hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロテイナーゼ活性化型受容体１を介する血管機能障害の分子機構解明

本研究ではトロンビンによるバリアー機能障害の初期相には細胞辺縁部におけるミオシン軽鎖リン酸化とアクチン線維束形成が、持続相にはアクチンストレスファイバー形成が重要で、収縮分子が時間的、空間的に異なる制御を受けていることを明らかにした。Rhoキナーゼ阻害剤により辺縁部でのアクチン線維束形成およびミオシン軽鎖2リン酸化は抑制され、バリアー機能障害も抑制された。さらにシンバスタチンを用いてRhoA活性を抑制すると、トロンビンによるミオシン軽鎖2リン酸化とアクチン繊維束形成が抑制され、バリアー機能障害も回復した。このことから、トロンビンによるバリアー機能障害の初期事象として重要な、細胞辺縁部でのミオシン軽鎖2リン酸化とアクチン線維束形成には、RhoA-Rhoキナーゼ経路が関与することを明らかにした。2.平滑筋細胞機能障害の分子機構を明らかにする。1PAR1ノックアウトマウスは、低酸素誘発肺高血圧症の病態形成(右室収縮血圧上昇、右室肥大、肺血管筋性化)を抑制したことから、肺高血圧症の発症においてPAR1が重要な役割を果たすことを明らかにした。2凝固因子XIをラット大動脈平滑筋細胞に作用させると、カルシウム流入を引き起こした。このカルシウム流入はPAR1阻害剤により抑制されたことから、凝固因子XIが新たなPAR1活性化因子であることを明らかにした。また、細胞に対する凝固因子XIの作用はこれまで報告は無く、凝固因子XIの細胞に対する直接作用を始めて明らかにした。本研究は、プロテイナーゼ活性化型受容体(PAR1)の観点から血管病の発症・進展に関わる分子機構を明らかにし、新たな治療法を開発することを目的とする。1.内皮バリアー機能障害の分子機構を明らかにする。トロンビン刺激によりプロテイナーゼ活性化型受容体(PAR1)が活性化されると血管内皮細胞のバリアー機能が障害される。トロンビンによる血管内皮細胞の透過性亢進の初期事象として、細胞辺縁部におけるミオシン軽鎖2リン酸化とアクチンストレスファイバーの形成が重要であることを明らかにした。さらに2種類のRho kinase阻害剤Y27632, H1152とRho kinase合成経路の阻害剤シンバスタチンを用いるとトロンビンによる細胞辺縁部でのミオシン軽鎖2リン酸化とアクチンストレスファイバーの形成が阻害され、それに伴い透過性の亢進も抑制された。これらのことからRho-Rho kinase経路が、従来報告されているストレスファイバー形成のみならず、内皮バリアー障害の初期事象における細胞辺縁部のアクチン線維束形成とミオシン軽鎖2リン酸化に関与することで透過性の亢進を引き起こすことが明らかとなった。ラット大動脈平滑筋細胞A7r5において凝固因子XIがプロテイナーゼ活性化型受容体(PAR1)を活性化させ、L型カルシウムチャネルを介して細胞内のカルシウム濃度上昇を引き起こすことを明らかにした。これまで凝固因子XIの細胞に対する直接作用の報告は無く、直接作用を初めて明らかにした。プロテイナーゼ活性化型受容体1(PAR1)を介する血管機能障害の分子機構について以下の点を明らかにした。
経皮的血管形成術後の血栓閉塞に対する局所遺伝子導入の検討

経皮的血管形成術後の血栓性閉塞の予防目的として種々の抗血栓、抗凝固薬が使用されているが、出血等の合併症のため、継続的に使用できない場合も多い。本研究では、組換えアデノウイルスを用いた遺伝子導入により障害血管壁で血栓形成に関与する2種類の遺伝子を持続的に高発現させ、局所での血栓形成を抑制することを検討した。この結果、局所への遺伝子導入により、ラットの動脈血栓モデル血管において目的蛋白の持続的発現が確認され、抗血栓効果の可能性が示唆された。〈研究目的〉経皮的血管形成術後の血栓性閉塞の予防目的として種々の抗血栓、抗凝固薬が使用されているが、出血等の合併症のため、継続的に使用できない場合も多い。局所での遺伝子導入はこの問題を克服できる可能性を有しており、本研究では2種類の酵素の局所遺伝子導入による抗血栓作用を検討する。<研究内容と結果>1)遺伝子組換えベクターの作製本研究では、血小板凝集に関する酵素、Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolaseおよびADAMTS13の組換えアデノウイルスベクターを新たに作成した。2)培養細胞への導入実験作製した遺伝子組換えベクターによる遺伝子導入効率を培養細胞にて検討した。培養細胞にはヒト血管平滑筋細胞を使用した。この細胞に対し、組換えアデノウイルスにて遺伝子を導入した結果、持続的に目的血管壁細胞にて目的蛋白が発現することを確認した。3)動物実験モデルの作製、遺伝子導入、評価動脈硬化性病変モデルは、SDラットの外頚動脈より2フレンチ径のバルーンカテーテルを総頚動脈内に挿入し、内膜を傷害することによって作製した。組換えアデノウイルスベクターを使用し、同血管に遺伝子導入を行ったのち、蛋白発現量、酵素活性測定を行った。この結果遺伝子導入により動脈硬化性病変モデル血管において目的蛋白の持続的発現を確認した。今後この遺伝子導入血管における抗血栓効果を検討する予定である。<研究目的>経皮的血管形成術後の血栓性閉塞の予防目的として種々の抗血栓、抗凝固薬が使用されているが、出血等の合併症のため、継続的に使用できない場合も多い。<研究内容と結果>1、遺伝子組換えベクターの作製血小板凝集に関する酵素、Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolaseおよびADAMTS13の組換えアデノウイルスベクターを新たに作成した。2、培養細胞への導入実験ヒト血管平滑筋細胞に対し、作成した組換えアデノウイルスにて遺伝子を導入した結果、持続的に血管壁細胞にて目的蛋白が発現することを確認した。また、この遺伝導入細胞を用い、生体外における血小板凝集反応への影響を検討した結果、血小板凝集反応を有意に抑制する可能性が示唆された。3、動物実験モデルの作製、遺伝子導入、評価動脈硬化性病変モデルは、ラットの総頸動脈の内膜を傷害することによって作製した。組換えアデノウイルスベクターを使用し、同血管に遺伝子導入を行ったのち、蛋白発現、および血栓形成への影響を評価した。また、抗血栓効果を示す可能性も確認された。今後はこれらのデータを蓄積していく予定である。〈研究内容と結果〉1、遺伝子組換えベクターの作製本研究ではこれまでに、血小板凝集に関する酵素、Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolaseおよびADAMTS13の組換えアデノウイルスベクターを作成していた。しかし、結果して、目的とするアデノウイルスや再現性のある十分な遺伝子導入効果が得られなかった。この原因としてさまざまな要因が考えられたが、ウイルスの設計や精製が不十分であったことが考えられたため、新たなキットを使用し,他の複数の遺伝子と共にウイルスベクターを再度作成、精製した。2、培養細胞への導入実験ヒト血管平滑筋細胞に対し、新たに作成した組換えアデノウイルスにて遺伝子を導入した結果、持続的に血管壁細胞にて目的蛋白が発現することを確認した。また、この遺伝導入細胞を用い、生体外における血小板凝集反応への影響を検討した結果、血小板凝集反応に影響する可能性が示唆された。

