hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
哺乳類組織でのカテプシンEの蛋白質分解の特異性と遺伝子工学による生理機能の解析

カテプシンEは細胞内膜系プロテアーゼで、活性中心の構造からアスパラギン酸プロテアーゼに分類される。申請者はサルなどの哺乳類でcDNAクローニングを始めとする構造解析とその比較、さらに酵素活性の詳細な解析を行い多くの成果を挙げてきた。本研究では今までの成果から予想される幾つかの生理機能について、培養細胞とターゲティングマウスを用いた遺伝子工学の手法により細胞・個体レベルで明らかにすることを目的とした。本研究の実績の概要は以下の通りである。1.マウスカテプシンE遺伝子を単離した。Stratagene社のλFix遺伝子ライブラリーから全9個のエクソンをすべて含むカテプシンE遺伝子が得られた。エクソンの塩基配列を決定し、他のカテプシンEと比較し構造上の特徴を明らかにした。また遺伝子数を調べるため、組織抽出液の電気泳動後の活性染色、サザーン分析、FISH法による解析を行った。いずれも1遺伝子であることを支持する結果を得た。これらのことからカテプシンE遺伝子ターゲティングのための基礎的データの解析が終了した。この成果はBiomed.Res.に発表した.2.細胞内でのカテプシンEの機能を明らかにするため、回虫インヒビターの遺伝子導入を検討した。この基礎的研究として平成9年度には、インヒビターのcDNAクローニングと酵母での発現,生産されたタンパク質について機能部位の検索を進め、Lys110とLys75が活性発現に必須のアミノ酸であることを明らかにした。カテプシンEはER、エンドソームなど細胞内膜系に存在する蛋白質分解酵素である。哺乳類組織に多く存在するが、その構造と生体内での機能については長い間不明な状態が続いてきた。申請者はモルモット、ウサギ、サル等でcDNAクローニングを始めとする構造解析とその比較、さらに酵素活性の詳細な解析を行い多くの成果を挙げてきた。本研究は遺伝子ターゲティングを最終目標としているので、最初にマウスカテプシンE遺伝子の単離に取り組んだ。Stratagene社より入手したλFix遺伝子ライブラリーをスクリーニングし3個のカテプシンE遺伝子を得、うち1個が全9個エクソンをすべて含んでいた。エクソンの塩基配列を決定すし、他のカテプシンEと比較し構造上の特徴を明らかにした。これらのことからターゲティングのための基礎的データの解析が終了した。細胞内でのカテプシンEの機能を明らかにするため、回虫インヒビターの遺伝子導入を検討した。この基礎的研究として平成9年度には、インヒビターの機能部位の検索を進め、Lys110とLys75が活性発現に必須のアミノ酸であることを明らかにした。本研究は遺伝子ターゲティングを最終目標としており,まずマウスカテプシンE遺伝子の単離に取り組んだ。この成果はBiomed. Res.に発表した.細胞内でのカテプシンEの機能を明らかにするため、回虫インヒビターの遺伝子導入を検討した。

この基礎的研究として平成9年度には、インヒビターのcDNAクローニングと酵母での発現,生産されたタンパク質について機能部位の検索を進め、Lys110とLys75が活性発現に必須のアミノ酸であることを明らかにした。
脂質代謝が脂肪の機能を制御する

イノシトールリン脂質代謝系において重要な酵素であるホスホリパーゼC(PLC)δ1の遺伝子欠損マウスは、野生型マウスと比較して脂肪量や体重の増加抑制、代謝の亢進など肥満しにくいことを第一に明らかにした。肥満における脂肪細胞数の増加には脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化が深く関与していることから、次に脂肪細胞分化におけるPLCδ1の役割を検討した。PLCδ1を発現抑制した3T3L1脂肪前駆細胞を脂肪細胞へと分化させた所、コントロールの細胞と比較して顕著に脂肪滴の蓄積が抑制された。またこの細胞では、PPARγやC/EBPαなど脂肪分化に関与する遺伝子の発現が顕著に抑制された。白色脂肪の幹細胞であるSVFを単離し分化誘導した場合にも、遺伝子欠損マウス由来のSVFで、顕著に脂肪滴の蓄積が抑制された。このことはPLCδ1が白色脂肪の分化を正に制御していることを示している。一方、褐色脂肪は、熱産生に重要な役割を担っている。褐色脂肪細胞の熱産生におけるPLCδ1の役割を検討するために、野生型マウスを寒冷環境下におき熱産生を誘導した所、褐色脂肪でのPLCδ1の発現量は減少した。同様に、褐色脂肪初代培養細胞を熱産生誘導剤のcAMPとフォルスコリンで処理した場合にもPLCδ1の発現の減少がみられた。また熱産生誘導時に増加するUncoupling protein 1(UCP1)の発現が、PLCδ1KOマウス由来の褐色脂肪初代培養細胞で顕著に亢進し、逆にPLCδ1をPLCδ1KOマウス由来の褐色脂肪初代培養細胞に過剰発現した場合には、UCP1の発現が抑制された。これらの結果は、PLCδ1が褐色脂肪の熱産生機能に重要な役割を担っていることを示している。
銅結合金属蛋白貭のアポ/ホロ比の定量:新しい細胞内酸化的傷害の指標

