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高次表意と証拠性/意外性をめぐって

初年度は、関連性理論における高次表意を念頭におきながら、言語類型論で述べられている証拠性と意外性に関する書籍、論文、研究発表等の主張を整理することを第一のテーマとしていた。それに従って本研究テーマにかかわる書籍を購入し、かつ国内外の関連学会に参加した。第11回英語学会国際春季フォーラムではとりわけ「fake past」にかかわる口頭発表から「意外性」につながる言語現象が参考になり、それを現在印刷中の論文「テクストのテンスとダイクシス」に応用した。アメリカ語用論学会では認知語用論に関する口頭発表に参加し、国内外の研究者と交流することができた。慶應言語学コロキアムでの2日間にわたる西山佑司氏の意味論と語用論の境界についての連続講義はこれからの研究に示唆を与えてくれる有意義なものであった。また、本研究の中心テーマである、高次表意については「'-ly + speaking'の語用論」のなかで、英語ではコバートな側面となるものも日本語では言語化される具体例として'-ly + speaking'をとりあげ、言語を交差する高次表意の特徴を論じた。(1)関連書籍の収集、国内外の関連学会出席から有意義な資料を得ることができたこと、(2)昨年度の業績、「'-ly + speaking'の語用論」のなかで今年度の研究につながるポイントが複数みえてきたこと、などからおおむね順調に推移していると思われる。関連性理論における高次表意については「発話行為と命題態度などを反映する」とされるが、今年度は、証拠性は発話行為に、意外性は命題態度に密接に関連する可能性を検討する。また、高次表意は、英語では日本語と異なりコバートな形で認識されるため、その理論的位置づけについての議論が少ない。文法カテゴリーとしての証拠性と意外性を関連づけることにより、高次表意の理論的基盤を補強する。まずは、昨年度収集した各種資料や証拠性と意外性との論点を整理し、そこにかかわる言語現象が高次表意とどう交差するのか検討し、論文にまとめたい。
抗エンドセリン変換酵素遺伝子による急性腎不全の遺伝子治療に関する研究

初年度は、ラットにサイクロスポリンを投与することにより急性腎不全モデルを作成し、検討を行った結果、サイクロスポリンの投与により、血漿エンドセリン濃度は1時間後より上昇し、6時間後まで高値を示した。このとき腎糸球体においてppET-1mRNAは30分後より上昇していた。しかし、腎糸球体におけるECE-1(エンドセリン変換酵素-1)mRNAは6時間後より低下を始め約48時間後まで抑制され72時間後にコントロールレベルまで回復した。蛋白レベルでも腎糸球体および腎髄質においてECE-1発現が抑制されていた(J.Am.Soc.Nephrol,in press)。これらの成績は新たにECE-1 mRNAはなぜ抑制されたのかという問題を提起した。2年度はこの点について血管内皮細胞を用いて直接的に検討した。培養血管内皮細胞にエンドセリンを作用させるとECE-1 mRNAの発現は3時間目頃より低下し始め、6時間目に有意に減少した。この変化はエンドセリンA型受容体拮抗薬の存在下においても認められておりエンドセリンA型受容体は関与していない。エンドセリンB型受容体拮抗薬の存在下においては、この変化は消失しており、このエンドセリンによるECE-1 mRNAの発現の抑制はエンドセリンB型受容体を介していると思われた。最近、血管内皮細胞、腎メサンギウム細胞及び腎尿細管細胞においてエンドセリン-1自身によるオートインダクションが存在することが報告されており、これは一度エンドセリン産生が高まる状況に陥ると、そのオートインダクションによって過剰のエンドセリンが産生され続け、病態が悪化していく可能性を示唆している。私達の成績はエンドセリン自身によるnegative feedbackの存在を示唆し、過剰に産生されるエンドセリンを減少させる調節機構があり腎障害を緩和する機序が存在することを示唆している。ラットにサイクロスポリンを投与することにより急性腎不全モデルを作成し、検討を行った。サイクロスポリンの投与により、血漿エンドセリン濃度は1時間後より上昇し、6時間後まで高値を示した。このとき腎糸球体においてppET-1 mRNAは30分後より上昇していた。しかし、腎糸球体におけるECE-1mRNAは6時間後より低下を始め約48時間後まで抑制され72時間後にコントロールレベルまで回復した。蛋白レベルでも腎糸球体および腎髄質においてECE-1発現が抑制されていた。A型受容体及びB型受容体mRNAも6時間から24時間において抑制されていた。これらのことよりサイクロスポリンによる急性腎不全の発現にはppET-1 mRNAの発現増加が関与しており、ECE-1は、むしろ抑制的に働いている可能性が示唆された。このことはET-1自身によるnegative feedbackの存在を伺わせるが、現在のところその機構の報告はなく、サイクロスポリンに自身による直接作用の可能性もある。ECE-1mRNAの抑制については、競合的PCRによるmRNAの定量化を行っており、また蛋白レベルでの低下も認めていることから、恐らくECE-1にはエンドセリン自身などによる何らかの制御機構が存在するものと思われる。最近、血管内皮細胞、腎メサンギウム細胞及び腎尿細管細胞においてエンドセリン-1自身によるオートインダクションが存在することが報告されており、これは一度エンドセリン産生が高まる状態に陥ると、そのオートインダクションによって過剰のエンドセリンが産生され続け、病態が悪化していく可能性を示唆している。私達のサイクロスポリン投与による急性腎不全で見られたECE-1の抑制は、過剰に産生されるエンドセリン-1にnegative feedbackをかけている可能性が示唆される。

前年度、ラットにサイクロスポリンを投与することにより急性腎不全モデルを作成し、検討を行った結果、サイクロスポリンの投与により、血漿エンドセリン濃度は1時間後より上昇し、6時間後まで高値を示した。このとき腎糸球体においてppET-1 mRNAは30分後より上昇していた。しかし、腎糸球体におけるECE-1 mRNAは6時間後より低下を始め約48時間後まで抑制され72時間後にコントロールレベルまで回復した。蛋白レベルでも腎糸球体および腎髄質においてECE-1発現が抑制されていた(J.Am.Soc.Nephrol,in press)。これらの成績は新たにECE-1 mRNAはなぜ抑制されたのかという問題を提起した。今年度はこの点について血管内皮細胞を用いて直接的に検討した。培養血管内皮細胞にエンドセリンを作用させるとECE-1 mRNAの発現は3時間目頃より低下し始め、6時間目に有意に減少した。この変化エンドセリンA型受容体拮抗薬の存在下においても認められておりエンドセリンA型受容体は,関与していない。エンドセリンB型受容体拮抗薬の存在下においては、この変化は消失しており、このエンドセリンによるECE-1 mRNAの発現の抑制はエンドセリンB型受容体を介していると思われた。最近、血管内皮細胞、腎メサンギウム細胞及び腎尿細管細胞においてエンドセリン-1自身によるオートインダクションが存在することが報告されており、これは一度エンドセリン産生が高まる状況に陥ると、そのオートインダクションによって過剰のエンドセリンが産生され続け、病態が悪化していく可能性を示唆している。私達の成績はエンドセリン自身によるnegative feedbackの存在を示唆し、過剰に産生されるエンドセリンを減少させる調節機構があり腎障害を緩和する機序が存在することを示竣している。
ショウジョウバエにおける記憶細胞の同定と解析

