hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
原発震災と市民社会研究―グローバルな連帯による子どもの保護を考える―

沖縄県内では、年間を通じて日本環境会議・沖縄大会の実行副委員長として、10月の大会を成功に導いた。大会では全体の統括と同時に第5分科会「放射能公害と人権」のコーディネーターを務め、発表者として研究成果を社会還元することができた。東京では5月と7月の2回に渡り、世界への原発輸出に関する専門家会議を持ち、研究成果の共有とともに、今後の共同研究に向けた有意義な議論を行うことができた。また11月には三重でフィールド調査を行い、原発計画の廃案に寄与する市民活動についての貴重なデータを収集できた。2017年2月には兵庫で、国内学会発表を行った。海外は2016年3月にカナダおよびフランスでフィールド調査および研究成果発表の講演を行い、出張費用の一部を2016年度の経費とした。9月にはベトナムで追加のフィールド調査を行い、研究データを完結させた。8月にはチェコ、プラハにおいて、また11月にはアフリカ、シエラレオネにおいて国際学会での研究発表を行った。以上の研究活動を通し、雑誌論文2本を発表、また国内外での学会発表は計5本を数えた。一般雑誌や新聞での記事執筆は多数にのぼる。福島の原発震災を通し、ベトナムでの原発建設計画に関してどのように住民、特に先住民族の人権に配慮した子どもの保護のあり方に、国内外へ研究成果をアピールできたことと考える。折から、本研究期間の終わりに呼応するかのように、同原発計画は廃案となった。駆け込みで新聞・雑誌に掲載した廃案の原因を分析した記事を含め、本研究3年間の成果を120ページの冊子にまとめて印刷、製本、配布した。研究成果が現実の社会を動かす一因になったのではと考える。日本からベトナムへの原発輸出を事例とし、輸出の背後にある重層的な差別構造を分析した。その中には先住民族差別も含む。また子どもを放射能から守るためにグローバルに連帯する市民社会の動きを明らかにした。研究成果は、日英越仏の四ヶ国語を駆使し、世界各地で発表した。特にベトナム語での発信は、ベトナムの研究者や学生のみならず公務員や国会議員にもアピール力を発揮し、同国が原発建設計画白紙撤回を決定するに際しての参考資料を提供できたと考える。計画撤回により放射能被害から免れることができたベトナムの子どもたち、そして大人も含む市民ともども、本科研費の支給に対し、この場をお借りして心よりお礼申し上げる。別途取得ずみの科研費基盤研究(C)「市民社会は児童問題の解決にいかに貢献できるか」は当初2013年度が最終年度の予定であったが、事情により2014年度にまで延長した。さらに本科研費申請時点ではまったく予期していなかったことに、2014年3月末に所属変更となり、本土から沖縄への転勤・転居という一大事があった。このため本年度は新たな職場での授業や生活基盤の立ち上げと同時に、前年度から持ち越した科研費の最終年度と本科研費の初年度という、大変に密度の濃い1年となった。幸いなことに健康に恵まれ、周囲の協力も得て研究に向ける時間や労力を確保することができた。何より研究への執念を維持できたという精神面が非常に大きいと考える。
腫瘍性遺伝疾患の遺伝子背景についての分子病理学的研究

ヒト腫瘍発生における遺伝子背景についての解析を分子病理学的に行った結果、次のような成果を得た。1)ヒト胃癌37例、腺腫8例についてras遺伝子の点突然変異の有無をホルマリン固定、パラフィン包埋標本より解析した。このうち低分化腺癌の1例のみに、c-k-rasコドン13の変異(Gly;GGC→Ser;AGC)を認めた。従って胃癌、胃腺腫の発生にras遺伝子の点突然変異はほとんど関与していない可能性が示唆された。2)尿路上皮癌における癌抑制遺伝子の不活性化と癌の悪性度との関与をヘテロ接合性の消失(loss of heterozygosity,LOH)という現象を指標に解析し、染色体3p,11p,13q,17p上の癌抑制遺伝子の不活化が尿路上皮癌の発生、進展に深く関与していることを示した。とくに尿路上皮癌の悪性度には11P,17p,13q上の癌抑性遺伝子の不活性化が重要であることが、我々の結果より示唆された。17p上のp53遺伝子変異のパターンが喫煙などの環境因子に関連がある場合にも明らかとなり癌における遺伝子背景と環境因子との比較検討も可能となった。3)遺伝性網膜芽細胞腫のRB遺伝子変異はgerm lineを介して伝えられ、その変異部位の塩基配列解析により、短い反復配列が関与していることが明らかになった。一方、散発性に発生したヒト膀胱癌例においてはLOHとは関係なくRB遺伝子の不活性が起っていることが明らかとなった。従って同一の癌制御遺伝子であってもgerm lineを経て変異が起こる場合と生後に体細胞変異として発生する場合で、その機構に違いがあると考えられた。4)癌の遺伝子解析の際、材料保存に用いられいるホルマリンの影響も分子病理学的解析を行なう場合に重要な因子となることが明らかとなった。目的ウィルムス腫瘍,増殖の背景にある遺伝的な遺伝子変化,Wt1の欠失は繊維芽細胞にも不死化傾向を付与することが示されているが,同じく,フォン・レックリングハウゼン氏病(NF1)についても,22番染色体の遺伝子の欠失が考えられる.本研究では,ウィルス腫瘍細胞の繊維芽細胞の遺伝子変化と癌表現型の対比を検討するとともに,NF1症例を中心に遺伝子を解析した.関連した癌抑制遺伝子の研究では,膀胱癌の症例で癌抑制遺伝子の存在する主要な染色体部位について,欠失の有無を研究した.結果1.ウィルムス患者細胞とNF1患者細胞の発癌剤による染色体切断感受性について,現在研究を続けている.なお,結果は,細胞株の発癌剤作用に対する反応の不安定さのために,結論を得るに至っていない.2.膀胱癌の癌抑制遺伝子の変化について,49腫瘍について検討した.その結果,9q(21/38=55%),11p(20/44=45%),17p(18/42=43%),13q(10/39=26%),3p(8/41=20%),10q(2/29=7%),1p(1/36=3%)の欠失の値を得た.このうち,Grade 3以上の進行浸潤癌では,13qの欠失は6/16=44%に,17pの欠失は13/16=81%の症例に見られた.この結果,膀胱癌では9qの欠失が初期の変化として重要であり,17pの欠失は悪性変化をもたらせるものとして,重要なものであると考えられた.3.ホルマリン固定によるDNAの変化は,ラムダ-ファ-ジを用いて広範に検討された.

