hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発酵生産菌リジン生合成経路の初発酵素アスパラギン酸キナーゼの活性調節機構の解析

グルタミン酸およびリジン発酵で知られるCorynebacterium glutamicumのリジン生合成量の調節を主に担っている酵素アスパラギン酸キナーゼ(CgAK)の活性調節サブユニットおよび全体構造の結晶構造決定を行った。CgAKのリジン、スレオニンによるアロステリック調節機構の概要を明らかになり、スクリーニングにより新たな調節解除変異酵素の作製に成功した。Corynebacterium glutatamicum由来のアスパラギン酸キナーゼの活性調節サブユニットの組み換えタンパク質の大量発現系、精製法を確立し、結晶化に成功し、1.58Å分解能でめ結晶構造の決定を行うた。結晶構造中には阻害剤であるスレオニンが存在しており、詳細な結合様式を解明することができた。このスレオニン結合部位は、リジンの工業生産に用いられているAEC(2-アミノエチルシステイン)耐性変異株の持つ変異部位に近接していることから、AEC耐性変異体は、実はリジン耐性変異体ではなくスレオニン耐性変異体であることを示すことができた。また、活性調節サブユニットがスレオニン非存在下では単量体として存在するのに対し、スレオニン添加により二量体を形成することを明らかにし、活性調節サブユニットの複合体形成が活性調節への1つのステップであるという、ユニークな酵素活性調節機構を示すことができた。また、高度好熱菌Thermus Thermophilus由来のアスパラギン酸キナーゼの活性調節サブユニットの結晶構造を、スレオニン存在下,非存在下で決定することにも成功した。この構造から、スレオニンによる構造変化と活性調節機構の一部が明らかとなり、またC.glutamicumの活性調節サブユニットとの比較から、疎水性相互作用がタンパク質の耐熱性に重要であることを明らかにすることができた。Corynebacteriumglutamicum由来のアスパラギン酸キナーゼ(AK)のα_2β_2サブユニットからなるヘテロ複合体の調製法を確立し、結晶化に成功した。昨年度我々が決定したβサブユニットの構造および報告されているMethanococcus jannaschii由来アスパラギン酸キナーゼの触媒ドメインの構造を用いた分子置換法により、2.4A分解能のAK/Lys, Thr複合体の立体構造を決定することに成功した。スレオニンがAKに存在する予想される4つのサイトすべてに結合しているのに対し、リジンは4つの予想サイトのうち2か所に結合していた。リジン結合サイトの部位特異的変異体の解析の結果、4つのサイトはアミノ酸配列上等価であるにも関わらず、実際にリジンが結合していたサイトのみが調節に関与するという興味深い知見を得た。また、この複合体は活性中心を構成するアミノ酸残基が触媒に適した位置にないことから、リジン、スレオニンによるシグナルが活性中心構造を不活性型に変化させるという、アロステリックモデルを証明することができた。触媒ドメイン内にランダム変異を導入し、AEC(2-アミノエチルシステイン)耐性(フィードバック阻害耐性)変異体をスクリーニングにより取得した結果、触媒ドメインと活性調節ドメインの接触面に存在するアミノ酸残基がリジン/スレオニンによるシグナルを活性中心へと伝達する役割を担っていることを示すことができた。
ミトコンドリア脱共役蛋白の神経系における機能解析とアルツハイマー病との関連

最近,脱共役蛋白(Uncoupling Protein : UCP)は新たなエネルギー代謝関連蛋白として,肥満・糖尿病・筋肉における熱産生などの多くの分野において注目されている.UCP1および2の遺伝子変異が高度の肥満と糖尿病を引き起こすことが報告されている.本研究では,UPC4およびBrain Mitochondrial Carrier Protein1(BMCP1あるいはUPC5)が,mRNAレベルでほぼ全脳において高い発現があることを確認した.また,これらの分子の遺伝子多型に基づく脳内でのエネルギー代謝の変化が,アルツハイマー病発症の危険因子あるいは防御因子となる可能性があると仮説を立て,これら二つの分子の遺伝多型のスクリーニングを行った.その結果,アルツハイマー病群(80例)とコントロール群(30例)においてBMCP1(9個のエクソン)およびUPC4(8個のエクソン)のcordingregionにはアミノ酸置換を伴う遺伝子多型は見出されなかった.また,エクソン近傍のスプライシングや転写に影響を与える部位にも遺伝子多型はなかった.両蛋白は,高度に保存された蛋白質であると考えられた.代表的なUCPであるUPC2のプロモーター領域の多型が,糖尿病発症の危険因子であることが報告されており,UCPの発現量が疾患に結びつくことが判明した、今後,脳内で高発現しているBMCP1およびUPC4においても,発現に影響を与えるプロモーター領域の多型がないかどうか検索したり,実験的にBMCP1およびUPC4の発現量を変化させた際の細胞内代謝の変化,特にアミロイドベータ蛋白やタウ蛋白に関連した細胞内代謝の変化を検討する必要があると考えられる.脱共役蛋白(Uncoupling Protein:UCP)はATPの合成を伴うことなしにプロトンの勾配を解消(脱共役)し,その結果,脂肪酸など基質の酸化を著しく亢進させエネルギー産生反応をつかさどる.UPC4およびBrain Mitochondrial Carrier Protein1(BMCP1あるいはUPC5)が,脳において高い発現がある.これら二つの分子の中枢神経系での詳細な働きはまだ明らかになっていないが,中枢神経系におけるミトコンドリアエネルギー代謝の消費調節系の維持に重要であることが予想されている.UPC4およびBMCP1という中枢神経系における新たなエネルギー代謝関連因子の発現・機能を解析する事は重要な課題と考えられる.今回UPC4およびBMCP1の中枢神経系における機能の解析や遺伝子多型の検討を行った.ヒト剖検脳からtotal RNAを抽出しRT-PCR法で両者が脳で発現していることを確認した.両者のcDNAと公開されたヒトゲノム配列とのホモロジー解析によりエクソンを決定し,各エクソンをはさむPCR用のイントロンプライマーを設計した.BMCP1の全てのエクソンについてPCR-SSCP法を用いて多型のスクリーニングを行った.アルツハイマー病(AD)患者63人(早発型25人,晩発型38人)とコントロール30人を検討対象とした.BMCP1の全てのエクソンにおいて,多型の存在を示唆する結果は得られなかった.BMCP1は高度に保存されている遺伝子であることが予想された.UPC4は現在解析中であるが,一つのエクソンにsilent polymorphismがあることが判明した.このgenotypeがADと関連があるかどうか検討を開始している.最近,脱共役蛋白(Uncoupling Protein : UCP)は新たなエネルギー代謝関連蛋白として,肥満・糖尿病・筋肉における熱産生などの多くの分野において注目されている.UCP1および2の遺伝子変異が高度の肥満と糖尿病を引き起こすことが報告されている.本研究では,UPC4およびBrain Mitochondrial Carrier Protein1(BMCP1あるいはUPC5)が,mRNAレベルでほぼ全脳において高い発現があることを確認した.また,これらの分子の遺伝子多型に基づく脳内でのエネルギー代謝の変化が,アルツハイマー病発症の危険因子あるいは防御因子となる可能性があると仮説を立て,これら二つの分子の遺伝多型のスクリーニングを行った.その結果,アルツハイマー病群(80例)とコントロール群(30例)においてBMCP1(9個のエクソン)およびUPC4(8個のエクソン)のcordingregionにはアミノ酸置換を伴う遺伝子多型は見出されなかった.また,エクソン近傍のスプライシングや転写に影響を与える部位にも遺伝子多型はなかった.両蛋白は,高度に保存された蛋白質であると考えられた.代表的なUCPであるUPC2のプロモーター領域の多型が,糖尿病発症の危険因子であることが報告されており,UCPの発現量が疾患に結びつくことが判明した、今後,脳内で高発現しているBMCP1およびUPC4においても,発現に影響を与えるプロモーター領域の多型がないかどうか検索したり,実験的にBMCP1およびUPC4の発現量を変化させた際の細胞内代謝の変化,特にアミロイドベータ蛋白やタウ蛋白に関連した細胞内代謝の変化を検討する必要があると考えられる.
会社債権者による会社管理と会社債権者の保護

