hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ocular surface疾患の予後を予測できるプロテインチップの開発

重症眼表面疾患患者の涙液中サイトカインの定量による病態評価昨年度に引き続き、重症眼表面炎症性疾患患者(Stevens-Johnson症候群、眼類天疱瘡、化学外傷)から1-数μlの涙液を採取し、プロテインチップを用いた炎症性サイトカインの定量を行った。本年度は眼表面疾患の臨床経過と涙液中インターロイキン8(IL-8)濃度との関連に注目し、細隙灯顕微鏡による結膜充血や角膜上皮欠損などの炎症に関連する所見と、同一観察時に採取した涙液中のIL-8濃度との関連をレトロスペクティブに検討した。その結果、急性期のStevens-Johnson症候群や化学外傷で遷延性上皮欠損や強い結膜浮腫や充血を伴っている症例において涙液中IL-8が上昇しているのみならず、臨床的には炎症が鎮静化されていると思われた症例においてもIL-8が上昇している場合があった。Stevens-Johnson症候群や眼類天疱瘡では慢性期にも炎症が遷延し、時として急性増悪を生じることがあるが、涙液中IL-8濃度の変化は臨床所見の悪化を予測する指標となる可能性が考えられた。さらに急性期Stevens-Johnson症候群の同一患者の両眼に異なる術式の眼表面再建術を行い、術後の涙液中IL-8濃度を定期的に定量した結果、培養角膜上皮シートを用いた再建術後には角膜輪部移植後よりも速やかに涙液中IL-8が正常化することが明らかとなった。培養角膜上皮シート移植術は上皮欠損を速やかに修復するために術後早期から眼表面の消炎が得られることが報告されているが、IL-8の正常化は培養角膜上皮シート移植の有用性を客観的に示すデータと考えられた。本研究結果より、重症眼表面炎症性疾患における涙液中サイトカインの定量は、臨床的な細隙灯顕微鏡所見と組み合わせて評価することによって、数値化が難しい眼表面炎症を定量的に評価し、病態解明および予後を予測するために有用な方法であることが示唆された。1.重症眼表面炎症性疾患患者における涙液中インターロイキン8の検出と定量重症眼表面炎症性疾患患者(Stevens-Johnson症候群、眼類天疱瘡、化学外傷)、眼表面疾患のない眼科患者(白内障患者など)、および健常人ボランティアからマイクロキャピラリーを用いて1-数μlの涙液を採取し、プロテインチップを用いてインターロイキン8(IL-8)濃度を測定した。Stevens-Johnson症候群、化学外傷の急性期には、眼表面疾患のない眼科患者および健常人ボランティアと比較して高濃度のIL-8が検出された。また、眼表面再建術後にはStevens-Johnson症候群および眼類天疱瘡で高濃度のIL-8の発現を認めたが、これらのIL-8は炎症の軽減とともに経時的に減少した。これらの結果より、患者涙液中に存在する高濃度のIL-8は、眼表面炎症性疾患の病態形成に関わっている可能性が高いと考えられた。2.重症眼表面炎症疾患患者における薬剤耐性菌の検討眼表面炎症が遷延状態にあるStevens-Johnson症候群、眼類天疱瘡患者9人より、両眼結膜嚢ならびに鼻腔前庭擦過検体をあわせて32検体採取し、細菌を分離・培養した。ブドウ球菌が検出された場合には。薬剤感受性試験、遺伝子型、エンテロトキシン型分析による型分類を行った。その結果、7人の患者から採取した24検体から薬剤耐性ブドウ球菌(MRSA, MR-CNS)が検出された。また薬剤感受性検査およびエンテロトキシン型分類の結果からは、眼科患者に特徴的なMRSAが存在する可能性が考えられた。Stevens-Johnson症候群や眼類天疱瘡などの重症眼表面炎症性疾患では、高率に結膜嚢や鼻腔前庭に薬剤耐性を獲得した常在細菌が存在することが明らかとなり、眼表面炎症と深く関わっていることが示唆された。培養角膜上皮シート

移植術は上皮欠損を速やかに修復するために術後早期から眼表面の消炎が得られることが報告されているが、IL-8の正常化は培養角膜上皮シート移植の有用性を客観的に示すデータと考えられた。本研究結果より、重症眼表面炎症性疾患における涙液中サイトカインの定量は、臨床的な細隙灯顕微鏡所見と組み合わせて評価することによって、数値化が難しい眼表面炎症を定量的に評価し、病態解明および予後を予測するために有用な方法であることが示唆された。
転写とDNA修復のカップリングの分子機構の研究

1.TFIIHのキナーゼ活性の基質特異性と転写におけるPolIIの特異的リン酸化の解析転写とPolII最大サブユニットのC末に存在する7個のアミノ酸の繰り返し構造(CTD)のセリン残基リン酸化との関連は、生化学的また生体内での多くの証拠が示されてきた。このCTDリン酸化を転写開始の際に行うTFIIHの基質特異性とPolIIの転写との関連を追及した。ヒトTFIIHを用いてCTDリン酸化部位を決定したところ、CTD配列の2番目と5番目のセリン残基をリン酸化した。特に5番目のセリンのリン酸化は転写開始複合体の中でTFIIEにより特異的に誘導され、転写伸長への移行との関連性が考えられる。2.TFIIHの欠損に起因する遺伝病患者細胞からの欠損TFIIHの活性の解析TFIIHは、紫外線等によるDNA傷害の修復にも関与し、9個のサブユニットの2個XPBとXPDの一方の変異で発がんを伴う色素性乾皮症(XP)が発症する。我々は、TFIIHのXPBあるいはXPDに変異を有する患者の欠損TFIIHと正常なTFIIHの機能を比較した。すると、XPB変異TFIIHは転写活性に大きな低下が見られるが、PolIIリン酸化活性の低下は小さいこと、一方XPD変異TFIIHには、転写活性の低下とPolIIリン酸化活性の低下の両方が見られた。3.TFIIHのDNA修復反応における他の修復因子との協調的制御機能の解析我々は、これまでTFIIHが遺伝子DNA上の紫外線、薬剤等による傷害部位にDNA修復因子が集まり修復する際に、形成される複合体内で損傷を認識するXPCと損傷DNA部位の3'側を切断するXPGの2者に結合することを見出している。今回、これら因子がTFIIHと相互作用し、その際紫外線、薬剤により損傷を生じたDNAとの相互作用の効率は、損傷の無いものより高いことを明らかにした。
気相植物ジテルペノイドの受容・代謝メカニズムとその役割の解明

