hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵β細胞におけるクロマチン構造タンパク質HMGN3 の機能解明

High mobility group N (HMGN)の機能解析により次の結果を得た。(1)HMGN3は膵臓の内分泌細胞で高発現しており、その欠損マウスは糖尿病様の表現型を示した。(2)HMGN3はスプライシング因子と相互作用している可能性がある。(3)線維芽細胞にHMGN3を過剰発現しても遺伝子発現にほとんど影響しないが、膵β細胞由来株細胞には多大の影響を与えた。(4)HMGN1の過剰発現ではHMGN3と逆の結果が得られ、HMGN1はPCNAに結合することでそのクロマチンとの相互作用を促進した。クロマチン構造蛋白質であるHMGNファミリー蛋白質はクロマチンに結合し様々な核内反応の制御において重要な役割を担っていることが示されてきた。一方で、HMGNファミリー蛋白質がどのような高次生命現象の制御に関与しているかは不明な点が多い。また、HMGNファミリー蛋白質間での機能的な重複性などに関しても不明である。そこで、独自に作成したHMGNファミリー蛋白質全てに対する抗体、遺伝子欠損マウス、および培養細胞系を用いて、上記の解明に取り組む。特に本研究では組織特異的発現が認められるHMGN3に着目し、多くの組織に偏在するHMGN1との比較も含めて解析した。得られた結果1)HMGN3は他のメンバーと異なり脳や膵臓で発現が高い。2)HMGN3欠損マウスは糖尿病様の表現型を示す。3)HMGN3は膵臓の内分泌細胞α、β、δ、PP細胞全てにおいて発現している。4)HMGN3をマウス胎仔線維芽細胞(MEF)において過剰発現させても遺伝子発現プロファイルに影響を与えなかったが、マウス膵β細胞由来MIN6細胞に過剰発現させると多くの遺伝子発現に影響を与えた。一方で、HMGN1はMEFにおいて遺伝子発現プロファイルに影響を与えたが、MIN6においてはHMGN3に比べ影響が小さかった。5)HMGN1はPCNAと相互作用し、DNA損傷時にPCNAがクロマチンにリクルートされるのを促進した。これらのことから、HMGN3は組織・細胞特異的に発現しているが、のみならず、組織・細胞特異的な蛋白質ネットワークの中で機能し、その組織・細胞特異的な機能発現に関与していることが示唆された。一方でHMGN1は、PCNAというより普遍的な因子の機能発現に関与していることが示唆されたことなどから、HMGN1そのものも、その発現様式にたがわず組織・細胞間に普遍的な生命現象の制御機構に関与していることが示唆された。High mobility groupN (HMGN)の機能解析により次の結果を得た。近年、エピジェネティクス制御の破綻と疾患との関連が次々と明らかにされている。クロマチン構造タンパク質であるHMGNファミリータンパク質はクロマチンに結合することによりエピジェネティクス制御において重要な役割を担っていることが示されてきた。また一方で、HMGNファミリータンパク質は転写、DNA修復、DNA複製といった様々な核内反応の制御に関与していることが古くから示されてきているが、HMGNファミリータンパク質がどのような高次生命現象の制御に関与しているかは不明な点が多い。また、HMGNファミリータンパク質間での機能的な重複性などに関しても未解明である。そこで、独自に作成したHMGNファミリータンパク質全てに対する抗体および遺伝子欠損マウスを用いることにより、上記の解明に取り組む。得られた結果1)HMGN3は他のファミリーメンバーと異なり脳や膵臓で発現が高い。4)HMGN3をマウス胎児繊維芽細胞(MEF)において過剰発現させても遺伝子発現プロファイルに影響を与えなかったが、マウス膵β細胞由来MIN6細胞に過剰発現させると多くの遺伝子発現に影響を与えた。これらのことから、HMGN3は組織・細胞特異的に発現しているが、のみならず、組織・細胞特異的なタンパク質ネットワークの中で機能し、その組織・細胞特異的な機能発現に関与していることが示唆された。1)HMGN3遺伝子欠損マウスが糖尿病様の表現型を示し、かつ、血中インスリン濃度が野生型に比べて有意に低いこと、ならびに膵臓での発現レベルが高いことなどから、HMGN3は膵臓において重要な役割を担っていることが示唆された。そこで、膵臓におけるHMGN3の発現様式を調べる目的で、独自に作成したHMGN3特異的抗体を用いて免疫染色を行った。その結果、他のファミリーメンバーである、HMGN1やHMGN

2が膵外分泌細胞ならびに膵内分泌細胞で発現している一方で、HMGN3は内分泌細胞にのみ発現が認められた。さらに、膵内分泌細胞内でのHMGN3の局在を、各細胞種の特異的抗体との二重染色により調べたところ、α、β、δ、PP細胞全てにおいて発現していた。2)HMGN3の膵β細胞における機能を明らかにする目的で、膵β細胞においてHMGN3と相互作用する因子の検索を行った。これまでにFlag-HA-tagを付加したHMGN3を安定的に発現しているマウス膵β細胞由来MIN6細胞株を樹立し、TAP (tandem affinity purification)法により、HMGN3がMIN6細胞内で相互作用する可能性がある因子の検索を行った。3)HMGNファミリータンパク質はクロマチンに結合することにより遺伝子発現制御に関与していることがこれまで示されてきたが、特定のターゲット遺伝子やファミリー間での機能的な重複性は不明である。そこで、組織・細胞特異的な機能発現へのHMGNファミリーメンバーの機能的関わりを明らかにする目的で、独自に作製した遺伝子欠損マウスから作製したMEF、およびそれら細胞にHMGNファミリータンパク質各々を過剰発現させた細胞を用いて、マイクロアレイ解析を行い遺伝子発現プロファイルへのHMGNファミリータンパク質の影響を検討した。これまで得られた結果から、HMGN3が他のファミリーメンバーとは異なり、かなり組織・細胞特異的な機能を有していることが示唆される。しかしながら、HMGN3が発現している組織・細胞において他のファミリーメンバーの発現が見られないわけではなく、多くの場合は共発現しているころから、HMGN3特異的な機能解析には細心の注意が必要であると考える。つまり、現在までにHMGN3に相互作用する可能性がある因子を同定できているが、それらが他のファミリーメンバーとの相互作用においてはどうか、あるいは、他の組織・細胞を材料として用いた場合はどうなるかなどを検討する。そのうえで、これまでに得られている各HMGNファミリータンパク質が遺伝子発現制御に関与していると考えられる因子群に関してより詳細な解析を行う。それらの解析結果をもとに、最終的にはHMGN3が膵β細胞においてどのような役割を担っているかを明らかにする。本研究に用いる測定機器および設備については、日常的に使用する機器については教室に設置されており、大型機器は本学部付属実験実習機器センターならびに遺伝子実験施設に備わっているものを使用可能なため、大型備品の購入の必要はない。したがって、前年同様に、経費の主要な用途は消耗品である。本研究の主材料は培養細胞なので、培地、ウシ血清、抗生物質、培養用フラスコ、ディッシュ、ピペットなどのプラスティック器具、ガラス器具、抗体やキット試薬類の購入が主である。旅費は、成果を発表し、最先端の情報を収集するための学会参加旅費である。24年度は国際学会での発表を予定している。
脳神経系発生過程において組織サイズ・増殖制御に死細胞-生細胞相互作用が果たす役割

