hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性リンパ浮腫におけるリンパ管の観察と炎症・線維化プロセス解明の基礎研究

1.マウス下肢リンパ浮腫モデルの作製マウス下肢リンパ系の解剖を実施し、リンパ排泄経路を3つ明らかにした。雌雄、週齢別に解剖を実施したが、いずれにおいても差はなかった。この3つの経路上には、それぞれ膝窩リンパ節、鼠径リンパ節、腸骨リンパ節が存在し、この3つのリンパ節を切除することで60日間リンパ浮腫が持続するモデルを作製することに成功した(Nakajima et al., 2018,Scientific Reports)。このモデルでは、リンパ浮腫部位で観察されるCD4+細胞の増加、毛細リンパ管の拡張、下肢周囲径・体積の増加がみられた。しかしながら、重症なリンパ浮腫の指標である線維化については、対照側と比較し有意差はみられなかった。この理由として、リンパ節切除部周囲では、切除部を迂回するリンパ管が出現し、これが側副路としてリンパを中枢へ排泄する役割を担っており、リンパ流を完全に遮断できなかったことが原因として考えられた。線維化を来すほど重症なモデルを動物で作製するためには、より多くのリンパをうっ滞させ続ける必要があり、このためには、リンパ節切除後に出現した側副路を遮断する方策の検討が必要である。また、リンパ節切除後に観察される側副路は平滑筋細胞をもつ導出リンパ管であった。2.リンパ浮腫の予防・治療法の開発Nishiguchiら(2013)とAsanoら(2015)の方法に準じて3次元培養を行い、幹細胞からリンパ管の作製に成功した。現在、リンパ管形成に必要な因子の同定を行っている。今後は、リンパ管形成に関わる因子を用いてin vivoでもリンパ節切除部でリンパ管が再生できるか検討を行う予定である。最終的に続発性リンパ浮腫患者への適応を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1.慢性リンパ浮腫モデルを作製するために、雌性・雄性マウスを用い、リンパ節とリンパ管の切除部位を検討した。リンパ管は切除しても再生されてしまうため、リンパ節の切除が適切であることがわかった。マウスの下肢に浮腫を作製するため、下肢の解剖を実施したところ、新たなリンパの経路を発見した。リンパ管の経路に性差はなかった。2.マウス下肢リンパ浮腫モデルを作製するために、リンパ節切除の部位や組み合わせを変え、モデルの作製を実施した。鼠径リンパ節の切除だけでは、長期間飼育してもリンパはうっ滞しないこと、鼠径周囲のリンパ管は再生することがわかった。本実験では、マウスの下肢を走行するリンパ管ルートを全て遮断したリンパ浮腫モデルが最も浮腫が持続した。現在、組織学的観察を実施し、浮腫性変化が観察されるか検討中である。3.マウスの集合リンパ管を観察するために、固定方法や包埋方法の条件を検討し、プロトコルが確立できた。集合リンパ管は非常に脆く、パラフィン切片では形態を保持できず、観察できないことが分かった。凍結切片にて試料を薄切し、リンパ管内皮細胞のマーカーであるPodoplanin、LYVE-1の染色を実施したが、非特異的反応が多く、プロトコルを調整しPodoplaninをマーカーとして採用することとした。今後は、集合リンパ管の観察のため、Podoplaninとα-SMAの抗体を用いて二重染色を実施し、リンパ管切除部周囲の新生リンパ管の評価を実施する予定である。慢性浮腫モデルの作製と集合リンパ管の組織切片作製に予想以上に時間を要したが、モデルの見通しが立ち、組織観察手法はプロトコル確立まで達成した。1.マウス下肢リンパ浮腫モデルを作製するために、リンパ節切除、bone morphogenetic protein (BMP)-9を投与した。リンパ節切除後1週間ほどで、通常切除部周囲に迂回路が発達し、これを通って下肢のリンパは中枢へ排泄される。この迂回路は、リンパ節切除後1週間ほどで出現すること、劇的に出現すること、平滑筋細胞をもつことより、導出リンパ管と考えられる。血管新生の概念とは異なり、リンパ管の傷害後は、元々存在する導出リンパ管がリンパ排泄経路の再建に大きな役割を果たすと考えられる。100ng/dayのBMP-9全身投与によって、リンパ節切除部周囲の迂回路はほとんど観察されなかった。迂回路の出現を阻害する意味では、BMP-9の投与は効果的と考えられる。一方で、BMP-9を投与しても、浮腫の程度は軽度であった。これは、リンパ節切除とBMP-9の投与だけでは、間質のリンパ排泄までは十分に阻害できていないためと考えられる。間質の流れを阻害することができれば、より重症度の高い浮腫モデルが作製可能と考えられる。このモデルを確立させ、新規治療の効果判定や下部に記載した線維化の解明へ発展させたいと考えている。2.長期間浮腫の持続するモデル確立後、浮腫部位の炎症と線維化の機序解明を実施予定である。継時的に浮腫モデルの組織変化を観察することで、どのように線維化のプロセスが進行するかを明らかにでき、関係するバイオマーカー等の探索を目指す。3.リンパ浮腫発症予防方法の検討として、リンパ管内皮細胞の3次元培養(Nishiguchi, 2013、Asano 2015)を行い、集合リンパ管の作製を目指している。現段階では、3次元培養を行ったサンプルの組織学的観察方法を検討中である。今年度はリンパ浮腫が動物で作製困難な理由を明らかにした。

