hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心筋虚血再灌流障害発生における白血球及び血管内皮細胞の接着因子の関与について

現在までに、好中球側の接着分子を抗体にてブロックすることにより、低酸素下の血管内皮細胞の障害が軽減されるか否かを検討してきた。1)抗ヒトCD11b抗体がウシ好中球と反応することを蛍光抗体法を用いて確認した。2)我々の作製したバイオアッセイ系を用い、抗CD11b抗体と反応させたPMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)にて刺激した好中球を低酸素下のウシ血管内皮細胞とincubareし、再酸素化後のEDRFの産生、放出能を血管平滑筋の弛緩率にて評価した。抗体を用いない群はコントロール群(好中球無添加)に比べ90%の弛緩率の減少を見たが、一方、抗体使用群は10%の弛緩率の減少を認めた。すなわち、抗CD11b抗体にてほぼ好中球と内皮細胞の接着がブロックでき、内皮細胞からのEDRFの産生、放出能が保たれ得ることを証明した。上述した如く、低酸素再酸素化血管内皮細胞の好中球による障害は内皮細胞と好中球とのdirect interaction、すなわち、細胞接着によって生ずることを抗CD11b抗体を用い細胞レベルで証明した。更に、抗ICAM-1抗体を用い低酸素下におけるICAM-1の発現量を定量し、内皮細胞側の接着分子をブロックすることによる内皮細胞の保護効果を検討することも今後の課題である。一方、ヒト材料を用い検討する必要があるが、ヒト冠動脈を新鮮材料として用いることは不可能である。従って現在は、抗ヒトCD11b及びCD18抗体、ヒト肺動脈、ヒト肺動脈、ヒト肺動脈内皮細胞、ヒト好中球を用いることにより、ヒト材料にて統一し肺における虚血再灌流障害を検討している。これらの実験は平成8年度までに終了し、報告する予定である。心筋虚血再潅流障害をヒト材料を用いて実験的に検討するのは困難であるため、ヒト肺材料をを用いて検討した。肺の虚血再潅流障害を検討するにあたり、肺手術摘出標本より得られた肺動脈、培養ヒト肺動脈内皮細胞、ヒト好中球を用いたバイオアッセイシステムを作成した。抗CD11bおよびCD18抗体が内皮細胞の虚血再藩流障害を軽減するかを検討した。1)フローサイトメトリーを用い、抗CDllbおよびCD18抗体の好中球との結合能を検討したところ、10ug/mlの濃度でそれぞれ約70%のmean channeel fluorescence ratioを得た。それ以上の濃度でもこの割合はほとんど増加しなかったので抗体濃度は10ug/mlを用いる事とした。2)バイオアッセイシステムにおける虚血再潅流時の肺動脈リング標本の弛緩率は50.3±2.0%であるが、活性化好中球を内皮細胞に添加すると弛緩率は19.7±1.0%まで減少した。しかしながら、活性化好中球を30分間抗CD11bおよびCD18抗体とincubateし、これを内皮細胞に添加した群では弛緩率は前者では40.9±1.0%、後者では41.8±1.7%まで弛緩率の改善を認めた。以上の如く、肺の虚血再潅流障害は血管内皮細胞と好中球のinteractionを阻害することにより軽減され、その手段として好中球の内皮細胞に対する接着分子CDllbおよびCD18を抗体を用いてブロックすることが有用であることを細胞レベルの実験で証明した。しかし、完全には虚血再潅流障害を防ぐことができず、他の因子(EDHFなど)の関与も考えられ、更なる研究が必要と考える。本研究は現在投稿中である。
CMB偏光成分の広帯域測定による原始重力波起源のBモード偏光の探索研究

インフレーション宇宙論の決定的証拠となる宇宙背景放射(CMB)の特殊な偏光パターン「Bモード」の探索を地上観測実験QUIETを用いて行う。40GHz帯の観測結果から世界第2位のBモードの上限値を得た。将来的にBモードの検出を決定的なものとするには、その妨げとなるフォアグランド(銀河系からの前景放射)の寄与見積もることが必須条件となり、本研究では40GHz帯の観測領域の1つにフォアグランドの寄与を確認した。90GHz帯データも既に取得済みであり、両周波数帯での観測を組見合わせて世界最高レベルのBモード探索が期待される。宇宙インフレーションの決定的証拠となるCMBのBモード偏光を世界最高感度で探索し、世界初検出を目指すことが本研究の目的である。研究初年度である平成20年度QUIET実験のQ-bandレシーバー(測定器)のコミッショニング、較正およびCMBの観測を行った。QUIET実験はチリのアタカマ高地(海抜5,080m)でその観測を行っている。研究代表者は現地でのQ-bandレシーバーのコミッショニング時に、データを安定かつ継続的に取り続ける為のデータマネージメントシステムの構築とDAQ下流ソフトウェアの改善、および実験サイトに常駐することなくデータのクオィティをリアルタイムでモニターするシステムを構築した。低圧(高度のため)かつ貧弱なネットワークという特殊環境のためこれらのシステムがちゃんとしていないとデータを取り続ける事すらままならない。これらの特殊環境に対応したシステムにより、QUIET実験はデータ輸送時に一切のデータを損失することなく、24時間安定にデータを取り続けている。また、コラボレーションが迅速に解析を行うための解析インターフェースの構築も行った。これにより、測定器校正等の解析は非常に早く軌道に乗った。QUIETではCMBの偏光強度分布を複数の測定器で測定するので、測定器間での相対的ゲイン(温度に対する出力強度)、ゲインの絶対値、偏光角度の3つが重要な検出器較正項目となる。研究代表者は、大気の輻射の変化を利用した相対的ゲイン較正の解析を観測開始から一ヶ月弱で確立し、今では全ての解析がこの結果をリファレンスポイントとして解析を行っている。また残り2つの較正項目はTauA(牡牛座かに星雲)を使った解析が進行中である。上記の成果は日本物理学会(2009年3月27日)にて報告を行った。平成21年度はQUIET実験のレシーバー(測定器)をW-band周波数帯のものへとアップグレードした。一方、それまでに取得したQ-bandレシーバーの解析が進行している。研究代表者はW-bandレシーバーシステムの構築と2ヶ月間にわたる現地での設置作業とコミッショニングを米国グループと共同で行い、観測を順調にスタートすることに成功した。平成20年度に開発したソフトウェアも改良し、長期的なデータクォリティモニターとDAQソフトウェアのトラブル自動解決機能を実装した。これにより、データ取得ソフトウェアのトラブルの発見と解決を迅速に行なうことが可能となり、装置のダウンタイムを最小限にとどめている。その他、Q-bandレシーバーでの経験を生かして、検出器の応答性能等の較正を現地で自動的に行なうソフトウェアも実装した。これにより、装置の状態を詳細に理解しながら、安定した観測を行なっている。平成21年6月まで行なったQ-bandレシーバーによる観測データの解析が進行している。装置の較正手法を確立し、その誤差が最終結果に与える影響の評価もおおむね終了した。取得したデータのクォリティとそれが最終結果に与える影響もまたほぼ理解しつつある。現在、解析はその最終段階にある。インフレーション宇宙論の決定的証拠となる宇宙背景放射(CMB)の特殊な偏光パターン「Bモード」の探索を地上観測実験QUIETを用いて行った。Bモードの強度はrというパラメータであらわされ、r=0.010.1が有力と言われている。一般的なインフレーションモデルにおいて、そのポテンシャルはV^<1/4>10^<16>×(r/0.01)^<1/4>GeVと記述されるので、Bモードの測定は10^<16>GeVという超高エネルギースケールの物理とも深く関わる。本年度は40GHz帯の観測結果から世界第2位のBモードの上限値r<2.2(95%信頼度)を得た。

