hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脊髄損傷急性期の積極的平温療法は、二次損傷による神経学的予後の悪化を防ぐか

動物実験においては、脊髄損傷ラットを作成し、平温維持群、高体温群に割り付けた。それぞれ受傷後6時間、24時間、48時間、72時間、1週で後肢運動機能をBBBスケールにて評価後、深麻酔下に屠殺し、脊髄損傷部を摘出、ホモジナイズして、脊髄内TNF-αとpNF-Hの含有量を測定する計画で、現在検体採取中である。ヒトでの研究では、血液検体が採取できた患者数が5名となった。臨床業務が忙しく、実験の時間がとれないため。引き続き脊髄損傷ラットを作成して検体最終終了後、ELISA法にて脊髄内TNF-αとpNF-Hの含有量を測定する。ヒトでの検体にて血清TNF-αとpNF-Hの濃度を測定する。臨床研究では、頸髄損傷患者に本研究の説明と同意を得て、血液サンプルを採取している。血液は搬入時、受傷後1日、2日、3日で採取している。現在までに3名の患者の血液サンプルが得られている。5名分得られたら、神経バイオマーカーの測定を行う予定である。動物実験では、脊髄損傷ラット(N=5)、偽手術ラット(N=8)、コントロールラット(N=4)を作成し、作成後24時間で深麻酔下にラットの損傷脊髄を露出した。脊髄から蛋白を抽出し、ELISA法にて脊髄内TNF-αとpNF-Hの含有量を測定した。TNF-αは偽手術、脊髄損傷ラットともに、コントロールラットより有意に増加していた。またpNF-Hの含有量は脊髄損傷ラットでは、偽手術、コントロールラットより有意に増加していた。これらの結果より、我々が用いているモデルは、本研究の遂行に適切であると判断された。動物実験は概ね順調に進展しているが、臨床研究での患者数が少ない状況である(年間5名を予定していたが、3名にとどまっている)。引き続き臨床研究のための症例収集を行う。動物実験は、引き続き、脊髄損傷ラット、偽手術ラット、コントロールラットを作成し、脊髄内炎症性サイトカインと神経バイオマーカーの含有量の経時的変化を調査する。設備備品の購入費が少なかった。また旅費と人件費謝金の支出がなかったため、次年度使用額が生じた。今年度は試薬購入の増加が見込まれ、こちらに使用を計画している。ラットの購入匹数が少なかった。試薬の購入量が少なかった。旅費の使用が無かった。今年度は最終年度のため、残りの実験計画を遂行していく。
エクソソーム分泌阻害と抗脈管新生に関わる遺伝子との複合治療による乳癌転移阻止

エクソソーム分泌に関与するneutral sphingomyelinase 2 (nSM2)をノックダウンさせるために、siRNA配列設計のアルゴリズムに基づいて、4種類の配列のnSM2に対するsiRNAを合成した(Qiagen)。24ウエルプレートに転移性のマウス乳癌細胞株(BJMC3879Luc2)を播種した後、カチオン性の遺伝子導入試薬HiPerfect(Qiagen)を用いて、25nM濃度でsiRNAを遺伝子導入し(遺伝子導入効率82%条件下)、18時間後に各細胞からRNA抽出を行い、Real-time PCR(TP850, Takara Bio)にてnSM2発現を解析した。なお、対照としてはヒト、マウスのいかなる遺伝子にも相補性を示さないスクランブル配列のNeg-siRNA-Alexa488を導入した。その結果、4種類のsiRNA配列のうち、2種類のsiRNA配列が対照群に対して、それぞれ52%、43%のノックダウンを示した(P<0.01)。最も効率よくnSM2発現をノックダウンしたsiRNA配列は5'-cagatgcacactacttcagaa-3'であった。この効果的なsiRNA配列にてショートヘアピン型siRNAを合成し、pAAV-U6-ZsGreen1 Vector(Takara Bio)に組み込み、nSM2-siRNA発現ベクターを作製した。このベクターはサンゴ由来の緑色蛍光タンパクZsGreen1を発現するため、遺伝子導入の状況が容易に可視化出来る。当初の予定通り、nSM2に対するsiRNA配列を求め、nSM2-siRNA発現ベクターを構築した。BJMC3879Luc2乳癌細胞株にnSM2-siRNA発現ベクターをエレクトロポレーションにて遺伝子導入した。ところが、遺伝子導入効率は1026%と悪く、ノックダウン効率も7%と評価に堪えないものであった。早急にプラスミドベクターの遺伝子導入効率を上げる条件検討を進めなければならない。nSnSM2-siRNA発現ベクターの遺伝子導入効率を上げるため、ベクターのDNA濃度、細胞数、遺伝子導入のパルスの強さと長さなど条件検討が急務である。至適条件でnSM2-siRNA発現ベクターの遺伝子導入が可能となった後、nSM2発現のノックダウンをReal-time PCRで確認すると共に、ウエスタンブロットないしは電子顕微鏡にてエクソソームの分泌低下のあることも確認しなければならない。実験の一部で条件設定の必要が生じ、それを翌年度に持ち越したため、翌年度分として請求した助成金を合わせて使用する。
インフルエンザAウイルス感染の経気道アレルギー感作誘導に関する研究

疫学調査では,気道ウィルス感染が気管支喘息の発症に関与していることが明らかにされている。感染型喘息の発症に気道感染が重要な関与をしているが、その機序はいまだ解明されていない。私共はインフルエンザAウィルス感染時に低濃度抗原を吸入させると,抗原特異的IgE抗体産生,気道過敏亢進が生じることなどを明らかにしてきた(JACI102;732,1998)。本研究では,ウィルス感染時の抗原感作元進においてどのような抗原提示細胞が活性化され,どのようなメカニズムでTh2細胞が活性化されるかを明らかにする。本研究では,気管支喘息患者の抗原感作・曝露の経路を考慮した経気道的なアレルゲン感作の方法を用いた。マウスに馴化したインフルエンザAウィルスをマウスに点鼻感染させた。感染急性期に抗原として卵白アルブミンを吸入させると,抗原特異的IgEが産生され,気道過敏性の出現,Th2サイトカインの放出が見られた。この際,気道内に樹状細胞が出現し抗原を貧食し,所属リンパ節に運ばれる。感染回復期に抗原を吸入させても,樹状細胞はほとんど出現せず,抗体産生も認めなかった。インフルエンザAウィルス感染時のサイトカイン放出を検討すると,IFN-γは3日目より上昇し,7日目にピークを示した。TNF-α,MIP-2,KCはともに3日目にビークを示し,5日目には低下を示した。IL-4およびIL-5は変化を示さなかった。IL-12も変化を示さなかった。以上,インフルエンザAウィルス感染の急性期には樹状細胞が気道に集積し,抗原を貧食し,T細胞活性化をおこしtype2の免疫反応を起こす。しかし,ウィルス感染時にはTh2サイトカイン以外の因子によって樹状細胞の抗原貧食およびT細胞の活性化が招来されると考えれる。ウィルス感染時にはvirus-specific CD8+TcellによるMHC class I拘束性の反応が強く起こり,IFN-γが産生される。一方,疫学上,ウィルス感染が抗原感作を促進していることが報告されている。これまで,私どもは実験的に動物でインフルエンザAウィルス感染後に経気道アレルギー感作が促進されることを明らかにしてきた。ウィルス感染時に抗原吸入を加えると,どのような機序でTh2反応に傾くかを検討した。マウスにインフルエンザAウィルス感染させ,感染急性期(ウィルス接種3-7日後)あるいは回復期(10-14日後)に卵白アルブミンの吸入を行い,その3週後に抗原吸入チャレンジを行った。急性期感作群では,気管支肺胞洗浄液のリンパ球数及び好酸球数の増加,さらにtype2サイトカインであるIL-4,IL-5も増加した。また,抗原特異的IgE抗体,抗原特異的IgG1抗体が上昇し,気道過敏性の亢進も認められ,type2の免疫反応が成立した。しかし,回復期感作群では上記反応が認められず,IFN-γの増加が認められ,type1の免疫反応が認められた。免疫組織学的検討では,急性期群で抗原吸入後に樹状細胞が気道表面に出現したが,回復期群では樹状細胞は認められなかった。所属リンパ節を観察すると,急性期群では樹状細胞が認められ,抗原の貪食像が認められた。一方,回復期群では気道,所属リンパ節にも樹状細胞は認められないが,マクロファージが認められ,抗原の貪食像が認められた。

