hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
匂いが摂食行動パターンへ及ぼす影響

脳内オレキシン活性レベルの上昇・下降に伴い、摂食量だけでなく他の摂食行動特性にも有意な変化がみられたことから、オレキシン活性レベルの調節は、捕食から嚥下に至る能動的な摂食行動を制御する要因の一つと推測された。さらに桂花の匂い刺激は、安静時と比較して血糖曲線における速やかな血糖の上昇・下降を引き起こし、唾液血清アミラーゼ値を減少させたことから、オレキシン活性レベルの下降は副交感神経系を賦活することにより、消化・吸収の受動的な活動調節にも関与している可能性が示唆された。桂花匂い刺激による血中糖動態への影響研究方法(ラット):雄性成獣ラット(280-300g, n=10)を用いて,実験前日より絶食状態とし,15分間匂い刺激(1.無臭,2.桂花匂い)を付与した。匂い刺激解除45分後に食前血糖値を測定した。20%糖液(グルコース/体重=1mg/g)を3分間で経口投与し,15分間隔で120分間,尾静脈より採血し,血糖値を測定した。研究方法(ヒト):健常人10名を対象とし,実験前日より絶食状態とし,15分間匂い刺激(1.無臭,2.桂花匂い)を付与した。匂い刺激解除45分後,食前の血糖値を測定した。トレーランG75を6分間で服用させた後,15分間隔で120分間血糖値を測定した。また,別の健常人6名を対象として,経口糖負荷試験を同様に実施し,糖負荷後60分時まで,5-10分間隔で血清インスリン値も測定した。対照実験として同じ健常者6名を対象として,同様の手法にて15分間の匂い刺激を付与し,匂い刺激解除45分後まで15分間隔で血糖値および血清インスリン値を測定した。研究結果:ラット,ヒトともに糖負荷後の血糖曲線において『無臭』条件下に比較して『桂花匂い』条件下では,有意に早い時点(無臭:30-45min,桂花匂い:15-30min)で血糖値は最高値を示した。また,両者とも最大血糖値は『桂花匂い』条件下で低値を示したが,統計学的に有意差を認めなかった。糖負荷後45分・60分時での血糖値は有意差を認めた。また,ヒトでの糖負荷後の血清インスリン反応曲線は,二条件ともに糖負荷直後から30分以内に第一相の最高値を示し,その後再び分泌は持続的に増加して第二相の最高値を示した。『桂花匂い』条件下では,6名中4名は第一相の最高値までの時間が短縮され,第二相の最高値までの時間も,6名中5名は短縮した。糖負荷を行わずに15分間の桂花匂い刺激を付与した条件下では,匂い刺激解除45分後まで血糖曲線および血清インスリン反応曲線において血糖値,血清インスリン値の明らかな変動は認められなかった。桂花匂い刺激による摂食行動へ及ぼす影響:脳内オレキシン活性レベルを上昇させた条件下で摂食行動パターン特性を検討し、桂花匂い刺激によりオレキシン活性レベルを下降させた条件下で摂食行動解析実験を行い、比較検討した。研究方法:雄性成獣ラット(280-300g,n=10)を用いて、左側側脳室に薬物注入用のガイドカニューレ、左側咬筋・顎二腹筋前腹に双極誘導電極を留置した。術後10日の回復期間を経て、オレキシンA(OX-A)(3nmol)あるいはControlとして生理食塩水を脳室内投与した。薬物投与4時間後までの摂食量を測定し、ビデオ撮影による行動解析実験ならびに咀嚼筋からの筋活動記録実験を行い、二条件間で比較検討した。研究結果:I)脳内オレキシン活性レペルを上昇させた条件下:薬液注入後の累積摂食量は二条件間で有意な差を認めた。摂食開始までの時間はOX-A投与条件下で有意に短縮し、摂食率も増大した。また、一定飼料量の咀嚼回数は,OX-A投与条件下で有意に減少した。また、咬筋からの筋活動記録においてControl条件下では、咀嚼準備期および粉砕期に相当する規則的な交替性の筋活動が観察されたが、OX-A投与条件下では咀嚼準備期と粉砕期に相当する筋活動の規則的な交替性が一部消失する傾向がみられた。さらに、OX-A投与条件下において咀嚼準備期では筋活動の最大振幅値の増大、バースト間インターバルの短縮、バースト発生頻度の増加傾向が観察された。一方、粉砕期においては、最大振幅値の増大に加え、バースト持続時間の延長,バースト発生頻度の有意な減少傾向が認められた。II)脳内オレキシン活性レベルを下降させた条件

下:雄性成獣ラット(280-300g,n=10)を用いて、匂い刺激(1.無臭,2.桂花匂い)を付与した状態で、実験III-iと同様の手法で開始後4時間までの摂食量を測定し、ビデオ撮影による行動解析実験にて二条件間で比較検討した。桂花の匂い刺激でOXの脳内活性レベルを下降させた条件下では、摂食量は減少し、同量の飼料を与えた際の摂食開始までの時間は延長し、摂食率は減少した。
鳥類血液寄生原虫のゲノム解析および遺伝情報を応用した分子疫学的研究

