hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インターネット上の共創効果の計測・評価に関する研究

本研究では、インターネット上で複数の人間が共創行為を行う場面を取り上げ、共創をもたらす条件を繰り返しの実験を通じて定量的に評価、検討することを目的とする。具体的には、一般のテキスト情報ベースのCGMシステムに加え、研究代表者が開発したアニメ版WikipediaシステムAnimepediaによるアニメ制作(百科事典の各アイテムを写真やイラストを含めたアニメ映像として複数ユーザ間で制作する)をも対象に含め、共創効果を定量的に評価、検討し、共創効果の定量化ならびに共創効果を高めるための方策について検討を行った。特に、研究代表者が提唱している「共創モデル」ならびにこのモデルに基づく「共創曲線」という仮説に対し、多様な実験条件のもとで共創効果の定量化と、実験条件の違いによって生じる共創効果の差異について検討を行った。以上の結果、多くの実験条件下で、共創モデルならびに共創曲線の存在を実証することができた。しかしながら、テキスト情報ベースのCGMシステム、アニメ版WikipediaシステムAnimepediaによる共創曲線の差異はもちろんのこと、同一システム(例えばAnimepediaシステム)を用いた場合でも条件(題材が創作系の場合と事実列挙系の場合など)によりその共創曲線に差異が生じた。実験結果よりこの差異は「制作の容易さ」に大きく依存している傾向が読み取れ、制作が容易なシステム、題材ほど共創曲線のカーブが急勾配になる傾向があることが明らかになった。以上の成果は、今後のソーシャルメディアサービス、グループウェア設計、さらにはIT時代の組織論に至るまで多様な場面での応用が可能な基礎知識となりえるものである。順調に研究が進捗し、予定よりも多くの評価実験を実施することができた。平成24年度で予定通り研究を終了した。特に、一般のテキスト情報ベースのCGMシステムに加え、研究代表者が開発したアニメ版WikipediaシステムAnimepediaによるアニメ制作(百科事典の各アイテムを写真やイラストを含めたアニメ映像として複数ユーザ間で制作する)をも対象に含め、共創効果を定量的に評価、検討し、共創効果の定量化ならびに共創効果を高めるための方策について検討する.これまでの研究成果より、研究代表者らは「共創モデル」ならびにこのモデルに基づく「共創曲線」という仮説を立て、非常に限定的な条件ながら(Animepediaを用いた実験のみ。被験者数は1020名程度と小規模、CGMコンテンツの制作方法は同期型のみ)、この共創曲線の存在を実験を通じて実証している。そこで、本研究ではこれまでの研究成果によって得られた知見をもとに、より多様な実験条件のもとで共創効果の定量化と、実験条件の違いによって生じる共創効果の差異について検討することを目標とする。本年度(平成23年度)は、これまでの成果を踏まえ、テキスト情報ベースのCGMシステムを対象に、共創効果実験までを実施した。その結果、アニメ制作時と同様の共創曲線の存在を確かめることができた。さらに、その共創曲線の形状はアニメ制作時とは若干異なり、よりピークが顕著に表れる傾向があることがわかった。これまでの成果を踏まえ、Animepediaシステムを用いたアニメ制作を対象とし予備実験に加え、テキスト型CGMシステムの実験を実施し、良好な(仮説通りの)結果を得ることができた。以上の点から順調に進展していると言える。平成24年度で計画通り研究を終了している。
アジドイミダゾリニウムを用いる求電子的アジド化反応の開発

有機アジド(R-N3)の開発は合成化学に限らずケミカルバイオロジーや高分子・材料分野において重要性が増している。一方,アジドやアジド化剤は爆発性を持つものが多く,爆発性のない安全で簡便なアジド化合物合成法の開発の需要は高い。一般に有機アジドは,炭素求電子種(R+等価体)である有機ハロゲン化物(R-X,X:ハロゲン)にアジ化物イオン(N3ー)を反応させる求核的な手法で合成されるが,この手法ではアリールアジドなど合成できないアジドも多い。一方,その逆の組合せ,すなわち炭素求核種(Nu-)に対しアジドカチオン(N3+)を反応させる求電子的な手法があれば,アリールアジドなどを簡便に合成できるが,その実用的なアジド化剤が無いのが現状である。求電子的アジド化剤の基本構造はN3-Y(Y:脱離基)で表すことができ,これが優れた求電子的アジド化剤としてふるまうにはいくつかの条件がある。まず,脱離基Yには,高い脱離能,低い求核能,求核攻撃を受けにくいこと,が備わることが求められる。また,求電子的アジド化剤がカチオン性であれば,より有効な求電子剤となる。さらに,汎用性を考慮し,アジド化剤が爆発性のない安定な固体として単離できることが好ましい。以上の諸条件を解決した反応剤として,アジドイミダゾリニウムを設計し,その合成に取り組んだ。イミダゾリウニウムの環を構成する二つの窒素原子上に嵩高い置換基を有する化合物の合成法を確立し,その単離を行った。単離したアジドイミダゾリニウムを用いて,フェノールの一段階アジド化に成功した。さらに,今回合成したアジドイミダゾリニウムは条件によりジアゾ化能を示すことを明らかにした。研究概要で述べたように,本研究は,求電子的アジド化能を有する反応剤の開発を目指すものである。反応剤としてアジドイミダゾリニウムを設計し,その合成に成功し,また,これを用いてフェノールの初の一段階アジド化に成功している。したがって,研究は順調に進展している。これまでに,フェノールのアジド化に成功しており,今後種々のフェノール類や各種求核剤との反応を試みる。また,アジド化剤として合成したアジドイミダゾリニウムにはいくつか反応点を有しており,その反応性の制御について検討を行う。置換基が異なる,6種類の異なるアジドイミダゾリニウムの前駆体の合成に成功した。さらに,この前駆体より調製したアジドイミダゾリニウムを用いて,芳香族化合物のアジド化を行いアジド化できることを見出した。また,3つのアジドイミダゾリニウムの単離に成功した。単離したアジドイミダゾリニウムを用いて同様にアジド化できることを明らかにした。そのアジド化剤のモチーフとしてアジドイミダゾリニウムを選び,その合成に成功し,また,合成したいくつかは,期待通り芳香族化合物をアジド化できることをあきらかにしており,研究は順調に進展している。

