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父親の育児休業をめぐる文化・実践・政策の相互作用の比較社会学的研究

本研究の目的に照らして、その研究活動は、(1)日本における夫婦の子育て・家事・就労に関する分担状況とその交渉過程についての実態調査と、(2)制度・実践・文化に関する諸外国との比較に大きく分かれる。それぞれの活動について、本年度実施した内容は以下の通りである。(1)に関しては、研究テーマの重なる別助成金を得て共同で実施した母親のフォーカスグループ、および個人インタビュー結果について、質的分析ソフトNVivoを用いて、妊娠・出産・子育てに伴う母親の就業状態の変化のありかた(育児休業の取得を含む)のタイプ別、父親の育児休業に関する働きかけとその結果について比較分析した。この調査により、地域別の保育所入所の認定プロセスとの関連に着目することなど、次年度、本研究費を用いて行うインタビュー調査の課題が明らかになった。(2)に関しては、まず、オーストラリアの研究協力者と育児休業・ケア体制・労働規範に関する比較研究を開始し、日本で開催された国際学会Society for the Advancement of Socio-Economics大会において口頭報告を行った。また同学会の別セッション後に行った、スウェーデンの報告者とのディスカッションでは、パパ・クオータ利用の実際についての情報を得ることができた。トロントにおいて開催されたInternational Network on Leave Policies and Researchの年次大会では、すでに比較研究を始めているオーストラリアの他、イタリア、ドイツ、スウェーデン、イギリス、リトアニアの研究者との議論を通じて、それらの制度と現状についても詳細を検討していく必要性を認識し、研究協力についての約束を得ることができた。さらに先行研究を元に、スウェーデンとノルウェーの育児休業および公的保育と日本の制度の相違について整理した。国外でのインタビューについては、今年度に研究協力者と相談を開始したものの、ドイツでのInternational Network on LeavePolicies and Researchの年次大会参加にあわせて、2019年度に実施することに当初の予定よりも遅れることになった。スウェーデンでのエキスパートインタビューについても2018年度中に参加の決まった関連プロジェクトのミーティングにあわせて、2019年度に入ってから研究協力者へのヒアリングを行った。日本におけるインタビューについては、別の共同プロジェクトによるインタビューを本研究のための予備調査と位置づけて分析したため、改めて2019年度に対象人数を当初の予定よりも増やして実施する予定である。本年度の予備的分析を踏まえて、改めてインタビュー調査を設計し、育児休業の取得を含む、夫婦の子育て・家事・就労に関する分担状況とその交渉過程について、待機児童数などの特徴の異なる地域の3歳までの子どもを持つ男性・女性に対してインタビューを実施する。海外調査については、すでに4月にスウェーデンでの予備的観察調査と研究協力者へのインタビューを行った。8月はドイツで開催されるInternational Network on Leave Policies and Researchの年次大会において、オーストラリアの研究者との共同研究の報告を行い、同じくドイツにおいて子育て中の親および企業での子育て支援サポート提供企業の担当者に対してインタビューを実施する。あわせてスウェーデンにおける当事者インタビューについても、今年度または来年度に実施できるよう、対象者へのアプローチ方法についてスウェーデンの研究者と打ち合わせを行う。

8月はドイツで開催されるInternational Network on Leave Policies and Researchの年次大会において、オーストラリアの研究者との共同研究の報告を行い、同じくドイツにおいて子育て中の親および企業での子育て支援サポート提供企業の担当者に対してインタビューを実施する。あわせてスウェーデンにおける当事者インタビューについても、今年度または来年度に実施できるよう、対象者へのアプローチ方法についてスウェーデンの研究者と打ち合わせを行う。日本において実施した予備的インタビューの文字おこし等の人件費を別の共同研究の助成金でまかなうことができ、本研究のための追加調査は次年度に実施することになったこと、また海外の調査についても準備期間の必要から次年度に実施することになったことから、次年度使用額が生じた。次年度は、今年度から繰り越した調査と当初より予定していた調査を日本および海外において行うため、本年度から繰り越した額を次年度分とあわせて使用する計画である。
慢性感染に伴うフリーラジカル産生と発がん

固型癌のうち、胃癌、肝癌、子宮癌などの原因が細菌やウイルスによることが次第に明らかになってきた。さらに、胆管や胆のう癌、食道癌も何らかの感染症に起因する容疑が濃くなってきた。これらの感染症と発癌に共通の事象として、それが長期にわたる慢性炎症を伴うこと、また活性酸素(スーパーオキサイドやH_2O_2、あるいはHOCl)や一酸化窒素(NO)などのフリーラジカル関連分子種が宿主の炎症反応に伴い、感染局所で過剰に生成していることである。さらに重要なことは、これらのラジカル分子種はDNAを容易に障害することである。そこで本研究では、微生物感染・炎症にともない生成するフリーラジカルと核酸成分との反応を特に遺伝子変異との関係から解析した。また、センダイウイルス肺炎モデルを作製し、in vivoでの遺伝子変異におけるフリーラジカルの役割を検討した。その結果、過酸化脂質がミオグロビン等のヘム鉄存在下に生じる過酸化脂質ラジカルが、2本鎖DNAに対して変異原性のある脱塩基部位の形成をもたらした。また、上記ウイルス感染においては、スーパーオキサイドラジカル(O_2^-)と一酸化窒素(NO)の過剰生成がおこることを明らかにしたが、この両者はすみやかに反応してより反応性の強いパーオキシナイトライト(ONOO^-)となる。ONOO^-とDNAやRNAとの反応では、グアニン残基のニトロ化が効率良くおこり、さらに生じたニトログアノシンがチトクロム還元酵素の作用によりO_2^-を生じることが分かった。このONOO^-がin vivo,in vitroいずれにおいてもウイルス遺伝子に対して強力な遺伝子変異をもたらすことを、NO合成酵素(NOS)ノックアウトマウスやNOS強制発現細胞を用いて明らかにし、上記の知見が正しいことを確認した。
水の添加によって熱音響エンジンの臨界温度が低下するメカニズムの解明とその応用