記憶情報をコードする細胞の同定を目指し、長期記憶に必須な転写因子であるCREBに着目してCREBレポーター遺伝子を設計し、これを持つショウジョウバエを作製した。このレポーターはショウジョウバエの記憶中枢であるキノコ体の細胞を顕著にラベルすることが解り、その中のγ細胞が記憶の全過程で重要であることを発見した。これまでCREBは長期記憶に必須の因子であることが言われてきたが、CREBが活性化する細胞は短期記憶にも重要であることが示された。平成24年度に作製したCREBレポータートランスジェニックフライを用いて、レポーターでラベルされる細胞群の記憶学習に機能解析を行った。ショウジョウバエの記憶中枢であるキノコ体は解剖学的にα/β、α'/β'、γ細胞に分類されるが、レポーター陽性細胞はγ細胞が大半を占めるため、レポーター陽性γ細胞に主眼をおいて解析した。レポーター陽性γ細胞の出力をshibire遺伝子の発現によって温度依存的に阻害したとき、どの記憶のどのステップでこれらの細胞の機能が必要かを調べたところ、短期記憶・長期記憶の全てのステップで必要不可欠であることを見いだした。しかしながら、これまでの知見ではγ細胞は短期記憶の読み出しに寄与するのみであり、本研究データと矛盾が生じる。そこで私はCREBレポーターには既存のエンハンサートラップ系統とは異なる特有のγ細胞ラベリングのパターンが存在するのではないかと考えた。そこでレポーターによるshibire遺伝子の発現パターンを既存のγ細胞のエンハンサートラップ系統を共存させて乱したところ、記憶障害から回復することを発見した。つまり、CREBレポーターと既存のエンハンサートラップ系統はほぼ共通のγ細胞をラベルするものの、CREBレポーター特有のラベリングパターンが存在し、これがγ細胞に特有の機能を与えうることが明らかになった。このことは、CREB活性が記憶のコーディングの決定因子であるというマウスの先行研究の結果とも一致するとともに、CREBが活性化される細胞は長期記憶だけでなく、短期記憶においても重要な役割を担うという意義深い知見を与える。内在性のCREB活性をモニターするためのCREBレポーターを持つトランスジェニックフライの作製に既に成功していたので、これを基に本年度はCREBレポーターによってラベルされるCREB活性化細胞において遺伝子発現させる実験系を構築し、それらの細胞の機能解析を実施した。CREB活性化細胞においてCREB活性を阻害すると忌避長期記憶が阻害されたことから、これらの細胞におけるCREB活性が長期記憶に必要であることが解った。また、これらの細胞の神経活動を阻害する実験から、CREB活性化細胞のうちキノコ体γ細胞の出力は記憶の維持と読み出しに、キノコ体以外の細胞は忌避記憶の維持に必要であることも解った。キノコ体においてCREB活性化細胞の神経活動を亢進したハエでは電気ショックを受けたときと類似した行動が見られ、匂いと連合させると記憶形成ができることが解った。エンハンサートラップ系統を使ってキノコ体の神経活動を活性化してもこのような異常行動は見られず、匂いとの連合学習も成立しなかったことから、キノコ体の細胞のうち、CREB活性化細胞が忌避情報の伝達に優位性を持つことが示唆された。また、CREB活性化細胞の出力を阻害しても、報酬系長期記憶の読み出しは阻害されなかったことから、CREB活性は忌避情報を伝達する細胞の決定に重要な働きを持つ可能性が示唆された。キノコ体は匂いの情報と忌避情報が連合する部位であるが、キノコ体のどの細胞で情報の連合が起こるかは解っていない。特にドーパミンニューロンから忌避情報を受け取るキノコ体細胞についてはよくわかっていないが、本年度の研究によってその突破口を開く可能性が出てきた。初期のCREBレポーターではCRE配列の下流に分解配列を付与したGFPを導入し、長期記憶形成依存的にCREBが活性化される細胞をGFP蛍光を指標に同定するというものであった。しかしCRE配列の下流にGAL4遺伝子やGeneSwitch遺伝子を導入して既存のトランスジーンを発現させるシステムを構築すると、トランスジーンの分解速度が遅く、記憶形成依存的に反応する細胞だけでトランスジーンを発現させることが困難となってしまった。そこで、記憶形成の有無にかかわらず、全てのCREB活性化細胞の中から記憶形成に関与する細胞の同定に目的を切り替えた。特に記憶中枢であるキノコ体の各細胞集団の機能の同定に注視し、その結果CREB活性化細胞が最も顕著であるγ細胞が忌避情報の伝達に関与している可能性を見いだし、新たな局面をむかえるに至った。成虫個体のCREB活性化細胞でのみ遺伝子発現をする実験系も既に構築済みである。今後はこれを利用して成虫脳のどの領域さらにはキノコ体の中のどの細胞集団でのCREBの機能が長期記憶あるいは忌避情報の伝達に必要であるか、忌避記憶・報酬記憶の両パラダイムを用いて調べていく。CREB活性化細胞をさらに細分化して機能解析を行うため、次年度の研究費は主に取らんトランスジェニック系統の作製費用に充てる。
言語コーパスを用いた「確率的規則からの逸脱予測システム」の構築

