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苔類ツボミゴケ属の化学成分および生理活性物質の探索

前年度に引き続きツボミゴケ属苔類について,またツボミゴケ属以外のヨーロッパ産苔類についても成分研究を行った.それぞれの有機溶媒抽出物の各種クロマトグラフィーを行うことにより,各成分を単離,精製した.また単離が困難なフラクションについては,申請,購入した紫外可視分光検出器を付随した高速液体クロマトグラフィーにより精製した.その結果,オオホウキゴケから新規パーオキシクパラン型セスキテルペノイド,新規パーオキシラブダン型および新規セコラブダン型ジテルペノイドを,その他に多数の既知化合物をそれぞれ単離した.新規化合物の相対構造は,主としてNMR解析を行うことにより決定した.しかし,相対立体構造の決定が困難であり,幸運にも結晶化した化合物についてはX線結晶解析により決定した.また,絶対構造未知の化合物については,CDスペクトルの測定,絶対既知化合物への化学誘導,あるいはX線結晶解析を行うことにより決定した.また,ツボミゴケ属以外の数種のヨーロッパ産苔類からも新規セスキおよびジテルペノイドと既知セスキおよびジテルペノイドを単離,構造決定した.今回のツボミゴケ属苔類の研究の結果とこれまでに行ってきた研究の成果とを併せ考えると,同族同種であっても地理的差異による化学成分の違いがあることをさらに裏付ける結果を得た.また,新規ラブダン型ジテルベンやパーオキシクパラン型セスキテルペンは,生合成課程を考える上で興味ある化合物であると考える.また,ヨーロッパ産苔類からの新規化合物の単離,構造決定は,これまでに行ってきた苔類の化学成分研究の資料の一部として新たな知見を得ることができた.今回,単離,構造決定した化合物の一部は,他の研究機関に依頼して活性試験をおこなったところ,数種の化合物にMMP阻害活性が弱いながらも見られ,また抗HIV活性,トポイソメラーゼ活性についても現在検討中である.各地で採集した数種のツボミゴケ属苔類オオホウキゴケについて成分研究を行った.それぞれのエーテルもしくはメタノール抽出物は,各種クロマトグラフィーを繰り返し行うことにより各成分を単離,精製した.また単離が困難なフラクションについては申請した高速液体クロマトグラフ用紫外可視分光検出器を付随した高速液体クロマトグラフィーにより精製した.その結果,オオホウキゴケの粗抽出物から新規パーオキシクパラン型セスキテルペノイドおよび新規ビスノルクレロダン型,クレロダン型および新規単環性変形ラブダン型ジテルペノイド,そのほかに既知クパラン型セスキテルペンとクレロダン型,カウラン型およびラブダン型ジテルペンをそれぞれ単離した.新規化合物の相対立体構造については,おもに2D-COSY NMRスペクトルの測定により決定したが,その決定が困難であり,幸運にも結晶化した化合物についてはX線結晶解析により構造を決定した.また,新規化合物の絶対構造および絶対構造不明の既知化合物については,CDスペクトルの測定,MTPA誘導体による新Mosher法の適用あるいはX線結晶解析を行うことにより,その絶対構造を決定した.パーオキシクパラン型セスキテルペノイド,ビスノルクレロダン型および単環性変形ラブダン型ジテルペノイドを苔類から単離したのは今回が最初の例であった.これまでに採集場所の違うオオホウキゴケの成分研究を行ってきており,採集地の違いによって含まれる化学成分が異なっていることを明らかにしている.今回の研究においても,採集地の違いによって含まれる化学成分が異なっていた.このことは,オオホウキゴケのケモシステマテイクスを考えるうえで,新たな知見として重要であると考えている.さらに,得られた化合物の生理活性については,現在検討中であるが,既知力ウラン型ジテルペンの一つには弱い抗菌活性があることが明らかなった.前年度に引き続きツボミゴケ属苔類について,またツボミゴケ属以外のヨーロッパ産苔類についても成分研究を行った.それぞれの有機溶媒抽出物の各種クロマトグラフィーを行うことにより,各成分を単離,精製した.また単離が困難なフラクションについては,申請,購入した紫外可視分光検出器を付随した高速液体クロマトグラフィーにより精製した.その結果,オオホウキゴケから新規パーオキシクパラン型セスキテルペノイド,新規パーオキシラブダン型および新規セコラブダン型ジテルペノイドを,その他に多数の既知化合物をそれぞれ単離した.新規化合物の相対構造は,主としてNMR解析を行うことにより決定した.しかし,相対立体構造の決定が困難であり,幸運にも結晶化した化合物についてはX線結晶解析により決定した.また,絶対構造未知の化合物については,CDスペクトルの測定,絶対既知化合物への化学誘導,あるいはX線結晶解析を行うことにより決定した.また,ツボミゴケ属以外の数種のヨーロッパ産苔類からも新規セスキおよびジテルペノイドと既知セスキおよびジテルペノイドを単離,構造決定した.今回のツボミゴケ属苔類の研究の結果とこれまでに行ってきた研究の成果とを併せ考えると,同族同種であっても地理的差異による化学成分の違いがあることをさらに裏付ける結果を得た.また,新規ラブダン型ジテルベンやパーオキシクパラン型セスキテルペンは,生合成課程を考える上で興味ある化合物であると考える.また,ヨーロッパ産苔類からの新規化合物の単離,構造決定は,これまでに行ってきた苔類の化学成分研究の資料の一部として新たな知見を得ることができた.今回,単離,構造決定した化合物の一部は,他の研究機関に依頼して活性試験をおこなったところ,数種の化合物にMMP阻害活性が弱いながらも見られ,また抗HIV活性,トポイソメラーゼ活性についても現在検討中である.
環境水域の変異原性モニタリングのための新手法の研究

