hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
芸術環境形成支援のための創造的アート・ライティングの学習に関する基礎的研究

1.関連領域ならびに諸外国におけるアート・ライティングの教育に関する資料収集と分析、高等教育におけるカリキュラム開発筑波大学所蔵美術作品に関して、正確なデータ採取から記述にまでにいたる作業の流れを実際に行って検証し、『筑波大学所蔵石井コレクション選集』を作成した。今後は、鑑賞支援に有効な作品解説を含むデータベースの構築を通して、アート・ライティング教育の基礎となる情報提供システムの開発へと発展させる[齋藤]。オーストラリア連邦シドニー大学文学部美術史・美術理論学科に調査滞在し美術史教育の実践的指導としての「アート・ライティング」について知見を得るとともに、鑑賞行動とアート・ライティングの関係について調査・考察した[寺門]。英国の美術学習における知性的批評主義の分析を通して、アート・ライティング学習の意義を考察して発表した。また、「ヴィジュアル・シンキング・ストラテジー」を通した美術体験の言語表現とアート・ライティングの学習について米国の博物館における実地訓練を含めて調査し、日本の大学院教育プログラムへの導入を準備した。学部の授業科目としては「芸術支援学」における学習成果として「Art Writing」第2号を発刊した[直江]。2.中等教育におけるアート・ライティングの教育に関する調査と支援全国の高等学校を対象に、美術をはじめとする教育課程や課外活動におけるアート・ライティング学習の実態や、アート・ライティングのコンテストに関する意識、学習方法開発への可能性や課題等について調査した結果に基づき、その現状と可能性についての考察を発表した[直江]。「アートライティング教育研究会」を開催し(3月11日筑波大学)高等学校における学習指導例と、第2回の全国コンテストの企画を中心にこの分野の今後の研究開発の方向性を検討した。1.高等学校におけるアート・ライティングの教育に関する調査全国から約1400校の高等学校を抽出し、質問紙によって、各学校の美術科をはじめとする教育課程や課外活動におけるアート・ライティングの学習の実態や、美術論・文化芸術学関連の進路への関心、アート・ライティングのコンテストに関する意識、学習方法開発への可能性や課題等について調査した回答内容について、整理・分析を行った。2.関連領域からの資料収集美術史[寺門]、美術批評[寺門・齋藤]、芸術支援[齋藤]、芸術教育[直江]の各領域から、美術の論述に関する教育方法確立の基礎となる資料を収集し、その整理・分析を行った。3.高等学校生を対象としたアート・ライティングに関するコンテストを通した調査全国から、美術に関する経験(作品創作、鑑賞・批評、アート・プロジェクトや美術教育への参加等)をもとに書いたエッセイを募集し、授賞や講評等を行った。コンテストには171編のエッセイが集まり、この活動を通して全国の学校教員や生徒に対してアート・ライティングの学習に関する意識を喚起するとともに、応募作品の評価を通して実情と課題を把握し、今後の学習方法開発への基礎データを収集した。4.高等教育における教育方法開発本学芸術支援学において「クリエイティブ・アートライティング」の専門科目を新設し、受講生による美術記事執筆を通した教育の実践を通して基礎的資料を収集した。
ヒトパピローマウイルス陽性中咽頭癌の撲滅に向けた包括的研究

ヒトパピローマウイルス(HPV)の咽頭感染について、これまでの435例のコホートに加え461名の別コホートの含嗽検体を用い検討した。その結果、HPV感染率は4.1%、高リスク型HPV感染率は2.8%%であり、両コホート間で同等であった。本邦における咽頭HPV感染率は約4%と考えられた。サイトケラチン14(K14)のプロモーター下にHPV16のE7遺伝子を強制発現するK14HPVE7トランスジェニックマウスを作製した。ヘテロマウスに表現型は認めていないが、ホモマウスを得るべく交配を継続中である。一方、Pik3ca変異ノックインマウスの作製については、Pik3ca exon9にE542K, Glu→Lys変異個体を得るためCRISPRを用い遺伝子改変を試みたが胎生致死であり、目的の変異個体は得られていない。今後も種々検討を行う予定である。これまでに市販の抗E6抗体の全てが無効な一方、一部の抗E7抗体は有効なことを明らかにした。そこでHPV関連中咽頭癌の臨床検体を用いE7タンパクの発現を免疫組織化学および蛍光免疫染色で検討すると、その発現は極めて微弱であった。HPV16陽性中咽頭癌培養細胞株もE7を発現しないことから、E7標的治療は不成立とが示唆された。また、E6タンパクの評価は不可能であり、E6標的治療の実験系の樹立は困難と考えられた。これらは既報の研究内容に疑問を投じるものである。HPV関連中咽頭癌について循環血液中のHPV DNAコピー数をデジタルPCRで定量し検討した。ベースラインのコピー数は病態の進行度(原発巣のみ、頸部リンパ節転移あり、遠隔転移あり)に従い激増していた。また、(化学)放射線療法を施行し照射終了後3カ月で治療効果を判定すると、HPV DNAコピー数とFDG PET-CTによる評価には乖離が認められ、前者がより正確に遺残病変の有無と相関していた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。435名の健常者を対象に咽頭HPV感染の検討を行った。咽頭から含嗽単独で回収した細胞検体、含嗽+咽頭洗浄で回収した細胞検体を用い、nested PCR + direct sequencing、そしてGENOSEARCH HPV31 (MBL)によるHPVの検出と型判定を行った。Nested PCRとGENOSEARCHによるHPVの検出効率は同等であった。含嗽単独の検体と含嗽+咽頭洗浄の検体を比較すると、HPV全体の検出効率は後者で優れており、高リスク型HPVの検出効率は後者が優れる傾向にあり、HPV16の検出効率は両者間で有意差を認めなかった。咽頭HPV感染率は5.5%であり、HPV16は1.4%で最も高頻度であった。また、咽頭HPV感染のリスクは性活動と相関していた。HPV16陽性中咽頭癌動物モデルの開発を目的として、K14(サイトケラチン14)プロモーターが挿入されているpG3Z-K14cassetteベクターに人工合成したHPV16 E6(TTL)E7配列を挿入したK14HPVE6(TTL)E7ベクターを作製した。今後、同ベクターをC57B6マウスの受精卵前核にマイクロインジェクションし、K14HPVE7トランスジェニックマウスを得る予定である。同様に、変異型PIK3CA (E542, Glu→Lys)を挿入したベクターを作製中である。HPV16 E6/E7遺伝子を標的としたguide RNAとCas9の一体化ベクターを作製し、CRISPR/Cas9システムを用いてE6/E7をノックアウトしたHPV16陽性中咽頭癌培養細胞株を作製中で、間もなく完成する見込みである。HPV DNAのliquid biopsyに関しては、条件の最適化を行っている。血漿からcell-free DNAを抽出し、デジタルPCRによるHPV16 E6/E7のコピー数の絶対定量を行っている。咽頭HPV感染の評価に関しては、当初予定していた手法よりも高感度な手法を用いて検討を行い、十分な回答が得られるか危惧された性活動に関するアンケートも全例で問題が無く、十二分に解析を行うことができた。HPV陽性中咽頭癌動物モデルの開発については、完成は未だであるがトランスジェニックマウスの作製が順調に進んでいる。CRISPR/Cas9を用いたE6/E7ノックアウト頭頸部扁平上皮癌の作製についても、完成は未だであるが作製は順調に進んでいる。HPV DNAのliquid biopsyに関しては、条件の最適化を行い、間もなく臨床検体を用いた検討を開始する見込みである。HPV陽性頭頸部扁平上皮癌細胞株であるUM47およびUM104のE6/E7遺伝子をCRISPR/Cas9システムを用いてノックアウトし、E6/E7タンパクの発現を比較検討したところ、qPCRではmRNAの発現が確認できているにもかかわらずタンパクの発現が親株でも全く確認できなかった。そこで、PA tagを付けたE6/E7発現ベクターを作製し293FT細胞に導入し解析した。抗PA tag抗体はE6/E7タンパクを認識したが、全ての抗E6抗体はE6タンパクを認識せず、一部の抗E7抗体はE7タンパクを認識した。

