hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ネットワーク環境における計算負荷を考慮したデータ配送のための分散アルゴリズム

申請者らはこれまでに秘密分散共有法の一種である(k, n)しきい値法を利用した秘密分散ストレージシステム(以下SSSS : Secret Sharing Storage System)を提案している。SSSSは(k, n)しきい値法を利用しているため、従来のネットワークストレージシステムに対して、よりネットワークやハードウェアの障害に強く、より秘密データの盗聴に強いなどの利点を有している。しかし、秘密分散共有法における符号化・復号化処理は多くの時間がかかり、その高速化が重要な課題の一つである。平成18年度では以下のタスクを遂行した。秘密分散共有法における符号化・復号化処理問題をシェア配送問題として定式化した。シェア配送問題は組み合わせ最適化問題であり、その解法を検討するに当たり計算複雑度の検討が必要不可欠である。検討の結果シェア配送問題がNP困難であるという知見を得た。シェア配送問題がNP困難であることが示せたので、解くためにはヒューリスティック手法を利用する必要がある。そこで、シェア配送問題をスタイナー木問題に帰着させる方法を提案した。これにより、スタイナー木問題に対する既存手法を利用することが出来る。また、Prunded-MST等の4種類のスタイナー木問題に対する既存のヒューリスティックアルゴリズムについて、シェア配送問題に対する適用可能性を調べるために計算機上で比較実験を行った。シェア配送問題をスタイナー木問題に帰着させる場合得られる解がシェア配送問題の制約条件を満たすことは得られるスタイナー木の最適性を利用している。すなわちヒューリスティクスを用いた場合制約条件を満たすこと(実行可能性)を保障できない。そのため、評価指標としては近似度、実行可能性を用いた。各種アルゴリズムのシェア配送問題への適用性に対する知見を得た。申請者らはこれまでに秘密分散共有法の一種である(k,n)しきい値法を利用した秘密分散ストレージシステム(以下SSSS:Secret Sharing Storage System)を提案している。SSSSは(k,n)しきい値法を利用しているため、従来のネットワークストレージシステムに対して、よりネットワークやハードウェアの障害に強く、より秘密データの盗聴に強いなどの利点を有している。本研究課題の主な目的は、(1)ネットワークのトポロジーに対して最適なシェア配送を実行する分散アルゴリズムの開発、(2)JGN IIを用いた広域網上での実証実験によるSSSSの評価を行うことである。平成17年度では以下のタスクを遂行した。リレーショナルデータベースにおいてシステムのパフォーマンスを向上させるために利用されているVertical Partitioning(VP法)というリレーション分割技術をSSSSへ適用した。データのサイズを考慮することによるSSSS向けのVPアルゴリズムを提案し、計算機実験によりその有効性を確認した。これによりシェア配送の効率化が行える。これまでSSSS実行環境はSun Solaris上で開発されていた。実験環境の整備のため実行環境をFedora Core(Linux)上へ移植した。また、実験用PCをJGN II上に配置した。実証実験は平成18年度に行う。
建物の熱的影響と気象条件による雪質の変化を考慮した屋根積雪多層熱収支モデルの開発

本研究では、旭川市と札幌市に設置したモデル検証用建物や実建物を対象とした屋根積雪性状の実測調査を行い、数値モデルの開発に必要となる基礎データの整備、及び建物性能と気象条件が屋根積雪性状に与える影響について把握した。また、気象分野と建築分野における研究蓄積を統合し、フラットな屋根における屋根積雪性状を予測可能な数値モデルのプロトタイプを開発した。平成23年大雪では、雪による死者が全国で131名に達するなど甚大な被害が生じ、屋根の雪下ろしや落雪など住宅の屋根雪による死者は全体の90%を占めた。また国内外では、大規模建築物における屋根雪事故が相次いでいる。建物の構造性能や除雪技術は年々向上しているにも係らず、このような甚大な被害が発生する要因として、屋根積雪性状(雪質・重量)が気象条件のみならず建物からの熱損失にも影響されるため、屋根雪の性状を詳しく推定することが困難であることが挙げられる。本研究では、建物の熱的影響と気象条件により異なる屋根積雪を対象とし、雪質(密度・重量)の変化や積雪に係る物理的諸過程を数値モデルにより再現し、多様な建物性能と気象条件に適用可能な屋根積雪多層熱収支モデルの開発を目的としている。平成23年度の実績は、以下の通りである。1.気象分野と建築分野における既往の積雪モデルの整理気象分野で主に地上の積雪を対象に検討されてきた積雪モデル(多層熱収支モデル)と建築分野において検討されてきた屋根融雪モデルについて、解析手法やモデルの特徴などを整理した。2.モデル検証用データ収集のための屋根雪実測調査旭川市と札幌市において屋根の断熱性能を3種類有する実験建物を製作し実測調査を行った他、旭川市と下川町に建設された実建物においても実測調査を行った。断熱性能、室内の設定温度及び気象条件の違いに着目して屋根積雪性状の分析を行い、これらが屋根積雪性状に与える影響ついて明らかにした。実測調査により得られたデータは、数値モデルの検証用データとして整備した。3.屋根積雪多層熱収支モデルの開発気象分野で検討されてきた多層熱収支モデルと建築分野において検討されてきた屋根融雪モデルを統合した数値モデルの検討を行った。数値モデルの開発は、引き続き次年度も行う。本研究の目的は、建物側からの熱的影響や気象条件によって異なる屋根積雪性状を予測することが可能な数値モデルを開発することである。平成24年度の実績は、以下の通りである。気象分野で検討されてきた積雪多層熱収支モデルと建築分野で検討されてきた屋根融雪モデルを統合し、フラットな屋根における屋根積雪性状を予測可能な数値モデル(屋根積雪多層熱収支モデル)のプロトタイプを開発した。計算結果の妥当性の検証のため、前年度に北海道旭川市にある北方建築総合研究所の敷地内で実測調査を行った実験建物を対象に計算を行った。屋根上積雪深は厳冬期である1月下旬くらいから計算値と実測値が比較的よく一致する結果となった。また、3月下旬に屋根雪が消失する時期も概ね再現できた。しかしながら、降雪が始まる11月中旬から1月中旬までの時期では、計算値と実測値があまり一致しない結果となった。この理由として、実際の観測では降雨であったのにも係らず、雨・雪判別式で計算すると降雪と判断されてしまうケースがあり、観測された降雪量よりも数値計算では降雪量を多く計算してしまったこと、また地上降雪量と同じ量が屋根上にも積もるという仮定で計算したために、屋根上積雪量が大きくなってしまったことなどが原因であると考える。また、屋根上積雪重量は実測値よりも計算値は小さく両者の誤差が大きい傾向を示した。この理由として、積雪内部の水分移動を最大含水率から算出し重力方向のみ起こると簡略化し、屋根面と接する最下層でも同様の扱いとしたため、屋根面付近で形成される氷板、高含水率状態の積雪層、毛管力による上向きの水分移動が再現できていないためであると考える。今後は、屋根雪内で起きているこれらの水分移動を再現できる新たなモデルを開発し数値モデルの精緻化を図るほか、勾配屋根においても計算可能な数値モデルに改良する予定である。平成23年度の研究実施計画を計画通り実施することができたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。数値モデルを開発するためには、実現象との対応を見極めながら重要となるパラメータを抽出するとともに、モデル係数のチューニング等を行う必要がある。そのため、平成23年度に整備した数値モデルの検証用データと数値解析の結果を照合し、モデル係数のチューニングを行うことで、数値モデルの精度向上を図りながら研究を推進する。また、効果的に研究を進めるために、屋根雪や気象分野と建築分野の積雪モデルに関する研究者と情報交換を密に行いながら研究を推進する。
多段階連続マイクロフロー合成装置による活性型ビタミンＤ３類の高効率合成法の確立