脳神経系発生過程では細胞増殖・細胞分化・細胞死が時空間的に協調して生じ、適切なサイズ・形態の組織が形成される。近年、生細胞間の相互作用に加え、死細胞と生細胞の相互作用が増殖や分化などに影響を与えうることが示唆され始めている。しかしながら、大量の細胞死が生じる脳神経系発生過程でそうした現象があるかどうか殆ど明らかになっていない。カスパーゼシグナルノックアウトマウス(caspase-3/caspase-9/apaf-1)は、この細胞増殖・細胞分化・細胞死のバランスによる組織のサイズ制御機構を調べる上でよいモデル系になると考えられた。これらの変異マウスでは、層構造の破綻、局所的ロゼッタの形成といった組織構築異常を示し、これは細胞死欠損による細胞の過増殖が原因とされてきた。しかし、これら組織構築異常には他の現象も複合的に関与している可能性がある。本研究では、アポトーシスの実行因子カスパーゼの機能を手掛かりに、マウス脳神経系形成過程における細胞増殖・分化と細胞死との関わりの包括的理解を目指した。まずカスパーゼシグナルノックアウトマウスで生じている組織構築異常の詳細な解析を行なったところ、これらの変異マウスでは神経前駆細胞の過剰形成は生じていないことが明らかとなった。この結果は、これまでの解釈とは異なりアポトーシスが正常に実行されずとも脳神経系の適切なサイズは保たれるということを示しており、発生過程の堅牢性と可塑性の大きさを如実に示す点で意義深い。そこで、これらの変異マウスにおける細胞死動態の観察と挙動が正常とは異なる細胞・因子の同定を試みた。その結果、これらの変異マウスでは脳神経組織構築異常が生じる以前に、通常は見られない遺伝子発現パターンを示す細胞集団の蓄積が認められた。これらの細胞集団が周辺組織構築に悪影響を及ぼす可能性を検討中である。しかしながら、大量の細胞死が生じる脳神経系発生過程でそうした現象があるのかどうか殆ど明らかになっていない。カスパーゼシグナルノックアウトマウス(caspase-3/caspase-9/apaf-1)は、この細胞増殖・細胞分化・細胞死のバランスによる組織のサイズ制御機構を調べる上でよいモデル系になると考えられる。これらの変異マウスでは、脳神経系領域で細胞死が欠損するとともに細胞の過増殖が認められ、極端な場合、層構造の破綻、局所的ロゼッタの形成といった組織構築異常をきたす。この表現型は細胞死欠損による神経前駆細胞の過剰形成によるものと考えられてきたが、組織構築異常には他の現象も複合的に関与している可能性がある。そこで本研究では、アポトーシスの実行因子カスパーゼの機能を手掛かりに、マウス脳神経系形成過程における細胞増殖・分化と細胞死との関わりの包括的理解を目指している。本年度は、カスパーゼシグナルノックアウトマウスで生じている組織構築異常の詳細な解析を行なった。驚いたことに、これらの変異マウスでは神経前駆細胞の過剰形成は生じていないことが明らかとなった。この結果は、これまでの解釈とは異なりアポトーシスが正常に実行されずとも脳神経系の適切なサイズは保たれるということを示しており、発生過程の堅牢性と可塑性の大きさを如実に示す点で意義深いと考えられる。今後は、どのような仕組みで適切なサイズが維持されるのか、これらの変異マウスにおける細胞死動態の観察と挙動が正常とは異なる因子の同定を行なっていく予定である。
「図書館資料保存論」に関する基礎的研究

最終年度にあたる2018年度は、全体で研究集会を6回開催した。前半は研究メンバーによる研究発表を輪番で行なった。各回2名が発表し参加者全員で討議した。後半は前年度からの繰越しで実施した「日本の図書館における一般資料の保存に関する現状調査」について、実態調査研究班で集計・分析した結果を研究メンバー全員で討議した。この成果は中間報告として第66回日本図書館情報学会研究大会で発表し、そこで寄せられた指摘も踏まえつつ、最終的に「「日本の図書館における一般資料の保存に関する現状調査」集計結果の概要」として、単純集計の分析結果を東京大学リポジトリを通じて公表した。館種を問わず図書館では保存に関する意識は全体的に高いものの、保存対策や修復などの処置は、計画的・積極的なものというより事後処置的かつ対症療法的な側面が強い傾向が出ており、保存のための専門部署が設けられている図書館は少なく、技術的側面が強いものほどマニュアルや作業外注のための仕様書といった文章化されたものが少ないことなど、日本の図書館における資料保存の実態をはじめて明らかにできた。また、新築や増改築とカビなどの保存上の問題との関係についても、これまで一般的に言われてきた、環境の変化が落ち着いた後に生物被害が生じやすいということを定量的に示すことができた。得られた成果については、2018年秋以降、研究代表者や分担者が図書館員を対照とする各種講演会で利用して図書館員への教育普及にも役立てている。このほか、前年度に引き続き、2018年6月と9月に「在泰京越南寺院景福寺旧蔵漢籍字喃本調査・研究会」を京都大学にて他の研究グループと共催し、2018年7月には公開シンポジウム「教育・研究資源としてのデジタルアーカイブ:その管理・活用・保存」を東京大学で漢字文献情報処理研究会等と共催し、研究メンバーから4名がパネリストとして登壇した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度は、研究上の必要から計画を変更し、まず首都圏の資料保存に実績を有する図書館等(東京都立中央図書館、国文学研究資料館、立川歴史民俗資料館、国立国会図書館)について設備・環境の実見と担当者からの聞き取りを行った(訪問実態調査)。さらに、平成28年12月まで計画を延長し、首都圏以外の図書館(金沢市立玉川図書館近世史料館、東北大学附属図書館、和歌山大学附属図書館、京都大学附属図書館)にて訪問実態調査を実施した。また平成28年は、現在の資料保存の基盤形成の契機となった「フィレンツェの水害」から50年の節目であり、情報と資料収集のため1名をイタリアに派遣した。これらから得られた情報を集約・分析するため、平成28年12月までの間に研究集会を5回、うち2回は公開シンポジウム形式として開催した(平成27年11月13日「マイクロフィルム等の図書館資料の媒体変換と情報共有」、平成28年11月10日「図書館におけるメディアの保存」)。いずれも図書館員など一般にも参加を呼びかけ、研究成果の社会還元に努めた。特に2回目の公開シンポジウムは、訪問実態調査の総括を兼ねたもので、総合討論では参加の図書館員から貴重な意見を仰ぐことができた。また、平成28年2月19日には、京都大学東南アジア研究所主催の国際ワークショップ「東南アジア地域研究情報資源の共有をめざして:いま、ライブラリアンから伝えたいこと」に協力し、セッシヨン2「多様な媒体による共同保存・利用への途」を受け持ち、構成の考案のほか、司会やコメンテーターなどを担当し、本研究の成果の国際発信に努めた。実態調査研究班と史的経緯研究班が中心となってメンバー全員が協力して、上記の諸活動を実施したほか、方法論研究班では米国の大学院の図書館情報学課程における資料保存教育や、図書館員が受講可能な国内の各種研修における資料保存の扱い方等について調査した。予算の繰り越し制度を利用して初年度の研究期間を9ヶ月延長したが、この期間に収集した首都圏、地方、海外の図書館における資料保存に関する情報は、平成29年度実施予定の質問紙調査のために非常に重要な基礎データとなった。当初予定していた個別の人物に対する聞き取り調査は実施できなかったが、訪問調査によって各図書館等の担当者から情報を聞き取ることで、これに代わる成果があったと考えられる。また、研究期間に公開のミニシンポジウムを2回開催し、国際ワークショップにも協力の形で参加するなど、研究成果の社会還元という役割も果たすことができた。以上のことから、多少の計画変更はあったものの、本研究はおおむね順調に進展していると言える。本研究では研究組織を(1)実態調査研究班、(2)史的経緯研究班、(3)方法論研究班に分けて、それぞれの専門分野から随時に研究活動を行いつつ、研究集会やメーリングリストを活用して情報の共有と集約に努めている。平成28年度について、全体としては年度当初と年度末に1回ずつ、計2回の研究集会を行った。このうち年度末の研究集会は、公開研究会「資料保存と製本技術」と銘打って、他の科研費研究班と合同で開催した。研究者のほか図書館職員など多数の一般来聴者があり、研究成果を社会に広く還元する機会を設けることができた。次に各研究班における成果について述べる。実態調査研究班では北海道大学附属図書館への訪問実態調査を行い、前年度の調査に新たなデータを付加することができたほか、公共図書館の資料保存に関する方針の公開状況についてウェブサイト調査を行い、公共図書館における資料保存の方針や取り組みの傾向について分析を加えた。史的経緯研究班では、3回の聞き取り調査を行った。