その結果,固定液の塩濃度,pH,ホルマリン濃度の関与することが明確になった.また,ホルマリンにより,DNAの各種制限酵素の作用が大きく影響を受けることが示された.これは,DNAの塩基にホルマリンが影響を与えることを示すもので,固定材料を用いて,癌素因の研究を行うさいに,注意が必要であるヒト腫瘍発生における遺伝子背景についての解析を分子病理学的に行った結果、次のような成果を得た。1)ヒト胃癌37例、腺腫8例についてras遺伝子の点突然変異の有無をホルマリン固定、パラフィン包埋標本より解析した。このうち低分化腺癌の1例のみに、c-k-rasコトン13の変異(Gly;GGC→Ser;AGC)を認めた。従って胃癌、胃腺腫の発生にras遺伝子の点突然変異はほとんど関与していない可能性が示唆された。2)尿路上皮癌における癌抑制遺伝子の不活性化と癌の悪性度との関与をヘテロ接合性の消失(loss of heterozygosity,LOH)という現像を指標に解析し、染色体3p、11p、13q、17p上の癌抑制遺伝子の不活化が尿路上皮癌の発生、進展に深く関与していることを示した。とくに尿路上皮癌の悪性度には11p、17p、13q上の癌抑制遺伝子の不活性化が重要であることが、我々の結果より示唆された。17p上のp53遺伝子変異のパターンが喫煙などの環境因子に関連がある場合にも明らかとなり癌における遺伝子背景と環境因子との比較検討も可能となった。3)遺伝性網膜芽細胞腫のRB遺伝子変異はgerm lineを介して伝えられ、その変異部位の塩基配列解析により、短い反復配列が関与していることが明らかになった。一方、散発性に発生したヒト膀胱癌例においてはLOHとは関係なくRB遺伝子の不活性が起っていることが明らかとなった。従って同一の癌制御遺伝子であってもgerm lineを経て変異が起こる場合と生後に体細胞変異として発生する場合で、その機構に違いがあると考えられた。4)癌の遺伝子解析の際、材料保存に用いられいるホルマリンの影響も分子病理学的解析を行なう場合に重要な因子となることが明らかとなった。
学童期からの英語スピーキング能力の発達に関する統合的研究－脳内文法基盤を中心に

本研究は、日本人の英語のスピーキング能力の発達に関連する要因を探るために、英語学習開始年齢や英語学習経験が英語スピーキングのパフォーマンスにどのように影響しているのかを調べる。これまでに幅広い年代に適用できるスピーキング評価方法を試し、実際に日本人大学生や英語が極めて得意な小学生より、英語スピーキングデータを収集してきた。当該年度にはこれらのデータの分析を進めた。スピーキングデータは書き起こしを行い、書き起こした英語に対して言語学的な分析を行い、発話量、流暢性、文法的複雑性、語彙的多様性などを調べた。正確を期すため、書き起こしや言語学的分析は同じデータに対して二重に実施しており、これは現在も進行中である。こうした分析により、同じ英語スピーキング課題を実施した際のパフォーマンスにおいて、日本人大学生と(過去の研究で報告されている)スペイン人大学生などを比較することが可能になった。また、この同じ課題・分析方法で、極めて優れた英語力を持つ日本人小学生も比較に加えることが出来るようになった。言語学的分析の結果は、彼らの高い英語スピーキング力を数値的に支持するものとなった。こうした研究結果が得られつつあるものの、予定していた別の実験については、実験機器類の老朽化や、以前の所属機関から実験室を移動することに時間がかかったことで、思うように進まなかった面がある。また、言語学的分析の中には適切に適用できなかったものもあり、改善が必要である。上述の通り、実験機器類の老朽化や、以前の所属機関から実験室を移動することに時間がかかったことで、予定していた実験のうち思うように進まなかったものがあるため。分析のダブルチェックをさらに進める。新しくデータを取得する。実験設備・環境を整えて、実施できていない実験を実施する。この研究は、日本人の英語スピーキング能力向上に関与する要因をより良く理解するために、英語学習開始年齢や文法的能力などの要因が、どのように英語スピーキングに関係しているのか明らかにする実験を行うものである。小学生から大人まで幅広い年代に適用できる英語スピーキング評価方法によりスピーキング能力が高い個人を同定し、彼らの行動的・認知的特性を調べる。そのため初年度である当該年度では、国際的な水準の研究で過去に用いられた英語スピーキング評価方法を、日本人大学生に対して適用することを試みた。2種類試したうちの1つでは、日本人からはほとんど有効なデータが得られず、海外の被験者とのデータ比較が成立しなかった。これは日本人大学生の英語スピーキング力が極めて低いことに起因すると考えられる。もう一方の評価方法では、有効なデータが得られた。日本人と同様、外国語として英語を学ぶスペイン人のデータと比較すると、日本人大学生の英語スピーキングにおける流暢性は、スペイン人大学生のおよそ半分であることが示唆された。現時点では日本人データを単一の大学からしか取得出来てないので、この傾向が日本人成人もしくは日本人大学生に一般化できるかは分からない。しかしながら、今回の被験者が国立大学の英語教員養成課程の所属であることを考えると、英語教育的な観点では心配になるデータと解釈できるかもしれない。有効性が確認された評価方法を用いて、今後、年齢の低い学習者の英語スピーキング力を評価していく予定である。今年度はこの計画に備えて、子どもの保護者とのネットワーク作りを進めた。現時点では、おおむね計画通り進んでいる。当該年度は3年間の研究期間のうち2年目である。この研究では、日本人の英語スピーキング能力に関連する要因を明らかにするため、特に英語学習開始年齢や文法的能力などが、どのように英語スピーキングに影響しているのか調べる。初年度には、幅広い年代に適用できる英語スピーキング評価方法を探り、日本人大学生に適用した。また、子どもの参加者を募るため、保護者とのネットワーク作りを進めた。これらを土台とし、2年目には子どもから英語スピーキングデータを得た。参加した子どもは、日本に住む未就学児から中学生までである。日本人の子どもにしては驚くほど高い英語スピーキング能力を持つ子どもを、保護者ネットワークを使って集めた。子どもの中で最も興味深いのは、両親ともに英語が出来ないが子どもは英語が出来るケースである。そうでない子ども(親のいずれかが英語が出来て、家庭で子どもに英語で話しかけているケース)も研究には参加してもらったが、分析段階では分ける予定である。参加した子ども達には、大学生で試してきた英語スピーキングデータ取得方法を適用した。この方法だと、おおむね、未就学児では上手くいかず、小学生2年生以上になると問題なくデータが取れるようであった。未就学児の場合、英語力の問題で課題がこなせないというより、記憶やストーリー理解(題材は無声映画)などの一般的認知能力の発達が十分でないことが推察された。今後は取得したデータに詳細な言語学的分析を加えるとともに、保護者ネットワークを拡充し、新たなデータの取得を目指す。子どもの研究参加者を集めるための保護者ネットワークの構築が前年度にスムーズに行ったため、それを利用したデータ取得が順調に進んだ。

