hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マナマコの色彩変異3型における遺伝的差異の解明

マナマコには市場価値の異なる体色変異「アカ型・アオ型・クロ型」が知られ、それらの生息環境の違いや繁殖期の違いなどの報告はみられるが、それらの色彩に関する差異の程度、色彩変異型間の生物学的差異に関する定量的・定性的研究はみることができない。本研究はマナマコの色彩の定量的・定性的評価法を考案して客観的に色彩変異の存在を捉え、遺伝標識を開発して色彩変異型の遺伝的差異を明確にする事を目的とした。その結果、(1)デジタルカメラで撮影したマナマコの画像をL*a*b*表色系で調べたところ、アカ型がアオ型及びクロ型とは明確に(不連続に)区分できることが明らかになった。(2)そこでマナマコの色彩を定性的に比較するために、表皮の色素の構成の違いを調べたところ、アカ型は他型にはない鮮赤色の色素を持つとともに他型にはある緑色の色素を持たないことで明確に区分できることが明らかになった。(3)次にアイソザイム分析を行ったところ、同じ湾の中でもアカ型は他型とは異なる遺伝的組成を持つこと、宮城と大分のアカ型が他型との間よりも遺伝的に極めて近縁であることが判明した。(4)そこで幼生でも分析可能なマイクロサテライトマーカーを開発し、(3)と同様の分析をした結果、アカ型が他型とは明確に異なる遺伝的組成を保有し、同湾でも生殖的に隔離された別種になる可能性があることを明らかにした。本論文は、これまで研究が極めて少なかったマナマコに焦点を当て、独自の発想によって色彩の評価法を考案し、初めてマナマコの色彩変異を定量的・定性的に明らかにした。また、これまで困難とされていたマナマコのアイソザイム分析を可能にし、極めて高い変異性があることを示したことや、やはり報告が皆無のマナマコのマイクロサテライトマーカーを20種類開発したこと、そしてそれらのマーカーを活用して、これまで1種とされていたマナマコについて、アカ型がアオ型とクロ型とは生殖隔離された異なる種(亜種)となるべきである証拠を提示できた。本研究は、同じ種の色彩多型として考えられているマナマコの3型(青ナマコ、赤ナマコ、黒ナマコ)について、遺伝学的差異を多角的に捉えて3型の生物学的位置を明確にし、これまで研究が極めて少ないマナマコの生物学的研究の基盤を確立することを目的とする。本年度はマナマコの色彩型変異の遺伝支配を把握するための標識遺伝子の開発とアイソザイム遺伝子による色彩型3型の地理的分化および3型の色彩の定性と定量化を行った。その結果、(1)tDNAの抽出には縦走筋を用いて、フェノールークロロフォルム処理が最適であることが分かった。(2)マグネット法を利用したマイクロサテライトDNAの抽出を試みたが、プライマーの設計までには至らず、次年度の課題となった。(3)棘皮動物のミトコンドリアDNAに関するデータベースおよび公表論文により、マナマコのmtDNAのD-loop領域のプライマーを検索したが認められなかった。(4)棘皮動物のDNAデータベースおよび公表論文により上記以外のDNA多型を検索したが、プライマーの設計ができる情報に乏しかった。(4)そこで、独自のプライマー設計を次年度に行うこととし、本年度には色彩型3型の色彩の定量化をこれまでに用いられていないデジタルカメラと画像編集ソフトを組み合わせた手法を開発して行った。

この結果、アカ型はクロ型やアオ型とは不連続に異なることを明らかにした。(5)そこで、それらの色素について顕微鏡観察をしたところ、アカ型が他の2型とはことなる色素を保有していることを明らかにした。(6)さらに、3型のアイソザイム分析を北海道、青森、宮城、大分の各県から採集した個体について行ったところ、アカ型はアカ型同士で地域を越えて遺伝的に近縁な関係にあることを示した。また、アオ型とクロ型はそれぞれ一つのクラスターに分かれず、地域間で近縁となる傾向を示した。また、これらの結果により、アイソザイムが多角的遺伝分析に必要な標識遺伝子の一つにあることを明らかにした。(7)3型の色彩に関する遺伝支配を明らかにするために女川周辺から採集したマナマコについて人為繁殖条件を明らかにし、交配実験および飼育実験を行った。マナマコに適したそれらの条件を明らかにする。これらは現在飼育中である。尚、(8)染色体標本作製には発生初期に行うことが効果的であることが分かった。本研究は、同じ種の色彩多型として考えられているマナマコの3型(青ナマコ、赤ナマコ、黒ナマコ)について、遺伝学的差異を多角的に捉えて3型の生物学的位置を明確にし、これまで研究が極めて少ないマナマコの生物学的研究の基盤を確立することを目的とする。本年度は昨年度完成できなかったマナマコの色彩型変異の遺伝支配を把握するための標識遺伝子の開発を行うと共に、アイソザイム遺伝子による色彩型3型の地理的分化の定性と定量化に関する研究成果の公表を行った。それらの成果を以下に報告する。(1)マグネチックビーズ法によりマイクロサテライトDNA多型の検出と遺伝マーカーとなるMS座検出用プライマーの設計を行い、51種類のプライマーが設計できた。また、その中から、21プライマーを用いた21MS座における遺伝変異を定量し、マナマコの遺伝マーカーとしての有効性を明らかにした。この成果は現在学術論文として投稿準備中である。(2)開発したマイクロサテライトDNAマーカー座を用いて、アカナマコ、アオナマコ、クロナマコの遺伝的差異を調べたところ、アカナマコにおいて他2種類と異なるアリルを保有する可能性を明らかにした。しかし、現在調査個体数が少数のため確証に至っていない。これに関しては次年度の課題として継続する。(3)開発したマイクロサテライトDNAマーカー座の遺伝支配を知るために、アオナマコを用いて雌雄一対交配による親個体と子どもの個体を作成、飼育した。これを用いて次年度にMS座親子関係の把握ができる準備がととのってきた。(4)前年度に明らかにしたアイソザイムによるマナマコ3型の遺伝的差異に関する研究成果を論文としてまとめ、Fisheries Scienceに投稿中である。本研究は、同じ種の色彩多型として考えられているマナマコの3型(アオナマコ、アカナマコ、クロナマコ)について、遺伝学的差異を多角的に捉えて3型の生物学的位置を明確にし、これまで研究が極めて少ないマナマコの生物学的研究の基盤を確立することを目的とする。本年度は昨年度までに開発したマイクロサテライトDNAマーカーを用いて、集団遺伝学的解析を行い、アイソザイム遺伝子によって明らかにした色彩型3型の地理的分化の定性と定量化に関するデータの収集を行った。また、これまでの成果を論文及び総説として研究成果の公表した。(1)マグネチックビーズ法により開発したマイクロサテライトDNA多型の20プライマーを用いて、女川におけるアオナマコを対象に20座での多型の有無及び遺伝的変異性を調べた。
ダウン症モデルマウスを用いた新規心奇形原因遺伝子の同定

