hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞融合を担う分子メカニズムの時空間制御機構の解明

細胞融合は生体内において精子と卵子の受精、破骨細胞の分化、筋芽細胞による筋繊維の形成、さらにウイルスの標的細胞への侵入にいたるまで、多くの生理的・病理的な生命現象の際に起こるダイナミックなイベントである。しかしながら、細胞融合を担う分子メカニズムの詳細は未だ解明されていない。このようななか、申請者は昨年度までにsmall G proteinであるRacの活性化が破骨細胞の細胞融合に重要であることを示唆する知見を得た。本年度はRacのGEFであるFARP2の破骨細胞における役割に注目し、遺伝子改変マウスを用いた解析に加えてタイムラプス蛍光顕微鏡を用いた"時空間的"な解析を行うことにより、破骨細胞の細胞融合におけるFARP2の機能の詳細を明らかにすることを試みた。GEFドメインを欠損させたドミナントネガティブ型FARP2(ΔGEF-FARP2)をRAW24.7細胞に強制発現する細胞株は、RANKL刺激による多核破骨細胞への分化が障害されていた。しかしながらこの細胞では破骨細胞分化マーカーの発現は認められ、破骨細胞分化後期に生じる多核化が障害されていることが明らかとなった。ΔGEF-FARP2発現細胞に認められる破骨細胞多核化障害を詳細に検討した。すると、(1)細胞骨格を形成するアクチン繊維構造が変化し、破骨細胞に認められるPodosome-beltの形成が障害されていた。(2)FRET法を用いて時空間的なRacの活性化を検討し、コントロール細胞で認められたpodosome-beltに特異的なRacの活性化がΔGEF-FARP2発現細胞では認められなかった。(3)ΔGEF-FARP2発現細胞はコントロール細胞に比べてインテグリンの活性が高く、細胞外基質に対する接着活性が顕著に高い、ということが明らかになった。FARP2の破骨細胞における機能をさらに確認するため、FARP2遺伝子欠損マウスを樹立し、in vitroにて破骨細胞分化誘導実験を行った。するとFARP2欠損細胞はRANKL刺激による破骨細胞分化マーカーの発現は正常であるにもかかわらず、多核破骨細胞の形成が障害され、FARP2が破骨細胞多核化に重要な分子であることが明らかとなった。本研究は細胞融合を担うシグナル制御機構の時空間的な解明を目的とする。具体的には、RacのGEFであるFARP2に着目し、破骨細胞分化過程におけるEARP2の機能をRacの活性を指標に解析を行った。1、FARP2-Dominant Negative formを恒常的に発現するRAW細胞を樹立し、この細胞をRANKLで刺激したところ、親株細胞で認められる多核破骨細胞への分化が顕著に障害されることが明らかになった。この結果から、FARP2が破骨細胞分化に重要な機能を有する可能性が示された。2、FARP2はRacのGEFであることから、破骨細胞分化過程におけるFARP2の機能をRacの活性を指標にFRET法にて解析した。その結果、親株細胞ではPodosomeと呼ばれる構造体にRac面の活性化が認められた一方、FARP2-DN細胞ではそのようなPodosome様の構造体及びPodosomeでのRacの活性化は認められなかった。この結果から、FARP2が破骨細胞の分化過程においてRacの活性化に重要な機能を有することが示された。3、FARP2の生体内における機能を明らかにするために、FARP2遺伝子欠損マウスの作成を行った。樹立しFARP2欠損マウスの骨髄を用いてin vitroにてRANKLで刺激し、破骨細胞分化誘導実験を行った。その結果、FARP2欠損細胞は野生型細胞に比べてsuboptimal doseでの破骨細胞分化が顕著に障害されていることが明らかになった。この結果から、FARP2が実際に破骨細胞分化に関与することが示唆された。(2)FRET法を用いて時空間的なRacの活性化を検討し、コントロール細胞で認められたpodosome-beltに特異的なRacの活性化がΔGEF-FARP

2発現細胞では認められなかった。(3)ΔGEF-FARP2発現細胞はコントロール細胞に比べてインテグリンの活性が高く、細胞外基質に対する接着活性が顕著に高い、ということが明らかになった。FARP2の破骨細胞における機能をさらに確認するため、FARP2遺伝子欠損マウスを樹立し、in vitroにて破骨細胞分化誘導実験を行った。するとFARP2欠損細胞はRANKL刺激による破骨細胞分化マーカーの発現は正常であるにもかかわらず、多核破骨細胞の形成が障害され、FARP2が破骨細胞多核化に重要な分子であることが明らかとなった。
臓器間ネットワーク制御を介した革新的メタボ肝発癌予防法の開発

