hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
翻訳後修飾において神経ペプチドのアミノ酸をＤ型化する酵素に関する研究

本研究では、軟体動物アメフラシの神経ペプチド(NdWFa)のトリプトファンをD型化する酵素の同定を試みた。まず、サブトラクション法で、NdWFa発現ニューロン特異的cDNAを調製し、それらがコードする機能不明でシグナル配列をもつ4種の蛋白質をD型化酵素の候補とした。一方、その候補遺伝子を共発現させ、NdWFaの産生・分泌を確かめるため、NdWFa前駆体遺伝子を発現するCHO-K1細胞の作出を試みた。リポフェクション法によるNdWFa前駆体遺伝子の導入と発現には成功したが、NdWFaの細胞外への分泌は確認できなかった。今後は、NdWFa発現系を確立し、D型化酵素の候補遺伝子の機能解析を目指す。軟体動物腹足類アメフラシ(Aplysia kurodai)の心拍動増強ペプチドであるNdWFamideは、D型トリプトファンをもつユニークな構造の神経ペプチドである。本研究は翻訳後修飾の過程でNdWFadmieのトリプトファンをD型化する酵素、ペプチドイソメラーゼを分子生物学的手法で同定することを目的としている。前年度までにサブトラクション法により、アメフラシ腹部神経節中でNdWFamideを発現するRUQニューロンに特異的なcDNAを調製した。そして、それらを配列分析して相同性検索により帰属を明らかにしてきた。今年度はさらにRUQニューロン特異的cDNAの同定を進めるため、最終的に72個のcDNAを配列分析した。そのうち43個は相同性検索により相同性が高いものが見つかった。既知の神経ペプチド・ペプチドホルモンをコードするものが15個、V-ATPaseなどを含む酵素をコードするものが5個、リボソームタンパク質をコードするものが9個含まれていた。また21個は相同性の高いものが見つからなかったが、コードするタンパク質のN末端にシグナルペプチドが見られないため、イソメラーゼ遺伝子ではないと判断した。これらのcDNAを除き、最終的にイソメラーゼ候補遺伝子と判定されたものは3個に絞られた。さらに、これらの候補遺伝子を培養細胞に発現させて活性検定するため、CMVプロモーターをもつFlexi vector system (Promega)に組み込んだ。合わせて、NdWFamide前駆体をコードするcDNAも同様に発現ベクターに組み込んだので、今後、これらを培養細胞に発現させ、イソメラーゼ活性を検定する。われわれが軟体動物腹足類のアメフラシから単離したNdWFamideはD型トリプトファンをもつユニークな心拍動増強ペプチドである。NdWFamideは翻訳後修飾の過程でトリプトファンがD型化すると考えられるため、D型化酵素(peptydil-D/L-イソメラーゼ)の同定することを目的に研究を行ってきた。前年度までNdWFamideを発現するアメフラシのRUQニューロンに特異的に発現するmRNAをサブトラクション法で取得し、そこから作製したcDNAのクローニングを行ってきた。その結果、機能不明の新奇分泌型蛋白質をコードすると思われるcDNAを最終的に3種得た。その後、新たにクローニングしたcDNAがpeptidyl proline isomeraseと相同性が高かったことは興味深い。これらの候補遺伝子が実際にNdWFamideをD型化できるかどうかをスクリーニングする方法として、予め、NdWFamide前駆体を発現する細胞を作製し、そこへ候補遺伝子を共発現させ、D型トリプトファンをもつペプチドが産生されるかどうかを確かめることとした。発現させる細胞として、哺乳動物の神経ペプチド前駆体を発現することが知られているCHO-K1細胞を用いた。NdWFamide前駆体cDNAをpF5A-CMV-neo-vector (プロメガ)に組み込み、リポフェクション法で遺伝子導入した。G418添加による選別では発現ベクターの取り込みはできていると思われたが、現在までにペプチドの産生は確認できていない。研究期間は終了したものの、今後さらに、他の細胞系の使用を含む発現条件等を検討し、前駆体遺伝子の発現と候補遺伝子の発現を成功させたい。軟体動物腹足類アメフラシ(Aplysia kurodai)を用いて、神経ペプチドをD型化するペプチドイソメラーゼの同定を試みた。アメフラシ腹部神経節のRUQニューロン群は、NdWFamideというD型トリプトファンをもつ神経ペプチドを発現するニューロンを含んでいる。これらのニューロンにはペプチドイソメラーゼが発現すると考えられる。そこで、RUQニューロン群と、NdWFamideを発現しないニューロン群からそれぞれtotal RNAを抽出してSMERTer pico-cDNAsynthesis kitを用いてcDNAを調製し、PCR-select cDNA subtraction kitを用いてRUQニューロン特異的cDNAを得た。

このcDNAをジゴキシゲニン(DIG)標識してプローブとし、別途調製したRUQニューロン由来のcDNAを対象にスクリーニングを行った。RUQ特異的と判定されたcDNAのうち、サイズが異なる44個のcDNAをクローニングして配列分析を行い、得られた配列を本に、データベース上でBLASTによる相同性検索を行った。その結果、29個は相類似する遺伝子が見つかった。これらのうち、16個はR3-R14ニューロンに発現する"Aplysia neuropeptide mRNA"であり、その他の神経ペプチド前駆体遺伝子が4個、酵素遺伝子が8個含まれていた(1つは機能不明)。一方、類似遺伝子が見つからなかったもののうち、5個は短い3'-断片であったが、それ以外の6個は比較的長いcDNAであった。これらのcDNAは、ペプチドイソメラーゼ遺伝子を含む可能性があり、今後、組換えタンパク質を作製してイソメラーゼ活性の検定を行うための基礎材料が得られた。本研究では、候補遺伝子を培養細胞系に発現させて活性を調べるため、完全なopen reqding frameを含むcDNAを取得する必要がある。サブトラクション法で取得したRUQニューロン特異的cDNAの中には3'-領域の断片が多く含まれていたため、5'-RACE法により完全長のcDNAをクローニングする必要があった。この作業に想定以上の時間を要したため、当初の計画よりやや遅れて進行している。計画より到達度がやや遅れている理由は、サブトラクションの条件設定に予想以上に手間取ったことが挙げられる。キットに添付のポジティブコントロールでは予想通りの結果が得られているので技術的な問題はないと考えている。サブトラクションに用いたアメフラシのRUQニューロン群に発現するcDNAに偏りがあり、「Aplysia neuropeptide mRNA」と呼ばれる神経ペプチド前駆体が大量に発現していることがわかった。そのため、スクリーニングによってRUQ特異的と判断されたcDNAの大半がその遺伝子であり、効率的なスクリーニングが難しかった。現在、別のNdWFa発現ニューロンからもcDNAを調製し、これを対象にスクリーニングを行っており、これらの結果を比較することで目的遺伝子の絞り込みが進むと期待される。現時点で3つの候補遺伝子が見つかっているので、計画通り、培養細胞系に発現させて活性の有無を確認する。その方法は、1)候補遺伝子とNdWFamide前駆体遺伝子を共発現させ、D型トリプトファンをもつNdWFamideが産生されるかどうかを確かめる方法、2)候補遺伝子を発現させて粗酵素標品を調製し、化学合成した前駆体タンパク質の一部を基質としてin vitroで活性を検定する、という2つのアプローチを想定している。酵素活性が確認できた場合は、実際にNdWFamide発現ニューロンに共発現しているか、基質特異性・反応速度などの酵素学的解析を試みる。NdWFa
分子雲内部に見られる階層構造と星形成との物理的関係の観測的解明

