hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
磁場印加中加熱による強磁性熱分解炭素の作製と物性

6テスラまでの磁場印加熱分解により、熱分解炭素試料を作製し、その磁気特性を調べた。熱分解生成物から、室温でも強磁性の試料を得ることができた。その最大自発磁化は300Kで3.0emu/gであった。SPring-8の放射光X線回折実験により、その結晶構造を調べた。強磁性試料については、ダイアモンド構造のピークが観測された。これより、ダイアモンド構造中の欠陥により、ラジカルスピンの強磁性秩序が起きた可能性がある。ダイアモンドピーク強度は試料合成の際の印加磁場に応じて増大した。したがって、炭素系磁性体の中で3次元強磁性構造を形成するのを磁場が補助しているのかも知れない。また、ダイアモンド粉末を入れて6テスラの磁場印加熱分解を行うことにより、300Kで6.4emu/gのより高い磁化を示す強磁性試料が得られた。強磁性熱分解炭素の結晶成長はダイアモンド粉末上で促進されたのかも知れない。これは、上で述べた放射光X線回折実験結果と矛盾しない。通常、炭素を主成分とした有機物質では結合性軌道に反対向きのスピンを持つ電子が2個入り、磁気モーメントが消失する。したがって、ほとんどの有機物質は磁性を示さない。しかし、近年、室温でも強磁性を示す熱分解有機物について報告され、我々のグループで追試実験を行ったところ、トリエチルアミンを800°C1000°Cで熱分解する事により微量(-mg)の強磁性炭素質試料が得られることを確認した。その磁化は10^<-1>emu/g程度である。また、この強磁性試料を800Kまで磁化測定を行い、室温に戻したところ、自発磁化が増大していることを見いだした。他の強磁性試料についても、石英管中に真空封入を行い、670K付近で磁場中熱処理を行うことにより、室温での磁化が10%程度上昇することを確認した。このように、熱分解で得られた試料を磁場中熱処理することにより自発磁化が増大することから、最初の熱分解の段階で磁場を印加しておくことにより、強磁性試料の収率および磁化値が向上することが期待される。本研究は、磁場印加熱分解により室温で強磁性を示す炭素質試料を効率よく作製することを目的とする。まずは、磁場印加の効果を調べるため、磁気回路を熱分解石英管に設置し、トリエチルアミンを原料として熱分解炭素を作製したところ、熱分解生成物の中から強磁性試料が得られた。その際、磁気回路を熱分解石英管に設置した場合の方が強磁性試料の収量が増大した。予想通り、磁場は、トリエチルアミン蒸気に影響を及ぼしているようである。また、物質・材料研究機構強磁場共用ステーションに設置されている大口径超伝導磁石を利用させてもらい、合成系の基本的な部分を構築した上で試験運転を開始した。しかし、近年、室温でも強磁性を示す熱分解有機物について報告され、我々のグループで追試実験を行ったところ、トリエチルアミンを800°C1000°Cで熱分解する事により微量(mg)の強磁性炭素質試料が得られることを確認した。物質・材料研究機構強磁場共用ステーションに設置されている大口径超伝導磁石を利用させてもらい、磁場印加熱分解実験を行った。2テスラの磁場中で作製した強磁性試料は室温において1.3emu/gの自発磁化を示した。

これは無磁場熱分解で作製した強磁性試料のチャンピオンデータの2倍程度の大きさである。したがって、熱分解時に磁場を印加することにより、熱分解炭素内での強磁性構造の形成が促進されているのかも知れない。この強磁性炭素の結晶構造を調べるため、大型放射光施設SPring-8での放射光X線回折測定実験を申請した。前年度に引き続き、物質・材料研究機構強磁場共用ステーションに設置されている大口径超伝導磁石を利用させてもらい、トリエチルアミンを原料とした磁場印加熱分解実験を行った。6Tの磁場中で作製した強磁性試料は300Kでは3.0emu/g,2Kでは3.2emu/gの磁化を示した。これは前年度作製した強磁性試料のチャンピオンデータの2倍以上の大きさである。したがって、熱分解時に磁場を印加することにより、熱分解炭素内での強磁性構造の形成が促進されている可能性がある。この強磁性炭素の結晶構造を調べるため、大型放射光施設SPring-8での放射光X線回折測定実験を行ったところ、磁場を印加せずに作製した試料に比べ、ダイヤモンド構造のピークが増加していることを見いだした。一般に、低次元の構造よりもより高次元的な構造の方が磁気秩序を起こしやすいため、本実験結果は矛盾しない。この結果より、ダイヤモンド構造が強磁性に関与していると考えられるため、強磁場中熱分解装置の石英反応管の中に非磁性ダイヤモンド粉末を挿入し、その上に熱分解生成物を堆積させた。6Tの磁場を印加しながらダイヤモンド粉末上に堆積させて作製した強磁性試料の磁化は300Kでは6.4emu/g,5Kでは6.9emu/gであった。これはダイヤモンド粉末なしで作製した強磁性試料の2倍以上の大きさである。1炭素原子当たりの磁化は5Kで1.42×10^<-2>μBと見積もられる。炭素原子あたりの磁化が小さいのは、磁気分離によって回収した強磁性試料が非磁性グラファイトおよび非磁性ダイヤモンドとの混合物となっているためと考えられる。今後、炭素系強磁性体の物性評価を詳細に行うために、強磁性部だけを取り出すことができるよう、磁気分離の方法を検討する必要がある。以上より、磁場中熱分解炭素の作製条件を探索し、強磁性発現の可能性が高い条件を実験的に明らかにすることに成功した。
心筋架橋による冠状動脈硬化の抑制機構と心筋虚血に連なる架橋の解剖学的特性