本研究では、肝臓、骨格筋、内臓脂肪等で形成される臓器間ネットワークの制御を介したメタボ肝発癌予防法の開発をめざしている。昨年度までに、レチノイドシグナルの活性化がNASH関連肝腫瘍形成を抑制することを報告してきたが、当該年度の基礎研究の成果として、合成レチノイドがMYCN陽性liver cancer stem cellを標的とすることで肝発癌を抑制することを明らかにした(Proc Natl Acad Sci USA. 2018)。本件研究成果は、レチノイド関連シグナルの制御が、(肥満・生活習慣病関連も含めた)肝発癌の抑制をめざす上で重要なtargetであることを改めて示すものである。また糖尿病治療薬SGLT-2阻害剤Tofogliflozinが肥満・糖尿病関連肝腫瘍形成を抑制することも報告した(Oncotarget. 2017)また臨床研究の成果としては、NASHを含めた慢性肝疾患患者のデータベースの充足をはかり、高用量ループ利尿剤の使用は肝硬変患者の骨格筋量減少と予後悪化に関連すること(Hepatol Res. 2019)、インスリン抵抗性および内臓脂肪の増加は、肝細胞癌根治的治療後の再発リスクを増加させること(Int J Mol Sci. 2019、Oncotarget. 2018)を明らかにした。これらの研究成果は、臓器間ネットーワークにおける「肝・筋・脂肪相関」の異常、特にインスリン抵抗性が、肝硬変・肝細胞癌患者の予後やQOLに大きく関与している可能性を示唆するものである。本研究では、肥満や糖尿病をはじめとする生活習慣病を背景とした肝細胞癌(メタボ肝癌)の新規予防法(薬)の開発をめざしている。当該年度の基礎研究の成果として、糖尿病治療薬であるSGLT-2阻害薬tofogliflozinが、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)様肝組織像を改善し、肝における炎症性サイトカインの発現を制御することで、肥満・糖尿病関連マウス肝腫瘍形成を有意に抑制することを明らかにした。本研究結果は、SGLT-2阻害薬が慢性炎症と肝脂肪化を改善することで、肥満関連肝発癌を抑制する可能性を示唆するものである。また腫瘍免疫に関与し、脂肪肝炎・肝障害に対して抑制的に働くindoleamine 2,3-Dioxygenase(IDO)を阻害すると、肝化学発癌が抑制されることも報告した。今後は脂肪肝(炎)環境下における腫瘍免疫制御に注目し、メタボ肝発癌機序の解明を進める必要がある。さらにメチルキサンチン誘導体であるpentoxifyllineが、慢性炎症や酸化ストレスの制御を介して、肥満に関連する大腸発癌を抑制することも明らかにした。酸化ストレス制御は、メタボ癌予防のkey strategyになる可能性があらためて確認された。臨床研究の成果として、NASHを含めた慢性肝疾患患者のデータベース作成をすすめ、サルコペニア(骨格筋量と筋力の低下)がミニマル肝性脳症の発症予測因子であること、また骨格筋の減少率が肝硬変患者の予後規定因子であることを明らかにした。これらの研究成果は、特に臓器間ネットーワークにおいて「肝筋相関」の異常が肝硬変患者の予後やQOLに大きく関与している可能性を示唆するものである。今後は、同相関に対する内臓脂肪の影響(脂肪の量、質、炎症、adipokine異常等)を明らかにすべく、研究を展開する予定である。生活習慣病・NASH関連肝発癌を制御する遺伝子・蛋白・シグナル異常を明らかにする新規動物モデルについては、現在作成中である。生活習慣病・NASH合併慢性肝疾患患者の臨床検体収集(血清、画像)、データベースの拡充は随時行っており、適時解析可能な状態にある。平成29年度以降の計画として、核内受容体RXR遺伝子改変マウスを用いた新規生活習慣病・NASH関連肝発癌モデルの作製・解析に関する研究を予定しているが、マウスの作成は終了した。現在、個体数の増加に努めるとともに、phenotypeの解析やpreliminaryな検討(高脂肪食負荷、肝切除実験等)を開始している。今後は同マウスモデルを用いて、薬剤投与による生活習慣病・NASH関連肝発癌抑制に関する研究を開始する予定である。臨床研究として、抗酸化作用・発癌抑制効果を有する緑茶カテキン抽出物を用いた、肝癌再発抑制を目的とする前向き介入試験を開始した。本研究では、メタボ関連biomarkerの推移についても評価していく。当該年度の基礎研究の成果として、ビタミンA誘導体レチノイドシグナルが、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)関連肝発癌に対して抑制的に働くことを明らかにした(Oncotarget 2017)。本件研究成果は、レチノイドや同関連シグナルを制御することで、NASHや肥満に関連する肝発癌が抑制できる可能性を示唆するものである。また膵癌や大腸癌転移を詳細に観察できる新規動物モデルを作成し、脂肪肝がmetastasis-resistanceな環境であることを明らかにした(Anticancer Res 2017)。発癌や転移の腫瘍微小環境における肝脂肪化の役割について、更なる検討が必要であると考えられた。臨床研究の成果として、NASHを含めた慢性肝疾患患者のデータベース作成をすすめ、サルコペニア(骨格筋量と筋力の低下)が肝細胞癌患者の予後規定因子であることや、ミニマル肝性脳症の発症予測因子であることを明らかにした。

これらの研究成果は、特に臓器間ネットーワークにおいて「肝筋相関」の異常が肝硬変・肝細胞癌患者の予後やQOLに大きく関与している可能性を示唆するものである。平成30年度以降の計画として、レチノイド核内受容体RXR遺伝子改変マウスを用いた新規生活習慣病・NASH関連肝発癌モデルの作製・解析に関する研究を継続する。現在、phenotypeの解析やpreliminaryな検討を行っている。臨床研究として、抗酸化作用・発癌抑制効果を有する緑茶カテキン抽出物を用いた、肝癌再発抑制を目的とする前向き介入試験を継続する(現在、患者エントリーを進めている)。本研究では、メタボ関連biomarkerの推移についても評価していく。本研究では、肝臓、骨格筋、内臓脂肪等で形成される臓器間ネットワークの制御を介したメタボ肝発癌予防法の開発をめざしている。昨年度までに、レチノイドシグナルの活性化がNASH関連肝腫瘍形成を抑制することを報告してきたが、当該年度の基礎研究の成果として、合成レチノイドがMYCN陽性liver cancer stem cellを標的とすることで肝発癌を抑制することを明らかにした(Proc Natl Acad Sci USA. 2018)。本件研究成果は、レチノイド関連シグナルの制御が、(肥満・生活習慣病関連も含めた)肝発癌の抑制をめざす上で重要なtargetであることを改めて示すものである。また糖尿病治療薬SGLT-2阻害剤Tofogliflozinが肥満・糖尿病関連肝腫瘍形成を抑制することも報告した(Oncotarget. 2017)また臨床研究の成果としては、NASHを含めた慢性肝疾患患者のデータベースの充足をはかり、高用量ループ利尿剤の使用は肝硬変患者の骨格筋量減少と予後悪化に関連すること(Hepatol Res. 2019)、インスリン抵抗性および内臓脂肪の増加は、肝細胞癌根治的治療後の再発リスクを増加させること(Int J Mol Sci. 2019、Oncotarget. 2018)を明らかにした。これらの研究成果は、臓器間ネットーワークにおける「肝・筋・脂肪相関」の異常、特にインスリン抵抗性が、肝硬変・肝細胞癌患者の予後やQOLに大きく関与している可能性を示唆するものである。Preliminaryな検討で、RXR遺伝子改変マウスは肝発癌過程のみならず、エネルギー代謝や炎症シグナルにも関与している可能性が明らかになってきている。同マウスを用いた肝発癌モデルは、核内受容体の制御異常が、臓器間ネットワークの恒常性の破綻とメタボ肝発癌に及ぼす影響を解析する上で非常に有用な実験系であり、今後も同マウスモデルを中心に研究をすすめる(特に、薬剤投与による生活習慣病・NASH関連肝発癌抑制に関する研究をすすめる)。また脂肪肝(炎)による微小環境の変化が、腫瘍免疫の変容を介して、肝発癌や多臓器癌の肝転移に関与している可能性がみえてきたため、これらの研究も行う。本研究に関しては、当講座で所用するIDO-1およびIDO-2ノックアウトマウスを用いてすすめる。
複数の非局所性を持つ微分方程式系の解析と応用

