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博物館植物標本の生存組織を用いた絶滅集団の復元：組織培養法の確立と普及

絶滅危惧種を中心に131種722標本の標本種子の発芽試験と胚の酵素活性を調査したところ、84種(64.12%)、336標本(46.54%)において生存が確認された。標本種子の組織培養に取り組むために、野外から収集したヒメヒゴタイとミスミイの健全種子を用いて、様々な培地条件、前処理条件において培養試験を行った。塩化第2水銀による表面殺菌と、防腐剤であるPPMを2%添加した培地を用いることで、菌類を100%抑制が可能だった。この方法を用いて、絶滅集団の標本種子を培地に播種した結果、種子の発芽についても確認されなかったものの,2週間が経過しても菌類の発生は確認されなかった。博物館の標本庫には、都市化などにより現在では失われてしまった植物集団の標本が残されている。このような種の標本から種子を収集し、生存組織を組織培養することにより、失われた集団を復元したり、種の遺伝的多様性を回復したりできる可能性がある。本研究では、博物館標本種子の生存組織を用いた組織培養法を確立すると共に、植物体を得て系統保存と野生復帰を行う。また、標本作製の意義と標本の価値について教育普及を進める。平成26年度は標本種子から組織培養を行う対象種の野生集団、もしくは近縁種の野生集団から種子を収集し、健全種子の胚などを用いた組織培養を行うことを目標とした。研究実績は以下の通りである。1,組織培養対象種の選定と野生集団の種子の収集:標本種子を用いて組織培養を行う前段階として、健全種子を用いた組織培養方法を確立するために、既に標本種子の生存が確認されている絶滅危惧種の中から様々な胚タイプ、果実タイプ、生態を網羅するように5種選定し(イソスミレ、ヒメヒゴタイ、ミスミイ、イヌハギ、スズサイコ)、その野生集団から当年種子を採集した。2,野生集団の種子を用いた組織培養:博物館標本の種子には限りがあるため、前項で野外から収集した種子の胚を用いて組織培養試験を行った。培地には一般的なMS培地の他に数種類用いて、最適な培地条件、温度条件、組織部位を検討した。3,博物館標本の種子の収集:組織培養試験を行う、ミスミイ、ヒメヒゴタイ、イヌハギ、スズサイコの博物館標本種子を収集した。4,結果のまとめ:本研究に関する研究成果を、日本植物学会(平成26年9月)、日本植物分類学会(平成27年3月)において発表した。本研究内容の一部を大阪市立自然史博物館にて開催されたミニ展示「植物標本のタネは地域の自然を救う!?」(2014年3月15日5月31日)において紹介した。本研究では、博物館標本の生存組織を用いた組織培養法を確立すると共に、植物体を得て系統保存と野生復帰を行う。標本作製の意義と標本の価値について教育普及を進める。平成27年度の主な研究実績は下記の通り。●野生集団の種子を用いた組織培養:標本種子の組織培養に取り組むために、野外から収集した健全種子を用いた組織培養法を確立するために、様々な培地条件、前処理条件において培養試験を行った。ヒメヒゴタイ、ミスミイに絞って実験を行ったところ、HgCl2による滅菌が最も高い菌類抑制効果がみられた。しかし、41.1%の種子で菌類の発生を抑えられなかった。そのため、防腐剤であるPPMの菌類抑制の効果を検討した結果、PPMを2%添加した種子では、菌類の発生が確認されなかった。これらの結果を組み合わせ、塩化第2水銀による表面殺菌と、PPM2%を添加した培地を用いることで、菌類を100%抑制が可能だった。●博物館標本種子を用いた組織培養:方法を用いて、絶滅集団の標本種子を培地に播種した結果、種子の発芽についても確認されなかったものの、2週間が経過しても菌類の発生は確認されなかった。今後、標本種子を用いて培地上での発芽試験を行う際には、表面殺菌だけでは滅菌が不十分である可能性があるため、PPMなどの防腐剤を添加することで、菌類が内在していても抑制できると考えられる。●結果のまとめ:本研究に関する研究成果を、日本植物分類学会(平成28年3月)において発表した。また、長岡市立科学博物館の企画展「めがはじまり」(5/307/12)において本研究内容を紹介した。これまで予定していた「組織培養対象種の選定と野生集団の種子の収集」、「博物館標本種子の収集」はそれぞれ予定通り成果を得ることができた。「野生集団の種子を用いた組織培養」では培地を用いて、種子試発芽験を行う際の条件をおおむね確定することができた。しかし、標本種子を用いた組織培養方法の確立には至っておらず、次年度への課題として残された。本研究では、博物館標本の生存組織を用いた組織培養法を確立を目指す。

また、標本作製の意義と標本の価値について教育普及を進める。平成28年度の主な研究実績は下記の通り。●野生集団の種子を用いた組織培養:昨年度同様に培養試験を行い、塩化第二水銀による表面殺菌と、防腐剤であるPPMを2%添加した培地において菌類の発生を抑制することを確認した。しかし、標本種子を播種するだけでは植物体を得ることはできなかったため、野外から得た各種の健全種子の胚を切り出して培養試験を行った。カルス状の組織がわずかに得られたが、分化した植物体を得るに至らなかった。また、テトラゾリウム染色法によって識別された生存組織を切り出して培養を行ったところ、カルス状組織への分化や発芽を確認することができなかった。●標本作製や保存・管理、利用に関する意識調査:植物標本に関わるステークホルダーの意識調査をWebアンケートにより行い、500件を超える回答を得て解析を行った。●教育普及:植物標本作製の意義と標本種子の発芽可能性と保全への利用可能性について取り扱った巡回展示を開催するためにコンテンツ作成を行った。また、これをもとに大阪市立自然史博物館において展示会を開催した(平成29年3月4日4月9日)。また、新潟大学旭町学術資料館でも開催することが決定した(平成29年4月28日5月28日)。絶滅危惧種を中心に131種722標本の標本種子の発芽試験と胚の酵素活性を調査したところ、84種(64.12%)、336標本(46.54%)において生存が確認された。標本種子の組織培養に取り組むために、野外から収集したヒメヒゴタイとミスミイの健全種子を用いて、様々な培地条件、前処理条件において培養試験を行った。塩化第2水銀による表面殺菌と、防腐剤であるPPMを2%添加した培地を用いることで、菌類を100%抑制が可能だった。この方法を用いて、絶滅集団の標本種子を培地に播種した結果、種子の発芽についても確認されなかったものの,2週間が経過しても菌類の発生は確認されなかった。当初予定していた「組織培養対象種の選定と野生集団の種子の収集」、「博物館標本の種子の収集」はそれぞれ予定通り成果を得ることができた。また、「野生集団の種子を用いた組織培養」については、培養試験を2種(ミスミイ、ヒメヒゴタイ)で開始することができた。おおむね順調に進展しているといえるが、対象種の培養条件の確立には至っておらず、次年度への課題として残された。平成28年度の研究の推進方策は以下の通り。●博物館標本種子を用いた組織培養:博物館標本種子を用いて組織培養試験を行う。組織培養は野生集団の種子を用いて検討した最適な条件で行う。●順化作業:新潟大学教育学部および大阪市立自然史博物館の実験圃場において、博物館標本種子の組織培養から得られた植物体の順化作業を行う。また組織培養により得られた植物が、野外の種子から得られた植物と同様に、正常な成長がみられるかを確認する。●生品展示と教育普及:大阪市立自然史博物館のビオトープにおいて、培養から順化作業まで成功させることができた植物を試験栽培する。一部については関係する各地植物園に寄贈し、系統保存を進めるとともに、今後の生品展示に利用してもらう。●普及展示の作成と巡回展の実施:標本種子を利用した生物保全、標本作製の意義と博物館標本の価値について教育普及を行うために展示を作成して、自然史系博物館をはじめ、植物園等において巡回展示を行う。総合領域平成27年度の研究を推進する内容は以下の通り。
局所麻酔薬の神経細胞毒性においてT型カルシウムチャネルが果たす役割の解明

