hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜タンパク質機能を直接制御する機能性脂質の探索と作用機序の解明

そこで各種脂肪酸を用いて異なる脂質分子間に発生する側方ストレスのタンパク質への影響を検討するため、周波数変換蛍光寿命測定装置を用いて測定を行う。本実験に必要な装置は日本国内にないため、米国に数か月滞在して測定を行うこととする。過年度はマテリアル(膜タンパク質)の作成を行うことに集中し、無事に精製過程まで終了することができた。そこで本年度、次年度(最終年度)は、各種脂肪酸の構造・物理的作用と膜タンパク質の活性との関係を実際に検討(実験)するため、米国出張(数か月滞在)を含めた実験に用いる消耗品、機器使用料、旅費、成果発表費(論文投稿、校正費)などに本助成金を使用する。
部位特異的エピゲノム編集による骨再生法に関する基盤的研究

1.ヒト多能性幹細胞の高効率骨芽細胞分化系の最適化:ゲノム解析は大量の細胞を必要とするため、初代細胞の取得が困難なヒトの器官形成過程の解析では、多能性幹細胞の分化系が広く用いられる。前年度までの検討により、低分子化合物のみを用いたdefined(無血清)かつxeno-free(異種由来のものを培養系に含まない)条件で、中胚葉分化を経由して多能性幹細胞から骨芽細胞を形成するプロトコールの大枠が決定した。そこで、本年度は中胚葉分化ステップに焦点を当てて、低分子化合物の種類と処理期間の最適化を行った。その結果、従来法と比べてより簡便な基礎培地を用い、数種類の低分子化合物の複数の組み合わせで段階的にヒトiPS細胞を処理することで、生理的な中胚葉形成過程を模倣するプロトコールを見出した。本プロトコールで培養した細胞において、中胚葉形成の各段階のマーカー遺伝子の発現を確認したところ、従来法に匹敵する発現上昇が認められた。また、発生段階の中胚葉形成を模倣した経時的な発現パターンを呈していた。本法で作成した中胚葉由来組織が骨芽細胞と軟骨細胞へ分化する能力を有することも確認した。2.ヒト・マウス骨芽細胞分化過程におけるエピゲノム動態、遺伝子発現動態の解析:マウス新生仔頭蓋骨の骨芽細胞をセルソーティングにより採取し、オープンクロマチン領域のプロファイリングとRNAシークエンスによる遺伝子発現プロファイリングを行った。当初計画の通り、ヒト多能性幹細胞の骨芽細胞分化系の基本プロトコールが確定し、一部エピゲノムデータの取得が開始されているため。ヒト多能性幹細胞の骨芽細胞分化系におけるエピゲノム・遺伝子発現データの取得を推進する。1.ヒト多能性幹細胞の高効率骨芽細胞分化系の最適化ヒト骨芽細胞分化過程におけるエピゲノム解析を行うため、本項ではヒト多能性幹細胞から骨芽細胞への高効率分化系の確立を目指した。ChIP-seqによるエピゲノム解析は大量の細胞を必要とするため、初代細胞の取得が困難なヒトの器官形成過程の解析では、多能性幹細胞の分化系が広く用いられる。低分子化合物のみを用いたdefinedな条件(無血清)で、中胚葉分化を経由して多能性幹細胞から骨芽細胞を形成する手法をすでに開発している(Stem Cell Reports, 2014)。本法をもとに、ヒト多能性幹細胞の骨芽細胞誘導のための低分子の種類と使用期間の最適化を行った。定量的RT-PCR法による骨芽細胞分化マーカー遺伝子の発現解析、免疫染色・フローサイトメトリーによるマーカー蛋白質の発現解析、及びvon Kossa染色による石灰化の確認を通じて、有望な条件を見出した。本条件は、完全にdefinedで、かつxeno-free(異種由来のものを培養系に含まない)である。この条件で、ヒト多能性幹細胞を培養すると、生体における骨芽細胞の分化過程を模倣しながら成熟骨芽細胞まで誘導できることが、マーカー遺伝子の発現パターン解析から確認された。また、石灰化も誘導されることを確認している。さらに重要なことに、本条件は複数のヒト多能性幹細胞系統(4系統)全てにおいて、骨芽細胞分化を誘導できることが判明した。当初の計画通り、ヒト多能性幹細胞の高効率骨芽細胞分化系の最適化が終了しつつあるため。ヒト多能性幹細胞の骨芽細胞分化系の最適化を終了し、エピゲノム動態・遺伝子発現動態のゲノムワイドデータの取得にとりかかる。
選択的除菌治療のための未分化型胃癌発症高危険群同定法の確立