連言錯誤と呼ばれる確率判断のバイアスに対して提案されたベイズ的確証度判断に基づく説明を言語統計的データを用いて検討した.言語統計データから算出した確証度指標を,先行研究の実験結果に当てはめ,中心的な確証度指標が実験結果に高い当てはまりを示すことを明らかにした.この知見は,実験参加者は連言の確証度を評価している可能性を示唆すると共に,言語統計的データが確率判断のバイアスを説明する上で重要な役割を果たしうる可能性を示すものといえる.本研究では、言語コーパスによる人間の判断が確率的な規則から逸脱する現象の予測システムを構築することを目的とする。本研究で対象とするのは、3つの確率規則からの逸脱現象(連言錯誤、基準比率の無視、Salience Bias)とし、以下の2つのステップでシステムを構築する。平成23年度は、利用する確証度の選定(各現象に対して、大量言語コーパスを用いて確証度を計算する。もっとも人間の意思決定を予測可能な確証度を割り出すため、確証度と心理実験結果を比較しする)と連言錯誤に対する研究を行った。言語コーパスの利用環境の構築では、公開されている言語データ収集し、単語頻度計算のためのデータベースを作成した。収集したデータは、ALAGINフォーラムで公開されているデータ、新聞データ、Blogデータ等である。「連言錯誤」に対する研究では、まず、心理実験を行った。先行研究から、連言錯誤の問題文を抽出し課題とした(英語論文が主なため、その翻訳を行い実験課題とした)。心理実験を行った後、確証度の計算を行った。具体的な手順としては、言語コーパスには上記で構築したデータベースを利用し、抽出単語の頻度を計算した。その頻度情報から確信度を計算し、心理実験の結果と比較した。これらの一連の結果から、Crupi, Tentori & Gonzalez(2007)が提案している確証度Zを言語コーパスデータを利用して計算した値と連言錯誤が起こる割合の間に有意な正の相関が見られた。この確証度Zに関しては,互いの事象の確率の差異が小さい場合,大きい方の確率の事象の評価が大幅に修正される特徴を持っている。このような特徴が人間の確率規則からの逸脱現象の原因となっていることが実験結果による議論から明らかになってきた。連言錯誤のみならず、比率基準の無視にも同様の傾向があることが示唆された。本研究では、言語コーパスによる人間の判断が確率的な規則から逸脱する現象の予測システムを構築することを目的とする。本研究で対象とするのは、確率規則からの逸脱現象である連言錯誤とし、以下の2つのステップでシステムを構築する。I.利用する確証度の選定:各現象に対して、大量言語コーパスを用いて確証度を計算する。もっとも人間の意思決定を予測可能な確証度を割り出すため、確証度と心理実験結果を比較しする。II.人間の判断が確率的な規則から逸脱する現象の予測システムの構築:対象となる文章を入力すると、その中から単語をピックアップし、その単語の組み合わせについて、それぞれの現象が起こる可能性を言語コーパスを用いた確証度計算によって予測する。連言錯誤に対する研究では、まず、心理実験を行った。先行研究から、連言錯誤の問題文を抽出し課題とした。また、本研究で構築した言語コーパスデータベースを使用し、単語の出現頻度、共起頻度を計算した。その頻度情報から、確証度を計算し、心理実験の結果と比較した。その結果、Crupi et al.(2007)が提案している確証度Zを言語コーパスデータベースを利用して計算した値と連言錯誤が起こる割合の間に有意な正の相関が見られた。この確証度Zに関しては、お互いの事象の確率の差異が小さい場合、大きい方の確率の事象の評価が大幅に更新される特徴を持っている。このような特徴が人間の確率規則からの逸脱現象の原因となっている可能性が示される結果となった。言語コーパスデータベースと確証度Zを使用して、人間の判断が確率的な規則から逸脱する現象の予測システムの構築を行った。このシステムでは、分析対象となる単語を3つ入力する。その入力した分析対象語について、言語コーパスデータベースから確証度Zを計算する。計算された確証度の差が、どの程度確率的な規則から逸脱しやすいのかという値として提示されるものとなっている。

収集したデータは、ALAGINフォーラムで公開されているデータ、新聞データ、Blogデータ等である。「連言錯誤」に対する研究では、まず、心理実験を行った。先行研究から、連言錯誤の問題文を抽出し課題とした(英語論文が主なため、その翻訳を行い実験課題とした)。心理実験を行った後、確証度の計算を行った。具体的な手順としては、言語コーパスには上記で構築したデータベースを利用し、抽出単語の頻度を計算した。その頻度情報から確信度を計算し、心理実験の結果と比較した。これらの一連の結果から、Crupi, Tentori & Gonzalez(2007)が提案している確証度Zを言語コーパスデータを利用して計算した値と連言錯誤が起こる割合の間に有意な正の相関が見られた。人間の判断が確率的な規則から逸脱する現象の予測システムのベースは完成しているが、確率判断の心理学実験がまだ実施できていないため、やや送れていると判断する。コーパスのデータベースの構築と、連言錯誤現象についての心理実験、コーパスからの連言錯誤現象の予測ができたため、平成23年度に予定していた内容を予定通りに終了できたといえる。基準比率の無視」、「Salience Bias」をターゲットとして研究を行っていく。前年度と同様の手順で、心理実験・確証度の計算を行い、言語コーパスによる人間の判断が確率的な規則から逸脱する現象の予測を行っていく。心理実験:先行研究から、「基準比率の無視」、「Salience Bias」の問題文を抽出する。英語論文が主なため、その翻訳を行い、実験課題とする。また、Salience Biasに関しては国勢調査等の最新のデータを用意し、実験課題に用いる。今年度は予測システムを完成させる。帯域幅の大きいのネットワーク環境で言語コーパスを収集し、計算用のワークステーションを購入し、システムを完成させる。「基準比率の無視」、「Salience Bias」をターゲットとして研究を行っていく。確証度計算:実験で使用した課題から、単語を抽出し、確証度を計算する。言語データには1年目で作成したデータベースに新しいものを加えて利用し、抽出単語の頻度を計算する。さらに、確信度それぞれを計算し、心理実験の結果と比較する。人間の判断が確率的な規則から逸脱する現象の予測システムのためのベースとなる知見を24年度中に明らかにし、最終年度は予測システムを構築をおこなう。23年度は所属機関のワークステーションを利用できたため、予定していたワークステーションを購入せずに研究ができたが、実行時間等の観点から、さらに大きなマシンパワーを持ったワークステーションが必要であることがわかった。
シュレディンガー方程式の準古典解析

