hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
系外銀河の中間赤外線スペクトルと中間赤外有機物バンドの定量的研定

これらの結果は有機物質の同定に重要な情報を与えるだけでなく、系外銀河中の有機物質バンドが、星生成活動度の有力な指標になることを強く示唆するものである。本年度は宇宙赤外天文台ISOの系外銀河の長波長分光器のデータ解析と同時に赤外線カメラのデータ解析を行った。長波長分光器のデータについては、われわれのグループの観測と共に昨年度に一般公開されたデータについても解析を行った。遠赤外スペクトルの結果は、系内天体の結果との比較も行った。この結果、特に遠赤外線域での禁制線の強度比は、紫外線強度に依存しているいわゆる光解離領域のモデルでよく説明できること、星生成活動の活発な銀河は、一般的に星間ガスの密度が高いことも導いた。これは、星生成活動が密度の関数であることをさらに支持するものである。またこれらと同時に、[CII]158ミクロン禁制輝線には、低密度の電離ガスからの寄与も同程度あることを示した。また系内天体の解析では、これらに加えて紫外光による励起も中性酸素の禁制線生成に寄与していることを見いだした。この作業と平行して、赤外線カメラのデータ解析を行い、系外銀河の中間赤外域の輻射の空間分布を調べた。一部の星生成領域で7ミクロンのフラックスがが15ミクロンのフラックスより弱くなる傾向があるものの、一般には、この2つのカラーは比較的一定である結果を導いた。この結果は、星間有機物質の特徴である中間赤外域のバンド強度と遠赤外線の強度がきわめてよく比例しているという昨年度の解析結果と一致し、星間有機物質が広い物理状態中で安定な物質であることを支持するものである。星生成領域では、15ミクロンフラックスが増加しているものと考えられ、超微粒子の寄与が星生成により増加することが示唆される。本年度は宇宙赤外天文台ISOの系外銀河の赤外線カメラのデータ解析を中心に行い、長波長分光器のデータとの関係を調べた。まず中間赤外線の7ミクロンと15ミクロンの銀河内の分布について、約10個の銀河について詳細に検討し、(1)多くの銀河では、7から15ミクロンにかけての銀河全体スペクトルエネルギー分布(SED)が、中心部の限られた領域での特徴で決まっていること、(2)棒構造を持っている銀河では、中心部で15ミクロンの強度が強くなる傾向があること、(3)しかし、一部の銀河については、広がった領域でSEDの変化が見られるものもあり、中間赤外のスペクトルが、比較的時間尺度の短い活動度を示していることを見いだした。さらに種々の系外銀外についての中間赤外から遠赤外までのSEDを求め、我々の銀河系内のデータも含め、温度揺らぎを考慮した星間塵の赤外線放射モデルの予想と比較した。この結果、100ミクロンより長波長の遠赤外のSEDと12ミクロンあるいは赤外線未同定バンドとの関係は、理論モデルで十分説明できるものの、25ミクロンから60ミクロンの間のSEDについては、我々の銀河系の観測と系外銀河の観測を理論モデルで統一的に説明することができないことが明らかになった。そこで、次に我々の銀河系の観測値に基づき経験的なSEDを導き、その積分として系外銀河のSEDを評価した。理論モデルは、25ミクロンと60ミクロンの放射が入射放射強度と比例することを予想するが、観測的には、適当な放射強度まで強度の2乗に比例し、その後減少する性質を示す。この傾向を仮定すれば、我々の銀河系と系外銀河の赤外線SEDをつじつまをあわせて説明できるモデルが構築できることを示した。
土地利用変化に伴う生物分布の将来予測：人為活動の退行がもたらす影響の把握

申請者は耕作放棄地の増加が地表性甲虫の分布にどのような影響をもたらすのか、減少が危惧される生物種にとって、耕作放棄地が代替生息地として機能するかを検証した。さらに、耕作放棄地を既存植生へと復元する際の効率的な手法を検討するため湿地復元サイトにて地表性甲虫の調査を行った。地表性甲虫と環境要因(放棄地の植生および土壌水分)の調査は平成26年度6月から10月に北海道釧路地方にて行った。各放棄地でみられた地表性甲虫群集と湿性草地の群集の非類似度を算出し、非類似度に局所環境(植生の草丈と土壌水分率)と周辺環境(周囲500mの湿地面積)が与える影響を把握した。解析の結果、土壌水分率と草丈が高い放棄地ほど湿性種の出現が増加し、甲虫群集が湿性草地の甲虫群集に近づくことが明らかとなった。また、この群集構造の変化には周辺環境よりも局所環境が大きく影響していた。これは、放棄地を地表性甲虫の生息地として機能させるためには、耕作放棄地の周囲の環境を考慮するよりも放棄地内の環境をどのように管理し、質を向上させるか考えることが重要であることを示唆している。また、釧路地方の湿原再生区を対象とし湿原復元手法の違い(放棄地周囲の明渠の埋め立ておよび放棄地の掘削)が地表性甲虫群集に与える影響を検証した。結果、埋め立て区では草丈は放棄地と変わらないものの、土壌水分率は放棄地と比べ増加しており、甲虫群集は湿性草地の甲虫群集と類似する方向に変化していた。一方掘削区では、土壌水分率が増加するものの掘削の影響で植生がまばらであり、甲虫群集は対照区とも湿性草地とも異なっていた。以上より、湿性草地の地表性甲虫を対象として耕作放棄地の湿地復元を行う際には、耕作放棄地の植生を残したまま土壌水分を増加させる明渠の埋戻し作業が即効性のある手法であると考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は北海道釧路地方においてオサムシ科甲虫類と草本・木本植生を対象としたフィールド調査を行った。調査は北海道釧路地方(釧路市、釧路町、標茶町、鶴居村)で行い、調査地内の牧草地、湿性草地、耕作放棄地に計39地点の調査サイトを設定した。また調査サイトの内、耕作放棄地は、放棄年ごとに10年未満・10年以上20年未満・20年以上の3つにカテゴリ分けを行い、放棄年ごとに生息する生物の群集構造が異なるのか検証を行った。オサムシ科甲虫は各調査サイトにピットフォールトラップを16個設置し、6月および9月の各1週間、捕獲調査を行った。草本植物については、2013年8月から9月に各サイトに2m四方のコドラートを2つずつ設置し、草本植物(ヨシ・クサヨシ)および木本植物(ホザキシモツケ)の被度、草丈を測定した。調査の結果、オサムシ科甲虫の調査では45種3,650個体を確認することができた。上記の野外調査で得られたオサムシ科甲虫の生息データおよび植生データを基に、牧草地が放棄されることにより創出された土地利用(耕作放棄地)が、過去の自然植生である湿性草地に回復するのか検証を行った。解析の結果、放棄地に生息するオサムシ科甲虫の群集構造は、湿性草地よりも牧草地のオサムシ群集構造と類似しており、耕作放棄からの経過年数がオサムシ群集に与える影響は小さかった。また、植生についても、湿性草地と耕作放棄地では、ヨシ・クサヨシの被度に違いが見られ、耕作放棄後に成立する植生構造が湿性草地の植生と大きく異なっていた。このことから、耕作放棄地のオサムシ群集は放棄から20年以上が経過しても、湿性草地のオサムシ群集へと回復せず、またその要因としては、耕作放棄後に成立する植生構造が湿性草地の植生と大きく異なるためであることが示唆された。また、釧路地方の湿原再生区を対象とし湿原復元手法の違い(放棄地周囲の明