第1に、会社の資金調達の決定における重要性の点では、社債と資金借入との間に大きな相違はない。第2に、違法な募集株式の発行等においては、これが有効であることを前提としつつ、財源規制により会社債権者を保護し、株式の返還により既存株主を保護することが可能である。第3に、融資契約の確約条項は、会社経営に一定の制限を加えうるが、一定の確約条項が有効であるために、定款の定めが必要である。第1に、会社債権者の保護については、従来の商法の規整と2005年新会社法の規整との間で、大きな相違は認められない。ただし、株式交換・株式移転において、あらたに、新株予約権付社債についての社債の承継が認められ、また、対価として完全親会社となる会社の株式以外のものが認められ、これらの場合に、債権者保護手続が必要とされることになった(会社法789条1項3号・799条1項3号・810条1項3号)。しかし、この相違は、債権者保護が必要とされる基準が変更されたことによるのではなく、たんに、組織再編行為の具体的な方法が増加したことに伴うものであると考えられる。第2に、社債については、新会社法によって、その発行の機動性が増し(会社法362条4項5号・676条参照)、また、社債管理者が責任を負う場合が拡大された(会社法710条)。このうち後者の責任の拡大の1つとして、社債管理者は、これと特別の関係のある者との間で行為をした一定の場合にも責任を負うとされた(会社法710条2項2号)。ここで、とくに社債管理者が銀行等(会社法703条)であることを考慮すると、特別の関係のある者の範囲(会社法施行規則171条)の妥当性が問題となりうるようにも思われる。第3に、取締役の対第三者責任については、規定の変更はなく(商法266条ノ3第1項、会社法429条1項)、そのため、会社取締役の会社債権者に対する直接の責任の検討をするにあたっては、従来の判例・学説を分析対象とすることが可能である。取締役の対第三者責任については、会社債権者の保護とともに、会社債権者の会社管理やその理論的背景に応用しうるようにも考えられる。第1に、会社法においては、会社債権者が会社情報を得る方法として、会社の登記や会社の公告(商業登記法10条1項等、会社法440条1項・2項)を利用する方法のほかに、定款、各種議事録、各種名簿、計算書類等の閲覧請求権等(会社法31条2項・318条4項等・125条2項等・442条3項)が用意されている。しかし、このような閲覧請求権等によって、会社債権者が必要な情報を充分には得られるとは限らないように考えられる。第2に、会社債権者のこのような閲覧請求権等が争われた裁判例は、裁判例掲載誌を調べた限りでは、1981年改正前商法282条2項の計算書類等の閲覧請求権にかかるものが見受けられるが(なお、その争いは1981年商法改正により処理されている)、そのほかには見当たらない。これに対して、株主の閲覧請求権等については、多くの裁判例がある。そのため、会社債権者の閲覧請求権等にかかる裁判例が見当たらないのは、会社債権者が、会社法が用意する閲覧請求権等を利用していないからではないかとも考えられる。第3に、会社債権者は、担保の取得のほかに、取引関係成立の際の特約(いわゆる誓約条項)によって、自己の債権の保全を図ろうとしている。すなわち、会社債権者は、会社法が用意する方法とは別に、特約によって用意された方法によって会社情報を得ることが多いと考えられる。さらには、会社法においては、剰余金の配当のような原則として株主総会に決定権限がある事項について、会社債権者は、会社との特約によって、会社に対して(会社経営者に対して)一定の制約をかけることもある。第1に、会社債権者には、各種の態様がありうるが、消費貸借契約における貸主と社債発行における社債権者とは、会社が外部資金を調達する際の債権者であり、会社に対する金銭債権者の典型例として挙げられよう。消費貸借契約に基づく金銭借入と社債発行とは、会社法においては、決定手続や決定事項の点で異なる取扱いがなされている。しかし、両者は、会社に及ぼす法的な影響等からは、決定手続や決定事項に差を設けるほどの相違を見いだすことは難しいと考えられる。むしろ、両者は、外部資金の調達方法という共通する性質に基づいて、会社法において位置付けられるのが妥当であろう(以上について、11.研究発表の今井克典「金銭借入・社債発行に関する取締役会の決議」を参照)。第2に、会社は、金融機関から貸付を受ける場合には、特約条項(いわゆるコベナンツ)に基づいて、債権者である金融機関に一定の義務を負うことがある。

逆にいえば、会社債権者である金融機関は、特約条項を用いて、会社をある程度の管理をすることが可能であるといえる。特約条項違反の効果は、一般には、貸付債務の期限の利益の喪失という法律上の効果や、これを背景とした交渉という事実上の効果である。ここからは、特約条項は、会社管理に関してどこまでをその内容に取り込むことができるかという、特約条項の内容による特約条項の有効性が問題となる。また、特約条項が有効である場合には、会社に生じる効果および取締役の会社に対する責任が、また、無効である場合には、会社または取締役の債権者に対する責任が問題となりうると考えられる。当該事項に関する決定権限の所在のほかに、株主の利益を考慮する必要があろう。第1に、違法な新株の発行・自己株式の処分(以下「募集株式の発行等」という)を採り上げて、取引の安全、既存株主の保護、および会社債権者の保護の関係について考察した。判例は、違法な募集株式の発行等につき、取引の安全を理由にして原則として有効であるとするが、そのため、取引の安全が必要ではない場合にまで、有効とされている。そこで、募集株式の発行等の有因性の程度を緩和して、募集株式の発行等が有効であっても、募集株式の引受契約が無効である場合があり、その場合には、会社は株式の返還を請求することができると解される。これにより、既存株主の保護を一定程度図ることがができる。また、会社は、金銭等を返還しなければならないが、会社が株式の返還を受けるのは、自己株式の取得であるから、財源規制がかかり、会社債権者の保護も図られる。このような考察の結果、従来、違法な募集株式の発行の処理について、会社債権者の保護を維持しつつ、株主の保護が図られる(11研究発表「違法な募集株式の発行等の事後処理」参照)。第2に、確約条項(コベナンツ)の効力について考察した。会社債権者は、確約条項によって、会社経営に一定の制限を加えることができ、場合によっては、株主ないし会社の利益を害することもありうる。そのため、確約条項が有効である場合には一定の限界があると考えられる。確約条項が、株主総会の決定権限を制限する場合には、確約条項は、定款の定めがなければ有効ではないと解される。しかし、定款の定めが有効である項目・内容は、必ずしも明確ではなく、また、確約条項のうち財務制限条項には、株主総会の決定権限を制限するか否かが必ずしも明確ではないものがある。このような考察の結果、会社債権者による確約条項を通じた会社経営への介入の限界がある程度明らかにされる(11研究発表「融資契約における確約条項の会社法上の効力」参照)。
新医師臨床研修制度のもとでの地域保健研修プログラムの開発と評価に関する研究