この有効な抗E7抗体を用いた免疫染色は可能であった。以上より、有効な抗E6抗体が存在しないこと(細胞内のE6タンパク発現の評価は不可能)、UM47およびUM104はE7タンパクを発現していないことが明らかとなった。子宮頸癌細胞株Caskiについて検討したところ、同様にE6/E7 mRNAは発現しているがタンパクは発現していなかった。E6/E7タンパクの発現はHPVによる癌化に必須であることから、UM47/UM104/Caskiを用いてこれまで行われてきた多くの基礎実験は全く無意味なものであることが判明した。HPV DNAのliquid biopsyに関して、血漿からcell-free DNAの抽出、デジタルPCRによるHPV16 E6/E7のコピー数の絶対定量の条件の最適化を完了した。HPV陽性頭頸部扁平上皮癌細胞株であるUM47およびUM104、更には子宮頸癌細胞株であるCaskiが様々な検討の結果、E6/E7 mRNAを発現する一方でタンパクを発現しないことが明らかとなった。従って、CRISPR/Cas9システムを用いてE6/E7ノックアウト株を作製したものの、タンパクレベルでは親株と差が無いことから、E6/E7ノックアウト後の細胞形質の変化(今回は特に放射線感受性)について検討する意義が無くなった。こうした点では、本研究は当初計画よりやや遅れていると言えるが、一方でこうした知見が得られたことは、HPV陽性中咽頭癌や子宮頸癌の基礎実験を行っている研究者に正しい方向へ転換する契機を与えることになり、大きな朗報と捉えることができる。また、現在市販されている抗E6/E7抗体の全てについて今回客観的な評価を下すことができたので、その意味においてもこの分野に関わる研究者が無効な抗体を用いて無駄な実験をする手間を省く一助となる。一方、我々はHPV陽性中咽頭進行癌を対象とした低侵襲治療の臨床試験を行っており、これに関連してliquid biopsyによるHPV DNAの評価で興味深い知見が得られつつある。ヒトパピローマウイルス(HPV)の咽頭感染について、これまでの435例のコホートに加え461名の別コホートの含嗽検体を用い検討した。その結果、HPV感染率は4.1%、高リスク型HPV感染率は2.8%%であり、両コホート間で同等であった。本邦における咽頭HPV感染率は約4%と考えられた。サイトケラチン14(K14)のプロモーター下にHPV16のE7遺伝子を強制発現するK14HPVE7トランスジェニックマウスを作製した。ヘテロマウスに表現型は認めていないが、ホモマウスを得るべく交配を継続中である。一方、Pik3ca変異ノックインマウスの作製については、Pik3ca exon9にE542K, Glu→Lys変異個体を得るためCRISPRを用い遺伝子改変を試みたが胎生致死であり、目的の変異個体は得られていない。今後も種々検討を行う予定である。これまでに市販の抗E6抗体の全てが無効な一方、一部の抗E7抗体は有効なことを明らかにした。そこでHPV関連中咽頭癌の臨床検体を用いE7タンパクの発現を免疫組織化学および蛍光免疫染色で検討すると、その発現は極めて微弱であった。HPV16陽性中咽頭癌培養細胞株もE7を発現しないことから、E7標的治療は不成立とが示唆された。また、E6タンパクの評価は不可能であり、E6標的治療の実験系の樹立は困難と考えられた。
癌化学療法における新規制吐薬の有用性評価と制吐薬使用法の適正化

2009年12月に発売開始となった新規制吐薬アプレピタントは、従来の制吐薬では効果不十分とされていた化学療法24時間以降に発現する悪心・嘔吐に対して、優れた有効性を発揮するとされている。しかしながら、臨床の現場では、アプレピタントを使用した患者においても、急性および遅発性の悪心・嘔吐を抑えることができなかった症例が散見される。このことは、化学療法施行患者にアプレピタントを漫然と使用するのでなく、効果を発揮する可能性の高い患者に適切かつ的確に使用することの重要性を示唆している。本研究では、アプレピタント使用患者に対するアンケートを通じてその有用性を評価し、その結果を基に、既存制吐薬の使用を含めた、より適正な制吐薬使用法を構築することを目的とした。当院外来化学療法室を利用し、アプレピタントを使用した、高度催吐性レジメン施行患者9名、中等度催吐性レジメン施行患者7名を対象として、アンケート調査ならびに処方解析を行った。評価項目は、化学療法後24時間以内(急性)及び24時間以降(遅発性)の嘔吐の回数、悪心の辛さとした。調査の結果、高度催吐性レジメン施行患者では、初回からのアプレピタントの使用が有用であることが示された。一方、中等度催吐レジメン施行患者では、一律にアプレピタントを使用するのではなく、患者の状態に応じて使用の適否を判断することが望ましいと考えられた。また、アプレピタントを使用したにもかかわらず、悪心が発現した患者は、その殆どが経口5-HT_3受容体拮抗薬を投与されていなかったことが明らかとなった。アプレピタントを適正に使用する上では、効果不十分な場合に速やかに経口5-HT_3受容体拮抗薬の使用を検討することが重要であると考えられた。
高精度ab initio計算に基づく分子間相互作用関係の確立と検証