左冠状動脈前下行枝にみられる心筋架橋が同動脈の動脈硬化及び心筋虚血の発生に及ぼす意義につき、心筋梗塞100例を含む総計300例の剖検心をもとに、組織計測学的に病理組織学的に検討した。心筋架橋に被覆された部位の冠状動脈硬化の抑制がみられるほか、心筋架橋を構成する心筋の容量が大きいと、心筋架橋部より近位側の冠状動脈には硬化性病変の増強がみられ、又、動脈硬化の好発部位も、冠状動脈入口部に向かって、2cm近位に変位しており、これらの結果、心筋架橋を構成する心筋の容量が大きいと、心筋梗塞が有意に高頻度に発生していた。即ち、心筋架橋が大きいと、これ自体が、独立して、心筋架橋の解剖学的危険因子となることが判明した。19年度の研究結果材料及び方法:死後時間が短く、免疫染色が可能で、かつ、冠状動脈の内膜表面に完全に内皮細胞が残存しており、又、左前下行枝に心筋架橋を有した18例につき、左冠状動脈入口部からら5mm間隔で、パラフィンブロックを作製した。これらにつき、型どおりに免疫染色を行った。すなわち、thrombomodulin,I-CAM,V-CAM,tissue factor,tPA,PAI-1,NF-kBの各種抗体を用い、適宜に免疫染色を施し、内皮細胞及び内膜中におけるこれら分子の発現状況を、冠状動脈周囲の心筋架橋の有無と共に観察した。結果:心筋架橋に被覆された部位の、冠状動脈内皮細胞において、上記の7種のうち、thrombomodulin,tissue factorの内皮細胞における発現が、心筋架橋の入口部の近位側における内皮細胞におけるこれらの発現に比して、有意に発現が多くみられた。一方、血液凝固因子や内皮細胞接着因子の発現に関しては、心筋架橋の有無との関係では、差がみられなかった。考察:一般的に認められている動脈硬化の発生機序としての"response toin jury"におけるモデルは、in vitro studyにおけるずり応力に対する内皮細胞における各種のタンパクの発現レベルでの応答とin vivoにおける実際の発現レベルとの関連からみると、若干の相違があることが窺えた。心筋架橋によるずりお威力を介した血液凝固・線溶系に限れば、心筋架橋の入口部の近位側では、比較的進行した病変においても、血液凝固の亢進はさほど顕著ではないのかもしれない。心筋架橋の解剖学的特性が心筋虚血の発生原因となり得るという作業仮説に関して、多数の100例の心筋梗塞及び200例の非心筋梗塞例の剖検例を蒐集し、左冠状動脈入口部から、前下行枝に沿って、周囲の脂肪織・心筋組織と共に、冠状動脈を採取した。各々につき、5mm間隔で、横断面を切り出し、通常の光顕標本を作製し、これらを組織計測により測定した。測定については、5mm間隔による切片から、心筋架橋の位置・長さを求め、顕微測定により、心筋架橋を構成する心筋の厚さを求めた。画像解析装置により、各動脈断面の内膜面積/中膜面積の比をもって、各断面の動脈硬化度とした。その結果、心筋架橋を有し、心筋梗塞を発生していた症例群にみられる心筋架橋は有意に厚く、又、その長さが長い傾向にあることが窺われた。心筋架橋を構成する心筋の容量を、長さX厚さとすると、心筋架橋を構成する心筋の容量は、対照群に比して、有意に大きかった。又、これらの例においては、最も動脈硬化の高度な部分は、心筋架橋の入口から2cm近位方向に、有意に集中していることも明らかとなった。又、これらの症例群の心重量・血清脂質の値は、心筋架橋がなく心筋梗塞の発生した症例群の値と差は無く、心筋架橋は、これらとは独立した解剖学的因子となることが判明した。今回の研究結果は、心筋梗塞の予防は、専ら、高脂血症、高血圧、糖尿病など、既知の危険因子を中心とした対策が、強調されてきたが、新たな先天的な解剖学的な危険因子として、心筋架橋の問題を考える必要があることを、国内外に先駆けて明らかにしたといえる。
メイラ-ド反応中間体,3ーデオキシグルコソンの食品および生体における意義

本研究はメイラ-ド反応の中間体である3ーデオキシグルコソン(3ーDG)の食品および生体における意義を明らかにする目的で行われた。第一に3ーDGの細胞増殖に対する影響を調べた。HeLaS3,EL4,Chung Liver,FDCP2の各細胞への^3HーTdRの取り込み量を測定した結果、3ーDGは細胞分裂に影響を与えることが明かとなった。フロ-サイトメトリ-を用いた実験から、3ーDGが細胞増殖サイクルのなかで特にS期に作用し、M期には大きな影響を与えなかった。以上のことから、3ーDGは細胞毒性を有することが明かとなった。第二に3ーDGの定量法を確立するためにHPLCおよびTMS誘導体のGCによって食品中や生体中の3ーDGの検出、定量が可能となった。3ーDGを含まない飼料を与えたラット尿中には3ーDGは検出されなかったが、3ーDGの代謝生成物である3ーデオキシフラクト-ス(3ーDF)が検出され、GCによって定量したところ正常ラット尿中には15μg/ml、実験的糖尿病ラット尿中には28μg/mlの3ーDFが認められた。従って、生体内で3ーDGが生成しているという関接的な証明がなされた。第三に3ーDGの高い反応性から3ーDG修飾タンパク質の化学構造を明らかにする目的でBzArgと3ーDGを反応させ、反応生成物の単離精製をHPLCなどにより行って、NMR、MSなどによって構造解析したところ2ー[δーNーornithyl]ー5[1ー(2,3,4ーtrihydroxybutyl)]ー4ーimidazoloneと同定した。第四にguanidobutyric acidと3ーDGの反応生成物であるimidazoloneをHPLCによって精製し、このハプテンをpolylysineにカップリングさせ抗原を得た。今後、マウスに免疫して抗体を作成する予定である。第五に、3ーDG修飾タンパク質のマクロファ-ジへの応答を調べた。3ーDGをBSAに反応させて調製した3ーDG修飾BSAはマクロファ-ジに特異的に結合し、その結合部位は二つあると推定された。3ーDG修飾BSAのマクロファ-ジに対する結合は、グリケ-ションGSAによって阻害された。
CD200陽性バルジ細胞を用いたヒト毛嚢再生の試み

