hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
米国ＰＲＩＭの検討と日本版ＰＲＩＭの作成

そのために、チラシ配布、障害児教育関連雑誌への広告と、関連学会(特殊教育学会)でのポスターの展示を行った。また、開設したHP上でも研究協力者のリクルートを開始した。初年度末時点で全国から約100人の研究協力者が集まり、徐々に問題行動への対応策が集まりつつある。多数の対応事例を投稿していただくために、研究協力者には発達障害に関する資料や情報を送り、個人の経験をできるだけ出しやすい環境を整備した。ホームページ開設、米国版PRIMの抄訳は、予定通りに進行しているが、モニター数が当初予定の200名にまだ届いていない。米国版PRIMには、200例の問題行動に対して、それぞれ50例、計10000例の対応策が記載されている。本研究では、最低2000例の対応策を収集する予定だったが、現在まだ900例で、目標の半数にとどまっている。米国版PRIMでは約200の教室内でよく見られる問題行動、学習困難の典型例が示され、それぞれに平均約50通りの対応策が示されている。本研究では、目標として100種類の代表的問題行動にそれぞれ2050通りの対応策を考えている。今年度の達成目標は、(1)たたき台となるアメリカのPRIの翻訳(2)研究協力者のリクルート(3)投稿された対応策を選択、検討、改定する作業と本研究の基本的方針を決定する運営委員の選定(4)本研究の宣伝と、投稿された対応策を掲示するホームページの開設であった。これらの目標はすべて達成されたが、研究協力者は予定の約50%程度にとどまっており、対応策の投稿数まだ十分ではない。本研究に残された課題は、より多数の対応例を集めることである。来年度は最終年度であるので、モニターにさまざまな方法で対応策を寄せていただくための工夫を行っていく。応募しやすいように、電話インタビューによる聞き取り、教諭や指導主事などが参加する講演会でのワークショップ開催、複数の関連学会での発表を計画している。研究協力者の増員と、それぞれの研究協力者からの教室での問題行動への対応策の投稿を促進することが、本研究の目的達成の鍵である。すでに登録いただいた研究協力者への協力要請の強化と、新たな研究協力者のリクルートをさらに進める予定である。前者については、発達障害に関する資料の研究協力者への送付、後者については学会、雑誌等での研究協力者の募集を行って行く。モニター協力者関連費(20万円)、研究協力者会議費(33万円)、ワークショップ出張旅費(10万円)、学会参加費(10万円)、謝金(50万円)、研究報告書印刷関連費(35万円)を使用予定としている。次年度の研究費の主な使用目途は以下のようになる。(1)研究協力者への参考資料の印刷、郵送費(2)新たな研究協力者を募集するための、チラシ印刷、雑誌広告費(3)運営委員会開催費(4)学会参加費
ベータ線を用いたX線に感度を持つCCDの空乏層厚の測定

X線CCDにおいて厚い空乏層を持つことは、高エネルギー側の検出感度を向上できるという点で重要である。現在、厚い空乏層を持つ裏面照射型CCDの開発が進められており、空乏層厚を精密に測定することが非常に重要となっている。そこで、私は、空乏層厚を調べる手法として、ベータ線を用いた斜入射法に注目した。本研究では、斜入射法に用いるベータ線源の種類により、ベータ線が進む長さの比較することを目的とした。今回、用いたベ一タ線源は^<90>Srと^<207>Biの2つである。空乏層厚80μmのX線CCDに入射角が約19度になるようにベ一タ線源を設置し、得られたイメージからベータ線が進んだ長さを調べ、比較を行った。また、事前にGeant4というツールを用いてこの実験のシミュレーションでも比較を行うといった2種類の方法で検証を行った。実験やシミュレーションから得られたイメージはクーロン力による相互作用で曲がったイベントが多く含まれてしまうため、選別アルゴリズムで直進したイベントのみを取り出し、比較する対象に用いた。シミュレーション結果から、ベータ線が進んだ長さの平均は、^<207>Biが6.93ピクセル、^<90>Srが4.95ピクセルとなり、^<207>Biの方で空乏層内を直進しやすいことが分かった。実験結果からは、^<207>Biが6.23ピクセル、^<90>Srが6.66ピクセルとなり、線源による違いが確認できなかった。そこで、アルゴリズムの条件を厳しくし、より直進したもののみを選別することにした。その結果、^<207>Biが、6.35ピクセル、^<90>Srが5.51ピクセルとなり、今回も明らかな違いは生じなかった。シミュレーションと実験で結果が異なった原因は、分からなかったが、空乏層内を進む動きをシミュレーションでより詳細に再現し、アルゴリズムに適用させることによって、検証できるものと考える。本研究では、1つの角度でしか検証を行っていいないので、角度による影響が生じるかは、今後検討する必要がある。
炎症時使用薬物の血液脳関門PGE2排出阻害による中枢神経副作用発生機構解明

炎症治療を目的として非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)、そして炎症を伴う細菌感染症時には抗生物質が広く用いられているが、これらの薬の一部は眠気を強く引き起こすことや、脳炎、けいれんなどの中枢症状の発症が報告されている。これらの中枢神経症状は脳におけるPGE2を介したシグナル伝達系が関与していると考えられ、これらの薬が脳内PGE2濃度変動を引き起こすか探ることは重要である。脳において合成されたPGE2は不活化されることなく、過剰な脳内PGE2蓄積回避のため、血液脳関門を介して促進的に排出されていると考えられる。そこで、本研究では炎症時に用いられる薬物によって、脳からのPGE2消失が阻害されるかを明らかにすることを目的とした。β-ラクタム抗生物質であるcefmetazole及びcefazolinを静脈内投与後、mouse brain efflux index法によって[3H]PGE2の脳からBBBを介した排出を検討した結果、[^3H]PGE2投与後40分における有意な脳内残存率の上昇が認められた。血液脳関門にはPGE2輸送担体としてOat3及びMRP4、そしてPGE2を基質とするか不明ではあるもののOatp2が発現している。Cefmetazole及びCefazolinはOatp2及びMRP4の基質であることが報告されており、脳からBBBを介した[^3H]PGE2排出を阻害する化合物の特徴としてとして、Oatp2及びMRP4の基質である化合物が脳からの[^3H]PGE_2排出を阻害すると考えられる。一方で、MRP4の基質ではなくOatp2の基質であるcefalexin及びcefsulodin静脈内投与条件下において有意な変化は認められなかった。よって、静脈内投与によって脳からのPGE2排出を阻害する化合物の輸送担体基質プロファイルとしてMRP4が重要である可能性が考えられた。前年度までの研究から一部のcephalosporin系抗生物質の静脈内投与によって、脳から血液脳関門(BBB)を介したPGE_2排出が阻害されることを明らかにした。これらの薬物がMRP4を介したPGE_2輸送を阻害するか、MRP4発現膜小胞を用いた取り込み実験によって解析した。その結果、静脈内投与によってBBBを介したPGE_2排出を阻害したcefmetazoleはMRP4発現膜小胞への[^3H]PGE_2取り込みを阻害し、そのIC_<50>値として10μMが得られた。そのIC_<50>値付近である20μM条件下、同様に静脈内投与によってBBBを介したPGE_2排出を阻害したcefazolinはMRP4発現膜小胞への[^3H]PGE_2取り込みを約40%阻害し、さらに同じくセフェム系抗生物質であるcefotaxime、ceftriaxone等、さらにindometacin、ketoprofenなどの非ステロイド性抗炎症薬もまた50%以上MRP4を介したPGE_2輸送を阻害した。MRP4を介したPGE_2輸送を強く阻害する化合物が実際にin vivoマウスBBBを介したPGE_2排出を阻害することを、大脳皮質pre投与条件下のmouse brain efflux index法によって解析した。その結果、cefmetazole、cefazolin、cefotaxime、ceftriaxone、indomethacin及びketoprofenの大脳皮質pre投与によってマウス脳からBBBを介した[^3H]PGE_2排出は阻害されることを明らかにした。以上の結果から、MRP4を強く阻害する抗生物質及び抗炎症薬は脳からBBBを介したPGE_2排出を阻害する可能性が示唆された。
１６４８年ウェストファリア条約におけるアルザス諸条項の交渉過程と歴史的影響