環境水域の変異原性モニタリングのためのブルレーヨン懸垂法を確立するとともに、継続したフィールドワークを行ない、検出した変異原性物質の解析を行なった。すなわち、京都・大阪を流れる淀川水系河川水の変異原性を1988年及び1990年にブルーレーヨン法で調べたところ、高い変異原性を検出した。次にその原因物質についての解析を行った、高速液体クロマトグラフ(HPLC)による分離を試みたところ、4種類のフレームシフト型間接変異原が存在することが明らかになった。また1988年と1990年の試料を比較したところ、HPLCの保持時間が同じであった。従って原因物質はある特定の物質であることが示唆される。またサルモネラ菌のO-アセチルトランスフェレース高生産株YG1024(tS9)で強い活性が得られることから多環性芳香族アミンであろうと推定した。またこの新手法が従来法と比べてどのような利点があるか研究した。瀬戸内海沿岸の海水をブルーレーヨン法で調べたところ10ヶ所の調査点で夏と秋の2回集めたサンプルから変異原物質ベンツ(a)ピレンを検出した。従来法では日本の沿岸海水中のベンツ(a)ピレン量は検出限界以下で検出されていなかった。2年間の成果をまとめると、ブルーレーヨンを水中に懸垂する方法によって、水域の変異原物質を簡単にモニターできることがわかった。24時間曝露するという半定量的な方法であるが、汚染源の検索に威力を発揮した。定量的に検討した結果、水の流速が大きく影響を与え、流速が大きい程、有効であった。環境水域の変異原性モニタリングとして、フィ-ルドワ-クを行ない、京都・大阪を流れる淀川水系河川水の変異原性をブル-レ-ヨン懸垂法で調べた。その結果淀川水系の1つ,桂川流域に位置する下水処理場からの処理放流水中から、変異原性を検出した。下水処理放流水中の変異原物質の精製・分離を行なったところ、少なくとも4種類は存在することがわかった。さらに、そのうち3種の精製物および1種の粗精製物を得た。いずれもフレ-ムシフト型間接変異原物質であり,その変異原性は非常に強いと考えられることもわかった。既知の変異原物質15種類との比較では該当するものはなく、未知の変異原物質である可能性がある。また、構造的には芳香族アミンであるという示唆を得ている。フィ-ルド・ワ-クとしては、日本国内のみならず、米国テキサス州のガルベストン湾における水域の変異原性モニタリングを行なった。また、日本国内の水域に関しては、繰り返し例を重ねて変異原性調査を行なった。吸着素材の検討も行なった。これまではブル-レ-ヨン,すなわち,レ-ヨンの1種の非晶質レ-ヨンに〓フタロシアニンを固着させたものを用いて研究を行なってきた。このブル-レ-ヨンは綿状の形状であるが、これをスポンジ状、あるいは薄いスポンジシ-ト状としたものについても検討している。環境水域の変異原性モニタリングのためのブル-レ-ヨン懸垂法を確立するとともに、継続したフィ-ルドワ-クを行ない、検出した変異原性物質の解析を行なった。すなわち、京都、大阪を流れる淀川水系河川水の変異原性を1988年及び1990年にブル-レ-ヨン法で調査したところ、高い変異原性を検出し、その主要な汚染源が下水処理場の処理放流水にあることがわかったので、原因物質についての解析を行なった。高速液体クロマトグラフ(HPLC)による分離を試みたところ、4種類のフレ-ムシフト型間接変異原が存在することが明らかとなった。また、1988年と1990年の試料を比較したところ、HPLCの保持時間が同じであった。また、サルモネラ菌のO-アセチルトランスフェレ-ス

高生産株YG1024(+S9)で強い活性が得られることから、多環性芳香族アミンであろうと推定した。この新手法が従来法に比べてどのような利点があるか研究した。対象とする変異原物質としてベンゾ(a)ピレン(B(a)P)を用いた。まず、室内水槽実験により懸垂したブル-レ-ヨンにB(a)Pが吸着すること、吸着量は時間とともに増大すること、水槽内の水の流速が大きいほど吸着量が大きくなることを明らかにした。さらにフィ-ルドワ-クとして、瀬戸内海沿岸の海水にブル-レ-ヨンを24時間懸垂してB(a)Pが検出できるかを調べた。その結果10ヶ所の調査点から夏と秋の各2回集めたサンプルからB(a)B3.5-80.3mg/gブル-レ-ヨンを検出した。従来は、1lの海水を有機溶媒抽出して定量する方法が行なわれ、日本の沿岸海水からB(a)Pは検出されていなかった。
対話の相互作用モデルの構築と数学学習を深める授業デザイン原則の抽出の往還

本研究は理論研究と実践研究を往還させたデザイン研究であり、学級内のすべての子どもが対話に参加し、算数・数学学習を深めていく学習の実現を目指す。そのために、理論研究として、話し言葉、動作等を組み込んだ対話の相互作用モデルを構築する。実践研究としては、このモデルを基盤として授業実践を行う。同一授業内でより算数・数学学習が深まったグループとそうでないグループを比較考察して要因を抽出し、再実践・再分析を続けていく。この実践と分析のサイクルを繰り返すことで、目的とする授業を実践するための授業デザインを修正し続ける。またこの継続的な分析から理論的な示唆を得て、対話モデルの修正も試みる。
Gタンパク質共役受容体に働く新規治療薬シーズの探索と活性評価

ヒト苦味受容体T2R16に対するアゴニスト活性の検討我々は今回、苦味受容体mT2R5とGiαの融合タンパク質を利用して苦味の受容体がGiと共役できることを示すことができた。これまで苦味受容体は味雷細胞に特異的なgustdusinと共役して働くと考えられていたため、苦味受容体の発現が他の臓器で確認されてもその意義は議論の対象にならなかった。しかし今後は各臓器で発現している苦味受容体の働きが今後ホルモンやオータコイドの受容体と同様に注目されると考えられる。そこでさらに腎臓などでの発現が観察され、phenyl-β-D-glucopyranosideによって活性化されることが報告されているヒトの苦味受容体T2R16を用いて以下のような検討をした。(1)京都薬科大学の吉川先生、松田先生より生薬由来の苦味物質として、ニガウリ(Momordica charantica)とコロシント(Citrullus colocynthis)の抽出画分をいただいた。このうちコロシント果実のメタノール抽出物の酢酸エチル可溶性画分にT2R16に対するアゴニスト活性が見出せた。そこでさらにこの画分の主成分であるcucurbitacin E 2-O-β-D-glucopyranosideをいただき、その活性を検討した。T2R16のアゴニストであるphenyl-β-D-glucopyranosideとこの化合物はグルコースの1位にphenyl基がついているかステロイド骨格がついているかの違いでありその活性が注目されたが、cucurbitacin E 2-O-β-D-glucopyranosideにT2R16のアゴニスト活性は検出できなかった。今後、他の成分にアゴニスト活性があるかどうか検討していきたい。(2)帝京大学薬学部の高橋先生よりグルコースとさまざまな糖からなる非天然型の合成糖ダイマー31個をいただいた。この中の数種類について弱いながらT2R16のアゴニスト活性が検出された。今後、この活性と糖の構造の関係についてさらに詳しく検討していきたい。
小笠原諸島における高等植物広分布域種の分化