気相ent-カウレンが受容され活性ジベレリンまで代謝されるには、細胞外から細胞質、小胞体膜上への輸送と同上におけるP450酵素および細胞質での数段階の酸化を経ることになる。これまでの結果から、大過剰の気相ent-カウレンに暴露したシロイヌナズナ野生株およびent-カウレン欠損変異体(gal突然変異体)の両者とも徒長は起こらず、ent-カウレンからGA_12までの生合成中間体が蓄積する一方で、活性ジベレリンであるGA_4が同レベルに制御されることが明らかとなった。一方、活性ジベレリンがさらに酸素官能化された不活性ジベレリン類の定量を行ったところ、野生株およびgel突然変異体の両者とも同レベルでの不活性化が行われていることが明らかとなった。生理レベルでの微量気相ent-カウレンの暴露条件でも同レベルの活性・不活性ジベレリン量が得られたことから、従来は難しかった生理レベルでのent-カウレンおよびジベレリン取り込み実験において、新たな手法を提示できたと考えられる。並行して、気相ent-カウレン受容に関わる因子を明らかにするため、変異原処理したシロイヌナズナgal突然変異体から気相ent-カウレンを受容できない変異株の取得を検討した。スクリーニングによって選抜した十数の候補変異株について、ジベレリン生合成中間体類の要求性プロファイリングを行った。気相ent-カウレンでは矮性から回復できず、最初の酸化体であるent-カウレノール以降のジベレリン生合成中間体類によって良好に回復する変異株を数株得ることができた。また、数株においてはent-カウレン酸以降のジベレリン生合成中間体類によって矮性から良好に回復するものの、ent-カウレノールでは回復できないことが明らかとなったことから、これらの変異株ではent-カウレンからent-カウレン酸への代謝が欠損または抑制されていることが示唆された。これらの変異株については責任遺伝子の同定を行っている。ジベレリンの生合成中間体ent-カウレンは、色素体に局在するent-CDP合成酵素(CPS)とent-カウレン合成酵素(KS)によって生合成される。これまでにent-カウレンが数種の植物体から気相へ放出され、シロイヌナズナのga1およびga2突然変異体(CPS又はKS機能欠損株)は気相ent-カウレンを取り込み、矮性から回復することを見出している。本研究では植物から気相放出されたent-カウレンの受容メカニズム解明と活性ジベレリンまでの代謝の化学的実証を目的とする。気相ent-カウレンが受容され活性ジベレリンまで代謝されるには、細胞外から細胞質、小胞体膜上への輸送と同上P450酵素および細胞質での数段階の酸化を経ることになる。無標識気相ent-カウレンを取り込ませたシロイヌナズナga1突然変異体からのジベレリンの検出を試みた。矮性から回復した新鮮重10gのga1突然変異体から極微量ながらジベレリン類を検出できた。この結果を基に[17,17-d_2]ent-カウレンの取り込み実験を行っている。重水素標識体は代謝の際の同位体効果による取り込み率の低下が懸念されることから、同位体効果が少ないと考えられる^<13>Cラベルent-カウレンの調製も試みた。ent-カウレン過剰生産シロイヌナズナとMEP経路に特異的に取り込まれる[1-^<13>C]1-deoxy-D-xyluloseを用いる系によって、高効率で^<13>Cラベルされた十分量のent-カウレンを調製できたことから、これを用いて同様の取り込み実験を行う予定である。平行して、気相ent-カウレン受容に関わる因子を明らかにするため、変異源処理したga1突然変異体から気相ent-カウレンを受容出来ない変異株の取得を検討している。当年度はM_2種子を得たと共に、気相ent-カウレンによる矮性からの回復の有無を指標としたスクリーニングを開始した。これまでにent-カウレンが数種の植物体から気相へ放出され、シロイヌナズナのga1およびga2突然変異体(CPS又はKS機能欠損株)は気相ent-カウレンを取り込み、媛性から回復することを見出している。無標識気相ent-カウレンを取り込ませたシロイヌナズナga1突然変異体からジベレリンの検出を試みたところ、極微量ながらジベレリン類を検出できた。本年度はこの結果を基に[17,17-^2H_2]ent-カウレンの取り込み実験を行った。活性ジベレリンであるGA4および生合成中間体のGA_<12>およびGA_<24>への重水素標識の取り込みが確認できたことから、本実験により気相ent-カウレンから活性ジベレリンへの代謝が実証できた。さらに、放射性同位体標識ent-カウレンを用いて、ent-カウレンから活性ジベレリンに至る生合成主経路や分岐経路全体の量的・質的推移を検証する予定である。

平行して、気相ent-カウレン受容に関わる因子を明らかにするため、変異源処理したシロイヌナズナga1突然変異体から気相ent-カウレンを受容出来ない変異株の取得を検討している。当年度はM_2世代およびM_3世代の変異植物体について気相ent-カウレンや活性ジベレリンによる媛性回復の有無を指標としたスクリーニングを行い、十数の候補変異株を選抜した。現在、これらの候補変異株の詳細な分析を行っている。気相ent-カウレンが受容され活性ジベレリンまで代謝されるには、細胞外から細胞質、小胞体膜上への輸送と同上におけるP450酵素および細胞質での数段階の酸化を経ることになる。これまでの結果から、大過剰の気相ent-カウレンに暴露したシロイヌナズナ野生株およびent-カウレン欠損変異体(gal突然変異体)の両者とも徒長は起こらず、ent-カウレンからGA_12までの生合成中間体が蓄積する一方で、活性ジベレリンであるGA_4が同レベルに制御されることが明らかとなった。一方、活性ジベレリンがさらに酸素官能化された不活性ジベレリン類の定量を行ったところ、野生株およびgel突然変異体の両者とも同レベルでの不活性化が行われていることが明らかとなった。生理レベルでの微量気相ent-カウレンの暴露条件でも同レベルの活性・不活性ジベレリン量が得られたことから、従来は難しかった生理レベルでのent-カウレンおよびジベレリン取り込み実験において、新たな手法を提示できたと考えられる。並行して、気相ent-カウレン受容に関わる因子を明らかにするため、変異原処理したシロイヌナズナgal突然変異体から気相ent-カウレンを受容できない変異株の取得を検討した。スクリーニングによって選抜した十数の候補変異株について、ジベレリン生合成中間体類の要求性プロファイリングを行った。気相ent-カウレンでは矮性から回復できず、最初の酸化体であるent-カウレノール以降のジベレリン生合成中間体類によって良好に回復する変異株を数株得ることができた。また、数株においてはent-カウレン酸以降のジベレリン生合成中間体類によって矮性から良好に回復するものの、ent-カウレノールでは回復できないことが明らかとなったことから、これらの変異株ではent-カウレンからent-カウレン酸への代謝が欠損または抑制されていることが示唆された。これらの変異株については責任遺伝子の同定を行っている。
家族の体験を基盤としたクリティカルケアにおける悲嘆ケアガイドラインの開発