また、リンパ浮腫発症予防についての実験も進行中であり、来年度も順調に進むと考えられる。1.マウス下肢リンパ浮腫モデルの作製マウス下肢リンパ系の解剖を実施し、リンパ排泄経路を3つ明らかにした。雌雄、週齢別に解剖を実施したが、いずれにおいても差はなかった。この3つの経路上には、それぞれ膝窩リンパ節、鼠径リンパ節、腸骨リンパ節が存在し、この3つのリンパ節を切除することで60日間リンパ浮腫が持続するモデルを作製することに成功した(Nakajima et al., 2018,Scientific Reports)。このモデルでは、リンパ浮腫部位で観察されるCD4+細胞の増加、毛細リンパ管の拡張、下肢周囲径・体積の増加がみられた。しかしながら、重症なリンパ浮腫の指標である線維化については、対照側と比較し有意差はみられなかった。この理由として、リンパ節切除部周囲では、切除部を迂回するリンパ管が出現し、これが側副路としてリンパを中枢へ排泄する役割を担っており、リンパ流を完全に遮断できなかったことが原因として考えられた。線維化を来すほど重症なモデルを動物で作製するためには、より多くのリンパをうっ滞させ続ける必要があり、このためには、リンパ節切除後に出現した側副路を遮断する方策の検討が必要である。また、リンパ節切除後に観察される側副路は平滑筋細胞をもつ導出リンパ管であった。2.リンパ浮腫の予防・治療法の開発Nishiguchiら(2013)とAsanoら(2015)の方法に準じて3次元培養を行い、幹細胞からリンパ管の作製に成功した。現在、リンパ管形成に必要な因子の同定を行っている。今後は、リンパ管形成に関わる因子を用いてin vivoでもリンパ節切除部でリンパ管が再生できるか検討を行う予定である。最終的に続発性リンパ浮腫患者への適応を目指す。作製した浮腫モデルの組織所見によるが、浮腫組織やリンパ管再生部位で起きている現象を形態学的に明らかにする。それらの組織変化に関連する細胞やサイトカイン等を探り、リンパ管内皮細胞の培養系を確立し、共培養を行い、リンパ浮腫の要因を検討する。リンパ浮腫部位での形態学的特徴を明らかにする。また、線維化に関連するバイオマーカーの探索を行い、治療への応用可能性を探る。再生医療として、培養下で作製したリンパ管を生体に移植し、リンパ節切除部位でのリンパ管再建を図る。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
神経シナプスにおける新規膜蛋白質ネットワークの機能解析

膜蛋白質は細胞外シグナルを正確に認識し、細胞内に情報を伝達する。膜蛋白質は単独で機能するのではなく、様々な蛋白質と複合体を形成して、その機能、局在が正確に制御されている。本研究では神経シナプス膜において重要な役割を担う足場蛋白質PSD-95を含む新規シナプス膜蛋白質複合体として、てんかん関連リガンド・受容体LGI1・ADAM22を発見し、新たなシナプス伝達制御機構を明らかにした(Fukata Y et al, Science 2006)。神経シナプスにおける生理的な膜蛋白質複合体を同定し、その機能を解析することは神経細胞の機能を理解する上で重要であるばかりでなく、様々な病態理解や治療にもつながることが期待される。申請者は最近、シナプス可塑性の根幹を成すと考えられているAMPA型グルタミン酸受容体複合体を生化学的に脳組織より精製し、構成分子を同定した(Fukata Y etal, J.Cell Biol.2005)。本研究では代表的なシナプス足場蛋白質PSD-95が裏打ちする新規膜蛋白質複合体の生理機能を明らかにし、シナプス形成、可塑性の新たな分子機構の解明を目指ざす。今年度はPSD-95に結合する蛋白質をラット脳から精製し、質量分析法にてその構成蛋白質を同定した。その結果、主要な構成蛋白質としてLGI1、ADAM22およびStargazinを見出した。これら3つの蛋白質はいずれもヒトおよびマウスの遺伝学的解析により、てんかん・けいれんに関連のある遺伝子として報告されているものだった。このようによく似た神経症状を示す3つの遺伝子が一つの蛋白質複合体の構成成分として見つかった例はこれまで殆ど報告されていなかった。これら3つの蛋白質の結合様式を解析した結果、分泌蛋白質であるLGI1は膜蛋白質ADAM22を受容体として結合し、ADAM22はPSD-95によりシナプスに裏打ちされることが明らかになった。一方、家族性特発性部分てんかんの家系で見られるLGI1の変異蛋白質はADAM22とは全く結合しなかった。さらに、LGI1はADAM22と結合することによりAMPA受容体の機能を促進することを電気生理学的に明らかにした。AMPA受容体機能を制御する新たなリガンド、受容体を同定したといえる(Fukata Y et al, Science. 2006)。このように、今年度の研究計画は達成できたと考えている。神経細胞はシナプスにおいてイオンチャネル等の膜蛋白質を中心に精密なネットワークを形成して複雑な情報処理を行っている。私は昨年度、代表的なシナプス足場蛋白質PSD-95複合体をラット脳より精製し、LGI1、ADAM22およびstargazinが主要構成蛋白質であることを見出した。さらに、分泌蛋白質LGI1が膜蛋白質ADAM22のリガンドとして機能し、AMPA型受容体機能を促進することを見出した(Fukata Y, et. al., Science 2006)。興味深いことにPSD-95結合蛋白質として同定したこれら3つの蛋白質の変異は共通の表現型(てんかん様症状)を示すことが報告されていた。今年度は新規シナプス伝達修飾リガンドと考えられるLGI1の作用機序を明らかにすることを目指した。まず、家族性てんかん家系で見られるLGI1の点突然変異体の機能を野生型LGI1と比較検討した。野生型LGI1は海馬培養神経細胞から効率よく細胞外に分泌され、ADAM22受容体と結合する一方で、LGI1点変異体は細胞外に全く分泌されず、ADAM22とも結合できないことが明らかになった。この知見は細胞外に分泌されたLGI1の量の減少がてんかん発症に重要な役割を果たすことを示唆するものと考えられる。今後、作成中であるLGI1ノックアウトマウスを用いてLGI1の分泌量とてんかん発作発症との関連を明らかにしていく予定である。さらに、独自に開発したシナプス蛋白質複合体の精製、同定技術を用いて新規LGI1複合体を脳組織より精製、同定することに成功した。このように、今年度の研究計画は十分達成できたと考えている。膜蛋白質(受容体、イオンチャネル、接着分子など)により細胞は細胞外シグナルを正確に認識し、細胞内に情報を伝達する。膜蛋白質は単独で機能するのではなく、制御膜蛋白質や細胞質の足場蛋白質、シグナル蛋白質、細胞骨格などと複合体を形成して、その機能、局在が正確に制御されている。よって、生理的な膜蛋白質複合体を同定し、その性状解析を行うことは生体機能を理解する上で極めて重要である。

これまでに私は神経シナプスの形態、機能において重要な役割を果たす足場蛋白質PSD-95を含むシナプス膜蛋白質複合体を精製し、ADAM22, LGI1, stargazinを同定した(Fukata Y, et.al, Science 2006)。興味深いことにこれら蛋白質はいずれも遺伝学的にてんかん発症に関わる蛋白質であった。さらに、LGI1は分泌蛋白質であり、ADAM22を受容体として機能し、AMPA受容体を介したシナプス伝達を促進することを見出している。本年度はLGI1の機能を明らかにする目的で1)脳内LGI1複合体の同定、および2)LGI1の局在解析、3)LGI1ファミリーの機能解析を行った。まず、タグ付きLGI1を発現させたトランスジェニックマウスからLGI1複合体の精製を行い、質量分析法にて特異的複合体構成蛋白質を定量的に同定した。また、電子顕微鏡を用いた解析によりLGI1の局在を詳細に検討している。さらに、LGIファミリー蛋白質(LGI2, 3, 4)の生理的複合体の探索を行い、興味深い候補蛋白質をいくつか同定している。このように、本年度の研究計画は十分達成できたと考えられる。
ウシならびにブタ卵母細胞の初期化(活性化)に関する研究