まずサイズ依存型の個体数変動モデルで、死亡率、生殖率、成長率がそれぞれ異なる重み付き個体数に依存した非局所性を持つものについて解析し、解の存在と一意性に関する結果が得られた。解の存在については、Schauderの不動点定理を用いることで、かなり一般的なモデルに対して成り立つことがわかった。一意性については、死亡率と生殖率に関する条件を強めれば成り立つことがわかった。これらの結果については、学術誌J.Math.Anal.Appl.に発表された。次に、サイズ依存型個体数変動の一般モデルで、成長率がサイズと時間に依存し、個体数減少を表す関数と個体数増加を表す関数がともに時間に依存する場合の解析を行い、正値解の存在、一意性、大域存在に関する結果を得た。このような時間依存性を持ったモデルは、収穫問題などを考える上で必要になってくる。実際、この結果を応用することにより、サイズ依存型非線形個体数変動モデルに対する収穫問題について考察した。ここでは、特に収穫率は時間のみに依存するが、成長率がサイズと時間に依存し、誕生率が重み付き全個体数に依存する非線形性を持つ場合を考察し,正値解の大域存在と一意性に関する結果を得た。この結果については、アメリカのフロリダ州で開かれた国際学会にて発表した。また、多価写像で規定される非局所条件を持つ非線形輸送方程式系について、以前からの研究を少し発展させて、筋収縮を記述する方程式に応用した。クロスブリッジの角度によって、4つの状態が生じるという4状態モデルは、従来線形の場合のみであったが、ここでは非線形の4状態モデルを考えた。非線形輸送方程式系に対する結果を応用することによって、解の一意存在のみならず、解の台と有界性に関する結果を得ることができた。得られた結果は、学術誌Adv.Math.Sci.Anal.に掲載決定している。団体数変動モデルの方程式においては、非局所型非線形性が自然に現れてくる。特に、典型的で有名な例として、Gurtin-MacCamyモデルと呼ばれる年齢依存型の非線形モデルがある。この場合、死亡率や生殖率が全固体数に依存して変化することから非局所非線形性が現れる。今回の研究では、サイズ依存型の個体数変動モデルで、死亡率、生殖率、成長率がそれぞれ異なる部分的個体数に依存した非局所性を持つものについて解析し、解の存在と一意性に関する結果が得られた。解の存在については、Schauderの不動点定理を用いることで、より一般的なモデルに対して成り立つことがわかったが、一意性については、一般的には不明で、条件を多少制限することで成り立つことがわかった。この結果については、現在論文にまとめ、投稿中である。次に、サイズ依存型個体数変動の一般モデルで、成長率がサイズと時間に依存し、死亡などによる個体数減少を表す関数と誕生などによる個体数増加を表す関数がともに時間に依存する場合の解析を行い、解の存在と一意性、正値解の存在、大域存在に関する結果を得た。以前、成長率だけが時間に依存し、他は時間依存しない場合を扱ったが、今回の結果はそれを拡張するものである。基本的方法は前回と同様であるが、時間依存のため本質的により詳細な議論が必要になる。この結果については、現在論文にまとめているところである。サイズ依存型非線形個体数変動モデルに対する収穫問題について考察した。これは,例えば農産物のように収穫することにより、個体数が減少するという影響を考慮したモデルである。

ここでは、特に収穫率は時間のみに依存するが、成長率がサイズと時間に依存し、誕生率が重み付き全個体数に依存する非線形性を持つ場合を考察し,正値解の大域存在と一意性に関する結果を得た。年齢依存型個体数変動モデルで誕生率が線形の場合は、Anitaによって研究されていたが、ここで得られた結果はこれを拡張するものである。今回の結果は、前年までの研究で得られていたサイズと時間依存型の個体数変動モデルの一般モデルに関する結果を応用することにより得られた。この結果については、アメリカのフロリダ州で開かれた国際学会にて発表した。また、多価写像で規定される非局所条件を持つ非線形輸送方程式系について、以前からの研究を少し発展させて、筋収縮を記述する方程式に応用した。筋収縮は、太い繊維のミオシンから伸びるクロスブリッジが細い繊維のアクチンに結合・解離することで、バネのような働きをすることで起きる。このクロスブリッジの角度によって、4つの状態が生じるという4状態モデルは、従来線形の場合のみであったが、ここでは非線形の4状態モデルを考えた。非線形輸送方程式系に対する結果を応用することによって、解の一意存在のみならず、解の台と有界性に関する結果を得ることができた。得られた結果は、学術誌Adv.Math.Sci.Anal.に掲載決定している。
糖尿病角膜症発症機序における基底膜蛋白 糖化の意義について

糖尿病角膜症は,多彩な臨床所見を呈するが,その病態は上皮細胞の脱落の促進や基質との接着や伸展・移動などの治癒過程の障害であると考えられている。糖尿病症例では,角膜上皮基底膜部の観察光の散乱は非糖尿病症例に比して有意に高くなっていることが明らかとなった。さらに,糖尿病網膜症が悪化している症例(増殖糖尿病網膜症)でその傾向は顕著であった。このことから糖尿病症例では角膜上皮基底膜に透明性を損なう変化をきたしている可能性が示唆された。また,糖尿病症例では,糖尿病神経症の一所見として角膜知覚の低下が認められる症例が有意に多く,角膜知覚低下症例に発症した角膜上皮欠損は時として遷延性角膜上皮欠損へと移行する。これらの症例に対して,現在我々は基底膜異常の観点から角膜上皮の伸展の基質の正常化を目的としたフィブロネクチン点眼と,神経麻輝の観点から神経伝達物質の供給を目的としたサブスタンスP由来ペプチドFGLMとIGF-1点眼の併用を行い臨床効果を確認中である。今後,高グルコースなどの異常環境において,角膜上皮細胞の細胞外マトリックスに対する接着性や細胞同士の接着性や移動能ががどのように変化するかを検討し,神経性因子であるサブスタンスPが細胞外マトリックスに対する受容体の発現をどのように変化させるかをさらに検討していく予定である。糖尿病角膜症は,点状表層角膜症,角膜びらん,遷延性角膜上皮欠損と多彩な臨床所見を呈するが,その病態は上皮細胞の脱落の促進や基質との接着や伸展・移動などの治癒過程の障害であると考えられている。糖尿病角膜症は直接的には視機能を障害することは少ないと考えられてきたが,角膜全体の透明性や形状を維持する上で角膜上皮層の生理的重要性が認識されるにつれ,臨床的にも重要な問題となりつつある。角膜の混濁は,眼底の観察(診察)をきわめて困難とし,糖尿病網膜症をはじめとする合併症の管理を十分に行う上でも透明な角膜の確保がきわめて重要である。糖尿病症例における基底膜の変化を観察する目的で,生体共焦点顕微鏡を用いて角膜を観察した。結果として,糖尿病症例の角膜上皮基底膜部の観察光の散乱は非糖尿病症例に比して有意に高くなっていることが明らかとなった。このことからも,糖尿病症例では角膜上皮基底膜に透明性を損なう変化をきたしている可能性が示唆された。今後,高グルコースなどの異常環境において,角膜上皮細胞の細胞外マトリックスに対する接着性や細胞同士の接着性がどのように変化するかを検討し,サブスタンスPやIGF-1が細胞外マトリックスに対する受容体の発現をどのように変化させるかをさらに検討していく予定である。
権力分立論と議院内閣制論の接合に関する研究

