hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大腿骨頭形成による大腿骨頭壊死への新規治療法の開発

1)ヒト大腿骨頭を用いたBFPの力学的試験大腿骨頭に関しては当院で大腿骨頭壊死患者に対して施行される人工股関節置換術の際に廃棄されるヒトの大腿骨頭を用いて行う。画像評価はマイクロCTを用いて行い、圧潰の改善率を算出する。力学的評価としては、外部検査機関に委託して圧縮試験を行う。2)ラット大腿骨頭壊死モデルを用いたX線学評価及び力学的負荷試験アルコール肝炎食を用いてラットのアルコール性大腿骨頭壊死モデルをBFP施行群と非治療群の2群に分けて、継時的な大腿骨頭の圧潰をX線及びマイクロCTにて評価を行う。BFP施行群、正常骨頭群の2群において力学的安定性を評価する。大腿骨頭壊死症は本邦の指定難治性疾患の一つであり、大腿骨頭の一部が血流の低下による壊死が起こることで大腿骨頭の圧潰を来し、疼痛により日常生活に大きな支障をきたす。本疾患の問題点としては比較的若年者に発症することで約半数において両側の股関節に発症する。大腿骨頭壊死に対する新規治療法としては国内では骨髄血移植、線維芽細胞増殖因子など再生医療を用いた報告が近年では比較的多く散見される。一方で医療用セメント及びバルーンを使用した治療として代表的なものとしては脊椎圧迫骨折の偽関節に対するballoon kyphoplastyであり、その安定した治療成績から世界中で広まっている。我々はこの技術を大腿骨頭壊死において応用することで比較的低侵襲に骨頭の圧潰を予防できる可能性があると考えた。平成30年度の期間の間に5個程度の大腿骨頭形成を行った。圧潰早期の大腿骨頭に関してはバルーン形成により球型回復が得られる症例も認められた一方で圧潰から時間経過している症例では球型回復が困難な症例も認められた。またバルーン形成に関してもかなりの強度が必要であり、バルーン部での故障が起こったため、症例検討や処置時の工夫が必要と思われた。良好なバルーン形成が施行できた症例に関してはX線学的にな球型回復率は5%程度得られていた。現状ではマイクロCTでの3次元的な球型回復率の評価やメカニカルテストなどを行う予定としている。その他に追加の研究として過去に治療を行った大腿骨頭壊死骨頭の病理学的な評価も行っており、血管柄付き骨移植、大腿骨頭回転骨切り症例を主に対象とした。病理の結果、大腿骨頭回転骨切り術に関しては一部骨のリモデリングを認める壊死領域が認められた。一方で血管柄付き骨移植では移植した腸骨は長期的な経過においても骨頭骨へのリモデリングはあまり認めなかった。ヒト大腿骨頭を獲得するためには大腿骨頭壊死患者に対する人工股関節全置換術の症例がある程度存在することが前提条件である。その点に関しては前年は比較的症例が少なかったことからヒト大腿骨頭壊死の供給が不十分であり、遅れてしまった。また大腿骨頭壊死を発症してから長期の時間経過をしている症例に関しては圧潰部が変形した状態で骨癒合している場合や骨硬化が著しく強い症例も多く存在するため、そのような症例に対しては本法の適応が困難である。引き続き、骨頭の圧潰が早期で本法により圧潰の修復可能と考えられるようなヒト大腿骨頭壊死を確保し、研究を継続していきたい。動物モデルに関してはヒト大腿骨頭での結果が安定したら移行を検討しているが状況によってはもう少し大きいモデル動物での検討が必要かもしれない。今後も引き続き、積極的に大腿骨頭壊死を獲得し、本法の有効性を評価していきたい。またモデル動物の作成にも引き続き注力し、可能であれば当初の予定よりも大きな動物でできるよう検討していきたい。

圧潰早期の大腿骨頭に関してはバルーン形成により球型回復が得られる症例も認められた一方で圧潰から時間経過している症例では球型回復が困難な症例も認められた。またバルーン形成に関してもかなりの強度が必要であり、バルーン部での故障が起こったため、症例検討や処置時の工夫が必要と思われた。良好なバルーン形成が施行できた症例に関してはX線学的にな球型回復率は5%程度得られていた。現状ではマイクロCTでの3次元的な球型回復率の評価やメカニカルテストなどを行う予定としている。その他に追加の研究として過去に治療を行った大腿骨頭壊死骨頭の病理学的な評価も行っており、血管柄付き骨移植、大腿骨頭回転骨切り症例を主に対象とした。病理の結果、大腿骨頭回転骨切り術に関しては一部骨のリモデリングを認める壊死領域が認められた。一方で血管柄付き骨移植では移植した腸骨は長期的な経過においても骨頭骨へのリモデリングはあまり認めなかった。ヒト大腿骨頭を獲得するためには大腿骨頭壊死患者に対する人工股関節全置換術の症例がある程度存在することが前提条件である。その点に関しては前年は比較的症例が少なかったことからヒト大腿骨頭壊死の供給が不十分であり、遅れてしまった。また大腿骨頭壊死を発症してから長期の時間経過をしている症例に関しては圧潰部が変形した状態で骨癒合している場合や骨硬化が著しく強い症例も多く存在するため、そのような症例に対しては本法の適応が困難である。引き続き、骨頭の圧潰が早期で本法により圧潰の修復可能と考えられるようなヒト大腿骨頭壊死を確保し、研究を継続していきたい。動物モデルに関してはヒト大腿骨頭での結果が安定したら移行を検討しているが状況によってはもう少し大きいモデル動物での検討が必要かもしれない。今後も引き続き、積極的に大腿骨頭壊死を獲得し、本法の有効性を評価していきたい。またモデル動物の作成にも引き続き注力し、可能であれば当初の予定よりも大きな動物でできるよう検討していきたい。
遠隔診療の精度向上をめざしたユーザーインターフェース改善のための研究開発

