hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ライブイメージングと定量化による心臓前駆細胞の移動制御機構の解析

脊椎動物の発生において、心臓形成は器官形成期の中でも初期に起こり、その前駆細胞群が同調した移動を伴うダイナミックな現象である。モデル脊椎動物であるゼブラフィッシュにおける心臓形成過程では、心臓前駆細胞が体節形成期に両外側から正中線に向かって移動し、正中線上で融合することにより一つの心臓が形成される。この時、心臓前駆細胞は隣接する内胚葉細胞と細胞外マトリックスを足場にしながら移動することが知られており、これらの組織形成に異常があると、心臓前駆細胞の移動異常により心臓が左右に分かれた二股心臓となる。本研究では、これまで十分に調べられていない心臓前駆細胞の細胞動態について、共焦点顕微鏡を用いてライブイメージングする実験系を確立し、得られた画像データをもとに心臓前駆細胞の動きを時空間的且つ定量的に解析した。ライブイメージングの対象として、正常胚の他、心臓前駆細胞の移動に必要なスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)シグナルの欠損胚も解析を行った。その結果、S1Pシグナル欠損胚の心臓前駆細胞は正中線とは異なる方向に移動するものが多く存在することが分かった。これはS1Pシグナルが細胞の移動方向の決定に必要である可能性を示唆しており、これまで行われてきた組織レベルでの解析からは分かり得なかった新たな発見である。また、S1Pシグナルに関与する分子(輸送体Spns2、受容体S1PR2)の分子動態を可視化するための、ノックインゼブラフィッシュ系統の作製をCRISPR/Cas9のゲノム編集システムを用いて試みてきたが、現在のところ十分なノックイン効率が得られていない。他のノックイン手法の使用も検討するなどして、改善を図っていく。心臓前駆細胞をライブイメージングするための系を確立させ、正常胚とS1Pシグナル欠損胚の心臓前駆細胞の移動パターンを定量的に解析し、比較したことによって、S1Pシグナルが心臓前駆細胞の移動に与える影響の特徴を抽出することができた。ライブイメージングと定量解析によって得られた結果をもとに、心臓前駆細胞の移動におけるS1Pシグナルの機能についてより詳細な解析を行う。具体的には、シグナルの下流で機能する分子の探索や、移動する心臓前駆細胞におけるS1Pシグナル関連分子の局在の解析を行う。後者の解析には当初ノックイン系統を用いる予定でいたが、まず免疫染色法を用いるなどして固定胚で時系列的解析を行う。本研究では、脊椎動物の心臓形成初期におけるダイナミックな細胞移動のメカニズムを細胞・分子レベルで明らかにすることを目指し、まず共焦点顕微鏡を用いたライブイメージングによってその動態を継時的に観察することから着手した。観察には、個々の心臓前駆細胞を識別することができるゼブラフィッシュ系統を用い、それらの細胞が分化し始める受精後16時間の時点から観察を行なった。その結果、心臓前駆細胞が集団としてのまとまりを保ったまま移動する様子が観察され、さらに細胞同士が集団中であまり活発には配置換えを行なっていないことがわかった。これまで、ゼブラフィッシュの心臓前駆細胞の動態については、個々の細胞レベルでほとんど明らかにされておらず、本研究で得られる知見が初期心臓形成期のメカニズムのさらなる理解につながることが期待される。現在、得られたライブイメージングのデータを元に、細胞動態を定量的に解析する作業を進めている。また、ライブイメージングと並行して、これまで心臓前駆細胞の移動に関与していることが知られているスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)の輸送体Spns2とS1Pの受容体S1PR2の挙動を生体内で可視化するためのゼブラフィッシュ系統の作製を進めてきた。各遺伝子の発現動態を可視化するため、CRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を使って遺伝子座の開始コドン周辺に蛍光タンパク質EGFPのノックインに使用するコンストラクトを作製した。現在、ノックイン系統の作製を行なっている。共焦点顕微鏡で心臓前駆細胞の移動をライブイメージングするための条件検討に対して、当初の想定よりも時間を要した。本研究で使用する共焦点顕微鏡(正立型)に合わせて、心臓前駆細胞を明瞭に観察できるようにゼブラフィッシュ胚をマウントすることができるチャンバーの選定を行なったが既製品では適当なものが見つからず、自作することによって対応することとなった。

また、S1Pシグナルに関与する分子(輸送体Spns2、受容体S1PR2)の分子動態を可視化するための、ノックインゼブラフィッシュ系統の作製をCRISPR/Cas9のゲノム編集システムを用いて試みてきたが、現在のところ十分なノックイン効率が得られていない。他のノックイン手法の使用も検討するなどして、改善を図っていく。心臓前駆細胞をライブイメージングするための系を確立させ、正常胚とS1Pシグナル欠損胚の心臓前駆細胞の移動パターンを定量的に解析し、比較したことによって、S1Pシグナルが心臓前駆細胞の移動に与える影響の特徴を抽出することができた。今年度に計画していた実験のうち完了していない実験を優先して行い、その後、来年度計画分の実験を順次行う。特にノックイン系統の作製は時間がかかることが予想されるため優先して行う。ライブイメージングと定量解析によって得られた結果をもとに、心臓前駆細胞の移動におけるS1Pシグナルの機能についてより詳細な解析を行う。具体的には、シグナルの下流で機能する分子の探索や、移動する心臓前駆細胞におけるS1Pシグナル関連分子の局在の解析を行う。後者の解析には当初ノックイン系統を用いる予定でいたが、まず免疫染色法を用いるなどして固定胚で時系列的解析を行う。研究の進捗に合わせて計画通りに使用した結果生じた。次年度は次年度分と合わせて計画通り、分子生物学的・生化学的研究関連試薬、ゼブラフィッシュ飼育関連用品、顕微鏡関連用品に使用する予定である。研究の進捗に合わせて交付申請時の研究計画に若干の変更を行った結果、次年度使用額が生じた。次年度も研究の進捗に合わせて計画に沿った使用を行う。
心血管リモデリングに関わる転写因子KLF5の分子機能とin vivoにおける意義

