hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
氷中の水分子の高速拡散メカニズム解明－粒界拡散の役割－

氷床コアによる古気候の高精度解読を目的とし、堆積後の氷中において温度の指標となっている水分子の安定同位体の粒界拡散移動に着目することが当初の研究目的であった。種々の事情で、水分子の安定同位体を分析が困難となったことから、同様に古環境復元に用いられている、溶存化学イオン成分の移動について調べることを目的とした。そこで、この拡散実験を行うため、氷試料を高空間分解能で化学イオン成分が分析が分析可能な連続自動融解装置の開発を研究の軸とした。本研究では、装置の分析部を考案し製作が完了した。自動化と融解部については現在も開発を継続している。昨年度から継続し、氷試料の詳細な分析を可能とするための自動融解分析装置の開発を行った。この装置は大きく分類すると、水試料の分析部、氷試料の融解部、これらをコントロールする制御部から構成されている。分析部は、陽イオン、陰イオンのイオンクロマトグラフ分析器、液送ポンプ4台、バルブ4台、気泡を抜きサンプルを一時的に貯蔵するバッファータンクとサンプルボトルで構成され、これらをチューブで配管し作成した。この分析部に対して、標準的な分析操作プロセスである、融解試料の分析、5種類のスタンダードサンプルの分析、ラインの洗浄、試料貯蔵部の洗浄について、自動処理するシーケンス制御するプログラムを検討した。昨年度に個々の機器の計測制御プログラムを作成していたが、イオンクロマトグラフによる分析が15分と比較的長い間欠的な分析であるのに対し、バッファータンクでの融解試料の流入量のモニタなどは数秒といった短時間であり、全体の制御が難しかったことからプログラムを全面的に見直した。そして、融解部の検討を行なった。高空間分可能の分析を行うため、融解試料の深度区間が明らかな融解試料を分析する必要がある。このため、バッファータンクから分析装置に試料導入している間は、バッファータンクに融解試料を流入させない必要があるが、融解を急激に停止させることは難しいと判断した。そこで、融解装置からバッファータンクへ融解試料導入を退避させるための流路を設けるため、液相ポンプと流路切替バルブを購入した。この他、分析装置であるイオンクロマトグラフの修理や消耗品のメンテナンスのため、また研究発表のために経費を使用した。氷床コアによる古気候の高精度解読が行われている。解読の指標として水の安定同位体や氷中に含まれる不純物成分が用いられているが、これらは氷中で拡散移動するため、堆積時の環境を知るためには、拡散効果を考慮する必要がある。そこで、多結晶氷において拡散効果について検討するため、3次元的な試料により水分子の安定同位体拡散実験を行い、2次元的な水分子の安定同位体分布を測定し、この時間変化より、主要な拡散経路について知ることが研究目的であった。本年度は2次元的な水分子の安定同位体分布を測定する装置の開発を主に行う予定であった。しかし、当初使用しようとしていた質量分析器の故障により、水の安定同位体の分析が難しくなり、また液体イオンクロマトグラフ分析器の入手したことにより氷中の不純物の移動について検討することとした。そこで、氷床コアの連続自動融解分析システム(CFA)を開発している国立極地研究所と連携し研究を進めることとした。ただし、このCFAは海外機関に比べて大きく遅れており、また本研究に必要な高分解能な分析を目的としていないことから、融解装置と液体イオンクロマトグラフを組合せ、高空間分解能で分析可能なCFAの開発を進めることとした。まず、CFAの主要機器であるイオンクロマトグラフ分析器、送液ポンプ、流路切替えバルブを外部から制御するプログラムを作成し、それぞれがコントロールが可能な状況となった。CFAとしては、このプログラムを組合せていくので準備が整った状態である。また、上述のCFAを用いず、マイクロトームにより氷試料から微小量を削取り、液体イオンクロマトグラフへ数μLの試料を導入する方法の準備を行っている。装置故障などの諸事情により、研究計画の見直しを中心として行ったため、当初の目標への進捗は少なく、達成度としては低い。ただし、今後の研究の推進方策で述べた氷中の不純物である化学成分の拡散実験を行う準備を開始しているので、従来の研究目的への達成へは遅れているが、氷中の物質の移動という側面も含めると目的として研究は進捗している。研究実績の概要で述べたが、当初予定していたレーザーアブレーションおよび質量分析装置による2次元的な測定装置の開発は、質量分析器の故障によりできなくなった。そこで、3次元的な結晶粒界ではなく、人工的に作成した2次元的な結晶粒界をもった試料を作成し、この試料を用いて不純物の拡散実験を行うこととする。

そこで、拡散後の氷試料から、微小量をCFAにより、あるいは融解試料として高精度に抽出し分析する手法を確立し、氷中の不純物の拡散の粒界効果について明らかにすることを研究の方針とする。拡散実験は拡散のための待ち時間が必要なため、研究期間内には実験および分析方法の確立まで完了する予定である。研究実績の概要や今後の研究の推進方策で述べたように、氷試料から微量試料の抽出する方法の確立、CFAの開発、分析器の消耗品購入のために主に物品購入費を充てる。極力無駄に使用せぬよう、外注による開発による費用ではなく、研究代表者が関係者と協力し、必要な部品として購入するものとする。また、学会参加や関係者と連携のための旅費を使用する。また少額であるが謝金や論文出版に必要な費用に利用する。
二硼化マグネシウム超伝導接合技術の確立