超臨界状態として実用上も最も良く利用されている基本的な物質である二酸化炭素の臨界点(304.3K,7.39MPa)近い状態で,高エネルギー物理研究所の中性子全散乱分光器で中性子回析を行ない構造解析を行なった。すなわち310Kで,10.1,8.6,8.1,6.1MPaの4点で,320Kで10.2,9.7,9.2MPaの3点で測定を行なった。試料セルは高圧に耐えねばならないが,チタンとジルコニウムの合金により中性子に対して透明なセルを製作した。セルは内径8mmで肉原0.8mmで40MPaまで耐えるものである。加熱は赤外炉で行ない,温度制御は310Kの実験で24K,320Kの実験で21Kにすることができた。測定時間は,圧力1.0MPaの気体の実験も行ったが87時間に及んだ。散乱ベクトルQの関数として構造因子S(Q)を求めた。Q=1.8Å^<01>に第1ピークが見られ,圧力が増加するほどピークは明確になる。S(Q)に高いQの領域でDebyeの式を適用し,分子内のC-O,O-O距離を求めたが,それぞれ約1.16Å,2,34Åで直線分子であることが判明した。この距離は気体から固体まで変りない。S(Q)からFourier変換により動径分布関数を求めた。分子間ピークは明確でないので,解析のために分子動力学シミュレーションを行なった。原子間ポテンシャルは3サイトモデルで,各原子を作用点とした。310K,8.6MPaの状態をシミュレートしたが動径分布関数は実験値と満足すべき一致が得られた。近接する2つのCO_2分子の相対的な配置関係は,そのC-C軸に対して30°60°の配置が多く,C-C軸方向から見た2つの直線分子の角度は30°60°のものが多く,液体状態のT字型や斜め平行型は少ないことが分った。配位数の分布を調べたが09の広い範囲に分布し,4及び5の頻度が多い。このように広い分布を示すことはゆらぎが大きいことを意味し,臨界点に近いことの特徴を表わしている。
活動時マウスにおけるダイナミックな循環調節の解明

自由行動下マウス心電図連続記録のための電極埋込み手術不要な平板型心電図・ピエゾ素子複合センサーシステムの開発を行い特許出願(特願2015-058838)を行った。本センサーは、心電図記録の際にマウス足裏の発汗(精神性発汗)を要件とするため、ストレス時および睡眠時について実験を行い以下の発見があった。1マウスは音や振動さらにヒトに凝視されるだけで足裏発汗と心拍数上昇を伴う精神的ストレス反応を示す。2ヒトと異なり、マウスは睡眠時に足裏に発汗する。31の反応は睡眠時に行うとダイナミックな心拍数変化が得られ、さらに心房細動と思われる不整脈を引き起こす。25年度の研究計画に基づいて、前年度に続き非拘束自由行動下でマウス心拍数連続記録を可能にする平板型心電図複合センサーの改良を行った。前年度は平板型心電図複合センサーは30個の長方形電極(1.5×2.3cm2)を約19×10cm2のガラスエポキシ基板上に配置したものを作成したが、心電図検出率(時間割合)が10%以下のことも多く低かったため、平板型心電図複合センサーの電極パターンを幅約3mmの15本の平行線とするシンプルなパターンに変更を行った。直後の実験では心電図検出率が50-80%と比較的高く電極パターンの効果と思われたが、その後に行った数回の実験において明瞭な心電図がほとんど記録できないことが続いた。増幅回路などシステムの異常は発見されず、マウスの心電図が記録できない原因がしばらくの間不明であった。そのため、膨大な量の15chデータのDigital Signal Processor (DSP)あるいはMicro Processor Unit (MPU)などを利用したデータ圧縮アルゴリズムの開発を行うことができなかった。数か月後、マウスのケージを棒で叩いた時に心電図が現れることを偶然発見し、マウス心電図の検出にはマウス四肢足裏の皮膚表面の適度な発汗が必要であることをつきとめた。以上のように、床面のマルチ心電図電極板方式は、マウス足裏の発汗に依存するものであり、安定した心電図検出は容易ではないことが分かった。したがって、26年度実施予定のマウス心電図長時間記録は多少の研究計画の変更が必要となる恐れがある。以上の重大な研究の障壁は、一方で新たなストレス発汗応答の実験系の創出に繋がった。また、このストレス発汗応答実験を数十回繰り返したところ、ストレス後の安定した心電図記録が可能となったため、得られたデータを基に15chデータを1chデータに圧縮する方法を見出した。平成24年度の研究計画に従い、非拘束自由行動下でのマウス心拍数連続記録を可能にする平板型心電図複合センサーおよび多入力心電図信号記録システムの開発を行った。始めに透明なプラスチック板の上で自由に行動するマウスの四肢の接地パターンを観察した結果、接地面積は前肢1cm2、後肢1.5cm2程度であった。また四肢の接地間隔は後肢左右間隔が1.5cm以上であったが、前肢左右間隔および前後肢間隔は1cm以内になることも多く最適電極パターンの決定は困難であり今後も検討を継続する。平板型心電図複合センサーの第1次試作は、15個の電極を配置しそれらの電極を全て抵抗を介して接地し記録する方法を開発した。15個の電極信号を16チャネル入力のADコンバーターに接続し、いずれか2つの電極にマウス四肢の前肢あるいは後肢が接触した時にその2電極に対応する信号(2/16チャネル)に心電図に対応する波形が現れることを確認した。残る1チャネルのADコンバーター入力にはセンサー裏面に接着したピエゾセンサー接続線を接続し、マウスの活動に応じた振動信号を記録した。また、平板型心電図電極は金メッキを施した結果、マウス糞尿に暴露されても腐食しないことを確認した。スタンフォード大学・西野教授とのディスカッションにおいて、睡眠中のマウス四肢は限局した面積に集中するため、本センサーの電極パターンでは四肢が同一電極上に位置し心電図記録ができないことが予想された。しかし、睡眠時のマウス心拍信号はピエゾセンサーで検出可能であり、したがって心電図およびピエゾセンサーの両特性を具備する本課題のセンサーは活動時、睡眠時の状態に依存しない、生直後のマウスなど小動物にも利用可能な非侵襲的心拍測定装置を世界で初めて実現するものであり、小動物の生直後から老齢期にわたる循環調節機構に関する研究を推進し基礎・臨床医学の発展に寄与するものと考える。非拘束自由行動下マウス心電図連続記録用の平板型心電図複合センサーシステムについて、膨大な15ch