スピーキングデータは書き起こしを行い、書き起こした英語に対して言語学的な分析を行い、発話量、流暢性、文法的複雑性、語彙的多様性などを調べた。正確を期すため、書き起こしや言語学的分析は同じデータに対して二重に実施しており、これは現在も進行中である。こうした分析により、同じ英語スピーキング課題を実施した際のパフォーマンスにおいて、日本人大学生と(過去の研究で報告されている)スペイン人大学生などを比較することが可能になった。また、この同じ課題・分析方法で、極めて優れた英語力を持つ日本人小学生も比較に加えることが出来るようになった。言語学的分析の結果は、彼らの高い英語スピーキング力を数値的に支持するものとなった。こうした研究結果が得られつつあるものの、予定していた別の実験については、実験機器類の老朽化や、以前の所属機関から実験室を移動することに時間がかかったことで、思うように進まなかった面がある。また、言語学的分析の中には適切に適用できなかったものもあり、改善が必要である。上述の通り、実験機器類の老朽化や、以前の所属機関から実験室を移動することに時間がかかったことで、予定していた実験のうち思うように進まなかったものがあるため。被験者を増やしてさらに実験を進める。具体的には、これまでとは別の大学からの被験者や、年少の被験者の参加を求めていく。そのための学外ネットワーク作りをまず行う。データが取れ次第、分析を進める。取得したデータを言語学的に詳しく分析する。分析のダブルチェックを進める。大学生・子どもともに、被験者数を増やす。分析のダブルチェックをさらに進める。新しくデータを取得する。実験設備・環境を整えて、実施できていない実験を実施する。人件費・謝金を低く抑えられたため理由:旅費、人件費・謝金を低く抑えられたため使用計画:今後の実験の人件費、研究補助者の謝金、研究環境の整備、図書購入、旅費などに使用する。理由:予定通り進まなかった実験があるため、想定より物品費や人件費・謝金がかからなかったため使用計画:今後の実験の人件費、研究補助者の謝金、研究環境の整備、図書購入、旅費などに使用する。今後の実験の人件費、研究補助者の謝金、研究環境の整備、図書購入、旅費などに使用する。
結び目空間の均質性に関する研究

結び目の構造と不変量を局所変形を通じて明らかにしLその発展としてL結び目空間の均質性を究明することを目的としL新しい局所変形としてnon self △move提唱しL対応する構造を決定した。またpass moveによる結び目空間の構造の均質性についてConway多項式の観点から研究した。「研究の目的」に書いたように,本研究では,結び目の構造と不変量を局所変形を通じて明らかにし,その発展として,結び目空間の均質性を不変量と局所変形の観点から究明することを研究目的としている。「研究計画」にもとづいて研究を実施したところ,この研究により得られた本年度の成果は以下の通りである。Erleが導入し,Kauffmanがそれによる絡み目の同値関係を研究した局所変形であるpass moveと結び目不変量であるConwaypolynomialに関する結び目空間の均質性を研究した。Conwaypolynomialの2次の係数α_2の奇偶が一致することと有限回のpass movesでうつりあうことが必要十分条件であることが既に知られているように,Conwayとpass moveには強い関係性がある。その意味で均質性の研究は重要である。どの結び目も,任意に大きな個数の結び目と互いにpass move1回でうつりあう。また,Conway polynomialが一致する結び目でもpass move1回でうつる結び目のConway polynomialsの集合が異なる例があることを示すことに成功した。研究分担者の一人である大山淑之氏との研究成果である。以上の結果は学術雑誌に投稿準備中である。局所変形として,△moveの特殊化として渋谷哲夫氏により提唱されたself△moveがあるが,ここではもうひとつの特殊化として,non self△moveを考える。結び目や絡み目のどのような同値関係が対応するかを研究した。結び目や絡み目が有限回のnon self△movesでうつりあうことと,(1)成分数が一致する,(2)対応する成分の絡み数が一致する,および,(3)対応する成分の結び目型が一致する,ことが必要十分条件であることがわかった。つまり,成分の結び目型を保存するようなlink homologyに対応する局所変形がnon self△moveである。この成果により,△movesの中での,self△movesとnon self△movesの役割が明確になったといえる。この研究は,渋谷哲夫氏,塚本達也氏との共同研究である。
胆汁酸受容体FXR阻害によるバレット食道腺癌の化学予防

