hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PETブレインバンクの構築

PIB(アミロイドベータタンパク質)、[^<11>C]TMSX(アデノシンA_<2A>受容体)など、疾患データベースとしては、パーキンソン病の[^<11>C]TMSX(アデノシンA_<2A>受容体)、[^<11>C】CFT(ドパミントランスポータ)及び[^<11>C]raclopride(ドパミンD_2受容体)、アルツハイマー病及び非アルツハイマー病変性型認知症の[^<11>C]PIB、脳虚血の[^<11>C]flumazenil(中枢性ベンゾジアゼピン受容体)と[^<11>C]MPDX(アデノシンA_1受容体)、統合失調症の[^<11>C]SA4503(シグマ_1受容体)などである。[^<11>C]FLB457と[^<11>C]TMSXについてはTest-retestにより、計測の再現性を確認した。PET計測全般では、MRIの解剖学的標準化技術を用いたPETの関心領域設定の自動化を進めた。異なる施設で頭部ファントムを用いて脳画像データを収集してカメラ間のデータ校正法をし、健常者脳FDG-PETデータベースの施設間の補正を行った。新しい脳機能診断薬としてμオピオイド受容体を計測する[^<11>C]carfentanilの合成法を確立し、品質管理法などを定めて、所内のPET薬剤委員会の承認を得て臨床使用を開始し、Test-retestから安定した参照領域法による計測法を定めた。
DNAポリメラーゼ反復反応を用いる新しい違伝子操作法と部位特異的変異導人法の開発

高度耐熱性DNAポリメラーゼの反復反応(Polymerase chain reactio,PCR)を利用すると、極微量の特定の遺伝子を10万倍以上に増幅ることができる。本研究は、このPCR法をより積極的に応用して、これまで遺伝子組換えの際に必須であったゲノムDNAのライブラリーやcDNAライブラリーを作成することなく、目的遺伝子のみを特異的に増幅しクローニングする簡便な方法や、制限酵素切断部位に関係なくDNA断片を連結または削除する方法、さらに任意の部位にヌクレオチドの置換、挿入、欠失などの変異を導入する新しい方法を開発することを目的とした。特に、人為的変異導入においては、1回の操作により全てのコドンに対応する変異遺伝子を一挙に作成する方法の確立を目指した。平成2年度平成4年度の研究成果の概要は以下の通りである。1)好熱菌のアスパラギン酸トランスフミナーゼの活性部位リジン残基を変異導入の標的部位として、PCR法により1回のクローニング操作で同時に20種類のアミノ酸残基に置換する新しい方法を開発した。2)高等植物のUDP-グルコースピロホスホリラーゼのcDNAを鋳型として、構造遺伝子部分をPCR法で増幅して大腸菌内高発現プラスミドを構築した。プライマー中に新規制限酵素部位を容易に導入できた。3)動物アデニル酸キナーゼの基質結合部位にPCR法でランダムに変異を導入し、種々の変異型酵素の迅速なスクリーニング法を確立した。4)基質特異性や細胞内局在性を異にする高等植物α-グルカンホスホリラーゼの2種のアイソザイムcDNA中の種々の領域をPCRによって増幅し、増幅DNA断片を連結することにより両アイソザイムのキメラ酵素を構築した。キメラ酵素は元の酵素のいずれよりも非常に高い基質に対する親和性を示すことが判明した。平成2年度(初年度)の研究においては、まず、PCRを応用して、1回のクロ-ニング操作によりタンパク質中の特定アミノ酸残基を全20種類のアミノ酸残基に置換する新しい部位特異的変異導入法を開発した。変異導入の標的部位として,本研究代表者らが先に遺伝子のクロ-ン化と全一次構造の解析を行った好熱性細菌,<Bacillus>___ーsp.YMー2の耐熱性アスパラギン酸トランスアミナ-ゼの補酵素ピリドキサルリン酸結合リジン残基を選び、本酵素遺伝子を含むプラスミドをPCRの鋳型として用いた。4種類のオリゴヌクレオチド(うち2種類は標的リジン残基のコドンがA,G,C,Tの4種類のランダムな塩基となっている)を合成し,これらをプライマ-として2通りのPCRを行った。増幅されたDNA断片を連結して大腸菌に形質転換した結果、約1200個のアンピシリン耐性コロニ-が得られた。イムノブロットで陽性,活性染色で陰性のコロニ-約50個を選び、これらのクロ-ン株からプラスミドを単離して、ジデオキシ法によるシ-ケンス解析を行った結果,標的部位のみがリジン以外の種々のアミノ酸残基のコドンに置換されていることが明らかとなり,本方法が実験計画通りに実施しうることが示された。即ち,本方法は部位特異的変異導入において,1回のクロ-ニング操作で同時に20種類のアミノ酸残基に置換するのに極めて有効な手段である。一方、PCRを利用する新しい遺伝子クロ-ニング法の開発についても,研究を開始し,既に植物UDPーグルコ-ス・ピロホスホリラ-ゼcDNAから,PCRを利用することにより新規制限酵素部位を導入し,本酵素の発現プラスミドを構築することができた。しかし,PCR反応中に目的部位以外の箇所で塩基置換などの変異が起こる場合も観察されたので、今後は、反応条件の改良やプライマ-の特異性をさらに高める工夫を施すことなどにより,これらの問題点を解決したいと考えている。

未熟ジャガイモ塊茎より単離したUDP-グルコ-スピロホスホリラ-ゼのcDNAを大腸菌内で発現させるため、CDNA中の構造遺伝子部分をPCR法を用いて増幅し、プライマ-中に導入した新規制限酵素切断部位を利用することにより、発現ベクタ-pTV118-N中に増幅DNA断片を組み込んだ。得られたプラスミドpTUGを大腸菌にトランスフォ-ムレ、この組換え株をIPTG添加培地で培養した結果、全可溶性タンパク質の約5%に相当する本酵素が大腸菌細胞内で生産された。大腸菌中で発現された本酵素は、2段階のカラムクロマトグラフィ-操作で容易に精製することができた。均一に精製した本酵素は、アミノ末端残基のアセチル化の有無を除いて、ジャガイモ塊茎から精製した酵素と構造的にも触媒機能的にも同一であった。このように、通常そのまま大腸菌系ベクタ-に組み込んでも発現が困難な真核生物由来のcDNAでも、PCR法を利用してその構造遺伝子部分のみを増幅してからベクタ-と接続することにより、タンパク質として発現されることが本研究により明らかになった。次に、ニワトリ骨格筋由来アデニル酸キナ-ゼcDNAを鋳型として、その基質AMPの結合に関与すると推定される残基へのランダムな変異導入をPCR法により検討した。本酵素中の保存性の高い2つの残基、Val67及びGln101に対応するコドンにAGCT混合の塩基を含むオリゴヌクレオチドをランダムプライマ-としてデザインし、PCR法を行った。本酵素に対するウサギ抗血清を用いて、本酵素タンパク質を発現している形質転換株を選択するとともに、大腸菌のアデニル酸キナ-ゼ温度感受性変異株を宿主とし、その45°Cでの生育を指標とすることによって、酵素活性を有する変異型酵素をスクリ-ニングした。その結果、11種類のVal67変異型酵素と6種類のGln101変異型酵素が得られ、PCR法によるランダム変異導入の新しい方法を確立できた。高等植物細胞内には,基質に対する親和性や細胞内局在性を異にする2種類のα-グルカンホスホリラーゼ・アイソザイムが存在する。われわれのこれまでの研究により、デンプンやグリコーゲンなどの分岐鎖グルカンに対して高い親和性をもつH型アイソザイムとジャガイモ塊茎などのデンプン集積器官に特に著量発現しており分岐鎖グルカンに対して低い親和性を示すL型アイソザイムに区別できることが明らかになっている。本年度の研究においては,基質特異性と両アイソザイムの構造との相関を明らかにすることを目的として,PCR法を駆使して両アイソザイムのキメラ酵素を作成した。キメラ酵素遺伝子を構築する場合には、通常既に存在する制限酵素部位を利用する方法が用いられるが、当然ながら接続(あるいは欠失)できるDNA断片の領域に制約を受けるため、望み通りのキメラ遺伝子を構築できる場合が少ない。そこで,PCR法により任意の部位に制限酵素切断部位を導入する方法を考案した。すなわち,DNAポリメラーゼ反応は5'→3'の方向に進行するが、プライマーの全体で鋳型と相補的である必要はなく,3'末端側のみ相補的であれば5'末端側は鋳型のDNA配列と全く関係がなくても反応することが判明した。
知識コラボレーションを指向したソフトウェア開発演習環境の研究

