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新規アンチセンス核酸を用いるエイズウイルス遺伝子の発現制御

現在、エイズウイルス遺伝子を標的としたアンチセンス法はある種の限界に到達しており、飛躍的な新しいアイディアの出現が待たれているのが現状である。我々はごく最近、アミノ基およびリン酸基に保護基を必要としない全く新しい核酸分子構築法を開発した。従来の核酸合成法では核酸のアミノ基およびリン酸基に塩基性条件下除去される保護基が用いられているために保護基の除去条件下で分解してしまうようなDNAの誘導体を得ることができなかった。我々の開発した新しい方法を用いればこれらの核酸誘導体が効率良く合成できるはずである。さらに、この新しい核酸合成法の特徴はリン酸よりも酸化度の低いH-ホスホネートDNA中間体を経由するために、この中間体からインターヌクレオチドを修飾した種々のアンチセンス核酸への変換が可能である。そこで、本研究では遊離のアミノ基をもつH-ホスホネートDNAを合成し、これを種々の新規アンチセンス核酸に変換する試みをおこなった。まず、すべての新規アンチセンス核酸合成における共通の合成中間体であり、構造的に最も単純なP-H結合をもつH-ホスホネートDNAの合成を検討した。オリゴヌクレオチドの3'および5'末端にヒドロキシヘキシル基を導入することによってインターヌクレオチド結合を安定化することができることを見出し、世界で初めてH-ホスホネートDNAを単離することに成功した。つぎに、このH-ホスホネートDNAを種々の新規アンチセンス核酸に変換する反応について検討したところ、P-NH_2結合をもつホスホロアミデートDNA、P-OCH_3結合をもつメチルホスフェートDNA、P-CH_2OH結合をもつヒドロキシメチルホスホネートDNAを合成することができた。一方、HIV-1 nef-mRNAの塩基配列を種々検索し、二次構造と変異頻度を考慮してアンチセンス核酸の標的部位を決定した。この標的部位に対する種々の新規アンチセンス核酸を合成し、nef-タンパク質の発現制御に関する基礎的な実験をおこなったが、顕著なアンチセンス活性は認められなかった。現在、種々の標的部位に対する鎖長の異なるアンチセンス核酸を用いて、nef-タンパク質の発現制御を試みている。
Bex2による肝幹細胞の自己複製誘導機構の解明

本研究では、肝幹細胞の自己複製制御候補分子として得た遺伝子であるBex2の機能解析を目的として実験を行った。具体的には、以下に示す3つのアプローチを用いてBex2の肝幹細胞における機能解析を試みた。1)Bex2により制御される遺伝子をcDNAマイクロアレイ解析により解析し,その遺伝子群の肝幹細胞における機能を調べる。2)Bex2の肝発生における生理的機能を知るため、Bex2ノックアウトマウスを作製する。3)Bex2相互作用因子を生化学的手法を用いて同定し、。同定された分子群との関係からBex2の細胞内における作用機序を明らかにする。これまでに、1)に関してはBex2が制御しうる遺伝子群の中に肝発生において必須であることが知られているような遺伝子群は確認されなかった一方で、肝細胞系譜においては機能が未知である遺伝子群の発現が確認され、現在これらの遺伝子群の機能解析を行っている。2)関してはBex2のORFをEGFP配列で置換することで、ノックアウトES細胞を取得し、Bex2欠損マウスを得た。Bex2欠損マウスは正常に発生し、外見上成体まで正常に生育可能であることが確認されたため、性的条件下においてはdispensableな遺伝子であることが示唆された。次に、EGFPの発現を指標にBex2の転写活性を組織および細胞レベルで観察したところ、Bex2は胎児肝臓においては肝幹細胞において高い発現を示した一方で、分化した成熟肝細胞においては発現が消失した。これらのことから、Bex2の発現は肝幹細胞の未分化性の有用な指標となりうることが考えられた。3)に関しては、研究は進展しなかった。本研究では、肝幹細胞の自己複製制御候補分子として得たBex2の機能解析を目的として実験を行った。Bex2の生化学的解析は研究計画当初に挙げたようにはいっていないが、Bex2欠損マウス(EGFPノックイン)マウスの作製は完遂することができた。予想外に、Bex2は生理的条件下においてはdispensableな遺伝子であることが確認されたが、これはBex family分子による機能の代替の為であることが考えられた。一方で、Bex2-EGFPの発現を指標に肝幹細胞の未分化性をモニターすることが可能であることが示唆されたため、未分化維持培養条件の検討に有用なツールとなることが期待される。本研究で得られたBex2-EGFPノックインマウス由来の肝幹細胞において、EGFPの発現を指標に未分化性を維持する培養系の構築を目指す。また、は樹立したノックアウトマウスラインについて詳細に解析し、Bex2の肝発生における機能を明らかにする。更に、他のBexfamily分子との代替性を検討し、必要であれば複数の遺伝子を同一個体でノックアウトしたマウスの作製を行う。申請者は、盛んに分裂しながら娘細胞である成熟幹細胞と胆管上皮細胞を産生する胎仔肝幹細胞の自己複製機構の解明を目的として研究を行っている。本研究では、肝幹細胞の自己複製制御候補分子として得た、X染色体上の遺伝子であるBex2の機能解析を目的として実験を行っている。現在以下に示す3つのアプローチを用いてBex2の肝幹細胞における機能解析を行っている。2)関してはノックアウトES細胞を取得し、キメラマウスを作製した。現在交配によりノックアウトマウスの系統を作製している。3)に関しては現在進行中であり、まだ結果は得られていない。

次に、EGFPの発現を指標にBex2の転写活性を組織および細胞レベルで観察したところ、Bex2は胎児肝臓においては肝幹細胞において高い発現を示した一方で、分化した成熟肝細胞においては発現が消失した。これらのことから、Bex2の発現は肝幹細胞の未分化性の有用な指標となりうることが考えられた。3)に関しては、研究は進展しなかった。本研究では、肝幹細胞の自己複製制御候補分子として得た、X染色体上の遺伝子であるBex2の機能解析を目的として実験を行っている。Bex2の生化学的解析は研究計画当初に挙げたようにはいっていないが、一方でEGFPノックインマウスや、マイクロアレイ解析においては肝幹細胞深い知見が得られている。今後の解析結果に期待したい。本研究では、肝幹細胞の自己複製制御候補分子として得たBex2の機能解析を目的として実験を行った。Bex2の生化学的解析は研究計画当初に挙げたようにはいっていないが、Bex2欠損マウス(EGFPノックイン)マウスの作製は完遂することができた。予想外に、Bex2は生理的条件下においてはdispensableな遺伝子であることが確認されたが、これはBex family分子による機能の代替の為であることが考えられた。一方で、Bex2-EGFPの発現を指標に肝幹細胞の未分化性をモニターすることが可能であることが示唆されたため、未分化維持培養条件の検討に有用なツールとなることが期待される。今後は樹立したノックアウトマウスラインについて詳細に解析し、Bex2の肝発生における生理的機能を明らかにする。また、Bex2により制御される下流遺伝子についても肝幹細胞における機能を解析し、Bex2が制御しうる肝幹細胞における一連のバイオロジーを明らかにしたいと考えている。本研究で得られたBex2-EGFPノックインマウス由来の肝幹細胞において、EGFPの発現を指標に未分化性を維持する培養系の構築を目指す。また、は樹立したノックアウトマウスラインについて詳細に解析し、Bex2の肝発生における機能を明らかにする。更に、他のBexfamily分子との代替性を検討し、必要であれば複数の遺伝子を同一個体でノックアウトしたマウスの作製を行う。
無機有機複合体膜により時空間制御されたオンデマンド型表面の創成