心電図情報量を圧縮するため開発した心電図信号加算回路を含む心電図ピエゾ複合センサーの特許出願(特願2015-058838)を行った。この加算回路は複数の電極に分割された心電図を一つにまとめノイズを低減するもので、どのチャネルを選択し、どのチャネルの信号を反転するかのアルゴリズムの最適化が必要であるが一定程度の効果が確認され本年度後半に使用した。本複合センサーはストレスを与えた時、および睡眠時に高い心電図検出率を持ち、本研究の目的であるマウスのダイナミックな循環調節の解明に関して限定的であるが活動時および睡眠時における循環調節態様を示す心拍数変動データの取得に貢献した。特筆すべき点として、本研究において以下のような予想外の興味深い発見があった。1従来の電気刺激などによる身体的ストレス反応実験と異なり、マウスケージの棒による打撃への反応から、音や振動に対しても神経性循環調節を伴う精神的ストレス反応を示すことが分かった。2ストレス付与の方法を模索している過程で、我々は偶然にマウスケージのある実験室に入室しマウスを覗き込むだけでも心拍数が上昇することを見出した。3さらに、2の反応は睡眠中かつ心拍数低下時(<400b/m)に行うとダイナミックな心拍数変化が得られ多くの場合心房細動を引き起こすことを発見した。これが事実であれば、ヒトの凝視による精神的ストレスがマウス心房細動を誘発する世界初の発見であり、生理学的、病態生理学的に意義がある。この現象は視覚による皮質でのストレス認知が辺縁系での情動喚起を引き起こし視床下部を介した自律神経制御に関与する結果であることが考えられ、心房細動モデルマウスとして未解明の心房細動発生メカニズムの研究にも貢献が予想される。(論文投稿準備中)生理学、睡眠科学、電子工学研究期間の途中、マウスの心電図が記録できない原因がしばらくの間不明であったために研究が停止した期間もあったが、最終的に15chデータの1chデータへの圧縮方法を発見し長時間記録を可能にするなど、次年度の睡眠時および活動時のダイナミックな心拍数変化の記録を行う平板型心電図複合センサーシステムを原理的にほぼ完成させた。実際のデータ圧縮システム試作は26年度初期に行うこととなった。(特許取得も検討)心拍数記録実験においては、マウス足裏の発汗が生理的に変化するため、心電図の長時間安定記録は困難が予想される。しかしながら、逆にこの障壁が新たなマウスのストレス発汗応答の実験系の創出に繋がったことは予想外の成果である。平成24年度の研究計画は非拘束自由行動下でマウス心拍数連続記録を可能にする平板型心電図複合センサーおよび多入力心電図信号記録システムの開発である。平板型心電図複合センサーは30個の電極(1.5×2.3cm2)を約19×10cm2のガラスエポキシ板上に配置したが、離れた位置にある電極を全て2個づつ接続したため電気的には15個の電極の構成とした。また、この平板型心電図複合センサー裏面にはピエゾセンサーを接着し、心電図信号の検出およびマウス活動量を振動として検出することができる構造とした。心電図電極には金メッキを施し、マウス糞尿による酸化・腐食を防ぎ繰り返し使用可能なセンサーの一時試作が完了した。センサーが検出する信号(心電図およびピエゾ信号)をADコンバーターに入力するために作成した16チャネル増幅器および記録用コンピューターもマウスを用いて動作を確認しており、多入力心電図信号記録システムの第一段階が完成した。
小学校理科における児童の探究能力(データの収集と解釈)の育成に関する研究

「研究目的」探究的な学習を通して,データを収集・解釈する能力の分析を行い,児童に有効なデータ収集と解釈能力の指導法を検討する。「研究方法」小学校第5学年3クラスを対象として,授業実践の事前におもりの質量の異なる振り子の1往復する時間に関する問題を課した。さらに,1クラス(男子15名,女子14名,計29名)を対象として,おもりの質量の異なる振り子の1往復する時間を調べる授業(45分間)を実践し,その理解について児童の実態調査を実施した。授業中,児童には「予想」実験中に考えたこと」「実験からわかったこと」の3つをレポートに記述させた。レポートの記述内容を,データの収集,データ処理の仕方,データ解釈の3つに分類し,分析した。また,1つの班(男子2名,女子2名)を抽出し,実験時の活動や会話をビデオやICレコーダーに記録し,プロトコル分析を行った。そして,授業実践後も実践前同様に問題を課した。「研究成果」データの取り方,処理の仕方,解釈に関して以下の3点が示唆できた。(1)児童は実験操作の理解ができていないため,データを正確に取ることができない。(2)児童は,誤差についての意識がないため,平均をとることや四捨五入するという,形式化したデータ処理の操作のみで済ませることが多い。(3)形式的にデータ処理を処理しているため,解釈したことに確信がもてない傾向がある。それゆえミスコンセプションを正規の科学的な概念に変容させるには至らない。つまり,児童のデータの取り方,処理の仕方が不十分であるためデータ解釈も不十分になる。また,児童のデータ解釈を困難にしている一つの要因として,ミスコンセプションの存在が明らかになった。そこで,データを収集・解釈する能力を育成するためには,データ解釈までの2つの前段階を丁寧に踏むことが大切である。
麻薬処方オーダリングシステムを用いた麻薬管理に関する方法論の開発

研究目的:医療用麻薬はその取扱いや保管方法において、麻薬及び向精神薬取締法により様々な制約を受ける。多くの施設では、麻薬管理関連書類の運用に関して、電子化の導入はされておらず紙媒体による管理を行っている。本研究では麻薬の購入、在庫管理、処方ならびに廃棄までの一連の認証を兼ね備えたモニタリングシステムを構築し、効率的な運用方法を確立することを目的とした。さらに本システムの臨床研究への導入についても、その適応性に関して麻薬使用量と患者遺伝情報との関係について評価を行った。研究方法:本研究では平成19年度に当施設に導入されたオーダエントリーシステムと薬剤業務支援システムに、通常の麻薬管理業務に連動する仮想システムを構築した。さらに、その製剤特性から適正な管理方法の構築が求められているフェンタニル経皮吸収製剤(FP)をモデル薬剤として本システムの試験運用を行った。臨床研究への導入については、文書同意を得た39名を対象にFPの使用量と薬物代謝酵素チトクロムP450(CYP)3A5の遺伝子型との関係について評価を行った。研究成果:本システムの導入により、院内におけるFPの製品ロットや患者の使用量などの情報についての即時の追跡が可能になった。また、返納されたFPの廃棄に関しても、診療録との照合や管理簿作成において、電子化による麻薬管理業務の効率化が実現できた。さらに在庫量設定や業務統計作成への有用性についても確認された。臨床研究への導入については、CYP3A5の*1/*3の遺伝子の保有患者では*3/*3の保有患者に比べ、FPの適応後に65%の投与量の有意な増加が認められた。このことから剤形変更後のFPの至適投与量の指標においても、遺伝情報は有用な情報となる可能性が示された。以上のことから、麻薬管理業務への電子化の導入に関して、有用性、実用性および応用性を確認できた。
神経性ペプチドおよびアミノ酸の中枢性血圧調節への関与

