hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
医薬品承認審査の国際調和のための医薬品添加物が製剤特性に与える影響の解析

特性が溶解性や成形性などの製剤特性に与える影響とその保存条件下における安定性を定量的に検討し,その機構と溶解性の関係を解明する方法を学問として確立することは高品質の医薬品を製造するために極めて重要である.カルバマゼピン,ペントキシフェリン,ピレタニドなどの医薬品の結晶転移現象について速度論的解析を試み,これらに医薬品添加物が影響を与えるとの多くの重要かつ興昧ある知見を得ることにより医薬品における添加物との相互作用を体系化し,国際的な医薬品申請データのハ-モナイゼイションを行うための製剤の安定性評価法の基準を確立するための基礎的資料とすることができた.1)練合溶媒としての添加物の溶解特性に与える影響と練合処理による多形転移に伴う原末の溶解性の変化をカルバマゼピン,ペントキシフェリン,ピレタニドなどの医薬品の結晶転移現象溶出実験によって溶解速度論的に解析検討した.2)添加物との粉砕処理によるイドアジドスルホン酸ナトリウム・リン酸ピリドキサールカルシウム散の着色変化に及ぼす混合様式の影響と多形転移に伴う原末の溶解性の変化をメカノケミカル効果として解析検討した.3)材料試験機の圧縮試験装置を用いてのカルバマゼピン,ペントキシフェリンなどの医薬品の結晶転移現象結晶形毎に圧縮曲線を記録し,これらを解析することよって塑性仕事率,弾性回復率,降伏応力等の力学的特性値を求め,添加物,乳糖,結晶セルロース,リン酸カルシウムなどの混合により圧縮成形性と錠剤の崩壊性,錠剤硬度との関係を比較し,添加物の製剤学的有用性について検討した.4)圧縮中あるいは粉砕処理中のカルバマゼピン,ペントキシフェリン,ピレタニドなど多形転移に伴う成形体表面の結晶の形態学的変化への添加物,乳糖,結晶セルロース,リン酸カルシウムなどの影響を走査型電子顕微鏡で観察した.また,あわせて比表面積や成形体内部の空隙率変化をポロシメータを利用し測定し,結晶形との関係を検討した.
児童のPeak Bone Mass獲得に向けた健康管理支援システムの開発

研究計画に基づいて、4年目の研究を計画通り遂行した。研究成果は、実績活動報告を日本公衆衛生看護学会に、文献レビューを日本学校保健学会に報告した。研究計画の遂行状況は、例年通り、全学年を対象にした骨密度測定と冬の測定前の1週間の生活習慣調査、骨密度測定後の骨の健康に関する保健学習、測定結果と生活習慣調査の結果を個別にfeed backするための出力表の作成を実施した。骨密度測定は、2017年より夏季の測定も実施し、2018年も継続実施した。2017年度の夏、冬季と比較して著しく値が低かったことを踏まえて、2018年度の夏季休暇前には、保護者と児童に昨年の実績を紹介し、夏季の生活や健康の管理についての啓発活動を実施した。研究開始時より継続的に重点的介入を行っている学年の4年生に対しては、保健学習を行った。内容は、発達段階と健康や生活課題を踏まえ、「間食のとり方」について、保護者の集まる学習参観の日に実施した。授業に先駆け、活動量計を装着して、2分間の自分の消費カロリーについて調べ学習をした。授業日には、実際の菓子の摂取状況を踏まえた人気の菓子についてカロリーの調べ学習をした。体験を通して、摂取するのは容易だが、消費することの難しいカロリーについて学ぶ機会になった。児童の関心は高く、帰宅後、親子でも間食について、話し合ったことが保護者より担任に報告されていた。研究成果は、2018年11月日本学校保健学会(大分県)で、「学童期における効果的な生活習慣病予防教育の支援に関する文献検討」について、2019年1月第7回日本公衆衛生看護学会(山口県)では、「児童のPeak Bone Massの獲得に向けた介入研究(3年間の実績)」のテーマで報告した。以上の活動実績を踏まえて、2019年度の最終年度は、教員や保護者を対象にした研究の成果や児童に対する介入の効果を検証する予定である。ほぼ当初の研究計画通りに研究が進捗している。最終年度に当たるため、5年間の介入による効果を検証することを目的として研究活動を行う。児童については、骨密度や生活習慣に対する意識・知識・行動の変化について、介入前後で比較する。保護者には、5年間の児童の骨の健康増進事業についての関心・今後の期待を明らかにする。また、本研究に関わった養護教諭や教職員、市職員に対しても調査を行い、成長発達期にpeak bone massを獲得するための学習活動を行政と小学校と大学が共同して実施することについての意見を聴取し、本研究の評価と課題を明らかにする。さらに、5年間、改良を重ねてきた身体測定結果や生活習慣調査結果の出力表のシステムについて、入力負担が少なく、児童の教育効果の高い出力表の完成を目指す。また、5年間、各学年の発達段階や学習指導要領をもとに検討してきた保健学習の内容について評価を行う。これらの研究実績と各種調査結果をもとに、行政と小学校と大学と保護者・児童が共同して、無理なく継続できる学童期のpeak bone massの獲得を通した生活習慣病予防のための健康増進事業の在り方について考察する。本年度は、初年度のため介入対象となる対象小学校の1年生とそれ以外の2年6年生の全生徒を対象に、健康測定会の測定と種々の生活習慣の実態調査を実施した。また、次年度以降の健康測定会並びに保健学習会のための体制づくり、並びに調査測定結果のフィードバックシステムの構築を図ることを目標に活動した。体制づくりの為に、2015年7月には、小学校教員を対象に市と大学の関係者で本研究の目的や方法を共有、検討するための研修会を実施した。研修会では、教職員の理解や協力を得るために骨梁面積率等の測定を実施し、その結果を基にした健康学習会を実施した。その後、児童生徒を対象とした保健学習の内容や方法について、教員らとともにグループワークを開催し、学年別の保健学習プログラムを開催する時期や内容について、教職員から様々な提案や要望が提出された。児童を対象とした調査は、全児童440名を対象に、1週間の日常生活習慣行動について実施した。また、健康測定会は、2015年12月の持久力走大会に合わせて、骨梁面積率等の測定を実施した。測定の対象は、全児童に加え、測定会に参加した一部、保護者を対象とした。調査や測定結果のフィードバックのための個人票は、2016年3月に学校側に返却し、フィードバックの仕組みを構築することができた。今後は、今年度の結果を基に、さらに学校側と協議を重ねながら、調査測定結果の個人フィードバック資料などを効果的に活用した保健学習プログラムの検討が課題である。さらに、保護者への情報伝達の在り方などをさらに検討を重ね、学校と地域・保護者を巻き込んだ保健学習活動にしていくことが課題である。2016年度は、学校側の人事異動が予定されており、体制が変わることが想定される。夏季の研修会の機会を通して、学校側と綿密な打ち合わせを実施して、計画にあたる予定である。2015年度の調査においては、万歩計を用いた歩数の調査や日常生活習慣調査では、学年やクラスにより回収率に差を認めたため、調査や測定の教育的な意味や学習効果などについてさらに学校側と話し合いを行い、2016年度は、昨年度以上の回収率が得られるように努めたい。「児童のPeak Bone Massの獲得に向けた健康管理支援システムの開発」の目的に照らし、下記の実施計画通り活動を遂行した。1全学年の生活習慣調査,骨梁面積率の測定を実施する(平成28年11月).