ヒトマラリア原虫のアピコプラストゲノムは、熱帯熱マラリア(P.falciparum)など3種において、その全塩基配列が明らかになったが、鳥類血液原虫のアピコプラストゲノムを含む核外ゲノムは部分的な情報しか得られていない。そこで、本年度も昨年度に引き続き、本ゲノムの解析を行った。また、鳥類血液寄生原虫を対象に2例ほど報告がある定量PCR法による原虫診断について、上記のゲノム解析を含めて得られたゲノム情報を利用し、3つのゲノムの各遺伝子を標的として検討を行った。結果、3つのゲノム(核、ミトコンドリアおよびアピコプラスト)上の遺伝子のいずれにおいても、従来のPCR法よりも感度が100倍以上高いことが明らかとなった。さらに、原虫特異的な細胞小器官であるアピコプラストの遺伝子を標的とした際にもっとも特異性が高いにとが示唆された。したがって、鳥類血液原虫の分子生物学的検出における標的配列としてミトコンドリアゲノムのcytb遺伝子が現在もっとも頻繁に利用されているが、原虫特異的なゲノムであるアピコプラスト上の遺伝子を標的とすることで、より検出能力の高いPCRによる検出系を構築できる可能性があるということがわかった。以上より、いまだ十分に把握されていない我が国における鳥類血液原虫の分布状況や原虫保有鳥種、ベクターとなる節足動物種を明らかにするための原虫検出法の開発に寄与する基礎情報が得られたと思われる。今後は、より最適な原虫特異的配列を増幅するプライマーセットの設計を考慮し、PCR系を改良して野外サンプルの検出に応用することが望まれる。鳥類血液原虫3種(Plasmodium gallinaceum,P.juxtanucleareおよびLeucocytozoon caulleryi)に関して、核外ゲノムであるミトコンドリアゲノムの全塩基配列とゲノム構造を決定し、これまで部分的な情報しか得られていなかったアピコプラストゲノムについても塩基配列を解析した。その結果、不足している鳥類血液原虫類のゲノム情報の充実が図られ、病原体の生物学的特徴の把握や、原虫検出手法の開発に応用が可能となった。また、両核外ゲノムの遺伝子の一部について、遺伝子発現をL.caulleryi血液ステージ虫体においてRT-PCRで確認することもできた。新たに解析したアピコプラストゲノム遺伝子の一部を標的として、実際に野外サンプルから鳥類血液原虫遺伝子の検出を行った。その結果、鳥類と蚊の検体の一部に増幅を認め、アピコプラストゲノム上の遺伝子であることが示唆された。よって、従来のミトコンドリア遺伝子の他、アピコプラスト遺伝子を標的とした検出法も、宿主種を問わずに可能であることが示唆された。鳥類の赤血球には核DNAがあるため、宿主のゲノムと原虫のゲノムが混在しているが、本研究成果はPCRによる検出に際しての特異性を検討するため応用可能であると考えられる。今後は、これらのゲノム解析に基づく原虫検出手法の開発を目標に、原虫特異的配列を増幅するプライマーセットの設計・PCR系の改良・検出限界の検討などに取り組む予定である。本年度の成果により、いまだ十分に把握されていない我が国における鳥類血液原虫の分布状況や原虫保有鳥種やベクターとなる節足動物種が不明なままの感染サイクル解明に寄与する原虫検出手法の開発と実証を目指しか、野外サンプルにおける解析手法の検証を行うことが可能となると思われる。鳥類血液原虫(Leucocytozoon caulleryi)に関して、核外ゲノムであるアピコプラストゲノムの全塩基配列解明を目的とし、ゲノム解析を進めてきた。解析を行う上で、鳥類の赤血球に存在する核DNAによる宿主ゲノムと原虫ゲノムの混在が遺伝子発現解析等へ影響することから、近年ヒトマラリア原虫の診断法の一つとして有力視されているフローサイトメトリー法を利用した鳥類血液原虫の分取を試みた。その結果、L.caulleryiのガメトサイトステージ原虫感染血液において、宿主血液細胞と明確に異なる分画が認められた。また、ソーティングにより特異的分画を分取して内容を観察したところ、一部に宿主血液細胞の混在が認められたものの、ガメトサイト期原虫が約85%を占めていた。本研究成果はPCRによる検出に際しての鳥ゲノムによる非特異反応を削減するのみならず、原虫感染の診断やステージ特異的な遺伝子発現解析を検討する際に、感染血液中からの高純度の原虫ゲノム回収に対して応用が可能であると考えられる。今後は、アピコプラストゲノムならびにミトコンドリアゲノム解析結果に基づく新たな原虫検出手法の開発やステージ別原虫特異的な遺伝子発現解析、また本年度行ったフローサイトメトリー法の改良によるガメトサイト期以外の血液ステージ原虫の検出・分取を目的とした研究に取り組む予定である。本年度の研究成果により、新たな原虫検出系の開発や比較的採取が容易である血液検体からの純粋な原虫ゲノム抽出の可能性、そしてそれを応用した血液原虫のステージ特異的な遺伝子発現解析などの研究が可能になることが期待される。

結果、3つのゲノム(核、ミトコンドリアおよびアピコプラスト)上の遺伝子のいずれにおいても、従来のPCR法よりも感度が100倍以上高いことが明らかとなった。さらに、原虫特異的な細胞小器官であるアピコプラストの遺伝子を標的とした際にもっとも特異性が高いにとが示唆された。したがって、鳥類血液原虫の分子生物学的検出における標的配列としてミトコンドリアゲノムのcytb遺伝子が現在もっとも頻繁に利用されているが、原虫特異的なゲノムであるアピコプラスト上の遺伝子を標的とすることで、より検出能力の高いPCRによる検出系を構築できる可能性があるということがわかった。以上より、いまだ十分に把握されていない我が国における鳥類血液原虫の分布状況や原虫保有鳥種、ベクターとなる節足動物種を明らかにするための原虫検出法の開発に寄与する基礎情報が得られたと思われる。今後は、より最適な原虫特異的配列を増幅するプライマーセットの設計を考慮し、PCR系を改良して野外サンプルの検出に応用することが望まれる。
KRAS変異・高増殖活性型肺腺癌の分子病理学的特性（S100蛋白質の関与）

申請者らは、先行研究で、KRAS変異を伴い且つ高い増殖活性を示す肺腺癌の術後再発率が特に高い事、および変異型KRAS下流の網羅的解析で複数のS100分子が高発現している事を明らかにした。当該研究では、肺腺癌における複数のS100分子の発現解析、および臨床病理学的因子との相関解析を行った。その結果、S100A11は、KRAS変異を伴い且つ高い増殖活性を示す一群において、有意に高い発現を示した。これは、S100A11が、KRAS変異を伴い且つ高い増殖活性を示す予後不良な肺腺癌の一群において、高悪性度を規定する分子基盤の一部を担っている可能性を示唆した。がんの悪性度を規定する分子基盤を明らかにすることは、がんの進展機構を解明する上で、また新規の分子標的療法の開発につながる重要な研究案件である。本研究の目的は、その分子基盤の一端を明らかにすることである。申請者らは、これまでに、KRAS変異を伴い且つ高増殖活性を示す肺腺癌の再発率が特に高いことを明らかにし、また、マイクロアレイを用いたKRAS下流分子の網羅的発現解析から、このような高悪性度肺腺癌の成り立ちに関わる複数の分子種を同定し報告してきた。この成績は、KRAS下流分子の検索が、高悪性度肺腺癌の分子基盤を追求するうえで優れた戦略であることを示していた。申請者らは、更に、プロテオーム解析を追加し、従来の発現アレイ解析では同定できなかたKRAS下流分子を既に網羅している。それらのうち、S100A2とS100A11蛋白質は、その発現レベルがKRAS変異・高増殖活性型肺腺癌において高い傾向がみられ、特に興味が持たれた。申請課題では、研究期間内に、肺腺癌切除材料を対象に、S100A2/S100A11蛋白質の発現解析、および予後との相関解析、また肺癌細胞株を用いた細胞生物学的な機能解析を行い、S100A2/S100A11蛋白質の、KRAS変異・高増殖活性型肺腺癌の分子病理学的特性への関与を明らかにすることを目標としている。当該年度では、肺腺癌切除材料を対象に、S100A2/S100A11の発現レベルを、リアルタイムPCRあるいは免疫染色を用いて定量的・半定量的に解析を行った。また、StageI肺腺癌約100例を対象とし、予後との相関解析を行った。結果、KRAS変異・高増殖活性型肺腺癌では、特にS100A11発現が高い傾向を認めた。また、StageI肺腺癌100例を対象とした予後との相関解析では、S100A11高発現と術後再発との間で、有意な相関を認めた。ほぼ計画通りの進行状況である。申請者らは、これまでに、KRAS変異を伴い且つ高増殖活性を示す肺腺癌の術後再発率が特に高いことを明らかにし、また、マイクロアレイを用いたKRAS下流分子の網羅的発現解析から、このような高悪性度肺腺癌の成り立ちに関わる複数の分子種を同定し報告してきた。この成績は、KRAS下流分子の検索が、高悪性度肺腺癌の分子基盤を追及する上で優れた戦略であることを示していた。申請者らは、更にプロテオーム解析を追加し、従来の発現アレイ解析では同定できなかったKRAS下流分子を既に網羅している。それらのうち、A100A2とS100A11蛋白質は、その発現レベルがKRAS変異・高増殖活性肺腺癌において高い傾向がみられ、特に興味が持たれた。申請課題では、研究期間内に肺腺癌切除材料を対象に、S100A2/S100A11蛋白質の発現解析、および予後との相関関係、また肺腺癌細胞株を用いた細胞生物学的な機能解析を行い、S100A2/S100A11蛋白質の、KRAS変異・高増殖活性肺腺癌の分子病理学的特性への関与を明らかにすることを目標としている。また、StageI肺腺癌約179例を対象とし、予後との相関解析を行った。またStageI肺腺癌179例を対象とした予後との相関解析では、S100A11高発現と術後再発との間で、有意な相関を認めた。ほぼ計画どおりの進行状況である。申請者らは、これまでにKRAS変異を伴い且つ高増殖活性を示す肺腺癌の術後再発率が特に高いことを明らかにし、またマイクロアレイを用いたKRAS下流分子の網羅的発現解析から、このような高悪性度肺腺癌の成り立ちに関わる複数の分子種を同定し報告してきた。