一方,その逆の組合せ,すなわち炭素求核種(Nu-)に対しアジドカチオン(N3+)を反応させる求電子的な手法があれば,アリールアジドなどを簡便に合成できるが,その実用的なアジド化剤が無いのが現状である。求電子的アジド化剤の基本構造はN3-Y(Y:脱離基)で表すことができ,これが優れた求電子的アジド化剤としてふるまうにはいくつかの条件がある。まず,脱離基Yには,高い脱離能,低い求核能,求核攻撃を受けにくいこと,が備わることが求められる。また,求電子的アジド化剤がカチオン性であれば,より有効な求電子剤となる。さらに,汎用性を考慮し,アジド化剤が爆発性のない安定な固体として単離できることが好ましい。以上の諸条件を解決した反応剤として,アジドイミダゾリニウムを設計し,その合成に取り組んだ。イミダゾリウニウムの環を構成する二つの窒素原子上に嵩高い置換基を有する化合物の合成法を確立し,その単離を行った。単離したアジドイミダゾリニウムを用いて,フェノールの一段階アジド化に成功した。さらに,今回合成したアジドイミダゾリニウムは条件によりジアゾ化能を示すことを明らかにした。研究概要で述べたように,本研究は,求電子的アジド化能を有する反応剤の開発を目指すものである。反応剤としてアジドイミダゾリニウムを設計し,その合成に成功し,また,これを用いてフェノールの初の一段階アジド化に成功している。したがって,研究は順調に進展している。アジドイミダゾリニウムの置換基の探索を行い,さまざまな誘導体の合成を行う,さらに,様々な求核剤と反応を行い,アジド化合物の新合成法の開発を検討する予定である。これまでに,フェノールのアジド化に成功しており,今後種々のフェノール類や各種求核剤との反応を試みる。また,アジド化剤として合成したアジドイミダゾリニウムにはいくつか反応点を有しており,その反応性の制御について検討を行う。(理由)当初配属予定した人数の研究従事者(2017年度配属学生)が集まらず,予定した消耗品等の購入が行われなかったため。(使用計画) 2018年度の学生の配属は,前年度よりも多く,2017年に比べ大幅に消耗品を購入する予定である2017年度計画より少ない人員で研究を行っていたため,無理に当初の予算を使い切らなかった。2019年度は人員を増やして研究を行う予定であり,トータルで当初の予算を執行する予定である。
人工マイクロＲＮＡを介したダイズの高度な遺伝子制御系の開発とその利用

ダイズの遺伝子を効率的に抑制するためダイズに内在するマイクロRNA(miRNA)を利用して人工miRNA(amiRNA)の遺伝子制御系を確立した。最初に,ダイズの貯蔵タンパク質遺伝子を標的にamiRNAを発現するダイズ形質転換体を作出した。これらの形質転換体では,標的遺伝子の発現が強く抑制され,貯蔵タンパク質の蓄積も減少していた。次に,ダイズ種子の機能性成分の一つであるDDMPサポニンの配糖化酵素遺伝子の機能解析を行った。その結果,対象とした遺伝子が目的とする機能を持つことが検証できた。これら一連の研究を通して,本遺伝子制御系がダイズ遺伝子の機能解析に利用できることを実証した。前年度から進めている人工マイクロRNA(amiRNA)を介したダイズ種子貯蔵タンパク質遺伝子の発現制御とその標的遺伝子のノックダウン個体を通してタンパク質を含む窒素源の動態を解析した。最初に,本研究で作出した形質転換体において標的遺伝子の発現解析を行った。その結果,標的遺伝子の発現は対象個体における発現レベルの1割程度にまで低下していることが明らかとなった。加えて,この抑制の程度は植物体内で産生されるamiRNAの量に依存していることも明らかとなった。これら一連の結果は,ダイズゲノム内における標的遺伝子の発現を効率的に抑制することに成功したことを示している。よって,本研究においてダイズにおけるamiRNAを介した遺伝子発現制御系を確立した。また,これら標的遺伝子の翻訳産物となる貯蔵タンパク質のSDS-PAGEならびにイムノブロット解析を行った。その結果,標的とする貯蔵タンパク質の蓄積量が大きく低下していることが明らかとなった。一方,元素分析器を用いて種子における窒素含量を測定したところ貯蔵タンパク質が大きく減少するにも関わらずノックダウン個体と対象個体の間には差異がないことが明らかになった。このことから,標的とした貯蔵タンパク質を構成していた窒素源が他の形態(他のタンパク質もしくは遊離のアミノ酸など)をとって種子に蓄積していることが示唆された。さらに,本研究において確立したamiRNAの遺伝子発現制御系を利用してダイズ種子に蓄積する機能性成分の一つDDMPサポニンの糖転移酵素をコードしていると考えられる遺伝子のノックダウンを試みた。現在,T1個体を養成中であり,これらの個体において目的のコンストラクトがダイズゲノム内に挿入されていることを確認した。ダイズ種子には数多くの生理機能性物質が含まれていることが知られている。DDMPサポニンもその一つである。DDMPサポニンは付加する糖鎖の種類によってその機能性が異なることが報告されいてる。これらの糖鎖を構成する糖は,主にグルコース,ガラクトース,アラビノースおよびラムノースの4種であることが分かっている。これらのうち,ラムノースを付加する酵素遺伝子については現在までに遺伝学的に検証された例はない。そこで,本研究は先行研究においてマップベースクローニングによって単離したDDMPサポニンのラムノース付加に関連すると考えられる遺伝子の機能解析を行った。前年度までに構築したダイズに内在するマイクロRNA(miRNA)の一つであるgma-miR159aのフレームを用いた人工miRNA(amiRNA)の系を利用して当該遺伝子のノックダウンを試みた。標的とする遺伝子配列とgma-miR159aを入れ換えたmRNAを発現するベクターを構築し,アグロバクテリウムを介してダイズの形質転換体を作出した。本形質転換体を自殖し導入遺伝子を固定化した後,種子におけるDDMPサポニンの組成をHPLCで分離・定量した。その結果,ラムノースを含む糖鎖を持つDDMPサポニンが対象個体と比べ有意に減少していることを明らかにした。加えて,登熟中にある種子において標的遺伝子の発現解析を行った。その結果,当該遺伝の発現量は対象個体と比べ有意に低下していることも明らかにした。本研究における一連の結果はダイズにおいてamiRNAを介した高度な遺伝子発現制御系の構築に成功したことを示す。また,本系が遺伝子の機能解析に利用できることも実証した。ダイズにおける遺伝子の特異的かつ効率的な機能解析を行うため人工マイクロRNA(artificial miRNAs, amiRNAs)による遺伝子制御系の構築を試みた。最初に,amiRNAsを効率的に行うためのフレームとなる内在のmiRNAを選定した。Pre-miRNAsのサイズ,二次構造およびそれらpre-miRNAsの発現部位の情報を基準に,gma-miR159aおよびgma-miR168を選定した。これらのmiRNA配列を含むpre-miRNAsのcDNAをクローニングするため,葉組織および未熟種子組織からRNAを抽出しRT-PCRを行った。