CD200と呼ばれる細胞表面のタンパクを目印に、ヒトの毛嚢のもととなる幹細胞を多く含んだケラチノサイト(皮膚の細胞)をヒト頭皮から分離・培養した。また、毛嚢を形作るシグナルを送る能力(毛誘導能)を維持したままヒト毛乳頭細胞を培養する技術を開発した。得られたCD200陽性の毛嚢細胞(バルジ細胞)と毛誘導能を有する毛乳頭細胞を組合せて免疫不全マウスの体内に移植し、ヒト毛嚢に類似した構造体を得ることができた。研究計画初年度である平成18年度は、申請書にあるように1)免疫不全マウスヘの移植系を用いた毛嚢再構成系の確立をはじめとし、2)毛嚢再構成系への細胞供給源であるヒト毛嚢由来ケラチノサイト、毛乳頭細胞の培養系の確立を試みるとともに、3)毛嚢誘導に必須とされる毛乳頭細胞に与える培養操作の影響につき検討を加えた。まず、マウス・ラットを用いて毛嚢由来ケラチノサイトと中胚葉由来細胞(胎児由来線維芽細胞あるいは毛乳頭細胞)を様々な組み合わせで免疫不全マウスに移植し毛嚢再構成の効率を検討した結果、シリコンチャンバー法を用いた場合に再構成の効率が良いことが明らかとなった。次いで、ヒトケラチノサイト(表皮またはバルジ細胞を含んだ毛嚢分画)と中胚葉由来細胞(ヒト毛乳頭細胞、マウス胎児由来線維芽細胞)を様々に組み合わせ毛嚢再構成能の検討を行った。ヒトケラチノサイトを用いた組み合わせでも毛嚢再構成が見られており、現在、再構成された毛嚢がどの程度ヒト由来細胞で構成されているのか免疫組織学的手法を用いて検討中である。培養条件の検討では、フィーダーなしでもコラーゲンコートディッシュと無血清培地の組み合わせで毛嚢ケラチノサイトの増殖が得られることを確認した。また、バルジ由来ケラチノサイトのCD200発現は培養操作後確認できず、CD200は生きたヒト毛嚢バルジ細胞の採取には利用できるが、培養操作後は利用できない可能性が示唆された。毛嚢誘導には毛乳頭細胞からのシグナルが必須である。ヒト頭皮サンプルから得られる毛乳頭細胞は少なく、毛嚢再生の実現には培養操作が必須である。培養操作がヒト毛乳頭細胞に与える影響を検討するため、培養前後のヒト毛乳頭細胞からマイクロアレイを作成し、網羅的に遺伝子発現の解析を行っている。来年度はこれらの知見をもとに、より濃縮されたCD200陽性バルジ細胞分画を用いたヒト毛嚢再生を試みる予定である。研究計画2年目となる平成19年度は、1.ヒト毛嚢CD200陽性バルジ細胞の分離・長期間培養が増殖能に与える影響について検討し、2.ヒトCD200陽性バルジ細胞を可能な限り培養し備蓄するとともに、3.3次元培養下でのヒトケラチノサイトと毛乳頭細胞の混合試験実験4.ヒト毛乳頭細胞の培養条件の最適化の試みを行った。CD200陽性バルジ細胞が初代培養で高い増殖能を有することはすでに申請者により示されていたが、その増殖能が現状の培養条件で継代を繰り返しても維持されるか否かは不明であった。同じ頭皮検体から得られたCD200陽性バルジ細胞、陰性細胞を継代培養したところ、陰性細胞が4代以内に継代不能になるのに対しCD200陽性バルジ細胞は継代5代を超えても数多くのコロニーを形成する高い増殖能を維持することが明らかとなった。また、前述継代培養実験の結果をうけ、次年度に行う毛嚢再構成実験のためにCD200陽性バルジ細胞を継代培養し可能な限り凍結備蓄した。ケラチノサイトと毛乳頭細胞のヌードマウスへの混合移植による毛嚢再構成系は、結果の確実性、結果判定に時間を要するなどの欠点があった。そのため本年度はゲル3次元培養系におけるケラチノサイト、毛乳頭細胞の混合培養の試験実験を行った。自然に凝集した毛乳頭細胞塊から円柱形の立体構造がゲル内に伸長する現象がみられ、毛嚢類似構造と考えられ現在検討を加えている。昨年度からの網羅的遺伝子解析にて培養後に毛乳頭細胞で発現の失われる遺伝子群を同定した。これらの遺伝子の発現低下が培養操作により毛誘導能が失われる原因となる可能性があるため、それらの発現を維持する培養条件を検討中である。研究最終年度となる平成20年度は、ヒト由来CD200バルジ細胞を主とする毛嚢ケラチノサイトと、毛誘導能を最適化した培養ヒト毛乳頭細胞を免疫不全マウスに混合移植し、ヒト毛嚢の再構成を試みた。前年度の検討により、CD200陽性バルジケラチノサイトは継代培養後も高い増殖能を維持することが示されたが、その後、継代ごとに分化が進むことが判明した。効率の良い毛嚢再構成には、極力未分化の継代数の少ない細胞を用いるべきだが、ヒト頭皮検体から採取可能なCD200陽性細胞は限度がある。

そこで、毛嚢再構成実験系の種類により継代数の低い(2-3継代)CD200陽性細胞のみと、CD200陽性細胞の含有率を高めた毛嚢峡部由来ケラチノサイトを使いわけることとした。毛乳頭細胞については、前年度より引き続き、我々が同定した毛誘導能関連遺伝子の発現をモニタリングし、その生物学的特性を維持する培養条件の検討を続けていたが、WNTシグナル系などの毛嚢発生に重要な役割を果たすシグナル伝達系を活性化することにより、現時点では毛誘導の維持に最適と考えられる培養条件を確立することができた。以上によりヒト毛嚢再構成のための材料が最適化された。こうして準備したCD200バルジ細胞に富むヒトケラチノサイトと、毛誘導能を最適化した培養ヒト毛乳頭細胞を混合し、ヌードマウスの背部に植えたシリコンチェンバー内(チェンバー法)、あるいは皮下組織内(パッチ法)に移植、または、マウスの無毛部皮膚片の表皮真皮境界部に混合細胞を挟み皮膚片ごとヌードマウス皮下に移植(サンドイッチ法)し、ヒト毛嚢再生を試みた。各手法のうち、パッチ法で頻度こそ低いが毛嚢類似構造を得ることができた。現在、再現実験を試みている。本研究の成果はヒト毛嚢再生実現に向けての一助となると考えられる。なお、本研究で確立された毛乳頭細胞の培養法を特許出願した。
乳酸ポリマー中のモノマー分率を高度に制御する微生物酵素の進化工学研究

