hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3D培養による膵癌線維化モデル構築と膵癌細胞―膵臓星状細胞間相互作用の機序解析

膵がんは薬剤治療に抵抗性で予後不良である。研究代表者はその原因を、腫瘍細胞群を囲む腫瘍線維組織に求めてきた。しかし、どのように線維化が治療抵抗性に寄与していて、どう標的化すれば治療成績を改善できるのか、詳細はまだ明らかでない。代表者らが最近確立した、ヒト膵がん線維組織に由来する膵臓星状細胞(PSC)を3D(立体)培養する方法を用いると、従来の平面培養では不可能だった線維成分・細胞外基質(ECM)の可視化にin vitroで成功した。平成30年度は、ヒト膵がん由来PSCは、正常線維芽細胞においては見られない異常なECM改築を、TGF-β/ROCK/MMP経路ならびに糖タンパク質SPARC依存的な機序により示すことを明らかにし、報告した(Biomaterials, 2019)。同様の3D線維化組織中にさらに血管構造を形成させたのちに腫瘍細胞を加え、転移の解析に用いうることも示した(Biomaterials, 2018)。以上のように、本研究において用いている立体培養法では、実験系を構成する細胞を任意に選択し混合することができる。平成30年度には、この方法を基盤に、腫瘍細胞と線維芽細胞を種々の比率で混合・播種し、線維化組織を伴う3D腫瘍微小環境モデルの構築に成功した(投稿準備中)。これらのモデルの更なる改良ならびに解析を通じ、腫瘍細胞とPSCの相互作用によるECM産生・構築への影響の分子メカニズムを解析する。これを通じて、将来的に、線維化の薬剤抵抗性への影響と、線維組織の制御の方法を見出すことに資する。申請時の計画において、平成30年度にはPSC単独におけるECM構築異常の機序解析ならびに、PSCならびに膵がんの共培養系の構築の検討を行うこととしており、いずれの項目についても順調な進展が得られたため。実際、前者に関しては、機序解析を実施し、その成果をBiomaterials誌に発表した。後者に関しても、機序解析に利用しうる実験条件の確立に成功しており、平成31年度以降に予定しているECM構造の可視化ならびに機序解析へ向けて順調に準備が進んでいる。平成30年度には、線維芽細胞および腫瘍細胞の直接的な共培養系の再現性のよい実験条件の確立を達成することができ、安定的に線維化を伴う3D膵がん微小環境モデルの作製を行うことができる状況を実現した(投稿準備中)。同モデルを用い、平成31年度は申請当初の予定通り、各種ECM因子の可視化に着手する。とりわけ、経時的な変化を追うことにより、ECM改築の異常に注目する。さらに平成32年度以降に予定している機序解析に向けて、候補因子の探索を行う予定である。その際、引き続きPSC単独におけるECM異常構築の機序の解析を行い、共培養系における機序解析の参考とする。
就学前年齢に達した低出生体重児の親に対するポジティブ・ペアレンティング

本研究の目的は、要支援児(援助がなければ健康や発達が達成できない可能性のある子供)のうち最多の割合を占める低出生体重児のうち、重篤な合併症等がなくおおむね順調な経過を辿っている子どもの親を対象に、就学を控えた時期の発達上のニーズに合ったポジティブペアレンティングプログラム(トリプルPレベル2)を実施し、その効果の検証を行うことである。2018年度は、前年度より実施中であったニーズ調査を行い(2018年6月まで)、その結果の分析を行った。NICUへの入院経験があり、在胎36週未満、体重1800g以下で出生、重篤な合併症がない就学を控えた46歳の子どもを育てている母親合計10名にインタビューを行った。インタビューの内容は、出生から現在までの育児について心配した時期や内容、就学を控えた現在の思いなどである。データの質的な分析を行い、母親の育児に対する思いとして、10のカテゴリー(様々な心配や戸惑いを感じながらの育児のスタート、低出生体重児の発達や育児についての情報が手に入りにくいことへの困惑、子どもなりの成長をじっくり見守ろうという思い、子どもの生命力への畏敬の念、子どもの成長や子育ての楽しさを感じながら生活が送れる喜び、など)が抽出された。この結果は、2019年度開催の小児保健学会で発表予定である。2018年度前半までにニーズ調査(インタビュー)を終了させ、その分析結果よりペアレンティングプログラムの内容への示唆を得ることはできた。しかし、具体的な実施計画を立案し、実施するところまではできなかったため、研究の進捗状況としては遅れている。2018年度は、ニーズ調査の結果をもとにしたペアレンティングプログラムの実施まで至らなかったため、補助事業期間の延長を申請し、承認を受けた。2019年度は、上記プログラムの具体的な実施計画の検討、実施を行う予定である。本研究の目的は、要支援児(援助がなければ健康や発達が達成できない可能性のある子ども)のうち最多の割合を占める低出生体重児の中でも、重篤な合併症等がなくおおむね順調な経過を辿っている子どもの親を対象に、就学を控えた時期の発達上のニーズにあったポジティブペアレンティングプログラム(トリプルPレベル2)を実施し、その効果の検証を行うことである。平成28年度の計画としては、就学前年齢に達した低出生体重児の母親の育児に関するニーズを質的調査により明らかにすることであった。先行研究の文献検討より、低出生体重児の母親の育児に関するニーズについての研究は、NICU入院中から退院前後、長くても1年以内に焦点をあてたものが多く、幼児期となった子どもを対象としたものは、発達の長期的な追跡調査や、すでに学齢期になった子どもの母親の振り返りによるもので、現在幼児期の子どもの育児をしている母親を対象としたものは少なかった。本研究では、現在就学を控えた46歳の子どもの育児をしている母親で、かつ子どもの状況としては、在胎36週未満、出生時体重1800g以下で出生し、重篤な合併症のない子どもの母親約10名を対象とすることとした。次年度実施予定のトリプルPレベル2は、短期の介入により、子どもの発達や行動について、あまり深刻でない問題に対するアドバイスを提供するものであり、その対象として適切と考えた。現在、インタビューの実施に向けて、研究協力施設との調整段階にある。また、研究代表者および研究分担者は、平成29年度に実施予定のグループセミナーを開催するために必要なファシリテーター養成講座を受講し、資格を取得した(1名は取得予定)。倫理審査委員会(和歌山県立医科大学)での指摘を受けた箇所の研究計画の修正、ファシリテーター養成講座の受講等に時間を要し、研究協力施設との調整が遅れたため、質的調査に遅れが生じている。平成29年度は、就学を控えた46歳の子どもの育児をしており、子どもの状況としては、在胎36週未満、出生時体重1800g以下で出生し、重篤な合併症のない子どもの母親を対象とした育児に関するニーズ調査を実施した。主な調査内容は、出生時の状況、成長・発達で心配だった時期やその内容、一段落ついたと思えた時期、現在の育児の困りごとや楽しさを感じること等である。平成29年11月平成30年3月までの期間で、5名の母親へのインタビューが終了しており、10名を目安に調査を継続中である。分析は今後実施するインタビューと合わせて行っていくが、データの概観としては、NICU退院直後から1歳くらいまでが最も心配だった時期であったこと、子ども自身の力を実感し34歳で一段落ついたと思えるようになっていること、育児に関する大きな心配事は少なくなってきているが、発達障がいの可能性、言葉やコミュニケーションの問題、手先の不器用さに関すること、通常の発達との比較が難しいこと等が現在のニーズとしてあげられていた。対象者の外来受診終了時に研究協力の依頼を行っているため、当日の受診内容、対象者の都合により、インタビューへの協力が得られないことがあった。また、選定条件を満たす対象者の受診日と研究者の都合が合わないこともあり、一定の期間に集中してインタビューを行うことが難しかったことなどにより遅れが生じている。

