hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
C末端アミド化酵素がミエリンペプチドアミドの生合成に関与している可能性について

それぞれの反応機構を考慮し、1)NH_2OH,NH_3,Asp,Gluなどの基質とピリドキサルリン酸,FAD,NADH,ATPなどの補酵素を添加した系、2)アスコルビン酸,NADH,FADH_2,グルタチオン,還元型プテリン,Cu^<2+>などのcofactor、もしくはNAD^+,NADP^+,FAD,FMNなどの酸化型補酵素を添加した系、3)GlyとCoAを添加した系に関して、ラット脳ホモジェネートおよび脳ミクロゾーム画分に関し、アミド化酵素活性の有無を系統的にスクリーニングした。その結果、どの系においても期待されるアミド化ペプチドの生成を認めなかった。以上の結果から、今後の検索のためには、前駆体アナログとすべき合成基質の種類をさらに検討し、用いるべき酵素標品の部分精製にも検討を加えていかなければならない。
光・電子・無線機能集積のための半導体ヘテロ機能デバイスの開発

電子・無線・光領域をシームレスに接続する事が可能な素子として、THz-光信号直接変換技術及び3電気端子を有する光増幅器・光源などの研究を行っている。昨年度は、特に次世代システムにおいて利用可能な、3電気端子を有する長波長帯トランジスタレーザ(TL)の実現に向け、理論解析・素子作製を行った。理論解析においてはLDの動作速度制限の要因であるキャリア輸送に伴う利得低下の影響がTLにおいて低減可能であると示し、その優位性を示した。適切な設計を行うことでLDでは実現困難な100Gb/sを越える変調速度を実現する事が可能であることを示し、キャリア引き抜きによる消費電力増加と変調帯域の評価を行うことで他の変調方式と比べて低い消費電力で40GHz程度の変調速度を実現できると述べた。一方、素子作製に向けては、昨年度までに達成してきたAlGaInAs/InP埋め込みヘテロ構造形成法・数値計算による設計を元に、pnp型及びnpn型のTL作製を行った。ストライプ幅1.8μm、共振器長500μmのp/n/p型のTLにおいてしきい値エミッタ電流密度J_<Eth>=1.9kA/cm^2、注入効率47%などを実現し、室温連続発振動作及びコレクタ電圧による光出力制御を得た。次に、npn型TLの室温パルス発振を達成し、しきい値ベース電流18mA、しきい値エミッタ電流150mA、しきい値における電流利得7.3を観測し、変調帯域増大に不可欠な電流増幅とレーザ発振を長波長帯TLとして初めて実現した。本素子は、別個の素子を同一チップ上に集積する光電子集積回路(OEIC)などとは異なり、異種デバイス融合による単一素子への集積化であり、シンプルかつ高性能デバイスとして情報通信ネットワーク発展に大いに貢献できると考えている。電子・無線。光領域をシームレスに接続する新素子として、光-THz直接変換素子に関する基礎実験、高速・多機能動作が可能な長波長帯トランジスタレーザ室温動作を達成した。本研究課題は今年度で終了となるが、これまでの結果により、研究目的である次世代システムに利用可能な新規素子開発に成功したと言える。理論解析においては数値計算法によりその動作機構を解明するとともにレーザダイオード(LD)では実現困難な40Gbpsでの高速変調の可能性を示し、TLの優位性を示した。一方、素子作製に向けては、導入予定の埋め込みヘテロ(BH)構造形成法に関する検討を行った。本研究で用いるAlGaInAs/InP材料系は、空気中で酸化されやすいという問題があり、その成長界面評価法も確立していない。本研究においては表面再結合速度Sを用いた成長界面評価を行い、その指数であるSτ値で12nmと良好なBH構造形成を実現した。この値は、GaInAsP/InP-BH-LDでの68nmと比べても低く、酸化影響の無い構造形成に成功した。また、実際にTL作製を行い、ストライプ幅1.8μm、共振器長500μmのp/n/p型のTLにおいてしきい値エミッタ電流密度J_<Eth>=1.9kA/cm^2、注入効率47%などを実現し、室温連続発振動作及びコレクタ電圧による光出力制御を得た。

本素子は、別個の素子を同一チップ上に集積する光電子集積回路(OEIC)などとは異なり、異種デバイス融合による単一素子への集積化であり、シンプルかつ高性能デバイスとして情報通信ネットワーク発展に大いに貢献できると考えている。電子・無線。光領域をシームレスに接続する新素子として、光-THz直接変換素子に関する基礎実験、高速・多機能動作が可能な長波長帯トランジスタレーザ室温動作を達成した。本研究課題は今年度で終了となるが、これまでの結果により、研究目的である次世代システムに利用可能な新規素子開発に成功したと言える。
ヒト血漿インターαトリプシン インヒビターの生化学的研究

インターαトリプシンインヒビター(ITI)は7種類のヒト血漿プロテアーゼ阻害子の一つである。本研究では、ITIの精製法を確立し、トリプシンとの反応機構を解析すると共に、ITIの基本構造を明らかにすることが出来た。1)ITIの精製法:ヒト血漿に塩化バリウムを添加し、凝固系の因子を除去した後、Q-セファロース、DEAE-セファセル、最後にヘパリン-セファロースを用いたクロマトグラフィーににより、ITIを精製した。この方法では、血漿1リットルから約50mgのITIが得られる。2)トリプシンとの反応機構:ITIにトリプシンを添加していくと、ITI-トリプシン複合体が生成するが、トリプシンが過剰になると、この複合体が切断され、最終的に45kDaの複合体が生成した。この複合体にα2-マクログロブリンを添加すると、トリプシンがα2-マクログロブリンに転移した。3)ITIの基本構造:ITIはSDS-ゲル電気泳動では、還元、非還元のいずれにおいても、210kDaの一本鎖構造を示すが、阻害活性のある140kDa鎖と不活性な70kDa鎖がS-S結合以外の相互作用力を介して接続した構造をしている。ITIを濃縮すると、一部はこの2本鎖に解離する。140kDa鎖はさらに阻害活性ドメインである25kDa鎖と100kDa鎖とからなり、両者はヒアルロニダーゼ感受生の糖鎖(20kDa)を介して結合している。ITIをpH12にすると、この3本鎖単位分かれた。これらから推定される基本構造を図に示した。インターαトリプシンインヒビター(ITI)は7種類のヒト血漿セリンプロテアーゼインヒビターのうちで最も研究のおくれているインヒビターである.本研究では, i)阻害機構, ii)自発的な切断反応, iii)生合成の3点についての研究を進める計画をしている.本年度の研究成果を以下に記す.1)阻害機構;分子量20万のITIをトリプシンに作用させると,トリプシン活性が阻害される.この反応液をSDS-ゲル泳動にかけたところ, ITI・トリプシン複合体は検出されず,逆にITIが数多くの低分子フラグメントに切断されていた.これは,トリプシンとITIとの複合体は解離しやすい非共有結合を介する複合体であり, ITIは解離したトリプシンによって速かに切断をうけることを示唆している. ITIにエラスターゼを作用させると, ITIが速かに分解をうけ,分子量3万の活性フラグメントが生成した.このフラグメントのN末端一次構造分析ならびにアミノ酸分析から,これがITIのN末端から由来したフラグメントであることを決定した.興味深いことに,このフラグメントはトリプシンと1:1の共有結合性複合体を形成した.2)自発的な切断反応;ITIは精製途中で自発的な切断反応が生り, 13万と6万のフラグメントになる.この2フラグメントを分離し, 13万フラグメントがITIのN末端側から由来することを明らかにした.13万フラグメントはさらに6万, 3万, 2万のフラグメントへと分解することも分った.この切断反応の機構は興味深いもので,さらに検討を進める予定である.3)生合成;培養肝細胞(HepG2)はITIを産生する.この産物をSDS-ゲル泳動と酵素免疫測定法とによって分析したところ,分子量25万のITIであることが分った.これは,血漿ITIよりも分子量5万も大きく,この高分子型ITIと血漿型ITIの関連性も次年度の課題である.インターαトリプシンインヒビター(ITI)は7種類のヒト血漿プロテアーゼ阻害子の一つである。

