hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞増殖に関わるO_2^-生成型NADPH oxidase の分子基盤と活性化機構

ヒト大腸癌細胞Caco-2のO_2^-生成酵素Nox1を無細胞系で活性化することに成功した。培養したCaco-2から形質膜を分離し,遺伝子工学により創成した、2つの活性化因子の融合タンパク質p51N-Racと混ぜ、FADとNADPHを加えるとO_2^-が発生した。p51NとRacの相互作用を損なわせた変異体は活性化を起さなかった。細胞を予めTNFαで刺激しておくとO_2^-生成活性は上昇した。一方血管平滑筋細胞A10についても形質膜を分画し、上述のやり方でNox1のO_2^-生成活性を見ることに成功した。ここではp47を加えるとさらに活性化が見られた。A10を予めアンジオテンシンIIで刺激しておくと活性は40%ほど上昇した。ヒト大腸癌の培養細胞であるCaco-2のNox1を無細胞系で活性化することに世界で初めて成功した。培養したCaco-2細胞から形質膜画分を分離し、一方、遺伝子工学により2つの活性化因子Racとp51^<nox>の融合タンパク質であるp51N-Racを創成した。形質膜にこの融合タンパクと補酵素FADを加えると酵素Nox1が活性化され、電子供与体の添加によりスーパーオキシドO_2^-が発生した。電子供与体として、NADPHが親和性においても、反応速度においてもNADHよりはるかにまさっていた。したがって、本酵素はNox2と同じく、NADPH特異的であることが判明した。Nox2の場合と異なり、Nox1の活性化にはSDSなど両親媒性アニオンの存在が不要であった。このことはNox2の存在する好中球の膜とCaco-2形質膜との組成の違いに起因していると思われた。酵素活性はフラビン酵素阻害剤であるdiphenylene iodoniumで阻害された。この系にもうひとつの活性化因子であるp41Nを加えた場合、V_<max>はいくらか増加したが、EC_<50>は変わらなかった。至適条件でのスーパーオキシド生成のV_<max>はおよそ1,100(nmol/min/mg形質膜タンパク質)であった。p51NとRacの分子内相互作用が損なわれた変異体p51N-Rac(A27K)はほとんど活性化を起さなかった。以上のことからp51^<nox>とRacはNox1活性化において最小限必要な因子であることが示された。さらに、p51N-Racは好中球の酵素であるNox2も活性化することが見い出された。このことはp51^<nox>がNox1のみならず他のNoxも活性化する多目的な活性化因子であることを示した。1.大腸癌細胞のNox1-活性化と性質ヒト大腸癌細胞Caco-2のO_2^-生成酵素Nox1を無細胞系で活性化することに成功した。すなわち培養したCaco-2から形質膜を分画し,活性化因子Noxa1(p51)とRacの融合タンパク質Noxa1N-Racを加え、電子供与体を添加するとO_2^-が発生した。この系について次のことを見いだした。i)本酵素の電子供与体はNADPHであり、補酵素としてFADが必要なこと。ii)活性化に両親媒性アニオンは不要であること(Nox2無細胞系と異なる点)。iii)もうひとつの活性化因子と目されるNoxo1N(p41N)はNox1活性をいくらか増加させること。iv)Noxa1NとRacの分子内相互作用が損なわれたNoxa1N-Rac(A27K)では殆ど活性化が起きないこと。v)Noxo1全長はNoxo1Nより高い活性化能をもっていること。vi)Caco-2を予めTNFαで刺激しておくと、無細胞系でのNox1活性が4倍に上昇すること。これは刺激によりNox1の発現が亢進したものと考えられるが、同時にNoxo1の発現も亢進していることが推定された。2.血管平滑筋細胞のNox1-活性化と性質血管平滑筋細胞A10について,形質膜を分画し、上述のNoxa1N-Racを加えて無細胞系でNox1の活性を見ることに成功した。この場合血管平滑筋における活性化因子と目されるp47による活性化が見られた。O_2^-生成活性はA10を予めアンジオテンシンIIで刺激しておくと40%ほど上昇した。3.新たな活性化因子の検索

β-Pixを大腸菌で発現させ精製を試みた。今後このβ-Pixを用いて、Nox1活性化への関わりとシグナル伝達における役割について細胞と無細胞系両方を用いて検討してゆきたい。その他安定化因子と思われるβ-アクチンについてこれを簡便に得る方法を確立した。
無細胞抽出液を用いたアポトーシスの解析

アポトーシスの分子機序解明を目指し、我々はこのプロセスに関わる遺伝子、ICEファミリ遺伝子やbcl-2ファミリ遺伝子などの解析を行ってきた。これら遺伝子産物の生化学的機能の解明および新たなアポトーシス関連因子の同定には、in vitro系は極めて有用な方法の一つである。現在多くの研究室で利用されているin vitroアポトーシス系は、Yuri Lazebnikが開発したものをベースにしているが、この系ではアポトーシスの特長である核変性が顕著な形でみることが出来ないため、多くの場合アポトーシスの付随現象であるDNA切断をアッセイマーカーとして用いられている。我々は、この難点を克服する新たなin vitro系を確立した。この系ではアポトーシス特有の核変性が顕著にかつ再現性よく観察されるほか、アポトーシスに必須であることを最近我々が示した能動核輸送も必須であり、極めて生細胞に近いin vitro系といえる。この系は、既存のアポトーシス関連因子の機能解析および新たなアポトーシス関連因子の探索に極めて有効である。一方、アポトーシス抑制遺伝子bcl-2の生化学的基盤を明らかにする目的で、単離ミトコンドリアを用いたアポトーシス解析系を確立した。我々は、細胞を用いた解析から、アポトーシスの進行にミトコンドリアの脱機能(膜電位の低下)が重要な役割を果たしていること、およびその脱機能をBcl-2が抑制することを明らかにしたが、単離ミトコンドリア系でこのBcl-2機能を再現することに成功した。この系はBcl-2の生化学的機能の基盤の割り出しに極めて有効である。アポトーシスの分子機序解明を目指し、我々はこのプロセスに関わる遺伝子、ICEファミリ遺伝子やbc1-2ファミリ遺伝子などの解析を行ってきた。一方、アポトーシス抑制遺伝子bc1-2の生化学的基盤を明らかにする目的で、単離ミトコンドリアを用いたアポトーシス解析系を確立した。我々は、細胞を用いた解析から、アポトーシスの進行にミトコンドリアの脱機能(膜電位の低下)が重要な役割を果していること、およびその脱機能をBc1-2が抑制することを明らかにしたが、単離ミトコンドリア系でこのBc1-2機能を再現することに成功した。この系はBc1-2の生化学的機能の基盤の割り出しに極めて有効である。
アジドケミストリーによる革新的標的タンパク質同定システムの開発