活性酸素種に代わる細胞内酸化的ストレスの指標としてスーパーオキサイドジスムターゼ(SOD-1)のアポ型(銅非結合型)とホロ型(銅結合型)の比率を超高感度ナノスプレーイオン化質量分析(NanoESMS)法にて明らかにし、関連疾患の診断・病態解明への手がかりを掴むため、昨年度に引続き中性pH条件下でのアポ型/ホロ型比を測定し得るNanoESMS法の分析条件を検討した。1)市販SOD-1標準品を用いて種々の条件(溶媒pH、有機溶媒濃度、スプレー温度)を変更し、in vivoでの存在形の2量体検出を試みた→精製過程での変性(非共有結合)分子の多量存在。既存MS機器の特性(加熱蒸発法)により、温和な条件下でのMS分析が不可能。→断念2)上記方法に代わるMS法として、誘導結合プラズマ質量分析法(ICPMS法)による金属結合蛋白の金属イオンの定量法確立に方向転換→市販SOD-1中の銅、亜鉛量の定量は可能であることを見出した。活性酸素種に代わる細胞内酸化的ストレスの重篤度を予測する指標としてスーパーオキサイド・ジスムターゼ(SOD-1)、メタロチオネイン(MT)等の銅結合メタロ蛋白のアポ型(銅非結合型)とホロ型(銅結合型)の比率を超高感度ナノスプレーイオン化質量分析法(ナノESMS法)にて定量し、関連疾息の診断・病態解明への手がかりを掴むため、先ず中性pH条件下でアポ型・ホロ型比を測定し得るナノESIMS法の分析条件を種々検討した。1)市販SOD-1標品を用いて種々の条件(溶液pH、有機溶媒の量、噴霧温度)を変え、生体中に存在する形の2量体検出を試みたが、市販標品は非共有結合した分子が多量に存在するため、至適分析条件を決定する試みを一時中断し、ナノESIMS分析条件を検討することにした。2)上記方法に代わる分析法として、誘導結合プラズマ質量分析法(ICPMS法)による精製蛋白中の金属イオンの定量法確立に方向を変更し、現在生体中より目的金属蛋白を分離・精製し分析条件を検討中である。活性酸素種に代わる細胞内酸化的ストレスの指標としてスーパーオキサイド・ジスムターゼ(SOD-1)、メタロチオネイン(MT)等の銅結合メタロ蛋白のアポ型(銅非結合型)とホロ型(銅結合型)の比率を超高感度ナノスプレーイオン化質量分析法(ナノESMS)にて明らかにすることにより、筋萎縮性側索硬化症など神経変性疾患の診断・病態解明への手がかりを掴むため、中性条件下でアポ型/ホロ型比を測定し得るナノESMS法の分析条件を種々検討した。1)市販SODム1標品を用いて種々の条件(溶液pH、有機溶媒の量)を変え、生理的条件下で存在する型(2量体)を試みたが、不成功に終わった。2)上記方法に代わるアポ/ホロ比の測定法として、誘導結合プラズマ質量分析法(ICPMS)による精製蛋白質中の金属イオン定量法の確立を目指した。その結果、生体試料(赤血球)中の目的金属蛋白質(SOD-1、MTなど)をLC-ICPMS法による至適分析条件の検討し、応用可能であることを確認した。1)市軍SOD-1標準品を用いて種々の条件(溶媒pH、有機溶媒濃度、スブレー温度)を変更し、in vivoでの存在形の2量体検出を試みた→精製過程での変性(非共有結合)分子の多量存在。
基板回転型CVD装置開発の基礎研究

半導体の薄膜製造において、従来のCVD装置の大部分は、チャンバー内に水平に置かれた基板に平行にガスを流すタイプである。このタイプの装置では、基板面上に形成される境界層の厚さは流れ方向に変化し、従って、薄膜の膜厚、膜内の各化学種の組成等を均一にするのが難しい。そこで、本研究では、淀み点流れと回転円板上の境界層厚さが一定であることに着目し、基板回転型のCVD装置を開発することを目的とし、チャンバー内の回転円板に垂直に流体が流れる場合の流れ場および温度場について実験的に調べた。その結果、以下のことが明かになった。1.円板上の境界層が層流から乱流に遷移するレイノルズ数は約2×10^5である。また、円板上の境界層内の流速分布は、層流域では解析解とよく一致し、一方、乱流域では対数分布則が成り立つ。2.吹き込み流量が小さい時には円板上部のチャンバー内に循環流が生じる。なお、上記の遷移レイノルズ数は吹き込み流速の影響をほとんど受けない。3.回転レイノルズ数が小さい場合は流体と回転円板との間の伝熱係数は淀み点流れ支配になり、一方、回転レイノルズ数が大きくなると伝熱係数は吹き込みレイノルズ数に依存しなくなり回転円板支配の層流の解析解に一致する。4.淀み点流れ支配においては、局所伝熱係数、温度変動強度ともに半径位置によらずほぼ一定値になる。また、回転円板流れ支配においては、回転レイノルズ数が約2×10^5以下であれば、ほとんど温度変動はなく、このとき局所伝熱係数も半径位置によらず一定値になる。本研究は、回転円板上の境界層厚さは一定であることに着目して、基板回転型のCVD装置を開発することを目的とし、この基礎研究として回転円板に垂直に流体が流れる場合の流れ場、温度場について検討した。実験装置は、円筒容器上面に回転円板、下部に多孔質板を設置した構造で、流体は多孔質板を通して回転円板上に垂直に流した。円板の回転数、及び円板に垂直に流れる流体の速度、及び円板の温度を変化させて、伝熱の実験を行ない、円板一流体間の伝熱係数の測定、及び可視化を行なった。また、装置全体を上下逆にすることにより、浮力の影響について検討した。回転円板の回転数が小さいときの伝熱係数は淀み点流れの解析解の値と一致し、回転数が大きくなると、無限回転円板の解析解の値と一致するようになった。これらの場合、境界層厚さが場所に依らず一定であることがわかった。さらに回転円板の回転数を大きくすると、半径位置の大きいところの局所伝熱係数が、無限回転円板の解析解の値よりも小さくなった。この原因は、多孔質板と円板の間の、半径位置の大きいところに大きな循環流が存在し、有効な伝熱を抑制してるためであることがわかった。さらに回転円板の回転速度を大きくしたときには、半径位置の大きいところは流れが乱流になり、局所伝熱係数が非常に大きくなることがわかった。円板が下向きのときには浮力の影響はほとんどなく、円板が上向きのときには円板と流体の温度差がある値を越えると自然対流が伝熱に対して支配的になることがわかった。自然対流支配の時、局所伝熱係数は場所に依らず一定で、その値は水平平板からの自然対流の実験式と一致することがわかったが、壁面温度がゆっくりと温度変動しており、この時流れが不安定であることがわかった。レーザードップラー流速計を用いた速度分布の測定を進行させているが、現在まとまった結果はでていない。

半導体の薄膜製造において、従来のCVD装置の大部分は、チャンバー内に水平に置かれた基板に平行にガスを流すタイプである。このタイプの装置では、基板面上に形成される境界層の厚さは流れ方向に変化し、従って、薄膜の膜厚、膜内の各化学種の組成等を均一にするのが難しい。そこで、本研究では、淀み点流れと回転円板上の境界層厚さが一定であることに着目し、基板回転型のCVD装置を開発することを目的とし、チャンバー内の回転円板に垂直に流体が流れる場合の流れ場および温度場について実験的に調べた。その結果、以下のことが明かになった。1.円板上の境界層が層流から乱流に遷移するレイノルズ数は約2×10^5である。2.上記の遷移レイノルズ数は吹き込み流速の影響をほとんど受けない。3.円板上の境界層内の流速分布は、層流域では解析解とよく一致し、また、乱流域では対数分布則が成り立つ。4.層流域では、円板上の温度変動はほとんどなく、伝熱係数は半径位置によらず一定値になる。
平面内細胞極性を司る新規制御系の探索