ヒト血漿のトリプシン阻害因子のひとつであるインターαトリプシンインヒビター(ITI)の基本構造の解析を進め、ITIは3本鎖構造をしたユニークな阻害蛋白質であることを明らかにした。1)ITIのN-末端構造:ITIはSDS-PAGEでは210kDaの一本鎖と推定されたが、N-末端分析ではAla-Val-Leuという配列とSer-Leu-Pro-の配列の2種類が同定された。これは、ITIが2本鎖からなり、両鎖は還元処理でも開裂しない特殊な様式で結合していると推定される。2)ITIの自発的切断反応:ITIの精製過程や濃縮操作において、新しく阻害活性のある140kDaと不活性な70kDaの2フラグメントが生成した。140kDa鎖のN-末端配列はAla-Val-Leu-であり、一方、70kDa鎖の配列はSer-Leu-Proであった。この結果は、ITIの2本鎖間の結合が開裂し、2フラグメントが生成したことを示唆している。3)ITIのアルカリ処理および酵素的切断:ITIをpH12にすると140kSa鎖と70kDa鎖とに切断され、さらに140kDaは阻害活性のある45 Da鎖と70kDa鎖とに切断された。一方、ITI、140kDa鎖、さらには45kDaフラグメントをヒアルロニダーゼ処理すると阻害活性のある25kDaフラグメントが生成した。これは、25kDaの阻害部位は糖鎖(20kDa)を介して100Daのポリペプチド鎖に結合し、140kD鎖を構成している事を示唆している。従って、ITIはN-末端Alaの阻害部位鎖(25kDa)、N-末端がブロックされた100kDa鎖、N-末端Serの70kDa鎖の3本鎖からなり、阻害部位鎖と100kDa鎖間は糖鎖で、100kDa鎖と70kDa鎖間はS-S結合以外の結合でつながった構造をしていると考えられる。
オシレーション法を用いた重症心身障害児（者）の呼吸換気メカニクスの検証

我々は、これまでの研究で重症心身障害児(者)における脊柱変形が拘束性換気パターンに影響を与えていることを示唆した。本研究の目的は、重症児(者)26名を対象に脊柱変形と呼吸抵抗との相関について調査することである。重症児(者)の脊柱変形(Cobb angle)は呼吸抵抗(Xrs)と有意に相関していた。呼吸リアクタンスもまた脊柱変形(Cobb angle)と有意に相関した。これらの結果から重症児(者)における脊柱変形は呼吸抵抗に影響を与えていることが示唆された。平成24年度挑戦的萌芽研究研究の進捗状況を以下に報告する。1総合呼吸抵抗機能検査についてはImplse Oscillation System(IOS)法を用いて、健常者9名(男性6名、女性3名)を対象に呼吸インピーダンス(Zrs)及びその成分でもある呼吸抵抗(Rrs)、呼吸リアクタンス(Xrs)を測定した。なお、重症心身障害児(者)のコントロール群として比較するために、体幹側屈0度、30度、50度にて測定を実施した。健常対象者の体幹側屈角度変化に伴い、呼吸抵抗(Rrs)は有意に高値を示した。2重症心身障害児(者)についてのIOS測定は、昨年度に引き続き今回、新たに3名測定し解析を進めた。なお、昨年度課題でもあった気管切開患者へのIOS測定についてはカニューレ接続用アダプタを新たに製作すると高価であるため、既存のスパイロメトリーカフを用いてair leakしないよう検討している。接続用カフには死腔を含めて検討する必要があることから、創意工夫を重ねているところである。気管切開をしている重症心身障害児(者)の多くは通常の呼吸機能検査測定は困難であることから、本IOS法を用いて呼吸機能障害の病態を把握することが重要である。3重症心身障害児(者)の呼吸運動の解析についてはBIMUTAS-VIdeoにて測定・解析を試みた。呼吸波形から呼吸様式の把握は可能であっが、三次元での胸郭呼吸運動の把握が困難であり、新たな呼吸解析ソウトにて今後検討が必要と考えれた。重症心身障害児・者の呼吸換気メカニクスを検討する目的で、対象者26名(喉頭気管分離術施行者:16名、口唇閉鎖可能者:10名)に対してオシレーション(implse Oscillation System:IOS)測定を試みた。その結果、喉頭気管分離術を施行されている重症児・者の呼吸抵抗は、口唇閉鎖可能な重症児・者に比して有意に呼吸抵抗が高値を示した。また、重症児・者の脊柱・胸郭変形(cobb角など)と呼吸抵抗との間に有意な相関が認められ、脊柱・胸郭変形が顕著であるほど呼吸抵抗が高い傾向を示した。これらのことから、脊柱・胸郭変形の重症度が呼吸抵抗に影響を与えることが推察された。一方、呼吸運動の解析については三次元動作解析装置の搬入が施設測定の関係から、物理的に困難であり、また予算的にも厳しかったため実施に至らなかった。呼吸運動についてはBIMUTAS-Videoでの解析のみにとどまった。これまで重症心身障害児(者)の安静換気測定が困難であったが、喉頭気管分離術施行者に対してはスパイロメトリーカフ(シリコンタイプ)を用い、air leakが発生しない様に十分配慮しながら測定することで十分IOS測定が可能であった。これらのことから、重症心身障害児者の呼吸換気測定法としてもIOS法が有用であると推察された。平成23年度挑戦的萌芽研究の結果について以下に報告します。(1)総合呼吸抵抗機能検査についてはImpulse Oscillation System(IOS)を用いて総合呼吸抵抗測定検査を施行し、呼吸インピーダンス(Zrs)及びその成分でもある呼吸抵抗(Rrs)、呼吸リアクタンス(Xrs)を測定した。また、得られた波形から呼吸周期依存性(呼気、吸気の抵抗変化)を評価した。その結果、重症心身障害児(者)4名の呼吸抵抗(Rrs)は健常者に比べ統計高くなる傾向を示した(対象者が少ないため、統計的な見解は示せず傾向を示した)。(2)胸郭・脊柱変形について(全脊柱正面X-P写真より)は対象者4名の脊柱側彎変形評価を行った。その結果、脊柱側彎角はcobb角25±10°であった。脊柱側彎右凸、胸腰椎カーブが多かった。脊柱回旋変形はNash & Moe法より椎体の回旋度評価はgrade2±0.5であった。胸郭前後径・横径等を計測し、脊柱側彎・回旋変形との関連性について検討したところ対象者が少なく統計的な見解を示せないですが、胸郭前後径が小さく横径が大きいほど、すなわち胸郭扁平なほど、一回換気量は低値を呼吸数は増加する傾向を示した。

