hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
潤滑油成分添加時の炭化水素燃料の自着火タイミングを予測する化学反応モデルの構築

潤滑油が実用燃料の自着火を促進するメカニズムを明らかにし,その着火特性を予測可能な化学反応モデルを構築することを目的として研究を推進している.期間は3年間であり,1年目は,実用燃料を構成する様々な炭化水素から構造別に代表成分を選択し,それらの炭化水素の着火特性に,潤滑油が及ぼす影響を明らかにし,着火を促進するメカニズムを検討した.実用燃料を構成する5つの構造を持つ炭化水素から,主成分であるアルカンと芳香族を選択し,実験を行った.アルカンを代表して,イソオクタン,イソペンタン,芳香族を代表して,トルエンを選択した.また,今後導入の可能性があるバイオ燃料としてエチルターシャリーブチルエーテルと2.5ージメチルフランを選択した.アルケンとナフテンについては2年目以降に実施する.急速圧縮装置を用いて,燃料予混合気を急速圧縮し,圧縮過程で潤滑油を噴射し,自着火特性を取得した.圧縮上死点の温度,圧力は,エンジン実験で潤滑油による燃料の自着火促進が起きた実績のある700 K,3 MPaとした.噴射タイミングは,潤滑油の飛散が観察されている上死点前30 deg. (上死点前約6 ms)とした.噴射量は4マイクロリットルとした.実験の結果,潤滑油を噴射した場合,どの燃料を用いても着火は促進されることがわかった.その要因を探るため,潤滑油を構成する基油と添加剤を選定し,どちらが自着火の促進に寄与するかを検討した.基油には代表成分であるエイコサンを,添加剤にはカルシウムスルホネートを選択し,同様の方法で自着火実験を行った.基油は燃料に寄らず自着火を促進し,添加剤は燃料により着火を促進する場合と促進しない場合があることが明らかになった.添加剤の効果については,次年度,燃焼中間生成物の詳細計測を実施し,そのメカニズムを明らかにし,化学反応モデルの構築を実施していく1年目は,実用燃料を構成する代表的な炭化水素成分の着火特性が,潤滑油によりどのように変化するのかを明らかにすることが研究の主な内容であった.主成分であるアルカンと芳香族,今後導入が予想されるバイオ燃料から構造の異なる炭化水素を選択し,急速圧縮装置を用いた実験を実施した.その結果,潤滑油は燃料の代表的な成分の着火を促進することが明らかになり,概ね1年目の研究目標は到達しており,研究計画通りに研究が進んでいるといえる.2年目は,1年目に明らかになった潤滑油の着火促進効果について,添加剤の促進効果のメカニズムを明らかにすることを目的として研究を進める.添加剤は,燃料によって,着火を促進する場合と促進しない場合があり,そのメカニズムを検討する.添加剤は,低温酸化反応を持たない燃料については,着火を促進せず,低温酸化反応を持つ燃料では,着火を促進する場合としない場合があることがわかっている.これは添加剤が酸化することによって生成する生成物が炭化水素の低温酸化反応に何らかの影響を及ぼしていることが考えられることから,添加剤を酸化させたときの生成物を明らかにしていく.この酸化実験は,十分な量の中間生成物を得ることができるよう,流通反応装置を用いて行う.生成する中間生成物の主成分に着目し,それらを混合した場合の自着火実験を行い,添加剤が炭化水素の予混合気の着火特性に及ぼす影響を整理し,メカニズムを明らかにしていく.流通反応装置については,概ね構築できている.3年目は,2年目に明らかになったメカニズムを基に,着火特性を予測可能な化学反応モデルを構築していく.潤滑油が実用燃料の自着火を促進するメカニズムを明らかにし,その着火特性を予測可能な化学反応モデルを構築することを目的として研究を推進している.期間は3年間であり,1年目は,実用燃料を構成する様々な炭化水素から構造別に代表成分を選択し,それらの炭化水素の着火特性に,潤滑油が及ぼす影響を明らかにし,着火を促進するメカニズムを検討した.実用燃料を構成する5つの構造を持つ炭化水素から,主成分であるアルカンと芳香族を選択し,実験を行った.アルカンを代表して,イソオクタン,イソペンタン,芳香族を代表して,トルエンを選択した.また,今後導入の可能性があるバイオ燃料としてエチルターシャリーブチルエーテルと2.5ージメチルフランを選択した.アルケンとナフテンについては2年目以降に実施する.急速圧縮装置を用いて,燃料予混合気を急速圧縮し,圧縮過程で潤滑油を噴射し,自着火特性を取得した.圧縮上死点の温度,圧力は,エンジン実験で潤滑油による燃料の自着火促進が起きた実績のある700 K,3 MPaとした.噴射タイミングは,潤滑油の飛散が観察されている上死点前30 deg. (上死点前約6 ms)とした.噴射量は4マイクロリットルとした.実験の結果,潤滑油を噴射した場合,どの燃料を用いても着火は促進されることがわかった.その要因を探るため,潤滑油を構成する基油と添加剤を選定し,どちらが自着火の促進に寄与するかを検討した.基油には代表成分であるエイコサンを,添加剤にはカルシウムスルホネートを選択し,同様の方法で自着火実験を行った.基油は燃料に寄らず自着火を促進し,添加剤は燃料により着火を促進する場合と促進しない場合があることが明らかになった.

添加剤の効果については,次年度,燃焼中間生成物の詳細計測を実施し,そのメカニズムを明らかにし,化学反応モデルの構築を実施していく1年目は,実用燃料を構成する代表的な炭化水素成分の着火特性が,潤滑油によりどのように変化するのかを明らかにすることが研究の主な内容であった.主成分であるアルカンと芳香族,今後導入が予想されるバイオ燃料から構造の異なる炭化水素を選択し,急速圧縮装置を用いた実験を実施した.その結果,潤滑油は燃料の代表的な成分の着火を促進することが明らかになり,概ね1年目の研究目標は到達しており,研究計画通りに研究が進んでいるといえる.2年目は,1年目に明らかになった潤滑油の着火促進効果について,添加剤の促進効果のメカニズムを明らかにすることを目的として研究を進める.添加剤は,燃料によって,着火を促進する場合と促進しない場合があり,そのメカニズムを検討する.添加剤は,低温酸化反応を持たない燃料については,着火を促進せず,低温酸化反応を持つ燃料では,着火を促進する場合としない場合があることがわかっている.これは添加剤が酸化することによって生成する生成物が炭化水素の低温酸化反応に何らかの影響を及ぼしていることが考えられることから,添加剤を酸化させたときの生成物を明らかにしていく.この酸化実験は,十分な量の中間生成物を得ることができるよう,流通反応装置を用いて行う.生成する中間生成物の主成分に着目し,それらを混合した場合の自着火実験を行い,添加剤が炭化水素の予混合気の着火特性に及ぼす影響を整理し,メカニズムを明らかにしていく.流通反応装置については,概ね構築できている.3年目は,2年目に明らかになったメカニズムを基に,着火特性を予測可能な化学反応モデルを構築していく.1年目は,潤滑油が実用燃料の着火特性に及ぼす影響について実験的研究を行い,概ね計画通りに進捗した.2年度目は,潤滑油が酸化した際の生成物を計測し,どの成分が着火に影響を及ぼすかを検討していく.この生成物計測では,炭化水素成分の計測が必要であり,それに使用する既存の装置に不具合がでたことから,それに必要な装置を1年度目に購入した.その装置は2年度目に本格的に使用するが,納期に時間がかかることがわかったことから1年度目に予定を変更して購入した.その予算の変更のため,1年度目に予定していた学会への参加を取りやめた.今年度参加予定の学会では,潤滑油の自着火に関する研究発表が少なく,論文等の調査で十分であったことから,この変更を行っても研究の進捗に影響はない.1年度目に装置の不具合は概ね解消したが,2年度目に不具合が生じた場合,研究の遂行が難しくなることと,予備実験において,装置の計測部が炭化水素成分により汚れる可能性があることがわかり,装置のメンテナンスを予定しておく必要があることから,1年度目の予算の一部を2年度目に繰越し,装置のメンテナンス費として使用する予定である.
ウーロン茶抽出物に含まれる抗う蝕物質の検出と同定