また,種子組織特異的にamiRNAを行うため,β-コングリシニンのサブユニット遺伝子の一つであるGlyma20g28650遺伝子のプロモーター領域の約2.2 kpbの下流に上述したgma-miR159aおよびgma-miR168のpre-miRNAsに相当するcDNAをつなぎ合わせた発現ベクターを構築した。さらに,amiRNAを行うβ-コングリシニン遺伝子の標的配列の設計を行った。ダイズゲノムデータベースから,3種類存在するβ-コングリシニンのサブユニット遺伝子のパラログを検索した。その結果,データベース上に合計6つの遺伝子の存在を確認した。そこで,これらの遺伝子に共通する配列を選定し,内在miRNA領域と入れかえた。上記の発現ベクターをアグロバクテリウムEHA105株へ導入し,この菌体を介してダイズの形質転換実験を行った。その結果,独立した複数のT1植物体を得ることに成功した。このことから,構築した発現ベクターは形質転換体の作出に大きな影響をもたらすことなく利用できることが確認できた。導入する遺伝子の構築は標的配列を含むプライマーを用いたPCRを介して行うため,簡便かつ迅速に発現ベクターを準備することができた。加えて,一定の形質転換効率を維持した状態で形質転換体を作出できたこともあり,解析を行うための十分な材料を確保することができた。また,形質転換体の導入遺伝子の挿入形態および遺伝子の発現解析といった基本的な解析は本研究予算で購入した機器を用いることで効率的に進めることができた。これらの点が予定していた期間内に所期の目標到達を可能にした。一方,形質転換体を養成できる培養室が共通施設ということもあり,本研究の進行の制限要因となっていた。そこため,随時連続的に材料を養成することでこの制限を回避する工夫をした。開始当初,発現ベクターの構築に相当な時間を要した。その理由は,標的とする遺伝子に対してamiRNAを形成させる配列の選定が煩雑であることにあった。すなわち,内在のmiRNAにおける二次構造を含めた重要な基本構造を残しつつ,標的とする遺伝子の特異的な配列に入れかえるためのベクターを設計することにもっとも時間を費やした。しかしながら,形質転換実験において一度に大量の外植片を準備するなどの処置を取ることによって初期の遅れを取り戻すことができた。その結果,全体としてのスケジュールをうまく調整することができた。また,その後の形質転換体の解析において,形質転換体を養成できる培養室が共通施設であり,解析対象となる個体数が制限されていることもあり,本件については順次行っている。解析に必要とする材料はすべて確保した。さらに,作出した形質転換体の導入遺伝子の確認も行った。今後は,これらの材料においてより詳細な解析を進めていく。貯蔵タンパク質遺伝子を標的にしたamiRNA制御系につていは,貯蔵タンパク質が減少するにも関わらず対象個体との間において窒素含有量の変化が認められなかったことから,その要因を精査する。
国際教育協力における授業アーカイブを活用した授業研究継承モデルの開発

本研究の目的は、国際教育協力のひとつとして、授業アーカイブを活用し、教育方法・技術が現地の教師に継承される授業研究モデルを開発することである。2018年は以下の2つを進めた。ひとつは、授業技術の継承の問題と授業アーカイブを用いた課題を検討し、途上国の教師の授業改善の軌跡を「学校の知見」として記録するための2つの要因を整理した。もうひとつは、研究協力校であるニランジャナ学校で授業アーカイブを用いた授業研究を円滑におこなうための参加型ワークショップを実施し、今後の実践の準備を進めた。今年度は先行研究の整理と、実践のための準備である。先行研究の整理である。授業技術の継承の問題と授業アーカイブを用いた課題を検討し、途上国の教師の授業改善の軌跡を「学校の知見」として記録するための2つの要因を整理した。授業研究同様に映像や写真を用いた授業アーカイブが途上国でどのようなプロセスで受け入れられ実施されていくのか、また、それを用いた授業改善の要因に関する研究事例は少ない。そこで、まず、記録方法を整理した。途上国の学校を取り巻く状況は先進国のそれとは大きく異なり、電気やICTのインフラが整っているわけではない。そのような中でどのような記録をとることが、「学校の知見」となるのかを、途上国のインフラ状況に合わせた記録方法を整理した。次に、そもそもの授業研究で議論される内容整理をした。授業研究の進め方や議論の内容は、それぞれの国の教育現場の社会文化的な文脈に依存する。たとえば教育方法・技術や子どもの状況把握、教材開発と評価、教科書の使い方などがあり、それによって授業者および授業を観察する教師の着眼点が異なる。そのため、授業研究における教師の知見を記録する授業アーカイブの方法や内容を整理した。実践のための準備は、研究協力校であるニランジャナ学校で授業アーカイブを用いた授業研究を円滑におこなうための参加型ワークショップを実施した。インフラが十分にない場合でも可能なような記録方法を検討し、それを用いた授業研究の方法を経験した。それをもちいた年間の授業研究の計画を立てた。今後は、管理職への連絡や、SNSを介した授業研究の状況をモニタリングし、実証研究のデータを収集する。教師や管理職に対して「授業アーカイブを自身への授業に活かすプロセス」「授業アーカイブを用いる際の問題点」を質問の中心とする半構造化インタビューを実施する。同時に文献研究を継続して進めると共に、それらを拡張的学習論の活動システムの枠組みから分析する。(理由) 2度のインドの授業研究調査の旅費として計上していたが、現地との調整の結果、1度の渡航に変更したためである。(使用計画)2019年9月以降に授業研究調査のための旅費として使用を予定している。
アメリカのジャポニズム文学における異人種混淆とオリエンタリズムの研究

本研究は、世紀転換期のアメリカのジャポニズム文学異人種混淆とオリエンタリズムに焦点において調査し、アメリカのジャポニズム文学の見取り図を描くこと、とりわけ、アメリカのオリエンタリズムの構造、異人種混淆の文学としてのジャポニズム文学の役割、またアメリカのジャポニズム・ブームと日本人芸術家の貢献、日本文化とアメリカ文化の相互影響関係を調査し、ジャポニズム文学の国際的な学術振興に努めることを目的とした。当該研究機関は、夏季休暇期間を中心に、アメリカ、そしてイギリスでの調査を行いながら研究に取り組んだが、大きな成果は、現在ではほとんど忘れ去られたジャポニスム演劇『神々の寵児』の全体像を明らかにすることができたことである。また、この演劇に対する日本人画家牧野義雄の貢献を明らかにすることができたことである。『神々の寵児』に見られる、蝶々夫人型の変形とも言える日本女性像はジャポニスム文学の系譜を考える上でも極めて重要な女性像であると結論づけることができる。またオリエンタリズムとしてのジャポニズムが日本のイメージを搾取するという形態を持っていたと同時に、日本人がジャポニズムという運動に積極的に関与していたこともジャポニズムという西洋文化の機構を考える上で重要である。これらの研究成果は、日本比較文学会やハワイでの国際人文芸術学会にて口頭発表を行うと同時に、ジャポニズム学会発行の『ジャポニスム研究』やハワイ国際人文・芸術学会大会の学会論文収録集、また都留文科大学紀要に論文として発表した。また本研究を通じ、モダニズムとジャポニズムの関係性も見えてきた。異人種混交の物語はアフリカ系アメリカ文学でも20世紀初頭からモダニズムの時代にかけて重要なテーマであるが、アフリカ系アメリカ文学とジャポニスムの関係もまたモダニズムとジャポニズムを介し、重要なリンクが見えてきた。1.アメリカのジャポニズムにおいて重要な役割を果たしたJohn Luther Longの調査を行った。Longには、『神々の寵児』というDavid Belascoと共同の「日本」演劇があるが、この演劇が20世紀初頭のアメリカでは『蝶々夫人』以上に影響力があったことが、ニューヨークの公立図書館や早稲田の演劇資料館から資料を取り寄せ検討することにより明らかになった。この点については日本比較文学会で「ジョン・ルーサー・ロングとデイヴィッド・ベラスコのジャポニズム演劇」という発表を行い、国内の比較文学研究者からも様々な知見を得た。2.『神々の寵児』の上演には、日本人芸術家の牧野義雄が関わっている。牧野義雄の著作や資料をイギリスの漱石博物館や愛知県の豊田市美術館、湯河原の重光葵博物館、一橋大学図書館などから集め、検討を行った。この調査については山梨県都留市の市民講座で「倫敦と牧野義雄」という講演を行った。3.カナダのカルガリー大学、ロアンゼルスの日系アメリカ人博物館などでWinnifred Eaton関係の資料を収集し、「シンデレラ・コンプレックスとエスニシティの壁-Winnifred EatonのMe:A Book of Remembranceについて」という発表を多民族研究会第5回大会にて行った。また論文をアジア系アメリカ文学研究会の雑誌に寄稿した。Eatonのカナダ人としてのアイデンティティの問題とポストコロニアル小説としてどのようにEatonのような混血文学の位置づけていくかが問題である。4.ジャポニズム文学が提示する問題は緊密にアフリカ系アメリカ文学の中にオリエンタリズムの形で陰を落としている。また階級問題とジェンダーも極めて重要な要素となる。俳句に興味を持ったRichard Wrightの男性中心主義的なレトリック、また19世紀のアフリカ系アメリカ人のオリエンタリズムを考える上で欠かせないエチオピアニズムと概念が重要であることを論文や発表の中で示した。1.前年の日本比較文学会での発表