多くの組織や器官は、上皮細胞の頂底軸と直行する組織平面内のある特定の軸に沿った極性を獲得する。これは、平面内細胞極性(planar cell polarity, PCP)と呼ばれ、組織・器官の構築や機能の発現に重要である。最近我々は、ショウジョウバエを用いた組織特異的RNAiスクリーニングにより新規PCP遺伝子jitterbug(jbug)を同定している。興味深いことに、遺伝学的解析からjbugは既知のPCP制御グループに分類されないことが分かった。この事は、新たなPCP制御グループの存在を示唆している。本研究において我々は、Jbugの機能解析を行うとともに、この新たな制御グループに属するPCP遺伝子群を同定した。上皮組織内の細胞の多くは、細胞の頂部-基部軸と直交する組織平面の特定の軸に沿った極性を獲得する。これは、平面内細胞極性(planar cell polarity, PCP)と呼ばれ、ほとんどの多細胞生物において見られる一般的な現象である。これまでPCP制御分子は機能的な違いから大きく2つのグループ(Ds/FtグループとFz/Fmiグループ)に分類されていたが、申請者は、独自に同定した新規PCP分子Jitterbug(Jbug)の機能解析において、未知の「第3のPCP制御グループ(“Jbugグループ")」の存在を示唆する結果を得ている。本研究では、Jbugの機能解析を通してこの第3のグループの全貌を明らかにし、この新規グループに属する分子群を介した新たなPCP制御機構を解明することを目的とする。本年度、昨年度より継続中のJbugグループ構成因子を同定するためのRNAiスクリーニングを完了し、Jbugグループ構成因子候補を合計28個(Member of Jbug Group (MJG) 1-28)同定することに成功した。その内の9遺伝子に関しては、異なるRNAi系統を用いて、最初のスクリーニングと同様の結果を得た。次に、Jbugグループ遺伝子と他のPCP遺伝子との遺伝学的相互作用を解析したところ、Ft/Dsグループ遺伝子のノックダウンによって、jbugおよびmjg遺伝子ノックダウン個体におけるPCP異常が抑圧された。また、jbugノックダウンは、Ft/DsグループおよびFz/Fmiグループ分子の局在には影響を与えなかった。以上の結果から、Jbugグループ分子はFt/DsグループまたはFz/Fmiコアグループの上流制御因子としては機能しないが、Ft/Dsグループと機能的に連関することが示唆された。PCPは組織や器官の構築・維持に必須であり、その破綻は発生異常や疾患の発症に繋がる。これまでPCP制御分子は機能的な違いから大きく2つのグループ(Ds/FtグループとFz/Fmiグループ)に分類されていたが、申請者は、独自に同定した新規PCP分子Jitterbug(Jbug)の機能解析において、未知の「第3のPCP制御グループ("Jbugグループ")」の存在を示唆する結果を得ている。本研究では、Jbugの機能解析を通してこの第3のグループの全貌を明らかにし、この新規グループに属する分子群を介した新たなPCP制御機構を解明する。我々は、Jbugグループの構成因子を同定するためのRNAiスクリーニングを行い、Jbugグループ構成因子を23個(Member of Jbug Group (MJG) 1-23と命名)同定した。また、各種エピトープタグを付加したjbugを発現誘導可能なトランスジェニックショウジョウバエ系統(UAS-EGFP::jbugおよびUAS-FLAG::jbug,UAS-HA::jbug)を作製した。今後、Jbugグループと既知のPCP制御グループ(Ds/FtグループとFz/Fmiグループ)との関係を明らかにし、新規PCP制御機構を解明したい。ほぼ当初予定していた通り、研究が進行しており、研究目的を達成するに充分な成果を得ているため。昨年度、ほぼ当初予定していた通り研究が進行し、Jbug構成因子(Member of Jbug Group: MJG)を多数同定することができた。また、当初予想していたよりも数多くのMJG分子を同定できたため、昨年度は実験結果の検証に時間を要した。本年度は、昨年度施行予定であった個々のMJG分子に着目した解析を引き続き行う予定である。これと併せて、本年度施行予定の実験に関しても、効率良く進める。上述したように、当初予想していたよりも数多くのMJG分子を同定できたため、昨年度は実験結果の検証に時間を要した。

本年度は、昨年度施行予定であった個々のMJG分子に着目した解析を引き続き行う予定であり、そのための繰越金が生じた。昨年度からの繰り越し金を合わせ、申請書の計画に従った研究を効率良く進める。
知能ロボットのための階層的行動発現機構とその教示法の開発

本研究では、多関節移動ロボットのための階層的行動発現機構とその教示法の開発を行なった.現在までにロボットの行動計画法は多く報告されているが,それらは,作業が簡単に記述できるレベルでの計画やそれで十分計画できるロボットが対象であった.しかし,本研究で対称としているような多くの自由度を持ったロボットに,これらの手法を適用することは難しい.そこで本研究では,階層的行動発現機構を提案し,コントローラの各階層への分解および生理,各層の最適なサンプリング時間の決定を行ない,現在までに開発しているロボットに導入し,その有効性を検証した.以下その詳細について述べる.(1)パラレルリンク機構を用いた建設ロボットの開発;当研究室ではすでにシリアルリンク機構をベースにした建設ロボットを開発しているが,このロボットの問題点を整理した新たにパラレルリンク機構をベースにしたロボットを開発した.(2)トランスピュータによるマルチCPUコントローラの製作;階層的行動発現機構を実現するためにトランスピュータを用いたマルチCPUコントローラを製作した.このボードを各ロボットに3枚ずつ実装した.(3)階層的行動発現機構の導入;まず行動を各階層ごとに記述し,各トランスピュータに割り振った.また感覚やエラーのレベルの階層的な分割を行ないそれぞれのトランスピュータに割り振ることにより行動制御の階層化を実現した.(4)実験ロボットへの導入と評価;パラレルロボットとシリアルロボットにマルチCPUコントローラを搭載し,さらに行動発現機構を導入し,その性能評価を行なった.また本手法の問題点等を整理した.本研究では、多関節移動ロボットのための階層的行動発現機構とその教示法の開発を行なった.現在までにロボットの行動計画法は多く報告されているが,それらは,作業が簡単に記述できるレベルでの計画やそれで十分計画できるロボットが対象であった.しかし,本研究で対称としているような多くの自由度を持ったロボットに,これらの手法を適用することは難しい.そこで本研究では,階層的行動発現機構を提案し,コントローラの各階層への分解および生理,各層の最適なサンプリング時間の決定を行ない,現在までに開発しているロボットに導入し,その有効性を検証した.以下その詳細について述べる.(1)パラレルリンク機構を用いた建設ロボットの開発;当研究室ではすでにシリアルリンク機構をベースにした建設ロボットを開発しているが,このロボットの問題点を整理した新たにパラレルリンク機構をベースにしたロボットを開発した.(2)トランスピュータによるマルチCPUコントローラの製作;階層的行動発現機構を実現するためにトランスピュータを用いたマルチCPUコントローラを製作した.このボードを各ロボットに3枚ずつ実装した.(3)階層的行動発現機構の導入;まず行動を各階層ごとに記述し,各トランスピュータに割り振った.また感覚やエラーのレベルの階層的な分割を行ないそれぞれのトランスピュータに割り振ることにより行動制御の階層化を実現した.(4)実験ロボットへの導入と評価;パラレルロボットとシリアルロボットにマルチCPUコントローラを搭載し,さらに行動発現機構を導入し,その性能評価を行なった.また本手法の問題点等を整理した.
補酵素における非共有結合性相互作用の定量的評価とリサイクル触媒作用