活性型ビタミンD3やその類縁体は、骨粗しょう症、乾癬、腎不全、二次性副甲状腺機能亢進症等のさまざまな疾病の治療薬として用いられており、その効率的な合成法の開発は重要である。最も汎用的な光および熱反応を駆使する合成法は、光反応における副反応が問題となっていた。これに対して申請者らは、微小な流路を反応場とするマイクロフロー反応装置と安価な光源(高圧水銀灯)を用いて光反応を行うことにより問題を解決することに成功した。すなわち、マイクロフロー反応装置は細い流路を持つため、光の減衰が抑制されて、均一な光が当たる。これにより問題となっていた副反応の抑制に成功した。本年は、1)前年までに確立した活性型プロビタミンD3の供給法を基盤として、数種の活性型プロビタミンD3の十分量の供給と、2)供給した活性型プロビタミンD3類縁体を原料とする活性型ビタミンD3類縁体の合成に取り組んだ。すなわち、合成標的としてビタミンD2、カルデロール、アルファカルシドール、ロカルトロールの4つを選定した。これらはいずれも医薬品として用いられている化合物である。これらを対応する活性型プロビタミンD3類縁体から供給することとし、前年までに確立した手法を基盤としてグラムスケールでの供給を検討した。その結果、各段階とも収率良く反応は進行し、マイクロフロー合成の検討に必要な十分量の目的物を供給することに成功した。続いて、供給した原料を用いて、マイクロフロー合成を検討した。前年までの結果を元に、石英製光マイクロフローリアクターをPEEKチューブで連結し、一つ目のリアクターには高圧水銀灯の光を直接照射し、二つ目のリアクターは100度に加熱した油浴上に浮かべ、ガラスUVフィルターを通した光を照射した。上記フローシステムに活性型プロビタミンD3類縁体のジオキサン溶液を注入して反応を行った。その結果、各化合物が概ね単離収率25%程度で得られた。これは、工業法の報告単離収率が20%で以下であることを考え合わせると良好な収率であると言える。一方、最も官能基化された活性型ビタミンD3については、対応する活性型プロビタミンD3の各種有機溶媒に対する溶解性が低く、低濃度条件で反応せざるを得なかったため収率が低下した。そこで、活性型プロビタミンD3の前駆体であるシリルエーテルを用いて、マイクロフロー反応を試みたところ単離収率28%で目的物を得ることに成功した。またシリル基の除去も定量的に進行し、開発した手法が種々の活性型ビタミンD3類縁体の合成に有用であることを実証した。本年度は、まずマイクロフロー光・熱反応の目的生成物量の評価手段として以前の研究で用いていたHPLC-UVを用いる手法の他にNMRを用いて内部標準と目的物の積分比により求める手法を検討し、その信頼性を単離収率との比較により検証した。その結果、HPLCーUVを用いる手法に比べ、よりNMRを用いる手法のほうが単離収率との良い一致を示すことがわかり、今後、類似研究のさらなる展開を図る際に有益な知見を得ることができた。また次に、さらなる収率の向上を念頭に置いた、副生物の構造決定に取り組んだ。反応生成物の詳細な解析の結果、現在までに幾つかの化合物の構造を推定するに至っており、その生成機構についても知見を得ている。今後、これらの知見を基盤として、さらなる検討を続けることによりより優れたプロセスの開発につながるものと期待している。研究期間全体を通じ、申請者らは世界初となる活性型ビタミンD3およびその類縁体のマイクロフロー合成を達成し、報告されている工業法の収率を超える成績を得ることに成功した。官能基化されたビタミンD3の誘導体の光・熱反応による合成では様々な副反応が起こりうることが過去に報告されており、これを克服することにより得られた本成果は大きな意義を持つものと考えている。得られた成果はOrganic&BiomolecularChemistry誌に掲載され、審査員からの高い評価を得て、表紙にも選定された。平成23年度は、次の二つの事項について研究を実施した。1)本課題研究で目的とする活性型ビタミンD3のマイクロフロー合成において、その原料となる活性型プロビタミンD3のスケールアップ合成法の確立と、スケールアップ合成の実施。2)供給した活性型プロビタミンD3を原料とする、マイクロフローリアクター中での光・熱連続反応による活性型プロビタミンD3合成の検討。研究事項1)前年度までの予備検討により、既に小スケールで活性型プロビタミンD3を合成する手法を確立した。そこで、本手法を基盤としてスケールアップ合成法を検討した。ここで鍵となったのはグリニャール反応であった。本反応は小スケールで行った際には再現性良く、良好な収率で目的物を与えたものの、スケールアップ時には収率が安定しなかった。

