hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アキラル化合物の結晶および表面キラリティーにより不斉誘導される不斉自己触媒反応

本研究はこれまでキラルな分子を触媒として用いるなど,分子キラリティーを用いて反応の選択性を制御する物が中心であった不斉反応に対し,結晶構造のキラリティーや表面構造のキラリティーといった分子配列が作り出すキラリティーを利用することで,分子不斉のない環境から不斉合成を達成することを目的としている。不斉自己触反応の高い不斉増幅力を利用することで,エチレンジアミン硫酸塩やフェノール誘導体,レトゲル石といったアキラルな化合物が形成するキラル結晶を用いた不斉誘導に成功している。また結晶構造はアキラルであるが表面キラリティーをもった石膏を用いて2次元キラリティーを用いた分子の不斉誘導に初めて成功した。本研究は,これまでキラルな分子を触媒として用いるなど,分子のキラリティーを用いて反応の選択性を制御する物が中心であった不斉反応に対し,結晶構造のキラリティーや表面構造のキラリティーといった分子配列が作り出すキラリティーを利用することで,分子不斉のない環境から不斉合成を達成することを目的としている。分子不斉のない環境から不斉合成を達成することは,有機合成上,非常に魅力的で革新的な合成手法となることに加えて,科学の未解決の課題である生命のホモキラリティーの起源を探る上でも重要な意味をもつ研究テーマである。本研究では,アキラルな化合物であっても結晶中またはその表面などといった,規則的な配列構造の中にはキラリティーを持ったパターン(キラル結晶,エナンチオトピック面)が存在することに着目し,生成物自身が不斉触媒となり,鏡像体過剰率の増幅を伴って自己の複製を行う不斉自己触媒反応の高い不斉認識力,増幅力を利用することで,その配列のキラリティーを分子キラリティーへと変換することに成功した。具体的には,キラル結晶を用いた不斉合成として,これまでアキラルな有機化合物であるエチレンジアミンの硫酸塩が形成するキラル結晶の存在下で不斉自己触媒反応であるピリミジンカルバルデヒドへのジイソプロピル亜鉛の付加反応を行うことで結晶のキラリティーに相関した絶対配置のアルカノールを得ることに成功している,またその他いくつかのアキラル化合物のキラル結晶の作成に成功している。さらにエナンチオトピック面を用いた反応として,新たに三種類のピリミジンカルバルデヒド類の単結晶の特定の面にジイソプロピル亜鉛を作用させることで,用いた面に相関した絶対配置のピリミジルアルカノール類を得ることに成功した。本研究は,これまでキラルな分子を触媒として用いるなど,分子キラリティーを用いて反応の選択性を制御する物が中心であった不斉反応に対し,結晶構造のキラリティーや表面構造のキラリティーといった分子配列が作り出すキラリティーを利用することで,分子不斉のない環境から不斉合成を達成することを目的としている。分子不斉のない環境から不斉合成を達成することは,有機合成上,非常に魅力的で革新的な合成手法となることに加えて,科学の未解決の課題である生命のホモキラリティーの起源を探る上でも重要な意味を持つ研究テーマである。これまで本研究では,不斉自己触反応の高い不斉増幅力を利用することで,アキラルな化合物が形成するキラル結晶やアキラル結晶のエナンチオトピック表面と言ったアキラルな分子が作るキラルな構造から分子の不斉を発生させることに成功している。具体的には,アキラルな有機化合物が形成するキラル結晶としてエチレンジアミン硫酸塩やベンゾフェノン誘導体類のキラル結晶化および不斉自己触媒反応における不斉誘導に成功している。また無機化合物としてはレトゲル石(硫酸ニッケル6水和物)のキラル結晶による不斉誘導に成功している。さらに本研究を通して,結晶の相転移によるアキラル結晶からのキラリティーの発現や,アキラルなベンゾフェノンのキラル結晶構造と分光学的なキラル物性の相関を明らかにするなど結晶構造のキラリティーに関する新たな知見を得ることにも成功している。以上本研究は結晶および表面のキラリティーの新現象を見出すことに成功している。これらの成果は学術論文に加えて国際学会での招待講演でも発表しており国際的にも高い評価を受けている。本研究の目的はキラル結晶といった結晶構造のキラリティーやエナンチオトピック面といった表面配列のキラリティーを用いて分子不斉のない場から分子不斉のキラリティーの発現を目指す物である。アキラルな化合物が形成するキラル結晶を用いた分子不斉の発現として,レトゲル石として知られる硫酸ニッケル六水和物のキラルな結晶が不斉自己触媒反応の不斉開始剤として働くことを見出している。またアキラルな有機化合物であるエチレンジアミンの硫酸塩が形成するキラル結晶による分子不斉誘起に成功したほか,種々のアキラルな有機化合物および無機化合物のキラル結晶を得ることに成功している。またアキラルな有機化合物であるベンゾフェノンはキラル結晶を形成するが,その結晶構造とキラル物性との相関はこれまではっきりと決定されていなかった。ベンゾフェノンのキラル結晶の絶対構造を単結晶X線回折の異常分散を利用して決定し,その結晶の円二色性スペクトルを測定することで,構造とキラル物性の関係を明らかにしている。さらにアキラルな化合物が形成するキラル結晶の研究の中で,結晶の相転移に伴ってアキラルな結晶構造からキラルな結晶構造へと転移を引き起こす物があることを見出している。これはこれまで殆ど例が知られていない現象で有り,キラリティーの観点からも有機結晶学の観点からも非常に興味深い現象である。

