hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
統合失調症の社会機能測定ツールの開発ー社会脳を実世界で評価する

テスト参加者20名は男性11名、平均年齢23.3歳、平均教育年数15.6年、推定値IQ(JART)103.9で、実施は20名いずれも円滑であり、実用性には問題がなかった。この評価時より標準的な評価尺度を確定する予定である。同時にパフォーマンステストの基準関連性を評価するために、社会的認知の評価(Social Cognition Screening Questionnaire)、およびメタ認知の評価(Beck Cognitive Insight Scale)を同時に実施し、現在その解析中である。統合失調症では就労や交友などの社会機能が障害されるが、その基盤として社会認知機能が注目されているが、文化差の問題などがあり、実世界で行動する能力を客観的に測定する標準化された尺度はまだ開発されていない。そこで社会認知機能のパフォーマンステストを作成した。研究の趣旨を説明し同意の得られた20・30代の男女36名(健常者20名、統合失調症患者16名)を対象とし、パフォーマンステストの実施と知的機能の簡易評価尺度JART(Japanese Adult Reading Test)、ベック自己認識評価尺度BCIS(Beck Cognitive Insight Scale)、心の状態推論質問紙SCSQ (Social Cognition. Screening Questionnaire)などを評価した。両群で有意差のあった年齢と教育年数を共変量として、各尺度の得点を共分散分析で群間比較したところ、パフォーマンステストの各項目で両群の社会的スキルの差が明確に示された(判別妥当性あり)。パフォーマンステストの多くの項目はSCSQやBCISの各項目と有意な相関があり(基準関連妥当性あり)、社会的認知が高いものは状況把握からプラン策定と実行、外顕的行動などの一連の社会的スキルの得点が高く、逆に自己認識の確信度の高いものは状況把握や事実認識などの得点が低かった。社会認知では状況把握から表出行動までの一連の過程とそれに対する自己認識が想定されるが、今回の因子分析でもそれに対応する因子が抽出された。児童や中年以後の成人や男女差、およびパフォーマンステストの評価の信頼性については今後の課題である。統合失調症の実世界で行動する社会的能力を客観的に測定するパフォーマンステストを作成した。同意の得られた20・30代の男女36名(健常者20名、統合失調症患者16名)に、パフォーマンステストと、知的機能の簡易評価尺度、ベック自己認識評価尺度、心の状態推論質問紙を行った。両群で有意差のあった年齢と教育年数を共変量として共分散分析で群間比較したところ、パフォーマンステストで両群の差が明確に示された(判別妥当性)。パフォーマンステストは社会的認知を評価する尺度と有意な相関があった(基準関連妥当性)。因子分析で状況把握から表出行動までの一連の過程とそれに対する自己認識の因子が抽出された。平成24年当初の研究計画書においては、3年間で実用的な社会機能の評価尺度を開発することを目標とした。1年目には、既存の社会機能の評価尺度を精査して、社会生活に要請される領域を絞り込み、評価項目を設定した。同時に開発すべき評価尺度の基本設計を行った。2年目には、評価項目それぞれについてのシミュレーション場面を製作した。
意識下動物における脳血流の連続的記録法の開発と調節機序の解析法

1.意識下のラットを生理的に安定な状態に維持して、レーザードップラー血流計を用いて脳血流を安定に連続的に測定する方法を開発した。ハロセンでラットを麻酔し、脳局所血流を測定したい部位の頭蓋骨をはずして替わりに透明のアクリル板をはめ込み、その上にレーザードップラー血流計プローブ用のガイドカニューレをのせて歯科用セメントで固定した。次に、ラットをハンモックに固定し、手足は自由に動かせるが移動はできないようにラットを保持した。ラットを麻酔から覚醒させた後、大脳皮質血流を連続的に安定に測定できた。この方法を応用してマイクロダイアリシスプローブによる大脳皮質細胞外液の採取も可能となった。これにより意識下ラットの大脳皮質局所血流と神経伝達物質を連続的に測定することが可能になった。2.1.の方法を用いて、ラットをトレッドミルにのせてゆっくりと歩行させ、歩行時の大脳皮質の血流とアセチルコリンを測定することに成功した。歩行により大脳皮質の血流とアセチルコリンはともに歩行前の約150%に増加した。歩行による大脳皮質の血流増加反応はアセチルコリンのニコチン受容体遮断薬メカミルアミンの投与により減弱した。したがって、歩行時に脳内のコリン作動性神経系が作動して大脳皮質にアセチルコリンが放出され、大脳皮質血管が拡張することがわかった。3.本方法を改変して、脳の深部にある海馬の血流を意識下動物で測定することが可能となり、歩行により海馬血流が薬1020%程度増加することがわかった。1.意識下のラットを生理的に安定な状態に維持して、脳血流を安定に連続的に測定する方法を開発した。麻酔動物で脳血流測定に用いてきたレーザードップラー法は脳局所血流を連続的に測定できる。しかし、振動などのアーチファクトが入りやすいという欠点があり、意識下の動物で使えなかった。そこで、ハロセンでラットを麻酔し、脳局所血流を測定したい部位の頭蓋骨をはずして替わりに透明のアクリル板をはめ込み、その上にレーザードップラー血流計プローブ用のガイドカニューレをのせて歯科用セメントで固定した。次に、ラットの体に布をまいてその布を支柱に固定し、手足は自由に動かせるが移動はできないようにラットを保持した。この方法はマイクロダイアリシスプローブにも使えたので、意識下ラットの大脳皮質局所血流と神経伝達物質を連続的に測定することが可能になった。1.の方法を用いてラットの体を1ヶ所に保持しておいて、ラットをトレッドミルにのせてゆっくりと歩行させ、歩行時の大脳皮質の血流とアセチルコリンを測定することに成功した。ラットを麻酔から覚醒させた後、大脳皮質血流を連続的に測定できた。

これにより意識下ラットの大脳皮質局所血流と神経伝達物質を連続的に測定することが可能になった。2.1.の方法を用いて、ラットをトレッドミルにのせてゆっくりと歩行させ、歩行時の大脳皮質の血流とアセチルコリンを測定することに成功した。歩行により大脳皮質の血流とアセチルコリンはともに歩行前の約150%に増加した。歩行による大脳皮質の血流増加反応はアセチルコリンのニコチン受容体遮断薬メカミルアミンの投与により減弱した。したがって、歩行時に脳内のコリン作動性神経系が作動して大脳皮質にアセチルコリンが放出され、大脳皮質血管が拡張することがわかった。3.本方法を改変して、脳の深部にある海馬の血流を意識下動物で測定することが可能となり、歩行により海馬血流が約1020%程度増加することがわかった。
イネ科植物の核ゲノムの分子構造

