hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ボルデテラ属細菌のエフェクターによる樹状細胞のディレクティング

百日咳菌とその類縁菌である気管支敗血症菌は,III型分泌装置を介して宿主細胞内にエフェクターを注入することで,気道での定着を確立している。申請者らは,これまでにエフェクターBopCとBopNを同定している。エフェクターBopNは細胞の核内に移行することを見出しているが,CyaAレポーターアッセイにより,BopNの宿主細胞への移行を確認した。また,細胞内に移行したBopNはBopCと相互作用することで,BopCの細胞傷害活性を増強することを明らかにした。気管支敗血症菌はIII型分泌装置を利用して,BopCとBopNエフェクターを宿主細胞内に注入する。これまでに,前者は樹状細胞に貧食阻害を誘導し,後者はIL-10の産生を促すエフェクターであることを明らかにしてきた。本研究の目的は,本来殺菌排除に関わる樹状細胞を,気管支敗血症菌がどのようにディレクティングするのかについて,エフェクターの機能から解析するものである。平成24年度の研究成果は以下に示すとおりである。BopNはIII型分泌装置によって細胞内に注入された後,核に移行する。予備的な実験から,BopNはインポーチンβと結合することを明らかにしている。BopNとインポーチンβの相互作用を明らかにするために,種々のBopN欠失体を作製し,両者の局在を免疫蛍光顕微鏡法にて確認した。その結果,BopNの61-120a.a.欠失体で,BopNの核移行が阻害され,同時にインポーチンβの核移行も極度に減弱した。これらのことから,BopNはN末端側に存在する61-120a.a.のドメインを介しインポーチンβと相互作用することで,核に移行することが示唆された。BopNの機能をさらに掘り下げて解析するために,X線結晶構造解析にて,BopNの立体構造を決定する。bopN遺伝子を発現ベクターに組み込み,大腸菌にて大量精製系を確立している。種々の条件検討を行い,BopN結晶化の条件を見出す予定である。今後の研究の展開:BopNならびにBopC局在化における宿主細胞のレスポンスをより詳細に解析するために,それらをコードする遺伝子を培養細胞の染色体に組み込み,Tet On-Offで発現誘導をかけられるようなシステムを構築する。エフェクターがどのような挙動を示し,感染細胞をディレクティングするのかについて,マイクロアレイを用いたmRNAの解析,感染細胞のタンパク質の発現プロファイルにて,詳細に調べる予定である。ボルデテラ属細菌はIII型分泌装置に依存して,気道上皮に長期的な定着を確立することが知られている。これまでの研究で,申請者はIII型分泌装置によって宿主細胞に注入される2種類のエフェクターBopCとBopNがin vivoでの病原性に関わることを明らかにしてきた。そこで,エフェクター遺伝子を発現ベクターに組込み培養細胞に導入して,エフェクターの機能を解明しようとした。しかし,発現ベクターを培養細胞に導入する際にバラツキが大きく定量解析に困難をもたらした。このような導入効率のブレを解消するために,エフェクター遺伝子を培養細胞の染色体上に組み込んで,Tet On/Offシステムにてエフェクター誘導が可能なシステムを構築した。BopCは細胞傷害を誘導するエフェクターでその解析に困難を極めたが,BopCの発現をTet On/Offシステムで厳密に制御することで,培養細胞の染色体上に安定に組み込むことに成功した。また,BopC発現を誘導することで,培養細胞に細胞死をもたらすことを確認した。今後はこの系にてBopCの発現時にみられる培養細胞の変化を経時的に解析するとともに,培養細胞における遺伝子発現・宿主側因子の変動について網羅的に解析をすすめる予定である。一方,BopNについても同様に培養細胞の染色体上に組み込んだ株を樹立しているところである。BopNはIL-10の産生誘導に関わるエフェクターであることを既に明らかにしているので,樹状細胞の培養細胞系であるDC2.4の染色体上にエフェクター遺伝子を挿入する予定である。本手法は他の病原細菌のエフェクター解析にも応用が可能である。今後はこのシステムを他の病原菌の研究にも利用できるよう情報公開していく予定である。ボルデテラ属細菌に属する百日咳菌と気管支敗血症菌の両者は,III型分泌装置に依存して気道への長期定着を確立することが知られている。この分泌装置のユニークな特徴として,菌体外に突出した針状構造を介しエフェクターとよばれる病原因子を宿主細胞内に注入することである。申請者は気管支敗血症菌を用いて,in vivoでの定着に関与するエフェクターの解析をおこない,これまでにBopCとBopNを同定してきた。BopCは細胞傷害,BopNはIL-10産生を誘導するエフェクターであった。

本研究では,これら2つのエフェクターの機能をさらに掘り下げて解析するのもである。これまでBopNは,他のエフェクターの分泌制御に関わると報告されてきたが,N末端のアミノ酸配列を介してIII型分泌装置依存的に宿主細胞に移行することを明らかにした。一方,BopCが誘導する細胞傷害活性は,気管支敗血症菌野生株と比較して,BopN欠損株において低下することを確認した。ドメイン解析の結果,BopCの細胞傷害活性を促進する領域は,BopNのN末端側に位置していることを明らかにした。さらにBopCとBopNの精製タンパク質を用いたプルダウンアッセイの結果より,両者は相互作用することを明らかにした。以上の結果,BopNは宿主細胞に移行後,そのN末端領域を介してBopCと相互作用することで,細胞傷害活性を増強することが示唆された。BopNはIL-10産生を増強するエフェクターとして同定してきたが,BopNと相互作用する未知エフェクターならびに宿主側因子の解析を行うことで,BopNの機能を解析していく予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学26年度が最終年度であるため、記入しない。ボルデテラ属細菌は肺内で長期定着を確立する。そのメカニズムの一つとして,樹状細胞を利用しIL-10産生を促すことがあげられる。今回,その責任因子であるBopNエフェクターがN末端領域を介してインポーチンβと相互作用していることを見い出した。今後,BopN野生型とインポーチンが結合できない欠損体の比較解析をおこなうことで,BopNの機能をより詳細に解析する予定である。宿主細胞に移行するエフェクターの機能解析については,培養細胞に発現ベクターを導入することで解析がおこなわれている。しかし,このシステムではベクターの導入効率のバラツキが定量的な解析に影響をあたえる場合があり,解析に困難をもたらしていた。今年度はこの問題を解決するために,培養細胞(上皮細胞,樹状細胞)にエフェクター遺伝子を安定に組み込むシステムを構築することに成功した。また,この系の利用により,宿主細胞におけるエピジェネティカルな遺伝子変動も可能にしており,今後は培養細胞系にて長期的な感染モデルを作製する予定である。このシステムを利用することで,他の病原細菌の毒素・エフェクターの解析も可能であり,社会的意義も大きいと思われる。ボルデテラ属細菌は,IL-10の産生誘導を促すことで,宿主の炎症反応を抑制して感染の足場を確立する。コンピュータを利用した比較解析から,他細菌においてもBopNと類似の作用をもつエフェクターの存在が示唆された。抗炎症作用を利用した感染戦略を他細菌も有しているのかについて,その普遍性を検証する。本研究課題は,本来,殺菌排除にはたらく樹状細胞を,ボルデテラ属細菌がどのようにディレクティングするのかについて,細胞に移行するエフェクターの機能から解析するものである。これまで樹状細胞の培養細胞系にてエフェクター研究を展開してきたが,エフェクターを発現するベクターの導入効率にバラツキがあり,定量解析に大きな問題をもたらしていた。今回,培養細胞にエフェクター遺伝子を導入する系を確立したことで,エフェクターBopC, BopNの解析が飛躍的に進展すると思われる。
大麻の系統分類に資するSNPマーカーの探索とその迅速検査法の確立

