hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高次元対数的シンプレテック多様体とパンルベ方程式の高次元化

平成15年度においては、研究代表者は、岡本・パンルベ対の高次元化,パンルベ型方程式の幾何学的特徴づけについて考察し,下記にあげるような成果を得た.●平成14年度に続いて,九州大学の岩崎氏,稲場氏とともにパンルベVI型方程式の初期値空間を,射影曲線上の4点確定特異点をもつ安定放物接続のモジュライ空間として定式化し,構成,非特異性の証明,自然なコンパクト化の構成を行った.また基本群の表現のモジュライ空間とのRiemann-Hilbert対応の構造を解析し,Riccati解の部分は,基本群の表現のモジュライの特異点に対応すること,またBacklund変換は,自然な幾何学的な双有理変換であり,いわゆるFlopという双有理変換であり,またそれによりパンルペ方程式は不変であることを示し,幾何学的な意味づけを行った.またRiemann-Hilbert対応がモジュライ空間の正則シンプレクテック構造を保つ超越的な解析同型であることも示した.●上記の結果は,n点確定特異点をもつ射影曲線上の安定放物接続のモジュライ空間の構成Riemann-Hilbert対応が全射かつ固有な解析的双有理写像である事を最終的に示した.これにより,ガルニエ系を含んだパンルベ性の厳密な証明が完成した.また,高次元のシンプレクテック特異点およびその特異点解消,また高次元のシンプレクテックFlopとBacklund変換の関係を明らかにした.これらの結果は下記の投稿中のプレプリントにある.齋藤は齋藤・梅村の仕事および齋藤・竹部の仕事を拡張し,院生の竹部太郎と寺島ひとみとともに,岡本・パンルベ対の概念を導入し,その分類および構造の決定を行った.さらに,境界が加法的な場合に,その複素構造の変型理論と局所コホモロジー完全列の議論を用いてパンルベ方程式の代数幾何学的特徴づけを得,また岡本・パンルベ対の大域族からパンルベ方程式の具体的な、ハミルトニアン系を導ける事も示した.さらに,岡本・パンルベ対内の-2-有理曲線とパンルベ方程式のRiccati解が対応することを示し,楕円曲面の構造を持つ岡本・パンルベ対内の-2-有理曲線の可能な配置から,楕円曲面の構造を持たない岡本・パンルベ対内の-2-有理曲線の可能な配置を全て分類する事に成功し,それにより,パンルベ方程式のRiccati解の分類を行った.また,高次元の場合の岡本・パンルベ条件の拡張として,有理2形式の退化する多様体の境界において,到達可能特異点がない条件をベクトル束のチャーン類の言葉で記述する事に成功した.これにより,岡本・パンルベ対の条件の意味も明確になった事に注意しておく.現在,それを用いて,A-型のアファイン・ワイル群を対称性にもつ野海・山田系の初期値空間の良い特異点解消の構成を試みている.以上の結果は学術論文に発表されたことを付記しておく。平成14年度においては、研究代表者は、前年度に引き続き、岡本・パンルベ対の高次元化,パンルベ型方程式の幾何学的特徴づけについて考察し,下記にあげるような成果を得た.・パンルベ方程式がRiccati方程式に還元する事と岡本・パンルベ対の内点に(-2)有理曲線を含む事が同値であることを示し,パンルベ方程式のRiccati解の完全な分類を行った.特に,D^<(1)>_7型の方程式はRiccati解を持たない事を示した.・九州大学の岩崎氏,稲場氏とともにパンルベVI型方程式の初期値空間を,4点確定特異点をもつSL_2(C)接続のモジュライ空間として定式化し,構成,非特異性の証明,自然なコンパクト化の構成を行った.また基本群の表現のモジュライ空間とのRiemann-Hilbert対応の構造を解析し,Riccati解の部分は,基本群の表現のモジュライの特異点に対応すること,またBacklund変換は,自然な幾何学的な双有理変換であり,いわゆるFlopという双有理変換であり,またそれによりパンルベ方程式は不変であることを示し,幾何学的な意味づけを行った.またRiemann-Hilbert対応がモジュライ空間の正則シンプレクテック構造を保つ超越的な解析同型であることも示した.以上の一般的な方法は,ガルニエ系の場合にもそのまま適用できるが,今後はモジュライ空間の詳しい記述等によりより深い理解が得られると予想される.特に高次元のシンプレクテック特異点およびその特異点解消,また高次元のシンプレクテックFlop)等についての具体的記述が期待される.平成15年度においては、研究代表者は、岡本・パンルベ対の高次元化,パンルベ型方程式の幾何学的特徴づけについて考察し,下記にあげるような成果を得た.●平成14年度に続いて,九州大学の岩崎氏,稲場氏とともにパンルベVI型方程式の初期値空間を,射影曲線上の4点確定特異点をもつ安定放物接続のモジュライ空間として定式化し,構成,非特異性の証明,自然なコンパクト化の構成を行った.また基本群の表現のモジュライ空間とのRiemann-Hilbert対応の構造を解析し,Riccati解の部分は,基本群の表現のモジュライの特異点に対応すること,またBacklund変換は,自然な幾何学的な双有理変換であり,いわゆるFlopという双有理変換であり,またそれによりパンルペ方程式は不変であることを示し,幾何学的な意味づけを行った.

またRiemann-Hilbert対応がモジュライ空間の正則シンプレクテック構造を保つ超越的な解析同型であることも示した.●上記の結果は,n点確定特異点をもつ射影曲線上の安定放物接続のモジュライ空間の構成Riemann-Hilbert対応が全射かつ固有な解析的双有理写像である事を最終的に示した.これにより,ガルニエ系を含んだパンルベ性の厳密な証明が完成した.また,高次元のシンプレクテック特異点およびその特異点解消,また高次元のシンプレクテックFlopとBacklund変換の関係を明らかにした.これらの結果は下記の投稿中のプレプリントにある.
ロバスト複合領域設計最適化手法の開発と再使用型宇宙往還機への応用

