hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯髄の発生・再生過程における低分子熱ショック蛋白Hsp27の役割に関する研究

熱ショック蛋白(Hsp)は温熱などのストレスにより細胞内に一時的に誘発される蛋白質で,細胞の損傷からの防御と修復に関与することが知られている.今回我々は発生における低分子熱ショック蛋白Hsp25/27の役割を明らかにする目的で,ラット切歯・臼歯象牙質形成におけるHsp25/27の歯髄での発現を検索すると共に,歯牙再植ならびに窩洞形成実験モデルを用いた歯髄再生過程でのHsp25/27の発現を検索し,以下の結果を得た.【歯髄発生過程におけるHsp25/27の役割について】幼若な歯髄細胞が一過性にHsp25/27陽性を示し,象牙質形成が進行すると,象牙芽細胞は細胞突起基部を含めた細胞質全体に強い陽性反応がみられたが,歯髄細胞の反応は減弱した.以上により,Hsp25/27発現は象牙芽細胞の分化・機能発現と密着に関与することが明らかとなった.【歯髄再生過程におけるHsp25/27の役割について】コントロール歯髄では,歯冠部象牙芽細胞がHsp25/27強陽性を示したが,歯牙再植後1日で歯髄の免疫活性が消失し,血行と神経分布が回復する5日後までに,Hsp25/27強陽性を示す細胞が歯髄・象牙境に配列する様になった.一方,窩洞形成は傷害を受けた象牙芽細胞と象牙前質間に滲出性変化を惹起し,傷害を受けた象牙芽細胞はHsp25/27免疫陽性を持続していたが,12時間後までに歯髄・象牙境のHsp25/27免疫反応は消失した.72時間後には,新しく分化した象牙芽細胞が歯髄・象牙境に配列し,Hsp25/27免疫陽性を示した.以上の様に,Hsp25/27免疫反応が歯牙再植ならびに窩洞形成後の象牙芽細胞の再生過程を反映していること,また当該蛋白が象牙芽細胞の分化マーカーとして利用できることが示された.熱ショック蛋白(Hsp)は温熱などのストレスにより細胞内に一時的に誘発される蛋白質で,細胞の損傷からの防御と修復に関与することが知られている.今回我々は発生における低分子熱ショック蛋白Hsp25/27の役割を明らかにする目的で,ラット切歯・臼歯象牙質形成におけるHsp25/27の歯髄での発現を検索すると共に,歯牙再植ならびに窩洞形成実験モデルを用いた歯髄再生過程でのHsp25/27の発現を検索し,以下の結果を得た.【歯髄発生過程におけるHsp25/27の役割について】幼若な歯髄細胞が一過性にHsp25/27陽性を示し,象牙質形成が進行すると,象牙芽細胞は細胞突起基部を含めた細胞質全体に強い陽性反応がみられたが,歯髄細胞の反応は減弱した.以上により,Hsp25/27発現は象牙芽細胞の分化・機能発現と密着に関与することが明らかとなった.【歯髄再生過程におけるHsp25/27の役割について】コントロール歯髄では,歯冠部象牙芽細胞がHsp25/27強陽性を示したが,歯牙再植後1日で歯髄の免疫活性が消失し,血行と神経分布が回復する5日後までに,Hsp25/27強陽性を示す細胞が歯髄・象牙境に配列する様になった.一方,窩洞形成は傷害を受けた象牙芽細胞と象牙前質間に滲出性変化を惹起し,傷害を受けた象牙芽細胞はHsp25/27免疫陽性を持続していたが,12時間後までに歯髄・象牙境のHsp25/27免疫反応は消失した.72時間後には,新しく分化した象牙芽細胞が歯髄・象牙境に配列し,Hsp25/27免疫陽性を示した.以上の様に,Hsp25/27免疫反応が歯牙再植ならびに窩洞形成後の象牙芽細胞の再生過程を反映していること,また当該蛋白が象牙芽細胞の分化マーカーとして利用できることが示された.熱ショック蛋白(Hsp)は温熱などのストレスにより細胞内に一時的に誘発される蛋白質で、細胞の損傷からの防御と修復に関与する事が知られている。今回我々は発生における低分子熱ショック蛋白Hsp25/27の役割を明らかにする目的で、30日齢ラット下顎切歯を用いて、象牙質形成におけるHsp25/27の分布を検索すると共に、4週齢ラット上顎第1臼歯再植モデルでのHsp25/27の発現を検索し、以下の結果を得た。【歯髄発生過程におけるHsp25/27の役割について】ラット切歯形成端部では、ほとんどの歯髄細胞がHsp25/27陽性を示し、象牙質形成が進行すると、象牙芽細胞は細胞突起基部を含めた細胞質全体に強い陽性反応が見られたが、歯髄細胞の反応は減弱した。以上により、Hsp25/27発現は象牙芽細胞の分化・機能発現と密接に関与することが明らかとなった。【歯髄再生過程におけるHsp25/27の役割について】コントロール歯髄では、歯冠部象牙芽細胞がHsp25/27強陽性を示し、Hsp25/27陽性神経要素は殆ど見られなかった。再植後1日では歯髄の免疫活性が消失し、血行と神経分布が回復する5日後までに、Hsp25/27強陽性を示す細胞が歯髄・象牙境に配列するようになると共にHsp25/27陽性神経要素も数多く見られるようになった。

7日後になるとHsp25/27強陽性細胞が配列する部位で修復象牙質形成が開始していた。14日以降、修復象牙質形成群歯髄ではコントロールと同様な免疫活性を示したが、骨様組織置換群では、歯髄・象牙境にHsp25/27陽性細胞が見られず、骨基質表面にHsp25/27陽性を示す細胞が観察された。以上より、歯髄変性後の歯髄治癒過程の決定にHsp25/27陽性を示す細胞と神経要素が重要な役割を果たすことが示唆された。熱ショック蛋白(Hsp)は温熱などのストレスにより細胞内に一時的に誘発される蛋白質で,細胞の損傷からの防御と修復に関与することが知られている.平成13年度はラット臼歯を用いた発生過程ならびに窩洞形成後の歯髄再生過程を検索し,以下の結果を得た.ラット臼歯発生過程において,象牙芽細胞に特異的なHsp25/27発現がみられたが,象牙前質内細胞突起も免疫陽性を示した.Hsp25/27免疫・ファロイジン二重染色を施すと,Hsp25/27免疫陽性象牙芽細胞体周囲ならびに細胞突起がファロイジン陽性を示したが,象牙質内のファロイジンの反応は象牙質内歯髄側半分に限局していた.ラット臼歯窩洞形成後の象牙芽細胞の反応を熱ショック蛋白heat shock protein(Hsp)25/27抗体による免疫細胞化学により検索して以下の結果を得た.窩洞形成は傷害を受けた象牙芽細胞と象牙前質間に彦出性変化を惹起し,ファロイジン陽性の象牙芽細胞突起の断裂像が認められた.窩洞形成により傷害を受けた象牙芽細胞はHsp25/27免疫陽性を持続していたが,12時間後までに歯髄・象牙境のHsp25/27免疫反応は消失した.しかしながら,傷害を受けた部位では,明らかな細胞突起をもたない円形の細胞がHsp25/27免疫陽性を持続しており,窩洞形成後にも象牙芽細胞が生存していることが示された.窩洞形成12時間後には,数多くのHsp25/27免疫陰性・ファロイジン陽性の細胞が歯髄・象牙境に集積し,その細胞突起を象牙細管深くに侵入させており,これらの細胞が免疫担当細胞であることが伺われた.72時間後には,新しく分化した象牙芽細胞が歯髄・象牙境に配列し,Hsp25/27免疫陽性を示した.以上の様に,Hsp25/27免疫反応が象牙芽細胞の再生過程を反映していること,また当該蛋白が象牙芽細胞の分化マーカーとして利用できることが示された.
星間水素分子生成のダイナミクス;水氷表面で生成脱離する水素分子の速度分布測定