この結果、遺伝子導入により動脈硬化性病変モデル血管において目的蛋白の持続的発現を確認した。また、血栓形成への影響の可能性も確認された。現在これらの結果を検証している。
大質量星の重力崩壊における多次元ニュートリノ輸送

重力崩壊型超新星爆発は大質量星が化学進化の果てに起こす人爆発である。本研究課題は、超新星爆発のメカニズム解明に不可欠な、ニュートリノ輸送や核物質の状態方程式の計算に主眼をおいている。本年度の研究成果は、「軽元素が超新星爆発に与える影響の解明」と「多核種を含む高温高密度な状態方程式テーブルの作製」である。本研究課題のシミュレーションで用いる状態方程式は、多核種の存在比を含む点が、既存の状態方程式との大きな違いである。特に軽元素はこれまでヘリウム4のみが含まれていたが、申請者の作製した状態方程式には、重水素、三重水素、ヘリウム3など、全ての軽元素が含まれている。そこでその新しい状態方程式を用いて、超新星爆発の衝撃波の再加熱時における、これまで無視されてきた軽元素の影響を調べた。具体的には軽元素によるニュートリノ加熱反応を含む2次元軸対称の超新星爆発シミュレーションを行った。結果として軽元素、特に重水素の加熱を考慮した場合に、大きく衝撃波の時間発展が異なることを示した。また、衝撃波の形が歪む段階で、局所的に軽元素が豊富に存在する部分が形成され、衝撃波加熱に影響が出ることが分かった。また申請者の状態方程式を、誰でも使える形としてテーブル化し、他の超新星爆発シミュレーションを行う研究者に譲渡した。この状態方程式テーブルは、これまでの状態状態方程式では考慮できなかった原子核の組成の情報を正確に含む。原子核の弱相互作用が重要な役割を担う超新星爆発シミュレーションにおいて、重要なインプット物理になると予想される。困難が続いた状態方程式テーブルの作製が終わったが、本研究課題の最終目標であった近似なしの多次元ニュートリノ輸送を含む超新星シミュレーションはまだ始めたばかりのため。現段階では、京都大学の長倉氏、沼津高専の住吉氏らが開発した、近似なしのニュートリノ輸送を含む流体シミュレーションコードに、申請者の作製した状態方程式は組み込まれている。今後は、そのコードを使い超新星爆発シミュレーションを行い、重力崩壊型超新星爆発における、状態方程式、原子核とニュートリノ反応の役割を調べていく。重力崩壊型超新星爆発は大質量星が化学進化の果てに起こす大爆発である。本年度の研究成果は、「多核種を含む高温高密度な状態方程式の改良」と「軽元素が超新星爆発に与える影響の研究」である。同じような多核種を含む状態方程式を研究している2つのグループと詳細な比較、議論を共同で行い、原子核の表面エネルギーの密度、温度、陽子比依存性や殻構造の有無が原子核存在比に大きく影響することが分かった。一方で、その中間密度では、核図表上で不連続な存在比を示すという欠陥も発覚した。そこで状態方程式に大幅な改良を施した。主たる変更点は体積エネルギーにおける温度効果の改良、原子核質量の理論値から予測される殻構造エネルギーの追加、量子多体計算を基にした軽元素の質量値の改良、の三点である。これらの改良により比較研究で発覚した、不自然な存在比の部分は、解消された。改良した状態方程式を用いて、超新星爆発の衝撃波の再加熱時における、軽元素によるニュートリノ加熱反応の影響を調べた。状態方程式の整備に予想以上の時間がかかったため、ニュートリノ輸送コード開発に遅れが生じている。ただし時間をかけた分、信頼たる状態方程式が得られた。実際に状態方程式関連の論文の1本は受理され1本は既に提出済みである。また、その後の超新星爆発シミュレーションへの応用は順調であり、軽元素の影響をまとめた論文を1本提出済みである。

困難が続いた状態方程式テーブルの作製が終わったが、本研究課題の最終目標であった近似なしの多次元ニュートリノ輸送を含む超新星シミュレーションはまだ始めたばかりのため。引き続きニュートリノ輸送コードの開発を進める。並行して重力崩壊の計算を1次元で行い、原子核ニュートリノ反応が爆発に重要なレプトン量などにどのような影響を与えるかを計算する。これも改良した状態方程式の効果を検証する上で、重要な研究である。ただし研究目的の一部である、相対論的効果の検証、ニュートリノ、重力波観測予測まで行うためには、一年以上の月日を要するため、多次元ニュートリノコード開発と爆発シミュレーションへの適用に集中する。現段階では、京都大学の長倉氏、沼津高専の住吉氏らが開発した、近似なしのニュートリノ輸送を含む流体シミュレーションコードに、申請者の作製した状態方程式は組み込まれている。今後は、そのコードを使い超新星爆発シミュレーションを行い、重力崩壊型超新星爆発における、状態方程式、原子核とニュートリノ反応の役割を調べていく。
英語スピーキング伝達能力客観テスト