以上より,ウィルス感染急性期の抗原吸入では気道に抗原提示細胞として樹状細胞が出現し,type1免疫反応が成立するが,感染回復期の抗原吸入ではマクロファージが免疫反応を担い,type2免疫反応を引き起こす。この結果は,ウィルス感染の時期により免疫反応が異なることを示唆する。アレルゲン感作の研究では,気管支喘息患者におけるアレルゲン感作・曝露を考慮すると,経気道的なアレルゲンの投与が必須であるが、これまで経気道的アレルゲン投与では必ずしもアレルギーが成立しなかった。これまでの私どもの研究で,経気道的な抗原感作はインフルエンザAウィルス感染によって促進されることが明らかにしてきた。本研究では,マウスに馴化したインフルエンザAウィルスを用いてマウスを感染させた場合,どのようなサイトカイン・ケモカインがアレルギー感作に関与しているかを検討した。以上,MIP-2やKCなどの好中球遊走性ケモカインやTNF-αなどの炎症性サイトカインは,インフルエンザAウィルス感染で増加したが,Th2サイトカインであるIL-4やIL-5は変動しなかった。このことは,前年に明らかにしたウィルス感染時の樹状細胞による気道内吸入抗原の認識には,これらサイトカインが関与しないことを示す。
マイクロRNA発現解析に基づいた間質性膀胱炎の発症メカニズムの解明

昨年度、間質性膀胱炎の分子レベルでの発症要因を解明するため、RNA sequencingにより間質性膀胱炎患者の膀胱粘膜検体における網羅的なマイクロRNA発現解析を行った。その結果、正常膀胱および膀胱癌組織と比較して366種のマイクロRNAが発現異常(203種が発現低下、163種が発現亢進)を示していることが分かった。中でもmiR-320ファミリーの発現低下に着目し、ゲノムワイド遺伝子発現解析およびインシリコデータベース解析により、E2F-1, E2F-2, TUBがmiR-320ファミリーの標的遺伝子であることを突き止め、更に間質性膀胱炎の臨床検体の免疫染色を行いこれら遺伝子の発現亢進を確認した。以上より、miR-320を基点とするパスウェイの間質性膀胱炎の発症への関与が示唆され、今後の間質性膀胱炎の新たなバイオマーカーや治療法の開発につながる可能性が示された。我々は、現在の間質性膀胱炎の確定診断が膀胱鏡の所見という主観的要素の強い項目に基づいて行われている問題点に着目し、間質性膀胱炎特異的に発現異常を示すマイクロRNAを用いた簡易的かつ明確な診断法の開発を目指している。具体的には、血液中のエクソソーム解析によりマイクロRNAの発現プロファイルを得て非間質性膀胱炎の血液と比較し何らかの発現異常を示すマイクロRNAの同定を試みる予定であり、現在、患者検体の採取に向けて鋭意準備を進めているところである。研究代表者の臨床業務が多忙となったため、検体採取、実験などが予定通りに進行しなかった。間質性膀胱炎患者の血清をもとに網羅的なマイクロRNA発現解析を行い、特異的な発現を示すマイクロRNAを同定し、間質性膀胱炎の新規バイオマーカー開発へとつなげようと考えている。間質性膀胱炎は、原因不明の難治性膀胱炎であり、頻尿や痛みといった症状により患者のQOLを著しく低下させるが、いまだ客観的な診断法や有効な治療法がないのが現状である。今回我々は、間質性膀胱炎の病態解明に向けて臨床検体におけるマイクロRNA発現プロファイルの作成を試みた。麻酔下膀胱水圧拡張時に間質性膀胱炎患者から得られた生検検体を用いて、RNAシーケンシングにより網羅的なマイクロRNA発現解析を行い、その発現レベルを、すでに当研究チームで作成していた正常膀胱検体および膀胱癌検体における発現プロファイルと比較したころ、間質性膀胱炎特異的に発現異常を認める336個のマイクロRNA(203個は発現低下、163個は発現亢進)が同定された。今回は、そのうち特に発現低下が顕著であったマイクロRNA320ファミリー(miR-320a, miR-320b, miR-320c, miR-320d, miR-320e)に着目し、ゲノムワイド解析およびイン・シリコ解析を用いてその標的遺伝子の探索を行ったところ、3つの転写因子(E2F-1, E2F-2, TUB)がmiR-320ファミリーから制御を受けていることが判明した。続いて間質性膀胱炎臨床検体において免疫染色を行ったところ、これら3つの転写因子は全て病変部において発現が亢進していた。以上より、miR-320ファミリーが制御する分子ネットワークが間質性膀胱炎の病態に関与している可能性が示唆され、今後の新規分子マーカーや新規治療法の開発につながることが期待されると考えられた。当初の第一目的である間質性膀胱炎におけるマイクロRNA発現プロファイルを完成できたため。間質性膀胱炎の病態に関与するマイクロRNAはほかにも複数存在すると考えられる。今回作成されたマイクロRNA発現プロファイルをもとに、発現異常を示す他のマイクロRNAについての解析も順次進め、より網羅的な分子ネットワーク解明を目指していく。可能であれば血中および尿中のマイクロRNA発現レベルの解析(リキッドバイオプシー)や動物モデルを用いたマイクロRNA補充による効果の検証なども行い、より臨床につながる研究結果につなげたいと考えている。