反応条件を精査したところ、温度を厳密に制御しつつ反応を行うことによって問題を解決できることがわかり、スケールアップ合成法の確立に成功した。また、本合成法により活性型プロビタミンD3のスケールアップ合成を実施し、十分量を供給することに成功した。研究事項2)供給した活性型プロビタミンD3を原料として、マイクロフローリアクター中での連続的な光・熱反応による活性型ビタミンD3のマイクロフロー合成を検討した。すなわち、我々が独自に開発したビタミンD3のマイクロフロー合成法を元に、光マイクロフローリアクターと光・熱マイクロフローリアクターを連結し、活性型プロビタミンD3のジオキサン溶液を導入した。反応液のNMR、LC解析の結果、目的物の生成を確認した。本結果は、我々が独自に開発したビタミンD3類のマイクロフロー合成法が官能基化されたビタミンD3類縁体の合成にも適用できることを示唆するものである。官能基化されたビタミンD3類は医薬品候補化合物として重要であることから、極めて意義の大きい結果であると言える。当初の計画では、研究開始二年目に当たるH24年度までに、種々の活性型ビタミンD3類縁体の合成法を確立することを目的としており、本法を実際に用いた、種々の活性型ビタミンD3類縁体の合成を最終年度に行う予定としていた。しかしながら、研究開始後初年度から順調に研究は進捗し、既に、H24年度までに、上記の通り4種の活性型ビタミンD3類縁体の合成に成功し、開発したマイクロフロー合成法の有用性を実証することができた。また、これらの成果を論文としてまとめてOrganic&BiomolecularChemistry誌に発表した。本論文は審査員から高い評価を得て、本雑誌の表紙に選定された。上述の通り、平成23年度は1)活性型ビタミンD3のマイクロフロー合成において原料となる活性型プロビタミンD3のスケールアップ合成法の確立と、スケールアップ合成の実施、2)供給した活性型プロビタミンD3を原料とする活性型プロビタミンD3のマイクロフロー合成の検討を目的として研究を推進し、研究事項1)2)のいずれについてもその目的を達成することができた。平成24年度には、活性型プロビタミンD3類縁体のマイクロフローリアクター中での光・熱連続反応によるマイクロフロー合成を検討する計画である。具体的な合成標的としては、生理活性天然物であるカルシフェロール、カルデロール、アルファカルシドールを選択することとした。この検討を行うためには、十分量の活性型プロビタミンD3類縁体を供給する必要がある。そこで平成23年度中に、活性型プロビタミンD3類縁体の合成経路確立を目指して検討を行った。その結果、活性型プロビタミンD3を合成する際に用いたグリニャール反応を鍵とする合成手法が他の活性型プロビタミンD3類縁体の合成にも有効であることを明らかにした。さらには、確立した合成手法を駆使して、スケールアップ合成を実施した。現在、既に十分量の活性型プロビタミンD3類縁体を所持しており、活性型ビタミンD3類縁体のマイクロフロー合成の検討にも着手している。
子宮内膜と脱落膜におけるPGH2合成酵素の発現とその調節機構に関する研究

妊娠初期脱落膜細胞に存在するサイクロオキシゲナーゼ(COX)につき抗COX-1抗体及び抗COX-2抗体を用いて検討したところ、COX-1は細胞質内に常に存在するのに対し、COX-2はインターロイキン-1(IL-1)等により誘導されることがあきらかとなった。また、これにともない脱落膜細胞のPGE2産生も促進される。合成副腎皮質モルモンのデキサメサゾン添加は、COX-2の誘導とPGE2産生を阻止し、天然型黄体ホルモンであるプロゲステロンも同様にin vitroにおけるCOX-2の誘導とそれに伴うPGE2産生を阻害した。このことは、初期妊娠の維持のために合目的的と考えられる脱落膜PGE2産生抑制機構にプロゲステロンの関与する可能性を示唆すると思われれる。一方、肝細胞の再生などに関与する成長因子として発見された肝細胞成長因子(HGF)は、COX-2の誘導を介さない機構により脱落膜細胞のPG産生を促進することがあきらかとなり、絨毛細胞により大量に産生されるHGFのin vivoにおける役割が今後注目される。COX-2の特異的阻害剤であるNS-398は、IL-1により促進される脱落膜細胞のPG産生につき濃度依存的に阻害し、10^<-6>Mで完全に阻止する。これは、脱落膜細胞の産生するPGが、本研究の無血清培地という条件下ではCOX-2にのみ依存する可能性と、IL-1によりリン脂質から放出が増加するアラキドン酸の利用がCOX-2に主に依存する可能性を示唆する。したがって、今後脱落膜細胞におけるアラキドン酸のCOXによる代謝をCOX-1及びCOX-2の双方につき詳細に検討する必要がある。今年度の研究により以下の点が明らかとなり今後の研究の方向性が示唆された。ヒト妊娠脱落膜細胞培養系にインターロイキン1(IL-1)を添加すると、プロスタグランディン(PG)の産生は濃度依存的(0.01-1ng/mI)かつ時間依存的に促進された。また、これと同時に、免疫組織化学的に検出されるプロスタグランディンH2合成酵素(PGHS2)が増加し、IL-1によるPG産生の促進に律速段階酵素の誘導が関与する可能性が強く示唆された。また、この酵素の誘導およびPG産生の促進は、妊娠中に高い値をとるプロゲステロンを、in vitroで添加することにより阻害されることが明らかとなり、初期妊娠の維持機構や、分娩発来機構へのプロゲステロンの関与の可能性について新たな側面を示唆した。(日本受精着床学会雑誌10:251,1993)ヒト子宮内膜および脱落膜においてPG以外のもうひとつの重要なPGH2代謝産物である12hydroxyeicosatetraenoic acid(12HETE)の産生を検討したところ、増殖期子宮内膜より分泌期にその産生は増大し、妊娠成立後の脱落膜でその産生は抑制されることが明らかとなった。この変化は、この組織におけるPG産生の変化と極めて類似しており、着床機構における12HETEの意義について、今後一層検討していく必要のあることを示唆する。(Prostaglandin Leukotrien Essent.Fatty Acids 49:609,1993)今年度の研究により以下の点が明らかとなり今後の研究の方向性が示唆された。ヒト妊娠初期脱落膜細胞培養系にインターロイキン-1(IL-1)を添加することにより誘導されるプロスタグランディン(PG)H2合成酵素と、それに伴うPGの産生促進は、培養液中へのプロゲステロンあるいはデキサメサゾンの添加した場合、阻害することが可能であった。

これは、妊娠により高値をとるプロゲステロンや副腎性ステロイドホルモンがPGH2合成酵素の誘導を阻害することにより、脱落膜によるPG産生またそれに伴う子宮収縮などを防止している可能性を示唆し、初期妊娠の維持機構や陣痛発来機構におけるPGH2合成酵素誘導の関与の可能性を示唆するとともに、その機序は一般の炎症反応と類似したものの可能性があると思われる(Prostaglandins:in the press)。ヒト胎盤や絨毛に大量に含まれ、妊娠中のその存在意義が興味の持たれるHGF(hepatocyte growth factor)の脱落膜細胞におけるアラキドン酸代謝およびPG産生に及ぼす影響を検討したところ、IL-1とはことなり、PGH2合成酵素の誘導作用は明らかではないものの、強いPG産生促進作用を有することが明らかとなり、PGH2合成酵素の誘導をかいさない別の機序による子宮内におけるPG産生調節機構の一端をになう可能性が示唆された(日本受精着床学会雑誌印刷中)。妊娠初期脱落膜細胞に存在するサイクロオキシゲナーゼ(COX)につき杭COX-1抗体及び抗COX-2抗体を用いて検討したところ、COX-1は細胞質内に常に存在するのに対し、COX-2はインターロイキン-1(IL-1)等により誘導されることがあきらかとなった。また、これにともない脱落膜細胞のPGE2産生も促進された。合成副腎皮質ホルモンのデキサメサゾン添加は、COX-2の誘導とPGE2産生を阻止し、天然型黄体ホルモンであるプロゲステロンも同様にin vitroにおけるCOX-2の誘導とそれに伴うPGE2産生を阻害した。このことは、初期妊娠の維持のために合目的的と考えられる脱落膜PGE2産生抑制機構にプロゲステロンの関与する可能性を示唆すると思われれる。一方、肝細胞の再生などに関与する成長因子として発現された肝細胞成長因子(HGF)は、COX-2の誘導を介さない機構により脱落膜細胞のPG産生を促進することがあきらかとなり、絨毛細胞により大量に産生されるHGFのin vivoにおける役割が今後注目される。COX-2の特異的阻害剤であるNS-398は、IL-1により促進される脱落膜細胞のPG産生につき濃度依存的に阻害し、10^<-6>Mで完全に阻止する。これは、脱落膜細胞の産生するPGが、本研究の無血清培地という条件下ではCOX-2にのみ依存する可能性と、IL-1によりリン脂質から放出が増加するアラキドン酸の利用がCOX-2に主に依存する可能性を示唆する。したがって、今後アラキドン酸のCOXによる代謝をCOX-1及びCOX-2の双方につき詳細に検討する必要がある。
シリコン単電子デバイスによる単一イオンの動き検出

