hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
試験管内での視細胞の大量調整および選択的分離法の確立

本年度は、まず、マウス、および、ラットを用いて成体眼球毛様体上皮よりスフェア法を用いて網膜幹細胞を取得する事に成功した。この幹細胞の性状を解析するために、まず、ラット胎生期(胎生14日齢)の前脳由来の神経前駆細胞と成体(6から8週齢)毛様体上皮由来網膜幹細胞の増殖能および分化能を比較検討した。その結果、網膜幹細胞は、胎生期の前能由来の神経幹細胞と比較してその増殖能は悪く、未分化な状態での細胞の維持が困難であるものの、前脳由来の神経幹細胞と異なり、感覚網膜細胞への分化能を有する事を免疫染色およびRT-PCRを用いて明らかとした。また、これらの幹細胞中に発現している遺伝子をRT-PCRで確認したところ網膜の幹細胞は前脳由来の幹細胞と異なり、網膜領域の決定遺伝子であるChx10や、Rxを発現する一方で、Pax2などの前脳得意的な遺伝子は発現していない事が明らかとなり、網膜幹細胞の特異性は、このような内在性の因子によって決定されている可能性が明らかとなった。さらに、より大型棒物であり、移植実験などに使用が容易である家兎を用いて同様の網膜前駆細胞を取得する事に成功した。更に、培地にメチルセルロースを添加する事によって、ほとんど細胞凝集がなく、網膜前駆細胞を単一細胞から培養し、個々の網膜前駆細胞の増殖分化能を検討する系を確立した。その結果、家兎の成体毛様体から取得される網膜前駆細胞は約20%が2分化能以上を有する細胞である程度未分化で増殖能があるもののあるものの、残りの80%はほとんどグリア系の細胞へと分化し、増殖能力も限られた細胞である事が明らかとなった。
ホウ酸塩融体における銀の熱力学

抗菌特性などの優れた銀含有ガラスを作製する場合、銀が貴な金属であるために思うような銀含有量が得られないという問題がある。この問題に対処するためにガラス融液中での銀の熱力学的性質を明らかにする必要がある。本研究では銀含有ホウ酸塩ガラスの作製を念頭に置き、ホウ酸塩ガラス融液中への銀の溶解度を熱力学的観点から調べた。銀のガラスへの溶解反応は酸化反応であるので、銀の溶解度は温度、酸素雰囲気に依存する。そこで、様々な組成のガラスに対して同一条件で銀の溶解度を評価するパラメータとして、酸化銀の活量係数を用いた。実際にはNa_2O-B_2O_3-Al_2O_3系を用い、この系のガラス融液と金属銀をアルミナるつぼ中で大気雰囲気下、所定温度で保持した。平衡到達後ガラス中の銀を分析し、ガラス中の酸化銀濃度、ならびに銀の活量が1、酸素分圧が0.21atmという条件を用いて、ガラス融液中での酸化銀の活量係数を計算した。酸化銀の活量係数はNa_2Oの濃度が増加すると急激に低下し、酸化銀がNa_2Oと同じ塩基性酸化物としての挙動を示すことが明らかになった。正則溶液モデルを用いて無限希薄時に酸化銀の活量係数を求め、この値に及ぼすNa_2OとAl_2O_3の影響を相互作用係数という因子で評価したところ、1423Kでそれぞれ22.1と0.9という値が得られた。また、溶解度の温度依存性より、金属銀が酸化してガラス融液に溶解する際のエンタルピー変化を見積もった。
制御化合物から紐解くかゆみ伝達におけるMrgprの役割そして創薬への応用

本研究課題では,ハイスループットスクリーニング技術により,化合物ライブラリーの中からMas関連Gタンパク質共役受容体(Mrgpr)ファミリーに分類されるMrgprA3を活性化する化合物および各種Mrgprの機能を抑制する化合物を同定する。そしてすでに発見したMrgprA3を活性化する化合物Xおよび新たに探索する制御化合物を切り口としてMrgprが関わるかゆみの発症や維持メカニズムを紐解き,さらには画期的な創薬シーズの発見につなげる。
MTH1遺伝子欠損マウスを用いた発がん研究

電離放射線や環境中に存在する化学物質、さらには生体内での通常の代謝活動によっても活性酸素が生じている。これらは様々な作用を生体にもたらすが、中でもDNAの酸化は突然変異や発がんさらには生体の老化に深く関わっていることが示唆されてきた。種々のDNAの酸化的損傷の中で、グアニン塩基の酸化はその強力な突然変異原性により注目されている。活性酸素に伴うDNA上の損傷と自然突然変異および発がんの関連を明らかにし、その過程を分子レベルで解明することを目的に、標的遺伝子組換えにより樹立したMTH1遺伝子の欠損マウスを用いて解析した。(1)アニマルセンター内のSPF飼育条件下で1年6ヶ月後に剖検したところ、MTH1遺伝子欠損マウス(MTH1^<(-/-)>は野生型(MTH1^<+/+>)マウスに比べて肺などの特定臓器において、自然発生腫瘍頻度の上昇が観察された。このことは、MTH1蛋白質の欠損により、DNA中に取り込まれる変異原性ヌクレオチドである8-oxodGTPを排除する効率が低下することで、結果的に突然変異の上昇がもたらされ発がんの誘因になるという考え方を支持し、発がん抑制におけるMTH1蛋白質の重要性を示唆している。(2)MTH1遺伝子欠損マウスの腺胃におて、H.pylori感染は、胃炎の持続と腺窩上皮の過形成を増強した。MTH1遺伝子欠損マウスでは特に、H.pylori惑染に伴って、異型度の高い病変(Atypical hyperplasia)の発生頻度が上昇した。(3)近交系C57BL6/Jマウスに戻し交配が完了したMTH1遺伝子欠損マウスを用いて、New HITECマウスとの交配によって得られる仔マウスにおける突然変異を調べた。その結果、4週齢の脾臓から抽出したDNAの解析により、MTH1遺伝子欠損マウスの方が。野生型マウスに比べて、突然変異頻度が約2倍ほど上昇していた。(4)MTH1遺伝子欠損マウスを用いて、X線によって誘発される腫瘍形成の実験を進めている。活性酸素に伴うDNAの損傷と自然突然変異および発がんの関連を明らかにし、その過程を分子レベルで解明することを目的に、標的遺伝子組換えにより樹立したMTH1遺伝子の欠損マウスを用いて解析した。(1)アニマルセンター内のSPF飼育条件下で1年6ヶ月後に剖検したところ、MTH1遺伝子欠損マウス(MTH1^<-1->)は野生型(MTH1^<+/+>)マウスに比べて肺などの特定臓器において、自然発生腫瘍頻度の上昇が観察された。このことは、MTH1蛋白質の欠損により、DNA中に取り込まれる変異原性ヌクレオチドである8-oxodGTPを排除する効率が低下することで、結果的に突然変異の上昇がもたらされ発がんの誘因になるという考え方を支持し、発がん抑制におけるHTH1蛋白質の重要性を示唆している。(2)MTH

