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代謝ネットワークから解き明かす生物－環境相互作用：解析基盤の確立と応用

環境・医学分野において生物と環境のつながりを理解することは重要であり、そのための基礎理論構築と解析手法の確立は急務である。本研究課題では、多様な生物種の代謝ネットワークを用いることで、これまで特徴付けることが難しかった生物ー環境相互作用を理解しやすいかたちで抽出・定量化するための手法を構築した。これを様々な分野の問題に適用し、多くの生物学的知見を得た。これらの結果はゲノム情報に基づく新たな医療診断や環境影響評価の基盤になると期待できる。本研究課題では、申請者がこれまでに構築してきた代謝ネットワークの解析法と、それに基づいて見いだされてきた生育環境との相互作用の知見に基づき、種間相互作用の抽出・定量化を可能とするための解析基盤を確立させる。特に、本年度では、理論とデータ整理において以下のような実績をあげた。【理論】代謝能力(Scope)を確率論的に定量化するための理論的枠組みを拡張した(Takemoto et al., 2013)。具体的にこれまでの理論では単一の入力(栄養や遺伝子摂動など)しか取り扱うことができなかったが、複数の入力にも対応できるようにした。このScopeを応用し、任意の代謝ネットワークから栄養素を見つけ出すアルゴリズムのプロトタイプを構築し、Web Server(限定公開)として実装した。また、この手法で抽出された種間相互作用の機能を特徴付けるため理論を構築した(投稿中)。【データ整理】H27以降の応用を円滑にするため様々なデータを集めた。1)微生物の生育環境情報を整理した。特に酸素要求性に注目した。このデータを応用し、代謝ネットワーク進化における酸素の影響について興味深い結果を得たので報告した(Takemoto & Yoshitake, 2013)。2)医療分野への応用も視野に入れ、疾病に関するデータ(がん患者の死亡率)についても整理した。このデータから、シグナルネットワークの構造と死亡率の関連を見いだしたので報告した(Takemoto & Kihara, 2013)。3)食物網や送粉系についてのネットワークデータやそれらの地理学情報についてもまとめた。このデータから興味深い結果を得たので、論文にまとめて投稿した。【その他】学術雑誌に総説(依頼)(竹本, 2014a; 2014b)を提供し、代謝ネットワーク分析の重要性を啓蒙した。本研究課題では、大規模な生物データから、生物ー環境相互作用の抽出と定量化を可能にするための解析基盤を確立させ、応用する。特に、本年度は、データ分析と理論において以下のような実績をあげた。【データ分析】海外のグループと協力し、の種間相互作用ネットワーク(食物網や送粉系のような共生ネットワーク)のデータ(約400)を収集した。研究支援員や学生と共同で、文献情報から観測地の位置情報(緯度・経度)を抽出し、整理した。これらのデータを用いて、ネットワーク構造と地理学パラメータとの関連を調査し、気候の季節変動性がネットワーク構造と関連することを見出した(Takemoto et al., 2014)。また、研究支援員と協力して代謝反応情報の整理を行った。更新されたデータを用いて、「代謝ネットワークのフラクタル性(自己相似)」に関する論争について取り組んだ。結果として、代謝ネットワークのほとんどは自己相似性を示さないことを見出した(Takemoto, 2014)。【理論】研究支援員と協力して、共生ネットワーク(種間相互作用)の安定性を分析するための理論を構築した(Feng and Takemoto, 2014)。「ネットワークの入れ子構造が生態系安定性の増加に貢献する」という定説が誤りであることを示した。また、生態系分析においては代謝速度(酸素やエネルギーの消費速度)も重要であることから、代謝速度と体サイズのアロメトリー則(3/4乗則)の問題についても取り組んだ。代謝速度をに関するMembrane pacemaker仮説は観測事実との食い違いから疑問視されていたが、細胞不均一性を考慮することでその問題が解決されること示した(Takemoto, 2015)。本年度は、以下のような実績をあげた。生態系において代謝速度(酸素消費速度)が重要であることから、遺伝子と代謝速度の関係について、調査した。構築した代謝ネットワーク分析手法から同定された遺伝子群が代謝速度と関連することを見出した(Takemoto and Kawakami, 2015)。これは、シークエンスから生態系モデリングが可能であることを示唆している。複雑系のトップ国際学会でも口頭発表を行った。環境相互作用の一例として、動物の生息域変動性についても調査を行った。理論からの予測では、生体分子ネットワークのモジュール性が生息域多様性を決定すると考えられるが、実データからはその予想が支持されないことを見出した(Takemoto, 2016)。構築した生態系ネットワークのデータベースを用いて、世界規模で、人間活動や気候変動が生態系ネットワークにどのような影響を与えているかについて調査した。結果を論文にまとめ、投稿した。ネットワークの機能評価のために、共同でネットワーク構造と可制御性についての理論を構築した。結果をまとめ、投稿した。その他、開発手法を応用して、未培養微生物の機能推定や、抗がん剤曝露下におけるがん細胞のシステム応答の評価なども行った。予定されていたデータ整理はほぼ終了した。ただ、追加が必要なデータが判明したため、それらのデータを順次整理している。収集されたデータを用いて順調に結果を出すことができている。

生物データから抽出される生物相互作用の評価のための理論もほぼ完成した。本研究課題では、大規模な生物データから、生物ー環境相互作用の抽出と定量化を可能にするための解析基盤を確立させ、応用する。本年度は、以下のような実績をあげた。昨年度構築したネットワーク構造と可制御性についての理論が論文として公開された(Takemoto & Akutsu, 2016)。生態系ネットワークの大規模データセットを構築し、人間活動や気候変動が地球規模で生態系ネットワークに影響を与えていることを示した(Takemoto & Kajihara, 2016)。構築したデータセットを利用し、Petoのパラドクス(なぜ大きな動物のがん発症率は予想されるよりも低いのか)にひとつの解決を与えた(Takemoto et al., 2016)。これまでに積み上げてきた、地理データ分析、ゲノム解析、統計分析の手法を応用して、哺乳類における生息域多様性とゲノムの関係を調査し、エキソソームは哺乳類の生息範囲拡大に貢献していることを見出した(Takemoto & Imoto, 2017)。その他、構築した理論を応用して、個別ゲノムやメタゲノムの代謝機能ポテンシャルを評価する手法において、機能モジュールの充足性についての統計的評価法を開発した(Takami et al., 2016)。構築したネットワーク分析の手法を応用し、蝶の食草選択の大規模調査を行なった(Muto-Fujita et al., 2017)。環境・医学分野において生物と環境のつながりを理解することは重要であり、そのための基礎理論構築と解析手法の確立は急務である。本研究課題では、多様な生物種の代謝ネットワークを用いることで、これまで特徴付けることが難しかった生物ー環境相互作用を理解しやすいかたちで抽出・定量化するための手法を構築した。これを様々な分野の問題に適用し、多くの生物学的知見を得た。これらの結果はゲノム情報に基づく新たな医療診断や環境影響評価の基盤になると期待できる。データ整理は順調に進み、それらのデータを応用して、生態系や代謝についての興味深い知見を複数引き出すことができた。特に生態系ネットワークの観測地情報のデータはデータ量の側面から世界をリードしているといえる。代謝ネットワークデータも他の研究者から広く使われている。理論に関しては、研究支援員の協力で、予定されていた種間相互作用ネットワークの分析手法を完成させることができた。これを応用することで、生態系における群集構造と安定性に関するある論争を解決することができた。また、代謝速度のアロメトリー則の理論を構築し、興味深い仮説を得ることができた。これは、生態系評価に重要な代謝速度の推定に応用できる。今年度、代謝ネットワーク分析を通して、代謝速度がゲノムから推定できることを報告した。
「通学区の変更」と「学校選択制度」が学校の規模と配置に与える影 響の日米比較研究

