hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
隔膜形成体の構築に関わる新規の細胞骨格関連タンパク質の検索

さらに、シロイヌナズナに相同性のあったタンパク質については、T-DNAインサーションラインを用い、組織への影響も観察したいと考えている。植物細胞は、赤道面の隔膜形成体と呼ばれる構造内で細胞板が合成されることにより細胞質分裂が終了する。微小管は細胞の分裂面に極性のそろった状態で規則正しく配列し、細胞板の発達とともに、同心円状に広がる。細胞板の材料となる小胞は、微小管に沿って細胞の赤道面に運ばれる。このような、隔膜形成体におけるダイナミックな微小管の構造変化や小胞の輸送には、多くの制御蛋白質が関与していると考えらる。近年、隔膜形成体に局在する微小管関連タンパク質がいくつも同定され、その重要性が示唆されているが、隔膜形成体の分子機構の全容を解明するためには十分ではない。そこで、本研究では、隔膜形成体の構築に関わる未同定のタンパク質を検索することを目的とし以下の実験を行った。高度に細胞周期を同調できるタバコ培養細胞BY-2を用い、隔膜形成体の細胞骨格成分単離を試みた。培養7日目の細胞は、アフィデコリンとプロピザマイドにより、細胞分裂終期に同調した。その後、酵素処理により細胞壁を消化し、パーコールを用いた密度勾配遠心分離を用い、隔膜形成体の細胞骨格成分と核を分離した。単離した隔膜形成体の細胞骨格成分を2次元電気泳動で分離し、間期の細胞成分と比較したところ、明らかな違いが見られた。質量分析により分析したが新規のタンパク質を同定するに至らなかった。上記の研究と平行して間期の細胞からの微小管結合タンパク質の分離とその局在を調べた。その結果、195kDaの微小管結合タンパク質の単離に成功した。質量分析によりタンパク質の同定を行ったところ未同定のタンパク質であることが明らかになった。抗体を作製し、その分布を観察したところ、隔膜形成体や核内に局在していることが明らかになった。
活性酸素ヒドロキシルラジカル産生抑制鉄キレーターを利用した木材防腐剤の開発

本研究では、木材腐朽菌による木材細胞壁の初期攻撃に関与する菌体外でのヒドロキシルラジカルの生成を阻止する木材防腐剤を見出すことを目的とした。このため、鉄の還元抑制能をもつキレーターを用い、木材腐朽菌の生育抑制効果を平成17年度に続いて試験した。試験の対象は、白色腐朽菌Ceriporiopsis subvermisporaが産生するceriporic acidBとその誘導体、および市販の鉄キレート剤とした。白色腐朽菌カワラタケおよび褐色腐朽菌オオウズラタケを、鉄キレーターを含浸させたブナ木片に植菌し、所定の時間培養した。本年度は、昨年度からキレーターの濃度範囲を広げて、腐朽試験を行った。菌の生育状態の観察と、腐朽後の木材の重量減少率により、鉄キレーターによる腐朽阻害効果を検証した結果、これまでに腐朽抑制効果が報告されていない複数の化合物の生育抑制効果を明確にすることができた。鉄キレーターによる腐朽阻害効果は、白色腐朽菌と褐色腐朽菌で明確な差異が認められた。白色腐朽菌でも、種によって感受性の大きな違いが認められた。このことは、キレーターの生育抑制機構が種によって異なることを示唆している。本研究では、ceriporic acidBおよび側鎖の鎖長が異なる誘導体を合成し、そのヒドロキシルラジカルの生成抑制作用を解析した。その結果、これらの誘導体によるヒドロキシルラジカルの生成抑制作用が鉄の還元抑制によることを示す知見を得た。新たに見出した生育抑制作用をもつ化合物は、防腐薬剤として利用できる可能性を秘めている。本研究では、木材腐朽菌による木材細胞壁の初期攻撃に関与する菌体外での活性酸素の生成を阻止することにより木材防腐を達成することを目的とした。このため、鉄の還元抑制能をもつキレーターを用い、木材腐朽菌の生育抑制効果があるかを試験した。はじめに、アルキルイタコネート(ceriporic acid)の鎖長の異なるアナログを化学合成した。合成は、α-ブロモメチルフマレートのグリニアル反応を用いた。合成したアナログは、フェントン反応による水酸化ラジカル生成抑制能と、鉄(III)の還元能を分析した。鉄(III)の還元能は、酸素の吸収速度および鉄(II)への配位により呈色するBPSを使用した。また、NTAをはじめとする各種の市販の鉄キレーターによる鉄(III)の還元抑制能を測定した。次に、白色腐朽菌カワラタケおよび褐色腐朽菌オオウズラタケを、鉄キレーターを含浸させたブナ木片に植菌し、所定の時間培養した。菌の生育状態の観察と、腐朽後の木材の重量減少率により、鉄キレーターによる腐朽阻害効果を検証した。その結果、これまでに腐朽抑制効果が報告されていない複数の化合物が、白色腐朽菌カワラタケおよび褐色腐朽菌オオウズラタケによるブナ材の腐朽抑制効果を持つことを明らかにした。しかしながら、これらの化合物の腐朽抑制に必要な濃度は、これまでに報告されている防腐剤に比べ高く、さらにスクリーニングを進める必要があるとの結論に至った。
がん幹細胞をも標的とするＲＥＩＣ遺伝子治療の消化器がんへの応用

