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高野山伝存史料から見た弘仁・天長両皇帝の時代

高野山大学図書館所蔵本を中心に東寺観智院所蔵本・お茶の水図書館所蔵本などを調査して、平安時代初期に関わる史料を収集した。これらのデータを検討し、『日本後紀』などのデータと合わせて弘仁年間の記事一覧表を作成した。さらにこれらのデータを分析して、空海と嵯峨天皇・平城上皇に関わる歴史的な問題について考察した。1.『高野雑筆集』所収の書状の宛先を分析し、嵯峨天皇の側近であった藤原三守宛てのものが三通存在することを明らかにした。空海は三守が参議に昇進した弘仁7年(816)10月頃には、三守と親密な関係を築いており、同年7月に空海が高野山の賜与を上表して許された背景にも、三守の協力があった可能性が高いことを論じた。2.空海が弘仁13年(822)に平城上皇に灌頂を授けたことが史実かどうかを検討した。高野山大学図書館本などの『平城上皇灌頂文』の記載、正倉院北倉出納文書・正倉院破璃装仮整理文書断片の記載などから、平城上皇の灌頂受法は歴史的事実と認められると結論した。3.空海が弘仁14年(823)に嵯峨天皇に灌頂を授けたことが史実かどうかを検討した。承和3年(836)の実恵書状に嵯峨が空海にたびたび密教の教義を尋ねていたこと、平城上皇の灌頂受法後、天皇・皇后らが多く空海から灌頂に預かったことが明記されているので、嵯峨天皇が空海から灌頂を受法した可能性はきわめて高いと考えた。以上の結論を空海の著作目録、『嵯峨太上大后灌頂文』の記載、東山御文庫本『一代要記』の記載などから補強することに努めた。4.薬子の変に至る原因とその背景について、東寺観智院所蔵の『東宝記』原本の記載を軸に考察した。私見によると、桓武天皇は安殿・神野・大伴の三親王が順番に即位することを遺勅し、平安京を万代宮と定めて他宮への遷都を禁じた。これに対して、桓武の構想に反対する安殿親王(平城天皇)と藤原薬子・仲成は高岳親王の立太子を実現し、平城遷都を計画した。薬子の変は王都・王統に関する桓武の構想を肯定するか否定するかの戦いであったと結論づけた高野山大学図書館所蔵本を中心に東寺観智院所蔵本・お茶の水図書館所蔵本などを調査して、平安時代初期に関わる史料を収集した。薬子の変は王都・王統に関する桓武の構想を肯定するか否定するかの戦いであったと結論づけた高野山大学図書館・国立歴史民俗博物館・国立公文書館内閣文庫などに出張し、空海や平安仏教史に関係する写本類を調査して、弘仁・天長年間の歴史的事実を復元する手がかりを探した。また、東寺観智院金剛蔵や国文学研究資料館などから紙焼写真を購入し、活字史料との対照を進めた。この他、謝金を用いて、弘仁・天長期の逸文史料を収集し、これらをもとに時系列一覧表データを作成する作業を開始した。これまでの日本古代史研究では仏教史料をきめ細かく追跡することが行われていないため、空海関係史料に限っても、弘仁・天長期の歴史的事実を復元しうる史料が数多く存在するという印象をもっていたが、作業を進めるにつれて、ますますその気持ちが強まってきている。

研究課題としては、今年度は空海の灌頂授与に焦点を絞り、弘仁13年(822)における平城太上天皇への灌頂授与の歴史的意義を探り、第38回日本古文書学会大会において「平城上皇の灌頂と空海-正倉院出納文書の検討を中心にして-」と題して口頭報告を行った。正倉院玻璃装文書のなかに平城上皇の灌頂に関わる新たな文書が存在することも報告されたので、平城上皇に対する空海の灌頂授与は歴史的事実であったと結論づけてよいであろう。『平安城太上天皇灌頂文』の古写本が存在することも確認できたので、来年度にかけてテキストの校訂を行いたいと患う。空海関係史料を収集する過程で、原本『東宝記』の記載から、桓武天皇の皇位継承に関する遺勅の存在を知ることができ、平城朝における皇太子廃立問題についての論考を発表した。前年度に収集した高野山大学図書館所蔵本や東寺観智院所蔵本・お茶の水図書館所蔵本などのデータを分析し、『日本後紀』などのデータと合わせて弘仁年間の記事一覧表を作成した。またこれらのデータを用いて、空海と嵯峨天皇・平城上皇に関わる問題について考察した。1.『高野雑筆集』所収の書状の宛先を分析し、嵯峨天皇の側近であった藤原三守宛てのものが三通存在することを明らかにした。空海は三守が参議に昇進した弘仁7年(816)10月頃には、三守と親密な閥係を築いており、同年7月に空海が高野山の賜与を上表して許された背景にも、三守の協力があった可能性が高いことを論じた。2.空海が弘仁13年(822)に平城上皇に灌頂を授けたことが史実かどうかを検討した。高野山大学図書館本などの『平城上皇灌頂文』の記載、正倉院北倉出納文書・正倉院玻璃装仮整理文書断片の記載などから、平城上皇の灌頂受法は歴史的事実と認められると結論した。3.空海が弘仁14年(823)に嵯峨天皇に灌原を授けたことが史実かどうかを検討した。承和3年(836)の実恵書状に嵯峨が空海にたびたび密教の教義を尋ねていたこと、平城上皇の灌頂受法後、天皇・皇后らが多く空海から灌頂に預かったことが明記されているので、嵯峨天皇が空海から灌頂を受法した可能性はきわめて高いと考えた。以上の結論を空海の著作目録、『嵯峨太上大后灌頂文』の記載、東山御文庫本『一代要記』の記載などから補強することに努めた。4.薬子の変に至る原因とその背景について、東寺観智院所蔵の『東宝記』原本の記載を軸に考察した。私見によると、桓武天皇は安殿・神野・大伴の三親王が順番に即位することを遺勅し、平安京を万代宮と定めて他宮への遷都を禁じた。これに対して、桓武の構想に反対する安殿親王(平城天皇)と藤原薬子・仲成は高岳親王の立太子を実現し、平城遷都を計画した。薬子の変は王都・王統に関する桓武の構想を肯定するか否定するかの戦いであったと結論づけた。
第4B族金属有機化合物を用いる反応活性種の生成と有機合成に関する研究

