hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経障害性疼痛モデルラットにおける下降性抑制系賦活機構の検討

ラット脊髄神経結紮モデル(Chung model)で、行動学的実験とともに脊髄in vivo patch clamp法を用いたシナプス応答を解析し下行性抑制系の役割を検討した。トラマドールは自発性興奮性シナプス後電流(sEPSC)減少と抑制性シナプス後電流(sIPSC)を増加させたが、頸髄半切断により脊髄下行性抑制経路の離断実験で主要代謝物M1が脊髄よりも上位で作用していることがわかった。ChungモデルでDSP-4により青斑核ノルアドレナリン作動性ニューロンを破壊しても、アロディニアの左右逆転現象はみられず、抑制性ニューロンの興奮が逆に痛みを増強する機序は確認できなかった。本研究の目的は、神経障害性疼痛の病態を模したChungのラット脊髄神経結紮モデルを用いて、行動学的実験とともに脊髄in vivo patch clamp法を用いたシナプス応答を解析し、各種鎮痛薬あるいは交感神経遮断がもたらす効果における下行性抑制系の役割を明らかにすることである。正常ラットでトラマドール5 mg/kgの静注は逃避閾値を有意に上昇させたが、ナロキソン4 μg/kgで前処置すると変化なかった。トラマドール5mg/kgの静注で興奮性シナプス後電流(EPSC)の曲線下面積(charge transfer)は79%に減少し、抑制性シナプス後電流(IPSC)のcharge transferは0.5 mg/kgから15 mg/kgまで用量依存性に増加した。これらの変化はナロキソン4 μg/kgの前処置で抑制された。脊髄に10 μMのトラマドールを還流させてもEPSC, IPSCは変化なかった。Chungモデルを作成し、選択的定量的侵害刺激を再現するために、定量的侵害機械刺激を加えるピンチメーターと定量的侵害熱刺激を加える痛覚計でラットの足底あるいは下腿を刺激し、トラマドールを脊髄くも膜下に投与して検討した。この脊髄in vivo patch clamp studyでは、覚醒下で求めたピンチ刺激、熱刺激による逃避反応閾値より大きい一定の閾上刺激を与えて誘発EPSC、誘発IPSCの変化とトラマドールの影響を検討した。本研究の目的は、神経障害性疼痛の病態を模したChungのラット脊髄神経結紮モデルを用いて、行動学的実験とともに、脊髄in vivo patch clamp法を用いたシナプス応答を解析し、各種鎮痛薬あるいは交感神経遮断がもたらす効果における下行性抑制系の役割を明らかにすることである。昨年度はトラマドール投与により脊髄in vivo patch clamp studyで自発性の興奮性シナプス後電流(sEPSC)減少と抑制性シナプス後電流(sIPSC)が増加するのは、脊髄よりも上位でのトラマドールの主要代謝物M1の作用によること、またsIPSCの増加作用は脊髄上位でのM1の作用が関与していることが頸髄半切断による脊髄下行性抑制経路の離断実験でわかった。本年度は神経障害疼痛モデルであるChungモデルを作成して、脊髄in vivo patch clampで検討すると、トラマドール投与によりsEPSCは減少, sIPSCはあまり変化なかった。選択的定量的侵害刺激を再現するために、覚醒下で求めたピンチ刺激、熱刺激による逃避反応閾値より大きい一定の刺激を与えて誘発EPSC、誘発IPSCの変化を検討したが、やはりトラマドール投与により誘発EPSCは減少,誘発IPSCはあまり変化なかった。下行性抑制系の薬理学的遮断遮断を行った動物は少数であるが、トラマドールにより誘発EPSCは減少した。この痛みに関する脊髄in vivo patch clamp研究において、特異性、定量性のある刺激を用いて刺激条件を揃えてデータの統一性を確保することが非常に重要であり、ピンチメーターと一定の熱刺激を設定できる痛覚計(熱刺激)で検討している。本来の目的に沿った修正研究計画で進行しているが、神経障害痛モデルを作成し、その後に薬理学的下行性抑制系破壊を行っているため、この二つの処置を行ったあとで限定されたtime windowで行う脊髄in vivo patch clampの実験の成功率が低く、complete studyがなかなか増えない状況である。脊髄下行性抑制経路が重要な役割を演じている事を想定して研究内容に大幅な変更は生じていないが、遅れが生じている。本研究の目的は、神経障害性疼痛の病態を模したChungのラット脊髄神経結紮モデルを用いて、行動学的実験とともに、脊髄in vivo patch clamp法を用いたシナプス応答を解析し、下行性抑制系の役割を各種鎮痛薬の効果を含め明らかにすることである。トラマドールは自発性興奮性シナプス後電流(sEPSC)減少と抑制性シナプス後電流(sIPSC)を増加させたが、頸髄半切断による脊髄下行性抑制経路の離断実験でト主要代謝物M1の脊髄よりも上位での作用が関与していることがわかった。Chungモデルにおいては、トラマドール投与によりsEPSCは減少, sIPSCはあまり変化なかった。選択的定量的侵害刺激を再現可能なピンチ刺激、熱刺激デバイスを用いて、誘発EPSC、誘発IPSCの変化を検討したが、トラマドール投与で誘発EPSCは減少,誘発IPSCはあまり変化なかった。最終年度は、Chungモデルで、青斑核のノルアドレナリン作動性下行性疼痛抑制系ニューロンを特異的に破壊する毒素であるDSP-4を用いて下行性抑制系の薬理学的遮断遮断を行い検討した。脊髄神経結紮側(右側)のallodyniaが確認されたラットに、DSP-4を50mg/kg腹腔内投与し、その1014日後にaesthesiometerで逃避閾値を再測定した。