血圧は麻酔薬や拘束によって著しい影響を受けるので、本実験はラットを用い全て無麻酔・無拘束のもとで行った。すなわち前もって腹部大動脈内に留置した血管チュ-ブを介して血圧の絶対値を測定し、また薬物注入用のガイドカニュ-レを慢性に脳内に植え込み、水・食塩水および食餌は自由に摂取させた。1)reninおよびangiotensin(AII)の脳室内投与により、AII受容体を介して血圧は上昇する。本受容体の反応性は高血圧自然発症ラット(SHR)では、対照のWKYより亢進する。2)血圧上昇に与かるAII受容体は、扁桃体中心核、傍室核には存在せず、視索前野、視交叉上核には認められ、このAII受容体の感受性はSHRにおいて視索前野では亢進し、視交叉上核では差がない。6週令および15週令で比較することにより、この部位での亢進は高血圧の誘因より維持に与かるものと考えられる。AIIの血圧上昇作用に、GABAおよびtaurineが拮抗するが、その部位は視索前野ではなく、他脳内部位を介す間接的なものと考えられる。3)AIIの中枢性昇圧のみならず中枢性の水・食塩摂取促進にも、視索前野は重要な作用部位で、この反応性もSHRで亢進する。この部位におけるAIIの中枢作用に、脳内存在のatrial natriuretic peptide(ANP)が拮抗し、この拮抗はSHRのみでみられることから、ANPの感受性もSHRでで亢進する。さらにAIIの中枢性昇圧の神経経路としては、後部視床下部も重要で、この部位でのANPの拮抗作用もSHRで強い。したがって視索前野および後部視床下部におけるAIIあるいはANPの反応性の変化が高血圧の発症・維持に中枢において重要な役割を果たしている可能性が示された。4)さらに現在脳内angiotensin messengerーRNAを測定しているが、SHRではWKYに比し視索前野、視床下部腹内側核で高く、線状体、視床下部外側核、乳頭体などの他の脳内部位では差が認められない。ラットを用い、慢性的に植え込んだカテーテルより無麻酔・無拘束で血圧の絶対値を測定できるようにし、1.アンジオテンシンII(AII)の存在が認められている脳内各部位に投与すると、AIIの同受容体を介する中枢性血圧上昇作用は、視索前野で最も強く、次いで視交叉上核で、扁桃体中心核、傍室核は作用部位ではない。2.このAII受容体の中枢性昇圧の反応性は、高血圧自然発症ラット(SHR)では、視索前野で増強され、視交叉上核でも増強が認められたが有意ではなかった。3.この視索前野における増強は、SHRの血圧の上昇している8週齢では認められず、15週齢では出現した。4.タウリンまたはギャバを脳室内に投与すると用量に依存した中枢性の血圧下降が出現したが、視索前野への投与では血圧変化は認められなかった。5.これら神経性アミノ酸を中枢性前投与し血圧変化が回復した後にAIIを視索前野に投与すると、AIIの昇圧はアミノ酸の視索前野前投与では影響をうけないが、脳室内前投与で拮抗された。6.このような拮抗は末梢投与では認められなかった。

7.全身投与によりギャバは血液脳関門を通過しないが、タウリンは長期投与で脳内に増加する。SHRで6から15週齢まで3%タウリン水を自由に摂取させると、SHRの視索前野におけるAIIの反応性増大の異常はほぼ正常に近く回復された。8.まとめ:AIIの中枢性昇圧作用の作用点としては視索前野がもっとも重要で、同部位の反応性はSHRでは異常に亢進する。この亢進は高血圧発症の直接の誘因ではないが、高血圧の維持に与かるものと考えられる。タウリンおよびギャバは中枢性降圧作用を有して、AIIの昇圧作用に拮抗し、この拮抗部位は視索前野ではない。またタウリン経口長期投与は、視索前野のAII受容体反応の異常亢進を抑制する。14週齢のラットで無麻酔・無拘束の状態において慢性に植え込んだカテ-テルを介して血圧の絶対値を測定し、1.アンジオテンシンII(ATII)100ngの脳室内、10ngの視索前野投与で、著明な血圧上昇が出現し、本作用は、WistarーKyotoラット(WKY)に比べ高血圧自然発症ラット(SHR)で強い。この血圧上昇は、心房性利尿ホルモン(αーhANP)の200または500ngの視索前野への前投与によって、SHRでは著明に抑制され、WKYでは抑制されなかった。2.またATII100ngの脳室内投与による昇圧は、αーhANPの200または500ngの後部視床下部への前投与によっても著明に抑制され、本抑制はSHRでとくに強かった。3.さらにSHRにおいて、ATII10ngの視索前野投与による血圧上昇は、αーhANP500ngの後部視床下部への前投与によって著明に抑制された。4.ATII10ngの後部視床下部投与、あるいはαーhAHP500ngの視索前野または後部視床下部への投与では血圧には全く変化は認められなかった。5.結論:ATIIの中枢性昇圧について、視索前野は重要な作用部位で、本部位におけるATIIの反応性はSHRで著しく亢進する。この視索前野において、ANPはATIIの昇圧作用に対して拮抗し、この拮抗もSHRで増強されている。さらにATIIの中枢性昇圧の神経経路として後部視床下部も重要な部位で、本部位においてもANPはATIIの昇圧に拮抗し、この拮抗もSHRで強い。したがって、これら脳内部位におけるATIIおよびANPの反応性の異常、ことにATIIの相応性増強が、高血圧の発症・維持に与かるものと考えられる。無麻酔・無拘束のWistarーKyotoラット(WKY)ならびに高血圧自然発症ラット(SHR)を用い、1)14週齢において、angiotesin II(AII)の視索前野投与により、著明な水・高張食塩水(2.7%NaCl)摂取が誘発され、この作用はSHRで著明であった。同量のAIIの静脈内投与で水・食塩摂取に変化は認められないことから、これはAIIの中枢作用にもとづくものである。このAIIの中枢作用はatrial natriuretic peptide(αーhAMP)の視索前野前投与により、WKYでは影響されず、SHRでは著明に抑制された。SHRでの視索前野へのreninの投与でも水・食塩摂取が促進され、本促進もαーhANPの視索前野前投与により水摂取が著明に抑制された。2)48時間絶飲食により水・高張食塩水摂取が促進され、本促進は特にSHRで著明であった。本促進はαーhANPの視索前野投与により、WKYでは抑制されなかったが、SHRでは抑制された。3)このようなαーhAMPの抑制作用は、扁桃体中心核への投与では認められなかった。
大腸癌培養細胞の腺管構造形成過程におけるメタロプロテアーゼの役割