ミュータンスレンサ球菌のう蝕誘発能に及ぼすウーロン茶抽出物の抑制作用をin vitroの実験系で調べ,下記の結果を得た.1.ウーロン茶抽出物はミュータンスレンサ球菌の増殖速度を抑制する傾向を示し,培地中に生成される酸濃度は,ウーロン茶抽出物非添加培地の場合に比べて明らかに低かった.しかし,ウーロン茶抽出物には明瞭な抗菌作用は認められず,ウーロン茶抽出物を精製したウーロン茶ポリフェノールにもこの作用は認められなかった.2.ミュータンスレンサ球菌をウーロン茶抽出物で処理すると,ミュータンスレンサ球菌の菌体疎水性が明瞭に低下した.この作用はウーロン茶抽出物よりもウーロン茶ポリフェノールで顕著であった.3.ウーロン茶抽出物はミュータンスレンサ球菌の唾液被覆ハイドロキシアパタイトへの吸着を阻害した.この作用はウーロン茶抽出物よりもウーロン茶ポリフェノールで顕著であった.以上の結果は,ウーロン茶抽出物の抗う蝕作用が,ウーロン茶ポリフェノールによる菌体疎水性低下とグルコシルトランスフェラーゼによるグルカン合成の阻害によってミュータンスレンサ球菌の歯面への付着とプラーク形成を抑制することにより,さらにウーロン茶抽出物に含まれるミュータンスレンサ球菌の増殖速度を抑制する物質の酸産生抑制作用によってより明瞭なものになることを示唆している.ミュータンスレンサ球菌のう蝕誘発能に及ぼすウーロン茶抽出物の抑制作用をin vitroの実験系で調べ,下記の結果を得た.1.ウーロン茶抽出物はミュータンスレンサ球菌の増殖速度を抑制する傾向を示し,培地中に生成される酸濃度は,ウーロン茶抽出物非添加培地の場合に比べて明らかに低かった.しかし,ウーロン茶抽出物には明瞭な抗菌作用は認められず,ウーロン茶抽出物を精製したウーロン茶ポリフェノールにもこの作用は認められなかった.2.ミュータンスレンサ球菌をウーロン茶抽出物で処理すると,ミュータンスレンサ球菌の菌体疎水性が明瞭に低下した.この作用はウーロン茶抽出物よりもウーロン茶ポリフェノールで顕著であった.3.ウーロン茶抽出物はミュータンスレンサ球菌の唾液被覆ハイドロキシアパタイトへの吸着を阻害した.この作用はウーロン茶抽出物よりもウーロン茶ポリフェノールで顕著であった.以上の結果は,ウーロン茶抽出物の抗う蝕作用が,ウーロン茶ポリフェノールによる菌体疎水性低下とグルコシルトランスフェラーゼによるグルカン合成の阻害によってミュータンスレンサ球菌の歯面への付着とプラーク形成を抑制することにより,さらにウーロン茶抽出物に含まれるミュータンスレンサ球菌の増殖速度を抑制する物質の酸産生抑制作用によってより明瞭なものになることを示唆している.ウ-ロン茶抽出物とこれを精製して得られたウ-ロン茶ポリフェノールのう蝕抑制効果をラットを用いた実験う蝕系で調べたところ,精製標品よりもウ-ロン茶抽出物により強いう蝕抑制作用が認められた.このことは,ウ-ロン茶ポリフェノールが示す強い抗GTase作用以外の作用を示す抗う蝕物質がウ-ロン茶抽出物中に含まれていることを示唆している.そこで,ミュータンスレンサ球菌のう蝕誘発能に及ぼすウ-ロン茶抽出物の抑制作用をin vitroの実験系で調べ,下記の結果を得た.1.ミュータンスレンサ球菌をウ-ロン茶抽出物を含むグルコース培地で培養すると,菌の増殖に相違は認められないにもかかわらず,培地中に生成される酸濃度は,非添加培地あるいはウ-ロン茶ポリフェノール添加培地の場合に比べて明らかに低かった.2.ミュータンスレンサ球菌をウ-ロン茶抽出物で処理すると,ミュータンスレンサ球菌の菌体疎水性が明瞭に低下した.この作用はウ-ロン茶抽出物よりもウ-ロン茶ポリフェノールで顕著であった.3.ミュータンスレンサ球菌を含めた多くの口腔レンサ球菌をウ-ロン茶抽出物で処理すると,S.mutansをはじめとする多くのレンサ球菌を凝集させた.この作用はウ-ロン茶抽出物よりもウ-ロン茶ポリフィノールで顕著であった.以上の結果は,ウ-ロン茶抽出物にはミュータンスレンサ球菌の酸産生を抑制する抗う蝕物質が含まれていることを示唆している.ミュータンスレンサ球菌のう蝕誘発能に及ぼすウーロン茶抽出物の抑制作用をin vitroの実験系で調べ,下記の結果を得た.1.ウーロン茶抽出物はミュータンスレンサ球菌の増殖速度を抑制する傾向を示し,培地中に生成される酸濃度は,ウーロン茶抽出物非添加培地の場合に比べて明らかに低かった.しかし,ウーロン茶抽出物には明瞭な抗菌作用は認められず,ウーロン茶抽出物を精製したウーロン茶ポリフェノールにもこの作用は認められなかった.2.ミュータンスレンサ球菌をウーロン茶抽出物で処理すると,ミュータンスレンサ球菌の菌体疎水性が明瞭に低下した.この作用はウーロン茶抽出物よりもウーロン茶ポリフェノールで顕著であった.3.ウーロン茶抽出物はミュータンスレンサ球菌の唾液被覆ハイドロキシアパタイトへの吸着を阻害した.この作用はウーロン茶抽出物よりもウーロン茶ポリフェノールで顕著であった.以上の結果は,ウーロン茶抽出物の抗う蝕作用が,ウーロン茶ポリフェノールによる菌体疎水性低下とグルコシルトランスフェラーゼによるグルカン合成の阻害によってミュータンスレンサ球菌の歯面への付着とプラーク形成を抑制することにより,さらにウーロン茶抽出物に含まれるミュータンスレンサ球菌の増殖速度を抑制する物質の酸産生抑制作用によってより明瞭なものになることを示唆している.
異種金属微細接合角部の電子流集中による原子集積と高度マイクロ・ナノ構造体の創製