遠隔診察の際の操作性を改善し、遠隔診察の所要時間の短縮を図るため、我々は遠隔診察を総合的にサポートするソフトウェアの開発を行った。このソフトウェアの仕様には、テレモニタリング・データの登録と閲覧を行える機能、各患者の疾患や病態に応じた診察項目が設定できる機能、画像を含む診察所見から得られた情報を記録し、かつ過去の記録と比較し易い機能、診療記録の多職種間での情報共有を可能にする機能を備えた。また遠隔診察時の患者側での能率的なカメラワークを実現する撮影カメラとその運用システムの開発、及び、モニタデータのアラームシステムも考案し、遠隔診察のための総合的プラットフォームを構築し、その実用実験を行った。I)先行研究での遠隔診察項目ごとの所要時間計測:先行研究で実施した遠隔診察実験の際に撮影した医師側および患者側でのVTR映像を分析し、遠隔診察の際の診察項目ごとの所要時間をリストアップした。その結果の一部は、(1)患者側での診察前のバイタル等の検査が2'07"(2分7秒)3'17"、(2)医師側での各患者の記録画面と日常のモニタリングデータ及び診察前のバイタルデータの表示画面を開く診察前準備作業が、0'33"2'24"、(3)視診を中心とした理学所見の観察が1項目あたり0'39"4'26"、この理学所見については画像保存や所見の入力で、さらに最長で1'30"の追加時間を要した。また、観察(理学所見)の種類では、撮影したい部位の特定や光の条件が難しい皮膚の観察が特に時間を要した。II)簡便な遠隔診療を実現する診療記録作成ソフトの開発:I)の時間計測の中で、視診に相当する診察行為とその記録作業がもっとも煩雑であり、この点の改善も含め、診療記録作成ソフトの開発を企図した。具体例として、テレビ(TV)電話の映像の中から記録したい画像をキャプチャし(必要に応じて動画記録を残したい場合にも対応)、これらがワンタッチで保存され、医師側のPC上の遠隔診察記録画面に自動的に表示されるか、動画の場合はリンクが容易に可能になること、またモニタデータと診療録の効率的連携などである。これらの作業の効率化を図る支援ソフトウェアの仕様書をまとめた。III)分担研究者での機器作成とソフト開発::患者側での診察介助者への支援として、遠隔診察用カメラ(撮影画像を撮影者がみることのできるディスプレイ、光源、ワンタッチ操作での静止画取り込み機能付き)の開発のための仕様書を作成した。また日常のモニタデータの脈拍数、体重、歩数の変化を早期に検出し、警告を発するアラート機能の開発仕様も検討した。計画では遠隔診療記録作業の支援ソフトウェアの開発仕様書作成から発注、契約締結までを初年度で行う予定であったが、この点は仕様書完成までの段階にある。しかし、契約書案まで既にまとめてあり、次年度早々に契約、実際の作業にとりかかれる見通しである。また、分担研究者での作業については、研究代表者との協議を重ねて、仕様書のまとまったものから順次、作業に入る準備が整っている。以上より、おおむね順調に進展していると思われる。本研究の究極の目的は、患者を遠隔地から診察する遠隔診療の普及を促すため、専門的なITに関する知識を持たない医療現場の従事者でも遠隔診療の導入を可能にする、汎用性の高い安価なシステムとプログラムを提示することにある。本課題では、先行研究での実用実験で使用した市販の製品やサービスを組み合わせたシステムを発展させ、医師の記録や患者側介助者の作業などのユーザーインターフェースの改善を目指したソフト・ハード両面での開発を行う。今年度は、診療記録作業の支援やモニタデータを解析するソフトウェアの開発、及び、患者側でのカメラの開発について仕様書を完成し、その発注から作成までの一連の作業を行った。この中でモニタデータの登録に関しては先行実験の際に利用したものと同じASPサービスを活用することを当初、考えていた。しかし、同サービスは当該年度中に終了し、代わりに、データ登録以外に、在宅患者の観察記録も登録できる在宅医療用の総合プラットホームに発展したサービスとなったため、仕様変更を余儀なくされた。それで、このプラットホームを基本に、画像データも含めた医師用の記録機能も拡張要素として加えた仕様への見直しを行った。また、患者側で使用する観察用カメラについても、最近の通信機器に付属したカメラの機能が高精度化しているため、これを利用した、より汎用性の高い仕様への変更を行い、作成に着手した。これらの仕様変更により、遠隔診療に特化した、よりパワーアップした総合的なプラットホームの体裁を整えた遠隔診療支援システムが完成できる見通しとなった。さらに本システムでは、先行研究での実験で用いたコンティニュア対応から、最新のアンドロイド機器にも対応する汎用性の高い設計とした。次年度に実用実験を実施するが、これに使用する新たな構成機器の選定、そして、一部については、発注・納品までを今年度中に実施した。当初計画では、今年度初めまでに、ソフトウェア、専用カメラ等の仕様書を完成し、それぞれの作成にかかる予定であった。しかし、利用を考えていた、モニタデータを登録するための市販のASPサービスが終了となり、代わって、データ登録のみならず、在宅患者の観察記録も登録できる在宅医療用の総合的プラットホームに発展したサービスに変更となった。このため、本研究開発の仕様を上記のプラットホームを基本に、画像データも含めた医師用の記録機能を含む拡張要素を加える形式に変更した。さらに、使用するアンドロイド対応通信機器の最新バージョンに合わせた仕様の見直しもソフト・ハード両面で行う必要が生じた。

以上から、ソフトウェアの正式な契約・発注は、今年度末近くにずれ込んだが、その代わり、詳細な仕様書としたため、発注から完成、納品までの期間は大幅に短縮できる見込みとなり、次年度の実用実験もほぼ遅れずに実施できる見通しになった。また、遠隔診察用カメラの開発についても、アンドロイド対応通信機器を利用する仕様変更を行った。結果として、ソフトウェアの開発は平成29年4月末に納品との契約になっており、これと連携する分担研究者が担当するカメラやモニタデータのアラートシステムなどの開発も同時期の完成とした。このため、次年度初めから、本課題の成果物を用いた実患者を対象とした遠隔診療実験を計画していたが、開始は1か月程度の遅延となる。しかし、今回の実験で新たに購入する必要がある機器については、大半は、開発品の仕様が明らかになった時点で発注・納品としており、実験を行うに際しての臨床研究の倫理審査についても、すでに申請済みであり、実験の準備は順調である。以上より、実用実験開始時期が1か月程度、当初予定より遅れるが、年度内に実験終了から、結果解析を終える期間も十分、残ることから、進捗状況は概ね順調と考える。今年度初めに開発を委託した医師業務の支援ソフトウェア(効率的な診療記録作業を支援するもの、データ解析機能、モニタリングデータの閲覧性を高めたもの)の納品を完了した。また、遠隔診察時の患部撮影画像を、テレビ電話画像よりも高精細な画像で観察するため、患者側で撮影された静止画像をドロップボックスに共有し、医師側で容易に診療録上にコピーできるシステムも開発した。患者側での撮影には、スマートフォンのカメラ機能を利用したシステムを開発した。実用実験では、2017年7月2018年1月の6か月間にわたって、今回の開発品を実装した遠隔診療実験を実施した。対象患者は福島県の高齢者施設(ケアハウス)に居住する、6989歳の男性3名と女性5名の計8名で、いずれも状態の落ち着いている慢性疾患(高血圧5名、糖尿病3名、リウマチ性多発筋痛症2名、ほか)患者であった。対象者には実験に先立って各測定器が配布され、毎日の血圧、脈拍、体温、体重、歩数の各測定データは、ケアハウスの職員によって、定期的に外部サーバへアップロードされた。そして、月1回、東京のクリニックと、福島県のケアハウスにある診察室を結んだ遠隔診察を実施した。また、実験開始時と終了時に遠隔診療を行う医師が現地に赴いて、遠隔診察時の所見と比較する目的で対面診察も行った。対象患者ごとに特有なプロブレムリストを遠隔診察セッション開始時に診療支援ソフトに予めインストールしておくことで、診察時の医師の記録業務は効率化された。また、モニタリングデータのグラフ表示も、表示期間の選択肢の増加や複数種のデータの並行表示により、各種データ間の関連や時系列変化を読み取ることが容易になった。一方、スマートフォンのカメラによる患部の観察は、光源が白っぽいため、色調の変化や立体感を向上させるには不十分であり、今後の課題となった。遠隔診察の際の操作性を改善し、遠隔診察の所要時間の短縮を図るため、我々は遠隔診察を総合的にサポートするソフトウェアの開発を行った。
大脳皮質と皮質下の相互作用による社会的認知発達機構とその障害の解明

