hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜結合型コレクチンCL-P1による新規補体活性化メカニズムの解明

今年度は、前年度検証を終えることができなかった野生型マウスを用いたCL-P1を介したCRP、C1qによる補体活性化について「C3ステップ」までについて検討を行った。野生型マウス(C57BL/6マウス)にCRPを接種し、抗CL-P1、CRP、C1q抗体を用いて蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にて共局在を確認することができた。さらに、ペントラキシンファミリーのSAPおよびPTX3についても同様の検討を行いCRP同様に機能することを確認した。研究計画では、補体制御因子Factor Hノックアウト(CFH KO)マウスを用いたCL-P1による補体活性化の「MAC形成ステップ」の証明およびCRPの接種による細胞障害の確認、CFH KOマウスとCL-P1 TGマウスの交配により血管障害モデルマウスの作製を行う予定であったが、9月に発生した北海道胆振東部地震により、マウスを用いた実験が困難となった。また、in vitroでの細胞実験も並行して進めていたが、停電により培養中の細胞も冷凍保存中の細胞株も全て死滅したため、復旧のためかなりの時間を要してしまった。動物実験は再開の見通しがたたないため、先ずはin vitroでの細胞実験として計画していたCL-P1過剰発現ヒト血管内皮細胞を作製により疾患の状況を再現してそのメカニズムの証明を行うことにした。今年度はヒト血管内皮細胞HUVEC(臍帯静脈)を用いてすでに作成済みのCL-P1発現ベクターを導入してCL-P1過剰発現ヒト血管内皮細胞を作製し、CRP、SAPまたはPTX3にヒトCFH欠損血清を添加することにより、細胞障害の再現を試みた。ヒト血管内皮細胞におけるCL-P1過剰発現は確認できたので、引き続き細胞障害の再現を試み、メカニズムの解明を進めていきたい。前年度のからの遅れを取り戻すべく、研究を進めたが、9月に発生した北海道胆振東部地震での長時間の停電により、実験中の細胞や冷凍保存していた細胞株も全滅したため、復旧にかなりの時間を要した。さらに、動物実験を進めていたが、こちらも全て中止せざるを得ず、計画も大幅に変更することになった。次年度が最終年度である為、本研究では動物実験は環境が整い次第今後行うこととし、実験計画に挙げていたin vitroでの計画を遂行することにした。引き続きヒト血管内皮細胞にCL-P1を過剰発現し、CRP、SAPまたはPTX3にヒトCFH欠損血清を添加することにより、in vitroでの細胞障害の再現を試みる。ヒト血管内皮細胞についてはHMVEC(臍帯静脈)以外のHAEC(大動脈)、HCAEC(冠動脈)、HMVEC(微小血管)、さらに加齢黄斑変性を想定しヒト網膜毛細血管内皮細胞(HREC)も入手して検討を行う。補体活性化ついては、各種抗ヒト補体抗体を用い、さらに、CFHを含む各種制御因子の欠損血清を用いて継時的な活性化機序を観察し、そのメカニズムを明らかにする。また、「MAC形成ステップ」については、これまで細胞上に形成されたMACの詳細な形成像が報告されていないので、電子顕微鏡を用いて細胞上でのMAC形成の状況を電子顕微鏡の画像と蛍光抗体や金コロイド抗体を用いた局在を合わせて明らかにする。今年度は、CL-P1を介した新たな経路を含めて宿主に対する補体活性化メカニズムを、野生型マウスを用いてin vivoで証明を試みた。先ず、生体においてCL-P1に急性炎症マーカーCRP、補体因子C1qが結合して補体経路が活性化し、膜障害性複合体を形成することを確認した。これはin vitroで見出したCL-P1による新規の補体活性化経路をマウスを用いてin vivoで証明する取り組みである。当初CL-P1 TGマウスを作製し、両者で証明を進めることも想定していたが、TGマウスを作製せず野生型マウスでのみ行った。確認は、補体活性化経路を、「C3ステップ」と「MAC形成ステップ」に分け、今年度は「C3ステップ」について行った。CL-P1依存的に「C3ステップ」まで活性化は進むかについての証明は、野生型マウス(C57BL/6マウス)にCRPを接種し、抗CL-P1、CRP、C1q抗体を用いて蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にて共局在を確認した。CRPの濃度依存性を想定し、いくつかの濃度で接種し、濃度依存性を確認した。実際にはCRP接種後のマウス組織切片を作成して上記因子に対する抗体で確認を行った。さらに詳細に局在について確認を行うため、金コロイド標識・蛍光標識抗体を用いて蛍光顕微鏡観察画像と電子顕微鏡画像を重ね合わせて共局在を証明するための予備実験を進めた。CL-P1を介したCRP、C1qによる補体活性化については「C3ステップ」までは検証作業が必要であるが結果をえることができた。この取り組みによりin vitroだけでなく、生体でも同様の現象が起こることを証明することができると考えている。今年度は、マウスにおける急性期炎症マーカーは同じペントラキシンファミリーのSAPが担っているとの報告から、ペントラキシンファミリーのSAPおよびPTX3がCRP同様に機能することについて、SAPを用いて同様の検討を行う予定であったが、CRPでの検討に想定以上の時間を要したため、そこまで検討を遂行することができなかった。次年度は、この取り組みについても行っていく予定である。