本研究の目的は、要支援児(援助がなければ健康や発達が達成できない可能性のある子供)のうち最多の割合を占める低出生体重児のうち、重篤な合併症等がなくおおむね順調な経過を辿っている子どもの親を対象に、就学を控えた時期の発達上のニーズに合ったポジティブペアレンティングプログラム(トリプルPレベル2)を実施し、その効果の検証を行うことである。2018年度は、前年度より実施中であったニーズ調査を行い(2018年6月まで)、その結果の分析を行った。NICUへの入院経験があり、在胎36週未満、体重1800g以下で出生、重篤な合併症がない就学を控えた46歳の子どもを育てている母親合計10名にインタビューを行った。インタビューの内容は、出生から現在までの育児について心配した時期や内容、就学を控えた現在の思いなどである。データの質的な分析を行い、母親の育児に対する思いとして、10のカテゴリー(様々な心配や戸惑いを感じながらの育児のスタート、低出生体重児の発達や育児についての情報が手に入りにくいことへの困惑、子どもなりの成長をじっくり見守ろうという思い、子どもの生命力への畏敬の念、子どもの成長や子育ての楽しさを感じながら生活が送れる喜び、など)が抽出された。この結果は、2019年度開催の小児保健学会で発表予定である。2018年度前半までにニーズ調査(インタビュー)を終了させ、その分析結果よりペアレンティングプログラムの内容への示唆を得ることはできた。しかし、具体的な実施計画を立案し、実施するところまではできなかったため、研究の進捗状況としては遅れている。当初、平成28年度に実施計画であった低出生体重児の母親に対するニーズ調査を、平成29年度の前半で実施する。その結果の分析に基づいたグループセミナーの内容、実施方法の検討を行い、セミナーの実施を行う。グループセミナーの実施にあたっては、対象者数の確保のために、研究協力施設の追加、開催の時期、回数、間隔、子どもの保育等について、十分な検討が必要と考えている。平成30年度の前半に目標の10例までインタビューを実施し、就学を控えた時期にある低出生体重児の母親の育児ニーズ調査を終了させる。この調査結果をもとに、ペアレンティングプログラムの内容、具体的な実施計画を検討する。現在の研究協力施設のみでは、プログラムを実施するための対象者数が不足することが予測されるため、他の施設への協力依頼も検討する。2018年度は、ニーズ調査の結果をもとにしたペアレンティングプログラムの実施まで至らなかったため、補助事業期間の延長を申請し、承認を受けた。2019年度は、上記プログラムの具体的な実施計画の検討、実施を行う予定である。平成28年度に実施予定であった質的調査が遅れていることで、それにかかわる対象者への謝金、インタビューのテープ起こしの費用、インタビュー中の子どもの保育のためのアルバイト代、研究協力施設への旅費等の支出がなかったため。また、購入予定としていたノートパソコン、統計ソフト等の購入を、次年度に見送ったため、未使用額が生じた。当初の計画では、今年度にペアレンティングプログラムの実施を予定していたため、プログラム実施に必要な教材・物品の購入、人件費、参加者への謝礼、研究成果発表のための旅費等を計上していた。しかし、今年度はプログラム実施の前段階のニーズ調査のみとなったため、この経費が持ち越された。
20世紀オーストリア文学における「故郷」理念と国民意識の展開

本研究課題は20世紀前半から中盤にかけてのオーストリア文学における「故郷」概念の形成と展開、及びその歴史的・文化的文脈を分析することを目的とし、初年度は各研究者の従前からの関心に基づき専門とする作家の文献読解と分析を行った。杉山は二つの観点から研究を進めた。一方ではシュテファン・ツヴァイクによる戦間期及び亡命後における「オーストリア」の主題化について考察した。他方では聖歌「Stille Nacht」とザルツブルク待降節音楽祭における「伝統」の称揚を例とし、オーストリアの地方文化が戦後国民アイデンティティの再構成に果たしてきた役割を分析した。いずれも2019年度に口頭及び論文での成果発表を予定している。共同研究者は戦後のウィーンを中心としたオーストリア像の文学的表象とその背景の分析に取り組んだ。日名はイルゼ・アイヒンガーの散文詩の分析を通して、彼女のウィーン表象の特性を明らかにし、その成果論文が2019年3月に発表された。前田はマックス・メル、ハイミート・フォン・ドーデラー、及びインゲボルク・バッハマンの小説及び詩を題材に、戦後オーストリアの旧世代と新世代の作家におけるオーストリア並びにウィーン像の比較研究を行い、口頭及び論文として発表した。なお、以上の研究に関連して、2019年2月に全員がオーストリア出張を行い、オーストリア国立図書館・ウィーン国立図書館・ザルツブルク大学図書館での手稿閲覧、資料収集を行った。杉山はザルツブルク大教授及びザルツブルク待降節音楽祭総監督との面会、意見交換を実施し、前田及び日名は2019年度に実施予定の国際コロキウムに招聘予定のウィーン大教授2名を訪問、本研究課題に関する意見交換を行った。年度内の口頭及び論文発表に至らなかった研究者も含め、文献収集及び論文の執筆は進行しており、参加者全員で定期的に進捗状況の報告及び意見交換を行っている。2019年秋のシンポジウムは当初予定通り開催の見込みで、さらに共同研究者の都合により、申請時には2020年度実施予定としていた国際コロキウムを2019年度内に実施することとした。これらの実現に向けてのテーマ選定はおおむね完了し、全員が定期的な共同研究会での研究構想の相互検討、招聘予定教授とのコンタクト等を続け、順調に準備を進めている。2019年10月の日本独文学会秋季研究発表会において、杉山、前田、日名に外部より1名を加えて、「オーストリア文学における『故郷』と『虚構性』の問題(仮)」をテーマにシンポジウムの開催を目指している。杉山がシュテファン・ツヴァイクの自伝『昨日の世界』における故郷としてのオーストリア表象、日名がゲオルク・トラークルの戦争詩、前田が戦後オーストリアの小説作品を題材に発表予定である。また2020年3月に都内大学にて、オーストリアの大学教授2名を招聘し、「オーストリア戦後文学の文化的機能(仮)」をテーマとした国際コロキウムの開催を予定している。以上の成果を2020年度中をめどに論文にまとめ発表することを目指す。

