hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネの耐冷性遺伝子(カフェイン感受性Ca2_+チャンネル)の機能解析

植物のCa2_+チャンネル遺伝子を分離する目的で、PCRプライマーをデザインし、PCRでDNA断片の増幅を行った。プライマーは主として動物のリアノジン感受性Ca2_+チャンネル遺伝子およびL-型Ca2_+チヤンネル遺伝子の保存性の高い域を参考にして多数作成した。PCRのテンプレートはイネ根の全RNAを用いた。その結果、多数のDNA断片の増幅ができたが、Ca2_+チャンネル特有の塩基配列を持つものは得られなかった。現時点でも未だ植物のCa2_+チャンネル遺伝子の報告はないので、この方法でさらに継続して研究する予定である。この研究と平行して、Ca2_+シグナルが耐冷性を発現させるメカニズムを耐冷性イネの場合について確証する実験を行った。その結果、耐冷性イネでも低温シグナルをCa2_+シグナルに変換することが耐冷性発現に必要なことが明らかになり、さらに、そのシグナルはカフェイン感受性であることも判明した。この結果は国際学会で発表した。また、Ca2_+のシグナルを受けて発現する遺伝子として、脱水で誘導される遺伝子2ヶについて遺伝子の構造と発現様式を解明した(低温感受性イネでは脱水処理によってCa2_+シグナルの発生が起こる。)。この内、wsi18遺伝子はCa2_+シグナルを受けて発現しないが、水チャンネル遺伝子は発現することが解った。非対冷性イネに予め短時間の脱水ストレスを与えると、4°C、24時間の低温処理をしても枯死しなくなり、抵抗性を獲得することが解った。脱水シグナルを受けて細胞内カルシュウム濃度の増加が見られ、さらに、カフェインで失活するカルシュウムチャンネルが耐冷性因子であることも判明した。カフェイン感受性カルシュウムチャンネル遺伝子を分離する目的で動物の類似のカルシュウムチャンネル遺伝子の構造を参考にプライマーを数種合成した。イネの根のRNAをテンプレートにして、本プライマーを用いてPCRでDNA断片の増幅を行ったところ、幾つかの断片が得られた。これらの断片の塩基配列を解析したが、今のところ、カルアシュウムチャンネル遺伝子のDNA断片と思われるものは見い出されていない。本プロジェクトを断続するとともに、電気生理学的手法および生化学的手法を用いて、カルシュウムチャンネル蛋白質の分離を試みるため実験条件を整備している。)。
水産廃棄物リサイクルにおける魚類中に含まれる水銀とセレンの運命

水産廃棄物の再資源化処理において、有毒性の高い遊離種生成の観点から水銀とセレンの運命を検討した。魚肉中に含まれるメチル水銀はセレノプロテインによって安定化および無毒化されているが、水熱処理(亜臨界水処理)によって、遊離のメチル水銀や低分子量セレン化合物が生成することを明らかにした。また、魚肉の発酵処理(堆肥化)では、メチル水銀の脱メチル化とセレンの気化が起こることがわかった。魚類試料中に含まれる水銀とセレンについて、それぞれ加熱気化型水銀測定装置およびマイクロ波照射-酸分解+ICP-MSを用いて、全量を測定する方法を確立した。HPLCとICP-MSを結合した装置を用いて、セレンの化学形態別分析法を検討した。アニオン交換クロマトグラフィーを用いて低分子量セレン化合物を、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いてセレノプロテインを分析した。また、魚肉より溶媒抽出した試料中の水銀は、セレノプロテインと同一分子量のSECピークを与えることを見出した。この事実は、魚肉中で水銀がセレノプロテインと結合していることを示唆する。逐次抽出法(水、SDS水溶液、酵素水溶液または2-メルカプトエタノール水溶液)により、水銀の遊離種と安定化種(多分セレノプロテインに結合)を分別できることを見出した。また、この方法により、セレンについても水溶性の低分子量セレンとセレノプロテインを分別できた。魚肉試料を発酵処理したときの水銀の化学形態変化について、予備的な検討を行った。魚肉を堆肥原料中に添加して2週間発酵処理を行った場合、魚肉中に含まれるメチル水銀が無機水銀(Hg^<2+>)に変化した。また、この生成物を逐次抽出法により分析すると、発酵処理前には水溶性の水銀はほとんど存在しないが、発酵処理後には水溶性の水銀が増加した。この事実は、発酵によりセレノプロテインおよびこれを含む不溶性の筋タンパク質が分解された結果、セレノプロテインに結合して安定化されていた水銀が遊離したためと考えられる。また、セレンについては、魚肉の発酵処理後は、低分子量のセレン化合物が増加した。この事実も、セレノプロテインの発酵処理による分解を示唆する。魚肉試料(クロマグロとサバ)についてオートクレープ中(220°C)で水熱処理(亜臨界水処理)を行い、水相中の水銀およびセレンの分析を行った。処理時間の増加とともに水相中の全水銀濃度は増加し、このほとんどがメチル水銀であり、50-60%の回収率であった。これは、魚肉中に含まれる無機水銀(Hg^<2+>)およびメチル水銀(CH_3Hg^+)が水相中に溶出し、無機水銀は原子状水銀に還元されて気化するためと考えられる。水相中のセレンについても、処理時間の増加とともに濃度は増加したが、回収率はほぼ100%であった。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)-ICP-MSによる分析の結果、魚肉中に含まれていた不溶性のセレノプロテインが、水熱処理により加水分解され、セレノペプチドになり水相中へ溶出し、これは処理時間の経過とともに低分子量化していくことがわかった。水熱処理後の水相をSEC-UV検出器で分析した場合も同様のクロマトグラムを与えるので、セレノプロテインは通常のタンパク質と同様に加水分解されていると考えられる。以上の結果により、魚肉中でセレノプロテインに結合して安定化されていたメチル水銀が、セレノプロテインの加水分解により水相中に溶出する機構が提案された。魚肉試料の発酵処理(堆肥化)を行った場合には、魚肉中に含まれていたメチル水銀が、処理時間の経過とともに脱メチル化して無機水銀が生じた。魚肉中の水銀は、1-メルカプトエタノール溶液のようなタンパク質分解剤を用いると抽出されるが、希塩酸などではほとんど抽出されない。しかしながら、発酵処理後は、希塩酸によりかなりの割合の水銀が抽出されるようになった。これは、発酵処理によりセレノプロテインが加水分解し、不溶性のセレノプロテインに結合していた水銀が抽出されやすくなったためと考えられる。種々の魚肉試料について水熱処理(亜臨界水処理)を行い、魚肉中に含まれるメチル水銀の溶出と、セレノプロテインの加水分解による水溶性セレノペプチドなど低分子量セレン化合物の溶出を確認した。後者は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)とICP-MSの組み合わせを用いて分析を行ったが、セレンの3つの主要マスナンバー(78, 80, 82)すべてについてクロマトグラムを確認することで、セレン種と保持時間が重なる他成分(臭素など)とを判別する手法を確立した。魚肉試料の発酵処理(堆肥化)を行った場合、魚肉中に含まれる水銀とセレン種の運命について検討した。セレンは魚肉中のみでなく、堆肥化処理の培養基材中にも含まれているので分析が複雑であるが、発酵処理過程でセレンの30%程度が消失することを明らかにした。