本研究では、ダウン症患者の中でも比較的高頻度に見られる心奇形に焦点を当て、その原因遺伝子および発症メカニズム解明を目指し、ダウン症心奇形(DS-CHD)原因候補遺伝子の一つであるZfp295欠損マウスの作製を試みた。しかしながら、ノックアウトマウスの作製が予想以上に困難であった為、別法としてヒト人工染色体(HAC)を用いたトランスジェニックマウスの使用を検討した。本研究では、ダウン症に見られる数ある症状の中から患者の4050%と比較的高い頻度で見られる心奇形に焦点を絞り、発症の原因となっている遺伝子を同定し、その発症メカニズムを明らかにすることを目指した。そのために、それまでの心奇形発症が認められたダウン症部分トリソミー患者およびダウン症モデルマウスの報告を基に、ダウン症心奇形の原因遺伝子を含む可能性が最も高いと考えられる領域をダウン症心奇形最小候補領域と名付け、そこに含まれる約10個のタンパク質をコードする遺伝子の中からさらに有力と思われるZfp295遺伝子に着目した。本年度は昨年度から引き続き、ダウン症心奇形候補遺伝子の一つであるZfp295遺伝子のノックアウトマウスの作製を行った。しかしながら寄与率が良好なキメラマウスは得られたが、変異アレルを有するF1個体は得られなかった。一方で新たな手法として、ヒト人工染色体(HAC)を用いた遺伝子導入マウスを用いる方法を検討した。HACはヒト21番染色体セントロメアを有するエピソームベクターであり、同ベクターを用いて目的遺伝子をBACクローン単位でマウスに導入することで対象遺伝子の直接的な遺伝子量効果を観察することが出来る。本研究では、既に進行中であったHAC導入マウスの解析を詳細に行うことで、本研究目的に対する応用性を検討した。本研究で作製したHAC導入マウスは、シスタチオニンβシンターゼ、U2補助因子1、クリスタリンαAの3つのマウス遺伝子を含むBACクローンを1コピーのみ有しており、HACベクターはマウス組織においてホスト染色体とは独立に、かつ安定に維持されていることを確認した。このことから、HAC導入マウスはダウン症における遺伝子と表現型との関係を明らかにするのに有効な手段の一つであると考えられる。そのために、それまでの心奇形発症が認められたダウン症部分トリソミー患者およびダウン症モデルマウスの報告を基に、ダウン症心奇形の原因遺伝子を含む可能性が最も高いと考えられる領域をダウン症先天性心奇形最小候補領域DS-CHD MCR(Down syndrome-congenital heart disease minimum candidate region)と名付け、そこに含まれる約10個のタンパク質をコードする遺伝子の中からさらに有力と思われる遺伝子、Zfp295(Zinc finger protein 295)を選択し、IKMC(International Knockout Mouse Consortium)からノックアウトES細胞を入手した。その細胞を用いて昨年度にキメラマウスの作製を行い、個体の毛色から高寄与率と思われる個体について交配、繁殖を試みたが変異アレルを有する個体を得ることができなかった。そこで、それら個体の精巣上体尾部を摘出し、体外受精を行ったところES細胞由来の仔マウスが得られたが、ヘテロノックアウトマウスは得られなかった。同時に、その精子より抽出したゲノムDNAを用いたPCRから変異アレル由来の増幅産物が検出された。以上のことから、キメラマウス作製に用いたZfp295ノックアウトES細胞は、germline transmission能力を有する細胞であることが確かめられた。したがって、本年度は再度同様の方法でキメラマウス作製を試みた。その結果、高寄与率と思われる個体が得られたため、現在自然交配による繁殖を行っている。本研究は、これまでの心奇形を発症したダウン症部分トリソミー患者群から絞られた心奇形原因候補遺伝子のノックアウトマウスを作製し、心奇形を発症する既存のダウン症モデルマウスとの交配により対象遺伝子のみを正常のダイソミーに戻した上で心奇形発症頻度を精査し、対象遺伝子と心奇形発症との関連を解明することが目的である。したがって、ノックアウトマウスの作製は本研究での重要な起点である。しかしながら、これまでZfp295ノックアウトマウスの作製に取り組んだ結果、高寄与率と考えられる個体が得られるものの、変異アレルを有するF1世代の個体が得られていないことから今後の対策が求められる。今後の研究推進方策として、Zfp295ノックアウトマウスの作製については、現在飼育しているキメラマウスを用いた体外受精による個体作出を考えている。また、本研究の対象領域からは外れてしまっているが、以前に入手したTryptophan-rich basic protein (Wrb)ノックアウトES細胞を用いてのマウス作製も行う。その理由として、Wrb遺伝子は酵母Get1遺伝子のオルソログ遺伝子であり、小胞体などの脂質二重膜に局在する膜タンパクであることが最近報告された。

また、Wrbタンパクが関与していると考えられるpost-translational pathwayは膜生合成やアポトーシス、小胞輸送などさまざまな役割を担っていると言われており、ヒトでも心臓、脳などで発現していることが知られている。このようにWrbタンパクは細胞の生命活動の基礎的な部分での役割を担っていることが考えられ、Wrbタンパクの高発現がダウン症の病態にも関与していることが予想される。したがって、Wrbノックアウトマウスを作製し得られた表現型がもたらす知見の意義は大きい。一方で、ヒト人工染色体(HAC)ベクターを用いたトランスジェニックマウスの作製を検討している。HACはヒト21番染色体セントロメアを有するエピソームベクターであり、同ベクターを用いて目的遺伝子をBACクローン単位でマウスに導入することで対象遺伝子の直接的な遺伝子量効果を観察することが出来る。このマウス作製系はすでに確立されており、すでに先行研究も行っている。また同時に本研究における目的遺伝子を含むBACクローンも入手しているので、この系を用いてダウン症心奇形原因候補遺伝子における遺伝子量効果の解析にも十分応用可能である。次年度の研究費は、Zfp295およびWrbノックアウトマウスの作製を行うための採卵、胚移植を行う為のマウスと出生したマウスとの交配用マウスを購入する為、そして現在それらのマウスは所属研究機関の動物飼育施設にて維持されているため、その飼育費として用いる。また、それらマウスの表現型解析および既存のダウン症モデルマウスを入手する為の費用として用いる。尚、昨年度に生じた繰り越し額は効率的な物品調達を行った結果生じたものであり、次年度の消耗品費として使用する。
腎細胞癌及び前立腺癌に対するノスカピンの効果に関する基礎的研究