乳酸重合酵素の開発を契機に、従来の微生物ポリエステルであるポリヒドロキシ酸ファミリーを拡張した乳酸ポリマーの微生物合成系開発に成功してる。本申請課題では、乳酸と共重合化モノマー3HB(3-hydroxybutyrate)とのコポリマー中のモノマー分率の制御を目指し、NADPH依存型acetoacetyl-CoA還元酵素(PhaB)に焦点を当て、実験室内進化を実施したところ、活性が向上しポリマー生産性も向上させる2種の優良変異酵素を取得できた。立体構造上で考察してみたところ、これらの変異効果が基質認識に関与する領域での構造柔軟性に起因することが推察された。乳酸重合酵素の開発を契機に、乳酸ユニットをベースとした多様なコポリマーを微生物重合系を用いて合成できる基盤を構築している。乳酸(LA)100%からなるポリ乳酸は、透明性と加工性に優れていることから、バイオベースポリマーの代表格である。一方で、硬質で対衝撃性に難がある。そこで、3HB(3-hydroxybuthanoate)のような他種のモノマーと共重合化することで、軟質化することが可能である。これまで、大腸菌ではLA低分率のコポリマーP(LA-co-3HB)は、大腸菌で効率よく生産できていた。対照的に、コリネ型細菌を使用すると、90%-100%のLA高分率のP(LA-co-3HB)を合成することが分かってきた。本研究では、3HBの分率を段階的に高めることで、60%90%のLA分率からなるP(LA-co-3HB)を合成することを目的に、3HB-CoA合成酵素(NADPH-dependent acetoacetyl-CoA還元酵素)であるPhaBの進化工学的分子改変を実施した。PhaB4量体は、可動性領域と非可動性領域からなり、基質結合部位は、可動性領域中に存在する。そこで、この可動性領域に限定して、エラー誘発PCR法によりランダム変異を1アミノ酸もしくは2アミノ酸置換頻度に設定して導入した。PhaB酵素の活性向上による3HB-CoA量の増大は、3HBのホモポリマーP(3HB)の細胞内合成・蓄積量に反映できるシステムを指標にした、すなわち、プレート中にポリマー染色色素を含有し、プレート上に生育する大腸菌コロニーの赤色呈色の強弱でポリマー合成量を識別した。本プレートアッセイ系により、野生型を上回るポリマーを合成した陽性クローンを、約2万個のライブラリーの中から2つ取得した。変異解析の結果、2種類の優良変異体には、それぞれ分子内に、Q47LとT173Sのシングル変異が見出された。実用化されているバイオベースポリマーの代表格であるポリ乳酸を発展させた乳酸ポリマーの生合成系は、独自に開発した乳酸重合酵素を微生物に遺伝子導入することで駆動する。一方で、乳酸ユニットと共重合化される3-hydroxybutyrate(3HB)との分率がコポリマーP(LA-co-3HB)の物性に直接影響を与えることが知られている。この共重合組成は、乳酸重合酵素の基質特異性に加えて2種のモノマーの供給力にも強く依存する。本研究では、acetoacetyl-CoAから3HB-CoAの合成をNADPHに依存して触媒するacetoacetyl-CoA reductase (PhaB)酵素に着目し、本酵素に進化工学を適用することで基質特異性の改変を試みている。昨年度までに、エラー誘発PCRによるランダム突然変異とプレートアッセイによる人工進化実験により、2種類の優良変異体(Q47LとT173S)を取得していた。本年度は、両変異酵素をHis-tagをN末端に付加した形で大腸菌で機能発現させ、速度論的解析に基づく酵素化学的な知見を得ることを計画した。2種の酵素は、活性型で組換え発現することに成功し、actoacetyl-CoA天然基質に対して、特徴的な反応性を示した。すなわち、kcat値に関しては、野生型酵素に比してQ47Lが2.4倍、T173S変異酵素が3.5倍の向上を示した。実際、その効果はCorynebacterium glutamicum細菌中で発現させた時にP(3HB)ポリマーの合成向上に反映した。すでに解明されている野生型酵素の立体構造上でそれら変異効果を考察したところ、基質認識に関与する領域での構造柔軟性に起因しているのではないかという推察がなされた。酵素変異体のライブラリー作成とプレートアッセイの条件設定に、予想以上に時間がかかった。また、変異体のほとんどが野生型酵素の活性を下回ると思われる変異体で、元々野生型の還元活性の高さが示唆された。これは、酵素によってはよく見られる現象で、以前P(3HB)重合酵素の進化工学的改変研究でも経験したことである。優良変異体が2個/2万個の低確率で取得されたこととも符合する。しかし、この遅れは研究全体からみれば深刻ではない。

すなわち、後続の2種優良変異体の組換え発現・精製は、すでに立体構造決定の際にその実験スキームは確立しているので、早期にリカバリー可能である。むしろ、優良変異体を取得するという最初で最大の課題をクリアできた価値は非常に大きい。酵素進化工学まず、2カ所の優良変異部位に対して総アミノ酸置換を導入する飽和変異を実施し、合計40種類の変異体を作成する。次いで、N末端にHis-tag配列が付加するデザインで、融合タンパク質を大腸菌で組換え発現し、酵素精製する。同時に、ウエスタン分析により、変異による酵素活性の向上が、発現量の向上によるものなのか、純粋に酵素活性の変化によるものなのかを検定する。精製に成功した酵素に関しては、acetoacetyl-CoAとNADPHの2つの天然基質に対して、速度論的パラメーターを決定し、変異の効果を立体構造上で考察する。また、酵素学的データを明らかにした酵素については、コリネ型細菌に遺伝子導入し、ポリマーの合成状況を乳酸分率、分子量、生産量、熱的性質、機械的性質を調べる。研究自体は優良変異体取得に成功しているなど全く問題なく、優良変異体酵素の精製と速度論的解析に必要な予算分が次年度に合理的に繰り越されることになる。優良変異体酵素の精製と速度論的解析を平成27年度早期に着手し、優良変異酵素遺伝子導入コリネ型細菌で合成したポリマーの構造・物性・機能との関連付けを行う。
アジアにおける陸棲肉食性ヒル類の多様性

