hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
X線応力測定法による動的現象下の応力その場観察

X線応力測定法は結晶格子のひずみから応力を算出する方法であり,得られる値は実応力である.しかし現在X線応力測定法はsin^2ψ法により行われており,複数のX線入射角での回折角を逐次測定している。従って動的負荷状況下での応力測定は全く行われていないのが現実である.本研究は動的負荷状況下の実応力のその場観察を実現することを目的とし,単一入射法というX線応力測定法と位置敏感型検出器の組み合わせにより問題点の解消を図った.単一入射法は一つのX線入射角で回折面法線法角ψが異なる2つの回折角を測定し応力を算出する方法であり,動的負荷状況下の実応力測定には最適な方法である.ただし,動的負荷状況下に適用するには2つの回折強度曲線を同時に計数する必要があり,2個の位置敏感検出器の使用と同時計数するための検出器接続法を開発することが最初の検討点であった.本研究では当初検出器としてX線域リニアイメージセンサを予定し,種々の検出器が装着可能な汎用X線応力測定装置を開発し検出器の特性も検討した.その結果,リニアイメ-キセンサでは同時計数するための方法が困難であり,位置検出型比例計数管PSPCを直列接続することで回折強度曲線の同時計数の問題点を解決した.次に動的X線応力測定を具現化する目的で,回転曲げ疲労試験中のX線応力測定を計画した.その第一段階としてまず単一入射法による応力測定装置を開発し,荷重計を装着した片持ち回転曲げ疲労試験機を用いて疲労繰返数増加に伴う最大負荷応力時の実応力変化の観察に成功した.その結果,き裂発生前の実応力は振幅に関係なく漸減し,またき裂発生後の実応力はき裂面での応力開放により大きく減少し破断に至るという新たな知見を得た.本研究の成果はX線応力測定の新たな適用分野の拡大を示唆し,今後の材料強度研究に大きく貢献するものと考える.X線応力測定法は結晶格子のひずみから応力を算出する方法であり,得られる値は実応力である.しかし現在X線応力測定法はsin^2ψ法により行われており,複数のX線入射角での回折角を逐次測定している。従って動的負荷状況下での応力測定は全く行われていないのが現実である.本研究は動的負荷状況下の実応力のその場観察を実現することを目的とし,単一入射法というX線応力測定法と位置敏感型検出器の組み合わせにより問題点の解消を図った.単一入射法は一つのX線入射角で回折面法線法角ψが異なる2つの回折角を測定し応力を算出する方法であり,動的負荷状況下の実応力測定には最適な方法である.ただし,動的負荷状況下に適用するには2つの回折強度曲線を同時に計数する必要があり,2個の位置敏感検出器の使用と同時計数するための検出器接続法を開発することが最初の検討点であった.本研究では当初検出器としてX線域リニアイメージセンサを予定し,種々の検出器が装着可能な汎用X線応力測定装置を開発し検出器の特性も検討した.その結果,リニアイメ-キセンサでは同時計数するための方法が困難であり,位置検出型比例計数管PSPCを直列接続することで回折強度曲線の同時計数の問題点を解決した.次に動的X線応力測定を具現化する目的で,回転曲げ疲労試験中のX線応力測定を計画した.その第一段階としてまず単一入射法による応力測定装置を開発し,荷重計を装着した片持ち回転曲げ疲労試験機を用いて疲労繰返数増加に伴う最大負荷応力時の実応力変化の観察に成功した.その結果,き裂発生前の実応力は振幅に関係なく漸減し,またき裂発生後の実応力はき裂面での応力開放により大きく減少し破断に至るという新たな知見を得た.本研究の成果はX線応力測定の新たな適用分野の拡大を示唆し,今後の材料強度研究に大きく貢献するものと考える.平成6年度の研究目標はX線リニアリメ-ジセンサをX線検出器としたX線応力測定装置のハード・ソフトウェアを含めた総合的製作および応力測定時間・測定精度などの基本性能の確認を行なうことであった.X線リニアイメージセンサを使用した応力測定装置を試作するにあたり,大きく分けて回折X線計測系の開発,X線回折装置への装着方法の検討およびソフトウェア作成(回折X線高速測定用プログラム,応力算出用プログラム)の作業が必要で,それぞれ同時遂行して行った.まず回折X線計測系の開発に関しては過去にX線域リニアイメージセンサがX線応力測定用として使用された例がなく,リニアイメージセンサによるX線測定用信号処理装置を試作した.また応力測定に使用する特性X線波長域でのリニアイメージセンサの適性を調べる目的で位置分解能,X線計数率について検討した.次にX線回折装置への装着方法に関しては、当初は本年度中にX線イメージセンサを単一入射法X線応力測定装置に装着する予定であった.しかしX線イメージセンサを直列接続する方法が困難であった.そこでイメージセンサの応力測定への適用性という点に注目し,X線イメージセンサを大型X線装置に装着して応力測定精度・測定時間などの基本的測定性能について実験を遂行した.その結果応力測定用のX線検出器としても充分使用できることが明らかとなった.また得られた結果を基に測定時間の改善方法を検討した.

平成7年度は本研究の最終年度であり,平成6年度に製作したX線用信号処理装置とX線応力装置を用いて変動負荷状況下での実働応力時系列測定および本システムの動的使用時の性能評価を行ない研究成果の取りまとめとして報告書を作成することが主要な計画であった.高速応力測定を実現するには単一入射法およびイメージセンサの直列接続法および信号処理方法の技術確立が重要であり,本年度の計画ではX線イメージセンサを単一入射法X線イメージセンサの直列接続方法には困難さを伴い,またX線検出の動的特性がさほど良好でないことが明らかとなり,当初の計画を若干変更して研究を遂行した.具体的には,動的X線応力測定に検出器の直列接続が有効であるかどうかという観点からPSPCを直列接続して回転曲げ疲労試験中のX線応力測定を行った.単一入射法応力測定装置はPSPCおよびX線イメージセンサー両方に対応可能なように新たに設計した.そして荷重計を装着した片持ち回転曲げ疲労試験機を用いて疲労繰返数増加に伴う最大負荷応力時の実応力変化の観察に成功し,実応力は応力振幅に関係なく漸減するという新たな知見を得た.またき裂発生後の実応力はき裂面での応力開放により大きく減少し破断に至ることが明らかとなった.さらにこのような高速の応力測定には検出器の直列接続法が極めて有効であることが確認できた.現在市販されているX線イメージセンサーの直列接続方法が解決されさらに動的な検出応答が改善されれば,その際検出器の直列接続と単一入射法の組み合わせが高速応力測定に有効であり,X線応力測定の新たな適用分野の拡大となり,今後の材料強度研究に大きく貢献するものと考える.
地震波干渉法による強震動記録を用いた大深度地盤構造の推定