胃がん発生に重要な役割を持つHelicobacter pyloriCagA蛋白に対するリン酸化型特異抗体を作成し、ヒト血清を用いた抗体価測定系を構築した。胃未分化型癌症例においては、抗体価が特異的に高値であることを示した。さらに、従来のペプシノゲン法を用いた血清診断においては、PG-II高値が重要であることを示した。北海道大学、畠山教授(現、東京大学)との共同研究としてHelicobacter pylori由来チロシンリン酸化型CagA蛋白(CagA-P)ポリクローナル抗体を作成した。免疫生物研究所(群馬県高崎市)との共同開発により、10merのepitope(CagA-P)を選出し、recombinant oligopeptideをウサギに免疫した。全血清採取後にIgG分画を精製し、さらにチロシン非リン酸化型ペプチドで吸収をおこない、チロシンリン酸化型特異分画を得た。この抗体を用いて、ヒト胃粘膜において、実際にCagA-Pが発現していることを免疫組織化学にて確認した。本抗体を用いた免疫組織学的検討においては、H.pylori感染ヒト胃粘膜において、本抗原は胃腺窩上皮に存在しており、十分量の抗原を用いた吸収試験にてシグナルは消失したため、本反応は特異的シグナルであることを確認した。また、本抗原をプレート上に固相化することにより、ヒト血清をサンプルとして抗CagA-P抗体価を測定するELISA系を新たに構築した。本ELISA系を用い、実際の患者血清を用いた抗Helicobacter pyloriCagA-P抗体価測定を継続実施している。胃癌発症症例と対照群を設定し、それぞれの患者血清をサンプルとして本抗体価を測定し、胃癌発症と本抗体価の因果関係を検討することを継続している。この抗体価をマーカーとすることで、選択的除菌治療のための胃癌発症高危険群同定を試みる予定である。免疫生物研究所(群馬県高崎市)との共同開発により、Helicobacter pylori (H.pylori)の重要な毒性因子であるCagA蛋白のうち、抗原とすべき10merのepitopeを選出した。CagA蛋白は宿主に移行後、細胞内リン酸化を受け、重要な細胞内シグナル撹乱蛋白となるため、チロシンリン酸化型oligopeptide (CagA-P)を作製し、これをウサギに免疫することで、チロシンリン酸化型CagA蛋白(CagA-P)ポリクローナル抗体を作成した。この抗体を用いて、ヒト胃粘膜において、免疫組織化学を施行したところ、ヒトH.pylori感染胃粘膜り腺窩上皮にCagA-Pの発現を確認した。実際の未分化型早期胃癌症例の胃粘膜と血清を用い、未分化型胃癌症例胃粘膜におけるCagA-Pの発現ないし、血清中の抗CagA-P抗体を測定したところ、未分化型胃癌症例において、胃粘膜におけるCagA-P発現ならびに血清中の抗CagA-P抗体は有意に高値であった。また既存のサンプルを用い、未分化型胃癌における血清マーカーを測定し、対照症例と比較検討をおこなった。これまで有用とされてきたペプシノゲン法は未分化型胃癌の高危険群設定には有用でなく、唯一ペプシノゲンIIの値が、未分化型胃癌高危険群設定に有用であった。今後はこれらマーカーを複合し、総合的な胃未分化型高危険群の同定を試みる予定である。さらには、未分化型胃癌を含む早期胃癌内視鏡治療後症例を対象とした、除菌介入前向き試験を実施計画し、現在当院倫理委員会に申請を行なっている。本邦における未分化型胃癌の高危険群を絞り込むため、主として血清学的胃炎マーカーを用いて、高リスク群設定をおこなった。その結果、Helicobacter pylori血清抗体陽性、ペプシノゲン法陰性、ペプシノゲンII値高値(>30ng/ml)以上の集団において、未分化型早期胃癌の発生危険度が最も高値となり、高危険度群として特定可能であった。現在、本邦においてABCリスク診断を用いた胃癌検診が行なわれつつあるが、これらの集団はB群に分類され、ともすれば中等度リスク(C群、D群に比べ比較的低リスク)と見なされてしまう可能性がある。本邦における胃癌死亡を減少させるためには、むしろこれらの集団に対して重点的な管理、介入が行なわれるべきである。本成績を今後の胃癌検診、診療に還元、応用していくことが必要である。なお、我々が独自に開発したHelicobacter pylori CagA oligopeptideを抗原に用いた抗体測定系においては、結果の再現性などに問題があり、測定系の再構築を含めた改善策を検討中である。本血清マーカーも胃癌リスクを同定するにあたって、将来的に有用なマーカーとなる可能性があり、引き続き検討を継続する予定である。

既存の古典的血清マーカーのみでは胃未分化型癌の高危険度群設定には限界がある事を証明しえた。本研究の課題である新しいマーカーとして、CagA-P関連マーカーが臨床的意義を有する事を証明する事は出来たものと考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。
エナメル芽細胞におけるRNAフィンガーブリンティング

15-25週齢Wistar系ラット上顎切歯のエナメル芽細胞層を3分割に剥離し、歯胚側からそれぞれ基質形成期、成熟期前期、および成熟期後期とし、それぞれの細胞層からtotal RNAを回収した。下流アンカープライマーT15V(5 ́CCCT15V3 ́VはA,G,Cのいずれか)を用いて逆転写反応を行いfirst strand cDNAを合成した。次いで、上流プライマー(20mer)を添加し、PCRを行った。PCR産物をポリアクリルアミドゲルで展開し、3つの細胞分化段階で産生量の違いが見られるバンドを切り出し、DNAの配列を決定した。現在までに、基質形成期:25クローン、成熟期前期:3クローン、および成熟期後期:9クローンの配列を決定した。基質形成期にアメロゲニンの遺伝子発現が認められたことは、この方法の信頼性を反映していると考えられた。配列を決定した遺伝子の中で興味深いものとして、次のような遺伝子とホモロジー(%)の高いクローンが挙げられる(昨年報告したもを除く)。基質形成期:カドヘリン関連腫瘍抑制遺伝子(69%)、タイプVIコラーゲン(82%)、ファーチリンα(72%)、グランザイムF(64%)、ゴリアスタンパク質(90%)、成熟期前期:プロテイン4.1(83%)、膜コート因子(66%)、成熟期後期:染色体分離タンパク質(91%)、M6P受容体(64%)、ERCC2(68%)。このうちゴリアスタンパク質のmRNAの発現をin situハイブリダイゼーションで確認し、成熟期エナメル芽細胞に豊富に存在していることを明らかにした。また、in situハイブリダイゼーション法を用い、フェリチンH,L鎖mRNAも基質形成期のエナメル芽細胞層に発現していることを明らかにした(Miyazaki et al.1998in press)。ラット上顎切歯のエナメル芽細胞層を3等分して先端部(成熟期後期に相当)、中央部(成熟期前期の相当)および基底部(分泌期に相当)にわけて剥離し、そこからtotal RNAを調整した。このtotal RNAをテンプレートとして、下流アンカープライマー5'CCCT15V3'(TはdTTP,VはdATP,dGTTP,dCTPのいずれか)を用いた逆転写反応を行い、first strand cDNAを得た。次に、上流プライマーを添加してPCR(polymerase-chain reacrion)を行った。今回は上流プライマーとして、システインプロテアーゼ間で比較的良く保存されている活性部位付近のアミノ酸配列Crs-Gly-Ser-Cys-Trp-Ala-Pheのコドンを考慮した20merを用いた。得られたPCR産物をポリアクリルアミドゲルで展開し、3つのエナメル芽細胞分化段階(成熟期後期,成熟期前期および分泌期)で産生量の違いがみられるバンドを切り出し、遺伝子クローニング・シークエンスを行った。その結果、次のようなタンパク質をコードする遺伝子とホモロジーの高い遺伝子が単離できた。分泌期:ヘパリン結合増殖因子2(ホモロジー58%)、フィブーリン2(60%)、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ-受容体(72%)、ad-1抗原(98%)、成熟期前期:チトクロームP450(76%)、膜コファクタータンパク質(66%)、成熟期後期:トランスフェリン(73%)、LIMタンパク質(80%)。現在、これらの遺伝子の発現をin situ hybridization法によって組織レベルで検討している。本年度は、当該研究でも用いる重要な手法であるIn situ hybridization法を用いた研究に関する発表を行った(Y.Miyazaki et al.(1996),F.Hashimoto et al.(1997 in press))。

また、in situハイブリダイゼーション法を用い、フェリチンH,L鎖mRNAも基質形成期のエナメル芽細胞層に発現していることを明らかにした(Miyazaki et al.1998in press)。
制御性T細胞を用いた関節リウマチ治療法の開発