本総合研究班において実施した3項目の研究の成果概要は、以下のとおりである。1)RFLP座位の連鎖地図の作成:常脇はパンコムギの21染色体のRFLP座位の連鎖地図を作成し、ほとんどの座位の座乗染色体腕を決定した。中村は、RAPD断片のコムギ染色体上の位置を決定した。また、常脇、森、中村は、これらRFLP座位を標識するDNA断片をプローブとするRFLP分析により、4倍性および6倍性コムギのすべての種について互いの系統関係を確立し、併せて、各ゲノムの遺伝的変異量と進化速度を推定した。一方、荻原は一粒系コムギのRFLP座位の連鎖分析に必要なDNAクローンを作出し、平井はパルスフィールド電気泳動により巨大DNA分子の単離に成功し、三上はペレニアルライグラスのrRNA遺伝子領域の物理地図を作成した。2)特異的配列の研究:期間中に最も大きな研究の展開をみたのがこの項目である。向井、辻本および山本は、GISH法およびFISH法を開発した。荻原、宮下、寺地、辻本、安室はコムギ、カモジグサ、ライムギなどに特異的な高度反復配列のクローニングに成功したが、これらクローンを用いたGISH法やFISH法(とくに、多色FISH法)による研究により、ゲノムおよび染色体における複数の特異配列の空間および線状配列について極めて新寄性の高い情報が得られた。また、遠藤による分染法の改良により、染色体の分染地図とRFLP地図の統合が可能となり、遠藤、向井、辻本および常脇は、それぞれ、別個の染色体について両地図の統合に成功した。3)ゲノム再編成因子の研究:遠藤はパンコムギにおいて、配偶子致死遺伝子によって誘発される染色体末端の欠失を精力的にスクリーニングし、400以上の欠失を同定した。この系統は上記の分染地図とRFLP地図の統合に大きく貢献した。谷坂はイネの細粒遺伝子座に近接して存在するmutatorの遺伝的特性を解明するとともに、この遺伝子をクローニングするための分子的方法を追及し、確立が最も高いと思われる方法を明らかにした。イネ科植物の核ゲノムの分子構造を解明し、将来の分子操作によるイネ科作物の改良のための基盤を構築するため、3項目の研究を実施している。それぞれについて、本年度得られた成果は次のとおりである。1)DNAライブラリーの作成とRFLP分析ーパンコムギ(常脇),一粒コムギ(荻原),ペレニアルグラス(三上)のゲノミックDNA,及びパンコムギのCDNA(森)を用いてクローンを作成し、RFLP分析のプローブに適したものを選抜した。また、パンコムギでは、このクローンを用いて、2品種CSとSpeltaのF2集団についてRFLP分析を行い、RFLP座位の連鎖地図を作成した(常脇)。また、イネではパルスフィルド電気泳動法により、1Mb以上のDNA断片の分画に成功した(平井)。2)特異配列の研究ー(1)超変異配列:パンコムギで超変異性を示すDNAクローンを1個得てその全構造を決定し、それに基づいて変異性の原因を推定した(宮下)。(2)種特異的配列:ライムギ(Rゲノム),オオムギ(Hゲノム),Aegilops caudata(Cゲノム)

染色体のみを特異的に識別するISH(in situ hybridigation)法を確立した(向井・辻本)。(3)高度反復配列:ライムギ固有の超高度反復配列を6クローン単離することに成功した(安室)。(4)核・オルガネラの共通配列:核・葉緑体・ミトコンドリアの3ゲノムに共通の配列をDNAデータバンクを利用して、検索した(寺地)。3)ゲノム再編成因子の研究ー(1)配偶子致死遺伝子:コムギに導入したとき染色体の構造異常を誘発するAe.triuncials,Ae.cylindrica,Ae.speltoides由来の配偶子致死染色体をCバンド法で比較分析し、それぞれの形態的特徴を明らかにした。また、誘発された染色体異常を50種類単離し、異常染色体の同定を行った(遠藤)。(2)Mutator:イネのmutatorであるsl遺伝子の連鎖地図上の位置を決定した(谷坂)。イネ科植物の核ゲノムの分子構造を解明し、将来の分子操作によるイネ科作物の改良のための基盤を構築するため、3項目の研究を実施している。それぞれについての本年度の成果は、次のとおりである。1)DNAクローンの作成とRFLP分析--顕微鏡レベルのサイズの核DNAを単離する手法を確立するため、イネ緑葉から抽出した巨大DNAのパルスフイルド電気泳動を行い、50-300kbの大きさのDNA断片の単離に成功した(平井)。また、昨年度までに作出したDNAクローンをプローブに用い、2倍性及び倍数性コムギ(常脇・森)、Aegilops属Sitopsis節植物(宮下)、栽培品種を含むLolium属植物(三上)、イネ科の主要禾殻8種(荻原)のRFLP分析を行い、種内変異、種間関係について多くの新知見を得た。2)特異配列の研究--辻本はコムギ・エギロプス属のA及びCゲノムに特異的なクローンを単離した。向井はゲノム特異的配列をプローブに用いてパンコムギの3種ゲノムの染色体を可視的に識別することに成功した。安室はライムギゲノムに特異的なクローンを3種単離し、それぞれの構造を決定した。寺地は核ゲノムからミトコンドリアゲノムへの遺伝子移行の機構を明らかにするため、そのような遺伝子のcDNAを単離した。3)ゲノム再編成因子の研究--遠藤は新しい染色体切断因子を2つ発見し、切断の株式をCバンド法で研究した。谷坂はイネMutatorの作用が生育の全期間にわたって発現することを明らかにした。最終年度に当たる本年度の研究成果の概要は、下記のとおりである。1)RFLP座位の連鎖地図の作成:常脇は、パンコムギのヒストン遺伝子及その調節タンパク質遺伝子の24座位の座乗染色体を決定し、その一部についてRFLP座位連鎖地図上の位置を特定した。中村は、4倍性コムギ特異的RAPD断片について、6倍性コムギにおける座乗染色体を決定し、クローニングを行った。荻原は、一粒系コムギのゲノミッククローンのライブラリーを構築し、連鎖地図作成に適したクローンを選別した。平井は、パルスフィールドでrRNA遺伝子を含む巨大DNAを単離し、その両端のDNA断片をクローニングした。三上は、ペレニアルライグラスのrRNA遺伝子座について6種制限酵素による物理地図を作成した。2)特異配列の研究:宮下は、コムギのBゲノム特異的DNAクローンをプローブにして、エギロプス属シトプシス節各種の系統関係を調べた。
扶養制度の展開可能性－公的扶助に対する優先、補完・廃止