結晶のエナンチオトピック面を用いた不斉反応については現在までに数種類のアルデヒドのアキラル結晶がエナンチオトピック面を持つことを発見しており,そのエナンチオトピック面への亜鉛試薬の付加反応において,結晶の特定の面から試薬を作用させることで,得られる生成物の絶対配置の制御に成功している。以上,本研究は今年度期待以上の進展を遂げており,引き続き研究を進めることで結晶や表面のキラリティーの知見およびその活用法を広める物となることが期待できる本研究は,これまでキラルな分子を触媒として用いるなど,分子キラリティーを用いて反応の選択性を制御する物が中心であった不斉反応に対し,結晶構造のキラリティーや表面構造のキラリティーといった分子配列が作り出すキラリティーを利用することで,分子不斉のない環境から不斉合成を達成することを目的としている。分子不斉のない環境から不斉合成を達成することは,有機合成上,非常に魅力的で革新的な合成手法となることに加えて,科学の未解決の課題である生命のホモキラリティーの起源を探る上でも重要な意味を持つ研究テーマである。前年度までの研究により,不斉自己触反応の高い不斉増幅力を利用することで,アキラルな有機化合物が形成するキラル結晶であるエチレンジアミン硫酸塩やベンゾフェノン誘導体類のキラル結晶を用いた不斉自己触媒反応における不斉誘導に成功している。また無機化合物の結晶として,レトゲル石(硫酸ニッケル6水和物)のキラル結晶による不斉誘導に成功し,さらに本研究を通して,結晶の相転移によるアキラル結晶からのキラリティーの発現や,アキラルなベンゾフェノンが形成するキラル結晶構造と分光学的なキラル物性の相関を明らかにするなど結晶構造のキラリティーに関する新たな知見を得ることにも成功している。本年度ではさらに発展的な課題として表面のキラリティーを用いた不斉誘導に取り組んだ。アキラルな結晶である石膏は特定の表面に着目すれば二次元のキラリティーを持ち,表面に吸着させた反応基質を用いて不斉自己触媒を行う事で結晶表面のキラリティーによる不斉誘導に成功した。本成果はアキラルな無機結晶の表面を用いて反応の不斉誘導を行った初めての例であり,国際会議での発表を行った事に加え,インパクトの高い学術誌であるAngew. Chem.誌に掲載されるなど高い評価を受けている。本研究はこれまでキラルな分子を触媒として用いるなど,分子キラリティーを用いて反応の選択性を制御する物が中心であった不斉反応に対し,結晶構造のキラリティーや表面構造のキラリティーといった分子配列が作り出すキラリティーを利用することで,分子不斉のない環境から不斉合成を達成することを目的としている。不斉自己触反応の高い不斉増幅力を利用することで,エチレンジアミン硫酸塩やフェノール誘導体,レトゲル石といったアキラルな化合物が形成するキラル結晶を用いた不斉誘導に成功している。また結晶構造はアキラルであるが表面キラリティーをもった石膏を用いて2次元キラリティーを用いた分子の不斉誘導に初めて成功した。本研究の目的はキラル結晶といった結晶構造のキラリティーやエナンチオトピック面といった表面配列のキラリティーを用いて分子不斉のない場から分子不斉のキラリティーの発現を目指す物である。
能動輸送機能を有する支持液膜の高機能化と実用化

省エネルギー的で高濃縮性を有する機能性分離膜として注目されている能動輸送液膜をさらに高機能化し、液膜の問題点を克服して実用化へと進展させることを目的として一連の研究を行った。まず、安定で膜比表面積が大きい新しい液膜形態として、原液相が流れる中空糸群と逆抽出液が流れる中空糸群が互いに相隣り合うように直交させて配置し、中空糸外部に有機液膜相が流れる方式の直交流中空糸流動液膜モジュールを試作した。有機リン酸糸抽出試薬を担体とするZnの能動輸送実験を行い、本モジュールは約1ヶ月にわたって安定で、効率よくZnが汲み上げられることを確認した。現在イオン交換樹脂吸着法で行われている亜鉛抽出残渣浸出液中のGa、Inの回収・濃縮を含浸液膜法で置きかえる可能性を検討するため、2-ブロモデカン酸を担体とする含浸液膜によるGa、In、Zn、Alの同時透過実験および分配平衡実験を行った。膜透過速度は各種拡散過程、抽出平衡を考慮した膜透過モデルによりほぼ説明できた。また、回分膜透過実験における金属イオンの透過率と連続式含浸液膜モジュールでの金属イオンの透過率との対応関係に基づいて、回分実験結果からモジュールの所要膜面積を決定する簡便法を提出した。本方法により、本プロセスに含浸液膜法を適用した場合の膜所要面積は240m^2と概算され、モジュールコストは非常に安価であることが判明した。含浸液膜による希土類の分類に対して高選択性を賦与する手法について検討した。すなわちYとErとを有機リン酸系抽出試薬を担体とする含浸液膜により分離する場合の分離係数(Er/Y)は1.4であるが、原液相に水溶性錯化剤ジエチレントリアミン五酢酸を添加することにより、(Y/Er)分離係数を約5まで向上させることができた。透過選択性に対する操作条件の影響は反応を伴う拡散モデルにより説明された。
メタボローム解析による抗菌薬の殺菌メカニズムとしての酸化ストレスの解明

バイオフィルム感染症等の慢性感染症の原因として抗菌薬抵抗性が注目されている。抗菌薬抵抗性とは,抗菌薬存在下で細菌は増殖しないものの,死滅しない現象であり,遺伝子の変異は伴わず,一時的な遺伝子発現の変化によるものと考えられているが,その詳細なメカニズムは明らかにされていない。我々は,緑膿菌psl遺伝子が抗菌薬抵抗性に重要な役割を果たしていることを見出した。また,抗菌薬の新たな作用機序として,酸化ストレスが注目されている。そこで,酸化ストレスと抗菌薬抵抗性との関連について,緑膿菌PAO1株や臨床分離株を用いて検討した。今回の研究から,ビアペネム,オフロキサシン,トブラマイシンなどの抗菌薬の添加により,緑膿菌は酸化ストレスを受け,その結果,活性酸素種の1つであるH2O2が菌体内に発生することが示された。またH2O2に対する抵抗性が,ビアペネムやオフロキサシンなどの抗菌薬抵抗性にも深く関わっており,この抵抗性には, psl遺伝子が重要な役割を果たしていることも明らかとなった。また,バイフィルム形成以前の付着細菌でも高い抗菌薬抵抗性を示すことから,臨床分離株を用いて,抗菌薬抵抗性が低い株をスクリーニングしたところ5株見出すことが出来た。これらの臨床分離株では,PCRではpslA遺伝子は検出されなかった。また,ビアペネムやオフロキサシン添加によるH2O2の発生や,H2O2に対する抵抗性,ビアペネムやオフロキサシンなどの抗菌薬抵抗性においてもPAO1株と同様の傾向は認められたが,菌株によりその程度は様々であり,より複雑な制御系が存在していることが推測された。さらに,マイクロアレイによるトランスクリプトーム解析やメタボローム解析などから,抗菌薬は細菌の遺伝子発現や,菌体内の代謝経路にも幅広く様々な影響を与え,酸化ストレスをはじめとする種々のストレス応答を誘導していることが明らかとなった。バイオフィルムは,抗菌薬に対し抵抗性を示すことから,治療が困難となることが知られているものの,そのメカニズムは依然として不明である。また,抗菌薬添加による酸化ストレス反応が,新たな抗菌薬の殺菌メカニズムとして報告されている。近年,解析装置の向上によりメタボローム解析と呼ばれる,細胞の全代謝産物の網羅的な解析手法が注目されている。本研究では,バイオフィルムのモデル微生物である緑膿菌を用いて,バイオフィルムなどの難治性感染症に対する新たな抗菌薬を開発することを目的として,抗菌薬の殺菌メカニズムとしての酸化ストレスに着目し,抗菌薬抵抗性メカニズムを解明し,新たな抗菌薬のターゲットを探索することを目的としている。本研究では,以下の4つの実験項目に沿って,実験を進めている。1.抗菌薬添加によるROS産生の検討,2.酸化ストレスマーカーによる抗酸化能の解析,3. CE-MSを用いたメタボローム解析,4.マイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析これまで,緑膿菌標準株PAO1株を用いて,対数増殖期の細菌で,それぞれの実験項目について条件設定を行ってきた。2の項目については,もう少し検討が必要であるが,1については順調に結果が得られている。3, 4についてはサンプル調整などの条件がほぼ整ったので,今後解析を順次実施していく予定である。1.抗菌薬添加によるROS産生の検討:抗菌薬添加による過酸化水素の産生について,ビアペネム,オフロキサシン,トブラマイシンを用いて検討を行った。抗菌薬添加時の細菌の状態,抗菌薬添加濃度,測定時間の設定など,条件設定にかなりの時間を費やしたが,ビアペネム,オフロキサシンについては抗菌薬添加による過酸化水素の産生が確認された。トブラマイシンについては更なる検討が必要である。2.酸化ストレスマーカーによる抗酸化能の解析:SOD,カタラーゼ,NAD, NADHの測定を現在行っているが,安定した実験結果を得るために実験方法を改善している。3. CE-MSを用いたメタボローム解析:緑膿菌によるCE-MSによるメタボローム解析はまだ実施例がないため,サンプル調整方法を含め予備検討を行っており,安定した結果を得られる条件がほぼ得られている。4.マイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析:マイクロアレイによる検討を行ってきたが,データの安定性,実験精度などの観点から次世代シークエンスによるRNA-seqの方が優れており,解析コストも下がってきている事から,こちらの方法に切り替えることを検討している。ペニシリンの発明以来種々の抗菌薬が作られてきて,その抗菌・殺菌メカニズムについての研究も行われてきた。しかし,現在までに解明されている抗菌・殺菌メカニズムだけでの説明は困難であり,特に抗菌薬耐性や抗菌薬抵抗性の解明には至っていない。そこで抗菌薬の新たな殺菌メカニズムとして,抗菌薬投与により菌体内で酸化ストレス反応が生じ,その結果ゲノムDNAが損傷を受け,細菌が死滅すると言う,という概念が提唱され注目されている。しかしながらこのモデルには未だ不明な点が多い。我々はこれまで固層に付着した細菌や,バイオフィルムを形成した細菌が,抗菌薬に対し抵抗性を示す現象に着目して来た。抗菌薬抵抗性とは,細菌が抗菌薬存在下で増殖はできないが殺菌はされにくい状態を示すものである。そこで,抗菌薬抵抗性と酸化ストレスの関連について検討を行い,抗菌薬抵抗性メカニズムを解明し,新たな抗菌薬のターゲットを探索することを目的としている。本研究では,バイオフィルムのモデル微生物であり,慢性感染症の起炎菌となることも多い緑膿菌を用いて研究を進めている。本年度は,以下の3つの実験項目について検討を行った。