熱音響エンジンは蓄熱器と中空の管,およびスタックと呼ばれる細管の集合体で構成されている.そのため,可動部を有さず,様々な熱源による駆動が可能であり,他の熱機関からの排熱や太陽熱の有効利用を実現する熱機関として注目されている.本研究では水の添加が熱音響エンジンの性能に与える影響を解明するため実験および数値計算を行っている.平成29年度の研究によりスタックを構成する細管の壁に液相の水が存在することが重要であることが重要であることが分かっている.そこで平成30年度にはスタックの細管壁に水を添加した熱音響エンジンの効率に注目して研究を進めた.数値計算の結果,同じ投入熱量で比べた場合,水を添加しないほうが,高温熱源の上昇により,高い熱効率(出力/投入熱量)が得られることが分かった.一方,熱力学的上限値であるカルノー効率で熱効率を除した第2法則効率で比べると,ほぼ同程度の熱効率が得られることが分かった.また,実機による音響振動の比較結果から,水添加時と水非添加時で同程度の出力が得られることが分かった.さらに課題として,長時間の駆動を実現するためにはスタックの細管壁に液相の水が常に存在するようにするための工夫が必要であることも分かった.平均気圧が水を添加した熱音響エンジンの性能に与える影響も実験的に検討した.その結果,沸点の上昇に伴い,熱音響エンジンの稼働温度が上昇することが分かった.このことから熱源の温度に対応して熱音響エンジン内の作動流体の封入圧を制御する必要があるといえる.平成30年度に予定していた熱音響エンジンの効率測定と予測,最適設計について,予測と最適設計については完了している.一方で,実機における効率測定については,いくつかの測定は行っているものの,液相の水の枯渇により現時点では完了していない.水を添加した熱音響エンジンのポテンシャルを評価するため,短時間で測定を行えるように手順を見直し,実験を行う.また,これまでに得られた成果を国際会議で報告する.熱音響エンジンは蓄熱器と中空の管,およびスタックと呼ばれる細管の集合体で構成されている.そのため,可動部を有さず,様々な熱源による駆動が可能であり,他の熱機関からの排熱や太陽熱の有効利用を実現する熱機関として注目されている.本研究では水の添加が熱音響エンジンの性能に与える影響を解明するため実験および数値計算を行っている.平成29年度の研究によりスタックを構成する細管の壁に液相の水が存在することが重要であることが重要であることが分かっている.そこで平成30年度にはスタックの細管壁に水を添加した熱音響エンジンの効率に注目して研究を進めた.数値計算の結果,同じ投入熱量で比べた場合,水を添加しないほうが,高温熱源の上昇により,高い熱効率(出力/投入熱量)が得られることが分かった.一方,熱力学的上限値であるカルノー効率で熱効率を除した第2法則効率で比べると,ほぼ同程度の熱効率が得られることが分かった.また,実機による音響振動の比較結果から,水添加時と水非添加時で同程度の出力が得られることが分かった.さらに課題として,長時間の駆動を実現するためにはスタックの細管壁に液相の水が常に存在するようにするための工夫が必要であることも分かった.平均気圧が水を添加した熱音響エンジンの性能に与える影響も実験的に検討した.その結果,沸点の上昇に伴い,熱音響エンジンの稼働温度が上昇することが分かった.このことから熱源の温度に対応して熱音響エンジン内の作動流体の封入圧を制御する必要があるといえる.平成30年度に予定していた熱音響エンジンの効率測定と予測,最適設計について,予測と最適設計については完了している.一方で,実機における効率測定については,いくつかの測定は行っているものの,液相の水の枯渇により現時点では完了していない.水を添加した熱音響エンジンのポテンシャルを評価するため,短時間で測定を行えるように手順を見直し,実験を行う.また,これまでに得られた成果を国際会議で報告する.本研究による成果を国際会議で発表するため.また,それに伴う追加実験を行うため.
市民の法動員におけるボランタリー・アソシエーションの機能に関する法社会学的研究

市民が権利主張や訴訟といったしかたで法を動員する場合にそこにどのような杜会的要因が作用しているかは法社会学研究の重要な課題であるが、本研究においては、個人をとりまく中間集団、とくにボランタリー・アソシエーションが個人の法動員に与える影響の重要性に着目し、ドイツおよび日本の事例について実証的な研究を行った。2年間の研究を通じて確認された主要な知見は以下の通りである。まずドイツでは、消費者保護・借家人保護・環境保護・社会福祉などさまざまな領域でボランタリー・アソシエーションが市民の法動員を活発に援助する活動を行っており、かかるボランタリー・アソシエーションの活動が、ドイツ社会の「法化」を進行させた主要な原因の1つとなっている。他方、日本でも、とりわけ1990年代以降、様々な分野でボランタリー・アソシエーションの活動が活発化しており、しかも、各地の市民オンブズマン活動に典型的に見られるように、その活動を法や訴訟に志向させる傾向も強まってきている。その際、ボランタリー・アソシエーションは、個人では調達困難な経済的・人的・知的資源を提供することによって個人の法動員を促進するとともに、構成員相互の日常的な接触やコミュニケーションを通じて法動員に積極的な法意識形成を媒介するという重要な機能を果たしている。今後このようなボランタリー・アソシエーションが一層の発展を遂げるならば、日本社会における法動員の場面が拡大し、そのマクロな集積として、日本杜会の「法化」が促進されるものと予測される。以上を要するに、各国の法化の進行を、各国社会における中間集団、とりわけボランタリー・アソシエーションの広がりと定着という社会構造的要因によって説明するアプローチの有効性を示しえた点が、本研究の最も重要な成果である。1.市民が権利主張や訴訟といったしかたで法を動員する場合にそこにどのような社会的要因が作用しているかは法社会学研究の重要な課題であり、従来の研究においても、法意識・資源・関係などさまざまな要因が析出されてきたが、本研究は、市民の法動員のプロセスにおいてボランタリー・アソシエーション(自発的集団)がはたす機能を、具体的な事例の調査研究を通じて実証的に解明することを試みた。2.初年度である平成12年度においては、主として、次の2つの作業を行い、それぞれに重要な成果が得られた。第1は、市民の法動員におけるボランタリー・アソシエーションの機能に関する理論モデルの構築である。法社会学の領域においてこれまで蓄積されてきた法の動員に関する研究成果と、社会学・組織論・経営学等において蓄積されてきたアソシエーションに関する研究成果とを総合的に整理・分析し、本研究独自の理論モデルを構築しえたと考えている。第2に、法動員援助型のボランタリー・アソシエーションの実態を明らかにしたことである。消費者保護・環境保護・情報公開・社会福祉・まちづくりなど広範な領域で具体的な事例を集積でき、日本社会でも、近年さまざまな領域で、法動員援助型のボランタリー・アソシエーションの活発化が観察された。3.最終年度となる来年度は、引き続き具体的な事実の収集に努めるとともに、当初構築した理論モデルを検証し、必要に応じて修正を加えた上で、より洗練された理論モデルを完成させることにする。それを通じて、(1)日本社会における法動員の具体的様相についての知見を豊かにするとともに、(2)これから到来するであろう法化社会における法・個人・集団の関係についての理論的示唆を得ることができると考えている。1.社会成員の法動員のプロセスに作用する社会的要因を法社会学的に考察しようとする場合、さまざまな中間集団が及ぼす影響は重要な研究課題であるが、本研究では、とくに市民の法動員におけるボランタリー・アソシエーション(自発的結社)の機能に焦点を合わせ、それを実証的かつ日独比較の視点も交えて解明する作業を行った。