平成20年度、21年度の本研究により、これまで化学療法に抵抗性であった腎細胞癌及び前立腺癌においても、ノスカピンによる抗腫瘍効果がある程度期待できると推察された。IC50はやや高めの濃度が必要であると考えられるが、これまでの報告によりノスカピンはマウスに投与しても毒性がないことや、人体に対しても大量投与の報告もあるため、今後臨床応用の可能性も考えていく価値があるものと推察された。我々は男性ホルモン非依存性前立腺癌細胞株DU145、C4-2、PC-3、男性ホルモン依存性前立腺癌細胞LNCaPに対し、ノスカピンの抗腫瘍効果を確認した。それぞれの細胞株に対するIC50は20-30uMであり、大差はないと考えられた。さらに腎細胞癌細胞株ACHNに対しても同様にin vitroにて抗腫瘍効果を確認した。ACHNのノスカピンに対するIC50は前立腺癌細胞株と同様で30uMであった。このため前立腺癌・腎細胞癌細胞株両者ともノスカピンに対する感受性に差はなく、ノスカピンはこの両者に対して有効である可能性が示唆された。In vivoの実験としては、前立腺癌骨転移モデルとして前立腺癌骨転移細胞株PC-3のマウスtibia骨移植モデルを使用した。治療対照群としてタキソテール腹腔内投与群および非治療対照群を設定した。PC-3をマウス骨に移植後治療群は2週間後より1)ノスカピン経口投与一日一回、2)タキソテール腹腔内投与一日一回3)両者の併用治療とに分け、腫瘍の増大スピードをモニタリングした。非治療群では骨移植腫瘍は38日間の治療期間中、継続して増大傾向を示した。タキソテール治療群、ノスカピン治療群、両者併用群ともに抗腫瘍効果を確認したが、タキソテール治療群よりノスカピン治療群で抗腫瘍効果を強く認め、一部のマウスでは、腫瘍の消退を認め。両者の併用群はノスカピン治療群とほぼ同等の抗腫瘍効果を認めた。SDが大きく追試が必要と考えているが、興味深いことにノスカピンはin vitroでの抗腫瘍効果に比較して、in vivoにおいて強い抗腫瘍効果を発揮していると考えられた。in vitroではノスカピンは前立腺癌細胞株にアポトーシスを誘導することが確認された。平成20年度の結果より、In vitroにおける前立腺癌・腎細胞癌に対する効果が確認されたため、平成21年度は細胞形態学的にノスカピンによる同細胞株への影響を確認した。細胞骨格を免疫染色したところ、ノスカピン投与群では細胞分裂時に紡錘糸の運動が阻害され、細胞分裂できずに細胞周期が停止する像が確認され、これまでの報告を裏付けるものであった。FACSを使用して細胞周期を測定したところノスカピン投与24時間にてG2/M期の割合が増加しており、48時間から72時間後にはこれらの細胞分画が減少を示し、hypodioloid (<2N) sub G1の割合が増加しており、これらはDNAのフラグメント化すなわちアポトーシスを誘導しているものと推察された。われわれはこのメカニズムをしらべるためリン酸化Bc12 (pBc12)とBaxの発現について確認した。ノスカピンを投与された細胞ではpBc12の発現がBc12の発現が増強していないにもかかわらず増強しており、Baxの発現も増強していた。これらの変化は、他の微小管阻害剤でも同様に確認されており、ノスカピンにおいても他の微小管阻害剤と同様な機序で細胞周期を抑制し、さらにアポトーシスへと導いていることが示唆された。
空気シャワーモデル直接比較のための多チャンネル粒子弁別測定システムの開発

超高エネルギー宇宙線の観測には宇宙線が大気中で生成する空気シャワー現象の正確な計算が必要となる。本研究は、空気シャワー現象中の電子-ミューオンの弁別測定が可能な検出器、データ取得システムを制作し、LHC加速器実験と同じエネルギーでの空気シャワーモデル計算の検証を可能にする測定技術を確立する。そのために、既存の空気シャワー観測装置と連動する新しいデータ収集システムを整備し、2年間の運用をおこなう。先行研究で報告されている"ミュー粒子数異常"と観測結果の比較を行う。これらの開発と解析を通し将来の"陽子"-"大気""衝突を選択的に選んだ空気シャワーモデルの検証を可能にする手法の一式を確立する。
ヨーロッパ史の諸時期における時間意識の様相についての研究

平成15年度は、これまで三年間にわたって行なわれた本研究について、一つの総決算としての学術論文を完成することと、ポーランドのポズナン大学史学科において「文明と時間」という表題のもとに、平成15年10月に英語での十回にわたる講義によって三宅の研究成果をポーランドの学生に伝達することを目標とした。学術論文は「ヨーロッパ史の諸時期における時間意識の様相:学説史に即しての考察」である。同論文では、古代史家モミリアーノの論文「古代の歴史叙述に見られる時間」を詳細に検討し、ヘロドトス、トゥキュディデス、ポリュビオスのいずれにも、循環史観は認めがたいとして、従来の通説に挑戦を試みている事実を確認した。中世ヨーロッパにおける時間意識と歴史観については、社会史の立場から庶民の「心性(マンタリテ)」に即して検証につとめたロシアの歴史学者グレーヴィチの研究に着目した。心性史を標榜するグレーヴィチといえども、アウグスティヌスという傑出した思想家が時間意識と歴史観の転換にはたした決定的な役割を重視せざるを得ず、循環的時間とキリスト教の両立を図ったオリゲネスに加えた彼の批判にも叙述を割いていることを、三宅論文は指摘する。同時にグレーヴィチが部分的に依拠したロシアの東洋学者コンラドが、ポリュビオスと司馬遷をどのように比較しているかに注目する。グレーヴィチを評価するポーランドの中世史家ギエイシュトルが、社会史に即して中世ポーランドの時間意識の多様性、複数性を指摘していることも明らかにした。中世から近代への過渡期については、フランスの社会史家ルゴフの「教会の時間と商人の時間」を論じ、ドイツの社会史家ロッスムに即してテイラー・システムの確立までを概観した。ポーランドでの英語の講義録はいずれ同地で公刊予定であるが、毎回七十人前後の熱心な聴講者に支えられたことを付言しておきたい。ヨーロッパ史の諸時期における時間意識の様相の中で、本年度は特に十九世紀半ばから二十世紀初頭にかけて、知識人のみならず一般民衆の時間意識にも決定的な影響を及ぼした進化論に焦点を当てて考察を行なった。進化論は、ダーウィンの著書『種の起源』によって初めて唱えられたと理解されがちであるが、ラヴジョイの大著『存在の大いなる連鎖』は、すでに十八世紀半ばからベルリン科学アカデミー総裁モーペルチュイや『百科全書』の編集の中心となったディドロー、『自然の体系』を著わしたドルバックなどによって、進化論の先駆的形態が提唱されていたことを明らかにしている。ダーウィンの『種の起源』の画期的な意義は、進化のメカニズムとしての自然淘汰の原理の提唱にあったと考えられる。この原理は、機械論的であって、むしろ唯物論の方向につらなる性格を有していた。エンゲルスがダーウィンを『空想から科学へ』の中で賞賛したことはよく知られているが、ダーウィンの進化論をドイツに導入した生物学者ヘッケルは、これより以前に進化論を唯物論の方向で理解した,この意味での進化論は、ドイツ語圏の社会科学の分野に、オーストリアの社会学者シェッフレにより導入され、グンプロヴィッチによって体系化され、さらに『国家論』で知られるオッペンハイマーに継承された。ドイツとオーストリアの社会科学への進化論の影響のさらなる解明は、本研究の今後の課題を形成する,進化論をこのように理解すれば進化と進歩は同義語ではなくなる。進化論それ自体、進歩の理念を支持するものではない。しかし、十九世紀の楽天主義の雰囲気の中で両者はしばしば同一視された。時間意識との関連において、進歩の理念が重要であることはいうまでもないが、進化論もまた時間意識とおおいに関連している。ラヴジョイが、進歩の理念と進化論とを「存在の連鎖」の「時間化」において共通すると見ていることは示唆的である。平成14年度は、キリスト教的時間意識を中心とした中世ヨーロッパの時間意識について、比較類型論的視角を加味しながら考察することにつとめ、あわせて特に比較類型論的視角の系譜の解明につとめた。中世ヨーロッパの時間意識を確立する上でアウグスティヌスの神学が決定的な役割を果たした事情を明らかにしたのはアーロン・グレーヴィチの『中世文化のカテゴリー』である。グレーヴィチの考察はたえず古代の時間意識と対比しながら行なわれる。古代ギリシャの思想家たちは、漠然とではあるが時間がピュタゴラス派のいう「大いなる年」を単位として円環を描いて反復されると考えていた。グレーヴィチによれば、このような時間と歴史の循環論にアウグスティヌスが強く反論したのは、それが神の子の一回限りの出現を否定する結果をもたらすからであり、その際に彼が念頭においていた論敵は、古代的な循環論とキリスト教とを結び付けようとした初期キリスト教の思想家オリゲネスであった。グレーヴィチには、中世ヨーロッパの時間意識を比較と類型化の立場で把握する姿勢が見られるが、このような立場からの歴史認識は、十九世紀ロシアの思想家ダニレフスキーを淵源とすると考えられる。ダニレフスキーは、唯一の著作というべき『ロシアとヨーロッパ』(1871年)において、文化類型論を「文化的歴史的類型」という彼の造語を通じて提唱した。このような歴史の比較類型着はオスヴァルト・シュペングラーの『西欧の没落』2巻(1918-22年)を経てアーノルド・トインビーの『歴史の研究』全12巻(1934-61年)に維承された。ドイツの歴史学者エルンスト・ノルテの765頁に及ぶ大著『歴史的存在』(1998年)もこの系譜に属する側面をもつ。