この成績は、KRAS下流分子の検索が、高悪性度肺腺癌の分子基盤を追求する上で優れた戦略であることを示していた。報告者らは、更にプロテオーム解析を追加し、従来の解析では同定できなかったKRAS下流分子を既に網羅している。それらのうち、S100A2とS100A11蛋白質は、KRAS下流で高発現を示し、特に興味が持たれた。申請課題では、研究期間内に肺腺癌切除材料を用いてS100A2/S100A11蛋白質の発現解析、および予後との相関関係、また肺腺癌細胞株を用いた細胞生物学的な機能解析を行い、S100A2/S100A11蛋白質の、KRAS変異・高増殖活性型肺腺癌における分子病理学的特性への関与を明らかにすることを目標とした。当該年度では、StageI肺腺癌179例におけるS100A2/S100A11発現レベルと、KRAS変異/増殖活性との間で相関解析を行った。その結果、S100A11発現レベルは、KRAS変異あり/高増殖活性群において、有意に高い値を示した(P=0.038)。これは、S100A11が、KRAS変異を伴い且つ高い増殖活性を示す予後不良な腺癌の一群において、高悪性度を規定する分子基盤の一部を担っている可能性を示唆した。この結果は、国際誌へも投稿され、掲載された(WOO T, et al. PLos One 2015)。申請者らは、先行研究で、KRAS変異を伴い且つ高い増殖活性を示す肺腺癌の術後再発率が特に高い事、および変異型KRAS下流の網羅的解析で複数のS100分子が高発現している事を明らかにした。当該研究では、肺腺癌における複数のS100分子の発現解析、および臨床病理学的因子との相関解析を行った。その結果、S100A11は、KRAS変異を伴い且つ高い増殖活性を示す一群において、有意に高い発現を示した。これは、S100A11が、KRAS変異を伴い且つ高い増殖活性を示す予後不良な肺腺癌の一群において、高悪性度を規定する分子基盤の一部を担っている可能性を示唆した。前述の如く、当該年度では、肺腺癌切除材料を対象に、S100A2/S100A11の発現レベルを、リアルタイムPCRあるいは免疫染色を用いて定量的・半定量的に解析を行った。また、StageI肺腺癌約179例を対象とし、予後との相関解析を行った。結果、KRAS変異・高増殖活性型肺腺癌では、特にS100A11発現が高い傾向を認めた。またStageI肺腺癌179例を対象とした予後との相関解析では、S100A11高発現と術後再発との間で、有意な相関を認めた。ほぼ計画どおりの進行状況である。呼吸器外科学、人体病理学申請書の計画通り、以下の如くに進める。1前年度に引き続き、肺腺癌手術材料を対象とし、リアルタイムPCRあるいは免疫染色を用いてS100A2/S100A11の発現レベル解析を進めていく。mRNA解析に当たっては、マイクロダイセクション法によって腫瘍細胞と非腫瘍部気道上皮をとりわけた後に定量的RT-PCRを行う。採取・保存されている新鮮凍結検体の質に関しては、前述のこれまでの研究成果に示す如く、本課題の研究項目の完遂に十分な質のものである。また、得られたS100A2/S100A11発現結果と、KRAS変異および増殖活性との相関解析を行い、これら分子の高悪性度肺腺癌(KRAS変異・高増殖活性型肺腺癌)の成り立ちへの関与を、引き続き検証する。2予後との相関解析前年度に引き続きStageI肺腺癌症例を対象とし、S100A2およびS100A11発現と予後との相関解析を、症例数をさらに拡大して進めていく。
ナノ多孔質ガラスに閉じこめたヘリウム4の超流動・固体液体転移

