hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重層上皮のみに発現する新規の細胞・細胞間接着タンパク質ANKRD35の解析

一方、この時、E-カドヘリン抗体による染色が陰性となった細胞では、しばしばANKRD35が細胞間接着部に局在するのが観察された。これらの結果は、E-カドヘリン以外のカドヘリンファミリータンパク質を含めたカドヘリン-カテニン複合体がANKRD35の細胞接着部への局在に重要であることを示唆しているものと考えている。以上から、ANKRD35の細胞内局在のメカニズムの解明については大きな進展が認められた。今後の研究展開としては、十分に明らかにすることができなかったANKRD35の機能についての解析のため、遺伝子改変マウスの作製を計画している。今後、ANKRD35の機能を明らかにしていく上で、欠くことのできない基礎的な知見と実験材料が平成26年度の研究成果により得られたため。1)JNK阻害剤存在下でANKRD35安定発現HaCaT細胞を観察し、分化や重層化の阻害が起きていないのかを調べる。2)マウス発生時のANKRD35タンパク質の発現と局在のパターンを調べるため、マウスANKRD35に対する抗体を作製する。3)ANKRD35の相互作用タンパク質の同定4)ANKRD35欠失マウス作製のための準備(Crisprコンストラクトの作製)皮膚科学1)ANKRD35は細胞・細胞間接着部位だけでなく、細胞膜にも局在している。このことからANKRD35のN末端部分は、アドヘレンスジャンクションとの相互作用ドメインだけでなく、細胞膜との相互作用にも重要な配列を含んでいるものと考えられる。アドヘレンスジャンクションおよび細胞膜への局在メカニズムを明らかにするため、安定発現株を用いた免疫沈降実験および、N末端部分を含むGST融合タンパク質によるpulldown実験により相互作用分子の探索/同定をおこなう。2)ANKRD35の表皮における機能を明らかにするため、重層化した初代培養ケラチノサイトのANKRD35をノックダウンし、その表現型を解析する。3)HaCaT細胞だけでなくDLD-1細胞でもANKRD35の安定発現株を作製する。これらの細胞株を用いて、ANKRD35が細胞の形態や接着性、移動能に、どのような影響を与えるのかを解析し、ANKRD35の表皮細胞接着における機能の解明につなげる。相互作用タンパク質を同定できなかったので、同定後のタンパク質間相互作用の検証のために予定していたノックダウン実験などをおこなわかったため。血清、プラスチック培養器、トランスフェクション用試薬などの消耗品について、予想よりも消費量がやや少なかったため。相互作用タンパク質の同定のための免疫沈降実験、pull-down実験、質量分析用試料作製、および同定後の相互作用検証のためのノックダウン実験などに使用することを計画している。主に消耗品の購入に使用する。
モンスーン循境に及ぼす大陸形状の効果について

大陸-海洋-陸面系からなる気候システムの特性を調べるために、前年度に行なった、海面水温を既知として与えた実験と同じ条件で、海面水温の変動を許す大気-海洋結合モデルを用いて調べてみた。海陸分布は、東西波数1、南北対称の太平洋型の海陸分布を仮定し、陸面が非常に乾燥して、水蒸気の補給が少ない場合と、陸面が沼地で無限に水蒸気の補給が続く場合の2つのケースを想定し実験を行なった。結論として得られたのは、海面水温を東西一様と仮定した時の前年度の実験結果と結合モデルの結果とは定性的には異らない、ということであった。即ち、陸面が乾いている場合は海洋の東側に降水域が分布しモンスーンの西風は海洋の東側に存在するが、結合モデルでも同様の現象が起き、結果として、海面水温は一様に近くなり、一様の海面水温を仮定したことは妥当であったことが分かった。陸面を湿らせた場合は、東西一様の海面水温を仮定しても降水域は海洋の西側に分布し、西風モンスーンは大陸の東側に存在していた。結合モデルを用いると、大陸-海洋のコントラストに起因して、海洋の東半分に強い東風が吹くために湧昇流が生じ、海水温分布に強い東西の非対称を生じた。この海面水温分布は、先に述べた降水域の海洋の西半分への局在を更に加速することとなる。即ち、結合モデルの方が海面水温を一様と仮定した場合よりこのシステムの特徴的な状態をより良く再現することが分かった。年々変動についても、陸面が乾いている時には、年々変動が存在したが、陸面が湿っている時には存在しなかった。つまり、海陸分布に伴う強制力が強ければ、年々変動は生じにくい、ということが示された。実行計画中の波数1の大西洋型の数値実験を行った。モンス-ンの場合には、海陸の温度差が重要な要因であり、そのためには、海面水温の分布が決定的に重要になる。それ故に、当初の海面水温を固定した場合の他に、海洋モデルと結合した、いわゆる、大気ー海洋結合モデルを用いて、数値実験を行った。陸面が乾燥していて砂漠の場合(β=0)と、完全に湿っていて沼地の場合(β=1)の二つの場合について、大気海洋結合モデルを、砂漠の場合には15年、沼地の場合には7年走らせた。その結果分かったことは、海面水温の分布に大きな差が生じ、従って、モンス-ン循環も大きく変化したことである。海面水温は、陸面が乾燥している時は、初期に与えられた東面に一様な場からの変化は少なく、むしろ、海洋中央部が冷たくなり、両側が暖かいという変化を示したモンス-ンに限ってみると、大陸上に顕著なモンス-ンの流れが形成され、更に、海の東側で弱いモンス-ンが見られた。それに伴い、海洋の東側の東風は弱く、湧昇も弱いという結果となった。一方、陸面が湿っている場合には、陸面からの蒸発による積雲活動により、より強い東風が赤道域に吹き、海洋の東側に冷たい海水温域が形成された。暖水域は、海洋の西側に限られていた。これは、陸面の蒸発により地温が下がり、それによって冷やされた冷たい空気が海洋上に吹いて来て、海面水温を冷やすためである。同時に、モンス-ンを強くなり、海洋西部の積雲活動と大陸上の積雲活動がつながることにより、モンス-ンの西風が海洋西部に強く吹き込む結果となった。このように、陸面状態の差異によって、大気海洋系が二種類の状態をとり得るということが分かったことが本年度の成果である。