本研究は、法学的な視点から見た議院内閣制(「議会ー政府」図式)と政治学的な視点から見た議院内閣制(「政府+議会内多数派与党)ー議会内反対派(野党)」図式)との関係性を探ることを目的とする。特に、「政府多数派ー反対派」図式においては、反対派は政府統制の機能を担うとされているが、この機能と、法学の伝統的な議論における権力分立論との関係は十分に解明されていないため、この点に力点を置いて研究を行う。
植物ウイルス感染による退緑症状発病機構の解明と耐病性植物作出の試み

本研究ではCMVをモデルウイルスとして,以下の二点について検討する。1CMV CPを誘導現させる実験系により,葉緑体遺伝子の発現量低下と葉緑体形態異常が「いつ」起こるのかを解析し,退緑発症,光合成活性の低下と葉緑体遺伝子発現量低下・葉緑体形態異常との因果関係を明白にする。2葉緑体遺伝子発現量低下に関与する宿主植物のシグナル経路を探索するために,CMV CPを誘導発現して退緑を示す形質転換シロイヌナズナを作出し,さらに変異原処理してCPが発現しても退緑しないCPナズナを得る。そして,退緑を示さなくなった原因遺伝子を同定する。
リポソーム膜中での電子伝達機能をもつタンパク質/ポルフィリン分子複合体の構築

本研究は、疎水性ポリペプチドを用いて距離と配向を制御したポルフィリン色素誘導体を組織化し、光合成などの生体エネルギー変換膜系で行われている効率の良いポルフイリン誘導体の電子伝達システムをリポソーム膜中で人工的に構築することを目的する。ここでは、光合成細菌のアンテナ色素複合体と類似した疎水性ポリペプチドに結合したポルフィリン誘導体の複合体を人工的に組織化し、複合体形成におよぼすN-およびC-末端のアミノ酸組成の影響ならびにBChlaのZn錯体の影響について検討を行った。その結果、その複合体形成にはN-末端側のカチオン性アミノ残基およびC-末端側のトリプトファン残基が大きな影響をおよぼしていることがわかった。また、膜中での複合体形成は、脂質の組成に依存し、その形成はZn錯体で特に安定であった。また、リポソーム膜系で安定なアンテナ色素複合体を組織化し、複合体の電子伝達挙動について電気化学的な手法を用いて検討した。その結果、電極上に形成させたリポソーム膜中でのアンテナ色素複合体の電子伝達挙動が光電流特性から検討できることがわかり、Zn錯体で顕著な光応答電流が認められた。
β-cateninを標的とした未分化性制御による新規多能性幹細胞の作製法の開発

再生医療の実現には、多能性幹細胞の利用が必須であると考えられている。ところが近年、ヒトES細胞・iPS細胞は、多くの問題を抱えていることが知られている。例えば、ゲノムの不安定性や分化能力の低さなど臨床応用への実現には大きな障害となっている。これらの原因は、ヒト多能性幹細胞が「分化傾倒状態(primed型)」であることが知られている。そこで、本研究では、分化傾倒状態であるヒト多能性幹細胞を基底状態へと転換させる技術の開発を試みた。β-cateninは、組織発生や細胞運動などあらゆる細胞動態に関わる分子として知られ、細胞状態に依存してその機能が変化することが示されている。多能性幹細胞では、β-cateninが基底状態の獲得に重要な機能を担っていると示唆される研究報告はあるが、詳細な機序は分かっていない。本研究では、β-cateninの修飾状態の違いに着目し、β-cateninの機能変化と基底状態ヒト多能性幹細胞の関係性を検討した。平成30年度では、昨年度に引き続きβ-catenin-lysine49の活性化を誘導することによる細胞性質への変化を観察した。基底状態マーカーの一つであるOct4 deltaPE-GFPの発現を観察したところ、GFP陽性細胞の出現が観察された。また、β-catenin-lysine49活性化により得られたヒト多能性幹細胞の性質をより詳しく評価するため、MicroarrayおよびRNA-seq解析を行った。その結果、従来のprimed型ヒト多能性幹細胞とは異なった性質を有しており、基底状態のマーカー遺伝子群の発現が上昇していることが示された。さらに、得られた細胞は従来のヒト多能性幹細胞と比べ低メチル化状態を示した。以上の結果から、β-catenin-lysine49の活性化は基底状態の獲得において重要な因子のひとつであることが示唆された。本年度では、β-cateninの特定部位の修飾状態:lysine49のアセチル化を人為的に活性化させることで、分化傾倒状態のヒト多能性幹細胞を基底状態へと誘導できる可能性が示された。β-cateninという普遍的な分子を正しく制御することで、従来のヒト多能性幹細胞が持つ弱点を克服できる新たな幹細胞制御法であると考えられる。また本研究の結果は、β-cateninの多様な(細胞・空間・時期特異的な)機能に対する知見として、それらの機能は翻訳後修飾によって引き起こされている可能性が示された。また、β-cateninは様々な種保存性が高く、ヒト以外の種においても同様な機能を保有していることが容易に想像できるため、ヒトを含めた霊長類あるいはブタやウマなどの動物種への適用が期待できる。最終年度ではより発展させた研究として、β-catenin lysine49の活性化がどのようにして基底状態に関わる遺伝子発現調節を行っているのかを明らかにする。また、本研究の狙いである異なる動物種においても同様にβ-catenin lysine49のアセチル化によって基底状態を導くことができるかを検討するため、カニクイザルあるいはウサギES細胞を材料に検討を行う予定である。研究は予定どおり実施しているため、概ね順調に進展していると考える。31年度も計画通り研究を進める予定である。β-catenin lysine49の活性化による選択的な遺伝子発現制御メカニズムの解明を試みる。30年度の実験結果より、β-catenin lysine49の活性化によって発現促進あるいは抑制される遺伝子群を制御すると考えられる遺伝子候補が得られている。この遺伝子候補は基底状態と密接な関係があることが知られている。そこで、β-catenin lysine49活性化による遺伝子制御機構を明らかにし、基底状態の獲得に対する知見を得る。また、β-cateninの特徴のひとつである種保存性に着目し、カニクイザルあるいはウサギES細胞を用いて同様にβ-catenin lysine49活性化による基底状態多能性幹細胞の誘導を行い、その性質評価を実施する。以上の研究計画を進めることで、β-cateninの修飾状態に着目した多能性幹細胞における遺伝子発現制御メカニズムの解明を試みる。近年、ヒトiPS細胞技術の発見および発展によって再生医療の移植材料として期待されている。しかしながら、従来からヒトiPS細胞は不安定な性質を有しており、臨床応用の実現には大きな障害となっている。本研究では、β-cateninという組織発生や細胞運動などあらゆる細胞動態に関わる分子に着目した。同分子は細胞状態に依存してその機能が変化することが多くの研究から明らかとなっている。多能性幹細胞においても同様で、基底状態の獲得には必要であるとされているが、分化を誘導するとも報告されており、β-cateninの正確な制御が重要であることが示唆される。本研究では、β-cateninの修飾状態の違いとその機能の解明を中心に、基底状態ヒト多能性幹細胞の誘導を検討した。平成29年度では、まずβ-cateninの修飾状態の違いによる遺伝子発現制御を理解するため、標的としているlysine49の変異β-catenin過剰発現ベクターを構築し、マウスES細胞にてその作用を観察した。その結果、Oct4などの未分化関連遺伝子の発現には影響を与えないが、初期分化関連遺伝子の発現が顕著に変化することが明らかとなった。また、β-catenin-lysine49のアセチル化を亢進させる低分子化合物を用いて基底状態ヒト多能性幹細胞の誘導を検討した。