この作業を通じて得られた主要な知見は以下の通りである。2.まずドイツでは、消費者保護・借家人保護・環境保護・社会福祉など様々な領域でボランタリー・アソシエーションが市民の法動員を活発に援助する活動を行っており、かかるボランタリー・アソシエーションの活動が、ドイツ社会の「法化」を進行させた主要な要因の1つとなっている。3.他方、日本でも、とりわけ1990年代以降、様々な分野でボランタリー・アソシエーションの活動が活発化しており、しかも、各地の市民オンブズマン活動に典型的に見られるように、その活動を法や訴訟に志向させる傾向も強まってきている。その際、ボランタリー・アソシエーションは、個人では調達困難な経済的・人的・知的資源を提供することによって市民の法動員を促進するとともに、構成員相互の日常的な接触やコミュニケーションを通じて法動員に積極的な法意識形成を媒介するという重要な機能をはたしている。今後このようなボランタリー・アソシエーションが一層の発展を遂げるならば、日本社会における法動員の場面が拡大し、そのマクロな集積として、日本社会の「法化」が促進されるものと予想される。4.以上の知見をふまえて、各国の法化の進行を、各国社会における中間集団、とりわけボランタリー・アソシエーションの広がりと定着という社会構造的要因によって説明するアプローチの有効性を示しえた点が、本研究の主要な成果である。
胚心蔵発生過程でおこる心内膜床領域決定での転写因子TBX20の役割

TBX20の全長をクローニングし、心臓発生過程での発現時期と場所の詳細を調べるためにin situハイブリダイゼーションを行った。その結果、TBX20が胚心臓の前後軸に沿った部域特異的な発現パターンを示すことが明らかになった。心臓で発現する別のTBX遺伝子群であるTBX2、-5と発現パターンを比較したところ、TBX遺伝子群は心臓発生過程で時間的・空間的に異なって発現することが明らかになった。また、胚発生過程を通してTBX20はおもに中胚葉、外胚葉に由来する組織で発現した。さらに、この実験の過程でTBX20のほかTBX2、-5が心房の発生段階に応じて部位特異的に発現することを見いだした。これらの結果から、TBX遺伝子群の発現の組み合わせが心房の部域化に関係している可能性が推測された。房室管領域でのTBX20の役割を明らかにするため、TBX20の機能阻害実験を試みた。ドミナントネガティブタイプのTBX20(TBX20-engrailed2)を作製し、この心内膜床領域の器官培養系で強制発現させてTBX20の機能阻害をおこなった。しかし、阻害効果は見られず、心内皮細胞は間葉細胞に形質転換した。この原因として心筋細胞との共培養による心内皮細胞への遺伝子導入効率の低下が考えられた。そこで心筋の代替物として心筋と同様の生理活性をもつ心筋培養上清を作製し、心筋を除去後に心内皮細胞にTBX20-engrailed2の導入を行った後、この心筋培養上清を加えて培養した。TBX20の機能の正確な評価にはより詳細な機能阻害実験を行う必要性があると考えているが、TBX20-engrailed2の実験によって心内皮細胞の形質転換が抑制された。これらの結果から、TBX20が心内膜床形成過程で起こる心内皮細胞の形質転換に関与している可能性が推測された。最初にTbx20の全長の塩基配列を決定し、次に心臓発生過程での発現時期と場所の詳細を調べるためにin situハイブリダイゼーションを行った。その結果、Tbx20は、stage4より観察され、stage5では心臓予定領域の中胚葉に見られた。この領域でのTbx20の発現は、stage6になるとより強くなった。stage8になると、Tbx20は心筋細胞の分化する臓側中胚葉にのみ発現が観察できた。その後、両側の中胚葉が融合し、心筒が形成される頃には、Tbx20は心筒全体で発現した。stage12になり心筒がループ形成し始める時期には、Tbx20の発現は心筒の前方と後方で強くなり、stage14では流出路と房室管領域に発現した。このとき、房室管領域の心内皮細胞にも弱い発現が見られた。stage16以降、流出路と房室管領域の心内膜床領域で、Tbx20は心筋細胞、心内皮細胞、間葉細胞に強く発現した。心内膜床でのTbx20の発現は、胎児に相当するstage33まで続いた。また流出路の心内膜床には神経堤細胞も侵入しmesenchymal condensationを形成するが、Tbx20はこの領域にも発現した。stage26から30までは、Tbx20は右心室に強く発現したが、stage33以降では心室領域での発現は弱くなった。

以上のin situハイブリダイゼーションの結果と、心臓で発現する別のTbx遺伝子、Tbx5、-2との発現パターンを比較したところ、心臓に発現するTbxは時間的にも空間的にも異なって制御されていることが明らかになった。また、胚全体を通してTbx20の発現を見てみると、おもに中胚葉、外胚葉に由来する組織で発現することも明らかになった。これまでにニワトリ胚発生過程でtbx20が胚心臓の前後軸に沿った部域特異的な発現パターンを示すことを明らかにした。その過程でtbx20のほかtbx2、-5が心房の発生段階に応じて部位特異的に発現することを見いだした。そこで心房領域でのこれらの遺伝子群の発現時期と場所の詳細を調べるためにin situハイブリダイゼーションを行った。心房の原基は、静脈洞と原始心房であり、心房の形成過程では静脈洞の心房への取り込み、心房中隔の形成、そして肺静脈の発生などがおこる。この過程においてtbx2の発現はst14では房室管に、st16では房室管、背側心間膜に見られた。st19では房室管、心房中隔、背側心間膜に、st24では房室管、心房中隔に発現がみられた。そしてst27では房室管にのみ観察できた。一方、tbx5はst14では心房に、st16では心房、房室管、背側心間膜に発現した。st19では心房、房室管、心房中隔、背側心間膜に、st24では心房、房室管、心房中隔、背側心間膜、spina vestibuli、前主静脈にも発現が観察できた。st27では心房、房室管、心房中隔、spina vetibuli、大静脈、肺静脈を含む背側心間膜に強く発現した。そして、tbx20はst14、16では心房、房室管に発現が観察できた。st19では左側の心房、房室管、背側心間膜に、st24では心房、房室管、背側心間膜、spina betibuliに発現がみられた。st27では、心房、房室管、背側心間膜、spina vestibuli、心内膜床に強く発現した。これらの結果から、tbx遺伝子群の発現の組み合わせは、心房の部域化に関係している可能性があるものと推測された。これまでにニワトリ胚発生過程で、TBX20が胚心臓の前後軸に沿った部域特異的な発現パターンを示すことを明らかにした。さらにTBX20のほかTBX2、-5が心房の発生段階に応じて部位特異的に発現することを見いだし、TBX2、-5、-20遺伝子の発現を詳細に調べたところTBX遺伝子群の発現の組み合わせが、心房の部域化に関係している可能性が明らかになった。つぎに房室管領域でのTBX20の役割を明らかにするため、TBX20の機能阻害実験を試みた。TBX20の塩基配列の情報をもとにニワトリTBX20にショウジョウバエengrailed2の転写抑制領域を結合させたドミナントネガティブタイプのTBX20(TBX20-en)を作製し、発現ベクターに組み込んだ。このTBX20-enを心内膜床領域の器官培養系で強制発現させてTBX20の機能阻害をおこなった。しかしながら、TBX20の機能阻害による影響は観察されず、心内皮細胞は間葉細胞に形質転換した。この原因として心筋細胞との共培養による心内皮細胞への遺伝子導入効率の低下が考えられた。そこで心筋の代替物として心筋と同様の生理活性をもつ心筋培養上清を作製し、心筋を除去後、心筋培養上清を加えて培養した心内皮細胞にtbx20-enの導入を試みた。その結果、TBX20を強制発現させたものでは心内皮細胞の形質転換が抑制された。これらの結果から、TBX20が少なくとも心内膜床形成過程で起こる心内皮細胞の形質転換に関与している可能性が明らかになった。
Ｃｌａｓｐｉｎのリン酸化と形態変化による複製フォーク複合体の活性制御機構の解析