電子流を駆動力とする原子移動、すなわちエレクトロマイグレーションを有効に利用したマイクロ・ナノ構造体の創製を扱い、効率よく原子を集積するために、異種金属接合角部にはじめて注目した。はじめに同部における原子集積の理論解析を行い、解析結果に基づき新しいサンプルを作製した。これを踏まえ、多くの原子を必要とする長いワイヤ、ワイヤアレイ、チューブ、等の高度マイクロ・ナノ金属構造体を創製した。さらに実現したマイクロ・ナノ構造体の力学的、電磁気的、および熱的要素としてのポテンシャルを探り、効率的なマイクロ・ナノ構造体創製指針を策定した。1.異種金属接合角部における原子集積の理論解析異種金属接合角部での電子流集中、ジュール発熱による温度分布、そしてこれらの影響による原子流束とその発散(単位時間、単位体積当たりの原子の蓄積量あるいは損失量)を解析し、異種金属境界面での原子の集積を理論的に求めた。これにより異種金属接合の場合、材料の組合せにより、角部近傍領域での原子集積が制御可能であることを理論的に明らかにした。2.異種金属微細接合角部を有する新規サンプルの作製マイクロ・ナノ材料の創製には、サンプル内に原子が集積しやすい箇所を設けることが得策である。ここでは異種金属微細接合の前段階として、単一元素金属からなるサンプルに急激な形状(幅)変化を導入し、原子集積へのその寄与について検討した。同サンプルにおける温度分布を評価して、電子流の場所による急激な変化と共に原子集積に寄与することを考察し、並行してサンプルを作製して、形状の急変部において原子の集積が起こることを実証した。ここに先端径がおよそ10μmの極微小熱電対を自作して通電時の当該サンプルの温度分布を実測し、意図した温度分布が形成されていることを確認した。3.金属微細ワイヤ/構造体アレイの実現平成24年度に本格的に取組む当該項目の前段階として、2本の微細ワイヤを同時創製することを基本に取上げ、直列回路型試験体が適する理由を通電中の電圧計測を踏まえた原子排出孔間の相互作用に関する考察より詳細に明らかにした。また微細ワイヤ、構造体アレイの実現において重要な原子排出孔の付与方法に関して、酸化物ナノワイヤを当該孔の鋳型として用い、これを還元消失させる新規手法を考案した(特許出願)。この手法によれば、これまでの収束イオンビームを用いる手法よりも微小な孔を容易に作製でき、さらに微小孔のアレイ作製も可能である。1.電磁気的素子としての金属マイクロリング・コイルの作製ジュール熱を用いた金属細線の省エネルギー熱処理法を提案し、当該手法により軟化させた銅マイクロ細線を塑性加工して、直径と線径の比がわずか3程度の金属マイクロコイルを作製することに成功した。さらに作製したマイクロコイルを永久磁石上に配置して交流電流を付与し、当該構造体の電磁気的アクチュエーション機能を確認した。また作製したCuOナノワイヤにPtを被覆した後、この2層構造体を加熱してナノワイヤのみをクリープ流動させることにより、マイクロコイル構造を作製し、さらにその発生磁場を評価した。2.力学的素子としてのマイクロ剛性機構の作製金属2層ナノチューブを作製した。またその構造体の力学試験を実施して当該構造体がマイクロ剛性機構の要素として利用可能であることを確認した。3.熱的素子としての微細熱交換器の実現直径の異なる様々な元素の金属細線を大気中、および真空中でジュール熱により切断し、切断に要した電流値の比較より大気中では細線表面からの放熱が顕著に生じていることを明らかにした。4.効率的なマイクロ・ナノ構造体創製指針の策定と応用への提言TiNやCrNといった導電性材料を保護膜として新たに使用することで、従来の半分以下となる作製工程の短縮に成功し、効率的な構造体創製に導電性保護膜の使用が推奨されることを示した。また導電性保護膜と新たに考案した櫛状サンプル構造を用いることで10本以上のマイクロ構造体の創製に初めて成功し、導電性保護膜と櫛状サンプル構造の融合が、効率的な構造体創製への応用に有効であることを示した。1.長い金属マイクロ・ナノワイヤの作製エレクトロマイグレーションによる長い金属マイクロ・ナノワイヤ創製には、通電によるサンプル断線寿命が長いことが重要であり、これを実現するため従来のサンプル構造を発展させたサンプル構造を考案した。具体的には、保護膜を従来の絶縁体であるTEOS膜から導電性を有する膜に変えることで主の原子拡散源である金属配線が一部断線しても継続して通電が可能となるようにした。同時に、金属マイクロ・ナノワイヤ作製のための最適な電流密度と基板温度との関係を実験により検討した。2.高機能断面を有するマイクロ構造体の作製高機能性を追求した断面を有するマイクロ構造体作製のためのサンプルを作製し、実験に着手した。

具体的には、保護膜に原子排出孔を作製するにあたり、従来の方法である集束イオンビーム装置を用いた手法のみならず、フォトリソグラフィーによってもこれが達成できることを実証した。フォトリソグラフィーを用いて高機能断面を有する排出孔を作製することは、マイクロ構造体の大量創製を見据えた製作時間の短縮につながる。これにより形状の異なる排出孔を複数作製し、実験に供した。3.金属微細ワイヤ/構造体アレイの実現10本のアレイ構造を有する新規サンプルを作製し、実験に着手した。なお上記1で説明の導電保護膜を用いることで、アレイ構造における断線の危険性が減るばかりでなくサンプル製作工程の大幅短縮を実現した。また、酸化物ナノワイヤアレイを鋳型とし、これを還元することにより、ナノスケールの原子排出孔アレイを提供する保護膜作製の基礎を確立した。その他、エレクトロマイグレーションにより作製したAlマイクロワイヤの弾塑性特性を取得し、当該ワイヤの降伏応力がバルク材に比べて20倍高いことを実証した。また原子拡散現象を利用して酸化鉄ナノワイヤアレイを短時間に作製することにも成功している。研究実績の概要に記載のとおり、申請時に計画した研究を遂行し、研究の鍵となる異種金属接合角部での特徴的構造に起因した原子集約を理論、実験の両面から検証した。さらに翌年度の実施項目に関して、複数の微細ワイヤを同時に作製する実験を開始し、また、酸化物ナノワイヤを鋳型として複数の微小孔を作製する手法も考案している。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究実績の概要に記載のとおり、申請時に計画した研究を遂行し、長い金属マイクロ・ナノワイヤ、高機能断面を有するマイクロ構造体、金属微細ワイヤ/構造体アレイを実現するための基盤となる新規サンプル構造を考案し、具体的に作製したサンプルで鋭意実験中である。申請書に記載の計画のとおり、研究を推進する。平成24年度は、本年度の研究成果に基づき、長い金属マイクロ・ナノワイヤ、U字断面を有するマイクロ構造体や金属微細ワイヤ/構造体アレイなどの高度マイクロ・ナノ構造体の実現に注力する。平成25年度(最終年度)は創製したマイクロ・ナノ構造体から、申請者らがこれまでに開発しているナノ溶接手法、コイル形成における曲率制御手法、等を駆使して、電磁気的素子、力学的素子、熱的素子を創出し、その利用価値を見出すと共に、応用への弾みをつける。さらに効率的なマイクロ・ナノ構造体の創製と応用指針を策定して、当該分野の発展に貢献することを目指す。平成25年度(最終年度)は、これまでの研究成果に基づき、創製したマイクロ・ナノ構造体から、申請者らがこれまでに開発しているナノ溶接手法、コイル形成における曲率制御手法、等を駆使して、電磁気的素子、力学的素子、熱的素子を創出し、その利用価値を見出すと共に、応用への弾みをつける。
EBウイルスワクチン開発のための上咽頭癌地域集積性とウイルス遺伝子多型相関の研究