渠の埋め立ておよび放棄地の掘削)が地表性甲虫群集に与える影響を検証した。結果、埋め立て区では草丈は放棄地と変わらないものの、土壌水分率は放棄地と比べ増加しており、甲虫群集は湿性草地の甲虫群集と類似する方向に変化していた。一方掘削区では、土壌水分率が増加するものの掘削の影響で植生がまばらであり、甲虫群集は対照区とも湿性草地とも異なっていた。以上より、湿性草地の地表性甲虫を対象として耕作放棄地の湿地復元を行う際には、耕作放棄地の植生を残したまま土壌水分を増加させる明渠の埋戻し作業が即効性のある手法であると考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。調査地域内の各土地利用(耕作放棄地・牧草地・湿性草地)においてオサムシ科甲虫の群集構造がどのように変化するか、予定通りフィールド調査およびデータ解析を進行させた。また、耕作放棄地は湿性草地と異なる植生構造を持つこと、オサムシ科甲虫群集についても耕作放棄地の放棄年による影響は小さいことが示された。25年度のフィールド調査およびの解析の結果、耕作放棄地でみれるオサムシ科甲虫郡集は、放棄年以外の他の要因が影響していることが示唆された。このため、平成26年度については、放棄年以外の環境要因(周囲の湿地面積などの景観要素)についても着目する。上記の環境要因が各土地利用によって異なるのか、また、これらの環境要因がオサムシ群集に与える影響を検証する予定である。また、調査地域においてどのような地域に耕作放棄地が発生しやすいか、耕作放棄地の発生要因の検証を行う。これにより、将来耕作放棄地が増加した場合に現在のオサムシ科甲虫分布がどのように変化するのかを検証する予定である。
人工転写因子を用いたがん増殖シグナルの人為的操作

ヒトVEGFプロモーターを認識する人工DNA結合タンパク質に、種々の転写抑制ドメインをつないだ人工転写因子遺伝子をCMVプロモーターの下流に導入したヒト細胞発現ベクターを作成した。さらに、VEGFプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結させたルシフェラーゼ・リポーターを作成し、ヒト由来細胞HEK293を用いて、どの人工転写因子(あるいは転写抑制ドメイン)がルシフェラーゼ発現量を最も抑制するかを定量できる系を確立した。このアッセイ系を用いて、KRAB転写抑制ドメインと同等もしくはそれ以上の活性を有するドメインを複数得ることに成功した。現在、その再現性を慎重に調べているところである。また、内在性のVEGF遺伝子の発現量をそのタンパク質生成量に基づいて定量できる系も確立した。また、同時に人工転写因子タンパク質そのものの細胞導入によるVEGF発現抑制も試みた。現在、上述したように最も効果的な抑制ドメインの探索を行なっているので、まずKRAB転写抑制ドメインを有する人工転写因子に種々の細胞膜透過ペプチドを繋げたタンパク質の大腸菌発現ベクターを作成した。このうち、細胞膜透過ペプチドPTD-4を連結した人工転写因子タンパク質を大腸菌で過剰発現させ、その精製を完了した。上述したルシフェラーゼ・リポーター・アッセイ系において、このタンパク質導入により、同一タンパク質非存在下のルシフェラーゼ遺伝子発現量の10%にまで抑制できることを確認した。
高機能演算子を有する分散実時間ストリーム処理基盤に関する研究

本研究では高機能演算子を有する分散実時間ストリーム処理基盤の研究開発に取り組んだ.高機能演算子としてはベイジアンネットワーク,そしてメディアデータ管理を実現した.その他に高速永続化機構,高信頼化機構,暗号化ストリーム処理,そしてストリーム結合処理に関する研究を行った.本研究では高機能演算子を有する分散実時間ストリーム処理基盤の研究開発に取り組んだ.高機能演算子としてはベイジアンネットワーク,そしてメディアデータ管理を実現した.その他に高速永続化機構,高信頼化機構,暗号化ストリーム処理,そしてストリーム結合処理に関する研究を行った.近年,センサや位置情報などの実世界から得られるストリームデータに対する問合せ要求が増大している.そして,そのような要求を実現するストリーム処理エンジン(SPE)がこれまで研究開発されてきた.SPEに関して,本研究では高信頼化技法の研究を行うと共に,単一マシン上でのカーネル・高速アーカイブ技術・高速来歴保存技術の開発を行った.特に成果の出た高信頼化技法に関して下記に述べる.SPEでは,地理的に離れた情報源の統合や負荷分散を実現させるために,SPEを分散配置させる分散ストリーム処理エンジン(DSPE)の利用が一般的である.DSPEでは,複数のSPEの入力と出力をつなぎ合わせることにより分散環境を構築するため,分散環境中のノードが1つでも停止してしまうと,システム全体が停止してしまうという問題がある.この問題を解決するため,我々が先行研究で提案したSemi-Active Standby方式(SAS)に関して,様々な環境下において評価・考察し,新たに適応型Semi-Active Standby方式(A-SAS)を提案する.A-SASは,ストリームデータの性質変化に対して,高信頼化によるバンド幅使用量,リカバリ時間を適応的に調整する.本研究では,A-SASの詳細と,我々が開発したプロトタイプシステムを用いたSAS,A-SASの性能を実験的に評価した.上記に加え,高信頼化を考慮した分散問合せ最適化技法を提案し,シミュレーションによってその有効性を示した.近年,センサや位置情報などの実世界から得られるストリームデータに対する問合せ要求が増大している.そして,そのような要求を実現するストリーム処理エンジン(SPE)がこれまで研究開発されてきた.本研究提案においては高機能演算子を有する分散実時間ストリーム処理基盤に関する研究を行ってきた.その結果として分散ストリーム処理システムSS*の試作版を開発した.SS*はリレーショナルストリーム処理システムである.SS*には高信頼化機能,分散データ処理機能を導入した.また,今年度は高速データアーカイビング,メディアストリーム処理,ストリームとリレーションの統合化,そして暗号化ストリーム処理について研究を行った.特に研究を行った暗号化ストリーム処理についてここで述べる.膨大なストリームデータ処理の実行にはパブリッククラウドなどの分散並列処理基盤を用いることが有効であると考えられる.しかし,パブリッククラウドは一般に組織のファイヤウォールの外側で第三者により管理されるため,パブリッククラウド上の情報に対して機密性を保持することができない.これに対し我々は,安全性を考慮したストリームデータ処理の実現を目的とし,CryptDBに基づく暗号化ストリーム処理方式の実現,及び通信帯域やメモリ使用量の効率化を実現する手法の提案を行った.提案方式はナイーブな方式に比べて通信帯域やメモリ使用量を効率化できることを実験的に示した.
転写因子GATA-2の造血系転写調節領域の解析と造血幹細胞試験管内増幅への応用