神経障害性疼痛では抑制性ニューロンのKCC2トランスポーターの抑制により細胞内Cl-イオン濃度が上昇し、GABAあるいはグリシン受容体刺激によるCl-チャネルの開口で逆に脱分極側に電位が移行して痛みが発生しており、下行性抑制性ニューロンの破壊でむしろallodyniaが緩和される可能性も考えられたが、左側のallodyniaは出現したが右側のallodynia緩和や左右逆転といった現象はみられず、神経障害性疼痛の発生に下行性抑制系の関与は少ないと考えられた。ラット脊髄神経結紮モデル(Chung model)で、行動学的実験とともに脊髄in vivo patch clamp法を用いたシナプス応答を解析し下行性抑制系の役割を検討した。トラマドールは自発性興奮性シナプス後電流(sEPSC)減少と抑制性シナプス後電流(sIPSC)を増加させたが、頸髄半切断により脊髄下行性抑制経路の離断実験で主要代謝物M1が脊髄よりも上位で作用していることがわかった。ChungモデルでDSP-4により青斑核ノルアドレナリン作動性ニューロンを破壊しても、アロディニアの左右逆転現象はみられず、抑制性ニューロンの興奮が逆に痛みを増強する機序は確認できなかった。機械的疼痛刺激を再現するピンチメーターと痛覚計(熱刺激)を代替装置として使用する事で本来の目的に沿った修正研究計画ですすめていくが、パルスジェネレーターの出力を工夫して数種類のサイン波を出力できる装置を作成して疼痛刺激を再現する検討も行う。引き続きChungモデルにおいて下行性のノルアドレナリンニューロン破壊を行った時のトラマドールの反応の違いを脊髄in vivo patch clamp法での結果をもとにその機序を解明してゆく。できればデクスメデトミジンについても検討を行う。麻酔科学、疼痛学当初、選択的なC線維、Aδ線維、Aβ線維刺激を達成するために、Neurometer NS3000を用いる予定であったが、業者取り扱いが中止され入手困難となった。当初の目的を達成するために必要な選択的定量的侵害刺激を再現するための代替装置の探索と特注が必要となり、機器の調達に日時を要し、本来の研究計画に基いた実験の開始が遅れるので、その間は従来のDynamic plantar aesthesiometerを用いた機械刺激での逃避行動閾値のみでの判断となるが、鎮痛薬の作用を検討する予備実験から始めた。まず脊髄in vivo patch clamp法による検討をトラマドールについて行うこととした。年度途中で鋭利な機械刺激による疼痛刺激を再現するピンチメーターと一定の温度上昇速度と設定温度のプラトー時間を設定できる痛覚計(熱刺激)を代替装置として使用する事で本来の目的に準ずる修正研究計画で進行しているが、トラマドールについては現在までに実施できている。下行性のセロトニンニューロン破壊群、ノルアドレナリンニューロン破壊群の検討は行えていないが、従来の痛みに関する脊髄in vivo patch clamp研究は刺激の特異性、定量性に欠け、得られた結果の解釈が非常に困難であったので、刺激条件を揃えてデータの統一性を確保することがこの研究で最も重要な点であり、遅れを生じたものの、研究内容に大幅な変更は生じていない。
エルンスト・ブロッホの美学-その可能性とアポリアーの研究

「われわれは何ものか?われわれはどこから来るのか?どこへ行くのか?われわれは何を期待しているのか?何がわれわれを待っているのか?」エルンスト・ブロッホの主著『希望の原理』はこの5つの問いで始まっている。そして、これらの問いには彼の哲学がすべて包括されている。すなわち、人間主体の本質はそれ自体では見出しえず、人間の過去と未来の関係の中から究明されるものであるが、人間も世界も依然としてそれら自身の究極的自己実現への途上にあり、したがって、人間主体の期待内容と世界主体の期待内容とが実現されて初めて「人間とは何か」という問いに最終的解答が与えられることになるというわけである。人間のみならず世界も夢を見ていると考えるブロッホの、いわば「未意識と未存在の哲学」は、したがって、その実現にアポリアを抱えている。すなわち、意識としても存在としても未決定である人間と世界が決定されるとすれば、その想定自体が両者の前提的規定に矛盾するのではないかという疑問にどう答えられないと思われるからである。ブロッホはこのアポリアに、人間と世界の可能性をキリスト教的弁証法的に、時間的に把握しなおすことによって答ええたと主張するが、現在の認識からすると、それは依然としてひとつの仮説にとどまっていると考えられる。ブロッホにとって芸術とは「相乗された生」である。つまり芸術は、過去、現在の現実の模倣ではなく、その中の未決の未来を導きの糸にして可能な未来をアレゴリー的かつ象徴的な一時的な達成として表現することであり、そのすぐれた作品は実証的でありながら未完の未来へ開かれていることによって、一時代の達成と未来とを完璧に現実化できることになるのである。ブロッホはこうして、美学でも時間的に否定性を肯定性に結びつけるが、哲学の場合と同様に、彼の美学も依然として美の実現のアポリアを論理的に解決する興味深い仮説にとどまっている。本年度は、ブロッホの生地ルートヴィヒスハーフェン市のブロッホ文庫で資料調査に従事し、それに基づいて入手可能な資料を購入、それに平行して、エルンスト・ブロッホが活躍した19世紀後半から20世紀前半の時代を背景に彼の美学に対する哲学者や思想家の影響についての研究に着手した。その結果、ブロッホの美学観の基盤にはアリストテレスなどのギリシア哲学に始まる物活論的一元論と生命体の実感との一体感があり、実はそれがカントの3批判に分裂して表現されるドイツ哲学の物質観への彼の批判を生み出していることが確認された。この認識はマインツ大学との国際シンポジウムで「Das Naturbild in der japanischen und deutschen Literatur」(「日独の文学における自然像」)と題して発表され共感と理解を得た。一方、ブロッホの美学に見られる象徴の強調はこの物質観に基づく歴史的成就の美学的表象であると考えると納得できるが、逆に、その点に、「表現主義論争」に典型的なブロッホの美学の特色とそのアポリアが現れていると想定される。この仮説は、北京学会での基調講演として「Plotzlichkeit oder Kontinuitat?」(「突然性か連続性か?」)と題して現在活躍中の理論家カール・ハインツ・ボーラーと対比して発表され、一定の評価を得た。この2発表は2003年中に論集として公表される予定である。

これらの研究の結果、ソ連やルカーチらの過去志向的理論への批判として有効であったブロッホの美学は、その点から、19世紀前半のロマン主義美学および20世紀後半の突然性の主張との関係から改めて見直されるべきであることが判明した。美学におけるユートピア性と美的成就の関係は論証可能なのか?本年度の研究は来年度の課題を明示していると思われる。本年度は生地ルートヴィヒスハーフェン市での資料調査はさらに進み、加えて、19世紀後半から20世紀前半の時代背景とブロッホの美学との関わりについての研究にも着手した。その間、マンハイム大学のロマン主義研究者ヨッヘン・ヘーリシュ教授とブロッホの美学について話し合う機会があり、ブロッホ美学の出発点はやはり初期のエッセイ集"Spuren"にあるという点で意見が一致した。ただ、"Heimat"や"Zu Hause"を求める少年ブロッホの豊かな好奇心は必ずしも世界全体を包括する哲学や美学にはならないはずである、という考え方から、ブロッホ美学の問題点の所在に関しても意見が一致したのは興味深かった。すでに"Erbschaft dieser Zeit"における文化遺産問題、および表現主義論争に明らかなように、ブロッホ美学のアポリアがその点に胚胎していることには間違いがないのである。本年度は幸いそれに加えて"Merkur"誌の編集人カール・ハインツ・ボーラー教授にも会うことができ、この問題に関して詳細に話し合うことができた。ボーラー流に考えれば、それは、突然性に依拠すれば連続性や目的性は論証しがたく、連続性に依拠すれば突然性がないがしろにされるという難問なのである。もっともボーラー教授自身がこの難問を解決しているとは言いがたい。その原因は、この問題の背後にはさらにもう一つ難題が隠れているからなのだろう。それはつまり、敢えて言えば、キリスト教を含めてヨーロッパのユートピア思想は実証主義の枠組から逃れられないのではないか、という疑問である。この疑問は今年度のマインツ大学とのシンポジウムで哲学者カール・レーヴィットの講演に倣って"Unterschied von West und Ost"というテーマで問題提起してみたが、問いかけはドイツ側参加者からも一定の評価を得たようである。こうして本研究の問題点は出尽くしてきた。来年度の仕事は、それらを現代とのかかわりでいかに究明するかである。本年度も、ルートヴィヒスハーフェン市のブロッホ文庫で、エルンスト・ブロッホ自身の哲学ならびに美学に関する資料を閲覧し調査した。本年度目立った新資料は、ブロッホの伝記的研究であった。息子Jan Robertによる数点の父親論(これらには彼のブロッホ哲学に関する誤解が見られるが、後代への悪しき影響を恐れるところである)、元助手のEberhard Braunの伝記的ブロッホ哲学研究、Arno MunsterのErnst Bolch, Eine politische Biograhie、加えて、かつてブロッホを追い出したライプチヒ大学から、シンポジウム報告Ernst Blochs Leipziger Jahreと論文集Denkein ist Uberschreitenが出版されたが、それとは別に、ライプチヒ時代の教え子で作家のZwerenz夫妻がSklavensprache und Revolteで彼らの視点からブロッホとその弟子たちについて証言をまとめている。これが示すように、旧東ドイツのライプチヒでは依然としてブロッホに対するプロとコントラが生きている。
オキシゲナ-ゼモデル錯体の作用機構と機能開発