概ね研究計画通り実験を遂行している。現在までに判明したこととして、1.ブピバカインは時間依存性、用量依存性にSH-SY5Y細胞の細胞死を誘導する。2.各種のイオンチャネル阻害薬のうち、T型カルシウムチャネル阻害薬のみがブピバカインの神経毒性作用を増強する。3.細胞内外のカルシウムキレート剤を併用した場合、細胞外カルシウムキレート剤のみがブピバカインの神経毒性作用を増強する。4.ブピバカイン、T型カルシウムチャネル阻害薬、カルシウムキレート剤の神経毒性作用ならびにその増強作用はいずれもミトコンドリア膜電位の脱分極、細胞内活性酸素の増加、カスパーゼ3の発現と関連している。5.ミトコンドリア膜電位の維持に関与していると言われているKATPチャネル開口薬であるdiazoxideを投与しても上記の神経毒性作用は影響を受けない。現在、おもに1から4の結果について学会発表を経て論文作成中である。また同時に、RT-PCR法とウエスタンブロット法を用いてSH-SY5Y細胞に発現するイオンチャネルとそのサブタイプの同定を試みている。研究は当初の計画に沿って概ね順調に進んでいる。ただし、ブピバカインはラセミ混合物であり、神経毒性の解明にはS体とR体のブピバカインの違いを調べる必要があり、当初そのような計画をしていた。しかしながら、研究の過程でS体のブピバカインが実験過程中に析出してしまう事例が続いており、実験の遂行に難渋している。物理的性質はラセミ体は同じはずなので、未知の化合物などの影響かも知れない。引き続き当初の計画に沿って実験を進めていく。SiRNAによる遺伝子発現抑制実験法を用いてイオンチャネルの発現をノックダウンし、局所麻酔薬の神経毒性に関連するイオンチャネルを同定する。平成29年度に得られた研究成果は以下のとおりである。1.ブピバカインはレボブピバカイン、ロピバカインに比べ強い神経細胞毒性を示した。2.これらの神経細胞毒性は、各種イオンチャネル阻害薬の中でもT型カルシウムチャネル阻害薬NNC55-0396のみによって増強された。3.NNC55-0396はそれ自体でも用量依存性、時間依存性に神経細胞毒性を示した。4.細胞内外のカルシウムキレート剤(EGTAとBAPTA-AM)を投与すると、細胞外のキレート剤のみが神経細胞毒性を示した。5.ブピバカイン、NNC55-0396はともにミトコンドリア膜電位を脱分極させアポトーシスを誘導した。これらの結果から、ブピバカインの神経細胞毒性にはT型カルシウムチャネルを介するカルシウムイオン流入の阻害が関連していることが示唆された。PI3キナーゼパスウェイの構成要素であるAKTはアポトーシス誘導に密接に関連していると考えられているが、先行研究でカルシウムイオンとの協働が示唆されている。今後、ブピバカインのAKT活性に対する影響を調べる必要があると考えられる。一方、ミトコンドリア膜電位はATP感受性カリウムチャネルによって制御されている。ブピバカインはATP感受性カリウムチャネルを阻害することによってミトコンドリア膜の脱分極を引き起こし、アポトーシスを誘導する可能性が示唆された。今後、ブピバカインのATP感受性カリウムチャネルに対する作用を調べる必要がある。さらに、ATP感受性カリウムチャネル開口薬リマカリムのブピバカインの神経細胞毒性に対する影響を調べることによって局所麻酔薬の神経細胞毒性を中和する可能性があると考えられる。その他、現在ブピバカインのミトコンドリアからのチトクロムC放出に対する影響を調べているところである。技術的困難によって未だ達成されていない事項(パッチクランプ法など)もあるが、平成30年度実施予定であった各種イオンチャネル阻害薬の神経細胞毒性に対する影響は前倒しで実験を完了しており、全体として研究は当初の計画より早く進行している。またその中で当初予想していなかった結果も得られており、新しい課題も浮かび上がってきている。現時点で得られている研究結果をもとに現在論文執筆を行っている最中である。平成30年度の研究計画の通り、以下の研究を実施する。

1.RT-PCR法を用いて神経細胞における各種イオンチャネルの発現を調べる。2.ミトコンドリアからのチトクロームC放出に対するブピバカイン、NNC55-0396の影響を調べる。その他、研究実績の概要に述べたように、以下の研究を追加で行う予定である。1.ブピバカイン、NNC55-0396、カルシウムキレート剤のAKT活性に対する影響を調べる。2.ブピバカインによるミトコンドリア膜脱分極作用ならびに神経細胞毒性に対するATP感受性カリウムチャネル開口薬、阻害薬の影響を調べる。引き続き当初の計画に沿って実験を進めていく。SiRNAによる遺伝子発現抑制実験法を用いてイオンチャネルの発現をノックダウンし、局所麻酔薬の神経毒性に関連するイオンチャネルを同定する。
細菌鞭毛レギュロンに特異的なシグマ因子の機能構造

