hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しいマクロファージ分子Ｍ－ｍｏｄによる２型糖尿病制御

マクロファージのM-mod(USP2A)の2型糖尿病発症における役割と作用機構を検証した。肥満マウスの脂肪組織マクロファージではM-mod2の発現が減少した。一方、マクロファージ選択的M-modトランスジェニックマウスを作成し、3カ月間の高脂肪給餌に供したところ、血液生化学的な変化は見られなかったが、脂肪組織マクロファージの炎症関連遺伝子の発現や脂肪組織への浸潤が抑えられた。さらに1年間後には体重の低下とインスリン感受性の改善がみられた。一方、マクロファージ選択的なM-mod KOマウスも作成した。培養細胞を用いた検討で、M-modは標的遺伝子周囲のヒストンメチル化やアセチル化に影響を与えた。1.マクロファージ選択的なthe fms intronic regulatory element (FIRE)存在下でM-modを発現するトランスジェニック(Tg)マウスに高脂肪食を1年程度まで給餌し、コントロールマウスと比較したところ、わずかな体重減少と、インスリン感受性の改善が認められた。またTgマウスから分離したマクロファージを豊富に含む間質画分を用いてマイクロアレイ解析を実施したところ、Tgマウスでは僅かに炎症関連分子の発現低下が見られた。2.C57BL/6マウスバックグラウンドのES細胞を用いて、前年度までに作製したキメラマウスから、M-mod flox/floxマウスの作製を試みた。なかなか生殖系細胞に相同組み換えが見られるマウスが得られなかったが、研究協力者の協力の基、大量繁殖を行いM-mod flox/floxマウスを複数ライン樹立することに成功した。さらにこれとLyzM-Creマウスをかけあわせることでマクロファージ選択的なM-modコンディショナルノックアウトマウスを作製した。3.これまでに樹立したM-modノックダウン細胞およびコントロール細胞を用いて、マクロファージ様細胞の分化刺激後、ヒストンタンパク質の修飾(アセチル化、メチル化、ユビキチン化、リン酸化)をウェスタンブロット及びクロマチン免疫沈降法で網羅的に調べた。これらの修飾の全体量には影響が無かった。しかしながら、ノックダウン細胞のaP2遺伝子座で、H4ヒストンの5、8、12番目のアセチル化の亢進が見られた。またこれまで見出していたH3ヒストンのメチル化が4番目のリジンのメチル化であることが明らかとなった。これらの変化に一致して、aP2遺伝子座のアクセシビリティの亢進が見られた。1.遺伝型肥満モデルマウス(ob/obマウス)およびコントロールマウスを比較したところ、生殖器周囲脂肪組織重量、血糖や血中脂質、空腹時インスリンレベル、脂肪間質のF4/80+, CD11b+マクロファージのPAI-1, TNF, aP2レベルの増加がみられ、糖尿病の兆候が確認された。このとき、M-modの発現は大幅に減少していた。2.これまでに確立したマクロファージ特異的M-modトランスジェニックマウスに高脂肪食を与え、形質解析を行った。高脂肪食を14週間与えたところ、トランスジェニックマウスとコントロールマウスで摂食量、体重ともに有意な差は見られなかった。また空腹時の血中インスリン濃度や随時血糖、血中脂質(中性脂肪、遊離脂肪酸、総コレステロール)にも有意な差は見られなかった。しかしながら腸間膜脂肪組織へのマクロファージの浸潤がわずかに抑えられていた。FACS解析の結果、M1様、M2様マクロファージの亜集団比には顕著な差は見られなかった。3.マクロファージ特異的M-modノックアウトマウス作製のためのflox/floxマウスの作成を試みた。当初予定したスケールでの繁殖ではキメラ率の低いマウスしか無かったためflox/floxマウスを得られなかった。しかし大規模繁殖を行い良好なキメラを得た。4.M-modノックダウン細胞を用いてM-mod標的遺伝子座のヒストンのアセチル化、メチル化等の修飾を免疫沈降法で調べ増加または減少を確認した。1)Usp2flox/floxマウスとLyzM-Creマウスを交配し作製したUSP2コンディショナルノックアウトマウスを大量に繁殖を行い系統化を進めた。これに60%kcalの高脂肪餌を2カ月給餌し、インスリン抵抗性試験を実施したがコントロールマウスと比べ大きな変化はみられていなかった。前年度までの検証でトランスジェニックマウスでの差も高脂肪餌給餌半年くらいからみられることから、マクロファージのUSP2の肥満症・糖尿病への効果は調節的というよりかは、修飾的なものだと考えられた。老化との関連も注目される。2)USP2

強制発現細胞の核タンパク質を用いて免疫沈降を実施したところ、沈降物の中に、CBB染色では検出できなかったが、銀染色で再現性よく検出できる複数のタンパク質が存在した。核外輸送を阻害すると共沈タンパク質の収量は増したが、一般的な質量分析にはさらに大きなスケールでのタンパク調製が必要であることが明らかになった。3)マクロファージが肥満個体の脂肪細胞で起こすのは緩やかな炎症反応であるという観点から、マクロファージのUSP2が細菌性の炎症反応も制御する可能性を考え、検討したところ、USP2強制発現やノックダウン細胞により炎症性サイトカインの産生・放出が抑制されることを明らかにした。実験動物学生殖細胞で組み換えが見られるマウス個体が得られず、樹立が難行していたM-mod flox/floxマウスの作製を終え、さらにマクロファージ選択的なM-modノックアウトマウスが作製できたのは計画通りである。予想に反しM-mod Tgマウスでの表現型の変化は軽微であったが、Tgマウスの長期高脂肪食給餌実験を遂行し、脂肪間質画分でのトランスクリプトーム解析を実施できたのも計画通りである。M-modノックダウン細胞を用いた網羅的なヒストン修飾解析で、H3ヒストンのメチル化の領域を明らかにするとともに、新たにH4ヒストンのアセチル化の変化を見出せたのは、今後のM-modの機能メカニズム解明のための足がかりとなる知見を得たことに他ならず、総じ当初の目的や計画に沿った結果を得られていると判断した。ob/obマウスの評価は予定通りの進捗で、予想通りの成果を得た。トランスジェニックマウスの評価は予想に反して大幅な糖尿病症状の改善は見られなかったが予定通りの検討はおおむね行えた。ノックアウトマウスは作製途中であり、クロマチン修飾の解析もまだ調べられていない修飾があるが、それぞれ一定の材料やデータは得ており、概ね順調に進展している。1.これまでのM-mod Tgマウスを用いた検討では、劇的な糖尿病の改善が認められなかった。これはTgマウスのマクロファージにおけるM-modタンパク量の増加が緩やかであったことに起因することが考えられた。そこで次にM-mod遺伝子ノックアウトマウスを用いて個体レベルでの役割を再評価することにした。即ち、これまでに樹立したマクロファージ選択的M-modコンディショナルノックアウトマウスに高脂肪食を給餌し、体重・摂食量・血糖・血中脂肪酸を測定するとともに、インスリン感受性を調べM-modの糖尿病における役割をより明確にする。また、このとき脂肪組織及び免疫臓器におけるマクロファージの数や遺伝子発現を評価することで、細胞レベルでのM-modの役割を明らかにする。2.M-modの作用メカニズムの詳細をさらに調べる。M-modノックダウン細胞とコントロール細胞を比較することで、H4ヒストンのアセチル化酵素や、H3ヒストンのメチル化酵素やその修飾タンパク質の量的な変化を調べる。また免疫沈降法により、M-modと核内で会合するタンパク質を濃縮・検出し、質量分析により同定を試みる。またM-modは核内で小顆粒状の局在を示すことから、核内小顆粒(スペックルやパラスペックルなど)のマーカー分子との局在比較を行う。
組み換え海洋ラン藻の培養工学