重症心身障害児(者)における呼吸機能障害の病態についてIOS法を用いて検証した報告はなく、また安静換気を測定できるため、有用な測定法であると考えます。次年度は、より対象者数を増やし、検証を進める予定です。課題としては気管切開をしている対象者が多いため、対象者が限定されることがあげられる。気管切開を施行されている対象者に、直接カニューレから呼吸抵抗測定が可能か否かを検証し、可能であればモストグラフと呼吸機能測定を行うためのカニューレ接続用アダプタの作成を検討する予定です。1今回、重症心身障害児(者)を対象にIOS測定を実施したが、当初予定していた人数を大幅に下回った。IOS法は短時間測定がメリットであるが、一方でair leakしないよう口腔内の持続的閉鎖が求められる。重症心身障害児(者)は口唇閉鎖能力が低いため、IOS測定が困難な場合が多く、また測定できても対象者が限定され少数となった。2平成25年度は主に気管切開患者へのIOS測定を積極的に進める予定であるが、気管カニューレ接続用アダプタとモストグラフとの適合に時間を要している。既存のスパイロメトリーカフを用いてair leakしないよう予備実験を進めているため研究進捗としては遅れている現状である。当該年度の研究進捗状況について報告します(1)脊柱変形評価については脊柱側彎変形と脊柱回旋変形を指標とし、脊柱側彎変形は、全脊柱正面X-P写真よりCobb法を施行し、脊柱回旋変形はNash & Moe法より椎体の回旋度を評価を施行した。対象者の測定については当初予定していた人数を実施することができた。(2)呼吸抵抗測定検査(MostGraph-01,チェスト社製)を用いて、呼吸インピーダンス(Zrs)及びその成分でもある呼吸抵抗(Rrs)、呼吸リアクタンス(Xrs)を測定し、呼吸周期依存性(呼気、吸気の抵抗変化)を評価しました。しかし、対象者が少なく難渋した。平成24年度は多くの対象者を評価できるように、他病院・関係機関との調整を行う予定です。その理由として、気管切開をしている重症心身障害児(者)の増加し、カニューレから呼吸機能測定が現段階では難しいことがあげられる。直接、カニューレから呼吸機能測定が可能か否かを検証し、可能であればモストグラフと呼吸機能測定を行うためのカニューレ接続用アダプタの作成を検討する予定です。(3)東日本大震災に伴い研究開始時期、倫理委員会開催が延期されが、研究を行うための初動が遅れた。また、上述のことが影響して関連諸機関との研究依頼および研究最終年度である平成25年度の研究推進方策については、IOS法を用いて重症心身障害児(者)の呼吸抵抗測定検査を施行し呼吸周期依存性を評価する。課題である気管切開対象者の呼吸抵抗測定検査ができるよう、測定方法について昨年に引き続き検討を進めて行く予定である。また、BIMUTAS-VIdeoにて測定が不十分だった、重症心身障害児(者)の三次元での呼吸運動の解析について新たな解析ソウトにて評価可能か検討していく。更に、IOS法を用いた研究発表等がなされている学会には、積極的に参加し情報収集に努め最終年度の研究到達が成就できる様すすめていく。平成24年度の研究推進方策については、平成23年度同様に重症心身障害児(者)の呼吸機能障害の病態を把握する目的で、総合呼吸抵抗測定検査を施行し、呼吸インピーダンス(Zrs)及びその成分でもある呼吸抵抗(Rrs)、呼吸リアクタンス(Xrs)を測定し、呼吸周期依存性(呼気、吸気の抵抗変化)を評価します。
Sclerodermatous GVHDマウスにおける制御性B細胞の役割

CD19欠損B10.D2マウスの骨髄および脾臓を放射線照射されたBALB/Cマウスに移入(ドナーが制御性B細胞を欠損)した結果は、コントロール群に較べより軽症のSclerodermatous GVHDを発症した。一方、B10.D2マウスの骨髄および脾臓を放射線照射されたCD19欠損BALB/Cマウスに移入(レシピエントが制御性B細胞を欠損)した結果は、コントロール群に較べより重症のSclerodermatous GVHDを発症した。これは、Sclerodermatous GVHDの過程において制御性B細胞が重要な役割を有し、ドノーとレシピエントで働きが違うことが示唆される。特に、制御性B細胞はホストの抑制作用において重要な役割を有していることが示唆された。本研究では、Sclerodermatous GVHDマウス(全身性強皮症のモデルマウスでもある)における制御性B細胞の役割を解析した。近年、B細胞は"悪玉"B細胞(effector B細胞)と"善玉"B細胞(制御性B細胞)に大別されて考えられるようになってきた。さらに、IL-10産生制御性B細胞はCDld^<high>CD5^+の表現型を有しており、CD19欠損マウスでは、このサブセットが完全に欠損しておいることより、制御性B細胞欠損マウスである。Sclerodermatous GVHDマウスは、マイナー組織適合抗原が不一致であるB10.D2(H-2^d)マウスの骨髄と脾臓細胞を、放射線照射されたBALB/C(H-2^d)マウスに移植することによって誘導した。まず、CD19欠損B10.D2マウスおよびCD19欠損BALB/Cマウスを作成し、Sclerodermatous GVHDマウスにおけるドナーおよびレシピエントの制御性B細胞の役割を解析した。その結果、CD19欠損B10.D2マウスの骨髄および脾臓を放射線照射されたBALB/Cマウスに移入(ドナーが制御性B細胞を欠損)した結果は、コントロール群に較べより軽症のSclerodermatous GVHDを発症した。
ナイジェリア、ケニアの脳卒中低減を目指した医科－歯科国際連携網の構築