本年度は、様々な大陸と海洋のコントラストを持つ条件で数値実験を行なった。実験は,大陸の西側に南北に海陸コントラストが存在する場合,大陸の東側に南北に海陸コントラストがある場合,及び,南北の海陸コントラストがなく,東西の海陸のコントラストのみが存在する場合の3つの場合について行なった。このモデルでは,基本的に東西の海陸コントラストで,太陸の東側,海洋の西側に降水が集中し,モンス-ンの西風は,大陸の東側に吹く(正確には,アルベドとwetnessをそのようになるように選んであるということである)。南北のコントラストを導入すると、それに伴いモンス-ンの雨が引き起こされるが、大陸の西と東とでは異なった反応をするようになることが分かった。大陸の西側に南北の非対称がある場合(アフリカ型)、その非対称により、モンス-ンが大陸の西側に形成される。一方,大陸の東岸は,それとは関係なく,東西の非対称により降水が存在する。結果として,両者のモンス-ンの西風は連ながってしまう。一方,大陸の東側に南北の非対象を入れると,本来ある東西の非対称に南北の非対称が加わり,強くはなるが,水平スケ-ルとしては,アフリカ型ほど長くはない。この実験は,北半球の夏の日射の条件で,海面水温は南北対象という条件で行なったので,南北の海陸の非対称による時は、北半球に降水分布は移り,南半球には降水が失いのが常であるが,大陸の東側にある場分は、東西のコントラストにより,南北両半球にわたって降水がみられた。結論的には,4000km程度の南北の海陸分布の影響は,割合と局所的であり,東西のプラネタリ-スケ-ルの海陸分布が風系を決めていることが分かった。
代謝捕捉の概念に基づくHIF-1活性化低酸素腫瘍の高感度イメージング法の開発

腫瘍の悪性化、治療抵抗性に関与する低酸素誘導因子(HIF-1)の酸素依存的分解に関与するアミノ酸配列に、膜透過配列と1型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを結合させた融合タンパク質(POTK)を構築し、それによってリン酸化されて細胞内に蓄積する基質プローブ([^<123>I]FIAU)を利用することで、代謝捕捉の概念に基づく腫瘍内HIF-1存在低酸素腫瘍の高感度イメージングの可能性を見出した。本応募課題では、腫瘍の悪性化、治療抵抗性に関与する低酸素誘導因子(HIF-1)の存在する腫瘍を高感度にイメージングする手法の開発を目的としている。これを達成するため、HIF-1の酸素依存的分解に関与するアミノ酸配列(ODD)をプローブの母体に選択し、膜透過配列(PTD)と1型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-1TK)を結合させた融合タンパク質(PTD-ODD-HSV-1TK : POTK)を構築し、それによってリン酸化されて細胞内に蓄積する基質プローブを利用することで、代謝捕捉の概念に基づくHIF-1活性化低酸素腫瘍の高感度イメージング法の開発を計画した。まず、融合させるHSV-1TKについて、全長を用いた場合と一部を欠損させたものを用いた場合の活性を比較したところ、欠損体を融合させた場合はPTD-ODDを融合させていない野生型のHSV-1TKと比べてTK活性は1/5に低下したが、全長を用いた場合は同等のTK活性が保たれていた。そこで、全長のHSV-1TKを融合させたPOTKを作製し、蛍光標識を行って細胞に処置して顕微鏡観察を行ったところ、細胞内への蛍光の分布が認められた。また、125I標識したPOTKを低酸素環境で細胞に取り込ませた後、通常酸素環境と低酸素環境で培養して上清に放出された放射能を比較したところ、通常酸素環境の方が放出される放射能が多く、それらは低分子化合物であったことから、通常酸素環境でのPOTKの分解が示唆された。最後に、細胞にPOTKを添加後、基質プローブである125I-FIAUを処置して細胞内に蓄積した放射能を測定したところ、低酸素環境で通常酸素環境と比較して有意に高い放射能の集積増加を認めた。以上、本年度の研究により、低酸素環境下で選択的に存在して基質プローブを代謝捕捉する融合タンパク質POTKの構築に成功した。次年度はこれをインビボへ展開し、HIF-1活性化低酸素腫瘍の高感度イメージングを達成する。これを達成するため、HIF-1の酸素依存的分解に関与するアミノ酸配列(ODD)をプローブの母体に選択し、膜透過配列(PTD)と1型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-1 TK)を結合させた融合タンパク質(PTD-ODD-HSV-1 TK:POTK)を構築し、それによってリン酸化されて細胞内に蓄積する基質プローブを利用することで、代謝捕捉の概念に基づくHIF-1活性化低酸素腫瘍の高感度イメージング法の開発を計画した。昨年度の成果として、低酸素環境下で選択的に存在して基質プローブを代謝捕捉する融合タンパク質POTKの構築に成功した。そこで今年度はインビボでの検討を行った。まず、蛍光色素で標識したPOTKを担がんマウスに投与し、その動態を光イメージング装置で経時的に撮像したところ、腫瘍移植反対側の筋肉に比べて腫瘍の蛍光強度は2倍以上高い値を示し、POTKの腫瘍集積性が確認できた。次にPOTKを担がんマウスに投与し、3時間後にそれによって代謝捕捉される[^<125>I]FIAUを投与したところ、腫瘍に集積した放射能は非投与群の3倍以上増加し、腫瘍血液比および腫瘍筋肉比はそれぞれ1.3倍および1.6倍向上した。さらに、POTKを前投与した担がんマウスに[^<123>I]FIAUを投与し、6時間後に平面画像を収集したところ、腫瘍が描出された一方移植対側肢への放射能集積は認められなかった。また、腫瘍に集積した放射能は、代謝捕捉の概念を利用していない既存プローブであるPOSを用いた場合よりも高く、POTKと[^<123>I]FIAUを用いることでHIF-1活性化低酸素腫瘍の高感度イメージングの可能性が示された。
普遍コンパクト空間の構造解析