本研究では、大学等高等教育機関において、グループによるソフトウェア開発演習を支援する環境構築を目的とした。特に、ソフトウェア開発を問題解決過程ととらえ、ソフトウェア開発における開発成果物に対して、それと関連付けて問題解決や知識獲得の軌跡を残すことにより個人の内省を促すとともに、個人で解決できない問題に対してグループメンバー等との協調的な問題解決を促進させる演習支援環境を構築した。そして、それを大学の演習に実適用を行い、その有効性を実証的に明らかにした。適用の結果、蓄積された知識の大部分は実装に関する技術的なものであることがわかった。また、学習者は自身が抱えている問題を解決する情報が存在するにもかかわらず、それに気づかず、教師等により知識の所在に関する仲介がなされていることが観測された。本研究は、高等教育機関におけるチームによるソフトウェア開発演習を支援する環境に関する研究を行うものである。本研究ではソフトウェア開発を問題解決過程ととらえ、ソフトウェア開発の全工程における開発成果物に対して、それと関連付けて問題解決や知識獲得の軌跡を残すことにより個人の内省を促すとともに、個人では解決できない問題に対して、グループメンバー、クラスのメンバー、教授者、外部リソースとのコラボレーションを通した問題解決過程を促進させるプロセスモデルを提案した。問題解決の軌跡を記録するために「失敗学」で規定されている6つの属性を採用した。そして、このモデルに基づく支援システムのプロトタイプ並びに基盤となるフレームワークを構築した。構築したシステムをチームによるソフトウェア開発演習の一部の工程に適用を行った。その結果、一部の学習者には効果的に利用されかつ有益な情報が蓄積された。その一方で、クラス全体に浸透するには至らなかった。適用結果から明らかになった問題点の分析を行うとともに、次年度の研究に向けた検討課題を明らかにした。研究成果を以下のように公表を行った。1.プロジェクトの構想と枠組モデルについて国際ワークショップ(査読付)において発表2.プロトタイプシステムについて、国内ワークショップにおいて発表3.プロトタイプの適用結果について査読付国際会議に投稿したところ、ポスター発表として掲載されることになった(口頭発表は2007年度に実施予定)。ソフトウェア開発を問題解決過程ととらえ、ソフトウェア開発の全工程における開発成果物に対して、それと関連付けて問題解決や知識獲得の軌跡を残すことにより個人の内省を促すとともに、個人では解決できない問題に対して、チームメンバー、クラスのメンバー、教授者、外部リソースとのコラボレーションを介した問題解決過程を促進させるプロセスモデルを提案した(平成18年度の成果)。本年度はこのモデルを基礎とした支援システムを開発した。そして、大学の演習に実適用を行った。その結果として以下のことが明らかになった。・53件の問題解決情報と8件の問い合わせ情報が蓄積された。8件に問い合わせについて、39件のメッセージ交換がなされた・そのほとんどはコーディング工程に関するものであり、コーディングにおける問題解決が頻繁に起こり、そのニーズが高いことが明らかになった・蓄積された問題解決情報の94%が他者から有益であると評価された。また問題解決情報の70%には内省がなされたことがわかった・タイムリーな情報は参照頻度が高いことが明らかになった。一方、開発が終了してから登録された問題解決情報も少なからずあった以上のように、今年度の適用により本手法の有効性が明らかになった。一方、問い合わせの数が少なかったこと、また登録された問題解決情報が開発終了後に登録されたことから、情報をよりタイムリーに収集できるように他の機能と連動させる仕組みについて継続研究を行う予定である。本テーマに関連して5件の学会発表を行った。そのうちの1件は「情報処理学会第70回全国大会」において学生奨励賞を受賞した。本研究では、大学等高等教育機関において、グループによるソフトウェア開発演習を支援する環境構築を目的とする。特に、ソフトウェア開発を問題解決過程ととらえ、ソフトウェア開発の全工程における開発成果物に対して、それと関連付けて問題解決や知識獲得の軌跡を残すことにより個人の内省を促すとともに、個人では解決できない問題に対してグループメンバー、クラスメンバー、外部リソースとのコラボレーションを通した問題解決を促進させる演習支援環境を構築し、それを大学の演習に適用し、その有効性を実証的に明らかにすることを目指した。そのために、問題解決プロセスモデルを提案し、提案モデルを実現する支援環境をWebアプリケーションとして実現した。開発した支援環境を、平成19年度と平成20年度の2回の大学で開講しているソフトウェア開発演習に実適用した。その結果,以下のことが明らかになった:・登録された問題解決情報の大多数はプログラミングに関するものであった.これは2回の適用において同じような傾向であった・問題解決情報の大部分は「作り方」に関するものであり、「進め方」に関するものは僅かであった・問題解決

情報並びに質問・回答の共有については全員が意義を認めた・2度目の実験では、平成19年度までに問題解決情報が登録されているにもかかわらず、それを見つけることができずにグループメンバーに相談したり、TAや教員がその存在をアドバイスするケース(知識の存在を仲介する人物が重要な役割を担う)、同一の問題解決情報が登録されるなどが見受けられた.
ALSに対する一本鎖治療抗体分泌型オリゴデンドロサイト前駆細胞移植治療法の開発