宇宙塵表面での水素引抜き反応による星間水素分子生成メカニズムを解明するために、引抜き反応水素分子の運動エネルギー測定を行うための飛行時間分布(Time-of-flight: TOF)測定装置を構築した。しかし、実際に水氷表面で生成される水素分子は微量であるため、水氷表面よりも水素分子生成量が多いと予想されるシリコン表面にて水素引抜き反応実験を行い、ダイナミクスに関する有益な結果を得た。平成19年度は、本申請課題であるアモルファス水氷表面(またはグラファイト)からの脱離水素分子の運動エネルギー測定を行うための飛行時間分布(Time-of-Flight:TOF)測定装置を組み立てた。予備実験として、まずシリコン表面から脱離(直接引き抜き脱離または吸着誘起脱離)する水素分子の運動エネルギー測定を行った。しかし、運動エネルギーを測定するために必要な脱離分子を四重極質量分析計で検出することができなかった。そこで、構築したTOF装置の性能を確かめるために、水素吸着シリコン表面からの散乱水素分子のTOF測定を行った。その結果、これまで水素分子の散乱過程はすべてtrapping-desorption scatteringであると報告されてきたが、本研究で使用する装置を用いて散乱分子の運動エネルギーを測定したところ、実はdirect-inelastic scatteringが主な散乱過程であることを見出した。このことから、本研究課題で構築したTOF装置は運動エネルギーを評価するのに十分な性能を有することが分かった。次に水素原子ビーム源の性能評価をシリコン表面における昇温脱離法によって評価したが、特に問題は見られなかった。そこでTOF飛行距離に問題があると考え、現行のTOF飛行距離60cmから35cm程度に縮小した実験装置を組み立てている。また、新たな四重極質量分析計を用いて、まずはSi表面での引き抜き実験を行っている。前年度、本申請課題であるアモルファス水氷表面(またはグラファイト)からの脱離水素分子の運動エネルギー測定を行うための飛行時間分布(Time-of-Flight : TOF)測定装置(TOF飛行距離: 60cm)を組み立てたが、水素吸着Si表面から散乱するD_2分子の運動エネルギーの測定は行えたものの、テストサンプルとしての水素吸着Si表面からの水素引き抜き反応によって生成される水素分子を検出するには至らなかった。そこで今年度は、TOF飛行距離が38cmになるように装置の再設計を行った。それと並行して、水素原子ビーム源の性能評価を行った。まず水素原子ビームの性能評価を昇温脱離法と等温脱離法によって行った。テストサンプルに研究実績の多いSi表面を選択し、重水素(D_2)をRFプラズマによってD原子に分解し、Si(100)表面に照射した。その結果、Si(100)表面では0.6ML以下の水素被覆率領域で、これまで信じられてきた水素脱離の活性化エネルギー2.5eVが実は1eV程度低い1.6eVで、1次反応成分の他に2次反応成分も存在することを突き止めた。Si(111)とSi(110)表面についても行ったが、これらはこれまで報告されてきた値とほぼ同じであったことから、本研究で使用した水素原子ビーム源は非常に高性能であることが分かった。その後、飛行距離38cmのTOF装置を用いて脱離する分子の検出を試みたが、その信号を四重極質量分析計で検出することは出来なかった。そこで、水素原子ビームのフラックス強度を高める工夫を行った結果、Si表面ではあるが、信号を検出することが出来た。しかし信号強度のSINが悪いために100回測定を行って解析し、Si表面での水素引抜き反応のキネティクスとダイナミクスを論じる上で重要な結果を得た。今後、アモルファス水氷表面へと展開する。
レストンエボラウイルス感染実態の解明を目指した新たな基盤技術の創出

本研究は、カニクイザルにおけるレストンエボラウイルス(REBOV)感染実態を解明するための新たな基盤技術の確立を目指す。サルにおけるREBOV感染症はフィリピンで2015年に19年ぶりに発生し、今後も散発的に発生する可能性があることから、REBOVのスクリーニング方法を確立する必要がある。そこで、リアルタイムPCRによるREBOV特異的遺伝子検出系、REBOVに対するモノクローナル抗体を用いたREBOV特異的抗体検出系の開発を行う。2017年度までにリアルタイムPCRによるREBOV特異的遺伝子検出系を開発した。2018年度は本手法を用いてフィリピンのREBOV感染サル検体からの遺伝子検出を行い、従来のコンベンショナルPCRと同等の結果が得られた。また、REBOVのGPを哺乳細胞で発現させた。精製したリコンビナントREBOV GPをマウスに免疫し、モノクローナル抗体の作製を試みたが、REBOV GP特異的なクローンは得られなかった。今後はGPに対するモノクローナル抗体を得るための抗原調製方法を変更し、ウイルスベクターを用いたREBOV GPの発現系を検討することとした。一方、REBOV NPに対するモノクローナル抗体をハイブリドーマから精製した。この精製NP抗体を競合ELISAに用いた。各種ウイルスNPを免役したウサギ血清を用いて検討したところ、競合ELISAにより抗REBOV NP抗体を特異的に検出できることが確認された。REBOVの遺伝子検出系、およびNPに対するモノクローナル抗体を用いた抗体検出系は順調に開発できた。GPに対するモノクローナル抗体調製は継続して行う。REBOVのGPを哺乳細胞で発現・精製し、マウスに免疫し、モノクローナル抗体の作製を試みたが、REBOVのGP特異的なクローンは得られなかった。今後はウイルスベクターを用いたREBOV GPの発現系を確立し、GPに対するモノクローナル抗体を得るための免疫原となるかどうか検討する。NPに対するモノクローナル抗体を用いた抗体検出系により、サル血清からのREBOV抗体検出が可能か検討する。先ず、REBOVに対するモノクローナル抗体を作製することを目的とする。REBOVのGPタンパク質はウイルス中和抗体の標的部位であり、この部位に対する抗体はウイルス特異性が高い。そこで、REBOVのリコンビナントGPを哺乳細胞で発現させ、精製した。このリコンビナントGPをモノクローナル抗体を得るための免疫抗原として用いる予定である。次に、REBOVの遺伝子系統解析から、2015年にフィリピンのサル管理施設で流行したREBOVは2008年にフィリピンのブタ間で流行したREBOVに近縁であることを明らかにした。また、これまで明らかになったウイルス遺伝子情報を集積し、高度に保存された領域にプライマー、プローブを設定し、REBOV特異的リアルタイムPCR法を構築した。ポジティブコントロールとして、レストンEBOV遺伝子をクローニングしたプラスミド(P.C.)を作製した。REBOVに対するモノクローナル抗体を作製するための抗原調製および、REBOV特異的リアルタイムPCRの構築が概ね順調に進展した。REBOVに対するモノクローナル抗体の作製とその性状解析を進める。レストンEBOVのみならず、それ以外(ザイール、スーダン、ブンディブギョ、アイボリーコースト型)のGPを哺乳培養細胞で発現させ、調製したMAbがレストンEBOV-GPのみに特異的かどうか、蛍光抗体法等により確認する。また、種々の合成RNAおよびREBOV以外のRNAを用いてREBOVリアルタイムPCRの特異性、感度を検討する。