トポロジーにおけるStone-Cechコンパクト化に対応するものとして、代数幾何学におけるZariski-Riemann空間を特徴付けた。その際に固有射の再定義を行っている。また凸体の幾何学を代数的に定式化することもできた:すなわちある代数型τが存在して、凸体はτ代数としてみなせることを意味する。これによって凸体に代数的な手法や定理が適用できるようになる。またそれをさらに発展させ、数論においても代数的整数環のスペクトラムの数論的コンパクト化の純代数的定式化に成功した。これは上のτ代数を考えると同時にZariski-Riemann空間の構成法を組み合わせることで可能となる。Zariski-Riemann空間の研究に先立ち、一度非ネータ環およびその上の加群の理論の総点検を行うことが必要となったため、その足固めを行った。これまで試みてきたスキーム理論の拡張において出現した「環」はアーベル群のなすモノイダル圏の可換モノイド対象ではなく他の代数上の可換モノイド対象になっているため、従来からある可換環の理論がどの程度まで拡張可能かがわからず、かつ参考文献がほとんどない。遡ると線形代数レベルでも色々なおざりにされている部分が多いため、一から書き直すことになった。いくつか重要な発見を挙げておくと(1)環や加群がスペクトラム・O_X加群の圏に忠実充満に埋め込むことは一般の代数系で成り立つ。一方でZariski-Riemann空間と付値環、正規環の対応は代数系に依存する。(2)線形代数レベルの話の多くは正規環まで拡張できる。(3)加群の素因子の概念はWeak Zariskiprimeを用いると非ネータ環まで自然に拡張でき、Krullの共通部分定理などに様々な応用がある。(4)行列式の理論は外積代数の「自然さ」を特徴づけないといけないが、そのためには次数付き微分代数まで持ち上げて議論する必要がある。(5)Poincare級数などはK群で計算が可能である。一方でK_0はDedekind環などの有名なクラスを除くとまだ完全にわかったとは言えない、などである。これらはまだ下準備であるが、予想以上の大部になってしまい、まだ作業が完了していない。非ネータ可換環およびその加群の理論の整備を引き続き進めてきたが、途中から非可換環上の加群の理論も含めるように拡張している。微分付き次数環への応用の他に、群作用に対する不変式環上の加群の分析などにねじれ群環の活用などが実際に有効だからである。また上三角行列環においてPoincare双対性に類似したTorとExtとの間の双対性が見いだされるということもある。また、ホモロジー代数を用いた各性質の詳細な分類および特徴付けに入っている。これは実際に正則環(これは基礎環上の平滑射に対応する)の特徴付けに必要であり、また正則環とPrufer環の類似性を浮き彫りにさせている。微分加群は非可換環にまで概念を拡張することができる。またそれはconnectiveな微分付き次数環から環への忘却関手の左随伴によって次数1の部分に自然に現出する。非可換環の場合でも不分岐性と無限小持ち上げとの関係は保たれるが、平滑性と無限小持ち上げの対応は難しい。平滑性はある種加群における射影性と性質が類似しており、有限表示性を仮定しないと局所判定法が一般に適応されない。一方で遠藤の定理と同様に基礎環が整域であればもう少し弱い条件である「有限生成」で局所判定が可能となる。その他には、以前A-概型と称していたものが実は局所環付き空間であることと同値であることが分かった。これは局所環付き空間の圏が環の圏と十分近いことを示唆しており、概型上で定義されている各種概念を局所環付き空間にまで拡張すべきであることを意味する。今年度は引き続き、研究課題であるA-スキームの基礎理論の構築を進めた。特にA-スキームの正規化がスキームの場合と同様に可能であることを示し、それが有限型という条件を外した上で固有であることを示している。実際、スキームの場合でも正規化は有限型とならない場合が多く、この有限型を仮定しない形での定式化の方が優れている。また、A-スキームのうちどのようなものがスキームの射影極限で表せるかということに対して特徴づけを与えた。この系として、クラシカルな永田の埋め込み定理を改めて証明できることを示した。これについては、分離的有限型射の場合についてはZariski-Riemann空間の間の射が開埋め込みになるというA-スキーム独自の結果を本質的に用いている。A-スキームの定義はデータの与え方が独特で、旧来のGrothendieck Topologyとの間の関連性が分かりづらいものがあった。

そこで筆者はさらにC-スキームというものの定義をし、A-スキームの一般化を行うとともにスキームの圏を普遍的性質によって特徴づけた。これには次のような動機づけがある:数論幾何学の一分野としてF1上の幾何学というものがあり、ここではモノイドなどからスキームのような幾何学的対象を構築、分析する。しかし、そのモノイドスキームは人によって定義がバラバラであり、定義した概念同士を比較する、あるいは正当化するためには結局その圏の性質を普遍性によって特徴づけるしかない。筆者の構築したモノイドスキームの圏はこの普遍性を持つという意味で通常のスキームと同じ性質を持ち、従ってその意味で正当な定義であると言える。さらに、最近になってこうしたスキームの一般化を考えることで有理整数環のスペクトラムのアラケロフコンパクト化を普遍性により定義、実現できる圏を構築することに成功している。各種基本的概念の普遍性による定式化を引き続き進めた。たとえばねじれ群環の普遍性による定式化であるが、これは代数型を一般化することにより群の間の半直積と同等のものとみなせる。他にも整域はその加群のprogeneratorの入射包絡が自己準同型環に関して単純加群になっているという性質で特徴付けられるが、これは非可換環に拡張するとOre整域の特徴付けとなり、Ore整域の位置づけがはっきりする。群が作用する環Rにおいて、ねじれ群環はある種環Rの不変環の双対、あるいは普遍包絡と位置づけられ、Galois理論を説明する際にも用いられる。この関係もあって、今年度は体論、特に実体の理論の洗いなおしをHilbert記号の理論も用いて行った。一方で凸体の理論の代数的記述を完成させた。現在のところはこれは実数係数上メネラウスの定理を用いた公理化であるが、将来的にはこれは(星状分割の理論と組み合わせたいため)任意の実閉体係数で行われるべきであり、そのため上述の実体の理論の見直しが必要となった次第である:実数体はアルキメデス実閉体の圏の中での終対象として特徴付けられる。凸体の理論は整数論と深い関わりを持ち、無限素点での挙動を描写する上で活用できる。また凸体の環の始対象(およびその加群)は付値環(の加群)と似た挙動を示すことから、これまでの研究内容に沿ったものと捉えられる。代数幾何学Zariski-Riemann空間の研究に必要な土台となる環論、加群の理論の整備はほぼできつつある。ネータ可換環論の理論の、非ネータ環やより一般の可換モノイド対象への拡張可能性および限界の検証についてはある程度達成された。非ネータ環論においてはPrufer環の理論がZR空間の研究に非常に応用が効き、かつ簡明であることがわかる:Prufer環上の有限生成射影加群は直線束の直和に分解することがわかっているので、局所的な分析はできる。問題はZR空間が局所的にアフィンでないことがどう影響するかが未だによくわかっていない。アフィンの場合とズレがあるとすれば、それを測る(コ)ホモロジカルな理論が必要になるかも知れない。代数的整数環のスペクトラムの数論的コンパクト化については、その上の加群がノルム付き加群に対応することはわかっている。
細胞増殖因子作用の分子機構とトランスフォーメーション