生体内酸化還元系補酵素が関与する反応はタンパク中の疎水場における非共有結合性相互作用により制御されている。我々はこれまでに種々の補酵素モデル反応で疎水的環境において初めてルイス酸である金属イオンが、リサイクル可能な触媒として有効に機能することを見いだしている。本申請研究では、反応中間体として生成する補酵素のラジカルイオン種と非共有結合性相互作用をする触媒との結合の強さと、触媒活性との関係について検討し、生体内酸化還元系補酵素における非共有結合性相互作用を定量的に評価し、リサイクル可能な触媒作用との関係を明らかにすることを目的としている。補酵素およびそのモデル化合物の電子状態は、疎水環境における金属イオン等のルイス酸との非共有結合性相互作用によって元の電子状態から大きく変化し、特にラジカルイオン種でその変化は顕著になる。我々はこれまでに、種々のカルボニル化合物の還元反応において、金属イオンが電子受容体ラジカルアニオン種を非共有結合性相互作用により安定化することで電子移動触煤として作用することを見出している。最近我々は、金属イオンのみならず、アミドプロトンと電子受容体ラジカルアニオンとの水素結合形成が疎水的環境下では電子移動の活性化に有効であることを見出した。今年度は、p-ベンゾキノン類の電子移動還元反応において、生成するセミキノンラジカルアニオンとスカンジウムイオンがπダイマー錯体を形成するという、高次の自己組織化による電子移動の活性化が可能であることを初めて示した。また、NADH補酵素の電子移動酸化により、ラジカルカチオンの分光学的検出や脱プロトン化ダイナミクスの観測に初めて成功し、熱力学パラメータの定量的評価を行った。また、NADH補酵素同様にヒドリド供与体である有機金属ヒドリドの光誘起脱プロトン化を初めて見出し、その機構を解明して新しい光酸発生剤としての可能性を示した。我々はこれまでに、種々のカルボニル化合物の還元反応において、金属イオンが電子受容体ラジカルアニオン種を非共有結合性相互作用により安定化することで電子移動触媒として作用することを見出している。今年度は、P-ベンゾキノン類の電子移動還元反応においてアミドプロトンの水素結合による電子移動の活性化が可能であることを初めて示した。また、NADH補酵素類縁体のBNAHおよび4-アルキルBNAHの酸化剤による電子移動酸化や光電子移動酸化反応により、これらのラジカルカチオンの分光学的検出や分子内プロトン移動ダイナミクスの観測に初めて成功し、熱力学パラメータの定量的評価を行った。
HMG1蛋白質およびその受容体分子の体内動態と分布に関する基盤解析

申請者らは抗好中球細胞質抗体の対応抗原のひとつとしてHigh Mobility Group蛋白質HMG1を同定し、抗HMG1抗体の臨床的意義を解析してきた。本研究では、自己抗原としてのHMG分子、特に分泌蛋白質としてのHMG1分子の機能と動態を解析するために、HMG1分子の血液・体液レベルでの動態解析とHMG1の受容体分子の分布解析を行った。(1)患者血清レベルでの可溶性HMG1蛋白質の変動を解析するために、HMG1に対するポリクローナル/モノクローナル抗体を用いてサンドイッチELISAによる可容性HMG1の定量システムを開発した。この系で10ng/ml以上の血清HMG1の測定が可能となり、病態としては種々のショック患者のうち、重篤で致死的な状態の血清にのみ検出された(投稿準備中)。(2)90%グリソン結紮による致死的な肝疎血モデルマウスを樹立してHMG1の意義を解析した。この系は60時間で全例死亡し、それに先行して血中TNF-αおよびHMG1の上昇が見られた。結紮直後にモノクローナル抗HMG1抗体(50μg)を投与すると死亡率の低下が見られ、この系の致死過程にHMG1が関与していることが推定された(投稿準備中)。(3)抗HMG1/HMG2抗体は本邦の自己免疫性肝炎患者の89%、原発性胆汁性肝硬変症(PBC)の70%で検出されたが、オーストラリアのPBC患者での陽性率は35%であることが共同研究で明らかとなった。(4)HeLa細胞内でHMGB1蛋白質と会合する因子の分離及び同定を試み、16種のタンパク質を同定した。これらの各因子についてその相互作用の機構を検索するとともに機能解析を開始した。(5)胆管系細胞株Hucc-T1がHMG1依存性の細胞増殖増強を示す現象を見い出した。HMG1受容体の同定を含め、この現象の分子機序の解析に着手した。本研究では、自己抗原としてのHMG分子、特に分泌蛋白質としてのHMG1分子の機能と動態を解析するために、HMG1分子の血液・体液レベルでの動態解析とHMG1の受容体分子の分布解析を行う。本年度は、HMG1蛋白質の簡便なマススクリーニング的な定量システムを樹立し、患者血清レベルでの可溶性HMG1蛋白質の変動を解析した。患者として、種々の自己免疫疾患患者と感染症を含む種々のショック患者を対象とした。まず、これまでに作製済みのHMG1に対するポリクローナル/モノクローナル抗体を用いて可溶性HMG1の定量システムを開発した。具体的には、(a)リコンビナントHMG1希釈列(または未知量のHMG1含有サンプル)とポリクローナル抗HMG1抗体によるimmunoblottingの反応強度を化学発光として読み取る系、および、(b)ポリクローナル/モノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAの系を構築して両者を比較検討した。その結果、後者の系で10ng/ml以上の血清HMG1の測定が可能となり、病態としては種々のショック患者のうち、重篤で致死的な状態の血清にのみ検出された。検出感度を上げるために、新たにポリクローナル抗体を作製して検討する予定である。

一方、HMG1の受容体分子として既に報告されているRAGEの疾患状態での発現解析とRAGE以外の受容体分子の新規クローニングのために、RAGEに対するモノクローナル抗体の作製、RAGE遺伝子およびその変異株のトランスフェクタント細胞株の作製、HMG1依存性の細胞増殖増強を示す胆管細胞株のcDNAライブラリーの構築などの準備を開始した。申請者らは抗好中球細胞質抗体の対応抗原のひとつとしてHigh Mobility Group蛋白質HMG1を同定し、抗HMG1抗体の臨床的意義を解析してきた。本研究では、自己抗原としてのHMG分子、特に分泌蛋白質としてのHMG1分子の機能と動態を解析するためにHMG1分子の血液・体液レベルでの動態解析とHMG1の受容体分子の分布解析を行った。前年度より検討してきた可溶性HMG1蛋白質の測定システムを完成した。この測定系はHMG1に対するポリクローナル/モノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAであり、測定感度は10ng/mlであった。これを用いた臨床応用として、種々の患者血清レベルでのHMG1の変動を解析したところ、ショック症状を呈する患者のうち、特に重篤で致死的な病態の血清に高頻度に検出された(投稿準備中)。動物モデルを用いた可溶性HMG1の意義解析を行なった。このモデルは90%グリソン結紮による致死的な肝疎血モデルマウスで60時間で全例死亡し、それに先行して血中TNF-αおよびHMG1の上昇が見られた。結紮直後にモノクローナル抗HMG1抗体(50100μg/匹)を腹腔内投与すると死亡率の低下が見られ、この系の致死過程にHMG1が関与していることが推定された(投稿準備中)。HMG1の培養細胞系への影響を解析し、胆管系細胞株Hucc-T1がHMG1依存性の細胞増殖増強を示す現象を見い出した。Hucc-T1細胞表面のHMG1受容体の同定を含め、この現象の分子機序の解析に着手した。一方、HeLa細胞内でHMG1蛋白質と会合する因子の分離及び同定を試み、16種のタンパク質を同定した。今後は、これらの各因子についてその相互作用の機構を検索するとともに機能解析を進める。
生体の恒常性維持機構に着目したカドミウム毒性発現の分子機構解明