今後はウイルスベクターを用いたREBOV GPの発現系を確立し、GPに対するモノクローナル抗体を得るための免疫原となるかどうか検討する。NPに対するモノクローナル抗体を用いた抗体検出系により、サル血清からのREBOV抗体検出が可能か検討する。(理由)年度末未納品等にかかる支払いが平成30年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成29年度分についてはほぼ使用済みである。(使用計画)上記のとおり。年度末納品等にかかる支払いが平成31年4月1日以降となったため。当該支出分については次年度の実支出額に計上予定であるが、平成30年度分についてはほぼ使用済みである。
静脈麻酔薬がもたらす抗炎症効果の分子機構の解明

手術侵襲に起因した急性炎症に伴う合併症は重大な問題であるが、未だ有効な抗炎症治療法が確立されていない。近年、静脈麻酔薬が鎮静以外にも抗炎症効果を持つことが報告されている。静脈麻酔薬の多くは、GABAA受容体の活性化を介して鎮静効果を得ている。GABAA受容体は免疫担当細胞にも発現しており、GABAによる炎症性サイトカインの制御への関与が報告されている。本研究は、静脈麻酔薬による抗炎症効果の詳細な分子メカニズムを明らかにし、高侵襲手術に対する麻酔方法を含めた管理法の最適化をはかる。将来的には合併症の低減を目指した麻酔方法の確立を目指す。
プロテオミクス的手法を用いたユビキチン化修飾の多様な機能の解明

1.Lys63を介するポリユビキチン鎖とLys48を介するポリユビキチン鎖をそれぞれトリプシンで消化後、得られたペプチド混合物をMALDI/TOF質量分析計で解析し、各ポリユビキチン鎖に特異的な分岐型ペプチドに由来するマスピークを指標にしたペプチド・マス・フィンガープリント(PMF)法により、ポリユビキチン鎖の結合特異性を決定できることを明らかにした。2.出芽酵母のUFD経路で働くE1酵素(Uba1)、E2酵素(Ubc4)およびE3酵素(Ufd4)存在下でユビキチン化反応を行い、次に、E4酵素(Ufd2)を加えて再度ユビキチン化反応を行い、各反応過程で生成するポリユビキチン鎖の結合特異性をPMF法により解析した。そして、Ufd2はLys48を介するポリユビキチン鎖の延長を触媒することを明らかにした。3.SH3ドメイン含有蛋白質Lsb2に共有結合したポリユビキチン鎖をPMF法により解析し、Lys63を介するポリユビキチン鎖であることを明らかにした。また、このポリユビキチン化がRsp5によって触媒され、Lys80がユビキチン化サイトであることを明らかにした。4.ユビキチン様蛋白質ISG15により修飾(ISG化)される標的蛋白質のプロテオミクス的解析を行い、6個の新規標的蛋白質を同定した。その中で、プロテインホスファターゼPP2Cβに着目して機能解析を行い、ISG15が、PP2Cβの翻訳後修飾を介して、NF-κBシグナル伝達系を制御することを明らかにした。5.ユビキチン依存的蛋白質分解系を構成するユビキチン化修飾システムと分解マシンである26Sプロテアソームに関する分子生物学的および創薬科学的研究をあわせて行い、26Sプロテアソームを構成するサブユニットの新しい性質を明らかにし、また、ユビキチン依存的蛋白質分解系を阻害する新規低分子化合物の単離を行った。1.ペプチド・マス・フィンガープリント法によるポリユビキチン鎖の結合特異性決定方法の確立:E1酵素(Uba1)とE2酵素(Ubc13・Mms2複合体)を発現して単離し、それらを用いてLys63残基を介するポリユビキチン鎖を調製した。それと、Lys48残基を介するポリユビキチン鎖(市販品)とをトリプシンで消化した。得られたペプチド混合物をMALDI/TOF質量分析計で解析し、各ポリユビキチン鎖に特異的な分岐型ペプチドに由来するマスピークを指標にして、各ポリユビキチン鎖に特有の結合特異性を決定できることを明らかにした。2.UFD経路で生成するポリユビキチン鎖の結合特異性の決定:出芽酵母のUFD(ubiquitin-fusion degradation)経路で働くE1酵素(Uba1)、E2酵素(Ubc4)、E3酵素(Ufd4)およびE4酵素(Ufd2)を発現して単離し、一方、UFD基質としてユビキチン-GST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)融合蛋白質を発現して単離した。はじめに、Uba1、Ubc4およびUfd4存在下でユビキチン-GST融合蛋白質のユビキチン化反応を行い、生成するポリユビキチン鎖の結合特異性を.ペプチド・マス・フィンガープリント法により解析したところ、ポリユビキチン鎖に特異的なマスピークを検出できなかった。

しかし、次に、Ufd2を加えて再度ユビキチン化反応を行い、生成するポリユビキチン鎖の結合特異性を同様に解析したところ、Lys48残基を介するポリユビキチン鎖に特異的なマスピークが検出された。以上の結果から、Uボックス型ユビキチンリガーゼUfd2は、Lys48残基を介するポリユビキチン鎖の延長を触媒すると結論した。1.Lsb2に共有結合するポリユビキチン鎖の結合特異性の決定:Las17に結合するSH3ドメイン含有蛋白質Lsb2は、ポリユビキチン化される。Lsb2に共有結合したポリユビキチン鎖を切り出してトリプシンで消化後、ペプチド・マス・フィンガープリント法により解析し、Lys63残基を介するポリユビキチン鎖に特異的なマスピークを検出した。また、このポリユビキチン化がHECT型ユビキチンリガーゼRsp5によって触媒されることを明らかにした。さらに、ユビキチンが共有結合している分岐型ペプチドの解析から、ユビキチン化サイトとしてLys80残基を同定した。2.Tom1が認識するポリユビキチン鎖の結合特異性の決定:VHSドメイン含有蛋白質Tom1は、ポリユビキチン鎖を結合できる。Tom1が結合できるポリユビキチン鎖の結合特異性をペプチド・マス・フィンガープリント法により解析し、Lys48残基を介するポリユビキチン鎖に特異的なマスピークを検出した。3.ISG15による翻訳後修飾の解析:ユビキチン様蛋白質ISG15は、ユビキチン化と類似の反応で標的蛋白質に共有結合する(ISG化)。ISG化の機能を明らかにするために,ISG化される標的蛋白質のプロテオミクス的解析を行った。HeLa細胞にFlag-ISG15をE1酵素及びE2酵素と共に発現し、抗Flag抗体を用いて免疫沈降後、得られた免疫沈降物からFlagペプチドを用いて溶出することにより、ISG化された標的タンパク質群を単離した。得られた標的タンパク質をペプチド・マス・フィンガープリント法により解析し、6個の新規標的蛋白質を同定した。その中で、プロテインホスファターゼPP2Cβに着目して機能解析を行い、ISG15が、PP2Cβの翻訳後修飾を介して,NF-κBシグナル伝達系を制御することを明らかにした。
時間的に制御された未分化細胞の運命決定機構の解明