本特定研究では,種々の分子間相互作用を利用して階層的な分子構築を界面で行い,オンデマンド型表面を合成し,情報変換機能を有する表面分子系の創成を目指した。ここでは,(1)オンデマンドな表面合成のためにコンビナトリアル化学による種々の表面官能基をもつ無機有機複合体の合成と(2)表面錯形成能をもつアンカー基(たとえばホスホン酸基)をもちいたポリアセチレンやDNAなどの高分子との無機・高分子表面複合体の合成について検討した。課題(1)については,ホスホン酸基をもつビス(ベンズイミダゾリル)ピリジンを配位子とするルテニウム錯体とジルコニウムイオンとの錯形成を利用したレドックス活性金属錯体をITO基板上に自己組織化し、次いでZrイオン溶液に浸して錯形成させ、またRu錯体の溶液に浸けるという操作を繰り返すことで界面積層化が進むことをUVスペクトルの吸光度の直線的な増加から明らかにした。シリコン基板上に5層積層化した多層膜系をAFMで観察すると幅50100nmの底部をもち、分子5層にほぼ対応する針状ドメイン構造が見られたことから積層化はドメインを作りながら起こることが明らかになった。異なる中心金属イオンをもつOs錯体を任意の位置にいれた積層膜も作製することもでき,各層がいずれもレドックス活性であることがわかった。課題(2)については,側鎖にフェニルホスホン酸基をもつポリアセチレンとレドックス活性な金属錯体との表面複合体の合成を検討した。まずITO基板上にレドックス活性なRu錯体を自己組織化膜として一層固定した後に、ホスホン酸基によりジルコニウムイオンと錯形成後、フェニルホスホン酸基をもつポリアセチレン水溶液中に基板をつけた。UVスペクトルでこの過程を追跡すると、490nm付近の吸収はITO基板の第1層目に自己組織化したRu錯体のMLCT帯に基づく吸収はポリアセチレン水溶液に浸積後測定してもほとんどかわらずに,いままで吸収の谷であった400nm付近の吸収のみが増加するのが観測された。ポリアセチレン水溶液の浸積回数が増えるとともに400nmの吸収の増加が見られた。ポリアセチレン水溶液は400nm付近にブロードな吸収をもつことからポリアセチレン-Zrイオン-ルテニウム錯体積層構造が表面にできていることが推定できた。
腫瘍細胞間質細胞化生および癌間質性状評価による癌悪性度研究

乳癌腫瘍間質線維芽細胞におけるp53蛋白発現、リンパ管腫瘍塞栓異型度、乳癌異型腫瘍間質線維芽細胞、リンパ節転移腫瘍核分裂数は乳癌患者の予後因子となった。提唱病理組織学的因子(Fibrotic focus、リンパ管腫瘍塞栓異型度、乳癌タイプ、リンパ節転移腫瘍核分裂数)は、既知病理学的因子に勝り、改訂提唱分類も、UICC pTNM分類、Nottingham Prognostic Indexに有意に勝った。癌間質における癌遺伝子・遺伝子蛋白発現の重要性が近年の研究により明らかとなってきた。我々は以前より乳癌癌間質線維芽細胞の生物学的性状が浸潤性乳管癌の予後を規定する重要な因子であることを報告してきた。また、我わらは脈管内腫瘍塞栓、特にリンパ管腫瘍塞栓成分が重要な乳癌予後因子であることを報告してきた。本年度の研究により以下のことを明らかとした:1)浸潤性乳管癌の腫瘍間質線維芽細胞におけるp53癌抑制遺伝子蛋白発現は術前薬物療法を受けなかった群(1042例)および受けた群(319例)において、他の既知臨床病理学的因子および腫瘍細胞p53癌抑制遺伝子蛋白発現との多変量解析により、浸潤性乳管癌患者の癌再発・死亡に密接に係わる因子であることを明らかとした。Fibrotic focus(FF)は浸潤性乳管癌の特異的な癌間質形態であるが、FFを形成する線維芽細胞におけるp53癌抑制蛋白発現は、非FF形成線維芽細胞におけるp53蛋白発現に比べ密接に患者予後に相関していることも明らかとした。また、術前薬物療法症例において、豊富な間質をもつリンパ節転移癌巣を持つ症例は予後不良であることを証明した。2)腫瘍細胞が腫瘍間質細胞に化生した乳癌を化生癌と定義するが、本年度の研究により、化生乳癌は通常型乳癌(浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌)に比べ悪性度が高いこと、化生乳癌群では40歳未満の若年者、皮膚浸潤陽性例、リンパ節転移癌組織に化生癌成分を認める化生癌症例は予後が極めて不良であることを明らかなものとした。3)リンパ管内に侵入したリンパ管腫瘍細胞よりなるリンパ管腫瘍塞栓異型度は術前薬物療法の有無に関係なく、浸潤性乳管癌患者の極めて重要な組織学的予後因子であることを、既知臨床病理学的因子などとの多変量解析により明らかとした。以上は総べて新しい知見であり、今後の乳癌治療の重要な資料となるものと考えられる。本年度の研究により以下のことを明らかとした1)浸潤性乳管癌の腫瘍間質線維芽細胞におけるp53癌抑制遺伝子蛋白発現は術前薬物療法を受けた群(319例)において、他の既知臨床病理学的因子および腫瘍細胞p53癌抑制遺伝子蛋白発現との多変量解析により、浸潤性乳管癌患者の癌再発・死亡に密接に係わる因子であることを明らかとした。Fibrotic focus (FF)は浸潤性乳管癌の特異的な癌間質形態であるが、FFを形成する線維芽細胞におけるp53癌抑制蛋白発現は、非FF形成線維芽細胞におけるp53蛋白発現に比べ密接に患者予後に相関していることも明らかとした。2)リンパ管内に侵入したリンパ管腫瘍細胞よりなるリンパ管腫瘍塞栓異型度は、術前薬物療法の有無に関係なく、浸潤性乳管癌患者の極めて重要な組織学的予後因子であることを、既知臨床病理学的因子などとの多変量解析により明らかとした。3)浸潤性乳管癌の腫瘍間質の主成分である腫瘍間質線維芽細胞の中で、奇怪な核異型を示す異型腫瘍間質線維芽細胞の存在を明らかとした。その存在は、浸潤性乳管癌患者の予後を推測する上で極めて重要であり、術前薬物療法を受けていない浸潤性乳管癌患者(1042例)、並びに術前薬物療法を受けた浸潤性乳管癌患者(319例)の腫瘍再発・腫瘍死と有意に相関することを他臨床病理学的因子との多変量解析にて明らかとした。4)以前、我々はリンパ節に転移した腫瘍細胞の核分裂数(閾値:6個以上)が重要な病理組織学的予後因子となることを報告した。今回は、異なる母集団(術前薬物療法を受けていない浸潤性乳管癌患者、1042例)において、リンパ節転移腫瘍細胞の核分裂像が同様に予後因子となることを確証した。上記1