杉山がシュテファン・ツヴァイクの自伝『昨日の世界』における故郷としてのオーストリア表象、日名がゲオルク・トラークルの戦争詩、前田が戦後オーストリアの小説作品を題材に発表予定である。また2020年3月に都内大学にて、オーストリアの大学教授2名を招聘し、「オーストリア戦後文学の文化的機能(仮)」をテーマとした国際コロキウムの開催を予定している。以上の成果を2020年度中をめどに論文にまとめ発表することを目指す。物品費が当初予定より若干少額で納まったため余剰が生じた。来年度はシンポジウム及び国際コロキウムの開催に際し、旅費の一部及び会場費等に当該金額を充当し、翌年度請求分と共に使用する。
近赤外分光法による脳血流同時測定を用いた精神疾患の経頭蓋磁気刺激治療法の開発研究

統合失調症を初めとする精神疾患に対して経頭蓋磁気刺激治療を行い、近赤外分光法を用いて治療中の血流同時測定を行ったところ、治療中に血流変化がみられることが観察されたが、何人かの被験者では磁気刺激による刺激のアーチファクトが測定に混入することが判明した。近赤外分光法により課題施行中の血流変化により、健常者と疾患群の判別解析が可能なことが明らかになり、磁気刺激治療への反応性予測に応用できる可能性がある。本研究課題では近赤外分光法(NIRS)による脳血流測定を同時に行いながら反復的経頭蓋磁気刺激治療(rTMS)を精神疾患に対して行い、治療効果と磁気刺激中の脳血流変化との関連を明らかにし、rTMSの有効性を高める方法を探索する。平成20年度は、統合失調症群30名と健常者群30名に対して、前頭葉機能課題を施行中に近赤外分光法による前頭前野の酸素化ヘモグロビン濃度の変化を測定し、言語流暢性課題(文字バージョン)、ハノイの塔課題において、両群の前頭前野賦活の差が最も顕著に見られることを見出した。これは近赤外分光法が統合失調症の前頭葉機能障害を評価する上で有用であり、障害の程度を評価するのに最適な課題は、前頭葉課題の中でも特定のものに限られるということを示している。この結果はSchizophrenia Research誌(2007年インパクトファクター値:4.240)に受理され、すでに出版されている。現在、新たに統合失調症群30名と健常者群30名を追加して、近赤外分光法の測定結果により、統合失調症と健常者と判別可能かどうか検討をおこなっている。その結果は正判別率75%以上、感度73.3%以上、特異度76.7%以上で再現性を持って、両者を判別できることを見出した。この結果は現在、Schizophrenia Research誌に論文投稿中である。また健常者6名に対し、右前頭前野(国際10-20法のFp2-F8に相当する部位)に、1Hzの経頭蓋反復磁気刺激を行い、近赤外分光法を用いた同時測定により当該部位で酸素化ヘモグロビン濃度が上昇することが示され、経頭蓋反復磁気刺激による大脳皮質内での血流変化が測定できることを確認した。これは近赤外分光法により磁気刺激治療の効果判定に応用可能であることを示唆する結果である。平成20年度は、統合失調症群60名と健常者群60名に対して、5種類の前頭葉機能課題を施行中に近赤外分光法による前頭前野の酸素化ヘモグロビン濃度変化を測定し、統合失調症と健常者と判別可能かどうか判別分析をおこなった。統合失調症群、健常者群とも30名ずつの2つの群に分け、第1群において最も正判別率が高くなる判別関数を計算し、その判別関数を第2群に適用する手法を用いた。課題成績のみ、酸素化ヘモグロビン濃度変化のみを従属変数とした場合、第1群では80%近い正判別率が得られたが、第2群において正判別率は65%前後となり、第1群での結果は再現できなかった。課題成績と酸素化ヘモグロビン濃度変化の両者を従属変数とした場合、第1群では88%、第2群では75%の正判別率を得た。その際、判別に有用な変数は、言語流暢性課題成績(文字バージョン、カテゴリーバージョン)、ハノイの塔課題成績、言語流暢性課題文字バージョンの酸素化ヘモグロビン濃度変化の4つであった。このことは統合失調症と健常者の判別には認知課題成績と近赤外分光法による血流変化の両者を考慮に入れた方がより再現性の高い結果が得られることを示唆している。この結果はSchizophrenia Research誌(2008年インパクトファクター値:4.174)に受理され、すでに出版されている。また難治性大うつ病性障害患者2名に対し、1名では右前頭前野に1Hzの、もう1名では左前頭前野に10Hzの経頭蓋反復磁気刺激を行った。近赤外分光法を用いた同時測定により当該部位で酸素化ヘモグロビン濃度が上昇することが示され、経頭蓋反復磁気刺激による大脳皮質内での血流変化が測定できることを確認した。平成22年度は、統合失調症群79名と健常者群130名に対して、5種類の前頭葉機能課題(言語流暢性課題レターバージョン、カテゴリーバージョン、ハノイの塔課題、スタンバーグ課題、ストループ課題)を施行中に近赤外分光法による前頭前野の酸素化ヘモグロビン濃度変化を測定し、統合失調症と健常者の賦活曲線の特性を評価した。その結果、5種類の前頭葉機能課題による賦活曲線の特性は異なっており、言語流暢性課題ではレターバージョン、カテゴリーバージョンともに、課題前半に賦活の中心が現れる賦活曲線となった。

一方でハノイの塔課題は課題後半で賦活の中心が現れる曲線となった。スタンバーグ課題では賦活曲線は課題のブロックに同期した波状の賦活曲線となった。ストループ課題では有意な賦活が見られず、平坦に近い賦活曲線となった。これらの賦活曲線特性の違いに注目することで、統合失調症と健常者を近赤外分光法を用いてより高精度に判別できる可能性が示唆された。また難治性大うつ病性障害患者3名に対し、右前頭前野に1Hz(2名)、左前頭前野に10Hz(1名)の経頭蓋反復磁気刺激を行った。近赤外分光法を用いた同時測定により当該部位で酸素化ヘモグロビン濃度が上昇することが示され、経頭蓋反復磁気刺激による大脳皮質内での血流変化が測定できることを確認したが、1例では刺激に同期したアーチファクトと思われる波形が記録された。これにより、近赤外分光法により磁気刺激治療の効果判定に応用可能であるが、アーチファクトの影響について考慮する必要が示された。平成23年度は、作業記憶を評価する代表的な課題であるスタンバーグ課題施行中のNIRS賦活曲線の特徴解析を行った。統合失調症では作業記憶を担う前頭葉機能の低下が重要な病態の一つであるため、課題中の前頭葉血流変化と臨床特性との関連を検討した。健常者271名、統合失調症144名において解析した。課題は、固視点を注視するだけのpre-task periodを30秒、スタンバーグ課題を行うtaskperiodを120秒、固視点を注視するだけのpost-taskperiodを60秒とした。taskperiod中には合計8回のスタンバーグ課題のtrialが繰り返された。1 trialは15秒からなり、まず5桁の数列(memoryset)が提示され、その数秒後に1桁の数字(probe)が3回提示された。提示されたprobeがmemory setの中にあったかどうかを口頭で回答させた。健常者のgrand average curveではtrialに同期した信号変化がoxyHb、deoxyHb、組織酸素化指標(TOI)のいずれにおいても見られ、8回のtrialの全てに対し信号のピークは、各trial開始より約11秒後に出現した。統合失調症患者のgrand average curveでは、trialに同期した信号変化が減弱していた。これより統合失調症では課題のタイミングに応じた神経活動の変化が行われておらず、作業記憶課題施行時の情報処理過程が非効率的になっていることが示唆された。1st trialに対するベースラインからの信号変化、2nd trial以降の7回の反応の平均、taskperiod全体の平均信号変化の3者を、課題による賦活の指標として、健常者と統合失調症で比較したところ、前2者は統合失調症で有意に低下していたが、task period全体の平均信号変化はdeoxyHbを除いて有意差を認めなかった。このことは、taskperiod全体の賦活に注目するよりは、賦活曲線の特性に注目した指標の方が統合失調症と健常者の弁別をより的確にできることが示唆された。この知見と磁気刺激治療成績との組み合わせにより、磁気刺激治療の効果予測、効果判定に応用できる可能性が示唆された。
解の制約許容量を活用する進化計算による制約付き多目的最適化