本研究は、電子1個1個のトンネリングを制御したSi単電子デバイスに可動イオンを導入し、電流振動特性の変化から単一イオンの空間的動きを検出することを目的とする。当初はLiを可動イオンとして選択し、SiN膜の対Li拡散阻止能を利用する予定であったが、デバイス作製上困難であり、18年度はバイクリスタルFETと呼ぶ転位網を内包した構造を作製してLiを転位網に偏析させる試みを行った。しかし、XPSで観測した限りでは転位網に特に偏析する徴候は見られなかった。そこで、視点を変えて単電子トランジスタが作製されているSOI基板の下地基板にドーピングしてあるイオンを1個ずつ検出する可能性を探った。そのため、初期条件として全てのB原子が中性となる極低温低電界状態を設定し、その後徐々に垂直電界を印加していき中性B原子がイオン化していくことに伴う単電子トランジスタの電流の時間変化をモニターした。その結果、B原子1個ずつのイオン化を反映して、単電子電流が階段状に変化することを発見した。我々が知る限り、単一イオンの検出は初めてであり、大きな成果と考えている。可動イオンであるLiで実現しなかったが今後につながる成果と思われる。本研究は、電子1個1個のトンネリングを制御したSi単電子デバイスに可動性イオンを導入し、電流振動特性の変化から単一イオンの空間的動きを検出することを目的とする。16年度は、(1)ゾルゲル法によるLiドープSiO_2膜の形成条件を確立し、(2)プラズマCVDSiN層のLiに対する拡散阻止能を調べるとともに、(3)KFMによって試料表面の電位を測定し、これと膜中のLiイオン濃度との関連を調べること、を目的として研究を行った。成果の概要は、以下のとおりである。(1)LiドープSiO_2膜は、TEOS,エタノール、リチウムナイトレート、硝酸、を組み合わせて、均一で再現性のある膜生成プロセスを確立できた。また、この試料の深さ方向の元素分析をXPSにより行った。SiO_2/Si構造では、Liは大部分Si基板に拡散して散逸し、SiO_2表面にわずかに偏析するだけであることが判明した。(2)Naイオンに対して拡散阻止能があることが知られているプラズマCVDSiN膜を、LiドープSiO_2とSi基板の間に挿入し、Liに対する拡散阻止能を調べた。その結果、SiN膜を800°C程度でアニールすることにより、LiをSiO_2層に閉じ込めることが可能となり、拡散ストッパー層として働くことが判明した。(3)KFMによる表面電位の測定は、原理的には試料内部の帯電電荷を反映するはずであり、Liイオンの検出に有効と思われる。測定結果は、かなりのばらつきを伴うが、SiN膜に元々含まれるHイオンと、ドープされたLiイオンの両者が試料電位をプラス側にシフトさせる傾向があることが明らかとなった。以上、概ね当初の計画通り進展したと考えている。本研究は、電子1個1個のトンネリングを制御したシリコン単電子デバイスに可動性イオンを導入し、電流振動特性の変化から単一イオンの空間的動きを検出することを目的としている。そのためには、可動性イオンが偏析しやすい構造を単電子FETの側に用意する必要がある。17年度は、2枚の(100)SOI層をわずかに面内角度をずらせて貼り合わせ、これによって形成されるらせん転位網を内包したいわゆるバイクリスタル構造のTEM観察とバイクリスタルFETのI_d-V_g特性を詳しく調べた。その主な結果は以下のとおりである。2つの薄いSOI層を貼り合わせた構造は、平面TEM像では全面にらせん転位網によるメッシュ構造が観察され、その周期は予測どおり、概ね面内のずれ角に逆比例した値となった。また、転位網をチャネル領域に内包したバイクリスタルFETのI_d-V_g特性においては、電流の立ち上がり領域で電流振動が見られ、その振る舞いの解析からこれが単電子トンネル特性であることを明らかにした(Appl.Phys.Lett.(2006))。さらに、貼り合わせ界面の位置によって転位網チャネルのしきい値電圧が変化することを見出した。このように人為的に転位網を導入して単電子特性を得ることができたことは、世界的にみても初めてのことであり、可動イオンを導入する準備が整った。また、Liイオン導入後、XPSでその深さ方向分布を測定する必要があるが、上記バイクリスタル層が20nm/20nmと薄いため、これに適したスパッタレートの調整を行い測定の準備を整えた。
好中球細胞外トラップを誘導する細胞死メカニズムの解明

