hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニホンカモシカの新しいモニタリング手法の開発―糞DNAに基づく個体識別法―

本研究では、同所的に生息するカモシカとニホンジカの糞DNAを用いて、種や性判別、個体識別法の確立を行なった。はじめに組織サンプルを用いてカモシカでは14、ニホンジカでは10のマイクロサテライトマーカを選定した。つづいて徳島県つるぎ町で194の糞を収集し糞DNAの解析を行なった結果、カモシカでは35サンプル、ニホンジカでは30サンプルについて種を決定した。個体識別の結果、カモシカでは14個体(雄7個体、雌7個体)、ニホンジカでは19個体(雄11個体、雌8個体)を特定することができた。本研究で開発した個体識別法は、野外でも応用することができ今後の精度の高いモニタリングの発展が期待される。本研究では、カモシカの糞DNAを用いた個体識別法および個体数推定法の確立を目指す。糞DNAを用いたマイクロサテライトの解析では、PCRの成功率が低いため、DNAの保存状態がよい糞のサンプリングが必要である。そこで本研究では、DNAの保存性が高い糞の指標を決めるために、糞の状態を4つのランク、Aかなり新しい(ヌメリがある)、B比較的新しい(ヌメリはないがテカリがある)、Cやや古い(乾燥しているが分解はしていない)、D古い(分解している)、の4つのカテゴリーに分けた。徳島県つるぎ町でカモシカ127の糞サンプルを採集し、各カテゴリーにおけるPCR成功率を算出した。その結果、PCRの成功率は、A95.0%、B26.1%、C2.9%、D0%であり、ヌメリのある新しい糞が最もPCRの成功率が高く、ヌメリのある糞塊をサンプリングの対象にする必要性を明らかにした。一方、徳島県および高知県で収集した滅失19個体および徳島県つるぎ町でサンプリングした糞21サンプルについて、個体識別するために、対立遺伝子型が多い、PCRの成功率が高い、PIDが低い、波形の判読のしやすい、という条件にあうマーカーの選定を行った。また、雌雄判別では蛍光色素を添加したSE47とSE58プライマーを用いてアメロゲニン遺伝子領域の増幅を行い、糞サンプルについて雌雄判別を行った。解析の結果、23のうち8マイクロサテライトマーカを選定した。また、性判別では21のうち20の糞サンプルについて性判別ができ、かなり高い割合で性を判別することができた。本研究では、カモシカの糞DNAを用いた個体数推定法の確立に向けて個体識別法の確立を目指す。該当年度は、カモシカの組織サンプルの解析により選定された11のマイクロサテライトマーカと性決定マーカーを用いて、徳島県つるぎ町で収集したカモシカの糞塊のDNA解析を行なった。収集した194糞塊のうち、PCRの成功率が高かったランクA(ヌメリのある糞塊)の15サンプル、ランクB(ヌメリはないがテカリのある糞塊)の12サンプル、計27サンプルを対象に解析を行なった。Allelic DropoutはランクAでは0.000から0.167、ランクBでは0.000から0.323であり、有為差は見られなかった。また、False AlleleはランクAとBは0.000であった。ランクAの15サンプルのうち全サンプル、またランクBの12のうち9サンプル、計24サンプルについてマイクロサテライト遺伝子座を決定することができた。解析の結果、24サンプルから14個体が識別でき(10サンプルは同一個体であった)、7個体は雄、7個体は雌であることが判明した。COLONYにより推定した血縁関係では、full-sibは6個体を検出することできたがhalf-sibを見つけることができなかった。また、該当年度は四国東部周辺のカモシカの糞塊の収集を行なったが、カモシカの個体数減少や分布域の変化により多くの糞サンプルを収集することができなかった。今後も継続して四国東部において糞サンプルを収集し、DNA解析を行なう予定である。個体識別法の確立はおおむね終わっており順調であるが、広範囲でのカモシカの糞の収集が遅れている。その理由として、カモシカの分布域が縮小しており糞塊を収集が難しいこと、通常調査員では新糞を識別することは難しいこと、新糞を収集するためには何度も調査地に訪れないといけないこと、などがあげられる。偶蹄類の密度推定には、一定面積に出現した糞塊(糞粒)数を数える「糞塊法(糞粒法)」が用いられているが、2種以上の偶蹄類が同所的に生息する場合、糞塊の誤同定により、密度推定に過大・過小評価を引き起こすことが知られている。日本には、カモシカとニホンジカの2種の偶蹄類が生息しており、2種が同所的に生息する地域では、ニホンジカの糞塊の区別が難しく、精度の低さがかねてより指摘されてきた。これまで、申請者は、糞塊の誤同定の問題を解決するために、糞DNAに着目し、PCR-RFLPs法を用いた2種の種判定法を確立させてきたが、糞塊法や糞DNAに基づく種判定法のみでは、生息密度と生息頭数を推定する以上のデータを得ることができない。そのため、本研究では、より精度の高いマイクロサテライトを用いた個体識別法の確立を目指した。研究の方法として、まずカモシカとニホンジカの組織サンプルを用いて19のマイクロサテライトのスクリーニングを行ない、カモシカでは14、ニホンジカでは10のマイクロサテライトを選定した。次に、カモシカとニホンジカが同所的に生息する徳島県つるぎ町において、広範囲での糞サンプルの収集を行いDNAを抽出した。

194の糞DNAについてマイクロサテライトを用いた解析の結果、カモシカでは35サンプル、ニホンジカでは30サンプルにおいて遺伝子型を決定することができた。解析の結果、カモシカでは14個体(雄7個体、雌7個体)、ニホンジカでは19個体(雄11個体、雌8個体)を特定でき、本研究で開発した個体識別法は野外でも応用できることを実証した。本研究では、同所的に生息するカモシカとニホンジカの糞DNAを用いて、種や性判別、個体識別法の確立を行なった。はじめに組織サンプルを用いてカモシカでは14、ニホンジカでは10のマイクロサテライトマーカを選定した。つづいて徳島県つるぎ町で194の糞を収集し糞DNAの解析を行なった結果、カモシカでは35サンプル、ニホンジカでは30サンプルについて種を決定した。個体識別の結果、カモシカでは14個体(雄7個体、雌7個体)、ニホンジカでは19個体(雄11個体、雌8個体)を特定することができた。本研究で開発した個体識別法は、野外でも応用することができ今後の精度の高いモニタリングの発展が期待される。調査地での糞のサンプリング、糞DNAを用いた個体識別、性判別の手法が確立でき、当初の目的に達している。申請書では、平成26年度に個体識別法の確立、平成27・28年度は個体数推定法の確立を予定していたが、個体識別法の確立に平成27年度までかかったこと、広域での糞塊の収集が終えていないことより個体数推定法の確立は厳しいことが予想される。平成28年度は、通常調査員の調査の導入策の再検討と平成27年度に行なう予定であったカモシカの分集団の構造の解析を行なう。また、同所的に生息するニホンジカはカモシカの糞の誤判定の問題を引き起こすだけでなく、2種の個体群動態は互いに影響を及ぼしあっていることが予想されるため、ニホンジカについてもカモシカと同様に糞DNAに基づく個体識別法を確立する必要がある。平成28年度はニホンジカの個体識別法の確立を追加する。生態・環境今後は、選定したマイクロサテライトマーカーを用いて徳島県つるぎ町剪宇地区に生息するカモシカの個体識別および生息頭数を推定する。また、調査対象地をカモシカが生息する四国東部に広げ、調査地の設定と糞サンプリングを行う。試薬が安く入ったため次年度使用額が生じた理由として、研究成果が学会発表の水準にまで達しなかったため、学会への出張を行わなかったことがあげられる。試薬として利用する次年度の使用計画としては学会への参加のための旅費に使用することを計画している。
胃液および粘膜内ヘリコバクターピロリの定量的測定法の確立と各種消化器疾患との関連