全国の救命救急センターを標榜する施設の救急外来に勤務する看護師を対象として、クリティカルケアにおける悲嘆ケアの実践状況やケアの実態について調査を行った。悲嘆ケアの実施においては、「家族が十分に悲しみを表現できているかを確認する」こととの相関が強いことが分かった。また、看護師の悲嘆ケアを内省する行為がケアの実施を高める可能性を示唆した。自由記述のテキストデータを分析した結果、救急外来経験年数と記述内容の特徴が見出された。看護師は経験年数を重ね、【介入の工夫】を持つ一方、【介入に伴うジレンマ】を抱きながら、救急外来の特徴を考慮した家族へのかかわりを模索していると考えられた。また、【介入の困難さ】がある中でも、家族の反応を注意深く見ながら【介入の工夫】を実践し、看護師間で【介入の共有】をして、救急外来という場で必要となる介入を思案していると考えられた。救急外来では、短時間のかかわりとなることから【ケアの評価の困難さ】が【介入の迷い】を生じさせている可能性もある。介入の困難さを感じながらも、家族にとって適した介入とするためにも、チームで振り返りの機会を設定することが重要であることが示唆された。これらの実態調査の結果を踏まえて、救急外来で家族を亡くした家族へのインタビュー調査を行った。結果として、【悲しみを感じる余裕がない】【覚えていないこともある】【経過を教えてほしい】【家族の思いを汲んだ対応がされる】【家族だけで過ごせる場がある】【遺品を丁寧に扱ってほしい】【亡くなった後の手配が不確かである】などが抽出された。家族の反応を見ながら過不足なくかかわることや、混乱している中で必要な情報がさりげなく提供されることを期待していることが示された。予測していた事ではあったが、家族の体験を理解するための面接調査の実施に難航した。これまで得た結果をもとに悲嘆ケアガイドラインに必要な内容を整理し、救急医療にかかわる医療従事者のヒアリングならびにフォーカスグループインタビューにより、実用可能なケアガイドラインとして洗練化していく予定である。家族の体験を基盤としたクリティカルケアにおける悲嘆ケアガイドラインを開発することを目的としている。本年度は、全国の病院における悲嘆ケアの状況やケアの実態について、救急外来において看護師が行っている悲嘆ケアの構造を明らかにし、援助を提供していく上での阻害要因や促進要因を解明することを目指した。救急・集中治療領域やその他の領域における悲嘆ケアに関する文献や資料から悲嘆ケア内容を抽出した。抽出した悲嘆ケア内容には【看護師の認識】と【看護師のケア行動】が含まれており、内容を吟味し、クリティカルケア領域の看護師が実施している悲嘆ケアの実態が把握できる項目となるように、研究チームで表現についての検討を繰り返した。検討過程で、エンドオブライフケアをテーマとする研修会にも参加し関心を持つ看護師とのネットワーク形成を行い、次年度以降の研究計画の準備活動を行った。また、救急外来での勤務経験のある看護師や、研究者に、質問項目等について意見を聴取し、質問項目の表現や構成を洗練化した。最終的に質問紙は、悲嘆ケア33項目と悲嘆ケアに関する看護師の認識4項目、自由記載1項目、協力者の背景に関する項目10項目から構成した。現在倫理審査受審中であるが承認後、全国の救命救急センターに研究協力依頼をして、研究協力に同意の得られた施設に調査票を1000部送付し、回収数500件を目指して調査を開始する予定である。回収数が不足する場合は、3次救急施設等を加えて対象者数を確保する予定である。看護師の実践として悲嘆ケアの実態を把握するための質問項目の表現についての議論に、予想以上に時間を要したため家族の体験を基盤としたクリティカルケアにおける悲嘆ケアガイドラインを開発することを目的としている。救急外来看護師が行う悲嘆ケアに関する質的研究及び先行研究を基に、看護師の属性11項目、悲嘆ケアの実施状況32項目、看護師の内省6項目の質問紙を作成した。回答方法は、「全くあてはまらない」から「とてもあてはまる」の7段階尺度とした。救命救急センターを標榜する病院全284施設の看護責任者宛に依頼文書を送付し、研究協力の可否と質問紙送付部数を確認し、最終的に92施設に1392枚の質問紙を配布した。673件を直接郵送法で回収し、有効な回答が得られた669件を分析に用いた。研究実施に際し、所属大学の研究倫理委員会の承認を得て行った。看護師経験年数は15.4±7.5年、救急経験年数は8.0±11.9年であった。悲嘆ケアの実施状況の項目は、全て天井効果とフロア効果が無く、全平均は4.5±1.4であった。最も得点の高い質問項目は、「患者の外観や周囲の環境を整える」(6.3 ±0.9)で、最も低い質問項目は、「電話訪問により遺族のその後の反応を確認する」(1.6±1.3)であった。時期別でみると臨終期のケアの実施率が最も高かった。各質問項目の相関分析の結果、個々のケアは関連し合い、特に治療期のケアと臨終期のケアは強い関係性があった。