進化計算による制約付き多目的最適化において,制約違反解の評価指標として制約違反量が用いられてきた.制約違反量は,制約条件をどれだけ超えているかを定量的に表し,制約条件を満たす場合,制約違反量は零になる.本研究では,制約条件を満たす場合に,制約条件までの余裕を制約許容量として定量的に表し,評価指標として新たに導入する.制約条件に対して解をより精緻に評価可能にし,解探索を効率化する方法論を構築する.進化計算による制約付き多目的最適化において,制約違反解の評価指標として制約違反量が用いられてきた.制約違反量は,制約条件をどれだけ超えているかを定量的に表し,制約条件を満たす場合,制約違反量は零になる.本研究では,制約条件を満たす場合に,制約条件までの余裕を制約許容量として定量的に表し,評価指標として新たに導入する.制約条件に対して解をより精緻に評価可能にし,解探索を効率化する方法論を構築する.
ピロロ[2,3-d]カルバゾール骨格を有する生理活性天然物の合成研究

共通骨格ピロロ[2,3-d]カルバゾールを合成中間体とするストリヌキノスアルカロイドとアスピドスペルマアルカロイドの全合成研究において、目的のピロロカルバゾール中間体の合成を達成するとともに、鍵反応であるPummerer反応において興味ある知見を得ることができた。すなわち、1.表題課題を達成するため申請者が開発した酸化反応で得られるインドリン-3-オンの化学を明らかにするとともに、様々な複素環化合物の合成に応用した。2.上記で得られた知見をもとに、2-メトキシインドリン-3-オンから9工程で収率よく目的の合成中間体4-ヒドロキシ-2,3,3a,4,5,6,6a,7-オクタヒドロピロロ[2,3-d]カルバゾールを合成した。すなわち、2-メトキシインドリン-3-オンのRobinnson環化反応、還元、イソシアナ-トとの反応、酸によるインドレニウム中間体を経由する分子内付加環化反応、アシル化、酸化、Pummerer環化反応、接触還元、加水分解により得た。現在、このピロロカルバゾール中間体からストリヌキノスとアスピドスペルマアルカロイドの両E環部の構築を検討している。3.光学活性アルカロイド合成のため、光学活性2ーメンチルオキシインドリン-3-オンを用いた上記合成反応は立体選択的に進行しで光学活性なカルバゾール中間体を得ている。4.上記合成経路の鍵反応である無水トリフルオロ酢酸によるスルホキシドのPummerer環化反応において、反応条件、保護基を選択することにより上記Pummerer環化反応と全く異なった今までにない反応を起こすことを見いだし、この反応が1-置換カルバゾールの新規合成法になることを明らかにした。共通骨格ピロロ[2、3-d]カルバゾールを合成中間体とするストリヌキノスアルカロイドとアスピドスペルマアルカロイドの全合成研究において、目的のピロロカルバゾール中間体の合成を達成するとともに、鍵反応であるPummerer反応において興味のある知見を得ることができた。すなわち、1.申請者が開発した酸化反応で得られる2-メトキシインドリン-3-オンから9工程で収率よく目的の合成中間体4-ヒドロキシ-2,3,3a,4,5,6,6a,7-オクタヒドロピロロ[2、3-d]カルバゾールを合成した。すなわち、Robinnson環化反応、還元、イソシアナ-トとの反応、酸によるインドレニウム中間体を経由する分子内付加環化反応、アシル化、酸化、Pummerer環化反応、接触還元、加水分解により得た。現在、この中間体からストリヌキノスとアスピドスペルマアルカノイドのE環部の構築を検討している。また、光学活性アルカロイド合成のため、2-メトキシインドリン-3-オンのメトキシ基を光学活性アルコールに変えた誘導体で上記合成反応も検討している。2.上記合成経路の鍵反応である無水トリフルオロ酢酸によるスルホキシドのPummerer環化反応において、反応条件、保護基を選択することにより上記Pummerer環化反応と全く異なった今までにない反応を起こすことを見いだし、その反応の一般性を検討することにより1-置換カルバゾールの新規合成法を開発した(投稿中)。この合成法はストリヌキノスアルカロイドのF環部を構築する手がかりになる。
末梢性自己寛容誘導機序の解明に基づく自己免疫疾患の発症予知診断法の開発

