hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ブラジル多文化社会における日本移民の老いとエスニシティに関する文化人類学的考察

平成15年度は、平成13年-14年度にブラジルで行ったフィールドワークの研究成果の口頭発表を以下の二つの学会にて行った。1.2003年7月(5日12日)、イタリア(フィレンッエ)で行われたXV International Congress of Anthropological and EthnologicalScienceの国際会議で研究発表を行う。発表論文のタイトルは、"Those Abandoned Twice-Aging and Ethnicity of Japanese Elderly in Brazil"である。この発表においては、ブラジルの日系老人の老いが、きわめて日本・日本文化との緊密な係わり合い(例えば、日本の年金の受給の有無や家族の日本への出稼ぎ、あるいは、言語や文化的活動など)の中で展開されている社会的・文化的状況についての報告を行った。2.2003年9月23日、東京(中央大学)で行われた第一回日本オーラル・ヒストリー学会設立大会における交流分科会「移民とエスニック・ストーリー」のパネリストとして研究発表を行う。発表論文のタイトルは、「オーラル・ヒストリーにみる日系ブラジル人の老い」である。この発表においては、移民の歴史資料としてのオーラル・ヒストリーの重要性を再確認するとともに、データの収集ならびに保存などの方法論を中心に議論を展開した。また、国際協力事業団の業務委託を受けたサンパウロ日伯援護協会が2003年1月から9月にかけて行われた「ブラジル日系社会高齢者実態調査(要介護者老人実態調査)」の専門家チームに加わり調査協力するとともに、報告書(日系社会高齢者実態調査委員会編「ブラジル日系社会高齢者実態調査(要介護者老人実態調査)」サンパウロ日伯援護協会発行2003年))の執筆・監修を行った。ブラジル連邦共和国サンパウロ州サンパウロ市・グァタパラ地区を中心に行ったフィールドワーク(平成13年8月12日9月24日)において、以下のような研究成果が得られた。(1)I.B.G.E.(Fundaco Instituto Brasileiro de Geografia e Estatistica)の人口動態調査資料は、肌の色(白・褐色・黒・黄色・ネイティブ)という分類に基づいており、日本人・日系人の多くを含んでいる「黄色」の統計は、1950年度において約3.7%であった高齢化率が、1980年には約7.0%に上昇したことを示している。2000年におけるブラジル全体の低い高齢化率(4.5%)から鑑みると、高齢化問題はアジア系エスニック・グループに顕著に発生していることが判明した。(2)サンパウロ日系援護協会事業報告書(1960-2000年)は、老いの過程にエスニック・グループが深く関わっていることを示している。1970年代には生活困窮者としての老人に対する問題意識が芽生え、日系老人のためのホームの建設、老人援助活動の開始、日本の年金取得のための支援体制の整備が行われた。高齢化率が9.7%に達する1988年頃には、増加する要介護者に対応するための福祉施設が設立された。現在は、若・壮年層の日本への流出・定住化に伴い、介護者の不在という深刻な問題に直面している。グァタパラ移住地ではデカセギの影響を強く受け、高齢化率40%という危機的状況下にあることが判明した。(3)個人の老いを分析するために、日系老人福祉施設(憩いの園・サントス厚生ホーム・あけぼのホーム・サクラホーム)や老人クラブにてオーラル・ライフ・ヒストリーの収集を行った。彼らは、老いを文化の問題と捉え、異文化で老いと対峙する老人のために日本文化の環境を提供する日系コロニアに信頼と安らぎを寄せていることが明らかとなった。ブラジル連邦共和国におけるフィールドワーク(平成14年7月31日9月20日)を行い、平成13年・14年をとおして60名の日系老人のオーラル・ライフ・ヒストリーの収集を行った。平成14年度のフィールド・サイトは、サンパウロ都市部以外の日系人口の集中している以下の7地域が選ばれた。[サンパウロ州(スザノ/グァタパラ)リオ・デ・ジャネイロ州(リオ・デ・ジャネイロ/フンシャール)エスピリート・サント州(ヴィトーリア)パラナ州(ロンドリーナ/マリンガ)パラ州(トメアス/ベレン)](1)家族と支援ネットワーク:サンパウロ州以外においては、日系老人福祉施設が整っておらず、家族と同居するケースが多く見受けられた。家族との繋がりが都市部と比べると強いといえよう。しかしながら、現在は若・壮年層の都市部及び日本へのデカセギによる流出・定住化に伴い、地方の日系コロニアにおける介護者の不在が大きな問題として浮かび上がってきている。地方の移住地においては、介護の問題のみならず、その存続すら危ぶまれている状況でもある。(2)経済状況にみる老い:日本国籍を保持したままの日系老人たちの中には、日本からの年金で生活を支えているものがおり、年金需給年齢に達することにより、日本との関係性が急激に変化するケースが認められた。例えば、リオ・デ・ジャネイロ州にあるフンシャール移住地は、そこに居住する過半数の家族が北海道の出身者で構成されている。この移住地には、炭坑離職者が多く、ブラジルで日系老人が受給できる年金平均額の数十倍にあたる炭坑離職者用の年金を日本から受給しており、老いて初めて出身国との繋がりが移住地全体において活性化するケースもあった。

(3)オーラル・ヒストリーにみる老い:文化地方においては、異文化で老いを対峙するために日本文化の環境を提供する日系コロニアの団体に寄せる信頼はとても強く、点在するお年よりたちを繋げる役割をはたしている。したがって敬老の日などの催し物や老人会への興味や参加が非常に高い。エスニック・グループに特有の記憶としてのエスニック・リメンバランス(具体的には、食・言葉や言語表現・歌・踊りなど)が日系コロニアの主導により老いの文化資源として活用されている様が観察された。平成15年度は、平成13年-14年度にブラジルで行ったフィールドワークの研究成果の口頭発表を以下の二つの学会にて行った。1.2003年7月(5日12日)、イタリア(フィレンッエ)で行われたXV International Congress of Anthropological and EthnologicalScienceの国際会議で研究発表を行う。発表論文のタイトルは、"Those Abandoned Twice-Aging and Ethnicity of Japanese Elderly in Brazil"である。この発表においては、ブラジルの日系老人の老いが、きわめて日本・日本文化との緊密な係わり合い(例えば、日本の年金の受給の有無や家族の日本への出稼ぎ、あるいは、言語や文化的活動など)の中で展開されている社会的・文化的状況についての報告を行った。2.2003年9月23日、東京(中央大学)で行われた第一回日本オーラル・ヒストリー学会設立大会における交流分科会「移民とエスニック・ストーリー」のパネリストとして研究発表を行う。発表論文のタイトルは、「オーラル・ヒストリーにみる日系ブラジル人の老い」である。この発表においては、移民の歴史資料としてのオーラル・ヒストリーの重要性を再確認するとともに、データの収集ならびに保存などの方法論を中心に議論を展開した。また、国際協力事業団の業務委託を受けたサンパウロ日伯援護協会が2003年1月から9月にかけて行われた「ブラジル日系社会高齢者実態調査(要介護者老人実態調査)」の専門家チームに加わり調査協力するとともに、報告書(日系社会高齢者実態調査委員会編「ブラジル日系社会高齢者実態調査(要介護者老人実態調査)」サンパウロ日伯援護協会発行2003年))の執筆・監修を行った。
分子レベルで表面設計した固体材料表面の機能発現機構