本研究は、これまで近代国家形成史や一国史的な見方からフランス王国の一州として扱われてきたアルザスに、神聖ローマ帝国の視点を導入し、1648年以降のアルザス譲渡をめぐる紛争の分析を通して、その背後にある地域と国家の権力秩序を浮き彫りにすることを試みてきた。本年度は、アルザス譲渡をめぐって地域秩序が揺らぐなかで、アルザスの地域諸権力が王国と帝国においてどのように振る舞い、いかなる人的ネットワークを用い、どのように秩序の回復ないし構築を図ったのかを、シュトラースブルク司教を中心に考察した。研究遂行のために、2017年1月から2018年9月まで、ストラスブール大学の客員研究員として海外実地研究を行った。その間、フランス、ドイツ、オーストリアの各文書館において史料調査を行い、フランス語、ドイツ語、ラテン語で書かれた複数の手稿文書を読み解くという作業を行った。その研究成果に基づき、論文「1723年の皇帝宮廷におけるシュトラースブルク司教の授封」をフランス語で執筆し、パリ・ドイツ史研究所の雑誌『Francia』第45号(2018年8月刊行予定)に掲載が決まっている。この雑誌は、独仏英の三言語の論文が掲載される学際的で権威ある西洋史の雑誌であり、そこへの論文掲載は、本研究が海外において評価されている査証といえる。また、2018年5月にはわが国の西洋史学において最大の学会「日本西洋史学会大会」において、王権、皇帝権、地域諸権力が重なり合う境界地域の秩序について、口頭発表を行う予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。近年、ヨーロッパ近世史研究は、国家の存在そのものを自明の前提とはせず、王権と地域諸権力が相互関係のなかで作り上げていくものとして国家を捉える傾向にある。本研究は、エルザスという地域を対象とし、フランス王と神聖ローマ皇帝の両者との関係を考察することを通して、国家を内と外の両面から考察し、近世国家の理解をさらに深めることを目的としている。この課題に取り組むために、昨年度は皇帝からフランス王へのエルザス譲渡を取り決めたウェストファリア条約(1648)を考察した。従来、エルザス譲渡は48年以降の状況から解釈されてきたが、そこには三つの問題があった。第一にエルザス譲渡をウェストファリア条約の一部として理解する視点の欠如、第二に講和会議における交渉の経緯を踏まえていない不正確な条文解釈、第三に48年以降の条文理解における変化の見落としである。それゆえ、ウェストファリア講和会議史料集を用いて、講和会議における交渉の経緯と条文内容を考察し、条約締結時の条文理解を明らかにした。このことは、ウェストファリア条約全体の理解にも影響をもつものであり、エルザス史のみならず、条約および条約が締結された近世という時代の研究にとってもインパクトを与えるものである。この成果は、今年の7月の関西フランス史研究会の大会で報告することになっている。続いて、17世紀後半におけるエルザス譲渡規定の適用状況を検討した。具体的には、神聖ローマ帝国の一員にとどまりつつも、フランス王との複雑な関係を結ぶこととなった十帝国都市を対象とし、フランス王とのあいだに生じた紛争とその処理のメカニズムを明らかにし、帝国都市から王国都市への移行をさまざまな角度から描き出した。現在論文を執筆中であり、今年の6月に『西洋史研究』に投稿する。研究を進めていくうちに、当初の目的や計画を変更する必要が生じ、そのために多くの時間を要した。しかし、その作業によって研究が良い方向に進展し、明確な見通しを得ることができた。昨年度は、フランスで1か月間の在外実地研究を行い、その後時間をかけて史料を考察することができた。その結果、今年度は6月に『西洋史研究』に論文を投稿し、7月に大会報告を行う準備が整っている。また昨年度の在外実地研究では、今年度用いる史料の調査と収集も行ったため、すぐに次のテーマに取り掛かることが可能である。本研究は、近世国家形成を、王権による一方的な地域の制度的・法的統合としてではなく、王権と地方諸権力の相互交渉および相互作用の過程として描き直す試みである。その際に研究対象とするエルザス(アルザス)は、1648年のウェストファリア条約とその後の戦争および和平の結果、神聖ローマ帝国からフランス王国へ移行した地域である。本研究は、エルザスの地域諸権力が特権を維持するために行った交渉、そこで用いることのできた手段、ならびに皇帝への忠誠や帝国における人的な結びつきなどに注目し、フランスによるエルザスの統合という従来の理解が見落としてきた諸相を浮き彫りにする。本年度は、具体的に二つの作業を行った。第一に、ウェストファリア講和会議(1643-48)においてエルザス譲渡が取り決められた経緯、ならびにフランス王と神聖ローマ皇帝の政治的意図を検討し、その成果を研究会の口頭報告および学術論文として発表した。第二に、1648年以降のウェストファリア条約適用について、フランス王と最も早く紛争に至った十帝国都市を対象とし、この問題の解決のために神聖ローマ帝国の帝国議会で行われた調停を中心に考察し、その成果を学術論文として発表した。以上の研究成果は、主に二つの意義を有している。