1.コバルトシック塩基錯体〔Co(SB)〕のジオキシゲナ-ゼ型触媒反応機構を解明する目的で、メタノ-ル中O_2酸化の条件下、反応初期に生成するヒドろキソコバルト(III)錯体がOーヒドロキシジべンゾイルメタンのフラボンおよびクロマノンへの変換反応を解媒することを見出した。この結果はCo(SB)(OH)の塩基触媒作用として理解され、その直接的証明となる。さらにこの反応(逆クライセン反応)で、系内にアルデヒドを添加するとクロマノン類が、溶媒をトリフルオロエタノ-ルに代えるとフラボン類が高収率あるいは定量的に得られることを見出した。この結果はクロマノン類フラボン類の新規合成法として意義がある。2.配位不飽和Co^<III>(SB)(OH)がアルコ-ル溶媒中スチレン類の一原子酸素酸化反応を触媒する反応の展間として、フェニルアセチン類への応用を試みた結果、アセトフェノン、マンデル酸エステル、ベンゾイルギ酸エステルの各誘導体が高選択的に得られることを見出した。その機構は中間に生成するHCo(SB)の三重結合への付加とそれに続くO_2導入およびアルコ-ル溶媒取込みの連続反応として理解できる。3.Co(SB)(OH)がNーベンジルアニリンのO_2酸化によるイミンへの脱水素反応を触媒する反応に続いてtーBuOOH/Co(SB)系で試みた結果、対応するイミンがほぼ定量的に得られる。この反応はO_2酸化の条件下で反応しないアミンも反応し、特に三級アミンからの生成物と反応機構はシトクロムPー450と類以していて、アニリン側からのCo^<III>(SB)(OH)への電子移動を含むと考えている。4.オレフィンのNaocl酸化反応に対してCo(SB)が触媒作用を示し、主生成物にエポキシドを与えること、酸化還元電位の高いCo(SB)ほど触媒活性が高いこと等を見出した。機構は反応初期に生成する配位不飽和Co^<III>(SB)(OCl)と基質との相互作用で生ずるClOの改撃を含むと考えられる。1.コバルトシッフ塩基錯体〔Co(SB)〕のジオキシゲナ-ゼ型触媒反応機構を解明する目的で、フラボノ-ルとCo^<III>(SB)(OH)との反応で基質アニオン錯体を合成し、そのO_2に対する挙動を研究した結果、配位飽和状態でのみO_2が取り込まれ、この取り込み過程が基質アニオン錯体とO_2との間の非ラジカル的2分子反応であることを明らかにした。この結果はヒドロキソ錯体Co^<III>(SB)(OH)の塩基触媒作用として理解されるが、その直接的証明として、配位飽和Co^<III>(SB)(OH)が2'-ヒドロキシカルコン類のフラバノン類への可逆的交換反応を、また0-ヒドロキシジベンゾイルメタン類の逆クライゼン反応、フラボン生成反応を触媒することを見出した。2.配位不飽和Co^<III>(SB)(OH)がアルコ-ル溶媒中スチレン類の一原子酸素化反応を触媒する反応の展開として、フェニルアセチレン類への応用を試みたところ、アセトフェノン、マンデル酸エステル、ベンゾイルギ酸エステルの各誘導体が高選択的に得られることを見出した。その機構は中間に生成するHCo(SB)の三重結合への付加とそれにつづくO_2導入およびアルコ-ル溶媒取り込みの連続反応として理解できる。

3.オレフィンのNaOCl酸化反応に対してCo(SB)が触媒作用を示すことを見出したが、主生成物はエポキシドであって、その反応がラジカル過程で進行すること、酸化還元電位の高いCo(SB)ほど触媒活性が高いことを明らかにした。この反応機構は反応初期に生成する配位不飽和Co^<III>(SB)(OCl)と基質との相互作用で発生するClO・が二重結合を攻撃を含むと考えられる。4.その他、Co^<III>(SB)(OH)かエポキシ化合物の加メタノ-ル分解反応を触媒し、その触媒作用が配位不飽和Co^<III>(SB)種の超酸触媒作用に起因することを明らかにした。今後、不斉酸素酸化反応におけるCo(SB)の触媒作用、Co(SB)のペルオキシダ-ゼ型活性等について研究を進める。1.ヒドロキソコバルトシッフ塩基錯体〔Co(SB)(OH)〕の塩基触媒作用に関する研究の一環として、0ーヒドロキシジベンゾイルメタン類のCo(Salpr)/メタノ-ル系でのO_2酸化を検討したところ、予想されたフラボンの他に対応するOーヒドロキシアセトフェノン、安息香酸メチル、サリチル酸メチル、アセトフェノンおよびクロマノンが生成し、さらにこの系内にアルデヒドを加えると4ークロマノン類が高収率で生成し、溶媒をトリフルオロエタノ-ルに変えるとフラボン類が定量的に生成することを見出した。これらは、両物質の新規合成法として意義がある。2.Co(SB)(OH)がNーベンジルアニリンのO_2酸化によるNーベンジリデンアニリンへの脱水素反応を効率良く触媒することはすでに見出している。今回DMSO中tーBuOOHを用いてアニリン誘導体を酸化すると、対応するイミンがほぼ定量的に得られることを見出した。この脱水素反応は、立体障害を受けない基質で生成物が共役イミン構造をとるものに有効であり、さらにO_2酸化では安定なアミンもこの系では溶易に酸化されることがわかった。その機構は置換基効果、基質ベンジル位の同位体効果等から、基質アニリン側からCo^<III>(Salen)(OH)ヘの一電子移動を含むと考えられる。3.配位不飽和(Co(SB)はNaOClの共存下でオレフィンのO_2酸化を触媒してエポキシド(主生成物)の他に少量のvicージクロロおよびαークロロカルボニル化合物を与える。反応は基質オレフィンの構造とコバルト触媒の性質に依存する。機構は反応初期に生成する配位不飽和Co^<III>(SB)(OCl)と基質の相互作用でOClの二重結合への攻撃が律速と考えている。4.その他、軸不斉を持つCo(SB)がスチレンのO_2酸化で得られる1ーフェニルエタノ-ルへの不斉導入に関する機構の解明等についての研究を進める。
川崎病発症機構の解明