マウス組織を用いてREIC/Dkk-3の発現局在の詳細なスクリーニングを行ったところ、皮膚と腸上皮組織において幹細胞のニッチとREIC/Dkk-3の局在が一致していた。また腸管上皮細胞株Caco-2を細胞外マトリクスタンパク質に包埋して3次元培養を行ったスフェロイドにおいてもREIC/Dkk-3の発現を認めた。またREIC/Dkk-3の発現制御因子を探索したところ、TNF-αが表皮ケラチノサイトのREIC/Dkk-3発現を低下させることがわかった。REIC/Dkk-3とTNF-αのバランスが発生過程や炎症における表皮ケラチノサイトと血管内皮細胞による組織構築を調整していることが示唆された。本年度の研究実績は以下の通りである。1. REIC/Dkk-3の腸上皮細胞における発現解析:遺伝子治療のターゲット遺伝子であるREIC/Dkk-3の腸上皮細胞における発現を詳細に解析した。腸上皮モデル細胞Caco-2(REIC/Dkk-3の発現が強い)を各種ゲルに包埋して3次元培養し、腸管組織形成のモデルとして用いた。包埋に使用するゲルにコラーゲン、マトリゲルなど複数の基質を用いたが、REIC/Dkk-3タンパク質の発現パターンと組織用構造の形成には相関を認めなかった。2. TNF-αによるREIC/Dkk-3発現制御:昨年度のスクリーニングによって表皮ケラチノサイトのREIC/Dkk-3発現を低下させる因子としてTNF-αが見つかったが、このTNF-αによる制御が他の細胞で認められないか検討した。複数の上皮系細胞株(REIC/Dkk-3の発現あり)で検討したが、検討した細胞ではTNF-αによる発現制御を認めなかった。今後細胞種を拡大して検討する必要がある。1.幹細胞ニッチにおけるREIC/Dkk-3の発現:遺伝子治療のターゲット遺伝子であるREIC/Dkk-3と幹細胞の関係を調査するため、まず上皮組織におけるREIC/Dkk-3の発現を詳細に調べた。その結果、皮膚においては幹細胞が存在するバルジ領域周辺、および腸管においても幹細胞が存在するクリプト周囲の細胞に強い発現を認めた。すなわちREIC/Dkk-3の発現は、幹細胞のニッチ領域と重なっていることが証明された。具体的な発現細胞の同定については、各種マーカーとの共染色を用いて細胞種の特定を進めているところである。2. REIC/Dkk-3の制御因子の解明:これまでREIC/Dkk-3の上位レベルでの制御因子はほとんどわかっていなかった。そこでREIC/Dkk-3を発現している正常細胞である皮膚表皮細胞(NHK)を用いて、これまでに表皮細胞の増殖・分化に関与しているとの報告があった因子を対象に、スクリーニングを行った。その結果、TNF-αがREIC/Dkk-3の発現を顕著に低下させることが明らかになった。現在は表皮細胞以外の上皮細胞で同様の効果を認めるかどうか、確認を進めている。REIC/Dkk-3は不死化した細胞でその発現が低下し、Dkkファミリーに属する細胞外分泌タンパク質である。アデノウイルスを用いてREIC/Dkk-3を強制的に発現させると、小胞体ストレスを介してがん細胞のみアポトーシスが誘導される。しかし、REIC/Dkk-3の正常な生理活性は不明で、特異的受容体もはっきりと分かっていない。またこれまでの予備実験から、REIC/Dkk-3の制御因子として感染などのストレスで分泌される炎症性サイトカインTNF-αが候補にあがった。今年度はこのTNF-αによるREIC/Dkk-3発現の制御について検討した。TNF-αを100ng/mLの濃度で正常ヒトケラチノサイトに添加したところ、REIC/Dkk-3の発現が低下した。Ki-67免疫染色法およびMTTアッセイにおいて、TNF-αの添加により正常ヒトケラチノサイトの細胞増殖が促進される傾向を示し、それに応じて細胞数が増加することが確認された。さらに最新の成果として、皮膚組織ではケラチノサイトが分泌するREIC/Dkk-3が血管内皮細胞の遊走と血管形成を抑制している結果が得られた。表皮幹細胞は炎症などのストレスに応答して炎症性サイトカインTNF-αを分泌するが、その結果として組織形成に大きく関わる血管内皮細胞の挙動に大きな影響を与えているとしたら、非常に有意義な発見と言える。細胞生物学昨年の研究代表者異動の影響のため、やや遅れている状況が続いている。次第に遅れを取り戻しつつあるので、今後は順調に進行することが期待される。本年度当初に研究代表者の異動があり、研究基盤設備等を整備する必要があったため、年度前半は十分に研究を進めることができなかった。研究環境を整えることができた年度後半からは、研究を進行させることができた。

特にこれまで全くわかっていなかったREIC/Dkk-3の制御因子として、皮膚表皮細胞や腸管上皮細胞においてTNF-αを同定することができた。REIC/Dkk-3の発現制御に関連して、様々な組織炎症因子をスクリーニングすることによりTNF-α以外の制御因子を見いだすように検索を進めたい。また最近心筋細胞において、REIC/Dkk-3がストレス応答制御キナーゼであるASK1を直接的に制御してるとの報告があった(Zhang et al, Cardiovasc Res. 2014)。ASK1はASK2とともに皮膚における炎症のパターンを制御するハブ的な役割を担ったキナーゼである。今年度はREIC/Dkk-3とASK1の皮膚における連関を詳細に検討したい。今後は、本研究計画で確認されたTNF-αのREIC/Dkk-3発現に対する影響が、実際の腫瘍組織においても存在するかどうか確認する。またがん幹細胞に対するREIC/Dkk-3遺伝子治療の効果についても、検討を進める。当該年度の助成金を無理に使用するよりは次年度と合わせて効果的な運用をした方が研究の進展に効果的と考えて、小額の残金を次年度に繰り越すこととした。次年度は本研究の最終年度となるため繰り越した助成金も含めて有効に運用し、特にREIC/Dkk-3の機能解明に向けた分子生物学的実験に力を入れて研究を進める計画である。該当なし
超伝導トンネル接合素子を用いた紫外線1光子分光検出器の開発

X線検出STJ素子作製用に構築された理化学研究所のSTJ作製専用プロセスラインを利用し、紫外線検出用STJ素子を試作した。この作製プロセスにおいて、1.表面保護膜(SiO_2層)の除去プロセスの導入2.陽極酸化法の導入3.Al準粒子トラップ層の厚みの4割増加を新たに施し、1により紫外線に有感な素子の実現、2によりトンネル障壁の品質の向上(従来の10倍の臨界電流1kA/cm^2で漏れ電流1nA以下を実現)、3により信号電荷の増幅(従来の5倍以上)を果たした。この素子の紫外線応答特性評価のために、高エネルギー加速器研究機構放射光施設(KEK-PF)で紫外線軟X線(47-280eV)の照射実験を行い、18eV(FWHM)@55eVというエネルギー分解能を達成し、国内で初めて一光子分光検出を実現した。また、雑音成分の主要因がクライオスタット内のステンレス同軸信号配線の高い浮遊容量に起因する電気的雑音であることを突き止め、配線を低抵抗の単線に置換して浮遊容量を低減し、雑音を2.1eV相当(従来の1/4)に低減した。さらに、よりエネルギーの低い2.6eVの可視光照射実験でエネルギー分解能1.5eVで分光検出に成功した。この実験では25光子の同時検出イベントも観測され、5-13eVの光子に相当するイベントの分光検出を実現した。エネルギー分解能はFWHMで1.8eV@5.3eV、2.6eV@13.2eVである。電気的雑音成分は1.1eV相当であり、素子固有のエネルギー分解能は1.4eV@5.3eV、2.4eV@13.2eVと見積もられた。この実験では、使用素子の漏れ電流が10nA程度と大きくλ/Δλは5程度に留まったが、同様の素子で1nA程度の漏れ電流を実現しており、信号雑音比(∝λ/Δλ)の向上のための技術基盤も確立したと言える。以上、本研究の目的は達成された。平成12年度は、紫外線用STJ素子の設計・試作・評価と、紫外線導入システムの開発を行った。素子の試作では、理化学研究所内のSTJ作製専用プロセスラインを用いて、これまで我々のグループで開発を行なってきたX線検出器用の素子の製作技術をベースとして、紫外線用のSTJの試作を行った。X線検出器用素子では、表面の保護膜としてSiO2層を積層しているが、紫外線の場合にはこのSiO2層が光子を吸収してしまう。そこで、素子性能を損なうことなくSiO2膜を除去するプロセスを新たに導入した。また、X線よりも信号電荷の小さな紫外線に対しても十分な感度を得るために、Alの準粒子トラップ層の厚みを従来よりも4割厚くして、マルチトンネリング効果による信号電荷の増幅を図った。この結果、従来に比べて発生信号電荷量が5倍以上大きくなった。この素子の光子に対する応答特性を測定するために、高エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所放射光施設(KEK-PF)において真空紫外線光源を用いて性能評価を行なった。その結果、約50eV(波長250Å)のエネルギーの光子について、国内で初めて一光子分光検出を行なうことができた。