今年度は、前年度検証を終えることができなかった野生型マウスを用いたCL-P1を介したCRP、C1qによる補体活性化について「C3ステップ」までについて検討を行った。野生型マウス(C57BL/6マウス)にCRPを接種し、抗CL-P1、CRP、C1q抗体を用いて蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にて共局在を確認することができた。さらに、ペントラキシンファミリーのSAPおよびPTX3についても同様の検討を行いCRP同様に機能することを確認した。研究計画では、補体制御因子Factor Hノックアウト(CFH KO)マウスを用いたCL-P1による補体活性化の「MAC形成ステップ」の証明およびCRPの接種による細胞障害の確認、CFH KOマウスとCL-P1 TGマウスの交配により血管障害モデルマウスの作製を行う予定であったが、9月に発生した北海道胆振東部地震により、マウスを用いた実験が困難となった。また、in vitroでの細胞実験も並行して進めていたが、停電により培養中の細胞も冷凍保存中の細胞株も全て死滅したため、復旧のためかなりの時間を要してしまった。動物実験は再開の見通しがたたないため、先ずはin vitroでの細胞実験として計画していたCL-P1過剰発現ヒト血管内皮細胞を作製により疾患の状況を再現してそのメカニズムの証明を行うことにした。今年度はヒト血管内皮細胞HUVEC(臍帯静脈)を用いてすでに作成済みのCL-P1発現ベクターを導入してCL-P1過剰発現ヒト血管内皮細胞を作製し、CRP、SAPまたはPTX3にヒトCFH欠損血清を添加することにより、細胞障害の再現を試みた。ヒト血管内皮細胞におけるCL-P1過剰発現は確認できたので、引き続き細胞障害の再現を試み、メカニズムの解明を進めていきたい。前年度のからの遅れを取り戻すべく、研究を進めたが、9月に発生した北海道胆振東部地震での長時間の停電により、実験中の細胞や冷凍保存していた細胞株も全滅したため、復旧にかなりの時間を要した。さらに、動物実験を進めていたが、こちらも全て中止せざるを得ず、計画も大幅に変更することになった。次年度が最終年度である為、本研究では動物実験は環境が整い次第今後行うこととし、実験計画に挙げていたin vitroでの計画を遂行することにした。先ずCL-P1を介したCRP、C1qによる補体活性化については「C3ステップ」までについて最終検証を行う。さらに、前年度予定していたペントラキシンファミリーのSAPおよびPTX3がCRP同様に機能するかついて検討を行う。上記検討を行うと共に、当初予定の平成30年度の研究実施計画を遂行する。補体制御因子Factor Hノックアウト(CFH KO)マウスを用いて、CL-P1による補体活性化が「MAC形成ステップ」において細胞障害を引き起こすかについて証明を行い、CFH KOマウスを用いてCRPの接種により細胞障害がおこるか確認する。CFH KOマウスとCL-P1 TGマウスの交配により、血管障害モデルマウスの作製を試み、メカニズムの解明のための準備を進める。前年度の計画の一部の実験と並行して進めるが、順調に進展した場合は、当初の計画通り様々なCRP濃度での1回接種または一定のCRP濃度の維持投与を行い、状況の推移を観察し、発症に繋がる現象を、炎症マーカーや組織標本の蛍光免疫染色によりメカニズムの解明を進める。引き続きヒト血管内皮細胞にCL-P1を過剰発現し、CRP、SAPまたはPTX3にヒトCFH欠損血清を添加することにより、in vitroでの細胞障害の再現を試みる。
がん細胞の遺伝子変異不均一性に関する数理モデル解析

がん治療における問題として、がん組織が持つ多剤耐性が挙げられる。この根本的な原因として、近年注目されている要因が、がん組織/細胞間における遺伝子変異の不均一性である。本研究課題では、細胞増殖に重要なErbBシグナル伝達経路(ERK経路とAkt経路)から細胞周期制御機構までの数理モデルを構築し、がん患者間で観察される遺伝子変異の不均一性がどのようにしてErbBシグナル伝達を破綻させているのかをシミュレーションにより明らかにする。今年度は、公共データベース(The Cancer Genome Atlas)より乳がん患者の遺伝子発現データをおよそ1000人分取得し、そのデータを構築したErbBシグナル伝達経路の数理モデルに反映させ、各患者の状態(pERKおよびpAktの応答)を予測するシミュレーションを行った。その結果、pERKおよびpAkt応答のパタンは患者サンプルごとに大きく異なり、一過的な応答パタンから持続的な応答パタンまで様々であった。このダイナミクスをいくつかの数理的指標を用いて特徴づけたところ、pERKおよびpAktの応答性が二峰性の分布を示した。さらに、これらの指標と患者予後を比較解析したところ、pERKおよびpAkt、共に応答性が高い患者サンプルは、低応答の患者サンプルに比べて、有意に予後が悪いことが示唆された。これらの患者でpERKおよびpAktの応答性が高くなった原因を現在モデルの数理解析により明らかにしている最中である。公共データベースより取得した患者データは、ErbBシグナル伝達経路の各タンパク質量に反映されているため、それらとpERK/pAkt応答性の高さの関係を精査する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、ErbBシグナル伝達経路と細胞周期制御機構を統合した数理モデルの構築および数値シミュレーションを実施した。ErbBシグナル伝達経路に関してはChen et al., MSB, 2009の数理モデルを、細胞周期制御ネットワークに関してはIwamoto et al., Genome Informatics, 2011の数理モデルをそれぞれ使用した。統合後の数理モデルを用いて、上皮成長因子(EGF)またはへレグリン成長因子(HRG)の濃度を変えた数値シミュレーションを実施し、A431細胞の実験データ(Chenらの論文より取得)を再現できるようにパラメータの調整を行った。その後、pERKおよびpAktタンパク質のタイムコース/用量応答を計算し、それらの最大発現量や発現タイミング等の指標に対するパラメータ感度解析を実行した。その結果、EGF刺激下ではpERK/pAkt活性化に対してERK/Aktのクロストークが重要でなかったが、HRG刺激下では、pAktの制御にクロストークが重要であった。今後は、さらに下流の細胞周期への影響を調べ、またがんゲノムデータベースから患者サンプルのデータを取得し、遺伝子変異を反映した患者ごとの数理モデルを作成・解析していく。今年度は、ErbBシグナル伝達経路と細胞周期制御機構を統合した数理モデルの構築までを目的に研究課題を進めた。当初の予定通り、ErbBシグナル伝達経路および細胞周期制御機構を統合した数理モデルを構築でき、また、統合モデルのシミュレーション結果も、論文に記載された実験データと一致し、生物学的に妥当なモデルが構築できた。まずは、このモデルの特徴を知るために、ErbBシグナル伝達経路の出力であるERKおよびAktの活性化に重要なタンパク質の同定をパラメータ感度解析により行った。その結果、EGFで刺激した場合、ERKの活性化はその上流にあるRasやEGFR受容体の量に依存することが示唆された。一方、Akt活性化に関しても、その上流にあるPI3KやPIP3が重要であることが示唆された。これらの結果からEGF刺激時は、ERKおよびAktの活性化が独立して起きていることが推定された。ところがHRG刺激下においては、ERK活性化はEGFと同様、ERK上流のタンパク質が重要であったが、Akt活性化は、Akt上流に加えて、ERK経路のタンパク質もその活性化制御に重要であった。この事は、Aktの制御には、ERK-Akt間のクロストークが貢献していることが推定された。これら制御構造に関する情報は、遺伝子変異不均一性を模したシミュレーションを行った際の結果の解釈に役立つ事が期待される。