大腸癌に認められる形態異常の発現メカニズムを解明するため、大腸腺癌培養細胞株を用いて分岐構造やbuddingをin vitroで再現する実験系の作成を試み、さらに、確立した実験系を用いて形態像の変化の機序を明らかにするために、形態に変化に伴う細胞増殖能の変化と遺伝子発現の変化を検索した。胃・大腸腺癌細胞株8株をコラーゲンゲル内で培養した結果、その内の1株が線維芽細胞培養上清(FCM)の存在下で中心部の球形部分から細胞が突起上に伸び出し、分岐構造に形態が変化した。中心部の球形部分は1から2-3層の細胞の殻から成り、内部は空洞構造を示したが、内腔側への粘液産生は明らかには認められなかった。また、突起部分は細胞が充実性に存在し、内部には腺管形成は認められなかった。分岐構造に関してはvivoを模倣している一方で、腺管形成の点では細胞株の分化度は低く、vivoとの相違点となった。形態変化に伴う細胞数の変化を計測した結果、分岐構造と細胞増殖能は相関が認められず、形態の変化を増殖能の変化では説明できなかった。一方、上皮の形態形成には間質のremodellingが強く影響することから、コラーゲンの分解に関与する間質型コラゲナーゼ(MMP-1)及びそのインヒビターであるTIMP-1,2の関与を想定し、形態変化時における発現の変化をノザン解析で検討した。これまでの、FCMによるMMP-1,TIMPの発現変化は認められず、形態像の変化を間質のremodellingの変化によって説明し得る結果は得られていない。今後は、分岐構造部分に腺管形成が認められ、vivoにより近い形態像を持つ実験系を作成することが課題となった。また、形態変化のメカニズムを解明するため、線維芽細胞によって発現が誘導される遺伝子のスクリーニングも行っていく予定である。
軌道自由度付フラストレーション系における三量体の物理

A2V13022における三量体形成と不純物効果A2V13022(A=Ba,Sr)は、Vが規則的に欠損した擬V三角格子が3層、fcc格子的に積層した構造をとり、Baでは290K、Srでは380Kで三量体相転移を起こす。このV3+(3d^2)サイトに非磁性不純物Sc、磁性不純物Cr(3d^3)を導入した試料を作製した結果、不純物ドーピングによって、三量体相転移に伴う電気抵抗の増大、帯磁率の減少が消失することを昨年度に見出した。さらに、本年度は結晶構造の変化について調べ、歪測定における相転移での異常が不純物ドーピングによって消失すること、また電子線回折実験の結果から、三量体相転移によって起こるCmce=>Pbcaの構造相転移が不純物ドーピングによって消失することを見いだした。これらの結果から、不純物ドーピングによってスピンシングレット三量体が崩壊し、スピンが現れるという振舞いが明確になった。Ba2Ti13022単結晶の物性Ba2Ti13022は、上記のA2V13022と同じ結晶構造をとるが、V3+(3d^2)ではなくTi3+(3d'1)によって構成されている。この物質の単結晶をFZ法によって作製し、210Kで電気抵抗の増大と帯磁率の減少が起こることを昨年度見出した。今年度はこの210Kの相転移についてより詳しく実験を行い、電子線回折実験の結果からCmce=>C2/mの構造相転移が起こっていること、またこれはある3層と隣の3層が非等価になる相転移に対応していることを見いだした。さらに歪測定とx線粉末回折実験の結果から、この相転移でa軸が縮み、b軸が延びることを見いだした。また光学測定の結果、0.1eV以下でギャップが開く様子を明らかにした。以上のことから、この物質の210Kでの相転移は電荷密度波に近いことが明らかになった。A2V13O22における三量体形成と不純物効果A2V13O22(A=Ba,Sr)は、Vが規則的に欠損した擬V三角格子が3層、fcc格子的に積層した構造をとり、Baでは290K、Srでは380Kで三量体相転移を起こすことが、我々によって見出されている。このV3+(3d^2)サイトに非磁性不純物Sc、磁性不純物Cr(3d^3)を導入した試料を作製した。その結果、不純物ドーピングによって、三量体相転移に伴う電気抵抗の増大、帯磁率の滅少が消失することを見出した。さらに、帯磁率のキュリーワイスの振る舞いの解析から、三量体形成により全体としてスピンシングレットになっていたVイオンが、不純物ドーピングに伴って全てS=1のスピンに変化していると解釈できることを見出した。Ba2Ti13O22単結晶の作製と物性Ba2Ti13O22は、上記のA2V13O22と同じ結晶構造をとるが、V3+(3d^2)ではなくTi3+(3d^1)によって構成されている。この物質の単結晶をFZによって作製した。この単結晶の電気抵抗と帯磁率を測定した結果、この物質は基本的には金属であり、210Kで電気抵抗の増大と帯磁率の減少が起こることを見出した。これは電荷密度波相転移の振る舞いと類似している。また、単結晶および多結晶の結果の比較から、この物質の物性は試料依存性が強いことを見出した。おそらく酸素のoffstoi chi ometryが重要な役割を果たしていると考えられる。
結核菌全ゲノム情報の活用は新たな分子疫学像を提供しうるのか