本研究は以下に示す2つの目的に焦点を当て表面制御・設計を目指した。第一の目的は表面改質により作製した試料表面を原子・分子レベルで定量化を行うことにあった。第二の目的は正確にキャラクタライズした改質試料表面に対し吸着量・吸着熱測定を行なうことで、改質基の量や質と、目的物性発現との間の関係を定量的に明かにし、改質に関する基本原則を確立することにあった。目的にしたがい、トリメチルシリル基を導入した液相合成シリカ表面の表面構造と濡れ性について検討し、以下のような知見を得た。窒素吸着実験、グリニヤール試薬法から、試料にはシランと化学反応可能な表面水酸基が4.2個/nm^2存在することがわかた。改質量は窒素吸着実験及び元素分析から定量でき、任意量の表面を被覆した試料を得ることができた。また、水及び窒素吸着実験から、試料にはマイクロポアが存在する事がわかった。表面改質により、半径0.3nm以下のマイクロポアは改質されず、0.3-0.9nmのマイクロポアは改質反応により閉塞した。前者は表面水酸基と同様に水吸着のサイトに成りうることが示唆された。ネオペンタン吸着実験による等量吸着熱の結果からはシリカ表面元来の性質が改質率約33%以上で消えることが明らかとなった。同改質率以降の試料では、ミクロ的濡れ性の指標である飽和蒸気圧近傍の水蒸気吸着量が理論的な単分子吸着量にも達しないことがわかった。また、分散嗜好性実験からマクロ的濡れ性の変化も同改質率で大きく変化することが示された。以上のように、改質表面を原子・分子レベルで評価した試料を作製し、目的物性発現(濡れ性)との関係を定量的に明かにすることで、第一及び第二の目的を達成することができた。
光子特性可変型レーザー励起超高分解能光電子分光による隠れた秩序相転移の研究

本年度は、URu2Si2の超高分解能三次元光電子分光におけるデータ解析と、昨年度に成果が得られていたVO2の時間分解光電子分光を中心に研究を遂行した。また、本研究課題の対象となっている超高分解能レーザーにおいても一定の成果が得られた。1. URu2Si2の隠れた秩序:超高分解能三次元光電子分光による相補実験放射光を用いてURu2Si2の超高分解能光電子分光を行い、そのデータを解析した。隠れた秩序相転移との関連が議論されていたバンドの面直波数依存性を調べたところ、そのバンドは表面由来であり、相転移とは関係ないことを明らかにした。また、相転移温度の前後で電子状態の周期性が変化する事を見いだし、隠れた秩序相転移は並進対称性を破ることを指摘した。2. VO2の時間分解光電子分光VO2において高次高調波レーザーを用いた時間分解光電子分光実験を継続し、そのデータ解析を行った。光誘起相転移後において、非占有準位側の強度が数十ピコ秒のオーターで残っている事を見いだした。この振る舞いは、電子温度の上昇では説明できず、一つの可能性としてフォノンによるスペクトルのブロードニングを提案した。3. ZrTe3における超高分解能レーザー光電子分光1.5K程度の超伝導転移温度を持つZrTe3において、超高分解能レーザー光電子分光実験を行った。Γ点近傍のフェルミ面において超伝導ギャップが開く事を見いだし、また波数依存性の観測にも成功した。レーザーと相補的な光源である先端放射光を用いて本研究の対象であるUR_<u2>Si_2の研究が進展した事に加え、超高分解能レーザー光電子分光においても本研究課題と関連するテーマで進展が見られたため。(抄録なし)本年度は、URu2Si2のレーザー超高分解能光電子分光におけるデータの解析と超短パルスレーザーの特性を生かした実験である「時間分解光電子分光法」を中心に研究を遂行した。特に時間分解光電子分光については、装置の整備に加え、光誘起金属絶縁体相転移を示すVO2という物質の時間分解光電子測定を行った。以下に得られた成果を示す。1.URu2Si2の隠れた秩序:電子構造における微細構造URu2Si2の超高分解能レーザー光電子分光測定では、光電子スペクトルにバンドの分裂構造が見られていた。新たに光電子強度の偏光依存性解析を行い、分裂構造が独立の行列要素で記述される2本のバンドでは説明できず、単一の電子状態であることが示唆された。これらは隠れた秩序の正体を明らかにする上で、新しい実験的な手がかりとなる事が期待される。2.VO2の時間分解光電子分光光誘起の金属絶縁体転移を起こす物質として知られるVO2において、上述の高次高調波レーザーを用いた時間分解光電子分光実験を行った。時刻ゼロ以降において、フェルミ準位上におけるスペクトルウェイトの増加が観測され、それに対応した変化として結合エネルギー1eV近傍の強度減少が見られた。光電子スペクトルの過渡変化におけるポンプ光パワー依存性を調べてみると、しきい値の存在が示唆された。フェルミ準位における光電子強度の時間変化では、時間分解能170fsよりも速い立ち上がりが観測され、その後3psにかけて線形的な増加が観測された。これらの実験データは、典型的なモット絶縁体で見られるものとは大きく異なり、VO2の絶縁体相が特殊な状態である事を示唆している。URu_2Si_2の成果が論文としてまとまった事に加え、VO_2における時間分解光電子分光実験に成功し、本研究課題で対象であるレーザーの特性を生かした光電子分光実験に進展が見られたため。

レーザーと相補的な光源である先端放射光を用いて本研究の対象であるUR_<u2>Si_2の研究が進展した事に加え、超高分解能レーザー光電子分光においても本研究課題と関連するテーマで進展が見られたため。時間分解光電子分光の対象を、成果が出つつあるVO_2や他の物質等に積極的に広げる。(抄録なし)
神経ガイダンス制御分子CRMPによる細胞内・外位置情報制御と組織構築