生後視覚経験のない新生児でも、顔を好んで見る。しかし、この顔の選好は一時的に消失し、生後数ヶ月後に再び現れる。このU字型の顔選好の行動変化の背景にある脳神経機構とその発達的変化を明らかにするために、網膜上のS-coneだけを刺激する視覚刺激を用いて、生後2ヶ月・4ヶ月・6ヶ月で、普通の輝度刺激と、このS-cone刺激で、正立顔の選好現象があらわれるかを調べた。その結果、4-6ヶ月は輝度刺激も、S-cone刺激も同程度に正立顔を選好した。一方、2ヶ月は、輝度刺激では選好がみられないのに、S-cone刺激では正立顔の選好がみられた。以上のことから、顔選好のU字変化の底辺においては、皮質機能はすでに発達しはじめているのに、皮質下と大脳皮質の連携が上手く機能していない可能性が明らかになった。この結果を論文にまとめて、英文査読誌に掲載された。つぎに、社会性の障害が主症状の自閉症では、皮質下の顔認知処理経路と大脳皮質の顔認知処理経路のどちらが障害を受けているのかを明らかにするため、同様のS-cone刺激を用いて、彼らの顔認知処理の神経機構に定型発達群と違いがあるかを調べた。自閉症の幼児20名と、発達年齢をマッチさせた定型発達の幼児20名に参加してもらい、正立顔の選好率をS-cone刺激と輝度刺激でそれぞれ計測した。その結果、輝度刺激では両者の選好率に違いはなかったが、S-cone刺激では、定型発達群は高い正立顔選好を示したのに対し、自閉症群ではそのような正立顔バイアスが生じていなかった。このことから、大脳皮質経路の何らかの異常が彼らの社会性認知障害を引き起こしている可能性が考えられる。現在、この結果を論文にまとめて、英文査読誌に投稿中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。生後視覚経験のない新生児でも、顔を好んでみる。しかし、この顔の選好は一時的に消失し、生後数ヵ月後に再び現れる。まず、乳児のリクルート体制を構築するため、補助員を一名やとい、100名ほどの乳児をリクルートして、研究に参加してもらうことができた。その結果、4ー6ヶ月は輝度刺激も、S-cone刺激も同程度に正立顔を選好した。当初は、成人を対象にして、S-cone刺激の開発をする予定であったが、すでに開発が完了し、乳幼児を対象とした研究を行うことが出来、さらに結果もでて、論文としてまとめて投稿している。乳幼児でえらえた知見に基づき、自閉症スペクトラム障害の子供にも同様の行動研究を実施することで、社会性の発達障害の神経機構を明らかにする。さらに、顔だけでなく、視線方向を検出する機構をいつから機能しだすかを乳幼児を対象とした行動研究で明らかにする。
新規のWntシグナル伝達分子による形態形成の制御機構の解析

Wntシグナルは初期発生時の体軸形成や細胞の増殖や分化などを制御する。Wntシグナルは細胞内でβ-カテニン経路とPCP(平面内細胞極性)経路、Ca^<2+>経路の3つに分岐する。DvlはWntシグナルをβ-カテニン経路とPCP経路に分岐点に当たる分子で、GSK-3βによるβ-カテニンのリン酸化と分解を抑制する一方、ショウジョウバエでの解析から、PCP経路によってJunキナーゼやRhoキナーゼを介して形態形成を制御することが見出されつつあるが、神経系細胞におけるPCP経路の作用は明らかでなかった。そこで今年度は、哺乳動物細胞におけるWntやDvl、Rhoキナーゼの作用を検討した。COS細胞において、Junキナーゼ活性化に必須のDEP領域を含まないDvl変異体がRhoキナーゼを活性化する事から、DvlはJunキナーゼとRhoキナーゼを異なった領域を介して活性化する可能性が示された.Wnt-1やWnt-3a、DvlによるRhoキナーゼの活性化はRhoキナーゼのRho結合ドメインを共発現することにより抑制されたことから、この活性化にはRhoが関与することが明らかとなった。Wnt-1やDvlを発現すると褐色細胞腫由来のPC12細胞でのNGF依存性の神経突起伸張や神経芽細胞腫由来N1E-115細胞での血清除去刺激による神経突起伸張が抑制されだが、この現象はRhoキナーゼ阻害剤により解除された。さらに、RhotekinのRho結合領域を用いたpull-down assayにより、Dvlを発現させたPC12細胞ではRhoが活性化することを見出した。高度に精製したWnt-3aでPC12細胞を処理することによりRhoキナーゼの活性化が認められた。したがって、Wnt-3aやDvlのシグナルは哺乳動物の神経系細胞において、Rhoキナーゼを介して神経突起の伸張や退縮に関わる可能性が示唆された。Axamは私共が見出したAxin結合蛋白質588アミノ酸からなる蛋白質である。Axamは中央(72-400)にAxin結合部位、C末端側は脱SUMO化酵素SENP1と相同性が高い部位を持つことが明らかとなった。SUMOはユビキチン類似の分子で、蛋白質の細胞内局在や安定性の制御、転写活性の調節などに関与することが知られている。実際に、AxamはSUMO化されたp53に対して脱SUMO化活性を示し、COS細胞にAxamをSUMO-1と共発現させると他の蛋白質と共有結合しているSUMO-1が限定分解されてモノマーとなることが明らかとなった。したがって、Axamは細胞内でも脱SUMO化酵素として作用すると考えられた。Axamはβ-カテニン分解を促進し、Wntシグナル伝達経路依存性の体軸形成を抑制するが、脱SUMO化酵素活性を欠失させたAxamC547SではAxam全長で認められるβ-カテニン分解作用とWntシグナル依存性の二次体軸形成の抑制作用が低下した。したがって、AxamによるWntシグナル伝達の抑制にはAxamの脱SUMO化活性が重要であることが示された。Duplinは私共が見出したβ-カテニンと結合し、初期胚の体軸形成やWntシグナル伝達を抑制する核内蛋白質である。変異体解析の結果、Duplinのアミノ酸残基(500-584)が本蛋白質の核内局在に必要かつ充分であり、Wntシグナル依存性のTCF転写活性化の阻害にも必須であることが明らかとなった。また、DuplinのC末端側のβ-カテニンと結合部位を欠失させた変異体Duplin-(1-668)はβ-カテニンと結合せず、Wnt3a依存性のTCF転写活性化の抑制能も失われていた。ところが、アフリカツメガエル初期胚の背側にこの変異体Duplin-(1-668)を導入したところ、Duplin全長と同様の体軸形成抑制作用を示した。したがって、Duplinはβ-カテニン以外の下流の遺伝子発現のシグナル伝達経路にも作用することにより体軸形成を抑制する作用を持つことが示唆された。