1)酸化ストレスマーカーによる抗酸化能の解析により,psl欠損株でSOD,カタラーゼ,NAD, NADHの測定を現在行ったところ,NAD, NADH活性のみが野生株と比較し,有意に低下していることが明らかになった。2) CE-MSを用いたメタボローム解析の結果を得,現在その解析を行っている。3)トランスクリプトーム解析による抗菌薬添加による遺伝子発現の影響については,マイクロアレイによる解析を予定したが,次世代シークエンスによるRNA-seqに切り替え,解析を行う準備をしている。1)酸化ストレスマーカーによる抗酸化能の解析:psl遺伝子欠損株はカルバペネム,キノロン,アミノグリコシド系抗菌薬に対し,感受性は変わらないもの,抵抗性が低下していることを明らかにした。このpsl欠損株では,過酸化水素に対する抵抗性も低下していたことから,抗酸化能が低下していることが推測される。そこでpsl欠損株でSOD,カタラーゼ,NAD, NADHの測定を現在行ったところ,NAD, NADH活性のみが野生株と比較し,有意に低下していた。2) CE-MSを用いたメタボローム解析:カルバペネム系抗菌薬添加後の緑膿菌について,CE-MSによるメタボローム解析を実施しており,現在データ解析を行っている。3)トランスクリプトーム解析による抗菌薬添加による遺伝子発現の影響:当初はマイクロアレイによる解析を予定したが,次世代シークエンスによるRNA-seqに切り替え,解析を行う準備をしている。バイオフィルム感染症等の慢性感染症の原因として抗菌薬抵抗性が注目されている。抗菌薬抵抗性とは,抗菌薬存在下で細菌は増殖しないものの,死滅しない現象であり,遺伝子の変異は伴わず,一時的な遺伝子発現の変化によるものと考えられているが,その詳細なメカニズムは明らかにされていない。我々は,緑膿菌psl遺伝子が抗菌薬抵抗性に重要な役割を果たしていることを見出した。また,抗菌薬の新たな作用機序として,酸化ストレスが注目されている。そこで,酸化ストレスと抗菌薬抵抗性との関連について,緑膿菌PAO1株や臨床分離株を用いて検討した。今回の研究から,ビアペネム,オフロキサシン,トブラマイシンなどの抗菌薬の添加により,緑膿菌は酸化ストレスを受け,その結果,活性酸素種の1つであるH2O2が菌体内に発生することが示された。またH2O2に対する抵抗性が,ビアペネムやオフロキサシンなどの抗菌薬抵抗性にも深く関わっており,この抵抗性には, psl遺伝子が重要な役割を果たしていることも明らかとなった。また,バイフィルム形成以前の付着細菌でも高い抗菌薬抵抗性を示すことから,臨床分離株を用いて,抗菌薬抵抗性が低い株をスクリーニングしたところ5株見出すことが出来た。これらの臨床分離株では,PCRではpslA遺伝子は検出されなかった。また,ビアペネムやオフロキサシン添加によるH2O2の発生や,H2O2に対する抵抗性,ビアペネムやオフロキサシンなどの抗菌薬抵抗性においてもPAO1株と同様の傾向は認められたが,菌株によりその程度は様々であり,より複雑な制御系が存在していることが推測された。
飽和脂肪酸による小胞体ストレス応答分子ＩＲＥ１活性化機構の解明

