hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固体試料の直接気化-原子スペクトル法による超微量分析法の開発

1.加熱気化-原子スペクトル分析法は高感度な方法であるが、固体試料を一度溶液化した後、原子化部へ導入しなければない。本研究では、目的元素としてカドミウムを例にして、環境試料のための固体試料の直接定量法を開発した。本法では、通常の加熱気化法で用いられるタングステン炉の上に、タングステン製サンプルキュベットを乗せ、いわば「2枚重ね」の形で間接的に試料を加熱できるようにした。まず、このキュベットの上にミクロ天秤を用いて数十ミリグラムの固体試料を秤量する。試料分解試薬や化学修飾剤も同時に添加した後、これをタングステンボ-ト上に密着させ、徐々に温度を上昇させながら試料を炉上で灰化分解する。同時に目的元素の原子化段階における化学種を同一に揃える。最後に約2500°Cに急速に加熱することによって、目的元素をオンラインでICP発光分析装置へ導入する。得られた発光シグナルのピーク面積から定量する。2.試料を短時間にしかも完全に分解するための試薬として、テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイドを添加して、有機物を分解することによって残渣を減少させることができた。さらに、リン酸アンモニウム粉末と試料粉末を最適混合比で混合することで、試料中のカドミウムが気化温度の高いリン酸塩を形成し、これによって灰化温度を比較的高い温度にすることができた。これらの化学修飾剤を併用することにより、検量線の標準物質としてカドミウム水溶液を用いることが可能になった。本法により環境試料中の微量カドミウムの直接定量を行い、保証値と良く一致した結果が得られた。3.本法はICP発光分析装置のための固体試料の直接導入-加熱気化法のみならず、他の検出装置にも応用できる。現在は加熱石英セル-原子吸光分析装置への拡張も検討中である。
放射光を用いたラウエトポグラフ法による蛋白結晶の格子欠陥の解析

X線トポグラフ法は生体高分子結晶の格子欠陥の研究には最も適した観察法であり今まで多くの試みがなされたが,結晶の内部構造が識別できる像は得られなかった。結晶は水分を失うとただちに崩壊し,またX線照射により簡単に変成するために試料保持,撮影法に特別の工夫が必要なためである。本研究では多数の反射面のトポグラフが同時に撮影可能なラウエ・トポグラフ法を採用した。試料保持法として,密閉した水雰囲気中にクモの糸での固定する,構造解析で行われているガラスキャピラリーに結晶を微量の溶液で固定する方法,それを発展させキャピラリー中で結晶成長を行い,その後溶液を除去して固定する方法により良い結果を得た。また放射光を利用し高解像度の像を短時間の露出で撮影した。放射光の場合,適当なフィルターで照射損傷を押さえるが,従来有機結晶で使用された金属板ではこれを有効に押さえることはできなかった。本研究では5mm厚の水フィルターの使用により同じ結晶から10枚ものラウエ・トポグラフの撮影に初めて成功した。試料は卵白リゾチームの正方晶,斜方晶結晶を条件を変えて成長させたものを使用した。本研究で初めて得られた結果の主なものを列挙する。1.大多数の結晶は強いアステリズムを示す。2.成長速度が遅いほどアステリズムを示さないことが多い。3.正方晶の方がアステリズムを示さない結晶が成長しやすい。4.結晶の特定方向を向くラセン転位と類似した線状コントラストが観察された。5.アステリズム内に逆格子の原点方向に向いた線状コントラストが観察された。6.正方晶,斜方晶ともに成長に従い歪みが蓄積されクラックが容易に発生する。7.クラックは(001)にほぼ平行で歪みもその面内にある。8.アステリズムを示さない結晶でもC軸方向に均一歪みを示す。9.気-液-固界面に沿い結晶が歪む。10.結晶の成長端の容器に接した部分は強い歪みが生じる。
ワールブルク効果を標的とした抗がん剤としてのSIRT6活性化剤の開発

従来sirtuin活性は酵素を2種類利用することにより検出されてきた。従って、ケミカルスクリーニングを実施する上で操作が煩雑になることに加え、多くの擬陽性化合物が生じる問題点があった。今回、sirtuinが長鎖脂肪酸を切断する活性を持つという知見に着目し、消光団でもsirtuinによって認識切断され得るとの仮説を立て、それを実証することにより一段階で簡便にsirtuin活性を検出できる系の構築に成功した。また、構築した系を利用したケミカルスクリーニングにより、新たな母核を有するSIRT6阻害剤・活性化剤を見出すことにも成功した。SIRT6活性化剤をケミカルライブラリーよりスクリーニングするために、蛍光偏光法を利用したSIRT6活性評価系の構築を予定していた。しかしながら、様々な検討の中から、予定していた評価系以上に簡便にSIRTs活性を検出可能な系の構築に成功した。その系ではFRET型の蛍光プローブを用いて蛍光強度を観察するのみでSIRT活性を評価できるため、蛍光偏光法は必要ではなく益々簡便であった。SIRTsが長鎖脂肪酸を認識・脱アシル化する知見に基づき、Dabcyl基のような消光団をも切断するのではないかとの仮説を立て、それを実証することより達成されたものであり、独自性の高い手法と考えている。合成した蛍光プローブはSIRT6活性を高感度かつ簡便に検出することが可能なだけでなく、長鎖脂肪酸を脱アシル化することが知られているSIRT1, 2, 3活性も簡便に評価することが可能であった。また、既存の阻害剤・活性化剤の活性を精確かつ迅速に評価することが可能であることから、大規模なケミカルスクリーニングに適した評価系の構築が達成できたと考えられる。蛍光プローブ、酵素濃度などアッセイ条件の最適化を行い、実際にケミカルスクリーニングを東大創薬機構より9600化合物の供与を受けて実施した。その結果、SIRT6活性を阻害或いは活性化する化合物候補を幾つか得ることに成功した。ただし、得られた化合物が真にSIRT6阻害剤・活性化剤かに関する評価は行えていないため、今後まずその評価より進めていく予定である。評価系の構築に最も苦戦することが予想されたが、その構築には既に成功し実際にケミカルスクリーニングを実施することができたため。昨年度までに構築した簡便なSirtuin活性蛍光検出系では、検出可能なSirtuin活性は一部のサブタイプに限られていた。細胞などへの応用を考慮した場合には利点となるが、in vitroで活性を評価する場合には十分機能を発揮しているとは言えない。そこで、これまでに検出できなかったSirtuin活性に関しても簡便に検出可能とするためペプチド配列や消光団の精査を行い達成を目指している。具体的には、一般的なSirtuinの認識配列であるヒストン配列に限らず、個々のSirtuinがより特異的に認識することが知られているペプチド配列を用いている。また、昨年度にケミカルスクリーニングから得られたSIRT6の阻害剤、活性化剤に関しては構造展開を行い構造活性相関を評価している。独自に構築した評価系ではSIRT6の脱アシル化活性を評価し、同時に市販の評価系を用いて脱アセチル化活性を評価することでそれぞれに対する阻害活性などを評価した結果、一方のみを特異的に阻害する化合物を見出すことができた。その化合物に関しては更なる展開・評価を予定している。交付申請書通り、得られているSIRT6阻害剤・活性化剤の構造最適化を行うとともに細胞応用を行うことにより抗腫瘍活性の評価を行う予定である。ケミカルバイオロジー物品費が当初の予定より少なく済んだことがその理由に挙げられる。本年度は合成を中心に行い、細胞評価なども同時に行うことから、当初の計画以上に物品費を多く必要とすると考えられる。従って、昨年度の残りの助成金は有効に活用できると考えられる。
コルチゾール分泌抑制薬が犬下垂体腺腫細胞増殖能に及ぼす影響の検討

