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高輝度遠紫外レーザ用光学材料の超精密加工と機能向上

高輝度遠紫外レーザは次世代のリソグラフィー,光化学反応による物質のプロセッシングおよびレーザ核融合の分野での応用が期待されているが、その波長域で光を透過する材料が限定されること、その材料を高精度に加工する技術が確立していないこと並びにレーザ照射による光学素子の損傷が問題となっている。本研究は,遠紫外の高輝度レーザに使用できる高精度・高透過率・高レーザ耐力・高信頼性を有する平面光学素子を提供することを目的とする。本年度の研究実績は以下のようである。1.遠紫外並びに真空紫外域での光学結晶である高純度CaF_2をフロート・ポリシングした結果、最も滑らかな面として液面粗さ0.16nm rmsが得られたが、それ以上に滑らかな面は得られていない。この面を超高圧透過型電子顕微鏡で断面観察した結果,結晶面は(III)面から少し傾き、そのため原子単位で滑らかな(III)面の所々で段差ができ、それが表面粗さに反映していることが明らかとなった。したがって,表面粗さを0.1nm rms以下にするには結晶の正確な面出しが最も重要であることが判明した。2.非線形光学結晶KDPとCLBOを用いてNd : YAGレーザを波長変換して波長266nmの遠紫外レーザを発生させ、これをCaF_2結晶内部に集光させて内部レーザ耐力を測定した結果、結晶材料間での性能は2倍異なることが明らかとなった。同じ個所に繰り返しレーザを照射した場合のレーザ耐力は単発のものに比べその値が1/2になる。3.上記遠紫外レーザを超精密研麿したCaF_2表面に集光して表面でのレーザ耐力を測定した結果、表面粗さおよび加工変質層によるレーザ耐力の労化だけでなく、加工後の表面洗浄法によるレーザ耐力の差が明瞭になった。高輝度遠紫外レーザは次世代のリソグラフィ、光化学反応による物質のプロセンシングおよびレーザ核融合の分野での応用が期待されているが、その波長域で光を透過する材料が限定されること、その材料を高精度に加工する技術が確立されていないこと並びにレーザ照射による光学素子の損傷が問題となっている。本研究は、遠紫外の高出力レーザに使用できる高精度、高透過率、高レーザ耐力、高信頼性を有する平面光学素子を提供することを目的にする。そのため、上記機能を有する材料の選定、表面を創成する技術の開発、その表面の原子的構造評価、機能としての光学素子の透過率・波面歪み・レーザ耐力の測定を行うものである。本年度は、中部大学に現有の各種超精密加工装置を使用して、フッ化物結晶CaF_2を超精密ダイヤモンド切削、超精密平面研削、フロート・ポリシングを利用した超精密研磨を行う予定であったが、2台の超精密加工装置が研究途中に故障したため、その修理と改造を行った。具体的には、超精密非球面加工装置のレーザー測長システムをZYGO社のZMI-1000に、角度計測システムをハイデンハイン社の高精度ロータリーエンコーダに、制御盤を豊田工機製AHN10-Cに代えた。これにより、超精密非球面加工装置の位置決め分解能は1nmとなった。超精密平面研削盤については、関東精機製の液温自動調整機オイルマチックを購入し、油圧オイルを高精度に制御できるようにした。超精密研磨については、予備実験でλ/3の平面度を得た。超精密加工表面の原子構造解析をするため、新たに精密イオン研磨装置を購入した。

CaF_2研磨面を切断後、その断面試料を精密イオン研磨装置で超薄片化し、超高圧透過電子顕微鏡観察を試み、原子像が観察できるようになった。高輝度遠紫外レーザは次世代のリソグラフィ、光化学反応による物質のプロセシングおよびレーザ核融合の分野での応用が期待されているが、その波長域で光を透過する材料が限定されること、その材料を高精度に加工する技術が確立されていないこと並びにレーザ照射による光学素子の損傷が問題となっている。本研究は、遠紫外の高出力レーザに使用できる高精度、高透過率、高レーザ耐力、高信頼性を有する平面光学素子を提供することを目的にする。そのため、上記機能を有する材料の選定、表面を創成する技術の開発、その表面の原子的構造評価、機能としての光学素子の透過率・波面歪み・レーザ耐力の測定を行う。本年度は、高輝度遠紫外レーザ用光学材料として最も脚光を浴びているCaF_2単結晶をフロート・ポリシングによりレーザグレードの滑らかな面を得るための加工条件の最適化を行った。その結果、表面粗さ0.162nm rms、0.131nm Ra、1.10nm Ryの面を得た。また、各種CaF_2単結晶にNd:YAGレーザの第4高調波(波長:266nm)を照射することにより、材料内部のレーザ損傷のしきい値、すなわちレーザ耐力を測定すると共に、研磨面のレーザ耐力を測定した。その結果、米国製結晶の母材のレーザ耐力6.32J/cm^2に対し、加工表面でのレーザ耐力5.40J/cm^2が得られ、国産結晶の母材のレーザ耐力6.73J/cm^2に対し、加工表面でのレーザ耐力5.33J/cm^2が得られ、母材に比べ表面のレーザ耐力がそれぞれ85.4%、79.2%と低いことが確認できた。また、超高圧電子顕微鏡による加工面の原子構造解析を行った結果、測定中にチャージアップが生じ、高分解能での原子像の観察はしばしば困難となるが、その問題を解決できる目途が立った。高輝度遠紫外レーザは次世代のリソグラフィー、光化学反応による物質のプロセッシングおよびレーザ核融合の分野での応用が期待されているが、その波長域で光を透過する材料が限定されること、その材料を高精度に加工する技術が確立していないこと並びにレーザ照射による光学素子の損傷が問題となっている。本研究は、遠紫外の高輝度レーザに使用できる高精度・高透過率・高レーザ耐力・高信頼性を有する平面光学素子を提供することを目的とする。本年度の研究実績は以下のようである。1.遠紫外並びに真空紫外域での光学結晶である高純度CaF_2をフロート・ポリシングした結果、最も滑らかな面として表面粗さ0.16nm rmsが得られたが、それ以上に滑らかな面は得られていない。この面を超高圧透過型電子顕微鏡で断面観察した結果、結晶面は(111)面から少し傾き、そのため原子単位で滑らかな(111)面の所々で段差ができ、それが表面粗さに反映していることが明らかとなった。したがって、表面粗さを0.1nm rms以下にするには結晶の正確な面出しが最も重要であることが判明した。2.非線形光学結晶KDPとCLBOを用いてNd : YAGレーザを波長変換して波長266nmの遠紫外レーザを発生させ、これをCaF_2結晶内部に集光させて内部レーザ耐力を測定した結果、結晶材料間での性能は2倍異なることが明らかとなった。同じ個所に繰り返しレーザを照射した場合のレーザ耐力は単発のものに比べその値が1/2になる。3.上記遠紫外レーザを超精密研磨したCaF_2表面に集光して表面でのレーザ耐力を測定した結果、表面粗さおよび加工変質層によるレーザ耐力の劣化だけでなく、加工後の表面洗浄法によるレーザ耐力の差が明瞭になった。
人間の行動状況理解のための時空間の非線形圧縮による映像の情報要約機構