本研究課題は、21世紀末に予測されているヘリウムの枯渇問題にむけ、Tc40Kの二硼化マグネシウム(MgB2)の超伝導接合作製技術を確立し、「ポストニオブ」20K動作超伝導エレクトロニクスの基盤を築くことを目的とした。本研究では、高品質MgB2薄膜を分子線エピタキシー法および化学気相成長法により成長する手法を確立するとともに、各種バリヤ材料を用いてオールMgB2ジョセフソン接合作製を試みた。本研究課題は、2001年に発見されたMgB2(Tc40K)を用いた超伝導接合の作製技術を確立し、「ポストニオブ」超伝導エレクトロニクスの基盤を築くことを目的とする。本研究課題は、2001年に発見されたMgB_2(T_c40K)を用いた超伝導接合の作製技術を確立し、「ポストニオブ」超伝導エレクトロニクスの基盤を築くことを目的とする。MgB_2は、T_cこそ銅酸化物に比べて低いが、二元化合物、シンプルな結晶構造、通常金属、弱異方性、長コヒーレンス長といった利点を有するために、超伝導応用に有望な材料として期待されている。実用に十分な臨界電流、特に薄膜ではJ_c100MA/cm^2に迫る値が報告されており、かつ、微細加工が容易なことから、線材応用と並んで、超伝導エレクトロニクス応用に向けた研究開発が始まりつつある。超伝導デバイス作製に向けては、高品質な薄膜及びジョセフソン接合の作製技術が鍵となる。銅酸化物高温超伝導体のジョセフソン接合技術の開発が困難を極める中で、MgB_2超伝導エレクトロニクス基盤技術を確立することは、今後のこの分野の発展にとっても極めて重要である。さらに、我々の最近の研究から、MgB_2は接合応用以外にも有望であることが明らかになりつつある。一般に、超伝導薄膜細線を温度計として用いることにより、X線や電磁波検出が可能となる。電波と光の中間に位置するテラヘルツ領域は高感度な検出が困難な波長帯である。この波長帯の最も高感度な検出器は超伝導体を用いたホットエレクトロンボロメータ(HEB)で、電波天文学では欠かせない素子となっている。HEBは、超伝導体にテラヘルツ波が照射されると、超伝導ギャップを超えて準粒子が励起され、電子温度が上昇するとともに、超伝導電流が抑制されることを原理としている。ボロメータの応答速度が速いほど、より広帯域のテラヘルツ検出器となる。高速応答には、電子系の温度上昇を格子系、さらには、環境系(基板)へ速やかに逃がす必要がある。通常律速となるのは後者であるが、MgB_2は音速が大きく、Si、MgO、Al_2O_3等広く使用されている基板との音響インピーダンス整合が良いため、MgB_2-HEBではτ_<esc>【approximately equal】20psという現状用いられているNbNに比べて約1桁速い応答が実証されている。さらに、HEBと同様な原理を基礎とする超伝導単一光子検出素子(SSPD)への展開も興味深い。本研究課題は、2001年に発見されたMgB_2 (T_040K)を用いたと超伝導接合の作製技術を確立し、「ポストニオプ」超伝導エレクトロニクスの基盤を築くことを目的とする。MgB_2は、T _こそ銅酸化物に比べて低いが、二元化合物、シンプルな結晶構造、通常金属、弱異方性、長コヒーレンス長といった利点を有するために、超伝導応用に有望な材料として期待されている。実用に十分な臨界電流、特に薄膜ではJ_0100A/cm^2に迫る値が報告されており、かつ、微細加工が容易なことから、線材応用と並んで、超伝導エレクトニクス応用に向けた研究開発が始まりつつある。銅酸化物高温超伝導体のジョセフソン接合技術の開発が困難を極める中で、MgB2超伝導エレクトロニクス基盤技術を確立することは、今後のこの分野の発展にとっても極めて重要である。平成19年度は、MgB_2薄膜成長のための分子線エピタキシー(MBE)装置の製作・立ち上げを行った。電子ビーム蒸発が必要なボロンに対する徹底したレートの安定化、及び、最先端の電子衝撃発光分光装置の導入による高精度蒸発レート制御により、現在までに再現性良く高品質MgB2薄膜が成長できるに至っている。現在、接合作製に取り組んでいるが、接合作製上の課題として、2ギャップ制御とバリヤ材料の選択が挙げられる。前者については、接合ジオメトリーの工夫が必要である。後者については、SIS接合に限定せずSNS接合まで視野に入れると、MgB_2と同構造のA1B_2構造の導電性硼化物が多くあるため、選定の範囲が広がる。

本研究課題は、2001年に発見されたMgB_2(T_c40K)を用いた超伝導接合の作製技術を確立し、「ポストニオブ」超伝導エレクトロニクスの基盤を築くことを目的とする。前年度までに確立した分子線エピタキシー成長技術を基礎に、2008年度は、サンドイッチ型接合作製に向けたMgB/バリヤ/MgB_2の三層積層に取り組んだ。最初に試みたのは、接合作製の観点から最も簡単なアモルファスバリヤである。三層積層の一連の成長を反射電子線回折(RHEED)により監視しながら行い、アモルファス層を挟んでも上部MgB_2は単結晶薄膜であることが確認された。また、三層膜の上下MgB_2電極の超伝導特性は単一膜の特性と遜色はない。同じ特定領域に属する名大・藤巻研究室との共同件研究によりMgB_2/a-B/MgB_2接合特性を評価したが、超伝導電流が小さいながら観測され、また、マイクロ波照射により鮮明にシャピロステップが観測されたことから、リーク電流でなくジョセフソン電流であることが確認された。また、マイクロ波のパワーによってはジョセフソン電流が完全に抑制されたことから考えて、余剰電流は少ないと判断される。30GHzでも3次、4次程度のステップまで見えており、高周波応答が期待される。アモルファスバリヤを用いた接合とともに、MgB_2と同構造のAIB_2型硼化物をバリヤとするオールエピタキシャルのSNS接合作製も進めている。積層型接合においては、バリヤ層と上部・下部電極の界面でMgB_2の超伝導性をいかに保持するかが最も重要な課題である。界面でのMgB_2の良好な超伝導性を保持するには、バリヤ材料としてMgB_2と化学的かつ構造的にも似たAIB_2型棚化物を用いることがベストであると考えられる。現在、MgB_2との格子整合が良いAIB_2・TiB_2をバリヤとする接合作製を試みている。本研究課題は、2001年に発見されたMgB_2(T_c40K)を用いた超伝導接合の作製技術を確立、「ポストニオブ」超伝導エレクトロニクスの基盤を築くことを目的とする。2008年度以来、本特定領域研究において製作した分子線エピタキシー成長装置を用いて、サンドイッチ型接合作製に向けたMgB_2/バリヤ/MgB_2の三層積層に取り組んでいる。最初に試みたのは、MgB_2と格子整合の良い常伝導AlB_2・TiB_2をバリヤとするオールエピタキシャルSNS接合である。しかし、MgB_2は真空中では300°C以上で分解するため、300°C以下の低温プロセスが要求される。バリヤ層のAlB_2・TiB_2がこのような低温では良好なエピタキシャル成長をしないことが判明したため断念した。2009年度は、アモルファスバリヤ(アモルファスボロン(a-B)、アモルファスシリコン(a-Si))とするSIS接合の作製を集中的に行った。同じ特定領域に属する名大・藤巻研究室との共同研究により評価したMgB_2/a-B/MgB_2接合では、磁場及びマイクロ波に応答するジョセフソン電流が観測された。一方で、ジョセフソン電流は小さく、また、接合のT_cは10K程度で、単体のMgB_2薄膜のT_c35Kに比べてはるかに低い。高品質MgB_2接合作製においては、バリヤ層に接した界面近傍のMgB_2の超伝導特性が鍵を握る。下部電極とバリヤの界面に劣化層がないこと、及び、バリヤ上の上部電極の初期成長が良好であること、の2点が重要である。我々の過去の研究から、MgB_2においては後者の問題がより重大であると判断しており、そのため、様々なバリヤ上のMgB_2初期成長に焦点を当てた。サファイア基板上にMgB_2を直接成膜した場合には、10nmのMgB_2超薄膜でもT
新規パッチクランプ原子間力顕微鏡によるＰｒｅｓｔｉｎ構造変化の分子メカニズム解明