本研究はCushing病罹患犬において小動物獣医領域で使用されているコルチゾール分泌抑制薬がACTH産生腺腫増殖能に及ぼす影響について解明数することを目的として実施した。健常犬にコルチゾール分泌抑制薬を投与することにより脳脊髄液中のCRHは有意に増加した。健常犬の下垂体前葉およびACTH産生下垂体腺腫の初代培養細胞にCRHを添加するとACTH産生細胞の増殖能が活性化した。また、これはCRH receptor1阻害薬により阻害された。以上の結果からコルチゾール分泌抑制薬の投与により過剰に分泌されたCRHはACTH産生細胞の増殖を促進することが明らかとなった。Cushing病罹患犬に対してop'-DDDやトリロスタンなどの薬剤によって、副腎皮質におけるコルチゾール産生・分泌を抑制する内科的治療が主に行われており、その有用性に関して多数報告されている。しかし、コルチゾール分泌を抑制することで、下垂体ACTH産生腺腫の成長を助長する危険性が示唆されているが未だ明確な見解は出されていない。よって本年度は日本獣医生命科学大学付属動物医療センターに来院し、Cushing病と診断された症例のうち、経蝶経骨下垂体切除術による外科的治療が行われた3症例のACTH産生腺腫サンプルの培養細胞を使用して、CRHが犬のACTH産生腺腫の増殖能に対する影響を検討した。増殖中のACTH産生細胞を検出するため、EdUによる化学的標識およびACTHの蛍光免疫学的標識を実施し、CRH添加によるEdU陽性かつACTH陽性細胞数およびACTH陽性細胞数を計測した。今後症例数を増やして更なる検討が必要であるが、CRH5nMの添加によりACTH産生細胞の増殖能に増加傾向が認められ、これはAntalarmin1μMの添加で阻害される傾向が認められた。マウス下垂体ACTH産生腺癌由来細胞株であるAtT20においても、CRHがその増殖を促進させることが報告されており、本検討結果の正当性を裏付けるものと考えられた。加えてCRHreceptor1阻害薬であるAntalarminの添加によってCRHにより増加したACTH産生腺腫細胞の増殖活性が低下傾向を示したことから、CRHによる増殖活性化作用はCRHR1を介することが示唆された。また、Cortisolを10nM, 100nM添加した場合増殖率に変化が認められなかったことから、これはCushing病罹患犬の特徴であるグルココルチコイド抵抗性の増大と合致するものと考えられた。これより、Cushing病に対するトリロスタンを使用した治療によるCRHの分泌促進によりACTH産生腺腫の増大が刺激される(Nelson症候群)可能性が示唆された。今後さらに症例数を増やして検討を行う予定である。健常犬に対するトリロスタン投与による脳脊髄液中のCRH濃度の変化に関する検討では、健常ビーグル成犬6頭にトリロスタン5mg/kg BID 4週間の投与を実施し、投与後2週目、4週目における脳脊髄液中のCRH濃度を測定した。測定は、脳脊髄液中のタンパク質をC18カラムにて精製、濃縮後、凍結乾燥を行い、その後ELISAキットにて測定を行った。トリロスタン投与前の脳脊髄液中のCRH濃度は、260±19.5pg/mlであった。投与後の脳脊髄液中のCRH濃度は投与前と比較して有意な増加(P<0.01)が認められ、投与後2週目および4週目のCRH濃度はそれぞれ337.8±20.7pg/ml、366.2±19.5pg/mlであった。次に、CRHが犬の下垂体ACTH産生細胞の増殖能に及ぼす影響に関する検討では、前検討で使用したトリロスタン投与を実施したビーグル犬の下垂体前葉組織を培養して実験に供した。また培養上清中のACTH濃度の測定も実施した。ACTH産生細胞のEdU陽性率は、対照群が1.28±0.23%、0.5nMCRH添加群が1.42±0.23%、5nMCRH添加群が2.52±0.25%であり、5nMCRHを添加した群では対照群と比較して有意に高値を示した(p<0.01)。また、培養上清中のACTH濃度は培養後4時間、24時間で対照群と比較し、有意に高値を示した。これらはCRHR1阻害薬であAntalarmin1μMの添加で阻害された。