ClaspinとMCMを中心とした複製フォーク複合体の分子構築と活性化制御の解明を目標に研究を始め,次の様な成果を得た。野生型Claspinと5種類のClaspin変異体を精製し、Cdc7キナーゼによるリン酸化、DNA結合、ヘリカーゼ活性などの生化学的なアッセイを行った。1)Claspinの分子内結合の役割を解明するために、Claspinの分子内結合をするバリアントでは、Cdc7によるリン酸化やDNA結合活性への影響は認められない。2)野生型ClaspinとCdc7のリン酸化を受けないClaspin_DE/A変異体を用いて、リン酸化によるClaspinのDNA結合能に差が認められない。また、MCMの存在下によるClaspinとMCMのDNA結合が促進された。3)ヒトClaspinはDNAポリメラーゼεと相互作用するが、DNAポリメラーゼεの酵素活性には影響しないことを見出した。これは出芽酵母Mrc1がDNAポリメラーゼεの活性を促進する報告と異なった。4)Claspinの存在によるMcm2-7複合体のDNAヘリカーゼ活性が阻害される結果を得た。このように、Claspinによる複製フォーク進行制御機構に関わることを示唆された。計画されていた実験が順次行われていた。ClaspinはDNA上にMCMと複合体形成し、MCMのDNAヘリカーゼ活性を阻害することを見出した。引き続き、ClaspinとMCMを中心とした複製フォーク複合体の活性化制御機構の解明を進める。さらに、MCMと結合するFACT複合体がClaspinのMASS解析で同定されたため、そのサブユニットのSpt16とSSRP1を293T細胞にタンパク発現と精製を行う。FACTがClaspin、MCMとの物理的な相互作用や活性への影響を調べる予定である。試薬が思ったより安く買えた。これから、ClaspinによるMCMのDNAヘリカーゼ活性の阻害メカニズムを明らかにするため、より多く使うと思う。研究室HPのURL
新規蛍光骨格の特性に基づいた非侵襲性ケージド化合物の開発と発生胚への応用

最終年度であった平成22年度は、本研究の目標であったBODIPYケージド化合物の生物応用に成功した。細胞応答の再現性の高さから、ケイジ対象分子をヒスタミンに変更し、BODIPYケージドヒスタミンを開発した。しかしBODIPYケージドヒスタミンの脂溶性の高さから、細胞系に添加すると細胞内膜構造に集積してしまい、光照射によって細胞応答を得ることができなかった。BODIPYケージドヒスタミンに高い水溶性を与えるため、BODIPYの2,6位にカルボキシ基を導入した2,6ジカルボキシBODIPYを合成し、それを基本骨格とした水溶性BODIPYケージドヒスタミンを開発した。このケージドヒスタミンを細胞系に添加、化合物の蛍光からその分布を観察したところ、細胞外液に一様に滞留して存在していることがわかった。この系に対して光照射を行なったところ、光照射依存的な細胞応答が観測された。この細胞応答は、ヒスタミンH1受容体阻害剤ピリラミン存在下では阻害されたことから、細胞外液に滞留していたケージドヒスタミンから放出されたヒスタミンが、細胞膜上のH1受容体を介して細胞応答を引き起こしていたことが明らかになった。この結果から、BODIPYをケイジ基としたケージド化合物は、生体応用可能かつ500nm以上の可視光でアンケージ可能な初めてのケージド化合物として利用可能であることがわかった。この分子ツールは、細胞傷害性が低く利用しやすい光で小分子を時空間特異的に活性化する初めての手法としての意義を持っていると考えられる。初年度の今年度は、主にケージド化合物開発の基本データとなる光化学関連データの収集とケージド化合物の開発と機能の最適化を行なった。まず、BODIPY4位修飾基の酸化電位と量子収率の関係を調べることで、4位修飾基からBODIPYへの光誘起電子移動(Photo-induced electron transfer: PeT)が光反応に必要であることが示唆され、このことから光反応の反応機構として、4位修飾基からBODIPYへの光誘起電子移動を初発とし、カチオン中間体となった4位phenoxy基が脱離能を高め、proticな溶媒分子により置換反応を受けることでBODIPYから遊離するという機構が考えられた。また、酸化電位と量子収率を調べたことで、光反応を効率的に誘起する4位修飾基とBODIPYの酸化電位の関係が明らかになり、以降のケージド化合物開発の基礎的なデータを得ることができた。ケージド化合物の開発としてはまず、ケージド化合物の中でも広く汎用されているケージドグルタミン酸の開発を行なった。光反応を見出した当初は、ケージ可能な官能基としてフェノール性水酸基に限られていたが、4位にp-oxybenzyl構造を導入することで、ケージ対象官能基をカルボン酸およびアミンにまで拡張することに成功した。この結果に基づき、グルタミン酸γ-カルボン酸をケージしたケージドグルタミン酸を分子設計・合成し、500nmの光照射によってグルタミン酸が放出されることを確認した。開発したケージドグルタミン酸は化学収率と水溶性に問題が見られたが、グルタミン酸のケージ部位の検討を行い、アミンをカルバメート構造でケージすることで、化学収率および水溶性を大幅に改善することに成功した。開発したケージドグルタミン酸は500nmの長波長でアンケージされる初めてのケージドグルタミン酸であり、水溶性、アンケージ効率、ともに実用的に十分な水準を満たしている。現在は、マウス神経細胞初代培養系におけるケージドグルタミン酸の応用を目指しており、開発したケージドグルタミン酸の実用性を示せると考えている。2年目となる今年度は、初年度に開発したケージドグルタミン酸の機能最適化を目的として研究を行なった。昨年度に開発したケージドグルタミン酸の有用性を示すべく、ラット胎児より取り出した海馬ニューロンの初代培養系にケージドグルタミン酸を添加、光照射によって放出されるグルタミン酸に対する細胞応答の観測を試みた。ところが、光照射の強度や照射部位を検討しても細胞応答を観測することは出来なかった。開発したケージドグルタミン酸は蛍光性を持つため、蛍光観察によりその分布を知ることができる。蛍光観察により、神経細胞に加えたケージドグルタミン酸の細胞内分布を観測した結果、ケージドグルタミン酸のBODIPY部位の高い脂溶性によって、細胞の膜構造に大部分が取り込まれていることが分かった。すなわち、光照射時にケージドグルタミン酸が細胞外部に殆ど存在していなかったため、光照射によって細胞外からのグルタミン酸刺激を与えられていないことが分かった。この問題点を克服するため、ケージドグルタミン酸の光分解性保護基であるBODIPYにカルボン酸を導入し、水溶性を上げると同時に細胞膜透過性を低下させ、ケージドグルタミン酸が細胞外部に滞留するよう設計を行なった。その結果、新たに設計・合成したケージドグルタミン酸は細胞外に滞留し、なおかつ水中での安定性が以前開発したケージドグルタミン酸よりも優れることがわかった。細胞外にケージドグルタミン酸が滞留した状態で光照射実験を行なったなところ、光照射依存的な細胞応答が観測d\され、設計・開発したケージドグルタミン酸は狙い通り機能し、生細胞にも適用可能であることが示された。