間質性膀胱炎患者の血清をもとに網羅的なマイクロRNA発現解析を行い、特異的な発現を示すマイクロRNAを同定し、間質性膀胱炎の新規バイオマーカー開発へとつなげようと考えている。本年度の研究では臨床検体を用いたin vitro解析およびインシリコ解析が主体であったため、研究にかかる費用が高額にはならなかった。また、今回の研究結果が出たのが年度末であったため、業績発表の機会がなく、旅費が発生しなかったことから、想定よりも少額の使用となった。次年度は本年度使えなかった助成金を用いて、血液や体液におけるマイクロRNA発現解析や動物モデルを用いた研究なども鋭意行いたいと考えている。本年度は研究代表者が臨床業務が多忙であり、本研究に関しては主にディスカッションによる今後の研究計画の方向付けを中心に行っていたため、実験に使用する金額が少額となり繰越金が生じた。次年度は、血清中のエクソソーム中のマイクロRNAの発現解析を計画しており、それにかかる費用(検体採取・保存に必要な物品購入および解析費)に繰越金を使用する予定である。
抗癌剤の細胞膜電位修飾効果における細胞外マトリックスの果たす機能の解明

当科にて樹立したSRsusNB株を浮遊細胞系に調製して、膜電位依存性色素の蛍光強度を観測した。昨年度までの研究で抗癌剤Methotrexateが濃度依存性に膜電位を変動せしめ、in vitroでの増殖抑制効果の有無を膜電位変化から正しく迅速に予測する可能性があることを示し得た。これまでの研究過程で本細胞の膜電位変動には外液中のカルシウムイオン濃度の修飾があることが示唆されたため、その機序について検討を加えた。細胞膜にあってはカルシウムイオンが影響をおよぼす態様は大別してイオンチャンネルを介する場合とCa-ATPaseを介する場合が想定される。カルシウムイオン存在下ではカルシウムイオンチャンネルブロッカーNIFEDIPINは16μg/mlの濃度では明らかな膜電位変化を生じないが、32μg/mlでは膜電位を解消する方向に働くことが明らかになった。また、予めNIFEDIPIN16μg/mlの濃度で処理した後にMTXを添加すると膜電位が濃度依存性の変化を示さなくなった。しかしMTXを先に添加して膜電位を上げておくと、あとからNIFEDIPINを添加しても膜電位は解消する方向には向かわなかった。また、in vitroでの増殖抑制試験では膜電位に影響を与えない16μg/mlのNIFEDIPINとMTXを同時に曝露すると、MTX単独の場合に比べて抑制効果が減弱することが明らかになった。以上の結果から、本細胞に関してはMTXの増殖抑制効果は膜に存在するカルシウムイオンチャンネルを介しており、このチャンネルが正常に機能していることがMTXに感受性であることの条件であることが明らかとなった。また従来信じられてきたMTXの作用機序が実際はカルシウムイオンチャンネルを介する膜表面における葉酸との競合である可能性をも示唆するものである。
医行為の実施による看護の機能拡大と看護の専門職化に関する歴史的研究

昨年度に引き続き米国および英国の高度実践看護に関する史料調査を実施した。米国のNurse Practitionerの発展に影響した社会的な背景要因には、医療費の高騰、医療技術の高度化、高齢者や慢性疾患患者の増加、地域医療を担う医師の不足などがあった。実現を促進したのはコロラド大学の小児科医Silverなどの理解ある医師からの協力であり、優れた看護実践家かつ大学教員として組織横断的に活動、教育する看護指導者の存在であった。NPが地域での実践を確立していくとともに、Physician Assistantは地域医療よりも高度医療機関における専門医の助手の役割を期待されるようになった。従来は医師の業務であった診断や治療の一部を看護師が実施することに対する法的な問題は、個々の業務手順書で示すのではなく、州の看護業務法においてNPの裁量権(Full Authority)を規定する方向で解決が図られている(看護登録法でもなく)。多くの州で看護師がPAから指示を受けることを禁止している。1990年以降NP、CNSの実践へのメディケア、メディケアによる支払いが行われている。日本では2007年からのチーム医療の推進、地域包括システム、医師の働き方改革の流れで、看護師による医行為の一部実施のための特定行為研修制度が開始されたが、米国のように研修制度は大学院教育に位置づけられておらず、研修を受けた看護師も地域包括に資する人材として活躍するには至っていない。今年度より日本看護協会は、米国型NPについての検討を開始した。米国に関しては雑誌等に掲載された関連記事の収集がおおむね終わっており、分析中である。英国の史料調査はいまだ十分とはいえず、関連文献を引き続き収集中である。引き続き関係史資料の収集を行い、分析と関係者へのインタビューを実施していく。1965年から1980年代までの米国および日本における高度実践看護師や看護関連職種の歴史について国内外の文献検討を行った。米国では、1965年のコロラド大学での小児NPの養成開始より、医師からは「二流の医療」、看護からも「医師の支配のもとに戻るのか」との異論があったが、1970年代にはNPの行うプライマリケアに対して利用者が満足しているとの研究結果が示され、1980年代にはNPに対する批判は根拠がないとの見解が関係団体から示されるようになった。PAが委任された一部の医行為を行うのに対して、プライマリ分野のNPは委任された一部の診断や処方を、看護と統合したかたちで提供するものと考えられている。日本では、1970年代から雑誌等で米国NPの紹介が行われ、当初、医師からは「患者が承知すまい、偽医者騒ぎになる」、看護からは「日本の開業医は世襲制なのでNPのindependent practiceは難しいがjoint practiceなら可能。であったとしても日本の看護師は自発性に乏しく、活発に発言しないので教育水準を高めるほうが先決」との意見がある。1980年代には看護からは「PAははからずも医行為が医師の独占するものではないことを証明」行政担当者からは「プライマリ分野では医師との競合も少ないであろうから、患者家族にとって満足のいく包括的なケアが提供でき、医療費の削減につながるのであればとりいれてみるとよい」との意見が示されている。1990年以降、看護の高等教育化が進展し、CNS、NP教育がはじまり、高度実践の道が拓かれた。2002年の看護師による静脈注射の実施、2007年のチーム医療の推進に関する一連の動きを経て、医行為の委譲も進んでいるが、看護師の裁量権の範囲、委任された業務の内容には、まだ米国とかなりの違いがあることは否めない。日本に関しては雑誌等に掲載された関連記事の収集と分析は終わっている。2002年以降の行政関係資料、新聞などを引き続き収集し分析する。米国および英国の関連文献を収集中である。

関係史資料の収集、分析と関係者へのインタビューを実施していく。引き続き関係史資料の収集を行い、分析と関係者へのインタビューを実施していく。海外渡航調査に必要な日程をまとめてとれなかったため。渡航調査は2年目に実施する計画である。大学の業務が忙しく、英国での渡航調査行うための十分な日程を確保できなかったため
札幌と東京の敬語行動の変化の実証的研究