本計画研究の目標は、講義を様々な観点から蓄積してアーカイブ化するシステムを構築することと、利用者自身がアーカイブの中から必要な部分を選択し、要約する枠組みを提案することである。様々な利用者の目的に応じることを可能とするために、講義アーカイブにはできるだけ多様な映像を記録しておくことが望ましい。そこで、受講者の動きを反映した活性度に基づく撮影と、話者位置を推定することによって、質問等をしている受講者の撮影を実現した。まず、受講者の活性度に応じた多様な映像を撮影するために、確率密度関数に基くカメラワークの決定手法を提案した。できるだけ多くの受講者を映像フレーム内に納めるため、位置的に近くに存在する受講者群を被写体の侯補とし、多数の被写体侯補に対して、受講者の動きに基づく活性度を割り当てた。そして、被写体候補を活性度に基いて順序付けたのち、撮影に利用できるカメラ台数に応じて等分し、それぞれのグループ内に含まれる被写体侯補を選択して撮影する確率を高めた確率密度関数を各カメラに対して割り当てることにより、ある時刻における受講者を、活性度に基き多様に撮影する手法を提案した。また、質問等をしている受講者の表情を撮影するために、講義室に複数設置した分散マイクシステムを用いた話者位置推定を実現した。二本のマイクからなるマイク対に到達する音の位相差を利用して音源方向を推定し、これを複数のマイク対に対して求めることによって、各音源方向の交点付近の領域に存在する話者位置を推定することが可能となった。さらに、利用者自身が視聴したい講義映像の被写体の数や撮影サイズなどの傾向を設定することにより、上記の手法によって撮影した複数の講義映像から、設定を満たすように自動選択して提示する枠組みについて検討した。人間の行動状況を映像で観測し、観測した映像を非線形圧縮(意味的情報を用いた圧縮)するための手法を、講義室を対象とした場面とスタジオでの映像生成を対象とした場面で検討をすすめた。講義室で行われる講義を複数のカメラで観測すると、複数本の映像が得られる。これらの映像を時空間において如何に圧縮してゆくかが本質的な問題である。このときに利用できる意味的制約として教材を利用する。教材は、講義のストーリを表現しているが、実際の講義は、必ずしも教材に沿って行われるとは限らない。そこで、講義中に観測される動的状況を併用する。講義映像を圧縮してゆくために、講義映像のアーカイブ化システムを構築するという目標を設定した。実現すべき講義のアーカイブは、教材を中心に複数台のカメラからの映像を選択して貼り付けたものであり、これにより同じ教材を利用しても講師ごとに異なったアーカイブが生成される。スタジオを対象とした情報圧縮では、シナリオに基づいて演技される役者の動作を自動カメラで撮影することを目標とする。撮影カメラの制御プランはシナリオをもとに予め作成できるが、実際の演技はシナリオどおりには行われない。この差異をどのようにして動的に解消してゆくかという問題を設定し、シナリオを制約とした映像の非線形圧縮を考えていく。始まって半年であるので、明確な研究成果はまだ出ていないが、研究の方向は決まっており、来年度以降さまざまな成果が期待できる。人間の行動状況を観測した映像を、ユーザの要求に応じて要約する枠組みについて、講義室における教材制約とスタジオにおけるシナリオ制約を利用するための枠組みに関する研究を行った。講義室を対象とした教材制約による研究においては、ユーザの要求が多様であることを考慮すれば、映像取得時にできるだけ多様な映像を取得しなければならない。そのために、空間的多様性と時間的多様性をいう概念を提案した。空間的多様性はさまざまな位置から同じ3次元空間を撮影するという概念であり、複数台のカメラを独立して制御する。時間的多様性は同じ時間にいろいろなものを撮影するという概念であり、やはり複数台のカメラを制御する。これらの概念に基づいて映像を取得するためのシステムを構築し実験を行った結果、さまざまな映像が取得できること、および、ユーザの要求に応じた要約を作成できる可能性があることが確認できた。スタジオにおけるシナリオに基づく撮影に関しては、予定した動きと実際の動きが異なる場合にカメラワークを補正する方法について研究を行った。この結果、シナリオ通りに役者が演じている場合は、実演と予め定めたカメラワークが多少ずれていても自動補正処理によりうまく撮影できることが確認できた。研究会での議論を通して、映像の非線形要約という言葉がよくないことが指摘された。我々が目指しているのは、ユーザに応じたデータの提示であり、要約もその中に含まれてはいるもののそれが重要な概念ではない。今後、何らかの言葉を考えてここでの重要な考え方をアピールしていく必要がある。

そして、被写体候補を活性度に基いて順序付けたのち、撮影に利用できるカメラ台数に応じて等分し、それぞれのグループ内に含まれる被写体侯補を選択して撮影する確率を高めた確率密度関数を各カメラに対して割り当てることにより、ある時刻における受講者を、活性度に基き多様に撮影する手法を提案した。また、質問等をしている受講者の表情を撮影するために、講義室に複数設置した分散マイクシステムを用いた話者位置推定を実現した。二本のマイクからなるマイク対に到達する音の位相差を利用して音源方向を推定し、これを複数のマイク対に対して求めることによって、各音源方向の交点付近の領域に存在する話者位置を推定することが可能となった。さらに、利用者自身が視聴したい講義映像の被写体の数や撮影サイズなどの傾向を設定することにより、上記の手法によって撮影した複数の講義映像から、設定を満たすように自動選択して提示する枠組みについて検討した。
ソフトフード摂取により誘導される唾液腺萎縮のメカニズムの解明