1.鞭毛レギュロンのクラスIIオペロン群に特異的なシグマ因子の遺伝子と推定されるflhDC遺伝子をサルモネラからクロ-ン化した。これらの遺伝子の塩基配列を決定したところ、FlhDは116個、FlhCは191個のアミノ酸からなる蛋白質であると推定された。flhD遺伝子上流には典型的なcAMPーCRP結合配列から見いだされたが、この位置は大腸菌において従来から言われていたcAMPーCRP結合位置とはまったく異なっていた。一方,flhDCオペロンはヌクレオイド蛋白質HーNSによって、正の転写調節を受けることが判明した。このオペロンの転写がHーNSに非依存性になった突然変異体を単離したところ、プロモ-タ-領域にマップされるものとそれ以外のものの2種類あることがわかった。2.鞭毛レギュロンのクラスIIIオペロン群に特異的なシグマ因子FliAは、アンチ・シグマ因子によってRNAポリメラ-ゼと相互作用を阻害される。アンチ・シグマ因子による阻害を受けなくなった突然変異体を多数分離し、その突然変異点を解析したところ、8つの異なる位置にアミノ酸置換があることが判明した。これら8種類の突然変異遺伝子について、大腸菌S30による試験管内転写・翻訳共役系を用いて蛋白質産物を合成させた。これらの蛋白質とアンチ・シグマ因子との相互作用を、特異抗体および架橋剤を用いて解析したところ、いずれの突然変異蛋白質も野生型FliAと同程度の相互作用を示し、in vivoで表現型から期待される両蛋白質間の親和性の変化を確伝できなかった。このことから、現在までに単離されているFliAのアンチ・シグマ因子との相互作用の突然変異体は、アンチ・シグマ因子とが結合能に欠損があるのではなく、アンチ・シグマ因子が結合してもRNAポリメラ-ゼとの相互作用が阻害されないようになったものであると推定された。
電子証拠サービス産業の日米における実態調査及び法学的研究

電子証拠に係る法的問題及び電子証拠に係る各種産業の発展について日米における比較研究を行った。米国では法的問題として、電子証拠(electronic evidence)に係る民事裁判においてディスカバリ(証拠収集手続)においてどのように取り扱うかという問題(E-Discovery)について判例理論が形成され、連邦民事訴訟規則の改正案が提案されている。電子証拠に係る産業についても、電子証拠産業という独立した市場が形成されるのではなく、コンピュータセキュリティ企業、コンピュータシステム、ソフトウェア企業、コンサルタント、コンピュータフォレンジック、ービスを提供している。それらのサービスの売上げ高も増加しているという特徴がある。これに対して、日本では電子証拠に係る法的問題および電子証拠に係る産業は未成熟である。電子証拠に係る判例がみられるわけではない。そして、電子証拠に係る産業は、主に、コンピュータセキュリティ企業が米国の電子証拠にかかわる企業の代理店になり事業を展開しており、現在のところ日本独自に市場や産業は形成されていない。日米では証拠収集手続と証拠の原則が異なっている。米国では裁量証拠法則との関係が議論され立法により文書の証拠と同等に取り扱われる解決が取られた。ディスカバリ手続は費用がかかる問題点が指摘され、電子証拠を利用することにより費用の節約が評価されていたが、近年逆に電子的ディスカバリの費用の問題が注目されるようになっている。これに対して日本では電子証拠と文書は自由心証主義の下で証拠価値の問題として従来から処理されている。証拠収集手続が米国ほど活用されない関係で費用の問題は生じていない。今後、個人情報保護法施行や企業のコンプライアンスの米国水準化により同様の問題が生じると考えられる。
Industry Concentration, Fully Endogenous Productivity Growth, and Economic Development

本プロジェクトの目的は、産業活動の地理的な集積が企業の研究開発投資による生産性成長と国の経済発展に及ぼす影響を理論的に考究することである。企業の生産活動とイノベーション活動の立地調整を通して、経済統合の進展が、企業の市場参入や生産性成長に与える影響を、また各国の経済厚生への効果を分析できるモデルの構築に成功した。具体的には以下2つの課題を分析した。先ず、国の間に生じる租税格差が産業の立地をどのように変化させるか、そして市場参入および生産性成長、国の厚生が受ける影響について、新しい結果を出した。次に、製造部門とイノベーション部門におけるオフショアリングが生産性成長を加速する可能性を証明した。経済理論の応用分析
化学療法によって起こる微小環境の変化を制御し、骨肉腫肺転移の治療抵抗性を克服する

骨肉腫(OS)は若年者に好発する骨原発悪性腫瘍である。病初期から肺転移が存在するため、全例で化学療法を行う。しかし、肺転移から再発・増悪した場合に有効な手段はなく、生存率の改善には、治療抵抗性肺転移に対する新たな治療を確立する必要がある。本研究課題は、肺転移の腫瘍を取り巻く免疫担当細胞など化学療法後の腫瘍微小環境が、治療に対する抵抗性を高めているとの仮説のもと、その機構を標的とした治療を確立することを目的としたものである。所属研究室で樹立された骨肉腫細胞AXTの同種移植モデルを用い、これまでに我々は、化学療法後に肺転移組織で発現上昇する遺伝子として、NFκBの作用を増強するものを同定している。そこで薬剤スクリーニングで、AXT細胞に対し抗腫瘍効果を呈したもののうち、NFκB経路に関与する薬剤として、多発性骨髄腫の治療薬Bortezomib(BZ)に着目した。BZは単剤投与で、in vivo, in vitroの双方でAXTに対する抗腫瘍効果を呈した。また、AXTより樹立した抗癌剤耐性細胞AXT-ARに対しても、抗腫瘍効果がみられた。抗癌剤とBZを併用すると、in vitroでは効果の増強がなかったのに対し、in vivoでは相乗的な腫瘍縮小効果を得た。以上から、BZは骨肉腫細胞AXTの抗癌剤耐性を改善し得ること、また、AXT/AXT-AR由来の骨肉腫の非腫瘍細胞成分(=微小環境因子)に作用し得る可能性が示唆された。さらに、AXTを移植し肺転移を起こしたマウスの肺組織を薄切し、生体外で培養・観察することで、抗癌剤投与後、腫瘍細胞の細胞死とともに、多くの血球系細胞が肺転移組織内に集簇していくることを見出した。今後は、その血球系細胞の同定・機能解析とともに、BZでその働きを制御し、肺転移に対する効果につながるのかについて検証を続ける予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。骨肉腫は若年者に好発する骨原発悪性腫瘍であり、病早期から発生する肺転移を制御できるか否かが、生命予後を規定する。生存率の改善には、治療抵抗性肺転移に対する新たな治療が必要である。我々はこれまでに、Ink4a/Arfノックアウトマウスの骨髄間質細胞にc-MYCを過剰発現させ、悪性度の高い骨肉腫細胞AXTを樹立し、骨肉腫の病態に関する研究を行ってきた。AXT細胞をマウスに移植すると、類骨形成を伴う致死性の悪性腫瘍が形成され、高率に肺転移をきたすなど、ヒト骨肉腫の病態を反映する。腫瘍細胞が生き残るよう働くことのできる、腫瘍微小環境は、治療抵抗性のメカニズムとして着目すべきものである。そこで我々は、化学療法によって微小環境にもたらされる変化が、骨肉腫肺転移において、残存腫瘍細胞の化学療法抵抗性を高めるのではないかとの仮説を立てた。AXT細胞を骨移植したのち肺転移を形成したAXT肺転移マウスを用い、以下の研究を行った。1ドキソルビシン・シスプラチン・メソトレキセート大量療法の併用による、ヒト骨肉腫の臨床治療に準じた三剤併用化学療法を、AXT肺転移マウスに施行した。過去の研究に先例はなく、多剤併用時の至適な薬剤投与方法を新たに確立した。2無治療群および化学療法施行群のAXT肺転移マウスの肺転移組織を用いて、サイトカイン発現のスクリーニングを行った。化学療法に伴って発現の変動した液性因子を同定した。3同条件の肺転移組織を用いて、網羅的遺伝子発現解析を行った。化学療法後に優位に発現が上昇した遺伝子群を同定した。上皮系の悪性腫瘍において、治療抵抗性や微小環境を介した腫瘍の生存促進に関与するとの報告がある遺伝子も含まれていた。初年度の到達目標は、サイトカインのスクリーニング解析結果に基づき、化学療法により発現が上昇する液性因子の候補を絞ったうえで、機能解析を行い、残存腫瘍細胞生存に寄与する分子を同定することであった。しかし実際には、網羅的解析の結果、候補となる分子を複数同定するにとどまった。それは主に2つの点で、克服すべき課題が見出されたことによると考えられた。慎重な検討を要した点について以下に述べる。1in vivoでのスクリーニング実験において、残存病巣での反応を解析するという目的に至適なプロトコルを確立しなければならなかった。多剤併用化学療法剤の投与法および検体採取のタイミングを決定する必要があった。1については、生体を用いた研究であることから長期間を要したが、複数条件を繰り返し試行することで、肺転移に対しても一定の効果を有しながら、マウスに対する毒性の少ない投与方法を見出すことができた。過去の骨肉腫研究に類をみない、新たな手法を確立し得た。2化学療法により肺転移巣が縮小することで、微小環境由来の液性因子も総じて発現が減少した。その結果、化学療法により活性化する微小環境因子を同定することが困難となった。2については、液性因子のみでなく、微小環境構成細胞も含めた遺伝子発現の変動に着目すべく、網羅的遺伝子発現解析を行った。治療抵抗性に関わる可能性のある複数の遺伝子において、発現が上昇することを突き止めた。その中には、サイトカインアレイで唯一発現が上昇した液性因子との関連が示唆される遺伝子も含まれた。