魚肉の替わりに亜セレン酸塩水溶液を入れて堆肥化処理を行った場合も、同様なセレンの消失が観測された。すなわち、一部のセレン種がセレン化水素のような揮発性物質となり、系外に排出されると考えられる。魚肉中に含まれる水銀については、堆肥化処理過程における消失は10%以下であった。水銀やセレンの存在形態解析のための逐次抽出法は効果的でなかったが、希塩酸抽出によって遊離水銀種(無機水銀)が検出されることは前年度に報告した。この抽出液についてSEC-ICP-MSを行いセレノペプチドの検出を試みたが、基材中に含まれるセレンや臭素(魚肉にも含まれる)の妨害によりうまく検出できなかった。以上述べたように、水産廃棄物の再資源化処理において、有毒性の高い遊離種生成の観点から水銀とセレンの運命を検討し、亜臨界水処理では遊離のメチル水銀や低分子量セレン化合物が生成し、堆肥化処理では遊離無機水銀の生成とセレンの気化が起こることを明らかにした。魚肉試料の水熱処理において、魚肉中に含まれる水銀やセレンの運命を明らかにした。特に、水相中にメチル水銀が溶出することを見出し、排水処理や製品中への混入を注意する必要があることを示した。また、魚肉の発酵処理における水銀やセレンの運命についても、種々の知見が得られつつあり、残り1年で全体の研究目的達成は可能と考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。発酵処理および水熱処理過程において、魚肉中に含まれる水銀とセレンの存在形態がどのように変化するかを、代表的魚類の種類や処理条件によって整理し、系統的知見を得る。水相中に存在するメチル水銀種やセレン種について、有毒性を簡易毒性試験で評価する。以上の情報をもとに、水産廃棄物リサイクルについて、有毒種生成の少ない処理条件の提言を行う。
確率的階層型凸最適化アルゴリズムの構築と高精度信号復元への応用

高精細信号復元を実現するために,確率的最適化(乱択評価に基づく効率的最適化)と階層型最適化(複雑な制約条件の下での最適化)の融合をキーアイデアとして研究を遂行した.主要な成果を以下に挙げる.1信号の観測過程を記述するモデル行列が特殊な構造を持たない場合に効率的復元を可能とする,確率的近接分離最適化に基づく信号復元アルゴリズム.2観測信号に含まれる雑音の統計的性質が非ガウスの場合に有効な複雑なデータ忠実性制約を効率的に扱う信号復元アルゴリズム.3固定ステップサイズによる加速を実現した階層型凸最適化アルゴリズム.4グループL0ノルムから成る非凸制約条件を効率的に扱うアルゴリズム.「確率的階層型凸最適化アルゴリズムの構築と高精度信号復元への応用」に関して様々な検討を行った。その中から,主要な成果である「1.確率的近接分離最適化に基づく画像復元アルゴリズム」と「2.複雑なデータ忠実性制約が課された信号復元問題を効率的に解くアルゴリズム」について詳述する。両者とも研究目的を一部であるが既に達成する手法である。1.従来の凸最適化に基づく画像復元アルゴリズムは,各反復において画像の観測過程を記述する行列(モデル行列と呼ぶ)と変数ベクトルの積を複数回計算する必要があった。これは,モデル行列にスパース性等の特殊な性質/構造を仮定できない場合に,その計算オーダーが画素数の二乗に相当する=計算量が莫大であることを意味している。提案法は,そのような性質/構造を仮定できないモデル行列(例えば,圧縮センシング復元におけるランダム観測やコンピューター断層撮影法に伴うラドン変換等)を扱う場合に,各反復において,ランダムに選ばれたモデル行列の一部の行と変数ベクトルの計算だけを行う設計になっており,格段に効率的な画像復元を実現する。2.信号復元問題は,一般に「復元信号に対する先験的性質(スパース性等)を評価する正則化項」と「観測データとの忠実性を評価するデータ忠実項」の和を最小化する最適化問題に帰着される。その際、このふたつの項のバランスを決定するパラメータの適切な設定が重要な課題となる。これを解決する手段としてデータ忠実項を制約条件として記述する方法があるが,最適化の難度が大きく増すことが問題となっていた。提案法は,ハイブリッド最急降下法と呼ばれる階層型不動点アルゴリズムの非自明な実現例となっており,従来法では解くことのできなかった「データ忠実性制約付き信号復元問題」の最適解を,劣勾配射影の不動点特徴付けを介することで,効率的に求めることができる。主な研究実績として取り上げた「確率的確率的近接分離最適化に基づく画像復元アルゴリズム」に関しては,主な結果を信号処理に関するトップカンファレンスであるICASSP2016で報告済みであり,「複雑なデータ忠実性制約が課された信号復元問題を効率的に解くアルゴリズム」に関しては,信号処理のトップジャーナルであるIEEE Transactions on Signal Processingに掲載されている。その他にも,研究課題に関連する成果(多チャネル画像の効果的な復元,行列ランク/核型ノルム最小化の効率化等)をICASSP2016やICIP2015(画像処理のトップカンファレンス)で報告している。「確率的階層型凸最適化アルゴリズムの構築と高精度信号復元への応用」に関して,昨年度の検討を踏まえた上で発展的な研究を行った。その中から,主要な成果である「1.階層型凸最適化の加速」と「2.非凸制約付き信号平滑化/復元アルゴリズムも構築」について報告する。1.昨年度から引き続き検討してきた(確率的)階層型凸最適化アルゴリズムは,反復数が増えるごとに徐々にステップサイズを小さくしなければ収束が保証されなかった。そこで,階層型凸最適化の一層目の最適化の記述を限定することにより,固定ステップサイズで収束が保証されるアルゴリズムを開発し収束解析を行った。画像復元を対象とした実験により,収束性能が大幅に改善されることを確認した。2.計画以上の進捗状況であったため,当初予定していた凸最適化だけではなく,非凸最適化に関する研究も進めた。具体的には,信号の差分値のグループL0ノルムとして定義される量の上界に関する制約条件を伴う信号平滑化/復元問題を効率的に解くアルゴリズムを構成した。これにより,平滑度をコントロールするパラメータの設定が格段に直感的になり,様々な応用(主に画像処理)においてその顕著な有効性を確認した。高精細信号復元を実現するために,確率的最適化(乱択評価に基づく効率的最適化)と階層型最適化(複雑な制約条件の下での最適化)の融合をキーアイデアとして研究を遂行した.主要な成果を以下に挙げる.1信号の観測過程を記述するモデル行列が特殊な構造を持たない場合に効率的復元を可能とする,確率的近接分離最適化に基づく信号復元アルゴリズム.2観測信号に含まれる雑音の統計的性質が非ガウスの場合に有効な複雑なデータ忠実性制約を効率的に扱う信号復元アルゴリズム.3固定ステップサイズによる加速を実現した階層型凸最適化アルゴリズム.4グループL0ノルムから成る非凸制約条件を効率的に扱うアルゴリズム.複雑なデータ忠実性制約が課された信号復元問題を効率的に解くアルゴリズムに関しては,広いクラスの最適化問題を対象にした厳密な収束解析を与えることに成功しているが,確率的確率的近接分離最適化に基づく画像復元アルゴリズムに関してはまだ収束解析が不完全であるため,引き続き,本研究課題の中で取り組んでいく予定である。新たなアルゴリズム・応用に関する検討も積極的に行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
視床下部-下垂体系におけるヒスタミンの動態と神経内分泌機能-無麻酔非拘束でのラット視床下部灌流による解析