これまでの研究結果により、飽和脂肪酸負荷時に小胞体ストレス応答分子IRE1が特徴的な活性化を起こすことが示されている。このIRE1の活性化には脂肪酸組成変化を感知する必要があるが、そのセンサータンパク質は同定されていない。そこで、膜リン脂質の脂肪酸組成変化と関連する分子を探索するため、PUFAを合成できないfat-3変異体の線虫を用い、RNAiスクリーニングにより表現型を増強させる遺伝子を探索した。その結果、PUFA欠乏によりEMC-1 (ER membrane protein complex 1)という膜タンパク質の局在が変化することが分かった。EMC-1は野生株において小胞体様に局在したが、fat-3変異体ではリソソームの内腔に存在していた。これより、EMC-1は生体膜の脂肪酸環境の変化により局在が影響を受ける分子であることが示唆された。EMC分子が高等動物においても脂肪酸組成感受性を持つかを検討するために、HeLa細胞に対して飽和脂肪酸であるパルミチン酸を添加したところ、EMC6のタンパク質量が減少することがわかった。これより、脂肪酸組成変化によりEMC6が分解することが示唆された。飽和脂肪酸負荷によるEMC6の分解の生理的意義を調べるため、EMC6を安定発現する細胞株を作製し、飽和脂肪酸負荷時の表現型を解析した。細胞に対して飽和脂肪酸負荷が加わると、そのストレスを軽減させるためにSCD1が発現上昇する。一方、EMC6安定発現細胞ではパルミチン酸添加時にタンパク質が減少することがわかった。このSCD1の発現減少はプロテアソーム阻害剤MG132処理により抑制されたことから、EMC6安定発現細胞ではプロテアソーム依存的にSCD1が分解していることがわかった。以上の結果より、飽和脂肪酸負荷時のEMC6の分解はSCD1のタンパク発現レベルを維持するために必要であることが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。IRE1結合タンパク質について,TAP(Tandem Affinity Purification)法による同定を行った。IRE1 KO MEF細胞にSBP(Streptavidin Binding Peptide)-Flagタグを付加したIRE1の安定発現株を樹立し,TAPによる精製,銀染色後,LC-MS/MSによりIRE1結合タンパク質を同定した。その結果,複数の新規IRE1結合タンパク質が同定された。これらの分子をHeLa細胞でRNAiにより発現抑制したところ,飽和脂肪酸増加時特異的にIRE1の下流で発現上昇する遺伝子の発現上昇が有意に抑制される結果が得られた。今回同定された分子は飽和脂肪酸増加時特異的に起こるIRE1活性制御のメカニズムを説明するものである可能性がある。IRE1近傍タンパク質について,BirAタグを用いたBioID法による探索を行った。IRE1 KO MEF細胞にBirAタグを付加したIRE1の安定発現株を樹立し,ビオチン化タンパク質を精製,銀染色によりIRE1近傍タンパク質を複数検出した。その中の一つに,異常タンパク質蓄積を起こす薬剤TunicamycinでIRE1によるビオチン化が抑制される一方で,飽和脂肪酸の添加や不飽和化酵素の発現抑制の処理ではビオチン化に変化は生じないものが存在した。この分子の同定には至っていないが,IRE1活性化シグナルの質を変化させる分子である可能性がある。さらに,BirAタグで問題となっていたラベル時間を解消し,効率的に周辺分子をビオチン化する手法が近年開発され,APEXタグを用いたIRE1周辺分子の同定も現在進行中である。この手法により更に詳細なプロテオームが可能になることが期待される。これまでIRE1のリン酸化ペプチドマッピングの結果から,飽和脂肪酸増加時と異常タンパク質蓄積時ではIRE1のリン酸化パターンが異なる可能性が示唆されていたが,リン酸化部位の候補となる残基の変異体ではXBP1スプライシングに与える影響に違いは見られていなかった。しかしながら,飽和脂肪酸負荷時のIRE1シグナルはXBP1に依存しない経路もあることから,この経路への寄与を調べるためにIRE1 KO HeLa細胞にIRE1の網羅的なセリン変異体を戻した安定発現細胞株を樹立した。これらの細胞で飽和脂肪酸負荷時のPRKAG2の発現上昇を指標にIRE1の活性化に与える影響を調べたところ,既知のリン酸化部位のS724の変異体に加え,S551の変異体においてもIRE1の活性化が抑制された。また,この変異体では異常タンパク質蓄積時のIRE1活性化には全く影響を与えなかったため,S551でのリン酸化が飽和脂肪酸負荷時にのみ起こる可能性が示唆された。また,作製した安定発現細胞でXBP1スプライシングに与える影響を調べたところ,T973の変異体では飽和脂肪酸負荷時のXBP1スプライシングが顕著に抑制されていた。一方で異常タンパク質蓄積時のXBP1スプライシングには影響を与えなかったため,この部位でのリン酸化も同様に飽和脂肪酸負荷時にのみ起こるものである可能性が示唆された。XBP1スプライシングに対する影響はIRE1 KO MEF細胞を用いていたときには見られなかったが、T973はマウスには保存されていない残基であるため,T973でのリン酸化はヒトでしか起こらない現象であるかもしれない。飽和脂肪酸増加時と異常タンパク質蓄積時においてIRE1のリン酸化パターンが異なることが示唆されており,これらのリン酸化がIRE1のXBP1を介さない活性化経路に寄与している可能性を検証するため,網羅的なIRE1のセリン変異体をIRE1 KO HeLaに戻した安定発現細胞を樹立した。

これらの細胞でIRE1の下流でおこるPRKAG2の発現上昇を調べたところ,551番目のセリン変異体で顕著な抑制が見られた。一方でこの変異体は異常タンパク質蓄積時のIRE1活性化には全く影響を及ぼさなかったことから,この部位でのリン酸化が飽和脂肪酸負荷時にのみ起こる現象である可能性が示唆された。このリン酸化に関わるキナーゼを探索する目的で、PRKAG2の発現上昇を指標にキナーゼ阻害剤ライブラリーを用いたスクリーニングを行った結果,複数のPKC阻害剤がPRKAG2の発現上昇を顕著に抑制した。このことから、飽和脂肪酸増加時にPKCを介したIRE1のリン酸化という新たなシグナル経路が存在する可能性が示唆された。以上の結果は従来異常タンパク質の蓄積で活性化すると考えられていたIRE1が飽和脂肪酸の負荷による異なった活性化機構を有することを示しており、飽和脂肪酸による小胞体ストレス応答活性化機構の一端を明らかにしたと考えられる。これまでの研究結果により、飽和脂肪酸負荷時に小胞体ストレス応答分子IRE1が特徴的な活性化を起こすことが示されている。このIRE1の活性化には脂肪酸組成変化を感知する必要があるが、そのセンサータンパク質は同定されていない。そこで、膜リン脂質の脂肪酸組成変化と関連する分子を探索するため、PUFAを合成できないfat-3変異体の線虫を用い、RNAiスクリーニングにより表現型を増強させる遺伝子を探索した。その結果、PUFA欠乏によりEMC-1 (ER membrane protein complex 1)という膜タンパク質の局在が変化することが分かった。EMC-1は野生株において小胞体様に局在したが、fat-3変異体ではリソソームの内腔に存在していた。これより、EMC-1は生体膜の脂肪酸環境の変化により局在が影響を受ける分子であることが示唆された。EMC分子が高等動物においても脂肪酸組成感受性を持つかを検討するために、HeLa細胞に対して飽和脂肪酸であるパルミチン酸を添加したところ、EMC6のタンパク質量が減少することがわかった。これより、脂肪酸組成変化によりEMC6が分解することが示唆された。飽和脂肪酸負荷によるEMC6の分解の生理的意義を調べるため、EMC6を安定発現する細胞株を作製し、飽和脂肪酸負荷時の表現型を解析した。細胞に対して飽和脂肪酸負荷が加わると、そのストレスを軽減させるためにSCD1が発現上昇する。一方、EMC6安定発現細胞ではパルミチン酸添加時にタンパク質が減少することがわかった。このSCD1の発現減少はプロテアソーム阻害剤MG132処理により抑制されたことから、EMC6安定発現細胞ではプロテアソーム依存的にSCD1が分解していることがわかった。以上の結果より、飽和脂肪酸負荷時のEMC6の分解はSCD1のタンパク発現レベルを維持するために必要であることが示唆された。飽和脂肪酸増加時のIRE1シグナル複合体構成分子の解明についてBioID法やTAP法によって新規IRE1結合タンパク質,近傍タンパク質が複数同定された。
新規癌精巣抗原KM-HN-1の機能解析と腫瘍マーカーとしての有用性の検討