その中で家族が十分に悲しみを表現できているかを確認することは、他のケアとの関係性が強く、悲嘆ケアの指標となる可能性があることが示唆された。また看護師の悲嘆ケアを内省する行為は、ケアの実施状況を高める可能性があることが示唆された。救急外来での突然の死別を体験した家族へのインタビューについては、専門家によるスーパーバイズを受け、面接時の注意点などを確認し、慎重に進められるようにしている。現在倫理審査受審に向けて準備中である。全国の救命救急センターを標榜する施設の救急外来に勤務する看護師を対象として、クリティカルケアにおける悲嘆ケアの実践状況やケアの実態について調査を行った。悲嘆ケアの実施においては、「家族が十分に悲しみを表現できているかを確認する」こととの相関が強いことが分かった。また、看護師の悲嘆ケアを内省する行為がケアの実施を高める可能性を示唆した。自由記述のテキストデータを分析した結果、救急外来経験年数と記述内容の特徴が見出された。看護師は経験年数を重ね、【介入の工夫】を持つ一方、【介入に伴うジレンマ】を抱きながら、救急外来の特徴を考慮した家族へのかかわりを模索していると考えられた。また、【介入の困難さ】がある中でも、家族の反応を注意深く見ながら【介入の工夫】を実践し、看護師間で【介入の共有】をして、救急外来という場で必要となる介入を思案していると考えられた。救急外来では、短時間のかかわりとなることから【ケアの評価の困難さ】が【介入の迷い】を生じさせている可能性もある。介入の困難さを感じながらも、家族にとって適した介入とするためにも、チームで振り返りの機会を設定することが重要であることが示唆された。これらの実態調査の結果を踏まえて、救急外来で家族を亡くした家族へのインタビュー調査を行った。結果として、【悲しみを感じる余裕がない】【覚えていないこともある】【経過を教えてほしい】【家族の思いを汲んだ対応がされる】【家族だけで過ごせる場がある】【遺品を丁寧に扱ってほしい】【亡くなった後の手配が不確かである】などが抽出された。家族の反応を見ながら過不足なくかかわることや、混乱している中で必要な情報がさりげなく提供されることを期待していることが示された。予測していた事ではあったが、家族の体験を理解するための面接調査の実施に難航した。今後は、実態調査と並行して、家族へのインタビューについて計画を立て進める予定であり、遅れは、取り戻せると考えている。救急外来での突然の死別を体験した家族へのインタビューは、繊細なテーマであるがゆえに、慎重に進めていく必要があり、必要なプロセスであったと考えている。悲嘆ケアの専門家によるスーパーバイズが受けられる体制整備もできたので、ケアガイドライン開発に向けて取り組みを続けていく予定である。これまで得た結果をもとに悲嘆ケアガイドラインに必要な内容を整理し、救急医療にかかわる医療従事者のヒアリングならびにフォーカスグループインタビューにより、実用可能なケアガイドラインとして洗練化していく予定である。本年度予定していた実態調査が、質問紙作成が遅れたことにより、次年度になったため。また、それに伴い、郵送費を使用しなかったこと、購入予定であったSPSSおよびパーソナルコンピューターの購入をしなかったことが挙げられる。
オキサゾリン基を活用したフッ素18標識GABA、アミノ酸、および乳酸の合成

本研究では、GABA、アミノ酸、および乳酸の^<18>F-標識PETトレーサーの実現を目指して、その前駆体となるオキサゾリン化合物の合成を行い、本前駆体を用いた目的の^<18>F-標識体の合成を鋭意検討した。しかしながら、PET化学特有の超希薄濃度(μMレベル)における無水反応は予想以上に困難に直面し、さらに放射線分解により化合物が壊れてしまう問題も発生した。そこで、思考をこらして、Pd触媒を用いたC-[^<18>F]フルオロメチル化反応の開発を並行して行い、この反応を応用して上記の乳酸をはじめとした目的化合物の^<18>F-標識化の検討を行った。生体丸ごとの分子イメージングを可能とするPET(陽電子放射断層画像撮影法)は、化学・生物学・物理学・工学・薬学・医学が連携した学際研究であり、ラットやサルを用いた薬理学評価を経て、最終的には生命科学の究極目標であるヒトの臨床・診断を目的とするものである。PET研究の根幹を成すものは生物活性有機化合物の標識化(PETトレーサー化)であり、有機化学者による効果的な標識反応の開発は急務の課題である。本研究では、これまで不可能とされてきたGABA、アミノ酸、および乳酸の^<18>F-標識PETトレーサー化を目指すこととした。PET(陽電子放射断層画像撮影法)は、化学・生物・薬学・医学が連携した学際研究であり、基礎科学である薬剤の創製ならびに標識反応の開発に始まり、ラットやサルを用いた薬理学検査を経て、最終的には生命科学の究極目標であるヒトの臨床・診断を目的とするものである。PET研究の根幹を成すものは生物活性有機化合物のポジトロン(陽電子)放射核での標識化、つまりPETトレーサーの創製であり、有機化学者による効果的な標識反応の開発は急務の課題である。本研究では、これまで不可能とされてきたGABA、アミノ酸、および乳酸の18F-標識PETトレーサー化を目指すこととした。本年度は、まずは、GABAのα位^<18>F標識化のための被標識基質(オキサゾリンあるいはオキサゾリジン前駆体)の合成ルートの確立に着手するとともに、とくにPET放射性条件下における求核的[^<18>F]フッ素化反応を実施するための遠隔操作型^<18>F標識用放射性化合物合成装置の立ち上げおよび機器調整を行った。著者が所属する理化学研究所においては本研究課題の推進に必要な求核的[^<18>F]フッ素化反応の実施は初めての試みであったため、上記の被標識基質の合成に先立って、まずは^<18>F-標識研究が実施できるように遠隔操作型合成装置の機器調整、ならびに、本装置を用いた[^<18>F]フッ素化反応条件の確立を優先して行った。その結果、求核的[^<18>F]フッ素化反応の基本条件を確立することができ、今後、本研究を推進する上で必要な^<18>F標識化のための研究基盤を当研究施設において整備することができた。来年度からは、上記標識基質の合成ルートを確立させるとともに、非放射性条件下におけるGABAなどのフッ素化反応の最適化を行う予定である。また本件と並行して、先の遠隔操作型合成装置を用いた^<18>F-標識PETトレーサーの合成に応用展開していく予定である。生体丸ごとの分子イメージングを可能とするPET(陽電子放射断層画像撮影法)は化学・生物・工学・薬学・医学が連携した学際研究であり、ラットやサルを用いた薬理学検査を経て、最終的には生命科学の究極目標であるヒトの臨床・診断を目的とするものである。当研究では、これまで不可能とされてきたGABA、アミノ酸、および乳酸の^<18>F-標識PETトレーサー化を目指すこととした。本年度は、乳酸の^<18>F-標識PETトレーサー化を実現するために必要な^<18>F-標識前駆体となる[^<18>F]ヨウ化フルオロメタン(^<18>FCH_2I)の製造法の確立を行った。前年度に引き続いて、まずは^<18>F-放射化学実験が安全に実施できるように遠隔操作型合成装置の機器調整、らびに、本装置を用いた[^<18>F]フッ素化反応条件の確立を優先して行った。