本研究の目的は、ナノ構造中にヘリウム4を閉じ込めたときに現れる新しい量子液体相を探索することにある。すでに平成18年度までの本研究において、孔直径2.5nmのランダムな孔構造を有するナノ多孔質ガラスの中のヘリウム4の超流動転移温度は加圧と共に大きく抑制され、約3.4MPaで絶対零度に到達することを明らかにした。これは、圧力をパラメータとした量子相転移が起きていることを示唆している。定積圧力の測定から得られた固化曲線は、1.4K以下の低温でほぼ温度に依存しないことより、超流動相と固体相の間に超流動を示さない液体相(非超流動相)が存在することを明らかにした。本年度は、非超流動相の熱力学的状態を明らかにするため、断熱法による熱容量測定を行った。その結果、超流動転移温度よりも高温度において熱容量のピークを観測した。この事実は長距離秩序である超流動が起こるよりも高温で短距離的な秩序状態が発達していることを示している。この短距離秩序状態は局在したボース凝縮状態であると考えており、細孔中^4Heの一部がボース凝縮を起こすが、全体としては凝縮体の位相がコヒーレンスでないために超流動を示さない状態である。この状態は^4He原子間の強い相関と多孔体の形成する孔径程度のスケールのランダムポテンシャルによって引き起こされる。極大を示す温度T_B以下では、熱容量の温度依存性はボース凝縮体に特有の励起であるフォノン、ロトンによる寄与により説明できる。これは、超流動転移温度以上の温度でも多孔体の中でボース凝縮体が局在して存在することを明瞭に示している。以上の研究成果はナノ空間中のボース凝縮体の局在状態の存在を提示し、物性物理学にインパクトを与えるものであると考えている。既に平成16年度までの本研究において、孔直径25Åの虫食い状の細孔を持つナノ多孔質ガラス中の加圧下ヘリウム4における超流動転移温度は加圧と共に大きく抑制され、約3.4MPaで絶対零度に到達することを明らかにした。これは圧力による量子相転移が起きていることを示唆している。また、定積圧力測定による多孔質ガラス中ヘリウムの固体相の探索により得られた固体液体共存線は、バルクのものと比較して低温度、高圧力側にシフトした。前述した超流動転移温度の圧力依存性と共に考えると、超流動相と固体相の間に、超流動ではない相が存在することが明らかとなった。この相のエントロピーは、定積圧力の測定から得られた固液共存線が低温で温度にほぼ依存しないことから、固体相のものと同様に非常に小さいということを示唆している。この相の解釈として、多孔質ガラスの細孔径の不均一性に起因する局在したボース凝縮状態が生じていると考えている。定積圧力の測定結果は本年度に開催された国際低温物理学会議(LT24)で報告した。本年度は、前年度に使用した極低温圧力計による定積圧力測定では低温での温度に依存しない固液共存線の測定が不可能であったため、温度一定でサンプルスペースを加圧出来るセルを作成し低温での共存線の測定を試みたが、実験セルの制約上加圧可能範囲が非常に狭く、従って共存線を決定するには至らなかった。さらに多孔質ガラス中における加圧下ヘリウム4の熱容量を交流法により50mKまで測定したが、詳細を明らかにするには至っていない。次年度は、断熱法による多孔質ガラス中ヘリウム4の熱容量測定を行う予定である。すでに平成17年度までの本研究において、ねじれ振り子による測定から、孔直径2.5nmのランダムな孔構造を有するナノ多孔質ガラスの中のヘリウム4の超流動転移温度は加圧と共に大きく抑制され、約3.4MPaで絶対零度に到達することを明らかにした。さらに、定積圧力の測定から得られた固化曲線は、1.4K以下の低温でほぼ温度に依存しないことより、超流動相と固体相の間に超流動を示さない液体相(非超流動相)が存在することを明らかにした。本年度は、非超流動相の熱力学的状態を明らかにするため、断熱法による熱容量測定を開始した。その結果、超流動転移温度よりも高い温度に熱容量のピークが観測され、ピーク温度の圧力依存性は、バルクのヘリウム4におけるラムダ線を0.2K程度低温にシフトしたものとなった。我々は、超流動転移温度と熱容量ピーク温度の不一致の解釈として、この熱容量のピーク温度で、多孔質ガラスの中のヘリウム4が局在したボース凝縮体を形成し始め、より低温で全てのヘリウムがボース凝縮したときにはじめて超流動として観測される、ということを考えている。局在したボース凝縮状態は、多孔質ガラスが形成するランダムポテンシャル、または強い閉じ込め効果によって生じていると考えている。

定積圧力の測定から得られた固化曲線は、1.4K以下の低温でほぼ温度に依存しないことより、超流動相と固体相の間に超流動を示さない液体相(非超流動相)が存在することを明らかにした。本年度は、非超流動相の熱力学的状態を明らかにするため、断熱法による熱容量測定を行った。その結果、超流動転移温度よりも高温度において熱容量のピークを観測した。この事実は長距離秩序である超流動が起こるよりも高温で短距離的な秩序状態が発達していることを示している。この短距離秩序状態は局在したボース凝縮状態であると考えており、細孔中^4Heの一部がボース凝縮を起こすが、全体としては凝縮体の位相がコヒーレンスでないために超流動を示さない状態である。この状態は^4He原子間の強い相関と多孔体の形成する孔径程度のスケールのランダムポテンシャルによって引き起こされる。極大を示す温度T_B以下では、熱容量の温度依存性はボース凝縮体に特有の励起であるフォノン、ロトンによる寄与により説明できる。これは、超流動転移温度以上の温度でも多孔体の中でボース凝縮体が局在して存在することを明瞭に示している。以上の研究成果はナノ空間中のボース凝縮体の局在状態の存在を提示し、物性物理学にインパクトを与えるものであると考えている。
リーマン多様体の共形変形に於けるスカラー曲率の方程式の解空間の構造について

本年度の研究では、対象を、主として、正のスカラー曲率を持つコンパクト・リーマン多様体M^^-から、そのコンパクトな部分多様体Σを除いた開部分領域上に絞った。このような領域の特徴は、一般化された立体射影により、スカラー平坦な(すなわち、0・スカラー曲率を持つ)領域に共形変形されることである。主結果の第一では、M^^-\Σ上の滑らかな非正の関数fの絶対値が、Σへの距離関数r_Σのl乗に近い挙動を示す時、fを実現するスカラー曲率の方程式の解で、スカラー平坦な計量で考えてΣで発散するものは一意であることを、Σの余次元が2より大である時に示した。これに類した結果は、Σの余次元が1である場合と、ユークリット空間上(M^^--S'.Σ={1点}と同値)の場合しか知られていなかったものである。主結果の第二では、さらに、Σ={1点}ならば、上記の様なfに対して、スカラー曲率の方程式の解空間は、(0.+∞]でパラメトライズされることを示した。これは、ユークリッド空間上でのCheng-Niの結果を、M^^-がスカラー曲率正のコンパクト多様体である場合に、完全に一般化したものである。なお、Σが二点以上の場合は、特徴付けはより複雑化することも、同時に観察した。これらの結果は、他の弱冠の結果とあわせて、preprint “Structure theorems of the scalarcurvetureequationon subdomains of a compact Riemannion manifold"として、まとめ、現在投稿中である。
脂質メディエータによる軟骨代謝制御機構の解析