主として、アメリカのある学区と日本の3市を対象に2000年以後の関係行政文書について調査を行った。アメリカの調査対象学区は、各学校の児童数にあまり差がない状況ながら、学区内全小学校について閉校可能性を点数で評価し、2006年から2011年の間に4校を閉校させた。一方、日本の3市は、いずれも学校間の児童生徒数に大きな差がある中で、国の標準に沿うかたちで市としての適正規模を定めたが、その後の学校規模や配置に影響を与えることはなく、学校統廃合も進んでいない。本研究の目的は、「通学区の変更と学校選択制度が学校の規模・配置に与える影響の実相を、日米の事例研究によって明らかにすること」にある。研究初年度である平成22年度は、当初の計画通り、基礎的調査を精力的に行った。具体的には次の3点を実施した。第1に、先行研究(特にアメリカのゾーニング、ゲリマンダーなど通学区の変更に関する文献)をレビューし、制度の全体像と課題の把握に努めた。第2に、日本について、ある地方都市学区を7月から1月にかけて断続的に訪問し、そこに保管されているすべての教育委員会議事録を閲覧し、関係資料の収集を行った。この資料に基づき、同市における小・中学校の通学区の変更と学校配置に関する記録や議論の様子を整理・検討した。その成果の一部として、県住宅団地造成に絡む地番名称と通学区の不整合など同学区に特徴的なケースについて日本教育制度学会で発表した。教育委員会議事録に基づき、歴史的な事実として通学区の変更と学校配置問題の実態を詳細に明らかにした事例研究は多くなく、その点で研究上の意義を主張できる。第3に、米国について、カリフォルニア州の3学区を対象に学区の歴史的史・資料を収集するとともに、3月には渡米調査を実施し、学区関係者、学校関係者から議事録、通学区地図、その他を入手した。また、渡米調査では通学区変更に関するプロセスや課題などについて直接関係者から情報提供を受け、その結果を整理・検討した。渡米調査に基づく具体的な研究成果の発表は23年度に行う予定であるが、選択制を採用している学校の存在はそれ以外の学校の所在地、学校配置にも影響を及ぼしていることを確認した。研究2年次の平成23年度は、おおむね当初の計画通り、各種文献資料の収集、アメリカ合衆国カリフォルニア州での現地調査、その他を精力的に行った。初年次に入手していた各種資料・データとあわせ、主として次の2点を実施し、成果をあげた。第1に、カリフォルニア州内に所在する、あるチャータースクールが、一般公立学校および学区といかなる関係にあるのか、その関係性をチャータースクールの役員会の会議録(1993年2011年5月)から読み取った。学校選択制度としてのチャータースクールと一般公立学校は、互いに学区内の学校規模や配置に影響を与える可能性があるからである。同チャータースクールは、公立学校のキャンパスをいわば「間借り」するかたちで発足し、その後2000年には専用の校地・校舎を得て独立した(ただし用地、校舎とも学区財産)。さらに2011年には他の公立学校校舎の一部を利用する、あるいは学区外に校舎の一部を設置する案も浮上したことを明らかにした。以上の分析結果については、日本比較教育学会で口頭発表した。第2に、カリフォルニア州内のある学区において2000年以後の10年間に、(1)何のために閉校・通学区の変更が行われているのか、(2)閉校・通学区の変更はどのような項目に基づいて検討されているのか、(3)通学区が変更される際、学校選択制度はどのように考えられているのかを分析した。それぞれの結論は次のようになる。(1)児童生徒数の不均衡の是正、"飛び地"の解消、"フィーダー・パタン"の是正、不統一な学年構成の是正のために行われていた。(2)学区内のすべての小学校を対象に、閉校の可能性を数値化した上で検討がなされていた。(3)閉校・通学区の変更を検討する際、学校選択制度がもたらす影響は考慮された形跡がない。以上の分析結果については、中国四国教育学会で口頭発表するとともに、同学会の学会誌に発表した。本年度は主として次の3点を研究した。第1に、日本とアメリカ(カリフォルニア州)を対象に、学校の適正規模・適正配置に関する行政事務内容について比較検討した。その結果、日本は適正な学校規模を学級数で定めているがアメリカは児童生徒数で定めている、日本の学校は小規模=分散型であるが、アメリカの学校は大規模=集中型である、アメリカの学校規模のちらばりが小さいのは、学校規模を一定程度に保つために、学区教委が閉校、学校選択制などを実施しているからである、といったことを明らかにした。第2に、カリフォルニア州内のあるチャータースクールの保護者を対象に、選ばれた学校、選ばれなかった学校、選ばれる可能性のあった学校を調査した。

その結果、調査対象校を含むチャータースクールは選ばれる可能性のあった学校群を形成していることで学校規模を維持していること、通学区のある一般公立学校はフィーダースクール群を形成していること、しかし、対象校(中学部)を卒業して他学区の公立学校(インターナショナルバカロレアプログラム)に進学する者が多少いること、インターナショナルバカロレアという人気プログラムをもつ同校には、学区を越えて生徒を受け入れる制度が適用されており、なおかつ生徒を受け入れる物理的余裕が十分にあることなどを明らかにした。第3に、自学区内ではないところ(すなわち他学区)にチャータースクールを設置し、そこで広範囲から生徒を獲得するということが起こっている事例を取り上げ、それが学区及び学校規模に与える影響を調査した。学区という地理的境界内でチャータースクールが申請され、それをその学区が認可、管理、監督するという従来型の設置管理形態ではなく、境界を越えたかたちの設置および学校管理形態が現象化することで、生徒獲得競争および学校規模の維持・拡大が学区を越えて激化していることなど明らかにした。全体的には、およそ計画通り文献調査、現地調査等を実施し、その成果に関して学会での口頭発表、論文発表を行い得ているため、上記のように判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後(研究最終年度)は予定どおり、目標達成、最終成果の公表を中心に行っていく。文献調査、現地調査についても実施するが、これも補足的なものを中心とする。これまで日米で計6学区を調査対象として資料収集、分析を行ってきたが、このうち日米で1学区2学区を主たる分析対象として、より精緻なリサーチをしていく予定である。学会発表、論文発表を継続するとともに、最終報告書を作成し、年度内にインターネット上にアップロードする予定である。
うつ病薬物治療の最適化の為の画像等検査バッテリーの確立とその有効性の前方視的研究