脳内ヒスタミン神経系は、視床下部後部の結節乳頭核に限局して存在する細胞集団から広範な部位に線維を投射している。ヒスタミンが視床下部機能に深く関与していることは、視床下部の諸核には脳内で最も密なヒスタミン神経線維の神経支配が認められることからも支持される。脳の複雑な働きの中で、視床下部-下垂体系の神経内分泌機能は、血中ホルモンの分析によって、化学的な定量が可能な唯一の神経機能である。そこで、本研究では無麻酔非拘束ラットの視床下部におけるヒスタミンの動態と血中内分泌ホルモンの変動との相関を検討することにより、神経内分泌機構におけるヒスタミンの役割とその制御機構を明らかにすることを目的として企画した。まず、視床下部からヒスタミン遊離の測定に脳透析法を応用することを試みた。脳内ヒスタミンは他の伝達物質に比べ、量的に少なく定量がきわめて困難であったが、潅流条件の検討とヒスタミン分析の高感度化により、視床下部から遊離されるヒスタミンのオンラインでの分析に成功した。さらに、この遊離されたヒスタミンが神経細胞由来であり、脳内の肥満細胞由来ではないということを神経薬理学的に証明し得た。そして、ヒスタミン遊離の日内変動を観察したところ、ラットの活動期であり血中コルチコステロンレベルも上昇する夜間に視床下部からのヒスタミン遊離が増大することが認められた。一方、ヒスタミンの生合成を特異的に阻害しておくと、コルチコトロピン(ACTH)とコルチコステロンの日内変動が平坦化した。つまり、脳内ヒスタミンが視床下部レベルでおそらくコルチコリベリン(CRF)分泌を制御しているものと思われる。脳透析法は脳内における神経伝達物質としてのヒスタミンの動態を探る上できわめて有用であり、現在、この脳透析法を駆使して、当初予定していた計画に従い脳内ヒスタミンの動態と神経内分泌系との相関を順次検討しつつある。われわれの研究室では、ヒスチジン脱炭酸酵素に対する抗体を用いた免疫組織蛍光法により、ラット脳内にヒスタミン作動性神経系が存在することを形態学的に証明した。そして、視床下部後部・乳頭体の極めて限局した部位の約3000個の大型の細胞集団から脳内の広範な部位に線維を送っているという形態学的な特徴を明らかにした。本研究の目的は、この脳内ヒスタミン神経系がどのような生理的および病態生理的な意義を持っているのかを明らかにする点にある。脳の複雑な働きの中で、視床下部ー下垂体系の神経内分泌機能は、血中ホルモンの分析によって、化学的な定量が可能な唯一の神経機能である。ヒスタミン神経線維は視床下部諸核に最も高密度に分布しており、特異的ヒスチジン脱炭酸酵素阻害薬を用いて脳内ヒスタミンを特異的に涸渇したとき、ACTHやバソプレッシンなどの神経内分泌機構が正常に反応できなくなることを報告した。そこで、本研究では無麻酔非拘束ラット視床下部微小透析法を用いて視床下部におけるヒスタミンの動態と血中内分泌ホルモンの変動との相関を検討し、神経内分泌機構におけるヒスタミンの役割とその制御機構を明らかにするを目的として行なった。初年度では、微小脳透析法を脳内ヒスタミン動態の研究に応用すべくその基本的条件の検討を行い、視床下部から遊離したヒスタミンのオンライン分析に成功し、ヒスタミン神経系の細胞体の存在する視床下部後部を電気刺激することにより、視床下部前部からのヒスタミン遊離が約2倍に増加することが確認できた。

また、成長ホルモン放出ホルモン(GRH)とソマトスタチンは脳内ヒスタミン動態に対して逆の作用を示すことを認め、成長ホルモン分泌にも脳内ヒスタミンが関与していることを示した。さらに、脳内ヒスタミンの涸渇がコルチコトロピンとコルチコステロンの日内変動を平坦化することを確認した。脳内ヒスタミン神経系は、視床下部後部の結節乳頭核に限局して存在する細胞集団から広範な部位に線維を投射している。ヒスタミンが視床下部機能に深く関与していることは、視床下部の諸核には脳内で最も密なヒスタミン神経線維の神経支配が認められることからも支持される。脳の複雑な働きの中で、視床下部ー下垂体系の神経内分泌機能は、血中ホルモンの分析によって、化学的な定量が可能な唯一の神経機能である。ヒスタミン神経線維は視床下部諸核に最も高密度に分布しており、神経内分泌の制御機構において重要な役割を果たしていることが想定されている。そこで、本研究では無麻酔非拘束ラットの視床下部におけるヒスタミンの動態と血中内分泌ホルモンの変動との相関を検討することにより、神経内分泌機構におけるヒスタミンの役割とその制御機構を明らかにするを目的として企画した。まず、視床下部からのヒスタミン遊離の測定にin vivoでのマイクロダイアリス法(脳透析法)を応用することを試みた。脳内ヒスタミンは他の伝達物資に比べ、量的に少なく定量がきわめて困難であったが、灌流条件の検討とヒスタミン分析の高感度化により、昨年度内に視床下部から遊離されるヒスタミンのオンラインでの分析に成功した。本年度は、この遊離されたヒスタミンが神経細胞由来であり、脳内の肥満細胞由来ではないということを神経薬理学的に証明した。そして、無麻酔非拘束の条件下での視床下部からのヒスタミン遊離の日内変動を観察したところ、ラットの活動期であり血中コルチコステロンレベルも上昇する夜間にヒスタミン遊離が増大することが認められた。このように、脳透析法は脳内における神経伝達物資としてのヒスタミンの動態を探る上できわめて有用であり、現在、この脳透析法を駆使して、当初予定していた計画に従い脳内ヒスタミンの動態と神経内分泌系との相関を順次検討しつつある。
遺伝性疾患の治療薬となりうる化合物の探索とその化合物の分子機構の解析