本研究の目的は、脂質および脂質メディエータが、ヒトの関節疾患(関節リウマチ、変形性関節症等)における骨軟骨変性にいかに関与しているかを明らかにすることである。本年度は、脂質メディエータのうち、セラミド関連スフィンゴ脂質であるスフィンゴシン1リン酸(sphingosine-1-phosphate;S1P)に着目し、ヒト軟骨細胞を用いて次の実験を行なった。各関節疾患および外傷患者より、手術時に採取した軟骨より軟骨細胞を分離し、単層培養した。これら培養ヒト関節軟骨細胞を、各濃度のS1Pにより試験管内で一定期間刺激した。培養後の軟骨細胞から、定法に従いmRNA,培養上清、ライゼート等を抽出し、S1P刺激前後での軟骨細胞における各種マーカーやサイトカイン産生等を比較した。以上の実験より、以下の知見が得られた。1.ヒト軟骨細胞・軟骨組織は、S1P受容体であるG蛋白結合受容体EDG/S1PRを発現していた。2.軟骨細胞をS1Pで刺激すると、プロスタグランジン(PG)E_2の産生増加,シクロオキシゲナーゼ(COX)-2の発現増強が認められた。S1P刺激によりERK・p38MAPKのリン酸化が認められた。さらに、PGE_2増加はG蛋白受容体阻害剤pertussis toxinで阻害された。3.S1Pは、用量依存的に軟骨細胞のプロテオグリカン・アグリカン発現を低下させた。以上より、S1Pおよびその受容体を介したシグナルが、ヒト軟骨において軟骨代謝の一部を制御しており、関節疾患における軟骨変性に関与している可能性が示唆された。本年度は、脂質メディエータのうち、セラミド関連スフィンゴ脂質であるスフィンゴシン1リン酸(sphingosine-1-phosphate ; S1P)に着目し、ヒト軟骨細胞を用いて次の実験を行なった。各関節疾患および外傷患者より、患者のインフォームドコンセントを得て手術時に採取した軟骨より軟骨細胞を分離し、単層培養した。これら培養ヒト関節軟骨細胞を、各濃度のSIPにより試験管内で一定期間刺激した。培養後の軟骨細胞から、定法に従いmRNA,培養上清、ライゼート等を抽出し、SIP刺激前後での軟骨細胞における各種マーカーやサイトカイン産生等を比較した。1.ヒト軟骨細胞および軟骨組織には、S1Pの受容体であるG蛋白結合受容体EDG/S1PRファミリーの発現がみられた。この発現には個体差が認められ、疾患による特異性は明らかではなかった。2.培養ヒト関節軟骨細胞をSIPで刺激すると、プロスタグランジン(PG)E_2の産生が増加し、これにはシクロオキシゲナーゼ(COX)-2の発現増強が伴っていた。SIP刺激により軟骨細胞においてERKおよびp38MAPキナーゼのリン酸化が認められた。さらに、PGE2増加はG蛋白受容体阻害剤であるpertussis toxinで阻害されたことから、EDG/S1PRを介したシグナル伝達であることが示された。3.S1P刺激軟骨細胞では、プロテオグリカンであるアグリカンの発現が低下した。【目的】脂質メディエータが、ヒト関節疾患(関節リウマチ、変形性関節症等)における骨軟骨変性にいかに関与しているかを明らかにする。【背景】

昨年度我々は、ヒト関節軟骨細胞が、スフィンゴシン1リン酸(sphingosine-1-phosphate;S1P)に対するG蛋白結合受容体EDG/S1PRを発現していること、また軟骨細胞をS1Pで刺激すると、シクロオキシゲナーゼ(COX)-2の発現増強を伴うプロスタグランジン(PG)E2の産生増加がみられることを報告した。またS1P刺激軟骨細胞では、プロテオグリカン・アグリカンの発現が低下する可能性を見いだした。本年度はS1Pの軟骨細胞に対する異化作用をさらに検討するため、ヒト軟骨細胞を用いて次の実験を行なった。【方法】各関節疾患および外傷患者より、患者のインフォームドコンセントを得て手術時に採取した軟骨より軟骨細胞を分離し、単層培養した。これら培養ヒト関節軟骨細胞を、各濃度のS1Pにより試験管内で一定期間刺激した。培養後の軟骨細胞から、定法に従いmRNA,培養上清、ライゼート等を抽出し、S1P刺激前後での軟骨細胞における各種マーカーやサイトカイン産生等を比較した。【結果】1.S1P刺激後の軟骨細胞では、アグリカン産生量の減少が認められた。この減少は、COX阻害薬meloxicamでの前処理により抑制され、また添加S1Pの用量依存性に認められた。OA由来軟骨細胞・外傷由来軟骨細胞とも同様の所見が認められた。2.GPCR阻害薬pertussis toxin(PTX)で軟骨細胞を前処理したところ、アグリカン産生低下はPTXの用量依存性に抑制された。4.S1P添加により、軟骨細胞でのアグリカンmRNA発現低下が認められ、転写レベルでの抑制が考えられた。【考察】S1Pおよびその受容体を介したシグナルが、ヒト軟骨細胞において、プロテオグリカン発現低下を介して関節疾患における軟骨変性に関与している可能性が示唆された。
四種硫黄同位体から読む嫌気的硫黄代謝の進化

四種硫黄同位体分析法の高精度分析を確立し,岩石試料・湖水試料・微生物培養実験試料のそれぞれに適用した結果次のような事が明らかになった。35億年前の硫酸塩鉱物に含まれる硫化物の四種同位体組成から当時、硫酸還元菌が活動した証拠を得た。一方、光合成硫黄細菌活動の類似環境として現在の成層湖において昨年から湖水の硫酸・硫化水素の観測および採取試料の培養実験を行って来たが、その結果、硫黄細菌の光合成活動が活発な夏の成層期には湖水中で硫酸還元と硫黄の酸化が生じていることが明らかになった。さらに、その期間は特異な四種同位体分別が見られる事から、存在度の低い^<36>Sの分析を高精度に行う事によって過去の嫌気光合成生物による硫黄酸化活動を検知できる可能性を示唆する結果となった。硫黄同位体分析法の改善のため多段回ガスクロマトグラフィーを導入した。この結果、イオウ同位体分析精度が^<36>Sについて3倍程度に向上する事に成功した。既に採集された岩石約40試料について硫黄抽出を行い、その同位体比分析を行った。その結果、約30億年前の同位体異常が無いと見なさた時代の岩石に小さいながらも有意な同位体異常が存在する事が明らかになった。これは当時の酸素濃度が低かった事を示唆する結果であり、論争に一石を投じる結果となった。また硫化水素試料の回収のため船内に持ち込み可能な小型真空ラインを作成したのち、沖縄トラフにおいて熱水調査に参加し試料を採集するとともに、現在の海底熱水に生息する原始的原核生物が生成する硫化水素と熱水に含まれる無機的硫化水素の両者が示す硫黄同位体比を実測した。その結果、生物代謝がしめす同位体比の特徴としてD^<33>S値のみが高いという結果を得た。一方微生物過程による同位体比分別係数を決定するため、元素硫黄還元菌の培養実験を開始し予察的な分析を行った結果、同種の原核生物が示す同位体分別は硫酸還元菌のそれと比較して極めて小さいらしい事が明らかとなりつつある。これは硫黄同位体組成を用いてこれら二種の生物代謝が区別可能である事を示唆している。前年度までに確立した四種硫黄同位体分析法を岩石試料・湖水試料・微生物培養実験試料のそれぞれに適用し、一部の結果についてさらに解析を進めた結果次のような事が明らかになった。35億年前の海水硫酸は硫黄不均化反応による硫酸と同位体異常を持つエアロゾル硫酸の混合である事が分かった(Ueno et. al., 2008 GCA)。当時のエアロゾルの同位体組成が推定されたことで、今後古大気組成についての制約が可能となり、あらたな研究へ発展した。またこの硫酸塩鉱物に含まれる硫化物の四種同位体組成を高精度に決定した事により35億年前の硫酸還元菌活動を強く支持した(Ueno et al., 2008 GCA)。これらの結果は継続中の純粋培養による硫黄代謝同位体比分別係数の決定と合わせて太古代の大気・生物硫黄循環を解析する上で予想以上に重要な事が分かりつつある。
薬物による眼内新生血管の抑制