細胞膜電位コントロールデバイスを開発し,これを用いてプレスチンを発現させた培養細胞の電気特性計測及び単離細胞膜表面の微細構造観察を試みた.その結果,デバイス基板の微小孔(直径約2 um)上に,細胞をポジショニングすることに成功し,細胞膜表面の詳細構造の可視化にも成功した.さらに,デバイス基板の微小孔上に,人工脂質膜を作製することを試み,脂質膜形成後にギガオームシールが形成されることが確認された.このことは,当該デバイスで脂質膜中に再構成したタンパク質の変形挙動を可視化できる可能性を示唆している.今後,得られた知見を基に,プレスチンの変形挙動の可視化に取り組む.本年度は,まず昨年度からの課題である「Prestinの多量体構造の制御法」について検討を行った.多量体構造制御に必要な高密度prestin脂質膜を作製するには十分量のprestin分子が必要である.そこで現状の発現系について検討を行ったところ,2 Lの培養液中に培養した200億個の細胞から精製できるタンパク質は約84 ugであり,不十分であることが明らかとなった.今回使用した培養細胞におけるprestinの発現密度から,精製効率は6-7割程度と見積もられる.したがって,発現系の改良に取り組み,発現効率を外有毛細胞における発現密度と同程度(現在の約20倍)に向上させる予定である.その後,精製過程の見直し(新規ペプチドタグ導入等)に取り組み精製効率の向上を目指す.「Prestinの変形状態の制御法」に関しては,昨年度開発した膜電位コントロールデバイスを用いた電気特性計測及び表面微細構造観察に関する検討を行った.膜電位コントロールデバイス基盤の微小ポア(直径2 um)上に,人工脂質膜を形成することを試み,脂質膜形成後に,2 GΩの電気抵抗(すなわちギガオームシール)が形成されることが確認された.このことは,開発したデバイスを用いて細胞膜電位をコントロールしながら細胞膜表面膜タンパク質の変形挙動を可視化できることを示唆している.今後,当該研究計画で開発したデバイス及び得られた知見を基に,人工脂質膜中に精製プレスチンを再構成し,その電気特性の計測と変形挙動の可視化に取り組む計画である.全体計画の進捗は,当初計画に対して遅れたものの,計画遂行に必要不可欠な課題とその解決策が明確となった.早期に高密度prestin脂質膜の作製を達成し,さらに開発した膜電位コントロールデバイスを用いた「Prestinの運動能(機能)評価」を実施する計画である.細胞膜電位コントロールデバイスを開発し,これを用いてプレスチンを発現させた培養細胞の電気特性計測及び単離細胞膜表面の微細構造観察を試みた.その結果,デバイス基板の微小孔(直径約2 um)上に,細胞をポジショニングすることに成功し,細胞膜表面の詳細構造の可視化にも成功した.さらに,デバイス基板の微小孔上に,人工脂質膜を作製することを試み,脂質膜形成後にギガオームシールが形成されることが確認された.このことは,当該デバイスで脂質膜中に再構成したタンパク質の変形挙動を可視化できる可能性を示唆している.今後,得られた知見を基に,プレスチンの変形挙動の可視化に取り組む.哺乳類の鋭敏な聴覚は,内耳に存在する感覚細胞である外有毛細胞(OHC)の伸縮運動に起因する.この運動能は,OHC細胞側壁の膜タンパク質“prestin(プレスチン)"の構造変化で実現されると予測されている.しかし膜タンパク質の立体構造とその構造変化を計測する方法は確立されておらず,そのためprestinの構造変化メカニズムは解明されていない.そこで本研究では,原子間力顕微鏡法を基盤とした,prestinの構造変化を直接計測できる新たな技術を確立し,分子レベルでその構造変化メカニズムを解明することを目的とする.本年度は,「Prestinの多量体構造の制御法」と「Prestinの変形状態の制御法」の確立に取り組んだ.「Prestinの多量体構造の制御法」については,prestinを発現させた培養細胞(CHO細胞)からprestinを精製・抽出することには成功した.しかしながら,当該実験に当初計画よりも時間を要したために,多量体制御の実験が十分に行えなかった.この点は来年度速やかに実施する計画である.「Prestinの変形状態の制御法」については,膜電位コントロールデバイスの開発を試み,さらに当該デバイスを用いてプレスチンを発現させた培養細胞の電気特性計測及び単離細胞膜表面の微細構造観察を試みた.その結果,開発した膜電位コントロールデバイス基盤の微小ポア(直径約2μm)上に,培養細胞をポジショニングすることに成功した.これにより,電気抵抗値が細胞ポジショニング前に比べて50倍程度増加する様子が観察でき,さらに細胞膜表面の詳細構造の可視化にも成功した.今後,当該研究計画で開発したデバイス及び得られた知見を基に,人工脂質膜中に多量体構造の異なる精製プレスチンを再構成し,その電気特性の計測と変形挙動の可視化に取り組む計画である.平成24年度は,「Prestinの多量体構造の制御法」と「Prestinの変形状態の制御法」の確立に取り組んだ.「Prestinの多量体構造の制御法」については,prestinの抽出・精製と多量体構造制御を計画していた.Prestinの抽出・精製法の確立に当初計画よりも時間を要したため,多量体構造制御の実験は十分に行えなかった.

「Prestinの変形状態の制御法」については,統合計測・制御・解析システムの構築と膜電位制御デバイスの開発を計画していた.膜電位制御デバイスの開発に当初計画よりも時間を要したため,統合計測・制御・解析システムの構築には至らなかった.平成24年度計画で未達成の計画について速やかに取り組む.平成25年度計画については,実験系の完成を高めることで実験効率を上げ,期間を短縮して実施する計画である.平成24年度に計画していたprestinの多量体制御に関する実験において,当初の予想とは異なる結果が得られたために追加実験が必要となり,計画目標の達成のために3,000千円の前倒し請求を行った.しかしながら,同実験に必要な統合計測・制御・解析システムの開発に計画よりも時間を要した結果,追加実験の実施に至らなかった.次年度使用額はこのために生じたものであり,次年度に当該実験を実施するのに必要な経費として,平成25年度請求額と合わせて使用する予定である.
高度侵襲後の胃蠕動低下とグレリン濃度変化、および六君子湯の有効性の検討