Wnt-1やDvlを発現すると褐色細胞腫由来のPC12細胞でのNGF依存性の神経突起伸張や神経芽細胞腫由来N1E-115細胞での血清除去刺激による神経突起伸張が抑制されだが、この現象はRhoキナーゼ阻害剤により解除された。さらに、RhotekinのRho結合領域を用いたpull-down assayにより、Dvlを発現させたPC12細胞ではRhoが活性化することを見出した。高度に精製したWnt-3aでPC12細胞を処理することによりRhoキナーゼの活性化が認められた。したがって、Wnt-3aやDvlのシグナルは哺乳動物の神経系細胞において、Rhoキナーゼを介して神経突起の伸張や退縮に関わる可能性が示唆された。
3次元多様体上の射影的アノソフ流と双接触構造

これまでの研究に引き続き、3次元多様体上の正則な(すなわち不安定葉層と安定葉層が滑らかな)射影的アノソフ流の分類に取り組んでいる。すでにザイフェルト多様体上の正則な射影的アノソフ流は安定葉層あるいは不安定葉層がコンパクト葉を持つならばT^2×I-モデルの有限和になるという結果を論文"Regular projectively Anosov flows with compact leaves"にまとめAnnales del'Institut Fourierに投稿していたが、査読報告の示唆に従い証明をより簡略かつ明解になるよう大幅に書き改め再び同誌に投稿し、掲載が確定している。この他に、Bonatti-Langevinによるアノソフ流の例に対するバーコフ切断の研究も進めている。その結果種数0で特異点が4つある例を具体的に構成し、この表示を利用して同様の性質を持つ例を無限に構成できるよう一般化した。Bonatti-Langevinの例はBarbotによっても一般化されているが、ここで見出されたバーコフ切断による一般化はBarbotのものとは独立であり、両者の手法を同時に用いることにより更に多くのアノソフ流の族が得られることになる。ザイフェルト多様体上の正則な射影的アノソフ流は安定葉層あるいは不安定葉層がコンパクト葉を持つならばT^2×I-モデルの有限和になるという結果を論文"Regularprojectively Anosov flows with compact leaves"にまとめAnnales del'Institut Fourierに投稿した。この主結果を証明するにあたり、ザイフェルト多様体上の余次元1葉層構造でトーラスに同相で圧縮不可能なコンパクト葉を持つものを分類している。これは論文の主題である射影的アノソフ流とは独立に葉層構造論の立場からも興味深い結果である。草稿を論文にまとめるにあたり証明中に必要ないくつかの命題を多様体がザイフェルトであることに依存しないより一般的な形に拡張した。また、正則より弱い半正則、すなわち不安定葉層のみが滑らかな葉層構造であるような射影的アノソフ流の研究にも着手した。半正則であるが正則でないものとして不安定葉層がReeb成分を含む例を構成し、逆に不安定葉層がReeb成分を持つ場合の特徴づけを行った。他方、正則性を仮定せずに一般のアノソフ流を考察しその力学系的性質についても調べた。結果として射影的アノソフ流は極小流にならないことを示した。この他に、Bonattei-Langevinによるアノソフ流の例に対するバーコフ切断の構成に関する研究も行っている。口頭発表としては2002年9月に龍谷大学で行われた研究集会「葉層構造の幾何学」で"Chain reccurent sets of projective flows"の題で射影的アノソフ流が極小流でないこととそれに関連する話題について説明した。
クロララクニオン藻成立に至る宿主ケルコゾアの進化