本研究ではナンセンス変異に起因する遺伝性疾患の治療薬となりうる化合物の同定を目的とし、RlucとFlucの間にイントロンを含む配列を挿入してNMD標的となるように設計したRluc-X-HBB-Flucレポーター発現系を用いてNMD阻害剤とリードスルー剤の探索を行い、8種のNMD阻害剤候補化合物を得た。1)NMD阻害剤候補化合物の検証、2)リードスルー剤探索用レポーターの改良、3)スクリーニング過程で発見したジストロフィン遺伝子内の新規IRES活性についての検証実験を行った。1)NMD阻害剤候補化合物の検証:東京大学創薬機構のコアライブラリーと既存薬ライブラリーに含まれる、同定された化合物と共通の構造を持つ化合物108種についてアッセイを行った。2)リードスルー剤の探索用レポーターの改良:以下の問題点が明らかとなった。1PTC124処理によりFlucタンパク質の安定化が観察された。2ナンセンス変異周辺の配列がIRES活性を持つため、リードスルー効率を正しく評価できていない。1に関しては、アッセイ系の改善を行った。Rlucの配列中にstopコドンを挿入し、Nano lucと連結させたレポーターRluc(stop)-HBB-Nlucを構築した。Nano luc活性を検出することにより高感度にリードスルーを観察することが可能になった。2に関しては、IRESを含む領域を削除したレポーターを構築することで正確にリードスルー効率を測定することが可能となった。3)ジストロフィン遺伝子内の新規IRES活性の検証:スクリーニングに用いたRluc-X-HBB-Flucレポーター由来の産物をウエスタンにより解析した結果、Fluc相当C末端側断片が観察された。RlucとFlucの間にジストロフィン遺伝子の配列の一部を挿入し、IRESの最小領域を同定するためのレポーターを構築した。29年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、1)NMD阻害剤候補化合物の検証、2)リードスルー剤探索用レポーターの改良、3)スクリーニング過程で発見したジストロフィン遺伝子内の新規IRES活性についての検証実験を行った。一次スクリーニングが完了し候補化合物が得られた。これらのC末端側断片産生がIRES活性に依存するかを解析する予定である。RlucとFlucの間にイントロンを含む配列を挿入してNMDの標的となるように設計したRluc-X-HBB-Flucレポーター発現系を用いてNMD阻害剤とリードスルー剤の探索を行い、8種のNMD阻害剤候補化合物を得た。今年度は、1)NMD阻害剤候補化合物の検証、2)リードスルー剤探索用レポーターの改善、3)スクリーニング過程で発見したジストロフィン遺伝子内の新規IRES活性についての検証実験を行った。1)NMD阻害剤候補化合物の検証:東京大学創薬機構のコアライブラリーと既存薬ライブラリーに含まれる、同定された化合物と共通の構造を持つ化合物108種についてRluc-X-HBB-Flucレポーターのstable発現系を用いてアッセイを行った。2ナンセンス変異周辺の配列がIRES活性を含むため、リードスルー効率を正しく評価できていない。Nano luc活性を検出することにより、高感度にリードスルーを観察することが可能になった。3)ジストロフィン遺伝子内の新規IRES活性の検証:スクリーニングに用いたRluc-X-HBB-Flucレポーター発現細胞でレポーター由来の産物をウエスタンにより解析した結果、Fluc相当C末端側断片が観察された。

これらのC末端側断片産生がIRESに依存するかを解析する予定である。本研究ではナンセンス変異に起因する遺伝性疾患の治療薬となりうる化合物の同定を目的とし、RlucとFlucの間にイントロンを含む配列を挿入してNMD標的となるように設計したRluc-X-HBB-Flucレポーター発現系を用いてNMD阻害剤とリードスルー剤の探索を行い、8種のNMD阻害剤候補化合物を得た。1)NMD阻害剤候補化合物の検証、2)リードスルー剤探索用レポーターの改良、3)スクリーニング過程で発見したジストロフィン遺伝子内の新規IRES活性についての検証実験を行った。1)NMD阻害剤候補化合物の検証:東京大学創薬機構のコアライブラリーと既存薬ライブラリーに含まれる、同定された化合物と共通の構造を持つ化合物108種についてアッセイを行った。2)リードスルー剤の探索用レポーターの改良:以下の問題点が明らかとなった。1PTC124処理によりFlucタンパク質の安定化が観察された。2ナンセンス変異周辺の配列がIRES活性を持つため、リードスルー効率を正しく評価できていない。1に関しては、アッセイ系の改善を行った。Rlucの配列中にstopコドンを挿入し、Nano lucと連結させたレポーターRluc(stop)-HBB-Nlucを構築した。Nano luc活性を検出することにより高感度にリードスルーを観察することが可能になった。2に関しては、IRESを含む領域を削除したレポーターを構築することで正確にリードスルー効率を測定することが可能となった。3)ジストロフィン遺伝子内の新規IRES活性の検証:スクリーニングに用いたRluc-X-HBB-Flucレポーター由来の産物をウエスタンにより解析した結果、Fluc相当C末端側断片が観察された。RlucとFlucの間にジストロフィン遺伝子の配列の一部を挿入し、IRESの最小領域を同定するためのレポーターを構築した。1)NMD阻害剤候補化合物の検証:改良系を用いて一次スクリーニングにより得られた候補化合物について、再度活性測定を行う。その後、類縁化合物について活性測定し、構造活性相関を解析する。mRNA安定性は、アクチノマイシンD添加後にタイムコースをとって細胞を回収し、半減期をノーザンブロッティング、定量PCRにより測定することにより検証する。2)リードスルー剤の探索: Rluc(stop)-HBB-Nlucレポーターにより、従来より高感度にリードスルーを観察することが可能になった。この系を用いて、化合物ライブラリーから新規リードスルー剤候補化合物を同定する。3)ジストロフィン遺伝子内の新規IRES活性の解析:前述のC末端側断片生成機構に関して、挿入配列の塩基配列依存性、アミノ酸配列依存性を詳細に解析する。また、遺伝性疾患の原因遺伝子においても網羅的に探索、必要な最小領域を同定する予定である。
心臓核医学画像および冠動脈造影像の3次元重ねあわせ表示システムの開発

昨年までに試作してきたシステムの使用経験をもとに、開発システムにおいて必要な用件を洗い出した。その結果、冠動脈造影像からの冠動脈像の3次元再構成の部分に手間がかかる場合があり、実用的でないことがわかった。このため、本年度は重ねあわせ表示システムの全体構成よりも、冠動脈像の3次元再構成の部分の省力化を中心に研究を進めた。具体的に以下を行った。1.SPECTおよびPETから計算機へ画像データを転送する方法を確立した。ただし、これらの撮影装置はバ-ジョンアップの可能性があり、その際には再確認が必要である。2.複数組みのバイプレーン造影像を基に冠動脈像の3次元再構成を自動的に行う手法について検討した。これまで、1組みのバイプレーン造影像を基に半自動的に冠動脈像を再構成するシステムを試作してきた。しかしながら、3次元空間を複雑に走行する冠動脈の走行を2方向の造影像のみから再構成するには、人手を用いても非常に困難な場合がある。そこで、複数方向の撮影像を用いることにより、その点を自動化する手法を検討した。複数撮影方向の像を用いるためには撮影系のパラメータを知っておく必要がある。そこで、冠動脈の3次元再構成と撮影系のパラメータの推定を同時に行う手法を検討し、自動化の見通しを得た。3.PETおよびSPECT像からの心筋部位の抽出法について、これまでの試作システムで新たな症例の処理を行い、有効性を確認した。4.心筋像と冠動脈像の重ね合わせ法について、これまでの試作システムで用いてきた手法を改善した。具体的には、最適化の計算部分を改善して計算時間の短縮を実現した。また新たな症例での重ねあわせを実現した。
リボソーム翻訳におけるアミノ酸基質許容性の拡大