本研究ではロバスト複合領域設計最適化手法の開発とその再使用型宇宙往還機への応用に取り組んだ.多目的最適化問題のパレート最適解群を効率的に求めることができる進化計算法は再使用型宇宙往還機のロバスト複合領域設計最適化に有効な最適化手法と考えられる.しかしながら,これまで用いられてきた制約条件の取り扱い手法は制約条件の数が複数ある場合に必ずしもロバストではなかった.よって本研究では複数の制約条件がある場合に効率的に最適解を探査できる新しい制約条件の取り扱い手法を開発した.この手法を2段式宇宙往還機の概念設計およびターボポンプの空力設計に適用しその有効性を確認した.この成果はTransactions of the Japan Society for Aeronautical and Space Sciencesに掲載予定である)また,設計のロバスト性を考慮した最適解を得るための手法として進化計算法と既存のシックスシグマ手法のアイディアを組み合わせた多目的シックスシグマ手法を開発した.この手法を現在宇宙航空研究開発機構(JAXA)内で検討されている火星航空機の空力設計に適用し,開発された手法の有効性を確認するとともに,設計点での空力性能とロバスト性の問のトレードオフなど火星航空機の空力設計に関する有用で新しい知見を得ることができた.この成果は今後学術雑誌等で発表していく予定である.複合領域設計最適化問題は一般に複数の自的関数と複数の制約条件をもち、再使用型宇宙往還機の設計最適化問題も例外ではない。さまざまな設計最適手法のなかで、進化アルゴリズムはパレート最適性の概念を取り入れることで多目的最適化問題におけるパレート最適解群を効率的に得ることが出来ることから、複合領域設計最適化問題に対して非常に有効な手段として考えられている。しかしながら進化アルゴリズムは制約条件を取り扱う機構をもっていないため、ペナルティ手法などの方法が一般に用いられるが、さまざまなパラメータを適切に設定しなくてはいけない、ロバスト性にかける、などの欠点をもっている。よって、本研究の一年目では、目的関数の最適性の評価手法であるパレート最適性の概念を制約条件の取り扱いにも適用する新たな制約条件取り扱い手法を開発した。この手法に基づいた進化アルゴリズムを用いて2段式宇宙往還機の概念設計を行うことで、従来の手法より優れた概念設計を得ることが出来た。また、制約条件同士のトレードオフ情報も得ることが出来た。今後は、より信頼性の高い数値流体力学なども組み合わせた宇宙往還機の形状設計最適設計を行っていく予定である。本研究では多目的進化アルゴリズムと数値流体力学等の高精度シミュレーション手法を用いた再使用型宇宙往還機の設計最適化に取り組んでいる.単段再使用型宇宙往還機においてはダウンレンジを確保するため,ノーズエントリ・ベースランディング方式を取る可能性が高く,その場合,着陸前に機体を空力デバイス等を使って反転させる必要がある.よって,今年度はさまざまな形状の空力フラップをとりつけた単段再使用型宇宙往還機形状について,数値流体力学を用いて空力特性を求め,空力フラップによる機体反転方式の妥当性について検討を行い,空力フラップ設計の指針を得た.今後は空力フラップによる反転を考慮した単段再使用型宇宙往還機形状について多目的進化アルゴリズムと数値流体力学などを組み合わせた宇宙往還機の形状設計最適設計を行っていく予定である。なお,今年度は昨年度開発した多目的進化アルゴリズムのための新しい制約条件取り扱い法やそれを用いた宇宙往還機の概念設計結果についてEUROGEN2005, AIAA CFD Conferenceなどの学会で発表を行い,雑誌論文としても現在準備中である.また,今年度の研究成果についても順次学会発表,雑誌発表を行っていく予定である.本研究ではロバスト複合領域設計最適化手法の開発とその再使用型宇宙往還機への応用に取り組んだ.多目的最適化問題のパレート最適解群を効率的に求めることができる進化計算法は再使用型宇宙往還機のロバスト複合領域設計最適化に有効な最適化手法と考えられる.しかしながら,これまで用いられてきた制約条件の取り扱い手法は制約条件の数が複数ある場合に必ずしもロバストではなかった.よって本研究では複数の制約条件がある場合に効率的に最適解を探査できる新しい制約条件の取り扱い手法を開発した.この手法を2段式宇宙往還機の概念設計およびターボポンプの空力設計に適用しその有効性を確認した.この成果はTransactions of the Japan Society for Aeronautical and Space Sciencesに掲載予定である)また,設計のロバスト性を考慮した最適解を得るための手法として進化計算法と既存のシックスシグマ手法のアイディアを組み合わせた多目的シックスシグマ手法を開発した.この手法を現在宇宙航空研究開発機構(JAXA)内で検討されている火星航空機の空力設計に適用し,開発された手法の有効性を確認するとともに,設計点での空力性能とロバスト性の問のトレードオフなど火星航空機の空力設計に関する有用で新しい知見を得ることができた.この成果は今後学術雑誌等で発表していく予定である.
エゴ・ドキュメントの比較史研究　ヨーロッパの事例から考える

