hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜輸送を介したオートファジー誘導のシグナル制御機構の統合的解析

低分子量G蛋白質Rabは真核生物に普遍的に保存された膜輸送の制御因子で、高等哺乳動物では60種類以上の異なるRab分子が存在し、様々なタイプの膜輸送を制御している。ダイナミックな膜動態を伴うオートファジーも例外ではなく、近年複数のRab分子やそれらの制御因子のオートファジーへの関与が報告されているが、Rabによるオートファジー制御の仕組みは未だ不明な点が多い。当研究室ではこれまで、独自に開発したRabの網羅的解析ツール『Rab panel』を駆使して、オートファジーのダイナミックな膜動態の制御機構の解明に取り組んで来た。その過程で、Rab33Bの不活性化因子・OATL1がLC3との結合を介してオートファゴソーム上にリクルートし、その成熟過程に関与することを明らかにしている。しかし、OATL1のターゲットとなるLC3はオートファゴソームの内膜と外膜の両方に分布しているにも拘わらず、OATL1はp62とは異なりオートファジーによる分解を受けていなかった。そこで本年度は、オートファゴソームに局在するOATL1がどのような仕組みでオートファジーによる分解を回避しているのかを明らかにするため、OATL1(N末端側からPB1様ドメイン、LIR (LC3 interacting region)、TBCドメイン)とp62(N末端側からPB1ドメイン、LIR、UBAドメインなど)の詳細な比較解析を行った。その結果、OATL1のPB1様ドメインはp62のPB1ドメインとは異なり、オリゴマー化能を欠損していることを見出した。また、強制的なオリゴマー化ツールを用いた解析から、オリゴマー化したOATL1変異体はオートファゴソーム開始点に集積し分解を受けるが、オリゴマー化能の無いOATL1はオートファゴソームの外膜に特異的に局在することが明らかになった(Autophagy, 2016)。本研究により、LC3結合分子のオートファゴソーム局在(両側の膜vs外膜のみ)がオリゴマー化能の有無で規定されている可能性が強く示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。ダイナミックな膜動態を伴うオートファジー(自食と呼ばれる細胞内蛋白質分解機構)も例外ではなく、近年複数のRab分子のオートファジーへの関与が報告されている。しかしながら、Rabの種類数が非常に多いこともあり、Rabによるオートファジー制御の仕組みは不明な点が多い。その過程で、Rab12によるアミノ酸トランスポーターPAT4の分解制御を介した全く新しいタイプのオートファジーの制御機構の存在を明らかにしている。しかし、Rab12の制御に関わる上流の活性化因子やエフェクター分子が未同定であったため、Rab12の時空間的な制御基盤の詳細はこれまで明らかではなかった。そこで本年度は、Rab12の上流活性化因子(GEF)の探索を行い、Dennd3という分子がRab12の活性化因子として作用することを突き止めた。すなわち、Dennd3を過剰発現する細胞ではRab12の活性化によるPAT4の分解が亢進するため、細胞内アミノ酸量が減少し、結果的にオートファジーが亢進することが明らかになった(J. Biol. Chem., 2014)。一方、Dennd3をノックダウンした細胞では、Rab12の不活性化によりPAT4の分解が抑制されるため、細胞内アミノ酸量が増加した。しかし、Dennd3のノックダウンはAktシグナルの低下も引き起こすため、mTORC1の活性低下を招き(アミノ酸量増大によるmTORC1活性化を相殺)、オートファジーには影響が認められなかった。

その結果、OATL1のPB1様ドメインはp62のPB1ドメインとは異なり、オリゴマー化能を欠損していることを見出した。また、強制的なオリゴマー化ツールを用いた解析から、オリゴマー化したOATL1変異体はオートファゴソーム開始点に集積し分解を受けるが、オリゴマー化能の無いOATL1はオートファゴソームの外膜に特異的に局在することが明らかになった(Autophagy, 2016)。本研究により、LC3結合分子のオートファゴソーム局在(両側の膜vs外膜のみ)がオリゴマー化能の有無で規定されている可能性が強く示唆された。当初の目的であるRab12の活性化因子としてDennd3を同定することに成功すると共に、これまで謎に包まれていたRab12の活性化機構の一端を解明することに初めて成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定通り研究計画を推進する。
喫煙による精巣上体精子の成熟障害誘発に関する研究

本研究では、当初、6週齢Wistarラットを、A)10週間受動喫煙群、B)ポジティブコントロール群、C)ネガティブコントロール群、D)7週間受動喫煙後に3週間の禁煙期間をおいた群、の4群に分け、研究を遂行する予定としていた。しかし、当大学の動物実験施設より施設内での受動喫煙モデル使用が不適切であるとの勧告を受けたため、モデルの変更を行うこととした。新しいモデルとして、最近の海外での報告等も参考に、100μl/mlのニコチン水を飲水させるモデルを使用することとし、Wistarラットを用いてニコチン水を3か月間投与する短期投与群と7か月間投与する長期投与群で実験を行うこととした。上記のように、当初より長期間の実験期間を必要とする実験モデルへの変更が必要になったため、現時点で研究は完遂できていないが、研究は遂行中であり、ニコチン水の長期暴露による精巣体積および体重への障害が確認できている。今後は、ニコチン水暴露終了後に尾静脈より採血を行い、ニコチン代謝産物であるコチニン濃度の測定を行い、妊孕性は、交配試験で評価する予定である。また、交配試験後に、精巣上体から精液を採取し精液検査を行い、精巣および精巣上体を摘出して造精機能の評価を行う。加えて、採取した精子を用いて、体外受精(in vitro fertilization : IVF)、顕微授精(intra cytoplasmic sperm injection : ICSI)を行い、受精した卵を36時間培養した後、雌ラットに胚移植を行い出生数を評価する。また、喫煙による酸化ストレスが精巣上体精子に与える影響を研究する目的で、抗酸化物質が精巣および精巣上体に与える影響についても解明し、国際学会での発表を行った。この成果は今後、喫煙による精巣上体精子成熟障害に酸化ストレスが与える影響の解明につながっていくと考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。
雄マウス求愛歌に対する雌の性嗜好性の脳内表象：聴覚－嗅覚シグナルの感覚統合