一方で、有機化合物の炭素骨格上ヘフルオロメチル基を導入するための先行研究としで、今回新たに開発したPd触媒存在下に、ヨウ化フルオロメタンと有機ホウ素化合物を用いた高速C-フルオロメチル化反応の開発を行った。本反応を用いると、わずか5分でベンゼン環上にフルオロメチル基を導入することが可能であり、現在、実際のPET放射性条件下において先の[^<18>F]ヨウ化フルオロメタン(^<18>FCH_2I)を用いた^<18>F-標識化([^<18>F]フルオロメチル化)を検討しているところである。なお、本研究成果は、Chemistry-A European Journal誌に投稿した(現在印刷中)。来年度からは、上記標識基質の合成ルートを確立させるとともに、非放射性条件下における乳酸やGABAなどのフッ素化反応の最適化を行う予定である。PET(陽電子放射断層画像撮影)研究の根幹を成すものは生物活性有機化合物の標識化(PETトレーサー化)であり、有機化学者による効果的な標識反応の開発は急務の課題である。当研究では、これまで不可能とされてきたGABA、アミノ酸、および乳酸の^<18>F一標識PETトレーサー化を目指すこととした。本年度は、アラニンのPETトレーサー化を実現するために本研究で立案したオキソザリン前駆体の合成を行った。現在、PET放射性条件下において本前駆体を用いた^<11>Cおよび^<18>F一標識アラニンの合成を検討中である。実のところ、本反応は厳密な無水条件下で行わなければならないのであるが、これをPET放射性条件下で行うには様々な問題点が浮上してきており、現在、合成化学的および機器操作的手法による解決法を探っているところである。また本件と並行して、有機化合物の炭素骨格上へ[^<18>F]フルオロメチル基を導入するための先行研究として、Pd触媒存在下に、[^<18>F]フルオロヨードメタン(^<18>FCH_2I)あるいは[^<18>F]フルオロブロモメタン(^<18>FCH_2Br)と有機ホウ素化合物を用いた高速C-[^<18>F]フルオロメチル化反応の開発を行ってきた。本年度は、ピナコールボランが置換した安息香酸エステルをモデル化合物としてPET放射性条件下において本反応を検討した。その結果、わずか5-15分の反応時間でベンゼン環上に[^<18>F]フルオロメチル基を導入できる反応条件を見いだすことができた。本反応は、^<18>F-標識PETトレーサーの新規合成法として潜在的に有効な手法であることから、まずその基本反応条件を特許出願し、また2010年1月の分子イメージング研究シンポジウムにおいて学会発表を行った。本研究費の最終年度となる2010年度は、オキソザリン前駆体を用いた^<11>Cおよび^<18>F-標識アミノ酸の合成を検討する。加えて、上記の高速C-[^<18>F]フルオロメチル化反応をアミノ酸、乳酸、および、GABAなどの[^<18>F]フッ素化に適用拡大し、PET標識反応として実用レベルにまで高度化したい。本研究では、これまで不可能とされてきたGABA、アミノ酸、および乳酸の^<18>F-標識PETトレーサーの実現を目指してきた。まずは当初の研究計画に沿って、その前駆体となるオキサゾリン化合物の合成を行い、PET放射性条件下において本前駆体を用いた^<18>F-標識体の合成を鋭意検討してきた。本標識合成は厳密な無水条件下で行う必要があるが、PET放射性核種を用いた超希薄濃度(μMレベル)における無水反応の実施は当初の予想以上に困難に直面した。そのため、化学反応の検討に加えて標識用合成装置の改良による解決法を探ってきた。
永続的バブルと長期不況の理論分析

世界各国で長期不況が続いているが、これまでのマクロ経済学では短期不況しか説明できなかった。本研究では、はじめに失業が長期的に続く状態で、失業率に応じて賃金が徐々に調整されるメカニズムを公正賃金の概念を使って提示した。つぎに、自分の保有する金融資産の社会的な位置(地位選好)を気にする家計の行動を定式化した。この二つの前提から、生産力の低い状態では完全雇用が実現されるが、生産力が高まると長期的な需要不足に陥って不況が続くことが理論的に示された。さらに、短期的な不況と長期的な不況では、金融政策や財政政策の効果に大きな違いが生まれることがわかった。はじめに、動学的なマクロ経済の枠組みに公正賃金仮説を適用し、失業率に依存しながら時間を追ってスラギッシュに変化する貨幣賃金の動きを明らかにした。そこでは、過去に払われていた貨幣賃金と現在の失業状況に照らし、自分にとって公正であると思われる賃金を形成し、賃金がそれより低ければ生産性が大きく落ちるがそれ以上なら一生懸命働く既存の労働者と、白紙の状態で入社してくる新規労働者の存在する経済を考えた。その上で、一定確率で退職する既存労働者に代わり需要状況に応じて新規労働者が採用される場合、公正賃金は、その時々の失業率に依存しながら徐々に変化していくことが明らかになった。さらに、企業の最適行動から、こうした公正賃金がそのまま現実の貨幣賃金になることが示された。次に、スラギッシュな賃金調整を前提に、各個人が他人の経済状態との比較によって効用を感じる場合(いわゆるステータス仮説)、比較の対象が何であるかによって、経済の動きがどのように変わるかを分析した。具体的には、社会の平均的な消費と自分の消費との差、平均的な実物資本保有量と自分との差、平均的な貨幣保有量と自分との差によって効用を感じる個人を考え、消費の差を気にする経済では完全雇用が、実物資本保有量の差を気にする経済では永続的な経済成長が、貨幣保有量の差を気にする経済では永続的な不況が発生することを明らかにした。その結果、一見まったく違って見える完全雇用、経済成長、不況という3つの状態が、単に人々の欲望の対象が違うことによって発生するものとして、統一的に導かれた。不況の分析は、近年、ニュー・ケインジアン理論による新たな発展があるとはいえ、理論構造が非常に複雑であることから、現実の政策提言には旧来の乗数効果が使われ、景気刺激のための金額的な財政拡大の根拠になって、国債の累積を生んできた。本研究では伝統的な乗数効果の持つ意味を再検討し、金額だけの財政拡大は経済厚生に何の影響も与えず、そのため、役に立たない公共事業と失業放置はすべての意味で同等であることを示した。さらに、伝統的な乗数効果分析を所得の異なる2階級の経済に拡張し、就業者から失業者への再分配は失業者の効用を上昇されるとともに、就業者の効用も下がらないことを証明した(JMCB2011掲載)。つぎに、本研究で構築した動学的不況モデルを少子化対策の分析に応用し、子供を持つことから効用を得て子供の数を決める家計を前提に、子育て補助金や労働所得税、養育環境整備の消費への効果を分析した。その結果、景気が好況か不況かによって、政策効果がまったく異なることが示された(JER2011掲載)。具体的な結果について記述すると、保育園整備などの養育環境整備は、ひとりひとりの子供に費やす養育時間は減るが子供の数は増えるため、合計の労働供給は増える場合も減る場合もあり得る。これに対して子育て補助金は、子供の数を増やす効果だけを持つため、労働供給を減らす効果を持つ。親の労働供給が増やすか減らすかにより、景気に異なる効果が生まれる。もし完全雇用が成立する経済であれば、労働供給の減少は生産を減少させ、そのことが消費の減退をもたらす。これに対して、有効需要不足による失業が存在する不況のもとでは、労働供給の減少は超過労働供給の状況が緩和され、賃金の下降圧力が軽減されて消費需要が高まり,結果として需要を満たすように生産量は上昇する.このように失業の有無によって政策効果が大きく異なることが示された。1)動学マクロ理論に基づく長期不況理論をもとに、有効需要と消費との関係を求めた。この関係は、伝統的ケインジアンモデルでは所得が入れば消費に回すという視点で論じられてきたが、本研究では経済全体の需要が雇用を決め、それが賃金と物価の変化率を決め、消費の時点間代替を通して現在の消費を決めるという構造を持っている。このように、同じ所得と消費との関係でもその意味はまったく異なるが、これを一般均衡の枠組みに組み入れることにより、形式上、有効需要が消費を決めそれが総所得を決めるという従来の所得分析と、似た構造を持った分析手法を確立することができた。