現代社会で好まれるソフトフードが唾液腺にどのような影響を及ぼすのかについて実験的に検討した。ラットに液状食を一定期間与えた後、各種唾液腺を顕微鏡にて観察した。その結果、肉眼的に縮小した耳下腺(唾液腺の1つ)では細胞の縮小、細胞死、細胞の更新速度の低下が認められた。一方、他の顎下腺や舌下腺では萎縮性変化は観察されなかった。以上より、唾液腺にはソフトフードによって萎縮するものとそうでないものがあることが明らかとなった。本研究はソフトフード過剰摂取により惹起される唾液腺の萎縮がどのようなメカニズムによるものかを解明しようとするものである。本年度ではラットに液状飼料を321日間投与する動物実験と今後の検索に用いる試料作りを中心に行った。実験は比較的順調に進行し、各種試料の作製もほぼ終了したが、凍結ブロックと凍結試料については保管していたディープフリーザーの不慮の故障により、損傷を被ったため、この部分に関しては次年度に再度試料の作製が必要となった。今年度までに得られた実験結果は以下の通りである。液状飼料を与えられたラット(実験群)と通常の固形飼料で飼育されたラット(対照群)では体重における差異は認められなかった。三大唾液腺の各湿重量を測定してみると、顎下腺と舌下腺では両群に有意差はみられなかったが、耳下腺については実験群のほうが有意に縮小していた。パラフィン切片に対してHE、PAS,アルシアンブルー染色した標本を光顕的に検索してみると、顎下腺や舌下腺では実験群と対照群の間には差異はほとんどみられなかった。一方、実験群の耳下腺では、線条部や介在部などの導管系にはほとんど差異が認められなかったが、腺房細胞に関しては、その大きさが縮小していることが確認された。特に細胞質の縮小が顕著であり、細胞内に占める核の面積比が増大していた。このような所見は耳下腺の萎縮の一因として重要であり、意義ある結果と考えられる。また、腺房細胞の一部には核が凝集し、ヘマトキシリンに濃染する小顆粒状を呈している像も観察された。このような構造が何なのかについては次年度にさらに検索を進めていく予定である。本年度は、昨年度作製された試料に対して主に細胞増殖活性に関する検討を行った。また、昨年度、ディープフリーザーの不慮の故障により損傷を被った凍結試料および凍結ブロックの作製のための追加動物実験も行った。今年度に得られた実験結果は以下の通りである。液状飼料を与えられたラット(実験群)の耳下腺は固形飼料を与えられたラット(対照群)の耳下腺よりも肉眼的に縮小し、湿重量も小さかった。萎縮した耳下腺を組織学的に観察すると、導管系の変化はほとんど認められなかったが、萎縮している腺房細胞が多数みられた。抗BrdUモノクローナル抗体を用いて免疫組織化学的に細胞増殖活性を検索してみると、実験群の耳下腺では液状飼料投与3日目からBrdU陽性を示す腺房細胞が対照群に比べて有意に減少していた。これに対して、導管細胞におけるBrdU標識率は実験群と対照群の間では有意差が認められなかった。一方、顎下腺や舌下腺では肉眼的大きさや湿重量が実験群と対照群との間では差異がなく、組織学的にも導管、腺房ともに両群における差異は認められなかった。抗BrdU抗体を用いて細胞増殖活性を検索してみると、顎下腺、舌下腺いずれにおいても両群間の導管細胞および腺房細胞に増殖活性に差異はみられなかった。以上のような所見は耳下腺の萎縮の原因は腺房細胞の大きさの縮小だけでなく、腺房細胞増殖活性の低下による細胞数減少も関係していることを示唆していると考えられた。次年度では、細胞増殖と密接に関係して細胞数の調整を行っている細胞死(アポトーシス)の動態について検討を加える予定である。本研究はソフトフード過剩摂取により惹起される唾液腺の萎縮がどのようなメカニズムによるものかを解明しようとするものである。本年度は、昨年度までに作製された試料に対して主にアポトーシスに関する検討を行った。また、データ解析中にサンプルの多少のばらつきが認められたため、追加の動物実験および試料作製も行った。液状飼料投与されたラットの耳下腺は肉眼的に萎縮していた。光学顕微鏡的には縮小した腺房細胞にアポトーシス小体様の構造が認められた。さらに、アポトーシスのマーカーである抗cleaved caspase-3抗体によって免疫染色したところ、陽性を示す腺房細胞が多く認められた。対照群(固形飼料投与群)と比較してみたところ、投与後314日目において抗cleaved caspase-3抗体陽性細胞が有意に多かった。

しかし、21日目においては有意差は認められなかった。透過型電子顕微鏡にて観察してみると、対照群ではすべての耳下腺において腺房細胞は正常であり、アポトーシスを示すような像は認められなかった。一方、液状飼料投与群では、核膜辺縁にクロマチンが凝集したアポトーシスの初期段階を示す腺房細胞や電子密度の高い顆粒状となったアポトーシス小体がいくつも観察された。このような所見は、耳下腺の萎縮には腺房細胞の収縮や増殖活性の低下(昨年度の実験結果による)だけでなく、アポトーシスによる腺房細胞数の減少も関係しているということを示唆していると考えられた。次年度では、こうしたアポトーシスがどのような分子メカニズムによっているのかをIn Situ Hybridization法とRT-PCR法を用いて網羅的に解析する予定である。本研究はソフトフード摂取により唾液腺がどのような反応を示すのかを解明しようとするものである。昨年度まで検討していた耳下腺は液状飼料投与により萎縮し、これは腺房細胞の収縮、増殖活性の低下、アポトーシスの亢進によって惹起されていることが明らかとなった。本年度は、耳下腺にみられるような事象が他の唾液腺でも起こるのかについて検討した。大唾液腺である顎下腺と舌下腺では、湿重量は液状飼料投与群(実験群)と固形飼料投与群(対照群)の間おいて有意差は認められなかった。また、実験群の腺房細胞の大きさに変化は認められず、分泌顆粒は組織化学的に対照群と同様の所見を示していた。電顕的にも実験群の顎下腺および舌下腺腺房細胞は正常と変わらず、ネクローシスやアポトーシス像は認められなかった。腺房細胞の増殖活性とアポトーシスの発生状況を検索するためにBrdU免疫染色と活性化Caspase-3免疫染色を実施した。その結果、顎下腺、舌下腺ともこれらの発生状況は実験群と対照群の間に有意差が認められなかった。さらに小唾液腺の1つである口蓋腺についても検討した。口蓋腺は湿重量を測定するのが困難であるため、連続切片より長径、幅径、高径を計測した。その結果、いずれの長さも実験群と対照群の間に有意差は無かった。また、組織化学的検索や細胞増殖活性およびアポトーシスの発生状況についても同様の検索を実施したが、両群に差異は認められなかった。以上の結果より、唾液腺の中にはソフトフード摂取により萎縮性変化を示すものと示さないものがあることが明らかとなった。また、本年度は耳下腺萎縮の分子メカニズム解明のため、アポトーシス関連遺伝子産物の免疫染色の後、In situ hybridizationやRT-PCRを行う予定であった。しかし、免疫染色がうまくゆかず、現在実験継続中のため残念ながら研究期間内にデータを得ることはできなかった。これまでの研究により、萎縮耳下腺の形態学的変化、細胞増殖活性の変化、アポトーシスの発生状況が解明されている。当初の研究目的において残っているテーマは、これらの分子メカニズムの解明のみとなっていることから、おおむね順調に進展していると判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究実績の概要に記載したように、次年度では、萎縮耳下腺におけるアポトーシスがどのような分子メカニズムによっているのかをIn Situ Hybridization法とRT-PCR法によって明らかにする。また、次年度は本研究課題の最終年度にあたっており、実験の遂行だけでなく、学会発表や論文発表を積極的に行っていく予定である。
アミノ多糖の生体活性効果の解明