有機金属反応剤のうち第4B族金属有機化合物はリチウム、マグネシウム、アルミニウムなどの金属を含む有機金属反応剤と異なり、水や空気に対して安定であることから取り扱いが容易であり、また反応性が低いことから、高選択的な精密有機合成を達成する反応剤として極めて有用である。従って種々の官能基を含む有機ケイ素を中心とする反応剤の合成設計が可能となる。本研究ではこれら新規反応剤の開発と新反応の開拓を目指した研究を行った。その成果をまとめると以下のようになる。(1)有機ケイ素化合物を他の方法によって得難い種々の反応中間体の合成等価体と見なせる反応剤としてデザインし、その合成法を明らかにした。さらにこれら反応剤を用いて、第4B族金属有機化合物の反応として興味のある1,nー脱離反応が関与した有用な新しい反応を明らかにし、合成化学的に重要な複素環状化合物の高選択的な合成法を確立した。例えば、他の方法では得難たい1,3ー双極子試薬である、母体のアゾメチンイリド、チオカルボニルイリド等価体の合成に成功し、ピロリジン、テトラヒドロチオフェン、1,3ーオキサチオラン、1,3ーチアゾリジンなどをこれら反応剤の新規1,3ー脱離反応によって、高選択的に得ることができた。(2)アリルシランおよびその関連化合物を用いる立体、位置選択的合成反応をみつけた。2,2′ービアリルジラジカル、2,2′ービアリル双性イオン等価体や、新しい1,3ージエンを合成し、縮合多環式化合物を高選択的に得ることに成功した。(3)高いルイス酸性と高い求極性を併せもつ複合反応剤としてのヒドリドシリコナート、アリルシリコナートなど新規5配位有機ケイ素化合物を合成することに成功し、これらを用いる、高立体、位置、官能基選択的反応の数々を見つけた。1.新規アゾメチンイリドおよび関連する1,3-双極子試薬の生成と〔3+2〕環化付加反応。(1)ピロリジン誘導体および反応中間体の検証を行った。先ず、講造式La,Lbで表わされるフェニル基についての位置異性体を各々合成することに成功し、アクリル酸メチル存在下、【Me_3】SiOTfや【Cl_3】CC【O_2】Hを触媒として反応すると位置および立体選択的な〔3+2〕環化付加反応が起り、La,Lbから同じ異性体比の2-フェニル-3-メトキシカルボニルピロリジンが混合物として得られた。この事実は前駆体La,Lbが中間体として共通の1,3-双極子試薬であるアゾメチンイリドを生成していることを強く示唆している。(2)母体チオカルボニルイソド等価体としてのシリルメチル,クロロメチル,スルフィド(2)の合成と反応。先ず化合物【2!】がシリルメチオールとトリオキサンの混合物にHclを吹き込むことにより容易に高収率で得られることを見出した。【2!】を種々のアルケンとCsF存在下室温で反応すると対応する〔3+2〕環化付加主成物であるテトラヒドロチオフェン誘導体が高収率でしかも立体特異的に得られた。明らかに【2!】は新しい母体チオカルボニルイリドの合成等価体となっている。2. 2,2 ́-ビアリルジラジカル等価体としての2-シリルメチル-3-アミノメチル-1,3-ブタジエン(【3!】)の新規合成法の開発と環化付加反応による多環状化合物合成を行った。

2,3-ジブロモプロペンを共通の前駆体として得られるβ-ブロモアリルアミンおよびβ-ブロモアリルシランのGrignardクロスカップリング反応により【3!】を得、この試薬が2,2 ́-ビアリルジラジカル等価体として働く、有機合成上有用な試薬であることを見出した。有機ケイ素化合物を他の方法によっては得難い種々の反応活性中間体の合成等価体としてみなせる反応剤としてデザインし,その合成法を見出すとともに,これら反応剤を用いて第4B族金属有機化合物の反応として興味のあるl,nー脱離反応が関与した有用な新しい環化付加反応を明らかにし,合成化学的に重要な環状化合物を得る方法を確立することを目的として,本年度は以下の結果を得た.1, 3ーアルキル置換イソプレニルシラン誘導体の合成2ージメチルアミノメチルー3ートリメチルシリルメチルー1,3ーブタジエンから誘導できるアンモニウム塩に対して銅塩触媒存在下,アルキルグリニヤール試薬を作用させると高収率で対応用する3ーアルキル置換イソプレニルシランを与えることを見出した.2.上記反応の原料となる1,3ージエンは2,2′ービアリルジラジカルシントンとして仂き,〔6.6〕および〔6.7〕員環化合物を収率よく与える.とくに置換1,2ージメチレンシクロヘキサンの効率的な合成法を提供するなど,本試薬は合成化学的に重要な反応剤となる.3.さらに,本反応剤は分子内にアリルシラン骨格を含むと同時にアリルアミン〓を求電子部分として作用させることが可能であるため, 2,2′ービアリル両性イオン等価体としても働く興味ある反応剤となることが見出された.本反応を利用することにより,新しい型の環状化合物を合成することが可能となる.このように本反応剤は段階的な環化付加反応の繰返しにより,縮合多環状化合物の短段階合成法として極めて優れた反応剤であることが見出された.アントラサイクリノン系抗生物質の合成にも応用できる.有機ケイ素化合物を他の方法によっては得難い種々の反応活性中間体の合成等価体としてみなせる反応剤としてデザインし、その合成法を見つけるとともに、これら反応剤を用いて、第4B族金属元素有機化合物の反応として興味のある新規反応をいくつか見出した。とくにl,n-脱離反応を新しく見出すことを目的として以下の研究を行ない、また、複分系反応剤としての5配位シリコナートの関与する反応を研究し、いくつかの成果を得た。1.クロロメチル(トリメチルシリルメチル)スルフィドを反応剤とする新しい〔3+2〕環化付加反応。標題化合物をトリメチル.シリルメチルメルカプタン、トリオキサン、塩化水素ガスから容易に合成できることを明らかにした。本反応剤は、炭素-炭素二重結合を有する化合物に対する環化付加反応を行ない、テトラヒドロチオクエン誘導体を効率的に与える。また、炭素-酸素、炭素-窒素2重結合を有する化合物に対しても、効率的に反応し、各々対応するl,3-オキサチオラン、l,3-チアゾリジン誘導体を与えることを見つけ、種々の複素環化合物合成の高選択的な反応剤となることを明らかにした。形式的なチオカルボニルイリド等価体となる。2.アリールチオメチルトリメチルシランの合成と反応。生理活性物質の合成のために必要なアリールチオメチル化反応剤として、本反応剤が有用であることを見つけた。フッ化物イオンによる活性化による金属フリーのアリールチオカルパニオン種が生成し、カルボニル化合物に効率的に付加し、β-アリールチオエタノール誘導体を与えた。3.アリルシリコナートとカルボニル化合物の反応が6員環状遷移状態を経て進行することを、光学活性体を用いた研究により明らかにした。
新規光学技術によるシナプス構造可塑性を担う分子構造の解明