本研究の目的は、星形成の母体である分子雲内部に普遍的に見られる複雑な階層構造の物理的性質と星形成におよぼす影響を観測的に明らかにすることにある。我々は、国立天文台野辺山の45m鏡マルチビームシステム(BEARS)を用いて、異なる質量の星を生み出している代表的な星生成分子雲(おうし座、オリオン座、へびつかい座)について、分子雲全体の広がりから分子雲コアにまで至る、2桁にもわたる空間スケールを高分解能で一様にカバーした高品質のマッピングを行い、比較研究を行ってきた。主な成果は以下の通りである。BEARSによる広域・高分解能マップデータに対応でき、その大容量データを効率よく解析できるデータ解析システム(BMAS)を、対話的データ解析言語IDLを用いて開発した。BEARSで実際に取得したデータを解析することで、高速化を行いつつ、基本的な解析ツールから高度な統計解析ツールまでを組み込んだ。2.分子雲内部に見られる卓越した微細構造の発見。我々は、BMASによるBEARSマップデータの解析から、分子雲内部の階層構造には星形成の直接の母体である分子雲コアよりも微細な構造(クランプ)が卓越し、それらの離合集散によって階層構造が形成されているという新事実を明らかにした。さらに、小質量星生成領域のおうし座分子雲では、高密度ガスの空間分布に基づく原始星の進化を決める新たな指標を発見した。中小質量星生成領域のへびつかい座分子雲では、赤外線天文衛星ISOによるイメージとの比較から、分子雲コアの初期段階での進化を明らかにした。大中小質量星生成領域のオリオン座分子雲では、これまで知られているフィラメントはさらに細いサブフィラメントで構成されていることが明らかになった。現在も解析は進行中である。星形成の母体である分子雲の内部は複雑な階層構造をなし、その最下層の分子雲コアで新しい星が誕生すると考えられている。本研究では、国立天文台野辺山のマルチビームシステムを搭載した45m電波望遠鏡でしか取得できない、分子雲全体の広がりから分子雲コアにまで至る、2桁にもわたる空間スケールを高分解能で一様にカバーした高品質のマッピングデータを解析し、分子雲内部の階層構造の物理的性質について、従来とは異なる新しい知見を得た。1.マルチビームによる分子雲の高品質・大容量マッピングデータの一次整約の確立。現在稼動中の2×2および立ち上げ中の5×5マルチビームによって取得される高品質・大容量データは、既存のリダクションシステムでは十分に整約・解析できないため、我々と野辺山の若手研究者数人とで一次リダクションだけは効率的に行えるよう改善した。さらに、一次処理後、我々の新データ解析システムに取り込めるよう、汎用的な3次元キューブデータへ変換しエキスポートすることも可能にした。2.対話的データ解析言語IDLによるデータ解析システムの開発。おうし座分子雲のキューブデータをサンプルとして、IDLで種々の電波天文データ解析ツールおよびデータ解析を行うウインドウ環境を開発した。本年度は基本的枠組が完成した。今後は、必要に応じて新しいツールを付け加え洗練させていく予定である。3.分子雲階層構造の記述方法の模索。データ解析システムの開発と並行して、様々な角度からおうし座分子雲のマッピングデータを調べた結果、従来から行われてきた分子雲コアの同定という手法は記述方法として不十分であり、分子雲コア内部にはさらに小さな微細構造(クランプ)が多数存在し、それらの離合集散によって階層構造が形成されている可能性が高くなってきた。従って来年度は、多数のクランプ集合体の記述にふさわしい統計的手法について研究する計画である。我々は昨年度、おうし座分子雲内部の階層構造において、星を直接生み出す分子雲コアよりも小さな微細構造が卓越しているという事実を明らかにした。

本年度は、この微細構造が異なる質量の星を生み出している分子雲間でどのように変わるかを調べる目的で、三つの代表的な星生成分子雲について、国立天文台野辺山の新25マルチビームシステム(BEARS)を搭載した45m望遠鏡で、高分解能・広域マッピングを行い、昨年度開発した分子雲マッピングデータ解析システム(BMAS)を用いて解析を行った。主な成果は以下の通りである。1.分子雲マッピングデータ解析システム(BMAS)の高機能化。昨年度開発したBMASについて、今年度はBEARSで取得した大容量・高品質データを解析することにより、バグフィクスと効率化・高速化を行った。さらに、階層構造の解析に必須のスペグトル解析を含む統計解析ツールを組み込んだ。2.異なる質量の星を生み出している分子雲間での階層構造の比較研究。本年度はBEARSによって、小質量星生成領域のおうし座分子雲、中小質量星生成領域のへびつかい座分子雲、大中小質量星生成領域のオリオン座分子雲について、高分解能・広域マッピングを行った。現時点での成果として、おうし座分子雲では、低密度ガスと高密度ガスとで分布の違いが見られ、原始星の進化を決める新たな指標を発見した。へびつかい座分子雲では、我々を含むグループが赤外線天文衛星ISOを用いて観測したイメージとの比較から、分子雲コアのかなり初期の段階での進化が明らかになった。さらに、オリオン座分子雲では、従来議論されてきたフィラメント構造はさらに細いフィラメントで構成され、おうし座と同様にフィラメント内部には微細構造が存在していることが明らかになった。今後、分子雲間で共通な性質と異なる性質を明確にし、生成される星の質量との相関を調べる予定である。
カスパーゼ(Caspase)活性の可視化による新しいアポトーシス検出法の開発