15,16年度本科学研究費で以下の4つの研究を行った.1.双曲型平衡点の近傍における超局所特異性の伝播の研究(J.-F.Bony, T.Ramond, M.Zerzeriとの共同研究)2.島の中の井戸型ポテンシャルが生成するレゾナンスの虚部の研究(A.L.Benbernou, A.Martinezとの共同研究)3.2次元2レベルシュレディンガー作用素の錐状交叉モデルの研究(C.Lasser, L.Nedelecとの共同研究).4.一階常微分方程式系に対する完全WKB法の理論の研究(L.Nedelecとの共同研究).1は,ハミルトニアンの双曲型平衡点に附随する安定多様体上の超局所特異性が不安定多様体に伝搬するかと言う問題である.この問題を,解析関数および滑らかな関数の範疇で解いた.この結果については,共同研究者のJ.-F.Bonyがパリの研究集会で発表した.2の問題は,ポテンシャルが解析的な場合の既知の結果(Helffer-Sj"ostrand)を,滑らかなポテンシャルの場合に拡張したものである.島の境界にはcausticsが現れるが,ここで解をAiry型の積分で表示し,相関数,振幅関数を概解析拡張を用いて複素空間に拡張することにより,WKB解をcausticsを超えて接続することに成功した.3は,ポテンシャルの固有値が錐状交叉する2次元シュレディンガー作用素のモデルについて,レゾナンスの量子化条件を求める問題である.一次元に帰着し,完全WKB法を適用することにより解決した.この結果は現在論文として執筆中である.4は3で用いた手法を一般化したものである.シュレディンガー方程式に対して構築された完全WKB法の理論を一階の常微分方程式系に拡張し,さらに確定特異点の近傍でのWKB階の構成方法およびその接続を研究した.この結果は6月に京都大学で行われた国際研究集会で発表した.現在論文として執筆中である.15,16年度本科学研究費で以下の4つの研究を行った.1.双曲型平衡点の近傍における超局所特異性の伝播の研究(J.-F.Bony, T.Ramond, M.Zerzeriとの共同研究)2.島の中の井戸型ポテンシャルが生成するレゾナンスの虚部の研究(A.L.Benbernou, A.Martinezとの共同研究)3.2次元2レベルシュレディンガー作用素の錐状交叉モデルの研究(C.Lasser, L.Nedelecとの共同研究).4.一階常微分方程式系に対する完全WKB法の理論の研究(L.Nedelecとの共同研究).1は,ハミルトニアンの双曲型平衡点に附随する安定多様体上の超局所特異性が不安定多様体に伝搬するかと言う問題である.この問題を,解析関数および滑らかな関数の範疇で解いた.この結果については,共同研究者のJ.-F.Bonyがパリの研究集会で発表した.2の問題は,ポテンシャルが解析的な場合の既知の結果(Helffer-Sj"ostrand)を,滑らかなポテンシャルの場合に拡張したものである.島の境界にはcausticsが現れるが,ここで解をAiry型の積分で表示し,相関数,振幅関数を概解析拡張を用いて複素空間に拡張することにより,WKB解をcausticsを超えて接続することに成功した.3は,ポテンシャルの固有値が錐状交叉する2次元シュレディンガー作用素のモデルについて,レゾナンスの量子化条件を求める問題である.一次元に帰着し,完全WKB法を適用することにより解決した.この結果は現在論文として執筆中である.4は3で用いた手法を一般化したものである.シュレディンガー方程式に対して構築された完全WKB法の理論を一階の常微分方程式系に拡張し,さらに確定特異点の近傍でのWKB階の構成方法およびその接続を研究した.この結果は6月に京都大学で行われた国際研究集会で発表した.現在論文として執筆中である.本年度本科学研究費で以下の三つの研究を行った.1.ホモクリニック軌道が生成するレゾナンス(多次元の場合)の研究(J.-F.Bony, T.Ramond, M.Zerzeriとの共同研究).2.島の中の井戸型ポテンシャルが生成するレゾナンスの虚部の研究(A.L.Benbernou, A.Martinezとの共同研究).3.断熱遷移の問題に附随するレゾナンスの研究(C.Lasser, L.Nedelecとの共同研究).1の問題については,ホモクリニック軌道の近傍でモノドロミー作用素を定義し,その存在を示した.モノドロミー作用素とは,軌道上の一点の近傍での超局所解に対して,それを軌道にそって接続し,軌道を一周したあとの同じ点での超局所解を対応させる作用素である.この作用素をフーリエ積分作用素を使って書くことができることを示した.実際にこの作用素の漸近展開が計算できれば,それが恒等作用素であるという条件が量子化条件を与える.この結果については東北大学,京都大学(2回)での国際研究集会で途中経過として発表している.2の問題は,ポテンシャルが解析的な場合の結果を解析的とは限らない,滑らかな場合に拡張したものである.滑らかな関数の概解析拡張を用いた.この結果は中央大学での研究集会,大阪大学でのセミナーで発表した.3の問題を解くにあたって,一次元シュレディンガー方程式の完全WKB法を一階の連立方程式に一般化する必要がある.

2×2の系の場合については一般化に成功し,これをレゾナンスの量子化条件を求めるのに応用した.この結果については神戸大学,門司での研究集会で発表した.本年度本科学研究費で以下の四つの研究を行った.このうち1から3は前年度からの継続である.2.島の中の井戸型ポテンシャルが生成するレゾナンスの虚部(with A.L.Benbernou, A.Martinez).4.一階常微分方程式系に対する完全WKB法の理論(with L.Nedelec).1は,ハミルトニアンの双曲型平衡点に附随する安定多様体上の超局所特異性が不安定多様体に伝搬するかと言う問題である.この問題を,解析的およびC^∞両方の範疇で解いた.この結果については,共同研究者のJ.-F.Bonyがパリの研究集会で発表した.2の問題は,ポテンシャルが解析的な場合の既知の結果(Helffer-Sjostrand)を,C^∞の場合に拡張したものである.島の境界にはcausticsが現れるが,ここで解をAiry型の積分で表示し,相関数,振幅関数を概解析拡張を用いて複素空間に拡張することにより,WKB解をcausticsを超えて接続した.3は,ポテンシャルがV(x_1,x_2)=【numerical formula】であるシュレディンガー作用素のモデルについて,レゾナンスの量子化条件を求める問題である.一次元に帰着し,完全WKB法を適用することにより解決した.この結果は現在論文として執筆中である.4は3で用いた手法を一般化したものである.単独の方程式に対して構築された完全WKB法の理論を一階の連立方程式系に拡張し,さらに確定特異点の近傍でのWKB階の構成方法およびその接続を研究した.この結果は6月の京都大学での国際研究集会で発表し,また論文として執筆中である.
遺伝子導入法を用いたネフロン構成細胞の不死化培養株の開発