その結果、pERKおよびpAkt応答のパタンは患者サンプルごとに大きく異なり、一過的な応答パタンから持続的な応答パタンまで様々であった。このダイナミクスをいくつかの数理的指標を用いて特徴づけたところ、pERKおよびpAktの応答性が二峰性の分布を示した。さらに、これらの指標と患者予後を比較解析したところ、pERKおよびpAkt、共に応答性が高い患者サンプルは、低応答の患者サンプルに比べて、有意に予後が悪いことが示唆された。これらの患者でpERKおよびpAktの応答性が高くなった原因を現在モデルの数理解析により明らかにしている最中である。公共データベースより取得した患者データは、ErbBシグナル伝達経路の各タンパク質量に反映されているため、それらとpERK/pAkt応答性の高さの関係を精査する。今年度、構築した統合モデル(ErbBシグナル伝達経路と細胞周期制御機構を統合したもの)を用いて、がん不均一性を模した数値シミュレーションを行う。がん細胞のゲノムデータベースの一つTCGA(The Cancer Genome Atlas)より、乳がん患者の遺伝子発現データをおよそ1000サンプル取得する。このデータの再解析を実施し、ErbBシグナル伝達経路および細胞周期制御に関与するタンパク質の遺伝子発現量を患者サンプルごとにまとめる。この解析結果を数理モデルの各タンパク質の初期値として使用し、成長因子(EGFまたはHRG)存在下での数値シミュレーションを実行する。そして、成長因子刺激後の時系列および刺激に対する用量応答のシミュレーションを行い、ErbBシグナル伝達経路で重要なERKやAKT、また細胞周期制御に重要なCyclin D/Eといったタンパク質の計算結果を取得する。この結果から、各タンパク質の最大発現量、総発現量、発現パターン等の指標を算出し、患者サンプル間で比較、遺伝子変異の不均一性とシグナル応答の破綻の関係を解析する。さらに、各々の指標と各サンプルの悪性度の関係をKaplan-Meier曲線等の統計手法や乳がんサブタイプの同定により解析し、どの指標が最も悪性度に関与するのかを予測する。さらに、同定した指標に関わるタンパク質や反応過程を、数理モデルのパラメータ感度解析により同定し、改善のためのターゲットを推定する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
von Willebrand病の遺伝子診断に関する研究

von Willebrand病(vWD)は頻度の高い先天性疾患であるが、その亜型は多様性に富む。type IIAvWDは常染色体優性遺伝形式をとり、出血時間の延長、血小板粘着能の低下、vWF:AGに比しvWF:RCoの著名な低下を呈し、vWFマルチマーの高分子が欠損する特異な機能異常症である。type IIA2家系の家族の末梢血より血小板と白血球を分離し、各々からtotal RNA,DNAを抽出した。一方vWF遺伝子のexon28にtype IIAの異常塩基構造のclusterの存在することが知られている。exon28部位の遺伝子の異常を同定するためsenseprimer(s-4251,s-4558)とantisense primer(a-5398,a-5361)を作成し、nested RT-PCR法にて増幅した。804bpのcDNAが増幅された。種々の制限酵素の中から既報の異常部位と同様の異常の有無を検出するためHpaII,BstEIIを用いてRFLPを検索した。患者及び異常者はBstEIIの切断部位を欠如しており正常の家族とは異なったパターンを呈した。1家系は更に増幅したcDNA(804bp)をsequenceしたが、増幅した範囲では既報のRFLPと一致した塩基置換が認められたのみであった。もう1家系は現在検討中である。別の亜型であるplatelettype vWDは血小板膜糖蛋白GPIbに異常があることが推測されている。2家系の分析を同様の方法で行った所、GPIb alphaの1299番目のadenineがguanineに置換されていた。かかる異常は239番目のアミノ酸であるmethionineをvalineに置換することになり、platelet type vWDの発現の病態と関係すると思われた。
農村文化に基づく介護予防事業に関する民族誌学的研究

本研究は、住民主体による介護予防事業を運営している前期高齢者に着目し、前期高齢者にとって介護予防事業を運営するとはどのようなことなのか、その意味を探求することを目的とした。0地区の前期高齢者にとって、介護予防事業を運営するとは、『後期高齢者が自分らしく生きていくために経験を発揮すること』であった。0地区の前期高齢者は、【後期高齢者が自分らしく生きていくことを支える】ために、<年中行事を生かす><区長や男性役員をたてる><先輩をたてる>地区の者同士<協調し合う>を内包した【地区の中での社会性を生かす】、【ボランティアや仕事の経験を生かす】【主婦による経験を生かす】【老いによる経験を生かす】という4つの経験を発揮していた。後期高齢者が自分らしく生きていくことを支える理由として【一般化された互酬性の規範】【後期高齢者への敬い】、自身の【老いを価値づけられる】【地区で生活している自分を確認できる】【自身の将来の居場所をつくる】という5つの動機づけがあった。前期高齢者は、【一般化された互酬性の規範】【後期高齢者への敬い】【自身の将来の居場所をつくる】を動機として、【後期高齢者が自分らしく生きていくことを支える】ために経験を発揮し、その行為を通じて、後期高齢者に喜んでもらえること、そして、後期高齢者が自分らしく生きていくことで、【老いを価値づけられる】【地区で生活している自分を確認できる】という自身の価値づけができるのである。そして、このことが前期高齢者の糧となり、後期高齢者が自分らしく生きていくための惜しみない、さらなる努力や経験の発揮につながるという前期高齢者と後期高齢者の相互作用の構造になっていた。すなわち、前期高齢者は、後期高齢者が自分らしく生きていくことで、自身もまた老いを価値づけ、自分らしく生きていくことができることが明らかとなった。農村部における住民主体による介護予防事業について、参加者である後期高齢者にとって事業に参加することはどのような意味があるのか、また、活動および運営の主体である前期高齢者にとって参加者である後期高齢者を支援することはどのような意味があるのかをそれぞれの立場から介護予防事業に関するものの見方、考え方、生活の仕方の意味を捉え探求することを目的とし、18年度は、住民主体による介護予防事業を運営している前期高齢者に着目し、農村部において前期高齢者が介護予防事業を運営するとはどのようなことなのか、どのような認識で、どのように介護予防事業を運営しているのか、その意味を探求することを目的とした。方法論として、文化の記述を目的としたエスノグラフィーを用いた。調査対象地域はA県B町であり、データ収集および分析は、そのステップが最もはっきりしているSpradleyの方法に基づいて行った。18年度は、O地城の介護予防事業および介護予防事業の準備や打ち合わせ、反省会、そして前期高齢者の多くが参加している配食サービスボランティア活動などへの参加観察を中心にデータ収集を行い、随時、インフォーマル・インタビューの実施および資料や書類の採取などを行った。フィールドへの滞在日数は33日間である。19年度は、参加観察のデータを補完するために、前期高齢者および一般情報提供者として、保健師や前期高齢者の家族、後期高齢者など約10人へのフォーマル・インタビューを実施し、前期高齢者にとっての介護予防事業を運営することの意味を明確化するとともに、後期高齢者にとって、介護事業に参加することの意味を探求していく予定である。
ヒト免疫グロブリン遺伝子の再編成に関与する核内因子の同定と関連遺伝子の単離