2その結果の個別フィードバック資料の作成を行う(平成29年1月返却).3測定結果の説明会を全学年(平成28年11月)・全教職員を対象に実施する(平成28年8月).4保健学習プログラムの検討・実施・評価を行う(平成29年1月).5学校保健計画について,関係者で協議する(平成29年3月).今年度も昨年同様、時計型の万歩計を活用して自記式の1週間の生活習慣調査と骨量面積率の測定を全児童を対象に実施した(1)。今年度は、その測定時に短時間ではあるが、クラス単位で説明会を実施し、判定結果の見方と測定結果を改善するための食事や運動の摂取について具体的な指導を行った(3)。教職員に対しても、児童と同様の測定会を実施するとともに、平成28年度の実績報告並びに、本研究の意義と目的、計画内容についての説明会を実施した(3)。保健学習プログラムは、介入学年である2年生に対して、生活習慣行動(歩数や起床・就寝時刻)と朝の登校時の体温(サーモメーターカメラで測定)の実態の関係を、生活習慣調査結果をもとに、保護者参観授業の中で保健学習会を実施した(4)。平成28年度の実績報告並びに平成29年度の学校保健計画について、学校関係者並びに行政の担当者とともに、計画を検討した(5)。学校や行政・教育委員会などの関係者の協力のもとに、学校プログラムの中で生活習慣の調査や骨密度測定の実施、それらを踏まえた保健学習の実施をすることに対しての理解や進み、共同体制の強化が図られてきた。調査測定データの整備、入力、出力などの処理について、簡便化を図る必要がある。学校関係者の理解は、高まってきた感じがあるが、今後は、より多くの保護者を巻き込む方法についても検討が必要である。さらに、事務量の削減や簡素化を図る必要がある。しかし、これらは、学校と行政の連携だけでは、限界があるため、今後、地域・保護者との共同、住民ボランティアなどとの連携の在り方などについても模索が必要である。2017年度の実績は、研究計画に基づいて、3年目の研究を計画通り遂行し、2年間の研究活動報告を日本公衆衛生看護学会に報告した。3年目の研究計画は、例年通り骨密度や1週間の生活習慣の経年変化を把握するための調査や測定を全校児童を対象として実施した。今年度は、測定後のフィードバック教育の時期を考慮して、測定の時期を11月から9月へ、生活習慣調査も11月から6月へと例年より早い時期に実施した。しかし、例年の測定結果と比べて骨密度の値が明らかに低い結果がでた。そのため、再度、例年通りの12月初旬に測定を実施した。今年度は2回の測定会を実施し、夏と冬の児童の健康状態の差が明らかになった。保健学習については、2015年度に入学した介入群の3年生を対象とした保健学習プログラムの計画・実施・評価を担任と一緒に実施した。「3・4年生の保健」の学習指導要領の中にある「毎日の生活と健康」について、児童自身の生活習慣の実態と骨密度の結果に基づく授業を担任と共に組み立てた。担任からは、授業の結果、この単元では全員が満点をとったと報告を受け、児童の関心が高く、学習内容の理解度がかつてないほど高い結果がでたと評価を受けた。
広葉樹を主体とする二次林の構造形成過程及びそのメカニズムに関する研究

1986年に北海道大学農学部付属苫小牧演習林内に設定した調査区(面積1ha)、および1992年に岐阜大学農学部付属位山演習林内に設定した調査区(面積0.25ha)の再測定を、それぞれ1996年と1997年に実施した。風害跡林分では、19861996年の10年間で組成的に大きな変化は認められなかったが、樹高2m以上での胸高断面積合計は27.57m^2/haから29.99m^2/haへと増加し、立木密度は4527本/haから3464本/haへと大幅に減少した。枯死木本数が1439本/haであったのに対して、新規加入本数は376本/haであった。伐採跡林分では、1992年から1997年の5年間で胸高直径5cm以上の立木の胸高断面積合計が33.82m2/haから33.72m2/haへと少しだけ減少し、立木密度も1404本/haから1260本/haへと減少した。したがって、風害跡林分、伐採跡地林分における構造的変化は枯死木の発生、および生存木の成長によってもたらされていることが明らかになった。枯死木の発生は密度依存的で、しかも小径木ほど死亡率が高いサイズ依存的過程であることが明らかとなった。生存木の成長にもサイズ依存性が認められ、サイズの小さな生存木ほど成長率が低かった。以上の結果から、風害跡地林分では約30年、伐採跡地林分では約50年が経過した時点で、初期侵入個体間での相互作用のもたらす自己間引きにより林分構造が変化する段階であることが明らかになった。岐阜大学農学部付属位山演習林の伐採跡地林分では、胸高直径5cm以上の立木を対象として1996年に成長錐による樹齢解析を行った。樹齢構成を検討した結果、全立木の75%が4060年生で、樹齢の頻度分布のモードが5560年生にあったことから、約60年前に行われた伐採の直後に侵入定着した立木が林分で優占していることが明らかになった。樹齢とサイズの関係から、成長速度の違いが樹種間での階層分化をもたらしたこと、また種内でも個体の生育環境(伐採時に切り残された大径木からの距離)によってサイズに差が生じてきたことが明らかになった。以上のことから、二次林の再生過程が立木間のサイズのバラツキが増大する過程であったことが示唆された。1992年に岐阜大学農学部附属演習林に設定した二次林調査区(面積1ha)内の50m×50mの方形区において、胸高直径5cm以上の立木の樹種、樹高、胸高直径を記録するとともに、成長錐によって樹齢の調査もおこなった。