EBウイルス(EBV)は口腔咽頭上皮細胞へ感染し、口腔癌や上咽頭癌の原因になる。世界の9割以上の人がEBVに感染しているのに比して、これらの癌は東アジアとアフリカ地域に集積している。この地域性を分子メカニズム的に説明することは殆ど行われていない。また、欧米では稀な腫瘍であるためEBウイルス感染の予防ワクチンも開発されていない。そこで、国際共同研究を行うことで、口腔癌や上咽頭癌のビトロにおける疾患モデルの開発を目指した。そのために、口腔扁平上皮細胞に組換えEBVを感染させ、細胞の腫瘍性形質の獲得などを調べた。我々は、EBVの持続感染細胞を高分化型のHSC1細胞株および低分化型のSCC25細胞株を用いて樹立した。EBV陽性HSC1細胞およびEBV陽性SCC25細胞におけるウイルスコピー数はそれぞれ2および5であった。EBV陽性HSC1細胞では、EBVコピー数は2と低いにもかかわらず、自発的なEBVの活性化、即ち溶解感染誘導が起こり、EBVの複製増殖が行われた。一方、EBV陽性SCC25細胞は5つのEBVコピーを有していたが、EBVの活性化は観察されなかった。また、EBV陽性HSC1細胞において非感染HSC1細胞よりも細胞の増殖および遊走が活性化された。EBV陽性HSC1細胞をTPA処理すると、ウイルス溶解性BZLF1遺伝子の発現が誘導された。しかし、これらのEBVの活性化や細胞の増殖および遊走の活性化は、EBV陽性SCC25細胞では観察できなかった。これらの結果から、1) EBV感染は口腔扁平上皮の腫瘍性増殖を起こす可能性が考えられた。2) EBVに感染した口腔扁平上皮細胞から放出されたEBVのが唾液へ分泌されてEBVを伝播すると考えられた。3) EBVは口腔扁平上皮細胞に持続的に感染するが、細胞増殖またはウイルスの活性化は細胞分化の程度によって異なると考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。上咽頭がんはEBウイルス(EBV)が咽頭上皮細胞へ感染することで発生する。全世界の9割以上の人がEBVに感染しているのに比べ、上咽頭癌はなぜかアジア・アフリカ地域に集積している。この地域性を分子メカニズム的に説明するために、国際共同研究を行い上咽頭がん患者における変異EBVの保有頻度を調査するとともに、ウイルス分離を行い、変異を確認することを提案した。今年度の計画は、アジア・アフリカの上咽頭がん患者からEBV感染腫瘍組織を分離し、EBV未感染者の末梢血と混合培養することにより、腫瘍由来のEBVによって不死化したリンパ球(LCL)を樹立する。このLCLのDNAを次世代シーケンスに供することで、腫瘍由来のEBVの遺伝子配列を決定し、多型を解析する。EBVを分離するには、ゲノム編集の手法を用いて薬剤耐性遺伝子をウイルスゲノムに挿入し、組換えEBVを作成する。シンガポール大との共同研究により、上咽頭癌患者の生検組織をフィーダー細胞と共培養したところ、上皮性の細胞株の代わりに、Bリンパ球が不死化したLymphoblastic Cell Line (LCL)を分離することができた。このLCL細胞が保持しているEBVを分離するために、CRISPR-Cas9を用いてゲノム編集法により、ネオマイシン耐性遺伝子を導入する実験を行ったが、うまくいかなかった。ガイドRNA配列の部位に変異がある可能性があり、遺伝子配列を決定し、再試行することになった。国際研究の体制作りに少し時間がかかり、エチオピアへの訪問が10月になったこと。シンガポールからの来日が12月になったことなどが挙げられる。また、組換えウイルスの作製も遅れており、遺伝子配列を決定することにした。

これらの結果から、1) EBV感染は口腔扁平上皮の腫瘍性増殖を起こす可能性が考えられた。2) EBVに感染した口腔扁平上皮細胞から放出されたEBVのが唾液へ分泌されてEBVを伝播すると考えられた。3) EBVは口腔扁平上皮細胞に持続的に感染するが、細胞増殖またはウイルスの活性化は細胞分化の程度によって異なると考えられた。上咽頭がんはEBウイルス(EBV)が咽頭上皮細胞へ感染することで発生する。しかし、全世界の9割以上の人がEBVに感染しているのに比して、上咽頭がんはなぜかアジア・アフリカ地域に集積している。この地域性を分子メカニズム的に説明することはこれまで行われていなかった。それに対して、上咽頭がん流行地で変異EBVが発見されたことを受けて、国際共同研究として上咽頭がん患者における変異EBVの保有頻度を調査するとともに、ウイルス分離を行い、腫瘍由来EBVの生物学性状に変化が無いかを調べることにした。シンガポール大との共同研究により、上咽頭がんの生検材料から腫瘍細胞由来の株化細胞を作成することを何度も試みたが、うまくいかなかった。代わりにBリンパ球が不死化したリンパ芽球様細胞(LCL細胞)が分離できたので、LCL細胞を使って、組換えEBVの作成を試みたが、成功しなかった。しかし、コンデショナルレプログラミング法を用いれば、非腫瘍性の鼻咽頭上皮細胞は一定期間培養でき、air-liquid interface culturesystemをを報告することができた。今年度から開始したタイのコンケン大との共同研究はスムーズに行われており、これまで報告されていない、皮膚や口腔粘膜由来の扁平上皮細胞にEBVが持続的に感染し、感染細胞は非感染細胞に比べて腫瘍性形質を示すことが明らかになった。現在、分子的なメカニズムを明らかにする研究を行っている。リンパ芽球様細胞(LCL細胞)の作成は可能であるが、LCL細胞は遺伝子導入効率が大変悪く、LCL細胞を用いて組換えウイルスを作成することが大変困難である。CRISPR-Cas9を用いてゲノム編集法により、ネオマイシン耐性遺伝子を導入する実験を行ったが、うまくいかなかった。ガイドRNA配列の部位に変異がある可能性があり、遺伝子配列を決定し、再試行する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。シンガポール大との共同研究が、当初とは違った方向ではあるが成果を上げることができた。もうしばらく研究を継続すれば、さらに論文を作成可能であると予測できるので、継続する。コンケン大との共同研究は、口腔咽頭癌のビトロの実験モデルの作成という方向性であるが、一定の成果をあげる目処が立ったので推進する。EBVばかりでなく、ヒトパピローマウイルスの重感染の影響も観察する予定である。
新規骨代謝改善薬の転移性骨腫瘍に対する効果の解析