【目的】卵母細胞の活性化技術は動物発生工学の重要な技術である。そこで,種々の時間体外成熟培養したウシならびにブタ卵母細胞の成熟中の変化や,活性処理後の前核形成率と細胞レべルの変化を観察し卵の加齢との関連を検討した。そして,発生率の高い活性化技術の確立を図った。【方法】実験1と2では,22-40時間体外成熟させたウシ卵に電気パルス(100V/mm,50μsec),Caイオノフォア(5μM),さらにシクロへキシミドまたはDMAPとの複合処理を施し,前核形成率と表面微細構造の変化を追跡した。実験3と4では,ブタの体外成熟条件の検討と成熟中の卵丘細胞との細胞間連絡の変化について観察した。実験5と6では,44-60時間体外成熟させたブタ成熟卵に電気刺激(150V/mm,60μsec.2回),Caイオノフォア(50μM)。エタノール(7%)処理し,活性率と細胞骨格の変化を検討した。さらに,反復電気刺激とサイトカラシンDが発生率に及ぼす影響を検討した。【結果】実験1と2:ウシ卵母細胞は,卵の加齢が進むにつれ高率に活性化した。また,活性化処理による形態学的な影響も若齢卵に比べ,加齢卵で早期に,かつ高率に現われ,その影響は19時間後には回復する傾向が示唆された。実験3と4:ブタ卵母細胞の成熟中の顕著な変化として卵丘細胞間隙の拡張が見られ,これには細胞外の粘液性物質の蓄積を伴うこと,また卵細胞膜における微絨毛の分布の変化はブタ卵母細胞の細胞質成熟に関連することが明らかにされた。実験5と6:ブタ卵の活性化にはイオノフォアとエタノール処理に比べ,電気刺激が最も有効で,卵の加齢に関わらず高率であった。ただし,加齢卵では細胞骨格の凝集が観察され,フラグメント率も高かった。ブタ成熟卵に反復電気刺激後サイトカラシン処理すると,倍数体が高率に生じ,最も高い胚盤胞発生率(24%)が得られた。ウシ成熟卵母細胞に対する活性化刺激が発生能と形態に及ぼす影響を知るために,イオノフォアと電気刺激に加え,シクロヘキシミド(CHX)またはDMAPによって活性化したウシ卵母細胞の表面微細構造,活性化率と細胞骨格の配列を検討した。1.ウシ卵母細胞の表面微細構造の変化成熟卵母細胞の細胞膜表面には良く発達した微絨毛が密に配列していた。CHX処理1時間後微絨毛は太く変化し,細胞質突起も出現した。処理3-6時間後微絨毛はお互いに接着し合っていた。処理19時間後では形態が回復していた。これに対し,DMAP処理3時間後では,比較的大型の細胞質突起が観察された。処理6時間後では微絨毛と細胞質突起が混在していた。処理19時間後では,伸張した微絨毛に被われていたが,局部的にその分布密度が低下していた。2.ウシ卵母細胞の活性化率と細胞骨格の配列成熟卵では染色体周辺に短い樽型の微小管(紡錘体)が形成されていた。イオノフォア処理4時間後では紡錘体がほぼ両極に分かれ,16時間後では12%が前核期に達していた。DMAP処理

4時間後では,紡錘体が再形成されたもの(34%)と前核形成を示したものに分かれた(57%)。マイクロフィラメントは卵表層には断続的な層として,細胞質内では多量に凝集していた。処理16時間後では,64%で前核形成が見られた。CHX処理4時間目に染色体の分離が認められ,8-16時間後の前核形成率は32-40%であった。電気刺激4時間後の活性化率は14%で,16時間後には前核形成率が44%に達した。分割溝を示した卵ではマイクロフィラメントが過剰に見られた。今後,ブタ卵母細胞で同様の検討をする予定である。【目的】卵母細胞の活性化技術は動物発生工学の重要な技術である。そこで,種々の時間体外成熟培養したウシならびにブタ卵母細胞の成熟中の変化や,活性処理後の前核形成率と細胞レベルの変化を観察し,卵の加齢との関連を検討した。そして,発生率の高い活性化技術の確立を図った。【方法】実験1と2では,22-40時間体外成熟させたウシ卵に電気パルス(100V/mm,50μsec),Caイオノフォア(5μM),さらにシクロヘキシミドまたはDMAPとの複合処理を施し,前核形成率と表面微細構造の変化を追跡した。実験3と4では,ブタの体外成熟条件の検討と成熟中の卵丘細胞との細胞間連絡の変化について観察した。実験5と6では,44-60時間体外成熟させたブタ成熟卵に電気刺激(150V/mm,60μsec,2回),Caイオノフォア(50μM),エタノール(7%)処理し,活性率と細胞骨格の変化を検討した。さらに,反復電気刺激とサイトカラシンDが発生率に及ぼす影響を検討した。【結果】実験1と2:ウシ卵母細胞は,卵の加齢が進むにつれ高率に活性化した。また,活性化処理による形態学的な影響も若齢卵に比べ,加齢卵で早期に,かつ高率に現われ,その影響は19時間後には回復する傾向が示唆された。実験3と4:ブタ卵母細胞の成熟中の顕著な変化として卵丘細胞間隙の拡張が見られ,これには細胞外の粘液性物質の蓄積を伴うこと,また卵細胞膜における微絨毛の分布の変化はブタ卵母細胞の細胞質成熟に関連することが明らかにされた。実験5と6:ブタ卵の活性化にはイオノフォアとエタノール処理に比べ,電気刺激が最も有効で,卵の加齢に関わらず高率であった。ただし,加齢卵では細胞骨格の凝集が観察され,フラグメント率も高かった。ブタ成熟卵に反復電気刺激後サイトカラシン処理すると,倍数体が高率に生じ,最も高い胚盤胞発生率(24%)が得られた。
虚血Preconditioningを促進する新たな心筋防御機構に関する研究-細胞内アデノシン産生に関与する心臓AMP deaminaseの意義について-