このときのエネルギー分解能は約15eVであったが、読み出し雑音の寄与を差し引くと、検出器単体のエネルギー分解能が約4eV程度を達成していることがわかった。この値は、波長3,000Åの一光子のエネルギーに相当し、素子性能として、可視光域に極めて近い紫外線光子に対しても一光子検出が可能なレベルを達成していることが確認された。また、上記の実際の実験での経験を踏まえて、実験室レベルでの素子評価用単色紫外線光源の検討を行ない、別添リストに挙げた備品類を組み合わせて、紫外線導入システムの開発を行なった。来年度以降、上記の素子のさらなる性能向上を図り、この紫外線導入システムを用いた評価と作製へのフィードバックをすすめるとともに、測定波長も1,000Åを越える領域まで拡大していく予定である。平成13年度は、平成12年度に整備した紫外線導入システムを用いた紫外線光子の1光子検出を試みたが、紫外線光子の検出には至らなかった。これには2つの原因が考えられた。1つは、Heガスフロー型の紫外線光源からのHeガスがクライオスタットの最低温度部に多量に侵入して最低温度部の温度が上昇してしまうためである。これに対しては、光源側のガスが漏れにくいペンシルビームコリメータを新たに導入し、検出器の置かれた最低温度部への熱流入を押さえることに成功した。もう一つの原因は、読み出し雑音が約8eVと紫外線光子の検出のためには大きすぎるということであった。軟X線光源を用いた予備実験の結果、この雑音成分の大部分はクライオスタット内のステンレス同軸信号配線の高い浮遊容量(約200pF)に起因することがわかった。そこで、この配線を低抵抗(1-3Ω)の単線に置き換え、浮遊容量を約60gFに低減した。この結果、読みだし雑音を2.1eV相当にまで低減すること成功した。これにより、紫外線光子により発生する信号出力が雑音成分に埋もれることなく検出される目処が立った。さらに、並行して素子作製プロセスの改良を進め、新たに陽極酸化法を導入することにより、素子の漏れ電流を1nA以下に抑えたまま臨界電流値を約10倍にすることに成功した。臨界電流値の上昇は、トンネル障壁の厚みがさらに薄くなっていることを意味し、これにより、発生準粒子のトンネル確率が飛躍的に向上し、出力信号のが大きくなることが期待され、より高いS/Nでの紫外線光子検出が可能になると考えられる。以上のように、平成12年度は、読み出し系と素子作製においてほぼ究極的と言える極めて重要となる要素技術を開発することができた。これらを用いて、すでに紫外線用素子の作製をすすめており、平成14年度に高いエネルギー分解能(波長分解能)の検出器の実現をめざす。平成14年度は、平成13年度に開発に成功した陽極酸化を利用した新しい作製プロセスを用いた素子の作製、及び、雑音低減法を用いた評価実験を行った。素子作製においては、理化学研究所内の超伝導接合素子(STJ)作製専用プロセスラインを用いて、トンネル障壁の薄いSTJ検出器の作製を行った。実現した臨海電流密度は約1kA/cm^2と従来の10倍である。素子構造はNb/Al/AlOx/Al/Nbである。素子評価においては、まず高エネルギー加速器研究機構の放射光施設を用いて、極端紫外線軟X線(47-280eV)の照射実験を行い、55eVの光子に対して18eV(FWHM)というエネルギー分解能を達成した。また、平成13年度に理化学研究所の実験室において、2.1eVという低雑音を実現していたため、理化学研究所において2.6eVという可視光領域の光子検出を試み、約1.5eVというエネルギー分解能で光子の分光検出に成功した。この実験においては、1光子のイベント以外に、25光子の同時検出イベントが観測されており、5-13eVという紫外線域相当のエネルギーのイベントの分光検出にも成功した。
量子スピン系の電子輸送現象

本研究では,低次元量子スピン系において,電子輸送現象を測定することから,低次元系が持つ量子揺らぎと電子相関の効果が発現させる新奇な物性,超伝導やLuttinger流体など,を実現するような物質を探索し,輸送特性の測定からその物性の由来を明らかにしていくことを目的としている。まず,これまでに発見された低次元量子スピン系である梯子型銅酸化物Sr_<14>Cu_<24>O_<41>系について,様々なキャリア濃度組成における高圧下電気伝導率の温度依存性の測定を引き続き行い,この系の高圧下における相図,すなわち,超伝導の発現する圧力・組成範囲と,電荷秩序を発現する相の確定,を確立した。この結果はEurophysics Lettersに発表された。また,同じSr_<14>Cu_<24>O_<41>系において,150K付近にピークを持つ異常な熱伝導率が発見されており,この由来についてスピンギャップとの関連も含めて研究を行った。その結果,1次元鎖を持つ系Sr_2CuO_3やSrCuO_2,また,梯子型構造を持つ系CaCu_2O_3において熱伝導率の異常な異方性が測定された。この結果は,低次元スピン系における熱伝導とスピン自由度の関係について新たな興味を集める契機となった。さらに,東大物性研・藤原氏との共同研究において,Sr_2Ca_<12>Cu_<24>O_<41>の超伝導状態でのNMR測定にはじめて成功し,この系の超伝導がコヒーレンスピークを持つということを明らかにした。最後に,最終目的である,超伝導などのエキゾティックな物性を発現する1次元量子スピン系の発見については,残念ながら実現しなかった。これについては,今後個人として継続して挑戦していきたい。
活性酸素によるヒト白血球病幹細胞の増殖制御機構の解析と治療への応用