天然物リガンドや薬剤の未知の標的タンパク質を高感度で検出できる新手法が強く求められている。これに対して本研究では、光親和性標識法における光ラベル化タンパク質の高感度検出を可能とする技術開発を目指した。これまでの研究から、光ラベル化および検出用官能基導入に関してさらなる技術革新が必要であることが明らかになった。そこで今年度は、昨年度に引き続き、光ラベル化タンパク質の高感度検出への展開を念頭に、独自のジアジドプローブ法に用いるためのプローブ分子を迅速に創製するためのジアジドビルディングブロックの開発とその利用法に関する検討を行った。その結果、前年度に簡便合成法の開発に成功したアジド基とアジドメチル基を有するベンジルアルコールやフェノールと、水酸基やカルボキシル基などを有する分子とを効率よく連結できる手法を開発することができた。今後、本成果を活用して、天然物リガンドや薬剤の標的タンパク質同定に有用なジアジドプローブが効率よく開発できると期待される。また、ジアジドプローブを用いる標的同定技術を利用し、本新学術領域内の班員との共同研究も進めることができた。具体的には、北海道大学薬学研究院の市川聡准教授が研究対象としている抗菌天然物が標的酵素のどの位置に結合しているかを同定するためのプローブ化を昨年度に引き続き支援した。さらに、理化学研究所の田中克典准主任研究員とは我々のアジド分子を利用した生体内分子の検出法開発に関する共同研究を新たに開始したほか、微生物化学研究所の坂本修一主任研究員とも、彼らの同定した生物活性化合物のプローブ化に関する共同研究を開始した。25年度が最終年度であるため、記入しない。天然物リガンドや薬剤の標的タンパク質のみを高感度で検出できる新手法が強く求められている。これに対して今回、近年のプロテオミクス研究において汎用されているLC/MS/MS質量分析法に着目し、その原理を光親和性標識法における光ラベル化タンパク質の検出に応用することを目指した。すなわち、マススペクトル測定において特徴的なフラグメントが観測される官能基を検出用レポータータグとして光ラベル化タンパク質に導入することで、LC/MS/MS解析時、検出タグ由来のフラグメントを手がかりに光ラベル化タンパク質を網羅的に検出・同定する手法の利用を試みた。その結果、光ラベル化技術および検出用官能基導入に関するさらなる革新が必要であることが明らかになった。そこで、光ラベル化タンパク質の高感度検出への展開を念頭に、ジアジドプローブを迅速に創製するためのビルディングブロック部位の開発を検討したところ、多彩なブロックを効率よく合成できることが明らかになった。さらに、この検討の中で、ジアジドを維持したまま種々の反応条件下でブロックを利用できることも見いだし、光ラベル化のためのプローブ分子の簡便合成に向けた有益な情報を取得することに成功した。加えて、一連のアジド化学に関する検討結果をもとに、ジアジドビルディングブロックを利用した生体高分子の2成分間の連結にも応用し、タンパク質間相互作用解析への展開の足がかりを得ることができた。また、標的同定技術に関して、本新学術領域内の班員との共同研究を開始した。具体的には、北海道大学薬学研究院の市川聡准教授が研究対象としている抗菌天然物が標的酵素のどの位置に結合しているかを同定するため、活性エステル部位を有するジアジド化合物を提供し、プローブ化を支援した。加えて、理化学研究所の田中克典准主任研究員と共同でジアジド化合物を用いる生体分子の新しい化学修飾法の開発にも着手した。本研究課題で目標としている「標的タンパク質同定技術の革新」に関して、順調に進展させることができている。質量解析法を利用した標的タンパク質同定を試みる中、光ラベル化タンパク質を迅速かつ確実に同定するためには、光ラベル化技術および光ラベル化したタンパク質への検出用官能基導入技術のどちらもを大きく進展させる必要があることが明らかになった。

そのため、光ラベル化技術のさらなる発展に向けて、その基盤として、光親和性標識プローブの迅速合成に役立つビルディングブロック開発に着手したところ、期待した以上の官能基許容性でジアジドビルディングブロックの変換が可能であることが明らかになった。そのため、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。検討の結果、光親和性標識後のアジドとの反応における標識効率が充分でないことが明らかになった。従って、これを解決すべく、ビオチンなどの検出基の改変により、光親和性標識されたタンパク質の検出効率の向上を目指す。加えて、引き続き、多彩なジアジドビルディングブロックにおいて、繊細な官能基であるアジド基を維持したまま変換する手法の開発を継続し、広範な生物活性化合物の光親和性標識プローブ化に有用な手法開発に努める。とくに、天然物をはじめとする生物活性化合物に対して、ジアジドビルディングブロックを用いるクロスカップリング反応や縮合反応などを行うことで、ジアジドユニットを導入した小分子を多種類合成する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
神経及び網膜の発生・分化異常におけるNEDD8及びNUB1の機能解析