小笠原諸島には多くの固有植物が産するが、このほかに他の地域の植物と形態的分化があまりおきておらず、広域分布種とされている植物も産する。本研究はこれまで蓄積した小笠原産固有種とその近縁種との遺伝的差異にくらべ、同諸島に産する広域分布種の小笠原と他の地域の集団間の遺伝的差異がどうであるかを明らかにする目的で行なわれた。小笠原諸島に分布する広域分布種としてテイカカズラとウラジロエノキを選び、テイカカズラは沖縄の石垣島と本州の知多半島の2集団、ウラジロエノキは石垣島の1集団をサンプリングし、小笠原諸島の集団との遺伝的差異を調査した、遺伝的差異は酵素多型分析によりNeiの遺伝的同一度を計算することにより比較を行なった。テイカカズラでは8酵素14遺伝子座について解析し小笠原集団と他の集団の遺伝的同一度の平均は0.786であった。ウラジロエノキについては8酵素15遺伝子座について解析を行ない集団間の遺伝的同一度として0.732の値を得た。これまでの小笠原の固有種と周りの地域の近縁種間の遺伝的同一度はアゼトウナ属で0.533、トベラ属で0.647、ハイノキ属で0.538であったが、今回の研究で得られた2種の広分布域種の値はこれらの固有種と比べて高い値を示した。これは今回調べた2種の広分布域種が小笠原諸島に進入した時期が固有種になった植物の祖先に比べて遅いか、あるいは両集団間になんらかの遺伝的な交流があるかどちらかである。いずれにせよ、形態的な分化の低さは遺伝的にも分化が進んでいないことを示している。
周産期障害による脳皮質のneuronal lossの評価

未熟児あるいはrisk児で,脳障害の有無を明かにするため,あるいは神経学的予後判定のために乳児期(生後1-13ケ月)に施行されたMRI画像のうち,後に神経学的に正常発達と診断された児(早期産児23例39MRI,満期産児19例26MRI)のMRIを用い,早期産児(preterm群)と満期産児(full term群)の脳の形態的発達に差異があるか否かについて検討した.MRI装置はGE社製Signa 1.5Tを用いた.Spin echo法TR600msec,TE30msec,T1強調像を,TR2000msec,TE80msecでT2強調像を得た.スライス幅は水平断で6mm,矢状断で10mmである.MRI画像をコンピューター画像解析装置に取り込み,脳室/脳比(T1強調像で側脳室前角が明瞭な断面より側脳室前角間距離と大脳の幅を計測:V/B比),脳実質と頭蓋骨との距離(extracerebral space)の幅(T2強調像で側脳室体部が明瞭な断面においてextracerebral spaceの最大値を計測:Es),脳梁の厚み(矢状断正中T1画像で脳梁体部の前方から1/3の部分の厚みを測定:CC)した.両群間の差異を共分散分析を用いて検討した.また早期産児については出生予定日より換算した修正月齢で判定した.1.V/B比は,preterm群,full term群ともに月齢に関係なく一定(0.30-0.37)の値を示した.2.Esは,preterm群,full term群ともに月齢との間に一定の関係はなく,いずれも8mm以下であった.3.CCは,preterm群,full term群とともに増加したが,両群間に有意差は認められなかった.これまでの検討においてはpreterm群とfull term群との間に有意差はみとめられなかった.今後は早期産児,満期産児の脳の皮質,白質の面積の差異を検討する予定である.未熟児あるいはrisk児で,脳障害の有無を明かにするため,あるいは神経学的予後判定のために乳児期(生後1-13ケ月)に施行されたMRI画像のうち,後に神経学的に正常発達と診断された児(早期産児23例39MRI,満期産児19例26MRI)のMRIを用い,早期産児(preterm群)と満期産児(full term群)の脳の形態的発達に差異があるか否かについて検討した.MRI装置はGE社製Signa 1.5Tを用いた.Spin echo法TR600msec,TE30msec,T1強調像を,TR2000msec,TE80msecでT2強調像を得た.スライス幅は水平断で6mm,矢状断で10mmである.MRI画像をコンピューター画像解析装置に取り込み,脳室/脳比(T1強調像で側脳室前角が明瞭な断面より側脳室前角間距離と大脳の幅を計測:V/B比),脳実質と頭蓋骨との距離(extracerebral space)の幅(T2強調像で側脳室体部が明瞭な断面においてextracerebral spaceの最大値を計測:Es),脳梁の厚み(矢状断正中T1画像で脳梁体部の前方から1/3の部分の厚みを測定:CC)した.両群間の差異を共分散分析を用いて検討した.また早期産児については出生予定日より換算した修正月齢で判定した.1.V/B比は,preterm群,full term群ともに月齢に関係なく一定(0.30-0.37)の値を示した.2.Esは,preterm群,full term群ともに月齢との間に一定の関係はなく,いずれも8mm以下であった.3.CCは,preterm群,full term群とともに増加したが,両群間に有意差は認められなかった.これまでの検討においてはpreterm群とfull term群との間に有意差はみとめられなかった.今後は早期産児,満期産児の脳の皮質,白質の面積の差異を検討する予定である.
転写共役ヌクレオチド除去修復因子の生化学的解析

