hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光通信用広帯域光素子の構成法に関する研究

本研究の目的は光導波路間の結合現象を利用した,広帯域な光通信用光素子の構成法をその作製法も含めて確立する事にあった。この研究課題に対して,まず,これまでに提案してきたTapered Velocity Coupler(TVC)を利用した任意比光分配器および偏波分離器の構成法の再検討を行った。すなわち,数値シミュレーションによって任意比光分配器の分配比拡大および偏波分離器のより実用的な三次元解析モデルによる特性評価を試みた。その結果,任意比光分配器では,素子形状および電極配置を変更することで,分配比の変化範囲を大幅に拡大できることを明らかにした。また,偏波分離器の三次元解析では,矩形の横断面形状を有するチャネル光導波路からなる偏波分離器を設計し,その特性を差分法による数値計算により求めることで,これまで二次元スラブモデルで取り扱った場合と同様に広帯域で効率の高い偏波分離特性を構成できることを示した。なお,これらの研究成果は口頭発表を行うとともに任意比光分配器の分配比拡大に関しては学術論文誌に投稿・掲載されている。さらに,実用的な多機能光素子の設計・作製のためには,試作条件とチャネル光導波路の構造パラメータの関係を明らかにすることが大変重要となる。そこで,ガラス基板を用いたイオン交換法によるスラブ光導波路およびチャネル光導波路の試作実験によりその基礎データを着実に蓄積している。そして,三線結合系からなる結合型光分配器を実際に作製し,その特性評価にも着手している。これらの実験結果についても口頭発表を行い,大学紀要にその基礎データを掲載している。ただ,現段階では試作導波路の基板にはガラスを用いているが異方性結晶のLiNbO_3を用いた試作実験も環境が整い次第行っていく予定である。また,多機能光素子で重要な外部電界印加用電極の最適形成法についても今後早急に取り組む必要があると考えられる。
職業性ストレスの個人差理解と介入的アプローチに関する研究

本研究では,職業性ストレスモデルとして代表的な「仕事の要求度-コントロール-サポートモデル」と「努力-報酬不均衡モデル」の2つを取り上げ,1)職業性ストレスが健康に及ぼす影響の個人差とそのメカニズムを,対処行動に注目して明らかにすること,2)職場環境と個人の双方を考慮したストレス対処プログラムを開発し,その効果評価を行うこと,の2点を目的とした.本年度は以下の4点に関する検討を行った.1.文献レビュー職業性ストレスモデルのうち,特に「仕事の要求度-コントロール-サポートモデル」に注目し,同モデルのメカニズムとその個人差要因についての文献を収集した.2.実証研究「仕事の要求度-コントロール-サポートモデル」の個人差要因の1つとしてストレス対処方法に注目し,精神的健康状態,職務満足感,仕事のパフォーマンスとの関連について縦断データを用いて検討した.3.eラーニングを用いた介入従業員のストレス対処能力の向上を目的に開発されたeラーニング教材を用いて無作為化対照試験を行い,教材の学習効果を検討した.4.グループワークによる介入従業員のストレス対処能力の向上を目的としたグループワーク形式の研修を行い,無作為化対照試験デザインを用いて,研修効果を検討した.仕事に関する積極的態度を測定するためのUtrecht Work Engagement Scaleを日本語に翻訳し,企業従業員300名のデータを用いて,信頼性と妥当性の検討を行った.本研究では,職業性ストレスモデルとして代表的な「仕事の要求度-コントロール-サポートモデル」と「努力-報酬不均衡モデル」の2つを取り上げ,1)職業性ストレスが健康に及ぼす影響の個人差とそのメカニズムを,対処行動に注目して明らかにすること,2)職場環境と個人の双方を考慮したストレス対処プログラムを開発し,その効果評価を行うこと,の2点を目的とした.本年度は以下の4点に関する検討を行った.1.文献レビュー職業性ストレスモデルのうち,特に「仕事の要求度-コントロール-サポートモデル」に注目し,同モデルのメカニズムとその個人差要因についての文献を収集した.2.実証研究「仕事の要求度-コントロール-サポートモデル」の個人差要因の1つとしてストレス対処方法に注目し,精神的健康状態,職務満足感,仕事のパフォーマンスとの関連について縦断データを用いて検討した.3.eラーニングを用いた介入従業員のストレス対処能力の向上を目的に開発されたeラーニング教材を用いて無作為化対照試験を行い,教材の学習効果を検討した.4.グループワークによる介入従業員のストレス対処能力の向上を目的としたグループワーク形式の研修を行い,無作為化対照試験デザインを用いて,研修効果を検討した.仕事に関する積極的態度を測定するためのUtrecht Work Engagement Scaleを日本語に翻訳し,企業従業員300名のデータを用いて,信頼性と妥当性の検討を行った.
低酸素負荷および一酸化炭素吸入の脳内神経伝達物質放出に及ぼす影響

低酸素負荷および一酸化炭素暴露時の脳内神経伝達物質放出に及ぼす影響をマイクロダイアリーシス法により行った。また、神経細胞障害の程度を組織学的に検討した。前頭皮質に透析カニューレを挿入したwistarラントをプラスチック箱に入れ、95%窒素・5%酸素混合ガス(低酸素負荷)あるいは2000ppmの一酸化炭素を含有した空気(CO負荷)を吸入させた。透析液の回収は15分毎とし、酵素カラムを用いた高速液体クロマトグフフィーにてアセチルコリンおよび各種アミノ酸を測定した。アセチルコリンは、低酸素負荷により30分後で前値に比べ増加傾向を示したが有意ではなかった。CO負荷では、吸入中は前値に比べ有意に高値を示し、吸入後150分以降に再度有意に高値となり、低酸素負荷に比べ大きな変化を示した。グルタミン酸は、低酸素負荷後30分から負荷終了15分まで高値を示すが有意ではなくその後低下した。CO負荷では吸入45分後から上昇し吸入後も高い傾向を維持した。両者の変動には有意差がみられた。グルタミン、アスパラギン、アルギニン、グリシン、アラニン、スレオニンは低酸素負荷では一過性の小さな変動にとどまり、CO負荷では吸入45分後より大きく変動し、これらの変動間には有意差がみられた。GABAは両群とも吸入30分後にピークとなり以後同様に低下した。タウリンは両群とも吸入中低下傾向を示し、この変動には有意差があり低酸素負荷で低下傾向が大きかった。組織学的検討では、海馬CA3、CA4領域で神経細胞の変性が認められたが、海馬CA1領域、大脳皮質では変化がなく、両群に差はみられなかった。C-Fos免疫組織染色では海馬、大脳皮質ともC-Fos陽性細胞は認められなかった。以上より一酸化炭素暴露は低酸素負荷に比べ脳内神経伝達物質放出に与える影響が大きく、低酸素より一酸化炭素による神経細胞障害の方がより大きいことが示唆された。低酸素状態は脳神経細胞にとって最大のストレスであり、低酸素負荷の程度と時間により神経細胞障害の程度が決定される。一方、一酸化炭素は、一酸化炭素ヘモグロビンの形成により組織低酸素症を引き起こすほか、一酸化炭素それ自身の神経細胞障害が加わる。そのため両者を低酸素状態による神経細胞障害と同一視することはできない。本研究では、マイクロダイアリーシス法を用いて低酸素負荷および一酸化炭素暴露時の脳内グルタミン酸、アセチルコリンを測定し、両者の違いを検討した。実験前日、wistarラットにペントバルビタールを腹腔内投与し麻酔し、定位脳固定装置を用いて前頭皮質にガイドカニューレを挿入した。当日、透析カニューレを挿入後プラスチック箱にラットを入れガスの吸入を行った。透析液の回収は20分毎とした。グルタミン酸は、低酸素負荷(95%窒素・5%酸素混合)により20分、40分後で著名に上昇し、60分後にはほぼ前値に戻った。一酸化炭素含有(0.025%)の空気吸入では低酸素負荷と同様の傾向であったが上昇の程度は少なかった。アセチルコリンは、低酸素負荷により20分後で低下したが、40分後にはほぼ前値に回復した。一酸化炭素含有空気吸入では、20分後で低下傾向を示すもののバラツキが大きかった。40分後ではほぼ前値と同様であった。データのバラツキに関して、一酸化炭素吸入により全身痙攣を強く起こすことがあるため、これら行動変化と透析液の回収時期を含めて検討中である。