哺乳動物の発生過程において未分化な前駆細胞では、多能性が維持されつつ、ある特定のタイミングで分化していく。更に、分化した細胞は、細胞種に特徴的な形態へと変化することで、器官形成を進行させていく。本研究では、未分化前駆細胞の分化と形態変化という2段階のタイミングが、鍵となる転写因子によって制御されているメカニズムに着目する。この転写因子の活性制御の機構を細胞レベル・分子レベルで解析することを通じて、細胞運命決定の時間制御を明らかにする。
ポリコーム群によるヒストンH2Aユビキチン化の局在と役割

ヒストンH2AのE3ユビキチンリガーゼであるポリコーム群Ring1A/Bが、標的遺伝子をどの様に認識して結合するかについて、PRC1複合体とMBLR複合体に注目した研究を行った。PRC1複合体については、PRC2複合体によるヒストンH3-K27トリメチル化修飾を認識するクロモドメイン蛋白質Cbx2/7とRing1A/Bが相互結合することによって発生制御遺伝子へリクルートされることが分かった。一方、MBLR複合体については転写因子Max/Mgaに依存して減数分裂関連遺伝子の転写開始点周辺へリクルートされ、Ring1A/BのH2Aモノユビキチン化活性を介して転写抑制に寄与することが分かった。ヒストンH2Aに対するモノユビキチン化酵素活性を有するポリコーム群遺伝子産物Ring1A/Bが、標的遺伝子をどのように認識して結合するかを明らかにするため、Ring1A/Bと結合してPRC1複合体を形成するMel18/Bmi1(Pcgf2/4)、Ring1A/Bと結合して固有の複合体を形成するMBLR(Pcgf6)のそれぞれを欠損したES細胞を準備し、Ring1Bの標的遺伝子への結合状態をChIP-seqの手法で調べた。野生型ES細胞においてMel18は数多くの発生関連遺伝子へRing1Bと共に結合しており、Mel18/Bmi1重欠損ES細胞では、これらMel18結合遺伝子へのRing1B結合レベルが大きく低下していることが分かった。一方、MBLRは減数分裂に関連する遺伝子の転写開始点周辺へRing1Bと共に結合し、MBLRをコンディショナルに欠損させると、これらMBLR結合遺伝子におけるRing1B結合とH2Aモノユビキチン化修飾が殆ど消失することが分かった。さらに、ヒストンH3の27番目のリジン残基のトリメチル化修飾(H3K27me3)を行う活性を有するPRC2複合体を欠損させたES細胞(Eed欠損ES細胞)において同様の解析を行った結果、PRC2欠損によりMel18結合遺伝子へのRing1B結合レベルが低下する一方で、MBLR結合遺伝子へのRing1B結合は影響を受けないことが分かった。以上の結果から、Ring1Bをリクルートする仕組みとしてPRC2-PRC1経路とMBLR経路の少なくとも2通りが存在し、それぞれ固有の標的遺伝子を制御していることが明らかになった。Ring1Bを包含するいわゆるPRC1タイプのポリコーム複合体による標的遺伝子の認識は、これまでPRC2が行うH3K27me3修飾に依存するとされてきたが、本研究によりPRC2非依存性の新規の仕組みの存在が明確になった。今後、MBLR複合体が標的遺伝子配列を認識する分子機構の詳細とその生物学的意義の解明を目指す。ヒストンH2Aのモノユビキチン化修飾(H2AK119ub1)酵素Ring1A/Bによる標的遺伝子の発現制御機構の詳細を明らかにするため、マウスES細胞をモデル系として用いて、Ring1A/Bに結合するPcgfファミリー遺伝子産物(Pcgf1-6)の機能発現機序に注目した研究を行った。Pcgf2/4(Mel18/Bmi1)はPRC1ポリコーム複合体を形成し、PRC2ポリコームによるヒストンH3K27トリメチル化修飾(H3K27me3)に依存して発生関連遺伝子群へ結合することが分かっている。一方で、Pcgf6はRing1A/B,Rybp,L3mbtl2,Max/Mga等と共に固有の複合体を形成し、減数分裂に関連する遺伝子群の転写開始点に結合してこれらの発現抑制に寄与することが分かった。また、Pcgf6が結合するDNA配列にはE-boxが高頻度に含まれ、Pcgf6の標的遺伝子への結合はbHLH-LZ型転写因子Max/Mgaに依存することも明らかになった。さらに、ES細胞においてPcgf6を欠損させると、これら減数分裂遺伝子座におけるRing1B結合およびH2AK119ub1修飾が消失し、さらにH3K27me3修飾も消失した。逆にPcgf6を特定の遺伝子座へ人為的にリクルートさせると、Ring1B/H2AK119ub1修飾に加えてPRC2ポリコーム/H3K27me3修飾も誘導されることが分かった。以上より、Pcgf6複合体は転写因子Max/Mgaに依存して減数分裂関連遺伝子に結合し、H2AK119ub1修飾を介してPRC2複合体をリクルートして、これら標的遺伝子の転写抑制に寄与することが明らかになった。これはポリコーム群による標的結合の仕組みとして従来と異なる新規の知見であり、PRC2ポリコームのリクルートにH2AK119ub1修飾が関わる可能性を示唆した重要な成果だと思われる。

分子生物学本研究は、ヒストンH2Aのユビキチン化酵素活性を持つポリコーム群遺伝子産物Ring1A/Bの局在や活性を制御する仕組みの解明を目的としており、Mel18/Bmi1とMBLRの役割に注目した昨年度の研究により新規の分子機構の存在を明らかにすることができた。よって本研究はおおむね順調に進展しており、本年度の研究によりその分子機構の詳細についてさらなる解明が見込める状況である。前年度の解析の続きを行うとともに、PRC1複合体の構成因子Cbx2/4/7/8の重欠損ES細胞や、MBLR複合体の構成因子Max/Mgaの欠損ES細胞を準備し、Ring1A/Bを標的遺伝子へリクルートする分子機構の全容解明を目指す。また、モノユビキチン化ヒストンH2Aに結合するタンパク質の同定を行い、モノユビキチン化ヒストンH2Aを介するシステムによる遺伝子発現制御の分子機構の解明を目指す。
道路網容量による道路網の感度分析に関する実証的研究