免疫グロプリン遺伝子の再編成は細胞の核内において以下の3つの過程を経て起こると考えられる。すなわち、(1)再編成に必要なシグナル配列の認識、(2)特定の部位でのDNAの切断、(3)2つのDNA断片の再結合の3段階であり、これらの過程のいずれが欠損しても遺伝子再編成は起こらないと考えられる。研究代表者はまずシグナル配列を認識する核内因子に注目し,これを同定するための方法としてゲルシフト法を用いた。プロ-ブとして7bp、9bpの再編成シグナル配列が12bpあるいは23bpのスペ-サ-により隔てられた2本鎖DNA(それぞれ12RSS、23RSS)を合成して、その5'末端を^<32>Pで標識した。また前駆B細胞、B細胞、HcLa細胞、再編成異常と考えられる重症複合免疫不全症(SCID)、およびX染色体連座免疫不全症(XLA)患者細胞株から核抽出液を調整して上記プロ-ブを用いたゲルシフト法を行った。12RSS、23RSSともに結合因子を認めることができるが、その移動度が異なることからそれぞれに特異的な結合因子が存在すると思われる。また23RSS結合因子はどの細胞にも見出されたが12RSS結合因子はB細胞、HeLa細胞、SCID細胞には見られずSCIDが12RSS欠損である可能性が示唆された。現在入gt11発現ベクタ-を用いて12RSS結合因子の遺伝子単離を進めている。一方近年23RSS結合因子やこれらの再編成系を何らかの機構により調節していると考えられる因子の遺伝子がされいてる。XLA、SCID細胞でこれらの遺伝子の構造,もしくは発現が正常か否かを検討することは重要であることから、PCR法により対応する遺伝子を単離し、現在XLA、SCIDでの解析を進めている。
iPS細胞を用いた腎性貧血に対する新規治療法の開発

本研究の目的は、腎性貧血治療のため、ヒトiPS細胞からエリスロポエチン産生細胞を分化誘導し、これを生体に導入することにより、エリスロポエチンの生理的な補充を行うことである。さらには、これまであまり明らかになっていなかったエリスロポエチン産生機構を解明することにより、新規腎性貧血治療を開発することにある。平成31年度は、ヒトiPS細胞からエリスロポエチン産生細胞を分化誘導し、高効率にエリスロポエチン産生を行う条件検討と、エリスロポエチン産生・分泌機構を解明することを計画していた。ヒトiPS細胞から誘導したエリスロポエチン産生細胞は、生体と同様に低酸素刺激によりエリスロポエチン産生が増加し、低酸素関連因子が重要な役割を担っていることを明らかにした。さらに、これまでの分化誘導法を改良することにより、高効率にエリスロポエチン産生細胞を誘導する条件検討を行った。また新規治療薬のスクリーニングを行うことも計画していた。臨床応用が期待される新規腎性貧血治療薬のプロリン水酸化酵素阻害剤は、エリスロポエチン産生および分泌を増加させた。ヒトiPS細胞由来エリスロポエチン産生細胞を、腎性貧血治療薬の薬効評価に用いる可能性が示唆された。現在、エリスロポエチン産生細胞の細胞治療への応用を目的として、腎性貧血モデル動物にエリスロポエチン産生細胞を移植し、貧血改善効果を検討している。本研究で得られる成果は、腎性貧血の治療に対する安価でより生理的な管理を可能とする医療技術の向上に加え、貧血に対する新規治療法の開発による本邦の医薬産業界の活性化をもたらすものであると考えている。平成31年度に予定していた研究内容については、ほぼ全て終了しており、概ね予想された結果を得ることができた。得られた知見を参考にし、また測定系や改良した分化誘導法を利用し、令和元年度に計画している研究内容に関しても、一部予備実験を開始し、既に準備を行っている。現時点では研究計画の立案に際し、問題となると予想された点についても順調に遂行できている。そのため交付申請書に記載された研究目的に対する達成度としては、おおむね順調に進展していると考えている。これまでの研究計画に関しては、おおむね順調に推移している。令和元年度は、腎性貧血免疫不全マウスにエリスロポエチン産生細胞を移植し、貧血改善効果を検討するとともに、生体適合性を考慮した医療材料でモジュール(カセット)を作製し移植することを計画している。腎不全および腎性貧血のモデル動物作製は、これまでの予備実験により安定して作製可能である。また細胞移植に関しても、既に確立している。モジュール作製に関しては、インスリン産生細胞等の先行研究を参考に、準備を進めている。研究を遂行する上で課題が生じた場合には、研究計画書に挙げた対策に沿って研究を行う予定である。

モジュール作製に関しては、インスリン産生細胞等の先行研究を参考に、準備を進めている。研究を遂行する上で課題が生じた場合には、研究計画書に挙げた対策に沿って研究を行う予定である。
リン酸化酵素の新生鎖における品質管理機構の解明