今年度は図書館の電算化と保存・修復用の紙の製作に関わった方々を対象とした。調査では6名のインフォーマントから、主として1980年代以降の資料保存・文化財保存の取り組みの実際について、当時の状況をインフォーマントの実績に即して聞き取った。方法論研究班では、収蔵環境や展示環境に関わる実態調査や理論的枠組みの構築、資料保存における媒体変換の位置づけについての考究などを進めた。また既存のマイクロフィルム保存のリーフレットについて、本研究班での成果を踏まえて改訂した上で英訳し、Guide to Micro Film Preservation for Libraries, Museums and Archivesとして刊行するとともに、Webを通じて世界に成果を公開した。訪問実態調査、聞き取り調査、Web調査など各種の調査が順調に進行しており、次年度に実施する予定の質問紙調査を実施するために必要なデータが集積されつつあり、これらのデータの分析から、質問紙調査のための問題点の洗い出しや、質問紙調査の方向性について議論できる段階に達することができたため。最終年度にあたる2018年度は、全体で研究集会を6回開催した。前半は研究メンバーによる研究発表を輪番で行なった。各回2名が発表し参加者全員で討議した。後半は前年度からの繰越しで実施した「日本の図書館における一般資料の保存に関する現状調査」について、実態調査研究班で集計・分析した結果を研究メンバー全員で討議した。この成果は中間報告として第66回日本図書館情報学会研究大会で発表し、そこで寄せられた指摘も踏まえつつ、最終的に「「日本の図書館における一般資料の保存に関する現状調査」集計結果の概要」として、単純集計の分析結果を東京大学リポジトリを通じて公表した。館種を問わず図書館では保存に関する意識は全体的に高いものの、保存対策や修復などの処置は、計画的・積極的なものというより事後処置的かつ対症療法的な側面が強い傾向が出ており、保存のための専門部署が設けられている図書館は少なく、技術的側面が強いものほどマニュアルや作業外注のための仕様書といった文章化されたものが少ないことなど、日本の図書館における資料保存の実態をはじめて明らかにできた。また、新築や増改築とカビなどの保存上の問題との関係についても、これまで一般的に言われてきた、環境の変化が落ち着いた後に生物被害が生じやすいということを定量的に示すことができた。得られた成果については、2018年秋以降、研究代表者や分担者が図書館員を対照とする各種講演会で利用して図書館員への教育普及にも役立てている。このほか、前年度に引き続き、2018年6月と9月に「在泰京越南寺院景福寺旧蔵漢籍字喃本調査・研究会」を京都大学にて他の研究グループと共催し、2018年7月には公開シンポジウム「教育・研究資源としてのデジタルアーカイブ:その管理・活用・保存」を東京大学で漢字文献情報処理研究会等と共催し、研究メンバーから4名がパネリストとして登壇した。2017年度は、わが国の図書館における資料保存の実態を把握するため、全国の図書館に対して質問紙調査を実施する予定で、年度当初に全体の研究集会を実施して方向性を調整した。
波浪中における損傷船舶の残余強度の研究