本研究においては,まず既往の各種の道路網容量の算定手法を,各OD交通の配分方法,最小カットの探索方法及び道路網容量の算定手法等の要因を通して比較検討した。そして,従来の各種の配分手法のうち,各OD交通を分割等時間配分で行う配分シミュレ-ション法が本研究に十分適用可能であることを考究した。これらの成果を踏まえて,本研究においては各OD交通の経路選択挙動を十分に考慮できるとともに,大規模な道路網にも適用可能な配分シミュレ-ション法を用いて,道路網容量の算定手法及び道路網容量を規定する最小カットの探索手法に関するアルゴリズムを開発した。さらに,配分シミュレ-ション法の考え方を基に最小カットよりフロ-水準の大きいカットの探索手法及び感度分析に必要なカット行列の作成手法等に関するアルゴリズムについてもそれぞれ開発した。そして,これら開発されたアルゴリズムをまず10ノ-ドモデルのネットワ-クを対象に適用を試みた。次に,実際規模の道路網として室蘭都市圏(ノ-ド123個(このうちセントロイド44個),リンク176本),及び苫小牧都市圏(ノ-ド197個(セントロイド61個),リンク257本)を対象にそれぞれ実証的な研究を行った。いずれの都市圏においても本研究で開発されたアルゴリズムが適用可能であることを検証するとともに,道路網容量からみた両都市圏の今後の道路網計画のあり方等についても言及することができた。以上の研究を通して,従来方法論の研究にとどまっていた道路網容量による道路網感度分析の研究を実際規模の道路網にも適用可能となった。今後は,これらの成果を踏まえてODーカット行列に作成手法に関するアルゴリズムの開発及び本手法の道路網の運用管理計画,土地利用計画等への適用についても考察を試みていく。
らせんや分子不斉を不斉源とする新規液晶性高分子の合成

長鎖アルキル鎖をもつイソシアニド誘導体を用いて、1)光学活性モノマーの重合時におけるらせん形成過程、2)不斉触媒により生長反応で形成されるらせん特有の不斉選択を重合化学の観点から検討した。イソシアニドの重合には、ニッケルートリフルオロ酢酸錯体が有効な開始剤であり、リビング的な重合挙動が確認され、また側鎖の光学活性基が不斉選択に大きく影響することが分かった。ポリマーのコンホメーションに関しては今後検討の必要がある。さらに、アレン、スピランの分子不斉に注目し、重縮合によってこれらユニットを高分子の主鎖に組み込みその液晶性について検討することを目的としてその合成法を検討した。アレン誘導体に関しては、トリメチルシリルエステルを経由したジカルボン酸の新規な合成ルートを確立したが、熱的、化学的安定性に問題があり、今後さらなる検討が必要である。また、スピロペプタンジカルボン酸の重縮合により目的とするポリマーを合成するにはスピロ化合物の光学分割が非常に重要であり、ブルシンを光学分割剤に用いて光学分割した。スピラン誘導体と重縮合させるモノマーとしてアミノ基をもつジオール、ジカルボン酸を合成した。これらを光学活性なスピランジカルボン酸、あるいはジオールと重縮合してポリマーを得る。得られるポリエステル、ポリアミドのアミノ基を四級化することで安定な捩れ構造を保持させる試みも行った。イオン性官能基による分子内相互作用と嵩高い官能基の導入による排除体積の増加によって効果的ならせんの形成、あるいはらせんの誘起が期待される。
健康寿命の延伸を目指す心理的・社会的ストラテジーの構築

1.研究の目的:成人中・後期の一般地域住民を対象とした「国立長寿医療研究センター・老化に関する長期縦断疫学研究(NILS-LSA)」のデータを用いて、高齢期における健康寿命の延伸、および機能障害を抱えた状態での主観的幸福感の維持に影響する心理的・社会的要因を解明する。その際、身体的機能の低下の程度による、心理・社会的要因の影響の差異が存在する可能性を考慮した検討を行う。最終的に、健康寿命の延伸およびサクセスフル・エイジングの実現を目指す心理的・社会的ストラテジーについて、身体的機能の状態を考慮したモデルを構築することを目的とする。2.今年度の研究:(1)昨年度に引き続き、健康からフレイル、すなわち軽度の身体的機能低下までの範囲に関して、機能の維持/低下/改善に影響する心理的・社会的要因を解明するため、地域在住高齢者のフレイル発症に対する社会経済的要因、および生きがいの影響について、縦断的データを用いて検討した。社会経済的要因の中では、主観的な指標である経済状態への満足度はフレイル発症に有意な関連を示さないのに対して、客観的な指標である等価所得が低い場合にフレイルになりやすい可能性が示された。生きがいの中では「趣味・スポーツ仲間とのつながり」のみがフレイル発症に有意な影響を示したことから、主体的に取り組める「活動」と「他者とのつながり」の両方を持つことが健康長寿を支える可能性が示唆された。(2)昨年度に実施した郵送法によるNILS-LSAフォローアップ調査のデータクリーンナップ作業を行った。(3)平成30年10月より、新たに施設型のNILS-LSAフォローアップ調査を開始した。本研究の知見は、健康寿命の延伸、およびサクセスフル・エイジングの実現に向けて心理・社会的領域からの接近可能性を探究するものであり、来年度以降、さらなる検討を行う上で、重要な知見であると考える。本研究課題の当初の全体的な計画としては、今年度は(1)昨年度に引き続きフレイルの査定結果を従属変数とし、心理的要因関係の指標、および社会的要因関係の指標を独立変数とした解析を行うこと、および(2)郵送法によるNILS-LSAフォローアップ調査を実施することを予定していた。現在までの進捗状況として、(1)に関してはフレイルの査定と「生きがい」という心理的要因、および子や孫、同居家族といった社会的関係の有無や経済的変数などの社会経済的要因との関連を検討し、学会発表を行った。また、(2)に関しては、当初の計画よりも前倒しで昨年度に実施した郵送法によるNILS-LSAフォローアップ調査(当初の計画では今年度実施を予定)のデータクリーンナップ作業を行い、基礎集計結果をホームページにて公開した(現在、既存データとの結合作業中)。さらに平成30年10月より、新たに施設型のNILS-LSAフォローアップ調査を開始し、現在も縦断的なデータを収集している。そのため、おおむね順調に研究が進んでいると思われる。来年度以降は既存のデータ、および収集済みのフォローアップ調査データから作成する縦断的データセットを用いて、(1)フレイルから要支援/要介護のような重篤な機能低下、および死亡に至る際に影響する心理的・社会的要因の解明、(2)要支援/要介護の状態における、主観的幸福感を高く維持するための心理的・社会的要因の解明、(3)健康寿命の延伸およびサクセスフル・エイジングの実現を目指す心理的・社会的ストラテジーに関する、身体的機能の状態を考慮したモデルの構築の研究遂行を順次行う。得られた知見については、学会等にて公表する。さらに、今年度10月より開始された施設型のNILS-LSAフォローアップ調査によるデータ収集を引き続き行う。2.今年度の研究:今年度は健康フレイルの範囲での、機能の維持/低下/改善に影響する心理的・社会的要因を解明するために、以下の事柄を行った。・老年医学領域の関連文献を収集し、知見の整理を行っている途中である。・65歳以上の対象者のデータを用い、フレイルの査定(CHS基準の一部改変)を行い、各調査時でのフレイルの割合、および縦断的変化を確認した結果、第2次-第7次調査時のフレイル有症率は6.2-9.8%(平均71.9-74.3歳)、2年の縦断的変化は改善が2.3-3.6%、進行が4.9-6.7%であった。・フレイルの進行と各種要因の関連について縦断的に検討した。まず(1)女性ではフレイルの進行が男性よりも多いものの、フレイルからの改善も有意に多いことが示唆された。(2)家族/家族以外からの情緒的/手段的サポート、および主観的幸福感は、その後のフレイル発症のリスクを有意に低下させることが示唆された。(3)フレイルの進行は自尊感情の低下と関連することが示唆された。