カドミウム摂取(曝露)によって発症するイタイイタイ病は骨の病気と考えられているが、その直接の標的となる臓器は腎臓である。本研究課題では、標的臓器と発症臓器の関連性からカドミウム曝露が腎臓においてビタミンD3代謝に及ぼす影響の解析を試み、腎臓由来の培養細胞においてFGF23によって制御されるビタミンD3代謝に関連する遺伝子の発現がカドミウム曝露の影響を受けることを明らかにした。今年度は、FGF23が担う生体の恒常性維持機構を再現できる腎近位尿細管由来の培獲細胞を用いて、FGF23によって誘導される細胞応答に対するカドミウムの曝露の影響を解明することが目的であった。FGF23によって制御される主な生理機能は、腎臓でのリン酸再吸収の抑制と活性化型ビタミンD_3合1成の制御と考えられている。リン酸再吸収の制御において重要な役割を担う分子はリン酸・ナトリウム共輸送担体(NaPi2a)である。定量的リアルタイムPCRによる解析から、近位尿細管由来の培養細胞に対してカドミウム曝露を行うとNaPi2a mRNAの発現が抑制されることが明らかとなった。一方、ビタミンD3の代謝制御に関しても、活性化型ビタミンD_3の分解を促進する律速酵素CYP24AのmRNAの発現がカドミウム曝露により抑制されることが明らかにとなった。すなわち、FGF23によって制御される恒常性維持機構に対して、カドミウム曝露が影響を及ぼす可能性が細胞レベルにおいて示唆された。カドミウム曝露が人体へ及ぼす影響として骨軟化症という症状が知られているが、この症状を発症させる直接の原因はカドミウムによる腎近位尿細管の機能障害と考えられている。一方、FGF23の過剰の作用により引き起こされる骨軟化症の原因の一つとして腎近位尿細管でのリン酸の再吸収の抑制(NaPi2aの作用不全)による血中リン酸濃度の上昇が知られている。カドミウム曝露によってNaPi2a mRNAの発現抑制が検出されたという結果は、カドミウム曝露による骨軟化症発症の直接の原因の1つが近位尿細管でのリン酸再吸収機構の機能不全である可能性を意味するものと考えられる。ここまではカドミウム単独曝露の影響を評価しているが、今後の研究においてFGF23からのシグナルが誘導された状態でのカドミウムの影響を様々な手法で評価していきたいと考えている。今年度は、昨年度の研究から明らかになった腎近位尿細管由来の細胞へのカドミウム単独曝露の影響を受け、この細胞に対してFGF23からのシグナルが誘導された状態でのカドミウム曝露の影響を評価するための解析を試みた。第一に、培養細胞系でのFGF23による遺伝子発現誘導に関して、その濃度依存性および経時変化を詳細に検討した。次に、本研究に使用している培養細胞が腎近位尿細管由来の細胞であるという特徴を考慮し、遺伝子発現作用が期待されるビタミンD_3に関してもFGF23と同様の検討を行った。FGF23に関しては、刺激後1時間という早い段階で一過的なEgr-1遺伝子の発現を誘導すること、また、刺激後3時間から活性型ビタミンD_3の分解を促進する律速酵素CYP24AのmRNAの発現を増強することが明らかになった。一方で、活性型ビタミンD_3の合成を促進する律速酵素CYP27B1のmRNAの発現には大きな影響を示さなかった。さらに、これらのFGF23による遺伝子発現制御に対して低濃度のビタミンD_3の添加効果を解析したところ、ビタミンD_3はEgr-1およびCYP27B1の発現には影響を示さなかったが、CYP24AmRNAの発現には単独刺激による発現上昇に加え、FGF23との共刺激において相乗的な発現上昇を誘導することが明らかになった。この結果より、細胞膜上に存在するFGF受容体/Klothoという共受容体システムを介するFGF23によるシグナルと核内受容体を介するビタミンD_3によるシグナルが協調的に制御するビタミンD_3の恒常性維持機構が存在することが示された。この2年間の解析から得られた結果をもとに、最終年度の研究においてFGF23によって誘導されるシグナルおよび細胞応答に対するカドミウム曝露の影響を明らかにし、生体の恒常性維持機構へのカドミウムの影響を明らかにしたいと考えている今年度は、これまでの研究から明らかになったFGF23が担う生体の恒常性維持機構を再現できる細胞を用いて、FGF23からのシグナルが誘導された状態でのカドミウムの影響を評価するための解析を試みた。そこで培養細胞系でのFGF23による遺伝子発現誘導に関して、カドミウム曝露の濃度依存性および経時変化に関して詳細な検討を行った。加えて、本研究に使用している培養細胞は腎近位尿細管由来の細胞であることを考慮し、作用発現が期待されるビタミンD_3の作用に関しても同様の検討を行った。FGF23刺激によって誘導される遺伝子発現変化のなかで、刺激後1時間という早い段階で一過的な発現上昇が誘導されるEgr-

4遺伝子の発現はカドミウム曝露による影響を受けなかったが、FGF23刺激後3時間から誘導が認められる活性型ビタミンD_3の分解を促進する律速酵素CYP24AのmRNAの発現上昇はカドミウム曝露により、その濃度依存的に発現促進が抑制された。また、活性化型ビタミンD_3の合成を促進する律速酵素CYP27B1のmRNAの発現はカドミウム曝露によってFGF23刺激の有無にかかわらず減弱していた。さらに、これらのFGF23による遺伝子発現制御に対して低濃度のビタミンD_3の添加効果を解析したところ、昨年度の解析で明らかになったFGF23とビタミンD_3の共刺激によって誘導されるCYP24AmRNAの相乗的な発現上昇は、カドミウム曝露によりFGF23単独刺激時と同様完全に抑制された。一連の結果は、FGF23刺激によるビタミンD_3の腎臓における恒常性維持機構がカドミウム曝露により破綻していることを示唆している。また、実際にカドミウム摂取よって発症するイタイイタイ病の原因が腎臓障害によることを考慮すると、培養細胞系で認められるビタミンD_3の恒常性維持機構の破綻が腎臓で起きることで二次的な骨代謝の異常を誘導している可能性を推測させるものである。
Quantum Schubert Calculus and Mirror Symmetry for Flag Varieties