強震動記録を利用した大深度地盤構造の探査に関わる研究を実施した.具体的には,基礎研究として,地震波伝播に関して,2次元散乱媒質中におけるP波及びS波の伝播の研究,S波減衰とリソスフェアの短波長不均質性に関する研究,非定常射線分解法に関する研究を行った.また,これらの研究成果を踏まえて,地震波干渉法による強震動記録の解析から大深度の地盤応答関数が安定して評価できることを実証し,大規模に堆積層が発達した関東平野において大深度地盤構造を推定した.強震動記録を利用した大深度地盤構造の探査に関わる研究を実施した.具体的には,基礎研究として,地震波伝播に関して,2次元散乱媒質中におけるP波及びS波の伝播の研究,S波減衰とリソスフェアの短波長不均質性に関する研究,非定常射線分解法に関する研究を行った.また,これらの研究成果を踏まえて,地震波干渉法による強震動記録の解析から大深度の地盤応答関数が安定して評価できることを実証し,大規模に堆積層が発達した関東平野において大深度地盤構造を推定した.本年度(研究初年度)は、解析手法としての地震波干渉法の数理的な原理を明確にするとともに、従来の物理探査やボーリング調査などで得られた関東平野の地盤構造に関する情報の集積や、首都圏強震動総合ネットワーク(SK-net)で収録されているSN比の良い強震動波形の抽出など、主にデータベースの構築に関わる研究をすすめた。具体的には、主に、下記の研究を実施した。・関東平野などの沖積層が発達した平野部における強震動を想定して、水平成層構造上に位置する観測点に下方から入射する平面SH波の(地表記録の)自己相関関数と水平成層構造のレスポンスとの関係を調べた。・地震基盤に入射するSH波形は、リソスフェア構造の不均質性に起因する散乱によってその形状が著しく変化することから、Multiple Lapse Time Window法(多重等方散乱モデルを仮定する)に基づいて、関東地方のリソスフェアにおけるS波の散乱減衰と内部減衰の大きさを周波数依存性も含めて測定した。・SK-netで記録された強震動波形から、地震波干渉法で解析するSN比の良いイベント波形を選んでデータベース化した。・SN比の良い強震動波形を集積し、観測点ごとに直達S波(SH成分)の自己相関関数を求めて重合処理することでレスポンス関数を評価した。その結果、関東平野における多数の観測点のレスポンス関数から、地震基盤からの反射波の位相を検出できることが確認された。・上記の位相の発現時間が、既往の研究・調査(反射法地震探査や屈折法地震探査など)から推定されている地震基盤の深さから予測される値と概ね整合することが確かめられた。・高感度・広帯域の微動観測用サーボ型速度計による三成分連続微動収録システムを製作した。また、同システムを用いて広帯域連続微動データを収録した。研究の2年目にあたる本年度においては、主に、地震波干渉法の基礎理論にもとづいて、関東平野に展開されている首都圏強震動総合ネットワーク(SK-net)や新たに構築されつつある首都圏地震観測網(MeSO-net)で得られた地震波形記録を解析し、各観測点における地盤のレスポンス関数を評価した。個別の研究とそれらの成果について以下にまとめる。・Multiple Lapse Time Window法にもとづいて、深層地震観測井で記録された近地地震の波形を解析し、関東地方のリソスフェアにおけるS波の散乱減衰と内部減衰の大きさを周波数依存性まで含めて測定した。S波の見かけ減衰についても、従来の測定値と比較して、その周波数依存性の確度を高めるとともに、減衰の物理的なメカニズムについて検討した。その結果、約10Hz以上では、自己相似的な不均質性による地震波の散乱がS波の見かけ減衰に寄与していることが明らかになった。・関東地方で発生する地震を対象として、地殻及び最上部マントルにおける地震波の減衰効果を周波数依存性まで考慮して、地震基盤への入力S波のモデル化を試みた。このモデルを使用して、地震波干渉法におけるレスポンス関数の時間分解能に関する指標を与えた。・深層地震観測井やその周辺で得られた強震動波形記録を解析して、地震波干渉法を強震動波形に適用する際の適切な解析時間長の取り方や解析周波数の設定方法を評価した。・地震波干渉法をSK-net及びMeSO-netで得られた地震波形記録に適用して、各観測点における地盤のレスポンス関数を求めるとともに、その地域変化を明らかにした。その結果、地震基盤面からのS波反射波の往復走時が7秒を超える地域があることが明らかになった。このことから、場所によっては地震基盤の深度が4kmを超えることが明らかになった。研究の最終年度にあたる本年度においては、主に、関東平野に展開されている首都圏強震動総合ネットワーク(SK-net)や新たに構築されつつある首都圏地震観測網(MeSO-net)などで得られた波形データを地震波干渉法にもとづいて解析し、関東平野の大深度地盤構造を推定した。この他の研究も含めて、今年度の主な研究成果について以下にまとめる。・地震波干渉法の利用にあたって表面波の寄与について考察するため、2次元等方散乱媒質を仮定して、点震源から等方的に輻射されたP波及びS波のエネルギーの時空間分布をエネルギー輻射伝達理論にもとづいて定式化した。この定式化により、多重散乱の効果を厳密に考慮して、異なるモードの地震波のエネルギー平衡状態への遷移過程をより簡便に評価できるようになった。

・地震波干渉法をSK-net及びMeSO-netなどで得られた地震波形データに適用して、隣接した観測点における地盤の応答関数を同時に求めることにより、関東平野内の複数の測線について疑似反射断面を合成することに成功した。このことで、反射法地震探査が実施されていない地域においても、大深度地盤構造を水平空間分解能23km程度で正確に把握できるようになった。・関東平野内の750地点において地盤構造を推定した。地震基盤の深度は、場所によっては4kmを超えるなど、地域によって大きく変化することが明らかになった。この結果は、従来の研究報告と大局的には整合するものであったが、東京都の中央部からほぼ北方向に連続する地震基盤の陥没など、水平方向に十km程度のスケールで堆積層及び地震基盤の構造が局所的に変化する様子がより明瞭に確認された。
環境に対する光合成膜形成の適応的調節の分子機構