クロララクニオン藻が二次共生により葉緑体を獲得するまでの宿主側の進化を解明するために、クロララクニオン藻に近縁な無色ケルコゾアの探索を行い、系統、分類、進化について、形態、微細構造、トランスクリプトーム解析などから新知見を得た。まず、クロララクニオン藻近縁ケルコゾアに3系統群の存在を明らかにすると共に、最もクロララクニオン藻に近縁な系統群の5培養株を確立し、この系統群の詳細な研究を初めて可能にした。これら5株の中からミノリサ属の3新種を見出すと共に、クロララクニオン藻の葉緑体獲得がクロララクニオン藻の分岐後に起こったことを明らかにした。鞭毛装置構造をはじめとする形態進化についても知見を得た。今年度は研究計画に基づき、Rhabdamoeba marinaの培養株(SRT404)について詳細な形態、微細構造観察を行った。採餌実験の結果、Rhabdamoeba marinaは緑藻、ハプト藻、クリプト藻など、様々な藻類を捕食することが明らかとなった。微細構造観察では細胞表面に巨大な棍棒状の射出装置が観察され、これを射出することで遊泳性の藻類を捕食していることが示唆された。Rhabdamoebamarina遊泳細胞の鞭毛装置については、完全な立体構造の解明には至らなかったものの、捕食性ケルコゾア生物やクロララクニオン藻とは異なり、放射状に伸びる多数の微小管を有することが明らかとなった。現在、これらの成果に関する論文を準備中である。Rhabdamoeba marinaに続くクロララクニオン藻の祖先にあたる生物の培養株確立のために、沖縄県宮古島及び東京湾にてサンプリングを行った。宮古島でのサンプリングでは、沿岸の海水サンプルからクロララクニオン藻に近縁な捕食性原生生物のMinorisa minutaの培養株(SRT609)が確立された。本培養株については今後詳細な形態、微細構造観察及びトランスクリプトームデータを用いた代謝系タンパク質の網羅的分子系統解析を行う予定である。東京湾のサンプリングでは、培養株の確立と平行して環境DNAからクロララクニオン藻の祖先にあたる生物の検出を行った。クロララクニオン藻に近縁な環境配列クレードに特異的なプライマーを用いたPCRの結果、東京湾にはクロララクニオン藻に近縁な生物が多数存在していることが明らかとなった。特にMinorisa minutaに近縁な環境配列クレードは、すべてのサンプルから検出されたため、東京湾に広く生息していることが示唆された。研究計画に沿って、Rhabdamoebaの培養株(SRT404)の栄養細胞ステージと遊泳細胞ステージについて、詳細な光学、電子顕微鏡観察を行い、その形態および微細構造を明らかにした。さらに、遊泳細胞の鞭毛装置構造については立体構築には至らなかったものの、放射状に伸びる多数の微小管という、他の捕食性ケルコゾア生物やクロララクニオン藻では報告のない構造を持つことが示されるなど、形態および微細構造についての進化的な議論を行うために必要なデータを得ることができた。さらに代謝系の進化の解明のために、次世代シーケンサーを用いてゲノムおよびトランスクリプトームデータをすでに取得しており、Rhabdamoebaに関する研究は計画通りに進行している。クロララクニオン藻の祖先と考えられる生物の培養株の確立のために、沖縄県宮古島および東京湾にてサンプリングを行った。宮古島でのサンプリングでは、沿岸の海水サンプルからクロララクニオン藻に近縁な捕食性原生生物であるMinorisa minutaの培養株(SRT609)の確立に成功し、期待以上の成果を上げることができた。特異的なプライマーを用いたPCRの結果、東京湾にはクロララクニオン藻に近縁な生物が多数存在していることが明らかになった。このことから、今後は東京湾を重点的にサンプリングすることで、クロララクニオン藻に近縁な生物の培養株の確立を加速させることができると考えられ、更なるクロララクニオン藻に近縁な新奇ケルコゾア生物の発見への道筋がついたと考えている。総じて、研究は計画どおりに着実に進展していると考えている。1.昨年度得たラブドアメーバのRNAseqデータをもとに調査した結果、緑藻類などから水平伝播(EGT)した遺伝子は検出されなかった。また、微細構造観察でも色素体の痕跡と思われる構造は観察されなかったことから、ラブドアメーバは色素体獲得が起こる前にクロララクニオン藻から分岐した生物であると考えられる。2.昨年度確立したSRT609株のRNAseq解析を行った。クロララクニオン藻のB. natansにおいて核から色素体に輸送されると予測された1061のタンパク質のうち、237タンパク質がSRT609のRNAseqデータから見つかった。これらのタンパク質の由来を調べたところ、クロララクニオン藻色素体の起源である緑藻に由来するタンパク質は見つからず、シグナルペプチドも検出できなかった。SRT609もまた色素体の共生が起こる前にクロララクニオン藻から分岐した生物であると考えられる。3.昨年度の環境DNA調査結果を指標としてクロララクニオン藻に近縁なケルコゾア生物の探索を実施し、東京湾の海水サンプルから新しい培養株Y-KSI-01株の確立に成功した。この生物の18S rRNA遺伝子は、既知のMinorisa minutaの配列と同じクレードに属したものの、配列は8%異なっていた。

4.SRT609株とY-KSI-01株について形態・微細構造観察を行った。SRT609株は、18S rRNA遺伝子の配列に加えて細胞サイズと鞭毛の長さがM. minutaの原記載と一致しており、SRT609株はM. minutaであると同定された。新たに確立されたY-KSI-01株については、M. minutaの原記載及びSRT609に比べて大きな細胞と長い鞭毛をもつことが明らかとなった。18S rRNA遺伝子配列の差異も考慮すると、Y-KSI-01株はMinorisa属の新種として扱うのが妥当である。研究計画のうち、ラブドアメーバのRNAseq解析、ミノリサのSRT609株の形態・微細構造観察とRNAseq解析、クロララクニオン藻近縁ケルコゾア生物の新奇培養株確立、新奇培養株の形態・微細構造観察について、計画通り進めることができた。その結果、ラブドアメーバもミノリサも色素体の共生が起こる前にクロララクニオン藻から分岐した生物であることを明らかにすることができた。研究計画のうち、代謝系遺伝子の進化については、注目すべき代謝系遺伝子の選定に時間がかかり、来年度まで継続される。一方で、Y-KSI-01株が、既知のミノリサとは異なる生物であり、新種であることが示唆されたことにより、研究計画にはなかったミノリサ属の種多様性を明らかにするという新展開も生まれている。総じて、研究はおおむね計画通りに着実に進展していると判断できる。前年度に引き続き環境中からクロララクニオン藻に近縁な生物の探索を目的として、2017年4月に三重県志摩市及び四日市港で、6月に鳥取県泊市、11月にパラオ共和国でサンプリングを行ったところ、三重県志摩市及び四日市港のサンプルからクロララクニオン藻に近縁な培養株SRT705、SRT710及びY-YKI-01の3株の確立に成功した。18S rRNA遺伝子に基づく系統解析の結果、これら3株はMinorisa minutaと同じクレードに属するものの、それぞれ遺伝的に異なることが明らかとなった。これら3株について詳細な形態比較及び分子系統解析を行ない、Y-YKI-01株は、以前に東京湾から確立しMinorisa属の新種の可能性があるY-KSI-01株と同じであることが示された。一方SRT705株とSRT710株は細胞サイズや鞭毛長、遊泳様式が他の培養株及びM. minutaと異なり、また系統的にも明確に区別されることから、Minorisa属の新種であることが示唆された。また、これら3株及び昨年までに確立したY-KSI-01株及びSRT609株はクロララクニオン藻の多くやRhabdamoebaと同様に仮足をもつことが示された。既に微細構造観察が行われたSRT609株以外の4株について透過型電子顕微鏡観察を行った。これら4株はSRT609株と同様に核、ゴルジ体、管状クリステを有するミトコンドリアをもち、色素体やその痕跡と思われる細胞小器官は観察されなかった。さらにSRT609株を用いてMinorisa属の鞭毛装置の解明に取り組んだところ、SRT609株の鞭毛に鞭毛小毛はみられず、微小管性鞭毛根は少数の微小管から構成されており、クロララクニオン藻の鞭毛装置に近い単純な構造であることが明らかとなった。
濁音始まりの付属形式に関する基礎的研究