シナプスでは構造的LTP(sLTP)を起こした後、Cofilinがその維持に重要であると考えられている。近傍のタンパク質を不活化できるSuperNova(SN)とCofilinの融合蛋白質(CFL-SN)によってCofilinを不活化すると、sLTP誘導後にスパインが縮小し、sLTPが特異的に解除されることを見出した。sLTPを起こしていないシナプスやsLTP後50分以上経過したシナプスには影響はなかった。またsLTP誘導前にCALIを起こしてもsLTPは阻害されなかった。スライスを用いた以上の結果から、本年度は上記の手法をマウスの脳内に応用することによって、LTP後のシナプスでのみ光によってLTPを解除する手法を開発した。CofilinをCre依存的に発現させるため、CFL-SNをfloxで発現制御可能なアデノ随伴ウイルス(AAV)を作成し、CaMKII-Creのマウスの両側海馬CA1領域にインジェクションし、CFL-SNを神経細胞特異的に発現させた。次に光を海馬CA1に照射するための光ファイバーのカニューレを両側背側海馬直上に装着した。記憶を検討するための学習課題は、比較的短時間で行えるInhibitory Avoidance Test(IA)を用いた。マウスに麻酔をかけてレーザーと接続し、その後30分間回復させてからIAテストを行った。ホームケージに戻してから2分後に559nm照射をした結果、光を照射しなかった場合に比べて、暗箱へ入るまでの遅延が抑制された。さらに、光照射を行動実験の1分前に行っても記憶への影響は見られなった。この結果は、CALIがLTP後のスパインのみに影響することを示唆している。以上、本年度はこれまでのスライス実験結果に基づき、一度成立したLTPを光学的に解除する方法の開発に成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。Cofilinがシナプスの可塑性にどのように寄与しているかを研究するにあたり、最終的にはマウスの行動レベルでの解析が必要となってくる。つまり、分子レベルでのcofilinの動態が、どのようにシナプス可塑性、記憶の分子メカニズムを構成し、その結果マウスのどのような行動に寄与するかを検討する必要があるaをまた、FRETを用いることで、in vitro, in vivo両方の実験系で多様な分子の活性の動態を調べることができる。したがって本課題を進めるにあたって、まず1年目である今年度はマウスの脳におけるFRET in vivo imagingの系を立ち上げた。行動制御に関与すると考えられる背側線条体に着目した。メインの出力細胞であるMedium Spiny NeuronはD1, D2受容体を介してドーパミンの影響を受ける。PKAはドーパミンを反映し、ERKは細胞の最終的な転写翻訳を反映していると思われるので、この2つの分子をin vivoで動いているマウスの脳内で観察する系を立ち上げた。まず、Creシステムを用いてPKAとERKのFRETバイオセンサーを背側線条体特異的に発現するマウスを開発した。次に、fiber状の内視顕微鏡を脳内に埋め込むことによって、覚醒下のマウスの線条体におけるPKAとERKのin vivoイメージングをすることに成功した。その結果、D1細胞ではコカイン投与によるhyperlocomotionの際にはPKAとERKの活性化が見られ、電気刺激による運動の際にはPKAとERKの不活性化が見られた。一方D2細胞ではPKAとERKにおいて逆の反応が見られた。以上から、報酬、忌避に関する運動の際、D1とD2では反対方向にPKAとERKが制御されていることがわかった。今後はこの系を、cofilinのvivoでの可塑性への寄与を検討するために用いる。昨年度はsLTP誘導に伴うspine頭底部でのCofilinの集積の意義を検討した。光照射によってCofilinを不活化することが可能であるCofilin-KillerRed (CFL-KR)を用いて、sLTP誘導後に集積したCofilinを不活化した後にspineの形態維持(sLTP)にどのような影響がでるかを検討した。sLTP誘導10分後に光照射によってCofilinを不活化すると、LTPによって拡大したspineの縮小が観察された。一方、LTPを誘導していないspineでCofilnを不活化してもspineの形態に変化は見られなかった。このことから、sLTPの形態維持にはCofilinが重要であうことが明らかとなった。さらにsLTPによって集積したCofilinの機能を検討するため、PAGFPーactinを用いて、spineにおけるactinのターンオーバーを検討した。sLTPを誘導していないspineでPAGFP-actinの光活性を行うと、PAGFP-actinは360秒以内でspine外に流出する。sLTPを誘導したspineでPAGFP-actinの光活性を行うと、光活性化されたPAGFP-actinが10分以上spine内にとどまった。さらにsLTP誘導後にCofilinを不活化すると、PAGFP-actinのターンオーバーが早くなった。このことから、集積したCofilinはactinのターンオーバーを遅くすることでspineの拡大とその維持に関与していることが示唆された。

近傍のタンパク質を不活化できるSuperNova(SN)とCofilinの融合蛋白質(CFL-SN)によってCofilinを不活化すると、sLTP誘導後にスパインが縮小し、sLTPが特異的に解除されることを見出した。sLTPを起こしていないシナプスやsLTP後50分以上経過したシナプスには影響はなかった。またsLTP誘導前にCALIを起こしてもsLTPは阻害されなかった。スライスを用いた以上の結果から、本年度は上記の手法をマウスの脳内に応用することによって、LTP後のシナプスでのみ光によってLTPを解除する手法を開発した。CofilinをCre依存的に発現させるため、CFL-SNをfloxで発現制御可能なアデノ随伴ウイルス(AAV)を作成し、CaMKII-Creのマウスの両側海馬CA1領域にインジェクションし、CFL-SNを神経細胞特異的に発現させた。次に光を海馬CA1に照射するための光ファイバーのカニューレを両側背側海馬直上に装着した。記憶を検討するための学習課題は、比較的短時間で行えるInhibitory Avoidance Test(IA)を用いた。マウスに麻酔をかけてレーザーと接続し、その後30分間回復させてからIAテストを行った。ホームケージに戻してから2分後に559nm照射をした結果、光を照射しなかった場合に比べて、暗箱へ入るまでの遅延が抑制された。さらに、光照射を行動実験の1分前に行っても記憶への影響は見られなった。この結果は、CALIがLTP後のスパインのみに影響することを示唆している。以上、本年度はこれまでのスライス実験結果に基づき、一度成立したLTPを光学的に解除する方法の開発に成功した。また、PAGFP-actinを用いたactinのターンオーバーの可視化も実行しており、Cofilinがactinのターンオーバーを遅くしているという仮定を立証することにも成功している。昨年度予定していた実験はおおむね実行することができており、以上の理由から順調に進展したといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後はCofilinによるsLTPの構造維持の作業仮説をさらに検討する。具体的には超解像度顕微鏡を用いてPALMによるactinの1分子追跡をおこなう。作業仮説が正しければ、LTPの誘導によってactinはの流れは遅くなることが予想される。さらにCFL-KRを発現した培養神経に光を照射してCofilinを不活化した後に、actinの流れが再び早くなるかを検討する。最終的には電気生理を用いて、光照射によってCofilinを不活化することでLTP(EPSP)が抑制できるかを検討する予定である。今年度はin vivoにおける分子活性を検出する系を確率することができた。今後cofilinのviVoでの機能解析を行う上で重要な技術を確率出来た。今年度はvivoでの解析技術を確率できたので、今後は研究計画の予定通りvitroにおけるcofilinの機能解析を行う。具体的にはスライス培養下の海馬錐体細胞にLTPをおこし、その際のcofilinの動態を検討し、さらにはそのメカニズムを検討していく。
カイコガとその近縁種をモデルとした性フェロモン選好性の進化の遺伝子基盤の解明

