hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
気孔発達過程における孔辺細胞の分裂と相称的形態形成の分子機構

植物表皮の気孔は大気とのガス交換調節を行う重要な構造である。我々は高等植物における気孔の発達メカニズム、そして細胞分裂や細胞分化の仕組みを解明することを目的に、シロイヌナズナの気孔形成突然変異体を用いて孔辺細胞の発達に関わる遺伝子の単離・解析を進めてきた。本年度の本研究課題では特に孔辺母細胞の分裂後の細胞形態構築に関する変異体(MC79)に着目して研究を進めた。MC79はロイシンリッチリピートを持つ受容体型キナーゼの変異体で、孔辺細胞の伸長方向や湾曲方向が異常になる表現型を示す。MC79はメリステモイドから孔辺細胞母細胞の周囲の細胞膜に出現し、孔辺母細胞の成熟段階では発現が消失する。また、孔辺母細胞の分裂面の細胞膜には局在しないという特徴がある。MC79受容体型キナーゼの情報伝達に上記のような一過的かつ特異的な局在パターンが深く関わっていると考え、孔辺細胞発達の異なる時期に発現する遺伝子SDD1のプロモーターを利用して、MC79-GFPの異所的発現の実験を行った。その結果、MC79受容体型キナーゼが孔辺母細胞の分裂面局在するようになり、それに伴い孔辺細胞の方向が逆転することが観察された。このことから、MC79受容体型キナーゼが本来は孔辺母細胞の周囲にのみ局在して、外側(背側)の信号を発しており、これに従って孔辺細胞の形態構築が進められていること、誤った局在部位である分裂面に局在させたため孔側が背側の性質を持って細胞極性の逆転が生じたことが示された。これらの結果から、MC79受容体が孔辺細胞の極性を決定する情報伝達の因子であり、その局在場所によって細胞の背腹性が決められるという制御の仕組みが見え始めた。細胞の形態に深く関わる微小管の配置との関連に興味が持たれる。我々は高等植物における細胞分裂や細胞分化の仕組みを解明することを目的に、シロイヌナズナの気孔形成突然変異体を用いて孔辺細胞の発達に関わる遺伝子の単離・解析を進めてきた。本年度の本研究課題では特に孔辺母細胞の分裂に関する変異体(shabondama40)および分裂後の孔辺細胞形態構築に関する変異体(MC79)に着目して研究を進めた。MC79はleucine rich repeatを持つreceptor like kinaseの変異体で、孔辺細胞の伸長方向や湾曲方向が異常になる表現型を示す。MC79はメリステモイドから孔辺細胞母細胞の細胞膜と根の先端部分表皮での発現が観察されている。今回、MC79信号伝達系の因子を探索するためキナーゼドメインを用いてtwo hybrid screeningを行ったところ、eIF3C1(eukaryotic initiation factor 3 subunit c)が選抜された。このeIF3cの発現解析を行ったところ、根の先端、側根原基、トライコームにおける発現が認められた。このことより、eIF3cは根においてMC79と何らかの相互作用を有していることが示された。eIF3cの破壊株は致死となるため、今後抑制株を作製して機能解析を、細胞の極性獲得、形態構築における情報伝達系の働きについて理解を深める。Shabondama40は出芽酵母Sec31ホモログの変異体で、孔辺母細胞の細胞質分裂が不完全となる表現型を示す。Sec31はSec13と結合して働くため、シロイヌナズナのSec13遺伝子をクローニングし、Sec31との局在比較を行った。シロイヌナズナ培養細胞での一過的発現系を用いて解析を行ったところ、Sec31、Sec13の両者が同じ局在を示し、またERマーカーとも重なったため、両者が配列から推定される通り、ER上で働いていることが示された。

これらの結果から、MC79受容体が孔辺細胞の極性を決定する情報伝達の因子であり、その局在場所によって細胞の背腹性が決められるという制御の仕組みが見え始めた。細胞の形態に深く関わる微小管の配置との関連に興味が持たれる。
環境応答型分子集合体を導入した化学発光検出用マイクロDNA分析システムの開発

本年度は,DNAのハイブリダイゼーションに及ぼす会合性高分子の影響について検討した.温度感応型会合性高分子の末端にチオール基を導入し,プローブDNAと同時にシリコン基板に蒸着した金表面上に固定化した.この会合性高分子は加温するとコンパクトに折り畳まれ,冷却すると再び伸長する.したがって,プローブDNAとのアニールに必要な温度に冷却したとき立体的々にハイブリダイゼーションを阻害することが期待される.そこで,これまで行ってきた化学発光法によりハイブリダイゼーション効率ならびに選択性について会合性高分子の影響を検討した.しかしながら,会合性高分子の共存によりDNAの固定化量が大きく低下し,完全に相補性のあるDNAとのハイブリダイゼーションを検出することができなかった.そこで,分子量のより小さい高分子を使用したところ,DNAの結合量が増加し,ハイブリダイゼーションの検出が可能となった.諸条件についてさらに検討し,会合性高分子の相転移温度前後でのハイブリダイゼーションの量を比較したが,顕著な違いは見られず,また相補性の違いを識別することはできなかった.これらの結果から,会合性高分子の同時固定化によるDNAのハイブリダイゼーションの制御が困難であることが明らかとなった.今回の場合,DNAと環境応答型の反応制御を別々に使用したが,例えば両者を結合させたプローブDNAを用いることによりハイブリダイゼーションの制御が可能になるものと考える.一方,会合性高分子共存下における化学発光については,フルオレセインやジブロモフルオレセインを発光基質に用いたところ,相転移温度前後での発光量の顕著な変化が見られた.これにより,会合性高分子を用いた化学発光反応の制御が可能であることが明らかとなった.本年度は,マイクロ分析システムに適用可能なシリコンをベース基板としたDNAのハイブリダイゼーションの化学発光法による検出とフロー法への応用,マイクロフローチャネルにおける化学発光反応ならびに反応の制御に使用する両親媒性高分子の評価を行った.まず,DNAハイブリダイゼーションと化学発光検出は次のように行った.金蒸着シリコン基板にチオール化したプローブDNAを固定化し,試料DNA溶液に浸してハイブリダイゼーションを行った.その後,ペルオキシダーゼで標識し,ルミノール化学発光により基板上のプローブDNAと結合した試料DNAを測定した.諸条件について最適化を行ったところ,それぞれの反応が定量的に進行していることが確認され,試料DNAの定量が可能となった.さらに,シリコン基板に微小流路を作成し,その流路内に金薄膜を蒸着したのち,ガラスで蓋をしてマイクロフローチップを作成した.ここに,上述のプローブDNAや試料DNA,標識酵素ならびに発光試薬を順次注入し,発光の測定を行ったところ,ハイブリダイゼーションに基づく発光反応が観察された.これらの成果からハイブリダイゼーションによるフロー型のDNA分析システムの構築が可能であることが示された.また,フロー型チップにおける化学発光反応についても検討を行った.エピネフリンとルシゲニンの化学発光反応を用いて微小流路内での発光強度や発光分布を計測したところ,それらが流路の形状やサイズに大きく依存することを見いだした.発光反応の速度論とフロー系における反応モデルを組合せて発光挙動を定性的に説明することが可能となった.現在,これらの発光挙動の定量的なモデルの構築を進めている.さらに,DNAハイブリダイゼーションの制御を行う予定である両親媒性高分子について,従来より行っていたミセル抽出法を用いてその性能を評価した.ポリエチレンオキシド(PEO)とポリプロピレンオキシド(PPO)からなるトリブロックコポリマーを用いたところ,PEOとPPOの配列の違いから形成されるミセルの形状が異なり,それにより生体分子との相互作用が大きく変化することを明らかにした.本年度は,DNAのハイブリダイゼーションに及ぼす会合性高分子の影響について検討した.温度感応型会合性高分子の末端にチオール基を導入し,プローブDNAと同時にシリコン基板に蒸着した金表面上に固定化した.この会合性高分子は加温するとコンパクトに折り畳まれ,冷却すると再び伸長する.したがって,プローブDNAとのアニールに必要な温度に冷却したとき立体的々にハイブリダイゼーションを阻害することが期待される.そこで,これまで行ってきた化学発光法によりハイブリダイゼーション効率ならびに選択性について会合性高分子の影響を検討した.しかしながら,会合性高分子の共存によりDNAの固定化量が大きく低下し,完全に相補性のあるDNAとのハイブリダイゼーションを検出することができなかった.そこで,分子量のより小さい高分子を使用したところ,DNAの結合量が増加し,ハイブリダイゼーションの検出が可能となった.諸条件についてさらに検討し,会合性高分子の相転移温度前後でのハイブリダイゼーションの量を比較したが,顕著な違いは見られず,また相補性の違いを識別することはできなかった.これらの結果から,会合性高分子の同時固定化によるDNAのハイブリダイゼーションの制御が困難であることが明らかとなった.今回の場合,DNAと環境応答型の反応制御を別々に使用したが,例えば両者を結合させたプローブDNAを用いることによりハイブリダイゼーションの制御が可能になるものと考える.一方,会合性高分子共存下における化学発光については,フルオレセインやジブロモフルオレセインを発光基質に用いたところ,相転移温度前後での発光量の顕著な変化が見られた.これにより,会合性高分子を用いた化学発光反応の制御が可能であることが明らかとなった.
神経変性疾患の治療を目指した神経移植による破綻神経回路網の再構築の試み-神経栄養因子GDNFの併用-