これはフォアグランドが最小になる90GHz帯でのその寄与見積もる上で非常に重要な結果である。90GHz帯データも既に取得済みであり、両周波数帯での観測を組見合わせて世界最高レベルのBモード探索が期待される。本研究のもう一つ注目すべき点は、QUIET実験が系統誤差に対して極めて強固であることを証明したことである。Bモードは極めて微弱な信号である。近い将来Bモードを確実に発見するためには、検出器感度の向上だけでは不十分である。従来の観測実験よりも桁違いに小さな系統誤差を達成する必要がある。今回達成した世界最良の系統誤差はr=0.10未満に相当する。主要な系統誤差の原因は特定されており、既に90GHz帯レシーバーでの観測に反映されている。今後の結果ではさらに優れた精度を達成する見通しである。
残響下の時間長知覚が音韻識別に与える影響

残響には音を伸長し実際の長さよりも長く知覚させる作用がある。この作用は残響下における言語音の明瞭度低下の一因とされているが、先行研究では音素識別の調査に偏っており、言語音の時間長知覚への残響の影響に関しては明らかになっていない。音素の長さによって意味が変わる日本語の長短対立と時間長が知覚の手掛かりになる英語の破裂音の有声性判別に焦点をあて、時間長知覚に対する残響の影響を調査する。残響を考慮した時間長の知覚という点において、音声を聞く環境への適応能力も研究の範囲に入れる。また、残響の影響は非母語話者の方が知覚に対する影響が大きいとされるため、非母語話者との対比も行う予定である。
コンブの効率的早期種苗生産に向けた養殖株と保存株を用いた葉体成熟制御技術の確立

既存のマコンブ培養株を用いて、青森県産業技術センター水産総合研究所にある屋内水槽(1.5m3角型(1m×3m×0.5m))における葉体の成熟誘導を試みたところ、水温:15°C、水量:500L/毎時のかけ流し、光量:6,000ー8,000Lux、光周期:短日(9hLー15hD)の培養条件で葉面の裏と表に子嚢班の形成が認められ、活発な動きを示す遊走子の放出も確認できた。そこで、戸井町小安から採取したマコンブの成熟個体(先端一部に子嚢班形成)と未成熟個体(なお、これらについて形態的な違いは、t検定による解析で有意差は得られず、幾つかのDNA領域の塩基配列比較においても相違は認められなかった)について、7月25日から上記条件で水槽培養をはじめたところ、成熟個体では2週間後に、未成熟個体では2ー3週間後に子嚢班の形成が認められ、成熟部位が前面に広がる過程でそれぞれの葉面に占める子嚢班の形成割合を測ることができた。その後、8月28日には得られた成熟個体を用いて種苗糸(100mのクレモナ糸)の生産を行い、2018年における戸井漁業協同組合小安支所での養殖用マコンブの種苗生産開始は9月29日であったことから、それよりも約一ヶ月早く種苗生産を行うことができた。そして、作出した種苗糸を戸井漁協の種苗生産施設で培養し、11月4日(現場水温が20°Cを切り始めた時期)と11月20日(慣行栽培より少し遅い時期)の2回に分けて沖出しを行い、現在までそれぞれの葉体の生長を観察し続けており、これまでのところ、水温が20°Cを切るタイミングでの種苗糸の沖出しは発芽体の生長が鈍くなることが示されている。今回、実海域における未成熟個体の成熟誘導を試みたが、時化により施設が破損し、満足なデータを得ることができなかった。また、春期から夏期の天候不順による漁業者の作業量増加(天日干しができず、昆布乾燥機を使用するため)にともない、作業船の利用が制限され、定期的な環境データの取得が困難であったが、屋内水槽を用いたコンブ葉体の成熟誘導と誘導株を用いた早期種苗生産、そして養殖現場における種苗糸の沖出しが計画よりも進展し、総合的に順調と考えられる。海上における定期的な環境・生長データの取得は、自然環境の影響を受けそれなりの困難も予想されるが、引き続き作業補助の大学院生と、現場作業の協力をお願いする漁業協同組合職員と漁業者のサポートのもとで、計画的・効率的に研究を推進する。前年度取り残したデータの穴埋めを行うとともに、前年度計画以上に進んだ内容については再現性の確保に努める。なお、分子解析については、研究予算上タンパク質情報の取得が難しいことから、遺伝子情報の取得に努め、また、養殖試験においても現場関係者と密に連絡を取りながら効率的・効果的に研究が進められるようにする。

海上における定期的な環境・生長データの取得は、自然環境の影響を受けそれなりの困難も予想されるが、引き続き作業補助の大学院生と、現場作業の協力をお願いする漁業協同組合職員と漁業者のサポートのもとで、計画的・効率的に研究を推進する。前年度取り残したデータの穴埋めを行うとともに、前年度計画以上に進んだ内容については再現性の確保に努める。なお、分子解析については、研究予算上タンパク質情報の取得が難しいことから、遺伝子情報の取得に努め、また、養殖試験においても現場関係者と密に連絡を取りながら効率的・効果的に研究が進められるようにする。
コケシノブ科(シダ植物)を主対象とする分子形質と表現形質の対比による系統解析