短時間虚血再潅流後の心筋梗塞サイズを縮小するischemic preconditioningを促進するmediatorがadenosineである.Adenosineは細胞より放出されるAMPが細胞外のecto5'-nucleotidaseにより代謝され産生される.さらに細胞内のcytosolic-5'nucleotidaseが虚血時に細胞内に蓄積するAMPをadenosineへ変換する.一方、AMP deaminaseはAMPをIMPに変換する酵素であり筋型(AMPD1)、肝型(AMPD2)、赤血球型(AMPD3)というAMPD familyを形成する.心臓のAMPDの活性化はAMPのIMPへの異化亢進を促進する為、ecto及びcytosolic5'-nucleotidaseの基質低下に繋がりadenosine産生が減少する可能性がある.本研究の目的は心臓でのAMPDの分布とその活性化機構を検討しさらに5'-nucleotidaseとの関連を考察する.結果:心臓移植時に得られた不全心臓を用いて左右の心房筋及び心室筋に発現するAMPDfamilyのmRNAをRT-PCRにより測定した.右房節にはAMPD1,2,8共にmRNA発現と酵素活性を認めたが左房、左室、右室にはAMPD2,3は発現していたが、AMPD1は発現及び酵素活性共に認めなかった.この結果はヒト不全心臓においてAMPD2及び3が重要である事を示す.AMPD1はミオシン重鎖と結合して活性化する事が知られておりさらにN-末にミオシン結合部位が存在する.実際AMPD2、3はAMPD1と高い相同性を有しており、N末側にミオシン結合motifを保有していた.COS7細胞にmyc-tagをN末に持つAMPDfamilyとミオシン重鎖を発現し局在を抗myc抗体と抗ミオシン重鎖抗体で検討するとAMPD1及び3はミオシン重鎖に結合するが、AMPD2は結合性が低い.myc-tagをN末に持つAMPDfamilyとミオシン重鎖をCOS7細胞に共発現し抗ミオシン重鎖抗体で免疫沈降し抗myc抗体でimmunoblottしてもAMPD1と3はミオシン重鎖と結合するがAMPD2は結合性が弱い.次にAMPD familyがミオシン重鎖と結合し活性化出来るか否かを検討した.AMPD1活性はミオシン重鎖と共発現すると有意に活性が上昇するが、AMPD3及び2はミオシンと共発現しても活性が上昇しなかった。そこで虚血下でのvivo rat model AMPD1(骨格筋)とAMPD3(心筋)のミオシン結合性と酵素活性の変化を見た。骨格筋のAMPD活性は虚血時のミオシン分画で有意に上昇するが心筋のAMPD活性はミオシン分画では上昇がなかった.以上の結果は虚血心筋においてAMPD3はミオシン重鎖と結合するが酵素活性の上昇には関与しない.即ち心臓型AMPD3は基質のAMPを異化する事でecto及びcytosolic 5'-nucleotidaseの活性に影響する事が示唆された.短時間虚血再潅流後の心筋梗塞サイズを縮小するischemic preconditioningを促進するmediatorがadenosineである.Adenosineは細胞より放出されるAMPが細胞外のecto5'-nucleotidaseにより代謝され産生される.さらに細胞内のcytosolic-5'nucleotidaseが虚血時に細胞内に蓄積するAMPをadenosineへ変換する.一方、AMP deaminaseはAMPをIMPに変換する酵素であり筋型(AMPD1)、肝型(AMPD2)、赤血球型(AMPD3)というAMPD familyを形成する.心臓のAMPDの活性化はAMPのIMPへの異化亢進を促進する為、ecto及びcytosolic5'-nucleotidaseの基質低下に繋がりadenosine産生が減少する可能性がある.本研究の目的は心臓でのAMPDの分布とその活性化機構を検討しさらに5'-nucleotidaseとの関連を考察する.結果:心臓移植時に得られた不全心臓を用いて左右の心房筋及び心室筋に発現するAMPDfamilyのmRNAをRT-PCRにより測定した.右房節にはAMPD1,2,8共にmRNA発現と酵素活性を認めたが左房、左室、右室にはAMPD2,3は発現していたが、AMPD1は発現及び酵素活性共に認めなかった.この結果はヒト不全心臓においてAMPD2及び3が重要である事を示す.AMPD1はミオシン重鎖と結合して活性化する事が知られておりさらにN-末にミオシン結合部位が存在する.実際AMPD2、3はAMPD1と高い相同性を有しており、N末側にミオシン結合motifを保有していた.COS7細胞にmyc-tagをN末に持つAMPDfamilyとミオシン重鎖を発現し局在を抗myc抗体と抗ミオシン重鎖抗体で検討するとAMPD1及び3はミオシン重鎖に結合するが、AMPD2は結合性が低い.myc-tagをN末に持つAMPDfamilyとミオシン重鎖をCOS7細胞に共発現し抗ミオシン重鎖抗体で免疫沈降し抗myc抗体でimmunoblottしてもAMPD1と3はミオシン重鎖と結合するがAMPD2は結合性が弱い.次にAMPD familyがミオシン重鎖と結合し活性化出来るか否かを検討した.AMPD1活性はミオシン重鎖と共発現すると有意に活性が上昇するが、AMPD3及び2はミオシンと共発現しても活性が上昇しなかった。

骨格筋のAMPD活性は虚血時のミオシン分画で有意に上昇するが心筋のAMPD活性はミオシン分画では上昇がなかった.以上の結果は虚血心筋においてAMPD3はミオシン重鎖と結合するが酵素活性の上昇には関与しない.即ち心臓型AMPD3は基質のAMPを異化する事でecto及びcytosolic 5'-nucleotidaseの活性に影響する事が示唆された.短時間虚血再潅流後の心筋梗塞サイズを縮小するischemic preconditioningを促進するmediatorがadenosineである。Adenosineは細胞より放出されるAMPが細胞外のecto 5'-nucleotidaseにより代謝され産生される。さらに細胞内のcytosolic-5'nucleotidaseが虚血時に細胞内に蓄積するAMPをadenosineへ変換する。一方、AMP deaminaseはAMPをIMPに変換する酵素であり筋型(AMPD1)、肝型(AMPD2)、赤血球型(AMPD3)というAMPD familyを形成する。心臓のAMPDの活性化はAMPのIMPへの異化亢進を促進する為、ecto及びcytosolic 5'-nucleotidaseの基質低下に繋がりadenosine産生が減少する可能性がある。本研究の目的は心臓でのAMPDの分布とその活性化機構を検討しさらに5'-nucleotidaseとの関連を考察する。結果:心臓移植時に得られた不全心臓を用いて左右の心房筋及び心室筋に発現するAMPDfamilyのmRNAをRT-PCRにより測定した。右房筋にはAMPD1,2,3共にmRNA発現と酵素活性を認めたが左房、左室、右室にはAMPD2,3は発現していたが、AMPD1は発現及び酵素活性共に認めなかった。この結果はヒト不全心臓においてAMPD2及び3が重要である事を示す。AMPD1はミオシン重鎖と結合して活性化する事が知られておりさらにN-末にミオシン結合部位が存在する。実際AMPD2、3はAMPD1と高い相同性を有しており、N末側にミオシン結合motifを保有していた。COS7細胞にmyc-tagをN末に持つAMPDfamilyとミオシン重鎖を発現し局在を抗myc抗体と抗ミオシン重鎖抗体で検討するとAMPD1及び3はミオシン重鎖に結合するが、AMPD2は結合性が低い。myc-tagをN末に持つAMPDfamilyとミオシン重鎖をCOS7細胞に共発現し抗ミオシン重鎖抗体で免疫沈降し抗myc抗体でimmunoblottしてもAMPD1とЗはミオシン重鎖と結合するがAMPD2は結合性が弱い。次にAMPD familyがミオシン重鎖と結合し活性化出来るか否かを検討した。AMPD1活性はミオシン重鎖と共発現すると有意に活性が上昇するが、AMPD3及び2はミオシンと共発現しても活性が上昇しなかった。そこで虚血下でのvivo rat model AMPD1(骨格筋)とAMPD3(心筋)のミオシン結合性と酵素活性の変化を見た。骨格筋のAMPD活性は虚血時のミオシン分画で有意に上昇するが心筋のAMPD活性はミオシン分画では上昇がなかった。
環境感応型蛍光核酸塩基の分子設計と画期的な蛍光核酸プローブへの展開