ヘリコバクター・ピロリ(Hp)のconpefitiuePCR法(c-PCR)を応用した定量的検出法を開発し、その有用性を検討した.Hpのウレアーゼの構造遺伝子のうち132bp部分を増幅するprimerによって増幅される66bpのDNA(compefifor)を合成し、c-PCR施行時の定量の基準とした.胃粘液中および胃粘膜組織よりDNAを抽出し、その中のHpのDNAをc-PCRによって定量化してHpの定量的検出に成功した.粘液中、粘膜中のHpの菌量が多いほど培養、ウレアーゼテスト、組織検鏡でのHpの陽性率は増加した。また胃粘液中のHp数と^<13>C尿素呼気試験の結果は有意に相関した.さらに本c-PCRは従来のPCR法によるHp検出に起り得る偽陽性偽陰性を避けることでき,有用性の高い検査法と考えられた.消化性潰瘍患者において、Hpの除菌治療を行い、菌量の推移を本法で検討し、また他の方法と比較した.その結果、プロトンポンプ阻害剤単独では、一時的に培養法、ウレアーゼテストの陽性率が低下し、胃液中のアンモニア濃度も低下するが、c-PCRでは菌が陰性化したものはなく、治療中止3ヶ月後には培養法なども再び元の陽性率に上昇した。すなわち、プロトンポンプ阻害剤ではHpのウレアーゼ活性は低下させうるが、除菌は不可能であることが明らかとなった.Hpの胃間分布は、体部胃潰瘍では胃体部粘膜および潰瘍周囲に菌量が多いのに対し、前庭部および胃通部潰瘍では、Hpは前庭部に多く感染していた。このことから潰瘍の部位とHpの感染範囲に関連性のあることが明らかとなった.血清ペプシノーゲンI/II比はHpの除菌によって変化することが知られているが、その変化率を検討することによってHp除菌の判定が良動な感度特異度で行いえることを明らかにした.今回のc-PCR法は、Hpc胃・十二指腸疾患との関連を検討する上で有力な方法を考えられた.ヘリコバクター・ピロリ(Hp)のconpefitiuePCR法(c-PCR)を応用した定量的検出法を開発し、その有用性を検討した.Hpのウレアーゼの構造遺伝子のうち132bp部分を増幅するprimerによって増幅される66bpのDNA(compefifor)を合成し、c-PCR施行時の定量の基準とした.胃粘液中および胃粘膜組織よりDNAを抽出し、その中のHpのDNAをc-PCRによって定量化してHpの定量的検出に成功した.粘液中、粘膜中のHpの菌量が多いほど培養、ウレアーゼテスト、組織検鏡でのHpの陽性率は増加した。このことから潰瘍の部位とHpの感染範囲に関連性のあることが明らかとなった.血清ペプシノーゲンI/II比はHpの除菌によって変化することが知られているが、その変化率を検討することによってHp除菌の判定が良動な感度特異度で行いえることを明らかにした.今回のc-PCR法は、Hpc胃・十二指腸疾患との関連を検討する上で有力な方法を考えられた.competitive PCR法を応用し、異粘液内、及び胃粘膜中のHelicobacter pylori (H.pylori)を定量的に検出する方法を確立した。同時に胃液のpH、アンモニア、及び尿素濃度を測定し、またウレアーゼテストとH.pyloriの培養を行った。胃粘膜内のH.pyloriの定量法によって胃潰瘍、十二指腸潰瘍ではH.pyloriの異内分布が異なり両疾患の病態の違いにH.pyloriの異内分布の違いが関与している可能性が示唆された。また、H.pyloriの除菌を併用した潰瘍治療を行い、上述の検査に加え、血清pepsinogen、及びgastrinの変化を検討した。プロトンポンプインヒビターの一つであるlansoprazoleには、常用量ではH.pyloriのウレアーゼ活性を抑制するものの、H.pyloriの除菌はできないことが明らかになった。lansoprazoleにAMPCを併用すると6070%の症例でH.pyloriの除菌が見られ、残りの症例でもほとんどでH.pyloriの菌数の低下が見られることがわかった。

H.pyloriが除菌された症例では血清pepsinogen IIは有意に低下し、pepsinogenI/IIは有意に増加し、その変化率を検討するとそれは除菌の指標の一つになりうることが明らかになった。また、胃液のpHの検討では、胃潰瘍症例ではH.pyloriが除菌されると胃液酸度が低酸状態から正酸に回復することが明らかになった。今後は、胃粘膜中のプロトンポンプ、ソマトスタチン、ガストリンのmRNAの検討をH.pyloriの除菌前後で行い、H.pylori感染の特に胃酸分泌に関わる影響について検討する予定である。また、内視鏡検査後のAGMLの発症にH.pylori感染の可能性があることにより、内視鏡検査後のファイバースコープの洗浄方法と遺残菌数についても検討中である。ヘリコバクター・ピロリ(以下Hp)のcompetitive PCR法(以下c-PCR法)を応用した定量的検出方法を開発し、その有用性を検討した。Hpのウレアーゼの構造遺伝子のうち132bp部分を増幅するprimerによって増幅される66bpのDNA(competitor)を合成し、c-PCR施行時の定量の基準とした。そして、胃粘液中および胃粘膜組織よりDNAを抽出し、その中のHpのDNAをc-PCRによって定量化する事によりHpの定量的検出に成功した。胃粘液中、及び胃粘膜組織中のHpの菌量が多いほど培養、ウレアーゼテスト、組織鏡検でのHpの陽性率は増加する事が明らかになり、さらに、胃粘液中のHp数と^<13>C尿素呼気試験の結果は有意に相関した。さらに、検討する事により、本c-PCR法によるHpの定量的検出法は、従来のPCR法によるHpの検出の際の偽陰性・偽陽性を軽減でき、きわめて有用度の高い検査法であることが明らかになった。消化性潰瘍患者において、Hpの除菌治療を行い、菌量の推移を本方法で検討し、他の検査方法と比較した。そして、プロトンポンプインヒビター単剤では、一時的に培養、ウレアーゼテストの陽性率を低下させ、胃液中のアンモニア濃度を低下しえても、胃粘液中に相当数のHpが存在しており、菌量に有意な減少が認められないことが明らかになった。すなわち、プロトンポンプインヒビターではHpのウレアーゼ活性は低下させうるが、除菌は不可能であるということが明らかになった。また、Hpの胃内分布は、体部胃潰瘍では潰瘍周囲及び胃体部にHpの菌量が多いのに対し、前庭部潰瘍や胃角部潰瘍ではHpは前庭部に多く感染していることが明らかになり、潰瘍の部位とHpの感染範囲に関連性のあることが明らかになった。また、血清pepsinogen I/II比がHpの除菌によって変化することが知られているが、その変化率を検討することによって、Hpの除菌診断が内視鏡検査を使用せずに行えるようになった。今後は、本c-PCR法による正しいHpの存在診断のもとに、Hpと胃十二指腸疾患との関連をより明らかにしていく。
有限群のモジュラー表現とコホモロジー理論

