hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パーソナルコンピュータクラスターを用いたトロイダルプラズマの乱流と構造の解析

パーソナルコンピューターの並列処理を用いた乱流と構造解析法の開発を行い、CHSの重イオンビームプローブデータの解析から、帯状流と背景乱流との結合、帯状磁場の発見、高速粒子とMHD不安定性の相互作用の結果による振動帯状流の生成の観測などの新しい知見を得た。本年度のプラズマ物理学上のもっとも注目すべき成果として、2004年にCHSで確認された流れの帯状構造が実際に乱流によって生成されていることを実証したことである。この事実により、2004年に確認した構造が、これまで理論やシミュレーションが予測してきた帯状流であることが示された.また、輸送障壁のある状態、ない状態について帯状流と乱流の成分比についても知見も得られ、輸送に寄与しない帯状流成分が乱流成分に対して増加することが輸送の改善の一端を担っていることが示されている。その他、帯状流の振動ブランチであるGeodesic Acoustic Modeについても解析が進み、GAMが示す間欠性、固有モード的な性質、解の多重性など新たな知見が得られている.ここで、乱流と帯状流の因果関係の同定には、本研究で提唱したウェーブレットやバイコヒーレンス法を用いた先進的なデータ解析法によってなされたことは特筆すべき点である。その他、本年度の成果として高エネルギー粒子が駆動する電磁流体力学的なモードの非線形発展に伴い、高エネルギー粒子の軌道に影響を与え、プラズマ中に対称な電場を形成することが明らかと成った。CHSにおいてこの電場は乱流に影響を与えるほどの大きさを持っていないが、将来の燃焼プラズマにおいてはアルファー粒子の軌道損失がプラズマの構造にもたらす効果を考える上で極めて重要な知見を与えると考えられる。また、最後に、本年度は本課題の技術的な課題であるコンピュータクラスターシステムの構築に成功したことを付記しておく。本年度のプラズマ物理学上のもっとも注目すべき成果としては、2004年の帯状流の実在の証明に続き、帯状磁場の存在が確認されたことである。トロイダルプラズマあるいは磁場閉じ込めプラズマ中の流れは電場と等価である。この事実を考えると、乱流が磁場成分を伴っていれば、帯状流(電場)が存在すれば、帯状磁場が同時に存在する可能性がある。別の言い方をすれば、プラズマ中のイオンの流れが流れすなわち電場を生み出すのに対し、電子の流れは電流となり磁場を生み出す可能性がある。本実験では、重イオンビームの潜在的な能力である磁場揺らぎ計測可能性を追求し実際に帯状磁場が存在することを確認した。ここで開発された計測法についてはPlasma Physics and Controlled Fusionの論文として、実際の帯状磁場の発見についてはPhysical ReviewLettersに論文として掲載された。その他、本年度の成果として、帯状流と乱流との結合についてwavelet bicoherenceなどの方法を用いて、乱流のスペクトル及び帯状流との結合が帯状流の位相に依存していることを示されたことなど、更なる知見が得られている。また、本年度は本課題の技術的な課題であるコンピュータクラスターシステムを2台新たに購入し、さらに性能を拡張したこと、Fortranで書かれていたプログラムを拡張性の高いC言語に一部変換したことを付記しておく。最終年度にあたる本年度は、PCクラスターによるデータ処理の更なる効率化に努め、CHSの乱流および高エネルギー粒子とMHDの相互作用に関する解析を進めるとともに、3年間の研究のまとめに努めた。解析法の拡張という点からは、ウェーブレットバイコヒーレンス法の計算処理が並列化され、ナノ秒でサンプリングされた大量データの処理が可能となった。物理的な成果として、乱流と帯状流、そして閉じ込めの影響が示されたほか、高エネルギー粒子が駆動するMHD不安定性が励起する構造変化による乱流への影響への解析が進められている。具体的な成果としては、これまでのCHSの乱流と帯状流の成果を簡潔にまとめた論文がPhysics of Plasmasから発刊されたほか、福岡で開催されたICPP会議において帯状磁場発見について講演を行った。また、高エネルギー粒子とMHDモードとの相互作用に関連した成果はスイスのジュネーブで開催されたIAEA主催のFusion Energy Conferenceにて発表した。また、これまでのプラズマ乱流研究によって得られた知見が、今後のトロイダルプラズマの閉じ込めの高性能化や今後の核融合研究について果たす役割について纏めた講演を第18回土岐コンファレンスにて行った。また、計画の最終年度に相応しく、帯状流実験の国際的動向およびこれまでの結果を纏めたレビュー論文がNuclear Fusion誌から発行したことは特筆すべき成果である。
言語取得期の言語・非言語的ユニットの形成と再構造化に果たす母子相互作用の役割

初期言語習得の過程を明らかにするために、前言語期から言語期の母子相互作用を観察し、母子間で共有される場面構造と、そこで子どもがもつと考えられる言語・非言語のユニット形成を検討することを目的とした。本研究は、このための第1ステップとして、初期の習得語彙とそのコンテクストを押さえた。これは、次のアプローチのための予備的作業である。このために、初期の産出・理解語彙の種類とそのコンテクストを、母親のインタビュー調査から調べた。調査対象は13カ月児20名(平均日齢400.6日;13カ月+6日)とその母親である。対象児の家庭を訪問し、自然場面の母子観察を実施したのに続いて母親へのインタビューを行った。実施時間は約1時間であった。産出、理解の平均語数をみると、産出平均は7.3(レンジ0-19)、理解平均は35.1(レンジ14-64)であり、産出語数と理解語数との相関は、r=.322(n.s.)であり、両者が関連をもっているわけではなかった。また、カテゴリ別にみていくと、産出・理解ともに行為・状況のカテゴリが半数以上を占めていることが特徴である。さらに、これらのカテゴリごとに文脈依存(CR)および文脈自由(CF)の比率を見ると、カテゴリによってかなり様相が異なっており、人に関する語彙では産出においてCFの比率が高く、事物が行為・状況はCRの比率がきわめて高くなっていた。また、理解においても事物カテゴリでCFの率が産出よりも高くなる以外は、同様の傾向が認められた。上位のカテゴリに属する語彙の対立が反応として明確に捉えられると、母親は語を文脈とは切り離して使用していることが回答でき、それについてのエピソードも出せるようになっていた。この後の作業としては、これらの語彙が埋め込まれているコンテクストを母親の報告から整理し、コンテクストの特性の記述の試案を作成し、習得文脈の仮説を構成していく必要があると考えている。
可換環論における概Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎ環論の開拓

