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タンパク質Ｓ－グアニル化修飾による中枢神経細胞の保護と機能調節

中枢神経系においてNO/cGMPによって誘導されるタンパク質S-グアニル化修飾に着目し、神経細胞の機能や生存維持におけるその役割を明らかにすることを目指した。前年度までに、レチノイン酸受容体刺激の下流で活性化されたNO/cGMPシグナルが、8-nitro-cGMPの産生とβ3-チュブリンのS-グアニル化修飾を伴ってドパミンニューロンの神経突起の形態形成や細胞保護において重要な役割を果たすことを明らかにした。そこで本年度は、レチノイン酸受容体刺激以外のより普遍的な刺激によっても同様のシグナル伝達系が駆動することを想定し、持続的脱分極刺激の効果について検討した。ラット胎仔由来初代培養中脳細胞において、細胞外K+濃度を40 mM増加させた条件でドパミン神経毒MPP+を72時間処置した場合、通常K+濃度条件下で認められる細胞死の誘導が著明に抑制された。この脱分極刺激によるドパミンニューロン保護効果は、NO合成酵素阻害薬、可溶性グアニル酸シクラーゼ阻害薬、およびプロテインキナーゼG阻害薬によって遮断された。持続的脱分極刺激は、神経型NO合成酵素の発現には影響を与えなかったが、8-nitro-cGMPの産生を増大させるとともにS-グアニル化タンパク質レベルを増大させた。また、MPP+毒性に対するドパミンニューロン保護効果は、外因性に適用した8-nitro-cGMPにも認められた。さらに、脱分極刺激や8-nitro-cGMPの適用はプロテインキナーゼG非依存的にヘムオキシゲナーゼ-1 (HO-1)の発現を増大させ、HO-1を阻害すると脱分極刺激や8-nitro-cGMPのドパミンニューロン保護効果は有意に抑制された。これらの結果から、タンパク質S-グアニル化修飾は、少なくとも一部にはHO-1発現誘導を介して神経活動依存的な神経細胞保護機能を発揮することが初めて明らかになった。24年度が最終年度であるため、記入しない。中枢神経系、特に中脳ドパミンニューロンにおけるレチノイド受容体(RAR)シグナル伝達機構として、NO/cGMPによって誘導されるタンパク質S-グアニル化修飾に着目し、神経細胞の機能や生存維持におけるその役割を明らかにすることを目指した。まずSH-SY5Y神経芽腫細胞において、RARアゴニストのAm80が神経型NO合成酵素の発現増大を伴ってβ3-チュブリンのS-グアニル化修飾レベルを増大させること、また同時にNO/cGMPシグナル依存的に神経突起の伸展および分岐形成を促すことを確認した。無細胞系のアッセイでは、S-グアニル化修飾はチュブリンの重合速度に影響を与えなかったが、SH-SY5Y細胞においてはRAR刺激後のβ3-チュブリンのS-グアニル化修飾に伴って重合型チュブリン量の増大およびチュブリンへのMAP1Bの連関が誘導されたことから、S-グアニル化修飾は重合型チュブリンを安定化させる働きがあることが示唆された。RAR刺激による神経突起形態の複雑化は、培養中脳-線条体組織切片において線条体組織内に伸展するドパミン神経線維にも認められた。この時、線条体において8-nitro-cGMPの産生とβ3-チュブリンのS-グアニル化修飾の増大も確認され、またNO/cGMPシグナルの阻害はドパミン神経線維の形態の複雑化を抑制した。初代培養中脳細胞では、ドパミン神経毒MPP+は重合化チュブリンを減少させたが、RARアゴニストAm80はこの減少を著明に抑制するとともに、MPP+によって誘導されるドパミンニューロン死を有意に抑制した。これらの結果から、RAR刺激によるドパミンニューロンの形態形成および生存維持において、NO/cGMPシグナル伝達系による重合型チュブリンの安定化が重要な役割を担うことが明らかになった。

これらの結果から、タンパク質S-グアニル化修飾は、少なくとも一部にはHO-1発現誘導を介して神経活動依存的な神経細胞保護機能を発揮することが初めて明らかになった。24年度が最終年度であるため、記入しない。中枢神経細胞における主要なS-グアニル化修飾のターゲットと考えられるβ3-チュブリンについて集中的に検討を行い、そのS-グアニル化修飾が持つ生理的/病態生理学的意義の一端を明らかにすることができた。今後は、引き続き神経細胞様細胞株や培養中脳-線条体組織切片を用いて、チュブリンのS-グアニル化修飾が細胞の形態形成や生存維持に及ぼす効果について、より多角的に検討を進める。また、S-グアニル化修飾のターゲットとなる他のタンパク質(特にミトコンドリア関連タンパク質)についても、その修飾とタンパク質機能との関係について検証する。
共鳴振動を利用した金属構造体の弾性特性評価