樹齢の頻度分布より、全立木の75%が樹齢4060年生であり、またモードが5560年生にあったことから、現在当林分の上層で優占する立木の大部分が、約55年前に伐採された跡地にほぼ一斉に侵入・定着した立木であることが明らかになった。樹高、胸高直径の頻度分布から、林分内の立木間にはサイズにばらつきが認められた。樹齢とサイズの関係を検討した結果、サイズのばらつきは定着時期の違いによってある程度まで説明できた。しかし、5060年生の伐採前後の短い期間に侵入・定着した立木の間にも大きなサイズのばらつきが見られたことから、個々の立木の生長過程が影響していることが示唆された。成長速度を樹種間で比較したところ、サイズの頻度分布において高い位置にモードをもっていた樹種(ウダイカンバ、ミズキ、アカシデ)は、低い位置にモードのあった樹種(リョウブ、クマシデ、コハウチワカエデ)より高い成長速度を示していた。ただし、同一樹種内でも5060年生の立木間にサイズの差が生じていたことから個々の立木の生育環境が成長速度を左右した可能性が考えられた。伐採跡に定着した立木(後生樹)の成長速度は、伐採前の林分の上層木であったと推定される胸高直径40cm以上の大径木からの距離、あるいは後生樹の周囲の前生樹密度と反比例の関係にあった。したがって、伐採前から存在した大径木、前生樹は伐採後跡地に侵入した後生樹の成長に負の影響を及ぼしたといえる。以上の結果から、二次林の再生過程は立木間のサイズのばらつきが増大する過程であり、その過程においては定着時期、種特異的な成長速度、そして個々の立木の生育環境が重要な役割を果たすことが解明された。1986年に北海道大学農学部付属苫小牧演習林内に設定した調査区(面積1ha)、および1992年に岐阜大学農学部付属位山演習林内に設定した調査区(面積0.25ha)の再測定を、それぞれ1996年と1997年に実施した。測定項目は前回測定木の成育状態、胸高直径、新規加入個体の樹種、胸高直径、根元位置とした。風害跡林分では、19861996年の10年間で組成的に大きな変化は認められなかったが、樹高2m以上での胸高断面積合計は27.5m^2/haから29.99m^2/haへと増加し、立木密度は4527本/haから3464本/haへと大幅に減少した。枯死木本数が1439本/haであったのに対して、新規加入本数は376本/haであった。したがって、風害跡林分における構造的変化は枯死木の発生、および生存木の成長によってもたらされていることが明らかになった。方形区を10m×10mの小方形区100個に細分化して解析した結果、枯死木の発生は密度依存的で、しかも小径木ほど死亡率が高いサイズ依存的過程であることが明らかになった。生存木の成長にもサイズ依存性が認められ、サイズの小さな生存木ほど成長率が低かった。また、生存木の成長率は、その生存木より樹高の高い立木の密度による負の影響が認められ、林分の階層構造が一方向的競争を介して下層木の成長を左右していることが示唆された。伐採跡林分では、1992年から1997年の5年間で胸高直径5cm以上の立木の胸高断面積合計が33.82m2/haから33.72m2/haへと少しだけ減少し、立木密度も1404本/haから1260本/haへと減少した。しかし、組成的な変化はなかった。伐採跡林分では新規加入が全くなかったことから、風害跡林分と同様に、枯死木の発生と生存木の成長が構造的変化の推進力となっていると考えられた。調査区を10m×10mの小方形区に分割して解析した結果、枯死木本数の密度依存性、成長率の林分構造依存性が認められた。以上の結果から、風害跡地林分では約30年、伐採跡地林分では約50年が経過した時点で、初期侵入個体間での相互作用のもたらす自己間引きにより林分構造が変化する段階であることが明らかになった。
岩石の粘弾性遷移挙動の構成則に基づく断層ダイナミクスの推定

1.岩石の粘弾性構成則とその逆問題断層帯を含む地殻岩石の遷移挙動を記述するための粘弾性構成則は,時間のべき乗則に従う応答関数で定式化できる.これを用い,地表で観測される応力・歪データから地下(断層帯近傍など)のダイナミクスを調べるための逆問題について,計算機上での解析手法の構築を行なった.この研究の一部は,国際会議にて公表した.2.ダメージを含む岩石の粘弾性構成則と地震に伴う力学的・電磁気学的緩和過程上で導出された粘弾性構成則を拡張した,内部に脆性過程(クラックなどのダメージ発展)を伴う岩石の力学的挙動を記述する構成則を用いて,東北日本沈み込み帯における余効すべりの時系列パターンや,地震に先立つベニオフ電磁放射・岩石磁化変化のパターンを説明した.この研究成果の一部は国際誌(Nat.Hazards Earth Syst.Sci.)及び国際・国内会議にて公表し,また現在国内学会誌(地質学雑誌)に投稿・査読中である.3.岩石の粘弾性構成則と地殻内流体の移流・拡散岩石内部のダメージ発展(空隙率や空隙連結度の変化)に伴う岩石内流体の輸送特性(移流・拡散)の時間変化を,非平衡熱力学・統計力学(異常拡散理論)に基づいて記述した.さらにこの理論に基づいて1995年兵庫県南部地震に先行して発生した大気中ラドン濃度の増加や電離層擾乱が地殻のダメージ発展に起因することを説明した.また,英国エディンバラ大学のIan Main教授らのグループが行なった応力腐食に関する実験結果についても,上の理論に基づく考察を行なった.この研究成果の一部は国際誌(Nat.Hazards Earth Syst.Sci.)及び国際・国内会議にて公表し,現在国際誌(Phys.Chem.Earth)に投稿・査読中である.1.非平衡熱力学に基づく岩石の粘弾性構成則とその逆問題の定式化地殻岩石,特に断層帯の岩石の遷移挙動を記述するための粘弾性構成則を非平衡熱力学・解析力学に基づいて導出し,時間のべき乗則に従う応答関数を持つ応力-歪関係の積分形式で定式化した.また,地表で観測される応力・歪データから地下(断層帯近傍など)のダイナミクスを調べるための逆問題を定式化した.この研究成果の一部は国際誌(Tectonophysics)及び国際会議にて公表した.2.ダメージを含む岩石の粘弾性構成則と地震の時系列パターン上で導出された粘弾性構成則を拡張し,内部に脆性過程(クラックなどのダメージ発展)を伴う岩石の力学的挙動を記述する構成則を導出した.さらにこの構成則に基づいて,大地震発生の前後にみられる地震の時系列パターン(地震前兆のべニオフ歪解放や余震数の減衰に関する統計則)を説明した,この研究成果の一部は国際誌(Tectonophysics)及び国際・国内会議にて公表した.3.岩石の粘弾性構成則と地殻内流体の移流・拡散岩石の粘弾性挙動は,それに伴う岩石内部の空隙率や空隙の連結度の変化を通じて,地殻内流体の輸送特性に影響を与える.このことを非平衡熱力学に基づいて定式化し,岩石のダメージ発展に伴う拡散や流体体積のフラックスを記述した.さらにこの理論に基づいて,1995年兵庫県南部地震に先行して発生した大気中ラドン濃度の増加は地殻のダメージ発展に起因することを説明した.この研究成果の一部は国際誌(Nonlin.Processes Geophys.)及び国際・国内会議にて公表した.1.岩石の粘弾性構成則とその逆問題断層帯を含む地殻岩石の遷移挙動を記述するための粘弾性構成則は,時間のべき乗則に従う応答関数で定式化できる.これを用い,地表で観測される応力・歪データから地下(断層帯近傍など)のダイナミクスを調べるための逆問題について,計算機上での解析手法の構築を行なった.この研究の一部は,国際会議にて公表した.2.ダメージを含む岩石の粘弾性構成則と地震に伴う力学的・電磁気学的緩和過程上で導出された粘弾性構成則を拡張した,内部に脆性過程(クラックなどのダメージ発展)を伴う岩石の力学的挙動を記述する構成則を用いて,東北日本沈み込み帯における余効すべりの時系列パターンや,地震に先立つベニオフ電磁放射・岩石磁化変化のパターンを説明した.この研究成果の一部は国際誌(Nat.Hazards Earth Syst.Sci.)及び国際・国内会議にて公表し,また現在国内学会誌(地質学雑誌)に投稿・査読中である.3.岩石の粘弾性構成則と地殻内流体の移流・拡散岩石内部のダメージ発展(空隙率や空隙連結度の変化)に伴う岩石内流体の輸送特性(移流・拡散)の時間変化を,非平衡熱力学・統計力学(異常拡散理論)に基づいて記述した.さらにこの理論に基づいて1995年兵庫県南部地震に先行して発生した大気中ラドン濃度の増加や電離層擾乱が地殻のダメージ発展に起因することを説明した.また,英国エディンバラ大学のIan Main教授らのグループが行なった応力腐食に関する実験結果についても,上の理論に基づく考察を行なった.この研究成果の一部は国際誌(Nat.Hazards Earth Syst.Sci.)及び国際・国内会議にて公表し,現在国際誌(Phys.Chem.Earth)に投稿・査読中である.
我が国におけるウシ免疫不全ウイルス(BIV)の浸潤調査とBIVの分離