酸素発生を伴う光合成では、2つの光化学反応系、PS I、PS II、によって駆動される電子伝達反応により光エネルギーが生化学エネルギー、ATP、NADPH、に変換される。従って、PS IとPS IIがバランス良く活動する事がエネルギー変換効率を高いレベルで維持する上に欠く事が出来ない。このバランスを保つ調節機構として、PS I、PS IIたん白複合体の量比の調節が存在する事を、我々はラン藻について見出し、電子伝達系の末端のPSIの量が合成制御を通じて調節される事を明らかにして来た。一方、カリホルニア大学のMelis教授らは、同じ調節現象を高等植物について見出し、研究している。この調節現象は、従来知られていない新しい現象であるので、酸素発生を伴う光合成一般の調節機構を意味するのか疑問であった。そこで、2つのグループが共同して、ラン藻と高等植物とは異なる系統門に属する緑藻クラミドモナスについて、この種の調節の有無、また、ラン藻での機構との異同を解析するべく、本研究を計画した。このPS I量の変動と共に、LHC II量の変化も起こった。PS II光生育細胞でLHC II/PS II比が高く、PS I光生育細胞で、その1/2程度まで減少した。これは、同じタイプのLHC IIを持つ高等植物では認められなかった現象である。LHC Iについても調べた所、同様に減少していた。高等植物で、Chl a合成を抑制すると、LHC IIとPS I合成が選択的に抑制される事が判っており、PS I光下ではPchlide光還元が起こらず、Chl aの合成が抑制される可能性があるので、このためにPS I/PS II比が変化したとも考えられる。しかし、Pchilde光還元を誘記する青色光下でもPS I量は減少する事、また、この時LHC量は増加する事からPS I/PS II比の変化はChl a合成抑制とは関係ないと結論された。PS II光からPS I光への光シフト時のPS I、PS II、LHC II量の変化を追跡した所、PS Iは増加が停止あるいは減少したが、LHC IIは遅いながら増加を続けた。この事実もPS I光下での,PD I量の減少とLHC量の減少は異なった仕組みで起こる事を示す。しかし、Pchlide含量は、PS I光生育細胞で有意に高いので、Pchlide明還元がPS I光下で抑制されているのも事実で、LHC量の減少の原因と考えられる。PS I、PS II光生育細胞について、それぞれの生育光へのPS I/PS II比順応前後の光合成収率を調べて見た。PS I/PS II比が順応すると、順応前の1.51.7倍まで収率が向上される事が判った。従って、この場合のPS I/PS II比の変化も光合成効率の維持に寄与していると結論された。以上のように、緑藻Chlamydomonas reinhardtiiにおいても、ラン藻の場合と同様に、PS I量の調節により、PS I/PS II比が調節され、光合成収率を維持している事が本研究を通じて明らかにされた。この結果は、高等植物からラン藻までの言わゆる緑色植物系統の光合成の一般的な調節現象として、PS I/PS II変化が起こるものである事を強く示唆する。15EA06:しかし、PS I励起偏重光はPchlide光還元に不活性である。従って、Pchlide暗還元能を欠く高等植物でのPS I/PS II比調節の解析では、この点を充分再検討する必要がある事を本研究の結果は示している。

PS II光からPS I光への光シフト時のPS I、PS II、LHC II量の変化を追跡した所、PS Iは増加が停止あるいは減少したが、LHC IIは遅いながら増加を続けた。この事実もPS I光下での,PD I量の減少とLHC量の減少は異なった仕組みで起こる事を示す。しかし、Pchlide含量は、PS I光生育細胞で有意に高いので、Pchlide明還元がPS I光下で抑制されているのも事実で、LHC量の減少の原因と考えられる。PS I、PS II光生育細胞について、それぞれの生育光へのPS I/PS II比順応前後の光合成収率を調べて見た。PS I/PS II比が順応すると、順応前の1.51.7倍まで収率が向上される事が判った。従って、この場合のPS I/PS II比の変化も光合成効率の維持に寄与していると結論された。以上のように、緑藻Chlamydomonas reinhardtiiにおいても、ラン藻の場合と同様に、PS I量の調節により、PS I/PS II比が調節され、光合成収率を維持している事が本研究を通じて明らかにされた。この結果は、高等植物からラン藻までの言わゆる緑色植物系統の光合成の一般的な調節現象として、PS I/PS II変化が起こるものである事を強く示唆する。15EA06:しかし、PS I励起偏重光はPchlide光還元に不活性である。従って、Pchlide暗還元能を欠く高等植物でのPS I/PS II比調節の解析では、この点を充分再検討する必要がある事を本研究の結果は示している。真核植物の葉緑体に、原核生物であるラン藻のチラコイド系でのPSIの環境に対応した合成制御と同一の制御機構が存在するかについてChlamydomonasとDunaliellaを用いて検討する事を計画した。平成5年1月25日より2週間カリフォルニア州立大学のメリス教授が来日して基生研で予備的に実験培養系の検討とPSI、PSII、チトクロムの定量法の検討を行った。Chlamydomonasについて、クロロフィルb励起光(PSII光)とクロロフィルa励起光(PSI光)の調整をそれぞれ蛍灯光とタングステン光とを光源として行い、両者がほぼ同一の増殖を示す光強度の調節を行った。弱いPSI、PSII光下で生育した細胞について、その光化学系IとIIの量比の測定、それぞれの光条件下での光合成効率のおおまかな測定をも行った。その結果、長波長型クロロフィルaを励起する暗赤色光下でPSI/PSII比が著しく低下することがわかり、更に光合成効率もそれぞれ生育光下で高い値をとることがわかった。従って、真核藻類でもラン藻型調節が起こることが確認できたといえる。しかし、暗赤色光下で生育した細胞は著しくクロロフィル濃度が低下することが観察され、フィトクロムによるクロロフィル合成の調節が関与している可能性が考えられた。この点を更に検討する必要がある。実験培養系が確立できたので、本格的培養装置の組立を行い、本格的実験をとりあえずChlamydomonasについて行うことを計画している。高等植物の営む光合成のモデルとして、緑藻クラミドモナスの光合成系での光合成光環境に対応したチラコイド系の適応的変化の様相の把握につとめた。えられた結果をすでにその様態が判明しているラン藻の場合との対比も行った。
膵ランゲルハンス島(膵島)移植における持続冷却潅流装置の臨床応用に向けた研究