NEDD8はユビキチンと最も高い相同性を有する81アミノ酸からなるタンパク質で,cullinに共有結合することでユビキチン-プロテアソーム系によるタンパク質分解に関与している.我々はNEDD8をbaitにしたyeast-two hybrid法により601アミノ酸からなるタンパク質NUB1を単離し,インターフェロンで誘導されることを明らかにした.さらに抗NEDD8抗体ならびに抗NUB1抗体を作成し,パラフィン包埋切片を免疫染色を行ったところ,NEDD8は比較的広い範囲の正常臓器にも発現していたが,Parkinson病やAlzheimer病などの神経変性疾患に出現する封入体に強い陽性像が得られた.常染色体劣性遺伝形式をとる重度の網膜変性疾患であるLeber先天盲の原因遺伝子のひとつとしてAIPL1が報告されているが,最近NUB1とAIPL1が結合することが報告された.AIPL1は光受容体特異的タンパク質として知られ,網膜に発現するのに対し,NUB1は多くのヒト正常組織で陽性像を示し,とりわけマクロファージに強い発現がみられることを明らかにした.さらに今回行ったNUB1をbaitとしたyeast two-hybrid法による結合タンパク質のスクリーニングにより,NUB1結合タンパク質の候補としてFKBPの一つが単離されたが,これはAIPL1と69%の相同性をもつタンパク質AIPとよく類似したタンパク質であることから,現在も相互作用を解析中である.NEDD8はユビキチンと最も高い相同性を有する81アミノ酸からなるタンパク質で,cullinに共有結合することでユビキチン-プロテアソーム系によるタンパク質分解に関与している.我々はNEDD8をbaitにしたyeast-two hybrid法により601アミノ酸からなるタンパク質NUB1を単離し,インターフェロンで誘導されることを明らかにした.さらに抗NEDD8抗体ならびに抗NUB1抗体を作成し,パラフィン包埋切片を免疫染色を行ったところ,NEDD8は比較的広い範囲の正常臓器にも発現していたが,Parkinson病やAlzheimer病などの神経変性疾患に出現する封入体に強い陽性像が得られた.常染色体劣性遺伝形式をとる重度の網膜変性疾患であるLeber先天盲の原因遺伝子のひとつとしてAIPL1が報告されているが,最近NUB1とAIPL1が結合することが報告された.AIPL1は光受容体特異的タンパク質として知られ,網膜に発現するのに対し,NUB1は多くのヒト正常組織で陽性像を示し,とりわけマクロファージに強い発現がみられることを明らかにした.さらに今回行ったNUB1をbaitとしたyeast two-hybrid法による結合タンパク質のスクリーニングにより,NUB1結合タンパク質の候補としてFKBPの一つが単離されたが,これはAIPL1と69%の相同性をもつタンパク質AIPとよく類似したタンパク質であることから,現在も相互作用を解析中である.我々はGST融合NEDD8蛋白質およびNUB1蛋白質を家兎に免疫し、抗NEDD8抗体および抗NuB1抗体を作製し、affinity精製を行った。これらはウェスタンブロットでそれぞれの蛋白質を特異的に認識し、パラフィン包埋組織切片における免疫組織化学染色が可能である。抗NEDD8抗体による免疫組織化学染色を行った結果、NEDD8はほぼ全てのヒト正常組織で発現が認められ、なかでも末梢神経や自律神経神経節では強い陽性像を示すことが明らかとなった。一方、ヒト成人の中枢神経組織でのNEDD8の発現は弱いものの、興味深いことにParkinson病やAlzheimer病などの神経変性疾患に出現する封入体に強い陽性像が得られた。神経変性疾患の封入体形成においてはユビキチン-プロテアソームシステムの関与が知られているが、今回の検討によりNEDD8蛋白質の異常集積が起きていることが明らかとなった。現在までNUB1の組織・臓器における局在は全く知られていないが、我々の検討では網膜を含めた多くのヒト正常組織において発現していることを明らかにした。興味深いことに、NUB1はリンパ節内の樹状細胞やマクロファージにとりわけ高い発現が認められた。NUB1の機能のひとつとして、我々はインターフェロンによりNUB1が誘導されることを報告しているが、同様にインターフェロンにより誘導されるユビキチン様蛋白質であるFAT10がNUB1と結合することが最近報告され、マクロファージ系細胞での蛋白質プロセッシングや抗原提示に関与する可能性が示唆された。現在、NUB1の神経性およびマクロファージにおける機能解析を継続中である。NEDD8はユビキチンと最も高い相同性を有する81アミノ酸からなるタンパク質で,cullinに共有結合することでユビキチン-プロテアソーム系によるタンパク質分解に関与している.我々はNEDD8をbaitにしたyeast-two hybrid法により601アミノ酸からなるタンパク質NUB1を単離し,インターフェロンで誘導されることを明らかにした。さらに抗NEDD8抗体ならびに抗NUB1抗体を作成し,パラフィン包埋切片を免疫染色を行ったところ,NEDD8は比較的広い範囲の正常臓器にも発現していたが,Parkinson病やAlzheimer病などの神経変性疾患に出現する封入体に強い陽性像が得られた.常染色体劣性遺伝形式をとる重度の網膜変性疾患であるLeber先天盲の原因遺伝子のひとつとしてAIPL1が報告されているが,最近NUB1とAIPL1が結合することが報告された.AIPL1は光受容体特異的タンパク質として知られ,網膜に発現するのに対し,NUBIは多くのヒト正常組織で陽性像を示し,とりわけマクロファージに強い発現がみられることを明らかにした.

さらに今回行ったNUB1をbaitとしたyeast two-hybrid法による結合タンパク質のスクリーニングにより,NUBI結合タンパク質の候補としてFKBPの一つが単離されたが,これはAIPL1と69%の相同性をもつタンパク質AIPとよく類似したタンパク質であることから,現在も相互作用を解析中である.
ヒトp53遺伝子の転写開始決定機構と新しい転写開始因子の機能解析

我々はこれまでにヒトp53遺伝子の発現制御機構を解析し、この遺伝子がこれまでに報告のない特異的な転写調節機構を持つことを明らかとしてきた。具体的には、ヒト細胞におけるp53の転写開始と紫外線ストレス応答を決定しているエレメントとして、転写開始点(mRNA合成開始点)より約50塩基上流に位置する約21baseの塩基配列(PE21)を同定した。本研究ではまず、(1)PE21が単独で両方向性(bidirectional)の転写開始活性を示し、約50base下流の特異的な点からの転写開始を促すこと、PE21内に変異を導入するとヒトp53の転写活性がゼロとなることを実証した。次に、(2)ゲルシフト法やサウスウエスタン解析により、PE21結合性の未知の核蛋白質が存在することを確認し、この核蛋白質がPE21塩基配列の両端に結合することと転写開始活性および紫外線応答が強く相関することを見いだした。これらの観察結果より、ヒトp53遺伝子の発現はPE21と当該核蛋白質(p53転写因子)の機能で説明できると推定し、(3)p53転写因子の単離精製と遺伝子クローニングを目標として研究を展開した。PE21をプローブとしたサウスウエスタンスクリーニングでいくつかの候補遺伝子の単離に成功し、また蛋白質の精製ではHeLa細胞より当該転写因子活性を1000倍以上に精製することができた。これらの結果、ヒトp53遺伝子の発現を決定する特異的な転写因子(p53転写因子)の存在とその生化学的特徴が明らかとなってきた。本研究は、発がんストレス応答性のp53遺伝子の発現制御と細胞癌化の関連を追及するこれまでにない新しい研究の展開が期待できる状況まで到達した。
トラウマ/PTSDリカバリー専門家養成・支援のための国際連携プログラム開発と評価