1)キチン質製材の開発:水溶性キチンの作製を実施した。キチンは生体親和性が高いが、水には不溶であり、その溶媒は強酸である蟻酸しか報告されていない。この不溶性のキチンをカルボキシメチル化、硫酸化、リン酸化して水溶性のキチンを作製した(重政、斎本、指輪)。2)水溶性キチンの獣医臨床への応用:これらの水溶性キチンをキトサンによる肺炎のブロッカーとして応用した.マウスの腹腔内にキトサンを投与し、同時に水溶性キチンを静脈内に投与したところ、これらの水溶性キチンはすべてキトサン肺炎を程度の差はあるがブロックした。しかしその効果はリン酸キチンで最も強く認められた(南、岡本)。リン酸キチンを低分子化したところ、肺炎の抑制効果は低下した。3)水溶性キチンの肺炎ブロック機構の解明:キトサンは多形核白血球の遊走因子であり、かつ多形核白血球の化学発光能を刺激し、またこの反応は補体副経路の活性を介したC5aがトリッガーとなることを明らかにしている(南、岡本)。したがってこれに基づく肺炎をブロックするには補体活性機能をブロックするか、多形核白血球の遊走をブロックする必要がある。これを解明する目的でキトサンによる補体の活性のこれらの物質による抑制効果を一元放射免疫拡散法で検討したが、いづれもその効果は見られなかった。したがって肺炎ブロックのメカニズムは多形核白血球の遊走をブロックすることによると考えられた。1)キチン質製材の開発:キチンに関してはイカ甲より抽出したβ-キチンを懸濁させ、凍結乾燥によってスポンジ状物を作製した。また、キチンドープをポリエステル不織布に含浸させ、キチン・ポリエステル不織布複合体を作製した。キトサンに関してはカニ殻より抽出したα-キチンを濃アルカリ液で処理し、脱アセチル化度82%のキトサンに変化させ、さらに酢酸溶液中に溶解後、凝固槽で紡糸し、その糸をミキサ-処理によって綿状物を作製した(重政、斎本、指輪)。2)キチン質製材の獣医臨床への応用:スポンジ状物は組織埋植あるいは被覆材として、キチン・ポリエステル不織布複合体は人工皮下組織、人工靱帯、人工横隔膜、人工関節嚢として、綿状物は組織埋植あるいは被覆材として牛、馬、犬および猫に応用した。その効能は肉芽組織の形成促進を主体とする創傷治癒促進効果、ヘルニア、突球、関節炎などの治療手技の簡便化が可能となり、創傷治療剤としてのキチンおよびキトサンの応用意義を明らかにした(南、岡本)。3)創傷治癒促進効果の機構解明:キチンによって誘引される滲出液にFGF因子、IL-1およびPGE_2が存在することを証明した(田中、谷川)。また、キチンおよびキトサンは多形核白血球の遊走因子であり、かつ多形核白血球の化学発光能を刺激することを明らかにした(南、岡本)。また、この反応は補体副経路の活性を介したC5aがトリッガ-となることを明らかにした(南、岡本)。1.キチン質製材の開発:水溶性キチンの作製を実施した。2.水溶性キチンの獣医臨床への応用:これらの水溶性キチンをキトサンによる肺炎のブロッカーとして応用した。これらの水溶性キチンはすべてキトサン肺炎を程度の差はあるがブロックした。

3.水溶性キチンの肺炎ブロック機構の解明:キトサンは多形核白血球の遊走因子であり、かつ多形核白血球の化学発光能を刺激し、またこの反応は補体副経路の活性を介したC5aがトリッガ-となることを明らかにしている(南、岡本)。したがってこれに基づく肺炎をブロックするには補体活性機能をブロックするか、多形核白血球の遊走をブロックする必要がある。これを解明する目的でキトサンによる補体の活性のこれらの物質による抑制効果を一元放射免疫拡散法で検討したが、いづれもその効果は見られなかった。したがって肺炎ブロックのメカニズムは多形核白血球の遊走をブロックすることによると考えられた。1)キチン質製材の開発:水溶性キチンの作製を実施した。キチンは生体親和性が高いが、水には不溶であり、その溶媒は強酸である蟻酸しか報告されていない。この不溶性のキチンをカルボキシメチル化、硫酸化、リン酸化して水溶性のキチンを作製した(重政、斎本、指輪)。2)水溶性キチンの獣医臨床への応用:これらの水溶性キチンをキトサンによる肺炎のブロッカーとして応用した。マウスの腹腔内にキトサンを投与し、同時に水溶性キチンを静脈内に投与したところ、これらの水溶性キチンはすべてキトサン肺炎を程度の差はあるがブロックした。しかしその効果はリン酸キチンで最も強く認められた(南、岡本)。リン酸キチンを低分子化したところ、肺炎の抑制効果は低下した。3)水溶性キチンの肺炎ブロック機構の解明:キトサンは多形核白血球の遊走因子であり、かつ多形核白血球の化学発光能を刺激し、またこの反応は補体副経路の活性を介したC5aがトリッガーとなることを明らかにしている(南、岡本)。
住宅抵当貸付市場の効率性-日本、米国、英国、オーストラリア、インド、タイ各国の比較分析-