研究の目的本研究では、特殊アミノ酸(Xaa)を付加した各アミノアシルtRNA(Xaa-tRNA)と翻訳伸長因子EF-Tu間の結合力を調整することで、Xaa導入に特化した試験管内ペプチド合成系を開発し、10種以上のXaaを含むペプチドの翻訳合成を実現する。さらにその翻訳系を応用してペプチド薬剤スクリーニングを行い、多数の人工修飾により優れた生理活性を獲得した新規特殊ペプチド薬剤を開発することで、本戦略の意義を実証する。DC1第三年度の研究概要(1)Xaa含有ペプチド翻訳合成に特化した試験管内翻訳系の確立。Xaa-tRNAのEF-Tu結合力を天然AA-tRNAと同等の値に調整した条件下で、翻訳反応の様々な条件(反応時間、Xaa-tRNA濃度、EF-Tu濃度、pHなど)の最適化を行った。結果として、モデルペプチドの翻訳効率および正確性が大きく改善され、Xaa含有ペプチド翻訳合成に特化した試験管内翻訳系が確立された。(2)本戦略によるXaa含有ペプチド翻訳合成の改善を実証。次に本戦略の効果を調べるため、複数種のXaaを含有するモデルペプチドの翻訳合成について、既存の改変型翻訳系と本研究で確立されたものの2つを比較検証した。既存の翻訳系による合成は不正確であり、多種の翻訳エラー産物が生成されたのに対して、本研究の翻訳系では望みのペプチドが正確に合成された。また定量実験の結果、合成効率も改善されていることがわかった。(3)本研究のまとめ。Xaa-tRNAとEF-Tuとの結合力を調整する本戦略により、複数種のXaaを含有するペプチドの翻訳合成が可能となる。この技術を既存のペプチドスクリーニング手法と組み合わせることで、将来的に革新的ペプチド医薬品の開発につながると期待される。28年度が最終年度であるため、記入しない。研究の目的本研究では、特殊アミノ酸(Xaa)を付加した各アミノアシルtRNA (Xaa-tRNA)と翻訳伸長因子(EF-Tu)の結合力を調整することで、Xaa導入に特化した試験管内翻訳合成系を開発し、10種以上のXaaを含むペプチドの翻訳合成を実現する。初年度の研究経過初めに、(1)アミノアシルtRNAとEF-Tuの結合力を調整する方法を開発し、実際にフェニルアラニンを付加したtRNA(Phe-tRNA)およびXaa-tRNAとEF-Tuとの結合力を多様に変動させられることを確認した。また、(2)多様な結合力を持つPhe-tRNAとEF-Tuの組み合わせそれぞれについて、Phe含有ペプチド翻訳合成速度をオートラジオグラフィーにより測定することで、EF-Tu結合力の強弱とペプチド合成速度との相関を調べた。現在各Xaa-tRNAの正確なEF-Tu結合力の測定を行っており、来年度において、最適なEF-Tu結合力を明らかとすることを目指す。次に、(3)低導入効率として知られる複数種のXaaについてEF-Tu結合力の最適化を行い、天然アミノ酸と同程度の効率にまで改善した。来年度においても、引き続き最適化実験を行い、その種類を10種以上に拡大することを目指す。DC1第二年度の研究経過初めに、(1)Xaa-tRNAとEF-Tu間の結合力を正確に定量する手法を確立した。(2)その測定法を用いて、Xaa-tRNAのEF-Tu結合力が天然アミノアシルtRNAよりも一般に低いことを実証した。(3)前年度に開発した結合力調整法により、Xaa-tRNAのEF-Tu結合力を天然アミノアシルtRNAに相当する値にまで補強できることを確認した。(4)結合力調整によりXaa含有ペプチドを翻訳合成する反応の効率・正確性が改善されることを確認した。(5)6種のXaa-tRNAのEF-Tu結合力を一定の値に揃えることで、人工修飾を多く含む特殊ペプチドを効率良く翻訳合成することを試みた。現在最適化実験の途中であるが、来年度に10種のXaaを含む特殊ペプチドの翻訳合成を達成することを目指す。また関連する新技術として「コドンボックス人工分割」法を確立し、Nature Chemistryに発表した(Iwane, Y. et al. Nat. Chem. 8, 317-325 (2016))。この研究はDC1採択テーマ「リボソーム翻訳におけるアミノ酸基質許容性の拡大」と密接に関係し、知見やノウハウを共有するものである。本年度の研究により、本研究課題で挙げた仮説すなわち「Xaaの導入効率が低い原因は、Xaa-tRNAがEF-Tuと十分に結合できないことにあり、この問題を解決することで、より多様なXaaを効率良く正確に導入できるようになる」という仮説が立証された。

本研究で確立されたEF-Tu結合力調整法は、多様なXaaの導入効率を改善する実用的な新技術であり、既に研究室内外で多数の共同研究に貢献している。また現在最適化実験中であるものの、6種以上のXaaを含む特殊ペプチドの高効率翻訳合成が実現することを示唆するデータも得られている。上記研究成果から、多数の人工修飾を含む特殊ペプチドのスクリーニング系が採用期間中に構築されると見込まれるため、「概ね順調に進展している」と判断した。研究の目的本研究では、特殊アミノ酸(Xaa)を付加した各アミノアシルtRNA(Xaa-tRNA)と翻訳伸長因子EF-Tu間の結合力を調整することで、Xaa導入に特化した試験管内ペプチド合成系を開発し、10種以上のXaaを含むペプチドの翻訳合成を実現する。さらにその翻訳系を応用してペプチド薬剤スクリーニングを行い、多数の人工修飾により優れた生理活性を獲得した新規特殊ペプチド薬剤を開発することで、本戦略の意義を実証する。DC1第三年度の研究概要(1)Xaa含有ペプチド翻訳合成に特化した試験管内翻訳系の確立。Xaa-tRNAのEF-Tu結合力を天然AA-tRNAと同等の値に調整した条件下で、翻訳反応の様々な条件(反応時間、Xaa-tRNA濃度、EF-Tu濃度、pHなど)の最適化を行った。結果として、モデルペプチドの翻訳効率および正確性が大きく改善され、Xaa含有ペプチド翻訳合成に特化した試験管内翻訳系が確立された。(2)本戦略によるXaa含有ペプチド翻訳合成の改善を実証。次に本戦略の効果を調べるため、複数種のXaaを含有するモデルペプチドの翻訳合成について、既存の改変型翻訳系と本研究で確立されたものの2つを比較検証した。既存の翻訳系による合成は不正確であり、多種の翻訳エラー産物が生成されたのに対して、本研究の翻訳系では望みのペプチドが正確に合成された。また定量実験の結果、合成効率も改善されていることがわかった。(3)本研究のまとめ。Xaa-tRNAとEF-Tuとの結合力を調整する本戦略により、複数種のXaaを含有するペプチドの翻訳合成が可能となる。この技術を既存のペプチドスクリーニング手法と組み合わせることで、将来的に革新的ペプチド医薬品の開発につながると期待される。「Xaa-tRNAとEF-Tuの結合力を人工的に調整することでXaaの導入効率を改善する」という研究方針のもと、Xaa-tRNAとEF-Tuの結合力を調整する手法を確立し、その後複数種のXaaについてEF-Tu結合力調整による導入効率の改善を試みた。結果として、複数種のXaaについて導入効率が改善されることが判明し、リボソーム翻訳において高効率に利用できるXaaの種類拡大を達成した。翌年度に本研究をさらに進展させることで、多数(10種程度)のXaaを含む特殊ペプチドライブラリーの翻訳調製が達成されると見込まれる。今後の研究の推進方策(1)EF-Tu結合力調整法を用いて10種のXaa-tRNAがバランスよくEF-Tuに結合することを可能とし、その条件において高度修飾特殊ペプチドの翻訳合成を検討する。(2)本技術と特殊ペプチドスクリーニング技術と組み合わせ、50%以上が特殊アミノ酸により構成される新規特殊ペプチド薬剤を開発する。(3)獲得された特殊ペプチドが多数の人工修飾により優れた生理活性を示すことを実証する。
空間統計学的手法についての研究