本研究は組み換え海洋ラン藻の培養工学を推進するための基盤を整えることを目的として、回分および連続培養系におけるベクタープラスミドの安定性ならびに外来遺伝子の発現について検討を行った。まず、単細胞性の海洋ラン藻Synechococcus sp.、および広宿主域ベクターpKT230を用いて、海洋ラン藻内でのベクタープラスミドの安定性について検討した。この組み換え海洋ラン藻の作製には申請者らが独自にその条件等を最適化し開発した接合伝達法を用いた。回分培養において、プラスミドの選択圧がない場合には、培養開始後約50時間後の対数増殖期においてプラスミド保持率の低下がみられ、培養終了時(120時間後)にはプラスミド保持率は約55%で一定となった。これに対して、選択圧として抗生物質(カナマイシン)が存在する場合、対数増殖期においてプラスミド保持率の低下は見られず、培養終了時においても保持率は90%以上であった。以上のように、選択圧存在下ではこのベクタープラスミドはきわめて安定であり、外来遺伝子発現用に適していることが明かとなった。次に外来遺伝子として酵素クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)の海洋ラン藻内での発現を試みた。その結果、回分培養では対数増殖期後期においてもっとも高い発現がみられ、本海洋ラン藻ならびに広宿主域ベクターを用いて外来遺伝子の発現に成功した。海洋ラン藻は比増殖速度がきわめて低いことから、本研究では連続培養方法として一定時間ごとに培地の一部を交換する疑似連続培養法により組み換え海洋ラン藻の特性を検討した。その結果600時間以上の長期にわたり連続培養においてもプラスミドが安定に保持され、また外来遺伝子としてのCATの発現が安定にみられた。しかし、問題点として以下のようなことが明かとなった。すなわち、CATの細胞蛋白質あたりの発現量は海洋ラン藻においては大腸菌に比較して約1/10と低いことがあきらかとなった。これは今回用いたプロモータに原因があると考察され、海洋ラン藻内での高遺伝子発現のためのプロモーター検索が急務であることが示唆された。以上のように本研究では組み換え海洋ラン藻の培養工学推進のための基礎知識が得られ、また今後対処しなければならない問題点も明かとなり、当初の目的は充分に達成されたものと確信する。
筋芽細胞の分化・融合におけるカルシウムプロテア-ゼの役割に関する研究

カルシウム依存性中性プロテア-ゼ(以下、カルパインと呼ぶ)は細胞内酵素であるうえ、細胞の重要な調節因子であるCa^<2+>によって活性が制御されていることから、その生理的役割は大変興味深い。カルパインはこれまでの研究から、細胞の分裂や分化あるいは細胞膜の融合を伴う生体反応(精子と卵子の融合、筋芽細胞の融合による筋管細胞の形成、エンドサイト-シス及びエクソサイト-シス等)など、細胞機能の重要な過程に関与することが示唆されている。そこで本研究では、特に人為的操作を加えることなく細胞の分化・融合が観察できる筋芽細胞の培養系を用い、カルパインの生理機能の解析を試みた。まず、筋芽細胞株を購入して培養系を確立することから実験を開始した。しかし、入手した細胞株は融合能が非常に低く本実験には使用不可能であった(血清の種類や濃度並びにインシュリン等の効果も検討したが殆ど改善されなかった)。そこで、再クロ-ニングを行い60%70%の融合能を有する数種のクロ-ンを得た。筋芽細胞の分化・融合時のカルパインの役割を探る第一歩として、種々のプロテア-ゼインヒビタ-影響を調べてみた。その結果、我々の研究室で開発した細胞膜透過性で且つカルパインの強力な阻害剤であるbenzyloxycarbonylーleucylーlencylーleucineーaldehybe(ZLLLal)が最も低い濃度(200nM)で筋芽細胞の融合、即ち筋管細胞の形成を阻害した。また、既に市販されているEー64dやカルペプチン(何れも細胞膜透過性と言われている)にも弱い阻害効果が認められたがかなり高濃度(10μM)を必要とした。一方、膜透過性が無いと言われているEー64cやロイペプチンには阻害が認められなかった。筋芽細胞から筋管細胞の形成に至る過程のカルパインの挙動を調べたところ、筋芽細胞の融合に伴ってμー及びmーカルパイン量の著しい増加が認められた。活性型カルパインやカルパスタチンの動きについては現在解析中である。以上の結果から、カルパインは筋芽細胞の分化・融合に際し重要な役割を担っていることが強く示唆された。
体液性免疫または細胞性免疫応答の初期誘導と維持におけるケモカインの役割の解析