胆汁酸受容体の一つfarnesoid X receptorのアンタゴニストであるガグルステロン(GS)が、バレット食道癌の発癌過程を抑制できるか否かを、ラット胃全摘後十二指腸食道逆流モデルを用いて検討した。ラットをGS高投与群、GS低投与群、非投与群の3群に分けて、20, 40, 50週目に屠殺し検討した。過形成、円柱上皮化生、異形成、癌の発生率は、いずれの時期においても、3群間で差が認められなかった。以上より、GSは本モデルにおいてバレット食道腺癌の発癌を予防できないと考えられた。当科で開発された十二指腸液の食道逆流による食道腺癌発生モテルにおいて、Farnesoid X receptor(FXR)のアンタゴニストであるガグルステロン(GS)による食道発癌への影響を検討するため、まずラットを用いて十二指腸食道逆流モデルを作成した。すなわち、7週齢のWistar雄性ラットを用いて、エーテル麻酔下に胃を全摘後、空腸を起始部から約4cmの部位で食道の断端に端側吻合した。合計120頭に手術を行い、それらのラットを無作為に以下の2群に分類した。(1)GS投与群60頭(2)コントロール群(非投与群)60頭である。当初手技慣れに時間を要したが、現在ようやく作成は順調に行われるようになり、術後の生存率もあがり、予定目標数に到達している。GS投与群は1mg/kg/dayを食餌に混じて経口的に投与しており、これらを手術後1週目から40週目まで投与する。その後、来年度に、10,20,30週目に各10頭ずつ屠殺し、最終的に40週目に30頭屠殺する。各群において、食道の炎症の有無を判定し、腫瘍が発生している場合は腫瘍の個数、大きさを測定する予定である。当科で開発された、ラットの胃全摘後十二指腸液食道逆流再建手術モデルを用いて、farnesoid X receptor(FXR)のアンタゴニストであるガグルステロン(GS)による食道発癌への影響を検討するため、まずラットを用いて十二指腸食道逆流モデルを作成した。本年はさらに60頭に手術を行い、GS高用量投与群(2mg/kg/day)とした。従って、昨年と合わせて(1)GS高用量投与群60頭(2)GS低用量投与群(1mg/kg/day)60頭(3)コントロール群(非投与群)60頭となった。術後の生存率も問題なく、予定目標数に到達している。GS低用量投与群とコントロール群を50週目にsacrificeして、各群における食道の炎症の有無を判定し、腫瘍が発生している場合は腫瘍の個数、大きさを測定した。GS低用量投与群の方がコントロール群に比較して、明らかに炎症の程度が軽く、腫瘍性病変の発生は低率で、大きさも小さかった。現在、病理組織学的な炎症、円柱上皮化生、異形成、腺癌の有無を調べている。またFXR, cyclooxygenase-2,PPARαのmRNAならびにタンパクの発現や、prostaglandin E2の産生量を検討するための準備をしている。今後は、20週、40週におけるモデル、GS高用量投与群についても、同様に検討して行く予定である。当科で開発された、ラットの胃全摘後十二指腸液食道逆流再建手術モデルを用いて、farnesoid X receptor (FXR)のアンタゴニストであるガグルステロン(GS)による食道発癌への影響を検討するため、ラットを用いて十二指腸食道逆流モデルを作成した。これらの動物を次の3群に分けて検討した。(1)GS高用量投与群60頭(2)GS低用量投与群(1mg/kg/day)60頭、(3)コントロール群(非投与群)60頭となった。ラットを50週目に屠殺して、各群における食道の炎症の有無を判定し、腫瘍が発生している場合は腫瘍の個数、大きさを測定した。病理組織学的な過形成の発生頻度はコントロール群、GS低用量投与群、GS高用量投与群ともに100%で差は認められなかった。

円柱上皮化生はコントロール群75%に対して、GS低用量投与群80%、GS高用量投与群83%と差がなかった。また異形成、癌の頻度もコントロール群がそれぞれ50%,38%に対して、GS低用量投与群は40%,50%、GS高用量投与群は40%,33%といずれも差が認められなかった。癌の種類は、扁平上皮癌、腺癌、腺扁平上皮癌、粘液癌がほぼ同じ頻度で見られたが、各群で発生率に差は認められなかった。免疫組織学的検討ではFXR, cyclooxygenase-2, PPARαの発現に3群間で差はみられなかった。以上の結果から、ガグルステロンはラット胃全摘後十二指腸液食道逆流モデルにおいて、腺癌の発生を抑制することはできないことが判明した。
小・中学校における水環境を素材とした環境教育教材の開発とその実証的研究

「琵琶湖の富栄養化」と「酸性雨」を素材とした小・中学校における水環境学習の教材開発,学習指導案の作成を学校現場の教諭の協力を得ておこない,実践授業を通して実証的に研究を進めた。できるだけ,体験・実験実習を通して科学的に理解できる学習を目指して検討した。この過程で児童・生徒が野外や教室内で容易に使うことができる測定器具を開発したり、安価な市販の器具の環境学習への応用を試みた。製作した器具には,簡易比色計,長い透視度計,応用した器具には,ph比色計(指示薬),簡易ろ過器などがある。さらに「富栄養化」学習の中で,リン酸イオンの検出液(モリブデンブルー法)を使った授業を展開したが,楽しく理解しやすい授業として推奨できる。また,ごく普通に家庭で使っている調味料や野菜のしぼり汁などを使って,植物プランクトンの培養を小学校レベルでもできる工夫もした。学校における環境教育を支援することを目的に,琵琶湖流入河川水の水質をモニタリングし,マップとして表した。調査・水質分析に現職教員の協力を得たが,地域環境を素材とした教材の開発に有効な結果が得られた。今後も,学習指導案に検討を加え,環境学習のモデルとなる授業を指示するとともに,他教科との関連を検討しながら,総合教科(環境科)を目指して研究を続けていく予定である。また,環境学習のための基礎データを得るために,雨水を継続的に分析しデータを得,児童・生徒にわかり易い表現方法に関する基礎検討を行った。将来,小・中学校における環境学習に活かしていくことができるであろう。「琵琶湖の富栄養化」と「酸性雨」を素材とした小・中学校における水環境学習の指導案を学校現場の教諭の協力を得て作成し,実践授業を通して実証的に研究を進めている。できるだけ,体験・実験実習を通して科学的に理解できる授業を目指して検討し,公開授業を行ってきた。ここ6年間に環境学習のための単元を構成し,学習指導案を33(本年度4)作成し,公表してきた。この過程で児童・生徒が野外や教室内で容易に使うことができる測定器具を開発したり,市販の器具の環境学習への応用を試みた。製作した器具には,簡易比色計,長い透視度計,応用した器具には,pH比色計,簡易ろ過器などがある。さらに,「富栄養化」学習の中で,リン酸イオンの検出液(モリブデンブルー法)を使った授業を展開しているが,楽しく理解しやすい授業とて推奨できるものである。また,植物プランクトンの培養を小学校レベルでもできるような工夫もした。来年度は,学習指導案に検討を加え,環境学習のモデルとなる授業を提示するとともに,他教科との関連を検討しながら,総合教科(環境科)を目指して研究を続けていきたい。また,環境学習のための基礎データを得るために,酸性雨と琵琶湖の水質を分析しデータを得ている。1991年来,24時間ごとに降水をサンプリングし,主要イオンと懸濁態および溶存態の窒素・リンについて分析を続けている。ここ1年簡に得た106個のサンプルを加え,合計512個のサンプルについてデータを蓄積してきた。来年度はこれらのデータを経年変化,季節,気象,各成分の起源といった観点から解析し,分かり易い表現方法に関する基礎検討を行い,小・中学校における環境学習に活かしていく予定である。できるだけ,体験・実験学習を通して科学的に理解できる学習を目指して検討した。この過程で児童・生徒が野外や教室内で容易に使うことができる測定器具を開発したり,安価な市販の器具の環境学習への応用を試みた。製作した器具には,簡易比色計,長い透視度計,応用した器具には,pH比色計(指示薬),簡易ろ過器などがある。