本研究は、ドイツ法との比較研究を通じて、日本における私的扶養制度の展開を検討するものである。ドイツでは、社会扶助が先行して給付され、その後扶養義務者への償還請求を行う仕組みをとりつつ、高齢社会を背景として基礎保障制度が整備され、老親の扶養義務者への償還請求は年収による制限が設けられ、部分的に私的扶養優先原則が後退する仕組みも整備している。このような法状況のなかでも強制可能な私的扶養が維持されているのは、私的扶養制度を維持することで当事者間での任意の扶養の履行につながり、それが「家族」の保護にもつながる可能性があるからである。この観点は、今後日本における扶養制度の展開を考える指針となる。2014年度における本研究の実施計画(1)ドイツ法において、社会扶助の受給者の扶養義務者に対する償還請求が可能となる要因を、社会扶助制度と扶養法の両面から探るについては、拙稿「扶養の権利義務の明確化と公的扶助制度との調整ードイツ法の視点から」において、ドイツ法上扶養義務者への償還が可能となる要因として、私的扶養における権利義務が規定されている中で、扶養権利者の権利は、社会扶助の客観的基準と扶養法の相当性、その他の社会給付による収入、権利者の財産、その他の共同体からの収入を考慮して要扶養状態を判断し、償還請求のなかで、扶養義務者の給付能力について、義務者の収入、居住用住居とその他財産、義務者の将来の生活、扶養義務者と配偶者等の生活における留保財産などを考慮して認定し、判例法理がされに精緻化されている。また、償還請求が否定される場面もこの請求の中で、民法上のルール、社会扶助法上のルールに従い厳格に判断されていることが明らかとなった。また、実施計画(3)ドイツにおいて社会法第12編に編入された高齢時と稼働能力喪失における基礎保障制度が整備されるにいたった経緯、現在の活用状況、さらにこの制度をめぐる肯定説・否定説について検討することについて、現在も介護保険でまかなえない需要について、社会扶助の問題となっていることが明らかとなった。基礎保障の是非については、2015年にドイツ訪問をしてえた資料等をもとに現在検討中である。実施計画(2)の日本での償還請求を機能させるための扶養制度および生活保護制度の検討については、日本法では、生活保護法改正により導入された扶養義務者への通知制度が、生活保護法77条の償還請求に向けた一石となることを指摘しつつ、償還請求を円滑に行うには、民法上のルールを明確化する検討が必要であることを明らかにした(拙稿「扶養法と生活保護法の現状と課題)。2015年度における本研究の課題は、昨年度の研究から生じた課題と本年の課題である社会保障制度・家族政策とそれをささえる理念の展開をもとに扶養のルールを検討しつつ、貧困政策をささえる財政的基盤について検討することであった。そこで、第1に、扶養制度が現行法に至った経緯をたどることで、国家による社会政策が与える扶養法制への影響さらに、高齢社会・核家族化が進行するなかでの日本型福祉の限界を踏まえた扶養制度のルール化の可能性を2016年3月11日家族法フォーラム(京都大学山本敬三=神戸大学窪田充見主催)の研究会にて、「扶養法における協議」をテーマに口頭報告を行った。ここでは、昨年行ったドイツ法との比較をもとに日本法のルールの展開可能性を示した。この報告は、本研究の中間報告と位置づけられる。第2に、社会政策との関係において、日本法がこれまで高齢者の介護から生じているリスクを解消してきたのか、介護保険制度が整備されて以降はどのような現状となっているかという問題について、家族がおかれている法的地位の観点から検討を加え、従来の家族主義的ケアから生じる問題点(本人の意思の欠缺・対立)を指摘しつつ、本人・家族の意向の実現と社会による負担の問題(財政的限界)との関係をいかに調整していくかという問題を明らかにした(拙稿「親族による財産管理と法的地位」)。第3に、従来の本研究では、社会扶助・基礎保障・介護保険などの社会法上の各制度を中心に検討をすすめてきたが、ドイツはEUの加盟国であることからEUが行っている貧困政策もドイツ国内に影響を及ぼす可能性があるため、このような観点からアプローチを試みたところ、山口大学の豊嘉哲教授より、「EUの社会保障政策へのヨーロッパ経済の影響について」というテーマで食料支援の観点から有益な示唆を得た。上記研究実績の通り、2014年度の研究成果とそこから生じた課題は、2015年度の研究を進めるうえでも重なる中心的な課題であったため、計画段階から予想されていたことであった。したがって、2015年度は、上記課題にとりくみつつ、当初から予定していた扶養制度と社会保障制度の調整を行うための理念的レベルでの課題から取り組み、3月の段階で口頭報告を行った。この点か当初通り進んだ点といえる。また、2015年の研究成果をもとに、家族関係への社会政策の転換の影響も予定通りすすみこの研究成果については公刊につなげることができた。

さらに、ドイツにおける貧困政策とEUにおける社会政策の一つとしての食料支援と経済状況の影響についても、この分野の専門家から知見をえることで、財政規律が社会政策にす少なからず影響を与えることが分かったが、この点がドイツ固有の社会政策や家族政策に影響があるのかどうか等についてはなお検証が必要となり、昨今のドイツの国内事情(難民流入)が、現在のドイツ国内の社会政策に影響があるのかという点も新たな課題として今年度生じたことから、このような問題点も踏まえた検討が本研究においては必要な課題であることが分かり、2015年度に行うことを予定していた経済事情と財政事情が与える社会政策への影響とそれが間接的に扶養法に与える影響について十分な分析が、現時点では出来ていない状況といえる。そして、この分析ができていない一因として当初予定していたドイツ国内での調査が今年度できなかったことがあげられる。したがって、上記のような評価になっている。2016年4月1日から8月31日までは、主に、日本のこの分野についての判例の状況を中心に検討した。特に、125歳の無職無収入の子の扶養義務の程度に関する裁判例(大阪家裁平成26年7月18日)、2成年者の親に対する扶養義務の算定方法に関する裁判例(札幌高裁平成26年7月2日)を中心に検討し、扶養の権利義務に関する規定が不明瞭な日本法のもとでは、扶養の権利者が必要な保護を受けられないだけでなく、扶養義務者の義務の限界が明確ではなく、扶養義務者も不安定な状況におかれていることを明らかにしている。2016年9月1日よりドイツ・ボン大学(Institut fuer Deutsches, Europraeisches und Internationales Familienrecht)の客員研究員として在外研究の機会をえて、本研究の比較対象であるドイツの状況を検討している。特に9月から3月にかけては、ドイツにおける1血族扶養(特に高齢の老親に対する扶養)と2未成年者に対する親の扶養義務、3離婚後扶養を含めた夫婦間の扶養義務の正当化根拠を中心に検討しつつ、貧困防止をめぐるドイツの近年の政策状況も検討し、これらの検討から生じている本研究を遂行するなかで生じている疑問を、現地の研究者である教授(Coester-Waltjenゲッティンゲン大学名誉教授、Hilbig-Luganiデュッセルドルフ大学教授)にミュンヘンにて2017年3月1日インタビューを行い、ドイツにおいて血族扶養制度が改革されずに維持されている制度的背景を確認した。このほか、ボン家庭裁判所(3月16日)・ボン少年局(3月17日)に訪問調査をし、2016年に改正された扶養前貸し制度の状況等を確認している。高齢社会を維持するための社会法の状況や家族の貧困を解消するためのドイツにおける家族政策の状況についても検討中である。2016年9月1日より2017年8月末まで、ドイツ・ボン大学にて在外研究の機会を得ている。そのため、2016年前期中は、在外研究の準備等と学内の業務負担が重なり、当初の予定に反して研究を進めることができなかった。また、ドイツでの在外研究の機会は、本研究を遂行するうえで当初予定した以上に、本研究の課題をより深くまた多角的に検討するための機会となっている。すなわち、本研究の中心的課題となっている血族扶養と社会法との関係に関する分析は、扶養義務者世代の義務負担の集中と公平な分担、扶養義務者自身の生活上の権利の保護の観点からみたときに、夫婦間扶養や未成熟子への扶養も含めた検討が必要となることに気づくきっかけとなり、このような新たな課題も含めた検討も行っている。上記の通り研究環境の変化にくわえ、研究の多角的な分析の必要性という実質的から、本研究の研究期間を延長した方がより本研究をより本質に迫る成果が得られるものと判断し、2016年度末で終了することをせず2017年度末まで延長することにした。
階層的マルチスケールプラズマ流体シミュレーションによる高速磁気再結合過程の研究