リン酸化酵素の新生鎖は、翻訳と同時にフォールディングされ、活性ドメインを形成すると報告されています。活性ドメインは、同一分子内の新生鎖を基質としてリン酸化します。この分子内自己リン酸化は、リン酸化酵素の構造を最適化し、成熟を促進することで、新生鎖の品質管理機構として機能しています。私たちは、リン酸化酵素DYRK1Aに着目し、研究を進めています。この研究の過程で、私たちは、DYRK1Aのフォールディング途中に一過的に存在する「中間体構造」が触媒する分子内自己リン酸化を特異的に阻害する低分子化合物を発見し、その化合物をFINDYと名付けました。興味深いことに、FINDYは完成型DYRK1Aによる基質リン酸化は阻害しませんでした。これらの結果から、フォールディング中間体は、完成型とは異なる特異な構造を有していると考えられます。さらにFINDYによって自己リン酸化を阻害されたDYRK1Aフォールディング中間体は、速やかに分解されることを見出しました。この結果は、フォールディング中間体の品質管理機構が存在することを示唆しています。本研究では、この品質管理機構の解明を目的として、DYRK1Aの分子内自己リン酸化依存的に結合・解離するタンパク質群を網羅的に同定しました。その結果、自己リン酸化依存的に、14-3-3等のリン酸化部位に結合するタンパク質群や脱ユビキチン化酵素が結合することや、HSP90等の分子シャペロンやE3ユビキチンリガーゼが乖離することを見出しました。さらに、FINDYのDYRK1A活性ドメインへの作用を詳細に解析したところ、FINDYは活性ドメインに直接作用し、その熱力学的な不安定化を誘導することを見出しました。これらの結果は、フォールディング途中にFINDYが作用しうる一過的中間状態が存在すること、さらにその品質管理機構には自己リン酸化依存的な様々なタンパク質の結合・解離が関与することを示しています。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、リン酸化酵素の新生鎖における品質管理機構の解明である。リン酸化酵素の新生鎖は、翻訳と同時にフォールディングされ、活性ドメインを形成すると報告されている。この活性ドメインは、同一分子内の新生鎖を基質としてリン酸化する。この分子内自己リン酸化は、リン酸化酵素の構造を最適化し、成熟を促進することで、新生鎖の品質管理機構として機能している。代表者(喜井)は、リン酸化酵素DYRK1Aの新生鎖が触媒する自己リン酸化反応を特異的に阻害する新規化合物の同定に成功した。この研究の過程で、DYRK1Aの自己リン酸化は新生鎖の状態で一過的に起こることを見出した。本研究では、これらの現象に関与する分子メカニズムを明らかにすることによって、DYRK1A新生鎖における品質管理機構の解明を進める。平成29年度は、以下の3つの研究を実施した。1:リン酸化酵素DYRK1A新生鎖における活性ドメイン形成の研究フォールディングの完了したDYRK1A活性ドメインとその新生鎖ーリボソームーmRNAの複合体を単離するため、活性ドメインに強く結合するDYRK1A阻害剤の構造類縁体の化合物を設計した。さらに、単離精製用ビーズへの固定化について検討を進めた。2:DYRK1A新生鎖のフォールディング異常認識分解機構の研究自己リン酸化依存的なフォールディングの過程で相互作用の変動するタンパク質分子を網羅的に探索した。これら同定されたタンパク質分子については、機能別分類とそれぞれの相互作用のインタラクトーム解析を実施した。さらに、siRNAを用いた実験により、DYRK1A新生鎖フォールディング・品質管理機構への関与を実証した。3:リン酸化酵素DYRK1A新生鎖のユビキチン化機構の解明発光タンパク質を融合したユビキチンの構築に成功し、DYRK1Aのユビキチン化を発酵により定量する技術を確立した。平成29年度は、以下の3つの研究項目で結果が得られており、「おおむね順調に進展している」と判断した。1:リン酸化酵素DYRK1A新生鎖における活性ドメイン形成の研究DYRK1A活性ドメインを新生鎖・リボソームごと単離精製するため、代表者(喜井)らがこれまでに設計・合成した阻害剤の中から、活性ドメインへの強い結合力、ビーズへの固定化のためのリンカーの配置、安定性などを指標に、新しい化合物の設計を進め、合成へと進める準備を行った。2:DYRK1A新生鎖のフォールディング異常認識分解機構の研究野生型DYRK1Aと点変異導入により酵素活性を失った活性欠失型DYRK1Aを培養細胞からTAP法により単離・精製し、それぞれに結合するタンパク質分子をnanoLC-MS/MSにより網羅的に同定、さらに質量分析データを解析することで、結合量の変動するタンパク質分子を定量的に同定した。これらの中には、既知のシャペロン群に加え、ユビキチン依存的なプロテアソーム分解を制御する多数の分子が含まれていた。さらに、これらの分子間の相互作用をインタラクトーム解析により同定、このインタラクトームの中のコアとなる分子については、siRNAによるノックダウンにより、DYRK1Aの自己リン酸化依存的なフォールディング過程や品質管理機構に関与するかを実証する実験を行い、幾つかの鍵分子の同定に成功した。3:リン酸化酵素DYRK1A新生鎖のユビキチン化機構の解明

発光タンパク質を融合したユビキチンの構築に成功し、DYRK1Aのユビキチン化を定量する技術を確立した。この技術は、これまで定性的であったユビキチン化を厳密に統計的に定量することを可能とし、項目2で同定された分子が、DYRK1Aの品質管理機構に対して、どの程度定量的に関与するのかを解析する。リン酸化酵素の新生鎖は、翻訳と同時にフォールディングされ、活性ドメインを形成すると報告されています。活性ドメインは、同一分子内の新生鎖を基質としてリン酸化します。この分子内自己リン酸化は、リン酸化酵素の構造を最適化し、成熟を促進することで、新生鎖の品質管理機構として機能しています。私たちは、リン酸化酵素DYRK1Aに着目し、研究を進めています。この研究の過程で、私たちは、DYRK1Aのフォールディング途中に一過的に存在する「中間体構造」が触媒する分子内自己リン酸化を特異的に阻害する低分子化合物を発見し、その化合物をFINDYと名付けました。興味深いことに、FINDYは完成型DYRK1Aによる基質リン酸化は阻害しませんでした。これらの結果から、フォールディング中間体は、完成型とは異なる特異な構造を有していると考えられます。さらにFINDYによって自己リン酸化を阻害されたDYRK1Aフォールディング中間体は、速やかに分解されることを見出しました。この結果は、フォールディング中間体の品質管理機構が存在することを示唆しています。本研究では、この品質管理機構の解明を目的として、DYRK1Aの分子内自己リン酸化依存的に結合・解離するタンパク質群を網羅的に同定しました。その結果、自己リン酸化依存的に、14-3-3等のリン酸化部位に結合するタンパク質群や脱ユビキチン化酵素が結合することや、HSP90等の分子シャペロンやE3ユビキチンリガーゼが乖離することを見出しました。さらに、FINDYのDYRK1A活性ドメインへの作用を詳細に解析したところ、FINDYは活性ドメインに直接作用し、その熱力学的な不安定化を誘導することを見出しました。これらの結果は、フォールディング途中にFINDYが作用しうる一過的中間状態が存在すること、さらにその品質管理機構には自己リン酸化依存的な様々なタンパク質の結合・解離が関与することを示しています。今後は以下の3つの研究項目を進め、リン酸化酵素DYRK1A新生鎖の自己リン酸化依存的なフォールディングに関わる品質管理機構の解明を進める。1:リン酸化酵素DYRK1A新生鎖における活性ドメイン形成の研究DYRK1A阻害剤などの化合物を固定化したビーズを作製し、これを用いて、DYRK1A活性ドメイン新生鎖複合体を単離する技術を開発する。単離した活性ドメイン-リボソーム複合体に含まれるmRNAの領域をRNA-seqにより配列決定することで、DYRK1A mRNA上をどこまでリボソームが翻訳すると、酵素活性ドメインが形成されるかを明らかにし、cotranslational foldingの概念をリン酸化酵素に適用し、新生鎖における品質管理機構の重要性を実証する。2:DYRK1A新生鎖のフォールディング異常認識分解機構の研究
非構造性帯水層への炭酸ガス地中貯留実現のための研究