近年のAM技術の急速な発展に伴って,複雑な三次元形状を持つ新しい構造用金属材料の作成が可能となりつつある.このような金属構造体は,従来のバルク状金属材料と比べて大幅な比強度の向上が期待されることから,高付加価値を有する新材料としての利用が期待されている.ところがその力学特性,とりわけ弾性特性の評価方法は確立されておらず,金属構造体の実用化を進める上で大きな障壁となっている.そこで本研究では,このような金属構造体の持つ複雑な弾性特性を完全に決定するための超音波計測の基礎技術と,その解析のための基礎理論の構築を目的に研究を進めてきた.本研究の推進により得られた具体的な研究実績は次の通りである:(i)金属積層造形法を用いた様々な内部周期構造を持つ三次元金属構造体の作成,(ii)超音波共鳴法による金属構造体の共鳴周波数計測,(iii)有限要素法解析による金属構造体の共鳴周波数の逆解析と弾性定数の推定,(iv)マイクロポーラー弾性理論による周期構造体の共鳴周波数解析, (v)マイクロポーラー弾性理論による周期構造体の曲げ変形のサイズ依存性解析,(vi)非線形弾性論に基づく曲面構造の構成論.これらの研究実績のうち,(i)(v)は当初の研究目標として取り上げた項目に相当しており,本研究は概ね計画通りに達成できたと言うことができる.一方,(vi)は当初計画にはなかった研究内容であるが,本研究は円滑に進行して当初予定していた研究期間に余裕が出たことから,本研究の延長線上に位置する発展的な研究課題として実施したものである.内容としては,AM技術の応用として三次元曲面構造を考えた場合の基盤理論の構築を行ったものでり,本研究の遂行から生まれた新しい研究のシーズと位置付けることができる.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。近年のAM技術の発展に伴って,複雑な三次元形状を持つ新しい構造用金属材料の作成が可能となりつつある.本研究では,こうした構造体の持つ複雑な弾性特性を完全に決定するための超音波計測の基礎技術と,その解析のための基礎理論の構築を目的に研究を進めている.今年度は,当初研究計画に従って,三次元構造体の作成と超音波共鳴法による共鳴周波数計測を行った.三次元構造体の作成には大阪府立産技研の金属積層造形装置を用い,マルエージング鋼粉末を出発材料としたレーザー積層造形によって,単純立方格子をユニットセルとした三次元金属構造体の作成に成功した.更に,得られた構造体に対して三点支持型の超音波共鳴法による共鳴スペクトル計測を室温・大気環境中において行った.その結果,この構造体の持つ大きな内部摩擦を反映して,極めてブロードな共鳴スペクトルが得られたが,共鳴周波数自身は十分決定することができた.得られた超音波計測結果の妥当性を検証するため,有限要素法を用いて計測した構造体の共鳴周波数を数値計算し,これを実験結果と比較した.具体的には,マルエージング鋼のヤング率とポアソン比を有限要素モデルに入力して共鳴周波数を順計算し,これを実験結果と比較した.その結果,両者は良好な一致を示すことが明らかとなった.このことは,共鳴周波数の計測・逆解析を利用した三次元金属構造体の弾性特性評価が原理的に可能であることを意味している.このように,当初の研究計画に従った初年度の実験研究を完了することができた.本年度は,当初計画していた研究をほぼ予定通り達成することができた.問題点としては,作成した三次元金属構造体の内部摩擦が当初の予想以上に大きく,そのため共鳴周波数の決定精度が低下するという問題も生じているが,この問題については実験側の工夫で対応することができている.近年のAM技術の発展に伴って,複雑な三次元形状を持つ新しい構造用金属材料の作成が可能となりつつある.本研究では,こうした構造体の持つ複雑な弾性特性を完全に決定するための超音波計測の基礎技術と,その解析のための基礎理論の構築を目的に研究を進めている.具体的には,「マイクロポーラー弾性理論」と呼ばれる連続体力学理論を用いて三次元構造体の共鳴周波数を決定するための基礎理論を構築するとともに,これを超音波計測実験,および有限要素法に基づく数値計算で求めた共鳴周波数を比較・検討することで,新たに構築した理論の妥当性について検討を進める.今年度は,当初研究計画に従ってマイクロポーラー弾性理論を用いた共鳴振動理論の構築を行った.具体的には,弾性はりの接続によって構成された二次元周期構造体を出発構造とし,これに対してマイクロポーラー弾性理論に基づく連続体近似を行った.こうして得られたモデルに対して最小作用の原理を適用すれば,その共鳴振動状態は作用汎関数の停留状態として特徴付けることができ,この変分問題をリッツ法を用いて数値的に解析した.具体的には,共鳴振動変位を変数分離形式で近似し,このうち時間方向には調和振動形式を,空間方向にはルジャンドル多項式を採用した.この近似解を用いて作用積分を実行し,停留条件を課すことで,この問題を線形固有値問題へと帰着させた.これより得られた固有値・固有ベクトルから共鳴周波数と共鳴振動モードの解析を行った.その結果,従来のバルク材料の共鳴振動モードでは見られないサイズ効果,すなわち共鳴振動周波数に対するスケーリング則の破綻,およびそれに伴う解の自己相似性の破綻が生じることを明らかとした.本年度は,当初計画していた研究をほぼ予定通り達成することができた.また,応用研究として,二次元カイラル構造体に対する曲げ変形特性や共鳴振動解析も行うことができ,当初の予定を上回るペースで研究を進めることができている.

近年のAM技術の急速な発展に伴って,複雑な三次元形状を持つ新しい構造用金属材料の作成が可能となりつつある.このような金属構造体は,従来のバルク状金属材料と比べて大幅な比強度の向上が期待されることから,高付加価値を有する新材料としての利用が期待されている.ところがその力学特性,とりわけ弾性特性の評価方法は確立されておらず,金属構造体の実用化を進める上で大きな障壁となっている.そこで本研究では,このような金属構造体の持つ複雑な弾性特性を完全に決定するための超音波計測の基礎技術と,その解析のための基礎理論の構築を目的に研究を進めてきた.本研究の推進により得られた具体的な研究実績は次の通りである:(i)金属積層造形法を用いた様々な内部周期構造を持つ三次元金属構造体の作成,(ii)超音波共鳴法による金属構造体の共鳴周波数計測,(iii)有限要素法解析による金属構造体の共鳴周波数の逆解析と弾性定数の推定,(iv)マイクロポーラー弾性理論による周期構造体の共鳴周波数解析, (v)マイクロポーラー弾性理論による周期構造体の曲げ変形のサイズ依存性解析,(vi)非線形弾性論に基づく曲面構造の構成論.これらの研究実績のうち,(i)(v)は当初の研究目標として取り上げた項目に相当しており,本研究は概ね計画通りに達成できたと言うことができる.一方,(vi)は当初計画にはなかった研究内容であるが,本研究は円滑に進行して当初予定していた研究期間に余裕が出たことから,本研究の延長線上に位置する発展的な研究課題として実施したものである.内容としては,AM技術の応用として三次元曲面構造を考えた場合の基盤理論の構築を行ったものでり,本研究の遂行から生まれた新しい研究のシーズと位置付けることができる.研究はほぼ当初の予定通り進めることができているため,今後の推進方策としては,当初の予定通りに進めたいと考えている.具体的には,今年度は超音波共鳴法によって得られた共鳴周波数を逆解析して弾性定数を決定するための,共鳴振動理論の構築・解析を重点的に進める予定である.研究はほぼ当初の予定通り進めることができているため,今後の推進方策としては,当初の予定通りに進めたいと考えている.具体的には,昨年度得られた実験結果と,今年度得られた共鳴振動理論を組み合わせることで,共鳴周波数を逆解析して弾性定数を決定するための新しい超音波共鳴法の構築を目指す.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
膵・胆管合流異常に伴う胆道癌の分子生物学的検討