RNAの転写と共役して働く転写共役型ヌクレオチド除去修復(TC-NER)におけるCSA・CSB・UVSSAといったTC-NER特異的因子の詳細な働きは未だ不明である。そこで、DNA損傷を部位特異的に導入したDNAテンプレートを作製して、in vitro TC-NERアッセイ系を再構築して生化学的にTC-NER特異的因子の機能解明することを目指した。また、UVSSAの機能解明の手がかりとするために、結晶構造解析を目的としたUVSSAタンパク質の精製を行なった。本研究の主要な目的である転写共役型ヌクレオチド除去修復(TC-NER)反応のin vitro再構成系の確立のため、蛍光物質修飾をDNA損傷に見たてたDNAテンプレートの構築を行った。1カ所に蛍光物質修飾を組み入れたDNAプラスミドを構築して、HeLaの抽出液を用いてTC-NER反応の再現を試みたところ蛍光物質の切り出しがみられた。しかしながらHeLa抽出液中のヌクレアーゼ活性が非常に高くて切り出された蛍光物質を含むフラグメントはかなり小さな断片になっていたが、TC-NERのテンプレートとしては機能していると思われる。またTC-NERに重要で機能が未知のUVSSAの結晶構造解析を目的として、UVSSAタンパク質の精製をおこなった。元々非常に不溶性であるためにUVSSAは精製が困難であったが、これまでに効率よくUVSSAを精製する条件を見出し、結晶化をめざしてUVSSAを精製している。In vitro転写系・TC-NER反応系の確立に向けて、その転写テンプレートとなる蛍光物質でラベルしたDNAプラスミドを構築した。またUVSSAタンパク質は非常に不溶性で精製が不可能であったが、結晶構造解析に向けて大量精製出来るようになった。転写共役型ヌクレオチド除去修復では、アクティブに転写されている遺伝子のDNA損傷部位で停止したRNAポリメラーゼがシグナルとなって、CSA・CSB・UVSSAといった転写共役型ヌクレオチド除去修復に特異的な因子が集積して、その後NER複合体を損傷部位に呼び込むことで修復の主要反応が進行していく。しかしながらその過程において、CSA・CSB・UVSSAがどのような働きをしているのか詳細は不明である。本研究では、転写共役ヌクレオチド除去修復に関わる個々の因子を単離・精製して、生化学的解析からそれぞれの因子の働きを解析し、最終的にはin vitro転写・修復反応系を再構築する事でTC-NER反応機構の解明を目指している。特に本年度はTC-NERに必須であるがその働き詳細が全く不明であるUVSSAの機能解明の手がかりとするために、結晶構造解析を目的としたUVSSAタンパク質の精製方法の改良を行なった。元々UVSSAは非常に不溶性であるために精製が困難であったが、これまでに大量に精製できる段階に至っていた。しかし結晶化のためには高濃度のタンパク質標品が必要であるところ、濃縮すると凝集してしまう等のため高濃度のUVSSAタンパク質標品が得られないという壁に直面していた。そこで精製方法を根本から見直してさらなる改良を加えて、数mg/mlという高濃度のUVSSAタンパク質を精製することに成功し結晶化スクリーニングを開始した。UVSSAの機能解明のために結晶化をめざしたUVSSAタンパク質の精製で、これまで到達できなかった高濃度のUVSSAタンパク質を精製することができ、タンパク質結晶化のスクリーニングの段階に入った。RNAの転写と共役して働く転写共役型ヌクレオチド除去修復(TC-NER)では、活発に転写されている遺伝子上のDNA損傷部位でRNAポリメラーゼが停止することで損傷が認識されて、CSA・CSB・UVSSAといったTC-NERに特異的な因子が集積して、その後主要なNER複合体を損傷部位に呼び込むことで修復反応が進行していく。しかしながらその過程においてCSA・CSB・UVSSAの詳細な働きは未だ不明である。そこで、UVSSAの機能解明の手がかりとするために、結晶構造解析を目的としたUVSSAタンパク質の精製を引き続き行なった。UVSSAタンパク質は不溶性であるために精製が困難な中これまでに高濃度のタンパク質標品が精製できる段階に至っていた。しかしながらそれでもUVSSAタンパク質の結晶化には至らず、さらに高純度かつ高濃度のタンパク質標品を得るためにアフィニティータグや可溶化タグを使用するなど精製方法の改良を加えて結晶化スクリーニングを実施した。また、DNA損傷時にはRNAポリメラーゼは速やかにユビキチン化されることが判明していて、UVSSAはCSA・CSB複合体と協調して転写型RNAポリメラーゼの機能的なユビキチン化による安定性制御及びTC-NERの正常な進行に関わることが示唆されている。RNAポリメラーゼは12のサブユニットからなる複合体であるがそのうち主にユビキチン化修飾に関与するのは最も大きなサブユニットのRPB1である。RNAポリメラーゼユビキチン化反応をin vitroで生化学的に解析するために、昆虫細胞系を用いてRPB1タンパク質を精製する系を確立した。それを基質に用いて、ユビキチン化反応に必要な一連のユビキチンリガーゼ複合体と共にin vitro反応系でTC-NER特異的因子の関与を検討した。

また、UVSSAの機能解明の手がかりとするために、結晶構造解析を目的としたUVSSAタンパク質の精製を行なった。FLAGタグとHisタグを付加したRNAポリメラーゼIIを発現する細胞を入手しているので、この細胞を大量に培養してFLAGとHisを利用したアフィニティー精製によりRNAポリメラーゼIIの精製を行う。精製したRNAポリメラーゼIIを用いてin vitro転写系を再構築し、特に蛍光標識テンプレートにおいてRNAポリメラーゼIIの転写が停止することを確認する。その確認が取れた上で、これまでに精製したTC-NER因子を添加していきTC-NER反応系の再構成を試みる。またUVSSAタンパク質を高濃度・高純度で精製し、結晶化条件をスクリーニングしてUVSSAの結晶化・X線回折による構造解析を行う。引き続きUVSSAタンパク質の結晶化スクリーニングを行なっていき、結晶が得られたらX線回折による構造解析をおこなう。また、これまでに構築した蛍光物質修飾を組み入れたDNAプラスミドをテンプレートとして、HeLaの抽出液を用いてin vitroのTC-NER反応の再現を試みていく。分子生物学UVSSAタンパク質の結晶構造解析のためのスクリーニングは共同研究を活用するなど、当初予定していたよりも安価に実施可能であったため研究費を次年度に繰り越すこととなった。UVSSAを始めとするTC-NER関連タンパク質の精製やin vitroでのTC-NER反応の再現を行なうための消耗品費として使用する他、UVSSAタンパク質の結晶化に成功した場合はSpring-8などのX線照射施設の利用料等に使用する予定である。
IgA腎症におけるIgAのメサンギウム沈着,増殖への断片化フィブロネクチンの役割