本研究の目的はパーキンソン病とハンチントン病モデル動物への移植に用いるドナー細胞である胎仔ドーパミン細胞や線条体ニューロンに強力な神経栄養効果を発揮するglialcell line-derived neurotrophic factor(GDNF)を移植に応用して、移植後の神経回路網再建をより完全なものとすることにある。具体的には、GDNFを移植部位に補給し破綻神経回路網の解剖学的、機能的再建の程度を形態学的ならびに電気生理学的手法で評価して従来の移植方法の場合と比較検討する。平成11年度の研究で次の二つの課題が達成できた。(1)神経回路網再建の程度の評価パラメーターである大脳基底核の神経活動の測定技術とその信頼性の確立ハンチントン病モデルラットにおける大脳基底核群の神経活動をミトコンドリア酵素のcytochorme oxidaseの活性および電気活動の測定により検討し、淡蒼球、中脳黒質網様部、視床下核の異常活動を明らかにした。これらの変化は一貫して認められ、信頼性のある評価パラメーターであることがわかった。さらに、ハンチントン病モデルラットに対してラット胎仔線条体ニューロンの脳内移植を行うと大脳基底核群に起こった異常活動が正常化することも見いだした。以上の結果は国際科学雑誌に発表した(裏面参照)。また、一部のデータに関しては現在執筆中。(2)GDNF補給手段としてのGDNF遺伝子導入線維芽細胞およびP19細胞株の確立とその効果の検討GDNF供給手段としてのGDNF遺伝子導入細胞の移植が考えられるが、平成10年度の研究で十分な生物活性を有するGDNFを分泌する線維芽細胞、さらにニューロンへの分化誘導が可能なP19細胞株の確立に成功した。同細胞株をパーキンソン病モデルラットに移植し、ドーパミンニューロンに対する保護効果を見いだした。この研究結果を国際科学雑誌に発表した(裏面参照)。平成10年度の研究で次の二つの課題が達成できた。(1)神経回路網再建の程度の評価パラメーターである大脳基底核の神経活動の測定技術とその信頼性の確立。パーキンソン病モデルおよびハンチントン病モデルラットにおける大脳基底核群の神経活動をミトコンドリア酵素のcytochorme oxidaseの活性および電気活動の測定により検討し、淡蒼球、中脳黒質網様部、視床下核の異常活動を明らかにした。さらに、パーキンソン病モデルおよびハンチントン病モデルラットに対して、それぞれラット胎仔ドーバミン細胞および線条体ニューロンの脳内移植を行うと大脳基底核群に起こった異常活動が正常化することも見いだした。(2) GDNF補給手段としてのGDNF遺伝子導入線維芽細胞およびP19細胞株の確立。GDNF供給手段としてのGDNF遺伝子導入細胞の移植が考えられるが、平成10年度の研究で十分な生物活性を有するGDNFを分泌する線維芽細胞、さらにニューロンへの分化誘導が可能なP19細胞株の確立に成功している。これらの研究結果については現在論文執筆中である。
溶接構造物へのX線応力測定法の適用に関する研究