膵・胆管合流異常(PBM)では膵液が胆管内へ恒常的に逆流し胆汁中に産生された起炎物質で胆管壁に炎症が起こり、変異原物質と相まって胆道癌(PBM associated BD cancer)が高率に発生すると考えられている。炎症に伴う酸化的ストレスと発癌との関連が報告されている。酸化的ストレスでは活性酸素が核酸障害をし、核酸塩基グアニンの8位の炭素が水酸化され8-oxoodeoxyguanosineを生じ、これがGCよりTAへの置換を誘導する事が知られている。一方、PBMでよく見られる上皮の遺伝子変異であるKi-ras codon 12の点突然変異がGGTよりGAT、GTTへの変異を誘導することを考えると持続する炎症に伴う酸化的ストレスがPBM assoiated BD cancerの発生に関与していることが考えられる。本年度は発癌と酸化的ストレスとの関連に注目し、人胆嚢炎(16例)、PB胆嚢(15例)、PBM合併胆嚢癌(12例)の組織標本を用いて、酸化的ストレスとして過酸化脂質のマーカーとなる4-Hydroxy-2-nonenal-modified proteinss (HNE)、DNA傷害のマーカーとして8-OH deoxyguanosine、細胞回転K167、核内転写因子NFKappaB、遺伝子変異としての変異型p53の組織内発現やその局在を詳細に検討した結果、PBM胆嚢では慢性胆嚢炎よりHNEや8-OH deoxyguenosine、NFKappaBが高頻度に発現し、p53蛋白は胆嚢癌にのみ発現し、細胞回転はPBM胆嚢、胆嚢癌で亢進していた。膵液逆流による慢性持続性の炎症による酸化的ストレス、それに伴うであろうDNA傷害とPBM胆嚢癌発癌との関連が示唆された。酸化的ストレスでは活性酸素が核酸障害をし、核酸塩基グアニンの8位の炭素が水酸化され8-oxodeoxyguanosineを生じ、これがG : CよりT : Aへの置換を誘導する事が知られている。一方、PBMでよく見られる上皮の遺伝子変異であるKi-ras codon 12の点突然変異がGGTよりGAT、GTTへの変異を誘導することを考えると持続する炎症に伴う酸化的ストレスがPBM associated BD cancerの発生に関与していることが考えられる。本年度は発癌と酸化的ストレスとの関連に注目し、人胆嚢炎(14例)、PBM胆嚢(11例)、PBM非合併胆嚢癌(12例)の組織標本を用いて、酸化的ストレスとして過酸化脂質のマーカーとなる4-Hydroxy-2-nonenal-modified proteinss(HNE)、DNA傷害のマーカーとして8-OH deoxyguanosine、遺伝子変異としての変異型P53の組織内発現やその局在を詳細に検討した結果、PBM胆嚢では慢性胆嚢炎よりHNEや8-OH deoxyguanosineが高頻度に発現し、P53蛋白は胆嚢癌にのみ発現していた。膵液逆流による炎症による酸化的ストレス、それに伴うであろうDNA傷害とPBM胆嚢癌発癌との関連が示唆された。PBMのハムスターモデルは現在作成中で、抑制実験に予定しているTNFαとIL1の産生阻害剤であるFR167653は藤沢薬品工業よりすでに供与を受け、また、iNOS阻害剤(ONO-1714)は小野薬品工業よりすでに供与を受けている。次年度はPBMハムスターモデルにつき検討する予定である。

膵・胆管合流異常(PBM)では膵液が胆管内へ恒常的に逆流し胆汁中に産生された起炎物質で胆管壁に炎症が起こり、変異原物質と相まって胆道癌(PBM associated BD cancer)が高率に発生すると考えられている。持続性の炎症と発癌との関連が報告されている。炎症では炎症性サイトカインであるTNFαやIL1が誘導されるが、その発現はNF-κBにより転写レベルで調節されている。また、炎症ではエイコサイドの関与するが、プロスタグランデインの合成酵素であるCOX2により誘導されることも知られている。持続的炎症では上皮障害により持続的再生に伴い上皮の細胞回転が亢進することも知られている。PBMに伴う炎症と発癌の関連に注目し、人胆嚢炎(14例)、PBM胆嚢(11例)、PBM非合併胆嚢癌(12例)、PBM合併胆嚢癌(8例)の組織標本を用いて、NF-κB、COX2、PCNA(細胞回転亢進のマーカー)の免疫組織化学染色を行った。PBM胆嚢では慢性胆嚢炎よりNF-κB、COX2、PCNAが高頻度に発現し、胆嚢癌ではPBM合併・非合併による胆嚢癌の差はなかった。胆嚢癌の周囲粘膜ではPBM合併例がPBM非合併例よりNF-κB、COX2、PCNAがより高頻度に陽性となる傾向にある。膵液逆流による持続的炎症とPBM合併胆嚢癌の発癌との関連が示唆された。PBMのハムスターモデルは現在作成中で、抑制実験のためのTNFαとIL1の産生阻害剤であるFR167653は藤沢薬品工業よりすでに供与を受けており、実験を進行中である。
位相不変量をもつスピン現象の理論研究及びその応用デバイスの設計

スピン量子十字構造素子なるものを提案し、それをモデルデバイスとして、スピン伝導の計算を行った。本研究課題では、近年話題になっているバルクとしては絶縁体で、表面は金属であるという奇妙な性質を有するトポロジカル絶縁体を電極に用いた場合のスピンコンダクタンスを計算した。トポロジカル絶縁体のバンド構造は、時間反転対称性で決まっているため、これを制御するために、表面に時間反転対称性を破る磁性絶縁体を蒸着したモデルを考え、その磁化の関数として、スピンコンダクタンスを計算した。その結果、磁化によって、スピンコンダクタンスを制御することが可能であることが分かり、新規なスピン素子として有望である事が判明した。平成25年度は、スピン量子十字構造素子(SQCS素子)の電極部にトポロジカル絶縁体と正常金属を用い、接合部に酸化物を挟んだ場合におけるトポロジカル絶縁体から正常金属へのスピン注入に関して理論的な検討を行った。トポロジカル絶縁体には、磁化mを有する磁性絶縁体を蒸着してあるものとして、この磁化mの大きさや垂線からの傾きに応じて、トポロジカル絶縁体のmassless Dirac電子のエネルギー分散が変化することによるスピンコンダクタンスの変化を酸化物絶縁体の幅を変化させて計算を行った。その結果、垂線に対する磁化の極角θと方位角φに対して、スピンコンダクタンスは、非常に敏感であることが分かった。スピンコンダクタンスは極角θと方位角φに対して、それぞれ、90度を中心に対称な形を取った。φを0度に固定したときは、θ=90度の時に最大のコンダクタンスを取り、またθを90度に固定した場合は、φ=90度の時に最小値を取ることもわかった。さらにバリアの幅dに関しては、幅が増加するにつれ、緩やかなコンダクタンスの現象が見られた。これは考察したバリア幅がフェルミ波長よりかなり狭い領域を考察した結果である。一方、今年度は、基礎的な部分の研究も行った。電子デバイスなどにおいて、一般的に輸送特性を計算する場合、電極は2次元や3次元の自由電子と考えて、自由電子のフェルミレベルでの状態密度のみを使用して計算を行う。しかしながら、実際の金属電極は、自由電子ではなく、クーロン相互作用を行っている電子の集合である。そこで、電子相関をGW近似で取り込んで、2次元電極での準粒子のエネルギー分散を求めた。2次元金属電極における自由電子の分散とGW近似で計算された準粒子の分散を比較し、自由電子近似の妥当性を考察した。その結果、フェルミ面近傍に限って自由電子近似は妥当であることを精度の高い計算で改めて証明できた。平成24年度は、SQCS素子の接合部に反転対称性の無い半導体であるGaAsやGaSbを挟んだ際に、これらの物質で3次のDresselhausスピン軌道相互作用が働いた場合のスピン伝導に関して、理論計算を行った。半導体の膜厚を変化させて計算した磁気抵抗(MR)比の結果より、スピン軌道相互作用が働かない絶縁体バリアの場合、MR比はバリア膜厚を変えても常に正であるが、GaAsバリアの場合、非常にバリア膜厚が薄い場合(0.010.02nm)は、MR比は正であるが、厚みを増すとすぐに負になってしまい、バリア膜厚が3nmまで、ずっと負のままであった。一方、スピン軌道相互作用の大きいGaSbバリアの場合、GaAsと同様に非常にバリア膜厚が薄い場合(0.010.02nm)は、MR比は正で、厚みを増すとすぐに負になってしまうが、やがて、厚みが1nm程度で符号を変えて、再び正になることが判明した。これら結果から、SQCS素子に、GaAsやGaSbを挟めば、スピンフィルターとして役に立つことを定量的に予想することが出来た。またこの系は、非可換ゲージ場による仮想磁場が生じてスピンが回転することから、その非可換ゲージ場を導出した。また、近年、Siに3端子でスピンを注入した際に観測される巨大Hanle効果が話題を集めている。そこで、SQCS素子において強磁性金属リボン間から間に挟んだSiにトンネルバリアを介してスピン注入をすることを想定して、強磁性CoFeからMgOバリアを介して、Siにスピンを注入した際に観測されるHanle効果について考察した。その結果、北大工学部の植村らが、この3端子Hanle効果測定においては、MgOバリアの幅とHanle電圧(シート抵抗⊿Rs換算)に指数関数的な対応が見られることを発見した実験事実を簡単なモデルで説明することに成功した。最終年度は、2個の量子ドットとナノワイヤを用いたAB(アハロノフ・ボーム)リングに磁場と1次あるいは3次のラシュバ・スピン軌道相互作用が作用した場合における、スピンのフィルタリングについて考察した。