IgA腎症患者血清のヘパリンアフィニティーカラム(HC)溶出物には正常者と異なるフィプロネクチン(FN)断片化物が特にC-末端を認識するモノクロナール抗体で約43kdの位置に検出されることを示してきた.この断片化物がIgAと結合性を示すことが本研究の重要な課題であった.今回,この断片化物は確かにIgAとの結合性を有することが示され,IgA腎症におけるIgA沈着機序の新しい考え方として提唱しうるように思われる.1平成7年度の検討は,(1)HC処理IgA腎症患者血清,ニトロセルロース膜に固相化したカテプシンD処理断片化FNに対するIgAの結合性,および(2)IgA1-カラム結合性FN断片化物の性状について行った.その結果,IgAの結合は約60kdの泳動帯のみにみられ,酵素処理断片化FNへの結合位置と類似していたが,抗体による同一性の証明はできなかった.酵素処理FNのIgA1-カラム溶出物は極めて微量で分析には不適であった.そこで,(3)IgA-親和性担体であるjacalin-agarose(J)を用いて血清を処理,結合したIgAを介して結合するFNを抗体で検出することを試みた.その結果,FNが検出されたが,FN単独による背景反応により目的とする断片化物は示されなかった.2平成8年度は,血清内断片化物とIgAとの反応性のモデルとして,精製IgA1と酵素処理FNを試験管内で混合,孵置,ついでJと反応させ,IgAと共に結合するFN断片化物を上述と同様にモノクロナール抗体により解析した.その結果,患者で示された約43kdのC-末端を含む断片化物は,IgAを強く結合することが示された.FNのC-末端は細胞外基質の会合に重要な役割を果たしていることが知られており,これがIgAとの結合性を有することはこれまで未知であったIgA沈着機序の考え方として興味ある所見である.IgA腎症にみられるIgA-フィブロネクチン形成の意義を検討するために以下の研究を行った.I)断片化フィブロネクチンとIgA1の結合性の検討.【検討項目】(1)Heparin-affinityカラム処理IgA腎症患者血清,cathepsin D処理FNをSDS-PAGEからnitrocellurose膜へ転写,固相化したFN断片化物に対するIgAの結合性.(2)IgA1-affinityカラム結合性FN断片化物の性状.(3)未処理FNを被覆したpolystyreneへのIgA-断片化FN混合物の結合性.【結果】固相化患者血清由来泳動物へのIgAの結合は約60kdの泳動帯のみにみられカテプシンD処理断片化FNへの結合位置と類似していた.酵素処理FNのIgA1-カラム溶出物はきわめて微量で上述のIgA結合結合フィブロネクチン断片化物と同一であるかはさらに検討が必要である.IgA1-断片化FN混合物のFN被覆plateへの結合性はIgA1-無処理FN混合物より大であった.II)IgA1-アフィニティー担体であるジャカリンアガロースをbatchwiseに用いて試験管内精製IgA-フィブロネクチン複合体におけるフィブロネクチン断片化物の性状の検討.【検討項目】IgA1あるいは初乳由来IgAとカテプシンD処理FNを試験管内で混合,孵置,ついでjacalin-agaroseと反応させ,IgAを介して結合すると思われるFNをSDS-PAGE,抗ヒトFN-monoclonal抗体(Takara,FN1-1)によるwestern blotを行った.対照としてIgG+FN,protein Gによる検討を加えた.【結果】jacalinによる血清処理では,患者,対照ともにFNが検出されたが,FNあるいはFN断片化物単独でも結合性を示し,IgA-FNのIgA側の結合仲介物としては,不適当であった.また,報告されているjacalinを用いたIgA1精製は容易にFNが混入する可能性が示唆された.IgA腎症患者血清のヘパリンアフィニティーカラム(HC)溶出物には正常者と異なるフィプロネクチン(FN)断片化物が特にC-末端を認識するモノクロナール抗体で約43kdの位置に検出されることを示してきた.この断片化物がIgAと結合性を示すことが本研究の重要な課題であった.今回,この断片化物は確かにIgAとの結合性を有することが示され,IgA腎症におけるIgA沈着機序の新しい考え方として提唱しうるように思われる.1平成7年度の検討は,(1)HC処理IgA腎症患者血清,ニトロセルロース膜に固相化したカテプシンD処理断片化FNに対するIgAの結合性,および(2)IgA1-カラム結合性FN断片化物の性状について行った.その結果,IgAの結合は約60kdの泳動帯のみにみられ,酵素処理断片化FNへの結合位置と類似していたが,抗体による同一性の証明はできなかった.酵素処理FNのIgA1-カラム溶出物は極めて微量で分析には不適であった.そこで,(3)IgA-親和性担体であるjacalin-agarose(J)を用いて血清を処理,結合したIgAを介して結合するFNを抗体で検出することを試みた.その結果,FNが検出されたが,FN単独による背景反応により目的とする断片化物は示されなかった.

2平成8年度は,血清内断片化物とIgAとの反応性のモデルとして,精製IgA1と酵素処理FNを試験管内で混合,孵置,ついでJと反応させ,IgAと共に結合するFN断片化物を上述と同様にモノクロナール抗体により解析した.その結果,患者で示された約43kdのC-末端を含む断片化物は,IgAを強く結合することが示された.FNのC-末端は細胞外基質の会合に重要な役割を果たしていることが知られており,これがIgAとの結合性を有することはこれまで未知であったIgA沈着機序の考え方として興味ある所見である.IgA腎症患者血清のへパリンアフィニティーカラム(HC)溶出物には正常者と異なるフィブロネクチン(FN)断片化物が特にC-末端を認識するモノクロナール抗体で約43kdの位置に検出されることを示してきた。この断片化物がIgAと結合性を示すことが本研究の重要な課題であった。今回,この断片化物は確かにIgAとの結合性を有することが示され,IgA腎症におけるIgA沈着機序の新しい考え方として提唱しうるように思われる。1)これまでの検討は,(1)HC処理IgA腎症患者血清,ニトロセルロース膜に固相化したカテプシンD処理断片化FNに対するIgAの結合性,および(2)IgA1-カラム結合性FN断片化物の性状について行った。その結果,IgAの結合は約60kdの泳動帯のみにみられ,酵素処理断片化FNへの結合位置と類似していたが,抗体による同一性の証明はできなかった。酵素処理FNのIgA1-カラム溶出物は極めて微量で分析には不適であった。そこで,(3)IgA-親和性担体であるjacalin-agarose(J)を用いて血清を処理,結合したIgAを介して結合するFNを抗体で検出することを試みた。その結果,FNが検出されたが,FN単独による背景反応により目的とする断片化物は示されなかった。2)本年度は,血清内断片化物とIgAとの反応性のモデルとして,精製IgA1と酵素処理FNを試験管内で混合,孵置,ついでJと反応させ,IgAと共に結合するFN断片化物を上述と同様にモノクロナール抗体により解析した。その結果,患者で示された約43kdのC-末端を含む断片化物は,IgAを強く結合することが示された。FNのC-末端は細胞外器質の会合に重要な役割を果たしていることが知られており,これがIgAとの結合性を有することはこれまで未知であったIgA沈着機序の考え方として興味ある所見である。
琉球弧・沖縄トラフのマグマ活動における揮発性成分の寄与解明

琉球弧・沖縄トラフは典型的な島弧・背弧海盆系であるが、その火山活動史については基礎的な地球化学的データすらも十分に揃っておらず、その全容は明らかになっていない。本研究では受入研究機関が収蔵する沖縄トラフの火山岩コレクションについて系統的な地球化学・岩石学的分析を行う。琉球弧火山岩類については地質調査を実施し、新規に採集する。これらの試料について全岩・鉱物化学組成分析を行い、琉球弧・沖縄トラフにおけるマグマ活動の全容を明らかにする。その後、火山ガラスや斑晶中のメルト包有物について揮発性成分分析を行い、琉球弧・沖縄トラフにおける沈み込み帯物質循環やマグマ成因について包括的に理解することを目指す。
超電導エネルギー貯蔵システムに適した新しい原理に基づく電力変換器の研究