本研究では、各自が担当する国・地域(イギリス・フランス・ドイツ・イタリア・ロシア・スペイン)におけるエゴ・ドキュメント研究の状況を把握した。具体的には、資料編纂状況であり、また分析の方法論である。エゴ・ドキュメントから派生する歴史理論の開拓も進んでおり、例えば、エゴ・ドキュメントを読み解く方法として、史料に照射される「主観性」、さらに情動・感情の歴史が注目されている。本研究の総括的位置を占める日本西洋史学会大会のシンポジウムでは、中世・近世から現代にいたるヨーロッパ内外で執筆されたエゴ・ドキュメントの分析の実践例を提示して、その歴史研究における射程を明らかにした。(1)全体研究会:本年度は、研究会を2度開催した〔札幌、東京〕。第一回は、札幌で行なわれ、現在のエゴ・ドキュメント研究の水準を確認するため基礎的文献を合評するなどした。まず8月17日(月)に、報告1長谷川貴彦(北海道大学)「エゴ・ドキュメントと現代歴史学ーLynn Hunt, Writing History in the Global Era (2014)に寄せてー」報告2大黒俊二(大阪市立大学)「限界リテラシーからエゴ・ドキュメントへーイタリア史からの提起ー」、8月18日(火)には報告3小野寺拓也(昭和女子大学)「書評:松井康浩『スターリニズムの経験』岩波書店、2014年。」リプライ:松井康浩(九州大学)を行った。また3月7日に東京大学駒場キャンパスにおいて、夏期の海外調査を受けて、それぞれが対象とする国地域のエゴ・ドキュメント研究ならびに史料編纂状況についての報告を行う研究会を持った。そこでは、報告1安村直己(青山学院大学)「エゴ・ドキュメントはどう活用されてきたかースペイン領アメリカ植民地史研究の視点からー」報告2長谷川まゆ帆(東京大学)「公的文書のエゴ・ドキュメント性ー近世末アルザスのある王国尚書の語りの力ー」の二つの報告が行われた。(2)海外調査:休暇期間を利用して史料編纂・保存状況、研究方法についての調査を行った。先進的なドイツの資料保存状況全般について、またベルリン・グループの研究方法について知見を得た。同じく、ロシア、イタリア、フランス、メキシコについての資料調査を行った。2回の研究会では、有益なる知見を共有することができた。また海外調査は、あらたな研究の状況について知ることができた。海外研究者との協力体制の確立という意味では、まだ不十分となっている。本研究は、エゴ・ドキュメントを中心とした歴史研究の動向を、広く欧米の歴史学に内在しつつ検討することを課題としているが、具体的には、第一に、ヨーロッパ規模で展開している研究を把握するため、研究分担者の対象とする国・地域における研究方法・史料保存の状況を概観し、第二に、研究分担者の現地調査をともなう具体的な史料分析によって、エゴ・ドキュメント研究の実践をおこなっている。本年度は、研究会を2度開催した〔東京、2回〕。第一回研究会(9月17日、東京大学駒場キャンパス)は、小野寺拓也と松井康浩が報告をおこない、前年の成果を確認しつつ、引き続き資料保存ならび研究状況などについて発表した。第2回研究会(3月4ー5日、青山学院大学青山キャンパス)は、海外調査などを受けて、それぞれが対象とするエゴ・ドキュメントを用いた実践例を検討する研究会をおこなった。これは、翌年の公開シンポジウムについての準備会の意味を併せもった。また長期休暇期間などを利用して、みずからの研究対象とするエゴ・ドキュメントについての海外調査をおこなった。長谷川は、イギリスのヒストリー・ワークショップ運動の集会に参加して、エゴ・ドキュメントをめぐる研究についての意見交換をおこなった。小野寺は、ドイツの「日記アルヒーフ」を訪問して史料調査をおこなった。松井は、研究対象とする回想録がいずれもモスクワの「民衆アーカイヴ文書センター」に所蔵されていたが、それが閉鎖された後に移管された「ロシア国立現代史文書館(RGANI)」を訪問した。同じく、大黒はイタリア、長谷川まゆ帆はフランス、安村直己はメキシコについて調査をおこなった。本研究は、このエゴ・ドキュメントを中心とした歴史研究の動向を、広く欧米の歴史学に内在しつつ検討することを課題としており、第一に、ヨーロッパ規模で展開している研究を把握するため、ヨーロッパのエゴ・ドキュメントに関する研究所(英・蘭)との交流活動を推進すると同時に、研究分担者の対象とする国・地域における研究・史料の状況を概観し、第二に、研究分担者の現地調査をともなう具体的な史料分析によって、エゴ・ドキュメント研究の実践をおこなうことにしている。ヨーロッパの研究者との交流は不十分であるが、各個人の史料調査による研究は、おおむね順調に推移している。本年度は、最終年度として研究成果を公表するための諸活動に取り組んだ。ひとつは、公開シンポジウムを開催することであり、具体的には第67回日本西洋史学会大会(一橋大学)にて研究発表をおこなった。その内容は、エゴ・ドキュメントをめぐる研究方法や資料保存状況を概観した後に、具体的な史料の検討によって分析の手法を示すという二つの柱から構成された。シンポジウムでは、エゴドキュメントの研究史的背景を考慮しつつ、中世・近世から現代にいたるヨーロッパ内外で執筆されたエゴ・ドキュメントの分析の実践例を提示しつつ、その歴史研究における射程を明らかにした(報告1:大黒俊二「エゴ・ドキュメントの出現ーラテン語から俗語へー」報告2:安村直己「エゴ・ドキュメントをめぐるせめぎあいーラテンアメリカ史研究の現場からー」報告3:小野寺拓也「感情と情報リテラシーの狭間でー第二次大戦末期のドイツにおける噂とコミュニケーションー」)。

3つの個別報告に対して、エゴ・ドキュメント研究を貫く「書くこと」と「読むこと」に関わる諸問題について、近世フランス史(長谷川まゆ帆)と現代ソヴィエト・ロシア史(松井康浩)の立場から具体的な素材を提示しながら、広くエゴ・ドキュメント研究に関わる論点を開示した。もうひとつは、研究成果を論文集として刊行することである。その内容は、公開シンポジウムの内容を受けて、エゴ・ドキュメントをめぐる研究方法や資料保存状況の国際比較,そして具体的な史料分析からなる二部構成を考えている。出版物は、まず日本語でまとめることにした。論文集に向けての企画会議ならびに研究総括という意味での全体研究会は開催できなかったが、メール会議にて代替した。本研究では、各自が担当する国・地域(イギリス・フランス・ドイツ・イタリア・ロシア・スペイン)におけるエゴ・ドキュメント研究の状況を把握した。具体的には、資料編纂状況であり、また分析の方法論である。エゴ・ドキュメントから派生する歴史理論の開拓も進んでおり、例えば、エゴ・ドキュメントを読み解く方法として、史料に照射される「主観性」、さらに情動・感情の歴史が注目されている。本研究の総括的位置を占める日本西洋史学会大会のシンポジウムでは、中世・近世から現代にいたるヨーロッパ内外で執筆されたエゴ・ドキュメントの分析の実践例を提示して、その歴史研究における射程を明らかにした。(1)全体研究会:本年度も、研究会を2度開催する。第一回は、前年の成果を確認しつつ、引き続き資料保存ならび研究の状況などについてとりまとめる。秋以降は、夏期の海外調査を受けて、それぞれが対象とするエゴ・ドキュメントを用いた実践例を検討する研究会を行う。これらは、翌年の公開シンポジウムの準備会の意味を併せもつ。(2)海外調査:本年度も休暇期間を利用して史料編纂・保存状況、研究方法についての調査を行う。具体的には、イギリス、オランダ、ドイツ、ロシア、イタリア、フランス、メキシコについての資料調査を行う。来年度は、最終年度として研究成果の公表に取り組む。ひとつは、公開シンポジウムを開催することであり、具体的は日本西洋史学会の大会などでの発表を考えている。その内容は、エゴ・ドキュメントをめぐる研究方法や資料保存状況を概観した後に、具体的な史料の検討によって分析の手法を示すという二つの柱からなる構成を考えている。ふたつ目は、研究成果を論文集としてまとめることである。刊行は、日本語でまとめることも考えているが、できれば、外国語〔英語〕による発表という形態も考えている。そのために海外の出版社との交渉をおこなうことにする。以上、論文集に向けての企画会議ならびに研究の総括という意味での全体研究会を一度開催することにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。イギリス史、歴史理論29年度が最終年度であるため、記入しない。
生産設備の自己劣化診断に関する研究