近年、ヒトの言語を含む音声コミュニケーションのモデルとして、マウスの超音波コミュニケーションが様々な文脈の研究で注目されている。現在、この超音波発声における声の単位は、約10種類に分類されているが、発声に含まれるや意味や意義については、不明な部分が多かった。申請者は、その発声に関して、以下のことを示すデータを採用期間中に得た。基本的には発声の特徴は遺伝によって決まること、しかし、個体差も存在すること。また、発声回数の個体差を形成する責任脳部位と、その部位での細胞種の特定もなされた。週齢と発声回数が負の相関を示すこと、発声回数の多い個体ほど繁殖効率が良いことなど、進化的・生態学的意義の一端もデータとして示され始めた。また、当初計画していた実験は技術的問題を解決することができず、断念した部分もあるが、その過程で得られた上記の結果は、マウス超音波コミュニケーションにとって非常に基礎的で重要なものであった。27年度が最終年度であるため、記入しない。(1)超音波刺激に対する電気生理反応測定系の確立雄の求愛歌(超音波発声)に対する雌マウスの聴覚応答を測定するための計測機器の立ち上げを行った。聴覚野と下丘の同時計測を、麻酔下で匂いを提示しながら行うことができる実験系の確立を目指した。また、これまで我々が用いてきた超音波スピーカーは、30kHz以上の帯域を出力するには優れているが、音量が小さいこと、20kHz以下の出力には適さないことが分り、通常の聴覚実験に適したスピーカーもあらたに用意することとした。聴覚実験を確実に行うため、加藤建築環境研究所の協力・コンサルタントの下、ほぼ無響環境の防音箱とあらたなスピーカーを準備した。この防音箱は電気生理実験にも行動実験にも、様々な点で適している。また、あらたなスピーカーは1kHz以上の人間の可聴域から、マウス求愛歌の主たる帯域である80kHz前後まで、良好な出力が出来ることを確認した。さらに、夏目製作所に依頼し、麻酔下で匂いが提示できる独自の機器を用意した。現在、純音(聴覚応答マッピング:トノトピーの決定に必須)のプログラムや出力刺激の音圧を調整し、音提示から電気生理測定までを高精度に行う実験系の最終調整を行っている。この申請者独自の実験系の確立によって、2014年度にはマウス求愛歌に対する雌の神経応答や、感覚統合の神経基盤の実証研究が可能になるものと考えている。(2)雌にとって重要な音声刺激の同定これまで、雄マウスの超音波発声は様々な分類がなされてきたが、その音声の種類が、雄にとって、もしくは雌にとってどのような生物学的意義を持つのか、その検証はなされてこなかった。そこで、申請者はそれらの意義を行動学的に検証した。結論として、ある種の音素(シラブル)は、発声量に随伴してその発現頻度が変化する事がわかった。雄の求愛発声(歌)から雌が受容する情報は何か?それを明らかにするために、求愛発声には、情動状態や個性など、雄のどのような情報が含まれるのかを現在主流な実験系統であるB6(C57BL6/J)を用いて、明らかにした。まず、発声量の個体差が大きいということが分った。そこで、他の行動との相関を検討したところ、不安や活動量、攻撃性などは発声量と相関をしなかったが、性行動である雌へのマウントの潜時と発声量が有意な逆相関をした。つまり、発声が多い個体は性行動を始めるのも早い。また、射精後は発声が全く観察されなかった。以上のことから、雄マウスのUSVsは、主として性的動機付けの表出であると考えられる。歌構造においても個体差が認められ、B6の主要なシラブルの一つ、Upwardは発声量と負の相関を、別の主要なシラブルであるJumpは正の相関を示すことが分かった。また、同一個体内でも同様に、発声が少ないときはUpwardの割合が多く、発声が多いときにはJumpが多いという個体内変動があることも分かった。これらを合わせると、発声量とそれに随伴して変化する歌のパターンは、性的動機付けの個体差を反映しており、その時々の状況によってゆらぐ情動状態(性的動機付け)の表出でもある、と考えられる。このことから、シラブル発現の変化は、言語的な文法の“能力"の変化というよりも、動機付けに基づいて状況依存的に変化する“多弁さ"と“語彙"の様なものであると考える方が妥当と思われる。加えて、B6の主要なシラブルの発現変化が発声量と明瞭な相関関係にあることから、シラブルパターンの行動学的な意味は、発声量と同様に性的動機付けの表出であり、指標の価値としては発声量と近似出来ると思われる。

週齢と発声回数が負の相関を示すこと、発声回数の多い個体ほど繁殖効率が良いことなど、進化的・生態学的意義の一端もデータとして示され始めた。また、当初計画していた実験は技術的問題を解決することができず、断念した部分もあるが、その過程で得られた上記の結果は、マウス超音波コミュニケーションにとって非常に基礎的で重要なものであった。求愛発声に含まれる意味成分が同定され、その発声を雌に曝露するために必要な新規超音波スピーカーも、改良を重ねた末、ほぼ完成したため。27年度が最終年度であるため、記入しない。準備は整ったものの、仮説検証型であるため、実験結果が当初の予想に反する可能性もある。しかし、実験系の準備段階で、雄における発声の行動学的特性や、その神経メカニズムやホルモン作用、発達に伴う音声の変化、発声に対する雌の応答の経時的変化など、派生した研究テーマを複数得た。どのような結果になっても、マウス雌雄間超音波コミュニケーションに関する基礎的で重要な知見が得られると期待出る。実験系の立ち上げに際し、各種機器を新規に準備したため。本年度、一連の行動解析を行い、雄マウスの特定の歌声が、雌にとって快刺激に可能性を見出しつつある。また、雄の歌発声と個体の"パーソナリティ"の関係も検討し、データを得つつある。申請と当初よりも、より歌の「意味論」的な研究が可能になりつつあり、そのような方向性も付け加えて進める。
磁場援用アーク放電プラズマジェットによる透明ダイヤモンド板合成装置の試作