「ジョン・ルーサー・ロングとデイヴィッド・ベラスコのジャポニズム演劇」を下地に論文「アメリカ世紀転換期のジャポニスム演劇-デイヴィッド・ベラスコとジョン・ルーサー・ロングの『神々の寵児』(1902)について」を『ジャポニスム研究』27号に発表した。また英語論文を2008年1月にハワイで行われた国際学会で英語で発表したが、海外の研究者との意見交換は有意義なものとなった。2.『神々の寵児』の上演には、日本人芸術家の牧野義雄が関わっている。牧野義雄の著作や資料をイギリスの漱石博物館や愛知県の豊田市美術館、湯河原の重光葵博物館、一橋大学図書館などから集め、検討した結果を、『都留文科大学紀要』に発表した。3.モダニズムとジャポニスムの関連を探るために、アメリカのニューメキシコ州サンタフェにあるジョージア・オキーフ・リサーチ・センターで調査を行った。オキーフはフェノロサとも親しかったアーサー・ダウの指導を受けており、日本的な絵画手法を表現の中に用いていることがわかった。モダニズムと融合したジャポニスムを考える上で重要である。この分野はさらに調査を続けたい。4.アフリカン・アメリカン・モダニズムとジャポニスムの調査をアメリカの南部の大学で行った。とりわけ、モダニズムの時代に英米文学の中に取り入れられた俳句は、リチャード・ライトのようなアフリカ系アメリカ人作家においてどのような意味を持っていたのかを検討することが今後の課題として浮かびあがってきた。
核磁気共鳴法、蛍光分光法を用いた外分泌腺細胞膜透過機構の研究

三年間の共同研究により得られた成果のうち代表的な2点について概要を報告する。1、細胞内水,Na、K、Rbイオンの動的挙動の研究細胞内外のNa、K、RbをNa-23、K-39、Rb-87 NMR法に緩和時間測定法、多量子緩和測定法を用い、細胞内外におけるこれらのイオンの動的挙動を明かにした。従来、Na-23磁気共鳴緩和速度はスピン・エコー法や、反転回復法で測定され、生物系では2から3個の緩和速度が測定されている。しかしながら、この複数の緩和速度が、複数の物理的分画のNaイオンに由来するのか、四極子緩和により組みになった二つの緩和速度に由来するのか、直接的な証拠はなかった。多量子(フィルター)NMRにより、はじめて、どの二つの緩和速度が遅い運動状態にあるNaイオンに対応するのか、どの緩和速度成分が速い運動状態にあるNaイオンに対応するのかを、あきらかにすることができるようになった。灌流唾液腺細胞内の輸送されるイオンは「遅い運動状態」にあり、見かけの(平均化された)分子相関時間は10ナノ秒程度であることを明かにした。細胞内のK,Rbイオンについても、数ナノ秒程度の見かけの分子相関時間を持つことを明かにした。また、細胞外のNaイオンの一部は同様に「遅い運動状態」にある。Na,Kイオンのモル容積の違いから、細胞内において両イオン運動状態が大きく異っているのではないかとの仮説もあったが、これら三種のイオンの細胞内における分子環境がさして変わらないというデータは、新たな発見であった。さらに、測定周波数・測定温度・細胞内Na量等を変化させた測定から、細胞内のNaイオンは、そのほとんどは比較的速い運動状態(分子相関時間10ピコ秒程度)にあり、ごく小さい分画が遅い運動状態(分子相関時間60ナノ秒程度)にあり、両者の間で速い交換をおこなっているモデルが妥当と考えられた。現在、細胞内の速い運動状態にあるNaイオンの運動を分子拡散速度で測定するために、実験準備をすすめている。中核となるのは、最大磁場強度5T/m、スイッチング時間1ミリ秒の自己シールド型磁場勾配コイルであり、現在最終調整中である。2、細胞内Caの分泌刺激中の時間的変動の測定法の検討蛍光分光法による上皮膜組織の分泌初期の細胞内Ca変動測定について、灌流臓器による測定法の確立研を行った。蛍光分光法による上皮組織単離細胞での細胞内Ca変動測定については、1990年初頭より研究者を割っての劇論となっていた。1992年9月に、方法論の確立と合意形成のために研究打ち合せをおこなった。同一手技によって単離された細胞であっても、分泌刺激によって種々の細胞内Ca反応をとることが示された。細胞単離作業により細胞の生理機能の一部が脱落することが示唆され、単離細胞での蛍光分光法による細胞内Ca変化測定についての結果が一致しない原因となっていることが明かになった。そこで、生理機能が維持されている灌流臓器を、蛍光分光光度計内に設置し、Fura-AMを灌流液中に付加し、細胞内に効率よく導入した。更に、蛍光の定量化の手法を検討し、再現性ののよいデータを得る方法を確立した。さらに単離細胞を用いた結果との刷り合わせを行ない、生化学的手法により細胞内情報伝達系を定量的に測定することにより、1993年中に数々の新しいデータを得ることができた。