CAG-Cre下でRap1bを欠損させる遺伝子組換えマウスを作出し、骨髄移植によって好中球特異的にRap1bを欠損させた。骨髄移植マウスの骨髄から調整した好中球でRap1bが欠損していることをウエスタンブロットで確認した。野生型マウス肺においてはLPS刺激で誘導されるNET様のDNA放出が二光子励起顕微鏡観察で確認した。好中球自体の可視化は赤色蛍光タンパク質または蛍光標識抗体(anti-Ly6G)で行った。一方、好中球特異的Rap1b欠損マウスでは、NET放出が減弱している傾向があり、細胞動態にも異常が見られたため、現在定量的な解析を進めている。Rap1b欠損好中球は細胞動態異常以外にも興味深いフェノタイプを示すことを発見しており、再現性も含め、現在検証を行っている。(論文投稿のため、本誌には詳細を記載しない。)しかし、Rap1b欠損マウス産子の生育不良や産子数の少なさのためにマウス作出計画は遅れている。また、前年度までにIntegrinの活性調節因子であるKindlin-3の好中球特異的欠損マウスの作出を完了し、当該年度ではTalin-1およびKindlin-3/Talin-1の二重欠損マウスの作出を完了した。先行論文で報告されているミトコンドリアDNAが放出されるタイプのNETosis(vital NETosis)の分子メカニズムを調べるために、mitoSOX染色を行った。しかし、通常使用される1-5μMでミトコンドリアではなく、好中球DNAがmitoSOXで染色されることが判明した。過去の報告に一部がartifactである可能性も含め、vital NETosisの分子メカニズムを再確認する必要がある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。好中球では、自身のクロマチンから成る高粘着性構造体「好中球細胞外トラップ:NETs」の放出を伴う細胞死「NETosis」が知られている。NETosisの本来の機能は外来異物の効率的な「捕捉」であるが、自己免疫疾患、癌転移、手術後の急性障害などにもNETosisが関与する。本研究では、二光子励起顕微鏡を用いた生体イメージングを駆使することでNETosisを制御する分子メカニズムに関して、以下の3つの課題に取り組んでいる。1. ApoptosisとNETosisの選択に関わる細胞接着シグナル:当該年度においては、細胞接着の制御因子Rap1からIntegrinへのシグナル伝達経路がNETosis制御にどのように関わるかをin vivoで調べる予定であった。Integrinの活性調節因子であるKindlin-3遺伝子をLysM-Cre下において好中球特異的に欠損する遺伝子組換えマウスの作出に予定より遅れて成功した。現在、その他の遺伝子組換えマウス作出も進行中である。2. NETosisに関わるMAP kinase(ERK, JNK, p38)の役割:p38バイオセンサーを入手し、バイオセンサーマウスの作出の準備を進めている。肝臓での生体イメージングによって、LPS刺激で誘導されるNET様のDNA放出プロセスを観察できた。3. NETsに伴う細胞骨格の変形、DNAの放出メカニズム:In vitroでNETosisを観察する系を立ち上げ、各種刺激に対するNETosisの定量化に取り組んだ。先行論文では、P-selectinと好中球との細胞接着がNET形成に重要であることが報告されているので、血流環境を再現するflow chamber内でP-selectinと好中球の相互作用を確認する系を立ち上げた。二光子励起顕微鏡を用いたマウス生体肺イメージング系を立ち上げ、NET観察を試みた。一般的な死細胞DNA染色試薬DAPI(青色)、PI(赤色)では十分な輝度の画像が得られなかったが、Sytox Green染色(緑色)により輝度の問題はほぼ解決した。しかし、Sytox GreenではFRETバイオセンサーマウスを用いたイメージングにおける色の分離が次年度以降の課題である。さらに生体内自家蛍光との分離も課題である。特に肺では自家蛍光が強かったため、今後は肝臓のイメージングを中心に行う予定である。肝臓の生体イメージングによって、LPS刺激で誘導されるNET様のDNA放出プロセスを観察できたが、好中球自体の可視化ができていないため、NET(死細胞DNA)と好中球の共染色を行う。また、生体内でのNETは短時間で形成・消滅する(血流、生体内DNAaseによる分解が原因と推測している)ため、Sytox Greenの静脈注射のタイミングが観察結果に影響を与えることがわかった。LysM-Cre下でRap1を欠損させる遺伝子組換えマウスの作出に当初取りかかったが、1)LysM-CreとRap1bが同じ染色体に載っていること、2)好中球ではRap1aよりもRap1bの発現量が多いことなどの理由でLysM-Cre, Rap1b f/fマウス作出を断念した。代わりにIntegrinの活性調節因子であるKindlin-3の好中球特異的欠損マウスなどの作出にとりかかった。またCAG-Cre下でRap1bを欠損させる遺伝子組換えマウスを作出し、骨髄移植によって好中球特異的にRap1bを欠損させる予定で交配を進めているが、産子の生育不良や産子数の少なさのためにマウス作出計画はやや遅れている。

骨髄移植マウスの骨髄から調整した好中球でRap1bが欠損していることをウエスタンブロットで確認した。野生型マウス肺においてはLPS刺激で誘導されるNET様のDNA放出が二光子励起顕微鏡観察で確認した。好中球自体の可視化は赤色蛍光タンパク質または蛍光標識抗体(anti-Ly6G)で行った。一方、好中球特異的Rap1b欠損マウスでは、NET放出が減弱している傾向があり、細胞動態にも異常が見られたため、現在定量的な解析を進めている。Rap1b欠損好中球は細胞動態異常以外にも興味深いフェノタイプを示すことを発見しており、再現性も含め、現在検証を行っている。(論文投稿のため、本誌には詳細を記載しない。)しかし、Rap1b欠損マウス産子の生育不良や産子数の少なさのためにマウス作出計画は遅れている。また、前年度までにIntegrinの活性調節因子であるKindlin-3の好中球特異的欠損マウスの作出を完了し、当該年度ではTalin-1およびKindlin-3/Talin-1の二重欠損マウスの作出を完了した。先行論文で報告されているミトコンドリアDNAが放出されるタイプのNETosis(vital NETosis)の分子メカニズムを調べるために、mitoSOX染色を行った。しかし、通常使用される1-5μMでミトコンドリアではなく、好中球DNAがmitoSOXで染色されることが判明した。過去の報告に一部がartifactである可能性も含め、vital NETosisの分子メカニズムを再確認する必要がある。CFPマウス由来好中球を用いることで、肝臓の生体イメージングで見られたNET様DNA放出が好中球由来であることを確認する。DNA染色試薬Sytox Green(緑色)の蛍光がFRET画像に混じる課題をsubtraction等の画像処理で解決したいが、別途赤色DNA染色試薬の利用も検討する。FRETマウスを用いたイメージングを当初予定していたが、Sytox Greenの蛍光がFRET観察に影響する課題が解決するまで、CFPマウスもしくは今春から導入予定の赤色蛍光マウスを用いた実験(薬剤を用いた実験と細胞接着関連因子の欠損マウスを用いた実験)を行う予定である。NET誘導のための刺激(LPSなど)のタイミングなどはin vitroの観察系で確認できているので、NET、アクチン細胞骨格、細胞接着制御因子等の同時染色を行い、NETsに伴う細胞骨格の変形、DNAの放出メカニズムをin vitroでの解析を中心に進める。先行論文では、P-selectinと好中球との細胞接着がNET形成に重要であることが報告されている。前年度までに、血流環境(流れ刺激)を再現するflow chamber内でP-selectinと好中球の相互作用(ローリング、アレスト)を確認する系を立ち上げた。このflow chamberを用いた実験系を蛍光観察できるようにセットアップし、in vitroで流れ刺激下でのNET形成プロセスを観察できるようにする。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
キ-・カレンシ-の侵食(erosion)と交替に関する理論的・実証的研究