イバダン(ナイジェリア),ナイロビ(ケニア)における脳卒中診療の現状を把握するために,ナイロビ大学副学長・疾患病理学Ogeng'o教授を訪問し,脳卒中の病型別頻度,病院コホート(データベース)の確立,高血圧,HIV感染等リスク因子の解析,口腔内衛生状態の調査を開始した.その成果を国内誌に発表した(殿村修一ら.アフリカでの脳卒中低減を目指した医科ー歯科国際連携の試み.脳卒中2019).さらに,アフリカの脳卒中患者と健常者から採取した唾液を日本に送付するためのセットアップ(倫理委員会の承認作業やMTA締結など)を開始した.日本国内の脳卒中患者および健常者の口腔内マイクロバイオームとの異同を検討し,脳卒中患者の口腔内細菌叢の変化を国際比較するための準備が整った.予定していたナイロビ訪問を行い,ナイジェリアの医師もナイロビに招聘しミーティングを行った.ナイジェリア(イバダン大学)倫理委員会の承認は得られ,ナイロビ大学倫理員会にも提出済みであり,国際共同研究の準備が整いつつある.2019年度中にナイロビ,イバダンからの臨床検体の受け入れを行い,国際共同研究の成果が得られるよう国際連携を密にする.イバダン(ナイジェリア),ナイロビ(ケニア)における脳卒中診療の現状を把握するために,イバダン大学内科学Akinyemi医師,ナイロビ大学疾患病理学Ogeng'o教授を国立循環器病研究センターに招聘し,脳卒中の病型別頻度,病院コホート(データベース)の確立,高血圧,HIV感染等リスク因子の解析,口腔内衛生状態の調査のためのキックオフミーティングを開催した.さらに,アフリカの脳卒中患者と健常者から採取した唾液よりDNA抽出を行い,乾燥DNAを連結匿名化の上で日本国内に輸送後マイクロバイオーム検索に用いるためのセットアップを開始した.日本国内の脳卒中患者および健常者の口腔内マイクロバイオームとの異同を検討し,脳卒中患者の口腔内細菌叢の変化を国際比較するための準備を整えた.ケニア、ナイジェリアの医師を日本に招聘し、現地調査のための事前計画を練った。平成29年度に予定していたケニア訪問は大統領選挙の混乱による情勢不安により実現しなかったが、平成30年度にナイロビ訪問が決定しており、おおむね順調に推移している。イバダン(ナイジェリア),ナイロビ(ケニア)における脳卒中診療の現状を把握するために,ナイロビ大学副学長・疾患病理学Ogeng'o教授を訪問し,脳卒中の病型別頻度,病院コホート(データベース)の確立,高血圧,HIV感染等リスク因子の解析,口腔内衛生状態の調査を開始した.その成果を国内誌に発表した(殿村修一ら.アフリカでの脳卒中低減を目指した医科ー歯科国際連携の試み.脳卒中2019).さらに,アフリカの脳卒中患者と健常者から採取した唾液を日本に送付するためのセットアップ(倫理委員会の承認作業やMTA締結など)を開始した.日本国内の脳卒中患者および健常者の口腔内マイクロバイオームとの異同を検討し,脳卒中患者の口腔内細菌叢の変化を国際比較するための準備が整った.予定していたナイロビ訪問を行い,ナイジェリアの医師もナイロビに招聘しミーティングを行った.ナイジェリア(イバダン大学)倫理委員会の承認は得られ,ナイロビ大学倫理員会にも提出済みであり,国際共同研究の準備が整いつつある.平成30年度にナイロビを訪問し、現地でのデータベース構築を実現させる。またアフリカ人の口腔内細菌評価のための具体的方法について話し合いを進めている。2019年度中にナイロビ,イバダンからの臨床検体の受け入れを行い,国際共同研究の成果が得られるよう国際連携を密にする.
ジェラティネイス活性発現調節による炎症性皮膚疾患治療への基礎的研究

皮膚の炎症病態に関わるジェラティネイス活性を司るmatrix metalloproteinase(MMP)-2および9.tissue inhibitor of metalloproteinases(TIMP)-1および2の発現抑制について検討した。培養細胞へのMMP-2あるいはMMP-9のRNA interferenceを施行、炎症やアポトーシスに関わるcaspases活性の変化について検討した。結果、いずれも発現抑制でcaspase-3/7活性の低下を認めた。2.KRE-M9結合蛋白によるMMP-9発現制御についての検討3.核外蛋白輸送制御分子、leptomycin B (LMB)投与治療についての検討培養細胞へのLMB投与によりMMP-9転写活性が抑制されると共に、TIMP-2転写活性が増強することが判明した。またマウスの紫外線照射皮膚および皮膚潰瘍に対してLMBを局所投与することで各々、炎症の抑制および創傷治癒に効果を示した。ジェラティネイス活性が皮膚の炎症病態に関わることが知られてきており、本活性を司るmatrix metalloproteinase (MMP)-2および9、tissue inhibitor of metalloproteinases(TIMP)-1および2の発現制御に関して検討を行った。皮膚培養細胞へのLMBの添加で炎症惹起刺激時を含めMMP-2と比較してMMP-9発現を抑制、TIMP-1と比較してTIMP-2発現を誘導した。また紫外線照射マウス皮膚へのLMBの局所投与により、異常角化、浮腫、炎症性細胞浸潤の抑制を認め抗炎症効果を実証した。さらに本炎症惹起皮膚でのMMP-9発現亢進とLMBによる発現抑制を確認した。MMP-9遺伝子プロモーター中のKRE-M9領域についてのdecoy ONを培養細胞に遺伝子導入、KRE-M9の置換配列ON導入と比較してMMP-9発現の亢進を確認した。3.KRE-M9結合蛋白発現制御によるMMP-9発現制御についての検討ジェラティネイス活性が皮膚の炎症病態に関わることが示唆されており、本活性を司るmatrix metalloproteinase(MMP)-2および9、tissue inhibitor of metalloproteinases(TIMP)-1および2の発現制御について検討した。培養細胞へのMMP-2およびMMP-9各々についてRNA interferenceを施行、炎症やアポトーシスに関わるcaspase-3/7,8および9活性の変化について検討した。結果、MMP-2,9どちらの発現抑制によっても特にcaspase-3/7活性の低下を認めた。2.KRE-M9結合蛋白によるMMP-9発現制御についての検討3.核外蛋白輸送制御分子、leptomycinB(LMB)投与治療についての検討培養細胞へのLMB投与によりMMP-9転写活性が抑制されると共に、TIMP-2転写活性が増強することが判明した。またマウスの皮膚潰瘍に対してLMBを局所投与することで創傷治癒に効果を示した。
ヘッジホッグ経路を標的とした猫乳癌幹細胞標的治療薬の探索とその臨床応用