またこの結果は、ケージド化合物の蛍光可視性の有用性を示しており、将来的にケージド化合物をある組織または器官に集積するよう設計し、その集積を蛍光で簡便に確認できる系の開発が可能であることも示唆している。最終年度であった平成22年度は、本研究の目標であったBODIPYケージド化合物の生物応用に成功した。細胞応答の再現性の高さから、ケイジ対象分子をヒスタミンに変更し、BODIPYケージドヒスタミンを開発した。しかしBODIPYケージドヒスタミンの脂溶性の高さから、細胞系に添加すると細胞内膜構造に集積してしまい、光照射によって細胞応答を得ることができなかった。BODIPYケージドヒスタミンに高い水溶性を与えるため、BODIPYの2,6位にカルボキシ基を導入した2,6ジカルボキシBODIPYを合成し、それを基本骨格とした水溶性BODIPYケージドヒスタミンを開発した。このケージドヒスタミンを細胞系に添加、化合物の蛍光からその分布を観察したところ、細胞外液に一様に滞留して存在していることがわかった。この系に対して光照射を行なったところ、光照射依存的な細胞応答が観測された。この細胞応答は、ヒスタミンH1受容体阻害剤ピリラミン存在下では阻害されたことから、細胞外液に滞留していたケージドヒスタミンから放出されたヒスタミンが、細胞膜上のH1受容体を介して細胞応答を引き起こしていたことが明らかになった。この結果から、BODIPYをケイジ基としたケージド化合物は、生体応用可能かつ500nm以上の可視光でアンケージ可能な初めてのケージド化合物として利用可能であることがわかった。この分子ツールは、細胞傷害性が低く利用しやすい光で小分子を時空間特異的に活性化する初めての手法としての意義を持っていると考えられる。
神経細胞機能阻害遺伝子の部位特異的強制発現による昆虫脳の行動制御メカニズムの解析

昆虫の視覚情報は、複眼にある網膜にアレイ状に並んだ光受容細胞群で明暗の分布情報として検出され、脳側部の視葉に送られる。この低次視覚感覚野の回路構造は、哺乳類と昆虫で類似性が高く、これまでかなり詳しく解析されてきた。しかしここから脳のどの高次領野に、どのような情報が出力として受け渡されているのかについては、不明な点が多く、物体の総合的な形状認識や方向の定位など、より高次の視覚情報処理過程を解析する上で、大きな障害になっている。本研究では4500系統を超える我々の世界最大規模のGAL4エンハンサートラップ系統コレクションから3939系統をスクリーニングし、低次領野である視覚葉から高次脳領域である脳本体とを結ぶ投射神経をラベルする系統を探索した。この結果、既知の12種類の投射神経のうちの10種類に加え、新規発見の経路31種類、合計41種類の情報伝達経路を同定した。これによって、高次脳領域にある7つの視覚領域には、それぞれ視葉内部の3つの主な領域からの投射が混じり合って連絡していること、しかし投射線維の形態や数には、視覚領域ごとに差があることが分かった。またこれらの系統を用いて、神経伝達物質のリサイクルに必要なタンパクdynaminの温度感受性優性突然変異shibire^<ts>の遺伝子を脳の一部で特異的に異所発現させた。昆虫の走光性行動は、明るさを好むという単純な走性ではなく、光源の方向を認識してそれに対して進路を定位する、高度な制御行動である。それぞれの情報伝達経路をshibire^<ts>の異所発現によって阻害した結果、例えば視葉の左右相同な領域を連絡する線維の連絡を遮断すると、走光性が大きく損なわれることが分かった。視覚情報は、複眼にある網膜にアレイ状に並んだ光受容細胞群で明暗の分布情報として検出され、脳側部の視葉に送られる。この領域には網膜での受容素子の配置に対応したコラム状の線維と、それに直交する層状の線維とが組み合わさった繰り返し構造が存在し、受容素子ごとの光強度の情報から、輪郭や動きなど基礎的な特徴情報を抽出する機能を担っている。これら低次視覚領野の回路構造は、哺乳類と昆虫で類似性が高く、これまでかなり詳しく解析されてきた。そこで本研究では、4500系統を超える我々の世界最大規模のGAL4エンハンサートラップ系統コレクションからこれまで約3000系統をスクリーニングし、低次領野である視覚葉から脳中枢の視結節・前大脳腹側部・側角・後傾斜の4つの高次領野へ投射する投射神経をラベルする系統を探索した。これによって従来知られていた10経路を大幅に上回る、30種の経路を同定した。共焦点レーザー顕微鏡による断層撮影像を三次元立体再構成処理して解析した結果、視葉第2層の視髄から出る線維と、第3層の視小葉から出る線維では、視葉内の細胞突起の形態に大きな特徴差があることが分かった。現在、各線維群を構成する細胞数や出力シナプスの分布状況、投射している領野ごとの線維終末形態の差など、さらに詳細な解析を進めている。
腸内細菌叢からみたIgG4関連疾患の発症機序の解明