2002年には、文献調査を主に、現在の敬語研究の進展状況を調査した。2003年には、文京区根津・西片地区において、敬語の面接調査を実施した。1981年に行った調査と同様に対象者を選び、同じ方法で実施した。しかし、その方法では1000人に依頼しても199人しか調査できず、1981年の時の488人にはるかに及ばない。そこで、途中で、現地の町会からの紹介を受けて回答者をお願いすることにした。最終的には262人を調査することができた。2004年には、再度同じ地区で町会からの紹介を主な手段として同じ内容の面接調査を実施した。今回は、186人に面接することができた。こうして、2003年と2004年のデータを合わせて集計・分析することで何とか1981年当時の結果と比べることができるようになった。調査の結果、男女差・両地域の差などは基本的に変化していなかった。しかし、年齢差の傾向は(1)親しくなくとも年下の人にはぞんざいに待遇する若い人の行動は20年を隔てても同じであった、(2)親しい人に対する言葉遣いが若い人では非常にぞんざいになる傾向は、20年間で進み、今や中年層までがそのような行動をするようになってきた、という変化と不変の両方が見られた。近所の人に対する言葉遣いでは、近所づきあいの程度に応じた言葉遣いが見られた。すなわち、親しい人にはややくだけた言い方をし、あまり親しくない人に対してはやや丁寧な言い方をするということである。親しさの程度で説明できる部分を除いても、さらに近所の人に対する言葉遣いに地域(それに性別や年齢など)との関連があるかを調べてみたが、それは明確にはできなかった。1次年度の面接調査に備えるために、今年度は敬語研究文献の収集を行った。最近20年ほどの間に、敬語体系や敬語行動に関するたくさんの論文が書かれている。それらを収集し、この期間内の敬語の変化を概観しておくことは次年度の調査の実施および分析に不可欠のことである。2『国語年鑑』と『日本語教育年鑑』の1980年から2001年までの版を利用し、敬語に関する論文を抜き出し、データベース化した。3大学図書館でそれぞれの論文を捜し、コピーを1セットとって、収集した。4詳しい検討は、後日改めて行うが、この間には、敬語体系に関わるような大きな変化はないようである。5敬語行動に関しては、注目するべき変化が見られる。若者の敬語行動が(敬語に限らず、もう少し広い言語行動全般に関わることであるが)変わってきており、周囲の人とのつきあい方・関わり方などの変化として意識されている。敬語体系が変わらなくとも、このような面で敬語行動が変わっていくことで敬語の使い方の変化とでもいうべきものが観察されるようである。6今年度は敬語行動に関するだいたいの概観ができたに過ぎないが、次年度の面接調査への手がかりとしては十分であろう。1 2003年の7月から8月にかけて、東京都文京区の根津・西片地区で、合計262人に対する面接調査を行った。主な目的は、1981年に行った同様の調査結果と比べ、この20年ほどの間にどのような敬語使用の変化があるのかを見ようとすることだった。2文京区役所でのサンプリングでは、1981年の時と同様に被調査者を選択して、事前に依頼状を配布し、個別に訪問するようにした。3実際に調査してみると、調査不能が非常に多かった。特に若い人に面接できない例が目立った。

これは、若い人の人口が減っているだけでなく、特に根津地区でマンションが急増し、そこに住む人の意識が変わり、またオートロックとインターホンで調査を断りやすくなったことなどが影響している。しかし、それだけではなく、全体に、調査に対する警戒心が強くなっているように思われる。4サンプリング調査がうまくいかないことから、急遽、町会役員に依頼して、そこから紹介してもらう方式を採用した。厳密に言えば、1981年の調査結果と比較できないことになってしまうが、調査不能があまりに多すぎては、どのみち比較ができないので、やむをえない判断であった。5調査の結果、男女差・両地域の差などは基本的に変化していなかった。しかし、年齢差の傾向は(1)親しくなくとも年下の人にはぞんざいに待遇する若い人の行動は20年を隔てても同じであった、(2)親しい人に対する言葉遣いが若い人では非常にぞんざいになる傾向は、20年間で進み、今や中年層までがそのような行動をするようになってきた、という変化と不変の両方が見られた。6平成16年度は札幌での調査を予定していたが、15年度の調査の状況から、これを取りやめ、再度根津・西片地区での補充調査を行うことにした。1 2004年の7月から8月にかけて、東京都文京区の根津・西片地区で、合計186人に対する面接調査を行った。主な目的は、1981年に行った同様の調査結果と比べ、この20年ほどの間にどのような敬語使用の変化があるのかを見ようとすることだった。2昨年度の同様の調査の経験から、サンプリング方式ではうまく調査ができないことがあきらかだったので、今年度は、すべて町内会からの紹介ということで話者の方々に協力していただいた。また、調査ができた人からさらに近所の友人などを紹介してもらい、その方に調査するようなことも行った。3調査の結果、男女差・両地域の差などは基本的に変化していなかった。4近所の人に対する言葉遣いでは、近所づきあいの程度に応じた言葉遣いが見られた。すなわち、親しい人にはややくだけた言い方をし、あまり親しくない人に対してはやや丁寧な言い方をするということである。親しさの程度で説明できる部分を除いても、さらに近所の人に対する言葉遣いに地域(それに性別や年齢など)との関連があるかを調べてみたが、それは明確にはできなかった。
非定型抗精神病薬が統合失調症の神経学的微候、予後、QOLに与える影響について

目的は、非定型抗精神病薬が神経学的徴候および患者の予後やQOLにどのような影響を与えるのかを調査することである。対象はDSM-IVで統合失調症と診断された患者で、まず過去に神経学的徴候の調査を行った時に使用していた薬剤により定型抗精神病薬使用群と非定型抗精神病薬使用群の2群に分別した。そして、神経学的徴候のフォローアップ調査と同時に、日常生活機能の全体的評価尺度(GAF)およびクオリティ・オブ・ライフ評価尺度(QLS)にて調査を行った。対象者のうち、現調査時点において、定型抗精神病薬服用者に対して非定型抗精神病薬が上乗せされたものや、また逆のパターンのものなど、定型・非定型抗精神病薬が混合で使用されている対象者は調査の結果から除外とした。そのため対象者はやや少なくなり、結果として定型抗精神病薬20名と非定型抗精神病薬使用群26名となった。それら2群において、神経学的徴候の総得点の改善度を比較した。改善度は、今回の神経学的徴候の総得点から過去の点数を引き算したものとして算出した。結果は、定型群が0±2点、非定型群が1±3点であり、t検定の結果では有意な差をみとめなかった。また同時にGAF、QLSを比較検討したところ、非定型群が定型群にくらべて有意に良い値を示した(p<0.05)。このことから、定型・非定型抗精神病薬の使用は、神経学的徴候に両者の改善度には差がみられなかったものの、非定型抗精神病薬を使用する方が日常生活機能やQOLには良い結果をもたらす可能性が示唆された。次に神経学的徴候の改善度とGAF、神経学的徴候の改善度とQLSとの相関を調査したところ、両者とも有意な相関は認めなかった(r=0.11、r=0.04)。このことから、神経学的徴候の改善度と日常生活機能およびQOLとの間には関連がないということが示唆された。ただ、神経学的徴候の改善度の数値を単純引き算として算出していることが統計的に有意な結果を示しにくい可能性や、各患者の調査時期の状態も結果に影響を与えている可能性があり、今後も引き続き調査をおこなっていく必要があるものと考えられた。平成15年度は、男性患者21名、女性患者14名の神経学的徴候、予後、QOL等の調査を行った。それら患者群を非定型抗精神病薬使用群と定型抗精神病薬使用群の2群に群別して、神経学的徴候をはじめとしたデータがどのように変化しているかを統計処理していく予定であるが、現時点では非定型抗精神病薬群が13名、定型抗精神病薬群が22名であり、現時点では十分有用な症例数がそろっているとは言えず、統計処理はまだ行っていない。
新しい分化誘導療法剤の開発と分化誘導療法の基礎的研究