係数体が正標数である有限群のモジュラー表現において、有限生成KG-加群Mに対するコホモロジー環Ext^*_<KG>(M,M)の極大イデアルに関する以下の結果を得た(Kは係数体、Gは有限群)。1は自明な加群Kに対するコホモロジー環の極大イデアルに関する性質を一般化させたもので、既に庭崎により証明されているCarlsonの予想を更に拡張した命題である。本研究ではCarlsonの予想の証明と同様の方法で証明した。2はPI環の理論を用いたCarlsonの研究により、単純加群の有限次元性だけが知られていた命題である。本研究では以下の様な圈論的な手法を用いることにより、2の形に一般化させて証明した。即ちExtを圈論的に関手として捉らえ、GreenがHom関手について用いた方法を拡張し、関手Extのイデアル部分関手やJacobson根基を定義・記述し、1の結果からcyclic shifted部分群を経由させて2の証明を得た。またスペクトル系列を用いない幾つかの手法を一般化させることも試みた。特にRinehartにより存在だけが抽象的に証明されている、群の拡大に対するコホモロジーの間の或る種の長い完全系列をスペクトル系列を用いずに具体的に叙述し直そうとしているが、現在のところまだ有効な結果には達していない。
統合失調症患者の言語機能に関する精神生理学的研究-統語機能の検討

【方法・対象】統合失調症の統語機能について検討する目的で,かき混ぜ文を処理中の事象関連電位(ERP)を測定し,健常対照群と比較を行った。対象は,統合失調症患者群11名,健常対照群18名である。以下のようなかき混ぜ文(標準語順文,短距離移動文,長距離移動文)をそれぞれ80文作成し,1句毎に提示時間400ms,刺激間間隔900msで連続的に視覚提示した。各文提示後に,名詞句と動詞からなる短文を提示し,正否についてボタン押し反応を求めた。長距離移動文のフィラーに相当する直接目的格とギャップ前の間接目的格の間に出現する持続性陰性電位,および各名詞句および動詞句に対するERPについて検討した。a)校庭で女の子が男の子に水をかけた。(標準語順文)男の子にかけた○b)校庭で女の子が水を男の子にかけた。(短距離移動文)男の子がかけた×c)校庭で水を女の子が男の子にかけた。(長距離移動文)女の子をかけた×【結果】統合失調症患者群は健常対照群に比して,短距離移動文における主格,短距離・長距離移動文における直接目的格と動詞の組み合わせに関する正誤判断成績が低下していた。また,統合失調症患者群では健常対照群と比較して,長距離移動文-標準語順文の差波形における持続性陰性電位が顕著であり,ギャップ直前の句に対するP600が不明瞭であった。【考察】統合失調症患者は,言語作業記憶機能の低下により,フィラーの記憶保持に要するコストが高いことが示された。また,フィラーのギャップへの挿入を含めた文構造の統合機能に障害があることが示唆された。今回は追加内定が決定したのが10月であったため,その時点から準備を開始した。今年度に行った活動は以下の通りである。(1)以下のようなかき混ぜ文(移動なし,中距離移動,長距離移動)をそれぞれ60文とfiller文を60文,作成した。さらに,移動を伴う非言語課題として以下の数字と記号の符号照合課題を作成した。(かき混ぜ文):記者は閣僚が有識者を招いたと報道した。(移動なし)記者は有識者を閣僚が招いたと報道した。(中距離移動)有識者を記者は閣僚が招いたと報道した。(長距離移動)(filler文)学生が研究会で意見を積極的に述べた。(移動を伴う非言語課題):123 ○△×123○△×正誤反応?(移動なし)123△○×231○×△正誤反応?(移動あり)(2)これらの課題について,健常者を用いて,遂行成績が8090%になるよう,呈示時間,刺激間間隔を調節,検討しているところである。事象関連電位測定のための脳波計測時間の制限があるため,遂行成績の改善が十分でなければ,四句からなるかき混ぜ文を用いる可能性も検討している。(3)上記と関連して,事象関連電位計測用のソフトウェアのプログラム作成を行い,第一句の呈示にあわせてトリガーを出力し,4秒間脳波が取り込めることが明らかになった。対象は,統合失調症患者11名(平均年齢33.1±6.7歳,男性4名,女性7名),健常対照群20名(平均年齢33.5±8.7歳,男性9名,女性11名)である。以下のようなかき混ぜ文(移動なし,中距離移動,長距離移動)をそれぞれ80文作成し,1句毎に提示時間450ms,刺激間間隔450msで連続的に視覚提示した。

各文提示後に,名詞句と動詞からなる短文を提示し,正否についてボタン押し反応を求めた(正否の比率は1:1)。ERPは頭皮上64部位から導出し,反原応試行について,1句毎に刺激前100msの平均電位をベースラインとして,波形を求めた。Fillerに相当する「を」,gap前の「に」に対する,中・長距離移動文と移動なし文に対するERPを各群毎に比較を行った。a)校庭で女の子が男の子に水をかけた。(移動なし)男の子にかけた○b)校庭で女の子が水を男の子に_かけた。(中距離移動)男の子がかけた×c)校庭で水を女の子が男の子に_かけた。(長距離移動)女の子をかけた×【結果】ERPについては,以下の結果が得られた。【考察】gap前におけるP600振幅が健常者では移動距離に照応して認められたのに対して,患者群では移動文に対するP600振幅の増大が認められず,文構造の統合に障害があることが示唆された。
RNAスプライシング因子に依存した抗体遺伝子高頻度突然変異の新規な制御機構の解明