その結果、β-catenin-lysine49を活性化させることで基底状態様のヒト多能性幹細胞の出現が観察された。得られた細胞は、KLF2などの基底状態マーカー遺伝子が高発現していることが示された。さらに誘導細胞においては単一細胞まで乖離してもマウスES細胞と同様に増殖することができたことから、性質として基底状態に近づいていると考えられる。以上の結果から、β-cateninの特殊な活性化は基底状態の多能性を獲得するためには重要な因子のひとつであることが示唆された。本年度では、β-cateninの特定部位の修飾状態:lysine49のアセチル化の変化が、異なる多能性状態において変化していること、そしてそれを人為的に操作することで、基底状態を誘導できる可能性が示された。本結果は、従来のβ-cateninを取り巻く研究で示されてきた細胞状態に依存した機能は、その細胞の性質を決定づけている可能性に対して重要な知見になりうる。さらに、β-catenin lysine49のアセチル化を亢進させる低分子化合物を含んだ培養液にてヒトiPS細胞を培養することで、基底状態で示されている特徴をもった幹細胞を得ることができた。実際に、遺伝子発現だけでなく、単一細胞から増えることができるという表現系をもっており、基底状態ヒト多能性幹細胞の誘導に近づいていると考えられる。β-cateninは種保存性が高いことが知られており、これらの知見は、マウスだけでなくヒトを含めたその他の動物種への適用が期待される。次年度ではより発展させた研究として、β-cateninの修飾状態が異なることで変化する遺伝子発現がどのように制御されているのかを明らかにするため、パートナー因子の探索を実施する。また、本研究の狙いである異なる動物種においても同様にβ-catenin lysine49のアセチル化によって基底状態を導くことができるか、その性質決定も含め検討を行う予定である。研究は予定どおり実施しているため、概ね順調に進展していると考える。再生医療の実現には、多能性幹細胞の利用が必須であると考えられている。ところが近年、ヒトES細胞・iPS細胞は、多くの問題を抱えていることが知られている。例えば、ゲノムの不安定性や分化能力の低さなど臨床応用への実現には大きな障害となっている。これらの原因は、ヒト多能性幹細胞が「分化傾倒状態(primed型)」であることが知られている。そこで、本研究では、分化傾倒状態であるヒト多能性幹細胞を基底状態へと転換させる技術の開発を試みた。β-cateninは、組織発生や細胞運動などあらゆる細胞動態に関わる分子として知られ、細胞状態に依存してその機能が変化することが示されている。多能性幹細胞では、β-cateninが基底状態の獲得に重要な機能を担っていると示唆される研究報告はあるが、詳細な機序は分かっていない。本研究では、β-cateninの修飾状態の違いに着目し、β-cateninの機能変化と基底状態ヒト
日本と中国西南部の常緑広葉樹林構成植物の化学分類学的、細胞分類学的比較研究

化学分類学グループは主として次の6種について研究を行った。1.バラ科Rubus属:中国西南部に自生する本属甜葉懸鈎子の成分を詳細に検討し、構造の類似したジテルペン配糖体を多数単離し、それらの化学構造を決定した。それらは僅かの構造の相違でその味が甘味、苦味、無味と変化し、化学構造と生物活性の相関に関する貴重な基礎知見を得た。雲南省南部の西双版納で採集した同属植物3種から、数種のトリテルペン配糖体を単離・構造を決定した。2.ウリ科植物棒錘瓜:中国南部に分布する植物で、解熱、抗炎症の目的に使用される本植物の地上部より、数種の新規ダマラン型トリテルペン配糖体が得られ、その構造を明らかにした。オコチロール型側鎖を有するものの他、側鎖に6員環を持つ珍しい構造の化合物も含まれており、化学分類的に興味深い発見である。3.シソ科Phlomis属:チベットに分布する2種の同属植物より、新規ジテルペン型化合物数種と、新規イリドイド型化合物数種を単離し、その化学構造を決定した。得られたジテルペン化合物は僅かな構造の差でその味が異なり、構造活性相関の新知見である。4.ユリ科〓黄精:中国で広く強壮や肺疾患治療の目的で薬用に用いられる黄精の1種である雲南地方特産の〓黄精より4種の新規ステロイドサポニンを単離し、化学構造を決定し、同属植物との差異を論ずる為の重要な知見を得た。5.ウコギ科フカノキ:ベトナムで民間薬として、抗炎症、肝臓病治療の目的で使用されている本植物の樹皮の成分検索を行い、12種のトリテルペン配糖体を単離しその化学構造を決定した。これらはいずれも同じ糖鎖を28位に有する6対のオレアナンとウルサン化合物であった。6.ベトナム人参:ベトナム中部山岳地帯に野生し、現地の小数民族の秘伝薬であり、最近新種として記載された本種の成分研究を行い、37種のサポニンを単離・構造決定した。そのうち、14種が未知物質であり、5種の新規アグリコンを含んでいた。この成分構成は、これまでの同属植物とは明らかに異なり、薬用人参と三七人参の中間の性質を有し、これらの間の進化、地理的分布、薬効を論ずる上で貴重な知見が得られた。7.雲南甘草:雲南地方に自生し、民間で甘草の代用品として用いられる本植物の化学成分研究を行ったところ、28種のオレアナン型トリテルペンサポニンを単離、構造決定した。これらはすべてグルクロナイド配糖体で、甘草との差異と類似点が注目される。植物染色体研究グループは中国雲南省を中心に東アジアの常緑広葉樹林構成植物を,それぞれ専門の植物を選んで昆明植物研究所スタッフと共同して染色体研究を進めた.近藤が指導してきた中国側研究分担者顧と夏は雲南省に接する四川省南部にでかけ,ツバキ属植物の調査,材料採集を行ってきた.これらの標本と材料により,従来から言われてきた『トウツバキは六倍体(2n=90)』であることを覆し,二倍体(2n=30)と四倍体(2n=60)を発見した.これにより,トウツバキは独自の種内倍数性を展開して分化し,人為嗜好も加わって,雲南省には六倍体だけが残ったと考えるに至った.荻沼は,昆明植物研究所で栽培されているクルミ科,カエデ科,モチノキ科,ミズキ科,トウダイグサ科,クロウメモドキ科,トリセリア科,ツバキ科の染色体数の報告のない種を選び,観察をして,大収穫を得た.特に,主要構成員ツバキ科は5属5種の染色体数を調べ,ツバキ属とのかかわりについての多くの知見を得た.田中(教)は麗江方面の山地へ出かけ,林床にみられるユリ科55種を標本作成とともに,根端を採集し,染色体を検鏡した.また,種子を採集して,日本に持ち帰り,播種して研究材料として育成している.黒木は,タデ科ギシギシ属植物を調査,種子を採集して,日本に持ち帰った.原始的雌雄性における,構造的,数的性染色体の解明を急いでいる.日詰は平成3年度と4年度に採集したマツ科植物約30種の種子を発芽させて,蛍光染色法,インサイト・ハイブリダイゼーション法により,染色体の詳細な解明に全力を注いでいる.マツ科植物の染色体は全体に大形で,スタンダード・オルセイン染色法による分析では互いに類似した核型を示して分類,同定が困難であることが分かった.従って蛍光染色法,インサイト・ハイブリダイゼーション法は有効であり,これにより,東アジアの常緑広葉樹林構成樹種の起源と種間関係をさぐる重要な成果を十分にあげてきた.化学分類学グループは主として次の6種について研究を行った。

