1匹あたりの平均肺コロニー数を算定したところ,非投与群は68+20, LAK細胞投与群42±8,更にrIL-2投与群では32±18といずれも危険率5%で有意差を認めLAK細胞のメラノーマ細胞に対する増殖抑制および転移抑制効果がみられた.またこの効果はrIL-2を腹腔内へ投与することにより効果の増強がられた. ^3H-TdRの取り込みについては, LAK細胞を加えることによって取り込み抑制が認められた.これらの結果より,我々は所属リンパ節に転移を認めたメラノーマ患者に対し,原発切除後,患者からLAK細胞を誘導し3ケ月間隔でLAK細胞をadoptive transferすることによって転移抑制効果としAK活性を検討中である.現在のところLAK活性の有意な上昇を認めていないが,転移巣の拡大はみられていない.C57BL/6マウスにBI6メラノーマ細胞を皮下移植し,移植10日後よりヒトのrccombinant lnterlcukin2(rIL-2)で活性化したマウス脾細胞,いわゆるLAK細胞を5日間静注し脾瘍の増殖抑制効果を, LAK細胞投与群と非投与群で比較検討した.また, LAK細胞の転移抑制効果をみるため高転移株であるB16-F10メラノーマ細胞を5×10^4個静注し20日後の肺転移巣数を, LAK細胞を静脈内へadoptivo transferした群と非投与群で比較し効果について検した.更にLAK細胞をadoptivo transferした当日より5日間連続でrIL-2IX10^3Uを腹腔内投与し,非投与群との転移抑制効果を比較した.また培養I-10細胞にLAK細胞を加え,メラノーマ細胞の^3H-TdR取り込みを検討した.腫瘍移植20日後の腫瘍重量をLAK細胞非投与群と比較検討したところ,いずれも40-50%の抑制を認めた.転移抑制効果については20日後のマウス1匹あたりの平均肺コロニー数を算定したところ,非投与群は68+20, LAK細胞投与群42±8,更にrIL-2投与群では32±18といずれも危険率5%で有意差を認めLAK細胞のメラノーマ細胞に対する増殖抑制および転移抑制効果がみられた.またこの効果はrIL-2を腹腔内へ投与することにより効果の増強がられた. ^3H-TdRの取り込みについては, LAK細胞を加えることによって取り込み抑制が認められた.これらの結果より,我々は所属リンパ節に転移を認めたメラノーマ患者に対し,原発切除後,患者からLAK細胞を誘導し3ケ月間隔でLAK細胞をadoptive transferすることによって転移抑制効果としAK活性を検討中である.現在のところLAK活性の有意な上昇を認めていないが,転移巣の拡大はみられていない.BALB/CマウスにB16メラノーマを皮下移植し、移植10日後よりマウスIL-2を10日間皮下に連続投与し腫瘍の増殖抑制効果を検討した。腫瘍移植20日後の腫瘍重量を対照群と比較検討したところ、いずれも対照群に比べ40-50%抑制された。更にIL-2の転移抑制効果を検討するため高転移株であるF-10メラノーマ細胞をマウス尾静脈に5×【10^5】/ml注入し20日後の肺転移巣数をIL-2投与群と非投与群で比較検討した。IL-2はメラノーマ注入2日後より連日10日間皮下に投与した。結果、対照群の肺転移巣の平均±標準偏差は42±12、IL-2投与群は12±7であり著明な転移抑制効果を認めた。in vivoにおける腫瘍抑制効果を検討するため、皮膚上皮性悪性腫瘍である有棘細胞癌,老人性角化腫,Bowen病,基底細胞癌にヒトレコンビナントIL-2を1日、1000U、5-10日間腫瘍内投与し、腫瘍の肉眼的縮小率および、LAK活性を投与前後で比較検討した。LAK活性は患者末梢血より分離精製したリンパ球を【^(51)Cγ】でラベルしたLAK標的細胞と37°C、4時間反応させ、上清中に遊離する【^(51)Cγ】の放射能を測定した。活性の測定にはNK非感受性株であるDaudi細胞を標的細胞に用いた。

局注後の肉眼的腫瘍の縮小率は有棘細胞癌、老人性角化腫で25-50%の縮小率を認めた。組織学的にも腫瘍巣の構築の崩壊、一部の腫瘍細胞の変性がみられた、基底細胞癌、Bowen病は肉眼的にほとんど変化がみられなかったが組織学的には腫瘍巣周囲に著明な反応性リンパ球浸潤がみられた。投与前後のLAK活性はいずれの症例共有意な変化を認めなかった。これはIL-2の投与量,免疫抑制細胞の関与,血清中に存在するIL-2中和因子の存在等が考えられ、今後の検討課題と思われる。
高静水圧環境下における硬脆機能材料の微細切削加工特性