溶接構造物の強度に影響する残留応力は、溶接法や組立順序によって変化するので、実構造物の安全を確保するためには、構造物ごとに非破壊的な方法で実測しておく必要がある。本研究では、実構造物への適用が困難であったX線応力測定法をとりあげ、これを実構造物に適用するに際しての諸問題のうち以下に述べる主要な点について解決した。1.溶接構造物に分布する残留応力には、溶接残留応力と拘束残留応力に分けられるが、このうち拘束応力は母材部でも測定可能で、X線によって妥当な応力値が得られることを示した。これに対して溶接残留応力は、殊に溶接部でX線による測定値が破壊的測定法によるそれと一致しない点に問題があり、今後検討を要する。2.構造部材の交叉部では、Sin^24法によるX線応力測定法で測定できなかったが、新しく開発したφ-Sin^24法では精度よく計測可能となった。3.多結晶金属材料の微視的変形挙動を検討し、巨視的弾性定数に与える影響を明らかにして、上述の1.における問題点に対する手がかりを得た。4.PSPCを用いた実機用の迅速X線応力測定装置を開発するとともに、弾性定数の測定を行って、その測定精度を確認した。この装置によって測定時間を従来の装置の1/4以下に短縮できた。5.溶接残留応力が疲労強度に及ぼす影響を実験的に検証した上に、ピーニング処理による圧縮残留応力の効果を明らかにした。6.溶接部の表面残留応力をエッチングに伴う呈色反応によって評価する方法を確立し、X線応力測定の補助的手段となり得ることを示した。7.リサージュ型の自動姿勢制御機構を有するゴニオメーターを開発し、位置決め操作から応力値の算定に至るまでのすべての測定作業の高速化と自動化を行った。X線応力測定法は,ひずみを非破壊的に直接測定できる唯一の方法であるといえるが,実際の溶接構造物における残留応力測定にこの方法を適用するにあたっては,測定装置が大型であること,測定時間が長いこと,X線の入射方向が制約される場合があること,溶接部におけるX線の測定値が機械的測定値と必ずしも一致しないこと等の問題がある.本研究はこれらの諸問題を解決するために行ったもので,本年度は以下の点を明らかにできた.1.溶接構造部材に作用している拘束応力のX線による測定値は機械的測定と妥当な対応を示した. (永井ほかの共同研究)2.位置検出型放射線計数管(PSPC)を用いて,携帯用X線応力測定装置を試作しつつあり,装置の軽量化および測定時間の大幅な短縮が可能となる見通しを得ている(吉岡,西沢,太田,大谷).なお,この研究では,長さ40mmの小型計数管(吉岡)およびXーY方式の位置決め装置(西沢)を開発し,測定精度の向上を計るとともに,コンピュータを用いて測定およびデーター処理の自動化を行っている.3.異方性材料の応力測定におけるデータ処理の自動化を行った. (本田)4.応力の大きさに応じた結晶の着色法を開発し,X線による測定結果と比較して,着色法の妥当性を確かめた.5.溶接構造部材が入り組んだ狭隘箇所における測定を模擬した小型の機械構造部材においてX線応力測定を試みて,良好な測定結果を得た. (岩田)溶接構造物の強度に影響する残留応力は、溶接法や組立順序によって変化するので、実構物の安全を確保するためには、構造物ごとに非破壊的な方法で実測しておく必要がある本研究では、実構造物への適用が困難であったX線応力測定法をとりあげ、これを実構造物に適用する際の諸問題を解決した。1.位置検出型放射線計数器を用いた携帯用X線応力測定装置を試作し、装置の軽量化と測定時間の短縮をはかった。

測定時間は従来の装置の約1/4に短縮できた(吉岡靖夫)。また、リサージュ型の自動姿勢制御機構を有するゴニオメータを試作し、位置決めから応力値の算定までのすべての測定作業の高速化と自動化を行った現場用計測システムを構築した(西沢英和)。2.すみ肉溶接部においては、sin^24法を用いたX線応力測定を行うことができないので、新しいφ-sin^24法を適用してX線による溶接残留応力測定を試み、精度のよい応力の推定値が得られることを実証した(岩田光正)。3.圧延による塑性変形をうけた多結晶金属材料のX線応力測定を行って、結晶の微視的変形挙動がX線的弾性定数に及ぼす影響を明らかにした(本田和男)。また、溶接部の表面残留応力をエッチングに伴なう呈色反応から推定可能となることを明らかにし、X線応力測定の補助手段となることを示した(田丸武好)。4.溶接残留応力が構造物の疲労強度に及ぼす影響を明らかにするために、継手による基礎的研究を行うとともに、ピーニングによって生じる圧縮残留応力の効果を明らかにした(太田省三郎)。5.以上の研究成果を取まとめるとともに、今後の検討課題として、実測経験による装置の改良と溶接部における測定を摘出した(岩田光正)。
均衡型相互転座染色体保因男性の精子の分子細胞遺伝学的な検討

1.45,XY,t(14;21)(q10;q10)の核型のRobertson型転座保因男性精子18566個および対照男性精子27702個についてfluorescence in situ hybridization(FISH)法を用いて染色体14番、21番、3番、9番、17番、18番の異常率を検討した。保因男性では(21 21/14),(21/14 14),(21/-),(-/14)の不均衡型精子の頻度は2.3%,3.3%,2.6%,3.4%で対照より有意に高頻度であったが理論値の16.7%より低頻度であった。均衡型の精子は88.3%と対照男性より低頻度であった。また、3番、9番、17番、18番のdisomy精子の頻度は対照男性との間に有意差を認めなかった。以上より14q21qRobertson型転座男性の精子形成時の成熟分裂における分離が不均等に起こっているあるいは均等に分離した後淘汰が起きていると考えられた。2.46,XY,t(3;9)(q26.2;q32)の核型の転座保因男性精子20038個および対照男性精子20182個についてFISH法を用いて染色体3番、9番の精子染色体構成および染色体18,X,Yの異常率を検討した。保因男性では交互分離、不均衡型分離(隣接1型分離、隣接2型分離、3:1型分離)で形成された精子の比率は、それぞれ52.5%、47.27%(33.7%、5.44%、5.93%)であり、一方、対照男性では交互分離の精子が98.7%、不均衡型分離の精子が1.1%であった。また、保因男性での18番,XX,XY,YYdisomy精子の頻度は対照男性との間に有意差を認めなかった。以上より、均衡型転座t(3;9)(q26.2:q32)の保因男性における精子の約半数が隣接1型分離、隣接2型分離、3:1型分離で形成された不均衡型の染色体構成を持つことが明らかになり、均衡型転座例にみられる高率の流産はこれらの精子が受精した結果、生じたものであることが示された。(結果)RT carrierにおいて染色体21番のシグナルを2、1、0個持った精子の頻度はそれぞれ1.49、96.5、1.72%、コントロール男性では0.26、99.4、0.17%で、RT carrierにおけるdisomy精子の頻度の方が有為に高値を示した。理論値の16.7%より明らかに低値を、また正常男性における頻度0.21%より高値を示した。また、染色体17番のdisomy精子およびdiploid精子の頻度は0.22%,0.28%でコントロール男性の0.21%,0.29%と同様の頻度を示した。