さらに,「富栄養化」学習の中で,リン酸イオンの検出液(モリブデンブルー法)を使った授業を展開したが,楽しく理解しやすい授業として推奨できる。また,ごく普通に家庭で使っている調味料や野菜のしぼり汁などを使って,植物プランクトンの培養を小学校レベルでもできる工夫もした。学校における環境教育を支援することを目的に,琵琶湖流入河川水の水質をモニタリングし,マップとして表した。調査・水質分析に現職教員の協力を得たが,地域環境を素材とした教材の開発に有効な結果が得られた。今後も,学習指導案に検討を加え,環境学習のモデルとなる授業を提示するとともに,他教科との関連を検討しながら,総合教科(環境科)を目指して研究を続けていく予定である。また,環境学習のための基礎データを得るために,雨水を継続的に分析しデータを得,児童・生徒にわかり易い表現方法に関する基礎検討を行った。将来,小・中学校における環境学習に活かしていくことができるであろう。
敗血症によって惹起される細胞性免疫能の抑制状態の解析と治療

敗血症からの回復期に粘膜免疫系で生じる免疫能の低下の病態解析を行った。マウスに実験的敗血症を誘導し回復したマウスの粘膜免疫法によって免疫を行い抗原特異的な免疫応答を解析するという手法を基本とした。敗血症を経たマウスでは粘膜免疫法に対する抗原特異的な免疫応答が細胞性免疫能の誘導の点で低下していることが組織適合抗原複合体四量体を用いた解析によって見出された。さらにPD-1, PD-L1経路に介入して粘膜免疫能の低下の改善を試みた敗血症からの回復期に粘膜免疫系で生じる免疫能の低下の病態解析を行った。さらにPD-1, PD-L1経路に介入して粘膜免疫能の低下の改善を試みた敗血症によって生じる細胞性免疫能の低下を評価するための実験系の樹立と更に進めてこの系の解析を行った。実験計画では細胞性免疫能の評価を行うために実験計画ではリステリア感染モデルを予定していたが、感染モデルによる評価が困難であることが判明して、これを腫瘍の排除モデルに変更して実験系の確立を行った。敗血症によって生じる免疫抑制状態を実験的に再現するために使用した慢性的敗血症モデルは計画通り、マウスにおける腹膜炎に誘発される敗血症モデル(Cecal Liation & Puncture:以下CLPと略)を軽症化させることにより作成した。CLP誘導後10日でCLPから回復したマウスを対象として以後の解析を行った。対照群としては開腹のみを行ったマウスを設定した。これらマウスに経鼻的に鳥卵白アルブミン(OVAと略)をアジュヴァントとともに投与して免疫する。追加免疫を5日後に行いその1週間後に免疫系の評価を行った。1週間後にOVAを腫瘍抗原として発現する腫瘍細胞であるEG7を接種すると腫瘍の排除能はCLP誘導群では対照群と比較して低下していた。次に腫瘍の排除に重要となる腫瘍抗原(OVA)特異的CD8T細胞の動態をOVAに対するMHC class Iテトラマーを用いて解析すると、CLP誘導群でも対照群と有意差なく腫瘍抗原特異的T細胞が誘導されていることが分かった。現在は腫瘍抗原(OVA)特異的なCD8T細胞の機能を、細胞障害性をはじめとしてCLP群と対照群の間で比較検討している(1)敗血症によって惹起される免疫抑制状態のモデルの作成と解析腹膜炎誘発性敗血症による実験的敗血症をマウスに導入し粘膜免疫応答の動態解析を行った。本年度はこれに引き続き生体防御という観点でこれを明らかにするために、腫瘍の排除モデルを確立しその解析系の確立に務めた。粘膜アジュバントとモデル抗原のOVAを経粘膜的に投与して免疫するという粘膜免疫法の実験モデルをもちい、成立してくる免疫応答をT細胞免疫応答についてはMHCテトラマーを用いた解析によりとB細胞免疫応答についてはOVA特異的免疫グロブリンの検出の二側面から解析を行った。粘膜免疫応答は、敗血症によりT細胞免疫応答と抗体産生の両面で低下していた。この個体レベルでの免疫系の生体防御への影響を解析するために、OVAを腫瘍抗原として発現する腫瘍EG7に対する排除能を評価した。通常マウスではOVAに対する免疫が成立してEG7は排除されるが、敗血症マウスではOVAに対する免疫の成立が弱いためEG7は増大した(2)ミダゾラムの樹状細胞に対する抑制作用が個体レベルでの免疫応答に与える影響の解析前年度は樹状細胞によって引き起こされる免疫反応は、臨床試用薬剤であるミダゾラムによって制御できる可能性を示した。本年度はこれに引き続き生体防御という観点で、樹状細胞機能のミダゾラムによる制御の可能性を追求するために、上に確立した腫瘍の排除モデルを用いた解析法の確立に務めた。OVAを腫瘍抗原としてもつ腫瘍細胞セルラインEG7を用い、これをマウスに移植すると腫瘍は増大しつづける。マウスにOVAを取り込ませた樹状細胞によって免疫することで、EG7腫瘍はマウスから排除されるという系を作成した。更にこの系の解析系としてOVAに対する抗原特異的応答の検出系を確立した。OVA特異的ELISPOT法によるIFN-gamma産生T細胞の検出系、OVA特異的テトラマーによるOVA特異的なCD8特異的T細胞の検出系、OVA特異的なIgM,IgGの検出系め3種類を確立した。現在はこれらの検出系を用いて腫瘍細胞に対する樹状細胞による免疫の結果を解析している。敗血症によって生じる粘膜免疫応答の変化の解析。マウスに実験的敗血症(盲腸結紮穿孔腹膜炎モデル:以下CLPと略称)を用いて敗血症を誘導した。マウスに誘導するCLPの死亡率は最終的に20%程度となるように盲腸を穿孔する穴を27G針を用いて穿孔して調節した。このモデルと開腹した後すぐに閉腹する偽手術群を対照群として設定して比較を行った。粘膜免疫応答の評価としては粘膜アジュバントであるコレラ毒素と共にモデル抗原である鶏卵白アルブミン(以下OVAと略)を経鼻粘膜的に投与する経粘膜的免疫法に対する免疫応答の成立を測定するという方法をとった。