以上より、コルチゾール分泌抑制薬の投与は、犬の視床下部のCRH分泌能を亢進させ、CRHはACTH産生細胞の増殖能およびACTH産生を促進することが示唆された。本研究はCushing病罹患犬において小動物獣医領域で使用されているコルチゾール分泌抑制薬がACTH産生腺腫増殖能に及ぼす影響について解明することを目的として実施した。まず腫瘍サイズを推定可能な臨床検査を探索するため、腫瘍サイズおよび各種臨床検査の結果を比較検討した結果、内因性血漿ACTH濃度と下垂体腫瘍サイズの指標であるP/B ratioの間に有意な正の相関関係が認められた。また下垂体腫瘍組織における増殖マーカーとして人医療で報告されているKi67およびminichromosome maintenance 7 (MCM7)タンパクの免疫組織学的検討を行った結果、P/B ratioおよびKi67陽性率間、P/B ratioおよびMCM7陽性率間に有意な正の相関が認められ、犬ACTH産生下垂体腺腫においても、これらの増殖マーカーの有用性が明らかとなった。次に健常犬にコルチゾール分泌抑制薬を投与することにより下垂体の過形成が生じることが報告されているが、その機序を解明するために、健常犬にコルチゾール分泌抑制薬を投与した際の脳脊髄液中のCRH濃度を測定した結果、投与により脳脊髄液中のCRH濃度は有意に増加した。さらに投与終了後の下垂体前葉細胞を使用した初代培養の結果、CRH添加によりACTH産生細胞のEdU陽性率が有意に増加し、CRHは犬下垂体ACTH産生細胞の増殖能を活性化することが示唆された。また、犬ACTH産生腺腫細胞によって同様の検討を実施したところ、CRHの添加によりACTH産生腺腫細胞のEdU陽性率が有意な増加を示し、これはCRH receptor1阻害薬であるAntalarminの添加によって阻害された。以上の結果からコルチゾール分泌抑制薬の投与により過剰に分泌されたCRHはACTH産生細胞の増殖を促進し、これはCRH receptor1を介した作用であることが明らかとなった。獣医神経内分泌学昨年度の検討より、コルチゾール分泌抑制薬であるトリロスタンの投与により脳脊髄液中のCRH濃度が上昇し、in vitroにおいてCRHが犬下垂体のACTH産生細胞の増殖を活性化することが明らかとなった。すなわち下垂体前葉ACTH産生細胞の肥大および過形成に伴った下垂体の腫大は、視床下部のCRH分泌能の亢進に起因することが示唆された。昨年度の実験を踏まえ、本年度は犬のACTH産生腺腫細胞においてもCRHがACTH産生細胞の増殖を促し、下垂体腫大に影響を与えるかを検討した。その結果、犬のACTH産生腺腫細胞においてもCRHが細胞増殖を促す傾向が認められ、これはCRHreceptor1阻害薬であるAntalarminにより抑制された。この結果は現在日本で主流で行われているコルチゾール分泌抑制薬による犬のCushing病の治療により、ACTH産生腺腫の増殖が促される可能性を示している。さらに、これはCRHR1阻害剤の投与により抑制することが出来る可能性が示唆された。しかしながら、今後症例数を増やして検討を行う必要がある。今年度の研究により、健常ビーグル成犬へのコルチゾール分泌抑制薬の投与が視床下部のCRH分泌を亢進させ、in vitroではCRHが犬のACTH産生細胞の増殖およびACTH分泌を活性化することが明らかとなった。この結果より、コルチゾール分泌抑制薬の投与によりNelson症候群が発生する危険性があることが示唆されたため。
自然免疫系における転写因子TFEBの役割についての解析

リソソームのマスター制御因子である転写因子TFEBの、自然免疫系における役割について解析を進めた。予備的な結果で、TFEBの過剰発現で病原体センサーToll様受容体(Toll-like receptor, TLR)の応答が誘導されるという結果を得ていることから、その機序について解析を加えた。しかしながら別のベクターで発現させると、TLR応答が誘導されなかったために、TFEBの解析を進めることは困難であった。そこで、TFEBの制御因子であるmTORについての解析を進め、TLR3の応答にmTORC2が関与していることを明らかにした。自然免疫系では、Toll様受容体(TLR)をはじめとする病原体センサーが、病原体の侵入を察知し、転写因子NF-kBを活性化して、感染防御反応を誘導する。ハエからヒトまで保存されているが、線虫では、TLRもNF-kBのどちらも保存されていない。それにもかかわらず、感染に際して抗菌ペプチド産生が誘導される。最近、リソソームの恒常性に重要な転写因子TFEBが線虫において抗菌ペプチド誘導に関わる事が報告された。しかしながら、TFEBのヒト・マウスの自然免疫系における解析は進んでいない。本研究で、TFEBとリソソームに局在する核酸特異的TLRとの関係に注目し、TFEB転写因子のTLR応答における役割を明らかにすることを目的として、解析を進めた。特に、TFEBを過剰発現した細胞において、TLR4/MD-2やTLR7の応答が高くなっていたことから、TFEBとTLR応答との関係について解析を進めた。しかしながら、TFEBを発現させていたベクターに問題があり、TFEBと別の分子の融合タンパク質が産生される可能性があったため、そのような危険性のないベクターで新たにTFEBを過剰発現させたところ、TLR4/MD-2やTLR7の応答の変化は認められなくなった。この時点で、TFEBの解析は断念したが、3T3細胞におけるTLR応答の分子基盤についての解析を継続した。その解析から以下の点が明らかとなった。TLR3は刺激前は核の周囲に分布しているが、刺激後は細胞膜周辺にまで移行すること、さらにその細胞内移行がTLR3依存性のI型インターフェロン産生に重要であることを見出した。さらにTLR3がリソソームに局在していることから、TLR3の活性化によってリソソームの細胞内移行が誘導されることが明らかとなった。今後、リソソームの細胞内移行とTLR3の応答についての解析を進めてゆく。免疫学
スギ間伐材からの昆虫行動制御物質の単離

スギ(Cryptomeria japonica)間伐材のMeOH抽出物が広食性の害虫として果菜類や蔬菜類に大きな被害をもたらすウスカワマイマイ(Acusta despesta)の摂食行動を強く抑制することを見いだした。活性成分は複数の化合物から構成されており、ヘキサン及び酢酸エチルでそれぞれ抽出できること明らかとした。各種クロマトグラフィーを駆使することによりヘキサン層からそれぞれ単独で活性を示す2つの化合物が得た。各種機器分析の結果、活性化合物を(-)-cubebolとスギ特有のセスキテルペノールである(+)-2,7(14),10-bisabolatrien-1-ol-4-oneと同定した。これらの化合物は濾紙1cm^2当たり120μgならびに80μgでウスカワマイマイの摂食行動90%以上阻害した。また、酢酸エチル層から、同様に各種クロマトグラフィーを駆使することによりそれぞれ単独で活性を示す2つの化合物を得、その構造をagatharesiolとsequirin-Cと同定した。これらの化合物は濾紙1cm^2当たり30μgならびに40μgでウスカワマイマイの摂食行動を90%以上阻害した。これらの知見は、スギ間伐材の有効利用に繋がるばかりか、広食性の害虫防除に新たな手法を導入できる可能性を示唆するものと考えられる。これらの化合物は濾紙1cm^2当たり120μgならびに80μgでウスカワマイマイの摂食行動を90%以上阻害した。また、酢酸エチル層から、同様に各種クロマトグラフィーを駆使することによりそれぞれ単独で活性を示す2つの化合物を得、その構造をagatharesinolとsequirin-Cと同定した。
分泌蛋白質キナーゼの制御機構の解明と関節リウマチ治療への応用