我々はOLGの機能改善が新たなALSの治療になるとの仮説に基づき、変異SOD1トランスジェニック(Tg)ラットに対するオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の髄腔内移植を行ったところ、長期の生着と有意な延命効果を示すデータが得られている。本研究は、ALS病態におけるOLGの分子病態の解明とOPC移植治療法の確立、さらに細胞移植治療の壁として常に問題となるALS関連蛋白質の細胞間伝搬を「特異的一本鎖抗体を分泌するOPCの移植」によって阻止するというあらたな治療パラダイムの構築を目指すものである。
断層帯を構成する蛇紋岩の変形組織に関する研究

蛇紋岩は,上部マントルを構成するかんらん岩が水を含んで変質した岩石であることから,沈み込み帯のマントルウェッジにおける対流や物質循環を理解する上で重要な鍵を握ると考えられている.本年度は,沈み込みプレート境界における蛇紋岩の存在形態やそのすべり挙動に対する物質科学的な制約を与える目的で,以下のとおり実施した.1.2008年4月2130日に実施されたYK08-05航海(伊豆・小笠原海域)に参加し,「しんかい6500」による5回の潜航調査(6k#1064-1068)を行った(申請者は#1066を担当).その後,採取した蛇紋岩を用いて変成・変形組織解析を行い,海洋性島弧における蛇紋岩体の貫入モデルを示した.2.蛇紋石の流動特性を明らかにする目的で,冷たい沈み込み帯のマントルウェッジコーナーに対応する温度圧力条件下で単純剪断変形実験を行った.実験は,広島大学所有の固体圧式変形試験機を用いて行い,温度200□,封圧1Gpa,定歪速度下で剪断歪(γ)を系統的に変化させた.蛇紋石(リザーダイド・クリソタイル)は,上記の条件下で均質な塑性流動を示したことから,沈み込み帯のマントルウェッジにおける低温型蛇紋石の存在は,プレート間地震の発生を抑制する働きがあると考えられる.3.2008年12月914日の間,カリフォルニアのゴルダ地域において,蛇紋岩のサンプリングと方位測定を目的とした野外地質調査を行った.蛇紋岩は,上部マントルを構成するかんらん岩が水を含んで変質した岩石であることから,沈み込み帯のマントルウェッジにおける対流や物質循環を理解する上で重要な鍵を握ると考えられている(Hyndman & Peacock,2003).また,かんらん岩と比べて強度が小さいことから,マントルウェジにおける蛇紋岩の存在は,スロー地震,低周波微小地震などの沈み込みプレート境界のすべり挙動との深い関わりが指摘されている(Seno,2005;Shelly, et. al.,2006).申請者は,沈み込みプレート境界における蛇紋岩の存在形態やそのすべり挙動に対する物質科学的な制約を与える目的で,カリフォルニア(ゴルダ地域)において地質学的な研究を行った.その結果,世界で初めて,沈み込みプレート境界浅部における蛇紋岩の存在形態とその具体的な変形過程が明らかとなった(Hirauchi & Yamaguchi,2007).また,沈み込み帯浅部の非地震性領域におけるすべり挙動に対し,物質科学的な制約を与えた.Hirauchi, et. al.(in press)は,蛇紋岩中に残された初生鉱物を用いて岩石学的・地球化学的研究を行い,ゴルダ地域の蛇紋岩体が低速拡大軸をもつ海嶺付近の海洋断裂帯を起源とすることを明らかにした.この研究により,もしゴルダ地域の蛇紋岩体に対して変成岩岩石学的な研究手法を導入すれば,海洋底で蛇紋岩が形成されてから,プレート境界域で沈み込み,上昇する際の温度圧力経路を推定できる可能性がある.蛇紋岩は,上部マントルを構成するかんらん岩が水を含んで変質した岩石であることから,沈み込み帯のマントルウェッジにおける対流や物質循環を理解する上で重要な鍵を握ると考えられている.本年度は,沈み込みプレート境界における蛇紋岩の存在形態やそのすべり挙動に対する物質科学的な制約を与える目的で,以下のとおり実施した.1.2008年4月2130日に実施されたYK08-05航海(伊豆・小笠原海域)に参加し,「しんかい6500」による5回の潜航調査(6k#1064-1068)を行った(申請者は#1066を担当).その後,採取した蛇紋岩を用いて変成・変形組織解析を行い,海洋性島弧における蛇紋岩体の貫入モデルを示した.2.蛇紋石の流動特性を明らかにする目的で,冷たい沈み込み帯のマントルウェッジコーナーに対応する温度圧力条件下で単純剪断変形実験を行った.実験は,広島大学所有の固体圧式変形試験機を用いて行い,温度200□,封圧1Gpa,定歪速度下で剪断歪(γ)を系統的に変化させた.蛇紋石(リザーダイド・クリソタイル)は,上記の条件下で均質な塑性流動を示したことから,沈み込み帯のマントルウェッジにおける低温型蛇紋石の存在は,プレート間地震の発生を抑制する働きがあると考えられる.3.2008年12月914日の間,カリフォルニアのゴルダ地域において,蛇紋岩のサンプリングと方位測定を目的とした野外地質調査を行った.
地区交通安全の為の車両速度抑制装置として設置されたハンプからの騒音の対策技術

危険な速度で走行する車が存在する生活道路では、歩行者の「通行の安全」が損なわれている。車の速度を抑制するにはハンプの設置が有効であるが、この方法には騒音問題がつきまとう。これまで申請者は、小型貨物車がハンプを跳躍して大きな衝撃音を発生させること、そして、その発生位置(ハンプからの水平距離、地面からの高さ)、パワーレベルとそのスペクトルを関数で表現した。更に、本年度は、この結果を使って、ハンプが設置された沿道の騒音を予測した後、ハンプによって発生する衝撃音への対応策を検討した。以下にその結果を述べる。1.騒音規制法で定められている規制基準値の決定方法に準拠して、ハンプの衝撃音により睡眠・会話影響が生じない評価値を提案した。この評価値と沿道騒音の予測値を比較検討した。2.その結果、沿道家屋の「窓を閉めた状態にする」ことは必須である。「夜間(睡眠)」の方が「昼間(会話)」より深刻な影響を受ける。3.ハンプを家屋から9m以上離せば騒音問題は生じない(条件:車速25km/h,窓閉,夜間,塀無し,寝室1階)。4.家屋が連担していれば、1.5m以上のブロック塀を遮音塀に使うと騒音問題は生じない(条件:3.と同様,但し,塀有)。5.寝室が1階ではなく2階にある場合で、しかも、寝室が道路側にあれば、2mのブロック塀があっても騒音問題が生じる。窓の防音化で対処が必要となる。6.基本的に、生活道路といえども、道路幅員をできるだけ広く取ることが大事である。生活道路にも拘わらず、30km/h以上の車が多数走行し、児童・主婦・高齢者の「通行の安全」が損なわれている。安全を担保するには、車の速度を抑制するハンプの設置が有効であるが、この方法には騒音問題が付きまとう。社会実験でも、80%以上の人々がハンプ存続を切望したが、騒音に悩まされた住民の反対でハンプが撤去された。これまで申請者は、貨物車がハンプを跳躍して大きな衝撃音が発生することを突き止めた。そこで本年度は、以下の研究を実施し、次の結果を得た。1、ハンプのある敷地内道路を、小型貨物車が2040km/hの定速で通過する時に発生する衝撃音を測定した。2、後輪の着地位置(車両進行方向のハンプ中央からの水平距離)を速度の関数で表現した。3、上記2)で求めた「後輪の着地位置」、並びに、車両と観測点の間に遮音板を設けての衝撃音測定実験から、衝撃音の発生位置は速度に関わらず地面から高さ0.55(m)の所であることを明らかにした。4、上記2)と3)から、衝撃音の発生位置(ハンプ中央からの水平距離、地面からの高さ)を求めることが可能になった。5、その結果、小型貨物車から発生する衝撃音の音響パワーレベル(オーバオールレベル)を速度の関数として表現できた。6、更には、次年度、沿道条件(家屋のブロック塀の有無など)に応じた、騒音対策を提案するために、音響パワーレベルのスペクトル(1/3オクターブ)の相対レベルを求めた。
内耳性難聴、耳鳴、めまいに対する局所療法に関する研究