ダイヤモンドの気相成長法として,高速合成に適したアーク放電プラズマジェットCVD法を選択した.しかし,これまでの装置では厚さや結晶性の不均一なダイヤモンド板ができやすいという欠点がある.そこで,電離気体であるプラズマが磁場の影響を受けることを利用し,磁場でプラズマの状態を制御することのできる,磁場援用アーク放電プラズマジェットCVD装置を設計,試作した.これは,プラズマト-チおよびプラズマジェットの軸方向に可動な電磁コイルを備えたものである.メタン,水素およびアルゴンガスの3種の混合ガスにより生成されるプラズマジェットに磁場を印加した結果,プラズマジェット径が増加して基板温度分布が均一化し,得られるダイヤモンド板の厚さ分布や結晶性分布が均一化されることを明らかにした.つぎに,透明ダイヤモンド板を得るための合成条件について検討した.その結果,合成初期の核発生密度によらず,メタン濃度を1%以下とすることで,高光透過性のダイヤモンドが得られることがわかった.このダイヤモンドをダイヤモンド砥石で研磨したのち,赤外分光分析した結果,波長10μmで約68%と天然ダイヤモンドに匹敵する光学特性を有し,X線回折により特定の結晶方位をもたない多結晶体であることを明らかにした.また,断面の結晶組織観察より,低メタン濃度で得られるダイヤモンド板は,高メタン濃度のものに比べて欠陥や不純物の少ないことがわかった.この透明ダイヤモンドが得られる条件で厚さの大きい板状のものを合成するには数十時間を要するため,装置には長時間安定したプラズマジェットを発生できることが必要である.ダイヤモンドの気相成長法として,高速合成に適したアーク放電プラズマジェットCVD法を選択した.しかし,これまでの装置では厚さや結晶性の不均一なダイヤモンド板ができやすいという欠点がある.そこで,電離気体であるプラズマが磁場の影響を受けることを利用し,磁場でプラズマの状態を制御することのできる,磁場援用アーク放電プラズマジェットCVD装置を設計,試作した.これは,プラズマト-チおよびプラズマジェットの軸方向に可動な電磁コイルを備えたものである.メタン,水素およびアルゴンガスの3種の混合ガスにより生成されるプラズマジェットに磁場を印加した結果,プラズマジェット径が増加して基板温度分布が均一化し,得られるダイヤモンド板の厚さ分布や結晶性分布が均一化されることを明らかにした.つぎに,透明ダイヤモンド板を得るための合成条件について検討した.その結果,合成初期の核発生密度によらず,メタン濃度を1%以下とすることで,高光透過性のダイヤモンドが得られることがわかった.このダイヤモンドをダイヤモンド砥石で研磨したのち,赤外分光分析した結果,波長10μmで約68%と天然ダイヤモンドに匹敵する光学特性を有し,X線回折により特定の結晶方位をもたない多結晶体であることを明らかにした.また,断面の結晶組織観察より,低メタン濃度で得られるダイヤモンド板は,高メタン濃度のものに比べて欠陥や不純物の少ないことがわかった.この透明ダイヤモンドが得られる条件で厚さの大きい板状のものを合成するには数十時間を要するため,装置には長時間安定したプラズマジェットを発生できることが必要である.今年度は、磁場を印加することのできるアーク放電プラズマジェットCVD装置を設計し、試作した。この装置は、直流プラズマト-チ、真空チャンバ、基板冷却ホルダおよび電磁コイルからなる。直流プラズマト-チは2層構造にし、電極保護のため内側および外側の流路からアルゴンガスを供給でき、さらに外側の流路からはダイヤモンド合成に必要な水素ガスも供給できる。真空チャンバは一部を石英管で構成し、プラズマジェットを観察できるようにした。電磁コイルは2個作製し、プラズマト-チ軸方向にその位置を変えられるようにしてアークおよびプラズマジェットに磁場を印加できるようにした。コイルにより連続で最大830ガウスの磁場を印加できる。この設計した装置の試作後、メタン、水素およびアルゴンガスの3種の混合ガスにより生成されるプラズマジェットに磁場印加し、プラズマの状態がどのように変化するかを観察した。その結果、磁場を印加することによりプラズマの発光領域が広がり、プラズマジェット径が拡大することをがわかった。また、磁場を印加すると、基板中心部の温度が低くなり周辺部で高くなり、基板の温度分布が均一になることを確認した。そして、試作した装置でダイヤモンドが合成できることを確認した。昨年度に設計,試作した磁場援用アーク放電プラズマジェットCVD装置によりダイヤモンド合成を行った.磁場を印加しない場合,中央部で厚い山形のダイヤモンド膜が得られるが,磁場を印加すると中心部の膜厚分布が均一化されることがわかった.この膜厚が均一化される領域は磁束密度の増加とともに拡大した.また,膜厚分布とともに,結晶の配向や粒径の分布の変化が均等化されることを走査型電子顕微鏡観察により明らかにした.そして,結晶性をラマン分光分析により調べ,良質のダイヤモンドが成長する範囲が,磁場の印加とともに拡大することを明らかにした.これは,磁場を印加することにより,プラズマト-チ内でアークが回転運動をし,温度や速度の均一なプラズマジェットが生成され,ダイヤモンド合成に寄与する活性種の分布が拡大するとともに均一化するためと考えられる.次に,光透過性に優れるCVDダイヤモンド膜の合成条件について検討した.光透過性には結晶の純度や完全性が関係するといわれており,より安定した成長条件が必要であるため,原料メタンガスの供給量を低くし,成長速度を10μm/hと低くした.得られたダイヤモンド膜の表面をダイヤモンド砥石により研磨し,赤外分光光度計で分析した結果,波長10μmで約68%の透過率を示すことを明らかにした.