これまで、本申請者は、Wnt5a-Ror2経路が、マクロファージ上のRANKの発現を促進する事を報告してきた。一方、腫瘍細胞におけるRANKの発現は骨転移を促進するという報告があることから、腫瘍細胞が発現するWNTは自身に作用しRANKの発現を誘導し骨転移を促進するという仮説が考えられた。以上の背景より、骨に親和性のある株化癌細胞を用い実験を行った。その結果、これらの細胞株ではRANKを高発現していた。さらに、Wnt5aやRor1/2の発現も認めた。以上の結果より、腫瘍細胞が発現するWnt5aは自身のRor1/2に作用し、RANKの発現を誘導し骨転移を促進するという可能性が考えられた。骨組織は生涯を通して形成と吸収が行われ、そのバランスを保つことで骨量が維持される。骨吸収を担う破骨細胞(OC)はマクロファージ由来の細胞である。骨形成を担う骨芽細胞(OB)に、骨吸収促進因子が作用するとOC分化因子RANKLが発現する。マクロファージには受容体RANKが発現しており、マクロファージはOB膜上のRANKLを認識し、OCへと分化する。一方、OBはOC分化抑制因子であるオステオプロテゲリン(OPG)も発現し、骨量維持の恒常性を保っている。これまで本申請者は、受容体型チロシンキナーゼRor2によって活性化されるWnt非古典経路が、マクロファージ上のRANKの発現を亢進することによって、破骨細胞分化を促進することを発見した。さらに、それを阻害することで新規骨代謝改善薬の可能性を報告してきた。一方、腫瘍細胞におけるRANKの発現は腫瘍の骨転移を促進するとの報告がある。以上の背景より、平成24年度は骨に親和性のある株化癌細胞を用い実験を行った。実験には、当教室所蔵の乳癌、肺癌細胞株を用いた。細胞を10cm dishに培養したのち、Trizolで処理し、total RNAを回収した。これらを、鋳型に逆転写反応を行いcDNAを作製した。Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/)にて、RANK、RANKL、OPGおよび各種WntリガンドのリアルタイムPCR用のプライマーを設計し、リアルタイムPCRを行い、これらの分子の定量を行った。しかし、当教室所蔵の細胞株ではRANKの発現は予想より高くなかった。上記の実験と並行して、ヒトWNT5A、ROR2の過剰発現実験用にウイルスベクターの構築を行った。現在、上記2分子のクローンを購入し、制限酵素処理を行い、ウイルスベクターを作製しているところである。RANKは、破骨細胞分化に必須の因子であるRANKLの受容体である。これまで、本申請者は、受容体型チロシンキナーゼであるRor2によって活性化されるWnt非古典経路が、マクロファージ上のRANKの発現を促進する事を報告してきた。一方、腫瘍細胞におけるRANKの発現は骨転移を促進するという報告がある。即ち、腫瘍細胞が発現するWntは自身にautocrine的に作用し、Wnt非古典経路を活性化しRANKの発現を誘導し骨転移を促進するという仮説が考えられた。以上の背景より、平成24年度は骨に親和性のある株化癌細胞を用い実験を行ったが、これらの細胞におけるRANKの発現は、予想より高くなかった。そこで、平成25年度は新規に骨親和性のある株化癌細胞を入手し、実験を行った。乳癌細胞株は細胞株は、MDA-MB231、H2578およびMCF-7を、前立腺癌細胞株は、LnNCap、Du145およびPC3をそれぞれ用いた。これらの細胞株よりcDNAを調製し、リアルタイムPCRに供した。その結果、これらの細胞ではコントロールと比較してRANKを高発現していた。さらに、Wnt非古典経路を活性化する代表的なリガンドであるWnt5a、受容体であるRor1/2の発現も認めた。現在、Wnt非古典経路の阻害剤やsiRNAを用いた実験を行っている。これまで、本申請者は、1)Wnt5aが骨芽細胞、滑膜細胞より産生される事、2)Wnt5aは破骨細胞の分化を強力に促進する事、3)破骨細胞前駆細胞特異的にRor2を欠損させたマウスでは、骨吸収が低下する事により骨量が著しく増加する事、4)関節リウマチ(RA)モデルマウスにRor2のデコイ受容体を投与すると関節破壊が顕著に抑制される事を報告してきた。即ち、Wnt5a-Ror2経路をターゲットとした新規骨代謝改善薬の可能性を世界に先駆け報告した。

論文を投稿し、査読を受けた結果、骨芽細胞特異的にWnt5aを欠損したマウスの硬組織の表現型を解析することを求められた。そこで、平成23年度は、骨芽細胞特異的にWnt5aを欠損したマウス(Wnt5aΔOB/ΔOB)の作出と硬組織の解析を行った。Wnt5aΔOB/ΔOBは、Wnt5a fl/+マウスとosterix- Creマウスを交配することによって作出した。Wnt5aΔOB/ΔOBは、大腿骨の成長発達に異常を示さなかった。しかし、マイクロCT撮影の結果、Wnt5aΔOB/ΔOBではコントロールと比較して海綿骨量の低下を認めた。骨形態計測の結果、Wnt5aΔOB/ΔOBは骨形成が抑制されており、破骨細胞数も減少していた。8週齢のWnt5aΔOB/ΔOBの大腿骨組織切片を解析した結果、破骨細胞数の減少を認めた。以上の結果より、骨芽細胞の分泌するWnt5aが破骨細胞分化を促進する可能性が示唆された。2012年度は、当研究室所蔵の細胞株を用い、骨転移惹起因子の発現を解析し第28回日本整形外科学会基礎学術集会で発表する予定であった。しかしながら、当研究室所蔵の細胞株は骨転移惹起因子の発現が極めて低く、計画した実験に利用するのが困難であることが判明した。2013年度は、新たに細胞株を購入し引き続き当初の仮説を実証していきたい。未使用額は、それらの経費に充てることとしたい。昨年度の研究計画では、Wnt5aの転移性骨腫瘍に対する役割を解析する予定であった。しかしながら、先行論文のreviseに追われ昨年度の研究計画を十分に遂行する時間が得られなかった。骨親和性のある株化腫瘍細胞を取得、増殖させー80°Cで保存した。また、Wnt5a発現レトロウィルスベクターをラージスケールで増殖させ、純化しー30°Cに保存するにとどまった。1先行論文で使用されていた細胞株を新規に購入し実験を行う:先行論文では、乳癌細胞はMDA-MB-231、Hs578T、前立腺癌細胞PC3、LNCaPが用いられている。これらの細胞株を、購入または譲渡により取得し、リアルタイムPCR法を用い骨転移惹起関連分子の定量を試みる。2カスタムメイドのプライマーを用いる:平成24年度の実験において、自作のプライマーを用いポジティブコントロールで目的遺伝子の発現は認めている。しかし、上記1の細胞株を用い骨転移惹起因子の発現が低い場合、新たにプライマーを購入して実験を行うことも考慮する。3ヒトWNT5A、ROR2過剰発現用ウイルスベクターの作製:平成24年度に引き続き、平成25年度も引き続きベクターの作製を行い、1の実験で予想された結果が得られ次第、速やかに過剰発現実験に移行できるように準備を進める予定である。腫瘍細胞においてWnt5aにより、Wnt非古典経路が活性化されると骨転移惹起因子であるRANKの発現が亢進するかどうかを検討する。4腫瘍細胞に発現するWnt5aの増減により骨芽細胞への遊走能が変化するかを検討する:腫瘍細胞に発現するWnt5aの増減により、骨芽細胞への遊走能が変化するかを検討するために、以下の実験を行う。ボイデンチャンバーを用い、下層にヒト骨芽細胞様細胞を培養(骨肉腫細胞株を使用)し、上層にはWnt5aを過剰発現させた腫瘍細胞を培養する。
技術連関表に基づく日本の研究開発基盤の評価及び科学技術政策の立案に関する研究