研究者たちは新しく「スピーキング伝達能力客観テスト(OCST)」を開発した。OCSTはタブレットPCを用いた計時情報ギャップ型テストである。伝統的な口頭運用能力テストの構成要素がテスト所要時間の原因になる事を前提に、発話者が評定者に新しい情報を述べる時間を計る。英語が第一(L1)及び第二言語(L2)である86名を対象にテストを行い、L2タスク完了時間にL1基準のスコアを当て、データは多相ラッシュ・モデルで解析された。仮説通りテストの客観的デザインは評定者の影響を弱め、評定者をモデルから除外できた。受験者の信頼性係数として0.88が観測され、多くの主観的なスピーキング能力テストの数値を上回った。従来の外国語スピーキング能力テストでは受験者のスピーキング能力を主観的に判断する評定者を起用してきたが、それは多くの場合信頼性の低下をもたらす。この課題に対処するため、研究者はObjective Communicative Speaking Test (スピーキング伝達能力客観テスト又はOCST)と呼ばれるスピーキング伝達能力における新しいテストを開発した。OCSTとは、計時する情報ギャップのタスク型テストであり、対にされたタブレットPCを通して実施される。このテストは伝統的な口頭運用能力とは対照的に、スピーキング伝達能力に焦点を当てる。スピーキング能力をいくつかの評価尺度によって主観的に判断するのではなく、伝統的な口頭運用能力テストの構成要素が終了までに所要する時間の原因になるという前提をもとに、OCSTは発話者が評定者にとって未知の情報を述べるまでに必要とする時間を測定する。テストは標準サンプルとして43名の英語母語話者(NSs)を対象に行われた。NSのタスク所用時間は6つのレベルによる評定尺度を構成するために使用された。次に、実験サンプルとして94名の非英語母語話者(NNSs)を対象にテストが行われ、実験対象者のタスク所要時間にNS基準のスコアが割り当てられた。能力推定値の信頼性におけるあらゆる要因の効果を測定するために、多相ラッシュ・モデル解析を用いた。受験者、セッション、項目を含む3相のラッシュ・モデルは高い信頼性のある結果を出すことがわかった。OCSTは確実にNNSsからNSsを区別し、NSの平均値における1標準偏差範囲内の中でNNS能力推定値が下がることはなかった。受験者の信頼性係数として0.88が観測され、多くのスピーキング能力における主観的なテストの数値を上回った。2012年度の主な活動は、ソフトウェア開発(ウェブ上アプリケーション)とテストの開発、検査、修正を行ったことです。また、開発したテストを使用し、基線となる英語を母語とする人(ネイティブスピーカー・NS)のデータを収集しました。10月には、テストの評価者を集め、研修を行い、予備のデータも収集しました。開発したテストの中に三種類のタスクをデザインしました。1種類目のタスクでは、スピーカーのiPadにある言葉が表示され、スピーカーはリスナーにその言葉を使わずに意味を説明します。リスナーはその言葉を正しく正解出来た時、タスクは終了します。このタスクは意図的に一番簡単なタスクとして作られています。2種類目は絵のタスクです。スピーカーのiPadにある絵が表示され、それをリスナーに説明します。リスナーは4つの絵の中から説明されている絵を選びます。このタスクは中級的な難易度として作られています。3種類目は聞き取りタスクです。スピーカーは自分の母語で、一般的な興味・関心を話題とした1分間の短い講義をヘッドホンで聞きます。その後、その講義の主要なポイントをリスナーに英語で説明します。リスナーはiPadに表示されている4つのあらすじの中から、一つ選んだ時、タスクが終了します。講義の具体的な内容を文脈が分からない人に説明する能力が必要とされるので、このタスクは最も難易度が高いタスクとして作られています。それぞれのタスクが終了した時点で、点数化され、かかった時間もMySQLデータベースに記録されます。テストが正確に行われるために、評価者の親密度の問題を回避し、評価者間の違いの調整を行うために、それぞれの回答者は4人の評価者により、違った項目で評価されるように、細かい疑似乱数の項目を配信するシステムを完成しました。聞き取り項目のタイプを追加したため、聞き取り資料の通訳、2つの言語による録音、編集など、項目開発に予定より時間がかかりました。また、ソフトウェア開発は予定通り進んでいたものの、ソフトウェアテストの中にいくつかの問題があり、調整を余儀なくされました。2013年、残りのNSの標本のデータ収集し、校正評価をします。

NSの人が解答するまでにかかった時間を、日本語を母語で話す人(ノンネイティブスピーカー・NNS)の標本の基線とします。また、2012年度に作成した日本語のオーディオコンテンツをソフトウェアに追加します。NSとNNSの人は自分の言語でオーディオコンテンツを聞けるようにするため、ソフトウェアに言語の設定を追加する予定です。現在、アメリカにある第三者のプッシュ配信システムを使用していますが、日本からアクセスしているため、時々レイテンシーの問題が起こることがあります。万が一、問題が発生すると、テストを行っている最中にソフトはフリーズしてしまう可能性がありますので、第三者のものではなく、自分で開発したものと取り替えることを検討しているため、ただいま新しいシステムを開発中です。NSの予備的結果を8月に台湾で行われる環太平洋地域客観測量法学術討論会(PROMS)というラッシュモデルの学会において発表する予定です。また秋に、このテストのメインデータである日本人の学生の標本をデータ収集する予定です。当初の計画より小規模になりますが、この新しいテストフォーマットの有効性を深く調査するため、私たちは日本人の学生の回答者をより具体的に研究する予定です。テストは、九州産業大学と慶應義塾大学湘南藤沢キャンパスのそれぞれの学生を対象とし、九州産業大学では5人の評価者、慶應大学では2人の評価者で行う予定です。2013年度の終わりまでに、データ分析を完成する予定です。最初の計画では、母語英語のテストセッションをビデオ撮影する予定でしたが、そのビデオは必要でないと判断したため、ビデオ編集の謝金を使用しませんでした。また、英語が母語の回答者に謝金を予定していましたが、無料で参加してくれる結果になりました。2013年に、この残ったお金を他の謝金として使用する予定です。
頸動脈動脈硬化巣の形態学的、生化学的分析による脳梗塞発症機序の検討

粥状硬化性頸動脈狭窄症に対する頸動脈内膜剥離術(以下CEA)により摘出されたplaque内の過酸化脂質および酸化LDLに着目し検討した。初年度はプラーク中の過酸化脂質の指標としてThiobarbituric acid-reactive substgances(TBARS)を用いた。CEAにより摘出されたplaqueの病理学的にmacrophageやlipid coreが厚い不安定なplaqueほどTBARSは高い値を示した。次年度は板部らによって開発された抗酸化LDLモノクロール抗体(DLH3)を使用して動脈硬化巣の酸化LDLの含量を測定し、それが血中の酸化LDL濃度とどう関連するかを検討した。また手術前に頚動脈撮影や頚部超音波エコーで狭窄率のみならずplaqueの形態を評価し、CEAで摘出されたplaque(n=44)の病理組織所見及びplaqueの酸化LDL量との関連性を検討した。その結果、頚動脈エコーで低輝度を示したplaqueはmacrophageを多く含み、かつ、lipid coreが厚く、plaque ruptureやfibrous capの菲薄化の頻度が高い不安定なplaque(n=20)であり、その酸化LDL含量は安定したplaqueより3.6倍高値を示した。また免疫組織学的にDLH3抗体で強い染色性と一致した。しかし、症候性と無症候性との間ではplaque中の酸化LDL値には有意差はなった。患者血中の酸化LDL値は頚動脈狭窄症例でコントロール群(n=17)より有意に高かった。とりわけ不安定なplaqueを有していた症例ではコントロールより1.5倍と有意に高い値を示した。以上よりpalque中の過酸化脂質及び酸化LDLはplaqueの性状と関連し、血中酸化LDL値の測定は頸部エコー所見とともにCEA手術適応の良い指標になることが示唆された。粥状硬化性頸動脈狭窄症に対して施行した頸動脈内膜剥離術によって摘出された41個のplaqueの形態を観察し、またその動脈硬化の不安定性の指標としてplaque内の過酸化脂質量に着目し検討した。過酸化脂質量はTBARS法で測定した。1)Plaqueの病理組織の所見と過酸化脂質量との関係2)頸部エコー所見と過酸化脂質量との関係Plaque摘出前の頸部エコーの所見よりplaqueの性状を低輝度、混合型、高輝度の群に分類すると、不安定性を示すとされる低輝度のplaqueほどTBARSの値が高かった。以上より、TBARSに代表された過酸化脂質量と頸動脈plaqueの不安定性には有意な関連があることが示唆された。今後は板部らによって開発された酸化LDLモノクローナル抗体(DLH3)を使用して動脈硬化巣の酸化LDLの分布および含量を測定し、それが血中の酸化LDL濃度とどう関連するかを検討する予定である。前年度はCEAにより摘出されたplaqueの病理学的にmacrophageやlipid coreが厚い不安定なplaqueほど過酸化脂質が多く抽出されたことを報告したが、本年度は板部らによって開発された抗酸化LDLモノクロール抗体(DLH3)を使用して動脈硬化巣の酸化LDLの含量を測定し、それが血中の酸化LDL濃度とどう関連するかを検討した。