(結論)以上より14q21qRobertson型転座男性の精子形成時の熟成分裂における分離が不均等に起こっている化膿しが示唆された。また、17番染色体においては、interchromosomal effectは存在しないと考えられた。今後は、さらに多数の症例について、また、多数の染色体について同様の検討を行う予定である。45, XY, t (14 ; 21) (q10 ; q10)の核型のRobertson型転座保因男性(保因者)の精子について,fluoresence in situ hybridization (FISH)法を用いて14番,21番染色体異常の頻度を検討するとともに,精子形成時の成熟分裂におけるinter-chromosomal effectの有無を見るために3番,9番,17番,18番染色体異常の頻度についても検討した.精子をスライドグラス上に固定した後dithiothreitolで前処理を行いFISH法に供した.FISH法は,2種類のDNAプローブを同時に用いたtwo-color法で行い,プローブはD3Z1, D9Z5, D14S308, D17Z1, D18Z1, LSI21を用いた.保因者では総数18566個,対照の二人の正常核型男性では27702個の精子のシグナルを蛍光顕微鏡下に判定した.21番または14番染色体のシグナルを2個認めるdisomy精子の割合は,保因者では2.3%, 3.3%で,対照の0.22%, 0.17%に比して有意に高値を示したが,理論値の16.7%に比して明らかに低値であった.また,21番または41番染色体のシグナルを1個も認めない不均衡型精子の割合は保因者では2.6%, 3.4%で対照の0.17%, 0.11%に対し有意に高値を示したが,理論値の16.7%に比して明らかに低値であった.一方,保因者における3番,9番,17番,18番染色体のdisomy精子の割合は,各々,0.22%, 0.24%, 0.22%, 0.23%で,対照の0.23%, 0.27%, 0.26%, 0.17%と有意な差を示さなかった.以上の結果より,Robertson型均衡型転座保因男性では,精子形成時の成熟分裂での分離は不均等に起きている可能性が示唆された.また,inter-chromosomal effectは存在しないと考えられた.均衡型転座t(3;9)(q26.2;q32)保因男性(保因男性)についてfluorescense in situ hybridization(FISH)法を用いて染色体3番、9番の精子染色体構成および染色体18,X,Yの異常率を検討した。保因男性及び対照の正常核型男性の精子を採取後、スライドグラス上に固定しdithiothreitolで前処理しFISH法に供した。FISH法は、Oncor社のDNA probe:tel 3q(digoxigenin標識)、Vysis社のDNA probe:CEP3(spectrum orange標識),CEP9(spectrum orange標識+spectrum green標識)あるいはD18Z1(biotin標識+digoxigenin標識),DXZ1(digoxigenin標識),DYZ1(biotin標識)を同時に用いたtriplecolor法で行い、蛍光顕微鏡下にシグナルの判定を行った。その結果、保因男性では総数20098個の精子、対照男性では20203個の精子を分析し、そのうち20038個および20182個の精子について分析可能なシグナルを検出した。分析の結果、保因男性での交互分離、不均衡型分離(隣接1型分離、隣接2型分離、3:1型分離)で形成された精子の比率は、それぞれ52.5%、47.27%(33.7%、5.44%、5.93%)であり、一方、対照男性では交互分離の精子が98.7%、不均衡型分離の精子が1.1%であった。また、保因男性での18番,XX,XY,YY disomy精子の頻度は対照男性との間に有意差を認めなかった。
樹状突起の三次元的な空間分布を決定するメカニズムの解析

本研究は、小脳プルキンエ細胞をモデルとし、樹状突起が三次元的な空間パターンを形成する仕組みを明らかにすることを目的とした。研究成果としては以下のものが挙げられる。1,同種樹状突起同士の交差防止の分子メカニズムの一端を明らかにした。2,ミトコンドリアおよびクレアチンキナーゼによる局所的なエネルギー産生が樹状突起の安定した成長に必須であることを示した。3,プルキンエ細胞の樹状突起が平行線維に対して直交して成長することを示した。生体内で平面な樹状突起を獲得するのに必要な仕組みであると考えられる。またこの成長方向決定メカニズムに関与する分子を一部同定した。本研究は小脳プルキンエ細胞をモデルとし、樹状突起が三次元的な空間パターンを形成する仕組みを明らかにすることを目的とする。ニューロンの樹状突起は伸長、分岐、退縮を含む固有の成長ダイナミクスにより発達する。ダイナミクスが周囲の環境によって修飾されることで、ニューロンは特異的な樹状突起を形成する。今年度は樹状突起ダイナミクスの制御機構について以下の研究を行った。(1)樹状突起の退縮・維持に関与する分子の探索および機能解析を行った。RNA干渉法や薬剤を用いて関連分子の探索を行う一方、先行研究により関与が明らかになっている接触認識分子(プロトカドヘリン)にも特に注目し、ノックアウト動物を手に入れて機能解析を行った。培養下における当該分子のノックアウト細胞では突起同士の接触(クロスオーバー)が増えているといった異常が見られた。当該分子の下流に存在すると予想されるFAKに機能阻害実験も始めている。(2)ミトコンドリアの樹状突起への輸送を阻害することで、ミトコンドリアが突起の安定な伸長に重要であることを見出した。また樹状突起成長期における細胞内のATP濃度を計測し、ミトコンドリアの輸送が樹状突起局所のATP生産に重要であることを明らかにした。(3)またニューロンは三次元組織の中で、周囲の物理的構造に影響を受けて形態形成を行うと考えられる。しかし生体内において組織の構造を人工的に操作し、そこに成長する突起形態への影響を解析するのは非常に難しい。そのため人工的に配列したナノ繊維上で細胞培養を行うことで、小脳の組織構造を模した培養系を開発した。ランダムに配向した繊維上で樹状突起は特徴的な方向性は示さないが、平行に配列した繊維上ではそれに対して直交方向に樹状突起を形成する。この単純化された実験系を用い、比較的容易に組織構造に依存した突起形成過程の観察が可能になった。本研究は小脳プルキンエ細胞をモデルとし、樹状突起が三次元的な空間パターンを形成する仕組みを明らかにすることを目的とした。伸長、分岐、退縮を含む成長ダイナミクスが細胞内シグナルや環境に依存して制御されるメカニズムについて注目し、以下の研究を行った。(1)プルキンエ細胞樹状突起は突起同士の反発により、交差の少ない分岐パターンを示す。本年度は、前年度までに関与を確認したプロトカドヘリン分子の下流シグナルとして働くFAKに注目した。FAKのドミナントネガティブ変異体や薬剤阻害により、突起間の交差数が増加する傾向にあることを見出した。当該分子シグナルが接触依存的反発に関与することが示唆された。(2)前年度までにミトコンドリアによる局所的なATP産生が樹状突起の安定な伸長に必要であることを示した。本年度は、突起末端でのATPレベルの維持にはミトコンドリアだけでなく、エネルギー供給システムであるクレアチンシャトルも必要であること示した。さらにATP枯渇条件下ではコフィリンのリン酸化維持ができなくなりアクチン代謝に異常が生じ、その結果、樹状突起の伸長が妨げられることが明らかになった。本研究によりニューロンの発生過程におけるエネルギー制御の一端が明らかになり、その結果をJournal of Neuroscience誌に報告した。(3)前年度までに小脳構造を模した人工ナノ繊維培養系を開発し、プルキンエ細胞樹状突起が平行線維と直交して成長することを明らかにした。本年度はこの進行方向を決定するメカニズムを解明するため、アデノ随伴ウイルスを利用したRNA干渉法等を用いて制御因子を探索した。その結果、接着因子や細胞骨格制御因子を含む複数の候補分子を同定することに成功した。プルキンエ細胞が当該接着因子を介して、平行線維の方向性を認識し自らの進行方向を決定している可能性が考えられる。神経発生学樹状突起の退縮・維持に関与する分子シグナルの候補を複数同定し、解析を始めている。退縮に伴うと予想したエンドサイトーシスの制御機構に関しては、関連性が確認できなかったが、新たにFAKの関予が示唆される結果を得ている。接触からPKC/PKDに至るシグナルカスケードの一端を明らかにできる可能性がある。