Bovine immunodeficiency-like virus(BIV)は1972年度米国においてbovine lymphosarcomaの研究中の分離された。BIVはbovinelent-ivirusに属しているが、ウシに対する病原性は不明である。米国とオランダ、スイスではBIVに対する抗体陽性のウシが存在している。しかし、日本では抗体陽性のウシが存在するか否かも不明であるし、BIVも分離されていない。我々は日本のウシがBIVに対する抗体を持ったいるか否かを調査し、もし抗体陽性牛を検出したならば、そのウシからBIVを分離することを目的とした。BIV感染牛の検出はindirect immunofluoresence antibody technique(IFA)によって抗体検出を行った。カバーグラスにBIV持続感染細胞を培養したものを抗原とし、被検血清は主に1:8希釈で用いた。二次血清はFITC標識ヤギ抗ウシIgG(Fab2)を用いた。その結果、7つの県から集めた2,846頭のうち29(1.02%)頭が抗体陽性を示した。次に、これらのウシの4頭から末梢血リンパ球のDNAを抽出しplymerase chain reactin(PCR)とSouthern blot hybridizatin testによってBIVのproviralDNAの検出を実施した。PCRはBIVのgag領域とpol領域の2ヵ所を増幅した。Southernblothybridizatin testはPCRに用いたと同じgag領域を用い、digoxig-enin標識probeを作成して使用した。その結果、4/4頭でBIV proviral DNAが検出された。これらの成績から、日本のウシがBIVに感染していることが示唆された。現在、BIV抗体陽性牛の血液を実験的にウシに接種し、そのウシからBIVを分離することを計画している。ウシ免疫不全ウイルス(BIV)はレトロウイルス科レンチウイルス亜科に属し、1972年米国において牛白血病ウイルスの研究中に分離された。他の国からのBIV分離報告もないし、その存在も不明であるが、最近米国においてBIV感染牛の存在が報告された。BIVはヒトのAIDS原因ウイルス(HIV)と同じ亜科に分類されるためその起病性や公衆衛生面からも研究の進展が望まれている。我が国でのBIV研究は我々の他に一大学でしか実施されていない。そのため我々の研究目的は(1)我が国の牛にBIV感染が存在するのか。(2)存在が確認されたならばそのウイルス分離と疫学を解明する。この2点とした。得られた実験成果1.米国から分与を受けたBIV標準株を日本産の牛胎仔初代培養細胞に感染させ間接蛍光抗体法によってBIV抗体陽性牛の検出を実施した。蛍光抗体手技の開発は(1)感受性細胞の検討、(2)蛍光標識抗ウシIgG(二次血清)のF(ab′)2部分を使用する。これらの検討による被検牛血清を28倍希釈で抗体検査が可能となり著しく感度を上昇させた。2.Polymerase chain reaction(PCR法)をBIVのプロウイルス検出に応用する手技を確立した。すなわち、BIVのgagとPolの2ケ所の遺伝子領域について被検牛のリンパ球DNA材料中のプロウイルスを証明することが可能となった。3.現在までに2,000頭の牛についてBIV抗体の検出を実施した結果20頭の陽性牛が検出された。しかしこの牛のリンパ球が入手できないため、リンパ球DNA中のプロウイルス証明が実施されていない。よって現時点では我が国でのBIV感染牛の存在は判定不能である。平成4年度では、今回の抗体陽性地区の牛について抗体検出と陽性牛のリンパ球DNAを用いたPCR法による証明とBIV分離を実施する。

平成3年度はBovine immunodeficiency-like virus(BIV)の感染牛が日本に存在するか否かを調べるために、BIVに対する抗体陽性牛の検出を実施してきた。抗体陽性牛の検出は、BIV持続感染細胞(MDBK-BIV)のアセトン固定抗原を用い、被検血清は非特異反応を抑えるために1:100希釈とした。BIVを実験的に接種したウシでは約3週後から抗体出現(1:100)し、その後、1:1,600位に上昇した後、半年1年後で検出不能(<1:100)となる(著者らの米国での実験)。この現象を考慮すると、IFAを改良し、もっと低希釈血清での抗体検出が可能なシステムが要求される。そこで、平成4年度はMDBK-BIV細胞と牛胎仔脾細胞(BESP)との混合培養を抗原とした。被検血清は1:8希釈を用い、FITC標識ヤギ抗ウシIgG(Fab2)血清を反応させた。この方法で非特異反応は抑制され抗体検出感度は上昇した。その結果、2,846頭のうち29頭(1.02%)が抗体陽性を示した。抗体陽性牛のうち4頭から末梢血を得ることができた。末梢血は一部のリンパ球を培養しBESPとの混合培養によって融合細胞が出現した。この細胞からDNAを抽出してpolymerase chain reaction(PCR)によってBIV proviral DNAの存在を証明した。これらの結果は、末梢血からBIVが分離されたことを強く示唆しているが、分離同定試験が今後必要である。平成3年度に開発したPCRは今年度更に改良を加え、Southern hybridizationも確実なものとした。これらの方法を用いて、抗原陽性牛4頭の末梢血リンパ球から抽出したDNAについてBIVのproviral DNAを証明した。以上の結果は、我が国にもBIVが存在することを強く示唆している。
行動中の交感神経活動パターンと唾液成分変化との関連