陸棲捕食性ヒル類の,東アジアに分布するクガビル科と東南アジアに分布するイツウコウビル科について,その種多様性・分類学的地位・進化史を解明するべく系統分類学的研究を行った.クガビル科については,日本各地より新たに採集した標本に基づいて7種を新種として記載すると共に,体環様式・性成熟サイズなどの形質状態の進化を明らかにした.加えて,クガビル類に見られる「胃通管」と呼ばれる器官が,交接時に精包を受け取る機能を有することを明らかにした.イツウコウビル科については,既知種のタイプ標本の再検討と新たに得られた標本の検討によって,科の分類学的地位について新たな知見を得ることが出来た.アジアにおける陸棲肉食性ヒル類は,東アジアに分布するクガビル属(Orobdella)と東南アジアに分布するイツウコウビル属(Gastrostomobdella)の2属であるが,ともに種多様性が把握されていない.またインドシナ半島は陸棲肉食性ヒル類が報告されていない空白地域であり,分布状況・種多様性は未解明である.クガビル類については,本州中部地域より得られた標本の形態観察ならびに分子系統解析の結果より,未記載種であることが確定したため,新種として記載した.このクガビルは性成熟サイズが4cmを超えない小型の種であるが,既知小型クガビルとは系統的に離れており,クガビル属において性成熟サイズの大小が並行的に進化したことを明らかにした.また,同属他種との同所的分布においても体サイズの大小が重要な要因である可能性を指摘した.くわえて,日本国内,特に東北,中国,四国地方において採集調査を実施し,得られた標本の形態観察ならびにミトコンドリア遺伝子の解析を行い,東北地方において1未記載種を,更に中国,四国地方において複数の未記載種の存在を確認した.現在それら未記載種の記載論文を準備している.イツウコウビル類については,ボルネオ島より得られた標本のミトコンドリア遺伝子の解析により,同島内において非常に高い遺伝的多様性をもつことが明らかになった.しかしながら,現段階では,分類学的異同は不明である.インドシナ半島におけるインベントリーでは,ベトナム中部のKon Tum高地において採集調査を実施したが,陸棲肉食性のヒル類を採集することは出来なかった.ベトナム北部における調査でも陸棲肉食性ヒル類は採集出来ていないため,インドシナ半島が陸棲肉食性ヒル類の空白地域である現状は変わらない.クガビル類については,西日本より得られた標本に基づいた分類学的研究を進展することが出来た.特に中国地方に分布する1種,そして四国と淡路島より得られた4種について,それぞれを新種として発表することが出来た.平成27年度中に記載したこれら種を加えると,クガビル属は全17種となり,ヒル類の既知属の中でも高い種多様性を有していることが明らかになった.さらに,クガビル類については,全既知種を対象とした分子系統解析によって,体サイズの中でも体長が20 cmを超える大型化の形質状態,そして一体節当たりの体環数が8体環である形質状態が,クガビル属において平行的に進化してきたことを明らかにした.これら体サイズの違い,あるいは1体節当たりの体環数の違う種が,同所的に分布していることから,クガビル属の高い種多様性が維持されている要因として,これら形質状態が重要である可能性は高い.イツウコウビル類については,サラワク州より採集された個体についてシンガポール大学の共同研究者よりサンプル提供を受け,形態観察と分子系統解析による分類学的位置の確定を行った.さらにタイの西部においてイツウコウビル科ヒル類を対象とした採集調査を行った結果,インドシナ半島より初めて本科ヒル類を得ることが出来た.タイより得られたサンプルについても形態観察と分子系統解析を行い,その分類学的位置を明らかにした.結果,イツウコウビル科の再定義が必要であることが明らかになり,特に今まで本科を定義していた胃通管が,イツウコウビル類の共有形質ではない可能性が高くなった.もともと,胃通管はクガビル類とイツウコウビル類の共有派生形質であると考えられていたこともあり,本知見は,陸棲捕食性ヒル類の分類,さらにはそれらヒル類の進化を考える上でも重要な視座を与えるものである.クガビル類については,網羅的な探索によって種多様性を次々に明らかにすることが出来ている.特に,平成27年度中に中国・四国地方から5新種を明らかにすることが出来たのは,大きな成果である.クガビル類の種多様性はその大枠が掴める程に,十分なサンプルが揃っており,さらなる新種記載の目星も着いているため,最終年度中に種多様性の全容に肉薄することが出来る,十分な成果を得ることが出来た.イツウコウビル類については,既知種の再検討が予定よりも大幅に遅れているが,新手に得られたサンプルに基づいた系統分類学的研究により,高次分類の見直しという重要な課題が明らかになり,なおかつ平成28年度中には得られた知見をまとめる段階まで研究を進められたため,平成27年度の研究について,おおむね順調に進展していると判断した.平成28年度は,四国より得られたクガビル類の1未記載種を新種とした記載論文を執筆し,受理された.この種は4体環の小型種で,中国地方ならびに四国に分布する4体環・小型の既知2種と近縁であることが,分子系統解析の結果から明らかになった.

更にこの3種間の遺伝的距離は小さく,瀬戸内海の形成史を加味すると,これら3種の種分化がごく最近になって起こった事が示唆された.東アジアに分布するクガビル類の総種数は18種となった.加えて,長らくその機能が不明であった,クガビル類が有する,消化管に結合する「胃通管」という器官について,その機能の一端を明らかにすることが出来た.交尾直後個体標本の胃通管にはカプセル状の構造物が詰まっており,その内容物をTEM観察によって特定した.結果,カプセルはクガビルの精包であることが判明し,胃通管は消化器官に連絡しながら,生殖器官としての役割を有していることを明らかにした.イツウコウビル類については,前年度のサンプルに加えて,東南アジア産肉食性ヒル類の既知種のタイプ標本を精査する機会を得た.結果,イツウコウビル科それ自体の定義に大幅な修正が必要であることが明らかになった.本研究課題では,目標の一つであった東南アジアに分布するイツウコウビル科既知種の分類学的再検討については,完遂することが出来なかった.しかし,イツウコウビル科自体の判別形質の更新,そしてその属分類を見直すための知見を得ることが出来た.またクガビル科については,本研究課題によって7新種を記載することが出来た.加えて,体環様式・性成熟時のサイズ等で平行的な進化が起こった事を明らかにした.特に,クガビル科が有する胃通管の機能を初めて明らかにすることが出来たのは,重要な成果である.これら研究成果を基に,本研究課題によって得られた未発表データについても,今後学術雑誌に投稿していく予定である.陸棲捕食性ヒル類の,東アジアに分布するクガビル科と東南アジアに分布するイツウコウビル科について,その種多様性・分類学的地位・進化史を解明するべく系統分類学的研究を行った.クガビル科については,日本各地より新たに採集した標本に基づいて7種を新種として記載すると共に,体環様式・性成熟サイズなどの形質状態の進化を明らかにした.加えて,クガビル類に見られる「胃通管」と呼ばれる器官が,交接時に精包を受け取る機能を有することを明らかにした.イツウコウビル科については,既知種のタイプ標本の再検討と新たに得られた標本の検討によって,科の分類学的地位について新たな知見を得ることが出来た.クガビル類については,小型クガビルを新種として記載するとともに現在の同属他種における同所的分布が体サイズの大小により可能となっていることを指摘することが出来た意義は大きい.現在明らかになっている未記載種についても体サイズの異なる種が同所的に分布していることから,陸棲肉食性ヒル類の進化史を考察するうえで重要な観点を明らかにすることが出来たと考えられる.未記載種についてもその数,産地,分布域をある程度まで把握することができている.イツウコウビル類については,調査した標本の数は限られているものの,形態的そして遺伝的多様性が非常に高いことが判明しており,クガビル類だけでなく陸棲肉食性ヒル類の種多様性が非常に高く,未記載種がまだ存在していることが判明した.タイプ標本ならびにタイプ産地を対象とした採集調査については,当該年度中に計画を進め,実施できる算段がついたため,既知種の再検討により,研究期間中に本属の多様性の概要を明らかに出来ると考えられる.インドシナ半島における陸棲肉食性ヒル類の調査においても,ベトナムに限らず他地域における調査の打ち合わせが進んでいる.
確定判決の効力を受ける第三者の救済方法：会社組織関係訴訟における詐害再審の許容性