研究代表者は末梢血を用いた研究で、関節リウマチの病態と関連する分子として翻訳後修飾にかかわる分子であるFAM20Aを同定している。本研究ではFAM20Aに対する抗体を作成し、FAM20Aの遺伝子発現、タンパク発現について病変部位との関連含めて検討した。その結果、関節リウマチの滑膜線維芽細胞においてもFAM20Aが発現しており、さらに複数のサイトカインによりFAM20Aが誘導されていることが明らかになり、翻訳後修飾と関節リウマチ病態の関わりが強く示唆される知見を得た。1FAM20A発現ベクターの作成・タンパクの精製FAM20AおよびCの完全長cDNAをPCR法を用いてクローニングした。FAM20Aのタンパクの精製のため、4種類のタグと、293T細胞へ3種類の発現系を試みた。最終的に数百ugのFAM20AおよびFAM20Cリコンビナントタンパクを高純度(>90%)で精製することができた。2キナーゼ活性の検討そのため、FAM20Aが稀なタンパク、稀な配列を基質にしている可能性を考えた。ノックアウトマウスの研究結果を参考に基質候補分子を絞りタグ付きタンパクで精製した。これらをFAM20Aと反応させ、放射線ラベルしたATPを利用する方法と、リン酸化タンパクとのみ反応して泳動が遅くなるという特徴のPhostag gelを用いた方法でリン酸化を検出しようと試みたが、いずれのタンパク・検出系でもFAM20Cによるリン酸化は認められるものの、FAM20Aによるリン酸化は認められなかった。FAM20Aの機能の解明をすすめるとともに、今後はリコンビナント蛋白を用いた抗体作成し、マーカーとしての利用可能性につき検討を行う予定である。1FAM20A抗体の作成昨年度作成したヒトリコンビナントFAM20A(hrFAM20A)をマウスに免疫し、モノクローナル抗体を作成し、最終的に6種類のハイブリドーマが得られた。各抗体の機能評価を行い、6種類全てが免疫沈降可能で、5種類がサイトスピンしたFAM20A発現細胞を比較的特異的に染色可能、3種類がWestern Blotで使用可能であることが判明した。2ECL法の構築作成した抗体を用いて、ELISAより感度の良いECL法でFAM20Aの測定系の構築を試みた。作成した抗体をビオチン化し、プレートに、未標識FAM20A抗体、ブロッキング試薬、hrFAM20A (スタンダード)もしくはサンプル、ビオチン化FAM20A抗体、ストレプトアビジン-ルテニウム錯体の順に反応させ、特定の2つの抗体を組み合わせることで、血清中で5ng/ml程度の濃度でスパイクしたhrFAM20Aを検出できるECL法を構築することができた。3MRM法の構築FAM20Aの測定法として、質量分析を用いたMRM法も検討した。hrFAM20Aをトリプシン消化して分析し、最も得やすいペプチドシグナルを選択した。次に安定放射性同位体標識した同ペプチドを作成し、それを内部標準として血清由来のFAM20Aを測定した。3ng/ml程度の濃度まで検出できる系を確立した。4臨床サンプルにおけるFAM20Aの測定臨床サンプルにおけるFAM20Aの測定を行った。血清中のFAM20AはELISAとMRM法で測定を試みたが、RAおよび健常人いずれも測定感度以下であった。次にPBMCに含まれるFAM20AのWestern blotによる測定を試みた。RAおよび健常人のPBMCをLysateとし、同じタンパク量を泳動した結果、RA由来のPBMCでより強いFAM20Aのシグナルを得ることができた。これにより、以前のマイクロアレイの研究で示されたFAM20AがRAにおいて高発現であったという結果がタンパクレベルでも検証できた。抗体作成・バイオマーカー利用について進展が認められた。昨年までの成果でFAM20Aのモノクローナル抗体を6種類作成することができた。今年度はまず作成した抗体が組織染色で使用できることを確認するため、20の組織が乗っている組織アレイを購入し、6つ全ての抗体で免疫染色した。その結果、5つの抗体で既報やリアルタイムPCRの結果と一致して、肝臓、腎臓、唾液腺などのFAM20Aが高発現していると思われる組織でよく染色され、良好な結果であった。さらに、特にFAM20Aが発現し働いているとされる副甲状腺の組織を購入し追加で検討したところ、1つの抗体だけで副甲状腺でもよく染色され、この抗体が最も組織染色に適していると考えられた。以上より選択された抗体を用いて、関節リウマチの滑膜組織で蛍光多重免疫染色を行ったところ、滑膜線維芽細胞のゴルジ体部分と思われる核周辺に染色が認められた。浸潤しているリンパ球には明らかな染色像を認めなかった。滑膜線維芽細胞での発現を確認するため、継代して培養した滑膜線維芽細胞を用いてリアルタイムPCRを行なった。

その結果、他のFAM20Aを組織する組織と同程度のシグナルが確認され、さらに、サイトカインの刺激によって発現の上昇も認められた。もともとFAM20A遺伝子の発現は関節リウマチ患者の末梢血中で高いことで発見されたものではあったものの、病変局所の線維芽細胞でも高発現であることが確認された。関節リウマチの病変部では線維芽細胞からのサイトカイン・ケモカインなどのメディエーター放出が炎症を増悪する一要素となっており、またFAM20Aは分泌タンパクを修飾するために必要な補酵素であることから、今まで以上にFAM20Aが病態に関わっている可能性が示唆される結果であった。キナーゼ活性については予想に反した結果であったが、バイオマーカーについては進展が認められてるため。作成した抗体を病変組織における免疫染色等に用いられるか検討し、局所における分布等を解明する。リウマチ・膠原病学28年度が最終年度であるため、記入しない。FAM20Aの機能の解明をすすめるとともに、今後はリコンビナント蛋白を用いた抗体作成し、マーカーとしての利用可能性につき検討を行う予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
多声的な授業を構想する力を育成する テーブルトップ授業シミュレーションの開発と評価