平成30年度は、大麻のSNPマーカー探索に向けて、1大麻DNAの抽出及び2次世代シーケンシング解析の予備実験を行った。1前年度収集した各種大麻サンプルからDNA抽出を行い、100種類近くのDNAサンプルを用意することができた。2本研究で採用する次世代シーケンシング解析について、予備実験として、一部のサンプルに対して適用することを試みた。上記で抽出したDNAの中から、薬物種大麻22サンプル、日本在来種大麻14サンプル、健康食品(種子)6サンプル、ペットフード(種子)2サンプル、漢方薬(麻子仁)1サンプル、麻繊維2サンプル、麻幹1サンプルの計48サンプルを対象として選定し、次世代シーケンシング解析の1種であるMultiplexed ISSR Genotyping by Sequencing(MIG-seq)法の適用を行った。その結果、一部のサンプルに対する限定的な解析ではあるものの、予備実験の段階で多くのSNPを検出することに成功し、本法の有効性が確認された。さらに、作成された系統樹から、「日本在来種大麻は、他国で栽培されている健康食品の大麻種子や嗜好用に用いられる薬物種大麻と大きく異なるグループに属する」「繊維に用いられている麻でも、タイ産とネパール産は大きく異なる系統である」「SNP情報から得られる系統グループは、活性型THCA合成酵素遺伝子の有無による区分とは全く一致しない」等、大麻系統分類に資する非常に興味深い情報を得ることができた。解析手法として、従来予定していたRAD-seq法からMIG-seq法への切り替えを行うことになったが、その検討に時間を要した。また、前年度に収集した大麻サンプルからのDNA抽出に関して、麻繊維の製品からの抽出が非常に困難であることが判明し、最終的に2製品から高品質のDNAを抽出することに成功したものの、その工程に想定外の時間を要した。以上の事由から、本来予定されていた化学分析(含有成分プロファイルの獲得)に着手することができなかった。本年度の予備実験において、適用可能であることが確認されたため、次世代シーケンシング解析であるMIG-seq法を適用し、大麻の系統分類及びSNP探索を試みる。さらに、それと並行して各種大麻サンプルに対して化学分析を行い、含有成分プロファイルを獲得し、DNA情報との相関について解析していく予定である。なお、種子や繊維等の製品については、大麻特有の成分をほとんど含有しないため、有効な含有成分プロファイルが得られないと考えられることから、入手可能な範囲で、大麻葉のサンプルを追加していく予定である。平成29年度は、系統分類に資する大麻のSNP探索に向けた準備として、1大麻サンプルの収集、2含有成分情報の獲得、3DNAの抽出を行った。1系統分類資するSNPマーカーの探索のためには、多種多様な遺伝的背景を持つ大麻のサンプルが必要となることから、まず国内の公的機関からの入手を試みた。その結果、東京都薬用植物園、医薬基盤・健康・栄養研究所薬用植物遺伝資源研究センター、農研機構遺伝資源センタージーンバンク、栃木県農業試験場、北海道庁及び関東信越厚生局麻薬取締部と連携し、適切な手続きに基づき、合計で大麻種子10品種、薬物種大麻の葉27品種を入手することが出来た。また、大麻取締法の取締対象から除外されて一般に流通している市販品から、大麻種子22品目(ペットフード10品目、健康食品11品目、漢方薬1品目)、麻糸11品目、麻殻2品目の計35品目の麻製品を入手した。2収集した複数系統の大麻種子に関して、ガスクロマトグラフィ飛行時間型質量分析による網羅的化学分析を行い、種子の状態における成分プロファイル情報を獲得した。さらに、種子一粒から出来るだけ多くの情報を獲得するという観点から、含有成分だけでなく、外形(長径、短径、長径と短径の比率)や重量など外観的な特性についても詳細な解析を行った。3次年度以降に予定されている次世代シーケンシング解析に先立ち、大麻サンプルからトータルDNAを効率的に抽出することが必須である。収集した各種大麻サンプルからのDNA抽出手法について検討を行い、種子については、一粒からであっても解析に十分な量のDNAが抽出可能であることが確認された。大麻サンプルの収集に関して、大麻取締法上の問題から、遺伝的背景が明らかな大麻(特に海外産のもの)を入手することに困難を伴ったが、市販されている不発芽処理された種子製品からのDNA抽出が可能であることが判明し、当初想定していたより多くの系統のサンプルを確保出来る見込みとなった。ただし、種子の状態では、幻覚成分テトラヒドロカンナビノールなど、重要な各種カンナビノイドを網羅した成長後の含有成分プロファイルが得られないため、次年度以降に予定されているDNA情報との相関についての解析は、従来の想定よりも少ない試料数で行う必要が生じている。一方で、種子の状態であっても含有成分プロファイルを詳細に見ていくことで、差異が見られるケースが確認された他、種子1粒に対するDNA検査の結果、薬物種と繊維種の交雑系統が発見されるなど、想定外の新知見も得られている。上記で抽出したDNAの中から、薬物種大麻22サンプル、日本在来種大麻14サンプル、健康食品(種子)6サンプル、ペットフード(種子)2サンプル、漢方薬(麻子仁)1サンプル、麻繊維2サンプル、麻幹