これは,天然ダイヤモンドの透光性に匹敵する値である.そして,ダイヤモンド膜の断面組織を観察し,光透過性に優れるダイヤモンド膜は欠陥や不純物の少なく,安定した結晶成長をしていることを明らかにした.
生殖幹細胞の減数分裂移行を制御するゲノム-エピゲノムプログラム

生殖系列サイクルにおける遺伝情報の維持と再編の制御転換に焦点を置き解析を進めた。その結果、(1)遺伝情報の大規模な再編が行われる減数分裂期組換えについて、未分化な生殖幹細胞が減数分裂へ向けた分子プログラムを予め獲得した上で高い遺伝的安定性を維持しつつ体細胞型増殖を行う事、(2)減数分裂期組換えに関わる遺伝子群と遺伝情報の安定性維持に関わる遺伝子群は生殖系列サイクルの発生段階に応じた特徴的な共発現クロストークを示す事、(3)多能性幹細胞と生殖細胞のゲノム損傷応答の比較解析から、遺伝情報の安定性は生殖系列サイクルを通じて一定ではなく発生段階に応じた特徴的な調節を受ける事、を明らかにした。生殖細胞では遺伝情報を体細胞よりも厳密に継承する分子機構が働くが、減数分裂期には逆にゲノムDNAを積極的に組換えると共にクロマチン動態の大規模な転換が起こる。生殖幹細胞から減数分裂期に起こるゲノム・エピゲノム制御の詳細な研究は進んでいない。研究代表者らはマウス生殖幹細胞株(GS細胞株)が体細胞型増殖から第1減数分裂前期に移行する培養条件を作出した。これまでにマウス生殖幹細胞株はGDNF、bFGFのシグナル存在下で体細胞型分裂周期による増殖を行うが両シグナルが生殖幹細胞株の減数分裂移行を抑制する事を見い出し、更に両因子の減数分裂抑制はレチノイン酸シグナルによって上位に抑制される事を明らかにした。この減数分裂の誘導過程はアポトーシスインヒビターの選択的使用もしくは誘導性shRNAレンチウィルスベクターを用いた特定のアポトーシス遺伝子の抑制により観察可能となった。生殖幹細胞のヒストンH3トリメチル化修飾、RNA pol II、RAR等のChIP-seq解析を進め、生殖幹細胞とES細胞の比較によりオープンなクロマチン修飾が両者で類似していること、生殖幹細胞のH3トリメチル化のbivalent修飾はES細胞と同様に初期発生過程で働く遺伝子群が占めること、RARは生殖幹細胞、ES細胞でターゲットが異なり生殖幹細胞では減数分裂遺伝子群に結合すること等を明らかにした。これらの結果を基に生殖幹細胞株の増殖分化転換のシグナル伝達経路と転写制御ネットワーク及びエピゲノム制御についてin silico解析、機能候補遺伝子群のcDNA発現、shRNAレンチウィルスベクターのライブラリを作成し表現型解析を進めている。またゲノム組換え制御及びクロマチン動態の制御に関わる事が示唆される2つ新規ノックアウトマウス系統の表現型解析を行い生殖細胞や幹細胞システム、初期発生過程における機能研究を進めた。生殖細胞は遺伝情報を次世代に伝達し、個体発生の起点となる細胞系譜である。多細胞生物では、初期胚で運命決定を受けた予定生殖細胞は体細胞型分裂により増殖する一方、減数分裂、配偶子形成、受精を経て次世代の個体形成を開始する。生殖細胞のゲノム-エピゲノム情報の安定な継承は、個体、種の継続に重要であると共に、減数分裂による相同遺伝子組換えと1倍体化によって遺伝情報の多様性が生まれる。すなわち、生殖細胞の増殖分化過程ではゲノム-エピゲノム制御の大規模な転換が起こると共に、クロマチン動態は大きく変化する。減数分裂の制御機構の研究は、主に酵母等の単細胞生物を用いて行われる一方、多細胞生物においてその分子基盤の解明は進んでいない。研究代表者はマウス生殖幹細胞株(GS細胞株、領域代表の京都大学篠原らが樹立)が体細胞型分裂から第1減数分裂前期に移行する培養実験条件を作出した。このGS細胞の第1減数分裂の移行は同調して進行する事から分子生化学解析の有用な実験対象となる。本研究では、同実験系を主な研究材料として、プロテオーム、ChIP-seq等を用いた網羅的data-driven型研究と個別の遺伝子、経路の機能解析スクリーニングを用いて、(1)GS細胞の減数分裂移行を規定するゲノム-エピゲノムプログラム、(2)GS細胞の増殖分化転換に伴うクロマチン動態、(3)生殖細胞ゲノム-エピゲノムの環境応答、の包括的な理解を進める事を目的として研究を進めている。生殖細胞では遺伝情報を体細胞よりも厳密に継承する仕組みが働くものと考えられるが、減数分裂期には逆にゲノムDNAを積極的に組換えると共に、クロマチン構造の大規模な変換が起こる。生殖細胞がゲノム恒常性維持から減数分裂組換えへ遺伝情報の制御転換を行う分子プログラムの研究は進んでいない。研究代表者らはマウス生殖幹細胞(GS細胞株、京都大学篠原らが樹立)が体細胞型増殖から第1減数分裂前期にin vitroで移行する培養条件を作出した。この生殖幹細胞株の第1減数分裂はほぼ同調して誘導されることから、分子生化学解析の有用な実験対象となる。哺乳類生殖細胞の減数分裂誘導は古典的にはレチノイン酸(RA)経路を介する事が明らかになっているが、RAはpleiotropicな効果を示し、生殖細胞への分化能を持つES細胞では神経分化を誘導し減数分裂は惹起されない。このため、生殖細胞には減数分裂を可能とする分子プログラム、すなわちエピゲノム修飾や翻訳制御等が予め存在していて、RAをトリガーとしてこれら経路のスイッチが入るものと考えられるが、その分子メカニズムは明らかとなっていない。研究代表者らは、GS細胞とES細胞の各分化誘導系および繊維芽細胞を用いてRNA発現解析、ChIP-seq解析や相対定量プロテオーム解析によるマルチオミクス解析を行った。その結果、GS細胞は未分化生殖幹細胞として体細胞型増殖を行う一方、減数分裂へ移行するためのエピゲノムプログラムをRA非依存的に予め獲得しており、RA刺激に応答して速やかに減数分裂を開始する事が明らかとなった。