本研究の目的は、形状自由度が高くかつ高能率な微細加工を実現するために高静水圧環境を利用した硬脆材料の無欠陥切削加工方法を検討することである。そこで本研究では高静水圧環境切削加工実験装置を開発し、その切削加工特性を検討した。本装置は圧力チャンバー、4000気圧を発生する油圧システム、高圧チャンバー内に組み込む切削実験装置、コントローラからなる。精密な切削実験が行えるように高精度な工具ステージを新たに開発し、またそれをコントロールするモータドライブシステムを開発し、サブミクロンオーダーの切込み設定が行える切削実験装置を完成させた。またチャンバー中での切削状態をモニタリングするために4000気圧中で使用できる切削動力計を開発した。これらを装置本体に組み込み高静水圧下で安定して所定の切削実験が行えることを確認した。この高静水圧環境切削加工実験装置を用い、ソーダガラス、石英ガラス、水晶、シリコンの切削実験を行い、高静水圧下での切削特性を検討した。工具として単結晶ダイヤモンド工具を用い、端面切削実験を行った。切削痕をレーザー顕微鏡で観察することにより、静水圧により延性-脆性遷移挙動が変化し、加工欠陥の発生が抑制されることを確認した。次に、高静水圧下での切削主分力、背分力を測定した。この結果、高静水圧環境下では見掛けの切削力が増大すること、また摩擦角(すくい面摩擦係数)が増大することが判った。近年、サファイヤやシリコン、水晶などの材料を母材とした新しい機能材料やデバイスの開発が盛んに行われている。これらの機能材料の多くは硬脆材料であるため、その加工には主にラッピング、ポリッシングなどの研磨加工、およびフォトリゾグラフィやスパッタリングなど化学的加工が用いられている。ところがこれらの加工プロセスでは加工形状の自由度が低い、加工効率が低い、などの問題があり、今後の新機能材料の開発にとって大きな足枷となっている。そこで本研究では、形状自由度が高くかつ高能率な微細加工を実現するために高静水圧環境を利用した硬脆材料の無欠陥切削加工方法を検討する。Bridgemanの研究によると高静水圧下では脆性材料でも延性が増し大きな塑性変形が可能であることが知られている。そこで本研究ではこの原理に基づいた無欠陥切削加工を実現するための高静水圧環境切削加工実験装置を開発し、その切削加工特性を検討する事により硬脆機能材料の新しい微細加工法を開発する事を目的としている。本年度は高静水圧中で高精度な加工実験を行える装置の開発を行った。また、米国の3つの大学を訪問し、最先端加工技術について情報収集を行った。本研究は、形状自由度が高くかつ高能率な微細加工を実現するために高静水圧環境を利用した硬脆材料の無欠陥切削加工方法を検討することを目的としている。そこで本研究ではこの原理に基づいた無欠陥切削加工を実現するための高静水圧環境切削加工実験装置を開発し、その切削加工特性を検討する。本年度は昨年度開発した高静水圧環境切削加工実験装置を用い、ソーダガラスの切削実験を行い、高静水圧下での切削特性を検討した。このためにまず4000気圧中で切削力が測定できる切削動力計を開発した。

工具として単結晶ダイヤモンド工具を用い、スライドガラスの端面切削を行った。切削痕をレーザー顕微鏡で観察することにより、静水圧により延性-脆性遷移挙動が変化し、加工欠陥の発生が抑制されることを確認した。さらに臨界切削厚さを測定し、静水圧に対する臨界切削厚さの変化を定量的に明らかにした。さらに種種のすくい角の工具においても同様に切削実験を行い、どのすくい角においても静水圧による加工欠陥抑制効果があることを確認した。次に、高静水圧下での切削主分力、背分力を測定した。この結果、高静水圧環境下では見掛けの切削力が増大すること、また摩擦角(すくい面摩擦係数)が増大することが判った。一方、切削機構を明らかにするには切り屑の観察および剪断角の測定が必要である。そこで本装置を改造し、高静水圧環境下で二次元切削を行い、それを光学的に拡大し観察することを試みた。ピエゾアクチュエータを用いた二次元切削実験装置を開発し、それに対物レンズ、白色LEDの光源を組み付け、高圧チャンバー内に設置した。それをサファイヤの窓を通して観察し、接眼レンズを通してビデオカメラで観察するシステムを開発した。本装置を用いて予備実験を行ったところ、圧力媒体として用いたタービンオイルの屈折率、透明度の問題で高倍率での観察は出来なかった。今後の課題として検討する必要がある。
脳磁図・脳波を指標とした語音認知の発達的研究