平成16年度からすべての新卒医師に対し2年間の臨床研修が義務付けられ,この課程の中で約3か月間,地域保健・医療領域における研修カリキュラムが位置付けられた。ここでは,保健所や市町村保健センターで,地域保健領域の研修を受けることになる。地域保健領域ですべての新卒医師に研修機会があることは保健所・市町村保健センターの役割と連携を知ってもらう貴重な機会であり,十分な研修効果があがるように,受け入れ側である県型保健所と保健所設置市の両者も効果的な研修体制を整備し,研修を実施している。本調査では,限られた研修期間の中で,地域保健法のもとで地域保健サービスの提供体制が大きく異なる県型保健所と市保健所での研修の特徴を明らかにすることによって,それぞれの保健所での研修医にとって実りの多い研修プログラムのあり方および今後の課題について考察した。本調査より,短期間で研修医に提供するプログラム企画の基本的考え方は次の事項である。1.健康危機管理対応や地域保健サービス実施の機会があれば,最優先で対応現場を経験してもらうこと,地域で市民と話をする機会を持つこと。2.法に基づく医師の届け出の意義とそれを受けての保健所での疫学調査と対策実施,集団および個を対象とした健康管理,医師会など関係機関との連携の重要性を知ること。3.患者が在宅で生活していくには,医療機関と地域保健福祉機関との連携が必須であり,医療機関以外の社会資源の存在意義,患者の地域での在宅生活を支える保健福祉サービス体系,ネットワークについて知ること。広島県内の保健所設置市および県型保健所における地域保健分野の医師臨床研修プログラムを調査し、保健所設置市と県型保健所における研修内容を比較検討した。1健康危機管理:保健所設置市、県型保健所の研修プログラムのいずれも最重要視した内容は、行政機関としての保健所の存在意義を理解することであった。最も重視された項目は、結核・感染症対策などの健康危機管理であり、臨床医から届け出を受けての保健所における集団を対象とした対応である。通常ではこれまでの事案の対応経験を図上演習として提供していた。2病院以外の社会資源の認識:病院では臨床医は患者の治療を担当しているが、患者が地域で在宅生活をしていくためには、病院医療と地域保健福祉の連携が必須である。この地域保健研修の場で、病院治療以外の社会資源の存在意義、患者の在宅生活を支える保健福祉サービス体系やネットワークシステム、病院医療の限界などについて知ることを保健所設置市、県型保健所のいずれも重点に置いていた。3今後の研究課題:地域保健研修の目的を達成するための研修プログラムの開発として,「市町村の社会資源の分析による特性把握」、「ヘルスプロモーションと住民参画の理解」などを今後の研究課題としたい。平成18年度以降は、平成17年度の広島県内の調査結果と検討課題を受け、全国の先駆的事例の調査を行い、臨床研修医師にとって実りの多い研修プログラム提供のあり方を研究する。平成18年度では、地域保健分野における医師臨床研修プログラムとして活用できそうな事例について実地調査および情報収集を行った。その中でも特に次の3つの領域について研修プログラム案の作成を行った。1)ヘルスプロモーションそれぞれが異なる法律の下で機能している健康管理システム(地域保健、産業保健、学校保健)が互いに連携して共通の課題・目標に取り組む事業を企画する過程について学ぶ研修プログラム(協議会参加型)2)健康危機管理臨床研修病院で収集された「ヒヤリ・ハッと」事例について、VTA法およびMSHEL法の手法を用いて要因分析を行い、医療安全システムの改善を検討することにより再発防止策を提言する研修プログラム(資料分析および実地調査型)3)地域診断市町村合併が進展していく中で、新たな市町村保健計画策定にあたり、市町村別の標準化死亡比や医療費などの成果指標と、保健医療資源や事業実績との関連を分析することにより、市町村合併後に重点的に取り組むべき保健事業を検討・企画する研修プログラム(資料分析型)[今後の研究の展開に関する計画]本研究テーマの最終年度に当たる平成19年度には、主に次の事項について追加調査および検討を加える予定である。(1)広島県内の保健所で実施された地域保健分野における研修プログラムの実態調査(平成17・18年度)とそのプログラム内容別集計

(2)主要な研修プログラムに関連した解説テキストの作成平成16年度からすべての新卒医師に対し2年間の臨床研修が義務付けられ、この課程の中で約3か月間、地域保健・医療領域における研修カリキュラムが位置付けられた。ここでは、保健所や市町村保健センターで、地域保健領域の研修を受けることになる。地域保健領域ですべての新卒医師に研修機会があることは保健所・市町村保健センターの役割と連携を知ってもらう貴重な機会であり、十分な研修効果があがるように、受け入れ側である県型保健所と保健所設置市の両者も効果的な研修体制を整備し、研修を実施している。本調査では、限られた研修期間の中で、地域保健法のもとで地域保健サービスの提供体制が大きく異なる県型保健所と市保健所での研修の特徴を明らかにすることによって、それぞれの保健所での研修医にとって実りの多い研修プログラムのあり方および今後の課題について考察した。本調査より、短期間で研修医に提供するプログラム企画の基本的考え方は次の事項である。1.健康危機管理対応や地域保健サービス実施の機会があれば、最優先で対応現場を経験してもらうこと、地域で市民と話をする機会を持つこと。2.法に基づく医師の届け出の意義とそれを受けての保健所での疫学調査と対策実施、集団および個を対象とした健康管理、医師会など関係機関との連携の重要性を知ること。3.患者が在宅で生活していくには、医療機関と地域保健福祉機関との連携が必須であり、医療機関以外の社会資源の存在意義、患者の地域での在宅生活を支える保健福祉サービス体系、ネットワークについて知ること。
in vivoにおけるミトコンドリア品質管理機構についての組織化学的評価