結核感染のリスクを軽減するためには,患者間の伝搬経路を可能な限り高い精度で推定し,感染拡大の防止を図らなければならない.本研究課題では,結核菌の全ゲノム情報を用いた高精度な菌株異同判定による伝搬経路推定の有用性を検証した.現行の遺伝子型別解析では単一クローンによる感染拡大と考えられた30株に着目し,全ゲノム解析を行った.その結果,これら30株の伝搬経路追跡に有益な,35箇所の一塩基変異が特定できた.本結果は,全ゲノム解析により,従来の結核分子疫学調査結果を補完することで,より詳細な感染伝搬経路の解明か可能であることを示している.平成25年度は、下記の3つの項目に関して、次世代シーケンサーを用いた全ゲノム情報の取得、並びに、全ゲノムマッピング解析による点置換変異の検出を行い、結核菌の微小進化について新たな知見を得た。[I]集団感染事例株:集団感染発生7年後に集団感染が再発生した事例に関して解析を行った。感染源である初発患者株との比較結果は、感染後すぐの発病者では変異なし、予防投薬中発病者で1塩基置換ならびに薬剤標的部位を含む領域の欠損、感染後7年後に発病したもので3塩基置換が検出された。感染後の時間経過とともに変異蓄積の数が増加することを示している。また、予防投薬がもたらす遺伝子遠位誘発という潜在的危険性を示しえた結果でもある。今後の感染経路追跡に有用な知見である。[II]地域内分子疫学調査で見出された感染拡大株:縦列反復数多型解析で同一遺伝子型と判断された30株から6株を選定して全ゲノム解析を行ったところ、これらの菌株をサブクローンレベルに細分類できる一塩基置換変異を合計30カ所特定した。これらの変異をマーカーとすることで、30株は5つの亜分類群(ゲノム型別)に細分類できることを示した。これまで、同一クローンによる感染拡大と捉えられていた事象ではあるが、本解析により、実際には複数のサブクローンによる異なる感染伝播経路が存在していることが解明された。今後、結核感染経路の推定をより高い精度で行うための基礎的知見として活用できるであろう。[III]初発時株と数年後の再発時分離株との比較:上記2例がヒトからヒトへの感染伝播を介しての変異出現を捉えたのに対して、同一人物の体内で生じる微小変化を捉えるために再発患者を対象に、初発時の株との比較を行った。再発までの期間が2から7年の患者4名について解析を行ったが、いずれの患者も初発株と再発株の間での変異は検出されなかった。結核感染のリスクを軽減するためには,患者間の伝搬経路を可能な限り高い精度で推定し,感染拡大の防止を図らなければならない.本研究課題では,結核菌の全ゲノム情報を用いた高精度な菌株異同判定による伝搬経路推定の有用性を検証した.現行の遺伝子型別解析では単一クローンによる感染拡大と考えられた30株に着目し,全ゲノム解析を行った.その結果,これら30株の伝搬経路追跡に有益な,35箇所の一塩基変異が特定できた.本結果は,全ゲノム解析により,従来の結核分子疫学調査結果を補完することで,より詳細な感染伝搬経路の解明か可能であることを示している.結核菌集団構造解析の実施においては、その科学的根幹部分をなす遺伝系統別分類の頑健性確保が大前提となる。H24年度は、まずこの点を科学的に検証した。具体的には、比較ゲノム解析から複数の系統群への分岐を齟齬なく反映するSNPセットを特定し、既存の遺伝系統分類との比較を行った。臨床分離株1340株を用いた検証により、従来の遺伝系統分類の不正確さを明らかにするとともに、新たな分類法としてのSNPセットを確立しえた。さらに、解析対象株を中国・韓国・ペルー分離株に適応することで、各国に特徴的な遺伝系統群の分布状況を解明した。現在は、より微小な進化単位での集団構造解析へと展開するため、次世代シーケンサーを用いた全ゲノム情報を活用するための基礎データとして、感染伝播が明確な事例や再発事例での遺伝子変異の出現をゲノムワイドで捉えるべく実験を推進中である。最終年度は,従来の遺伝子型別解析法に対する全ゲノム解析による菌株異同判定の優位性を検証するために,拡張型クラスター形成株について全ゲノム解析を行い,その感染伝搬様式の解明を目指した.具体的には,VNTR解析により同一遺伝子型を示した30株から8株を選定し,全ゲノム解析を行い,各菌株に固有の変異箇所を合計35か所検出した.次に,これら8株で特定された個々の株固有のSNVを残る22株について調べた.その結果,感染拡大株30株は,11株からなるグループ(G1),10株からなるグループ(G2),そして,その他散発的なものに大別された.G1の11株について,それぞれの疫学的関連性を精査したところ,これら11株は特定の職種・職場に勤める者とその家族で構成されることが分かり,これまで感染経路が不明としていた感染拡大株の感染様式の一つが解明された.

さらに,G2については,神戸市以外の近隣地域で高頻度に分離される株が同じグループに分類されることが分かった.本成果は,従来の結核分子疫学調査結果を基礎として,ゲノム疫学を組み合わせることで,より詳細な感染伝搬経路の解明を目指すことが出来ることを示し得たもので得ある.研究期間全体を通じて,近年急速に発展してきた次世代シーケンサー(Next Generation Sequencer, NGS)を結核菌の異同判定,系統分類,ならびに感染実態調査に活用し,結核の新たな疫学像の解明を目指した.その成果として,信頼性高く,遺伝系統分類のできる遺伝子マーカーを特定した.また,結核菌の生活環(感染伝搬,休眠)での微小進化の実態を明らかにし,全ゲノム情報を用いた場合の菌株異同判定の基準を設定しえた.また,現在の分子疫学では感染伝搬の実態把握場困難である,拡張型クラスター形成株の詳細な感染伝搬様式を解明しえた.分子疫学明確な疫学的背景を持った菌株セットを解析対象として選定し、全ゲノム塩基配列データの比較解析を実行した。解析結果から、結核菌の感染伝播、発病、不顕性感染の各ステージにおける微小進化の出現について新たな知見を得ることができ、25年度の目標は十分に達成されたものと考えている。独自の系統分類マーカーの特定、ならびに、臨床分離株の地域間比較を行った研究成果は既に一流の国際試に掲載されており、初年度の目標は十分に達成されたものと考えている。引き続き、結核菌の様々な生活環における微小進化出現様式の解明に取り組む。特に、前年度の解析により特異な遺伝子変異の誘発が示唆された、長期間にわたる薬剤への曝露事例(イソニアジドによる予防投薬)での解析を中心に取り組む。また、地域内感染拡大株に対する全ゲノムマッピング解析データを蓄積し、従来の遺伝子型別解析法に基づく分子疫学解析では追跡不可能であった、サブクローンレベルでの感染伝播様式の解明を目指したい。最終年度であり、本研究において得られた全ゲノムワイドでの遺伝子変異に関するデータを総合的に考察し、結核菌が遺伝的多様性を創生するための背景について、新たな解釈を提示したい。・全ゲノム塩基配列データの比較を行うことで、結核菌の生活環での微小進化を解明する。すなわち、伝搬・感染・発病or不顕性感染からの再増殖への推移における結核菌ゲノム変異の頻度と傾向を解析する。解析対象には、地域内分子疫学調査で特定されたルーツが同一と推定される結核菌株での集団発症や再発病などの事例を選び出す。このような事例検証での微小進化データの蓄積は、全ゲノムデータを用いた分子疫学新時代(ゲノム疫学)での菌株の同一性に関する基盤データとなる。平成24年度にも、次世代シーケンサーによる全ゲノム解析を実施したが、解析のためのケミストリーの進展に伴う低コスト化が急激に進んだため、当初予定額を下回る費用で実験を遂行できた。このため、平成25年度への繰越金が発生したが、本年度の解析により予算執行を行う予定である。・結核菌分子疫学をゲノム疫学に昇華させるための科学的検証を行う。過去10年継続してきた地域内(神戸市)分子疫学調査から、遺伝子型別解析でルーツが同一と推定される結核菌株が数年間にわたり感染拡大を繰り返しているケースを複数例経験している。これらの事象について、全ゲノム解析を行うことで、従来の分子疫学解析では追跡不可能であった特定クローン株の伝播様式の解明を試みる。次世代の分子疫学、すなわちゲノム疫学の確立に向けた先行実験として位置付けられるものである。年度末に参加予定であった、ゲノム微生物学会への参加を見送ったため、繰越金が発生した。26年度の学会出張費として、活用する予定。複数菌株での比較ゲノム解析を進めるにあたり、必要となる消耗品、培地、分子疫学試薬などの物品費を中心に研究費を使用する(24年度繰越金634,218円+600,000円)。
ヒトドレブリンEの神経再生機能解析およびヒトドレブリンAのCDNAクローニング