野生型マウスにニワトリ卵白アルブミン(OVA)をアジュバントと共に皮下免疫すると、抗原特異的な抗体産生細胞や細胞障害性T細胞(CTL)が誘導される。ケモカインCCL19とCCL21-serの発現を欠損する突然変異マウス(plt)では、野生型マウスに比べて抗体産生能が増強していた。一方、抗原特異的CTLはpltでは誘導が抑制されていた。以上の結果より、ケモカインCCL19とCCL21は抗原特異的T細胞の初期免疫応答と、メモリー細胞誘導の制御に重要な役割を果たしていることが示唆された。本研究では、体液性免疫と細胞性免疫応答を同時に誘導できるリポソームアジュバントを用いて、抗原特異的T細胞の反応におけるケモカインCCL19とCCL21の役割について検討した。BALB/cマウスにリポソーム結合ニワトリ卵白アルブミン(liposome-OVA)を皮下免疫すると、OVA特異的な抗体産生が認められるが、ケモカインCCL19とCCL21-serの発現を欠損する突然変異マウス(plt)では、野性型マウスに比べて抗体産生が増強していた。また、免疫後13週目には、野性型マウスの抗体産生能は低下したが、pltマウスでは高い抗体産生能を維持したままであった。一方、liposome-OVAペプチド(I-A^b拘束性CTLエピトープ)を免疫すると、免疫後1週目に、野性型マウスでOVAペプチド特異的なCD8陽性細胞傷害性T細胞(CTL)が誘導されたがpltマウスでは誘導が抑制されていた。さらに免疫後12週目、野性型マウスではメモリータイプのCTL活性が維持されていたが、pltでは低下していた。同様の検討をCD4陽性T細胞に対する抗体をマウスに投与してCD4陽性T細胞除去マウスを用いて行なったところ、免疫後10週目のCD4陽性T細胞除去群においても野性型マウスでは、無処置マウスと同様にCTL活性が維持されていた。また、pltマウスでは、アジュバントを用いないOVAのみの免疫でも、抗体産生と抗原特異的なT細胞のプライミングが起こることが示唆される結果が得られた。以上の結果より、ケモカインCCL19とCCL21は抗原特異的T細胞の初期免疫応答と、メモリー細胞の誘導にも重要な役割を果たしていることが示唆された。BALB/cマウスにリポソーム結合ニワトリ卵白アルブミン(liposome-OVA)を皮下免疫すると、OVA特異的な抗体産生が認められるが、ケモカインCCL19とCCL21-serの発現を欠損する突然変異マウス(pltマウス)では、野生型マウスに比べて抗体産生が増強していた。一方、liposome-OVAペプチド(1-A^b拘束性CTLエピトープ)を免疫すると、免疫後1週目に、野性型マウスでOVAペプチド特異的なCD8陽性細胞傷害性T細胞(CTL)が誘導されたがpltマウスでは誘導が抑制されていた。
悪性脳腫瘍における薬剤耐性遺伝子に対する分子生物学的解析と臨床への応用

まずわれわれは脳腫瘍、特に悪性脳腫瘍においてどのぐらいの頻度でMDR1が発現しているかをPCRを用いて遺伝子レベル(mRNA,DNA)にて解析致しました。方法は腫瘍細胞よりtotalRNA,DNAを抽出し、PCRを用いてMDR1の一部を増幅、アガロース電気影動を行った後、エチジンブロマイドにて染色、UVライト上にて発現の有無を観察しました。グリオーマにおけるMDR1mRNA発現の結果は、low grade glioma10例中8例80%、anaplastic glioma 11例中8例73%、glioblastoma30例中22例73%、glioblastoma cell line6例中0と今回の調査によりMDR1の発現率はgliomaの悪性度に関係しないことがわかりました。ついでDNAレベルでのMDR1の発現状態では、すべての症例において発現が認められました。約75%のgliomaにおいて、悪性度に関係なく多剤耐性遺伝子(MDR1)のmRNAレベルでの発現が確認され、またDNAレベルでの発現がmRNAの発現を認めなかった14症例においても確認されたことは、MDR1のmRNAレベルでの発現の制御がプロモーター、エンハンサーにおいて制御されていると考えられ、我々臨床医がよく経験する徐々に化学療法が効かなくなる一つの説明になると考えられた。
卵形成初期におけるミトコンドリアの爆発的増殖機構の解明

母性成分の一つであるミトコンドリア(Mt)は卵形成の極初期に爆発的に増加・蓄積される。このミトコンドリアの蓄積はMtDNAの増加を伴う。この時期、rRNAも蓄積が開始されるが、MRPRNAはこのミトコンドリアとrRNAの蓄積いづれにも関与している。報告者はゼノパスMRPRNA遺伝子の構造を決定し、極初期卵母細胞への遺伝子導入・転写活性定量法を確立した。その結果、(1)MRPRNA遺伝子は他の遺伝子と近接しており、独自の転写必要と考えられる領域は約1kbp以内であり、_-839_-407の領域があれば転写に十分であること、(2)この領域にはほ乳類の同遺伝子について報告されている転写調節配列(NRF-1結合部位)は存在しないこと、(3)MRPRNAの上流領域にはこの時期に特異的に働いていると思われる転写調節部位ボックスIが存在することが明らかになった。そこで、この部位を介して転写を調節する因子B1Pを精製し、その性質を検討した。B1Pはヘパリンカラムクロマトグラフィー、DEAEカラムクロマトグラフィーによって分離でき、極初期卵母細胞の他、成体肝からも少量ながら得られた。B1Pは配列ACTTTATTとその周辺部の配列を認識し、上流に存在する類似配列には結合しなかった。本配列は本報告と前後して単離された極初期卵母細胞特異的SRY様蛋白質の標的である可能性が考えられる。
生物発光蛋白質プロープを用いた植物細胞内活性酸素シグナルの解明

1.フォラシン導入植物の作出ヒカリカモメガイ由来の活性酸素種(ROS)応答性発光蛋白質・フォラシンを植物細胞内ROSシグナル検出用プローブとして利用可能とするため、アグロバクテリウム感染法を用いてシロイヌナズナおよびタバコ培養細胞への遺伝子導入を行った。将来的にCa^<2+>シグナルとの同時計測を目指すことから、シロイヌナズナではオワンクラゲ由来のCa^<2+>レポーター蛋白質であるエクオリンを導入済みの組換え体への追導入を行い、T1種子5-4gを得た。種子検定の結果からこのうち約650粒が形質転換体であると推測され、耐性マーカーであるBASTAを含む寒天培地上で現在、20個体程度の形質転換体について栽培を進めている。また、タバコ培養細胞ではエクオリン導入株・野生株の両方に対して同様にアグロバクテリウム感染法を用いた遺伝子導入を実施済みであり、形質転換体の選抜を行っている。2.出芽酵母発現系を用いた機能解析フォラシン導入酵母培養液に過酸化水素を投与すると、過酸化水素流入に伴った持続的発光が検出される。この酵母にシロイヌナズナの過酸化水素透過性水チャネルAtTIP1;1を発現させると、フォラシン発光が亢進された。AtTIP1;1を介した過酸化水素の取り込みは処理2分後をピークに減衰するので、AtTIP1;1は酸化ストレス条件において機能抑制される可能性が示唆された。また、点変異導入フォラシンを用いた実験の結果から発光基質であるデヒドロセレンテラジンとの結合に重要なアミノ酸について同定することが出来た。フォラシンの再構成機構が明らかになったことで、発光強度およびROS特異性に優れた発光基質の開発を行えるようになると期待される。
骨癒合性を付与したPEEK製脊椎インプラントの研究