1型糖尿病に対する膵島移植が国内で始まったものの、依然として大きな問題はドナー不足である。その解決手段のひとつは、マージナルドナーから提供された膵臓の有効な利用である。そこで、マージナルドナーからの採取膵を携帯型持続冷却灌流装置(LifePort)にて保存することにより、分離膵島の収量を上げ、膵島機能を保持させ、I型糖尿病に対する膵島移植を普及させることが期待できる。ビーグル犬を用いた実験により、分離膵島の収量・機能とも、従来法(UW法や二層法による単純冷却浸漬保存)より優れていることが明らかとなった。さらなる保存条件の改善や工夫が必要ではあるが、近い将来の臨床応用が期待できると考えられた。本研究は、改正脳死移植法の施行による脳死膵臓移植の増加に伴い、増加が予想される心停止ドナー、いわゆるマージナルドナーよりの膵ランゲルハンス島(膵島)移植を想定して、LifePort(LP)による新たな持続冷却潅流保存法の有効性を評価し、現在膵臓保存法として広く行われている二層法と比較検討し、これを膵島移植に臨床応用し、より安全で効果的な膵島移植を実現することを目的としたものである。本研究の初年度にあたる平成26年度は実験モデルの作成や試薬・実験機器の準備に重点をおいた。まず、障害膵の作成モデルとして、ビーグル犬に30分の温阻血時間を加えた後、全膵摘出するイヌ膵移植モデルを採用した。実験デザインは、LPを用い24時間灌流保存したものをLP群、摘出膵を二層法にて24時間単純冷却保存したものを二層法群とし、二群間の比較対照実験とした。LPの灌流条件は、灌流液として細胞外液組成であるKPS-1液を使用し、灌流圧は10mmHg、灌流温度は4°C、灌流時間は24時間と設定した。また、二層法群の保存条件は、二層法を用いた4°C・24時間単純浸漬保存とした。以上、今年度は、温阻血時間、還流量、灌流圧、保存温度などの実験デザインの設定や試薬・実験機器等の準備についてほぼ完了した。次年度からは実際に設定された条件で障害膵臓の保存を行い、二群間における膵島の分離状態・分離効率(収量評価)と分離膵島の機能評価(内分泌機能評価、病理学的解析)を行い、LPを用いた新たな持続冷却灌流保存法の有効性の有無を確かめてゆく予定である。本研究は、改正脳死移植法の施行による脳死膵臓移植の増加に伴い、増加が予想される心停止ドナー、マージナルドナーよりの膵ランゲルハンス島(膵島)移植を想定して、LifePort&#8482;(LP)による新たな持続冷却潅流保存法の有効性を評価し、現在膵臓保存法として広く用いられている二層法と比較検討し、これを膵島移植に臨床応用し、より安全で効果的な膵島移植を実現することを目的としたものである。本研究の二年目にあたる平成27年度は初年度に作成した実験モデルに従って実際の動物実験に重点をおいた。ビーグル犬に30分の温阻血時間を加えた後、全膵臓を摘出し、LPを用い24時間持続冷却灌流保存したものをLP群、摘出膵を二層法にて24時間単純冷却保存したものを二層法群とし、二群間の比較対照実験を行った。LP群の灌流条件は、潅流液として細胞外液組成であるET-K液を使用し、潅流圧は10mmHg、灌流温度は4°C、灌流時間は24時間と設定した。また、二層法群の保存条件は、二層法を用いた4°C・24時間単純冷却浸漬保存とした。現在までLP群5例と二層法群5例の動物実験を行った。それぞれの保存膵から膵島を分離・純化し、分離膵島の収量や機能評価(内分泌能評価、病理学的解析)を行った。次年度は、分離膵島の実際の内分泌機能評価(実際に移植したときの機能の評価)等の補足実験とデータの解析を行い、LPを用いた新たな持続冷却灌流保存法の有効性についてまとめる予定である。平成27年度の研究計画の主なものは、実験モデルに沿った動物実験によるデータの収集である。温阻血膵の摘出と実験群の作成である。LifePortにより持続冷却灌流保存された膵臓と二層法により単純冷却保存された膵臓から、膵島を分離し、収量やインスリン分泌能などのデータを収集した。しかし、実際に分離した膵島を移植した場合のデータの収集がまだであり、以上の理由より、研究の進行がやや遅れていると判断した。本研究は、改正脳死移植法の施行による脳死膵臓移植の増加に伴い、増加が予想される心停止ドナー、マージナルドナーよりの膵ランゲルハンス島(膵島)移植を想定して、LifePort(LP)による新たな持続冷却潅流保存法の有効性を評価し、現在膵臓保存法として広く用いられている二層法と比較検討し、これを膵島移植に臨床応用し、より安全で効果的な膵島移植を実現することを目的としたものである。本研究の初年度はビーグル犬を使用した実験モデルの作成を行い、2年目は実験モデルに従って実際に動物実験を行った。ビーグル犬に30分の温阻血時間を加えた後、全膵臓を摘出し、LifePortを用い24時間持続冷却灌流保存したものをLP群、摘出膵を二層法にて24時間単純冷却保存したものを二層法群とし、二群間の比較対照実験を行った。

それぞれ5例の動物実験を行い、3年目となる昨年度に、データの収集と解析を行った。LP群において、分離膵島の収量(総量、膵臓重量あたりの収量)、分離膵島のインスリン分泌能(stimulation index)、分離膵島の形態(Dithizone染色による形態と膵島のsize)等の結果において、有意差はなかったが二層法群に比べて良好な結果となった。また、分離膵島の自家移植において二群間に有意差はなかった。以上の結果より、膵島移植において、LifePortによる持続冷却灌流保存の有効性が示された。最終年度となる今年度は、国際学会において最終的な研究発表と論文作成に使用し、研究を終了する予定である。動物実験、データ収集、データ解析等は、ほぼ終了しているが、最終的な国際学会での発表、論文作成が終了していない。以上の理由より、研究の進行がやや遅れていると判断した。本研究は、改正脳死移植法の施行による脳死膵臓移植の増加に伴い、増加が予想される心停止ドナー、マージナルドナーよりの膵ランゲルハンス島(膵島)移植を想定して、LifePort(LP)による新たな持続冷却潅流保存法の有効性を評価し、現在膵臓保存法として広く用いられている二層法と比較検討し、これを膵島移植に臨床応用し、より安全で効果的な膵島移植を実現することを目的としたものである。本研究の初年度はビーグル犬を使用した実験モデルの作成を行い、2年目は実験モデルに従って実際に動物実験を行った。ビーグル犬に30分の温阻血時間を加えた後、全膵臓を摘出し、LPを用い24時間持続冷却灌流保存したものをLP群、摘出膵を二層法にて24時間単純冷却保存したものを二層法群とし、二群間の比較対照実験を行った。以上の結果より、膵島移植において、LPによる持続冷却灌流保存の有効性が示された。1型糖尿病に対する膵島移植が国内で始まったものの、依然として大きな問題はドナー不足である。その解決手段のひとつは、マージナルドナーから提供された膵臓の有効な利用である。そこで、マージナルドナーからの採取膵を携帯型持続冷却灌流装置(LifePort)にて保存することにより、分離膵島の収量を上げ、膵島機能を保持させ、I型糖尿病に対する膵島移植を普及させることが期待できる。ビーグル犬を用いた実験により、分離膵島の収量・機能とも、従来法(UW法や二層法による単純冷却浸漬保存)より優れていることが明らかとなった。さらなる保存条件の改善や工夫が必要ではあるが、近い将来の臨床応用が期待できると考えられた。平成26年度の研究計画の主なものは、実験モデルの作成と試薬・機器の準備である。実験モデルのプロトコールは作成され、温阻血障害膵の摘出はできる状態であり、LifePortによる灌流保存、2層法による浸漬保存の準備も完了している。まだ、ビーグル犬を使った実験は始まっていないが、現在すぐに始めることができる状態にある。実際に分離膵島を移植した実験を残しているが、今年度中に実験を終了し、データの解析を行い、研究をまとめることは可能であると考えます。今年6月に開催される国際膵・膵島移植研究会での研究発表とその後の論文作成を行い、本研究を終了したいと思います。移植外科実験モデルのプロトコール作成と試薬・機器の準備はほぼ完了している状態である。
分泌小胞膜ー形質膜融合の分子機構