本研究の主目的は磁気流体(MHD)シミュレーションと二成分磁気流体シミュレーションおよび粒子シミュレーションコードを時空間的に融合し階層構造化してシミュレーションするコードをもちいて高速磁気再結合過程における磁気拡散領域とスロー衝撃波、およびプラズモイドを含むPetschek解の存在性を検証し、ミクロな異常電気抵抗とマクロな高速磁気再結合およびプラズモイド形成過程の関係を明らかにすることである。具体的には、それらマルチスケールシミュレーションによる研究とPetschek解とプラズモイドの接続に関するMHD理論的研究を並行しておこなってきた。まず、MHD理論の研究ではプラズモイド周辺のMHD波動状態の解析結果からプラズモイドの移動速度が上流プラズマのベータ値とプラズモイドのふくらみ方により一意に決まることをつきとめた。次に、マルチスケールコードの研究については、小さなスケールコードをイオン粒子+電子流体のハイブリッドコードとし、大きなスケールコードをMHDコードまたは二流体MHDコードとして融合したマルチスケールコードを作成した。計算そのものは可能な段階まできているが、これら各スケールのコード間結合の処理時間においてまだ十分な並列実行パフォーマンスが得られておらず、コード開発が続けられている。つまり、現時点では、マルチスケール化により、従来のシングルスケールコードよりも大幅なメモリ節約は可能であるが、ミクロスケールコードの計算領域を磁気拡散領域に強く局在化すると、コード間結合(両スケールコードの境界領域でのデータやりとり)で数値的不安定性が起こるし、かといって、ミクロスケールコードの計算領域を拡大すると、ミクロスケールコードの計算負荷が増えていまい、マルチスケール化のメリットが消失してしまうという問題がうまく解決できていない。これは自発的な高速磁気再結合過程では、磁気拡散領域そのものが電流層に沿って移動したり、広がっていくことへの対応が未だに不十分なためである。なお、もうひとつのマルチスケールコードとして、MHDマクロスケールとMHDミクロスケールを組み合わせて、高い計算精度を要求する磁気拡散領域を細かいメッシュで解き、他の領域は荒いメッシュで解く三次元MHDマルチスケールコードの製作も行った。これをもちいて、高速磁気再結合過程が三次元的に強い非線形不安定性をしめし、三次元的に強く局在化して発生することを数値的に示した。この研究は太陽フレアにともなうプラズマ下降流の観測との関連が指摘されている。まず、一成分磁気流体力学(MHD)シミュレーションにより高速磁気再結合過程におけるプラズモイド圧縮加熱の様子とスロー衝撃波および断熱膨張によるプラズマ加速機構の関係をしらべた。昨年までの研究により、上流磁場領域のベータ値が0.5以上の場合、スロー衝撃波により生じる再結合ジェットは亜音速となり、ゆえにプラズモイド前面にはファースト衝撃波は現れない。そのとき、再結合ジェットは亜音速断熱膨張加速により二次的加速を受ける。一方、上流磁場領域のベータ値が0.5以下の場合、再結合ジェットは超音速となり、ゆえにプラズモイド前面にはファースト衝撃波は現れる。そのとき、再結合ジェットは超音速断熱膨張加速により二次的加速を受けることがわかっている。これらはいずれも開領域境界条件においておこなわれた。これを踏まえて、本年度は、太陽フレアにおいてすでに観測されているループトップ加熱現象との対比をおこなうため、閉領域境界条件として、つまり、高速磁気再結合過程により生じたプラズモイドがジェット下流に堆積する場合のプラズマ圧縮加熱について調べた。

結果として、閉領域境界条件では開領域境界条件のときよりも全般にプラズマ圧縮が上昇したが、超音速断熱膨張加速の場合はファースト衝撃波におけるプラズマ圧縮加熱が正のフィードバックにより著しく強められ、しかもその圧縮加熱領域がブロードに広がる傾向があるのに対し、亜音速断熱膨張加速の場合は負のフィードバックによりプラズマ圧縮加熱が弱められ、しかもその領域がプラズモイド前面に強く局在化することがわかった。つぎに、ホールMHDシミュレーションにより開領域境界条件における高速磁気再結合過程を調べた。従来から粒子コード、ハイブリッドコード等において磁気中性点付近の磁場が電流方向にねじれる効果が知られているが、これはホールMHDでも現れる。ただし、断熱膨張加速領域ではその効果は弱い。そして、プラズモイド周辺では再び同様な効果が現れるが、超音速の場合においてさえも、その磁場のねじれ効果は磁気中性点付近よりも弱いことがわかった。これは高速磁気再結合過程における電流強度分布からも予想されることであるが、今後は閉領域境界条件における同様なシミュレーションを実施し、それを踏まえてホール効果の強く現れる領域においてさらにミクロなプラズマの振る舞いを解くために階層的シミュレーションコードを適用する予定である。本研究の主自的は磁気流体(MHD)シミュレーションと二成分磁気流体シミュレーションおよびVlasovシミュレーションコードを時空間的に融合し階層構造化してシミュレーションするコードをもちいて高速磁気再結合過程における磁気拡散領域とスロー衝撃波、およびプラズモイドを含むPetschek解の存在性を検証し、ミクロな異常電気抵抗とマクロな高速磁気再結合およびプラズモイド形成過程の関係を明らかにすることである。現在、MHDスケールと二流体のコードを融合し並列処理化する研究とPescchek解とプラズモイドの接続に関するMHD理論的研究を並行しておこなっている。後者の研究ではプラズモイド周遊のMHD波動状態の解析結果からプラズモイドの移動速度と上流プラズマ状態の関係について部分的に解明された。その一部は文献になった。前者の研究について、各スケールのコード間結合は第一に差分格子の空間的接続問題、第二に時間ステップ調整問題に帰する。こめうち後者についでは大きなスケールゴード側で時間を間引いて計算することで大きな問題はない。前者は従来の構造格子を両コード間の境界付近で重ねておいて、ある種の減衰フィルタをもちいて波動の空間的な構造を調節している。
(チオフェン/フェニレン)コオリゴマー自己キャビティからのポラリトンレーザー発振