平成1214年の間に、ニューカレドニア、ニュージーランド、チリ等で特異な分布を示すコケシノブ科植物の資料収集をした他、パリ自然史博物館、キュー植物園標本館、ロンドン自然史博物館、ミズーリ植物園標本館、中国科学院研究所の標本館などにおいて資料調査を行なった。これらの研究に基づいて、別記のものなど11編の論文を仕上げた。このうち、コケシノブ科については5編の論文を仕上げており、ニューカレドニアに固有の特異な種についての系統解析を行なったもの、ニューカレドニアで発見されたものの、有性生殖器官をもたない材料の新種記載を行なったもの、以前にマレーシアで収集した材料による形態形成の示す系統解析を行なったもの、バヌアツにおけるコケシノブ科の同定の記録などがあり、他の1編はパリ第6大学との共同研究の成果の報告で、広義のコケシノブ属の構成種の分子系統解析を行なったものである。これらの研究によって、コケシノブ科の単系統性についての証拠をより確固としたものとし、広義のコケシノブ属、ホラゴケ属の系統上の独立性を明らかにし、さらに、系統的所属が相互に混乱している種について、その系統的位置を確認する情報を明らかにすることができた。たとえば、元来ホラゴケ群の1型とみなされていたPleuromanesが広義のコケシノブ属のものであることを明らかにしている。これらの他、チャセンシダ科について、とりわけオオタニワタリ群の種の識別を確認し、スジヒトツバの種の内部構造を確かめ、ミゾシダ属について日本における地理的変異に関する知見をまとめた。また、中国で収集した材料についての細胞分類学的研究をすすめ、中国のシダ植物の形質についての解析を深めた。野外調査は中国(加藤雅啓、林蘇娟)、ニューカレドニア(岩槻邦男、村上哲明、美和美胤)、中国(岩槻、村上、谷田部陽子)で実施した。加藤と林はカワゴケソウ科植物の調査を行ったが、この科は種子植物中で異例に単純化を進めた植物で、コケシノブ科の進化と平行している点があり、コケシノブ科との比較研究の上で不可欠の研究対象である。ここで収集された材料に基づく研究成果は近く論文にまとめられる予定である。岩槻らはニューカレドニアで、Rosenstockiaなど、この島に固有の材料をはじめ、コケシノブ科の系統解析に不可欠な貴重な材料を多数入手した。このうち、Rosenstockiaの比較解析については、その成果がほぼ整ってきたので、来年度中には論文として公表する予定である。岩槻らの中国調査は四双版納地域で行われたが、ここでは予定していたコケシノブ科の材料は十分に収集できなかった。しかし、チャセンシダ科など、平行して進めている研究の材料は十分に収集した。岩槻邦男はパリ自然史博物館とプラハ大学ハーバリウムで資料の調査研究を行ったが、この調査研究によって、マレーシア地域のコケシノブ科の種属誌の研究はほぼ完了し、記載などの原稿部分は完成に近い状況にある。現在、詳細部分図などを、最近購入した機器を活用して、顕微鏡撮影する作業などを進めている。それらをまとめて、近くマレーシア植物誌の1冊として刊行すべく、準備を進めている。収集されたコケシノブ科の分子系統の解析は、研究室の整備が進んだところで研究協力者を雇用してデータの算出に勤めた。広義のコケシノブ属が比較的短期間に分化したらしいこと、広義のホラゴケ属は単元的ではあるが、複雑な系統分化を行っていることなどが予備的に示されている。これらについては次年度にもさらにデータを積み上げ、より正確な系統関係の追跡を行いたい。系統的位置が不分明であったニューカレドニア固有属Rosenstockiaについては、比較形態と分子系統の両面からの解析が進められたので、狭義のホソバコケシノブ属近縁の種であることを示す論文を近く作成する予定である。

平成13年度のおける現地調査は中国(岩槻、加藤、村上、長谷部、及び研究協力者林蘇娟、矢田部洋子)とニュージーランド(岩槻、及び研究協力者の篠原歩、海老原淳)で実施した。中国では、中国植物誌シダ篇に関する研究で、それぞれに対応する分類群の研究を行なった。すなわち、長谷部はシダ全般の分子系統学的解析を、岩槻はシダの分類体系とコケシノブ科の、加藤はシノブ科、メシダ科、ハナヤスリ科を、村上と矢田部はチャセンシダ科を、そして林はホングウシダ科をそれぞれ対象とする研究を分担した。ニュージーランドの調査では、岩槻、海老原は南半球に分布の偏るコケシノブ科の材料収集と生態的解析を主対象として、篠原はメシダ科の研究材料を中心に調査を行なった。これらの現地調査と、日常的なシダ植物の研究を通じて、いくつかの課題について研究報告の準備を行なっている。また、12年度に収集した材料についての解析を引き続き行なっており、論文1編はacceptされ、他の1編も原稿を仕上げる段階にある。コケシノブ科の分子系統学の準備が進んだため、既存の分類系(岩槻、1996)に改訂を施す必要が生じ、完成に近づいていたFlora Malesianaの原稿についても一部手直しを必要とすることになった。必要な手直しをし、図表等を整えた上で、この大部の出版物もできるだけ早く完成させたいと思っている。平成14年度の現地調査はインドネシア・チリ・中国で実施した。7月に村上哲明と協力者矢田部洋子がインドネシアを調査し、オオタニワタリ群の種分化に関する研究の充実をはかった。12月に岩槻邦男と、追加した分担者朝川守毅(千葉大学理学部助手)それに協力者海老原淳の3名がチリへ赴き、主としてコケシノブ科の分子系統解析のための材料収集などを行った。15年2月に岩槻が中国要南省を訪れ、四双版納でコケシノブ科の観察を行った他、昆明植物研究所で資料標本による研究を行った。また、6月には、岩槻と協力者海老原がパリ自然史博物館、ロンドン大英自然史博物館、キュー植物園ハーバリウムを訪れ、資料標本にもとづく研究を行った他、研究者とコケシノブの系統について討議を行った。これらの研究によって、分子系統にもとづくコケシノブ科の分類体系の改訂のデータをほぼ完全に整えることができたところである。
宇宙環境模擬による強制体液移動に伴う循環調節機構の研究