本研究は(1)トラウマ/[PTSDケア先進国イスラエルの専門家との連携により、心理・医療・福祉等の専門家向けにトラウマケアの新しい概念モデルであるリカバリーを標榜する「トラウマ/PTSDリカバリー専門家養成・支援プログラム」を開発・実施し、(2)アクションリサーチの形でエンパワーメント評価を行う。プログラム内容は、特に海外で「レジリエンス強化技法」として知られる「表現セラピー」を根幹とし、イスラエルと連携しながら日本的に設計・実施する。同時に多職種の専門家をネットワーク化し、フィードバックや結果データの蓄積により、プログラムを改良し、現場に繋げる。これはトラウマ/PTSDリカバリーにあたる専門家の継続的な養成と支援者の支援を目的とした。このテーマについて2018年度は以下のような成果を得ることができた。(1)加藤恵美・松平千佳・津田友理香・片岡真紀・いとうたけひこ・井上孝代(2018).ホスピタル・プレイの普及の意義対人援助専門職を主な対象としたアクティブラーニング型研修会を通して静岡県立大学短期大学部研究紀要要32ーW号(2018年度)ー3, 1-20.(2)井上孝代・いとうたけひこ(2018, 11月9ー10)トラウマケアとPTSD予防のためのグループ表現セラピーとコミュニティ構築:スリランカ研修会の実践報告第25回多文化間精神医学会学術総会2018年11月9日-10日ホテル日航成田(3)井上孝代・いとうたけひこ(2018, 9月)ビジュアル・ファシリテーションのカウンセリングへの導入と効果:コンフリクト解決のシングル・セッション事例をもとに日本カウンセリング学会第51回大会(2018) 9/16-17松本大学研究代表者の井上は、イスラエル人のアートセラピストを講師に招き読書療法の日本人を対象にグループ表現のトレーニングを実施するとともに、医療系学会においてもワークショップ企画しその報告を行った(1)。また、研究の進展を踏まえ、「トラウマケア/ PTSD予防における支援者支援の課題」をテーマに学会におけるシンポジウムで発表を行った(2)。さらにグループ表現セラピーによる支援活動と心的外傷後成長との関連をまとめ、その成果による研修会を応用心理学会で企画・実施した(3)。研究分担者の伊藤とともに、本研究で用いられたPAC分析の方法論的考察を行い国際学会で発表した(4)。(1)ワークショップ参加者へのインタビューを含むデータ収集が順調に行われている。(2)(1)の成果を翌年度の国際学会(ICP2016)で発表予定である。(3)グループ表現セラピーのこれまでの成果を中心として、書籍を準備している(2016年出版予定)。(4)以上の3つの成果発表と並行しながら、さらにグループ表現セラピーによるトレーニングを継続発展させることを準備している。(1)井上・いとう・福本・オレン(2016)の単行本を2016年に公刊した。その構成は次のとおりである。序章:トラウマケアノリカバリーの専門家養成のための国際連携-プログラム開発を目指して、第1章:日本にトラウマケアの力を育てる-東北復興支援におけるJISPの活動を通してー、第2あ章:トラウマケアにおける表現セラピー、第3章:トラウマケア/リカバリーの専門家養成プログラム-包括的グループ表現セラピーの視点ー、第4章:被災支援者養成のためのグループ表現セラピーの実際、第5章:心的外傷後成長(PTG)研究におけるナラティブ・アプローチ-苦労体験学(Suffering Experience Research)に向けてー、第6章:テキストマイニングによる被災体験学(Disaster Experience Research)への混合研究法アプローチ-死に関する表現と心的外傷後成長(PTG)-、第7章:東北被災者における援助体験学(Helper Experience Research)-援助者セラピー原則(Helper Therapy Principle : HTP)に着目して。(2)井上・いとう・オレン(2017)により、科研費研究の中間総括論文を公刊した。(1)単行本とプロジェクトの中間報告的な論文を発表することが出来たため。また国際学会で3本、国内学会で3本の発表ができたため。(2)次年度に向けてのプログラム開発も順調に進行しているため。(1)岡本悠・津田友理香・片岡真紀・小玉紗織・成田彩乃・いとうたけひこ・井上孝代の連名により、2017年11月に心理臨床学会で成果の発表をおこなった。(3)研究代表者が本研究の成果を踏まえて、日本カウンセリング学会の招待講演及び日本ピアメディエーション学会の設立記念講演をおこなった。(4)水野修次郎と共同で、本研究の成果を踏まえて、単行本を出版することができた。(1)前年度に単行本を出版することができた。それをふまえて今年度では中国蘇州と国内でグループ表現セラピー体験ワークショップの参加者についての学会発表を行うことができた。(2)多文化間精神医学会、日本カウンセリング学会で、今回の研究成果を踏まえた講演を研究代表者が行うことができた。(3)しかしながら、今年度に予定されていたイスラエルとの読書療法に関する国際交流は、先方の研究者の急病により、断念せざるを得なかった。

同時に多職種の専門家をネットワーク化し、フィードバックや結果データの蓄積により、プログラムを改良し、現場に繋げる。これはトラウマ/PTSDリカバリーにあたる専門家の継続的な養成と支援者の支援を目的とした。このテーマについて2018年度は以下のような成果を得ることができた。(1)加藤恵美・松平千佳・津田友理香・片岡真紀・いとうたけひこ・井上孝代(2018).ホスピタル・プレイの普及の意義対人援助専門職を主な対象としたアクティブラーニング型研修会を通して静岡県立大学短期大学部研究紀要要32ーW号(2018年度)ー3, 1-20.(2)井上孝代・いとうたけひこ(2018, 11月9ー10)トラウマケアとPTSD予防のためのグループ表現セラピーとコミュニティ構築:スリランカ研修会の実践報告第25回多文化間精神医学会学術総会2018年11月9日-10日ホテル日航成田(3)井上孝代・いとうたけひこ(2018, 9月)ビジュアル・ファシリテーションのカウンセリングへの導入と効果:コンフリクト解決のシングル・セッション事例をもとに日本カウンセリング学会第51回大会(2018) 9/16-17松本大学(1)ワークショップ参加者へのインタビューを含むデータ収集にの分析結果に基づく論文作成が翌年度の課題である。(2)その成果を英文として発表することも翌年度の国際学会(ICP2016)での課題である。(3)グループ表現セラピーのこれまでの成果を中心として、書籍を準備しているので、これを完成させ2016年内に出版することも来年度の課題である。(4)以上の3つの成果発表と並行しながら、さらにグループ表現セラピーによるトレーニングを継続発展させることが来年度と最終年度の課題である。(1)ワークショップ参加者へのインタビューを含むデータ収集および分析を行い、論文作成を行うこと。(2)研究の成果を、国際学会と国内学会で発表するべく準備すること。(3)書籍の発行を踏まえ、さらなる理論と実践の構築を行うこと。今年度が最終年度であったが、来年度も引き続き継続することになった。来年度は、国際交流研究をひとつの軸にして研究の幅を広げていく予定である。場所としては、スリランカ、シンガポール、カナダなどでの講演や学会を通した交流を予定している。初年度に、データ収集が順調以上に進み、費用が生じたため。イスラエルからのアートセラピストの当該年度の招聘が延期になったため次年度に改めて招聘する予定で準備を進めている。今年度が最終年度であったが、イスラエルから招待した研究者が急病のため交通費・滞在費などが未使用のため来年度に残高を持ち越した。テープ起こしなど謝金に使用。イスラエルより、アートセラピーの専門家を招聘するための、旅費及び関連する経費のために使用する。(2)のサイトでは、Papersのページで論文を紹介した。Conferenceのページで学会発表を紹介した。
造血幹細胞移植における意思決定と看護支援に関する研究