会社法853条の類推適用により、独立当事者参加による方法だけではなく、補助参加の申出をするとともに補助参加人として再審の訴えを提起する方法や、再審原告として再審の訴えを提起するとともに、本案についての当事者の一方に共同訴訟的補助参加をする方法も採り得ることを示したい。
伝統的農法「稲田養魚」の高い米魚生産性を支える生態系プロセスの科学的検証

本研究は、水田で米と魚を同時に生産する伝統的農法「稲田養魚」の自然共生型農法としての潜在性に注目し、環境親和性と高生産性の両立を可能にする生態系プロセスを炭素窒素安定同位体比から明らかにすることを目的としている。最終年度である本年度は、前年度までに収集した生物等試料の同位体データを用いて、養殖魚(フナ幼魚)の食性を分析した。調査水田におけるフナの潜在的餌種は、大きく動物プランクトン、底生無脊椎動物(ユスリカ、貧毛類等)および養魚飼料(人工配合飼料、米ぬか、さなぎ粉等)に分けられた。同位体混合モデルSIARにより、これら餌種のフナへの寄与率(%)を評価したところ、水田によって動物プランクトンは7-28%、底生無脊椎動物は23-31%、給餌飼料は46-57%と推定され、相対的には養魚飼料への依存度が高いものの(50-60%)、動物プランクトンと底生無脊椎動物を合わせた天然餌料への依存度も小さくないことが示された(40-50%)。また、上記のデータを水田土壌、稲体等のデータと統合し、フナの排泄による土壌への有機物供給(施肥効果)を詳細に検討した。その結果、作土表層中の土壌有機物(SOM)のおよそ16-20%および20-24%がそれぞれフナにより排泄された天然餌料および養魚飼料に由来するものと見積もられた。残りの60%のSOMは直接養魚飼料に由来するもの、すなわち食べ残しであった。こうして形成された土壌栄養状態が栽培期間を通じて稲体に吸収・同化されることも土壌と稲体(葉身および玄米)の窒素同位体比の回帰分析から確かめられた。以上のことから、今日見られる稲田養魚においては、養魚飼料の過剰投入が水田内の栄養動態に直接的に大きな影響を与えている一方で、魚の摂餌・排泄という生態学的プロセスもまた水田内の物質フローや土壌栄養動態に寄与し、本農法の高い生産性を支えていることが示された。本研究は、水田で米と魚を同時に生産する伝統的農法「稲田養魚」の自然共生型農法としての潜在性に焦点を当て、その環境親和性と高生産性を両立させる生態系プロセスを明らかにすることを目的としている。本年度は長野県佐久地域の水田地帯に調査水田を設定し、野外調査と炭素窒素安定同位体分析を実施した。その主な成果は以下のとおりである。1)土壌、稲体および玄米の窒素同位体比耕作者が同一で互いに隣接した慣行水田と養魚水田(フナ養殖水田)3組において、1土壌、2稲体(葉身)および3玄米を採取し、それらの炭素窒素安定同位体比(δ15N)を測定した。養魚水田では、養魚にともなう動物性有機物の増加を反映して、土壌の窒素同位体比が慣行水田と比して高いことが明らかとなった。また、慣行・養魚両水田において、稲体の窒素同位体比は土壌の窒素同位体比と正に関係しており、土壌の窒素条件の違いが吸収・同化を通じて稲体の窒素同位体比の違いをもたらすことが確かめられた。さらに、各水田の玄米の窒素同位体比が稲体とほぼ同様の値(傾き1の回帰)を示したことから、土壌窒素条件の違いは代謝過程を通じて玄米まで波及することも確認できた。2)玄米収量構成要素養魚水田は、慣行水田と比べて1一穂あたり籾数、2一穂あたり稔実籾数および3千粒籾重の各玄米収量構成要素の値が大きい傾向にあり、従来経験的に語られてきた養魚水田の高い生産性がデータで示された。3)水田内の食物網構造慣行水田と養魚水田において、湛水期(5月から8月)に月1回の頻度で1植物プランクトン、2動物プランクトン、3底生動物(ユスリカ、貧毛類等)および4大型水生生物(魚類、カエル幼生等)の採集を行い、安定同位体分析による食物網構造評価のための試料を得た。水田内の食物網構造の評価について、当初計画では安定同位体分析まで実施する予定であった。しかし、想定よりも多くの試料生物が採取されたため、1分類、2体サイズ測定(体長と体重)および3分析前処理(乾燥、粉末化等)に時間を要し、実施に至らなかった。本研究は、水田で米と魚を同時に生産する伝統的農法「稲田養魚」の自然共生型農法としての潜在性に焦点を当て、環境親和性と高生産性の両立を可能にする生態系プロセスを炭素窒素安定同位体比から明らかにすることを目的としている。本年度は、長野県佐久市内の調査水田において2年目となる野外調査を実施し、魚の排泄物による土壌の肥沃化への影響(施肥効果)を定量的に評価した。また、次年度に実施する養魚水田と慣行水田の食物網構造の比較に向けた試料の採集と分析を行った。各実施項目の概要は以下のとおりである。(1)施肥効果の量的評価フナ養殖水田3面において、58月にかけて作土表層の土壌有機物(SOM)を採取するとともに、農家より施用肥料および養魚飼料を入手した。また、水田で捕獲したフナを蓄養し、ふんを集めた。