本研究は、先進国および発展途上国の6力国における住宅抵当貸付金融システムの比較分析を行ったものである。特に日本およびインドにおいては、まさに住宅金融システムの改革を経験しているところであり、その意味でも本研究の与える政策示唆は意義深い。いずれの国においても、人々は住宅の購入に対し強い希望を追い続けている。しかし、現金で一括支払いできる十分な資金を持ち合わせておらず、住宅融資に頼らざるを得ないのが現実である。そこで、借入による資金調達は、住宅の一括支払いに対する代替策として全世界において発展してきた。いかなる国の金融政策担当者も自己所有の住宅購入に対して、より効率的に融資可能な制度を生み出そうと模索している。賃貸や持ち家といった住宅形態、リスク配分、そして経済的かつ制度的な背景が、異なる国々での抵当貸付に見られる重要な策定の相違に関係している。本研究は特に日本、米国、英国、オーストラリアの4先進国、ならびにインド、タイの2途上国に焦点を当て、住宅金融政策の比較分析を行った。分析を通じ、各国で見られる抵当貸付システムが、その他の国においても適用可能であることが明らかとなった。本研究の1年目は、研究提案書の詳細にあるように、分析に必要なほとんどの文献と統計を収集した。統計は、日本、英国、米国、インド、タイの住宅金融システムに関わるものである。オーストラリアに関しては、2年目に統計を収集する予定である。住宅金融システムの仲介効率性の研究にはリスク分析を含む必要があり、本研究では特にこの点を重要視するものである。これまでは日本とインドの統計の詳細について分析を行い、その中の研究成果のいくつかは、アリカンテ(スペイン)で開催されたヨーロッパ不動産学会、東京でのアジア不動産学会、京都での日本地域学会、バンガロール(インド)でのアジアリスク保険学会において報告を行った。研究結果に関しては、東京やムンバイにおける住宅金融期間の専門家と議論を行い、その中で住宅金融機関に関わるいくつかの重要な政策課題が明らかになった。さらに、これまでの研究結果に基づき4本の論文を作成し、それぞれは現在学術雑誌において投稿審査されているところである。本研究の2年目については、これまでに導かれた研究結果を用いて、住宅金融の効率性についてより具体的な分析を進め、仲介効率性の比較分析を行う予定である。本研究の2年目は、オーストラリアにおける住宅金融システムに関する統計を収集した後、1年目に収集した日本、英国、米国、インド、タイ各国の統計と合わせて、住宅抵当貸付市場の効率性に関する各国の比較分析を行った。特に分析対象国のそれぞれについて抵当市場におけるリスク分析を行い、住宅抵当貸付金融システム全体について制度・政策の具体的な評価を行った。評価を通じて、各国で見られる抵当貸付システムが、その他の国においても適用可能であることが明らかとなった。研究成果の一部については、ウィーン(オーストリア)で開催されたEuropean Network of Housing Researcherにおいて報告し、学会の中で不動産・住宅分析を専門とする学者や住宅金融機関の専門家らと議論を行った。最後に、1年目に行った日本における住宅投資に関わる金融・財政政策の評価、東京における住宅需要分析、ならびにインドにおける抵当貸付市場分析に、本年度の各国比較分析と研究期間を通じたそれぞれの分析の総括を行い、研究成果報告書としてまとめた。
抗原特異的細胞障害性T細胞の活性化による微生物に対する感染防御の検討

現在更に我々は、最も免疫原性の高いDNAワクチンの開発を行っている。まず、DNAワクチンの遺伝子発現プロモーターをいくつか変えて、最も免疫原性の高いワクチンの開発と同ワクチンの接種ルートによる、免疫応答に質的変化が生じるのかどうかの検討を行っている。次に、新しく作製したIL-12,IL-2,GM-CSF等の発現プラスミドをアジュバントとしての混合割合等を小動物レベルで検討している。アジュバントの開発としてはウベニメックス,リポソーム等が免疫原性を高めることが判明した。HIV-1のA型、B型、C型、E型、マクロファージトロピック型(BAL型)等の、gag,pol,envのDNAワクチン候補を次々に作製してその免疫原性等も詳細に検討して、現在臨床試験に向けて検討している。更に、免疫原性が高いものとして、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus,AAV),欠損アデノウイルス(deficient adeno virus),ワクチニアウイルス等のウイルスベクターワクチンを作製し、免疫したところ、強いEnv特異的免疫活性化能が認められた。現在、これらウイルスのベクターをして使用した新しい型を作製中である。緑膿菌については我々はべん毛抗原をコードしている遺伝子を用いてワクチンとしてマウスに免疫し、防御効果を検討したが、あまり強い防御効果がなかった。今回の検討により、DNAワクチンとウイルスベクターワクチン等の組み合わせが、有効性の高いエイズワクチンとして有効であると考えている。DNAワクチンの接種ルートの検討では、経鼻投与,筋肉内投与,更には各種アジュバント物質との組み合わせで、Th1あるいはTh2の免疫応答を選択的に増強させることもある程度可能になった。我々はこれらの研究に全力をつくし、将来的にはHIV-1のnef,tat,rev,env,gag,pol等の遺伝子を変異させ、安全性に全く問題の無いウイルスを作製する。この弱毒生ワクチンがHIV-1の最良のワクチンとなる可能性が高いと思える。勿論、DNAワクチンは現在のDNAワクチンのプロモーター等でも肝炎、インフルエンザ、狂犬病、癌等の幾つかのワクチンとして極めて有力なものとなると考えられる。DNAワクチンが更に有効性の高いものとなるため、新しい、プロモーターの開発、蛋白発現の上昇、DNAの分解阻止、アジュバント等の改良が必要と思われ、研究を続けている。今回の実験をもとにして、次に大型動物を使用した有効性の検討を行う。更に、緑膿菌については今までべん毛のみのDNAワクチンであったが更に、線毛やいくつかの菌体抗原遺伝子を使用して、このワクチンの緑膿菌感染予防効果を検討する。今回の補助金により、細胞内寄生性微生物(特にHIV)のDNAワクチンの効果について、検討を行った。今までに作製されているDNAワクチンは他のウイルス等、例えば我々の実験ではインフルエンザウイルスについてはM抗原を発現するDNAワクチンを作製する事により、感染防御効果が認められた。しかし、HIV-1については今の所チンパンジー、アカゲザル等を使用した系では、DNAワクチンでは抗体の産生があまり強くないため、我々のデータを含めて目覚しい防御効果が低いように思われる。

今回のマウスを使用した検討では、DNAワクチンはCTLを主とするTh1細胞の活性化を起こし、その活性化をIL-I2、IFN-γ、IL-I2等の発現プラスミドと共に免疫することにより強く発現されることが判明した。しかし、MuLV/HIV-1キメラウイルスを使用した実験では1)GP160、Tat、Nef等の蛋白を3度免疫したグループは、これらの抗原に対する抗体価は非常に高かったが、キメラウイルスの注入により感染抵抗が獲得できなかった。2)次に、env、tat、nefのDNAワクチンを免疫したグループは、同様のキメラウイルスの注入に対して完全に感染抵抗性が獲得されており、抗体価はあまり高くないが、細胞障害性T細胞活性(CTL)が高かった。3)一方、これらDNAワクチンとIL-2の発現系プラスミドを同時に免疫したグループは、CTL活性が極めて高いにもかかわらず抗体価はほとんど検出されなかった。しかしながらこの群はキメラウイルスのchallengeに部分的にしか感染防御能は獲得し得なかった。以上の結果、我々は現在のHIV-1ワクチンの有効性を得るためにはHIV-1に対する中和抗体と、CTLを主とするTh1タイプの反応性の両方に免疫原性のあるワクチンは最も有効であると思っている。HIV、リステリア等の細胞内寄生体に対する感染防御に最も重要な免疫反応は、Th1を主体とした細胞性免疫反応であるが、粘膜表面上の分泌型IgAの誘導もまた重要であることが明らかになりつつある。今回の研究は、その双方の免疫応答を惹起することが可能かどうかを検討することであった。その応用への一つのモデルとして、我々の有するHIV,緑膿菌,インフルエンザウイルスワクチンの系を利用し、IL-12,IFN-γやB7プラスミドをワクチンと共に注入することにより、Th1タイプ反応を主体とするこれらの病原体に対する特異的免疫反応を、さらに増強できることが判明した。次に、インフルエンザM及び、NP抗原のDNAワクチンを注入した後に、各々免疫したマウスに緑膿菌又は、インフルエンザウイルスを注入し感染させる、いわゆる、チャレンジ実験を実施したところ、いずれの場合も完全ではないが非免疫グループに対し、有為な差で感染防御が増加することが判明した。今回の実験の結果、これらの方法により病原体に対する有効な防御能が得られることが判明したが、次の段階として安全性、更に大型動物による有効性等の検討が必要と思われる。
工業晶析装置内の混相流と溶液状態に着目した現象モデルの開発