白血病の治療は抗癌剤による化学療法が主体であるが、時として致命的な合併症や副作用が問題となる。近年、白血病に対す分子標的療法が注目されているが、本研究においてはより侵襲の少ない新たな白血病に対する分子標的療法の確立を目的とした研究を展開した。緑茶成分EGCGは活性酸素(ROS)を産生し、ミエロペロキシダーゼ(MPO)を介して最終的にはDNA障害活性の強いヒドロキシラジカルを産生することでヒト骨髄性白血病細胞のアポトーシスを誘導した。そこで、白血病の治癒を目的として、CD34陽性CD38陰性分画より、ヒト白血病幹細胞(LSC)を単離し、EGCGによるヒトLSCに対する効果を検討し、白血病に対する新たな分子標的療法確立のための基礎的な検討を行った。本研究は、活性酸素によるヒト白血病幹細胞(LSC)の増殖制御機構を明らかにし、LSCを標的とした新たな治療法確立を目的とした。本年度は、まず活性酸素の白血病細胞に対する増殖制御機構について検討した。緑茶成分カテキン誘導体EGCGは、活性酸素の産生を介して、白血病細胞のアポトーシスを誘導した。種々の白血病細胞を用いた検討により、EGCGは骨髄性白血病に感受性が高く、この際ミエロペロキシダーゼ(MPO)が重要な意義を有することが明らかになった。すなわち、MPO陰性K562細胞に完全長のMPO cDNAを導入し、MPO過剰発現株を樹立するとEGCGへの感受性を獲得した。また、MPO活性を欠如したドミナントネガティブフォーム導入株では、EGCGの作用はキャンセルされた。活性酸素による白血病細胞のアポトーシス誘導におけるMPOの意義について検討したところ、骨髄性白血病細胞に発現するMPOは、EGCGにより産生される過酸化水素を強力なDNA障害活性を有するヒドロキシラジカルに変換することで、直接白血病細胞のアポトーシスを誘導することが明らかになった。白血病の治癒を目指すにはLSCを根絶する必要があるため、上記の結果に基づき骨髄性白血病患者骨髄よりCD34^+CD38^-分画を分離精製し、EGCGの感受性を検討するとともに、感受性を規定する分子の同定を行った。次年度は、LSCにおけるMPO発現と活性酸素によるアポトーシス誘導の相関関係の有無を明らかにし、さらに免疫不全マウスにLSCを移植することでヒト白血病モデルマウスを樹立し、活性酸素による白血病治療の可能性についてin vivoにて検討する予定である。本研究は活性酸素(ROS)によるヒト白血病幹細胞(LSC)の増殖制御機構を明らかにし、LSCを標的にした新たな治療法を確立することを目的としている。申請者はすでに緑茶成分EGCGがROSを産生し白血病細胞のアポトーシスを誘導することを見いだしている。この際、EGCGはミエロペロキシダーゼ(MPO)を触媒とし、過酸化水素を強力なDNA障害活性を有するヒドロキシラジカルに変換し、白血病細胞のDNAを直接傷害し、アポトーシスを誘導した。また、ROSはdeath receptorであるFasを誘導する活性も有し、セカンドメッセンジャーとしての作用を有することも明らかにした。EGCGはMPO活性を有する骨髄性白血病のみにRosを産生しアポトーシスを誘導した。骨髄性白血病細胞のMPO活性を阻害剤やsiRNAなどの種々の方法で抑制することでEGCGの感受性は低下した。一方、MPOが発現していないK562細胞に対して、MPO cDNAを強制発現させることでEGCGに対する感受性は回復した。したがって、EGCGによる白血病細胞のアポトーシスにMPOは必須であることが明らかになった。今年度はMPO活性と白血病細胞のアポトーシス誘導の臨床的な意義を明らかにするために、急性骨髄性白血病(AML)患者細胞のMPO活性と予後の関係を検討した。AML症例においてはMPO活性と予後は相関し、MPO高発現症例では化学療法剤によるROS産生が充進し、化学療法剤に対する感受性が増強されることを明らかにした。さらに、白血病患者細胞よりCD34^+CD38^-墨分画を分離精製し、幹細胞としての特性を有することを明らかにした。この分画における細胞は、EGCGに対して感受性を有し、濃度依存性にアポトーシス誘導を介して増殖が抑制された。
糖鎖修飾によるAMPA受容体の発現調節機構の解明

糖鎖に関する研究は、その多様性に加え、機能解析があまりにも煩雑であるため、腫瘍マーカーへの利用などを除き、体系的な研究はほとんどなされていない。最近、我々の研究室では、AMPA型グルタミン酸受容体のサブユニットの一つであるGluA1の糖鎖修飾が細胞膜への発現制御に関与することを報告したが、詳細なメカニズムについては未だ不明である。そこで本研究では、受容体分子の合成から分解までの素過程を一分子動態解析により解明することを目指す。本研究は、神経細胞における機能分子の発現制御という糖鎖の新たな役割の一端を拓くものと考える。
キノイド化合物を利用した固相重合反応と構造制御

置換キノイド化合物(置換キノジメタン化合物、置換キノンメチド化合物、置換キノンメチドイミン化合物)の結晶や共結晶の結晶構造解析とそれらの固相重合反応生成物の解析を基に結晶中における分子間相互作用と固相重合反応性との関係を明らかにした。また、種々の置換キノンメチド化合物を合成し、それらの固相重合と溶液重合を行い生成ポリマーの一次構造制御について議論した。種々のアルコキシ基を有する7,7,8,8-テトラキス(アルコキシカルボニル)キノジメタン類(RCQ)が電子受容性の強いテトラシアノキノジメタン(TCNQ)との電荷移動相互作用を利用して電荷移動錯体共結晶を作製し、その固相重合反応性と結晶構造について調査した。直鎖のアルキル基を有するRCQはTCNQと赤色・橙色の柱状結晶を形成した。一方、枝分かれ構造や長鎖アルキル基、末端に大きな原子を有するRCQを用いた場合、TCNQとの共結晶は得られず、RCQの置換基の立体障害が共結晶形成の妨げになることが分かった。得られた共結晶は光照射または加熱によりトポケミカル重合が起き、有機溶媒に不溶な淡桃色結晶が得られた。単結晶X線構造解析より共結晶の結晶構造はいずれもRCQとTCNQが約60°ねじれて交互にスタッキングしており、光照射または加熱により交互共重合体を生成していることが明らかになった。また、これまでに見出しているキノジメタン類が示すトランス特異的なトポケミカル重合とは異なり、RCQとTCNQがそれぞれ逆方向に回転することで結合を形成するシス特異的なトポケミカル共重合を示す初めての例を見出した。シアノ基とアルコキシカルボニル基、ハロゲン置換フェニル基を有する置換キノンメチド化合物の光学活性開始剤を用いた光学活性ポリマー合成と構造制御について検討した。(-)-Spと(-)-PhBox不斉配位子/リチウムイソプロピルフェノキシドを開始剤とした不斉アニオン重合を行った。不斉配位子に(-)-Spを用いた場合、値は小さいものの、負の旋光度を有するポリマーが、(-)-PhBoxを用いた場合には他の系と比べて非常に大きな正の比旋光度を有するポリマーが得られた。生成ポリマーの比旋光度の値への開始剤濃度や溶媒の極性の効果から、成長鎖末端の会合体の形成が立体制御に大きく影響していることが示唆された。重合の初期生成物である1量体、2量体の立体選択性について検討した結果、光学活性ポリマー主鎖中の不斉炭素の絶対配置は、おおよそ2:1程度の割合で制御されていることが分かった。1)溶解性を付与し構造解析を可能にするため長鎖アルコキシカルボニル基(C18)を有する置換キノジメタン化合物(1a)とパーフルオロフェノキシ基を有する置換キノジメタン化合物(1b)を合成し、テトラシアノキノジメタン(TCNQ)との共結晶作成を検討した。1a/TCNQの共結晶は得ることが出来なかったが、1b/TCNQの共結晶は得ることができ、種々の検討からトポケミカル共重合することが分かった。しかし、有機溶媒に不溶であること、結晶構造解析可能に結晶が得られなかったため明確な構造についての知見は得られなかった。新規に合成したアセトキシエチル基を2,5位に有するTCNQ誘導体がメトキシカルボニル基を有する置換キノジメタン化合物(1c)との共結晶を形成することを見出し、その固相重合反応性と結晶構造解析を行った。結晶中での分子配列はトポケミカル共重合が起きた系と同様のスタッキング構造を取っていたが、重合は起きなかった。反応点の重なりの程度の違いによることが明らかになった。2)プロキラルモノマーとして種々のアルキル基を7位に有する置換キノンメチド化合物を合成し、不斉配位子/アニオン開始剤系を使用した不斉アニオン溶液重合による不斉誘導を検討した。5種類のアルキル基(Me,Et,iPr,t-Bu)を有するモノマーの合成を行ったがiPr基を有するキノンメチド化合物のみが純粋なモノマーとして単離可能であった。また、そのモノマーの不斉重合を検討したところポリマー中に不斉が導入でき光学活性なポリマーが得られた。フェニル基を有するモノマーとは反対の光学活性を示し、7位置換基により制御様式が異なる可能性を見出した。固相重合を試みたが、重合は起きなかった。3)光学活性置換基をエステル部位に導入した置換キノイド化合物を合成し、溶液重合するとポリマー主鎖中に不斉が誘起されることを見出した。しかし、光学活性置換基は嵩いため解重合が起き高分子量のポリマーは得らなかった。また、光固相重合ではポリマーは得られなかった。