ERで合成された蛋白質の特定の膜コンパ-トメントへの選別輸送はいくつかの膜融合過程より成立している。その最終目的地が形質膜である場合、膜融合ステップはエキソサイトシスの形で終了する。この最終ステップである「分泌小胞膜ー形質融合」の分子機構を明かにすることが本研究の最終目的である。最近、小胞膜輸送のいくつかのステップが無細胞in vitro系に再機成され、それらの分子機構の多くが明らかにされた。とくにオルガネラ間小胞膜輸送における低分子量GTP結合蛋白質(G蛋白)とNEM感受性蛋白因子(NSF)の関与の解明は特筆に値する。しかし、このNSFの「小胞膜ー形質膜融合」への投割は未だ不明のままであり、G蛋白のそれもyest系ではかなり明らかにされたが、哺乳動物細胞系では未だ不明である。また、分泌過程での蛋白キナ-ゼの関与が示唆されてきたが、「小胞膜ー形質膜融合」ステップでの役割の直接的検討は未だなされていない。そこで本研究では哺乳動物細胞エキソサイトシスへの蛋白キナ-ゼ、G蛋白、NSFなどの関与の可能性を検討した。本年度は、モルモット胃より酵素的に単離した壁細胞(胃酸分泌細胞)にパッチクランプ膜容量測定法を適用して、形質膜とサイトソルをほぼ正常な状況においたままで膜容量増加を指標に「小胞膜ー形質膜隔合」過程をモニタ-した。その結果、ヒスタミンを投与してH,Kーpump ATPaseを小胞膜から管腔側膜へと転座(insertion)させたときに膜容量の増大が観察できることを世界ではじめて示した。このエキソサイトシスは細胞内Ca^<2+>に強い依存性を示すこと、ヒスタミンの効果はdibutyryl cyclic AMPでもミミックできること、また細胞内へNEMを投与したときには強く抑制されることを明かにした。また、サイクリックAMP依存性蛋白キナ-ゼ阻害剤によってこのヒスタミンに対する「小胞膜ー形質膜隔合」反応は阻止されることが明らかとなった。
超分子リボザイムの機能発現の研究

2分子からなるリボザイムの構成要素の解析をすすめている。テトラヒメナに存在するリボザイムをもとに作成した、2分子から構成されるスプライシングシステムは、イントロンに分子内に存在するP5abcとよばれる小さな機能構造単位を単独に合成し、これをイントロンRNAのP5abcが欠落した本体に、高次の分子間相互作用させることによりその機能を強く発現する。このシステムを構成する要素について解析を行ってきた結果を参考に、P5abcが本体であるΔP5abc intronとの相互作用を通じて、スプライシング機能の活性化に重要な役割を果たす構造単位の同定をおこなった。P5abcの突然変異体を各種作成し、これらを分子内すなわちΔP5abc intronに組み込んだもの、また上記2分子システムを用いてそれぞれの機能発現の促進効果をみた。その結果、P5abcの2次構造を特徴づける3箇所のループ構造は、すべて機能発現の促進に有用であり、またその中でA-rich bulgeとよばれるものが最も重要であることが明らかとなった。これによりA-rich bulgeとΔP5abc intronの相互作用が、超分子システムとして機能発現をするための鍵であると結論できる。そこでA-rich bulgeを構成する塩基配列とΔP5abc intronの活性化の能力との関係をin vitroselection法を応用したin vivoでのselection法により解析を行った。その結果A186残基を中心に特定の位置でのプリン残基の存在がP5abcの活性の発現には必要であることが明らかとなった。またこの時点で独立に研究を進めている米国コロラド大のグループによるP5abcを含むイントロンRNAの部分構造のX線構造解析の結果が報告されたため、これらの結果を照合したところ塩基配列,構造,機能間の相互関係があきらかとなった。
インスリンシグナル活性化作用を持つ香辛料成分の探索とその抗糖尿病効果の検証