IgG4関連型自己免疫性膵炎の発症に関わる自然免疫反応について、解析を進めた。マウスの自己免疫性膵炎モデル及びヒトIgG4関連型自己免疫性膵炎の血液細胞・膵臓組織標本を用いて検討を行った。その結果、マウスの自己免疫性膵炎及びヒトIgG4関連型自己免疫性膵炎の双方において、形質細胞様樹状細胞(plasmacytoid dendritic cells, pDCs)の活性化が重要な役割を果たすことを見出した。pDCsは腸内細菌を認識することにより活性化され、IFN-alphaとIL-33を産生することにより、自己免疫性膵炎を誘導していることが明らかになった。平成27年度においては、IgG4関連疾患において最も多い表現型である自己免疫性膵炎モデルを用いた検討を行った。MRL/MpJマウスにTLR3 ligandであるPolyinosinic:polycytidylic acid (Poly (I;C))を全身投与する自己免疫性膵炎モデル動物を用い、自己免疫性膵炎の発症に腸内細菌がどのように関わるのか?解析した。まず、抗生剤投与による腸内細菌の除去が膵炎発症に及ぼす効果を検証した。その結果、腸内細菌の除去により、自己免疫性膵炎の発症が抑制されることが明らかになった。また、その効果は膵臓に浸潤する免疫細胞(形質細胞様樹状細胞、T細胞、B細胞)の減少を伴っていた。炎症性サイトカインの発現解析はサイトカインアレイ法により、実施した。サイトカインアレイでは、形質細胞様樹状細胞の減少に伴うI型IFN、CXCL10、CXCL11の産生低下が著明であった。また、TNF-alpha、IFN-gamma、CCL2、IL-6の発現も著明に低下していた。以上のことから、自己免疫性膵炎の発症に腸内細菌を介する免疫反応が関与することが明らかになった。現在、マウスの自己免疫性膵炎の発症に関わる腸内細菌叢の解析を試みており、マウス便検体を用いた16S ribosomal RNAのSequenceを解析することにより、マウスの自己免疫性膵炎の発症に関わる腸内細菌の同定を目指している。マウスの自己免疫性膵炎の発症に腸内細菌を介する免疫反応が関与することを明らかにすることができた。しかしながら、マウスの便検体を用いた検討では、膵炎を惹起あるいは抑制する腸内細菌の同定には至らなかった。IgG4関連型自己免疫性膵炎の発症機序について、「腸内細菌に対する自然免疫反応」という視点から解析を進めた。自己免疫性膵炎モデルマウスとしては、poly(I:C)の全身投与により誘導されるMRL/MpJマウスを用いた。この自己免疫性膵炎モデルでは、形質細胞様樹状細胞(plasmacytoid dendritic cells, pDCs)が膵臓に集積していることを見出した。これらの膵臓に浸潤するpDCsはTLR刺激により、IFN-alphaとIL-33を産生した。pDCsの除去抗体、I型IFN受容体抗体、IL-33受容体抗体の投与により、慢性炎症と線維化が著明に抑制された。これらの事実から、自己免疫性膵炎モデルマウスでは、IFN-alphaとIL-33を産生するpDCsが活性化されることにより、膵炎が誘導されることが明らかになった。抗生物質投与による腸管の清浄化により、自己免疫性膵炎の発症は著明に抑制され、その効果はpDCsの減少を伴っていた。16SrRNA Sequenceを用いた解析により、自己免疫性膵炎を引き起こす腸内細菌の候補が同定された。上記のモデルマウスを用いた検討により、IFN-alphaとIL-33を産生するpDCsが自己免疫性膵炎の発症に病的な役割を果たすことが明らかになった。ヒトIgG4関連疾患の末梢血より分離したpDCsはIFN-alphaを大量に産生し、B細胞をIgG4産生形質細胞へと分化させた。また、ヒトIgG4関連疾患の膵臓組織にはIFN-alphaとIL-33を産生するpDCsが多く浸潤していた。以上のマウス自己免疫性膵炎モデル及びヒトIgG4関連疾患を用いた解析により、pDCsによるIFN-alphaとIL-33の産生がIgG4関連型自己免疫性膵炎の発症に重要な役割を果たすことが明らかになった。平成28年度においては、マウスの自己免疫性膵炎及びヒトIgG4関連疾患の発症に腸内細菌叢の差異が関与していることを目指す。この目標のため、まず、16S ribosomal RNA Sequenceを用いた検討により、膵炎惹起性あるいは抑制性腸内細菌の候補の同定を行う。平成28年度においては、下記の研究課題に取り組んでいく予定である。1)マウスの自己免疫性膵炎モデル及びヒトIgG4関連疾患の発症に関与する腸内細菌叢の同定を行う。

2)1)で同定した腸内細菌をB細胞と共に培養し、IgG4の産生がどのように制御されるのかを検討する。上記の検討を介して、マウスの自己免疫性膵炎及びIgG4関連疾患の発症に関わる腸内細菌叢の同定と腸内細菌叢の制御を用いた疾患の新規治療法を提案する。消化器免疫学
花粉壁エキシンを構成するスポロポレニン生合成経路の解明