低酸素状態は脳神経細胞にとって最大のストレスであり、低酸素負荷の程度と時間により神経細胞障害の程度が決定される。一方、一酸化炭素による神経細胞障害は、一酸化炭素ヘモグロビンの形成による組織低酸素状態のほか、一酸化炭素それ自身による細胞障害が加わるため、低酸素負荷による神経細胞障害と同一視することはできない。本研究では、マイクロダイアリーシス法を用いて低酸素負荷および一酸化炭素暴露時の脳内グルタミン酸、アセチルコリンを測定し、両者の違いを検討した。前頭皮質に透析カニューレを挿入したwistarラットをプラスチック箱に入れ、95%窒素・5%酸素混合ガス(低酸素負荷)あるいは2500ppmの一酸化炭素を含有した空気(CO負荷)を吸入させた。透析液の回収は15分毎とし、高速液体クロマトグラフィーにてグルタミン酸およびアセチルコリンを測定した。グルタミン酸は、低酸素負荷により30、45、60分後で前値に比べ有意(P<0.05)に増加し、負荷終了後回復傾向を示すが依然高値を示していた。CO負荷では低酸素負荷と同様の傾向を示したが負荷終了15分後でも有意に増加していた。アセチルコリンは、低酸素負荷により30、45、60分後で前値に比べ有意(P<0.05)に増加し、負荷終了後回復傾向を示すが負荷後3060分で再上昇を認めた。CO負荷では、吸入15、30後に前値に比べ増加傾向を示すが有意ではなく、低酸素負荷と異なった変動を示した。低酸素負荷とCO負荷において、グルタミン酸はほぼ同様の変動を示したが、アセチルコリンでは異なっており、神経細胞に対する両者の障害機序が異なる可能性が示唆された。現在組織学的アプローチを加えて検討中である。
質量分析用高性能標識試薬の開発と生体分子の高感度分析

近年、高速液体クロマトグラフィー(LC)とタンデム型質量分析計(MS/MS)を組み合わせたLC/MS/MSが広く用いられている。そこで、LC/MS/MSにおける検出感度および選択性の向上を目的として、LC/MS/MS用の標識試薬を作製することを目的として研究を行った。また、作製した標識試薬を用いて疾患のマーカーとなる生体分子の高感度な分析法を開発した。本研究で開発した分析法は、先天性代謝異常症のスクリーニング法として有用であった。近年、タンデム型質量分析計(MS/MS)が開発され、HPLCを組み合わせたLC/MS/MS法が、広い分野で用いられるようになっている。本研究は、MS/MS用およびLC/MS/MS用標識試薬として適した構造を見出し、新たな高性能標識試薬を開発することを第一の目的とした。また、得られた標識試薬を用いて、疾患のマーカーとなる生体分子の高感度分析法を開発するとともに、特定の官能基を有する生体分子の網羅的解析法を開発し疾患マーカーの道程に取り組むことを第二の目的とした。LC/MS/MS法に用いる標識試薬は、1)対象分子と速やかに反応する、2)適度な疎水性を有し対象分子を逆相HPLCによる分離に適した構造に変換できる、3)容易にイオン化する構造を有している、4)MS/MS法により特定のプロダクトイオンを選択的に高い収率で生じる、などの条件を満たすことが必要である。これまでに、ベンゾフラザン骨格を有するLC/MS/MS用標識試薬として、DAABD-AE(カルボン基用)、DAABD-ABおよびDAABD-AP(短鎖カルボン酸用)、DAABD-MHz(カルボニル基用)などを開発した。さらに、DAABD-AEを用いて、血漿中極長鎖脂肪酸の高感度分析法を開発し報告した。25年度は、ベンゾフラザン骨格を有するLC/MS/MS用標識試薬であるDAABD-AEを用いて、プロピオン酸血症のマーカー分子であるメチルクエン酸の高感度かつ簡便な分析法を開発し、生体試料の分析に取り組んだ。患者(n=18)およびコントロール(n=370)の濾紙血液試料中のメチルクエン酸を誘導体化しLC/MS/MSで分析した結果、本法が、プロピオン酸血症のスクリーニングに有用であることが示された。平成24年度は、ベンゾフラザン以外の骨格にも着目し、さらに高性能な標識試薬を開発することをめざして研究を行った。文献を調査した結果、構造中に、芳香族スルホンアミド、ヒドラジン、アミド、エステル、ウレア、チオウレアなどの構造を有する化合物は、MS/MS法により容易に開解し、特定のプロダクトイオンを選択的に高い収率で生じることが明らかになった。これらの構造を有する標識試薬を設計し合成中である。また、既に開発したDAABD-AEを用いて、プロピオン酸血症のマーカー分子であるメチルクエン酸の高難度かつ簡便な分析法を開発中である。平成25年度までに、ベンゾフラザン骨格を有するLC/MS/MS用標識試薬として、DAABD-AE(カルボン基用)、DAABD-ABおよびDAABD-AP(短鎖カルボン酸用)、DAABD-MHz(カルボニル基用)などを開発した。さらに、DAABD-AEを用いて、血漿中極長鎖脂肪酸の高感度分析法を開発し報告している。平成26年度は、ベンゾフラザン骨格を有するLC/MS/MS用標識試薬であるDAABD-AEを用いて、2-メチルクエン酸の高感度かつ簡便な分析法の開発し、新生児の先天性代謝異常症のスクリーニング(マススクリーニング)に応用した(この課題には平成25年度から継続して取り組んでいる)。