(i)粒子のラグランジアン解析を組み込んだ数値流動解析にもとづいて、撹拌羽根への粒子の衝突位置、衝突速度を定量化し、羽根の表と裏での衝突現象の違いを明らかにした。(ii)貧溶媒中で結晶粒子の衝突により生成される摩耗微結晶の粒径分布と個数を計測する手法を構築した。摩耗微結晶はおもに母結晶の角から生成され、摩耗微結晶の生成速度は母結晶の摩滅比率と相関することを明らかにした。(iii)結晶粒子の凝集現象の経時的な変化を、画像解析する手法を構築した。カリミョウバンをモデルケースとして、「一次粒子」、「二次粒子(凝集粒子)」、および「二次粒子を構成する一次粒子」を区別して定量化することが可能となった。本研究では、化学・製薬・食品工業での代表的な反応・分離操作の一つである晶析操作について、結晶製品の高度な品質予測・制御方法の構築、ならびに生産性の向上を目指して、数値流動解析およびモデル実験を行った。得られた知見は以下の通りである。1.晶析操作における核発生の主要な因子と考えられる、結晶粒子と撹拌羽根の衝突現象に関連して、撹拌羽根の設置高さhが異なる条件(液深Hの1/2と1/10)について羽根への粒子衝突現象をCFD(Computational Fluid Dynamics)により定量化するとともに、羽根まわりの液流速との関連性について検討した。その結果、羽根前面での衝突についてはhの影響は少ないことがわかった。一方、背面での衝突では、h=H/10の場合、粒子の衝突位置は上下方向に2つに分割され、おもに羽根の下部に集中するのに対して、h=H/2の場合は羽根背面全域に広がることを明らかにした。2.上記のCFDの結果について実験的に検証するために、撹拌槽内で回転する撹拌羽根近傍での粒子の挙動を観察するために、高速度カメラを撹拌翼の回転と同期して回転させ、粒子の挙動をビデオ撮影するシステムを開発した。あわせて、撮影された動画をもとに粒子の軌跡、ならびに羽根への衝突速度を算出するための画像解析プログラムを作成した。3.固液撹拌においてしばしば問題となる粒子衝突による羽根のエロージョン問題に着目した。羽根面に対して法線方向の衝突エネルギーの累積量にもとづいて、羽根面塗膜のエロージョン量の経時変化を予測できることを明らかにした。4.カリミョウバンの種晶添加冷却晶析をモデルケースとして、溶液の過飽和度の経時変化を考慮したPopulation BalanceとMass Balanceの連成解析手法を構築した。本研究では、工業的に汎用される晶析操作について、結晶製品の高度な品質予測・制御方法の構築を目指して、数値解析およびモデル実験を行った。平成26年度に得られた知見は以下の通りである。1.粒子径および粒子密度を変えた場合の撹拌羽根に対する粒子の軌跡、衝突位置および衝突頻度を算出した。粒子は羽根前面の縁付近に集中して衝突し、流体への追随性が鈍くなると粒子は羽根へ衝突しやすくなる。羽根近傍の粒子濃度で規格化した衝突頻度はストークス数で整理できることがわかった。2.撹拌羽根近傍の粒子の運動を観察することのできる回転同期・高速動画撮影システムを構築した。同システムにより約0.5 m/sの高速で回転する撹拌羽根近傍の粒径1 mm程度の粒子を数フレームにわたって観察することができた。撹拌羽根への粒子の衝突現象を自作の画像処理プログラムで定量化し、その定量化した実験結果とCFDの結果を比較したところ、定量的に良好に一致したことから、CFDの信頼性を確認することができた。3.カリ明礬の冷却晶析をモデルケースとしたPopulation Balance解析において、大きな温度変化を伴う条件への対応について検討した。その結果、結晶成長モデルにおける表面集積速度係数にアレニウス型の温度依存性を組み込むことで、大きな温度変化を伴う条件においても、過飽和度の経時変化およびD10, D50の経時変化を良好に再現できることがわかった。4.結晶が撹拌羽根に衝突する際の母結晶および微結晶のSEM撮影とその画像処理にもとづいて、摩耗現象を定量化する手法を構築した。摩耗微結晶個数および摩滅体積は、経時的に増加し、徐々に一定値に近づくことがわかった。母結晶において摩滅現象は結晶の角で起こることが確認され、撹拌時間とともに角は丸みを帯びていき、微結晶の生成速度は小さくなる。その程度は撹拌速度によらず、摩滅比率で相関されることがわかった。平成27年度に得られた知見は以下の通りである。(a)撹拌羽根近傍の固体粒子の運動を観察することのできる回転同期・高速動画撮影システムを構築した。撹拌羽根への粒子の衝突現象を自作の画像処理プログラムで定量化し、羽根前面および背面に対して、それぞれ法線方向および接線方向の衝突速度の確率密度分布を算出した。定量化した実験結果とLESにもとづいた固体粒子のラグランジアン解析の結果を比較したところ、衝突速度の確率密度分布が再現率6580%で良好に一致することを確認した。(b)カリ明礬の結晶粒子が撹拌羽根に衝突する際に生成される摩耗微結晶と母結晶のSEM画像にもとづいて、摩耗現象を定量化する手法を構築した。生成される摩耗微結晶の個数および母結晶の摩滅体積の割合