成立するOVAに対する免疫応答はOVAに対する主要組織適合抗原複合体四量体(MHCテトラマー)を用いて細胞性免疫能を検出し、血中に検出されるOVA特異的免疫グロブリンによって液性免疫応答を評価した。CLP導入後1週間で敗血症から回復したマウスに対して2回経鼻粘膜的にOVAを免疫しその後1週間後に免疫応答を評価した。OVA特異的な免疫グロブリンに関してはCLP群で差は無かったのに対して、OVA特異的なテトラマー陽性細胞の数はCLP群で低下していた。さらにOVA特異的テトラマー陽性細胞で産生されるTh1型サイトカインであるIFN-gも低下していた。これらから敗血症によって粘膜免疫的な免疫の成立は低下が考えられた。この免疫機能低下が個体レベルでの生体防御に影響しているのかを評価するためにOVAを腫瘍抗原として持つEG7腫瘍細胞を接種しその増大を評価するという実験を行った。偽手術群では腫瘍の増大は抑制できたのに対して、CLP群ではOVAを腫瘍抗原として持つEG7の増大は抑制されなかった。また各群のマウスの脾細胞中のEG7に対する細胞傷害性を比較するとCLP群ではEG7への細胞傷害性は低下した。以上の結果から敗血症において粘膜免疫応答が低下することが示された計画の実行のためのモデルを感染症モデルから、腫瘍免疫モデルに変更をおこなったが、当初予定している細胞性免疫能を中心とした解析はモデルを変えても順調に進行しており今後もこの方向性で研究を継続する予定である。本年度は樹状細胞によって免疫応答を修飾する試みを進めていく24年度が最終年度であるため、記入しない。当初は敗血症後にリステリア肺炎を誘導するというモデルを用いた解析を計画していた。しかし敗血症後のリステリア感染は重症化が著しく免疫系の解析をするのには困難な程死亡率が高く、病態解析を行うのは困難であった。そこで生体防御機能の解析には敗血症から回復したマウスにたいして、モデル抗原を腫瘍抗原として発現する腫瘍を接種して腫瘍免疫を解析するという実験系を用いた実験に変更した。24年度が最終年度であるため、記入しない。
リグニン分解能を有するバクテリアによるセルロース系バイオマスの生物的前処理

Ureibacillus thermosphaericusによる生物的脱リグニンを行うために、まず、Thermobifida fsucaのCel9Bのcellulose binding domainを用いて、糖化率と高く相関する脱リグニン効果を迅速に評価する方法を確立した。本菌はリグニン分解に関与する酵素として、Mn-peroxidase、Cu-amine oxidaseなどをもっていた。本菌は7種のアミノ酸、2種のビタミンおよび無機塩からなる培地で培養することができ、グルタミン酸を添加しながら培養することによってリグニン分解酵素を継続的に生産させることができた。粒径2mm以下に粉砕したトウモロコシ穂軸にUreibacillus thermosphaericusを乾燥重量比で1/10添加し、水分50%を保ち、50°Cで好気的に120時間処理したところ、糖化率を35%から58%に向上させることができた。走査型電子顕微鏡で観察すると、細胞壁の表面構造が壊れ、繊維状物質が表面に露出していた。しかし、リアルタイムPCRで本菌の生菌数を追跡したところ、処理中に本菌は次第に死滅していくことがわかった。菌体あたりのリグニン分解能を向上させるため、栄養条件の検討が必要と考え、まず、17種アミノ酸、ビオチン、チアミンおよび無機塩から成る合成培地を作製した。この培地で本菌を培養したところ、菌体増殖が停止した後でリグニン分解酵素として、マンガンペルオキシダーゼ(以下MnP)が誘導され、この活性は培養における通気条件によって大きく影響されることがわかった。培地のアミノ酸を分析した結果、MnP活性が抑制される条件においては、Ser, Ala, Pro, Val, Cys, Ile, Trp. Met, Lysの濃度が高いことがわかった。このうち、Val, Pro, Cysについては、その添加によってMnP活性が抑制されることが確認できた。適切な種類と濃度のアミノ酸を供給することによって、脱リグニン処理中のMnP活性を高める実験を行う予定である。Thermobifida fsucaのcellulaseE1のセルロース結合ドメイン(CBD)を大腸菌にクローニングして調製し、これを蛍光標識したF-CBDを調製したところ、F-CBDはセルロースディスクに対して吸着定数1×10^5M^<-1>、解離速度定数9×10^5s^<-1>で結合した。単位バイオマス当たりのF-CBD結合量は糖化率と高く相関し、脱リグニンの程度の評価法として適切であることがわかった。今後は、単位バイオマス当たりのF-CBD結合量を経時的に測定し、その増加速度をリグニン分解比活性と定義し、これにより本菌の脱リグニン効果を評価する。リグニン分解能を持ち、糖を全く資化しないUreibacillus thermoshaericusによるバイオマスの省エネ低コスト脱リグニン技術を確立するため、本菌が生産するリグニン分解関連酵素を特定した。本菌の培養上清に含まれるタンパク質を二次元電気泳動で分離し、ペプチドフィンガープリントを行ったところ、S-layer protein、proteaseの他に、oxidaseと推定されるタンパク質が同定できた。培養上清から、リグニン基本骨格と類似構造を持つguaiacol、caffeic acid、pyrogallolを発色させる酵素を陰イオン交換クロマトグラフィーで分画したところ、caffeic acidおよびpyrogallolを基質とする酵素活性は同じ画分に溶出したが、guaiacolを基質とする酵素活性は異なる画分に溶出した。前者の活性画分を回収し、さらに疎水クロマトグラフィーで精製した後、native PAGEで分離し、pyrogallolで活性染色したところ、2本のバンドが観察された。うち一本は酸化還元関連酵素で、残りの一本はこれまでに報告がないタンパク質であった。また、二次元電気泳動ゲルを活性染色したところ、S-layer proteinの大きなスポットの近傍に染色スポットがあり、分子サイズから考えて上述の3つのタンパク質とは異なるものであった。以上のことから、oxidaseが過酸化水素を供給し、他3つの酵素(何れもperoxidase活性をもつ)が環境中の低分子をラジカル化することで、リグニンを分解していると考えられた。今後は上述の4つのタンパク質をクローニングして大腸菌等で発現させ、再構成系を構築するなどしてU.thermoshaericusの脱リグニン機構を解明するとともに、その能力の増強を目指す。リグニン分解能を持ち、糖を全く資化しないUreibacillus thermosphaericusによるバイオマスの省エネ低コスト脱リグニン技術を確立するため、迅速な脱リグニン評価指標の確立、リグニン分解関連酵素の特定、分解活性の増強を行った。まず、脱リグニンによる糖化率向上を迅速に評価する指標としてThermobifida fsucaのcellulaseE1のセルロース結合ドメイン(CBD)を大腸菌にクローニングして発現させ、これを蛍光標識したF-CBDを調製した。F-CBDはセルロースに特異的に結合し、単位バイオマス当たりの結合量は糖化率と高く相関し、脱リグニンの程度の評価法として適切であることがわかった。