PEEK製脊椎インプラントに骨癒合性を付与する検討として、PEEK表面に骨形成促進作用を有する機能性アパタイトを固定化するための検討を実施した。従来から行われているコーティング方法ではアパタイトとPEEK樹脂の界面接着が不十分で、機械的摩擦や体内への移植でアパタイトコーティングが脱落や溶解することが報告されているため、本研究では炭酸ガスレーザーを照射することでアパタイトとPEEK樹脂を熱融着し一体化する検討を行った。レーザー照射条件(エネルギー密度や走査速度等)を種々変化させ、照射表面の温度を高速放射温度計で計測することでPEEK樹脂表面の軟化点である300°C付近の温度でアパタイトのPEEK表面への熱融着とこれによる両者の複合一体化が達成された。アパタイトとして特にケイ素とストロンチウムイオンの両イオンを結晶中に含むケイ酸ストロンチウムアパタイト(SrSiP)を選び、生体不活性なPEEK樹脂表面に生体親和性と骨芽細胞に対する骨形成促進作用を付与する検討を行った。ラット骨髄から採取した骨髄間葉系幹細胞をPEEK樹脂表面で培養し、骨形成マーカーであるオステオカルシン(OC)やアルカリフォスファターゼ(ALP)の濃度を定量し、アパタイトの影響を調査した結果、アパタイト層の存在により骨形成が顕著に促進されることが判明した。培養でPEEK樹脂表面に形成されたリン酸カルシウムはアパタイト層の存在によりPEEK樹脂表面に強固に接着し良好な骨伝導性を示した。これによりPEEK樹脂に良好な骨癒合性を付与出来る可能性を示すことが出来た。PEEK製インプラントのモデルとして13mmφ×1mm厚PEEK製ディスクを利用し、その表面にケイ酸ストロンチウムアパタイト(SrSiP)やこれ以外の種々のアパタイトをレーザー溶着する検討を実施した。当初設定したレーザー照射条件ではパワー密度が高く、アブレーションが生じたが、エネルギー密度を低下させることで問題を回避することが出来た。また、当初はPMMAをバインダーに用いてアパタイト層をPEEK表面に接着し、PMMA/アパタイト複合体を溶着していたが、PMMAの存在は生体内で免疫反応を誘起することが判明した。そのためバインダーを使用せずアパタイトを直接PEEK表面に融着する技術を検討し、これに成功した。レーザー照射中の表面温度を高速放射温度計により直接計測することで、レーザー照射条件と表面温度との関係を明らかにし、レーザー溶着条件を精密に制御することが可能となった。これにより種々の厚みでアパタイト層をPEEK樹脂表面に直接溶着する技術を確立した。合成したSrSiPに関する詳細な解析評価を実施した。XRD、FT-IR、さらにSEM、TEMおよびEDSを利用して解析を行い、極めて結晶性の高い高純度なアパタイトが形成されていることを確認した。さらにアパタイトから溶出するストロンチウムイオンをICP発光分析装置により定量した。溶出イオン濃度はアパタイトのコーティング厚みと相関し、厚みを変化させることで溶出イオン濃度を制御できることを見出した。上記で作製したアパタイトをコーティングしたPEEK樹脂ディスクを用いて、その表面にラットの大腿骨より採取した骨髄間葉系細胞を培養することで、骨形成促進作用について検討した。培養中の分泌オステオカルシン濃度や骨芽細胞への分化とともにPEEKディスク表面に析出したカルシウムアパタイトの量もPEEK表面のアパタイトコーティングにより顕著に増加した。PEEK樹脂表面に導入したSrSiP溶着層からのストロンチウムイオンやケイ酸イオンによる骨形成促進作用について検討を進める。さらに他の金属イオンとして亜鉛(Zn)やマグネシウム(Mg)およびマンガン(Mn)についても先行文献から骨形成を促進する効果が報告されており、検討中のSrSiP結晶中にこれらのイオンを併せて導入する検討を実施し相乗的な効果が発現するか検証する。ラット或いはラビット脛骨に骨孔を形成し、棒状PEEK樹脂表面に上記のアパタイトをレーザー溶着して骨孔に移植する実験を実施する。移植後のPEEK樹脂表面近傍における新生骨の形成の様子をマイクロCTを利用して観察を行い、さらに摘出後の組織切片、断面観察等から移植後のPEEK表面のアパタイト層の状態や新生骨の状態などを直接観察する。既存の報告などによると、コーティングしたアパタイト層の溶解消失が懸念されるため生体吸収性に乏しい高結晶性アパタイトをレーザーによる熱溶着することで、恒久的なアパタイト層をPEEK製インプラント表面に形成することを目標に検討を進める。ラット骨髄から採取した骨髄間葉系幹細胞をPEEK

樹脂表面で培養し、骨形成マーカーであるオステオカルシン(OC)やアルカリフォスファターゼ(ALP)の濃度を定量し、アパタイトの影響を調査した結果、アパタイト層の存在により骨形成が顕著に促進されることが判明した。培養でPEEK樹脂表面に形成されたリン酸カルシウムはアパタイト層の存在によりPEEK樹脂表面に強固に接着し良好な骨伝導性を示した。これによりPEEK樹脂に良好な骨癒合性を付与出来る可能性を示すことが出来た。PEEK製インプラントのモデルとして13mmφ×1mm厚PEEK製ディスクを利用し、その表面にケイ酸ストロンチウムアパタイト(SrSiP)やこれ以外の種々のアパタイトをレーザー溶着する検討を実施した。当初設定したレーザー照射条件ではパワー密度が高く、アブレーションが生じたが、エネルギー密度を低下させることで問題を回避することが出来た。また、当初はPMMAをバインダーに用いてアパタイト層をPEEK表面に接着し、PMMA/アパタイト複合体を溶着していたが、PMMAの存在は生体内で免疫反応を誘起することが判明した。そのためバインダーを使用せずアパタイトを直接PEEK表面に融着する技術を検討し、これに成功した。レーザー照射中の表面温度を高速放射温度計により直接計測することで、レーザー照射条件と表面温度との関係を明らかにし、レーザー溶着条件を精密に制御することが可能となった。これにより種々の厚みでアパタイト層をPEEK樹脂表面に直接溶着する技術を確立した。合成したSrSiPに関する詳細な解析評価を実施した。XRD、FT-IR、さらにSEM、TEMおよびEDSを利用して解析を行い、極めて結晶性の高い高純度なアパタイトが形成されていることを確認した。さらにアパタイトから溶出するストロンチウムイオンをICP発光分析装置により定量した。溶出イオン濃度はアパタイトのコーティング厚みと相関し、厚みを変化させることで溶出イオン濃度を制御できることを見出した。上記で作製したアパタイトをコーティングしたPEEK樹脂ディスクを用いて、その表面にラットの大腿骨より採取した骨髄間葉系細胞を培養することで、骨形成促進作用について検討した。培養中の分泌オステオカルシン濃度や骨芽細胞への分化とともにPEEKディスク表面に析出したカルシウムアパタイトの量もPEEK表面のアパタイトコーティングにより顕著に増加した。PEEK樹脂表面に導入したSrSiP溶着層からのストロンチウムイオンやケイ酸イオンによる骨形成促進作用について検討を進める。さらに他の金属イオンとして亜鉛(Zn)やマグネシウム(Mg)およびマンガン(Mn)についても先行文献から骨形成を促進する効果が報告されており、検討中のSrSiP結晶中にこれらのイオンを併せて導入する検討を実施し相乗的な効果が発現するか検証する。ラット或いはラビット脛骨に骨孔を形成し、棒状PEEK樹脂表面に上記のアパタイトをレーザー溶着して骨孔に移植する実験を実施する。
ヒト多能性幹細胞由来の大脳新皮質組織を用いた霊長類に於ける神経回路の再構築