唾液腺を支配する交感神経の活動を記録することが,本研究課題の大きな目的である。とくに,覚醒状態で自由に行動しているときの活動を慢性的に記録する方法を開発するものである。13年度は慢性的記録用の電極を開発することに焦点を絞り、14年度は実際の神経活動を分析した。以下にその概要をまとめる。平成13年度1.慢性実験に適したラットについて,交感神経の露出が比較的容易な顎下腺を対象とした。顎下腺支配の交感神経は3-5mm露出が可能であり,電極を装着する場所を確保できる。2.交感神経の直径は約100ミクロンであり,慢性記録用に従来から考案されているコラーゲン電極は装着が不可能であった。このため双極金属電極を試作することとした。電極には30-50ミクロンの白金イリジウム線を使用し,ポリエチレンチューブ(内径500ミクロン)に極間距離1mm以下で装着した。この電極に交感神経を挿入し,神経活動を記録した。3.神経活動は複合活動電位であり,機能的単一神経活動を記録することはできなかった。また,麻酔下の動物では記録可能であったが,長時間の電極の保持と絶縁が不完全であるため,覚醒動物での記録は数時間程度であった。平成14年度1.神経活動を分類するため、記録部位の末梢側あるいは中枢側を切断して記録した。その結果、交感神経中には遠心性神経と求心性神経が存在することが分かった。2.遠心性神経は口腔領域の刺激に応じて反射的に活動したが、求心性神経は顎下腺体の圧刺激に応答した。上記の研究実績は、顎下腺交感神経の活動が記録可能であることを示すものである。また、交感神経が従来考えられた遠心性の調節だけでなく唾液腺の圧などを感知する求心性を有することが分かった。これらの知見は今後、新たな研究を展開する上での基礎的知識として極めて重要である。とくに,覚醒状態で自由に行動しているときの活動を記録する必要がある。このため本年度は,慢性的記録用の電極を開発することに焦点を絞った。以下に実施結果をまとめる。1.慢性実験に適したラットにつて,交感神経の露出が比較的容易な顎下腺を対象とした。顎下腺支配の交感神経は3-5mm露出が可能であり,電極を装着する場所を確保することが可能と考えられた。2.交感神経の直径は約150ミクロンであり,慢性記録用に従来から考案されているコラーゲン電極は装着が不可能であった。電極には30-50ミクロンの白金イリジウム線を使用し,ポリエチレンチューブ(内径500ミクロン)に極間距離1mm以下で付着した。この電極チューブに切断した交感神経の中枢側を挿入して,神経活動を記録した。また,現在のところ,麻酔下の動物では記録可能であったが,長時間の電極の保持と絶縁が不完全であるため,覚醒動物での記録には至っていない。4.電極の絶縁と固定の材料として,一液型のシリコンゲル,歯科用レジンや印象剤などを使用したが,長時間の絶縁と固定を同時に行うことのできる方法を見いだすには至っていない。この点を改良して,来年度はまず電極の保持方法を工夫する必要がある。
高密度近赤外分光法を用いたリハビリテーション課題における脳機能ネットワーク解析

近赤外分光法は、非侵襲で身体拘束の少ない大脳皮質活動計測法である。本研究では、測定チャネルを高密度に配置したヘッドキャップを開発し、リハビリテーション課題中の脳活動を計測した。手指の巧緻性課題を繰返し行うことで動作獲得の学習効果が得られ、この学習効果と前頭前野各領域の活動上昇が相関することが明らかとなった。特に前頭極領域は、左右の運動前野や左運動野との相関があり、運動学習に重要な役割を担うことが示唆された。リハビリテーション動作時の脳活動を解析するため、近赤外分光法の計測プローブを高密度に配置したヘッドキャップを作成し、前頭葉の各部位の神経活動を詳細に測定できる測定法を開発した。これにより、従来の方法と比較して脳の各関心領域に位置する測定チャネルの数が増加し、測定データに対する信頼性を向上することが出来た。近赤外分光法を用いた研究課題として、手指機能のリハビリテーション課題として用いられるペグ動作に着目し研究を行った。簡易上肢機能検査(STEF)を使用し、手前に置いた小さな金属棒を右母指と示指で摘み、前方の小さな穴に入れるペグ課題を行わせ、課題時間20秒におけるペグの移動本数をペグスコアとした。動作を行わない安静時間をおいて、合計8回の課題を繰り返した。その結果、細い金属棒を小さな穴に差し込む動作を繰り返すことで徐々に素早い動作が可能となり、巧緻動作の繰返しによる学習効果が確認された。この学習効果は動作時の前頭葉機能と相関することがわかり、学習効果の高い被験者では、前頭葉各領域の活動上昇が促進されていた。特に内側前頭前野では、他の前頭前野領域と比較して動作開始後いち早く活動上昇していることが明らかとなった。さらに内側前頭前野の活動上昇は、運動前野、補足運動野、補足運動前野等の前頭前野各領域における活動上昇と相関があり、各領域間の相互連絡が示唆された。本研究結果より、リハビリテーション動作時の学習効果には、前頭前野各領域の活動上昇が関与しており、特に内側前頭前野は重要な機能を担うことが示唆された。脳の前方に位置する前頭前野領域を詳細に解析することを目的とした、新しいヘッドキャップの開発を行った。近赤外分光法による脳機能測定には光ファイバーを用いるが、従来よりも高密度に配置することで空間分解能が上昇する。研究実施計画どおり初年度において、従来の方法に比して2倍の密度に光ファイバーを設置するヘッドキャップを作成した。制作に当たっては、島津製作所の3次元デジタイザーにより各プローブ位置が実際の脳表においてどの部位に相当するか確認しながら行った。これにより、運動野・前運動野・補足運動野・前補足運動野・背外側前頭前野・前頭極などの前頭前野各領域をカバーし、さらに脳活動を詳細に測定可能な新しいヘッドキャップを得ることが出来た。ヘッドキャップ制作と並行して、リハビリテーション課題遂行時の脳活動の解析を行った。リハビリテーション課題では、ある程度の困難を伴う動作を繰り返し行うことで脳機能を再教育し、新たな動作獲得を図る。このような動作課題としてペグ動作を用い、手指巧緻動作時の被験者脳活動を測定した。巧緻動作の繰り返しにより、パフォーマンスの向上がもたらされるが、この上達がよくみられる被験者と、あまり上達しない被験者に分かれる。このような被験者ごとの上達の個人差と、前頭前野(特に前頭極)の脳活動が相関していることがわかった。すなわち、より巧緻動作の上達がみられた被験者ほど、前頭前野の脳活動が上昇することが明らかとなった。この内容を含め、前頭前野の脳活動に関する研究結果を学会で発表した。初年度の第一目的は、高密度に光ファイバを設置したヘッドキャップを測定することであった。このヘッドキャップでは、前頭前野領域へ高密度に光ファイバを配置するために測定可能な脳の領域が限定されてしまい、無駄のない的確な光ファイバの空間配置が求められた。このため数名の被験者において、実際に各チャネルが脳のどの部位に相当するかを確認しながら、空間配置を決定した。また、高密度に配置したことで従来のヘッドキャップよりも測定時にアーチファクトが混入する可能性が考えられたため、より安定した測定を目指してヘッドキャップの素材、固定ベルト等の工夫による改善を図った。これにより、高い空間分解能をもち詳細な脳機能測定が可能なヘッドキャップが完成した。リハビリテーションに関する手指巧緻動作課題や、認知行動中の前頭前野各領域の脳機能を測定する。また、高密度ヘッドキャップを用いて脳各部位における詳細な神経活動を解析し、脳機能結合を検討する。脳機能結合を解析する手法は、独立成分分析法を活用する。測定機器由来のアーチファクトは高周波の周波数成分が多く、生体由来のアーチファクトとして心拍成分は1 Hz程度、呼吸は約0.3 Hzとされ、脳活動成分を含む周波数帯として0.01-0.1 Hzの帯域を独立成分分析法を利用して測定する。