損傷船舶の残余強度を適切に評価する手法の構築を目的として、損傷船舶にはたらく波浪荷重推定法から信頼性手法も含めた強度評価法までを一貫して研究を実施した。損傷船舶の波浪荷重については、運動の非線形性、初期条件(姿勢変化)、縦・横・捩りの複合荷重、弾性応答の影響等を考慮した水槽試験法及び理論推定法を開発した。さらに、損傷船舶の最終強度解析法を開発し、これと信頼性解析手法を組み合わせることで損傷船舶の破損確率推定法も開発した。はじめに、国際海事機関(IMO)における目標指向型船体構造基準(GBS)で規定されているものの、船級規則では明確に規定されていない残余強度要件について、現行のタンカー及びバルカーに係る船級規則で関連する要件の整理と残余強度要件を評価するための技術的評価方法について整理を行った。これらの検討に基づき、残余強度要件を考える上で必要となる事故シナリオの設定を行なった。この事故シナリオに基づく残余強度要件を評価するための以下のツール開発を行った。1)運動の非線形性、初期条件(波だけでなく損傷状態等)の依存性、縦・横・捩りの複合荷重、弾性振動の影響等を考慮した水槽試験法を開発した。また、検証のための荒天中水槽実験は本来H21年度の研究であったが前倒しで実施した。この結果、荒天中において弾性振動を含む縦及び横荷重が精度よく計測される等、理論推定法による計算結果と直接比較が可能な精度でデータを取得することが出来た。2)理論推定法については、非線形ストリップ法をベースに、船体運動の(形状)非線形性だけでなく縦運動と横運動の連成、弾性振動、漂流運動も考慮した損傷船舶の船体運動・波浪荷重の時系列計算法を開発した。これらは、上記荒天中水槽試験を通じた検証を実施し、良好な結果を得た。また、波浪中ランキンソース法についても開発を行い、向波中での縦運動の計算を可能にするとともに形状非線形を考慮するための拡張作業を進めた。3)事故シナリオに関連する船体の損傷確率モデルと部材の経年劣化の確率モデルの開発を行った。本研究では、損傷船舶の残余強度を適切に評価する手法の構築を目的として、損傷船舶にはたらく波浪荷重推定法から信頼性手法も含めた強度評価法までを一貫して研究を実施する。1.損傷船舶の波浪中における水槽試験法(運動・荷重)の開発捩り剛性まで適切に相似則を満足できるように新しく設計・開発したバックボーンモデルを製作し、弾性応答も含めて、曲げ・剪断(縦・横)、振りの5分力の計測を可能にした。陸上での検定及び水槽試験の結果、極めて良好にこれらの荷重を計測できることを検証した。2.弾性応答を考慮した損傷時船舶の波浪中における波浪荷重推定法の開発船体運動の非線形性だけでなく縦運動と横運動の連成、弾性応答、漂流運動も考慮した損傷船舶の船体運動・波浪荷重の時系列計算法を開発した。ベースとなる計算法には、非線形ストリップ法とランキンソース法を用いる。非線形ストリップ法については、従来から研究代表者がコードの拡張を行っており、既に船体運動の非線形性、弾性応答、漂流運動が考慮できるようになっているため、研究の初期段階において縦・横・捩り荷重の連成が考慮出来るように開発した。さらに、ランキンソース法を時々刻々の物体表面条件を満足するように拡張して、縦波大波高中でも計算可能な時系列計算法を開発した。3.信頼性手法にもとづく損傷船舶の残余強度評価法の開発逐次崩壊解析法により解析するための設定荷重について検討を行った。また、船体の損傷確率モデルと部材の経年劣化の確率モデルの開発を行った。(1)損傷船舶の波浪中における水槽試験法(運動・荷重)の開発H20年度に開発した水槽試験法に基づき、H21年度にはバックボーン模型を用いた水槽試験を実施したため、計画を前倒しで終了していた。このため、H22年度は下記(2)で開発した推定法の検証作業と(3)にエフォートを集中した。(2)弾性応答を考慮した損傷時船舶の波浪中における波浪荷重推定法の開発前年度までに開発した非線形ストリップ法と3次元ランキンソース法ベースの波浪荷重推定法を用いて、不規則波中での長時間シミュレーションを実施し、(3)の入力データを作成した。また、これらの計算を通じて当該手法の推定精度の検証も行った(3)信頼性手法にもとづく損傷船舶の残余強度評価法の開発前年度までに開発した船体の損傷確率モデル及び1次信頼性法(FORM)を用いた損傷船舶の強度評価のモデル化の検証を行った。さらに上記(2)で開発した推定法により求めた縦・横・捩りの複合荷重を与えて手法構造応答を求めることで手法の検証を行う。
角膜実質細胞によるコラーゲン収縮に対する角膜上皮細胞由来の促進因子の解析

角膜実質細胞をコラーゲンゲルに包埋し、10%ウシ胎児血清存在下で培養すると、培養時間に比例してコラーゲンゲル直径の収縮を認めた。さらに、角膜上皮細胞培養上清の添加によって実質細胞によるコラーゲンゲル収縮は促進された。角膜上皮細胞培養上清をアセトン処理すると、アセトン濃度70%で析出される不溶性分画に、実質細胞によるコラーゲンゲル収縮活性に対する促進効果を認めた。次に、得られたアセトン不溶分画をヘパリンセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製すると、NaCl濃度400mM付近で溶出されるヘパリン親和性分画が実質細胞のコラーゲンゲル収縮を促進させることが認められた。さらに、この分画をc-18カラムを用いた逆相クロマトグラフィーにて分離精製した。この結果、アセトニトリル52%付近で溶出される分画に実質細胞によるコラーゲンゲル収縮を促進する作用が認められた。さらに、この分画に含まれる蛋白質のアミノ酸配列を検討しN末端から13個までのアミノ酸配列を決定した。そのアミノ酸配列とすでに報告されている蛋白質のアミノ酸配列との比較検討を行ったところ、基底膜成分の一つであるヒトおよびウサギのSPARC(Secreted Protein that is Acidic and Rich in Cystein)のアミノ酸配列と高い相同性が認められた。現在、我々の分離精製した角膜実質細胞によるコラーゲンゲル収縮促進因子がSPARCと同一であるかを検討中である。
医療サービス需給の相互作用が住民の保健行動と将来需要に与える効果の社会医学的考察

地域の将来医療需要を推計する方法として、岐阜県中津川市の将来推計人口と患者調査結果から、一日あたりの入院患者数の推計値を算出した。まず基礎となる将来人口の推計は、過去5回の国勢調査をもとにセンサス変化率を求め、今後の性別年齢階級別予測人口を算出する方法を採った。続いて平成5年実施の患者調査の全国値での年齢階級毎の受療率を推計人口と掛け合わせて、平成27年までの入院患者数の推計を行った。これとは別に、中津川市の国民健康保険レセプトから得られる1月当たりの入院患者総数から、一日あたりの入院患者数を推定する方法を考案した。そのために平成5年実施の患者調査結果をもとに、前月からの繰り延べ入院患者数と新規入院患者数を分離し、さらに後者の値に在院日数別の累積百分率を掛け合わせることで、一日あたりの値に換算した。この方法で得られた値は、受療率と人口から求めた値よりやや大きな推定値が得られた。その理由として、国民健康保険加入者では他の医療保険加入者より入院期間が長いため、その値をそのまま全市民の入院状況と等しいと仮定したことの影響が考えられる。しかし、既存の資料から医療需要を推定するには有効な方法であると考えられた。平成10年度の研究計画は、中津川市の保健医療福祉に関する広範な情報資料の収集であり、関係各部署より必要資料(患者調査や国勢調査など全国調査結果報告書、岐阜県衛生年報、岐阜県恵那保健所年報、中津川市民病院報告、中津川市保健センター年報、中津川市高齢者保健福祉計画、中津川消防署出動記録、中津川市民病院休日時間外診療統計、国民健康保険レセプト記録、訪問看護に関する統計資料等)を収集した。収集したデータを大型計算機上で解析するためのデータベース化は、既に大半は終了した。さらに並行して、本研究を行なう上で基礎となる中津川市の人口及び人口動態について、その経年変化と現状の解析を進めた。既に解析を進めた項目は、人口構成、出生数及び出生率、死産及び周産期死亡数・率、乳児死亡数・率、粗死亡率、脳血管疾患・悪性新生物・心疾患などの死亡構造の変化、部位別悪性新生物死亡数率、疾患別の標準化死亡比(SMR)である。これらの項目について、中津川市と東濃地域の他市町村、岐阜県、全国とを比較し、中津川市の人口及び人口動態の特徴を以下の如く把握した。1.65歳以上の老年人口割合が昭和60年の12.3%から平成6年には17.0%と増加しており、全国平均を上回っている。2.粗死亡率(人口1000対)は、高齢化の影響をうけ昭和50年の7.0から平成6年7.6と岐阜県、全国平均に比して高いレベルを推移している。3.全死亡のSMR(平成3年全国の死亡を100)は、近隣の市と比べ107.0と高値である。死因別では悪性新生物(80.7)、心疾患(82.9)、脳血管疾患(78.6)は低く、老衰(141.7)が高い。これは岐阜県全体の傾向である。次年度は、計画に沿い、保健医療福祉サービスの変化、保健行動の変化の動向を把握し、将来需要を予測する。
1950-1980年代の家政通信・遠隔教育に関する社会学的研究