生殖系列サイクルにおいて減数分裂期は積極的にゲノムDNAを組換えると共にクロマチン構造の大規模な変換が起こる。生殖細胞がゲノム恒常性の維持から減数分裂組換えへと遺伝情報の制御転換を行う分子基盤の理解は進んでいない。研究代表者らはマウス生殖幹(GS)細胞が体細胞型増殖から第1減数分裂前期に効率良く移行する培養条件を作出した。この樹立細胞株であるGS細胞の第1減数分裂誘導系は分子生化学解析の有用な実験対象となる。哺乳類生殖細胞の減数分裂誘導は古典的にはレチノイン酸(RA)経路を介する事が明らかになっているが、RAはpleiotropicな効果を示し、例えば生殖細胞への分化能を持つ胚性多能性幹(ES)細胞では神経分化等を誘導し減数分裂は惹起されない。このため生殖細胞は減数分裂開始を可能とする分子プログラム(meiosis priming)を予め存在していて、RAをトリガーとして同プログラムのスイッチが入るものと考えられるが、その分子メカニズムは殆ど明らかとなっていない。本研究では、GS細胞とES細胞の分化誘導系および体細胞(胎仔繊維芽細胞等)を用いてRNA発現、ChIP-seqや相対定量プロテオーム解析によるマルチオミクス解析および機能候補遺伝子群のgain-of-function、loss-of-function実験を行い、生殖系列サイクルにおけるmeiosis prmingの基本的な分子メカニズムの解明を進めている。GS細胞とES細胞の分化誘導系および体細胞(繊維芽細胞等)を用いたRNA発現およびプロテオーム解析から、GS細胞は未分化な生殖幹細胞として体細胞型増殖を行う一方で、初期減数分裂の機能遺伝子群のサブセット(減数分裂期コヒーシンなど、class 1 meiosis genesと定義)をRA非依存的に発現する事が明らかとなった。一方、初期減数分裂の機能遺伝子群の別のサブセット(stra8、rec8など、class 2 meiosis genesと定義)は、GS細胞が体細胞型増殖を行う過程ではRNAおよび蛋白質発現が低レベルに抑制される一方、RA添加に応答して速やかに発現上昇が観察された。ヒストンH3K4me3、K9me3、K27me3、RNA polIなどのChIPseq解析により、未分化状態のGS細胞および減数分裂誘導後のいずれにおいても減数分裂期の機能遺伝子群class1、2プロモーターは抑制的修飾やbivalant修飾を持たず、H3K4me3+、H3K9me3-、K27me3-である事が明らかとなった。RARおよびアセチル化ヒストン等のChIPseq解析により、未分化GS細胞においてRARはRA非存在下で減数分裂期の機能遺伝子群のサブセット(主にclass2 meiosis genes)に結合しており抑制性の転写制御に関わる事、およびRA添加によりRNA発現上昇と相関してヒストンアセチル化が明瞭に上昇する事を見出した。更にRAは減数分裂期の機能遺伝子群の抑制に関与するMAXおよびE2F6のプロモータ結合を制御する事が明らかとなった。
リグニン及びリグナン生合成の遺伝的生化学的調節機構の解明

研究成果の概要の次のとうりである。先ず、7種類のラセミ体リグナンを化学合成し、これらのリグナンのエナンチオマー同士をキラルHPLCで分離する条件を検討した。次にこのキラルLCを質量分析計を直結したキラルLC-MSでリグナンを分析する条件を確立した。このことにより、安定同位体トレーサー実験とLC-MSによってリグナン生合成機構を検討する条件が確立された。次に、ちょうせんれんぎょうから培養細胞系を誘導し、元の植物体と同程度にマタイレジノールを蓄積するカルスを得た。このカルスから得た酸素標品のセコイソラリシレジノール合成酸素活性は、元の植物体のそれに匹敵しており、季節を問わずリグナン生合成機構を検討するための実験系が確立された。この培養細胞系と、元の植物体から得た酸素標品を用いて、セコイソラリシレジノールの生合成機構を検討した。この酸素標品は、コニフェリルアルコールと(+)-ラリシレジノールからのエナンチオ選択的な(-)-セコイソラリシレジノールの合成を触媒するが、同時に、コニフェリルアルコールからの非天然型のエナンチオマーの(-)-ピノレジノールと(-)-ラリシレジノールの生成を触媒した。結局コニフェリルアルコールからのセコイソラリシレジノールの生成には少なくとも2種の立体化学的性質の異なる還元酸素が関与していることが明かとなった。リグナンの光学活性生成に関与すると考えられるペルオキシダーゼとNADPHキノンレダクターゼを、木化していないチョウセンレンギョンの若枝でモニターした。電気泳動とゲルろ過のパターンから、両酸素には多形が存在することが明かになった。同時にNADPH:H_2O_2酸化還元酸素の存在も示唆された。また、リグナン生合成に関与する遺伝子を明らかにするための戦略を、この生合成を念頭において論じた。リグナン生合成に関する本研究の目的の一つは、レンギョウのリグナン(マタイレジノ-ル)における生合成経路と、粗酵素による立体選択的カップリング反応などの解明にあった。昨年、分担者の一人を含むアメリカのグル-プによって、これらの点は明らかにされた。このような背景から、本生合成研究の主体は、マタイレジノ-ルとはタイプの異なるリグナンに移行している。現在、標品の合成、液クロ(カイラルカラム)、GCMSなど中間体や生成物の分離条件などの基礎デ-タをそろえ、実験条件が確立されつつある。遺伝子レベルの研究に関しては、リグニンとリグナンにそれぞれ特異的なケイヒ酸経路が存在するか否かを探る目的で、フェニルアラニンアンモニアリア-ゼ(PAL)遺伝子に着目した。試験管内でDNAを増幅させること(PCR)によって、染色体DNAからこの遺伝子を特異的に増幅・検出することに成功した。PCRの生成物は電気泳動上で複数個存在することから、数種類のPAL遺伝子の存在が予測される。一方、上述の生合成研究において、タ-ゲットとなるリグナンが変わることに対応して、新たな材料でゲノムDNAやmRNAを取るための準備(プライマ-設計など)が進行しつつある。ゲノムDNAやcDNAを出発材料に、既に条件の確立したPCRなどを用いてクロ-ニング、シクエンシングなどを行なう予定である。なお、購入したDNAシクエンサ-は、機械の調整が終わり、稼働状態にある。リグナンとリグニンは、共にケイヒ酸経路を経て生合成され、化学構造も類似しているが、光学活性に関しては、全く異なっている。即ち、リグナンは光学的に活性であるのに対して、リグニンは光学的に不活性である。