本年度は,DBRマイクロキャビティ中に(チオフェン/フェニレン)コオリゴマー(TPCO)薄膜を成膜し,その光学特性を調べることを目的とした。対象物質は,2,5-Bis(4-biphenylyl)thiophene (BP1T)と5,5'-di([biphenyl-4-yl)-2,2'-bithiophene (BP2T)の2種類とした。これまでのTPCOを用いたレーザー発振の研究においては,気相成長法や溶液成長法によって作製した単結晶を用いたものが主であった。今回は,溶液プロセスを用いたマイクロキャビティの作製を目指し,ミニエマルション法によってBP1TとBP2Tのサブミクロン粒子を初めて作製し,その評価を行った。TPCOサブミクロン粒子の透過電子顕微鏡(TEM)観察を行ったところ,400nm程度の粒子が作製できていることが確認できた。Poly(vinyl alcohol)(PVA)膜中にTPCOサブミクロン粒子を埋め込んだ複合膜を活性層とする分布ブラッグ反射鏡(DBR)ーAuマイクロキャビティの角度分解透過スペクトル測定を行った結果,励起子エネルギーと交差する共振器モードを確認した。このことから,活性層厚を適切に調整できたと考えられる。現状ではQ値が46程度であるため,Q値を向上させることで明確なラビ分裂が期待できる。DBRーAuマイクロキャビティの発光スペクトルにおいては,ミラー帯域中においても強い発光が観測され,複数の共振器モードも見られた。簡便な溶液プロセスを用いてTPCOサブミクロン粒子膜を活性層とするマイクロキャビティの作製を初めて作製できた点は新規性があるが,TPCO結晶を活性層とするマイクロキャビティの作製条件の確立はまだできていない。まず,TPCOサブミクロン粒子を用いたマイクロキャビティのレーザー発振スペクトル測定及び時間分解測定を行う予定である。それと並行して,TPCO粒子の粒子径及び活性層厚の制御を試みる予定である。TPCO結晶を活性層とするマイクロキャビティについては,BP1T-CN結晶において先行例があるため,その文献を参考にしてサンプル作製を行い,キャビティポラリトンの存在を実証する。年度末にDBR基板や光学部品等の購入を考えていたが,納期に時間がかかることがわかり,年度内の納品が間に合わないことから,発注を取りやめた。そのため,使用予定の予算を全て執行することができなかった。
ラット皮質味覚野での反応性興奮の発生の時間的及び空間的拡がりの研究

膜電位測定装置(浜松ホトニクス・Argus50)を用いて、口腔内味刺激に対する大脳皮質味覚野での興奮伝播の時間的・空間的拡がりを調べることを目的とした。ウィスター系ラットを、人工呼吸ウレタン麻酔下で維持した。皮質味覚領域が水平になるように脳固定装置に固定し、開頭後、硬膜を取り除き、膜電位感受性色素(di-2-ANEPEQ)を浸透させた。舌電気刺激の直前に味溶液(0.2M NaCl(N)、0.03M HC l (H)、0.15M NaCl(S)、NとHの混合液(N+H))を滴下し、味質による光学応答の違いを調べた。舌陽極電気刺激による光学応答のピーク潜時は約1545msで、誘発電位のピーク潜時(1737ms)とほぼ一致した。また、舌陰極電気刺激では、光学応答のピーク潜時(810ms)は、誘発電位のピーク潜時(1014ms)とほぼ一致した。本研究で得られた光学応答のピーク潜時は、誘発電位ピーク潜時(文献:約3040ms)とほぼ一致したこと、光学応答が現れた部位は組織標本から皮質味覚領域であることから、舌陽極電気刺激による電気性味覚を表わすものと考えられる。舌陽極電気刺激による光学応答ピーク潜時は、舌陰極電気刺激時に比べ長かった。このことは陰極電気刺激が、舌神経および鼓索神経を直接刺激すると推定されるのに対して、電気性味覚が陽性電流によって味細胞膜周辺にイオンが電気泳動的に蓄積されて起こることに因ると考えられる。光学応答は、口腔内に滴下した味の種類にかかわらず、皮質のほぼ同じ領域に出現した。これは、皮質味覚領域でのN-、H-、NH-ベスト・ニューロンの混在を示唆する。しかし、Nまたは、N+Hの滴下時の陽極電気刺激による光学応答は、HまたはS滴下時よりも広い領域で認められる傾向であった。これは、電気生理学研究でN-ベスト・ニューロンが最も多く記録されることと一致する。膜電測定装置(浜松フォトニクスArgus50)を用いて、ラット大脳皮質味覚領域の口腔内味刺激に対する反応の空間的および時間的ひろがりを調べ、味の種類の弁別の背後にある神経機序を知ろうと試みた。実験動物は全身麻酔下で、気管挿管し、開頭術を施し、硬膜を除去した。神経細胞膜に接着し、その興奮によって蛍光を発する色素としてはRH795を用いた。色素の濃度は0.2mg/mlとした。皮質表面からの色素の浸透時間は90分とした。蛍光測定のサンプリング間隔は1kHzとした。舌の味刺激に最も強く応答する部位は中大脳動脈の腹側方向に局在し、前後および背腹方向の長さは約1mmであった。蛍光検出用のレンズの焦点を、皮質表面から0.3-0.5mmとした時に最も強い螢光が検出された。反応の時間的経過としては、舌に載せた味溶液を染ませた濾紙に電気パルスを与えた時点から計測すると、約20msの潜伏時間で蛍光が発現し始め、25msで最大強度に達し、30msでほぼ元に復した。味の種類としては、NaClが最も有効で、次いでHClであった・興奮する皮質の範囲についての味質特異性は顕著ではなかった。これらの結果は平行して行った電気生理学的実験結果とよく一致した。