自己免疫疾患の病因規定因子である末梢性自己寛容の誘導因子と標的臓器の発生制御因子に着目し、自己免疫性甲状腺疾患の発症増悪予知に有用な遺伝子多型を見出すことを試みた。その結果、GITR、Foxp3、HHHEX、FoxelがAITDの重症度(予後)と関連し、CTLA-4がAITDの発症と関連していること、そして、これらのSNPsがAITDの発症増悪の予知診断法に有用であることを明らかにした。自己免疫疾患の病因規定因子である末梢性自己寛容の誘導因子と標的臓器の発生制御因子に着目し、発症予知に有用な遺伝子多型を見出すことを試みた。1.制御性T細胞の解析甲状腺に浸潤している制御性T細胞では、エフェクターT細胞に抑制を誘導する膜型TGF-β1分子と抗原提示細胞等が発現するGITRリガンド(GITRL)からの刺激を受けて抑制機能の低下をもたらすGITRの発現が、末梢血の制御性T細胞に比し、増強していることを明らかにした。また自己免疫性甲状腺疾患の組織内では、間質に存在する単核球以外に、甲状腺上皮細胞もGITRLを発現していることを発見した。さらに正常の甲状腺組織においても、甲状腺上皮細胞がGITRLを発現していたが、自己免疫性甲状腺疾患の発現の方が強かった。従って、甲状腺上皮細胞に発現するGITRLが、自己免疫性甲状腺疾患の増悪を促している可能性が示唆された。2.遺伝子多型(SNP)の探索・解析標的臓器である甲状腺の発生制御因子としてTTF-1、Pax-8、HHEXにまず着目し、既に存在が報告されているTTF-1-854G/T、Pax-8T225M、HHEXrs1111875の一塩基多型(SNP)の解析を行った。対象は、健常人69人、バセドウ病患者105人(難治群64人、寛解群41人)、橋本病患者(重症群50人、軽症群21人)とした。バセドウ病と橋本病を健常人と比較してもgenotypeの頻度に有意の変化は見られなかった。次に、バセドウ病の難治群と寛解群を比較したところ、HHEX rs1111875において、GG genotypeが寛解群には存在せず有意に少なかった。すなわち、HHEX rs1111875がGG genotypeの時には寛解しやすいことを示している。今後、さらにGITRLのSNPやHHEX多型の機能の差について解析する予定である。自己免疫疾患の病因規定因子である末梢性自己寛容の誘導因子と標的臓器の発生制御因子に着目し、発症予知に有用な遺伝子多計を見出ずことを試みた。1.制御性T細胞の解析2.発生制御因子の解析標的臓器である甲状腺の発生制御因子のひとつであるFoxe1遺伝子の-283G/ASNP(rs1867277)と自己免疫性甲状腺疾患の病態との関連を調べたところ、高産生型のAアリルの頻度が、軽症橋本病よりも重症橋本病で低下していた。F6xelはサイログロブリン(Tg)や甲状線ヘ・ルオキシダーゼ(TPO)のフ・ロモーターに結合する特異的各蛋白で、クロマチンの構造を変化させ、他の転写因子の結合を促進ずることより、TPOの発現を促す可能性が考えられる。従って、甲状腺の発生制御因子が自己免疫疾患の発症・増悪に関係があり、その制御因子のひとつであるFoxelのSNPが自己免疫疾患の発症・増悪の予知に使用できる可能性が示唆された。さらにTreg細胞の制御能に関連するFoxp3やCTLA4のSNPと自己免疫性甲状腺疾患の病態との関連を解析し、Foxp3の-2383CC genotypeの頻度は橋本病の重症群で軽症群よりも高いこと、-3279CAgenotypeの頻度はバセドウ病の寛解群で難治群よりも高いこと、そしてFoxp3の転写に欠陥のある-3279AAgenotypeがバセドウ病の寛解群に存在しないこと、さらにCTLA-4のCT60 SNPのGG genotypeと+49A/G SNPのGalleleの頻度が橋本病全体で高いことを明らかにした。2.発生制御因子の解析標的臓器である甲状腺の発生制御因子(TTF-1,Pax-8,HHEX,Foxel等)のSNP解析に関しては、その後有意の結果は得られなかった。
幕末・明治期における民謡・流行歌を通じてみた外国文化摂取の歴史的研究

本研究の成果は,「幕末・明治期における民謡・流行歌を通じてみた外国文化摂取の歴史的研究」,および「幕末明治初期,長崎における外国音楽摂取の時代的背景」の二編からなる報告書にまとめた。第一部では,『長崎新聞』『西海新聞』を主要な資料として,次の結論を得た。長崎を事例とする研究で明白になったことは,第一に身分解放令後も芸妓は娼妓と同様激しい差別に晒されていたが,1879年半ばより彼女らの清楽を中心とする演奏が高く評価されるに至り工尺譜が普及し,第二に,この直後から開始された文部省の唱歌教育が五線譜の浸透力不足のため軽視される中で,清楽師範として人気の高かった長原梅園が明治22(1889)年,工尺譜『月琴・俗曲今様手習草』を発刊し,文部省唱歌を12曲紹介し民衆の問で愛唱される大きな契機をつくり,第三に,スコットランド民謡「あさひのひかり」(のちの「蛍の光」),ルソーを発端とする「みわたせば」(のちの「結んで開いて」),モーツアルト『魔笛』のアリアのメロディーを転用した「仁は人の道」(原曲パパゲーノのアリア)等が定着したことを明らかにした。第二部では,長崎県『学務課教育掛事務簿』,『r長崎県会日誌』r明治十二年六月,米国前大統領来港接待記事』等の精査をもとに,第一に,得られた主な資料を,その歴史的背景を説明しながら紹介し,第二に『活水学院百年史』等を参照しつつ分析し,義務教育における音楽教育は難渋しつつも,俗曲が,その担い手であった芸妓に対する差別的観念と相侯って,文部省の狙い通り零落したことを明らかにし,第三に小学校における唱歌教育が童謡をもとに,生徒の健康増進を実際上の目的として進められたことを解明し,第四に活水学院の前身では発足当初から高度の西洋音楽の教授が重視され,長崎県下の子どもに西洋音楽を定着させる有力な途を開いたことなどを明らかにできた。長崎歴史文化博物館に移管された旧県立長崎図書館郷土資料室所蔵資料を中心に調査研究を行い,ほぼ次のような成果を挙げた。1 16世紀にキリシタン信仰とともに導入されたキリスト教音楽は,導入時にはオルガンの伴奏による歌唱・合唱,オルガンおよび弦楽器の演奏等が堪能な日本人が相当数育成されたが,これらが民謡ないしは流行歌として定着し,幕末・明治期にまで愛唱されることはなかった。このことは,工尺譜曲集にその痕跡を留めていないことから証明できる。2江戸時代の日本において,少なくとも11曲以上のオランダ歌曲が知られ,19世紀なかばには長崎諏訪神社の祭礼「おくんち」でオランダの軍服を着た住民が「和蘭兵隊さん」と称する歌を歌ったことが知られている(笠原潔「江戸時代の日本で歌われたオランダ歌曲について」)。しかし,これも江戸時代末期に出版された工尺譜曲集には採録されず,民謡として定着しなかったと推定される。3江戸時代に出版された工尺譜曲集は,ほとんど例外なく明楽ないしは清楽曲であり,とくに長崎において月琴等で演奏されたことが明らかにできる曲は,「九連環」「算命曲」「茉莉花」「中山流水」などである。