本年度は、申請書の年次計画で記載した通り、大脳皮質の分化誘導を中心に条件検討を行った。まず、SFEBq法を用いて3次元での大脳皮質組織の誘導を行った。非血清存在下に神経組織が誘導されることを元に、まずSFEBq法によって神経上皮の誘導を行い、Wnt/BMP阻害剤の添加によりそれらの神経組織を吻側化する事で大脳皮質領域の誘導を行うことで、分化誘導開始後30-40日で3次元のヒト大脳組織を得ることができた。得られた神経組織は当初のin vitro培養条件では培養50日程度で構造が保持できなくなっていたが、40%酸素下での培養とガス透過性の改善によって長期培養が可能となり、培養100日前後まで安定して培養できるようになった。この分化誘導系を用いてヒトの大脳発生過程を模倣することを確認することができ、得られた3次元組織を、CLARITYのシステムで組織を透明化することで、cricoid様のVZ構造とそれを取り巻く神経層構造の3次元イメージングにも成功した。最後に得られた大脳組織の機能評価として細胞内カルシウム動態をライブイメージングで観察した。大脳オルガノイドを分散培養することで自己組織的な2次元神経ネットワークの形成を行い、Fluo4-AMで前処理した後に共焦点顕微鏡でイメージングをしたところ、分散2週後では各神経の活動がバラバラに見られたが、分散4週では、神経活動には同期発火するものとそうでないものが見られた。この神経活動を評価後、CNQXで処理して、神経活動を一旦止めた後の継時的変化を観察したところ、一旦止まった神経活動はCNQX洗浄後10分ほどから活動を開始し、洗浄後30分には処理前と同じ割合の神経細胞が活動していた。しかし、その活動細胞および活動パターンは処理前とは異なるものであった。これらの活動の時系列変化を評価する系を立ち上げ、定量化および可視化した。本年度は3次元での大脳皮質オルガノイドの分化誘導における基盤を現在の研究室で立ち上げた。3次元組織の評価法として、透明化技術と3次元イメージングの高い技術を用いることによって、大脳皮質オルガノイドのWhole mount stainingによる3次元イメージングに世界で初めて成功した。また、オルガノイドの分散培養系を用いたカルシウムイメージングによって、ヒト多能性幹細胞由来の大脳神経によって形成される神経ネットワークの複雑な活動パターンを測定・評価し、ヒト大脳神経の活動測定における新たな基盤を構築した。これらの結果だけでも、ヒトの神経活動の計測を細胞レベルで可能にする技術であることより、十分な新規性と有用性を兼ね備えていることから、現在論文投稿の準備をしているところである。そのため、当初の計画より進展していると考える。大脳皮質組織の3次元での分化誘導系の確立はほぼ終了している状況であるので、今後の方針としては、本来の目的であった生体への移植とその機能評価を第1に考えている。そのため、げっ歯類への移植に関してはすでに予備検討を始めている段階で、サルへの移植については移植方法の検討や、実際の管理について各部門と相談しているところである。ただ、分化誘導が非常に早く進んだことは良かったが、げっ歯類への大脳オルガノイドの移植についてはごく最近論文報告がなされてしまい(Mansour et al. Nat Biotech. 2018)、状況が研究開始当初とは異なってきている。当該論文においては、大脳オルガノイドのげっ歯類への移植とその詳細な機能評価が報告されてしまったので、大脳オルガノイドの移植に今後の研究を特化させることは、新規性を生むには現状では不利と考えている。よって、大脳皮質以外の神経組織に関しても挑戦してみたいと考えている。具体的には、海馬、腹側終脳に関して、分化誘導+移植後評価の確立ができればと考える。もしくは、大脳オルガノイドの移植に成功したその研究室へ留学することができれば、当初の研究計画をより早く実現することができるかもしれないので、そのようなコンタクトも取ってみたいと考えている。

この神経活動を評価後、CNQXで処理して、神経活動を一旦止めた後の継時的変化を観察したところ、一旦止まった神経活動はCNQX洗浄後10分ほどから活動を開始し、洗浄後30分には処理前と同じ割合の神経細胞が活動していた。しかし、その活動細胞および活動パターンは処理前とは異なるものであった。これらの活動の時系列変化を評価する系を立ち上げ、定量化および可視化した。本年度は3次元での大脳皮質オルガノイドの分化誘導における基盤を現在の研究室で立ち上げた。3次元組織の評価法として、透明化技術と3次元イメージングの高い技術を用いることによって、大脳皮質オルガノイドのWhole mount stainingによる3次元イメージングに世界で初めて成功した。また、オルガノイドの分散培養系を用いたカルシウムイメージングによって、ヒト多能性幹細胞由来の大脳神経によって形成される神経ネットワークの複雑な活動パターンを測定・評価し、ヒト大脳神経の活動測定における新たな基盤を構築した。これらの結果だけでも、ヒトの神経活動の計測を細胞レベルで可能にする技術であることより、十分な新規性と有用性を兼ね備えていることから、現在論文投稿の準備をしているところである。そのため、当初の計画より進展していると考える。大脳皮質組織の3次元での分化誘導系の確立はほぼ終了している状況であるので、今後の方針としては、本来の目的であった生体への移植とその機能評価を第1に考えている。そのため、げっ歯類への移植に関してはすでに予備検討を始めている段階で、サルへの移植については移植方法の検討や、実際の管理について各部門と相談しているところである。ただ、分化誘導が非常に早く進んだことは良かったが、げっ歯類への大脳オルガノイドの移植についてはごく最近論文報告がなされてしまい(Mansour et al. Nat Biotech. 2018)、状況が研究開始当初とは異なってきている。当該論文においては、大脳オルガノイドのげっ歯類への移植とその詳細な機能評価が報告されてしまったので、大脳オルガノイドの移植に今後の研究を特化させることは、新規性を生むには現状では不利と考えている。よって、大脳皮質以外の神経組織に関しても挑戦してみたいと考えている。具体的には、海馬、腹側終脳に関して、分化誘導+移植後評価の確立ができればと考える。もしくは、大脳オルガノイドの移植に成功したその研究室へ留学することができれば、当初の研究計画をより早く実現することができるかもしれないので、そのようなコンタクトも取ってみたいと考えている。
核膜孔複合体蛋白の細胞分裂時中心体間の相互作用解析に関する探索