戦後の女性向けメディア通信教育に、日本女子大学家政学部の通信教育、GHQのCIE(民間情報教育局)主導によるラジオ=メディア教育(婦人の時間)がある。両者は戦後の民主化政策のもと、男女平等の理念を日本社会に根付かせる教育機関として登場した。日本女子大学は戦前から女子家政学教育を手がけてきた伝統を、男女ともに学ぶべき教養科目として刷新した。CIEも日本女性の民主化意識向上を目的にラジオ番組政策を指導する。だが初期理念とは裏腹に、両教育は女性向け家庭的、教養的な内容となり、男女平等を実現する目的は薄れ、次第に女性へとジェンダー化されていくが、一方で女性同士の縁を強める役割を果たした。2014年度は、2か月に1度の割合で定期的に研究会を開催しながら、1950年代以後のメディア教育の下地を形成した婦人雑誌愛読者による講習会や、ラジオの料理番組の家政教育としての可能性についての検討を行った。まず雑誌メディアを通じた家政や家庭科教育の普及について考察した。婦人雑誌『主婦之友』では、太平洋戦争末期の家政や生活に関する講習会が読者支援のために行われたが、それが戦後の雑誌存続をあと押しした。もともと主婦之友社には、読者との関係性を密なものとするために文化事業部が存在した。こうした組織を核として、戦時期の読者の生活支援として毎月のように実施されたのが「生活必需品の防護展覧会」や「洋裁講習会」、「防寒物の工夫展覧会」などである。「読者のため」の雑誌作りをモットーとした同社社長の石川武美が実施した読者への懸賞サービスや文化事業の宣伝効果は、『主婦之友』が危機的状況のなかで威力を発揮し、そのたびに読者の「信頼」を裏切ることなく、愛読者ネットワークを形成する契機となった。「雑誌と読者の絆」の育成は、同時代の生活教育という点からも、現代の公共圏のあり方を検討する上でも注目に値すると考えられる。また、1970年代の「若い女性」向けのメディアがファッション雑誌でありながら、結婚生活を前提としない趣味的な実用情報(クッキングやお弁当、お菓子作りからインテリアなど)を掲載し、実質的な家庭科教育としての機能を担っていたことへの検討も行った。一方、現在のテレビにおける料理番組の人気は、戦前からつづくラジオの料理番組へさかのぼることが出来る。番組では多様な「家庭料理」が紹介され、主婦には日々異なる献立を作ることがすすめられる。さらに栄養に関する知識の普及がラジオを通じて図られ、戦時体制下にあっては家庭生活の維持に必要な主婦の教養ともなった。今日のメディア環境の変化において、雑誌の凋落が著しい。その一因に、かつてほど若者たちが雑誌を必要としなくなったことがある。そもそも教育とはこれから社会に出て行く若者(青年期)との関わりにおいて意味がある。教育という営みはそもそも欲望充足を延期することが前提で、今日ではそうしたメディアの教育的機能は「時代遅れ」と見なされるようになってきた。だが過去において、雑誌は若者たちの生活に必要不可欠のメディアであった。それは雑誌読者が青年という「未完成な」存在だったからである。日本における経営もグローバル化し、即時的価値が求められるようになっていった現状のなかで、かつて雑誌メディアが持っていた遅延報酬的機能が意味を持ちにくくなっている。とはいえ、かつて雑誌は彼/彼女らにとっての社会について学ぶための情報媒体であり、その教育的効果は明らかだった。雑誌が「青年」読者に対し、教育メディアとして機能した最後の時代は、日本の雑誌黄金期である1970年代から80年代と重なっている。それは女性向けのファッション雑誌についても言うことができる。1971年創刊の『non・no』(集英社)は、1970年創刊の『an・an』(平凡出版、現マガジンハウス)の後追い雑誌と言われてきたが、料理記事やファッション指南、手芸講座といったその丁寧な指導的要素で若い女性読者たちの心をつかんだ。一八歳から二四歳の未婚女性という非常に限定した読者を想定しながら、それ以上のより幅広い読者の獲得に成功し、百万部を越えるファッション誌となっていった。同時期は女性の初婚年齢が上昇し始めた時期である。『non・no』は家族という集団を単位とせず、それでいて若い女性にとっての「暮らし」や生活情報を読者に提供した結果、人気となった教育的要素を持つ雑誌であった。およそ2ヶ月に1度、共同研究者と情報交換を行い、研究はおおむね順調に進められている。ただ学校や公教育をを母体とする通信教育の展開についての考察がやや遅れている。女性の受講を想定するメディア・通信教育は、社会におけるジェンダーを強化した側面も持つ。家庭料理番組のテキスト購入をはじめとして、家事や家政に関わる女子教育はその典型であろう。女性の社会参加よりも家事スキルの向上をめざしたように見える教育は、性別役割分業を強化するものとして批判的に考察する必要があるだろう。とはいえ戦後日本においていち早く認可された女子高等教育機関である日本女子大学の家政学の通信教育は、男女共に受講すべき教養講座の一科目として位置づけられていた。また、GHQのCIE(民間情報教育局)主導によるラジオ=メディア教育(ラジオ『婦人の時間』)も、戦後の民主化政策のもと、男女平等の理念を日本社会に根付かせるための女性向け教育番組として登場している。占領期が終了し日本の経済成長が始まると、「サラリーマンー専業主婦」家庭が一般化していく。通信教育の受講傾向には性別の違いが歴然とあり、なかでも商品としての通信教育では、その傾向は顕著であった。男女問わず受講が可能であってもその選択には文化的ジェンダーが長らく存在した。