侵襲後の消化管蠕動の低下に関して、六君子湯の有効性の機序の解明を目的として研究を行った。腹膜炎モデルを作製し、胃蠕動に関与する血漿グレリン濃度を測定した。また、胃蠕動低下に対する六君子湯の有効性の機序を、グレリン濃度への影響の側面から検討した。侵襲後に低下した食餌摂取量や水分摂取量は六君子湯投与により早期に回復した。六君子湯投与群では体重の回復も対照群に比べて数日早いことが示唆された。投与群では活性化グレリン濃度が高く、不活性化グレリン濃度が低い傾向がみられたため、経口摂取の回復には活性化グレリンへのシフトが関与していることが示唆され、六君子湯は活性化グレリンの増加に関与していると考えられた。高度侵襲後消化管蠕動の低下に関して、動物モデルを作製し、胃蠕動に関与する血漿グレリン濃度を測定し、侵襲に伴う濃度変化を把握する。また、侵襲後の胃蠕動低下に対する六君子湯の有効性を検討する。さらに、臨床検体を用いて集中治療領域の重症患者における胃蠕動低下に対する六君子湯の有効性の機序を、グレリン濃度変化の側面から解明する。これまで明らかにされていない重症患者における胃蠕動低下とグレリン濃度の低下を探求するものであり、六君子湯の有効性の機序の解明、さらには活性化グレリン製剤の開発にも貢献できると考えられる。科研費が追加で交付決定となったため、平成27年度は研究の準備期間として、動物実験計画書およびIRB書類の作成を行っている段階である。重症患者の中でも重症度が高く、予後の悪い血液疾患患者の重症化例に関して、臨床データからその特徴と経腸栄養管理の状況について、日本静脈経腸栄養学会学術集会で発表した。科研費の採択が10月の追加採択であったため、準備期間が取れず、動物実験計画書およびIRB書類の作成準備を行っている段階である。重症患者では高度侵襲に伴う臓器障害の一分症として消化管蠕動が低下する。特に、胃蠕動の低下は生じやすく、胃内容停滞によって、胃食道逆流による誤嚥や呼吸器関連肺炎(VAP)を誘発するほか、経鼻胃管排液量増加による電解質の喪失など代謝性障害をきたす可能性もある。このため、胃管からの経腸栄養の開始遅延や経腸栄養そのものの中止を余儀なくされることも多い。このような病態に対しては、種々の消化管運動賦活薬が用いられるが、十分な有効性を得られない症例もあるため、その際は栄養剤の経空腸投与を行う必要がある。経空腸投与による消化器合併症の軽減が報告されているが、経胃投与がより生理的である。しかし、投与経路による消化管蠕動や消化管ホルモン分泌の差異については十分に議論されていない。高度侵襲後消化管蠕動の低下に関して動物モデルを作成し、胃蠕動に関与する血漿グレリン濃度を測定し侵襲に伴う濃度変化を把握する。さらに、臨床検体を用いて集中治療領域の重症患者における胃蠕動低下に対する六君子湯の有効性の機序を、グレリンの濃度変化の側面から解明する。これまで明らかにされていない重症患者における胃蠕動低下とグレリン濃度変化の低下を探求するものであり、六君子湯の有効性の機序の解明、さらには活性型グレリン製剤の開発にも貢献できると考えられる。平成28年度は動物実験計画の承認およびIRB審査が終了し、臨床検体の採取を続けている。平成29年度は臨床検体の採取を継続し、一定数ごとに活性型および不活性型グレリンの測定を行い、臨床データと併せてデータ解析を行う。また、平行して動物実験を行い、同様にグレリン測定を行い、六君子湯投与の有効性などについて検討を行う予定である。スタッフの人員減により、動物実験を行う時間がとれなかったため。特に、胃蠕動の低下は生じやすく、胃内容停滞によって、胃食道逆流による誤嚥や呼吸器関連肺炎VAP)を誘発するほか、経鼻胃管排液量増加による電解質の喪失など代謝性障害をきたす可能性もある。高度侵襲後の消化管蠕動の低下に関して、動物モデルを作成し、胃蠕動に関与する血漿グレリン濃度を測定し、侵襲に伴う濃度変化を把握する。さらに、臨床検体を用いて、集中治療領域の重症患者における胃蠕動低下に対する六君子湯の有効性の機序を、グレリン濃度変換側面から解明する。これまで明らかにされていない住所

患者における胃蠕動低下とグレリン濃度の低下を探求するものであり、六君子湯の有効性の機序の解明、さらには活性化グレリン製剤の開発にも貢献できると考えられた。平成29年度は臨床検体の採取し、一定数の検体が集まり次第、活性型および不活性型グレリンを測定した。また、平行して動物実験を行い、同様にグレリン測定を行った。現在、全県体のグレリン濃度の測定は終了していないが、今後、測定を完了する予定である。測定囚虜後、他の臨床データ・実験データと併せて解析を行い、六君子湯投与の有効性などについて検討を行う予定である。侵襲後の消化管蠕動の低下に関して、六君子湯の有効性の機序の解明を目的として研究を行った。腹膜炎モデルを作製し、胃蠕動に関与する血漿グレリン濃度を測定した。また、胃蠕動低下に対する六君子湯の有効性の機序を、グレリン濃度への影響の側面から検討した。侵襲後に低下した食餌摂取量や水分摂取量は六君子湯投与により早期に回復した。六君子湯投与群では体重の回復も対照群に比べて数日早いことが示唆された。投与群では活性化グレリン濃度が高く、不活性化グレリン濃度が低い傾向がみられたため、経口摂取の回復には活性化グレリンへのシフトが関与していることが示唆され、六君子湯は活性化グレリンの増加に関与していると考えられた。動物実験計画書とIRB審査が通り次第、動物実験および臨床検体を用いた研究を同時に進める予定である。平成29年度は人員および実験を施行する時間が確保できる見込みのため、遅れを取り戻すべく検体の測定および動物実験を進める予定である。集中治療医学科研費の交付決定が遅れたため、動物実験計画書および臨床研究のIRB書類の提出および実験開始が遅れているため。人員減による動物実験および検体濃度測定が遅れているため。動物実験の許可とIRB審査が済みしだい、早急に実験を開始し、必要経費を使用する予定である。平成29年度は人員および研究施行時間が確保できるため、早急に動物実験と検体濃度測定を行う。
マグネシウム合金の高強度化に寄与する準結晶粒子分散と界面構造解析