1)実験装置の改良および改修については,前年度から整備している実験装置の改良を行った。具体的には,セルの寸法変更,恒温室の改良,連続フローシステムの開発と導入を行い,長時間の透過実験を安定した環境下で行うことができるようになった。2)実験装置の確認試験については,改良した実験装置を用いて,1200時間におよぶ確認実験を行った。実験では,ベレア砂岩を用いて,段階的に注入量を増加させる実験を行い,実験中の温度変化を±0.1°の範囲に押さえることを確認するとともに,連続フローシステムが正常に稼働することを確認した。3) CTによる貯留メカニズムの検討については,対象としている相浦砂岩の空隙幸造をμフォーカスX線CTスキャナー画像解析で明らかにし,既知の空隙構造を持つ複数の岩石試料に対して空気および液体CO2の置換実験を実施した。本研究ではまず,μフォーカスX線CT画像データから岩石内部での水ー空気および水ーCO2の置換の割合を示す置換率を求める方法を確立した。さらに,空気は大気圧下において,CO2については7MPaの封圧下で置換実験を実施した。その結果,いずれの場合も平均置換率は40%50%とほぼ同様の結果が得られたものの,同じ岩石試料を用いた水ー空気および水ーCO2の置換実験であっても,内部での置換の分布は,封圧の違いにより大きく異なっていることがわかった。4)CO2透過・貯留・溶解・固定化モデルの開発については,間隙分布モデルの構築による,基礎的な検討を行い,モデルの開発に関する調査研究を行った。実験装置の改良がほぼ終了し,次年度以降には,幾つかの実験を行えるようになった。現在,対象とする岩石の選定を行っており,これが決まり次第メカニズム解明おための実験を実施する予定である。また,CTによる構造の分析とメカニズムとの関連性に関する研究を引き続き実施するとともに,数値モデルの構築についての検討を継続する予定である。CO2の透過特性について,実験的なアプローチを先行的に実施する予定である。解析モデルの構築に際しては,実験結果の蓄積が必要であることから,これについては,基礎的な検討を継続して進める予定である。1)実験装置の改良研究に使用するための既存の実験装置に対して,改良を加えた。今回の改良点の最も大きな点は,多様な実験に対応するための三軸セルの改良であり,直径5cm,高さ10cmの円柱試験体が使用できるように設計するとともに,弾性波,比抵抗の実験,実験時のひずみを計測できるよう改良を加えた。具体的には円筒サイズを大きくし,三軸セルの上下底板部分を必要に応じて変更できるよう改良を加えた。もう1点,従来の装置では,注入する炭酸ガスがシリンジポンプの容量を超えた場合,一旦実験を停止して注入する必要があり,この点を改良するために連続フローを行えるようなシステムに改良した。3点目は,恒温室の改良を行い,装置全体を断熱材で覆うことで3重の恒温室を設け,実験中の人の出入りによる温度変化を最小限に抑えるように改良した。2)確認実験とメカニズムの検討改良した実験装置の確認を兼ねて,CO2を同一流量で同じ試験体に3回注入する実験を行い,CO2の透過メカニズムについて検討を行った,さらに,実験で用いた試験体をCTスキャナを用いて計測を行い,間隙分布の変化を捉えた。その結果,同一の流量での注入と停止を繰り返すことで,試験体内での不均一なCO2分布が解消され,CO2飽和度が大きくなり,同時に差圧も小さくなる挙動を確認した。これは,1回目の注入停止後のP波速度が微小ではあるが,回復を示すことから,注入を停止した際,CO2が浮力や圧力勾配により拡散し,2回目の注入において,新たな流路形成を助長したためと考えられる.また,3回目の注入では,CO2飽和度やP波速度,ひずみに変化が生じなくなることから,同一の流量によるCO2注入は,CO2が既存の流路を優先的に流動することが確認でき,低浸透率砂岩においても,CO2流動においてキャピラリー圧の影響から粘性抵抗の影響を受ける流動に移行することが明らかになった。実験装置の改良は,来年度も必要であるが,ほぼ予定通りの改良を行うことができた。実験については,岩石の種類を幾つか変えて検討を行う必要があると考えられ,研究分担者のCTなどを積極的に活用しながら進めていくことが重要である。研究分担者との連携もうまくとれており,進捗状況はおおむね順調であると考えられる。

さらに,空気は大気圧下において,CO2については7MPaの封圧下で置換実験を実施した。その結果,いずれの場合も平均置換率は40%50%とほぼ同様の結果が得られたものの,同じ岩石試料を用いた水ー空気および水ーCO2の置換実験であっても,内部での置換の分布は,封圧の違いにより大きく異なっていることがわかった。4)CO2透過・貯留・溶解・固定化モデルの開発については,間隙分布モデルの構築による,基礎的な検討を行い,モデルの開発に関する調査研究を行った。実験装置の改良がほぼ終了し,次年度以降には,幾つかの実験を行えるようになった。現在,対象とする岩石の選定を行っており,これが決まり次第メカニズム解明おための実験を実施する予定である。また,CTによる構造の分析とメカニズムとの関連性に関する研究を引き続き実施するとともに,数値モデルの構築についての検討を継続する予定である。次年度は,弾性波試験装置の高度化を図りながら,試験装置の改良を加える。さらに,注入条件,岩石の種類(空隙状況が異なるもの)などをパラメータとして基本的な実験を行い,CO2注入のメカニズムを明らかにする。また,空隙分布による透過挙動をシミュレートできるような数値解析手法の開発にも取り組む予定である。CO2の透過特性について,実験的なアプローチを先行的に実施する予定である。解析モデルの構築に際しては,実験結果の蓄積が必要であることから,これについては,基礎的な検討を継続して進める予定である。
日本語学習者作文支援のための共起表現・例文表示システム構築と評価