独立成分分析法の解析は、島津製作所社製測定・解析ソフトNIRStaion OMM-3000に装備されている。安静時・手指巧緻動作課題時の脳機能結合パターンを各被験者ごとに抽出し、設定した脳関心領域(シード)の経時的信号変化と相関する領域を相互相関解析により解析する(seed correlation analysis, Zhang et al, NeuroImage 51, 2010)。脳機能解析のためのソフトウェア購入費、学会発表のための旅費等として研究費を使用する。
RNF168によるK63結合型ポリユビキチン鎖特異的認識の構造的基盤

DNA二重鎖切断(DSB)が生じると、ユビキチンリガーゼRNF8がヒストンH1をLys63結合型ユビキチン鎖修飾する。続いて、RNF168のLRM-UMI-MIU1ドメインがLys63結合型ユビキチン鎖と特異的に結合することでDSBへと集積する。RNF168はヒストンH2Aをモノユビキチン化し、さらに下流のDNA修復酵素群を集積させる。しかしこれまで、RNF168のLRM-UMI-MIU1ドメインによるLys63結合型Ub鎖の認識メカニズムは不明であった。本研究ではRNF168のLRM-UMI-MIU1ドメインとLys63結合型ユビキチン鎖の複合体の結晶構造解析を行う。さらに、変異体を用いた解離定数の測定、変異体の細胞内での局在の解析を行うことで、RNF168によるLys63結合型ユビキチン鎖の認識メカニズムとその意義を明らかにする。昨年度までの研究成果として、RNF168のLRM-UMI-MIUドメインとLys63結合型ユビキチン鎖複合体の結晶構造を明らかにした。さらに、RNF168のMIU2ドメインもLys63結合型ユビキチン鎖特異的な認識を行うことを解明し、RNF168のMIU2ドメインとLys63結合型ユビキチン鎖複合体の結晶構造を明らかにした。得られた結晶構造を元にした点変異体を用いて、RNF168とユビキチン鎖の解離速度定数の解析を行った。その結果、RNF168によるLys63結合型ユビキチン鎖の詳細な認識機構が明らかになった。また、RNF168のLys63結合型ユビキチン鎖の認識に関わる領域に変異を導入し、DSBが生じた際の変異RNF168の細胞内での局在を調べることで、RNF168のDSBへの集積メカニズムの一端を明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。DNA二重鎖切断(DSB)が生じると、ユビキチンリガーゼRNF8がヒストンH1をLys63結合型ユビキチン(Ub)鎖修飾する。続いて、RNF168のLRM-UMI-MIU1ドメインがLys63結合型Ub鎖と特異的に結合することでDSBへと集積する。RNF168はヒストンH2AをモノUb化し、さらに下流のDNA修復酵素群を集積させる。本研究ではRNF168のLRM-UMI-MIU1ドメインとLys63結合型Ub2量体(Lys63-Ub2)の複合体の結晶構造解析を行う。さらに、変異体を用いた解離定数の測定、変異体の細胞内での局在の解析を行うことで、RNF168によるLys63結合型Ub鎖の認識メカニズムとその意義を明らかにする。平成27年度の研究成果として、RNF168のLRM-UMI-MIUドメインとLys63-Ub2の複合体の結晶を作成し、大型放射光施設SPring8にてX線回折実験を行なった。得られたデータセットをプログラムHKL2000、ccp4i、phenix、cootを組み合わせて解析し、その結晶構造を決定した。得られた結晶構造から、RNF168のLRM-UMI-MIUドメインが8種類あるUb鎖のうち、どのようにしてLys63結合型Ub鎖のみを認識しているのかが、明らかとなった。当初の予定通り、目的の結晶構造を決定することに成功したため。

また、RNF168のLys63結合型ユビキチン鎖の認識に関わる領域に変異を導入し、DSBが生じた際の変異RNF168の細胞内での局在を調べることで、RNF168のDSBへの集積メカニズムの一端を明らかにした。平成27年度の成果として、RNF168-LRM-UMI-MIU1とLys63-Ub2複合体の結晶構造の決定に成功した。本年度は続いて、得られた複合体の結晶構造の情報から、RNF168-LRM-UMI-MIU1ドメインのLys63結合型Ub鎖との相互作用に関わると考えられる残基に変異を導入し、結合の解離速度定数を測定する。解離速度定数の測定は、Lys63-Ub2のC末端にテトラシステインモチーフ(Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys)を導入し、緑蛍光試薬FlAsHでLys63-Ub2をラベル後、マイクロプレートリーダーEnVisionを用いた蛍光偏光解析法により行う。また、実験が上手く行かない場合は、Biacoreを用いたSPR法も試みる。解離速度定数の解析結果から、野生型と変異体の間で解離速度定数の変化を比較することでRNF168がどのようにして8種類あるUb鎖の中でLys63結合型Ub鎖を特異的に認識するのかという詳細な機構を明らかにし、結晶構造とあわせて考察する。さらに、結晶構造および点変異体の解離速度定数解析の情報から、RNF168のLys63結合型Ub鎖との相互作用に重要であると考えられる残基に変異を導入し、細胞内でDNA二重鎖切断に対するRNF168の局在を観察する。細胞内局在試験を野生型、およびLys63結合型Ub鎖との結合能を失った変異体RNF168を用いて行うことで、RNF168によるLys63結合型ポリUb鎖認識が、RNF168のDNA損傷応答にどのような影響を与えるか調べる。28年度が最終年度であるため、記入しない。
計測精度とユーザビリティを両立する非接触生体センサーシステムの研究