脳の発達過程におて軸索や樹状突起のガイダンス制御は、であるセマフォリン3Aやネトリンなどの反発性ないし誘引性の神経ガイダンス分子によって制御されている。コラプシン応答媒介タンパク質(CRMP)はSema3Aの応答を媒介する細胞内タンパク質として同定された。我々は、Sema3Aが軸索内輸送を亢進し、それが海馬神経におけるAMPA型グルタミン酸受容体の局在制御に関わることを見出した。CRMPタンパク質の生体内における役割を明らかとするため、crmp1を初めとするcrmpファミリー遺伝子の欠損マウスを作製し、その表現型を解析した。例えばcrmp1欠損マウスにおいて、胚初期の大脳皮質細胞の移動が遅延する。CRMP1はリーリンシグナルのアダブタータンパク質であるDab1と共局在するリーラーマウス脳においては、CRMP1とDab1は高発現する一方、CRMP1のチロシンリン酸化の水準は低下する。Dab1へテロバックグランドにおけるcrmp1欠損マウスにおいては、リーラーマウス同様に、海馬における細胞の層構造に乱れが生ずる。CRMP1はまたSema3AによるAMPA型グルタミン酸受容体の局在制御とスパインの成熟に関わる。培養皮質神経細胞において、Sema3A適用はシナプス前・後のマーカータンパク質であるシナプシンIとPSD-95タンパク質のクラスター形成を促進するが、crmp1欠損神経細胞においては、この作用が著しく減少する。一方、我々は、ネトリンの局在異常とガイダンス異常を示す線虫変異体を単離した。これらの知見は、グルタミン酸受容体やガイダンス分子の局在制御が、細胞移動や神経回路形成にわたる様々な神経発生のプロセスにおいて重要な役割を果たすことを示す。CRMP1ノックアウトマウスの作製に成功した。表現型を解析した結果以下の知見が得られた。1)マウス胎生期E1418の大脳皮質神経細胞の細胞移動に異常が認められた。2)成熟マウス皮質神経細胞をゴルジ法により染色し、神経細胞の形態を観察したところ、crmp1-/-マウスにおいては神経樹状突起のパターンが異常となり、細胞の分布にも正常とは異なっていた。3)マウスの行動にも幾つかの側面において正常マウスと異なる表現型を示した。4)crmp1-/-皮質神経細胞の培養系における異常も観察された。5)crmp1,fyn, sema3A各々のヘテロ同士の交配と表現型解析により、細胞移動についてはfyn, crmp間にのみ遺伝的相互作用が見出された。CRMP2変異体のノックインマウスは現在作製終了に近づきつつある。神経系組織の構築には細胞分化、細胞移動、細胞間相互作用が複雑に織りなす制御機構が存在することが想定されているが、その詳細は不明である。CRMPファミリータンパク質は軸索ガイダンス分子セマフォリン3A(Sema3A)の情報を媒介する分子として同定されたが、その分子機構は長らく不明であった。我々は、Sema3A応答に、FynおよびCdk5というリン酸化酵素が関わること、CRMP1およびCRMP2のCdk5とGSK3による2ステップのリン酸化を介して起こることを発見した(Sasaki et al,2002;Ucida et al.,2005)。またSema3Aが軸索輸送を充進し、その輸送分子として、その受容体であるニューロピリン-1(NRP-1),プレキシンA(PlexA)に加え、分子Xを見いだしつっある。本年度実績としては、1crmplノックアウトマウスの表現型解析crmpl-/-マウスを作製し、表現型を解析した。

同マウスの大脳皮質神経の樹状突起発達およびスパインの成熟は遅延し、sema3A遺伝子との間で遺伝学的相互作用が存在することが判明した(投稿中)。crmpl-/-マウス大脳皮質ニューロンの細胞移動が遅延すること、この遅延はSema3AではなくReelinシグナルの媒介機能の欠損によることが明らかになった(Yamashita et al,2006).3.受容体およびリガンドの時間的・空間的制御を明らかにする目的で、線虫をモデル動物として用い、もう一つの代表的な軸索ガイダンス分子ネトリンUNC-6/Nerin,ネトリン受容体UNC-5の局在がUNC-51/UNC-14により選択的に制御されていること(Ogura and Goshima,2006)、またガイダンス分子スリットの受容体SAX-3/Roboの細胞における発現をキネシン様分子VAB-8がUNC-73(Rac/RhoGEF)を介して制御すること(Watad-Goshima et al.,2006)を発見した。神経細胞の分化・移動・軸索伸長・神経回路形成の過程には、細胞と細胞外環境に存在する分子との相互作用が必須である。私たちは主要な神経突起のガイダンス(伸展方向を調節する分子)のひとつセマフォリンファミリーのSema3Aの情報伝達を媒介する分子CRMPの分子機構、細胞内外分子の局在機構を中心に、ガイダンス分子の細胞内情報伝達と細胞外マトリックスを含む細胞外環境および組織構築との連関を明らかとする一方,成長円錐部局所のシグナルが神経活動を基盤とする神経細胞の極性や神経回路形成過程に如何に関わるかを形態的・機能的に検証してきた。本年度の成果は、1)CRMP1およびCRMP2が樹状突起パターンの形成やシナプス成熟過程にも関与することを明らかにしたこと2)モデル生物として線虫を用いガイダンス分子ネトリンおよびその受容体UNC-5の局在に異常を示す変異体を単離し、そのメカニズムの一端を明らかとしたこと等である。さらに主にCRMPノックアウトマウスないしリン酸化部位を欠失したCRMP変異体ノックインマウスを作製し、その解析の結果、樹状突起の方向性が逆転するなどの極めて特異な表現型が認められることを発見した。1)CRMPと細胞内輸送: CRMP2の非リン酸化型の細胞への導入がSema3Aによる軸索輸送の亢進作用を抑制すること、この輸送される積荷分子としてNRP-1、Fyn、PlexAを同定し、各々特定の速度分布を持つ輸送粒子群であることを発見した。さらにこの過程に、ある種のイオンチャネル機構が関わることを発見した。このSema3Aによる効果が特定の伝達物質受容体、グルタミン酸受容体GluR2/3の樹状突起における局在制御に関与することを見いだしつつある(投稿準備中)。2)CRMPと細胞骨格制御: Sema3Aシグナルの下流に、CRMP2のCdk5-GSK3bによる2段階のリン酸化と、それによるチュブリン相互作用制御の過程が存在することを見いだした。このリン酸化を受けたCRMP2はAlzheimer病脳の神経原線維の主要な構成成分の一つであることが判明した。さらに、PlexAs、CRMPとアクチン結合蛋白質FilaminAが相互作用することを見出した。
クラミドモナスの鞭毛形態形成が異常な突然変異株の解析