1)メトキシ(1a)、エトキシ(1b)、パーフロロフェノキシ基(1c)を有する7,7,8,8-テトラキス(アルコキシカルボニル)キノジメタン(1)とキノン類(1,4-ベンゾキノン(BQ)、p-クロラニル(PCA)、DDQ)、キノンジイミン(2)、N-シアノ-7,7-ジシアノキノンメチドイミン(BMI)との共結晶作製を検討した。1a/DDQ, 1b/DDQ, 1a/BMI, 1b/BMI及び1c/BMI系で共結晶を得ることが出来た。1a/DDQと1b/DDQ系共結晶の熱固相重合は溶融重合であり、光固相重合は進行しなかった。結晶構造解析から、結晶中で分子は重合が進行する交互積層配列にはなっていないことが原因であることが分かった。1a/BMI, 1b/BMI及び1c/BMI系の共結晶では、結晶の形を維持しながら熱及び光で固相重合が進行した。粉末X線測定から、非晶質の交互共重合体が生成し、トポケミカル共重合ではなかった。1a/BMI系共結晶の結晶構造解析から、分子は結晶中で交互積層配列しているが、一方向に直線的に一軸上には並んでいないことが原因であることが明らかになった。トポケミカル共重合が起きる条件は、結晶中で分子が交互積層し、一軸方向に直線的に配列し、反応点間距離が、4Å以下であることが明らかとなった。2)エステル基として光学活性な(l-メンチル基)を有する7-シアノ-7-(アルコキシカルボニル)-1,4-キノンメチドを合成し、その光固相重合を検討した。収率は低いが、不斉アニオン重合(Mn=2000)で検討した場合に比較し分子量が高く(Mn=4600)かつ旋光度の大きな重合体を得ることができた。主鎖への不斉誘導の可能性を示す結果が得られたが、光学活性基脱離することが出来ず不斉誘導の程度を決定することはできなかった。また、良質の単結晶を得ることが出来ず結晶構造解析も出来なかった。溶液での重合は順調に進んでいるが、長鎖アルコキシ基を有する置換キノイド化合物からの共結晶が得られず結晶構造、固相重合が進んでいない。また、重合に適した配列に関する知見を得るために、新規に合成したテンプレート分子とキノイド化合物が共結晶を形成しないケースがほとんどで、テンプレート分子を用いてキノイド化合物を重合に適した配列に並べる検討が進んでいない。24年度が最終年度であるため、記入しない。構造解析を可能にするためさらに異なる鎖長アルコキシカルボニル基を有する置換キノジメタン化合物を合成し、TCNQとの共結晶生成を調査する。さらに、TCNQ誘導体との共結晶生成についても検討を行う。共結晶が得ちれた場合には、それらの光、電子線照射下での固相重合と熱固相重合を種々の条件で調査し、重合反応生成物の解析を行う。光学活性置換基をエステル部位に導入した置換キノイド化合物を合成し、光、電子線射下での固相重合と熱固相重合による主鎖中への不斉誘導を検討する。
不連続面を有する斜面の安定性評価に関する研究

本研究では新規開発した現場せん断試験装置を用いて斜面内に潜在する不連続面に沿った土のせん断強度特性を調べた。得られた知見は以下のとおりである。(1)関門層群堆積岩からなる切土斜面の崩壊事例を綿密に調査し,崩壊・非崩壊を分ける要因として強風化・黒色薄層土・褶曲構造などの他に断層面の存在があることを指摘した。(2)垂直応力やせん断速度などの影響を検討するため,試験条件を制御しやすい実験室内において050°の範囲で任意の傾斜角を設定できる室内模型地盤とその上に設置する超簡易現場せん断試験装置を試作した。本装置では模型地盤容器の取り外しが可能であり,不連続面を壊すことなく不撹乱試料を採取することができる。(3)平成16年度に山口県内で発生した斜面崩壊の現地調査を行い,従来の指摘のとおり斜面内の不連続面で表層崩壊が発生していたことを明らかにした。そして,実際の崩土およびまさ土を用いて超簡易現場せん断試験を実施し,その結果を一面せん断試験結果と比較し,本試験のせん断強度の信頼度ならびに適用限界を検討した。また,傾斜模型地盤において実際の崩壊斜面と同じ傾斜角を付加した状態でのせん断挙動および強度特性を検討した。主な結論として,超簡易現場せん断試験の結果の解釈では土試料の原粒度に対して注意を要することが明らかになった。(4)厚さ11.5mの表層崩壊に関する素因として不連続面の他に樹木根系を取り上げた。現地で採取した表層土の根系の分布を調べ,その含根率を基に根系を混入させた一面せん断試験を実施した。また,根系の代替材として麻紐をまさ土に混入した試料も使用した。試験結果に基づき根系の補強メカニズムを検討した。主な結論として,根系の補強効果は内部摩擦角の増加よりもむしろ粘着力の増加に起因すること,低い拘束圧下にある方が発揮されやすいことが明らかになった。平成15年度の研究成果は下記13の項目から構成され,以下にその概要を記載する.1.室内傾斜地盤と小型現場せん断試験装置の製作本研究の目的の一つは,小型現場せん断試験装置(幅15cm×長さ60cm×高さ50cm,総質量6.2kg)の性能検定と改良を行うことである.本項目では,垂直応力の大きさやせん断応力の載荷速度などの影響を検討するため,試験条件を制御しやすい実験室内において050°の範囲で任意の傾斜角を設定できる室内模型地盤とその上に据え付ける小型現場せん断試験装置を製作した.2.関門層郡風化土の断層における斜面崩壊の現地調査と土質試験の実施本項目では,不連続面を有する斜面崩壊の一例として平成15年3月に山口県豊田町で発生した切土法面の崩壊を取り上げ,崩壊斜面の現地調査および採取した土試料の物理試験および一面せん断試験の結果,さらに他の関門層群切土崩壊との比較により本崩壊の機構について検討した.今回の切土斜面の崩壊に関しても,提案した危険因子の表により,崩壊の発生・非発生を概略判定できることを確認し,強風化,黒色薄層土,摺曲構造などの要因に加え,不連続面の一つの断層面の存在により安定性が低下したことが崩壊の引き金になったと結論付けた.3.根系を含む表層土の一面せん断試験法の確立本項目では,現地で採取した表層土の根系の分布を調べ,その含根率を基に根系を混入させた一面せん断試験を実施した.