本年度は、2つの非接触心拍計測技術(容量結合型心電計とマイクロ波ドップラー心拍計)を組み込んだ生体計測システムの開発と、計測精度の向上のためのアルゴリズム開発を行った。提案システムは、心拍センサと加速度等複数のセンサを組み合わせ、個人ごとの特徴をフィードバックすることで、計測精度の向上、及びノイズの低減を実現することを目的としている。非接触計測時の個人差を明らかにするために被験者数を増やし、複数の測定環境下で性能評価を進めている。容量結合型心電計については単電極式と2電極式での回路構成を絞り込み、ノイズを十分に抑制して実現する見通しを得た。消費電力面でも、低消費電力な増幅器を用いた回路構成で従来と同等の性能を実現できることを確認した。マイクロ波ドップラー心拍計については、小型のアンテナを用いた評価を行い、室内環境化であれば背面からの計測でも心拍数が計測可能であることを示した。距離画像センサと組み合わせたノイズ削減手法にも取り組み、体動ノイズモデルを構築するためのアルゴリズムを検討している。さらに、システムの低消費電力化のために、信号処理アルゴリズムの専用ハードウェア化を行った。65nm CMOSプロセスで試作を行い、現在評価を進めている段階にある。アルゴリズムについては、低サンプリングレートでの計測に特化したサンプリング誤差補正アルゴリズムを開発し、平均心拍数ではなく瞬時心拍を低アクティブ率で抽出できることを確認した。当初の計画通り、提案アルゴリズムのハードウェア化を行い、1回めのLSI試作を完了した。また、試作システムを用いたフィールドテストも計画通り実施できた。個人最適化手法に関しては当初計画では平成30年度に完了予定であったが、より多くの被験者と評価環境での計測を行うために平成31年度も引き続き開発を続ける予定である。センシング技術開発に関しても複数の新たな改良方法を提案しており、当初計画よりも性能向上を実現できる見通しを得た。平成31年度は本年度は、2つの非接触心拍計測技術(容量結合型心電計とマイクロ波ドップラー心拍計)を組み込んだ生体計測システムの改良と、フィールドテストを継続して実施する。平均心拍数ではなく瞬時心拍を計測するための改良アルゴリズム、複数センサ(マルチモーダル)によるノイズ除去アルゴリズムを実装し、また、前年度に試作した信号処理回路及びサーバー連携機能を集積する。回路の試作は前年度同様相乗りチップ試作を利用し低コストに実現する。フィールドテストは室内環境及び走行中の車両内で実施する予定であり、被験者数を増やして実施する。本研究では、活動量計測やストレス推定、心疾患予測を目的とし、非接触で心拍変動と加速度を計測可能、かつ携帯可能な生体センサーを開発する。さらに、センサーデータをサーバサイドで解析・フィードバックし、センサーを個人最適化して高精度化する手法を開発する。提案技術を用いて実環境でのフィールドテストを実施し、上記の社会課題に対する有用性を示す。平成28年度はマイクロ波ドップラーセンサーを用いた非接触心拍間隔計測手法と、容量結合型センサーを用いた非接触心電計測手法の開発・比較を行った。また、心拍と加速度を組合せた活動量推定アルゴリズムを開発し、センサーデバイスに実装して性能評価を行った。今後の実証実験に向けて、病院を実験フィールドとした予備検討を実施した。協力病院における1つの病棟全体を対象として、スマートフォンと加速度センサ、無線ビーコンを用いた行動・活動量モニタリングのための基礎データ収集を行った。マイクロ波ドップラーセンサー出力に対する周波数解析アルゴリズムと心拍抽出アルゴリズムを開発し、実証実験を行った。提案手法により体動に起因するノイズが除去できることを確認した。また、容量結合型センサーに対するノイズフィードバック手法を開発し、DCオフセットや電源ノイズの多い実環境でも動作することを確認した。それぞれのセンサーを用いてプロトタイプを開発し、平成29年度以降の開発に向けたセンシングデータの収集を行った。現状ではマイクロ波ドップラーセンサーを用いた手法が体動ノイズに対してより高い耐性を示している。当初計画通り、容量結合方式とマイクロ波ドップラー方式という2つの方法に対する性能向上技術を開発し、実環境での動作確認を行った。また、活動量推定アルゴリズムの開発とフィールドテストに向けた基礎データの収集を先行して実施した。本研究では、活動量計測やストレス推定、心疾患予測を目的とし、非接触で心拍変動と加速度を計測可能、かつ携帯可能な生体センサーの開発を目的としている。現在、特にマイクロ波ドップラーセンサーを用いた非接触心拍間隔計測手法と、容量結合型センサーを用いた非接触心電計測手法に着目し、その低消費電力実装とノイズ耐性向上アルゴリズムの検討を行っている。平成29年度は、まず2つの計測手法を3cm角サイズの小型プロトタイプとして実装し、実験室内と車両内でそれぞれ10名程度の被験者に対して性能評価を行った。マイクロ波ドップラーセンサーに対しては、個人差が計測波形に与える影響を明らかにし、その影響を除外して心拍間隔を抽出する方法を提案した。容量結合型センサーに対しては、電極のサイズと材質および絶縁方法による性能への影響を評価し、特に走行中の車両内で計測可能な構成を提案した。次に、提案非接触計測手法で得られる心拍間隔と、従来の3軸加速度センサーを組み合わせる活動量推定アルゴリズムの開発、及びハードウェア実装について評価を行った。低消費電力に特化させた実装では、容量結合型と提案活動量推定アルゴリズムの組み合わせで約30uAの消費電流で実現できる見通しを得た。また、上位の信号処理に用いる32bitマイコンとSRAMを65nm CMOSプロセスで試作し、消費電力性能を確認した。

当初計画通り、活動量推定アルゴリズムの開発を完了し、プロトタイプを用いたデータの収集、及び計測手法の改善と性能評価を行った。LSI試作についてはアルゴリズムが未確定であったため、汎用のマイコンとSRAMを回路IPとして試作を行った。フィールドテストは計画よりも前倒しで進捗している。本年度は、2つの非接触心拍計測技術(容量結合型心電計とマイクロ波ドップラー心拍計)を組み込んだ生体計測システムの開発と、計測精度の向上のためのアルゴリズム開発を行った。提案システムは、心拍センサと加速度等複数のセンサを組み合わせ、個人ごとの特徴をフィードバックすることで、計測精度の向上、及びノイズの低減を実現することを目的としている。非接触計測時の個人差を明らかにするために被験者数を増やし、複数の測定環境下で性能評価を進めている。容量結合型心電計については単電極式と2電極式での回路構成を絞り込み、ノイズを十分に抑制して実現する見通しを得た。消費電力面でも、低消費電力な増幅器を用いた回路構成で従来と同等の性能を実現できることを確認した。マイクロ波ドップラー心拍計については、小型のアンテナを用いた評価を行い、室内環境化であれば背面からの計測でも心拍数が計測可能であることを示した。距離画像センサと組み合わせたノイズ削減手法にも取り組み、体動ノイズモデルを構築するためのアルゴリズムを検討している。さらに、システムの低消費電力化のために、信号処理アルゴリズムの専用ハードウェア化を行った。65nm CMOSプロセスで試作を行い、現在評価を進めている段階にある。アルゴリズムについては、低サンプリングレートでの計測に特化したサンプリング誤差補正アルゴリズムを開発し、平均心拍数ではなく瞬時心拍を低アクティブ率で抽出できることを確認した。当初の計画通り、提案アルゴリズムのハードウェア化を行い、1回めのLSI試作を完了した。また、試作システムを用いたフィールドテストも計画通り実施できた。個人最適化手法に関しては当初計画では平成30年度に完了予定であったが、より多くの被験者と評価環境での計測を行うために平成31年度も引き続き開発を続ける予定である。センシング技術開発に関しても複数の新たな改良方法を提案しており、当初計画よりも性能向上を実現できる見通しを得た。平成29年度はそれぞれのセンサーに対する信号処理方式の更なる改良と、ウェアラブルセンサとして使用するために低消費電力化・小型化を行う。また、複数センサによる高精度活動量推定アルゴリズムの開発を行う。平成30年度は個人最適化アルゴリズムの開発を行い、フィールドテストを開始する。平成31年度はセンサーシステムを完成させフィールドでの実証実験によって有効性を示す。
好冷細菌由来低温適応酵素グルコキナーゼにおける低温適応機構の分子メカニズム解明