植物花粉壁の外層(エキシン)はスポロポレニンと呼ばれるポリマーから形成されているが、非酸化的分解に対して耐性のため、その化学構造は明らかになっていない。代表者はシロイヌナズナを用いてメタボローム解析と分子遺伝学的手法を組合せ、3-Ketoacyl-CoA合成酵素、およびBAHDアシル基転移酵素遺伝子のエキシン形成への関与を解析した。BAHD遺伝子突然変異体が微細なエキシン形態変化を示したことから、エキシン形成への何らかの関与が示唆された。花粉壁外層はエキシンと呼ばれ、脂質とフェノール化合物を主成分としたポリマー(スポロポレニン)から成ると提唱されているが、詳細な構造は不明である。代表者は、シロイヌナズナ転写因子MS1遺伝子の突然変異体を用いた解析から、エキシン形成に関与することが示唆される脂質とフェノール化合物の生合成・代謝系酵素遺伝子群のホモローグを同定している。スポロポレニン生合成遺伝子群を明らかにして、そのポリマー構造を推定するために、本年度は候補遺伝子群のうち、3-ketoacyl-CoA合成酵素(KCS)および、BAHDアシル基転移酵素に注目し、シロイヌナズナのT-DNAおよびトランスポゾン挿入変異体の単離、解析を行った。3つのKCS遺伝子パラログについて各遺伝子の破壊変異体を単離した。これらは葯発達に関する表現型異常が認められなかったので三重変異体を作製したが、これも葯発達表現型異常は観察されなかった。さらに、1つのBAHDアシル基転移酵素遺伝子の破壊変異体も単離したが、葯発達異常は認められなかった。そこで、代謝物レベルでの表現型を野生型と比較した。LC-MS/MS解析の結果、ヒドロキシシナモイルスペルミジン及びその誘導体が、この変異体では検出されなかった。このことから、この酵素は、ヒドロキシシナモン酸とスペルミジンとのアミド化酵素であることが示唆された。以上から、花粉形成過程でのヒドロキシシナモイルスペルミジンの重要性が示唆された。代表者は、シロイヌナズナ転写因子MS1遺伝子の突然変異体(雄性不稔形質を示す)を用いた解析から、エキシン形成に関与することが示唆される脂質とフェノール化合物の生合成・代謝系酵素遺伝子群のホモローグを同定している。本研究課題では、新規のスポロポレニン生合成遺伝子群を明らかにしてそのポリマー構造を推定するために、候補遺伝子群のうち、3-ketoacyl-CoA合成酵素(KCS)および、BAHDアシル基転移酵素に注目し、シロイヌナズナのT-DNAおよびトランスポゾン挿入変異体の作製を行い、花粉粒の表現型解析を行っている。前年度に、3つのKCS遺伝子パラログの三重変異体について、葯発達表現型異常が観察されなかったことを報告した。また、ヒドロキシシナモン酸とスペルミジンとのアミド化酵素である、BAHDアシル基転移酵素遺伝子の破壊変異体は、ポーレンコート内のヒドロキシシナモイルスペルミジンの消失が観察されたが、花粉致死形質を示さなかったことを報告した。今年度は、これら遺伝子の四重変異体を作製した。詳細な表現型解析は現在進行中であるが、ms1突然変異体のように完全に花粉形成が阻害される表現型は示さなかった。しかし、微細なエキシンの異常は認められることから、これら遺伝子群のエキシン形成への関与が示唆された。本研究課題では、新規のスポロポレニン生合成遺伝子群を明らかにしてそのポリマー構造を推定するために、候補遺伝子群のうち、3-ketoacyl-CoA合成酵素(KCS)および、BAHDアシル基転移酵素に注目し、シロイヌナズナのT-DNAおよびトランスポゾン挿入変異体の作製を行い、花粉粒の表現型解析を行った。3つのKCS遺伝子パラログの三重変異体は、葯発達表現型異常が観察されなかった。また、ヒドロキシシナモン酸とスペルミジンとのアミド化酵素である、BAHDアシル基転移酵素遺伝子の破壊変異体は、花粉コート内のヒドロキシシナモイルスペルミジンの消失が観察されたが、花粉致死形質を示さなかった。さらに、これら遺伝子の四重変異体は、ms1突然変異体のような花粉形成阻害の表現型は示さなかったが、微細なエキシンの異常は認められた。
ストレス関連転写調節分子を介するヒトβ_1アドレナリン受容体遺伝子発現調節機構

本研究では、ヒト神経芽細胞腫SY5Y細胞を用い、グルココルチコイド(GC)や熱ショック転写因子(HSF)によるヒトβ_1アドレナリン受容体(AR)遺伝子発現調節機構解明を目的とした。翻訳開始点から5'上流269/-365のCATT box逆配列(ATTGG)に結合するNF-Yと-345/-337あるいは-332/-324に結合するAP-2とが協調的に作用しヒトβ_1AR遺伝子基礎転写活性を調節する。さらにAキナーゼ活性に伴うβ_1AR遺伝子転写促進にはNF-Yと-353/-346に結合するCREBが協調的に作用する。いずれの場合でもATTGG配列に変異を導入すると転写括性は著しく低下することから、NF-Yはβ_1AR遺伝子転写調節に必須の転写因子である。NF-Yは3量体として存在し、NF-YA,-YB, YCサブユニットから構成される。ウエスタンブロット解析によりNF-YA,-YB, -YCサブユニットの存在を確認した。抗NF-YA,-YB抗体存在下のゲルシフトアッセイではスーパーシフトが認められたが、抗NF-YC抗体では認められなかった。このことから、NF-YC抗休が認識するエピトープ部位にAP-2あるいはCREBが結合している可能性が示唆された。CREB結合配列とNF-Y結合配列との距離は11bp、2箇所のAP-2結合部位との距離はそれぞれ19bp、32bpであることから、NF-YとCREB、AP-2はいずれもDNAの同側に結合しNF-Y-CREBあるいはNF-Y-AP-2複合体を生じたものと考えられる。一方、タンパク質-タンパク質相互作用により、活性化されたGC受容体がNF-Yと結合し、NF-Yを補足することによりβ_1AR遺伝子発現を抑制する可能性が示唆された。1 RT-PCR法により、ヒト神経芽細胞腫SY5Y細胞にβ1およびβ2アドレナリン受容体mRNAが存在することを確認した。mRNAの量比は、ほぼ1:1であった。2 [125l](-)iodocyanopindolol結合実験の結果、SY5Y細胞は、β1およびβ2アドレナリン受容体タンパク質をほぼ1:1の量比で発現していた。3グルココルチコイド受容体アゴニスト、デキサメサゾン(DEX)処置すると、結合実験では、β2受容体:β1受容体比は増加した。このとき、RT-PCR法でmRNAの半定量を試みると、β2受容体mRNA:β1受容体mRNA比は増加していた。従って、DEX処置により、β2受容体遺伝子の転写は促進され、一方、β1受容体遺伝子の転写は抑制された。4 β1受容体5'非翻訳領域およそ3kbの領域を順次欠失し、pGL2 Basicベクターに連結し、プロモーター活性測定用ベクターを構築した。5ルシフェラーゼ活性を指標に、DEX処置のβ1遺伝子転写への影響を調べると、翻訳開始点から、5'上流-450bpの領域が、DEX処置によるβ1受容体遺伝子転写抑制に関与する領域であることがわかった。6この領域には、AGACCAから構成される、1/2GR結合配列、TGACGCGAから構成されるCREB結合配列が存在する。1/2GR結合配列を介して、β1遺伝子転写が抑制される可能性がある。さらに、グルココルチコイド受容体がCREBと結合することにより、最終的に、CREBがCREB結合配列に結合することによりもたらされるβ1受容体遺伝子転写活性の増加を抑制する(減弱させる)可能性がある。