本研究では、抗体遺伝子への高頻度突然変異へのスプライシング因子SRSF1-3の寄与を分析するための実験系を構築し、その分子機構を解析した。アイソフォームであるSRSF1とSRSF1-3の違いがC末領域だけにもかかわらず、SRSF1-3のSHMにおける機能発現にC末領域が必ずしも必要でないことが明らかになった。さらに、SRSF1-3がAIDの核外排出を制御することがSHMにおける役割の一つであることが明らかになった。変異能力を有し、かつSRSF1-3を発現するB細胞株を用いて、SRSF1-3の機能をgain of function解析、loss of function解析できる実験系を構築することを試みた。これまでに樹立したAIDの発現をON/OFFできるニワトリB細胞株DT40-SWにおいてSRSF1-3をノックアウトした細胞株を樹立した。また、DT40細胞を用いて見いだしたSRSF1-3の機能の一般性を示すために、自発的に抗体遺伝子への変異を起こすヒトB細胞リンパ腫細胞株RamosにおいてSRSF1-3遺伝子をノックアウトした。Ramos細胞は相同組換えを高頻度に起こさないが、RNAiでは効果的にSRSF1-3をノックダウンできなかったため、CRISPR/Casを用いたゲノム編集を用いてSRSF1-3遺伝子をノックアウトした。一方、マウスB細胞株CH12F3-2Aは、SRSF1-3を発現しておらず変異を起こさないが、AID発現が誘導される刺激条件でSRSF1-3を強制発現させることにより変異を誘導できることを見いだし、この細胞株においてもSRSF1-3のノックアウトを現在試みている。今後は、これらの細胞株に各種変異SRSF1-3を導入してSRSF1-3の機能部位を同定する。抗体の抗原に対する高親和性は、抗体遺伝子上に起こる体細胞高頻度突然変異(SHM)によって向上する。本研究では、RNAスプライシング因子SRSF1のアイソフォーム(SRSF1-3)がSHMに関与する分子機構を明らかにする。SHMの鍵因子であるAID、およびSRSF1-3を、それぞれ、GFP、mCherryとの融合タンパクとして発現させるためのベクターを作製し、マウス線維芽細胞NIH3T3へ導入し、一過性発現系での各因子の局在性の関係について検討した。AIDは核で作用すると考えられているにもかかわらず、AIDタンパク質のほとんどは細胞質に存在する。本実験系でも、AID単独の導入では細胞質への局在が確認された。SRSF1が核への移行する際、RSドメインのリン酸化を必要とするが、RSドメインを有しないSRSF1-3はこの系では核に局在した。興味深いことに、AIDとSRSF1-3を共発現させると核に局在化した。すなわち、SRSF1-3は、AIDの核局在における役割があることが示唆された。一方、DT40細胞での安定形質転換体では、SRSF1-3の存在にもかかわらずAID融合タンパク質は細胞質に局在したことから、定常状態でAIDを細胞質に局在させるフィードバック機構の存在が示唆された。また、レプトマイシン処理によってAIDの核外輸送を阻害すると、SRSF1-3を発現しないDT40細胞でもAIDの核への輸送が確認された。さらに、野生型のAIDを発現するDT40細胞では、SRSF1-3の過剰発現はSHMを増強したのに対して、核外輸送シグナルを欠損したAIDを発現するDT40細胞ではSRSF1-3の過剰発現の効果が見られなかったことから、SRSF1-3の機能とAIDの核外排出の制御に関連があることが考えられる。これらの結果から、SRSF1-3はAIDの核外排出の制御に寄与していることが示唆された。当初の計画どおり進んでいる部分、進んでいない部分があるが、計画通り進んでない部分についてもは、予想された結果とは異なる新たな発見を伴っており、研究全体としては順調に進んでいると言える。細胞工学、免疫学当初の計画通り研究を遂行する。また、新たに明らかになった予想外の部分については、関連する実験手法を新たに試みることによって解決する予定である。
これまで植物糖として考えられていたキシロース含有糖鎖の神経系における機能の解明

本研究では、キシロース含有糖鎖の担う役割を解明することを目的としている。キシロース含有N型糖鎖の生合成にかかわる候補遺伝子(AGO61)の遺伝子欠損マウスは、胎生11.5日におけるAGO61欠損マウスの発達が顕著に遅れており、特に脳構造の形成が遅延していることを明らかにした。こうしたことから、キシロース含有糖鎖が神経系の発生に重要な役割を担っていることが予想された。本研究では、高等動物の脳神経系においてキシロース含有糖鎖がこれまで知られていない普遍的な高次機能を担っているのではないかという着想のもとに、この糖鎖の担う役割を解明することを目指している。本年度はまず、キシロース含有糖鎖を介した相互作用に関与する因子(レクチン、結合タンパク質、キシロース分解酵素)の探索を試みた。しかしながら、未だ候補分子を見出すには至っていない。その理由として、どの因子も生体内の存在量が非常に低いことが考えられる。そこで今後は、これまでに樹立することができているキシロース転移酵素様タンパク質であるaer61およびago61の遺伝子欠損マウスを適切な対照試料として利用することにより、相互作用因子を見出すことを計画している。これまでに、in situハイブリダイゼッションにより、aer61およびago61のmRNAはともにマウスの大脳、海馬、小脳に発現量が多く、また特にニューロンに発現していることが明らかとしているが、タンパク質レベルでも同様の局在を示すことを明らかにした。また、細胞免疫染色により、aer61, ago61はともにER-Golgi間に局在していることを見出した。今後は、ago61遺伝子欠損マウスの胎生致死の原因を明らかにすることで、キシロース含有糖鎖の機能解明を目指す。申請者はこれまでに、キシロース含有N型糖鎖の生合成にかかわる候補遺伝子(AGO61)の遺伝子欠損マウスは胎生致死であることを見出している。本年度はより詳細な検討を実施し、胎生11日におけるAGO61欠損マウスの発達が顕著に遅れており、特に脳構造の形成が遅延していることを明らかにした。一方、これまでの研究により、成体の脳においては神経細胞に特異的にAGO61が発現していること見出している。こうしたことから、キシロース含有糖鎖が神経の発生に重要な役割を担っていることが予想される。X線結晶構造解析によるβ1,2-キシロース転移酵素様タンパク質(aer61およびAGO61)のキシロース転移メカニズムの解明に向けて、これらタンパク質の大量発現系の構築を試みた。AGO61に関しては、未だ大量発現系の構築には未だ成功していないが、aer61に関しては、大腸菌にて低温誘導発現をシャペロン分子共存下で行うことで、安定なリコンビナントタンパク質を得ることに成功した。現在、結晶化条件の検討を行っている。一方、これまで申請者が開発してきたHPLCを利用した糖鎖分析法の適用範囲を0型糖鎖にまで拡張した。これにより、多種多様な糖鎖の構造の同定が可能な基盤技術が整った。こうしたHPLCを用いた分析法を応用することにより、Lewis X構造やHNK-1糖鎖構造を含む糖鎖が、神経幹細胞に特異的に発現していることを見出した。さらには、これら神経幹細胞特異的な糖鎖が、幹細胞性を維持する機能を担っていることを明らかにした。
マイクロ部品におけるゼロアッベ誤差の高精度3次元形状評価方法に関する研究