さらに,まさ土に根系の代替材として麻紐を混入させて一面せん断試験を実施した.両試料の試験結果に基づいて,根系の補強効果とその機構について検討した.主要な結論は以下のとおりである.(1)補強効果は内部摩擦角の増加よりもむしろ粘着力の増加に起因するものと考えられる.(2)高い拘束圧下より低拘束圧下の方が根系の影響は発揮されやすい.僅少な降雨においても斜面内に不連続面が潜在すれば,それが弱面となって容易に斜面崩壊が発生する.本研究課題の目的は,新規開発した傾斜模型地盤上の原位置せん断試験装置を用いて不連続面に沿った土のせん断強度特性を解明することである.平成15年度に開発着手した室内傾斜模型地盤における超簡易現場せん断試験装置は模型地盤容器を取り外し可能とすることで,不連続面を壊すことなく不撹乱試料を採取することができる.また,傾斜角を自由に設定できるため,実際の斜面と同じ傾斜角での試験実施が可能となる.平成16年度は,全国的に豪雨災害や地震災害に見舞われ,山口県においても梅雨期および台風通過時に斜面崩壊が頻発した.これら土砂災害に対する現地調査を行った結果,従来の指摘のとおり斜面内の不連続面で表層崩壊が発生していた.そこで,平成16年梅雨期の集中豪雨による岩国市下の崩壊事例を取り上げ,粘土・シルト分を多く含む同現場試料および中国地方における代表的土試料として宇部まさ土を用いて,超簡易現場せん断試験によってせん断強度を測定するとともに,試験結果を一面せん断試験の結果と比較することにより,試作装置から得られた強度定数の精度ならびに試験の適用限界について検討した,また,傾斜模型地盤において実際の崩壊斜面と同じ傾斜角を付加した条件での超簡易現場せん断試験におけるせん断挙動および強度特性を検討し,これらに及ぼす傾斜角の付加の影響を考察した.本研究の主な結論を要約すると,砂分が多く粒径分布が比較的広い試料において試験結果の誤差が顕著であったことから,超簡易現場せん断試験結果を大きく左右する要因として土試料の粒径つまり粒径分布が挙げられる.したがって,超簡易現場せん断試験を実施する場合,対象土質の粒度に十分注意する必要がある.
IoTとAIで実現する患者習熟度に応じて最適化するバーチャルリアリティ鏡治療

我々が開発したバーチャルリアリティ(VR)鏡治療では、治療内容は患者の習熟度が向上しても変化しなかった。同じ治療タスクの繰り返しでは患者の治療意欲の維持が難しい。当該研究では、IoT(モノのインターネット)とAI(人工知能)により、患者の症状と習熟度に応じた治療タスクのカスタマイズ(最適化)や、患者の治療意欲の向上に有効な激励・教育を行うシステム開発を目指す(研究1)。一方VR鏡治療の開発当時はVR関連技術が発展途上で、バーチャル酔いなどの問題でヘッドマウンテッドディスプレー(HMD)の疼痛患者への導入は尚早だと考えた。しかし昨今のVR技術の進歩は目覚ましく、安価なシステム構築が可能となったため、当該研究では、HMDを用いたVR鏡治療システムを開発する(研究2)研究1:VR鏡治療へ実装する、患者の治療意欲の維持を図るシステムの検討として、平成29年度は、患者の治療成果を視覚化し、フィードバックするシステムを作成し単調作業の継続的な実施に与える効果を健常者において検討した。平成30年度はこの取り組みを発展させ、コンピュータ上での単調作業において、間接的な否定フィードバックの「諭し」と直接的な否定フィードバックの「警告」の影響を健常者において検討した。研究2:HMDを用いたVR機器が低価格化してきている。そこで我々は、コントローラによって使用者の手の位置情報を光センサにより検出できるVINEシステムを用いて、コントローラの動きに応じて仮想空間内の物体をハンドリングするHMDを用いたVR鏡治療システムを、Unity開発環境を用いて構築した。このシステムでは、最初の鏡治療タスクとして、ジグザクに配置された坂を転がるボールを、途中あるいは坂の下部で掴んで、坂の上部あるいは途中から転がすタスクを実装した。現状では、仮想空間でのコントローラの描画を仮想の腕とするには至っていないが、タスクが実行できることを確認している。研究1:当該研究の最終的な目標は、IoT(モノのインターネット)とAI(人工知能)により、患者の症状と習熟度に応じた治療タスクのカスタマイズ(最適化)や、患者の治療意欲の向上に有効な激励・教育を行うシステム開発である。平成29年度に引き続き平成30年度も特に後者の患者治療意欲の維持にはどのような仕組みの実装が有効であるかの検討に時間を要したため、研究計画全体での進捗状況に遅れが生じてしまった。研究2:昨今のVR関連機器の進歩は目覚ましく、様々な機器メーカーより多数の製品が発表されている。それぞれの製品で、仮想空間への現実空間での情報を反映させる方法が異なっており、我々の研究対象である、健常者ではない「重篤な痛みを有する難治性疼痛患者」が実施するVR鏡治療システムに最も適した製品の検討とVR-MVFタスクの実装に時間を要した。また、Unityによる仮想空間での仮想の腕や手のモデル作成に時間を要している。最終年度である平成31年度は、それぞれのシステムを難治性疼痛患者へ導入し、システムが想定通りに稼働するかの検証を行う予定である。IoT&AIで最適化するVR鏡治療では、先ず、平成30年度に検討した、患者の治療意欲の向上に有効な激励・教育のシステムの実装を完了させる。次に、最適化内容の妥当性や最適化によるアップデートが患者の治療意欲や鎮痛効果、および機能改善などへ及ぼす影響について臨床的な検証を行う。平成29年度および30年度も残念ながら当該研究を予定どおりに進捗させることができず、その一部は最終年度である平成31年度にずれ込みこととなる。遅れの部分を早急に完成させ、平成31年度以降の研究計画を予定通りにすすめていく。研究進捗状況の遅れには、研究責任者・所属機関の変更も一因となったが、現在は研究体制もしっかり整っており、当該研究の予定通りの進捗を目指す。我々が開発したこれまでのバーチャルリアリティ(VR)鏡治療では、治療内容は患者の習熟度が向上しても変化しなかった。一方VR鏡治療の開発当時はヘッドマウンテッドディスプレー(HMD)を含めたVR関連技術が発展途上であり、バーチャル酔いなどの問題で疼痛患者への導入は尚早だと考えた。しかし昨今のVR技術の進歩は目覚ましく、また普及にともない比較的安価にシステムを構築することが可能となったため、当該研究では、HMDを用いたVR鏡治療システムを開発する(研究2)研究1:VR鏡治療へ実装する、患者の治療意欲の維持を図るシステムの検討として、平成29年度は、患者の治療成果を視覚化し、フィードバックするシステム(セルフモニタリング・システム)を作成した。そのシステムが単調作業の継続的な実施に与える効果を調べるため、まず、健常者において実験を行った。この予備実験の結果からは、「ポジショニングの明確化」や「短期目標設定」を用いたセルフモニタリング画面がユーザーの単調作業の継続的実施に有効であることが示唆された。研究2:現在、VR機器として多くのものが市販されている。我々は、2台のカメラによって使用者の位置情報を検出することで腕が移動するといった動作が仮想空間に反映させることができるHTC viveを選択して、HMDを用いたVR鏡治療システムを開発を行った。