1遺伝子欠損マウスの腺胃におて、H. pylori感染は、胃炎の持続と腺窩上皮の過形成を増強した。MTH1遺伝子欠損マウスでは特に、H. Pylori感染に伴って、異型度の高い病変(Atypical hyperplasia)の発生頻度が上昇した。(3)近交系C57BL6/Jマウスに戻し交配が完了したMTH1遺伝子欠損マウスを用いて、New HITECマウスとの交配によって得られる仔マウスにおける突然変異を調べた。その結果、4週齢の脾臓から抽出したDNAの解析により、MTH1遺伝子欠損マウスの方が。野生型マウスに比べて、突然変異頻度が約2倍ほど上昇していた。(4)MTH1遺伝子欠損マウスを用いて、X線によって誘発される腫瘍形成の実験を進めている。
温度感受性増殖制御下細胞の増殖回復を促す遺伝子の探索

温度感受性の突然変異のSV40(tsA58)ラージT抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスより樹立した機能細胞株の非許容温度での増殖停止と細胞死に関与する因子の解明と、増殖停止と細胞死を抑制する遺伝子を検索することを目的とした。肝細胞株(TLR2)、腎内皮細胞株(TKD2)、尿細管細胞株(TKC2)は、突然変異の非許容温度で増殖を停止する。この増殖停止を高濃度血清、PDGF、IGF-I及びIGF-II、bFGFを加えることで回復できるかを観察したところ、TLR2はこれらの因子によっては増殖、細胞死とも回復しなかった。TKC2は細胞死を起こす前の増殖にすべての因子が効果的であったが、細胞死の時期を変えることはできなかった。TKD2は細胞死をあまり誘起しない細胞株であるが、この細胞株ではFGFが全く効果がみられない以外は増殖を促進した。これらの結果は、細胞の分化形質によってSV40ラージT抗原の作用点が異なることを示唆するものである。また、温度シフトによるラージT抗原の機能喪失が細胞死を誘起するか否かも分化形質によって異なることが分かった。ラージT抗原との結合が知られているp53について調べたところ、三株すべてにおいて野生型のp53タンパクを特異的に認識する抗体でのみラージT抗原が免疫沈降され、不死化された細胞株では野生型のp53が機能していると考えられた、このことは、ラージT抗原による不死化と、その機能を喪失させたときの細胞死が、野生型p53の量的変動の結原と推察することができた。単純なモデルとしては、ラージT抗原によるp53の機能阻害が不敷化を誘導し、ラージT抗原の温度シフトによる不活性化が機能的p53の増加を引き起こし細胞死を誘起すると推定され、順次検証して行く予定である。
ナノセルロース複合体の界面構造制御と物性解析

同様の条件で調製・改質を行ったナノセルロースを、異なる溶媒中でポリマーと複合化し、調製溶媒と複合体の物性の関係を検討した。ポリマーマトリクスはセルローストリアセテート(CTA)を、補強材は2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル(TEMPO)酸化セルロースナノファイバー(TOCN)表面に末端アミン化ポリエチレングリコール(PEG-NH2)を導入したPEG-TOCNを使用した。調製溶媒はN,N-ジメチルアセトアミド(DMAc)、ジクロロメタン(DCM)、1,4-ジオキサン(DIO)、アセトン(ACT)を選択した。TOCN添加量は2.5%とした。PEG-TOCNを添加した際の補強効果が、用いた溶媒によって異なることが明らかになった。これらの差異は、PEG-TOCN/CTA界面におけるPEG鎖とCTAマトリクスの関係性が異なるためだと考えられる。また、CTAフィルムは溶媒種によって異なるガラス転移温度を示し、DMAc・DIOから調製した場合(グループ1)では、PEG-TOCN添加によってガラス転移温度が向上した。一方、DCM・ACTから調製した場合(グループ2)ではPEG-TOCN添加によってガラス転移温度が低下した。これらの結果から、グループ1ではグラフトPEGとCTAが相溶ではなく、PEG-TOCN/CTA界面においてCTA分子鎖が局所的に配向もしくは拘束されており、グループ2ではグラフトPEGとCTAがある程度相溶であり、PEGによる可塑化効果でCTA分子鎖の運動性が増加していることが示唆された。以上のように、調製溶媒によってPEG-TOCN/CTA界面構造が異なっており、その構造の差異が得られる複合体の物性に影響を与えることが示された。したがって、PEG-TOCNの補強効果を効率的に発揮させるには適切な調製溶媒を選択することが重要であると考えられる平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。TOCN酸化セルロースナノファイバー(TOCN)/セルローストリアセテート(CTA)複合体中の界面構造が、複合体物性に与える影響を検討した。TOCN/CTAの界面構造は、TOCN表面にポリエチレングリコール(PEG)鎖を導入することで制御した。まず、TOCN/CTA界面におけるPEG層の存在の有無による物性への影響を検討した。その結果、界面PEG層がない場合は、従来のナノセルロース/ポリマー複合体と同様、TOCNの添加によってCTAマトリクスは硬く強く、脆くなる傾向を示した。一方、界面PEG層が存在する場合、CTAマトリクスは硬く強くなると同時に、より粘り強くタフになることが明らかとなった。この結果は、界面PEG層が存在することにより、変形中のエネルギー散逸が促進され、破壊に要するエネルギーが増加したことに起因すると考えられる。また、TOCNやPEGグラフトTOCNを添加した場合でも、CTAマトリクスの光学特性はほとんど変化せず、高透明性・低複屈折性を維持した。これはTOCNやPEGグラフトTOCNがCTAマトリクス中で凝集せず均一に分散していることを示唆している。次に、TOCN表面に導入するPEGの分子量を変化させることで、TOCN/CTA界面層の厚さを制御し、その厚さが複合体物性に与える影響について検討した。この場合、導入するPEGの分子量によらず、TOCNは良分散性を維持しており、界面層厚さが与える影響のみを評価することが可能であると言える。結果として、TOCN/CTA界面層が薄いほど、ヤング率・破断強度の補強効果が大きく、破壊に要するエネルギーはある界面層厚さで最大となった。このことから、複合体を高強度化・高靭性化を両立するためには、適切な界面層厚さをデザインすることが重要であることが示唆された。当初の研究計画に従った進度で研究が進んでおり、論文化に足る精度・量のデータの蓄積を達成しているため。TEMPO酸化セルロースナノファイバー(TOCN)に対し、末端アミン化ポリエチレングリコール(PEG-NH2)をグラフト化した。本研究ではPEG-NH2の添加量を制御することにより、TOCN表面のカルボキシ基のうち、0、27、44、60、72%に分子量約2000のPEG鎖を導入することに成功した。上記の、グラフト鎖密度の異なるTOCNをセルローストリアセテート(CTA)マトリクスと複合化し、TOCN/CTA複合体を調製した。引張試験の結果から、グラフト密度が低いTOCNを添加した場合には複合体の弾性率と破断強度が向上し、その補強効果はグラフト密度が増加するのに従って減少することが明らかとなった。また、グラフト鎖密度が低い場合、複合体の延性や靭性(粘り強さ)は元のCTAと同程度であるのに対し、グラフト鎖密度が高い場合には延性や靭性が大きく向上し、複合体がよりタフになることが示された。これらの結果から、グラフト鎖密度が低い場合にはTOCNが効果的に弾性率や強度を向上させる一方で、グラフト鎖密度が高い場合にはTOCNがPEG層によって被覆されて補強効果が減少すると同時に、変形時のエネルギー散逸が増加することで、複合体が高靭性化することが明らかとなった。ガラス転移温度について、各複合体について測定を行った。その結果、TOCNおよびPEGグラフトTOCNの添加によってCTAマトリクスのTgが増加した。すなわち、TOCNやPEGグラフトTOCNの添加によってCTAマトリクスの分子運動性が抑制されることが示された。また、PEGのみをCTAと複合化した場合、CTAマトリクスのTgは減少した。