本研究は可換環の階層化を目的としています。可換環とは、加減乗除という四則のうち加減乗までを自由に行うことができる世界(集合)のことです。このような構造は数理科学の至るところで見られますが、そのような構造のうち本質的な部分のみを抽出して全体像を俯瞰することで、新たな発見を目指しています。抽象化に際して、「何が本質的なのか」が非常に重要な問いになります。本研究は、既存の環構造論では解決できなかった問題を、新たな環構造の開発とその解析方法を確立することで解決を目指します。様々な分野への応用を見据えており、その一つとして、表現論に由来する未解決問題への寄与を図ります。
ムコ多糖症モデルマウスを用いた中枢神経障害に対する遺伝子治療法の開発

マウスヘ内頸動脈へのカニュレーションの技術は小林らによって確立した。マウスよりマクロファージを培養しレトロウイルスベクター(MFG-LacZ)にてE.coliのLacZ遺伝子を導入しマーキングを行った。内頸動脈より投与を行ったが細胞は肝臓、脾臓に定着し脳実質内への定着は認められなかった。そこで2年目は正常マクロファージのSlyマウス静脈内への投与を行った(2X106/mouse)。肝臓、脾臓に多くの細胞が定着した。組織学的にも生化学的にも肝臓、脾臓におけるムコ多糖の蓄積は軽減された。つぎに遺伝子治療法の検討としてSly病マウスより同様の方法にてマクロファージを培養しMFG-HBGレトロウイルスベクターにてSly病の欠損酵素である、beta-glucuronidase遺伝子を導入し同様に移植を行った。レトロウイルスベクターにて効率よく遺伝子が導入された。その遺伝子導入された細胞をSly病モデルマウスに導入したところ少なくとも5週目までは肝臓、脾臓に定着していた。正常細胞を移植した場合と同様に組織学的にも生化学的にもムコ多糖の蓄積は改善しいた。マクロファージが抗原提示細胞であることを考えると欠損遺伝子をマクロファージで発現させることはホストの免疫反応を惹起させる可能性がある。事実我々の培養したマクロファージでは、その30%にB7を発現していた。2回目の投与と行ったが生着はするものの1回目の投与より細胞数は少なかった。今後解決すべき問題と思われた。次にヒトのマクロファージに応用可能か否かを検討した。ヒト臍帯血よりIL-3、GM-CSFを用いてマクロファージを培養したところ、遺伝子導入が可能であっった。以上よりマクロファージ移植の有用性、および遺伝子導入細胞としての有用性が判明した。Sly病はムコ多糖症の1つでありβ-gluduronidaseの欠損により種々の臨床症状を呈する疾患である。我々は本症の遺伝子治療をモデルマウスを用いて検討している。本年度はSly病の中枢神経障害の治療をめざしてミクログリア細胞の移植を行った。ミクログリア細胞は藤田保健衛生大学沢田博士と国立精神神経センター高坂博士より御供与いただいた細胞(Ra-2細胞、MG5細胞)を用いた。投与方法としては静脈内投与、頸動脈内投与、脳室内投与を行った。生着したミクログリア細胞を同定するため投与前に細胞を蛍光ラベルした。まずは生着出来るか否かを検討するため正常のマウスを用いて実験を行った。しかしながら上記の細胞はどの投与経路においても脳への生着は確認できなかった。これら細胞の主な生着組織は肝臓、脾臓であった。つぎに正常なマウスの骨髄を採取しL929細胞のconditioning mediumを用いて培養しCD11b/CD18陽性細胞を採取した。この細胞はミクログリア同様、貧食系の細胞集団である。この細胞も同様に静脈内投与したところ、やはり脳内への生着は認められず肝臓、脾臓に生着した。以上のように中枢神経系への細胞移植は不成功に終わったがSly病の主な罹患臓器が肝臓、脾臓であることを考えるとCD11b/CD18陽性細胞が肝臓脾臓への遺伝子治療の標的細胞になり得るのではと検討を加えた。正常マウスより培養したCD11b/CD18陽性細胞をSly病モデルマウスに経静脈的に投与した。1週後に組織を取り出し酵素活性を検討したところ酵素活性の上昇が認められた。

組織の凍結切片を作成し酵素の活性染色を行うと散在性に活性陽性細胞が認められた。病理学的検討も加えたが残念ながらムコ多糖の蓄積を改善するまでには至らなかった。これは生着細胞の数が少ないためと思われた。またCD11b/CD18陽性細胞への遺伝子導入を検討したが少なくともアデノウイルスでは可能であった。しかしながらアデノウイルスでは免疫学的問題があるため現在アデノ関連ウイルスを用いて遺伝子導入を検討中である。また、より多数のCD11b/CD18陽性細胞を移植して病理学的改善度も検討中である。【目的】ムコ多糖症VII型(Sly病)はライソゾーム酵素の1つであるβ-glucuronidase(HBG)の遺伝的欠損により、様々な臨床症状を呈する疾患である。本症にはモデルマウスが存在し骨髄移植療法、酵素補充療法、遺伝子治療が試みられている。今回、我々はSly病に対する治療法としてマクロファージ移植の有用性および遺伝子治療の標的細胞としての有用性を検討した。【方法】正常マウスより骨髄細胞を採取し、L929細胞conditoning mediumを含む培養液にて培養した。培養2週後に様々な抗体で染色しマクロファージであることを確認した。この細胞をSly病モデルマウスの尾静脈より投与し1週後に各組織におけるHBGの活性を検討した。また凍結切片を作成し移植された細胞の存在の組織学的に検討した。トルイジンブルーにて組織染色しムコ多糖の蓄積の改善度を検討した。生化学的にも肝臓、脾臓のムコ多糖を定量した。またSly病モデルマウスより骨髄を採取しレトロウイルスベクターにてHBG遺伝子を導入後同様の実験を行った。再投与の検討もおこなった。同様の方法でヒトマクロファージへの遺伝子導入を試みた。【結果、考察】正常マクロファージをSly病モデルマウスに移植し、1週後の肝臓、脾臓におけるHBGの酵素活性を測定した。HBGの酵素活性は肝臓、脾臓においてSly病マウスより上昇し、活性組織染色でも活性陽性細胞すなわち移植された細胞は組織中に散在していた。ムコ多糖の蓄積の改善度を病理学的に検討したが1週の時点ではほとんど改善は認められなかったが5週後では著名に改善しており、生化学的にムコ多糖の蓄積は減少していた。レトロウイルスにてHBG遺伝子を導入した場合の同様の検討でも5週後でムコ多糖の蓄積は組織学的にも生化学的にも減少しており、また2回目の投与も可能であった。ヒトのマクロファージにも同様の方法で遺伝子導入可能であった。以上より本細胞は遺伝子治療を行う上での標的細胞になりうると思われた。
大域的マップマッチングに基づく「屋内外」経路推定の確立と防災訓練への適用

本研究の目的は、BLE(Bluetooth Low Energy)ビーコンとGPSを融合し、かつ、物理的なBLEビーコンの配置関係と実際の経路を分離するモデルを採用することで、全体最適かつ高精度で耐故障性のある「屋内外」経路推定手法を提案する。さらに、提案手法を実際の避難訓練に適用し、大規模な実験データを取得・検証する。これにより、屋内外経路推定の仕組みを確立し、都市計画や防災訓練、人流推定などの分野に貢献する。
アクティブ・エネルギー回生・ハイブリッド振動制御システムの試作研究