公募研究の最終年度として、当初の申請内容をほぼ完了した。1)作文支援システム「なつめ」の構築を目標とし、日本語教育から利用する立場からBCCWJを評価することを中心課題として研究を進めた。2)「なつめ」共起表現検索の機能として、「名詞」から「格助詞+用言]の検索、さらに「用言」から「名詞+格助詞」、「副詞」から「述部用言」が検索を可能にし、それを利用してBCCWJ野様座菜ジャンル別のコーパスにおける出現の様相を提示し、BCCWJの評価をした。3)例文提示システムは、文字対照一致方式でジャンル別、レベル別で検索し、ジャンル別、文字長順、レベル別のフィルタ表示ができるようにし、データを精密に評価することで、検出時間も短縮し、学習者の利用しやすいインターフェースでの検索を可能にするべく研究を進めた。言語処理学会、日本語教育学会に例文表示許諾の要請をし、科学技術論文などのジャンルの表示も可能にした。4)学習者誤用文を収集することで誤用例文データベースを構築に取り組んだ。現時点での共起表現提示・例文提示に加え、学習者が入力すると同時に、誤用データベースと照応することで誤用チェックをし、適切な表現ヒントを与えるシステムへの展開を開始した。5)共起表現、例文表示に関連する言語習得理論、言語処理、教育工学に関連した論文を日本教育、言語処理の学会で多数発表した。本研究は第二言語としての日本語学習をコーパス利用によりData Driven LanguageLearningの考えに基づいて日本語運用に有益な辞書記述を目指し、日本語作文支援システムにおける共起表現と例文提示機能開発とバランスコーパス評価を最終目的とする。この目標達成のために以下のことを行った。1)必要な日本語学習項目をあきらかにするための調査=大学などで学ぶ外国人学習者に必要な日本語作文のためのスキルとはどのようなものかを調査した結果、ディスコース全体の枠からみた必須要素を確定した。2)誤用分析・例文選択の認知的心理学的検討=学習上の重要項目を知るためには、誤用分析が必要である。誤用から見えてくる学習上の問題点から誤用例文を収集し、学習者に見られる誤用乃至不自然な表現の原因を意味的・構文的・運用論的な視点で分類した。3)パラフレーズの分析と検討=日本語学習者への作文支援の視点から学習者のパラフレーズに焦点を当て、学習者の誤りの原因及び作文ストラテジー等を究朋する。更に得られた知見より学習者に役立つ例文表示方法を考察した。4)副詞とモダリテイ-呼応の距離=1文中の副詞と述語の呼応関係をクラスタリングなどの統計的な方法で傾向を示し、副詞モダリティのコーパスごとの使用傾向が明らかになり、その成果として論文がSpringerに掲載された。5)作文支援システム「なつめ」の構築=1)4)の成果を作文支援システム「なつめ」に反映させた。作文支援システム「なつめ」に学習者にとって使いやすい例文表示システムの構築を継続して行い、文のデータベースから日本語能力に適した例文をフィルタリングにより表示できるシステムを完成した。
硝酸態窒素による地下水汚染の実態調査とその防止法

硝酸態窒素による地下水汚染が進行している農耕地(濃尾平野の一端に位置する各務原洪積台地)を対象として実態調査を実施し、汚染原因について解明することを主眼とした。調査対象農耕地のうち、地下水中の硝酸態窒素量が著しく高濃度を示す地点を中心に地下水流の方向を考慮した6地点を選び、地下深3080mのボーリング調査を行い、深度別地下水中の硝酸態窒素およびその時期別変動値を調べた。現地調査より、対象とした各地点とも硝酸態窒素の著しい富化現象が認められ、最高値は60ppmにも達している。また深度別による硝酸態窒素濃度差は大きく、概して深度5mでは30mに比較してはるかに高い硝酸態窒素濃度を示している。このように地下深度間で濃度的な相関性が認められない点より、これら層位間に不透水層の介在がうかがえ、これが2分していると推察される。一方、各地点とも硝酸態窒素量と降水量との間には量的相関が認められ、多量の降雨後では硝酸態窒素濃度を著しく高め、この傾向は深度5mにおいてとくに顕著であった。これについては単に硝酸態窒素量の動態のみでなく、石灰、苦土量についてもほぼ類似のパターンが示され、これらが肥料として施用される主要形態の1つである点、また調査地点における窒素施用試算量との間に密接な相関性が認められる点、さらには表層土における硝酸化成能が大きい点などを考えあわせて、表層部での硝酸態窒素富化が一次的汚染源として考えられ、汚染物質として各種窒素質肥料を推定した。したがって今後は地下深層にいたる二次的汚染経路を明らかにし、表層部における一次的汚染との因果関係について解明することを主軸として、汚染内部構造の立体的解析を行い、一方では汚染をもたらさない窒素の施用形態、施用適量および時期など、特別とされる窒素肥培管理技術を早急に確立することが必要とされる。
パーキンソン病の分子病態を基盤としたバイオマーカーの開発