従来のスクリーニングでは、濾紙血液試料中のプロピオニルカルニチンを測定し、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、コバラミン代謝異常症を検出している。しかしこの方法では偽陽性がしばしば認められることが知られている。患者(n=20)およびコントロール(n=377)の濾紙血液中2-メチルクエン酸を測定したところ、2-メチルクエン酸濃度は患者血液中の方が明確に高かった。本法は、従来のスクリーニングの二次スクリーニングに用いることができると考えられる。近年、タンデム型質量分析計(MS/MS)が開発され、HPLCと組み合わせたLC/MS/MS法が、広く用いられるようになっている。本研究は、MS/MS用およびLC/MS/MS用標識試薬として適した構造を見出し、新たな高性能標識試薬を開発することを第一の目的とした。また、得られた標識試薬を用いて、薬物や生体分子の高感度分析法を開発することを第二の目的とした。平成26年度までに、ベンゾフラザン骨格を有する標識試薬として、DAABD-AE(カルボン酸用)、DAABD-MHz(カルボニル基用)などを開発するとともに、血漿中極長鎖脂肪酸の高感度分析法を開発し報告している。平成27年度は、開発した標識試薬を用いて、ナノ粒子内包薬物を標識化し、分離定量することを試みた。近年、薬物を標的部位に送達することを目的として、薬物を内包したナノ粒子が用いられており、有効で安全な薬物療法を実施するためには、これらの薬物を正確に定量することが必要であると考えた。まず、ナノ粒子の精製法の開発に取り組んだ。これまで、ナノ粒子の精製には、超遠心、透析、サイズ排除クロマトグラフィー等の方法が報告されている。しかし、これらの方法は手順が複雑であり長時間を要するなどの問題点があった。そこで、ナノ粒子を簡便に精製するために、モノリスシリカディスクを用いる方法を検討した。その結果、ナノ粒子を、2分間遠心することにより分散溶液中から精製することが可能となった。この方法は様々な大きさのナノ粒子に適用できる。次に、薬物内容ナノ粒子をモノリスカラムで分離した。ナノ粒子は、内包薬物の種類にかかわらず、ハイドロダイナミックモードで分離された。分離された薬物を、昨年度までに開発した標識試薬を用いて標識化し、LC/MS/MSにより高感度に分析できると期待される。近年、高速液体クロマトグラフィー(LC)とタンデム型質量分析計(MS/MS)を組み合わせたLC/MS/MSが広く用いられている。そこで、LC/MS/MSにおける検出感度および選択性の向上を目的として、LC/MS/MS用の標識試薬を作製することを目的として研究を行った。また、作製した標識試薬を用いて疾患のマーカーとなる生体分子の高感度な分析法を開発した。本研究で開発した分析法は、先天性代謝異常症のスクリーニング法として有用であった。申請時の計画では、平成26年度中に、「低分子化合物の網羅的解析法の開発と疾患マーカー分子の同定」に関する研究を行う予定であった。しかし、DAABD-AEを用いて2-メチルクエン酸の分析法を開発し、患者濾紙血液試料を用いて、本法のマススクリーニングにおける有用性の検討を行ったため、本研究の進行が全体的に遅れている。分析化学先天性代謝異常症のマーカー分子は多数報告されている。今後は、2-メチルクエン酸以外の「先天性代謝異常症のマーカー分子」の高感度かつ迅速な分析法の開発に取り組む。
食道癌のTCR遺伝子導入細胞療法との併用増強効果を起こすがんワクチンの最適化

がんワクチン臨床試験でのワクチンが投与された例から採取された血液検体の血清及びリンパ球成分を収集と保管を行った。MAGE-A4, NY-ESO-1のがん・精巣抗原蛋白に対するELISA解析(血清)を実施し、データを集計した。CHP-MAGE-A4がんワクチンの解析において、腫瘍組織でのNY-ESO-1発現とワクチン前の抗体免疫応答例の予後が不良であることが明らかになり、対象の抗原同士が相互に関係する可能性が明らかになった。TCR遺伝子細胞治療において併用するがんワクチンデザインの最適化のための比較データが取得された。難治性食道癌を対象にしたTCR遺伝子細胞療法とがんワクチンの複合療法のデザイン最適化を目指して、これまで実施してきた8種のデザインの異なるがんワクチン臨床試験で採取された血液検体(血清、リンパ球)を用いて、腫瘍抗原NY-ESO-1、MAGE-A4特異的抗体反応とプロテインアレイによる拡大現象を解析した。また、半定性的Tリンパ球反応解析と定量的Tリンパ球反応解析(qPCR細胞内サイトカイン測定法)を解析した。これらにより、がんワクチンの最適な治療スケジュールと併用アジュバント薬の選定を行いTCR遺伝子導入細胞療法との複合的免疫療法の臨床試験の実施計画を可能にするものである。本研究の目的は、がんワクチンのデザインとアジュバントについて比較可能な免疫応答解析を行うことで、その最適化を可能し、TCR遺伝子細胞治療との複合的治療の臨床試験の根拠を提示することである。8種のがんワクチン臨床試験に登録されがんワクチンが投与された例から採取された血液検体の血清及びリンパ球成分を収集と保管を行った。終了した臨床試験の検体を対象にして、1MAGE-A4, NY-ESO-1のがん・精巣抗原蛋白に対するELISA解析(血清)、2半定性的Tリンパ球反応解析(テトラマー法、ELISPOT法)(リンパ球)3定量的Tリンパ球反応解析(qPCR細胞内サイトカイン測定法)(リンパ球)を実施し、データを集計した。本年度は、データの収集が主な実績である。来年度以降で、さらにデータを集積し、解析を行う予定である。各がんワクチンの免疫反応に関する評価を行い、がんワクチンの最適化を行う。終了した臨床試験の検体を対象にして、1MAGE-A4, NY-ESO-1のがん・精巣抗原蛋白に対するELISA解析(血清)、2半定性的Tリンパ球反応解析(テトラマー法、ELISPOT法)(リンパ球)3定量的Tリンパ球反応解析(qPCR細胞内サイトカイン測定法)(リンパ球)を実施し、データを集計したため。本年度は、解析データの収集が主な実績である。来年度以降で、集積データの統合的な解析を行う予定である。終了した臨床試験の検体を対象にして、1MAGE-A4, NY-ESO-1のがん・精巣抗原蛋白に対するELISA解析(血清)、一部検体でのタンパクアレイ解析2半定性的Tリンパ球反応解析(テトラマー法、ELISPOT法)(リンパ球)3定量的Tリンパ球反応解析(qPCR細胞内サイトカイン測定法)(リンパ球)を実施し、データを集積したため。本研究の目的は、がんワクチンのデザインとアジュバントについて比較可能な免疫応答解析を行うことで、その最適化を可能にし、TCR遺伝子細胞治療との複合的治療の臨床試験の根拠を提示することである。難治性食道癌を対象にしたTCR遺伝子細胞療法とがんワクチンの複合療法のデザイン最適化を目指して、これまで実施してきたデザインの異なるがんワクチン臨床試験で採取された血液検体(血清等)を用いて、腫瘍抗原NY-ESO-1、MAGE-A4特異的抗体反応とプロテインアレイによる拡大現象を解析した。これらにより、がんワクチンの最適な治療スケジュールと併用アジュバント薬の選定を行いTCR遺伝子導入細胞療法との複合的免疫療法の臨床試験の実施計画を可能にした。がんワクチン臨床試験に登録されがんワクチンが投与された例から採取された血液検体の血清及びリンパ球成分を収集と保管を行った。