制御性T細胞は免疫応答を負に制御するCD4T細胞のサブセットであり、過剰な免疫応答や自己免疫の抑制に必須の細胞である。転写因子Foxp3はTregの発生・分化、抑制機能の発現に必須なマスター遺伝子として同定された。また様々な関節炎モデルマウスにおいてTregを除去すると疾患が悪化するという報告や、Tregの発症前の移入で一定の治療効果を認めるという報告、抗TNF-α抗体投与により疾患の寛解に伴って活性化Tregの細胞数が増加するという報告は、Tregをターゲットとした治療法の有用性を示唆する。一方で、発症後にTregを移入してもその抑制効果は十分に得られないという報告もあり解決すべき点てある。Th17などの炎症促進細胞とのバランスや、抑制機能分子Foxp3の発現の安定化を視野に入れたT細胞免疫の制御法を確立することが、関節リウマチを制御する上で重要であると考えられる。本年度では主に、解析に必要な実験系のセットアップを行った。第2に、リウマチを発症した関節から単離したさまざまな種類の関節構成細胞とT細胞のサブセットを試験管内で共培養を行った。その結果、特定の細胞群がT細胞分化に影響を与える可能性を見出した。このことは免疫抑制と促進のバランスの制御を視野に入れたT細胞免疫の制御法を確立上で有用な知見を与えると考えられる。今後生体内でのT細胞分化の検討を行い、T細胞免疫を介した関節リウマチ制御法の確立を目指す。
日本語中上級学習用マルチメディア素材のデータベース化及び中国での利用展開

インターネット上では日本語学習のためのさまざまな視聴覚リソースが公開されているが、それらは主に初級者を対象にしたものである。また上級者ならば放送局等で公開されている生の素材を用いた教育と学習が可能である。しかし、初級後半から中級・上級にかけての教育的配慮のある素材は著しく不足している。本研究は、教育的配慮の利いた中上級素材を制作してデータベース化し、WEB上で公開することを第一の目的とした。ついで、世界各地の日本語教育者がこれらの素材をもとにして、自分の教育現場に合った教育メディアへと編集・カスタマイズしていく技法の伝播を第二の目的とした。特に、インターネット網の発達が著しい中国で、この活動を行うことにより、IT技術を利用した新しい教育方法論の開発に寄与している。研究期間中、マルチメディア素材の制作および整備を行い、順次WEBサイトでの公開を行ってきた。また、利用促進のために全ファイルをリレーショナルデータベースとして集積し学内公開している。中国での利用展開については、まず、上海復旦大学国際関係与公共事務学院をカウンターパートとし、同学院のサーバーに、2002年11月現在の素材すべてをインストールし、利用方法に関する交流活動も行って実際に利用されている。平成14年度は標記課題の基礎素材の制作と、マルチメディア教材とするための一部のカスタマイズ、さらに中国での素材供給サイトの開設を行った。素材については、現在までのところ、中上級の聴解素材101ファイル、上級敬語動画素材43ファイル、中上級擬態語素材25ファイル、素材写真素材360ファイルが制作され、出来たものからWEBで公開している(http://japanese.human.metro-u.ac.jp/)。また、当初目標にはなかったが、著作権者の許可を得て初級動画素材「あうんでいこう!」94ファイル(クイズ付きスキット46と通常スキット46)を加えることができた。当初計画にあった副詞の用例については、聴解や敬語素材の中に含まれていた方が得策と判断し、15年度の作業として副詞を辞書的に検索できるシステムを開発する予定である。カスタマイズについては、その実用例として中級聴解素材をもとにしたインターラクティブクイズを制作して試用している。また、初級動画素材をもとにインターラクティブクイズを制作し、学習者の意見を取り入れ改良中である。試用版については両者ともすでに公開している。中国での利用展開については、上海復旦大学国際関係与公共事務学院をカウンターパートとし、同学院のサーバーに、2002年11月現在の素材すべてをインストールしすでに利用可能となっている。(http://www.sirpa.edu.cn/)また、同大学関係者と連絡をとりつつ利用展開を図っている。本研究用WEBサイトは、まだ一般に対する伝播・広報活動は行っていないが平成14年度だけで5万を超えるアクセスがあった。日本語中上級学習用の視聴覚素材を制作し、WEB上で公開している(http;//Japanese.human.metro-u.ac.jp)。素材開発に当っては、コミュニカティブ・アプローチの理論と、談話分析の観点から洗練化を行った。当初計画にあった素材(聴解ファイル、写真データベース、敬語学習用動画ファイル、擬態語の動画による理解)のうち、写真と敬語の動画については、データベースでの検索が可能となっている。また、当初計画にはなかったが、インタビューを通じて現代日本文化と東京を紹介する内容、及び中国人・韓国人学習者に対するインターラクティブな音声教育教材も制作した。これらの素材を有効に利用するために、メディアの統合・双方向性・編集可能性を生かしたマルチメディア素材の組み立てを、中国・タイ・米国の研究協力者とともに検討した。特に、中国上海とタイ・バンコクについては、現地に赴き、データのインストールと現地日本語教育関係者を対象とした講習会及び研究会を行い、以下のサイトで、この研究の成果が公開されている。タイバンコクチュラロンコン大学http://www.arts.chula.ac.th/japan/もう一つの提携先である中国西安外国語大学との共同研究は、SARSや2003年11月の反日運動などのため停滞したが、データ自体は送られており、同大学及び西安の西北大学で利用されはじめている。
X線小角散乱法によるカブトガニ・ヘモシアニンの分子構築の解明