研究の目的我々が同定したKM-HN-1は正常臓器では精巣のみで発現するが、様々な癌組織で発現する事、癌患者のin vivoにおいて特異的IgG抗体が産生されており、in vitroで特異的CTL(細胞障害性T細胞)が誘導できる事を既に報告している。そこで我々はKM-HN-1の機能解析と癌患者血清中の抗体価を測定する研究を企画した。1.KM-HN-1の遺伝子導入癌細胞株を作製し、遺伝子導入株で表現型が変化するか(細胞増殖やストレス状況下での変化など)2.1.で変化がみられた揚合、cDNAマイクロアレイを用いて遺伝子導入株のmRNAの変化を解析する。3.癌患者血清中の抗体価の癌の進展度との関連、治療前後や再発後に変化するかについて明らかにしたい。本年度(平成19年3月31日)までの研究実施2.癌細胞株への遺伝子導入については、KM-HN-1を発現していない頭頚部癌細胞株HSC-4に遺伝子導入を行い、geneticinにてselectionし、遺伝子の高発現株を5株樹立した。3.遺伝子導入株の表現型の解析については、現在解析中であるが、HSC-4では今のところ明らかな表現型の違いは認められていないため、他の癌細胞株にて遺伝子導入株を作成中。4.癌患者血清中の抗体価については正常人より高値を示したが、進展度や治療前後の変化については有意差を認めなかった。研究の目的我々が同定した脳KM-HN-1は正常臓器では精巣のみで発現するが、様々な癌組織で発現する事、癌患者のin vivoにおいて特異的IgG抗体が産生されており、in vitroで特異的CTL(細胞障害性T細胞)が誘導できる事を既に報告している。1.KM-EN-1の遺伝子導入癌細胞株を作製し、遺伝子導入株で表現型が変化するか(細胞増殖やストレス状況下での変化など)2.1.で変化がみられた場合、cDNAマイクロアレイを用いて遺伝子導入株のmRNAの変化を解析する。本年度(平成18年3月31日)の研究実施2.癌細胞株への遺伝子導入については、KM-HN-1を発現していない頭頚部癌細胞株HSC-4に遺伝子導入を行い、geneticinにてselectionし、遺伝子の高発現株を5株樹立した。3.遺伝子導入株の表現型の解析については、現在解析中であるが、今のところ明らかな表現型の違いは認められていない。4.癌患者血清の収集については、現在まで頭頚部癌患者にて約30人の収集を行っており、血清を冷凍保存している。
KRAS遺伝子変異に伴う癌代謝変化の診断および治療への応用

癌におけるKRAS遺伝子変異は糖代謝に関与することが分子レベルで近年報告される。大腸癌遠隔転移巣の切除標本を検討したところ、KRAS遺伝子変異は糖代謝に関与することでFDG-PET検査における転移巣へのFDG集積に関与しており、SUVmaxを計測することで71.4%の精度でKRAS遺伝子変異の有無が予測できた。FDG-PET検査は大腸癌における抗EGFR抗体の適応の有無を判断し大腸癌治療に応用できる可能性がある。また大腸癌におけるKRAS遺伝子変異特異的な代謝経路の検討から、グルタミン・アスパラギン代謝の阻害はKRAS遺伝子変異を有する大腸癌に対する新規治療ターゲットとして期待できる。本研究ではKRAS遺伝子変異による大腸癌の代謝変化に着目し、1)診断への応用(癌の解糖系代謝を評価する画像診断法FDG-PET検査を用いたKRAS遺伝子変異予測や抗EGFR抗体の治療効果予測)や、2)治療への応用(KRAS遺伝子変異のある大腸癌に特異的な代謝経路をターゲットにした治療法の開発)の可能性について明らかにすることを目的とする。2009年4月2014年3月までに京大病院で大腸癌遠隔転移巣(肝臓、肺、遠隔リンパ節)を切除した35症例、55転移巣を用いて、KRAS遺伝子変異を認めた群(n=30転移巣)と遺伝子変異を認めなかった群(n=25転移巣)とで大腸癌遠隔転移巣へのFDG集積(SUVmax:1ピクセルあたりの最大SUV)に違いがあるかを検討した。全症例での解析ではKRAS遺伝子変異群は遺伝子変異なし群に比べFDG集積に有意な差は認められなかった(6.3±4.2 vs 5.4±2.6; P = 0.84)。しかしながら腫瘍サイズの分布をみるとKRAS遺伝子変異群のほうが遺伝子変異なし群に比べ有意ではなかったもののサイズが小さい傾向にあった(P = 0.06)ため、腫瘍サイズが10mm以上のものに絞ってサブグループ解析をしたところ、KRAS遺伝子変異群(n=19転移巣)は遺伝子変異なし群(n=23転移巣)に比べFDG集積が有意に高く(8.3±4.1 vs 5.7±2.4; P = 0.03)、またSUVmaxのcut-off値を6.0とすると71.4%の精度でKRAS遺伝子変異の有無を予測できることが明らかとなった。以上の結果は論文として発表した(Kawada K et al. J Nucl Med.56:1322-7.2015)。当初の予定通りにおおむね実験計画が進んでおり、現在までに得られた実験結果は学会発表のみならず論文発表することができたから。本研究ではKRAS遺伝子変異による大腸癌の代謝変化に着目し、1)診断への応用や、2)治療への応用(KRAS遺伝子変異のある大腸癌に特異的な代謝経路をターゲットにした治療法の開発)の可能性について明らかにすることを目的とする。大腸癌細胞株についてはKRAS遺伝子変異を相同組換え法により野生型に戻した2種類のヒト大腸癌細胞株(HCT116,DLD-1)に加え、siRNA法にてKRAS遺伝子を発現抑制した複数のヒト大腸癌細胞株を樹立した。これらの細胞株における代謝物をメタボロミクス解析にて包括的スクリーニングの結果からKRAS変異に伴い低下するものとしてアスパラギン酸(Asp)に注目した。そこでAspの生成に関与する各種酵素の発現をスクリーニングしてみるとアスパラギン合成酵素(ASNS: Asparagine synthetase)の発現が増加していることを見出した。KRAS遺伝子変異を有する大腸癌細胞はASNSの発現がKRAS野生型と比較して発現が亢進しており、ASNS発現をノックダウンするとグルタミン濃度依存的にアポトーシスが誘導され、またin vivo(マウスモデル)の実験で腫瘍の増殖が抑制された。さらに、ASNSの発現制御にはPI3K-mTOR経路が関与していることを明らかにし、mTOR阻害剤であるラパマイシンと血清中のアスパラギンを分解する抗がん剤L-Asparaginaseとの併用療法では、in vitro、in vivoいずれの実験においてもKRAS変異型細胞株の腫瘍増殖が有意に抑制された。以上からグルタミン・アスパラギン代謝の阻害はKRAS遺伝子変異を有する大腸癌に対する新規治療ターゲットとして期待できることが示され、論文として発表した(Toda K et al. Neoplasia.18:654-665.2016)。当初の予定通りにおおむね実験計画が進んでおり、現在までに得られた実験結果を論文発表することができたから。これらの細胞株における代謝物をメタボロミクス解析にて包括的スクリーニングの結果からKRAS変異に伴い変化するものとしてアミノ酸代謝が重要であることを我々はすでに明らかにしてきた(Toda K et al. Neoplasia.18:654-665.2016)。さらにそれらのアミノ酸トランスポーターのスクリーニングを行ったところ、KRAS変異によりグルタミンのトランスポーターであるASCT2(SLC1A5)が増加することが明らかとなった。