終了した臨床試験の検体を対象にして、MAGE-A4, NY-ESO-1のがん・精巣抗原蛋白に対するELISA解析(血清)、2プロテインアレイによる網羅的抗体反応解析を実施し、データを集計した。CHP-NY-ESO-1単剤の試験、アジュバントとしてpoly-ICLCあるいはMIS416を併用した試験のワクチン前後のELISA解析(血清)を行った。またCHP-MAGE-A4がんワクチンの解析において、腫瘍組織でのNY-ESO-1発現とワクチン前の抗体免疫応答例の予後が不良であることが明らかになり、対象の抗原同士が相互に関係する可能性が明らかになった。TCR遺伝子細胞治療において併用するがんワクチンのデザイン最適化のための比較データが取得された。がんワクチン臨床試験でのワクチンが投与された例から採取された血液検体の血清及びリンパ球成分を収集と保管を行った。MAGE-A4, NY-ESO-1のがん・精巣抗原蛋白に対するELISA解析(血清)を実施し、データを集計した。CHP-MAGE-A4がんワクチンの解析において、腫瘍組織でのNY-ESO-1発現とワクチン前の抗体免疫応答例の予後が不良であることが明らかになり、対象の抗原同士が相互に関係する可能性が明らかになった。TCR遺伝子細胞治療において併用するがんワクチンデザインの最適化のための比較データが取得された。本年度は、データの収集が主な実績である。来年度以降で、さらにデータを集積し、解析を行う予定である。各がんワクチンの免疫反応に関する評価を行い、がんワクチンの最適化を行う。本年度は、解析データの収集が主な実績である。来年度以降で、集積データの統合的な解析を行う予定である。腫瘍内科、腫瘍免疫本年度計画研究のうち、「抗原蛋白パネルのタンパク質マイクロアレイ(セロミクス)解析(血清)」の項目については、総括的に実施することが必要なため、平成28年度に実施することとしたため。平成28年度に「抗原蛋白パネルのタンパク質マイクロアレイ(セロミクス)解析(血清)」の実施のための消耗品(実験試薬、器具)購入とする。
化学療法剤による下痢発症機構と下痢抑制剤併用療法の基礎

抗腫瘍剤の塩酸イリノテカンは、DNAトポイソメラーゼIの阻害剤のカンプトテシン誘導体で、肺癌、大腸癌、卵巣癌などの難治性の癌にも優れた効果がある。しかし、その副作用として激烈な下痢や白血球減少があり、その使用は現在厳格にコントロールされている。塩酸イリノテカンによる激しい下痢はヨーロッパや米国では高用量のロペラミドとの併用により、防げることが報告されている。しかし、ロペラミドの下痢抑制機序については未だ明らかにされていない。本研究の目的は、vitroラット大腸粘膜を用いて1)塩酸イリノテカンによる下痢に対するロペラミドの抑制機序を明らかにすること、2)塩酸イリノテカンの下痢誘発機構に介在するメディエーターを検索することである。本研究の結果、次の成果を得た。In vitroラット大腸粘膜において、1)塩酸イリノテカンが、トロンボキサンA_2(TXA_2)の遊離を介して引き起こす塩素イオン分泌(過剰イオン・水分泌による下痢誘発の指標)は、ロペラミドにより濃度依存的に抑制されること、2)TXA_2の遊離は一酸化窒素(NO)により刺激されNOも塩素イオン分泌を引き起こすこと、3)別のカンプトテシン誘導体のDX-8951fは、塩素イオン分泌を増大させるが、その効果は、非常に小さいこと、4)一方、5-FUおよびその関連化合物は塩素イオン分泌を引き起こさないことがわかった。塩酸イリノテカンが引き起こす下痢抑制には、TXA_2レセプターアンタゴニストあるいはTXA_2合成酵素阻害剤の投与も有効であると考えられる。興味深いことに、臨床において炎症性大腸疾患の患者にTXA_2合成酵素阻害剤を経口投与すると、症状の改善が見られることが報告されている。新規カンプトテシン誘導体のDX-8951fは、現在臨床試験中で、塩酸イリノテカンとは異なり、重度の下痢は観察されていない。これらの臨床知見は、本研究の動物モデルで得られた結果とパラレルであり、本実験モデルにより、ヒトでの下痢誘発効果が予測可能であることがわかった。
マンソン裂頭条虫の擬充尾虫が産生する生理活性物質についての研究

1.マンソン裂頭条虫擬充尾虫が産生する成長ホルモン様因子のcDNAクローニングとその役割擬充尾虫からmRNAを抽出し、vectorとしてpSPOTを、宿主細胞としてE.coli XL-1 blue株を用いてcDNA libraryを作成した。精製した成長ホルモン様因子(PGF)はcystein proteaseと高い相同性を有し、プロテアーゼ活性を示したので、その部分的アミノ酸配列と活性中心のアミノ酸配列をprobeとしてcDNAをクローニングした。得られたfull lengthのPGFcDNAは、1085bpであり、そのアミノ酸配列はマウスcathepsin-Lと65%の相同性を有していた。そして、PGFcDNAを用いてGST融合蛋白の作成を大腸菌、mouse 3Y1 fibroblast cellでの発現を試みたが、PGFmRNAの発現は認められたものの分泌蛋白としては産生しなかった。一方、本虫の蛋白分解酵素中にtrypsinn inhibitorが存在したのでこれを精製したところ、PGFであることが判明した。よってPGFの存在意義はproteaseとして抗体の切断、消化酵素の不活化であることが示唆された。2.マンソン裂頭条虫擬充尾虫の培養上清のマウス腹腔マクロファージヘの影響擬充尾虫の培養上清は、LPS刺激マウス腹腔マクロファージのiNOS,chemokine,JE遺伝子の発現を抑制し、さらにTNF-α遺伝子の発現も抑制することが示唆された。この因子をカラム・クロマトグラフィで分画すると94kDa以上の蛋白分子であることが推測された。よって、当面成長ホルモン様因子-PCFの融合蛋白の作成及びマクロファージ抑制因子-エンドトキシン・ショック抑制因子-の精製とその分子生物学的特性の解明が早急の課題である。1.マンソン裂頭条虫擬充尾虫が産生する成長ホルモン様因子として精製された27kDa蛋白のcDNAを作成するために以下の実験を行った。擬充尾虫からPharmacia mRNA Isolation Kitを用いてmRNAを抽出し、VectorとしてpSPOT、宿主細胞としてE.coliのXL-1 Blue株を用いてcDNA Libraryを作成した。27kDa蛋白は、カテプシン-Lと高い相同性を持つことから、この蛋白の既知のアミノ酸配列とカテプシン-Lの活性中心のアミノ酸配列をプライマーとしたPCRにより作成したプローブを使用して、cDNA Libraryから27kDa蛋白cDNAをクローニングした。このcDNAクローンは、1085bpであり、プライマーに使用されたアミノ酸配列を完全にコードしており、停止コドンは有していたが、開始コドンは見出せなかった。このcDNAをプラスミドpGEX-5X-1に挿入し、XL-1 Blueにて融合蛋白の発現を試みている。一方、27kDa蛋白のgenonicDNAをクローニングするためにgenomicDNA Libraryを作成中である。2.本擬充尾虫は、ほ乳類の中間宿主及び終宿主消化管内で宿主消化液で消化されず、自らが体部を離断して腸管を穿通し、また成虫へと発育する。この消化酵素抵抗性の機序を明らかにするために次の実験を行った。擬充尾虫をTriton X-100を含む抽出緩衝液で抽出し、ブタ・Trypsin,Pepsin活性を抑制する物質の存在の有無を観察した。カゼイン及びヘモグロビンを基質としてそれぞれの活性を測定する系に虫体抽出液を添加するとTrypsin及びPepsin活性が抑制された。そこで抽出液を各種のクロマトグラフィを用いて精製したところ、Trypsin Inhibitory Activityは27kDa蛋白であることが判明した。1.マンソン裂頭条虫擬充尾虫が産生する成長ホルモン様因子(PGF)の機能についてこの擬充尾虫は、哺乳類の中間宿主の消化管内で消化されず、消化酵素抵抗性を示すことからトリプシン活性を抑制する物質の存在を観察した。