梅田はマウス由来のL・P3細胞の培養上清からゼラチン親和性のGCP(還元下で270kDa)とヘパリン親和性のGNCP(還元下で170kDa)接着因子を精製した。平井(玲)はラットの活性型30kDaTGFはA鎖ホモダイマーPDGFと同一であり、TGF活性はAサブユニットにDNA合成誘起活性はBサブユニットにあることを示唆した。西川はA431細胞のFGFレセプターの分子量は140kおよび170kであることを確認した。春日はGlyーXーGlyーXーXーGlyに関して、変異インスリンレセプターVal^<996>を導入した細胞ではそのレセプター機能を消失することを明らかにした。矢追はV型コラーゲンα_1鎖由来の30K断片が強いインスリン結合性(結合部位はβ鎖)をもち、そのアミノ酸配列はArgに富んでいること、インスリンの保持・安定性を高める働きをしている結果を得た。伊藤はヒト包皮由来FSー4細胞株を用いて、TNF・EGFがアラキドン酸を遊離させることによってプロスタグランジンを産生させ、抑制シグナルとして作用することを示した。桑野はEGF応答欠損変異株(Nー3)が“EGFのオートクリン制御"による新しいトランスフォーメーションの例であることを見出した。河野はシグナル伝達系の中核と考えられる41・43K蛋白のTyr燐酸化に関してこの蛋白質の分離・精製を行った。大竹はラット肝細胞の完全無血清培地での初代培養法を開発し、増殖開始に新しい遺伝子の関与を示唆した。平井(雅)はCキナーゼの主要基質である80K蛋白のアミノ酸配列を決定し、モノクローナル抗体を作製した。天野はKB細胞からのEGF応答欠損変異株を用いてEGFレセプター異常が癌の増殖を抑制する結果を得た。〈若い研究者〉菊池はウシ大脳から低分子量のGTPase活性促進蛋白(GAP)を分離・精製した。竹下はT細胞のILー2レセプターβ鎖が単独でILー2結合能をもち特異的にチロシンリン酸化されて増殖シグナルを伝達することを示した。宮川は癌細胞では分子量130Kの低親和性GMーCSFレセプターが発現されていることを明らかにした。
標的分子であるTBPに結合した転写活性化ドメインの立体構造解析

転写制御機構を理解するためには、転写活性化ドメイン(AD)とその標的分子の間に成立する蛋白質間相互作用の実体を明らかにする必要がある。われわれはTFIIDサブユニットであるyTAF145/dTAF230のN末端にTBPと極めて強く結合し、その機能を阻害する活性領域(TAND)を同定し、TANDが役割分担の異なる二個の小サブドメイン(TAND1,TAND2)から構成されること、TAND1はADと多くの機能的な共通点を持つことなどを明らかにしてきた。またすでにIkuraらにより、ショウジョウバエ由来のdTAND1がTATAボックスの分子擬態を利用してTBPに結合していることが明らかにされている。その後の詳細な解析からdTAND1が二個のyTAND1相当領域を内包する可能性が示されたため、それぞれについてTBPとの複合体形成を試みたが、yTAND2との融合蛋白質のin vitroにおけるTBP結合活性はいずれも極めて低いものであった。そこで今回dTAND1-dTAND2間に本来挿入されているspacer領域(78-115aa)の機能に新たに注目し、in vivo及びin vitroにおいて種々の解析を行った。その結果、(1)spacer領域の付加はin vivoにおいて野生型orキメラ型TANDを持つyTAF145蛋白質全長の発現を抑制すること、(2)spacer領域をC端側に融合することにより転写活性化ドメインの活性が顕著に低下すること、(3)spacer領域の挿入によりdTANDIN(or C)-yTAND2融合蛋白質のTBP結合能がわずかながら増大することなどが明らかとなった。以上の結果は、spacer領域が単なるリンカーではなく、少なくともショウジョウバエのTFIIDにおいてはTAND1,TAND2と同様にTBPと可逆的に結合する第三のサブドメインとして機能していることを強く示唆している。
環境微生物群集における光エネルギー利用と細菌の飢餓適応戦略

紅色光合成細菌は,用いた4種すべてで栄養条件の悪い条件でも光エネルギーを利用して生きのびることができた.温泉の微生物群集では外部から供給された少ない量の電子が光合成細菌の関与で群集内に循環的に保持されて,バイオマスが成長していくことが分かった,その際,水素による電子の授受が重要な役割を果たしていた.貧栄養傾向のある湖沼中の脱窒素反応が部分脱窒をする光合成細菌と非光合成細菌が協働して進行することが分かった.(1)温泉微生物マット中の光合成細菌遺伝子とイオウ・炭素・水素の循環機能の解析.(1)典型的な貧栄養環境の一つである温泉流水中の光合成細菌を含む微生物マットを材料にイオウ化合物,窒素化合物,水素の増減活性を測定する.(2)微生物マット中のリボソーム遺伝子,光合成反応中心遺伝子,クロロフィル合成酵素遺伝子の塩基配列を決定する.(3)温泉中の光合成細菌を含む微生物群集におけるイオウ循環と水素の発生を明確に示す.あわせて,それに関わる細菌群の群集構造解析と空間分布を明らかにする.(4)微生物マット中での主要な物質循環の全体像を明らかにするために,物質循環に関わる細菌を単離し,実験室内で温泉微生物マットを再構築し,上記の光合成細菌が関与する物質循環系の存在を実験的に検証する.(5)上記の結果を合わせて,微視的な環境条件が,そこでの物質代謝,特に炭素,イオウ,水素の代謝に与える影響と,その中の光合成細菌の役割を明確にする.それを通して,光エネルギーのうち,増殖に使われる割合と増殖を伴わない生存に使われる割合を推定する.(2)多摩川の川底礫上の微生物マット中の光合成細菌の存在と機能の解析.(1)貧栄養環境である清浄な河川中の微生物群集中において,光合成細菌が光エネルギーを利用して多くの種類が存在する可能性を,光合成遺伝子解析を用いて検証する.(2)川底の礫上の微生物マットの発達過程を経時的に観察し,光合成細菌が発達段階に応じてどのように増加するかを明らかにする.(3)川底礫上の微生物マットと,前項の温泉微生物マットを比較し,中温域の微生物マットにおける光合成細菌と硫酸還元細菌が関与するイオウ循環の可能性を検証する.(4)川の水質等(有機物濃度,温度,pH,各種塩類濃度,光強度)と,そこに存在する光合成細菌の相関を明らかにする.それにより,光合成細菌の物質循環における役割の他に,飢餓的条件における生存のために光合成機能を利用している可能性を探る.(3)土壌中の光合成細菌の分布と貧栄養環境での光エネルギー利用(1)土壌中の貧栄養環境での光合成細菌の存在を,貧栄養条件を用いた集積培養で明らかにし,存在する細菌を単離同定する。(2)実験ほ場に,栄養条件の異なる土壌および砂地を用意し,光合成細菌を散布して,明暗両条件を与える。その後の消長をDNAプローブを用いて追跡し,光エネルギー利用の光合成細菌生残に適した条件を野外で調べる。RNAも解析することにより,実際に利用されている光合成活性との関係を明らかにする。(3)単離した光合成細菌を用いて,実験室で光合成細菌の生存曲線を,さまざまな光条件で測定する.こられの結果と野外における光エネルギー利用との関係を探る.(4)土壌および水界中の光合成細菌の物質循環機能と飢餓適応戦略のとりまとめ(1)設定した仮説「自然界に光合成細菌が広範に分布している理由は,分解者としての細菌が飢餓環境で生残(サバイバル)していくために光エネルギー利用が重要であるためである」を検証する.(2)前項を通して「多くの分解者が広範に光エネルギー利用(広義の光合成,ただし炭酸固定はなし)もしている」という新しい概念を確立することを目指す.紅色光合成細菌は,用いた4種すべてで栄養条件の悪い条件でも光エネルギーを利用して生きのびることができた.温泉の微生物群集では外部から供給された少ない量の電子が光合成細菌の関与で群集内に循環的に保持されて,バイオマスが成長していくことが分かった,その際,水素による電子の授受が重要な役割を果たしていた.貧栄養傾向のある湖沼中の脱窒素反応が部分脱窒をする光合成細菌と非光合成細菌が協働して進行することが分かった.(1)自然界では栄養分の供給は限定的であり,微生物が増殖できない期間をどのように生残しているのかが重要である.紅色光合成細菌の飢餓条件における生残率に対する光の影響を解析したところ,対数増殖期の細胞は、暗条件では10日目以降から生菌数が大きく減少したが,光照射条件では生菌数の低下はほとんど見られなかった。一方、定常期の細胞は光の照射に関係なく一ヶ月以上の間生菌数を維持しており,増殖が定常期に入ってくると飢餓に対する何らかの準備が細胞内で起こってくると考えられた.(2)好気的な通常環境中で光合成細菌が,光合成能により生存を有利にしているかどうかを調べることを目的して,低い栄養条件でかつ非嫌気下で生育できる通常環境中の光合成細菌を探索した.これまでに微好気条件に適応したと思われる光合成細菌2種を単離した.(3)高温の温泉域は,貧栄養条件であるが微生物マットが発達している.このような条件では,微生物間の物質的相互作用が,重要だと考えられる.これまで研究が遅れている水素に注目し,採取した微生物マットを用いて水素発生量を測定したところ,硫酸還元菌の阻害剤を添加すると顕著な水素発生がみられた.その水素発生は、光照射によって約半分に抑制された.