猫の乳癌は病態進行が早く、肺転移や再発するため予後が極めて悪い。また抗がん剤や放射線療法に抵抗性を示すため、未だ治療法が確立していない。癌幹細胞は自己複製能、分化能、免疫不全マウスにおける高い腫瘍形成能、薬剤抵抗を示す細胞集団であり、癌の発症だけでなく、癌の進展、再発、転移に重要な役割を果たしている。それゆえ、新規治療法として乳癌幹細胞を標的した治療法の開発が必要不可欠である。本研究では、幹細胞性維持に関与するヘッジホッグシグナルに着目し、培養細胞および乳癌移植モデルマウスにおける抗癌幹細胞効果を検討した結果、Smo阻害剤GDC0449が抗腫瘍抑制効果がみられ、候補治療薬として同定された。癌幹細胞は自己複製能、分化能、免疫不全マウスにおける高い腫瘍形成能を示す細胞集団であり、癌の発症だけでなく、癌の進展、再発、転移に重要な役割を果たしている。また、癌幹細胞は化学療法や放射線療法に抵抗性を示すため、癌幹細胞標的療法の開発が必要不可欠である。本研究は臨床挙動が悪く、効果的な治療法が確立していない猫乳癌を対象とし、癌の根源である乳癌幹細胞を標的とした新規治療法の開発を目的とする。癌幹細胞の自己複製能に関与するシグナルは数多く報告されており、本研究ではヘッジホッグ(Hh)シグナルを標的とし、in vitroにおける癌幹細胞増殖に及ぼすHh阻害剤の抗腫瘍効果、in vivoにおける猫乳癌モデルマウスに対する抗腫瘍効果などを検討した。平成24年度は、癌幹細胞の濃縮し、さらに自己複製能を評価できるsphere assayを用いて猫乳癌細胞株に含有する乳癌幹細胞の自己複製能を阻害するHh阻害剤を抽出した。平成25年度は、平成24年度のin vitroスクリーニングで良好な成績が得られたGDC0449に着目し、猫乳癌モデルマウスにおける抗腫瘍効果を検討した。2つの猫乳癌細胞株を超免疫不全マウスの皮下に移植し作製されたモデルマウスを使用した。両株ともにGDC0449単独投与群は無処置群に比べて腫瘍容積が減少し、抗腫瘍効果が認められた。これらの結果から、GDC0449は獣医医療への有用性が期待できる。本研究は、極めて病態進行が速く、効果的な治療法がない猫乳癌を対象とし、癌の根源である乳癌幹細胞を標的としたヘッジホッグ(Hh)阻害剤の抗癌幹細胞効果を明らかにし、獣医医療へと展開することを目的とする。計画している研究項目は、1Hh阻害剤が癌幹細胞増殖に及ぼす効果、2乳癌幹細胞移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果、3Hh阻害剤耐性に関わるHhシグナル関連遺伝子変異の同定および検査システムの構築および4遺伝子変異の保有率および腫瘍病態機構の解明の4つである。本研究の標的細胞である癌幹細胞はsphere(浮遊細胞塊)assay、aldefluor assayなどで濃縮することが可能である。平成24年度は、癌幹細胞の濃縮、自己複製能の評価に有効なsphere assayを用いて猫乳癌細胞株に含まれる癌幹細胞の自己複製能を阻害する低分子化合物を探索した。使用した4細胞株は、Hh阻害剤GDC0449は濃度依存性にsphereの数の減少、大きさおよび形状の変化がみられ、aldefluor assayでは癌幹細胞の割合が減少していた。また他のHh阻害剤(シクロパミン、GANT61)も同様に、いずれも濃度依存性にsphere数の減少、大きさおよび形状の変化が観察された。また、それらの通常の接着性培養における増殖能も濃度依存性に細胞増殖能の低下が観察された。ヒト固形癌ではHh阻害剤GDC0449抵抗性に必要なsmo遺伝子変異の存在が報告されているため、同領域の猫smo遺伝子の塩基配列の決定を行った。健常猫におけるsmo遺伝子配列はGDC0449抵抗性に関連するヒト遺伝子変異は確認されなかった。以上の成果より、猫乳癌細胞株におけるHh阻害剤のin vitro抗腫瘍効果が明らかとなり、猫乳癌モデルマウスにおける抗腫瘍効果の検討を行う。平成24年度の研究は、計画調書通り遂行することができた。また、平成25年度に実施予定していた遺伝子解析を行うことができ、in vitro解析に用いた細胞株のモデルマウスの作出にも成功した。平成25年度は、平成24年度の研究成果を踏まえて、さらに発展させる。癌幹細胞の自己複製能を阻害剤GDC0449を用いて猫乳癌モデルマウスにおける抗腫瘍効果を検討する。猫乳癌モデルマウスに阻害剤を投与し、形成される腫瘍の容積、個体を経過観察し、エンドポイントで安楽殺後、それらの腫瘍について病理組織学的検索を行い、抗腫瘍効果を解析する。

また、ヒト固形癌ではGDC0449に抵抗性に必要なsmo遺伝子変異の獲得が知られており、猫乳癌組織におけるsmo遺伝子変異の有無を確認するとともに、GDC0449耐性猫乳癌株を作製し、遺伝子変異の同定および耐性機構の解明を行う予定である。得られる成果をを基に、獣医医療へ臨床応用できるに否かを総合的に評価する。当初の計画通り行う。
水疱症をモデルとした細胞骨格・細胞接着制御におけるプロテインキナーゼCの役割

細胞骨格・細胞接着系の構造分子は細胞外シグナルに対応し、細胞の分化増殖に深く関わっている。自己免疫性水疱症の1つである天疱瘡の水疱形成メカニズムにおいて、カルシウム依存性シグナル伝達とホスホリパーゼCの関与、プロテインキナーゼC(PKC)各アイソザイム間の発現および活性動態の差が示されてきた。本研究は、表皮細胞の細胞骨格・接着の動体構造に関してその障害である水疱症をモデルとし、天疱瘡抗体によって惹起される細胞骨格・細胞接着系の構造分子、特にケラチンおよびデスモソーム構造分子のPKCによるリン酸化を検討し、PKCによる機能的制御機構を、基礎的細胞生物学的に解明しようとするものである。本年度は、PKCの活性化を誘導すると考えられているホルボールエステルの1つである12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA)を刺激として、ヒト有棘細胞癌由来培養DJM-1細胞におけるPKCおよびPKM(PKCの調節部分を欠いた活性部分Mキナーゼ)の局在を、PKCアイソザイム抗体を用いたウェスタンブロッティング法によって検討した。その結果、PKCαおよびηに対する抗体でPKMは検出されたが、PKCδおよびεには検出されなかった。PKMαは、細胞質、細胞膜、細胞骨格画分すべてに存在したが、PKMηは細胞質画分のみで観察された。さらにDEAE-Sephacel columnによってPKCとPKMを分離し各々の活性を測定したところ、細胞質画分において二峰性の活性がみられ、モノクローナル抗PKCa抗体を添加することにより活性の抑制がみられた。次いで、高濃度KCl不溶性画分(ケラチン画分)におけるPKCの発現とPKC活性の検討を行い、ケラチン画分でのPKCaおよびPKMa、PKCeの存在を観察した。以上より、ヒト表皮細胞において、PKMαおよびηが存在し、それらはリン酸化能を保持し、PKCおよびPKMがケラチン蛋白リン酸化制御に関与する可能性が示唆された。
銀河形態の多様性の起源の研究