その結果、頚動脈エコーで低輝度を示したplaqueはmacrophageを多く含み、かつ、lipid coreが厚く、plaque ruptureやfibrous capの菲薄化の頻度が高い不安定なplaque(n=20)であり、その酸化LDL含量は安定したplaqueより3.6倍高値を示した。また免疫組織学的にDLH3抗体で強い染色性と一致した。しかし、症候性と無症候性との間ではplaque中の酸化LDL値には有意差はなった。患者血中の酸化LDL値は頚動脈狭窄症例でコントロール群(n=17)より有意に高かった。とりわけ不安定なplaqueを有していた症例ではコントロールより1.5倍と有意に高い値を示した。以上より酸化LDLはplaqueの性状と関連し、特に血中酸化LDL値の測定は頸部エコー所見とともにCEA手術適応の良い指標になることが示唆された。
シイタケに存在する癌遺伝子ras類縁の2つの遺伝子の染色体分布と一次構造の解析

シイタケの染色体をパルスフィールドゲル電気泳動法により分離する目的で、菌糸細胞のプロトプラスト化を再々度検討した。その結果、静置培養菌糸細胞をセルラーゼオノズカR-10、メイセラーゼ、キチナーゼ(或いはウスキサイム)の混合液で処理すると高効率でプロトプラストが得られることがわかった。プロトプラストを濃縮し上記電気泳動にかけたところ、出芽酵母の染色体(16本あるいは17本ある)と比べてかなり大きく、その数も多いことが予想された。なお、分裂酵母の染色体も高分子であるが、その数は3本であると報告されている。一方、ras遺伝子のクローニングであるが、昨年中に一応有望と考えられていたクローンを解析したところ、単離したDNA断片は計らずも目的のものではなかった。この原因としては、調整した染色体DNAがかなり低分子化しており、ras遺伝子を含む一定サイズのDNA断片を量的に揃えられなかったこと、及び、V-Ha-ras(或いは出芽酵母のras)をプローブとしてのハイブリダイゼーションシグナルが弱い(シイタケras遺伝子内にイントロンがある可能性あり)ことが考えられた。そこでこれら問題点を解決すべく種々検討した結果、染色体DNAの調整に関しては、菌糸細胞を液体窒素で凍結しブレンダーで粉状に粉砕する方法により、高分子でかつサイズの揃った染色体DNAが得られた。また、ニックトランスレーション法の代りにランダムプライマー法を用いて、プローブの放射能比活性を10倍に上げることができた。この組合せでサザンハイブリダイゼーションしたところ、非常にシャープなハイブリダイゼーションバンドが得られた。これによりDNAライブラリー作成時の目標範囲を狭める、つまり少ないクローンから効率良く目的クローンを選び出すことが可能となった。現在、鋭意、ras遺伝子を単離すべく大腸菌内でクローニング中である。シイタケの染色体を分離するためのパルスフィールドゲル電気泳動装置を作製した.まず,酵母の染色体分離を試みたところ,十数本にきれいに分離できた.ところが,シイタケの場合は細胞壁の部分が予想外に,非常に厚く,菌糸としてのかさはかなりのものであっても,プロトプラストにするとほとんのわずかの体積になってしまった.そこで大量の菌糸をプロトプラスト化し,遠心して濃縮し,それをSDS存在下プロティナーゼK処理して電気泳動にかけたところ,染色体サイズのDNAバンドは得られず,全て100キロ塩基対(kb)以下の断片になっていた.他方, DNA分解酵素阻害剤存在下で菌糸を破砕し,核を分離濃縮し,それをSDSで破裂させると同時に電気泳動してみたが,やはりまともな染色体の分離には至らなかった.何回も両方法を試みたが結果は同じであった.一方, ras遺伝子のクローニングであるか,シイタケ染色体DNAを制限酵素EcoRIで切断したときに, 5.3kbと15.0kbのDNA断片上にras類縁遺伝子が存在するので,まず, 5.3kbのものをファージベクターλgt11を用い大腸菌内でクローニングすることにした.46kbのEcoRI-断片をλgt11に連結し得られたファージクローン約3000についてプラークハイブリダイゼーションし,有望クローンを10個選び出し,ドットハイブリダイゼーションで3個に,ついでサザンハイブリダルゼーションにより1個にまでしぼり得た.これから挿入断片を分離しサイズを調べたところ5.3kbであった.現在, 5.3kbを種々の制限酵素で切断し,得られる断片についてサザンハイブリダイゼーションを行い,どの断片にras遺伝子が存在するかを解析中である.シイタケの染色体をパルスフィールドゲル電気泳動法により分離する目的で、菌糸細胞のプロトプラスト化を再々度検討した。
日本脳炎ウイルスE蛋白質の感染防禦抗原部位の解析