本研究では、看護師の臨床での様々な意思決定場面での困難な経験が、意思決定支援に関する学習動機につながる可能性が示唆された。また、医師との協働におけるジレンマやADLが低下した状況下での移植の実施などの場面で看護師は患者や家族への介入が困難と感じていた。患者の意思決定プロセスにおける看護援助では、内発的動機付けに基づく決意がより治療をスムーズに進め、その後の回復への経過も異なっていくと考えられた。平成24年度は、移植看護に携わるなかで困難だった看護介入場面に関する自由記載内容について分析を行った。分析方法は、自由記載のテキストデータから形態素解析によるコンセプトを抽出し、品詞の頻度を確認した。その後、言語学的手法に基づきカテゴリー化しネーミングを行った。分析ソフトとして、SPSS Text Analytics for Surveys Ver.4を用いた。分析の結果、自由記載文字数は約4255文字で、看護師1人につき約115文字であった。形態素解析によって得られた品詞とその頻度は、名詞(70)、動詞(64)などで名詞の内容を具体的に示すと、患者(40)、移植(36)、家族(18)、医師(12)、支援(10)などであった。次に、名詞を言語学的手法によって分類した結果、18個のサブカテゴリーが抽出された。これらを類似性に沿って整理し7個のカテゴリーが抽出された。【移植と向き合う患者の精神的支援】の場面では移植を選択したことを自ら肯定できるような指示的かかわりが求められ、【医師との協働におけるジレンマ】を感じる場面では医師と看護師など関係職種がお互いを評価・承認し合いコミュニケーションを円滑にしチームを形成する必要がある。【意思決定時における支援の難しさ】を感じる場面では移植を決意した思いを傾聴し、【患者-家族関係への援助】の場面では家族のもつ機能が患者にとって効果的に働くよう、家族ができるケア内容などの教育的介入が必要である。【合併症・副作用の理解と対応】では移植に対する期待が大きい分、合併症などに対する心理的反応も大きいため、これらのギャップを最小限にする必要がある。【急変時の対応について事前に情報収集する】では病状の受け止め方や治療に対するニードを把握する必要があり、【ADLが低下した状況下での移植の実施】では移植前からのリハビリテーションの必要性が考えられた。最終年度は、血液疾患により造血細胞移植(以下、移植)を受けた外来通院中の患者を対象に、移植を決定していく過程において、医療者との関係や家族の意思が患者の意思決定にどのような影響を与え、患者はそれをどう認知していたのかなど患者を取り巻く他者との関係性や患者個人の特性も踏まえ、病気の診断から移植の決定に至るまでの患者の意思決定プロセスを提示することを目的とした面接調査を行った。研究参加を承諾した対象者は5名であった。面接時の対象者の年齢は平均44歳(2164歳)で急性骨髄性白血病が3名、急性リンパ性白血病が1名、骨髄異形成症候群が1名であった。移植方法は、骨髄移植が3名で残り2名は末梢血幹細胞移植であった。面接調査より得られたカテゴリーは【突然の衝撃】【未知の世界】【移植以外の選択の余地が無いことへの苦悩】【現実味を帯びた移植】【受容できない移植】【家族同士の気遣い】【移植に向けての奮起】【迷いのない移植を決意】【医療者とのパートナーシップ】の9カテゴリーと2概念はカテゴリーと同等の説明力をもつ概念として〔他の患者との比較による心の安寧〕〔移植を絶対視しない医療者による安心感〕が生成された。移植の必要性は理解できていても、心情としては簡単に受容できない患者が多い。しかし、家族や医療者とのかかわりを通して、移植の必要性を理屈で解る理解の状況から、納得を伴った了解に至っていた。心理的に不安定な時期から徐々に前向きに移植を捉え、決意を固めていくためには、患者の揺れ動く意思決定プロセスを理解したうえで患者の決定を支持する必要があり、内発的動機付けに基づく決意がより治療をスムーズに進め、その後の回復への経過も異なると考えられた。今後の課題として、患者の意思決定の実際とQOLとの関連を明らかにし、情報提供のあり方や自己決定をどのように促進することが可能か検討していく必要がある。平成23年度は、造血幹細胞移植患者の看護に携わる看護師の、患者の意思決定支援に対する認識と援助の実際について質問紙調査を実施した。調査対象は、日本造血細胞移植学会平成22年度全国調査報告書の中で、診療科別移植報告件数が40件以上の施設等を中心に抽出、同意の得られた13の移植実施施設に勤務する看護師を対象とした。調査票は属性9項目、医師からの移植の説明における看護援助に関する項目22項目、患者や家族の心理社会的支援に関する項目24項目から構成。251部配布し192部回収(回収率76.5%)、有効回答数は189名(75.3%)であった。

医師からの移植の説明に関する看護援助、患者や家族の心理社会的支援に関する看護援助について因子分析および因子得点を用いて看護師の属性で比較検討するため、t検定・分散分析を行った。結果、医師からの移植の説明に関する看護援助では3つの因子が抽出された。第1因子は"情報提供と医師との連携"、第2因子は"説明内容の理解と精神的支援"、第3因子は"権利と意思の尊重"に関する因子とした。属性との関連では、第1因子では年齢・移植看護経験年数・専門学歴が、また第2因子では移植看護経験年数が、第3因子では移植看護経験年数・専門学歴に有意差を認めた。また、就職後の意思決定支援に関する学習の機会の有無も影響していることが明らかとなった。次に、患者や家族の心理社会的支援に関する看護援助では3つの因子が抽出され、第1因子は"家族間関係の調整"、第2因子は"患者・家族の価値観の尊重"、第3因子は"自己決定に向けた情報提供と意思確認"に関する因子とした。属性との関連では年齢や移植看護経験年数等には有意差は無く、就職後の意思決定支援に関する学習の機会の有無が影響していた。したがって、造血幹細胞移植を選択する患者における看護師の意思決定支援には、卒後教育の重要性が示唆された。研究はおおむね順調に進展している。また、研究結果も順調に学会発表を通じて公表できている。面接調査を当初は先に予定していたが、昨年度の研究の流れから先に自由記載内容についての分析を進める方が妥当であったため、適宜優先順位を考えながら研究を進めたことが、その理由と考える。今年度の研究は、おおむね順調に進展している。対象施設のリクルートや調査票の回収がスムーズに行え、データ入力を業者委託したことで、その後の解析に十分な時間を確保することができた点が、その理由と考える。これまで看護師の実態について調査してきた。最終年度では、実際に移植を受けた患者への面接調査を行う予定である。対象者の選定について、対象施設の関係者と調整を進めていく。今年度の調査票に、自由記載欄を設けている。したがって、自由記載欄に書かれた内容について分析することから始めていく予定である。また、次年度は実際に造血幹細胞移植を受けた患者への面接調査を予定している。さらに、今年度の研究成果を学会で発表する予定である。最終年度は、面接調査を予定しているため質的研究の専門家にスーパーヴァイズを受け、分析結果の信頼性・妥当性を高めていく必要がある。その際の、研究打ち合わせ旅費としての使用を予定している。また、面接調査結果を年度末の学会で発表する予定であるため、その旅費としても計画している。物品としては、面接調査に必要なICレコーダーの購入などを予定している。次年度は、面接調査を予定しているため、質的研究の専門家にスーパーヴァイズを受け、分析結果の信頼性・妥当性を高めていく必要がある。また、今年度の研究成果を学会発表する予定であり、その際の旅費としても計画している。物品としては、面接調査に必要なICレコーダーの購入を計画している。
シロイヌナズナ種子発芽の温度による調節に関わる植物ホルモン作用の解析