計算機の発達にともない空間的・時空間的な構造をもつデータの解析が多く試みられているようになってきている.このようなデータを取り扱うため空間的・時空間的なモデルを利用した統計的解析を考える場合に現れる問題についての研究を行った.なかでも,広く利用されている空間モデルのひとつである格子上のガウス過程のモデルを考える際に現れるいくつかの問題について研究を行った.特に,時系列における自己回帰モデル,およびその多次元版と見なせるCARモデルの場合についての推定と空間的な予測について研究した.1.独立同一分布の場合に予測分布の方法として知られているアプローチがある.この考えを拡張した空間的な予測方法を新たに提案した.これは,あるクラスの広く利用されている空間的な予測法を改良するものである.微分幾何学的なアプローチを有効に利用してこれらの手法の性質を理論的に研究し,提案した手法の漸近的な最適性を示した.空間的な現象を考える場合,多量のデータを取り扱う必要が生じるためハードディスク,MOドライブ,メモリ素子を導入して計算機環境を整備しつつ,シミュレーションによる研究を平行しておこなった.シミュレーションによる有限個のデータの場合の評価を行い,実際に予測精度が改善されることを示した.2.基本的なモデルの推定量の性質について研究した.とくに,最尤推定量をはじめとするいくつかの代表的な推定量の漸近的な性質について比較,考察した.計算機の発達にともない空間的・時空間的な構造をもつデータの解析が多く試みられているようになってきている.このようなデータを取り扱うため空間的・時空間的なモデルを利用した統計的解析を考える場合に現れる問題についての研究を行った.なかでも,広く利用されている空間モデルのひとつである格子上のガウス過程のモデルを考える際に現れるいくつかの問題について研究を行った.特に,時系列における自己回帰モデル,およびその多次元版と見なせるCARモデルの場合についての推定と空間的な予測について研究した.1.独立同一分布の場合に予測分布の方法として知られているアプローチがある.この考えを拡張した空間的な予測方法を新たに提案した.これは,あるクラスの広く利用されている空間的な予測法を改良するものである.微分幾何学的なアプローチを有効に利用してこれらの手法の性質を理論的に研究し,提案した手法の漸近的な最適性を示した.空間的な現象を考える場合,多量のデータを取り扱う必要が生じるためハードディスク,MOドライブ,メモリ素子を導入して計算機環境を整備しつつ,シミュレーションによる研究を平行しておこなった.シミュレーションによる有限個のデータの場合の評価を行い,実際に予測精度が改善されることを示した.2.基本的なモデルの推定量の性質について研究した.とくに,最尤推定量をはじめとするいくつかの代表的な推定量の漸近的な性質について比較,考察した.
酸化的ストレスにより変性した細胞の認識除去機構

本研究は、酸化ストレスにより傷害を受けた赤血球を健常人血中の抗band3糖タンパク質自己抗体及びマクロファージが認識するというこれまでの知見をふまえ、その認識機構を解明するとともに、酸化ストレスの関与が示唆されている老化細胞、アポトーシス細胞に対するマクロファージの反応性についても検討したものである。I酸化変性細胞の認識機構の解明1)酸化赤血球の膜ではband3が凝集し、その結果、誘導されるband3のポリラクトサミン型糖鎖の細胞表面におけるクラスターが、抗band3自己抗体のリガンドになることを明らかにした。2)マクロファージが認識する酸化赤血球表面の構造もband3のポリラクトサミン型糖鎖のクラスターであることを明らかにした。3)酸化赤血球の認識にかかわるマクロファージ細胞膜のポリラクトサミン結合性レセプターの精製と構造解明に取り組み、(1)ヒトマクロファージ膜に、酸化赤血球膜ポリラクトサミン糖鎖を特異的に認識するレセプタータンパク質が数種存在することを見出した。(2)次いで、これらポリラクトサミン結合性レセプタータンパク質のうち主要なタンパク質として、分子量50kDaのタンパク質を精製し、そのN末端アミノ酸10残基の配列を決定した。この配列のホモロジー検索の結果、新規タンパク質であることがわかった。II老化細胞の認識機構老化体細胞のモデルとして、in vitroでインキュベーションを行った好中球はヒトマクロファージにより認識されることがわかった。IIIアポトーシス細胞の認識機構ある種の薬物によりアポトーシスを誘導した培養細胞はマクロファージにより認識されたが、認識を受ける部位、および、この部位の形成における酸化ストレスの関与は明らかではない。1.酸化変性細胞の認識(1)Anti Band3自己抗体の結合をもたらすBand 3糖タンパク質の細胞膜における変化の解明.酸化赤血球細胞膜のBand 3糖タンパク質の存在状態を解析した結果、酸化赤血球膜ではBand 3がaggregateすることによってそのポリラクトサミン糖鎖の局部的高密度化が起こり、ポリラクトサミン糖鎖に対する抗体であるanti Band 3自己抗体が細胞表面に結合しやすくなることが明らかとなった。(2)マクロファージにより認識される細胞膜糖タンパク質変化の解明.マクロファージとしてヒト単球系白血病細胞株(THP-1細胞)を用いた場合、酸化赤血球膜Band 3のポリラクトサミン糖鎖がTHP-1細胞により認識されることが明らかとなり、(1)で認めたBand 3 aggregateの糖鎖がマクロファージのレセプターによっても認識されることがわかった。(3)酸化変性赤血球の直接認識に関わるマクロファージ細胞膜レセプター単離精製.ポリラクトサミン型糖鎖を持つラクトフェリン、および精製Band 3を固定化したアフィニティーカラムを用いて、THP-1細胞からポリラクトサミンに対する分子量80kDaのレセプターを部分精製することができた。(4)酸化的ストレスを受けた体細胞に対するマクロファージの認識能の検討.酸化好中球もマクロファージにより認識され、この認識にも好中球表面のポリラクトサミン糖鎖が関与していることが判明した。平成8年度は、以上のような酸化変性細胞に対する認識除去機構が、2.老化細胞や3.アポトーシス細胞に対しても機能しているかどうか検討する。今年度は、酸化変性細胞のマクロファージによる認識機構の解明を分子レベルで進めるとともに、老化細胞、アポトーシス細胞のマクロファージによる認識についても検討した。I酸化変性細胞の認識機構の解明