川崎病の発症機序を解明するため、川崎病モデルマウスを解析した。Candida Albicans Water Soluble Fraction (CAWS)はマウスに川崎病類似の血管炎を生じた。血管炎はTNFα受容体阻害薬で著名に抑制され、血管炎の程度と血中TNFα濃度とは強い正の相関を認めた。遺伝子発現プロファイリングでは、自然免疫に関わる遺伝子が強く抑制されていた。川崎病症例とCAWS血管炎での血清サイトカインプロファイリング比較では、高い類似性を認めた。川崎病とCAWS血管炎は組織学的、生化学的、治療反応性において類似していた。川崎病発症には自然免疫とTNFが深くかかわることが示唆された。Candida Albicans Water Soluble Fraction (CAWS)により血管炎を生じさせたDBA/2マウスでは、特にTNFa受容体拮抗薬のEtanerceptが血管炎を著明に抑制した。Etanerceptは、血清サイトカインのInterleukin (IL)-6、IL-12、IL-13、TNFaの上昇を著明に抑制した。血中白血球の遺伝子プロファイリングでは、Etanerceptにより抑制された遺伝子は、defense response, immune system process, inflammatory response, innate immune response, tumor necrosis factor superfamily cytokineに関わる遺伝子群であった。さらにパスウェイ解析では、特にInnate Immunityに関わるパスウェイが著名に抑制されていた。以上の結果をもとに、CAWSによる血管炎惹起にはInnate immunityからTNFやIL-6といった炎症性サイトカインの活性化につながる免疫システムの活性化が必要と考え、以下の実験を施行中である。1innate immunityの関与をIL-1beta受容体阻害薬やIL-1beta knockout mouse、またToll like receptor knockout mouseを用いて検討する。2innate immunityの活性化後、血管炎の進展に炎症性サイトカインがどのように関与するのかをTNF knockoutマウスやIL-6拮抗薬(トシリズマブ)を用いて検討する。CAWS血管炎におけるサイトカインプロファイルを検討し、実際の川崎病症例でのサイトカインプロファイルと対比させることで、CAWS血管炎と川崎病との類似性・相違点を検討した。5週齢のオスDBA/2マウスにCAWS0.5mgを連日5日間腹腔内投与することで、血管炎を生じさせ、投与後2週間のマウスの血清からBioPlex 200Systemを用いてサイトカインプロファイリングを行った。一方、川崎病患児の治療前の血清からBioPlex 200Systemを用いてにてサイトカインプロファイルを行った。測定したサイトカインは、正常コントロール(マウスではCAWS非処理マウス、川崎病でのコントロールは年齢と性別をマッチングさせた感染症(肺炎・気管支炎)にて入院となった症例)との比で表し、CAWS血管炎と川崎病でのサイトカインプロファイルパターンを比較し、その類似点・相違点を検討した。CAWS血管炎、川崎病ともにIL-6、IL-10の上昇が著しかった。加えて、CAWS血管炎ではG-CSFの発現が高値を認めたが、全体的にはマウスCAWS血管炎と川崎病では類似するサイトカインプロファイルのパターンを呈していた。CAWS血管炎と川崎病とにはサイトカインプロファイルにおいて類似するパターンが確認された。これまでの病理組織学的類似性、治療薬剤に対する反応の類似性から鑑みて、CAWS血管炎が川崎病モデルと考えられる可能性がより高くなったと結論された。Candida Albicans Water Soluble Fraction (CAWS) 0.5mgを連日5日間腹腔内投与し血管炎を生じさせた4-5週齢のDBA/2マウスに、免疫グロブリン(IgG)、Tumor Necrosis Factor-α(TNFa)受容体阻害剤Etanercept、メチルプレドニゾロン、シクロスポリンを投与し、それぞれの薬剤の血管炎抑制効果を組織学的に評価した。さらに、血清学的にも血管炎抑制効果をBioRad社BioPlexによる血清サイトカインプロファイルを行い評価した。それぞれの薬剤に種々の程度に血管炎抑制効果を認めたが、特にEtanerceptは組織学的に血管炎を著明に抑制し、血清サイトカインプロファイルでもEtanerceptによりInter Leukin (IL)-6、IL-12、Intrerferonγ(INFg)、TNFaの著明な抑制を認めた。さらにCAWSに対するEtanerceptとIgGの血管炎抑制効果の機序を解明するため、血中白血球遺伝子プロファイリングをAgilent社製DNAチップを用いて行った。CAWSにより発現が亢進した遺伝子においてIgG、Etanerceptによりともに抑制されて遺伝子は126遺伝子あり、GO Termによる分類ではdefense response, immune system process, inflammatory response, innate immune response, tumor necrosis factor superfamily cytokineなどが有意に抑制を受けていた。

さらにパスウェイ解析では、パスウェイ上で抑制される遺伝子が多く関わるパスウェイとしては、INFgに関わるパスウェイ、およびInnate Immunityに関わるパスウェイがあげられた。これまでの実験はスクリーニング的な意味合いが強く成績が得られやすい。2Innate immunity活性化後の血管炎の進展に関する炎症性サイトカインの役割についての検討:Innate immunity活性化後の炎症性サイトカインの役割について、TNF knockout mouse、IL-6 antagonist(トシリズマブ)を用いて検討する。3CAWS血管炎と川崎病血管炎との類似性の検討:CAWS血管炎に必要なシグナル経路が、川崎病においてどの程度活性化されているのかを実際の川崎病患者血清、血球をを用いて検証する。Innate ImmunityおよびINFgのどのMoleculesが特に重要なのかをさらに明らかにしていく。またパスウェイをどのように刺激すれば血管炎を生じるのかを検索する。またこれらのパスウェイが実際の川崎病と関連していくのか検証する。該当なし研究を継続する上で主に消耗品の購入に充てる。
耐性機構を制御する分子標的薬剤