イットリウム系セラミック等のいわゆる高温超電導材の発明に伴い、超電導エネルギー貯蔵システムに対する期待が高まってきいてる。従来のシステムでは電力変換器にはサイリスタ整流回路が採用されいてるが、実規模の大容量システムでは送配電系統に種々の高調波障害を引き起こす恐れがある。本研究は、超電導エネルギー貯蔵システムに適した高性能電力変換器の開発を目的として、以下の研究成果を得た。1.開発した電力変換器は、高効率で大容量化が容易、しかも高調波を発生しないという優れた特長を有している。これは、基本的には並列接続形サイリスタ整流回路がエネルギーの放出・流入、すなわち交流から直流(直流から交流)への電力変換を行うが、LCフィルタを整流回路と並列に接続し、電圧形PWM変換器を整合変圧器を介して系統と直列に接続している。整流回路の発生する高調波はLCフィルタが補償し、電圧形PWM変換器はLCフィルタと系統インピーダンスとの反共振の抑制と系統かちLCフィルターへの高調波電流の流入の抑制を行う。このため電圧形PWM変換器の容量は整流回路の約2%で済み、97%の高効率(システム効率)を達成することができた。2.並列接続形サイリスタ整流回路の出力電流のアンバランスを解析し、制御角の誤差が0.25゚の場合でも並列運転が危険となり得ることを明らかにした。この対策として電流フィードバックが有効であることを実験により確認した。従来から相間リアクトルにはギャップ付が用いられていたが、電流フィードバックを付加することによりギャップのない相間変圧器を用いることができる。このため、従来の相間リアクトルと比較して大幅な小型・軽量化(体積容量で1/3)を可能にした。
ヨードシクロカルバメーションによる鎖状の系での立体制御

ヨードシクロカルバメーション反応は,ベンジルオキシカルボニル基等で保護されたアリルアミン,ホモアリルアミン誘導体にヨウ素を作用させると,"保護基"であるカルバメートが求核的に攻撃し,酸化的に閉環する反応である。われわれは,アミノアルコールを与える本反応を鎖状の系での立体化学の制御に展開し,ネガマインシ,ベスタチン,6ーエピ-パプロサミンBなどの生理活性物質の合成に応用し,本反応の有用性を示してきた。本反応は分子内反応であるため,反応の遷移状態は基質の構造により制限をうける。そこで,本研究ではカルバメート窒素原始上の置換基の有無,二重結合のシス,トランスの組合せを系統的に変え,立体選択性,位置選択性がどのように変化するかを明らかにすることを目的とした。この2つのパラメーターを変え,アラニン,バリンより4タイプ,計8個のアリルアミン誘導体を調整し,ヨウ素との反応を行った。シスオレフィンの場合は窒素原子上の置換基の有無にかかわらず,トランス型5員環カルバメートが単一生成物として得られることを明らかにした。この高い選択性は類似するハロラクトン化反応,あるいは他の分子内環化反応の結果ともよく一致する。トランスオレフィンの場合は,窒素原子上に置換基が存在するとトランス型5員環カルバメートが優先して生成するが,選択性はα位の置換基の大きさに依存することを示した。一方,窒素原子上に置換基がないと,予期に反して6員環カルバメートが主生成物として得られることが明らかになった。このような位置選択性の逆転はハロラクトン化反などでは知られておらず,窒素原子を含むヨードシクロカルバメーション反応特有の興味ある結果が得られたものと考えられる。この現象は電子吸引性の窒素原子によるカチオンの不安定化と遷移状態での立体反発によって定性的に説明することができる。
非営利協同セクターによる、市場と社会関係の再構築に関する実証的研究と中範囲理論形成

研究目的は非営利協同セクターとそれを取り囲む三つのセクター〔行政、市場、地域社会〕との相互作用の実態把握と分析を行い、中範囲理論化を試みることにあった。成果は以下の通り。1.非営利・協同セクターと行政との相互作用については、「事業の受・委託」及び「地域政策策定プロセスへの参加」の二点から検討を行った。受・委託関係において留意すべきは、行政と非営利セクターとの間の垂直的な契約関係が相対化され、非営利セクターとのパートナーシップの形成と、さらにはそれを通じた公務労働者側の「仕事の文化」の変容が確認できた。2.非営利・協同セクターと市場との相互作用については、特に規制緩和の進むEU労働市場の中で、移民、障害者、社会的排除の対象者の就労開拓に際し、働く者の側からみた雇用の柔軟化とディーセントワークの保障を確保すべく、非営利セクターが、一方で「規制緩和」の流れ(職業紹介事業を協同組合として展開したり、B型社会的協同組合における雇用形態の多様化の積極的な活用等)を踏襲しながらも、結果として重要な「再規制」機能を果たしていることが確認できた。3.さらに「地域社会」との関係であるが、なぜ非営利・協同組織が「再規制」機能を担いうるのか、その背景としてアソシエイティヴな社会関係〔R.パットナムのいう「ソーシャル・キャピタル〕の歴史的存在と、現代的な再生が重要な土台となっていることが確認できた。中範囲理論化の作業としては、グローバリゼーションや規制緩和の流れの中にあって、非営利・協同セクターは、社会的弱者が「ニッチ」として生き延びる場なのではなく、むしろ市場や行政との積極的関係づくりの中で、他セクターの価値観にも変容をもたらしながら、自らも運動の刷新を模索していく、そのダイナミズムとして「再規制」「ソーシャルキャピタル」「アソシエーション」を相互に関連づけ捉え直す必要性を確認した。成果は以下の通り。二年にわたる研究計画のうち、初年度である本年度の課題は、非営利セクターと他のセクターとの相互作用をめぐる海外研究成果の収集と、事例調査の実施の二つであり、方法論としてはこれを日本の現実とも照らし合わせながら考察することが求められていた。前者については、フィールドワークの対象地域であるイタリアの文献や報告書を中心に分析を行った。また事例調査については、ローマ市、ミラノ市、パヴィア市における社会的協同組合やその関連団体からヒアリングを行い、調査報告書の作成と仮説を提示した研究論文を執筆した。成果として特記すべきは、イタリアにおいては、単位協同組合もさることながら、協同組合のネットワーク組織である事業連合において、市場に対する積極的な関わり合いが形成されている点である。その形成は二つのベクトルによって支えられている。一つは、市場に対する、ある意味での「適応」であり、今ひとつは、市場に対して新しい価値観や仕組みを投げかけようとする「介入」の方向性である。一見相反する二つのベクトルを有することによって、社会的協同組合が、市場との緊張ある連携を形成していることが事例等から仮説として導かれた。また、合併に揺れる日本の中山間地域や、社会的排除の一例としての「ひきこもり」などを通じて、我が国における地域おこしや仕事おこしの課題についても取材を重ねた結果、一般的には社会的弱者とされる「高齢者」や「若年層」において、あらたな「仕事への回路」づくりが積極的に取り組まれていることが明確となった。これについては、田中を含む二名の共著によって、単行本『現場発スローな働き方と出会う』(岩波書店)を発刊した。イタリアにおいては協同運動の背景とその制度化過程および制度化による各主体の変容を重点に展開し、日本においては協同運動の芽生えと制度化にむけた課題を示し得たのが本年度の研究成果である。(790字)