本研究の知見は、健康寿命の延伸、およびサクセスフル・エイジングの実現に向けて心理・社会的領域からの接近可能性を探究するものであり、来年度以降、さらなる検討を行う上で、重要な知見であると考える。本研究課題の当初の全体的な計画としては、今年度は第一点目として老年医学領域の文献レビューを行い、フレイルの概念整理等を行うこと、第二点目としてNILS-LSAでこれまでに収集されたデータを用いてフレイルの査定を行い、一般地域住民におけるフレイル有症率やその縦断的変化に関する基礎的な情報を得ること、および第三点目としてフレイルの査定結果を従属変数とし、心理的要因関係の指標、および社会的要因関係の指標を独立変数とした解析に着手することを予定していた。これに対して、現在までの進捗状況としては、第一点目の文献レビューに関してはまだ中途段階にある。第二点目に関してはNILS-LSAの第2次-第7次調査時点でのフレイルの査定を行い、5査定項目のフレイル判定との関連や有症率、および各Wave間でのフレイルの縦断的変化(各査定項目の縦断的変化の検討含む)などについて基礎的情報を得た。第三点目に関してはフレイルの査定と自尊感情・主観的幸福感などの心理的変数、ソーシャルサポートなどの社会的変数、性別・教育年数・婚姻状況・就業状況などの個人背景要因との関連を検討し、学会発表を行った。また、当初の計画では平成30年度に実施する予定であった郵送法によるNILS-LSAフォローアップ調査を今年度実施した(現在データクリーンナップ作業中)。そのため、おおむね順調に研究が進んでいると思われる。1.研究の目的:成人中・後期の一般地域住民を対象とした「国立長寿医療研究センター・老化に関する長期縦断疫学研究(NILS-LSA)」のデータを用いて、高齢期における健康寿命の延伸、および機能障害を抱えた状態での主観的幸福感の維持に影響する心理的・社会的要因を解明する。その際、身体的機能の低下の程度による、心理・社会的要因の影響の差異が存在する可能性を考慮した検討を行う。最終的に、健康寿命の延伸およびサクセスフル・エイジングの実現を目指す心理的・社会的ストラテジーについて、身体的機能の状態を考慮したモデルを構築することを目的とする。2.今年度の研究:(1)昨年度に引き続き、健康からフレイル、すなわち軽度の身体的機能低下までの範囲に関して、機能の維持/低下/改善に影響する心理的・社会的要因を解明するため、地域在住高齢者のフレイル発症に対する社会経済的要因、および生きがいの影響について、縦断的データを用いて検討した。社会経済的要因の中では、主観的な指標である経済状態への満足度はフレイル発症に有意な関連を示さないのに対して、客観的な指標である等価所得が低い場合にフレイルになりやすい可能性が示された。生きがいの中では「趣味・スポーツ仲間とのつながり」のみがフレイル発症に有意な影響を示したことから、主体的に取り組める「活動」と「他者とのつながり」の両方を持つことが健康長寿を支える可能性が示唆された。(2)昨年度に実施した郵送法によるNILS-LSAフォローアップ調査のデータクリーンナップ作業を行った。(3)平成30年10月より、新たに施設型のNILS-LSAフォローアップ調査を開始した。
ヒルベルト函数解析を手法とした局所環論

本研究は,ヒルベルト函数の理論を積極的に用いてネーター局所環内のイデアルの構造を分類することを目的としている。本研究では,主に,次の2つの研究成果を与えた。1.W. V. Vasconcelos氏によって定義された加群上のホモロジカル次数の概念を用いて,ネーター局所環上の有限生成加群に於ける巴系イデアルの第1オイラー標数や第1,第2ヒルベルト係数の無駄のない境界を与えた。2.コーエン・マコーレイ局所環内に於ける階数が3以下の極大イデアルに関するSally加群の構造を完全に決定した。その際に,M. V. Pintoによって定義されたSally加群のフィルトレーションの理論を用いた。可換なNoether局所環内の巴系イデアルには,それを含む局所環の構造の主要な部分がかなり含まれていると考えられている。従って,巴系イデアルのヒルベルト函数の挙動を解析することで,局所環の構造の分類が期待できる。本研究の目的は,ヒルベルト函数解析を手法に与えられた局所環に含まれる巴系イデアルの構造を解析しながら,局所環の可換環論を展開するものである。平成25年度は,主に,『巴系イデアルのヒルベルト函数による非Cohen-Macaulay環解析』に取り組んだ。特に,巴系イデアルの第1オイラー標数とヒルベルト函数の挙動との関係解明について,明治大学の後藤氏との共同研究として取り組み,成果を挙げた。その中で,加群のホモロジカル次数の理論を用いて第1オイラー標数を制御することにより,巴系イデアルの構造および,そのヒルベルト函数の挙動を特徴付けることが可能となった。また,研究代表者は,5月末から約2週間,ジェノバ大学(イタリア)に滞在し,M. E. Rossi教授との情報交換を行った。これは本研究課題を遂行する上で軸となる研究活動である。その中で,研究代表者はRossi氏とイデアルの断面種数とヒルベルト函数との相互関係についての議論を行ったが,その議論を基に新たな研究課題も芽生えつつある。本研究は,ヒルベルト函数の挙動解析を積極的に行いながら,ネーター局所環(A, m)及び,そこに含まれるm-準素イデアルの構造の分類を目的とするものである。平成26年度の研究実績は下記の通りである。平成25年度に引き続き,「巴系イデアルのヒルベルト函数による非Cohen-Macaulay環解析」に取り組んだ。特に,巴系イデアルの第2ヒルベルト係数の挙動についてホモロジカル次数の理論を用いての制御を試み,特徴づけを与えた。この研究成果は,後藤四郎氏(明治大学)との共同研究として実施され,同氏との共著論文として発行済みである。また,第36回可換環論シンポジウム(11月・IPC生産性国際交流センター)に於いても,この研究成果に関する講演発表を行った。さらに,8月末より約3週間,ジェノバ大学(イタリア)に滞在し,M. E. Rossi教授と共に研究打ち合せを行い,その中で,本研究の予備課題であった「Sally加群論からのヒルベルト函数解析」にも取り組んだ。研究着手時の段階では,Cohen-Macaulay局所環内に於ける極大イデアルのSally加群について,階数が2以下の場合はその構造は既に知られていた。それに対して,本研究では,階数が3の場合に取り組み,その構造を決定することが出来た。この研究内容については,現在論文執筆中である。代数学「9.研究実績の概要」で述べた通り,平成25年度には,巴系イデアルの第1オイラー標数とヒルベルト函数の挙動の関係について一定の研究成果を与えることができた。これは本研究の目標の一つである,巴系イデアルのヒルベルト函数による非Cohen-Macaulay環解析を一歩前進させるものである。その中で,加群のホモロジカル次数の理論を積極的に活用したことは,今後のヒルベルト函数の挙動研究の範囲を大きく広げるものであると考えられる。一方で,巴系イデアルの断面種数とヒルベルト函数の挙動との関係についての新たな課題が見つかり,これは26年度の課題として残されている。以上の通り,本研究は,当初の計画に対して一定の成果を残す一方で,計画時にはなかった新たな研究課題も見つかるなど,現時点においておおむね順調に進んでいると考えられる。本研究課題申請時の研究計画の通り,平成26年度は,『正規化されたヒルベルト函数の挙動解析』に主に取り組む。ここでは,局所環の正則性・Gorenstein性と正規化された第1ヒルベルト係数との関係解明を目標に,一般の解析的不分岐な局所環上での正規化されたヒルベルト函数の挙動解析を行う。