日本語の付属形式(助詞、助動詞、接尾辞など)には濁音で始まるものが少なからず見られる。これは、一般の大和言葉の自立語では清音で始まるのを原則とするのと対照的である。他方、複合語を作るときに連濁と呼ばれる現象が生じる。本研究は、連濁との関連性を考慮しながら、濁音で始まる付属形式に関して、それらの適切な分類法を提示し、それらがどのように生じたのか、日本語の清濁対立とどのように関係するのかといった点について調査、考察した。本課題は、日本語の歴史に関わる基本的な問題を明らかにするための研究の一つとして位置付けられる。日本語の助詞・助動詞・接尾辞と呼ばれる要素(付属形式)には,「・が」「・ばかり」「・だろう」「(病気,休み...)・がち」「・ごと〔毎〕」のように濁音で始まものが数多く存在する.他方,「さくら」「そら」「くも」など一般の和語(大和言葉の自立語)では濁音で始まることがなく,濁音が来る語は「ごみ」「どなる」「じらす」のように全体として意味に大きな片寄りが見られる.これに対して濁音始まりの付属形式には,そのような意味の片寄りがない.他方,単純語が複合語の後部要素に来て,たとえば「カキ」が「ホシ・ガキ(干し柿)」「シブ・ガキ(渋柿)」に変わる現象(連濁)がある.これらも意味に片寄りが見られない.そして,他形式に後続する位置に現れるという点で濁音始まりの付属形式と共通し,両者が近い関係にあることがわかる.しかし,連濁についてはかなりの程度,研究の蓄積があり,多くのことがわかっているのに比べると,濁音始まりの付属形式はその全体像がまだ正確に把握されておらず,本格的な研究がないままである.濁音で始まるか否か,さらに,濁音で始まるのはどのような場合かは,日本語の構造を知る上で重要な問題であり,また,今日に至るまで日本語がたどってきた歴史を知る上でも無視できない.日本語の語彙特性,および音韻と語彙との相互関連性を解明する上でも欠かせない研究課題である.そこで,本研究では,これらの形式に関する包括的な言語データを作成し,それをもとにした分析を行うが,平成26年度は,まず,その包括的な言語データのフォームの検討をおこなった.その上で,とくに古代語を中心に該当語の抽出作業をおこなった.これとあわせて,古代語に関する最新の研究情報の収集にも努めた.また,連濁とあわせて,日本語の音韻構造(とくに形態音韻論的構造)の問題とどう関わるかについての考察も進めた.当該年度は、昨年度に引き続いて、濁音で始まる付属形式(付属語、接尾辞)の全貌を把握するための基礎資料の作成を中心に進めた。それとともに、これに深く関連する二つの問題についても調査、考察を進めた。すなわち、濁音で始まる付属形式と連濁とが歴史的にいかなる関係にあるかという点、清濁対立がどのようにしてできあがったかという点、の二点である。これらは、昨年度より、古代語を中心とする該当語の抽出作業と並行しつつ、調査、考察を進めてきた課題である。当該年度は、それをさらに進め、その成果をまとめ、公表した。考察の手順としては、調査対象である濁音始まりの付属形式を、(1)語の内部構造における形態、(2)助詞・助動詞の類の形態、の二つに大きく分類した。これによって、同形式がどのような言語の階層に現れるかを把握、整理し、濁音始まりの形式の全体的な特質を明らかにした。とくに、この点は、連濁によるものも含めて濁音始まりの形式が日本語の歴史において、どのように発生、発展してきたかを推定するための大きな手がかりとなる部分である。さらに、個々の形式が歴史的にどのように発生してきたかについて、いくつかの場合に分け、想定される複数の可能性を指摘した。より具体的な問題としては、濁音配列則および連濁起源説との関係についての問題点を整理した。また、歴史的に見たとき、濁音配列則と母音調和との差異および共通性にも注目した。母音調和と比較するのは、濁音で始まる付属形式の形態音韻論的特性を明らかにするために大いに参考になるからである。とくに、機能面からどのようにこの現象をとらえるかという点、および、類型論的に見た場合のこの現象の位置づけという点で重要である。これについても、問題点を整理し、成果を公表した。調査済のデータに基づいて一定の考察が進展した点は、予定より早く進んでいる。しかし、未調査の部分を含めた、将来の研究の足がかりとするためのデータの整理、詳密化が予定よりも遅れている。これらの点を総合すると、概ね順調に進んでいると判断される。濁音始まりの形式の発生は、日本語の歴史を通じて非常に長く持続的に起こっていることがわかる。その発生のもっとも古いものは、文献が明らかにしうる時代をさらに遡る。その一方、比較的近年に発生したものまである。このように、本研究で取り上げた対象は、歴史的持続性を特徴とする言語現象であるということができる。一般的にいって、言語の変化に関する研究は、たとえば、11世紀とか16世紀などといった特定の時期に発生した現象を取り上げるものが多い。さらにいえば、上述のような持続的に起こる一連の出来事を一つの現象として包括的に取り扱うことすらあまり一般的ではない。これに対して、本研究は、むしろ積極的に一つの現象としてとらえることを提案している。

なぜならば、個別言語がたどる歴史(あるいは、その変遷過程)を明らかにするためには、時代ごとの諸変化を時間軸に沿って順々に取り上げ、見ていくだけではなく、継続的に発生する出来事にも十分に目を配る必要があると考えるからである。歴史を通じて、変わる点と変わらない点とを具体的に見極めなければ、言語の変化の真のあり方を精確にとらえることはできない。濁音始まりの形式が持続的に発生する背景には、日本語が持つ音配列の安定性があると考えられる。しかし、漢語の移入に伴って語頭濁音は増えている。その点では、音配列は必ずしも安定的であるとはいえない。しかしながら、依然として、濁音始まりの形式の発生が持続的に起こってきた。これが何を意味するのか、音配列の安定性と不安定性の両側面との関わりをさらに考える必要がある。なお、濁音始まりの形式は、連濁形もその中に含めることができるが、本研究では、連濁が関わる複合語の生成に限定せず、考察範囲を拡張させたものである。それら全体を歴史的考察の射程の中に入れている。補助事業の期間延長を申し出て、その承認を受け、成果の取りまとめを引き続き進めている。ただし、論文などの研究成果の公表(論文発表など)は予定通り行っており、その点では順調に進展してきている。総合的に判断すると「やや遅れている」と評価される。濁音始まりの付属形式がどのように発生したかについては、連濁の起源とも密接に関わる問題であり、さらに、連濁については、日本語の清濁対立の形成との関係が先行研究によって指摘されている。具体的には、複合語の形成を契機に、初期の濁音が発生し、子音の清濁対立が出来てきたとする考え方である。一言で言えば、連濁の発生によって濁音が生まれたとするものである。濁音は、古代語の単純語にも現れるので(その濁音は、事実上、2音節語の2音節目に現れるものにほぼ限られる)、この考え方に従うと、これらも連濁によって形成されたことになる。要するに、濁音を持つ2音節語には、歴史的には1音節語と1音節語の複合に由来するものが少なからずあるということである。実際、ナベのような例があり、もとはナ(菜あるいは魚)とヘ(食器)の二語の複合であるとする語源が説かれている。他方、先行研究によれば、古代語にはザ行の連濁例が他の行(ガ行、ダ行、バ行)に比べて際だって少ないことが明らかにされている。その原因は、ザ行の音声が、破裂音のガ・ダ・バ行と違って、破擦音(あるいは摩擦音)であることと何らかの関係が疑われる。しかし、上記のような2音節語について調べてみると、2音節目に来る濁音のうち、ザ行が他の行に比べて少ないわけではない。だとすれば、これらについては、連濁とは異なる生成を考えるか、あるいは、それらの濁音を清音に還元する考え方自体を見直すか、再考しなければならなくなる。濁音始まりの付属形式についても、否定辞(打ち消し)のズ、助動詞ジといった例がある。これらも連濁から派生したとは考えられないだろう。このように、古代語の濁音に関しては未解決の問題が存在する。語頭に現れないという濁音の配列則に対しては、実際にはもっと複雑で、多元的な形成過程を考える必要があるのかもしれない。さらに考えていくべき今後の課題である。日本語の付属形式(助詞、助動詞、接尾辞など)には濁音で始まるものが少なからず見られる。これは、一般の大和言葉の自立語では清音で始まるのを原則とするのと対照的である。
数理的な移動軌跡モデルに基づく広域交通流の推定手法