グラスマン多様体上のトートロジカル部分束のチャーン類に対し、その量子カップ積を計算するために、等方的なグラスマン多様体の特殊な場合の量子シューベルト計算の研究を行い、量子ピエリ公式をB、C、D型のリー群に対応するグラスマン多様体の場合に得た。自然な射影写像による旗多様体の量子コホモロジーの関手性の問題を完遂させた。一般のリー群に対応する旗多様体の直線類に対し、そのK理論的種数0の3点グロモフ-ウィッテン不変量についての量子から古典への対応原理を開発した。また、ミラー対称性において重要な役割を果たす原始形式の理論に対する複素微分幾何的なアプローチを、滑らかな多重ベクトル場を用いて開発した。
次世代の世界史単元開発研究のための質的研究方法の探究

本研究の目的は、生徒が法・憲法について語る能動的な学習単元を開発し、歴史を語るという資質の成長をとらえる評価問題の開発と評価方法を解明することである。そのため、世界史教育における能動的な学びは、アクティヴ・ラーニングとして評価されるロールプレイの差異体験やジグソー法の他者交流などによる学びの変化に留まるものではなく、生徒と生徒、生徒と教師が協力して、歴史を語るという市民的資質を段階的に向上するものであることを明らかにすることを試みた。具体的には、ジグソー法の他者交流にトゥールミン図式を導入した単元「1791年憲法を考える」を開発した。単元は、フランス革命期の政治家や思想家の演説や著書を読み解き、1791年憲法に対する発言を生徒に考えさせた。そして、憲法賛成派は経済的自由を重視する価値観をもっていること、憲法反対派は平等を重視する価値観をもっていることを生徒と生徒、生徒と教師が協力して解明する活動を組織し、また、生徒自身が価値観を選択判断し、1791年憲法の内容について発言させるようにした。最後に、パフォーマンス評価にもとづく評価活動を組織することで、生徒自身がフランス革命や1791年憲法についての自分の語りを評価し、何をどのように学べば良いか学びの方向性を示せるようにした。本研究の意義は、トゥールミン図式を導入することで学びの段階性と向上性に基づく能動的な学習を組織できること、それ故に、パフォーマンス課題とその評価を導入することが可能になること、その結果、生徒の一人ひとりの達成水準が見えるようになり、子どもたちの学習が教師にも生徒自身にも理解でき、自分が授業で何を学んだのかを把握できるようになることを単元レベルで示したことである。今後の課題としては、本授業はモデル単元であるため、実践を繰り返すことで、単元構成や資料、グループ活動の方法などを精緻化していく必要がある。
フォトフェントン反応による二酸化炭素固定化・水素エネルギー回収複合技術の創製

廃棄物であるスクラップ鉄を原料に,排水中の有機汚染物質を分解し,同時に水素・電気エネルギーを回収し,有機汚染物質が分解することにより発生する二酸化炭素を鉄触媒により固定化する,Innovative Water Treatment System(IWTS)の開発を行った。IWTSによる二酸化炭素固定化実験では、常温常圧の条件下でフォトフェントン反応の触媒として用いられた溶液中のFe^<2+>は,溶存二酸化炭素種との反応によりFe_2(OH)_2CO_3を形成して二酸化炭素を固定化FT-IRのスペクトルにより確認した。このことより,排水処理と同時に水素・電気エネルギー生成を行い,二酸化炭素を固定化できることが確認された。IWTSを実際に工業的に用いる場合、スケールアップや処理条件の最適化が必要とされるため、手軽に扱える、シンプルなシミュレーションモデルの構築を行った。シミュレーションモデルに必要なパラメーターはバッチ式の実験より得た。得られたパラメーターをもとに連続式の実験結果と比較し、モデルの評価を行った。バッチ式の実験結果より得たパラメーターを用いて構築したシミュレーションモデルの計算結果と実験値はよく一致していることが確認できた。今までに得られた結果よりIWTSの特徴をまとめると以下のようになる。IWTSは電気化学的腐食反応とフォトフェントン反応を組み合わせることによって、排水処理と同時にエネルギー生産を行える新しい水処理技術である。IWTSでは酸化力の強いOHラジカルにより、従来の排水処理法では処理するのが困難であった難分解性有機汚染物質を迅速かっ完全に処理することが可能となる。IWTSでは付加価値のある副生成物(電気・水素エネルギー)や二酸化炭素固定化により、利益を生むことができ、ランニングコストを削減できる。フォトフェントン反応を応用し,電気化学的腐食反応と複合することにより排水処理,二酸化炭素排出削減,エネルギー生成を同時に行う,Innovative Water Treatment System(IWTS)の開発を行った。モデル染色排水としてオレンジIIを用い,IWTSによるモデル染色排水の連続処理実験により,その性能を考察した。鉄板の電気化学的腐食反応によって排水中に溶出した鉄イオンはフォトフェントン反応の鉄源として用いることができ,それによりOHラジカルが生成され,オレンジIIの脱色が行われることを確認した。染色排水は連続装置内の相対流路位置が0.8の点では,定常状態で人口オレンジII濃度の約84%まで脱色することができた。また,鉄イオン濃度はリアクター内でほぼ一定の値を示し,過酸化水素は,フォトフェントン反応によって連続装置内を進むにつれ徐々に分解されていった。IWTSによる染色排水の脱色中に生成した電気エネルギーと水素ガスは溶出した鉄1kgあたりそれぞれ16.5Whkg^<-1>-Fe_<reacted>と13g-H_2kg^<-1>-Fe_<reacted>であった。理論的には,鉄1kgから,水素・電気エネルギー,それぞれ36g-H_2kg^<-1> Fe_<reacted>,421Whkg^<-1> Fe_<reacted>と見積もられるが,本研究ではアノード電極上の酸化被膜の形成やオレンジIIの還元に電子が使われたため,それぞれの発生量が減少したと考えられる。以上のことから,フォトフェントン反応と電気化学的腐食反応を複合することにより,排水を処理すると同時に電気・水素エネルギーを回収することができることがわかった。これにより,排水処理をすると同時に,エネルギーを生産することのできる新しい水処理技術の開発の可能性が示唆された。
果樹レクチンの比較研究