本研究ではうつ病患者に対し、個人ベースでの治療計画の最適化に役立つような、MRIによる画像検査を主体とする検査プロトコルの確立を目指した。与えられた場面における適応的または非適応的な行動が文章呈示され、それが自分に当てはまるか否かを判断する「自己参照課題」が開発された。これを用いると、適応的行動に関する選択の時、うつ病患者群の内側前頭前皮質における脳活動は健常対照群より亢進し、Hamiltonうつ尺度とは正に相関することが示された。また、健常対照群では非適応的行動に関する選択の時、内側前頭前皮質の別の部位での活動性が患者群より亢進し、性格傾向の一つである危険回避傾向との相関が認められた。本研究で開発された当該課題は、うつ病の状態(state)ないし同病への罹りやすさ(trait)の両者を反映し、患者の状態を神経ネットワークレベルで理解できることから、治療計画を検討する上での一助となる可能性が示唆された。本研究ではうつ病患者を対象として、個人ベースで薬物治療計画の最適化を行うため、MRIによる画像検査を主体とした検査プロトコルの確立を目指す。ここでの「治療最適化」とは、診療の初期段階で病態把握のための検査バッテリーを実施し、その結果を元に治療方針を定め、患者ごとに奏功する薬物の種別・用量設定までの期間を可能な限り短縮することを意味する。研究の性質上、実施期間(5年)を2期に分け、前期で患者の病態把握と治療反応性を予測するのに適した検査の確立を行い、後期でその有効性を評価するための前方視的研究を実施する。本研究を通して確立された治療最適化に関する知見と、これまでに提唱されているうつ病の神経基盤モデルとの関連性・整合性を検討する。本研究はうつ病患者に対し、個人ベースで薬物治療計画の最適化を行うため、磁気共鳴撮像装置(MRI)による画像検査を主体とした検査プロトコルの確立を目指すものである。本年度は、その初年度として、機能的MRI(fMRI)を用いてうつ病患者の病態を把握するのに適した認知機能検査の確立に重点を置いた研究が実施された。病態を表す指標としては、患者当人のうつ病の状態を反映するstate-dependentな指標と、うつ病への罹りやすさを示すtrait-dependentな指標があることが知られている。そこで各々の指標につき、先行研究で汎用性が確立されている心理タスクを参考にfMRI用認知課題を作製し、健常者を対象としたfMRI検査を実施し、その有効性を検証した。具体的には、International Affective Picture System(Lang et al.2005)に収録されている図版を素材とした情動課題や、練習効果の出にくい前頭葉機能課題、言語課題、注意課題、心の理論(Theory of Mind)課題など複数の認知課題が試験的に作製された。これまでに約20名の健常成人に対してfMRI検査が実施され、その有効性の検討ならびに認知課題の改良が行われた。また少数例ながら、うつ病患者に対しても同検査が実施され、健常人の結果との比較検討が行われた。来年度以降、より大きな被験者集団に対し検査を実施する予定である。本研究は、うつ病患者の薬物治療を個人ベースで最適化する目的で、磁気共鳴撮像装置(MRI)による画像検査を主体とした検査プロトコルの確立を目指すものである。実施期間(5年)の前半で患者の病態把握と治療反応性を予測するのに適した検査の確立を行い、後半でその有効性を評価するための前方視的研究を実施する。本年度はその2年目として、前年度に作製した機能的MRI(fMRI)検査用・認知課題を、うつ病患者約10名と、同年代の健常者約30名を対象として実施した。

認知課題としては、情動図版(International Affective Picture System, Lang et al.2005)を使用した視覚的情動課題や、心の理論(Theory of Mind)に関連した自己参照課題などが実施された。そして、各認知課題遂行中の主要脳部位(扁桃体・海馬・内側前頭前野など)における活動性と、うつ尺度など他の臨床評価尺度との関連性(患者群)、もしくは個人の性格傾向などとの関連性(患者群・健常対照群双方)について解析が進行している。これらを通して、当該認知課題が患者当人のうつ病の状態を反映するstate-dependentな指標、もしくは、うつ病への罹りやすさを示すtrait-dependentな指標として有用であるか、詳細な検討を行っている。来年度以降、より多くの被験者を対象とした検査を継続しながら、治療最適化において有用な認知課題の絞り込みを行う予定である。本研究は、うつ病患者の薬物治療を個人ベースで最適化する目的で、磁気共鳴撮像装置(MRI)による画像検査を主体とした検査プロトコルの確立を目指すものである。ここでの「治療最適化」とは、診療の初期段階で病態把握のための検査バッテリーを実施し、その結果を元に治療方針を定め、患者ごとに奏功する薬物の種別・用量設定までの期間を可能な限り短縮することを意味する。研究期間(5年)の前半で患者の病態把握と治療反応性を予測するのに適した検査の確立を行い、後半でその有効性を評価するための前方視的研究を実施する。本年度はその3年目として、前年度までに確立された機能的MRI (fMRI)検査用・認知課題を、より多くのうつ病患者と、年齢・性別などをマッチさせた健常者に実施した。特に心の理論(Theory of Mind)に関連した自己参照課題を遂行している間の脳活動について検討が重点的に進められ、主要脳部位(内側前頭前皮質・帯状回・扁桃体など)における活動性と、Hamiltonうつ尺度など臨床評価尺度との関連性(患者群)、ならびにTemperament and Character Inventory (TCI ; Cloninger et al.1994)などで測られる個人の性格傾向などとの関連性(患者群・健常対照群双方)について解析が行われた。結果、当該認知課題遂行中の前頭前野における賦活は、うつ病患者の病状を反映するstate-dependentなマーカーとして使用できる可能性が示唆された。来年度以降、さらに多くの症例を通して当該課題の有用性について検討を行う予定である。
電磁スピニングシステムによる超高粘性領域の迅速・広帯域粘弾性スペクトル測定