本研究の基本的目的は、(1)科学技術データベース(論文データベースのINSPEC,COMPENDEX, JOIS、および特許データベースのPATOLIS,WPI等)を用いて技術連関表を作成し、世界の科学技術の進歩の基本的トレンドを明らかにすること(とりわけ、情報通信分野のそれを明らかにすること)、(2)アメリカの技術連関表と日本のそれを比較対照することによって日本の科学技術の進歩が世界の潮流の中でどのように位置づけられているかを解明すること、(3)日本の研究開発基盤の特質や問題点を析出すること、にあった。このうち、(1)(2)については世界の情報通信ネットワークがソフトウェアをベースとしたコンピュータネットワーク(インターネットに代表される)に向かっているのに、日本がハードウェアにバイアスのかかったテレコムネットワーク(電話網の延長上にある)への指向が、1990年代を通して強かったことを解明することが出来たこと、等、当初の目的をかなりの程度において達成できた。とりわけ、INSPEC,COMPENDEXから作成された技術連関表や、WPIの検索から得られた主要国の特許取得件数のデータがこの分析に極めて有意義であることが分かった。今後の課題として、さらに情報通信分野に限らず、21世紀に間違いなく重要になる生物生命科学・工学分野にまで拡大して分析することの必要性を確認することが出来た。(3)については、上述の日本の特徴が、マクロ的(産業組織や官民の連携システム)にもミクロ(企業組織や雇用慣行)的にもにもさまざまなレベルでの制度的要因と不可分であること等を解明できたが、さらに今後の一層の分析が必要であることが確認された。本研究の目的は、アメリカに比して立ち後れの目立っている日本の科学技術研究基盤の育成に向けた取り組みについて、その実態把握とそのあるべき政策の方向性についてのそれを論じること、とりわけ21世紀の経済社会を切り開くであろう情報通信ネットワーク系の技術について論じることにある。具体的には、科学技術データベースから作成された技術連関表に依拠して分析する。当初は科学技術論文のデータベースを中心に分析する予定であったが、研究の過程で特許データベース(WPI)の有効性が高いことが確認されたので、その分析も加えた。分析の結果、日本の科学技術研究基盤がハードウェアに偏りソフトウェア分野が脆弱であること、基礎研究への人的資金的投資の不足が目立つことことを始め、多くの興味深い事実が分かった。また、あるべき方向性についても、ソフトウェア分野の例をあげれば、従来の人工知能のような研究ではなくエージェントソフトウェアのような新しい知的なソフトウェアの開発が必要であることなど、現在の技術進歩のトレンドを確認できたたたもに、このようなシフトに関して日本がアメリカよりも大きく遅れていることも理解できた。分析の結果は、2つの著作として刊行された。次年度は、これを踏まえてさらに日本のあるべき科学技術研究基盤の育成の方向性について研究を深める予定である。11年度は主として技術連関表の作成に重点が置かれたが、12年度はその解析・解釈に重点を置いて分析した。上の3点のうち、(1)(2)については世界の情報通信ネットワークがソフトウェアをベースとしたコンピュータネットワーク(インターネットに代表される)に向かっているのに、日本がハードウェアにバイアスのかかったテレコムネットワーク(電話網の延長上にある)への指向が、1990年代を通して強かったことを解明することが出来たこと、等、当初の目的をかなりの程度において達成できた。

とりわけ、INSPEC,COMPENDEXから作成された技術連関表や、WPIの検索から得られた主要国の特許取得件数のデータがこの分析に極めて有意義であることが分かった。今後の課題として、さらに情報通信分野に限らず、21世紀に間違いなく重要になる生物生命科学・工学分野にまで拡大して分析することの必要性を確認することが出来た。(3)については、上述の日本の特徴が、マクロ的(産業組織や官民の連携システム)にもミクロ的(企業組織や雇用慣行)にもにもさまざまなレベルでの制度的要因と不可分であること等を解明できたが、さらに今後の一層の分析が必要であることが確認された。
ミトコンドリア由来活性酸素生成によるシアン中毒等の細胞・臓器・個体の死の分子機構

我々はこれまでの実験においてラットに青酸カリを経口投与し死亡させると、その濃度に応じて脳、肺、心、腎、肝などの各臓器のシアンの作用点であるチトクロームオキシダーゼ活性が低下することを報告していた。また、それらのチトクロームオキシダーゼ活性の抑制は脳と心臓で高度であることが分かっていた。さらに、低酸素下においたラットは青酸カリの影響を受けにくいことが分かっていた。本研究では、副腎腫瘍由来の神経細胞であるPC12細胞を虚血の条件としてよく用いられているグルコースと血清のない環境下に置き、細胞変化を観察した。すると死亡するほとんどの細胞はPI、ヘキスト等の蛍光試薬、タネル法等で観察するとネクローシスに陥っていた。一方、ミトコンドリアの電子伝達系を阻害する試薬であるDPIを投与するとほとんどの細胞がアポトーシスに陥った。この現象は心筋由来の細胞であるH9C2細胞の方が顕著に現れていたため、以後H9C2細胞を用いて実験を継続した。H9C2細胞の虚血条件の一つである0.2%の低酸素環境下で1時間おきに、細胞の形態学的変化を観察したが、有意な変化は観察されなかった。蛍光試薬を用いても変化は観察されなかった。細胞死の指標であるLDH活性の上昇もなく、低酸素だけでは細胞死は起こらないことが判明した。ところが、低酸素環境におかれた後のミトコンドリアのチトクロームオキシダーゼ活性を測定すると、酵素活性が低酸素時間依存性に上昇していることが観察された。ウエスタンブロットによって観察すると、チトクロームオキシダーゼ・サブユニットIおよびIVのタンパク量は一時的に抑制されるが、低酸素時間依存性に上昇していることが判明した。また、RT-PCR法によって、このたんぱく質のメッセンジャーRNAの発現を観察すると、一時的に抑制されるが、時間依存性にメッセンジャーRNAの発現が急激に上昇していることが判明した。ミトコンドリアの酵素活性の上昇は、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性についても認められ、ミトコンドリア全体の活性が上昇していることも示唆された。この低酸素によるミトコンドリア機能の上昇のメカニズムを解明することを目的として、低酸素下での活性酸素の生成を測定した。細胞が低酸素下に置かれると、活性酸素の生成が一時的に抑制されるが、時間依存性に増加していることが観察された。したがって、低酸素下に増加する活性酸素がミトコンドリアの機能上昇と引き続くミトコンドリアタンパクの合成の何らかの誘引になっている可能性が示唆された。これまでの実験においてラットに青酸カリを経口投与し死亡させると、その濃度に応じて脳、肺、心、腎、肝などの各臓器のシアンの作用点であるチトクロームオキシダーゼ活性が低下することを報告していた。そこで本年度ははじめに、神経細胞であるPC12細胞を虚血の条件としてよく用いられているグルコースと血清のない環境下に置き、細胞変化を観察した。死亡するほとんどの細胞はPI、ヘキスト等の蛍光試薬、タネル法等で観察するとネクローシスに陥っていた。この現象は心筋細胞であるH9C2細胞の方が顕著に現れていたため、以後H9C2細胞を用いて実験を継続した。H9C2細胞の虚血条件の一つである低酸素環境下での細胞の変化を観察した。0.2%の低酸素では細胞の形態学的変化は観察されなかった。しかし、ミトコンドリアのチトクロームオキシダーゼ活性が低酸素時間依存性に上昇することが判明した。酵素活性の上昇はチトクロームオキシダーゼ・サブユニットIおよびIVのメッセンジャーRNAと蛋白増加によって引き起こされていることが判明した。さらに酵素活性の上昇は、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性についても認められ、ミトコンドリア全体の活性が上昇していることが示唆された。低酸素によるミトコンドリア機能の上昇は、ミトコンドリアをターゲットとするシアンを代表とする各種薬毒物中毒の治療にも応用できる可能性が考えられた。