細胞核膜上に多数ある核膜孔は核膜孔複合体から成り立っており、その複合体は約30種類の核膜孔複合体タンパク質(ヌクレオポリン)から構成されている。ヌクレオポリンは核膜を介する物質輸送だけではなく様々な働きを持つ。我々はその中でもヌクレオポリンの細胞有糸分裂期における役割を研究している。本研究課題は有糸分裂期における集合・脱集合時に、ある種のヌクレオポリンが動原体、紡錘体、中心体に局在していることを明らかにした中で、中心体に局在するヌクレオポリンの役割について4報の論文を発表したこれらの論文はすべてインパクトファクターは平均5である。常軌を逸した中心体の生合成は中心体の機能障害を引き起こし、ゲノムの不安定化と異数化につながり、さらに90%以上のヒト固形腫瘍で異数化が確認されている。真核細胞の核膜孔を形成する核膜孔複合体(NPC)は、ヌクレオポリンと呼ばれる30種類以上のタンパク質から構成される巨大タンパク質複合体であり、核-細胞質問の物質輸送を制御している。当初ヌクレオポリンは、有糸分裂初期に核膜の崩壊と共にばらばらに分解されると、有糸分裂後期に再びNPCとして集合するまで不活性であると考えられていたが、最近の研究ではいくつかのヌクレオポリンの中には紡錘体形成、及び、有糸分裂後期開始に影響を与え、細胞の癌化に関与するものがあることが明らかになってきた(Funasaka and Wong, Cancer Metasta Rev 2011; Nakano et al., Cell Cycle 2011)。さらに、いくつかのNPCタンパク質が有糸分裂期に中心体に局在していることが見出されている。研究課題では、NPCタンパク質の中心体/中心体小体の正常な生合成を始め、分離・複製・成熟に関与していると仮定し、NPCタンパク質の中心体への関与とそのメカニズムを明らかにすることを目的としている。一つの細胞を国家とすると核は政府と言える。政府の行政命令で社会活動が行われるが細胞内でも同じように、核の命令の伝達で細胞が活動する。核膜孔複合体は核の門番と言われ、東京の霞ヶ関駅と中央省庁の出入り口(核膜孔)でICカード(核内外搬出シグナル)を持つ官僚職員(転写因子)をチェックする役割を担う。核膜孔複合体はヌクレオポリンと呼ばれる30種類以上のタンパク質から構成される。本研究課題では核膜孔タンパク質の細胞分裂時における相互作用に関する探索を行った。実施期間に、NPCタンパク質の一つであるTprが、中心体の分離・複製・成熟に重要な役割を持ち、がん細胞において過剰発現が見られるAurora A kinaseと有糸分裂期に相互作用していることを見出した。また、Aurora A kinaseの阻害は細胞に染色体の異数化を引き起こすが、Tprの発現抑制も同じく染色体の異数化を引き起こした。Aurora A kinaseと直接結合するTprのMドメインに、Aurora A kinaseが過剰発現している癌において治療効果が期待できることを示唆し、論文発表した(Kobayashi et.al., Cell Cycle, 2015)。また、このTprと染色体の論文も発表した(Wong et.al., JV, 2015)。さらに、ヌクレオポリンNup358中心体で発現し、我々はNup358/RanBP2抑制によって誘導される分裂死メカニズムを明らかにしました(Wong & D'Angelo, Cell Chem Biol, 2016)。研究計画に則り、おおむね順調に進展している。総合生物研究計画に則り、今年度に予定している実験を進める。物品費として使用予定だった抗体が予想以上にコストパフォーマンスが良く、節約して使用することが出来たこと、さらに機器等も故障することなく使用できたため。差額分は新たに発売された核膜孔複合体をはじめとする抗体を購入し、研究データの蓄積につなげていきたい。
腸管神経と腎臓の発生過程の動的観察とGDNFシグナルの役割の解明

神経堤細胞が腸管全体に移行し、神経分化をすでに開始しているマウス胚15.5日目にGDNF受容体を条件的ノックアウトしたところ、結腸遠位部以降において36時間以内に神経網が消失することを見いだした。つまり、生体内でGDNFシグナルが腸神経細胞の生存に必須であることを初めて示したことになる。ヒルシュスプルング病における腸管壁内神経節細胞の先天的欠損は神経堤細胞の移行異常によるものと従来考えられてきたが、我々の研究により、GDNF/RETシグナルの減少による神経細胞死の可能性が新たに出てきた。そこで、Ret遺伝子変異によるヒルシュスプルング病モデルマウスを作製し、細胞死の有無を検証した。我々は、マウスにおいてRETチロシンキナーゼの発現を通常の約30%に下げることで、従来のRetノックアウトマウスと異なり、腎臓やモーターニューロンの発生異常は認められず、結腸遠位部以降の腸神経の欠損が認められ、またこの異常の発症率がオスに高い傾向がみられるというヒルシュスプルング病の多くの特徴を示すことを見いだした。このモデルマウスにおいてRetの発現の減少が後腸遠位部の神経細胞の細胞死を引き起こすことをtime-lapse観察、電子顕微鏡観察により確認した。このモデルマウスは、Ret遺伝子変異によるヒルシュスプルング病の発症メカニズムの解明につながる有用なツールであり、発症に神経堤細胞の移行異常だけでなく神経細胞死が関与していることを強く示唆した初めての研究である。胚形成期における腸管神経系において、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)とその受容体であるGFRα1の発現を調べたところ、腸管神経堤由来幹細胞が腸管全体に移行した後の時期(胎生15.5日)において、後腸に限定した発現パターンが認められた。そこで、胎生15.5日にGFRα1をノックアウトしたマウスを解析したところ、大腸の神経節が消失していた。GFRα1欠損後、GFP陽性の神経細胞の消失を経時的に解析したところ、GFRα1不活性化後24時間で消失が認められるようになり、36時間以内にほぼ完全に消失することが明らかになった。その過程において、TUNEL陽性細胞はわずかしか認められず、活性型のカスペース-3および7はほとんど認められなかったことから、従来のアポトーシスによる細胞死ではない可能性が示唆された。そこで腸管神経細胞を単離し、初代培養条件化で、GDNF除去による細胞死がカスペースおよびBax依存性かどうか検討したところ、カスペース阻害剤存在下でもBaxをノックアウトした状態でもGDNF除去による細胞死を抑えることはできなかったことから、カスペース非依存性の細胞死であることが示された。さらにノックアウトマウスの腸管神経を透過型電子顕微鏡で観察したところ、クロマチンのコンパクションや典型的なネクローシスは認められず、特徴的な異常として核の歪な収縮が多くの細胞で認められた。後腸における神経節の欠損はHirschsprung病の症状と酷似していること、GDNFおよびそのレセプターRETは原因遺伝子であることから、この細胞死が発症メカニズムに関与している可能性は十分考えられる。今後は、この細胞死のメカニズムの解明とHirschsprung病マウスモデルの改良とHirschsprung病の発症メカニズムの解明に重点を置いて研究を進めていく予定である。
アイヌ音楽の旋律分析研究、及び北方諸民族の音楽との比較研究に向けた基礎的調査