従って、リグナンの生合成機構を解明するには、生成物(リグナン)のエナンチオマ-の組成比を簡便に知ることが必要不可欠である。この目的のために、本研究に於いては、各種のラセミ体リグナンを合成し、それらのエナンチオマ-同士をキラルHPLCで分離する条件を確立した。また、季節を問わず材料を得るために、ちょうせんれんぎょうの培養系を検討した。得られた実験系は、リグナン類を比較的高濃度で産生する事が確認された。しかしながら現時点では大量懸濁培養系が確立されてない。遺伝子レベルの研究としては、昨年度得たフェニルアラニンアンモニアリア-ゼ(PAL)遺伝子断片から、リグニン或いはリグナンに特異的なPAL遺伝子を特定することは原理的に困難(どちらの場合も生成物はケイヒ酸)である。現在、光学的に活性なリグナンの生成に関与する遺伝子とその遺伝子産物にタ-ゲットを絞り、研究を進めている。コニフェリルアルコ-ルからリグナン(セコイソラリシレジノ-ル)の試験管内生成は、カップリングと還元反応が関与する。この過程に関与する遺伝子産物を電気泳動及び酵素精製によって検討した。その結果、異なる遺伝子産物が関与している可能性が強く示唆された。この遺伝子産物のアミノ酸配列の情報を得ること、調製済みのcDNAライブラリ-からこれらの情報をもとに特定の遺伝子を釣り上げることなどが今後の課題である。さらに、これらの精製酵素画分によるリグナン生成のエナンチオ選択性につき、上述のキラルHPLCシステムによって検討中である。研究実績の概要は次のとうりである。昨年度までに確立されていた、マタイレジノール産生培養細胞系からリグナン合成酵素活性を精査したところ、元の植物体と同程度にセコイソラリシレジノール合成酵素活性を有する培養細胞系得られた。よって季節を問わずリグナン生合成機構を検討するための実験系が確立された。この培養細胞系と、元の植物体から得た酵素標品を用いて、また昨年度までに確立されていた、キラルLC-MSと安定同位体を用いるトレーサー実験系を用いて、セコイソラリシレジノールの生合成機構を検討した。この酵素標品は、コニフェリルアルコールト(+)-ラリシレジノールからのエナンチオ選択的な(-)-セコイソラリシレジノールの合成を触媒するが、同時に、コニフェリルアルコールからの非天然型のエナンチオマーの(-)-ピノレジノールと(-)-ラリシレジノールの生成を触媒した。結局コニフェリルアルコールからのセコイソラリシレジノールの生成には少なくとも2種の立体化学的性質の異なる還元酵素が関与していることが明かとなった。チョウセンレンギョウの木化していない若枝からmRNAを単離しcDNAライブラリーとした。このライブラリーからPCRによる遺伝子の増幅を試みたが、予測される大きさの断片は得られなかった。そこで、IBPPAL遺伝子断片からPCRによって約600bpのPAL断片を得てプローブとし、ライブラリーをスクリーニングした。数個のポジティブクローンが得られ、一部の塩基配列を決定した結果、その内の1個は少なくともPAL遺伝子であることが確認された。
精神保健福祉士の職業性ストレス尺度の開発と職業性ストレス評価

前年度までに精神保健福祉士の尺度における項目の候補として明らかとされたのは68項目であった。しかしながら、それはやや多めの項目数であり被調査者の負担となりかねないことが予測された。精神保健福祉士の職業性ストレスの独自性をより高めて、被調査者の負担が少ない尺度を構成していく上では項目の精選化が必要であり、冗長でない尺度の構成が必要になると考えられた。そして、近年尺度開発において応用されている項目反応理論を用いて項目の識別力および困難度を確認したうえで、尺度項目を厳選させることの必要性が検討された。作成された精神保健福祉士の尺度項目の内容的妥当性を確認すると、同じ精神科医療・福祉に携わる精神科看護師および准看護師の職業性ストレスと比較して、精神保健福祉士の独自の職業性ストレスと考えられた内容は【精神保健福祉士の業務の煩雑性】、【精神障害者を地域へ橋渡しすることの困難さ】、【精神保健福祉士の職場環境】の要素についてであった。今後、精神保健福祉士の職業性ストレス尺度を量的に検討していく上で、【精神保健福祉士の業務の煩雑性】、【精神障害者を地域へ橋渡しすることの困難さ】、【精神保健福祉士の職場環境】に関する職業性ストレスの要因について検討していくことが必要であると考えられた。さらに、本研究では海外の精神保健福祉士のストレスは検討されていなかった。よって、海外の精神保健福祉士の職業性ストレスをレビューすることにより国際的に通用する尺度に繋がると考えられた。精神保健福祉士の職業性ストレス尺度開発のために予備的調査による回答を分析し、精神保健福祉士の職業性ストレスに関する要因を抽出した。解析対象は、A県2精神科病院・3精神障害者施設(就労・相談・地域活動支援)の29名であった。具体的には、設問「あなたのPSWとしての業務についてうかがいます。現在、あなたが業務上ストレスと感じることについて下記の回答欄に思いつくだけ記載して下さい。」について自由記述式の回答結果から精神保健福祉士の職業性ストレスを抽出した。回答データを精読し、一つの意味を類似性と相違性に基づき集約して「コード」とし、より抽象化した概念「カテゴリ」とした。その結果、68のコードを抽出し、最終的に【PSWの業務の煩雑性】、【精神障害者を地域へ橋渡しすることの困難さ】、【PSWとしての能力不足】、【PSWの職場環境】、【PSWが対象とする者との関わりにおいて生じる負担】、【他職員との間の葛藤】の6カテゴリをPSWの職業性ストレス要因として抽出した。現在は68のコードに基づき質問紙を作成し本調査へ向けて山口大学研究倫理審査委員会へ倫理審査申請し承認を得た。平成28度は調査対象地域が熊本地震の影響により本調査の実施が困難な状況であり、研究がやや遅れている。前年度の研究では【精神保健福祉士の業務の煩雑性】、【精神障害者を地域へ橋渡しすることの困難さ】、【精神保健福祉士としての能力不足】、【精神保健福祉士の職場環境】、【精神保健福祉士が対象とする者との関わりにおいて生じる負担】、【他職員との間の葛藤】カテゴリを精神保健福祉士の職業性ストレス要因として明らかとした。精神保健福祉士の職業性ストレスの独自性を確認するために精神科に勤務する看護職(看護師・准看護師)の職業性ストレスを確認した。看護職の職業性ストレスには【精神科看護の能力】、【患者の態度】、【看護観】、【コミュニケーション】があり、准看護師は【精神科看護の能力】のストレスについて看護師よりも有意に高かった。准看護師の特有の職業性ストレス【精神科看護の能力】は精神保健福祉士の職業性ストレス【精神保健福祉士としての能力不足】と内容が類似していた。精神保健福祉士と看護職の職業性ストレスの共通性を見た場合、自身の能力に関わること、対象との関わりにおいて生じること、他職員との間で感じる葛藤については共通していた。一方で、【精神保健福祉士の業務の煩雑性】、【精神障害者を地域へ橋渡しすることの困難さ】、【PSWの職場環境】については精神保健福祉士独自の職業性ストレスと確認された。精神保健福祉士特有の職業性ストレス尺度を構成するためには、精神保健福祉士の独自の職業性ストレスである【精神保健福祉士の業務の煩雑性】、【精神障害者を地域へ橋渡しすることの困難さ】、【PSWの職場環境】のカテゴリを中心に検討していく必要がある。調査対象地域が熊本地震の影響により本調査の実施が困難な状況であることに加えて、他施設共同研究を同時進行しているために大幅に研究が遅れている。