1造血幹細胞増幅用アデノウィルスベクターの構築初回暴露のみに感染性を限定するためにアデノウィルスのゲノムに欠失を加え,かつ2つに分割したベクターは考案されてより久しいが,2ベクター間で起きなければならない組換えの効率が低いのが致命的な欠点であった.MicrobixBiosystems社のAdMaxは,Cre-loxPシステムによる高効率の組換えを応用することでこの欠点を克服したものである.ベクター構築の第一段階としてシャトルプラスミドにGATA-2 cDNAを導入した.2 GATA-2遺伝子座における造血系調節領域の解析転写活性化の指標となるリポーター遺伝子としてはGATA-2自身のプロモーター領域にGreen Fluorescent protein(GFP)を結合したものを用いた.この手法では、GATA-2調節領域の活性化強度は形質導入された細胞内のGFP発現量,すなわち緑色蛍光強度として表されるが,これを全く無染色でフローサイトメーターにより定量することが可能であった.GATA-2造血系転写調節における第1必要領域・約5kb中,転写活性化能がいずれに局在しているかを明らかにすべく様々な欠失変異を作成した.第一段階として約1kbごとに5つの内部欠失変異を作成したところ,中心部のNco I-Spe I間の欠失により大きく活性が減衰することが示された.これとは逆にこのNco I-Spe Iのみを取り出し導入したものには調節領域全長の持つ活性が保持されており、この部に転写活性化の中心が存在していることを見出した.この注目されるNco I-Spe I間は約1kbpであるが,末端から一連の欠失変異を作成しその塩基配列を決定した.既知の転写因子の結合部位を探索したところ,5'端より約450bpにGATA転写因子群とSTATの結合部位が隣接していることが認められた.さらに,Spe-1サイト近傍に造血幹細胞分化へ密接に関わるOct-1,GATA, SCL結合部位が集中しているという注目すべき結果が得られた.1造血幹細胞増幅用アデノウィルスベクターの構築初回暴露のみに感染性を限定するためにアデノウィルスのゲノムに欠失を加え,かつ2つに分割したベクターは考案されてより久しいが,2ベクター間で起きなければならない組換えの効率が低いのが致命的な欠点であった.MicrobixBiosystems社のAdMaxは,Cre-loxPシステムによる高効率の組換えを応用することでこの欠点を克服したものである.ベクター構築の第一段階としてシャトルプラスミドにGATA-2 cDNAを導入した.2 GATA-2遺伝子座における造血系調節領域の解析転写活性化の指標となるリポーター遺伝子としてはGATA-2自身のプロモーター領域にGreen Fluorescent protein(GFP)を結合したものを用いた.この手法では、GATA-2調節領域の活性化強度は形質導入された細胞内のGFP発現量,すなわち緑色蛍光強度として表されるが,これを全く無染色でフローサイトメーターにより定量することが可能であった.GATA-2造血系転写調節における第1必要領域・約5kb中,転写活性化能がいずれに局在しているかを明らかにすべく様々な欠失変異を作成した.第一段階として約1kbごとに5つの内部欠失変異を作成したところ,中心部のNco I-Spe I間の欠失により大きく活性が減衰することが示された.これとは逆にこのNco I-Spe Iのみを取り出し導入したものには調節領域全長の持つ活性が保持されており、この部に転写活性化の中心が存在していることを見出した.この注目されるNco I-Spe I間は約1kbpであるが,末端から一連の欠失変異を作成しその塩基配列を決定した.既知の転写因子の結合部位を探索したところ,5'端より約450bpにGATA転写因子群とSTATの結合部位が隣接していることが認められた.さらに,Spe-1サイト近傍に造血幹細胞分化へ密接に関わるOct-1,GATA, SCL結合部位が集中しているという注目すべき結果が得られた.1 GATA-2遺伝子座における造血系調節領域の解析造血系調節領域の解剖として,様々な欠失変異を作成し、転写活性化が調節領域のどの部に局在しているかを検証した.転写活性化の指標となるリポーター遺伝子としてはGATA-2自身のプロモーター領域にGreen Fluorescent Protein(GFP)を結合したものを用いた.GFPの特性により、形質導入された細胞内のGFP発現量,すなわち,GATA-2調節領域の活性化強度が全く無染色で直接フローサイトメーターにより定量することが可能であった.第一段階として約1kbごとに5つの内部欠失変異を作成したところ,中心部のNco I-SPe I間の欠失により大きく活性が減衰することが示された.これとは逆にこのNco I-SPe Iのみを取り出し導入したものでは調節領域全長の持つ活性が保持されていることが認められ、この部に転写活性化の中心が存在していることを既に見出すことができた.この注目されるNco I-Spe I間は約1kbpであるが,末端から約200bpごと欠失した一連の構築を作成し、現在、其々につきp815細胞株に安定形質導入を行い、残存する活性化の程度を測定した.2造血幹細胞増幅用アデノウイルスベクターの構築アデノウイルスベクターは,Microbix Biosystems社のAdMax^<TM>を選択した.

初回暴露のみに感染性を限定するためにアデノウイルスのゲノムに欠失を加え,かつ2つのベクターに分割したベクターは従来より考案されてきたが,2ベクター間で起きなければならない組換えの効率が低いのが致命的な欠点として批判されてきた.AdMaxは,Cre-loxPシステムによる高効率の組換えを応用することでこの欠点を克服したものである.ベクター構築の第一段階としてシャトルプラスミドにGATA-2 cDNAを導入した.1、造血幹細胞増幅用アデノウィルスベクターの構築初回暴露のみに感染性を限定するためにアデノウィルスのゲノムに欠失を加え,かつ2つに分割したベクターは考案されてより久しいが,2ベクター間で起きなければならない組換えの効率が低いのが致命的な欠点であった,Microbix Biosystems社のAdMaxは,Cre-loxPシステムによる高効率の組換えを応用することでこの欠点を克服したものである.ベクター構築の第一段階としてシャトルプラスミドにGATA-2 cDNAを導入した.2、GATA-2遺伝子座における造血系調節領域の解析転写活性化の指標となるリポーター遺伝子としてはGATA-2自身のプロモーター領域にGreen Fluorescent Protein(GFP)を結合したものを用いた.この手法では、GATA-2調節領域の活性化強度は形質導入された細胞内のGFP発現量,すなわち緑色蛍光強度として表されるが,これを全く無染色でフローサイトメーターにより定量することが可能であった.GATA-2造血系転写調節における第1必要領域・約5kb中,転写活性化能がいずれに局在しているかを明らかにすべく様々な欠失変異を作成した.第一段階として約1kbごとに5つの内部欠失変異を作成したところ,中心部のNco I-Spe I間の欠失により大きく活性が減衰することが示された.これとは逆にこのNco I-Spe Iのみを取り出し導入したものには調節領域全長の持つ活性が保持されており、この部に転写活性化の中心が存在していることを見出した.この注目されるNco I-Spe I間は約1kbpであるが,末端から一連の欠失変異を作成しその塩基配列を決定した.既知の転写因子の結合部位を探索したところ,5'端より約450bpにGATA転写因子群とSTATの結合部位が隣接していることが認められた.さらに,Spe-1サイト近傍に造血幹細胞分化へ密接に関わるOct-1,GATA, SCL結合部位が集中しているという注目すべき結果が得られた.
頭蓋下顎障害患者における前頭面からみた咬合平面の傾斜度に関する研究