このことから、PEGの可塑化の効果が、TOCN表面へのグラフトによって減衰したことが示唆される。以上の結果より、複合体の物性を制御するため、例として高弾性率と高靭性を両立させる・熱安定性を効果的に向上させるためには、界面グラフト鎖密度を精密に制御することが重要であると示された。当初の研究計画通りの進度で研究が進捗しているため。同様の条件で調製・改質を行ったナノセルロースを、異なる溶媒中でポリマーと複合化し、調製溶媒と複合体の物性の関係を検討した。ポリマーマトリクスはセルローストリアセテート(CTA)を、補強材は2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル(TEMPO)酸化セルロースナノファイバー(TOCN)表面に末端アミン化ポリエチレングリコール(PEG-NH2)を導入したPEG-TOCNを使用した。調製溶媒はN,N-ジメチルアセトアミド(DMAc)、ジクロロメタン(DCM)、1,4-ジオキサン(DIO)、アセトン(ACT)を選択した。TOCN添加量は2.5%とした。PEG-TOCNを添加した際の補強効果が、用いた溶媒によって異なることが明らかになった。これらの差異は、PEG-TOCN/CTA界面におけるPEG鎖とCTAマトリクスの関係性が異なるためだと考えられる。また、CTAフィルムは溶媒種によって異なるガラス転移温度を示し、DMAc・DIOから調製した場合(グループ1)では、PEG-TOCN添加によってガラス転移温度が向上した。一方、DCM・ACTから調製した場合(グループ2)ではPEG-TOCN添加によってガラス転移温度が低下した。これらの結果から、グループ1ではグラフトPEGとCTAが相溶ではなく、PEG-TOCN/CTA界面においてCTA分子鎖が局所的に配向もしくは拘束されており、グループ2ではグラフトPEGとCTAがある程度相溶であり、PEGによる可塑化効果でCTA分子鎖の運動性が増加していることが示唆された。以上のように、調製溶媒によってPEG-TOCN/CTA界面構造が異なっており、その構造の差異が得られる複合体の物性に影響を与えることが示された。したがって、PEG-TOCNの補強効果を効率的に発揮させるには適切な調製溶媒を選択することが重要であると考えられる今後もTOCN/CTA界面層の構造と物性の関係について検討する。まず第一にTOCN表面のグラフト鎖密度について検討する。その後、TOCNのアスペクト比や、グラフト鎖/ポリマーマトリクスの親和性(相溶性)について検討を行う予定である。当初はTOCNのアスペクト比について検討する予定であったが、グラフト鎖/ポリマーマトリクス間の親和性や調製時に使用する溶媒が複合体物性に大きな影響を与えることが考えられるため、そちらを優先して検討する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
同系腫瘍に対する二つの異なるキラーT細胞サブセットの誘導活性化の免疫遺伝学的制御

われわれは、マウスの同系腫瘍に対する細胞障害性T細胞(CTL)の誘導から活性発現の解析を行って来た。その結果、同系腫瘍に対するCTLには少なくとも二種類のCTLサブセットが存在することを明らかにした。その一つは、誘導活性化にインタ-ロイキン2(ILー2)、あるいはL3T4陽性T細胞の存在を必要とするヘルパ-T細胞依存性CTLであり、他の一つはヘルパ-T細胞非依存性CTLである。これら異なる二つのCTLサブセットの生物学的意義、役割を示すと思われる実験デ-タとして、腫瘍細胞が血球由来の細胞である場合、このような同系腫瘍に対するCTL応答にはヘルパ-T細胞依存性CTLが対応するのに対して、それ以外の固型腫瘍に対するCTL応答はヘルパ-T細胞非依存性CTLが対応していることが明らかにされた。これら二つの異なるCTLサブセットの性状について解析した結果、BALB/c由来のイディオタイプ陽性形質細胞腫MOPC104EやA/J由来のT細胞リンパ腫L1117に対するCTL応答はL3T4陽性T細胞の存在下で誘導活性化されるCTLであり、その細胞表面のphenotypeは、Thyー1^+,Lytー1^+,2^+である。これに対して、A/J由来のメチルコラントレイン誘発肉腫S1509aやB10・D2マウス由来のラウス肉腫ウイルス誘発肉腫に対する同系CTL応答は、L3T4陽性T細胞の存在なしに誘導活性化されるCTLであり、その細胞表面のphenotypeはThyー1^+,Lytー1^+,2^+である。このヘルパ-T細胞非依存性CTLの誘導活性化にはマクロファ-ジ様アクセサリ-細胞の存在が必須であり、このアクセサリ-機能は、アクセサリ-細胞から遊離される可溶性因子(キラ-T細胞活性化因子,KAF)によって代行される。これらのCTL応答はHー2D領域の遺伝子によって支配されているが、この遺伝子はアクセサリ-細胞から遊離されるKAFの産生を制御することによってCTL応答を調節しているのではないことが明らかになった。
経済経営数学の直観的教授法の基礎研究