カゼインを基質にしてブタ・トリプシン活性を測定する系を虫体のtriton X-100を含む緩衝液での抽出液が抑制した。そこで、虫体抽出液をTOYOPEARL HW-55にてゲル濾過、Mono-Qによるイオン交換クロマトグラフィー、Superdex 75HR/30カラムによるゲル濾過の3ステップの処理によって、トリブシン活性抑制物質が精製され、活性が約50倍に濃縮された。そして、この物質は、SDS-PAGEで還元状態で27kDaの分子サイズを有し、Immunoblot分析にてPGFである27kDa蛋白の抗-27kDa monoclonal抗体と交叉反応し、さらに抗-ヒト成長ホルモン・モノクローナル抗体とも交叉反応した。よって、擬充尾虫によって産生される成長ホルモン様因子は、宿主-奇生体関係における重要な役割を果たす多機能蛋白であることが明らかとなった。2.マンソン裂頭条虫擬充尾虫が産生するPGFのcDNAのクローニングとその融合蛋白の発現マンソン裂頭条虫擬充尾虫のcDNA libraryから開始コードを持つcDNAをcloningできた。PGFmRNAをPCRにて増幅し、T-vectorにligationし、大腸菌プラスミドに挿入し、精製されたプラスミドをEcoR1とNot1 1で切り出して、GST蛋白を発現するpGEX-5X-1 Vectorに組込み、大腸菌XL-1 blueに入れた。PGFが組み込まれたGST蛋白が発現していることを抗-27kDa抗体を用いてWestern blotting法にて確認した。しかし、GST融合蛋白は、1%triton X-100を含む緩衝液、Guanidine塩酸に溶解しなかった。よって、大腸菌での発現は不可能と考え、PGFを組み込んだplasmidを用いて3T3 fibroblastに発現させる実験を行っている。一方、PGFmRNAの発現が成虫にも存在するか否かをNorthern blotting法にて観察したところ、成虫には発現していなかった。そして、中性pHで最高の発現が観察され、Dexamethasoneで抑制された.1.マンソン裂頭条虫擬充尾虫が産生する成長ホルモン様因子(PGF)の融合蛋白の作成PGFのcDNAをクローニングし、GST蛋白を発現するpGEX-5X-1 vectorに組込んで大腸菌XL-1blueにてGST融合蛋白の合成を試みたが、可溶化GST-融合蛋白を作成することはできなかった。次に全長のcDNAではなくfragme nt-cDNAをXL-1blueに挿入したところ溶解度の比較的高いGST融合蛋白を発現できたが活性を持たなかった。次いでG418 resistant vectorにligationして全長cDNAを3Y1 rat fibroblastに挿入ししたところ、PGFmRNAの高い発現が観察された。しかし、培養上清に活性は存在せず、分泌蛋白として産生されなかった。
ドーパミン神経保護作用を示すプロテオグリカンの構造とその作用分子機構

本研究は、ドーパミン神経に特異的な神経毒である6-水酸化ドーパミン(6-OHDA)やRotenoneによるニューロン変性に対して保護作用を示す糖鎖分子の配列・構造と作用分子機構を明らかにすることを目的とした研究である。コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)やヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)は、神経の損傷に応答して損傷部位周辺に発現誘導される糖鎖分子であり、神経損傷時の細胞の保護や修復、神経再生を制御している。しかしながら、CSPGやHSPGの分子構造は複雑で不均一であるため、神経保護作用を示す糖鎖配列は明らかにされていない。Rotenoneの細胞毒性をマウス中脳由来細胞(MN9D、MN9X)で検討した。Rotenone (20 nM)を含む培養液で7日間培養したところ、チロシン水酸化酵素(TH)陽性細胞のMN9Dの生存率は、58.7±5.8%でありRotenone非添加に比べて有意に低下した。一方、TH非陽性細胞であるMN9Xでは有意な差は認められなかった。また、MN9DのRotenoneによる細胞死は、THの活性阻害剤(α-MT)の処理により消失した。細胞死に対して保護作用を示す糖鎖分子は、現在スクリーニング中である。これとは別に、グルコースやマンノースが、RotenoneによるMN9Dの細胞死に対して保護作用を示すことも見出しており、これらの単糖の作用分子機構ならびにその他の単糖の効果についても検討を行っている。コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)やヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)は、神経損傷時の細胞の保護や修復、神経再生を制御している糖鎖分子である。しかしながら、これらプロテオグリカン(PG)の神経保護作用を示す部分の正確な糖鎖配列・構造は決定されていない。これは、CSPGやHSPGの分子構造が非常に複雑であるため、神経組織からの精製や化学合成が困難であることが原因となっている。生理活性を示すPGの糖鎖配列・構造を明らかにし、その機能を医療に応用するためには、複雑な構造の糖質が繋がったPGやその誘導体を人工的に合成するための技術開発とその合成PGの性質や生物学的機能を評価することが必要である。本研究は、研究協力者のDr.Hsieh-Wilson L.C.(カリフォルニア工科大学)により合成されたPGライブラリー分子を利用し、パーキンソン病誘発神経毒であるRotenoneによるドーパミンニューロン変性に対して保護作用を示すPGの糖鎖配列・構造と、その作用分子機構を明らかにすることを目的としている。平成18年度は、マウス中脳由来細胞(MN9D、MN9X)を用いて、Rotenoneによる細胞変性の分子メカニズムについて検討した。Rotenone(20nM)の添加培地で、MN9D、MN9X細胞を培養後、細胞の生存率をMTT法により計測した。Rotenoneを添加せずに培養したコントロール細胞の生存率を100%とした時、チロシン水酸化酵素(TH)陽性細胞であるMN9Dの生存率は、58.7±5.8%であり、コントロール細胞に比べて有意に低下した。一方、TH非陽性細胞であるMN9Xの生存率(91.7±6.1%)は、有意な差は認められなかった。Rotenone添加によるMN9D細胞の生存率低下は、THの活性阻害剤(α-MT)の処理によりドーパミン合成を抑制することで消失した。以上より、RotenoneによるTH陽性細胞の変性は、ドーパミンの放出抑制に伴う酸化的傷害による可能性が示唆された。この細胞変性メカニズムに対して保護作用を示すPG構造は、現在スクリーニング中である。
歯周病罹患破骨細胞が脂質異常により受ける影響の解明