本年度も前年度に引き続き、以下に示すような種々の実験条件の組み合わせの下で実験を行なった。各群6ないし10名の被験者について、6゚ヘッドダウンティルトを一定時間(1時間、3時間、および12時間)続けた状態で下半身に陰圧(-20mmHgおよび-40mmHgを各30分、または-30mmHgを1時間)を負荷して、下肢インピ-ダンスプレティスモグラム、心電図、非観血連続血圧、エコ-心電図などの循環動態計測、および血漿中の特殊ホルモンなどの測定実験を実施した。比較的短時間のヘッドダウンにおいては前後に70゚ヘッドアップティルトを実施して起立耐性の低下を評価し、12時間のヘッドダウンにおいては水分摂取制限を行ない、ヘマトクリットなどを測定して脱水状態を確かめ、前年度までの実験で分かっていた起立耐性の低下が起こり易い状態にあることを確認した。これらの各群に対して、(1)補液および薬剤(硫酸アトロピン)、(2)大腿部カフによる血液の移動制限、(3)下肢の筋肉ポンプによる血液の一部強制移動などを行ない、起立耐性低下に対する対策として妥当性があるかどうかの影響を調べた。結論として、(1)の補液は末梢抵抗減少型の起立耐性低下の回復に特に有効であり、薬剤は当然のことながら迷走神経緊張型の起立耐性の低下の例に有効であった。(2)の大腿部カフは逆に起立耐性低下を悪化させ、(3)の下肢の筋肉ポンプも同様に結果が悪かった。こうした理由について種々議論がなされた結果、次のような原因が類推された。つまり、大腿部カフはかえって静脈を閉塞して下肢への血液貯留を増加し、循環血漿量の低下を助長したのではないか。与圧服のように下肢全体を圧するのならば有効であったかもしれない。また下肢の筋肉ポンプについては、稼働時間が短時間で持続しなかったため、筋肉内にその後の血液の貯留がかえって起こり易かったためではないかと考えられた。本年度の研究計画は,設備備品である傾斜台付き下半身陰圧負荷装置の設置と調整であった.これについて研究代表者は,宇宙開発事業団の医学嘱託として,筑波宇宙センターに設置した日本人宇宙飛行士の特殊環境訓練用の下半身陰圧負荷装置の開発を指導し, NASAなどの装置も実地調査した経験を活かして,最良の装置を設計した.特徴の(1)は, -10°+90°まで連続可変の傾斜台がついていることで,実験の前処理として約一時間,臥床および6°ヘッドダウンの姿勢をとらせる必要があり,事業団ではその度に大変な騒ぎであったが,傾斜台を組込むことによって被験者に外乱を与えずにヘッドダウンが可能になった.特徴の(2)は負荷される陰圧の範囲で,当初の予定では-60mmHgまでを考えたが,その後世界の趨勢はより高い陰圧の方向に進んでいることが判明し,仕様を変更して-100mmHgまで引けるようにした.陰圧能力も予想を上まわり, -100mmHgの陰圧が10秒程度で達成出来た.この陰圧能力は持続精度とも密接に関係するので,本装置は持続精度も高いことが予想される.事業団の装置では陰圧のシールドが不完全で,腰の部分から空気が入りこむという問題があったが,本体とスカートが密着する部分を充分広くとることで対処した.もう一つの問題点であった足首の固定については,内部に支持棒を付け,足の先を固定した器具が支持棒をスライドするようにして足に力が入るのを防いだ.陰圧で体が装置の中へ引込まれるのを防ぐ器具としては,事業団は自転車のサドルを用いたが,力が一部に集中してしまうので,本装置ではベルトによって圧を広い範囲に分散させてサポートするようにした.外型は卵型をした透明のプラスティックで,全体に非常にスマートなものが出来た.この装置は昨年12月に開催された日大宇宙航空科学シンポジウムで,米国,西独の超一流の宇宙送学者達8人を招いた会場で展示を行ない,多大の賞賛をあびた.1、下肢容積変化計測のため、インピーダンスプレティスモグラフィーを製作した。最初の試作機がうまく働いたので、左右用に2台の機器を製作した。下肢血流量の変化に比例したインピーダンスの変化はほぼ2秒毎に計測・表示され、計測値が50秒溜めると自動的にフロッピーディスクに収納される。動作は極めて安定しており、期待以上の性能の機器を完成することが出来た。2、傾斜台を用いた6日間-6°傾斜臥床実験およびその前後に+70°傾斜負荷実験を行なった。10人の被検者について実験し、その内に半数である5例に、6日間臥床後の+70°傾斜負荷について失神状態が出現し、起立耐性低下と判断された。さらに失神状態が分析され、出現に少なくとも二種類の原因があることが示唆された。3、62年度に設備した傾斜台付き下半身陰圧負荷装置を用いた実験を行なった。頭部を下に6°傾斜させた状態で13時間仰臥させ、続いて下半身に-20mmHg、-40mmHg、-50mmHgの圧を5分づつ負荷し、強制的に体液を担動させた際の循環系の反応を、心電計、超音波心臓断層図、超音波頚動脈流量計、インピーダンスプレティスモグラム等により計測し、それに関連する内分泌系の反応を見るためホルモン系の測定を行なった。

測定したホルモンは、利尿ホルモン、Ca代謝に関係するPTHやビタミンD系ホルモン、ストレスに反応するステロイド系ホルモン、等であった。20名の20才台の男性を対象にし、計測・測定を実施した。心拍出量などの循環動態は宇宙に似た反応を示し、利尿系のホルモンは傾斜後30分以内に反応し、Ca系ホルモンは傾向が掴めず、ストレス系ホルモンは一部に反応が早いものがあった。これらの結果はみな現在の宇宙医学にとって極めて貴重なデーターであり、国内のみならず国外の学会でも注目を浴びている。1、短時間ヘッドダウンティルト(HDT)のパラメ-タの決定傾斜台を用いて水平位(0°)、-6°、-20°のHDTを各1時間行ない循環動態の変化を計測した。循環動態の測定はインピ-ダンスプレティスモグラフ、血圧、心電図などを計測した。その結果、傾斜が増すに従い下肢から上肢への体液還流量が増加し、1時間では平衡状態に達しなかった。-20°では被験者の不快感が強かったので次に0°、-6°の2種類の傾斜で4時間のHDTを実施したところ、下肢からの体液流出傾向に6°HDT3時間で変曲点が見られ、一応のプラト-と考えられた。0°では時間がかかりすぎ、やはり6°HDTが至適であることが確認され、3時間が一応の区切りと考えられることが判明した。2、下半身陰圧(LBNP)負荷のパラメ-タの決定従来の-20mmHg、-30mmHg、-40mmHg、-50mmHgの陰圧を5分づつ負荷するデ-タは揃った。起立耐性の低下を予測するための新しい方法を宇宙開発事業団と協議し、宇宙飛行士の選抜に使う目的で一つの陰圧を長時間かける方法を考案した。陰圧と時間のパラメ-タを設定するため、-20mmHg30分間と、日を改めて-40mmHg30分間の負荷を同じ被験者に与え、負荷の前後に70°ヘッドアップティルトを実施し、起立耐性低下の度合いを調べた。-40mmHg負荷30分間で10人中1人が失神前状態に陥った。3、6°HDT下でのLBNP負荷実験10人の被験者に対し、まず24時間の6°HDTによって被験者を軽度の脱水状態にした後、-30mmHgで60分間のLBNP負荷を行ない、循環動態や特殊ホルモンを含めた各種臨床検査を行なった。10人中5人が失神前状態に陥り、前年度から示唆されていた起立耐性低下に副交感神経緊張型と下肢の血液調節失調型の2種類あるという仮説を支持する2種類の起立耐性の低下が観察され、傍証が固まってきたと考えられた。本年度も前年度に引き続き、以下に示すような種々の実験条件の組み合わせの下で実験を行なった。各群6ないし10名の被験者について、6゚ヘッドダウンティルトを一定時間(1時間、3時間、および12時間)続けた状態で下半身に陰圧(-20mmHgおよび-40mmHgを各30分、または-30mmHgを1時間)を負荷して、下肢インピ-ダンスプレティスモグラム、心電図、非観血連続血圧、エコ-心電図などの循環動態計測、および血漿中の特殊ホルモンなどの測定実験を実施した。比較的短時間のヘッドダウンにおいては前後に70゚ヘッドアップティルトを実施して起立耐性の低下を評価し、12時間のヘッドダウンにおいては水分摂取制限を行ない、ヘマトクリットなどを測定して脱水状態を確かめ、前年度までの実験で分かっていた起立耐性の低下が起こり易い状態にあることを確認した。これらの各群に対して、(1)補液および薬剤(硫酸アトロピン)、(2)大腿部カフによる血液の移動制限、(3)下肢の筋肉ポンプによる血液の一部強制移動などを行ない、起立耐性低下に対する対策として妥当性があるかどうかの影響を調べた。結論として、(1)の補液は末梢抵抗減少型の起立耐性低下の回復に特に有効であり、薬剤は当然のことながら迷走神経緊張型の起立耐性の低下の例に有効であった。
自然免疫シグナルTRIF経路を介した視床下部炎症による摂食調節異常機構の解析