単細胞緑藻クラミドモナスの、鞭毛形態形成が異常な突然変異株の解析を平成3年度に引続き平成4年度も行った。この変異株は、高照度下では鞭毛を形成せず、暗黒下に移すと鞭毛を形成し、その形態は棒状(野生株と同じ)のもの、棒状の途中が円盤状になったもの、全体が円盤状のものまで様々であるという特徴を持つ。まず、暗黒下で形成された変異株鞭毛への光の影響を見た。暗黒下で16時間培養し、約70%の個体に鞭毛を形成させた後、高照度の白色光下に移すと8-12時間後に鞭毛を持つ個体は10%以下に減少し、その形態も円盤状が多くなる傾向が見られた。この結果と、昨年度の、高照度下から暗黒下に移してから約16時間後に80%以上の個体で鞭毛が形成された結果とから、鞭毛形成阻害には細胞周期と関連があることが示唆された。次に、光がどのようにして変異株の鞭毛形成を阻害するのかを短時間で調べるため、以下の実験を行った。野生株及び暗黒下で形成された変異株の鞭毛を機械的に切断除去し、高照度下及び暗黒下での再生過程を観察した。野生株の鞭毛はどちらでも切断後ほぼ2時間で切断前の長さにまで再生した。一方、変異株の鞭毛は、暗黒下では野生株とほぼ同じ再生過程が見られたが、高照度下では切断前の約1/2-2/3までしか再生してこなかった。また、蛋白質合成阻害剤(cycloheximide:20μg/ml)の存在下で同様に鞭毛の再生過程を調べたところ、野生株は高照度下、暗黒下ともに約1/3-1/2の長さまで再生したが、変異株では両所ともに約1/4以下までにしか再生してこなかった。これらの結果から、変異株では鞭毛蛋白質の細胞質中のプール量が鞭毛の長さにして約1/4以下と野生株の半分以下であることと、高照度下では鞭毛蛋白質の合成または活性が阻害されることが考えられた。野生株と交配し、四分子解析したところ変異株の表現型と野生株の表現型が2:2の比率でみられたことから、遺伝子の変異は単一であることが判った。単細胞緑藻クラミドモナスの、鞭毛形態形成が異常な突然変異株loopー1の解析を行なった。このloopー1は、高照度下では鞭毛を形成せず、低照度下に移すと鞭毛を形成し、その形態は野生株と同じ棒状のものから野生株では見られない円盤状(鞭毛膜が膨らみ、その中で軸糸がloop状になっている)のものまで様々であるという特徴を持つ。提出した研究計画に従って報告する。1.高照度(約4,800ルクス)の白色蛍光灯下で培養した突然変異株を低照度下に移し、光学顕微鏡とビデオシステムで観察記録した。その結果、低照度下に移してから10ー16時間で鞭毛が形成されるのが観察された。また、形成された鞭毛は野生株と同じ棒状のものがほとんどであった。

しかし、それら棒状の鞭毛はやがて、その途中が膨らみ、その膨らみが先端へと移動し、棒状の先端が円盤状になった鞭毛となった。それらは、やがて円盤状の部分が根門まで達し、鞭毛全体が円盤状になった。2.円盤状鞭毛を界面活性剤で処理し、鞭毛膜を除去した際の鞭毛軸糸の形態変化を暗視野顕微鏡で観察した。その結果、鞭毛膜を除去しても鞭毛軸糸の形態に変化は見られず、loop状構造を保つ性質が軸糸側にあることが示唆された。3.野生株および突然変異株の鞭毛の微細構造を透過型電子顕微鏡で比較観察した。その結果、野生株鞭毛と同じ棒状構造を持ったものでは、正常な軸糸構造を持っていたが、円盤状になった鞭毛では、軸糸構造がバラバラになり、鞭毛膜内で数回転巻いているのが観察された。また、円盤状に膨らんだ部分には均一な物質が存在しているのが確認された。4.SDSゲル電気泳動で鞭毛構成物質の変化を調べたところ、変異株鞭毛では分子量250kDと7kDが欠損しており、また、240kD、160kD、140kDそして60kDのバンドが新たに出現していた。5.野生株との交配により、四分子解析法で遺伝解析を行なった結果、一遺伝子の変異によると思われる結果を得た。単細胞緑藻クラミドモナスの、鞭毛形態形成が異常な突然変異株の解析を平成3年度に引き続き平成4年度も行なった。この変異株は、高照度下では鞭毛を形成せず、暗黒下に移すと鞭毛を形成し、その形態は棒状(野生株と同じ)のもの、棒状の途中が円盤状になったもの、全体が円盤状のものまで様々であるという特徴をもつ。まず、暗黒下で形成された変異株鞭毛への光の影響を見た。暗黒下で16時間培養し、約70%の個体に鞭毛を形成させた後、高照度の白色光下に移すと8-12時間後に鞭毛を持つ個体は10%以下に減少し、その形態も円盤状が多くなる傾向が見られた。この結果と、昨年度の、高照度下から暗黒下に移してから約16時間後に80%以上の個体で鞭毛が形成された結果とから、鞭毛形成阻害には細胞周期と関連があることが示唆された。次に、光がどのようにして変異株の鞭毛形成を阻害するのかを短時間で調べるため、以下に実験を行なった。野生株及び暗黒下で形成された変異株の鞭毛を機械的に切断除去し、高照度下及び暗黒下での再生過程を観察した。野生株の鞭毛はどちらでも切断後ほぼ2時間で切断前の長さにまで再生した。一方、変異株の鞭毛は、暗黒下では野生株とほぼ同じ再生過程が見られたが、高照度下では切断前の約1/2-2/3までしか再生してこなかった。また、蛋白質合成阻害剤(cycloheximide:20μg/ml)の存在下で同様に鞭毛の再生過程を調べたところ、野生株は高照度下、暗黒下ともに約1/3-1/2の長さまで再生したが、変異株では両所ともに約1/4以下までしか再生してこなかった。これらの結果から、変異株では鞭毛蛋白質の細胞質中のプール量が鞭毛の長さにして約1/4以下と野生株の半分以下であることと、高照度下では鞭毛蛋白質の合成または活性が阻害されることが考えられた。野生株と交配し、四分子解析したところ変異株の表現型と野生株の表現型が2:2の比率で見られたことから、遺伝子の変異は単一であることが判った。
鳥類の卵表面を覆う脂質の定性・定量評価とその機能の解明