1サンプルの計48サンプルを対象として選定し、次世代シーケンシング解析の1種であるMultiplexed ISSR Genotyping by Sequencing(MIG-seq)法の適用を行った。その結果、一部のサンプルに対する限定的な解析ではあるものの、予備実験の段階で多くのSNPを検出することに成功し、本法の有効性が確認された。さらに、作成された系統樹から、「日本在来種大麻は、他国で栽培されている健康食品の大麻種子や嗜好用に用いられる薬物種大麻と大きく異なるグループに属する」「繊維に用いられている麻でも、タイ産とネパール産は大きく異なる系統である」「SNP情報から得られる系統グループは、活性型THCA合成酵素遺伝子の有無による区分とは全く一致しない」等、大麻系統分類に資する非常に興味深い情報を得ることができた。解析手法として、従来予定していたRAD-seq法からMIG-seq法への切り替えを行うことになったが、その検討に時間を要した。また、前年度に収集した大麻サンプルからのDNA抽出に関して、麻繊維の製品からの抽出が非常に困難であることが判明し、最終的に2製品から高品質のDNAを抽出することに成功したものの、その工程に想定外の時間を要した。以上の事由から、本来予定されていた化学分析(含有成分プロファイルの獲得)に着手することができなかった。また、それと並行して各種大麻サンプルに対して化学分析を行い、含有成分プロファイルを獲得し、DNA情報との相関について解析していく予定である。本年度の予備実験において、適用可能であることが確認されたため、次世代シーケンシング解析であるMIG-seq法を適用し、大麻の系統分類及びSNP探索を試みる。さらに、それと並行して各種大麻サンプルに対して化学分析を行い、含有成分プロファイルを獲得し、DNA情報との相関について解析していく予定である。なお、種子や繊維等の製品については、大麻特有の成分をほとんど含有しないため、有効な含有成分プロファイルが得られないと考えられることから、入手可能な範囲で、大麻葉のサンプルを追加していく予定である。次年度使用額が生じた最大の原因は、物品費に大幅な未使用額が生じたことである。計画立案段階においては、次世代シーケンシング解析としてRAD-Seq法の実施を予定しており、その準備(DNAライブラリー作製等)のために必要な消耗品をはじめとする物品費を平成29年度に計上していた。しかしながら、文献調査の結果、より安価かつ効率的な解析手法であるMIG-Seq法が確認されたため、MIG-Seq法の適用の可否を吟味した上で研究計画の再検討を行うこととし、RAD-Seq法の実施のための物品費の執行を一旦留保した。平成29年度未使用額は、その結果、翌年度への繰り越しとなったものである。MIG-Seq法の適用の可否が明らかになった段階で、平成29年度未使用額は、翌年度分の助成金と合わせ、次世代シーケンシング解析の準備及び解析実施のためのに使用する予定である。
大型(並列)計算機を用いたクォーク閉じ込め機構の研究

研究計画に沿って、大型(並列)計算機を用いたモンテ・カルロ・シミュレーションでQCDにおけるクォーク閉じ込めの機構の研究を進めてきた。我々は、アーベリアン射影をすると生じる磁極子(モノポール)が凝縮をおこしてカラー荷電粒子(クォーク、グルオン)を閉じ込めるという考えで研究している。研究成果の概要は以下のようである。(5) 2つの新しいabelian dominanceおよびmonopole dominanceが示す新しいゲージを発見した。引き続き一般のゲージで調べている。(6)モノポール凝縮と非閉じ込め相転移の関係をはっきりさせることを試みた。(7) full QCDの計算を行い、abelian & monopole dominanceを小さい格子ではあるが確かめた。これも続いている。これらの結果は、Lattice′94-′96の国際会議で発表された。これも続いている。我々は、アーベリアン射影をすると生じる磁極子(モノポール)が凝縮をおこしてカラー荷電粒子(クオーク、グルオン)を閉じ込めるという考えで研究している。今年度の実績は以下のようである。1。最大可換ゲージでアーベリアン射影を行ったとき、可換ゲージ場のみで閉じ込めの本質が記述できることがわかっていたが、更に可換ゲージ場の寄与は、モノポールと光子の寄与に分離でき、閉じ込め相に特徴的な弦定数は、モノポールのみで再現されることがわかった。2。このことは、有限温度系でも確認され、長い1本となっているモノポールのみが弦定数に効いていることもわかった。3。有限温度系でのQCDで閉じ込め・非閉じ込め相転移の秩序パラメーターとなっているPolyakov Loopも、モノポールの寄与のみが重要であることがわかった。4。更に、Polyakov loopの研究から最大可換ゲージのみならず他の例えばユニタリーゲージでもモノポールの寄与が閉じ込め-非閉じ込め相転移に本質的なことがわかった。このことは、モノポール凝縮による閉じ込め機構がゲージのとり方によらない可能性を示しており、たいへん重要な発見である。5。有限温度系でのQCDで閉じ込め・非閉じ込め相転移の機構もモノポール凝縮によって理解されるかどうかを調べた。まづ、モノポールのエネルギーは温度系と同様にモノポール作用を決めることでもとまった。次にモノポールのエントロピーを調べるために、モノポールの存在形態を詳しく調べた。その結果、閉じ込め相では、モノポールは長い1本のループと少数の孤立した短いループに区別され、長いモノポールのみが重要であること。更に、一定の拡張されたモノポールが相転移点を決めることがわかり予言値は実験値に良い一致をすることがわかった。これらの結果はいずれも国際会議「格子94」で報告され、また論文として発表された。1。最大可換ゲージでアーベリアン射影を行ったとき、可換ゲージ場のみで閉じ込めの本質が記述できることがわかったていたが、更に可換ゲージ場の寄与は、モノポールと光子の寄与に分離でき、ハドロンの質量やカイラル対称性の自発的破れもモノポールのみで再現されることがわかった。2。これまで、SU(2)QCDで、で、デュアル変換された世界でのモノポール作用が知られていたが、SU(3)QCDでももとまることがわかった。もとまった作用は両者でよくにており、デュアルな世界での繰り込み群変換も可能である事がわかった。3。有限温度系での相転移でのオーダーパラメーターとなっているポリアコフループの振る舞いを閉じ込め、非閉じ込め両相でのモノポールの存在様式の違いからきれいに理解できる事がわかった。4。弦定数を測定する事で、最大可換ゲージのみならずポリアコフゲージでもモノポールの寄与が閉じ込め-非閉じ込め相転移に本質的なことがわかった。5。閉じ込めのオーダーパラメーターを構成する試み、有限格子上で定式化をおこない、またシミュレーションで測定して、両相で顕著な変化をしている事がわかった。これらの結果は最後の仕事を除いて国際会議「格子95」で報告され、また論文として発表された。

我々は、アーベリアン射影をすると生じる磁極子(モノポール)が凝縮をおこしてカラー荷電粒子(クォーク、グルオン)を閉じ込めるという考えで研究している。今年度の実績は以下のようである。(1)SU(3)pure gaugetheoryの1つのmonopole currentに対するeffective actionを求めた。monopole loopの単位長さあたりのentropy ln7と比較することにより、monopole凝縮が示された。(2)pure SU(2)QCDに対してmonopole actionのcouplingをこれまでに得られていたよりも、より低エネルギー領域まで正確に調べた。その結果、低エネルギー領域において得られたactionは、ほぼfixed length abelian Higgs modelに対応したmonopole current actionになることがわかった。また、このactionがVillain like modelやstring modelに変形できることを利用して、解析的な計算によりstring tensionを求めたところ、物理的なstring tensionとconsistentであることが示された。(5)2つの新しいabelian dominanceおよびmonopole dominanceが示す新しいゲージを発見した。(6)モノポール凝縮と非閉じ込め相転移の関係をはっきりさせることを試みた。これらの結果は、Lattice'96の国際会議で鈴木、北原、江尻、中村によって発表された。
動的統合系としての極浅海域生態系の維持・変遷機構解明と複合ストレス下での機能再生