植物レクチンの生理的役割の一つとして貯蔵タンパク説がある.そこで,ニホングリレクチン(CCA)と貯蔵タンパク質のクローニングによって得たcDNAを用い,ノーザン解析によって発現特性を比較した.その結果,貯蔵タンパク質は種子特異的に発現し,また発現時期は登熟後期にピークとなり,その後休眠中も発現を続けたが,発芽時に消滅した.これに対し,CCAは種子,茎,雄花,雌花で発現を認めた.特に種子では登熟初期から高レベルの発現を維持し,休眠中にややレベルは低下するが,発芽時に再度高レベルで発現した.以上の結果から,CCAはその発現特性が貯蔵タンパク質とは明確に異なることが明らかになった.一方,前年度の,PCR-サザン解析から,ニホングリのレクチンをコードする遺伝子がイントロンを持つと推定したが,プローブの純度を高めて精査した結果,イントロンは持たないことが明らかになった.従ってこれまで用いていたプローブに問題があることから,プローブの再調製を行った.またPCRを行う際のプライマーも,これまでのCCAの配列に基づくN, Rに加え,他のジャッカリン関連レクチンの塩基配列を参照し,新たにJF, JRのプライマーをデザインした.これら2組のプライマーセットと再調製したプローブを用いて,12種のブナ科植物に対してPCR-サザン解析を行った.その結果,ブナ属(ブナとイヌブナ)を除くブナ科植物全てについて,ニホングリと同一のパターンを示した.特に,N, Rのプライマーセットで同一のパターンを示したことから,これらはニホングリ同様二つのドメインからなるレクチンであると推察される.ブナ属については,PCRでの増幅は認めたが,サザン解析でのシグナルが極めて弱かった.以上の結果から,、ブナ科植物は,ブナ属を除き,ニホングリのレクチンと類似したレクチンを有し,これは発芽や受精の際に重要な役割を担っていることが明らかになった.さらにブナ属では,他のブナ科植物とは異なったレクチンがぞんざいする可能性が高いと考えられる.まず,ゲノミックサザン解析を行うため,クリ属18種,およびコナラ属,マテバシイ属のそれぞれ約5種について,ゲノムDNAの単離を試みた.しかしながら,ブナ科植物は,葉肉が厚く,ポリフェノール含量が高いため,再現性良く制限酵素消化が可能なゲノムDNAの単離ができなかった.そこでPCR-サザン解析を行うこととした.プライマーには,ニホングリレクチン(CCA)クローニング時に使用した.ミックスプライマーのセットを用いた.また,検出のフローブにはCCAのオープンリーディングフレームほぼ全域に該当するフラグメントを用いた.その結果,'国見'では約2200,1600,1300,900,740bpの位置に5つのポジティブシグナルが得られた.このうち2200,1600,1300bpのフラグメントは,イントロンを持つ全長CCAのイソレクチンを,900,740bpのフラグメントはN-もしくはC-ドメインの一方をコードしている可能性を示唆している.同様の操作を,シバグリ,ヨーロッパグリ,傍士系統のクリに対して行ったところ,シバグリとヨーロッパグリは'国見'と同じパターンを示した.これに対してモーバングリでは900,740bpのシグナルが強く,また400bp付近にもホジティブシグナルを認めた.さらに,傍士系統のチュウゴクグリは多様性に富んでおり,特に傍士354,360,377,445,446および480号では他のクリでは認められない.2800bp付近にシグナルが認められた.これらの結果は,チュウゴクグリには他のクリにはないレクチンが存在している可能性を示唆している.一方,他のブナ科植物では,パターンが大きく異なった.今回解析を行ったイチイガシ,クヌギ,シリブカガシ,スダシイはいずれも1kbp付近にシグナルがあるが,イチイガシを除いては,他にポジティブシグナルは検出できなかった.またイチイガシについても380bp付近にシグナルを認めただけであった.これらの結果は,ブナ科植物にもCCAに類似のレクチンが存在するが,イソレクチンのパターンはクリ属とは大きく異なることを示唆している.以上の結果は,園芸学会平成13年度春季大会において発表予定である.植物レクチンの生理的役割の一つとして貯蔵タンパク説がある.そこで,ニホングリレクチン(CCA)と貯蔵タンパク質のクローニングによって得たcDNAを用い,ノーザン解析によって発現特性を比較した.その結果,貯蔵タンパク質は種子特異的に発現し,また発現時期は登熟後期にピークとなり,その後休眠中も発現を続けたが,発芽時に消滅した.これに対し,CCAは種子,茎,雄花,雌花で発現を認めた.特に種子では登熟初期から高レベルの発現を維持し,休眠中にややレベルは低下するが,発芽時に再度高レベルで発現した.以上の結果から,CCAはその発現特性が貯蔵タンパク質とは明確に異なることが明らかになった.一方,前年度の,PCR-サザン解析から,ニホングリのレクチンをコードする遺伝子がイントロンを持つと推定したが,プローブの純度を高めて精査した結果,イントロンは持たないことが明らかになった.従ってこれまで用いていたプローブに問題があることから,プローブの再調製を行った.またPCRを行う際のプライマーも,これまでのCCAの配列に基づくN, Rに加え,他のジャッカリン関連レクチンの塩基配列を参照し,新たにJF, JRのプライマーをデザインした.これら2組のプライマーセットと再調製したプローブを用いて,12種のブナ科植物に対してPCR-サザン解析を行った.

その結果,ブナ属(ブナとイヌブナ)を除くブナ科植物全てについて,ニホングリと同一のパターンを示した.特に,N, Rのプライマーセットで同一のパターンを示したことから,これらはニホングリ同様二つのドメインからなるレクチンであると推察される.ブナ属については,PCRでの増幅は認めたが,サザン解析でのシグナルが極めて弱かった.以上の結果から,、ブナ科植物は,ブナ属を除き,ニホングリのレクチンと類似したレクチンを有し,これは発芽や受精の際に重要な役割を担っていることが明らかになった.さらにブナ属では,他のブナ科植物とは異なったレクチンがぞんざいする可能性が高いと考えられる.
注意欠如多動性障害患児に対する薬物治療終了時期判定のための客観的指標の開発