第一に、1648年以降のエルザス史を単に大国の利害に翻弄された係争地の歴史として描くのではなく、エルザスにおける複数のアクターがフランス王国と神聖ローマ帝国におけるネットワークや紛争解決手段を用いて状況変化に対応していく過程として描き直したことである。この成果は、近代国民国家成立以降のエルザス史との比較により、今後さらなる重要性を提示できるものと思われる。第二に、エルザスという地域に注目することは、長らく国際関係ないし国家間関係に限定されてきた近世外交を、日常レベルの対外関係として描き直す可能性をもつことである。本年度は、二本の論文を学会誌に発表するとともに、フランス史研究者の研究会において口頭発表を行い、当初の計画以上の成果があったといえる。関西フランス史研究会では、修士論文および前年度の研究成果を口頭で報告し、質疑応答を行った。そこでのフランス史研究者との議論は、研究の方向性や意義を見直す最良の機会となった。これを踏まえて研究を発展させ、『北大史学』と『西洋史研究』に論文を発表した。それに伴い、さまざまな研究者から有意義な指摘ないし助言を受けることができた。これらの研究成果は、博士論文のおおよそ半分を構成するものである。2017年1月からフランスにおいて在外実地研究を行い、主にアルザスのバ・ラン県立文書館に所蔵されている史料の読解に取り組んだ。この作業は、今後これらの史料を日常レベルの対外関係という観点から考察する際の基礎をなすものである。本研究は、これまで近代国家形成史や一国史的な見方からフランス王国の一州として扱われてきたアルザスに、神聖ローマ帝国の視点を導入し、1648年以降のアルザス譲渡をめぐる紛争の分析を通して、その背後にある地域と国家の権力秩序を浮き彫りにすることを試みてきた。本年度は、アルザス譲渡をめぐって地域秩序が揺らぐなかで、アルザスの地域諸権力が王国と帝国においてどのように振る舞い、いかなる人的ネットワークを用い、どのように秩序の回復ないし構築を図ったのかを、シュトラースブルク司教を中心に考察した。研究遂行のために、2017年1月から2018年9月まで、ストラスブール大学の客員研究員として海外実地研究を行った。その間、フランス、ドイツ、オーストリアの各文書館において史料調査を行い、フランス語、ドイツ語、ラテン語で書かれた複数の手稿文書を読み解くという作業を行った。その研究成果に基づき、論文「1723年の皇帝宮廷におけるシュトラースブルク司教の授封」をフランス語で執筆し、パリ・ドイツ史研究所の雑誌『Francia』第45号(2018年8月刊行予定)に掲載が決まっている。この雑誌は、独仏英の三言語の論文が掲載される学際的で権威ある西洋史の雑誌であり、そこへの論文掲載は、本研究が海外において評価されている査証といえる。また、2018年5月にはわが国の西洋史学において最大の学会「日本西洋史学会大会」において、王権、皇帝権、地域諸権力が重なり合う境界地域の秩序について、口頭発表を行う予定である。今後の課題は、個々の地域諸権力の事例研究を進めつつ、エルザスの全体像を描き出し、地域の視点からフランス王国さらには近世国家の理解に貢献することである。事例研究として、すでに都市を考察したため、今後は聖俗諸侯の検討を行う。今年度は、聖界諸侯としてシュトラスブルク司教を対象とし、司教がフランス王と皇帝の両者といかなる関係を築いたのかという点、またそのなかで司教がどのように司教領の管理を行ったのかという点を考察していく。すでに史料の一部を調査し収集しているが、必要に応じて在外実地研究を行う。
生体金属イオンシグナルによる新規サイトカイン産生制御機構の解明

Toll-like receptor(TLR)は,病原体由来の共通パターン分子(PAMPs)を認識するパターン認識受容体として自然免疫系において重要な役割を担う.これまで,TLRによる炎症性サイトカイン遺伝子の発現機構の研究は精力的に行われてきたが,サイトカイン蛋白質の分泌制御に関しては不明な点が多く残されている.本研究では,IFN-αの細胞外への分泌を担うキャリア分子として同定したSortilinのサイトカインキャリア分子としての機能の詳細及びその発現制御機構を明らかにする.本年は,昨年度行ったSPR解析による物理学的相互作用の解析から同定されたSortilin新規リガンドの解析を進めた.Sortilinが同定した新規リガンドの輸送に関与するかを検討するため,Sortilinの全身KOマウス及びfloxマウスを導入し,新規リガンドを発現する細胞特異的にSortilinをKOすることを試みた.しかしながら,全身KOマウス及びコンディショナルKOマウス共に作出に時間がかかり,実験へ供与可能なマウスを得ることが出来なかった.引き続きマウスの作製を行い,細胞レベル及び個体レベルでのSortilinと新規リガンドの機能相関に関する解析を行っている.また,昨年から引き続きSortilin組換蛋白質の結晶化に取り組み,リガンド非結合型Sortilinの結晶化と構造決定に成功した.興味深いことに,SortilinはpHに依存して2量体化していた.そこで,この2量体化に関与すると思われるアミノ酸残基の変異体を作製し解析したところIFN-α輸送活性へ影響を与えたことから,SortilinのpHに依存した2量体化はIFN-α輸送活性に重要であることが明らかとなった.また,Sortilinの新規リガンドを発現する動物細胞株の樹立も行い,予備的精製を行った.現在,大量精製系の構築を行っている.Toll-like receptor(TLR)は,病原体由来の共通パターン分子(PAMPs)を認識するパターン認識受容体として自然免疫系において重要な役割を担う.これまで,TLRによる炎症性サイトカイン遺伝子の発現機構の研究は精力的に行われてきたが,サイトカイン蛋白質の分泌制御に関しては不明な点が多く残されている.本研究では,IFN-αの細胞外への分泌を担うキャリア分子として同定したSortilinが各種サイトカインの分泌を担うサイトカインキャリアとして機能することを明らかにする.Sortilin及びサイトカイン組換蛋白質を用いたSPR解析による物理学的相互作用の解析を行った結果,NGF-bやIFN-gに加えて,IFN-aやIL-6,IL-10,IL-12及びIL-17とSortilinの結合が観察された.また,マウス骨髄から誘導した形質細胞様樹状細胞(pDC)において,SortilinとIFN-aが共局在することを間接免疫蛍光抗体法にて確認した.また,pDCを用いてSortilinのsiRNAによるノックダウンによって,pDCでのTLRシグナル依存的なIFN-aの分泌が顕著に減少した.このことから,SortilinはpDCにおいてIFN-aの細胞外への輸送に重要な役割を担っていることが示唆された.更に,Sortilin mRNAがTLRシグナル依存的に分解されることを見出した.解析を進めた結果,ポリC結合蛋白質1(PCBP1)がSortilin mRNAの3'非翻訳領域(UTR)に結合し,Sortilin mRNAを安定化することを見出した.また,Sortilin mRNAが細胞内亜鉛濃度依存的に分解されることを見出した.以上から,PCBP1で安定化されたSortilin mRNAを分解へ導く,TLR-亜鉛シグナル依存的転写後制御機構が存在することが示唆された.28年度はSortilinに結合するサイトカインとその機能制御機構に関して,亜鉛が関与するという新しい知見が得られた.Toll-like receptor(TLR)は,病原体由来の共通パターン分子(PAMPs)を認識するパターン認識受容体として自然免疫系において重要な役割を担う.これまで,TLRによる炎症性サイトカイン遺伝子の発現機構の研究は精力的に行われてきたが,サイトカイン蛋白質の分泌制御に関しては不明な点が多く残されている.本研究では,IFN-αの細胞外への分泌を担うキャリア分子として同定したSortilinのサイトカインキャリア分子としての機能の詳細及びその発現制御機構を明らかにする.本年は,Sortilin及びサイトカイン組換蛋白質を用いたSPR解析による物理学的相互作用の解析を行い,これまでその結合が知られていなかった新規リガンドの同定に成功した.また,Sortilin組換蛋白質の発現系の構築を行い,動物細胞における安定発現株の構築に成功した.そこでこの蛋白質を用いた結晶構造解析にも取り組んだ.現在,結晶化の1次スクリーニングが終了し,幾つかの条件に関して,結晶化条件の精密化を行っている.また,サイトカインとの複合体の構造解析に向けた予備実験も行っている.Sortilin発現制御機構に関しては,ゲノム中に存在するPCBP1オルソログに関する解析を行った.siRNAによるノックダウン,ゲルシフト解析などから,このオルソログがPCBP1同様,Sortilinの転写後発現制御機構への関与を示す結果を得た.また,PCBP1同様,見いだしたオルソログも亜鉛との結合によって,核酸に対する結合能を失うことを見いだした.以上から,PCBP1オルソログもPCBP1同様,Sortilinの転写後発現制御機構に関与することが示唆された.本年は,Sortilinに結合する新規リガンドの同定に成功し,PCBP1オルソログに関する知見も得られた.