サンゴ礁生態系の機能保全・再生のための有用な科学的知見を提供することを目指して,これまで評価が難しかった地下水経由栄養塩の評価法を確立すること等により複合ストレスの評価体系を一般化するとともに,その複合ストレス下でのサンゴ群集の維持・変遷に関わる繁殖戦略過程などを明らかにした。また,サンゴ礁物質循環・炭酸系動態・低次生態系モデルを開発するとともに,複合ストレス下での生態系応答評価の基盤となるサンゴ内部モデルを開発した。(1)サンゴ礁生態系に作用する複合ストレスのうち,これまで定量化がほとんど出来ていない地下水経由の栄養塩負荷量の評価を可能にするべく,222Rnトレーサー濃度計測法と地下水流出シミュレーションとを組み合わせた方法を開発する.そして開発済みの熱輸送モデルや赤土輸送モデル,さらには下記の(2),(3)で開発するサンゴ礁炭酸系動態・物質循環モデル等に基づいて,サンゴ礁生態系に作用する複合ストレスの統合的な評価モデル体系の開発を目指す.(2)サンゴ礁生態系物質循環の根幹をなすサンゴ群集代謝に関して,サンゴ礁海水流動・炭酸系動態シミュレーションに多地点炭酸系計測データを同化させる新たな手法を開発することにより,サンゴ礁の複雑な地形・海底被覆空間構造の効果を陽に取り込んだ形の群集代謝評価法を確立する.これによりサンゴ礁全体としてCO2吸収となる条件を明確にする.(3)サンゴ礁生態系を,サンゴ群集を基幹とした「サンゴ-藻場-干潟-マングローブ」動的統合系としての極浅海域生態系として捉え,サンゴ群集代謝および複合ストレス空間分布の評価モデルを取り込んだ統合的な物質循環・低次生態系モデルを構築する.(4)短期的なサンゴ群集の維持・変遷機構だけでなく,中・長期的な群集維持・変遷機構を明らかにするため,遺伝的解析手法をさらに導入することにより,サンゴ群集の自己加入過程やconnectivityから見た維持機構の基本プロセスの解明とその環境影響評価を行う.(5)景観生態学的手法に基づくfragmentation metrics解析を多時点の衛星画像解析に適用して群集のパッチ性やその多層スケール構造等の変遷を明らかにすることにより群集の空間的分布構造の変遷を定量的に評価し,複合環境ストレスの変遷との対応関係を解明する.(6)群集間競合関係と環境変動応答過程等のモデル化に基づいて極浅海域生態系を構成する群集構造の時空間変遷過程を表現する動的統合生態系モデルを構築し,環境ストレス増加に伴うサンゴ群集優占型から藻場優占型へのフェイズ・シフトといった強非線形過程の解析を可能にする.(7)以上に基づいて,複合ストレス中の制御可能要因についての合理的制御目標設定指針等を提示することにより,動的統合系としての浅海域生態系の機能保全・再生策構築に寄与する.サンゴ礁生態系の機能保全・再生のための有用な科学的知見を提供することを目指して,これまで評価が難しかった地下水経由栄養塩の評価法を確立すること等により複合ストレスの評価体系を一般化するとともに,その複合ストレス下でのサンゴ群集の維持・変遷に関わる繁殖戦略過程などを明らかにした。1)サンゴ礁へのストレス要素の一つとして重要性が指摘されながら定量化が進んでいない地下水経由栄養塩負荷について,^<222>Rnトレーサー濃度計測法と栄養塩自動分析法を合わせた地下水起源の栄養塩フラックス評価法を確立し,サンゴ礁内の多地点で地下水起源栄養塩フラックスを定量化した.2)サンゴ礁生態系物質循環の根幹をなすサンゴ群集代謝に関して,サンゴ礁海水流動・物質循環数値シミュレーションに炭酸系計測データを同化させるという,新たな発想による手法を開発するための基礎的検討を行った.具体的には,先に開発した準3次元サンゴ礁海水流動・物質輸送シミュレーションモデル(Tamuraら,2007)をベースにサンゴ礁海水流動・炭酸系動態シミュレーションモデルを開発し,それにサンゴ礁内の多点多時点で計測した炭酸系データを非線形最適値問題として解くことで,サンゴ礁内の群集代謝構造の空間分布を評価する形のモデル構築を進めた.今年度は基本モデルの構築とその検証データの取得のための現地観測を行った.3)サンゴ礁地形と物理環境の相互作用について,地形形成と波浪場の関係,礁原の浅い地形によるガス交換の促進という両側面から現地調査の結果に基づいて検討した.4)アオサンゴの幼生分散を高度多型マイクロサテライト7遺伝子座を用いて解析し,その結果を数値シミュレーションと比較した.その結果,アオサンゴ群集は礁嶺を隔てたサンゴ礁内側と外側で集団分化が見られるなど極めて小スケールの群集単位で維持されていることがわかった.また,現代では集団分化が起こっているものの石西礁湖と白保のアオサンゴ群集の祖先遺伝子型は似ており,長い時間スケールでみると白保海域から石西礁湖に幼生が供給されて群集が発達した可能性も示唆された.さらに,調査の過程で,石垣島東海岸北部の明石において新たなアオサンゴ大群集を発見した.5)景観生態学的手法に基づくfragmentation metrics解析を多時点の衛星画像解析に適用することにより,群集のパッチ性やその多層スケール構造等の変遷を明らかにすることにより群集の空間的分布構造の変遷を定量的に評価した.1)咋年度に引き続いて,サンゴ礁への地下水経由栄養塩負荷について