ドレブリンは神経細胞の移動や神経突起伸展との関連が示唆されるアクチン結合蛋白質である。ドレブリンE tipeとA typeの違いは挿入配列ins2の有無により、現在までは分化した神経細胞に発現するA typeにおける機能解析を進めてきたが、今回ドレブリンEの神経突起伸展作用について主にアクチンとの相互作用を中心に解析した。一方、現在までラットおよびニワトリにおいてA typeのcDNAがクローニングされているが、A typeを特異的に認識する抗体は得られていない。そこで、ヒトドレブリンA cDNAのクローニングを行うとともに、抗ドレブリンA抗体の作製を目的として実験を行った。我々はすでにhuman drebrin E cDNAをβアクチンプロモーターを有するpMIW-HEP、およびmetallotinein-Iプロモーターを有するpMTID13Sに組み込み、それぞれ非神経細胞であるL cellに導入しtransfectantを得ている。そこでL cellに対する、ドレブリンEのもつ神経突起形成作用、アクチンとの相互作用を検討した。さらに、antisense human drebrin E発現ベクターを作製し、神経芽細胞腫B104cellにtransfectし、antisense drebrin transfectantを得た。さらに、上記と同様にその細胞形態変化および蛋白発現量の変化を解析する予定である。一方、human drebrin Aをクローニングする目的でヒト海馬cDNA-λte10ライブラリーをPCRにてスクリーニングしたところ、human drebrin Aのins2を含むと思われる約700bpのbandを検出した。現在sequence中であるが、ドレブリンAは神経特異性が高く今後さらに神経細胞のマーカーと成り得る抗体の作製を計画している。
p53の阻害を介して正常細胞へのダメージを軽減する低酸素細胞放射線増感剤の開発

本研究目的は,従来のニトロイミダゾール型低酸素細胞放射線増感剤にp53を"一過的かつ可逆的"に阻害する機能を付加することにより低酸素腫瘍細胞の放射線感受性を高めつつ,腫瘍組織周辺に存在する正常細胞の細胞死(副作用)を低減するバイファンクショナル低酸素細胞放射線増感剤の開発である.本年度は,TX-2004,TX-2071及びTX-2072を用いて,野生型p53を組み込んだH1299/wtp53細胞と変異型p53を組み込んだH1299/mp53細胞に対する温熱死の防護効果を調べた.コントロール化合物としてpifithrin-αおよびpifithrin-βを用いた.その結果,H1299/wtp53細胞において,TX-2004はpifithrin-αおよびpifithrin-βと同等のp53依存的細胞死の防護が見られた.しかしながら,H1299/mp53細胞においても細胞死が見られたことから,p53特異的な作用機構であるとは決定できなかった.次に,更なる構造活性相関としてTX-2004のメチレンリンカーの長さを変化させたTX-2088(メチレン鎖=3)及びTX-2112(メチレン鎖=4)を合成し,同様にp53依存的細胞死の防護を調べた.その結果,H1299/wtp53細胞の温熱処理による細胞死に対して,TX-2088はTX-2004よりも高い防護効果を示した.よって,標的部位は不明であるが,イミノチアゾール骨格と2-ニトロイミダゾール骨格の間の距離にはある程度の自由度があり,メチレン鎖が3つのTX-2088の方がより空間的相互作用が有利に働くと考えられる.これらの結果は本研究にて初めて得られたものであり,本研究目的である「p53の阻害を介して正常細胞へのダメージを軽減する低酸素細胞放射線増感剤の開発」に対して極めて重要な知見であることが示唆された.本研究目的は,従来のニトロイミダゾール型低酸素細胞放射線増感剤にp53を"一過的かつ可逆的"に阻害する機能を付加することにより低酸素腫瘍細胞の放射線感受性を高めつつ,腫瘍組織周辺に存在する正常細胞の細胞死(副作用)を低減するバイファンクショナル低酸素細胞放射線増感剤の開発である.この目的達成のために,本年度は,分子軌道計算及びモデル構築実験の結果からp53阻害剤Pifithrin-αのメチルフェニル基を2-ニトロイミダゾール基に置換した分子TX-2004を,また,TX-2004のニトロ基位置異性体であるTX-2071及びTX-2072を分子設計・合成した.そこで,ヒト非小細胞肺癌由来H1299/wtp53 (野生型p53株)及びH1299/mp53Trp248(変異型p53株)を用いて,Pifithrin-α(10 μM)及びTX-2004 (10 μM)の存在又は非存在下で43°C,60 minの温熱処理を行い,増殖抑制とアポトーシス率を調べた.変異型p53株ではPifithrin-α及びTX-2004の有無に関わらず同程度の増殖抑制効果が見られたが,野生型p53株ではPifithrin-α及びTX-2004の存在下では,生存率がそれぞれ13%及び8%上昇した.また,apoptosis率はそれぞれ16%及び14%ずつ減少した.以上の結果より,Pifithrin-α及びTX-2004は温熱処理によるp53依存アポトーシスに対して防護効果を示すことが証明された.今後は,TX-2004及びそのニトロ基位置異性体であるTX-2071,TX-2072のin vitro放射線防護効果と新たな分子設計について検討していく予定である.本研究目的は,従来のニトロイミダゾール型低酸素細胞放射線増感剤にp53を"一過的かつ可逆的"に阻害する機能を付加することにより低酸素腫瘍細胞の放射線感受性を高めつつ,腫瘍組織周辺に存在する正常細胞の細胞死(副作用)を低減するバイファンクショナル低酸素細胞放射線増感剤の開発である.本年度はp53阻害活性のファルマコフォア同定のため,pifithrin-α(PFT-α)又はpifithrin-β(PFT-β)アナログの分子設計・合成を行った.また,昨年度に分子設計・合成したp53阻害活性を有する低酸素細胞放射線増感剤TX-2004のホモログ合成を行った.分子軌道計算を用いた分子設計より,PFT-αのカルボニル基をメチレンおよびアルコールへ還元した分子を候補化合物とした.アルコール体の合成に関しては,PFT-αをBH_3・Me_2Sにより還元して収率57%で目的物TX-2120を得た.一方,メチレン体の合成に関しては,種々の条件で還元を行ったものの目的物を得ることはできなかった.この理由として,アルコール中間体の分子内水素結合による3級炭素の還元性の低下が考えられる.TX-2004ホモログの合成に関しては,メチレン側鎖の長さが3及び4のTX-2088及びTX-2112をそれぞれ21%,36%で得た.これら分子設計・合成した化合物のp53阻害活性に関しては,p53 statusの異なる2種類の細胞(p53野生型:SAS/neo, p53変異型:SAS/Trp248)を用いた温熱実験系により評価した.