このことから水素は光合成細菌ではなく,発酵性細菌によって発生しており,硫酸還元菌がその消費者と考えられた.マット中の微生物細胞を分散懸濁した場合は,阻害剤の添加なしに水素発生が見られたため,水素の授受には細胞間の近接した分布が必要であると考えられた.これまでエネルギーに関わる物質循環は炭素を中心に考えられてきたが,本研究では還元力の循環考えることで理解が進んだ.物質と還元力の流れを同時に示すことは,微生物マットだけでなく地球上の生態系や環境の変遷を理解するためのモデルになると考えられた.(1)地上を流れる温泉水中には,微生物群集が良く発達するが,温泉水自体は貧栄養である.光エネルギーを利用することが微生物群集の発達に関係すると考えられたので,微生物群集中の物質循環とエネルギーの流れを詳しく調べた.長野県の中房温泉の65°C域に発達している微生物マットを研究室に持ち帰り,65°Cで培養し水素発生量を測定した.硫酸還元菌の阻害剤を添加すると顕著な水素発生がみられた.その水素発生は,水素は発酵性細菌によって発生しており,硫酸還元菌が消費していると考えられた.同マットから,水素発生発酵細菌の分離に成功した.この微生物マットでは,(1)光合成細菌による硫化水素を利用した有機物合成,(2)発酵性細菌による有機物からの水素生産,(3)硫酸還元菌による水素を利用した硫化水素生産が,サイクルを形成していることがわかった.つまり電子が有機化合物・水素・硫化水素を電子伝達体として循環しており,光エネルギーの供給によって電子がポンプアップされるため,群集内での電子の再利用と保持が可能になっていると考えられる.このことにより貧栄養条件で供給の限られた電子を最大限利用していることがわかった.(2)栄養分の供給が限られた条件で,増殖できない期間をどのように生残しているのかを明らかにするため,紅色光合成細菌の飢餓条件における生残性を解析した.増殖している3種の光合成細菌の細胞を炭素源飢餓条件に置くと,光照射下では約一ヶ月にわたって生菌数の大きな低下は見られないが,暗条件下では生菌数が顕著に低下することがわかった.暗条件における生存率の低下は,3種間で大きく異なっていた.生細胞内のATP量を測定したところ,生細胞内ATP量はほぼ一定であった.このことから生残性を維持するにはATPが関与していると考えられた.光エネルギーによるエネルギー供給が,増殖ばかりでなく,生残にも大きく影響しることがわかった.酸素を発生しない光合成細菌に注目し,微生物が貧栄養条件や飢餓条件にどう適応しているかの機構を明らかにする研究を進めた.微生物間の相互作用や物質循環に注目した.(1)温泉微生物マット中の光合成細菌遺伝子とイオウ・炭素・水素の循環機能の解析を進めた.長野県中房温泉の65°C微生物マットでの水素発生とイオウ代謝との関係を前年度までに明示して水素発生に関わる細菌を単離したが,本年度の研究で,それらの微生物群集中での量比を調べた.
CGを用いた現実感の高い仮想世界の構築に関する研究

本研究では,CG映像の作成,つまり,人工現実世界構築のためには,(1)人工現実世界構築の容易性(2)リアルさの表現(3)バーチャル生物の個体差の表現(4)汎用性を考慮する必要性等があると考えている.そこで,今年度我々は,2次元の画像を入力として,容易に3次元モデルを作成できる「簡易モデル作成システムに関する研究」および,人工現実世界内で仮想生物の動きを容易に表現できる「仮想生物の動きの生成に関する研究」を行った.「簡易モデル作成システム」においては,図鑑から入力した魚の画像を用いて,魚の抽出,魚本体とヒレ部分への分割を行い3次元モデルを作成した.最終的には,入力画像をテクスチャとして利用し,リアルな魚の3次元モデルを作成した.また,人間の顔を撮影した画像に対して,画像処理を施し,頭髪領域を抽出し,その頭髪領域を利用した,頭髪の3次元モデリングに関する研究も同時に行った.現在のところ,顔の正面画像しか利用していないため,正面からみた3次元モデルはリアルに作成できていることが明らかとなった.「仮想生物の動き生成」においては,仮想金魚の動き,特に群行動の創発に関する研究や水槽中の金魚を複数のカメラで撮影しその動きを抽出し仮想金魚の動きに利用する研究を行った.群行動の創発に関しては,基本的な個体の運動の定義と群の定義をするだけで,魚の群行動を創発することができた.また,画像処理を用いた動きの抽出においては,5(frame/sec)で撮影した映像から,重心位置を抽出し,重心位置の補間および金魚の方向の推定を行い30(frame/sec)での仮想金魚の動きを表現することができた.本年度は,これらの多くの研究成果を挙げることができた.本研究では,CG映像の作成,つまり,人工現実世界構築のためには,(1)人工現実世界構築の容易性(2)リアルさの表現(3)バーチャル生物の個体差の表現(4)汎用性を考慮する必要性等があると考えている.そこで,今年度我々は,2次元の画像を入力として,容易に3次元モデルを作成できる「簡易モデル作成システムに関する研究」および,人工現実世界内で仮想生物の動きを容易に表現できる「仮想生物の動きの生成に関する研究」を行った.「簡易モデル作成システム」においては,図鑑から入力した魚の画像を用いて,魚の抽出,魚本体とヒレ部分への分割を行い3次元モデルを作成した.最終的には,入力画像をテクスチャとして利用し,リアルな魚の3次元モデルを作成した.また,人間の顔を撮影した画像に対して,画像処理を施し,頭髪領域を抽出し,その頭髪領域を利用した,頭髪の3次元モデリングに関する研究も同時に行った.現在のところ,顔の正面画像しか利用していないため,正面からみた3次元モデルはリアルに作成できていることが明らかとなった.「仮想生物の動き生成」においては,仮想金魚の動き,特に群行動の創発に関する研究や水槽中の金魚を複数のカメラで撮影しその動きを抽出し仮想金魚の動きに利用する研究を行った.群行動の創発に関しては,基本的な個体の運動の定義と群の定義をするだけで,魚の群行動を創発することができた.また,画像処理を用いた動きの抽出においては,5(frame/sec)で撮影した映像から,重心位置を抽出し,重心位置の補間および金魚の方向の推定を行い30(frame/sec)での仮想金魚の動きを表現することができた.本年度は,これらの多くの研究成果を挙げることができた.
レチノイドによる肝線維化抑制効果に関する研究