短い間隔で繰り返し提示される同一の音(標準刺激)の中に標準刺激とは異なった聴覚的特性を持つ逸脱刺激がまれ(1015%)に挿入された場合に、逸脱刺激に特異的に認められる脳磁場成分がある。この成分はMMNmと呼ばれ、1)前注意的な、2)逸脱検出過程を反映した成分である、と考えられている。本研究ではMMNmを指標として日本語の音素体系では区別されない/la//ra/に対する脳磁場を測定し、子音部に対する母音部の持続時間の効果を検討した。被験者は右利き日本人話者11名であった。刺激としてカスケード型フォルマント合成器によって作成した刺激音セット/lait/と/rait/から先頭の110msと150msの区間を切り出した/la/と/ra/を刺激として用いた。第1フォルマント(F1、750Hz)の定常部は/la/、137ms、/ra/、89msであった。第2フォルマント(F2)、第3フォルマント(F3)の定常部は83msであった。F2は/la/が1280Hz、/ra/が960Hz、F3はそれぞれ3000Hz、1400Hzであった。/la/を標準刺激(85%)、/ra/を逸脱刺激(15%)として、刺激長の短いshortセッション(110ms)、長いlongセッション(150ms)を各被験者に行った。両セッションとも刺激間間隔(onset-to-onset)は600msであった。刺激提はイヤーチューブを介して両耳に行った。BTi社製の37チャンネルの脳磁場計測を用いて、両側の側頭部から脳磁場を同時記録した。左右両半球において、short条件ではMMNmが認められるが、long条件では認められなかった。従って、本結果は、temporal window内の統合時に母音部が子音部をマスクし、その結果、知覚された/la//ra/の差が減少したためと解釈可能である。
CRISPR/Casを用いた不妊原因遺伝子の同定とその分子機能の解明

我々は,Slc22a14とDlec1の発現様式や生理的機能についてマウスを用いて解析し,これらの遺伝子が雄の生殖能に極めて重要な遺伝子であることを見出した。例えばSlc22a14は精巣特異的かつ生殖細胞特異的に発現しており,この遺伝子を欠損すると精子の運動能・受精能が低下し,雄マウスの生殖能力が著しく低下する。また,Dlec1を欠損したマウスでは,精子分化に異常があるため,正常な精子がほとんど産生されず完全な不妊となる。Slc22a14やDlec1はヒトにも保存されていることから,これら遺伝子は潜在的なヒト男性不妊原因遺伝子であることが示唆される。CRISPR/Cas9システムにより、当初予定していたDlec1遺伝子KOマウスおよびSlc22a14遺伝子KOマウスを作製した。作製したマウスにおいて期待通りの欠損が起きていることを確認した。また、オフターゲット作用について検証し、これらのマウスにおいては調べた限りでは非特異的な切断は起きていないことを確認した。これらのマウスの交配実験を行い、Dlec1遺伝子の欠損は完全な雄性不妊を、Slc22a14遺伝子の欠損は重篤な低受胎性を引き起こすことを見出した。また、どちらの遺伝子の欠損においても雌の生殖能力には影響を及ぼさないことを明らかにした。Dlec1遺伝子KOマウス精巣の組織学的解析を行ったところ、減数分裂の終了までは正常に進行しているものの、伸長精子細胞期において、精子分化が途中でストップすることがわかった。このため精巣上体にはほどんど精子が存在していなかった。この分化異常がDlec1ーKOマウスの不妊原因と分かった。また、Slc22a14遺伝子KOマウスについても同様に解析を行ったところ、こちらのマウス精巣では精子分化そのものには顕著な異常は認められず、精巣上体精子数も野生型と差はなかった。しかし、KOマウスにおいては精子鞭毛がヘアピン状あるいはV字状に屈曲しているものが多く存在していること、そして前進運動能・受精能が低下していること等を明らかにした。これらの異常がSlc22a14遺伝子欠損マウスの生殖能力低下の原因であると考えられた。本年度は、2つの遺伝子欠損マウスを作製しその雄の生殖能の表現型を明らかにするとともに、生殖能力に影響を及ぼした場合は、精子分化・機能のどこに問題があるのかを解明することを計画していた。この計画は達成されており、順調に進展しているものと判断した。昨年,雄性不妊に関わる2つの遺伝子(Slc22a14とDlec1)を同定した。今年は,その2つの遺伝子の機能や局在について解析した。その研究概要は次の通りである。Slc22a14:これまでの研究で,本遺伝子を欠損すると,精子鞭毛がヘアピン状やV字状に曲がってしまい,運動能が低下していることを見出していた。本年は,その原因について解析を行った結果,細胞内の浸透圧の異常や鞭毛の構造タンパクの発現や局在の異常であることが明らかとなった。また,本遺伝子の精子は運動能が低いだけでなく,受精能獲得にも異常があることを見出した。以上の結果から,Slc22a14は精子機能に複合的な問題を抱えているため,重度の繁殖能力の低下が引き起こされることが示唆された。