これらの試料の炭素窒素安定同位体比(δ13C、δ15N)を測定し、安定同位体混合モデルSIARを用いて、6、7および8月のSOMに占める1フナふん、2食べ残された養魚飼料、および3もとの土壌(5月のSOMおよび施用肥料)の寄与率(%)を推定した。その結果、各月・各水田のSOMに占めるフナふんの推定寄与率は941%の値を示し、フナふんがもたらす施肥効果は小さくないことが確かめられた。その一方で、養魚飼料の推定寄与率は3160%の値を示し、養魚飼料の食べ残しがフナふん(施肥効果)以上に大きな割合を占めることが明らかとなった。(2)食物網構造比較のための試料の採集と分析耕作者が同じ養魚水田と慣行水田3組において、昨年度同様、68月にかけて植物プランクトン、動物プランクトン、底生動物(ユスリカ、貧毛類等)および大型動物(フナ、ドジョウ、カエル幼生等)の採集を行った。計500を越えるこれらの試料について、安定同位体比を測定し、δ13Cおよびδ15Nの値を得た。本年度予定していた野外調査および安定同位体分析は、すべて計画通り実施することができた。また、一部未実施であった昨年度分の試料の分析も今年度実施することができ、予定していた2年間の分析データの整備が完了した。本研究は、水田で米と魚を同時に生産する伝統的農法「稲田養魚」の自然共生型農法としての潜在性に注目し、環境親和性と高生産性の両立を可能にする生態系プロセスを炭素窒素安定同位体比から明らかにすることを目的としている。最終年度である本年度は、前年度までに収集した生物等試料の同位体データを用いて、養殖魚(フナ幼魚)の食性を分析した。調査水田におけるフナの潜在的餌種は、大きく動物プランクトン、底生無脊椎動物(ユスリカ、貧毛類等)および養魚飼料(人工配合飼料、米ぬか、さなぎ粉等)に分けられた。同位体混合モデルSIARにより、これら餌種のフナへの寄与率(%)を評価したところ、水田によって動物プランクトンは7-28%、底生無脊椎動物は23-31%、給餌飼料は46-57%と推定され、相対的には養魚飼料への依存度が高いものの(50-60%)、動物プランクトンと底生無脊椎動物を合わせた天然餌料への依存度も小さくないことが示された(40-50%)。また、上記のデータを水田土壌、稲体等のデータと統合し、フナの排泄による土壌への有機物供給(施肥効果)を詳細に検討した。その結果、作土表層中の土壌有機物(SOM)のおよそ16-20%および20-24%がそれぞれフナにより排泄された天然餌料および養魚飼料に由来するものと見積もられた。残りの60%のSOMは直接養魚飼料に由来するもの、すなわち食べ残しであった。こうして形成された土壌栄養状態が栽培期間を通じて稲体に吸収・同化されることも土壌と稲体(葉身および玄米)の窒素同位体比の回帰分析から確かめられた。以上のことから、今日見られる稲田養魚においては、養魚飼料の過剰投入が水田内の栄養動態に直接的に大きな影響を与えている一方で、魚の摂餌・排泄という生態学的プロセスもまた水田内の物質フローや土壌栄養動態に寄与し、本農法の高い生産性を支えていることが示された。本年度実施予定であった食物網構造評価のための安定同位体分析について、次年度中に当該年度分と併せて実施し、進捗の遅れを取り戻す。具体的な方策として、1本年度確立した分類基準に照らして試料生物の分類を迅速に行う。2本年度のデータから作成した体長ー体重換算式を用いて測定に要する時間を半分以下に短縮する。3本年度の経験を基に、試料の保存方法を個別容器保存からマルチウェルプレートを利用した多試料同時保存とすることで分析前処理の作業を大幅に効率化する。本年度で計画していた2年間の野外調査が終わり、分析に必要なすべてのデータが揃ったことから、今後はこれらのデータの分析を着実に進める。とくに、安定同位体混合モデルを用いて養魚水田と慣行水田の食物網構造を量的に記述し、両者の比較を行う。安定同位体分析に供する試料が当初予定よりも多く採取されたことにともない、必要な物品の量が増えた。
階層的複合化手法を用いる貴金属使用量を低減した高性能脱硝触媒の開発

リン酸アルミニウムを担体とする白金触媒を作製し、これとゼオライト触媒との階層複合化を検討した。作製した複合化触媒について、水素を還元剤とした脱硝反応を行ったところ良好な特性を示した。赤外吸収により反応吸着種を評価したところ、反応過程におけるアンモニアの生成が確認され、白金触媒上で生成したアンモニアがゼオライト触媒上に吸着し、疑似NH_3-SCR的に脱硝が進行することで良好な特性が得られることがわかった。本研究は、ディーゼル自動車等から排出され、酸性雨や光化学スモッグの原因となるNOxについて、これを効率良くN2に還元浄化する触媒の創出を目的としている。これまでに我々は、固体酸性担体を用いたPt担持触媒が、反応系中においてNH_3を生成することで、良好なNOx浄化特性を示すことを見出している。そこで、平成22年度では、上記触媒とNH_3を還元剤としたNOx浄化に高い活性を有する(NH_3-SCR)ゼオライト系触媒とを複合化することで、さらなるNOx浄化特性の向上を検討した。水熱合成法により種々の条件でAlPO_4を作製し、それらの形状をSEMにより観察した結果、テトラエチレングリコールを若干量添加した場合に、数μm程度の正八面体粒子の生成が確認された。上記の形態制御されたAlPO_4粉末から作製したPt担持触媒のNOx還元活性を評価したところ、110170°Cで約50%のN_2転化率が得られ、市販のアルドリッチ製AlPO_4から作製したもの(140°C、約40%のN2転化)に比べて高い触媒活性を示した。さらに、静電作用により複合化したPt/AlPO_4-ZSM5では、N_2転化率は110200°Cで約5060%となり、単独のPt/AlPO_4よりも高い活性を示した。比較として、物理的混合により作製したPt/AlPO_4-ZSM5では、顕著な活性の向上が認められなかったことから、Pt/AlPO_4とZSM5との界面状態が、触媒活性に影響していることがわかった。ディーゼル車が主な発生源となるNOxは、人体への有害性だけでなく酸性雨等の環境破壊の原因ともなることから、これの効率的な除去技術の確立が求められている。我々は、固体酸性担体を用いたPt担持触媒が、反応系中においてNH_3を生成し、これが還元剤として機能することで、良好なNOx浄化特性を示すことを見出している。今年度は、固体酸点の発現が期待されるモリブデン酸によりPt/AL_2O_3触媒表面を修飾し、水素を還元剤としたNOx浄化特性を評価した。作製した触媒のうち、25wt%のモリブデンを担持したものが最も活性が高く、モリブデンを担持していないPt/Al_2O_3の最大N_2転化率が50%以下に留まることに対して、100200°Cの広い温度範囲で約60%以上のN2転化率を示した。35wt%のモリブデンを担持した触媒のXRD測定から、Al_2(Mo_O3)_3相の生成が認められた。NH_3昇温脱離スペクトルから固体酸性度を調べたところ、モリブデン修飾した触媒では未修飾の触媒に比べて高温側でのNH_3の脱離が観察されたことから、固体酸性度がNOx浄化特性に寄与していることが考えられる。DRIFTsにより反応中間種を評価した結果、過剰の酸素共存下にもかかわらずNH_3の生成が確認され、良好なNOx還元能を有するNH_3が反応過程において生成し、これが固体酸点で保持されNH_3-SCR的に還元反応が進行することで、優れた触媒特性が得られたことが示唆された。
ミトコンドリアDNAの多型解析を用いた犬の遺伝子疾患に関する系統解析