平成3年度は,6量体構造を持つイセエビ・ヘモシアニン(Hc)のX線小角散乱測定を行った.その結果,X線結晶解析により得られた構造とX線小角散乱により得られた水溶液中Hcの構造はほぼ同じであった.平成4年度の当研究の目的は,分子量が大きいためX線結晶回析により解析されていない12量体Hcの水溶液中の分子構造をX線小角散乱法により推定することにあった.モデルとして1)3)を用いた.1)大球モデル:6量体の準基本単位(submultiple)を1個の球とみなしたモデル.2)小球モデル:subunitを1個の球とみなして6個の球で準基本単位を作った.subunitはX線結晶解析に従い配置したモデル.3)原子座標モデル:X線結晶回析像で得られたsubunitの原子座標のα炭素を球の中心にしビーズをつなげた.subunitの配置は2)モデルと同じにした.12量体Hcとしてカブトガニ(腿口類)の1/4量体,タカアシガニ(甲殻類),アメリカザリガニ(甲殻類)を用いた.submultipleの構造はイセエビと同じと仮定して,その組み上げ方を2),3)モデルについてa),b)の両方の組み上げを検討した.その結果,腿口類12量体カブトガニ・Hcの構造は,b)モデルを採っていた.甲殻類ザリガニならびにタカアシガニの12量体Hcはsubmultipleの積み重なり方がa)となっていた.2種の綱の異なる生物のHcではsubmultipleの立体配置に差があることが明かとなった。24量体,48量体への2),3)のモデルの適用は現在行っている所であるが、モデル内の粒子数の2乗に比例した計算時間を必要としている.平成3年度は,6量体構造を持つイセエビ・ヘモシアニン(Hc)のX線小角散乱測定を行った.その結果,X線結晶解析により得られた構造とX線小角散乱により得られた水溶液中Hcの構造はほぼ同じであった.平成4年度の当研究の目的は,分子量が大きいためX線結晶回析により解析されていない12量体Hcの水溶液中の分子構造をX線小角散乱法により推定することにあった.モデルとして1)3)を用いた.1)大球モデル:6量体の準基本単位(submultiple)を1個の球とみなしたモデル.2)小球モデル:subunitを1個の球とみなして6個の球で準基本単位を作った.subunitはX線結晶解析に従い配置したモデル.3)原子座標モデル:X線結晶回析像で得られたsubunitの原子座標のα炭素を球の中心にしビーズをつなげた.subunitの配置は2)モデルと同じにした.12量体Hcとしてカブトガニ(腿口類)の1/4量体,タカアシガニ(甲殻類),アメリカザリガニ(甲殻類)を用いた.submultipleの構造はイセエビと同じと仮定して,その組み上げ方を2),3)モデルについてa),b)の両方の組み上げを検討した.その結果,腿口類12量体カブトガニ・Hcの構造は,b)モデルを採っていた.甲殻類ザリガニならびにタカアシガニの12量体Hcはsubmultipleの積み重なり方がa)となっていた.2種の綱の異なる生物のHcではsubmultipleの立体配置に差があることが明かとなった。24量体,48量体への2),3)のモデルの適用は現在行っている所であるが、モデル内の粒子数の2乗に比例した計算時間を必要としている.平成3年度の研究目標は6量体のイセエビ・ヘモシアニンのX線小角散乱パタ-ンを測定し,その結果とモデルから計算した散乱パタ-ンとの比較を行うことであった。解析には次の3つのモデル;単球モデル,サブユニット(6球)モデル,原子座標を球の中心とした多球モデルを用いた。結果:単球モデルはsubunitを半径58Aの一つの球として6量体の散乱を計算した。この散乱パタ-ンは実測に比べて深い切れ込みを持ち,カブトガニHcの構造を解析した時のように,単純なsubmultiple 1個の球で6量体ヘモシアニンはsimulationできないことが分かった.しかし,距離分布関数の計算結果はかなり実測と良い一致を見せた。6球モデルではsubunitを半径29Aの1つの球として6量体のモデルを組み立てて計算した。単球モデルに比べて散乱パタ-ンの極小位置の切れ込みは実測の6量体に近づいている。しかし距離分布関数の方を見ると,30A付近の肩が実際のパタ-ンに比べて大きくなって不一致を示している。これはsubunitの積み重ね部分が実際とは少し違って,モデルではくびれが強いことを示しているものと思われる.結晶座標からの原子多球モデルによる6量体の計算パタ-ンは,Coseによるmultiーsphere modelを用い,α炭素の座標に注目した多球モデルを用して計算した。球の半径は,Hc全部の各α炭素間距離の平均の1/2である1.9Aを用いた.原子多球モデルの計算散乱パタ-ンはh=0.12Aまではほぼ6量体Hcの実測値と同じパタ-ンを示した。距離分布関数は極大部分のパタ-ンが少し形が異なっているが全体のパタ-ンは非常に実測に近いものである。

このことからmultiーspher modelにより溶液中のX線小角散乱パタ-ンを予想することはresonableであろうと思われる。次年度は,6量体のモデルを基にして12量体,24量体,48量体へとモデルの拡張をはかっていく計画である.当研究の目的は、X線結晶回折により解析不能である巨大生体分子の水溶液中の構造をX線小角散乱法により推定することにあった。平成3年度は、6量体構造を持つイセエビ・ヘモシアニン(Hc)のX線小角散乱測定を行い、その結果と1)から3)のモデルより計算される散乱パターンと比較した。1】大球モデル:6量体の準基本単位(submultiple)を1個の球とみなしたモデル。2】小球モデル:subunitを1個の球とみなして6個の球で準基本単位を作った。subunitはX線結晶解析に従い配置したモデル。3】原子座標モデル:X線結晶回折像で得られたsubunitのα炭素原子座標を球の中心にしビーズ状につなげた。subunitの配置は2)モデルと同じとした。3)のモデルは1),2)のモデルよりも実測のデータに近いパターンを示した。このことから6量体のイセエビ・Hcにおいて、X線結晶解析により得られた構造とX線小角散乱により得られた水溶液中Hcの構造は、ほぼ同じであった。平成4年度は、今までX線結晶解析されていない12量体Hcとしてカブトガニ(腿口類)の1/4量体、タカアシガニ(甲殻類)、アメリカザリガニ(甲殻類)を用いた。submultipleの構造はイセエビと同じと仮定して、2),3)モデルについて以下の組み上げ方を検討した。a】submultipleの中心軸を結んで積み重ねたモデル。b】submultipleの側面同士を重ねたモデル。その結果、腿口類12量体カブトガニ・Hcの構造は、b〕モデルを採っていた。甲殻類ザリガニならびにタカアシガニの12量体Hcはsubmultipleの積み重なり方がa)となっていた。2種の綱の異なる生物のHcではsubmultipleの立体配置に差があることが明かとなった。また、方法論として溶液X線散乱法は巨大分子のsubunitの分子構築を推定するのに強力な手段であることを示すことができた。
骨髄腔内への造血幹細胞輸注による移植療法確立のための基礎的研究