鳥類の卵殻は炭酸カルシウムを主成分とし,その外側は多糖類,水酸アパタイトの結晶,脂質,糖タンパク質から成る薄い層で覆われ、細菌などの病原体が卵内に侵入することを防ぐ重要な役割を担っている.しかし,鳥類の卵殻を覆う層の構造や成分はニワトリや一部のガンカモ類を除いてほとんど研究されていない.そこで本研究では,営巣環境の異なるスズメ目鳥類2種であるスズメPasser montanusとシジュウカラParus mionrを対象に,卵殻表面の構造と撥水性を比較することを目的とした.卵殻の撥水性を種間で比較するために,接触角計を用いて卵殻表面に水滴を定着させたときの接触角を測定した.接触角とは,固体表面を基準に液滴の端点における液の角度で,この角度が大きいほど撥水性が高いことを示す.また,各種の卵殻にみられる気孔数を種間もしくは卵殻の部位(鋭角部,赤道部,鈍角部)で比較するため,スズメとシジュウカラの卵殻表面を走査型電子顕微鏡で観察した.シジュウカラの卵では,産卵期と抱卵期を含むグループのほうが未孵化卵のみのグループと比較して卵表面の撥水性が高かった.また,スズメとシジュウカラの未孵化卵の撥水性にはほとんど差はみられなかった.スズメとシジュウカラの卵殻の気孔密度は,2種ともに鋭角部,赤道部,鈍角部にかけて減少し,スズメの気孔密度はシジュウカラより少ないことも明らかとなった.これらのことから,鳥類の卵表面に存在する気孔密度には種間による違いがあること,孵化に至らなかった卵は表面の撥水性が低いことなどが示唆された.本研究で対象とするシジュウカラやスズメなどの鳥類が,順調に巣箱を利用して営巣したため,本研究課題を遂行する上で重要な鳥類の繁殖生態に関する野外データを収集することができた.鳥類を対象とする生態学の分野で,接触角計を用いて卵殻表面の撥水性を測定した研究は,我々の知る限りでは国内にこれまで例がなく,世界的にみてもごく一部の研究者のみが実施している研究課題である.そのような現状で,本研究では,初年度に曲面補正が可能な接触角計を用いて,鳥類の卵殻表面の接触角を適切に測定し,撥水性を定量的に評価することが可能となった.また卵殻表面を走査型電子顕微鏡で観察することで,卵表面にみられる気孔の密度を測定,比較する手法も導入して研究を発展させることができた.さらに,卵殻表面を覆う脂質が,産卵されたときにすでに卵表面を覆っているのか,もしくは,産卵後に親が卵を温める際に抱卵斑とよばれる皮膚が裸出した部分から移行するのかについて,擬卵を用いて実験的に確かめるための手法も確立することができた.鳥類の卵殻表面の撥水性について,種間もしくは繁殖ステージ間(産卵期や抱卵期)の違いを明らかにするためには,同じ条件で複数種の卵表面の撥水性を測定し,それぞれの対象種について各繁殖ステージ間で比較可能な必要最低限以上のデータを効率よく収集する必要がある.また巣箱で繁殖する鳥類を定期的にモニタリングして,繁殖状況を詳細に把握し,適切なタイミングでサンプリングを行うことが必要不可欠となる.このため研究代表者は,この研究課題に関連する野外データの収集と室内実験の作業を,研究分担者と分担して効率よく実施する予定である.調査地は,シジュウカラやスズメが巣箱を利用して例年繁殖している場所で継続的に実施する.これまでに本研究に関連して手法を確立させた卵殻表面を覆う脂質の定性・定量評価,2018年度に新しく自身の研究に導入した接触角計を用いた測定,走査型電子顕微鏡による表面構造の観察,擬卵を用いた野外実験などを用いて,今後は本研究に関する仮説を検証するためのサンプリングを実施していく予定である.鳥類の卵殻は炭酸カルシウムを主成分とし,その外側は多糖類,水酸アパタイトの結晶,脂質,糖タンパク質から成る薄い層で覆われ、細菌などの病原体が卵内に侵入することを防ぐ重要な役割を担っている.しかし,鳥類の卵殻を覆う層の構造や成分はニワトリや一部のガンカモ類を除いてほとんど研究されていない.そこで本研究では,営巣環境の異なるスズメ目鳥類2種であるスズメPasser montanusとシジュウカラParus mionrを対象に,卵殻表面の構造と撥水性を比較することを目的とした.卵殻の撥水性を種間で比較するために,接触角計を用いて卵殻表面に水滴を定着させたときの接触角を測定した.接触角とは,固体表面を基準に液滴の端点における液の角度で,この角度が大きいほど撥水性が高いことを示す.また,各種の卵殻にみられる気孔数を種間もしくは卵殻の部位(鋭角部,赤道部,鈍角部)で比較するため,スズメとシジュウカラの卵殻表面を走査型電子顕微鏡で観察した.シジュウカラの卵では,産卵期と抱卵期を含むグループのほうが未孵化卵のみのグループと比較して卵表面の撥水性が高かった.また,スズメとシジュウカラの未孵化卵の撥水性にはほとんど差はみられなかった.スズメとシジュウカラの卵殻の気孔密度は,2種ともに鋭角部,赤道部,鈍角部にかけて減少し,スズメの気孔密度はシジュウカラより少ないことも明らかとなった.これらのことから,鳥類の卵表面に存在する気孔密度には種間による違いがあること,孵化に至らなかった卵は表面の撥水性が低いことなどが示唆された.

本研究で対象とするシジュウカラやスズメなどの鳥類が,順調に巣箱を利用して営巣したため,本研究課題を遂行する上で重要な鳥類の繁殖生態に関する野外データを収集することができた.鳥類を対象とする生態学の分野で,接触角計を用いて卵殻表面の撥水性を測定した研究は,我々の知る限りでは国内にこれまで例がなく,世界的にみてもごく一部の研究者のみが実施している研究課題である.そのような現状で,本研究では,初年度に曲面補正が可能な接触角計を用いて,鳥類の卵殻表面の接触角を適切に測定し,撥水性を定量的に評価することが可能となった.また卵殻表面を走査型電子顕微鏡で観察することで,卵表面にみられる気孔の密度を測定,比較する手法も導入して研究を発展させることができた.さらに,卵殻表面を覆う脂質が,産卵されたときにすでに卵表面を覆っているのか,もしくは,産卵後に親が卵を温める際に抱卵斑とよばれる皮膚が裸出した部分から移行するのかについて,擬卵を用いて実験的に確かめるための手法も確立することができた.鳥類の卵殻表面の撥水性について,種間もしくは繁殖ステージ間(産卵期や抱卵期)の違いを明らかにするためには,同じ条件で複数種の卵表面の撥水性を測定し,それぞれの対象種について各繁殖ステージ間で比較可能な必要最低限以上のデータを効率よく収集する必要がある.また巣箱で繁殖する鳥類を定期的にモニタリングして,繁殖状況を詳細に把握し,適切なタイミングでサンプリングを行うことが必要不可欠となる.このため研究代表者は,この研究課題に関連する野外データの収集と室内実験の作業を,研究分担者と分担して効率よく実施する予定である.調査地は,シジュウカラやスズメが巣箱を利用して例年繁殖している場所で継続的に実施する.これまでに本研究に関連して手法を確立させた卵殻表面を覆う脂質の定性・定量評価,2018年度に新しく自身の研究に導入した接触角計を用いた測定,走査型電子顕微鏡による表面構造の観察,擬卵を用いた野外実験などを用いて,今後は本研究に関する仮説を検証するためのサンプリングを実施していく予定である.2018年度に計画していた一部の実験については、サンプル数が十分得られる見通しのたった次年度に実施したほうが合理的と判断したため、次年度使用額が生じた。これらは前年度より多く得られる見込みのサンプルの処理や、得られた成果の発表する際に使用する予定である。
和算、特に数論と円理の西欧数学との比較研究、及びその視点を活かした中等教育の実践