分化誘導療法開発のために臨床応用可能な新規分化誘導剤を検索し、分化誘導剤の臨床応用への基礎的諸条件を検討して次の研究成果を得た。1.新規分化誘導剤の開発:骨髄性白血病細胞(M1)蛋白質性分化誘導因子(D因子)の遺伝子をクローニングし、組換えD因子の生産に成功した(穂積)。また、新規化学合成アルキルエーテル非燐脂質が前骨髄球性白血病細胞に対して強い分化誘導と増殖抑制活性を示すことを見出した(穂積)。2.分化誘導療法補強剤の開発:TGFーβおよびステロイドホルモンとTNFとの併用(武田)、GーCSFとレチノイン酸との併用(穂積)が骨髄性白血病細胞の分化誘導を増強すること、ハービマイシンAとNGFとの併用が褐色腫細胞の分化誘導を促進することを見出した(水野)。また、正常肺組織から単球性白血病細胞の増殖抑制因子(G1因子)が産生されることを見出し、その性質を明らかにした(穂積)。3.分化誘導剤の作用機序:GーCSF,GM-CSF,M-CSF,IL-3が好中球および単球機能を活性化すること(高久)、D因子とILー6が骨代謝を修飾すること(須田、穂積)、シアロ糖化合物が細胞膜レセプターを介して骨髄性白血病細胞を合化誘導すること(斎藤)、癌遺伝子(cーmyc)がフレンド白血病細胞の増殖分化を制御すること(帯刀)、熱ショック蛋白質(hsp47)が胚性腫瘍細胞の分化誘導機序に関与すること(永田)を明らかにした。4.実験動物による骨髄性白血病分化誘導療法の基礎的検討:マウスの倍数性骨髄性白血病株細胞(LLー2)を樹立し、この細胞を用いてin vivoの分化誘導剤に対する反応性と分化誘導剤による白血病マウスの治療効果を明らかにした。また、分化誘導剤耐性のラット骨髄性白血病細胞が宿主マクロファージ由来の活性化酸素によって分化し、増殖が抑制されることを確認した。
腎糸球体の発生分化を決める遺伝子のクローニング

発生期の腎においては尿管芽により未分化間葉細胞が尿細管に分化し、ついで尿細管の一部のボ-マン嚢と毛細血管から糸球体が形成されます。この糸球体の発生で重要な役割を果たす成長因子を同定し分子レベルで機序を明らかにするために本研究を行いました。糸球体の発生を一種の血管新生過程と考え文献的に検討したところ、血管内皮細胞成長因子(VEGF)が発生期の糸球体と尿細管上皮細胞に、またそのレセプターが糸球体内皮細胞に強く発現することが報告されていますので、これに着目しました。12日目胎仔から新生仔までの腎をin vitroで器官培養しVEGF放出量を測定した結果、1.2-5.6 ng/mg(組織重量)であり、その量は腎の発生が進み未分化組織が減少するにつれて低下しました。このことからVEGFが腎糸球体の発生に関与することが強く示唆されました。次に腎の発生におけるVEGFの役割をin vivoで解析しました。VEGF遺伝子欠損マウスは胎生早期に死亡し腎発生の研究には使えないため、中和抗体を用いました。マウスでは腎の発生が生後2週間続くため、生下時から1週間抗体の投与を続けたところ5日目に浮腫が出現し、6日目の腎組織では糸球体の発生、特にその毛細血管形成が障害されました。抗体は糸球体血管内皮細胞に特異的に沈着し、ボ-マン嚢上皮細胞のVEGF産生は代償性に増加しました。他の臓器および糸球体以外の腎血管に変化を認めませんでした。この結果から、ボ-マン嚢上皮細胞でつくられたVEGFがパラクラインとして血管内皮細胞に作用し糸球体が形成されること、また糸球体は内皮細胞密度が高いためにVEGFへの依存度が他の血管に比べ大きいと考えられました。本研究の成果は器官形成のみならず腎再生療法へも道を拓くものと考えられます。ラット胎仔の後腎を糸球体形成前(14日目)からほぼ完成する時期(20日目)までの種々の時期で採取し,無血清培地を用いて6日間器官培養し,隔日で培地の交換を行なった。培養上清のVEGF濃度をELISA法で測定した。糸球体形成前に比べて形成が進む時期に採取した腎からのVEGFの培地への放出量は多く,また培養により尿細管の分化が進むにつれてVEGFの培地への放出はふえた。培地中のVEGF濃度は50-550ng/mlであり血管内皮の増殖をおこすには充分であると考えられた。以上をまとめると(1)糸球体の形成期にVEGFが腎で作られ細胞外に放出された。(2)放出量は尿細管の形成に比例して増えた。この結果から,発生期の後腎で尿細管の形成が進むにつれてVEGFの産生が増し,血管新生を誘導し糸球体形成に関与することが強く示唆された。

12日目胎仔から新生仔までの腎をin vitroで器官培養しVEGF放出量を測定した結果、1.2-5.6 ng/mg(組織重量)であり、その量は腎の発生が進み未分化組織が減少するにつれて低下しました。このことからVEGFが腎糸球体の発生に関与することが強く示唆されました。次に腎の発生におけるVEGFの役割をin vivoで解析しました。VEGF遺伝子欠損マウスは胎生早期に死亡し腎発生の研究には使えないため、中和抗体を用いました。マウスでは腎の発生が生後2週間続くため、生下時から1週間抗体の投与を続けたところ5日目に浮腫が出現し、6日目の腎組織では糸球体の発生、特にその毛細血管形成が障害されました。抗体は糸球体血管内皮細胞に特異的に沈着し、ボ-マン嚢上皮細胞のVEGF産生は代償性に増加しました。他の臓器および糸球体以外の腎血管に変化を認めませんでした。この結果から、ボ-マン嚢上皮細胞でつくられたVEGFがパラクラインとして血管内皮細胞に作用し糸球体が形成されること、また糸球体は内皮細胞密度が高いためにVEGFへの依存度が他の血管に比べ大きいと考えられました。本研究の成果は器官形成のみならず腎再生療法へも道も拓くものと考えられます。
カイラル有効理論に基づく微視的多体理論の構築と３体力効果