近年、振動制御の分野にアクティブ制御が応用されるようになり、制振性能の大幅な向上に寄与してきた。しかし、アクティブ制御を行なうためには外部エネルギーを必要とし、その消費エネルギーがアクティブ制御の欠点となることがある。一方、通常のダンパは振動エネルギーを吸収することによって振動を減衰させるデバイスであり、吸収した振動エネルギーは摩擦などによって熱エネルギーに変換され大気中に廃棄されている。そこで、ダンパで吸収した振動エネルギーを有効なエネルギーとして貯え、そのエネルギーを利用してアクティブ制御を行なうことを提案する。理想的には、このシステムでは、外部からエネルギーを供給することなくアクティブ制御を行なうことが可能である。本研究ではこのシステムを、アクティブ・エネルギー回生ハイブリット制御と名付け、その実現性を調べることが目的であり、実際にアクティブ・エネルギー回生ハイブリット制御装置を試作した。本研究と試作した装置は以下の特長を有している。(1)エネルギー損失が少ないリニアDCモータを利用したエネルギー回生ダンパおよびアクチュエータを製作し、デバイスの開発を行ったこと。(2)外部からエネルギーを供給せずに回生された振動エネルギーのみを利用するアクティブ制御を実現するために、エネルギー消費の少ないスカイフック制御を利用した新たな制御則を構築したこと。(3)試作した装置は次に述べるような実験から良好な性能を発揮したこと。実験では、正弦波とランダム波の2種類の外乱を入力した。正弦波を入力した実験では、高周波の領域で優れた制振性能を示した。これは、高周波になるほど振動のエネルギーが大きくなり、回生される振動エネルギーが増加するからである。ランダム波を入力した実験では、低周波の領域においても制振性能が向上していることが確認された。これは、ランダム波では、低周波の成分と高周波の成分が同時に入力されるため、高周波で回生された振動エネルギーが低周波の制振に使用されたことが理由と考えられる。以上のように、アクティブ・エネルギー回生ハイブリット制御は、現実的なランダム波外乱では低周波の制振性能も向上させることが可能であることが確認され、将来的にも非常に期待の持てるシステムであることがわかった。機械システムにおいて、自動車や鉄道車両のような交通機械、各種産業機械を問わず、振動現象の発生は色々な問題を引き起こすため、各種の防振対策が施されている。しかし、本来、交通機械では走行エネルギー、各種産業機械ではその駆動エネルギーの一部が振動エネルギーに変換されたものであり、従来のパッシブな防振方法では、ダンパによる減衰力は熱エネルギーに変換され、エネルギー損失を伴うことになる。アクチュエータを利用したアクティブな振動制御では、エネルギーを消費してしまう。この不合理を解決し、合理的な振動制御方式を確立することが本研究の目的である。平成7年度は、主として理論的な検討と試験装置の具体的な設計を行った。理論的な検討に関しては、まず本システムを2自由度振動系として数学モデルを構築し、次にこのモデルを用いて制御系の設計を、ロバスト制御の一手法であるH∞制御理論により行い、防振効果、アクチュエータの消費エネルギーおよび回生エネルギーなどの検討を行った。なお、解析にはアクチュエータおよびエネルギー回生ダンパとして働く要素として、電気モータを用いた。解析の結果によると、本システムは十分な防振効果があり、高周波数領域においてはエンルギーが回生されることが明らかになった。制御エネルギーを必要とする周波数領域は低周波なため、回生されたエネルギーをどのように蓄積するかをさらに検討する予定でいる。

装置の試作に関しては、動電型振動試験装置、実験計測用ディジタルオシロスコープを購入し、アクティブ・エネルギー回生・ハイブリッド振動制御装置の基本設計を行った。近年、振動制御の分野にアクティブ制御が応用されるようになり、制振性能の大幅な向上に寄与してきた。しかし、アクティブ制御を行なうためには外部エネルギーを必要とし、その消費エネルギーがアクティブ制御の欠点となることがある。一方、通常のダンパは振動エネルギーを吸収することによって振動を減衰させるデバイスであり、吸収した振動エネルギーは摩擦などによって熱エネルギーに変換され大気中に廃棄されている。そこで、ダンパで吸収した振動エネルギーを有効なエネルギーとして貯え、そのエネルギーを利用してアクティブ制御を行なうことを提案する。理想的には、このシステムでは、外部からエネルギーを供給することなくアクティブ制御を行なうことが可能である。本研究ではこのシステムを、アクティブ・エネルギー回生ハイブリット制御と名付け、その実現性を調べることが目的であり、実際にアクティブ・エネルギー回生ハイブリッド制御装置を試作した。本研究と試作した装置は以下の特長を有している。(1)エネルギー損失が少ないリニアDCモータを利用したエネルギー回生ダンパおよびアクチュエータを製作し、デバイスの開発を行ったこと。(2)外部からエネルギーを供給せずに回生された振動エネルギーのみを利用するアクティブ制御を実現するために、エネルギー消費の少ないスカイフック制御を利用した新たな制御則を構築したこと。(3)試作した装置は次に述べるような実験から良好な性能を発揮したこと。実験では、正弦波とランダム波の2種類の外乱を入力した。正弦波を入力した実験では、高周波の領域で優れた制振性能を示した。これは、高周波になるほど振動のエネルギーが大きくなり、回生される振動エネルギーが増加するからである。ランダム波を入力した実験では、低周波の領域においても制振性能が向上していることが確認された。これは、ランダム波では、低周波の成分と高周波の成分が同時に入力されるため、高周波で回生された振動エネルギーが低周波の制振に使用されたことが理由と考えられる。以上のように、アクティブ・エネルギー回生ハイブリット制御は、現実的なランダム波外乱では低周波の制振性能も向上させることが可能であることが確認され、将来的にも非常に期待の持てるシステムであることがわかった。
新規中間径フィラメント・デスマスリンに結合する因子の探索