中核となるのは、最大磁場強度5T/m、スイッチング時間1ミリ秒の自己シールド型磁場勾配コイルであり、現在最終調整中である。2、細胞内Caの分泌刺激中の時間的変動の測定法の検討蛍光分光法による上皮膜組織の分泌初期の細胞内Ca変動測定について、灌流臓器による測定法の確立研を行った。蛍光分光法による上皮組織単離細胞での細胞内Ca変動測定については、1990年初頭より研究者を割っての劇論となっていた。1992年9月に、方法論の確立と合意形成のために研究打ち合せをおこなった。同一手技によって単離された細胞であっても、分泌刺激によって種々の細胞内Ca反応をとることが示された。細胞単離作業により細胞の生理機能の一部が脱落することが示唆され、単離細胞での蛍光分光法による細胞内Ca変化測定についての結果が一致しない原因となっていることが明かになった。そこで、生理機能が維持されている灌流臓器を、蛍光分光光度計内に設置し、Fura-AMを灌流液中に付加し、細胞内に効率よく導入した。更に、蛍光の定量化の手法を検討し、再現性ののよいデータを得る方法を確立した。さらに単離細胞を用いた結果との刷り合わせを行ない、生化学的手法により細胞内情報伝達系を定量的に測定することにより、1993年中に数々の新しいデータを得ることができた。1。細胞内水,Na,Kの動的挙動の研究細胞内外のNaをNaー23NMR法に緩和時間測定法、多量子緩和測定法を用い、細胞内外におけるNaの動的挙動を明かにした。細胞内Na,水の並進運動速度をパルス磁場勾配法をNaー23,Hー1 NMR法に用い測定した(瀬尾,村上,Lee,McDouall,Rooney)。これらの成果のもとに、11月中旬に研究打ち合せ会議を岡崎にて行い(Springer,Steward,Wimperis,Pekar,Shinar)。多量子NMR法を用いた細胞内電解質(Na,K,Cl,Rb等)の研究成果を討論し、細胞内の電解質が今まで考えられていた以上に束縛された状態にあることががわかった。今後、細胞内電解質の物理化学的存在状態の研究を新しい化学シフト剤の開発(Springer)、磁気緩和理論の構築(Wimperis,Shinar)、in vivo多量子NMR測定技術開発(瀬尾,Pekar)の方向でおこなっていくことが合意された。2。細胞内水,Na,Kの定常分泌相における動態の解析Hー1,Naー23,Kー39 NMR法を用い測定した。定常分泌相において細胞内水,Kは約30%減少し細胞内Naは2ー3倍に増加することを明かにした。細胞内水の動的変動測定への微小磁気共鳴画像法の適用について、基礎実験と技術収集をおこなった(瀬尾,McDouall,大河原)。3。細胞内Caの分泌刺激中の時間的変動の測定法の検討蛍光分光法により上皮膜組織の分泌初期の細胞内Ca変動測定について、とりわけ、単離細胞系での時間経過の速い変化の測定について方法論を中心に情報収集、検討を行った(Case・Steward・村上・瀬尾)。1)細胞内Caの分泌刺激中の時間的変動の測定蛍光分光法による上皮組織単離細胞での細胞内Ca変動測定については、この2年間研究者を割っての劇論となっていた。方法論の確立と合意形成のために研究打ち合せをおこなった(Case,Steward,Baum,Turner,Putnety,Schulz9月)。
有機化学的アプローチによるイノシトールリン酸の生理機能解明

イノシトール1,4,5-三リン酸(IP_3)の2位あるいは3位を修飾した類縁体の合成とその生物化学的利用について検討した。まず、2位の水酸基をアミノベンゾイル化した類縁体の合成ルートとして、ホスホニウム塩を活性種とする新しいリン酸化法を見いだし、これによって効率的に目的の合成が達成できることとなった。この類縁体に、可視化のためのビオチン部と光分解性基としたアジド基あるいはトリフルオロメチルジアジリニル基を同時に有するリジン誘導体あるいはサリチル酸誘導体をジアゾカップリングで統合させ光親和性標識化合物の合成を完成した。これらとIP_3代謝酵素を混合し光を照射するとタンパクのある部分が標識されることが明らかとなった。今後、この手法で得られる標識部位の特定を行うことにより活性部位の探索が進められるものと期待される。同様に、上記の類縁体を利用してIP_3を樹脂に固定化し、アフィニティークロマトグラフィーを行いIP_3親和性タンパクの単離精製を試みたところ、PLCδと共にこれまで報告されていない新しいタンパク質を発見することができた。このものの機能を中心に種々性質を現在調査しいる。また、前者の酵素もIP_3との親和性の高さが示唆され、生理機能との関連で興味がもたれる。一方、3位ベンゾイルIP_3の合成に成功し、そのものの生物活性を調べたところ、2位類縁体とは異なり5-ホスファターゼに対してのみ活性のあることが明らかとなった。この性質を利用して特定のタンパクの精製や活性部位の検索ができるものと期待される。なお本研究の中で、上述のリン酸化法を検討中に、トリアルキルホスファイトのエステル交換反応がテトラゾールによって触媒を受ける事実を見いだし、同時に交換反応の中間体としてホスホラン誘導体が存在することをNMRの観測により証明した。
マクロ界面とナノ界面の理論的接点