本研究の目的は、ドルの基軸通貨性の侵食の状況を、国際通貨の諸機能ー契約通貨、為替媒介通貨(私的国際通貨)、介入通貨、準備通貨(公的国際通貨)ーのレベルで考察し、今後の国際金融システムの展開についての展望を得ることであった。資料の分析と研究討論を通じて、基軸通貨ドルは為替媒介通貨としての機能においてマルク、円を均等化する傾向を示していることを検出することができた。ドルの基軸通貨性を支えていたのが為替媒介通貨としての機能であったことからすれば、その地位の後退はドルの基軸通貨性の侵食の始まりを意味する。このドルの基軸通貨性の侵食という状況は、ドル圏に対してマルク圏の形成、そしてアジアにおける円圏の萌芽が指摘されている。更にそれは、ニュ-ヨ-ク、ロンドン、東京といった各国金融市場の巨大化→国際金融市場の多極化、といった事態と密接に係わりながら進行している。このことは、国際金融市場の拡大と国際的マネ-・フロ-の増大を意味する。変動相場制下で金融のグロ-バリゼ-ションが進展する過程で、三大為替市場は膨張し、為替媒介通貨としてのドルの優位性は相対的に低下し始めたのである。しかし、貿易取引での契約通化や資本取引での表示通貨としての円やマルクの使用の増大が、変動性相場制下では、直ちに国民通貨の国際通貨化を意味するものではない。この意味で、国際金融システムは、基軸通貨性の侵食を開始したドルとそれに代わりえない局地的国際通貨マルク、円との不安定性の中で推移していかざるをえない。本年度の研究によって明らかにされた論点は以下の通りである。ドルが国際通貨になった道筋は、ポンドの場合とは異なり、貿易金融(企業レベル)からくる取引通貨をステップに決済通貨・準備通貨へと展開していったのではなく、第二次大戦後創設されたIMF制度のもとでの「ドル本位制」的要素に則っている。この視点からは、大戦前の時期については、再建金本位制下の分裂した国際金融市場でのドル比重の増大や三国通貨協定下のドルの役割は、ドルの国際通貨としての地位の確立とは評価出来ない。また、大戦後の時期については、IMF体制の持つ「二重性」からくる「上からの」国際通貨化のルートの分析を必要ならしめると同時に、変動相場制移行以後重要性を増した為替媒介通貨に分析の焦点がおかれる。(山本)アメリカの銀行業が作り上げた国際信用システムが、その際の国際通貨としてのドルの機能を支える現実的基盤である。このシステムは、歴史的には、世紀転換期以降ニューヨーク市場を中心に着々と形成されていった。(平岡)アメリカ国内での金融制度の発展は、基軸通貨国の金融活動としてシステムに大きな影響を与える。(青山、数阪)環太平洋圏における銀行業・通貨圏の研究では、その国際信用システムの各部分の動きが基軸通貨国金融市場との関連で分析された。(石田・島崎)第二次大戦後、国際通貨国としての地位を固めたアメリカは、しばしばドル危機にみまわれ、基軸通貨国としての負担を強く受けることとなった。(西倉・前田)この負担への対処が、変動相場制への移行という形でのIMF体制の変質であった。1985年以降のアメリカの債務国への転化と変動相場制下での国際的な過剰通幣資本の激しい動きは、国際信用システムの動揺をまねき、また現在のドルの基軸通貨としての地位の低下を具体的に表わしている。(片岡・深町)本年度の研究において明らかになったことは、次のようなことである。国際通貨の多様化なる現象は、国際金融市場の分裂化、通貨ブロックの形成、世界経済の多極化といった事象と深くかかわっている。今後、国際金融市場、国際通貨、国際経済取引の各レベルにおける分裂化・分極化の諸相を検証していくことがますます必要になる。とくに通貨ブロックの形成過程にかんする歴史的研究はこの視角からの分析にとって極めて有効であった。

分裂化・分極化が進む一方で、国際金融市場の統合化がまずます進展しつつあることも明らかになった。それは、とくにユ-ロ市場の拡大、とりわけクロス・ボ-ダ-取引の急膨張という現象となってあらわれてきている。それは、外国籍企業の展開による取引のボ-ダ-レス化あるいは金融のグロ-バリゼ-ションとかかわりをもっている。基軸通貨の侵食(erosion)は、とくに表示通貨・準備通貨のレベルで進展してきた。今後の基軸通貨ドルの行方をさぐる鍵は、外国為替市場におけるドルを含まないクロス・カレンシ-取引の動向、国際債権市場(とくにユ-ロ・ボンド市場)における建値通貨の構成と金利・為替の動きである。以上のような成果をふまえて、今後次のような問題について討議していく必要がある。(1)こうした世界経済・国際金融市場の分裂・多極化と金融のグロ-バリゼ-ション・ボ-ダ-レス化との関係、(2)分極化と統合化が同時に進む中での国際的なマネ-フロ-の変化、(3)国際的な資産代替、クロス・カレンシ-取引の状況と基軸通貨ドルの侵食(erosion)との関係をさぐっていくことが必要である。本年度は、これまでの資料収集・調査及び討論・研究会を踏まえ、当初の研究課題に対して一定の解答を与えることが目的であった。本年度は数回の研究・討論会を通じて次のような結論を導きだした。(1)アメリカ国際収支ファイナンスを中心とする1980年代の先進国間マネ-・フロ-の特徴は、経常収支不均衡を上回るグロスの資本取引の拡大である。変動相場制における為替リスクの増大は、為替銀行のカバ-取引や「外ー外」取引、機関投資家による非ドル建て証券への国際的地域分散投資、既存金融資産の金利・為替の動向に応じた国際的代替取引を増大させ、債権債務の両建化を促進した。これは準備通貨の侵食の新しい現象である。(2)このような国際的マネ-・フロ-の活発化のなかで、国際金融市場の多極化と統合化の並進という現象が生じた。1930年代と著しく異なる特徴である。非ドル建て取引の増大がニュ-ヨ-ク、ロンドン、東京といった各国金融市場の拡大、国際金融市場の分極化をもたらす一方、各国金融市場間の国際的資産代替の活発化は、特に証券市場を通じて各国際金融市場の直接的統合化(グロ-バライゼ-ション)をもたらしている。(3)これに伴う外国為替市場の膨張の過程において、ドルを用いない直接的なクロス・カレンシ-取引が増大し、インタ-・バンク為替市場において、ドル・マルク・円のシェアの均等化傾向が生じていることを検証することができた。ドル圏に対してマルク圏の形成と円圏の萌芽がみられる。これは為替契約通貨としてのドルの優位性の低下である。契約通貨あるいは金融市場での表示通貨としての機能をあわせて、基軸通貨の侵食(erosion)の新しい状況を検出することができた。
現代ブラジルにおける都市問題と政治の役割