この大著刊行を契機に編集されたノルテ教授八十歳祝賀論文集に寄稿したドイツ語の三宅論文は、比較類型論的視角の系譜の解明につとめた本研究の本年度における成果であり、国際学界に対する発言である。この論文はダニレフスキー以来の文化類型論の系譜をたどると同時に、我が国においても西田幾太郎門下の哲学者高山岩男が戦前に『文化類型学』(1939年)を刊行し、戦後には山本新が『文明の構造と変動』(1961年)によってダニレフスキー以降の系譜の上に自己の比較文明論を確率したことを明らかにしている。平成15年度は、これまで三年間にわたって行なわれた本研究について、一つの総決算としての学術論文を完成することと、ポーランドのポズナン大学史学科において「文明と時間」という表題のもとに、平成15年10月に英語での十回にわたる講義によって三宅の研究成果をポーランドの学生に伝達することを目標とした。学術論文は「ヨーロッパ史の諸時期における時間意識の様相:学説史に即しての考察」である。同論文では、古代史家モミリアーノの論文「古代の歴史叙述に見られる時間」を詳細に検討し、ヘロドトス、トゥキュディデス、ポリュビオスのいずれにも、循環史観は認めがたいとして、従来の通説に挑戦を試みている事実を確認した。中世ヨーロッパにおける時間意識と歴史観については、社会史の立場から庶民の「心性(マンタリテ)」に即して検証につとめたロシアの歴史学者グレーヴィチの研究に着目した。心性史を標榜するグレーヴィチといえども、アウグスティヌスという傑出した思想家が時間意識と歴史観の転換にはたした決定的な役割を重視せざるを得ず、循環的時間とキリスト教の両立を図ったオリゲネスに加えた彼の批判にも叙述を割いていることを、三宅論文は指摘する。同時にグレーヴィチが部分的に依拠したロシアの東洋学者コンラドが、ポリュビオスと司馬遷をどのように比較しているかに注目する。グレーヴィチを評価するポーランドの中世史家ギエイシュトルが、社会史に即して中世ポーランドの時間意識の多様性、複数性を指摘していることも明らかにした。中世から近代への過渡期については、フランスの社会史家ルゴフの「教会の時間と商人の時間」を論じ、ドイツの社会史家ロッスムに即してテイラー・システムの確立までを概観した。ポーランドでの英語の講義録はいずれ同地で公刊予定であるが、毎回七十人前後の熱心な聴講者に支えられたことを付言しておきたい。
エチレンアイオノマーを用いた酸素分子の選択的吸着・透過分離膜の試作と工業的応用

1.各種Mn(II)-有機アミン錯体エチレンアイオノマーをエチレン-5.4mol%メタクリル酸共重合体(EMAA)のMn(II)塩と各種有機アミンとの溶融反応により試作した。これらの有機アミン錯塩エチレンアイオノマーの錯塩の安定性および錯塩構造、さらにはイオン会合体の形成とその構造ならびに諸物性を調べた。2.Mn(II)-1,3-ビスアミノメチルシクロヘキサン(BAC)錯塩アイオノマーを成膜し、その酸素分子吸着・透過を超精密天秤、IRスペクトル、ESRスペクトル、UVスペクトルにより検討した。その結果、Mn(II)-BAC錯塩は酸素分子吸着がMn原子付近で起き、酸素分子吸着に伴い無色から黒褐色への色変化をもつことを確認した。3.エチレンアイオノマーは食品などの各種包装材として使用されている。この包装した内部にMn(II)-BAC錯体アイオノマーをセンサーとしておき、包装内の酸素分子濃度をMn(II)-BAC錯塩アイオノマーの色変化により検出する試験的実験を行った。その結果、このMn(II)-BAC錯塩アイオノマーが酸素センサーとして有用であることを見出した。4.Mn(II)-BAC錯塩エチレンアイオノマーフィルムの選択的酸素吸着・透過実験を行ない、優秀な選択性のあることを見出した。5.今後の課題として、エチレン系アイオノマーさらには他のアイオノマーに種々の有機アミンを添加したMn(II)-有機アミン錯塩アイオノマーについての酸素分子吸着・透過に関する基礎実験とその応用を検討する必要がある。さらに我々はCo(II)塩エチレンアイオノマーに酸素吸着を見出しており、Mn(II)-有機アミン錯塩エチレンアイオノマーとの比較研究が必要である。本研究の目的は、このエチレン-メタクリル酸共重合体の各種有機アミン配位Mn(II)錯体の酸素吸着特性の評価およびその工業的応用を探究することである。研究は目下進行中であるが、現在までの進捗状況を以下に述べる。得られた知見は、今後の研究遂行に重要なものと考えられる。1.10種類以上ものの有機アミンを用いて、有機アミン配位Mn(II)錯体アイオノマーを合成した。酸素分子の選択的吸着は色変化をともなうため、酸素吸着特性を主に購入備品である紫外可視分光光度計により検討したところ、既に報告しているMn(II)-1,3-ビス(アミノメチル)シクロヘキサン錯体以外に、1,8-ジアミノオクタンやドデシルアミンを用いた錯体アイオノマーにおいても同程度の酸素吸着特性を示した。また、酸素の吸脱着過程を繰り返した場合、高分子量、高沸点の有機アミンの方がアミンの脱離がなく特性の再現性が良かった。これらの錯体アイオノマーは、成膜性も良く、フィルム化も容易であった。2.酸素吸着特性の温度(室温-200°C)による変化を調べるために、購入備品である分光光度計の試料室を上記目的に合うよう改良し、空気中における紫外可視スペクトルの温度変化測定は可能となった。真空中での測定のためのアタッチメントは目下試作中である。3.IRスペクトルのCOO^-の逆対称伸縮振動バンドは、酸素の吸着とともに分裂することから、酸素の吸着はMn(II)イオンの近傍で起こっており、配位状態を変えていることが推察された。4.超精密天秤による酸素吸着量の測定、ならびに酸素分子透過測定(いずれも通産省物質研にて借用)のための膜の試作は目下進行中である。本研究の目的は、エチレン-メタクリル酸共重合体の各種有機アミン配位Mn(II)錯体の酸素吸着特性の評価およびその工業的応用を探究することである。