また,Sortilinの結晶構造解析にも進展が見られた.Toll-like receptor(TLR)は,病原体由来の共通パターン分子(PAMPs)を認識するパターン認識受容体として自然免疫系において重要な役割を担う.これまで,TLRによる炎症性サイトカイン遺伝子の発現機構の研究は精力的に行われてきたが,サイトカイン蛋白質の分泌制御に関しては不明な点が多く残されている.本研究では,IFN-αの細胞外への分泌を担うキャリア分子として同定したSortilinのサイトカインキャリア分子としての機能の詳細及びその発現制御機構を明らかにする.本年は,昨年度行ったSPR解析による物理学的相互作用の解析から同定されたSortilin新規リガンドの解析を進めた.Sortilinが同定した新規リガンドの輸送に関与するかを検討するため,Sortilinの全身KOマウス及びfloxマウスを導入し,新規リガンドを発現する細胞特異的にSortilinをKOすることを試みた.しかしながら,全身KOマウス及びコンディショナルKOマウス共に作出に時間がかかり,実験へ供与可能なマウスを得ることが出来なかった.引き続きマウスの作製を行い,細胞レベル及び個体レベルでのSortilinと新規リガンドの機能相関に関する解析を行っている.また,昨年から引き続きSortilin組換蛋白質の結晶化に取り組み,リガンド非結合型Sortilinの結晶化と構造決定に成功した.興味深いことに,SortilinはpHに依存して2量体化していた.そこで,この2量体化に関与すると思われるアミノ酸残基の変異体を作製し解析したところIFN-α輸送活性へ影響を与えたことから,SortilinのpHに依存した2量体化はIFN-α輸送活性に重要であることが明らかとなった.また,Sortilinの新規リガンドを発現する動物細胞株の樹立も行い,予備的精製を行った.現在,大量精製系の構築を行っている.Sortilin mRNAを転写後制御機構によって分解に導く亜鉛依存的なシグナル経路の解明を目指す.また,樹状細胞以外の細胞において,Sortilinが同様の機能を担うかどうか,Sortilinパラログが同様の機能を担うかに関しても検討する.Sortilinに結合する新規リガンドが,実際に細胞において結合していることを確かめる.また,新規リガンドの分泌に関与しているかどうかも検討する.また,結晶構造解析を進めると同時に,Sortilin転写後発現制御機構に関する解析も進める.次世代シーケンス解析用の試料調製が遅れたため,次世代シーケンス解析費用として計上していた費用が未使用分として計上された.研究の進展に伴い,遺伝子組換えマウスの新規導入を行ったが,海外からの輸入となったため,その手続き及び輸送に時間を要した.そのため,購入費及び輸送費に関する支払い時期に遅れが生じた.次年度にはその費用に充てる.前年度で計画していた次世代シーケンス解析費として計上し,その解析費用として使用する予定である.報道発表2016年5月26日(木)北國新聞朝刊掲載「免疫細胞の新機構解明-炎症性疾患治療に期待」
肺移植後の拒絶反応抑制の治療方法の開発－ＩＬ－６増幅回路の遮断を用いた治療戦略－

肺移植は進行性で不可逆的な慢性呼吸不全に対して臓器置換型の根治的治療法として確立されているが、肺は他の臓器に比して拒絶反応が起こりやすく他の臓器の移植に比べて長期生存率は低い。したがって拒絶反応の抑制が、肺移植の長期成績の向上には極めて重要である我々はこれまでに、IL6によって誘導されるTh17細胞がBOの発症に関与していることを明らかにしてきた。本研究では、IL-6 amplifierの増幅回路とEGF、CCL2の発現を介してBOが発症することを動物実験と肺移植後のBO病変の生検検体を用いて明らかにした。本研究結果は、肺移植後の慢性拒絶反応を抑制する新たな治療戦略の構築につながる。肺移植は心・腎・肝の移植とともに確立した治療として認識されつつあるが、肺移植後の長期生存率は未だ満足すべきものではなく、その原因として遠隔期での慢性拒絶反応の制御の困難さが大きな因子となっている。近年、自己免疫疾患におけるeffector細胞としてTh17細胞が注目を集めており、当教室は動物実験モデルにおいて、肺移植後の拒絶反応である閉塞性細気管支炎の発症機序におけるTh17細胞の関与を明らかにしてきた。Th17細胞の分化にはIL-6が深くかかわっており、局所の炎症で繊維芽細胞などが分泌するIL-6によりTh17細胞が誘導されると、そのTh17細胞がさらにIL-6を産生し、Th17細胞の分化が一層促進されるというIL-6 amplificaton回路が働くことが知られている。これまでの我々の研究では、抗IL-6抗体の全身投与がTh17細胞の分化を抑制し、マウスモデルにおける慢性拒絶反応を抑制することを明らかにしてきた。今回の研究では、IL-6 receptorから細胞内に入るシグナルを抑制することにより、Th17細胞の分化が抑制され拒絶反応が抑制されるかどうかを検証している。IL-6 receptorからのシグナルはJAK2/STAT3を介して核に伝達されることが知られている。またTh17細胞への分化における重要なregulatorとして、IκBζという分子の役割が明らかにされている。これらの細胞内タンパクの発現の抑制と機能制御はTh17細胞分化の抑制を通して、肺移植後の慢性拒絶の克服につながると考えられる。このような方法論が確立されれば、肺移植の術後生存率が飛躍的に向上すると期待される。肺移植は、進行性で不可逆的な慢性呼吸不全に対して臓器置換型の根治的治療法として確立されており、本邦においても脳死ドナー・生体ドナーからの肺移植は年間に合計で40例程度行われている。しかしながら、肺は他の臓器に比して拒絶反応が起こりやすく、国際心肺移植学会の報告では5年生存率は50%程度であり、他の臓器の移植に比べて長期予後も低い。拒絶反応の抑制が、肺移植の長期成績の向上には極めて重要である。肺移植後の慢性拒絶反応は閉塞性細気管支炎(BO)という形態で発症することが知られているが、その発生メカニズムは未だ不明なところが多い。我々は、マウスの肺移植動物実験と、ヒトにおける臨床肺移植後の生検検体を用いて、Th17細胞がBOの発症に関与していることを既に明らかにしてきた。近年の基礎免疫学研究の進歩により、Th17細胞の分化にはIL-6が関与していることが明らかにされている。炎症部位では、繊維芽細胞が分泌するIL-6によりTh17細胞が誘導されると、そのTh17細胞がさらにIL-6を産生し、Th17細胞の分化が一層促進されるというIL-6増幅回路の存在が明らかにされており、我々はこのIL-6増幅回路がBOの確立に関与していることも明らかにした。BO病変部分では1型コラーゲンを発現する上皮細胞がIL-6とリン酸化STAT3を発現していることを確認した。IL-6増幅回路により発現するケモカインとしてCCL2が既に知られており、BO病変部分では1型コラーゲンを発現する上皮細胞がCCL2を発現することも確認された。さらに、1型コラーゲンを発現する上皮細胞の活性化にはEGF receptorのシグナルが関与することも確認された。以上より、BOの発症におけるIL-6増幅回路の発現にはEGFの関与も予測される。これらの知見をもとに、肺移植後の慢性拒絶反応抑制方法を開発中である。肺移植後の拒絶反応は閉塞性細気管支炎(BO)という形態で発症することが知られている。Th17細胞の分化にはIL-6が関与している。炎症で繊維芽細胞などが分泌するIL-6によりTh17細胞が誘導されると、そのTh17細胞がさらにIL-6を産生し、Th17細胞の分化が一層促進されるというIL-