日本脳炎ウイルスはフラビウイルス科に属し黄熱病ウイルスやデング熱ウイルスと同じ仲間である。フラビウイルス粒子の表面には1種類の糖タンパク質(E)が存在しウイルスの細胞への吸着、侵入、細胞融合に関与し、また宿主の感染防禦においてはウイルス中和抗体の唯一の標的となっている。著者らは近年、E蛋白のC末端中の約80残基のペプチドの中に一次構造のみで感染防禦抗原となる部位の存在することを発見した。さらにインフルエンザウイルスとの比較から日本脳炎ウイルスのこのE蛋白領域はインフルエンザウイスHA蛋白のH2、即ち細胞融合発現部位に相当する部位を含むのではないかと考えた。この未知の感染防禦抗原について1)感染防禦に関わるアミノ酸1次構造を詳細に解析し,2)この部位の機能を検証し,3)そのワクチンとしての可能性を検討することを目的としてこの研究を行なった。現在(2月末日)までに上記目的の1),2)をほぼ終了した。即ち、日本脳炎ウイルス蛋白質C末端の種々の長さの遺伝子断片をPCR法により作成しこれを大腸菌発現ベクターにクローニングし大腸菌内で産生された日本脳炎蛋白を精製した後、マウスに免疫してその後マウス体内で産生された抗体のウイルス中和能を検証した。その結果このウイルス中和抗原はE蛋白C未端付近の26個のアミノ酸配列に存在することを突き止めた。またこの抗体はウイルスのHA活性を阻害する(HI活性を有する)事も明らかとなりこの部位がウイルスの宿主細胞への吸着、侵入過程で重要は役割を果たしている事が推測された。現在上記の目的3)を達成する為にさらに短いペプチド断片を化学的に合成してマウスに免疫しそのウイルス感染防禦抗原としての活性や強さを検証している。
光呼吸系の再評価に関する基礎研究

光呼吸系は、葉緑体内のCO2濃度が低下するとRubiscoのオキシゲナーゼ作用がおこり、その産物であるグリコール酸が代謝され、その結果細胞内でCO2を発生させる代謝機能である。特に強光を受ける柵状組織中の葉緑体内では光合成が盛んになりCO2が不足する一方で、CO2の拡散供給速度が高くないので、光呼吸が活発に起こる。このとき、光呼吸系の活性が低いとCO2を十分に供給できず、やがては光傷害を起こす。本研究は、このメカニズムをさらに詳細に研究することによって、作物の光合成を飛躍的に高めることをめざすことを研究目標としている。今年度の研究成果は次の通りである。1)初年度に購入したWALZ社の光合成測定装置を用いて、光合成と光呼吸との関係を詳細に調べた。その結果、強光下で光呼吸が抑制される2%CO2条件下におくと、光呼吸を行うことのできる21%O2条件下と比較して、どの植物も光合成が徐々に低下することが判明した。その原因は、2%O2条件下では、光化学系の光傷害が進行するためであることも明らかとなった。2)光合成量の高い植物(イネ、ヒマワリ、ナスなど)では、葉の表裏に気孔が発達しており、さらに細胞間隙も発達していること、のために、強光下でCO2の拡散供給速度が比較的高いこと、が判明した。1)光呼吸活性を測定するには、従来の方法は一定時間光照射後急に暗黒に移して、CO2の一時的放出量を測定するなど、煩雑で定量性にも問題があった。そこで、PAMを用いてクロロフィル蛍光を解析することにより、葉緑体内の電子伝達速度をO2濃度21%と2%とで測定し、その差から光呼吸による寄与を算出する方法を考案した。この方法を用いると多くの植物では、葉の表面に光呼吸活性が高く、逆に葉の裏面では非常に低いことが判明した。2)光呼吸活性の葉の断面における分布の差が、光呼吸系酵素の分布の差であるかどうかを知るために、光呼吸系の鍵酵素の一つであるグルタミン合成酵素(GS2)の分布を調べた。GS2の分布を調べるために、GS1にはないGS2に特異的なC末のペプチドに対する抗体を作成したところ、抗体価の高い抗体が得られた。これを用いて、組織染色を行ったところ、多くの植物で柵状組織に多くのGS2が分布するものの、海綿状組織にもある程度存在することが判明した。したがって、光呼吸活性の分布の差は、主にCO2が葉肉細胞中をCO2が拡散しにくいことによるものと考えられる。3) GS2が柵状組織で多く発現していることは、強光が当たることが原因であろうと考えられる。次年度は、光呼吸系のGS2以外の酵素について、分布と発現の条件を調べる。その原因は、2%CO2条件下では、光化学系の光傷害が進行するためであることも明らかとなった。

2)光合成量の高い植物(イネ、ヒマワリ、ナスなど)では、葉の表裏に気孔が発達しており、さらに細胞間隙も発達していること、のために、強光下でCO2の拡散供給速度が比較的高いこと、が判明した。3)光呼吸系の鍵酵素である、グルタミン合成酵素(GS2)、カタラーゼの遺伝子発現には活性酸素種の一つである過酸化水素が関与していることを明らかにした。光呼吸系は、葉緑体内のCO2濃度が低下するとRubiscoのオキシゲナーゼ作用がおこり、その産物であるグリコール酸が代謝され、その結果細胞内でCO2を発生させる代謝機能である。特に強光を受ける柵状組織中の葉緑体内では光合成が盛んになりCO2が不足する一方で、CO2の拡散供給速度が高くないので、光呼吸が活発に起こる。このとき、光呼吸系の活性が低いとCO2を十分に供給できず、やがては光傷害を起こす。本研究は、このメカニズムをさらに詳細に研究することによって、作物の光合成を飛躍的に高めることをめざすことを研究目標としている。今年度の研究成果は次の通りである。1)初年度に購入したWALZ社の光合成測定装置を用いて、光合成と光呼吸との関係を詳細に調べた。その結果、強光下で光呼吸が抑制される2%CO2条件下におくと、光呼吸を行うことのできる21%O2条件下と比較して、どの植物も光合成が徐々に低下することが判明した。その原因は、2%O2条件下では、光化学系の光傷害が進行するためであることも明らかとなった。
SNP解析可能な次世代DNAチップとTRAPを用いた膵癌遺伝子診断システムの開発