当初の計画をほぼ実践することができた。以下に項目別に要約する。温度感受性(ts)-SV40large T抗原遺伝子をマウスの胚に注入して第一世代の遺伝子導入マウスを作出した。この動物から腎を構成するネフロン各分節を単離して培養し、100代以上も継代可能な培養株を樹立した。2)樹立細胞株の特性の検討正常マウスから新鮮ネフロン各分節を単離し、分節特有の酵素の分布、代謝機能の局在性、ホルモン受容体の存在等を検索した。しかる後、当該ネフロン分節由来株化培養細胞の特性維持を比較検討した。樹立細胞株は由来部位の特異性を良く保持していたが、一部の特異酵素(γ-GTP)、特異代謝(糖新生)、ホルモン受容体(副甲状腺ホルモン)の喪失が認められた。3)樹立細胞株の薬理学、毒科学への応用近位尿細管終始部由来株化細胞を用いて抗腫瘍薬のシスプラチンによる腎障害の定量的評価と障害機序解明へのin vitro実験系が確立できた。髄質外層集合由来細胞にはATP受容体の発現が高く維持されており、この受容体タンパクをコードするcDNAクローニングに最適である。この研究は目下進行中である。当初に計画した研究をほぼ順調に進行させることができた。以下箇条書きに記す。1)トランスジェニックマウスの作出:SV40-T抗原をコードする遺伝子をマウス胚に注入し、子宮に戻して第一世代の遺伝子導入マウスを作出した。2)単離ネフロンの採取:このマウスが成熟し、器官分化が完了した時点で、大動脈よりcollagenaseを注入して腎を剔出し、実体顕微鏡下で単一ネフロンを構成する各分節を無菌的に採取し、培養を行った。3)培養条件の検討:RITC80-7培地に5%の牛胎児血清を加えた培地が最適であった。単一ネフロン分節の細胞はその由来部位により増殖のスピードに著しい差異が認められた。即ち、糸球体や遠位側尿細管は3週間1ヶ月で対数増殖期に入ったが、近位尿細管細胞は12ヶ月を要した。何れの細胞も温度感受性因子(ts)の発現を認め、33°Cで増殖の促進を、37°Cで増殖の抑制を示した。何れの細胞もグルタミンの存在が必須であった。4)新鮮組織と培養細胞との比較:継代を繰り返して20代以上に達しても形態の変化は認められず、初代とほぼ同様の所見が維持されていた。アンモニア産生能は新鮮ネフロンで近位尿細管に高く、継代細胞でも近位尿細管由来細胞は集合尿細管由来細胞の3倍高く、新鮮ネフロン分節の結果と同様であった。アルギニンバゾプレシン(AVP)による細胞内cAMP産生の増強効果も新鮮ネフロンの集合尿細管に認められたと同様、同部位由来培養細胞での反応が認められた。5)細胞のクローン化:従来の形態学的検索で明らかに複数種類の細胞から構成されている集合尿細管由来培養細胞を希釈法でクローン化した結果、AVPやisoproterenolに対するcAMPの産生量が異なるいくつかのクローン化細胞の樹立に成功した。前年度に引き続き単一ネフロン内由来部位の明らかな培養細胞の性質を新鮮ネフロン分節と比較すると共に不死化培養細胞株の樹立をめざして、以下の新知見を得た。1、近位尿細管起始部(S1)から継代した細胞には我々が新しく見出したバソプレシン(AVP)受容体(Vp)の発現が認められた。即ちAVPにより既存のV_1やV_2受容体拮抗薬で遮断されない一過性の細胞内遊離カルシウムの増大を維持していた。2、近位尿細管終末部(S3)から継代した細胞には当該部位での特異酵素のalkaline phosphatase活性が発現しており、培地へのdexamethasoneや牛胎児血清の添加により活性発現が新鮮組織と同等にまで増大した。この継代(不死化)細胞を用いてシスプラチンによる細胞障害の定量評価ができるモデルを確立した。

即ち、腎障害薬物のスクリーニングやその作用強度を定量する系として応用が可能になった。3、遠位尿細管や集合尿細管由来の継代細胞はAVPによるcAMP産生上昇を示すV2受容体が安定発現しており、同時にisoproterenolによるcAMP上昇は新鮮組織以上に反応性の増大を認めた。以上の様にネフロン機能を代替する主要な培養株の樹立に成功した。次年度は更に細胞の種類を増やし、応用範囲を拡大したい。当初の計画をほぼ実践することができた。以下に項目別に要約する。温度感受性(ts)-SV40largeT抗原遺伝子をマウスの胚に注入して第一世代の遺伝子導入マウスを作出した。この動物から腎を構成するネフロン各分節を単離して培養し、100代以上も継代可能な培養株を樹立した。2)樹立細胞株の特性の検討正常マウスから新鮮ネフロン各分節を単離し、分節特有の酵素の分布、代謝機能の局在性、ホルモン受容体の存在等を検索した。しかる後、当該ネフロン分節由来株化培養細胞の特性維持を比較検討した。樹立細胞株は由来部位の特異性を良く保持していたが、一部の特異酵素(γ-GTP)、特異代謝(糖新生)、ホルモン受容体(副甲状腺ホルモン)の喪失が認められた。3)樹立細胞株の薬理学、毒科学への応用近位尿細管終始部由来株化細胞を用いて抗腫瘍薬のシスプラチンによる腎障害の定量的評価と障害機序解明へのin vitro実験系が確立できた。髄質外層集合管由来細胞にはATP受容体の発現が高く維持されており、この受容体タンパクをコードするcDNAクローニングに最適である。この研究は目下進行中である。
心筋ミトコンドリアDNAによる年齢推定

心筋ミトコンドリア(mt)DNAにみられる、特定領域の欠失の有無と年齢との関係を検索した。材料:当教室の法医剖検例のうち、0歳から84歳で各年齢層に広く分布している66例の心筋組織を材料とし、定法に従いフェノール・クロロホルム法でDNAを抽出した。PCRによる心筋mtDNAの検索:ATPase6とDループ領域間の約7.4kbの欠失の存在で、1,002bpの増幅産物がえられるようにプライマーを設定した。一方、対照としてCOI領域中の1,030bpをターゲットとして総mtDNAの増幅とした。対照の増幅が認められることを前提として、欠失領域の増幅の有無によって欠失の有無を判定した。年齢と心筋mtDNA欠失の有無について、欠失存在群が欠失非存在群に比して、年齢が有意に高かった。また、欠失の存在する最低年齢は17歳であり、欠失の非存在の最高年齢は48歳であった。心筋mtDNAの特定領域の欠失は、年齢に依存する変化として認められると同時に特発性心筋症などの心疾患と関連して報告されている。そこで、心疾患症例が欠失の有無に影響を与えるかをみるために、心臓突然死と欠失の有無、および、心肥大/低心重量と欠失の有無について検索した。その結果、心臓突然死群と対照群との間に有意差は認められなかった。また低心重量群と正常心重量群、心肥大群と正常心重量群との間においても有意差は認められなかった。心筋mtDNAの欠失の存在と心臓突然死や心肥大/低心重量との相関は無く、年齢に依存してその頻度が有意に増加していた。今後欠失のratioを算出し、連続量で評価することで法医実務への適用を考察していく必要がある。
生体骨における力学的刺激と骨形成の組織学的評価に関する研究

