hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網羅的かつ簡便なインプリントーム解析エピゲノム技術の確立・普及・診断応用

ベンチトップシーケンサーを用いたアンプリコンバイサルファイトシーケンスプロトコールを確立し、ライブラリ作製条件を論文(PMID: 29962238)に記載した。自作スクリプト並び既存のバイサルファイト配列解析ツールを組み合わせたデータ解析系を構築した。10-15種類程度のアンプリコンをプールしアダプター付加したライブラリーを作製し、シーケンスデータをプライマー配列よりアンプリコンのタイプに応じて分別し、メチル化率算出・データ可視化までが簡便に実施できることを確認した。実験系研究者が各自の通常のPCにデータ解析系を整備するためのマニュアル作成を進めている。ヒト全ゲノム片親性ダイソミー症例のゲノムワイドなDNAメチル化データをDNAメチル化アレイEPICで取得・解析し、PTCHD3-DMR, JAKMIP1-DMRを新規インプリント制御領域として報告した(PMID: 29962238)。胎盤特異的なインプリント制御領域の親由来アレル特異的メチル化の厳密性には個人差がある。その個人差を規定する分子機構の解明に向けて、胎盤8検体についてゲノムワイドなDNAメチル化データと全ゲノムシーケンスデータを取得した。2019年度にデータ解析を実施する。マウスF1雑種由来ES細胞についてFAIREseqデータを取得し、SNPsplitを用いたアレル特異的データ解析系を構築した。同細胞についてCapture-HiC法データを取得した。2019年度にプロモーター・エンハンサー相互作用をアレル別に検出する予定である。簡便なバイサルファイトアンプリコンシーケンス法の確立、ヒト新規DMR探索、胎盤特異的インプリント制御領域の解析、アレル特異的オープンクロマチン領域同定、のいずれにおいても、申請時に提案したスケジュールに概ね従った形で、実施目標を達成できている。申請当時との状況変化に応じて、目的とするタイプのデータを取得するための方法を一部変更することで、研究の効率化を図っている。1.実験系研究者がストレス無く、アンプリコンバイサルファイトシーケン配列データを実施するためのソフトウェアインストールマニュアルを作成する。2.胎盤特異的インプリント制御領域の親由来アレル特異的メチル化厳密性の個人差に対応するDNA多型の同定を試みる。3.マウスF1雑種由来ES細胞について取得したCapture-HiCデータの解析を通じてアレル特異的なプロモーター・エンハンサー同定のためのデータ解析系を構築する。マウスF1雑種9.5日胚についてCapture-HiC解析を実施する。インプリント遺伝子のアレル親由来特異的遺伝子発現は、アレル特異的DNAメチル化領域(imprinted differentially methylated region, iDMR)に制御される。iDMRでのメチル化異常はインプリンティング異常疾患の原因となる。DNAメチル化異常(エピ変異)によるインプリント疾患症例では、責任iDMRだけにエピ変異が生じた場合が大半を占める一方で、一部の症例では複数のiDMRエピ変異が認められる(複数座位エピ変異症例)。単一座位エピ変異と複数座位エピ変異症例の識別は、エピゲノム診断の観点だけでなく、エピ変異メカニズム解明という観点からも重要である。このためインプリント疾患のエピゲノム診断では疾患表現型から予想される単一DMRに限定した解析よりも網羅的解析が好ましい。イルミナ社Human Methylation EPIC Beadchipアレイは、全ゲノムバイサルファイトシーケンス法ほどのゲノム高カバー率は無いものの、安価・簡便にゲノムワイドなメチル化プロファイルが取得できる長所を持つ。EPICアレイはインプリンティング疾患のメチル化診断法として極めて有用である。ヒト全染色体片親性ダイソミーモザイク症例についてEPICアレイデータを取得・解析し、50箇所の既知DMRに対応する789箇所のCpGプローブカタログを作成した。更に新規のiDMRとしてJAKMIP1-DMRとPTCHD3-DMRを同定した。これらの情報により、EPICアレイによるインプリンティング異常疾患症例のエピゲノム診断が迅速化・簡便化されることが期待できる。全ゲノム母性ダイソミー・父性ダイソミー症例のDNAメチル化アレイ解析(イルミナ社Human-Methylation EPIC)によるDNAメチル化アレイ解析で、50箇所の既知DMRに対応する789箇所のCpGプローブカタログを作成し、更に新規のiDMRとしてJAKMIP1-DMRとPTCHD3-DMRを同定した。これらの成果を論文化し、Epigenomics誌に受理された。他の実施項目についても概ね予定通りにデータ取得が進んでいる。

その個人差を規定する分子機構の解明に向けて、胎盤8検体についてゲノムワイドなDNAメチル化データと全ゲノムシーケンスデータを取得した。2019年度にデータ解析を実施する。マウスF1雑種由来ES細胞についてFAIREseqデータを取得し、SNPsplitを用いたアレル特異的データ解析系を構築した。同細胞についてCapture-HiC法データを取得した。2019年度にプロモーター・エンハンサー相互作用をアレル別に検出する予定である。簡便なバイサルファイトアンプリコンシーケンス法の確立、ヒト新規DMR探索、胎盤特異的インプリント制御領域の解析、アレル特異的オープンクロマチン領域同定、のいずれにおいても、申請時に提案したスケジュールに概ね従った形で、実施目標を達成できている。申請当時との状況変化に応じて、目的とするタイプのデータを取得するための方法を一部変更することで、研究の効率化を図っている。アンプリコンシーケンス法:H29年度に取得したヒトiDMR領域(12箇所)を対象とするアンプリコンシーケンスデータをモデルとしてデータ解析系を構築する。BismarkによるマッピングとCGメチル化率算出、QUMAによる作図工程の自動処理プログラムの作出を試みる。キャプチャーシーケンス法:110箇所のヒトiDMRを対象に、キャプチャーベイト(各2-10kb,合計500kb程度)をデザインし、キャプチャーDNAをPBAT法でバイサルファイト変換・ライブラリ化する。ヒト正常血液・胎盤検体(各1例)を対象にデータ(HiSeqペアエンドシーケンス1Gb)を取得し、各解析領域について読み取り深度・メチル化率を評価する。アレル特異的オープンクロマチン解析:マウスF1雑種9.5日胚の胎仔・胎盤についてATACseqあるいはFAIREseq法により、アレル特異的オープンクロマチン領域を網羅的に検出する。健常人・インプリント疾患症例(エピ変異例)由来の繊維芽細胞についてオープンクロマチンデータを取得し、疾患特異的エピゲノム変化を検索する。1.実験系研究者がストレス無く、アンプリコンバイサルファイトシーケン配列データを実施するためのソフトウェアインストールマニュアルを作成する。2.胎盤特異的インプリント制御領域の親由来アレル特異的メチル化厳密性の個人差に対応するDNA多型の同定を試みる。3.マウスF1雑種由来ES細胞について取得したCapture-HiCデータの解析を通じてアレル特異的なプロモーター・エンハンサー同定のためのデータ解析系を構築する。マウスF1雑種9.5日胚についてCapture-HiC解析を実施する。キャプチャーシーケンス法で用いる試薬の購入時期をH29年度からH30年度に変更した。次年度使用額はキャプチャー試薬並びにシーケンス試薬購入に充てる予定である。
低線量率または超多分割法による定位放射線治療法の開発とその臨床応用