desmuslinは、α-dystrobrevin-1をbaitとして行ったtwo-hybrid法で獲得された中間径フィラメントで、免疫沈降法ではdesminに結合するという特性を持つ。そこで本研究では、desmuslinに結合する因子の探索を行い、desmuslinの機能を解析することで筋細胞の構造および筋収縮機構の解明に近づくことを目的とし、Yeast Two Hybrid法を用いて網羅的にdesmuslinに結合する蛋白質の探索を行った.ヒト筋cDNAライブラリーからdesmuslinの全長cDNAをPCRで増幅しbaitベクターを構築した.さらに結合部位の検討のために全長cDNAの5'側,3'側を増幅したcDNAおよびヒトリンパ球DNAより増幅したdesmuslin遺伝子をベクターに組み込んだ.desmuslinの全長cDNAをbaitとして用い、ヒト筋cDNAライブラリーからdesmuslinに結合する因子をスクリーニングした結果では、α-dystrobrevin-1とdesminをdesmulinに結合する蛋白質として得ることはできたが、新規に結合する因子は現時点では得られていない.また多くの非特異的結合蛋白質が得られ、結合部位を限定したbaitの作製が必要と考えられた.さらにイントロンを含むdesmuslin遺伝子のヒト筋cDNAおよびヒト脳cDNAスクリーニングは現在進行中である.さらに今回desmuslinに対する抗体を作製し、骨格筋細胞における局在を検討した.その結果ヒト骨格筋の細胞膜上と細胞内での染色と、電子顕微鏡でZ帯に沿った存在を確認した.共焦点顕微鏡による観察では、contamereに強い染色性を認め、desmuslinはcostamereや神経筋・筋腱接合部等の筋収縮においてストレスのかかる部位により強く発現しており、筋収縮機構において重要な役割を持つと考えられた.desmuslinは、α-dystrobrevin-1をbaitとして行ったtwo-hybrid法で新規に見いだされた中間径フイラメントタンパク質で、免疫沈降法ではα-dystrobrevin-1とdesminに結合するという特性を持つ。そこで本研究では、desmuslinに結合する因子の探索を行い、desmuslinの機能を解析することで筋細胞膜・筋細胞骨格の構造および筋収縮機構の解明に近づくことを目的としている。まず、Yeast Two Hybrid法を用いて網羅的にdesmuslinに結合する蛋白質の探索を行い、その後、単離された個々の因子について詳細な検討を行う予定である。本年度は、Yeast Two Hybridのbaitベクターを構築するためにヒト筋cDNAライブラリーからdesmuslinの全長cDNAをPCRで増幅し、baitベクターにサブクローニングした.さらに結合部位の検討のために全長cDAの5'側,3'側を増幅したcDNAおよびヒトリンパ球より分離したDNAより増幅したイントロンを含むdesmuslin genomeをbaitベクターにサブクローニングした.上記にて構築したベクターをbaitとして用い、ヒト筋cDNAライブラリーからdesmuslinに結合する蛋白質をYeast Two Hybridの系を用いて網羅的に探索している。現在この系のなかでいくつかのdesmuslinに結合するcDNAが単離され、これらについて塩基配列の決定および既知の遺伝子との相同性の検討を行っている。そこで本研究では、desmuslinに結合する因子の探索を行い、desmuslinの機能を解析することで筋細胞の構造および筋収縮機構の解明に近づくことを目的とし、Yeast Two Hybrid法を用いて網羅的にdesmuslinに結合する蛋白質の探索を行った.ヒト筋cDNAライブラリーからdesmuslinの全長cDNAをPCRで増幅しbaitベクターを構築した.さらに結合部位の検討のために全長cDNAの5'側,3'側を増幅したcDNAおよびヒトリンパ球DNAより増幅したdesmuslin遺伝子をベクターに組み込んだ.desmuslinの全長cDNAをbaitとして用い、ヒト筋cDNAライブラリーからdesmuslinに結合する因子をスクリーニングした結果では、α-dystrobrevin-1とdesminをdesmulinに結合する蛋白質として得ることはできたが、新規に結合する因子は現時点では得られていない.また多くの非特異的結合蛋白質が得られ、結合部位を限定したbaitの作製が必要と考えられた.さらにイントロンを含むdesmuslin遺伝子のヒト筋cDNAおよびヒト脳cDNAスクリーニングは現在進行中である.さらに今回desmuslinに対する抗体を作製し、骨格筋細胞における局在を検討した.その結果ヒト骨格筋の細胞膜上と細胞内での染色と、電子顕微鏡でZ帯に沿った存在を確認した.共焦点顕微鏡による観察では、contamereに強い染色性を認め、desmuslinはcostamereや神経筋・筋腱接合部等の筋収縮においてストレスのかかる部位により強く発現しており、筋収縮機構において重要な役割を持つと考えられた.
耳鳴モデル動物の皮質可視化による聴覚野の皮質過剰補正の検証

サリチル酸を人や動物に過剰投与すると急性の耳鳴を生じることが知られている。サリチル酸の過剰投与により、末梢では、蝸牛電位の低音部と高音部の応答が減少し中音部は変化しないこと、下丘、内側膝状体、聴覚皮質では、高い音圧では神経活動が増大するが低い音圧では無変化で、その閾値も変化しないことが報告された。蛍光色素を用いた光学的測定法により音圧を55, 65, 75, 85 dBSPL、周波数を0.5, 1, 2, 4, 8, 16kHzの24種の純音刺激の時空間パターンからモルモット聴覚皮質の中心野(一次聴覚野とDC野)の周波数バンドの時空間的音圧-周波数特性を測定した。正常では、すべての純音に応じて周波数バンドに沿った活動の伝搬と強い音圧ではその後バンドを超えた活動の伝搬が観察された。サリチル酸を付加して2時間後、0.5, 16kHzの閾値が上昇した。特に、閾値が高い動物では顕著に低周波と高周波の閾値が高くなる傾向があった。低音圧の下行FM音(16kHzから0.5kHz)を用いると正常な場合は一次聴覚領とDC野の高周波数バンドが隣接しているので活動スポットが中心に表示された。サリチル酸付加後2時間では、高周波数の閾値が高くなり活動スポットの出現位置が低周波バンド側にずれた。同様に上行FM音(0.5kHzから16kHz)では、低周波数の閾値が高くなり高周波数バンド方向にずれた。これらFM音刺激を用いると24点測定する場合より短時間で周波数バンドの閾値情報が測定可能になった。正常な場合は、音圧を変えても下行FM音の活動スポットは中心部に出現するが、サリチル酸付加後2時間では、45dBSPLで中心より低周波側に出現し、6ー8時間後には45dBSPLでは出現せず、55dBSPLで低周波数側に出現した。前年度の耳鳴動物モデルでの繰り返し音応答の左右聴覚領の機能差の消失を報告した。今年度は耳鳴動物モデルでの周波数バンドを横断するFM音の左右特性差に対する影響を検討した。以前の研究で、光学的測定を用いて左右の聴覚野のFM応答特性を測定し、FM応答変調速度特性も左右差が存在することを報告した。サリチル酸過剰付加後、左右聴覚領のFM音変調速度特性の変化を調べた。上行FM音刺激では、サリチル酸付加後8時間、音圧85dBSPLの条件では、活動スポットが高周波数側にずれる現象が正常の場合と同じように観察された。しかし、FM変調速度特性の左右皮質差は観察されず同じような特性曲線を観測した。一方、下行FM音刺激の場合、正常では中心部に活動スポットが出現し、左右の低周波数側に活動の移動が観察される。サリチル酸付加後8時間では、高音圧条件では、正常と同じであるが、低音圧にすると活動スポットが左右の低周波数側に出現することが観察された。さっそく、時空間音圧ー周波数特性を測定してみると、サリチル酸を付加後、2時間で、高音領域で閾値の上昇が観察された。この結果は、聴覚皮質でも高音領域の閾値が高くなり、蝸牛での現象を反映しているものと考えられる。耳鳴りの周波数である中音域はサリチル酸で障害されないので、聴覚皮質の補正が一律と仮定すると、中音域で過剰な補正回路が働いている可能性を示唆される。前年度の耳鳴動物で聴覚皮質の空間音圧周波数特性を測定した結果、聴覚皮質でも高周波数と低周波数バンドの閾値が高くなり、耳鳴りの周波数である中音域は、サリチル酸で障害されないことがわかった。聴覚皮質の補正が一律ならば、中音域で過剰な補正回路が働いている可能性が示唆される。周波数バンド内の補正回路は、表層と深層の活動の特性に反映されるものと推察される。サリチル酸付加後の高音、中音、低音バンドでの皮質内の神経回路特性変化を明らかにするため、多電極法により、周波数バンド内の表層と深層の耳鳴発生過程に伴う活動変化を記録する。多電極による耳鳴モデル動物の周波数バンド特性の測定:耳鳴周波数とその周辺の周波数バンドに多電極を挿入し、耳鳴動物の表層での活動と深層での活動変化を測定し、応答の相関係数の変化を調べる。多電極による耳鳴モデル動物のFM特性の測定:FM開始、中間、終止の周波数バンドに多電極を挿入し、耳鳴モデル動物の表層と深層でのFM音に対する活動変化を測定する。以上により耳鳴の皮質過剰補正説を検証し、サリチル酸による耳鳴モデル動物の聴覚皮質過剰補正の周波数バンドでの差異を検証する。サリチル酸の過剰投与により、末梢では、蝸牛電位の低音部と高音部が減少し、中音部は変化しなかった。下丘、内側膝状体、聴覚皮質の細胞外記録による研究では、高い音圧では神経活動が増大するが、低い音圧では無変化で、その閾値も変化しなかった。直接聴覚皮質や扁桃体にサリチル酸を付加すると細胞外電位のみ大きくなり、閾値は変化しないことや皮質の顆粒層への電流の流入が増加することが報告された。