本菌の培養上清に含まれるタンパク質を各種クロマトグラフィーと電気泳動で分離して同定したところ、peroxidase活性をもつタンパク質3種とoxidaseと推定されるタンパク質が同定できた。oxidaseが過酸化水素を供給し、他3つの酵素が環境中の低分子をラジカル化することで、リグニンを分解していると考えられる。本菌はGlu、Pro、Asp、Met、Ile、Leu、Val、ビオチン、チアミンおよび無機塩を含む培地で培養可能で、定常期以降にリグニン分解酵素を生産する。その後、Gluを逐次流加すれば分解酵素生産を長時間持続することができた。また、当初コーンコブの脱リグニン処理において、糖化率60%を達成するために乾燥重量としてバイオマスの1/10の菌体を要していたが、Gluを適切に供給することで、必要菌体量を当初の1/10に削減することができた。今後は上述の4つのタンパク質をクローニングして大腸菌等で発現させ、再構成系を構築するなどしてU.thermosphaericusの脱リグニン機構を解明するとともに、その能力の増強を目指す。
原子炉過酷事故時の炉心溶融回避のための安全系の確実な作動保証に関する研究

本研究案において提案した非常用復水器や静的炉心注水系に見られるU字配管系の曲がり部を対象とした気液二相流実験装置を構築した。1インチ径配管内にて生じる全気液二相流動様式の可視化ならびに励振力測定を可能とした。また、管内液膜厚さとの関連のあるボイド率変動を計測するためのインピーダンスセンサと圧力センサも設置し、非常用注水系配管部にて生じる管内気液二相流の様々な流動様式におけるデータベースを構築した。本実験装置により取得したデータベースから、二流体モデルを基に、1インチ配管系における入り口境界条件から気液二相流体励振力スペクトルを予測するモデルを開発した。本研究課題では,原子炉過酷事故時の炉心溶融回避のための安全系の確実な作動保証を目的として,非常用復水器(IC)と静的格納容器冷却系(PCCS)の作動保証と最適化,及び,沸騰水型炉の事故時に想定される圧力や温度相当での作動試験,流体励振力予測ツールの開発を目的としている.具体的には,高温高圧蒸気が冷却系内において急速に凝縮される際の流体的挙動を解明するため,局所圧力変動や案内ボイド率といったパラメータが測定可能な実験装置を製作し,広範囲におけるデータベース構築を行う.本年度の研究実績は下記の通りである.まず,当該分野における研究動向を把握するため,入念なLiterature Reviewを行い,レビュー論文を執筆した.次に,実験装置建設に伴う成果を下記に記す.(1)管内ボイド率計測装置の開発: ICやPCCS管内にて生じる気液二相流特性を検証するため,インピーダンスボイド率計測器の設計,及び,作製を行った.ボイド率は管内二相流中に存在する空気相の割合を示すパラメーターであり,二相流動特性を検証するにあたり,最も重要なパラメーターである.本装置により,空気-水系における管内ボイド率計測が可能となった.計測に必要な電子回路基盤の製作も完了し,装置の校正テストを行った.(2)管内気液二相流励振力測定ループ設計・建設:安全系において生じる流動現象を再現するための励振力評価試験装置の設計を完了し,建設に着手した.現象をシンプル化するため,U字配管形状の上下対称部位であるエルボー形状に着目し,測定対象とすることとした.データベース構築に必要な計測機器(3軸力覚センサー,圧力計,流量計)や,流動様式可視化を目的としたアクリル配管の作製,ステンレス製配管エルボー部の作製,貯水タンクといった実験ループに必要な機材を揃えた.平成27年度は、北海道大学工学研究院工学院原子力システム安全工学研究室の実験室において「原子炉過酷事故時の炉心溶融回避のための安全系の確実な作動保証に関する研究」にて提案した実験装置構築を完了した。本実験装置においては、研究提案の対象である非常用復水器や静的炉心注水系に見られるU字配管系の曲がり部を対象とし、1インチ配管系内にて生じる全流動様式の可視化ならびに励振力測定を可能とした。励振力測定部位はステンレス製エルボーを採用し、共振を回避するため二相流の周波数領域よりも高い固有振動数に設定した。また、励振力と気液二相流形態の関連性を調査するため、管内液膜厚さを含めた管内ボイド率変動を計測するためのボイド率計測器を設計し、ドリフトフラックスモデルをベースとした校正曲線を基にデータベース取得に用い、正常な作動を確認した。以上に加え、圧力センサも配管エルボー部に設け、管内気液二相流にて見られる様々な流動様式におけるデータベースを構築した。本実験装置により取得したデータベースから、二流体モデルを基に、入り口と境界条件のみから気液二相流流体励振力スペクトルを予測モデルを作成した。垂直上昇二相流においては、1インチ配管系において最も顕著な振動を引き起こすと予想されるスラグ流領域において、最大励振力振幅、卓越周波数を概ね良い精度で予測可能とした。本研究課題にて開発された1インチ曲がり配管部での励振力ツールは、全気液二相流動様式において適用可能であるため、管内二相流現象が生じる化学プラントや工業用熱交換器等の安全設計の観点からも役立つものと期待される。交付申請書に記載した平成26年度計画通りに進展しているため,おおむね順調に進展していると考える.熱流体工学平成26年度は,北海道大学工学部建物における耐震工事の都合上,実験室移設を余儀なくされたが,再移設完了後の27年度6月には実験ループの取り付けを完了し,冷却系作動実験,及び,データベース構築に着手する予定である.当初の研究計画通り,本年度は広範囲な流動条件における実験を行う.まずは,空気-水系から始め,凝縮現象を除いた二相流動特性を検証する.

次に,蒸気源であるボイラーを用いて蒸気-水系の実験を行い,凝縮を伴った励振力評価を行う.以上,2種類の実験により構築されたデータベースを基に,モデル構築,励振力予測ツールの開発を行う予定である.本年度に得られた研究成果は,随時,学術論文や学会発表を通して公開し,国民に還元していく予定である.実験設備を準備するにあたり,インターネットを利用し,なるべく安価な資材を選定するようにした.そうした積み重ねにより生じた630円である.平成27年度に購入を予定している計測機器,及び,実験室工事費用にあてる予定である.
精子幹細胞における活性化酸素産生の転写制御機構の解明