これまで、ヒト-マウスの移植系において臍帯血幹細胞の骨髄腔内輸注が経静脈移植より生着率の点で優れていると報告されてきた。今回われわれは、ヒト造血幹細胞のソースとして、骨髄および臍帯血を用いた。CD34陽性細胞をビーズを用いて濃縮し、90%程度の純度のものを臍帯血で20,000100,000個、骨髄血で100,0001,000,000個を1匹のマウスに移植した。移植マウスは、58週齢のNOD-SCID β2-nullマウス及びShi-SCIDマウスの2系統を用いた。マウスに300cGyの放射線照射後、尾静脈から移植したものを対照とし、脛骨腔内に移植したものとその生着率を比較した。移植68週後マウス骨髄、脾臓、末梢血から細胞を抽出しヒト細胞の生着をCD45抗体を用いて計測した。同時にCD19抗体、CD11抗体、CD14抗体、CD3抗体、GlycophorinA抗体で染色し構成細胞分画を検討した。臍帯血の移植では、経静脈的移植、骨髄腔内移植いずれも高率に生着が認められ、両者に差は見いだせなかった。ヒト骨髄血の移植では、これまで高率に生着した報告はなかったが、細胞を前処理し、骨髄腔内輸注することでNOD-SCID β2-nullマウスに高率に生着せしめる方法が見いだせた。尾静脈から移植したマウスでは、生着しないか数%の生着しか確認できなかったが、骨髄腔内への移植では、最大80%の生着をみた。生着細胞は、T cellを除く系統の細胞が確認された。今後、移植前に行った細胞処理の方法について、さらに検討を加え、細胞のホーミングや生着に関与する分子についての解析が必要であると考えられた。ヒト造血幹細胞のソースとして、骨髄および臍帯血を用いた.CD34陽性細胞をビーズを用いて濃縮した後、ABCG2抗体で染色し、FACS Vantageを用いて、CD34陽性ABCG2陽性細胞と、CD34陽性ABCG2陰性細胞を分画分取した。移植マウスは、生後5週から8週齢のNOD-SCID β2-nullマウスを用いて、前処置として300cGyの放射線照射を施した。移植経路は、尾静脈注射と、大腿骨骨髄腔内輸注の2経路を用いた。移植細胞生着の解析は、移植後12週に行った。移植後マウスの骨髄、脾臓、末梢血を抗ヒトCD45抗体、CD19抗体、CD11抗体、CD14抗体、CD3抗体、GlycophorinA抗体で染色しFACSVantageで解析した。臍帯血を経静脈的に移植したマウスでは、ヒト細胞は310%の生着が確認されたのに対し、骨髄腔内移植を行った場合有意に高い4060%の生着が確認され、T cellを除くすべての系統の細胞の生着が確認できた。ヒト骨髄細胞の移植では、経静脈的移植では00.5%、骨髄腔内移植では0.24%の生着が見られ、骨髄腔内移植の方が若干効率よく生着しているようであったが、優位差は認められなかった。ABCG2に関しては、陽性細胞、陰性細胞いずれも生着が認められ、両群間に差は認められなかった。以上より、臍帯血移植に関しては骨髄腔内輸注の優位性が確認された。

今後、骨髄幹細胞と臍帯血幹細胞表面の接着因子を用いた分画で、移植実験を行い、何故ソースの違いによる生着率の差が生じるのか明らかにして行く予定である。ヒト造血幹細胞のソースとして、骨髄および臍帯血を用いた。CD34陽性細胞をビーズを用いて濃縮し、90%程度の純度のものを臍帯血で20,000100,000個、骨髄血で100,0001,000,000個を1匹のマウスに移植した。移植マウスは、58週齢のNOD-SCID β2-nullマウス及びShi -SCIDマウスの2系統を用いた。マウスに300cGyの放射線照射後、尾静脈から移植したものを対照とし、脛骨腔内に移植したものとその生着率を比較した。移植68週後マウス骨髄、脾臓、末梢血から細胞を抽出しヒト細胞の生着をCD45抗体を用いて計測した。同時にCD19抗体、CD11抗体、CD14抗体、CD3抗体、GlycophorincA抗体で染色し構成細胞分画を検討した。臍帯血の移植では、経静脈的移植、骨髄腔内移植いずれも高率に生着が認められ、両者に差は見いだせなかった。骨髄血の移植は、これまで高率に生着した報告はなかったが、細胞を前処理し、骨髄腔内輸注することでNOD-SCIDβ2-nullマウスに高率に生着せしめる方法が見いだせた。尾静脈から移植したマウスでは、生着しないか数%の生着しか確認できなかったが、骨髄腔内への移植では、最大80%の生着をみた。生着細胞は、T cellを除く系統の細胞が確認された。今後、移植前に行った細胞処理の方法について、さらに検討を加え、細胞のホーミングや生着に関与する分子についての解析が必要であると考えられた。また、並行して研究した好中球エラスターゼの造血系に与える影響について知見が得られた。これらの知見をふまえて、好中球エラスターゼが造血再幹細胞のホーミングに与える影響について、さらに研究を進めて行く予定である。
新機能光デバイスのための化合物半導体の物性制御の研究

化合物半導体の新機能制の発現のための物質設計,物性制御に関して以下のような研究成果が得られた。1.p型ZnSeアクセプタ準位の候補としてLi不純物を選び,新たに開発したDSA法人によりZn置換位置周辺でのLiの移動エネルギ-と構造安定性を計算した.その結果Liのアクセプタとしての不安定性の起源が置換位置から格子間位置への移動とイオン化による自己補償であることを解明した.(吉田)2.ZnSeの物性制御に於いて基板との格子不整の影響を検討した結果,GaAs上に成長したn型ZnSe膜には圧縮応力が働き,この応力を緩和するために界面付近に深い欠陥準位が導入され,それに伴い高抵抗層が存在することを明らかにした.また,NH_3を用いた窒素添加ZnSeに於いてAu電極の熱処理の最適化により正孔濃度が2x10^<16>cm^<ー3>程度のp型伝導膜であることを確認した.さらに,GaAsに整合したZnSSe混晶膜の成長を行い窒素添加を試みたが,ZnSeに比べて窒素は取り込まれにくい事が分かった.(吉川)3.SrS/ZnS超格子薄膜の成長を行うために,ホットウォ-ル蒸着型のALE装置の作製を進め,薄膜成長の予備実験を行った.その一方で,基礎となる知見を得るため,電子線蒸着法で作製したSrS薄膜の評価を行った.SrS薄膜は成長温度500°C以上のとき比較的良質の多結晶薄膜になる.また,成長中に容易に酸素原子を取り込み,酸素汚染される.500°C程度の温度で熱処理を行うと,膜質が改善されることが分かった.(小林)4.量子細線・量子箱構造を用いる交差型光スイッチの理論解析を行い,低損失化および高消光比化のためには,量子細線や量子箱が優れていることを明らかにすると共に,幅25ー35nm,井戸層厚8nmのGaInAs/InP3層多重量子細線構造を世界で初めて試作し,その電界屈折率変化スペクトルを測定した.(荒井)化合物半導体の新機能制の発現のための物質設計,物性制御に関して以下のような研究成果が得られた。1.p型ZnSeアクセプタ準位の候補としてLi不純物を選び,新たに開発したDSA法人によりZn置換位置周辺でのLiの移動エネルギ-と構造安定性を計算した.その結果Liのアクセプタとしての不安定性の起源が置換位置から格子間位置への移動とイオン化による自己補償であることを解明した.(吉田)2.ZnSeの物性制御に於いて基板との格子不整の影響を検討した結果,GaAs上に成長したn型ZnSe膜には圧縮応力が働き,この応力を緩和するために界面付近に深い欠陥準位が導入され,それに伴い高抵抗層が存在することを明らかにした.また,NH_3を用いた窒素添加ZnSeに於いてAu電極の熱処理の最適化により正孔濃度が2x10^<16>cm^<ー3>程度のp型伝導膜であることを確認した.さらに,GaAsに整合したZnSSe混晶膜の成長を行い窒素添加を試みたが,ZnSeに比べて窒素は取り込まれにくい事が分かった.(吉川)3.SrS/ZnS超格子薄膜の成長を行うために,ホットウォ-ル蒸着型のALE装置の作製を進め,薄膜成長の予備実験を行った.その一方で,基礎となる知見を得るため,電子線蒸着法で作製したSrS薄膜の評価を行った.SrS薄膜は成長温度500°C以上のとき比較的良質の多結晶薄膜になる.また,成長中に容易に酸素原子を取り込み,酸素汚染される.500°C程度の温度で熱処理を行うと,膜質が改善されることが分かった.(小林)4.量子細線・量子箱構造を用いる交差型光スイッチの理論解析を行い,低損失化および高消光比化のためには,量子細線や量子箱が優れていることを明らかにすると共に,幅25ー35nm,井戸層厚8nmのGaInAs/InP3層多重量子細線構造を世界で初めて試作し,その電界屈折率変化スペクトルを測定した.(荒井)
腸内細菌が敗血症における免疫制御機構に与える影響の解明