課題中の"マクロ界面"は電極界面のような通常の界面を指し,"ナノ界面"はイオンと溶媒分子間の分子レベルの界面を指す.ナノ界面の界面エネルギー(すなわち溶媒和エネルギー)に関しては,古くからボルン型の静電理論が用いられてきたが,最近我々は,イオンの溶媒間移行エネルギーの研究から,イオンと溶媒との近距離相互作用が重要であることを明らかにし,新しい非ボルン型理論を提案した.この理論では,イオン-溶媒分子間の近接相互作用エネルギーが,イオンの表面電場の二次関数で近似できることが示された.この依存性は,マクロ界面である水銀電極の界面エネルギー,すなわち界面張力の電位依存性(電気毛管曲線)に類似している.そこで,以下の作業仮説をたてた:「ナノ界面とマクロ界面の界面エネルギーが本質的に同じであれば,マクロ界面の一つである水銀電極界面の表面エネルギーも電極の表面電場(E)の二次関数で表され,その二次の微係数がドナー数(D_N)やアクセプター数(A_N)などの経験的溶媒パラメーターと相関を持つであろう.」この作業仮説を検証するため,各種溶媒中でイオンの特異吸着のない水銀電極界面の微分容量を交流インピーダンス法により測定し,拡散層の寄与を補正した表面エネルギー(γ_i)を評価した.γ_iはEに対して二次の依存性を示し,Eの正負の領域の二次の微係数(a_+およびa_-)について各種溶媒特性との相関を調べた.調べた十種類すべての溶媒については,a_+,a_-はどの溶媒特性値ともほとんど相関を持たなかったが,水銀電極と特異的に結合するホルムアミドとN-メチルホルムアミドを除外すると,a_+,a_-は溶媒の分極率に対して有る程度の相関を示し,D_NやA_Nなどの経験的溶媒パラメーター(単位面積当りの溶媒分子数を考慮)に対して予想通り比較的高い相関(それぞれr=0.821,0.910)を示した.このように,上記の作業仮説は支持された.課題中の"マクロ界面"は電極界面のような通常の界面を指し,"ナノ界面"はイオンと溶媒分子間の分子レベルの界面を指す.ナノ界面の界面エネルギー(すなわち溶媒和エネルギー)に関しては,古くからボルン型の静電理論が用いられてきたが,最近我々は,イオンの溶媒間移行エネルギーの研究から,イオンと溶媒との近距離相互作用が重要であることを明らかにし,新しい非ボルン型理論を提案した.この理論では,イオン-溶媒分子間の近接相互作用エネルギーが,イオンの表面電場の二次関数で近似できることが示された.この依存性は,マクロ界面である水銀電極の界面エネルギー,すなわち界面張力の電位依存性(電気毛管曲線)に類似している.そこで,以下の作業仮説をたてた:「ナノ界面とマクロ界面の界面エネルギーが本質的に同じであれば,マクロ界面の一つである水銀電極界面の表面エネルギーも電極の表面電場(E)の二次関数で表され,その二次の微係数がドナー数(D_N)やアクセプター数(A_N)などの経験的溶媒パラメーターと相関を持つであろう.」この作業仮説を検証するため,各種溶媒中でイオンの特異吸着のない水銀電極界面の微分容量を交流インピーダンス法により測定し,拡散層の寄与を補正した表面エネルギー(γ_i)を評価した.γ_iはEに対して二次の依存性を示し,Eの正負の領域の二次の微係数(a_+およびa_-)について各種溶媒特性との相関を調べた.調べた十種類すべての溶媒については,a_+,a_-はどの溶媒特性値ともほとんど相関を持たなかったが,水銀電極と特異的に結合するホルムアミドとN-メチルホルムアミドを除外すると,a_+,a_-は溶媒の分極率に対して有る程度の相関を示し,D_NやA_Nなどの経験的溶媒パラメーター(単位面積当りの溶媒分子数を考慮)に対して予想通り比較的高い相関(それぞれr=0.821,0.910)を示した.このように,上記の作業仮説は支持された.溶媒抽出,液膜,センサーなどに用いられる油水界面や電極界面などの"マクロ界面"と,溶質と溶媒との間の分子レベルの界面である"ナノ界面"の界面エネルギーが,同一の理論によって統一的に解釈できることを明らかにすることを目的とした。マクロ界面として水銀電極と溶液の界面を選び,その界面張力(γ)および電気二十層容量(C)の測定を試みた。水溶液中で電極界面への特異吸着のないことが分かっているNaFと,比較対象として特異吸着のあるKFについて,まず水銀電極の滴下時間の測定からγの電位依存性を測定した。文献値との比較により,正確な測定ができたことを確認した。引き続き,ロックインアンプを用いて製作した電極インピーダンス測定装置を用いて,NaFおよびKFの水溶液中の水銀電極の電気二重層容量Cを測定した。この際,測定周波数の最適化などを行い,正確な測定が行えたことを確認した。電極界面のCを電位について二回積分するとγを得ることができるが,このことを上記の系においても確かめた。このようにして正しく測定できたNaF水溶液中のCは,ゼロ電荷点よりも正側の電位では概ね一定の値を示したが,負側の電位ではかなり電位に依存した。しかし,正側と負側をそれぞれ一定値と見なして二回積分することにより,理論的なγ(正側と負側でそれぞれ二次関数)が得られ,これは実測したγと概ね良く一致した。

電極界面のCには,電極最表面の内部層からの寄与だけでなく,電気二重層の寄与が含まれるので,電気二重層の寄与をグイ・チャップマンの理論を用いて補正した。この補正は比較的高い電解質濃度の場合は大きくなかったが,これによりより正確に電気界面の表面エネルギーを評価することができた。本年度では水溶液系の測定が完了したため,次年度は測定を各種有機溶媒系に広げて,水銀電極の界面エネルギーの溶媒依存性について明らかにする予定である。課題中の"マクロ界面"は電極界面のような通常の界面を指し,"ナノ界面"はイオンと溶媒分子間の分子レベルの界面を指す.ナノ界面の界面エネルギー(すなわち溶媒和エネルギー)に関しては,古くからボルン型の静電理論が用いられてきたが,最近我々は,イオンの溶媒間移行エネルギーの研究から,イオンと溶媒との近距離相互作用が重要であることを明らかにし,新しい非ボルン型理論を提案した.この理論では,イオン-溶媒分子間の近接相互作用エネルギーが,イオンの表面電場の二次関数で近似できることが示された.この依存性は,マクロ界面である水銀電極の界面エネルギー,すなわち界面張力の電位依存性(電気毛管曲線)に類似している.そこで,以下の作業仮説をたてた:「ナノ界面とマクロ界面の界面エネルギーが本質的に同じであれば,マクロ界面の一つである水銀電極界面の表面エネルギーも電極の表面電場(E)の二次関数で表され,その二次の微係数がドナー数(D_N)やアクセプター数(A_N)などの経験的溶媒パラメーターと相関を持つであろう.」この作業仮説を検証するため,各種溶媒中でイオンの特異吸着のない水銀電極界面の微分容量を交流インピーダンス法により測定し,拡散層の寄与を補正した表面エネルギー(γ_i)を評価した.γ_iはEに対して二次の依存性を示し,Eの正負の領域の二次の微係数(a_+およびa_-)について各種溶媒特性との相関を調べた.調べた十種類すべての溶媒については,a^+,a_-,はどの溶媒特性値ともほとんど相関を持たなかったが,水銀電極と特異的に結合するホルムアミドとN-メチルホルムアミドを除外すると,a_+,a_-は溶媒の分極率に対して有る程度の相関を示し,D_NやA_Nなどの経験的溶媒パラメーター(単位面積当りの溶媒分子数を考慮)に対して予想通り比較的高い相関(それぞれr=0.821,0.910)を示した.このように,上記の作業仮説は支持された.
金属クラスター内包フラーレンの構造解析と分子変換