即ち、明瞭な味反応を示すニューロン活動が頻繁に記録される皮質領域と皮質表面からの深さが一致した。また、最も高頻度で遭遇するニューロンの味反応特性はNaClベスト、即ち、NaClに最も強く反応した。味質の違いが、ラット大脳皮質味覚領域における神経細胞活動の空間的及び、時間的拡がりに違いをもたらすのかを調べるために、膜電位測定装置(浜松ホトニクス:Argus50)を用いて実験を行った。実験動物は、全身麻酔下で気管挿管した後、頭骨を穿孔し、硬膜を除去した。膜電位感受性色素は、前年度使用したRH795よりも、より強い応答が得られることが知られているdi-2-ANEPEQに変更した。皮質表面から色素を120分間浸透させた後、30分間人工脳脊髄液で洗浄した。味刺激として舌陽極電気刺激を用いた。数十から数百μAの陽極電気刺激は、イオンの電気泳動によって電気性味覚を誘発することが知られている。舌陽極電気刺激による蛍光応答の頂点潜時は、約3040msで、その蛍光応答率は約-0.5-3.0%であった。蛍光応答の振幅と頂点潜時は、刺激強度に依存した。刺激強度を強くすると、振幅は増加し、頂点潜時は短くなる傾向があった。舌陽極電気刺激によって応答が現れた部位は、嗅溝の背側かつ、中大脳動脈の吻側で、電気生理学実験で報告されてきた味覚領域と一致した。光学応答の頂点潜時は、脳表面から記録した誘発電位の潜時(約2040ms)とほぼ一致した。味溶液を染み込ませた濾紙を舌にのせ、その上から電気刺激すると、最も光学応答が強いのは、NaClとHClの混合液、次いでNaCl、HClの順であった。このことから今後、Na^+応答を増強するアルギニン・バソプレッシンを舌に予め順応させておき、味溶液を染み込ませた濾紙上から電気刺激を行う。もし、舌陽極電気刺激によって得られた光学応答がNa^+応答であるなら、相当な増強が起こるはずである。そのような増強は、味覚領域内の特定の空間的位置で起こるかもしれない。これにより、塩応答に占めるNa^+応答の役割を調べていきたい。膜電位測定装置(浜松ホトニクス・Argus50)を用いて、口腔内味刺激に対する大脳皮質味覚野での興奮伝播の時間的・空間的拡がりを調べることを目的とした。ウィスター系ラットを、人工呼吸ウレタン麻酔下で維持した。皮質味覚領域が水平になるように脳固定装置に固定し、開頭後、硬膜を取り除き、膜電位感受性色素(di-2-ANEPEQ)を浸透させた。舌電気刺激の直前に味溶液(0.2M NaCl(N)、0.03M HC l(H)、0.15M NaCl(S)、NとHの混合液(N+H))を滴下し、味質による光学応答の違いを調べた。舌陽極電気刺激による光学応答のピーク潜時は約1545msで、誘発電位のピーク潜時(1737ms)とほぼ一致した。また、舌陰極電気刺激では、光学応答のピーク潜時(810ms)は、誘発電位のピーク潜時(1014ms)とほぼ一致した。本研究で得られた光学応答のピーク潜時は、誘発電位ピーク潜時(文献:約3040ms)とほぼ一致したこと、光学応答が現れた部位は組織標本から皮質味覚領域であることから、舌陽極電気刺激による電気性味覚を表わすものと考えられる。舌陽極電気刺激による光学応答ピーク潜時は、舌陰極電気刺激時に比べ長かった。このことは陰極電気刺激が、舌神経および鼓索神経を直接刺激すると推定されるのに対して、電気性味覚が陽性電流によって味細胞膜周辺にイオンが電気泳動的に蓄積されて起こることに因ると考えられる。
脊椎動物の器官再生能を規定する普遍原理の解明

本研究はゼノパス(ツメガエル)を主な材料にして、動物の器官再生の普遍的なメカニズムの解明を目指した。四肢の前後軸形成に着目して、鳥類四肢の指のアイデンティティーを決定した。また哺乳類とは異なり、ゼノパスは成体でも皮膚をほぼ完全に再生できることを発見した。さらに器官再生におけるHippoシグナル経路の機能を検証し、動物界における普遍的な再生メカニズムの存在を裏付けた。これとは別に再生過程におけるゲノムのエピジェネティックな修飾の安定性をエピゲノム解析から実証した。また新しい実験技術として、両生類における局所的な遺伝子発現操作を可能にするシステムを開発した。(1)無脊椎動物での研究からインターカレーションへの関与が予想されるシグナル経路が脊椎動物の四肢再生で果たす役割を解析する研究を行った。まず、ERKシグナル経路が活性化された部位でGFPが光る遺伝子組換え(Tg)ゼノパスを作製して、同シグナルの活性の視覚化を可能にした。また同シグナル経路を時期特異的に阻害しうるTgゼノパスを熱ショックプロモーターによる発現誘導系を用いて作製し、四肢再生における同シグナル経路の果たす機能の解明を可能にした。また同様にインターカレーションへの関与が予想されるHpo/Wtsシグナル経路についても遺伝子操作によって時期特異的にシグナル経路をオン/オフにするためのコンストラクトを作製した。(2)四肢の前後軸形成に重要な働きをするshh遺伝子の遠位エンハンサーであるMFCS1領域の活性を、MFCS1にGFPをつないだTgゼノパスを作製することで視覚化し解析した。ニワトリやマウスと同様に発生中の肢芽ではその後側でMFCS1の活性が見られることや、幼生期の再生芽でも同様に後側で活性化が見られることを確認した。一方でshhの発現が見られず、前後軸を持った四肢を再生できない成体期の再生芽においてはMFCS1の活性がほとんど見られないことを見出した。しかし一方で、少数の例では弱いながらもMFCS1の活性が再生芽の後側で一過的に見られることを発見した。この結果から、成体期の再生芽といえども前後軸に沿った位置価を残しており、後側でshhを発現しうる余地を残していることが示唆された。さらに、このエンハンサー活性を視覚化できるMFCS1-GFPのゼノパスを性成熟するまで育ててライン化することに成功した。1本研究においては、無脊椎動物での研究から再生(インターカレーション)への関与が示唆されているERKシグナル、Hpo/Wts経路などが、脊椎動物の再生(インターカレーション)に対してどのように関与するのを調べるために、これらのシグナル経路を時期特異的に阻害しうるトランスジェニック(tg)個体を作製した、特にHpo/Wts経路については既にTgのライン(系統)を確立し、質のそろったTg個体が大量に得られるようになった。そして四肢再生の初期にHpo/Wts経路を阻害すると、四肢の再生が不完全になることを発見した。また逆にHpo/Wts経路を時期特異的に活性化しうるTg個体も作製し、ラインを確立しつつある。2平成23年度の研究では再生能が高い幼生(変態前)と再生能が低下した成体(変態後)のそれぞれの再生過程で発現してくる遺伝子群を実際に次世代シークエンサーで網羅的に解析(トランスクリプトーム解析)した。得られたトランスクリプトームに関するデータを現在分析中である。また四肢再生への関与が予想される遺伝子であるPrx1, shhに関してゲノムのシス調節領域の機能をTg技術を利用して解析した。その結果Prx1に関してはゼノパス由来のシス調整領域(エンハンサー)にGFPをつないだコンストラクトによって、これまで報告されてきたマウス由来のシス調節領域による結果を完全に再現でき、発生中の肢芽および再生芽で特異的にGFPレポーターの蛍光が観察されることが分かった。shhに関しては遠位エンハンサーであるMFCS1にGFPをつないだtg個体ではGFPの蛍光が内在性のshh発現をほぼ正確に反映する。平成23年度はこのTgをさらにライン化して均質な個体間での比較を行い、変態期にエンハンサーが不活性化されることを確認した。また不活性化されながらも四肢の後ろ側に活性が残りやすいことを見つけた。1.イモリのような有尾両生類とは異なり、ゼノパス(アフリカツメガエル)は幼生期には四肢(肢芽)を完全に再生できるが、成体では不完全な四肢しか再生できない。この違いを生み出す原因として四肢の前後軸形成に重要な働きをするshh遺伝子の遠位エンハンサーであるMFCS1に着目して、その活性化をMFCS1にGFPをつないだ遺伝子組換え(Tg)ゼノパスを作製することで解析を行ってきた。同じ新学術領域の計画班員である阿形研究室との共同研究として、イモリ由来のMFCS1を単離してゼノパスに導入する実験を行ったところ、幼生期の段階で同エンハンサーが不活性化されGFPの蛍光が肢芽内で全く見られないことが分かった。したがって成体で四肢を再生できるイモリに由来するMFCS1であってもゼノパスに導入されると不活性化されることから、イモリとゼノパスの再生能の差はMFCS1の配列の違いによるものではないことが示唆された。2.成体期のゼノパスにおける四肢再生能の低下の原因がshh遺伝子にあることを実証するため、赤外レーザーの照射による局所的遺伝子発現誘導システム(IR-LEGO)の導入を進めてきた。