我々の研究グループでは、生体組織の三次元構築の変化に中心的役割を果たすZn-finger型転写因子KLF5を分離同定した。KLF5遺伝子欠損マウスでは、動脈硬化病変やアンジオテンシンIIによる心臓肥大や線維化、肉芽形成、腫瘍血管新生等の反応が著明に低下していることが明らかとなった。1.KLF5抑制薬Am80の粥状硬化・脂肪肝への作用KLF5抑制薬Am80を粥状硬化モデルマウスApo-E欠損マウスに投与したところ、大動脈洞部および大動脈表面の粥状硬化巣を有意に抑制した。マクロファージに対する影響を検討したところ、主要なスカベンジャー受容体であるCD36,SR-Aの発現を抑制し、腹啌マクロファージの酸化LDL負荷後の泡沫化を抑制した。この作用は、Am80がIL-6誘導を減弱させることが一要因であり、Am80でのこれらの減弱効果はIL-6を外投与することで軽減された。実際に投与マウスの血中IL-6値は有意に低下しており、免疫組織学的検討でも同様に粥状硬化部位でのIL-6発現量は有意に低下していた。CD36遺伝子のプロモーターを用いてルシフェラーゼ活性を検討したところ、Am80は転写レベルでも抑制機序を発揮していることが明らかとなった。また肥満モデルであるleptin欠損マウスへのAm80を投与したところ、脂肪肝(肝機能異常および病理)を軽減させた。Am80投与でインスリン抵抗性は改善され、gene arrayを用いた検討では、肝臓での数種のlipogenic genesの発現を低下させた。2.PDGFR抑制薬の抗動脈硬化作用KLF5の標的遺伝子としてPDGF-Aを同定し、これが動脈硬化や線維化に強く関与しているものと考えられる。各病態におけるPDGFの役割を再検討するため、我々はPDGF受容体拮抗薬(imatinib)を用いた実験を行った。アンジオテンシンII負荷では心肥大は抑制されなかったが、間質の線維化が抑制された。線維芽細胞を用いたIn vitroでの検討では、imatinibはPDGF受容体のリン酸化を抑制するとともに、アンジオテンシンII投与後にリン酸化されるablをも抑制していることが明らかとなった。3.各組織におけるKLF5の役割の検討平滑筋の形質転換における転写因子カスケードの検討からKLF5を分離同定したが、その欠損マウスを用いた検討から、KLF5は動脈硬化のみならず心肥大や脂肪分化にも重要な役割を有すること明らかとなった。Cre-LoxP技術を用いた組織特異的な欠損マウス(コンディショナルマウス)を作成し交配を開始した。我々の研究グループでは、生体組織の三次元構築の変化(リモデリング)に中心的役割を果たすZn-finger型転写因子KLF5を分離同定した。KLF5遺伝子欠損マウスでは、動脈硬化病変やアンジオテンシンIIによる心臓肥大や線維化、肉芽形成、腫瘍血管新生等の反応が著明に低下していることが明らかとなった(Nature Medicine 2002;8:856-863)。1.KLF5抑制薬の肥満・脂肪肝への作用KLF5欠損マウスでは腫瘍血管新生の反応が低下し、KLF5抑制薬(Am80)投与により大腿動脈結紮後の血流回復は著しく遅延していた。最近、脂肪形成に伴う血管新生の重要性も報告されるようになり、我々は肥満モデルであるleptin欠損マウスへヘのKLF5抑制薬投与を行った。低容量投与で脂肪肝(肝機能異常)を軽減させ、高容量では肝機能改善とともに体重増加を軽減した。抑制薬投与でインスリン抵抗性は改善され、gene arrayを用いた検討では、肝臓での数種のlipogenic genesの発現を低下させた。脂肪組織では血管内皮細胞数が減少し、VEGF発現は低下していた。2.PDGFR抑制薬の抗動脈硬化作用KLF5の標的遺伝子としてPDGF-Aを同定し、これが動脈硬化や線維化(リモデリング)に強く関与しているものと考えられる。各病態におけるPDGFの役割を再検討するため、我々はPDGF受容体拮抗薬(STI571)を用いた実験を行った。アンジオテンシンII負荷では心肥大は抑制されなかっだが、間質の線維化が抑制された。またカフ障害モデルでの新生内膜形成やApoE欠損マウスでの粥状硬化モデル、DOCA-saltを用いた腎硬化モデルなどでも奏功した。既に報告のある平滑筋増殖の抑制とともに、線維芽細胞でも増殖刺激後の細胞増殖は抑制された。アポトーシス関連遺伝子(Bcl-2,Bax)の関与も観察された。3.各病態モデル動物におけるKLF5の役割の検討各病態モデル動物のphenotypeがどの様に変化するかを検討し、各病態の進展におけるKLF5の役割を検討する。粥状動脈硬化との関連ではApoE受容体、他の転写因子との関連ではPPARγ、アンジオテンシン系との関連ではATla受容体との二重欠損マウスを樹立に成功し、その解析を開始している。1.KLF5抑制薬Am80の粥状硬化・脂肪肝への作用KLF5抑制薬

Am80を粥状硬化モデルマウスApo-E欠損マウスに投与したところ、大動脈洞部および大動脈表面の粥状硬化巣を有意に抑制した。マクロファージに対する影響を検討したところ、主要なScavenger receptorsであるCD36,SR-Aの発現を抑制し、腹啌マクロファージの酸化LDL負荷後の泡沫化を抑制した。この作用は、Am80がIL-6誘導を減弱させることが一要因であることがわかった。また肥満モデルであるleptin欠損マウスへのAm80を投与したところ、脂肪肝(肝機能異常および病理)を軽減させた。Am80投与でインスリン抵抗性は改善され、gene arrayを用いた検討では、肝臓での数種のlipogenic genesの発現を低下させた。2.PDGFR抑制薬の抗動脈硬化作用KLF5の標的遺伝子としてPDGF-Aを同定し、これが動脈硬化や線維化に強く関与しているものと考えられる。各病態におけるPDGFの役割を再検討するため、我々はPDGF受容体拮抗薬(STI571)を用いた実験を行った。アンジオテンシンII負荷では心肥大は抑制されなかったが、間質の線維化が抑制された。またカフ障害モデルでの新生内膜形成やApoE欠損マウスでの粥状硬化モデル、DOCA-saltを用いた腎硬化モデルなどでも奏功した。既に報告のある平滑筋増殖の抑制とともに、線維芽細胞でも増殖刺激後の細胞増殖は抑制された。アポトーシス関連遺伝子(Bcl-2,Bax)の関与も観察された。3.各組織におけるKLF5の役割の検討平滑筋の形質転換における転写因子カスケードの検討からKLF5を分離同定したが、その欠損マウスを用いた検討から、KLF5は動脈硬化のみならず心肥大や脂肪分化にも重要な役割を有すること明らかとなった。組織特異的な欠損マウス(コンディショナルマウス)を作成した。我々の研究グループでは、生体組織の三次元構築の変化に中心的役割を果たすZn-finger型転写因子KLF5を分離同定した。KLF5遺伝子欠損マウスでは、動脈硬化病変やアンジオテンシンIIによる心臓肥大や線維化、肉芽形成、腫瘍血管新生等の反応が著明に低下していることが明らかとなった。1.KLF5抑制薬Am80の粥状硬化・脂肪肝への作用KLF5抑制薬Am80を粥状硬化モデルマウスApo-E欠損マウスに投与したところ、大動脈洞部および大動脈表面の粥状硬化巣を有意に抑制した。マクロファージに対する影響を検討したところ、主要なスカベンジャー受容体であるCD36,SR-Aの発現を抑制し、腹啌マクロファージの酸化LDL負荷後の泡沫化を抑制した。この作用は、Am80がIL-6誘導を減弱させることが一要因であり、Am80でのこれらの減弱効果はIL-6を外投与することで軽減された。実際に投与マウスの血中IL-6値は有意に低下しており、免疫組織学的検討でも同様に粥状硬化部位でのIL-6発現量は有意に低下していた。CD36遺伝子のプロモーターを用いてルシフェラーゼ活性を検討したところ、Am80は転写レベルでも抑制機序を発揮していることが明らかとなった。
脳血管障害および口腔腫瘍患者に対する画像口腔容積分析による発音補助床設計システム