その結果、従来のケインズ的乗数効果分析とほぼ同等の簡潔さを持ちながら、動学的最適化に基づいた新たな分析手法が確立された。さらに、その中に含まれる各パラメーターが、現実の経済政策にそれぞれ明確に対応する定式化が可能になった。2)上記の方法を現実の政策に応用し、金融緩和の効果、インフレターゲット政策の効果、雇用を生み出す財政支出拡大と所得移転を目指した財政支出拡大の効果の違い、再生可能エネルギーへの転換を行い、その資金を財政負担で賄う場合と電気料金値上げで賄う場合の景気への効果の違い、などを分析した。たとえば、新たな分析手法から求められるベースマネーの量と物価あるいはGDPとの関係とは、潜在的生産能力の少ない段階では従来の比例的関係が、また生産能力が高い成熟段階の経済ではその関係が消滅する、というものである。このことを、日米英のデータを使って確かめたところ、ほぼ理論通りの結果が観察された。3)本理論の国際経済への拡張について、いくつかの基礎的知見を得た。その中には、不況と為替レートとの関係や景気の国際波及を分析する理論的枠組みの構築などがある。失業下の賃金調整メカニズムを組み込んだ連続時間でのマクロ動学モデルを使って、金融緩和や財政支出の経済効果を分析した。その結果、不況の深刻度(すなわち好況か不況か、および一時不況か長期不況か)によって、政策の効果が大きく異なることがわかった。たとえば、一時不況で金融緩和を行った場合、完全雇用に向かう経路上のすべての時点で消費が増大するが、長期不況定常状態の経済では、金融緩和は動学経路にまったく影響を与えず、需要も増大しないことが示された。さらに、財政支出の増加は、一時不況のときには短期的に消費を増やす場合も減らす場合もあり、最終的な完全雇用ではかならず減らすが、長期不況なら現在も将来も含めて消費が増えることがわかった。つぎに、本研究で構築した不況動学理論から得られる雇用と消費の関係を応用し、現実の雇用創出政策が景気に及ぼす影響を試算した。具体的には、再生可能エネルギーへの転換を行った場合の新規雇用を試算し、はじめに、好況時にはそれが日本経済への負担になることを示した。つぎに、不況で人が余っている場合を考え、本研究で求めた雇用と消費との関係を適用して消費一般が増加することを明らかにした上で、その大きさを試算した。結果は、著書『エネルギー転換の経済効果』(岩波書店)として発表している。最後に、非飽和的な貨幣保有願望を生み出す要因として、他人の貨幣保有額との比較という地位選好に注目し理論モデルを構築した。その結果、貨幣だけでなく金融資産一般への保有願望を前提としても、貨幣保有願望と同じ効果が得られることがわかった。また、比較対象が圧倒的に比よりも差であることを経済実験の結果を使って確かめた。さらに、他人の金融資産保有額のとの差を気にする家計の貯蓄行動が長期不況をもたらすことも示した。その結果、25年度にこの分析をさらに精緻化して、論文として完成するための土台作りができた。本研究で行った動学マクロ分析に基づく長期不況理論の確立と、今後の発展の可能性について、いくつかの国内および海外の研究集会で発表した。そこでは、はじめにこれまで従来の短期不況理論と長期不況を扱う本研究との構造上の違いを示し、マクロ経済学における本研究の位置を明確にした。
うま味の受容メカニズムに関する共同研究:味受容器におけるグルタミン酸応答の解析

味覚は舌上皮上にある味細胞によって感知される.その感知機構は味細胞膜上にあるチャネルに味物質が直接作用する場合と受容体に作用する場合が考えられる.うま味受容は受容体を介して行われるが,研究の方向づけのために主要な研究室を訪問し学会に発表されていない情報を収集した結果、甘味・苦味に関与するGたんぱく質がうま味に関与していないであろうという情報を得た。本研究では,この様に他の基本味とは異なるうま味の受容メカニズムの解明を目的として国際的に共同して研究を行った.方法は細胞内カルシウムの変化と細胞応答(膜電位・膜電流)の変化を光学的手法と電気生理学的手法を用いて測定した.これにより、少なくともL-AP4、NMDAタイプの複数のグルタミン酸受容機構を味細胞は持っていることがわかった。そしてL-AP4系の応答にはKチャネルの関与が示唆された.また,MSG応答時に関与するイオンとチャネル特性について調べ、複数のグルタミン酸受容タイプに関わるイオンチャネルのイオン選択性について明らかにした.この成果を,国際シンポジウム(International Symposium of Olfaction and Taste)が米国において開催されたため林・松本・呉が渡米し研究成果の発表を行うと共に,国外グループと綿密な打合せを行った.また成果の一部は,1996年,1997年日本味と匂い学会においても発表されており,さらに1998年ECRO(欧州化学感覚学会)において発表される予定である.味覚は舌上皮上にある味細胞によって感知される.その感知機構は味細胞膜上にあるチャネルに味物質が直接作用する場合と受容体に作用する場合が考えられる.うま味受容は受容体を介して行われるが,研究の方向づけのために主要な研究室を訪問し学会に発表されていない情報を収集した結果、甘味・苦味に関与するGたんぱく質がうま味に関与していないであろうという情報を得た。そしてL-AP4系の応答にはKチャネルの関与が示唆された.また,MSG応答時に関与するイオンとチャネル特性について調べ、複数のグルタミン酸受容タイプに関わるイオンチャネルのイオン選択性について明らかにした.この成果を,国際シンポジウム(International Symposium of Olfaction and Taste)が米国において開催されたため林・松本・呉が渡米し研究成果の発表を行うと共に,国外グループと綿密な打合せを行った.また成果の一部は,1996年,1997年日本味と匂い学会においても発表されており,さらに1998年ECRO(欧州化学感覚学会)において発表される予定である.味覚は舌上皮上にある味細胞によって感知される。その感知機構は味細胞膜上にあるチャネルに味物質が直接作用する場合と受容体に作用する場合が考えられる。5基本味のうち、塩味や酸味はチャネルに、甘味・苦味は受容体を介して感知されていると考えられている。うま味受容は受容体を介して感知される可能性が有力であるが、他の4基本味に比べて研究が遅れているのが現状である。そのため、常に最新の研究成果を収集することは本研究を進めるにあたって非常に重要でり、特に行動学・神経生理の情報は有用である。今回、主要な研究室を訪問し学会に発表されていない情報を収集した結果、甘味・苦味に関与するGたんぱく質がうま味に関与していないであろうという情報を得た。そして、このGたんぱく質が関与する情報伝達機構を排除して研究を行った。方法は細胞内カルシウムの変化と膜電位の変化を蛍光色素を使って可視化した。用いる緩衝液の組成によってグルタミン酸に応答した細胞の細胞内pHが変わり、カルシウム濃度が上昇し続けることによる細胞傷害を考慮して、一般的に用いられるHEPES緩衝液からリン酸-炭酸塩緩衝液に換えた。この結果、細胞内カルシウム濃度は刺激後回復し、くり返し刺激を行えるようになった。舌上皮から酵素処理によって単離した味蕾をグルタミン酸受容体のアゴニストであるNMDA(イオノトロピック型)・L-AP-4(代謝型)・グルタミン酸で味刺激したときの応答と、加えて、KチャネルブロッカーのTEAを存在させたときの応答も調べた。これにより、少なくともL-AP4、NMDAタイプの複数のグルタミン酸受容機構を味細胞は持っていることがわかった。今後各々の受容機構が何に関係しているのか、つまり、味細胞におけるうま味受容、味細胞と味神経との味情報伝達、味細胞と基底細胞や味細胞間の味情報相互伝達機構への関わりについて調べることにしている。味覚は舌上皮上にある味細胞によって感知される.その感知機構は味細胞膜上にあるチャネルに味物質が直接作用する場合と受容体に作用する場合が考えられる.