温度は種子発芽の季節を決定する主要な環境シグナルである。冬型一年性草本であるシロイヌナズナの種子発芽は吸水時の高温で抑制される(高温阻害)。種子の発芽は植物ホルモンのアブシジン酸(ABA)とジベレリン(GA)のバランスによって調節されている。私は、シロイヌナズナ種子の高温阻害には吸水後の新たなABA合成の促進とGA合成の抑制が重要であることを明らかにした。そこで、種子発芽の高温阻害におけるABAとGAの相互作用を明らかにすることを目的として解析を行った。ABA合成阻害剤で処理した野生型種子、およびABA欠損突然変異であるaba2-1種子の高温条件における発芽は、GA合成阻害剤によってほぼ完全に抑制された。また、この発芽抑制はGA_3によって解除されたことから、高温阻害条件におけるGA合成はABAを介して抑制されている可能性が考えられた。ABA欠損突然変異種子では、GA3ox1およびGA3ox2遺伝子の発現が高温で抑制されず、また常温で吸水した野生型種子よりも高い発現が認められた。ABA欠損突然変異種子におけるGA20ox2およびGA20ox3遺伝子の発現は高温でやや抑制されたが、野生型種子よりも高い発現を示した。したがって、高温阻害条件において、GA3ox遺伝子の発現はABAによって抑制され、GA20ox遺伝子の発現はABAと高温によって誘導される他の因子の両者によって抑制されると考えられた。ABA欠損突然変異種子では、GAシグナリングの抑制因子であるSPY遺伝子の高温による発現上昇が認められなかった。したがって、高温阻害条件におけるSPY遺伝子の発現は、ABAによって調節されると考えられた。シロイヌナズナ種子において、GAの合成とGAシグナリングはいずれも高温により合成されたABAによって抑制され、発芽の高温阻害をもたらすと考えられた。発芽の高温阻害におけるNCED遺伝子の生理機能NCED遺伝子は、ABA合成の律速段階を担うエポキシカロテノイド酸化解裂酵素をコードし、シロイヌナズナには5つの遺伝子が存在する。このうち、乾燥によるABA合成にNCED3遺伝子が働くことが示されているが、その他の4つの遺伝子の生理的な機能は明らかにされていない。そこで、高温による発芽阻害(高温阻害)におけるNCED遺伝子の役割を明らかにするため、NCED遺伝子の機能喪失突然変異体種子の発芽を調べた。その結果、NCED9遺伝子にT-DNA挿入変異を持つ種子は高温阻害条件で高い発芽率を示した。また、NCED2およびNCED5のT-DNA挿入突然変異体の種子も、弱いながら高温阻害に耐性を示した。これら機能喪失突然変異体の高温阻害耐性の度合いと、高温条件における遺伝子の発現量には相関関係が認められた。以上の結果から、種子における高温に応答したABA合成の促進には、これまで生理機能が示されていなかったNCED2,NCED5とともに、NCED9が主要な働きを持つことを明らかにした。高温によるABAシグナリングの制御ABA情報伝達の2次メッセンジャーであるIP3の分解酵素遺伝子、FRY1の発現を定量的RT-PCR法により解析した結果、常温で発芽する際には発現が顕著に誘導され、高温阻害条件ではその発現が強く抑制されることを明らかにした。また、FRY1の機能喪失突然変異体の種子は、野生型の発芽が抑制されない温度(28°C)において発芽が強く抑制された。このことから、吸水時の高温はABAの合成を誘導すると同時に、ABAの情報伝達を負に制御するFRY1の発現を抑制することにより、ABAの作用を高めていることを明らかにした。冬型一年性草本であるシロイヌナズナの種子発芽は吸水時の高温条件で抑制される(高温阻害)。私は、シロイヌナズナ種子の高温阻害には吸水後の新たなアブシジン酸(ABA)合成が必要であることを見出し、ABAの前駆物質であるカロテノイドの酸化開裂を触媒するNCED2、5、9遺伝子の発現が高温条件で高まることを示した。これらのNCED遺伝子の生理的機能を明らかにするため、T-DNA挿入突然変異種子の発芽を調べたところ、野生型(Col)種子の発芽がほぼ完全に抑制される34°Cにおいて、NCED09遺伝子に挿入変異を持つ種子(nced9)は高い発芽率を示したが、nced2およびnced5突然変異種子は明確な高温耐性を示さなかった。そこで、二重変異における高温条件での発芽を調べたところ、nced5nced9とnced2nced9は両親よりさらに高い発芽率を示したが、nced2nced5は両親と同程度の発芽率を示した。また、nced2nced5nced9三重変異体は全ての2重変異体よりも強い高温耐性を示した。したがって、シロイヌナズナ種子の高温阻害には、これら3つのNCED遺伝子の高温による転写産物量の調節が重要な役割を持ち、NCED9とNCED2、5はunequally redundantな関係にあると考えられた。次に、高温阻害におけるジベレリン(GA)シグナリングの負の制御因子の寄与を明らかにするため、これらの機能喪失突然変異体種子の発芽を調べた。GA常感受性変異であるspyと、種子で働くDELLAタンパク質遺伝子内にT-DNAの挿入を持つrgl2の種子は、どちらも高温耐性を示した。したがって、吸水時の高温はGA作用を負に制御する因子の発現を高いレベルに維持することにより、発芽誘導に関わるGA反応を抑制していることを明らかにした。

冬型一年性草本であるシロイヌナズナの種子発芽は吸水時の高温で抑制される(高温阻害)。種子の発芽は植物ホルモンのアブシジン酸(ABA)とジベレリン(GA)のバランスによって調節されている。私は、シロイヌナズナ種子の高温阻害には吸水後の新たなABA合成の促進とGA合成の抑制が重要であることを明らかにした。そこで、種子発芽の高温阻害におけるABAとGAの相互作用を明らかにすることを目的として解析を行った。ABA合成阻害剤で処理した野生型種子、およびABA欠損突然変異であるaba2-1種子の高温条件における発芽は、GA合成阻害剤によってほぼ完全に抑制された。また、この発芽抑制はGA_3によって解除されたことから、高温阻害条件におけるGA合成はABAを介して抑制されている可能性が考えられた。ABA欠損突然変異種子では、GA3ox1およびGA3ox2遺伝子の発現が高温で抑制されず、また常温で吸水した野生型種子よりも高い発現が認められた。ABA欠損突然変異種子におけるGA20ox2およびGA20ox3遺伝子の発現は高温でやや抑制されたが、野生型種子よりも高い発現を示した。したがって、高温阻害条件において、GA3ox遺伝子の発現はABAによって抑制され、GA20ox遺伝子の発現はABAと高温によって誘導される他の因子の両者によって抑制されると考えられた。ABA欠損突然変異種子では、GAシグナリングの抑制因子であるSPY遺伝子の高温による発現上昇が認められなかった。したがって、高温阻害条件におけるSPY遺伝子の発現は、ABAによって調節されると考えられた。シロイヌナズナ種子において、GAの合成とGAシグナリングはいずれも高温により合成されたABAによって抑制され、発芽の高温阻害をもたらすと考えられた。
新生体用ハイエントロピー合金の開発と細胞との相互作用