ズームインの手法を用いて潮汐場を考慮しつつ銀河形成領域を高分解能化した銀河形成シミュレーションをおこなった。銀河形成では超新星爆発などからのエネルギーフィードバックが重要である。昨年度までの取り組みで、申請時に検討していた確率的に熱エネルギーを入れて放射冷却時間が十分長い高温領域を作るモデルでは観測に合うような銀河を作ることが困難であったことから他のモデルを模索してきた。今年度最終的にP.Hopkinsらが提案したFIREモデルを採用し、観測される星形成効率に近い銀河のシミュレーションができる様になった。このモデルを元に、流体スキームの違い、CELibを用いて化学進化モデルの違いを評価した。流体スキームの違いは大きく、最終的に形成される銀河の構造に大きなインパクトを与える。接触不連続面の扱いを改善したDISPHを用いると非物理的な表面張力によって作られるクランプがなくなる。その結果として角運動量輸送が押さえられより大きな銀河円盤が形成される。化学進化モデルの影響の一例としてはCELibに導入されているPopIIIモードを用いて初代星の効果を取り込むと、特に銀河形成初期の星形成が抑制され、最終的な銀河中心の星密度を下げる効果があることなどがわかった。この映像では、宇宙初期に埋め込まれていた密度ゆらぎを種に原始銀河が形成され、初期に激しい合体を経て成長し、その後角運動量の大きなガスが降着してくることで円盤を形成するという現在の銀河形成理論が手に取る様に分かる様になっている。最新のシミュレーションに基づく本映像は研究のみならず、研究成果の社会還元という意味で十分な意義を持つ。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題では、私が開発した流体不安定性を扱うことのできる新しいSPH法と、従来の標準的なフィードバックモデルでは扱えない高温ガスを生み出せるモデルを組み合わせ、銀河形成過程の明らかにすることを目的としている。本年度は主としてフィードバックモデルの実装をおこなった。通常の銀河形成シミュレーションでは、実際の恒星より大きな恒星集団を表す星粒子の進化を解く。そのとき、星粒子は同じ時間に生まれた同じ金属量を持つある質量関数に従う恒星集団とする。この仮定の元で、10太陽質量より重い恒星が爆発したとすると、星形成領域のガス温度は百万ケルビン程度になる。この温度は熱的不安定な領域にあり、星形成領域の力学的時間より早く冷却される。したがって超新星爆発は進化に寄与しない。これはモデル化からくる制限であり、現実の宇宙で起きていることを正しく反映できていない。そこで、フィードバックにより解放されるエネルギーの保存を条件として課しつつ一部のガスだけを熱的不安定領域を超える温度まで加熱する確率的フィードバックモデルを構築・実装した。これにより、従来のモデルよりも高温のガスを生成し銀河形成進化にインパクトを与えることができるようになる。さらに、従来のII型超新星爆発のモデルに加えて、HII領域のモデル、Ia型超新星爆発、AGBによる質量放出のモデル化と実装をおこなった。現在はパラメータを変えながらモデル銀河の中で影響を調べている段階である。本年度は化学進化を扱うための拡張を行った。化学進化は銀河進化の重要な指標である。シミュレーション結果を観測データと比較する上で、化学進化の情報は欠かすことが出来ない。また、放射冷却の効率を通じて銀河の進化に重大な影響を与える。文献からII/Ia型超新星爆発、AGBからの質量放出、中性子星合体から放出される元素のデータを収集して、銀河形成シミュレーションで使える形にしたソフトウエアライブラリCELibを構築した。ソフトウェアライブラリとして実装したことで、シミュレーションコードとは独立に最新のデータを常に導入することが出来るようになっている。これを用いて、one-zoneと非宇宙論的な孤立した銀河のシミュレーションを行い、採用するイールド表の違いによる金属量分布や銀河進化へのインパクトを調べた。最新のイールド表を組み合わせたものでは、天の川銀河の観測されている金属量分布を良く表すことが出来ることを確認した。イールド表によって星間空間に解放されるエネルギーが異なるため銀河の構造に与える影響も異なる。現在、本ソフトウエアについての論文とオープンソース版のコードを準備している。また、本ライブラリを結合したN体/SPHシミュレーションコードASURAを用いて宇宙論的初期条件からの銀河形成シミュレーションを実行している。これまでのところ同じ初期条件から出発しても、従来のSPH法とDISPH法を用いた場合では、形成される銀河の構造に大きな違いが見られている。本格的な結果の解析は次年度に行う。予定していた宇宙論的銀河形成シミュレーションを開始するところまで進んだ。本年度、SPH法とDISPH法を、重力流体力学だけを考慮しておこなう銀河団形成シミュレーション、サンタバーバラクラスタテスト、に適用し、SPHスキームの違いが銀河団形成に与える寄与を調べた研究が出版された。従来、このテストでは使うスキームの違い(粒子法かメッシュ法)で、エントロピープロファイルに系統的な違いが出ることが知られていた。DISPH法を用いたシミュレーションでは、従来のメッシュ法のようにエントロピーコアが形成される。しかし、そのサイズはより小さく、近年開発された新しいスキーム(Moving meshやmesh free法)による結果と良く一致する。また、SPH法への修正としてよく使われる人工熱伝導項はパラメータ依存性が大きく、どの値を採用するのが良いかの判断が難しいという指摘もした。DISPH法はこれからの銀河形成シミュレーションにおいて有力なスキームだと期待できる。また、銀河の化学進化シミュレーション研究を支援する、化学進化シミュレーション用ソフトウェアライブラリCELibを開発し、その内容を論文として出版し、さらにライブラリをオープンソースとしてコミュニティーに公開した。