私共は既に182例の手術不能進行癌に対して^<60>Co遠隔照射装置を用いて、低線量率遠隔照射を試みてきたが、(1)予想以上に局所制御率が高く、(2)予想以上に障害発生率が高い、という結果を得た。固定式の^<60>Co遠隔照射装置による低線量率遠隔照射のために1門照射しかできず、精度も不良のため、広い照射野を取らざるを得なかった。今回リニアックを用いて3D治療計画あるいは定位照射法よる低線量率照射あるいは超多分割照射法を行うことにより比較的大きな腫瘍に対する線量増加、治療成績向上を計画した。最近一回線量0.5Gyの超多分割照射法は低線量率照射と同様に癌の低酸素細胞に対して有効で、その効果は一日2Gyの通常分割照射法より優れているとの生物学的データが発表された。そこで3D治療計画装置により腫瘍に限局してのリニアックによる超多分割照射法を試みた。本年度までに手術不能新鮮食道扁平上皮癌15例、再発食道癌1例、IVB期膵臓癌1例、食道癌および膀胱癌の腹部リンパ節転移各1例に本法を試みた。新鮮食道癌はIIA期9例、IIB期2例、II期3例、IVA期1例で放射線は1回2Gyの通常分割照射60Gy後の残存腫瘍に対して1回0.5Gyで1日4回2Gyで10Gy追加を原則とした。局所効果は10例CR、3例PR、2例MRと比較的良好であった。12例が324箇月生存中であり、3例が515箇月で死亡している。Grade2の食道炎を認めたほかは重篤な晩期障害は認められなかった。膵臓癌、膀胱癌症例はともに14箇月生存し、膵臓癌の患者さんは死亡直前まで仕事をしていた。食道癌再発例は短期に死亡した。本治療法は、食道癌新鮮例に特に有効である。以前の^<60>Co遠隔照射装置を用いて低線量率遠隔照射を行った食道癌症例と局所制御率、生存率および有害事象について比較検討を行い、本法の有用性に関して最終報告を行った。当初固定式の^<60>Co遠隔照射装置を若干改良して、低線量率遠隔照射を行ってきたが、l門照射しかできず、精度も不良のため、広い照射野を取らざるを得なかった。高率な障害発生率は照射装置の問題と考えられ、平成6年からは小照射野で多門照射が可能となるよう回転式の^<60>Co装置を改良し、21例に低線量率遠隔照射を試みた。その結果高度な晩期障害は、15%から5%に減少したが、未だ不十分であり、線量増加も行えない。今回リニアックを用いて低線量率遠隔照射法の試行を開始した。

本法を定位照射法で行うことにより線量増加が可能であり、比較的大きな腫瘍に対する治療成績向上が期待できる。本年度はリニアックによる線量率減少のためのデバイスを開発し、精度管理および線量測定を行った。同時に長時間照射用の固定具の開発を試みた。本年度中に現有2台のリニアックが3台となるので、臨床試行は来年度以降になる。また0.5Gy/時間の低線量率照射は30分毎0.25Gyあるいは2時間毎1Gyの分割照射に相当するという実験データがあるので、超多分割照射法を2時間毎の分割に固定して、1回線量の線量増加研究も同時に行う予定である。実際の治療は通常照射法で60Gy照射後低線量率照射法ないしは超多分割照射法にて1020Gy追加の予定である。私共は既に182例の手術不能進行癌に対して^<60>Co遠隔照射装置を用いて、低線量率遠隔照射を試みてきたが、(1)予想以上に局所制御率が高く、(2)予想以上に障害発生率が高い、という結果を得た。固定式の^<60>Co遠隔照射装置による低線量率遠隔照射のために1門照射しかできず、精度も不良のため、広い照射野を取らざるを得なかった。今回リニアックを用いて3D治療計画あるいは定位照射法よる低線量率照射あるいは超多分割照射法を行うことにより比較的大きな腫瘍に対する線量増加、治療成績向上を計画した。最近一回線量0.5Gyの超多分割照射法は低線量率照射と同様に癌の低酸素細胞に対して有効で、その効果は一日2Gyの通常分割照射法より優れているとの生物学的データが発表された。そこで3D治療計画装置により腫瘍に限局しての超多分割照射法を試みた。1例は57歳男性で食道癌T4N0M0で通常照射法70Gyで腫瘍残存と激しい疼痛を残していた。この症例に1回0.5Gyで1日4回、3日間連続で計6Gy追加した。6ケ月後の現在腫瘍および疼痛の残存を認めるが、腫瘍の増大はなく、超多分割照射法による障害も認めていない。もう1例は61歳女性で膀胱癌の後腹膜リンパ節転移例である。本例も60Gy照射後腫瘍の残存があり、1回0.5Gyで1日4回の超多分割照射法で5日間計10Gy追加した。腫瘍は5×6.5cmであったが、4×4cmに縮小し、中心部は著名な壊死を示し、3ケ月後の現在増大をみていない。本例にも超多分割照射による障害発生は認めていない。本年度は例年500例の放射線治療新患が900例と増加し、また定位放射線治療件数も50例を超えるに至り、超多分割照射に利用できるリニアックの時間が限定された。本年度中に現有3台のリニアックが4台となるので臨床試行は来年度以降本格的に行うことになる。現在は一日2Gyの超多分割照射であるが、一日線量を5Gyまで増加させる予定である。最近一回線量0.5Gyの超多分割照射法は低線量率照射と同様に癌の低酸素細胞に対して有効で、その効果は一日2Gyの通常分割照射法より優れているとの生物学的データが公表された。本年は6例の手術不能進行食道扁平上皮癌に本法を試みた。
中国魏晋南北朝時代の石刻資料から見た女性と婚姻