治療抵抗性に関わる微小環境因子の同定は、本研究課題の根幹をなすプロセスであり、計画立案時より、困難を伴うことが予想されていた。当初の年次計画には遅れる形となったが、解析範囲を拡大するなどの方策で適切に対処できていると考える。Ink4a/Arfノックアウトマウスの骨髄間質細胞にc-MYCを過剰発現させて樹立した、悪性度の高い腫瘍細胞AXTは、マウスに移植すると、類骨形成を伴う致死性・易転移性の悪性腫瘍を形成し、ヒト骨肉腫の病態を反映する。骨肉腫の実臨床では、肺転移の制御が生命予後を規定するが、再発・残存病変に対する有効な治療は未確立であるため、治療抵抗性肺転移に対する新たな治療戦略の構築が必須である。腫瘍細胞の生存を維持する働きを持つ腫瘍微小環境は、治療抵抗性を生み出す原因となりうる。そこで、化学療法に伴う微小環境の変化が、肺転移巣の薬剤耐性を高めるのではないかとの仮説のもと、AXTを骨移植し肺転移を形成したマウスを用い、本研究課題に取り組んだ。肺転移マウスに抗癌剤を投与し、肺組織の遺伝子発現を解析したところ、NFκBを活性化する機能を持つ分子の発現が上昇していた。NFκBは、骨肉腫に対し促進的に働く分子であり、NFκBを介する細胞内経路を制御することが残存病巣の制御に有効である可能性が示唆された。そこで我々はプロテアソーム阻害薬(PI)に着目した。PIはタンパク質産生の負荷が高い腫瘍に効果があり、多発性骨髄腫などの臨床治療に用いられている。類骨の産生が骨肉腫の特徴であること、またPIがNFκBを抑制することから、PIの骨肉腫に対する効果について検証を進めた。PIは、in vitro・in vivoでAXTに対する抗腫瘍効果を呈した。またPI投与後のAXT細胞では、NFκBの抑制・小胞体ストレスと酸化ストレスの上昇が確認された。PIは従来の抗癌剤と異なる作用機序を持ち、化学療法抵抗性分画に対する効果を期待できる。また、微小環境から腫瘍細胞に対し促進的に働き得る機構をも標的とする薬剤でもある。腫瘍微小環境の制御による骨肉腫治療に応用できる可能性につき、引き続き研究を進める予定である。化学療法後の肺組織における遺伝子・サイトカインの発現を網羅的に解析し、肺転移が治療抵抗性を獲得する上で鍵となる微小環境由来の分子を同定するという当初の計画に基づいて、結果の解析を進めた。パスウェイ解析、ジーンオントロジーエンリッチメント解析などの手法にて、治療抵抗性に関わる細胞内機構やシグナル伝達経路に着目して検索を行ったが、治療抵抗性形成に結びつくものを見出すことが困難であった。発現解析の結果をもとに、着目すべき分子・シグナル経路を見出し、次の実験へと進展させる段階で難航した。骨肉腫(OS)は若年者に好発する骨原発悪性腫瘍である。病初期から肺転移が存在するため、全例で化学療法を行う。しかし、肺転移から再発・増悪した場合に有効な手段はなく、生存率の改善には、治療抵抗性肺転移に対する新たな治療を確立する必要がある。本研究課題は、肺転移の腫瘍を取り巻く免疫担当細胞など化学療法後の腫瘍微小環境が、治療に対する抵抗性を高めているとの仮説のもと、その機構を標的とした治療を確立することを目的としたものである。所属研究室で樹立された骨肉腫細胞AXTの同種移植モデルを用い、これまでに我々は、化学療法後に肺転移組織で発現上昇する遺伝子として、NFκBの作用を増強するものを同定している。
高い制振効果をもつ柱脚浮き上がり構造による建物地震被害の抑制