先の戦後に導入されたメディア・通信教育は次第に女性に特化された家庭的、教養的な内容となり、社会において男女平等を実現するという初期の理念は薄れていった。一方でジェンダー化された戦後のメディア・通信教育は、日本の家庭生活、ライフスタイルを支える文化的コンテンツ(とくに家庭料理文化の多様化など)として発展し、消費者の要望に応えて多くのプログラムを生み出した。教育効果そのものよりも女性同士の縁(つながり)を生み出した契機としての側面にも目を向ける必要がある。当初の目的とは異なっていたものの、女性を中心に受講されたメディア・通信教育が、教育の枠を超えて日本のメディア文化の世界を拡大したことは間違いないだろう。戦後の女性向けメディア通信教育に、日本女子大学家政学部の通信教育、GHQのCIE(民間情報教育局)主導によるラジオ=メディア教育(婦人の時間)がある。両者は戦後の民主化政策のもと、男女平等の理念を日本社会に根付かせる教育機関として登場した。日本女子大学は戦前から女子家政学教育を手がけてきた伝統を、男女ともに学ぶべき教養科目として刷新した。CIEも日本女性の民主化意識向上を目的にラジオ番組政策を指導する。だが初期理念とは裏腹に、両教育は女性向け家庭的、教養的な内容となり、男女平等を実現する目的は薄れ、次第に女性へとジェンダー化されていくが、一方で女性同士の縁を強める役割を果たした。とくに大きな問題はなく、おおむね順調に実施している。ただ研究遂行者のこれまでの研究と連続性を持たせるため、まず取り組むべき研究対象を、学校教育ではなく、マスメディアの教育的機能の考察を優先することにした。日本において各種学校をを通じて受講されてきた家庭科や家政学に関する通信教育の社会学的考察について取り組む予定である。マス・メディアである雑誌を通じた主婦向けの家政関連情報の提供は、戦前戦後において連続性が見られるが、学校教育としての家庭科は、戦後の教育改革による大きな変化にともなう断絶が見られる。その大きな変化は、家庭科教育にいち早く導入された通信教育の在りようにどのような影響を与えたのかを中心に考察を進めていく。歴史社会学消費社会が進展し、女性の専業主婦化がすすむ時代にあって、家庭的な知識を獲得する場が、学校公教育から市場に移動し、メディア教育と結びついていく過程を考察する。日本における理想化された家庭イメージがメディアを通じて流布するとともに、その実践を獲得するために通信教育、ないしメディア教育が機能したと思われる。このテーマを軸に、日本において展開された女性向けに商品化された通信教育の特徴について明らかにする。具体的には「家庭科」をめぐって展開される学校教育と通信教育のジェンダーポリティクスについて検討し、学校家庭科教育と、ジェンダーに基づいて女性消費者を魅了する講座商品開発に余念のない通信教育関連企業とのせめぎあいについて、2015年度は検討していきたい。インタビューや出張に当初予定していたほど行くことができなかったため、予定した金額とは差額が生じている。むしろ資料収集のための物品費の支出が当初の想定以上に必要となった。
高齢糖尿病患者の疾患性サルコペニア治療を目的とした食事・運動療法の創出

本研究ではサルコペニア治療を目的とし、日本糖尿病学会が薦める食事・運動療法の介入が高齢者糖尿病患者の筋肉量や身体機能、QOL改善に与える影響ついて、無作為比較化試験で明らかにする。これまでに高齢糖尿病患者におけるサルコペニア治療を目的とした食事・運動療法に関するエビデンスはほとんどない、高齢糖尿病患者の血糖管理や腎症重症化予防の他、新たにサルコペニア治療を含めた従来の食事・運動療法の有効性を明らかにすることで、我が国の高齢者糖尿病治療に向けた新たなエビデンス創出が期待できる。2018年度は高齢2型糖尿病患者の食事・運動療法の有用性に関する検討を行った。また、糖尿病を発症していない一般高齢者(非糖尿病)集団も含め、食事療法群、運動療法群、食事+運動療法群に分けた介入研究を行い、2型糖尿病の病態が食事・運動療法の介入効果に与える違いについて検証を行った。18週間の介入の結果、糖尿病治療を行っていない健常高齢者では食事+運動療法群は各単独介入と比べ四肢の筋肉量や膝伸展筋力が有意に増加していた。また、健常高齢者では四肢の筋肉量や膝伸展筋力の増加と共に身体的QOLが有意に増加していた。一方、高齢2型糖尿病患者は、一般高齢者と比べ食事+運動療法による四肢の筋肉量や膝伸展筋力の介入効果が少なかった。その結果、高齢2型糖尿病患者では食事+運動療法による身体的QOLの改善を認めなかった。本研究より、高齢2型糖尿病患者は健常な高齢者と比べ、食事+運動療法による介入効果が得られにくい可能性が示された。アジアの診断基準を用いて、サルコペニアの対象者を抽出し、食事療法群、運動療法群、食事+運動療法群に分けた介入研究を開始することができた。しかし、2018年度中に全症例の介入研究を終了できなかった。2019年度も引き続き全症例の経過をフォローしていく。高齢2型糖尿病のサルコペニア治療を目的とした食事+運動療法を検討するため、介入24週間まで継続して行う。従来のエネルギー;25-30kcal/日、たんぱく質;標準体重あたり1.0-1.2g/日の食事管理では高齢糖尿病患者の筋肉量増加が期待できない可能性が示唆される。エネルギーやたんぱく質といった栄養素としての一次機能だけではなく、栄養素以外の特定成分としての三次機能に注目した食事療法を検討する必要がある。本年に実施する介入研究の開始時期が遅れ、研究費を使用する時期が遅れた。現在、介入終了後までデータを収集するので、2019年度に差額分を使用する。
大脳皮質の局所神経回路の解析