^<222>Rnトレーサー濃度計測法と栄養塩自動分析法,塩分計測定等に基づく地下水起源の栄養塩フラックス評価調査を行った.2)炭酸系時空間動態評価のために,アルカリ度・全炭酸の定点連続計測を実施し群集代謝を見積もった.特に最近のサンゴ群集の劣化に伴う代謝の減退を,過去の群集代謝計測結果と比較して明らかにした.また,野外における群集規模の代謝と現場チャンバー実験による群体規模の代謝を比較して両者の差異を考察した.3)開発済みのサンゴ礁海水流動モデルをベースに,関連する現地計測データ等に基づいてサンゴ礁物質輸送モデルや炭酸系動態モデルを開発し,石垣島東海岸で得られた現地計測データを良好に再現することを示した.また,この炭酸系動態モデルによって,同サンゴ礁海域でのCO_2放出・吸収特性が時空間的に大きく変動する特徴を持つことを明らかにし,夏期の条件下ではサンゴ礁全体として吸収側に働くことを示した.4)これらの海水流動,物質輸送,炭酸系動態モデルや,関連する現地データ解析の結果等に基づいて,サンゴ礁物質循環・低次生態系モデルの基本形を開発した.5)石垣島東岸の3地点のサンゴ礁内および外洋斜面に分布するアオサンゴ・ハナヤサイサンゴの集団解析をマイクロサテライトマーカーを用いて行った.その結果,サンゴ礁内と外洋側では遺伝的に分化しており,サンゴ礁内はサンゴ礁内同士で,外洋は外洋側同士で比較的遺伝的に近いことを明らかにした.そのことから,異なる環境下で幼生着定時ないし着定後にselectionが生じている可能性が示唆された.6)Fragmentation解析を隣接流域での土地利用空間構造分析に適用し,それと土壌流出シミュレーション解析と組み合わせることにより,土地利川の空間構造特性と土壌流出特性の関連性について検討した.サンゴ礁生態系への複合ストレスの評価体系の一般化のために,地下水およびそこに含まれる栄養塩類に関する観測を実施するとともに,地下水流出モデルを調査対象地域に適用し,流出パターンを概ね再現することに成功した.また,サンゴ礁生態系炭酸系動態・物質循環モデルの高度化・一般化のために,出水前後における群集代謝の過渡過程を把握するための観測を行うとともに,モデルによる再現を試みた.さらに,栄養塩類(窒素・リン)動態を再現するために,有機物(粘液)や微生物ループのモデル化にも着手した.また,サンゴ礁炭酸系動態モデルのコンパートメントのひとつとしての,サンゴなどの主要な生物を含まない「砂地」における光合成,呼吸,石灰化,溶解など代謝パラメータを現地と実験室において計測し,日中は光合成と石灰化が,夜間は呼吸と溶解が起こっていることを示した.この結果から,「砂地」も炭酸計動態の重要なコンパートメントとしてモデルに取り込むことが必要であることが明らかになった.そして,これらの成果に基づいて,動的統合生態系モデル構築のために必要なモデル構成やパラメータの同定方法等について検討した.一方,造礁サンゴ群集の形成・維持・変遷機構の解明の上で重要となる遺伝構造分布特性に関して,八重山列島内でサンプリングを行ったアオサンゴ(15地点)とハナヤサイサンゴ(14地点)の集団を比較した.特に,裾礁型サンゴ礁である石垣島東海岸に関しては,リーフ内とリーフ外斜面間の集団遺伝特性を比較した.
生体吸収性を制御した絹基盤医療用パッチの開発

家蚕絹をベースとして、様々な再生医療の分野に応用することが可能と期待される、各種、高機能化絹をトランスジェニック蚕を用いて十分な量、生産する事が出来た。そして様々な絹とセグメント化ポリウレタンを共通溶媒に溶解させ、エレクトロスピニングの手法によって不織布状の複合材料を作製、心臓パッチや極めて細い人工血管の作製を行うことができた。その動物移植評価実験によって、その優れた操作性や性能を確認する事が出来た。絹とポリウレタン(宇部興産(株)のセグメント化ポリウレタン、ならびに日華化学(株)の水分散ポリカーボネート系ポリウレタン(商品名:ネオステッカー))の複合化は、共通の溶媒としてヘキサフロロイソプロパノール(HFIP)を用いることで可能となった。複合化された絹ーポリウレタンの表面形態観察を走査電子顕微鏡を用いて行うとともに、引っ張り試験、透水試験等の物性試験、ならびにIRや13C CP/MASNMRを用いた詳細なキャラクタリゼーションを行った。さらに、絹とこれらのポリウレタンの2:1(重量比)混合物から成るスポンジをラット皮下4か所に埋植、200日後に取り出した所、十分に分解されるとともに毒性はないことが分かった。従って、これらの絹ーポリウレタン複合材料は、共通溶媒のHFIPとともに、次年度用の医療用パッチ材として、十分に使用できることがわかった。高機能化絹のTG絹での生産については、順調に研究成果が得られた。すなわち、群馬県蚕糸技術センターにおいて、以前の共同研究のプロジェクトで実用化が終了していたTG絹生産用の家蚕の卵を用いてTG絹を生産した。フィブロネクチンの細胞接着部位、(RDG)8、ならびにラミニン野細胞接着部位、(YIDSR)そして内皮細胞増殖因子、(VEGF)を、各々、導入した3種類のTG絹を、500 g以上、順調に生産することができ、それを次年度実験用に用いることとした。一方、研究代表者の研究室に設置されたカトテック(株)のエレクトロスピニング装置を用いて、家蚕絹繊維をスポンジ状に加工するとともに、ヘキサフロロイソプロパノール(HFIP)の共通溶媒を用いることによって、ポリウレタン(PU)と複合化された医療用パッチ材の不織布を作製することができた。ただし、得られる不織布の各種物性は、必ずしも十分でなく、優れた物性を有する不織布を生産するためには、その共通溶媒や溶解条件に関する、より詳細な検討が必要であることが分かった。家蚕絹とセグメント化ポリウレタンのヘキサフロロイソプロパノール混合溶液を作製、エレクトロスピニング(ES)法で不織布状とし、繊維平均径の分布、引っ張り強度、伸度等の物性を測定、絹のみの場合と比較した。ポリウレタンを混合することによって、湿潤状態(生体中に移植した状態を想定)で、絹のみの場合より、高い強度と高い伸縮性を併せ持ち、より優れた再生医療材料となることを示した。さらに、乾燥状態での絹とポリウレタンとの固体NMRによる相溶性実験や含水状態で、固い所を強調する13C CM/MAS NMR、柔らかい所を強調する13C INEPT、その両方を検出する13C DD/MAS NMRを測定、そのキャラクタリゼーションを十分に行い、本材料の物性発現と構造や運動性との関連に関する知見を集積した。引き続き、本材料で心臓パッチ用不織布を作製、イヌに移植した結果、移植時の針穴からの血漏れも少なく、既存のパッチ材と遜色のない、優れた操作性を有する事を明らかにした。イヌ移植後の狭窄や拡張は認められず、10カ月後に摘出したパッチには内膜が形成されていた。さらに、一層の応用を目指して、絹とポリウレタンの不織布でマウス総頸動脈用の筒状人工血管を作製、移植評価実験を行った。移植後の人工血管の染色評価に関しては、現在、切片作製中であるため十分なデータは得られていないが、特に強調すべき事は、1mm以下の直径で極めて細いために実験の難しいマウスへの移植実験を、物性の大幅な向上によってスムースに行うことができた点である。フィブロネクチンの細胞接着部位、(RDG)8、ならびにラミニン野細胞接着部位、(YIDSR)そして内皮細胞増殖因子、(VEGF)を、各々、導入した3種類のTG絹を、500 g以上、順調に生産することができたことは、予想以上の成果であった。またHFIPの共通溶媒を用いることによって、ポリウレタン(PU)と複合化された医療用パッチ材の不織布を作製することができた点も順調であった。しかしながら、優れた物性を得るためには、より検討が必要であった。平均すると、おおむね順調と言える。化学材料化学高分子・繊維材料エレクトロスピニング装置を用いて、優れた物性を有する絹とPUとの不織布を得るために、材料のエレクトロスピニングの分野で第一人者である滋賀県立大学の山下先生との共同研究を開始する。エレクトロスピニングの際の各条件を慎重に精査し、本プロジェクトを遂行する。得られた医療用パッチ材の不織布について詳細な物性データを得る。