1.虹彩血管新生モデル:黒色家兎の角膜輪部に切開を加え、血管新生因子である塩化第2銅10-40μgを含むペレトを前房内に移植した。14日後に虹彩の新生血管を前眼部写真撮影および前眼部蛍光撮影を行い、その後に眼球を摘出し組織学的に検索した。塩化第2銅を移植した9眼中5眼(55.6%)に虹彩血管新生を認め、塩化第2銅を含まないペレットを移植した2眼には血管新生を認めなかった。この虹採血管新生モデルを用いて、血管新生抑制剤(FR118487)の2%燐酸緩衝液を点眼投与し、血管新生の抑制を観察した。塩化第2銅のペレトを移植した翌日から1日2回14日間点眼をし、前眼部観察および前眼部蛍光撮影を行って血管新生を観察したところ、12眼中4眼(33.3%)に血管新生を認め点眼をしない群に比べ新生血管の発生は抑制される傾向を示した。家兎眼での新生血管モデルでは、その発生頻度が低くモデルとしての安定性に欠けるので、サル眼での血管新生モデルの形成を試みた。家兎眼と同様の方法で、塩化第2銅を前房内に移植したところ、2眼中2眼に虹彩血管新生を見、塩化第2銅を含まないペレットを移植したものや、角膜に切開を加えただけの眼では新生血管は発生しなかった。今後、サル眼での虹彩血管新生モデルで研究を続けたい。2.硝子体血管新生モデル:家兎眼の硝子体に塩化第2銅を移植し血管新生抑制因子を、(1)10mg/kg全身投与したときにはほぼ100%に血管新生が抑制され、(2)2%に溶解した燐酸緩衝溶液を1日2回点眼投与したところ33.3%に血管新生の抑制効果がみられた。点眼投与では確実な薬剤の吸収がされていないことが疑われ、今後軟膏製剤を作りより確実な吸収を期して研究を進たい。
生物学的関係に拘束されない親子関係についての国際比較研究

現代の欧米で、異性愛の夫婦と彼らの生物学上の子供たちから構成される中流階級の白人核家族は、揺らぎ多様化している。グローバル化の中で国境を越えて親子関係が形成されることも稀ではない。外国から養子をもらうことで形成され国際養子縁組家族もその一例である。本研究は、北欧社会の事例を中心にその特徴を以下の結論をえた。第一に、国際養子縁組家族では、従来の核家族を構成する「文化」と「自然」が反転している。第二に、国際養子自信は受け入れ国の市民として自己規定するのに対して周囲は出生国や生物学的つながりを重視し、それが養子に対する「差別的」ステレオタイプにつながっている。今年度は海外調査に先立ち、連携研究者の上杉富之成城大学教授と石原理埼玉医科大学教授とともに、同性婚、提供配偶子による生殖医療なども視野に入れて、研究計画を検討した。また国際比較分析のため、日本国内で養子縁組支援に関わる家庭養護促進協会神戸事務所を片岡が訪問し、日本の養子縁組の事情について情報収集した。海外調査では、まず片岡がフィンランドにおいて、中国から子どもを養子縁組した女性と、海外・国内の養子縁組後の家族について実践的な研究を行なっている専門員にインタビューした。出口はスウェーデンで国際養子家族および国際養子縁組を申請している夫婦にインタビューした他、石原とともに、過去にインタビューした国際養子家族のフォローアップ調査を行った。片岡のフィンランドの事例も含めて養子縁組を行なおうとする人たちの動機は決して同じではなく、シングルの女性でも養母になっていたり、不妊でなくとも人道主義的観点から国際養子をもらおうとする夫婦もいることがわかった。また出口と石原は、スウェーデンのヨテボリ大学で子宮移植の研究の現状について、スコーネ大学マルメ病院で提供配偶子による生殖医療の現状について、調査した。後者では、精子提供で生まれた17歳の男の子が提供者情報を求めてきており、これが1985年の人工受精法施行以来スウェーデン国内で二例目にあたることがわかった。今年度終わりには、国際養子を拠出する韓国でも調査を行うことができた。出口、片岡、上杉は、韓国で親のいない子どもを海外に斡旋する活動をしている福祉団体、養子として海外に送り出された子どもが出生国を訪問するための支援を行なうNPOを訪問した。どちらにおいてもシングル・マザー支援の重要性が課題とされていることが分かった。研究代表者である出口は連携研究者の石原とともに前年度に引き続き、国際養子縁組家族の調査をスウェーデンとデンマークで実施した。両国とも縁組み件数が近年減少しており、斡旋機関が閉鎖されたり縮小されたりしている。そのため関係者が危機意識を持ち打開策を検討していることがわかった。さらにスウェーデンのヨテボリ大学医学部で行われた子宮移植手術の経過を代表者のマッツ・ブランドストスム教授にインタビューし、家族や友人から子宮移植が行われたことと、移植した子宮による妊娠・出産は、うまくいけば2014年の夏以降になることがわかった。またスウェーデンのゲイとしてははじめてインドに渡航し代理出産により双子の父親になったシングル男性に取材できた。彼の家族形成は職場でそして彼の家族からも好意的に迎えられていることがわかった。また出口は2012年に引き続き養子拠出国の韓国での調査を行った。国際養子たちは同じ韓国で生まれたにせよ育った文化が異なるからもはや「同じ韓国民」ではないし「在外韓国人」でもないと、人びとが考えていることがわかった。一方分担者である片岡は、フィンランドの国際養子家族を継続調査した。その結果、他の養子縁組家族との交流が生活情報や精神面で養親・養子の支えになっていることがわかった。また片岡のアメリカの国内養子縁組家族斡旋機関の調査では、異性愛カップルによる大家族という「理想の家族」像のために養子縁組が選択されることもわかった。出口は,スウェーデンの国際養子縁組家族のインタビュー調査を継続した。前年までに調査した家族の追跡調査だけでなくあらたな家族にもインタビューした。同じ時に同じ国から養子をもらった親たちが緊密なネットワークを形成していること,養親たちの多くが都市の中心部の裕福なエリアに居住していることが確認できた。さらに連携研究者の石原とともにインド人代理母に双子を産んでもらったシングルのスウェーデン人男性にインタビュー,代理出産契約の内容、親権獲得の手続きについて調査した。また単独でノルウェーのオスロ大学やスウェーデン・ルンド大学の研究者らと研究の推進について意見交換した。片岡はフィンランドにおいて,アジアから子どもを養子に迎えたフィンランド人の養親にインタビュー調査を実施した。調査では,子どもと血縁関係がないだけでなく外見も全然異なる養親がどのように「自分たちは家族である」という認識を形成しているのかを、養子縁組後15年経つケースと5年経つケースを比較して把握することに努めた。共通の文化や習慣,生活史の共有による行動の類似性や円滑な相互作用が確認されたとき,「自分たちは家族である」という認識を安定化させることが分かった。連携研究者の石原は出口と合流する前にスウェーデンのストックホルムで,スウェーデンにおけるDIによる出生児による精子提供者の情報を求めた新たな例がないこと,またART管理システム事業が,保健省直轄のデータ収集方式から第三セクターへ移行したことをインタビュー調査で確認した。またヨテボリ大学で実施された子宮移植手術プロジェクトと未受精卵子凍結プログラムについてを調査した。前者については既に二例の手術が行われ,経過が良好であること,また法律で禁止されている代理懐胎の代替策になる可能性があることなどがわかった。後者はすでに100例行われたことが確かめられた。出口は、スウェーデンとデンマークで国際養子家族の継続調査を実施した。