特に、聴覚皮質では、耳鳴音の周波数に対応した特徴周波数を持ったニューロンの神経活動が上昇すること、また他の特徴周波数を持ったニューロンも耳鳴の周波数に同調するように変化することが報告された。我々は、最近非侵襲的に皮質の神経活動を時空間的に測定できる光学的測定法を用いてモルモットでの周波数バンド内の活動や繰り返し音特性を調べた。左聴覚領の広さが、右聴覚領より大きいこと、繰り返し音特性が左右聴覚領で異なることを報告した。本研究では、サリチル酸過剰投与下で繰返し音応答特性がどのような時間経過で変化するかを調べた。サリチル酸付加前は、第一ピークと第二ピークの高さの比による繰返し音特性は、右脳がcut-off周波数8Hzの鋭いベル型特性を示した。しかし、サリチル酸付加後2-3時間では、左脳の特性が改善し、逆に右脳は低下して、9時間後には、左右ともにバンドパス型の特性に変化した。さらに左右聴覚領の広さを比較すると9時間後には同じ大きさになっていた。この結果は、周波数バンド内での左右聴覚野の情報処理を考察する上で非常に興味深い。今後左右聴覚領の周波数バンド内の情報処理の違いを統計的に調べていきたい。サリチル酸過剰付加による機能的変化として、皮質の自発放電の上昇と耳鳴の発生が実験動物で報告されている。しかし、皮質の機能的な変化についてはよくわかっていない。光学的測定法により、聴覚皮質中心聴覚領(一次聴覚野とDC野)の周波数バンド間距離が左脳の方が右脳より大きこと、繰返し音応答特性の右脳優位であることをすでに報告した。本年度は、繰返し純音(8kHz)の応答特性が耳鳴発生に伴いどのように変化するか、2ー3時間後、5ー6時間後、8時間以降で左右の皮質で調べた。その結果、5-6時間後までは、特性の左右差は保たれているが、8時間以降では同じ特性になることが分かった。また、その時の周波数バンド距離を調べると左右差は減少し、同じになることも分かった。耳鳴が生じることと左右の機能差の消失との関連は、耳鳴の発生機序を考える上で非常に興味深い。サリチル酸を人や動物に過剰投与すると急性の耳鳴を生じることが知られている。サリチル酸の過剰投与により、末梢では、蝸牛電位の低音部と高音部の応答が減少し中音部は変化しないこと、下丘、内側膝状体、聴覚皮質では、高い音圧では神経活動が増大するが低い音圧では無変化で、その閾値も変化しないことが報告された。蛍光色素を用いた光学的測定法により音圧を55, 65, 75, 85 dBSPL、周波数を0.5, 1, 2, 4, 8, 16kHzの24種の純音刺激の時空間パターンからモルモット聴覚皮質の中心野(一次聴覚野とDC野)の周波数バンドの時空間的音圧-周波数特性を測定した。正常では、すべての純音に応じて周波数バンドに沿った活動の伝搬と強い音圧ではその後バンドを超えた活動の伝搬が観察された。サリチル酸を付加して2時間後、0.5, 16kHzの閾値が上昇した。特に、閾値が高い動物では顕著に低周波と高周波の閾値が高くなる傾向があった。低音圧の下行FM音(16kHzから0.5kHz)を用いると正常な場合は一次聴覚領とDC野の高周波数バンドが隣接しているので活動スポットが中心に表示された。サリチル酸付加後2時間では、高周波数の閾値が高くなり活動スポットの出現位置が低周波バンド側にずれた。同様に上行FM音(0.5kHzから16kHz)では、低周波数の閾値が高くなり高周波数バンド方向にずれた。これらFM音刺激を用いると24点測定する場合より短時間で周波数バンドの閾値情報が測定可能になった。
革新的分離培養技術で解明する硝化細菌の生理生態と多様性