さらにヒト臨床検体をもちいた免疫染色の解析から、KRAS変異とASCT2(SLC1A5)発現の間には有意な相関関係があり、腫瘍の深達度や脈管侵襲に関与することが明らかとなった。さらにKRAS変異大腸癌細胞株にASCT2(SLC1A5)をノックダウンさせると、腫瘍増殖が抑制されアポトーシスが誘導されることがわかった。以上の結果はASCT2(SLC1A5)がKRAS変異大腸癌に対する新規治療ターゲットになりえることを示しており、論文として発表した(Toda K et al. Int J Mol Sci.2017;18(8).pii:E1632)。癌におけるKRAS遺伝子変異は糖代謝に関与することが分子レベルで近年報告される。大腸癌遠隔転移巣の切除標本を検討したところ、KRAS遺伝子変異は糖代謝に関与することでFDG-PET検査における転移巣へのFDG集積に関与しており、SUVmaxを計測することで71.4%の精度でKRAS遺伝子変異の有無が予測できた。FDG-PET検査は大腸癌における抗EGFR抗体の適応の有無を判断し大腸癌治療に応用できる可能性がある。また大腸癌におけるKRAS遺伝子変異特異的な代謝経路の検討から、グルタミン・アスパラギン代謝の阻害はKRAS遺伝子変異を有する大腸癌に対する新規治療ターゲットとして期待できる。現在までに行なった解析結果を踏まえ、臨床検体をもちいた解析ではFDGの集積程度の定量評価が抗EGFR抗体治療の治療効果をどこまで正確に予測できうるのかを検討していく予定である。また大腸癌細胞株やマウスモデルを用いた解析では、KRAS遺伝子特異的な代謝経路を特定し、代謝経路を標的とした新規の抗癌剤の開発に結びつくか今後検討していく予定である。現在までに行なった解析結果を踏まえ、臨床検体から樹立したスフェロイド細胞で検証し、ASNSの抑制が腫瘍増殖抑制に有効であるかを検討していく予定である。ASNSの抑制が大腸癌治療に有効な可能性が示されたら、実際に臨床応用をめざしたASNS阻害剤の開発に発展させていきたいと考えている。消化器外科若干の端数が生じたため。若干の端数が生じた為。次年度の予算と合わせて使用の予定である。次年度の予算と合わせて使用予定である。
中国におけるイネの栽培化と農耕社会の形成過程-考古学と遺伝学の学際的研究

昨今再考がうながされている、中国におけるイネの栽培化とそれに基づく農耕社会の形成過程について、考古学(植物遺存体・人工遺物)と遺伝学の共同研究による解明をめざした。イネ栽培化期における野生植物利用の実態解明、農耕具・加工具の体系化、栽培イネの伝播経路について新しい見解を得ることができ、複数の英語・日本語論文や国際学会で発表した。また、国際シンポジウム2件(1件は共催)を開催し、国際的な研究者の意見・情報交換の場を提供するとともに、その成果の出版も行った。本研究の目的は、中国初期稲作期において、イネの栽培化と農耕社会の形成過程の関係はどのようなものであったか、考古学と遺伝学の共同研究により実証的な検討を行うことである。イネの栽培化の様相については、これまで人工遺物を扱う考古学と植物考古学の分野でそれぞれ研究が進められ、近年はさらに、遺伝学分野からの栽培イネの系統に関する研究の発展も著しい。しかし、これらの分野間の学際的意見交流は十分に行われてこなかった。本研究は上記3分野の研究者が共同し、中国初期稲作期研究について真に学際的な議論を展開させていこうとする画期的な試みである。研究第一年次である平成21年度は、まず中国初期稲作期研究の現状を明らかにし、考古学・遺伝学の間での問題意識を共有すべく、総合地球環境学研究所において関連シンポジウムを開催した(同研究所・佐藤プロジェクトと共催、2009年8月30日31日開催、担当・細谷、佐藤)。さらに、このシンポジウムを基盤とした論文集を編集した(Journal of Archaeological and Anthropological Sciences特別号、2010年6月出版予定、担当・細谷、佐藤)。加えて、考古学と遺伝学の両分野において、平成22年度以降の研究活動のための基盤作りを行った。考古学については、稲作の起源とともにその南方への伝播の様相から稲作社会の成立過程を考察すべく華南に重点を置き、香港での学会参加や広東省文物考古研究所訪問を通して、資料収集の基盤を作った(担当・槙林)。また、欧米での中国初期稲作期研究の現状を把握すべく、ロンドン大学、ハーバード大学を訪問、関連研究者と意見交換を行った(他研究費による、担当・細谷)。遺伝学においては、中国漢代およびインド先史時代のイネ遺存体のDNA分析を行い、遺存体のDNA分析が可能であることを証明するとともに、分析のためのマーカーを作成した(担当・田中)。イネの栽培化と農耕社会の形成過程を解明すべく、考古学と遺伝学それぞれの分野で昨年度の準備研究で培った新しい視点を生かし、研究活動を展開した。結果、いずれも画期的な成果を得ることができた。まず考古学分野においては、従来の中国初期稲作研究で行われてきたイネ遺存体分析ばかりでなく、初期稲作期においても重要な食料源だったことが示唆されている野生植物遺存体の組織的分析と、その加工法の復元、さらに、生業の舞台となった地形環境の変化の様相も併せて検討する必要性を指摘し、研究を実施した。地形環境の形成過程については、沖積作用・海岸線形成および後背湿地形成のパターンから、長江下流域を「寧紹平原タイプ」と「太湖・江蘇平原タイプ」に分類できた。出土している野生植物遺存体の様相の分析からも、この2タイプの地域においては、自然資源利用の方向性が異なっていたことが読み取れた。すなわち、イネ栽培化を基盤とする農耕社会の形成過程は、長江下流域においても一様ではなく、地形環境と社会的指向性の違いによって複数のパターンが存在したことを見出した。遺伝学においては、中国における稲作の発達過程を解明すべく、陜西省西安市にある魚化寨遺跡出土の漢代墓葬のイネ遺存体をDNA分析した。同地域は中国北域の粟作と南域の稲作の境界にあたり、東西交流を考察する上で重要な場所である。昨年開発した葉緑体ゲノムと核ゲノムのDNAマーカーを利用した分析によって、陶倉に収められていたイネはインディカ型と温帯ジャポニカ型だと判明した。インディカ型は4000年前には南方で利用されたとされる(Fuller 2010)。また、イネはシルクロードを伝播していたことも示唆されている(Molina et al.2011)。すなわち、東西や南北の交易の中で様々な文化やモノが導入されて同地域が社会的発展をとげた中で、多様なイネが利用されていた事実が復元できた。イネの栽培化と農耕社会の形成過程の解明を目的に、過去2年間は考古学と遺伝学それぞれの分野で研究活動を展開してきたが、本研究費の最終年度である今年度は、その統合と成果発信を行った。まず、研究代表者・細谷と、研究分担者・槙林は、それぞれの視点から本研究費のテーマについて研究成果の統合をはかり、複数の国際学会で口頭発表を行った。