頭蓋下顎障害(CMD)患者における前頭面からみた咬合平面の傾斜度が頭蓋下顎障害の発症因子のひとつになるか否かを明らかにする目的で、まず前頭面からみた咬合平面の傾斜度を臨床の場で測定できるシステムを開発し、次いで開発したシステムを用いて正常者と頭蓋下顎障害患者における前頭面からみた咬合平面の傾斜度を計測した。下顎左右中切歯切端と両側の第2大臼歯遠心頬側咬頭頂に接するように平面板Aを被験者の下顎歯列上に設定し、平面板Aと接する別の平面板Bを下顎歯列頬側面にクラッチで取りつけた。平面板Aをはずすことにより、中心咬合位においても咬合平面と平行な平面(平面板B)を口腔外に設定することができた。フランクフルト平面は、顔面頭部に固定したU字形の平面を眼下下縁と外耳道上縁を結ぶ平面と平行にすることにより設定することができた。被験者に咬合平面とフランクフルト平面の両平面を構成する装置を装着後、咬合平面を構成する平面板に3個のLED、フランクフルト平面を構成する平面板に3個のLEDを付着し、6個のLEDの3次元的位置座標から、フランクフルト平面を基準にした場合の前頭面からみた咬合平面の傾斜度を算出できるシステムを開発できた。開発したシステムを用いて正常者50名とCMD患者30名における前頭面からみた咬合平面の傾斜度を算出した結果、正常者では平均が1.42度で小さかったが、CMD患者では平均が3.64度であり、正常者よりも著明に大きく、両群間に高度な有意差が認められた。これらのことから、CMD患者における前頭面からみた咬合平面の傾斜度がCMDの発症因子のひとつになる可能性が示唆された。頭蓋下顎障害患者における前頭面からみた咬合平面の傾斜度が頭蓋下顎障害の発症因子のひとつになるか否かを明らかにする目的で、本年度は、まず前頭面からみた咬合平面の傾斜度を臨床の場で測定できるシステムを開発し、次いで開発したシステムを用いて正常者における前頭面からみた咬合平面の傾斜度を計測した。結果は以下の通りである。1.下顎左右中切歯切端と両側の第2大臼歯遠心頬側咬頭頂に接するように平面板Aを被験者の下顎歯列上に設定し(平面板Aは、被験者の歯列の大きさにより3種類作成した)、平面板Aと接する別の平面板Bを下顎歯列頬側面にクラッチで取りつけた。フランクフルト平面は、顔面頭部に固定したU字形の平面を眼眼窩下縁と外耳道上縁を結ぶ平面と平行にすることにより設定することができた。2.正常者に咬合平面とフランクフルト平面の両平面を構成する装置を装着後、咬合平面を構成する平面板に3個のLED、フランクフルト平面を構成する平面板に3個のLEDを付着し、6個のLEDの3次元的位置座標を計測できるシステムを用いて、各LEDの位置座標を計測し、コンピュータのディスクに記録した。3.フランクフルト平面を基準にした場合の前頭面からみた咬合平面の傾斜度を算出するシステムを開発後、正常者の前頭面からみた咬合平面の傾斜度について計測を行った結果、正常者の前頭面からみた咬合平面は、フランクフルト平面にほぼ平行であることが判明した。頭蓋下顎障害(CMD)患者における前頭面からみた咬合平面の傾斜度がCMDの発症因子のひとつになるか否かを明らかにする目的で、20歳代の正常者20名とCMD患者20名におけるフランクフルト平面を基準にした場合の前頭面からみた咬合平面の傾斜度を測定し、両者間で比較した。

実験は、まず下顎左右中切歯切端と両側第2大臼歯遠心頬側咬頭頂に接する平面板Aを被験者の下顎歯列上に設定し、平面板Aと接する別の平面板Bを下顎歯列にクラッチで取りつけた。平面板Aをはずすことにより、中心咬合位においても咬合平面と平行な平面(平面板B)を口腔外に設定した。フランクフルト平面は、顔面頭部に固定したU字形の平面を眼窩下縁と外耳道上縁を結ぶ平面と平行にすることにより設定した。次いで、咬合平面と平行な平面板に3個のLED、フランクフルト平面に平行な平面板に3個のLEDを付着し、3次元計測システムを用いて各LEDの位置座標を計測し、フランクフルト平面を基準にした場合の前頭面からみた咬合平面の傾斜度を算出した。結果は以下の通りである。1.正常者におけるフランクフルト平面を基準にした場合の前頭面からみた咬合平面の傾斜度は、0.17度2.86度の範囲で、平均が1.35度で小さかった。2.CMD患者におけるフランクフルト平面を基準にした場合の前頭面からみた咬合平面の傾斜度は、0.73度7.06度の範囲で、平均が3.81度であり、正常者よりも有意に大きかった。3.これらのことから、CMD患者における前頭面からみた咬合平面の傾斜度がCMDの発症因子のひとつになる可能性が示唆された。頭蓋下顎障害(CMD)患者における前頭面からみた咬合平面の傾斜度がCMDの発症因子のひとつになるか否かを明らかにする目的で、20歳代の正常者50名とCMD患者30名におけるフランクフルト平面を基準にした場合の前頭面からみた咬合平面の傾斜度を測定し、両者間で比較した。実験は、ます下顎左右中切歯切端と両側第2大臼歯遠心頬側咬頭頂に接する平面板Aを被験者の下顎歯列上に設定し、平面板Aと接する別の平面板Bを下顎歯列にクラッチで取りつけた。1.正常者におけるフランクフルト平面を基準にした場合の前頭面からみた咬合平面の傾斜度は、0.17度2.87度の範囲で、平均が1.42度で小さかった。2. CMD患者におけるフランクフルト平面を基準にした場合の前頭面からみた咬合平面の傾斜度は、0.73度8.08度の範囲で、平均が3.64度であり、正常者よりも有意に大きかった。
光トポによる失語症回復過程を支える脳内機序の解明