研究目的と当初計画にしたがって大きく3つの領域を立てて研究を実施した。(1)アイヌの歌の旋律構造の分析について:資料の情報を収集していく中で、現在絶版となっているアナログレコード盤資料のひとつで、1950年代に白老町の伝承者らから採録した音源の所在がわかったことから、版元であるレコード会社と協議し、複製(デジタル)で購入した。また別の用務で6月に白老町を訪れた際に、当該の資料での演唱者について断片的ではあるが情報を得た。(2)アイヌ音楽及び関連する北方諸民族の芸能に関する情報収集について: 10月に平取町で開催された「日本映像民俗学の会第41回大会「アイヌと北方文化映像フィルムと知の再編」」に参加し、アイヌ文化及び関連する北方諸民族の文化を記録した各種の映像をまとめて鑑賞し、記録内容を確認した。また、同会の有識者より、アナログ形式で記録された映像のデジタル化について助言を得る等の機会とできた。(3)北方諸民族の芸能を記録した音声・映像資料の所在(国内)調査について:民族音楽学者の故・谷本一之氏が19702000年代に採録した研究資料は、現在、国立民族学博物館において、その利活用に向けての準備が進められつつあることから、12月に同館を訪問した。その際、担当の齊藤玲子氏より、当該資料整理の現況と問題点等について説明を受けた。また、谷本氏による採録資料の整理作業を効率的に進めるうえで同氏の調査履歴と個々の資料との関連づけが不可欠であり、甲地による情報提供が有効であることから、同館での同資料の整理作業を、本研究と相互に協力しながら進めていくこととした。所属機関での年間業務との兼ね合いもあり、前記(1)(2)(3)を並行させて進めることが難しかった。(1)については、所属機関での行事や内部報告会でこれまでの情報や音楽分析の方法再検討について整理しまとめることに時間を費やしたため、購入した資料をはじめとする新たな対象には着手できなかった。(2)については既存資料のデジタル化を優先することにしたものの、その方法を模索する時間を要した。(3)については、国立民族博物館の担当者と面談できる機会がなかなか折り合わなかった。(1)アイヌの歌の旋律構造の分析:既存の音声資料の内容分析の一環として、「神謡」と呼ばれる語り物音楽の分析方法について、2018年に見直しを図っており、これを以前の結論と具体的に比較対象する作業を進める予定。(2)アイヌ音楽及び関連する北方諸民族の芸能に関する情報収集: 2018年10月に参加した「日本映像民俗学の会第41回大会」で有識者より受けた助言により、映像メディアの劣化対策を優先すべきと判断したことから、研究計画や方策を少々変更する。具体的には、2019年度は、以前分担者として参画した科研費課題において採録したコリヤークほかの北方諸民族の芸能の映像(Hi8ビデオテープ)のデジタルデータ化を進める。(3)北方諸民族の芸能を記録した音声・映像資料の所在(国内)調査:国立民族学博物館が整理作業を進めつつある谷本一之採録資料について、同氏の調査歴と個々の資料のとの関連づけをはかり、相互に情報を共有することを進める。

(3)については、国立民族博物館の担当者と面談できる機会がなかなか折り合わなかった。(1)アイヌの歌の旋律構造の分析:既存の音声資料の内容分析の一環として、「神謡」と呼ばれる語り物音楽の分析方法について、2018年に見直しを図っており、これを以前の結論と具体的に比較対象する作業を進める予定。(2)アイヌ音楽及び関連する北方諸民族の芸能に関する情報収集: 2018年10月に参加した「日本映像民俗学の会第41回大会」で有識者より受けた助言により、映像メディアの劣化対策を優先すべきと判断したことから、研究計画や方策を少々変更する。具体的には、2019年度は、以前分担者として参画した科研費課題において採録したコリヤークほかの北方諸民族の芸能の映像(Hi8ビデオテープ)のデジタルデータ化を進める。(3)北方諸民族の芸能を記録した音声・映像資料の所在(国内)調査:国立民族学博物館が整理作業を進めつつある谷本一之採録資料について、同氏の調査歴と個々の資料のとの関連づけをはかり、相互に情報を共有することを進める。既存の採録資料のデジタル化を進めるに際し、当初は機材の購入と臨時職員の雇用により進めることを考えていたが、一方で、業者に委託して行う方法についても模索したものの、どちらの方法がよいかの見極めに手間取った。2019年度はこの点を早々に決断決定し、研究目的の遂行に必要な執行をはかる。併せて、音楽分析作業や収集情報データの整理作業に必要なソフトウェアやプリンタ等、当初予定の機材選定に手間取った。2019年度の早期に購入する。また、相手方のつごうにもよるが、昨年度中に23回実施する予定で1回しかできなかった国立民族学博物館(大阪府吹田市)への出張を今年度中に実施する予定。・ミュージアムカレッジ「アイヌの子守歌・諸民族の子守歌」(H30年6月17日、北海道博物館)アイヌや北方諸民族等の子守歌をテーマとした一般向けの講座・報告「神謡の旋律構造」(H30年10月10日、北海道博物館館内定例研究報告会)神謡と呼ばれるジャンルの口承文芸の旋律構造の分析方法について再考を試みた結果について報告
雇用対策事業を有効具体化する法技術－地域〈雇用実現の法〉を構築する－