力学的刺激が骨の形成や吸収に関与していることは,これまでの研究で明らかにされているが力学的刺激の大きさ及び種類との関係については、未だ不明な点が多い.これを明らかにすることが本研究の目的である.動物実験には日本白色ウサギを用い,右脛骨の近位端,遠位端に70mmの間隔をあけて各々1本ずつ径2mmのステンレス製ピンを刺入し,2本のピンの中に径3mmの円孔を作成した.平成4年度に製作した荷重刺激装置を用い,ピンを介して圧縮または引張荷重を1日1時間,荷重量49N,周期0.5Hzで間欠的に与えた.圧縮刺激群,引張刺激群,対照群の3群につき,それぞれ1週,2週,4週群を設定し,各群とも5羽とした.骨形成量の定量化は画像解析処理ソフトウェアにて行った.円孔周囲に作用する力学的刺激量としてひずみエネルギー密度を3D-FEMにより求めた.実験開始後1週間では3群とも骨形成はみられなかった.2週間では圧縮刺激群,引張刺激群では荷重軸方向に平行な円孔辺緑部すなわち0.34.9[×10^<-3>](MPa)のひずみエネルギー密度が生じた部位に多くの未熟骨の形成を認めた.これに対し荷重軸に垂直な円孔辺縁部すなわち0.00.7[×10^<-3>](MPa)のひずみエネルギー密度が生じた部位には骨形成を認めないかまたは骨形成を認めても少量であった.対照群では2例に骨形成を認めたが骨形成量は少なく発生部位も一定ではなかった.4週間では2週間の圧縮刺激群,引張刺激群でみられた未熟骨は成熟した骨梁となり,円孔の中心に向かい骨形成が進行していた.対照群では骨形成を認めたが未熟骨であり,刺激群と比較して骨形成量も少なかった.以上より圧縮ひずみ,引張ひずみはともに骨形成を促進し,骨形成量はひずみの大きさに依存するものと考えられた.力学的刺激が骨の形成や吸収に関与していることは,これまでの研究で明らかにされているが力学的刺激の大きさ及び種類との関係については、未だ不明な点が多い.これを明らかにすることが本研究の目的である.動物実験には日本白色ウサギを用い,右脛骨の近位端,遠位端に70mmの間隔をあけて各々1本ずつ径2mmのステンレス製ピンを刺入し,2本のピンの中に径3mmの円孔を作成した.平成4年度に製作した荷重刺激装置を用い,ピンを介して圧縮または引張荷重を1日1時間,荷重量49N,周期0.5Hzで間欠的に与えた.圧縮刺激群,引張刺激群,対照群の3群につき,それぞれ1週,2週,4週群を設定し,各群とも5羽とした.骨形成量の定量化は画像解析処理ソフトウェアにて行った.円孔周囲に作用する力学的刺激量としてひずみエネルギー密度を3D-FEMにより求めた.実験開始後1週間では3群とも骨形成はみられなかった.2週間では圧縮刺激群,引張刺激群では荷重軸方向に平行な円孔辺緑部すなわち0.34.9[×10^<-3>](MPa)のひずみエネルギー密度が生じた部位に多くの未熟骨の形成を認めた.これに対し荷重軸に垂直な円孔辺縁部すなわち0.00.7[×10^<-3>](MPa)のひずみエネルギー密度が生じた部位には骨形成を認めないかまたは骨形成を認めても少量であった.対照群では2例に骨形成を認めたが骨形成量は少なく発生部位も一定ではなかった.4週間では2週間の圧縮刺激群,引張刺激群でみられた未熟骨は成熟した骨梁となり,円孔の中心に向かい骨形成が進行していた.対照群では骨形成を認めたが未熟骨であり,刺激群と比較して骨形成量も少なかった.以上より圧縮ひずみ,引張ひずみはともに骨形成を促進し,骨形成量はひずみの大きさに依存するものと考えられた.
炎症反応を制御する情報伝達の分子メカニズムとバイオプローブによる解明

炎症反応を調節しているサイトカインレセプターは、様々なアダプタータンパク質やプロテインキナーゼ等を介して、転写因子nuclear factor κB(NF-κB)等の情報伝達経路を活性化する。NF-κB経路は、サイトカイン、ケモカイン、細胞接着因子等をコードしている多くの遺伝子の転写を誘導し、それらの遺伝子発現を介して炎症反応を調節している。本研究では、おもに小分子化合物をバイオプローブとして用いて、炎症性サイトカインによる情報伝達や遺伝子発現を制御している分子メカニズムを解明した。ペデリン系化合物であるイルシニアスタチンA(irciniastatin A)は、タンパク質合成を強く阻害する。本研究では、イルシニアスタチンAがIL-1αによる転写因子NF-κBの核移行を阻害せず、TNF-αによるNF-κBの核移行を選択的に阻害することを見出した。さらに、イルシニアスタチンAは、TNFレセプター1のエクトドメインシェディングを誘導した。イルシニアスタチンAはERKのリン酸化を強く誘導したが、p38 MAPキナーゼのリン酸化をほとんど誘導しなかった。以上の結果から、イルシニアスタチンAは、他のタンパク質合成阻害剤とは異なる分子メカニズムで、リボトキシックストレス応答を誘導することが明らかになった。五環性トリテルペノイドの一つであるウルソール酸(ursolic acid)は、IL-1αによって誘導される細胞接着因子ICAM-1の細胞表面の発現を顕著に阻害した。ウルソール酸で処理した細胞では、エンドグリコシダーゼH感受性の高マンノース型糖鎖が結合したICAM-1が小胞体に蓄積していた。さらに、ウルソール酸はゴルジ体の断片化を誘導していることを見出した。以上の結果から、ウルソール酸の新しい生物活性として、細胞内タンパク質輸送を阻害することが明らかになった。カスパーゼ8モデュレーターc-FLIP(L)は、アダプタータンパク質RIP1を介してカスパーゼ8によるNF-κBの活性化を制御している。本研究では、c-FLIP(L)のC末端ドメインがカスパーゼ8プロドメインとRIP1デスドメインとの相互作用を阻害し、カスパーゼ8依存性のNF-κBの活性化を制御していることを見出した。したがって、カスパーゼ8によるc-FLIP(L)のc-FLIP(p43)への切断がFasリガンドによるNF-κB活性化に必要であることが明らかになった。強心配糖体であるウアバイン(ouabain)、ジギトキシン(digitoxin)、ジゴキシン(digoxin)のアグリコンであるウアバジェニン(ouabagenin)、ジギトキシジェニン(digitoxigenin)、ジゴキシジェニン(digoxigenin)が、tumor necrosis factor α(TNF-α)によって誘導される細胞接着因子intercellularadhesion molecule-1(ICAM-1)の発現を抑制することを見出した。ウアバジェニン、ジギトキシジェニン、ジゴキシジェニンは、ICAM-1 mRNAの発現を抑制せず、ICAM-1タンパク質の発現を強く阻害した。これらの強心配糖体アグリコンによるICAM-1発現に対する阻害活性は、ウアバイン耐性のラットNa+/K+-ATPase α1の強制発現によって抑制された。一方、Na+/K+-ATPase α1をノックダウンすると、ICAM-1の発現に対するウアバジェニンとウアバインの阻害作用が亢進した。以上の結果から、強心配糖体アグリコンは、Na+/K+-ATPaseを阻害することによって、TNF-α誘導性のICAM-1発現を翻訳プロセスの段階で阻害することを明らかにした。アラントピロンA(allantopyrone A)は、植物内生糸状菌が産生するα-ピロン系代謝産物である。ヒト肺がん腫A549細胞において、アラントピロンAがTNF-αによって誘導されるICAM-1の発現を阻害することを見出した。アラントピロンAは転写因子nuclear factor κB(NF-κB)応答性レポーター遺伝子の発現を阻害した。さらに、アラントピロンAは、NF-κBサブユニットの核移行、及びinhibitor of NF-κB α(IκBα)のリン酸化とそれに続くIκBαのプロテアソームによる分解を阻害した。一方、アラントピロンAはIκBキナーゼβの酵素活性を直接的に阻害しなかった。これらの結果から、アラントピロンAは、IκBリン酸化の上流のNF-κBシグナル経路を阻害していることが明らかになった。ベツリン酸(3β-hydroxy-20(29)-lupen-28-oic acid)、オレアノール酸(3β-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid)、ウルソール酸(3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid)は、天然に存在する五環性トリテルペノイドであり、同じ分子量をもつ構造類縁体である。これまでに、ウルソール酸が粗面小胞体からゴルジ体への輸送を阻害し、細胞接着因子intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)の粗面小胞体への蓄積を誘導することを明らかにした。本研究では、ベツリン酸とオレアノール酸の作用について検討し、ベツリン酸とオレアノール酸が、ウルソール酸と異なり、インターロイキン1αで誘導される細胞表面ICAM-1の発現量を阻害しないことを見出した。一方、ベツリン酸やオレアノール酸で処理すると、ICAM-1やvascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)の低分子量化が観察された。ICAM-