慢性肝疾患の究極的な治療目的のひとつに肝線維化抑制と肝再生が挙げられるが、現在まで有効な治療法は確立されていない。申請者は、レチノイド(ビタミンA)誘導体を用いた肝線維化の制御を目的とし、研究を進めてきた。今年度得られた成果は以下のものである。1)レチノイドは肝実質障害を伴わないラット肝線維化モデルにおいて肝腺維を刺激した。その際、肝線維化を刺激し、同時に肝再生を強力に抑制するサイトカインTransforminggrowthfactor(TGF)-betaの肝内濃度を亢進させた。2)そこでレチノイドによるTGF-betaの誘導を検討する目的で、ラットより分離培養した伊東細胞を用い、各種レチノイドのTGF-betaの合成・分泌・活性化に及ぼす影響を検討しレチノイン酸誘導体が分泌・活性化を刺激することを見いだした。3)さらに、そのメカニズムを解明する目的でヒト線維芽細胞を用い、レチノイドはTGF-betaの合成に変化を及ぼさない早期より、潜在型TGF-betaの培地への放出を刺激した。4)また、レチノイン酸はこれらの培養細胞系においても、コラーゲンの産生を亢進させ、コラゲナーゼ活性を抑制した。従って、レチノイドはTGF-betaの放出・活性化を介して細胞外マトリックスの産生を亢進させている可能性が考えられ、現在検討中である。さらに、肝線維化の治療薬を目的としたレチノイド拮抗剤の開発にも着手している。
加工領域限定と極間距離検出の機能を備えた電解加工工具の研究開発

本研究では、電解加工の致命的な欠点である低い加工精度と環境への悪影響を根本的に解決するため、工具内部に電解液の流路を設け、吸引によって電解液が工具の端面と工作物の対向部分に限定して流れることにより、工作物の溶出領域を限定する機能と、吸引力の変化により工具端面と工作物の距離を検出する機能を備えた電解加工工具を提案し、総形電極に不向きな多品種・少量生産の部品加工法を研究開発する。本研究では、電解加工の致命的な欠点である低い加工精度を根本的に解決するため、加工しない箇所に電解液に存在させないという発想で、加工領域の限定機能と極間距離の検出機能を備えた電解加工工具を提案し、切削は困難で、放電加工は電極消耗が激しく、加工速度が遅いインコネルや超硬合金の穴及び複雑形状を、単純工具の走査により、高速度で加工し、総形電極に不向きな多品種・少量生産の部品加工を実現することを目的とする。研究目的及び研究目標を達成するために、以下の課題を明確にし、解決策を検討する。a)電解液が加工領域外に漏れず、また十分な量の電解液を吸引できるよう、流体解析を行ったうえ、工具構造を設計する。b)極間距離と吸引力の関係を求め、加工中の極間距離を検出・制御することにより、加工精度と速度の向上を狙う。なお、極間距離の検出と制御を実現する制御システムを構築する。c)構造が複雑で製作コストの高い工具を半永久的に使用するため、パルス電源使用時の電極消耗対策を検討する。d)電解液の吸引穴による加工残留部と穴加工貫通時の電解液吸引不能の対策を検討する。e)電極の走査により複雑形状を創成するため、目標形状に合わせた電極のパスと走査速度を求めるアルゴリズムを確立する。今年度は、実験装置を構築し、単一のポンプにより吸引を行い、電解液を工具直下で循環させると同時に、吸引チューブ内の圧力変化により非接触で極間距離を検出できることを流体解析および実験により検証した結果、以下のことを確認した。(1)工具電極からの吸引のみにより、極間に電解液を循環できる。(2)工具の吸引圧力によって極間距離の推定が行える。(3)工具側面での加工を抑制し、加工領域の限定が可能である。(4)工具を横方向に走査し、加工を行うことも可能である。本研究では、電解加工の致命的な欠点である低い加工精度を根本的に解決するため、工具内部に電解液の流路を設け、吸引によって電解液が工具の端面と工作物の対向部分に限定して流れることにより、工作物の溶出領域を限定する機能と、吸引力の変化により工具端面と工作物の距離を検出する機能を備えた電解加工工具を提案し、総形電極に不向きな多品種・少量生産の部品加工を実現する。25年度は、実験装置を構築し、単一のポンプにより吸引を行い、電解液を工具直下で循環させると同時に、吸引チューブ内の圧力変化により非接触で極間距離を検出できることを流体解析及び実験により検証した結果、以下のことを確認した。26年度は、吸引圧力による極間検出と制御の電気回路を設計・製作し、検証実験を行った。また、より小さい加工単位を実現するため、加工領域が1mm×1mmの工具構造を設計・製作した。そして、吸引工具の特長を生かし、領域限定電解めっきの方法を提案し、走査速度や電流値を制御し、膜厚制御の検証実験を行った。その結果、以下のことが明らかとなった。(1)工具直下にしか電解液が存在しないため、高い腐食性を持つ塩化ナトリウムでも領域限定の電解加工が可能であること。(2)周囲からの空気の吸引量を減少させると、加工生成物の吸引を円滑に行えるため、加工精度が向上することが分かった。(3)チタン電極では、走査速度を早くすると、めっき膜表面が改善される。(4)走査速度と電流値を変えると膜厚の制御ができる。生産加工25年度の研究計画には、以下の4項目を実施すると予定していた。(1)加工工具の構造設計・流体解析、(2)極間距離と吸引力の関係の調査、電解液流れの性能検証、(3)加工実験、(4)工具電極の運動制御及び電源装置の構築。これらの項目を実施したうえ、電極走査により、形状創成の可能性を実験により検証した。また、応用事例として、提案した工具を大型工作機械の摺動面上のオイルポケットの形成に適用し、優位性と可能性を検証した。今後は、25年度の研究成果を踏まえ、以下の項目を実施する予定である。(1)中央突起部と穴貫通時の対策検討:現在使用している工具の構造では、穴加工を行うと中央に突起部が残る。