酸化赤血球のヒトマクロファージ(THP-1細胞)による認識においては、酸化赤血球表面で密集化したband3糖タンパク質のポリラクトサミン型糖鎖にたいする結合反応が関与していることが昨年度判明したことをうけて、(1)ヒトマクロファージ膜に、酸化赤血球膜のポリラクトサミン糖鎖を特異的に認識するレセプタータンパク質が数種存在することを証明した。(2)次いで、これらのポリラクトサミン結合性レセプタータンパク質のうち主要なタンパク質として、分子量50kDaのタンパク質を精製し、そのN末端アミノ酸10残基の配列を決定した。この配列のホモロジー検索の結果、新規タンパク質であることがわかった。II老化細胞の認識機構老化体細胞のモデルとして、in vitroでインキュベーションを行った好中球はヒトマクロファージにより認識されることがわかった。IIIアポトーシス細胞の認識機構ある種の薬物によりアポトーシスを誘導した培養細胞はマクロファージにより認識されたが、認識を受ける部位、および、この部位の形成における酸化ストレスの関与は明らかではない。
一酸化窒素分解触媒の開発に関する研究

これまでの研究で、【Cu^(2+)】交換ゼオライトがNOの接触分解反応に定常活性を示すこと、母ゼオライトの活性序列がZSM-5>>M>Y>Xであることを明らかにした。更に反応機構に関連して、【Cu^+】がNO分解の活性点であること、ゼオライト構造中では【Cu^+】が特異的に安定化され、このためNO分解の定常活性が発現することを提案した。本年度はZSM-5を中心に、Si【O_2】/【Al_2】【O_3】比および調製法の異なる種々のゼオライトについて【Cu^(2+)】交換体のNO分解活性を調べ、活性を支配する化学的および構造的因子を検討すると共に、IR等によりNO分解機構を究明した。【Cu^(2+)】交換ZSM-5は反応温度773-873Kで最高活性を示し、Si【O_2】/【Al_2】【O_3】比50、【Cu^(2+)】交換率73%、接触時間1g・s・【Cm^(-3)】でNOの90%以上が除去された。MおよびZSM-5中の銅イオン1個あたりのNO分解活性は、TPAを用いてつくられたZSM-5を除いて、Si【O_2】/【Al_2】【O_3】比に対してほぼ直線的に増大した。これよりゼオライト中の銅イオンの活性はゼオライトの結晶構造によらず、Si【O_2】/【Al_2】【O_3】比によって決まることがわかった。ZSM-5上のNOの吸着状態、反応挙動をIR、TPD、同位体トレーサ法で検討した結果、NOの吸着状態には【NO^-】(single型およびtwin型)、【NO^+】等があること、【NO^-】および【NO^+】の吸着点がそれぞれ【Cu^+】および【Cu^(2+)】であること、【NO^-】種は室温で2次速度式に従って減少し、その反応次数が流通反応におけるNOの反応次数2・3次とよく一致すること、等がわかった。これらの結果より【Cu^(2+)】交換ゼオライト上のNOの接触分解機構を次のように結論した。(1)【Cu^(2+)】交換ゼオライトでは高温加熱により酸素の脱離を伴って【Cu^(2+)】の一部が【Cu^+】に還元される。(2)NOは【Cu^+】上に吸着して【Cu^(2+)】-【NO^-】(singleまたはtwin)を形成し、その2分子反応によりNOの分解が進行する。(3)律速段階は表面反応過程である。今後、【Cu^+】によるイオン交換法を検討し、触媒活性を更に向上させることを計る。耐【SO_x】性の付与についても検討する。(2)NOは【Cu^+】上に吸着して【Cu^(2+)】-【NO^-】(single

またはtwin)を形成し、その2分子反応によりNOの分解が進行する。(3)律速段階は表面反応過程である。今後、【Cu^+】によるイオン交換法を検討し、触媒活性を更に向上させることを計る。耐【SO_x】性の付与についても検討する。
液相レーザーアブレーション法による難合成ナノ粒子作製技術の開発

有機溶媒中に分散したホウ素やタングステン原料粉体にレーザー光を照射したところ、真球状の炭化ホウ素や炭化タングステンの生成を確認した。また、液相中の多角状の炭化ホウ素や炭化ケイ素の原料粉体にレーザーを照射したところ、真球状のこれらの粒子が得られた。本手法はこれらの材料のように高温・高硬度な材料で一般的な化学合成や機械的粉砕による微細化が困難な真球状ナノ粒子の合成に有効であると考えられる。本研究では通常の化学液相法での合成が困難な易酸化性元素の非酸化物や高融点材料ナノ粒子合成のための新規液相プロセスの一つとして、「液相レーザーアブレーション法」に着目した。有機溶媒中に分散させたホウ素粒子をレーザー照射することにより炭化ホウ素が得られることを見出してきたが、平成20年度はレーザー照射強度や用いる液相溶媒の種類が生成物に及ぼす影響を調査した。0.03Wのレーザー強度では炭化ホウ素のみを得ることが出来たのに対し、照射強度の増加に従い、ホウ酸の生成が顕著となり、炭化ホウ素の生成率が減少した。これらの結果から、ホウ素の様な易酸化性元素を含む非酸化物(本研究では炭化物)の合成を行う場合、比較的弱いレーザー強度での照射により酸化物の生成が抑制されることが明らかとなった。また、種々の液相中でのレーザー照射後の生成物のサイズを比較したところ、用いる液相の誘電率が減少するに従い得られる炭化ホウ素粒子の平均粒径が大きくなることが明らかとなった。液相分子の粒子表面への溶媒和の程度により粒子間の凝集の程度が変化することにより生成炭化ホウ素粒子のサイズが影響を受けたためと考えられる。平成20年度は有機溶媒中に分散させたホウ素粒子をレーザー照射することによって得られる炭化ホウ素粒子に着目し、用いる溶媒の種類と照射条件によって得られる炭化ホウ素粒子の生成率や粒子サイズを調査した。平成21年度は炭化ケイ素ナノ粒子を有機溶媒中に分散させ、同様にレーザー照射を行ったところ、比較的弱い照射強度では照射後の炭化ケイ素粒子はサブミクロンの球状粒子に変化しており、溶融プロセスが起こっていることが考えられる。生成した球状粒子の表面には、炭化ホウ素粒子の場合と同様に厚さが約10nmのグラファイト皮膜が生成していることも明らかとなった。レーザー照射強度を増加すると、ホウ素の場合と同様に酸化物(酸化ケイ素)の生成が顕著になる傾向が確認され、アブレーションが起こっていると考えられる。しかし、一方でシリコン結晶の生成もが確認されるようになり、アブレーションの条件では複数の異なる反応が起こっていると考えられる。これはレーザー照射に集光レンズを用いており、分散液面付近に焦点を合わせていたために、液面付近と液面から距離が離れた液相の空間でのレーザー光フルエンスに分布があったことから異なる反応が同時に起こったと考えられる。この様に、従来は本手法において一般的であった集光照射法では反応が複雑であり、現象の解明のためには非集光照射が適していると考えられる。
吸入麻酔薬セボフルランが心筋リズムと遅延整流Kチャネルに及ぼす影響