カスパーゼ-3に比較的特異性の高い切断モチーフの構造をもとに作成した4-methoxy-2-naphthylamide(MNA)基質Z-Asp(OME)-Glu(OME)-Val-Asp(OME)-MNA(DEVD-MNA)は、MNAの直前でカスパーゼにより切断される。遊離したMNAは励起波長340nmで蛍光を発する(425nm)。マウスの骨髄細胞と頭蓋骨由来の骨芽細胞様細胞の共存培養によって形成させた破骨細胞に、一酸化窒素(NO)発生剤であるNOC18を作用させてアポトーシスを誘導し、経時的にDEVD基質の水解活性を検討した。その結果、DEVD基質水解活性はNOC18を作用させた8時間後に最も高いピークを示し、以後減少するという一過的な活性上昇を示した。遊離MNAは弱酸性条件下で、5-nitro-salicylaldehyde(NSA)とジアゾカップリングをおこし、不溶性の蛍光物質を産生する。UV励起でこの蛍光物質は黄色い強い蛍光を発する。破骨細胞にNOC18を作用させ、8時間後の細胞に、NSA存在下(pH6.0)でDEVD-MNAを作用させると、黄色蛍光を発する細かい針状結晶が細胞内に形成された。結晶の形成はカスパーゼの阻害剤であるDEVD-fenylmethylketone(FMK)でほぼ完全に抑制された。即ち、NOCによって破骨細胞に引き起こされるアポトーシスに伴うカスパーゼ活性の可視化が可能となった。このとき、破骨細胞の細胞形態は正常であるが、さらに8時間たつと(形6時間経過後)、結晶の形成は顕著に減少するが、破骨細胞内では細胞核の凝縮と細胞の萎縮という典型的なアポトーシス像を呈した。すなわち、可視化されるカスパーゼ活性は、典型的なアポトーシス像への細胞内変化に先行することが明らかとなった。我々は,4-methoxy-2-naphthylamide(MNA)をカップルさせたペプチド性基質を5-nitro-salicyladehyde(NSA)存在下で用いることにより,生きた破骨細胞のリソソーム性システインプロテアーゼ活性を可視化する方法を開発した(Kamiya et al.J.Biochem 123,752(1998)).この方法は,プロテアーゼにより基質から遊離したMNAがNSAとシッフ塩基を形成し,蛍光を発する不溶性の沈殿物を生じることを利用したものである.本年度は,カスパーゼ-3と-8に比較的特異性の高い蛍光基質の構造をもとに,それぞれZ-Asp(OME)-Glu(OME)-Val-Asp(OME)-MINAとZ-lle-Glu(OME)-Thr-Asp(OME)-MNAという2つのMNA基質を合成した.この基質を用いて,細胞組織学的にカスパーゼ活性の検出が可能か否か検討を行う予定にしている.一方,破骨細胞におけるアポトーシスとカスパーゼ活性に関する研究も進めた。マウスの骨髄細胞と,頭蓋骨由来の骨芽細胞様間質細胞の共存培養を行って形成させた破骨細胞に,一酸化窒素(NO)発生剤であるNOC-18(400μM)を加えると,アポトーシスを誘導できる.Z-Asp-Glu-Val-Asp-MCAを用いて破骨細胞抽出液中のカスパーゼ活性を測定したところ,アポトーシス誘導8時間後に活性の上昇が確認できた.

さらに,NOC-18によって誘導される破骨細胞のアポトーシスは,カルシトニンやカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP),あるいは破骨細胞分化因子(ODF/RANKL)によって顕著に抑制することができた(金岡ら,1999 in press).カスパーゼ-3に比較的特異性の高い切断モチーフの構造をもとに作成した4-methoxy-2-naphthylamide(MNA)基質Z-Asp(OME)-Glu(OME)-Val-Asp(OME)-MNA(DEVD-MNA)は、MNAの直前でカスパーゼにより切断される。遊離したMNAは励起波長340nmで蛍光を発する(425nm)。マウスの骨髄細胞と頭蓋骨由来の骨芽細胞用細胞の共存培養によって形成させた破骨細胞に、一酸化窒素(NO)発生剤であるNOC18を作用させてアポトーシスを誘導し、経時的にDEVD基質の水解活性を検討した。その結果、DEVD基質水解活性はNOC18を作用させた8時間後に最も高いピークを示し、以後減少するという一過的な活性上昇を示した。遊離MNAは弱酸性条件下で、5-nitro-salicyladehyde(NSA)とジアゾカップリングをおこし、不溶性の蛍光物質を産生する。UV励起でこの蛍光物質は黄色い強い傾向を発する。破骨細胞にNOC18を作用させ、8時間後の細胞に、NSA存在下(pH6.0)でDEVD-MNAを作用させると、黄色蛍光を発する細かい針状結晶が細胞内に形成された。結晶の形成はカスパーゼの阻害剤であるDEVD-fenylmethylketone(FMK)でほぼ完全に抑制された。即ち、NOCによって破骨細胞に引き起こされるアポトーシスに伴うカスパーゼ活性の可視化が可能となった。このとき、破骨細胞の細胞形態は正常であるが、さらに8時間たつと(計16時間経過後)破骨細胞内の細胞核は凝縮し、典型的なアポトーシス像を呈した。すなわち、可視化されるカスパーゼ活性は、典型的なアポトーシス像への細胞内変化に先行することが明らかとなった。
シクロプロピル亜鉛活性種の新規合成法の開発とオリゴシクロプロパン類の合成

シクロプロピル亜鉛活性種の新規合成法の開発ついて交付申請書に記載した研究計画に従って研究を行い次の2つの成果を得た。1.アルケニル亜鉛種のシクロプロパン化によるシクロプロピル亜鉛活性種の合成シクロプロピル金属活性種はシクロプロパン環を有する化合物を合成する上で有用な中間体である。本研究では合成の容易なアルケニル亜鉛活性種をジエチル亜鉛とジヨードメタンから得られる亜鉛カルベノイドによりシクロプロパン化してシクロプロピル亜鉛活性種を穏和な条件下で収率よく合成することに成功した。さらに生成したシクロプロピル亜鉛種は、シアン化銅の存在下、種々の求電子剤により捕捉することができ、更なる炭素炭素結合生成反応に利用できることが明らかとなった。また、1-ドデシンにSchwartz反応剤を作用させて得られたアルケニルジルコニウムを金属交換によりアルケニル亜鉛種に変換し、ジエチル亜鉛とジヨードメタンで処理することにより、1-アルキンからOne-potで収率よくシクロプロピル亜鉛種を調製することにも成功した。2.亜鉛エノラートのシクロプロパン化によるシクロプロパノールの合成α-ヨードケトンに対してジエチル亜鉛を作用させると亜鉛エノラートが生成する。このようにして得た亜鉛エノラートを1で述べた反応においてアルケニル亜鉛活性種の代わりに用いると、亜鉛エノラートのオレフィン部分に亜鉛カルベノイド種が反応し、シクロプロパノール誘導体が収率よく得られることを見いだした。同一分子内に炭素-炭素二重結合を持つα-ヨードケトンを原料として用いてもエノラートのオレフィン部分に化学選択的にシクロプロパン化が起こる。また、α,β不飽和ケトンに対してアート錯体型亜鉛反応剤を1,4付加させて調製した亜鉛エノラートも収率よくシクロプロパン化できることが明らかになった。
セントロメアDNAメチル化が保証する生殖細胞発生システムの検証