H9C2細胞の虚血条件の一つである0.2%の低酸素環境下で1時間おきに、細胞の形態学的変化を観察したが、有意な変化は観察されなかった。蛍光試薬を用いても変化は観察されなかった。細胞死の指標であるLDH活性の上昇もなく、低酸素だけでは細胞死は起こらないことが判明した。ところが、低酸素環境におかれた後のミトコンドリアのチトクロームオキシダーゼ活性を測定すると、酵素活性が低酸素時間依存性に上昇していることが観察された。ウエスタンブロットによって観察すると、チトクロームオキシダーゼ・サブユニットIおよびIVのタンパク量は一時的に抑制されるが、低酸素時間依存性に上昇していることが判明した。また、RT-PCR法によって、このたんぱく質のメッセンジャーRNAの発現を観察すると、一時的に抑制されるが、時間依存性にメッセンジャーRNAの発現が急激に上昇していることが判明した。ミトコンドリアの酵素活性の上昇は、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性についても認められ、ミトコンドリア全体の活性が上昇していることも示唆された。この低酸素によるミトコンドリア機能の上昇のメカニズムを解明することを目的として、低酸素下での活性酸素の生成を測定した。細胞が低酸素下に置かれると、活性酸素の生成が一時的に抑制されるが、時間依存性に増加していることが観察された。したがって、低酸素下に増加する活性酸素がミトコンドリアの機能上昇と引き続くミトコンドリアタンパクの合成の何らかの誘引になっている可能性が示唆された。
動脈硬化病変の形成過程におけるカベオリンの役割

悪性腎硬化症のモデルとなるDahl食塩感受性(Dahl-S)ラットでは、高食塩食負荷18週後に腎皮質特異的にカベオリン-1の発現が増加していた。しかし、腎血管病変が出現する前の11週のDahl-Sラットや、Dahl食塩非感受性(-R)ラット腎臓ではこのような変化はみられなかった。また、アンジオテンシノーゲン遺伝子欠損(Atg-/-)マウスにおいては、血管平滑筋細胞の増殖および配列異常を含む腎血管の肥厚性病変がみられ、この部位にカベオリン-1が過剰発現していた。一方、糸球体においてはメサンギウムの増殖を伴う腎炎モデルを作成するとカベオリンの発現増加がみられるのに対し、主として腎微小循環の血行動態異常(糸球体過剰濾過)のモデルとなる5/6腎摘ラットではカベオリンの発現は変化しなかった。一酸化窒素(NO)は平滑筋の増殖を抑制するパラクリン因子として重要であり、カベオリンは内皮型NO合成酵素(eNOS)活性の抑制性制御分子として知られている。そこで、上記のモデルにおけるeNOS発現を検討したところ、食塩負荷18週後のDahl-SラットやAtg-/-マウスの腎臓においてはeNOS発現が減少していることが明らかとなった。さらに、Atg-/-マウスの腎灌流圧を上昇させるため塩分負荷を行ったところeNOS発現は増加し、カベオリン発現は減少した。塩分摂取量による影響を除くため、ヒドララジンによって血圧を対照群と同様に下降させたところ、これらの変化はみられなくなった。また、preliminary dataであるが、これらのモデル動物にHMG-CoA阻害薬を投与すると血管壁カベオリン発現が減少し、eNOS発現の増加がみられた。以上の結果から、血管肥厚性病変において過剰に発現したカベオリンがeNOS活性を抑制することにより平滑筋の増殖を促進している可能性がある。アンジオテンシノーゲン遺伝子欠損(Atg-/-)マウスおよびAT1a受容体遣伝子欠損(Atla-/-)マウスの病理学的検索を行ったところ、光顕レベルで腎臓の葉間動脈小葉間動脈を中心として高度な壁肥厚と平滑筋の増殖が認められた。電顕レベルでは、平滑筋細胞の配列と内弾性板の走行異常ならびに増生が認められた。これちの所見は腎臓特異的な病変であった。これらは、Dahl食塩感受性(Dahl-S)ラットの腎血管病変(12週令以降)と類似していた。血管病変の性質を明らかにするため内皮型一酸化窒素(NO)合成酸素(eNOS)の発現を検討したところ、Atg-/-マウスの葉間小葉間動脈においてeNOSの発現がmRNAレベルで著明に抑制されていることが明らかとなった。eNOSの活性の指標となるNADPHdiaphorase活性の検討でも再現性が認められた。また、Atla-/-マウスの同部位においては、塩分摂取量の違いによってeNOSの発現および活性が野生型にはみられない異常な変化を示し、血管内皮機能の恒常性が損なわれていることが示唆された。一方、Dahl-Sラットにおいても血管病変の進行とともにeNOSの発現低下がみられた。次にeNOS発現異常のメカニズムを明らかにするために、カベオリン-1について検討を加えた。その結果、Atg-/-マウスの葉間小葉間動脈の内皮では、野生型動物と比較してカベオリン-1の発現が減弱していた。