内耳への60mWソフトレーザー照射が耳鳴の抑制に効果があるかどうか二重盲検にて検討した。耳鳴の大きさ、持続時間、音色、苦痛度の変化にレーザー照射群とプラセボ照射群の間に有意差は認られなかった。メニエール病におけるゲンタマイシン鼓室内注入療法は、広く世界的に行われるようになってきている。我々は、、モルモットにおいてゲンタマイシンを蝸牛窓または鼓室内に投与し、基底回転の外リンパにおけるゲンタマイシン濃度を経時的に測定した。外リンパゲンタマイシン濃度は投与後12時間後にピークとなり半減期が2数時間と非常に早いものであった。ゲンタマイシン鼓室内注入療法後、麻痺性眼振が出ても、その後前庭代償がおこって日常生活で問題となることは極めで少ない。高齢者では前庭代償がおこりにくいが、若い人でも直線加速刺激を行うと正常者とは異なる垂直方向の眼球の動きを前庭代償が完成されたと思われた時期においても観察された。モルモットにおいてシスプラチン内耳毒性に対するαトコフェロールの抑制効果を確認した。また、プロスタグランディンE1を蝸牛窓に置くと蝸牛血流が上昇した。内耳機能の評価に内耳血流状態の把握は重要である。レーザードップラープローブの先端を蝸牛骨壁にあてると、ラットではレーザードップラー出力の3040%が骨の血流成分で蝸牛血流とは別に考えなければならないことがわかった。人工内耳手術では、蝸牛骨壁に穴をあけるので、この穴にプローブをさしこんで血流測定をおこなえば可能な限り純粋に蝸牛血流の測定ができる。現在までのところ人工内耳手術を受けた20人にこのような方法にて蝸牛血流の測定を行ったが6人(特発性感音難聴2人、原因不明の先天聾2人、内耳道狭窄1人、髄膜炎後難聴1人)において顕著な蝸牛血流信号の低下を認めた。「内耳性難聴・耳鳴・めまいに対する局所療法」平成11年度の研究実績は以下のとおりである。1)血管拡張剤の局所投与の内耳血流への影響プロスタグランディンE_1をモルモット蝸牛窓に局所投与したときの蝸牛血流をレーザードップラー血流計で測定した。プロスタグランディンE_1の局所投与は内耳血流を増加させることがわかった。2)ソフトレーザー内耳照射の耳鳴に対する治療効果ソフトレーザー照射の耳鳴に及ぼす効果につき二重盲検法により現在その効果につき検討中である。今までのところ約30人の耳鳴患者にソフトレーザー照射を実照射群とダミー照射群に分けてその効果について検討した。平成12年度中には件数40人以上としてその効果についてまとめる予定である。3)メニエール病・遅発性内リンパ水腫のゲンタマイシン鼓室内投与療法については引き続き基礎的臨床的に研究を行っている。基礎的研究はモルモットを用いてゲンタマイシンの動態について、臨床的研究についてはゲンタマイシン局所投与後の麻痺性眼振の3次元解析、VEMPへの影響につき検討中である。1)ソフトレーザー(60mw)の内耳への照射が耳鳴に有効かどうかを検討した。45人、68耳を無作為に実照射群とプラセボ照射群の2群に分け二重盲検にて行った。ソフトレーザー実

照射またはプラセボレーザー照射は、週1回連続4回、耳鳴が一側性の場合は1側に、両側性の場合は両側に行った。耳鳴の評価は5週間、週1回ずつ毎回行ったが、1週目の照射直前、3週目の照射直前、4回目の照射から1週間たった5週目の3回においては耳鳴についてアンケート、純音聴力検査、DPOAE、耳鳴ラウドニス、ピッチマッチテストを施行した。結果として脱落例2例を除きレーザー実照射群23人33耳、プラセボ照射群20人31耳の比較ができたが耳鳴に及ぼす効果について両群で差は認められなかった。2)保存的治療に抵抗するメニエール病に対して鼓室内ゲンタマイシン注入療法をひき続き行なっているが、なんとかして蝸牛毒性を減らすことができないか、セミナーを行いそれをreviewにまとめた。3)モルモットを用いた実験的研究としてプロスタグランディンE_1(PGE_1)を正円窓上に置いた時の蝸牛血流の変化について検討した。PGE_1は蝸牛血流を上昇させる結果が得られ、日本耳科学会(2000年)において発表した。内耳機能の評価に内耳血流状態の把握は重要である。ラットを用いてレーザードップラー法にて前下小脳動脈圧迫の蝸牛血流への影響を検討した。蝸牛骨壁上の粘膜を除去しても蝸牛骨壁の上にプローブの先端をあてて測定すると前下小脳動脈を完全に圧迫しても血流信号はゼロにはならなかった。この時、マイクロスフェアを左心室に注入すると蝸牛内にはマイクロスフェアが入らなくても、蝸牛骨壁内部にマイクロスフェアの存在が認められた。したがって、蝸牛骨壁の上にプローブの先端をあてて測定する場合、蝸牛血流からだけでなく骨血流からの信号が混入することが明らかとなった。その程度は、ラットではレーザードップラー出力の3040%と推定された。ヒトでは蝸牛骨壁が厚く、骨血流の影響はラット以上と推察できる。人工内耳手術では、蝸牛骨壁に穴をあけるので、この穴にプローブをさしこんで血流測定をおこなえば可能な限り純粋に蝸牛血流の測定ができると考えた。現在までのところ人工内耳手術を受けた20人にこのような方法にて蝸牛血流の測定を行った。うちわけは、原因不明の先天聾7人、特発性感音難聴5人、髄膜炎後難聴2人、遺伝性難聴1人、ワールデンブルグ症候群1人、内耳道狭窄1人、メニエール病1人、サイトメガロウイルス内耳感染1人、突発性難聴1人である。このうち、原因不明の先天聾2人、特発性感音難聴2人、髄膜炎後難聴1人、内耳道狭窄1人あわせて6人においては顕著な蝸牛血流信号の低下を認めた。
生体機能を利用した省エネルギ-型異性体分離法に関する研究