欧州各国では、非営利事業組織を主な担い手とする「社会的経済」を、日本に一歩先んじて制度化してきた。たとえばイタリアの場合、小規模で公共性の高い非営利事業組織の法的な認知を1991年に「社会的協同組合法」という形で実現し、以降、自治体が直営で担っていた様々な事業を社会的協同組合に委託する等の過程で、地域にとって最適な「協働」の形とは何かを、協同組合、労働組合、自治体の三者が関わりながら模索してきた。現在、こうした流れが各地に定着したものの、成熟段階に達したがゆえの新たな課題も浮上している。たとえば、非営利事業組織に働く人々の仕事観が徐々にかつての公務員に類似してきたこと、非営利事業体が地域社会における独占事業者的な位置づけによって中小規模の事業者との摩擦が生じていること、すぐれた就労支援機能を持つものの障害者を受け入れる企業の側の整備が後手に回っていること等、「制度化」と「運動としての革新性」との両立に困難が生じていることも否めない。こうした新しい課題にどのように対応していくべきか、地域ごとに特色ある模索が展開されている。本研究では、障害者雇用促進のための労働市場改革と、そこでの非営利・行政の協働関係を中心に、ラツィオ、ヴェネト、ロンバルディアの各州を事例として取り上げ、(1)制度化による硬直化からの脱却、(2)非営利陣営からのイノヴェイティヴな社会サービスの展開、(3)営利的企業への働きかけについて、行政関係者(労政局、雇用センター)、雇用開拓を担うB型社会的協同組合、協同組合の事業連合等にインタヴューを重ね、地域ごとの傾向を分析した。
深紫外近接場分光による超ワイドギャップ半導体の物性解明

本研究は,深紫外(波長:210300nm)領域で分光計測が可能な近接場光学顕微鏡(SNOM)技術を開発し,AlGaNナノ構造,BN系半導体,ダイヤモンドなどの超ワイドギャップ半導体における励起子や励起子分子などのキャリア素励起(準粒子)の空間・時間ダイナミクスを明らかにすることを目的に,平成27年度より研究をスタートした。しかしながら,開始から数か月で基盤研究(S)に採択されたため,規定によって交付決定の一部取り消しを行うこととなった。このような事情のため,研究実施はごく短期間ではあったが,深紫外SNOMファイバープローブについて,ファイバー材質と形状の最適化によって波長200nmまでの高透過率特性を実験的に検証することに成功しており,所期の目的の一部を達成することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。
きのこβ-1,6-グルカンを認識する新規受容体の同定

きのこ類の細胞壁多糖は人体において生理活性機能を示すことが知られている。申請者は、真菌類に特有の多糖分子である「β-1,6-グルカン」の免疫活性化機能を見出し糖鎖の酵素合成も可能にしてきた。本課題では、生体内におけるβ-1,6-グルカン認識機構を明らかにすることを目的とし、β-1,6-グルカン受容体タンパク質を同定する。
BSO単結晶を用いたホログラフィ-干渉法による非破壊検査に関する研究

BSOの単結晶をホログラフィ-干渉計測に応用し、ホログラム記録、再生像記録、干渉縞解析の一連のプロセスをすべて電気的に行うことが可能となり、非破壊検査への応用の可能性を検討した。まず、BSO単結晶がホログラフィ-干渉計測に有効に利用できるためには、回折効率を高くする必要があり、そのため、BSO単結晶のホログラム記録特性を実験的に検討した。これによって、ホログラフィ干渉計測で精度の良否を左右する干渉縞のコントラストを向上させる要因を明確にした。次に、実験で得られる最大回折効率を変動させる要因として、BSO結晶自身の材料のパラメ-タをとりあげ、光学的、電気的にそれらを測定しトラップ密度と吸収係数のばらつきが、回折効率に影響していることがわかった。BSO単結晶を使用して、ホログラフィ干渉法による粗面物体の微小変形計測を行い、実時間縞走査法による干渉縞画像処理により数nmの精度で変位量が測定できることがわかった。さらに、非破壊検査の1方法として、この方法を傷のある板材に適用し、傷に対応した干渉縞の変化、および変位量が観測された。この手法を実用的に非破壊検査に適用するには、欠陥部を変位量の大小で区別することから、その差が明確にでるような外力の与え方を検討する必要がある。また、干渉縞のコントラストをさらに向上させること、記録時、再生時の参照光ー物体光強度比のコントロ-ルを容易にできるよう改善すること、等の検討すべき余地がある。最後に、この方法は、透明体中の変化を光路長変化としてとらえられるので、透明体に温度などの外乱を与え、その中の欠陥の検出にも適用することを考えた。その前段階として、自然対流を含む水の温度変化分布の測定を行い、数値解と良い一致を示し、そうした欠陥検出への応用の可能性も有しているものと考えられる。珪酸ビスマス(BSO)結晶は光情報処理の空間変調素子やホログラフィ-記録材料として利用可能な新しい光機能素子材料である。この結晶は、光導電効果と電気光学効果を合わせ持ち、光の強弱を屈折率の変化として記録し、現像定着なしでホログラムの記録、読みだし、消去が可能である。この素子に検査対象材料の微小変形前後のホログラムを全くのドライプロセスで記録、再生し、生じた干渉パタ-ンをITVカメラにより画像処理装置に入力して、変化量を測定し、また、その干渉縞の異常より、検査対象の良否を判定する。全てが電気的にコントロ-ル、処理可能になるため、自動化が図れる。こうした非破壊検査システムの実現について検討し、複合材料等の非破壊検査への応用を目的としている。BSO結晶のホログラム記録、再生、消去は、アルゴンイオンレ-ザを使用した。新しいBSO結晶に電極をつけ、高電圧電源を使用してホログラム記録部を製作した。これを用いて、BSO結晶のホログラム記録、再生、消去特性についての検討を行い、BSO結晶の波長、光強度露光良、解像力、印加電圧等に対する回折効率の関係を求めた。回折効率の向上は、印加電圧を大きくすることによって、可能であるが、結晶の組成の問題、高電圧印加についての技術的問題の解決が必要である。また、ホログラフィ-干渉縞のコントラストを決定する要因を検討し、光量比、偏光方向の調整が重要であることがわかった。また、ホログラフィ-干渉縞による非破壊検査を行うには、対象の変形前後をホログラムに記録後、再生されるホログラフィ-干渉パタ-ンを取り込み、その場で、画像の計算機処理を行わねばならない。