本研究計画は、経済数学教育におけるイメージを重視した直観的理解を促す為の教材ならびにカリキュラム開発を目的とする基礎研究を行うことを目的とし、幾何学的直観、経済学的直観、それ以外の直観につき、経済数学の入門段階からより高度な段階において組織的に直観的解説・理解の為のリソースの開発を行うこととした。上記の目的を果たすための基礎研究として、学部レベルの教程、大学院レベルの教程の双方につき、文献調査及び関連研究者との意見交換を踏まえつつ教材の開発ないし素材の開発を行った。本研究計画は、経済学及び経営学の為の数学(以下、経済数学と称す。)教育におけるイメージを重視した直観的理解を促す為の教材ならびにカリキュラム開発を目的とする基礎研究を行うことを目的とし、幾何学的直観、経済学的直観、それ以外の直観につき、経済数学の入門段階からより高度な段階において組織的に直観的解説・理解の為のリソースの開発を行う計画である。平成24年度は東日本大震災に起因する遅延を取り戻しつつ、上述の目的に適した内外の文献を探索し調達して内容の解析作業を進め、仙台東北を訪れた数理経済学研究者と意見交換し、それと並行して前年度の東北大学経済学部の経済経営数学の講義資料開発に引き続いて、東北学院大学経済学部の経済数学(約30レクチャー)を開発し、直観的な理解を教程に盛り込む際の現実的課題について、より多様な数学的準備と課題を持つ学生を対象として、実際の学生の反応を参考しつつ考察を進めた。大学院レベルの教程に関しては講義教材という纏まった形での検討を行う機会は無かったが、1「行列のテンソル積の幾何学的な意味に関する考察」、2「非負行列に関するフロベニウスの定理の幾何学的意味に関する考察」、3「割引現在価値の概念を通じての完全微分・積分因子の直感的理解に関する考察」をmimeoに取り纏めた。平成24年度東北学院大学経済学部経済数学講義資料本研究計画は、経済学及び経営学の為の数学(以下、経済数学と称す。平成25年度は前年度の遅延を取り戻しつつ、上述の目的に適した内外の文献を探索し調達して内容の解析作業を進め、仙台東北を訪れた数理経済学研究者と意見交換した。学部レベルの教程については、前々年度の東北大学経済学部の経済経営数学の講義資料開発、前年度の東北学院大学経済学部の経済数学開発を踏まえて、教材の実用試験を通じての改善を行った。大学院レベルの教程に関しては、平成24年度に取り纏めた、1「行列のテンソル積の幾何学的な意味に関する考察」、2「非負行列に関するフロベニウスの定理の幾何学的意味に関する考察」、3「割引現在価値の概念を通じての完全微分・積分因子の直感的理解に関する考察」について、収集した関連文献を調査し関連研究の有無の情報収集を行いつつ考察を進めた。また、新たに4「積行列の転置行列と価格・数量双対性に関する考察」、5「行列の列空間と転置行列のゼロ空間の関係と価格・数量双対性に関する考察」を行い前者をmimeoに取り纏めた。平成25年度東北学院大学経済学部経済数学講義資料本研究計画は、経済数学教育におけるイメージを重視した直観的理解を促す為の教材ならびにカリキュラム開発を目的とする基礎研究を行うことを目的とし、幾何学的直観、経済学的直観、それ以外の直観につき、経済数学の入門段階からより高度な段階において組織的に直観的解説・理解の為のリソースの開発を行うこととした。平成23年度は東日本大震災の影響の為に当初計画から遅延しつつも、上述の目的に適した内外の文献を探索し調達して内容の解析作業を限定的ながら進めることができた。他方、それと並行して経済学部第2年次配当用4単位科目(約30レクチャー)の経済経営数学の為の講義資料を新たに開発した。教材の開発に際しては、直観的な理解を教程に盛り込む際の現実的課題についても実際の学生の反応を参考しつつ考察を進めた。また教材の開発に際しては、購入した内外の文献に加えてインターネット上で利用可能である内外各大学の経済数学科目についても資料を収集し教程内容やベストプラクティスを調査し取材するように努めた。大学院レベルの教程に関しては講義教材という纏まった形での検討を行う機会は無かったが、より個別テーマの教材開発として、計量経済学で用いられる行列代数の直感的理解の為の考察を進めた。特に行列のクロネッカー積の性質、射影行列や線型空間の基本分解との関係などについて考察を進めた。後者の論考は未だ取り纏められていないので次年度早々に仕上げる予定である。平成23年度東北大学経済学部経済経営数学講義資料http://www.econ.tohoku.ac.jp/akita/lecture/index.html

本研究計画は、経済学及び経営学の為の数学(以下、経済数学と称す。)教育におけるイメージを重視した直観的理解を促す為の教材ならびにカリキュラム開発を目的とする基礎研究を行うことを目的とし、幾何学的直観、経済学的直観、それ以外の直観につき、経済数学の入門段階からより高度な段階において組織的に直観的解説・理解の為のリソースの開発を行う計画である。平成26年度は、上述の目的に適した内外の文献を探索し調達して内容の解析作業を進めつつ、1「行列のテンソル積の幾何学的な意味に関する考察」、2「非負行列に関するフロベニウスの定理の幾何学的意味に関する考察」、3「割引現在価値の概念を通じての完全微分・積分因子の直感的理解に関する考察」、4「積行列の転置行列と価格・数量双対性に関する考察」、5「行列の列空間と転置行列のゼロ空間の関係と価格・数量双対性に関する考察」のうち、特に1,3、4について首都圏、関西の数理経済学研究者3名と意見交換し考察を深め、結果をmimeoに取り纏めた。経済理論本研究計画においては、幾何学的直観、経済学的直観、それ以外の直観につき、経済数学の入門段階からより高度な段階において組織的に直観的解説・理解の為のリソースの開発を行う計画だが、初年度の東日本大震災の影響により研究活動全般が大きく遅延した。遅延した関連文献の整理・解析作業はある程度予定を取り戻したが新規調達はその為、なお遅延しており、残された時間を有効活用するよう努めたい。初年度に引き続き、他大学の学生対象の教材開発とその利用を通じて、典型的教程において何についての直感的理解が求められるかについて具に検討する機会を得た。幾何学的直観、経済学的直観、それ以外の直観という分類の観点からすると、平成24年度は、1「行列のテンソル積の幾何学的な意味に関する考察」において、二つの行列A、Bのテンソル積の列空間に対する射影を表す射影行列が、行列A、Bそれぞれの列空間への射影行列同士のテンソル積によって与えられることを手がかりに、テンソル積の幾何学的な意味を検討した。また2「非負行列に関するフロベニウスの定理の幾何学的意味に関する考察」においては、可視化可能な二次元、三次元に限定して最大固有値が1を超える必然性を視覚的に理解させる方法を検討した。経済学的直観についても3「割引現在価値の概念を通じての完全微分・積分因子の直感的理解に関する考察」において、いわゆる積分因子が経済学の割引因子に対応することの認識を出発点に、それがなぜ完全微分の条件を導くのかについての経済学的直観を考察した。本研究計画は、幾何学的直観、経済学的直観、それ以外の直観につき、経済数学の入門段階からより高度な段階において組織的に直観的解説・理解の為のリソースの開発を行うものだが、初年度の東日本大震災の影響により全般が大きく遅延した。遅延した関連文献の整理・解析作業は昨年度にある程度迄取り戻したが新規調達は遅延し、平成24年度に取り纏めた、1「行列のテンソル積の幾何学的な意味に関する考察」、2「非負行列に関するフロベニウスの定理の幾何学的意味に関する考察」、3「割引現在価値の概念を通じての完全微分・積分因子の直感的理解に関する考察」についてについての関連文献資料の有無の調査と解析の時間が切迫した。
神経系進化における刺胞動物神経環の位置づけ：遺伝子発現解析によるアプローチ