本研究課題は、性フェロモン交信系のモデル生物として研究が進んでいるカイコガとその近縁種を用いて、フェロモン認識機構の進化の遺伝子基盤を解明することを目的とした。本年度は、単一感覚子記録法により、イチジクカサンのフェロモン受容細胞の応答特性の解析を行い、カイコガとの比較を実施した。単一感覚子記録の結果、イチジクカサンのオス毛状感覚子からは2つの異なる振幅の自発発火が記録されたことから、感覚子内部に2つの受容細胞が存在することが示唆された。カイコガ近縁種のフェロモン成分であるボンビコール(BOL)、ボンビカール(BAL)、ボンビキルアセテート(Bkyl)でそれぞれ刺激を行ったところ、2つの受容細胞はそれぞれBALとBkylに特異的に応答を示した。またBOLにはいずれの受容細胞も応答を示さなかった。カイコガにおいても毛状感覚子内には2つの受容細胞があり、それぞれBALとBOLに特異的に応答し、Bkylには応答を示さない。またBALに特異的なフェロモン受容体はイチジクカサンとカイコガの間で保存されていることから、両種のフェロモン受容系では、BALの受容系は保存されており、もう一方の受容細胞で発現するフェロモン受容体遺伝子が種間で変化し、同時期にフェロモン化合物もBkylからBOLに変化することで両種間のフェロモン交信系の変化が生じた可能性が示唆された。現在、これらの解析結果をまとめた論文の投稿準備を進めている。並行して、前年度までに実施したフェロモン結合タンパク質遺伝子ノックアウトカイコガの解析結果をまとめた原著論文を発表した(Shiota et al., Sci. Rep, 2018)。加えて、カイコガのフェロモン腺に含まれる、BOL幾何異性体(E,E体)のオスカイコガの受容機構に関する原著論文をまとめて投稿した(Fujii, et al., Under review)。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、性フェロモン交信系のモデル生物として研究が進んでいるカイコガとその近縁種を用いて、フェロモン選好性を決定する原因遺伝子を同定する。そして、原因遺伝子の種間での類縁関係の比較解析を行うことで、フェロモン認識機構の進化の遺伝子基盤を解明することを目的とする。本年度は、カイコガ近縁種のフェロモン受容体遺伝子の単離と機能同定を主に行った。なお、実施期間中にカイコガ近縁種の一つであるテンオビシロカサンのメス性フェロモンの化学情報とそれらに対する同種オスの選好性に関する情報を入手した。そこで、テンオビシロカサンを新たに解析の対象種として加えて研究を遂行した。一方で、開始当初に対象種としたウスバクワコについては年度内での生体試料の入手が困難となった。そのため本年度はテンオビシロカサン、イチジクカサンの2種を研究対象とした。まず、テンオビシロカサン、イチジクカサンのオス成虫触角のRNA-seqのデータからフェロモン受容体様遺伝子配列を探索した。その結果、両種においてカイコガのフェロモン受容体BmOR1とBmOR3の相同遺伝子にあたる受容体遺伝子を含む複数種のフェロモン受容体候補遺伝子を見出した。そこで、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いた応答計測により、これらの受容体のリガンド同定を試みた。その結果、イチジクカサンのフェロモン受容体はカイコガの相同遺伝子にあたる受容体とリガンド特異性が一致することが明らかになった。これらの結果から、イチジクカサンとカイコガの間でフェロモン受容体のリガンド選択性が保存されていることが示唆された。一方で、テンオビシロカサンの受容体の機能同定にはいたっておらず次年度引き続き解析を進める予定である。また本研究に関連して、カイコガを中心にガ類の性フェロモン受容・識別機構に関してまとめた総説を発表した。前年度に引き続き、カイコガ近縁種のフェロモン受容体遺伝子の単離と機能同定を主に行った。前年度RNAseqのデータを基に単離したテンオビシロカサン、イチジクカサンのフェロモン受容体候補遺伝子についてアフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いてリガンドの同定を行った。その結果、カイコガの性フェロモン成分であるボンビコールの受容体BmOR1とボンビカールの受容体BmOR3の両種における相同遺伝子がそれぞれボンビコールとボンビカールに選択的に応答を示すことが明らかになった。これらの結果から、この3種の間でフェロモン受容体のリガンド選択性が保存されていることが示唆された。なお、本研究の実施期間において、ゲノム編集技術による遺伝子ノックアウトカイコガの作出が可能となった。この技術を利用して、フェロモン受容体の機能と性行動発現との因果関係を実証することは、本研究の目的であるフェロモン選好性を決定する遺伝子を同定する上できわめて重要であると考えた。