非接触、極微小量測定、広いダイナミックレンジといった様々な特徴を有するまったく新しい粘弾性測定法である電磁スピニングシステムを、10^3 Pa・s以上の高粘性領域に対応させる試みを進めた。さらに完成したシステムを用いて、樹脂の硬化プロセスやガラス転移などの現象に見られる非常に高い粘性の出現過程における粘弾性の広帯域周波数スペクトルを、秒分程度の分解能で迅速測定できるシステムを構築した。現有のシステムでは向かい合う2個一組の永久磁石をモータによって試料の周りを回転させることにより回転磁場を生成していたが、ここから定置した一組の永久磁石と、電流により磁場の向きと大きさを制御することができる電磁石を組み合わせた電磁駆動型EMSの作製を試みた。粘性が10^3Pa・sのシリコンオイルを標準試料として用い、性能の確認を行った。回転子として半径1mmのアルミ球を用いると、球の最大回転角速度は10^<-4>rad/sの程度であり、例えば100Hzの振動磁場に対する角度変化は10^<-6>rad/s、赤道の移動距離は1nmとなる。この微小な変化量の測定を実現するために、レーザースペックル測定を試みた。アルミニウム球に下からレーザー光を照射すると、表面のわずかな凹凸のためにファーフィールドにおいて反射光にスペックルパターンを生じるため、球の回転によるこのスペックルパターンのその移動から球のわずかな動きを測定した。さらに振動の高周波化で微小振幅を測定するために、光パターンの変化に非常に敏感な光学測定手法・センサを用い、印加信号との同期から位相敏感検波するロックインアンプを組み合わせて行った。このシステムにより、当初10^3Pa・sの粘性標準の100Hzまでの粘弾性スペクトル測定を行った。ゼロ周波数極限では粘性はフィッティングパラメータなしでその絶対値を決定することができるため、これをもって装置の精度の評価を行うことができ、高精度で粘性を測定できることを確認した。本年度はEMSシステムを用いたアルコール水溶液粘性の精密計測について精細に行った。あわせて、今回のシステムにより定量評価が可能となった回転系におけるNavie-Stokes方程式の非線形項の影響についても考察を行った。従来、粘性計測が液体の輸送や撹拌といった化学工学プロセスの設計・運用に用いられていた時代には、低粘性計測に対する需要はそれほど大きくはなかった。これは、これら水などの低粘性液体のマクロプロセスでは、Navie-Stokes方程式を構成するいくつかの項のうち慣性および圧力勾配の項が優越し、粘性項の寄与がほぼ無視できるという事情による。このため低粘性測定は専ら希薄溶液の反応モニタリングや物性研究等に用いられていた。これに対し最近における微小液体プロセスの進歩は急速であり、このため最近では低粘性域における精密測定法への需要が大きくなっている。これに対応すべく、申請者を含む研究グループは自身が開発したEMS方式に改良を加え、浮上型のディスク回転子を採用することにより機械摩擦の問題を解決した。ディスク型EMSではシャーレに入れた試料表面に浮力によって浮かべた金属製の回転子に、鉛直方向の成分を持つ磁場を印加してこれを回転させる。このとき動磁場により生成された誘導電流と磁場とのローレンツ相互作用により、回転子には自賠追随する方向にトルクが印加される。このトルクによる回転の速さを計測することで、試料の粘性を精度よく計測することができる。回転型粘度計では試料がニュートン液体の場合、トルクに比例した回転数が実現されるとするが、Navie-Stokes方程式の非線形項の効果によりこれは厳密には成り立たない。実験値では粘性の小さい試料において直線から外れ、非線形の効果が表れていることが確認できる。申請者を含む研究グループはまた、流体数値シミュレータを用いて回転円板の系における印加トルク及び回転数の関係を求めた。その結果は実験結果をよく再現することを確認した。
被服繊維の吸湿過程における熱機械特性変化

1.装置の改良について現有の熱機械分析装置の試料セル部分に枝付き管を挿入して二重円筒様にし、枝部分より定湿度エア-を一定速度で導入し、かつ管下部より二重管部を経て排気できるようにした。また、高速応答・微小サイズ型の湿度センサーを試料近傍に取付け試料雰囲気をモニターできるようにした。一定湿度エア-は、乾燥空気発生装置より得た乾燥空気と、恒温槽に取付けた泡発生装置より得た湿潤空気を、三叉バルブを用いて混合することにより発生させた。2.試料について蛋白質繊維は、吸湿により結晶や非晶分子の配列状態を変えることが知られているので興味深い。そこで、今回はそのモデルとして絹繊維より得たフィブロンを試料とすることとし、それを溶解・フィルムキャスティングして使用した。力学測定においてフィルムを利用するメリットの一つとして、そのサイズを設定し易いことがあげられる。3.試料の熱機械特性について試料に正弦伸縮を与えて応力応答の時間遅れを測定する動力学試験を行った。結果は弾性率解析ソフトを用いて解析した。その結果、極く微量の吸湿により弾性率が約100倍増加するが、0.2%の初期伸長を行った状態で強制振動を行うと約10%RHを堺に弾性率が再び100倍低下することがわかった。すなわち、極く微量の吸湿は分子を再配列させて弾性率を高めるが、10%RHの吸湿によりその構造がくずれる、と考えた。
臨床Nurseの色表現能力の向上に向けた認知能力形成過程の分析