失語症の30%は劣位半球に言語活動がみられた。追跡を行った11名中7例は半年後には劣位側の活性が優位側に移行。回復早期には劣位側が言語をささえ、その後優位側に移行する現象が認められた。バーチャル・レジストレーション法の推定精度は約1cm以内でMRI3次元デジタイザーなしでも脳回レベルの空間解析は可能であると考えられた。この標準脳座標系により被験者間のデータの比較や他の計測法データとの統合も可能となった。失語症の回復過程を支える脳内機序を研究するため、回復過程にある失語症の症例において、言語刺激を行ったときの脳の活動の時間的および空間的な分布を計測する懸隔である。48チャンネルの光トポグラフィーを用いて計測を開始した。現在までに7名の失語症症例を計測した。すべて左半球の脳卒中による損傷で失語をきたしており、回復中である。言語刺激として語想起題を15秒間行うことを5回繰り返し光トポグラフィー計測し平均加算した。結果としては、3名は左前頭葉に非定型的な活動がみとめられ、3名は右前頭葉のみに言語課題に一致した時間帯に活動が、1名は両半球とも明確な活動が認められなかった。このうち現在3名を継続して追跡している。今後は症例を積み重ねて、時系列的な追跡もあわせて行う予定である。一方、計測法の標準化も合わせて研究を行っている。失語症の回復を光トポでモニタリングするためには、多被験者にわたって安定的に言語野の位置を計測するための、標準的なプローブ設置法の開発が望まれている。従来のMRI併用による脳構造画像の取得では、光トポの簡便性が損なわれてしまう。そこで、光トポプローベの形状と被験者の頭皮上への設置をコンピュータ上にシミュレートする、バーチャルレジストレーション法を開発した。これによって、光トポ単独でも、計測位置を標準化し、客観的に記載することが可能となった。今後は、被験者の頭のサイズの影響をシミュレーションに取り込んでいく。さらに、言語野に焦点を絞った検証研究を展開していく予定である。失語症の回復過程を支える脳内機序を研究するため,回復過程にある失語症の症例において,言語刺激を行ったときの脳の活動の時間的および空間的な分布を計測する懸隔である。結果としては,3名は左前頭葉に非定型的な活動がみとめられ,3名は右前頭葉のみに言語課題に一致した時間帯に活動が,1名は両半球とも明確な活動が認められなかった。さらに3名の患者を新しく追加した。今後はさらに症例を積み重ねて,時系列的な追跡もあわせて行う予定である。一方,計測法の標準化も合わせて研究を行っている。失語症の回復を光トポでモニタリングするためには,多被験者にわたって安定的に言語野の位置を計測するための,標準的なプローブ設置法の開発が望まれている。従来のMRI併用による脳構造画像の取得では,光トポの簡便性が損なわれてしまう。そこで,光トポプローベの形状と被験者の頭皮上への設置をコンピュータ上にシミュレートする,バーチャルレジストレーション法を開発した。これによって,光トポ単独でも,計測位置を標準化し,客観的に記載することが可能となった。今後は,被験者の頭のサイズの影響をシミュレーションに取り込んでいく。さらに,言語野に焦点を絞った検証研究を展開していく予定である。失語症の回復過程を支える脳内機序を研究するため、回復過程にある失語症の症例において、言語刺激を行ったときの脳の活動の時間的および空間的な分布を計測した。48チャンネルの光トポグラフィー(ETG4000)を用いて計測した。初年度からしだいに症例数を増やし現在は総計30名の失語症患者につき機能計測を続けている。30例中13例は右(劣位)半球下前頭回に言語活動に一致した血流増加が観察され、この部位の神経活動が言語機能を支えていると考えられた。10例は優位側(左)に活性が認められ、7例は左に血流が低下するような、異常な反応が認められた。30例中11名は複数回の計測を行い、活動部位の変遷を検討した。11例中7例は右に活性が認められたが、2例は半年後に他の5例は3-6ヵ月後に活動が優位側にも出現し、同時に非優位側の活動が低減していることが観察された。

このように、回復期の早期には非優位側が言語活動をささえ、次第に優位側が回復してくるとともに、非優位側の活動が下がって切り替えが行われる現象が起こることが分かった。一方、残りの4例ははじめから左に潜時の遅れや波形逆転など波形の異常はあるもののなんらかの活性があり、経過とともに明確で正常な反応へと正常化する傾向が認められた。複数の被験者から得られた光トポデータの解析は、通常、被験者間でチャンネル(計測点)の位置が同じであると仮定して、チャンネルごとにデータ解析を行なう。しかしこの方法では、異なるチャンネル設定を用いて計測した複数の研究のデータを統合するのが難しい。そこで、チャンネルを脳の解剖領域別に分類してから、被験者間のデータを解析する、新しい解析方法を開発した。これにより、チャンネル設定の異なる研究官でのデータ統合が可能となった。また、ノイズや欠損値の多い光トポデータに頑健な統計手法として、ノンパラメトリック法の優位性を示した。さらに、ブローカ野の機能解析において、光トポが、舌運動、語想起課題、味覚刺激課題遂行時の脳活動パターンを明確に判別しうることを明らかにした。
荷電不安定性が引き起こす非平衡膜界面の新奇構造・機能