抗がん剤耐性を制御する新しい分子標的治療法開発に向けた基礎的研究を行った。がん細胞のアポトーシス耐性、固形がんの薬剤耐性の分子機序、細胞生存に係わるPDK1-Aktシグナル系、テロメアなどについて、その分子機構解明の研究を進め、新しい分子標的を同定した。そして、それら分子標的に対する阻害化合物の探索や同定した化合物の抗腫瘍効果の評価を行い、耐性を制御する治療法開発のための基盤情報を得た。本年度は以下の研究を推進し、成果を得た。1)がん細胞のアポトーシス耐性GLO1は、前立腺癌や大腸癌などで過剰発現している。新規抗癌剤の開発を目的として、GLO1を分子標的とした強力且つ化学的に安定なGLO1阻害剤の探索を行った。約60万の化合物からリード化合物として4種類見出されている。2)シャペロンタンパクが関与する耐性機構を制御する分子標的薬剤腫瘍増殖に選択的に関わるヒートショック蛋白質Hsp27について、その阻害物質やペプチドのスクリーニングを進めた。まず、Hsp27のsiRNAを3種類デザインし、その効果を調べ、その結果、Hsp27発現亢進のあるヒト前立腺癌細胞に対して、Hsp27の発現抑制および細胞増殖抑制効果があることを見い出した。3)微小環境依存的な薬剤耐性を制御する分子標的薬剤グルコース飢餓ストレスで誘導されるUPR(unfolded protein response)について、UPR誘導の薬剤耐性に対するプロテアソーム阻害剤の作用やUPR阻害剤の作用の詳細を明らかにするため、耐性細胞の樹立や新たな阻害剤の探索などの検討を行った。そして新たなUPR阻害剤として、糖尿病薬のビグアナイド系化合物群を見出した。これは、今後の分子機序解析のための有用なツールとなるものと考えられる。4)耐性に関わるシグナル伝達系を制御する分子標的薬剤新たなHsp90結合タンパク質としてIntegrin-linked Kinase(ILK)を同定した。ILK上の結合部位を検討した結果、ILKの377-406番目の部位がHsp90との結合に関与している事を見いだした。Hsp90阻害剤添加によるILKの半減期の変化を検討した結果、ILKの半減期は約33%減少しており、これはプロテアソームによるILKの分解が促進されたためであった。1.がん細胞のアポトーシス耐性前立腺癌や大腸癌で過剰発現するGLO1を分子標的として、化学的に安定なGLO1阻害剤の検索を続けている。リード化合物として4種類見出されており、さらなるGLO1阻害増強及び化学的性質向上のために、GLO1蛋白の3次元構造情報を基に、化合物の最適化(化学修飾)を行った。2.シャペロンタンパクが関与する耐性機構を制御する分子標的薬剤ミトコンドリア依存的な細胞死誘導経路の調節因子Hsp27や脂質代謝酵素などの阻害による影響を検討した。その結果、脂質代謝酵素阻害剤トリアシンによる抗癌剤CPTの効果増強を見出した。3.微小環境依存的な薬剤耐性を制御する分子標的薬剤グルコース飢餓ストレスで誘導されるUPR(unfolded protein response)について、UPR阻害活性を有する化合物versipelostatin、ビグアナイド系糖尿病薬メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミンを用いマイクロアレイによる遺伝子発現解析を進め、薬剤の作用とリンクする発現signatureの同定に成功した。これは、今後の分子機序解析やPOC(Proof of Concept)研究のための有用なツールとなるものと考える。また発堤signatureに含まれる遺伝子群の機能を探索するため、siRNA等の作製等の準備を進めた。4.耐性に関わるシグナル伝達系を制御する分子標的薬剤がんの抗がん剤耐性化に関わるAktに関し研究を進め、Aktに結合する分子を大腸菌を用いたツーハイブリッド法にて検索し、侯補分子を同定した。この侯補分子の過剰発現は、Aktの活性を減弱するとともに抗がん剤感受性を増大させた。ヌードマウス移植モデルで、侯補分子の過剰発現はがん細胞の増殖能を低下させることが確認された。1)がん細胞のアポトーシス耐性:がんで過剰発現するGL01を分子標的として、in vivoで薬効が認められるGL01阻害剤の検索を続けている。GL01阻害活性をもつ化合物とGL01蛋白との共結晶がとれた。これらの3次元構造情報を基に、さらなるGL01阻害増強及び化学的性質向上のために、化合物の最適化を行った。2)細胞死調節に関わる代謝酵素を制御する分子標的薬剤:細胞死調節に関わる脂肪酸代謝酵素阻害剤であるトリアシンと抗癌剤エトポシドは併用効果を示すことを見出した。また、トリアシンは熱ショック蛋白質の発現の低下に関わり、さらに、エトポシドとの併用によりカスパーゼの相乗的活性化を引き起こすことがわかった。3)微少環境依存的な薬剤耐性を制御する分子標的薬剤:グルコース飢餓ストレスで誘導されるUPR(unfolded protein response)について、UPR阻害薬剤の作用とリンクする発現signatureを用い、化合物探索を展開した。

その結果、Connectivity mapの手法を利用することで、新たなUPR阻害剤の同定が可能であることが明らかになった。4)耐性に関わるシグナル伝達系を制御する分子標的薬剤:がん細胞の生存や抗がん剤耐性化に関わるPimキナーゼの新たな結合分子として、p27とフォークヘッド転写因子を同定した。Pimキナーゼはp27の核外移行・タンパク質分解を誘導しp27の転写をも抑制しており、これががんの異常増殖につながることを明らかにした。5)耐性に関わるテロメアタンパク質を制御する分子標的薬剤:テロメラーゼ阻害剤耐性因子として機能するタンキラーゼ1の細胞内活性評価系を構築した。本系を用いた探索により、タンキラーゼ1を阻害する化合物、すなわちテロメラーゼ抑制因子TRF1のテロメア結合を安定化する化合物を複数同定した。1)がん細胞のアポトーシス耐性:耐性がん細胞で過剰発現するGL01の阻害剤検索を続行した。既知のGL01阻害剤の弱点である不安定性を回避するため、化学的に安定なリード化合物を同定し最適化研究を進めた。前立腺がんの治療抵抗性に重要なアンドロゲン受容体シグナルの阻害剤探索系を確立し、化学療法基盤情報支援班標準阻害剤キットを用い複数の陽性化合物を同定した。また、薬剤耐性を示すSP(side population)細胞ではABCG2が過剰発現していること、ABCB1を阻害する多剤耐性克服薬DofequidarがABCG2をも阻害し、SP細胞の多剤耐性形質を克服できることを証明した。2)細胞死調節にかかわる退社酵素を制御する分子標的薬剤:アシルCo-A合成酵素(ACS)が、微小環境で見られる低pH下でのグリオーマ細胞の生存増殖に寄与することを明らかにした。その分子機序として、低pH下ではミッドカイン遺伝子の発現が低下するが、ACS過剰発現細胞ではその発現が増強・維持され、細胞生存につながることを見出した。3)微小環境依存的な薬剤耐性を制御する分子標的薬剤:遺伝子発現情報を用いた化合物探索系Connectivity mapを活用し、寄生虫薬のパモ酸ピルビニウムが、グルコース欠乏時選択的に小胞体ストレス応答を抑制することを見出した。Versipelostatinの作用機序解析から、グルコース欠乏時の小胞体ストレス応答制御に、翻訳開始抑制因子4E-BP1が関与することを明らかにした。4)耐性にかかわるシグナル伝達系を制御する分子標的薬剤:がん細胞の薬剤耐性にかかわるPimキナーゼが、新たな基質として同定したp27の157番目と198番目のスレオニン残基をリン酸化することを見出した。同定したリン酸化部位を含むp27ペプチドとPimとの共結晶化に成功し、阻害剤開発につながる構造的基盤を解明した。1)がん細胞のアポトーシス耐性:再燃性前立腺がんに見られる短鎖型アンドロゲン受容体(AR)は、ARシグナリングを常時作動させることにより、同細胞のアンドロゲン非依存性増殖に寄与することを見出した。
根の重力屈性の情報伝達系におけるアポプラストの役割