そのため、計画を一部変更し、カイコガのフェロモン受容体BmOR1のノックアウト系統を作出し解析を実施した。その結果、BmOR1ノックアウトカイコガではボンビコールに対する生理応答、行動応答が完全に欠失しており、フェロモン受容体が性フェロモンに対するin vivoでの応答に必須であることが示された。この成果をScientific Reports誌に原著論文として発表した(Sakurai et al., 2015 Sci Rep)。当初の計画では、(1)単一感覚子記録によるフェロモン受容細胞の応答特性の解析および、(2)フェロモン受容体様遺伝子の網羅的機能同定、を並行して進めながら、(1)で確立した計測法をベースとして(3)フェロモン受容細胞-触角葉投射パターンの解析に着手する予定にしていた。単一感覚子記録の計測法の確立に予想以上の時間を要したこと、本研究の目的達成のために、ゲノム編集技術を利用したフェロモン受容体遺伝子のノックアウトカイコガの解析を研究計画に組み入れたことから、当初計画に対する成果としては主に(2)項に関するものとなった。しかしながら、(2)項に関しては順調に成果が得られていること、ノックアウトカイコガの解析から、研究目的の達成に直結するきわめて重要な情報を得られていることから、現在まで概ね順調に研究が進んでいるものと考えている。本研究では、性フェロモン交信系のモデル生物として研究が進んでいるカイコガとその近縁種を用いて、フェロモン選好性を決定する原因遺伝子を同定する。そして、原因遺伝子の種間での類縁関係の比較解析を行うことで、フェロモン認識機構の進化の遺伝子基盤を解明することを目的とする。前年度に引き続き、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を利用して、カイコガ近縁種のフェロモン受容体の機能同定を主に行った。テンオビシロカサン、イチジクカサンのフェロモン受容体候補遺伝子についてリガンドの同定を行った結果、前年度までに同定したボンビコール、ボンビカールの受容体に加えて、新たにボンビキルアセテートに反応を示す受容体を複数見出した。リガンド選択性の詳細な試験から、これらの受容体はボンビカールにも強く応答することが示された。これらの結果から、カイコガ科のフェロモン成分と受容体は必ずしも1対1に対応するわけではなく、単一の成分が複数の受容体の活動の組み合わせにより認識されたり、複数成分が単一の受容体により検出される可能性が示唆された。またこれらの種に加えて、ウスバクワコの触角RNAseqデータを基にフェロモン受容体候補遺伝子の探索を行い、本種においてもカイコガのフェロモン受容体遺伝子と保存性の高い相同遺伝子配列が存在することを見出した。また近年、フェロモン受容体に加えて、フェロモン結合タンパク質(PBP)がフェロモン成分間の識別に関与する可能性が提唱されてきている。そのため、計画を一部変更し、PBPノックアウトカイコガの作出と解析を実施した結果、PBPノックアウトオスの触角ではボンビコール、ボンビカールへの生理応答が同程度に低下していた。これらの結果から、カイコガではPBPが高感度なフェロモン受容には重要であるが、フェロモン成分の識別には関与しないことが示唆された。当初の計画では、(1)単一感覚子記録によるフェロモン受容細胞の応答特性の解析および、(2)フェロモン受容体様遺伝子の網羅的機能同定、(3)フェロモン受容細胞-触角葉投射パターンを進めながら(4)フェロモン選好性の変異をもたらすステップの特定に着手する予定にしていた。
流動沸騰定常・過渡限界熱流束に関する研究

円管発熱体を用い種々の速度で変化する指数関数状発熱率を与え、円管内径、肉厚、有効長さ、流速、系圧力およびサブクール度を変え、管内流動沸騰定常・過渡CHFを系統的に求めた。流動沸騰定常・過渡CHF表示式を提案した。さらに、管内における高流速水流動沸騰において、流動沸騰開始条件を系統的に求め、新たにウェーブレット等の音響解析手法を導入することにより、沸騰開始条件を特定して、沸騰開始条件の実験相関式を提案した。1直流安定化電源の新規購入:既設の水強制流動沸騰実験装置を用いて,種々の速さの指数関数状発熱率を与え、高流速水流動沸騰定常・非定常CHF(限界熱流束)実験を行った。水を用いたジュール発熱による流動沸騰実験を少しでも広範囲に行うために、既存の直流安定化電源設備に加え、35V-300Aの直流安定化電源を新規購入した。2プール沸騰熱伝達および限界熱流束実験:流動沸騰熱伝達及び流動沸騰限界熱流束との比較検討のために、プール水中リボン発熱体による実験を行った。3円管内水流動非沸騰定常実験及び過渡実験:当初は、円管発熱体を用いて、20m/sを超える高流速水流動非沸騰実験を予定していたが、内径3mm以下の細管を使用したため、圧力損失は予想以上に大きく、また、電源容量の不足から、実用的な10m/s程度の低流速で実験を行った。純水が円管内を流動する場合において、準定常的に非常にゆっくりした速度で上昇する発熱率から、急激な速度で上昇する発熱率まで、種々の速度で変化する指数関数状発熱率を与え、発熱体直径、流速及びサブクール度を変えて、非沸騰強制流動熱伝達特性を求めた。4円管内水流動沸騰定常実験及び過渡CHF実験:純水が円管内を流動する場合において、準定常的に非常にゆっくりした速度で上昇する発熱率から、急激な速度で上昇する発熱率まで、種々の速度で変化する指数関数状発熱率を与え、発熱体直径、流速及びサブクール度を変えて、強制流動沸騰下の定常・過渡沸騰熱伝達特性及び定常・過渡限界熱流束を実験的に求めた。5FC-72を用いた円管内流動非沸騰定常実験:流体の相違による影響を検討するために、フロリナートFC-72が円管内を流動する場合において、準定常的に非常にゆっくりした速度で上昇する指数関数状発熱率を与え、発熱体直径、有効長さ、流速、系圧力及びサブクール度を変えて、定常非沸騰強制流動熱伝達特性を求めた。当初は、円管発熱体を用いて、20m/sを超える高流速水流動非沸騰実験を予定していた。その目的で、電源容量を大きくしたが、試験発熱体として内径3mm程度以下の細管を使用したため、圧力損失増大による水流量低下は予想以上に大きかった。そのため、循環ポンプの最大性能を発揮できかつ既存データも少なく、また実用的な流速である10m/s程度で流動沸騰実験を行った。その結果、おおむね順調に進展している。1高流速水管内流動沸騰定常・過渡CHFの実験的研究当初研究計画で予定した20m/s程度の高流速実験は、電源容量の不足により実施できなかったので、既存データが少ない10m/s程度の実用的な流速で、管内流動沸騰定常・過渡CHFの実験研究を行った。平成27年度に実施できなかった条件を中心に、純水を用い、種々の速度で変化する指数関数状発熱率を与え、円管内径、肉厚、有効長さ、流速、系圧力およびサブクール度を変え、管内流動沸騰定常・過渡CHFを系統的に求めた。円管内径は、1及び2mmの細管を使用して行った。平成27年度と同様、既設の加圧器を用い、確度の高い定常・過渡限界熱流束を求めた。2管内内流動沸騰開始条件の解明に関する実験的研究管内における水流動沸騰において、沸騰開始の現象を解明することは、非沸騰状態から沸騰状態に遷移する条件を明らかにすることができる。円管発熱体直径、有効長さ、系圧力およびサブクール度を変え、流動沸騰開始条件を系統的に求めた。純水中において、種々の速度で変化する指数関数状発熱率を与えて、沸騰開始条件を決定するために、赤外線放射温度計で円管表面温度を観測しながら得られた動画の画像処理のみならず、高性能マイクロフォン音響装置によって得られた音響データを分析しているところである。新たに音響解析手法を導入し現象の解明を行っている。3管内流動沸騰定常CHFに関する非線形現象実験データの再構築を行い、非沸騰熱伝達相関表示式及び定常・過渡限界熱流束(CHF)に関する実験相関式を作成し提案した。4大気圧以下の減圧下フロリナートFC-72中の円柱における定常・過渡プール沸騰熱伝達及び定常・過渡沸騰限界熱流束及び円管内管内流動非沸騰定常及び過渡熱伝達現象の解明を行い、実験相関式を作成し、提案した。当初計画では、28年度までに、3mm程度以下の円管発熱体を用いて、20m/sを超える高流速水流動非沸騰及び沸騰実験を予定していた。しかしながら、加熱用直流電源容量の不足により実施できなかった。そこで、既存データもなく、また実用的な流速である10m/s程度での伝熱流動沸騰実験を行った。さらに、液体をフロリナートFC-72を用いた流動非沸騰熱伝達の比較実験も行い、異なる流体での比較もでき、おおむね順調に進展している。