本研究は生殖細胞に特徴的なセントロメアDNA低メチル化の生物学的機能を明らかにすることを目的としている。エピゲノム編集によってセントロメア特異的にDNAメチル化を亢進させた生殖細胞を作製し、この生殖細胞の発生動態を追跡することで、生殖細胞形成におけるセントロメアDNAメチル化機能について解析を行う。
イネ葉身の形態的特徴が、蒸散と水利用効率に及ぼす影響

水稲の葉身傾斜角度が蒸散を含めた生理反応に及ぼす影響を知るために、人為的に葉身角度を調節した際の蒸散量・水利用効率の変化とその機構について検討した。1/5000aワグネルポットを用いて出穂日に水稲葉身の先端にクリップを貼り傾斜を大きくする垂れ葉処理と、支柱と麻紐で葉身を結束し傾斜を小さくする収束処理を設け、無処理の対照区と比較した。垂れ葉区と収束区の蒸散量は対照区より小さかった。5時から18時まで連続的に風をあて続ける送風処理を行うと、対照区と垂れ葉区の蒸散量は差が見られなくなり、収束区の蒸散量も他の区との差が小さくなった。このことからイネの葉身の傾斜角度は葉面境界層を起因として蒸散量に影響を及ぼすことが推察された。また収束区および対照区において40日間調査を行った結果、収束区の蒸散量は登熟前期には対照区よりも小さかったが、登熟中期には等しくなり後期には対照区よりも大きかった。積算蒸散量および水利用効率は収束区で小さかった。しかし穂重のみを比較すると有意な差は見られなかった。水田群落条件下で対照区と収束区を調査した結果、蒸散量および乾物増加量ともにポット実験と同様の傾向が認められた。以上の結果から、直立した葉身のイネは蒸散量が少なく、水不足に対して耐性があると推察された。また乾物増加量は小さかったが穂重は等しかったことから、登熟期に直立した葉身を維持できるイネは、低水分状況下における稲作に有利であると考えられた。葉身の形態が大きく異なるイネ13品種(C-115,ニシホマレ,オオチカラ,BG-1,コシヒカリ,コガネマサリ,BG-4,アキヒカリ,新大黒,短銀坊主,H-342,細葉,新細葉)を用いて,葉面積,草丈,茎数,葉数などの形質が,個体あたりの蒸散量におよぼす影響について調査した.測定は,各品種の出穂日から20日間の積算蒸散量を重量法で行い,ろ紙蒸発計で同時に求めた蒸発要求量で除して柑対蒸散量を求めた.相対蒸散量および各形質について分散分析を行ったところ,品種間差異が年次や播種日よりも大きな分散を示した.各形質と柑対蒸散量との間の偏相関係数を求めると,草丈と葉数とは正の有意な偏相関を示したが,葉面積とは偏相関を示さなかった,草丈と相対蒸散量との間には正の偏相関があり,草丈の高い品種はと相対蒸散量は高かい傾向を示した.さらに詳しく検討すると,BG-1,コシヒカリ,アキヒカリ,新大黒,短銀坊主,H-342,,細葉(品種群Aと呼ぶ)のみに有意な正の相関があり,品種群Aによって得られた回帰直線に平行にBG-4,コガネマサリ,ニシホマレ,オオチカラ,新細葉(品種群B)が分布し,さらに品種群AとBに平行にBG-1とC-115(品種群C)が分布した.各品種群別に葉面積,茎数,葉数を検討したところ,葉面積は群間に有意差はなく,茎数は品種群Aが有意に多く,葉数はA, B, C間に有意な群間差が示された.これらのことから,相対蒸散量は草丈が高いほど高い値を示すが,葉数が異なるときには,葉数が多いほど大きくなることが示唆された.水稲の葉身傾斜角度が蒸散を含めた生理反応に及ぼす影響を知るために、人為的に葉身角度を調節した際の蒸散量・水利用効率の変化について検討した。実験は新潟大学圃場のビニールハウス内で行った。水稲品種アキヒカリを用い、1/5000aワグネルポットに1株1本植えで湛水条件で栽培し、出穂日に葉身の傾斜角度を人為的に調節した。処理は葉身先端にクリップを貼り傾斜を大きくする垂れ葉処理と、支柱と麻紐で葉身を結束し傾斜を小さくする収束処理の2処理を行った。そこに無処理の対照区を加えた3区における蒸散量、乾物増加量、日中の葉身水ポテンシャルを測定した。測定期間は出穂日から約2週間とした。また各処理個体に5時から18時まで連続的に弱風をあて続ける送風処理を行い、蒸散量を測定した。蒸散量は対照区で大きく、垂れ葉区、収束区の順に小さくなった。大気の蒸発要求量が大きい程、処理間の差違は大きくなった。各処理区の葉身水ポテンシャルは、最頂葉では収束区が他区と比較して有意に大きく、また下位の葉身でも収束区で大きい傾向があった。送風処理を行った個体では、対照区と垂れ葉区との蒸散量の差違はほぼ見られなくなり、また収束区との差違も小さくなった。葉面境界層抵抗は送風によって小さくなることが知られている。以上のことから直立した葉身や垂れている葉身は、葉面境界層抵抗が大きく、そのため蒸散量が小さいと考えられた。出穂後14日間の積算蒸散量と乾物増加量は対照区と比較して垂れ葉区および収束区でともに小さかった。しかし乾物増加量の処理間差は、積算蒸散量のそれより大きく、そのため水利用効率は垂れ葉区及び収束区で小さかった。以上のように、葉身の傾斜角度に応じて蒸散量は変化した。

特に収束区の直立した葉身は蒸散量が小さく水ポテンシャルも高く維持されていたため、土壌水分欠乏に対する耐性力験いと推察された。水稲の葉身傾斜角度が蒸散を含めた生理反応に及ぼす影響を知るために、人為的に葉身角度を調節した際の蒸散量・水利用効率の変化とその機構について検討した。1/5000aワグネルポットを用いて出穂日に水稲葉身の先端にクリップを貼り傾斜を大きくする垂れ葉処理と、支柱と麻紐で葉身を結束し傾斜を小さくする収束処理を設け、無処理の対照区と比較した。垂れ葉区と収束区の蒸散量は対照区より小さかった。5時から18時まで連続的に風をあて続ける送風処理を行うと、対照区と垂れ葉区の蒸散量は差が見られなくなり、収束区の蒸散量も他の区との差が小さくなった。このことからイネの葉身の傾斜角度は葉面境界層を起因として蒸散量に影響を及ぼすことが推察された。また収束区および対照区において40日間調査を行った結果、収束区の蒸散量は登熟前期には対照区よりも小さかったが、登熟中期には等しくなり後期には対照区よりも大きかった。積算蒸散量および水利用効率は収束区で小さかった。しかし穂重のみを比較すると有意な差は見られなかった。水田群落条件下で対照区と収束区を調査した結果、蒸散量および乾物増加量ともにポット実験と同様の傾向が認められた。以上の結果から、直立した葉身のイネは蒸散量が少なく、水不足に対して耐性があると推察された。また乾物増加量は小さかったが穂重は等しかったことから、登熟期に直立した葉身を維持できるイネは、低水分状況下における稲作に有利であると考えられた。
フェムト秒円2色分光計の製作とその軸性不斉分子の光ラセミ化測定への応用