)、2)は総べて新しい知見であり、今後の乳癌治療の重要な資料となるものと考えられる。我々は以前より乳癌癌間質線維芽細胞の生物学的性状が浸潤性乳管癌の予後を規定する重要な因子であることを報告し、また、脈管内腫瘍塞栓、特にリンパ管腫瘍塞栓成分が重要な乳癌予後因子であることを報告してきた。本年度の研究により以下のことを明らかとした:1)浸潤性乳管癌の腫瘍間質の主成分である腫瘍間質線維芽細胞の中で、奇怪な核異型を示す異型腫瘍間質線維芽細胞の存在を明らかとした。その存在は、浸潤性乳管癌患者の予後を推測する上で極めて重要であり、術前薬物療法を受けていない浸潤性乳管癌患者(1042例)、並びに術前薬物療法を受けた浸潤性乳管癌患者(319例)の腫瘍再発・腫瘍死と有意に相関することを他臨床病理学的因子との多変量解析にて明らかとした。また、術前薬物療法の有無に係らず、異型腫瘍間質線維芽細胞は、-非異型腫瘍間質線維芽細胞に比べ、p53蛋白の核内発現が有意に高いことを明らかとした。2)以前、我々はリンパ節に転移した腫瘍細胞の核分裂数(閾値:6個以上)が重要な病理組織学的予後因子となることを報告した。今回は、異なる母集団(術前薬物療法を受けていない浸潤性乳管癌患者、1042例)において、リンパ節転移腫瘍細胞の核分裂像が同様に予後因子となることを改めて証明した。3)我々が報告してきた乳管癌の病理組織学的因子(Fibrotic focus、リンパ管腫瘍塞栓組織異型度、乳管癌タイプ型、リンパ節転移腫瘍核分裂像)と既知臨床病理学的因子の中で、どの病理組織形態因子が最も乳管癌患者の予後を正確に推測できるか検討し、我々提唱因子が既知臨床病理学的因子に優る予後因子であることを明らかとした。上記1-4)は総べて新しい知見であり、今後の乳癌治療の重要な資料となるものと考えられる。
膨張している宇宙の中のクォーク、グルーオンの性質の超弦理論を用いた解析

2009年度は、強電場でのメソンへの影響を、超弦理論のゲージ弦対応を用いて調べた。ここで、メソンは、曲がった10次元時空に、D7ブレーンと呼ばれる8次元世界体積をもつ超弦理論のソリトン解を埋め込むことで導入され、D7ブレーンの枚数がフレーバーの数に対応する。また、電場はD7ブレーン上のゲージ場として導入される。先行研究で、電場が小さいときは、電流がながれず、メソンの系は絶縁相となっているが、大きい電場をかけると、電流がながれる導体相となることが示され、また、導体相では、電気伝導度が計算された。そこで、私は、カイラル対称性が破れたゲージ理論にdualな10次元時空の超弦理論を解析することで、電場によってカイラル凝縮の値がどのように変化するのかを調べた。研究の結果、クォーク間の閉じ込めの力よりも弱い電場では、カイラル対称性が自発的に破れているが、クォーク間の閉じ込めの力以上の値の電場をかけると、カイラル凝縮の値がゼロとなり、カイラル対称性が回復することがわかった。また、カイラル対称性が破れている領域では、電流が値を持たず、絶縁相となっているがカイラル対称性が回復する領域では、電流が有限の値をもち、導体相となっていることも分かった。SU(N)ゲージ理論では、N個のクォークでカラーのないバリオンができる。超弦理論の立場では、このバリオンは、5次元球面に巻きついたD5ブレーンと、それにくっつくN本の弦の束として表される。本年度は、D3ブレーンによって歪められた10次元ブラックホール時空中に、D5ブレーンとストリングを埋め込むことで具体的にバリオンを構成し、SU(N)ゲージ理論の有限温度、非閉じ込め相で、バリオンがどのように振舞うのかを超弦理論を用いて調べた。D5ブレーンの運動方程式を解くと、カスプ状の特異点が現れ、この特異点にD5ブレインの張力と弦の張力がつりあうようにN本のストリングをくっつけることで、弦理論の立場でバリオンを具体的に構成することができた。ところが背景時空にブラックホールが存在すると、D5ブレーンにくっついているN本のストリングうち、(N-k)本のストリングをブラックホールの地平面に入りこませることができる。ここで、kはN未満の任意の正の整数である。そのような解は、ゲージ理論の立場では、カラージンクレットではないk(<N)個のクォークの新たな束縛状態を表している。しかし、エネルギーを調べるとこのようなカラーのある束縛状態はカラーのないバリオンに比べて不安定であることが分かった。また、クォークの新たな束縛状態に対応するD5ブレーンの別の解も構成した。この解では、D5ブレーンは二つの特異点を持ち、この二つの特異点にそれぞれk個のストリングが互いに逆向きにくっつけることができる。このような束縛状態は、k個のクォークとk個の反クォークの束縛状態に対応している。とくにk=2の時は2008年にBelle実験(KEK)で発見されたテトラクォークに対応する解の可能性がある。
土壌に潜む致死性アメーバ生息特性解析と新規無細胞培養法の開発

本研究は、環境下におけるバラムチアの生息特性を明らかにし、新たな培養法を構築する研究である。これまで報告されるバラムチア培養法は、グルコースを主な栄養成分とするBM-3や接着細胞を足場とした細胞培養法(RPMI1640)がある。共に富栄養の培地で、細菌が共生する環境由来バラムチアは、細菌有意の増殖により死滅する。そこで本研究では、1土壌中に生息するバラムチアの生息特性を明らかにし、2新たな無細胞液体培地の開発を行うことを目的としている。今年度は青森県を中心に土壌を採取し、バラムチアの分離及び環境遺伝子の検索を実施した。約30種類の土壌を培養し、3種の環境分離バラムチアを検出した。またバラムチア遺伝子陽性土壌は7種であった。これらのバラムチア及びバラムチア遺伝子を検出した土壌の粒径分布や性状解析を実施したところ、土性はLoamClay Loam、電気伝導率はバラムチア未検出土壌に比べ、比較的高い土壌であった。また環境下から分離されたバラムチアには、細菌の共生が認められた。単離アメーバを無栄養培地上で継続培養し、DNA抽出後、クローンライブラリー法による解析を実施した結果、複数の環境分離バラムチアで共通した細菌を検出した。またこれらの細菌は、アメーバシスト内で生存し、長期間死に至ることはなかった。今後は培養法構築へ向けて、抗菌薬選択等の検討を実施する。今年度はバラムチア生息土壌の土性解析を実施し、土種・土性を明らかとした。また、共生細菌の存在及び種の同定を終了したことから、2019年度には抗菌薬の選択や試作培地の有効性などを検討することが可能である。したがって、おおむね順調に進展しているを選択した。土種土性解析を終了し、アメーバ生息土壌の至適pHや電解質濃度を明らかとしたことから、バラムチアの無細胞大量培養法の構築へ向けて、試作培地を作成する。形態学的な恒常性を維持できるpH及び電気伝導率を検討後、世代時間の短縮へ向けアミノ酸や脂質、ビタミン類の添加を検討していく。残高1万円以下となったことから、次年度物品購入費への繰り越しとした。
既承認医薬品を対象としたカルバペネマーゼ阻害活性を有する薬剤の探索