樹状突起の安定な伸長の維持に必要なミトコンドリアによるATP供給機構に関しては、予想外に進展し、論文を準備中である。三次元組織内での突起動態の制御機構を明らかにするために行った人工ナノファイバー上での細胞培養にも成功している。この系を用いることでプルキンエ細胞樹状突起の成長方向が平行線維の配列に影響を受けることを見出している。接触認識分子ノックアウト細胞の樹状突起成長ダイナミクスを引き続き解析する。特にタイムラプスイメージングを行うことで、隣接する樹状突起との接触時のダイナミクスの変化に注目する。当該分子の下流シグナルとしてFAKが知られている。またFAKはこれまでに退縮を制御することを示しているPKC/PKDの活性に関与することから特に注目している。FAK阻害時の樹状突起動態を明らかにするとともに、より明確なシグナルカスケードの同定を目指す。樹状突起の三次元空間における平面性を制御する分子の探索を阻害剤、RNA干渉法などを用いて行う。人工ファイバー上で成長する樹状突起をタイムラプスで観察し、突起動態を解析することで、周囲構造が成長ダイナミクスに与える影響を精査する。また細胞内メカニズムを明らかにするために、ファイバー上で成長する突起にかかる物理的な力と、突起内の細胞骨格のトポロジーに注目する。STORMを用いることで精細な細胞骨格構造を観察することを予定している。
口腔機能維持による健康寿命延伸のエビデンスの確立：2000人の6年間コホート研究

対象者は,ベースライン調査ならびに,3年後のフォローアップ調査に参加した79ー81歳の地域高齢者,549名(男性277名,女性272名)とした.認知機能の評価は日本語版Montreal Cognitive Assessment(MoCA-J)を用い,変化が大きかった25%を認知機能低下群とした.歩行速度は,0.8m/秒をカットオフ値とし,歩行速度がベースライン時正常閾で,追跡時に0.8m/s以下の者を歩行速度低下群とした.ロジスティック回帰分析の結果,臼歯部咬合支持は,性別や教育歴,全身疾患や他の交絡因子を調整した上でも,3年後の認知機能の低下や歩行速度の低下に影響を及ぼすことが示唆された.【目的】後期高齢者を対象に3年間の追跡調査を行い,臼歯部咬合支持が認知機能の低下に与える影響について検討を行うことを目的とした.【方法】79ー81歳の地域高齢者に対して行ったベースライン調査ならびに,3年後のフォローアップ調査に参加した549名(男性277名,女性272名)を対象者とした.ベースライン時に,性別,教育歴,握力,Eichner分類を用いて臼歯部咬合支持の有無を記録した.認知機能の評価は日本語版Montreal Cognitive Assessment(MoCA-J)を用いた.また,認知機能の変化については、ベースライン時のMoCA-Jの得点からフォローアップ時の得点を引いた値を算出し、そのうち差が大きかった25%を認知機能低下群と定義した.臼歯部咬合支持の有無と認知機能の低下との関連を検討するためにMann-Whitney U検定,ロジスティック回帰分析を行った.有意確率は5%とした.【結果】MoCA-Jの得点は,ベースライン時には臼歯部咬合支持の有無で有意な差は認められなかった(p=0.49)が,フォローアップ時には,有意な差を認めた(p<0.01).さらに,認知機能の低下の有無を目的変数としたロジスティック回帰分析の結果,臼歯部咬合支持は,他の因子を調整したうえでも,有意な変数(オッズ比1.79,95%信頼区間1.21-2.65)となった.被験者のデータも順調に集まり,想定どおりの結果も得られ,順調に進んでいる.I.目的サルコペニアとなっている者では,顎顔面領域の筋肉量,筋力も同様に低下し,咀嚼機能が低下することが考えられる.そこで地域高齢者を対象として,筋肉量・筋力と口腔機能との関連を検討し,特に握力と咀嚼能率との関連に注目して分析した.II.方法対象者は,82-84歳の地域高齢者809名(男性407名,女性402名)とした.体組成計を使用し筋肉量を,また全身の筋力指標として握力を測定した.次に,口腔内検査を行い,残存歯数を記録した.さらに,口腔機能として,最大咬合力(デンタルプレスケール,ジーシー社),咀嚼能率スコア(検査用グミゼリー,UHA味覚糖社),刺激時唾液分泌速度(SSFR),舌圧(JMS舌圧測定器,ジーシー社),開口量を測定した.統計学的分析には,筋肉量・握力と各口腔機能との関連について検討するために,Spearmanの順位相関係数の検定,ロジスティック回帰分析などを用いた.III.結果と考察残存歯数,最大咬合力,咀嚼能率スコア,舌圧,開口量の平均は,それぞれ14.7本,198N,3.9,27.0kPa,48.8mmであった.筋肉量ならびに握力は,すべての口腔機能(最大咬合力,咀嚼能率スコア,SSFR,舌圧,開口量)と有意な正の相関関係を認めた.重回帰分析を用いて性別と年齢を調整したところ,握力は最大咬合力,咀嚼能率舌圧,開口量と有意な関連を認め,筋肉量は舌圧とのみ有意な関連を認めた.さらに従属変数を咀嚼能率(下位25% /それ以外)としたロジスティック回帰分析の結果,性別と残存歯数を調整した上でも,最大咬合力,舌圧も加えて,握力は,咀嚼能率と有意な関連が認められた.本結果より,筋肉量(Sarcopenia)よりむしろ筋力の低下(Dynapenia)が,口腔機能維持に重要であることが示唆された.縦断研究の参加者も予想通りで,データ整理,分析も順調である.歩行速度は,サルコペニア診断に用いられる身体能力指標の一つである。これまでの研究では,歯・口腔の状態と,歩行速度との関連について,横断的な分析結果が報告されている。しかしながら,歩行速度に対する,歯・口腔の状態の影響について,多人数の後期高齢者を対象として,縦断的分析を行った研究はみられない。80歳の地域高齢者を対象として,3年間での歩行速度の変化に対する咬合支持の影響について検討した。方法:対象者は,7981歳の地域高齢者547名(男性272名,女性275名)としてベースライン調査を行い,3年後にフォローアップ調査を行った。フォローアップ調査時において,歩行速度が0.8m/秒以下の者を,歩行速度低下群とした。なお,本研究では,べースライン時にすでに歩行速度が0.8m/秒以下の者は分析対象外とした。