作成された精神保健福祉士の尺度項目の内容的妥当性を確認すると、同じ精神科医療・福祉に携わる精神科看護師および准看護師の職業性ストレスと比較して、精神保健福祉士の独自の職業性ストレスと考えられた内容は【精神保健福祉士の業務の煩雑性】、【精神障害者を地域へ橋渡しすることの困難さ】、【精神保健福祉士の職場環境】の要素についてであった。今後、精神保健福祉士の職業性ストレス尺度を量的に検討していく上で、【精神保健福祉士の業務の煩雑性】、【精神障害者を地域へ橋渡しすることの困難さ】、【精神保健福祉士の職場環境】に関する職業性ストレスの要因について検討していくことが必要であると考えられた。さらに、本研究では海外の精神保健福祉士のストレスは検討されていなかった。よって、海外の精神保健福祉士の職業性ストレスをレビューすることにより国際的に通用する尺度に繋がると考えられた。調査対象地域の研究協力者と連携をとり、精神保健福祉士職業性ストレス尺度開発のための本調査を実施して、得られたデータをもとに尺度を構成し、精神保健福祉士の職業性ストレスを教育や経験別に評価していく予定である。調査対象地域の研究協力者と連携をとり、精神保健福祉士職業性ストレス尺度開発のための本調査を早急に実施して、得られたデータに基づき量的に尺度を作成する。そして、精神保健福祉士の職業性ストレスを教育や経験別に評価していく予定である。平成28年4月の熊本地震に伴い、調査が実施できない状況となり、調査実施にかかる経費の使用がなかったため未使用額が生じた。(理由)平成28年4月の熊本地震に伴い、調査が実施が遅れ、申請者が他施設共同研究を同時進行しているために調査が遅れている。調査実施にかかる経費の使用がなかったため未使用額が生じた。使用計画)この未使用額については調査実施に伴う雑費・旅費・データ入力のための謝金に充てる予定である。この未使用額については調査実施に伴う雑費・旅費・データ入力のための謝金に充てる予定である。
英語学習者の個人特性の抽出と個に応じた英語学習コースナビゲーションシステムの開発

本プロジェクトの目的は、日本人英語学習者の学習方法の好み、学習不安、意欲の方向性、学習スタイルなどに焦点を当て、自動診断のフィードバックシステムを開発することである。ウェプアプリケーションを用いて、51の調査項目に答えることにより、診断結果が個別出力される仕様となった。この診断システムを受けることで、(1)自分がどういったスタイルで学習に臨んでいるか、(2)英語学習におけるどのような学習方法に頼っている/忘れがちであるか、(3)英語学習においてどのような不安感を持っているか(4)どういったものに英語学習に対する意欲を掻き立てられるのかなどの認識することが可能である。本研究では,英語学習者の個人特性を包括的にとらえ,得点化し,それにもとづき学習者に学習上のアドバイスを与える診断的フィードバックシステムを開発する。英語学習者の個性を認め,一律的な教育だけにとどまらず,個性を考慮に入れた自主的な学習活動を促すことを大きな目標としている。本年度は,オンラインで調査を実施し,MySQLと連動することにより,調査後すぐに調査結果に対してのフィードバック文が自動生成される仕組みをつくるために次のようなことを行った。個人特性を抽出するために扱った学習者データは,性別,学部,テストスキル,ストラテジー使用,学習不安,モチベーションで,教育実践の中で得られた約3000名の実データを分析した。因子分析項目応答理論よる分析を経て,項目の精選を行い,大量の項目に回答する学習者への負荷と尺度の信頼性のバランスを考慮した新たな尺度を構成しなおした。また,分析結果より,得点化する数式を導き出して,オンライン上でレーザーチャートが示されるようなプログラミングを組み,調査終了後,すぐに結果が反映されるようにした。次に,学習者の特性に応じてグループ分けを行い,集団の特性の抽出も試みた。Rasch DIF(差異項目機能)による分析から得られた情報を基に,学習者の特性に応じて,推奨される語学コース,学習法,ストラテジーなどが紹介されるよう,共同研究者と共にそのカウンセリング文を作成した。このカウンセリング文についても,調査後,すぐに反映されるようなシステムにした。実際の教育現場におけるこのシステムの運用は来年度より開始する。本研究の主たる目的は、英語学習者の個人特性を得点化し、システムユーザーに英語学習上のアドバイスを与える診断的カウンセリングシステムを開発することである。ユーザーがいくつかの質問に答えることにより、推奨される語学コース、学習方法・学習ストラテジーが紹介される仕組みになっている。そのため、このシステムは、科目選択の際に運用される。しかし、本研究の知見から、普段の授業や学習の中で、継続的な学習ストラテジー使用が重要であることが示されたため、授業の中で英語学習の自己調整をサポートする方法論を模索した。本年度は、近年導入数を増やしているLearning Management SystemであるMoodleを用いた。いくつかのモジュールを導入することで、データ収集を容易にし、簡易ではあるものの即事フィードバックを与えることが可能であった。このナビゲーションシステムのように、緻密で微細な計算・結果出力は今のところMoodleでは難しいようであるが、Moodleは機動性に優れており、普段の授業・学習と相性の良いシステムである。また、学習者の自己内省が非常に大切であることから、自律的な学習を行ったかどうか自己診断するための、セルフチェックリスト作成を試みた。そのチェックリストの項目を作成するにあたり、約200人に対してセルフチェックリストを毎週授業後に実施した。データを分析した後、項目を精選しなおし、セルフチェックリストの改定版を完成させた。チェックリストは、来年度も継続して実施する。研究の主な目的は、英語学習者の個人特性を包括的にとらえスコア化し、それに基づいて教員が学習者に学習上のアドバイスを与える診断的フィードバックシステムの開発である。このシステムの最大の特徴は、学習者の多様な個性を重視する理念に基づいており、英語学習者の個性を考慮に入れた自主的な学習活動を促している点にある。21年度、重点を置いたことは、前年度までに散見していたシステム運用の問題点を改善し、実際の現場に運用可能な枠組みを提示することと、英語学習者コースナビゲーションを実際に使用したユーザー(英語学習者)からの声を聞いてさらなる改善に努めたことである。そして、3年間の成果を報告するべく、成果報告書の作成に多くの時間と労力を費やした。Moodleや診断シートを用いることによって、一度限りのアセスメントとして、このシステムを利用するだけでなく、長いスパンで、学習者の自律支援を行うことが可能となった。教員側の自律性支援の教育的意義だけでなく、学生自身が今後の学習の仕方に活かしていけるような、学生側のメリットを探るべく、このシステムを学生がどう受け止めているかを、実際にシステムを使用したユーザーである大学生からアンケート形式で調査も行っている。システムの結果に関する信用の度合い、システムの結果が今後の学習につながるか、大まかに2方向の質問をした。アンケート調査および面接法による聞き取り調査を行った。