魏晋南北朝時代には多くの石刻資料が作製されているが、本研究では、墓誌資料に注目した。この時代の墓誌資料は、北魏のものを中心として、約1600件の数量がある。これらの多くは石刻資料としては長文の部類に入り、資料的価値が高い。文章中には、墓主の諱字の他、本籍地・卒年月日・葬年月日もあり、多様な個人的情報を収集することができる。また、すべての資料に記述があるわけではないが、妻や子供の記録、妻の場合はその父や母の記録、男子の子供の場合はその妻、女子の子供の場合は、嫁ぎ先の人物の名称にまで記述が及ぶことがあり、さながら一大家系図を描くことができる。墓誌は清朝末期の碑学派の隆盛のころから注目されだし、中華民国時代に主要な資料が発掘されている。発掘地域は北魏洛陽城の北側の芒山という地点である。しかし、近年の科学的発掘の成果により、新資料が追加されるようになり、情報も多角的に収集できるようになっている。私は、「墓誌データベース」を作成し、発掘報告は言うまでもなく、墓誌の銘文や図版をデジタル情報として管理できるようにしてきた。その結果、知りたい情報が速やかに正確に獲得できるようになった。1件1件をつなぎあわせるために、本研究では、系図作成を積極的に行った。これらを行うことにより、史書ではわからない人物間の近さをみることができた。また、女性と婚姻の情報を整理することが重要であることは、史書に書かれていない第一次情報として利用ができることである。この分析は、細かなつながりを見ることを可能とし、歴史関係の資料として将来的にも利用可能な資料となった。魏晋南北朝時代の墓誌銘は、未整理の部分が多い。そのため、新旧資料を一つにしたDBを作成するとともに、図版・釈文のデジタル化に取り組んできた。魏晋南北朝時代の墓誌銘の著録には、趙万里『漢魏南北朝墓誌集釈』や趙超『漢魏南北朝墓誌彙編』等があるが、収録墓誌数は500前後までである。上記のDBの墓誌銘収録数は1,100件を超過するまでになり、他のどの著作よりも多くの情報を得ることができるようになった。墓誌銘中に見られる婚姻に関する情報は、先祖(父母以上)の中の女性の記録、墓主の妻の記録、女性の子供の記録の三種がある。この記録は、墓主とは直接的には関連がないために、従来注目されることは少なかったが、系図を描いたり、中央の皇子と皇子、地方の領主と領主、あるいは皇子と領主など、種々の関係を見るには、繋がりを明らかにできる資料であり、『魏書』等の歴史書には見えない関係を探ることができる。女性の記録を読みながら一族と一族の関連を探るには、まずは系図を描くことが必要と考え、今年度は墓主を中心として妻子の関係を描く事にした。はじめに、歴史書中から系図を作成し、そこに女性の氏名を補っていく方式を採用していった。墓誌銘中で家族の記録が見られる資料は200件ほどあるが、文章内容としては関連性の高い後漢時代の墓碑にはこの種の記録を見ることはできず、西晋の時代以降に普及してくる習慣と考えている。また、南北朝時代になると、墓誌の形式そのものが、碑の形から誌の形に変化してくるが、そこに刻される墓誌銘の婚姻の記録を読み進めると、漢民族の記述方法が北の胡族にも伝わったのであろうという推察ができる。

また、墓誌の作成目的については、死者の血筋や家柄を明らかにし、墓の改葬やその他不測の事態に備えようという防御的なねらいがあったり、墓を作る子孫が被葬者との繋がりを明示しようという目的もあったと考えられる。本年度は、山東省の墓誌に関して集中的に調査するとともに、墓の紀年から読み取ることのできる墓誌作製の目的に関して考察を行った。(1)山東省の墓誌について魏晋南北朝時代の墓誌は、多くが洛陽周辺で作製されており、山東省で出土の墓誌は100件にも満たない。この墓誌に注目した理由は、これらがすべて被支配者である漢族のものであり、洛陽の墓誌とは違った記述内容が見られるからである。その違いとは、一族の記録および妻や子供の記録が非常に多いことである。墓誌銘は死者(墓主)を追悼・顕彰するために製作するものであるから、通常、墓主の記録が中心に行われる。しかし、被支配者である漢族の墓誌には、一族・家族の記録を長く記録する資料が多く、元氏のものとは根本的に異なる。この違う部分を利用することにより、本研究の「婚姻と閨閥構築」の現状が見えるのである。特に清河崔氏に注目し、その墓誌を利用して家系図を描くことも行った。(2)墓誌の紀年よりみる墓葬について墓誌は、なぜ墓中に埋葬されるのかという基本的な疑問を解決する先行研究は、見ることができない。墓誌作製の目的を探ることは、墓誌に記述される文書そのものの性格にも影響することである。本年は、墓誌が作られる過程を墓誌銘の紀年(卒年月日と葬年月日)・墓誌銘の撰文者の記録から、墓誌作製の過程と墓誌銘作成の過程を考えた。本年度は、以下の内容の研究を実施した。(1)河北省の調査地域博物館などを訪問し、拓本等で読むことのできない文字の解読や従来の研究ではデータのない採寸(特に厚みと文字の大きさ)や石質の調査を行った。北京・天津周辺の資料を中心に、石刻の実物・貴重拓本を調査、画像などの資料を入手した。(2)石刻資料のDB化と系図作成石刻資料を整備していくと、歴史文献にはできない詳細な個人年譜や女性を加えた全員の家系図を描く事が可能となる。このため、本年も収集できた資料を中心にデータをデジタル化し、その中から、すべての人間の情報を抽出し、系図を描いた。また、姓の異なる者の婚姻を調査し、閨閥作成の実体を探った。婚姻関係や子供の記録は、女性の移動により成り立つ。歴史書は基本的には男子のみの記録であり、女性の実態が知られることはあまりない。石刻資料では女性の動きが分かり、資料的価値は非常に高い。(3)文字から見る閏閥間のつながり墓誌などの石刻資料では、銘文の書者や撰文者の情報をあまり得ることができない。しかし、手書きである墓誌銘の書を追ってゆくと、「書き手」が同じである墓誌銘に多く出会うことができる。このことに注目し、誰が書写したのかを追跡した結果、書の名手と思われる者が一族の死亡者の墓誌銘を揮毫したことをはじめ、その他の一族の墓誌銘を揮毫している事例が確認できる。このことからも、一族間のつながりをうかがうことができた。(1)デジタル化された資料の整理資料総数は、1,570件、図版などから銘文を起こしデジタル化された資料は1,233件あり、これらが分析の基本資料となった。(2)郷里地図の作製と家系図の図式化北魏洛陽の墓誌銘には墓主が生前に居住していたと予想できる「里」の具体的名称をみることができる。一般的には「坊制」あるいは「坊里制」と言われるが、孝文帝の洛陽遷都後、都としてり体制作りの基礎とも言うべき制度である。里は一辺が三百歩ほどの正方形の空間であるが、同名の里に複数の墓主が居住してた事実が明らかにできた。また、『洛陽伽藍記』に記載の里から洛陽城内の位置を推定し、「洛陽内城・洛陽外城・洛陽城外・洛陽都郷」等に分類して地図を作成し、位置を推定した。
複数のCRISPR/Casを用いたDNA構造の改変と転写制御機構の解析