Dlec1:Dlec1は精子分化に必須の働きをもつことを昨年見出した。今年は,Dlec1の分子機能の解明に必要な,抗Dlec1抗体の作製を行った。様々な部位のDlec1を抗原に用い,抗体の作製を試みたが,内在性のDlec1の免疫染色や免疫沈降に利用可能な抗体を得ることはできなかった。そこで,Dlec1のC末端にFLAGタグを付加したマウスをゲノム編集技術を用いて作製した。現在,このマウスを交配により増やし,既存の抗FLAG抗体で免疫染色や免疫沈降を行えるかどうか検討中である。一方,Dlec1ーKOマウスの精子分化の異常について詳細に解析したところ,KIF3Aなど微小管上の物質輸送に関わる遺伝子のノックアウトマウスの異常と非常に一致する点が多いことを見出した。このことから,Dlec1は微小管上物質輸送に関わっている可能性が考えられた。本年は,不妊原因遺伝子の分子機能について解析していく計画であった。Slc22a14については,その輸送能が失われることにより細胞内の浸透圧異常が引き起こされることを明らかにできたほか,この輸送体が受精能獲得に関わっていることも明らかにできた。Dlec1については期待したとおりの抗体ができなかったものの,FLAGタグのノックインマウスを作製できたので,今後,解析が進むことが期待される。本研究ではゲノム編集技術を用いてSlc22a14とDlec1の遺伝子欠損マウスを作製,解析することにより,以下のような成果を得た。Slc22a14遺伝子を欠損したマウスは雄性不妊を引き起こすこと,そしてその直接的な原因は精巣上体通過中に生じる鞭毛屈曲による精子運動性低下と受精能獲得能の低下が重なって起こる受精能力の低下であることを明らかにした。また,鞭毛屈曲を引き起こすメカニズムは,浸透圧性細胞膨張とアニュラス構造異常によるものであることを明らかにした。

さらに最終年度では,Slc22a14遺伝子を欠損したマウス精子において,なぜ受精能獲得能力が低下するのかを解析し,受精能獲得の最上流にある重炭酸イオンの流入不全により,cAMP産生が著しく低下するためであることを示唆するデータを得た。以上より,Slc22a14は様々な精子機能を支えるための重要な遺伝子であることを見出した。また,Dlec1も雄の生殖能に必須の働きをもつことが分った。Dlec1のノックアウトマウスの精子分化は,減数分裂終了までは正常に進行するものの,伸長精子細胞期において,精子頭部の変形や尾部の伸長異常が生じ,結果として正常な精子が全く産生されないことを見出した。その結果,交配行動は正常であるが,完全に不妊であった。また,Dlec1ノックアウトマウス精子の異常な形態をより詳細に解析したところ,異常なマンシェットを有していることが分り,またこの異常はKIF3Aノックアウトマウスの精子とよく似ていた。KIF3Aは鞭毛内の微小管上輸送に関わることが知られていることから,上記の結果から,Dlec1が微小管上輸送に関わる分子であることを示唆している。しかしながら,特異性の高い抗Dlec1抗体の作製が困難であったこともあり,細胞内での局在や分子機能を解明するには至らなかった。我々は,Slc22a14とDlec1の発現様式や生理的機能についてマウスを用いて解析し,これらの遺伝子が雄の生殖能に極めて重要な遺伝子であることを見出した。例えばSlc22a14は精巣特異的かつ生殖細胞特異的に発現しており,この遺伝子を欠損すると精子の運動能・受精能が低下し,雄マウスの生殖能力が著しく低下する。また,Dlec1を欠損したマウスでは,精子分化に異常があるため,正常な精子がほとんど産生されず完全な不妊となる。Slc22a14やDlec1はヒトにも保存されていることから,これら遺伝子は潜在的なヒト男性不妊原因遺伝子であることが示唆される。今後は、Slc22a14およびDlec1の分子機能を明らかにしていくことを目標とし、その分子機能とKOマウスの雄性不妊という表現型がどのように結びつくのか明らかにしていく予定である。Slc22a14に関しては,なぜ本遺伝子を欠損すると受精能獲得が進まなくなるのか,その分子メカニズムを解析する予定である。また,Dlec1については,抗体の作製について再度試みるほか,FLAGタグノックインマウスを用いて,Dlec1の局在や相互作用タンパク質の同定をこことみる予定である。生殖生物学当初予算のほぼすべてを使用した。次年度使用額は、ごく少額(264円)であり、この金額で購入できるものがなかったため次年度に繰り越した。試薬などを購入するには少なすぎる額(249円)が残ってしまったため。次年度の予算と合わせて試薬等の購入に使用する。次年度の予算と合わせて必要な物品を購入する予定である。