高脂肪食によって誘導される脳の自律神経中枢である視床下部の炎症反応が、摂食抑制ホルモンであるレプチンのシグナルを障害し、過食になることが肥満のメカニズムの1つとして注目されている。我々は、自然免疫センサーのシグナル伝達分子TRIFが視床下部炎症に関与し、摂食調整異常を誘導して、過食性肥満の発症に深く関与することを見出した。そこで本研究では、TRIFシグナルによる視床下部炎症の誘導機序を解明し、過食の新規分子メカニズムを明らかにする。
持久性運動に対する老化した筋の生化学的適応に関する研究

持久性トレーニングによる骨格筋の生化学的適応が、異なる加齢段階において、同じように起こるかどうかを明らかにするために、一般のマウスに比べて急速に老化現象を示することから、老化研究のモデル動物として有用な老化促進モデルマウス(SAM)を用いて脚筋のミトコンドリア内に局在し、有酸素性エネルギー代謝に関連する諸酵素、及び多量の体内への酸素摂取に伴って上昇する活性酸素を除去する働きを有するスーパーオキシドデスムターゼ(SOD)の持久性トレーニングによる適応用応答について研究を行った。初年度にはP/2系SAMマウスは老化が早く、生存率低下も通常の老化を示すR系SAMに比べて著しく早いので、12カ月齢以後では筋のミトコンドリア諸酵素活性を顕著に増加させるような激しい持久性トレーニングを行わせることが困難であることが明らかになった。そこで、最終年度においては、6カ月齢と10カ月齢のP/2系、R系SAMによる8週間のトレーニングを実施した。トレーニングはマウス用トレッドミルを用い、斜度15%で、速度と運動時間を週毎に増加し、第3週以降は21.4m/分で60分間の負荷で行った。8週間のトレーニング後、非運動対照群のマウスと共にと殺し、大腿四頭筋を採取し、ミトコンドリア内酵素であるクエン酸合成酵素(CS)、3ーヒドロキシアシルC_oA脱水素酵素(HAD)の活性を測定したところ、P/2系、R系いずれの加齢段階においても両酵素とも運動群が対照群に比べてそれぞれ3040%、2030%高い値であった。SODについては、総SODのトレーニングによる上昇はわずかであり、ミトコンドリア局在のSOD活性は運動群が非運動群よりも2030%高かった。しかし、細胞質SOD活性は持久性トレーニングによる影響を受けなかった。以上の結果から、たとえ高齢であっても激しい持久性運動を規則的に行うことが可能であれば、筋の生化学的適応は十分起こりうることが示唆された。老化促進モデルマウス(SAM)のうち,比較的緩徐で,正常な老化を示すR系(SAMーR)と,急速に老化現象を示すP系(SAMーP)の若齢か老齢までの各々の加齢段階における,筋ミトコンドリア中に存在するするTCA回路の諸酵素の一つであるクエン酸合成酵素(CS)と,酸素ラジカル除去系諸酵素の一つであるスーパーオキシドディスムターゼ(SOD)の活性を測定した.SAMーRは4,7,17,22カ月齢, SAMーPは4,7,13,16カ月齢においてと殺し,表層部に白筋線維,深層部に赤筋線維を含む大腿四頭筋を採取し,上記の酵素活性測定に供した.各々の月齢のマウスはTakedaらによる,行動性,皮膚,眼,脊柱の計11項目からなる老化度判定法により老化の程度が評価された.SAMーRは, 4及び7カ月齢では老化度評点は0であり, 17カ月齢では平均約4点, 22カ月齢では約6点であった.SAMーPは, 4カ月齢では0であったが, 7カ月齢ではすでに平均4点とSAMーRの17カ月と同水準の老化度評点を示した.さらに, 13,16カ月齢では,平均18点と著しく高いスコアーであった.

これらの結果は, SAMマウスに対する運動トレーニングの負荷は, R系では22カ月齢においても可能であるが,生存率の著しい低下と相まって, P系においては13カ月齢以上では不可能であることが示唆された.大腿四頭筋のCS活性は,とくに加齢による差は認められず, SOD活性についても,ミトコンドリア局在のMnーSOD,細胞質に存在するCu,ZnーSODいずれも,加齢による顕著な差は認められなかった.マウスに対する有酸素的なトレーニング条件の設定に関しては,トレッドミルの搬入が遅れたため現在検討中であるが,トレーニングによるミトコンドリア諸酵素への影響を明確にするには,できる限り強い負荷と,一定の期間(おそらく8週間程度)が必要であると思われる.
分化型脂肪肉腫発生に関わるHMGI-C遺伝子異常とその下流遺伝子群の同定