散在神経系は系統発生的に最も原始的な神経系と考えられている。散在神経系は一般に一様な神経網からなると考えられているが、神経細胞の集中を伴う明瞭な神経線維束も観察されており、それらは系統発生的に最も古い中枢化である可能性がある。本研究では、ヒドラの口周囲神経線維束、神経環に着目し、神経環に発現している遺伝子を差次的cDNAクローニング法とin situハイブリダイゼーション法により探索した。また神経環に発現する候補遺伝子として、我々はシナプシンを同定し、機能解析を行った。シナプシンは、神経環を含めたヒドラ神経系の一部の神経細胞に発現し、シナプシンの異所性発現は神経突起の形態変化を生じた。ヒドラなどの刺胞動物にみられる神経環(nerve ring)は、系統発生的に最も古い神経回路のひとつと考えられる。神経環の形成や機能に関わる遺伝子群を同定することにより、神経系の初期進化過程について手がかりを得ることができる。本研究では、既に神経環に発現することが明らかにできたsynapsinについて局在および機能解析を進めると共に、新たな神経環関連遺伝子の同定を進めている。1)トランスジェニック・ヒドラによるsynapsinの機能解析synapsinが神経細胞に過剰発現するトランスジェニック・ヒドラを24年度に得たが、導入したsynapsin遺伝子の発現がモザイクであった。このため、25年度はより発現領域の大きな個体の選抜を行い、全身広範囲の神経細胞に導入遺伝子が発現する系統を得た。このトランスジェニック・ヒドラは摂食行動に異常があり、現在、原因を調べている。また、このトランスジェニック・ヒドラでは、元々synapsinを発現していないGLWamide陽性神経細胞に導入したsynapsin遺伝子が発現している。そこで、このsynapsinを異所性に発現しているGLWamide陽性神経細胞の形態異常を検討したが、大きな異常は検出できなかった。一方、ヒドラsynapsinの発現を阻害するRNAi型トランスジェニック・ヒドラについては、今年度、5系統樹立できた。2)ネマトステラsynapsinの局在・機能解析ヒドラではsynapsinは神経環など一部の神経細胞だけに発現しているが、同様の発現様式が他の刺胞動物神経系でも認められるのかどうか明らかにするため、ネマトステラsynapsinに対する抗体を作成し、免疫染色による局在解析を行った。抗体価は上昇したが、特異的な染色像は残念ながら得られなかった。3)新たな神経環関連遺伝子の同定今年度、in situハイブリダイゼーション法による神経環関連遺伝子約70クローンのスクリーニングを行い、新たに1種、有望な候補遺伝子が同定できた。ヒドラなどの刺胞動物でみられる神経環(nerve ring)は、系統発生的に最古の神経回路と考えられる。神経環の神経系進化における位置づけを明確にするために、ヒドラ神経環に発現する遺伝子の同定・機能解析を行なっている。本年度は、以下の研究を行った。1)HySynの局在様式の検討:これまでの我々の研究で神経環に発現することが明らかになったHydra synapsin (HySyn)について、免疫電子顕微鏡法によりHySynたんぱく質の局在を検討した。その結果、synaptic boutonと思われる部分で、大型有芯小胞が集積している部分に一致して発現が認められた。この結果は、HySynが大型有芯小胞の集中化に必要であることを示し、シナプス伝達もしくは神経分泌の制御に重要であることを示唆している。2)ネマトステラsynapsin(NvSyn)の発現解析:他の刺胞動物のsynapsinについても解析を行うため、NvSyn synapsinに対するin situハイブリダイゼーション法を行った。触手や口丘周囲にシグナルがみられたが、シグナルは弱く分布様式の決定には、さらなる検討が必要と思われる。3)トランスジェニック・ヒドラの作成:HySyn-GFP融合タンパク質を神経細胞に過剰発現するトランスジェニック・ヒドラを作成した。また、RNAiトランスジェニック・ヒドラについては、ベクターを作成し、共同研究者に送り、トランスジェニック・ヒドラの作成を依頼した。4)Synapsin以外の神経環発現遺伝子の同定と機能解析:これまでにdifferential cloning法により得られている神経環発現候補遺伝子のデータを解析・整理し、同一遺伝子に由来するクローンの整理を行い、in situハイブリダイゼーション法を行うために必要なRNAプローブの作成を進めている。刺胞動物の神経環は、系統発生的に最古の神経回路のひとつと考えられている。本研究では、ヒドラ神経環に発現する遺伝子を同定し、その機能を調べることにより、神経回路の進化に関する手がかりを得ることを目的とした。研究開始時、既に神経環に発現することを突き止めていたシナプスタンパク質synapsinに関しては、1)遺伝子改変ヒドラを用いた機能の検討、2)他のモデル刺胞

動物であるネマトステラ(花虫類)でのsynapsinの局在について解析を行った。また、3)synapsin以外の神経環発現遺伝子の探索を行った。1)蛍光たんぱく質で標識したsynapsinを異所性に発現する遺伝子改変ヒドラ2系統と、synapsinの発現を抑制する遺伝子改変ヒドラを作成した。26年度の解析で、本来synapsinを発現しない神経細胞にsynapsinを強制的に発現させると神経突起の形態が変化し、より大型でより多くの瘤状構造(シナプス小胞が集積する領域)を形成することが示唆された。2)ネマトステラのsynapsinに対して抗体作成を行った。作成した抗体を用いた免疫染色により、ネマトステラ散在神経系におけるsynapsinの局在を調べた。その結果、口周囲など一部の神経細胞のみsynapsinを発現するという、ヒドラと類似した発現パターンがネマトステラでも認められた。1)と2)の結果から、散在神経系の一部(神経環や口周囲など)の神経細胞はsynapsinを発現し、シナプスの機能が他の神経細胞とは異なっていることが示唆された。3)神経環の存在する頭部に発現する遺伝子の候補として540遺伝子の相補的DNAを得たが、このうち約360遺伝子に対してin situハイブリダイゼーション法による発現解析を行った(H26年度は155遺伝子について実施)。今後、神経環近傍に発現している遺伝子について機能解析を進める。神経科学1)ヒドラsynapsinの局在様式の検討synapsinを発現する頭部RFamide陽性シナプスとsynapsinを発現しないGLWamide陽性シナプスの構造を免疫電子顕微鏡法により比較する予定であった。この実験は、他大学の電子顕微鏡を借りて研究を行う必要があったが、今年度、研究棟の新設・研究室の移動、学科長・大学院新設など学内業務量増大のため、十分な時間がとれず実施できなかった。2)ネマトステラsynapsinの発現解析ネマトステラsynapsinに対するペプチド抗体作成は行ったが、抗体が免疫染色に適さず、再度抗体作成を行う必要がある。3)トランスジェニック・ヒドラによるsynapsinの機能解析異所性過剰発現型、機能阻害型のいずれもトランスジェニック系統が得られた。このうち、異所性過剰発現型については、摂食行動の異常がみられること、神経細胞の形態に大きな影響が見られないことなどが明らかとなったが、synapsin過剰発現がシナプス構造やシナプス可塑性に与える影響が評価できていない。一方、機能阻害型については今年度トランスジェニック系統が得られたので今後解析を進める必要がある。4)synapsin以外の神経環発現遺伝子の同定と機能解析25年度は、実験補助者を活用し約70クローンの候補遺伝子のスクリーニングを行った。研究速度を上げるため、プロトコルの改良などの工夫を行ったが、予定したスクリーニング数には達しなかった。
LOTUSによる神経再生阻害受容体PirBの制御