今回考案した実験の原理は、要約すると次のようであった。すなわち、基底状態において光学異性体であるR体とS体が等量存在するビフェニルを円偏光の超短パルス紫外ポンプ光で励起して、励起状態におけるR体、S体の量に円2色性に由来する差を生じさせる。その差を超短パルス可視プローブ光の偏光回転によって検出する。ポンプ光とプローブ光の時間差によって時間分解して、励起状態でのラセミ化の時定数を得る。この方法においては、プローブ光が試料のS_n←S_1吸収に共鳴していて、円2色性が共鳴による増大を受けることが必要であった。ビフェニルのS_n←S_1吸収は650nm付近に存在し、その点では問題はなかったが、共鳴による増大が期待ほどには大きくないためか、信号を得ることは出来なかった。そこで、1,1'-ビ-2-ナフトールを試料とすることを試みた。1,1'-ビ-2-ナフトールはそもそも光学分割がなされており、基底状態ではほとんどラセミ化しないものの、励起状態においては速いラセミ化が起こる可能性がある。光学分割がなされているという点で、ビフェニルの場合よりも大きな信号が期待された。実験においては、まず、光学分割がなされていないラセミ化の安価な1,1'-ビ-2-ナフトールを試料として、S_n←S_1吸収の波長を確かめようとしたのであるが、吸収信号はほとんど得られなかった。従って共鳴による増大もほとんど期待できない状態であった。結果として円2色性の信号は得られなかった。この実験の最も重要な意義は、ごく短い時間しか存在しない光学活性体を捉える、という点にあり、非常に興味深い問題であるから、今後は新たな試料の探索と更なるレーザーの安定化によって研究を続ける予定である。
ART出生児由来インプリント疾患のエピゲノム解析

ヒト生殖補助医療(ART)の普及に伴い、本来稀なゲノムインプリント異常症の発症頻度の増加が世界中で報告されている。本研究では、Beckwith-Wiedemann症候群およびSilver-Russell症候群患児におけるART出生児は非ART児と比較し、メチル化異常の頻度および程度が大きいことを示し、ゲノムワイドなエピゲノム変異が起こっている事を明らかにした。また、エクソーム解析の結果、メチル化関連遺伝子に重大な影響を及ぼす変異は確認できなかった。以上より、ART出生児のゲノムワイドなメチル化異常はART操作時の影響を受けたと推測された。ヒト生殖補助医療(ART)の普及に伴い、これまで非常に稀であったゲノムインプリンティング異常症の発症頻度の増加が世界中で報告され注目されている。本研究では、ARTによるリスク要因を検索するため、インプリント異常症患児DNAを用い、インプリント領域のメチル化解析、メチル化関連遺伝子の構造・機能解析を行い、メチル化異常の発症メカニズムとARTの影響について比較検討する。本年度は、Silver-Russell症候群(SRS)患児の末梢血DNAを用いて、Reduced Representation Bisulfite Sequence(RRBS)法によりDNAメチル化解析を行った。インプリント領域において、Bisulfite-polymorphic PCR Sequencing(BS)法と比較した結果、RRBS法はアレル特異的なメチル化解析を困難であったが、BS法よりも広い領域を解析することでき、メチル化率についても同等なものが得られ、信頼のおける実験手技であることが確認できた。次にゲノムワイドな解析を行った。SRS各検体において、8人の正常児の血液DNAのメチル化平均から2SDおよび10%メチル化が異なる領域をメチル化可変領域(Differentially Methylated Regions: DMRs)として抽出した。抽出したDMRについて、プロモーター、CpGアイランドでは高メチル化されたDMRが多かったが、SINE等の繰り返し配列では低メチル化されたDMRが多かった。次に、抽出したDMRをART群および非ART群で検討した。いずれの領域についても非ATR群に比べART群の方がメチル化変化の程度および頻度で大きかった。本研究では、ARTによるリスク要因を検索するため、RRBS法を用いてインプリント異常症患児のゲノムワイドなメチル化解析を行い、メチル化異常の発症メカニズムとARTの影響について比較検討する。昨年度までに、Silver-Russell症候群患児のメチル化を行い、プロモーター、CpGアイランドおよび繰り返し配列において、非ATR群に比べART群の方がメチル化変化の程度および頻度で大きいことを明らかにした。本年度は、Beckwith-Wiedemann症候群(BWS)患児9検体(ART群2、非ART群7)のメチル化解析を行った。BWS各検体において、8人の正常児の血液DNAのメチル化平均から2SDおよび10%メチル化が異なる領域をメチル化可変領域(Differentially Methylated Regions: DMRs)として抽出した。次に、抽出したDMRをART群および非ART群で比較した。プロモーターおよびCpGアイランドではART群の方がメチル化変化の程度および頻度は多かった一方、SINEなどの繰り返し配列では非ART群の方が多かった。すべてのBWS患者におけるプロモーター領域にメチル化異常が見られた遺伝子群をGO解析した結果、生物学的接着や細胞接着など成長に関わるGO termが抽出されたが、ART群および非ART群単独ではGO termは抽出されなかった。以上の結果から、BWSのゲノムワイドなメチル化にはARTの影響は少ないと推察された。当初の計画通り、RRBS法によりBWS患児のゲノムワイドなメチル化解析を行った。当初の計画通り、RRBS法によりSRS患児のインプリント領域のメチル化を解析した。従来の手法と同等の結果となり、信頼のおける実験手法を確立することができた。SRS患者では非ARTに比べ、ARTの方がメチル化変化の影響を受けていることを明らかにし、十分な成果が得られたと考えている。今後は、症例数、特にBWSのART患児を増やし、メチル化解析の信頼性を向上させ、メチル化異常領域の頻度、程度、影響を受けやすい領域を明らかにする。また、メチル化基質合成酵素遺伝子MAT2AおよびDNAメチル化酵素DNMT3A, 3Bおよび3Lの遺伝子変異およびプロモーター領域のメチル化解析を行う。
重症虚血性心筋症に対する心移植代替療法の開発