本研究では光ファイバを用いてトラッピングしたマイクロ球をプローブとして利用するナノCMMを提案している.光ファイバトラッピングプローブでは光ファイバの先端から出射する光がプローブとして利用するマイクロ球をとラッピングする.また,光ファイバ先端から再入射する光の光量変化がプローブ接触信号として使われる.このような光量変化はプローブが測定対象の表面に接触すると生じるプローブ球と光ファイバ先端からの相対的な位置ずれにより発生する.シミュレーションにより設計した光ファイバを用いて行った実験では光ファイバトラッピングプローブが測定対象と接触するときのプローブ信号の変化が検出できた.また,その信号変化の原因をシミュレーションにより明らかにした.本研究では光ファイバを用いてトラッピングしたマイクロ球をプローブとして利用するナノCMMを提案している.光ファイバトラッピングプローブでは光ファイバの先端から出射する光がプローブとして利用するマイクロ球をとラッピングする.また,光ファイバ先端から再入射する光の光量変化がプローブ接触信号として使われる.このような光量変化はプローブが測定対象の表面に接触すると生じるプローブ球と光ファイバ先端からの相対的な位置ずれにより発生する.シミュレーションにより設計した光ファイバを用いて行った実験では光ファイバトラッピングプローブが測定対象と接触するときのプローブ信号の変化が検出できた.また,その信号変化の原因をシミュレーションにより明らかにした.本研究では,急斜面や高アスペクト比構造を持つマイクロ部品の3次元形状評価方法の開発を目的とする.そこで,マイクロ部品の3次元形状を評価するため,ゼロアッベ誤差の高精度高汎用性nano-CMM(ナノ3次元座標測定器:nano-Coordinate Measuring Machine)を開発する.開発するnano-CMMのプローブとしては特殊にデザインした先端形状を持つ直径5μmの光ファイバを用いて直径8μmのマイクロ球をレーザトラッピングし,トラッピングしたマイクロ球をプローブとして利用する光ファイバトラッピングプローブを搭載する.また,nano-CMMのアッベ誤差を補正するため移動ステージに角度検出用高精度センサーを設置することで移動軸の角度ずれを検出する.以上のことから本申請では高精度高汎用性ゼロアッベ誤差ナノCMMを開発することで、マイクロ部品の3次元形状評価方法の開発を目指す.本年度はnano-CMMで最も重要であるプローブの性能向上の研究を主に行った.開発するnano-CMMのプローブとして搭載する光ファイバトラッピングプローブはトラッピング効率が良いかつ最入射効率も良い光ファイバ先端形状をデザインするため,先端形状の変化によるトラッピング力と最入射強度の変化をシミュレーションにより計算し光ファイバ先端形状をトレードオフでデザインした.このシミュレーションの結果により,光ファイバトラッピングプローブが測定対象の表面に接近するときのプローブ信号強度が強くなる原因を明らかにした.本研究では,急斜面や高アスペクト比構造を持つマイクロ部品の3次元形状評価方法の開発を目的とする.そこで,マイクロ部品の3次元形状を評価するため,ゼロアッベ誤差の高精度高汎用性nano-CMM(ナノ3次元座標測定器:nano-Coordinate Measuring Machine)を開発する.接触型CMMの場合,測定対象の表面と接触し表面形状を読み取るプローブの精度がCMMの測定精度の大きく影響する.特にnano-CMMの場合は数mm程度以下の小さいものを測定対象とするので,プローブのサイズもそれに伴い小さくなる.そこて,本研究ではnano-CMMのプローブとしては特殊にデザインした先端形状を持つ直径5μmの光ファイバを用いて直径8μmのマイクロ球をレーザトラッピングし,トラッピングしたマイクロ球をプローブとして利用する光ファイバトラッピングプローブを利用する.本年度は開発するnano-CMMの性能向上のため,接触センサーとして利用する光ファイバトラッピングプローブの性能向上に関する研究を行った.光ファイバトラッピングプローブは光ファイバ先端から再入射する光量を信号として利用するが,再入射する光にはプローブ表面からだけではなく測定対象の表面から反射した光も光ファイバ先端から再入射する.そこて,光ファイバの先端から測定対象の表面までの領域全体が計算できるシミュレーションソフトを開発し,測定対象の表面から反射し光ファイバの先端から再入射する光量がプローブ信号の変化を解析することで,プローブ信号の強度変化の原因を明らかにした.
癌パスウェイマーカの同定と治療応用の研究