本研究の目的は、カルバペネム分解能を有するβ-ラクタマーゼであるカルバペネマーゼの阻害剤を開発することである。本研究では、1018種の既承認薬についてスクリーニングを行い、カルバペネマーゼ阻害活性を有する既承認薬の特定を行った。スクリーニングにあたり、精製酵素、ニトロセフィン、既承認薬を用いて阻害活性を判別するためのハイスループット(HTS)系を構築した。本HTS系は高い信頼性で簡便、かつ短時間で多数の化合物を評価することを可能にした。結果として、ある種のカルバペネマーゼに対し弱い阻害活性を有すものを13個、中程度の阻害活性を有するものを11個、強い阻害活性を有するものを9個特定するに至った。本研究では、メタロβ-ラクタマーゼIMP-1およびSMB-1に対する阻害剤探索を行った。探索対象化合物を既承認薬とした。まず、それぞれの酵素を用い、阻害剤探索のためのアッセイ系を構築した。IMP-1に関しては、最終酵素濃度5nM、基質ニトロセフィン濃度100uM、既承認薬化合物10もしくは100uMとし、30°Cで10分間、吸光度482nmの変化を観察した。SMB-1に関しては最終酵素濃度10nMとし、他の条件についてはIMP-1と同様とした。測定の結果、化合物濃度10uMでIMP-1の酵素活性を強く阻害するもの、同じくSMB-1の酵素活性を強く阻害するものを、それぞれいくつか発見することができた。次に、IMP-1とこれらの化合物との複合体結晶を作製し、X線結晶構造解析による阻害機構の解明を試みた。IMP-1のapo結晶を一度作製し、ミクロシーディング法による再結晶育成を行った。その際、あらかじめIMP-1溶液と阻害剤を混和しておくことで、阻害剤が結合した結晶が成長することを期待した。本方法により結晶を得ることには成功したものの、回折像の回収を行ったところ分解能が悪かったため、再度結晶化の条件から見直すこととした。SMB-1に関してもIMP-1同様X線結晶構造解析による阻害機構の解明を試みた。SMB-1についてはapo結晶を作製し、常法のソーキングにより、阻害剤との複合体結晶作製を試みた。回折像の回収を行ったところ分解能は良好であったが、解析の結果、阻害剤に相当する電子密度がはっきりと確認できなかったため、IMP-1同様結晶作製の段階から見直しを行っている。細菌学
有用魚種孵化仔魚の餌料としての従属栄養性鞭毛虫および繊毛虫の有効性に関する研究

魚類の種苗生産における初期餌料として現在多用されているS型ワムシは、魚種によっては孵化後の摂餌開始時期の口径に比較して大きすぎるため仔魚は効率よく摂食することができず、その初期減耗の大きな原因になっている。このため本研究では、S型ワムシに代わるより小型でかつ安定大量培養が可能な餌料の開発を目的とし、原生動物(鞭毛虫・繊毛虫)の仔魚初期餌料としての可能性について検討した。また、天然海域に生息する仔魚の消化管内容物を調べ、原生動物プランクトンの消費者としての仔魚の役割について調べた。まず稚魚ネットにより土佐湾や伊予灘で採取された全長数mm程度の仔魚の消化管内容物を、微生物学的な手法を用いて詳細に観察した。その結果、大きさが1040μm程度の原生動物が仔魚によって捕食されているのが確認された。約47属319個体の仔魚について、その消化管内部を観察した結果、魚種によって、(1)観察した個体のほとんどすべてで原生動物が多量に観察されたもの、(2)観察されないかされても比較的少量であったもの、および(3)全く原生動物の捕食がみられなかったものの3群に分かれることが明らかとなった。(1)のグループにはカワハギ・アミメハギ・ヒメダラ等が、また(2)のグループにはシロギスやタチウオ等が、(3)のグループにはカタクチイワシ・マイワシ・クロサギ等が該当した。天然仔魚が原生動物を摂餌していることが明らかとなったため、種苗生産により得られた孵化後23日の摂餌開始期にあたる仔魚を約24時間飢餓させたのち、海水中より分離した鞭毛虫および繊毛虫を与えた。その結果、孵化後3日齢のアユ仔魚や孵化後4日齢のヒラメ仔魚ではまったく繊毛虫を摂食していないことを示す結果しか得られなかった。またマダイにおいては、孵化後3日齢の仔魚はほとんど摂食しなかったものの6日齢仔魚ではわずかながら仔魚添加実験区での繊毛虫の密度が無添加対照区に比較して減少しており、マダイ仔魚による繊毛虫の摂餌が示唆された。また前記の魚種に比較してより口径の小さい2日齢のキジハタ仔魚では、繊毛虫を捕食していることを示唆する結果が得られた。以上の観察・実験結果から、魚種によっては孵化直後の初期餌料として繊毛虫等の原生動物プランクトンが有効であることが示唆された。魚類の種苗生産における初期餌料として現在多用されているS型ワムシは、魚種によっては孵化後の摂餌開始時期の口径に比較して大きすぎるため、仔魚は効率よく摂餌することができずその初期減耗の大きな原因になっている。このため本研究では、S型ワムシに代わるより小型でかつ大量培養が可能な餌料の開発を目的とし、鞭毛虫・繊毛虫等の原生動物の仔魚初期餌料としての可能性について検討した。