中国・余挑市で開催された国際学会「Hemudu Culture International Forum:In Global Perspective」(2011年5月)は、まさに本研究費のテーマである長江下流域の農耕文化をテーマに各国の研究者が討議したものであったが、細谷と槙林の両名が発表者として参加した。細谷は植物遺存体会析、槙林は人工遺物分析の視点から、長江下流域・初期稲作期の植物食料の生産・加工文化と社会の関係、そして農耕社会形成にむけてのその変遷について、植物考古学・考古学・遺伝学の学際研究によって新しい視点が開けることを発表し、良いフィードバックを得たとともに、この学会を基にした書籍出版にも、依頼されて参加することになった。その他、細谷は北京大学における国際シンポジウム、スロベニア・リュブリャナ大学における招待講演、槙林は総合地球環境学研究所における国際シンポジウムなどで、さらに広く国際的な研究発信を行った。2011年2月には、当初の計画通り、海外研究協力者の趙志軍(中国社会科学院)、楊春(吉林省考古研究所)らを招待し、北海道埋蔵文化財センターにて、本研究費主催による国際ワークショップを開催した。研究代表者・分担者の細谷、槙林、田中、佐藤の全員が研究成果を発表(佐藤はコメンテーター)したとともに、趙志軍に加えて東北大学大学院、北海道開拓記念館などの研究者らの招待発表も得て、本研究費の成果のみならず、今後効果的な学際研究をいかに展開していくべきかを十分に議論した。ワークショップの内容についてさらに発信すべく、報告書を作成中である。
糖蛋白質糖鎖のシグナリング機能を利用した植物成長コントロール技術の開発

平成11年度には,銀杏種子,トマト果実、カボチャ子葉,及びタバコ培養細胞からエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)を精製し,それらの基質特性を始めとする詳細な酵素学的諸性質を明らかにした。その結果,約6万の分子量を有するこれら植物エンドグリコシダーゼはpH6-6.5に至適pHを有し,α1-2結合マンノース残基を有するハイマンノース型に対して強い活性を示すこが明らかになった。次いで平成12年度には,カボチャ子葉を用いてハイマンノース型糖鎖の遊離を司るENGaseの細胞内分布解析を行い,本酵素及び遊離型N-グリカンが細胞質に存在することを明らかにした。また,数種のENGase(トマト,タバコ)については,部分アミノ酸配列をもとにして遺伝子クローニングを進めてきた。その結果,平成13年度迄に,アラビドプシス酵素については遺伝子クローニングに成功し,大腸菌による大量発現系を確立することができた。この組み換え酵素は,種々植物細胞から精製してきた酵素と同じ酵素学的性質を示すものであった。植物ENGaseの生理機能を考える上で,本酵素の内在基質を明らかにすることも重要な課題であるが,平成13年度迄に得られた本酵素の基質特異性及び細胞内分布解析の結果から,本酵素の内在基質はフォールディングの完了した,いわゆる成熟糖蛋白質に結合した糖鎖ではなく,オリゴ糖鎖-脂質中間体あるいは新生糖蛋白質の品質管理系で排除され生じた糖ペプチドに結合するハイマンノース型糖鎖である可能性を提示した。また,平成11年度13年度にかけては,植物細胞内に遍在する遊離型N-グリカンが蛋白質の4次構造形成あるいはリフォールディングにおいて重要な機能を担っていることを明らかにした。この結果は,遊離精鎖の植物の成長促進活性に関与する新たな機能発見となった。平成14年度には,細胞質に存在するハイマンノース型遊離糖鎖の分解に関与すると思われる細胞質α-マンノシダーゼ(C-MANase)を登熟期種子から精製し,(1)酵素がコバルトイオンによる基質特異性のコントロールを受けること,(2)還元末端にGlcNAc残基が1分子のみを有するENGase消化物に対して強い活性を示すことを明らかにするとともに,(3)N-末端配列及び内部部分アミノ酸配列を明らかにし,遺伝子クローニングを開始した。また,平成14年度はゲノムプロジェクトが進行中のイネに注目し,イネ細胞からもENGaseを単一精製後,その内部アミノ酸配列を基に遺伝子クローニングを完了した。大腸菌でのイネ酵素の発現系も確立することができ,現在,ENG-ase遺伝の発現を制御したトランスジェニック植物の作成を行っている。精製酵素のアミノ酸配列を基にして,真核生物由来のENGaseのクローニングと発現系の確立に成功したのは,我々の研究室が初めてであった。本研究は,植物細胞の分化・成長に係わると推定される糖蛋白質糖鎖の生理機能の詳細を解明するとともに,それら糖鎖のシグナリング機能を利用した植物成長コントロール技術開発の基礎を確立することを目的とする。本年度は,トマト,タバコ培養細胞からエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを,昨年度我々が確立した新規アフィニティークロマトにより完全精製することに成功した,現在それら酵素のリジルエンドペプチダーゼ消化物から精製したペプチドのアミノ酸配列の解析を行っている。これらのアミノ酸配列情報から,遺伝子クローニングに着手する予定である。一方,アラビドプシス由来に酵素については,遺伝子クローニングがほぼ完了し,大腸菌での大量発現系の検討を行っている。また,昨年度,カボチャ子葉を試料として,エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの細胞内分布解析を行い,本酵素が細胞質画分に存在することを明らかにしているので,今年度は,カボチャ子葉由来のエンドグリコシダーゼの部分精製を行い,詳細な基質特異性解析を行った。その結果,本酵素も,既に我々が明らかにしているその他の植物エンドグリコシダーゼと同様,ハイマンノース型糖鎖を効率よく加水分解することが明らかとなった。更に,カボチャ実生中における遊離N-グリカンの分布解析を行った結果,遊離N-グリカンは子葉部,胚軸,根部いずれからも同程度の濃度検出され,それらはMan9-7GlcNAc1の構造を有していた.カボチャ種子中には,ハイマンノース型糖鎖を有する糖蛋白質は殆ど存在しないことから,これら遊離糖鎖は貯蔵糖蛋白質から誘導されたものでは無いことが明らかとなった。