本年度は、酵素の安定性、酵素の固定化と失活した酵素の入れ換えの容易さなどの観点から、より優れた酵素固定化法を探索し、ついでこれらの酵素固定化法に最も適した分離用リアクタ-の開発を行った。成果の概要は以下の通りである。(1)酵素サルファタ-ゼの活性の半減期はpHによらず一定であり、温度40°Cでは700hであった。また、酵素の安定性の向上を目的として、数種の高分子化合物の添加の影響を調べたが、効果のある化合物は見いだせなかった。(2)種々の酵素固定化法を試みた結果、光架橋性プレポリマ-PVA-SbQを用いたゲル包括法が優れていることがわかった。本法で作製した固定化酵素膜によるβ-およびα-ナフチルサルフェイトの加水分解の速度の比の最大値は220(pH7.8)であり、昨年度の固定化酵素膜の場合の52、ならびに遊離酵素の場合の80のいずれよりもかなり高かった。(3)上記方法で作製した固定化酵素膜を組み込んだ昨年度と同様な平膜型メンブレンリアクタ-(膜面積102cm^2)を用いて、α-およびβ-ナフチルサルフェイトの分離実験を行った。原料液として等モルのα-およびβ-ナフチルサルフェイトを含む溶液を用いた場合、空間時間が1.5hのとき、β-ナフチルサルフェイトの反応転化率、α体とβ体の純度、ならびに回収率はいづれも90%近い値を示し、昨年よりも優れた性能が得られた。(4)多管式熱交換器と類似な形状のホロ-ファイバ-型リアクタ-(内径1.0cmのガラス管内に内径0.8mm、外径1.4mm、有効長さ30cmのホロ-ファイバ-を31本充填)を作製し、遊離酵素を用いて分離実験を行った。その結果、平膜型リアクタ-の場合と全く同様な良好な性能を発揮することがわかった。したがって、酵素の封入と失活した酵素の入れ換えが容易である点を考え併せると、ホロ-ファイバ-型リアクタ-が遊離酵素を触媒として用いる場合に適したリアクタ-であることがわかった。
日本の南極外交に関する基礎的研究：変容する南極レジームへの対応とその要因

南極地域の非軍事化と科学協力から出発し、資源管理と環境保全を軸とした国際協調体制へと変容してきた南極レジームに対する日本の政策的対応のあり方を具体的に把握することを目的に、文献調査とインタビュー調査を実施した。主に南極鉱物資源活動規制条約ならびに南極海洋生物資源保存条約の政府間交渉における日本の対応について、特定歴史公文書等利用請求および行政文書開示請求を実施しながら文献調査を進めた。鉱物資源活動規制条約の交渉においては、日本は南極条約体制の維持、資源開発による自然環境への悪影響の回避、南極地域における人類全体の利益を損なわないことの3点を基本的方針として掲げつつ、各論においては、領土権主張を行わないノンクレイマントとしての立場の維持を最優先とし、環境影響については簡潔な記述にとどめることを目指した対応がとられたことが確認された。一方で、海洋生物資源保存条約に関しては、漁業国としての立場を明確にし、独自の条約案を提示するなど、より踏み込んだ対応がなされたことが示唆された。また、南極海洋生物資源保存条約の実施機関である南極海洋生物資源保存委員会における最近の主要議題の一つである海洋保護区の交渉過程について、同委員会の公式文書の分析および関係者へのインタビュー調査を行い、交渉の経緯を把握するとともに、南極ロス海の海洋保護区に対する日本の交渉態度の説明要因について、1)南極条約体制におけるノンクレイマントとしての立場の維持、2)海洋生物資源の利用から生じる利益、3)南極の環境保全に対する関心、という3つの視点から予備的な検討を行い、国内外で発表した。南極鉱物資源活動規制条約および南極海洋生物資源保存条約について、条約草案の交渉段階における日本の対処方針と実際の対応を歴史公文書にもとづき明らかにすることができた。しかしながら、近年の南極条約協議国会合における政府間交渉に対する日本の対処方針に関しては非公開とされた部分も多く、行政文書以外の情報源を活用して把握していく必要性が確認された。こうした課題が明らかになった一方で、南極海洋生物資源保存委員会における海洋保護区に関する政府間交渉への日本の対応については公式文書の分析、インタビュー調査、予備的考察および発表を行うことができた。以上から、本研究はおおむね順調にし進展していると判断した。南極条約体制が環境保全レジームとしての性格を強めていく1990年代以降の時期について、引き続き公文書等の文献調査およびインタビュー調査を進めていく。特に、鉱物資源活動規制条約の未発効から環境保護議定書の採択へと急展開する南極条約体制の転換期における日本の南極外交のあり方とその説明要因を明らかにすることを目指す。近年の南極条約協議国会合における日本の対処方針を公文書に基づき把握することが困難であることが示唆されたことから、二次文献を含む情報源についても適宜活用することとし、また、国会議事録や新聞記事データベースの活用により国内の議論を分析していく。

次年度使用額は当初、歴史公文書の調査のための旅費として想定していたものであるが、既公開分の公文書の内容を精査したうえで新たな公開請求を行うために時間を要し、新規公開分の調査を次年度に持ち越す必要が生じた。当該使用額については、次年度において、公文書の調査のための旅費として使用する計画である。
中枢神経細胞の運命決定機構メカニズムの解明

神経幹細胞から成熟細胞への分化、更に成熟した神経系細胞に至る時間軸上で神経細胞ネットワーク機能構築に対するBMPシグナリングを介した細胞内のダイナミックな遺伝子のスィッチのオン、オフがどのように制御されているか明らかにしたいと考えた。そこで、組織特異的ジーンターゲティング法を用いて時期、組織特異的にBMP-2/4分子の受容体であるALK3遺伝子を欠損させる手法を用い大脳皮質を構成する神経系細胞の一生にBMPシグナリングがどのように関与するか検討した。当初、神経幹細胞にレトロウイルスを用いてcreリコンビナーゼを発現させたが、十分な発現量が得られなかった。そこで、Emxlプロモーターによって大脳皮質特異的にcreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスとのかけ合わせをした。このマウスに於いては、大脳皮質層構造の形成、さらにルシファーイエローを注入した錐体細胞の形態になんら異常を認めなかった。以上のことから、神経細胞の成熟過程にALK3受容体は必須でないと考えられた。一方、血管周囲の細胞が特異的に細胞死を起こしていることが認められた。このマウスでは、神経幹細胞からグリア細胞への運命決定機構には何ら異常がないことから、細胞の生存維持機構にALK3受容体を介したBMPが機能していることが示唆された。今後、血管内皮やアストログリアなどの形態を詳細に解析し、血管からのエネルギーの取り込みが神経活動に及ぼす影響を検討する。組織特異的ジーンターゲティング法を用いて時期特異的にBMP-2/4分子の受容体であるALK3遺伝子を欠損させる。その為に、この組織特異的BMP受容体遺伝子欠損を作製することのできるトランスジェニックマウス(floxp-Bmprマウス)を脳科学総合研究センターに導入した。我々はこれまでに細胞系譜を探索すべくレトロウイルスベクターの開発を行ってきた。レトロウイルスは分裂能を持つ細胞のみに感染することが可能であり、外来遺伝子を感染した細胞の染色体中で安定的に発現させることが可能であることから感染した細胞で確実にcreリコンビナーゼと標識蛋白質が共発現する事ができる。そこで、floxp-Bmprマウスの胎生10日の神経組織に感染させ、ALK3機能欠損に伴う神経細胞の運命を追跡する。また、我々がこれまでに開発してきた神経幹細胞の低密度細胞培養系を用いて多分化能を持つ神経幹細胞が受ける影響をモニターする。このin vivo及びin vitroの実験系を用いてBMPシグナルによる細胞運命の決定、更にそれに伴う細胞内の遺伝子のスイッチングがどのように変化するか解析を行う。岡崎国立共同研究機構生理学研究所の池中一裕教授との共同研究によってcre-LacZを発現する高力価レトロウイルスはすでに作製した。我々はカナダのDr.Nagyよりloxpサイト間の組み換えによってアルカリフォスファターゼが発現するように作製されたトランスジェニックマウス(Z/APマウス)を供与していただいた。このトランスジェニックマウスからin vitroで神経幹細胞培養を行い、レトロウイルスを一時感染させることによってcreリコンビナーゼの機能評価をした。その結果、レトロウイルスに感染した神経幹細胞からアルカリフォスファターゼの発現を検出し、機能検定を終了した。
海水活性汚泥による窒素・リンの除去