まず天然環境に生息している仔魚が原生動物を捕食しているかを知るために、その消化管内容物を微生物学的な手法を用いて調べたところ、観察した12属31個体のうち6種12個体において繊毛虫と思われる微小原生動物が観察された。このうちトラギス科・ハゼ科の魚種(種名は不明)およびナベカ・マサバでは観察したすべての個体で原生動物の摂食が確認された。一方、アジ科・ネズッポ科魚種(種不明)およびカタクチイワシ・シロギスではいずれの個体の消化管内にも原生動物の存在が見られず、魚種による明確な違いが観察された。天然海水中より鞭毛虫および繊毛虫を分離し、大量培養のための条件を検討し確立することができた。その結果、鞭毛虫で約4x10^6cells/ml、大型の繊毛虫で2x10^3cells/ml小型の繊毛虫で6x10^4cells/mlの最大収量が得られた。これらの原生動物を種苗生産されたキジハタおよびアユの各孵化仔魚に与えたところ、アユ仔魚は摂食しなかったもののキジハタの仔魚は繊毛虫を摂餌することが示唆された。これらの結果から、原生動物を初期餌料に用いた有用魚種孵化仔魚の飼育が実現可能であることが示唆された。昨年度の研究結果から,天然海水中より分離された鞭毛虫および繊毛虫を種苗生産された孵化直後の仔魚に与えたところ,アユ仔魚で摂食されなかったもののキジハタ仔魚は繊毛虫を補食することが示唆された。そこで本年度は,さらにヒラメおよびマダイの孵化仔魚について,原生動物の初期餌料としての可能性を調べた。その結果,マダイにおいては,孵化後3日齢の仔魚はほとんど繊毛虫を摂食しなかったものの6日齢仔魚ではわずかながら仔魚添加実験区での繊毛虫の密度が無添加対照区に比較して減少しており,マダイ仔魚による繊毛虫の摂餌が示唆された。しかしながら,孵化後4日齢のヒラメ仔魚ではまったく繊毛虫を摂食していないことを示す結果しか得られなかった。その他キジハタやアカハタ等のハタ類仔魚で再実験を試みたが,本年度は孵化仔魚の歩留まりが極めて悪く,繰り返しの実験を行うことが出来なかった。また天然環境における原生動物捕食者としての仔魚の役割を明らかにするために,土佐湾や伊予灘より様々な魚種について全長数mm程度の仔魚を採取し,昨年度と同様その消化管内容物を微生物学的な手法により詳細に観察した。約45属285個体の消化管内部を観察した結果,魚種により,【.encircled1.】観察した個体のほとんどすべてで原生動物が多量に観察されたもの,【.encircled2.】観察されないかされても比較的少量であったもの,および【.encircled3.】全く原生動物の捕食がみられなかったものの3群に分かれることが明らかとなった。【.encircled1.】のグループにはカワハギ・アミメハギ・ヒメダラ等が,また【.encircled2.】のグループにはシロギスやタチウオ等が,【.encircled3.】のグループにはカタクチイワシ・マイワシ・クロサギ等が該当した。これらの実験・観察結果から,ある種の魚類は,孵化後比較的日齢の浅い仔魚期に繊毛虫等の原生動物を捕食していること,またこれらの性質を利用して仔魚の種苗生産の初期餌料として繊毛虫等の原生動物を利用することが可能であることなどが示唆された。
慢性腎臓病の診断における血清シスタチンC測定の意義

【目的】腎臓での糸球体濾過量(glomerular filtration rate : GFR)を評価する指標として、従来よりクレアチニン・クリアランス(Ccr)が日常の臨床現場において広く用いられてきた。2008年には日本腎臓学会より"日本人の推算GFR(eGFR)"が提唱され、24時間の蓄尿を行うことなく血清クレアチニン(Cre)値から簡便にGFRを算出することが可能になった。しかし、年齢や筋肉量の違いによるクレアチニン値への影響は避けられず、得られたGFRには未だ信頼性に乏しい部分がある。近年、性や年齢に影響を受けない新たな腎機能マーカーとしてシスタチンCが注目されている。本研究では、シスタチンCとeGFRとの相関性を分析し、慢性腎臓病(chronic kidney disease : CKD)診断の指標としての有用性を検討した。【対象および方法】対象は本院において血清Creを測定した患者検体200件とした。各々の検体についてシスタチンCを測定し、同時にCre値から算出されたeGFRとの相関分析を行った。【結果と考察】シスタチンCはeGFRと対数相関を示し、CKD診断指標であるeGFR 60ml/min/1.73m^2未満での相関はγ=0.714であった。一方、eGFR 60ml/min/1.73m^2以上ではγ=0.472であった。また、シスタチンCと血清Creは直線相関にあり、eGFR 60未満および60以上での相関はγ=0.636、γ=0.424であった。いずれの場合も、腎障害が疑われるeGFR 60未満の検体で比較的高い相関が得られた。しかし、シスタチンCがGFRと同等に、CKDの診断指標となるには満足できる相関とは言い難い。シスタチンCの測定は標準化が遅れており、GFRへの推算式の検討が行われている段階にある。今後、eGFR算出でのCreの影響、シスタチンC測定の標準化などを解決した上で再度、相関解析を行うことが必要である。さらに、薬剤投与でのeGFRの普及、さらにはシスタチンC値そのものがGFRに代わることを期待したい。
刺激誘起相転移変形する高分子ゲル

平成2年度・3年度には、種々の刺激受容官能基をもつポリ(N-イソプロピルアミド)(PNIPAM)水溶液が、金属イオン、アンモニウムイオン、プワトンの添加あるいは酵化1還元反応により相分離応答することを報告した。本年度は、これらの高分子をゲル化し金属イオンあるいはアンモニウムイオンによる変形応答変動を検討した。高分子ゲルは、流動パラフィン中で懸演重合することにより直径100-200umサイズのものを作製し用いた。ベンゾ〔18〕クラウン-6をもつPNIPAMゲルは、金属イオン無添加の場合、28.4°Cにおいて相転移変形した。カリウムイオンを添加すると相転移変形する温度は上昇し、0.05MのK_2SO_4を添加すると33°Cにまで上昇した。この相転移温度の上昇はカリウムイオンに特異的で、他へイオン、ナトリウム、リチウム、セシウムを添加した様には認められなかった。同じ組成のPNIPAM水溶液の場合にはナトリウムイオン添加により相分性温度の上昇が認められており、ゲル化により応答変動に差があらわれた。クラウンエーテルをもつPNIPANゲルは、ヒ-ブチル、プロビル、フェニルアンモニウムイオンの添加により相転移変形する温度が下降した。下降の程度は、ヒ-ブチル、プロピルアンチニウムイオに比べ、フェニルアンチニウムイオンで顕著であった。これは高分子水溶液の相分離変動とよく対応している。これらの高分子ゲルは、それぞれ31°Cあるいは26°Cに固定してカリウムイオンあるいはフォニルアンモニウムイオンを添加すると、それに応答して体積膨潤、収縮を示し、目的である刺激応答相転移変形するゲルを得ることができた。
アレクサンドロフ空間のリプシッツ構造・崩壊理論とスペクトル逆問題の新展開