6増幅回路が働くことも知られており、このIL-6増幅回路がBOの確立に関与していることを我々は明らかにした。IL-6 receptorから細胞内へのシグナル伝達はJAK2/STAT3が介在し、Th17細胞分化はIκBζが関与している。STAT3は亜鉛によりconformationに変化が生じ、機能が抑制されることが知られている。我々は、3000ppmの亜鉛を含む飲み水を経口投与したマウスをレシピエントとして移植を行ったところ、慢性拒絶が軽減されることを明らかにした。さらに、BO病変部分では1型コラーゲンを発現する上皮細胞がIL-6とリン酸化STAT3を発現していることを確認した。IL-6増幅回路により発現するケモカインとしてCCL2が既に知られており、BO病変部分では1型コラーゲンを発現する上皮細胞がCCL2を発現することも確認された。さらに、1型コラーゲンを発現する上皮細胞の活性化にはEGF receptorのシグナルが関与することも確認された。以上より、BOの発症におけるIL-6増幅回路の発現にはEGFの関与も予測される。昨年度の研究結果を進めて、L-6増幅経路の抑制を通じて、Th17細胞分化を抑制し肺移植後の慢性拒絶を克服するための新しい治療方法を開発するための基礎的研究をを進めている。STAT3は亜鉛イオンによりconformation変化が生じ、機能が抑制される。亜鉛イオンを経口投与したマウスをレシピエントにして移植を行ったところ、慢性拒絶が認められなかった。現在、この移植モデルにおけるグラフト内で亜鉛イオンによりSTAT3の活性化が抑制され、その下流で制御されている遺伝子の発現が抑制されているかどうかを解析中である。25年度が最終年度であるため、記入しない。IL-6増幅回路を抑制することにより、肺移植後の慢性拒絶が抑制されることを証明し、さらにその抑制方法も明らかにしている。研究実績の概要で記した研究結果の一部を既に英文論文として発表した。IκBζはTh17の発現を制御しており、IκBζノックアウト・マウスではTh17によって誘導される自己免疫疾患の発症が抑制されている。今後、IκBζの発現を抑制する方法を開発すれば、強力な拒絶の抑制が得られる期待される。我々はsiRNAを用いたIκBζの発現抑制の開発を試みている。この方法が確立されれば、移植医療の成績向上に貢献するだけでなく、自己免疫疾患治療にも新展開がもたらされる。昨年度の研究により示された亜鉛による慢性拒絶の軽減の機序をより確固たるものにするため、このモデルにおける肺グラフト内のTh17細胞の分布とSTAT3のリン酸化の有無を評価し、そのシグナルの下流の遺伝子の現が抑制されているかどうかもRT-PCR法により解析する。また、BOの発症におけるIL-6増幅回路の発現にはEGFの関与が示唆されたため、EGF receptorを介するシグナルの抑制もBOの予防につながるかどうかを検討する。EGFのシグナルを遮断するための方法として、EGF receptorに対するモノクローナル抗体を用いて検証する予定である。
ストレス脆弱性モデル動物の脳画像学的病態研究

平成7年度研究実績:脳内中枢型ベンゾジアゼピン(BZD)受容体は感情障害や不安障害に有効とされるBZD系薬物(抗不安薬)が結合する部位であり,これらの精神疾患に特徴的な不安症状との関連が深い。そこで感情障害および不安障害患者を対象に1231-lomazenil SPECTによるBZD受容体結合の非侵襲的検索を施行した。その結果,BZD系薬物を未服薬の患者群では,前頭上部,頭頂,側頭,後頭皮質で受容体結合の有意な低下が認められた。また左前頭皮質上部および右側頭皮質においては,不安症状の重症度と受容体結合強度との間に有意な負の相関がみられた。このBZD受容体機能の変化は,上記疾患における不安症状と関連した病態を反映するものと考えられた。平成8年度研究実績:既に本研究者らは胎生期にストレス負荷を加えたラットが成熟後明らかなストレス脆弱性を示すことを確認し,これがヒトでの感情障害や不安障害のモデル動物となる可能性があることを立証している。前年度の臨床研究の結果の機序を解明するため,(1)通常ラットで,不安惹起物質として脳内にも存在するβ-CCBを投与した場合のBZD受容体結合の変化を1251-lomazenilによるオートラジオグラフィーによって検討した。(2)また胎生期ストレス負荷ラットに急性拘束ストレスを負荷した場合についても同様に検討した。その結果は予備的なものであるが,(1)β-CCB投与によってBZD受容体が占拠されると共に受容体のリガンド結合親和性も低下する傾向が認められ,(2)胎生期ストレス負荷ラットでは急性ストレス負荷によって右前頭皮質の受容体結合が相対的に増加する傾向が認められた。すなわち不安惹起物質あるいはストレス負荷は脳内BZD受容体機能の変化をもたらすことが示されたが,臨床研究でみられた同受容体結合の変化とは必ずしも平行関係にあるとはいえず,さらなる検討が必要である。平成7年度研究実績:脳内中枢型ベンゾアゼピン(BZD)受容体は大脳皮質など脳内に広く分布し,感情障害および心的外傷ストレス障害患者に有効とされるBZD系薬物(抗不安薬)が結合する。従って上記疾患に特徴的な「不安症状」と関連が深いと考えられる。そこで最近開発された中枢型BZD受容体のSPECTリガンドである^<123>I-iomazenilを用い,BZD系薬物を未服用の感情障害および神経症患者を対象に脳内BZD受容体密度の検索を非侵襲的に実施した。その結果,患者群では特に前頭葉皮質でのBZD受容体密度が正常者に比べ有意に低下していることが判明した。また同時に臨床的に評価された不安症状の重症度と同脳領域でのBZD受容体密度が逆相関する傾向が示された。この変化はBZD受容体の何らかの機能的変化やdiazepam bindinginhibitor (エンドゼピン)などの内在性不安惹起物質による同受容体の占拠などいくつかの可能性が考えられた。平成8年度はこれらの臨床知見の検証として,疾患モデル動物における脳内BZDの変化を検討していく予定である。平成8年度研究計画:1)ストレス負荷がラット脳内のベンゾアゼピン受容体密度に与える影響を検討するため,(a)慢性ストレス負荷したラット,(b)胎生期にストレスを負荷した仔ラットに,^<125>l-iomazenilによるオートラジオグラム法によって脳内ベンゾアゼピン受容体密度を測定し,それぞれ非ストレス群と比較する。