被験者は音声器官に異常がない者および脳血管障害によって運動障害性発音障害を有する患者を対象とし,研究内容の十分な説明と同意の上で開始した.被験音は歯頸音の[ta],[na],[ra]と軟口蓋音の[ka]の計4音とした.被験者に発音直前の舌の形態を維持させMRIを撮影した.撮影前には舌形態維持の十分な練習を行った.MRI画像から舌表面と口蓋との間のスペースを140箇所の計測点について計測した.また舌と口蓋の接触パターンをパラトグラムとして抽出した.健常者においては[ta],[na],[ra]は正常パラトグラムパターンとよく一致していたが,[ka]は正常パターンとは異なる所見が得られた.[ta]と[na]はパラトグラムではほぼ同様のパターンを示すが,[na]は[ta]に比べて舌後方のスペースが少ない傾向があった.[ka]は各被験者間で舌の形態が様々で,パラトグラムにもばらつきがみられた.健常者から得られたこれらのデータを元に平均的口腔内容積を算出しデータベース化を行った.運動障害を有する患者における撮影では,明瞭な像を得ることが困難であったが,本研究において,正常者における発音中の正常口腔スペースがデータベース化されたことによって,今後の運動障害を有する構音障害患者の口腔スペース再現のための重要な情報を蓄積することができた.運動性構音障害患者の全身状態については,それぞれの病状によって個体差が大きく,今回蓄積したデータベースと重ね合わせることが可能な症例も多数存在すると考える.被験者は音声器官に異常がない者および脳血管障害によって運動障害性発音障害を有する患者を対象とし,研究内容の十分な説明と同意の上で開始した.被験音は歯頸音の[ta],[na],[ra]と軟口蓋音の[ka]の計4音とした.被験者に発音直前の舌の形態を維持させMRIを撮影した.撮影前には舌形態維持の十分な練習を行った.MRI画像から舌表面と口蓋との間のスペースを140箇所の計測点について計測した.また舌と口蓋の接触パターンをパラトグラムとして抽出した.健常者においては[ta],[na],[ra]は正常パラトグラムパターンとよく一致していたが,[ka]は正常パターンとは異なる所見が得られた.[ta]と[na]はパラトグラムではほぼ同様のパターンを示すが,[na]は[ta]に比べて舌後方のスペースが少ない傾向があった.[ka]は各被験者間で舌の形態が様々で,パラトグラムにもばらつきがみられた.健常者から得られたこれらのデータを元に平均的口腔内容積を算出しデータベース化を行った.運動障害を有する患者における撮影では,明瞭な像を得ることが困難であったが,本研究において,正常者における発音中の正常口腔スペースがデータベース化されたことによって,今後の運動障害を有する構音障害患者の口腔スペース再現のための重要な情報を蓄積することができた.運動性構音障害患者の全身状態については,それぞれの病状によって個体差が大きく,今回蓄積したデータベースと重ね合わせることが可能な症例も多数存在すると考える.今後はこれらのデータに基づき,本年度内に顎口腔機能に異常を認めない被験者5名を対象とし,上記で決定した撮影条件にて「た」,「か」,「け」,「ら」発音時のMR像撮影を行い,それぞれのMR像を立体構築し,口蓋と舌の間のスペースの測定を行う予定である.被験者は音声器官に異常がない者および脳血管障害によって運動障害性発音障害を有する患者を対象とした.被験音は歯頸音の[ta],[na],[ra]と軟口蓋音の[ka]の計4音とした.被験者に発音直前の舌の形態を維持させ撮影した.撮影前には十分な練習を行った.MRI画像から得られた舌と口蓋の接触パターンをパラトグラムとして抽出した.健常者においては[ta],[na],[ra]は正常パラトグラムパターンとよく一致していたが,[ka]は正常パターンとは異なる所見が得られた.[ta]と[na]はパラトグラムではほぼ同様のパターンを示すが,[na]は[ta]に比べて舌後方のスペースが少ない傾向があった.[ka]は各被験者間で舌の形態が様々で,パラトグラムにもばらつきがみられた.健常者から得られたこれらのデータを元に平均的口腔内容積を算出した.しかし運動障害を有する患者における撮影では,明瞭な像を得ることが困難であった.これには1発音の撮影時間3分と長く,舌に運動障害を有する患者には,この間舌形態を維持することが困難であったためと思われる,これに対して,撮影時間を短縮できるように撮像条件を変えて行ったが,解像度が低下し定量的な評価は困難となってしまった.以上のように,本研究においては発音時の舌形態を定量的に評価することが可能であった.特に口蓋と接していない部位の形態に関しては新しい知見を得ることができた.しかしながら,、運動障害を有する患者に対して行うには撮影方法が適しておらず,PAP設計に応用するには撮影条件をより短時間で高解像度の像が得られるようにさらに工夫する必要がある.
新規摂食抑制蛋白、ネスファチン-1欠損マウスの樹立とその行動学的解析