本研究では、膵液を用いた膵癌診断を高感度に実施するために、新たなテロメラーゼ活性測定法、新たな遺伝子を標的とする膵液中mRNA定量解析、ならびにECA (Electrochemical array)による電気化学的解析の開発を進めた。Hybridization Protection Assay (HPA法)とTRAP法を組み合わせたHPA/TRAP法は、超高感度のテロメラーゼ活性測定法であり、4時間という短時間で測定可能であり、我々は膵液解析のためにHPA/TRAP法に改良を加え、臨床診断に極めて有用な測定系を確立した(業績6)。また、現在普及しているReal-time PCRとこのTRAP assayを組み合わせて、さらに迅速で定量性のある手法(real-time TRAP)を確立した。この新規の手法はおよそ1時間で解析可能であり、膵液を検査対象とすると膵癌鑑別に有用であった(業績4)。さらに、膵液サンプルからRNAを抽出し、テロメラーゼの調節サブユニットであるhTERT mRNAの定量解析を初めて実現した。この方法は、特に膵癌とIPMNの鑑別に有用であった(業績1)。さらに他の癌関連遺伝子mRNAの定量解析を行った。MUC1とMUC5ACは、膵癌細胞で高い発現があり、膵液中の解析でも膵癌診断に有用であった(業績3)。S100A6の膵液解析では、膵癌の膵非腫瘍性病変との鑑別に有用であった(業績5)。ECAによる解析では、膵癌切除組織を用いてRAS遺伝子変異解析を行った。その結果ECAチップは、従来法と同程度の高い変異検出力があり、短時間解析系として有用であった(業績2)。膵液を用いる分子解析のなかで、テロメラーゼ活性の測定による方法は感度が高く、肺癌の臨床診断に有効であることを我々は報告してきた。しかし、従来の測定系(TRAP法)では、手技の複雑さや、測定時間、非放射性蛍光色素(SYBR Green)の感度、再現性などの問題から、未だに定型的臨床診断法とは成り得ていない。Hybridization Protection Assay(HPA法)とTRAP法を組み合わせたHPA/TRAP法は、超高感度のテロメラーゼ活性測定法であり、4時間という短時間で測定可能である。我々は膵液解析のためにHPA/TRAP法に改良を加え、臨床診断に極めて有用な測定系を確立した。膵癌細胞株と膵液を混合させる実験系から、膵液を用いる場合、プロテアーゼ阻害剤とRNase阻害剤を十分に添加することが必須であることが判明した。SYBRGreenを用いたTRAP法では、肺癌細胞100個の活性が検出限界であったが、HPA/TRAP法では、0.01個分の活性を検出でき、10000倍の感度があった。高感度であるため、測定に必要な蛋白量は0.6μgの微量で十分であり、膵液中のPCR阻害物質の影響を排除することが可能となった。ERCP下に採取した膵液サンプル52例について、HPA/TRAP法でテロメラーゼ活性を測定し、活性をGrade1から5まで分類した。慢性膵炎の症例は全てGrade2以下であった。21例のIPMTのうち2例がGrade5で、その他のIPMTと2例のMCTはGrade2以下であった。膵癌11例のうち、主膵管に完全閉塞があった2例はGrade1であったが、それ以外の9例のうち7例(81%)はGrade4または5の非常に高いテロメラーゼ活性を示し、診断に有用であった。以上の検討からHPA/TRAP法は、膵癌の診断に有用な超高感度のテロメラーゼ測定法であることが示された。なお、ECAチップによる研究は現在継続中である。本研究では、膵液を用いた膵癌診断を高感度に実施するために、HPA-TRAP法を中心とするテロメラーゼ活性測定法とECA (Electrochemical array)による電気化学的解析の開発を進めている。

Hybridization Protection Assay (HPA法)とTRAP法を組み合わせたHPA/TRAP法は、超高感度のテロメラーゼ活性測定法であり、4時間という短時間で測定可能であり、我々は膵液解析のためにHPA/TRAP法に改良を加え、臨床診断に極めて有用な測定系を確立した。さらに現在普及しているReal-time PCRとこのTRAP assayを組み合わせて、さらに迅速で定量性のある手法(real-time TRAP)を確立した。この新規の手法は膵癌鑑別に有用であった(論文掲載)。さらに、同様のサンプルからRNAを抽出し、hTERT mRNAの定量解析を行ったが、その診断法としての有用性は明らかではなかった(論文掲載)。さらに他の癌関連遺伝子であるS100familyやMUCfamilyの膵液中の発現解析を行い、非腫瘍性病変(膵炎症例など)との鑑別に有用であるいくつかの遺伝子が同定された(論文投稿準備中)。ECAによる解析では、現在RAS,P53,Telomeraseの解析チップを作成し、臨床サンプルによる検討を加えている。本研究では、膵液を用いた膵癌診断を高感度に実施するために、HPA-TRAP法を中心とするテロメラーゼ活性測定法とECA(Electrochemical array)による電気化学的解析の開発を進めた。Hybridization Protection Assay(HPA法)とTRAP法を組み合わせたHPA/TRAP法は、超高感度のテロメラーゼ活性測定法であり、4時間という短時間で測定可能であり、我々は膵液解析のためにHPA/TRAP法に改良を加え、臨床診断に極めて有用な測定系を確立した。さらに現在普及しているReal-time PCRとこのTRAP assayを組み合わせて、さらに迅速で定量性のある手法(real-timeTRAP)を確立した。さらに他の癌関連遺伝子であるS100familyやMUCfamilyの膵液中の発現解析を行い、非腫瘍性病変(膵炎症例など)との鑑別に有用であるいくつかの遺伝子が同定された(論文掲載済み)。ECAによる解析では、RAS遺伝子変異解析を行った(論文掲載済み)。
音楽科教育は社会性を育むー音楽教育学、行動内分泌・遺伝学、脳機能イメージング研究

