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中国東北における「跨境領域」の形成と展開－中東鉄道をめぐる国際政治史

本年度は採用中に博士論文『中東鉄道経営史ーロシアと満洲ー』を学術成果公開促進費の援助を受けて出版できることとなり、ほとんどの時間をその加筆修正に費やした。再度、博士論文を見直す中で、新しい史料に出会うことも多く、研究の深化につながった。他にも、『20世紀満洲史歴史事典』では項目「大連」、「関東州」、「旅順」、「中東鉄道」、「東省特別区」、「ホルヴァート」を担当し、中東鉄道関連の知識を一般向けの書籍で普及することができた。また5月前半に行ったイギリスにおける史料調査で、ロシア革命後から1960年代後半に至る広範な史料を収集することができた。今後はこの史料を活用し、中東鉄道を再度ソ連が支配下においた、1945年から1952年の長春鉄道の問題や、中ソ対立の問題などに取り組む予定である。こうした問題に関して、イギリス側の史料は省みられることがなかったため、新たな知見を提供できるであろう。科学研究費補助金にかかわる具体的な研究成果を、書籍の形で刊行できた(麻田雅文『中東鉄道経営史ーロシアと満洲1896-1935ー』名古屋大学出版会、2012年)。本書でも中東鉄道の全てが解明されたわけではないが、今後、中東鉄道に関する基礎的な知識を供給できる。中東鉄道についての研究は、より詳細な部分にわたる研究を、単独の論文形式で積み重ねてゆき、いずれは論文集として刊行したいと思う。今後は、研究の重点を中国長春鉄道に移す。1945年8月、ソ連は「満洲国」に侵攻した。ソ連は、戦利品として以前から要求していた旧中東鉄道(北満鉄道)と満鉄を中華民国との共同経営という条件で獲得し、名前を長春鉄道と改めて、1952年末まで事実上単独で経営した。本研究は、その長春鉄道をめぐる東アジアの国際関係と、その経営実態を分析する。本年は博士課程ですすめてきた中東鉄道の研究を、より多様で、一般的なコンテキストに転換して学会で発表し、論文化することに努めてきた。具体的には伊藤博文暗殺や辛亥革命など、百年の話題と絡めた形で中東鉄道の存在に読者と聴衆の関心をひきつけ.その経営の一側面を論じた([辛亥革命へのロシア帝国の対応]、「ロシン側から見た伊藤博文暗殺」)。また、もっと直戴に、中東鉄道の敷設決定過程を再考することで、ロシアの極東再生策を論じることも行った(「中東鉄道の敷設決定過程再考」)。これらの一部は、昨年に執筆した博士論文にも活用されている。一方で、研究それ自体の国際化をすすめてきた。具体的には英文による国際学会での発表と、英文雑誌への投稿である。第一次大戦下のロシア極東についての発表では(How the Russian Defeat Began in the East)討論者から有益なコメントを聞くことができた。この他、学会で読み上げた論文を英文難誌に投稿するのが、次のステップである。この点、今年英語論文(The China-Russia-Japan Military Balance in Manchuria,1906-1918)が掲載されたことは、自分にとって大きな励みとなっている。ただ、この論文の掲載まで2年間かかっていることを考えると、インパクトファクターにこだわりすきる戦略は転換して、量産に努めたい。中東鉄道に関する研究では、今年度はその国際関係歴史に重点を置き、学会報告を行ってきた。中東鉄道は日本やロシア、中国、フランス、アメリカの各国が激しい争奪戦を繰り広げてきた歴史があり、その中で経営も翻弄されてきた。日本国際政治学会2011年度研究大会の報告「中東鉄道をめぐる国際情勢、1917-1924年」、東アジア近代史学会第132回月例研究会「日本と中東鉄道-「静かなる占領」の水面下で、1931-1935年-」は、その時期をそれぞれ1917年から1924年、1931年から1935年にそれぞれ絞って論じたものである。研究成果公開促進費の内定可否を待っており、研究成果をとりまとめた単著の刊行がまだ出版の目途がついていないのが残念ではある。しかしながら、大規模な国際学会での発表を2度行い、国内では中東鉄道に関係した報告を重ねるなど、着実に研究の成果を研究者のサークル内に広めることはできている。

本書でも中東鉄道の全てが解明されたわけではないが、今後、中東鉄道に関する基礎的な知識を供給できる。次年度の課題は、これまでの研究成果をいかに日本国外でも知らしめてゆくか、にあると想定している。というのも、当該分野の研究がドイツと北米で急速に進歩しているためである。そのためには、やはり英語での研究成果め発表を重視し、国際学会での発表や英語論文の投稿の機会を増やしてゆきたい。また学会論文のみならず、広く一般向けにも研究成果を公表する努力をしていきたものの、こちらについてはグ板的な手段を見いだせていない。こちらは、博士論文をまとめた単著出版後の課題である。中東鉄道についての研究は、より詳細な部分にわたる研究を、単独の論文形式で積み重ねてゆき、いずれは論文集として刊行したいと思う。今後は、研究の重点を中国長春鉄道に移す。1945年8月、ソ連は「満洲国」に侵攻した。ソ連は、戦利品として以前から要求していた旧中東鉄道(北満鉄道)と満鉄を中華民国との共同経営という条件で獲得し、名前を長春鉄道と改めて、1952年末まで事実上単独で経営した。本研究は、その長春鉄道をめぐる東アジアの国際関係と、その経営実態を分析する。
生体神経ダイナミクス制御用複合マイクロプローブの試作と制御方式