近年、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集が比較的容易に行えるようになってきた。また様々な生物のCas9やCas9の変異体を活用する事により、これらをゲノム編集以外の様々な研究に活用しようとする試みも盛んに行われている。特に、遺伝子切断不活性化型のCas9をdCas9といい、転写活性化タンパク質や、蛍光タンパク質などと融合させることにより、遺伝子発現の調節や転写調節の仕組みを解明する為に活用することができる。本研究では、Bリンパ球において抗体改変に必須のタンパク質であるAIDに着目し、その遺伝子発現の仕組みおよび、遺伝子活性化時に生じるAID遺伝子(Aicda)の立体的な状態を上述したCRISPR/Cas9systemを用いて明らかにしようとするものである。これまで、Aicda及びその周辺の領域には、広範にわたり散在する転写調節領域が存在し、それらに結合する転写調節因子も複数存在することが明らかにされてきた。本年度は、dCas9-VP64などを活用し、これらの各DNA領域の転写活性への寄与を検討した。また、各種蛍光タンパク質融合型のdCas9、およびルシフェラーゼを発現するコンストラクト作製を行い、生物発光を利用したBリンパ球活性化時・非活性時のDNA構造の解明を試みた。その結果、本研究で用いた細胞においては、dCas9-VP64による転写の活性化は弱いものの、プロモーター上の適切な配列にdCas9-VP64タンパク質を結合させることにより、プロモーター下流の遺伝子の転写を活性化することを確認できた。次年度は、これらの解析によって得られた知見を基に、定常状態の細胞内において、Aicda遺伝子上の立体構造を再構築し、AID発現を操作できるかを検討する予定である。研究計画書に記載の通り、本年度は、各種発現コンストラクトの作製、及びdCas9-VP64を用いたAicda遺伝子上の転写制御領域が転写活性に与える影響を検討した。また、これらを基に、ルシフェラーゼなどの生物発光を用いたDNA立体構造の解明を試みた。しかしながら、ルシフェラーゼを導入した細胞では十分な発光強度を得ることができず、実験条件を詳細に検討する必要が考えられた。このため、本研究課題立案時に予定していた、Aicda遺伝子周辺の転写調節領域間および転写調節領域とプロモーターとが形成する立体構造の解明に至ることができなかった。必要があれば、現在使用しているspCas9以外にも、saCas9など別種のCas9も活用し、引き続き、Aicda遺伝子周辺の各転写調節領域とプロモーターが形成する立体構造の解明を試みる。また、現在用いているルシフェラーゼを含む各種発現プラスミドが細胞において機能していない可能性も考えられることから、遺伝子発現時のDNA構造変化が既知であるグロビン遺伝子などに本システムを当てはめることで、実験条件が整っていることを確かめたい。

上述したように解析にやや遅れが生じており、本年度は、定常状態のBリンパ球におけるAicda遺伝子上において立体構造再構築を試みる事が出来なかった。本年度生じた残額は、この立体構造を検討するための各種コンストラクトの作製や、試薬購入に当てる予定の費用であった。研究計画全体に変更の必要性はないと考えているため、今年度の未使分は、次年度に再検討を行う際に使用する予定である。
残響時間法を利用した表面積計の開発

建築音響の分野で,室内の音場が拡散音場であれば,室の残響時間は室の内表面積に反比例することが知られている.この現象を利用して,測定対象物体を中に置いた容器の残響時間を求めて,対象の表面積を測定することができる.この原理に基づく表面積計を実現するための,理論的および実験的な検討を行った.測定用容器内の音場をできるだけ拡散音場に近づけるため,実在の残響室を縮小した形状を持つ容器を製作した.この容器に,音源および音圧検出用マイクロホンを取り付け,音源から帯域雑音を断続的に放射して,容器の残響時間を測定した.いくつかのサンプルを用いて実験をおこない,以下の結果が得られた.(1)塩化ビニールフィルムなど,比較的吸音率の高い対象については,残響時間法によって表面積を測定できるという見通しがえられた.(2)しかし,試作装置内は,十分には拡散音場になっておらず,対象の配置などへの依存性がのこった.(3)測定装置の気密性などの条件が極めて敏感に残響時間に影響を与える.また,並行して容器の音響インピーダンスを測定する実験も行った.これらの検討結果を総合して,金属など吸音率の低い材質の物体には音響インピーダンス法が適し,比較的吸音率が高く形の変形しやすい対象には残響時間法が適することが分かった.今後,測定容器内をより拡散音場に近づけ,気密性を厳密に制御すると共に,温度変動,気圧変動などを遮断する測定装置を設計して,実用的表面積計の実現を目指す予定である.建築音響の分野で,室内の音場が拡散音場であれば,室の残響時間は室の内表面積に反比例することが知られている.この現象を利用して,測定対象物体を中に置いた容器の残響時間を求めて,対象の表面積を測定することができる.この原理に基づく表面積計を実現するための,理論的および実験的な検討を行った.測定用容器内の音場をできるだけ拡散音場に近づけるため,実在の残響室を縮小した形状を持つ容器を製作した.この容器に,音源および音圧検出用マイクロホンを取り付け,音源から帯域雑音を断続的に放射して,容器の残響時間を測定した.いくつかのサンプルを用いて実験をおこない,以下の結果が得られた.(1)塩化ビニールフィルムなど,比較的吸音率の高い対象については,残響時間法によって表面積を測定できるという見通しがえられた.(2)しかし,試作装置内は,十分には拡散音場になっておらず,対象の配置などへの依存性がのこった.(3)測定装置の気密性などの条件が極めて敏感に残響時間に影響を与える.また,並行して容器の音響インピーダンスを測定する実験も行った.これらの検討結果を総合して,金属など吸音率の低い材質の物体には音響インピーダンス法が適し,比較的吸音率が高く形の変形しやすい対象には残響時間法が適することが分かった.今後,測定容器内をより拡散音場に近づけ,気密性を厳密に制御すると共に,温度変動,気圧変動などを遮断する測定装置を設計して,実用的表面積計の実現を目指す予定である.本研究は,残響時間法を利用して物体表面積を測定する方法を実用化することを目的としている.この目的を達成するためには,測定装置内を可能な限り拡散音場に近づけること,被測定物体の体積効果の補正法を確立することが必要となる.本年度は,基礎的な実験を行うための試作装置を設計・製作した.まず,可能な限り拡散音場に近い音場を測定容器内に形成するため,容器の形状について検討を行い,実在の残響室を縮尺1/50で相似に縮小した容器を製作した.続いて,音源およびマイクロホンについても,拡散音場を形成し音圧の空間平均を検出するという観点から検討を行い,機種,使用個数,取付位置を決定した.これに合わせて,音源駆動回路,マイクロホンアンプを設計・製作した.さらに,ノイズ断続法を用いて残響時間を測定するための処理プログラムを製作した.以上の製作によって,残響時間式表面積計のプロトタイプが完成した.また,実験用被測定物体として,体積と表面積の関係を系統的に変化させた円柱状サンプルを数十個準備した.一方,被測定物体の体積効果の補正法を検討するために,音響式体積計(計測科学研究所製)を改造して実験を行い,被測定物体の体積と音響インピーダンス偏角の関係を調査した.その結果,音響式体積計と残響時間式表面積計とをインテグレートできる見通しが得られた.次年度は,上記のプロトタイプとサンプルを用いて,残響時間と表面積の関係,サンプルの形状の影響,サンプルの体積の影響について実験を行う.その結果に基づいて,試作装置に必要な改良を施すとともに,処理の自動化を進め体積補正処理を実装した実用的なプログラムの開発を行う.容器内に音を放射したときの残響時間から容器の内表面積を推定し,容器内に置いた物体の表面積を測定するという原理の表面積計について,実験的検討を行った.上記の測定原理が成り立つためには,容器内の音場が,十分な拡散音場となっていることが必要である.この条件を満足するために,容器の形状,音源,音圧検出法,対象物体の支持法,放射音などについて総合的に検討を加えた.最終的に,残響室の形状を模した不整形の容器を作製し,圧電式スピーカーおよびコンデンサーマイクロホンをそれぞれ3個ずつ使用して,測定実験を行った.