高分解能電子顕微鏡を用いてMg-2.7Zn-0.4Y合金の双晶界面と析出粒子の相互関係を観察した。析出粒子の大部分はmonoclinic構造を持つMg_4Zn_7相で、双晶または母相と[0001]_<Mg>||[010];{10-10}_<Mg>||(201)の方位関係を示すことが分かった。Mg_4Zn_7相は、hexagonal構造を示し、[010]_<Mg_4Zn_7>||[1120]_<MgZn_2>方位関係にあるMgZn_2相に成長した。また、MgZn_2相析出粒子は、双晶界面と密接な関係を示すことが分かった。さらに、Mg_4Zn_7相とMgZn_2相は、積層構造をもち、icosahedrally coordinated atomsと良く似ることを明らかにした。MgZn_2相の界面では、変態構造であるMg_4Zn_7相を形成し、[100]または[001]方向に1/2ユニットセル分伸張していることが分かった。現在、これらの析出粒子が母相に分散する試料の機械的特性を調査している。本研究成果は、アメリカ:TMSから、Mg Fundamental Research Awardの対象となり受賞に至った。Mg-2.7at%Zn-0.4at%Y鋳造合金を、熱処理(400°C、24時間)と押出加工(350°C)を用い、マグネシウム母相に準結晶粒子相、金属間化合物相が分散する試料を準備した。同試料の室温引張・圧縮試験を行い、特に準結晶分散粒子マグネシウム合金の機械的特性を理解した。また、150°Cで種々の保持時間で熱処理を行い、時効特性を調査した。硬さ測定による時効挙動の把握、ならびに透過型電子顕微鏡組織観察による金属間化合物相の組織形態を理解した。これらの結果や条件をもとに、圧縮試験で予ひずみを与え、その後、時効処理を行い、予ひずみが組織変化に及ぼす影響について検討を開始する足がかりを得ることが出来た。Mg-2.7at.%Zn-0.4at.%Y合金を使用し、双晶界面に存在するMg_4Zn_7析出粒子について微細組織観察を行った。Mg-Zn系に見られる針状形態の析出粒子ではなく、不規則形態を有する析出粒子が、双晶界面で多く存在することが分かった。双晶界面上に存在するこれらの析出粒子は、母相ではなく双晶界面に近い構造を示すことが分かった。また、これらの機械的特性、特に硬さについて調査した結果、双晶界面は、転位の運動を阻害するため、硬さの改善に寄与するが、双晶界面に存在する析出粒子は、硬さにあまり影響を及ぼさないことが明らかになった。これらの結果は、日本金属学会およびTMSにて発表行った。また、学術誌には、現在、投稿中である。
マウス受精前核での遺伝子発現制御機構に関する研究

昨年に引き続き、受精後の前核期で転写される遺伝子を免疫沈降法によって単離する方法を試みた。しかし、量的問題を克服することができず、達成が困難となった。また、縮重PCRによる新規クロマチンリモデリング因子の単離および同定も断念せざるを得ない状況となった。そこで、初期胚におけるクロマチン構造の変化を担う可能性のあるタンパク質PFTF1/BHC80の機能解析を行った。PFTF1/BHC80ノックアウトマウスを作製したところ、初期胚発生には問題がなかったものの、新生児死を起こすことが明らかとなった。他グループからの報告によりPFTF1/BHC80は非神経細胞における神経特異的遺伝子の転写抑制を担うことが報告された。そこで、PFTF1/BHC80欠損マウスの肺における神経特異的遺伝子の発現量をRT-PCR分析により検討したところ、調べた4つの遺伝子のうちの1つシナプシンI(SynI)の異所的発現を認めた。さらに、クロマチン免疫沈降法によりPFTF1/BHC80がSynIのプロモーター領域に結合していることを証明した。これらの結果は、初期胚発生におけるクロマチン構造の維持を介した神経特異的遺伝子の転写抑制に、PFTF1/BHC80が部分的に貢献することを示唆している。前核期に転写される遺伝子単離法の構築のための条件設定を行った。BrUTP存在下でin vitro転写反応を行い、BrUTPを含むRNAに対してRT-PCRが可能であるかどうかを検討した結果、可能であることが判明した。また、購入した抗BrUTP抗体が、実際に取り込まれたRNAに反応するかどうかをゲルシフトアッセイにより検討したところ、抗体とBrUTPとの反応を確認することができた。今後は、実際に受精卵を用いて、本抗体による免疫沈降及びRT-PCRにより転写産物の同定を行う予定である。次いで、BrUTPを取り込ませた受精卵を経時的に回収し免疫染色を行った結果、約15時間後からde novoの転写が起こることを見出した。このことから、IP4及びIP5のマイクロインジェクショシは、受精前もしくは直後に行い,その後15時間後までの観察を行うのが適当であるとの示唆を得た。さらに、縮重PCR法によるATP依存的DNAヘリカーゼ遺伝子の単離を試みた。既知のヘリカーゼであるMi2とSWIの配列をもとにしてプライマー対をデザインし、マウス未受精卵由来のファーストストランドcDNAをテンプレートにしてPCRを行った。得られた増幅産物をクローニングしてDNA配列解析を行ったが、現在のところ既知のDNAヘリカーゼドメインと相同性を有する配列は得られていない。また、これまで解析を行ってきたヒストン脱アセチル化を担う複合体の足場タンパク質PFTF1について、標的遺伝子の同定を試みた。ヒト細胞より、クロマチン免疫沈降(ChIP)により精製したDNAをクローニングした結果、2つの遺伝子制御領域を単離することができた。本方法は、受精卵におけるクロマチン構造変換を解析するために有用であると考えられる。受精後の前核期に転写される遺伝子単離方法を構築すべく、種々の条件検討を行った。具体的には、マウス前核期卵にBrUTPを取り込ませて、BrUTPに対する抗体で免疫沈降し、沈降したRNAを鋳型にcDNAを合成、クローニング、さらにDNAシーケンスを行った。その結果、rRNAなどの非特異的な沈降物が多く、新規転写産物の単離は量的問題から困難ではないかと考えられた。今後は、更なる改善を施すとともに、別の実験系の構築の必要があると考えられる。前年度の実績報告に記したように、縮重PCR法による新規クロマチンリモデリング因子の単離ができなかったため、既知のクロマチンリモデリング因子であるMi-2と相同性を有するPFTF1/BHC80に焦点を当て、その機能解析を行った。その結果、PFTF1/BHC80は恒常的に発現する遺伝子であること、PFTF1/BHC80には単一遺伝子から生じる少なくとも6つのアイソフォームが存在すること、PFTF1/BHC80は転写抑制複合体BHC(BRAF35-HDAC Complex)の足場として機能すること、PFTF1/BHC80の転写抑制活性には複合体構成成分との結合部位であるC末端領域が重要であることなどを明らかにした。さらに、PFTF1/BHC80ノックアウトマウスを作製したところ、ホモ欠損マウスは生後1日以内に死亡することから、PFTF1/BHC80が胚発生に重要な役割を果たしていることが示唆された。今後は、PFTF1/BHC80が果たす役割をマウス初期胚や生殖細胞をモデルとして検討していく予定である。

そこで、PFTF1/BHC80欠損マウスの肺における神経特異的遺伝子の発現量をRT-PCR分析により検討したところ、調べた4つの遺伝子のうちの1つシナプシンI(SynI)の異所的発現を認めた。さらに、クロマチン免疫沈降法によりPFTF1/BHC80がSynIのプロモーター領域に結合していることを証明した。これらの結果は、初期胚発生におけるクロマチン構造の維持を介した神経特異的遺伝子の転写抑制に、PFTF1/BHC80が部分的に貢献することを示唆している。
ショウジョウバエの複眼形成異常をモデルとしたレクチンー糖鎖の分子作用機構の解明