申請者は、COS7細胞に強制発現させたPirBに対して精製LOTUSが結合することを見出した。このLOTUS-PirB結合を更に検証するために、ストレプトアビジン結合タンパク質(SBP)融合のLOTUS(SBP-LOTUS)とPirBの両者を強制発現させたCOS7細胞の可溶化液に対しストレプトアビジン樹脂を用いてpull downassayを行ったところ、精製産物中にSBP-LOTUSとPirBの両者が検出されることから、LOTUSはPirBと相互作用することが明らかとなった。次に、LOTUS結合がPirBの分子機能に及ぼす影響を検証するために、PirBリガンドであるNogoとPirBとの結合に対するLOTUSの影響を調べたところ、PirB単独を強制発現させたCOS7細胞にNogoは結合するが、LOTUSおよびPirBの両者を強制発現させたCOS7細胞にはNogoはほとんど結合しないことを明らかにした。さらに、PirBの神経突起伸長阻害作用に対するLOTUSの影響を検討した。PirBを高発現するマウス小脳顆粒細胞はNogo等の神経再生阻害因子により神経突起伸長が阻害される。しかし、この神経細胞はPirBと同じリガンド分子を受容し、同様な機能を有するNgR1も発現しており、LOTUSがNgR1拮抗作用を有することから、PirBに対する拮抗作用を特定化できない。そこで、NgR1欠損マウスの小脳顆粒細胞のNogoに対する応答性を調べたところ、Nogoにより神経突起伸長は阻害されたが、精製LOTUSタンパク質を添加した神経細胞ではNogoによる神経突起伸長阻害がレスキューされた。申請者は、COS7細胞に強制発現させたPirBに精製LOTUSが結合することを見出した。このLOTUS-PirB結合を更に検証するために、種々の精製LOTUSタンパク質濃度においてPirBを強制発現させたCOS7細胞に対する結合実験を行い、LOTUSとPirBとの結合親和性を明らかにした。次に、PirBの神経突起伸長阻害作用に対するLOTUSの影響を検討した。PirBを高発現するマウス小脳顆粒細胞は神経再生阻害因子Nogoにより神経突起伸長が阻害される。また、マウス後根神経節細胞にもPirBが高発現しており、Nogoにより成長円錐崩壊が誘起される。しかしながら、これらの神経細胞にはPirBと同じリガンド分子を受容し、PirBと同様な機能を有するNogo receptor-1(NgR1)も発現しており、LOTUSがNgR1拮抗作用を有することから、PirBに対する拮抗作用を特定化できない。そこで、NgR1欠損マウスの小脳顆粒細胞および後根神経節細胞におけるNogoの応答性に対するLOTUSの影響を検討した。NgR1欠損マウス小脳顆粒細胞はNogoにより神経突起伸長が阻害されたが、精製LOTUSタンパク質を添加したNgR1欠損マウス小脳顆粒細胞ではNogoによる神経突起伸長阻害がレスキューされた。さらに、Nogoにより誘起されるNgR1欠損マウス後根神経節細胞の成長円錐崩壊が、精製LOTUSタンパク質の添加によりレスキューされることが判明した。現在、Nogoにより誘起される、NgR1欠損マウス小脳顆粒細胞および後根神経節細胞の神経突起伸長阻害がPirBを媒介しているか否かを検証するために、電気穿孔法やウイルス感染法を用いたshRNAによるPirBノックダウン実験を遂行中である。本年度の研究計画(LOTUS-PirB相互作用、PirBリガンド-PirB結合に対するLOTUSの分子機能および神経細胞におけるPirBの神経突起伸長阻害作用に対するLOTUSの抑制効果に関する検証)が概ね順調に進んでいることが理由として挙げられる。神経薬理学NgR1欠損マウスの小脳顆粒細胞を用いて、Nogoの他に2種存在するPirBリガンド(MAG、OMgp)の応答性に対してLOTUSが抑制できるか否かについて検証する。さらに、PirBを高発現するマウスの後根神経節細胞においても同様の実験を行う。
プログラムモデルによるソフトウェア保守の自動化に関する研究

1.OLIT(Open Look Intrinsics Toolkit)のうちで特にmenuButtonに着目し,35個のターミナルプランと17個の抽象化プランを抽出した.そして,これらのプランをプログラム合成系に適用し,プランを用いてC++のソースプログラムを半自動的に合成できることを確認した.さらにこの実験を通じて,プランにおいては変数だけではなく,関数名や定数が重要である,変数の型に関する情報も保持することが望ましい,などが今後の課題として明らかになった.2.プログラムプランをOODB(オブジェクト指向データベース)に格納するためのクラス設計を行い,それをC++で実現した.プランは設計上では5個のクラスで構成されたが,実現に際してはさらに4個のクラスを追加した.プランを扱う際には,ネットワーク状に結合されたオブジェクトを正しくコピーする必要があることが明らかになり,木構造やネットワーク構造,リスト構造など,任意の構造のオブジェクトを正しくコピーするための機構を開発し,上記のプログラムプランの実装に適用し,正しく動作することを確認した.3.ソースプログラムのデータフロー解析を行い,プログラムの複雑さを示す余波複雑度を計算するツール試作した.そしてプログラム保守の実験を行い,この余波複雑度が,ソースコードの行数,McCabeの閉路複雑度などの尺度よりも,プログラムの保守性とより強い相関を持つことを確かめた.以上のように,本研究では,プログラム保守作業においてもっとも時間を必要とする作業であるプログラム理解を支援するために,プログラムプログラムプランの収集ならびに管理に関する研究を行った.また保守に必要な作業量を事前に見積もるための尺度として,余波複雑度が有効であることを確かめた.1.OLIT(Open Look Intrinsics Toolkit)のうちで特にmenuButtonに着目し,35個のターミナルプランと17個の抽象化プランを抽出した.そして,これらのプランをプログラム合成系に適用し,プランを用いてC++のソースプログラムを半自動的に合成できることを確認した.さらにこの実験を通じて,プランにおいては変数だけではなく,関数名や定数が重要である,変数の型に関する情報も保持することが望ましい,などが今後の課題として明らかになった.2.プログラムプランをOODB(オブジェクト指向データベース)に格納するためのクラス設計を行い,それをC++で実現した.プランは設計上では5個のクラスで構成されたが,実現に際してはさらに4個のクラスを追加した.プランを扱う際には,ネットワーク状に結合されたオブジェクトを正しくコピーする必要があることが明らかになり,木構造やネットワーク構造,リスト構造など,任意の構造のオブジェクトを正しくコピーするための機構を開発し,上記のプログラムプランの実装に適用し,正しく動作することを確認した.3.ソースプログラムのデータフロー解析を行い,プログラムの複雑さを示す余波複雑度を計算するツール試作した.そしてプログラム保守の実験を行い,この余波複雑度が,ソースコードの行数,McCabeの閉路複雑度などの尺度よりも,プログラムの保守性とより強い相関を持つことを確かめた.以上のように,本研究では,プログラム保守作業においてもっとも時間を必要とする作業であるプログラム理解を支援するために,プログラムプログラムプランの収集ならびに管理に関する研究を行った.また保守に必要な作業量を事前に見積もるための尺度として,余波複雑度が有効であることを確かめた.
地域組織活動を通じた地域づくりにかかわる看護固有の役割