加えて,25年度に実施した『巴系イデアルのヒルベルト函数による非Cohen-Macaulay環解析』についても継続する。特に,前年度からの課題として残されている巴系イデアルの断面種数とヒルベルト函数の挙動との相互関係についての理論構築に早急に着手する。これらの課題が,予定通りに進まない場合は,一般のm-準素イデアルのヒルベルト函数による随伴次数環およびRees代数の構造の分類を目標に,本研究の予備課題である『Sally加群論からのヒルベルト函数解析』に取り組む。25年度にM. E. Rossi教授(ジェノバ大学・イタリア)との研究議論を行ったが,本年度も引き続き同氏との研究議論および情報交換を継続していく。得られた研究成果については『日本数学会』,『可換環論シンポジウム』,『環論及び表現論シンポジウム』,『可換環論セミナー』,『代数学若手研究会』といった,国内で開催される学会,シンポジウム,若手研究会にて成果発表を行っていく。年度末には,一連の研究成果と内容を総括し,学術論文として発表予定である。
感染細胞内で機能する牛乳ラクトフォリンのウイルス複製阻害機構の解明

ロタウイルスは乳幼児下痢症の主因である。牛乳乳清に含まれる18kDaラクトフォリン(LP)は宿主細胞に対して何らかの相互作用をすることで、ウイルスゲノムの転写以降のステップを抑制することを見出した。LPにはN結合型糖鎖およびO結合型糖鎖が修飾されている。この活性には、LPのタンパク質構造の関与は低く、O結合型糖鎖が重要であることが示唆された。申請者らは、牛乳加熱耐性タンパク質18 kDaラクトフォリン(LP)が、ウイルスの直接的な結合によるものではなく、ウイルス感染の前にLPを細胞に1時間作用させることにより宿主細胞がウイルス増殖抑制能を獲得するというユニークな阻害様式を持つことを見いだした。しかしその阻害メカニズムは不明である。LPは、1つのN型糖鎖構造と2本のO型糖鎖構造、C末端にはαヘリックスを持つ。本年度は、LPがウイルスゲノム発現に与える影響とLPの活性に関与する分子基盤の特定について検討した。特異的プライマーを用いた逆転写によりターゲットRNAのみをcDNA合成し、定量PCRにより各ウイルスゲノム量を定量した。その結果、ウイルス感染前のLP添加は、11分節からなるロタウイルスゲノム全てにおいて、程度に違いがあるものの概ね発現を抑制することを見いだした。このことから、LPの感染阻害メカニズムは一部のウイルスゲノムの転写阻止による阻害の可能性は低く、転写よりも初期のステップ(接着、侵入、脱殻)を阻害していると考えられた。LPの活性に関与する分子構造の特定を試みたところ、加熱処理および酵素処理に耐性を示したことから、活性には糖鎖構造の関与が考えられた。LPからN型糖鎖を酵素的に切断しゲルろ過クロマトグラフィー(Sephadex G-25)に供することでO型糖鎖のみをもつLP(O-LP)とN型糖鎖に分離した。ウイルス感染と同時に各種サンプルを細胞へ添加することで活性を評価したところ(同時添加法)、O-LPはLPとほぼ同等の活性を示した。この結果から、活性にはO型糖鎖が重要であることが示唆された。以上の所見より、LPに修飾された糖鎖構造が宿主細胞に対して何らかの作用を及ぼすことでウイルス感染の初期段階を抑制していると考えられる。牛乳乳清に含まれる18kDaラクトフォリン(LP)は、乳幼児下痢症の主因であるロタウイルス感染に対して強力でユニークな感染阻害活性を示す。LPを細胞に1時間作用させた後にウイルス感染を行っても、ウイルスゲノムの転写およびウイルスタンパク質の合成を抑制する。昨年度の研究において本活性に必要となるLP側の基盤構造を検証したところ、O結合型糖鎖の重要性を示唆するデータを得た。本年度は、レクチンを用いた競合感染試験より感染阻害に必要となる詳細な糖鎖構造の特定を試みた。LPとレクチンを37°C、1時間インキュベートしてLP-レクチン混合液を調製した。このLP-レクチン混合液を細胞へ1時間作用させたのち、接種物を取り除いて細胞をよく洗いウイルス感染を行った。コントロールはレクチンの代わりにPBSを用いることで、レクチン添加がLPの感染阻害に与える影響を調べた。ハイマンノース・2本鎖複合型・混成型を認識するconAレクチンおよび3本鎖・4本鎖を認識するPHA-Lレクチンでは、コントロールと比較して、レクチン競合によるLPの感染阻害率の低下が見られなかったことから、N結合型糖鎖の活性への関与は低いと考えられた。O結合型糖鎖にみられるT抗原(Galβ1-3GalNAc)を認識するPNAによる競合試験では、予想に反して感染阻害率の低下が見られなかった。単一レクチンの添加ではLPの感染阻害活性の低下が見られなかったことから、活性に関与する構造として、今回検討できなかったレクチンが認識する糖鎖構造や複数の糖鎖構造が関与している可能性が考えられた。本年度計画した研究項目(1) LPがウイルスゲノム発現に与える影響ついては当初の目標を達成した。当初、研究計画にはなかったが、LP活性の分子基盤の推定を進める。研究項目(2)乳飲みマウス消化管の形態変化を指標としたLPの感染予防効果の検証については、LPの大量調製に時間を割いたためスケジュールが遅れており、今年度は採材まで行った。解析は次年度に実施する。食品科学本年度計画した研究項目(1) LPがウイルスゲノム発現に与える影響ついては当初の目標を達成した。研究項目(2)乳飲みマウス消化管の形態変化を指標としたLPの感染予防効果の検証については、LP大量調製の分画条件の設定に時間を割いたためスケジュールが遅れている。今年度は採材まで行い、解析は次年度に実施する。実験スケジュールの延滞および共同研究者との研究打ち合わせや学術集会などの成果発表の機会が少なかったため次年度は岐阜大学応用生物科学部へ移動しての実施となるため、移動に伴った備品の購入が生じる可能性がある。次年度は論文化を見据えて、積極的に共同研究者との打ち合わせの機会をつくる。自身の研究領域だけでなく病態生理学など関連する異分野においても学術発表を予定している。
ウイルスベクターを用いた幹細胞相同組換え法の開発と治療モデルへの応用