このことはすでに提出した佐々木・鍋本の科研費報告書(2003年および2005年)で明らかにしたが,今年度はこれらの曲がどうして日本民衆に愛好されたのかを検討した。この検討には,原曲の含むメッセージ性と,これを受容した日本民衆の雰囲気との両方を解明する必要があるが,今年度中に結論を得るには至らなかった。この検討は来年度の課題とし,報告書で結論を述べたい。4明治期については,文部省唱歌・神楽・大津絵節・「数え歌」・「一つとせ」などが流行する反面,中国人に対する蔑視の風潮が起こり,並行して清楽の衰退が起こることが新聞記事から解明できた。5明治初期から長崎にはフランス軍艦の表敬訪問などがなされ,軍楽隊の演奏が行われたことが把握できた。ここで演奏された曲目や日本に与えた影響などは,来年度の検討課題としたい。本研究は,上記のテーマを二つの問題に分け,研究を進めた。第一の問題は,義務教育制度が発足したあと,唱歌教育が軽視される中で,幾つかの唱歌は民衆の間で愛唱されたことを明らかにし,その媒介者を解明することである。第二の問題は,江戸期から外国文化流入の窓口の役割を果たした長崎で,外国人の歌唱や器楽演奏の日本民衆への影響,明治以後の義務教育における唱歌教育の実態,ミッションスクールの音楽教育の実態を検討し,音楽文化がどう定着したかを解明することである。第一の問題は,『長崎新聞』『西海新聞』などを精査し,ここで得られた資料を,中村洪介『近代日本洋楽史序説』,大和淳二『文部省唱歌集成』,長田暁二『世界の愛唱歌』等を参照しながら分析し,明治10年代初頭に芸妓らが演奏する清楽が見直され,月琴が民間に普及し,同時に工尺譜で書かれた清楽曲集が愛用されたこと,明治22年,清楽師範として圧倒的な人気を誇った長原梅園が『月琴・俗曲今様手習草』を発刊し,この中で後の「蛍の光」「結んで開いて」,当時の「霞か雲か」「誠は人の道」を,文部省唱歌の題・歌詞を変えて採録して愛好者を広げ,定着させたことが明らかにできた。第二の問題は,長崎県『学務課教育掛事務簿』,『長崎県会日誌』『明治十二年六月,米国前大統領来港接待記事』等を精査し,ここから得られた資料を,塚原康子『十九世紀日本における西洋音楽の受容』,文部省音楽取調掛『洋楽事始』,『長崎県教育史』,『活水学院百年史』等を参照しながら分析した。結果、俗曲の主な担い手であった芸妓たちに対して、身分解放令施行後も差別的観念があり、それらと政府の「俗曲」否定の理念を背景として、小学校における唱歌教育が西洋音楽と日本音楽の折衷としての童謡を定着させ,生徒の健康増進を実際上の目的として進められたこと,活水学院の前身ではピアノ・オルガン・合唱などの教授が重視され,義務教育の定着とは別に長崎県下の生徒に西洋音楽が定着していったと思われることを明らかにできた。これらを二編の論文にまとめ,報告書に収録した。
多次元顕微光学システムによる免疫・神経クロストークの薬学への展開

生体の免疫系と神経系はこれまで独立したシステムと考えられてきた。しかも、このようなシステムを追究する適切な手段がなく、これまではほとんどその研究がなされてこなかった。研究代表者らはこのような免疫系と神経系のクロストーク研究の突破口として、新生児マウスから神経節を単離し、神経成長因子の存在下で、神経初代培養細胞を継続培養する技術を確立した。そして、初代培養神経細胞として交感神経と感覚神経の両者を用いることを可能にした。これら初代培養神経細胞と免疫細胞(マスト細胞とリンパ球)をin vitroで共存培養し、両者の細胞間相互作用を顕微光学法で追究した。神経系から免疫系へは(マスト細胞)へは液性因子(サブスタンスP)を介してグロストークが起こっていることが明らかになった。本開発技術は免疫・神経連関を物理系薬学の立場から追究するのに有力な手段となった。開発したin vitro共存培養システムと顕微光学法により、末梢及び中枢での免疫・神経クロストークを多角的に機能解析した。また、その研究成果を薬学研究の発展・展開に結びつけた。具体的研究成果は、(1)神経節初代培養細胞と免疫細胞の共存培養法の確立、(2)多次元顕微光学システムを用いた、免疫系と神経系クロストークの機能解析、(3)神経細胞からマスト細胞への情報伝達にはサブスタンスPが関与、(4)神経細胞からTリンパ球への情報伝達にはノルアドレナリンが関与、(5)免疫系(マスト細胞)から神経系への逆方向の情報伝達にはATPが関与、(6)マスト細胞と神経突起は神経シナップス様の構造体を形成する、(7)これらシナップス様構造の形成には接着分子(蛋白質)のN-カドヘリンとSynCAMが重要な寄与をなしている等の多くの先端的な成果を世界に先駆け明らかにした。免疫学と神経科学の急速な進歩は、免疫系と神経系との間には密接な相互作用(クロストーク)が存在し、両者の相互作用により生体の恒常性が維持されていることが分かってきた。しかし、このような神経系と免疫系の相互作用については、適切な研究手段がなく、これまで詳細な解析がほとんどなされてこなかった。申請者らはこのような免疫系と神経系の相互作用(クロストーク)研究の突破口として、新生児マウスの神経節を神経成長因子(NGF)の存在下で初代培養する技術を確立するとともに、その初代培養神経細胞と免疫細胞(マスト細胞やリンパ球)を共存培養し、両者の細胞間で液性因子を介してクロストークが起こっていることを明らかにした。申請者らが確立した手法は免疫・神経連関を物理系薬学の立場から追究する有力な手段と考えられた。そこで、研究代表者らが開発したin vitro共存培養システムを基盤に顕微光学法により、末梢及び中枢での免疫・神経クロストークを多角的に機能解析を進め、その成果を薬学研究の発展・展開に結びつけようと試みた。このような視点からの研究はこれまで皆無であり、その研究成果は物理系薬学の進展に大きく寄与するだけでなく、薬学および医療の進展にも多大の貢献をなすと考えられた。具体的には、(1)神経節初代培養細胞と免疫細胞の共存培養(co-culture)システムの確立、(2)多次元顕微光学システムを用いた、免疫系と神経系のクロストークの機能解析を実施した。その結果、(1)神経細胞とマスト細胞の相互作用ではサブスタンスPが、(2)神経細胞とTリンパ球の相互作用では、ノルアドレナリンが液性因子として関与し、(3)活性化のシグナルは相互作用の局所部位でまず起こり、順次、細胞全体に広がっていることが明らかになった。また、(4)N-カドヘリンが両者の細胞間相互作用に強く関与していた。生体の免疫系と神経系はこれまで独立していると考えられていた。