2) (a)慢性ストレス負荷したラット,(b)胎生期にストレスを負荷した仔ラットに不安惹起物質であり,なおかつGABA-A受容体複合体に作用すると考えられている,エンドゼピンやβ-カルボリンを投与し,その後脳内ベンゾジアゼピン受容体密度を測定することによって,不安惹起物質が同受容体に与える影響を検索する。平成7年度研究実績:脳内中枢型ベンゾジアゼピン(BZD)受容体は感情障害や不安障害に有効とされるBZD系薬物(抗不安薬)が結合する部位であり、これらの精神疾患に特徴的な不安症状との関連が深い。そこで感情障害および不安障害患者を対象に、^<123>l-lomazenil SPECTによる脳内BZD受容体結合の検索を非侵襲的に施行した。その結果、BZD系薬物を未服薬の患者群では、前頭葉上部、頭頂葉、側頭葉、後頭葉皮質で脳内BZD受容体結合の有意な低下が認められた。また左上部前頭皮質および右側頭皮質において、不安症状の重症度と脳内BZD受容体結合強度との間に有意な負の相関が認められた。このことから、上記疾患では脳内BZD受容体機能が何らかの原因によって変化していることが予測された。平成8年度研究業績:既に本研究者らは胎性期にストレス負荷を加えることによってストレス脆弱性ラットが生じ、これがヒトでの感情障害や不安障害のモデル動物となりうる可能性があることを立証している。前年度の臨床研究の結果を検証するため、(1)ストレス脆弱性ラットに急性拘束ストレス負荷した場合の脳内BZD受容体結合へ影響について^<125>l-lomazenilを用いたオートラジオグラフィーによって検討した。(2)また通常ラットで、不安惹起物質として脳内に存在することが明らかにされているβ-CCBを投与した場合についても同様に検討した。その結果は予備的なものであるが、(1)急性拘束ストレスによってBZD受容体結合は左前頭皮質で相対的に低下する傾向、(2)β-CCBが脳内BZD受容体を占有することが明らかになった。すなわちストレス負荷あるいは不安惹起物質は脳内BZD受容体機能に影響をもたらしており、このことは感情障害や不安障害の病態との関連を強く示唆するものである。
人工口腔癌幹細胞の作製とその性状解析による新たな研究基盤の確立

本研究では、口腔癌細胞において、Emi1の過剰発現あるいはCdh1のノックアウトによりAPC/Cユビキチンリガーゼの活性を恒常的に抑制し、胚性幹細胞の細胞周期調節を再現させることにより、胚性幹細胞でみられる恒常的なAPC/Cの活性の抑制を介した自己複製や未分化能の維持を誘導し、人工的に口腔癌幹細胞を作製することにチャレンジすることを目的にしている。本年度は、APC/C inhibitorであるEmi1を口腔癌細胞に過剰発現させた細胞における幹細胞マーカーの発現を検討した。昨年度、我々は、Emi1の分解ドメインを変異させた分解抑制型変異体を作成し、野生型および分解抑制型変異体をテトラサイクリン誘導性に口腔癌細胞に導入した細胞を作成し、テトラサイクリンの投与によりEmi1の発現が誘導されることを確認している。さらに、Emi1の分解抑制型変異体は、野生型に比べて、増殖能が遅く、幹細胞の性質を有することが明らかにしている。本年度は、Emi1の分解抑制型変異体を導入した細胞において、幹細胞マーカーであるNANOG、SOX、POU5F1およびFBXO15の発現上昇を確認している。興味深いことに、Emi1の分解抑制型変異体の方が、野生型に比べて幹細胞マーカーの発現が高かった。Cdh1をCRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集によりノックアウトを試みたが、うまくいかなかった。また、Cdh1ノックアウトマウスの胎児線維芽細胞(Mef)を用いて、幹細胞マーカーの発現を検討したところ、幹細胞マーカーの発言が見られることを見出した。また、胚性幹細胞の細胞周期の特徴であるG1期の短縮も見られることを確認した。本年度で研究は終了であるが、引き続き、Emi1を口腔癌細胞に過剰発現させた細胞のin vivoにおける役割や性質を明らかにしたい。本研究では、口腔癌細胞において、Emi1の過剰発現あるいはCdh1のノックアウトによりAPC/Cの活性を恒常的に抑制し、胚性幹細胞の細胞周期調節を再現させることにより、胚性幹細胞でみられる恒常的なAPC/Cの活性の抑制を介した自己複製や未分化能の維持を誘導し、人工的に口腔癌幹細胞を作製することにチャレンジすることを目的にしている。本年度は、APC/C inhibitorであるEmi1を口腔癌細胞に過剰発現させ、胚性幹細胞でみられる自己複製や未分化能の維持を誘導することを試みた。Emi1は、体細胞の細胞周期では、分裂期初期からG1期まではユビキチン分解され、発現していない。そこで、ユビキチン分解に重要な部位を変異させ、分解されない分解抑制型変異体を作成した。Emi1の野生型および分解抑制型変異体をテトラサイクリン誘導性に口腔癌細胞に導入し、テトラサイクリンの投与によりEmi1の発現が誘導されることを確認した。さらに、Emi1の分解抑制型変異体により、野生型に比べて、増殖能が遅く、幹細胞の性質を有することが明らかになった。さらに、Emi1の分解抑制型変異体を導入した細胞では、幹細胞マーカーの発現上昇がみられた。また、Cdh1をCRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集によりノックアウトするためのベクターを構築した。現在、口腔癌細胞でCdh1をノックアウトした細胞を作成している最中で、Cdh1ノックアウト口腔癌細胞で、幹細胞の性質を有しているかを詳細に検討する予定である。Emi1の発現誘導をする細胞が作成でき、現在、幹細胞としての性格を有しているかを詳細に検討している。また、Cdh1のノックアウトに関しては、ノックアウトするベクターの構築に時間がかかってしまったため、やや遅れている。