なお,29年度は、内径1mm以下の細管において、20m/sを超える高流速で伝熱流動沸騰実験ができる見込みがついている。1高流速水管内流動沸騰定常及び過渡限界熱流束(CHF)の実験的研究当初研究計画で予定した高流速実験は、加熱電源容量の不足のため実施できなかったので、既存データが少ない10m/s程度までの実用的な流速、さらに、できるだけ高サブクール入口条件で管内流動沸騰定常及び過渡限界熱流束(CHF)の実験的研究を行った。平成28年度に実施できなかった条件を中心に、純水を用い種々の速度で、円管発熱体に指数関数状に上昇する発熱率を与え、円管内径、肉厚、有効長さ、流速、系圧力及びサブクール度を変え、管内流動定常及び過渡限界熱流束を求めた。2管内流動沸騰の開始条件の解明に関する実験的研究管内における水流動沸騰において、沸騰開始の現象を解明することにより、非沸騰状態から沸騰状態に遷移する条件を明らかにすることができる。円管発熱体直径、有効長さ、系圧力及びサブクール度を変え、流動沸騰開始条件を調べた。純水を用い種々の速度で、円管発熱体に指数関数状に上昇する発熱率を与え、沸騰開始条件を検出するため、赤外線放射温度計で発熱体表面温度をビデオ撮影観測データを得た。同時に高性能マイクロフォン音響装置によって得られた沸騰開始音を含む音響データをウェブレット解析を導入し、沸騰開始を特定した。3フロリナートFC-72の円管内流動定常及び過渡熱伝達の実験的研究フロリナートFC-72を用い種々の速度で、円管発熱体に指数関数状に上昇する発熱率を与え、円管内径、肉厚、有効長さ、流速、系圧力及びサブクール度を変え、管内流動定常及び過渡熱伝達を求め、実験相関式を作成し、提案した。円管発熱体を用い種々の速度で変化する指数関数状発熱率を与え、円管内径、肉厚、有効長さ、流速、系圧力およびサブクール度を変え、管内流動沸騰定常・過渡CHFを系統的に求めた。流動沸騰定常・過渡CHF表示式を提案した。さらに、管内における高流速水流動沸騰において、流動沸騰開始条件を系統的に求め、新たにウェーブレット等の音響解析手法を導入することにより、沸騰開始条件を特定して、沸騰開始条件の実験相関式を提案した。引き続き、1プール沸騰熱伝達および限界熱流束実験:流動沸騰熱伝達及び流動沸騰限界熱流束との比較検討のために、プール水中に水平にして縦に置かれたリボン発熱体による沸騰限界熱流束実験を行う。2円管内水流動非沸騰定常実験及び過渡実験:円管発熱体を用いて、内径1mm程度の細管を使用した10m/sの低流速で実験を行いデータを集積する。純水が円管内を流動する場合において、準定常的に非常にゆっくりした速度で上昇する発熱率から、急激な速度で上昇する発熱率まで、種々の速度で変化する指数関数状発熱率を与え、発熱体直径、有効長さ、流速、系圧力及びサブクール度を変えて、非沸騰強制流動熱伝達率を実験的に求める。3円管内水流動沸騰定常実験及び過渡CHF実験:純水が円管内を流動する場合において、準定常的に非常にゆっくりした速度で上昇する発熱率から、急激な速度で上昇する発熱率まで、種々の速度で変化する指数関数状発熱率を与え、発熱体直径、有効長さ、流速、系圧力及びサブクール度を変えて、強制流動沸騰下の定常・過渡沸騰熱伝達率及び定常・過渡CHF(限界熱流束)を実験的に求める。平成29年度は、最終年度となる。1高流速水管内流動沸騰定常・過渡CHFの実験的研究:平成27年度及び28年度に実施できなかった実験条件を中心に、純水を用い、種々の速度で変化する指数関数状発熱率を与え、管内流動沸騰定常・
プロテインチップとプロテオーム技術を用いた新自己抗体の網羅的探索

膠原病各疾患の患者血清中には、その疾患特有な自己抗体群が検出されることがある。この自己抗体を簡便に検出するために光固相化法を用いて、自己抗原プロテインチップを作成した。その結果、同じ自己抗原を用いれば、従来法と同程度の感度で、自己抗体を検出できることを確認した。一方、自己抗体によって認識されるペプチドエピトープは各疾患患者の特定の症状に関連性が高いことがある。そこで、症状・疾患特異的なペプチドを見つけることは、予後をある程度予測することや診断・治療に役立つと考えられる。そのため、光固相化法によるプロテインチップ技術を応用しタンパクの代わりにペプチドを固相化してチップを作成し、自己抗原のepitope mappingの開発を試みた。しかしながら、タンパクの代わりに自己抗原のcommon epitopepeptideをチップ上に固相化して患者血清と反応させたところ、反応性が低かった。この原因が光固相化法を用いたことであるかどうかを確かめるために、使用したペプチドと患者血清の反応性を、従来の研究報告で陽性血清を確認することができたとされているELISA法を用いて確認した。方法は、光固相化チップの実験に用いたペプチドと患者血清を用い、抗原も同じものをプレートにコーティングし、あらかじめU1RNPタンパク抗原に対して陽性が確認されている患者血清と反応させた。その結果、少なくともU1RNP Cペプチドに関してはチップを用いた実験では陰性だった血清の一部がELISAでは陽性を示した。これらの結果から、今回用いた患者血清はU1RNP Cpeptideの配列を認識する自己抗体を含んでいると確認できた。したがって、光固相化法ではタンパクの代わりにペプチドを固相化することが、困難であると考えられた。光固相化法は、タンパクを固相原とする限りは、従来法に勝る簡便性をもった自己抗体検出検査法になると考えられる膠原病各疾患の患者血清中には、その疾患特有な自己抗体群が検出されることがある。光固相化法は、タンパクを固相原とする限りは、従来法に勝る簡便性をもった自己抗体検出検査法になると考えられる
重金属カドミウムがグルタチオン代謝と蛋白誘導合成に及ぼす影響に関する研究