我々は本年度、主に2つの研究を行った。1つは、肝細胞がんでの主要29遺伝子のパスウェイを文献情報に基づいて作成し、肝細胞がんの患者の遺伝子発現情報と組み合わせて解析した。さらに、遺伝子機能分類(GO)を用いた部分ネットワークの解析を行い、治療における有効性部分ネットワークの確認を行った。2つ目は、昨年から継続している癌の浸潤・転移に関わる上皮間葉転換の解析を行うため、細胞株でのより詳細な時間間隔での時系列の遺伝子発現情報を測定し、非負値行列特異値分解により、4つの特徴的な成分を抽出することができた。各時期の主要転写因子を更に絞り込むことで、転移阻害剤の開発に繋がる成果が得られた。パスウェイ準拠治療を実現する上で最も重要なものは、言うまでもなく分子パスウェイ異常分枝の正確な認識である。例えば、肝細胞癌では血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、上皮成長因子(EGF)、インスリン様成長因子(IGF)、肝細胞増殖因子(HGF)などの成長因子、およびこれらの下流に位置するERK/MAPKパスウェイ、PI3K/AKT/mTORパスウェイ、あるいはWntパスウェイなど、さまざまなシグナル伝達系が相互作用している。さらに、腫瘍細胞と間質細胞との相互作用(tumor microenvironment)におけるVEGFやPDGFなどの存在も重要である。本年度は、これらのパスウェイに関する生物学的知見を整理して、肝細胞癌の病態分子像を規定する「基準パスウェイ」を検討した。肝細胞癌の基準パスウェイの雛型として、まず文献(Whittaker S. Oncogene. 2010)等を元に、特に重要な29遺伝子を抽出した。これらの遺伝子発現パターンを予後良好群vs.予後不良群(各n=20)で比較したところ、MAPK1やGSK3B、VEGFA、KRAS遺伝子などの発現増加、およびSHC2やTP53などの発現減少が予後と相関していた。さらに、これら29遺伝子の発現データから、遺伝子ネットワーク推定アルゴリズムであるGENIE3を用いて肝細胞癌の予後を規定するネットワークを作成した。予後良好群と予後不良群のネットワークを比較したところ、TP53・BCL2L1・BADを含むアポトーシス関連や、MTORからAKT1に連なるmTOR系などが共通していた。一方、予後不良群ではEGFRやMAPK1などの系において特徴的なネットワークが見られた。今後、これらの遺伝子のタンパク質発現およびリン酸化特異的抗体を用いた検討を進め、パスウェイマーカーとしての機能の評価を行う。パスウェイに基づく治療を実現する上で最も重要なものは、言うまでもなく分子パスウェイ異常分枝の正確な認識である。本年度では、前年度に作成した29遺伝子のコアとなるパスウェイをもとに、遺伝子発現データと組み合わせたネットワークの解析を進めた。その際、ネットワークのエッジを決定するための閾値を調整する必要があるため、最適な閾値をランダムネットワークに対する偽陽性率として求める方法の検討を行った。またネットワークの解釈を行うため、従来の遺伝子機能解析手法として広く用いられているGene Set Enrichment Analysis (GSEA)法との比較検討を行った。今回対象とした29遺伝子は、タンパク質レベルでのシグナル伝達等の相互作用を考慮しているため、完全な一致性は得られていないが、今後はその差異についての検討を進める。癌の転移・浸潤に関わる上皮間葉転換(EMT)の検討を行うため、昨年度のように他の実験的研究者のデータを使用するのではなく、A549細胞株に対する時系列の遺伝子発現データを本研究室の実験担当グループによってより詳細な時間間隔で、EMT過程での遺伝子発現プロファイルを測定し、解析を行った。その際、近年注目されている非負値行列特異値分解(NMF)を用いて評価を行い、従来の主成分分析(PCA)との差異を検討した。PCAでは負の値をとりうるため、例えば時系列的に増加・減少しているものは逆の符号で示されることになる。実際に、今回のデータではNMFの第1成分・第2成分はPCAの第1主成分を符号ごとに分離した場合と遺伝子の組成が90%以上一致しており、もともと正の値しかとり得ない遺伝子発現量をより自然な形で分離することが可能となった。また、NMFの成分の時系列的変動を確認したところ、単調増加・減少以外に、(A) EMT誘導から1-2時間後に現れる早期応答と、(B) 4-8時間後にピークとなる中間状態、の2つの変動パターンを抽出することができた。さらに、NMFの各成分に対してしてGOタームの評価を行ったところ、早期応答では細胞周期関連遺伝子の減少、中間状態では免疫応答・遊走・コレステロール代謝などの発現変動が見られた。現在、これらの中間状態に関わる転写因子の解析を行っており、各時期のマスターレギュレーターを特定することで癌の転移阻害剤の開発に繋がることが期待される。

このように本研究では、EMT過程ではE細胞状態(E)、中間状態(I)、間葉細胞状態(M)の3状態を推移し中間段階が幹細胞状態の未分化状態にもどることが示唆された。我々は本年度、主に2つの研究を行った。1つは、肝細胞がんでの主要29遺伝子のパスウェイを文献情報に基づいて作成し、肝細胞がんの患者の遺伝子発現情報と組み合わせて解析した。さらに、遺伝子機能分類(GO)を用いた部分ネットワークの解析を行い、治療における有効性部分ネットワークの確認を行った。2つ目は、昨年から継続している癌の浸潤・転移に関わる上皮間葉転換の解析を行うため、細胞株でのより詳細な時間間隔での時系列の遺伝子発現情報を測定し、非負値行列特異値分解により、4つの特徴的な成分を抽出することができた。各時期の主要転写因子を更に絞り込むことで、転移阻害剤の開発に繋がる成果が得られた。基本となる計算アルゴリズムについての検討は、おおむね目処が立った。本年度は、得られた候補遺伝子に対する免疫染色やウェスタンブロットによる検討とバリデーションを進める。27年度が最終年度であるため、記入しない。生命情報学がんシステム生物学システム分子医学1.パスウェイ・バイオマーカの探索平成25年度・26年度に引き続き、パスウェイの構築および候補パスウェイマーカーの絞り込みを行う。パスウェイ上にあるタンパク質に関連する論文を定期的にレビューし、確度の高い新規な知見についてはリファレンスパスウェイに適宜取り込んでいく。それに伴い、拡張パスウェイも更新し、差分についての検討を随時行うとともに、手法部分についての論文化の準備を進める。2.候補パスウェイマーカーのバリデーション臨床検体を用いて候補タンパク質のリン酸化特異的抗体によるウェスタンブロットを行うことにより、シグナル伝達経路の活性度をを評価して少数のパスウェイバイオマーカとの精度の比較をする。有望なな候補パスウェイマーカについては、独立症例を用いた免疫染色によるバリデーションを開始する。基準パスウェイを用いた評価はほぼ完了した。ほかにも細胞周期関連遺伝子を用いた解析を進めており、予後不良群に特徴的なAURKBやCDC20を中心としたネットワークについても検討を進めている。消耗品の購入や出張のタイミングにより、若干の差異が生じた。1.パスウェイ・バイオマーカの探索平成25年度に引き続き、パスウェイの構築および候補パスウェイマーカーの絞り込みを行う。それに伴い、拡張パスウェイも更新し、差分についての検討を随時行う。ウェスタンブロットにより有用な候補パスウェイマーカが得られた時点で、独立症例を用いたバリデーションを開始する。
時間にとって十全なこの世界:現在主義の可能性