対象者は,ベースライン時での天然歯による臼歯部咬合支持あり群(Eichner A1-B3)となし群(Eichner B4-C3)に分類された。統計学的分析には,歩行速度低下と咬合支持との関連について検討するために,カイニ乗検定,ロジスティック回帰分析を用いた。有意確率は5%とした。結果:フォローアップ時に歩行速度低下群となった者は,臼歯部咬合支持あり群では18.1%,なし群では27.3%であり,カイニ乗検定の結果,有意な関連が認められた(p=0.033)。従属変数を3年後の歩行速度,独立変数を性別,ベースライン時のBMI,歩行速度,臼歯部咬合支持としたロジスティック回帰分析を行った結果,臼歯部咬合支持は,3年間の歩行速度の低下と有意な関連が認められた(オッズ比=1.69,p=0.048)。本研究の結果より,咬合支持の有無は歩行速度の低下に影響することが示唆された。対象者は,ベースライン調査ならびに,3年後のフォローアップ調査に参加した79ー81歳の地域高齢者,549名(男性277名,女性272名)とした.認知機能の評価は日本語版Montreal Cognitive Assessment(MoCA-J)を用い,変化が大きかった25%を認知機能低下群とした.歩行速度は,0.8m/秒をカットオフ値とし,歩行速度がベースライン時正常閾で,追跡時に0.8m/s以下の者を歩行速度低下群とした.ロジスティック回帰分析の結果,臼歯部咬合支持は,性別や教育歴,全身疾患や他の交絡因子を調整した上でも,3年後の認知機能の低下や歩行速度の低下に影響を及ぼすことが示唆された.引き続きデータを収集するとともに,解析について,充実させて行きたい.次年度は86歳が調査対象であるが,かなり高齢であるので,参加者の減少が心配である.適宜訪問調査も取り入れたい.29年度が最終年度であるため、記入しない。高齢者歯科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
カブトガニ血球細胞中に含まれる体液凝固インヒビターの構造と機能の解析

カブトガニ血球細胞には複数のセリンプロテアーゼインヒビター(セルピン)が存在し、既に2種のLimulusIntracellular Coagulation Inhibitor (LICI) type-1,type-2の精製、クローニングが行われている。今回、LICI-1,-2とは特異性の異なるインヒビター(LICI-3と命名)の精製、クローニングを行った。LICI-3はデキストラン硫酸セファロース、セファクリルS-200とpHの異なる2回のDEAEセファロースにより精製され、その分子量は53,000であった。LICI-1,-2がそれぞれカブトガニ体液凝固系セリンプロテアーゼC因子、凝固酵素を阻害するのに対し、LICI-3は真菌等の細胞壁の構成成分である(1,3)-β-D-glucanにより活性化されるセリンプロテアーゼG因子を最もよく阻害した(k_1=3.9x10^5M^<-1>s^<-1>)。精製LICI-3をリシルエンドペプチダーゼにより消化し、逆相系HPLCによりペプチドを分取の後、気相シーケンサーによりアミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列情報を元にプローブを作成し、カブトガニ血球cDNAライブラリーより、LICI-3のcDNAを得た。LICI-3はシグナル配列22残基、インヒビター部392残基よりなり、その反応部位の配列はArg-Serであった。相同性解析を行うとLICI-3は他のLICI同様にシグナル配列は持つものの白血球エラスターゼインヒビター(35%)等の細胞内セルピンと高い相同性を示した。各種臓器より調整したtotalRNAに対し、RT-PCRによりLICI-3の発現組織を調べると血球のみで特異的増幅がみられ、血球細胞以外の組織で発現していないと考えられた。次に血球内での局在を明らかにするために抗LICI-3抗体を用い、大・小顆粒画分に対しウェスタンブロティングを行った。抗LICI-3抗体は大顆粒画分に反応し、他のLICI同様に体液凝固系プロテアーゼと共に大顆粒中に存在し、リポ多糖などの刺激により細胞外へ放出されると考えられた。そこで血球細胞にカルシュウムイオノフォアA23187を加え、LICI-3の細胞外へ放出を調べるとイオノフォアにより細胞外に放出された。このことは構造上は細胞質に存在する細胞内セルピンに相同性が高いものの、シグナル配列を持ち顆粒内に存在し、刺激により細胞外に放出される点で大きく異なっていた。
原子分解能をもつX線ホログラフィの開発とその応用

本研究の当初の目標は、結晶基板上に薄膜状に成長させた原子に対して蛍光X線ホログラフィの手法を適用して、原子座標を立体的に決定することであった。そのための試料としてGe原子を1原子層程度ドープしたSi/SiGe/Si結晶を用意して、強力な放射光光源であるSPring-8で測定を行った。しかし得られたGeの蛍光X線の強度が予想に反して極めて弱かったので、薄膜状の試料で測定を行うことは断念した。その後バルクのGe(111)結晶を用いて蛍光X線ホログラフィの実験を行った。蛍光X線ホログラフィの手法には下記の2種類がある。1.注目する原子から放出された蛍光X線が周囲の原子によって散乱されて物体波を形成し、直接放出された参照波の蛍光X線と干渉する。その強度を広範囲の立体角にわたって測定してホログラムを得る。(順過程)2. 1.とは逆に、平面波X線をある方向から試料に対して入射させ、入射波のうち注目する原子に直接到達するものを参照波とし、周囲の原子で散乱されてから到達するものを物体波として、注目する原子の位置で干渉させる。その干渉の強度を蛍光X線の収量でモニターする。同様の測定を入射線の方向や波長を変えて繰り返し、波数空間での強度分布を得る。(逆過程)バルクの試料の測定はフォトンファクトリーで2回行い、順過程と逆過程の両方のデータをとった。試料がバルクであるため収量は十分であった。データをフーリエ変換することによって実空間の原子位置が再現できたと思われる。本研究の目標は、結晶基板上に薄膜状に成長させた金属に対してX線ホログラフィーの手法を適用することである。十分な精度でX線ホログラフィーの実験を行うためには大型放射光施設の強力なX線の利用が不可欠となる。本年度は準備段階として、超高真空蒸着装置を作製して、研究室で予備的な実験を行った。まず超高真空条件下においてSi(111)√<3>×√<3>-Auの系をサンプルとして作製した。このサンプル表面に電子線を入射し、表面Au原子が放出する特性X線の強度分布の測定を試みた。特性X線、基板結晶のブラック角を満たす方向に強く回折され、コッセル線とよばれる線状の強度分布を形成する。X線ホログラフィーはコッセル線のほぼ逆の過程となす事ができる。したがってこの予備実験が成功すれば、励起源を電子線から放射光のX線に切り替えるだけで容易にX線ホログラフィーの測定が行えるはずである。現時点では明瞭なコッセル線を観測できていないが、強度とS/N比の観点からは十分な結果を得ている。明確な結果を得るためには、平坦で歪みのないサンプルをつくると同時に、特性X線のアナライザーの精度と操作性を向上させる必要があると考えられる。X線ホログラフィー放射光コッセル線本研究の当初の目標は、結晶基板上に薄膜状に成長させた原子に対して蛍光X線ホログラフィの手法を適用して、原子座標を立体的に決定することであった。その後バルクのGe(lll)結晶を用いて蛍光X線ホログラフィの実験を行った。(順過程)