分化型脂肪肉腫の腫瘍発生に関わる分子機構をarchitecturalfactorの一つであるHMGI-C遺伝子の発現亢進とその分子機構ならびにHMGI-Cの間葉系腫瘍発生における役割に注目し,以下の項目に関し検討した。(2) In situ hybridization(ISH)法によるによるメッセージ発現の解析3. HMGI-C遺伝子のノックアウトマウス由来の線維芽細胞を用いたHMGI-C遺伝子の腫瘍発生における機能に関する検討分化型脂肪肉腫細胞では他の間葉系腫瘍に比べ明らかに高頻度(21/21例)かつ強いHMGl-C遺伝子発現を蛋白及びメッセージレベルで認めた.分化型脂肪肉腫内に発生した高悪性脱分化型脂肪肉腫では陰性化していた.Western blot解析では,分化型脂肪肉腫において発現されるHMGI-C遺伝子の分子量に異常はなく,nested RT-PCRでもcoding領域には明かな構造異常は認めなかった.Southern blotによる解析でも,HMGI-C遺伝子の増幅は観察されず,3'RACE法による解析でもHMGI-C遺伝子内における新たなキメラ遺伝子形成は現在まで検出されていない.HMGI-C遺伝子のノックアウトマウス由来の線維芽細胞を用いたin vitroのデータでは,HMGI-C-/-fibroblastは高頻度にtransformし,このtransformationはHMGI-C cDNAの導入により抑制された.以上の所見から,分化型脂肪肉腫の腫瘍発生にHMGI-C遺伝子の活性化が関わることが明かとなり,発現されたHMGI-Cは高悪性腫瘍へのプログレッションを阻止する役割を演じている可能性が示唆さた.分化型脂肪肉腫におけるHMGI-Cの活性化には,3'UTR AUUUA motifsあるいはプロモーター部の異常が関与している可能性が考えられ,継続して解析中である.分化型脂肪肉腫の腫瘍発生に関わる分子機構をarchitecturalfactorの一つであるHMGI-C遺伝子の発現亢進とその分子機構ならびにHMGI-Cの間葉系腫瘍発生における役割に注目し,以下の項目に関し検討した。(2) In situ hybridization(ISH)法によるによるメッセージ発現の解析3. HMGI-C遺伝子のノックアウトマウス由来の線維芽細胞を用いたHMGI-C遺伝子の腫瘍発生における機能に関する検討分化型脂肪肉腫細胞では他の間葉系腫瘍に比べ明らかに高頻度(21/21例)かつ強いHMGl-C遺伝子発現を蛋白及びメッセージレベルで認めた.分化型脂肪肉腫内に発生した高悪性脱分化型脂肪肉腫では陰性化していた.Western blot解析では,分化型脂肪肉腫において発現されるHMGI-C遺伝子の分子量に異常はなく,nested RT-PCRでもcoding領域には明かな構造異常は認めなかった.Southern blotによる解析でも,HMGI-C遺伝子の増幅は観察されず,3'RACE法による解析でもHMGI-C遺伝子内における新たなキメラ遺伝子形成は現在まで検出されていない.HMGI-C遺伝子のノックアウトマウス由来の線維芽細胞を用いたin vitroのデータでは,HMGI-C-/-fibroblastは高頻度にtransformし,このtransformationはHMGI-C cDNAの導入により抑制された.以上の所見から,分化型脂肪肉腫の腫瘍発生にHMGI-C遺伝子の活性化が関わることが明かとなり,発現されたHMGI-Cは高悪性腫瘍へのプログレッションを阻止する役割を演じている可能性が示唆さた.分化型脂肪肉腫におけるHMGI-Cの活性化には,3'UTR AUUUA motifsあるいはプロモーター部の異常が関与している可能性が考えられ,継続して解析中である.発生頻度の高い間葉系悪性腫瘍である分化型脂肪肉腫の腫瘍発生に関わる分子機構をarchitecturalfactorの一つであるHMGI-Cの遺伝子の異常発現に着目して解析した.1.分化型脂肪肉腫におけるHMGI-C遺伝子の発現亢進(i)免疫組織化学による各種肉腫組織でのHMGI-Cの発現解析分化型脂肪肉腫20例全例で高度の発現亢進が観察された.脱分化型部では発現は陰性化していた.脂肪肉腫粘液腫型およびMFHをはじめとする他の肉腫組織にはHMGI-C蛋白の発現は認めなかった.(ii)ウェスタンブロット法による発現解析分化型脂肪肉腫組織において分子量約20kDaのHMGI-C蛋白の発現が認められた.(2)分化型脂肪肉腫におけるHMGI-C遺伝子の転写亢進胎生612週のヒト胎児を陽性対照にたて、nested RT-PCR法にてHMGI-C遺伝子(exon15を含む)の発現を解析した.分化型脂肪肉腫症例ではHMGI-C mRNAの発現の見られるものと見られないものが存在した.分化型脂肪肉腫腫瘍細胞にHMGI-CmRNAが同定された.HMGI-C遺伝子内における融合遺伝子の形成、3'UTR部のAUUUAモチーフの異常、コピー数の増加によるHMGI-C遺伝子の発現亢進の可能性が上記結果より推測され、(1)、(2)に関し現在精力的に解析中である.(1)3'RACE法によるHMGI-C遺伝子の構造異常の解析(2)RT-PCR陽性例におけるHMGI-C遺伝子のコピー数のサザンブロット法による解析発生頻度の高い間葉系悪性腫.瘍である分化型脂肪肉腫の腫瘍発生に関わる分子機構をarchitecturalfactorの一つであるHMGl-C遺伝子の発現冗進機構とHMGl-C遺伝子発現の間葉系腫瘍発生における役割に注目し解析した。1.分化型脂肪肉腫におけるHMGl-C遺伝子の発現亢進機構の解析(1)分化型脂肪肉腫におけるHMGl-C遺伝子の転写亢進(3)3'RACEによるHMGl-C

遺伝子transcriptのクローニングとシークエンスによる解析を現在行っているが、現在まで明かなキメラ遺伝子形成などHMGl-C遺伝子の構造異常は見つかっていない。2. HMGl-C+/+fibroblastはほとんどtransformしないのに対して、HMGl-C-/-は継代培養により高頻度にtransformした.このtransformationはHMGl-C cDNAの導入にて阻止できた.間葉系腫瘍におけるHMGl-Cの蛋白レベルの発現解析の結果と総合すると、HMGl-Cの活性化は、間葉系腫瘍の高悪性肉腫へのプログレッションを阻止する役割を演じている可能性が示唆された.
臍帯血細胞を用いた多能性幹細胞の単離と心筋細胞への分化誘導法の確立