1.回転円板微生物膜反応器を用いて海水活性汚泥によるアンモニア酸化速度γと操作因子との相関を検討し次の結果を得た。(1)最適なpHは8.0,pH=7.0:γ/γmax=0.84,pH=9.0:γ/γmax=0.36となる。(2)pH=8.0におけるミカエリス定数はKm(【NH_4】)=1.37mg-【NH(^+_4)】-N/l, Km(【PO_4】)=0.00388mg-【PO_4】-P/lであった。(3)アンモニア酸化に必要なリンの量は、質量比でP/N=0.0026と微量であった。(4)淡水を混入した塩分変動に対しては、海水割合0.045%と淡水に近い状態まで酸化活性が維持されるが、3日以上経ると微生物膜の剥気回分曝気槽を用いてリン除去に及ぼすマグネシウムの影響を淡水活性汚泥により検討し次の結果を得た。(1)流入水中のマグネシウム量が決まるとその値に対応して除去できるリンの量に最大値が存在する。リンを過剰に除去するためには、マグネシウムも過剰に必要となる。(2)1サイクルの終期における活性汚泥中のリンY〔%〕、マグネシウムX〔%〕にはY=1.049+3.17X(2.2≦Y≦9.1%)の関係が成立する。(3)Mgが制限基質の場合、処理水中の残余Mgは0.1mg/L以下のオーダーとなる。また、流入Mgがステップ変化すると、処理水中のPは新たな定常値へと変化してゆくが、時定数は液の平均滞留時間に近い。(4)嫌気状態ではPの放出にMgの放出が付随し、好気状態でのPの摂取にはMgの摂取が伴う。しかし、両者の速度の比(ΔMg/ΔP)は時間と共に増減し一定ではない。3.海水活性汚泥がリンを過剰に除去する嫌気-好気の時間配分法を検討した。1サイクルを24hrとした場合、嫌気10又は16hrでは硫化水素臭が出て、リン過剰摂取は起らなかった。嫌気48hr-好気15.519.5hrで過剰摂取が起り、汚泥中のリン濃度8.2%が達成された。
付調停の研究ーーー「付ADR」のための予備的考察として

裁判所における「合意」による紛争解決としての「訴訟上の和解」と「調停」については、制度上は別個のものであるものの、それらが並存することについての意義が明らかではない。本年度はこの点を追求するため、和解および調停制度に関する先行研究の文献調査と、和解手続の規律に関する文献調査およびアメリカの民事訴訟規則16条改正プロセス等についての文献調査を行った。また、特に訴訟の途中で調停に回付する付調停という制度に関しては、訴訟上の和解があるにもかかわらず、別の手続での合意形成を裁判官の裁量によって行わせるものであり、その存在意義が問われることになるのであるが、この点を解明するために、本年は研究初年度として、付調停に関する文献調査を行った。これらの結果、特に注目されるのは、調停では、従来、法専門家以外の専門家が調停委員となることにより、より実情に即した解決が可能であることに着目されてきていたが、平成15年民事訴訟法改正による専門委員制度の導入により、専門的知識が必要な事件について、訴訟や訴訟上の和解に専門委員が関与することが可能となったため、「付調停」のニーズが減少し、あるいは調停に付するケースが変質しているのではないかという仮説を得た。今後は、この仮説を検証するために、実務経験のある者へのインタビュー調査を行う予定である。このほか、アメリカ(ニューヨーク)におけるインタビューによって、最近の和解の状況および付ADRの実際について知見を得た。予定通り進展しているが、付調停制度の成立に関する文献が少なく未だ探索中である。今後は裁判官や調停委員など、実務経験のある者に、制度選択についての視座やそもそも付調停経験の有無などをインタビューする予定である。インタビュー調査の結果整理等において謝金を支払う予定であったが、今年度はその必要がなかったため次年度使用額が生じた。しかし、次年度早期に謝金支払いの予定がありこれに充てることを考えている。
神経因性疼痛発症における軸索輸送の位置づけと神経保護に関する基礎的研究