1の分子量に対するベツリン酸やオレアノール酸の作用は、小胞体α-グルコシダーゼI、II阻害剤であるカスタノスペルミンの作用と類似し、ベツリン酸、オレアノール酸、カスタノスペルミンで処理した細胞では、ICAM-1はいずれもエンドグリコシダーゼH耐性を示した。ベツリン酸とオレアノール酸は、酵母由来α-グルコシダーゼ活性を阻害したが、ナタマメ由来α-マンノシダーゼ活性を阻害しなかった。以上の結果から、ベツリン酸とオレアノール酸は、ICAM-1のN結合型糖鎖修飾に作用するが、ウルソール酸とは異なり、ICAM-1の細胞表面への輸送には作用しないことが明らかになった。炎症反応を調節しているサイトカインレセプターは、様々なアダプタータンパク質やプロテインキナーゼ等を介して、転写因子nuclear factor κB(NF-κB)等の情報伝達経路を活性化する。NF-κB経路は、サイトカイン、ケモカイン、細胞接着因子等をコードしている多くの遺伝子の転写を誘導し、それらの遺伝子発現を介して炎症反応を調節している。本研究では、おもに小分子化合物をバイオプローブとして用いて、炎症性サイトカインによる情報伝達や遺伝子発現を制御している分子メカニズムを解明した。本研究では、炎症性サイトカインの情報伝達や遺伝子発現を阻害する小分子化合物の作用メカニズムを解析した。強心配糖体アグリコンが細胞レベルでの標的分子としてNa+/K+-ATPaseに作用し、翻訳プロセスを阻害することを明らかにしたこと、並びにアラントピロンAがNF-κBサブユニットやIκBキナーゼβに直接的に作用しているのではなく、NF-κBシグナル伝達経路の初期プロセスを阻害していることを明らかにした点は意義が大きい。27年度が最終年度であるため、記入しない。細胞生物学本研究では、小分子化合物をバイオプローブとして用いて、炎症性サイトカインの情報伝達や遺伝子発現の分子メカニズムの解明を行う。さらに、NF-κBの情報伝達に関与しているタンパク質の生理機能の解明に取り組む。本研究では、炎症性サイトカインによる情報伝達や遺伝子発現の分子メカニズムの一端を解明した。さらに、イルシニアスタチンAとウルソール酸が新しい生物活性を有することを明らかにした点は意義が大きい。本研究課題では、小分子化合物をバイオプローブとして用いて、炎症性サイトカインによる情報伝達や遺伝子発現の分子メカニズムの解明を行う。さらに、NF-κBの情報伝達に関与するタンパク質の生理機能の解明に取り組む。設備備品の機種選定等を行い、より安価な製品を購入した。消耗品の購入に利用する予定である。
中華民国期における華北地域と東北地域の政治的・社会的統合状態に関する実証的研究

1.前年度に実施した『天津大公報』(1912-1931)による、華北地域と東北地域の「地域間連繋」に関する記事をワープロ入力した。これらを(1)政治・(2)軍事・(3)経済・(4)外交・(5)社会に分類し、各年ごとに整理して「中国華北・東北の“地域間連繋"に関する天津『大公報』記事索引(1912-1931)」とした。2.中央が(東北)地方政府を媒介としてどのように(東北)地域社会に浸透したか、また逆にどのようにフィードバックしたかについての分析・検討作業をすすめ、華北と東北の両地域社会の比較および「地域間連繋」についての研究を具体化した。特に、中華民国前半期における「政治的中枢」たる華北地域と「周辺」としての東北地域の構造的連繋の形成過程と、後半期におけるその展開過程について、政治的・経済的・イデオロギー的概括をめざした。3.研究代表者西村成雄は、世界システム論を用いて二十世紀の日中関係の特質を概括した上で東北地域経済の展開過程を検討し、三度の「敵産接収」を通じてその凝集性が高まったとした。また、研究分担者田中仁は、一九三〇年代における華北・東北の「地域間連繋」を政治的局面から概括し、両地域社会における日本のプレゼンスの拡大が同時に中国の民族的要素の拡大を齎したとした。4.本研究課題の報告書を作成した。本研究課題は、1.中華民国前半期(1912ー1928)における「政治的中枢」(Core)としての華北地域が、政治的・経済的・文化的に「周辺」(Reriphery)としての東北地域とどのような「地域間的連繋」(Intreーregionalーlinkage)を形成したかについて、(1)地域人口移動とその原因・(2)地域経済圏域の形成過程とその実態・(3)各地域政治の特質とその連繋性、などについて比較実証研究を行う;2.「政治的中枢」が華中地域に移行した中華民国後半期(1928ー1949)における華北・東北両地域の「地域間連繋」の展開過程について、政治史・社会経済史の両側面から比較・実証分析を行う;3.上記の実証分析を通じて、地域社会の側から国家としての中華民国がどのような統合状態にあったかについて、政治的・経済的・イデオロギ-的諸領域から概括することにより、中華民国時期における華北と東北の両地域の統合状態を明らかにすることを目的としている。今年度は、『天津大公報』を素材として、中華民国の成立から満州事変にいたる時期(1912ー1931)における華北地域と東北地域の「地域間連繋」に関する記事8288点を抽出してそれに初歩的な分析を加えるとともに、同後半期における諸問題について論点の整理を行った。次年度は、抽出したデ-タの整理と分析を引き続き進めることによって『中華民国時期・華北=東北地域間連繋大公報記事目録』にまとめるとともに、研究代表者および分担者が具体的なテ-マを設定して報告書を作成することとする。
細胞密度感知機構を利用したオーラルバイオフィルムの抑制法に関する研究