敗血症因子に晒された赤血球は,シア流下での形状変化が健康な赤血球に比べて小さく,これが敗血症における全身性炎症の引き金になりうる事が知られていたが,弾性等の物性の変化の理解は不足している.そこで細胞形状ゆらぎのスペクトル解析とマイクロ流体デバイスや光トラップ等を統合して個々の赤血球の物性変化を定量した.内毒素分子の糖鎖が長い程作用した赤血球の曲げ弾性係数は減少すると同時にシア弾性係数は増加する事,新生児赤血球は成人赤血球よりこの変化が顕著である事,新薬候補ペプチドがこの変化を抑える事,を解明した.特に生体界面の特徴として,赤血球の形状ゆらぎの理解に細胞骨格に由来する結合項が不可欠である事を立証できた.また,外部から添加され細胞膜表面に作用する内毒素分子が細胞質側の細胞骨格のシア弾性に影響を与えるという結果は,細胞膜に埋め込まれた膜貫通タンパク質への作用を示唆しており,メゾスケールの形状ゆらぎと分子スケールの現象の関連の理解を深めるものである.また,より動的で非平衡状態にある生体界面の振舞いの解明を目的として,アクチン・ミオシンタンパク質系(アクトミオシン)に駆動される再構成脂質膜界面の研究も並行してまとめた.アクトミオシンと脂質膜の結合に静電相互作用を援用することで,再構成したアクトミオシンの自発構造形成とカップルした人工脂質膜界面の動的変形が初めて観察されていたが,その解析や数理モデリングから界面変位の非熱的性質や曲率依存的な挙動が明らかになった.また,界面の非熱的ゆらぎの解析を深め,10秒スケールの時間相関をもつ有色ノイズ型の動的力生成が界面の非熱的変位に変換されていることを議論した.上記の主要な成果に加え,荷電性界面の粗視化MD計算や多細胞生物ヒドラの界面変形など,階層横断的に非平衡界面現象の解明に取り組み成果を挙げた.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、研究計画の内容である高濃度のタンパク質溶液を封入した細胞サイズリポソームの創成を目指し、界面透過法と呼ばれる作製手法の適用を検討した。界面透過法では脂質単分子膜に覆われた油中水滴が、別の脂質単分子膜が並ぶ油水界面を透過することでリボソームが形成される。これまでに得られている予備的な成果として、界面の通過の際に多くの膜が壊れるか界面に引っかかって止まっていることがわかっているが、その透過のダイナミックな過程は未解明であった。界面透過法に適した実験条件の探索はこれまで経験的に行われてきたが、本研究で目標とする高濃度タンパク質溶液系においてはその経験則では作製効率が不十分であり、透過の詳細を理解することが必要となった。そこで、透過のダイナミクスの直接観察と数理モデル化を行った。その結果、透過のダイナミクスは液滴の変位が時間の2乗に比例する初期の速い過程と変位が時間の1/2乗に比例する終期の遅い過程の2つの動力学的過程をとっていることがわかった。さらに、その透過時間は液滴サイズに強く依存する事がわかった。現象をより深く理解するためその動力学過程の双安定系における反応拡散方程式を用いた記述を試みたところ、そのスケーリング則とサイズ依存性が同時に再現され、さらに数理モデルから示唆される別のサイズ依存性も追実験で確認することができた。また、ここで得た数理モデルからは、μmの液滴サイズ、広い引き込み領域を持つ脂質の炭化水素鎖、といった界面透過法に適した実験条件の基準が明らかになった。界面透過の動的過程の実験・考察を通じて明らかした今回の研究成果は、これまで経験則で行われてきた界面透過法の条件探索に物理化学的な判断基盤を与える初めてのものであり、今後の研究において極めて大きな役割を果たすと期待できる。この研究結果はSoft Matter誌に掲載され、論文誌の表紙に選出された。膜界面の非平衡挙動を対象として、1.アクトミオシン系を封入した細胞スケールの膜界面の構築、および、2.血液の病気に関する赤血球膜の形状ゆらぎの定量を行った。以下にその詳細を記す。1.アクチンとミオシンと呼ばれるタンパク質をAmoeba proteusから精製し、その複合体(アクトミオシン)が発生させる収縮力を柔らかい脂質膜界面と結合させ界面変形を引き起こすことに成功した。界面変形時のアクチン分布を可視化することで、界面が二種の異なる変形モードを示すことが明らかになった。2. flicker spectrocopyという溶液中における赤血球膜の形状ゆらぎのスペクトル解析を用いて、赤血球膜の力学的物性の定量化を試みた。特に、各種分子構造を持つ内毒素が赤血球の力学的物性に与える影響の定量化を行った。個々の赤血球で異なる物性値やその力学応答を定量化するために、単純な母集団の平均ではなく、マイクロ流体デバイスと光トラップを用いて、内毒素添加前後の赤血球を個々に経時観察した。前年度に試作していたdiffusion chamberと呼ばれるマイクロ流体デバイスを完成させ、成人赤血球、新生児赤血球の形状ゆらぎを測定した。そのゆらぎ解析から、内毒素の糖鎖が長いほど赤血球の曲げ弾性定数は減少しシア弾性定数は増加すること、新生児赤血球は成人赤血球に比べ弾性定数の変化が顕著であること、抗敗血症薬候補のペプチドが弾性定数の変化を抑える働きを持つこと、が明らかになった。

本成果は成人・新生児赤血球における内毒素の影響を系統的に定量化する初めての試みであり、膜界面の物理学に留まらず物理学の視点から医学的にも重要な知見を与えるものである。敗血症因子に晒された赤血球は,シア流下での形状変化が健康な赤血球に比べて小さく,これが敗血症における全身性炎症の引き金になりうる事が知られていたが,弾性等の物性の変化の理解は不足している.そこで細胞形状ゆらぎのスペクトル解析とマイクロ流体デバイスや光トラップ等を統合して個々の赤血球の物性変化を定量した.内毒素分子の糖鎖が長い程作用した赤血球の曲げ弾性係数は減少すると同時にシア弾性係数は増加する事,新生児赤血球は成人赤血球よりこの変化が顕著である事,新薬候補ペプチドがこの変化を抑える事,を解明した.特に生体界面の特徴として,赤血球の形状ゆらぎの理解に細胞骨格に由来する結合項が不可欠である事を立証できた.また,外部から添加され細胞膜表面に作用する内毒素分子が細胞質側の細胞骨格のシア弾性に影響を与えるという結果は,細胞膜に埋め込まれた膜貫通タンパク質への作用を示唆しており,メゾスケールの形状ゆらぎと分子スケールの現象の関連の理解を深めるものである.また,より動的で非平衡状態にある生体界面の振舞いの解明を目的として,アクチン・ミオシンタンパク質系(アクトミオシン)に駆動される再構成脂質膜界面の研究も並行してまとめた.アクトミオシンと脂質膜の結合に静電相互作用を援用することで,再構成したアクトミオシンの自発構造形成とカップルした人工脂質膜界面の動的変形が初めて観察されていたが,その解析や数理モデリングから界面変位の非熱的性質や曲率依存的な挙動が明らかになった.また,界面の非熱的ゆらぎの解析を深め,10秒スケールの時間相関をもつ有色ノイズ型の動的力生成が界面の非熱的変位に変換されていることを議論した.上記の主要な成果に加え,荷電性界面の粗視化MD計算や多細胞生物ヒドラの界面変形など,階層横断的に非平衡界面現象の解明に取り組み成果を挙げた.本研究課題では、荷電を有する脂質膜界面が示す動的挙動について、その機構および機能を実験的に明らかにすることを目指している。特に生体膜の動的挙動の理解を目指すに当たり、当初は人工脂質膜小胞(リポソーム)を利用したボトムアップ的な手法のみを用いて実験系の構築を予定していた。しかし、現在までに、共同研究者の支えもあり生体高分子や生体膜を扱う実験技術が当初の予想以上に深まったことで、1.細胞の力生成に関わる生体高分子アクチン・ミオシンを利用したモデル脂質膜の界面変形や、2.生体膜として赤血球膜の形状ゆらぎの研究等に到達することができた。それらの系は当初の予定以上に生体膜に近いもの、または生体膜そのものであり、生体膜において荷電効果が現れる現象を実験的に理解する下地が整ったと言える。本年度の成果からは、アニオン性の内毒素分子が赤血球膜に挿入されることによる赤血球の形態変化・力学物性変化の定量や、静電相互作用を用いた界面とタンパク質の結合による界面変形など、荷電の役割と機能が着実に明らかになってきている。27年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は、今年度に行った1.アクトミオシンを封入した液滴系や、2.赤血球膜の力学物性に対する内毒素添加の定量評価の結果を論文誌・学会等で報告していく。以下にそれぞれの研究課題に関する今後の推進方策を示す。1.アクトミオシンによる界面変形。前年度に実験・モデル化を行った界面透過法を用いて脂質二分子膜に転化させる。
顎骨における骨粗鬆症の特異性解明と予防法の確立-卵巣摘出サル顎骨の解析とhPTH(1-34)間欠投与-