現代の分析形而上学における時間論の論争状況は、複数の立場が競合する、非常に錯綜したものとなっている。過去、現在そして未来はすべて等しく存在すると考える「四次元主義」、過去と未来は等しく存在するが未来は無であるとする「オープン・フユーチャー理論」、現在のみが存在すると主張する「現在主義」、大きくはこれら三つの立場がある。このような論争状況において、本研究では現在主義の立場に立脚しつつ、時間にまつわる諸問題を体系的に取り組んだ。より具体的には、1.時制表現(「過去である(かつて一だった)」、「現在である(今一である)」、「未来である(やがて一だろう)」)の存在論的意味と解釈、2.現在主義のありうる様々な体系化の比較検討、3.現在主義の理論化、4.「過去と未来の違い(時間の非対称性)」と「時間の流れ(時間の動的側面)」の解明、5.現在主義と特殊相対性理論の両立(不)可能性、6.K.ゲーデルの閉じた時空モデルの可能性と現在主義に対するインパクト、7.現在主義の観点から見たタイムトラベルの(不)可能性、以上7項目が3年間にわたる本研究の主要なターゲットであった。今年度は、1から4の基礎研究を継続するとともに、現在主義と科学理論の両立可能性についての研究を行なった。より具体的には、「真理の存在論的基礎づけ」のプロジェクトに関して、現在主義において過去(未来)言明の真理はいかにして存在に基礎づけられるかという問題に取り組んだ。また、一般には絶対的同時性を否定すると考えられている特殊相対性理論の形而上学的帰結を丹念に検討し、それと現在主義の両立可能性について考察を深めた。これらの成果は各学会において口頭発表された。過去、現在そして未来はすべて等しく存在すると考える「四次元主義」、過去と未来は等しく存在するが未来は無であるとする「オープン・フューチャー理論」、現在のみが存在すると主張する「現在主義」、大きくはこれら三つの立場がある。このような論争状況において、本研究は、現在主義の立場に立脚しつつ、時間にまつわる諸問題を体系的に研究することを目指している。より具体的には、1.時制表現(「過去である(かつてだった)」、「現在である(今である)」、「未来である(やがてだろう)」)の存在論的意味と解釈、2.現在主義のありうる様々な体系化の比較検討、3.現在主義の理論化、4.「過去と未来の違い(時間の非対称性)」と「時間の流れ(時間の動的側面)」の解明、5.現在主義と特殊相対性理論の両立(不)可能性、6.K.ゲーデルの閉じた時空モデルの可能性と現在主義に対するインパクト、7.現在主義の観点から見たタイムトラベルの(不)可能性、以上7項目が本研究のターゲットである。今年度は、1から4の基礎研究を継続するとともに、主にタイムトラベルを素材として、時間の非対称性とその動的側面の問題を検討した。本研究は主として時間の形而上学に関わるが、時間概念の探求というより大きな目的のため、太田紘史氏との共同研究により、意識と時間をめぐる現象学的問題にも着手した。また、その予備段階として、意識の共時的統一やその反例とされる分離脳の事例を考察した。これらの成果は学会にて発表した。今年度は、1から4の基礎研究(特に時間の流れに関する形而上学的考察)をさらに深めるため、学会や論文などを通じてこれまでの成果を国内外で発表し、そこから得たフィードバックをもとに自らの研究を発展させた。本研究は主として時間の形而上学に関わるが、時間概念の探求というより大きな目的のため、太田紘史氏との共同研究により、意識と時間をめぐる現象学的問題にも着手し、これらの成果は論文として発表した。

より具体的には、1.時制表現(「過去である(かつて一だった)」、「現在である(今一である)」、「未来である(やがて一だろう)」)の存在論的意味と解釈、2.現在主義のありうる様々な体系化の比較検討、3.現在主義の理論化、4.「過去と未来の違い(時間の非対称性)」と「時間の流れ(時間の動的側面)」の解明、5.現在主義と特殊相対性理論の両立(不)可能性、6.K.ゲーデルの閉じた時空モデルの可能性と現在主義に対するインパクト、7.現在主義の観点から見たタイムトラベルの(不)可能性、以上7項目が3年間にわたる本研究の主要なターゲットであった。今年度は、1から4の基礎研究を継続するとともに、現在主義と科学理論の両立可能性についての研究を行なった。より具体的には、「真理の存在論的基礎づけ」のプロジェクトに関して、現在主義において過去(未来)言明の真理はいかにして存在に基礎づけられるかという問題に取り組んだ。また、一般には絶対的同時性を否定すると考えられている特殊相対性理論の形而上学的帰結を丹念に検討し、それと現在主義の両立可能性について考察を深めた。これらの成果は各学会において口頭発表された。哲学という学問の特性上、批判や議論を通じて発展的に考察は深まるので、必ずしも当初予期したとおりに研究が進んでいるとはいえない。しかし、そのことを考慮に入れても、学会発表や論文などにおいて当初の計画に劣らない成果が得られたと考える。次年度は本研究の最終年度である。未だ着手されていない研究課題(現在主義と相対性理論の両立可能性)もあるので、まずはこれに優先的に取り組む。また、論文作成などによりこれまで得た成果を何らかの形で整理することにも努める。
胆汁うっ滞治療薬開発を目的とした胆汁分泌機構の包括的解析

胆汁うっ滞症は難治性疾患であり、より良い治療薬を開発するには胆汁分泌機構の詳細を明らかにする必要がある。ウルソデオキシコール酸は胆汁分泌を促進する作用を有しているが、どのようなメカニズムで作用しているかはわかっていなかった。本研究では細胞を用いた実験系を用いて、ウルソデオキシコール酸が胆汁酸トランスポーターであるBsep蛋白を細胞膜上で安定させることにより胆汁分泌を促進していることを明らかにした。1.胆汁酸トランスポーター(Bsep)のendocytosis調節機構の解析Bsepのendocytosis調節機構を解析するためにBsepの細胞外表出部位にHAをタグしたconstruct(Bsep-HA)を作成した。かかるコンストラクトはトランスフェクションによりMDCKII細胞に発現し、さらに[H^3]-taurocholateを用いた胆汁酸輸送活性測定系を用いてBsep活性を有することを確認した。細胞膜上のBsepをビオチンにてラベルし、cycloheximide処理により蛋白合成を阻害した後、細胞膜上Bsepの半減期を解析した。その結果、UDCA添加後の細胞膜上Bsepの半減期は6.3時間であり、コントロールの4.6時間に比し、延長していた。以上の結果からUDCAは細胞膜上のBsepのendocytosis-degradation pathwayから回避させ、細胞膜上のBsepを安定化させることにより、胆汁酸輸送活性を増強していることが示唆された。ラットにUDCA1%を含む食餌を与え、屠殺後、肝細胞のcanalicular membrane vesicleを分離し、膜上のBsepを特異抗体によるimmunoblotで定量的に解析した。その結果、肝細胞膜上のBsep蛋白量をほとんど変化せず、上記in vitroのデータと異なる成績であった。今後、食餌中のUDCA含有量を変えて、再度検討する予定である。1.利胆作用を有する薬剤のハイスループットスクリーニングBsepを恒常的に発現するMCKII細胞を用いて、Bsepを活性する薬剤を生理活性物質ライブラリーから見いだすためのスクリーニングをおこなった。現在までのところ、Bsep活性を軽度(1.3倍)上昇させる一つの化合物を見いだした。本化合物はNtcp活性には影響を与えず、Bsepのみ活性化することが明らかとなった。2.胆汁分泌トランスポーターのクラスター分子の同定現在までのところ、Bsepと結合するクラスター分子は同定できていない。同定できない原因としてBsepに対する抗体の親和性が低い可能性があり、この問題を解決するため、Bsep蛋白にFlag tag,HA tagを付加したBsep蛋白を恒常的に発現するMDCKII細胞を樹立した。現在、本細胞と抗Flag抗体、抗HA抗体を用いて、実験を行っている。3.UDCAの作用機序解析UDCAは細胞膜上のBsepをendocytosis-degradation pathwayから回避させ、細胞膜上のBsepを安定化させることにより、胆汁酸輸送活性を増強していることを平成22年に明らかにした。本年度はその作用機序について検討した。UDCAの作用はrecycling inhibitorであるmonensinやmicrotubule inhibitorであるnocodazoleで阻害されるが、PKAやPKCのinhibitorでは阻害されないことが判明した。このことより、UDCAのBsep活性化はmicrotubule-dependentであることが明らかとなった。1. UDCAの作用機序解析UDCAは細胞膜上のBsepをendocytosis-degradation pathwayから回避させ、細胞膜上のBsepを安定化させることにより、胆汁酸輸送活性を増強していることを平成22、23年に明らかにした。本年度は進行性家族性肝内胆汁うっ滞症(PFIC2)および、良性反復性肝内胆汁うっ滞症(BRIC2)の発症の原因となるBSEP変異体に対するUDCAの影響を検討した。PFIC2変異体としてD482GとG982R、BRIC2変異体としてA570Tを定常的に発現するMDCKII細胞株を樹立し、UDCAを添加、Bsep活性の変化を解析した。その結果、UDCAはBRIC2変異体に対してはwild-typeと同様に活性を約1.3倍に増強したが、PFIC2変異体に対してはほとんど効果がないことが判明した。その原因としてPFIC2変異体蛋白が極端に不安定で、UDCAでrescueすることができないためと考えられた。また、UDCAの効果がBsep特異的であるかを明らかにするため、apical proteinとしてtransferrin receptor、GL-GPIを、basolateral proteinとしてNa+K+-ATPaseに対する影響を検討したが、いずれの蛋白にも影響せず、UDCAの蛋白安定化はBsep特異的であることが判明した。2.胆汁分泌トランスポーターのクラスター分子の同定HEK293細胞にBsepのC末端にFlagをタグしたconstructを作成し、定常的に発現する細胞株を樹立した。抗Flag抗体を用いた免疫沈降法によりBsepと結合する4つの新規蛋白を同定した。現在それぞれの蛋白を阻害剤あるいはsiRNAを用いてknockdownし、Bsep蛋白に及ぼす影響を解析中である。