和算を軸とした数学史全般について原典の解読,研究を進めた.特に,関孝和の数論と円理について中国伝来の解法および西欧での研究との比較検証を進めた.また,数学史の研究,原典の解読の成果をもとに,学習指導要領「数学活用」をはじめ高校1年「数学I」「数学A」の[課題学習]及び総ての科目において,数学史の視点を活かした授業の研究,さらに生活の中に活きている数学について発見,気付かせる授業の研究,実践を進めた.特に「数学活用」, [課題学習]では,生徒による主体的な数学的活動の充実,アクティブラーニングの取り組み,研究,実践と教材研究,作成を続けた.今年度は主に授業実践に力を注ぎ,研究発表としては8月上旬日本数学教育学会の全国算数・数学教育研究岐阜大会で12年に亘る授業の実践報告を行った.また, 8月下旬全国和算研究大会愛媛大会に参加,伊佐爾波神社に伝わる算額の研究を進め, 3月には重ねて同地で調査,研究を続けた.また同3月NPO法人和算を普及する会主催「算額をつくろうコンクール」表彰式において司会を務めた.例年参加してきた京都大学数理科学研究所の研究集会「数学史の研究」は日程が9月となったため,勤務校授業と重なり参加できなかった.そのほか,共立出版に於ける数学文献を読む会など多数の学会,研究会に参加し,研鑽を積むとともに,原典,特に関孝和,建部賢明,賢弘兄弟による『大成算経』と中国南宋の数学者秦九韶の『数書九章』の精読に努めた.数学史の専門的な研究と中等教育における授業研究は直接的な関連が薄いとも考えられるが,数学嫌いを多く生んでいる現状を鑑み,数学の本質的な意義,良さを伝えるため,数学が拠って生まれ来るその歴史を踏まえた授業の実践,先人達が築き上げた数学的な実りとそれに至る数学的営みをよく理解した上で教壇に立つことが肝要と考え,数学史の研究とその視点を活かした授業の研究,実践を試みている.和算を軸とした数学史全般について原典の解読,研究を進めた.特に,関孝和の数論と円理について中国伝来の解法および西欧での研究との比較検証を進めた.また,数学史の研究,原典の解読の成果をもとに,学習指導要領「数学活用」をはじめ高校1年「数学I」「数学A」の[課題学習]及び総ての科目において,数学史の視点を活かした授業の研究,さらに生活の中に活きている数学について発見,気付かせる授業の研究,実践を進めた.特に「数学活用」, [課題学習]では,生徒による主体的な数学的活動の充実,アクティブラーニングの取り組み,研究,実践と教材研究,作成を続けた.今年度は主に授業実践に力を注ぎ,研究発表としては8月上旬日本数学教育学会の全国算数・数学教育研究岐阜大会で12年に亘る授業の実践報告を行った.また, 8月下旬全国和算研究大会愛媛大会に参加,伊佐爾波神社に伝わる算額の研究を進め, 3月には重ねて同地で調査,研究を続けた.また同3月NPO法人和算を普及する会主催「算額をつくろうコンクール」表彰式において司会を務めた.例年参加してきた京都大学数理科学研究所の研究集会「数学史の研究」は日程が9月となったため,勤務校授業と重なり参加できなかった.そのほか,共立出版に於ける数学文献を読む会など多数の学会,研究会に参加し,研鑽を積むとともに,原典,特に関孝和,建部賢明,賢弘兄弟による『大成算経』と中国南宋の数学者秦九韶の『数書九章』の精読に努めた.数学史の専門的な研究と中等教育における授業研究は直接的な関連が薄いとも考えられるが,数学嫌いを多く生んでいる現状を鑑み,数学の本質的な意義,良さを伝えるため,数学が拠って生まれ来るその歴史を踏まえた授業の実践,先人達が築き上げた数学的な実りとそれに至る数学的営みをよく理解した上で教壇に立つことが肝要と考え,数学史の研究とその視点を活かした授業の研究,実践を試みている.
メニスカスにおけるDNAの伸長ダイナミクスの解明

これまで申請者は、DNA水溶液上にカチオン性の両親媒性化合物を展開し、静電的相互作用により気水界面に形成したDNA分子とのポリイオン複合膜をLangmuir-Blodgett(LB)法により、単分子膜に流動性を持たせた状態で固体基板上に移し取ると、溶液中ではランダムコイル形状であったDNA分子が伸長して固定化されることを見い出してきた。伸長・固定化された個々DNAA分子は長さ解析の結果、単一分子であることが明らかとなり、また二重らせんDNA鎖をほぼ伸び切り構造で2次元に配列することができることを示した。しかし、DNAが伸長するメカニズムは明らかになっていない。そこで研究では、これまで未開拓であったメニスカスにおける高分子鎖のダイナミクスの計測技術の開発を通じて、LB法によるDNAの伸長機構を明らかにすることを目的とした。DNAが気体・液体・固体の三相が交差するメニスカスにおいて伸長されることから、メニスカスでのDNA分子の運動を観察できる蛍光顕微鏡システムを構築した。このシステムを用いてDNA水溶液上にジアルキルアンモニウム塩(2C_<18>N^+2C_1)を展開することで気液界面に形成した2C_<18>N^+2C_1/DNAポリイオン複合単分子膜の観察を行った。その結果、糸まり状のDNAがメニスカス境界部分で数秒間滞留し、その後基板状に伸長した状態で固定化されていく様子が観察された。一方、溶液中のDNAはメニスカス部分で対流を行うだけで固定化されないことが分かった。一度固定化した伸長DNAを90度回転させて引き上げを行ったところ、部分的に強固な接着点が存在することが解明された。また、山形大学・佐野研究室との班内共同研究によって、Langmuir-Blodgett(LB)法により、DNA分子の伸長固定化を利用することで、これまで伸長・配向化が困難とされてきたカーボンナノチューブの伸長固定化を行った。DNAとカーボンナノチューブを水溶液中で混合し、DNAが巻き付いたカーボンナノチューブ複合体を作製し、これをLB法により固体基板上に伸長・固定化できることがわかった。伸長・固定化された個々DNA分子は長さ解析の結果、単一分子であることが明らかとなり、また二重らせんDNA鎖をほぼ伸び切り構造で2次元に配列することができることを示した。そこで本申請では、これまで未開拓であったメニスカスにおける高分子鎖のダイナミクスの計測技術の開発を通じて、LB法によるDNAの伸長機構を明らかにすることを目的とした。メニスカスにおける蛍光イメージのその場観察を行うための装置の作製を行った。ガラス基板を通してメニスカス付近の水面単分子膜内のDNA分子の蛍光イメージングを行うために、LBトラフを改造して設備備品として申請した超焦点距離を持つ対物レンズで水平に観察できるよう実験装置を作製した。これにより、両親媒性化合物単分子膜に結合したDNA分子のダイナミクスを実時間で観察することで、どの時点で弛緩して糸まり状になっていたDNA分子が伸長するのかを調べることが可能となる。DNA分子の伸長と単分子膜の物性との相関を調べるために、様々な物性を有する両親媒性化合物を新規に合成して単分子膜を作製した。