1) Atg7遺伝子を神経系特異的に欠損させたマウスとParkin欠損したマウスそれぞれとカテプシンD欠損マウスとのダブルノックアウトマウスを作成したところ、前者でミトコンドリアサブユニットcの蓄積が完全に阻害されたが、後者では部分的な阻害に止まった、Parkinを介するマイトファジーの寄与は部分的であった。2)神経細胞特異的に鉄を増加させたIRP2トランスジェニックマウスとparkin欠損マウスを交配して得た二重変異マウスで黒質のドパミン細胞特異的な神経変性を見い出した。3)オメガソームのマーカータンパク質とされるDFCP1についてその内在性分子のミトコンドリアに関連した局在を示した。本年度は、カテプシンD欠損マウスの神経細胞のリソソームにおいてミトコンドリア内膜のサブユニットcが蓄積する機構が、ミトコンドリアの非選択的なマクロオートファジーのみならず選択的なミトコンドリアのマクロオートファジーすなわちマイトファジーを介するのかについて、遺伝学的な検証を試みた。具体的にはマクロオートファジーに必須なAtg7遺伝子を神経系特異的に欠損させたマウス(Atg7F/F;Nes)ないし、マイトファジーに必須なParkin遺伝子を欠損したマウス(Parkin-/-)と、カテプシンD欠損(CD-/-)マウスとを交配しそれぞれのダブルノックアウトマウス(CD-/-Atg7F/F;NesないしCD-/-Parkin-/-マウス)の作成に成功した。これらダブルノックマウスにおいてサブユニットcの免疫陽性反応をCD-/-マウスと比較したところ、CD-/-Atg7F/F;Nesではサブユニットcのリソソームにおける陽性像がほとんど消失したのに対して、CD-/-Parkin-/-マウスでは陽性像が減弱するのみであった。このことは正常の神経細胞ではミトコンドリアは非選択的なマクロオートファジーにより分解される割合が高く、Parkinを介するマイトファジーの寄与はない訳ではないが必須ではないことを示唆している。本年度はミトコンドリアとオートファジーについて以下のin vivoおよびin vitroの実験系を利用し成果を公表した。1)神経細胞特異的鉄代謝制御タンパク質IRP2Tg/parkin欠損二重変異マウスの黒質変性ダメージを受けたミトコンドリアにはparkinが局在化し、マイトファジーによる分解に導くという報告が数多くなされている。そこで、鉄代謝異常とマイトファジーとの因果関係を検討する目的で、神経細胞特異的に反応性に富んだ鉄を増加させたトランスジェニックマウス(IRP2 Tg)をパーキンソン病の原因遺伝子であるparkinの欠損(KO)マウスと交配し、解析した。その結果、parkin単独欠損マウスが目立った表現型を示さないのに対し、IRP2 Tg parkin KO二重変異マウスの黒質神経細胞ではミトコンドリアにおける酸化ストレスの増大が認められ、電顕的にも黒質の領域特異的な神経変性を呈することが分かった。2)オメガソームマーカータンパク質DFCP1の内在性分子のミトコンドリアに関連した局在がこれまでDFCP1とオメガソーム関連はすべて蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現させた細胞における動態の解析がもっぱらで、定常状態では蛍光が粗面小胞体(ER)とゴルジに局在し、飢餓状態でERに沿ってドット状のオメガソームの局在パターンに変化すると考えられてきた。我々は内在性DFCP1を認識する抗体を作成し、生化学的、組織化学的に特異性を検定した上でHela細胞を用いてその動態を検討した。その結果定常状態の細胞においても従来言われていたER-ゴルジパターンではなく、既にミトコンドリアに沿ってドット状の局在を示し、これがERと部分的に共局在することを見いだした。このことは定常状態の細胞のER-ミトコンドリアのコンタクトサイトが既にDFCP1陽性であることを強く示唆している。神経毒であるmethy-phenyl-tetrahydopyridine(MPTP)をインフュージョンポンプを用いて投与することによって作成したパーキンソン病モデルマウスにおける黒質神経細胞のミトコンドリアの超微形態の検討を行った、MPTP投与後4週後および対照群の黒質神経細胞の透過電子顕微鏡(TEM)観察を行った。MPTP投与群では、対照群と比べて、丸く粗大なミトコンドリアが細胞質を占めていることが分かった。高倍率の観察では、ミトコンドリア内でのクリステの不均一な分布を認め、クリステがミトコンドリアの中央に長軸に沿って層板状に集積し、周辺には内腔が開大したクリステが配置するものが大部分であった。膨化が顕著なミトコンドリアでは層板状に集積したクリステの境界が不明瞭になり電子密度の高い塊状の構造を呈したものが観察された。さらに膨化が極度に顕著になものは、外膜・内膜は認めたが、クリステとマトリックスを認めない空胞状の形態を呈した。さらに新たに導入した収束イオンビーム(FIB)搭載走査型電子顕微鏡(SEM)システム(FIB/SEM)を用いた黒質神経細胞のミトコンドリアの電子顕微鏡レベルの三次元構築を試みた。30nm単位の切削と得られた切削面の走査電子顕微鏡観察を繰り返し、得られた像より黒質神経細胞の核とミトコンドリアだけを描出(セグメンテーション)し、3次元再構築像を得た。その結果、MPTP投与群ではサイズの大きな球形のミトコンドリアがしばしば細長いミトコンドリアと連続していた。