本研究では、環境に感応しその蛍光強度、波長が劇的に変わる画期的な環境感応型蛍光核酸塩基の開発を行なった。例えば、新たな分子内CT構造を有する蛍光核酸塩基をデザインし、溶媒の極性により劇的に蛍光強度を変化させる性質を有する事を見いだしている。さらに、多くの候補となる修飾蛍光核酸塩基の中から、ミクロ環境に特異的に感応して蛍光が大きく変化させる核酸塩基を多数見いだしており、中でも特に優れた蛍光特性を有する7-デアザプリン誘導体を用いたプローブの開発に成功している。また、細胞内での分子イメージング等にも使えるような構造認識機能をもつ蛍光核酸塩基をデザインする事にも初めて成功している。本研究では、環境に感応しその蛍光強度、波長が劇的に変わる画期的な環境感応型蛍光核酸塩基を開発し、この環境感応型蛍光核酸塩基をDNAやRNAに導入することで核酸の局所構造、塩基配列の違い、蛋白との結合状態の有無を蛍光の強度と波長でモニターするシステムを開発することを目的としている。我々は独自のコンセプトに基づき、天然の核酸塩基に二重結合ならびに三重結合を介して置換芳香族化合物を連結した一群の蛍光核酸塩基を合成した。このなかで、芳香環に電子吸引基が置換した化合物は、溶媒の極性により劇的に蛍光強度が変化する事を見いだした。すなわち、極性溶媒ではほとんど蛍光を出さないが、無極性溶媒では強い蛍光を発することが判明した。これらの蛍光核酸塩基をDNAオリゴマーに導入して相補鎖とハイブリさせて蛍光を測定すると、一本鎖やフルマッチの時には全く蛍光を発しないが、バルジ構造の時にのみ強い蛍光を発することがわかった。さらに、多くの候補となる修飾蛍光核酸塩基の中から、ミクロ環境に特異的に感応して蛍光が大きく変化する核酸塩基をセレクトすることができた。遺伝子の検出の目的だけでなく広く遺伝子工学のさまざまな分野、例えば細胞内での分子イメージングにも使えるような構造認識機能をもつ蛍光核酸塩基をデザインする研究も現在進行中である。さらに、何故ドナー・アクセプター型に置換したものだけが、溶媒極性依存型の蛍光発光をするのかを、物理光化学的研究により追求した。同時に、これらの全ての蛍光核酸塩基について分子軌道計算を行い、置換基の効果を解明し、次の分子設計に活用した。修飾核酸塩基に二重結合ならびに三重結合を介して置換芳香族化合物を連結した一群の蛍光核酸塩基を合成した。次に、酸性(pH6.2以下)でのみ蛍光を発する新しいタイプの蛍光核酸塩基を開発し、細胞内で酸性であるがん細胞特異的に蛍光を発する事を確かめた。さらに、多くの候補となる修飾蛍光核酸塩基の中から、ミクロ環境に特異的に感応して蛍光が大きく変化する核酸塩基をセレクトし、新規デアザアデニン誘導体及びグアニン塩基骨格をもつ蛍光核酸塩基がきわめて優れた機能を有する事を発見した。遺伝子の検出の目的だけでなく広く遺伝子工学のさまざまな分野、例えば細胞内での分子イメージングにも使えるような構造認識機能をもつ蛍光核酸塩基をデザインする事にも成功している。

本24年度には、これらに加えて、酸性(pH6.2以下)でのみ蛍光を発する新しいタイプの蛍光核酸塩基を開発し、細胞内で酸性であるがん細胞特異的に蛍光を発する事を確かめた。将来、がん細胞の蛍光イメージングに使われる可能性がある。さらに、多くの候補となる修飾蛍光核酸塩基の中から、ミクロ環境に特異的に感応して蛍光が大きく変化する核酸塩基をセレクトし、7-デアザー8-アザアデニン及びグアニン塩基骨格をもつ蛍光核酸塩基がきわめて優れた機能を有する事を発見した。遺伝子の検出の目的だけでなく広く遺伝子工学のさまざまな分野、例えば細胞内での分子イメージングにも使えるような構造認識機能をもつ蛍光核酸塩基をデザインする研究も現在進行中である。ミクロ環境に感応する蛍光性核酸塩基を十数種類開発する事に成功しており、なおかつそのデザインコンセプトも理論計算も含めて完成しつつあり、研究の達成度は70パーセント以上である。25年度が最終年度であるため、記入しない。ミクロ環境に感応する蛍光性核酸塩基を十数種類開発する事に成功しており、研究の達成度は80パーセント以上である。ミクロ環境に感応する蛍光性核酸塩基の開発に既に成功しているので、今後はこれらをどの様なオリゴマーに組み入れ、どの様な機能を持つ蛍光プローブをデザインするかが今後の課題である。我々は、既に一本鎖モレキュラービーコンを開発できる事を確認している。生体内でたんぱく質との相互作用をモニターできる画期的な核酸蛍光プローブの開発が本研究の最終目的である。ミクロ環境に感応する蛍光性核酸塩基の開発に成功しているので、今後はこれらをどの様なオリゴマーに組み入れ、どの様な機能を持つ蛍光プローブをデザインするかが今後の課題である。生体内でたんぱく質との相互作用を蛍光で簡便にモニターできる画期的な核酸蛍光プローブの開発が本研究の最終目的であるので、今後はこれに集中して研究を行う。
温度応答性高速液体クロマトグラフィー用充填剤の開発