課題1.亜硝酸酸化細菌Nitrotogaのゲノム情報に基づいた増殖活性因子の探索昨年度までに,アマモ場群落の海水サンプルから亜硝酸酸化細菌Nitrotoga sp. AM1純菌株を獲得し,ゲノム解析から得られた遺伝子情報に基づき,代謝経路を予測した。本年度は,AM1株の代謝経路から,細胞の増殖活性を促す可能性を持つ有機物を推定し,その有機物が細胞に与える影響を評価した。有機物の選定にあたり,クエン酸回路など基本的な生化学反応経路の中間代謝物を候補とした。AM1株の増殖活性を促す物質として,ピルビン酸が有力な候補として挙げられた。ピルビン酸は,亜硝酸酸化の過程で発生する過酸化水素を分解するポテンシャルを持ち,一方で炭素源・エネルギー源として利用できる可能性も合わせ持っていることから,AM1株の増殖活性を促していることが示唆された。課題2.茶畑の土壌サンプルを対象とした亜硝酸酸化細菌の分離培養昨年度までに,茶畑の土壌サンプルから亜硝酸酸化細菌Nitrobacter vulgaris NbAS純菌株を獲得し,亜硝酸酸化細菌Nitrospiraを集積することに成功した。本年度は,獲得したNbAS株を対象にゲノム解析を実施した。すでに公開されているNitrobacterのゲノム情報と比較したところ,NbAS株は脱窒反応関連遺伝子を複数保持しており,特に亜酸化窒素還元酵素をコードする遺伝子nosZを保持していたのは,NbAS株のみであった。nosZ遺伝子に基づいた系統解析により,Bradyrhizobium属,Rhodopseudomonas属などのAlphaproteobacteria綱の細菌と近縁であることがわかった。今後,実際に亜酸化窒素を還元する機能を持っているかどうか検証していく予定である。硝化細菌は環境中のアンモニアを亜硝酸,硝酸へと変換する硝化反応を担っている。近年,メタゲノム等の遺伝子解析により,環境中には系統学的に新規な硝化細菌が豊富に存在している可能性が示唆されている。しかしながら,実験室での分離培養が難しく,古典的な培養手法への依存が純菌株の獲得を制限している。そこで本研究では,工学的なアプローチに基づいた分離培養手法を用いて,各種環境サンプルから新規な硝化細菌を獲得し,性状解析を行うことを目的とした。本年度は,硝化反応が活発なフィールド(アマモ場群落の海水,茶畑の酸性土壌)からサンプルを採取し,新規な亜硝酸酸化細菌を標的とした集積・分離培養を行った。具体的な実施内容は以下の通りである。1.アマモ場群落の海水サンプルを対象に,バイオリアクターによる連続培養とフラスコによる回分培養を組み合わせ,Nitrotoga属に属する亜硝酸酸化細菌を集積培養した。Nitrotogaは低温性の亜硝酸酸化細菌として知られており,様々な環境中にクローンレベルで検出されているが,集積株,純菌株は非常に少なく,その生理生態について詳細は明らかになっていない。そこで,本研究で得られたNitrotoga集積株の生理学的な性質を明らかにした。2.茶畑の土壌サンプルを対象に,バイオリアクターを用いて,土壌に棲息する亜硝酸酸化細菌の集積化を図った。培養中,定期的にFISH法および次世代シークエンサーによる微生物叢解析を実施した。その結果,集積サンプル中には複数種の亜硝酸酸化細菌が共存し,生態学的なニッチを形成していることが明らかになった。FISHで検出された亜硝酸酸化細菌については,セルソーターを用いて分取・培養を試みたところ,Nitrobacter属に属する純菌株を獲得することに成功した。アマモ場群落の海水サンプルについては,バイオリアクターによる連続培養とフラスコを用いた回分培養を繰り返したことで,Nitrotoga属に属する新規な亜硝酸酸化細菌Nitrotoga sp. AM1の集積株を獲得することに成功した。集積されたAM1株は,16°Cで最も高い亜硝酸酸化活性を示し,従来知られている亜硝酸酸化細菌の中でも比較的低温域で機能していることが明らかになった。AM1株の倍加時間はおよそ54時間であった。また,アンモニア濃度による感受性を調べたところ,30mM以下のアンモニアでは,亜硝酸酸化活性が向上したことから,AM1株は窒素源としてアンモニアを取り込む可能性が示唆された。また,0.5%以上の塩濃度に対して増殖阻害が確認されたため,AM1株は海洋性ではなく陸域から流れ込んできたものと考えられる。一方,茶畑の土壌サンプルについては,バイオリアクターを用いて土壌に棲息する亜硝酸酸化細菌の集積化を図った。その結果,集積サンプル中には複数種の亜硝酸酸化細菌が優占していることが明らかになった。pHの変化に伴い,優占する亜硝酸酸化細菌の種類も変動することを見出した。続いて,集積サンプルを対象にセルソーターで亜硝酸酸化細菌が形成するマイクロコロニーを分取した。一定の培養期間を経て,増殖が確認されたウェルについてシークエンスを同定したところ, Nitrobacter vulgarisに近縁な株を獲得することに成功した。課題1.アマモ場群落の海水サンプルから集積された亜硝酸酸化細菌Nitrotogaの純化とゲノム解析昨年度までに,アマモ場群落の海水サンプルから亜硝酸酸化細菌Nitrotogaを集積し,生理学的な特徴づけを行った。本年度は,集積株に共存する従属栄養細菌を除去するための方法論を構築し,純菌株を獲得した。

具体的には,セルソーターを用いてNitrotogaの細胞を含む凝集体を分取し,複数種の抗生物質を用いて従属栄養細菌の増殖を抑制させた。また,Nitrotogaの増殖を促すために,アンモニアとピルビン酸を培地に添加したところ,亜硝酸酸化活性の上昇を確認することができた。一方,Nitrotogaの集積株からDNAを抽出し,シークエンス解析により得られたリード情報に基づいて,ゲノムを再構築した。ドラフトゲノム中のタンパク質コード領域の同定とアノテーション作業を経て,保有している遺伝子情報に基づいて,代謝経路を予測した。課題2.茶畑の土壌サンプルを対象とした亜硝酸酸化細菌の分離培養昨年度までに,茶畑の土壌サンプルを対象に,バイオリアクターを用いて土壌に棲息する亜硝酸酸化細菌を集積した。集積サンプルから亜硝酸酸化細菌の獲得を試みたところ,Nitrobacter属に属する純菌株を獲得することに成功した。本年度は,バイオリアクター内のpHを厳密に制御し,亜硝酸酸化細菌の群集構造がどのような変遷を辿るか追跡し,耐酸性亜硝酸酸化細菌Nitrospiraの集積化を目指した。亜硝酸を連続的に供給することが可能なバイオリアクターをpH5.56の範囲で運転したところ,Lineage IIに属する多様なNitrospiraが集積されることを見いだした。FISH法による顕微鏡観察を行ったところ,マイクロコロニーを形成するNitrospiraの細胞が多数観察された。課題1.アマモ場群落の海水サンプルから集積された亜硝酸酸化細菌Nitrotogaの純化とゲノム解析研究計画に沿って,Nitrotogaの純化とゲノム構築を行うことができた。特に増殖速度の遅いNitrotogaはこれまで純菌株を獲得できた報告例がないことから,今後の研究を発展させる上で重要な成果である。課題2.茶畑の土壌サンプルを対象とした亜硝酸酸化細菌の分離培養研究計画に沿って,耐酸性Nitrospiraの集積化を行うことができた。当初予想していたよりも,系統学的に多様なNitrospiraが棲息していることが明らかになり,実際の土壌において亜硝酸酸化に深く関わっていることが示唆された。課題1.亜硝酸酸化細菌Nitrotogaのゲノム情報に基づいた増殖活性因子の探索昨年度までに,アマモ場群落の海水サンプルから亜硝酸酸化細菌Nitrotoga sp. AM1純菌株を獲得し,ゲノム解析から得られた遺伝子情報に基づき,代謝経路を予測した。本年度は,AM1株の代謝経路から,細胞の増殖活性を促す可能性を持つ有機物を推定し,その有機物が細胞に与える影響を評価した。有機物の選定にあたり,クエン酸回路など基本的な生化学反応経路の中間代謝物を候補とした。AM1株の増殖活性を促す物質として,ピルビン酸が有力な候補として挙げられた。ピルビン酸は,亜硝酸酸化の過程で発生する過酸化水素を分解するポテンシャルを持ち,一方で炭素源・エネルギー源として利用できる可能性も合わせ持っていることから,AM1株の増殖活性を促していることが示唆された。課題2.茶
多機能搭載型電子版ディケンズレキシコン作成とその活用研究