1.大脳皮質出力ニューロンを逆行性に細胞体・樹状突起をGolgi染色様に標識する方法により、前もって出力ニューロンを標識したラットの大脳皮質スライス標本を作成した。微小ガラス電極を各層のニューロンに刺入し、基本的な電気的性質を記録してニューロンを分類し、Biocytinを注入した。スライス標本を固定した後、組織学的な検索として免疫蛍光法を用いてBiocytinを注入したニューロンが興奮性あるいは抑制性であるか検討した。次に、Biocytinを注入したニューロンと特にその出力である神経軸索をAvidin-biotinylated peroxi-dase complex法によって青黒色に染色し、逆行性に標識された出力ニューロンの樹状突起をPeroxidase anti-peroxi-dase酵素免疫染色法で赤く染色し、1個のニューロンから一群の大脳皮質投射ニューロンへの連絡を調べた。その結果、興奮性のIII層錐体ニューロンの出力はV層の皮質脊髄投射錐体ニューロンへ多く入力しているが、VI層の皮質視床投射錐体ニューロンへはその4分の1しか入力していないことを見出し報告した。さらに、VI層の錐体ニューロンへの入力を調べII/III層及びV層の錐体ニューロンからの入力は少ないが、IV層・VI層からの入力が多いことを見いだしており、報告をまとめている。3.GABA作動性のインターニューロンをGolgi染色様に染色する手法を、トランスジェニックマウスを利用して作ろうとしている。現在、GABAニューロンのマーカーであるParvalbuminとCalretininというカルシウム結合タンパク質の遺伝子をBACを用いてクローニングしている。Calretininトランスジェニックマウスは作成済みで、pGFPの発現特異性を検討している。1.大脳皮質は原則的に6層から構成され、錐体細胞はその主要な構成ニューロンであり、錐体細胞は皮質外へ出力するばかりでなく、皮質局所に軸索側枝を多数出力し皮質内の情報処理にも重要な機能を持つと考えられる。大脳皮質出力ニューロンを逆行性に細胞体・樹状突起をGolgi染色様に標識する方法により前もって出力ニューロンを標識したラットの大脳皮質スライス標本を用いて、微小ガラス電極を各層のニューロンに刺入し、基本的な電気的性質を記録し、分類した。記録後、ニューロンにBiocytinを注入し、スライス標本を固定する。組織学的な検索として、まず三重蛍光法を用いてBiocytinを注入したニューロンが興奮性あるいは抑制性であるか検討した。Biocytinを注入したニューロンと特にその出力である神経軸索をAvidin-biotinylated peroxidase complex法によって青黒色に染色した。この神経軸索の入力先として逆行性に標識された出力ニューロンをPeroxidase anti-peroxidase酵素免疫染色法で赤く染色した。III層錐体細胞の出力はV層錐体細胞へ多く入力してたが、VI層錐体細胞へはその4分の1しか入力していなかったことを報告した。さらにVI層の錐体細胞への入力を調べII/III層及びV層の錐体細胞からの入力は少ないが、IV層・VI層からの入力が多いことを見いだした。3.大脳皮質GABA作動性の内在性抑制ニューロンを染色様に染色する手法を、トランスジェニックマウスを利用して作ろうとしている。現在、GABAニューロンのマーカーであるParvalbuminとCalretininというカルシウム結合タンパク質のプロモーター部位をクローニングし、特異性の検討をしている。これらのGABAニューロンに2と同じく膜移行シグナルを導入したGFPを発現させる予定である。
植物種子細胞に見られるATP依存型翻訳活性の分子機構解明

イネ胚盤由来カルスの無細胞タンパク質合成系の確立に成功し、GTP依存性に関し試験を進めた結果、これまでにATP添加条件においてGTPの有無に無関係で試験タンパク質GFPの合成が可能であることを確認した。poly(U)を鋳型とする翻訳伸長活性測定では、GTP添加が伸長反応活性を阻害することを確認した。さらに、この活性がシクロへキシミドにより阻害されることより、観察している活性が確かに細胞質由来の80Sリボソーム翻訳系のものであることを合わせて確認した。この新たに確立したイネカルス無細胞翻訳系は、1 mlあたり数百マイクログラム相当のタンパク質合成が可能であり、脂質二分子膜ベシクル添加条件でのヒト心筋に存在する重要なカリウムチャネルタンパク質hERGの合成も可能であることを確認した。hERGは同年度内にコムギ無細胞翻訳系で調製し、カリウムイオンチャネルとして機能することを示し報告済みである(Tadaaki et al. Sci Rep. 7: 17736, 2018)。以上のように、イネカルス抽出液はコムギ胚芽抽出液に準ずる生化学的なタンパク質調製ツールとしての利便性も併せ持つことより、他の特性も考慮の上、共同研究契約を結ぶ企業と特許申請する予定で準備を進めている。研究計画では、H29年度には翻訳開始因子を対象とする解析を予定していたが、この年度内には、パン酵母および大腸菌の無細胞翻訳系をそれぞれ独自に準備し、GTP依存性をイネカルスおよびコムギ胚芽の抽出液のものと比較を行った。その結果、大腸菌では完全なGTP依存性を確認し、酵母においてもGTP添加が活性をより亢進させることを見出し、イネおよびコムギの系との大きな相違をみた。特に真核生物である酵母の無細胞系においてはGTPの伸長阻害効果が見られず、イネとコムギの系と明瞭に異なることが観察された。イネカルスに加え、パン酵母および大腸菌の無細胞タンパク質合成系を確立し、比較対象が増えたことにより、我々が見出したコムギ胚芽抽出液のGTP依存性に関する疑問をより明瞭にする基盤実験系ができたと考えている。計画と照らし合わせると遅れている部分があるが、イネカルス抽出液を利用する無細胞翻訳系が予想外に高い活性を示し、今後の応用に道が拓け、企業も関心を示し特許化に向け準備が進んでいる。挑戦的な方向性という点で評価していただけると信じ、この自己評価とした。申請時に記載したH29以降の研究計画の項目で、翻訳開始因子と翻訳伸長反応因子のクローニングと組換えタンパク質のATPase活性解析を計画通りに遂行し、タンパク質レベルでのGTPaseおよびATPase活性の比較解析を完了させる。最終年度のため、必要データを収集し、イネカルス抽出液を材料とする無細胞翻訳系技術の特許出願と、その論文の投稿を完了させる。また、コムギ胚芽抽出液およびイネカルス抽出液のGTP無添加条件での翻訳活性に関する論文の投稿も完了する。これらの成果は日本分子生物学会および日本農芸化学会において発表する。コムギ抽出液を利用するインビトロ翻訳系において、GFPをテストタンパク質とした系で、翻訳反応液にGTPを含まない条件下でのタンパク質合成活性がGTPを含む条件と遜色なく維持できることを確認した。その一方で翻訳鋳型として添加するmRNAの分解物GMPに由来するGTPが翻訳反応液中に再生されることも見出した。そこで、GMPからGTPが再生される系を排除するために、poly(U)を鋳型とする翻訳伸長活性を調査したところ、GTP非依存的なペプチド伸長活性を確認した。以上より、少なくともペプチド伸長過程においてはコムギ翻訳装置はGTP非依存的に反応を進めることが可能であるという結論に達している。コムギ胚芽抽出液に続き、昨年度は新たにイネの培養細胞(カルス)に由来する抽出液を用いたインビトロ翻訳系の構築を図り、これに成功した。この系もコムギ胚芽抽出液と同様にGTP非添加条件下での翻訳活性を示し、poly(U)を鋳型とする系においても、同様にGTP非依存的なペプチド伸長反応活性を示した。さらに、酵母Saccharomyces cerevisiaeを材料としてインビトロ翻訳系の構築を進めた。活性は植物由来の抽出液に比べ低いものの、ペプチド伸長活性の測定には十分であった。驚くべきことに、酵母細胞抽出液においても、poly(U)を鋳型とするペプチド伸長活性はGTP非依存的条件下においても検出可能なことが明らかとなった。現在、イネ培養細胞を利用するインビトロ翻訳系を特許申請するか否かを検討している。計画書に記載したロジックにほぼ沿った形で実験をすすめることができており、コムギ胚芽抽出液において見出した現象が、イネ培養細胞抽出液においても同様に確認できた。予想外な展開もあり、酵母細胞抽出液においても同様な現象、すなわちGTP非依存的なププチド伸長活性を確認した。基礎研究の分野における新たな学説を提唱する上での基盤的な情報を収集できていると判断している。「おおむね」としているのは、特許も絡み結果を公表する機会を先延ばしにしている点からの判断である。