Dahl-Sラットにおいても動脈硬化病変を呈した部位の内皮においてカベオリン-1の発現が低下していた。一方、Atl-/-マウスの塩分摂取量を変化させても、カベオリン-1は一定の発現を維持していた。カベオリンはeNOSの活性を抑制的に制御している代表的な膜タンパクであるが、モデル動物の病変部位にみられる血管内皮のeNOS発現の低下は、カベオリンが過剰に発現した結果とは考えにくく、内皮の細胞膜自体の病変が関与しているものと堆測される。レニン・アンジオテンシン系遺伝子欠損マウスの腎血管特異的肥厚性病変の検索過程で、Atg-/-マウスは血管壁におけるカベオリンならびにeNOS発現が野生型と比較して著明に減少していること、Atla-/-マウスではこれらの変化は認められないが、食塩摂取量を変化させると摂取量に並行したeNOS発現の変化のみられることが明らかとなった。ただし、カベオリンにはそのような変化は認められなかった。一方、野生型マウスではこれら両者の変化はみられなかった。これらのことから当初は、血管病変に関与する可能性の高いeNOSの発現低下にカベオリンは関連性が薄いと考えられたが、その後、Atg-/-マウスを用いた検討ではカベオリンtype-1および-2の発現が塩分摂取量と逆相関する動きを示すことが明らかとなった。Atla-/-マウスにおける変化量は少ないため検出できなかった可能性がある。これらの結果は、レニン・アンジオテンシン系の欠損によるeNOSの恒常的発現の欠如がノックアウトマウスの腎臓特異的血管病変の原因の一つとなっている可能性、さらにeNOSの発現異常にカベオリンが関わっているという仮説を支持する結果となった。カベオリンアンチセンスオリゴヌクレオチドの作成が1-3typeについて完成したため、現在in vivoにおける導入結果を検討中である。悪性腎硬化症のモデルとなるDahl食塩感受性(Dahl-S)ラットでは、高食塩食負荷18週後に腎皮質特異的にカベオリン-1の発現が増加していた。しかし、腎血管病変が出現する前の11週のDahl-Sラットや、Dahl食塩非感受性(-R)ラット腎臓ではこのような変化はみられなかった。また、アンジオテンシノーゲン遺伝子欠損(Atg-/-)マウスにおいては、血管平滑筋細胞の増殖および配列異常を含む腎血管の肥厚性病変がみられ、この部位にカベオリン-1が過剰発現していた。一方、糸球体においてはメサンギウムの増殖を伴う腎炎モデルを作成するとカベオリンの発現増加がみられるのに対し、主として腎微小循環の血行動態異常(糸球体過剰濾過)のモデルとなる5/6腎摘ラットではカベオリンの発現は変化しなかった。一酸化窒素(NO)は平滑筋の増殖を抑制するパラクリン因子として重要であり、カベオリンは内皮型NO合成酵素(eNOS)活性の抑制性制御分子として知られている。そこで、上記のモデルにおけるeNOS発現を検討したところ、食塩負荷18週後のDahl-SラットやAtg-/-マウスの腎臓においてはeNOS発現が減少していることが明らかとなった。さらに、Atg-/-マウスの腎灌流圧を上昇させるため塩分負荷を行ったところeNOS発現は増加し、カベオリン発現は減少した。塩分摂取量による影響を除くため、ヒドララジンによって血圧を対照群と同様に下降させたところ、これらの変化はみられなくなった。
ハダニ類の群れとしての性質を左右する付和雷同

前年度までの研究成果より、ハダニ類の歩行跡(吐糸)は、ハダニの個体及び集団の行動を制御する手段として利用される一方で、ハダニの捕食者であるカブリダニがハダニを探索するためにも利用されることが明らかになりました。本年度は、成虫化前の感受期に絶食させたケナガカブリダニ個体を用いることにより、ハダニの歩行跡に対する安定した生物検定方法を確立しました。この検定法を用いて、カブリダニがハダニの吐糸の物理的構造か化学成分のいずれを感知しているかを調べました。まず、ナミハダニの歩行跡をメタノールで丁寧に洗浄した後、ハダニの吐糸の構造が流されずに残っていることを走査電子顕微鏡で確認しました。この洗浄後の吐糸をケナガカブリダニが追わなかったことから、カブリダニが感知しているのは、ハダニの吐糸の物理構造ではないことが示唆されました。次に、ナミハダニの吐糸だけを回収してメタノールで抽出した成分を濾紙に塗ると、ケナガカブリダニがこれを追跡したことから、カブリダニはハダニの歩行跡の化学成分を感知することが証明されました。ハダニの歩行跡の化学成分だけでカブリダニが誘引されたことや、ハダニの歩行跡に対するカブリダニの追跡反応の強さが、歩いたハダニの数と正相関する事実から、ハダニの歩行跡の化学成分の濃度を高めれば、カブリダニをより強く誘引できるものと思われます。以上の結果は、将来的にカブリダニ類を自在に誘導してハダニを生物防除する可能性を示す成果であると考えます。ナミハダニ(Tetranychus urticae Koch:以下「ハダニ」)の「群れ」としてのいくつかの性質に注目し、それらを実現する至近的メカニズムを探った。ナミハダニの雌成虫は集合して餌植物を加害するが、餌が劣化して1匹が歩行によって分散すると皆がこれに続く。行先が別れる場合には、後続個体は多数派が分散した道筋に続くので、多くのハダニ個体は分散した先の餌植物上で再び集合できる。一方、群れからはぐれたハダニは、群れの通過した道筋に出会えばこれに合流するが、さもなくば単独でコロニーを創設する。道筋の誘導効果は、同世代の後続個体に対してのみ有効である。これらの一見複雑にデザインされたハダニの「群れ」としての諸性質は、ハダニが歩行時に残す吐糸を後続個体が辿る、という単純なメカニズムによって自己組織化されていることを明らかにした。さらに、高密度下ではこの性質が暴走する結果、ハダニは餌植物株の上部に密集した網を張ることになる。この網がハエやガなどの飛翔性昆虫に便乗してハダニが分散することに役立つかどうかを実験的に検証した。その結果、昆虫を介した分散例は確認されたものの、その頻度は極めて低く、ナミハダニでは昆虫を介した便乗分散は起こりにくいと結論された。飛翔性昆虫を介したハダニ類の便乗分散については、本研究が世界初の検証例となる。上記成果の一部をExperimental and Applied Acarology誌にて公表した(研究発表を参照)。昨年までに、ハダニ類(ナミ/カンザワハダニ)の「群れ」としての一見複雑な諸性質は、ハダニの歩行跡(に残される吐糸)を後続個体が辿るという単純な行動規則によって自己組織化されていることを明らかにしたが、16年度はこのハダニ類の歩行跡をハダニ類の捕食性天敵であるカブリダニ類(チリ/ケナガ/ミヤコカブリダニ)が辿れるかどうかを検証した。その結果、在来種のカブリダニ(ケナガ/ミヤコ)はわずか1匹のハダニの歩行跡を辿れることや、数日前のハダニの歩行跡を辿れることが判明した。歩いて移動するハダニの過去の歩行跡は現在の居場所につながっている可能性があるため、ハダニを歩いて探すカブリダニにとって、ハダニの歩行跡は餌探索の有力な手掛りとなることが示された。一方、定説によればカブリダニはハダニに加害された植物の出す「匂い」を手掛りにしてハダニを探すと考えられている。カブリダニが加害葉の「匂い」を感知できるハダニの密度は葉当たり数十匹(雌成虫数)以上と報告されているが、10箇所で年に3回、合計3000枚の野生植物の葉をサンプリングしてハダニのコロニーサイズを調査したところ、葉当たり15匹のハダニのコロニーがほとんどであり、したがって野外のハダニを餌として存続するカブリダニにとって「匂い」は有力な手掛りになりえないことも判明した。以上の結果は、カブリダニの餌探索に関する定説に変更をせまるものである。これらの成果の一部を現在海外誌に投稿中である。