背景: Lox-1は、脂質異常症の原因であるoxLDLの受容体である。慢性歯周炎の主要な病原体であるP gingivalis菌LPSの受容体であるTLR2および4は、破骨細胞上のoxLDLの影響を受ける可能性がある。したがって脂質異常症における歯周炎の歯槽骨吸収が増加する可能性がある。本研究は、インビトロでTLRに関連する破骨細胞形成に対するLox-1の効果を解明することを目的とした。結果:Lox-1の発現は、BMCにおいてPam3およびlipid Aによって有意に増加したが、BMMでは影響がなかった。Pam3は、FACS分析を用いてBMCにおけるRANKおよびLox-1発現を増加させた。TRAP+細胞は、Pam3のみの添加では増加しなかったが、Pam3およびLox-1のリガンドであるoxLDLの添加によって増加した。Lox-1およびMyD88の両方の発現は、TLR2、TLR4、MAPKの各阻害剤によって抑制された。結論:BMCsにおいて、TLR2誘導性Lox-1のアップレギュレーションによってoxLDLの共存下で破骨細胞形成が促進された。脂質異常症の進行とともに歯周炎が悪化する可能性が示唆された。今年度は、骨吸収を担う破骨細胞や破骨前駆細胞にTLR刺激を行い、real time PCR法や免疫染色法を用いてLox-1の発現の変化や下流シグナルに与える影響について検討した。今年度は、TLR刺激を行った破骨細胞および破骨前駆細胞に対し、酸化LDL刺激を行い、s成熟破骨細胞への分化に与える影響について検討した。TLR刺激を行った破骨細胞および破骨前駆細胞に対し、酸化LDL刺激を行い、s成熟破骨細胞への分化に与える影響について検討している。骨髄細胞より破骨前駆細胞への分化時にTLR刺激を行うと、成熟破骨細胞への分化は阻害される。しかし、酸化LDLを添加することで抑制が一部回復することが明らかとなった。マウス骨髄細胞(BMC)および破骨前駆細胞(BMM)に対し、TLR合成リガンドを用いて刺激し、Lox-1発現に対する影響を調べたところ、BMMへのTLR2およびTLR4の各合成リガンド刺激でLox-1は有意に発現上昇したが、BMMでは影響がなかった。その発現は、TLR2およびTLR4の各阻害剤で抑制された。また、MAPK阻害剤によっても同様に阻害された。以上により、TLR刺激によりLox-1が増加し、破骨細胞形成が増加することが明らかとなった。また、脂質異常症罹患中に歯周病感染のようなTLR刺激が併発すると、骨吸収が促進する可能性が示唆された。準備に時間がかかったため、投稿が遅れました(平成29年度2月末)。現在、査読中であります。1. nativeの破骨細胞および破骨前駆細胞において、ルシフェラーゼ活性を検討する。2. TLRシグナルの阻害剤を用いて、Loxー1発現にかかわるシグナル伝達経路について検討する。現在までの知見を論文として投稿する。さらに、Lox-1をnativeの細胞に過剰発現させ、その影響を明らかにする予定である。現在、査読中である投稿論文のアクセプト獲得に向け、努めます。手持ちの残余薬品を使用して研究を行ったため、また、使用マウスが少なかったために今年度の使用が少なくなりました。使用マウス・薬剤が計画よりも少なかったために、今年度の使用額が少なくなりました。論文投稿が遅れたため、おもに投稿費用として次年度使用致します。ネイティブの破骨細胞を培養するため、マウス骨髄細胞が必要となり、当初計画よりも今年度に使用させていただく予定です。更に研究を深めるため、ネイティブの破骨細胞を培養し、トランスフェクションを行う予定です。今年度使用させていただきます。
メッセンジャーRNA投与による新たな心筋症治療法の開発と評価

特発性心筋症は、その原因となる遺伝子異常や発症機序が明らかにされ、その病態が明らかになりつつある。一方で治療方法は薬物療法や機械的補助といった対症療法に限られていた。本研究では、遺伝性拡張型心筋症を呈するマウスモデルを対象に、遺伝子異常により不足する正常タンパク質をメッセンジャーRNAを補充することにより補うという原因療法を試み、特発性心筋症治療法に新たな活路を見出すことを目的とした。投与するメッセンジャーRNAの生合成や有効な投与経路の開発に予想より長時間を要したが、約2年をかけてこれを確立し、現在も治療効果を判定するための投与実験を継続して行なっている。特発性心筋症は、近年徐々に原因となる遺伝子異常やそれに関わる発症機序が明らかにされ、その病態が明らかになりつつある。その一方で治療方法は実臨床において薬物療法や機械的補助といった対症療法に限られており、その進展が望まれている。近年、遺伝子やその転写産物をターゲットにした新規治療法が考案され注目を集めている。本研究の目的は、遺伝性拡張型心筋症や蓄積病を呈するマウスモデルを対象に、遺伝子異常により不足する正常タンパク質をメッセンジャーRNAを補充することにより補い,病因を克服することによる原因療法を試み、特発性心筋症治療法に新たな活路を見出すことである。1.マウス心組織へのmRNA導入法の確立;野生型マウスにGFPまたはluciferase発現mRNAを高分子ポリマーと会合させた高分子ミセルを、尾静脈よりの高圧静注、心筋への直接投与、冠動脈投与、および縦隔内心周囲への縦隔投与を行った。投与後の心筋組織におけるGFPまたはluciferase活性の拡がりから、成獣では冠動脈投与が心筋全般に幅広くmRNAを投与することの出来る手段であることが判明した。2.拡張型心筋症モデルマウスへの野生型mRNA導入;mRNA内包高分子ミセルの投与経路を決定した後、拡張型心筋症を発症するモデルマウスであるLmna遺伝子KOマウスに対し、正常野生型Lmna mRNAを投与し治療効果を検証する準備を行っている。現在、培養細胞を用いて正常野生型Lmna mRNAの発現を確認中であり、Lmna KOマウスへの投与は未だ行えていない。研究実施計画の3.ファブリー病モデルマウスへの野生型mRNA導入および4.質量顕微鏡法による解析には上記2が完結していないため未だ着手出来ていない。特発性心筋症は、近年次第に原因となる遺伝子異常やそれに関わる発症機序が明らかにされ、その病態が明らかにされてきている。その一方で実臨床における治療手段としては、薬物療法や機械的補助といった対症療法に限定されており、原因療法の開発が待ち望まれている。本研究の目的は、遺伝性拡張型心筋症や蓄積病を呈するマウスモデルを対象に、遺伝子異常により不足する正常タンパク質をメッセンジャーRNAを補充することにより補い、病因を克服することによる原因治療を試み、特発性心筋症治療法に新たな道を切り開くことである。現在、拡張型心筋症モデルマウスへの野生型mRNA導入に取り掛かっている。mRNA内包高分子ミセルの投与経路は、成獣では冠動脈投与が最適であることが判明し、冠動脈からの投与を行うと決定している。その後、拡張型心筋症を発症するモデルマウスであるLmna遺伝子ノックアウトマウスに対し、正常野生型Lmna mRNAを投与し治療効果を検証する段階である。正常野生型Lmna mRNA作成にあたり、T7プロモーターの下流に正常野生型マウスLmna遺伝子を組み込んだプラスミドを作成し、in vitroトランスクリプションによるmRNAを作成し、培養細胞に導入の上、正常野生型タンパクの発現を確認しているが、この人工的mRNA産生手法では野生型Lmna mRNA産生がうまく行われず、現在プラスミドの再デザインを行っている。また同時にHeterozygous KOマウスに対するmRNA補充による表現系改善を観察する予備実験として、同マウスに対しアンギオテンシンIIの投与を行い、圧負荷による心への影響を心エコーによる形態評価およびRNAシーケンスによるトランスクリプトーム解析を行っている。平成26年度報告でも記載した通り、まず研究実施計画の第一段階であるマウス心組織へのmRNA導入法の確立において、その投与経路の確立に時間を要した。これについては、冠動脈からの投与経路が最適であり、その手法を確立した。しかしながら、研究実施計画の第二段階である正常野生型mRNA投与段階において、人工的mRNA生成が計画通り進まず、試行錯誤を繰り返している状況である。平成27年度計画内の実施可能な部分は同時並行で進めているが、これらの理由により全体の研究計画に遅れが生じている。特発性心筋症は近年徐々に原因となる遺伝子異常やそれに関わる発症機序があきらかにされ、その病態が解明されてきている。その一方で、治療方法は実臨床において薬物療法や機械的補助などの対症療法に限られており、原因に迫った治療方法が望まれている。本研究の目的は、遺伝性拡張型心筋症や蓄積病を呈するマウスモデルを対象に、遺伝子異常により不足する正常タンパク質をメッセンジャーRNAを補充することにより補い、病因を克服することによる原因療法を試み、特発性心筋症治療法に新たな活路を見出すことである。前年度までにマウス心組織へのmRNA導入法を確立し、本年度は拡張型心筋症モデルマウスへの野生型mRNA導入を中心に研究をすすめた。