残響時間測定には,放射音として帯域雑音を用い,ISOの規定するノイズ断続法を用いた.この測定装置によって,塩化ビニールなどの比較的吸音率の大きい材質であれば,理論通りに表面積が測定できることが確かめられた.しかし,測定対象物体の寸法が大きくなると,拡散音場の前提が崩れるため,大きな誤差が発生することも分かった.また,測定装置は,測定対象を出し入れするため必然的に開閉機構を有するが,この機構の気密性の僅かな変動が極めて敏感に測定値に影響し,金属など吸音率の低い対象については,表面積変化がバラツキに埋もれてしまうことが分かった.実用的な表面積計を実現するためには,より徹底して拡散音場を実現することが必要であり,現在,音源・マイクロホン・測定対象の相対位置関係を変化させながら空間的・時間的な平均を取る方法を検討している.また,金属などの吸音率の低い対象に関しては,容器の音響インピーダンスの位相角を利用する方法が適することを実験的に確認し,この方法についても今後実験を進める予定である.更に,容器の気密性に強く影響を受ける性質は,逆に,容器の漏洩検出原理としての有効性を示唆するものであり,漏洩検査装置への応用の検討も開始した.
量子ドットへの単一光子照射による単一電子生成と電子スピンへの情報転写の研究

長距離伝送を担う光子から固体量子演算素子の量子、特に量子ドット中の電子スピンヘ量子情報の転写の実現は将来の量子情報通信の基盤技術として非常に重要である。本年度は量子情報転写の第一段階として、単一光子の円偏光を量子ドット中の単一電子スピンで検出するという、単一光子から単一電子スピンヘの角運動量転写の実験に取り組んできた。本年度はまず、単一光子の円偏向を単一電子スピンにより検出する実験法を以下のように考案した。円偏向した微弱レーザを擬似単一光子源として使用し、量子ドット中にスピン選択的に単一電子-正孔対を励起する。横型量子ドットでは光生成された単一電子のみが量子ドットに束縛される。電子スピンの検出には量子ドットに近接する量子ポイントコンタクト(QPC)による電荷検出法を使い、円偏向した単一光子が生成した単一電子がスピン上向きあるいは下向きのどちらのゼーマン分裂状態を占有するかを測定することで電子スピン向きとして右・左円偏光を検出する。次に上記の実験を行うための試料作製を行なった。試料は、GaAs/AlGaAs2次元電子とゲート電極によって静電的に形成される横型量子ドットと単一電荷検出用のQPCから成る。ここで量子ドットにのみ光が照射されるように、ドット直上に微小開口を持つ金属マスクの作成法を確立した。これはGaAs/AlGaAs2次元電子の光照射で特有な永続的な電荷の蓄積を避け、電荷検出の安定化を図るためであり、今後の実験の成否の鍵を握る重要な技術であり、当初計画どおり本年度に達成できた。また永続的な効果を抑える別の手段として、Al濃度の異なる2次元電子基板の使用を検討し、光照射効果と電荷読出しの電気的な安定性の評価も行なった。今後は作成した試料を用いて、単一光子から単一電子スピンヘの角運動量の転写実験の実現を目指す。
進行肺癌を対象とした腫瘍免疫抑制回避と能動免疫を併用するがん免疫療法の臨床研究

本研究では、免疫チェックポイント阻害剤単剤投与により、1肺癌関連新規がん精巣抗原( LY6K, KIF20A, CDCA1 )に特異的なT細胞が、肺癌患者において活性化・増殖するか、また2免疫チェックポイント阻害剤投与が与える抗原特異的T細胞への影響が、抗腫瘍効果と関連するかを問うことを目的とした。現在までに、熊本大学病院呼吸器内科を受診し、肺癌の診断を受け免疫チェックポイント阻害剤単剤投与を受けた肺癌患者のデータ集積、検体採取、保存を進めている。本研究に関する検体保存と解析に必要な倫理関係書類は、熊本大学大学院生命科学研究部倫理委員会へ提出し承認を受けることができている。多重蛍光免疫染色を用いた患者組織検体解析を開始し、サイトケラチン、PD-L1、CD3、DAPI、FOXP3、CD206、CD19などのf複数の免疫関連マーカーを同時に測定・定量化し、腫瘍組織内および間質に浸潤した免疫サブセットの分布、密度、量と免疫細胞関連マーカーの定量化解析を進めている。客観的・効率的な複数の免疫細胞関連機能マーカーの同時定量化を目的とした自動解析法も導入するため、機器の選定と予備実験を進めている。さらに、末梢血単核球細胞中の免疫サブセットおよびそれらの細胞が発現するPD-L1等の機能マーカーをマルチパラメーター・フローサイトメトリーを用いて解析するための予備実験を進めている。患者検体の解析を開始する前段階として、CD3/CD2/CD28抗体、PMA、LPSなどを用いて健常人由来の血液を試験管内で刺激し、活性化T細胞を含む免疫サブセットの刺激後の変化をマルチパラメーター・フローサイトメトリーで定量化が可能か予備実験での評価を進めている。熊本大学病院呼吸器内科を受診し、肺癌の診断を受け免疫チェックポイント阻害剤単剤投与を受けた患者のデータ集積、検体採取、保存は概ね順調に進行している。本研究に関する検体保存と解析に必要な倫理関係書類は、熊本大学大学院生命科学研究部倫理委員会へ提出し、承認を受けた。多重蛍光免疫染色を用いた患者組織検体解析を開始し、客観的、効率的な定量化を目的とした自動解析法も導入するため予備実験が進行中である。マルチパラメーター・フローサイトメトリーによる末梢血解析に関する予備実験も進み、Treg、T細胞サブセット、B細胞サブセット解析が可能であること、それら免疫サブセットの機能マーカー解析が可能であることも確認できている。多重蛍光免疫染色法による患者検体解析を進める。本解析には多数のマーカー解析が必要となるため、複数の組織検体を客観的・効率的に解析するための自動解析法を導入予定としている。マルチパラメーター・フローサイトメトリーによる末梢血解析法の効率化を試み、安定したデータを治療開始前・後の患者検体で得るためのシステムを構築する。
生理的条件下で天然構造と平衡にあるタンパク質の変性構造の解明