スピンのフィルタリングは100%の効率が出せれば、それは、純スピン流生成器として成立するため、その理論的考察並びに実現は、今後のスピントロニクスにおいて重要である。その結果、ABリングにおいては、磁場が無い場合には、スピン軌道相互作用があってもスピンフィルタリングは起こらないのだが、磁場を掛けると、1次あるいは3次のラシュバ・スピン軌道相互作用のどちらが作用していても、特定の磁場で完全偏極が得られることが判明した。また、その特定の磁場は、ラシュバ・スピン軌道相互作用の次数が1次か3次かで変化することを発見した。この事実を使えば、2次元電子及び2次元正孔で作用しているラシュバ・スピン軌道相互の次数をこの素子を用いて弁別可能である。研究期間全体に亘り、新規なスピントロニクス素子としてのSQCS素子を舞台として、スピントロニクにおいて、重要な役割を担うスピン軌道相互作用をゲージ場として見ながら、理論と実験両面から、SQCS素子の可能性を探ってきた。初年度では、SQCS素子の接合部に3次のDresselhausスピン軌道相互作用が働く半導体を挟んだ場合のスピン伝導に関して半導体の膜厚を変化させて磁気抵抗(MR)比を計算した。その結果から、SQCS素子がスピンフィルターとして役に立つことを定量的に示した。また、その際スピンの回転を起こす仮想磁場としての非可換ゲージ場の導出も行った。次年度には、SQCS素子の片方の電極に磁性絶縁体を蒸着したトポロジカル絶縁体を用い、もう一方の電極に金属を用い、接合部に絶縁体を挟んだ場合について考察し、Dirac電子を用いたスピン伝導について定量的に議論した。応用物理学および工学本研究は、位相不変量をもつスピン現象の理論を基礎から研究し、基礎理論をデバイス設計に向く形に発展させ、トポロジカル絶縁体や内因性スピンホール効果をデバイスに利用する方法を構築することが研究目的である。今年度は、新型の素子であるスピン量子十字構造素子(SQCS素子)において、片方の電極に、奇パリティのZ2位相不変量を有するトポロジカル絶縁体を使用し、接合部に絶縁体を挟んでバリア層とした場合に、もう一方の正常金属にどれほどのスピン注入が出来うるかを考察した。その結果、この系におけるスピンコンダクタンスを定量的に計算出来たことは、位相不変量をもつスピン現象の理論をデバイス設計に利用する一歩になったと考えている。一方で、これらの研究の過程では、輸送特性を計算する際に、自由電子での状態密度を使用して、導電率を計算しても良いということが通説になっている。その事柄に対して、実際の金属電極の電子は、自由電子ではなく、お互いにクーロン力によって相互作用している多体系なので、この暗々裏に仮定している仮定については、検証する必要性を感じた。そこで、自由電子にクーロン相互作用を取り入れた場合の電子の分散を精度の高いGW近似という計算によって求めた。その結果、フェルミ面近傍に限って自由電子近似は妥当であることを改めて証明できたことは、今後、位相不変量をもつスピン現象の理論をデバイス応用する際に、計算の正当性を保証するという意味で重要であること考えている。研究課題の目的としては、位相不変量を背景としたスピン現象の解明を行うとともに、新規な応用デバイスをスピントロニクスに応用することであるので、SQCS
H^∞感度低減化問題におけるサンプル値制御系の性能限界