そして、ラットやイヌを用いた移植評価実験を行う。当初、細胞毒性試験や生分解性試験のin vitro実験を計画したが、ラットへのin vivo移植実験を絹ーポリウレタン複合材料のスポンジについて行った結果によって、十分に、その実験目的を達成することができた。すなわち、作製した絹ーポリウレタン複合化材料は、毒性がないことを確認するとともに、ある期間で適度に分解させることができた。従って、この複合材料を次年度以降用いることとした。物性も良好であることが示された。次年度は、エレクトロスピニングによる絹ーポリウレタン複合材料の不織布作製実験が予定されている。そのため、絹とポリウレタンの共通溶媒を探す必要があったが、HFIPを使用すれば良いことがわかった。絹とポリウレタン(PU)を共通溶媒に溶解、エレクトロスピニング(ES)によって不織布を作製する実験において、得られる不織布が、優れた物性を有するためには、その共通溶媒や溶解条件の詳細な検討が必要であることが分かった。そのため、急遽、溶解性実験用の装置を購入することとし、物性実験等は来年度に繰越すこととした。詳細なESによる不織布の作製や物性評価の実験を、次年度に繰り越すので、未使用額が生じた。HFIPを使用することによって、絹ーポリウレタンの複合化材料を作製出来ることが分かったので、エレクトロスピニングの手法を用いて、不織布の作製実験に取り掛かる。その作製条件を変えて得られた試作品について、物性試験を行い条件を特定する。その際、細胞の遊走性を向上させることにも留意する。できれば、作製された、絹ーポリウレタンの複合化材料の不織布を用いて、イヌについて移植評価試験を行う。絹とPUが相溶した材料から成る不織布の詳細な物性実験を行う前に、溶解性の基礎実験を行うこととした。そのため、各種溶媒の購入、生分解性や物性評価試験のための薬品や冶具の購入を行うとともに、溶解性の実験やエレクトロスピニングによる不織布の作製や物性評価等を行うため、非常勤研究員を雇用し、その賃金等に使用予定である。細胞毒性試験や生分解性試験のin vitro実験を計画したが、ラットへのin vivo移植実験(農工大の獣医学科で飼育されたラットを使用)を絹ーポリウレタン複合材料のスポンジについて行った結果によって、十分に、その実験目的を達成することができた。従って、ハムスター由来細胞版溶液等の培養基材やプロテアーゼXIVを購入する必要がなくなったので、その費用や実施のための研究補助費も出費しなくて済んだ。さらに、それ以外に、農工大で、全ての実験を行うことができたので、福井や群馬に出張する必要もなくなった(旅費も必要なくなった)。以上のように、最小限の費用で成果を出すことができたので、次年度に繰り越すこととなった。今年度使用しなかった分については、当初の研究計画にはなかった動物移植評価実験を行うための費用として計上する。すなわち、本絹基盤医療用パッチの開発は、研究計画書の4ページに記載の通り、挑戦的萌芽研究が終了した平成27年度以降、すみやかに動物移植評価実験に移行する予定であった。しかしながら、今年度の費用が、次年度以降に使用できるようになったので、本研究計画中に、絹ーポリウレタンの複合化
腫瘍特異的遺伝子治療と高精度放射線治療を融合した新しい癌治療法の開発

(1)低酸素誘導性ベクター系の開発低酸素応答配列を組み込んだLuciferase Reporter Plasmidsを作成し、各種腫瘍細胞に導入後、低酸素下培養による遺伝子発現増強を検討した。低酸素刺激による特異的発現増強を得た。次に、発現効率を高める目的で制御領域の改変を行い、改良型のベクターを構築した。(2)薬剤活性化酵素の発現による抗腫瘍効果の検討薬剤活性化酵素発現ベクターを作成し、遺伝子導入したクローンを樹立した。低酸素培養後に細胞を回収し、Western法により酸素濃度と曝露時間に依存した蛋白レベルの発現増強が観察された。同様に、免疫染色法にても明瞭な細胞内発現が確認可能であった。続いて、薬剤による抗腫瘍効果を検討した。通常の酸素濃度では、殆ど野生型株と同等の薬剤感受性を示すのみであったが、低酸素特異的に抗腫瘍効果の発現を認め、これらのベクター系により、腫瘍選択的に遺伝子発現を制御できる可能性が示された。(3)放射線応答性新規遺伝子の探索と遺伝子調節領域の単離放射線応答遺伝子の同定を試みた。SAGE法では使用する制限酵素系を改変し、長い断片を得る手法を開発した。また独自のGene Trap法により、放射線照射に反応してレポーター遺伝子を発現するクローンを回収し、上流制御配列の単離した。候補クローンの一つより得られた配列は、c-IAP geneに一致した。プロモーター領域を含むと予測される3.5kbの断片をpGL3にクローニングし、放射線照射を行い発現増強を確認した。順次deletion constructsを作成、放射線応答に関わる領域を推定したところ転写開始点上流に存在するNF-kB結合配列の関与が示唆された。放射線応答配列を利用してレポーターおよびBax geneを発現する系を構築した。放射線照射による細胞致死効果の増強を認めた。これらにより、低酸素および放射線応答性遺伝子治療ベクターの研究基盤が確立した。低酸素応答配列(HRE:Hypoxia Response Element)を含むヒトVEGF(VascularEndothelial Growth Factor)遺伝子の5'非転写領域およびエリスロポイエチン遺伝子の3'非転写領域を、pGL3に組込み低酸素刺激による特異的遺伝子発現を得た。種々の低酸素応答配列の組み合わせから低酸素応答が一番強く認められたレポーター・ベクターのレポーター遺伝子部分をβガラクトシダーゼ遺伝子に置換して、X-Gal染色実験を行ったところ、低酸素刺激群の特異的な染色が認められた。この結果から、治療遺伝子を組込んだレポーター・ベクターも充分な効果が得ることが期待され、治療遺伝子を用いた実験を検討中である。(放射線照射および低酸素刺激による遺伝子調節領域の単離)SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)のプロトコールに従って、ヒト胎盤mRNAより作成したcDNAライブラリーのタグを抽出することができた。このタグを効率良くコンカテマーにするには、ビオチン化プライマーを使用する方法や、熱処理を加えてpseudotagsの生成を抑制する方法などが最近報告されており、どの方法が有効か現在検討中である。低酸素により誘導・抑制される遺伝子の解析には、低酸素分画の細胞と酸素化された細胞のmRNAより作成したcDNAよりライブラリーを作成する必要があった。しかMicroSage法は組織中の低酸素分画の検討を可能としているため、この方法によるタグの作成を検討中である。放射線照射および低酸素などの微小環境が作用する新規の遺伝子調節領域の検索を行うための方法として、Gene Trap法、SAGE法を検討している。SAGE法については、使用するIIs型制限酵素を改変することで21塩基以上の長いタグを得る手法を開発した(投稿中)。これによりデータベースの整っていないラットなどの実験