平成15年6月の日本ラテンアメリカ学会定期大会で、同年1月の労働者党(PT)ルーラ大統領誕生という政治変動を基底に住田がコーディネーターとなって「現代ブラジルにおける政治と都市問題」について研究会を立ちあげ、翌平成16年度より2年間に亘って約15名の研究報告者が、通算10回の研究会を実施した。この成果は報告書として論集に纏めて出版した。具体的に、現代の問題を中心に歴史研究をもおこない、研究代表者住田は、ブラジルの都市空間発達の典型にリオを選び、当初ポルトガルのリスボンを都市計画のモデルとして、20世紀にはフランスの影響が強まり、その結果ファヴェーラを産んだと指摘した。研究協力者のカヴァルカンティ氏は、ブラジルの中核都市形成の歴史を都市工学の立場から解説した。現代ブラジルにおける最大の都市問題は、ファヴェーラの存在であろう。この点について、複数の研究協力者からの情報提供があった。まず奥田が、フィールドワークに基づいてブラジリアの衛星都市の貧困住民を扱い、谷口が、現地調査を踏まえて、リオとブラジリアの特に住宅政策について分析した。近田氏は貧富の格差に対する都市行政について独自のモデルをサンパウロに応用して解説した。また、農村地域における農民らのいわゆる土地無し農民運動(MST)について、近藤エジソン氏が現地調査の成果を紹介、根川氏はサンパウロの東洋街でのエスニック行事を扱い、カイゾー・ベルトラン氏とスガハラ氏はリオの電気・上下水道・ごみ収集などの生活インフラ整備問題を取りあげた。研究分担者の田所は、リオの貧民街住人の日常を観察し、飢餓という究極の都市問題を論じ、同じく山崎が、都市行政に一般住民が関わる「参加型予算」にアプローチした。さらに萩原は、リオやブラジリアとライバル関係にある大都市サンパウロの問題を、州と市という2つの行政単位から論じた。1ルーラ大統領誕生という政治変動の下、対立するブラジル社会民主党(PSDB)候補が勝利したサンパウロを中心に「ブラジルにおける2004年市長選挙と都市行政」について、ソブリーニョ氏(サンパウロ大学)が報告した。サンパウロとリオの比較は、「サンパウロの都市貧困層のエンパワーメント」を近田氏(アジア経済研究所)が、「リオの都市問題」についてはカイゾ氏(ブラジル地理統計院)が担当した。「ブラジル・クリチバ市の環境政策」について小池氏(拓殖大学)が経済学の視点から、「首都ブラジリアの誕生」を人類学のグスターヴォ氏(ブラジリア大学)が、「サンパウロのムニシピオ」の現状を近藤氏(グァタパラ市初代市会議員)がそれぞれ報告し、学際研究の立場から貴重な情報交換ができた。2大都市に加えて、今日5千560団体を超えている行政単位ムニシピオについて、ブラジル地理統計院や応用経済研究所、アジア経済研究所では、あらゆる事象が数値化されて計量分析がなされている。今回の人的交流により今後の資料収集への協力の約束が得られた。3本年度の研究会を通じて、従来日本では十分に確認されてこなかった制度の微細な点(専門的で詳細な事柄)が招聘した複数の研究者との議論を通じて確認されたことも、大きな成果であった。たとえばブラジルは住民票も戸籍もないが、どのようにして毎年の各都市住民数を割り出しているのか、あるいは「都市人口」の定義はどのようになされているのか、といった基礎的事項について、各報告者に何度も確認した。従来、おおまかな国際制度比較がなされてきたが、こうした微細な点に立ち入った厳格な比較検討は、必ずしも十分にはなされていなかった。重要なことは、こうした細かい制度上の特徴に、ブラジルの歴史が陰を落としていることである。針の穴からブラジル社会全体の本質に迫ることができるという意味で、記録にとどめるべき成果である。

1 2005年6月に開催された日本ラテンアメリカ学会第26回定期大会で、研究代表住田、研究分担者山崎、萩原、研究協力者谷口、奥田らで、パネルを立ち上げ、「ブラジルの都市問題-ムニシピオの形成と都市行政の展開」について報告した。今日5千560団体を超える行政単位ムニシピオの形成と土地所有や住宅政策などの実情に焦点を絞って都市問題を考えた。植民地時代にさかのぼる過去の遺制をも意識しつつ、今日の農村地区における土地なし農民運動や市街地ファヴェーラの土地占拠の問題にも触れ、学際研究の立場から貴重な情報交換ができた。2山崎は、平成17年度日本地方自治学会(11月開催)の分科会「海外の自治体行財政」で「南米の財政分権化と参加型予算」を報告したが、これはブラジル都市自治体の動向に関する本研究プロジェクトの成果の一旦を発表したものである。3学会の他に京都外国語大学で研究会を開催し、7月に近藤エジソン謙二氏(筑波大学)が「ブラジルの土地所有問題とその解決策としての土地無し農民運動(MST)の意義」について報告、10月に奥田(大阪大学大学院)が「ブラジリアの都市下層と不法問題」と題して現地調査の成果を発表した。12月には根川幸男氏(ブラジリア大学)が「マルチエスニック都市サンパウロにおける「日本文化」の表象-東洋街における新伝統行事を中心に-」を発表、2006年1月にはニレウ・カヴァルカンティ氏(フルミネンセ連邦大学建築都市学部教授)が都市工学の観点から「ブラジル19・20世紀における都市化について」と題して発表した。こうした人的交流により今後の資料収集への協力の約束が得られたことも大きな成果である。4研究代表と研究分担者の編集により、15名分の研究報告の成果を『現代ブラジルにおける都市問題と政治の役割-論集』(京都外国語大学国際言語平和研究所、2006年)として印刷・製本する。
コラ-ゲンの階層的線維形成因子の研究

コラ-ゲン線維の形成は直線分子であるとされるトロポコラ-ゲンが平面的にquarter staggerしただけではフィラメントから線維にいたる多様な階層化を理解できない。三次元の構造モデルが必要である。穏和な処理でfibrilは容易に膨化し、表面には斜走する条線や割れ目が現れる。そのとき横紋は不明瞭になるが消失し、フィラメントにまで散開する。横断面は多様な渦巻き状を示す。さらにI型コラ-ゲンが石灰化する場合ヒドロキシアパタイトの微結晶は線維軸に対して平行ではなくおよそ15-18度傾斜し、線維の横断像では多数のアパタイト微結晶が線維外周から中心に向って湾曲して進入していき、円心円状や放射状や層板状にはならない。これらの事実を総合し矛盾のないI型コラ-ゲンの階層的構造モデルを考察した。小さい単位からpentamer、filament、fibrilとする。pentamerはトロポコラ-ゲン5分子がquarter staggertheoryに基づき1Dづつずれて側方会合した基本単位であり、最大幅は9nmである。filamentは、このpentamerが長軸方向に会合すると同時に上下にも5層会合して一辺9nmの棒状になり、これをpentamer rodとする。5層の間では横にずれることができるので断面は正方形から長く伸びた菱形まで変形できる。fibrilはpentamer rodがシ-ト状に側方会合し、さらにそれらが中心軸に集合し、その軸を中心にねじれて多重helixになる。pentamer rodの側方会合が密着していれば横紋が現れ、隙間ができると斜走する条線が現れる。このようなモデルを想定すれば多くの事実をよく説明できるので、各段階の電顕像を実際に撮影すべく努力中である。本補助金の交付が遅かったためまだpentamerやpentamer rodの直接撮影には成功していない。各段階で停止させた試料作りの条件を定めることが肝要である。
発汗異常症に続発する皮膚アレルギー疾患のメカニズムの解明