平成28年から取り組んでいる臨床研究を進めた。当院における植込み型補助人工心臓装着術の周術期管理について、後方視的解析を行った。具体的には、当院で行われた植込み型補助人工心臓装着術後に集中治療室滞在中に出血イベントがあった群となかった群を比較し、出血イベントの術前リスク因子と、出血イベントの予後への影響を調べた。その結果、単変量解析では、周術期出血イベントの術前リスク因子としては、総ビリルビン値、胸骨正中切開の既往、年齢であることがわかった。多変量解析で、年齢が術前のリスク因子であることがわかった。なお、術前の心機能、肝機能、凝固機能と出血イベントとの関連は見られなかった。また、出血イベントは、集中治療室滞在期間を有意に延長し、術後28日以内の人工呼吸離脱期間を有意に短縮することがわかった。今後は、植え込み型補助人工心臓の術後管理で問題となる右心不全のリスク因子とその予後に関して、解析を行い、より安全な周術期管理に役立てることを目指す。幾つかの論文に投稿したもののの、アクセプトされず、論文の手直しと再投稿に時間を要している。現在手がけている論文を再投稿する。それに加えて、植え込み型補助人工心臓装着術後の右心不全をターゲットとした前向きの臨床研究を立ち上げる。そのために、まずは後ろ向きのデータ解析で、術後右心不全のリスク因子を解析する。平成28年から取り組んでいる臨床研究を優先的に進めた。植込み型補助人工心臓装着術は、高侵襲手術であること、術後に抗凝固療法を必要とすることから、周術期の出血イベントが多いことが知られている。今後更なる安全な周術期管理のために、症例数を増やして、他の周術期イベントに関しても解析を広げる予定である。平成29年度は、臨床研究を優先した。平成28年度から取り組んでいる植込み型補助人工心臓装着術の周術期管理に関する臨床研究のデータをまとめた。英文校正も終わり、投稿直前の状態である。現在行っている臨床研究の論文を学術誌に投稿するとともに、基礎実験を推進する。試薬の購入及び学術誌への投稿、学会参加の旅費に使用する。英文査読、国際誌への投稿料、学会出張費に使用する
低侵襲心臓手術治療成績向上に向けた術後炎症反応の病態解明

2018年度は、前年に引き続き、自治医科大学倫理委員会の承認の元、大動脈狭窄症に対する治療(TAVR/SAVR)を実施した70歳以上の高齢者から、2019年1月までに合計23名の患者検体を採取して(TAVR群:T群N=12・SAVR群:S群N=11例)、低侵襲手術術後の免疫応答に関する研究実験を施行した。本研究成果は2019年度第72回日本胸部外科学会で発表予定である。現在、当施設では、心臓手術リスクの少ない症例に対しては、通常の外科的大動脈弁置換手術を第一選択として実施しているが、80歳以上の高齢者や全身状態が不良な症例では、TAVR手術を積極的に実施している。手術手技及び周術期管理の改善や、次世代人工弁の出現によりTAVR手術の治療成績はさらに向上し、手術実施件数はここ数年で急激に上昇しているのが現状である。本研究は、最終的な患者検体の採取が2019年1月に終了した。当初の研究計画に比べて、患者検体採取に遅滞が生じた結果となったが、その理由はいくつかの点が挙げられる。まず、高齢者に対する通常の大動脈弁置換術(SAVR)を実施する頻度が急激に減少したため、SAVR群が突出して患者検体採取数が少なかった(最終的には11例採取)。また、本研究は、無輸血症例を対象にしているため、周術期に輸血療法が実施された症例は研究対象から除外したが、この点も実験開始の遅れに影響を及ぼした。本研究の主体であるMILLIPLEX cytokine panelを使用した網羅的サイトカイン発現解析実験とその後のバイオインフォマティクス解析は既に終了しており、今後は対象症例以外の患者データの抽出及び解析と、遺伝子発現解析結果に対するvalidation RT-PCR(micro RNA)を2019年5月中に行う予定である。最終的には2019年中の論文化を目指す方針である。具体的には、今回のTAVR症例とSAVR症例のサイトカイン研究は、合計23症例の比較的小規模な患者群での比較研究であるため、これら23症例も含めて過去の当センターの弁膜疾患研究データベースから、TAVR群N=120ー150例程度・SAVR群120ー150例程度の患者データを抽出して、術後の炎症反応(白血球数)の2群間比較を行い、TAVRの術後炎症反応の抑制の程度を調査する。また、validation RT-PCRに関しては、Pathway解析から既にTAVRが抑制しうる炎症cascadeに関連した候補micro RNAを選定しているため、これらの候補micro RNAを中心にしたRT-PCRをSYBR green法で実施する予定である。血管内皮細胞株に壁せん断応力を負荷する実験モデルを使用したin vitro研究の実施も今後検討している。低侵襲心臓手術は近年目覚ましい発展を認めるが、その優位性を炎症反応という視点から科学的に解析した報告はごく稀である。申請者らは、これまで重症僧帽弁疾患の外科治療を長期に渡り報告する一方、2015年から右開胸僧帽弁手術と経皮的大動脈弁移植術(TAVI)を開始しその適応を広げている。2016年度は、TAVI手術実施症例を対象に、通常手術の炎症反応との相違を解析する臨床研究を開始した。まず、2009年4月から2017年2月までに、外科治療を要した80歳以上の大動脈弁狭窄症症例(通常の外科的大動脈弁置換手術139例・TAVI手術64例)を対象とした基礎臨床データの解析研究を実施した。80-84歳(外科的大動脈弁置換手術実施群:n=119 vs. TAVI手術実施群:n=27)、及び85歳以上(外科的大動脈弁置換手術実施群:n=25 vs. TAVI手術実施群:n=37)の年齢階層別の比較試験では、両年齢層において、TAVI手術実施群での手術時間と在院日数の短縮化、輸血量の減少を認めた。特に、85歳以上の群において差はより顕著であり、超高齢者におけるTAVI手術の有効性が示唆された。血液検体を使用する分子細胞学的研究実験は、現在、当大学倫理委員会で審査中であるが、患者以外のヒト末梢血検体を使用した予備実験では、核磁気細胞分離装置(MACS)を使用し、99%に近い精度で単球と好中球を精製し、各細胞群からRIN値7以上のRNAを抽出している。今後、倫理委員会の承認後、外科的大動脈弁置換手術実施群とTAVI手術実施群の周術期炎症反応の相違を解析する臨床研究を開始する予定である。現在、当施設では、80歳以上の高齢者を中心にTAVI手術を積極的に実施している。一方、79歳以下の心臓手術リスクの少ない症例に対しては、通常の外科的大動脈弁置換手術を第一選択として実施している。大動脈弁狭窄症の外科手術実施症例数に関しては、TAVI手術は年間40-50例程度、通常の外科的大動脈弁置換手術は年間60-80例程度施行している。分子細胞学研究を開始する前に、臨床データの詳細な解析研究を実施した。本研究結果は、2017年度日本胸部外科学会で発表予定であり、今後論文化を予定している。ヒト血液検体を使用した予備実験も当初の予定通り実施しており、今後定量的PCRや網羅的遺伝子解析実験を開始できる状況となった。