東北大学より分与される予定のSCID-X1患者由来の体細胞がいまだに入手不可能であるため、昨年度、Stanford大学のMatt Porteus博士との共同研究で、男性由来正常iPS細胞のIL2RG遺伝子座のエクソン1を標的として、人工制限酵素TALENを用いた遺伝子ノックアウトにより変異を導入した。今年度は、このiPS細胞より線維芽細胞を誘導した。元のiPS細胞といくつかの代表的な遺伝子の発現の有無の解析を行い、分子レベルで線維芽細胞である事を確定した。この細胞を用い、今後、センダイウイルスを用いてiPS細胞に誘導しながら、それと同時にHDAd-hIL2RGアデノウイルスベクターを用いた遺伝子修復を行う。昨年度までに構築した、感染後に造血前駆細胞特異的にEGFPを発現するHDAd-HOXB4-EGFPベクターDNAの特異性を比較したところ、本来発現するはずのK562細胞で発現が見られなかった。そこで、細胞レベルでのこのレポーターの機能を確認する目的で、このレポーターがノックインされたhiPSC/HOXB4-EGFP細胞株を、HDAdV感染による遺伝子ターゲッティングで樹立した。今後、この細胞を造血系に分化誘導した際にEGFPが得られるかを、詳細に検討する予定である。(抄録なし)ベクターの構築と機能確認HDAd-hIL2RG、HDAd-HOXB4-EGFP、HDAd-OCT3/4-TKを、それぞれの該当する遺伝子座をコードするBACクローンを入手して、RedET法によって単離した。そのために、マーカー遺伝子(ネオマイシン耐性遺伝子もしくはブラストサイジン耐性遺伝子)を、それぞれのBACの標的領域にファージの組換え酵素を用いて挿入した。次に、組込まれたマーカー遺伝子の上流下流それぞれ約10kbの相当する部分を含めて、ファージの組み換え酵素によってpBR322プラスミドにretrieveした。さらに、アデノウイルスベクターとしての産生に必要な種々のDNA配列を持つアデノウイルスベクタープラスミドに、定法に従いサブクローニングした。中でも、HDAd-OCT3/4-TKプラスミドについては、293細胞(OCT(-))とヒトiPS細胞(OCT(+))へ一過性導入した後に、ガンシクロビルを添加することによって、ヒトiPS細胞を特異的に殺すことを確認した。このようにして作られたアデノウイルスベクタープラスミドを116細胞に導入して、ヘルパーアデノウイルスを感染させることによって、各HDAdVを産生した。ベクターのDNA構造と力価とを、サザン法によって確認した。特に、HDAd-hIL2RGに関してはウイルスを正常ヒトiPS細胞に感染させ、遺伝子ターゲッティングが起きることを確認した。ベクターの機能確認i)IL2RG遺伝子修復ベクターの染色体組込みを検出するためのブラストサイジン選択が、マウスES細胞と異なりヒトiPS細胞では毒性が強すぎるためか働かないため(京大と熊大でも同様の報告あり)、ベクター上の薬剤耐性遺伝子をネオマイシン耐性に変えたベクターを構築し直して、産生した。このベクターをヒトiPS細胞に感染させ、染色体組込みによって得られるネオマイシン並びにガンシクロビル(GANC)二重薬剤耐性コロニーを別個に単離・増殖し、遺伝子ターゲッティングの効率を確認した。その結果、二重耐性コロニーの35%(17/48)という高効率で相同組換え体が得られたことを、PCRとサザン法により確認した。ii)HDAd-HOXB4-Venusベクターは、K562を感染し、コントロールのCAG-Venusベクターと、血液細胞特異的蛍光発光の比較実験を行った。コントロールではポジティブであった一方、HOXB4ベクターからのシグナルは検出されなかった。トランスフェクションで再実験を行う。iii)HDAd-OCT3/4-TKは、未分化ヒトiPS細胞とOCT3/4陰性ネガティブコントロールの293細胞にトランスフェクションで導入し、ヒトiPS細胞に導入した場合にGANC投与下でのみ特異的に細胞が死滅することを確認した。人工的にSCID-X1特異的iPS細胞を樹立するために、iPS細胞にPorteus博士より入手したIL2RG2エクソン1特異的TALENs(人工制限酵素)とドナーDNAとを導入して、変異iPS細胞を作製した。さらに、作製の際に導入したPGK-neo遺伝子カセットを、FLP遺伝子の一過性発現によって除いた。

今後、この細胞を造血系に分化誘導した際にEGFPが得られるかを、詳細に検討する予定である。H23年度はベクタープラスミドの構築とベクターウイルスの産生とを計画していたため、現在の状況はほぼ計画通りと言える。ベクターに関して、IL2RGターゲッティングベクターが効率良くips細胞において遺伝子ターゲッティング可能であることを確認できた。さらに、OCT-TKベクターの機能についても確認した。唯一の未解決点は、HOXB4ベクターの機能の確認である。一方、細胞の調製については、患者由来細胞の入手が相変わらず困難であるため、人工的な患者変異保有ips細胞の作製の目的のために、遺伝子ノックアウトを行い成功した。この細胞から線維芽細胞を誘導することによって、当初予定していた遺伝子修復実験が可能となる。当初の計画通り、ウイルスを用いて、実際にiPS細胞を用いた遺伝子ターゲッティングと、未分化及び分化細胞の選択とを行う予定である。患者変異保有iPs細胞より、線維芽細胞を誘導する。一方、HoxB4ベクターの機能を、K562ならびに293細胞へのトランスフェクションにより確認する。変異線維芽細胞よりセンダイウイルスベクターでips細胞を誘導しつつ、アデノウイルスベクターを用いて遺伝種修復を行う。更に、変異修復ips細胞より血液幹細胞を誘導し、未分化細胞をOCT-TKで除くと同時に、HOXB4-Vienusベクターの感染によって、造血系に誘導された遺伝子修復細胞を分取する。(抄録なし)