うま味受容に関して現在明らかになっていることは官能検査や行動学的研究から1.動物種や同じ動物種でも系統によってうま味の受容が異なる,2.うま味物質にはアミノ酸系(グルタミン酸やアスパラギン酸)と核酸系(イノシン酸やグアニル酸)が知られている,3.アミノ酸系とグルタミン酸系の間に感知閾値や感知強度の相乗効果が見られること、などである.前年度の結果から,少なくともL-AP4,NMDAタイプの複数のグルタミン酸受容機構を味細胞は持っていることがわかった.この成果を,国際シンポジウム(International Simposium of Olfaction and Taste)が米国において開催されたため林・松本・呉が渡米し研究成果の発表を行うと共に,国外グループと綿密な打合せを行った.そして両国が連絡を取りながら論文作成にむけて追加的な実験を行った.本年度に実施した実験はパッチクランプを用いてうま味受容時の膜電流・膜電位変化を測定し,MSG応答時に関与するイオンとチャネルについて調べ,複数のグルタミン酸受容タイプに関わるイオンチャネルのイオン選択性について明らかにし,日本味と匂い学会大会で発表した.その後,うま味に関して研究の盛んな,日本味と匂い学会大会における情報を収集・および研究打ち合わせにRawson博士が来日した.そして,論文作成のために林・呉が渡米し,うま味受容に関する情報を集めるとともに共同研究者と研究成果の国際誌への公表について打ち合わせを行った.
血清および腹水中の補体が豚膵島細胞に及ぼす影響

本研究の目的は、糖尿病犬に対する膵島異種移植をできるだけ少ない免疫抑制下で実施することにある。特にMcKenzieらが膵島細胞には超急性拒絶反応に関与すると考えられている糖鎖、Galα(1-3)Galが存在しないことを報告し、また我々も予備試験で犬の腹水中で豚膵島が生存する例のあったことから、以下の実験を行った。第一に、犬、豚を含むいくつかの動物種の血清を採取し、豚膵島細胞の培養液にこれらを加えたときの補体介在性細胞障害を検討した。その結果、予想とは異なり、豚以外の血清はすべて豚膵島細胞を障害した。次に、補体レセプターインヒビター(sCRI)をこれらの培養液に加えて、その時の細胞障害性について検討した結果、細胞障害作用はいずれも低下したことから、血清による細胞障害には、補体が関与することが認められた。次に、豚膵島を長期間培養し、その時のGalα(1-3)Galを含むいくつかの抗原の推移を検討した。その結果、我々が使用した培養豚膵島細胞には、約30%にGalα(1-3)Galが発現し、長期培養によってその発現は低下するものの、なくなることはなかった。しかし、免疫組織化学検査では、成熟した膵島細胞にこの糖鎖は発現しておらず、この理由は今後検討する必要があると考えられた。同じ研究で、細胞性免疫に関与するMHC, ICAM-1等は長期培養によってその発現量が低下するものの、拒絶反応に大きな役割を担っているものと考えられた。従って、膵島細胞の抗原性の低下には、さらに多くの研究が必要であると考えられた。本年度は、各種の動物血清中の補体による豚の膵島細胞に対する傷害性をまず検討した。豚膵島細胞は、と場から入手した豚膵から大河原らの方法に従って分離・精製した。ウサギ、モルモット、ラット、犬、豚、人の各血清を培養液似て段階希釈し、この中で豚膵島を培養し、培養後の細胞活性をMTTアッセイにより測定した。その結果、豚血清を除き、すべての動物種の血清が豚膵島細胞に傷害性を示した。しかし、その程度は動物種によって大きく異なり、犬の血清による傷害性が最も高く、人の血清が最も弱かった。次に、可溶化補体レセプターインヒビター(sCRI)を各血清に加え、その補体価ならびに、豚膵島細胞に対する傷害性の変化を確認した。その結果、犬以外の血清では、cCRI添加により補体価は減少し、細胞傷害性も低下したが、犬ではその効果は見られなかった(これらは現在、J.Vet.Med.Sci.誌に投稿中)。以上の結果から、仮説とは異なり、犬の膵島細胞に対する傷害は補体を解することが明らかとなった。このことは、豚膵島にはこれまでの報告と異なり、超急性拒絶反応を介在する糖鎖Galα(1-3)Ga1が存在するか、あるいは別の経路で補体の活性化が起こるものと考えられた。したがって、現在はこれらの糖鎖の存在などについてさらに検討を加えている。
突然変異ミトコンドリア導入によるミトコンドリア病の病態モデルマウスの作製