核子弾性散乱と3,4He弾性散乱を調整パラメータなしに記述する反応模型を考案した。Brueckner Hartree-Fock理論を用いて、カイラル有効理論に基づく核力(2体力+3体力)から、核内有効核力を導出し、この反応模型を用いて、3核子力効果が核子弾性散乱より3,4He弾性散乱に顕著であることを示した。最近実験されたMg同位体の反応断面積を理論解析し、37Mgが変形ハロー核であることを示した。ハロー核のハロー性を定量化する量Hを考案した。2倍の太陽質量をもつ中性子星中でクォーク相が実現するためのクォーク間相互作用の強さの上限値を決定した。1)Brueckner-Hartree-Foc(BHF)理論をカイラク有効理論(Ch-EFT)による核力(2体力+3体力)に適用し、束縛系・散乱系に対する核内有効核力を密度毎に導出した。また、このBHF理論を用いて核物質の状態方程式を作成した。この有効核力は数値的に求められているため、核構造・核反応計算に適用し難い。このため、簡単な関数形の重ね合わせてで表現する「関数化」に着手した。2)九大グループの従来の微視的多体理論では、散乱系に対して、Bonn-B型2体核力から導出されたメルボルン型有効核力を用いてきた。この有効核力とCh-EFTの2体力から導出された有効核力が非常に近いことを確認した。このため、「メルボルン型有効2体力」に「Ch-EFTによる有効3体力」を加えた「ハイブリッド核力」を考えて、核子-核反応、核-核反応における3体力効果を定性的に調べた。この「ハイブリッド核力」を入射核と標的核の密度で畳込むことによって、核子-核間、核-核間の光学ポテンシャルを求め、核子-核散乱、核-核散乱における3体力効果の定性的性質を調べた。核子-核散乱は散乱過程で高い密度を生み出さないため、3体力効果が小さいことを示した。これに反して、核-核散乱では標準核密度以上の高密度状態が発生し、3体力効果が大きく現れることを示した。今後は、Ch-EFTの「2体力+3体力」による有効核力の導出を目指す。3)福田グループ(阪大)によって実験されたMg同位体に対する反応断面積を2)の微視的反応理論を用いて解析し、37Mgが変形ハロー核であることを示した。1)Brueckner-Hartree-Fock(BHF)理論をカイラル有効理論(Ch-EFT)による核力(2体力+3体力)に適用し、H26年度には、核内有効核力の導出に成功した。このため、H27年度は、簡単な関数形の重ね合わせてで表現する「関数化」に着手し、これに成功した。また、導出した「Ch-EFTの2体力+3体力による関数化有効核力」と二重畳込み模型を組み合わせて、核子散乱、3,4He散乱における3体力効果を定性的に分析し、無視できない効果であること確認した。今後の定量的分析を行うために、Ch-EFTの3体力に含まれているパラメータを核物質の性質で決めることに着手した。2)種々のハロー核を系統的に理論分析し、ハロー度を定量化する量を提案した。また、Mg同位体に対して、変形度を実験量から直接導出することに成功した。3)中性子星内でのハドロン-クォーク相転移を記述する模型を、u-quarkとd-quarkからなる2-flavorに対して、構築した。課題1「カイラル有効理論に基づく微視的多体理論の構築」に関しては、最も困難なG行列の関数化に成功したため、8割程度の達成度である。課題2「変形ハロー核の探査」に関しては、ハロー度を定量化するパラメータを提案し、Mg同位体に対して変形度を実験量から決定するができたため、9割程度の達成度である。課題3「状態方程式の導出と中性子星への応用」に対しては、中性子星内でのハドロン-クォーク相転移を記述する模型を2-flavorに対して構築できたため、7割程度の達成度である。このため、全体的に8割程度達成している。2) H27年度は、最近実験されたMg同位体の反応断面積から、double folding modelを用いて、Mg同位体の半径を系統的に決定した。特に、37Mgが変形ハロー核であることを示した。H28年度は、このHが弱束縛の極限で1になり、スケール不変であること示した3) H27年度に考案したハドロン・クォーク2相模型を用いて、H28年度は、2倍の太陽質量をもつ中性子星中でクォーク相が実現するためのGV(クォーク模型におけるベクター型クォーク間相互作用の強さ)の上限値を決定した。

ハロー核のハロー性を定量化する量Hを考案した。2倍の太陽質量をもつ中性子星中でクォーク相が実現するためのクォーク間相互作用の強さの上限値を決定した。課題1「カイラル有効理論に基づく微視的多体理論の構築」に関しては、ハイブリッド核力を用いたため、6割程度の達成度である。課題2「変形ハロー核の探査」に関しては、37Mgがその候補であることを示したため、5割程度の達成度である。課題3「状態方程式の導出と中性子星への応用」に対しては、核物質の状態方程式を求めた段階であるため、1割程度の達成度である。このため、全体的に4割程度達成している。(理由)課題1「カイラル有効理論に基づく微視的多体理論の構築」に関しては、Ch-EFTの3体力に含まれているパラメターを核物質の性質で決め、「Ch-EFTの2体力+3体力による関数化有効核力」と二重畳込み模型を組み合わせて、核子散乱、3,4He散乱における3体力効果を定量的に分析する。また、核構造における3体力効果と比較する。課題2「変形ハロー核の探査」に関しては、ハロー度を定量化するパラメータを提案し、Mg同位体に対して変形度を実験量から決定することができたため、これらの論文化を行う。課題3「状態方程式の導出と中性子星への応用」に対しては、s-quarkを考慮した2+1 flavorに対して、中性子星内でのハドロン-クォーク相転移を記述する模型の構築を目指す。原子核理論課題1「カイラル有効理論に基づく微視的多体理論の構築」に関しては、ハイブリッド核力は用いず、Ch-EFT(2体力+3体力)による有効核力を求める。また、求めた有効核力を関数化することによって、核構造・核反応計算を容易にする。課題2「変形ハロー核の探査」に関しては、Mg以外の同位体に着目し、変形ハロー核、ハロー核の探査を行う。課題3「状態方程式の導出と中性子星への応用」に対しては、核物質の状態方程式に加え、クォーク物質の状態方程式も求め、ハドロン-クォーク相転移を記述できるようにする。また、この状態方程式を中性星の質量-半径関係式に適用する。キャンパスを移転(2015年10月)後、現在、コンピュータ室を新たに設営中であり、スペースの関係で一部のコンピュータしか更新できなかった。設営終了後、他のコンピュータを新しいものにし、強化する予定であるため。九大キャンパスを移転(2015年9月)を区切りに、コンピュータ・システムを新しいものに変える予定のため。更に、簡単な近似法を見つけたため、2014年度の数値計算は従来所有のコンピュータで行えたため。また、研究成果が予定以上に上がったため、論文発表に注力したため。重い数値計算を予定しているため、コンピュータを買う予定である。2015年度は重い数値計算を予定しているため、コンピュータを買う予定である。
短波長光照射による野菜の機能性二次代謝成分の制御