前年までにPINK1野生型マウスと欠損マウスの脳サンプルで候補基質のリン酸化を確認することができなかった。そこで本年度はこれらの原因追求のために培養細胞での実験に立ち戻った。具体的には培養細胞にCCCP処理を行い、細胞サンプルで候補基質を認識するか否かを確認した。その結果、ウエスタンならびにELISAでもリン酸化基質を確認することはできなかった。抗体の問題と考え、急ぎ新たな抗体作成に着手し、リン酸化基質の同定を行った。しかしながら有効な抗体を得ることは困難であった。老化や活性酸素の影響によって生み出された異常ミトコンドリアの識別機構は未だ不明な点が多いが、これまでの研究からの類推によると、ミトコンドリアの膜電位の低下を契機にPINK1(リン酸化酵素)がミトコンドリアに蓄積し活性化するように調節されている。このようなPINK1の活性型への変化こそが異常ミトコンドリアクリアランスのためのシグナルとなる。本年度は当該施設内に設置された高性能の質量分析計(LTQ OrbiTrap ETD,TripleTOFTM 5600)を用いてリン酸化タンパク質の同定に成功した。方法としてPINK1 WTとKOマウス脳のミトコンドリア分画を用いて網羅的にリン酸化プロテオーム解析を行った。その結果、PINK1 KOマウスではリン酸化が見られなかったが、PINK1 WTのマウスではリン酸化が顕著であった。サンプルとして高齢マウスの脳を用いているため、同定した2種類のリン酸化されたタンパク質は,加齢によるミトコンドリア障害が亢進した結果と推測された。一方で本研究の開始後も遺伝性パーキンソン病の原因遺伝子が次々と同定され、PARK9(Atp13a2が原因遺伝子)を筆頭にコードをタンパク質の本来の機能が明らかになりつつある。そこで我々は脳特異的にAtp13a2を欠損するコンディショナルマウスを作製しin vivoにおける機能解析を推進した。その結果、Atp13a2はリソソームの機能障害を引き起こすことが判明し投稿準備中である。予定通りバイオマーカーとなるリン酸化候補タンパク質が同定されたため当初の計画通り研究は進展している。老化や活性酸素の影響によって生み出された異常ミトコンドリアの識別機構は未だ不明な点が多いが、これまでの研究からの類推によると、ミトコンドリアの膜電位の低下を契機にPINK1がミトコンドリアに蓄積し活性化するように調節されている。これらの知見をもとにすると、異常ミトコンドリアの蓄積に伴い遺伝性パーキンソン病原因遺伝子産物PINK1のリン酸化活性が亢進することが推測される。本研究ではこの知見を応用し、同様にミトコンドリア障害が指摘されている認知症関連疾患において、PINK1リン酸化活性亢進に伴うリン酸化タンパク質を同定すると共に早期診断を可能とするバイオマーカーを開発する。質量分析計(LTQ OrbiTrap ETD,TripleTOFTM 5600)を用いて、リン酸化タンパク質の同定を行う。方法としてPINK1 WTとKOマウスの脳ミトコンドリア分画を抽出し、網羅的にリン酸化プロテオーム解析を行った。その結果、2種類のリン酸化タンパク質を同定した。該当リン酸化タンパク質は,加齢によるミトコンドリア障害を感知したPINK1のキナーゼ活性が亢進した結果と推定された。リン酸化を認識する抗体を作製し、in vitroの系でリン酸化抗体を評価したところリン酸化認識抗体は高い特異性を示すことを確認した。予定通りリン酸化基質の同定が行われ、抗体を獲得することができたため。本年度は培養細胞を用いてin vitroの実験を継続した。HeLa細胞をCCCP(脱分極剤)処理後に細胞lysateを回収しサンプルを作製した。CCCP処理群と未処理群について質量分析計(LTQ OrbiTrap ETD)によりリン酸化基質の定量を行った。その結果、CCCP処理群と未処理群で変化を認める基質を見出した。さらに前述のlysateについて昨年度作製した昨年度作製したリン酸化抗体を用いてウエスタンブロットによる定量を試みた。しかしながらCCCP処理群と未処理群では有意差は認められなかった。さらに作製したリン酸化抗体を用いてELISAを作製した。PINK1 KOマウスとWTマウスの脳サンプルを用いて定量を行なったが有意差が確認されなかった。前年度までに同定していたリン酸化基質について異なる方法により定量したところバイオマーカーとして期待される結果が得られないため。候補タンパク質のリン酸化を認識する抗体を作製しモデルマウスや患者脳切片での評価を行いバイオマーカーとなりうるか検討を行う。同定されたリン酸化基質を認識する抗体にて疾患モデル動物や患者切片を用いての抗体評価を行う。異なる質量分析方法による基質候補の再同定を行う。

目的の候補タンパク質の同定が予想よりも短期間に決定されたため高性能の質量分析計(LTQ OrbiTrap ETD,TripleTOFTM5600)に用いる消耗品を節約することができたため。リン酸化基質の同定に難航することが予想されたが、予定より早期に目的の候補が確認されたため。研究の進行に伴い研究初期の結果と異なる結果が生じたため研究期間を延長しさらに検討を重ねるため。異なる測定方法により基質候補の再同定を行う。さまざまな患者サンプルについて高感度免疫システムを利用してバイオマーカーとなりうるか検討する。最良の抗体を得るために複数の抗体を作製し評価を行う。
多パラメタ多項分布の研究

パーマネントに関する成果:行の個数が列の個数以下で,列和が一定の行確率行列のパーマネントに対しても,エゴリチェフ-ファリクマンの不等式が成立することを示した.更に,等号が成立するのは,各行が全て同一のベクトルのとき,正方行列の場合と同じく,全ての成分が同一の場合に限るという結果を得た.行ベクトルが相異なるときの考察は今後の課題である.二項定理と包除原理に関する成果:アーベルによる二項定理の一般化に対する直接的な証明を考えた.この証明は第2種のスターリング数の表現とも関連していて,組合せ論的立場から興味深いものと思われる.なお,レニによる確率的解釈に対する解析的な証明も考えた.また,包除原理の条件付確率版を考察し,それに基づいて,多次元区間の確率を分布関数で表現する公式に対して,簡明な証明を考えた.負の二項分布に関する成果:天然記念物カササギの佐賀平野における生息分布調査データに対する統計的解析を行った.その結果,生息数の分布が負の二項分布で良く説明できることを示した.近似理論に関する成果:当研究の研究課題からは少しはずれるが,研究分担者の北原和明氏との共同研究成果である.実数直線上の有界閉区間から順序付回帰的バナッハ空間への関数のうち,有界変動なものの全体からなる関数空間を考え,この空間に関数の全変動を用いたノルムを導入する.そしてこの空間において,単調増加な関数全体や凸関数全体を近似関数の空間としたときに,最良近似解の存在と一意性について考察し,基本的な結果を得た.パーマネントに関する成果:行の個数が列の個数以下で,列和が一定の行確率行列のパーマネントに対しても,エゴリチェフ-ファリクマンの不等式が成立することを示した.更に,等号が成立するのは,各行が全て同一のベクトルのとき,正方行列の場合と同じく,全ての成分が同一の場合に限るという結果を得た.行ベクトルが相異なるときの考察は今後の課題である.二項定理と包除原理に関する成果:アーベルによる二項定理の一般化に対する直接的な証明を考えた.この証明は第2種のスターリング数の表現とも関連していて,組合せ論的立場から興味深いものと思われる.なお,レニによる確率的解釈に対する解析的な証明も考えた.また,包除原理の条件付確率版を考察し,それに基づいて,多次元区間の確率を分布関数で表現する公式に対して,簡明な証明を考えた.負の二項分布に関する成果:天然記念物カササギの佐賀平野における生息分布調査データに対する統計的解析を行った.その結果,生息数の分布が負の二項分布で良く説明できることを示した.近似理論に関する成果:当研究の研究課題からは少しはずれるが,研究分担者の北原和明氏との共同研究成果である.実数直線上の有界閉区間から順序付回帰的バナッハ空間への関数のうち,有界変動なものの全体からなる関数空間を考え,この空間に関数の全変動を用いたノルムを導入する.そしてこの空間において,単調増加な関数全体や凸関数全体を近似関数の空間としたときに,最良近似解の存在と一意性について考察し,基本的な結果を得た.