2.ウリ科植物棒錘瓜:中国南部に分布する植物で、解熱、抗炎症の目的に使用される本植物の地上部より、数種の新規ダマラン型トリテルペン配糖体が得られ、その構造を明らかにした。オコチロール型側鎖を有するものの他、側鎖に6員環を持つ珍しい構造の化合物も含まれており、化学分類的に興味深い発見である。3.シソ科Phlomis属:チベットに分布する2種の同属植物より、新規ジテルペン型化合物数種と、新規イリドイド型化合物数種を単離し、その化学構造を決定した。得られたジテルペン化合物は僅かな構造の差でその味が異なり、構造活性相関の新知見である。4.ユリ科〓黄精:中国で広く強壮や肺疾患治療の目的で薬用に用いられる黄精の1種である雲南地方特産の〓黄精より4種の新規ステロイドサポニンを単離し、化学構造を決定し、同属植物との差異を論ずる為の重要な知見を得た。5.ウコギ科フカノキ:ベトナムで民間薬として、抗炎症、肝臓病治療の目的で使用されている本植物の樹皮の成分検索を行い、12種のトリテルペン配糖体を単離しその化学構造を決定した。これらはいずれも同じ糖鎖を28位に有する6対のオレアナンとウルサン化合物であった。6.ベトナム人参:ベトナム中部山岳地帯に野生し、現地の小数民族の秘伝薬であり、最近新種として記載された本種の成分研究を行い、37種のサポニンを単離・構造決定した。そのうち、14種が未知物質であり、5種の新規アグリコンを含んでいた。この成分構成は、これまでの同属植物とは明らかに異なり、薬用人参と三七人参の中間の性質を有し、これらの間の進化、地理的分布、薬効を論ずる上で貴重な知見が得られた。7.雲南甘草:雲南地方に自生し、民間で甘草の代用品として用いられる本植物の化学成分研究を行ったところ、28種のオレアナン型トリテルペンサポニンを単離、構造決定した。これらはすべてグルクロナイド配糖体で、甘草との差異と類似点が注目される。植物染色体研究グループは中国雲南省を中心に東アジアの常緑広葉樹林構成植物を,それぞれ専門の植物を選んで昆明植物研究所スタッフと共同して染色体研究を進めた.近藤が指導してきた中国側研究分担者顧と夏は雲南省に接する四川省南部にでかけ,ツバキ属植物の調査,材料採集を行ってきた.これらの標本と材料により,従来から言われてきた『トウツバキは六倍体(2n=90)』であることを覆し,二倍体(2n=30)と四倍体(2n=60)を発見した.これにより,トウツバキは独自の種内倍数性を展開して分化し,人為嗜好も加わって,雲南省には六倍体だけが残ったと考えるに至った.荻沼は,昆明植物研究所で栽培されているクルミ科,カエデ科,モチノキ科,ミズキ科,トウダイグサ科,クロウメモドキ科,トリセリア科,ツバキ科の染色体数の報告のない種を選び,観察をして,大収穫を得た.特に,主要構成員ツバキ科は5属5種の染色体数を調べ,ツバキ属とのかかわりについての多くの知見を得た.田中(教)は麗江方面の山地へ出かけ,林床にみられるユリ科55種を標本作成とともに,根端を採集し,染色体を検鏡した.また,種子を採集して,日本に持ち帰り,播種して研究材料として育成している.黒木は,タデ科ギシギシ属植物を調査,種子を採集して,日本に持ち帰った.原始的雌雄性における,構造的,数的性染色体の解明を急いでいる.日詰は平成3年度と4年度に採集したマツ科植物約30種の種子を発芽させて,蛍光染色法,インサイト・ハイブリダイゼーション法により,染色体の詳細な解明に全力を注いでいる.マツ科植物の染色体は全体に大形で,スタンダード・オルセイン染色法による分析では互いに類似した核型を示して分類,同定が困難であることが分かった.従って蛍光染色法,インサイト・ハイブリダイゼーション法は有効であり,これにより,東アジアの常緑広葉樹林構成樹種の起源と種間関係をさぐる重要な成果を十分にあげてきた.田中グル-プは平成3年7月に3名で中国を訪問し、主として昆明植物研究所に滞在し、野外調査と研究打ち合せを行なった。
遺伝子操作による鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの感染性粒子の人工構築

伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)感染性粒子の人工構築を目的として、IBDVのRNA依存RNAポリメラーゼ(VP1)およびカプシド蛋白(VP2およびVP3)とプロテアーゼ様機能を持つVP4を前駆蛋白質(NH-_2-VP2-VP4-VP3-COOH)として発現する組換え鶏痘ウイルスを構築した。また、cDNAとしてクローニングしたウイルスゲノムからRNAを合成し、合成RNAの細胞内導入による感染性ウイルス粒子の構築について検討した。1.組換え鶏痘ウイルスによるウイルス抗原の発現組換え鶏痘ウイルスから発現された前駆蛋白質は、感染細胞でVP2およびVP3に成熟した。VP1発現組換え鶏痘ウイルスおよび前駆蛋白質発現組換え鶏痘ウイルスを同一細胞に感染させたところ、培養上清中にVP2およびVP3が検出され、それらが30,000rpmの遠心で沈渣として回収された。また、電子顕微鏡による観察で感染細胞質中には、非感染細胞に認められない粒子様構造物の構築が認められた。2.ウイルスゲノムの細胞内導入による感染性ウイルス粒子の構築cDNAとしてクローニングしたIBDVゲノムからプラス鎖およびマイナス鎖RNAをin vitroで合成し、細胞内へ導入した。しかし、ウイルス抗原の発現および粒子の構築は確認できなかった。今回用いたcDNAは、ウイルスゲノムの完全な配列を含んでいなかった。今後、IBDVゲノム両分節の完全長をcDNAとしてクローニングし細胞内へ導入する必要があると考えられた。
カーボンナノドットを用いたフロー電気化学イムノアッセイ法の開発