根の重力屈性は、植物が生存する上で最も重要な環境に対する応答である。そのため多くの研究者によって解析され、種々の仮説が提案されてきた。最近では、根冠アポプラストにおける遊離Ca^<2+>の動向が注目を浴びている。我々は、重力刺激によりアポプラストの遊離Ca^<2+>量が上昇すること、さらに、遊離Ca^<2+>量の上昇は細胞壁中の結合型Ca^<2+>の解離が原因である可能性を報告した。本研究は、根冠の遊離Ca^<2+>の動向に及ぼすプロトンの影響、さらに遊離Ca^<2+>の役割を解析し、情報伝達系における根冠アポプスストの役割を明らかにすることを目的とした。暗下生育のトウモロコシ(Zea mays L.,cv.Golden Bantam70)の一次根(1.5cm)を材料とした。Ca^<2+>の測定はQuin-2を輸送液とした蛍光検出フローインジェクション分析法で行った。根冠を含む1-mm切片を種々のpHの緩衝溶液中に浸し、これらの溶液中に含まれるCa^<2+>量を調べたところ、Ca^<2+>量はpHに依存し、pHが低くなるにつれて増加した。また、根冠をプロトンポンプの阻害財であるDCCDはNa_3V0_4で処理した根は、重力刺激を与えても根冠で遊離Ca^<2+>量の上昇は見られなかった。これらの結果は、重力刺激の細胞内情報伝達によりプロトンポンプが活性化し、プロトンが細胞外へ排出される、プロトンは細胞壁を構成するペクチンのガラクツロン酸のカルボキシル基を結合するため、カルボキシル基とキレート結合していたCa^<2+>が解離し、根冠アポプラストの遊離Ca^<2+>量が上昇するという反応鎖が、重力刺激の情報伝達系に関わっていることを示唆する。さらに、根冠→伸長域への信号伝達物質の候補としてIAAに焦点化し、拡散性IAAの動向を調べたところ、拡散性IAAの求基的移動が根冠における遊離Ca^<2+>量に依存していることが分かった。このように、根冠アポプラストは重力刺激情報伝達系の鍵部位であることが明らかになった。現在、拡散性IAAの求基的移動におけるCa^<2+>の役割を調べている。
DNAのハイブリダイゼーションを活用した色素ナノ超分子の合成

本研究では、機能分子として色素分子を天然のヌクレオチドの代わりに複数個導入したDNA-色素コンジュゲートを合成することで、新規なナノ超分子の構築を目指す。前年度、我々はD-threoninolをリンカーに用いてメチルレッド(あるいはナフチルレッド)と1,3-propanediolをDNA鎖の中央に交互に導入した、互いに相補的なDNAコンジュゲートを合成し、これをハイブリダイズすることで色素がアンチパラレルにスタックしたH会合体の調製に成功している。本年度は、この会合体の構造解析および配向制御を目指した。NMRによる構造解析の結果、DNAの中央に導入された色素分子は設計どおりに互いにアンチパラレルに配向していることが判った。また配向状態の詳細も明らかとなり、吸収スペクトルと会合状態の対応も判明した。次にメチルレッドを導入するためのリンカーをL-threoninolに変えたところ、CDスペクトルに大きな変化が見られた。D-threoninolを使用した場合には色素の極大吸収波長領域のCDスペクトルが大きな正のコットン効果を示したのに対し、L-threoninolではD-体の1/5以下に低下した。この事実は、D-threoninolでは色素会合体がDNA中で右巻きらせんを形成しているのに対し、L-threoninolではほとんどらせんを形成していないことを意味する。このようにリンカーのキラリティーを変えることで、色素会合体の配向状態を制御できた。DNAは任意の塩基配列を特定方向に配向させることに長けた機能性超分子であり、天然のDNA骨格を活用すれば、通常は調製の極めて困難な分子会合体も容易に設計・調製できる。一方色素分子は単量体として機能を発揮することは少なく複数の分子が配向することで高度な機能を発揮するが、これまでは色素分子の会合数と配向を意図通りに制御することは極めて困難であった。そこでDNAに色素を結合し、DNAの自発的な二重鎖形成力を活用して、これらの色素を設計どおりに会合させることに成功した。その具体的な分子設計は以下の通りである。まず一方のDNA鎖の中央には色素とスペーサーを交互に配列させ、その両端に天然のDNAをタグとして導入する。もう一方のDNA鎖も同様に色素とスペーサーを中央に交互に配列させ、両端に天然のDNAを導入する。こうすれば、色素自体に会合力が無くても、両端に導入したDNAの二重鎖形成力によって色素を"強制的"に会合させることができる。色素の会合数や配向状態は、色素を導入するリンカーの分子設計やDNA合成機のプログラミングで自在に制御することができる。実際この手法を用いることで通常は調製の極めて困難なヘテロ型色素会合体でも、容易に調製することができた。例えば、片側の鎖にメチルレッドを導入し、下側にナフチルレッドを導入するだけで、二つの異なる色素が交互に配列したヘテロ型色素会合体が調製できた。また得られたヘテロ型会合体は、非常に特異な光学物性を示すことも明らかとなった。
作物根の伸長成長における日周性リズムの解析