S-S結合を欠損させて天然の立体構造を失わせたリゾチーム分子に残留する部分秩序構造をNMR分光法と重水素交換法を組み合わせて研究した結果、リゾチームに存在するA、B、Cへリックスが作るαドメインの疎水性ポケットにβシートの底部にある残基I55、L56が固定された構造が、このタンパク質の折りたたみ反応開始部位であることを解明することができた。一方、ピロリドンカルボキシルペプチダーゼ(PCP)の天然立体構造の揺らぎを調べる実験からは、208残基から成るこのタンパク質の残基70番近傍で起きる構造変化がこのタンパク質を2つの大きな構造ドメインに分割しようとするが、その揺らぎのモードが立体構造を完全な無秩序鎖状態にほどいてしまうことを突き止めた。2つのタンパク質を用いて、タンパク質foldingの初期過程を研究した。リゾチームS-S結合欠損変異体の研究においては、4種の1SS変異体のうち、リゾチームのN末とC末端を連結するCys6とCys127間にS-S結合を残した1SS[6-127]変異体だけが、他の3種の1SS体に比べて、有意に空間的秩序構造を維持する能力が高いことを見出し、リゾチーム分子の構造形成にとってCys6-Cys127間のS-S結合が特別に重要であることを明らかにした。グリセロール添加によって誘導される部分秩序構造をアミノ酸残基レベルの分解能で調べるために、水素/重水素(H/D)交換NMR分光法を用いて研究した。その結果、1SS[6-127]変異体に誘導される構造は、安定性が劣るものの、すでに論文発表[Biopolymers 91(2009), 665-675]された2SS[6-127, 64-80]変異体に誘導される部分構造とよく似ていることが分かった。一方、ピロリドンカルボキシルペプチダーゼ(PCP)を用いた初期構造形成の実験においては、立体構造をまだ形成していない段階で、主にαヘリックスを中心にして、徐々に部分秩序構造が成長していく様子を直接観測することに成功した。pH3.0、4°Cの条件下では8時間程度のインキュベーション時間の後、分子全体に渡るall-or-none型の構造変化が起きて立体構造形成が始まる。変性剤を除去した直後から天然PCPに存在するα6ヘリックスはH/D交換からプロテクトされた状態になっており、インキュベーション中に、さらにα4ヘリックスの構造も回復する現象が観測された。しかし実験にはまだ不明な点が多く、pH3.0の条件下でも、4°Cと8°CではPCPの無秩序鎖状態に大きな違いが存在することが分かった。これらの違いの詳細を明らかにすることが折りたたみ反応初期過程の正しい描写を得るための鍵になると感じている。リゾチームのS-S結合欠損変異体の研究の集大成として、本年度はCys30-Cys115間にS-S結合を持つ1SS-2変異体の部分構造形成を研究した。その結果、4種の1SS変異体の部分構造形成を比較検討することが可能になり、高濃度グリセロール存在下で誘導される部分構造形成反応における各S-S結合の役割の違いを解明した。50%グリセロール中で4種の1SS変異体は皆ほぼ同程度のヘリックス含量(約40%)を回復するが、主鎖アミド基のH/D交換反応に対する遅延因子の測定結果は「1SS-1変異体(Cys6-Cys127を持つ)だけが、誘導された部分ヘリックス構造を安定化する空間秩序構造を形成できる」という事実を明らかにした。1SS-1変異体以外の場合は、誘導された短いヘリックスがポリペプチド主鎖上を浮動して定まった領域に安定構造を確保することができない。グリセロール誘導フォールディング反応の初期過程におけるCys6-Cys127結合の優位性を明瞭に立証したが、反対にフォールディング転移終了後このS-S結合は必ずしも必須ではなく、折りたたみ反応の遷移状態前後でS-S結合の役割が大きく変わることを見出した。現在、S-S結合欠損体の全研究を総括して、各S-S結合の役割を解明する論文を準備しているが、前述の視点の重要性がキーポイントである。一方、ピロリドン・カルボキシルペプチダーゼ(PCP)の研究は、pH3.0、8°Cの条件に変更し、NMRスペクトル測定前の急速なリフォールディングの条件を改善して実験を行った。その結果、α4ヘリックスとα6ヘリックスが他のβストランド領域に先駆けて明瞭に構造形成することを解明することに成功したが、この研究はまだ現在継続中である。

タンパク質の折りたたみ反応の初期過程の研究は、非天然状態にあるタンパク質に残留する部分秩序構造とそれが徐々に立体構造に成長する過程の研究である。S-S結合欠損リゾチームとピロリドンカルボキシルペプチダーゼ(PCPと略す)を用いて研究することが今年度の研究課題であった。S-S結合欠損リゾチームの研究においてCys6-Cys127間にだけ1本S-S結合を残す1SS[6-127]変異体とCys30-Cys115間にS-S結合を持つ1SS[30-115]変異体の構造の違いが非常に興味深い実験事実であった。その違いを残基レベルの分解能で調べるため、溶媒にグリセロールを添加する方法によって違いを顕在化させ、NMR分光法とH/D交換法を組み合わせた方法で研究を行った。その結果、明瞭な違いが残基4-15領域のA-helixの安定性にあることを突き止め、Biopolymers,97(2012),539-549に論文発表した。PCPに関する研究においては、pD2.9で天然状態にあるPCPの主鎖アミドプロトンのH/D交換反応を温度35°C50°Cの範囲で測定した。主鎖NHのH/D交換反応は、天然構造が大きく崩壊して溶媒に露出したopen-formで交換反応が媒介されるため、非天然状態の情報も得られる。実験の結果、PCPは折りたたみ反応の開始状態であるD_1状態における構造までアンフォールディングして溶媒露出し、H/D交換反応が起きることが明らかとなった。さらに、D_1状態においてC末端の20残基ほどから成るα6-helix領域にH/D交換反応を阻害する13程度の遅延因子が存在することが分かった。すなわち、D_1状態において、すでにこのα6-helixはヘリックスを形成していることを示唆している。この結果は現在論文を準備中である。その他、グルコアミラーゼのデンプン結合ドメイン(SBD)というタンパク質の折りたたみ反応中間体を直接NMR分光法で構造解析する研究を成功させ、J.Mol.Biol.,412(2011),304-315に論文発表した。
脂肪酸パルミチン酸アミド体を使った大腸がん分子標的療法の開発