今後の研究遂行に重要と思われる知見を以下に述べる。1.各種有機アミンを用いて錯体アイオノマーを合成し、酸素分子の選択的吸着による色変化を利用して、酸素吸着特性を主に購入備品である紫外可視分光光度計により検討した。その結果、現在までに合成した錯体アイオノマーの中でポリオキシプロピレンジアミン(PODA)錯体が非常に優れた酸素吸着特性を示すことがわかった。このPODA錯体は、酸素の吸脱着過程を繰り返したときの再現性にも優れていた。これらの優れた特性はPODAのもつオキシプロピレン鎖の可塑効果によって酸素透過性が向上したことに起因している。現在、この観点からさらに優れた酸素吸着特性をもつ錯体アイオノマーの開発を試みている。2.酸素吸着特性の温度(室温-200°C)による変化を調べるために、購入備品である分光光度計の試料室を種々の気体雰囲気下における測定が可能なように改良した。窒素気流下の測定から、70°C以上で酸素分子の脱離が起こることを見出している。同条件下のIRスペクトルの測定から、酸素分子の吸脱着にともなってMn(II)の配位構造が変化することもわかった。3.得られた各種有機アミン配位Mn(II)錯体アイオノマーは酸素透過性に優れたシリコン系高分子とのブレンドあるいは多層フィルム化を行うことにより、より高特性のフィルムの作成が可能となる。そのために、シリコン系高分子との相溶性をDSCや電子顕微鏡等で検討しているところである。エチレン-メタクリル酸(5.4mol%)(EMAA)共重合体のMn(II)-有機アミン[1.3-ビス(アミノメチル)シクロヘキサノン、BAC]錯塩について酸素吸着特性を超精密天秤及びUVスペクトルにより行った。酸素分子の収着は初期段階ではHenryの法則に従い、吸収係数は56×10^4cm^3(STP)cm^2(polymar)・cmHgであった。また、Ar、N_2等の分子は吸着しないことを確かめた。このように本試料は選択的酸素分子収着が存在することを確認した。次に酸素分子吸着によるクロミズムをUVスペクトルにより調べた。酸素分子吸着と共に、試料は無色から褐色さらに黒褐色に変化した。この色変化をUVスペクトルにより定量的に検討した。その結果、本試料は感度が高い酸素分子吸着に伴うクロミズムを示すことを見出した。他の有機アミンを用いたMn(II)-有機アミン錯塩アイオノマーについても有機アミンの化学構造と錯塩の安定性、酸素分子吸着の安定性と色変化などを検討した。BACは錯塩の安定性及び高い酸素分子吸着能をもつMn(II)-有機アミン錯塩を作る有機アミンであることを見出した。次にMn(II)-BAC錯塩アイオノマーによる酸素分子センサーの試作を行った。具体的にはペレット、及び単層あるいは多層フィルムを作成し、実験を行った。特に食品その他の包装フィルム中あるいは包装内の酸素分子の存在に対する酸素センサーとしての試作実験を行った。その結果、この試料が食品その他の保存状態を酸素分子の存在濃度より、視覚的に(酸素分子吸着による無色から黒褐色への色変化により)検索できる有用な酸素センサーであることを見出した。
データ圧縮法CSEを核とする圧縮情報処理基盤技術の再組織化