動物の遺伝子発現も、高精度に評価することができるようになり、遺伝子治療モデルとしてのマウス・ラットを使用することが容易になると考えられる。(1)低酸素誘導性ベクター系の開発低酸素応答配列を組み込んだLuciferase Reporter Plasmidsを作成し、各種腫瘍細胞に導入後、低酸素下培養による遺伝子発現増強を検討した。低酸素刺激による特異的発現増強を得た。次に、発現効率を高める目的で制御領域の改変を行い、改良型のベクターを構築した。(2)薬剤活性化酵素の発現による抗腫瘍効果の検討薬剤活性化酵素発現ベクターを作成し、遺伝子導入したクローンを樹立した。低酸素培養後に細胞を回収し、Western法により酸素濃度と曝露時間に依存した蛋白レベルの発現増強が観察された。同様に、免疫染色法にても明瞭な細胞内発現が確認可能であった。続いて、薬剤による抗腫瘍効果を検討した。通常の酸素濃度では、殆ど野生型株と同等の薬剤感受性を示すのみであったが、低酸素特異的に抗腫瘍効果の発現を認め、これらのベクター系により、腫瘍選択的に遺伝子発現を制御できる可能性が示された。(投稿中)(3)放射線応答性新規遺伝子の探索と遺伝子調節領域の単離放射線応答遺伝子の同定を試みた。SAGE法では使用する制限酵素系を改変し、長い断片を得る手法を開発した。(投稿中)また独自のGene Trap法により、放射線照射に反応してレポーター遺伝子を発現するクローンを回収し、上流制御配列の単離した。候補クローンの一つより得られた配列は、c-IAP geneに一致した。プロモーター領域を含むと予測される3.5kbの断片をpGL3にクローニングし、放射線照射を行い発現増強を確認した。順次deletion constructsを作成、放射線応答に関わる領域を推定したところ転写開始点上流に存在するNF-kB結合配列の関与が示唆された。放射線応答配列を利用してレポーターおよびBax geneを発現する系を構築した。放射線照射による細胞致死効果の増強を認めた。(印刷中)
高等専門学校における発達障害学生のキャリア形成支援プログラム開発

本研究は、高等専門学校(高専)の教育体系に合った特別支援教育の構想と、発達障害学生のキャリア形成支援プログラムの立案を目的としている。アンケート調査から、高専に在学する発達障害学生には、学生寮で生活する寮生の割合が高いことが明らかとなった。各高専の学生寮では、本人の特性に配慮し、日常生活や社会生活で必要なライフスキルを育む支援が行われている。ライフスキルを獲得し、生活を安定させることは、修学支援の効果を高め、卒業後の就労や自立した生活の基盤を作る。キャリア形成支援においては、全学生に対するキャリア教育(その一環としてライフスキルを指導)と個別の支援を併用することが有効だと思われる。本研究は、高等専門学校(以下、高専)において特別支援のニーズをもつ学生について、その特性を実証的に把握することによって、工業高専教育の教育体系に整合的な特別支援教育を構想すること、および発達障害学生が将来的に中堅技術者として社会内に位置を獲得するための特別支援キャリア教育プランの立案を目的としている。平成25年度は、研究グループの打ち合わせ会を毎月実施し、研究経過報告・実践事例報告を日本高専学会で3件、高専教育フォーラムで2件、女性研究者研究交流会(国立高等専門学校機構や技術科学大学に在籍する女性の教員・技術職員を対象とした会)で1件行った。以上のことから、本研究が主たるフィールドとする高専の教育関係者に対し、本研究の趣旨を周知することができた。また、「特別支援教育に関する研究集会」を平成26年3月18日に津山高専で開催した。同研究集会には、高専で特別支援教育に携わる教職員に広く声をかけ、中国地区の高専から学生相談室長や学生主事などの参加があった。電動車椅子サッカーワークショップ、特別支援教育に関する情報交換を行い、本研究を紹介すると共に、今後の研究への協力を取り付けた。本研究は、高等専門学校(以下、高専)において特別な支援や配慮を必要とする学生について、その特性を実証的に把握することによって、工業高専の教育体系に整合的な特別支援教育を構想すること、および発達障害学生が将来的に中堅技術者として社会内に位置を獲得するための特別支援キャリア教育プランを立案することを目的としている。平成25年度の研究を通して、高専の特別支援教育で最も立ち後れており、可及的に整備する必要があるのは、学生寮における支援であることが明らかになった。そこで、平成26年度は、学生寮における対応や支援について考察するべく、中国地区8高専でアンケート調査を行った。そして、平成26年度中国地区高等専門学校学生相談室長連絡会議で特別支援教育シンポジウムを開催し、「中国地区学生寮における発達障がい学生への対応・支援に関する調査報告」を行った。研究代表者は、女性研究者研究交流会(国立高等専門学校機構や技術科学大学に在籍する女性の教員・技術職員を対象とした会)でも発表を行い、本研究の主たるフィールドである高専の教育関係者に対し、広く研究成果を知らせるよう努力した。また、研究分担者は、各自の専門分野と関連づけた研究を行い、学会・研究会でその成果を報告している。なお、研究代表者は、本研究の成果も書類審査で加味され、平成27年4月1日付で特別支援教育士(S.E.N.S)の資格を取得している。本研究は、高等専門学校(以下、高専)において、特別な支援や配慮のニーズを有する学生について、その特性を実証的に把握することにより、高専の教育体系に整合的な特別支援教育を構想すること、および発達障害学生が将来的に技術者として、社会的な位置を獲得するための特別支援キャリア教育プランを立案することを目的としている。平成27年度は、平成26年度までの研究成果をもとに考察を進めた。まず、発達障害学生が抱える問題や困り感の背景には、日常生活や社会生活で必要な様々なスキル(以下、ライフスキル)の不足があること、それにより生活が安定していない学生には、修学や就労に関する支援を行っても、期待する効果が出にくいため、ライフスキルの獲得を助ける支援や指導が必要であることを明らかにした。そして、ライフスキルは障害の有無に関わらず必要なものであることから、キャリア教育の一環として全学生に対する指導を行うと共に、スキルの獲得が困難な学生に対しては、個別の支援も併せて行っていくことが効果的であるという結論に達した。本研究の成果は、日本LD学会等で発表した。また、本研究の成果を活かし、研究代表者所属校において、合理的配慮についての指針を作成した(外部発表未定)。なお、今後高専において行うことが望ましい、ライフスキルの獲得やキャリア形成に関する指導・支援についても検討を行ったが、実践を通してデータを収集し、有効性を検証する必要がある。それについては、今後の課題となっている。他高専で特別支援教育に携わる教職員の協力も得て、効率的に研究を進めることができている。また、研究成果の報告も随時行っており、おおむね順調であると言える。