教育実習生が,児童・生徒の多様な態度や考えを踏まえた授業シミュレーションを行えるようにすることを目的に,協調的な参加型授業シミュレーション支援システムを開発した.授業シミュレーションを人形劇で行い,ARマーカー等を活用してその過程を記録した後,記録された人形劇をWebサイトにログインして再生し,相互コメントすることで,授業展開の省察・改善を協同で検討することが可能な学習環境である.このシステムの予備的評価を行った結果,通常のマイクロティーチングでは生じない,多様な子どもの役割演技を引き出すことができることが分かった。本研究では,教師教育において,子どもたちの多様な考え(多声)を引き出しながら探究的に進める「多声的授業」の構想力を育成するために,(a)Tabletop Computingの技術を応用して,机上授業を発展させた参加型授業シミュレーション支援システムを構築し,その効果を検証するとともに,(b) Tabletop上で記録した机上授業と当初授業案をもとに,授業計画の省察・改善を協同で検討する学習環境を開発し,実践的に評価する.TabletopのようなAR技術を活用することで,教育実習生を授業シミュレーションに真摯に没入させ,その過程でよりリアルな「多声」を共有することで,「多声的授業」の構想力を着実に高めることにある.平成24年度は、平成23年度から継続してシステム開発を行い、タンジブル型ロールプレイ支援システムえでゅーすぼーどを開発した。このβバージョンを使った予備実験を行い、評価を行ったところ、参加者が多様な子どもたちの姿を真摯に演技することができており、子どもたちのリアルな姿を再現しやすかったとの評価を得た。また、えでゅーすぼーどに実装した振り返り機能の効果についても、ロールプレイの細かな内容について指摘ができるため、活かしやすいとの評価を得た。この開発物については日本教育工学会第28回全国大会と、国際会議SITE2013で発表した。現在ICCE2013等の会議への投稿を準備している。また、前年度から継続して理論的検討を行ったものをまとめ、国際会議CSCL2013で発表するとともに(採択済みであり、2013年6月発表予定)、日本教育工学会論文誌に論文を投稿して審査中である。本研究では,教師教育において,子どもたちの多様な考え(多声)を引き出しながら探究的に進める「多声的授業」の構想力を育成するために,(a)Tabletop Computingの技術を応用して,机上授業を発展させた参加型授業シミュレーション支援システムを構築し,その効果を検証するとともに,(b) Tabletop上で記録した机上授業と当初授業案をもとに,授業計画の省察・改善を協同で検討する学習環境を開発し,実践的に評価する.TabletopのようなAR技術を活用することで,教育実習生を授業シミュレーションに真摯に没入させ,その過程でよりリアルな「多声」を共有することで,「多声的授業」の構想力を着実に高める.平成23年度は、本システムの予備的検討の為ラピッドプロトタイピングにより、テーブルトップでの机上授業がどのように展開し、それが教育実習生が演じる「声」や振る舞いにどのような影響を与えうるかについて実験的検討を行い、その成果を国際会議CSCL2011や日本教育工学会全国大会において発表し、討論を行った。その上でシステムの使用を作成し、開発を行っているところである。また、平成23年度に実施した授業でベースラインとなり得るデータを取得した。システム開発途中にさまざまな困難が伴った為、開発が途中になっているため。ただし、十分遅れを取り戻せるレベルで進行している。また、ラピッドプロトタイピングによる実験を先行して実施したことから、予想される効果について確認をすることができている。システム開発が途上となっているため、残金についてはその推進に充当する。システム開発をさらに推進するため、技術的助言をいただいている神戸大学の佐々木博史助教(ARやVRによる情報科学的研究を専門とする)との交流を深め、適宜地理的な移動を行いながらシステムを完成させ、すみやかに実験・実践研究に充当できるようにする。システム開発のための謝金、および実験・実践のための機材準備(主にカメラ付きのタブレットPC)、および成果公表の為の費用として充当する。
金属/化合物半導体界面の電気特性及び微細構造に関する研究

本研究は近年当研究室で初めてオーム性が確認された高融点金属間化合物の機能性コンタクト材としての適用性の基礎研究を進める。金属間化合物コンタクト材は低融点の相が形成されないために、GaAs基板への拡散が浅く、耐熱性が優れ、コンタクト材表面は平坦であり、コンタクト抵抗値の低減のみが達成されればVLSIデバイス適用条件をすべて満足する。従って本研究は金属間化合物コンタクト材と半導体界面の電気伝導機構を明らかにし、良質の電気特性を得ることを第一目的とする。平成6年度は、NiGeコンタクト材の接触抵抗の低下を試みた。具体的にはNiGeコンタクト材へ微量の第3元素を添加した。第三元素は以下の見地から選定した。金属と半導体界面近くのGaAs内にGaの空孔を形成し、その空孔にGeが拡散しやすい微量の第三元素であるPd,Pt,Agを選択したこの実験において当初の目的通り、NiGeコンタクト材の高い接触抵抗を(0.8Ωmm)、様々な特性を維持しながら1/10の0.1Ωmmまで低下させることができた。また、X線回析実験、ラザフォード後方散乱実験、高分解能電子顕微鏡観察により界面微細構造に関する情報を得てコンタクト形成機構を明らかにすることができた。これらの結果より、今後のNiGe系金属間化合物コンタクト材の材料設計指針を得ることができた。今後さらに、コンタクト材/半導体界面近傍での微量元素の詳細な解析はさらに進めれば、将来的なデバイスに適用可能な高信頼性コンタクト材が開発されるであろう。
Ti-Al-X3元系金属間化合物の組織制御と高機能化