本研究の目的は、インスリンシグナルを活性化する香辛料成分を探索・同定し、その抗糖尿病作用を評価することである。本研究では、インスリンシグナルを負に制御しているprotein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B)の阻害剤を探索し、アブラナ科植物由来のイソチオシアネート類が強い阻害活性を持つことを見出した。また、phenethyl isothiocyanate (PEITC)が培養筋管細胞内のPTP1B活性を顕著に阻害することでインスリン非依存的にインスリンシグナルを活性化し、抗糖尿病作用を発揮することを明らかにした。本研究の目的は、インスリンシグナルを活性化する香辛料成分を探索・同定し、その抗糖尿病作用を培養細胞および動物実験レベルで実証することである。また、分子レベルでそのメカニズムを解明することで科学的根拠に基づいた機能性食品の創出を目指している。平成25年度は、糖尿病治療薬の新しいターゲットとして注目されているプロテインチロシンホスファターゼ1B(PTP1B)阻害剤のスクリーニングを実施し、サフランやアブラナ科香辛料抽出物に強い阻害成分が含有されることを明らかにした。また、阻害成分の単離・同定を試み、サフランの主香気成分であるサフラナール、アブラナ科香辛料の辛み成分であるイソチオシアネート類を同定した。さらにマウス由来筋芽細胞株C2C12細胞をインスリンの標的細胞である筋管細胞へと分化させ、phenethyl isothiocyanate (PEITC)、benzyl isothiocyanate (BITC)、phenyl isothiocyanate (PITC)およびallylisothiocyanate (AITC)を処理することによってインスリン受容体、およびその下流のシグナル分子(IRS-1、およびAkt)がインスリン非依存的にリン酸化(活性化)することをウェスタンブロットによって明らかにした。イソチオシアネート類によるPTP1B阻害機構を検討したところイソチオシアネート類は、求電子剤としてPTP1Bの活性中心であるシステイン残基の反応生チオールに共有結合し、阻害する分子機構が示唆された。現在、より詳細な阻害機構を質量分析等により行っている。平成26年度は、マウス由来筋芽細胞株C2C12細胞をインスリンの標的細胞である筋管細胞へと分化させ、平成25年度にPTP1B阻害剤として同定したphenethyl isothiocyanate (PEITC)、benzyl isothiocyanate (BITC)、phenyl isothiocyanate (PITC)およびallylisothiocyanate (AITC)を処理することによって抗糖尿病効果を検証した。その結果、PEITCが顕著にインスリン受容体、およびその下流のシグナル分子(IRS-1、およびAkt)をインスリン非依存的にリン酸化(活性化)することが明らかになった。また、PEITCは、濃度依存的に細胞内PTP1Bを阻害した。さらに、グルコース輸送体(Glut4)を介した細胞のグルコース取り込み能を評価した結果、PEITC処理した細胞では、濃度依存的にGlut4が細胞膜へ移行していることがウェスタンブロット法によって観察された。また、グルコースの蛍光誘導体(2-NBD-Glc)を用いて細胞内グルコース濃度の評価を行ったところ、PEITCは、濃度依存的に2-NBD-Glcの細胞内濃度を増大させることが判明した。平成27年度は、マウス由来筋芽細胞株C2C12細胞をインスリンの標的細胞である筋管細胞へと分化させ、平成25年度にPTP1B阻害剤として同定したアブラナ科植物由来のphenethylisothiocyanate (PEITC)、benzylisothiocyanate (BITC)、phenylisothiocyanate (PITC)およびallylisothiocyanate (AITC)を処理することによって抗糖尿病効果を検証した。その結果、PEITCが細胞内のPTP1Bのシステイン残基の反応性チオール基に結合することによって酵素活性を顕著に阻害し、インスリン非依存的にインスリンシグナルを活性化する分子機序を解明した。PTP1Bは、飽食シグナルであるレプチンシグナルの負の制御因子としても機能していることから、ヒト由来の培養SH-SY5Y神経様細胞を使用してPEITCの効果の検証を行った。その結果、PEITCは、同様にPTP1B活性を阻害し、レプチンシグナル分子であるJanus Activating Kinase 2(JAK2)をレプチン非依存的にリン酸化することを新たに見出した。平成26年度に計画していた実施項目

(3)培養筋肉細胞を使用した香辛料成分の抗糖尿病作用の評価をほぼ予定通りに実行できたため。食品機能化学平成25年度に同定した香辛料由来のPTP1B阻害剤の作用機構をより詳細に検討するとともに、その抗糖尿病作用を動物レベルで実証することを目標とする。2型糖尿病態モデルKK-Ayマウスに香辛料成分を摂餌させて糖尿病マーカー(血糖、糖化ヘモグロビン量、インスリン、トリグリセリド等)を測定する。さらに、経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)、およびインスリン負荷試験(ITT)における血糖値の変化を測定し、抗糖尿病効果を検証する。平成25年度に計画していた実施項目(1)PTP1Bを阻害しインスリンシグナルを活性化する香辛料成分の単離・同定(2)香辛料成分のPTP1B阻害機構の解析をほぼ予定通りに実行できたため。平成25年度に同定した香辛料由来のPTP1B阻害剤の作用機構をより詳細に検討するとともに、その抗糖尿病作用を培養細胞レベルで実証することを目標とする。(1)イソチオシアネート類などの香辛料成分によるPTP1B阻害様式の詳細な解析を行うとともに、活性中心のシステイン残基の修飾構造をnano-LC/MS/MSを使用して解析する。また、修飾構造に対する抗体の作製などを検討して細胞内における修飾を明らかにする。(2)同定した香辛料成分を添加した培地中で培養筋管細胞を培養し、グルコース輸送体(Glut4)の細胞膜への移行をウェスタンブロット、および蛍光免疫染色法により解析する。また、細胞のグルコース取り込み能の増大をグルコースの蛍光誘導体(2-NBD-Glc)および2-デオキシグルコースを用いて評価する。2-NBD-Glcの細胞内濃度は、蛍光プレートリーダーを使用して、また、2-デオキシグルコースは、酵素法による比色定量によって解析する。さらに、パルミチン酸処理などによってインスリン抵抗性を惹起した培養筋管細胞を使用してPTP1B阻害成分の2型糖尿病改善作用を検証する。
微粉炭の物理的および化学的構造に基づく混相乱流素反応モデリング