本研究では、看護記録に記載される看護情報のうち、色表現は多彩で個別性のある表現が多く共通理解されにくいことから、どのような思考過程で表現されるのかに注目した。まず、色表現にいたるまでの思考選程を分析し、さらに看護師の色の認知に調するアセスメント能力の形成選程を分析することを目的とした。調査対象は、関東・東梅・甲信越の6つの総合病院に勤務している常勤看護師のうち、研究協力に同意した61名とした。対象者の臨床経験年数は124年目(平均787±6.2年)、男性2名、女性59名であった。勤務病棟は外科系23名、内科系22名、産婦人科6名、救急救命系5名、手術室3名、小児科2名であった。調査は、7項目の質問紙調査と半構成式の面接調査を実施した。面接から逐語記録を作成し、色表現に至る思考過程の違いが表現されていると判新された文脈を抽出し、内容分析を用いて整理・分類した。色を用いて患者情報を表現する機会がよくあると全ての対象者が認識していた。今回の調査では、同じ色を見て条件を変え、3回表現をしてもらった。その結果、3回すべて同じ表現をした人は3名のみであり、すべて違う表現をした人が75.4%と圧倒的に多かった。色表現用語と臨床経験年数には関係が無かった。色表現の共通理解に対する認識は、「共通理解している」が27.9%、「多少の誤差があっても共通理解している」が18.0%、「よく表現するものに関してのみ」が6.6%、「経験年数を重ねれば」が4.9%、「共通理解していない」が42.6%という結果が得られた。勤務病棟による特徴的な色表現用語がみられ、看護師の色の共通理解に関する認識からも、同じ病棟であれば色表現用語が共通理解できていることが示唆された。看護師が視覚データを捉えてから色表現に至るまでには「対象物の認識」「観察の経験」「情報との比較」「色表現の選択」「色表現」の5段階の思考選程を通過していた。さらに5段階を通過するパターンを分類すると、7つの思考パターンがあった。パターン分類からみると、色を表現する時には色を捉えるだけでなく、異常かどうかのアセスメントをしなが,ら意識して対象物全体を捉えようとする看護師が多い。このことから、色表現は重要なアセスメントが含まれている情報であるといえる。平成13年度は、(1)看護職者の色表現用語の実態を、いくつかの地域から多面的に調査し、色表現方法の普遍性を検証する。(2)色表現の経験を具体化することで、色表現能力の形成過程に影響を与える要素を抽出し、さらに臨床経験との関連を検討することで看護職者の色の認知に関するアセスメント能力の形成過程を分析することを目的として調査を実施した。調査対象は、協力の得られた関東、東海、甲信越地方の6つの病院に勤務する看護職者、合計60名とした。対象の選定にあたっては、看護職者全体の実態を明らかにするため、勤務病棟、臨床経験年数等の指定をしていない。調査は、対象者の施設の1室で、1名ずつに20分30分程度の半構成式の面接調査を実施した。自作の尿の色彩サンプルと患者の情報用紙を用いて実際に見せた色を自由に表現してもらい、さらにどのような判断によってその表現に至ったかというプロセスを語ってもらった。現在、面接で語られた内容の逐語記録を作成し、質的研究法を用いて分析中である。関東地域25名のデータから、色を見て表現に至るまでの思考プロセスは、大きく「見たことのある色か」「その色を何の色として見るか」「情報を取り入れるか」「情報の示す色表現があるか」という4つの段階を通過して表現に至ることが明らかになっている。この4段階を通過するプロセスとして8つのパターンに分類できた。このうち、第2段階で何の色としてみるかが表現の判断に大きく影響するのではないかと考えられる。また、視覚でとらえたものの正常、異常の判断は、思考プロセスの各段階にみられていた。色表現が多様になる原因を明らかにし、今後はどのような表現が看護情報として重要なのかを検討していく。

その結果、3回すべて同じ表現をした人は3名のみであり、すべて違う表現をした人が75.4%と圧倒的に多かった。色表現用語と臨床経験年数には関係が無かった。色表現の共通理解に対する認識は、「共通理解している」が27.9%、「多少の誤差があっても共通理解している」が18.0%、「よく表現するものに関してのみ」が6.6%、「経験年数を重ねれば」が4.9%、「共通理解していない」が42.6%という結果が得られた。勤務病棟による特徴的な色表現用語がみられ、看護師の色の共通理解に関する認識からも、同じ病棟であれば色表現用語が共通理解できていることが示唆された。看護師が視覚データを捉えてから色表現に至るまでには「対象物の認識」「観察の経験」「情報との比較」「色表現の選択」「色表現」の5段階の思考選程を通過していた。さらに5段階を通過するパターンを分類すると、7つの思考パターンがあった。パターン分類からみると、色を表現する時には色を捉えるだけでなく、異常かどうかのアセスメントをしなが,ら意識して対象物全体を捉えようとする看護師が多い。このことから、色表現は重要なアセスメントが含まれている情報であるといえる。
農村の新たな担い手の戦略的確保に向けたグリーンツーリズムに関する基礎的研究

今後の農村・農業の維持に資するグリーンツーリズムのあり方を探るために、本研究では自治体の取り組み状況と、農業特性・農村特性、消費者の志向(訪問意向・体験内容の嗜好・発地着地の関係等)とを対照させることで、地域条件に応じた好ましいグリーンツーリズムメニューを検討した。また、グリーンツーリズムを通じた農業の6次産業化や長期間継続可能性の先進地域の事例分析を通じて、新たな担い手としての外部人材の特徴についても考察している。本研究はグリーンツーリズムを、農業の担い手となる人材確保の戦略的手段として位置づけ、グリーンツーリズム実施農村の実施状況と利用特性、農村と市場都市の結びつき及びその要因、参加率向上のための支援システムの在り方、を考察することを目的としている。本年度はまず、既存文献等より先進的なグリーンツーリズムの事例を抽出し、農業ワーキングホリデーや農業体験を実施する農村、農業レジャー公園、地元農産物の宿泊施設での活用事例について視察及び実施主体へのインタビュー調査等を実施した。また、気候条件によって全国を97地域に区分、それぞれの地域特性(農業生産環境特性、立地特性)を明らかにした。続いてこれらの地域へのグリーンツーリズム客の特性を把握するために、2段階に分けて消費者インターネットアンケートを実施した。スクリーニング調査では「農村での余暇活動メニュー」全般について経験率・認知率、今後の参加意向等を訪ね、その中で本格的グリーンツーリズムに該当するメニューの経験者へ本調査を実施した。居住地・訪問地(97地域区分)の他、詳細な活動内容や選択理由、旅行費用、日常の生活や趣味等の嗜好についても訊ね、(1)サンプル数は限定的ながらも、グリーンツーリズムに関する全国的なOD表を作成、(2)発地として有力な地域の特性を考察した。さらに、全国の自治体の農業関係部局ヘグリーンツーリズムの実施状況、集客状況についてもアンケート調査をしている。次年度は両者の対照を行うことで、グリーンツーリズムに有望な農村側・居住地側の条件を整理しマーケティングの方法論として整理する。また、グリーンツーリズム参加に係るコスト分析や農業生産との関係の分析、さらにグリーンツーリズムに対する期待・満足、コスト負担感に影響するポイントの分析等を行うことを予定している。本年度は、首都圏を対象地域に選び、そこを発地とするグリーンツーリズムの着地農村自治体の優位性を測るため、農業生産環境特性、立地特性について首都圏及び周辺12都県の523市町村(及び23区)を単位として集計・分類した。その結果及びインタビュー調査・文献調査の結果を用いて指標を作成し、消費者インターネットアンケート調査を実施、コンジョイント分析を行うことで、「農作業を伴う」、即ち農業面で農村の担い手として期待できる6種類のグリーンツーリズムのメニューのそれぞれに関して、優位なデスティネーションの特性を明らかにした。その結果、農業生産環境特性、立地特性、グリーンツーリズム参加の際の特典、料金・参加日数といったコスト、それぞれにおいて消費者を引き付ける条件が導き出されたものの、それが集客要素の全てでなく、それ以外の条件(ホスピタリティや文化等)も無視できない割合(数値は各メニューによる)で影響することが判明し、マーケティングにおいて考慮すべき地域側の条件の整理ができた。また、類似条件で近接地域に立地する農村の取組みを詳細に把握するために、長野県南信地方及び福島県会津地方の市町村ヘインタビュー調査を実施し、前述の「それ以外の条件」の具体的内容を把握し、不利条件を克服するための要因についても考察している。前年度までの消費者・自治体アンケートの結果及び文献調査等から集客面で特徴的性格を有する対象地を選定し、現地受入れ側へのインタビュー調査を通じて、(1)長期間GTに取組む自治体においては、どのように取組みを変化させて集客を維持し、また農業・農村の持続性に寄与しているのか、(2)近年新たに取組みを始めた自治体においては、ツーリズム以外の要素へどのように波及することを企図して取組みを設計しているのか、等を考察した。主な対象地は、(1)は大分県宇佐市安心院町・山梨県甲州市、(2)は静岡県富士宮市である。その結果、i)新たな担い手としての外部人材がGTを通じて農村にかかわるためには、農業生産の付随としてGTを捉えるのではなく、GTのための農業活動自体をビジネスと捉えて農業を構築することも必要であること、ii)取組みの変化要因として、取組み開始から長時間経過した後に、GTや農業技術を若い頃より研究した外部人材がキーパーソンとなって、一定の時間をかけて農業者に働きかけること等が農業を高次化させ、ビジネスに結びつける役割を担っていること、が指摘できた。また、iii)外部人材のポテンシャルとしては、加工技術や経営コンサルティング等の農業以外の技術を外部から持参し(Uターン等も含む)、かつ地域住民と交流を継続できるコミュニケーション能力が重要な役割を果たしている傾向がある。そしてそのプロセスにおいては、GTを活用した結果として行われるものと、新たな高次化の取組みがGTの魅力となって集客に結びついているものが見られた。