Lectin24DbはHRP抗原糖鎖を認識するレクチンであり、FucTAはHRP抗原糖鎖を合成する酵素である。ショウジョウバエの複眼形成にLectin24DbとFucTAが関与するという我々の知見を基に、両者の相互作用が形態形成にどのような影響を与えているのか解析を行った。複眼でLectin24Db、FucTAの発現量を減らすと、複眼の発生に関係するEGFR、リン酸化ERKの発現量が減っていることが示され、これが原因となって複眼形成の異常を導くことが示唆された。本研究では、HRP抗原糖鎖上のα1,3Fucを認識するレクチンLectin24Dbとα1,3Fuc転移酵素FucTAがショウジョウバエ複眼形成に関与するという知見を基に、レクチン-糖鎖構造の相互作用が形態形成の過程でどのような役割を担っているのか解析を行う。Lectin24DbとFucTAの発現解析を行うために、それぞれの特異抗体を作製し組織染色を行った結果、複眼成虫原基においてLectin24Dbは細胞の膜表面の細胞間基質に、FucTAは細胞内のゴルジ体に局在していることが示された。さらに、HRP抗体による疫沈降実験を行った結果、沈降物中にはEGFR、tkv抗体で認識されるバンドが認められなかった。Lectin24DbとHRP抗原糖鎖の相互作用の影響を受けているのはEGFR、tkvの受容体ではなくリガンドであるspitz, dppの可能性が考えられる。本研究では、N結合型糖鎖上のα1,3Fucを認識するレクチンであるLectin24Dbとα1,3Fuc転移酵素であるFucTAのショウジョウバエ複眼形成における関与を解析することで、レクチン-糖鎖構造の相互作用が形態形成の過程でどのような役割を担っているのか明らかにする。Lectin24DbとFucTAの複眼成虫原基における発現解析を行うために、Lectin24DbとFucTAに対するポリクローナ抗体を作製した。これらの特異抗体を用いた免疫組織学的解析により、複眼成虫原基においてLectin24Dbは細胞の膜表面の細胞間基質に、FucTAは細胞内のゴルジ体に局在していることが示された。さらに、Lectin24DbとEGFRシグナルとの関係を明らかにするために、複眼成虫原基におけるEGFRの発現を免疫組織学的に解析したところ、Lectin24Db RNAi体においてEGFRの発現減少が示された。加えて、EGFRシグナルの下流因子であるリン酸化MAPKについても同様に解析したところ、発現が顕著に減少していた。また、FucTA RNAi体においてもEGFR、リン酸化MAPKの発現減少が示された。これらのことより、N結合型糖鎖上のα1,3Fucを認識するレクチン、Lectin24Dbとα1,3Fuc転移酵素であるFucTAは、EGFRシグナル因子に作用して複眼形成に関与することが示された。生物学本研究の目的は、N結合型糖鎖上のα1,3Fucを認識するレクチン、Lectin24Dbとα1,3Fuc転移酵素であるFucTAのショウジョウバエ複眼形成における関与を解析することで、形態形成におけるレクチン-糖鎖構造の相互作用の役割の解明することである。本年度の研究計画である、(1)Lectin24Db、FucTAの複眼成虫原基での発現解析は、Lectin24Db、FucTAの特異ポリクローナル抗体を作製し、複眼成虫原基における免疫組織学的解析を行ったため、計画は達成されている。(3)Lectin24Db、FucTA RNAi体の複眼成虫原基におけるEGFRの発現量、およびEGFRシグナルの下流因子であるリン酸化ERKの変化については、EGFR、リン酸化ERKの発現量がLectin24Db、FucTA RNAi体の双方で減少していることを示している。したがって、当初の研究計画に則り解析を行い、研究目的であるLectin24DbとFucTAの複眼形成におけるEGFRシグナルへの関与を明らかにしている。また、当初25年度の計画であったLectin24Dbタンパク質の発現実験を開始しており、本研究はおおむね順調に進展している。本年度では、Dppシグナル変異体との遺伝学的相互作用解析に加え、当初の研究計画に則り解析を進める。(4)EGFRやtkv等の受容体の抗HRP抗体を用いた免疫沈降解析では、EGFRやtkv等の細胞膜上の受容体がFucTAの合成するα1,3Fucを持つHRP抗原糖鎖の修飾を受けているかどうか、免疫沈降実験を行う。沈降産物の質量分析装置による解析も合わせて行い、未知のHRP抗原糖鎖を持つタンパク質の同定も行う。

さらに、それらの分子の変異体とLectin24Db、FucTA RNAi体との遺伝学的相互作用解析、遺伝子相互作用データベースを用いたバイオインフォマティクス解析も行う。(5)Lectin24Dbと相互作用する分子の同定では、組み換えLectin24Dbタンパク質のアフィニティービーズを作製し、タンパク質抽出物と反応させ回収された反応物の質量分析によりLectin24Dbと相互作用する分子を同定する。(4)のHRP抗原糖鎖による修飾を受ける分子と一致する分子があるか比較し、Lectin24DbとHRP抗原糖鎖の複合体の構成因子となり得る分子を検索する。それらの分子とLectin24Db、FucTAとの遺伝学的相互作用解析、免疫組織学的解析、バイオインフォマティクス解析を行い、関連性を追求する。得られた解析結果を連携させ、研究目的である形態形成におけるレクチン-糖鎖の整理機能とシグナルまで含めた分子メカニズムについて検討を行う。次年度使用額に繰り越された24,709円のうち、23,940円は前年度3月中旬に納品されている消耗品の購入費用である。所属機関の支払いシステム上、3月中旬の納品に対する支払いは4月期にずれ込むため、上記額面が次年度使用額として計上された。本年度も前年度同様、実験材料であるショウジョウバエの飼育に関する消耗品、免疫組織学的解析、生化学的解析、分子生物学的解析に関わる試薬、抗体などの消耗品を中心に使用する。
円筒デトネーション波を用いた大直径デトネーションイニシエータの開発