r_aは、撹拌時間の進行とともに数時間にわたって経時的に増加し、その後一定値に漸近することがわかった。母結晶の摩滅現象はおもに結晶の角で起こることが確認され、撹拌時間とともに角は丸みを帯びていき、微結晶の生成速度は小さくなる。同翼回転数、同r_aにおいて比較すると、槽径20cmの撹拌槽における微結晶生成速度は、槽径10cmの場合と比較して820倍程度大きくなることがわかった。(c)カリ明礬の冷却晶析をモデルケースとして、結晶の凝集現象を画像解析にもとづき定量化する手法について検討した。同法では、まず吸引サンプリング法により可視化セル内を通過する結晶を、高速度ビデオカメラを用いて撮影した。一次粒子の形状を円形であると仮定して画像内での一次粒子の位置と直径を算出した。全ての一次粒子について粒子の重なりの有無を判定することで、「単独で存在する一次粒子」と「二次粒子を構成する一次粒子」を区別することができ、さらに二次粒子の直径(球体積相当径)とそれを構成する一次粒子の個数の関係についても詳細に定量化することが可能となった。平成27年度までに、(a)撹拌羽根への結晶粒子の衝突現象の定量化と粒子特性の影響についての検討、(b)撹拌羽根への結晶粒子の衝突に伴う微結晶発生量と母結晶の摩滅量の定量化手法の検討、(c)結晶凝集現象の定量化手法の検討、(d)ポピュレーションバランス解析による結晶成長速度の温度依存性に関する検討について、それぞれ取り組んだ。平成27年度は、(a)については、CFDにもとづき粒子径や粒子の比重が異なる場合の影響について整理し、さらに実験的な検証を加えるために、回転する撹拌羽根近傍での粒子の挙動を観察するための回転同期・高速動画撮影システムを開発し粒子衝突の定量化データを取得した。国際会議(ECOM15において2件)ならびに国内会議(化学工学会桐生大会)にて成果を発表した。なお、化学工学会での発表は同会において特別賞を受賞した。(b)については、結晶粒子が撹拌羽根に衝突する際の母結晶形状および微結晶生成量の経時変化をSEM画像の解析処理にもとづいて定量化する手法を構築し、国際会議(BIWIC2015)、ならびに国内会議(日本海水学会若手会第7回学生研究発表会)にて成果を発表した。(c)については、カリミョウバンの種晶添加冷却晶析をモデルケースとして、画像解析による凝集粒子の定量化手法について、2016年度の国内会議(日本海水学会第67年会)での成果発表を予定している。(a)硫酸カリウム結晶を対象に、撹拌操作に起因する摩耗微結晶の生成量、粒径分布、母結晶の摩滅比率r_aの経時変化などの定量化実験を実施し、前年度に検討したカリミョウバン結晶の摩耗実験と同じ撹拌操作条件下で比較した。その結果、摩耗微結晶の生成量につては、カリミョウバンの場合は撹拌開始5時間後までに急激に増加するのに対して、硫酸カリウムでは撹拌開始後30時間にわたって徐々に増加する傾向を示した。母結晶1個あたりの摩耗微結晶の生成速度b_f,p [1/s]は、母結晶の角の丸み具合(摩滅比率r_a)と相関(b_f,p∝αr_a(-β乗)で整理できる)が確認され、硫酸カリウムのb_f,pはカリミョウバンのb_f,pと比較して、r_aのべき数βが小さいことがわかった。(b)カリミョウバンの種晶添加冷却晶析をモデルケースとして、結晶の凝集状態を画像解析にもとづき定量化する手法について検討した。まず、一次粒子の形状を円形であると仮定して、一次粒子の位置と直径を算出した。
宍道湖と中海を繋ぐ大橋川の汽水域生態系における生物群集の長期的変動

島根県大橋川において汽水性二枚貝類のヤマトシジミとホトトギスガイの個体群を調べた。上流(宍道湖側)から下流(中海側)までの定点において毎月サンプリングを行った。大橋川の深部を塩水が遡上し、ホトトギスガイの分布と進入はこの塩水遡上に対応していた。出水時にヤマトシジミは下流側まで分布を拡大した。2005年11月から2013年3月までの大橋川上流地点におけるヤマトシジミの個体群密度は、冬季に小さく夏季に大きい傾向があった。本研究は、汽水域生態系の特徴である塩分の時間的・空間的変化に対してヤマトシジミとホトトギスガイを中心とした生物群集の動態がどのように変化するかを明らかにし、出水や高潮などの現象が生態系へ及ぼす影響を評価する。突発的な短い時間スケールにおける生態系変動と、数年単位の比較的長期の生態系変動の両方を押さえることで、将来に予測される地球規模の気候変動が汽水域生態系に及ぼす影響を示す。大橋川の上流から下流まで流心部に数地点の定点を設け、スミスマッキンタイヤ型採泥器を用いて毎月、各地点の河床の底生動物の採集を行った。0.5mm目合いのサーバネットを用いて船上で底泥を落とし、ポリエチレン袋に入れて実験室に持ち帰った。実験室で2mm目合いと0.5mm目合いのふるいを使用してふるい分けを行った。0.5mmのふるいの残った試料は、後で分析するため10%中性ホルマリンで固定して保存し、2mmのふるいに残った試料について選別を行った。ヤマトシジミ、ホトトギスガイ、その他の無脊椎動物に分けた後、ヤマトシジミとホトトギスガイについて殻長を計測した。毎月の調査時によって異なるパターンで大橋川への塩水の進入が見られた。ヤマトシジミは大橋川の上流側と剣先川で現存量が大きく、ホトトギスガイは大橋川の下流側に多く剣先川では少なかった。2008年度は秋季から大橋川上流の地点でホトトギスガイの小さい個体が多数見られた。塩分の変化の傾向やその他の要因との関連を今後精査する必要があると考えられた。2009年度は6月と7月に比較的大きな出水があり、7月の出水後に臨時調査を行ったが、ホトトギスガイは消滅していなかった。