2. 1.とは逆に、平面波X線をある方向から試料に対して入射させ、入射波のうち注目する原子に直接到達するものを参照波とし、周囲の原子で散乱されてから到達するものを物体波として、注目する原子の位置で干渉させる。その干渉の強度を蛍光X線の収量でモニターする。同様の測定を入射線の方向や波長を変えて繰り返し、波数空間での強度分布を得る。(逆過程)バルクの試料の測定はフォトンファクトリーで2回行い、順過程と逆過程の両方のデータをとった。試料がバルクであるため収量は十分であった。データをフーリエ変換することによって実空間の原子位置が再現できたと思われる。
消滅の危機に瀕する琉球語（沖永良部方言）の記述研究

平成26年度は沖永良部島国頭集落を対象に3度の現地調査を行い、平成25年度に引き続き、記述文法の基礎資料となる自然談話資料の収集と書き起こしを行った。自然談話資料は形態素毎の訳・文法情報を付与し、データベース化したほか、その一部を言語資料として『奄美沖縄文芸研究』に投稿した。平成25年度までに行った基礎語彙、文型、動詞活用の調査結果と自然談話の分析を合わせ、国頭方言における文法概要(音韻・形態・統語構造)を中間報告としてまとめた。文法の分析はこれまで形態的な側面のみに着目していたが、自然談話データが蓄積したことで個々の接辞の意味用法に関する分析が進んだ。また、格助詞や名詞接辞の選択に関わる有生性の影響など、複数の文法現象を横断して一般化できる特徴についても整理が進んだ。今後はこれまでに調査が出来ていない待遇表現の体系、自動詞・他動詞の体系、イントネーションの分析等に取り組み、総合的な文法記述としたい。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、消滅の危機に瀕する奄美諸島沖永良部島方言の総合的な文法記述と記録を目的としている。平成25年度は、文法記述に向けて2度の現地調査を行い、主に名詞、動詞、形容詞の形態論に関する調査と、分析の基礎となる自然談話資料の収集、アノテーションの付与作業に取り組んだ。調査で得られた知見のうち、動詞・形容詞の活用変化の概要は、科学研究費基盤研究A「消滅危機言語としての琉球諸語・八丈語の文法記述に関する基礎的研究」の研究会で報告を行った。文法の概要については同研究会で配布した「沖永良部島国頭方言(中間報告)としてまとめたほか、Gi js van der Lubbe氏と共著した"Okinoerabu"にまとめた(Handbook of the Ryukyuan languagesに掲載予定)。名詞形態論のうち、人称代名詞の体系については「沖永良部国頭方言の人称代名詞」として『琉球の方言』に論文投稿し、複数接尾辞の選択条件については「奄美沖永良部島方言の複数接尾辞」としてJLVC2014にて発表を行った。自然談話資料は独話、歌、昔話、会話など計6時間ほどを収集し、書き起こし、及びアノテーション付与の作業を進めた。この他アウトリーチ活動として、平成26年1月に沖永良部島知名町公民館において沖永良部方言と言語継承を話題とした講演を行った。文法記述に向けての調査は大きく前進したが、同時に目指している記録資料の公開については限定的なものにとどまった。今後は引き続き研究を前進させると共に、資料のデータベース化と一般公開への準備を進めたい。音韻論、形態論について調査と分析の進展が見られ、今後の文法分析の基礎となる自然談話資料の収集も進んだ。研究結果は論文や研究会の発表を通して報告したものの、記録資料の公開は限定的なものにとどまった。(1)自然談話資料へのアノテーション付与作業を進め、文法分析の為の基礎資料を整える。(2)個別の文法事象に関する分析を進める。(3)ホームページを整備し、記録資料を公開する。
脂質二分子膜カプセルの電気崩壊性を利用した電子回路中へのバイオセンサ素子の配列化

筆者らはこれまでにMEMS技術を利用し、微小な生物・化学センサを集積したデバイス開発を目指している。これは極微量の血液・体液に含まれる抗体や蛋白の種類を認識し、電気信号に変換するためのセンサ素子である。本研究では、電気回路内に種々のバイオセンサ素子を高密度に配列化するための方法の確立を目指した。第1番目に、ガラス基板上に電極センサを構築し、その電極上に薄膜を形成させ、この薄膜表面に細胞由来の生化学物質が固定化できるように化学構造を最適化した。この表面にIgG(イムノグロブリン)抗原を集積させ、IgG抗体の応答についてセンサ応答性機能を調査した。この結果、電極に電流を負荷させると条件によっては電極や薄膜が崩壊し、信号の検出が難しいことが分かった。そのため第2段階の検討事項として、薄膜に添加物を加えることによる安定な信号検出が可能なセンサ電極表面の製造方法を検討し、特許出願を行った。生物は巧みに生体物質を自己組織化し、目、舌、鼻等の表皮に感覚細胞群を構築している。センサ素子の高度・高機能化には、このような生物の感覚器形成の機構を模倣する必要がある。本研究では、電気回路内に種々のバイオセンサ素子を高密度に配列化するための新方法の確立を行う。そのため以下の2点を研究目的としている。(1)電気回路内に機能性分子を任意の位置に配列させる。(2)機能性分子の配列はデバイス上にて電気的制御で実現する。初年度はセンサ素子の高度配列化のための前段階として、電気信号検出確認の評価を実施した。(1)Au(1μm)/Cr(0.1μm)/ガラス基板上にフォトリソグラフィー法にてMEMSセンサ回路を構築した。センサ配列と信号の最適化を図るため、10μm3mm間隔の電極対(ソース/ドレイン)で、510mm四方に525対集積化した。電極部分に絶縁体の膜を積層させ表面に液滴を滴下すると、絶縁膜/液滴界面に電気的偏り(分極)が生じ、ゲート電極の機能を果すこと、及び液滴中の濃度に応じて電圧値が変化する現象を確認した。信号処理回路との兼ね合いで以降センサ数を5とし、各種認識物質をそれぞれ配列化するための基板設計が終了した。(2)上記センサのための信号処理回路基板を新たに試作し、応答感度とノイズ除去が可能となった。これによって、微小な信号変化を精度よく計測するための方法が確立できた。(3)さらに特異的検出機能を付加させるため、絶縁膜表面に各種抗体を疎水性相互作用を利用して固定化した。溶液中の抗原濃度μg/mlpg/mlの範囲で検出可能であることが確認された。電気回路中に様々な特異的検出機能をもつバイオセンサ素子構築のための基本概念が確立できた。申請者はこれまでにMEMS技術を利用し、微小な生物・化学センサを集積したデバイス開発を目指している。これは極微量の血液・体液に含まれる抗体や蛋白の種類を認識し、電気信号に変換するセンサ素子である。一方、生物は巧みに生体物質を自己組織化し、目、舌、鼻等の表皮に感覚細胞群を構築している。(1)電気回路内に機能性分子を任意の位置に配列させることが第一の研究目的である。(2)機能性分子の配列はデバイス上にて電気的制御で実現することが第二の研究目的である。今年度は(1)の要素技術確立を行なうため、これまでに試作した電極センサチップの表面に、機能性物質が固定化できる薄膜構造を構築することを試みた。これは薄膜表面に微小カプセルを予め配置し、その表面に細胞由来の生化学物質を固定化する方法である。微小カプセル表面には、あらかじめ蛍光によって発光する標識分子を固定化し、蛍光顕微鏡で発光強度を測定した。今年度は分子固定化の最適条件を見出した。このような方法を応用して、微小カプセル表面にIgG(イムノグロブリン)抗原を集積させ、IgG抗体の応答についてセンサ応答性機能を調査した。次年度はこの微小カプセル表面に脂質を二分子膜としたシェルを構築させ、この脂質小胞体に機能性物質が固定化できるか試みる。