全体の分析結果を用いて、農業・農村地域特性を踏まえたGTメニューの選択モデル、想定される市場地域の設定モデル、農業の高次化とGTの相互連携を通じた持続的農業・農村モデルを整理し、戦略的な都市農村交流と人材確保に向けたGTのあり方を考察している。なお国際会議において論文2編を発表した。
分光光度法による希土類元素とタンパク質、ヌクレオチドとの錯形成反応に関する研究

希土類元素(M)とタンパク質(牛血清アルブミン、BSA)、およびMとヌクレオチド(アデノシン三リン酸、ATP)との錯形成反応を調べた。錯形成平衡は、(ア)配位子、A(BSA,ATP)自身の吸光度変化、(イ)競合配位子、B(高感度呈色試薬、5ーBrーPAPS)とその錯体、MBの吸光度変化をそれぞれ測定する方法で解析した。購入した超純水製造装置は、試薬の精製、溶液調整等に使用した。1.錯形成解析法の比較:同一の系に(ア)、(イ)の手法を適用した結果、(イ)の手法でのみ錯形成が確認された。このことから、BSAあるいはATPのUV吸収を示す官能基が金属に配位する傾向は小さいと考えられる。(イ)の手法で得た結果を以下に示す。2.希土類ーBSA錯体:吸光度から得られた〔MB〕と〔B〕の値およびMBの生成定数を用いて〔M〕を求め、Scatchard plotを行って解析した。重希土(Yb,Er)では直線関係が得られ、一定の結合比(Yb:BSA=4:1)をもつこと、その安定度はYb>Erであり、pHの増加(6.4ー7.2)とともに増大することなどが判明した。一方、軽希土(Nd,Eu,Gd)では、直線は得られず、より不安定な錯体種の混在が確かめられた。初期の直線部を解析して求めた安定度は、元素種、pH(6.4ー7.2)、何れの変化に対しても顕著な差異を示さず、重希土との結合部位と比較して、明らかに性質の相違が認められた。3.希土類ーATP錯体:pH=7.2における1:1錯体の条件生成定数(K)を求めた結果、logKの値は6.5(Nd)から5.3(Yb)となり、原子番号の順に減少することが認められた。この結果は、速度論的手法(酵素阻害作用を利用)で得られた文献値(pH=8.0において6.5(La)から7.4(Lu))の増加傾向と異なっているので、今後さらにこの原因を究明したい。
金融自由化と金融伝播に関する理論的研究

本年度の主な成果は以下の2点である。1点目は渡辺誠教授(VU Amsterdam)と共に、中央銀行の「最後の貸手(lender of last resort)」機能と銀行のリスク回避行動についての関係性を分析した。貨幣サーチ理論に銀行システムやマクロ的流動性ショックを導入し、銀行危機のモデル化に成功した。その上で、銀行危機の際に中央銀行が緊急資金供給を行う最後の貸手機能をモデルに導入した。本研究結果は以下の通りである。(1)最後の貸手の存在は、銀行準備を減少させ銀行危機の確率を上昇させる、(2)そしてある条件の下では銀行のモラルハザードを促す、(3)しかしながら事前の意味での経済厚生は上昇する、(4)ある条件の下では懲罰的高金利はモラルハザードを制御できない、である。これらの結果は、現行の最後の貸手政策やバジョット・ルールの理念と相反する含意を含んでおり、今後の最後の貸手政策の方針に関して重要な示唆を与えていると考えられる。本研究結果は共同論文“Banking Panics and the Lender of Last Resort in a Monetary Economy"にまとめworking paperとして公開されている。現在、国際査読付雑誌に投稿中である。2点目は、新興国における急激な資本流入と銀行危機との関係性を扱った単著論文“Banks and Liquidity Crises in Emerging Market Economies"が国際査読付雑誌Journal of Economic Dynamics and Controlに掲載許可を受けた。本研究は、急激な資本流入がいかに資産価格の急上昇と急降下、またそれに伴う銀行システムの崩壊を生みだすのかを理論的に解明した研究である。資本の流入規制等が銀行システムを不安定化させる効果がある事を示した。今後は、単独研究および渡辺教授との共同研究2件を国内外の研究会・コンファレンスで報告し、国際査読付雑誌に掲載されるように継続的に改訂を進める。また金融自由化と金融危機伝播に関する単独研究論文“Financial Contagion in a Two-Country Model"の改訂にも務め、国際査読付雑誌への掲載を目指す。1年目において渡辺教授との共同研究3が完成し、ワーキングペーパーとして公開されたことは、申請段階において設定した目標を達成していることを意味している。さらに、従来より継続的に進めていた共同研究4が国際査読付雑誌Macroeconomic Dynamicsに採択された。しかしながら、単独研究1、2を国際査読雑誌に掲載できていないことが本年度の心残りである。今後ともこれらを国際査読付雑誌に掲載できるよう努める。今後は、単独研究1、2、3を国内外の研究会・コンファレンスで報告し、国際査読付雑誌に掲載されるように継続的に改訂を進める。さらに現在進行している渡辺教授との共同研究3を拡張させた、中央銀行による「最後の貸手」機能と銀行のモラルハザードに関する共同研究を完成させ、ワーキングペーパーとしてまとめる事を目指す。
訪問看護師に必要なフィジカルアセスメント能力－看護基礎教育で求められる教育内容