また、山形大学・佐野研究室との班内共同研究によって、Langmuir-Blodgett(LB)法により、DNA分子の伸長固定化を利用することで、これまで伸長・配向化が困難とされてきたカーボンナノチューブの伸長固定化を行った。DNAとカーボンナノチューブを水溶液中で混合し、DNAが巻き付いたカーボンナノチューブ複合体を作製し、これをLB法により固体基板上に伸長・固定化できることがわかった。
ビタミンEフリーラジカル捕捉反応生成物の高感度分析法の開発と生体への応用

ビタミンEの脂質フリーラジカル捕捉反応生成物の高感度分析法を,電気化学検出器を装備したHPLCを用いて検討し,ヒト血漿の分析に応用した。ビタミンE反応生成物は,キノン体(TQとepoxyTQ),リン脂質ペルオキシルラジカルとの付加体(TOOPC),コレステロールエステルとの付加体(TOOCE)を用いた。全ての化合物の同時分析は不可能であったので,個別の分析条件を検討した。まずキノン体は,HPLCカラムで分離した後,亜鉛粉末を充填したカラムを通過させることによってヒドロキノン体とし,これを電気化学的に検出することで高感度分析が可能となり,同時にビタミンEが分析できた。一方,TOOPCとTOOCEは,白金黒を充填したカラムを通過させることによってビタミンE部位をヒドロキノン体に還元し,これを電気化学検出することで高感度分析が可能となった。次に,このHPLC-電気化学検出法を生体試料分析へ適用する際の試料調製法を検討した。ビタミンE反応生成物を添加したヒト血漿より総脂質を抽出し,固相抽出カラムによってクロロホルム溶出区分(ビタミンE,TQ,epoxyTQ及びTOOCE)とメタノール溶出区分(TOOPC)に分けHPLC分析したところ,各化合物とも十分な回収率を得た。そこで,本法をヒト血漿の過酸化反応時における内在性ビタミンEの作用機構解明に応用した。すなわち,ヒト血漿に対して過酸化反応を起こさせ,反応溶液中の過酸化脂質量とビタミンE及びその反応生成物を分析した。その結果,過酸化反応による内在性ビタミンEの消失と,反応生成物としてTQ,epoxyTQ,TOOCE及びTOOPCの生成を確認することができた。以上の結果より,本HPLC-電気化学検出法は,生体試料中のビタミンEとその脂質フリーラジカル捕捉反応生成物を高感度で特異的に分析することができ,生体内脂質過酸化反応におけるフリーラジカル捕捉剤としてのビタミンEの役割を解明するための強力な手法となりうることが示された。ビタミンEの脂質フリーラジカル捕捉反応生成物を高感度に分析する方法を確立した。まず,ビタミンE-リン脂質ペルオキシルラジカル付加体について化学発光検出法を検討した。HPLCで分離した付加体を酸性条件下でルシフェリン誘導体および鉄キレートと反応させたところ化学発光が生じ,本付加体の選択的高感度検出が可能となった。一方,電気化学検出器を用いた方法についても検討したところ,全てのビタミンE反応生成物を同時に分析することは不可能であったので,キノン体とリン脂質ペルオキシルラジカル付加体をそれぞれの条件で分析することとした。まず,キノン体は,HPLCカラムで分離した化合物を亜鉛粉末を充填したカラムを通過させることによってヒドロキノン体とし,これを電気化学的に検出することによって高感度に分析することができ,この条件で同時にビタミンEの分析も可能であった。一方,リン脂質ペルオキシルラジカルとの付加体は,白金黒を充填したカラムを通過させることによってビタミンE部位をヒドロキノン体に還元し,これを電気化学検出することによって高感度分析が可能となった。次に,これらの分析手法を生体試料へ適用する際の条件について検討した。ヒト血液より総脂質をクロロホルム/メタノールで抽出し,得られた脂質溶液を直接HPLC-電気化学検出法で分析したところ種々の妨害ピークが認められた。そこでHPLC分析の前処理として、脂質溶液をシリカゲルNH_2固相抽出カラムにのせ,クロロホルムとメタノールで順次溶出させた。

その結果,クロロホルム溶出区分からはビタミンEとキノン体が,メタノール溶出区分からは付加体がそれぞれ回収された。この前処理操作は,1つの生体試料から全てのビタミンEフリーラジカル捕捉反応生成物の分析試料を調製することができるので,今後,この手法を使用して生体内脂質過酸化におけるビタミンE反応生成物を検討していく予定である。ビタミンEの脂質フリーラジカル捕捉反応生成物の高感度分析法を,電気化学検出器を装備したHPLCを用いて検討し,ヒト血漿の分析に応用した。ビタミンE反応生成物は,キノン体(TQとepoxyTQ),リン脂質ペルオキシルラジカルとの付加体(TOOPC),コレステロールエステルとの付加体(TOOCE)を用いた。全ての化合物の同時分析は不可能であったので,個別の分析条件を検討した。まずキノン体は,HPLCカラムで分離した後,亜鉛粉末を充填したカラムを通過させることによってヒドロキノン体とし,これを電気化学的に検出することで高感度分析が可能となり,同時にビタミンEが分析できた。一方,TOOPCとTOOCEは,白金黒を充填したカラムを通過させることによってビタミンE部位をヒドロキノン体に還元し,これを電気化学検出することで高感度分析が可能となった。次に,このHPLC-電気化学検出法を生体試料分析へ適用する際の試料調製法を検討した。ビタミンE反応生成物を添加したヒト血漿より総脂質を抽出し,固相抽出カラムによってクロロホルム溶出区分(ビタミンE,TQ,epoxyTQ及びTOOCE)とメタノール溶出区分(TOOPC)に分けHPLC分析したところ,各化合物とも十分な回収率を得た。そこで,本法をヒト血漿の過酸化反応時における内在性ビタミンEの作用機構解明に応用した。すなわち,ヒト血漿に対して過酸化反応を起こさせ,反応溶液中の過酸化脂質量とビタミンE及びその反応生成物を分析した。その結果,過酸化反応による内在性ビタミンEの消失と,反応生成物としてTQ,epoxyTQ,TOOCE及びTOOPCの生成を確認することができた。以上の結果より,本HPLC-電気化学検出法は,生体試料中のビタミンEとその脂質フリーラジカル捕捉反応生成物を高感度で特異的に分析することができ,生体内脂質過酸化反応におけるフリーラジカル捕捉剤としてのビタミンEの役割を解明するための強力な手法となりうることが示された。
肺腺癌の初期浸潤にかかわるマトリックスメタロプロテアーゼ関連分子の同定