また、得られた連続切片の観察により、極めて大きく膨化した空胞状のミトコンドリアは、細胞体より突起に多く観察される傾向も認められた。以上は、MPTP投与によるパーキンソン病モデルマウスにおいても、ミトコンドリアのクリステの変化が顕著であることを示すものである。1) Atg7遺伝子を神経系特異的に欠損させたマウスとParkin欠損したマウスそれぞれとカテプシンD欠損マウスとのダブルノックアウトマウスを作成したところ、前者でミトコンドリアサブユニットcの蓄積が完全に阻害されたが、後者では部分的な阻害に止まった、Parkinを介するマイトファジーの寄与は部分的であった。2)神経細胞特異的に鉄を増加させたIRP2トランスジェニックマウスとparkin欠損マウスを交配して得た二重変異マウスで黒質のドパミン細胞特異的な神経変性を見い出した。3)オメガソームのマーカータンパク質とされるDFCP1についてその内在性分子のミトコンドリアに関連した局在を示した。神経細胞特異的鉄代謝制御タンパク質IRP2Tg/parkin欠損二重変異マウスを用いたin vivoにおけるミトコンドリア品質管理機構についての組織化学的評価に成功し、共筆頭著者として論文発表に至った(Asano and Koike et al., Neurosci Lett. 2015)。上記二重変異マウスはparkin単独欠損マウスには認められない神経変性が黒質特異的に見いだされ、その機序が黒質神経細胞ではミトコンドリアにおける酸化ストレスの増大であることが示唆された。ヒトのパーキンソン病では異常なミトコンドリアの処理の不全が原因となる黒質を中心とするの神経変性が認められることが特徴の難治性神経疾患であるが、パーキンソン病の原因遺伝子の欠損マウスは数多く作られているが黒質に変性が認められるものはほとんどない。しかしこの二重変異マウスはミトコンドリアの病態を基点とするヒトパーキンソン病の病態に酷似する症状を呈す極めて良いモデルマウスであることが明らかとなった。加えて、in vitroのモデル系で、マイトファジーの過程で必須なオートファゴソームの形成の場を提供するオメガソームとよばれる構造体のマーカーであるDFCP1の内在性分子の局在がミトコンドリア-粗面小胞体(ER)のコンタクトサイトに由来する可能性があることを、DFCP1に対する特異的抗体を用いて初めて明らかにし、共筆頭著者かつ責任著者として論文発表に至った(Nanao and Koike et al., Biomed. Res. 2015)。この知見は通常のオートファジーのみならず、マイトファジーの機構とオメガソームの新たな関連を提唱する上でも重要な知見であると考えられる。解剖学今後マイトファジーとDFCP1との関連をより明らかにするためには、微細形態レベルでのミトコンドリア・粗面小胞体(ER)・オートファジー(LC3)のマーカーとオメガソームのマーカーDFCP1の共局在の有無を明らかにする必要があるため、二重染色が可能で感度の良い免疫電子顕微鏡観察を行う必要がある。このため筆者が得意としている凍結超薄切片法の利用を検討する。オートファジーマーカーであるLC3については、光顕レベルの蛍光抗体法では容易に検出可能な抗体を用いても、凍結超薄切片を用いた免疫電顕で検出することは困難であった。
持続的競争優位獲得のための適切な製造－販売協働の実証的研究

現在、サプライチェーン上の多くの業務プロセスが、需要不確実性の問題に直面している。この需要不確実性を削減するための有効な処方箋の一つに、製造ー販売協働があるが、実務面では、十分機能しておらず、その実証研究の蓄積も乏しい。本研究では、この需要不確実性を削減し、競争優位獲得につなげていくためには、製品のライフサイクルごとに協働する流通を使い分け、製品の特性と適合した顧客を結びつける適切なレベルの協働活動を設計・推進することが有効であることを明らかにし、その実践可能な概念モデルの提示を行った。平成27年度は、製造ー販売協働のマネジメントシステム(Supply Chain Collaborated Management System:以下SCCMS)において需要不確実性の低減に焦点をあてた新たなモデルを提起すべく、研究実施計画書の通り、主に聞き取り実態調査を行った。対象は、日本製造メーカーXにおいて、『鮮度重視』の製造・販売管理を推進しているデジタルカメラ(DSC)、液晶テレビ(TV)、メディア記録媒体の3つの製造事業場を取り上げ、それら事業場の購買、製品開発、生産、販売、物流部門への一連の業務過程の聞き取り実態調査を行った。(国内6回/海外9回)聞き取り実態調査が、前倒しで進んでおり、2年間で計画していた製造事業場と大規模小売業への聞き取り調査を、初年度である平成27年度で、ほぼ完了した。2年目の平成28年度には、そこでカバーできなかった部分(日本の流通への聞き取り調査)をフォローしていく。平成28年度は、製造ー販売協働のマネジメントシステム(Supply Chain Collaborated Management System:以下SCCMS)において需要不確実性の低減に焦点をあてた新たなモデルを提起すべく、研究実施計画書の通り、主に、聞き取り実態調査を行った。対象は、前倒しで進んでいた計画のうち、カバーできていなかった日本の流通部門への一連の業務過程の聞き取り実態調査を行った。結果、平成27年度から28年度に至る2年間で予定していた聞き取り調査は、予定通り全て完了した。上記の調査結果を踏まえ、これまで実践方法が十分に解明されていなかったSCCMSの効果的なあり方を、4つの活動の設計要素(製品の普及段階と特性、流通業者の選択、協働の度合い)と4つの組織間の関係性要素(信頼関係、報酬、相互関係、協働の度合い)という2つの枠組みから構築、これらSCCMS概念モデルと企業の事例による検証結果を、英文ジャーナル掲載1本、国際大会発表2回を通じて提示した。申請者が太いパイプを持つ企業を中心とした聞き取り調査だったため、企業の内部者でないと知り得ぬような実態やプロセスに関する克明な情報を入手できた。1モデル化:文献調査並びに収集した一次データに基づき、活動の設計という枠組みから、早期に競争優位獲得、それを維持できるSCCMSの概念モデルを構築する。2モデルの検証と理論化:収集した一次データをもとに、成果を創出し、持続的競争優位獲得に成功している市場のSCCMSを、我々の活動の設計の概念モデルを通じて、理論的、実証的に説明できることを明らかにした。また、協力企業との勉強会を通じて、実際の現場での我々の概念モデル適応を行いながら、最終的にSCCMS概念モデルの実効性を確認し、国内外での学会発表や国際ジャーナル投稿を行った。このように、これまで実践方法が十分に解明されていなかったSCCMSの効果的なあり方を、4つの活動の設計要素(製品の普及段階と特性、流通業者の選択、協働の度合い)の枠組みから構築、これらSCCMS概念モデルと企業の事例による検証結果やそのプロセスを、理論的、実証的に提示することができた。一方、この製造ー販売協働の研究を通じて、グローバルにサプライチェーンを展開している企業は、開発・生産の協働、生産・販売の協働、開発・販売の協働というように、これまでの2者間協働の問題を個別に解くのではなく、開発・生産・販売を3者間問題として同時に解かねばならない状況に直面していることも明らかになった。今後は、こうした課題への処方箋を見出すために、グローバルなサプライチェーンにおける開発・生産・販売の協働のあり方を研究していきたい。今後は、日本の流通への聞き取り調査と合わせて、平成29年度研究計画に掲げていた以下の2つのテーマを着実に実践していきたい。:1モデル化:文献調査並びに聞き取り調査の結果収集した一次データに基づき、早期に競争優位獲得、それを維持できるSCCMSの概念モデルを構築する。2モデルの検証と理論化:収集した一次データをもとに、成果を創出し、持続的競争優位獲得に成功している市場のSCCMSを、我々の活動の設計と組織間の関係性構築の概念モデルを通じて、理論的、実務的に説明できることを明らかにする。また、協力企業との勉強会を通じて、実際の現場での我々の概念モデル適応を行いながら、必要に応じて、モデル修正をしつつ、最終的にSCCMS概念モデルの実効性を確認し、国内外での学会発表や国際ジャーナル投稿を行う。