マシニングセンタを例にとり,制御装置内で得られる情報を活用して劣化診断を行う手法の検討を行った.1)小型マシニングセンタのNC制御装置から各送り軸モ-タのサ-ボル-プの偏差信号を取り出し送り軸モ-タの負荷トルクを計測できるようにした.また,工具交換装置については,ア-ム停止時の振動信号が計測できるように変位計を装着した.2)これらの信号を,NC制御装置に接続した計算機システムで集録できるようにした.また,この計算機はNC制御装置に対してDNC機能を有するようにしており,計測信号をNCプログラムと対比させて解釈が可能なようにした.3)送り軸負荷トルク信号から機械および切削状態のを認識が可能なことが明かとなった.また,送り系の特性を線形予測モデルで表現し,そのパラメ-タから送り系の状態を診断する方法を考案した.4)ア-ム停止時の振動は,ア-ムが把持している工具の種類によって異なるため,この波形の周波数解析結果をパタ-ン化し,登録した正常時のパタ-ンとマッチングすることにより異常状態を識別する方法を考案した.5)シ-ケンス制御機械の制御プログラムと異常診断プログラムを統合化する方法について検討し,機械の動作を表現した状態遷移モデルから半自動的に制御・診断プログラムを生成するアルゴリズムを考案した.マシニングセンタを例にとり,制御装置内で得られる情報を活用して劣化診断を行う手法の検討を行った.1)小型マシニングセンタのNC制御装置から各送り軸モ-タのサ-ボル-プの偏差信号を取り出し送り軸モ-タの負荷トルクを計測できるようにした.また,工具交換装置については,ア-ム停止時の振動信号が計測できるように変位計を装着した.2)これらの信号を,NC制御装置に接続した計算機システムで集録できるようにした.また,この計算機はNC制御装置に対してDNC機能を有するようにしており,計測信号をNCプログラムと対比させて解釈が可能なようにした.3)送り軸負荷トルク信号から機械および切削状態のを認識が可能なことが明かとなった.また,送り系の特性を線形予測モデルで表現し,そのパラメ-タから送り系の状態を診断する方法を考案した.4)ア-ム停止時の振動は,ア-ムが把持している工具の種類によって異なるため,この波形の周波数解析結果をパタ-ン化し,登録した正常時のパタ-ンとマッチングすることにより異常状態を識別する方法を考案した.5)シ-ケンス制御機械の制御プログラムと異常診断プログラムを統合化する方法について検討し,機械の動作を表現した状態遷移モデルから半自動的に制御・診断プログラムを生成するアルゴリズムを考案した.
未来を拓く次世代育成のための「統合化」を主軸とした理科カリキュラムのデザイン

本研究は、育成する児童・生徒像を、これまで相克の関係にあった「専門家育成」と「市民育成」を越えて、「専門家」を包摂した「未来を拓く次世代育成」と定義する。そこから、物理・化学・生物・地学の専門分化した既存の科目を「つなぐ」という視座から再考し、未来を拓く次世代育成のための理科カリキュラムを理論的・実証的にデザインしていく。国内での試行的授業実践研究や諸外国(主として英国)の科学カリキュラムの動向調査、国際的な科学教育の潮流の理論的解明といった多様なアプローチを相補的に駆使しながら、「統合化」を主軸とした総合的考察を行い、これからの理科教育が目指すべき1つの方向性について知見や示唆を得る。
水質浄化プロセスの高度化を目指した迅速・簡便・正確な微生物モニタリング技術の開発

ACE(Affinity Capillary Electrophoresis)法を基盤とした新規な複合微生物群解析手法の開発を行った。Escherichia coliおよびPseudomonas putidaからそれぞれ抽出したtotal RNAを用いて、2種混合模擬複合系を構築した。いずれの微生物をターゲットとした場合においても、total RNAの混合比率の増加とともに検出されるピーク面積が増加し、5-50%の範囲において定量的に検出可能であることが示された。また、実際の排水処理リアクターより採取した活性汚泥中のE. coliおよびP. putidaの検出を行った結果、同時に行った定量的PCR法の結果とほぼ同等の定量結果が得られた。平成19年度は合成した遺伝子断片を用いたモデル系について基礎的検討を行った。Escherichia coliおよびPseudomonas puticlaからそれぞれ抽出したtotal RNAを用いて、2種混合模擬複合系を構築した。当該年度における検討項目は1:それぞれのtotal RNAの定量的検出、および2:プローブの結合・解離の繰り返しによる測定値の変化の2つである。E.coliおよびP.putida由来のtotal RNAの5'末端をビオチンで標識した。続いてそれぞれのRNAの合計を4μgとし、その混合比率を段階的に変化させてアビジン標識したマグネティックビーズと結合させた。調製したマグネティックビーズ溶液をキャピラリー管内に導入し、磁石で保持した。E.coli、P.putidaのそれぞれの16S rRNAをターゲットとした特異的プローブEco997およびPSMGを供試し、測定を行った。定量には、ホルムアミドでプローブを解離させた時のピーク面積を用いた。繰り返し測定については、ビーズをキャピラリー管内に保持させた状態で、Eco997プローブおよびPSMGプロ-ブを交互に供試し、検討を行った。その結果、いずれの16S rRNAをターゲットとした揚合においても、total RNAの混合比率の増加とともにプローブの解離ステップで検出されるピーク面積が増加し、5-50%の範囲において定量的に検出可能であることが示された。また、異なるプローブの結合・解離を交互に繰り返し行ったところ、5回までそれぞれのRNA量を反映したピーク面積が検出された。従って本手法は、5種類のターゲットをそれぞれ定量的に検出可能であると考えられる。ACE(Alfinity Capillary Electrophoresis)法を基盤とした新規な複合微生物群解析手法の開発を行った。平成20年度は活性汚泥中の微生物の検出について基礎的検討を行った。活性汚泥から抽出したtotal RNAに対してEscherichia coliおよびPseudomonas putidaからそれぞれ抽出した16S rRNAを加え、模擬活性汚泥試料を作製した。模擬活性汚泥から抽出したtotal RNAの5^'末端をピオチンで標識した。続いて5^'末端ピオチン標識RNA4μgをアピジン標識したマグネティックビーズと結合させた。E. coli, P. putidaのそれぞれの16S rRNAをターゲットとした特異的プローブEco997およびPSMGを供試し、測定を行った。その結果、いずれの16S rRNAをターゲットとした場合においても、混合比率の増加とともにプローブの解離ステップで検出されるピーク面積が増加した。E. coliの定量値は添加した量とほぼ同程度の値を示した。一方、P. putidaの定量値は添加した量に対して1.5倍程度高い値を示した。これはもともと活性汚泥に存在するP. putidaの量に依存するものだと推測される。結論として、本手法は活性汚泥中の特定の細菌を定量的に検出可能であると考えられる。
界面イオン移動システムの構築と分離化学への展開