[目的]肺腺癌細胞が浸潤し転移する機構を解明することで、浸潤、転移の早期発見や的確な治療方法の開発が可能になる。癌細胞が細胞外器質を分解する酵素として種々のマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)が発見されてきている。本研究では肺腺癌の初期浸潤にいかなる種類のMMPが重要な役割を担っているのかを明らかにすることを目的とした。[方法]直径20mm以下の初期肺腺癌40症例について初期浸潤の形態指標となる活性化線維芽細胞の有無とゼラチンザイモグラフィーを用いた各種MMPの発現量と活性化量との関係を検討した.[結果]MMP-2,MMP-9の発現総量およびそれぞれの活性化量は肺腺癌の腫瘍直径と関係は見られなかった。肺腺癌の浸潤初期の組織形態指標である活性化線維芽細胞の癌病巣内への出現の有無とMMPの関連では活性化線維芽細胞の有無にかかわらずMMP-2の総発現量に有意な差は見られなかったが、活性化線維芽細胞の存在する肺腺癌のMMP-2は活性化線維芽細胞の存在しない肺腺癌のMMP-2に比較して高率に活性化されており、活性化線維芽細胞存在肺腺癌において活性化MMP-2は有意に高値を示していた。MMP-9の総発現量と活性化線維芽細胞の有無との間にはMMP-2と同様に有意な関係は認められなかった。活性化MMP-9量と活性化線維芽細胞の有無との間にはMMP-2で見られた様な関係は見られず、殆どの肺腺癌ではMMP-9は高率に活性化されていた。[考察]肺腺癌において非浸潤癌に比較し初期浸潤癌ではMMP-2の活性化量が増加していることより、肺腺癌が初期浸潤する過程では活性化されたMMP-2が重要な役割を担っていることが明らかとなった。1.小型の肺腺癌でのMMP2,MMP9の活性化量と組織形態像の関係本年度の研究で小型の肺腺癌の手術例59例についてgelatin zymographyを用いてMMP-2,MMP-9の活性化量と肺腺癌組織像との関係を明らかにした.線維芽細胞の増生巣のある腺癌と増生巣のない腺癌ではMMP-2,MMP-9の総量に差はなかったが、活性化MMP-2の量は線維芽細胞増生巣のある腺癌で高値を示した。すでに我々の研究では線維芽細胞増生巣のある肺腺癌は増生巣のない肺腺癌に比べ生命予後が悪いことを明らかにし,線維芽細胞増生巣の有無が癌の浸潤の有無に対応している可能性を考えてきたがその根拠は得られていなかった.今回の結果で線維芽細胞増生巣の有無とMMP-2活性化量との間に相関が認められたことで線維芽細胞増生巣の存在は癌浸潤に関係しており,肺腺癌の初期浸潤にはMMP-2活性化が重要な因子の1つであることを明らかにすることができた。2.Film in situ zymography(FIZ)を用いてより詳細に浸潤部でのMMP-2活性の局在を解析することを目的に研究を計画した.

まずFIZの有用性を検証するために上皮内癌,微小浸潤癌などの形態的所見が明確な子宮頚部腫瘍(異形成,上皮内癌,微小浸潤癌)についてFIZによりMMP-2の局在活性発現の検討を行った。MMP-2活性は病変部で一様に見られる様式(HOP : homogenous pattern)と不均一に見られる様式(HEP : heterogenous pattern)に分けられた.すでに異形成の段階でMMP-2活性が見られたが発現様式はHEPのみ,上皮内癌ではHEPとHOP、浸潤癌になるとHOPのみを示していた.これより癌の初期浸潤にはMMP-2活性の発現の有無だけでなく発現様式が重要であることが示された。3.非浸潤肺腺癌と初期浸潤肺腺癌についてmacro arrayを用い非浸潤腺癌と初期浸潤腺癌での遺伝子発現の相違についてMMP関連遺伝子を含めて検討を開始した.肺腺癌の初期浸潤にかかわるマトリックスメタロプロテアーゼ関連分子の同定を行うことを目的として我々は、平成13年度の研究により肺腺癌の初期浸潤にはmatrix metaloproteinase-2 (MMP-2)の活性化が重要な因子の1つであり、MMP-2活性化量と肺腺癌病巣内での線維芽細胞の出現との間に関係のあることを明らかにした.平成14年度は肺腺癌病巣内で癌細胞と線維芽細胞の相互作用時に,どちらの細胞がMMP-2産生の主たる細胞かを明らかにすることを目的としてlaser capture microdissection (LCM)法とreal time reverse transcription polymerase chain reaction (real time RTPCR)を組み合わせた方法で検討を行った.ヒト肺腺癌14症例の凍結組織標本からLCM法で癌細胞と癌病巣内間質の線維芽細胞のそれぞれに分けて細胞を採取し、MMP-2遺伝子の発現量をreal time RT-PCR法で解析した.また同一標本でGelatin zymography法および免疫組織化学を行い、MMP-2タンパクの活性化量や局在性とMMP-2遺伝子の発現量との関係を検討した.その結果、MMP-2遺伝子は浸潤部,非浸潤部の癌細胞に比較して線維芽細胞では5倍以上高く発現していることが明らかとなった.免疫組織染色でMMP-2タンパク発現を解析しても遺伝子解析と同様に癌病巣内線維芽細胞でMMP-2タンパクの発現が見られた一方、癌細胞での発現は見られなかった.しかしGelatin zymography法にてMMP-2活性量を解析したが,これと遺伝子発現量との間には相関は見られなかった.これはMMP-2の活性化が多因子により調整されているためと考えられた.以上,肺腺癌の浸潤において間質の線維芽細胞から産生されるMMP-2が癌細胞との相互作用により活性化されることが示唆された.平成13,14年度の研究により肺腺癌の初期浸潤にはmatrix metaloproteinase-2(MMP-2)の活性化が重要な因子の1つであり、MMP-2活性化量と癌病巣内での線維芽細胞出現との間に関連のあることを明らかにし研究成果を論文として発表した(Cancer Sci 2004;95 & Pathol Int 2004:54).本年度はまず非浸潤肺腺癌手術2症例についてcDNA filter array(MMP関連遺伝子を含む550種類の癌関連遺伝子がプロットされている)を行ったところ癌部は非癌部に比較してMUC1,RhoGDI-beta, alpha-Hexosaminidase, MIP3-betaが高発現していることを明らかとした.さらにsupression subtractive hybridization(SSH)法を用いて肺腺癌における初期浸潤部で特異的に発現しているMMP関連遺伝子の網羅的な解析を行った.3症例の初期浸潤肺腺癌の癌部と非癌部のそれぞれから抽出したmRNAでSSH法を行い癌部で特異的に発現している遺伝子を19個クローニングした.さらクローニングした遺伝子について別の初期浸潤肺腺癌4症例で検討したところ7