そのため、画像メモリと画像解析用の計算機を導入し、小型の画像解析システムを構成した。解析のためのプログラム作成、自動化のためのインタフェ-ス回路の検討を現在、進めている。BSO単結晶をホログラフィ-干渉計測に応用し、ホログラム記録、再生像記録、干渉縞解析の一連のプロセスをすべて電気的に行うことが可能となり、非破壊検査への応用の可能性を検討した。まず、BSO単結晶がホログラフィ-干渉計測に有効に利用できるためには、回折効率を高くする必要があり、そのため、BSO単結晶のホログラム記録特性を実験的に検討した。これによって、ホログラフィ干渉計測で精度の良否を左右する干渉縞のコントラストを向上させる要因を明確にした。次に、実験で得られる最大回折効率を変動させる要因として、BSO結晶自身の材料パラメ-タをとりあげ、光学的、電気的にそれらを測定しトラップ密度と吸収係数のばらつきが、回折効率に影響していることがわかった。BSO単結晶を使用して、ホログラフィ干渉法による粗面物体の微小変形計測を行い、実時間縞走査法による干渉縞画像処理により数nmの精度で変位量が測定できることがわかった。さらに、非破壊検査の1方法として、この方法を傷のある板材に適用し、傷に対応した干渉縞の変化、および変位量が観測された。この手法を実用的に非破壊検査に適用するには、欠陥部を変位量の大小で区別することから、その差が明確にでるような外力の与え方を検討する必要がある。また、干渉縞のコントラストをさらに向上せさること、記録時、再生時の参照光ー物体光強度比のコントロ-ルを容易にできるよう改善すること、等の検討すべき余地がある。最後に、この方法は、透明体中の変化を光路長変化としてとらえられるので、透明体に温度などの外乱を与え、その中の欠陥の検出にも適用することを考えた。その前段階として、自然対流を含む水の温度変化分布の測定を行い、数値解と良い一致を示し、そうした欠陥検出への応用の可能性も有しているものと考えられる。
植物機能を利用した細胞内における金属ナノ粒子の生成

単細胞藻類Pseudococcomyxa simplexおよびChlamydomonas reinhardtiiに,100 ppmの塩化金(III)水溶液を添加したところ,細胞内において数万ppmの金が蓄積された。またいずれの藻類を用いても,金ナノ粒子が細胞内で生成されることが示された。細胞内で生成された金ナノ粒子は比較的粒径が揃っており,およそ50 nmだった。この金ナノ粒子は凝集せず長期間にわたって安定に存在していた。一方,パラジウムは錯体として細胞内に蓄積されていた。白金および銀については,添加条件によってナノ粒子のできる可能性が示された。本研究では,植物を用いる金属ナノ粒子の生成およびその機構の解明を目的としている。初年度は,浮遊液体培養法で増殖させた単細胞藻類Pseudococcomyxa simplexとChlamydomonas reinhardtiiに対して金,白金,銀,パラジウムの金属溶液を添加し,その蓄積性を評価した。培養した藻類細胞P.simplexに塩化金酸溶液([Au] = 50 mg/L, pH3.3)を添加したところ,24時間後には,32,000 mg/kg DWもの金が蓄積していた。このように金を蓄積した藻類の個々の細胞に対して,放射光X線マイクロビームを用いて大気下非破壊で元素分布を調べたところ,金は時間の経過に伴って細胞内に取り込まれていくことが示された。高輝度な放射光X線マイクロビームを用いることで,金を添加1分後の細胞内においても金の信号を検出することができた。一方,細胞内に蓄積された金の化学形態分析を行った結果,塩化金酸イオンとして添加した金(III)は,細胞内に取り込まれると金属状態の金(0)に還元されていることが明らかになった。添加溶液は赤く呈色していることから,金ナノ粒子の生成が示唆された。SEMで観察したところ,約5 μm程度の藻類細胞において,約50 nm程度の金ナノ粒子が形成されて多数分散していた。このように,単細胞藻類は金を高濃度に蓄積する能力を持ち,さらに細胞内では金ナノ粒子が容易に生成されることが実証された。白金や銀,パラジウムを添加した場合でも,これら藻類細胞における高蓄積がみとめられた。細胞内に蓄積されたこれらの金属の化学形態について,現在解析を進めている。初年度は,2種類の単細胞藻類<I>Pseudococcomyxa simplex</I>と<I>Chlramydomonas reinhardtii</I>に対して,金,白金,銀,パラジウムの金属溶液を添加し,その蓄積性を評価した。その結果,金,銀,パラジウムについて数万ppm(乾燥質量あたり)の蓄積量となった。白金については数千ppm程度となった。蓄積された金の化学形態について検討したところ,50 nm程度の金ナノ粒子として存在していることが明らかとなった。SEM像および放射光マイクロXRFイメージングにより,細胞に取り込まれている様子が可視化された。最終年度では,細胞内に取り込まれたパラジウム,銀,白金の化学形態について解析を進めた。さらに単細胞藻類以外の植物シダ植物を用いたり,希土類元素や水銀など様々な元素の添加実験も実施した。その結果,パラジウムは窒素原子が4つ配位したアンミン錯体のような化学形態で,単細胞藻類細胞内に取り込まれていることがわかった。パラジウムの場合にはナノ粒子は形成されていないが,細胞内に高蓄積されるという特徴は明らかである。銀の場合には,添加条件によってはナノ粒子の生成が認められた。白金の場合には,いくつかの化学種が混在するため,定量的な評価をするために詳細な解析を行っている。研究期間全体を通しての研究成果は以下の通りである。1.単細胞藻類を用いると,金ナノ粒子が細胞内で生成される。2.細胞内で生成された金ナノ粒子は比較的粒径が揃っており,およそ50 nm程度となった。3.金ナノ粒子は細胞内に取り込まれているため,凝集せず長期間にわたって安定に存在する。4.他の金属イオンでは金属ナノ粒子の生成は難しいが,条件を検討することで生成できる可能性はある。有用メタルの蓄積性と金ナノ粒子の生成について知見を得ることができた。放射光X線マイクロビームを光源とする蛍光X線イメージングにより,細胞内部に金が取り込まれている様子が可視化された。パラジウムや白金についても同様に細胞内部に取り込まれていた。分析化学平成26年度は,単細胞藻類in vivoでの評価を行ってきたが,今後の実用化を見据え,細胞を凍結乾燥・粉砕した粉末試料や細胞破砕液からの抽出溶液試料を用いて,金属溶液との反応について検討する。白金,銀,パラジウムについても,同様に研究を推進していく。

初年度は金属蓄積について定量的な評価を中心とし,次年度にはQuick-XAFSによる化学形態分析を実施する。それにあわせてXAFS測定容器を自作することにしたため,予算を繰り越した。藻類と金属溶液を混合した直後からのXAFSスペクトルを取得するため,専用のセルを作成する。