土壌の物理性が不良な耕地条件下では、作物根の伸長生長は抑制されることが知られている。この伸長生長の低下率は、ある一定期間における根の伸長速度として表示されるが、これまでの研究では1日単位の伸長量よりもさらに微細な伸長速度にふれた報告はほとんど見あたらない。そこで、本研究では土壌のストレスに対する根の伸長抑制を評価する上で、これまでの研究で欠けていた、時・分単位の伸長生長の変動を明らかにすることを目的とした。具体的には、根の伸長生長における日周性リズムが存在するか否か、さらにリズムが存在する場合にはそれが内因性のリズムであるか否か、を明らかにすることを本研究の到達点として設定した。この目的を達成するため、根圏の水・養分・温度・光などの環境因子が一定の条件下で根の伸長生長を観測しうるシステムを作成した。低照度域においても感度良好なCCDビデオカメラで撮影した根端部の位置をタイムラプスビデオに記録し、コンピュータ上で画像処理した。観察対象とする根は、イネ、白花ル-ピン、モロコシの種子根とし、播種後約3週間程度に渡って種子根の伸長リズムを調査・解析した。数種の作物根の時・分単位の伸長速度には明らかな変動が認められた。数日間の調査期間中における1時間当たりの伸長速度の最大値は、最小値の1.4から6.7倍であった。昼夜温度が変化する場合には伸長速度は昼夜間で明らかに異なっており、伸長速度は温度に依存する傾向が認められたが、恒温条件下では昼夜間の伸長速度には明確な差異は認められなかった。このことは、伸長速度の変動は日周の温度変動に依存する変動パターンを示しうることを暗示した。今後、明暗が交代する通常の条件と、連続明条件の二つの条件で観察を行ない、その結果の違いによって、伸長パターンが外因性か内因性かを判定する必要を認めた。
遷延性意識障害の評価とその治療に関する研究

重症脳損傷後に遷延性意識障害に陥り3月を経過すると、植物状態と診断され、そのうち94-97%は植物状態より脱却出来ずに経過する。従来より各種治療法が試みられてきたが、認むべき効果が期待できないために、回復不可能な病変として生命維持のための治療も中止してもよいとされてきた。しかし植物症でも3-6%は自然経過で社会復帰できる症例があり、その重症度にはかなりの多様性があることが指摘されていた。本研究では植物症の病態について検討し、その重症度の評価法を確立し、視床・脳幹網様体とマイネルト核に慢性植え込み電極で刺激することで植物症から回復しえた症例と回復しなかった症例との病態の差異を検討し、新しく設定した植物症の重症度評価法の確実性を確認した。今回、覚醒機能と認知機能にわけて神経行動学的に完全型、不完全型、移行型に分類でき、慢性脳深部刺激療法によって、不完全型と移行型では回復率が高かった。この重症度の差は脳波・各種知覚誘電位の変化からはとらえがたいが、事象関連電位としてP250の振幅が7-10uVを基準に鑑別できた。更に慢性脳深部刺激に有効例では、刺激により脳温が上昇し、ブドウ糖摂取率・酸素摂取率の増加を認め、大脳皮質の脳血流量が増加し、髄液内のノルアドレナリンとドーパミンが増加傾向をしめした。特にマイネルト核刺激では両前頭葉の血流量の増加が著しく、髄液内のアセチールコリンの増加が認められた。慢性脳深部刺激により植物症よりの回復の良い例ではPGE2が日中に増加し、夜間にPGD2の増加をみた。回復が困難とされ生命維持療法され絶たれてきた植物症には種々の程度の病態があり、本研究の新しい神経行動学的・神経生理学的診断法を利用することで、慢性脳深部刺激療法によって回復の可能性野ある植物症を選びだせることを明らかにしえた。神経症状の6-8が認められる症例と他の症例では、電気生理学的評価と長期予後に明らかな差を認め、神経症状の1-5までの症状を呈するものをPVSとして各種の治療法を検討する必要があるものと考え、神経症状の6-8が認められる症例をPVSとするのは不適当であると結論された。さらに、神経症状が1-5までの症例においては、神経症状のみで長期予後の比較は困難で、電気生理学的評価が有効であった。すなわち、発症後3ヶ月の時点では、神経症状が1-5のみの症例でも、電気生理学的評価では、かなりのvariationが存在し、脳波連続周波数分析にて脳波の脱同期化を認め、ABRの第V波、SEPのN20が記録され、Pain-related P250が記録される症例では、deep brain stimulation therapyによって、高率にPVSから脱却可能な症例が存在することが明らかとなった。また、PVSでは、深部体温の日内変動や髄液中のPGE2,PGD2の日内変動が明らかではないが、deep brain stimulation therapyでは、これらの日内変動を創出することが可能で、睡眠-覚醒サイクルに関与するこれらの神経伝達物質の変動を考慮した刺激方法をおこなっている。これまでに、20例中7例が完全にPVSから脱却している。植物状態を呈する患者を電気生理学的に分類し、脳深部刺激療法の効果との比較を行なった。また、髄液中のPGE_2,PGD_2ならびに深部体温の日内変動をモニターして、脳深部刺激療法の効果について検討した。

その結果、脳波連続周波数分析にてdesynchronizationを認め、聴性脳幹反応の第V波、体性感覚誘発電位のN_<20>を認め、Pain-related P_<250>が高振幅で記録される症例において、脳深部刺激療法によって植物症から脱却した症例が多く認められた。さらに、脳深部刺激療法の刺激方法を決定するための指標として、髄液中のPGE_2,PGD_2の日内変動ならびに深部体温の日内変動をモニターすることが有用であることが明らかとなった。すなわち、PGE_2が日中増加して夜間に減少するbiphasicな変化を呈するように、また、PGD_2がその逆の変化を呈するように刺激時間を設定することにより、睡眠-覚醒サイクルを考慮した刺激が可能となり、深部体温についても早朝に最低となり、午後9時頃に最高となる日内変動も出現した。これまでは、遷延性意識障害の患者はマスコミなどで植物人間などと呼ばれ、家族の精神的また肉体的から社会問題として扱われては来たが、植物症を呈している症例の中にも治療医学の対象となる症例が多数存在することが明らかとなり、今後さらに研究を発展させる予定である。
アジア地域における細石刃文化の基礎的研究

【I】基礎的データの収集・分類ソ連邦シベリア地区・中国地区・モンゴル地区・東南アジア地区・インド地区・日本地区の各地区毎の細石刃石器群出土遺跡について、遺跡カードを作製した。とくに、シベリア地区・中国地区については、すべてとは言えないまでも、収集し得るかぎりの情報を集めることができた。すでに中国地区については、細石刃石器群に関する予備的な原稿を書きあげてある。【II】細石刃の使用痕研究黒耀石製石器にのこされた使用痕についつの基礎的な実験を終了した。その結果、石器上に残された微細痕には、数多くの形態が認められ、一方向に集中して走る線状痕(striation)が存在する部分を、道具の刃部として区別することが可能であるとした。ここに、黒燿石製細石刃の機能を明らかにする手掛りを明確にすることができた。【III】古生態学的資料の収集原新世終末から完新世初頭にかけての自然環境・動植物に関する研究データの収集も、ほぼ終了した。
遺伝子操作下増殖胎児肝細胞移植による肝硬変に対する新しい治療の開発