今後は、Emi1の分解抑制型変異体を誘導した口腔癌細胞およびCdh1をノックアウトした口腔癌細胞において、1細胞周期の詳細な解析、2薬剤排出能の検討、3in vivoにおける造腫瘍性について検討する。さらに、コントロール細胞との遺伝子発現プロファイルを網羅的に検討する。実験の予定は一部遅れている実験もあるが、そのほかは順調に進んでいる。当初、購入予定であったセルアナライザーが購入する必要がなくなったことと実験の予定で培養用消耗品の一部などの購入を次年度にまわすことにしたため、繰越しとなった
人間と環境に優しい非塩素漂白による色素及び細菌除去に及ぼす新規な触媒の開発

日本の高齢社会が抱える課題は多く、中でも高齢者の快適な生活を支援する研究はまだ始まったばかりである。近年、あらゆる生活用品に抗菌加工を施したものが多く市販されているが、洗浄回数の多い衣服は、日常の洗濯時に手入れを行うことが良いとの立場に立って、本研究では人間の生活が清潔で快適に行われるために漂白剤が有効に利用されるよう、漂白及び殺菌作用について検討した。環境に優しいマイルドな条件で漂白及び殺菌を行うためには、反応を活性化させる有効な触媒の開発が必要であり、この目的のためには、諸種のポルフィリン誘導体を用いて効果を検討した。環境に優しく、ダイオキシンの発生を伴わない漂白剤として、過酸化水素を発生させる酵素(グルコースオキシダーゼ)を用いて、色素退色作用の測定を行い、さらに大腸菌と黄色ブドウ球菌に対する殺菌作用を調べた。pH8という条件で、グルコースオキシダーゼは活性触媒の作用を受け、色素退色を十分に行う一方で、2種の細菌に対して殺菌作用を示した。これらの殺菌作用はまた界面活性剤の存在で顕著な効果が現れることも確認できた。また、過酸化水素のマイルドな条件下での色素退色能に及ぼす触媒の効果を検討した。酸素のモデル物質としてポルフィリン誘導体の合成を行い、その触媒活性を調べた。新規なポルフィリン誘導体としてはポリマー(ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミンなど)と結合したポルフィリン誘導体を合成した。それらを触媒としてpH8.0というマイルドな条件で過酸化水素による色素の漂白を行った結果、ポリマーと結合したポルフィリン誘導体共存下では色素の退色が大きく促進された。また、ポリエチレングリコールと結合したポルフィリン誘導体では、ポルフィリン骨格を塩素化したポルフィリン誘導体よりもプロトポルフィリンのほうに大きな効果が認められた。高齢者の快適な生活を支援するための研究はまだ少ない。本研究では高齢者の生活特性から生じる汚れ物質を除去し、清潔で安全な生活の実現に向けて、殺菌作用をも併せ持つ漂白剤について、近年、大きな社会問題となっているダイオキシンの発生を伴わない過酸化水素の有効利用を検討した。その中で環境と人間に優しい条件で過酸化水素を利用するために天然物由来の酵素や、それらのモデル物質として種々の新規なポルフィリン誘導体の触媒効果を研究した。それらを触媒としてpH8.0という温和な条件で過酸化水素による色素の漂白を行った結果、過酸化水素のみではほとんど色素の退色がみられなかったが、ポリマーと結合したポルフィリン誘導体存在下では色素の退色が促進された。ポルフィリンの骨格をフッ素化したポルフィリン誘導体よりも塩素化したポルフィリン誘導体のほうに大きな効果が認められた。また、過酸化水素の安全で安定的な供給のために、グルコースオキシダーゼに糖を作用させて過酸化水素を発生させる方法を試みた。その際の糖は、洗剤中に配合されるセルラーゼの有効利用を考え、セルラーゼによるセルロース分解生成物の利用により行った。この系により発生した過酸化水素の色素分解能を測定したところ、有効な触媒の利用によりpH8においてもすぐれた色素分解能が認められた。さらにこの系における除菌効果について研究を進める計画である。

環境に優しいマイルドな条件で漂白及び殺菌を行うためには、反応を活性化させる有効な触媒の開発が必要であり、この目的のためには、諸種のポルフィリン誘導体を用いて効果を検討した。環境に優しく、ダイオキシンの発生を伴わない漂白剤として、過酸化水素を発生させる酵素(グルコースオキシダーゼ)を用いて、色素退色作用の測定を行い、さらに大腸菌と黄色ブドウ球菌に対する殺菌作用を調べた。pH8という条件で、グルコースオキシダーゼは活性触媒の作用を受け、色素退色を十分に行う一方で、2種の細菌に対して殺菌作用を示した。これらの殺菌作用はまた界面活性剤の存在で顕著な効果が現れることも確認できた。また、過酸化水素のマイルドな条件下での色素退色能に及ぼす触媒の効果を検討した。酵素のモデル物質としてポルフィリン誘導体の合成を行い、その触媒活性を調べた。新規なポルフィリン誘導体としてはポリマー(ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミンなど)と結合したポルフィリン誘導体を合成した。それらを触媒としてpH8.0というマイルドな条件で過酸化水素による色素の漂白を行った結果、ポリマーと結合したポルフィリン誘導体共存下では色素の退色が大きく促進された。また、ポリエチレングリコールと結合したポルフィリン誘導体では、ポルフィリンの骨格を塩素化したポルフィリン誘導体よりもプロトポルフィリンのほうに大きな効果が認められた。
森林生態系における樹木と林床植物を繋ぐ菌根菌ネットワークの機能的意義の解明