このようなシステム間の相互作用については、適切な研究手段がなく、ほとんど解析はなされてこなかった。申請者らはこのような免疫系と神経系のクロストーク研究の突破口として、新生児マウスから神経節を単離し、神経成長因子(NGF)の存在下で神経初代培養細胞を継続培養する技術の確立に成功した。しかも、初代培養神経細胞として、交感神経と感覚神経の両者を用いることを可能にした。次に、これら初代培養神経細胞と免疫細胞(マスト細胞とリンパ球)をin vitroで共存培養し、両者の細胞間相互作用を顕微光学法で追究した。神経系から免疫系(マスト細胞)へは液性因子(サブスタンスP)を介してクロストークが起こっていることを明らかになった。申請者らが確立した技術は免疫・神経連関を物理系薬学の立場から追究する有力な手段と考えられた。そこで、開発したin vitro共存培養システムと顕微光学法により、末梢及び中枢での免疫・神経クロストークを多角的に機能解析した。また、その研究成果を薬学研究の発展・展開に結びつけることを企てた。このような視点からの研究はこれまで皆無であり、薬学および医療薬学の新しい進展にも多大の貢献をなすと考えられた。具体的成果は、(1)神経節初代培養細胞と免疫細胞の共存培養(co-culture)システムの確立、(2)多次元顕微光学システムを用いた、免疫系と神経系のクロストークの機能解析、(3)神経細胞とマスト細胞の相互作用にサブスタンスPの関与、(4)神経細胞とTリンパ球の相互作用には、ノルアドレナリンの関与、(5)免疫系から神経系への逆方向のシグナルにATPの関与、(6)接着分子N-カドヘリンとSynCAMの両者が細胞間相互作用に強く関与している等の多大の先端的研究成果を得た。生体の免疫系と神経系はこれまで独立していると考えられていた。このようなシステム間の相互作用については、適切な研究手段がなく、ほとんど解析がなされてこなかった。申請者らはこのような免疫系と神経系のクロストーク研究の突破口として、新生児マウスから神経節を単離し、神経成長因子(NCF)の存在下で神経初代培養細胞を継続培養する技術を確立した。そして、初代培養神経細胞と免疫細胞(マスト細胞とリンパ球)をin vitroで共存培養し、両者の細胞間相互作用を顕微光学法で追究した。神経系から免疫系(マス下細胞)へは液性因子(サブスタンスP)を介してクロストークがおこっていることが明らかになった。本開発技術は免疫・神経連関を物理系薬学の立場から追及する有力な手段となった。開発したin vitro共存培養システムと顕微光学法により、末梢及び中枢での免疫・神経クロストークを多角的に機能解析した。また、その研究成果を薬学研究の発展・展開に結びつけた。このような視点からの研究はこれまで皆無であり、薬学及び医療薬学の新じい進展にも多大の貢献をなすと判断された。具体的薪究成果は、(1)神経節初代培養細胞と免疫細胞の共存培養(co-culture)システムの確立、(2)多次元顕微光学システムを用いた、免疫系と神経系のクロストークの機能解析、(3)神経細胞とマスト細胞の相互作用にサブスタンスPの関与(4)神経細胞とTリンパ球の相互作用にはノルアドレナリンの関与、
植物におけるCO_2シグナル伝達系の解明

1.クラミドモナスCA遺伝子CAH1のCO_2濃度変化に応答する発現調節領域PCRにより得た様々な長さのCAH1遺伝子上流域とレポーター遺伝子(ars)を融合させたキメラ遺伝子をもつプラスミドを作製し、硝酸還元酵素(nit)遺伝子を持つ選抜用プラスミドpMN24とともにクラミドモナス宿主株(nit欠損株)に導入した。アンモニア非要求性となった形質転換株について、発色基質X-SO_4を用い低CO_2ならびに高CO_2条件下におけるars活性を調べた。また、導入したキメラ遺伝子全体が核ゲノムに挿入された株を選抜するためにPCR反応用プライマーをデザインし、形質転換株(アンモニア非要求性株)のゲノムDNAに対してPCR反応をおこなったところ、形質転換株の約20%がキメラ遺伝子を完全な形で保持していた。この結果、転写開始点から-293塩基までの上流域があればCO_2濃度の変動に応答できることが判明した。2.クラミドモナス高CO_2要求性変異株の単離と解析二酸化炭素濃度の低下を細胞が感知してからCA遺伝子の発現誘導が引き起こされるまでの過程を明らかにする目的で、nit1遺伝子を遺伝子タギングの指標として用いて、高CO_2要求性変異株のスクリーニングを行った。nit1遺伝子の挿入変異によってCA活性の誘導がかからなくなった株を6株単離した。また、CA活性は野生型と同じように誘導されるにも関わらず、低CO_2条件下で生育速度が低下した株も単離できた。現在これらの株について、光合成特性の評価・挿入DNA断片のクローン化をおこなっている1.クラミドモナスCA遺伝子CAH1のCO_2濃度変化に応答する発現調節領域PCRにより得た様々な長さのCAH1遺伝子上流域とレポーター遺伝子(ars)を融合させたキメラ遺伝子をもつプラスミドを作製し、硝酸還元酵素(nit)遺伝子を持つ選抜用プラスミドpMN24とともにクラミドモナス宿主株(nit欠損株)に導入した。現在これらの株について、光合成特性の評価・挿入DNA断片のクローン化をおこなっている
樹状細胞の腫瘍内局注による特異的免疫療法の基礎研究

Balb/cマウスの骨髄細胞をrGM-CSFとrIL-4にて培養することにより、強力な抗原提示細胞である樹状細胞が誘導された。この樹状細胞は未熟であり、抗原を捕捉して取り込み、免疫担当T細胞に抗原提示できる。我々は未熟樹状細胞を皮下に移植した同系乳癌腫瘍MT-901に直接局注することにより注入病変の増大を有意に抑制するとともに、対側に移植した非局注腫瘍においても同様の腫瘍増殖抑制効果を確認した。またこのマウスの脾細胞はMT-901に対して特異的細胞傷害活性と特異的Type1サイトカイン産生を示すことが確認され、腫瘍内樹状細胞局注により全身性の特異的免疫応答が誘導され、抗腫瘍効果を示すことが実証された。この樹状細胞局注効果は異系であるC57BL/6マウスの樹状細胞の局注では認められずMHCに拘束された免疫応答と考えられた。樹状細胞の局注に先立ってあらかじめマウスのCD8陽性T細胞を除去すると、樹状細胞局注の効果は消失し、体内におけるCD8陽性T細胞が抗腫瘍効果発現に重要な働きを担っていることが示された。樹状細胞をあらかじめヘルパー抗原であるKLHでパルスし、局注後にIL 2の全身投与を併用することにより移植腫瘍は完全に退縮し、抗腫瘍効果は著明に増強した。以上の基礎結果をもとに、KLHをパルスした樹状細胞を腫瘍内に局注しその後4日間IL-2の全身投与を併用する方法が最も、有効に抗腫瘍効果を誘導可能であると考えられ、新しい免疫細胞治療として臨床研究を計画立案し実施した。14例の臨床研究の結果、重篤な副作用を認めず、腫瘍マーカーの減少及び腫瘍縮小効果を確認でき、樹状細胞局注療法は安全に実施可能であり、臨床効果が期待できる新しい免疫細胞治療としてさらなる研究の展開が期待されると考えられた。1、マウス骨髄細胞からの樹状細胞の採取と分離培養BALB/cマウスの大腿骨より骨髄細胞を採取しリコンビナントマウスGM-CSF及びIL-4添加培養液にて1週間培養した後に、metrizamideを用いた比重遠心法にてdendritic cell rich interfaceを採取した。この樹状細胞の表面抗原をモノクローナル抗体を用いてFACSにて解析した結果、樹状細胞に特徴的であるCD11b,11c,80,86,MHC classI,classII陽性を示し、以上の方法でマウス樹状細胞が採取誘導可能と考えらえた。2、樹状細胞の成熟化と貪食能に関する検討GM-CSFとIL-4にて1週間培養された樹状細胞は通常未熟樹状細胞と考えられる。この未熟樹状細胞をさらに24時間TNFα、CD40 ligand等にてさらに刺激培養することにより成熟樹状細胞が誘導される。この成熟化を樹状細胞の貪食能にて検討するため、FITC-conjugated DextranをGM-CSF及びIL-4にて培養した樹状細胞もしくはGM-CSF,IL-4にて5日間培養した後にTNFαを添加してさらに48時間培養した樹状細胞とで比較検討したところ、GM-CSF及びIL-4にて培養した未熟樹状細胞ではDextranの貪食が盛んであったが、TNFα添加にて成熟化した樹状細胞ではDextan貪食能が低下していた。以上の結果より本研究題目である腫瘍内樹状細胞局注療法においては未熟な樹状細胞を用いることが腫瘍の貪食及び癌抗原の提示により有効であることが示唆された。