胆汁分泌トランスポーターのクラスター分子の同定ができていない。その理由として抗体の親和性が低い可能性があり、現在、新たなシステムを構築中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。利胆作用を有する薬剤のハイスループットスクリーニングは順調に進行中であり、本年度も種々の化合物のスクリーニングを遂行していく予定である。UDCAの作用機序解析の順調に進行しており、さらなる解析を行っていく。胆汁分泌トランスポーターのクラスター分子の同定については実験システムの変更をしており、それを用いて実験を遂行していく予定である。
ソフトウェア再利用のためのドキュメント自動生成手法

ソフトウェア再利用を支援する手法として,開発者が注目するソフトウェア部品の周辺との関係をソースコードおよび実行履歴情報からそれぞれ抽出,可視化する手法を実現した.いずれの成果も,プログラミング言語Javaで書かれたソフトウェアを解析するツールとして実現している.実行履歴を用いる手法については,多くのソフトウェア開発者が設計段階で用いるUMLのシーケンス図形式での可視化を採用し,ソフトウェア開発支援ツールとして公開した.ソフトウェア再利用を支援する手法として,開発者が注目するソフトウェア部品の周辺との関係をソースコードおよび実行履歴情報からそれぞれ抽出,可視化する手法を実現した.いずれの成果も,プログラミング言語Javaで書かれたソフトウェアを解析するツールとして実現している.実行履歴を用いる手法については,多くのソフトウェア開発者が設計段階で用いるUMLのシーケンス図形式での可視化を採用し,ソフトウェア開発支援ツールとして公開した.本年度は,各ソフトウェア部品が行う入出力の情報を抽出するツールを,過去の研究で開発したプログラムスライシングツールの拡張として実装した.ツールの枠組みについては,プログラム解析技術に詳しいKing's College Londonの研究者や,IBM T.J. Watson Research Centerの研究者らと意見交換を行い,その知見を踏まえたものとなっている.現在は試作したツールを用いて実験の一部を実施している段階であり,次年度,結果を論文としてまとめる予定である.また,このようなプログラム解析手法が開発者と協調する手段として,開発者が情報タグをソースコードに付与し,その情報を入力とした解析の結果もまた情報タグとしてソースコード上に提示する手法を考案した.このアプローチについては,国内の研究者との議論を踏まえて,ツールの試作を進めている.これらの研究と並行して,ソフトウェア部品のコンテキスト依存性を確かめるための手段として動的解析手法の実験を行った.これは,以前より継続的に開発していた,プログラムの実行履歴を解析する手法を本研究テーマに応用したものである.実際のソフトウェア企業で開発されたソフトウェアをその設計時に作られたシナリオに基づいて実行したとき,ソフトウェア実行中のある時間軸上の区間(フェイズ)がシナリオの各ステップに該当するかという対応関係の候補を半自動的に抽出できることを確認した.この成果については,今後,実行シナリオと実行履歴の対応関係を自動的に抽出する手法へと発展させることを検討している.この対応関係が得られると,ソフトウェアの各部品が,特定の機能の実行に関係した部品であるのか,複数の機能から用いられる部品なのかを推測することが可能となり,ソフトウェア部品群の再利用性を評価する一助となることが期待できる.本年度は、まず、昨年度の成果である、ソフトウェアの各部品が特定の機能の実行に関係した部品であるのか、複数の機能から用いられる部品なのかを推測する手法について、ソフトウェア工学に関する国際会議においてツールを公開し、研究討論を行った。この討論で得られた知見を踏まえて、開発者が注目したソフトウェア部品が、ある機能の実行においてどのように外部の部品と相互作用を生じるのか、動作例を抽出、可視化する手法を開発した。また、ソフトウェア部品の動作例を図示する際、周辺に提示すべき関連部品と、省略してもよい部品を自動的に分類するための手法の開発を行った。適用実験では、開発者が注目した2つのソフトウェア部品の相互作用を理解するという状況において、開発者にソフトウェア部品の動作例を効果的に提供できることを確認した。これは、開発者が効果的にソフトウェア部品を再利用する環境を構築するための基礎技術として意義のある成果である。今後、さらに多くのソフトウェア部品が動作する状況に対して、適切な動作例を抽出する手法へと研究を発展させることで、ソフトウェア部品群のより効果的な再利用へとつながると考えている。上記の研究と並行し、このような解析手法が抽出した情報を、開発者に提供する手段として、ソースコードに情報タグを付与、閲覧するための環境DocumentTagの試作を行った。試作したツールを用いると、ソフトウェア部品に対する解析の結果を開発者に提示できるだけでなく、複数の開発者がそれぞれ自由に独自の注釈をソフトウェア部品に追記することで、知識を蓄積していくことが可能となる。今後、DocumentTag環境を一般の開発者に提供するには、ツールの完成度を作り込む必要があるが、プログラム解析に関する研究の成果を開発者に提供するための基盤ツールとして使用することを考えている。