本研究は、Scクラスター内包フラーレンの特異な構造に起因した新規な特性の探求と、それらの機能性の発現に向けて、Scクラスター内包フラーレンの反応性を解明し、それらの知見を基に化学修飾による分子変換を行い、その構造解析を目的とする。発現した事象については、共同研究として遂行する理論計算と実験結果とのインタープレイにより考察した。平成19年度は以下2点の研究成果を得た。(1)Scクラスター内包フラーレンの酸化還元特性と反応性を明らかにした。代表的なScクラスター内包フラーレンとして、Sc_2C_2@C_<82>(C_s,C_<2v>,C_<3V)とSc_2C_2@C_<84>(D_<2d>)の酸化還元特性を明らかにすると共に、ケミカルプローブとして有用なジシリランとの光及び熱反応を検討し、Scクラスター内包フラーレンの反応性を解明した。Sc_2C_2@C_<82>(C_s,C_<2v>,C_<3v>)については、理論計算により、それぞれのHOMO-LUMOを明らかにした。これらの結果はScクラスター内包フラーレンの機能化に向けた化学修飾による分子変換を目指す上で、非常に意義深いと考えられる。(2)Scクラスター内包フラーレンの構造を明らかにした。平成18年度は以下3点の研究成果を得た。(1)Scクラスター内包フラーレンの反応性を明らかにした。代表的なScクラスター内包フラーレンとして、Sc_3C_2@C_<80>、Sc_3N@C_<80>、Sc_2C_2@C_<82>、Sc@C_<82>の酸化還元特性を明らかにすると共に、ケミカルプローブとして有用なジシリランとの光及び熱反応を検討し、Scクラスター内包フラーレンの反応性を解明した。また理論計算により、それぞれのHOMO-LUMOを明らかにした。(2)Scクラスター内包フラーレンの構造を解明した。Sc_3C_2@C_<80>、Sc_3N@C_<80>、Sc_2C_2@C_<82>、Sc@C_<82>の^<13>C NMRと^<45>Sc NMR測定による構造決定に成功した。Sc_3C_2@C_<80>、及びSc@C_<82>は常磁性を有するためNMR測定が困難とされてきたが、申請者はSc_3C_2@C_<80>、及びSc@C_<82>を一電子還元し反磁性のアニオン体を合成することで、この問題点を解決した。また、金属内包フラーレンは球状構造を有するため単結晶X線構造解析が困難であるが、申請者は剛直な骨格を有するアダマンタンジアジリンとの光反応により、効率よくアダマンタン誘導体を合成し、誘導体の単結晶X線構造解析に成功した。Sc_3C_2@C_<80>とSc_2C_2@C_<82>の誘導体の単結晶X線構造解析は、特異な分子C_2がフラーレンケージに内包されていることを単結晶X線構造解析により証明した初めての例である。
ｍｉＲＮＡを含むエクソソームを用いた骨腫瘍治療への応用

ヒト骨肉腫細胞株(143B)の増殖抑制または転移を抑制するようなmiRNAに注目し、微小胞であるエクソソームに包まれて細胞外に放出される分泌型のエクソソームフォームmiRNAを利用することで治療に応用することを目的とした。間葉系幹細胞へ合成miR-143を導入すると培養上清中にエクソソームフォームのmiR-143として放出し、143Bに容易に毒性なく取込まれ、細胞遊走能を抑制することを明らかにした。骨肉腫細胞に対して有効なmiRNAのデリバリーツールとしてエクソソームフォームmiRNAは、新たな治療法の開発に向けた可能性を示唆した。本研究は、微小胞であるエクソソームに包まれて細胞外に放出される分泌型のmiRNAに注目し、ヒト骨肉腫細胞株の増殖抑制または転移を抑制するようなmiRNAのエクソソームフォームを利用することで治療に応用することを目的としている。これまでに高転移能を有するヒト骨肉腫細胞株(143B)へのmiR-143の過剰発現は、その遊走能を減少させ、肺への転移を抑制することが報告されている。そこで、miR-143に注目し、間葉系幹細胞へ合成miR-143を導入すると、その培養上清中にエクソソームフォームのmiR-143を濃度依存的に放出することを明らかにした。そして、このエクソソームフォームのmiR-143は、ヒト骨肉腫細胞株に添加するだけで容易にしかもこれまでのリポフェクション法より毒性なく導入することを明らかにした。このようにして導入されたエクソソームフォームのmiR-143は、ヒト骨肉腫細胞株における細胞遊走能を抑制することを明らかにした。骨肉腫細胞に対して有効なmiRNAのエクソソームフォームは、in vitroレベルではあるが治療効果を示唆した。以上の結果は、論文として報告した(BBRC, 2014)。また、高転移能を有するヒト骨肉腫細胞株(143B)と有さないヒト骨肉腫細胞株(HOS)のエクソソームを含む培養上清とエクソソームのみ、そして、エクソソームを除いた培養上清を用いて間葉系幹細胞の細胞遊走能を調べた結果、エクソソームを含む培養上清とエクソソームのみでその細胞遊走能が増加していた。そこで、HOSと143B細胞より分泌しているエクソソーム中のmiRNAをnCounterシステムによりプロファイリングを行った結果、各々の細胞間における分泌miRNAの種類や発現量に違いがあることを明らかにした。我々は、微小胞であるエクソソームに包まれて細胞外に放出される分泌型のmiRNAに注目し、ヒト骨肉腫細胞株の増殖を抑制または転移を抑制するようなmiRNAのエクソソームフォームを利用することで治療に応用することを目的としている。間葉系幹細胞へ合成miRNAを各濃度で導入すると、その培養上清中にエクソソームフォームの目的miRNAを濃度依存的に放出することを確認した。そして、この培養上清をヒト骨肉腫細胞株に添加するだけで容易に濃度依存的に導入することができた。このようにして導入されたmiRNAは、ヒト骨肉腫細胞株における増殖や細胞遊走を抑制することを明らかにした。また、エクソソームの構成分子をsiRNAによりノックダウンさせた細胞では、その培養上清中のエクソソームマーカー分子の発現を減少させたことから、エクソソームの分泌を低下させることを示した。このエクソソームの分泌抑制が、抗がん剤の耐性に関与するかどうかを調べているが明らかな結果はまだ得ていない。今後、エクソソームフォームの目的miRNAを用いた骨肉腫モデルマウスへの局所注射もしくは静脈注射による骨肉腫治療効果を明らかにするとともに、骨肉腫細胞より分泌するエクソソームの動態を調べることで転移への関与などを明らかにする予定である。ヒト骨肉腫細胞株の増殖抑制または転移を抑制するようなmiRNAのエクソソームフォームを利用することで治療に応用することを目的としている。そこで、間葉系幹細胞へ合成miR-143を導入すると、その培養上清中にエクソソームフォームのmiR-143を濃度依存的に放出することを明らかにした。そして、このエクソソームフォームのmiR-143は、ヒト骨肉腫細胞株に添加するだけで容易に導入され、ヒト骨肉腫細胞株における細胞遊走能を抑制することを報告した(BBRC, 2014)。さらに、エクソソームを蛍光標識したエクソソームフォームmiRNAを尾静脈より投与することで、エクソソームの動態をin vivoイメージングできることを確認した。