水-有機層界面で特異的に濃縮生成するポリ酸錯体の欠損部位のサイズや電子密度は、酸素酸イオンや金属イオンの種類や電荷を変化させることにより広い範囲で制御することができる。界面電位差を自由に制御できる界面イオン移動システムの導入により、特定のイオン種に対する選択性の高い分離濃縮が可能となる。本研究では、新規欠損型ポリ酸錯体の水-有機層界面における特異吸着性を用いる新しいタイプの界面イオン移動システムの構築および種々の酸素酸イオン、金属イオンの分離濃縮への応用を目的とする。購入したポテンショスタット/カルバノスタットおよびパーソナルコンピューターを用いて、コンピューター制御界面イオン移動システムを構築し、欠損型ポリ酸錯体の生成過程、水-有機層界面における酸素酸イオンや金属イオンの捕捉過程の解析に応用した。その結果、ピロリン酸イオンを含む2種類の新規錯体を合成単離することができた。その内、18-モリブドピロリン酸錯体は、通常のケギン錯体、ド-ソン錯体が2電子酸化還元しか受けないのに対し、4電子移動波を生じる全く新しい酸化還元機構を有することを見いだした。また、生成反応の速度論的解析が可能となったため、2種類のケギン型錯体の電流-時間曲線の解析に適用した結果、欠損型錯体がケギン錯体の反応中間体であることを明らかにすることができた。現在、酸素酸イオンや金属イオンを捕捉後単離した置換型ポリ酸錯体の組成分析を行っているが、これまで報告例のない新規錯体が生成していることが分かっている。その解析を進めると共に、酸素酸イオンの状態分析へ応用するための基礎検討を急いでいるところである。
生体に学び・生体を凌駕する超高性能細胞分離・非標識検出法の創成

従来法では、非侵襲的な循環腫瘍細胞(circulating tumor cell: CTC)の分離・同定は不可能であった。しかし、今回の研究により非侵襲的かつ簡便なCTCの分離同定の可能性を見出すことに成功した。このことで分離・増殖させたCTCを利用した医学研究の推進が期待される。さらに、細胞分離手法を改良することで細胞分離および細胞内分子(DNA, RNA)の抽出を可能とする手法の開発に成功した。本手法では細胞の回収および細胞内分子の抽出が簡便でありサンプルロスの抑制も期待できる。このため本手法はCTCのような希少細胞の分離・細胞内分子の抽出に適した手法になりうると期待できる。[研究の目的・意義]日本人の大半は悪性新生物(がん)で死亡している。このためがんによる死亡者数低減にはがんの超早期発見およびがんの術後検査が重要であることは言うまでもない。がんの超早期診断および術後検査で期待されているのが血中循環腫瘍細胞(CTC)の分離・計測である。がん患者の血中にはCTCの存在が知られおり、CTCの数および遺伝子の解析により腫瘍の部位・大きさ、抗がん剤の適切な選択が可能になると期待されている。つまり、がんの超早期発見、がんの術後経過観察が採血という低侵襲的な操作で実施可能になる。そこで、本提案では、従来法をはるかに凌ぐCTCの分離・計測法の開発を目指した。[成果の内容・意義・重要性]今年度は昨年度までの知見をもとに、さらに性能の向上を達成すべく手法の検討を実施した。その結果、がん細胞を従来法と比較し低侵襲かつ簡便に同定・分離可能とした。従来法では、分離・同定に際して細胞を固定化するために、その後培養に供することは不可能である。しかし、本提案での手法では、非侵襲での同定・分離が可能であり、生きて回収した細胞を培養し、その後の医学研究に供することも可能である。また、CTCの一部はすでに生存していないとも報告されているが、本手法では死んだCTCも同定可能であることを明らかとした。このように昨年度までの知見をもとにさらに検討を行った結果、従来法との差異を明らかにすることに成功した。[成果の内容・意義・重要性]今年度は、当初の予定に従い、循環腫瘍細胞(circulating tumor cells: CTC)の特性評価を実施した。その結果、循環腫瘍細胞が正常細胞と比較し、プロテアーゼを過剰に発現していることを突き止め、測定により確認した。この事実は、従来の抗体抗原反応を使用せず、プロテアーゼの発現量でCTCの存在の有無を確認できる可能性を示唆し、現状では取りこぼしているCTCの分離・計測を達成できる可能性を有している。この事実を基に、CTCと血球細胞の分離原理を確定し、これをもとに生体内を模倣したマイクロ流体デバイスの作製に取り組んだ。まず初めにマイクロ流体デバイスの表面改質法を検討した結果、流体のせん断応力により剥離しないコーティング手法の開発に成功し、生体内環境を模倣したマイクロ流体デバイスの作製に成功した。また、ここで当初想定していなかった、工夫を凝らすことで、CTCの非標識検出を簡便に可能とするマイクロ流体デバイスの作製にも成功した。当初の計画以上の成果をあげられ、しかも従来法の性能をはるかに凌ぐ性能を得られる可能性のある分離・計測手法になる可能性を見出すことに成功した。

そこで、本提案では、従来法をはるかに凌ぐCTCの分離・計測法の開発を目指した。[成果の内容・意義・重要性]がん細胞を従来法と比較し低侵襲かつ簡便に同定・分離可能とした。従来法では、分離・同定に際して細胞を固定化するために、その後培養に供することは不可能である。しかし、本提案での手法では、非侵襲での同定・分離が可能であり、生きて回収した細胞を培養し、その後の医学研究に供することも可能である。さらに、細胞分離手法を改良することで細胞分離および細胞内分子(DNA)の抽出を可能とする手法の開発に成功した。現状では細胞分離と細胞内分子の抽出には多大な操作を必要とし、抽出時における細胞内分子のロスも問題となっている。一方で今回報告した手法では細胞の回収および細胞内分子の抽出が簡便であり、サンプルロスの抑制も期待できるために本手法はCTCのような希少細胞の分離・細胞内分子の抽出に適した手法であると期待できる。分析化学[研究の目的の達成度]当初の予定通りにおおむね順調に進展していると考えられる。原理構築・実証は昨年度までにある程度完成しており、今年度はさらに詳細な点まで検討項目を増やして検討を行った結果、従来法との差異を明らかとし、本提案の優位性を示すに至ったために当初の計画通りに研究推進しているものと評価する。[研究の目的の達成度]当初の計画以上の進展を見せている。先ほどの成果報告に記載のとおり、申請時に計画した実施項目・課題はすべて今年度内に完了し、順調な研究状況である。当初計画していた、CTCモデル細胞と血球細胞の差異を見出す研究は論文等の知見や医学系研究者の協力もあり、順調に進み、CTCの分離・計測に利用可能な差異を見出すことに成功した。また、この差異を利用した分離・計測を可能とするマイクロ流体デバイスの作製に関しても、せん断応力によっても剥離しない表面コーティング手法の開発に成功し、生体内を模倣するマイクロ流体デバイスの作製に成功した。そして、当初想定していなかった、アイデアがひらめき、この表面コーティングに一工夫加えることで非標識検出を可能とするマイクロ流体デバイスの作製に成功したために、当初の計画以上の進展を見せていると自己診断している。昨年度に当初予想していなかった事案が出てきたためにこれの評価を実施したのちに、当初の計画どおりに研究を推進する。そして、従来法と本提案法を再度比較検討し、利点・欠点を整理し、最終評価をまとめる予定である。[今後の研究の推進]今後は当初の予定通りに研究を推進する予定である。具体的には次の項目を検討している。生体内模倣環境を人為的に構築する条件の検討。昨年までは、“分けられる側の細胞"に着目したが、本年度以降は、その物性の差を認識する分離場の構築を行なう。いかに分離する細胞の物性の差を増幅できたとしても、それを単一細胞レベルで認識し、捕捉するシステム(分離場)が必要である。正常なヒトでさえ生体内では、がん細胞が生まれ、血液に漏れ出ているといわれている。しかし、がんにならないのは、生体が多量の血球細胞にまぎれたがん細胞を異物として認識・捕捉し、駆逐するためである。つまり生体を模倣できれば高分離性能が達成可能である。
聴性脳幹反応による意識障害・脳死の診断と内耳・神経病理学的研究