そこで、電極を揺動させ、または電解液の吸引穴の位置を中心からずらして設置したうえ、工具電極を回転しながら加工し、突起部をなくす。また、貫通穴を加工する場合、穴間通時に貫通した穴から外気が吸引されるため、電解液の吸引ができなくなる。対策として、工作物の下部に犠牲板を設置し、工具直下に常に狭い極間距離を形成する。(2)電極消耗対策の検討:直流電流を用いた際に発生しない工具電極の消耗が、パルス電源を用いると発生してしまうこと、ローレベル電圧を上げることにより消耗を防げることはこれまでの研究で明らかとなった。本研究も、電極が消耗しないようなローレベル電圧を調べ、加工に用いる。(3)3次元微細形状の創成加工の実現と評価:形状創成加工には、工具パスと走査速度を求める必要がある。これまで、筆者らが電解液ジェット加工において、重ね合わせの理に基づいて、複雑形状の創成加工を実現する工具軌跡と速度を求める方法を確立している。その方法を利用し、目標形状を加工する工具電極の軌跡と速度を求め、3次元微細形状を創成する。また、加工後形状を形状測定器により評価する。
リスク対応行動を考慮した交通管理方策

都市内の既存道路網を有効に利用し,円滑な交通流を実現する方策として,交通情報の提供による交通の分散誘導や,混雑料金制,フレックスタイム制等の交通需要管理方策(TDM)が近年注目を集めている。これらの交通管理方策の実施により交通量・交通状態が変化するが,変化に対するドライバーの反応を,所要時間リスクへの対応行動としてモデル化した。すなわち,管理方策の有無,経路,交通機関ごとに提供されるサービスの指標として所要時間とその変動を取り上げ,交通に要するコストとしてリスクに伴う損失も考慮する。モデル化の基本となるリスク分析的な交通管理方策の評価,個人行動のモデル化については,既に検討を済ませており,本研究では,上記の成果を踏まえて,現実に適用するためのモデル構造の汎用化と政策評価への具体的な適用を図った。(1)道路交通管理政策を類型化し,施策と旅行時間分布との対応関係を定式化した。(2)個人の行動を類型化して,それらを取り止めることによって生じるコスト,活動内容と活動場所の関係等をモデル化した。(3)交通状態にインパクトが生じた場合の,活動,交通機関,出発時刻,経路の選択への影響を表現する,総合的なモデルシステムを構築した。(4)活動・交通の変化が交通状態に及ぼす影響を定量的に表現するモデルを定式化して,(3)を動的相互作用を考慮したモデルシステムに拡張した。(5)いく通りかのシナリオを設定して,評価を試行する。モデルパフォーマンスを検証するとともに,交通管理政策に関して定性的な提言を行った。
単位球上の単葉正則写像に関する研究

Aがある条件を満たす正方行列であるとき、ユークリッド単位球上で、A漸近的螺旋形正則写像の概念とAパラメーター表現を持つ単葉正則写像の概念が同一であることを示した。また、複素バナッハ空間の単位球上の星形正則写像の様々な部分族に対する精密な増大度定理、被覆定理および係数評価式を与えた。更に、単位円盤上の正則関数に対するBohrの定理を、複素バナッハ空間の有界balanced領域から複素バナッハ空間内の等質単位球への正則写像に拡張した。本年度の研究実績の概要は以下の通りである。1.C^nの任意のノルムに関する単位球上の放物型星形正則写像に対する精密な増大度定理,被覆定理および係数評価式を与えた。更に,様々な放物型星形正則写像の例を与えた。2.ユークリッド単位球上で,漸近的星形正則写像の概念とパラメーター表現を持つ単葉正則写像の概念が同一であることを示した。特に,星形正則写像と螺旋形正則写像が漸近的星形写像であることを示した。また,螺旋形正則写像で漸近的星形正則写像でない例を与えた。更に,単位円盤上の正規化された単葉正則関数は漸近的星形正則関数であるが,複素次元が2以上の単位球上の正規化された単葉正則写像は漸近的星形正則写像とは限らないことを示した。3.Aがある条件を満たす正方行列であるとき,ユークリッド単位球上で,A漸近的螺旋形正則写像の概念とAパラメーター表現を持つ単葉正則写像の概念が同一であることを示した。特に,A螺旋形正則写像がAパラメーター表現を持つ単葉正則写像であることを示した。また,A螺旋形正則写像がパラメーター表現を持つ単葉正則写像であるためのAに関する十分条件を求めた。更に,A漸近的螺旋形正則写像の例を与えた。4.単位円盤上の正則関数に対するBohrの定理を,複素バナッハ空間の有界balanced領域から複素バナッハ空間内の等質単位球への正則写像に拡張した。5.複素バナッハ空間の単位球上の星形正則写像の様々な部分族に対する精密な増大度定理,被覆定理および係数評価式を与えた。単位円盤U上の正規化された単葉正則関数に対しては、増大度定理及び係数評価式が成り立つことが知られている。H. Cartan(1933)は、これらの結果は多変数の単葉正則写像については成り立たないことを指摘し、星形正則写像について研究するよう勧めている。Hamada-Kohr(2000)は、複素n次元の単位球上の正規化された多変数のα型螺旋型正則写像に対して、増大度定理を示した。n次元複素ユークリッド空間の単位球上の正規化されていない単葉なsubordinationchainとLoewner微分方程式との関係について研究した。そのために、変換写像に対する初期値問題の最も一般的な形について研究し、解の存在と一意性を証明した。また、可測な行列値写像に関する一般化された螺旋型写像の概念を導入し、正規化されていない単葉なsubordinationchainの観点からこの概念を研究した。そのような螺旋型写像は、単葉なsubordination chainの第1要素として埋め込めることを証明した。また、対角行列値写像に関する螺旋型写像の様々な例を与えた。可測な行列値写像が、定数写像の時は、線形写像に関する通常の螺旋型写像の概念を得る。上記の応用として、正規化された対角行列値写像に関する螺旋型写像に対して、増大度定理を示した。
胃癌発癌機構の臨床的解析