細胞密度感知機構(クオラムセンシング)の担い手であるオートインデューサー(AI)を利用したオーラルバイオフィルムの抑制法や阻害剤の開発を目指して研究を行った。合成した計20種のAI類似化合物がPorphyromonas gingivalisのバイオフィルム形成に及ぼす影響を,in vitroのバイオフィルム形成モデル上で,細菌学的および3次元形態学的に検索した。C_<16>H_<32>N_2O,C_<19>H_<29>NO_3ならびにC_<11>H_<14>N_2O_3の3種類の化合物は,P.gingivalisのバイオフィルム形成に対しアンタゴニスト様に作用したが,9種類はバイオフィルム形成量が有意に増加した。アンタゴニスト様効果を示した3種の化合物作用群では,バイオフィルムの厚みが薄く,形成領域は狭かった。赤血球凝集活性および細胞外マトリックスへの付着には影響がなかったが,高濃度ではKgpおよびRgp活性を低下させ,その病原性にも影響した。これらの研究成果は,抗バイオフィルム薬の開発に向けた,in vivo実験や臨床治験の礎となる重要な新規の知見である。一方,歯周病関連細菌であるEikenella corrodensのAIの産生に関与するLuxSの欠損株を,E. corrodens1073株より作製した。LuxS欠損株と親株とのバイオフィルム形成能を静置系とフローセル系で比較検討し,静置系では欠損株は親株より約L3倍形成量が増加するが,フローセル系では欠損株のバイオフィルム形成量は有意に低下し,バイオフィルム内の細菌密度が低いことを3次元形態学的に明らかにした。E. corrodensでは,バイオフィルムの成熟にはLuxSだけでなく複数の遺伝子が関与していと推察されるが,初期のバイオフィルム形成にはLuxSが重要な役割を果たしていることが明らかとなった。一方,ヒトの病巣局所で観察されるバイオフィルムを可及的にin vitroで再現するため,根尖性歯周炎の難治化に関与している14試料より根尖孔外バイオフィルム中の細菌種を,16S rRNA遺伝子解析法により同定し,検出頻度の高い細菌種の局在性を免疫組織学的に検索した。その結果,1,207クローンから113細菌種が同定された。Fusobacterium nucleatum (14/14), P.gingivalis (12/14), Tannerella forsythensis (8/14)などの歯周病原性細菌種が高頻度で検出されたほか,培養不可能で未同定の細菌種も14試料中11試料から検出された。P.gingivlisおよびP.ncleatumは根尖孔外バイオフィルム中では散在性に観察されたが,T.forsythensisはバイオフィルム表層に局在していた。現在これらの結果をもとに,複数菌種バイオフィルムモデルの作製を行っている。昨年に引き続き,緑膿菌のオートインデューサー(アシルホモセリンラクトン)の類似化合物がPorphyromonas gingivalisのバイオフィルム形成を阻害するか否かのスクリーニングを行った。新規に合成したオートインデューサーの類似化合物6種類を加えた計19種のサンプルをP.gingivalis培養液中に各々混和した後,Modified Robbins device内に装着したヒドロキシアパタイトディスク上にバイオフィルムを形成させ,バイオフィルム細菌を定量的および微細形態学的に検索した。調べた19種類中,C_<16>H_<32>N_2OとC_<19>H_<29>NO_3の2種類の化合物は,P.gingivalisのバイオフィルム形成に対しアンタゴニスト様に作用した。

さらに,1)P.gingivalisと赤血球との凝集活性,2)上皮細胞およびKgpやRgp活性,3)P.gingivalisとコラーゲン,ラミニンあるいはフィブロネクチンへの付着,に対する19種の化合物の影響についてそれぞれ検索した。19種の化合物は全て,P.gingivalis菌体と赤血球との凝集活性およびコラーゲン,ラミニン,フィブロネクチンへの付着には影響を及ぼさなかった。しかしながら,C_<16>H_<32>N_2OとC_<19>H_<29>NO_3は,100μMでは赤血球や上皮細胞に対する細胞毒性が認められた。また,これら2種の化合物は,100μMで24時間作用させるとKgpおよびRgp活性を低下させた。現在,研究分担者の菅らが合成した,植物の病原細菌のクオラムセンシングに対し強力なアンタゴニストとして作用するC_<11>H_<14>N_2O_3がP.gingivalisのバイオフィルム形成に及ぼす影響を検索中である。歯周病関連細菌の一種であるEikenella corrodensのオートインデューサーの産生に関与するLuxS遺伝子をノックアウトした菌株を,E.corrodens 1073株を用いて作製した。E.corrodens LuxS欠損株と親株とのバイオフィルム形成能を静置系とフローセル系で比較検討したところ,静置系では,欠損株は親株より約1.3倍形成量が増加したが,フローセル系では欠損株のバイオフィルム形成量は有意に低下し,バイオフィルム内の細菌細胞が空疎であることを3次元的に明らかにした。。E.corrodensでは,成熟したバイオフィルムの形成には,LuxSだけでなく他の遺伝子が複雑に関与している可能性が示唆された。昨年に引き続き,緑膿菌のオートインデューサー(アシルホモセリンラクトン:AHL)の類似化合物がPorphyromonas gingivalisのバイオフィルム形成に及ぼす影響を検討した。新規に合成したオートインデューサーの類似化合物6種類を加えた計20種のサンプルをP.gingivalis培養液中に各々混和した後,Modified Robbins deviceを用いてヒドロキシアパタイトディスク上にバイオフィルムを形成させ,バイオフィルム細菌を定量的および共焦点レーザー顕微鏡にて3次元的に検索した。20種類中,C_<16>H_<32>N_2O,C_<19>H_<29>NO_3ならびにC_<11>H_<14>N_2O_3の3種類の化合物は,P.gingivalisのバイオフィルム形成に対しアンタゴニスト様に作用した。20種類の化合物中9種類では,対照群と比較して,バイオフィルム形成量が有意に増加した。アンタゴニスト様効果を示した3種の化合物作用群では,バイオフィルムの厚みが顕著に薄く,フィルムの形成領域は狭かった。さらに,1)P.gingivalisと赤血球との凝集活性,2)上皮細胞およびKgpやRgp活性,3)P.gingivalisと細胞外マトリックスであるコラーゲン,ラミニンあるいはフィブロネクチンへの付着,に対する20種の化合物の影響についてそれぞれ検索した。20種の化合物は全で,P.gingivalis菌体と赤血球との凝集活性およびコラーゲン,ラミニン,フィブロネクチンへの付着には影響を及ぼさなかった。