通常のin vitro transcriptionでは正常野生型Lmna mRNAの発現がうまくいかず、codon optimizationを行なった上で正常野生型Lmna mRNAの作成に成功した。培養細胞を用いin vitroでのmRNA導入、およびlamin蛋白発現を確認した上で、in vivoへの投与を行った。In vivoでは、Lmna homozygousノックアウトマウスに対し、生直後に正常野生型Lmna mRNAを投与し、成長の程度および生命予後を評価した。その結果、単回のmRNA投与のみでは成長障害の改善や生命予後の改善には至らないことが判明した。これは、ミセル化したmRNAの半減期が予想以上に早く、十分な表現型改善を待たずに組織から消失することに起因するものと考えられた。現在、短期での表現型改善を評価する目的で、新たな実験系を計画・構築している。この新たな実験系を確立ののち、他の遺伝子異常に伴う特発性心筋症モデルマウスへの適用拡大を計画している。特発性心筋症は、その原因となる遺伝子異常や発症機序が明らかにされ、その病態が明らかになりつつある。一方で治療方法は薬物療法や機械的補助といった対症療法に限られていた。本研究では、遺伝性拡張型心筋症を呈するマウスモデルを対象に、遺伝子異常により不足する正常タンパク質をメッセンジャーRNAを補充することにより補うという原因療法を試み、特発性心筋症治療法に新たな活路を見出すことを目的とした。投与するメッセンジャーRNAの生合成や有効な投与経路の開発に予想より長時間を要したが、約2年をかけてこれを確立し、現在も治療効果を判定するための投与実験を継続して行なっている。研究実施計画の第一段階である1.マウス心組織へのmRNA導入法の確立において、マウスへの投与経路の確立に時間を要した。具体的には冠動脈投与法の確立に際し、マウスの様な小動物では冠動脈への直接投与は不可能であり、大動脈を一時的に遮断して心腔内に投与し冠動脈内に散布するという手段の開発から施行した。主として、この手段を確立するのに相当の時間を要したため全体の研究計画に遅れが生じている。現時点では引き続き、拡張型心筋症モデルマウスへの野生型mRNA導入に取り組んでいる。正常野生型mRNAの作成をノウハウを有している連携研究者とともに試行錯誤を繰り返しながら行っている。培養細胞での正常野生型ラミンタンパク発現確認の後、拡張型心筋症発症モデルマウスに正常野生型Lmna mRNAを投与し、その心機能や生命予後を評価するとともに、アンギオテンシンII投与による圧負荷条件下での拡張型心筋症早期発症におよぼす正常野生型Lmna mRNA投与による表現形改善効果を検証する予定である。その構造的理由等により人工Lmna mRNAがうまくいかない場合は、同一アミノ酸をコードするコドンを変更するコドン最適化作業を行い、人工Lmna mRNA作成を試みる。
鼻から脳へ移住するLHRHニューロンの移動と定着に関する研究

生殖機能を司る視床下部のコナドトロピン放出ホルモン(LHRHまたはGnRH)産生ニューロンは、脳外の鼻プラコートで発生し、脳内へ移動して中隔-視索前野-視床下部系へと分化する。本研究では、脳内に進入したLHRHニューロンが中隔・視索前野を中心とする領域に移動し、定着するメカニズムを知る手がかりとして、中隔LHRHニューロンと視索前野LHRHニューロンの定着部位の違いは誕生日時の違いから生じる可能性を調べた。プロモデオキシウリジン(BrdU)による誕生日時の標識実験では、早生まれのLHRHニューロンは中隔一視索前野の全領域に分布するのに対し、遅生まれのLHRHニューロンは腹側の視索前野には分布しないことが判明した。領域別によるLHRHニューロン数の定量実験は、後期胚におけるLHRH抗体の免疫染色性低下なと技術的な問題により統計可能なデータが得られず、継続中である。組織学的観察から、脳内に進入したLHRHニューロンは嗅神経の分枝とともに嗅球尾側の腹内側部から背尾側方向へ移動し、この経路の終点てある中隔領域でガイド構造となる神経線維から離れて腹側方向へと向かうことが想定された。E5.5生まれのLHRHニューロンが腹側の視索前野に分布しない理由のひとつとして、中隔から腹側方向への移動が阻害された可能性が考えられる。ラミニン様構造を持つ液性分子ネトリンの発現をin situ hybridizationによって調べた結果、E7.5におけるネトリンmRNAは中隔ではなく前脳腹側の視床下部領域に強く発現していた。嗅上皮や嗅神経にはネトリンmRNAの発現はみられず、ネトリンが脳内におけるLHRHニューロンの移動に関与する可能性が示唆される。特に前脳背側の中隔から視索前野に向かう腹側方向への移動に関与する可能性があり、今後の検討課題と考える。視床下部に多く分布するゴナドトロピン放出ホルモン(GnRHまたはLHRH)産生ニューロンは脳外の鼻プラコードで発生し、脳内へ移動して中隔-視索前野-視床下部に定着する。ニワトリ胚では、脳内に進入したLHRHニューロンは、嗅球腹内側部から背尾側方向へ向かう経路と、この経路の終点近辺で腹側の視索前野へ向かう2つの経路をたどる。予備的にプロモデオキシウリジン(BrdU)による誕生日時の標識を行った結果、早生まれのLHRHニューロンは中隔-視索前野の全領域に分布するのに対し、遅く生まれたLHRHニューロンは背側の中隔領域には分布するものの、腹側の視索前野には分布しない傾向が見られた。この現象を明らかにするため、ひとつはBrdU投与が特定の時期のLHRHニューロンを標識しているかどうか実験方法の妥当性の確認と、ひとつは誕生日時と定着部位の関係を定量化することを行った。BrdUと^3H-thymidineの追いかけ投与実験では、E2.5でBrdUを取り込んだLHRHニューロンはE5.5における^3H-thymidine投与で標識されず、E2.5とE5.5生まれはBrdU投与によって特定化できることがはっきりした。E2.5でのBrdUラベルは24時間後でも体内に残存して取り込まれることがわかったため、誕生日時と定着部位との詳細な相関関係を調べるには他の方法を用いる必要があることが判明した。