本研究の最終ゴールは、脂肪酸誘導体を使った大腸がん分子標的療法の開発である。デセン酸を初期リード、パルミチン酸を後期リードとしてヒト大腸がん細胞株に対するIC_50値を指標に構造活性相関(QSAR)解析により抗がん効果のファルマコフォアが飽和炭素数16と1位炭素へのピペリジン環導入であることを突き止めた。化合物コード903 (特願2010-079755)は今のところ細胞レベルでの抗がん効果が最も強く、正常細胞に対する毒性が低い。ヌードマウス皮下移植モデルでは腫瘍体積抑制効果を認めた。本モデルでのED_50値(effective dose)はおおよそ0.0250.05 mg/kgと見積もられた。化合物コード903のpKaおよびcLogDを計算した結果、経口投与した場合に消化管より吸収されることが予測された。化合物コード903は腫瘍選択性が高く、広範な抗腫瘍効果を持つため大腸がんを含む消化器がん治療の新たなリード化合物になりうると考えられた。本研究の目的は(1)構造活性相関(QSAR)に基づく抗がん剤の構造最適化、(2)インシリコ解析による標的候補分子の抽出である。中鎖脂肪酸であるデセン酸(炭素鎖10個)との構造類似性より天然脂肪酸であるパルミチン酸(炭素鎖16個)をリード化合物として70種類の誘導体を合成し、ヒト大腸がん細胞株に対する増殖抑制効果を指標にQSAR解析を行った結果、化合物808が最も強い抗がん活性を発揮し、正常細胞への毒性も少ないことがわかった。化合物808の50%増殖抑制濃度(IC_<50>)は5マイクロモル/Lであった。がん細胞が100%死滅する808の濃度においてヒト大腸正常上皮細胞は100%生存した。QSAR解析の結果、飽和直鎖状炭素配列(炭素鎖16個)とアミド結合による側鎖ピペリジン構造が抗がん効果に重要であることを突き止めた。この情報を基にさらに改良を加え、新たに30種類を追加合成し、抗がん活性を測定した結果、化合物903(炭素鎖16個)のIC_<50>が200ナノモル/Lであり、従来型抗がん剤5FUより25倍強い新規抗がん剤であることが新たにわかった。化合物903の毒性に関して、パイロット実験で薬剤を72時間暴露させた場合にがん細胞(HT29細胞)は60%が死滅したのに対し正常細胞(FHC細胞)は90%が生存した。細胞増殖アッセイのデータより化合物903の構造が今のところ最適であると思われた。化合物903の物理化学的特性は脂溶性ではなく水溶性であるため、この物質が細胞表面に存在する何らかの受容体に対して親和性があることが推測された。がんに関連する受容体型チロシンキナーゼを標的候補にインシリコ・構造ベーススクリーニングを実施した結果。化合物903はc-kitチロシンキナーゼのリン酸化ドメインに高い結合性を持つことを突き止めた。これらのエビデンスに基づき化合物808と他2剤の特許審査請求を行った。本年度目的は、前年度に得られた抗がん剤903とそのファルマコフォアの情報を基に抗がん剤903をリードとして構造を最適化することである。飽和炭素鎖にアミド結合するピペリジンは求核基として働くと考えられ、インシリコ解析でのc-kitチロシンキナーゼのリン酸化ドメインへの親和性に関する3次元イメージ結果を考慮して、ピペリジンの構造を修飾した新たな化合物を分子設計した。この化合物の分子量は約420であり、カルボキシル基に結合する側鎖に窒素分子数個を含む立体構造を呈する。また、脂肪酸であるデセン酸の構造の一部と同じ構造を組み込み、抗がん剤903をリードとして20種類程度の新規化合物を合成した。内数種類のものは、HT29細胞株およびHCT116細胞株に対してIC50<0.2マイクロモルであることがわかった。リードである抗がん剤903を凌駕する新たな抗がん剤の創製に成功した。抗がん剤903の個体レベルでの抗がん効果を検証するための前実験として急性毒性試験を実施した結果、LD50値を得ることができた。SDラット雄で約1,000mg/kg、雌で約500mg/kgであることがわかった。

高用量短期経口投与に伴う主な症状として肉眼および組織学的に消化管のびらん、潰瘍がみられたが、肝細胞は比較的変化が少ない所見であった。抗がん剤903のヒト大腸がん以外の固形がんに対する抗がん効果を調べた結果、ヒト肝がん、ヒト肺がん、ヒト悪性中皮腫、マウス悪性黒色腫に対するIC50は2から5マイクロモルであることがわかった。抗がん剤903は固形がんに対して広範な抗がんスペクトラムを有することを突き止めた。本研究の最終ゴールは、大腸がん治療の薬剤カテゴリー創製である。具体的には、デセン酸を初期リードとしてヒト大腸がん細胞株に対するIC50値を指標に構造活性相関(QSAR)により至適炭素数が16であることを突き止めた後、パルミチン酸を後期リードとしてその誘導体を設計、合成し構造の最適化を行った。化合物コード903(特願2010-079755, H25.1.15審査請求)は今のところ細胞レベルでの抗がん効果が最も強く、正常細胞に対する毒性が低いのでこれを用いて個体レベルでの効果検証を行った。ヌードマウス皮下移植モデルを用いて0.05 mg/kgで10日毎の腹腔内投与にて薬剤を投与し腫瘍の生着と肉眼的増殖を確認し薬剤を投与した。実験開始後3週目より腫瘍体積抑制効果を認め、犠牲死(6週目)まで抑制効果が持続した。肉眼的には薬剤投与群の腫瘍は中心部が壊死に陥り、組織学的には中心部の腫瘍細胞に壊死像、karyorrhexis、picnosisなどの所見を認めた。実験期間中に有意な体重減少は認めなかった。本モデルでのED50値(effective dose)はおおよそ0.0250.05 mg/kgと見積もられた。化合物コード903のpKaおよびcLogDを計算した結果、経口投与した場合に消化管より吸収されることが予測された。化合物コード903の抗がん効果は5FUより強く、腫瘍選択性が高いという優れた特性を持つため大腸がんを含む消化器がん治療の新たなリード化合物になりうると考えられた。分子設計でねらった化合物を効率良く合成することができ、合成した複数の誘導体の中に安定した抗がん効果を発揮する化合物が含まれたこと。共同研究によりラージスケールでの合成が可能になり、動物実験を実施することができた為。24年度が最終年度であるため、記入しない。ラージスケールでの高収率合成法を確立したのでグラム単位で抗がん剤903を合成し、ヌードマウス皮下移植モデルにて個体レベルでの抗がん効果を検証する。有効性を確認後、強制経口投与あるいは混餌投与にて消化管腫瘍自然発症モデル(Minマウス等)を用いて抗がん効果(腫瘍発生抑制率、生存率)、有害作用を検討する。投与形態と剤形を検討する。引き続きインシリコ解析データのウエットでの検証実験を行う。
幾何的特徴を持つグラフに対する高速生成アルゴリズム