これまでの我々の研究により、吸入麻酔薬イソフルランが心筋活動電位持続時間を濃度依存性に2相性に延長、短縮することを報告してきた。(Suzuki A. Anesthesiology 97,2002)また、慣習的に心筋イオンチャネルの研究は室温下で、しかも各チャネルごとに異なる電位プロトコールを用いた検討が行われてきたが、我々は室温条件ではタンパクが十分機能できないために麻酔薬がチャネルに与える影響が異なる可能性を報告した。(Suzuki.A, Anesth Analg 96,2003)今回の実験において、日本において小児から老人まで臨床で使用されているセボフルランも、モルモット単離心筋を用いたパッチクランプ法による検討で、濃度依存性に2相性に持続時間を延長、短縮し、使用濃度に応じて心筋リズムへの影響が変化しうることが示唆された。その機序として、活動電位のプラトー相で特に活躍するカルシウムチャネル、および遅延整流カリウムチャネルへの異なる程度での抑制が関与していることが判明した。特に遅延整流Kチャネルはセボフルランによる抑制が強く、活動電位の延長に重要な役割を果たしていると考えられたため、遅延整流カリウム電流をrapid、slowの2成分に分けてセボフルランの影響を検討した。その結果、セボフルランはIKr、IKsの2つの成分のなかでも、IKsをより強く抑制することが明らかとなった。このことから、セボフルランによる活動電位の延長は、いわゆる薬剤誘発性のQT延長症候群がIKrを介して活動電位および心電図上のQTを延長するのとは異なる機序で生じていることが示唆された。本研究の要旨はEuropean society of anesthesiologist meeting 2006, Spainで発表された。(Suzuki A.Anesthesiology 97,2002)また、慣習的に心筋イオンチャネルの研究は室温下で、しかも各チャネルごとに異なる電位プロトコールを用いた検討が行われてきたが、我々は室温条件ではタンパクが十分機能できないために麻酔薬がチャネルに与える影響が異なる可能性を報告した。(Suzuki.A, Anesth Analg 96, 2003)今回の実験において、日本において臨床で使用されているセボフルランも、モルモット単離心筋を用いたパッチクランプ法による検討で、濃度依存性に2相性に持続時間を延長、短縮し、使用濃度に応じて心筋リズムへの影響が変化しうることが示唆された。予定通り、後半2年目において特に重要な関わりを持つと考えられる遅延整流カリウム電流をrapid、slowの2成分に分けて検討する予定である。
近世東国における高野山参詣と文化的影響

東国における人々の高野山参詣は、相模国のおける事例をとってみると、既に中世末期には確立してたといえる。その後、近世期に入って高野山参詣は増加してくるが、その隆盛は特に中期以降の所謂社寺参詣行動と連動してみられる。しかし、東国人の高野参詣の動向と形態は高野山参詣とうい単独で表出するものではなく、むしろ高野山を含めた伊勢神宮や各地霊場・札所、或いは京・大阪・奈良といった寺社や古跡名所に富んだ地域との複合的参詣スタイルを採ることが一般的な傾向である。このような参詣行動の傾向が、東国においてどのような文化的影響を与えたかといえば、ひとつには、参詣人ら自ら筆記する「道中記」等を借りた日記に表出してくる。本研究は庶民階層の「日記論」を考究したものではないが、道中日記の多出は庶民階層と文化の接点で大きな文化活動であった。次に、高野山を含めた各寺社や名所・旧跡地側における文化的動向の顕著なもののひとつとして、地図や絵図、案内誌の刊行など在地の出版文化に影響を与えたといえる。一方、中央出版においても、各寺社の案内誌や道中記といった出版物を多刊したことでも理解されるように、参詣行動の隆盛は無関心ではいられないことであった傾向を捉えることができた。また、高野参詣を含めた参詣行動の隆盛を特に高野山に例をとって、高野山山内図の刊行に視点をあてる分析を試みた結果、版形の相違が明かになったが、版形の相違は近世における社寺参詣と出版権に関する認識の指標として理解できるようである。東国における荒野山参詣の初源は中世末期にもとめられよう。東国という広範囲に限定しての参詣行動の把握は広範な資料収集を要するので、サンプル的に参詣行動をながめその特徴的傾向を捉えることとした。サンプルとして抽出したのは相模国で、当該地域は中世末期から高野山高室院と慈眼院の檀家として存在したことが知れるが、これは戦国大名後北条氏と両院の歴史的関係の上に成立したもので、その基盤上に近世期の参詣行動が展開すると理解しうる。ただ、参詣行動が隆盛になるのは、既に指摘されるごとく近世中期以降で、諸人の参詣と文化的活動を跡ずける「参詣記」「道中記」の多出は近世後期の現象としてあったことが数量的にも把握された。これら「参詣記」「道中記」に見える高野山参詣の記事は、単独で記述されることはなく、多くの場合「伊勢参宮」や「金比羅参詣」等とセットで参詣したことが窺え傾向にある。このことから、近世中期以降の高野山参詣は、高野山信仰単独の欲求から説明されるものではなく、高野山周辺に所在する聖地への参詣行動と複合した展開の上にその傾向を理解する必要があろう。また、参詣行動の隆盛に従って諸出版物(刊本「道中記」等)が多く刊行されることから参詣地側の刊行物との相関関係を捉え参詣傾向を把握し課題に迫りたいと考えているが、特に高野山側に於ける刊行物は数量的にきわめて少ない傾向を示した。東国における高野山参詣は既に中世末期には確立していたといえようが、その隆盛は近世期、特に中期以降の所謂社寺参詣行動と連動してみられる。既に先年度、東国人の高野参詣の動向と形態は単独で表出するものではなく、むしろ高野山を含めた伊勢神宮や各地霊場・札所、或いは京・大阪・奈良といった寺社や古跡名所に富んだ地域との複合的参詣スタイルを採ることが一般的であると指摘しておいたが、逆に、高野山を含めた地帯が参詣行動の隆盛となった時期に、参詣人を受け入れるにあたってどの様な文化的変化を遂げたのかを問題意識として揚げ、その為の調査を進めた。特に、高野参詣の隆盛と密接な関係があろうとの予測から高野山山内図の調査収集につとめた。高野山山内図は、木版摺りの簡単なものでまま彩色を施したものもある。図様は弘法大師入定の奥院やその参道、壇上伽藍・山内諸塔頭等を描き、注記している。