「てんかん発作」は,大脳皮質もしくは深部の神経ネットワークにおいて生じる大振幅の電気振動が原因であるが,それの引き金となるのは,ある狭い領域(「てんかん原性域」)で発現する電気振動である.そこで,この「てんかん原性域」を探し出し,瞬間凍結融解壊死をさせ,他の組織には全く影響を与えないようなマイクロプローブを開発した.ラットの脳を使った生理実験では,直径300ミクロンという狭い領域を凍結させ,その両側にある神経組織を完全に分離することができた.「てんかん発作」は,大脳皮質もしくは深部の神経ネットワークにおいて生じる大振幅の電気振動が原因であるが,それの引き金となるのは,ある狭い領域(「てんかん原性域」)で発現する電気振動である.そこで,この「てんかん原性域」を探し出し,瞬間凍結融解壊死をさせ,他の組織には全く影響を与えないようなマイクロプローブを開発した.ラットの脳を使った生理実験では,直径300ミクロンという狭い領域を凍結させ,その両側にある神経組織を完全に分離することができた.「てんかん」とは,突然発作がおき,その発作を繰り返す大脳の慢性的な病気である.その発生メカニズムは,詳しくはまだ解明されていない.この発作を抑制するのに,脳を冷却することの有効性が既に報告されており,局所冷却(脳表面で4mm角)のためにペルチエ効果を利用した冷却装置も開発されている.しかしこの方法では,ペルチエ効果の冷却能があまり大きくないので,急激な冷却や,微小な冷却装置によるミクロな領域の冷却が困難である.もし,冷却能のより大きい方法が採用できれば,脳のミクロな領域にダメージを与えることなく,「てんかん」発作の原因となる神経細胞群の凍結融解壊死を可能にする.壊死した細胞は数週間後には生体内に吸収されてしまうので,極めて自然な治癒が期待できる.本年度は,真鍮をプローブ材料とし,液体窒素を冷媒とするマイクロフリーザーを試作した.これは,先端がおよそ200μm,根元が約22mmの同心二重構造のプローブで,スイッチにより適量の液体窒素を先端部に注入・気化させることができるので,先端部が気化熱を奪って,急激にその温度が低下する.この試作マイクロフリーザーの先端部は,わずか3秒間で室温から-20°Cに降下させることができ,4050秒で室温に戻った.したがって極めて高速の凍結・融解が可能となり,かつ狭い領域のみを選択的に壊死させることができた.具体的な実験として,ラットの海馬を用いてその性能を確認した.海馬スライスのmossy fiberを剌激してCA3から誘発電位(「てんかん波」)を確認し,その後CA3を凍結融解壊死させた.その際,CA3を含む約1mm程度の白く変色した凍結領域が顕微鏡下で確認できた.その後のCA3では常温に戻しても,2度と「てんかん波」を誘発させることができなかった(すなわちこの部位は凍結融解により破壊された).さらに,凍結融解壊死させた領域近くのSchaffer collateralを刺激してCA1で誘発電位を記録することができた.すなわち,CA1とその近傍を破壊することなく,CA3のみを選択的に破壊することに成功した.平成18年度には、マイクロプローブに使用した冷媒は液体窒素であったが、これは沸点が低すぎてプローブ全体が極度に冷却されるので、先端のみの冷却を必要とする脳内深部冷却には不向きである。そこでプローブ先端のみを急速冷却するためにプローブ外径が0.35ミクロン、0.45ミクロン、0.81ミクロンの3種類を試作し冷媒として沸点の比較的高いHFC(ハイドロフロロカーボン)を使用した。これをゼラチンと水で作ったゼリー状の媒質の中で使用したところ、冷媒注入後5秒以下で、プローブ先端のみに水が出来ることを確認した。(山川、Zimin)一方、5mMK+を含んだ人工脳脊髄液(ACSF)で灌流したラット海馬CA3脳切片を用い、苔状線維を高頻度カオス刺激して安定した「てんかん様バースト波」を発生させた。この「てんかん様バースト波」を、試作した上記のマイクロプローブを利用して凍結させ、その後再度、苔状線維を高頻度カオス刺激して、「てんかん様バースト波」が再発することなく、その部分が壊死したことを確認した。(石塚、Zimin、山川)てんかん原性域推定の基礎実験として、寒天内に計測用電極及び刺激用電極を配置する装置を開発し、計測信号を入カとして刺激電極位置同定を実現するSORネットワークの開発を行った。そのSORネットワークの学習を、より確実にするために、従来(入力、出力)のペアを同時に学習に用いていたが、今年度は、学習を2段階に分割してバッチ学習を行うアルゴリズムを考案した。第1ステップで(入力)のみの集合でバッチ学習を行い、競合層上のユニットの参照ベクトルを決定し、次に第2ステップでは(入力)のマッチしたユ二ットを勝者ユ二ットとし、その近傍のユニットのみの(出力)をバッチ学習した。これにより、従来のSORネットワークよりもはるかに精度の高いモデリングが可能になった。(山川、堀尾)本基盤研究(A)の発展的研究として平成20年度特別推進研究を申請していた.6月になってそのテーマが採択されたので,本基盤研究(A)は中止するに至った.従って平成20年度基盤研究(A)の実施期間は4月1日6月5日までの約2ヵ月間である.

この間に実施した研究は,冷凍プローブの代わりに,レーザー光を用いて神経の機能を破壊する実験である.すなわち,「てんかん原性域」が見つかった場合に,それを狙い撃ちして破壊するためのレーザー焼灼の見通しを立てることである.具体的には,ウシガエルの坐骨神経(神経束)を10cmほど取出し,一方の端に電流刺激を与え,活性部位が他端へ移動することを確認した.この神経束は,太くて伝達速度の速い低閾値神経(有髄神経)と,細くて伝達速度の遅い高閾値の神経(無髄神経)とが混在しており,したがって,1回のパルス電流刺激を与えると,それによる活性部位が他端に伝達される間に2峰性の電流が観測された.このような神経束の途中に,ハイパワーレーザーダイオードから送られたレーザー光を直径1mmのグラスファイバーを通して照射する実験を行った.焼灼用のレーザー光は,パルス幅990μsec.周期20msecのものを用いた.刺激用電流としては,0.8mA,10msecの電流を10sec間隔で与えた.レーザー光のパルス電流値を10A以上にすると,神経束の伝達機能が徐々に阻害され,25Aでは有髄神経は2分間照射で,また無髄神経は1分間照射で,伝達機能を消失してしまい,回復することはなかった.
物理的限界を越える光ピンセットの開発

本研究では、光ピンセットに情報技術を取り入れ、これまでの物理限界と考えられて来た制約を越えた光ピンセット技術を創出することを研究の目的とする。光ピンセットでは、光を用いるメリットを生かしながらも光の物理的限界による制限も受けて来た。スポットは波長の2分の1よりは小さくならず、スポットから外れた対象物には有効な捕捉力を与えられない。また光の散乱効率は対象物が波長より小さくなると急速に小さくなり、発生する放射圧も小さくなる。本研究では、これらの制限を対象物の状態に応じた制御を行うことで克服する。さらに、近年勃興して来た人工知能等の新たな情報技術を取り入れ、最新技術で何が実現可能かを示していく。
翻訳開始因子ｅＩＦ２の機能発現の構造的基盤