本研究では日本に広く分布する林床植物,イチヤクソウを対象として根の顕微鏡観察とDNA解析,葉の安定同位体比を調べた.イチヤクソウには菌鞘が形成されないアーブトイド菌根が形成されていた.遺伝子解析により大部分の共生菌はベニタケ属の仲間と推定された.炭素安定同位体解析より,イチヤクソウは炭素源の約50%を菌根菌に由来すると推定された.以上より,林床植物は根に共生する特定の菌類に部分的に炭素源を依存する部分的菌従属栄養性植物であると考えられた.光合成による独立栄養獲得と根に共生する菌,菌根菌を介した従属栄養獲得の両方を通して炭素源を得る植物を混合栄養性植物という.本研究では日本に広く分布する林床植物,イチヤクソウを対象として異なる光条件下における菌根共生関係と混合栄養性の可塑性を明らかにするため,根の顕微鏡観察とDNA解析,葉の安定同位体比を調べた.コナラ林から明所,暗所ぞれぞれからイチヤクソウを2か月に1度採取した.根への菌糸の感染,定着率を光学顕微鏡観察により評価した.共生菌の推定は真菌類のバーコード領域とされる核DNAのスペーサー領域のITS(Internal Transcribed Spacer)領域のダイレクトシークエンスを通して行った.周辺の独立栄養性,菌従属栄養性植物とともにイチヤクソウの葉のδ13C,δ15N安定同位体比を計測した.イチヤクソウは菌鞘を形成しないアービュトイド菌根を形成し,菌糸コイルの形成は春から夏にかけて多い傾向にあった.検出された菌の大部分は分類的に外生菌根菌であり,その84%はベニタケ属菌の配列と最類似していた.菌根化率とベニタケ属菌の出現頻度は暗所で高い傾向にあった.δ13C,δ15Nは周辺植物に比べて有意に高く,炭素源の約50%を菌根菌に由来すると推定された.両安定同位体比は光量と負の有意な相関があり,暗所で菌従属性が高くなると示唆された.以上より,イチヤクソウに定着する菌根菌種と菌への依存度は光条件により変化すると考えられた.本研究では日本に広く分布する林床植物,イチヤクソウを対象として根の顕微鏡観察とDNA解析,葉の安定同位体比を調べた.イチヤクソウには菌鞘が形成されないアーブトイド菌根が形成されていた.遺伝子解析により大部分の共生菌はベニタケ属の仲間と推定された.炭素安定同位体解析より,イチヤクソウは炭素源の約50%を菌根菌に由来すると推定された.以上より,林床植物は根に共生する特定の菌類に部分的に炭素源を依存する部分的菌従属栄養性植物であると考えられた.本研究では,日本の森林に遍在する林床に生育するツツジ科やラン科植物の根に共生する菌類の多様性と植物の根に共生する菌根菌の生態的意義を明らかにすることを目的としている.今年度は東アジアに分布し,日本にも自生する低木のツツジ科ドウダンツツジ属植物における菌根タイプを,組織学的および分子生物学的アプローチから明らかにすることを目的とした.日本に自生するドウダンツツジ属植物計6種(サラサドウダン,カイナンサラサドウダン,ベニドウダン,ドウダンツツジ,アブラツツジ,コアブラツツジ)と変種の複数種を対象にした.各種の菌根の形成状況をトリパンブルーおよびカルコフロール染色法にもとづきそれぞれ光学,蛍光顕微鏡による組織学的調査をした.その結果,全ての種で植物細胞上にコイル状の菌糸の存在が確認された.さらにサラサドウダン,ベニドウダン,ドウダンツツジにおいては,嚢状に肥大した菌体構造が確認された.またサラサドウダンについては,4地点15個体を対象にして,根に感染している菌の系統群を調べた.18S rDNA領域を対象にPCR増幅した後クローニングを行い,それらの塩基配列の解読を行った.得られた塩基配列をBLASTによる相同性検索したところ,いずれもグロムス属のものと最も類似していた.以上のことから,形態的,分子生物学的な調査により,ドウダンツツジ属植物にはアーバスキュラー菌根菌が定着していることが明らかになった.目標とする植物分類群に関する菌根共生の一端が新たに解明されたため.計画に大きな変更はなく,他の植物分類群,イチヤクソウ,についても同様に遺伝子解析,安定同位体解析を進めていく.DNA解析に伴う試薬,解析さらに,安定同位体の解析に用いる.得られた成果を公表する.今回招聘予定であった海外研究協力者が震災の影響で来日予定を延期することになったため,当該分を次年度に繰り越した.
家蚕濃核病ウイルスの増殖機構とその宿主特異性の分子機構

家蚕濃核病ウイルス(山梨株:BmDNV-2)は、ゲノムとして線状1本鎖DNA(VD1,VD2)を含み厳格な宿主特異性を示す小型球状ウイルスであるが、その遺伝子構造について不明な点が多く、増殖機構については全く判っていない。本研究ではBmDNV-2の増殖機構を解明する目的で、まずDNA複製機構についての回折を行った。た同時にウイスルの増殖機構を解明する目的で、ウイルスゲノムDNAの一次構造解析、およびウイルスタンパク質の機能解析を行った。これらの研究の結果、本ウイルスは今までに報告されている他の線状1本鎖DNAウイルス(パルボウイルス)とは全く異なった遺伝子構造を持つ新しいタイプのウイルスであることが判明した。まず、本ウイルスがBmDNV-1など他のパルボウイルスとは異なるDNA複製機構を有する事が示唆された。次に、本ウイルスの2種のウイルスゲノム(VD1,VD2)の一次構造が判明し、ゲノムDNA上に存在するORFの大きさや位置、そしてウイルス遺伝子の発現制御に関わると考えられる配列などが明らかになった。また、VD1/ORF2には主要構成タンパク質がコードされており、VD1/ORF3とVD1/ORF4にコードされているウイルスタンパク質(p37,p14)は共に主要構成タンパク質遺伝子のプロモーターをアクティベートする制御タンパク質である事が判明した。さらに、VD2/ORF2にコードされているウイルスタンパク質(p27)はウイルスのゲノム上に存在する全てのプロモーターをアクティベートすることが示され、p27が本ウイルスの宿主、および組織特異性を決定している分子機構を解明する上で極めて重要なタンパク質であることが推定された。本年度の研究ではBmDNV-2の遺伝子構造をより詳しく解析し、本ウイルスがパルボウイルスとは異なる新型ウイルスであることを明確にした。1.(新型家蚕濃核病ウイルス(BmDNV-2)の複製機構)パルボウイルスのゲノムDNAの末端領域は大きなヘアピン構造を形成し得る回文配列を有している。本研究では、PCR法を用いてこのパルボウイルスに特徴的な複製中間体の構造解析を行った。この結果の解析によりBmDNV-2がパルボウイルスとは異なる機構でDNAを複製する事が示され、本ウイルスがこれまでに報告のない新しいタイプのウイルスであことが強く示唆された。2.(BmDNV-2のゲノム構造解析)本ウイルスは2種のゲノム(VD1,VD2)を持つウイルスであるが、それぞれの大きさは6.6kb,6.1kbと小さく、その一次構造の決定は比較的容易である。本研究では、BmDNV-2の2種のウイルスゲノム(VD1.VD2)におけるORFの大きさや位置、ウイルス遺伝子の発現制御に関わると考えられる配列を解析し、ゲノムの性状を明らかにした。3.(BmDNV-2におけるウイルスタンパク質のコード領域同定と機能解析)本研究では、感染細胞におけるウイルス遺伝子の発現を追うと共に、ウイルスDNAの塩基配列を基にウイルスタンパク質発現プラスミドを構築し、培養細胞における一過性の発現系を用いて、ウイルスにコードされているタンパク質の機能解析を試みた。その結果、ゲノム上に存在する6つのORFからmRNAの転写が認められ、発現量に差はあるものの、VD1,VD2共にウイルス感染細胞内において発現していることが明らかになった。またこれらORFにコードされているウイルスタンパク質についても、その機能の一部が明らかになった。本研究ではBmDNV-2の増殖機構を解明する目的で、まずDNA複製機構についての解析を行った。また同時にウイルスの増殖機構を解明する目的で、ウイルスゲノムDNAの一次構造解析、およびウイルスタンパク質の機能解析を行った。