1.汗腺幹細胞の分離、汗腺分泌部でのアセチルコリン(Ach)受容体の発現及び細胞内内在化、細胞内カルシウム濃度の上昇について:汗腺自体の分離と汗腺幹細胞の同定については完了した。また、汗腺でのAch受容体の同定も完了している。シェーグレン症候群ではAch受容体の内在化が外分泌機能障害の原因であることが指摘されているため、無汗症患者においても共焦点顕微鏡や超解像顕微鏡を用いてAch受容体の細胞内内在化を可視化して検討したところ、Ach受容体の内在化は確認できなかった。機能面においては、Achや種々の刺激に対する細胞内Caの上昇を細胞内蛍光プローブを用いて確認できたので、現在無汗症患者での反応を追試している。2.無汗症患者での汗腺分泌部での幹細胞性の維持について:無汗症患者での汗腺分泌部での幹細胞性の維持について、蛍光免疫染色により検討したところ無汗症患者では汗腺特異的幹細胞数の減少認めた。現在は無汗症患者の罹病期間とステロイドパルス療法が無効である患者の特徴については疫学調査が進行している。シェーグレン症候群ではAch受容体の内在化が外分泌機能障害の原因であることが指摘されているため、無汗症患者においても共焦点顕微鏡や超解像顕微鏡を用いてAch受容体の細胞内内在化について可視化を行っている。さらに機能面においてもAch受容体の内在化によって、シグナル伝達や細胞内Caの上昇に影響を与えるか細胞内蛍光プローブを用いて検討中である。2.無汗症患者での汗腺分泌部での幹細胞性の維持について:昨年までに、無汗症患者での汗腺分泌部での幹細胞性の維持について、蛍光免疫染色により検討したところ無汗症患者では汗腺特異的幹細胞数の減少認めた。現在は無汗症患者の罹病期間と汗腺幹細胞の関係や、ステロイドパルス療法が無効である患者の汗腺幹細胞の残存、治療前後の幹細胞数について検討を進めている。3.無汗症に対する自己抗体の推定:ヒトのアセチルコリンM3受容体(M3R)の全長をクローニングし、発現ベクターへの組み込み、確認作業を行っている。4.部位特異的免疫機構の解析:汗腺の周囲に浸潤するランゲルハンス細胞やDCやT細胞(Treg)、抗菌ペプチド(human-βdefensin, LL-37, dermocidin)の発現を免疫組織化学染色にて検討している。複数の実験計画を同時進行で進めている。実験中に新たな課題を生じることもあるが、予定していた課題は概ねクリアしている。当初の計画に大きな変更はなく、年次計画の通り進めていく方針である。備品や試薬等はほとんどが、すでにあるものを使用したため、所要額が低くなった。来年度においても必要最低限の支出に抑える予定であるが、抗体や培養関連用品の購入のため費用がかかる見込みである。
ゲノム編集とターゲットシークエンスによる特定ゲノム領域内の責任遺伝子単離の高速化

本研究では水産重要種であるアユの性決定遺伝子をモデルとして、ゲノム編集技術とターゲットシークエンス法を駆使して、遺伝学的に同定された目的形質と連鎖するゲノム領域内に位置する多数の候補遺伝子の中から責任遺伝子を効率的にスクリーニングするための水産育種技術基盤を開発することを目的とする。アユはXX-XY型の性決定様式でありY染色体上の性決定遺伝子によって性が決まると考えられている。これまでの遺伝学的解析によりY染色体上の性決定領域は約1Mbpまで限局化されており、この領域内には多数の候補遺伝子が位置していた。平成30年度はまず性決定ゲノム領域に位置するいくつかの候補遺伝子についてcDNAのクローニングを行いエクソン/イントロン構造を明らかにした。また精巣および卵巣からRNAを抽出し、RT-PCR法により候補遺伝子mRNAの発現を解析した。次に予備実験としてアユにおけるcrispr/cas法によるゲノム編集の条件検討を行った。クローニングした性決定遺伝子候補cDNAのエクソン内にガイドRNAを設計し、Cas9とともにアユ受精卵へのマイクロインジェクションを行った。人工受精のあとマイクロインジェクションを行うまでの時間、受精卵の保持方法、インジェクション針の形状等を検討し、マイクロインジェクション条件の最適化を試みた。現在、作出したゲノム編集アユを飼育し、孵化率、孵化後の生残率、発生への影響等の評価を行っている。また、ヒレの一部からDNAを抽出し、ゲノム編集により標的領域に変異が導入されているか、編集効率はどのくらいかについて解析を進めている。計画通り進捗した。平成30年度はY染色体上の性決定ゲノム領域に位置する候補遺伝子のクローニングとゲノム編集アユの作出条件の検討を行った。いくつかの候補遺伝子はY染色体上の性決定ゲノム領域に位置し、生殖腺で発現しており、候補遺伝子の絞り込みは順調に進んでいると言える。またアユ卵に対するマイクロインジェクションの基礎技術を確立した。今年度、本格的にアユ性決定遺伝子候補の網羅的なノックアウト実験を行うことで本研究の目的が達成できることが期待される。引き続きこれまでに同定したY染色体上の性決定ゲノム領域に位置する候補遺伝子のクローニングを行い、既知の遺伝子との相同性や生殖腺での発現パターンから候補遺伝子の絞り込みを行う。絞り込んだアユ性決定遺伝子候補について、計画通りcrispr/cas法による網羅的なノックアウトを行う。一度に10から30個程度の遺伝子に対するガイドRNAとCas9 mRNAを混合してアユ卵にマイクロインジェクションにより導入し、確率論的にノックアウトすることを試みる。同時にノックアウトする候補遺伝子の組み合わせを変えたゲノム編集アユを複数ロット作出し、候補遺伝子のうちいくつかがランダムにゲノム編集された可能性のあるアユ集団を作出する。ゲノム編集アユはロットごとの識別は行わず混合して、鰭および生殖腺の外部形態から雌雄を判別できるサイズまで飼育する。次に遺伝的性と表現型が一致しない個体、すなわちゲノム編集により性転換が起こっている個体を探索する。生き残ったすべてのゲノム編集魚の鰭と生殖腺を固定する。鰭からDNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いたターゲットシークエンスにより変異導入部位の塩基配列を決定する。ゲノム編集魚における候補遺伝子内の変異の有無と目的形質の表現型の相関関係を集団全体として解析し責任遺伝子の同定をする。すなわち目的形質に影響がみられなかった個体ではゲノム編集による変異がなく、影響が観察された個体においてのみ変異が導入されていた遺伝子が責任遺伝子であると考えられる。計画通り進捗した。