翻訳開始因子eIF2に特異的なグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)である翻訳開始因子eIF2Bの立体構造を決定し、eIF2BのeIF2の認識部位を決定した。eIF2BのeIF2認識様式は複数あることが明らかとなり、リン酸化eIF2によるeIF2BのGEF不活性化の構造的機構のモデルを提唱した。翻訳開始因子eIF2AのWD-リピートドメインの立体構造を決定し、9枚の羽根からなるβプロペラフォールドの構造を明らかにした。TrmDと基質tRNA,およびメチル基供与体アナログであるシネフンジンの三者複合体の立体構造を決定し、基質認識の分子機構を明らかにした。本研究は真核生物の翻訳開始の最初のステップにおいて中心的役割を果たす翻訳開始因子eIF2とその相互作用因子の立体構造解析を進め、eIF2の機能発現のメカニズムを明らかにすることを目的としている。本年度は特にeIF2に対するグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)として機能するeIF2Bの立体構造解析を中心として、研究を進めた。翻訳開始因子eIF2Bはヘテロ5量体(eIF2Bαβγδε)であり、eIF2BεのC末端側に位置するHEATドメインがGEF活性を担っている。eIF2BはeIF2のGEFという比較的単純な活性を担う因子であるにも関わらず、ヘテロ5量体という複雑な構造をしている。これまでにヒト由来のαサブユニットの立体構造を申請者のグループが明らかにしている他は、上述のεサブユニットのHEATドメインの立体構造情報しか存在せず、どのように5量体が形成されているかは全く不明であった。本年度は今まで困難であった酵母由来eIF2Bヘテロ5量体の組み換え体の調製方法を確立し、大量精製に成功した。精製したeIF2Bの結晶化条件の探索を試みたところ、立体構造解析が可能なレベルの高品質な単結晶を得ることに成功した。放射光施設における回折実験を行い、実験データの収集に成功した。重原子を用いた初期位相の決定にも成功し、現在までにモデルの構築をほぼ終了している。現在、精密化を進めており、投稿論文を準備中である。更にeIF2Bの立体構造解析と並行して、酵母由来野生型eIF2の調製法の検討も行った。これまでにリン酸化eIF2αの大量調製法を確立し、eIF2Bとの複合体の結晶化条件を探索中である。本研究は真核生物における翻訳開始の最初のステップにおいて中心的な役割を果たす翻訳開始因子eIF2とその相互作用因子の立体構造解析を進め、生化学的な解析と併せて、eIF2の機能発現のメカニズムを明らかにすることを目的としている。昨年度はeIF2特異的なグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)として機能するeIF2Bの立体構造解析に成功し、モデルの構築を終了したが、本年度は得られたeIF2Bの立体構造に基づき、eIF2との相互作用部位を同定する研究を進めた。また、これまで困難であった酵母由来の内在性のeIF2の大量調製法を確立した。翻訳開始因子eIF2Bは5つのサブユニット(αーε)からなり、eIF2BεのC末端側に位置するHEATドメインがGEF活性を担っていると考えられている。これまでに5つのサブユニットがどのような複合体を形成しているかの詳細は不明であった。また、eIF2との相互作用様式についても詳細は不明であった。本年度の生化学的な解析により、eIF2BαとeIF2Bβ、eIF2Bδからなる調節サブコンプレックスに形成されているくぼみでeIF2αと相互作用することが可能なことを明らかにした。また、酵母より精製したeIF2を用いて生化学的な実験をおこない、eIF2γはeIF2BγとeIF2Bεからなる活性サブコンプレックスと広い範囲で相互作用していることを明らかにした。このように同定したeIF2BのeIF2との相互作用部位はeIF2のリン酸化の有無でどのように変化するかを現在実験中であり、eIF2Bの立体構造とこれらのeIF2-eIF2Bの相互作用の生化学的な解析を併せて論文として報告する予定である。また、eIF2を含まない翻訳開始に関連する因子の1つであるeIF2Aの立体構造についても決定できたため、これを発表論文として報告した。本年度は昨年度に引き続き、eIF2に対するグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)として機能するeIF2Bの立体構造解析を中心として、研究を進めた。

翻訳開始因子eIF2Bはヘテロ5量体(eIF2Bαβγδε)であり、eIF2BεのC末端側に位置するHEATドメインがGEF活性を担っている。eIF2BはeIF2のGEFという比較的単純な活性を担う因子であるにも関わらず、ヘテロ5量体という複雑な構造をしている。これまでにどのように5量体が形成されているかは全く不明であった。昨年度に得た放射光施設における回折実験の実験データを基に、モデルを構築し、精密化を終了した。部位特異的光クロスリンカー導入による生化学的な実験によりeIF2BのeIF2αとの相互作用部位を同定した。投稿論文を準備中である。更にeIF2Bの立体構造解析と並行して、酵母由来野生型eIF2の調製法の検討も行った。酵母内在のeIF2をアフィニティーカラムで精製するための株を作成し、結晶化などの実験に耐えうる量を精製することが可能であることを確認した。また、すでに精製が可能であったeIF2αについては、リン酸化状態と非リン酸化状態の2つについてeIF2Bとの複合体の結晶化条件の探索を行った。これまでにいくつかの条件で結晶を得ることができたが、解析可能なデータの収集には至っていない。本研究は真核生物における翻訳開始の最初のステップにおいて重要な役割を果たす翻訳開始因子eIF2とその相互作用因子の立体構造解析を進め、その機能発現のメカニズムを明らかにすることを目的としている。昨年度までに、eIF2特異的なグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)であるeIF2Bの立体構造解析に成功し、eIF2との相互作用部位を同定することに成功していた。本年度はリン酸化eIF2によるeIF2Bの阻害機構を明らかにするため、eIF2B変異体を用いてGEF活性測定やITC測定、ゲル濾過クロマトグラフィー測定を行い、阻害機構モデルを提唱することに成功した。現在、これらの結果の投稿論文を準備中である。昨年度までの研究により、eIF2BαとeIF2Bβ、eIF2Bδからなる調節サブコンプレックスに形成されているくぼみがeIF2αおよびリン酸化eIF2αの認識部位であることが明らかになっていた。eIF2αのリン酸化に感受性のなくなるeIF2B変異体には上述のくぼみに変異があるものがあり、本年度はこれらの変異体の生化学的解析をおこなった。これらの変異体はくぼみを介したeIF2αおよびリン酸化eIF2αとの結合が弱くなっていることが明らかになった。一方でGEF活性は上昇しており、これらと今までのデータを基に、eIF2とeIF2Bの相互作用には不活性型と活性型の複数の様式があるというモデルを提唱した。eIF2特異的なシャペロンタンパク質と共発現させることにより、脊椎動物由来のeIF2と酵母由来のeIF2を大腸菌により大量に発現させ、精製することに成功した。昨年度までに酵母内在性のeIF2の精製にも成功しており、eIF2BおよびeIF5などの翻訳開始因子との相互作用様式を立体構造解析や生化学的解析により明らかにするための基盤を整備することができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。構造生物化学26年度が最終年度であるため、記入しない。eIF2の立体構造の決定には至っていないが、重要なeIF2との相互作用因子であるeIF2Bの立体構造の決定に成功している。重要なeIF2との相互作用因子であるeIF2Bの立体構造の決定に成功し、eIF2とeIF2Bがどのように相互作用しているかについて、詳細なデータがそろいつつある。
革新的イメージングとKOマウスを駆使した骨代謝におけるArkadiaの機能解析