宇宙航空機や宇宙開発用高温構造材料として注目されているTi-Al-X三元系金属間化合物の機械的性質を左右する高温での相安定性に関する情報を得た.本合金系の高温での耐酸化性は良好ではあるが,表面層の酸化が皆無ではなく,高温X線回折法などにても相構造の決定は非常に困難である.ゆえに,高温からの急冷微細組織に着目して,包晶反応温度近辺で安定であるα相およびβ相の存在領域について検討した.その結果,X=Cr,Moの場合にはβ相の存在領域が高Al濃度側にまで拡大,X=Zr,Oの場合にはその逆の傾向になることが明らかになった.この傾向は上記の第三元素がTiのβ-transusに及ぼす影響,つまり前者および後者がβ-transusを各々下降および上昇させることと強く関連しているように考えられ,高温における三元系の平衡状態の明確化に貢献できる結果および機械的性質を左右する高温組織制御に関する基礎的知見が得られた.相分離過程に関しても特異な結果が得られた.Ti-48at.%Al合金のβ相中に析出したα_2相の微細構造観察において,規則化完了後に格子不変歪としての積層欠陥が導入されていることを確認した.つまり,剪断機構による結晶構造変化において注目される格子対応が非常に短範囲な拡散を通じて生じることに起因して,格子不変剪断変形が生じたものと結論できた.また,Ti-30at.%Al合金については定性的ではあるがβ相からのα_2相の析出に関するCCT図を初めて作成した.冷却速度の増大につれて,(1)β相からα_2相への拡散変態,(2)β相からα相へのmassive変態および(3)β相からα相への無拡散変態とその後のα相のα_2相への規則化(auto-tempering)などが確認できた.以上の変態過程の解明は,微細組織制御に大きく貢献でき,各種物性制御をはじめ,本合金系の高機能化に寄与できるものと確信できる.宇宙航空機や宇宙開発用高温構造材料として注目されているTi-Al-X三元系金属間化合物の機械的性質を左右する高温での相安定性に関する情報を得た.本合金系の高温での耐酸化性は良好ではあるが,表面層の酸化が皆無ではなく,高温X線回折法などにても相構造の決定は非常に困難である.ゆえに,高温からの急冷微細組織に着目して,包晶反応温度近辺で安定であるα相およびβ相の存在領域について検討した.その結果,X=Cr,Moの場合にはβ相の存在領域が高Al濃度側にまで拡大,X=Zr,Oの場合にはその逆の傾向になることが明らかになった.この傾向は上記の第三元素がTiのβ-transusに及ぼす影響,つまり前者および後者がβ-transusを各々下降および上昇させることと強く関連しているように考えられ,高温における三元系の平衡状態の明確化に貢献できる結果および機械的性質を左右する高温組織制御に関する基礎的知見が得られた.相分離過程に関しても特異な結果が得られた.Ti-48at.%Al合金のβ相中に析出したα_2相の微細構造観察において,規則化完了後に格子不変歪としての積層欠陥が導入されていることを確認した.つまり,剪断機構による結晶構造変化において注目される格子対応が非常に短範囲な拡散を通じて生じることに起因して,格子不変剪断変形が生じたものと結論できた.また,Ti-30at.%Al合金については定性的ではあるがβ相からのα_2相の析出に関するCCT図を初めて作成した.冷却速度の増大につれて,(1)β相からα_2相への拡散変態,(2)β相からα相へのmassive変態および(3)β相からα相への無拡散変態とその後のα相のα_2相への規則化(auto-tempering)などが確認できた.以上の変態過程の解明は,微細組織制御に大きく貢献でき,各種物性制御をはじめ,本合金系の高機能化に寄与できるものと確信できる.
フランチャイズ型の農業経営における人材育成システムの成立条件の解明

本課題では、新規就農者などへの経営実態調査から、フランチャイズ型の農業経営における人材育成システムの特徴を分析した。その結果、第一に、新規就農者の特徴として、生産への特化を図ることで、早期に技術を習得していること、第二に、農業法人側では、新規就農者の育成により、グループ全体の生産体制の強化、販売量の拡大につながっていること、第三に、新規就農者の技術習得、経営資源の獲得に対してネットワークによる支援を継続的に行うことで、新規就農者の経営確立につながっていることなどを明らかにした。当該年度では、青年就農給付金などの就農政策の変化が、フランチャイズ型就農などの新規就農に与える影響について分析した。青年就農給付金を受給している新規就農者の実態調査結果から、青年就農給付金による年間150万円の給付金が、参入初期の経営安定に一定の貢献をしていることが明らかになった。しかし、青年就農給付金制度においては前年度の所得が250万円以上になると給付停止となることから、通常の新規参入に比べて、経営定着までの期間が短いフランチャイズ型就農の場合、給付対象外となる場合が多い。そのため、フランチャイズ型就農の場合、青年就農給付金の効果が限定的になることが示唆された。さらに、フランチャイズ型就農方式による新規就農者の育成を図っている施設園芸経営の実態調査を行い、人材育成状況について分析した。その結果、研修段階から経営者意識を高め、計数管理を徹底させることが重要になること、新規就農者に圃場を提供し、分社化させることで、経営者能力の向上を促していることが明らかになった。また、新規参入後の経営確立の際には、農業技術の習得、経営管理能力の向上などが重要になるため、新規就農者向けの経営管理チェックシートを作成し、新規参入者の経営管理の達成度を把握した。その結果、収量が低い新規参入者においては、栽培管理における判断・実行段階についての評価が低い傾向がみられ、人材育成にあたっては、農業知識の習得に留まらず、営農時の判断能力の向上などを促すことが重要であることが示された。当該年度はフランチャイズ型の農業経営において、新規参入した経営の実態分析から人材育成システムの特徴を分析した。新規参入者を対象としたヒアリング調査から、新規参入者の参入費用などを把握するとともに、経営を確立するまでの農地、住宅の確保、農業技術の習得状況、資金の確保状況を把握した。さらに、経営を確立している新規参入者を中心として、参入後の経営面積、農産物販売金額の推移などを把握し、従来の新規参入経営との比較分析を行った。その結果、フランチャイズ型経営においては、初期の参入費用が少ないだけではなく、研修制度の利用、農地の斡旋などによって、スムーズに経営を開始しており、参入障壁の軽減に大きな効果があることが示された。さらに、新規参入後の経営確立にむけては、参入障壁の軽減だけではなく、販売チャネルの確立、優良農地の確保・集積、技術情報の提供等、経営確立までの期間を支える仕組みをつくりあげることが必要になることを示し、これらの経営確立に向けた課題への対応策について分析した。その結果、フランチャイズ型経営の場合は、組織内のネットワーク、及び本部を中心とした販売機能の集約化などの役割分担を図ることで、短期間での新規参入者の経営確立が可能になっていることを示した。これらの結果は、従来の新規参入と異なるフランチャイズ型就農の特徴になっており、参入障壁の軽減だけではなく、参入後の経営展開に多大な影響を及ぼしていることを明らかにした。本研究の課題は、フランチャイズ型の農業経営による人材育成システムの成立条件について明らかにすることであり、当該年度は、農業法人を通じた独立就農者の就農後の経営展開について、参入後の経営面積、農産物販売金額の推移などを把握し、経営確立の要因を分析した。その結果、経営確立の要因として、生産への特化、独立就農者の技術水準の高さ、ネットワークによるつながり、農地の拡大・集積の早さが示された。一方、課題としては独立就農者間での経営内容のばらつき、雇用管理の問題、農村社会への適応の問題が示された。さらに、農業法人を通じた人材育成システムの成立条件について、農業法人側、独立就農者側からのメリット、デメリットを整理した。その結果、農業法人側のメリットとしては、グループ全体の生産体制の強化、販売量の拡大、仲間づくりなどがあげられ、一方、デメリットとしては、就農者の育成、指導に対するコストの発生が指摘される。また、独立就農者側から整理すると、メリットは技術の早期習得、生産部門への特化、経営資源の獲得に対する支援などがあり、一方、デメリットとしては、販売面での制約、支援する農業法人側の経営業績の影響などが明らかとなった。農業法人を通じた人材育成システムの成立には、農業法人、独立就農者の双方にとってメリットがデメリットを上回る関係を整備することが求められ、新規就農支援を継続している法人においてはメリットを高め、デメリットを軽減する仕組みを形成していることが明らかとなった。農業経済研究の目的は、新規参入者の確保方策として、フランチャイズ型就農などについて分析し、人材育成システムの成立条件について解明することにある。