本研究では、東京銀座に実在する12階建て鉄骨構造(塔状比10)を対象に、ステップカラムシステムの設計、解析、粘弾性ダンパーの実大実験を行い、その総合的な性能について述べた。さらに、ステップカラムシステムと一般の鉄骨構造、別の方法による制振構造とについても性能の比較を行った。これらのパラメータスタディから、ステップカラムシステムの実際の挙動、効果、解決すべき問題が明らかとなった。また、ステップカラムシステムの解析に有効な、等価なダンパーモデル(Kelvinモデル)の作成方法についても提案した。Kelvinモデルは剛性要素と粘性要素を並列にした単純なもので、どの汎用解析コードでも使えるため、提案手法は実務に有用である。解析結果は、厳密なダンパーモデルを使った場合と極めて良く一致する。この研究の主目的は「ステップカラム構造」を用いて制振制御された建物の地震応答を簡易的に予測することである。まず、ステップカラム構造を使用する建物の数値パラメーター解析を行うことで、実挙動とその効果、そして欠点を明らかにし、その結果としてこの新しい制振制御システムの理解を深める。次に、最大地震応答を評価するための簡易な手法を提案する。この手法は多大なデータ処理を要する時刻歴応答解析を用いることなく、応答スペクトルのみを使用する。また、様々なステップカラム構造における広範囲にわたる動的特性を一貫して共通のモデルで表す概念を用いる。最後に、ステップカラムの実現のために、その他ダンパー(粘性、オイル、粘弾性等)のステップカラムへの適用を考慮する。これまで、我が国において「ステップカラム構造」を適用した建物は非常に少ないため、まず適用建物の詳細な諸元や実建物を想定した解析モデルを得ることが重要となる。そこで、本研究では「ステップカラム構造」を実際に適用した主構造の塔状比が10を越える12階建ての建物を検討対象として、建物の主構造の詳細な解析モデルの作成を行っている。今後は、作成した解析モデルを用いて広汎なパラメータースタディを行い、この検討結果をもとにステップカラムシステムの応答制御の有効性を実証し、また設計手法を提案するとともに、簡易な解析モデルや近似時刻歴応答解析手法についても論議を展開していく予定である。.そこで、本研究では「ステップカラム構造」を実際に適用した主構造の塔状比が10を越える12階建ての建物を検討対象として、建物の主構造の詳細な解析モデルの作成を行っている。作成した解析モデルを用いて広汎なパラメータースタディを行い、この検討結果をもとにステップカラムシステムの応答制御の有効性を実証し、また設計手法を提案するとともに、簡易な解析モデルや近似時刻歴応答解析手法についても論議を展開していく予定である。
腎癌におけるDHL癌抑制遺伝子の解析とそれにもとづく新しい診断,治療の検討

フォン・ヒッペル・リンドウ病(VHL)癌抑制遺伝子の体細胞性異常を散発性腎癌患者47症例についてPCR-SSCP,シークエンス法にて解析した。その結果47例中22例の腎癌にこの遺伝子の変異を確認した。変異の位置は遺伝子の酸性リピート領域より3'側に集中しておりVHL患者に見つかったものとほぼ同様な傾向であった。VHL遺伝子の変異と腎腫瘍の組織型との関係ではThoenesの組織分類による淡明細胞型の腎癌にのみこの遺伝子の変異がみられた。遺伝子の変異様式の検討では,腎細胞癌に見つかった体細胞性変異の80%以上はVHL蛋白が途中から切断,欠損しまうような欠失あるいは挿入変異であり,アミノ酸1ケの置換が起こるミスセンス変異は少なかった。一方VHL患者に見られる遺伝的変異ではミスセンス変異が50%以上を占め,両者に変異様式の違いがあることがわかった。またVHL遺伝子のヘテロ接合性の消失(loss of heterozygosity : LOH)は,淡明細胞型腎癌の80%以上にみられた。これらの遺伝子変異,LOHは腫瘍の悪性度(grade),進行度(stage)にかかわりなく検出された。以上の結果よりVHL遺伝子は散発性の腎細胞癌,特にその中で7580%を占める淡明細胞型の腎癌における主要な癌抑制遺伝子であると考えられる。一方他の組織型の腎癌(色素好性型,色素嫌性型,ベリニ-管癌など)ではこの遺伝子の異常は全く認められなかったことから,その発生には全く別の機序いいかえれば別の原因遺伝子が関与しているものと考えられた。さらに腎細胞癌以外に散発性の中枢神経系の血管芽腫においても同様なVHL遺伝子異常がみられ,この腫瘍の発症にもこの遺伝子が深く関与しているものと考えられた。これらの遺伝子解析でえられたデータは今後診断にも応用可能と考えらる。悪性腫瘍は多段階に発生進展し,その各ステップに複数の癌遺伝子の活性化や癌抑制遺伝子の不活性化が関与していると考えられています。尿路悪性腫瘍でもその癌化のプロセスは全く同様であり,それゆえ個々の腫瘍において癌遺伝子や癌抑制遺伝子の分子生物学的な解析を行うことが,尿路癌の悪性度,浸潤傾向の診断,また治療方針の選択を行う上で今後重要なステップになると考えられます。今回の我々の研究目的は,ヒト腎細胞癌における癌抑制遺伝子,特にVHL遺伝子に焦点を絞り,この遺伝子の変異・異常(mutation)をDNAレベルで解析し,この遺伝子が癌抑制遺伝子としてどの様に腎癌の発生進展に関与しているかを明らかにすることです。我々は現在までに腎癌患者47症例について癌及び正常部よりDNAを抽出し,SSCP-シークエンス法にてVHL癌抑制遺伝子の変異について解析を行いました。その結果clear cell typeの腎癌ではVHL腎癌抑制遺伝子のシークエンスレベルでの異常が22/39例(56%),またヘテロ接合性の消失(LOH)が17/20例(85%)と高頻度に確認されました。一方,non-clear cell typeの腎癌では解析症例が7例と十分ではないが,現在のところVHL遺伝子の変異は全く見られませんでした。以上の結果からVHL癌抑制遺伝子は散発性のclear cell typeの腎癌の発生,進展に重要な働きをしていることが推定されました。今後は1)non-clear cell typeの腎癌症例を追加してさらに解析を進める,2)診断,治療法の開発に役立つような良い実験モデル系を確立する為に腎癌細胞株におけるVHL遺伝子の変異解析を行うことが重要と考えられました。

我々は第一段階として腎癌患者47症例について癌及び正常部よりDNAを抽出し,SSCP法・シークエンス法にてVHL癌抑制遺伝子の変異について解析を行った。その結果47例中22例の腎癌でこの遺伝子のシークエンスレベルでの異常が確認された。またサザンブロット法でこの遺伝子のヘテロ接合性の消失(LOH)について調べたところ25例中17例にてLOHを確認した。しかもこれらの変異は淡明細胞型(Thoenesの分類による)の腎癌にのみ認められた。以上第一段階の結果からVHL癌抑制遺伝子は散発性の淡明細胞型の腎癌の発生進展に重要な働きをしていることが推定された。一方非淡明細胞型の腎癌では解析症例が7例と十分ではないが,VHL遺伝子の変異は全く見られなかった。そこで今回腎癌症例数を新たに163例追加し合計210例にてVHL遺伝子の変異解析を行った。現在SSCP法がほぼ終了したが,約120例でSSCPのバンドシフトが認められており,現在これらの症例についてシークエンスを行い遺伝子の変異を確認している。さらに診断,治療法の開発に役立つような良い実験モデル系を確立する為に腎癌細胞株16例におけるVHL遺伝子の変異解析を行い,3例で遺伝子変異を確認した。今後これらの細胞株を用いてVHL遺伝子産物の機能解析を行っていく予定である。
肝幹細胞特徴的発現遺伝子の機能解析と慢性肝炎・肝硬変診断への応用