Arkadiaを制御するcofactorを同定し、その分子メカニズムを解明することを目的に、Arkadia結合タンパク質のスクリーニングを行い、候補遺伝子を得た。Arkadiaの新規標的タンパク質Smad6を同定し、Arkadiaが骨芽細胞分化後期過程においてBMPシグナルを優位に活性化することで分化を促進し、BMPシグナルを選択的に抑制するSmad6をユビキチン化し分解へと導く研究成果については論文発表を行った。Arkadiaの解析の比較対象として準備していたBMPシグナルを負に制御するE3ユビキチンリガーゼSmurf2のノックアウトマウスで著明な異常が見出された。最先端の分子生物学的手法、細胞生物学的手法と申請者自らが開発した多光子励起顕微鏡を用いた革新的生体蛍光イメージング法を駆使し、BMPシグナルを制御するE3ユビキチンリガーゼArkadiaの骨芽細胞分化における時空間的な役割・作用点とその分子メカニズムを明らかにし、新たな骨粗鬆症の治療薬へ繋がる基礎的知見を得ることを目的に研究を行った。まず、平成27年度は、Arkadiaを制御するcofactorを同定し、その分子メカニズムを解明することを目的に、Arkadia結合タンパク質のスクリーニングを行い、その機能解析のために基盤整備を行った。具体的には、293細胞にFLAG-tagのついた野生型Arkadiaとリガーゼ活性を喪失した変異型Arkadiaの遺伝子を導入し、免疫沈降後に、質量分析法を用いてArkadia結合タンパク質をスクリーニングした結果から、候補タンパク質の選別し、そのドメインや機能を考慮して、FLAGと6xMycなどのepitope-tag付きタンパク質用のプラスミドのコンストラクションを開始した。in vivoの先進的遺伝子改変マウスを用いた実験については、単純なArkadia KOマウスは胎生致死なので、Cre-loxコンディショナルノックアウト法を利用したArkadiaに対する骨特異的ノックアウトマウスの作製が必要であるが、すでに作製済みのhypomorphic phenotypeのArkadia floxマウスの解析を先行させるために、そのgenotyping等の準備を行った。一方で、Arkadia floxマウスのデザインを完了した。さらに、BMPシグナルのイメージングのために、BMP特異的プロモーターの下流で蛍光タンパク質が発現するTgマウスのデザインを完了した。最先端の分子生物学的手法および細胞生物学的手法に関しては、Arkadia結合タンパク質のスクリーニングとArkadiaを制御するcofactorの候補タンパク質の選別が終了しそのドメインや機能を考慮した候補タンパク質のFLAGと6xMycなどのepitope-tag付きタンパク質用のプラスミドのデザインとコンストラクションに着手し、タンパク質の機能解析のための基盤整備は順調に進展している。in vivoの先進的遺伝子改変マウスを用いた実験については、Arkadia floxマウスの作製のためのデザインは完了し、掛け合わせるための骨芽細胞特異的ColI-Creトランスジェニックマウス(ColI-Cre Tgマウス)は入手した。さらに両者のgenotyping等の条件設定は完了した。一方で、すでに作製済みのhypomorphic phenotypeのArkadia floxマウスの解析を先行させるための基礎実験に着手し、in vivoのための基盤整備は順調に進展している。さらに、BMPシグナルのイメージングのために、BMP特異的プロモーターの下流で蛍光タンパク質が発現するTgマウスのデザインは完了した。具体的には、BMP標的遺伝子であるID1のプロモーターのBMP responsive element (BRE)の下流にGFP遺伝子を繋げたプロモーターレポーターを設計した。昨年に引き続き、Arkadia結合タンパク質のスクリーニングとArkadiaを制御するcofactorの候補タンパク質の機能解析のための基盤体制の確立を進め、epitope-tag付きタンパク質用のプラスミドのデザインとコンストラクション、一部のタンパク質の機能解析を行った。in vivoの先進的遺伝子改変マウスを用いた実験については、Arkadia floxマウスの作製のためのデザインは完了し、掛け合わせるための骨芽細胞特異的ColI-Creトランスジェニックマウス(ColI-Cre Tgマウス)について、in vivoの発現の特異性の検討を完了した。BMP特異的プロモーターの下流で蛍光タンパク質が発現するTgマウスについては、プロモーターの特異性の検討をin vitroで完了した。さらに、比較対象として準備していたBMPシグナルを負に制御するE3ユビキチンリガーゼSmurf2のノックアウトマウスの骨に異常が見出され、その骨解析を進めた。より詳細に骨のイメージング解析を行うために、透明化の手法を新たに取り入れ、骨のイメージングに条件検討を行った。最先端の分子生物学的手法、細胞生物学的手法と申請者自らが開発した多光子励起顕微鏡を用いた革新的生体蛍光イメージング法を駆使し、BMPシグナルを制御するE3ユビキチンリガーゼArkadiaの骨芽細胞分化における時空間的な役割・作用点とその分子メカニズムを明らかにし、新たな骨粗鬆症の治療薬へ繋がる基礎的知見を得ることを目的に今後も研究を進める。

まず、Arkadiaを制御するcofactorに関しては、FLAGと6xMycなどのepitope-tag付き候補タンパク質用のプラスミドをCOS7細胞に強制発現またはshRNAによってノックダウンし、ArkadiaとSmad6の結合、ArkadiaによるSmad6のユビキチン化・分解、ArkadiaによるBMPの転写制御に対する効果を解析し、cofactor候補分子を同定する予定である。次に、in vivoの先進的遺伝子改変マウスを用いた実験については、hypomorphic phenotypeのArkadia floxマウスの解析を先行させるとともに、Arkadia floxマウスの作製、骨芽細胞特異的ColI-Creトランスジェニックマウス(ColI-Cre Tgマウス)との掛け合わせを進める。さらに、BMPシグナルのイメージングのために、BMP特異的プロモーターの下流で蛍光タンパク質が発現するTgマウスのデザインを完了したので、今後は、BMP標的遺伝子であるID1のプロモーターのBMP responsive element (BRE)の下流にGFP遺伝子を繋げたプロモーターレポーターを作製し、Tgマウス作製を進める。骨代謝比較的費用がかからないin vitroにおけるArkadia結合タンパク質のスクリーニングを精力的に進め、比較的費用がかかるin vivo実験については、既存のhypomorphic phenotypeのArkadia floxマウスの解析を先行させ、さらに比較的費用がかからないマウス作製における実験条件設定など基礎基盤の整備を完了した。整備された実験条件設定など基礎基盤にもとづき、比較的費用がかかるマウス作製・維持などin vivo実験について精力的に研究を進める。
LRH-1のβ-カテニンによる転写活性化機構の分子メカニズム解析