南極にて生育する好冷細菌由来低温適応酵素の低温適応機構を原子レベルで解明するため、部位特異的スピンラベル法およびX線結晶構造解析法による研究を行う。低温適応酵素として、生体が糖代謝の第一段階の酵素反応として利用しているグルコキナーゼを対象とした。部位特異的スピンラベル法はシステイン残基に特異的に結合するため、ラベル剤を付加したい箇所に変異体を導入する必要がある。ところが天然に存在するグルコキナーゼの6つのシステイン残基にもラベル剤が付着するため、まずは何か所、そしてどの部位にスピンラベル剤と反応しうるシステイン残基が存在するか検証を行った。その結果、好冷細菌由来グルコキナーゼにはひとつのシステイン残基のみしか反応しないにも関わらず、中温菌由来グルコキナーゼには3つのシステイン残基に反応することが明らかになった。さらにこの結果を発展させるべく、中温菌と低温菌で差の出た2つのシステイン残基をセリン残基に変化させた変異体を作成したところ、酵素の熱安定性と酵素活性が著しく変化することが分かった。またこのシステイン残基は古代生物のみにしか存在していないことも明らかにした。さらにスピンラベル剤での研究にむけて、部位特異的変異体のプラスミドを構築したので、今後この発現系を作成し、純粋な酵素試料を得る。好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼ両方において結晶構造解析、動的構造解析に向けた結晶化スクリーニングを行った。今後は現在得られている条件をさらに絞り放射光実験を行う。好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼについて、それぞれ天然状態で6つ持っているシステイン残基の反応性をエルマン法により評価を行った。その結果、好冷細菌由来グルコキナーゼではひとつの、中温菌由来グルコキナーゼでは3つのシステイン残基に反応することが明らかになったので、部位特異的変異体導入法により、それぞれで数種類の変異体プラスミドを構築し、大腸菌による発現系の作成を行った。プラスミドを構築したものすべてで発現していることを確認出来た。さらに高純度の精製を行ったところ、ひとつをのぞき、全てで単一かつ構造・活性を保持した状態で高濃度試料を得ることに成功した。これらを用いたエルマン法による解析から、天然状態でのエルマン、スピンラベル剤と反応し得るシステイン残基を好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼの双方で確定するに至った。さらにそれぞれの酵素について円偏光2色性分光法による解析、およびその温度依存性から天然状態では好冷細菌由来グルコキナーゼの方が中温菌由来グルコキナーゼより熱安定性が高いことが分かった。これは従来から通説として考えられてきた低温適応酵素の性質とは異質であることを示している。この性質を発揮している分子メカニズムを今後さらに明らかにしていく。また低温適応機構を解明すべく、部位特異的スピンラベル法に必要な変異体のプラスミドの構築を行った。これについて発現系・精製系を確立し、低温適応機構の分子メカニズムをスピンラベル法およびX線結晶構造解析により解き明かす。これまでに天然状態好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼにおいてスピンラベル剤と反応し得るシステイン残基を同定した。さらに低温適応機構解明に必要な個所にシステインの変異を導入したプラスミドも構築出来た。今後、これらについて発現系・精製法を確立する。得られた標本について数種類のスピンラベル剤の付加を行い、様々な個所での低温域から高温域に至る幅広い温度範囲において、構造ゆらぎがどのように変化していくか、それを好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼにおいて比較検討を行う。また、反応性の高いシステインを同定する際に明らかになった好冷細菌由来グルコキナーゼの熱安定性機構についても、部位特異的変異体導入法および円偏光2色性分光法より解き明かしていく予定である。さらにX線結晶構造解析を用いて、静的な構造からも低温適応機構の分子メカニズムについて解き明かしていく予定である。

好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼについて、それぞれ天然状態で6つ持っているシステイン残基の反応性をエルマン法により評価を行った。その結果、好冷細菌由来グルコキナーゼではひとつの、中温菌由来グルコキナーゼでは3つのシステイン残基に反応することが明らかになったので、部位特異的変異体導入法により、それぞれで数種類の変異体プラスミドを構築し、大腸菌による発現系の作成を行った。プラスミドを構築したものすべてで発現していることを確認出来た。さらに高純度の精製を行ったところ、ひとつをのぞき、全てで単一かつ構造・活性を保持した状態で高濃度試料を得ることに成功した。これらを用いたエルマン法による解析から、天然状態でのエルマン、スピンラベル剤と反応し得るシステイン残基を好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼの双方で確定するに至った。さらにそれぞれの酵素について円偏光2色性分光法による解析、およびその温度依存性から天然状態では好冷細菌由来グルコキナーゼの方が中温菌由来グルコキナーゼより熱安定性が高いことが分かった。これは従来から通説として考えられてきた低温適応酵素の性質とは異質であることを示している。この性質を発揮している分子メカニズムを今後さらに明らかにしていく。また低温適応機構を解明すべく、部位特異的スピンラベル法に必要な変異体のプラスミドの構築を行った。これについて発現系・精製系を確立し、低温適応機構の分子メカニズムをスピンラベル法およびX線結晶構造解析により解き明かす。これまでに天然状態好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼにおいてスピンラベル剤と反応し得るシステイン残基を同定した。さらに低温適応機構解明に必要な個所にシステインの変異を導入したプラスミドも構築出来た。今後、これらについて発現系・精製法を確立する。得られた標本について数種類のスピンラベル剤の付加を行い、様々な個所での低温域から高温域に至る幅広い温度範囲において、構造ゆらぎがどのように変化していくか、それを好冷細菌由来グルコキナーゼ、中温菌由来グルコキナーゼにおいて比較検討を行う。また、反応性の高いシステインを同定する際に明らかになった好冷細菌由来グルコキナーゼの熱安定性機構についても、部位特異的変異体導入法および円偏光2色性分光法より解き明かしていく予定である。さらにX線結晶構造解析を用いて、静的な構造からも低温適応機構の分子メカニズムについて解き明かしていく予定である。