2008年度から継続している方法と同様に、大橋川の上流から下流まで数地点(流心部と水深2mの場所)、剣先川および宍道湖に定点を設け、スミスマッキンタイヤ型採泥器を用いて毎月底生生物の採集を行った。ヤマトシジミ、ホトトギスガイ、その他の無脊椎動物に選別した後、ヤマトシジミとホトトギスガイについて殻長を計測した。数年間のデータを得た後に、月ごとの殻長頻度分布の変化から小型個体の加入時期など個体群動態の特性を解析する。2010年度は、夏季に記録的な猛暑、冬季に記録的な大雪と気象条件が例年と異なったほか、夏季より秋季にかけて宍道湖でアオコが大発生するなど、これまでの調査期間とは環境条件が異なる年であった。2010年10月2011年1月において宍道湖の表層水の塩分が57psu程度あった。ヤマトシジミとホトトギスガイの現存量が採集時において例年より少ない印象を受けた。このような環境要因と二枚貝個体群の現存量との関係については、年単位でデータを整理して統計解析を行う予定である。日本最大の汽水域である宍道湖・中海水系において汽水性二枚貝類のヤマトシジミとホトトギスガイの個体群を調べた。本調査は2005年11月より継続しており、ここではこれまでに得られたデータを元に報告する。宍道湖と中海を繋ぐ島根県大橋川において、上流(宍道湖側)から下流(中海側)まで定点を設けておよそ毎月の頻度でサンプリングを行った。最も下流側の地点をO-1とし、最も上流側の地点をO-5として、大橋川の流心部の水深が45m程度の場所で船上からスミスマッキンタイヤ型採泥器を1回下ろし、採取された堆積物を0.5mmのサーバネットに入れて水中で細かい泥を落とした残渣をポリエチレン袋に入れて持ち帰った。実験室で0.5mmと2mmのふるいを用いて2mmふるいの上に残ったものからヤマトシジミとホトトギスガイを選別した。2mmふるいを抜けて0.5mmふるいに残ったものは10%中性ホルマリンで固定して後日に処理を行うために保存した。選別されたヤマトシジミとホトトギスガイの個体数と総湿重量を測定し、各地点の試料につき約300個体(300個体より少ない場合は全ての個体)の最大長(ここでは殻長と呼ぶ)をノギスを用いて測定した。2005年11月から2013年3月までのO-5におけるヤマトシジミの個体群密度の経時変化を見ると、冬季に密度が小さく、夏季に密度が大きい傾向が見られた。密度の大きい夏季について年による差異を比較すると、2010年は他の年より密度が小さかった。宍道湖のヤマトシジミの資源量の減少が近年、地域の深刻な問題となっているが、大橋川のヤマトシジミの個体群密度は宍道湖のそれより数倍大きく、他の生物種も含めて大橋川は高い生物量を持つ生息場であると言える。ホトトギスガイの個体群密度もまた、同様に年変動が大きく、継続的なサンプリング調査によって2種の個体群の動態を今後も追跡する必要がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。
高等植物に特異的な小胞輸送制御機構の解析

本年度は,昨年度に引き続き植物に特異的なRab/Ypt GTPaseファミリーに属するAra6の機能解析を行った.Ara6は,動物細胞において初期エンドソームの融合を制御することが知られているRab5に最も高い相同性を示す.その一方で,Ara6はこれまでに他の生物より単離されているRab/Ypt GTPaseに全て保存されている,カルボキシル末端のイソプレニル化のコンセンサス配列を持たない等,非常にユニークな構造上の特徴をもつ.GFP融合タンパク質を,シロイヌナズナ培養細胞のプロトプラストに一過的に発現させたところ,この融合タンパク質は細胞質中のドット状のオルガネラに局在した.このオルガネラは,エンドサイトーシスのマーカーであるFM4-64によっても染色されることから,Ara6が局在しているオルガネラはエンドソームであることが明らかとなった.また,Ara6のエンドソームへの局在化には,アミノ末端の脂質修飾,ヌクレオチドの結合,カルボキシル末端のアミノ酸配列が関与していることも明らかにした.続いて,シロイヌナズナゲノムにコードされている動物型のRab5ホモログ(Ara7,Rha1)についても全て単離し,その細胞内局在を解析した.その結果,いずれの分子もエンドソームに局在していることがわかった.このことから,シロイヌナズナにおいては,エンドソームの融合を,植物特異的なRab/Ypt GTPaseであるAra6と2つの動物型Rab5ホモログの合計3つの低分子量GTPaseが協調的に制御していることが示唆された.以上の結果の前半部分は,本年度EMBO Journalに発表した.高等植物における小胞輸送制御機構の多様性と,その制御機構の理解を目的とし,平成12年度では,シロイヌナズナより既に単離していた高等植物に特異的なRab/Ypt GTPaseであるAra6の解析を行った.その結果,Ara6がこれまでに知られていたRab/Ypt GTPaseとは全く異なった脂質修飾,即ちミリストイル化とパルミトイル化を介して膜に結合していること,その発現が植物体,培養細胞双方において恒常的であることを明らかにした.さらに,緑色蛍光タンパク質と融合させたAra6を用いた解析により,Ara6は,細胞外から細胞内への物質の輸送系であるエンドサイトーシス経路を担うオルガネラ,エンドソームに局在していることを突き止めた.Ara6のエンドサイトーシスにおける調節的役割は,活性型のAra6を植物細胞内で発現させた際にエンドソームの融合が促進されるという結果からも支持された.これらのことより,Ara6の機能解析により得られる知見は,植物におけるエンドサイトーシス制御の機構解明の突破口となると期待している.さらに,Ara6のエンドソームへの局在化機構に関しても詳細な解析を行った.その結果,Ara6の正確な局在には,ヌクレオチドの結合,アミノ末端の正確な脂質修飾,カルボキシル末端のアミノ酸配列が,協調的に機能することが必須であることを明らかにした.これらの知見は,これまでに広く知られている一般的なRab/Ypt GTPaseの局在化機構とは異なっており,植物に特異的なものであると考えられる.以上の結果を発表すべく,現在論文投稿の準備を行っている.本年度は,昨年度に引き続き植物に特異的なRab/Ypt GTPaseファミリーに属するAra6の機能解析を行った.Ara6は,動物細胞において初期エンドソームの融合を制御することが知られているRab5に最も高い相同性を示す.その一方で,Ara6はこれまでに他の生物より単離されているRab/Ypt GTPaseに全て保存されている,カルボキシル末端のイソプレニル化のコンセンサス配列を持たない等,非常にユニークな構造上の特徴をもつ.GFP融合タンパク質を,シロイヌナズナ培養細胞のプロトプラストに一過的に発現させたところ,この融合タンパク質は細胞質中のドット状のオルガネラに局在した.このオルガネラは,エンドサイトーシスのマーカーであるFM4-64によっても染色されることから,Ara6が局在しているオルガネラはエンドソームであることが明らかとなった.また,Ara6のエンドソームへの局在化には,アミノ末端の脂質修飾,ヌクレオチドの結合,カルボキシル末端のアミノ酸配列が関与していることも明らかにした.続いて,シロイヌナズナゲノムにコードされている動物型のRab5ホモログ(Ara7,Rha1)についても全て単離し,その細胞内局在を解析した.その結果,いずれの分子もエンドソームに局在していることがわかった.このことから,シロイヌナズナにおいては,エンドソームの融合を,植物特異的なRab/Ypt GTPaseであるAra6と2つの動物型Rab5ホモログの合計3つの低分子量GTPaseが協調的に制御していることが示唆された.以上の結果の前半部分は,本年度EMBO Journalに発表した.