LRH-1は初期発生で重要な役割を担い、また肝臓、膵臓、卵巣、などで遺伝子発現制御を担っている核内受容体の1つの転写因子である。また、癌との関連も指摘されている。これまでに大腸菌を用いた大量発現系を用い、ヒトLRH-1の全長タンパク質(4ドメイン)とN末端ドメインを削ったタンパク質の調製を行って、2重鎖DNAとの複合体を調製した。2重鎖DNAと混合し、複合体形成を行うことによって、結晶化やX線溶液散乱解析が可能なサンプルとして調製することが可能である。SAXS解析の結果、N末端ドメインがある場合、ない場合、共に全体として細長い分子形状をもつことが示唆された。これまでに結晶は得られていない。LRH-1 (NR5A2)は、初期発生で初期発生で重要な役割を果たすだけでなく、肝臓、膵臓、卵巣などで発現し、細胞周期や代謝の制御に関わる転写因子である。LRH-1はN末端、DNA結合ドメイン、ヒンジ領域、リガンド結合ドメイン(Ligand Binding Domain, LBD)の4つのドメインから構成されている。このヒトLRH-1について全長LRH-1、LBDについて大腸菌を用いて発現、精製を行うことができた。全長についてはレスポンスエレメントDNA2重鎖との複合体として調製した。これらの複合体とLBDについてはX線溶液散乱解析を行った。また、さらに全長LRH-1/DNAもしくはLBD単独として結合することが知られているコアクティベーターSRC2に由来するペプチドとの複合体としても調製することができ、それぞれKEK構造生物学研究センターに設置されている結晶化ロボットを使って結晶化条件のスクリーニングを行った。さらに、N末端ドメインを除いたDNA結合結合ドメインーヒンジ領域ーリガンド結合ドメインについて発現・精製を行うことができた。LRH-1(NR5A2)は胚性幹細胞で発現が見られることからもわかるように初期発生で重要な役割を果たすだけでなく、肝臓、膵臓、卵巣等で遺伝発現制御を担っている転写因子である。LRH-1はN末端、Zinc fingerモチーフからなるDNAを結合ドメイン(DBD)、リンカーとなるヒンジドメイン、そしてC末端にリガンド結合ドメイン(LBD)をもっている。これまでに、大腸菌を用いた大量発現系により、ヒトLRH-1の4ドメインからなる全長タンパク質およびDNA結合ドメインーヒンジドメインーLBDの3ドメインからなるタンパク質の調製を行い、LRH-1レスポンエレメントを含む2重鎖DNAとの複合体を調製をした。これらのサンプルを用い、X線溶液散乱(SAXS)解析と共に結晶化を試みた。全長タンパク質とDNAとの複合体については、LBDのAF2サイトと呼ばれる領域に結合することが知られているコアクティベーター由来ペプチドとの3成分複合体としてもサンプル調製を行うことができ、結晶化実験に供した。SAXS解析の結果、N末端の有無にかかわらず、全体として細長い分子形状をもつことが示唆され、またサンプルとしても結晶化も供するに適していることも明らかになった。これまでにいずれも結晶は得られていないものの、今後さらに複合体を安定化する方向でサンプル調製を行っていき、当初の目標である全長分子とDNAとの複合体の立体構造決定さらには分子メカニズムの解明につなげていきたい。26年度が最終年度であるため、記入しない。構造生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに当初予定していた全長LRH-1およびN末端ドメインを除いたDNA結合ドメインーヒンジドメインーリガンド結合ドメインからなる系について発現精製を進め、結晶化条件の探索、X線溶液散乱解析の実験に進めることができたので、概ね進展していると考えている。今後はこれまでに確立した発現・精製方法を用い、特に全長よりも安定化していると考えられるDNA結合ドメインーヒンジ領域ーリガンド結合領域からなる系についてDNAとの複合体サンプルを調製し、SRC2由来ペプチドの有無の条件で結晶化条件の探索を行っていく予定である。また、X線溶液散乱解析も行う予定としている。
歯肉粘膜の加齢変化に関する免疫組織学的研究

歯周組織の加齢変化を明らかにするために、生後1週齢から80週齢のマウスの下顎第一臼歯の歯周組織を組織学的に観察するとともに、蛍光抗体法と免疫電顕法により、各組織におけるI型コラ-ゲン、III型コラ-ゲンおよファイブロネクチンの分布を検索した。歯槽骨量は、20週齢までに増加し、歯根膜に面する壁は次第に平坦になるが、以後徐々に骨量を減じ、壁は凹凸不整となったことから、20週齢がタ-ニングポイントであると考えられる。I型コラ-ゲン、III型コラ-ゲンおよびファイブロネクチンの分布は週齢間で差はなかった。セメント質の歯根への添加に伴い、歯根膜腔は増週齢的に狭小となった。歯根膜細胞数は増週齢的に減少した。歯根膜線維は、2週齢以後、歯根面から歯槽骨まで歯冠側方向へ、方向性の明瞭な走行を示したが、20週齢以後、歯槽骨骨頂部で走行方向が不明瞭となり、また各線維束間は粗であった。この線維に一致してI型コラ-ゲンとIII型コラ-ゲンが同様に染色され、これら両コラ-ゲンが歯根膜線維の成分であることを確認した。III型コラ-ゲンはさらに、20週齢までの接合上皮の根尖側限界に隣接する線維束と歯槽骨壁に近傍する線維束で強く染色され、線維束の形成が盛んに行われていることが伺われた。30週齢以後、接合上皮の根尖側限界が根尖側へ移動し、接合上皮の外側基底膜に一致してファイブロネクチンが染色され、ファイブロネクチンの、接合上皮の深行増殖への関与が示唆された。歯肉外壁上皮には大きな変化はなく、粘膜固有層において線維芽細胞数の減少と線維の増加が観察され、線維網に一致したI型コラ-ゲンの染色強度が増週齢的に増加した。歯周組織の加齢変化を明らかにするために、1、2、3、5、7、10、15、20、30、40、50、60、70、80週令のマウスの下顎第一臼歯の歯周組織を組織学的に観察するとともに、各組織におけるI、III型コラ-ゲン及びファイブロネクチンの分布について免疫組織学的検索を行った。組織学的観察では、1週令例で歯胚であった歯牙は、2週令例では未萌出、3週令例で萌出している。以後週令を重ねるに伴い、骨表面にセメント質が沈着する。歯根膜に面する歯槽骨壁は骨の成長に伴い、15週令までに次第に平坦になり、歯根面との間を結ぶ歯根膜線維の走向も次第に明瞭になる。20週令以後、歯槽骨壁は歯冠側より次第に凹凸不整となり、増令とともにその度合を増す。一方、セメント質は次第に厚みを増し、歯根膜腔は狭小となる。歯根膜線維の歯冠側での走向が乱れる。接合上皮層は各週令とも4層前後で構成され、根尖側の限界はセメントエナメル境に位置するが、20週令以後、根尖側セメント質上に移動する。歯肉組織には著変はない。免疫組織学的観察では、I型コラ-ゲンは骨、象牙質、歯根膜、歯肉粘膜固有層、III型コラ-ゲンは歯根膜、歯肉粘膜固有層に分布していた。I型コラ-