研究1:当該研究の最終的な目標は、IoT(モノのインターネット)とAI(人工知能)により、患者の症状と習熟度に応じた治療タスクのカスタマイズ(最適化)や、患者の治療意欲の向上に有効な激励・教育を行うシステム開発である。平成29年度は特に後者の患者治療意欲の維持にはどのような仕組みの実装が有効であるかの検討に時間を要したため、研究計画全体での進捗状況に遅れが生じてしまった。研究2:昨今のVR関連機器の進歩は目覚ましく、様々な機器メーカーより多数の製品が発表されている。それぞれの製品で、仮想空間への現実空間での情報を反映させる方法が異なっており、我々の研究対象である、健常者ではない「重篤な痛みを有する難治性疼痛患者」が実施するVR鏡治療システムに最も適した製品を検証することに時間を要した。さらに、当該年度の中途で、研究責任者の所属機関が変わることとなり、研究会議の定期的開催の再開など、研究体制の整備に時間がかかったことも進捗状況の遅れに影響があったことは否定できない。我々が開発したバーチャルリアリティ(VR)鏡治療では、治療内容は患者の習熟度が向上しても変化しなかった。同じ治療タスクの繰り返しでは患者の治療意欲の維持が難しい。当該研究では、IoT(モノのインターネット)とAI(人工知能)により、患者の症状と習熟度に応じた治療タスクのカスタマイズ(最適化)や、患者の治療意欲の向上に有効な激励・教育を行うシステム開発を目指す(研究1)。一方VR鏡治療の開発当時はVR関連技術が発展途上で、バーチャル酔いなどの問題でヘッドマウンテッドディスプレー(HMD)の疼痛患者への導入は尚早だと考えた。しかし昨今のVR技術の進歩は目覚ましく、安価なシステム構築が可能となったため、当該研究では、HMDを用いたVR鏡治療システムを開発する(研究2)研究1:VR鏡治療へ実装する、患者の治療意欲の維持を図るシステムの検討として、平成29年度は、患者の治療成果を視覚化し、フィードバックするシステムを作成し単調作業の継続的な実施に与える効果を健常者において検討した。平成30年度はこの取り組みを発展させ、コンピュータ上での単調作業において、間接的な否定フィードバックの「諭し」と直接的な否定フィードバックの「警告」の影響を健常者において検討した。研究2:HMDを用いたVR機器が低価格化してきている。そこで我々は、コントローラによって使用者の手の位置情報を光センサにより検出できるVINEシステムを用いて、コントローラの動きに応じて仮想空間内の物体をハンドリングするHMDを用いたVR鏡治療システムを、Unity開発環境を用いて構築した。このシステムでは、最初の鏡治療タスクとして、ジグザクに配置された坂を転がるボールを、途中あるいは坂の下部で掴んで、坂の上部あるいは途中から転がすタスクを実装した。現状では、仮想空間でのコントローラの描画を仮想の腕とするには至っていないが、タスクが実行できることを確認している。
SLE患者自己抗体産生B細胞でのRAG発現不全の解析とその治療応用

SLEでの自己抗体産生にはレセプターエディティング(RE)の不調が関わる。REの不調にRAG発現が関与するのかを検討した。SLEB細胞では非刺激状態でB細胞にRAG1,RAG2を過剰に発現しており、SAC+IL-2刺激による発現の増強を認めなかった。この成績はループスモデルマウスB細胞で報告されているRAG過剰発現と一致した成績である。SLE患者B細胞から抗DNA抗体産生B.細胞を分離した。方法はビオチン化DNAを患者B細胞と反応させた後、磁力を用いてDNA結合B細胞と非結合B細胞に分離した。DNA非結合B細胞はRAGを過剰に発現し、SAC+IL-2刺激後もRAGは持続的に発現していた。一方、DNA結合B細胞は非刺激状態でもSAC+IL-2刺激を行ってもRAGの発現を認めることはなかった。同様に、DNA非結合B細胞はRAGmRNAを過剰に発現した。DNA結合B細胞では非刺激でもSAC+IL-2刺激を加えてもRAGmRNAの発現は認めなかった。即ちSLE患者の抗nNA抗体産生B細胞はRAGを発現できないことが示された。SLE抗DNA抗体産生B細胞がRAGの発現を経てアポトーシスに陥ることがあるのかAnnexinVを用いて検討した。RAGを恒常的に発現しているDNA非結合B細胞にはアポトーシス細胞を認めた。これに対してRAGを全く発現しないDNA結合B細胞はアポトーシスに陥らなかった。即ち、DNA結合B細胞はRAGを発現せず、REを起こさず、アポトーシスにもならず生体内で存続し続けることが示された。この成績は、SLE患者抗DNA抗体産生B細胞ではRAGは発現されず、REもアポトーシスも起こらずSLE患者抗DNA抗体産生B細胞は自己抗体遺伝子の産生が持続することを示している。即ちSLE患者B細胞は過剰にRAGを発現しているにもかかわらず、SLE患者抗DNA抗体産生B細胞ではRAGの発現は全く認められない。このためにSLE患者抗DNA抗体産生B細胞は自已反応性B細胞レセプターがREを起こすことなく、またアポトーシスで除去されることもなく、抗DNA抗体産生を維持することで、SLEの病態形成に至ると考えられた。本年度は、まず初めに全身性エリテマトーデス(SLE)患者の末梢血から多数のEBウイルスでトランスフォームしたB細胞株を樹立し、これらを用いて、SLE患者B細胞株でのRAG発現とCD40を初めとする種々のアクセサリー分子の発現を検討した。これらのB細胞株の一部はクローニングできたが、残りの細胞株ではクローニングが十分行えておらず、single cell levelでの抗原特異性の同定は十分行えていない。しかしながらSLE患者B細胞株ではRAG発現は様々であり、必ずしも全ての細胞においてRAG発現が亢進しているわけではなかった。この点はこれまでの他の研究室からの報告とは異なっていた。