虚血性心筋症と呼ばれる重症心疾患患者に対して唯一の治療法は心臓移植であるがドナーは絶対的に不足している。そこで、心移植の代替となる革新的治療法の開発を試みた。冠動脈バイパス手術中に得られたヒト心臓周囲脂肪ならびに冠動脈内膜摘出標本の解析から、動脈硬化部位では血管壁のみでなく周囲脂肪組織に慢性炎症が生じていることが明らかになった。また、脂肪細胞死により放出された核酸がマクロファージのTLR9と相互作用することが、脂肪組織における慢性炎症の惹起機構として重要であることが判明した。この知見をもとに、血管と同時に良質の脂肪組織を移植する画期的なバイパス手術法の開発に着手した。ヒトびまん性冠動脈病変の組織学的解析においては、血管壁における増強した慢性炎症を基盤としており、そこには、マクロファージやTリンパ球の浸潤が認められ、病変内血管新生が亢進していることが明らかとなった。また、慢性炎症は血管壁のみでなく、冠動脈を覆う心臓周囲脂肪組織にも波及していた。心臓周囲脂肪に浸潤しているマクロファージのサブタイプを解析したところ、炎症性であるM1型/抗炎症性M2型の比率は冠動脈疾患患者で上昇しており、Gesini scoreで評価した冠動脈疾患の重症度と良好に相関していた。そこで、慢性炎症を生じている冠動脈周囲の脂肪組織を、炎症の程度が軽い自己の皮下脂肪に置換して、びまん性病変で心移植しか従来治療法がないとされたきた重症虚血性心筋症患者に対して、心臓移植の代替になるような革新的血行再建術の開発を行うことにした。まず、マウス大腿動脈のワイヤー傷害モデルにおいて、周囲脂肪組織が病変形成に及ぼす影響を検討した。GFPマウス由来の脂肪を移植して、脂肪組織が移植4週後、血管周囲に内因性の脂肪と同様に定着し、血管壁と毛細血管で物理的連携をとっていることを確認した。痩せたマウスの皮下脂肪移植では病変形成が抑制され、肥満マウスの内臓脂肪移植では病変形成が促進されることがわかった。また、このような病変への悪影響は、炎症性アディポサイトカインの発現増強や抗炎症性アディポサイトカインの発現低下と相関していた。以上の基礎的な裏付けをもとに、びまん性冠動脈病変に対して、血管と脂肪移植による新規血行再建術の研究を着手した。豚にバルーンと高脂肪食で、びまん性の冠動脈病変を作成するモデル開発を開始した。
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子(FUT1,FUT2)の構造解析

ABO血液型は、糖鎖抗原であり、赤血球膜表面のみならず様々な組織並びに分泌液中にも存在する。さらに、動物種間によってその組織発現パターンが異なることが知られている。ABO型の発現は、主としてその前駆体糖鎖(H抗原)の合成に関与するa(1,2)フコシルトランスフェラーゼによって調節されている。現在、人では2種の遺伝子(FUTl,FUT2)の存在が知られている。我々は本科学研究費補助金を得て、FUTl及びFUT2の遺伝子の構造とcDNAの構造さらにはそれらの転写開始点を5'RACE法、3'RACE法ならびにPCR法を用いて同定してきた。さらにそれらの遺伝子の転写に関与しているプロモーター領域をcassette mediated PCR法を用いてクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子とのfusion constructの作製によりこれらの領域がプロモーター活性を持つことを示した(Koda et al.J.Biol.Chem.,272,7501一7505,1997.Eur.J.Biochem.,246,750-755,1997)。これらの研究でFUTlには少なくとも3ヶ所以上の転写開始点が存在することも明らかになった。又、FUT2に関しては、そのmRNAの3'untranslated region(UTR)に2つのAIu配列がhead to headで伺いあって存在しており、その結果mRNAが3'UTRでstem and loop構造をとる可能性を示した。さらにFUTlでは、赤血球の分化に伴って転写開始点が5'のものから3'のものへ変化していくことを示した(Koda et al.Eur.J.Biochem.,256,379-387,1998)。さらにFUTlの2番目の転写開始点が、retrovirus like sequence(LTR)中に存在することを示し、このLTRが転写に重要な働きをしている可能性を示した。ABO血液型抗原の組織特異的発現の調節機構を解明するために我々はまずそれらの前駆体糖鎖であるH型糖鎖の発現を決定している2種のalpha(1,2)fucosyltransferase遺伝子(FUT1,FUT2)に関して、それらの遺伝子のmRNAの5'末端ならびに3'末端をRapid amplification of cDNA end(RACE)法を用いて決定した。その結果、FUT1は少なくとも三ヵ所の異なった5'末端をもちalternative splicingによりさまざまなisoformのtranscriptが組織特異的に発現していることを同定した(Koda et al.,1997,Biol.Chem.,vol.272,7501-7505)。またこの遺伝子のゲノム構造を決定し、そのプロモーター領域もクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子とのfusion constructを作製してtransient expressionstudyによりそのプロモーター活性を測定した。FUT2に関してはmRNAの全長を5'-並びに3'-RACE法を用いて決定した。その結果、FUT2はFUT1と異なりさまざまな細胞で単一の転写開始点をもつことが示された。さらにプロモーター領域を含む全genomeシークエンスも同定しFUT1同様そのプロモーター活性を測定した。(Koda et al.,1997,Eur.J.Biochem.,vol.246,750-755)。さらに我々はFUT1,FUT2を共にnull alleleとしてもつインド人のボンベイ型個体についてこれらの遺伝子の解析を行った。その結果FUT1については725番目のヌクレオチドのTからGへのミスセンス変異を、またFUT2に関してはそのタンパク翻訳領域の全欠失を見い出し、それらが2種のalpha(1,2)fucosyltransferaseの不活化に関与していることを示した(Koda et al.,1997,Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.238,21-25)。

さらにFUTlでは、赤血球の分化に伴って転写開始点が5'のものから3'のものへ変化していくことを示した(Koda et al.Eur.J.Biochem.,256,379-387,1998)。さらにFUTlの2番目の転写開始点が、retrovirus like sequence(LTR)中に存在することを示し、このLTRが転写に重要な働きをしている可能性を示した。
農業機械へのCAN-LBSの導入に関する研究