聴性脳幹反応(ABR)は1970年に米国のJewettによって発見されて以来、意識障害や脳死の判定の補助診断法として、NICUやICUにおいて欠くことの出来ない地位を確立している。クリック音に対する蝸牛、聴神経、脳幹の聴覚中継核より出現する7つの波は、意識障害では、波の数が減少したり、潜時が延長したりし、脳死では第I波のみ出現するが無反応の場合は側頭骨病理では、その多くはコルチ器が融解状態であるが例外的に、良く保たれている。しかし、神経病理では脳幹内の血管の赤血球はゴ-スト化し、ヘモグロビンが失われている。ところが髄外を走る脳底動脈およびその分枝内の赤血球はほぼ正常である。これは、脳死状態では脳幹内の血流が途絶しているが、脳底動脈には血流が存在することを示している。コルチ器が融解している例では、前下小脳動脈の枝の迷路動脈の血行障害が生じている。(2)脳死状態では大脳皮質、海馬、小脳皮質の神経細胞の著明な脱落が認められる。脳幹では蝸牛神経核でも同様な現象が認められるが、他の聴覚中継核の保存状態は良い。ラットの脳死実験では、(1)両側の頚動脈結紮による大脳血流遮断モデルでは、ABRは612時間経てもほとんど影響がない。大脳皮質のニューロンは海馬を除き良く保たれている。(2)脳底動脈結紮モデルでは、ABRは直ちにI波だけとなり、その後、無反応となる。(3)クモ膜下にキシロカインを注入する全脊麻モデルでは、ABRは数分で無反応になるが、しかしその後、徐々に回復し正常波形になった。他にネコおけるABRの各波の起源を脳幹全体からの電場電位、破壊実験、HRP注入実験より明らかにすることが出来た。I.症例に基く研究。これまでICUなどにてABRによって脳死と診断した症例の側頭骨病理と神経病理を完成させ、それぞれの連続切片を作製し、比較検討した。ABRはいずれも病院へ搬入された時点では正常波形で、治療にもかかわらず消失し脳死状態となった。消失後、2100時間で心停止となった。原疾患は、脳血管障害、頭部外傷、ヘルペス脳炎などである。側頭骨病理では1例のみコルチ器の内外有毛細胞が保たれ、他の5例は完全に脱落していた。一方神経病理では、脳幹の聴覚伝導路の神経核に無酸素状態による核の萎縮、細胞質の膨化が認められた。特に蝸牛神経核の細胞の脱落が顕著で、脳死の物差しとして重要であると考えられた。一方、脳死の際に見い出されるという脳幹内部の血管の赤血球の泡沫状の変化は、我々の例でも1例を除き見い出された。しかし、脳幹の髄外の血管の赤血球並びに蝸牛内の赤血球にはこのような変化は見い出されなかった。以上の事実は、脳幹と髄外および蝸牛の血行支配が異なることを示唆している。II.動物モデルに基く研究。人工呼吸下のモルモットを用い、不動化後、人工呼吸器を停止し、呼吸の再開後までのABRの変化を調べた。その結果人工呼吸停止後5分以内は、ABRは元に戻るがそれ以外はいわゆる脳死状態となり、ABRは消失しても心活動は続くことがわかった。今後は、CM、蝸電図の同時記録も検討し、かつ病理学的にも調べる予定である。

他にネコおけるABRの各波の起源を脳幹全体からの電場電位、破壊実験、HRP注入実験より明らかにすることが出来た。(1)症例に基く研究ABRによって脳死と診断した症例の側頭骨病理と脳病理について、有毛細胞ラセン神経節、脳幹の聴覚伝導路の中継核、大脳の皮質ニューロンの病理学的変化、ならびに側頭骨内の血管、脳幹の内部の血管と外部の血管、大脳の内部の血管と外部の血管、それぞれの赤血球の状態について比較検討した。側頭骨病理では一般に有毛細胞は崩壊状態になり消失し、ラセン神経節は膨化することがわかった。例外的に正常な症例もあった。脳幹のニューロンは核の萎縮、細胞質の膨化を認めた。大脳の皮質ニューロンは脱落消失の傾向が著明であった。側頭骨内の血管と脳幹の外部、大脳の外部の血管の赤血球の状態は正常な形と色と保っているが、脳幹の内部および大脳の皮質内の血管の赤血球の状態はいずれも泡沫状の変化を示した。以上の脳死による形態学的変化は、ABRが無反応を呈する脳幹死の状態が約12時間以上持続すると生じることがわかった。カロリックテスト無反応を呈する症例の側頭骨病理についても今回、検索した。(2)動物モデルに基く研究ABR無反応を呈する動物モデルを作成した。(1)人工呼吸下のモルモットを不動化させ、人工呼吸器を約5分停止させるとABRが無反応になった。(2)強大音響外傷を与えると1回目ではABRは回復するが、約12時間おいて2回目の強大音響外傷ではABRが永久的に無反応になる。(3)モルモットのクモ膜腔にリドカインを注入すると蝸電図、ABRが無反応になるが、少量では回復し多量では恒久的に無反応になる。この間、CMは保たれることがわかった。リドカインの静注では注射後、超短時間だけ、わずかの影響を受けることがわかった。以上の動物モデルの蝸牛の病理と脳の病理を調べるべく準備中である。I症例に基づく研究1.幼小児で溺水事故、布団による窒息事故などにより心停止を来したが救命され、脳性麻痺などの脳障害を来した症例を対象にABR検査を行った。その結果、溺水事故例では、ABRは脳幹障害を示したが、窒息事故例では、異常波形を示さなかった。2.脳死例の側頭骨病理と比較するために、溺水事故、窒息事故死例の側頭骨病理を調べた。その結果、外耳道皮膚、内耳腔粘膜、乳突洞粘膜に共通して出血が認められた。一部内耳、内耳道に出血を認めた。II動物モデルに基づく研究ハムスターを用いて、脳死モデルを作成した。ABRの消失後もCMの出現が長く続くことがわかった。病理学的に臨床例でみられるように脳が無酸素状態が長く続くと下丘の神経細胞が脱落するか否か検索中である。聴性脳幹反応(ABR)は1970年に米国のJewettによって発見されて以来、意識障害や脳死の判定の補助診断法として、NICUやICUにおいて欠くことの出来ない地位を確立している。クリック音に対する蝸牛、聴神経、脳幹の聴覚中継核より出現する7つの波は、意識障害では、波の数が減少したり、潜時が延長したりし、脳死では第I波のみ出現するが無反応の場合は側頭骨病理では、その多くはコルチ器が融解状態であるが例外的に、良く保たれている。しかし、神経病理では脳幹内の血管の赤血球はゴ-スト化し、ヘモグロビンが失われている。ところが髄外を走る脳底動脈およびその分枝内の赤血球はほぼ正常である。これは、脳死状態では脳幹内の血流が途絶しているが、脳底動脈には血流が存在することを示している。コルチ器が融解している例では、前下小脳動脈の枝の迷路動脈の血行障害が生じている。(2)脳死状態では大脳皮質、海馬、小脳皮質の神経細胞の著名な脱落が認められる。脳幹では蝸牛神経核でも同様な現象が認められるが、他の聴覚中継核の保存状態は良い。ラットの脳死実験では、(1)両側の頸動脈結紮による大脳血流遮断モデルでは、ABRは612時間経てもほとんど影響がない。
聴覚障がい者の双方向コミュニケーションにおける表出手段に関する研究開発