今後は、平成29年度研究計画通り、以下2つのテーマを着実に実践していく:1モデル化:文献調査並びに収集した一次データに基づき、早期に競争優位獲得、それを維持できるSCCMSの概念モデルを構築する。2モデルの検証と理論化:収集した一次データをもとに、成果を創出し、持続的競争優位獲得に成功している市場のSCCMSを、我々の活動の設計と組織間の関係性構築の概念モデルを通じて、理論的、実務的に説明できることを明らかにする。また、協力企業との勉強会を通じて、実際の現場での我々の概念モデル適応を行いながら、必要に応じて、モデル修正をしつつ、最終的にSCCMS概念モデルの実効性を確認し、国内外での学会発表、国際ジャーナル投稿、並びに図書出版を行う。国際経営当初前倒しをした150万円は、主に海外への聞き取り調査のための旅費であったが、格安航空券等の使用により、コストを抑えることが出来たため、102.291円残額となった。平成28年度に実施した日本の流通部門への一連の業務過程の聞き取り実態調査や国際大会発表は、他の研究活動と並行して行ったため、それらの費用は、他の研究費用から捻出した。そのため、平成28年度本研究実績費用はゼロになっている。次年度の研究調査経費に充当する。モデルの枠組みを構築する過程において、モデルの質的向上を図るための研究者との議論、モデルの外的妥当性を確保するためのインタビュー調査や実務家との議論を計画している。加えて、結論の理論的・実務的示唆を検証するために、実務家、研究者との議論も予定している。上記を踏まえ、SCCMS概念モデルと企業の事例による検証結果を、国際大会で発表、書籍にもまとめて発刊する計画である。
旅行記と文学創造-フランス文学の場合

旅と文学は古来密接な関係を結んできたが、西欧では大航海時代以後、世俗的または宗教的権威の意向を受けて大旅行を企てた探検家や宣教師によって、多数の旅行記が遺された。フランス革命を経て近代に入ると、「記録する旅行者」に代わり、「旅する作家」が登場する。本研究は、この大きな変化以後を主な対象として、旅とフランス文学との関係を、時代の条件との多様な関わりを勘案しながら時系列に即してたどり、最後に、旅は今日なお文学的霊感の源泉となりうるかという問いに肯定的に答える形で締めくくられた。本研究第一年目は,まず19世紀,20世紀のフランス語で書かれた旅行記の書誌を作成し,欠落していた重要文献を蒐集し,基本コーパスの充実に努めた。また,近年次々と刊行されている近代旅行記関連の目ぼしい研究書をそろえた。これと併行して,研究代表者は現代における知的な旅,記号論による異文化読解の一例として,1960年代におけるロラン,バルトの日本論にかねがね注目してきたが,同じ作家の中国体験との比較を通じてその日本体験の特質を定義する試みとして,2007年5月に招聘された台湾国立中央大学で「ロラン,バルトと日本」と題する仏語講演(中国語への通訳〔逐語訳〕付)を行なった。6月には,近代考古学と文学とが交差する領域を専門的に研究しているパリ第4大学のソフィー,バッシュ教授と,また2008年3月には19世紀散文理論の専門家で,ロマン派作家の旅行記にも詳しいポワティエ大学のアンリ,セッピ教授と研究交流の機会を持ち,その成果をさらに発展させるために,上記二教授のほか,プルースト研究者でプルーストのヴェネツィア旅行の記述をめぐる文学的源泉に関して興味深い論考を発表しているフランス国立科学研究所研究員ナタリー,モーリャック氏を2008年10月に招聘して研究集会を催すための下準備を行なった。旅行記における文学創造と歴史や文化イデオロギーとの絡み合いの好個の例として,ロマン派のテクストではシャトープリアンの『パリからエルサレムへ,またエルサレムからパリへの旅程』(1811年)をモデル,ケースとして前代の客観的旅行記との比較で集中的に分析する方針,また世紀末から20世紀初頭の時期の考古学,民族誌学と文学との干渉現象の好個のモデルとして,とくにマスペロの『エジプトの廃墟と風景』(1910年)に注目する方針が固まった。本研究二年目にあたる平成20年度は、代表者と分担者が本研究開始時以来の成果を持ち寄り、旅行記と歴史文化的諸条件との関わりを具体的に検討した。10月にはフランス語圏の三人の専門家(ジュネーヴ大学助教授フレデリック・タングリ氏、パリ第四大学教授ソフィー・バッシュ氏、フランス国立科学研究センター研究員ナタリー・モーリヤック=ダイアー氏)を共同研究者として迎え、国際研究集会「旅行記から文学作品へ」を組織した。前近代の旅行記(ベルニエ)、ロマン派の旅行記(ネルヴァル)、19世紀末-20世紀初頭の旅行記(マスペロ、プルースト、ヴァレリー)、現代の旅行記(ル・クレジオ)の代表的作品をそれぞれ選び、旅行記がいかに歴史的条件に規定されるか、また、旅行の記録はいかにして文学作品たりうるかについて議論を重ねた。その結果、前近代から近代への旅行記の変質は「文学」概念の変質とある程度併行的な軌跡をたどるが、旅行記に固有の記録性、断片性、偶発性が完全な虚構化や物語性に抵抗すること、また、近代の旅行記はしばしば虚構(小説)と組み合わさって、文学作品の生成を実存的角度から照射する機能を果たすことが、多数の実例とともに浮かび上がってきた。研究代表者はまた、6月にパリ第四大学で開催されたピエール・ブリュネル教授退官記念シンポジゥム「声(La Voix)」に招待され、旅行記『ロドリゲス島への旅』を含む、作家ル・クレジオの父祖の地モーリシャスにちなむ作品群を扱う発表を行ない、小説と旅行記におけるナレーションの偏差を考察した。本研究最終年度にあたる2009年は、主に20世紀、とくに第二次大戦後の文学創造にとって、旅がいかなる意味をもつかを探ることに重点を置いた。この時代を旅行記の観点から見ると、従来にない根源的な変質を被ったことがわかる。目的地に向かう長い道のりが物語となりえた前代とは異なり、交通手段の飛躍的発展が旅の道程の意味を希薄にする。また、通信伝達手段の刷新により、文字情報のみならず映像情報が氾濫し、旅が未知なものの発見の場になることがまれになる。発見があるとすれば、より精神的な次元のものにならざるをえない。われわれは旅行記が成立しにくい時代に生きているのである。また現代は、いわゆるポストコロニアルと呼ばれる状況が否応なく文学を規定する時代でもある。旧植民地とフランス(ヨーロッパ)の間で、何らかの形でアイデンティティの危機を生き、それを創作の原動力とした作家は数知れない。