生体用ハイエントロピー合金の合金設計・組織制御を行い、組成・組織制御された生体ハイエントロピー合金を用いて細胞との相互作用を評価することで、単純な構成元素の線形加算則では説明できず多様な構成原子間の非線形相互作用(すなわちカクテル効果)に起因すると考えられる生体適合性の起源を解明し、新たな生体ハイエントロピー合金の開発を行う。
有機リン系殺虫剤の経時的毒性変化について

日本の農業では狭い耕地面積で多量の収穫や省力化を目的として,多種類の農薬が大量に使用されている.各々の農薬については安全性が検討されているが,それらの分解生成物の毒性についてはほとんど検討されていない.そこで我々は農薬の分解生成物の対生物影響を知る目的で以下の実験を行った.試験薬剤としては広島県下で最も多く使用されている有機リン系殺虫剤の1つであるフェニトロチオン(MEP)乳剤を使用した. pH8, pH10, pH14に各々調整されたMEP乳剤を加温しつつ,冬期の自然光に曝露し,分解した.分解開始時のMEPの約90%が分解した時点で分解操作を終了し,分解原液とした.動物曝露実験にあたっては,これらの分解原液を各々所定のMEP濃度に稀釈したもの(分解液)を使用した.実験室内で得られたメダカ卵を所定のMEP濃度の3種分解液及び未分解液(未分解のMEP乳剤を脱塩素水道水で所定のMEP濃度に稀釈したもの)の中で受精後45時間以後5日間曝露した.その後脱塩素水道水に移し, 3ヶ月魚に達するまで飼育した.一方妊娠マウスに対する実験では,所定のMEP濃度の3種分解液及び未分解液を妊娠マウスの背部皮下に,妊娠第3日目から第15日目まで連続投与し,妊娠第18日目に開腹し,胎仔を観察した.また, Behrens法を用いて3種分解液及び未分解液のLD_<50>を求めた.被曝露メダカ卵飼育実験の結果から,ふ化率及び3ヶ月魚生存率は未分解液より3種分解液の方で低い傾向を,また異常仔魚発生率は3種分解液で高い傾向を示すことが認められた.妊娠マウスに対する毒性実験の結果から,分解液が母獣の死亡,胎仔体重の低下, LD_<50>の低下に未分解液より強く影響する場合があることが認められた.以上の結果から,分解生成物の毒性も無視できないことが指摘され,従って農薬の安全性を検討する時,分解生成物の対生物影響をも考慮に入れる必要があるものと思われる.日本の農業では狭い耕地面積で多量の収穫や省力化を目的として,多種類の農薬が大量に使用されている.各々の農薬については安全性が検討されているが,それらの分解生成物の毒性についてはほとんど検討されていない.そこで我々は農薬の分解生成物の対生物影響を知る目的で以下の実験を行った.試験薬剤としては広島県下で最も多く使用されている有機リン系殺虫剤の1つであるフェニトロチオン(MEP)乳剤を使用した. pH8, pH10, pH14に各々調整されたMEP乳剤を加温しつつ,冬期の自然光に曝露し,分解した.分解開始時のMEPの約90%が分解した時点で分解操作を終了し,分解原液とした.動物曝露実験にあたっては,これらの分解原液を各々所定のMEP濃度に稀釈したもの(分解液)を使用した.実験室内で得られたメダカ卵を所定のMEP濃度の3種分解液及び未分解液(未分解のMEP乳剤を脱塩素水道水で所定のMEP濃度に稀釈したもの)の中で受精後45時間以後5日間曝露した.その後脱塩素水道水に移し, 3ヶ月魚に達するまで飼育した.一方妊娠マウスに対する実験では,所定のMEP濃度の3種分解液及び未分解液を妊娠マウスの背部皮下に,妊娠第3日目から第15日目まで連続投与し,妊娠第18日目に開腹し,胎仔を観察した.また, Behrens法を用いて3種分解液及び未分解液のLD_<50>を求めた.被曝露メダカ卵飼育実験の結果から,ふ化率及び3ヶ月魚生存率は未分解液より3種分解液の方で低い傾向を,また異常仔魚発生率は3種分解液で高い傾向を示すことが認められた.妊娠マウスに対する毒性実験の結果から,分解液が母獣の死亡,胎仔体重の低下, LD_<50>の低下に未分解液より強く影響する場合があることが認められた.以上の結果から,分解生成物の毒性も無視できないことが指摘され,従って農薬の安全性を検討する時,分解生成物の対生物影響をも考慮に入れる必要があるものと思われる.1.MEP乳剤半減期について:試験薬剤としてはMEP乳剤(MEP50.0%,有機溶剤・乳化剤等50.0%)を使用した。種々の条件を設定し検討した結果、MEP濃度が低い方が、またPHの値が大きい方が半減期が短かいことが認められた。紫外線照射と加熱は分解を促進する効果が大きく、曝気は緩徐な分解作用を示した。有機リン剤は一般に昜分解性であると言われているが、本実験の結果では必ずしもそうとは言えないように思われた。2.対メダカ卵毒性実験:100ppmのMEP乳剤をPH7.2,25±2°C,200ml/minで30日間または60日間曝気処理したものを被検材料とした。残存MEPは未処理50ppm,30日曝気20ppm,60日曝気8.2ppmであった。各被検材料を種々の濃度でヒメダカ卵に作用させた結果、ふ化率に及ぼす影響は未処理液の場合が最も大きく、曝気分解液ではその影響は低下した。ふ化仔魚の外形異常については、未処理液では全く認められなかったが、曝気分解液では多数認められた。

3.対マウス胎仔毒性実験:市販のMEP乳剤あるいはその分解液を妊娠マウスに第3日目から13日間連続投与し、第18日目に開腹し、胎仔数、着床数、胎仔体重、外形異常を観察した。(1)未処理MEP乳剤では対照群(生食)に比較して、妊娠率低下,死胚数増加,胎仔数減少,胎仔体重減少が認められた。(2)0.5×【10^6】ppmのMEP乳剤をPH8,30±3°C,冬季連日の太陽光照射の条件で分解した分解液について、MEP濃度が17×【10^3】ppm,8×【10^3】ppmでは各5尾の母獣全部が斃死した。しかし未処理MEP乳剤の同濃度では5尾の母獣全部が生残し、妊娠の継続が認められた。PH8の分解液に強い急性毒性があることが認められた。(3)0.5×【10^6】ppmのMEP乳剤をPH14,30±3°C,冬季連日の太陽光照射の条件で分解した分解液については、残存MEPの濃度に相当する所見が認められるのみであった。
ライダーによる都市大気中浮遊物質と気温の鉛直分布の同時測定法の開発