部分列数え上げデータ圧縮法(Compression by Substring Enumeration.以下,CSE法)と呼ばれる無ひずみデータ圧縮法の高効率実現法を確立し,関連する諸手法との関係を明らかにすることで,体系化をはかった。また,CSE法を真に実用法とするためには,実際にエントロピー符号化を組み込む必要がある。そのようなエントロピー符号化法として,ANSと呼ばれる手法が有効であることを指摘し,ANSとその関連手法の理論解析を行って強力な性能を証明した。部分列数え上げデータ圧縮法(CSE: Compression by Substring Enumeration)と呼ばれる無ひずみデータ圧縮法の新規符号化アルゴリズムを開発し,圧縮性能の実験的評価に応用した。CSE法は,数え上げ符号,反辞書法,ブロックソート法等の他のユニバーサルデータ圧縮法と密接に関連し,近年,注目されつつあるデータ圧縮法である。しかし,単純な実装法が知られていないために,実データによる実際的な性能評価はほとんどなされていない。本研究では,これまで提案されてきた木構造を利用した実装法にかえて,配列情報のみで符号化が可能な新規アルゴリズムを開発し,実際に計算機プログラムとして実装することにより,大規模データの符号化実験を可能にした。開発したアルゴリズムは単純かつ高速なため,メガバイト長のデータに対しても適用可能である。圧縮実験の結果,マルコフ情報源の出力に対しては,理論が予測するとおりの圧縮性能の変化を確認することができた。計算機ファイルや標準コーパス等の実データでは,組み合わせる符号化モデルの選択によって圧縮性能に変化が見られることは確認できたが,従来法の圧縮性能を必ず凌駕するような決定的なモデルはまだ見つかっていない。今後,候補となるような符号化モデルのほか,単なるモデル以上のより実際的な符号化法も含めて,新規な可能性の比較検証を継続する予定である。以上のほか,CSE法の多値アルファベットへの拡張,CST木の直接構成法,ブロックソート法への応用についても予備的考察を行った。本研究では,部分列数え上げデータ圧縮法(Compression by Substring Enumeration: CSE)と呼ばれるユニバーサルデータ圧縮法とその周辺領域の体系化を目指している。CSE法は,対象データに含まれる部分列数の列挙を基礎とする,従来にない概念に基づくユニバーサル符号である。本研究で開発した実現法は,従来の木構造のかわりに配列を利用する符号化法であり,これまででは不可能だった長大なデータに対する圧縮実験を可能にした。この成果は,多様なデータに対する実験結果とともに電子情報通信学会の英文論文誌において発表した。さらに,新規実現法を発展させ,既に提案されているフェーズ導入法の検証を行った。ただし,これらはすべてモデルの性能と呼ばれる理想的な圧縮性能での評価である。CSE法の実用化のためには,CSE法のモデルに組み合わせる実際の符号化法が必要である。本研究では,そのような符号化法の候補として,ABS/ANSと呼ばれるエントロピー符号化法の理論解析を行った。特に,ABS/ANSの状態の定常分布に対する近似分布を提案し,それが真の分布に漸近することを証明した。これを応用することで,これまで明確にされていなかった,ABS/ANSの圧縮性能のエントロピーへの収束を示すことができる。今後は,ABS/ANSの実際的な性能を検証することで,CSE法への導入可能性を明らかにする計画である。本研究の核であるCSE法そのものについては主たる考察を完了しているので,符号化部分の実現法に移行していたところ,ABS/ANSの解析において,予想以上の進捗がみられた。部分列数え上げデータ圧縮法(Compression by Substring Enumeration;以下,CSE法)と呼ばれる無ひずみユニバーサル・データ圧縮法の高効率実現法を確立し,Burrows-Wheeler変換(以下,BW変換)との関連を複数の側面から明らかにすることで,関連する周辺の手法を含む統合的理解を深めた。データ圧縮はモデルと符号化という2側面を有する。CSE法および関連諸手法というモデルを実現するための具体的符号化についても考察を深め,ANS (Asymmetric Numeral Systems)と呼ばれる新規なエントロピー符号化法の導入の端緒を与えた。より具体的には,CSE法をBW変換から導出することに成功し,BW変換に基づくデータ圧縮法がCSE法と同様の理論的性能を持ちうることを示した。さらに,BW変換からの導出法を変形させることでCSE法とは異なる関連法を導けることも示した。また,ANSについては,エントロピー符号化法としての漸近的な最良性を理論的に証明し,モデル実現の有力な手段であることを明らかにした。研究期間全体を通じて,CSE法の効率的な実現法開発を基礎として,それとは異なるCSE法の導出を明らかにしたことで,実用的な側面とBW変換に基づくデータ圧縮法解析の理論的な側面とにおいて,関連する諸概念の整備という当初の目的を確実に達成することができた。CSE法の従来の理論解析に加え,より現実的な実現法を開発できた意義は大きい。さらに,ANSへの着目によって,モデル実現の新潮流を拓くことができた。

本研究の核であるCSE法そのものの実現には計画以上の進展があり,それに付随する研究課題についても,いくつかの重要な知見が得られている。確定的決定文脈の計算法については2元アルファベットを対象とする場合は解決済みなので,今後は,多元アルファベットに拡張する計画である。また,統計型・文脈参照型データ圧縮法との融合も試験的な実験に着手している。一方,着手したものの実際の進展は今後の課題として残ったままの問題もある。更にこれらの各部分問題を統合して全体的な再構成につなげることも今後の課題である。本研究の核であるCSE法そのものについては主たる考察を完了しているので,符号化部分の総合的なまとめを行う。多元アルファベットを対象とする確定的決定文脈計算法を実装し,実データでの検証を行う。さらに,ABS/ANSを実装し,種々のモデルとの組合せによって,その動作確認および性能の検証を実施する。情報数理工学CSE法の長所・短所が明確になってきたので,長所をいかすような具体的な符号化法の開拓に重点をシフトする。その上で,関連する他の手法をCSEの視点の再評価を進める。具体的には,辞書式データ圧縮法,ブロックソート法,そして情報検索への応用の特に理論解析を進展させる。CSE法単体としては,符号化法の工夫により,従来法の最高水準の圧縮性能を目指す。年度末から年度をまたいで開催された国際会議への出張旅費が次年度使用額から執行されることになったことが第一の理由である。さらに,購入を予定していたパーソナルコンピュータの予定価格が当初想定を上回ったため,次年度購入に切り替えたことが第二の理由である。計算機実験用のPC購入に充当する予定で確保しておいた額であるが,所望の性能のPC購入にはやや不足することが判明した。ただ,これに次年度分からわずかに加える程度で,所望の性能を十分満たすPCが購入できることも同時に判明したので,そのように執行することにした。年度末の国際会議の出張旅費については執行済みであり,次年度購入に切り替えたパーソナルコンピュータについては,次年度の使用可能額と合算して購入する予定である。次年度使用額を追加することで所望の性能のPC購入に充当する計画である。
画像によって喚起された感情が視覚処理の時間精度に及ぼす影響の検討

交通事故などの強い感情が喚起されるような状況で「周囲がまるでスローモーションのように見えた」と語る人は多い.本研究では,この現象に関して,視覚処理の時間精度の向上が生じるのか,心理物理学的方法論によって検討する.実験では,様々な感情を喚起する表情画像の観察直後に数段階の時間間隔で変動するターゲット刺激を提示し,ターゲット刺激の変動が知覚可能となる時間間隔を視覚処理の時間精度の指標として測定する.感情喚起画像とターゲット刺激に関する時間的変数を体系的に操作し,感情による時間精度向上の効果が最大になる条件の解明を通して,感情が視覚処理の時間精度に及ぼす影響について包括的な理解を目指す.交通事故などの強い感情が喚起されるような状況で「周囲がまるでスローモーションのように見えた」と語る人は多い.本研究では,この現象に関して,視覚処理の時間精度の向上が生じるのか,心理物理学的方法論によって検討する.実験では,様々な感情を喚起する表情画像の観察直後に数段階の時間間隔で変動するターゲット刺激を提示し,ターゲット刺激の変動が知覚可能となる時間間隔を視覚処理の時間精度の指標として測定する.感情喚起画像とターゲット刺激に関する時間的変数を体系的に操作し,感情による時間精度向上の効果が最大になる条件の解明を通して,感情が視覚処理の時間精度に及ぼす影響について包括的な理解を目指す.
在宅における精神障害者虐待予防に向けた訪問看護ケアプログラムの構築