本研究は、山本忠雄博士(1904-91)(元広島大学)がその著Growth and System of the Language of Dickens: An Introduction to A Dickens Lexicon (1946年東京大学より文学博士の学位を授与、1950年に出版され、1953年学士院賞受賞、2003年第3版の改訂版(溪水社)刊行)において構想したDickens Lexiconを、コンピュータ技術を駆使して様々な機能を搭載し、Dickensの言語文体研究のみならず18世紀、19世紀の英国小説の言語文体研究に寄与することを目的とした、プロジェクトである。平成20年度のプロジェクトを進めるに際し、第1回目の打ち合わせを7月5日に行い、現在の進捗状況の報告、定義項目充実に伴う諸問題の検討、研究発表会の実施日程等を話し合った。Dickensの長編15作品2作品の定義入力、及びDickensの全作品の電子テクスト化とタグ付けを終了した。英国のSheffieldで、8月7日に開催された国際文体論学会(PALA)で、The Dickens Lexicon Project: A Preliminary Reportという題で本プロジェクトの発表を行った。論文として、広島大学英語研究会の機関誌ERA Vol. 25, Nos. 1&2にThe Dickens Lexicon Projectとして掲載された。第2回目の打合せを平成21年1月28日に行い平成20年度の進捗状況と平成21年度の研究計画を話し合った。平成21年度は、次の(1)(4)の仕事を遂行した(一部は現在も継続中)。研究代表者の堀と研究協力者の西尾美由紀を中心に、山本忠雄のイディオムの定義と一般的な定義の違いを明確にし、Dickensにおけるイディオムの特徴を明らかにすることができた。その成果はSHELL2009で発表した。その際海外の研究者からこのような大量の用例に基づくイディオム研究はこれまでなかったというコメントをいただいた。(2)定義項目の入力長編15作品のうち定義入力がされていない作品のうち2作品を終了させた。今後も継続していく。今林は定義入力が終了した作品の定義入力の問題点を点検した。(3)Lexiconの言語研究への利用法Lexiconの利用法の一つとしてイディオムの通時的研究への貢献を明らかにした。その成果については、SHELL2009と大阪大谷大学での招待講演において堀が発表した。2010年には利用法についてさらに発展させて、PALA2010(7月開催)において発表予定である。(4)電子テクストへのタグ付けの確認と多機能搭載の改良田畑を中心にほぼ電子テクスト化は終了しタグ付けの適正を確認。さらにどのような多機能搭載がさらに可能であるかを検討した。具体的には、インターネット上での公開においてどのサーチエンジンが最適か、他種類の検索機能やアクセスのしやすさ、また18世紀や191世紀の小説を検索する際の表示の仕方等を改良した。(1)Dickensの言語文体研究のみならず18世紀、19世紀の英国小説の言語文体研究に寄与することを目的として、18、19世紀を代表する作家の主要作品の電子テクストを完成。機能としては、単純な語句検索だけでなく、コンコーダンス作成機能を搭載し、Dickensの作品だけでなく他の18世紀や19世紀の作家の言語使用も調査研究できるように配慮した。(3)以下の国際学会で発表を行った。
gammaーインターフェロン遺伝子導入により増強されたキラーT細胞の抗腫瘍効果の解析

1.キラーT細胞の形質の変化マウスgammaーインターフェロン遺伝子を導入することにより細胞にいかなる変化が惹起されるかを細胞表面形質の面から検索した。その結果、Thyー1抗原、Lytー1、2、抗原並びにasialoーGM_1抗原量に変化はなくClassIMHC抗原量にも変化はなかったがClassIIMHC抗原量は著明に増加していた。この現象はキラーT細胞の標的細胞であるglioma細胞がgammaーインターフェロンによりClassIMHCが著しく増量するのと対照的であった。2.gammaーインターフェロン遺伝子導入キラーT細胞のin vivoでの抗腫瘍効果上記キラーT細胞はwinn typeの抗腫瘍効果が親株に比較して著しく強まっていることが明らかになった。又gliomaを皮下移植し、5日及び8日後に上記キラーT細胞を静脈内に移入した場合にも腫瘤の形成がほとんどのマウスにおいて阻止された。この様にキラーT細胞を移入されたマウスでは血中gammaーインターフェロン活性がかなり長期間維持された。3.ヒトgliomaに対するキラー細胞ヒトglioma培養細胞株を樹立し、同一の患者末梢血からリンパ球を種々の方法で活性化してその性質を検索すると、gammaーインターフェロン処理によりClassIHLA抗原を増加させたglioma細胞に対して腫瘍抗原特異的なキラーT細胞はそのキラー活性を著しく高めるが、それとは対照的にnatural killer typeのLAK細胞に上記glioma細胞に対するキラー活性を減弱させた。このことはgammaーインターフェロンとキラーT細胞の組合わせは治療法として有効であるが、gammaーインターフェロンとLAK細胞の組合わせにし疑問があることを示唆している。
昆虫内部共生の成立に関わる共生細菌の遺伝的基盤