【研究実績】1.AID/EMT遺伝子の発現と予後との関連性をunivariate analysisにて統計学的に解析するために症例を追跡中である2.浸潤度別・組織型別のEMT関連分子やAID遺伝子発現をreal-time RT-PCR arrayで行った。浸潤能の評価にはAID遺伝子よりもEMT関連遺伝子の発現の方が重要であり、病期・予後との強い関連性を認めた。H.pylori菌感染は胃粘膜において直接的なシチジンデアミナーゼ(AID)の変化のみならず各種morphogenの変化を惹起することが知られている。私達は胃癌発癌において胃分化発生に関わるhedgehog(Hh)情報伝達系の関連等を解析にとりかかるべく、本年度では各病期別患者のフォローアップデータを登録・整理してきた。一方、preliminary studyとして、データ解析可能な食道癌ではHh情報伝達系の下流に位置するpolycomb group (PcG)familyのBMI1発現の臨床的意義について検討した。【方法】術前CRT施行後食道扁平上皮癌患者78例において免疫組織学的染色を行いBMI1発現を検討し、3年生存率との関連を統計学的に解析した。【意義】Hh-PcG経路の活性化は、CRT施行食道癌術後早期再発のindicatorとなり、また'more aggressive'な特徴を示すCRT抵抗性cancer stem cellを反映するsurface markerとなりうることが明らかになった。Hh経路は食道のみならず胃でも分化・癌化に深く関わっている可能性が高く、Hh-PcG経路を解析することが来年度以降の重点課題となることが明らかになった。【本年度の研究実績】(1)5年生存がフォローアップできる病期別胃癌患者の登録およびデータ整理を継続して行い、効率的な予後解析ができるようにデータ整理を継続する。(2)胃がん症例において性・年齢・部位・ステージ・進達度・分化度・遠隔転移の有無・リンパ節転移の有無・腹膜播種の有無などをcovariateとして、予後との関連性をunivariate analysis(症例数がそろえばmultivariate)にて統計学的に解析するために症例を追跡中である。(3)胃がん組織におけるEMTとその可逆的反応であるMETは、がんの発生・浸潤・転移だけでなく本研究の目的とする幹細胞の分化増殖において重要であることがわかっている。われわれの平成22年度までの実験結果から胃がんにおいてもEMT/METが非常に重要である結果が得られた。特に腹膜播種症例におけるEMT関連遺伝子の発現を1 realtime RT-PCR arrayで行い、腹膜播種胃がんにおいてEMTが起きていることを明らかにした。現在30症例における臨床検体の集積が終わり、解析中である。【本年度の研究実績】(1) 5年生存がフォローアップできる病期別胃癌患者の登録およびデータ整理を継続して行い、効率的な予後解析ができるようにデータ整理を継続している。(3)胃がんは組織におけるheterogeneityと強い浸潤転移能が特徴である。浸潤度別・組織型別(同一症例組織における局所的な組織型を含む)のEMT関連分子やAID遺伝子発現をreal-time RT-PCR arrayで行った。結果としては、浸潤型胃がんでは早期にEMTが起きており腹膜播種胃がん組織においてその傾向は顕著であることが明らかになった。また、同一症例においても部分的に浸潤型組織型に変化した場合は、やはりEMT関連分子の発現変化が起きることも明らかになった。がん幹細胞との関連性や予後解析などは継続しており、現在投稿準備中である。
大動脈平滑筋ミオシンに存在する必須軽鎖アイソフォームの生理的機能

ブタ大動脈平滑筋ミオシンに存在する2種の必須軽鎖アイソフォームのうち、非筋型必須軽鎖を特異的に認識する抗体を作成する際抗原として用いる9残基ペプチド(AFVRHILSG)を合成した。合成したペプチドの純度を確認するために高速液体クロマトグラフィーを行ったところ2つの大きなピーク(p1、p2)が6:4の割合で検出された。量ピークのアミノ酸組成分析及び質量分析結果はそれぞれ目的物と同じ値であった。従ってどちらかのピークは合成中にアミノ酸残基がラセミ化して生じた複生成物であろうと予想された。今回のように一部ラセミ化したペプチドを検出できる簡便な方法は今までに報告がない。そこでL体のアミノ酸残基のみを認識しペプチドのN末端から順に消化するロイシンアミノペプチダーゼ(LAP)を用いたラセミ化ペプチドの簡単な検出法を開発した。0.2mgのペプチドを重量比1/23のLAPで消化させたところp1は3時間で全残基が定量的に遊離したが、p2は18時間反応を行っても4残基目のアルギニン以降のアミノ酸は検出されなかった。従って、目的物はp1であり、p2はアルギニン残基がラセミ化していると判定できた。さらにそれぞれのペプチドを抗原とし兎を免疫したところ、p1に対する抗血清はミオシンと強く反応したのに対しp2に対する抗血清はほとんど反応しなかった。この結果もp2は目的とするペプチドではないことを示し、LAPを用いたペプチド検定法の結果を支持している。p1に対する抗血清を硫安分画、p1アフィニティーカラム、およびプロテインAカラムを用いたクロマトグラフィーで精製し得られた抗体の特異性を確認したところ、大動脈抽出液に含まれる蛋白質のうちミオシン非筋型必須軽鎖のみを認識することが示された。今後は平滑筋型必須軽鎖に対する抗体も作成し、両抗体がそろい次第血管組織内の両アイソファームの分布を調べる予定である。
哺乳動物neuronal identityを規定する細胞内機構

哺乳動物の多様な神経細胞の各々に特徴的な性質(neuronal identity)が、神経発生から神経回路網の構築に至る過程でいかに決定されるのかを分子レベルで明らかにすることを目指している。本年度は脊髄交連神経細胞の運命決定を制御する、Bar型ホメオボックス遺伝子MBH1の発現制御機構と転写因子間のカスケードの解析を中心に研究を行った。MBH1は脊髄の交連神経細胞が分化する時に発現し、脊髄で異所的に発現させると発現細胞を交連神経細胞に分化転換させることができる。昨年度までのトランスジェニックマウスやノッククアウトマウス等の解析により、MBH1遺伝子の発現制御配列を同定するとともに、MBH1はヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子Math1の下流で発現することを明らかにしてきた。さらに、本年度のクロマチン免疫沈降実験により、マウス胎仔脊髄内でMath1タンパク質はMBH1の発現制御領域に特異的に結合していることを示し、Math1タンパク質が直接的にMBH1遺伝子を制御することを明らかした。また、in vivo electroporation法でMath1を脊髄で強制発現させた場合にも、Math1タンパク質がMBH1の発現制御領域に結合し、MBH1の発現を誘導することにより、交連神経細胞を生み出すことを示した。これらの一連の実験により、MBH1は、長年謎とされてきたヘリックス・ループ・ヘリックス型プロニューラル転写因子の標的遺伝子として、神経細胞の運命決定を制御することが明らかとなった。一方、大脳皮質幹細胞に遺伝子を異なる発生段階で二回導入する実験系を確立し、大脳皮質幹細胞の性質は個体発生とともに不可逆的に変化することを明らかにした。