2018年度は、虐待予防プログラムの作成に向けて文献における検討と訪問看護師インタビューを実施し、適切な支援状態にある利用者への介入内容検討を行った。1)「虐待予防の介入」に関する国内外の文献から概念分析を行い、看護介入に必要な構成概念を抽出した。対象となる概念を「虐待予防abuse prevention」として、文献検索を行った。対象となる学問分野として、看護学、心理学、医学、社会福祉学の4分野を選択し、検索は辞書、医学中央雑誌、CiNii、PubMedを用いた。372件が抽出され、そのうち削除文献を除いた25件とハンドサーチによる16文献を追加した41件を和文献の分析対象とした。分析方法にはWilsonが提唱した方法論を基盤としたWalker & Avantの概念分析のアプローチ法を用いた。属性には5カテゴリ、先行要件には4カテゴリ、帰結には4カテゴリが抽出された。2)精神科訪問看護師10名を対象に、1で抽出された概念をもとに半構造化面接を行った。「不適切な支援状態にある精神障害者に対する介入、改善がみられた事例、悪化した事例」について介入前の支援状態を【在宅精神障害者の介護状態評価尺度】で評価した。2)のデータについては現在分析中である。今後はこれらの分析をもとにアセスメント、介入内容を評価する。3)基礎データとして参考にしている、全国訪問看護事業協会に登録している訪問看護ステーションの訪問看護師を対象とした自由記載質問紙調査(配布数473枚で回収数は136枚)をまとめ、論文投稿した。内容は、訪問看護師が虐待まで至らない不適切な介護に対応する中で生じる困難感について、その実態を明らかにした。1)「虐待予防の介入」に関する国内外の文献から概念分析対象となる概念を「虐待予防abuse prevention」として、文献検索を行った。372件が抽出された。そのうち重複文献や、内容に「介護者」、「支援者」、「ケア」、「虐待」に関する記述がないもの、また在宅に関連しない領域、工学、薬学領域の文献を除いた25件とハンドサーチによる16文献を追加した41件を和文献の分析対象とした。本結果については学会発表予定であり、1)については概ね順調に進展している。2)訪問看護師へのインタビュー機縁法により10名の訪問看護師に半構造化面接を実施した。平均インタビュー時間100分、管理者である看護師が対象であった。現在、データ内容を分析中である。分析結果を共同研究者と検討し、ケアプログラムの素案に向けて項目内容を精選する予定である。項目内容は訪問看護師にフィードバックし、意見を頂く予定である。以上より、進捗状況は当初の予定よりやや遅れていると考える。1)現在までの進捗状況と理由で述べた通り、一部はやや遅れている状況である。共同研究者はいずれも多忙なため、一堂に集まる場や機会が十分確保できない状況にある。そのため、看護学会等への参加に付随して開催するなどの工夫をし、情報共有と研究課題の検討に努めるとともに、それ以外の手段も用いて意見交換及び研究を進行していきたい。上記の状況に伴い、予算執行が計画通りに行っていないところがあるものの、今後は研究計画に沿った活動を実施したい。2)2018年に実施したインタビュー調査は、本年度中に分析を終了し、研究者間でケアプログラムの項目の抽出を行う。また、項目は訪問看護師にフィードバックして項目の洗練化を行う。作成したプログラムは、訪問看護師を対象にフォーカスグループインタビューを行い、実用化に向けた項目の洗練化を目指す。研究の進捗については、学会等の開催に合わせた計画を早期に作成できるようにしたい。

3)基礎データとして参考にしている、全国訪問看護事業協会に登録している訪問看護ステーションの訪問看護師を対象とした自由記載質問紙調査(配布数473枚で回収数は136枚)をまとめ、論文投稿した。内容は、訪問看護師が虐待まで至らない不適切な介護に対応する中で生じる困難感について、その実態を明らかにした。1)「虐待予防の介入」に関する国内外の文献から概念分析対象となる概念を「虐待予防abuse prevention」として、文献検索を行った。対象となる学問分野として、看護学、心理学、医学、社会福祉学の4分野を選択し、検索は辞書、医学中央雑誌、CiNii、PubMedを用いた。372件が抽出された。そのうち重複文献や、内容に「介護者」、「支援者」、「ケア」、「虐待」に関する記述がないもの、また在宅に関連しない領域、工学、薬学領域の文献を除いた25件とハンドサーチによる16文献を追加した41件を和文献の分析対象とした。分析方法にはWilsonが提唱した方法論を基盤としたWalker & Avantの概念分析のアプローチ法を用いた。属性には5カテゴリ、先行要件には4カテゴリ、帰結には4カテゴリが抽出された。本結果については学会発表予定であり、1)については概ね順調に進展している。2)訪問看護師へのインタビュー機縁法により10名の訪問看護師に半構造化面接を実施した。平均インタビュー時間100分、管理者である看護師が対象であった。現在、データ内容を分析中である。分析結果を共同研究者と検討し、ケアプログラムの素案に向けて項目内容を精選する予定である。項目内容は訪問看護師にフィードバックし、意見を頂く予定である。以上より、進捗状況は当初の予定よりやや遅れていると考える。1)現在までの進捗状況と理由で述べた通り、一部はやや遅れている状況である。共同研究者はいずれも多忙なため、一堂に集まる場や機会が十分確保できない状況にある。そのため、看護学会等への参加に付随して開催するなどの工夫をし、情報共有と研究課題の検討に努めるとともに、それ以外の手段も用いて意見交換及び研究を進行していきたい。上記の状況に伴い、予算執行が計画通りに行っていないところがあるものの、今後は研究計画に沿った活動を実施したい。2)2018年に実施したインタビュー調査は、本年度中に分析を終了し、研究者間でケアプログラムの項目の抽出を行う。また、項目は訪問看護師にフィードバックして項目の洗練化を行う。作成したプログラムは、訪問看護師を対象にフォーカスグループインタビューを行い、実用化に向けた項目の洗練化を目指す。研究の進捗については、学会等の開催に合わせた計画を早期に作成できるようにしたい。2018年度は、文献検討と訪問看護師へのインタビュー調査を実施した。研究分担者はいずれも多忙を極めていることから、一堂に集まる場の確保が難しく、web会議等で研究会を開催した状況である。そのため、旅費に関する費用はほとんど使用しない結果となった。2019年度は前年度の反省を鑑み、学会等で研究会を開催する予定である。
細胞から細胞へ伝達するGPCRシグナルの証明および伝達機構の解明