1年目は、訪問看護師対象の全国調査の調査内容の検討を行った。現在の訪問看護師のフィジカルイグザミネーション実施状況の実態を知るために、どのような質問をすればよいのか、対象の属性で必要な調査項目、教育ニードに関して知るための調査項目、質問法等についての検討を、共同研究者、研究協力者と共に行った。現在は郵送調査の準備、研究者の所属する大学の倫理審査への申請を行っているところである。2019年度中に、第1段階の郵送調査を実施し、その結果を公表する予定である。調査内容の検討に時間を要したことと、研究責任者の大学内での仕事、人事関係での問題が起きたために、本研究を遂行する時間的余裕が取れなかったためである。2年目である今年度中に、第1段階の郵送調査を実施し、得られたデータ入力、分析までを行う予定である。その結果もふまえて、第2段階のインタビュー対象者の選定、インタビュー内容の見直し、インタビュー調査実施の計画、分担を行い、次年度の前半には、インタビュー調査を実施する予定である。1年目の主な使用額である予定であった郵送調査の準備が遅くなり、実施できなくなったために、大幅に金額が少なくなった。しかし2年目に使用予定であるため、2年目は当初の予算より必要経費が多くなる見込みであり、この金額を当てる予定である。
メガリン(gp330)の分子・細胞生物学的解析と新規薬物送達システム開発への応用

メガリンは、腎尿細管上皮細胞の管腔側に多く発現している約600kDの膜蛋白であり、様々な物質を結合し、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込むことが知られている。基質として、アプロチニンやアミノグリコシド(AG)等のカチオン性物質やアルブミンのようなアニオン性物質を認識すると言われているが詳細は不明である。本研究では、メガリンの発現が報告されているラット卵黄嚢がん由来L2細胞及び培養腎上皮細胞(LLC-PKl,OK)を用い、アルブミンやAG系抗生物質アミカシン(AMK)の取り込み特性を解析し、メガリンとの関係を考察した。メガリンはカルシウム結合蛋白としても働くため、L2細胞におけるメガリン発現を^<45>Ca^<2+>によるオートラジオグラフィーにより検討したところ、高分子蛋白領域にメガリンと推定されるバンドが検出された。上記3種の細胞を用い、アルブミンの取り込みを解析したところ、レセプター介在性エンドサイトーシスの特性を示したが、他のメガリン基質で影響されず、別のレセプターの関与が示唆された。次に、L2細胞におけるAMKの取り込みを検討したところ、レセプター介在性エンドサイトーシスの特性を示し、他のアミノグリコシド共存で阻害された。また、メガリンと基質の結合はカルシウム依存性であることが知られているが、L2細胞膜に対するAMKの結合もカルシウム依存性を示した。従って、L2細胞におけるAGの取り込みには、メガリンが関与するものと推察された。さらに、高濃度のAG共存下、^<45>Ca^<2+>オートラジオグラムのバンドが減弱したことから、in vivoで報告されているカルシウムとAGの相互作用に、メガリンが関与する可能性が示唆された。これと並行して、腎皮質内のメガリン量が変化すると考えられる腎障害時の薬物(AG等)腎挙動についても解析を進めている。メガリンは分子量約600kDのLDLレセプターファミリーであり、腎尿細管上皮細胞の管腔側に多く発現している巨大膜蛋白である。最近メガリンが、アプロチニンやアミノグリコシド等のカチオン性物質のみならず、アルブミンのようなアニオン性物質に対してもレセプターとして働き、これら物質をエンドサイトーシスにより管腔側から上皮細胞内へ取り込むとの説が提唱されているが詳細は不明である。本研究では、培養腎上皮細胞を用いてアルブミンの取り込み特性を解析し、基質間相互作用やメガリンの発現等について考察を加えた。培養腎上皮細胞として、ブタ腎由来のLLC-PK1細胞、フクロネズミ腎由来のOK細胞を、基質としてFITCで蛍光標識した牛血清アルブミンを用いた。LLC-PK1細胞によるアルブミンの取り込みは、37°Cでは時間依存的に増加したが、4°Cでは極めて小さく時間依存的な取り込みも観察されなかった。アルブミンの取り込みは、基質濃度の上昇にともなって飽和性を示し、また代謝阻害剤DNPで細胞を処理することにより著しく低下した。しかし、その取り込みはカチオン性のゲンタマイシンやアプロチニンの共存によっては変化しなかった。また、ある種の細胞でメガリン発現を誘導することが知られているretinoic acid/debutyryl cAMP処理によっても、大きな変化は見られなかった。同様の検討を一部OK細胞でも行ったが、LLC-PK1細胞と類似した結果であった。従ってこれら培養細胞では、メガリンが発現していないかあるいはアニオン性物質とカチオン性物質でメガリン中の結合サイトが異なる、アルブミンのエンドサイトーシスにはメガリンとは異なるシステムも関与する、等の可能性が示唆された。
三次元パターンを用いた曲率認識タンパク質群の単一細胞スクリーニング

我々は、異方的ドライエッチングと等方的ドライエッチングを組み合わせることで、凹凸マイクロパターン表面の突出部のカーブの曲率を10 nmから1000 nmの範囲で自在に作り分けることに成功した。次に、この凹凸マイクロパターン上で、NIH3T3細胞などの培養を行い、単一細胞内にさまざまな曲率のカーブを創り出す技術を確立した。更に、単一細胞内に創り出されたさまざまな曲率のカーブから発せられる生化学的なシグナルの観察を行った。生化学的なシグナルの観察は、膜タンパク質および低分子量Gタンパク質の発現を時空間的に追跡することで行われた。三次元パターンを用いて細胞膜をカーブさせ、カーブに曲率認識タンパク質が局在するかどうかを調査している。その結果、曲率認識のあるAmphiphysin(F-BAR)が直径50 nmのカーブに集積することが確認された。この現象は、カベオラを形成するカベオリンでも確認されており、三次元パターンによって曲率認識タンパク質の局在を制御できることを示唆している。そこで我々は、単一細胞内にさまざまな曲率のカーブを創ることができる三次元パターンを設計し、フォトリソグラフィーを用いて作製した。このパターンは一枚の基板にさまざまな曲率のカーブを有し、この上に播種された細胞はパターンのカーブに合わせて細胞膜をカーブさせた。本年度は、こういった三次元パターンを用いて、単一細胞内にさまざまな曲率のカーブを創る実験を行った。細胞膜のカーブの曲率は、三次元パターン上で培養された細胞を共焦点顕微鏡で三次元的に観察することで評価された。その結果、NIH3T3、HaCaT、MEF、HeLa、HUVECs、ADSCsなどの単一細胞内にさまざまな曲率のカーブを創るのに成功した。本研究課題の最大の関門である、単一細胞内にさまざまな曲率のカーブを創ることができる三次元パターンの作製に成功したため、概ね順調に進展していると思われる。今後は、各膜タンパク質のGFP融合体を三次元パターン上の細胞に発現させ、その発現部位を膜のカーブの曲率とあわせて観察するだけである。各膜タンパク質の曲率選択性を、生きた細胞を用いて調べる。BAR、EFC/F-BAR、IMD、ALPS、Caveolinなどのドメインを有するGFP融合タンパク質を三次元パターン上の細胞に発現させ、その発現部位を膜のカーブの曲率とあわせて観察する。さまざまな曲率のカーブを単一細胞内に創り出すことで、カーブの曲率を認識するタンパク質を効率よくスクリーニングできると考えている。膜受容体の曲率選択性の調査五十嵐靖之特任教授(北大院先端生命)、光武進准教授(佐賀大農)らと共同で、EGF受容体やインスリン受容体などのカーブへの局在を調べる。EGF受容体やインスリン受容体が膜のカーブによって活性を変化させることが報告されおり((LuらJBC (2009)、FotiらPNAS (2007)、SonninoらFEBS Lett. (2009))、これらがカーブに局在している可能性も非常に高い。複合領域実験場所の変更および機器の移設のため研究できない時期が4ヶ月程度発生した。そのため、消耗品の発注が滞り、次年度使用額が生じた。休日を利用して研究を推進する予定である。
琵琶湖固有魚種におけるin vitro 卵子分化培養法の開発