今年度は初めてデンマーク自治領のフェロー諸島で行ったインタビューで、養子家族のうち三家族はいずれも男性不妊が原因で国際養子を選択したが、デンマークの精子バンクを利用した提供精子による人工授精を最初から選択しなかったことがわかった。またスウェーデンの国際養子縁組評議会を訪れ、近年国際養子縁組が減少している理由を探った。子どもの出生国内での養子縁組が増加していることが主な原因と思われる。連携研究者の石原は、子宮移植研究に従事するヨテボリ大学のMats Branstrom教授を訪問し、出産が間近に迫った妊娠例の経過についてインタビューをするとともに、この治療の科学的意義と社会的・文化的意義について討議し、今後の心理学者によるフォローアップ研究へ関与する可能性について相談を行った。次いで、フェロー諸島のフェロー国立病院Katrin Kalsberg医師を訪れ、人口約3万人に過ぎない同国における生殖医療を含む産婦人科医療全体の提供体制と、医療受給者に対する社会的支援・援助の実態についてインタビューした。外国医療機関による国民への医療提供依頼など、次善的解決策の採用について、有益な討議を行った。片岡は、アジアを養子縁組しているフィンランドの養親にインタビュー調査を行なった。養子個人の意思に養親が寄り添いながら尊重することで,養親子関係の「かけがえのなさ」についての認知が強まることが伺えた。また,日本で里親として子どもを養育している人にもインタビュー調査をした。フィンランドとの相違点としては,生物学的親の存在が強く意識されていた。アメリカにおいては,血縁関係にない親子関係についてどのように見られているか,大学生等に話を聞いた。その成果は片岡の博士論文に盛り込まれた。研究の最終年度である今年度は、これまでの理論モデルを検証すべく、補充調査をおこなった。片岡はフィンランドの国際養子縁組の養親へのインタビュー調査を行った。その結果、養子が生物学的親や自分自身のルーツの探求を実際に行なうのを養親たちが容認し協力する場合、養子がティーンエイジャーになった頃であることが分かった。そうしたルーツ探求を実際に経験したことで、養子が自分自身に納得でき、生物学的親や出生国への想いに一区切りがついたという。出口はスウェーデンならびにデンマークで生物学的母親に会うことのできた国際養子たちにインタビューした。生みの親と再会しても養父母との関係は変わることなく継続されること、言葉の通じない生物学的母親との間で親密な親子関係を構築・継続するのは難しいこと、すべての再会がハッピーエンドにはならないことがわかった。その一方で今までおとぎ話の架空の世界のように感じられた出生国が訪問することによってリアルな存在に変わり、養子のアイデンティティのなかで占める割合が大きくなる事例があることもわかった。
遺伝子工学的手法を併用した組織修復治療の研究

骨髄間葉系細胞に皮膚や骨の再生治療は、臨床で倫理委員会でも承認され、現在臨床治療研究へと大きく進展した。皮膚においては、熱傷や、高齢者の褥瘡、外傷などによる深部に達する皮膚損傷の治療に15患者に施行し、その有効性が確認された。骨の再生治療に関しても15症例において施行し、いずれも満足すべき結果が得られている。今後さらに臨床治療研究をすすめてゆく展望をもつことができた。骨髄間葉系細胞の増殖因子として、また、分化促進因子として大豆蛋白の成分であるgenisteinが、骨形成促進因子に成りうることを発見し、ラットおよびヒトにおいて骨髄細胞の骨形成細胞への分化能力を2倍以上促進することを発見し、骨再生治療に役立つことを証明した。また、女性ホルモンの1種であるエストリオールが促進因子として有効であることも発見した。生理的濃度で、骨髄細胞の増殖因子、分化因子として極めて有効で、エストリオールは発ガン性もなく生体内に存在するホルモンであるため安全で、再生医療には実用的である。倫理委員会でも承認され、現在エストリオールを新たな促進因子として培地に添加し皮膚や骨の再生治療研究を展開中である。研究分担者の植村らは、血管誘導因子であるVEGFを、ラットの培養骨髄細胞に遺伝子を導入し、人工骨を組み合わせることで、血管の新生を促進する研究を試みている。また、骨発生のキー遺伝子であるcbfa-1遺伝子を骨髄間葉系細胞へ導入し、骨発生の促進効果を検討した。骨芽細胞の増殖分化に関わる蛋白にひとつであるオステオポンチンの遺伝子を作製し、アデノウイルスベクターに組み込み培養骨髄細胞に発現させた。遺伝子効率をしらべるとともに、発現したオステオポンチンがin vitroにおいて骨芽細胞の分化にどのような影響を与えるか調べた。オステオポンチン遺伝子の組み換えアデノウイルスの力価は有効な価が検出され感染させた細胞のうち3日後で約72%、7日後で約94%の細胞が組み換えアデノウイルス由来のLac-Z遺伝子を発現していることが判明した。この発現は時間とともに減少するが3週間持続することがわかった。オステオポンチン遺伝子を過剰発現させた細胞のアルカリフォスファターゼ活性は感染後1週間で1.5倍上昇し、肉眼的にも石灰化組織の形成が多数見られた。また、組織の再生に不可欠な血管の新生を促進する血管増殖因子VEGFを組み込んだプラスミドを培養骨芽細胞に導入して培養し、分泌されるVEGFをウエスタンブロット法で測定した。VEGFを過剰発現させた細胞では、その分泌が3倍促進させることに成功した。以上、オステオポンチンと血管増殖因子に関しては遺伝子導入に成功し、その発現による有効な骨再生の促進効果や因子の分泌の促進が確認できた。以上のデータは今年の研究会や学会で報告した。さらに、分泌効率を高めれば、より高い骨再生、組織の再生能力を細胞からひきだすことができ、広範に欠損した組織の修復が可能になると考えられる。骨蛋白にひとつであるオステオポンチンの遺伝子を作製し、アデノウイルスベクターに組み込み培養骨髄細胞に発現させた。遺伝子効率をしらべるとともに、発現したオステオポンチンがin vitroにおいて骨芽細胞への分化を促進せることができた。また、組織の再生に不可欠な血管の新生を促進する血管増殖因子VEGFを組み込んだプラスミドを培養骨芽細胞に導入して培養し、分泌されるVEGFをウェスタンブロット法で測定した。以上のデータは、研究会や学会で報告した。