マウス、ラットに四塩化炭素を長期投与し硬変肝モデルを作製、このモデルを用いて70%肝切除では生存し得ないことを明らかにした。上記の硬変肝作製過程ならびに、四塩化炭素中止後経時的に、肝繊維化の律速酵素の一つであるhydroxyprolyl dehydrogenaseの酵素活性を測定し、硬変肝の作成過程で硬変肝の程度とhydroxyprolyl dehydrogenaseの活性が相関して増加することを明らかにした。またマウス胎児肝細胞の分化誘導をおこない、この細胞株が肝の上皮系細胞に分化することを明らかにした。移入細胞作製のために新たにレーザー光による選択的細胞融合装置を設計、試作し、細胞のトラッピングの条件、融合のためのパルスの波長、照射時間を検討した。エミローマ細胞とリンパ球を用いた融合実験では2030%の確立で融合が成功し、融合細胞がoriginalの細胞の性格を持っていることを確認した。目下、肝実質細胞とリンパ球との融合条件の検討を行っている。また遺伝子操作を行うためのmRNAのアンチセンスをいれるHVJリポゾームの作成に取り掛かった。均一な大きさのリン脂質のリポゾームの作成、センダイウィルスの紫外線による不活化などの作業を行なった。現在TNFのmRNAのアンチセンスを用いて、肝濯流モデルにおいて実質細胞、非実質細胞のどちらに遺伝子導入がなされるか検討中である。今後の展開;硬変肝に対する遺伝子治療を行うための基礎となる正常肝が硬変肝に変化していく過程、ならびにその治癒過程で、コラーゲンの合成酵素がどの様に変化していくことに関する研究はほぼ予定どおり進んだ。また胎児肝細胞と肝細胞を選択的に融合させるためのレーザー装置も完成し、遺伝子導入を行うためのHVJリポゾームの作成もほぼ予定通りに進んだ。しかし、collagenase inhibitorのmRNAの分析、このmRNAに対するアンチセンス・クレオチドの合成に関する研究が遅れており、これらに関する研究は今後に待ち越された。平成7年度の研究成果1.マウス、ラットに四塩化炭素を長期投与し、硬変肝モデルを作製した。また両硬変肝モデルを用いて30%、70%肝切除をおこない70%肝切除では生存し得ないことを明らかにした。2.上記の硬変肝作製過程ならびに、四塩化炭素中止後3か月間経時的に血液をサンプリングし肝繊維化の律速酵素の一つであるハイドロオキシ・プロリル・デハドロゲナーゼの酵素活性を測定し、肝の繊維化の過程およびその消失過程におけるハイドロオキシ・プロリル・デハドロゲナーゼの酵素活性変化を観察した。その結果硬変肝の作成過程で硬変肝の程度とハイドロオキシ・プロリル・デハドロゲナーゼの活性が相関して増加することを明らかにした。3.実験2と同様に硬変肝作製過程ならびに、四塩化炭素中止後3か月間経時的に肝臓をサンプリングし、肝繊維化のマーカーであるコラーゲン量、コラゲナーゼ活性、コラーゲン・インヒビター活性を測定中である。4.マウス胎児肝細胞の分化誘導実験をおこない、この胎児肝細胞株が肝の上皮系細胞に分化することを明らかにした。5.移入細胞作製のために新たにレーザー光による選択的細胞融合装置を開発中である。今年度の研究の評価と今後の展開硬変肝に対する遺伝子治療を行うための基礎となる、マウスおよびラットにおける正常肝に変化していく過程、ならびにその治療過程で、コラーゲン、コラゲナーゼ、その合成酵素がどの様に変化していくことに関する研究はほぼ予定どおり進んだ。

しかし、コラゲナーゼ・インヒビターのmRNAの分析、このmRNAに対するアンチセンス・クレオチドの合成に関する研究が遅れており、平成8年度に持ち越された。前年度までにマウス、ラットに四塩化炭素を長期投与、硬変肝モデルを作製し、硬変肝モデルを用いて70%肝切除では生存し得ないことを明らかにした。上記の硬変肝作製過程ならびに、四塩化炭素中止後3か月間経時的に血液をサンプリングし肝繊維化の律速酵素の一つであるハイドロオキシ・プロリル・デハドロゲナーゼの酵素活性を測定し、硬変肝の作成過程で硬変肝の程度とハイドロオキシ・プロリル・デハドロゲナーゼの活性が相関して増加することを明らかにした。またマウス胎児肝細胞の分化誘導実験をおこない、この胎児肝細胞株が肝の上皮系細胞に分化することを明らかにした。平成8年度の研究成果今年度は移入細胞作製のために新たにレーザー光による選択的細胞融合装置を設計、試作し、細胞のトラッピングの条件、融合のためのパルスの波長、照射時間を検討した。ミエローマ細胞とリンパ球を用いた融合実験では2030%の確立で融合が成功し、HAT selectionにて融合細胞がoriginalのミエローマ細胞とリンパ球の両者の性格を持っていることを確認した。目下、肝実質細胞とリンパ球との融合条件の検討を行っている。また遺伝子操作を行うためのmRNAのアンチ・センスをいれるHVJリポゾームの作製に取り掛かった。均一な大きさのリン脂質のリポゾームの作成、センダイ・ウィルスの紫外線による不活化などの作業を行なった。現在TNFのmRNAのアンチ・センスを用いて、肝灌流モデルにおいて実質細胞、非実質細胞のどちらに遺伝子導入がなされるか検討中である。研究の評価と今後の展開硬変肝に対する遺伝子治療を行うための基礎となる、マウスおよびラットにおける正常肝が硬変肝に変化していく過程、ならびにその治癒過程で、コラーゲン、コラゲナーゼ、その合成酵素がどの様に変化していくことに関する研究はほぼ予定どおり進んだ。また胎児肝細胞株と実質肝細胞を選択的にハイブリッドさせるためのレーザー装置も完成し、融合細胞が増殖能、ならびにoriginalの細胞の性格を待ち合わせていることも確認できた。また遺伝子導入を行うためのHVJリポゾームの作成もほぼ予定どうりに進んだ。しかし、コラゲナーザ・インヒビターのmRNAの分析、このmRNAに対するアンチセンス・クレオチドの合成に関する研究が遅れており、この二つに関する研究は今後に持ち越された。
北琉球徳之島伊仙方言の記述文法書作成

本研究の目的は、(1)徳之島(鹿児島県)で話されている奄美語の方言の包括的記述を行うこと、(2)その記述を用いて、一般言語学に理論的な貢献を行うことである。徳之島方言はこれまで十分な記述がなされていない「消滅危機言語」であり、その記述は今すぐに行わなければならない喫緊の課題である。この研究の成果は、「参照文法」(ある言語の文法体系のあらゆる項目について参照できるようにまとまった文法書)としてまとめられる。