我々がこれまでに見出したブタ成体肝幹細胞様細胞に特徴的に発現する遺伝子amyloid βprecursor protein(APP)とdickkopf 3(DKK-3)の肝分化や肝再生における機能を解析し、肝組織における分化、再生が関わると考えられる慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がんなど肝疾患の診断、治療にこれらの遺伝子を応用することを目的として、本年度は以下の研究を行った。1.ブタを用い胎仔肝の発達、分化と成体の肝再生過程におけるこれら遺伝子の発現を蛋白発現と併せて解析する。2.ヒト肝細胞がん組織(多くは肝硬変を背景とする。)、および肝芽腫におけるDKK-3の発現を解析し、それらがん種の違いによる発現の差異を明らかにする。その結果、1.APPおよびDKK-3はブタ7、13週齢胎仔肝に比べ5週齢胎仔肝に有意に高発現していた。これらの発現は肝分化マーカーであるα-fetoprotein(AFP)およびalbumin(ALB)の発現と同時に門脈域、肝内胆管、肝細胞索の発達など組織学的発達にも逆相関しており、APP、DKK-3の発現は未分化な段階の胎仔肝組織に特徴的であることが示された。またブタ80%部分肝切除モデルを用いた再生肝においては、AFP高発現、ALB低発現、細胞増殖能が高い切除後7日目の肝組織に、DKK-3が有意に高発現していることが明らかになった。切除後7日目の肝組織は門脈域を含む小葉間隔壁、肝細胞索の構造が修復過程にあり、組織学的に5週齢胎仔肝に類似する部位が観察された。2.DKK-3を発現する腫瘍細胞は、肝細胞がんで21%、肝芽腫で79%であった。またDKK-3もしくはAFPを発現する症例は肝細胞がんで58%、肝芽腫では100%であった。以上の結果からDKK-3は肝分化および肝再生に関与する可能性、および肝芽種のマーカーとして有用である可能性が示唆された。本研究は我々がこれまでに見出したブタ成体肝幹細胞様細胞に特徴的に発現する遺伝子に関し、1、標的遺伝子の発現を蛋白レベルで明らかにする。3、医療応用への発展として、炎症における再生反応に着目し、これら標的遺伝子について、ヒト慢性肝炎または肝硬変の肝組織でどのように発現しているかを明らかにする。の研究を行い、肝幹細胞の増殖・分化の機構に関する新知見を得ること、さらにこれら遺伝子の発現と肝再生能との関連に関する知見から慢性肝炎、肝硬変に対する進行度評価の新しい客観的指標の開発につなげることを目的としている。本年度における進捗状況は以下の通りである。1、標的遺伝子amyloid βprecursor protein(APP)とdickkopf 3(Dkk3)のブタ5週齢胎児肝における蛋白レベルでの発現パターンが確認された。これらの発現部位は遺伝子の発現とほぼ一致しており、APP, Dkk3が未成熟である胎児肝で何らかの機能を担っている可能性が示唆された。一方成体肝に関しては、これらの蛋白がヒト肝硬変組織において、発達した門脈域の一部の間質細胞や血管内皮と考えられる細胞に発現する事などが明らかになった。2、に関しては、RNAi解析に使用するヒト肝細胞癌細胞株を選択するために、13細胞株における標的遺伝子の発現を解析した。今後蛋白発現をウェスタンブロット解析にて確認後、適切な細胞株を選択しRNAi解析に進む予定である。

3、に関しては、肝細胞癌の切除手術標本の背景非癌肝組織(肝炎、もしくは肝硬変組織)72例を用い標的遺伝子の発現解析を行った。現在他のマーカー、予後との相関を分析中である。以上の成果は第94回日本病理学会総会、第12回肝細胞研究会、第5回日本再生医療学会総会で発表した。我々がこれまでに見出したブタ成体肝幹細胞様細胞に特徴的に発現する遺伝子amyloid βprecursor protein (APP)とdickkopf 3 (DKK-3)の肝分化や肝再生における機能を解析し、肝組織における分化、再生が関わると考えられる慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がんなど肝疾患の診断、治療にこれらの遺伝子を応用することを目的として、本年度は以下の研究を行った。1.ブタを用い胎仔肝の発達、分化と成体の肝再生過程におけるこれら遺伝子の発現を蛋白発現と併せて解析する。2.ヒト肝細胞がん組織(多くは肝硬変を背景とする。)、および肝芽腫におけるDKK-3の発現を解析し、それらがん種の違いによる発現の差異を明らかにする。その結果、1.APPおよびDKK-3はブタ7、13週齢胎仔肝に比べ5週齢胎仔肝に有意に高発現していた。これらの発現は肝分化マーカーであるα-fetoprotein (AFP)およびalbumin (ALB)の発現と同時に門脈域、肝内胆管、肝細胞索の発達など組織学的発達にも逆相関しており、APP、DKK-3の発現は未分化な段階の胎仔肝組織に特徴的であることが示された。またブタ80%部分肝切除モデルを用いた再生肝においては、AFP高発現、ALB低発現、細胞増殖能が高い切除後7日目の肝粗織に、DKK-3が有意に高発現していることが明らかになった。切除後7日目の肝組織は門脈域を含む小葉間隔壁、肝細胞索の構造が修復過程にあり、組織学的に5週齢胎仔肝に類似する部位が観察された。2.DKK-3を発現する腫瘍細胞は、肝細胞がんで21%、肝芽腫で79%であった。またDKK-3もしくはAFPを発現する症例は肝細胞がんで58%、肝芽腫では100%であった。以上の結果からDKK-3は肝分化および肝再生に関与する可能性、および肝芽種のマーカーとして有用である可能性が示唆された。
高分子ナノカプセルを用いた生体内における新規酵素利用基盤の構築