ゲンは高齢マウスの歯肉粘膜固有層で濃染される傾向があった。ファイブロネクチンはIII型コラ-ゲンとほぼ同部位に分布するが、3週令例の歯槽骨の歯冠側歯根膜側壁面、20週令以後の根尖部セメント質表面およびそれに対向する歯槽骨表面で強染した。以上の事から、接合上皮の根尖側限界が深部に移動しはじめるのとほぼ同時期に、一旦形成された歯槽骨が歯冠側歯根膜側骨壁より次第に吸収されはじめ、それに伴い、歯根膜線維の走向にも乱れが生じることが明らかになった。生後1,2,3,5,7,10,15,20,30,40,50,60,70,80週齢の雄C3Hマウスの下顎右側第一臼歯の歯根膜の加齢に伴なう変化について、組織学的に観察し、さらにI型コラ-ゲン、IIIコラ-ゲン及びファイブロネクチンの分布について免疫組織学的に観察した結果、次のような結論を得た。(1).歯槽骨量は20週齢まで次第に増加し、歯根膜側骨壁は次第に平担となるが、以後、骨量は減少し、骨壁の凹凸も著しくなることから、20週齢がタ-ニングポイントであると考えた。I型コラ-ゲン、III型コラ-ゲン及びファイブロネクチンの分布に変化はなかった。(2)歯根膜腔は、週齢が増すとともに狭窄する傾向にあった。(3)歯根膜線維は、2週齢以後、歯根面から歯槽骨まで歯冠側方向へ、方向性の明瞭な走向を示したが、20週齢以後歯槽骨頂部で走行方向が不明瞭となり、また各線維束間は粗であった。(4)前述の歯根膜線維に一致してI型コラ-ゲンとIII型コラ-ゲンが同様に染色され、両コラ-ゲンが歯根膜線維の成分であることを確認した。(5)さらにIII型コラ-ゲンは、20週齢までの接合上皮の根尖側限界に隣接する線維束と歯槽骨壁に近接する線維束で強く染色され、線維束の形成が盛んに行われていることが伺われた。(6)線維芽細胞の数は週齢が増すとともに減少し、形態的にも変化をきたした。(7)30週齢以後、接合上皮の根尖側限界が根尖側へ移動し、接合上皮の外側基底膜に一致してファイブロネクチンが染色され、ファイブロネクチンの、接合上皮の深行増殖への関与が示唆された。生後1、2、3、5、7、10、15、20、30、40、50、60、70、80週齢の雄C3Hマウスの下顎左側第一臼歯の歯根膜組織の加齢にともなう変化について、超微形態を観察するとともに、I型コラ-ゲン、III型コラ-ゲンおよびファイブロネクチンの分布を免疫電顕的に検索した。その結果、以下のような結論を得た。1.歯槽骨は小区間に区切られ基質には直径50ないし70nmの周期性横紋構造を示す線維が密にみとめられ、小腔内には骨細胞が存在した。基質を構成する線維に一致してI型コラ-ゲン、III型コラ-ゲンおよびファイブロネクチンが染色され、これらの染色態度は週齢間で差はなかった。2.歯根膜腔には直径50ないし70nmの周期性横紋構造を示す線維が束状で走行し、この線維に一致してI型コラ-ゲンとIII型コラ-ゲンが均一に染色され、両コラ-ゲンが線維の成分であることが明らかになった。また、ファイブロネクチンは線維の辺縁に分布していたことから、線維束の形成に関与していることが推測された。3.前述の線維束間に直径8nmの周期性横紋構造を示さない細線維群がみられ、この線維に一致してIII型コラ-ゲンが染色された。4.また、前述の線維束間に直径10ないし15nmの周期性横紋構造を示さない細線維群も存在したが、I型コラ-ゲンにもIII型コラ-ゲンにも染色されなかった。5.セメント質基質にも直径50ないし70nmの周期性横紋構造を示す線維が密にみとめられ、この線維に一致してI型コラ-ゲン、III型コラ-
本州島東北部における弥生・続縄文時代以降の食性復元

本研究は、本州島東北部(北海道および東北地方北部)の弥生・続縄文時代以降の文化集団の食性変遷を、土器付着炭化物の炭素・窒素同位体分析、C/N分析等を用いた食性分析から解明するものである。主要な研究課題として、1東北北部の稲作受容と続縄文時代の食性、2トビニタイ文化の食性復元、3器種組成・サイズの違いによる食性差の3つを設定している。平成30年度は、研究課題1では、比較試料として関東地方の弥生時代中期から古墳時代前期にかけての分析を行った。東北地方とは異なり、淡水魚類等を含めた水生生物の活用は確認できず、陸上起源食料の煮炊きが中心だったといえる。研究課題2では、追加測定を含めたデータの整理を行い、学会・論文発表を行った。トビニタイ文化は擦文文化と煮炊きの内容物が類似しており、海生生物の影響が高いと判断される。研究課題3では、続縄文時代の注口土器と深鉢の分析を進めた結果、注口の有無は煮炊きの内容物に関係しない可能性が高いことが分かった。本研究では、本州島東北部における弥生・続縄文時代以降の食性復元に関して多くの知見を得ることができた。東北地方の弥生時代前期は稲作文化を受容するが、アワ・キビといった雑穀類は利用せず、沿岸部では稲作と併用して漁撈活動が活発であった。津軽海峡を隔てた北海道の続縄文時代以降では、全時期を通して海生生物に依存した食性であったが、続縄文・オホーツク・トビニタイ・擦文文化等の各文化間では、その内容物に少し異なる傾向がみられた。これらの違いは、サケ・マス利用や雑穀栽培、海獣狩猟等による北方地域に特有の生業形態に起因するものと考えられる。この他に比較資料として、ロシア・ハバロフスク地方の古金属器時代、関東地方の弥生・古墳時代等の周辺地域も分析を実施し、本州東北部とは異なる食性に関しても議論を行った。当該地域では、弥生時代以降における稲作文化受容の過程、津軽海峡を隔てた古代社会における交易・交流といった重要な研究課題が存在する。また、擦文文化やアイヌ文化にみられるサケ・マス利用や雑穀栽培、外来のオホーツク文化による海獣狩猟等、北方地域に特徴的な生業形態もあり、総合的な生業研究が重要になる。平成27年度は、予定通り研究計画に沿って分析を実施した。研究課題1では、田向冷水遺跡(青森県八戸市)、常呂川河口遺跡、大島2遺跡(北海道北見市)の分析を行った。田向冷水遺跡は、東北地方で弥生時代前期中期のイネが出土している数少ない遺跡の一つで、貴重なデータを得ることができた。今後は、水田遺構が検出されている弥生時代中期の垂柳遺跡(青森県田舎館村)等と比較検討を行う予定である。北海道に所在する常呂川河口遺跡と大島2遺跡では、続縄文土器、擦文土器、オホーツク土器、トビニタイ土器すべてで、海洋資源の影響が確認された。北海道における各文化集団の主な生業は、海産物(遡上性のサケ・マスも含む)に依存していたことが人骨のコラーゲン分析から解明されているが、土器付着物からも確認できたことは意義が大きい。研究課題3では、常呂川河口遺跡の試料について分析を行った。土器サイズと内容物に大きな相関性はなかったが、大型サイズほど海棲哺乳類の依存度が高くなる傾向にあった。今後は分析事例を増やして研究を深化させたい。平成27年度は、研究課題1「東北北部の稲作受容と続縄文時代の食性」、3器種組成・サイズの違いによる食性差に対して十分な成果を得ることができた。「研究実績の概要」で記した常呂川河口遺跡の分析結果は、『擦文文化期における環オホーツク海地域の交流と社会変動ー大島2遺跡の研究(1)ー』に報告を行った。学会発表では、比較研究で進めているロシア極東地域の分析結果を、第22回国際放射性炭素会議で発表した。国内学会では、第32回日本文化財科学会と第18回AMS研究協会で発表した。日本文化財科学会では、研究課題3の比較検討として「器種・サイズによる縄文土器付着炭化物の炭素・窒素同位体比の差異」、「北海道東部における縄文時代早期の年代測定と食性分析」の2本を報告した。両報告は、現在検討を進めている弥生・続縄文時代以前のデータを整理した成果であり、今後のデータを解釈する上で重要になる。平成28年度の研究実施計画は、27年度の調査成果を受けて、研究課題2「トビニタイ文化の食性復元」に移行したい。トビニタイ文化の分析に関しては、すでに常呂川河口遺跡等で先行的に始めている。また、滝ノ上遺跡、トビニタイ遺跡、ルサ遺跡(北海道羅臼町)、トコロチャシ南尾根遺跡、栄浦第二遺跡(北海道北見市)で分析試料の採取も終えており、当初の計画以上に進展している。