W/O型エマルションを反応場とし、チタンテトライソプロポキシドの加水分解・重合反応により、球状多孔質チタニア粒子を合成することができた。水相部分に相当するチタンアルコキシド溶液中(出発溶液)に、錯形成剤として2-メトキシエタノールを加えることにより、球状化が容易となった。また、安定なW/Oエマルションを得るためには、用いる界面活性剤の親水性・疎水性バランスを調節することが大切であり、上記チタンアルコキシドを用いた場合、Span80:Span60を重量比で3:1の割合で油相に加えると、粒子径10μmで、粒子径の揃った球状粒子を得ることが出来た。得られた粒子の細孔分布を測定したところ、4nm以下に細孔ピークを有する粒子であった。この粒子の細孔径制御を目的として、出発溶液にシリコンアルコキシドを添加してチタニアーシリカ二成分系粒子の合成を試みた。チタニア:シリカの比を1:1で合成し、その後のアルカリ処理によりシリカ成分を溶出させることにより、比表面積を160m^2/gまで増大できた。さらにホウ素-ナトリウム-チタン三成分系粒子の合成を試みた。B_2O_3:Na_2Oを2:1に固定し、チタニアヘの添加効果を見た。得られた粒子を酸処理し多孔化を試みた。ホウ素-ナトリウムの添加量が増大するにつれ、細孔径ピークは大きい方へシフトし、比表面積も増大した。TiO_2:B_2O_3:Na_2Oを50:33:17にしたとき、220m^2/gにも達した。水相部分に相当するチタンアルコキシド溶液中(出発溶液)に、錯形成剤としてジエタノールアミンを、乾燥制御剤としてメタノールを加えることにより、球状化が容易となった。また、安定なW/Oエマルションを得るためには、用いる界面活性剤の親水性・疎水性バランス(HLB価)を調節することが大切であり、上記チタンアルコキシドを用いた場合、Span80:Span20を重量比で1:1(HLB価6.5)の割合で油相に加えると、粒子径10μmで、粒子径の揃った球状粒子を得ることが出来た。得られた粒子の細孔分布を測定したところ、5nm以下に細孔ピークを有する粒子であった。この粒子の細孔径制御を目的として、出発溶液にポリエチレングリコールを添加し、チタンアルコキシドの加水分解・重合時に起こるポリエチレングリコールとの相溶性の低下による相分離を利用して球状粒子の多孔化を試みた。平均分子量1540以下及び6000以上では、添加の効果は見られなかったが、2000では12nm付近に、4000では15nm付近に細孔ピークを有する粒子が得られ、ポリエチレングリコール添加による相分離を利用した多孔化が可能となった。また、4000の添加量を、チタンアルコキシドに対し、モノマー換算で5倍モル量のポリエチレングリコールを添加することにより、比表面積及び細孔径とも最大となった。水相部分に相当するチタンアルコキシド溶液中(出発溶液)に、錯形成剤として2-メトキシェタノールを加えることにより、球状化が容易となった。

得られた粒子の細孔分布を測定したところ、4nm以下に細孔ピークを有する粒子であった。この粒子の細孔径制御を目的として、出発溶液にシリコンアルコキシドを添加してチタニア-シリカ二成分系粒子の合成を試みた。チタニア:シリカの比を1:1で合成し、その後のアルカリ処理によりシリカ成分を溶出させることにより、比表面積を160m^2/gまで増大できた。さらにホウ素-ナトリウム-チタン三成分系粒子の合成を試みた。B_2O_3:Na_2Oを2:1に固定し、チタニアへの添加効果を見た。得られた粒子を酸処理し多孔化を試みた。ホウ素-ナトリウムの添加量が増大するにつれ、細孔径ピークは大きい方へシフトし、比表面積も増大した。TiO_2:B_2O_3:Na_2Oを50:33:17にしたとき、220 m^2/gにも達した。
主観的認知障害のコネクティビティ解析によるアルツハイマー病超早期診断法の開発

主観的認知障害の安静時脳機能的結合および脳内神経線維の構造的結合の特徴を明らかにするため、主観的認知障害を有する高齢者の認知機能検査・脳画像検査を実施した。記銘力課題成績結果により高群・低群に分けた横断的な2群間比較を行ったが、脳画像に関して有意な群間差は得られなかった。その理由としてサンプルサイズの不足が考えられ、適切なサイズのデータ数を収集することが今後の課題であると考えられた。初年度にあたる平成27年度は、既に生命倫理審査を経て愛知県内で実施中である「地域在住高齢者の介護予防プログラムの開発と効果検証」研究参加者のうち、本研究への参加同意の得られた22名の脳画像検査(rsfMRI・DTI)・認知機能検査(全般的認知機能・記銘力・言語能・作業記憶・精神運動速度・実行機能)・血液検査(アポリポ蛋白E)を実施した。同検査を名古屋大学医学部附属病院通院患者においても実施するため、生命倫理審査申請を行い、本年受理された。現在、対象者のリクルートを行っている。rsfMRIおよびDTI画像は、Statistical Parametric Mapping12(SPM12)で解析可能となるデータに変換作業を行っているほか、画像解析方法の習得を行った。SCIを有する地域在住高齢者のデータ収集を終え、解析準備の段階にある。通院患者のデータ収集も、間もなく開始される。初年度としては、おおむね順調な達成度と考える。主観的認知障害を有する高齢者27名の認知機能検査(全般的認知機能・記銘力・言語能・作業記憶・精神運動速度・実行機能)・血液検査(アポリポ蛋白E)を実施した。その後、脳画像検査(rsfMRI・DTI)を予定したが、内5名は撮像禁忌要件に該当したため、脳画像検査は22名に対して実施した。また22名中10名については、6ヶ月後に同様の追跡検査(認知機能検査・脳画像検査)を実施できた。rsfMRIおよびDTI画像は、Statistical Parametric Mapping12(SPM12)で解析可能なデータに変換作業を行い、解析を行っている。認知機能検査結果を用いて成績の高群・低群に分けて横断的な2群間比較を行ったが、有意な結果は得られなかった。その理由としてサンプルサイズの不足が最大の要因として考えられ、適切なサイズのデータ数を収集することが今後の課題であると考えられた。当初の研究計画では、脳画像検査・認知機能検査・血液検査と併せて脳脊髄液検査を実施する予定であったが、生命倫理審査にて、侵襲性の高さを理由に脳脊髄液検査実施が認められず、代替方略での補完を推奨された。本研究では、詳細な認知機能検査を実施するため、この検査結果および血液検査(アポリポ蛋白E)結果を代替方略として用いることとし、主観的認知障害者をハイリスク群とローリスク群とに分割し、2群間のrsfMRIおよびDTI画像の差異を解析することとする。神経心理学臨床心理学通院患者のデータ収集開始が遅れたため。通院患者の脳画像機器使用料、当研究の成果発表および関連する学術的情報収集のため学会参加旅費に使用する。
双極性障害に対する時計遺伝子バイオロジカルマーカーの探索