植物ENGaseの生理機能を考える上で,本酵素の内在基質を明らかにすることも重要な課題であるが,平成13年度迄に得られた本酵素の基質特異性及び細胞内分布解析の結果から,本酵素の内在基質はフォールディングの完了した,いわゆる成熟糖蛋白質に結合した糖鎖ではなく,オリゴ糖鎖-脂質中間体あるいは新生糖蛋白質の品質管理系で排除され生じた糖ペプチドに結合するハイマンノース型糖鎖である可能性を提示した。また,平成11年度13年度にかけては,植物細胞内に遍在する遊離型N-グリカンが蛋白質の4次構造形成あるいはリフォールディングにおいて重要な機能を担っていることを明らかにした。この結果は,遊離精鎖の植物の成長促進活性に関与する新たな機能発見となった。平成14年度には,細胞質に存在するハイマンノース型遊離糖鎖の分解に関与すると思われる細胞質α-マンノシダーゼ(C-MANase)を登熟期種子から精製し,(1)酵素がコバルトイオンによる基質特異性のコントロールを受けること,(2)還元末端にGlcNAc残基が1分子のみを有するENGase消化物に対して強い活性を示すことを明らかにするとともに,(3)N-末端配列及び内部部分アミノ酸配列を明らかにし,遺伝子クローニングを開始した。また,平成14年度はゲノムプロジェクトが進行中のイネに注目し,イネ細胞からもENGaseを単一精製後,その内部アミノ酸配列を基に遺伝子クローニングを完了した。大腸菌でのイネ酵素の発現系も確立することができ,現在,ENG-ase遺伝の発現を制御したトランスジェニック植物の作成を行っている。精製酵素のアミノ酸配列を基にして,真核生物由来のENGaseのクローニングと発現系の確立に成功したのは,我々の研究室が初めてであった。本研究は,植物細胞の分化・成長に係わると推定される糖蛋白質糖鎖の生理機能の詳細を解明するとともに,それら糖鎖のシグナリング機能を利用した植物成長コントロール技術開発の基礎を確立すること目的とする。本年度は,トマト及びタバコ培養細胞より精製したエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼのリジルエンドペプチダーゼ消化物からペプチド断片を精製後,それらのアミノ酸配列を明らかにした。次いで,それらの配列をもとに数種のプローブを作成後,ゲノム及びcDNAを鋳型にしてPCRにより約1500 bp及び400 bpの単一バンドを得ることに成功した。現在,コンピテントセルを用いて発現系の確立を行っている。昨年度,アラビドプシス由来のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子のクローニングをほぼ完了していたが,今年度,大腸菌による発現系により,弱いながらも活性のある酵素の大量生産に成功した。更に今年度は,植物細胞内に存在するハイマンノース型の遊離N-グリカンの分解に関与すると考えられる細胞質α-マンノシダーゼを,銀杏種子より単一に精製することとに成功した。本酵素はpH5.5付近に至適pHを有し,SDS-PAGEにより約120kDa程度の分子量を持つサブユニット2分子からなるダイマー構造であることが示唆された。次いで,種々の蛍光標識N-グリカンを基質として種々の酵素学的性質を解析した結果,本酵素は(1)α1-2マンノース残基を有するハイマンノース型糖鎖に対して強い活性を有すること,(2)金属イオンの種類によって基質特異性に違いが生じることが明らかになった。
DNA－タンパク質相互作用のデジタルカウンティング

「少数性生物学」では数を知ることが重要である。分子の数を数える方法として、蛍光1分子イメージング技術がある。現在用いられている全反射照明による蛍光1分子イメージング法では、蛍光色素分子の濃度がおよそ50 nMを越えると、常に近接した領域に複数の蛍光標識生体分子が存在するようになり、個々の分子の観察が非常に困難になる。そのため、全反射照明蛍光顕微鏡法による蛍光1分子イメージングで解析できるのは、基質との親和性が十分高い酵素に限られていた。高濃度条件下で1分子蛍光イメージングを行うことができる新しい蛍光1分子イメージング法としてナノ開口が開発された。ナノ開口はガラス基板上の厚さ100 nm程度のアルミフィルムに作製した直径80100 nmの穴である。穴の直径に比べて、励起光の波長が大きいため、ガラス基板の下から励起光を照射すると、励起光は穴の外には出ることができず、穴の底面ごく近傍に近接場光が生じる。全反射照明法より、さらに微小領域を励起するこの方法を用いることで、数μMでも1分子観察が可能になる。ガラス基板上にナノメートルサイズの加工を施す技術は確立されておらず、ナノ開口の作製は容易ではない。これまでにいくつかのナノ開口基板作製手法が報告されているが、我々はMetal Lift-off法でナノ開口基板を作製している。昨年度は条件検討を繰り返し、30×20 mm角の石英ガラス基板に安定してナノ開口を作製することができるようになった。今年度はナノ開口を大量に作製するため、直径4インチの石英ウェハを使って、1回の作業で60枚のナノ開口を作製する方法を確立した。その結果、安定して大量のナノ開口が作製できるようになった。このナノ開口を使って、エピジェネティクス制御の1つであるDNAメチル化パターン維持に関与するタンパク質の機能解析を行っている。27年度が最終年度であるため、記入しない。水溶液中の蛍光色素を1分子イメージングする方法として、現在用いられている全反射照明蛍光顕微鏡法では、蛍光色素分子の濃度がおよそ50 nMを超えると常に近接した領域に複数の蛍光分子が存在するようになり、個々の分子の観察が困難になる。そのため、全反射照明蛍光顕微鏡法による蛍光1分子イメージングで解析できる酵素は、基質との親和性が十分高い酵素に限られていた。このような状況の中、ナノ開口を用いた新しい蛍光1分子イメージング法が開発された。ナノ開口はガラス基板上の厚さ100nm程度のアルミフィルムに作製した直径80100nmの穴である。穴の直径に比べて励起光の波長が大きいので、ガラス基板の下から励起光を照射すると、励起光は穴の外には出ることができず、穴の底面ごく近傍に近接場光が生じる。全反射照明法よりさらに微小領域を励起するこの方法を用いることで、数μMでも1分子観察が可能になる。シリコン基板上にナノメートルサイズの加工を施す技術はナノインプリント法、EBナノ加工をはじめ、いくつかの方法がすでに確立され、半導体やメモリ作製に使われているが、ガラス基板上にナノメートルサイズの加工を施す技術は確立されておらず、ナノ開口の作製は容易ではない。これまでにいくつかのナノ開口基板作製手法が報告されているが、Ion Beam Milling法とMetal Lift-off法に大別できる。我々はMetal Lift-off法で、ナノ開口基板を作製している。この1年間、条件検討を繰り返し、安定して石英カバーガラス基板にナノ開口を作製することができるようになった。今後は、自作のナノ開口を使ってDNA組換えやエピジェネティクス制御にかかわるタンパク質の機能解析を行う予定である。