(山口)昨年度、断面曲率が下に、境界の第2基本形式が一様に有界であるリーマン多様体で内半径が非常に小さい、いわゆる内半径崩壊多様体の構造を解明した。今年度はその論文の修正と同時に、内半径崩壊とは限らない、より一般の境界つきリーマン多様体の崩壊理論を展開した。具体的には、極限空間の距離構造を解明し、崩壊に対する障害として、境界つき多様体のダブルの単体的体積がノンゼロであることを見い出した。ただしこの結果においては、直径に関するバウンドが必要であり、このバウンドを取り除くことは今後の課題である。更に体積について、非崩壊収束の下での体積収束性、一般の崩壊多様体の境界成分の体積比の一様有界性、境界成分が小さい場合の空間の分解定理などを得た。来年度に論文を完成させる予定である。また曲率が下に有界なアレクサンドロフ空間の鈍角定数に関する結果を修正した。比較角の代わりに実際の角を用いて鈍角定数の定義を修正し、修正された鈍角定数と直径により正規化された体積との間の関係を得た。更に修正された鈍角定数が最大値をとるような空間の特徴づけを得た。(塩谷)測度距離空間において,そのisoperimetric profileとオブザーバブル分散の関係を見い出し、等号成立条件を求めた.これはChengの最大直径定理およびCheeger-Gromollの分割定理の一種の一般化となっている.(太田)前年度より進めていたリーマン的曲率次元条件を満たす測度距離空間が最小の第一固有値を持つ場合の剛性定理を完成させ、論文を発表した。また距離空間上の凸関数の勾配流の研究を進め、CAT(0)空間上の準凸関数の勾配曲線の弧長の有限性に関する論文を発表した。磯崎)ユークリッド空間内の回転面に対する与えられたガウス曲率をもつ曲面の構成問題において、再構成可能な曲面の特徴づけをスペクトル逆問題の手法によって与えた。29年度が最終年度であるため、記入しない。・アレクサンドロフ空間の任意の点からの距離関数が正則であるような距離球が、SLC(強リプシッツ可縮であることを証明した。また、アレクサンドロフ空間の「良い被覆」という概念を、任意の空でない有限交叉が錐的でSLCであるという条件により定め、任意のアレクサンドロフ空間が局所有限な良い被覆をもつこと、良い被覆の脈体(nerve)と同じホモトピー型をもつこと、および、曲率の下限、直径の上限、体積の下限が一様に押さえられたn次元アレクサンドロフ空間が、グロモフ・ハウスドルフ距離に関して安定的な良い被覆をもつことを証明した。・測度距離空間の列の相転移性質について,オブザーバブル直径を用いた必要十分条件を得た.これを用いて代表的なリー群が相転移性質をもつことを証明した.また,離散的な測度距離空間のl_p積のオブザーバブル直径の評価を行った.さらに別の研究として,閉曲面の等径定数の評価を与えた.・無限遠において一般的な挙動を許す非コンパクトなリーマン多様体、さらにオービフォールドに対してスペクトル理論を構築し、S行列から多様体を再構成する逆問題を解決した。六角格子等の物理的に重要な例を含む格子上のシュレーディンガー作用素に対して散乱の順問題を解決した。・Miklos Palfia氏(京都大学)と共同で距離空間上の弱凸関数の勾配流を研究し,CAT(0)空間で知られていた収縮性などの性質を,論文中で「可換性」と呼んだ空間が「リーマン的」であることの本質である概念を導入することで,CAT(1)空間に拡張した.・断面曲率が下に、境界の第2基本形式が一様に有界であるリーマン多様体で、内半径が0に近いような内半径崩壊多様体の構造を解明した。特に、内半径崩壊多様体の境界成分の個数が高々2であり、丁度2個の場合は内半径崩壊多様体は閉区間と境界成分の積に微分同相になること、(Gromov, Alexander-Bishopの結果の拡張),内半径崩壊多様体のグロモフ・ハウスドルフ極限空間が、曲率が下に有界なアレクサンドロフ空間になることを示し、更に直径が一様に有界であるとき、余次元1の内半径崩壊を完全に決定した。・既存のユークリッド空間における自己相似集合を、曲がった空間上の漸近的自己相似集合の概念に拡張し、そのハウスドルフ次元を決定した。例として、曲面上のシェルピンスキー・ガスケットのハウスドルフ次元を決定した。・曲率が下に有界なアレクサンドロフ空間は、良い被覆の脈複体(nerve)と同じリプシッツ・ホモトピー型をもつことを示した。これより、曲率が下に、直径が上に、体積が下に一様に有界なアレクサンドロフ空間の集合において、リプシッツ・ホモトピー型の有限性が得られた。・スティーフェル多様体と旗多様体の次元が無限大へ発散する列の極限空間が、それぞれ無限次元ガウス空間とそのある作用による商空間となることを証明した.応用として,これらの多様体のオブザーバブル直径の漸近的な評価を得た.・電磁気学の逆散乱問題を考え、無限遠の近傍では真空と一致し、有限部分では任意の異方性を許す媒質に関するマックスウエル方程式の外部境界値問題において、散乱作用素から領域の境界の1次元ベッチ数を定めることができることを示した。

・フィンスラー多様体の等周不等式について、局所化と呼ばれる方法やBakryらによるΓ解析の一般化により、それぞれ不等式評価を得た。アレクサンドロフ空間は、その上の良い被覆と同じリプシッツ・ホモトピー型をもつことを証明できた。任意に小さい良い被覆で、被覆の各要素である狭義凸領域のサイズが一様に有界にとれることを証明できれば、アレクサンドロフ空間のリプシッツ・ホモトピー収束性を示すことができる。この意味で、当面の目標であるアレクサンドロフ空間のリプシッツ・ホモトピー収束性の証明に近づいた。また今年度の研究により、境界付きリーマン多様体の崩壊に関して、内半径崩壊するものの構造がかなり解明された。その意味で、境界付きリーマン多様体の崩壊理論構築に向けた重要な足がかりを得ることができた。スティーフェル多様体や旗多様体といった具体的な空間に対して、その次元が大きくなる時の極限空間が分かった。今後これを一般化することにより、測度集中現象についての、新しい理論に発展する可能性が出てきた。電磁気学の物理モデルにおいて、逆散乱問題に対する結果が出たことで、この手法を一般の非コンパクト・リーマン多様体のスペクトル逆問題に拡張できる可能性が開けた。等周不等式がフィンスラー多様体で展開されたことで、一般のアレクサンドロフ空間の幾何解析にも適用できる状況が確認された。山口:曲率が下に有界なアレクサンドロフ空間に対して、比較角の概念を用いることにより鈍角定数という幾何不変量を導入した。この定数は比較角の意味で空間の大域的な広がり具合を図るものであり、0とπ/2の間にその値を取る。空間に対する一様な直径のバウンドの下で、鈍角定数が体積と密接な関係があり、空間が崩壊するのは鈍角定数が非常に小さい場合に限ることを示した。空間が非有界の場合には、無限遠からの鈍角定数という概念が自然に定まり、空間が非負曲率をもつとき、体積増大度と無限遠からの鈍角定数の関係を明らかにした。また、空間のリプシッツ・ホモトピー収束について曲率が下に、直径が上に、体積が下に一様に有界なアレクサンドロフ空間の無限列がアレクサンドロフ空間にGromov-Hausdorff収束する状況で、正則部分の間の概等長写像が空間全体の間のリプシッツ・ホモトピー同値写像に拡張することを示し、前年度の結果の精密化が得られた。磯崎:回転面のスペクトル的特徴づけを無限次元ヒルベルト多様体の観点から逆問題を解いた。また摂動された格子上のシュレーディンガー作用素のスぺクトル散乱現象を解析し、散乱の逆問題、特に格子中の欠損の同定を行った。取り扱い得る格子としては六角格子等の個体物理学における重要な例が含まれる。塩谷:測度距離空間に対してチーガーの等周定数とオブザーバブル直径の間の不等式を得た.これは従来知られていたものと異なり,最良の評価式である(東氏と共同).太田:フィンスラー多様体の幾何解析について、前年度の研究で進めた重みつきリッチ曲率と熱流に関するΓ解析の応用として、幾つかの関数不等式を示した。具体的には、リッチ曲率の変形である重みつきNリッチ曲率が正数K以上であるフィンスラー多様体に対し、ポアンカレ不等式(Lichnerowicz不等式)、対数ソボレフ不等式、ソボレフ不等式を示した。アレクサンドロフ空間のリプシッツ・ホモトピー収束理論については、リプシッツホモトピー同値写像のリプシッツ定数の一様性を除き当初の目的を達成した。
足浴は高齢者における夜間多尿と睡眠の質を改善する