保健婦(士)は看護の専門性を発揮させながら地域づくりに貢献しており、保健婦(士)がその育成に責任をもつ地域保健推進員活動も、住民の力を活かして行う地域づくりに向けた活動である。そこで、地域保健推進員活動を中心に、保健婦(士)が育成に関わる住民組織活動を広く捉え、この活動を発展させていく過程における保健婦(士)の認識と住民側の立場である組織の成員の認識を調べることにより、地域づくりにおける看護固有の役割を明らかにすることをめざした。地域づくりをめざした活動に意欲的に取り組んでいる岐阜県内5市町村の保健婦に協力を得て、面接調査を実施した。地域保健推進員等の住民側の協力者と協働で地域づくりをめざした活動について、活動の経過、その過程における保健婦の認識を調ベ、保健婦(士)が看護の専門性を発揮して果たしている役割を検討した。保健婦(士)は、行政サービスの枠組みで行う地域保健活動としてのあり方を重視しながら、看護固有の援助のあり方を重視して、住民側の協力者に関わり協働活動を行うという役割を発揮していることを再確認した。重視している看護援助のあり方は、住民側協力者を援助の支え手として捉えて働きかけると同時に、援助の受け手としても認識して働きかけ育成しているという特徴があった。住民協力者側の認識としては、近隣住民同士が生活の営みの中で助け合い支え合う意識は当然もっているものであり、この意識を現代の地域社会の状況にあわせて育てていくために、住民側も保健婦(士)を活用するという認識をもつことを確認した。地域づくりに向けてさらに保健婦(士〉が貢献できる可能性が確認できた。今後はその方法について検討する必要があると考えられた。そこで、保健婦(士)が地域づくりをめざして行う活動の実態と特徴、推進員活動を発展させていく過程における保健婦(士)の認識を調べることにより、この活動における看護固有の役割を明らかにすることをめざした。1.保健婦(士)が地域づくりをめざして行う活動の実態調査千葉県内市町村保健婦(士)に、地域づくりをめざした活動の実態調査を実施した。保健婦(士)の行う地域づくり活動は、(1)住民との協働活動(2)住民の身近な場で行う活動(3)健康増進への支援活動(4)共通の健康問題をもつ人同士の交流支援活動(5)在宅ケア・育児等支援体制づくり活動の5つであった。これらは、活動の目標という点からみると、住民個々の問題解決能力の向上、生活共同体の営みの中で生活を豊かにする取り組みの促進、サービス資源の整備・拡充という側面をもって地域づくりに貢献している特徴があった。2.地域保健推進員活動事業を担当する保健婦(士)の認識の実態調査千葉県内3市町の地域保健推進員活動事業担当保健婦(士)に協力を得て、本事業展開過程における地域づくりに関する保健婦(士)の認識を捉え、ここで果たしている保健婦(士)の役割を検討した。保健婦(士)は、行政サービスの枠組みで行う地域保健活動としてのあり方を重視しながら、看護固有の援助のあり方を重視して、推進員を育成し協働活動を行うという役割を発揮していることが確認できた。以上の結果を基に、岐阜県内市町村保健婦(士)に調査を実施した。今後、検討を行う予定である。
部類記の調査に基づく宮廷儀礼変容課程の基礎的研究

部類記とは、宮廷でなされた様々な儀礼に関して、過去の日記などを集めて編纂された先例集である。平安時代以降、先例・故実を知っている貴族が宮廷の中で重んじられるようになり、こうした部類記が数多く作られた。本研究では、京都大学総合博物館が所蔵する勧修寺家文庫の部類記を対象に、その目録を作成し、同時に、勧修寺家の祖である藤原為房の日記、大記の写本調査を行って、宮廷儀礼の継承のあり方について考察した。本研究では、(1)おもに宮廷儀礼を運営するために製作された部類記と呼ばれる書物について、研究に活用するうえで利便性があるような詳細な目録を作成すること、および、(2)そこでの調査成果を基礎として、部類記に関する基礎的な考察をおこなうこと、の2つの目標を掲げている。本年度は、この2つの目標のうち、とくに(1)の目録作成のための作業を重点的におこなうことを課題とし、比較的まとまった分量の部類記が現存している勧修寺家文書(京都大学総合博物館所蔵)を対象に設定して調査をおこなった。これに関しては、所蔵機関などの協力のもと、おおむね計画どおりに進めることができ、予定していたほぼすべての調査を終えることができた。ただし、諸般の事情から閲覧が叶わなかった史料が数点存在し、次年度以降に補足的な調査をおこないたいと考えている。また、本研究の最終的に目指すところは、部類記の調査から宮廷儀礼の変容過程を描き出す点にあり、そのためには、宮廷儀礼そのものの多角的な考察が不可欠であることも間違いないと考える。そして、儀礼を研究するにあたっては、儀礼を実際に開催する儀場やそれを取り巻く都市空間をいかに具体的に理解できるかが重要な課題となろう。このような観点のもと、本年度は、周縁地域という視点から都市の変容を考えた論文を1本発表し、また、宮廷儀礼と密接なつながりのある平安京内部の問題についても、後院という題材を用いて2度の口頭発表をおこなった。いずれも部類記を直接的に扱った儀礼研究ではないものの、本研究を意義深いものとするうえで資するところが大きい作業だつたものと考える。本研究では、(1)おもに宮廷儀礼を運営するために製作された部類記と呼ばれる書物について、研究に活用するうえで利便性があるような詳細な目録を作成すること、および、(2)そこでの調査成果に基づいて、部類記に関する基礎的な考察をおこなうこと、の2つの目標を掲げている。3年間の研究期間のうちで2年目にあたる本年度は、この2つの目標のうち、(2)にむけての基礎的作業をおこなった。昨年度おこなった(1)の目録作成は、京都大学総合博物館所蔵の勧修寺家文書に含まれる部類記を当面の対象としたものであったが、それを(2)の考察へ移すにあたっては、対象とした勧修寺家の特色を記録の伝来という形で整理する作業が不可欠と思われる。そして、その格好の素材となるのが、勧修寺家の祖である藤原為房の日記(大記)がいかに書写され、どのように伝来しているかという問題であろう。そこで本年度は、為房の日記に関する詳細な調査を行うことを主要な課題とした。現存する大記の写本は、約20機関が所蔵しているが、本年度はそのうちの10機関を実際に訪れて資料を閲覧し、写本系統を明らかにするための調査をおこなった。日程など種々の理由から閲覧が叶わなかった残りの写本については、次年度に調査を行い、より有効的で充実した調査成果を期したいと考えている。また、本研究の最終的な目標は部類記を用いて宮廷儀礼の変容過程を明らかにすることだが、そうした点と密接に関係すると考える個別研究もおこない、学会発表と学会誌における公表をした。上記の調査とあわせて、本研究を意義深いものとするうえで資するところが大きいものと考える。本研究の最終年度にあたる平成21年度には、前年度までの調査の補足と総括をおこなった。本研究の第一の目的は、部類記とよばれる書物について利便性のある目録を作成することにあった。その目的のもと、京都大学総合博物館が所蔵する勧修寺家文庫を対象に調査を遂行し、平成21年度には、その成果を「勧修寺家文庫所蔵部類記目録(稿)」と題して公刊することができた。種々の日記・記録を収載することに特質のある部類記は、書名のみではどのような史料を含むかが判然としないため、今回作成した目録では、内容を可能な限り明示することにつとめた。目録化しえた部類記はわずか65点にすぎないが、利便性のある目録の姿を提示できたものと考える。また、部類記の史料的価値を対比的に捉える素材として、前年度より、勧修寺家の祖である藤原為房の日記、大記の写本調査をおこなってきた。平成21年度には、補足的な調査も終えることができ、その成果を「大記写本一覧(稿)」と題して刊行した。調査した写本は、23機関が所蔵する合計85種類におよぶ。