【研究項目A】「双方向コミュニケーションのための表出手段の分類調査と代替手段・システム開発」に関して発話に依存しなくて済むような聴覚障がい学生のための表出インタフェース(手法や工学的なシステム)に関して調査するために、聴覚に障がいのある学生、情報保障者、教員等に対するアンケートの調査項目を選定するための準備を引き続き進めた.今年度、調査項目や研究協力者(被験者)のカテゴリーを確定し、国内の教育機関にて表出に関する現状を調査するためのアンケート実施に向けて、学内研究倫理委員会に申請し、受理された。今後、アンケートを実施・分析し、学会発表を実施する予定である。アンケートの実施、分析までは至っていないが、アンケート実施のための研究計画を作成し、学内研究倫理委員会から受理された。研究倫理委員会から許可を得た【研究項目A】のアンケート調査に関して注力し、優先的に進めてゆく予定である。【研究項目A】「双方向コミュニケーションのための表出手段の分類調査と代替手段・システム開発」に関して発話に依存しなくて済むような聴覚障がい学生のためのインタフェース(手法や工学的なシステム)を調査するために,聴覚に障がいのある本学学生,情報保障者,教員等に対するアンケートの調査項目を選定するための準備を進めた.研究活動に必要なソフトウェアやハードウェア機材、そして分析用ソフトウェアの再選定等を実施した.また,上記アンケートに関しては,学内研究倫理委員会に申請するための準備も進めた.現時点で想定しているインタフェースとしては,まず情報保障者(音声を文字に即座に変換する担い手)を介さない方法と介す方法があると考えており,現場でのスムーズな双方向コミュニケーションの実現を目指していきたいと考えている.【研究項目B】「双方向コミュニケーションのリアルタイム性確保とシステム開発」について字幕の大画面表示,ヘッドマウントディスプレイ表示,小型携帯端末表示などの字幕提示手法の特性の違いに関して比較検討を開始した.特に,本研究の【研究項目A】で開発する双方向コミュニケーション実施時におけるリアルタイム性への影響の検討に備えたい.特に近年,ヘッドマウントディスプレイの製品化が加速し,様々な表示手法が見られる.これらの最新技術も積極的に取り入れ,最適な双方向コミュニケーション手段を見出したいと考えている.実験等の実施にまでは至っていないが,そのための各種準備は進行中である.【研究項目A】「双方向コミュニケーションのための表出手段の分類調査と代替手段・システム開発」に関して発話に依存しなくて済むような聴覚障がい学生のための表出インタフェース(手法や工学的なシステム)に関して調査するために、聴覚に障がいのある学生、情報保障者、教員等に対するアンケートの調査項目を選定するための準備を引き続き進めた.今年度、調査項目や研究協力者(被験者)のカテゴリーを確定し、国内の教育機関にて表出に関する現状を調査するためのアンケート実施に向けて、学内研究倫理委員会に申請し、受理された。【研究項目A】【研究項目B】に関して進め,場合によっては優先度を付けて実施してゆきたい.研究倫理委員会から許可を得た【研究項目A】のアンケート調査に関して注力し、優先的に進めてゆく予定である。次年度使用額は少額であり,次年度の消耗品として研究活動に供したい.アンケート実施に伴う経費や学会発表の予算使用に遅れが生じたためである。次年度、アンケートの実施・分析、そして学会発表用として使用する予定である。
マウス白血病細病に於ける胸腺白血病(TL)抗原発現の分子機構の解析

腫瘍特異抗原並びに分化抗原の発現機構を解析するために、マウス胸腺白血病(TL)抗原をモデルとして、分子生物学的・細胞工学的・胚工学的手法を用いて、実験を行ない、次の様な結果を得た。1.細胞の白血病化に伴なうTL抗原の発現機序の解析:正常では発現されないTL抗原が白血病細胞で発現されるのは、遺伝子の転写のレベルにおける活性化によることを、各種正常並びに白血病細胞におけるTLmRNAの検索により明らかとした。さらに、遺伝子及び染色体の構造の解析を行ない、(1)トランスポゾン様配列の挿入,点突然変異等によるTL遺伝子,もしくは5'側プロモーター領域での構造の変異,(2)遺伝子の増幅,転座,もしくは再構成,(3)クロマチン構造の変化,等が白血病細胞に於ける遺伝子活性化の原因ではないことを明らかにし、細胞質因子が関与していることを示唆した。2.細胞分化に伴なうTL抗原の発現機序の解析:白血病化に伴なうTL抗原の発現の場合と同様の結果が得られた。しかし分化に伴なう発現には、クロマチン構造(DNase【I】に対する感受性)が関与することを明らかとした。3.トランスフェクション法によるIn vitroにおけるTL遺伝子の発現の解析:クラスIであるが発現様式の全く異なるH-2遺伝子と各種TL遺伝子との間で作成した各種キメラ遺伝子をマウスL細胞に導入し、それら遺伝子の発現を検索した。その結果、H-2遺伝子の5'側プロモーターは、TL遺伝子のそれに比べ10倍以上強いことを明らかとし、またTL遺伝子の転写がL細胞では一定の塩基配列から開始していないことを示す結果を得た。4.トランスジェニックマウス作成によるIn vivoにおけるTL遺伝子の発現の解析:TL並びにキメラ遺伝子の導入に成功してはいるが、抗原発現を示すトランスジェニックマウスを得るには至っていない。
ゲノム編集技術を用いた寄生虫フリーなトラフグの作出