本研究では、高分子中空カプセルPICsomeを利用して生体内での酵素利用のための技術基盤の構築を目指した。具体的には、(1) Biodetoxification、(2)酵素補充、(3)ナノ光源デリバリー、のための新技術の確立を目指した。(1)では、ヒスタミン分解酵素を封入したPICsomeを開発し、花粉症治療などに価値の高いBiodetoxificationシステムを開発した。(2)では、より穏和な酵素封入法や酵素の安定性向上法を開発し、さらに細胞導入制御手法を開発した。(3)では、発光酵素を封入したPICsomeナノ光源を開発し、外部光源フリーの光応答システムの端緒とした。本研究では、高分子中空カプセルPICsomeを利用することで、生体適合性に優れ、生体内で安定に活性を維持し、長期間にわたって酵素を利用するための技術基盤を築く。具体的には、(1)Bio-detoxification、(2)酵素補充、(3)ナノ光源デリバリー、を実行するための酵素封入PICsomeを作製し、疾患治療などに応用できる酵素型ナノリアクターを開発することを目指している。平成26年度は、目的に挙げた3つの研究項目について共通する研究項目から着手し、酵素封入条件の選定と酵素活性の確認について、各項目で利用を予定している酵素を用いて実験を進めた。Bio-detoxificationリアクター構築に向けて、生体内のアレルギー反応のメディエーターであるヒスタミンに注目し、これを分解・除去するためにジアミンオキシダーゼ(DAO)を封入したDAO封入PICsomeの調製に成功した。ヒスタミンなどを基質とし、残存ヒスタミンなどを定量することでDAOの活性の維持を確認した。さらにマスト細胞モデル培養細胞RBL-2H3を用いてDAO封入PICsomeのヒスタミン処理能力評価を行ったところ、脱顆粒後のペプチダーゼ共存条件であってもヒスタミンの処理が可能であることを見出した。酵素補充用ナノリアクターとして、β-galactosidaseをモデル酵素として選択した。当該年度では、より封入酵素にダメージが残らない手法の開発を行い、ほとんど活性低下を招くことなく、β-galactosidase封入PICsomeを得ることができるようになった。生物発光型ナノ光源のための酵素として、発光強度や発光波長、あるいは酵素自体の分子量などの観点から、ウミシイタケルシフェラーゼとNano-Lucに注目し、利用のための準備を始めた。同時に、これらの酵素の示す発光に応答してPICsome機能が活性化するシステムの構築に向けて、クマリン誘導体によるPICsomeの化学修飾を行い、十分な量を導入可能であることを見出した。本研究では、水中で簡便に酵素を封入できる高分子中空カプセルPICsomeを利用することで、生体適合性に優れ、生体内で安定に活性を維持し、長期間にわたって酵素を利用するための技術基盤を築くことを目指しており、本課題では、(1)Bio-detoxification、(2)酵素補充、(3)ナノ光源デリバリー、を実行するための酵素封入PICsomeを作製し、疾患治療などに応用できる酵素型ナノリアクターの開発を進めている。平成27年度は、(1)に関して、即時型アレルギーのトリガになるヒスタミンを分解する酵素(ジアミンオキシダーゼ; DAO)を封入したPICsomeを用いてマスト細胞モデル培養細胞RBL-2H3を用いての評価を進め、培養条件下で脱顆粒後に有意にヒスタミンが除去可能であることを示すと同時に、DAOのみに比べてDAO@PICsomeが優れた処理能を示すことを明らかとした。これらの成果は、高く評価され、Pacifichem2015において優秀ポスター賞を受賞した。(1)に関連して、酵素封入PICsomeの粘膜部位での活用、及び、(2)に関連して、細胞内での活用のための実践的手法開発に向けて、PICsomeのPIC膜の化学修飾法の確立を行った。特に、PICsomeの粘膜付着能と細胞取り込み能と膜修飾の相関を明らかにした。(3)では、発光酵素であるNanoLucを封入したPICsomeを作製し、ナノ光源として利用できることを明らかにした。また、光応答性PICsomeとして、クマリン誘導体で修飾したPICsomeを作製し、その光応答性について基礎的評価を開始した。交付申請書記載事項と照らし合わせ、上述の3つの研究項目について点検する。項目(1)について、DAO封入PICsomeを用いてヒスタミン除去能の評価を進め、マスト細胞モデルRBL-2H3を用いての試験を行い、定量的評価を進めた。また、細胞に取り込まれにくいPICsomeを用いてヒスタミン除去ができることを示した。さらに、投与場所として想定される粘膜組織への吸着能についての評価を開始し、その機能強化のための材料開発を、計画を前倒しして開始した。加えて、動物を用いた脱顆粒実験の準備も進めた。項目(2)について、β-gal@PICsomeに関して酵素をより高活性な状態を維持したまま長期間活用する手法の検討を引き続き行い、酵素活用範囲の拡大に成功した。また細胞内のリソソームに適切に酵素を送り込む手法の確立に向けて、PICsomeの一般の培養細胞への取り込み能を向上させるための新しいPIC膜修飾法の確立に取り組んだ。項目(3)について、ナノ光源としてNanoLuc@PICsomeの作製法の確立を行った。特に、分子量のあまり大きくないNanoLucをPICsome内に保持するための工夫を行い、封入効率の向上に成功するとともに、活性の維持を確認した。また、光応答性PICsomeの開発を前年度に続いて進め、クマリン誘導体をPICsomeのPIC膜に修飾する手法を確立した。次に試験管レベル、及び、培養細胞を用いた機能評価も進め、定量的な機能評価法の基礎を固めた。

以上まとめると、項目(1)についてはスムーズな展開が行われた結果、一部計画を前倒しすることもできており、十分な進捗が認められる。項目(2)については、材料開発の観点では大幅な進捗が見られたものの、生物評価が十分でない点があるため、引き続き28年度にフォローアップをはかる。項目(3)については計画通り十分な進捗が認められた。全体の評価としては、当初の計画に修正を要するほどの遅れはなく、十分に進展したものと判断される。本研究では、水中で簡便に酵素を封入できる高分子中空カプセルPICsomeを利用することで、生体適合性に優れ、生体内で安定に活性を維持し、長期間にわたって酵素を利用するための技術基盤を築くことを目指した。特に、(1)Bio-detoxification、(2)酵素補充、(3)ナノ光源デリバリー、を実行するための酵素封入PICsomeを作製し、疾患治療などに応用できる酵素型ナノリアクターの開発を進めた。平成28年度は、(1)に関して、前年度の成果を基に即時型アレルギーのトリガになるヒスタミンを分解する酵素(ジアミンオキシダーゼ; DAO)を封入したPICsomeを用いて、マウス体内で誘発させた炎症性応答を抑える効果を実証した。この成果は新規biodetoxificationナノデバイスとして注目を集め、日本薬学会第137年会において講演ハイライトに選出された。さらに、花粉症などの症状緩和に用いるために、マウスを用いた粘膜付着性に関する評価に着手し、さらなる展開の準備を整えた。(2)に関しては、四量体酵素であるβ-galactosidase封入PICsomeを用いた系について検討を進め、生体内での長期活用や長期保存に向けた安定性向上の検討を行った。その結果、デキストラン共封入条件では-20 °C条件で一週間保存後でも活性が維持できた。また、単量体で活性を持つペルオキシダーゼ(HRP)についても顕著な活性維持効果が生体温度にて確認できたことから、PICsomeには酵素の実効濃度を高い状態で維持する働きの他、酵素周囲の物理的外濫を軽減する保護効果があることも明らかとした。また、細胞取り込み経路の制御などに向けて、リガンドの膜修飾法の確立に取り組んだ。(3)に関連して、発光酵素封入量・効率が十分でないことから、この点を解決する技術の開発に取り組んだ。本研究では、高分子中空カプセルPICsomeを利用して生体内での酵素利用のための技術基盤の構築を目指した。具体的には、(1) Biodetoxification、(2)酵素補充、(3)ナノ光源デリバリー、のための新技術の確立を目指した。(1)では、ヒスタミン分解酵素を封入したPICsomeを開発し、花粉症治療などに価値の高いBiodetoxificationシステムを開発した。(2)では、より穏和な酵素封入法や酵素の安定性向上法を開発し、さらに細胞導入制御手法を開発した。
結腸内カプサイシン投与の結腸運動亢進・排便誘発効果とその作用機序