マイクロフィルムや写真帳を利用することもあったが、所蔵機関を訪れ、実際に閲覧することを基本とした。いまだまとまった翻刻がない大記という院政期の日記史料について、今後、翻刻作業をおこなううえでの基盤となるような重要な成果であるものと考える。そのほか、宮廷社会の様相を明らかにする図書1本(共著)と、口頭発表を1回おこなった。
DNAメチル化とヒストン修飾による骨格原基細胞の分化制御

細胞が分化や決定を受ける時にはクロマチン構造が変化する。その変化には、DNA配列のCpGのシトシン残基のメチル化とヒストン末端の翻訳後修飾のパターンが関わる。本研究は骨格系細胞分化におけるそれらの変化を解析したところ、ヒストン末端のH3K9メチル化を担う酵素群が分化に伴って発現がダイナミックに変化し、さらにその基質の局在も変化することを見いだした。またヒストン修飾を変化させると分化機能にも影響を及ぼすことがわかった。クロマチン構造は遺伝子発現を調節する重要な要素であり、このクロマチン構造を維持あるいは変化させるのは、DNA配列のCpGメチル化とヒストン修飾である。本研究は骨格系細胞におけるそれらのエピジェネティックな変化を解析し、分化とどのように関わるかを解析することを目的としている。今年度は以下の結果を得た。1)骨格系細胞分化におけるヒストン修飾酵素の発現変動を解析した。ヒストン修飾酵素であるsetdb1, chd7, EZH2 G9a GLPなどの発現を確認し、それらが分化に伴って、一時的に増加しそれ以降経時的に減少することを見出した。またそれらの発現変動の多くは、分化に伴って発現が変化するLine-1フラグメントを有する複数の遺伝子と類似していた。2)ヒストンメチル化酵素阻害による効果の検討骨格系細胞分化においてG9aが特徴的な分化変動を示すことから、G9aの阻害を行うBIX 01294を用い、G9a-HMTase.の阻害剤による効果を検討した。10T1/2細胞においてsox9の発現が上昇していることがわかった。一方でPPARgamma, osterixなどは影響を受けなかった。一方でLine-1フラグメントを有する複数の遺伝子の発現はむしろ上昇していた。3)ヒストン修飾酵素抗体によるChip解析ならびに免疫組織化学Chip解析を行う予備的検討として、各抗体の特異性をチェックした。具体的には、各種各社の抗体についてGAPDH promoter近傍をターゲットとした、Chip解析ならびに、共焦点顕微鏡による細胞内局在を比べた。抗体はH3, H3K9me0, me1, me2, me3を用いたところ、とりわけme2の特異性がメーカーにより異なるため、結果の解釈に注意が必要であることがわかった。それらの抗体を用い、現在遺伝子プロモーター部位のChip解析を行っている。クロマチン構造は遺伝子発現を調節する重要な要素であり、このクロマチン構造を維持あるいは変化させるのは、DNA配列のCpGメチル化とピストン修飾である。今年度は以下を行った1)骨格系細胞分化におけるヒストンメチル化酵素阻害による効果の検討マウス胎児由来初代培養骨芽細胞、骨芽細胞様細胞株ST2、胎児由来線維芽細胞株10T1/2それぞれを用いてH3K9meヒストンメチル化酵素阻害BIXあるいはshRNAによるノックダウンを行いそれらの影響を解析した。BIXあるいはshRNAによるノックダウンではosterix,runx2 osteopontinなどの遺伝子は大きな影響を受けなかった。一方で、前年度の結果で見られたline配列群は発現が上昇した。また同部位のH3K9me2の結合もノックダウンにより減少していることをChipで確認した。2)10T1/2細胞からの分化転換におけるヒストンアセチル化酵素阻害の影響胎生線線維芽細胞株10T1/2細胞は脱メチル化活性をもつ5aza-cytidineで筋肉、脂肪細胞をまたわずかであるが軟骨細胞も生ずることが知られている。ま分化転換におけるエピジェネティックな変化が分化転換に及ぼす変化を解析する目的で、5aza-cytidineとヒストンアセチル化酵素阻害を用いることによりその影響を調べた。5aza-cytidine単独では筋肉細胞と脂肪細胞を豊富に生じる。一方処理後長期にわたって観察したが、軟骨細胞は全く生じなかった。5aza-cytidineとTSA(Tricostatin A)の共存下では筋肉細胞はほとんど消失し、脂肪細胞と若干の軟骨基質を生じるコロニーを形成した。本研究は、骨格系細胞におけるそれらのエピジェネティックな変化を解析し、分化に伴いどのように変化するか、エピジェネティックな変化がどのような機能的役割を持つか解析することを目的としている。前年度までの研究でin vitroのヒストンメチル化酵素阻害による分化への影響が見られたことから、続いてin vivoの解析を行った。まずin vivoでの発現局在の解析を行うために、免疫組織学的解析、ウェスタンブロットによってタンパクの局在を、またreal time PCRによってmRNAの局在を調べた。骨格系分化のモデルとして長管骨のgrowth plateの軟骨分化における発現局在を詳細に解析した。ヒストンメチル化酵素にはG9a, GLP, SETDB1, PRDM2, SUV39H1とSUV39H2の5種類存在するが、すべてgrowth plateで発現が認められた。mRNA、タンパクともに、前肥大軟骨から肥大軟骨にかけて発現の増加が認められた。そのヒストンメチル化酵素群の発現の増加に伴いさらに、H3K9me1,3の局在も増加していた。