ネスファチン-1の活性部位の同定を試み、中央部分のM30部分のぺプチドのみがネスファチン-1と同様の摂食抑制作用が認められた。M30250pmol/g体重の単回投与による代謝に及ぼす影響を検討した。雄性ICRマウスにM30を腹腔内投与し、その後1時間の酸素消費量の変化や各種血中代謝マーカーに対する影響について検討を行ったが、明期におけるM30の単回投与実験条件下においてはM30投与による明らかな酸素消費量への影響は認められず、血糖値や脂質濃度にも有意な変動は観察されなかった。また褐色脂肪組織におけるuncoupling protein(UCP)-1の発現にも有意な急性効果は認められなかった。更に予備的な検討として、のネスファチン/ヌクレオビンディン-2遺伝子欠損雄性マウスの酸素消費量の変動に関する検討を行ってみたが、明期中期のみにおいて3時間にわたり測定した酸素消費量に関する検討結果では、明らかな酸素消費へのネスファチン/ヌクレオビンディン-2遺伝子欠損の影響は認められていない。更に自発運動量の計測も予備的に行ってみたが、有意な変動は認められなかった。新規摂食抑制蛋白,ネスファチン-1による摂食行動への影響を検討する一貫としてまずネスファチン-1の活性部位の同定を試みた。ネスファチン-1を3分割したベプチド(N-端側(N),中央(M30),C-端側(C)を合成し,それぞれのベプチドをICRマウスの腹腔内へ暗期直前に投与し,その後の摂食量の変動を検討することによりその活性部位の特定を試みた。その結果,中央部分のM30部分のベプチドのみがネスファチン-1と同様の摂食抑制作用を示した。この結果より,ネスファチン-1の活性部位はM30部分に存在することが明らかとなり,その後の検討はM30を用いて行った。本年度は,予備的実験としてM30の単回投与による代謝率に及ぼす影響を検討した。雄性ICRマウスにM30を腹腔内投与し,その後1時間の酸素消費量の変化を検討した。明期におけるM30の単回投与実験条件下においてはM30投与による明らかな酸素消費量への影響は認められなかった。ネスファチン-1の活性部位が明らかにされることにより,今後の創薬に向けて貴重なデータを得ることが出来たが,この活性ベプチドの腹腔内への急性投与実験結果では酸素消費量の増加作用が認められない可能性が示唆された。ネスファチン-1自体の生理的な意義を更に解明する目的により,今後,ネスファチン-1を欠損したマウスを用いて更なる検討を予定している。新規摂食抑制蛋白、ネスファチン-1による摂食行動への影響を検討する一貫として昨年度ネスファチン-1の活性部位の同定を試み、ネスファチン-1の中央部分に存在するM30部分の30個のアミノ酸がネスファチン-1の摂食抑制活性を示す為に重要な部位と同定した。このような成果に基づき、本年度はM30を用いて全ての検討を行った。この活性ぺプチドを多量に合成し、マウス腹腔内へ急性投与を行った実験結果では、褐色脂肪組織におけるuncoupling protein(UCP)-1の発現や酸素消費量の増加作用が認められない可能性が示された。ネスファチン-1自体の生理的な意義を更に解明する目的により、ネスファチン-1を欠損したマウスを作成し、バック・クロスによる繁殖を施行中であるが、繁殖過程における偶発事項のために現段階においてはまだ最終的なマウスが得られていない状況にあるが、予備的な検討として本研究費にて導入した酸素消費量測定装置を用い明期中期のみにおいて3時間にわたり測定した検討結果においては、明らかな酸素消費へのネスファチン/ヌクレオビンディン-2遺伝子欠損の影響は認められていない。更に自発運動量も同時に測定可能なシステムを確立し、同様な検索も予備的に行ってみたが、有意な変動はえられていない状況にある。今後充分にバッククロスを行ったマウスを用いて終夜を通じた長期的な検討を継続的に行うことにより、最終的な結論が得られるものと考えられる。
急性膵炎の重症化予知を目指した血行動態の解析と炎症性サイトカインの関与

平成13年度は,急性膵炎重症化に伴い,胃十二指腸血流の低下に伴い,相対的に肝動脈血流が増加する可能性について解析した.さらに,本年度は,平成10年度からの重症急性膵炎症例に対し,膵酵素阻害剤持続動注療法を実施した8例の腹腔動脈撮影を後ろ向きに検討した.この結果,4例に胃十二指腸動脈の枯れ枝状変化(withered GDA)が捉えられており,いずれも死亡例であった.つまり,膵血流・腸管血流の低下がtotal prognosisに及ぼす影響が高いことが容易に想定される.従って,平成14年度は以下の実験を実施した.Wistar系雄性ラットを用い,膵胆管十二指腸開口部を中心に4cmのclosed duodenal loopを作成し急性膵炎を作成した結果,発症4時間後にはinflammatory cytokinesである血清IL-6はsham群の119.459±22.663pg/mlに比し,327.674±124.720pg/mlと有意に上昇をみとめ,発症6時間後でもsham群の83.459±17.784pg/mlに対し,309.499±102.410pg/mlと有意な上昇を続けた.また,血清IL-1βは,発症4時間後では285.065±48.659pg/ml(sham群:238.089±17.372pg/ml)であったが,発症6時間後で422.556±122.601pg/mlとなりsham群の232.818±4.836pg/mlに比し有意な上昇をみとめた.つまり,実験的急性膵炎モデルでは,発症の比較的早期から,inflammatory cytokinesの上昇がみられることが想定された.他方,L-arginine monohy drochloride450mg/kg体重を7週齢のWistar系雄性ラットに単回腹腔内投与することにより作成した急性膵炎モデル(アルギニン膵炎)においてCanon LC-1 laser dopplerflowmetryを用いて膵の組織血流の解析を行った結果,発症前:4.83±0.152BFI(blood flow index),12時間後:4.42±0.213BFI,24時間後:3.49±0.263BFI,72時間後:1.47±0.36BFIと漸次低下していった.さらに,急性膵炎の重症化に関わる血流変動におけるbradykininの関与を検討するため,2種類のラット急性膵炎モデルを用いて検討を加えた.すなわち,軽症急性膵炎モデルであるセルレイン膵炎と重症急性膵炎モデルであるアルギニン膵炎をラットに惹起させ,血漿bradykinin免疫活性値とlaser Doppler flowmeterを用いた膵・腎組織血流を比較検討した.加えて,各々のラット急性膵炎モデルにbradykinin B2 receptor antagonist (HOE140)を投与した場合の検討を実施した.血漿bradykinin値はコントロール;15.2±1.5pg/mlに対して,セルレイン投与後4時間で35.3±2.8pg/ml,アルギニン投与後6時間で49.6pg/mlとアルギニン膵炎モデルで著明な上昇を認めた.膵組織血流は,アルギニン膵炎モデルにおいてコントロール;6.81±0.23BFIに比し,4.97±0.28BFIと有意に低下していた.HOE140の前投与はアルギニン膵炎早期の膵・腎血流低下を阻止した.平成14年度の検討結果として,急性膵炎の予後に関わる因子としてwithered GDAが挙げられ,その成因にはIL-1βやbradykininが強く関与するものと想定した.急性膵炎重症化に際して肝動脈血流が増加する可能性があるが,本年度はこの肝血流増加反応が胃十二指腸血流の低下による相対的増加であることを臨床的,疫学的,実験的に検証することを目的とした.【方法】<臨床的検討1>:発症早期に腹部超音波ドプラ検査を施行しえた重症急性膵炎6例の固有肝動脈血流,門脈血流を解析し,対照群15例と比較検討した.検討項目は肝動脈に関しては最高流速(Vmax),最低流速(Vmin),平均流速(Vmean),Pulsatility Index(PI),Resistive Index(RI),門脈に関してはFlow Volume(FV)とした.<臨床的検討2>:胆膵疾患が疑われ,診断的ERCP検査を施行した患者のうちERCP前後に腹部超音波ドプラ検査を施行しえた入院症例のうち,肝疾患・悪性疾患を除外した34例(61.1±14.6歳,M/F;13/21)を対象とした.ERCP前に関しては,ERCP検査の3日前から検査当日の早朝空腹時(AM6:307:00)にFFT解析を実施した.同時にP型アミラーゼの採血を行った.ERCP後に関しては,ERCP検査の翌日の早朝空腹時(AM6:307:00)にFFT解析を実施した.同時にP型アミラーゼの採血を行った.固有肝動脈の最高流速(Vmax),平均流速(Vmean),Pulsatility Index(PI),Re sistive Index(RI)を測定した.<疫学的検討>:上部消化管イベント(胃十二指腸潰瘍,AGML)を併発した重症急性膵炎24例のイベント発生日を検討した.<実験的検討