また、高転移能を有するヒト骨肉腫細胞株(143B)と有さないヒト骨肉腫細胞株(HOS)のエクソソームを含む培養上清とエクソソームのみ、そして、エクソソームを除いた培養上清を用いて間葉系幹細胞の細胞遊走能を調べた結果、エクソソームを含む培養上清とエクソソームのみでその細胞遊走能が増加していた。そこで、HOSと143B細胞より分泌しているエクソソーム中のmiRNAをnCounterシステムによりプロファイリングを行った結果、143Bの細胞内で発現がHOSに比べて2倍以上増加していたmiRNAは40種、エクソソーム中のmiRNAも40種であったが、細胞内とエクソソーム中で共通しているmiRNAは6種のみであった。以上により各々の細胞間における分泌miRNAの種類や発現量に違いがあり、必ずしも細胞内で発現しているmiRNAとエクソソーム中に存在するmiRNAが一致するわけではなかった。今後さらにmiRNAを含むエクソソームが、がん細胞機能にどのように関与しているかを明らかにしていく。整形外科学エクソソームフォームのmiR-143は、ヒト骨肉腫細胞株に添加するだけで容易にしかもこれまでのリポフェクション法より毒性なく導入することを明らかにした。そして、このようにして導入されたエクソソームフォームのmiR-143は、ヒト骨肉腫細胞株における細胞遊走能を抑制することを明らかにし論文として報告した。以上のことから、研究計画はおおむね順調に進展している。細胞へ目的合成miRNAを導入すると、その培養上清中に分泌miRNAを放出することを確認した。そして、この分泌miRNAは、ヒト骨肉腫細胞株に添加するだけで導入することができ、増殖や細胞遊走を抑制することを明らかにすることができた。また、エクソソーム構成分子のノックダウンによりエクソソームの分泌が抑制されることを確認できたことで、研究計画はおおむね順調に進展している。今後、エクソソームフォームの目的miRNAを用いた骨肉腫モデルマウスへの局所注射もしくは静脈注射による骨肉腫治療効果を明らかにするとともに、骨肉腫細胞より分泌するmiRNAの作用を調べることで転移への関与などを明らかにする予定である。今後、エクソソームフォームの目的miRNAを用いた骨肉腫モデルマウスへの局所注射もしくは静脈注射による骨肉腫治療効果を明らかにするとともに、投与エクソソームや骨肉腫細胞より分泌するエクソソームの動態を調べることで転移への関与などを明らかにする予定である。また、エクソソームの分泌抑制が、抗がん剤の耐性や転移に関与するかどうかを調べる。本年度は、骨肉腫モデルマウスを用いてmiRNA過剰導入エクソソームの抗腫瘍や抗転移の効果をIn vivoイメージングにより抗腫瘍効果をモニターするとともに、病理組織学的評価を行う。また、骨肉腫より分泌したエクソソームの転移などへの関与を調べるためにその局在をIn vivoイメージングよって解析する。このように、免疫不全マウスにルシフェラーゼ発現ヒト骨肉腫細胞株を移植することによるモデルマウス作製とエクソソームの精製・投与、In vivoイメージングが主体の研究となり、そのため研究費の内訳は、実験用動物、エクソソーム抽出キット、In vivoイメージングに関する消耗品などに研究費の多くを割くことになる。また、昨年度、今年度の研究により得たデータを用いた研究成果の発表のための経費も計上する。
頚動脈小体におけるノルアドレナリンによる低酸素受容調節機構

低酸素環境下では、動脈血中の酸素分圧低下は末梢化学受容器である頚動脈小体から頚動脈洞枝を介して延髄へ伝えられ、酸素分圧を正常に戻すための呼吸数増加が生じる。この頚動脈小体から延髄へのシグナル伝達はノルアドレナリン(NA)によって抑制的に調節されることが示唆されている。ラットへ週単位の長期間低酸素暴露を行うと、頚動脈小体におけるNA含有量が増加することが報告されている。一方で、1日以内という短期間の低酸素環境下での頚動脈小体におけるNAの発現動態はほとんど知られていない。そこで、NA合成酵素であるドーパミンβ-水酸化酵素(DBH)に着目し、ラットに24時間までの低酸素暴露(10%O_2 in N_2)を0(コントロール)、6、12、18、24時間行い、頚動脈小体におけるDBHの発現変化を捉えることを目的として実験を行った。ウエスタンブロット法では、コントロール群に比べ12時間暴露群においてDBHシグナルの増強が観察された。免疫組織化学では、コントロール群と比較し12時間暴露群において、化学受容細胞におけるDBH免疫反応性の有意な増強が観察された。以上の結果から、頚動脈小体の化学受容細胞においてDBHタンパク発現は低酸素暴露後12時間で増加することが明らかとなった。このことから、頚動脈小体の化学受容細胞では低酸素暴露後12時間でNA合成能が一過性に亢進していることが示唆された。それゆえに、本研究で示された化学受容細胞におけるDBH増強の意義は、低酸素環境が継続した際に化学受容細胞のNAを増加させて頚動脈洞枝活性の抑制調節を増強することにあると考えられる。本研究の結果は、低酸素環境の初期段階における適切な呼吸反射に化学受容細胞のNAが貢献している可能性を示唆させるものである。本年度の研究結果は、英文論文としてJournal of Histochemistry & Cytochemistry誌に発表した。しかしながら、当初の研究計画における頚動脈小体のアドレナリン受容体の発現解析を進展させることができなかったため。化学受容細胞のノルアドレナリンは頚動脈小体内の細胞要素のうち化学受容細胞や神経終末に作用するのか、血管などの他の構成要素に作用するのかを明らかにする必要がある。そのため、今後の推進方策としてはノルアドレナリンの作用部位であるアドレナリン受容体の頚動脈小体における発現解析を行うことが重要であると考えられる。
自己血貯血の安全性向上を目的とした網状赤血球ヘモグロビン等量(RET-He)測定

研究目的RET-He(網赤血球1個当たりのヘモグロビン量)は、ごく短期間の鉄欠乏で速やかに低下する、鉄欠乏の最も鋭敏な指標である。RET-Heは、血球数と同時に自動測定されるため、迅速かつ安価という利点がある。自己血貯血は同種輸血を避けるため、患者自身の血液を術前に採取・保存し手術時に用いるものであるが、貯血後予想外に貧血が進行することがあり、鉄の補充不足が主原因と考えられている。自己血貯血の安全性向上を目的として、自己血貯血におけるRET-He測定の有用性を検討した。研究方法RET-HeはRETマスタ搭載XE-2100にて測定し、健常者1392例(内訳男性419名:2264歳女性973名:1762歳)にて再現性の評価・安定性・基準範囲の算出を行った。自己血貯血患者48例および鉄欠乏性貧血患者13例を対象にRET-He・ヘモグロビン濃度(Hb)、血清鉄・フェリチンを測定し解析した。研究成果RET-Heの基礎評価は同時再現性が1.271.74%と良好で24時間後まで安定性が確認された。また、健常参考値は男性が32.3-38.8pg、女性が27.0-38.3pgであった。RET-HeとTSATの関連を解析したところ良好な相関がみられ、さらに鉄欠乏性貧血診断のROC解析の結果、RET-Heが最も優れた指標となった。自己血貯血前後の比較において、貯血前のHbが正常であるため鉄剤の補充をしない群では貯血後に貧血が進行する場合とそうでない場合に分かれ、前者の貯血前のRET-Heは低く、後者はある程度保たれていた。また、鉄剤補充のある群でも、貯血前のRET-Heが極端に低い場合は貯血後さらに貧血が進行した。このことより貯血前のRET-He低値例はすでに鉄欠乏状態にあり、この場合Hb10g/dL以上であればRET-Heをフォローしつつ鉄剤補充療法を行い自己血貯血を行うべきであることが示唆された。さらにRET-He低値かつHb10g/dL以下の場合は自己血貯血を中止すべきである。以上をまとめると、RET-Heは信頼性・利便性・迅速性に優れた安価な鉄欠乏性貧血診断指標であることが判明した。さらにRET-He測定により、自己血貯血における鉄剤補充の有無の判定や自己血貯血中止の決定等安全性向上が期待できることが判明した。