ヒト神経芽細胞腫SY5Y細胞におけるヒトβ_1アドレナリン受容体(AR)遺伝子基本転写活性には、翻訳開始点から5'上流-403/-340が関与した。-403/-340からPst I(-364)/Sma I(-342)を除去すると基本転写活性は-403/-340に比して低下した。一方、-403/-364および-364/-1には転写活性を認めなかった。興味あることに、-444/-364の5'→3'方向性を3'→5'に変えると、転写活性は著しく低下した。このとは、-403/-364領域中、-364近傍の配列が、-364/-342の配列と協調的に作用し転写活性を示すものと考えられた。転写因子結合配列を検索すると、-369/-366にCATT boxの逆配列および-352/-345にCRE類似配列(TGACGCGA)を見出した。CATT boxの逆配列は変異させても転写活性には影響しなかったが、CRE類似配列を変異させると、転写活性は低下した。CRE類似配列を含む領域(-364/-337)をプローブに用いたゲルシフトアッセイおよび-452/-251をプローブに用いたDNase Iフットプリンティングアッセイの結果、CRE類似配列に結合する転写因子はCREBである可能性が示唆された。この条件下で、CREBと協調的に作用しCRE類似配列近傍に結合すると考えられる転写因子は検出できなかった。今回の実験条件では検出できなかったが、グルココルチコイド受容体(GR)がCREBとヘテロダイマーを形成し、CREBのCRE類似配列への結合を抑制し、結果的にβ_1AR遺伝子転写活性が減少した可能性、あるいは、CREBと協調的に作用する未同定の転写因子の作用をGRが抑制し、結果的にβ_1AR遺伝子転写活性が減少した可能性などが考えられた。平成13年度までの研究で、ヒトβ_1アドレナリン受容体(AR)遺伝子基礎転写には、翻訳開始点から5'上流-403/-364領域中、-364近傍に結合する転写因子が、-364/-342に結合する転写因子と協調的に作用している可能性が示唆された。データベース検索により-369/-365にCATT boxの逆配列(ATTGG)を見出した。ATGG配列にATTAAと変異を導入すると基礎転写活性は著しく低下した。ATTGG領域をプローブにゲルシフトアッセイを行い、同領域に結合する転写因子をNF-Yと推定した。NF-YはNF-YA、-YB、-YCサブユニットで構成される3量体である。SY5Y細胞核抽出物を用いたウエスタンブロット解析によりNF-YA、-YB、-YCサブユニットの存在を確認した。抗NF-YA、-YB抗体存在下のゲルシフトアッセイではスーパーシフトが認められたが、抗NF-YC抗体では認められなかった。このことから、NF-Yに他のタンパク質(転写因子)が結合し、抗NF-YC抗体が認識するエピトープ部位が覆われている可能性が示唆された。平成13年度の研究で同定したCREB結合類似配列(TGACGCGA:-353/-346)と本年度同定したNF-Y結合部位との距離は11bpで、DNA構造上ほぼ1回転に相当する。従って、NF-Y、CREBはDNAの同側に結合し、協調的にヒトβ_1AR遺伝子基礎転写活性に関るものと考えられる。
食道癌細胞におけるProtein Kinase CとChimaerinの役割

(目的)食道癌細胞におけるprotein kinase C(PKC)とβ2chimaerinの役割を分子生物学的手法を用いて検討した。(結果)食道癌培養細胞株KE3にPKCのactivatorであるPMAを30nM、1時間投与すると投与48時間後にはcontrolと比較して42%の増殖抑制作用が認められた。細胞周期の検討ではPMA投与群ではcontrolと比較してS、G2/M期が14.6%増加した。この結果よりKE3の細胞増殖にはPKCあるいはβ2chimaerinが関与していることが考えられた。KE3にPKCδadenovirus(PKCδAdV)を感染させ、PKCδを強制発現させることによる生物学的効果を検討した。感染後24時間後にはcontrolと比較して60%の細胞増殖抑制が認められた。しかし、β2chimaerin AdV10MOl感染群では細胞増殖抑制は認められず、細胞周期にも変化は見られなかった。以上より、PMAによる増殖抑制効果はPKCの中でもPKCδが強く関与しているものと考えられ、β2chimaerinによる効果は否定的であった。ただし、β2chimaerinは細胞内シグナル伝達の中心的役割をはたしており、今後さらに詳細な細胞内シグナル伝達とβ2chimaerinの関係を検討する必要があると考えられた。食道癌培養細胞株KE3にprotein kinase CのactivatorであるPMAを30nM、1時間投与すると投与24時間後にはcontrolと比較して23%の増殖抑制作用が認められた。この結果よりKE3の細胞増殖にはPKCが関与していることが考えられた。さらにKE3の内因性PKCδはwestern blotの解析では中等度の発現が認められた。従って、KE3細胞において、PKCの中でもPKCδはKE3細胞の増殖に関与している可能性が考えられた。そこで、この現象を裏付ける目的でKE3にPKCδadenovirus(PKCδAdV)を感染させ、PKCδを強制発現させることによりその生物学的効果を検討した。まず、PKCδAdV感染24時間後にPKCδ蛋白の発現をwestern blotで確認したが、良好な発現が認められた。さらに感染後24時間後にはcontrolと比較して60%の細胞増殖抑制が認められた。以上より、KE3細胞においてPKCδは強い細胞増殖抑制作用を有することが示唆された。今後は増殖抑制のメカニズム、とくにMAPKを中心とした細胞内シグナルの変化を検討していく予定である。食道癌切除標本による抗Chimaern抗体を用いた免疫染色では、chimaerinは上皮細胞の細胞質に発現しており、上皮細胞の増殖に強い関係があるものと考えられた。今後、Chimaerin発現と臨床病理学的所見との関係を明らかにしていく予定である。食道癌培養細胞株KE3にprotein kinase C(PKC)のactivatorであるPMAを30nM、1時間投与すると投与24時間後にはcontrolと比較して23%の増殖抑制作用が認められた。従って、KE3細胞においてPKCの中でもPKCδはKE3細胞の増殖に関与している可能性が考えられた。この現象を裏付ける目的でKE3にPKCδadenovirus(PKCδAdV)を感染させ、PKCδを強制発現させることによる生物学的効果を検討した。PKCδAdV感染24時間後にPKCδ蛋白の発現をwestern blotで確認したが、良好な発現が認められた。さらに、感染後にPMAでPKCδをactivateすると73%の細胞増殖抑制が認められた。食道癌培養細胞株8種類を使用し、β2Chimaerinの発現を検討するために、RT-PCRを施行した。