3、BALB/cマウス皮下に同系腫瘍であるMT901(mammary carcinoma MT-7のサブクローン)3X10^6個を接種し3,10,17,21日後に未熟樹状細胞1X10^6個を腫瘍部に局注して腫瘍増殖抑制効果を検討した。腫瘍部にHBSSのみを局注したコントロール群に比較して、現時点までの結果では、樹状細胞局注群において皮下腫瘍の増殖抑制が認められている。Balb/cマウス皮下に同系乳癌腫瘍MT-901を皮下接種し増殖させた後に、同腫瘍内に樹状細胞を局注することにより腫瘍の増大が有意に抑制された。この腫瘍内樹状細胞局注による抗腫瘍効果は、同系の樹状細胞の局注では認められたが、異系のC57BL/6マウスの骨髄由来樹状細胞では認められずMHCに拘束された免疫応答であった。また、樹状細胞のかわりに脾細胞を局注しても効果は認められなかった。あらかじめCD4陽性もしくはCD8陽性T細胞を除去したマウスを用いた実験では、CD8陽性T細胞除去マウスでは樹状細胞局注療法の抗腫瘍効果が認められず、CD4陽性T細胞除去マウスではコントロールマウス群と同程度の腫瘍増殖抑制効果が認められた。これより、樹状細胞局注による腫瘍増殖抑制効果には生体内のCD8陽性T細胞が重要な働きを担っていることが示された。樹状細胞の特異的免疫励起作用はヘルパー抗原であるKLHの添加で増強されることが報告されているが、腫瘍内樹状細胞局注療法においても同様に、樹状細胞を局注前にKLHにてover nightでパルスすることによって有意に腫瘍増殖抑制効果の増強を認め、腫瘍の完全退縮が確認された。さらに樹状細胞を局注後、リコンビナントマウスIL-2を4日間連続で腹腔内投与したマウスでは有意に腫瘍増殖抑制効果が増強し、腫瘍の完全退縮が確認された。これらの免疫応答が認められたマウスの脾細胞を摘出し、in vitroにて抗CD3抗体とIL-2にて1週間活性化した脾臓リンパ球は接種腫瘍特異的IFNγ及びGM-CSF産生の増強を示し、同腫瘍の肺転移を有意に抑制した。以上の基礎結果より、KLHをパルスした樹状細胞を腫瘍内に局注しその後4日間IL-2の全身投与を併用する方法が、最も有効に抗腫瘍効果を誘導可能であると考えられ、新しい免疫細胞治療として臨床研究を計画立案し、実施をすすめている。現在まで重篤な副作用を認めず、腫瘍マーカーの減少及び腫瘍縮小効果を確認しており、さらなる研究の進展が期待される。
中性子結晶構造解析によるヒドロゲナーゼの水素合成・分解機構の全容解明

ヒドロゲナーゼは水素の合成・分解を両方向に触媒する酵素であり、その特徴的な機能に基づいた化石燃料に代わるクリーンエネルギーの創製が期待されている。ヒドロゲナーゼの反応機構を真に理解するためには、反応中の各状態の水素原子を直接観測することが必須であるため、本申請研究では中性子を中核に据え、X線を相補的に組み合わせた構造解析から全原子構造情報を高精度に取得することを目的としている。今年度は、前年度に収集した還元型(活性状態:Ni-R型)の2.1Å分解能の中性子回折データの構造精密化を同一結晶から取得した1.0Å分解能程度のX線回折データを組み合わせて実施した。その結果、若干酸化型(不活性状態:Ni-A型)が混在した状態の構造であることが判明した。そこで、還元剤を添加した溶液に結晶を一定時間浸漬したのちに国内のパルス中性子源J-PARCでの中性子回折実験に供した。その結果、2.0Å分解能での中性子回折データを収集したが、データ処理後の統計値に若干の問題(データの完全性が低い)があった。また、同一結晶から取得したX線回折データを用いた構造解析の結果、前年度に取得した結晶に比べて還元状態が進んでいるものの、まだ少しだけ酸化型が混在していることが判明したため、還元剤添加溶液への浸漬時間を長くすることで、還元状態をより進めた結晶を作製した。予備的なX線回折実験の結果、X線回折で判断できる範囲では十分な還元状態であることを確認できたため、この条件下で中性子回折実験に供する大型結晶を作製した。還元型(活性状態:Ni-R型)制御の知見を取得し、中性子結晶構造解析に目処をつけることが出来た。収集済み及び今後取得する還元型の中性子回折データを、同一結晶から取得したX線回折データを組み合わせて、構造解析を完了する。平成28年度は、過年度に取得した酸化型(不活性状態:Ni-B型)の中性子結晶構造解析を同一結晶から取得したX線回折データを組み合わせた構造精密化により進めた。反応中心の貴金属原子が一部欠落していたが、占有率を同定した後に水素原子を含む反応中心近傍の構造決定をほぼ終了した。また、還元型(活性状態:Ni-R型)の大型結晶作製を2通りの方法(好気環境で大型結晶を作製した後に水素還元する方法と、試料調製から結晶作製までの全行程を嫌気環境で行う方法)で進めた。両結晶を用いてJ-PARCにおいて中性子回折実験を複数回実施した。その結果、前者の方法で作製した結晶から3Å分解能を超える回折点を確認することに成功した。後者については、まだ結晶のサイズが不十分なため最高でも3.5Å分解能程度の回折点の確認に留まった。なお、いずれの方法で作製した結晶においても、試料凍結の際に結晶の質が低下したことによる反射の乱れが確認されたため、回折データ収集には至らなかった。還元型(活性状態:Ni-R型)の大型結晶作製に成功し、3Å分解能を超える中性子回折点も確認済みである。平成29年度は、還元型(活性状態:Ni-R型)結晶からの中性子回折データ収集を試みた。前年度に実施した回折実験では、試料凍結の際に生じたと考えられる結晶性の低下が確認されていたため、今年度は試料凍結方法の見直しをおこなった。前年度は嫌気チャンバー内において液体窒素中で凍結を実施していたが、今年度は吹き付け型冷却装置のノズルを嫌気チャンバー内に導入し気流下で凍結することで、試料凍結時の結晶の劣化を回避することに成功した。作製法の異なる2種の還元型結晶(好気環境下で結晶作製後に水素還元した結晶、および全行程を嫌気環境下で実施した結晶)について、前者は国内のパルス中性子源J-PARCで、後者は米国パルス中性子源SNSで回折実験を実施した。その結果、前者は1.9Å、後者は2.3Å分解能での中性子回折データ収集に成功した。また、相補的構造精密化を実施するためのX線回折実験を国内の放射光施設(KEK-PF)において実施し、同一結晶からそれぞれ1.0Å分解能程度のX線回折データ収集も完了した。還元型(活性状態:Ni-R型)の良質な中性子回折データ収集に成功した。