本研究は、抗酸化成分の増加に効果的で、人工光型植物工場で有用なUV照射条件を探索することを目的とした。主な対象植物は赤系リーフレタスと赤ジソとした。ここでは赤系リーフレタスを用いた研究成果について報告する。異なるピーク波長のUVLEDとUV蛍光灯を組み合わせて照射し、UV波長がレタスの成長、総抗酸化能、抗酸化成分濃度、抗酸化成分の生合成に関わる遺伝子発現について調査した。その結果、310 nm付近をピーク波長とするUV光を、0.1から0.2 W m-2のUV強度で短期間照射することで、アントシアニン等の抗酸化成分の生合成・蓄積が促進されることが明らかとなった。まず、UV波長とアントシアニンの生合成遺伝子の発現量との関係を明らかにするために、半値幅の狭い紫外線LEDを用いて調査した。UV光源として、310、325および340nmをピーク波長とする3種の紫外線LED(UV-LED)を用いた。UV照射は、明期(16h)に0.5 Wm-2のUV強度で3日間行った。主光源として、育苗期間には昼白色蛍光灯、UV照射期間には赤色LED(ピーク波長660 nm)を使用した。調査項目はアントシアニンの生合成遺伝子(生合成経路の上流のCHSおよび下流のUFGT)の発現量とした。UV照射開始後0hから72hまで、8hおきに経時変化を調査した。CHSのmRNA発現量は、310nm区でUV照射8 h以降、325nm区で32 h以降に上昇した。また、CHSおよびUFGT両遺伝子の発現量が大となることがアントシアニンの蓄積量を高めるのに必要であり、特に310nm付近の波長が適すると示唆された。つぎに、UV-LEDに代わり実用化がしやすいUV光源として近年開発されたUV付加白色蛍光灯を用いて、アントシアニンの蓄積に対して効果的なUV強度および照射期間を明らかにすることを目的とした。UV領域におけるピーク波長は310 nmであり、UV照射は明期(16h d-1)に0.0(対照区)、0.1、0.2、0.3、0.5 Wm-2のUV強度で6日間行った。その結果、0.2 Wm-2以下のUV強度で5日間UV照射を行うことで、アントシアニンの蓄積量を高められる可能性が示唆された。考察において既往研究を含めて検討を行った結果、光照射による抗酸化成分の合成誘導とオゾンガスによる抗酸化成分の合成誘導には、共通点と相違点が存在することを推察し、その考察を進めるために栽培室にオゾンガス濃度を変化させる機能を付加した。UV波長とアントシアニンの生合成遺伝子の発現量との関係を明らかにすることができた。波長依存性を期待通りに示すことまではできていないが、明期にUV照射をすると効果的で、光合成有効光量子束密度が高い方が蓄積しやすいことも明らかになった。以上のように予想以上の成果も出せており、おおむね順調と考えている。前年度は、リーフレタスの生育阻害を起こさずにアントシアニンの蓄積量を高められるUV照射条件(0.2 W m-2以下)を見出した。今年度はこのUV照射条件で生育阻害を起こさずに抗酸化成分の生合成を促進することが可能であるかを調査した。試験中のPPFDは150および250 μmol m-2 s-1の2水準を設け、UV照射は0.0(対照区)、0.1、0.2 W m-2のUV強度で5日間行った。いずれのPPFDにおいても、試験区間で生育に有意差はみられなかった。UV照射区のアントシアニン濃度、総ポリフェノール濃度および抗酸化能(ORAC値)は、いずれのPPFDでも対照区と比較して大となる傾向がみられた。PPFDが150と250 μmol m-2 s-1で比較すると、PPFDが高いほど、UV照射によるアントシアニン等の抗酸化成分の蓄積の促進効果があった。この理由として、PPFDが高いほど光合成産物量が多くなり、抗酸化成分の生合成に用いられたと考えられた。以上から本試験で用いたUV付加白色蛍光灯では、生育も考慮した上で抗酸化成分の蓄積量を高めるためには、PPFDを250 μmol m-2 s-1としてUV強度を0.2 W m-2で5日間程度育成するのが適すると考えられた。ところで、前年度と今年度に試験に用いたUV付加白色蛍光灯の照射光のUV組成は、大部分がUV-BとUV-Aでありその割合はUV-Bが2倍ほどである。しかもUV-Cも少し含んでいる。年度末にUV-CをカットしたタイプのUV付加白色蛍光灯を入手したので栽培試験を行ったところ、0.2 W m-2以上でも生育阻害が生じなかった。このことからUV-Cの含有の有無で生育に違いが生じると考えられるため、UV光源の比較検討を次年度の課題とした。UV-Bを含む光源において、UV-Cを含む割合によって、生育が異なることが分かった。これはUV-Cの生育阻害によるものであり、光源の選択が研究成果に影響すると言える。その点が明らかになったので、次年度は、光源の波長域を詳細に検討する予定である。植物種間差は大きいため、網羅的に統一的な傾向を把握するのは少し難しそうである。前年度はリーフレタスの生育阻害を起こさずにアントシアニンおよび総ポリフェノーの蓄積量を高められるUV照射条件を調査し、UV強度が0.2 W m-2程度であることを見出した。