さらに、この活性がシクロへキシミドにより阻害されることより、観察している活性が確かに細胞質由来の80Sリボソーム翻訳系のものであることを合わせて確認した。この新たに確立したイネカルス無細胞翻訳系は、1 mlあたり数百マイクログラム相当のタンパク質合成が可能であり、脂質二分子膜ベシクル添加条件でのヒト心筋に存在する重要なカリウムチャネルタンパク質hERGの合成も可能であることを確認した。hERGは同年度内にコムギ無細胞翻訳系で調製し、カリウムイオンチャネルとして機能することを示し報告済みである(Tadaaki et al. Sci Rep. 7: 17736, 2018)。以上のように、イネカルス抽出液はコムギ胚芽抽出液に準ずる生化学的なタンパク質調製ツールとしての利便性も併せ持つことより、他の特性も考慮の上、共同研究契約を結ぶ企業と特許申請する予定で準備を進めている。研究計画では、H29年度には翻訳開始因子を対象とする解析を予定していたが、この年度内には、パン酵母および大腸菌の無細胞翻訳系をそれぞれ独自に準備し、GTP依存性をイネカルスおよびコムギ胚芽の抽出液のものと比較を行った。その結果、大腸菌では完全なGTP依存性を確認し、酵母においてもGTP添加が活性をより亢進させることを見出し、イネおよびコムギの系との大きな相違をみた。特に真核生物である酵母の無細胞系においてはGTPの伸長阻害効果が見られず、イネとコムギの系と明瞭に異なることが観察された。イネカルスに加え、パン酵母および大腸菌の無細胞タンパク質合成系を確立し、比較対象が増えたことにより、我々が見出したコムギ胚芽抽出液のGTP依存性に関する疑問をより明瞭にする基盤実験系ができたと考えている。計画と照らし合わせると遅れている部分があるが、イネカルス抽出液を利用する無細胞翻訳系が予想外に高い活性を示し、今後の応用に道が拓け、企業も関心を示し特許化に向け準備が進んでいる。挑戦的な方向性という点で評価していただけると信じ、この自己評価とした。まず、これまでに得られた結果を論文と学会において発表を行う。イネ培養細胞抽出液を利用するインビトロ翻訳系に関しては、進化工学技術などへの応用を検討し、特許化するか否かを早期に判断する予定である。GTP依存的な翻訳活性は、これまで永きに渡り大腸菌系を中心にした解析で明らかにされてきた。そこで、最終年度には、大腸菌のインビトロ翻訳系を構築し、そのGTP依存性を明らかとし、生化学的な観点から昨年度までに二つの植物の細胞抽出液および酵母細胞抽出液より見出したGTP非依存的なペプチド伸長活性との相違を明確にしておきたいと考えている。想定外の結果としては、系内に含まれる微量のGMPが抽出液が含むguanylate kinaseおよびdinucleotidekinaseによりGDPやGTPへ再生されることが、翻訳装置の活性維持に必要十分なGTPの供給源となっている可能性を残している。最終年度はこの懸念を払拭し、明快な結論とともに、新たな学説提唱の活動に力を入れて行く予定である。申請時に記載したH29以降の研究計画の項目で、翻訳開始因子と翻訳伸長反応因子のクローニングと組換えタンパク質のATPase活性解析を計画通りに遂行し、タンパク質レベルでのGTPaseおよびATPase活性の比較解析を完了させる。
アストロサイトに存在する特異的膜内粒子の機能解明

脳において、基底膜と接触するアストロサイトの形質膜部分には、小型膜内粒子が四角配列した、Assemblyとよばれる特異な粒子集合体が高密度に分布している。しかし、このAssemblyの機能はまったくわかっていない。そこで培養アストロサイトを用いて、Assemblyが強く発現される条件を見出し、遺伝子工学技術を駆使して、Assemblyをコードすると考えられるcDNAの塩基配列を明らかにできれば、Assemblyの機能解明に到達できると考えた。そのためには、「培養アストロサイトにおいて、確実にAssemblyの発現促進条件を見出すこと」が出発点であり、本研究の目的であった。私どもは、Assemblyが高密度に分布する形質膜が常に基底膜に接触している事実に着目し、アストロサイトを細胞外マトリックス(ECM)成分でコートした培養皿で培養すると、ECM成分をコートしない場合に比べて、Assemblyの発現が促進されるのではないかと予想して実験を行なってきた。本研究で得られた主な結果は次の如くである。(1)生後5日目のマウス大脳由来のアストロサイトを、IV型コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンの混合液でコートした培養皿で培養し、凍結割断法を用いてAssemblyの分布密度を対照群と比較する実験を3回行なった。そして、分布密度が明らかに27倍増加するという実験結果が得られた。この発現促進効果はこれまでに報告されているいかなる効果よりも大きい。(2)Assemblyが、Na,K-ATPaseのβサブユニットあるいはP糖タンパクではないかと予想し、これらの膜タンパクを強く発現している線維芽細胞と腎腫瘍細胞を凍結割断法で調べた。しかし、この予想に反してAssemblyを観察することはできなかった。従ってAssemblyは少くともNa,K-ATPaseのβサブユニットでもなくP糖タンパクでもないことが示唆された。脳において、基底膜と接触するアストロサイトの形質膜には、小型膜内粒子が四角配列した、Assemblyとよばれる特異な粒子集合体が密度高く分布している。しかし、このAssemblyの機能は全く未知のままである。そこで培養アストロサイトを用いて、Assemblyが強く発現される条件を見出し、遺伝子工学技術を使って、Assemblyをコードすると考えられるcDNAの塩基配列を明らかにし、Assemblyの機能の解明にせまることが、私どもの研究の目的である。私どもは、Assemblyが密度高く分布する形質膜が常に基底膜に接触しているという事実に着目し、アストロサイトを、細胞外マトリクス(ECM)成分でコートしたフラスコ上で培養すると、ECM成分でコートしない場合に比べて、Assemblyの発現が促進されるのではないかと予想した。これまでに得られた実験結果は以下の如くである。1.生後25日目のマウス大脳由来のアストロサイトを、IV型コラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンの混合液で、コートしたフラスコ上で培養すると、Assemblyの分布密度が対照群と比較して約2倍増加するという実験結果が得られた。2.培養細胞から、細胞分画法により、総膜フラクションをとり、SDS-PAGE電気泳動を行い、膜タンパクの比較を行ったところ、分子量18万と9万付近でバンドの染色性に差が見られた。現在この差が再現性のあるものかどうか追試中である。しかし、このAssemblyの機能はまったく判っていない。そこで培養アストロサイトを用いて、Assemblyが強く発現される条件を見出し、遺伝子工学技術を使って、Assemblyをコードすると考えられるcDNAの塩基配列を明らかにできれば、Assemblyの機能解明に到達できると考えた。そのためには"培養アストロサイトにおいて、確実にAssemblyの発現促進条件を見出すこと"が出発点であり、本研究の目的であった。