目的:高齢者に夕方足浴を実施した場合としない場合の成果を比較した。対象及び方法:40°Cの湯温に10分間足浴を17時に実施群と非実施群にランダムに割り付けcrossover designで実施。結果:夕方足浴の実施により、眠前の排尿促進はしなかったが、夜間排尿量は有意に減少し、夜間排尿回数は0.5回減少した。また足浴実施群の夜間睡眠効率は上昇傾向がみられ、中途覚醒回数は有意に減少し睡眠が良好化したといえる。以上より夕方5時の足浴は夜間頻尿、夜間多尿に有効と思われる。さらにプレ実験した就寝4時間前の入浴も夜間尿量が減少したことから、就寝前の足浴や入浴より有効であると思われ更なる研究が必要である。このことについて、プレ研究として、取り組み、山梨県立大学看護学部紀要に投稿し、査読の結果採択され掲載された。その研究目的は、(1)夕方の足浴により、午後から夕方にかけて貯留した浮腫傾向の水分が足浴の排尿促進効果により、入眠前に排尿され、夜間排尿量と夜間排尿回数を減少させる。(2)足浴により睡眠効率が良好化するとともに、(1)の成果も加わり夜間の中途覚醒が減少する、とした。クロスオーバーデザインで夜間1回以上の排尿がある65歳以上の女性7名を対象とした。評価指標は排尿日誌(足浴実施群5日間、非実施群を3日間)、アクチグラフを用いた。データ分析はt検定・Mann-WhitneyのU検定のいずれかを用いた。その結果、夕方5時に足浴を実施した群は、夜間尿量は有意に減少し、夜間排尿回数も減少(0.5回)した。日中尿量も有意に増加した。しかし、眠前の足浴実施後から入眠までの間の眠前尿量では有意な差はみられず、個別の結果でも眠前尿量が増えていたのは7人中2名のみであった。1名は高血圧で他の1名は低血圧であったことから、共に日中は腎血流量が低下するので、足浴による効果が比較的迅速に出るのではないかと推測するが、症例数が少ないため今後の追求課題である。また足浴を実施した群の睡眠効率には良好化傾向が見られた程度であった。以上のような結果から研究成果は得られると考えられるので、今後は対象人数や対象条件等を整え仮説に対する検証研究を本格的に実施したい。研究目的は、夜間多尿、夜間頻尿に対し、末梢血液循環を促進する看護技術である『足浴』を入眠前ではなく、夕方に実施することにより、一日蓄積された浮腫傾向が修正され、就寝前までに排尿されることにより、夜間多尿が改善し夜間頻尿も改善すること、およびその改善により、良質な睡眠が得られることの2つの仮説を検証することであった。このことについて、プレ研究として取り組み、山梨県立大学看護学部紀要に掲載された。その研究目的は、(1)夕方の足浴により、午後から夕方にかけて貯留した浮腫傾向の水分が足浴の排尿促進効果により、入眠前に排尿され、夜間排尿量と夜間排尿回数を減少させるとした。対象および方法は、ランダム化crossover designで、夜間1回以上の排尿がある65歳以上の女性7名を対象として実施した。評価指標は排尿日誌(足浴実施5日間、非実施群を3日間),アクチグラフを用いた。その結果、夕方5時に足浴を実施した群は、夜間尿量は有意に減少し、夜間排尿回数も減少(0,5回)した。日中の尿量も有意に増加した。1名は高血圧で他の1名は低血圧であったことから、共に日中は腎血流量が低下するので、足浴による効果が比較的迅速に出るのではないかと推測するが、症例数が少ないため、今後の追究課題である。また、足浴を実施した群の睡眠効率には良好化傾向が見られた程度であった。以上のような結果から、研究成果は得られると考えられるので、今後は対象人数や対象条件等を整え仮説に対する検証研究を実施したい。目的:高齢者に足浴を実施し、以下の仮説を検証した。1)夕方の足浴により、午後から夕方にかけて貯留した浮腫傾向の水分が足浴の排尿促進効果により、入眠前に排尿され、夜間排尿量と夜間排尿回数を減少させる。2)足浴により睡眠効率が良好化するとともに、1)の成果も加わり夜間の中途覚醒が減少する。対象および方法:湯温40°Cに踝骨の上10cmの湯量で10分間の足浴を17時に実施群と非実施群にランダムに割り付けcrossover designで実施した。結果および考察:夕方の足浴の実施により、眠前の排尿促進はしなかったが、夜間排尿量は有意に減少し、夜間排尿回数は0.5回減少した。また、足浴実施群の夜間睡眠効率は上昇傾向がみられ、中途覚醒回数は有意に減少したことから、睡眠が良好化したといえる。以上のことから、本研究の仮説はほぼ検証できた。そこで、足浴と同じ作用のある日常的な入浴の場合はどうか、夕方の入浴の効果を追究した。