音楽科教育は、長きにわたりその存在意義を問われ続けてきたが、音楽の授業の必要性について科学的・学問的な根拠を示せなかった。本研究は、音楽教育学、行動内分泌学、行動遺伝学、脳機能イメージングの手法を用い、中学生を対象に、音楽が脳を賦活し、社会行動に関わる生体化学物質を調整することで、ヒトの共感性や利他性に影響を与え、社会性を高めることを検証する。研究の結果、好きな音楽を聴取したとき脳の共感性や利他性に関連する領域の活動が活性化し、同時に経済ゲームでの配分額が増加することがわかった。社会性を育てることは喫緊の教育課題であり、本研究により音楽科教育が社会性を育むことが出来ることが証明された。本研究は、音楽教育学、行動内分泌学、行動遺伝学、脳機能イメージングの手法を用い、小・中学生を対象に、音楽(聴取)が脳を賦活(活性化)し、社会行動に関わる生体化学物質を調整することで、ヒトの共感性や利他性に影響を与え社会性を高めることを検証する。そして、その成果を音楽科教育の意義の確立や医療・福祉等関連分野への応用をはかるものである。27年度は、28年度の小・中学生を対象にした本実験に向けた準備を行った。具体的には、大学生を対象に、被験者が選んだ1好きな音楽2嫌いな音楽および3沈黙(コントロール)を条件にして利他性の変化を調べるため、以下の測定を行った。その結果、独裁者ゲームでは女性のみ、好きな音楽で利他性が上昇し、嫌いな音楽で低下した。生化学物質の分析では、男性に有意差がみられなかったものの、女性では好きな音楽でE値が増加し、嫌いな音楽で減少するという結果が得られた。MRI実験では、嫌いな音楽を聴いているときに葛藤や痛みなどに関連する前帯状皮質の活動が見られた。この結果は、5月に開催される日本音楽知覚認知学会で発表される。当初の実施計画に従い、打ち合わせ会議および研究会を五回開催した。その間、研究代表者、研究分担者が所属するすべての大学で倫理委員会の審査・承認を得、具体的な実験準備を行った。27年度の主たる計画である、大学生を対象にした予備実験を実施した。その過程で、問題や修正すべき事項が明らかになり、本実験にむけて、実施計画の改善を行った。本研究は、音楽教育学、行動内分泌学、行動遺伝学、脳機能イメージングの手法を用い、小・中学生を対象に、音楽(聴取)が脳を賦活(活性化)し、社会行動に関わる生体化学物質を調整することで、ヒトの共感性や利他性に影響を与え、社会性を高めることを検証する。その結果を基に、音楽科教育の目的を社会性の育成の観点から再構築することを目的としている。本年度は、上記計画に基づき玉川大学において小・中学生を対象に行動実験を実施した。教育委員会を通じて被験者を募集、応募者に対し説明会を実施し、インフォームドコンセントを得た上で、各種心理テスト(日本語版POMS、主要5因子性格検査(BIG-5)、音楽才能テスト)を実施した。その後、被験者が自ら選んだ音楽2曲(強い情動を喚起する(chill-induced music)音楽(好・嫌))及び沈黙(コントロール)を刺激として提示し、刺激前後でホルモン分析用の唾液サンプルを採取すると共に経済ゲーム(独裁者ゲーム)を実施した。被験者募集を担っていた研究分担者が急逝し、被験者募集に関わる地元教育委員会との折衝に手間取ったため、実験開始時期が予定より大幅に遅れた。その結果、年度内に当初予定していた実験を終了することが難しくなったため、実験を中断し次年度に実施する事とした。それにともない予算の繰り越し手続きを行った。その後、当初計画より玉川大学で実施を予定していたfMRI実験が大学の事情により実施できなくなった。本研究の目的は、音楽がヒトの共感性や利他性に影響を与え、社会性を高めることを検証することで、音楽科教育の目的や意義について、科学的な事実や裏付けに基づき、具体的で分かりやすい説明を行うことを目指す。上記目的のために、音楽聴取が利他性に及ぼす影響を調べるため、中学生被験者を対象に行動実験、行動内分泌学およびfMRI実験を実施した。被験者を公募し、インフォームドコンセントを得た後、各種心理テスト(日本語版POMS、主要5因子性格検査(BIG-5)、音楽才能テスト)を実施した。次に被験者に、強い情動を喚起する(chill-induced music)音楽(好・嫌)及び沈黙(コントロール)を聴取させ、刺激前後で経済ゲーム(独裁者ゲーム)を実施し、同時にホルモン分析のための唾液を採取した。また、上記音楽を聴取時のfMRI画像を撮像し、音楽聴取と活性化される脳領域を調べた。分析の結果、好きな音楽聴取が利他性を増すこと、および脳の報酬領域の活動が活性化されることがわかった。上記実験(聴取)に加え、音楽演奏(合唱)が利他性に及ぼす影響を調べるために、中学生約1000名を対象に、経済ゲーム(独裁者ゲーム)を実施した。その結果、音楽演奏(合唱)が利他性を増すことがわかった。本研究により、音楽はヒトの利他性や社会性を増加させることが明らかになった。この結果により、音楽科教育の目標・目的に「共感性」や「利他性」の育成を挙げることが可能となり、曖昧だった音楽科教育の目標・目的をより具体的に示すことができることになる。

音楽科教育は、長きにわたりその存在意義を問われ続けてきたが、音楽の授業の必要性について科学的・学問的な根拠を示せなかった。本研究は、音楽教育学、行動内分泌学、行動遺伝学、脳機能イメージングの手法を用い、中学生を対象に、音楽が脳を賦活し、社会行動に関わる生体化学物質を調整することで、ヒトの共感性や利他性に影響を与え、社会性を高めることを検証する。研究の結果、好きな音楽を聴取したとき脳の共感性や利他性に関連する領域の活動が活性化し、同時に経済ゲームでの配分額が増加することがわかった。社会性を育てることは喫緊の教育課題であり、本研究により音楽科教育が社会性を育むことが出来ることが証明された。現在は、本実験実施のため準備作業を行っている。音楽実験に使用する機材も準備を完了しており、被験者(小学生中学生40名)を募集するため、ホームページを立ち上げる準備を行っている。また、スクリーニング(被験者選出)を行うための、各種テスト類も準備済みで、それらの結果をもとに最適な被験者集団を構成する予定である。実験は玉川大学および周辺の小・中学校で実施する予定で、実施校については、教育委員会の理解を得つつ候補を選定中である。玉川大学で予定していた実験(行動実験、サンプル採取、fMRI)を中止し、奈良教育大学で行うこととする。これにともない、新たな研究計画を倫理委員会に再申請し、承認を受けた後、被験者を募集し実験を行う。fMRI実験については、ATR-Promotions(国際電気通信基礎技術研究所(ATR)、京都府相楽郡精華町)に実験を依頼し、研究を続行することにする。以上により、当初の計画の遂行(同一被験者による行動実験、サンプル採取、fMRI)が可能になると考える。29年度が最終年度であるため、記入しない。音楽行動内分泌学29年度が最終年度であるため、記入しない。
喉頭麻痺に対する線維芽細胞増殖因子を徐放させた自家筋膜移植術の検討