さらにSLE患者の末梢血B細胞を高度に精製した後、DNA-ビーズとの結合性からDNA結合B細胞、すなわち抗DNA抗体産生B細胞とそれ以外を産生する非DNA結合B細胞に分画した。DNA結合B細胞では、非刺激状態でRAGの発現が低下していた。さらにDNA結合B細胞を抗CD40抗体やStaphylococcus aureus Cow an Iなどの刺激とIL-2,IL-4,Il-10などのサイトカイン刺激を組み合わせたが、どのような組み合わせでも、SLE患者末梢血抗DNA抗体産生B細胞に適切なかたちでRAGを誘導することは、難しかった。そこで、RAG発現が低下しているEBウイルスでトランスフォームB細胞株を用いてRAG1とRAG2の発現ベクターを導入し、強制的なRAGの遺伝子発現がB細胞の抗原特異性を変えることができるのかの検討を始めている。SLEでの自己抗体産生にはレセプターエディティング(RE)の不調が関わる。REの不調にRAG発現が関与するのかを検討した。SLEB細胞では非刺激状態でB細胞にRAG1,RAG2を過剰に発現しており、SAC+IL-2刺激による発現の増強を認めなかった。この成績はループスモデルマウスB細胞で報告されているRAG過剰発現と一致した成績である。SLE患者B細胞から抗DNA抗体産生B細胞を分離した。方法はビオチン化DNAを患者B細胞と反応させた後、磁力を用いてDNA結合B細胞と非結合B細胞に分離した。DNA非結合B細胞はRAGを過剰に発現し、SAC+IL-2刺激後もRAGは持続的に発現していた。一方、DNA結合B細胞は非刺激状態でもSAC+IL-2刺激を行ってもRAGの発現を認めることはなかった。同様に、DNA非結合B細胞はRAGmRNAを過剰に発現した。DNA結合B細胞では非刺激でもSAC+IL-2刺激を加えてもRAGmRNAの発現は認めなかった。即ちSLE患者の抗DNA抗体産生B細胞はRAGを発現できないことが示された。SLE抗DNA抗体産生B細胞がRAGの発現を経てアポトーシスに陥ることがあるのかAnnexinVを用いて検討した。RAGを恒常的に発現しているDNA非結合B細胞にはアポトーシス細胞を認めた。これに対してRAGを全く発現しないDNA結合B細胞はアポトーシスに陥らなかった。即ち、DNA結合B細胞はRAGを発現せず、REを起こさず、アポトーシスにもならず生体内で存続し続けることが示された。この成績は、SLE患者抗DNA抗体産生B細胞ではRAGは発現されず、REもアポトーシスも起こらずSLE患者抗DNA抗体産生B細胞は自己抗体遺伝子の産生が持続することを示している。即ちSLE患者B細胞は過剰にRAGを発現しているにもかかわらず、SLE患者抗DNA抗体産生B細胞ではRAGの発現は全く認められない。このためにSLE患者抗DNA抗体産生B細胞は自已反応性B細胞レセプターがREを起こすことなく、またアポトーシスで除去されることもなく、抗DNA抗体産生を維持することで、SLEの病態形成に至ると考えられた。
生体モータ分子構造変化の可視化を目指すシリコンナノ構造と分子の特異的結合技術

モータータンパク質の動きを観察するために、最も一般的な方法は、ビーズを付着させ、これを目印とすることである。変位の観察は容易であるが、回転の動きは、ビーズが対称形であるため、観察が困難である。そのような場合には、針状の構造を目印とすることが望まれる。そのような構造について、以下の条件が要求される。(1)数100万個ほどの針状構造を迅速かつ容易に製作する必要がある。(2)針の直径(100-200ナノメートル)と長さ(1-2マイクロメートル)は、加工精度が十分で、それぞれが均一でなければならない。(3)局所的にタンパク質を付着するため、付着面の材質の検討が必要となる。平成16年度の研究により、直径100nm200nm、長さ12ミクロンの柱状構造の端部に金修飾を施した構造を提案した。この際パターニング材としてナノビーズを用い、ポリスチレンビーズをマスクとして用い金の加工を行い、引き続いてシリコンマイクロマシーニングを行い、超音波加工によって百万個以上の構造を一度に製作することができるようになった。前年度の研究では、得られた針を、分子モーターのF1に接着するところまでの成果が得られた。しかしながら、成功率は大変低いものであった。理由は柱の端部の金薄膜が機能化されていなかったため、F1に特異的に接着できずランダムにそこかしこに付着する結果となっていた。本年度は端部金薄膜の機能化に取り組み、金→自己組織化単分子膜(Self Assembled Monolayer)→ビオチン(Biotin)→ストレプタビジン(Streptavidin)修飾をおこなった。分子修飾は超音波リリースの前に行った。また、分子修飾の前に真空アニールプロセスをはさみ、金とシリコンの密着性を改善した。このことにより、F1モーターへの針の付着確率を50%にまで大きく高め、モーターの回転運動の観察に成功した。収率が向上したことを受け、引き続き、ストレプタビジンが端部の金にのみ選択的に付着し、シリコンに付着していないことを確認した後、針を直線運動型のKIF1Aモーターに付着させて分子モーターの動作の可視化を行う予定である。最初の製作プロセスについて、TRANSDUCERS'03会議で発表した。しかし、良好な局所的な付着表面を得るのは難しかった。微細加工技術を使った、2番目の簡単で迅速な製作プロセスは、MEMS'04会議で発表した。この独自技術は200ナノメートルの直径の、何百万ものポリスチレンナノビーズを使う。そして、針の製作のためのマスクとして、金の薄膜で覆われるシリコンウエハーの上に散布する。ビーズマスクを通して金とシリコンのエッチングの後、140ナノメートルの直径のシリコンナノ針を製作できる。金の薄膜に、タンパク質がよく付着し、全体の構造高さは1.5マイクロメートルとなる。表面から柱状構造を分離するために、超音波洗浄器を用いる。大量のナノ針を一度に製作することができ、プロセスの効率が向上した。回転方向に動いているF1モータータンパク質にナノ針を付着させる最初の実験で、ナノ針がタンパク質の回転のよい目印となり、視覚認識ができることがわかった。つぎに、直線的に動くKlF1Aモータータンパク質に適用したところ、直線的に動きながら、回転の動きも観察された。

理由は柱の端部の金薄膜が機能化されていなかったため、F1に特異的に接着できずランダムにそこかしこに付着する結果となっていた。本年度は端部金薄膜の機能化に取り組み、金→自己組織化単分子膜(Self Assembled Monolayer)→ビオチン(Biotin)→ストレプタビジン(Streptavidin)修飾をおこなった。分子修飾は超音波リリースの前に行った。また、分子修飾の前に真空アニールプロセスをはさみ、金とシリコンの密着性を改善した。このことにより、F1モーターへの針の付着確率を50%にまで大きく高め、モーターの回転運動の観察に成功した。収率が向上したことを受け、引き続き、ストレプタビジンが端部の金にのみ選択的に付着し、シリコンに付着していないことを確認した後、針を直線運動型のKIF1Aモーターに付着させて分子モーターの動作の可視化を行う予定である。