ヒト顎骨の骨粗髭化の病態を把握し、治療・予防法を確立することを目的として、卵巣を摘出したサルの顎骨についてpQCT及びマイクロCTを用いて骨量変化と骨構造変化を解析しhPTH(1-34)の間欠投与効果も検索した。【平成13-14年度】雌カニクイザル12匹を2群に分け、卵巣摘出術(OVX)または偽手術(Sham)を施し、術後78週目に屠殺した。下顎骨を摘出後、pQCT及びマイクロCTにて、右下顎第1大臼歯遠心根を通る前頭断面を観察し、画像解析装置を用い海綿骨および皮質骨の2次元的構造解析を行った。また顎骨の3次元構築像を作成し、骨構造変化と皮質骨中の管腔構造の解析も試みた。【平成14-15年度】雌カニクイザル12匹を用いた。動物を3匹ずつ以下の4群に分け実験した。1群:Sham手術+溶媒週1回投与群,2群:OVX+溶媒週1回投与群,3群:OVX+hPTH(1-34)1.26μg/kg週1回投与群,4群:OVX+hPTH(1-34)6μg/kg週1回投与群とした。術後52週目に屠殺し、下顎骨を摘出。マイクロCTと画像解析装置を用いて解析し、Sham群、OVX群間で比較検討した。【結果と考察】卵巣摘出したサル顎骨では、エストロゲン欠乏により、海綿骨量が減少するとともに皮質骨中を近遠心方向に走る管腔が拡大する事によって粗髭化が生じる事が明らかとなった。hPTH(1-34)1.26μg/kg週1回投与あるいはhPTH(1-34)6μg/kg週1回投与処置で、骨梁は増加する事が示された。その効果は1.26μg/kg週1回投与より6μg/kg週1回投与がより有効であった。しかしながら皮質骨中の血管腔の増大を阻止する効果は認められず、低濃度ではエストロゲン欠乏によって生じる皮質骨の粗髭化を逆に助長してしまう可能性も示唆された。顎骨における閉経後骨粗鬆症の病態解明岸目的として、雌カニクイザルに卵巣摘出術を施し、エストロゲン欠乏によって生じるサル顎骨の微細構造変化を既設のマイクロCTを用い観察記録するとともに、新規購入設置したマイクロCT用硬組織画像解析装置(LuzexF)にて解析した。【方法】9歳以上の雌カニクイザル12匹を2群に分け、両側卵巣摘出術(OVX)、または偽手術(Sham)を施し、術後24週目に屠殺した。下顎骨を摘出後、マイクロCTにて、右下顎第一大臼歯遠心根を通る前頭断面を観察し、マイクロCT用硬組織画像解析装置(LuzexF,)を用い海綿骨および皮質骨の2次元的構造解析を行った。さらに顎骨の3次元構築像を作成し、骨構造の変化と皮質骨中の管腔構造の3次元的解析も試みた。【結果】OVX群ではSham群に比べ、海綿骨量、骨梁幅、骨梁数ともに有意に低値を示す一方で、骨梁間隙は有意に高値を示していた。

また骨梁数自体が少なく、とくに皮質骨と連続した骨梁が著明に減少していることが示された。この傾向は顎骨基底部において顕著であった。一方、皮質骨幅や皮質骨量には両群間に有意差は認められなかったが、OVX群の管腔量はSham群よりも有意に高値であつた。OVXサル顎骨では、海綿骨量および骨梁の連結性の減少が認められるとともに、皮質骨中を近遠心方向に走る血管腔が多数形成されていた。【総括】卵巣摘出したサル顎骨では、エストロゲン欠乏により、海綿骨量が減少するとともに皮質骨中を近遠心方向に走る管腔が拡大する事によつて粗鬆化が生じる事が明らかとなった。本研究は顎骨粗鬆化の特異性の解明とその予防法の確立を目指している。平成14年度は、卵巣を摘出したサルの顎骨について末梢定量的CT(pQCT)およびマイクロCTを用いて、骨量変化と3次元的顎骨構造変化を中心に解析を行った。また顎骨における骨粗鬆症の予防法・治療法確立を試みる実験として、12歳カニクイザル20匹を5匹ずつの5群に分け、1群には卵巣摘出の疑似手術(Sham)を、残りの4群には卵巣摘出術(OVX)を行うと同時に、溶媒またはヒト副甲状腺ホルモン(1-34)(hPTH 1-34)あるいはAlendronateを以下の条件で6ヶ月間投与した実験を行った。[1群:Sham手術+溶媒週1回投与群、2群:OVX+溶媒週1回投与群、3群:OVX+hPTH60μg/kg週1回投与群、4群:OVX+hPTH20μg/kg週3回投与群、5群:OVX+ALN/10μg/kg週2回投与群]卵巣摘出サルの実験では、下顎骨、橈骨について、pQCTによる骨密度測定およびマイクロCTによる微細骨梁構造の解析結果を学会で発表した。卵巣摘出サルの骨密度および骨構造は、腰椎、橈骨、下顎骨で相関していた。それぞれの部位の骨密度は、対照群と卵巣摘出群間では有意差が認められなかったが、個体毎に検索すると、腰椎骨密度が低下する個体では、橈骨、下顎骨でも骨構造が著しく脆弱化していた。また、歯科用X線写真上にも下顎骨の粗鬆化が認められることが明らかとなった。卵巣摘出したサル顎骨では、エストロゲン欠乏により、海綿骨量が減少するとともに、皮質骨中を近遠心方向に走る管腔が拡大することによって粗鬆化が生じる事が明らかとなった。なお、OVXを施したサルにhPTH(1-34)あるいはAlendronateを投与する実験は本年度で終了しており、次年度にその骨動態を解析する計画になっている。ヒト顎骨の骨粗鬆化の病態を把握し、治療・予防を確立することを目的として、卵巣を摘出したサルの顎骨についてpQCTおよびマイクロCTを用いて骨量変化と骨構造変化を解析しhPTH(1-34)の間欠投与効果も検索した。【材料と方法】雌カニクイザル12匹を用いた。動物を3匹ずつ以下の4群に分け実験した。1群:Sham手術+溶媒週1回投与群,2群:OVX+溶媒週1回投与群,3群:OVX+hPTH(1-34)1.26μg/kg週1回投与群,4群:OVX+hPTH(1-34)6μg/kg週1回投与群とした。術後52週目に屠殺し、下顎骨を摘出した、摘出した下顎骨をマイクロCTおよび画像解析装置を用いて解析し、Sham群、OVX群間で比較検討した。【結果と考察】OVXによるエストロゲン欠乏はサル顎骨の皮質骨中に血管腔の形成を促し粗鬆化を生じさせるが、hPTH(1-34)1.26μg/kg週1回投与あるいはhPTH(1-34)6μg/kg週1回投与処置ではこの現象を阻止する効果は認められなかった。一方、皮質骨から連続して伸び出す骨梁は、hPTH(1-34)の間欠投与によって増加する事が示されたと言える。またその効果は1.26μg/kg週1回投与より6μg/kg週1回投与処置の方が有効であった。低濃度のhPTH(1-34)の間欠投与ではエストロゲン欠乏による皮質骨中の血管腔の増加を逆に助長してしまう可能性も示唆された。
虚血・低酸素性脳神経細胞選択死のメカニズム解明に関する研究