グラフは様々な現実問題を表現する離散的なモデルとして優れたツールである.特に幾何的特徴を持つグラフは,地理情報やセンサーネットワークなどの幾何データをはじめ,様々な実問題のモデル化として現れるグラフで,盛んに研究が行われている.フロンティア法は特定の性質を満たすすべての部分グラフをコンパクトに表現するZDDと呼ばれるデータ構造を高速に構築し,ZDDに備わる演算体系を構築されたZDDに適用することで,多くの実問題が解かれてきた.本研究では,フロンティア法の拡張性を高めるための新たな技法を設計するとともに,その技法を適用した幾何的特徴を持つグラフに対する高速なアルゴリズムを開発する.グラフは様々な現実問題を表現する離散的なモデルとして優れたツールである.特に幾何的特徴を持つグラフは,地理情報やセンサーネットワークなどの幾何データをはじめ,様々な実問題のモデル化として現れるグラフで,盛んに研究が行われている.フロンティア法は特定の性質を満たすすべての部分グラフをコンパクトに表現するZDDと呼ばれるデータ構造を高速に構築し,ZDDに備わる演算体系を構築されたZDDに適用することで,多くの実問題が解かれてきた.本研究では,フロンティア法の拡張性を高めるための新たな技法を設計するとともに,その技法を適用した幾何的特徴を持つグラフに対する高速なアルゴリズムを開発する.
乳幼児早期マウスへの抗生剤投与の自然リンパ球への影響と喘息との関連

我々は乳児早期からの抗菌薬曝露が腸内細菌叢変化を介して粘膜免疫の変化を誘導し、特に自然リンパ球の変化が喘息の病態に関与する可能性について検討した。マウスに離乳直後から抗菌薬(アモキシシリン)を持続的に曝露することにより、腸内細菌叢の多様性が減少すること、離乳期の腸内細菌として優勢菌である乳酸菌とビフィズス菌が消失し、バクテロイデス属が最優勢菌となることがわかった。次にこのような腸内細菌叢構成の変化による腸管や肺での粘膜内免疫細胞プロファイルの変化を検討したところ、腸管においては粘膜内免疫細胞数の減少とILC2細胞数の減少を認めた。本研究の目的の1つは申請者がこれまで明らかにしてきた乳幼児早期の抗生剤投与による粘膜の変化の評価を消化管と肺で同時に行い、臓器間の関連性を検討することである。粘膜の評価方法としてはH&E染色などによる組織評価、組織由来のRNAを用いた遺伝子発現解析による評価、更に粘膜免疫に関しては自然リンパ球に焦点を当て、その構成変化での評価としている。平成27年度の予定としては、組織評価方法の確立、組織からのRNA抽出方法の確立、消化管および肺からリンパ球抽出方法の確立、そして抽出したリンパ球中の自然リンパ球の評価を確立することである。このうち、組織評価のプロトコル、および組織からのRNA抽出のプロトコル、消化管からのリンパ球抽出のプロトコルは確立し、粘膜リンパ球中の自然リンパ球を評価するためのフローサイトメトリー解析の方法も確立することが出来た。現在は肺からリンパ球抽出のプロトコルの確立を急いでいる。本研究の初年度の目標は研究を進めるうえで基盤となる実験プロトコルを確立することであり大変重要な部分であるが、その目標は大半は達成できたと考えている。しかし、当初の予定よりは若干の遅れている状況である。遺伝子発現解析に関しては当初qPCRによるターゲット遺伝子の発現解析を予定していたが、より簡便にマルチターゲットで解析できるnCounter systemの所属施設での導入申請を行い採択された。このことは今後の解析が簡便に行うことが可能になり、より迅速に研究を進められる体制作りが出来たと考えている。消化管からのリンパ球抽出に関しては申請者が以前使用していたコラゲナーゼが国内では手に入れることが難しく、新たなコラゲナーゼを用いたコラゲナーゼ処理時間を確立するまでに想定外の時間を要した。肺からの粘膜リンパ球の抽出の経験はなく、Changらの論文のメソッドを参考にしながらプロトコルの確立を目指しているが、抽出できるリンパ球数が少なくプロトコルを改良しながらプロトコルの確立を目指している状況である。粘膜評価の基盤となる実験のプロトコルの確立に予定より時間を要しているため現状はやや遅れている状況である。研究代表者はこれまで乳幼児早期の抗菌薬による腸内細菌の変化が粘膜免疫に影響することを明らかにしてきた。この粘膜免疫の変化が近年急増しているアレルギー性疾患の病態形成に関与する可能性を検討することが本研究の目的である。本研究では粘膜免疫細胞の中でも自然免疫に関与する自然リンパ球に着目して、アレルギーモデルマウスを用いて抗菌薬を投与する群としない群の2群で、消化管と肺でのILC2の相違を評価すること、肺の病理像の相違を評価することとしている。有意義なフェのタイプの違いを認めることができれば腸内細菌叢解析や消化管と肺で炎症をターゲットとした遺伝子群の遺伝子発現解析を行う予定である。平成27年度は組織評価、組織からのRNA抽出、消化管からのリンパ球抽出、抽出したリンパ球のフローサイトメトリー解析などのプロトコルを確立した。平成28年度は肺からのリンパ球抽出のプロトコルを確立した後、アレルギーモデルマウスを用いて消化管と肺での組織評価と両臓器から抽出したリンパ球を用いてフローサイトメトリー解析を施行した。さらに、このマウスを用いて抗菌薬投与群と非投与群の2群での組織評価とフローサイトメトリー解析を行っている。しかし、抗菌薬投与の実験では現在まで2群間で明らかな差を認められていないため現在再検討を進めている。また、2群間で明らかな差を認められていないため、プロバイオティクス/プレバイオティクスを用いた介入実験は検討できていない。アレルギーモデルマウスを用いた抗菌薬暴露の有無で2群間で当初予測していた差が得られていないため。その理由としてアレルギー誘導に使用している薬剤が参考文献と異なっており、その影響の可能性がある。プロトコルの再チェックをし変更可能な部分の修正しながら検討を繰り返す必要がある。