さらにより広範囲に遺伝子発現を誘導できる温冷負荷装置も導入して発現誘導の実験を行った。この2つの手法を用いることで、四肢や再生芽の目的の場所で遺伝子発現を誘導することが可能になった。3.無脊椎動物での研究からインターカレーションへの関与が報告されているシグナル経路のうちとくにHpo/Wts経路に着目した。同経路の中心分子であるYapの機能を阻害するTgゼノパスの系統を樹立して、再生過程で時期特異的にYapの機能を阻害すると、四肢再生やインターカレーションが阻害されることが明らかになった、さらに再生過程におけるshhの発現も消失または不完全になることが分かった。ゼノパス(アフリカツメガエル)において遺伝子組換え(Tg)技術を利用することでHippo/Wts経路の中心的分子であるYapとTead4の機能を特定のタイミングで阻害する実験を行った。その結果、幼生期の四肢(肢芽)の再生においてYapが必須であること、肢芽を切断した際の再生だけでなく、移植実験によって位置価の不連続を人為的に作った際のインターカレーション(挿入再生)においてもYapの機能が必須であることを示した(Hayashi et al., 2014a)。さらに幼生の尾の再生に着目してYapとTead4の機能が尾の再生に必須であることを実証した(Hayashi et al., 2014b)。ここでは全身でYapやTead4の機能を阻害する実験とともに、赤外レーザーの照射によって局所的に遺伝子発現を誘導する技術(IR-lEGO)を利用して、尾の中の1細胞でのみYapやTead4の機能を阻害することにも成功した。その結果、再生中の尾における細胞の生存と増殖において、とくにTead4の機能が必須であり、細胞自律的に再生現象に関与している可能性が示唆された。またこれら実験とは逆にYapやTead4を活性化させるTgゼノパスでは、個体の生存率が極めて低いことがこれまでネックになっていたが熱ショックプロモーターを変えて、IR-LEGOのような局所的な発現誘導技術を導入することで、生存率低下につながる遺伝子発現の漏れを回避できる可能性を示唆する結果を得た。またこれとは別にゲノムワイドにヒストン修飾の状態を明らかにするエピゲノム解析を行い、四肢形成の過程で確立したヒストン修飾の状態は再生過程を通じて維持されることを明らかにした。この成果については同じ新学術領域-再生原理を構成する計画研究「イモリを用いた再生原理の解明」のグループとの共著論文として論文を投稿し、現在リバイズ(改訂)中である。1これまで行ってきた器官再生におけるHippo/Wts経路の機能解析の続きとして、同経路を担う中核分子のYapとTeadの機能を、ゼノパス(アフリカツメガエル)の幼生の尾の再生において阻害した。その結果、Wnt/βカテニン経路を阻害した場合には再生の開始そのものが阻害されるのに対し、YapまたはTeadの機能を阻害した際には尾の再生は開始されるものの、再生される尾のサイズが著しく小さくなることを発見した。2これまでの研究から、四肢の再生能力とゲノムのエピジェネティック制御との関連が示唆されていた。エピジェネティックなゲノムの制御のうちヒストンの修飾として代表的なものに、転写活性化の指標であるH3K4トリメチル化(H3K4me3)と転写抑制の指標であるH3K27トリメチル化(H3K27me3)の2つがある。
犬で臨床応用可能な角膜実質の再生法の確立