本研究は、喉頭に入っていく血管・神経を断絶させるモデルを再生させることを基本とした研究である。組織は、通常、血管・神経が遮断されると生きていけない。しかし、in vivoの実験では、細胞が死に絶えない。たとえ、中心となる血管・神経を遮断しても、末梢で側副路があり、周囲から栄養を受け取れることができるからである。これが、in vitroと異なる点である。だからこそ、我々は、この組織再生の研究に、万能細胞ではなく、環境因子を賦活させるLangerの考え方を選んだこの研究を行っている。昨年度までに行った喉頭の組織学的検討は、血管分布をみるCD34、神経再建の指標にもなるシュワン細胞のマーカーであるS-100と、神経軸索であるNFの発現をみた。コントロールである脱神経・血管モデル群は、健側に比べて、血管分布、神経分布が低下していた。S-100は、bFGFを徐放させた自家筋膜移植群が、他群より陽性部分が多かった。NFは、bFGF徐放群と、bFGFを徐放させた自家筋膜移植群で、陽性部分が多かった。今年度の本研究の問題は、手術操作の安定と、逆行性神経トレーサーの実験系の確立と実験の終了であった。手術は、麻酔薬の変更と、手術時間の短縮で、安定した結果を得た。30症例中で5例のみに手術関連死を認めた。一方、逆行性神経トレーサーの実験は、まずは、喉頭内に確実に試薬を注入できるかから始まった。これを解決したのは、焦点距離の変更であり、フィルターを用いることで解決した。これで、的確に喉頭内に神経トレーサーを注入できた。注入部位の確認は、安楽死後の摘出喉頭標本で確認した。さらに、パラホルムアルデヒドによる還流実験も、安定して組織採取ができた。蛍光抗体の評価は、共焦点顕微鏡を用いて行う。逆行性神経トレーサの実験は、24例中13例で完遂できており、随時継続中である。我々は、組織の支配神経が障害された後に起こる、廃用組織の再生について研究している。喉頭で、神経麻痺がおこると、組織は萎縮し、嗄声や誤嚥のリスクを上げ、患者の生活の質を低下させる。そこで、組織再生に必要な、足場、細胞と調節因子をこの廃用組織に与えることで、再生が起こることを期待し、増殖因子である塩基性線維芽細胞増殖因子を徐放させた自家筋膜移植の治療効果を検討している。神経障害の後に起こる組織変化は、生体内の様々な因子か絡み合って起こっており、in vitroの研究では十分に解明できない。そこで、神経麻痺の動物モデルを作成し、増殖因子を徐放させた自家筋膜移植の治療効果を観察している。平成27年度は、組織学的検討のための検体採取が主な研究となった。上喉頭神経と反回神経の切除は、比較的安定して施行できていたが、麻酔深度が不安定になる症例や、出血の調節が十分できない症例があり、手術後に3例死亡してしまった。このため、麻酔深度の安定化のため、麻酔薬投与後、十分な観察期間を設けることとし、追加の投与量は、初回投与量の8割にした。また、治療例の早期に実験を行ったものは、術後の呼吸状態の悪化などにより、手術後に死亡する症例があった。そこで、手術中、特に喉頭内に移植片を移植する前に、気管切開などの上気道の確保を行うことにした。気管切開孔は、一過性のものであり、手術後は自然閉鎖する症例もあり、実験動物への身体影響は強くないと考える。治療が完遂した症例は、二酸化炭素の吸入で安楽死させてから、喉頭を摘出して、ホルマリンで固定後にパラフィンで包埋する。これを200μm間隔に3μmで薄切して、連続切片を10枚ずつ作成した。薄切に際して、軟骨の骨化が強い症例があり、この場合は蟻酸入りのホルマリンで、組織の軟化を図ってから薄切した。現在、薄切検体の搾取中である。現在、37匹のラットを用いて、反回神経と上喉頭神経の切断モデルの作成と、喉頭内への移植手術を行っている。すでに、この実験を完遂している症例は15匹で、安楽死後に喉頭を摘出して薄切を行っている。実験の途中で、死亡するラットがあり、すべての症例が、この実験過程を完遂できていない。実験過程での死亡例を無くすため、手術操作について、幾点か改良を試みた。改善点は、麻酔投与の手順の改善と、呼吸状態によっての上気道の確保である。改善後は、多くの症例で支障なく実験を遂行できている。摘出した喉頭は、順次薄切し検体を作成している。ただ、移植症例では、軟骨の骨化があるのか、薄切しにくい。そこで、薄切面の面出し後、蟻酸とホルマリンの混合液に、数十分つけてから薄切している。脱灰時間が短いため、次の薄切を行う場合は、同様の手順を踏む必要があり、時間がかかっている。現在、連続切片の薄切が終了した症例は、7例である。我々の研究目的は、麻痺喉頭の再生である。再生の治療効果を評価するには、麻痺によっておこる変化と、治療介入による変化を比較する必要がある。この点から、組織学的評価は欠かせない項目である。神経麻痺によっておこる廃用症状は、筋肉の萎縮、筋周囲組織の線維化、栄養血管の萎縮などがある。

喉頭が廃用状態になると、声帯筋の萎縮、声帯粘膜の弾性繊維の減少、声帯の粘性の低下が起こり、声門閉鎖不全を引き起こす。これにより嗄声や誤嚥の危険性が増大する。我々の研究は、この喉頭の廃用変化に対して、線維芽細胞増殖因子とうい成長因子と、自己筋膜の移植を行うことで、再生に必要な3要素、細胞、足場、成長因子を麻痺喉頭組織に与え、組織の再生を促す試みである。組織評価は、摘出喉頭の連続切片を作成し、ヘマトキシリンーエオジン染色を行いその形状を評価する。喉頭は、軟骨がある組織であるため、薄切時に軟部組織との剥離が生じやすい。そのため、ギ酸+ホルマリンやXCL+ホルマリン溶液を薄切時に随時施行することで、比較的安定して薄切ができている。検体は、免疫染色の反応性が低下しないように、薄切後、パラフィンでコーティングし、4°Cの冷蔵庫でサランラップに包んで保管している。免疫染色は、血管分布についてはCD34を、神経分布についてはS100を用いて免疫組織染色を行っている。一次抗体の反応時間は、オーバーナイトとしている。治療効果を評価するため、喉頭麻痺群の組織変化を基本としている。非治療側と比較して、各症例の組織の変化を表した。筋膜移植群、bFGF徐放群とbFGFを徐放させた自家筋膜移植群の各群で6例の標本を作成し、検討している。現在、HE染色での各群での形態変化を評価しながら、並行して免疫染色を行っている。組織学的検討で、使用したラットは45匹であった。当初、実験動物の経過が安定しなかったため、脱落症例があった。そのため、当初の予定より、終了まで時間が多くかかってしまった。結局、最終的に評価できる症例は25例であった。実験終了後に速やかにCO2の吸入により安楽死させて、喉頭を摘出した。ヘマトキシリンーエオジン染色は、16例、179標本で、CD34染色は、8例、85標本で行っている。S100染色は、現在、先行実験中であり、コントロールの設定と、染色時間、一次抗体の濃度の選定を行っている。現在、神経トレーサを用いた治療介入後の神経支配の評価を行うため、喉頭麻痺モデルの作成を行っている。ただ、移植後のラットの状況が安定せず、体重減少による安楽死症例などが続発している。現在、原因の同定作業中であるが、手術後の経口摂取障害が起こっている可能性があるかもしれない。本研究は、神経や血管の支配がなくなり廃用した喉頭組織を再生させる目的で、成長因子である塩基性線維芽細胞増殖因子を徐放させた自家筋膜移植を実験動物で行っている。まず、喉頭に入る主要血管と神経を切除・焼灼し、喉頭麻痺モデルを作成した。神経支配の消失から十分に時間が経過(16週間)してから、移植治療を行った。治療効果は、治療後、12週間して検討した。治療効果は、組織学手法で判断した。各症例の摘出喉頭を薄切(連続切片)し、HE染色を行った。薄切枚数を考慮して、各構造物の大きさを計測した。神経麻痺によって萎縮した筋肉は、治療群で、筋肉の肥大が確認できた。移植した自家筋膜の大きさは、bFGFを徐放しない群が、bFGF徐放群より、有意に残存していた。一方、脂肪組織の大きさは、有意差を認めなかった。さらに、組織の様相を見るため、血管内皮細胞の標識マーカーであるCD34抗体と、シュワン細胞などを指標とするS100抗体を用いて免疫染色を施行した。内喉頭筋のひとつである甲状披裂筋は、声門の閉鎖に関与し、萎縮で起こる声帯の弓状変化にも関与している。