宗主国の言語(フランス語)を教え込まれ、それを知的形成の手段としながらも、元来の母語との絆にこだわるクレオールの作家はもとより、植民地生まれのフランス人作家、引揚げ植民者の末裔である作家など、多様な実例が見出せる。旅と文学創造に関して現代に特有のこれら二面のうち、後者を例証する作家として、カミュ、デュラス、ル・クレジオを集中的に考察した。とくに2009年11月にはル・クレジオを東京大学本郷キャンパスに招聘し、引揚げ植民者の子供としての二重帰属が作家の中でいかに内面化され、先祖の土地(モーリシャス)への旅が作家の実存と創作にとってどのような意味をもつかを、直接討論する機会をもてたことは大きな収穫であった。本研究の仕上げのために、前者の側面を例証する作家との直接的討論の機会をもつことが欠かせないという判断から、研究期間を半年延長し、2010年5月にドミニック・ノゲーズ氏を招聘、この面についての議論を深める予定である。その成果を組み込んで最終報告としたい。
培養系を用いたショウジョウバエＧＳＣ／ニッチ・システムの解明と分化系の開発

ショウジョウバエのGSC/ニッチ・システムをin vitroで再構築した。雌雄のニッチ細胞の安定的な細胞株を作成し、雌雄のニッチ細胞由来の細胞株で発現する遺伝子群と発現量をマイクロアレイにより解析し、生殖幹細胞の未分化維持・分裂に関与するキャップ細胞やハブ細胞で特異的に高発現する遺伝子群が存在することがわかった。またインスリン遺伝子など従来ニッチ細胞では発現していないと思われていた遺伝子も発現し、GSCの維持に機能していることが示唆された。GSCとニッチ細胞株を共培養し、成長因子の定量的な機能的解析を行った。さらに、GSCとニッチ細胞を共培養し、GSCの分化や脱分化を誘導することに成功した。多細胞生物の成体の組織において、血液、皮膚、生殖細胞などが継続的に生産され続けているのは、それぞれに自己再生能と分化能を持つ未分化な幹細胞が存在しているためである。これらの幹細胞はニッチと呼ばれる特別な微小空間で維持されていることが明らかになりつつある。ショウジョウバエの生殖幹細胞(GSC)とニッチは、雌雄ともに形態的に容易に同定できるため、GSC/ニッチ・システムの最も優れたモデルである。我々は、ショウジョウバエのGSC/ニッチをin vitroで再構築し、始原生殖細胞がGSCに移行するメカニズムやGSCの維持・分裂におけるニッチ細胞との細胞間相互作用や、分化過程を細胞および分子レベルで明らかにする。多細胞生物における生命活動は、機能的な細胞を産生することにより、維持されている。成体の組織では、血液、皮膚、生殖細胞など様々な細胞が、生涯を通じ、生産され続けているが、それぞれに自己再生能と分化能を持つ未分化な幹細胞が存在している。そして、これらの幹細胞はニッチと呼ばれる特別な微小空間で維持されているが明らかになりつつある。ショウジョウバエの生殖幹細胞とニッチは、雌雄ともに形態的に容易に同定できるため、GSC/ニッチ・システムの最も優れたモデルとして、種々の遺伝学アプローチや免疫組織化学的手法を駆使して、GSCの分裂に関するシグナル伝達経路や接着接合によるニッチの実態が明らかにされてきた。しかし、ニッチは極めて限られた空間に存在するため、種々のリガンド(成長因子)の定量的な解析やシグナル伝達様式の実体は、解明されていない。これらの重要な問題をアプローチするには、in vitro系の構築が必要不可欠である。我々は、既に雌のGSCが分化できない腫瘍化突然変異体bamを用い、GSCと卵巣性体細胞幹細胞の細胞株の樹立に成功している。本年度は、オスにおいて、精原細胞の不完全分裂、減数分裂さらには最終的な精子を分化する過程をin vitroで再現する系の開発に成功した。この培養系により、精原細胞の分裂・分化過程には、ホルモンの一種であるエクダイソンが重要な役割を果たしていることを明らかにした。また、メスにおいては、少数の細胞からも、細胞株を樹立する方法を開発し、幼虫の卵巣からニッチ前駆細胞と始原生殖細胞からなる安定的に細胞株の樹立し、これらの細胞間での細胞接着やシグナル伝達経路を明らかにすることができた。多細胞生物の成体の組織において、生涯を通じ、血液、皮膚、生殖細胞などが継続的に生産され続けているのは、それぞれに自己再生能と分化能を持つ未分化な幹細胞が存在しているためである。ショウジョウバエの生殖幹細胞(GSC)とニッチは、雌雄ともに形態的に容易に同定できるため、GSC/ニッチ・システムの最も優れたモデルであり、GSCとニッチ細胞との相互作用やシグナル伝達様式が明らかにされつつある。我々は、既に、メスのGSCと卵巣性体細胞幹細胞の細胞株の樹立に成功している。本年度は、この樹立した細胞株を用い、体細胞性幹細胞内で発現しているnon-coding RNAの解析をハーバード大医学部との共同研究により明らかにした。また、in vitroで卵原細胞特有の同調的不完全分裂を誘導するシステムを構築し、細胞分裂過程で見られる生殖細胞特有の構造の形態変化などを明らかにした。さらに、オスにおいて、精原細胞の不完全分裂、減数分裂さらには最終的な精子へ分化する過程をin vitroで再現し、精原細胞の分裂・分化過程には、ホルモンの一種であるエクダイソンが重要な役割を果たしていることや核内受容体やエクダイソン受容体などの発現パタンの詳細を明らかにした。また、ニッチ細胞の細胞株化にも成功し、始原生殖細胞との相互作用をライブイメージングにより調べるとともに、これらの細胞間での細胞接着やシグナル伝達経路を明らかにすることができた。

これらの幹細胞はニッチと呼ばれる特別な微小空間で維持されていることが明らかになりつつある。ショウジョウバエの生殖幹細胞(GSC)とニッチは、雌雄ともに形態的に容易に同定できるため、GSC/ニッチ・システムの最も優れたモデルであり、GSCとニッチ細胞との相互作用やシグナル伝達様式が明らかにされつつある。我々は、既に、メスのGSCと卵巣性体細胞幹細胞の細胞株の樹立に成功している。本年度は、この樹立した細胞株を用い、体細胞性幹細胞内で発現しているnon-coding RNAの解析をハーバード大医学部との共同研究により明らかにしだ.また、in vitroで卵原細胞特有の同調的不完全分裂を誘導するシステムを構築し、細胞分裂過程で見られる生殖細胞特有の構造の形態変化などを明らかにした。きらに、オスにおいて、精原細胞の不完全分裂、減数分裂さらには最終的な精子へ分化する過程をin vitroで再現し、精原細胞の分裂・分化過程には、ホルモンの一種であるエクダイソンが重要な役割を果たしていることや核内受容体やエクダイソン受容体などの発現パタンの詳細を明らかにした。また、ニッチ細胞の細胞株化にも成功し、始原生殖細胞との相互作用をライブイメージングにより調べるとともに、これらの細胞間での細胞接着やシグナル伝達経路を明らかにすることができた。多細胞生物の成体の組織において、生涯を通じ、血液、皮膚、「生殖細胞などが継続的に生産され続けているのは、それぞれに自己再生能と分化能を持つ未分化な幹細胞が存在しているためである。我々は、雌雄ともにニッチ細胞由来の細胞株の樹立に成功した。そして、これらの細胞株と始原生殖細胞あるいはGSCを共培養すると、生殖細胞が未分化の状態を維持し、増殖することが分かった。このことは、それぞれの細胞株が本来のニッチ細胞の性質を長期的に維持していることを示している。これらの細胞株で発現する遺伝子のプロファイリングを行い、ニッチ細胞特有の遺伝子を多数同定した。これらの遺伝子群には、既にGSCの維持・増殖に関与していることが明らかになっているものや全く機能のわかっていない未知の遺伝子群があった。現在、これらの遺伝子群の発現パタンや機能を明らかにしつつある。更に、GSCが分化する過程でエピジェネティクスな変化を定量的に解析した。そして、in vitroで分化した生殖細胞をGSCへ脱分化する実験系の構築にも成功した。これらの細胞株位対し、遺伝的改変を行うためpiggyBacベクターを改良し、効率的な遺伝子の導入やRNAiによる発現抑制も可能となった。今後、任意の外来性遺伝子の強制発現や遺伝子発現抑制をシステマティックに行い、ニッチ細胞で発現している遺伝子の機能を明らかにする予定である。ショウジョウバエのGSC/ニッチ・システムの確立および維持のメカニズムを明らかにするため、ニッチを構成する細胞(ニッチ細胞)
内因性カンナビノイド受容体リガンドのアナンダミドの加水分解酵素の研究