非球形単一粒子の6自由度解析データから非球形粒子の運動モデルを開発するとともに,運動モデルを用いた混相乱流場の直接数値計算を実施し,粒子の乱流中分散挙動に対する粒子形状の影響を明らかにした.また,同様の6自由度単一粒子の着火挙動について直接数値計算を実施し,粒子周囲に広がる揮発分に着火し燃え広がる過程において予混合火炎から拡散火炎と遷移する様子を明らかにした.さらに,非球形粒子運動モデルを用いるラージ・エディ・シミュレーション(LES)を同軸噴流における球形および非球形粒子の分散挙動を計測した実験を対象に実施し,実験と定性的な一致を見るとともに,粒子ストークス数に依存して特徴的な環状構造が形成されることを明らかにした.石炭の熱分解時に放出される揮発分の二次気相分解について,詳細化学反応機構を用いた素反応解析による感度解析により主要な化学種や反応経路を抽出することで,数値解析に適用可能な簡略化反応機構を構築した.また,揮発分に含まれる窒素化合物の分解挙動について,化学形態分析に基づいて定義されたピリジン,ピロール,および4級アミンが気流中でアンモニアやシアンを経由しNOxに転換される反応を,詳細化学反応機構を用いる素反応解析によって明らかにするとともに,主要な化学種や反応経路を抽出することで,数値解析に適用可能な総括反応機構の構築を行った.小型噴流微粉炭火炎を対象に簡略化反応機構を用いたLESを実施し,実験との比較によりその有効性を確認するとともに,火炎構造の詳細を明らかにした.非球形粒子の振動・回転運動を粒子形状バラメータに応じた確率密度関数による非定常抗力式として,粒子の運動方程式を定式化した.また,これを質点近似による一様等方性乱流場における乱流中粒子分散挙動の直接数値計算を実施し,この非定常抗力式により考慮される粒子形状効果の有無が,粒子の分散挙動に影響を及ぼすことを明らかにした.さらに,この結果を踏まえ,乱流噴流における粒子分散挙動について,真球ポリマー粒子と微粉炭粒子を用いたPIV計測実験を行うとともに,ラージ・エディ・シミュレーションを実施した.その結果,粒子形状や粒径分布により,乱流噴流中の粒子分散挙動が影響を受けることを実験的に明らかにするとともに,数値解析によりこの挙動を再現することに成功した.報告者らが開発した石炭の化学構造に基づく熱分解モデル「拡張Chemical Percoaltion Devolatilization(E-CPD)モデル」を数値解析コードに導入するとともに,多環芳香族炭化水素(PAH)の分解・重合反応を考慮可能な素反応式に基づく化学反応機構,およびすす生成モデルとのカップリングを図り,タール放出から重合・分解反応に至る一連の微粉炭粒子の初期反応についての数値モデルを開発した.また,石炭中窒素化合物の熱分解特性を解明するとともに,数値モデル検証データを取得することを目的に,Drop Tube Rector(DTR)を用いた熱分解実験を瀝青炭,亜瀝青炭,および粘結炭の3炭種を対象に実施し,炭種毎に熱分解過程において窒素化合物の放出割合はCHO化学種放出割合と異なること,しかしながら,熱分解完了時点においては,CHO化学種放出割合とほぼ等しくなること等が明らかとなった.平成28年度の当初計画通り,非球形粒子の6自由度直接数値計算データベースから導かれた確率密度関数に基づく非定常抗力式を提案するとともに,質点近似による一様等方性乱流場および乱流噴流場における粒子分散の数値解析を実施した.また,タール放出から重合・分解反応に至る一連の微粉炭粒子の初期反応についての数値モデルを開発した.さらに,Drop Tube Rector(DTR)を用いた熱分解実験を瀝青炭,亜瀝青炭,および粘結炭の3炭種を対象に実施し,窒素化合物の放出挙動について明らかにした.上述の成果により,おおむね計画通りに進展しているものと考えられる.報告者らが開発した石炭の化学構造に基づく熱分解モデル「拡張Chemical Percoaltion Devolatilization(CPD)モデル」によって計算される非球形単一粒子からの揮発分放出,粒子の周囲に形成される揮発ガスと周囲の酸化剤との予混合気形成とそれに続く着火,ならびに予混合燃焼から拡散燃焼へと移行する燃焼形態の変化の様子について,直接数値計算によりその詳細を明らかにするとともに,実験の着火状況との良い一致を見ることを確認した.非球形粒子の振動・回転運動を粒子形状バラメータに応じた確率密度関数による非定常抗力式として定式化した粒子の運動方程式を用いた,質点近似による一様等方性乱流場における乱流中粒子分散挙動の直接数値計算に着手し,粒子形状効果の有無が,粒子の分散挙動に影響を及ぼし,さらには着火・燃え広がり挙動に影響を及ぼす様子を捉えることを試みた.微粉炭燃焼炉,ならびにガス化炉の大規模ラージ・エディ・シミュレーション(LES)の実施向けて,拡張CPDモデルとカップリングするための素反応メカニズムについて,275化学種1,107素反応からなる詳細化学反応メカニズムをベースに,74化学種131素反応からなる簡略化化学反応

メカニズムを構築した.拡張CPDモデルに対して,石炭中窒素化合物としてピリジン,ピロール,および4級アミンを石炭化学構造の中に定義できるように改良するとともに,Drop Tube Rector(DTR)を対象とするモデル単体の動作検証計算を実施し,定性的に正しい挙動を示すことを確認した.当初計画通り,タール放出から重合・分解に至る一連の微粉炭粒子の初期熱分解モデルによる微粉炭粒子の着火状況について,実験との良い一致を確認した.また,この初期熱分解モデルに対して,窒素酸化物を考慮できるような改良を実施した.さらに,ラージ・エディ・シミュレーションによる大規模解析に向けて,簡略化化学反応機構の構築を行った.上述の成果により,おおむね計画通りに進展しているものと考えられる.非球形単一粒子の6自由度解析データから非球形粒子の運動モデルを開発するとともに,運動モデルを用いた混相乱流場の直接数値計算を実施し,粒子の乱流中分散挙動に対する粒子形状の影響を明らかにした.また,同様の6自由度単一粒子の着火挙動について直接数値計算を実施し,粒子周囲に広がる揮発分に着火し燃え広がる過程において予混合火炎から拡散火炎と遷移する様子を明らかにした.さらに,非球形粒子運動モデルを用いるラージ・エディ・シミュレーション(LES)を同軸噴流における球形および非球形粒子の分散挙動を計測した実験を対象に実施し,実験と定性的な一致を見るとともに,粒子ストークス数に依存して特徴的な環状構造が形成されることを明らかにした.石炭の熱分解時に放出される揮発分の二次気相分解について,詳細化学反応機構を用いた素反応解析による感度解析により主要な化学種や反応経路を抽出することで,数値解析に適用可能な簡略化反応機構を構築した.また,揮発分に含まれる窒素化合物の分解挙動について,化学形態分析に基づいて定義されたピリジン,ピロール,および4級アミンが気流中でアンモニアやシアンを経由しNOxに転換される反応を,詳細化学反応機構を用いる素反応解析によって明らかにするとともに,主要な化学種や反応経路を抽出することで,数値解析に適用可能な総括反応機構の構築を行った.小型噴流微粉炭火炎を対象に簡略化反応機構を用いたLESを実施し,実験との比較によりその有効性を確認するとともに,火炎構造の詳細を明らかにした.・前年度までに作成した数値モデルを用いた数値解析を実施し,DTR実験データとの比較検証を通じ,モデルの妥当性の検証を図る.・大規模数値解析に向けて,計算負荷低減のための窒素化合物の熱分解挙動を含む素反応に基づく詳細化学反応機構の簡略化を図る.・小型噴流微粉炭火炎の数値解析を実施し,実験データとの比較検証を通じ,一連の開発されたモデルの妥当性検証を行う.・前年度までに開発・改良を行った非球形粒子の運動モデル,ならびに初期熱分解モデルを用いて,大規模数値解析を実施し,実験等との比較を通じて,モデルの妥当性検証を行う.参加予定の学会の参加取り止めにより,その他経費に差異が生じたことによる.予定していた計算機使用量について,設備リプレース等により使用計画を変更したため.次年度は必要な計算機使用量および化学反応計算ソフトウェアに充てる予定である.積極的な学会参加や論文掲載による成果発表を推進することにより,本次年度使用額を有効に活用する.
哺乳類の受精における多精拒否機構の研究