本研究は,これまで数値的解法しか得られていなかったサンプル値制御系の感度,および相補感度低減化問題に対し,解析的な解を導くことによって,サンプル値制御系の性能を劣化させる要因を明らかにすることを目的としたものである.そのために,サンプル値制御系の問題と純粋な離散時間系の問題が,エイリアスの影響を反映した周波数重み関数(以下,エイリアス因子と呼ぶ)によって密接に関連していることに着目し,エイリアス因子の性質,および純粋な離散時間系の性能限界を明らかにした上で,サンプル値制御系の性能限界を導くという手法をとった.まず,エイリアス因子の性質に関して明らかにしたことを以下に示す.1.エイリアス因子は安定かつプロパーな有理関数であり,そのH∞ノルムは1以下である.2.エイリアス因子のシステムとしての次数は,制御対象の次数より1次だけ小さくなる.3.サンプリング周期をゼロに近づけたときのエイリアス因子は,制御対象の相対次数のみで決まるある関数に漸近する.次に,純粋な離散時間系の性能限界について得られた結果を示す.1.感度低減化問題における純粋な離散時間系の性能限界は,相補感度低減化問題における性能限界に一致する.2.これらの性能限界は,制御対象の不安定極,不安定零点,および離散化零点に依存する.3.サンプリング周期をゼロに近づけたときの性能限界の挙動は,不安定零点の有無によって異なる.サンプル値制御系の性能限界については,現在のところ1次系に関しては厳密な解析解が得られている.一般の場合に対しては厳密解は得られていないが,上と同様の結果が得られている.一般の場合に対するサンプル値制御系の性能限界の厳密な解析解を得ることが今後の課題となる.前年度において、周波数重みのないサンプル値系の感度低減化問題は、純粋な離散時間系の周波数重み付きの混合感度低減化問題に帰着されることを示した。この周波数重みは、エイリアスの影響を反映しているものと考えられるため、エイリアス因子と呼んでいる。本年度は、エイリアス因子の複素平面上における解析的性質(どのような伝達関数で表現されるか。サンプリング周期を0、あるいは、∞に近づけたとき、どのように振舞うか。エイリアス因子が定数になるのはどのような場合か。など)を明らかにすることを目標とし、以下の結果を得た。(i)エイリアス因子は、安定かつプロパーな有理関数である。(ii)エイリアス因子のH∞ノルムは1以下である。(この性質から、サンプル値系の性能限界は、離散時間系の性能限界よりも良くはならないことがわかる。)(iii)制御対象がn次系のとき、エイリアス因子はn-1次系となる。(このことから、制御対象が1次系の場合、エイリアス因子は定数となることがわかる。また、この定数はサンプリング周期を0に近づけたとき、1に漸近することを示した。)(iv)制御対象が積分器のn乗で表現される場合のエイリアス因子はサンプリング周期に依存しない関数となる。また、相対次数nの制御対象の場合、サンプリング周期を0に近づけたときのエイリアス因子はその関数に漸近する。来年度は、これらエイリアス因子の性質をサンプル値系の感度低減化問題に適用し、純粋な離散時間系の解と比較することで、感度低減化問題におけるサンプル値制御系の性能限界を導く。本研究は,これまで数値的解法しか得られていなかったサンプル値制御系の感度,および相補感度低減化問題に対し,解析的な解を導くことによって,サンプル値制御系の性能を劣化させる要因を明らかにすることを目的としたものである.そのために,サンプル値制御系の問題と純粋な離散時間系の問題が,エイリアスの影響を反映した周波数重み関数(以下,エイリアス因子と呼ぶ)によって密接に関連していることに着目し,エイリアス因子の性質,および純粋な離散時間系の性能限界を明らかにした上で,サンプル値制御系の性能限界を導くという手法をとった.まず,エイリアス因子の性質に関して明らかにしたことを以下に示す.1.エイリアス因子は安定かつプロパーな有理関数であり,そのH∞ノルムは1以下である.2.エイリアス因子のシステムとしての次数は,制御対象の次数より1次だけ小さくなる.3.サンプリング周期をゼロに近づけたときのエイリアス因子は,制御対象の相対次数のみで決まるある関数に漸近する.次に,純粋な離散時間系の性能限界について得られた結果を示す.1.感度低減化問題における純粋な離散時間系の性能限界は,相補感度低減化問題における性能限界に一致する.2.これらの性能限界は,制御対象の不安定極,不安定零点,および離散化零点に依存する.3.サンプリング周期をゼロに近づけたときの性能限界の挙動は,不安定零点の有無によって異なる.サンプル値制御系の性能限界については,現在のところ1次系に関しては厳密な解析解が得られている.一般の場合に対しては厳密解は得られていないが,上と同様の結果が得られている.一般の場合に対するサンプル値制御系の性能限界の厳密な解析解を得ることが今後の課題となる.
可視化に向けた看護技術の暗黙知データの定量的特徴抽出

看護技術における「熟練の技(わざ)」や「コツ」はその「暗黙性」ゆえに伝承しにくい.著者らは先行研究において,暗黙知を形式知化する方法として看護師と初学者の看護技術実施時の視線の動きに着目し,その違いを明らかにしてきた.本研究では,看護技術の暗黙的な特徴データを多様な視点から抽出するため,採血実施時の脳波,心拍数などの生体データに着目し測定を行った.本論文では,採血技術実施時の初学者と看護師の脳波の分析から,リラックスした状態の指標となるθ/α値に違いがあることを見出した.看護技術における「熟練の技(わざ)」や「コツ」はその「暗黙性」ゆえに伝承しにくい.これまで先行研究では暗黙知を形式知化する方法として看護師と初学者の看護技術実施時の視線の動きに着目し,その違いを明らかにしてきた.本研究では,採血実施時の脳波等の生体データに注目し,看護師と初学者の緊張・集中状態の変化の違いなど,その特徴を分析することを目的としている.初年度に対象者に対して点滴・採血トレーナー(ADAM ROUILLY社)を用いて採血を実施させ,その際の脳波(前頭前野)を脳波計Brain Pro(FM-929)(セルシネ・エイム研究所)を使用して測定した.本年度は,得られたデータの分析を行った.脳波は得られた周波数によって,δ波,θ波,α波,β波の4つに分けられ,それぞれに脳の活動の特徴が意味づけられている.今回,緊張を示す指標としてβ/α値を,安静を示す指標としてθ/α値を用い,看護師と初学者それぞれの採血技術実施中のβ/αとθ/αの比較をおこなった.その結果,看護師は実施中θ/α値が優位で落ち着いた状態でいるのに対し,初学者はβ/α値が高く緊張状態が続くものや,実施中にβ/αとθ/αの大小が逆転し緊張と安静の優位が変化するものも見られた.心拍数については,測定時のノイズの影響か,今回は脳波との相関を認めることができなかった.手指動作データについては装着に時間を要すこと,干渉によるデータの揺らぎを回避することが困難であったことから,まずは脳波データと心拍データを対象として看護技術の暗黙知を統合して可視化(形式知化)する方法とそれらデータを一元管理して表示するシステムを用いて,時間計測を加えるなどの学習支援方法を検討した.今後はこのシステム上で看護技術実施時の生体データから看護師と初学者の違いや初学者が習熟するまでの過程を分析し,看護実践知の特徴を明らかにしていく.看護技術における「熟練の技(わざ)」や「コツ」はその「暗黙性」ゆえに伝承しにくい.看護の持つ暗黙知や技の伝承に関して研究されたものは少なく,その研究の歴史は浅い.これまでの研究では,主に知識の暗黙性に焦点を当てたものが多く,その方法はインタビューやナラティブなどの質的な研究アプローチがほとんどであり,看護技術の技能の暗黙性についての研究は少ない.著者らは先行研究において,暗黙知を形式知化する方法として看護師と初学者の看護技術実施時の視線の動きに着目し,その違いを明らかにしてきた.本研究では,さらに看護技術の暗黙的な特徴データを多様な視点から抽出するため,採血実施時の脳波,心拍数などの生体データに着目し,看護師と初学者の緊張状態の変化の違いなど,その特徴を分析した.その結果,脳波について,初学者と看護師の平均値についてt検定を行った結果,β/α値では有意差は見られず(p=0.54),θ/α値で初学者と看護師に有意差がみられた(p<0.001).また,採血技術実施中,看護師は2名とも常にθ/α値がβ/α値に対して優位であったが,初学者11名のうち3名は常にβ/α値の方がθ/α値より優位となり,2名はβ/α値とθ/α値の優位が実施回数により逆転するものがみられた.心拍データについては,初学者では,採血技術の成功回数が多い被験者でもCVIとLF/HFの相関は低く,採血技術に対する精神的な安定度が高いとは言い難い.すなわち,採血時の心理状態は,初学者と看護師とでは明らかに異なることがわかった.看護技術における「熟練の技(わざ)」や「コツ」はその「暗黙性」ゆえに伝承しにくい.著者らは先行研究において,暗黙知を形式知化する方法として看護師と初学者の看護技術実施時の視線の動きに着目し,その違いを明らかにしてきた.