事前に慶応義塾大学の倫理審査において研究計画・意義・危険性につき同意を得る。ヒト膀帯血を入手するにあたり、患者夫婦に膀帯血の採取法、危険性や研究結果の発表方法(個人が特定されることはなくプライバシーが保たれることなど)等につき情報提供を行い膀帯血採取の同意を得る。ヒト膀帯血を入手後にヘパリンを混入し凝血を予防する。比重の違いを利用してヒト膀帯血より赤血球、血小板等の不要と思われる細胞を除き単核細胞のみを分離する。ヒト膀帯血の表面抗原を様々な抗ヒト表面抗原抗体に反応させflow cytometryを用いて解析、分離を行う。ある特定の表面抗原を呈する単核細胞集団を用い、ある特定の基質への反応性の違いから更なる細胞集団の分離精製を繰り返す。そこで得られた、細胞は特定の培養条件下において増殖能と分化性が維持されることが確認された。ここで得られた細胞に対して、様々なスクリーニングを行った結果から特定の基質と、増殖因子を組み合わせることにより一定の確立で心筋細胞が誘導されることが確認された。この細胞は自己拍動を開始し、心筋細胞特異的な転写因子、収縮蛋白、分泌因子などの発現がRT-PCR, Nortern blot, Western blot, Immunostainingなどの手法により確認された。この細胞を用いることにより、心筋梗塞モデル、心不全モデルの動物に細胞移植を行い、心機能改善・予後改善の程度を検討している。ヒト臍帯血より多能性幹細胞の分離と心筋細胞への分化誘導(1)ヒト臍帯血中の細胞より多能性幹細胞の分離:ヒト臍帯血を入手後にヘパリンを混入し凝血を予防している。ヒト臍帯血の表面抗原を抗ヒト表面抗原抗体を反応させflow cytometoryを用いて解析を行った。解析する表面抗原としてはCD34,c-kit等の造血幹細胞等の未分化な細胞に発現しているもの、CD45等の血球系の細胞に発現しているものや他の幹細胞に発現しているものを用い分化能の予測を行った。ヒト末梢血に比して臍帯血においては各種幹細胞マーカーの発現の上昇を認めた。比重の違いを利用してヒト臍帯血より赤血球、血小板等の不要と思われる細胞を除き単核球細胞のみを分離している(パーコール法)。ヒト臍帯血より得られた単核球細胞を各種培養皿(ファイブロネクチン等でコートあるいはコーティングなし)に無血清20%牛胎仔血清の条件下に培養している。本来血球系の細胞は培養皿に付着しないが、この方法では接着する細胞が高率に得られることが判明した。培養前・後の細胞に対して、上記と同様の細胞表面抗原の解析を行い表現系の変化から分化能を現在は行っている。(2)心筋細胞への分化誘導:(1)ヒト臍帯血由来多能性幹細胞を新生仔ラット心筋細胞と共培養を行い心筋細胞への分化誘導を行った。あらかじめヒト臍帯血由来の細胞を細胞膜に付着する色素を用いラベルすることにより共培養後に識別可能となった。低い確率ではあるがヒト臍帯血由来の細胞より心筋細胞と思われる形質を示す細胞が得られることが判明した。各種抗体を用いて免疫染色を行い分化誘導した細胞を共焦点レーザー顕微鏡にて観察したところ、あらかじめ標識した色素が存在する細胞の一部に心筋収縮蛋白や心筋特異的転写因子などを発現する細胞が出現することが判明した。(2)ヒト臍帯血由来多能性幹細胞に対して、心筋分化に関与していることが推測されている細胞増殖因子(BMP2,TGFβ,Activin-A, FGF-1/2,IGF-1,LIF, CT-1,PDGF-BB, HGF, EGF等)を添加し、心筋細胞への分化能を観察した。また我々が骨髄由来の間葉系幹細胞より心筋に分化した際に用いた脱メチル化剤5-アザシチジンを添加し心筋細胞への分化能を観察した。現在分化能を検討中である。事前に慶應義塾大学の倫理審査において研究計画・意義・危険性につき同意を得る。ヒト臍帯血を入手するにあたり、患者夫婦に臍帯血の採取法、危険性や研究結果の発表方法(個人が特定されることはなくプライバシーが保たれることなど)等につき情報提供を行い臍帯血採取の同意を得る。ヒト臍帯血を入手後にヘパリンを混入し凝血を予防する。比重の違いを利用してヒト臍帯血より赤血球、血小板等の不要と思われる細胞を除き単核球細胞のみを分離する。ヒト際帯血の表面抗原を抗ヒト表面抗原抗体を反応させflow cytometoryを用いて解析を行う。解析する表面抗原としてはCD34,c-kit等の造血幹細胞等の未分化な細胞に発現しているもの、CD45等の血球系の細胞に発現しているものや他の幹細胞に発現しているものを用い分化能の予測を行う。ヒト臍帯血より得られた単核球細胞をファイブロネクチン等の基質でコートした培養皿に無血清20%牛あるいは馬胎仔血清の条件下に培養する。培養前・後の細胞に対して、上記と同様の細胞表面抗原の解析を行い表現系の変化から分化能を予測する。<心筋細胞への分化誘導>(1)ヒト臍帯血由来多能性幹細胞を新生仔ラット心筋細胞と共培養を行い心筋細胞への分化誘導を行う。(2)ヒト臍帯血

由来多能性幹細胞に対して、心筋分化に関与していることが推測されている細胞増殖因子(BMP2,TGFβ,Activin-A, FGF-1/2,IGF-1,LIF, CT-1,PDGF-BB, HGF, EGF等)を添加し、心筋細胞への分化能を観察する。また我々が骨髄由来の間葉系幹細胞より心筋に分化した際に用いた脱メチル化剤5-アザシチジンを添加し心筋細胞への分化能を観察する。得られた自己拍動を開始した細胞に対し、心筋収縮蛋白であるアクチン、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、ANP、BNPの発現等を解析する。さらに心筋特異的転写因子である。Nkx2.5、GATA4、Tbx5、MEF2C、TEF-1遺伝子等の発現をNorthern blot法やRT-PCR法により解析する。自己拍動を開始した心筋細胞をガラス微小電極法により活動電位を記録する。<心筋梗塞モデルに対する細胞治療>免疫不全マウスを用いて心筋梗塞モデルを作成する。分化誘導後の心筋細胞あるいはヒト臍帯血由来多能性幹細胞を心筋梗塞部位周辺の心筋に移植(注射)を行う。その後、時間経過に従い心臓組織標本を作製し、免疫染色やin situ hybridysationを行い移植細胞の生着の有無等を観察する。また移植により、心筋梗塞のために低下した心機能の改善を超音波検査心臓カテーテル検査等により、また生命余後についても検討する。事前に慶応義塾大学の倫理審査において研究計画・意義・危険性につき同意を得る。ヒト膀帯血を入手するにあたり、患者夫婦に膀帯血の採取法、危険性や研究結果の発表方法(個人が特定されることはなくプライバシーが保たれることなど)等につき情報提供を行い膀帯血採取の同意を得る。ヒト膀帯血を入手後にヘパリンを混入し凝血を予防する。比重の違いを利用してヒト膀帯血より赤血球、血小板等の不要と思われる細胞を除き単核細胞のみを分離する。ヒト膀帯血の表面抗原を様々な抗ヒト表面抗原抗体に反応させflow cytometryを用いて解析、分離を行う。ある特定の表面抗原を呈する単核細胞集団を用い、ある特定の基質への反応性の違いから更なる細胞集団の分離精製を繰り返す。そこで得られた、細胞は特定の培養条件下において増殖能と分化性が維持されることが確認された。ここで得られた細胞に対して、様々なスクリーニングを行った結果から特定の基質と、増殖因子を組み合わせることにより一定の確立で心筋細胞が誘導されることが確認された。この細胞は自己拍動を開始し、心筋細胞特異的な転写因子、収縮蛋白、分泌因子などの発現がRT-PCR, Nortern blot, Western blot, Immunostainingなどの手法により確認された。この細胞を用いることにより、心筋梗塞モデル、心不全モデルの動物に細胞移植を行い、心機能改善・予後改善の程度を検討している。
DNA Highwireを足場にしたナノデバイスの超高密度実装