このライブラリを用いることで、様々な初期質量関数、イールド表を自在に組み合わせてその影響を測ることが簡単にできるようになった。現在、ASURAにCELibを導入して宇宙論的銀河形成シミュレーションをおこなっている。現在宇宙論的銀河形成シミュレーションの中で、SPHスキームの違い、採用する化学進化モデルの違いによる進化への寄与を評価している。また、従来銀河形成シミュレーションの中で十分に考慮されていなかった遠紫外線によるフィードバックを実装した。これまで銀河形成で用いられてきたフィードバックにくらべて、とくに低質量天体内で星形成を効果手に押さえることができるため、銀河進化への寄与が大きいと考えられる。遠紫外線の効果の評価も行っている最中である。星間ガスの熱的構造の研究では、Far UV(以下FUV)が熱源として重要な役割を果たすことが知られている。一方、銀河形成シミュレーションではこれまでFUVについてはほぼ取り入れられてこなかった。本年度、FUVをモデル化し、回転速度40-230 km/sの孤立銀河に適用し、FUVの効果について評価し、孤立銀河の進化においてFUVが極めて大きなインパクトを持つこと天文学会で報告した。しかしながら、このモデルを通常の分解能の銀河形成シミュレーションに適用するとそのインパクトは弱い。これはFUVは柱密度に敏感で、かつ、柱密度推定近似式が質量分解能によってしまうからである。星形成領域の質量分解能を一定に保つ方策を模索し、粒子分割法の実装をおこなった。これにより近傍で較正した強度のFUVフィードバックを用いることができ、星間ガスの現実的構造を評価できるようになると期待される。また、私が当初採用していた超新星爆発によるフィードバックのモデルにはまだ改良の余地がある。このモデルでは、超新星爆発によって注入されるエネルギーが放射冷却に打ち勝てるだけ高い温度になるようにイベント数を調整するが、この条件だとイベント数が下がり、結局フィードバックが有効にならない。設定温度の調整では対応不可能であった。そこで現在は北海道大学岡本崇講師が先頃構築したマルチフェーズガスモデルを組み込んで評価している。以上に加え、主に東京大学平居悠博士課程院生(現在理研特別研究員)と、前年度開発した化学進化シミュレーション用ライブラリCELib (やその拡張版)を矮小銀河の化学進化シミュレーションに用い、rプロセス元素の分布から金属量混合係数に制限を付ける研究や、電子捕獲型超新星爆発による亜鉛分布についての研究をおこなった。これらはCELibの有用性を強く示したと考えられる。
末梢血FACS解析とヒト化マウスによる特発性ネフローゼ症候群液性因子の解明

東京医科歯科大学では特発性ネフローゼ症候群を引き起こす液性因子を解明する目的で、2名特発性頻回再発型ネフローゼ症候群患者において、再発中の血球表面抗原分析を行った。疾患特異的表面抗原パターンの同定には解析数の蓄積が必要である。いずれの症例も免疫抑制剤の内服下であり、治療前の患者血球を含め、症例を増やして解析する必要があり、今後も研究を継続していく。他方、東海大学では前年に行ったマウス培養ポドサイトの研究に加え、胎児マウスの前腎由来の腎臓オルガノイド作成を進めた。In vivoの腎臓糸球体において、ポドサイト特異的に発現しているNephrinやSynaptopodinは、培養ポドサイトでは発現が弱く、培養上清に患者血球を加えた際の発現変化の検討には向いていないことが明らかとなった。これに代わる検討材料として有効と考えられたものは、マウス腎臓オルガノイドである。オルガノイドは未分化な状況から増殖因子を加えて腎臓を促した細胞塊である。この腎オルガノイドでは糸球体状構造や蛍光抗体染色によるSynaptopodinやNephrin、WT1等の発現を確認することができた。またLTLを発現する尿細管構造を確認した。今後のポドサイト障害の検討に有用であることが示された。今後、さらにヒト検体数を増やし、ポドサイト障害を引き起こすネフローゼ症候群の発症因子の解明に向けた検討に有効である可能性が明らかになった。ヒト化マウスに対するヒト血液検体を投与する実験については、投与前に検体を無菌状態にする方法が障壁となり、計画の見直しを迫られた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。小児特発性ネフローゼ症候群の発症機序には、腎糸球体上皮細胞へ作用する血漿中に存在する単一あるいは複数の循環液性因子が関与することが想定されている。一方で、TまたはBリンパ球、あるいはその両者が疾患の発症に関与することを示唆する報告がなされているが、特発性ネフローゼ症候群の発症機序の詳細は明らかになっていない。本研究は、リンパ球を含む患者末梢血球のいずれかより循環液性因子が産生され腎糸球体上皮細胞に作用することが本疾患の発症要因になるとの仮説をたて、特発性ネフローゼ症候群患者末梢血の表面抗原を用いた血球分画をフローサイトメトリーを用いて解析することで、発症機序と循環液性因子の同定を目的としている。H29年度は、患者検体の提供に関する同意書の準備とコントロールサンプルを用いたFACS表面抗原分析を実施した。またマウス培養糸球体上皮細胞(培養ポドサイト)を入手し、細胞特異的なタンパク質の発現がみられていることを確認した。実際の患者検体の入手に向けた準備段階で、当該施設における対象となりえる症例の数が極端に少ないことを初めとする複数要因の障壁があり、計画通りに患者検体を解析するに至っていない。現在、遅れを取り戻すべく多施設での臨床研究に向けた計画を立て、実施していくところである。1)特発性ネフローゼ症候群の患者血球の表面抗原分析に使用予定のFACS機器を用いて、コントロールサンプルの解析を実施していますが、研究対象と想定している患者数が想定より少なく検体を得ることが困難となっています。2)入手した培養マウスポドサイトはポドサイト特異的なNphs2やZO-1蛋白の発現が確認しました。これらを用いた解析の準備をすすめているが、対象とする症例範囲や施設を増やす必要があると考えています。また当初予定していなかった申請者の所属機関の移動に伴い環境再整備が必要になった点も研究遂行遅延の理由の一つであります。

初発の小児特発性ネフローゼ症候群を本研究の解析対象と想定していましたが、検体収集に難渋していることから、同疾患でも様々な状況の患者を対象範囲に広げてこの解析を進めるよう計画を修正していく方針です。またそのためには、短施設から多施設での研究協力を募り、検体収集の効率が上げより意義のある解析を進めたいと考えその準備を進めています。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子導入を用いた生体内副次肝臓の構築