角膜潰瘍治療への応用を目指して、角膜実質の再生法、欠損部の充填法を検討した。兎角膜の上皮全層と実質を部分的に剥離した部分に豚由来市販材料を縫合して充填すると、移植片上に上皮が進展しその下で角膜実質が再生する場合と、移植片の下に上皮が侵入し実質の再生が生じる場合の2パターンを認めた。角膜の透明性は経時的に増加したことから角膜潰瘍に対して、角膜実質欠損部を今回の移植片で充填することは1つの治療法となる可能性が示唆された。一方で移植片が縫合後34日で消失する場合も認められたため、必要に応じて瞬膜被覆術あるいは結膜被覆術を組み合わせることも有用と思われた。ウサギを全身麻酔した後、直径5 mmの角膜上皮および部分的角膜実質欠損モデルを作成し、その部分に直径5 mmの豚膀胱由来細胞外マトリックス製品を縫合し移植した。移植から3日後、1週間後、2週間後、12週間後、16週間後に組織学的評価を行った。3日後と1週間後の組織標本では角膜上皮細胞が移植片の表面を覆いかつ実質細胞が移植片内に侵入したものと、角膜上皮細胞が移植片の実質側で角膜実質の表面を覆ったものとが認められた。2週目の組織標本では上皮は移植片の表面を完全に覆っていた。したがって、角膜上皮細胞が移植片上を覆いかつ実質細胞が移植片内に侵入して角膜が治癒する場合と、角膜上皮細胞が移植片の下で角膜実質の表面を覆い、この下で実質細胞が再生していく場合の2つのパターンがあると考えられた。一方、2週間を超えて観察する予定だった5匹中3匹では、移植片が次第に溶けていき、3日目と4日目に消失した。移植片が残存した個体では移植後の時間が経過するにつれて、角膜の透明性は亢進した。12週目と16週目の組織標本では角膜には上皮、実質、内皮の3層構造を認めた。以上より移植片が早期に脱落する例があるため、今回用いた材質を角膜実質欠損部に埋め込み縫合する方法は、欠損部を補填する目的では安定性に欠けると思われた。また、角膜上皮が移植片の下(角膜側)で再生した場合は、移植片は角膜欠損部を物理的に保護しているだけである可能性があり、移植片の存在により角膜の再生が促進されるかは不明である。さらに他の材質を開発する目的でレーザーを用いて小孔を作成した豚角膜(摘出眼)を組織学的に評価した。低出力の場合は角膜に著しい損傷は認めなかった。(1)ブタ膀胱由来で無細胞化・滅菌化された材質を、ラット角膜の上皮全層と実質を部分的に剥離した部分(直径3 mm)に移植すると、移植部は次第に透明化し、約12週間目には肉眼的には判別できない程度の透明性を得た。この時、移植片は10-0ナイロン糸で角膜に縫合したが、抜糸を1週間目に行った時は、4週間目に行った時よりも、肉眼的な透明性が高まるのが速かった。これは組織学的所見とも一致していた。したがって、角膜混濁の一因としてナイロン糸に対する角膜の反応の関与があると思われた。一方、移植後3日目の観察で、一部角膜上皮が移植片の下側(角膜実質側)に進展している像がみられた。これからは、角膜上皮の下で角膜実質が再生した可能性も考えられ、移植片が角膜実質再生の足場として機能し、移植片に角膜実質の細胞が侵入して再生したのか疑問が生じた。そこで、ウサギを用いた実験を次に行った。(2)ウサギを用いて同様の実験を行った。ウサギの角膜の上皮全層と実質を部分的に剥離した部分(直径5 mm)に上述の移植片を移植した。移植後8週目では、移植部が肉眼的に透明性が増した個体と、移植部の混濁部が混濁したままではあるが縮小した個体とが認められた。移植後3日目および7日目のフルオレセインを用いた角膜染色では移植部が部分的あるは全体的に染色された。このことから、移植片上への上皮の進展が不十分あるいは欠如している可能性があった。しかし、移植後3日目および7日目の組織学的観察ではともに、角膜上皮は移植片の外側(角膜実質側ではない部分)上に進展していた。このことから、移植片内に角膜実質細胞が侵入して、角膜実質の再生が起きていることが示唆された。

ラット角膜の上皮全層と実質を部分的に剥離した部分(直径3 mm)にブタ膀胱由来で無細胞化・滅菌化された材質を縫合すると、縫合部は次第に透明化し、約12週間目には肉眼的には判別できない程度の透明性を得た。次に、ラットと同様にウサギで角膜上皮全層と実質を部分的に剥離した部分(直径35 mm)に、ブタ膀胱由来材料を縫合した。縫合後37日後の組織学的検査では、角膜上皮細胞が縫合片の表面を覆うパターンと、縫合片の下面で角間実質欠損部表面を覆うパターンの2つが見られた。縫合後12週目以降の組織学的検査では角膜には上皮、実質、内皮の3層構造が認められた。また角膜の透明性は経時的に増加した。したがって今回用いたブタ膀胱由来材料を用いた時の角膜の修復のパターンとしては、角膜上皮下で角膜実質欠損部を縫合片が充填して角膜再生につながるパターンと、縫合片が角膜欠損部を覆いその下で上皮および実質が形成されるパターンの2つがあると思われた。しかし2週間を超えて観察予定のウサギの約半数で縫合片が縫合後34日で消失した。そこで、ウサギの上皮全層・部分的実質剥離モデルに上述の材料の縫合した後に結膜被覆術あるいは瞬膜被覆術を行うとその部分でも角膜上皮および実質の形成がみられた。瞬膜被覆術を行うと縫合片の観察ができないが、超音波生体顕微鏡を使用することで縫合片の存在は確認可能であった。以上より、角膜潰瘍に対して、角膜実質欠損部を充填するように今回用いた材質を縫合することは1つの治療法となる可能性があると思われた。しかし短期間で縫合片が消失する場合もあるため、瞬膜被覆術を、あるいは瘢痕の残存が許容可能な場合は瞬膜被覆術を組み合わせることも有用と思われた。臨床獣医学ラットやウサギを用いた実験からこれまで用いてきた材質を角膜実質欠損部に埋め込んだ場合、角膜実質細胞再生の足場として機能し得る場合と、単に物理的に欠損部を保護している場合との両方の可能性が出てきた。後者のみの効果の場合は治療用コンタクトレンズ等と類似の作用とも考えられる。また、移植後早期に脱落した例が半数程度で認められ効果の安定性に欠けると思われた。このため犬を用いた実験には至っていない。当初の計画では平成24年度中にイヌを用いた実験、およびラットを用いた同種角膜移植との比較に関する実験を行う予定であった。しかし、ラットを用いた実験で、角膜上皮の下で角膜実質が再生した可能性も考えられた。もしこのような機序で再生したのであるならば、移植片は、角膜損傷部を単に被覆して物理的に保護しているのみであり、移植片が角膜実質再生の足場として機能して移植片に角膜実質の細胞が侵入して再生しているのではないことになる。したがって、この点を明確にするためにウサギを用いた実験を追加した。ウサギはラットよりも角膜が厚いため、より深い角膜の上皮全層と部分的実質剥離モデルを作成しやすく、移植片をより深層まで埋め込む事が可能であるからである。さらに、当初は移植片がどの程度の期間で生着するかは不明であったので、ラットの実験で当初は抜糸までの期間を4週間としていた。しかし、縫合糸に対する角膜の反応が角膜混濁の一因である可能性が組織学的検査から考えられた。そこで、この点を確認する目的で、抜糸までの期間を1週間と短縮して透明性を評価するラットの実験を追加した。これにより、縫合糸に対する角膜の反応が角膜混濁の一因である可能性が強まった。以上の2点は今回の移植実験を評価する上で非常に重要な点と考え、これらの点を確認する実験を当初の予定にはなかったが追加した。こうした理由のため、イヌを用いた実験等に至っておらず、当初の計画よりやや遅れている。これまでにレーザーを用いて小孔を作成した豚角膜(摘出眼)を組織学的に評価し、低出力の場合は角膜に著しい損傷を認めていない。しかし小孔の深さが不十分なため、今後出力を上げた場合の角膜への影響を組織学的に評価する。また、グリセリンに保存した角膜の使用がヒトや動物で報告されているため、この小孔がグリセリンに保存した角膜にも作成可能かを評価する。