本研究では,看護技術の暗黙的な特徴データを多様な視点から抽出するため,採血実施時の脳波,心拍数などの生体データに着目し測定を行った.本論文では,採血技術実施時の初学者と看護師の脳波の分析から,リラックスした状態の指標となるθ/α値に違いがあることを見出した.本研究では,看護技術における「熟練の技(わざ)」や「コツ」などの「暗黙知」を体得するために,それらの特徴を多様な側面から定量的に明らかにして形式知として可視化することを目的とする.今年度は,脳波の測定を行い,その特徴の分析から技術の熟達の度合いを明らかにすることを目的に実験を行った.研究計画では静脈注射技術としていたが,初学者の熟達過程を調べるため,さらに単純な採血技術を採用した.脳波は時々刻々と変化する脳の自発的電気的活動を頭皮上の電極から記録したもので,そこから人のリラックス状態や緊張状態を判定することができる.脳波の成分指標としてβ波(覚醒・興奮時),θ波(入眠時),α波(リラックス時)がある.実験では,初学者(看護以外)10名および看護師2名によるシミュレーションモデルへの採血技術実施時の脳波を測定し,緊張や集中の評価,熟練による変化などを検証した.仮説は以下の2点とした.1)「熟練者は,無意識のうちに技術を行っているため,技術実施時にはα波が多く出現する」2)「熟練者は,先行処理に入る前に特徴的な脳波が出現する」.実験の結果,看護師は採血技術実施時の緊張が低く,集中が高い状態であることがわかった.初学者は10名中4名が緊張状態にあったことがわかった.しかし,初学者は初め緊張していても10回の繰り返し技術の中で回数を重ねるごとに落ち着いて集中できるようになる変化もみられた.先行処理についてはデータ分析中である.また,本研究では,「熟練の技(わざ)」や「コツ」などの「暗黙知」を体得させる学習支援システム開発のために,まず,複数の取得データを時系列に一括して表示できるシステムの開発を行った.これにより,視線映像と脳波,心拍,手指データなどのファイルを一括して表示でき,これまでできなかった各技術手順時に出現する生体データから看護スキルの特徴を分析することが可能となった.看護技術における特徴を多様な生体データとして定量的に収集し,そのデータファイルを一元表示できるシステムを開発し,学習支援システムとしても活用できることを明らかにした.実験で取得した脳波データを看護師と学生で比較した結果,看護師は実施中θ/α値が優位で,落ち着いた状態でいるのに対し,初学者はβ/α値が高く緊張状態が続くものや,実施中にβ/αとθ/αの大小が逆転し緊張と安静の優位が変化するものも見られ,安定状態に差があることが明らかになった.この結果の一部は医療情報学会で発表した.また,採血実施過程で時間制限を課したグループとそうでないグループでの脳波に差がみられ,緊張状態で実施している初学者に対して,実施に時間制限を持たせると,脳波上,緊張よりも集中が高まる傾向がみられた.これより,緊張の高いスキルに対する学習方法において配慮すべき内容が示唆された.以上の結果より,看護技術の暗黙知を形式知化する方法として脳波等の生体データに注目し,看護師と初学者の緊張・集中状態の変化の違いなど,その特徴を抽出することができた.さらに,時間制限を課すという学習方法が有効であり,学習支援システムとして実装するうえでの機能要件を導くことができた.看護技術における特徴を多様な側面からデータとして定量的に収集し,分析できることが明らかになった.また,ファイルを一元表示できるシステムを開発し,より分析しやすい環境を構築した.本研究では,看護技術実施者(看護師)の脳波等のデータしか測定,分析していない.次のステップとして,看護技術における「熟練の技(わざ)」や「コツ」などの「暗黙知」を体得するために,看護師と患者の生体リズム(脳波と心電図)の同調情報(引き込み現象※)を活用して,看護技術の「暗黙知」の修得を支援できる教育システムの開発を目的として研究を進めていく予定である.(※引き込み現象:生体リズムが相互に時系列的関係を成立させて同期する現象)今後は,暗黙知の可視化方法と学習支援システムデザインの検討を行う.平成23年度に収集した視線,脳波,手順,手指動作などのデータを解析する.さらに,磁気を使用する手指センサーによる脳波計への干渉を回避する測定方法を検討するなど,実験のプロセスを改善し,熟練した技術をもつ看護職および看護学生を対象に同様のデータを収集する.これらの結果をもとに看護技術の暗黙知を統合して可視化(形式知化)する方法と,学習支援システムとしてのデザインを検討する.得られた結果を取りまとめ,成果の発表を行う.連携協力者として以下の研究者からアドバイスを得ながら推進する.[連携協力者]
膜型ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB-EGF)のアポトーシス抑制機序

今年度は昨年より症例を追加し、以下の検討をおこなった。1)慢性関節リウマチ(RA)滑膜細胞をCD163陽性(マクロファージ系細胞)とCD163陽性細胞に分離し、HB-EGFにてRT-PCRをおこなったところ、CD163陰性細胞にもCD163陰性細胞と同程度にHB-EGFを発現している症例がみられた。また、変形性関節炎(OA)の滑膜細胞においても、RA滑膜細胞と同程度にHB-EGFを発現している症例がみられた。CD163陰性細胞の多くは線維芽細胞と考えられるが、HB-EGFのアンチセンスRNAプローベを用いたRA滑膜組織のin situ Hybridizationの結果も、滑膜線維芽細胞におけるHB-EGFの発現を示した。線維芽細胞におけるHB-EGF発現の報告は少なく、滑膜線維芽細胞においてはHB-EGF発現の機序について今後検討する予定である。2)Raji細胞はHB-EGFを発現していないので、pcDNA3に組み込んだHB-EGFをRaji細胞に遺伝子導入し、transformantを得た。この細胞を用いて、Jurkat細胞のアポトーシスに及ぼす膜型HB-EGFの影響を検討したが一定の結果はみられなかった。また、Jurkat細胞のアポトーシスに及ぼすヘパラン硫酸,コンドロイチン硫酸の影響を検討したところ、ヘパラン硫酸のアポトーシス抑制作用が示されたので、この系におけるヘパラン硫酸のアポトーシス抑制が、Jurkat細胞の膜型HB-EGFによるものか今後検討する予定である。膜型ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB-EGF)の慢性関節リウマチ(RA)滑膜における分布・役割に関する報告はみられない。今年度は1)RA滑膜におけるHB-EGFの発現を免疫組織学的に検索し、HB-EGFが滑膜表層マクロファージ系細胞に多量に発現していることを見出した。2)RA滑膜細胞に抗HB-EGF抗体で染色し、フローサイトメトリーにて検索したところ、滑膜マクロファージ系細胞、リンパ球に膜型HB-EGFの発現がみられた。3)ウエスタンブロットでも、RA滑膜に22KDaの模型HB-EGFが存在した。しかし、RA滑液には可溶型HB-EGFはみられなかった。4)変形性関節炎(OA)滑膜においても同様の検索をおこない、OA滑膜マクロファージの膜型HB-EGFの発現はRA膜型マクロファージに比し、軽度であることがわかった。今年度の研究より、RA滑膜において膜型HB-EGFの存在が確認できたので、次年度は以下の研究をおこなう予定である。1)膜型HB-EGFを発現していない細胞株に膜型HB-EGFをトランスフェクトし、T細胞、マクロファージ、線維芽細胞のアポトーシス抑制効果を検討する。この際、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸添加の影響も検討する。2)RA OA軟骨部のプロテオグリカンに可溶性HB-EGFが結合しているか否か。検討をおこない、もし、軟骨部に可溶型HB-EGFが結合しているなら、可溶型HB-EGFの軟骨細胞のアポトーシスへの影響も検討する。