>:ラットアルギニン急性壊死性膵炎モデルを作成し(対照群は生食を投与),肝・脾・十二指腸の組織血流をlaser-Doppler Flowmeterで経時的に測定し,5秒間の平均血流を最低6回連続測定し平均値としてBFl(Blood Flow Index)とした.【成績】<臨床的検討1>:重症急性膵炎群の肝動脈Vmax(107.0±12.1cm/s)は対照群(52.5±3.4cm/s)に比し,有意な高値を示した(P=0.0047)同様にVminとVmeanも対照群に比し高値であった(P=0.039,0.026).肝動脈のPI, RI,門脈FVに有意な変動はなかった.<臨床的検討2>:ERCP後翌朝まで腹痛が持続した5例においては,固有肝動脈のVmax(ERCP前;44.36±4.62cm/s, ERCP後;66.7±5.43cm/s:P=0.011),Vmean(ERCP前;26.1±3.99cm/s, ERCP後;39.24±5.32cm/s:P=0.017)が,ERCP後において有意な高値をとったが,PI(ERCP前;1.24±0.21,ERCP後;1.2±0.14:P=0.745),RI(ERCP前;0.68±0.04,ERCP後;0.67±0.04:P=0.91)については変動をみとめなかった.腹痛を認めなかった29例においてはいずれのパラメーターも有意な変化を認めなかった〔Vmax(ERCP前;55.94±2.64cm/s, ERCP後;55.5±3.48cm/s:P=0.87),Vmean(ERCP前;31.18±1.82cm/s, ERCP後;31.3±2.43cm/s:P=0.95),PI(ERCP前;1.28±0.06,ERCP後;1.27±0.06:P=0.86),RI(ERCP前;0.69±0.02.ERCP後;0.68±0.01:P=0.53)〕.ERCP検査翌朝のP型アミラーゼ(正常域:2671IU/I)が300IU/I以上に上昇した8例における検討では,固有肝動脈のVmax(ERCP前;48.05±3.72cm/s, ERCP後;62.08±3.51cm/s:P=0.024),Vmean(ERCP前;27.75±3.19cm/s, ERCP後;35.8±2.95cm/s:P=0.043)が,ERCP後において有意な高値をとった.PI(ERCP前;1.28±0.14,ERCP後;1.21±0.09:P=0.54),RI(ERCP前;0.7±0.03cm/s, ERCP後;0.68±0.03cm/s:P=0.53)については変動をみとめなかった.P型アミラーゼの上昇を認めなかった26例においてはいずれのパラメーターも有意な変化を認めなかった〔Vmax(ERCP前;56.64±2.97cm/s, ERCP後;55.46±4.02cm/s:P=0.71),Vmean(ERCP前;31.46±1.94cm/s, ERCP後;31.28±2.79cm/s:P=0.93),PI(ERCP前;1.26±0.06,ERCP後;1.27±0.07:P=090),RI(ERCP前;0.68±0.02,ERCP後;0.68±0.02:P=0.76)〕.<疫学的検討>:対象となった重症急性膵炎24例中,重症化した日から前後3日以内での上部消化管イベント発生が14例と大半を占めており,重症化した日のイベント発生が6例と最大であった.<実験的検討>:実験的急性膵炎モデルにおいて,肝組織血流は0.5,1,3日目において有意な上昇を認めた(P=0.0003,0.0004,0.0029).
国際移動のなかの「からゆきさん」――日本の開国から戦間期にかけての通時的分析