顕微鏡観察より導き出された仮説“GPCR活性が細胞間を伝達する"を証明するために,より高感度で短時間のGPCR活性変化を追跡できる観察系を確立した.リアルタイム発光イメージングを実行することで, GPCR活性の伝達メカニズムの解明を目標とした.既存のルシフェラーゼの100倍以上の発光強度を誇るNanoLucルシフェラーゼをベースとしたタンパク質再構成法によるプローブを新規に開発し,それぞれのプローブペアを細胞に導入して発光イメージングシステムにて発光値の変動を観察した.経時的な観察の結果, GPCR活性と細胞活動の協調性を見出した.本申請研究では,「細胞の主要な膜レセプターであるGPCRの活性が,隣接する他の細胞のGPCRを活性化する」というレセプターの概念を超えた現象を裏付け,証明するため,ルシフェラーゼを基盤とした発光プローブを開発し, GPCR活性を細胞レベルで発光検出する.同プローブを細胞に導入して,複数の細胞でのGPCR活性を光シグナルとして経時的にイメージングすることで,細胞間での活性の伝達を証明する.最終的に, GPCR活性の伝達を担っていると予想されるタンパク質因子の同定を含め,伝達様式の解明および薬剤ターゲットとしての応用展開を目指す.本年度は,タンパク質再構成法を基盤とした発光プローブの開発及び,顕微鏡観察系の構築を行った.申請者がこれまで用いてきたルシフェラーゼ再構成法では,絶対的な発光量が微弱であったため,発光強度が既存のルシフェラーゼの約100倍を誇るNanoLucを導入することで迅速な撮影が可能な発光プローブを開発した.実際に同プローブを細胞に導入して, GPCR活性に伴う発光の上昇および, 1細胞レベルでの発光顕微鏡観察を実行した.顕微鏡の構築では,通常の蛍光顕微鏡をベースにして生物発光を高感度に迅速に撮影できるシステムを構築した. EM-CCDを検出機器として設置し,装置全体を暗箱で囲い,外部の光を全て遮断した.また,複数の発光シグナルを光波長で分光し撮影できるよう分光フィルターの設置も行った.全ての装置の動作を,接続したPCにて専用制御ソフトを用いて操作できることを確認した.本申請研究では,「細胞の主要な膜レセプターであるGPCRの活性が,隣接する他の細胞のGPCRを活性化する」というレセプターの概念を超えた現象を裏付け,証明するため,ルシフェラーゼを基盤とした発光プローブを開発し, GPCR活性を細胞レベルで発光検出する.最終年度では,発光プローブの開発としてGPCR-arrestinの相互作用だけでなく,細胞間密度を認識し細胞分裂を制御するタンパク質因子YAP2に着目した.まずYAP2による遺伝子発現の促進を検出するために, YAP2と転写関連因子TEAD2それぞれにNanoLuc断片を繋げた新規のプローブを準備した.また,これまでに報告例がないYAP2-GPCR間の相互作用が実際に起きているかどうかを確認するために,このペアに対してもプローブを作製した.発光を測定した結果,細胞密度の異なる状況でYAP2-TEAD2相互作用及びYAP2-GPCR相互作用それぞれの程度が変化することが明らかとなった.顕微鏡観察システムの改良としては,前年度までに行った発光観察用のセットアップに加えて,複数波長の発光,蛍光をタイムラグなく同時に観察できるようにEM-CCDカメラのCCD部分を二つの領域に分ける作業も行った.具体的には,ミラーを搭載した分光器を対物レンズとEM-CCDカメラの間に設置した.研究期間全体を通して,複数の細胞でのGPCR活性の発光検出,さらに細胞の密度を検知して増殖シグナルを誘導するYAP2-TEAD2相互作用の発光検出に成功した.この検出法は細胞間での活性の伝達を行う上で不可欠な細胞接着認識シグナルをモニターすることに繋がるため,伝達様式の詳細な解明に向けた大きな成果である.顕微鏡観察より導き出された仮説“GPCR活性が細胞間を伝達する"を証明するために,より高感度で短時間のGPCR活性変化を追跡できる観察系を確立した.リアルタイム発光イメージングを実行することで, GPCR活性の伝達メカニズムの解明を目標とした.既存のルシフェラーゼの100倍以上の発光強度を誇るNanoLucルシフェラーゼをベースとしたタンパク質再構成法によるプローブを新規に開発し,それぞれのプローブペアを細胞に導入して発光イメージングシステムにて発光値の変動を観察した.経時的な観察の結果, GPCR活性と細胞活動の協調性を見出した.本年度は,当初の目的のひとつである, NanoLucルシフェラーゼをベースとしたタンパク質再構成法による発光プローブの作製に着手した. NanoLucアミノ酸配列を任意の位置で分割し,その再構成効率をFKBP-FRB系につなげることで確認した. Rapamycin添加により相互作用が起こるFKBP-FRBを利用してNanoLucの再構成を誘導すると,一部の断片ペアにおいて明確な発光値の上昇が確認された.複数の切断位置を検討した結果,既存の発光再構成系と比較して, 100倍以上の発光強度を示す最適な断片ペアを選抜した.同ペアを以降のプローブ作製に用いた.NanoLuc断片をそれぞれGPCRおよびarrestinに融合させることで, GPCR活性を測る発光プローブを作製した.同プローブをHEK293細胞に導入して, GPCR特異的なリガンドを添加することでその発光変化を確認した.96穴プレートリーダーを用いた測定では,細胞溶解液にてリガンド添加により著しい発光の上昇が検出された.また,生きた細胞中においても,リガンド添加により発光輝点が観察され,細胞膜上およびER等に輝点が移動する様子が観察された.

それぞれの撮影時間は1枚あたり1秒以下であり,細胞間でのGPCR活性の相関を観察するために十分な輝度であった.顕微鏡の開発では,既存の倒立蛍光顕微鏡をベースにした発光観察用のシステムを開発した.これまで正立型の発光用顕微鏡での実例はあったが,比較してより細胞の形状が明瞭に観察され,また長時間の撮影に適した観察環境を設定出来るようになった.蛍光観察との同時使用など,複数の目的に適用できるシステムを構築した.分子生物学発光プローブの開発として, GPCR-arresitinの相互作用だけでなく, GPCR間のダイマー化を検出出来るように, NanoLuc断片を繋げた新規のプローブも準備する.また,複数のGPCR種でそれぞれプローブを作製する.開発した様々なプローブを細胞に導入して,リガンド添加に対する発光値の変動を確認する.また,細胞観察時に用いる,核,ミトコンドリア等をラベルする蛍光プローブも準備する.顕微鏡観察にて,細胞中の発光輝点を観察,プロットし,隣り合う細胞間で発光プロットがどの程度一致しているかその頻度を計算する.相関が期待されるならば,細胞密度の異なるサンプル間でリガンド刺激後の発光値の変化速度が異なることを確認する.細胞間のGPCR活性の伝播を担う因子として,細胞接着因子に注目する.カドヘリンやインテグリンなどの因子は蛍光タンパク質で標識し, GPCRプローブの発光輝点の発生位置とどの程度一致するか観察する.また,接着因子にNanoLucの断片をつなげることで, GPCRと接着因子との相互作用で発光が生じるシステムも開発する.リガンド刺激の濃度,細胞密度,時間変化等,発光強度がどのように変化するか計測,観察する.最終的には,接着因子に対する阻害剤の添加,ノックアウト,または細胞増殖に関与する細胞内タンパク質のモニタリングをそれぞれ行うことで, GPCR活性の伝播の仕組みを解明する.本年度予定していた発光プローブの開発のうち, GPCRのダイマー化を検出するプローブについて,構造ないし発光量に改善の余地が生じており,次年度においても引きつづき開発を継続する必要がある.DNAテンプレートの改良において,各種修飾酵素及び実験プラスチック類が必要となり,次年度の使用額が生じた.また,同作成予定プローブの検出時には,顕微鏡に専用の光学フィルターを導入する必要があり,そちらも次年度の使用額として求める.DNA合成試薬として約10万円, DNA修飾酵素として約5万円,実験プラスチック類として約5万円を見積もる.光学フィルターとして約20万円を見積もる.