人文学平成26年度に実施した、「学生寮における発達障がい学生への対応・支援に関する調査」を元に、発達障害学生に対する、より良い対応・支援のあり方について考察する。また、研究分担者の研究成果も合わせ、キャリア形成プログラムの作成を行う。研究成果については、高専教育関係者が多く参加する学会やフォーラムで発表する他、特別支援教育関連の学会でも発表する予定である。当初6月に予定していた「第3回特別支援キャリア教育研究会」の開催を見送り、平成26年3月に「特別支援教育に関する研究集会」を開催したため。初年度に研究集会を自校で開催したため、会場費がかからず残額が生じた。その残額を平成26年度に全て使用するには至らなかったため、次年度使用額が発生した。平成25年度の研究を通して、高等専門学校(以下、高専)の特別支援教育で最も立ち後れており、可及的に整備しなければならないのは、学生寮における支援ではないかという結論に達した。高専の学生寮は、学生にとって主たる生活の場であり、そこでの支援やライフスキルの育成などについて考えることは、発達障害学生に対するキャリア形成プログラムを作成する上で欠かせないものと言える。そこで現在、他高専の学生寮において、発達障害の学生にどのような対応や支援がなされているか調査すべく、準備を行っている。また、その調査結果をもとに、研究集会の開催や学会発表を行い、キャリア形成プログラムを開発する予定である。他高専における特別支援について調査するための旅費や物品費、研究成果を学会や研究会で発表する際の旅費として使用する予定である。研究集会を所属校で行い、会場費がかからなかったため。他の高等専門学校の学生寮における特別支援について調査するために、通信費や旅費として使用する予定である。
抗菌活性を持つ培養皮膚の生体内における機能の解析

(背景・目的)重症熱傷に対する自家培養皮膚移植は、感染創への生着が不良である。本研究の目的は、抗菌ペプチド遺伝子を導入したヒト培養表皮細胞を用いて、感染創に対する培養皮膚移植の成績向上をはかることである。(方法・結果)ヒト抗菌ペプチド遺伝子(hBD3,hCAP18および両者)を組み換えたウイルスベクターを作製した。これらをヒト表皮細胞に感染して各遺伝子を導入したところ、当該表皮細胞は各抗菌ペプチドを発現・分泌した。遺伝子導入細胞を免疫不全マウスに移植したところ、移植後には正常なヒト皮膚が再生され、炎症反応は見られなかった。(結論)本研究成果は感染創に対する培養皮膚移植に応用できる可能性がある。本研究は、hBD3およびhCAP-18/LL37遺伝子を導入した培養皮膚が、移植後生体内において当該抗菌ペプチドを発現・分泌し、またヒト皮膚組織の再生および局所免疫に対して悪影響を与えないことを明らかにしようとするものである。平成24年度までに、1hBD3 cDNA、hCAP-18/LL37 cDNAまたは両者をタンデムに連結した遺伝子を組換えたウイルスをそれぞれ作製。2組換えウイルスの感染により各遺伝子をヒト培養表皮細胞、真皮線維芽細胞へ導入すると、導入遺伝子が発現して各蛋白が培養上清中に分泌され、3このうち分泌されたhCAP-18は好中球プロテアーゼにより抗菌活性を持つLL37が生成されること、を確認している。平成25年度は、hCAP18/L37のcDNA組換えアデノウイルスを感染させたヒト培養表皮細胞をヒト真皮由来培養線維芽細胞とともにヌードマウス皮下に移植し、形成された類上皮嚢胞を非感染細胞(対照)移植後の嚢胞と病理組織学的に比較検討した。移植後12日の皮下結節は、感染細胞移植後が非感染対照移植後よりやや大きかった。形成された類上皮嚢胞周囲の新生血管(CD31陽性細胞)の切片上密度は、感染191.7±49.9/mm2、非感染対照105.9±26.3/mm2で感染細胞移植後が有意に高かった。また基底膜蛋白の局在、p63陽性細胞の密度、ki67陽性細胞の密度などに大きな差異は見られなかった。以上から、hCAP18/L37のcDNAを導入した表皮細胞は、移植後の皮膚再生に悪影響を与えることなく、再生皮膚周囲の血管新生を促進するものと考えられた。平成24年度の成果は以下のとおり。1hBD3 cDNA、hCAP-18/LL37 cDNAまたは両者をタンデムに連結した遺伝子を組み替えたウイルスをそれぞれ作製・増殖し、充分量のウイルスストックを準備した。2各組み換えウイルスの感染により、各遺伝子をヒト培養表皮細胞、真皮線維芽細胞へ導入した。3導入遺伝子が発現し、各蛋白が培養上清中に分泌されることをRT-PCRおよびwestern blotにて確認した。4培地中に分泌されたhCAP-18を好中球プロテアーゼで処理し、LL37に分解されることをwestern blotにて確認した。5hCAP-18/LL37 cDNA組み換えウイルスを感染したヒト表皮細胞と真皮線維芽細胞を免疫不全マウスに移植した。今後、移植後の組織を経時的に切除のうえ、導入遺伝子の発現、抗菌ペプチドの存在、再生皮膚の組織構造などを、生化学的、病理組織学的に検討する。また、hBD3 cDNAおよびhCAP-18/LL37 cDNAをタンデムに連結した遺伝子の導入細胞についても、同様の移植実験を実施する。本研究は、ヒト抗菌ペプチドであるhBD3およびhCAP-18/LL37遺伝子を導入した培養皮膚が、移植後生体内において当該抗菌ペプチドを発現・分泌し、またヒト皮膚組織の再生および局所免疫に悪影響を与えないことを明らかにするものである。平成25年度までに、1hBD3 cDNA、hCAP-18/LL37 cDNAまたは両者をタンデムに連結した遺伝子を組換えたウイルスをそれぞれ作製。2組換えウイルスの感染により各遺伝子をヒト培養表皮細胞、真皮線維芽細胞へ導入すると、導入遺伝子が発現して各抗菌ペプチドが培養上清中に分泌される。3分泌されたhCAP-18は好中球プロテアーゼ処理により抗菌活性を持つLL37が生成される。4hCAP18/L37CDNA組換えアデノウイルスを感染させたヒト表皮細胞をヒト真皮線維芽