2018年度は、熊本、長崎、で福岡での資料収集に励んだ。特に長崎では地元で発行されていた新聞から密航摘発記事を大量に収集することができた。ただし、現在整理と分析に努めているが、膨大な量であるため当初の予定より時間がかかっている。また、少しずつではあるが文献、資料、映像から「からゆきさん」のネットワークが見えてきた。本課題の「からゆきさん」の再生産労働の実態解明と合わせて着実に考察を深めていきたいと考えている。加えて、老年の「からゆきさん」と過去に直接出会ったことがある方々にインタビューをすることができた。晩年の「からゆきさん」に出会った方々の話は、「からゆきさん」の子どもや配偶者の状況含めて再生産労働とも大いに関係する事柄であるため、貴重なインタビュー機会となった。他方で、インタビュー調査をしていく過程で地元の方々の「からゆきさん」に対する複雑な思いもみえてきた。「からゆきさん」をどのように語るのか、あるいはどのように語ることができるのか、長崎や熊本の関係者の方々の葛藤はいまもまだ続いていることを調査の折々に感じた。こうした心情を軽視することなく、その語り口の背後にある歴史的背景や権力構造をも考察していく必要があるだろう。進捗状況がやや遅れている理由としては、資料の膨大さにある。当初想定していた以上の資料が必要となったため、その収集と整理に時間がかかっているためである。また、現地調査で地元の方々にインタビューを行う上で、信頼関係を築く時間が必要なためである。進捗状況が遅れていることの反省を踏まえ、資料整理等はアルバイトを雇ってお願いするなど、より効率的に作業が進められるよう模索していきたい。また、本課題の研究遂行には国内の調査はもとより、国外での資料収集も不可欠なため、入念な計画を立てて、時間確保に努めるようにしたい。初年度にあたる2017年度は、シンガポールでの資料調査と九州地域の現地調査および資料収集をおこなった。シンガポールではシンガポール国立公文書館でマイクロフィルム資料を閲覧、収集してきた。だが、シンガポールでの調査を進めながら、他方で「からゆきさん」の送り出し地域である九州地域の現地調査や資料収集の重要性も実感し、年度後半には九州地域の調査も敢行した。その国内調査では、「からゆきさん」が多く出たとされる天草・島原地域で地元の郷土史家の方、歴史民俗資料館館長、「からゆきさん」に所縁のあった方々からお話を伺うことができた。地元の方々の「からゆきさん」への思いは単純ではないため、少しずつ信頼関係を築きながら今後もお話をきかせていただきたいと考えている。また、当時、国際港であった口之津港や長崎港、門司港などの地理的状況や女性の移動の具体的な経緯の検討に着手できた。港付近に設置される「遊郭」と「からゆきさん」の関係を含んだ女性の労働状況など、なお考えるべき課題が残されているが、それは現地に行き、当時の地図と照らしあわせながら地理的状況を把握することが肝要であった。また、「からゆきさん」を国際移動や再生産労働の観点から考察するために、女性の国際移動とあわせて再生産労働の理論に関する先行研究を学びはじめたところである。これら上記の研究はまだ計画の全体からみれば緒についたばかりではあるが、引き続き着実に積み重ねていく所存である。進捗状況がやや遅れているのには理由が2つある。1つは、当初の想定よりも収集した資料の整理に時間がかかっているためであり、2つ目に、現地調査で地元の人々から話を伺うにあたって時間をかけて信頼関係を築く必要があるためである。進捗状況がやや遅れていることの反省に基づき、資料整理等はアルバイトを雇ってお願いするなど、より効率的に作業が捗る方法を模索していきたい。また、研究遂行には国内での調査もさることながら海外での資料収集が不可欠なため、入念な事前準備を行い、計画どおりに研究が進められるよう時間確保に努めたい。

進捗状況が遅れていることの反省を踏まえ、資料整理等はアルバイトを雇ってお願いするなど、より効率的に作業が進められるよう模索していきたい。また、本課題の研究遂行には国内の調査はもとより、国外での資料収集も不可欠なため、入念な計画を立てて、時間確保に努めるようにしたい。
育児不安の軽減を図るための集団による保健活動の効果に関する検討

育児不安の軽減を図るために実施される集団による保健活動の効果を明らかにすることを目的に、知識伝達型(保健師などの専門職による育児に関する知識を伝えることが主体)と自主発生型(母親同士の仲間作りが主体)とに、前年度の予備調査をふまえ、質問紙調査を行った。本研究における集団による保健活動とは、育児グループや遊びの教室など母親が集まる活動をさす。対象は、群馬県内2市の集団による保健活動に参加している母親100名である。方法は、無記名自記式の質問紙調査であり、質問紙は、対象である母親に直接配布し、郵送法にて回収する。調査項目は、基本属性、育児不安の内容、集団による保健活動の効果などである。調査期間は、平成17年2月である。結果、有効回答は45%であった。回答者の属性は、母親は「30歳代」が、子どもは「3歳未満」が最も多く、子どもの数は「1人」が半数であった。育児不安の内容は、「子どもへの接し方・遊び方」、「病気時の対応」、「同じ気持ちで接することの困難さ」が多く、集団による保健活動に参加することにより「育児不安が軽減した母親」は7割であった。また、参加による効果は、「家で体験できないことができる」、「子どもと自分の友達が増える」に多くの回答が得られた。子どもの変化は、「慣れてきた」、「楽しんでいる」であり、母親の変化は、「子どもを客観視できる」、「育児が楽しいと思える」、「気分転換できる」に多くの回答が得られた。集団による保健活動に参加している母親のうち、保健師が運営している集団による保健活動に参加している母親は2割であり、保健師との関わり状況は、「育児の知識を教えてもらえる」、「いろいろな相談ができる」であった。知識伝達型の集団による保健活動に参加している母親の方が、保健師などの専門職に、育児の知識や保育園などの情報提供とそのような場づくりの役割を求めていることが明らかとなった。母親の育児不安の内容と育児不安の軽減を図るために実施される集団による保健活動の効果を明らかにすることを目的に、集団による保健活動を知識伝達型(育児に関する知識を伝えることを主体とした活動)と自主発生型(母親同士の仲間作りを主体とした活動)とに分類し予備調査を行った。予備調査は、群馬県M市の集団による保健活動参加者に、半構成的面接を実施した。面接は、研究の主旨および倫理的配慮を説明し、母親の同意を得た上で実施した。調査期間は、平成15年9月から平成16年1月までである。対象は、知識伝達型と自主発生型それぞれ8名であり、母親の年齢は2838歳、参加対象の子どもの年齢は6ヶ月5歳であった。結果、育児不安の内容は、「不安だらけ」「これでいいのかと思う」「できないことがあると不安」「マニュァル通りにいかない」が抽出された。知識伝達型と自主発生型とに分類し分析を行ったところ、集団による保健活動のメリットについては、知識伝達型は「遊びを覚えられる」「身体を動かすことができる」が抽出され、自主発生型は「ストレスが発散できる」、「作り物ができ、楽しい」が抽出された。他の母親との交流状況については、知識伝達型は「子どもが楽しめればいいと思い、他の母親とは交流していない」が抽出され、自主発生型は「情報交換ができる」「同じ境遇の仲間ができる」が抽出された。保健師などの専門職との関わり状況については、知識伝達型は「情報がもらえる」「細かい相談ができる」が抽出され、自主発生型は専門職との関わりはない。これらから、知識伝達型は、保健師などの専門職との相談の場を求めて、自主発生型は、母親同士の交流をはかりながら自分たちの創作活動をする場を求めていたといえる。次年度は、本年度の結果をふまえた質問紙を用いて、育児不安の内容とその軽減を図るための集団による保健活動の効果を客観的に明らかにする。

子どもの変化は、「慣れてきた」、「楽しんでいる」であり、母親の変化は、「子どもを客観視できる」、「育児が楽しいと思える」、「気分転換できる」に多くの回答が得られた。集団による保健活動に参加している母親のうち、保健師が運営している集団による保健活動に参加している母親は2割であり、保健師との関わり状況は、「育児の知識を教えてもらえる」、「いろいろな相談ができる」であった。知識伝達型の集団による保健活動に参加している母親の方が、保健師などの専門職に、育児の知識や保育園などの情報提供とそのような場づくりの役割を求めていることが明らかとなった。
組合せ位相幾何に基づく高レベル仕様からの並列・分散プログラムの生成