また、発生の進んだE5.5-E6.5でのBrdU取り込み量に個体差があることと、E11.5-E18.5でのBrdU/LHRH免疫反応性にばらつきが大きいことから、定量解析に支障が生じた。このため、技術的な改善を行った結果、電子レンジの使用などにより免疫反応の増強が可能であることがわかった。E2.5生まれとE5.5生まれのLHRHニューロンの数を領域別にカウントする定量化の実験を継続中である。生殖機能を司る視床下部のゴナドトロピン放出ホルモン(LHRHまたはGnRH)産生ニューロンは、脳外の鼻プラコードで発生し、脳内へ移動して中隔-視索前野-視床下部系へと分化する。本研究では、脳内に進入したLHRHニューロンが中隔・視索前野を中心とする領域にどのようなメカニズムによって移動し定着するのかを知る手がかりを得るために、中隔LHRHニューロンと視索前野LHRHニューロンの定着部位の違いは誕生日時の違いから生じる可能性について検証した。また、移動に関与する分子候補の探索のために、移動経路におけるガイダンス分子の発現を調べた。フロモデオキシウリジン(BrdU)による誕生日時の標識実験から、E2.5生まれのLHRHニューロンは中隔-視索前野の全領域に分布するのに対し、E5.5生まれのLHRHニューロンは腹側の視索前野には分布しないことが判明した。E2.5生まれとE5.5生まれのLHRHニューロン数を領域別にカウントする定量化実験は、LHRH抗体の免疫染色性の低下など技術的な問題により統計可能なデータが得られず、継続中である。E5.5生まれのLHRHニューロンが腹側の視索前野に分布しない理由のひとつとして、前脳背側の中隔から腹側方向への移動が阻害された可能性が考えられる。ラミニン様構造を持つ液性分子ネトリンの発現をin situ hybridizationによって調べた結果、最終目的地である前脳腹側の視床下部領域に強い発現を観察し、ネトリンが脳内におけるLHRHニューロンの移動に関与する可能性を得た。この結果は国内における解剖学会と神経科学学会にて発表された。
リニアモータ駆動超小型拍動型補助人工心臓の開発

心臓移植は、重症心不全患者を治療する自的で行われているが、脳死からの臓器提供には限りがある。この様な状況において、補助人工心臓(Ventricular Assist Device:以下VAD)は移植までのブリッジユースとして必要不可欠な治療機器となっている。現在、拍動流式のVADを駆動するためのメカニズムとして、ローラースクリュ、ヘリカルカムといった運動変換機構が用いられている。運動変換機構は、VADの部品点数を増加させ小型化や信頼性向上の妨げとなっている。本研究ではVADを駆動するアクチュエータとして、運動変換機構を使用せずに直接往復運動を得ることができるリニア振動アクチュエータ(Linear Oscillatory Actuator:以下LOA)の応用を試みた。LOAの開発に対し、内側固定子・外側可動子構造、非対称推力特性を有する構造、および起動推力改善構造の新規提案を行い、磁場解析などを用いてその特性を明らかとした。開発したLOAは、直径60mm、高さ24mm、重量465g、容積約68mlであった。次に、LOAを組み込んだVAD (Linear-VAD)を新規に設計・開発した。試作したLinear-VADは、直径96mm、高さ50mm、重量620g、容積280mlであり、現在臨床使用されている他の埋め込み型VADと比較して、大幅に軽量・小型化が図られた。模擬循環試験において、最大拍出量約10L/min、最大効率約18%というVADとして十分な性能が得られることを確認した。動物実験用デバイスの開発を行い、成山羊1頭を用いた慢性動物実験を行った。Linear-VADは、慢性動物実験において42日間に渡り動物を生存させることが可能であった。実験中は、駆動制御回路およびドライブラインに関連する問題は発生せず、本デバイスの耐久性および信頼性を確認した。1.補助人工心臓を駆動するためのリニアモータ(リニア振動アクチュエータ)の設計・開発を行った。補助人工心臓を駆動するためには、ポンプ駆出段階に大きな推力が必要であり、充満段階には僅かな推力でかまわない特徴を持つ。このため、往復運動の一方向のみに大きな推力を発生するような、非対称推力特性を有するリニアモータを提案した。磁場解析を応用して、静推力の検討、試作モータの設計を行った。試作したモータは、直径60mm、高さ24mmおよび重量465g、容積68mlであった。2.試作リニアモータを組み込んだ電磁式補助人工心臓の設計・開発を行った。ポンプハウジングは3次元CADソフトを用いて設計を行い、CAM技術を応用して試作した。試作人工心臓は、直径101mm、高さ47mmおよび重量770g、容積300mlであった。in-vitroテストでは、150bpmの拍動数において最大拍出量6L/minおよび最大効率14%を記録した。3.試作した電磁式補助人工心臓を用いて、急性動物実験を行った。成羊(体重50kg)を使用し、手術室内麻酔下において人工心臓装着・駆動実験を行った。拍動数100bpm、補助流量3L/minにおいて、6時間の動作確認を行った。4.慢性動物実験用人工心臓の設計・開発を行った。急性動物実験において発生した問題点を検討し、血液ポンプ形状の再設計を行った。また、実用化の際に技術転換を容易にするためにポンプの製作工程を見直し、量産性の向上を図った。5.次年度は、慢性動物実験を行い更なる改良を進める予定である。1、14年度に開発した補助人工心臓駆動用リニアモータ(リニア振動アクチュエータ)の、製作工程および材料の変更を行った。