1.カドミウム(Cd)とグルタチオン(GSH)複合体の形成Cdと還元型GSHを1:1、1:2または1:3の濃度比に50mM TrisーHC1,pH7.4緩衝液に溶かし室温に一夜放置した。その結果、形成されたCdーGSH複合体を5DiolーCosmosilカラム(7.5x300mm)を装着したFPLC装置を用い、上記の緩衝液で展開して分離を試みた。複合体は極めて分離不十分な複数ピ-クとして溶離された。次に複合体分離にイオン交換樹脂カラム、mono Qおよびmono Sカラムを用いたが、やはり分離不十分な複数ピ-クとして溶離された。この様にCdとGSHが一定比率の複合体の分離は果たせなかった。そこでCdとGSHを1:1の比率で含むが、Cdに対するGSHの比率が異なる種々のCdーGSH複合体混合物溶液として以下に示す如く気管内注入実験を行った。2.上記緩衝液に0.82mMずつのCdとGSHを含むCd・GSH混液を室温で一夜放置後、その0.5mlを体重約300gの一群の雄ラット気管内にネンブタ-ル麻酔下で注入した。他の一群のラットには同濃度のCdのみ含む溶液を注入した。注入後0,6,12,30及び48時間に麻酔し、生食水で肺を潅流して剔出。Cd注入群の肺は出血性炎症が強く、時間とともに増悪した。一方CdーGSH複合体注入群では炎症所見はCd注入群に比べやや軽度にみえた。肺のGSHはCd投与群では、6時間後に有意に減少し、その後48時間以内に回復しなかった。然しCdーGSH複合体投与群では一定した減少を認めず、目下その再現性を確認する実験を継続中である。またメタロチオネインの誘導時間に関して、Cd投与群とCdーGSH投与群間の異同を確認すべく実験中である。
腸管免疫系を構成するTリンパ球のシングルセル解析への挑戦

従来の免疫担当細胞のFACSや定量PCRによる解析手法では,集団の「傾向」を見るにとどまり,詳細なクローン組成や個々の細胞における定量情報は皆無であった.本研究では,DNAバーコード法を改良・発展させ,T細胞受容体ペアのハイスループットかつバイアスのない検出を行う方法の確立を試みた.本手法により,免疫がダイナミックに活性化されている大腸炎モデルにおいて,腸管浸潤T細胞のTCRレパトア解析を実施した.バーネットのクローン選択説以来,免疫現象は特定クローンを有するリンパ球の選択によって起こりうる現象であることが共通認識となっている.その一方で,これまでの免疫学的解析手法では,マス(全体)としてポピュレーションを解析することで,集団の「傾向」を見るにとどまり,クローン組成や1細胞での定量情報は得られない.申請グループでは本手法を応用することで,リンパ球のTCRペア情報を,個別に,バイアスなく,そしてハイスループットに検出することが可能にできると考えている.クローンを個々のレベルで「観る」ことで,マスとして同じに見える2つの集団から全く異なる性質を読み取ることが可能と考えられる.そこで本研究では,TCRペア情報を取得可能なシングルセル解析手法の確立を行った.具体的には,マウスよりT細胞集団を取得した後,個々の細胞をチップ上のウェル内に封入し,一細胞からTCRαとTCRβの増幅を試みた.その際に、新規ワンステップRT-TS-PCR法の開発に取り組み成功した.合成RNAやTCRβを安定して増幅できるようになり,TCRαの増幅,αとβの同時増幅も可能となった.本手法を用いて,恒常的に免疫応答が誘導され,ダイナミックに制御されている腸管免疫系におけるT細胞のクローン解析を実施した.すなわち、腸管由来のリンパ球のうち、エフェクターメモリーT細胞をフローサイトメーターにより分取し,シングルセル解析を実施した.その結果,エフェクターメモリーT細胞今回解析した複数のクローンでは,かなり偏ったTCR構成が認められることが判明した.従来の免疫担当細胞のFACSや定量PCRによる解析手法では,集団の「傾向」を見るにとどまり,詳細なクローン組成や個々の細胞における定量情報は皆無であった.本研究では,DNAバーコード法を改良・発展させ,T細胞受容体ペアのハイスループットかつバイアスのない検出を行う方法の確立を試みた.本手法により,免疫がダイナミックに活性化されている大腸炎モデルにおいて,腸管浸潤T細胞のTCRレパトア解析を実施した.免疫学
加齢による疼痛受容機構の変調