カンナビノイドは大麻に含まれる精神活性物質であり,その特異的受容体が脳や種々の臓器で発現している。カンナビノイド受容体の内因性リガンドとして見出されたアナンダミド(アラキドノイルエタノールアミド)は,アラキドン酸とエタノールアミンに加水分解されてそのカンナビノイド様生物活性を失う。この反応を触媒するアナンダミド加水分解酵素の酵素学的性質を明らかにするために,ラット肝由来の酵素に対するcDNAをCOS-7細胞に導入し,リコンビナント酵素を発現させた。酵素はアナンダミド加水分解活性に加えて,その逆反応のアラキドン酸とエタノールアミンの脱水縮合によるアナンダミド合成活性を示した。両反応はコントロールのCOS-7細胞では認められなかった。以上の結果からアナンダミド加水分解反応の可逆性が実証された。しかしながら,エタノールアミンに対する高いKm値を考えると,酵素は生理的条件下ではアナンダミド合成酵素としてではなく,加水分解酵素として働いているものと考えられた。また,このようなアミダーゼ活性に加えて,同じ酵素がアラキドン酸メチルエステルを分解するエステラーゼ活性を持つことを見出した。そこで,カンナビノイド受容体のもうひとつの内因性リガンドとして知られる2-アラキドノイルグリセロール(2-AG)のエステル結合を同酵素が水解するかどうか検討した。その結果,酵素はアナンダミドの約4倍の速度で2-AGを水解し,2-AGに対するKm値は約6μMと低く,至適pHは10であった。コントロール細胞では2-AGの水解活性はほとんど検出されなかった。アナンダミドの水解を阻害する2種類の化合物は2-AGの水解反応を同程度阻害し,またアナンダミドは濃度依存的に2-AGの水解反応を阻害した。以上の結果より,アナンダミドと2-AGは同一酵素によって分解されうることが明らかとなった。カンナビノイド受容体の内因性リガンドのアナンダミド(アラキドニルエタノールアミド)は、酵素的にアラキドン酸とエタノールアミンに加水分解されてその生物活性を失う。最近Cravattらによってラット肝からcDNAクローニングの行われた脂肪酸アミド加水分解酵素は、アナンダミドと高い反応性を示すことから、私達が以前から研究を進めてきたアナンダミド加水分解酵素と同一蛋白であると考えられた。そこで、この酵素をCOS-7細胞で過剰発現させて、酵素学的性質を検討した。酵素を過剰発現させた細胞を破砕して、遠心分離により顆粒画分を調製し、酵素標品として使用した。酵素を^<14>C標識アナンダミドと反応させて、生成物を薄層クロマトグラフィーにより分離すると、アラキドン酸の生成が認められた。この加水分解反応の比活性は約140nmol/min/mg蛋白であり、アナンダミドに対するKm値は18μMであった。エタノールアミン存在下に^<14>C標識アラキドン酸と反応させた場合には、アナンダミドの合成が見られた。この脱水縮合反応の比活性は約200nmol/min/mg蛋白であり、アラキドン酸に対するKm値は190μM、エタノールアミンに対するKm値は36mMであった。アナンダミドの加水分解反応と合成反応は、コントロールのCOS-7細胞では認められなかった。以上の結果より、私達が以前にブタ脳の酵素を用いて示唆した、アナンダミド加水分解反応の可逆性が、本研究により実証された。

しかしながら、エタノールアミンに対する高いKm値を考えると、酵素は生理的条件下では、アナンダミド合成酵素としてではなく、加水分解酵素として働いているものと考えられた。また、同じ酵素はオレイン酸アミドやアラキドン酸アミドのような脂肪酸アミドや、アラキドン酸メチルエステルともよく反応し、広い基質特異性を示すことが明らかになった。カンナビノイドは大麻に含まれる精神活性物質であり,その特異的受容体が脳や種々の臓器で発現している。カンナビノイド受容体の内因性リガンドとして見出されたアナンダミド(アラキドノイルエタノールアミド)は,加水分解を受けてそのカンナビノイド様生物活性を失う。この反応を触媒する加水分解酵素は,このようなアミダーゼ活性に加えて,アラキドン酸メチルエステルを分解するエステラーゼ活性をもつ。そこで,もうひとつの内因性リガンドとして知られる2-アラキドノイルグリセロール(2-AG)のエステル結合を同酵素が水解するかどうか検討した。ラット肝のリコンビナント酵素を過剰発現させたCOS-7細胞の顆粒画分を酵素標品として,2-AGと反応させた。その結果,酵素はアナンダミドの約4倍の速度で2-AGを水解し,2-AGに対するKm値は約6μMと低く,至適pHは10であった。コントロール細胞では2-AGの水解活性はほとんど検出されなかった。アナンダミドの水解を阻害する2種類の化合物は2-AGの水解反応を同程度阻害し,また両基質は互いに拮抗的に阻害した。以上の結果より,アナンダミドと2-AGは同一酵素によって分解されうることが明らかとなった。一方,ブタの脳における2-AG水解活性を調べたところ,可溶性画分でも顆粒画分でも比活性約100nmol/min/mg蛋白という高値を示した。0.1%TritonX-100を用いた可溶化やヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーにより,2-AG水解活性の大部分はアナンダミド加水分解酵素から分離された。したがって,ブタの脳で2-AGの加水分解に関与している酵素は,主として,アナンダミド加水分解酵素と区別されるモノアシルグリセロールリパーゼ様の酵素であると考えられた。