当該年度は、2012年から開始された青年就農給付金制度が新規就農に及ぼす影響について分析を行うとともに、フランチャイズ型就農の実態調査と、新規参入者の経営管理の達成度調査を行うことで人材育成の状況について考察した。新規参入者の人材育成の課題を明らかにするなど、研究はおおむね順調に進展しているとすることができる。本研究の目的の一つには、新規参入者の確保方策として、フランチャイズ型の農業経営における人材育成機能に着目し、フランチャイズ型の農業経営による人材育成システムが、新規参入者の定着に及ぼす効果について示すことにある。24年度は、フランチャイズ型農業経営の実態調査などをもとにこれらの課題に取り組み、従来の代表的な新規参入と比較することで、人材育成システムの特徴について明らかにした。そのため、研究はおおむね順調に進展しているとすることができる。今後はこれまでの実態調査、及び追加調査をもとにフランチャイズ型農業経営における人材育成システムの課題を整理する。さらに、関係機関への調査から、人材育成に向けた地域的な支援策について考察する。これらの結果及び、研究期間内の成果をもとに、フランチャイズ型就農を含めた新規参入者の人材育成システムの成立条件についてとりまとめる。今年度は、フランチャイズ型就農の調査から、新規参入者の参入後の経営展開への影響を分析する。具体的には、新規参入者のキャリア形成に関する調査を中心に行い、新規参入者の資源獲得の状況、2技能の形成状況などについて把握する。さらに、平成24年度から始まった青年就農給付金制度が新規就農に与える影響に関して考察する。調査候補地が大雪被害の影響などによって調査が難しくなったこと、さらに物品費について効率的な利用につとめた結果、次年度使用額が生じた。本研究課題の推進のため、次年度の研究費は、交付申請時の計画通り使用する。なお、次年度使用額399,816円は、研究費を効率的に使用して発生した残額であり、次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。なお、次年度使用額174,348円は、研究費を効率的に使用して発生した残額であり、次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。
ガムラン・バラガンジュールの表演特性に基づくアジア伝統音楽の教材開発

1研究目的本研究は、小学校音楽科におけるアジア伝統音楽の指導について、インドネシア・バリ、島に伝わる行列形態の打楽器合奏「ガムラン・バラガンジュールgamelan balaganjur」の表演特性に基づく教材開発を試み、児童の音楽行為を省察することを通して、この教材がもつ教材価値を明らかにする教育実践研究である。2研究方法バラガンジュールの表演は、演奏者同士のコミュニケーションを基盤に行われる。演奏が行われる状況の中で、演奏者同士が繰り広げる臨機応変な音楽行為を省察することで、教材としてのバラガンジュールの価値を分析するとともに、小学校音楽科授業における実践の可能性を探る。3研究成果(1)バラガンジュールの音楽構造が、「ギラッgilak」と呼ばれる基本旋律の繰り返しで構成されるため、小学校の児童でも個別の技能差に関わらず比較的容易に演奏に取り組めること。(2)演奏者同士が独自の合図を共有し、場の状況に応じて太鼓奏者が出す即興的な合図をきっかけに、一時停止、身体的パフォーマンスの挿入等、多様な表演ができること。(3)演奏者が特定の楽器に固定されず、一旦全てのパートを口頭伝承で習得するため、個々の奏者が常に音楽の全体像を把握して演奏でき、状況の変化に瞬時に対応することが可能であること。
血管病の観点から行うステロイド性骨壊死の病態解明