就寝直前の入浴より、夕方の入浴の方が夜間尿量に減少傾向が見られた。今後更なる追究が必要である。目的:高齢者に夕方足浴を実施した場合としない場合の成果を比較した。対象及び方法:40°Cの湯温に10分間足浴を17時に実施群と非実施群にランダムに割り付けcrossover designで実施。結果:夕方足浴の実施により、眠前の排尿促進はしなかったが、夜間排尿量は有意に減少し、夜間排尿回数は0.5回減少した。また足浴実施群の夜間睡眠効率は上昇傾向がみられ、中途覚醒回数は有意に減少し睡眠が良好化したといえる。以上より夕方5時の足浴は夜間頻尿、夜間多尿に有効と思われる。さらにプレ実験した就寝4時間前の入浴も夜間尿量が減少したことから、就寝前の足浴や入浴より有効であると思われ更なる研究が必要である。退職に伴い在籍大学の移籍により、新たに研究実施施設や対象者の開拓等が必要になり、実施に向けて検討や依頼を試みたが急には難しく研究再開が困難であった。看護学排尿関連の医療関係者やそこで活動する方々との人間関係を構築し、研究について協力が得られるよう、説明し研究再開ができるように取り組みたい。平成25年度は本格的に研究を実施展開する前に、倫理審査委員会の承認を受けプレ研究を行った。その結果から、足浴は排尿と睡眠に影響があるという傾向が分かったが、足浴が睡眠の質にどのように影響しているかについては、スリープスキャンとアクチグラフを使って調査した。しかしその分析やアクチグラフとスリープスキャンの結果の整合性など、データの取り方やその分析が適切にできなかったので、次年度の研究活動に繋げていきたい。研究が再開できなかったため、前年度に引き続き緩急実施を目指す為。平成26年度は所属する大学を移籍したため、地域特性を知り、研究実施施設の状況やそこで活躍する方々との人間関係を形成し、研究について協力が得られるよう丁寧に説明し、研究が再開できるよう取り組みたい。プレ研究から得られた課題の1足浴の効果は血圧値により影響を受けるのか、2足浴が睡眠の質にどのように影響しているか、等から夕方の足浴は夜間多尿、夜間頻尿を改善するか、その根拠について、さらに研究計画を再考し本格的に研究を実施したい。睡眠、および活動に関する測定機器、および研究対象者への謝礼。排尿・睡眠の国際学会への参加費用。プレ研究で小規模であったこと、また研究のための打ち合わせや検討のための会議を持つことができなかったこと、また学会への参加もできなかったため、謝礼や旅費、及び準実験経費も少なかったためである。本格的な研究の実施にあたり、打ち合わせや検討会を行い、専門家からの意見を得たりするための謝礼や学会に参加し新しい情報を得るための費用とし、計画を緻密に練り、実施するための費用として使用していきたい。
エクソソーム内microRNAを用いた非アルコール性脂肪性肝疾患の予後予測法開発

非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)患者の予後予測に有用なバイオマーカーとしてのエクソソームマイクロRNA(miRNA)を患者血清中に同定する目的でNAFLD患者の保存血清からエクソソームの単離を試みたが研究初年度は収率や純度が不十分でmiRNA解析ができなかった。そこでエクソソーム単離の手順を改良し高品質の血清エクソソームを得ることができ、そこからmiRNAを抽出し、2600種のmiRNAプローブを搭載したオリゴチップにかけて網羅的解析を行った。臨床的プロファイルから軽症NAFLDグループと、肝線維化が進んだ重症グループに分けて上記のエクソソームmiRNAの解析データについてクラスター解析を行ったところ両群間でmiRNA発現パターンに違いを認めた。しかしその中からNAFLD重症度に相関したmiRNAを抽出するためには、重症NAFD患者のサンプル数が少なかったため、新たなサンプル集積とエクソソームmiRNA解析を続け、NAFLDの重症度に関連するmiRNAが複数同定出来た。それらの標的遺伝子の解析も既に行い、患者臨床プロファイルと照合して予後予測に重要と思わるmiRNAの絞り込みを行った。絞り込んだmiRNAをエクソソーム検体においてRT-PCRをもちいて定量し、NAFLD重症度との相関性を検証したところ、昨年度において少数例の解析である程度の相関性を認めていたmiRNAがいずれも単独ではNAFLD重症度と相関しないという結果となった。そこで現在、各miRNAの標的遺伝子をNAFLD進展のメインパスウエイ以外の糖および脂質代謝に関わる蛋白質にまで拡げて検討し、個々の症例のプロテオソームの背景差による影響を排除してNAFLD重症度予測ができるような、複数のエクソソームmiRNAを用いた予後予測式作成に取り組んでいる。当初の予定より重症のNAFLD患者の研究登録数が少なく、予後予測のために有用なエクソソームmiRNA抽出のための解析に必要な検体数が不足したため患者リクルートに時間を要した。次年度以降で検体数が増加し候補となるmiRNAを抽出できたが、NAFLD重症度との相関性を検証したところ、いずれも単独では統計的有意性が得られなかった。個々の症例の臨床パラメータ、患者背景や血液データを見直し、各miRNAの標的遺伝子を再検討したところ、NAFLDのメインパスウェイと考えられている標的分子以外の蛋白発現レベルがmiRNAによる重症度予測に干渉している可能性が出てきた。以上の経緯により、研究目標である血清エクソソームmiRNAによるNAFLD重症化予測式の完成がやや遅れています。前述のとおり、血清エクソソームmiRNAによるNAFLD重症化予測に干渉していた要因を解析し、これらの中から重要と推測される項目をピックアップし、これらを補正することで、既に絞り込んでいたmiRNAとNAFLD重症度との相関性を見出すことができるかを検証する。それが成功すれば、補正に用いた臨床パラメータを予測式の中に盛り込むことでエクソソームmiRNAによるNAFLD重症化予測式を完成させる予定である。非アルコール性脂肪性肝障害(NAFLD)の患者の予後予測に有用なバイオマーカーとしてのエクソソームマイクロRNA(miRNA)を患者血清中に同定する目的で20名のNAFLD患者に同意取得の上で血清を採取保存した。保存血清から先ずはエクソソームの単離を試みたが、当初は収率や純度が不十分でmiRNAの解析に堪えなかった。そこでエクソソーム単離の手順を見直し、試行錯誤した結果ようやく安定した高品質の血清エクソソームを得ることができた。このエクソソームからmiRNAを抽出し、2600分子のmiRNAプローブを搭載したオリゴチップにかけてそのmiRNAを網羅的に解析した。臨床的プロファイルからNAFLDとしての病態が軽症のグループと、既に重症化しているグループに分けて上記のエクソソームmiRNAの解析結果についてクラスター解析を行ったところ両群間でのmiRNA発現パターンの違いが認められた。しかしその中からNAFLDの重症度に相関したmiRNAを抽出するためには、重症NAFD患者のサンプル数が少なく(現時点で5名しか得られていない)ため、現在サンプルを集積中である。しかしこれまで集積した検体において統計的な信頼性はまだ不十分であるがNAFLDの予後予測に関連する可能性のあるエクソソームmiRNAが複数同定できている。それらの標的遺伝子の解析も既に行っており、患者臨床プロファイルと照合して予測式作成に重要と思わるmiRNAの絞り込みも既に開始している。絞り込んだmiRNAをエクソソーム検体においてRT-PCRをもちいて定量し、NAFLDの重症度との相関性を検証しある程度の相関性をつかんでいる。これらの研究結果は来年度以降に追加サンプル集積完了後の解析において予後予測式を作成できる可能性が高いことを示唆していると考える。予想より重症のNAFLD患者の集積が少なく、予後予測に必要な検体数が不足したため患者リクルートに時間を要することとなった。しかし追加の検体集積は順調に進んでおり本年6月には解析が再開できそれ以降のステップは予定通りに進みやすい行程となるため本年度中にNAFLD重症化の予後予測に重要なエクソソームmiRNAの同定や予後予測式が完成すると思われる。