神経因性疼痛は中枢あるいは末梢神経の障害によって起こり、その痛みは患者のQOLを著しく低下させる。そのため、神経因性疼痛緩和薬が果たす役割は大きい。本研究では、整形外科、麻酔科(ペインクリニック)領域の治療に広く用いられているノイロトロピンを用いて実験を遂行し、培養感覚神経細胞において軸索輸送を抑制することを明らかにした。本研究結果は、神経因性疼痛を緩和するメカニズムの解明に寄与したといえる。そのため、神経因性疼痛の緩和薬が果たす役割は大きい。本研究は、局所麻酔に起因する末梢神経障害をいかに防ぐことができるか、すなわち局所麻酔薬による神経因性疼痛を緩和するメカニズムの解明を目的としている。当該年度は、前年度に引き続き、神経因性疼痛緩和薬の代表例として整形外科、ペインクリニック、皮膚科領域の治療にも用いられているノイロトロピンを使用して実験を行なった。また、ノイロトロピンに加え、局所麻酔薬および抗不整脈薬として広く知られているリドカインを新たに用いて以下の実験を遂行した。マウスの脊髄後根神経節より感覚神経細胞を培養し、実験に供した。ビデオ増感顕微鏡を用いて、リドカイン単独、およびリドカインとノイロトロピンの混合薬処置による神経線維内の軸索輸送の変化をリアルタイムで観察、解析した。また、これらの薬物処置前後の軸索径を測定、比較した。本実験と前年度の実験結果を考え合わせ、リドカインは神経線維内の粒子の輸送を減少させること、また、リドカインとノイロトロピンの混合薬はリドカインの単独処置時と比較して輸送粒子数の減少を有意に抑制すること示した。さらに、この混合薬処置による軸索径への有意な影響はみられないことを明らかにした。当該年度における研究結果は、リドカインによる末梢神経障害に対するノイロトロピンの神経保護作用について検討した国内外初の知見となった。当該年度は研究計画に則し、神経因性疼痛緩和薬の代表例として整形外科、麻酔科(ペインクリニック)領域の治療に用いられているノイロトロピンを用いて以下の実験を遂行した。マウスの感覚神経細胞を培養し、実験に供した。ビデオ増感顕微鏡を用いて薬物投与前(コントロール)およびノイロトロピン処置後の神経線維内の軸索輸送をリアルタイムで観察、解析した。また、薬物投与前後の軸索径を測定、比較した。これらの実験により、ノイロトロピンは神経線維内の粒子の輸送を減少させることを明らかにした。また、薬物投与による軸索径への影響はないことからノイロトロピンの神経細胞への毒性の低さを示した。当該年度における研究結果は、ノイロトロピンが感覚神経細胞に及ぼす影響について明らかにした国内外初の知見となった。また、ノイロトロピンの適応症の一つである帯状疱疹後神経痛の原因となるヘルペスウィルスは軸索輸送を介して感染することが知られており、本研究結果はノイロトロピンによる神経疼痛緩和のメカニズムの解明の一端を担う結果となりえた。局所麻酔薬は臨床使用濃度での作用は可逆的で安全だが、脊髄くも膜下麻酔に用いた場合に馬尾症候群や一過性の神経症状などの末梢神経障害を起こすことがある。局所麻酔薬には神経毒性があると考えられており、中でもリドカインは毒性が強いことで知られている。本研究は、局所麻酔に起因する末梢神経障害をいかに防ぐことができるか、すなわち局所麻酔薬による神経因性疼痛を緩和するメカニズムの解明を目的とした。ノイロトロピンは、整形外科、麻酔科(ペインクリニック)、皮膚科領域の治療において鎮痛薬として用いられており、近年神経因性疼痛に対する緩和作用が注目されている。しかし、これまで臨床的な報告は数多く認められるが、作用機序を明確にした報告は認められていなかった。本研究では、ノイロトロピンが培養感覚神経細胞の軸索輸送に及ぼす影響を明らかにした(Isonaka et al., Neurosci Lett 2013)。また、ノイロトロピンがリドカインをはじめとする局所麻酔薬の神経毒性に対して及ぼす影響を検討した(Isonaka et al.,論文投稿中)。本研究結果は、ノイロトロピンをはじめとする薬剤の神経因性疼痛緩和、および神経保護効果の機序について検討した国内外初の知見となった。

生理学当該年度における研究計画に従い、本研究代表者は神経因性疼痛緩和薬の代表例であるノイロトロピンおよび強い神経毒性をもつことで知られているリドカインを用いて培養感覚神経細胞の軸索輸送への影響を観察する実験を遂行した。本研究結果については国内外の学会(日本生理学会、米国神経科学会議)にて発表し、多くの分野の研究者が関心を寄せる研究課題であることを確認した。また、ノイロトロピンが神経線維伸長に及ぼす影響を検討する次の実験項目に対しても予備実験を開始している。これらの点については当初の計画通りもしくはそれ以上に進展していると考える。同大学医学部麻酔科竹浪講師らと共同して実施するクモ膜下腔にカテーテルを留置したラットをモデル系とする個体レベルでの実験の進行速度は緩徐ではあるが、データを米国神経科学会議にて発表するに至っている。細胞内微細構造の観察に使用する共焦点レーザー顕微鏡は学内共用機器であり、研究進行速度が緩徐である。また、ノイロトロピン以外の神経因性疼痛緩和薬の実験が行えていないことに関しては、当初の計画にやや遅れが生じているといえる。これらを考え合わせると、研究項目により進捗状況に差はあるが、本研究全体を通すとおおむね計画通りであると考える。当該年度における研究計画に即し、本研究代表者は神経因性疼痛緩和薬の代表例であるノイロトロピンを用いて培養感覚神経細胞の軸索輸送への影響を観察する実験を遂行した。本研究結果については国内外の学会(日本生理学会、米国神経科学会議)にて発表し、国際学術誌に投稿するに至った。また、次年度以降の研究計画に記した細胞レベルでのリドカインとノイロトロピンの混合投与の実験、および同大学医学部麻酔科竹浪講師らと共同して実施するクモ膜下腔にカテーテルを留置したラットをモデル系とする個体レベルでの実験の予備実験を開始した。これらの点については当初の計画以上に進展していると考える。しかし、共焦点レーザー顕微鏡を用いた細胞内微細構造の観察については、学内共用機器を使用するため、研究進行速度が緩徐になったことから検討がまだ不十分であると考える。また、ノイロトロピン以外の神経因性疼痛緩和薬の実験が行えていないことから、当初の計画にやや遅れが生じている部分もあるといえる。これらを総合すると、研究項目により進捗状況に差はあるが、本研究全体を通すとおおむね計画通りであると考える。ノイロトロピン、リドカインそれぞれ単独処置、およびリドカインとノイロトロピンの混合薬処置が神経線維の伸長に与える影響について検討する。また、共焦点レーザー顕微鏡を用いた細胞内微細構造の観察およびノイロトロピン以外の神経因性疼痛緩和薬の影響に関しても引き続き検討する。さらに、同大学医学部麻酔科竹浪講師らと共同し、ラットのくも膜下腔に留置したカテーテルを用いてノイロトロピンを投与し、神経機能評価(運動機能検査テスト、痛覚閾値テスト)および電子顕微鏡による組織標本の観察を行ない、個体レベルでの検討を開始する。本研究で得られたデータを解析し、成果を国内外の学会および国際学術誌に発表する。当該年度と同様の手法でリドカインとノイロトロピンの混合薬が神経細胞に与える影響を調べ、リドカイン単独処置の結果と比較し、ノイロトロピンの神経保護効果について検討する。また、共焦点レーザー顕微鏡を用いた微細構造の観察およびノイロトロピン以外の神経因性疼痛緩和薬の影響に関しても引き続き検討する。
パネル調査データを用いた新しい交通システムの選好意識の動的分析