これまでのラット脳一側梗塞モデルによる実験で、神経細胞の核には他の細胞に比べて極めて高濃度にμ-カルパイン前駆体が存在し、それが虚血により早期に活性化されることを示してきた。本研究ではその実態を一層明らかにするために神経芽細胞腫GOTO細胞の培養実験により低酸素下における細胞死の解析を行い、以下の結果を得た。1.酸素分圧1/5の低酸素条件下でμ-カルパイン前駆体抗体による核の染色性は経時的に減少し、Trypan blueexclusion testによる細胞死もそれに平行的に進行することが示された。2.ARGUS-50による低酸素実験で細胞内カルシウム濃度は2-3分後から急速に上昇し、5分後には最高値に達した。この値は細胞質の濃度より核における濃度の方が常に先行して上昇し最終濃度において1020%高いことが示された。3.低酸素下の細胞死は(1)カルパインインヒビターI, II, III、(2)カルシウム拮抗剤によって抑制されるとともに、(3)カスパーゼインヒビターICE1によつても軽度に抑制されることが示された。そして(1)・(2)・(3)の併用で極めて高い相乗的抑制効果がみられた。4.アポトーシス/ネクローシスの判別法であるacridine orange/ethidium bromide法により、ネクローシスは6時間値62%,12時間値65%,24時間値68%であったのに対し、アポトーシスではそれぞれ58%,712%,7.615%であった。5.μ-カルパイン前駆体の活性化による核内蛋白質の分解を検索するために、数種類の転写因子について、in vitroでのμ-カルパインによる切断を試みた。その結果NFκBp65,Pit-1,Oct-1,GHF4,CREB等が限定分解をうけることが示された。これらの結果から脳神経細胞が虚血/低酸素に弱い原因の一つはとりわけ神経細胞の核にμ-カルパイン前駆体が高濃度に存在し、それが低酸素下に活性化して核内蛋白質を分解すること、細胞死の大半はネクローシスであり、それにアポトーシスによる細胞死が加わること、及びカルパインインヒビターとカルシウム拮抗剤の併用が虚血性神経細胞死の抑制に効果的で今後治療対策に有用であることが示された。平成9年度の計画にそって神経芽細胞腫GOTOの細胞培養による低酸素実験を行い核に濃厚に存在するμ-カルパイン前駆体の動態、並びにカルシウムの流入・分布、インヒビターの保護効果、細胞死の経時的な追跡などを行い、以下のような結果を得た。1、神経系の細胞核に濃厚に存在するμ-カルパイン前駆体に対して細胞内カルパインインヒビターであるカルパスタチンの細胞内分布を免疫染色法により検索した。その結果カルパスタチンは細胞質には観察されたが、核内の染色はみられなかった。2、低酸素により細胞内にカルシウムが流入することは多くの報告にみられるが、同時に神経系細胞の核内カルシウム濃度がどれ程上昇するかの詳細は明らかでない。

低酸素条件下培養液還流実験でのARGUS-50による測定では、23分後から細胞質、核内ともにカルシウム濃度は急速に上昇しはじめ約5分で最高値に達したが、核における濃度は細胞質における濃度より常に1020%高いことが示された。したがって、1の結果と合わせて、低酸素条件下で核内μ-カルパイン前駆体が活性化し、連鎖反応を起こしてその大部分が短時間に活性化されうる可能性が示された。μ-カルパイン前駆体の活性化による核内蛋白質の分解を検索するために、数種類の転写因子について、まずin vitroでのμ-カルパイによる切断を試みた。その結果これまでにNF-κBp65,pit-1,oct-1,GHF-1,CREBが限定分解をうけることが証明された(第70回日本生化学会、抄録、生化学69,566,1977)。4、虚血/低酸素による脳神経細胞死にカルパインがどれ程係わっているかを知るために、低酸素状態での細胞死の実験系にカルパインインヒビターを加えて経時的変化を観察した。3060分の時間経過で5060%の細胞が死滅するところインヒビターの存在下では2040%生存率は回復しカルパインインヒビターによる有意な保護効果が認められた。尚プロテアソームインヒビターによっては保護効果は観察されなかった。以上、これまでの結果は少なくとも虚血/低酸素状態で神経細胞の核内カルシウム濃度は短時間のうちに上昇し、μ-カルパイン前駆体は活性化され、それが生理的に重要な核内蛋白質を分解して、神経細胞死をもたらすことが示され、当初の仮説を支持する結果となった。これまでの研究結果から、虚血・低酸素による脳神経細胞の選択死の原因は神経細胞の核にμ-カルパイン前駆体が多く存在し、それによりカルパインが短時間のうちに活性化することによるものであるとする示唆を得た。平成10年度はその細胞死がアポトーシスによるものかネクローシスを主体にするものかを検討するとともに、カルパインに対し作用点の異なる阻害剤の相乗作用について検討した。1.低酸素性神経細胞死の識別:神経芽細胞腫株GOTOの低酸素培養による細胞死はTrypan blueexclusion testで判定し、アポトーシスによるDNAの断片化はladderの検出とin situ endolabelling法(TUNEL法)により検出した。30分1時間の低酸素条件でladderは形成されたが細胞死との割合に比べて弱く、その後の経時的増加が認められなかった。またTUNEL法ではアポトーシス陽性細胞は検出されたが全体の細胞死の2030%であった。これより細胞死の一部はアポトーシスであるが他の多くはネクローシスによるものと判定された。2.カルパインインヒビター、Ca^<++>拮抗剤による相乗的抑制効果:低酸素下のカルパインによる細胞障害を証明する一手法として2種類の作用の異なる阻害剤効果を検討した。カルパインインヒビターIとIIによる抑制効果はいずれもdose dependentであり経時的に増加したが、抑制の最大限は3040%であった。一方、カルシウムブロッカー及びカルシウム拮抗剤ではそれぞれ10%、30%前後であった。そこでこれ等の併用効果を検索したところ、カルパインインヒビターとカルシウム拮抗剤との併用が最も有効で7080%の抑制効果が観察された。以上の結果より低酸素下での細胞死の原因の一つは低酸素によるカルシウムの流入と、それによるカルパインの括性化が重要な役割を果たしていることが示された。