平成27年度のオホーツク文化の分析では、海洋資源への依存度が高かったことを解明しているが、この食性がトビニタイ文化にも引き継がれたかどうか検討を行う予定である。平成30年度に実施予定であったロシア・ハバロフスク地方の調査は、計画を前倒しで実施でき、現在分析を進めている。分析遺跡は、ジョルティ・ヤル遺跡とマリムジ1遺跡で、平成28年度中にデータを報告予定である。本研究は、本州島東北部(北海道および東北地方北部)の弥生・続縄文時代以降の文化集団の食性変遷を、土器付着炭化物の炭素・窒素同位体分析、C/N分析等を用いた食性分析から解明するものである。主要な研究課題として、1東北北部の稲作受容と続縄文時代の食性、2トビニタイ文化の食性復元、3器種組成・サイズの違いによる食性差の3つを設定している。当該地域では、弥生時代以降における稲作文化受容の過程、津軽海峡を隔てた古代社会における交易・交流といった重要な研究課題が存在する。また、擦文文化やアイヌ文化にみられるサケ・マス利用や雑穀栽培、外来のオホーツク文化による海獣狩猟等、北方地域に特徴的な生業形態もあり、総合的な生業研究が重要になる。平成28年度は、予定通り研究計画に沿って分析を実施した。研究課題1では、砂沢遺跡(青森県弘前市)、垂柳遺跡(青森県田舎館村)、湯舟沢遺跡、仏沢III遺跡、大石渡V遺跡(岩手県滝沢市)、三十刈I遺跡、横長根A遺跡(秋田県男鹿市)の分析を行った。現状では、八郎潟周辺の遺跡や砂沢遺跡で海洋生物の影響があり、稲作と併用して漁撈活動もおこなわれていた可能性が高い。研究課題2では、トビニタイ文化の分析と併行して擦文文化を中心に分析を実施した。常呂町周辺の遺跡を対象にした結果、サケ・マス類等の海洋生物が中心であることが分かった。一部でC4植物の影響と考えられそうな試料も確認でき、これまで議論されてきた擦文文化のサケ・マス利用と雑穀栽培という食性と矛盾しない結果であった。人骨がほとんど出土しない擦文文化の食性を、土器付着物から議論できたことは意義が大きい。また、最終年度に比較資料として分析を予定していたロシア・ハバロフスク地方や沿海地方、中国東北部の遺跡の分析を前倒して実施した。ジョルトゥイ・ヤル遺跡、マルムゥジュ1遺跡では淡水魚類とC4植物を組み合わせた食性が確認できた。平成28年度は、研究課題1「東北北部の稲作受容と続縄文時代の食性」、2「トビニタイ文化の食性復元」に対して十分な成果を得ることができた。学会発表では、第33回日本文化財科学会と第19回AMS研究協会等で発表した。日本文化財科学会では、「ロシア古金属器時代の土器付着物にみられるC4植物の影響」、「大島2遺跡の放射性炭素年代および土器付着物を用いた食性復元」の2本を報告した。また、比較研究で進めているロシア極東地域や中国東北部の分析結果は、以前のデータも含めて整理し、国際誌に発表を行った。平成29年度の研究実施計画は、28年度の調査成果を受けて、研究課題2「トビニタイ文化の食性復元」、3「器種組成・サイズの違いによる食性差」を中心に進めたい。トビニタイ文化の分析に関してはまだ十分な結果が得られていないため、採取したサンプルを継続して分析する予定である。これまでの結果では、オホーツク文化、擦文文化ともに海洋資源への依存度が高かったことを解明しているが、この食性がトビニタイ文化にも引き継がれたかどうか検討を行う予定である。また、器種の違いによる課題では、続縄文時代の後北C2・D式期の注口土器や、擦文文化の片口土器の試料採取を終えており、当初の計画以上に進展している。
眼球運動の自動解析システムおよび人工知能を利用した障害部位推定プログラムの開発

眼球運動障害の発生率は加齢によって増加し、80歳以上では50%以上が日常生活において何らかの眼球運動障害を有している。高齢化社会において、眼球運動異常は身近な病気の一つであるが、従来の眼球運動検査は日常生活とかけ離れた環境で測定しているため、万国共通のゴールデンスタンダードが存在しない。本研究では日常生活に近い環境下で眼球運動を短時間で他覚的に測定できる試験システムを新たに開発し、眼球運動を可視化および数値化する。更に、得られたデータを元に人工知能技術「ディープラーニング」を用いて、障害部位や疾患を推定するプログラムを開発することで眼球運動障害の診断および治療に役立てることを目的とする。
聖教類についての史料学的研究