同一個人から得られた選好意識(SP)の時間的安定性について検討した.具体的には,過去3時点(1987,88,90年)と同じ回答者を抽出して同じ質問形式のSP調査を実施し,開業1年前の新交通システムに対するSPが47年前のSPと比べてどの程度変化したか,その主要な原因は何か,SPに対する交通サービス要因の主効果はどの程度変化したかについて,集計分析,分散分析,交通機関選択モデルの推定を通して検討した.分析の結果,以下の結論が得られた.1)交通システムに対するSPは,個人の社会経済属性や利用交通手段が変化することにより大きく変化する.しかし交通手段の変化とSPの変化には時間的にずれがあり,同時マルコフ推移の仮説は棄却され.1時点データに基づくモデル構築の限界が示された.2)SPに影響を及ぼす交通サービス要因の主効果は時点の違いによって異なっており,同じ個人が交通機関選択で重要視する要因は計画の進展と共に変化することが明らかになった.3)集計ロジット型の交通手段選択モデルを時点毎に推定した結果,いくつかの交通サービス変数の推定パラメータは時間的に安定していないことが示された.また異なる時点のモデルの誤差項間には一次の系列相関が存在することが実証された.同一個人から得られた選好意識(SP)の時間的安定性について検討した.具体的には,過去3時点(1987,88,90年)と同じ回答者を抽出して同じ質問形式のSP調査を実施し,開業1年前の新交通システムに対するSPが47年前のSPと比べてどの程度変化したか,その主要な原因は何か,SPに対する交通サービス要因の主効果はどの程度変化したかについて,集計分析,分散分析,交通機関選択モデルの推定を通して検討した.分析の結果,以下の結論が得られた.1)交通システムに対するSPは,個人の社会経済属性や利用交通手段が変化することにより大きく変化する.しかし交通手段の変化とSPの変化には時間的にずれがあり,同時マルコフ推移の仮説は棄却され.1時点データに基づくモデル構築の限界が示された.2)SPに影響を及ぼす交通サービス要因の主効果は時点の違いによって異なっており,同じ個人が交通機関選択で重要視する要因は計画の進展と共に変化することが明らかになった.3)集計ロジット型の交通手段選択モデルを時点毎に推定した結果,いくつかの交通サービス変数の推定パラメータは時間的に安定していないことが示された.また異なる時点のモデルの誤差項間には一次の系列相関が存在することが実証された.
腸球菌性フェロモンレセプターTraAの機能と構造

1)腸球菌フェロモン反応性接合伝達プラスミド(EPRCP)のフェロモン受容、ペプチドフェロモン結合-DNA結合蛋白であるTraAのペプチドフェロモン結合、DNA結合それぞれの機能局在を明らかにした。pAD1 TraA, pPD1 TraAが厳密なフェロモンおよびDNA結合特異性を持つことを利用し、DPAC(DNA associated Protein-tag Affinity Chromatography),PPAC(Peptide associated Protein-tag Affinity chromatography)によって、chimeraおよびmosaic蛋白のDNA結合能、フェロモン結合能を独立してin vitroで観察し、機能局在を調べた。2)pAD1 TraA蛋白の結合DNA領域をDPAC法によって再同定した。TraAはこれまで報告されていた結合領域には単独には結合できないこと、この領域を含まない近傍に別の2カ所の結合領域を持つことが明らかになった。3)臨床分離VRE KV22株の解析、および、臨床分離VREの合成フェロモンに対する反応の疫学的解析から臨床分離VRE株が高い頻度でEPRCPを保持すること。それらの一部が染色体に組み込まれて存在し接合伝達によってプラスミドとして染色体外に分離される可能性があること示した。4)接合伝達と複製の連関を調べるために遺伝的解析によって複製、および複製の安定性に関与すると考えられていたpAD1 RepAおよびRepB蛋白を精製し、TraAとのin vitroでの相互作用を観察した。蛋白同士の結合や、機能に対する影響は観察されなかったが、RepAおよびRepBのDNA結合能を観察することが出来、共同研究によってpAD1の複製について知見を得た。(結果)(1)TraA蛋白の機能局在を明らかにするためにフェロモン依存接合伝達プラスミドpAD1及びpPD1のフェロモン結合-DNA結合蛋白TraAを融合したキメラ蛋白を作成し、それらのフェロモン結合能、DNA結合能をそれぞれPPAC法、DPAC法によって調べた。さらに、フェロモンの信号伝達能をDPAC法によって調べた。DNA結合には、N末端約150aaが、フェロモン結合にはC末端約150aaが必要であることが分かった。N末端30aaの置換、C末端40aaの置換はそれぞれ、DNA結合能、フェロモン結合能を変化させた。今回作成したキメラ蛋白は何れもフェロモンの信号伝達能を示さなかった。キメラ作成によって、信号伝達に必要なコンフォメーションが失われたと考えた。(2)DPAC法によって、pPD1及びpAD1 TraAの結合DNA部位の解析を行った。これまでに、pPD1, pCF10において、複数のDNA結合部位が報告されていたが、pAD1においても、複数のDNA結合部位が観察された。これまでpAD1の唯一のDNA結合部位とされてきた部位は、単独ではDNA結合を示さないことも明らかになった。(考察)フェロモン依存接合伝達プラスミドのフェロモン信号受容体蛋白であるTraAは、短縮蛋白が不安定であること、適当な変異蛋白が得られないことから、その機能局在が明らかにされていなかった。TraAがお互いに相同性を持ちながらフェロモン結合・DNA結合の特異性を持っていることを利用しキメラ蛋白を作成、機能局在を明らかにすることが出来た。今後、分子構造の予測と機能局在の関係が明らかにされれば、この蛋白の由来を知る手がかりになるだろう。これまで、TraAのDNA結合部位には共通の特徴がないとされてきたが、何れも、協同的に働く複数の結合DNA部位を持つという特徴が明らかになってきた。今後、さらに詳細に検討することによって、TraAの構造と結合DNA部位の構造の関係が明らかになると考えた。腸球菌のフェロモン依存接合伝達プラスミドについて1)接合伝達機構の解析と2)1)の解析結果を応用して臨床分離バンコマイシン耐性腸球菌KV22の解析を行った。

(1)平成14年度に引き続きフェロモン受容体蛋白TraAの機能局在を調べた。pPD1 TraA(321aa)とpAD1 TraA(319aa)のキメラ蛋白、モザイク蛋白のDNA結合特異性、フェロモン結合特異性を親和クロマトグラフィーを用いた検出法であるDPAC法、PPAC法によって測定した。DNA結合、フェロモン結合にそれぞれTraAのamino末端150aa, carboxyl末端150aaが必要であることに加え、それぞれの末端30aaの置換によってDNA結合能、フェロモン結合能が変化することが明らかになった。(2)TraAの調節遺伝子としての作動機序を明らかにするためにDPAC法とPCRによるDNA断片、overlapextension PCRによるモザイクDNA断片を用いてpAD1 TraAが結合するDNA部位の同定を行った。これまで報告されていたpAD1 TraAの結合DNA部位は単独ではTraAと結合せず、この領域を必要としない結合領域が他に2カ所あることが明らかになった。(3)本研究において、KV22から接合伝達によってpCF10が分離されること、KV22が合成フェロモンcCF10,cAD1に反応すること、PCR、サザンハイブリダイゼーションによってそれぞれのフェロモンのレセプター遺伝子が検出されることが明らかになっていた。KV22のプラスミドDNA中にpCF10,pAD1に対応するバンドが見つかっていなかった。腸球菌株V583株のgenome sequenceからこの株が染色体上にフェロモン依存接合伝達プラスミドを持っていることが明らかになり、隣接するpathogenicity island(PAI)との関連が論じられている。KV22においてpCF10,pAD1が染色体に組み込まれPAIの形成に関連している可能性高いと考えた。