双極性障害は、躁病相とうつ病相という対極的な病相を繰り返す疾患であり、睡眠ー覚醒サイクルの障害などサーカディアンリズムが異常な疾患である。初めに、末梢組織であるマウスの唾液腺と中枢神経系の時計遺伝子を比較し、時計遺伝子の末梢組織と中枢神経系の変化の違いを検討した。従って、マウスにおいてはうつ状態の時に中枢神経系での時計遺伝子の変化を同様に末梢組織である唾液腺で測定出来ることが判明した。
モジュラー形式,数論,代数的構造の研究

1.畑田一幸(研究代表者)の研究:(1)gを任意整数2とする。次数gのジーゲスカスプ形式について、eigenformでラマヌジャン予想を満たすものが無限個存在することを、得た。それらの各元に対し、絶対ガロワ群の期待されていた表現が存在することも、得た。(以上、平成11年度本科研費交付申請書に書いた。)ラマヌジャン予想を満たさない次数gのジーゲルカスプ形式のeigenformの或る無限族(任意の重さg+1の元を含む)の任意の元に対し絶対ガロワ群のよい表現が存在することも、得た。(2)アーベル多様体の第1種微分形式にも、上記(1)の方法が適用できることがわかった。(3)m【greater than or equal】0を整数、lを素数、Nをlと素な整数とする。レベルNl^mのnebentypus正則モジュラー形式はレベルNのl進モジュラー形式であることを、得た。さらに、l=2の時もΓ_1(Nl^m)上の原始形式に付随するmodlガロワ表現は、Γ_1(N)上の原始形式に付随するmodlガロワ表現であることを、得た。(4)レオポルドの一般ベルヌーイ数のp進極限表示を、代数体に拡張した。(5)有理数体の新しい構成を与えた。2.藤本圭男(分担者)の研究:Xを小平次元k(X)【greater than or equal】0で同型でない自己準同型写像を持つ非特異3次元射影代数多様体とする時、Xの極小モデルは非特異な事、更にk(X)=0,2ならば、Xの適当な有限次エタノール被覆は正次元アーベル多様体と非特異代数多様体との直積に分解する事を示した。3.愛木豊彦(分担者)の研究:非線形境界条件の相転移現象に力学的境界条件が有効である例を幾つか得た。Caginalp型とPeorose-Fife型のphase-field方程式のwell-posednessを示した。形状記憶合金の弱解の存在と一意性を、従来より弱い仮定で考察。磁場のモデルを与えた。4.他の分担者の研究:竹内茂はCategory of DR/CR spaces/algebrasを研究。中馬悟朗は数学教育を研究。岩田恵司は数学教育の調査を行った。畑田一幸(研究代表者)の研究:(1)フーリエ係数が代数的数のモジュラー形式を考える。mを任意整数でlを任意素数とする。レベルがl^mのhaupt型モジュラー形式、及びレベルが奇素数lのneben型モジュラー形式はSL_2(Z)のl進モジュラー形式である事は、J.-P.Serre教授により得られた。その後いろいろな人達によってこれの部分的な拡張が行われたが不充分であった。

畑田は一般の場合、即、Nを正整数でl〓Nとする時のレベルNl^mのneben型モジュラー形式に対し、このSerre教授の結果を最終的な形で拡張する事に成功した。これをpreprint(K.Hatada′′On classical and l-adic modular formsof levels Nl^m and N′′)にまとめた。(2)以前からの畑田の研究を続けてジーゲルカスプ形式に関するラマヌジャン予想の肯定的な解決へ、大きく研究を前進させた。藤本圭男(分担者)の研究:非特異射影代数多様体Xから、自分自身への全射正則写像f:X→Xを、Xのendomorphismという。Xの小平次元が非負の時、fは有限、エタール射となり、更にXが一般型ならば、fは同型となる。Xをk(X)【greater than or equal】0なる非特異3次元射影代数多様体で、同型写像でないendomorphismf:X→Xを持つ時、Xの極小モデルは非特異で、更にk(X)=0,2の時、Xの適当な有限エタール被覆X^^をとると、X^^は正次元のアーベル多様体Aと、非特異代数多様体Wとの直積に分解する事を証明した愛木豊彦(分担者)の研究:線形偏微分方程式のシステムで、phase-filed方程式より物理的状況を正確に記述するPenrose-Fife-modelに対し、非線形な境界条件を伴う場合でも問題の適切性を示した。また、2相ステファン問題に対して境界上でヒステリシス作用素で表現されるような制御を考えても問題が適切であることを証明した。岩田恵司(分担者)は数学教育の研究を行った。1.畑田一幸の(研究代表者)の研究:(1)gを任意整数【greater than or equal】2とする。次数gのジーゲルカスプ形式について、eigenformでラマヌジャン予想を満たすものが無限個存在することを、得た。それらの各元に対し、絶対ガロワ群の期待されたいた表現が存在することも、得た。(以上、平成11年度本科研費交付申請書に書いた。)ラマヌジャン予想を満たさないジーゲルカスプ形式のeigenformの或る無限族(これは任意の重さ【greater than or equal】g+1の元を含む)の任意の元に対し絶対ガロワ群のよい表現が存在することも、得た。(2)アーベル多様体の第1種微分形式にも、上記(1)の方法が適用できることがわかった。(3)m【greater than or equal】0を整数、Nを奇数とする。Γ_1(2^mN)上の原始形式に付随するmod2ガロワ表現は、Γ_1(N)上の原始形式に付随するmod2ガロワ表現であることを、得た。(4)レオポルドの一般ベルヌーイ数のp進極限表示を、代数体に拡張した。(5)有理数体の新しい構成を与えた。2.藤本圭男(分担者)の研究:(1)非特異射影代数多様体を余次元が2以上の部分多様体Wを中心としてblow upした多様体Yが、非自明な全射自己準同型写像を持つ為の、Wの満たす或る必要条件を得た。応用として、Wが一般型か有理連結ならば、特にFano多様体ならば、Yは非自明な全射自己準同型写像を持たぬ事を示した。(2)有理楕円曲面間の全射正則写像は同型を、示した。特に、有理楕円曲面は非自明な自己準同型写像を持たぬ事を示した。3.愛木豊彦(分担者)の研究:形状記憶合金の弱解の存在と一意性を、従来より弱い仮定の下で証明。磁場をかけて制御する問題とphase-
ゼロ・エミッション型社会システムへの法的政策的支援手法の検討