突然変異mtDNAのマウス細胞株への導入法の確立、さらには突然変異mtDNA導入マウス系統の樹立は急務となっているが、従来の方法ではDNAを核には導入できてもミトコンドリアには導入することができない。従って、ミトコンドリアノックアウトマウスの作製には、突然変異を持つマウスmtDNAと、マウスの培養細胞株からmtDNAが完全に削除された細胞株(マウスρ^o細胞株)の樹立が必須である。このような背景の中で、これまで不可能と考えられてきた「マウス突然変異mtDNAを導入したミトコンドリアノックアウトマウスの作製」という本申請の目標が、以下にまとめたような今年度の成果により、かり現実性の高いものになってきたといえる(1)現在当研究室で保管されている50種以上のマウスの培養細胞を様々な薬剤で処理した後、サザン法やPCR法を用いてmtDNAの様々な欠失や点突然変異を持った細胞株をスクリーニングしたところ、4.5kbの大規模な欠失突然変異を持つmtDNAを30%の割合で含むマウス繊維芽細胞株の樹立に成功した。今後この細胞を再クローン化することにより、より突然変異の多いクローンを分離する予定である。(2)マウス培養細胞を様々な薬剤で処理してmtDNAを完全に失ったρ^o細胞の樹立に成功した。(3)多様な欠失や点突然変異やが蓄積しているとされる老化したマウスの脳から、シナプス部分(シナプトソーム)を単離し、これをポリエチレングリコールを用いて、マウスρ^o細胞に融合させる事により、生体からmtDNAが直接導入された融合細胞(cybrids)を作製した。今後は(3)のcybridsより欠失や点突然変異を大量に持った細胞をクローニングし、このような細胞及び(2)で分離した細胞から単離したミトコンドリアをマウス受精卵に導入してミトコンドリアノックアウトマウス系統を樹立する予定である。本研究の目的は、まず第一にヒトのミトコンドリア病、糖尿病、老化などの原因になると推察されているmtDNA突然変異をヒトのmtDNA欠損細胞に導入する実験系を用いて、その突然変異が病気の原因となり得るか、単なる多型かを"診断"することである。次にこのような実験系で病因性が認められた突然変異を持つマウスmtDNAを部位突然変異法を用いて人工的に作製し、これを導入したトランスジェニックマウス系統を樹立することによりmtDNA突然変異と上記疾患の因果関係を明らかにするだけでなく、治療薬のスクリーニングにも応用することである。本年度は、mtDNA欠損細胞にMELASやCardiomyopathyなどの疾患で認められたmtDNA突然変異のうちすくなくとも2カ所の変異が病因性を持つことが立証できた。次に、マウスmtDNAの断片をプラスミドに組み込み、これらの突然変異と同等の突然変異を部位突然変異法を用いて人工的に導入することに成功した。またジーンパルサーを利用することによりこのプラスミドをマウスの肝臓から単離したミトコンドリア画分に導入することにも成功した。さらに現在、mtDNAを導入する際の宿主細胞として必要になってくるマウスのmtDNA欠損細胞の樹立が可能な段階にきている。ヒトのミトコンドリア病では、その病因性の突然変異がmtDNAのtRNA^<Leu>(UUR)遺伝子にホットスポットとして集中していることから、それぞれに対応する位置に人工的に突然変異を起こさせたマウスmtDNAの断片を含むプラスミド(BluescriptKS+)の作製を試み、すでに4種類の突然変異体の作製に成功している。

一方、昨年度内に樹立をめざしていたマウスのp^o細胞に関しては、多くの試行錯誤の結果ごく最近樹立に成功し(投稿準備中)、PCR法によってもmtDNAの存在は確認できないことから、本申請の最も大きな障害がクリアされたことになり、今後の研究に大きな期待を与えてくれた。今年度は、すでに作製が完了している人工的に突然変異を起こさせたマウスmtDNAを、マウスのp^o細胞のミトコンドリアに導入する実験系の確率を目指しており、すでに、エレクトロポレーション法を用いると、少なくとも5Kb程度のmtDNA断片はミトコンドリアに導入できることが確認できた。現在は、さらに16Kbの全mtDNA導入の実験条件の設定を重点的に行っているところである。一方、この実験系が成功しなかった場合を想定して、mtDNAの体細胞突然変異が比較的多量に存在することが確認された老化マウスの脳の組織(Takai, D and Hayashi, J. -I., Biochem. Biophys. Res. Commun. 217: 668-674, 1995)のミトコンドリアをマウスのp^o細胞へ導入したところ、欠失突然変異を持つmtDNAが確認できたことから、今後この細胞のミトコンドリア画分をマウスの受精卵に直接導入して、取りあえずできるだけ早くミトコンドリア病の病態モデルマウスの完成を目指したいと考えている。突然変異mtDNAのマウス細胞株への導入法の確立、さらには突然変異mtDNA導入マウス系統の樹立は急務となっているが、従来の方法ではDNAを核には導入できてもミトコンドリアには導入することができない。従って、ミトコンドリアノックアウトマウスの作製には、突然変異を持つマウスmtDNAと、マウスの培養細胞株からmtDNAが完全に削除された細胞株(マウスρ^ο細胞株)の樹立が必須である。このような背景の中で、これまで不可能と考えられてきた「マウス突然変異mtDNAを導入したミトコンドリアノックアウトマウスの作製」という本申請の目標が、以下にまとめたような今年度の成果により、かなり現実性の高いものになってきたといえる。(1)現在当研究室で保管されている50種以上のマウスの培養細胞を様々な薬剤で処理した後、サザン法やPCR法を用いてmtDNAの様々な欠失や点突然変異を持った細胞株をスクリーニングしたところ、4.5kbの大規模な欠失突然変異を持つmtDNAを30%の割合で含むマウス繊維芽細胞株の樹立に成功した。今後、この細胞を再クローン化することにより、より突然変異の多いクローンを分離する予定である。(2)マウス培養細胞を様々な薬剤で処理することによってmtDNAを完全に失ったρ^ο細胞の樹立に成功した。(3)多様な欠失や点突然変異やが蓄積しているとされる老化したマウスの脳から、シナプス部分(シナプトソーム)を単離し、これをポリエチレングリコールを用いて、マウスρ^ο細胞に融合させる事により、生体からmtDNAが直接導入された融合細胞(cybrids)を作製した。今後は(3)のcybridsより欠失や点突然変異を大量に持った細胞をクローニングし、このような細胞及び(2)で分離した細胞から単離したミトコンドリアをマウス受精卵に導入してミトコンドリアノックアウトマウス系統を樹立する予定である。