線維芽細胞におけるHB-EGF発現の報告は少なく、滑膜線維芽細胞においてはHB-EGF発現の機序について今後検討する予定である。2)Raji細胞はHB-EGFを発現していないので、pcDNA3に組み込んだHB-EGFをRaji細胞に遺伝子導入し、transformantを得た。この細胞を用いて、Jurkat細胞のアポトーシスに及ぼす膜型HB-EGFの影響を検討したが一定の結果はみられなかった。また、Jurkat細胞のアポトーシスに及ぼすヘパラン硫酸,コンドロイチン硫酸の影響を検討したところ、ヘパラン硫酸のアポトーシス抑制作用が示されたので、この系におけるヘパラン硫酸のアポトーシス抑制が、Jurkat細胞の膜型HB-EGFによるものか今後検討する予定である。
犬における遺伝性グルタミン酸輸送体欠損症の分子機構

グルタミン酸輸送体は哺乳動物の中枢神経系に多く発現する膜蛋白質であり,細胞外グルタミン酸レベルを低値に保つことにより神経細胞を保護する役割を果たしている.一方,本輸送体は犬赤血球にも発現し,細胞を酸化的ストレスより保護するGSHの産生に必要なグルタミン酸を取り込むためにはたらいている.現在までに申請者らは,犬赤血球に発現するグルタミン酸輸送体がグリア細胞に多く発現するGLAST型であること,犬において全身諸臓器に広く発現することを明らかにする一方で,日本犬の一部において遺伝性赤血球GLAST欠損症を見出した.この欠損の原因遺伝子については,点突然変異によるアミノ酸置換および転写活性の低下の組合せにより生ずることを明らかにしたが,その分子機構については不明な点があった.前年までの研究では,人由来赤芽球細胞株を用いた強制発現系において犬GLAST蛋白質および機能を検討したが,変異GLASTは野性型GLASTとほぼ同様の挙動を示した.そこで生体で見られる現象が再現されていない可能性があったため,本年は犬末梢血由来多能性幹細胞の赤芽球への分化誘導系の確立を試みた.犬末梢血由来単核球分画をPHA刺激コンディション培地により前赤芽球に分化誘導したのち,エリスロポエチン存在下で5%CO2,5%O2で培養し,最終的に正染性赤芽球が大半を占める系を確立した.次に,GLAST欠損犬および正常犬由来の末梢血単核球を材料に同様の分化誘導を行い,GLAST発現の比較検討を行った.正常犬およびGLAST欠損犬両者においてGLAST蛋白質は,コンディション培地において前赤芽球への分化を終えた時点でGLAST蛋白質の発現が見られた.通常の66kDaの分子に加え,50kDa程度の未成熟と考えられる分子が検出された.赤芽球赤血球への分化誘導の過程で,未成熟GLASTの消失に伴い成熟型GLASTの発現の増加が認められ,この時期に犬赤血球GLASTの発現が誘導されることが明らかになった.しかしながら,正常およびGLAST欠損犬の間に差異は認められず,正染性赤芽球までの時期に発現量の差異は無いものと考えられた.一方,生体より採取した網状赤血球の時点では,欠損犬においてGLAST欠損が観察されることから,正染性赤芽球から脱核,網状赤血球に至る短い時期にGLASTの分解消失がおきている可能性が示唆された.グルタミン酸輸送体は哺乳動物の中枢神経系に多く発現する膜蛋白質であり,細胞外グルタミン酸レベルを低値に保つことにより神経細胞を保護する役割を果たしている.一方,本輸送体は犬赤血球にも発現し,細胞を酸化的ストレスより保護するGSHの産生に必要なグルタミン酸を取り込むためにはたらいている.現在までに申請者らは,犬赤血球に発現するグルタミン酸輸送体がグリア細胞に多く発現するGLAST型であること,犬において全身諸臓器に広く発現することを明らかにする一方で,日本犬の一部において遺伝性赤血球GLAST欠損症を見出した.この欠損の原因遺伝子については,点突然変異によるアミノ酸置換および転写活性の低下の組合せにより生ずることを明らかにしたが,その分子機構については不明な点があった.前年までの研究では,人由来赤芽球細胞株を用いた強制発現系において犬GLAST蛋白質および機能を検討したが,変異GLASTは野性型GLASTとほぼ同様の挙動を示した.そこで生体で見られる現象が再現されていない可能性があったため,本年は犬末梢血由来多能性幹細胞の赤芽球への分化誘導系の確立を試みた.犬末梢血由来単核球分画をPHA刺激コンディション培地により前赤芽球に分化誘導したのち,エリスロポエチン存在下で5%CO2,5%O2で培養し,最終的に正染性赤芽球が大半を占める系を確立した.次に,GLAST欠損犬および正常犬由来の末梢血単核球を材料に同様の分化誘導を行い,GLAST発現の比較検討を行った.正常犬およびGLAST欠損犬両者においてGLAST蛋白質は,コンディション培地において前赤芽球への分化を終えた時点でGLAST蛋白質の発現が見られた.通常の66kDaの分子に加え,50kDa程度の未成熟と考えられる分子が検出された.赤芽球赤血球への分化誘導の過程で,未成熟GLASTの消失に伴い成熟型GLASTの発現の増加が認められ,この時期に犬赤血球GLASTの発現が誘導されることが明らかになった.しかしながら,正常およびGLAST欠損犬の間に差異は認められず,正染性赤芽球までの時期に発現量の差異は無いものと考えられた.一方,生体より採取した網状赤血球の時点では,欠損犬においてGLAST欠損が観察されることから,正染性赤芽球から脱核,網状赤血球に至る短い時期にGLASTの分解消失がおきている可能性が示唆された.
パターン計測用同時高速多点検出センサ