リアルタイムに広範囲の交通状況を推定するため,プローブカーにより得られる移動軌跡を数理的にモデル化することにより,リンク交通量及びOD交通流を短い時間粒度で推定するだけでなく,その渋滞の要因を明らかにし,渋滞の変化を予測する手法を考案する.渋滞時にはプローブカー自体の動きは制限され,周辺の交通状況をそのまま反映すると考えられ,また,交通制御情報,地図情報,気象情報など,車の混雑に与える要因となる情報を組み合わせることで,通常時及び積雪都市における交通状況の推定を実現する.さらに,この数理モデルを発展させ,自動運転による運転挙動モデルを考案し,従来車と調和する自動運転車の運転挙動を実現する.本取組では,朝夕の通勤時に発生する渋滞に代表される日常的な交通状況を把握するだけでなく,事故に伴う渋滞や大規模なイベントに伴う通常時と異なる交通状況を,迅速かつ正確に把握することで,都市部における円滑な交通環境を実現することを目的とする.本年度は,まず,都市部における交通流を把握するために,単独の交差点に留まらず,近隣に複数の信号機が存在する交差点において形成される車列の長さを求める手法を提案した.この手法では,対象交差点の上流に位置する信号機の状態に応じ,上流の交差点に接続するいずれのリンクから車両が流入するかを判断し,かつ,その流入期間に応じて,プローブカーの停止位置及び停止時刻から,前方に存在する車両数を把握するとともに,信号サイクル中に到着する車両数を予測する.これにより,ある交差点において推定した車列長に基づいて,さらに下流の交差点における車列長を推定していくことで,各リンクにおける交通量を把握する.また,交通状況の短期的な変化を把握することを目的とし,10分程度の短い時間粒度でOD交通量を推定する手法を考案した.この手法では,上記手法により推定したリンク交通量に基づき,エントロピー最大化法によりOD交通量を推定する.エントロピー最大化法で利用する事前OD分布は,観測されたプローブカーの走行経路の利用頻度に基づき算出し,各OD組の経路に含まれる通行リンクについてもプローブカーによる通行実績がある経路から抽出する.交通シミュレーションによる性能評価を実施し,格子状の単純な道路網において,高い精度でOD交通量を推定できることを示した.平成27年度は,単一の交差点を対象とした交通量推定手法を発展させ,互いに接続した複数の交差点の関連性を考慮することで,より正確に交通量を推定する手法を考案した.また,OD交通量を推定する手法の検討にも取り組み,交通シミュレーション上の性能評価において,真値との相関係数が高い推定値を導出できることを示した.実世界における性能評価については実施できていない一方,平成29年度に予定していたOD交通流推定手法について先行して取り組んでおり,研究は概ね順調に進んでいると考えられる.平成29年度は,複数のプローブカーデータだけでなく,網羅的な交通シミュレーションを組み合わせることにより,渋滞の規模だけでなく,道路状況を推定する手法の検討に取り組んだ.冬季に多量の降積雪を観測する都市道路網においては,積雪量や気温の変化によって路面状態が日々変動し,旅行時間が増大することが予想される.また,除雪によって路肩に積み上げられた堆雪の影響により,部分的な車線減少が長時間発生する.このような状況下において,積雪が道路環境に与える複雑な影響を定量的に把握し,交通流の観測から道路状態の変化を推定することによる除排雪作業の効率化が期待されている.本取組では,片側1車線道路,片側2車線道路,信号付き交差点において,路肩に堆雪がある際の交通流を交通シミュレーターでモデル化し,交通量(1時間あたり車両通過台数),スポット堆雪の位置と距離,路面状態を,雪道の交通量に影響を与える「雪道パラメータ」とし,これらを変化させて旅行時間を観測することで,雪道特有の道路状況が交通流に与える影響を推定する.また,堆雪の有無や路面状態の変化により,道路を通過する車両の旅行時間分布が異なることに着目し,一致度の高い分布を網羅的シミュレーション結果から探索することにより,旅行時間の観測から堆雪状況などを推定する.Leave-One-Out交差検証による性能評価実験を実施し,(a)片側1車線道路,(b)片側2車線道路,(c)信号付き交差点の3つの道路に対して,旅行時間の観測のみから交通量,スポット堆雪の距離と位置,路面状態を推定した結果,交通量が1000veh/h程度の信号付き交差点において,交通量を7.5%の誤差,堆雪の位置を81%の正解率,路面状態を65%の正解率で推定可能なことを示した.平成28年度には,積雪都市における耐雪の状況を推定する手法を考案し,交通流そのものの推定だけでなく,道路状況の推定手法の検討に取り組んでおり,より実用的な手法としての活用が期待され,研究は概ね順調に進んでいると考えられる.平成29年度は,自動運転車の運転挙動による,交通流とドライバのストレスの変化を評価ため,自動運転車と従来車が混在するマイクロ交通シミュレーションの検討に取り組んだ.自動運転車の普及過渡期においては,自動運転車と人間が運転を行う車(従来車)が同じ道路上に混在する環境が生じるため,自動運転車の運転挙動が従来車の運転挙動に影響を与える.例えば,自動運転車が安全性を重視し速度を抑えて走行する際,従来車による追い越し行動を誘発することが想定される.本取組では,ドライバの個性や自動運転車の運転特性を反映可能な運転挙動モデルを,マルチエージェントシミュレータに組み込むことで,自動運転車と従来車が混在する環境を再現し,自動運転車の運転挙動による交通流とドライバのストレスの変化を評価した.