今年度は新たに上市を目指して開発されたUV付加白色蛍光灯を用いた場合にこのUV照射強度よりも高い条件で生育阻害を起こさずに抗酸化成分の生合成を促進することが可能であるかを調査した。試験中のPPFDは150および250 μmol m-2 s-1の2水準を設け、UV照射は0.0(対照区)、0.3、0.6、0.9 W m-2(以降、0W区、0.3W区、0.6W区、0.9W区)の強度で3日間行った。抗酸化成分の指標としてORAC法で分析するORAC値を用いた。0.6W区と0.9 W区の生体重、乾物重、葉面積は対照区よりも小となった。0.3 W区の生体重、乾物重、葉面積は対照区と差が無かった。0.3W区、0.6W区のクロロフィル濃度は0W区と0.9W区よりも高かった。3つのUV照射区の抗酸化能(ORAC値)および総ポリフェノール濃度は対照区より有意に大であり、UV区の中では0.9 W区が最大となった。以上のことから、3日間の短期間照射の場合、生育阻害を起こさずに抗酸化能を高める条件は0.3W m-2、生育抑制があっても最も抗酸化能の高い葉を作るには0.9W m-2が適することが明らかになった。赤ジソについてもUV処理の試験を行い、UV-Bが赤ジソの葉の生理活性物質の濃度を高めることを明らかにした。本研究では、UV波長域としてUV-Bに焦点をあてた。UV-AとUV-Bで照射強度(光エネルギー)が等しい場合、いずれの作物もUV-Bで抗酸化成分や生理活性物質の濃度がより増加した。しかしUV-Cの波長域がある程度以上含む場合には長期間の照射では生育阻害が生じることが多い。そのため、UVランプの選択と照射量の組み合わせを最適化する必要があると考えられる。本研究は、抗酸化成分の増加に効果的で、人工光型植物工場で有用なUV照射条件を探索することを目的とした。主な対象植物は赤系リーフレタスと赤ジソとした。ここでは赤系リーフレタスを用いた研究成果について報告する。異なるピーク波長のUVLEDとUV蛍光灯を組み合わせて照射し、UV波長がレタスの成長、総抗酸化能、抗酸化成分濃度、抗酸化成分の生合成に関わる遺伝子発現について調査した。その結果、310 nm付近をピーク波長とするUV光を、0.1から0.2 W m-2のUV強度で短期間照射することで、アントシアニン等の抗酸化成分の生合成・蓄積が促進されることが明らかとなった。UV波長とアントシアニンの生合成遺伝子の発現量との関係を明らかにすることができた。植物種間差についてはまだ十分に取り組めていない。次年度はほぼ計画どおりに進める予定であるが、実施に当たって植物種の一部見直しなどを行うことも想定している。UV-Bを含む光源において、UV-Cを含む割合によって、生育が異なることが分かったため、光源の波長域を詳細に検討する予定である。次年度はほぼ計画通りに行う予定であるが、植物種間差に配慮して植物種の見直を検討している。29年度が最終年度であるため、記入しない。植物環境工学29年度が最終年度であるため、記入しない。
がん増殖・転移の分子機構に基づく創薬研究

がん細胞の増殖と転移に関する分子機構を解明し、標的分子に作用する抗がん剤リード化合物を、微生物代謝産物および化合物ライブラリーを活用して探索・創製することを目的とする。転移に関わるRECKやヘパラナーゼ等の解析から新たな標的分子を提示するとともに、抗がん剤リード化合物標的予測のためのプロテオミクス解析システムを開発した。そして、リベロマイシンA(骨転移阻害剤)、エポキシキノールB(血管新生阻害剤)、メチルゲルフェリン(破骨細胞分化阻害剤)やパーピュロガリン(PBD依存結合阻害剤)などの作用標的・作用機構を同定し、抗がん剤リードとしての有用性を明らかにした。癌骨転移の成立、進展には破骨細胞による骨吸収が深く関わっている。今回、破骨細胞選択的にアポトーシスを誘導するリベロマイシンA(RM-A)の骨転移抑制効果を、ヒト小細胞肺癌多臓器転移モデルマウスを用いて検討した。その結果、RM-Aは肺癌細胞の骨への転移を有意に抑制していた。また、RM-A投与マウスの骨転移巣において、破骨細胞が減少し、アポトーシス細胞が増加していた。これらのことから、RM-Aは癌骨転移の治療薬として有用であることが示唆された。また、転移関連因子として、金属依存性マトリックス分解酵素阻害因子であるreversion-including cysteine rich protein with Kazal motifsの糖鎖修飾に着目した。このタンパク質の1次配列からは5ヶ所の糖鎖修飾が予想されたが、変異体(アスパラギン残基をグルタミン残基に置換)やグリコシダーゼを用いた解析から、4箇所のアスパラギン残基が糖鎖修飾されていることが分かった。いずれの糖鎖修飾も、GPIアンカーとして細胞外膜への局在には必要なかった。一方、金属依存性マトリックス分解酵素-9分泌抑制能や金属依存性マトリックス分解酵素-2の活性化抑制に必要であった。さらに、この遺伝子の過剰発現細胞ではがん細胞の浸潤能が低下するが、糖鎖修飾がされない変異体を細胞に発現させるとがん細胞の浸潤能は低下しなかった。これらの結果より、このタンパク質の糖鎖修飾によっても金属依存性マトリックス分解酵素の機能発現、さらにがん細胞浸潤能が調節されていることが明らかになり、新たながんの分子標的となる可能性が示唆された。癌骨転移の発症・進行には、破骨細胞による骨吸収(骨破壊)が重要な役割を担っている。我々はこれまでに、ヒト小細胞肺癌多臓器転移モデルマウスでの検討から、ポリケチド化合物リベロマイシンAが溶骨性骨転移を有意に抑制することを明らかにしてきた。今年度我々は、リベロマイシンAが破骨細胞選択的にアポトーシスを誘導することを見出し、in vitro及びin vivoにおいて破骨細胞の骨吸収を阻害することを明らかにした。その作用機序として、破骨細胞周辺の酸性環境に依存したりベロマイシンAの細胞内への取り込みが、破骨細胞に対する選択性を発揮する要因であることを報告した(PNAS,103,4729-34(2006))。また、プロテオームを基盤とした新しい薬剤標的タンパク質同定法の開発を行った。まず、HeLa細胞や酵母に種々の既知化合物を処理し、その後2D-DIGE法を用いて未処理細胞と処理細胞間でたんぱく質の変動をプロテオーム解析し、それらをデータベース化した。本系を利用して、まだ標的分子が同定されておらず、培養がん細胞に対して増殖抑制効果を示すイエジマライドの標的分子の解析を行った。その結果、イエジマライド処理した細胞のプロテオーム・プロファイルは、V-ATPase阻害剤として知られているパフィロマイシンのそれと類似していた。実際に、イエジマライドが粗精製したV-ATPaseを直接阻害することを明らかにした。今後は、さらなるデータベースの充実のために、既知化合物のプロファイルを増やしていくとともに、作用点が不明な化合物の標的分子を同定していく。これまで、主に微生物二次代謝産物から血管新生阻害剤のスクリーニングを行い、多くの新規天然化合物の同定に成功してきた。今年度は、その中で、VEGFで誘導される血管内皮細胞の遊走を阻害する化合物として単離されたepoxyquinol Bについてin vitroおよびin vitroにおける血管新生抑制効果の検討を行った。Epoxyquinol Bは血管内皮細胞において、VEGF刺激で誘導されるVEGF受容体のリン酸化、引き続いて起こるPLCγおよびERKなどのリン酸化を阻害した。また、epoxyquinol Bは、in vitroでVEGF受容体のキナーゼ活性を直接阻害したが、DTTなどの還元剤存在下ではその阻害効果は認められなかった。さらに、epoxyquinol Bは血管内皮細胞において、VEGF刺激だけでなくEGF、FGFおよびPDGF刺激で誘導されるERKなどのリン酸化も抑制した。また、Renca細胞を用いたin vivoの血管新生モデルをepoxyquinol Bは阻害した。