「目的」capsaicin結腸内投与の回・結腸運動、排便に及ぼす効果とそのメカニズムを検討する事。「方法」ビーグル犬を用いstrain gaugeforce transducerを回腸末端、結腸に縫着・固定し、消化管の輪状筋収縮を測定した。生理食塩水、capsaicin結腸内投与における、また拮抗薬存在下での消化管運動と排便に対する効果を検討した。さらに結腸の外来性神経切離モデル、結腸ループモデルを作成し検討した。「結果」capsaicin 5mg、10mgの投与直後から結腸に巨大収縮波を高頻度に誘発し、排便を誘発した。Atropineとhexamethonium存在下ではcapsaicin結腸内投与の効果は抑制された。また、外来性神経切離モデルでは、capsaicinの効果に減弱が見られ、結腸ループモデルではcapsaicinの効果は消失した。「結語」capsaicin結腸内投与は、コリン受容体を介して結腸運動・排便を制御しており、この作用は結腸へ分布する外来性神経及び壁在神経系が関与していると考えられた。雌雄の雑種成犬を、全身麻酔科で回復し、消化管運動測定用のstrain gauge force transducer(スターメディカル社製)を輪状筋収縮が測定できるように、回腸(回盲部から5cm)、近位結腸(回盲部から5cm)、結腸内部結腸(近位結腸と遠位結腸の中間)、遠位結腸(下腸間膜動脈流入部)、の計4カ所に縫着した。結腸内投与用のシリコンチューブを盲腸から挿入し、先端を近位結腸内に留置する。Strain gaugeの導線とシリコンチューブを皮下トンネルを通して肩胛骨間から体外に誘導し、小コネクターと接続した。食事投与は全て1日1回、午後の決まった時間とした。術後2週間経ったところで、小コネクターと消化管運動測定用のアンプとを接続し、意識下で消化管運動の測定を開始した。消化管運動の波形は、アンプからコンピューターへと取り込み、消化管運動解析用のソフトウエアー(MacLab)を用いて解析する。全ての実験は前日の食事投与から16時間以上経過した空腹期に行う。結腸内カプサイシン投与による結腸運動亢進効果の確認と用量-反応関係の検討:結腸内に留置したシリコンチューブから、生理食塩水10ml(対照)、カプサイシン1mg,2mg,5mg,10mgを投与し結腸運動と排便に対する効果を検討する。生理食塩水またはカプサイシン投与後15分間の波形下面積をMacLabを用いて計算し、motility indexとして結腸運動の定量化に用いる。生理食塩水またはカプサイシン投与後15分間に排便が全実験中何回認められたかを測定し、排便に対する効果の定量化に用いる。これらの検討により、カプサイシンの結腸運動亢進効果、排便誘発効果を確認し、同時にカプサイシンの用量と効果に相関があるのかどうかも明らかに出来る。各種拮抗剤の結腸内カプサイシン投与に対する影響:カプサイシンまたは生理食塩水結腸内投与の5分前に以下の拮抗剤を静脈内注射し、これら拮抗剤が結腸内カプサイシン、5mgまたは10mg投与の結腸運動亢進効果・排便誘発効果を抑制するかどうかを検討する。用いる拮抗剤は、アトロピン(ムスカリン受容体拮抗剤、0.1mg/kg+0.1mg/kg-h)、ヘキサメソニウム(ニコチン受容体拮抗剤,5mg/kg+10mg/kg-h)、フェントラミン(アルファ受容体拮抗剤、1mg/kg+1mg/kg-h)、プロプラノロール(ベータ受容体拮抗剤、1mg/kg+1mg/kg-h)、オンダンセトロン(セロトニン3受容体拮抗剤、0.5mg/kg)、FK444(ニューロキニン1受容体拮抗剤、1mg/kg)、の6種類である。「背景」排便時、大腸には波高が高く伝播速度の速い巨大伝播波収縮(giant migrating contractions, GMCs)が出現し、下痢時にはこのGMCsが頻発することが報告されている。GMCsを制御することは下剤や排便誘発剤の開発へとつながる可能性がある。「方法」ビーグル犬を用いstrain gauge

force transducerを回腸末端、結腸に縫着・固定し、消化管の輪状筋収縮を測定した。生理食塩水、Capsaicin 1,2,5,10mg結腸投与における、また拮抗薬存在下での消化管運動と排便に対する効果を検討した。さらに結腸への外来性神経切離モデルも作製し、除神経下におけるカプサイシン結腸内投与の効果も検討した。外来性神経、壁在神経叢の関与を検討するために結腸ループモデルも作成し検討した。「結果」capsaicin 5mg、10mgの投与直後から結腸にGMCsを高頻度に誘発し、排便を誘発した。Atropineとhexamethonium存在下ではcapsaicin結腸内投与のGMCs・排便誘発効果は抑制されたが、その他の拮抗薬はこの排便誘発効果を抑制しなかった。また、外来性神経切離モデルでは、カプサイシン結腸内投与による結腸運動亢進・排便誘発効果の減弱が見られた。結腸ループモデルではカプサイシン結腸内投与による結腸運動亢進・排便誘発効果は消失した。「結語」capsaicin結腸内投与は、アセチルコリンの放出をコントロールしてGMCsと排便を制御していることが示され、GMCsと排便の制御には結腸へ分布する外来性神経及び壁在神経系が関与していると考えられた
反応活性種としての有機スズ化合物試薬の開発

有機スズ化合物において炭素-スズ結合は分極しており、炭素原子はカルボアニオンとしての反応性を示す。しかしこの反応性はあまり大きくないので、アニオン性やカチオン性をもつスズ試薬を用いて多官能基性基質と反応させることにより、まず第一段目の反応として分子内に種々の官能基を有するスズ化合物を安定な化合物として合成、単離し、このものについて改めて第二段目の反応としてこれらの官能基を種々の方法で活性化することにより、炭素-スズ結合を反応に関与させることができる。これによりスズ化合物に特有な反応を誘起させることが期待できる。我々はこの概念を基に新しい有機合成反応を開発することを目的とし研究を進めてきた。一般式(I)および(II)で表される試薬はそれぞれダブルアニオン(III)およびアニオン/カチオン等価体(IV)と見ることができる。我々は本研究により、これらに相当する試薬として(1)(4)を開発してその反応性を検討した結果、反応形式は(1)分子内に共存する官能基の種類、(2)その官能基の活性化の手法、(3)官能基とスズ原子との相対的な位置、(4)反応には直接関与しない補助基の存否およびその種類、などに大きく支配されることが分かった。本年度の研究では(5)がビニルカルベン等価体(6)として作用し、形式的にアルデヒドのR-C結合への挿入反応が起こることを見いだした。この反応を応用し、天然物(±)-Bakuchiol(7)を合成した。