2017年度は、経皮的大動脈弁移殖術(transcatheter aortic valve implantation: TAVI)手術実施症例を対象として、通常の外科的大動脈弁置換手術術後の炎症反応との相違を解析する臨床研究を行った。2009年4月から2017年2月までに、外科治療を要した80歳以上の大動脈弁狭窄症症例(通常の外科的大動脈弁置換手術139例・TAVI手術64例)を対象として、基礎臨床データの後ろ向き解析研究を実施した。80-84歳(外科的大動脈弁置換手術実施群:n=119 vs. TAVI手術実施群:n=27)、及び85歳以上(外科的大動脈弁置換手術実施群:n=25 vs. TAVI手術実施群:n=37)の年齢階層別の比較試験では、両年齢層において、TAVI手術実施群での手術時間と在院日数の短縮化、輸血量の減少を認めた。特に、85歳以上の群において、治療成績の差はより顕著であり、超高齢者におけるTAVI手術の有効性が示唆された。本研究成果は、第70回日本胸部外科学会定期学術集会(2017年9月26日29日札幌)で発表した。血液検体を使用する分子細胞学的研究実験は、当大学倫理委員会の承認を得て、患者検体の採取を現在行っている。予備実験で核磁気細胞分離装置(MACS)を使用し、99%に近い精度でCD14+単球を精製し、RIN値7以上のRNAを抽出している。目標症例数は、外科的大動脈弁置換手術実施群12例・TAVI手術実施群12例・コントロール群6例の合計30例であり、現在約1/3の患者検体を収集した。現在、当施設では、心臓手術リスクの少ない症例に対しては、通常の外科的大動脈弁置換手術を第一選択として実施しているが、80歳以上の高齢者や全身状態が不良な症例では、TAVI手術を積極的に実施している。2017年は、通常の外科的大動脈弁置換術は114例(大動脈弁狭窄症・大動脈弁閉鎖不全症を合計した症例数)に実施し、TAVI手術は54例に実施した。TAVI手術の治療成績は、手術死亡症例・術後脳梗塞症例ともに0例と非常に良好であった。2018年7月頃、患者検体の採取は終了する見込みである。得られた患者検体を使用して、単球細胞の遺伝子解析研究、並びに炎症性サイトカインとケモカインの網羅的な計測実験を実施する予定であり、その後、専用ソフトウエアを使用した解析実験を行う。2018年度は、前年に引き続き、自治医科大学倫理委員会の承認の元、大動脈狭窄症に対する治療(TAVR/SAVR)を実施した70歳以上の高齢者から、2019年1月までに合計23名の患者検体を採取して(TAVR群:T群N=12・SAVR群:S群N=11例)、低侵襲手術術後の免疫応答に関する研究実験を施行した。本研究成果は2019年度第72回日本胸部外科学会で発表予定である。現在、当施設では、心臓手術リスクの少ない症例に対しては、通常の外科的大動脈弁置換手術を第一選択として実施しているが、80歳以上の高齢者や全身状態が不良な症例では、TAVR手術を積極的に実施している。手術手技及び周術期管理の改善や、次世代人工弁の出現によりTAVR手術の治療成績はさらに向上し、手術実施件数はここ数年で急激に上昇しているのが現状である。本研究は、最終的な患者検体の採取が2019年1月に終了した。
ナノリットル水滴間の人工脂質二分子膜を用いたハイスループット薬剤透過性測定