トラフグゲノムデータベースより免疫グロブリンM(ミュー)鎖の塩基配列を抽出し、第二エキソンを標的とするガイドRNAを作製した。次に長崎県総合水産試験場の協力を得て、トラフグの産卵期である4月に同場にて約300個の受精卵にガイドRNA、Cas9、およびスクリーニング用の蛍光色素を実体顕微鏡下でマイクロインジェクションした。これを北里大学まで輸送し、インジェクションに成功した個体を蛍光顕微鏡下でスクリーニングしたところ、約60%の成功率であった。インジェクションされた個体を孵化させ、継続して飼育を試みたものの、約1ヵ月後に全滅してしまい、IgM欠損個体を得ることは出来なかった。複数の遺伝子にノックアウトを施すことが可能かどうかを調べるための予備実験として、ゼブラフィッシュの受精卵に、3つの遺伝子を標的とするガイドRNAを共注入した。ゲノム配列をシーケンシングしたところ、いずれの遺伝子にも変異が確認された。トラフグ受精卵へのインジェクションには成功したものの、飼育過程で全滅してしまい、予定していた感染実験に耐えうる大きさの個体を得ることが出来なかった。しかしながら、昨年度および今年度行ったゼブラフィッシュを用いた予備実験により、インジェクションに成功した個体は、ガイドRNAの種類に係らず、高い確率でターゲット遺伝子のゲノムに変異が生じていたことから、トラフグにおいてもゲノム編集が導入されていた可能性は高い。今後の飼育技術の向上を目指したい。引き続き春季にトラフグ受精卵へのインジェクションを行う。飼育に関しては、トラフグの稚魚の飼育に実績を有する共同研究先の東京大学大学院農学生命科学研究科附属水産実験所の技術職員に指導を仰ぎ、少しでも多くの個体を成長させる。また、トラフグ稚魚の飼育に失敗した場合は、夏季に産卵し、かつヘテロボツリウムの付着が確認されているクサフグを用いる。本研究は、トラフグにゲノム編集を施し、IgM欠損個体を作出することを第一の目的としている。具体的にはトラフグ受精卵にIgM遺伝子配列に相補的なガイドRNAおよびゲノムDNA切断酵素Cas9をインジェクションし、IgM遺伝子のノックアウトを目指している。しかしながらトラフグの産卵期は春季に限定されること、かつインジェクションにはある程度の技術が求められることから、初年度は、年中人為的に産卵を誘発でき、かつ成長も早いゼブラフィッシュを用い、IgMのゲノム編集を行うこととした。まず、ゼブラフィッシュゲノムデータベースからIgM重鎖定常領域の第一エキソン配列を抽出し、制限酵素認識部位(Bam HI)を含むようにガイドRNAを設計した。次に自然産卵によって得たゼブラフィッシュ受精卵約100個に対し、ガイドRNAおよびCas9を顕微鏡下でインジェクションした。受精卵を28°Cで飼育し、ある程度の大きさに育った個体をランダムに16個体選別し、ゲノムDNAを抽出した。その後、これを鋳型とし、ガイドRNA認識部位を含む領域約250bpを増幅させるように設計したプライマーでPCRを行った。その後、PCR産物を2等分し、一方を制限酵素Bam HIで処理した。制限酵素処理区および未処理区のPCR産物をアガロースゲル電気泳動に供し、切断の有無を確認することで、ゲノム編集された個体の1次スクリーニングを行った。電気泳動の結果、6個体のPCR産物において、制限酵素処理後のバンドサイズが未処理区と変化が見られず、ゲノム編集の導入が示唆された。そこで次にこれらの個体由来のPCR産物の塩基配列をダイレクトシーケンス法を用いて解析し、正常個体のそれと比較した。その結果、全ての個体で塩基の欠損が認められた。アミノ酸配列に翻訳したところ、6個体中4個体でフレームシフトが生じており、IgMの欠損が示された。当初の予定では初年度からトラフグ受精卵にインジェクションを行いIgM欠損トラフグを作出する予定であったが、技術の習得および試薬の準備に時間をとられ、トラフグの産卵期を逃してしまった。そのため、やむなく初年度は対象魚を急遽ゼブラフィッシュとし、技術の習得に重点を置いた。そのため、トラフグを用いての成果はガイドRNAを得た程度であり、進捗状況は芳しくはない。しかし今年度実施したゼブラフィッシュを用いた予備実験では、ランダムに選出した16個体のうち、6個体にゲノム編集が導入されており、その導入率は37.5%であった。さらにフレームシフトを生じていた個体は4個体得られ、その成功率は25%と極めて高いものであった。今年度習得した技術をトラフグに応用し、かつインジェクションする受精卵を大量に準備できれば、来年度以降はスムーズに研究を遂行することができるものと考えている。

トラフグ受精卵へのインジェクションには成功したものの、飼育過程で全滅してしまい、予定していた感染実験に耐えうる大きさの個体を得ることが出来なかった。しかしながら、昨年度および今年度行ったゼブラフィッシュを用いた予備実験により、インジェクションに成功した個体は、ガイドRNAの種類に係らず、高い確率でターゲット遺伝子のゲノムに変異が生じていたことから、トラフグにおいてもゲノム編集が導入されていた可能性は高い。今後の飼育技術の向上を目指したい。トラフグ産卵期に大量の受精卵を用意し、IgM遺伝子を標的とするガイドRNAおよびCas9をインジェクションする。ゲノム編集導入個体をスクリーニングし、ある程度の体長になるまで飼育した後、ヘテロボツリウム幼生の曝露実験を行う。そして寄生数をワイルドタイプのそれと比較する。引き続き春季にトラフグ受精卵へのインジェクションを行う。飼育に関しては、トラフグの稚魚の飼育に実績を有する共同研究先の東京大学大学院農学生命科学研究科附属水産実験所の技術職員に指導を仰ぎ、少しでも多くの個体を成長させる。また、トラフグ稚魚の飼育に失敗した場合は、夏季に産卵し、かつヘテロボツリウムの付着が確認されているクサフグを用いる。当初トラフグを用いてゲノム編集を行う予定であったが、トラフグの産卵期および技術的問題により、今年度はゼブラフィッシュを対象魚とした。ゼブラフィッシュおよびその飼育機器は安価なため、次年度使用額が生じた。また、トラフグに対するインジェクションを共同研究先の東京大学大学院農学生命科学研究科附属水産実験所(浜松市)で行う予定であったが、その旅費として計上していた予算も未使用となり、次年度使用額が生じた。来年度以降は本格的にトラフグを用いた実験を行うため、飼育設備や旅費にあてる予定である。試薬購入の際、代理店による割引価格が予想より高かったため、次年度使用額が生じた。しかし来年度の試薬の購入等で十分消費が可能と考えている。