本研究の目的は農業機械学会の研究者人脈を通じて,農用CAN-LBS研究チーム編成と国際規格翻訳と出版のための研究会設置,海外のCAN-LBS研究者とのネットワーク作りと先進地ドイツ訪問による現地研修会の実施,本邦におけるCAN-LBSに関する国際研修集会の開催を通じて啓蒙と普及の活動展開,以上3つの目的を2年間で達成することにある.<平成12年度成果>1.CAN-LBS研究会は,平成12年4月1日農業機械学会(新潟大学)テーマ公募型自由集会を開催し,「トラクタと作業機のコミュニケーション-国際規格ISO 11783とその動向-」のタイトルのもとで.プロジェクトチームのパネリスト4名によるAGRITECHINICA'99 in Hannover展(1999.11.9-13)と同時開催された当該関連シンポジウムの学習成果を話題提供して,意見交換の場とした.2.11月20日第2回札幌国際シンポジウム「農用バスシステムLBSによる農業機械の電子的コミュニケーション」を北海道大学学術交流会館で開催した.参加者は122名.この内訳は道内72名,道外50名(ドイツ・デンマーク・アメリカ・中国・韓国を含む)で,第1回目の1997年当時は83名であったのでこの3年間で47%増と普及活動の成果が見られたと評価される.3.標記3つの目標はほぼ達成され,別紙の研究成果報告書にその詳細が記載されている.本研究の目的は農業機械学会の研究者人脈を通じて,慶用CAN-LBS研究チーム編成と国際規格翻訳と出版のための研究会設置,海外のCAN-LBS研究者とのネットワーク作りと先進地ドイツ訪問による現地研修会の実施,本邦におけるCAN-LBSに関する国際研修集会の開催を通じて啓蒙と普及の活動展開,以上3つの目的を2年間で達成することにある.く平成11年度成果>1.上記の目的を達成するため,5月に北海道大学(3名),岩手大学(1名),農林水産省農研センター(1名),農水省草地試験場山地支場(1名)計6名からなる研究チームを組織し,このうちの2名が11月ドイツハノーバ市で開催されたAgritechnica'99/Precision Farminng,LAV主催のCAN-LBS研修集会へ出かけ,知見を広めるとともに現地の研究者と交流を図り,人脈ネットワークを構築した.2.11月(大宮)次年度札幌で開催するCAN-LBSに関するシンポジウム「SAPP0R0国際シンポジウム2000-農用BUSシステムLBSによる農業機械の電子的コミュニケーション」の開催に関する素案検討と当該研究活動の方針検討,1月(北大)でCAN-LBS理論と実演の研究会を実施した.第3回は次年度農業機械学会(新潟大学)で当該研究成果の中間報告を自由研究集会にて実施する予定である.3.「農業機械学会テーマ公募型自由集会in新潟」に申請した当該関連研究課題「トラクタと作業機のコミュニケーション-国際規格IS011783とその動向」が農業機械学会で採択され,学会から後援されることになった(農業機械学会誌第62巻第1号).本研究の目的は農業機械学会の研究者人脈を通じて,農用CAN-LBS研究チーム編成と国際規格翻訳と出版のための研究会設置,海外のCAN-LBS研究者とのネットワーク作りと先進地ドイツ訪問による現地研修会の実施,本邦におけるCAN-LBSに関する国際研修集会の開催を通じて啓蒙と普及の活動展開,以上3つの目的を2年間で達成することにある.<平成12年度成果>1.CAN-LBS研究会は,平成12年4月1日農業機械学会(新潟大学)テーマ公募型自由集会を開催し,「トラクタと作業機のコミュニケーション-国際規格ISO 11783とその動向-」のタイトルのもとで.プロジェクトチームのパネリスト4名によるAGRITECHINICA'99 in Hannover展(1999.11.9-13)と同時開催された当該関連シンポジウムの学習成果を話題提供して,意見交換の場とした.2.11月20日第2回札幌国際シンポジウム「農用バスシステムLBSによる農業機械の電子的コミュニケーション」を北海道大学学術交流会館で開催した.参加者は122名.この内訳は道内72名,道外50名(ドイツ・デンマーク・アメリカ・中国・韓国を含む)で,第1回目の1997年当時は83名であったのでこの3年間で47%増と普及活動の成果が見られたと評価される.3.標記3つの目標はほぼ達成され,別紙の研究成果報告書にその詳細が記載されている.
数値風況解析によるドーム風況制御システムの開発と実証的研究

望遠鏡やドームといった天文観測施設周辺で生じる乱流や気流の淀みは、波面の乱れとして観測性能の悪化を引き起こすことが知られている。本研究は、観測施設の風況を体系的に制御し、観測性能の安定的向上を図る仕組みを確立するために、都市計画等の風工学分野において多数の実績を有する非定常数値風況解析技術を用いた。数10cm数10mという幅広い空間分解能を扱うアルゴリズムを組み込むことで、望遠鏡ドーム内外の風況場の時間変化を精密に予測することが可能となり、この手法の有用性を示すことが出来た。望遠鏡・ドーム周辺の気流の乱れ(乱流)や淀みは、ドームシーイングと呼ばれる光学性能の悪化を引き起こす。本研究では、これまでいわば場当たり的に対処され軽視される傾向にあったこれらの風況現象に対して、風工学分野の技術を取り入れてより体系的に風況を制御することにより、安定的にドームシーイングを抑制させる仕組みを開発することを目的とする。非定常数値風況解析技術を導入することで、時間的に不安定な気流場を扱い、高精度にドームシーイングを抑制することができる。この仕組みは既存および将来の望遠鏡施設に適用できるものであり、観測的天文学の底上げになると期待される。平成27年度は、天文学的用途への応用の第一歩として広いダイナミックレンジの空間グリッド(望遠鏡周辺で数10cm、施設上空数kmで数10m)をAFAへ導入し、数値解析を行うことに成功した。望遠鏡指向方向やドーム内における乱流や滞留の有無を確認することが出来たという点で、天文への応用は順調であるといえる(日本天文学会2016年春季年会において口頭発表)。また、風況データの実測試験として、地面から鉛直方向に2m置きに風況計測器を3台設置出来る器具を製作し、チリ・アタカマ高地(標高2400m)のサンペドロ・デ・アタカマ市に東京大学が有する滞在施設において測定試験を実施した。24時間の連続測定により、風速・風向の時間変化の高度依存性データを取得することが出来た。AFAのメッシュグリッドの最適化とそれによる数値風況解析は順調に進展している。一方、気流データの実測に関しては、山麓での計測試験は上手くいったが、悪天候により望遠鏡施設がある山頂サイトでは計測を実施する事が出来なかった。そのため当初の計画に対して若干の遅れが生じている。望遠鏡やドームといった天文観測施設周辺で生じる乱流や気流の淀みは、空気の温度や密度分布のムラにより観測性能の悪化(波面の乱れ)を引き起こすことが知られている。そうした気流の影響を抑制するために、低速の風を構造物に均等に当て続けることが有効であると考えられている。本研究は、都市計画等の風工学分野において多数の実績を有する非定常数値風況解析ソフトウェアAirflow Analyst(R) (AFA)を観測的天文学に応用して、観測施設の風況を体系的に制御し、観測性能の安定的向上を図ることを目的としている。平成28年度は、前年度に行った東京大学アタカマ天文台(TAO) 6.5m望遠鏡を対象とする風況数値シミュレーション結果と建物形状等の最適化の検討結果について国際研究会において発表した(Konishi, M., et al. 2016, Proc. SPIE, 9906, 99062M)。また、TAO 6.5m望遠鏡の建設地(標高5,640mのチャナントール山山頂)において風速の高度分布を測定した。前年度に山麓で行った測定試験の成果を踏まえて、地表から鉛直方向に2m毎に風況計測器を3台設置し48時間の連続測定を行った結果、風向・風速と時刻の間に顕著な関係が見られた。これはこれまでに経験的・定性的に分かっていたことではあるが、精密な実測により風況数値シミュレーションとの比較およびそれによる建物構造へのフィードバック(風況制御)に向けて大きく前進した。こうした精密な実測を望遠鏡建屋の周囲数か所において連続して行い、風況数値シミュレーションとの比較結果から望遠鏡建屋の換気窓を制御し風況を沈静化・安定化させることが出来ると期待される。引き続きAFAによる数値風況解析手法の最適化・安定化を行い、ドーム風況解析システムを完成させる。風況計測器を用いた気流の高度分布の測定は、27年度に用いた方法に加えて、より高い高度のデータを取得するために飛翔体等による方法も検討する。望遠鏡施設が設置されている山頂サイトへアクセスが出来次第、現地へ渡航しそれらの手法を用いてデータを取得する。研究成果と進捗は国際研究会において発表する予定である。赤外線天文学風況計測器を10台購入することを予定していたが、既に所有していた3台を導入して手順の確立を行うことで、新規購入を翌年度に持ち越したため。また、研究メンバーとの打ち合わせをテレビ会議システムを通して行ったため、交通費を節約することが出来たため。