都市の下層大気中の浮遊物質の動態を明らかにするために、都下八王子市の都立大学構内において、大気境界層付近までの浮遊物質濃度と大気温度の鉛直分布を同時に連続的に測定できるライダーシステムの開発を行い、実際の測定を行った。浮遊物質測定法としては、送信にNd:YAGレーザーの第2高調波、受信に偏光プリズムを用いたミ-散乱偏光ライダーを用い、散乱信号強度と偏光解消度の測定を行い、エアロゾル濃度と球形か非球形かの粒形情報の鉛直分布を各季節毎に得た。特に春季には花粉の分布と偏光解消度が良い相関があることが明らかになった。大気温度の測定には、大気分子の回転ラマンスペクトルの温度依存性を利用した回転ラマンライダーシステムを用いた。送信光には、インジェクションシーダ-付のNd:YAGレーザの第2高調波を用いた。ビームスプリッターにより2つに分けた光を、それぞれ中心波長の異なる狭帯域干渉フィルターを用い回転ラマン成分を取り出した。2つのフィルターは蛍光による影響を避けるため、アンチストークス成分を用い、中心波長は530.2nmと529.0nmで、帯域幅0.7nmの物をそれぞれ2枚重ねて使用した。それぞれのフィルターの送信波長(532.1nm)におけるブロッキングは1枚あたり10^4以上である。2つのフィルターの出力比が気温に依存することを利用し、大気温度の高度分布を測定した。ラジオゾンデデータとの比較により、高度5kmまでの範囲で良い一致が得られた。都市の下層大気中の浮遊物質の動態を明らかにするために、都下八王子市の都立大学構内において、大気境界層付近までの浮遊物質濃度と大気温度の鉛直分布を同時に連続的に測定できるライダーシステムの開発を行った。まず浮遊物質測定法として、送信にNd:YAGレーザーの第2高調波、受信に偏光プリズムを用いたミ-散乱偏光ライダーを開発した。このライダーにより散乱信号強度と偏光解消度の測定を行い、エアロゾル濃度と球形か非球形かの粒形情報の鉛直分布が得られた。次に大気温度の測定法として、大気分子の回転ラマンスペクトルの温度依存性を利用した回転ラマンライダシステムの開発を行った。送信光には、インジェクションシーダ-付のNd:YAGレーザーの第2高調波を用いてた。レーザの出力は300mJ、繰り返し10Hzである。受信光は20cmのシュミットカセグレン望遠鏡により集め、ビームスプリッターにより2つに分けた光を、それぞれ中心波長の異なる狭帯域干渉フィルターを用い回転ラマン成分を取り出した。2つのフィルターは蛍光による影響を避けるため、アンチストークス成分を用い、中心波長は530.2nmと529.0nmで、帯域幅0.7nmの物それぞれ2枚重ねて使用した。館野の高層気象台のラジオゾンデデータとの比較により、17分間の測定で高度1.5kmから5kmの範囲で良い一致が得られた。高度1.5km以下ではライダーとゾンデの結果が一致しなかった。この一致の原因は、ラジオゾンデとライダーの観測点が離れているためか、その他の誤差要因どうかを検討中であり、平成9年度も引き続き比較実験を行う。
糖輸送機構におけるインスリン作用の情報伝達の解明-ノックアウトマウスを用いた解析

本研究はインスリン刺激による糖輸送活性化機構の解明のため、インスリンがその受容体に結合し、チロシンキナーゼによる自己リン酸化から糖輸送刺激伝達系の第一段階の基質として重要と考えられるinsulin receptorsubstrate(IRS)-1を欠くノックアウトマウス(IRS-1null)を用いて実験した。IRS-1nullの脂肪細胞では最大糖輸送活性が約50%まで低下し、インスリン刺激による用量反応曲線も右方に移動し、IRS-1nullではインスリン抵抗性を認めた。PI3-kinase活性はwild typeに比較して最大刺激時に約54.3%と低下していたが、依然としてインスリン刺激は下流に伝達されていた。ワルトマニンの前処置により糖輸送活性もPI3-kinase活性もインスリン効果を完全に阻害した。インスリン刺激2分後の細胞内リン酸化蛋白はIRS-1nullでは弱い190kDのバンドを認めたが、これは抗IRS-2抗体により免疫沈降され、IRS-2と考えられた。さらに抗p85抗体でPI3-kinaseと共に免疫沈降されるpp60を見い出した。従って、IRS-1nullの脂肪細胞ではpp60とPI3-kinaseがassociationしており、インスリン受容体からの情報伝達に主要な役割を果たしていることが推測された。インスリン刺激によるGLUT4分子のtranslocationはIRS-1nullにおいて障害されていたが、細胞総GLUT4量はWild typeと差を認めなかった。以上から、IRS-1を欠くインスリン抵抗性状態は情報伝達系に変化をもたらし、研究の新しい標的物質を見い出した。本研究はIRS-1遺伝子をノックアウトしたマウス(IRS-1null)を用いて、インスリンによる糖輸送活性化機構における細胞内情報伝達機構と糖輸送坦体(GLUT)のなかでもGLUT4の細胞内から細胞膜上への移動機構を解明することを目的とした。2細胞内膜分画を精製し、GLUT1とGLUT4に対する特異抗体によりimmunoblotら検討した糖輸送坦体の移動では細胞膜分画のGLUT4はIRS-1nullマウスにおいてbasalで軽度増加、インスリン刺激(1nM)によりwild typeの約60%と低下していた。細胞全体のGLUT4量には変化を認めなかった。リン酸化蛋白の経時変化とPI-3kinase抗リン酸化チロシン抗体によるリン酸化蛋白の検討では180kDa、95kDa,60kDaにWild typeではリン酸化、脱リン酸化蛋白が認められたが、IRS-1nullマウスでは95kDa、60kDaでは同様のであったが、180kDa付近のbandは弱かった。PI-3kinase活性は10-9から10-7Mまでのインスリン刺激で実験をおこなったが、Wild typeでは用量反応的に活性増加が認められたが、IRS-1nullマウスでは10-7M刺激でもWild typeの50%以下の活性にとどまっていた。本研究はインスリン刺激による糖輸送活性化機構の解明のため、インスリンがその受容体に結合し、チロシンキナーゼの活性化から糖輸送への情報伝達系の第一段階の基質として重要と考えられるInsulin receptorsubstrate(IRS)-1を欠くノックアウトマウスを用いて実験を行った。IRS-1ノックアウト(Null)マウスの脂肪細胞ではインスリン刺激により最大糖輸送活性が約50%まで低下し、インスリンによる用量反応曲線も右方移動しhalf-maximum responseは野生型3.62X10^<-10>Mに対し、IRS-1ノックアウトマウスでは0.95X10^<-9>Mであり、インスリン抵抗性が認められた。IRS-1の下流に存在すると考えられているフォスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI-3kinase)の阻害剤であるワルトマニンの前処置により、野生型マウスもNullマウスもインスリンの刺激効果を完全に消失させた。肝臓、筋肉組織とは異なり、IRS-1を欠く代償機構としてのIRS-2の発現は極めて弱く、PI-3 kinase抗体と共免疫沈降される60kDaの蛋白がNullマウスにおいてリン酸化され、IRS-