大腿骨頭壊死症における圧潰のメカニズムを病理学的に検討した結果、圧潰は分界部外側端を起点として発生することが考えられた。圧潰領域については壊死域の大きさが影響を与える因子の一つであることが示唆された。また、骨壊死の修復過程をSPECT/CT融合画像を用いて評価したところ、圧潰前の極めて早期より壊死層周辺にはテクネチウムリン酸化合物の集積が見られ、ステージの進行とともに増強していることがわかった。集積の部位については、骨頭圧潰前後では骨頭外側に最も強い集積を認める傾向にあった。ステロイド性骨壊死家兎モデルにおいて、骨壊死発生個体と非発生個体における血管内皮前駆細胞の経時的変化を解析することを目的に、血管内皮細胞表面に発現されている細胞表面マーカーCD34に対する抗体を用いてフローサイトメトリーにより家兎全血中のCD34陽性細胞数の測定を試みた。結果、本実験ではCD34陽性細胞は実験に用いたどの家兎からも検出されず測定できなかった。CD34陽性細胞は、人全血中だけでなく、家兎全血中においても検出されると報告されているが、人と兎の持つ抗原性は様々な組織で異なることも多い。今後は、抗体を変え、また、全血中のみではなく、骨髄液中の検討も加える予定としている。ステロイド性骨壊死のもっとも多い基礎疾患である全身性エリテマトーデス(SLE)症例における大腿骨頭前方回転骨切り術の20年以上の長期経過を調査した。手術時年齢を20-40歳に限定した本調査では、25年関節温存率は73%であった。注目すべきは、7割以上の若年者が人工関節置換術を回避できただけではなく、これらの関節温存患者のなかには健常日本人と変わらないQOLを獲得・維持している患者も複数認められたことである。本調査結果は、人工関節一辺倒の欧米型股関節外科のあり方に警鐘を鳴らす上でも意義のある研究であり、SLE研究の代表的な英文誌であるLupusに掲載が決定された。本調査結果は、人工関節一辺倒の欧米型股関節外科のあり方に警鐘を鳴らす上でも意義のある研究であり、SLE研究の代表的な英文誌であるLupusに掲載された。また、大腿骨頭壊死症の発症における重要なステップである骨頭圧潰に関しては、そのメカニズムや病態は未だに不明である。今回、手術時の摘出骨頭標本を用いて、圧潰は骨頭のどの部位を起点として発生するのか、及び、圧潰部位は壊死領域の大きさと関連があるか、を検討した。Stage 3Aまたは3BのIONの初回手術時に切除された、連続した30骨頭(25患者)を対象とした。骨頭中央の切片において、壊死領域の内側端が大腿骨頭窩を超える群と超えない群とに分け、圧潰部位の違いの有無を検討した。30骨頭すべてにおいて、圧潰は壊死領域の外側端を起点として発生していた。壊死領域の内側端が大腿骨頭窩を超えない場合、19骨頭中18骨頭(94.7%)において軟骨下領域に圧潰を認めた。これに対し、壊死領域の内側端が大腿骨頭窩を超える場合、軟骨下領域に圧潰を認めたのは11骨頭中4骨頭(36.4%)であった。本結果は、骨頭圧潰のメカニズムを解明する上で重要な見解であり、整形外科の代表的な臨床系雑誌であるJournal of Bone and Joint Surgery Brに掲載された。大腿骨頭壊死症において、骨壊死巣に対する修復反応が骨頭圧潰などの病態に大きく関与しているが、未だ不明のままである。今回我々は、大腿骨頭壊死症における壊死層周辺の修復反応について、骨SPECT/CT融合画像を用いて評価する試みを行った。骨壊死発生初期であるStage 1において、CT像において壊死層周辺に部分的な骨硬化像を認め、tracer uptakeはnormal, low, moderateと様々なものであった。骨頭圧潰前であるStage 2では、CT像において壊死層周辺にはっきりとした帯状硬化像を認め、tracer uptakeは全例で帯状硬化像に一致する一様なmoderate uptake像を認めた。圧潰後早期であるStage 3Aでは、tracer uptakeは多くの症例で部分的にhigh uptakeを示しており、圧潰の起点を画像的にとらえられる可能性が示唆された。

骨SPECT/CT融合画像は大腿骨頭壊死症のそれぞれの病期において壊死層周辺の生体反応を明瞭に示しており、壊死層周辺の部位によりtracer uptakeの程度は異なっていることから、骨頭圧潰の病態解明に有用なツールであることが示唆された。本研究内容を世界的な放射線学会であるRadiological Society of NorthAmericaに投稿中である。また、臼蓋形成不全を合併する大腿骨頭壊死症に対する治療法として、臼蓋形成術を併用した大腿骨頭前方回転骨切り術について、その中期成績を調査した。平均観察期間7.5年の間、人工股関節への移行例はなく、全例において骨頭圧潰の進行は認めなかった。本結果より、大腿骨頭壊死症に対する大腿骨頭回転骨切り術において、臼蓋形成不全を伴う症例では、臼蓋形成術の併用は有用なオプションである可能性が示唆され、整形外科の英文誌であるJournal of Orthopaedic Scienceに掲載が決定された。大腿骨頭壊死症では、骨壊死発生後すみやかに周囲健常組織からの修復がはじまると考えられており、修復過程が骨頭圧潰などの病期進行に重要な役割を担っていることが推測されているが、その詳細は未だ不明である。これまで我々は、早期修復過程を評価する目的に、骨シンチグラフィ時に撮像されるSingle-photon emission computed tomography with computed tomography (SPECT/CT)の融合画像を用いて、骨芽細胞活性の動向を視覚的に評価してきた。しかしながら、視覚的評価であったため、骨頭内のどの部位で活性が強いのか、あるいは、個体間での違いについての定量的な評価ができていなかった。そこで我々は、融合画像においてカウント値を測定することによりtracer uptakeを定量的に評価する試みを行った。結果、Stage 1では骨頭前方にuptakeが最大となる傾向にあったのに対して、Stage 2および3Aでは骨頭外方にuptakeが最大となる傾向を認めた。また、uptakeの程度については、Stage 1に比してStage 2および3Aで統計学的有意差を持ってuptakeの程度が強いことが示唆された。本結果は、骨頭外側における、添加骨形成を伴う肥厚骨梁と壊死骨梁間での力学的ストレスが同部位での骨折をきたし骨頭圧潰を導く、という我々の仮説(J Bone Joint Surg Br. 2011)をサポートするものであり、修復過程と骨頭圧潰との関連における重要な知見であると考えている。本研究内容は、骨壊死の国際シンポジウムである第17回Association Research Circulation Osseous (ARCO)で発表した。研究計画に類似する論文が他方からpublishされたこともあり、当初の計画通りには進んでいないが、大腿骨頭壊死の病態解明という点では幅広く研究を進めており、交付を受けたH21年度以降4本の英文論文をfirst authorでpublishしてきた。以上より(2)と評価した。24年度が最終年度であるため、記入しない。すでに他方より類似する論文がpublishされたことから、変更を余儀なくされている。血管病の観点から行うステロイド性骨壊死の病態解明、という点で、現在SPECT/CTを用いて骨壊死周辺の修復過程を評価する試みを行っており、有用な結果が得られている。今後症例数を増やして英文論文を作成し、投稿する予定である。