本研究では,著者が提案するパルスデトネーションエンジン用イニシエータによる大直径デトネーション波生成の一般則を導くことを目的として,本イニシエータ内を伝播する円筒デトネーション波の伝播限界,および円筒デトネーション波から円環デトネーション波への遷移条件を調査した.円筒波の伝播限界は流路幅と曲率とセルサイズの比によって決定され,閾値は1/16である.また,円筒波から円環波への確実な遷移条件は,円環流路幅を円筒流路幅の半分以下にし,かつセルサイズの4倍程度を確保することである.本研究では,著者が提案するパルスデトネーションエンジン用イニシエータによる大直径デトネーション波生成の一般則を導くことを目的として,本イニシエータ内を伝播する円筒デトネーション波の伝播限界,および円筒デトネーション波から円環デトネーション波への遷移条件を調査した.円筒波の伝播限界は流路幅と曲率とセルサイズの比によって決定され,閾値は1/16である.また,円筒波から円環波への確実な遷移条件は,円環流路幅を円筒流路幅の半分以下にし,かつセルサイズの4倍程度を確保することである.本研究では,当該年度において,あらゆるターゲットガスに適用可能な大直径デトネーション波生成の一般則を導くことを目的として,プリデトネータ直径および平板流路幅を変更し,円筒デトネーション波の生成条件に及ぼす流路幅とドライバーガス充填半径の影響を実験的に調べた.流路幅を10 mmに固定しプリデトネータ直径を10 mmから20 mmに変更すると,プリデトネータ出口におけるデトネーション波の再開始現象が,一度の衝撃波の衝突によって円筒デトネーション波が生成される直接開始から,複数回の反射を繰り返して円筒デトネーション波に遷移する間接開始になる現象が確認された.この時,ターゲットガスに対するドライバーガスの必要過供給半径が大きくなるが,これは再開始現象が直接開始から間接開始になることにより円筒デトネーション波が形成される位置が半径方向外側に移動するためと考えられる.またプリデトネータ直径を20 mmに固定し,流路幅を10 mmから15 mmに変更し流路幅がターゲットガス内の円筒デトネーション波伝播に与える影響を調べた.流路幅を10 mmで行った過去の研究から,ターゲットガスの伝播限界は円筒波のセルサイズが流路幅と等しい場合と考えられた.しかし,流路幅を15 mmに変更した場合の伝播限界はセルサイズと流路幅が等しくなった時ではなく,セルサイズが約10 mmの場合であり,円筒デトネーション波の伝播限界に流路幅は無関係であることが強く示唆された.現在の流路幅の伝播限界セルサイズ10 mmはターゲットガスの窒素希釈率に換算すると約60%である.この希釈率付近は希釈率に対するセルサイズの変化が大きいため,より低希釈率で伝播限界を判断できるようにするため,来年度はターゲットガス領域のみ流路幅23 mmになるような中子を製作し,セルサイズの円筒波伝播限界に与える影響を調査する予定である.本研究では,申請者が提案するパルスデトネーションエンジン用イニシエータによる大直径デトネーション波生成の一般則を導くことを目的として,本イニシエータ内を伝播する円筒デトネーション波の伝播条件,および円筒デトネーション波から円環デトネーション波への遷移条件を調査した.昨年度の成果により,円筒デトネーション波の伝播条件(伝播限界)は流路幅とセルサイズの比(w/lambda)によらず伝播する円筒波の曲率とセルサイズの比(lambda/r)によって決定されることが示唆された.当該年度ではこれを確認するため,昨年度採用した10 mmと15 mmの円筒流路幅に加えて,3 mmの流路幅を実現するスペーサを製作し伝播実験を行った.ターゲットガス(水素・酸素量論混合気を窒素希釈)の窒素希釈率が50 %と55.6 %の間に円筒デトネーション波の伝播限界があり,その伝播限界は流路幅に依存しないことが明らかになった.伝播判断位置はr = 160 mm,窒素希釈率50 %55.6 %のセルサイズは約10 mmであることより,伝播限界を決める閾値lambda/rは1/16である.当初計画通り,新たに内径300 mm,燃焼器長150 mmの燃焼器を製作し,寸法の異なるアルミニウム製の中子を挿入することにより,流路形状(円筒流路幅wおよび円環流路幅l)が円筒デトネーション波から円環デトネーション波への遷移に与える影響を調査した.結果,水素/空気量論混合気(lambda = 10 mm)に対しては,w/l > 0.5,l > 35 mm,lambda > 3.4l mmを満たすように流路を設計することで,反射体下流まで円環デトネーション波を伝播させることが可能であることが分かった.燃焼工学当該年度では,下記の知見が得られた.プリデトネータと燃焼器の接続部を可換式とし,プリデトネータ直径と流路幅をパラメータとして,円筒デトネーション波の直接開始条件を明らかにした.直接開始は円筒デトネーション波の伝播限界条件付近では,プリデトネータ直径と流路幅が等しい場合に起こり,プリデトネータ直径が流路幅よりも大きい場合は間接開始となることが分かった.

円筒デトネーション波の伝播はドライバーガスとターゲットガスの境界面における初期窒素濃度勾配の影響を受ける.当該年度では汎用熱流体解析ソフトFluentを用いた3次元混合計算を行いその影響を評価した.その結果,境界面における濃度勾配はドライバーガスの過供給量によらず約80 mmの幅を有していることが分かった.よって必要なドライバーガス過供給量は上述の円筒デトネーション波の成立距離に80 mmを加えたものと考えることが出来る.プリデトネータ直径を20 mmに固定し,流路幅を10 mmから15 mmに変更し流路幅がターゲットガス内の円筒デトネーション波伝播に与える影響を調べた.流路幅を10 mmで行った過去の研究から,ターゲットガスの伝播限界は円筒波のセルサイズが流路幅と等しい場合と考えられた.しかし,流路幅を15 mmに変更した場合の伝播限界はセルサイズと流路幅が等しくなった時ではなく,セルサイズが約10 mmの場合であり,円筒デトネーション波の伝播限界に流路幅は無関係であることが強く示唆された.以上の知見が得られたことにより,当該研究はおおむね順調に進展していると考えられる.当該年度の結果,円筒デトネーション波の伝播限界が流路幅に無関係であることが強く示唆された.よって,今後は伝播限界が円筒デトネーション波の曲率によって決定されるとの仮説を立て,それを実証することとする.そのために円筒デトネーション波が伝播する流路幅を23mmに設定可能な実験装置を製作する.この流路幅で実験を行うことにより,伝播限界が流路幅で決定されている場合,伝播限界セルサイズは流路幅と等しい23 mmとなる.逆に曲率によって決定される場合,伝播限界セルサイズは現在と同様の10 mm付近になるはずである.この実験に際し,円筒燃焼器中心部の平板間隔が23 mmだと,ドライバーガス条件でも円筒デトネーション波が起爆しないという問題が生じる.そこで解決策として中心領域のみ平板間隔が10 mm,外周領域の平板間隔が23 mmとなるようなドーナツ状中子を製作するものとする.なお,実験方法に関しては当該年度からの変更は想定していない.また,当初計画通り,流路幅の変化が円筒波から円環波の遷移に与える影響を調べるため,円筒形状燃焼器ないに円盤中子を設置し,円筒波から円環波への遷移が起こる反射体コーナーを再現する.この実験では流路幅は円筒流路における円筒波の伝播限界によって決定し,反射体と燃焼器の距離および円筒形状燃焼器の内径をパラメータとする.流路幅15 mmの燃焼器を用いて円筒デトネーション波の伝播限界におけるセルサイズを調査した結果,流路幅と伝播限界のセルサイズに相関がないことが示唆された.当初案ではさらに流路幅の大きな20 mmスペーサー用フランジの製作を予定していたが,この条件では目標セルサイズにおける窒素希釈率が大きくなりすぎて有意なデータ取得が困難になる.よって今後の推進方策で述べたとおり,流路幅とセルサイズに相関がないことを示すためには,より流路幅が小さな条件で実験を行うことが妥当であると判断した.次年度では20 mmスペーサー用フランジにかえて流路幅を23mmに設定可能なドーナツ状平板を製作する.
骨細胞(osteocyte)のメカニカルストレス活性化イオンチャネルの調節機構