カーボンナノドットをクエン酸とエチレンジアミンにマイクロ波を照射して作製した。このカーボンナノドットの電気化学特性、電気化学発光特性、並びに光物性を明らかにした。さらに、カーボンナノドットを、抗原である3-phenoxybenzoic acid (除草剤の土壌代謝物)に化学的に修飾し、これを認識する抗体をPDMSマイクロチップ上に固定化し、フローイムノアッセイを行い、抗原が定量できることを示した。この時、検出に電気化学発光法、蛍光法、電気化学法を検討したが、蛍光法が最も高感度であり、100 ppm程度の定量が可能であった。カーボンナノドットを抗体や抗原に化学修飾し、カーボンナノドットからの蛍光および電気化学発光を用いるフローイムノアッセイ系の構築を目的としている。H27年度は、カーボンナノドットの光物性、電気化学特性について検討を行った。カーボンナノドットはクエン酸とエチレンジアミンを溶解させた水溶液にマイクロ波を照射することによって合成した。カーボンナノドットを分散させた水溶液では、355 nmに吸収極大を、460 nmに蛍光極大を示した。また、蛍光寿命を測定したところ、蛍光減衰曲線は指数関数でフィットでき、その寿命は16 ns程度であった。カーボンナノドット水溶液をPDMSで作製したマイクロチップ(深さ500μm、幅2 mm)に注入し、フローインジェクション蛍光応答を測定したところ、5100 ppmの範囲で良好な曲線関係が得られた。電気化学特性を明らかにするために、サイクリックボルタモグラムを測定した。測定にはグラッシーカーボン電極を作用極に、白金コイルを対極に、銀|塩化銀電極を参照極に用いる3電極式を採用した。カーボンナノドット水溶液のサイクリックボルタモグラムでは、-1.4 Vと0.9 V付近にそれぞれ還元と酸化のピークが観察された。これらの還元および酸化波は非可逆的であった。即ちカーボンナノドットの酸化体、および還元体は不安定であることがわかる。非可逆的な電極反応は電気化学発光に不利である。なぜならば酸化還元種の寿命が短い場合、効率よく励起状態を生成できないからである。そこで、共反応体を用いる電気化学発光法に着目した。共反応体として、ペルオキソ2硫酸を用いて還元側に電位掃引を行うと、ペルオキソ2硫酸の還元が開始する-1 V付近からカーボンナノドットに由来する発光が観察された。今後はカーボンナノドットを抗体や抗原に化学修飾し、フローインジェクション分析への応用を試みる。初年度の予定として、合成したカーボンナノドットの光物性や電気化学特性の解明を目的としており、この目的は達成されている。今後この知見を生かし、フローインジェクションイムノアッセイ分析の応用を目指す。PDMSチップ上で、3-phenoxybenzoic acid (3PBA)-カーボンナノドットコンジュゲートのフローイムノアッセイを行った。PDMSチップはY字の流路を持ち、その深さは650、幅は1000マイクロメートル程度であった。2つのシリンジポンプから送液を行い、一方のシリンジより、5000 ppmの抗体を注入し、他方より1000 ppmの3PBA-カーボンナノドットコンジュゲートを注入した。キャリア溶液にはpH=7.1のリン酸緩衝液を用いた。この時、345 nmの主波長を持つLEDをPDMSの背面から照射し、発生する蛍光をチャンネル上方に設置したPMTを使って検出した。注入後にベースラインの蛍光強度の増加が観察された。これは即ち3PBAカーボンナノドットコンジュゲートが抗体に捕捉されていることを示す。蛍光強度変化から、100 ppm程度のジフェニルエーテルの検出が可能であると見積もられる。また、PDMSに抗体を固定化していない場合に3PBAカーボンナノドットコンジュゲートを注入してもベースラインの増加はほとんど観察されず、PDMS表面へ特異的に吸着しない。これはカーボンナノドットが親水性であることが一因と考えられる。さらに、コンジュゲートが補足された後、pH=2.2のグリシン塩酸塩を解離剤として注入することにより、ベースラインの蛍光強度の減少が観察された。即ち、解離剤を注入することによって、測定系の再生が可能である。さらに、検出系に電気化学応答、電気化学発光応答を検討したが、どちらも応答が小さく、蛍光法による検出がこれらの検出法で高感度であることが分かった。H28年度は、カーボンナノドットを抗体あるいは抗原に化学的に修飾し、マイクロチップ上で蛍光及び電気化学発光フローイムノアッセイを行う。カーボンナノドットの化学修飾にはアミノカップリング法を用いる。これは、カーボンナノドットの表面にアミノ基やカルボキシ基が存在することを利用する。抗原にはストレスマーカーであるイムノグロブリンAや数種類の農薬や殺虫剤を用いる予定である。実サンプル(唾液や環境水等)への応用も検討している。

電気分析化学物品費では、高価な抗体や抗原の購入を抑えた。これは、カーボンナノドットを用いるフローイムノアッセイののモデル系を構築するにあたり、特に必要ではなかったからである。実際のサンプルへ応用が可能であることを示すために、これらの購入は、実験の進捗状況に合わせて、H28年度に行う。また購入を予定したマイクロピペット作製用のプラー(約40万円)の購入は、H27年度に納入が間に合わなかったため、H28年度に予定している。H27年度に生じた繰り越し分は、H28年度に高価な消耗品(抗体や抗原、電極等)に適切に使用する。ピペットプラーの購入(約40万円)を行う。
逆行性標識タンパク質特異的発現を利用したGnRH分泌調節回路の可視化