当初の購入予定のものに加えて、いくつかの周辺機器も合わせて購入しなければデータ収集・解析がうまく進まない事が判明したため、計測器に関する機器の購入費に充てる。但し計測機本体は、購入を予定していた型番が廃番になってしまったため、性能等を再検討し選定する。また、計測器を器具で固定する現在の方法に加えて、飛翔体に搭載して計測する方法も検討しており、見通しが立った場合にはその費用に充てる。
L-アスパラギナーゼアレルギーの病態解明と新規診断・治療法の開発

L -アスパラギナーゼ(L-ASP)は、小児急性リンパ性白血(ALL)の第一選択薬であるが、高頻度でアレルギー反応を生じるため治療中止を余儀なくされ、ALLの治療完遂が困難となる。ALL治療においてL-ASPアレルギー発症が重要な課題であるにも関わらず、L-ASPアレルギーの有効な予防・治療方法はなく、L-ASPアレルギーの特徴も解明されていない。本研究は、患者への負担を最小限に出来る微量血清を用いた「L-ASPアレルギーのin vitro評価系」と「L-ASP特異的抗体検出チップ」を開発し、L-ASPアレルギーを迅速かつ高感度に診断する方法を構築する。さらに、L-ASPアレルギーに対するIgE中和抗体の有用性を明らかにする。これらを通じて、L-ASPアレルギーの予見と克服を可能にし、白血病治療に貢献することが本研究の目的である。今年度は、L-ASPアレルギーのモデルマウスの血清を用いて、L-ASPに対する中和抗体の影響を検討した。L-ASPアレルギーのモデルマウスの血清は、前年度よりもさらに臨床に近い条件で動物を感作して作製した。L-ASPに対する中和抗体の影響は、前年度に開発した「L-ASPアレルギーのin vitro評価系」を用いて検討した。この評価系では、L-ASPアレルギーのモデルマウスの血清を用いてIgE受容体(FcεRI)を発現する培養肥満細胞(RBL-2H3細胞)を感作すると、L-ASP抗原を添加することで肥満細胞が活性化する結果が得られている。L-ASPアレルギーのモデルマウスより採取した血清を、プロテインGセファロースを加えてIgGクラス抗体を全て吸着除去した血清では、除去前と比較して、肥満細胞が活性化が低下した。これより、L-ASPアレルギーのモデルマウスにおいて、プロテインGセファロースで吸着可能なIgG抗体が中和抗体として出現することが示唆された。今年度は、L-ASPに対する中和抗体の影響を明らかにするために、血清中IgG除去後のL-ASPアレルギー反応性の評価を行う計画と、前年度に達成できていなかった「L-ASP特異的抗体検出チップ」の代替として、「ELISA法を応用したLASP特異的抗体の定量系」の開発に取り組む計画をしていた。これまでに、L-ASPアレルギーのモデルマウスにおいて、プロテインGセファロースで吸着可能なIgG抗体が中和抗体として出現することが示唆された。一方、前年度に達成できていなかった「ELISA法を応用したLASP特異的抗体の定量系」の開発を行う計画については、検討で使用するL-ASPアレルギーのモデルマウスの血清を作製した。申請時の計画とは異なり、今年度は産前・産後休暇と育児休業を取得したため、今年度は4か月間のみが研究実施期間であった。そのため、「ELISA法を応用したLASP特異的抗体の定量系」の開発についてはやや遅れており、今年度作製したマウス血清を用いて、次年度に取り組む計画である。L-ASPアレルギーのモデルマウス血清を用いて「L-ASPアレルギーのin vitro評価系」の開発に成功し、L-ASPアレルギーはIgEを介した反応であり、L-ASPアレルギーのモデルマウスに対して抗IgE抗体が有効であることが明らかになった。今後は、ヒト高親和性IgE受容体を発現した肥満細胞株であるRS-ATL8細胞をL-ASPの治療経験がある患者血清で感作してL-ASP刺激を行うことにより、L-ASPアレルギー患者の血清が肥満細胞を活性化させるIgEを含有するか否かについて検討する。この実験系を用いて、抗IgE抗体であるオマリズマブの患者に対する有効性についても、in vitroで評価できるようにする。また、今年度作製したL-ASPアレルギーのモデルマウスの血清を用いて、「ELISA法を応用したLASP特異的抗体の定量系」の開発に取り組み、アレルギー発症の契機となるL-ASP特異的IgE、ならびに臨床上薬効を低下させることで問題となるL-ASPに対する中和抗体としてのIgGの定性・定量化を行う。さらに、L-ASPアレルギーを抑制するために抗IgE抗体であるオマリズマブを併用してもL-ASPによる治療効果には影響しないことを明らかにする目的で、ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株であるMOLT-4、CCRF細胞を用いた検討を行う。L-アスパラギナーゼ(L-ASP)は、小児急性リンパ性白血(ALL)の第一選択薬であるが、高頻度でアレルギー反応を生じるため治療中止を余儀なくされ、ALLの治療完遂が困難となる。初年度は、L-ASPアレルギーのモデルマウスの血清を用いて「L-ASPアレルギーのin vitro評価系」を開発し、L-ASPアレルギーの特徴を明らかにするとともに、L-ASPアレルギーに対する抗IgE抗体の有効性を検討した。L-ASPアレルギーのモデルマウスより採取した血清を用いてIgE受容体(FcεRI)を発現する培養肥満細胞(RBL-2H3細胞)を感作したところ、L-ASP抗原を添加することで肥満細胞が活性化することが示された。さらにこの活性化は、あらかじめ抗IgE抗体を加えることで抑制された。