本研究は、文献学的及び関係研究機関や先行的な自治体や企業体へのヒアリングを通して、現状認識と研究者間の問題意識の共有化に努めながら、以下の研究項目について、調査・分析を行っている。具体的には、1.法政策の視点からみた資源循環型社会のフレーム・ワーク形成、2.欧米諸国におけるゼロ・エミッション型社会の誘導手法の検討、3.廃棄物政策に係わる経済的インセンティブ手法の活用・検討、4.閉鎖・循環型経済システムの構築に係わる国際利害調整手法等について廃棄物関連政策を主体とした考察を行っている。本年度は、1.及び2.に重点を置きながら、先行的取り組みを行っている自治体のヒアリング(屋久島ゼロエミッション、京都府木津町リサイクルステーション、北海道厚岸町エコトピア構想など)を実施するとともに、この1年間を通じて中央紙(2社)及び地方紙(23社)に掲載された廃棄物関係の新聞記事をKJ法で集約するなどによって、廃棄物問題の抱える多様性を把握した。
化学発癌における前癌病変、潜在癌および顕在癌の特性に関する分子病理学的追求

伊東はヒトc-ha-ras遺伝子を導入したtransgenic mouseを用いて、6-nitrochrysene誘発の肺腫瘍の癌遺伝子差異を検討し、肺腫瘍及び前胃腫瘍で導入したras遺伝子の変異を認めた。岡田は鉄-NTAによる腎癌発生過程においてTGF°alphaの発現を蛋白並びにmRNAレベルで認めた。江角はラット大腸のaberrant cryptの分子病理学的位置づけについて検討し、BrdU及びPCNAでの検討の結果、aberrant cryptは正常部位に比較して強い増殖能を示す細胞集団であることを示した。森はMAMおよび1-HAQO誘発ラット大腸癌のKi-ras exon1,2及びp53 exon4から8の点突然変異の有無を検討し、55個の腫瘍のうち1つのみではあるがp53 exon 8で変異を見出した。津田はENU誘発のラット脳腫瘍と腎芽腫及びDMN誘発の間葉性腎芽腫についてras及びp53の点突然変異の有無について解析し、何れも1,2例に変異を認めたのみであった。樋野は遺伝性腎癌ラットの戻し交配ラットを作成し、リンケージ解析用にDNAを抽出し、原因遺伝子がラット染色体10番に局在することを見出した。その他の研究分担者として泉はLECラットの肝、腎腫瘍の癌遺伝子変異を検討し、自然発生腫瘍にはいずれも変異を認めなかったが、EHEN誘発肝腫瘍の1例にp53遺伝子変異を認めた。井内はウレタン投与により誘発したマウス肺腫瘍のK-ras遺伝子の活性化を検討し、肺病変の初期に必ずしもその変異は生じないことを示した。日浅はラットの可移植性甲状腺癌のKi-rasの点突然変異の検索を行い、16例中3例のcodon12に変異を認めた。
小笠原諸島と琉球列島に分布する外生菌根菌の集団遺伝学的研究

リュウキュウマツが自然分布する琉球列島のうち、奄美大島、沖縄島、石垣島、宮古島を対象に、リュウキュウマツと共生する外生菌根菌であるチチアワタケ(イグチ目ヌメリイグチ科)およびアカハツ(ベニタケ目ベニタケ科)の2種の子実体を集中的にサンプリングした。また、リュウキュウマツが人為的に移入された先である小笠原諸島の父島および母島においても、同2種のサンプリングを集中的に行なった。サンプリングにおいては子実体が10メートル以上離れて発生している場合に別個体とみなした。最終的にはチチアワタケ200個体以上、アカハツ120個体以上を採集し、解析に用いた。全個体からDNAを抽出し、核ITS領域の塩基配列で同一種であることを確認した後に、RAPD法により近隣に発生していた子実体の個体識別を行った。その結果残ったDNAサンプルをピコグリーンにより定量し、かつバイオアナライザーにより定性した。その結果DNAの質・量が十分であるものを次の解析に用いた。抽出DNAは2種類の制限酵素により断片化し、今回のプロジェクト用に作成したアダプターをライゲーションしたうえでRAD-Seq法により個体群を解析した。イルミナ社MiSeqを用い、MiSeq Reagent Kit v3 (150 Cycle)キットにより計5ランのシーケンシングを行い、2種それぞれの全個体におけるSNPs(一塩基多型)を検出した。それぞれの遺伝子型を基にSTRUCTUREによるクラスター解析を行い、移入元(琉球列島)と移入先(小笠原諸島)における遺伝構造を解析した。その結果、(1)琉球列島内では概ね島ごとに遺伝構造が異なること、(2)琉球列島と小笠原諸島では遺伝組成が異なることが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。DNAの質・量が十分であるものを次の解析に用いたが、DNAの収量が期待されていたものよりも少なかったため、複数のDNA抽出のプロトコルを比較検討し、最も収量の大きい方法を選択した。抽出DNAは2種類の制限酵素により断片化し、今回のプロジェクト用に作成したアダプターをライゲーションしたうえでRAD-Seq法により個体群を解析に用いた。イルミナ社MiSeqを用い、MiSeq Reagent Kit v3 (150 Cycle)キットにより1ランのシーケンシングを行い、2種それぞれの全個体におけるSNPs(一塩基多型)を検出した。本ランでは合計50個体を1ランで解析し、十分なSNPsが検出できるか、および十分なカバレッジがあるかを検討した。当初は初年度でサンプリングとDNA抽出を完了させ、RAD-Seq法の複数ランを行う予定であったが、DNA抽出の効率が想定より悪く、より収量を大きくする必要があったため、DNA抽出のための複数のプロトコルを比較検討する必要が生じた。その結果、解析に十分量のDNAを抽出することができるようになったため、全体的にはやや遅れているものの、プロジェクトの完了には問題ない程度である。

本プロジェクトに最適なDNA抽出プロトコルと、その後の解析の流れが把握できたため、次年度には計5ランのRAD-Seq法を行い、サンプリングした全個体の遺伝構造の比較を行う予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。