視床下部に散在している性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロンは、生殖内分泌系を調節する最終共通路であるが、支配する神経回路についてはほとんどわかっていない。本研究では、トランスジェニックラットにおいて逆行性トレーサーをGnRHニューロン特異的に発現させ、経ナプス的に支配ニューロンを可視化することを目論んだ。すなわち蛍光タンパク質(EGFP)と無毒化テタヌストキシンC末端(TTC)の融合タンパク質を逆行性トレーサーとして用いた。前年度に作製したGnRHプロモーター-EGFP-TTCという導入遺伝子をラット受精卵に注入し、4系統のファウンダーラットを得た。サザンブロットの結果から導入された遺伝子は1コピー(1)、100コピー(2)および300コピー(1)と推定され、これまでの当研究室でのトランスジェニックラット作出の経験から、表現型発現が期待されるレベル(100-300)にあることがわかった。野生型と交配しそれぞれ産仔を得たが、ある系統では産仔に導入遺伝子がまったく伝達されなかった。また別の系統では雌のみに導入遺伝子が伝達され、このファウンダーが雄だったことから、導入遺伝子がX染色体上にあることが示唆された。他の2系統はメンデルの法則に則って産仔が得られた。これら産仔(4週令と7週令)の脳切片を作成し、EGFP蛍光発現を検討したが、どの系統も蛍光は観察されなかった。発現したEGFP分子が蛍光として可視されるほど多くないことを予想してGFPに対する兔疫染色を試したが、これもまったく染色されなかった。これらの結果は遺伝子導入実現が必ずしも表現型として表出されるとは限らないというトランスジェニックの宿命のためであると考えられる。現在更に系代し、表現型の確認を進めるとともに、導入遺伝子の更なる受精卵移植を検討しているところである。視床下部に散在している性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロンは、生殖内分泌系を調節する最終共通路であるが、支配する神経回路は皆目不明である。本研究では、トランスジェニックラットにおいて逆行性トレーサーをGnRHニューロンに特異的に発現させ、経シナプス的に支配ニューロンを可視化する。蛍光タンパク質(ECFP)と無毒化テタヌストキシンC末端(TTC)の融合タンパク質を逆行性トレーサーとして用いる。ECFP-TTC遺伝子をGnRHプロモーター領域の下流に挿入したトランスジーンを用い、トランスジェニックラットを作出して、GnRHニューロンに特異的にECFP-TTC融合タンパク質が発現せしめる。GnRHニューロンの活動に伴って細胞体周囲に分泌された融合タンパク質は、投射ニューロンの軸索末端から逆行性に取り込まれ、蛍光標識を行う。本研究により脳内に散在するGnRHを支配する神経回路と伝達物質、性ホルモンの作用部位を同定することにより、生殖内分泌調節の重要な課題となっている排卵の中枢調節機序や更年期の自律神経症状の病態の生理学的基盤を明らかにすることを期している。GnRH遺伝子のpromotor配列(3142bp)の下流にパスツール研究所Philippe Brulet教授(Miana-Mena et al., PNAS 99: 3234, 2002; Maskos et al., ibid. 99: 10120, 2002)から供与されたTTC遺伝子と蛍光タンパクEGFP遺伝子をっなげた導入遺伝子GnRH・P-IGFP-TTC(5962bp)を作成した。この遺伝子をGnRHの株細胞であるGT1-7細胞に導入して蛍光タンパクが合成されることを確認した。すでにトランスジーンをCrj:wistarラット受精卵に注入し、胚をレシピエントに注入したので、当初計画通り本年度内にトランスジェニックラットの産仔を得て、明年度の系統樹立と形態的・生理的実験に供する運びである。

これらの結果は遺伝子導入実現が必ずしも表現型として表出されるとは限らないというトランスジェニックの宿命のためであると考えられる。現在更に系代し、表現型の確認を進めるとともに、導入遺伝子の更なる受精卵移植を検討しているところである。
癌遺伝子産物の発現阻害と表現形態の正常化

近年,細胞癌化における癌遺伝子発現の重要性が認識されてくるようになって,癌遺伝子産物の発現を阻止する物質の探索研究が活発化している.しかしこのような物質が果たして癌の新しい化学療法となりうるかの基礎的検討は未だなされていない.そこで我々は,先に癌遺伝子src発現ラットNRK細胞(tslNRKと略記,33°Cで癌化)において,src産物のチロシンリン酸化能を阻害して癌の形態を正常化する物質として見い出したハービマイシンを用い,この問題の基礎的検討を行ない,以下のことを明らかにした.即ち,ハービマイシンは細胞の形態だけではなく,癌細胞に特異的な他の種々の表現形質も正常化した.即ち,33°Cにおいて,ハービマイシン処理により細胞骨格蛋白のひとつアクチンのケーブル構造がほぼ全ての細胞に形成されることが間接蛍光抗体法により観察された.また,癌細胞では正常細胞に比べ一般的にグルコースの膜透過が上昇していることが知られているが,ハービマイシン処理の細胞では,33°Cで23倍上昇していたグルコースの取り込みが,39°Cの正常細胞のレベル近くにまで低下することも観察された.また,癌細胞の造腫瘍性と最も相関性が高いと考えられている軟寒天中でのコロニー形成を,足場依存のコロニー形成に比べはるかに強く阻害することも観察された.更に,ハービマイシンおよびその誘導体について,src機能発現の阻害活性,核酸・蛋白合成等の高分子物質合成阻害活性の比較を行ない,既に得られているエールリッヒ腹水癌に対する治療効果との関連について検討したが,src機能阻害活性とエールリッヒ癌の抗腫瘍性とは全く相関性がないことが明らかとなった.よって,癌遺伝子を標的とする癌化学療法剤の評価のためには,今後,特定の癌遺伝子を発現させた実験腫瘍モデルの開発と,それを用いた抗腫瘍効果の判定が重要な課題となろう.近年,細胞癌化における癌遺伝子発現の重要性が認識されてくるようになって,癌遺伝子産物の発現を阻止する物質の探索研究が活発化している.しかしこのような物質が果たして癌の新しい化学療法となりうるかの基礎的検討は未だなされていない.そこで我々は,先に癌遺伝子src発現ラットNRK細胞(tslNRKと略記,33°Cで癌化)において,src産物のチロシンリン酸化能を阻害して癌の形態を正常化する物質として見い出したハービマイシンを用い,この問題の基礎的検討を行ない,以下のことを明らかにした.即ち,ハービマイシンは細胞の形態だけではなく,癌細胞に特異的な他の種々の表現形質も正常化した.即ち,33°Cにおいて,ハービマイシン処理により細胞骨格蛋白のひとつアクチンのケーブル構造がほぼ全ての細胞に形成されることが間接蛍光抗体法により観察された.また,癌細胞では正常細胞に比べ一般的にグルコースの膜透過が上昇していることが知られているが,ハービマイシン処理の細胞では,33°Cで23倍上昇していたグルコースの取り込みが,39°Cの正常細胞のレベル近くにまで低下することも観察された.また,癌細胞の造腫瘍性と最も相関性が高いと考えられている軟寒天中でのコロニー形成を,足場依存のコロニー形成に比べはるかに強く阻害することも観察された.更に,ハービマイシンおよびその誘導体について,src機能発現の阻害活性,核酸・蛋白合成等の高分子物質合成阻害活性の比較を行ない,既に得られているエールリッヒ腹水癌に対する治療効果との関連について検討したが,src機能阻害活性とエールリッヒ癌の抗腫瘍性とは全く相関性がないことが明らかとなった.よって,癌遺伝子を標的とする癌化学療法剤の評価のためには,今後,特定の癌遺伝子を発現させた実験腫瘍モデルの開発と,それを用いた抗腫瘍効果の判定が重要な課題となろう.