我々は昆虫にみられる宿主-細菌間相互作用の分子機構の総合的理解を目指し、昆虫では例外的に共生細菌の培養と遺伝子組み換えが可能なホソヘリカメムシ-Burkholderia共生系を対象に研究を行っている。本研究の全体構想は以下のようになる:1培養時と共生時における共生細菌の遺伝子発現比較により共生時に特異的に発現する遺伝子を同定;2共生時に特異的に発現亢進する遺伝子の欠損株を作成し機能解析を行う;3得られた知見を統合し、内部共生の遺伝的基盤を網羅的に解明する。最終年度である本年度は、昨年度までに得られた培養時(in vitro)と共生時(in vivo)における共生細菌の細胞学的比較、運動性比較、生理学的比較、抗生物質等への耐性比較、遺伝子発現比較に関するデータについて取りまとめ、(1)共生細菌はカメムシ腸内において宿主免疫系による生育阻害(生育調節)を受けている可能性があること、(2)共生細菌の機能としては宿主の代謝老廃物のリサイクリングである可能性が高いことを明らかにした。ほとんどの昆虫共生細菌は宿主体外での培養が困難であることから、in vitroおよびin vivo細菌細胞の比較は一般的に不可能だと考えられてきた。しかし今回、培養が容易なホソヘリカメムシのBurkholderia共生細菌を用いることでin vitro細胞とin vivo細胞の総合的比較が可能となり、これら共生細菌がどのような代謝変化によって昆虫の体内環境に適応しているのかが初めて詳細に解明することに成功した。本成果は原著論文としてまとめられ、国際一流誌に掲載される運びとなった。In vivoで特異的に高発現している遺伝子の機能解析にはさらなる研究進展と情報蓄積が必要であると考えられる。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。具体的には、ゲノムが解読されているいくつかのBurkholderia共生細菌株について培養時と共生時のトランスクリプトーム比較を行い、共生時に発現亢進する遺伝子を特定し、高精度に共生関連遺伝子の取得を行うことを目的とする。本年度は、培養時と共生時における共生細菌の遺伝子発現比較により共生時に特異的に発現する遺伝子の同定を試み、概ね成功することができた。その結果、Burkholderia共生細菌は、(1)共生時特異的にタウリンなどの含硫有機物の代謝が大幅に亢進すること、(2)新規ABCトランスポーターなど輸送系の遺伝子が発現亢進すること、(3)鞭毛などの運動生に関わる遺伝子の発現は大きく低下すること、などが明らかとなった。試験結果についてさらに精査する必要があるが、カメムシとの共生におけるBurkholderiaの性状変化やその機能にも迫る成果を得ることができた。これらの遺伝子は次年度以降遺伝子欠損株を作成する際の候補になると考えられる。本研究による成果を国内外の学会で発表し、国際誌への投稿も行った。共生細菌のトランスクリプトームについてはさらなる精査が必要だが、本年度は共生関連遺伝子の同定に向けていくつかの候補遺伝子も発見することができ、十分な結果を得ることができた。学会発表や論文発表も積極的に進めており、概ね順調に進展していると言える。本年度は、培養時と共生時における共生細菌の遺伝子発現比較により共生時に特異的に発現する遺伝子の同定について、トランスクリプトーム解析の結果を精査するとともに、培養時の細胞と共生時の細胞について形態・生理・ストレス耐性等を広範に比較し、カメムシへの共生による変化を総合的に評価した。その結果、共生時においてポリエステル合成酵素の亢進や膜透過性の増大、窒素・硫黄代謝の亢進、酸化ストレスへの抵抗性増加などが特徴的に見られることが明らかとなった。窒素化合物や硫黄代謝の活性化は、宿主の窒素・硫黄老廃物のリサイクルに関与している可能性が考えられる。この点を検証するために、これら代謝系の遺伝子の中から共生時に特に発現亢進する遺伝子を抽出し、遺伝子欠損株の作成およびカメムシへの感染実験を行なった。これら遺伝子変異株をカメムシに感染させたところ、野生株同様に共生器官に安定的に定着することが明らかとなった。これらの結果は、窒素老廃物や硫黄老廃物の代謝機能は少なくともカメムシ共生器官への感染・定着には必須ではないことを示している。今年度の研究において酸化ストレスへの耐性能などさらなる共生関連遺伝子候補も見つかっていることから、次年度以降はそれら遺伝子の機能について調査を進める。

共生細菌のトランスクリプトームについてはさらなる精査が必要だが、本年度は共生関連遺伝子の同定に向けていくつかの候補遺伝子を発見し、遺伝子組み換え等により検証実験を行い、当初の計画通り十分な成果を得ることができた。学会発表や論文発表も積極的に進めており、概ね順調に進展していると言える。我々は昆虫にみられる宿主-細菌間相互作用の分子機構の総合的理解を目指し、昆虫では例外的に共生細菌の培養と遺伝子組み換えが可能なホソヘリカメムシ-Burkholderia共生系を対象に研究を行っている。本研究の全体構想は以下のようになる:1培養時と共生時における共生細菌の遺伝子発現比較により共生時に特異的に発現する遺伝子を同定;2共生時に特異的に発現亢進する遺伝子の欠損株を作成し機能解析を行う;3得られた知見を統合し、内部共生の遺伝的基盤を網羅的に解明する。最終年度である本年度は、昨年度までに得られた培養時(in vitro)と共生時(in vivo)における共生細菌の細胞学的比較、運動性比較、生理学的比較、抗生物質等への耐性比較、遺伝子発現比較に関するデータについて取りまとめ、(1)共生細菌はカメムシ腸内において宿主免疫系による生育阻害(生育調節)を受けている可能性があること、(2)共生細菌の機能としては宿主の代謝老廃物のリサイクリングである可能性が高いことを明らかにした。ほとんどの昆虫共生細菌は宿主体外での培養が困難であることから、in vitroおよびin vivo細菌細胞の比較は一般的に不可能だと考えられてきた。しかし今回、培養が容易なホソヘリカメムシのBurkholderia共生細菌を用いることでin vitro細胞とin vivo細胞の総合的比較が可能となり、これら共生細菌がどのような代謝変化によって昆虫の体内環境に適応しているのかが初めて詳細に解明することに成功した。本成果は原著論文としてまとめられ、国際一流誌に掲載される運びとなった。In vivoで特異的に高発現している遺伝子の機能解析にはさらなる研究進展と情報蓄積が必要であると考えられる。計画2年目は、本年度に行ったBurkholderia共生細菌RPE64株のトランスクリプトーム解析結果について、遺伝子ネットワーク解析やヒートマップ解析により精査し、培養時および共生時に特異的に働く遺伝子を明らかにする。また、トランスクリプトーム解析の結果を共生細菌の生理状態と結びつけ解釈するために、培養時および共生時のBurkholderia共生細菌における形態や生理活性、種々のストレス耐性(浸透圧、温度、pH、界面活性剤、抗生物質など)について比較調査を行う。培養条件については、前年度に引き続き共生細菌の培養に通常用いているYG培地(酵母抽出物とグルコースを含む)に加え、最小培地を用いる。細胞採取時期については、対数増殖期と定常期の2点についてその性状解析を行う。共生状態にあるBurkholderia共生細菌については、共生細菌が安定的に定着した3齢から5齢個体の盲嚢を解析対象とし、摘出盲嚢を破砕後に微細フィルターにかけ、菌体のみを取得しその形態や性状を解析する。