Intelligent Driver Model(IDM)をベースにした加減速モデルと,車線変更モデルを組み合わせた運転挙動モデル実装し,希望速度や希望車頭時間など,ドライバ毎に異なる様々な特性を表現する.また,判断から操作までの遅延時間を指定することで,自動運転車と従来車の違いを表現する.多車線の直線道路を対象としたシミュレーションを実施し,自動運転車の運転挙動と混在率によって,交通流とドライバのストレスの変化を分析した.交通流は交通容量と目的地までの時間に基づき,乗員のストレスは運転中にストレスを感じる事例に基づき評価を実施した.シミュレーション実験の結果,自動運転車の混在率に応じて,交通流を維持しつつ,ドライバのストレスが軽減できるような,自動運転車の希望速度と希望車頭時間を導出できることを示した.例えば,混在率が20 %以下の場合,自動運転車の希望速度と希望車頭時間をそれぞれ70-80km/hと1.0-2.0sに設定することで,交通流を維持しつつ,ドライバのストレスを軽減できることを示した.リアルタイムに広範囲の交通状況を推定するため,プローブカーにより得られる移動軌跡を数理的にモデル化することにより,リンク交通量及びOD交通流を短い時間粒度で推定するだけでなく,その渋滞の要因を明らかにし,渋滞の変化を予測する手法を考案する.渋滞時にはプローブカー自体の動きは制限され,周辺の交通状況をそのまま反映すると考えられ,また,交通制御情報,地図情報,気象情報など,車の混雑に与える要因となる情報を組み合わせることで,通常時及び積雪都市における交通状況の推定を実現する.さらに,この数理モデルを発展させ,自動運転による運転挙動モデルを考案し,従来車と調和する自動運転車の運転挙動を実現する.平成28年度は,平成27年度に考案した交差点におけるリンク交通量推定手法,及び,OD交通流推定手法を対象とし,実世界における有効性を評価する.この取組に際し,いくつか異なる期間において交通量調査を実施し,リンク交通量とOD交通流の精度を評価する.
ボツリヌスC_2毒素による細胞骨格アクチンのADPリボシル化に関する研究

ボツリヌスC_2毒素は、共有・非共有のいずれの結合も持たない2種類のタンパク成分(component I,component II)より構成されている。component Iは酵素活性を、component IIは細胞膜への結合活性をもつことをこれまでに明らかにしてきた。本研究では、C_2毒素の細胞内標的分子が細胞骨格の主要成分であるアクチンであること、component IのもつADP-ribosyltransferase活性によって修飾されたアクチンの性状変化を明らかにすることによって、細菌毒素ではこれまでにみられなかった極めてユニ-クなC_2毒素の活性発現機構の詳細を解明することを目的とした。その結果以下のような事が明かとなった。ボツリヌスC_2毒素の2成分を精製し、トリプシンにより活性化後培養細胞と反応させると細胞種によって反応毒素量に多少の違いはあるが、細胞形態の著しい変化がみられた。一方、毒素を細胞に作用させ細胞内アクチンのADPーリボシル化を、オ-トラジオグラフイ-によって検討したところ細胞の形態変化とアクチンのADPーリボシル化とが並行した。さらに、in vitroで精製非筋細胞アクチンをcomponent IによってADPーリボシル化後その性状を検討したところ、アクチン1モル当り1モルのADPーリボ-ス残基の結合がみられた。ADPーリボシル化されたアクチンは、モノマ-からポリマ-への変換能を完全に消失することがわかった。細胞の形態変化に伴ってストレスファイバ-の切断がみられた。このような結果は、毒素によるアクチンの化学的修飾によって細胞骨格の破壊が起こることが、C_2毒素による致死の原因であることを示している。本年度の研究計画は、1.C_2毒素を構成する2種のタンパク成分(Component IおよびII)を調製すること。2.C_2毒素に対する感受性のある培養細胞を選択すること。3.培養細胞にC_2毒素を作用させたときに、細胞内アクチンが特異的にADPリボシル化されることを明らかにすること。4.C_2毒素による細胞骨格アクチンのADPリボシル化に並行して、細胞の形態変化がおこること。などを検討することであった。その結果、以下のような成績を得た。1.C_2毒素の2成分のタンパクを、ボツリヌスC型菌92ー13株より精製した。2.C_2毒素に対する培養細胞の感受性を検討した結果、検討したすべての細胞株(8種)が、細胞間に多少の差異がみられたが、C_2毒素に感受性(形態変化を示標とした)を示した。3.培養細胞に外からC_2毒素を加え、細胞のLysateを調製し、2次元電気泳動によって細胞内タンパクの挙動をみたところ、アクチンのみが特異的にADPリボシル化されていることが分った。4.細胞内アクチンのADPリボシル化と細胞の形態変化(円形化)を定量的に解析したところ、アクチンのADPリボシル化と並行して、細胞の形態変化が起ることが分り、細胞に対するC_2毒素の作用機構が、細胞骨格を構成するアクチンの特異的な化学修飾(ADPリボシル化)によることが明らかとなった。前年度で、C_2毒素2成分を調製し、培養細胞と反応させたところ細胞の著しい形態変化がみられ、C_2毒素に対する培養細胞の形態変化に特徴的な細胞の円形化と毒素量との間に定量的な関係があることを見い出した。さらに細胞の形態変化が毒素による細胞内アクチンのADPリボシル化と並行することがわかった。本年度の研究計画は、C_2毒素による培養細胞の形態変化と細胞骨格の動態との関連性を、細胞内アクチンその他の細胞骨格成分の蛍光染色によって観察すること、C2毒素によってADPリボシル化したアクチンの性状変化を明らかにすることであったが、細胞の円形化に伴ってストレスフアイバ-の切断・消失がみられた。

一方、in vitroで精製非筋細胞アクチンをC2毒素のcomponent IによってADPリボシル化すると、アクチン1モル当りADPリボシル残基1モルが結合すること、毒素によるADPリボシル化によって、アクチンの重要な活性である重合能が完全に不活化されることなどがわかった。このような結果は、C2毒素によって細胞内アクチンがNADのADPリボ-スの転移を受けて修飾されることによって、細胞形態を支持している細胞骨格の主要メンバ-であるアクチンの活性であるG→F変換能が失われ細胞の形態変化を起こすことがわかった。