精子幹細胞は精子の源となる細胞である。活性酸素(ROS)は生殖細胞に悪影響を及ぼすと考えられてきたが最近我々はNox1遺伝子によるROS産生が精子幹細胞の自己複製分裂に必要であることを見出した。本研究では精子幹細胞におけるROSがどのようなシグナル伝達を行い自己複製を促進するのかを解明することを目的とする。本年度は実施計画通りに進捗した。p38 Mapkと協調してROS産生およびNox1遺伝子の発現に必要な分子のスクリーニングを実施しBcl6b遺伝子を同定した。具体的には以下の4項目について実験を行った。1p38alpha KO GSと野生型GSのマイクロアレイ2p38alpha KO GSと野生型GSのRNAシーケンス3Bcl6b遺伝子をOE/KDした野生型GSでのROS産生4p38alpha遺伝子をOE/KOした野生型GSでの免疫染色5Bcl6b遺伝子をOE/KDした野生型GSでNox1遺伝子の発現誘導に及ぼす影響解析平成31年度計画: GS細胞におけるミトコンドリア由来ROSの影響の解析ROSはミトコンドリアからも産生されておりNox1由来のROSがどの程度GS細胞の自己複製に影響があるかは明らかになっていない。Nox遺伝子がどの程度GS細胞におけるROS産生に寄与するかを明らかにする為、Nox1分子を導入しROSの再構成実験を行い、通常のサイトカインによりGS細胞の増殖誘導を試みた場合と比較する。Noxと複合体を形成する遺伝子の発現誘導をrealtime PCRにより確認し、誘導されてきた遺伝子をNox1と共にGS細胞へ導入し自己複製因子のない状態でのROS産生を再構成する事でROS産生に必要な最低限の制御因子を同定する。更にミトコンドリア由来ROSを特異的に染色する蛍光分子を用いて1自己複製刺激時にどの程度ミトコンドリア由来ROSが発生するか、2Nox遺伝子を強制発現時にどの程度ミトコンドリアのROSに影響するのかを検討する。更に3ミトコンドリアに局在するカタラーゼをGS細胞に発現させ、ミトコンドリアのROS産生を抑制し精子幹細胞の自己複製がどの程度影響を受けるのかを確認する。本年度はp38 Mapk遺伝子改変マウスの解析を実施した。p38alphaのconditional KOマウスを大津欣也博士より導入し、精原細胞においてCreを発現するStra8-Creマウスと交配した。作成したp38alpha欠損マウスにおける精子形成の状態をGFRA1(未分化精原細胞マーカー),KIT(分化型精原細胞マーカー), SYCP3(減数分裂細胞マーカー)を用いた免疫組織化学で評価した。また、p38alpha conditional KOマウスをGFPを発現するマウスと交配し、ドナーとしてのマーカーを導入した。交配して生まれてきたホモのconditional KOマウスの精巣細胞を酵素処理によりバラバラにし、試験管内でCreを発現するアデノウイルスを感染させ、ブスルファン投与にて不妊となったマウスの精細管内へとマイクロンジェクションを行い、移植後2ヶ月後に精子幹細胞活性をコロニー数およびホストマウスの精巣の精子形成を含む精細管数を測定した。更にp38alphaのシグナル伝達機構を解析するためにp38alphaのconditional KOマウスの精巣からGS細胞の樹立を行った。このGS細胞よりRNAとタンパク質を回収した。このRNAを用いてp38alpha conditional KOマウスGSと野生型GSのマイクロアレイを実施しp38alpha欠損により発現が低下する分子を検索し候遺伝子を抽出した。現在それらの候補遺伝子について更に解析を進めている。1p38alpha KO GSと野生型GSのマイクロアレイ2p38alpha KO GSと野生型GSのRNAシーケンス3Bcl6b遺伝子をOE/KDした野生型GSでのROS産生4p38alpha遺伝子をOE/KOした野生型GSでの免疫染色5Bcl6b遺伝子をOE/KDした野生型GSでNox1遺伝子の発現誘導に及ぼす影響解析平成30年度は当初の計画通りNox1制御シグナルの同定を実施する。以前の我々の報告でp38 MapkのinhibitorであるSB203580によりGS細胞の増殖が制御されNox1の発現が低下する事を見出した。これまでにp38 MapkがGS細胞におけるNox1の発現およびROSの発生に必要である事は判明しているが我々の予備実験では活性型p38 Mapkの強制発現のみではROS産生およびNox1の発現には十分でないという結果を得ていた。この為、p38 Mapkと協調して働く分子が存在してGS細胞のNox1遺伝子によるROS産生を促進していると予想した。

この予想に基づき、今後はp38 Mapkと協調してROS産生およびNox1遺伝子の発現に必要な分子をさらに同定することでROS産生に関わる分子をより大きなスケールで検索する。今回の実験では小分子化合物の自動スクリーニングを行う。現在のところSelleck chemical (476個)、calbiochem(65個)、およびPrestwick社(1120個)由来のケミカルライブラリーが入手可能である。これらの小分子化合物を用いてスクリーニングを二段階で行う予定である。先ず第一のステップではlucigeninの発行を利用してこれらの薬剤のうちROS産生を抑制する分子を同定する。次のステップでは候補分子が実際にNox1遺伝子の発現抑制を引き起こすかどうかを調べる為にRealtime PCR法により確認を行う。候補遺伝子の選定後、shRNA及びCrisper-Cas9を発現するレンチウィルスによりGS細胞におけるROS産生及びNox1遺伝子の発現誘導に及ぼす影響を解析する。これらの分子がキナーゼや転写因子であった場合は活性型の分子を作成し、p38 Mapk(Mapk14)と同時に遺伝子導入する事でその影響を調べる。平成31年度計画: GS細胞におけるミトコンドリア由来ROSの影響の解析ROSはミトコンドリアからも産生されておりNox1由来のROSがどの程度GS細胞の自己複製に影響があるかは明らかになっていない。Nox遺伝子がどの程度GS細胞におけるROS産生に寄与するかを明らかにする為、Nox1分子を導入しROSの再構成実験を行い、通常のサイトカインによりGS細胞の増殖誘導を試みた場合と比較する。Noxと複合体を形成する遺伝子の発現誘導をrealtime PCRにより確認し、誘導されてきた遺伝子をNox1と共にGS細胞へ導入し自己複製因子のない状態でのROS産生を再構成する事でROS産生に必要な最低限の制御因子を同定する。更にミトコンドリア由来ROSを特異的に染色する蛍光分子を用いて1自己複製刺激時にどの程度ミトコンドリア由来ROSが発生するか、2Nox遺伝子を強制発現時にどの程度ミトコンドリアのROSに影響するのかを検討する。更に3ミトコンドリアに局在するカタラーゼをGS細胞に発現させ、ミトコンドリアのROS産生を抑制し精子幹細胞の自己複製がどの程度影響を受けるのかを確認する。海外に発注した試薬の納品に遅れが生じた為。