位相幾何的手法を用いた共有メモリ並列分散計算モデルの理論では、n+1プロセスからなるシステムの状態をn次元の図形(単体的複体)とみなし、その幾何的な特徴によって計算能力を同定することができる。この単体的複体に「穴」を開ける操作に対応する実行が可能であり、その穴が高次元であればあるほど、そのシステムは高い計算能力を持つことが知られている。昨年度までの研究対象であった、即時スナップショットモデルは「穴」を開けることができないため、その計算能力は非常に限られている。当該年度の研究では、「穴」を開けることが可能なより強力な計算モデルのひとつであるk-並列実行(高々k個のプロセスまでが並行してプロトコルを実行可能)モデルを用いて並列分散計算の仕様を記述するための基盤として、このモデルが導出する単体的複体の組み合わせ幾何的構造とその幾何的特徴について研究を行った。即時スナップショットプロトコルについて、これをk-並列実行したときの出力結果に対応する単体的複体の幾何的特徴をあらわすEuler標数の一般形を特定した。(河合草一氏との共同研究)この結果は、数え上げ組み合せ論で用いられる母関数の手法を適用し、即時スナップショットの単体的複体に含まれる各次元の単体の個数を正確に数え上げることによって得ており、分散計算と組合せ論というふたつの分野の意外な関連を示唆しており興味深い。一方、即時スナップショットの二回繰り返し実行をk-並列実行した場合の単体的複体は、並列度kを下げる毎により高次元の穴が広がっていくよい構造を持っていることがGafniらによって示唆されている。この単体的複体のEuler標数の特定も試みたが、残念ながらこれにうまく対応する母関数が構成できなかったためよい結果は得られなかった。この点については、数え上げ組み合せ論での母関数の手法のさらなる深化が待たれるところである。当該年度の研究ではk-並列即時スナップショットの位相幾何的構造、特に高次元の穴の空き方に関する幾何的指標については一定程度の理解を進めることができ、これによって年度目標に掲げていた位相幾何的構造と分散システムの橋渡しを一定程度強化することができた。しかし、即時スナップショットの二回繰り返しk-並列実行に関しては、十分に満足できる成果にまでは到達できなかった。これは、そのような並列実行から導出される組み合せ構造が予想していたよりずっと複雑度の高いものと判明したためである。このような組み合わせ構造は本質的に困難な数学的構造を内在していると考えられるが、この方面での研究は組合せ論の分野でも手付かずのようである。ただ、このような組み合せ構造の調査の過程でいくつかの重要な知見を得ることができた。その中でもとくに重要なのは、即時スナップショットの二回繰り返し実行によって得られる単体的複体に対応する組み合せ構造の表現として、2つの直行する順序付き集合分割の行列表現の着想を得たということである。このことは次年度の研究を推進する大きな足掛かりとなる。上述の行列表現を利用することによって、即時スナップショットの二回繰り返しのk-並列実行の組み合わせ的特徴づけを統一的かつ見通しよく与えることが可能になると考えられる。本研究課題最終年度では、この行列表現を中核として主に以下の2点の課題に注力して研究を推進していく方針である。【k-並列分散計算の高レベル仕様記述】即時スナップショットの二回繰り返しのk-並列実行モデルは、並列度kを変化させることで柔軟に単体的複体の高次元の穴の空き方を調整することができるため、様々な計算能力に対応するシステムの統一的な仕様記述に対応できると考えられるが、その扱いは単体的複体の組み合せ幾何的構造の複雑さゆえその扱いは明らかではない。上記の行列表現から、組み合せ幾何的構造の厳密かつ簡明な表現方法を開発する。この表現方法を基盤として、分散並行計算を、単体的複体の変形に関する仕様として記述する方法を与える。【単体的複体変形の仕様記述からのプログラム生成手法】上記の仕様記述は、単体的複体に関する変形に対するものであるから、これを実際に実行可能な形とするには、仕様に対応したプログラムを生成しなければならない。このような仕様からプログラムの生成のための方法論について考察する。具体的には、各単体に関する操作を、即時スナップショットの二回繰り返しで得られる計算結果と対応させなければならない。これは上記の組み合わせ幾何的構造の表現を用いて統一的に行われることになる。また、k-並列性については、プロセス故障の起こらない通常の並列計算モデルを仮定すれば、並列度を制限することによって容易に実現可能である。これらのプログラム生成のための手法は、前年度に研究を行った即時スナップショットの実行アルゴリズムの最適化手法と組み合わせることも考えられる。近年、分散計算の理論のひとつの重要な潮流として、分散タスクを組合せトポロジーにおける抽象単体的複体間の写像としてモデル化し、プロトコル実現性等の問題を位相幾何的性質の解析によって明らかにしようとする位相幾何的手法が大きく発展してきている。1年目の研究においては、プロトコル実現性を抽象単体的複体の変形可能性の問題に帰着し、この問題をある程度現実的な計算時間内で解くためのアルゴリズムを開発した。分散タスクの仕様からcarrier複体と呼ばれる単体的複体を組合せ的操作によって導出し、プロトコル実現性の問題がこのcarrier複体内での適切な部分複体変形可能性に帰着できることを明らかにした。この問題は一般的には決定不可能であり、これを解く完全なアルゴリズムは存在し得ないが、なるべく広い範囲の分散タスクについて適用可能なもので、健全ではあるが完全ではない(変形可能と判定された場合は実際そうであるが、変形可能であってもそう判定されない可能性がある)アルゴリズムを得ることができた。