絶滅の危機にある琵琶湖固有種の保全、復元を目的として、琵琶湖固有種ホンモロコの卵子をin vitro培養で作製する技術の開発に取り組んだ。その結果、卵子のもととなる未分化な卵原細胞の凍結保存、培養による増殖が可能であることを明らかにした。さらに卵母細胞の培養による細胞質サイズの成長、卵子の培養液中への放出も確認された。本研究は、琵琶湖固有種ホンモロコにおいてin vitro培養による卵子形成に必要な卵原細胞の凍結保存、分化培養の技術基盤を確立し、その可能性を示した。一方で、そのサイズは正常卵子より小さかったことから卵子成熟に関して、今後さらに検討が必要であると考えられた。琵琶湖固有種固有種ホンモロコにおけるin vitro卵子形成を試みるにあたり、まず、卵原細胞を採取し、凍結保存することが必要である。そのために卵原細胞の凍結保存方法の開発、条件設定を試みた。卵原細胞が存在する非繁殖期の雌個体から卵巣を採取し、トリプシンにより、卵巣細胞を単離した。この細胞を凍結保存の際に使用される様々な凍害防止剤を含む溶液に浸漬し、トリパンブルー排出試験による細胞毒性試験を行った。その結果、エチレングリコール(EG)、プロピレングリコール(PG)、およびジメチルスルフォキシド(DMSO)の毒性が低いという結果が得られた。そこでこれらを中心に実際に卵巣細胞を、ガラス化凍結保存し、加温後における卵原細胞の生存率をvasa抗体により染色して、計測した。その結果、卵原細胞は凍結保存が可能であること、凍結保存にはEG, PG, DMSOが適していることが確認ができた。さらに培養を継続するとvasa陽性の細胞数の若干の増加が認められ、本条件下で、増殖可能な卵原細胞の凍結保存が可能であることが示唆された。同時に、卵子成熟培養の基盤技術の開発を並行して進めた。卵子成熟には肝臓で合成されるビテロジェニンが必要である。本研究では安定したビテロジェニンの供給のため、卵細胞と肝臓細胞の共培養を計画している。そこで我々が確立している固有魚の細胞株樹立方法を用い、稚魚、および雌成魚の肝臓を材料として肝臓細胞株の樹立を行った。その結果、稚魚、成魚の両者において安定に増殖可能な細胞株が樹立でき、遺伝子発現解析により本細胞株は微量ながらビテロジェニンを合成していることが示された。琵琶湖固有種固有種ホンモロコにおいて、その卵原細胞の凍結保存が可能な基本条件を見いだすことができた。また凍結保存した細胞は培養により、若干ではあるが増殖する可能性が示唆された。また、卵子成熟培養に必要なビテロジェニンを合成する肝臓由来細胞株を樹立することができた。琵琶湖固有種固有魚種ホンモロコは季節繁殖性であるため、そのin vitro卵子分化培養に必要な卵原細胞の採取時期が限られる。そこでまず卵原細胞の凍結保存方法を検討した。その結果、精原細胞とは異なり、ジメチルスルフォキシド(DMSO)が適しており、融解後も凍結前とほとんど変わらない細胞数の卵原細胞が回収できることがわかった。次に培養条件の検討のため、凍結融解した卵原細胞を培養し、核酸アナログの取り込み実験を行ったところ、DNA複製が確認され、in vitroで卵原細胞の増殖または減数分裂が進行していることが示された。一方で卵子成熟に必用なビテロジェニンの供給を目的として樹立した肝臓由来細胞株におけるビテロジェニン発現は、肝臓組織と比較すると微量であった。そこでエストロジェン(E2)、およびジエチルスチルベステロール(DES)を単独、または共に添加し、ビテロジェニンの誘導を試みたが、高濃度の添加条件においてもその誘導はわずかであった。今回樹立した細胞株はビテロジェニンの供給源としては適しておらず、初代培養細胞をビテロジェニンの供給源として使用する方法が現実的と考えられた。これらの結果をもとに、2ー3月の卵巣由来の卵母細胞の培養を行ったところ、培養の継続に伴う細胞質サイズの成長が認められ、培養液中への放出も確認された。但し、卵膜形成は認められず、サイズも実際の卵子と比較すると小さく、卵子形成、成熟は部分的であると考えられた。また同時に存在する体細胞の増殖が長期培養において障害となる可能性も示された。本研究により、卵原細胞の凍結保存、および増殖、細胞質成長が可能である培養条件など、in vitro卵子形成に必要な技術基盤を確立することができた。凍結保存条件の至適化を計ると共に、凍結保存した卵原細胞が確実に増殖しているかを確認する。その具体的確認方法としては核酸アナログの取り込み実験、および減数分裂マーカーとしてSycp1,3の染色を行い、増殖と分化を区別する。

凍結細胞の培養を継続し、培養液へのwntシグナル阻害剤や増殖因子の添加を行い、未分化培養、分化培養条件の検討を行い、特に分化培養の開発に取り組む。樹立した肝臓細胞のビテロジェニン合成は微量であったことから、エストロジェン等のホルモン添加によるビテロジェニンの誘導を確認する。誘導された場合はその培養上精をを用いて、もし誘導されなかった場合は肝細胞の初代培養上清を卵原細胞培養液に添加し、in vitro卵子成熟培養を行う。幹細胞生物学、生物保全学当初予定より機器価格が安価に納入できた。ホンモロコ購入費、ホンモロコ購入旅費、細胞培養液、遺伝子解析試薬の購入