空間的または時間的に広がりを持った画像や音響などのパターン計測では、複数の点を同時にかつ高精度に測定する必要がある。しかし、現状のPSDやCCDはこの要求に充分応えていない。そこで、本研究では従来のパターン計測用センサの問題点を解消するため、次の3点の機能を有するパターン計測用センサの開発をめざす。(1)複数点の同時検出(2)高速検出と高精度計測との両立(3)低周波ノイズの低減本研究では上記(1)(3)を満足させるためにCCDのデジタル的要素とPSDのアナログ的要素を併せ持つハイブリッド型センサ原理を提案した。その基本原理は次の3点からなる。(1)センサ素子数を従来のアレイ型センサであるCCD比べて非常に少なくとり、素子間隔を広くとる。(2)センサアレイ部に複数のスポット信号を入力し、極大出力センサ素子の走査を並列的に行う。(3)極大出力素子とその両隣のセンサ素子の出力を用いて、極大値付近のセンサアレイの出力分布を二次曲線で近似して、スポット信号位置を求める。本研究では以上の原理を全て電子回路により実現した。回路構成上の従来にない特徴は、(2)の走査方式においてセンサ素子を2つづつの組に分けてト-ナメント方式により並列的に極大値を求めて高速化を図った点にある。それに加えて、二次曲線近似補間をアナログ回路だけで実現して、A/D変換による量子化誤差による検出精度の悪化と検出速度の遅れを回避した点である。本研究では、光センサを用いた回路を実際に試作して実験を行い、今回の補助金で購入した計測用計算機にて特性解析した結果、以下の成果を得て、当初の研究目標が達成できた。(1)4点の同時検出(2)線形性誤差±1.6%以内、サンプリング周波数10KH_Zの高精度高速測定機能の実現(3)背景光の影響少空間的または時間的に広がりを持った画像や音響などのパターン計測では、複数の点を同時にかつ高精度に測定する必要がある。(1)4点の同時検出(2)線形性誤差±1.6%以内、サンプリング周波数10KH_Zの高精度高速測定機能の実現(3)背景光の影響少
多能性幹細胞移植・遺伝子治療による複合的内耳治療戦略

Connexin (Cx) 26をコードするGjb2遺伝子は原因遺伝子の50%以上と最も高頻度に変異が検出されるが、未だ有効な根本的治療法は存在しない。我々は二種のCx26遺伝子改変難聴モデルを用いて、Cx26がギャップ結合プラーク(GJP)複合体を安定化させていることを証明した(Kamiya, 2014, J Clin Invest)。このGJPを遺伝子治療にて修復し、Cx26欠損難聴モデルマウスの聴力を有意に改善させることに成功した(Iizuka, 2015, Hum Mol Genet)。遺伝性難聴の根本的治療法は皆無であり、新た治療戦略を必要としている.。本研究では内耳幹細胞治療法とウイルスベクターによる内耳遺伝子導入法という2種類の独自に開発したアプローチを組み合わせ、独自の遺伝性難聴モデルに適用する。主に標的とするのは蝸牛線維細胞・支持細胞および同細胞で機能するコネキシン26遺伝子である。この治療による聴力回復に関する有効性と安全性を評価する。本研究では、多種多様な欠損細胞を一元的に修復する治療法としてi)欠失した遺伝子の導入とii)骨髄間葉系幹細胞および成人細胞から樹立可能な新規多能性幹細胞iPS細胞(induced Pluriopotent Stem Cell)の移入を我々の作製した遺伝性難聴モデルマウスへ適用し安全性・有効性評価を行うことにより、これまで皆無であった遺伝性難聴の根本的治療法を開発することを目的とした。これまでの研究では遺伝性難聴モデル、コネキシン26欠損マウスの蝸牛内へ半規管から投与した移植間葉系幹細胞を蝸牛へ誘導させる効率を飛躍的に増強させることに成功した。更にこれらの細胞が蝸牛組織内で標的の蝸牛細胞へ分化誘導されていることが示唆された。更に骨髄間葉系幹細に加えて人工多能性幹細胞iPS細胞(induced Pluriopotent Stem Cell)を用いた新規細胞移植法をアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入と複合的に応用することにより40KHzの高音領域を有意に聴力改善させることに成功した。主に標的とするのは蝸牛線維細胞・支持細胞および同細胞で機能するコネキシン(CX)26遺伝子(GJB2)である。更に骨髄間葉系幹細に加えて人工多能性幹細胞iPS細胞(induced Pluriopotent Stem Cell)を用いた新規細胞移植法をアデノ随伴ウイルス(AAV)による遺伝子導入と複合的に応用することにより高音領域を有意に聴力改善させることに成功した。また新生仔マウス(生後0日齢)へのCX26遺伝子を搭載したAAVの投与によりCX26欠損マウスの聴力を有意に改善させることに成功した(Hum Mol Genet, 2015)。

また新生仔マウス(生後0日齢)へのCX26遺伝子を搭載したAAVの投与によりCX26欠損マウスの聴力を有意に改善させることに成功した(Hum Mol Genet, 2015)。さらにCX26(GJB2)変異患者への細胞治療法の臨床応用を目指し、iPS細胞からCX26発現細胞への分化誘導法の開発を試みた。その結果CX26およびCX30を発現する内耳前駆細胞様細胞への分化誘導が確認された。Connexin (Cx) 26をコードするGjb2遺伝子は原因遺伝子の50%以上と最も高頻度に変異が検出されるが、未だ有効な根本的治療法は存在しない。我々は二種のCx26遺伝子改変難聴モデルを用いて、Cx26がギャップ結合プラーク(GJP)複合体を安定化させていることを証明した(Kamiya, 2014, J Clin Invest)。このGJPを遺伝子治療にて修復し、Cx26欠損難聴モデルマウスの聴力を有意に改善させることに成功した(Iizuka, 2015, Hum Mol Genet)。新たな細胞・遺伝子複合治療法により遺伝性難聴モデルマウスの有意な聴力改善が認められた。また新生仔マウスの内耳へのアデノ随伴ウィルスの局所投与によっても有意な聴力改善が見られ、これらの方法を条件検討することにより遺伝性難聴の根本的治療法が開発できる可能性が高まったため。27年度が最終年度であるため、記入しない。耳鼻咽喉科学大部分の研究費に関しては計画通りに支出したが、旅費や謝金等の勤務状況に応じて予想困難な変動が生じるため、今後はこれらを事前に予測し、正確な支出計画を立てる予定である。課題としては旅費や謝金等の勤務状況に応じて予想困難な変動が生じるため、適時年度計画を見直しつつ3か月ごとの支出計画の確認と消耗品購入量の調整を行う予定である。これまで細胞治療により遺伝性難聴の聴力回復に成功した例はないが、新たな細胞・遺伝子複合治療法により遺伝性難聴モデルマウスの有意な聴力改善が認められたため。研究員が退職し後任者が決まらなかったことから、当初の見込みより賃金等の支出が少なかったため。大部分の研究費に関しては計画通りに支出したが、実験動物の繁殖状況や謝金等の勤務状況に応じて予想困難な変動が生じるため、今後はこれらを事前に予測し、正確な支出計画を立てる予定である。新規研究員・研究補助員の募集および雇用により研究推進・データ解析を加速させるとともに、旅費、謝金や使用消耗品の購入量を調整して3か月ごとの試算を行うことにより計画的な支出を目指す。実験動物の繁殖状況や謝金等の勤務状況に応じて予想困難な変動が生じたため実験動物の繁殖状況や謝金等の勤務状況に応じて予想困難な変動が生じるため、適時年度計画を見直しつつ3か月ごとの支出計画の確認を行う予定である。