一方、臨床への応用技術も向上させた。培養骨髄細胞の治療研究に関しては熱傷についてはおこなっているが、最近ではさらに高齢者の褥そうや、難治性の下腿の潰瘍の治療、高齢者の骨折や人工関節の治療に成功した。人工骨材料としては、セラミックや吸収性人工骨を用い患者への臨床応用に成功した。骨髄間葉系細胞に皮膚や骨の再生治療は、臨床で倫理委員会でも承認され、現在臨床治療研究へと大きく進展した。皮膚においては、熱傷や、高齢者の褥瘡、外傷などによる深部に達する皮膚損傷の治療に15患者に施行し、その有効性が確認された。骨の再生治療に関しても15症例において施行し、いずれも満足すべき結果が得られている。今後さらに臨床治療研究をすすめてゆく展望をもつことができた。骨髄間葉系細胞の増殖因子として、また、分化促進因子として大豆蛋白の成分であるgcnisteinが、骨形成促進因子に成りうることを発見し、ラットおよびヒトにおいて骨髄細胞の骨形成細胞への分化能力を2倍以上促進することを発見し、骨再生治療に役立つことを証明した。また、女性ホルモンの1種であるエストリオールが促進因子として有効であることも発見した。生理的濃度で、骨髄細胞の増殖因子、分化因子として極めて有効で、エストリオールは発ガン性もなく生体内に存在するホルモンであるため安全で、再生医療には実用的である。倫理委員会でも承認され、現在エストリオールを新たな促進因子として培地に添加し皮膚や骨の再生治療研究を展開中である。研究分担者の植村らは、血管誘導因子であるVEGFを、ラットの培養骨髄細胞に遺伝子を導入し、人工骨を組み合わせることで、血管の新生を促進する研究を試みている。また、骨発生のキー遺伝子であるcbfa-1遺伝子を骨髄間葉系細胞へ導入し、骨発生の促進効果を検討した。
新規遺伝子改変法によるメサンギウムの糸球体形成と糖尿病性腎症への系譜的役割の解明

糖尿病性腎症におけるメサンギウム細胞の役割を成体にて検討するために、まずタモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスにおいて糸球体ではメサンギウム特異的にCre recombinaseを発現することを、Cre依存的β-galactosidase発現マウスとの掛け合わせで証明した。よって、このマウスを使って注目する分子のメサンギウム細胞における役割を成体にて解明できることがわかった。次にタモキシフェン誘導型Foxd1-CreマウスとTSC1 floxedマウスとの掛け合わせによりメサンギウム細胞にてTSC1を欠失させ、mTOR経路の活性化をおこしたところ、collagen IVの発現増加やPAM染色領域の増加がみられ、mTOR経路の活性化のみでもメサンギウム細胞にて形質変化、硬化を起こしうることをin vivoにて世界で初めて証明できた(J Am Soc Nephrol. 2017;28:2879-2885)。またPodocin-CreマウスとCre依存的BMP4過剰発現マウスやCre依存的TGF-β1過剰発現マウスを掛け合わせることにより、糸球体でのBMP4やTGF-β1の効果とその表現系の違いを比較検討中であり、一部の成果を報告した(Sci Rep. 2018;8:13011.)。次にタモキシフェン誘導型Foxd1-CreマウスとCre依存的安定化β-catenin発現マウス、Cre依存的β-catenin floxedマウスを掛け合わせることによりWnt/β-catenin経路のメサンギウム細胞における糸球体硬化形成における役割を解析中である。同時にタモキシフェン誘導型Foxd1-CreマウスとCre依存的BMP4過剰発現マウスやCre依存的TGF-β1過剰発現マウスをも掛け合わせており、現在この表現系も比較検討中である。in vitroではDynabeads method (Am J Pathol. 2002;161:799-805.)由来の糸球体からメサンギウム細胞を単離する手法を模索し、以前採用していたSieving methodより、簡便かつ効率的にメサンギウム細胞が培養する方法を確立した。in vivoではまずCre依存的BMP4過剰発現マウスをFoxd1-Creマウスと掛け合わせた。Foxd1-Creマウスは出生時にはメサンギウム細胞に(Development. 2014;141:346-54.)、生後1ヶ月の時点で糸球体全体にCre recombinaseが誘導されるため(J Clin Invest. 2016;126:1926-38.)、出生時糸球体形成へのメサンギウム細胞の役割を明確にするのに有用、かつタモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスとの掛け合わせにて起こる表現型を予測するのに効率的である。その掛け合わせにより、Foxd1-Cre陽性Cre依存的BMP4過剰発現マウスは胎生致死にはならないことが確認できた。この所見から、タモキシフェン誘導型Foxd1-CreマウスとCre依存的BMP4過剰発現マウスの掛け合わせにて、マウス成体においてメサンギウム細胞におけるBMP4過剰発現の表現型を検討することができることが明らかになり、現在、掛け合わせを施行し、目的とするタモキシフェン誘導型Foxd1-Cre陽性Cre依存的BMP4過剰発現マウスを作成している。また、Cre依存的TGF-β1過剰発現マウスをJackson Laboratoryから、Cre依存的安定化β-catenin発現マウスを京都大学より入手した。上記と同様にFoxd1-Creマウス、タモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスと掛け合わせ、目的とするマウスを作成中である。in vitroにおいてはほぼ順調に進展しており、とくに培養メサンギウム細胞が比較的容易に採取できるようになったことは予想を超えた成果である。in vivoにおいてはもともと当施設に導入されていたCre依存的BMP4過剰発現マウスに関してはほぼ順調に進展している。逆に、この実験計画に必要とされていたCre依存的TGF-β1過剰発現マウス、Cre依存的安定化β-catenin発現マウスマウスは、動物実験施設への感染マウスの持ち込みをさけるため、いったんマウスをクリーン化してから当施設に導入したため、掛け合わせをはじめるまでに時間を要した。そのためにやや遅れているとした。また、下流のmTOR経路に対して抑制的に働き、細胞増殖や肥大の制御を行っているTSC1のfloxedマウスとタモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスを掛け合わせることによりメサンギウム細胞にてmTOR経路の活性化→ribosomal protein S6のリン酸化をおこしたところTSC1が欠如した糸球体でcollagen IVの発現増加やPAM染色領域の増加がみられ、mTOR経路のみでもメサンギウム細胞にて細胞外基質の増加、形質変化を起こすことをin vivoにて初めて証明できたが、蛋白尿は顕著に排出されなかったことを論文として投稿し、現在in rivisionであり、それも遅れを来した理由となっている。in vitroではDynabeads method (Am J Pathol. 2002;161:799-805.)にてえられた糸球体から、メサンギウム細胞を以前より効率的に培養する方法を確立した。メサンギウム細胞が比較的容易に採取できていることも蛋白の発現などで確認できた。in vivoではまずCre依存的TGF-β1過剰発現マウスをFoxd1-Creマウスと掛け合わせた。