平安末・鎌倉初期に編集された『覚禅抄』(百余巻)について、東寺観智院本と随心院本について、調査した。写真撮影と焼き付けを行い、整理のめどをたてた。内容の考察については、一部を「文献史学からみた密教図像」と題して文章化し、東寺宝物館特別展図録『東寺の密教図像』(1999年3月)に寄せ、聖教が歴史史料として重要であることの一端を政治史に即して述べた。この他、順次研究を纏めていくための条件を整えた。聖教類が歴史研究者にあまりよく認識されていないという盲点をつ衝いて、「文書様式の聖教について-杲宝筆範俊解写-」(東寺文書研究会論文集、1999年5月刊行予定)を執筆した。『平安遺文』等に載せられ文書として扱われているが、実は聖教として作成されたものである。そのように見てこそこの文献から平安末期と南北朝期の政治史・宗教史・寺院史の情報を引き出すことが出来る、と述べた。聖教の中でも特別の位置を占める一切経について、論文を2篇作成した。その前提となる作業として、7世紀から12世紀までの一切経関係の史料を網羅し、「一切経年表」を作成した。これに基づき、「一切経と古代の仏教」(『愛知県立大学文学部論集』第47号、1999年3月)と「一切経と中世の仏教」(『年報中世史研究』第24号、1999年5月予定)を執筆し、年表を前者に付した。ともに、対外関係史と密接に関係する国家史の一部として仏教史を捉えることの有効性を提示し、一切経研究がそのための重要課題であることを述べた。前者の論文では、支配集団による古代仏教の汎東アジア性志向とその独占形態を見、後者の論文では、中世仏教の擬似的汎東アジア性を政権主導者が構築しようとしたことを述べた。このほか、年表作成に伴って収集した史料を整理し、今後の研究の基盤を整えた。聖教類の調査を実施した。第一に、京都市随心院所蔵の『覚禅鈔』について、調書を採り、写真撮影を行った。京都市東寺観智院所蔵の『覚禅鈔』については、部分的に調書作成と閲覧を行った。これらの調査をもとに、データの整理を順次進めつつある。第二に、一切経(大蔵経)について、十二世紀以前の史料を把握すべく、“一切経年表"の作成にとりかかった。十二世紀末までについて、伝存状況を把握し、また古記録・古文書に見える一切経関係記事を博捜し、これら一件ずつを綱文化して年代順に配列した。稿本としてほぼ完成したので、公表の形式を考え、またこれを基本として論文作成を、次年度に予定している。第三に、近年開催の多い、聖教関係の展覧会を見学し、図録等の資料を集めた。研究口頭発表と論文作成を行った。口頭発表は、日本史研究会(京都市)主催の特別研究会にて、「宗教史研究からみた東寺百合文書」と題して行った。主に中世の東寺を素材として、聖教と古文書の関係を論じ、双方を用いた歴史研究の有効性を提示した。口頭報告原稿を作成したので、これをもとにして次年度に論文として公表する。今年度に公表した論文は二篇である。「大乗戒主義仏教への基本視角」と「顕密主義仏教への基本視角」なるタイトルで、それぞれ古代・中世の仏教史を把握するための枠組みを提示し、自ら聖教類を積極的に用いて研究を進めるためのよりどころにした。

前者の論文では、支配集団による古代仏教の汎東アジア性志向とその独占形態を見、後者の論文では、中世仏教の擬似的汎東アジア性を政権主導者が構築しようとしたことを述べた。このほか、年表作成に伴って収集した史料を整理し、今後の研究の基盤を整えた。
ヒト良性及び悪性扁平上皮核内におけるイノシトール三燐酸レセプターの発現とその意義

イノシトール三燐酸(IP_3)は細胞内シグナル伝達における重要なメッセンジャーであり、IP_3レセプター(IP_<3->R)を介して細胞内Ca^<++>の調節に関与している。IP_<3->R蛋白質およびこれをコードする遺伝子は御子柴らにより明らかにされているが、同時に作製された抗IP_<3->R単クローン抗体を利用して、免疫組織細胞化学的研究も進められてきた。IP_<3->Rが細胞内で普遍的役割を担う物質であることから、我々はラット抗マウスIP_<3->R単クローン抗体3種(10A6、4C11、18A10)のヒト抗原との交差反応性を利用して、ヒト正常皮膚、扁平上皮組織、及び培養扁平上皮癌組織のIP_<3->Rの分布を明らかにしてきた。この中で、扁平上皮癌細胞核内に10A6抗体とのみ反応する抗原を認めたので、この抗原の性状について検討した。ヒト頭頚部扁平上皮癌及び食道扁平上皮癌を材料として10A6対応抗原の分布を共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて調べたところ、核小体を除く核内に微細顆粒状にこの抗原の発現がみられ、細胞株間で染色強度に差が認められた。しかしこの染色強度と細胞の分化度、あるいは原発部位との間には明らかな相関は認められなかった。電子顕微鏡学的にこの抗原の細胞内分布の観察を試みたが一定の結論を得ることはできなかった。これまでの機能的な解析では核膜以外の核内にはIP_<3->Rの存在は知られておらず、3種のモノクローナル抗体のうち10A6のみにみられた免疫反応性であることからIP_<3->R以外の抗原を交叉反応によりとらえている可能性が考えられた。この抗原の実体およびその発現の生物学的な意義について更に検討を進めている。御子柴らにより発見されたイノシトール三燐酸レセプター(IP3-R)蛋白はカルシウムとならぶ細胞内伝達系の重要なメッセンジャーのひとつであるイノシトール三燐酸(IP3)の受容体であり、これに対する単クローン抗体が作成されて以来細胞内小胞体膜上におけるIP3-Rの存在が証明されてきたが近年小胞体膜上以外の存在も明らかにされてきた。今回ヒトの良性扁平上皮細胞及び悪性扁平上皮細胞におけるIP3-Rの局在について検討を行った。正常皮膚扁平上皮には10A6対応核内抗原陽性細胞と陰性細胞があり,角化層を除く全層に分布していた。当教室において継代培養中の頭頚部扁平上皮癌細胞株及び新鮮頭頚部扁平上皮癌組織を用いて免疫組織化学的にIP3-Rの発現及び分布を検討した。新鮮手術材料として得られた頭頚部扁平上皮癌組織より凍結切片を作成し免疫化学染色を行った結果、10A6単クローン抗体がほぼすべての扁平上皮癌細胞核内抗原と反応を示した。しかし分化度との明らかな関連は認められなかった。また、頭頚部扁平上皮癌培養細胞株4株(上顎癌2株、下咽頭癌1株、喉頭癌1株)の単層培養標本を用いて同様に10A6単クローン抗体を用いた免疫化学染色を行った結果、核内に微細顆粒状に発現がみられ細胞株間で染色強度に差が認められた。この抗原を共焦点レーザースキャン顕微鏡下に観察したところ核小体を除く核内にびまん性に発現がみられた。イノシトール三燐酸(IP3)は細胞内シグナル伝達におけるセカンドメッセンジャーとして細胞内Ca+の調節に関与している。

近年イノシトール三燐酸受容体(IP3-R)に対する単クローナル抗体が作製された以来IP3-Rの細胞内における分布が次第に明らかになってきたが、ヒト組織における分布および細胞機能との関連はまだほとんど明らかにされていないのが現状である。今回の研究では主としてラット抗マウス単クローナル抗体3種(10A6,4C11,18A10)を用いてそのヒト正常皮膚上皮、新鮮扁平上皮癌組織、及び種々の扁平上皮癌培養細胞株に対する交差反応性について免疫組織化学的に検討を加えた。その結果、3種の抗体のうち10A6単クローナル抗体が正常皮膚において角化層を除く全層の扁平上皮細胞と免疫学的に反応を示し、またほとんどすべての扁平上皮癌細胞の核内に10A6に対応する抗原の発現がみられた。共焦点レーザー顕微鏡下にこの10A6対応抗原の観察を行ったところ、核小体を除く核内にびまん性に発現がみられた。さらにこの染色強度に関しては培養細胞株間で差異がみられたものの、原発部位や分化度との明らかな関連は認められなかった。この10A6対応抗原のさらに詳細な細胞内局在の解析を免疫染色後の電子顕微鏡学的観察によって試みたが、局在部位について一定の結論を得ることはできなかった。この10A6対応抗原が果たしてIP3-Rそのものであるか否かが重要な問題となってくるが、これについても十分な確認ができず、今後の課題となった。