これは極微量の血液・体液に含まれる抗体や蛋白の種類を認識し、電気信号に変換するセンサ素子である。一方、生物は巧みに生体物質を自己組織化し、目、舌、鼻等の表皮に感覚細胞群を構築している。センサ素子の高度・高機能化には、このような生物の感覚器形成の機構を模倣する必要がある。本研究では、電気回路内に種々のバイオセンサ素子を高密度に配列化するための新方法の確立を行う。そのため以下の2点を研究目的としている。(1)電気回路内に機能性分子を任意の位置に配列させることが第一の研究目的である。(2)機能性分子の配列はデバイス上にて電気的制御で実現することが第二の研究目的である。昨年度は(1)の要素技術を確立した。ここではガラス基板上に電極センサを構築し、その電極上に薄膜を形成させた。この薄膜表面には、あらかじめ機能性物質を固定化できる微小粒子(カプセル)を配置させた。このカプセルに細胞由来の生化学物質が固定化される方法である。微小カプセル表面には、あらかじめ蛍光によって発光する標識分子を固定化し、蛍光顕微鏡で発光強度を測定した。昨年度は分子固定化の最適条件を見出した。このような方法を応用して、微小カプセル表面にIgG(イムノグロブリン)抗原を集積させ、IgG抗体の応答についてセンサ応答性機能を調査した。しかし電極に電流を負荷させると、条件によっては電極や薄膜が崩壊し、上手く信号を検出することが難しいことが分かった。そのため今年度は(2)を達成するために薄膜に添加物を加え、安定な信号検出が可能なセンサ電極表面の製造方法を検討し特許出願を行った。
シンクロトロン光と次世代シークエンサーを用いた効率的な欠失突然変異体単離系の開発

H30年度は、逆遺伝学的な変異遺伝子単離を行う際に利用しやすい、1塩基から数十塩基程度のIN-DEL変異の導入効率が高いシンクロトロン光(X-線)の照射条件を明らかにすることを目的として、供試するダイズ種子の水分含量およびAlおよびCuフィルターの有無、照射量を変化させた、シンクロトロン光照射ダイズ種子集団を作成し、当代における放射線障害を評価するため、発芽率および3週間後の生存率を調査した。その結果、種子水分含量が20%のものの方が10%のものに比べて顕著な発芽率および生存率の向上が認められ、種子中の水分含量の増加が何らかのメカニズムを介してX-線照射のダメージを軽減していることが明らかになった。また、照射量については、いずれの条件でも300Gy前後で3週間後の生存率が50%程度となることが明らかになった。さらに、これらの結果を踏まえて、水分含量20%の無照射区、20%および10%のフィルター無し300Gy照射区、20%のAlフィルター有り300Gy照射区、20%のCuフィルター有り300Gy照射区の5種類の集団それぞれからM2種子を採種した。その後、温室内で栽培したM2個体の緑葉よりDNAを抽出し、試験区ごとに5個体ずつのDNAを混合し、次世代シークエンサーで塩基配列を解析し、約20倍深度のゲノム塩基配列データを得た。これらのデータとWilliams 82のゲノム塩基配列の比較から解析を進めている。次世代シークエンサーによるIN-DELの検出を行なっているが、プールした変異体のDNAを用いた影響か既存の解析プログラムによる変異の検出が難しく、最適な解析条件を見出すのに時間を要しており、さらに別の手法を適用することも検討している。本年度は、さらに規模を拡大した変異集団の作成を進めるとともに、表現型と塩基配列の両方からさらに詳細に導入された変異の評価を進めてゆく予定である。H29年度は、1次世代シークエンサーを用いたアンプリコンシークエンスによる変異集団中の欠失変異配列の検出法の確立に取り組んだが、当初は、以前作成したダイズX-線照射集団の約2万系統から得たDNAをプールし、それぞれのプールを鋳型として標的遺伝子領域をPCRによって増幅し、これを次世代シークエンサーを用いて解析する予定であったが、保存されていたDNAを用いて予備的に3個の遺伝子を標的としたTILLING法による変異の検出を行った結果、今回用いたX-線照射集団では当初の予想より変異頻度が低く、アンプリコンシークエンスを用いた変異頻度の評価は難しいことが明らかになった。そのため予定を変更し、この集団に含まれる5個体の突然変異個体のゲノミックDNAを混合して全ゲノムシークエンスを行い、ゲノム全体についての変異頻度を算出することに計画を変更し、突然変異個体を栽培し再度DNAの抽出を行った。その後、これらのDNAを混合して、次世代シークエンサー用のライブラリー調整を行ない、次世代シークエンサーによる解析を進めている。2変異体集団中からの目的とする欠失変異個体の迅速検索法の確立を進めるため、次世代シークエンスを用いた一次スクリーニングの後の二次スクリーニングに利用する手法についても検討を行った。これについては、当初想定していたCAPs法およびdCAPs法による変異個体の検出には12個体程度まで混合したサンプルからの検出が可能であることが明らかになった。また、これらの方法とは別にTILLING法に使う酵素であるCEL1より高感度で欠失変異を検出できるとされているT7エンドヌクレアーゼを用いた変異箇所の検出法についての検討も進めている。3小規模な欠失変異の導入効率を高めたX-線照射条件の最適化を進めるために、シンクロトロン光施設でのダイズ乾燥種子に対しX-線照射を行い、変異集団の作成を進めている。予備実験の結果、以前に作成していたX-線処理突然変異集団の変異頻度が予想より低かったため、当初計画していたアンプリコンシークエンスを用いた変異効率の評価では十分な成果が得られない可能性が出てきた。そこで、当初の方針を変更し、全ゲノムシークエンスによる変異効率の評価を行うこととし、新たなサンプルの調整を行った。このため、研究計画の一部が遅延しているが、この点については補完的な手法を用いることで2年次以降で十分挽回が可能であると考えている。