ミトコンドリアDNA (mtDNA)は、同一哺乳動物種の集団内または近縁の動物種間における遺伝的近縁関係を調査する指標として用いられている(Wayne et al.,1991).平成13年度の研究においては、本学附属家畜病院および帯広市内の開業動物病院に来院したさまざまな疾患を有する犬の品種・系統の母系効果の影響をミトコンドリアDNA (mtDNA)のハプロタイプを用いて明らかにするため、365頭の犬からmtDNAのDループの600塩基対を増幅し、その塩基配列を決定すると共に,抽出したmtDNAを用いて系統樹を作製し、それらのイヌから聴取した個体情報を主成分とした判別分析を行い、イヌの系統と特定の疾患の発症との間に関連性が見られるかどうかを検索した.母系遺伝を示すmtDNAのハプロタイプの系統解析により得られた系統樹からは、すでに報告されている通り、遺伝的近縁関係の深い4クラスターに分類され,ハプロタイプの分類は必ずしも犬種による分類と一致せず,犬種によって系統樹上の分布が異なり,新たに発見した46種を含む64種のハプロタイプによる分類からは,複数の遺伝子集団から個体数を増やしたと推察される犬種(シーズー、ゴールデン・レトリーバー、マルチーズなど)と、ごく少数の個体または遺伝子集団から構築されたことを示唆させる犬種(キャパリア・キング・チャールズ・スパニエル、シェットランド・シープドッグ、ポメラニアンなど)に分類された.また,遺伝的系統と疾患との関連性を調べる目的で,特に症例数の多かった皮膚疾患と乳腺腫瘍について判別分析を行ったが、皮膚疾患および乳腺腫瘍のいずれにおいてもハプロタイプの疾患への影響については明確に示されなかった。平成14年度はさらに例数を増やすと共に,疾患との関連性を明らかにする目的で健康犬についても材料採取した.すなわち,健康犬130頭と症例犬117頭の計247頭から血液採取した.犬種別では平成13年度に特に多かったシーズーについて地域差についても明らかにする目的で,帯広で6頭,札幌で38頭,広島で15頭から採取した.その他,頭数の多い順に雑種,G.レトリーバ,ミニチュシュナウツァー,L.レトリーバ・ヨークシャーテリア,柴犬と続き,雑種の他36犬種よりサンプル採取をおこなった.結果については現在,特定の犬種のハプロタイプと疾患との関連性について解析中である.ミトコンドリアDNA(mtDNA)は、同一哺乳動物種の集団内または近縁の動物種間における遺伝的近縁関係をする指標として用いられている(Wayne et al., 1991)。本年度の研究においては、本学家畜病院および帯広市内の開業動物病院に来院したさまざまな疾患を有する犬の品質・系統の母系効果の影響をミトコンドリアDNA(mtDNA)のパプロタイプを用いて明らかにするため、365頭の犬からmtDNAのDループの600塩基対を増幅し、その塩基配列を決定すると共に、抽出したmtDNAを用いて系統樹を作製し、それらのイヌから聴取した固体情報を主成分とした判別分析を行い、イヌの系統と特定の疾患の発症との間に関連性がみられるかどうかを検索した。母系遺伝を示すmtDNAのハプロタイプの系統解析により得られた系統樹からは、既に報告されている通り、遺伝的近縁関係の深い4クラスターに分類された。また、ハプロタイプの分類は必ずしも犬種による分類と一致せず、犬種によって系統樹上の分布が異なり、今回新たに発見した46種を含む64種のパプロタイプによる分類からは、複数の遺伝子集団から個体数を増やしたと推察される犬種(シーズー、ゴールデン・レトリバー、マルチーズなど)と、ごく少数の固体または遺伝子集団から構築されたことを示唆させる犬種(キャパリア・キング・チャールズ・スパニエル、シェットランド・シープドッグ、ポメラニアンなど)に分類された。遺伝的系統と疾患との関連性を調べる目的で、特に症例数の多かった皮膚疾患と乳腺腫瘍について判別分析を行った。その結果、皮膚疾患および乳腺腫瘍のいずれにおいてもハプロタイプの疾患への影響については明確に示されなかった。ステップワイズ法では、ハプロタイプが疾患と関係していることが示唆されたが、疾患犬の分別までにはいたらなかった。今回は帯広近郊で飼養されているイヌから採取されたサンプルについて検討したが、今後更に例数を増やすと共に他地域で飼養されている犬のサンプルについても検索し、今回の成績と比較すると共に、さらに特定の犬種のハプロタイプと疾患との関連性について解析を行う予定である。ミトコンドリアDNA (mtDNA)は、同一哺乳動物種の集団内または近縁の動物種間における遺伝的近縁関係を調査する指標として用いられている(Wayne et al.,1991).平成13年度の研究においては、本学附属家畜病院および帯広市内の開業動物病院に来院したさまざまな疾患を有する犬の品種・系統の母系効果の影響をミトコンドリアDNA (mtDNA)のハプロタイプを用いて明らかにするため、365頭の犬からmtDNAのDループの600塩基対を増幅し、その塩基配列を決定すると共に,抽出したmtDNAを用いて系統樹を作製し、それらのイヌから聴取した個体情報を主成分とした判別分析を行い、イヌの系統と特定の疾患の発症との間に関連性が見られるかどうかを検索した.

母系遺伝を示すmtDNAのハプロタイプの系統解析により得られた系統樹からは、すでに報告されている通り、遺伝的近縁関係の深い4クラスターに分類され,ハプロタイプの分類は必ずしも犬種による分類と一致せず,犬種によって系統樹上の分布が異なり,新たに発見した46種を含む64種のハプロタイプによる分類からは,複数の遺伝子集団から個体数を増やしたと推察される犬種(シーズー、ゴールデン・レトリーバー、マルチーズなど)と、ごく少数の個体または遺伝子集団から構築されたことを示唆させる犬種(キャパリア・キング・チャールズ・スパニエル、シェットランド・シープドッグ、ポメラニアンなど)に分類された.また,遺伝的系統と疾患との関連性を調べる目的で,特に症例数の多かった皮膚疾患と乳腺腫瘍について判別分析を行ったが、皮膚疾患および乳腺腫瘍のいずれにおいてもハプロタイプの疾患への影響については明確に示されなかった。平成14年度はさらに例数を増やすと共に,疾患との関連性を明らかにする目的で健康犬についても材料採取した.すなわち,健康犬130頭と症例犬117頭の計247頭から血液採取した.犬種別では平成13年度に特に多かったシーズーについて地域差についても明らかにする目的で,帯広で6頭,札幌で38頭,広島で15頭から採取した.その他,頭数の多い順に雑種,G.レトリーバ,ミニチュシュナウツァー,L.レトリーバ・ヨークシャーテリア,柴犬と続き,雑種の他36犬種よりサンプル採取をおこなった.結果については現在,特定の犬種のハプロタイプと疾患との関連性について解析中である.