哺乳類の多精拒否機構の解明をめざし、体外受精法でブタ受精卵を調製し受精による透明帯の特性や構造の変化を調べた。1.濾泡期の卵胞をもつブタ卵巣から卵丘に包まれた卵子を採取しTCM199A液中39°Cで48時間5%CO_2下で培養し卵子を減数第二分裂中期まで成熟させた後、受精培養液に移した。2.一方、ブタ副精巣尾部から採取した精子をTCM199B液中37°C、70分間5%CO_2下で保温し受精能を獲得させた。3.成熟卵子に精子を媒精し39°Cで12時間保温した。培養過程の卵子の状態は適時万能倒立顕微鏡(本補助金で購入)で観察し条件を検討しつつ実験を進めた。上記条件下で90%以上の受精率が達成された。4.卵巣内の未成熟卵子、成熟させた卵子および受精卵から透明帯を調製し、まず0.2%プロナーゼや希酸(pH3.6)による溶解速度を測定したところ、受精卵透明帯は40%ほど溶解速度が遅くなり、受精で透明帯が硬化するマウスで既報の現象がブタでもみられた。また温和な条件下FITCで透明帯をラベル後溶解しゲル濾過HPLCにかけ比較した結果、パターンに顕著な変化は見られず、微量画分ながら透明帯の単位構造の外側に位置するPZP2が最も修飾され易いことがわかり、透明帯全体の構造は大きくは変化しないものと思われた。しかし受精卵透明帯に結合する精子数が大巾に減ることから精子レセプターなどの微細な変化は起きていることが確認された。5.二次元泳動や二次元目は還元状態で行なう対角線電気泳動で詳細に調べたところ、PZP2に含まれる90K蛋白質のみが受精後完全に消失することがわかった。1万個以上の受精卵を得るという当初の目標に達せず、交付申請書に記したCDの測定とペプチドのマッピングはできなかったが、今後更に受精卵の調製に務める一方、蛍光試薬で修飾後酵素消化したペプチドをマッピングするなどの分析の微量化も計りたい。
条鰭類系統初期に分岐したポリプテルスの両生類型発生における体軸/胚葉形成機構

ポリプテルスは原始的な硬骨魚であり、脊椎動物の進化を探るうえで非常に重要な系統的位置を占める。その初期発生の様子は全割卵で両生類と類似し、盤割卵の真骨魚(一般的な進化した硬骨魚)とは様々な点で異なる。しかしながら、ポリプテルスは全割発生であるにも拘らず、植物極側細胞集団が胚葉に貢献しない点で両生類とも異なる。この特徴は、最も原始的な現生脊椎動物であるヤツメウナギでも保存されており、ポリプテルス様の初期発生機構は脊椎動物の祖先型と考えられる。脊椎動物における胚発生に共通の特徴は、卵黄を多量に獲得した点にある。卵黄の存在は直接的に卵割や形態形成へ影響するため、脊椎動物の初期発生様式はその分布様式に従って多様化した。卵割様式はその典型であり、ホヤ/ナメクジウオと共通する祖先的な全割卵から、多くの系統で盤割化が平行に起きている。脊椎動物における全割と盤割の発生で最も大きな違いは卵黄を割球細胞内に持つか卵黄細胞として胚体と区分するかであると考えられてきた。なぜなら両生類では卵黄を多量に含む植物極側割球は内胚葉の性質を持つためである。しかしながら、これまで脊椎動物の全割発生における知見めほとんどは両生類についてであった。本研究では、より祖先的な全割発生をする脊椎動物であり、'条鰭類系統で最初に分岐したポリプテルスについて解析を行った。ポリプテルスにおいて、中胚葉(マーカー遺伝子:no-tail相同遺伝子)は赤道面付近に分化し、その植物極側に接した領域と胞胚腔床部でのみ内胚葉(sox17相同遺伝子)が認められた。割球化した植物極側細胞集団は胚葉へ貢献せず、真骨魚の卵黄多核層の様に中内胚葉誘導活性を持っていた。従って、この領域は真骨魚における卵黄細胞の進化的起源であると考えられる。さらに、ポリプテルスでは、両生類における胚葉パターン形成や体軸決定の分子機構で中心的な役割を果たすVegT相同遺伝子の母性発現が検出されない。これらのデータは真骨魚類における盤割化の前段階として、全割卵で割球化された胚体外卵黄細胞が存在する事を示すと共に、両生類で見られる胚全体での胚葉パターニングは卵割様式よりもむしろ母性VegTの発現と相関する事を示唆する。このようなポリプテルスの初期発生は、すべての四足動物・硬骨魚の進化的初期設定として盤割化を頻発させる基盤となった可能性がある。両生類の発生では、全割卵で生じた割球のすべてが胚体を形成する三胚葉の一部となる.これは、原始的脊索動物と共通するため、概して脊椎動物め祖先的発生様式と考えられてきた。しかし、両生類の胚葉形成機構は母性のVegTが中心的役割を担う点で特徴的である。また両生類以外の、全割発生する脊椎動物については、胚葉形成の分子生物学的知見がこれまで全くなかった。本研究では、条鰭類系統で最初に分岐したポリプテルスと、加えて本年度は、現生脊椎動物で最初に分岐したヤツメウナギについて、胚葉形成機構の解析を行った。両者は両生類と類似の全割発生をする。結果として、ポリプテルス/ヤツメウナギ胚で共通に、中内胚葉は赤道面近傍でのみ分化し、植物極側細胞集団(VCM :両生類では内胚葉)は胚体外組織であった。また、両生類を除く他の脊椎動物と共通して、VegTでなくeomesoderminが母性発現(ゼブラフイツシュ、マウスで内胚葉分化に必要とされ、原始的脊索動物でも検出される)していた。さらに、ポリプテルスのVCMは、共培養により動物極側細胞を中内胚葉や誘導する活性を持っていた.類似の活性は、両生類では内胚葉に、他の脊椎動物では胚体外組織(真骨魚の卵黄多核層YSLを含む)に由来する。これらの結果から、脊椎動物初期発生の多様化について以下の仮説を提唱した。現生脊椎動物の共通祖先で、胚に含まれる卵黄量が劇的に増加し、それに伴ってVCMは胚体外組織へ特化した(ポリプテルス/ヤツメウナギが保持)。胚盤と一つの大きな卵黄細胞を形成する盤割は、羊膜類/真骨魚類/軟骨魚類などの系統で、VCMが進化的に融合し獲得された。その際、羊膜類でVMCは胚体外組織(羊膜、漿膜など)の起源となった。両生類においては母性VegTの発現と機能を独自に獲得し、二次的にVMCを内胚葉へ分化させた。本仮説は教科書的見地を覆す画期的なものと自負している。