加齢による口腔内疼痛受容機構の変調の解明を目的として,老齢促進モデルマウス(SAMP8雄性マウス20週齢,以下P8)及び老齢促進モデルマウスに対するコントロールマウス(SAMR1雄性マウス20週齢,以下R1)を用い,左側上顎口蓋部歯槽粘膜への規定した切開による炎症誘発後の,延髄における三叉神経脊髄路角尾側亜核(Vc)の二次ニューロンの興奮性に対する,加齢変化が与える変調機構をミクログリアとミクログリアから放出されるサイトカインに着目し,コントロールマウスと比較して解析した。行動観察実験の結果,P8切開群は切開後1日目以降21日目まで,R1切開群は1日目から7日目まで機械痛覚過敏の発症を認め,切開後3日目以降のP8切開群は,R1切開群と比較しても機械痛覚過敏の増強と持続を認めた.免疫組織化学的解析の結果,切開後3日目と11日目において,P8切開群はR1切開群よりもミクログリアの活性化が有意に増強し,ミクログリアのうち傷害性ミクログリア(M1)の発現は3日目と11日目において,P8切開群はR1切開群R1非切開群と比較して有意な増強を認めた.またミクログリアのうち保護性ミクログリアである(M2)の発現は,切開後3日目においてP8切開群はR1非切開群と比較して有意な増強を認めたが,11日目ではR1切開群と比較して有意な減弱を認めた.以上より,口腔内に発症した機械痛覚過敏は,加齢により増強と持続する事が明らかとなり,VcにおけるM1の活性化増強とM2の活性化減弱が関与している可能性が示された.加齢が口腔内疼痛受容機構に与える影響の解明を目指して研究を行う上で,初年度では,1口腔粘膜損傷モデルマウスの作成及び機械痛覚過敏発症の確認と,2機械痛覚過敏発症時の,損傷部を支配するVcでの,加齢変化が及ぼすミクログリアの発現およびIL-1βの量に対する影響解析を予定していた。1に関しては,口腔粘膜切開により発症した機械痛覚過敏が加齢によって増強及び持続するというデータを得,順調に遂行された。2に関しては,加齢により活性化ミクログリアの発現が増加するという結果を得,また興味深いことに傷害性ミクログリア(M1)及び保護性ミクログリア(M2)が加齢によりコントロール群とは異なる特徴的な発現変化を示すという結果を得たことは,予想を上回る大きなデータと考えている。しかしながら,ミクログリアから放出されるIL-1βの解析に関しては,解析で困難を示した。よって,うまくいかない時の対応として想定していたTNF-αに現在ターゲットを移し,解析を進めていることから,総合的に判断し上記区分とした。今後の研究では当初の計画に従い,1ミクログリアから放出されるTNF-α発現量に対する加齢変化が及ぼす影響を免疫組織化学的解析によって明らかにする。この結果とこれまでの結果とを合わせることで,ミクログリアおよびTNF-αおよび口腔内機械痛覚過敏発症時の動態の明確化が可能になると考えている。2ミクログリアM1,M2,あるいはTNF-α阻害剤の髄腔内持続投与を行った上での行動薬理学的解析および免疫組織化学的解析を行う。この結果により,ミクログリアのM1,M2およびTNF-αによる口腔内損傷後の機械痛覚過敏発症に対する関与が明確になるとともに,コントロールラットと比較検討することで,加齢変化が口腔内疼痛受容機構へ及ぼす影響が明らかになると考えており,以上を今後の研究の推進方策とする。行動観察実験の結果,P8切開群は切開後1日目以降21日目まで,R1切開群は1日目から7日目まで機械痛覚過敏の発症を認め,切開後3日目以降のP8切開群は,R1切開群と比較しても機械痛覚過敏の増強と持続を認めた.免疫組織化学的解析の結果,切開後3日目と11日目において,P8切開群はR1切開群よりもミクログリアの活性化が有意に増強し,ミクログリアのうち傷害性ミクログリア(M1)の発現は3日目と11日目において,P8切開群はR1切開群R1非切開群と比較して有意な増強を認めた.またミクログリアのうち保護性ミクログリアである(M2)の発現は,切開後3日目においてP8切開群はR1非切開群と比較して有意な増強を認めたが,11日目ではR1切開群と比較して有意な減弱を認めた.以上より,口腔内に発症した機械痛覚過敏は,加齢により増強と持続する事が明らかとなり,VcにおけるM1の活性化増強とM2の活性化減弱が関与している可能性が示された.加齢が口腔内

疼痛受容機構に与える影響の解明を目指して研究を行う上で,初年度では,1口腔粘膜損傷モデルマウスの作成及び機械痛覚過敏発症の確認と,2機械痛覚過敏発症時の,損傷部を支配するVcでの,加齢変化が及ぼすミクログリアの発現およびIL-1βの量に対する影響解析を予定していた。1に関しては,口腔粘膜切開により発症した機械痛覚過敏が加齢によって増強及び持続するというデータを得,順調に遂行された。2に関しては,加齢により活性化ミクログリアの発現が増加するという結果を得,また興味深いことに傷害性ミクログリア(M1)及び保護性ミクログリア(M2)が加齢によりコントロール群とは異なる特徴的な発現変化を示すという結果を得たことは,予想を上回る大きなデータと考えている。しかしながら,ミクログリアから放出されるIL-1βの解析に関しては,解析で困難を示した。よって,うまくいかない時の対応として想定していたTNF-αに現在ターゲットを移し,解析を進めていることから,総合的に判断し上記区分とした。今後の研究では当初の計画に従い,1ミクログリアから放出されるTNF-α発現量に対する加齢変化が及ぼす影響を免疫組織化学的解析によって明らかにする。この結果とこれまでの結果とを合わせることで,ミクログリアおよびTNF-αおよび口腔内機械痛覚過敏発症時の動態の明確化が可能になると考えている。2ミクログリアM1,M2,あるいはTNF-α阻害剤の髄腔内持続投与を行った上での行動薬理学的解析および免疫組織化学的解析を行う。この結果により,ミクログリアのM1,M2およびTNF-αによる口腔内損傷後の機械痛覚過敏発症に対する関与が明確になるとともに,コントロールラットと比較検討することで,加齢変化が口腔内疼痛受容機構へ及ぼす影響が明らかになると考えており,以上を今後の研究の推進方策とする。
遺伝子組換えフローラ大腸菌含有ハードカプセルを用いた漫性大腸炎に対する治療戦略

我々のグループではこれまでにヒト炎症性腸疾患やマウス慢性腸炎モデルにおいて、慢性炎症の発症・持続のメカニズムを解明し、種々のサイトカインや抗体、増殖因子を用いた新しい治療法を開発してきた。しかし、これらの治療法の臨床応用を考えた場合、遺伝子組換え蛋白を用いるため非常に高価であること、また蛋白を活性を保ったまま病変局所へdeliverする有効な投与法が問題となっている。今回の研究は、生体に毒性のない腸管フローラ大腸菌を用いて、目的とする遺伝子組み換え蛋白を腸管内で産生させ、この遺伝子組換え蛋白産生大腸菌を大腸内で腸内細菌により崩壊するキトサン系ハードカプセルに含有することにより、大腸菌が胃・十二指腸内で分解されることなく大腸粘膜に高濃度の生理活性物質を作用させるという全く新しいdrug deliverysystemを用いて、腸疾患に対する独創的かつ安全性の高い治療法の開発を試みた。プロトタイプとして我々が明らかとした慢性大腸炎に対するIL-7投与の有効性にもとづき、まず、ジフテリア毒素を結合させたIL-7(DAB3891L-7)を開発し、TCRαノックアウトマウスにおける慢性大腸炎に対する治療効果の検討を開始した。これまでに遺伝子工学的にDAB389IL-7の発現ベクターを合成し、大腸菌に発現させ、DAB389IL-7蛋白を精製する技術の開発に成功し、in vitroにおいてIL-7レセプター陽性細胞に対してアポトーシス誘導効果を確認した。マウスに経胃管的に投与可能な小型のハードカプセルの開発を進めているものの、技術的にかなり困難である。現在、このDAB389IL-7蛋白発現組換え大腸菌をTCRαノックアウトマウスに対して経口投与し、慢性大腸炎に対する治療効果を検討しており、今後、ヒト炎症性腸疾患治療に新しい道が開けると期待される。