本研究は、DNA分子で構成される複数種のナノデバイスを、超高密度に実装する技術を開発する。研究代表者がこれまでに実現したDNA分子の非侵襲操作技術を利用することにより、DNA分子をマイクロピラー電極基板間を橋渡しする状態で献花し、溶液中にDNA highwireと呼ぶ新たな1次元構造体を形成する。これをナノデバイスの実装足場として利用することにより、従来は散在していたDNAデバイス同士を高密度・高精度に実装する。研究期間内にDNA Highwire形成までは到達できなかったものの、実現に必要な要素技術のうち微小構造体の開発に集中的に取り組み、効率的なDNA操作を達成した。本研究は、DNA分子で構成される複数種のナノデバイスを、超高密度に配置・実装する技術を開発するものである。研究代表者がこれまでに実現した独自技術であるDNA分子の非侵襲操作技術を利用することにより、DNA分子をマイクロピラー電極間を橋渡しする状態で懸架し、溶液中にDNA Highwireと呼ぶ新たな1次元構造を形成する。これをナノデバイス実装の足場として利用することにより、従来は散在して機能していたDNAナノデバイス同士を自己組織化を利用してナノメートルサイズのピッチで高密度かつ高精度に実装する。研究期間内に本提案原理を実証するため、金マイクロピラー電極間にDNA Highwireを形成し、塩基配列の相補性を利用した自己組織化によるDNAナノデバイスの配置を実証することを目標とする。研究目的の「DNA Highwireを用いたナノデバイス実装」を期間内に実現するため、以下の6ステップで実験技術の構築と検証を行う。平成27年度は(1)ナノ構造体を微細加工プロセスによって作製し、(2)レーザー操作光学系の制御システムの構築を完了させ、(3)DNAを固定するためのアミノ基修飾金マイクロピラー電極基板を作製に取り組んだ。(1)ナノ構造体の製作:これまでのDNA操作の実績に基づき、様々な長さのDNA分子を安定に捕捉し操作できるナノ構造体のデザインを決定し、電子線リソグラフィと紫外線リソグラフィを組み合わせた作製法により100万個程度一括形成し、リフトオフ法により水溶液中に回収する。本年度は特に、DNAを操作する際に滑ることなくDNA鎖方向に伸長操作が可能なナノ構造体のデザインを検討し、表面に微細な凹凸構造を形成することで操作距離を伸ばすことに成功した。(2)レーザー光学系制御システムの開発:配線操作に必要な2軸の光ピンセット光学系をすでに構築している。1軸のレーザーはガルバノミラーにより操作することができるようになっている。そこで、光トラップ位置を作業者が顕微鏡観察画面を見ながら、リアルタイムで操作できるようにするため、PCベースの制御システムの構築に取り組んだ。必要な装置の使用選定・購入・接続を行っており、今後テストを進める計画である。(3)アミノ基修飾金マイクロピラー電極の作製:ピラー電極と電源をつなぐ平面電極パターンをガラス基板上に作製した上に金ピラー電極を作製する。ピラーを電極として機能させるため、スパッタリングによりピラー表面を金で被覆する。その際、垂直壁面部分が完全に被覆されない可能性があるため、スパッタ条件の検討を行った。結果として側面にも金を均一に被覆することを達成した。電極と接触しただけではDNA分子を電極に接合できない。そこで、金表面に正電荷を持つアミノ基をピラー電極に化学修飾することで、負電荷を持つDNAを静電的に固定する。今後、金チオールにより形成した自己組織化単分子膜に、カップリング反応によりアミノ基を多数もつポリリジン分子を固定することを計画している。本研究は、DNA分子で構成される複数種のナノデバイスを、超高密度に配置・実装する技術を開発する。研究目的の「DNA Highwireを用いたナノデバイス実装」を期間内に実現するため、実験技術の構築と検証を行う。平成28年度は前年度に開発した操作技術を基に0.1ー1ミリメートル長のDNA分子を用いてDNA Highwireの形成実験に取り組み、その課題を明らかにした。その結果、現状のDNA操作に用いるナノ構造体では十分な操作距離が得られないことが判明した。そこで、構造体表面にナノサイズの微細凹凸を形成し、構造体間に生じる微細空間に効率的にDNA分子を閉じ込めることで、操作距離を数倍程度に向上することに成功した。一方で期間中には配線の実証とDNAナノデバイスの結合には到達することができなかった。期間内には、他にも周辺技術として構造体の姿勢制御のための光学系の構築や作製工程の変更による視認性の向上を達成しており、さらなる開発を推進する環境が整備されたと考えている。

これをナノデバイスの実装足場として利用することにより、従来は散在していたDNAデバイス同士を高密度・高精度に実装する。研究期間内にDNA Highwire形成までは到達できなかったものの、実現に必要な要素技術のうち微小構造体の開発に集中的に取り組み、効率的なDNA操作を達成した。(4)DNA Highwireの形成実験:操作時の粘性抵抗力によるナノ構造体トラップ姿勢の変化とトラップからの脱離現象の観察から最大トラップ力、安定したトラップ姿勢が得られる限界速度を決定し、その発生力・速度以下の領域で配線操作を行う。DNAには操作実績を有しているゲノムマーカー用の0.1ー1ミリメートル長の市販のDNAサンプルを使用する予定である。蛍光顕微鏡下でリアルタイム1分子観察を行いながら、金ピラー電極への固定化と懸架実験を行う。また、並行して操作に必要な光学系制御システムの構築と高度化を27年度に引き続き進める。(5)原理実証用ナノデバイスの作製:DNA Highwireの一部分の配列と相補的な配列をもつ短鎖DNAもしくはPNAなどの人工核酸を合成し、量子ドットなどのナノサイズの蛍光粒子に固定化することで、原理実証用のナノデバイスとして用いる。複数種のターゲット配列に対して異なる蛍光波長のナノ粒子を使う。(6)ナノデバイスの実装実験:金表面のアミノ化に取り組み、達成された後、提案手法の原理実証のため、作製したナノデバイスである複数種類の蛍光ナノ粒子をDNA Highwireに対して実装する。塩基の相補性を利用したハイブリダイゼーション処理により、粒子をHighwireに固定化し、多色蛍光観察により、粒子の結合・配列の可視化評価を行う。マイクロ・ナノ工学