雇用政策法/労働市場法制を構成する〈雇用創出の法〉〈就業支援の法〉そして〈雇用安定の法〉を想定する。各法が連携し効果を発揮するよう計画・立法され、総合的かつ相互協調的に運用されれば、多くの雇用が創出され、求職者の就業が効果的にサポートされ、創出された雇用機会にマッチする就業者の雇用関係が始まり、個別の労働契約の持続・安定に至り、効果的な雇用対策となる。当研究は雇用政策の充実と実効化を目的として、3年間で雇用政策法/労働市場法制を構成する関連諸法の連携および協調の法技術を調査し、地方自治体レベルで汎用可能な〈雇用実現の法〉を構想し、具体的な地域雇用プログラムの構築を試論した。〈雇用創出の法〉〈就業支援の法〉そして〈雇用安定の法〉の概念整理と理論モデル化を目指し、関連諸法の制定経緯と各種政策事業の進捗推移について各種資料の集積を図る。並行して地方自治体が企画実施する雇用関連事業について特に先端〈現場〉での事業状況を調査する。その上で雇用創出から雇用契約の持続安定に至る連続性に注視した事業体制の問題点を掘り下げる。また諸外国における就業と雇用形成サポートの実例にアプローチを試み、雇用創出と就業支援の具体化に関する多角的検討視座を得る。当研究は3ヶ年計画で進められる。期間中途で取材調査レポートを随時リリースし、先端〈現場〉と研究の相互フィードバックに努める。また取材先〈現場〉担当者らの共同レポート作成にも取り組む。地方自治体の雇用創出担当セクションに参画し、同自治体が企画創出する地域雇用プログラム等への具体的還元ないし実証実験を試行し、〈雇用実現の法〉研究の成果具現化を目指す。上記の目的の実現のために、全国自治体が平成20年度以降に作成・提出した約150の「地域雇用創出計画」と約100の認定「自発雇用創造地域」の事業計画とその評価を手掛かりに、近時の雇用創出の契機と展開を、本来需要型、計画助成型、代替試行型といった分類を通じて、当事者への刺激・誘発、インセンティブ付与、助成の各相関を整理してみた。また、昨今の通称「緊急雇用」事業の具体化に関する現場の創生アイデアと雇用実現、さらには事業監理の諸問題等を現地ヒアリングするなどした。また政策法とは別に、雇用と労働法の法理の研究も並行して進め、特に地域雇用と関連する入職時のステートメントに関する論考、地域労働紛争の調整と解決に関する論考、あるいは非正規雇用契約に付される特約強制に関する論考等を作成し、地域雇用の法のありかたをなお検討した。この研究では、雇用政策法/労働市場法制を構成する〈雇用創出の法〉〈就業支援の法〉そして〈雇用安定の法〉を想定する。各法が連携し効果を発揮するよう計画・立法され、総合的かつ相互協調的に運用されれば、多くの雇用が創出され、求職者の就業が効果的にサポートされ、創出された雇用機会にマッチする就業者の雇用関係が始まり、個別の労働契約の持続・安定に至り、効果的な雇用対策となるとの仮説である。この仮説に対し、特に雇用創出の現場の自治体等で事業実現の困難があるとの発想をあわせ、当研究は雇用政策の充実と実効化を目的として、雇用政策法/労働市場法制を構成する関連諸法の連携および協調の法技術を基盤に、地方自治体レベルで汎用可能な〈雇用実現の法〉を構想し、具体的かつ効果的な地域雇用プログラムの構築と実証へと還元するものである。平成24年度は、〈雇用創出の法〉〈就業支援の法〉そして〈雇用安定の法〉の概念整理と理論モデル化を目指し、関連諸法の制定経緯と各種政策事業の進捗推移について各種データや実例の集積を図ろうとした。特に雇用創出に悩む地方自治体が企画実施する雇用関連事業について実体調査を試みた。岩手県被災沿岸部での緊急雇用創出事業や災害復興事業に関する雇用創出事例、あるいは鹿児島県大島郡喜界町(喜界島)における農商ビジネスに関連した雇用創出事例などは、参与的活動を合わせて行い、理論モデルの中途フィードバックとノウハウ関連付けを行った。また、国の雇用対策法や地域雇用開発促進法等、雇用創出に関する法制度の問題を探るため、各地の労働局職業安定部や各自治体の雇用創出協議会等にインタビューを行い、近時の雇用創出の契機と展開を、本来需要型、計画助成型、代替試行型といった分類を通じて、当事者への刺激・誘発、インセンティブ付与、助成の各相関機能を整理した。

この着想の下で、当研究は雇用政策の充実と実効化を目的として、雇用政策法/労働市場法制を構成する関連諸法の連携および協調の法技術を基盤に、地方自治体レベルで汎用可能な〈雇用実現の法〉を構想し、具体的かつ効果的な地域雇用プログラムの構築と実証へと還元しようとした。最終年度は、国の雇用対策法や地域雇用開発促進法等、雇用創出に関する法制度を下部構造まで含めて調査分析を進めた。各種の事業計画とその中間評価を手掛かりに、近時の雇用創出の契機と展開を、本来需要型、計画助成型、代替試行型といった分類を通じて、当事者への刺激・誘発、インセンティブ付与、助成の各相関を整理したほか、全国の地方自治体の緊急臨時雇用プログラムについても同様の調査と整理を試みた。これらとイギリス「エンプロイメントゾーン」と民間事業者の雇用開拓に関して相補関係を構築し、比較法的遠近法からの視座を通じた検討もこころみた。とりわけイギリスの現地調査(ロンドン大学、インパクトハブ等)を通じて、雇用開拓の実相と、経済状況の変動に影響を受けやすい短期雇用政策の是非をも検討に含め、雇用安定の法モデルを考察することができた。これら研究成果は今後リーフレット等でリリースを検討するほか、各種研究会での研究情報交換に役立てる予定である。社会法東日本大震災の影響により、東北の各自治体では、緊急雇用事業やそれ以前の雇用パッケージ事業の振り返りを試みる余裕がなく、したがってこれら過去事業への振り返りと評価のためのアプローチが困難になっている。他方で、復興雇用の問題点はリアルタイムでトレース可能であり、今年度末においては各被災地自治体における「セトルフォーワーク」(研究代表者の造語)が重要になってきており、この観点および研究視角での自治体への情報提供と取材等を進めることで、研究全体の進捗を図っている。雇用政策法/労働市場法制は、市場の設計合理性と機能有効性を追求するのだが、その実効化と親当事者的な具体化については雇用創出、就業支援、そして雇用安定の実践の〈現場〉からフィードバックされた情報や知見により修正および再構築されるところが大きい。平成24年度の当研究の遂行にあっては、雇用創出事業の具体的立案者、そして地方公共団体の雇用創出関連セクションをはじめ、各地の雇用創出協議会、職業紹介事業者、職業訓練行政、求人企業等への〈現場〉アプローチを手掛かりに、雇用創出、就業支援そして雇用安定に携わる支援者らの事業実態と当事者の行動態様を調査し、雇用機会の形成刺激と雇用関係の成立までを系列的に構成しながら、関連各法の実現と有効化に関する一体性、連続性、協調・連携性の各点に注目した解明・分析を試みようとした。このことは研究目的を満たし、当研究資料のデータ集積にもちろん寄与したほか、自治体への中途の研究成果の提供依頼にも応えることになった。資料データ集積の実績と、中途フィードバックおよび地域貢献を理由に、上記の区分とする。上記のとおり、〈雇用実現の法〉の具体化のために、新視角となるセトル(復興あるいは地域再構築のための定住ないし帰還)とのための地域雇用の在り方を、今後の研究推進方策の一つとし、同時に研究計画に従った研究実施に努めることにしたい。平成25年度は各地方自治体が実施する雇用創出安定事業等の雇用助成金の給付事例を素材にして、新規創出雇用への求職者の充当過程における就業能力、契約内容、助成給付手続等に着目し、創出から持続・持続安定への法理論モデルをなお考察する。