注意欠如多動性障害(ADHD)は塩酸メチルフェニデート(MPH)の治療が有効とされ長期服用の副作用として低身長、思春期における薬物乱用などの問題が指摘されているが、症状改善後の薬物治療終了時期の判定のための基準は示されていない。薬物治療の終了時期判定における客観的指標を開発する目的で研究を行った。客観的指標として光トポグラフィー(NIRS)信号を用いた。ADHD群では、MPHによる治療を行なう以前は、健常児よりもNIRS信号低下が見られるが、1年間の継続内服後には、休薬1週間後でもNIRS信号に健常児群との差が見られなくなった。NIRSが服薬終了時期を示す補助的指標となる可能性が示唆された。ADHDは発達の水準に不相応で不適応な不注意や多動性又は衝動性行動を特徴とする障害で、小児期に多く認められる代表的な精神疾患である(本邦の学童で有病率2.5%)。塩酸メチルフェニデート(MPH)の治療が有効とされ、長期服用の副作用として低身長、思春期における薬物乱用また思春期における服薬アドヒアランスの低下が問題となっているにも関わらず、薬物治療効果の客観的指標がなく、症状改善後の薬物治療終了時期の判定のための基準は示されていないことが問題となっている。そこで薬物治療の終了時期判定における客観的指標を開発することを目的として研究を行った。客観的指標として、ADHDの病態を反映するといわれている抑制課題施行中の、光トポグラフィー(NIRS)の信号を用いた。ADHD児および健常児とも初回と1年後にNIRS検査を実施した。ADHD児は、初回実施時にはMPHの服薬経験がなく、その後1年間継続的にMPHを服用した。ただし、1年後のNIRS検査実施時の1週間前からMPHを休薬し、MPHをウォッシュアウトした状態で1年後のNIRS検査を実施した。小児ADHD群では、MPHによる治療を行なう以前は、健常児群を比較して、NIRS信号低下が見られるが、1年間の継続内服後には、休薬1週間後でもNIRS信号に健常児群との差が見られなくなった。本研究においては、1週間のウォッシュアウト期間を設けて実施したが、今後、ウォシュアウト期間をより長くした場合の検討を行なうことにより、小児ADHDに対する薬物療法において、服薬の頻度を低くしていく目安や服薬終了時期を示す補助的指標として、NIRSを用いることが可能になるのではないかと考えられた。目的:注意欠如多動性障害(attention deficit hyperactivity disorder : ADHD)は、小児期に最も多く見られる精神疾患で、薬物治療として、特に塩酸メチルフェニデート(MPH)の治療が有効とされる。しかし、長期服用の副作用として低身長、思春期における薬物乱用などの問題が指摘されているにも関わらず、症状改善後の薬物治療終了時期の判定のための基準は示されていないことが問題となっている。そこで、本研究では近赤外線スペクトロスコピィ(Near-infrared spectroscopy; NIRS)を用いて、薬物治療の終了時期判定における客観的指標を開発することを目的とする。平成24年は主にデータ収集を行った。臨床試験参加者を外来にて治療継続し、MPHが臨床的に有効と考えられる小児ADHD患者に対しMPHを1年間継続した。11週間休薬→2休薬後の臨床評価(医師の薬効評価(CGI-S))・心理検査/NIRS検査をADHD患児に対して行った。健常群にもNIRS検査実施。健常群にも比較対照群としてNIRS検査実施。<NIRS検査>NIRS検査をベースラインと一年内服後1週間休薬して、患児に対して実施した。同様の間隔にて健常児にも施行した。抑制課題を実施し、その間の脳活動をNIRSにて計測した。<現在までの結果>ADHD群14名、健常群15名で、統計解析を行なったところ、以下のような結果が得られたが、目的のためには更なる検討が必要である1ベースラインの未内服でのアセスメントでは、健常児群とADHD群の酸素化ヘモグロビン変化量は、有意に差が認められた。2MPHを一年間内服して1週間休薬した14名の酸素化ヘモグロビンの変化量は、健常児群の酸素化ヘモグロビン変化量と差が認められなくなった。3酸素化ヘモグロビンの変化量CGIスケールとの相関は認められなかった。1年間の追跡期間があるとdrop out率は高まるが、注意欠如多動性障害の児14名、健常児15名と解析可能な人数までデータ収集を行うことができた。また解析も一通り行うことができた。今後はさらに解析を進め、論文化して今年度中の出版を目指す。
海洋生物由来抗腫瘍性物質の探索と開発

海洋という特殊な生息環境下にあり物理的防御機能をもたない種々の海洋生物は,常に病原微生物の侵襲や他種生物による捕食に脅かされている.この様な特殊な環境に生息し,適応するため,これらの海洋生物はその進化の過程において,陸上生物とは異なる代識系あるいは生体防御系を発展してきたと考えられる.したがってその産生成分には新奇な化学構造を有する抗腫瘍性物質の存在が期待される.本研究において,沖縄サンゴ礁域,伊豆諸島をはじめ日本各地沿岸で採集した海綿動物,腔腸動物,棘皮動物,ホヤ類,軟体動物,海藻,海洋微生物など種々の海洋生物の試料について新規抗腫瘍性物質の探索を行った.抗腫瘍活性物質探索の予備スクリーニングとして,これら試料の抽出エキスおよびさらに粗分画したものについてウニおよびヒトデ受精卵卵割阻害効果や癌細胞増殖阻害効果をin vitroで迅速に検討し,有効と判定された物質はさらに実験腫瘍やヒト腫瘍細胞を用いてin vivoで詳細な検討を行った.その結果,多彩な化学構造を有する種々の新規抗腫瘍性物質:海綿類......ポリエーテル系(ハリコンドリン系),大環状ラクトン(ビステオネリド類),アルカロイド(トリアノシンA),ペプチドラクトン(テオネラペプトリド類);八放サンゴ類......テルペノイド(ネフテオキシジオール,ケリセンブレノリド類);後鰓類......テルペノイド(アプリクロディンA),含ハロゲンテルペン(アプリシアピラノイド類);ホヤ類......アルカロイド(シュウドディストミン類,シストディチン類),プロテオグリカン;海洋微生物......マクロリド(アンフィジノライドA)などを見い出している.今後,顕著な活性を示す抗腫瘍性物質については,さらに作用ならびにその作用機作について詳細に調べるとともに,化学修飾を検討する.また,引き続き海洋生物由来の新規抗腫瘍性物質の探索を継続する.海洋という特殊な生息環境下にあり物理的防御機能をもたない種々の海洋生物は,常に病原微生物の侵襲や他種生物による捕食に脅かされている.この様な特殊な環境に生息し,適応するため,これらの海洋生物はその進化の過程において,陸上生物とは異なる代識系あるいは生体防御系を発展してきたと考えられる.したがってその産生成分には新奇な化学構造を有する抗腫瘍性物質の存在が期待される.本研究において,沖縄サンゴ礁域,伊豆諸島をはじめ日本各地沿岸で採集した海綿動物,腔腸動物,棘皮動物,ホヤ類,軟体動物,海藻,海洋微生物など種々の海洋生物の試料について新規抗腫瘍性物質の探索を行った.抗腫瘍活性物質探索の予備スクリーニングとして,これら試料の抽出エキスおよびさらに粗分画したものについてウニおよびヒトデ受精卵卵割阻害効果や癌細胞増殖阻害効果をin vitroで迅速に検討し,有効と判定された物質はさらに実験腫瘍やヒト腫瘍細胞を用いてin vivoで詳細な検討を行った.その結果,多彩な化学構造を有する種々の新規抗腫瘍性物質:海綿類......ポリエーテル系(ハリコンドリン系),大環状ラクトン(ビステオネリド類),アルカロイド(トリアノシンA),ペプチドラクトン(テオネラペプトリド類);八放サンゴ類......テルペノイド(ネフテオキシジオール,ケリセンブレノリド類);後鰓類......テルペノイド(アプリクロディンA),含ハロゲンテルペン(アプリシアピラノイド類);ホヤ類......アルカロイド(シュウドディストミン類,シストディチン類),プロテオグリカン;海洋微生物......マクロリド(アンフィジノライドA)などを見い出している.今後,顕著な活性を示す抗腫瘍性物質については,さらに作用ならびにその作用機作について詳細に調べるとともに,化学修飾を検討する.また,引き続き海洋生物由来の新規抗腫瘍性物質の探索を継続する.