完全性をあきらめたとしても、この問題は組合せ的に解の探索空間が非常に大きくなりがちであるが、単体的複体をこれと等価なhypergraphで表し、これに既存の縮約アルゴリズムを適用することによって解の探索空間を大幅に縮退させる手法を開発することによってある程度小さなプロセス数(4くらいまで)の分散タスクに関しては現実的な計算時間で判定を行えることを確認した。また、この手法で正しく判定が行える分散タスクに関する条件を特定し証明を行った。分散read-write共有メモリ型システムにおいて、分散タスクの仕様を満たすwait-free分散プロトコルが存在することの証拠を、タスクの仕様に内在する位相幾何的な性質を利用して自動的に発見するための理論とアルゴリズムの開発とその実証コードのプロトタイプまで行っており研究はおおよそ順調に進んでいる。なお、上記研究の途中段階において、2016年7月に独Dagstuhlで行われたセミナーTopological Methods in Distributed Computingへ発表者の一人として招かれ、位相幾何的手法に関する一線級の研究者達と交流し意見交換を行った。位相幾何的手法を用いた共有分散メモリモデルの理論において中核的な役割を果たす、即時スナップショットプロトコルについて、これを位相幾何的観点からより見通しよく再構成するとともに機械的なプログラム最適化を適用可能にした。即時スナップショットプロトコルはREAD-WRITE共有分散メモリモデルの理論において非常に重要なプロトコルである。即時スナップショットの1回の実行は位相幾何的には単体的複体の標準色付き細分にちょうど対応し、これから同モデルで実現可能な分散計算の位相幾何的特徴付けが与えられる。(HerlihyとShavitによる非同期計算可能性定理)即時スナップショットを実現するアルゴリズムはBorowskyとGafniによって最初に与えられた。しかしながらこのアルゴリズムは、位相幾何的な構成との対応が明確でなかった。実はKozlovによる近年の研究で、標準色付き細分は低次元部分からの段階的なSchlegel図による細分の繰り返しで構成できることが指摘されていた。この結果に合わせて、BorowskyとGafniによる即時スナップショットのアルゴリズムをSchlegel図による細分の繰り返しと対応するように再構成することができることを示した。このように再構成された即時スナップショットのアルゴリズムに対して、部分評価(プログラム変換の分野で知られている最適化の手法)を適用することによって、分散プログラムの最適化を機械的な手続きで行うことが可能であることも示した。すなわち、特定の分散プログラムの実行に含まれる無駄な共有メモリアクセスをプログラムの実行前に機械的に取り除けることを示した。
カルバペネマーゼの活性上昇に関与するアミノ酸残基の網羅的特定と立体構造変化の解析

平成30年度は、1IMP-6、及び類似酵素の構造解析実験、2第2世代の進化酵素遺伝子のライブラリーの作製を行った。まず、IMP-6の構造解析については、従来、3.0 Å程度の分解能の回折データしか得られなかったのに対し、結晶化条件、及び液体窒素で凍結させる際の条件を精密化し、2.2 Åを超える回折データを与える結晶を得ることに成功した。ただ、その成功率がまだ低いため、放射光施設を用いて回折データの取集を続けている。また、昨年度に進化実験で得られたY123N変異型酵素のアミノ酸置換部位は、活性中心から離れた部位にある。同様に活性中心から離れた部位にある1アミノ酸置換が基質特異性に影響を及ぼす例として、CTX-M-1βーラクタマーゼのAla219→Valの変異が報告されている。Ala219は、CTX-M型βーラクタマーゼにおいて高度に保存されている。そこで、この両者に共通する構造変化があるかどうかを探るために、本邦で多く分離されるCTX-M-2、及びA219V変異型酵素の構造解析を行った。ところが、両者の構造にはほとんど差がなかったとともに、酵素学的パラメータも差が見られなかった。従って、このアミノ酸置換により基質特異性が変化する現象は、CTX-M-1に特異的であることが示唆された。一方、第2世代の進化酵素遺伝子のライブラリーの作製については、Y123N変異型IMP-6遺伝子に対しランダムなアミノ酸置換を導入した。pHSG398-IMP-6-Y123Nを保有する大腸菌は0.004 mg/mLメロペネムまで生育するため、得られた864コロニーについて0.016 mg/mLのメロペネムを含むLB培地で培養したところ、68コロニーの大腸菌について生育が見られた。それらの遺伝子配列を決定したところ、のべ39か所の変異点が判明した。当初の計画では、平成30年度において、IMP-6の立体構造解析が終了している予定であった。しかしながら、良好な回折データを与える結晶を得る結晶化、及び液体窒素保存条件の決定に時間がかかったために当該年度までの構造決定が行えなかった。このことについては、平成30年度中に結晶化条件、及び液体窒素で凍結させる際の条件を精密化し、2.2 Åを超える回折データを与える結晶を得ることに成功したとともに、平成31年4月にSPring-8でのデータ収集を行い、1.8 Å分解能の回折データを得た。既に3.0 Å分解能におけるIMP-6の構造を決定していることから、今回得られた回折データを用いて、原子レベルでの立体構造解析を行い、すでに立体構造が解明されているIMP-1との比較から、立体構造の違いと基質特異性の変化との相関関係の議論は可能であると考えている。また、進化実験については、平成30年度にpHSG398-IMP-6-Y123Nを保有する大腸菌に対し第2世代の変異型酵素遺伝子を作成し、十分な母集団数についてのスクリーニングを行った。既にこれらの変異型酵素のDNA配列は決定しており、アミノ酸置換が導入された位置は決定している。現在、これらのアミノ酸置換が立体構造上どのような位置にあるかの解析を行っている。また、これらの変異型酵素についての詳細なMIC測定、及び酵素学的性質の決定を遂行している状況であるので、令和元年度は当初の計画に沿った実験が可能であると考えている。IMP-6の構造解析については、平成30年度に結晶化条件、及び液体窒素で凍結させる際の条件を精密化し、2.2 Åを超える回折データを与える結晶を得ることに成功したことから、平成31年4月にSPring-8でのデータ収集を行い、1.8 Å分解能の回折データを得た。すでに3.0 Å分解能におけるIMP-6の構造を決定していることから、今回得られた回折データを用いて、原子レベルでの立体構造解析を行い、すでに立体構造が解明されているIMP-1との比較を行うことで、両者の立体構造の違いを解明し、立体構造と基質特異性の変化との相関関係の議論を行う予定である。第2世代の変異型酵素の解析については、既に十分な母集団数についてのスクリーニングを行ったうえ、個々の変異型酵素のDNA配列は決定しており、アミノ酸置換が導入された位置は決定している。そこで、これらのアミノ酸置換が立体構造上どのような位置にあるかの解析を行っている。また、これらの変異型酵素についての詳細なMIC測定、及び酵素学的性質の決定を遂行している状況にある。さらに、基質特異性の変化が見られた変異型酵素については、結晶化条件のスクリーニングを行い、構造解析実験を行う予定である。以上の実験を通して、IMP型βーラクタマーゼにおいては、アミノ酸置換の導入によりどのように基質特異性が変化するか、アミノ酸置換の導入が立体構造に与える影響はどのようなものであるかという疑問に対する答えを得ていく予定にしている。平成29年度は、既に作成されていたIMP-6を恒常的に発現する大腸菌より、プラスミドpHSG298-IMP-6を単離し、IMP-6遺伝子に対して1Kbあたり1塩基置換程度の頻度で変異が導入される条件で、変異導入PCRを行った。得られたフラグメントをpHSG298-IMP-6の野生型IMP-6遺伝子と入れ替えて挿入し、変異型IMP-6遺伝子を持つプラスミドライブラリーを作成した。得られたプラスミドライブラリーを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られた形質転換体297