近年、骨細胞が機械的刺激に反応するメカノセンサーであることが報告されているが、その受容体および情報伝達経路に関しては殆どが不明である。そこで今回、メカニカルストレス情報伝達経路の一環として、骨細胞の膜イオン輸送系への作用を検討した。まず、Whole-cell patch clamp法を用い、MSによるイオンチャネル調節機構への関与を検討した。実験には新生児ラット頭蓋骨より採集した骨細胞を用い、MSには外液の低浸透圧溶液刺激により生じる細胞膜伸展作用を用いた。低浸透圧刺激により細胞膨張と同期して外向整流性Cl^-電流が活性化された。このCl^-電流はDIDS・NPPB感受性で、陰イオン透過比はI^->Br^->Cl^->Gluconate^-であった。また、プロッカーによりCl^-電流を抑制した状態で、低浸透圧刺激を与えるとCl^-電流以外の外向整流性K^+電流が活性化された。次に、骨細胞においてMSにより活性化されるCl^-チャネルが、CLC型Cl^-チャネルの内、どのタイプのCl^-チャネルなのかを免疫染色法や分子生物学的手法により検討した。その結果、骨細胞にはCLC2及びCLC3型Cl^-チャネルが共に発現していた。全RNAを調整しCLC型Cl^-チャネルの内CLC2とCLC3遺伝子の発現量(mRNA)を定量的に検討するためにDNAテンプレート(λDNA)を用いて各々のcompetitorを作成し、Competitive PCRにより発現量を比較した。その結果、CLC3遺伝子の発現量はCLC2に比較して圧倒的に多いことが明らかになった。以上より、骨細胞にはメカニカルストレス(MS)により活性化されるCl^-チャネルが存在し、このチャネル自身がMS受容器として働いていることが明らかとなった。この活性化されるCl^-電流の外向き整流性や陰イオン透過性および薬理学的性質が、真核細胞においてMSによる細胞容積調節に関与すると報告されているCLC3型Cl^-チャネルと類似していることや、骨細胞にはCLC3型Cl^-チャネルが有意に発現していることより、CLC3型Cl^-チャネルが骨細胞のMS受容器として重要な役割を持つ可能性が示唆された近年、骨細胞が機械的刺激に反応するメカノセンサーであることが報告されているが、その受容体および情報伝達経路に関しては殆どが不明である。この活性化されるCl^-電流の外向き整流性や陰イオン透過性および薬理学的性質が、真核細胞においてMSによる細胞容積調節に関与すると報告されているCLC3型Cl^-チャネルと類似していることや、骨細胞にはCLC3型Cl^-チャネルが有意に発現していることより、CLC3型Cl^-チャネルが骨細胞のMS受容器として重要な役割を持つ可能性が示唆された機械的刺激による骨細胞の膜イオン輸送系への情報伝達を解明する目的で、Whole-cell patch clamp法を用い、機械的刺激によるイオンチャネル調節機構への関与を検討した。実験には新生児ラット頭蓋骨より採集した骨細胞を用い、機械的刺激には外液の低浸透圧溶液刺激により生じる細胞膜伸展作用を用いた。次に、ブロッカーによりCl^-電流を抑制した状態で、低浸透圧刺激を与えるとCl^-電流以外の外向整流性K^+電流が活性化された。また、この電流はTEA・4APにより抑制された。以上の結果より、骨細胞では低浸透圧による機械的刺激によりCl^-チャネルが活性化され、生理的条件下では細胞内からのCl^-放出が促進されることが解った。

また、このCl^-チャネルが抑制された条件では、機械的刺激により主にK^+チャネルが活性化され、代償的にK^+放出が促進される調節機構が働くことも明らかとなった。従って、機械的刺激は複数のイオンチャネルを活性化しCl^-やK^+の輸送を促進することにより、機械的刺激による細胞容積変化の調節をしたり、細胞の膜電位を変化させその興奮性や細胞全体のイオン輸送系の駆動力を調節するものと考えられた。平成13年度は、これら機械的刺激により活性化されるイオンチャネルの性質を分子生物学的手法や免疫組織学的手法を用いて更に詳しく検討したいと考えている。また、交付申請書の段階で購入予定備品であった解析システムpCLAMP8.0はメーカー側の事情で納入時期が著しく遅れることが分かり購入を取りやめた。従って、平成12年度備品には、試薬や標本保存用のメディカルフリーザーと、データー解析用ソフトを使用するためのコンピューターを購入した。平成12年度の結果、骨細胞にはメカニカルストレス(MS)により活化さるCI-チャネルが存在し、このチャネル自身がMS受容器として働いている可能性が明らかとなった。また、活性化されるCI-電流の外向き整流性や陰イオン透過性および薬理学的性質が、真核細胞においてMSによる細胞容積調節に関与すると報告されているCLC3型CI-チャネルと類似していることも分かった。従って、平成13年度は、この骨細胞においてMSにより活性化されるCI-チャネルが、CLC型CI-チャネルの内、どのタイプのCI-チャネルなのかを免疫染色法や分子生物学的手法により検討した。まず、新生児ラット頭蓋骨より骨細胞を採集し、ABCによる二次抗体法と蛍光免疫染色法によりCLCチャネルタンパクの発現を検討した。その結果、骨細胞にはCLC2及びCLC3型CI-チャネルが共に発現していたが、両者の発現量の差は明確ではなかった。次ぎに、骨細胞より、全RNAを調整しCLC型CI-チャネルの内CLC2とCLC3遺伝子及びハウスキーピング遺伝子のG3PDHの発現をRT-PCR法にて検討すると共に、その発現量(mRNA)を定量的に検討するためにDNAテンプレート(λDNA)を用いて各々のcompetitorを作成し、Competitive PCRにより発現量を比較した。その結果、CLC3遺伝子の発現量はCLC2に比較して圧倒的に多いことが明らかになった。また、活性化されるCI-電流を検討した結果からも、MS活性化CI-電流の性質はCLC3型CI-チャネルと類似していた。従って、骨細胞にはCLC2型CI-チャネルよりCLC3CI-チャネルが有意に発現しており、このCLC3型CI-チャネルが骨細胞のMS受容器として重要な役割を持つ可能性が示唆された。