わが国では肝臓移植はほとんど実現が不可能な臓器移植であり、肝機能を代用する医療技術の発達が急務となっている。現在、体外型の人工肝臓はこれまでのところ長期の肝機能を代用することは成功していない。そこで我々はこれまでの人工肝臓の概念とは異なり、肝臓に特殊な機能を付加した、体内埋め込み型人工肝臓の構築を試みることにした。近年になり、血管新生は腫瘍をはじめとした臓器、器官形成に必須であるという事実が明らかになってきた。肝臓も又、その特徴として高度に発達した血管系を持つことが知られており、肝細胞の増殖、肝器官形成に重要であると考えられている。そこで、これまで遺伝し導入が困難であると言われてきた初代肝細胞に高率に遺伝子を導入する方法を開発し、単離した初代肝細胞に血管形成因子であるVEGF遺伝子を導入し、この肝細胞をコラーゲンビーズとともにマウス腹腔内に移植した。2週間後にマウス腹腔より、生着した組織塊を取り出し解析したところ、VEGF遺伝子の導入により、生着する組織片のコロニー数の増加、組織重量の増加が認められ、さらに、切片を観察したところ、顕著な血管系の発達が認められた。この血管系の発達は対照の2-3倍に達した。さらに興味深いことに、VEGF遺伝子を導入した組織塊を形成する肝細胞は、BrdUを取り込むことから、DNA合成を行い、増殖していることが判明した。これらの肝細胞は、ほぼ100%がアルブミン陽性であり、分化機能を保持していると考えられた。このように、移植肝細胞における血管形成因子の発現は、その生着、増殖、さらには器官構造の構築を促進させることが判明した。以上のことから、生体内における肝器官形成に血管系の構築が重要な役割を果たしていると考えられる。我々はこれまでの体外型の人工肝臓の概念とは異なり、肝臓に特殊な機能を付加した、体内埋め込み型人工肝臓の構築を試みることにした。肝臓は、その特徴として高度に発達した血管系を持つことが知られている。我々はこの特異な肝臓構造が、肝細胞の増殖、肝器官形成に重要であると考えている。そこで、血管系の肝臓形成における役割を、生体内人工肝臓の構築を指標として検討した。「方法」単離した初代肝細胞に単離した初代肝細胞に血管形成因子であるVEGF(vascular endothelial growth factor)遺伝子をカチオンリポソームを用いて導入した。この際遺伝子導入した肝細胞を効率的に回収するために遺伝子導入の際にスフェロイドを形成させた。この肝細胞をコラーゲンビーズとともにマウス腹腔内に移植した。2週間後にマウス腹腔より、生着した組織塊を取り出し解析した。「結果」スフェロイド型肝細胞は、コラーグンにおける培養と異なり、遺伝子導入後にも高い生存率をもって肝細胞を回収できた。また、VEGF遺伝子の導入により、生着する組織片のコロニー数の増加、組織重量の増加が認められ、さらに、切片を観察したところ、顕著な血管系の発達が認められた。「考察」近年になり、血管新生は腫瘍をはじめとした臓器、器官形成に必須であるという事実が明らかになってきたが、我々は移植肝細胞においても血管形成因子の発現が、正常細胞である移植組織の生着、増殖、さらには器官構造の構築を促進させることを示した。
ヒト胎児肝における薬物代謝酵素の糖質コルチコイド応答性の差異に関わる機序の解明

本研究はヒト胎児肝(HFL)細胞におけるSULT1E1およびCYP3A7の糖質コルチコイドに対する応答性の差異に関わる機構を明らかにすることを目的とし、以下の解析を行った。デキサメタゾン(DEX)はSULT1E1とCYP3A7の発現をグルココルチコイド受容体(GR)を介して誘導することが示されたが、各種GRの発現パターンでは両遺伝子の応答性の差異を説明できなかった。そこで、エピジェネティックな機構によって制御されているか否かを検討した結果、両遺伝子ともDNAのメチル化およびクロマチンの構造変化では糖質コルチコイド応答性の差異を説明できなかった。今後、SULT1E1の糖質コルチコイド応答性におけるSAA1の役割と、CYP3A7の糖質コルチコイド応答性におけるFOXO1、ASF1B、E2F1の役割について解析していく必要がある。胎齢18.3週のヒト胎児肝(HFL)細胞18.3wを用いて、各種糖質コルチコイド(100 nM)の発現誘導能をリアルタイムPCR法により解析した結果、SULT1E1およびCYP3A7の発現上昇はそれぞれデキサメタゾン(DEX)で15.3、4.44倍、メチルプレドニゾロンで13.4、4.94倍、プレドニゾロンで10.6、3.22倍、ベタメタゾンで10.2、4.25倍、コルチゾールで7.48、2.89倍、コルチコステロンで4.27、2.89倍、コルチゾンで1.32、2.34倍であった。また、他の異なる胎齢のHFL細胞(13週、14.4週、16週)についても同様に解析したところ、SULT1E1では胎齢の進行とともに発現誘導レベルが上昇したが、CYP3A7については胎齢との関連性は認められなかった。HFL細胞18.3wを用いて、DEXによるSULT1E1およびCYP3A7の発現誘導におけるグルココルチコイド受容体(GR)の関与を検討したところ、両遺伝子の発現誘導はGRアンタゴニストであるRU-486によって有意に抑制された。このことから、DEXを含む糖質コルチコイドはHFL細胞のSULT1E1およびCYP3A7の発現をGRを介して誘導することが示唆された。GRにはGRαとそのスプライスバリアントであるGRβおよびGRPが存在するが、HFL細胞には主にGRαおよびGRPが発現しており、これらのGRはDEXによる発現制御を受けていないことが確認された。しかし、各種GRの発現パターンでは、DEXによるSULT1E1の発現誘導レベルが胎齢の進行とともに上昇することを説明できない。これらのことから、SULT1E1のDEXに対する応答性の差異は、SULT1E1遺伝子のエピジェネティックな機構によって制御されている可能性が考えられた。本研究では、HFL細胞における各種糖質コルチコイドのSULT1E1およびCYP3A7発現誘導能を評価し、SULT1E1とCYP3A7の間で糖質コルチコイドに対する応答性が異なることを明らかにすることができた。その差異を明らかにするために、GRの発現解析を行ったが、GRの発現パターンでは説明できないことを確認することができ、次年度のSULT1E1およびCYP3A7遺伝子のエピジェネティックな制御機構の解析へと繋げることができた。前年度の解析において、SULT1E1およびCYP3A7のデキサメタゾン(DEX)に対する応答性の差異は、SULT1E1およびCYP3A7遺伝子のエピジェネティックな機構によって制御されている可能性が示唆された。そこで、DNAメチル化の解除がSULT1E1およびCYP3A7遺伝子のDEX応答性に及ぼす影響について検討した。胎齢13週、14.4週、16週、18.3週のヒト胎児肝(HFL)細胞にDNA脱メチル化剤5-アザ-2′-デオキシシチジン(AdC)を96時間前処理した後、DEXを24時間処理した結果、SULT1E1遺伝子のDEX応答性はAdCにより消失した。一方、CYP3A7遺伝子のDEX応答性は胎齢13週のHFL細胞においてのみAdCによって増強された。このように、SULT1E1遺伝子もCYP3A7遺伝子も、DNAのメチル化では胎齢によるDEX応答性の差異を説明できなかった。次に、クロマチンの構造変化がSULT1E1およびCYP3A7遺伝子のDEX応答性に及ぼす影響について検討した。各HFL細胞にヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるバルプロ酸またはトリコスタチンAの存在下でDEXを24時間処理した結果、SULT1E1遺伝子のDEX応答性はクロマチン凝縮により制御を受けている可能性が示唆された。一方、CYP3A7遺伝子のDEX応答性はクロマチン凝縮以外の機序により制御を受けている可能性が考えられた。しかし、SULT1E1遺伝子もCYP3A7遺伝子も、クロマチンの構造変化では胎齢によるDEX応答性の差異を説明できなかった。以上のことから、SULT1E1およびCYP3A7のDEX応答性の差異はエピジェネティクス以外の機序によって制御されている可能性が考えられた。本研究では、HFL細胞におけるSULT1E1およびCYP3A7のDEX応答性に対するDNAメチル化およびクロマチン構造変化の影響を解析し、両遺伝子が異なる機構によってエピジェネティックな制御を受けていることを明らかにした。