本研究では,微細加工技術によって基板上に作製した微細な流路(マイクロ流路)を用いた,人工脂質二分子平面膜の作製および薬剤透過性の計測に関する研究を行った.マイクロ流路のT字,十字といった分岐構造を利用して,薬剤を含む数ナノリットルサイズの水滴(ドナー滴)および含まない水滴(アクセプタ滴)を脂質を含む有機相中に連続生成し,流路下流域において有機相のみを選択的に吸引・除去することで,水滴同士を接触させ,ドナー滴とアクセプタ滴の間に脂質ニ分子平面膜を形成することができた.また形成された二分子膜を介した薬剤分子の受動輸送性能を迅速に測定することができた.平成25年度は以下の研究を行った.(1)薬物透過試験用マイクロデバイスの製作:脂質二分子平面膜アレイの作製および薬物透過試験を行うためのマイクロ流路を製作した.既存のガラス(合成石英)チップに加え,より安価に作製可能な樹脂製チップとして,PDMS製およびアクリル製チップの利用を検討した.微細構造の作製には転写型としてフォトレジストSU-8を用いたソフトリソグラフィおよびレーザ加工を用いた. Ag/AgCl電極の微細パターンをガラス基板上に設け,微細溝を転写した樹脂シート片と貼り合わせ,流路デバイスを構成した.(2)脂質二分子平面膜アレイの作製:上記のマイクロ流路デバイスを用い,脂質二分子膜アレイの形成試験を行った.数ナノ数十ナノリットルサイズの水滴を互いに接触させた後に,交流電圧を膜を隔てて印加し,膜の電気応答の測定を行った.測定波形から単位膜面積あたりの静電容量の値を算出し,文献値と比較することで二分子膜が形成されていることの確認を行った.また,チャネル形成物質(a-hemolysin)を脂質膜に埋め込み,蛍光分子カルセインの移動を蛍光観察により確認した.(3) UV吸収スペクトルの測定による薬物透過性測定試験マイクロ流路内に作製した脂質二分子膜アレイを用い,薬物透過製測定試験を行った.既に測定実績のあるCaffeineのほか,Naproxen, Metoprolol等のイオン性の薬剤分子の測定を行った.測定データを用いた数値計算により,各薬剤の膜透過係数の算出を行った.平成26年度は以下の研究を行った.(1)脂質二分子膜内包ダブルエマルションの作製:有機相の液滴の内部にドナー水滴,アクセプタ水滴をともに内包させた直径約100 um前後のダブルエマルションを二段階のマイクロ流路分岐を用いて生成し,ドナー滴とアクセプタ滴の接触を促すことで単一の脂質平面膜をダブルエマルション液滴内部に作製することができた.ダブルエマルションの構造として,最外相が水相で構成されるwater-in-oil-in-water (W/O/W)型,および最外相が有機相で構成されるwater-in-oil-in-oil(W/O/O)型の作製試験を行った.水相,有機相の流量比率を変化させることで,ダブルエマルション滴内部に形成される脂質平面膜の面積を増減させられることを確認した.チャネル形成物質とチャネル透過蛍光分子(カルセイン)を用い,作製される脂質平面膜が二分子膜を含んでいることを確認した.マイクロ流路デバイスは,既に申請者が所持している合成石英製マイクロ流路表面を局所的に疎水化処理して用いたほか,シリコーン樹脂(PDMS)製マイクロ流路をフォトレジストSU-8を鋳型として用いたソフトリソグラフィにより新たに製作して用いた.(2)脂質二分子膜内包ダブルエマルション滴を用いた蛍光分子透過性測定試験:上記の手法で作製したダブルエマルション滴を用い,分子透過性試験を行った.薬物モデル分子として,水溶性蛍光分子のフルオレセインを用い,蛍光顕微鏡を用いた観察により,ダブルエマルション滴内のドナー滴とアクセプタ滴間の濃度勾配による蛍光分子の受動輸送を確認した.平成27年度は以下の研究を行った.(1)薬物濃度測定用UV分光測定機を組み込んだマイクロデバイスの試作UV分光測定機が内蔵された顕微鏡装置は非常に高価であるため,より安価に微小液滴内の薬物濃度を測定できる装置として,光ファイバ接続型のUV分光測定機をマイクロデバイスに組み合わせたマイクロデバイスの試作を行った.合成石英基板(厚さ1-2 mm)の上に,ドナー滴とアクセプタ滴をセットし且つそれらの間に人工脂質二分子平面膜を作製するための微小チャンバー対を,アクリル樹脂(PMMA)へのCO2レーザ加工,あるいはシリコーン樹脂の微細加工によって作製した.UV分光機に接続された測定用光ファイバとUV光源に接続されたUV光照射用光ファイバをコリメータレンズを介してマイクロデバイスに組込み,透過型の吸収率測定を行える装置の試作を行った.(2)UV分光測定組み込み型マイクロデバイスを用いた薬物膜透過性の測定試験上記の作製したマイクロデバイスを用い,薬物膜透過性測定のための試験を行った.これまでに行った測定試験と同様に,既に測定実績のあるCaffeineを薬剤モデルとして用いたところ,アクセプタ滴側において,時間経過とともに,Caffeine分子による吸収スペクトルの増大が認められた.別途測定した校正曲線を用いて時間ー濃度データを得た後,膜透過係数を算出を行ったところ,過去に得られた値および文献値と非常に近い値が得られた.また従来技術であるPAMPA法と比べ,より短時間で測定を行えることを確認した.

本研究では,微細加工技術によって基板上に作製した微細な流路(マイクロ流路)を用いた,人工脂質二分子平面膜の作製および薬剤透過性の計測に関する研究を行った.マイクロ流路のT字,十字といった分岐構造を利用して,薬剤を含む数ナノリットルサイズの水滴(ドナー滴)および含まない水滴(アクセプタ滴)を脂質を含む有機相中に連続生成し,流路下流域において有機相のみを選択的に吸引・除去することで,水滴同士を接触させ,ドナー滴とアクセプタ滴の間に脂質ニ分子平面膜を形成することができた.また形成された二分子膜を介した薬剤分子の受動輸送性能を迅速に測定することができた.平成26年度に予定していたダブルエマルション内包滴のUV分光測定を次年度に繰り越したものの,全体としてはおおむね順調に進展していると考えている.マイクロ・ナノデバイス平成27年度はマイクロ流路デバイス内でUV分光測定を行うことができる装置の製作を予定している.製作した装置を用い,平成26年度から繰り越したダブルエマルション内包滴の測定を含めた,UV分光測定試験を行う.デバイス作製,作製したデバイスを用いた脂質膜形成試験,および薬剤分子透過性試験まで,当初の計画通りに順調に進んだと考える.平成26年度に予定していたダブルエマルション内包滴の薬物分子濃度のUV分光測定が既存の装置構成では困難であることがわかり,平成27年度に予定しているマイクロ流路内UV分光測定用装置の製作に合わせて,当該測定を実施するように予定を繰り越した.平成25年度からの繰越額があったことに加え,上記の理由により,当該年度に使用を予定していたUV分光測定用薬剤一式の購入を次年度に繰り越したことから,次年度使用額が生じた.平成26年度,27年度の研究も当初の計画どおりに進める予定.上記の薬剤一式は次年度の研究にそのまま使用する予定であるので,当初の使用目的は変更せずに次年度に使用する計画とする.試薬(リン脂質,膜タンパク質,薬剤分子等)の購入に当てる予定だったものが,使用量および個数が当初想定したまでに至らず,他の経費での購入分や研究室の備蓄分で補えたため,未使用額を次年度以降に繰越とした.上記試薬は次年度以降の研究においても引き続き使用するものであるので,当初の使用目的は変更せずに次年度に使用する計画とする.