現時点で103名の大学生の結果をまとめたところ、約95%のユーザーから支持を得ることができた。また、約5%の賛意の得られなかった学生の考察もおこない、今後もさらなるシステムの信頼性と妥当性の向上に努めていく予定である。
植物・ラン藻のグリシンベタインの合成・輸送・蓄積の分子機構

植物をはじめ多くの生物は、様々なストレスに曝されると、グリシンベタイン(ベタイン)などの適合溶質を蓄積して蛋白質、核酸の失活を防止することが知られている。本研究では、植物・ラン藻のベタインの合成・輸送・蓄積の分子機構を明らかにすることを目的とした。死海から単離した耐塩性ラン藻がもつグリシンの3段階のメチル化によるベタイン合成経路を植物および淡水性ラン藻に導入すると、ストレス耐性が著しく向上することが明らかになった。また、耐塩性ラン藻のベタイントランスポーターはベタインを輸送するがプロリンを輸送せず、両者を輸送するマングローブのベタイントランスポーターと異なことが明かとなった。耐塩性ラン藻のベタイントランスポーターはアルカリ性のpHで輸送活性が高く、アルカリ性での塩ストレス耐性に重要であることが明らかになった。ベタインの蓄積はナトリウムイオンの蓄積と密接に関係することが知られているのでNa^+/H^+アンチポーター遺伝子についついても検討した。ラン藻のSynNhaP1アンチポーター(CPAI型)をタバコの根の細胞質膜に特異的に発現させたところ、形質転換植物の耐塩性が増加することが明らかになった。また、ラン藻のApNhaP1およびSynNhaP1のC末端が輸送するイオン特異性および親和性に関与するとともに、pH依存性にも関与することが明らかになった。カリウムイオンは細胞内に大量に存在し細胞の活性を阻害しないことから、浸透圧適合溶質としても働くと考えられていたが、今回、K^+が細胞外に多量(過剰)に存在するストレス条件下で、大腸菌のChaAおよびVibrioのNhaP2アンチポーターが濃度勾配にしたがってK^+を細胞内へ排出することを見い出した。動物、植物、バクテリアを含め、ベタインはコリンの酸化により作られると考えられてきた。しかし、申請者は、最近、死海から単離された耐塩性ラン藻(Aphonothece halophytica)はグリシンの3段階のメチル化によりベタインを合成する新規の遺伝子をもっていることを明らかにした。この反応には、S-アデノシルメチオニンがメチル供与体として必要である。一方、植物のベタインは葉緑体で合成されると考えられているが、根をはじめとする他組織へのベタインの輸送機構は不明である。最近、申請者は、ベタインを蓄積する植物からはじめてベタイントランスポーター遺伝子を単離した。コリンをコリンモノオキシゲナーゼおよびベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼによる2段階の酸化反応によりベタインを合成する場合と、グリシンおよびサルコシンのメチル化を触媒するGSMTと、ジメチルグリシンのメチル化を触媒するDMTによるベタインの合成について検討した。その結果、メチル化酵素をコードする遺伝子を淡水性ラン藻で発現させると、淡水性ラン藻は海水中でも生育するが、コリンの酸化を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現させたものはそのような耐塩性が見られないことが明らかになった。メチル化酵素をコードする遺伝子をアラビドプシスランで発現させると、コリンの酸化酵素遺伝子を発現させたものよりは、より強い耐塩性の付与が見られることが明らかになった。この違いを、コリンの葉緑体への供給と、グリシンの細胞質への供給の違い等から議論した。この結果は、Proc Natl Acad Sci USA.に発表した。本研究では、植物・ラン藻のベタインの合成・輸送・蓄積の分子機構を明らかにすることを目的としている。

最近、私達が見い出したグリシンの3段階のメチル化によるベタイン合成経路の有用性について検討した。その結果、コリンの酸化酵素遺伝子を発現させたものよりは、より強い耐塩性の付与が見られることが明らかになった。ベタインの蓄積はナトリウムイオンの蓄積と密接に関係する。植物の場合、Na+^/H^+アンチポーターがNa^+の動態に重要な役割りを果たす。植物のNa^+/H^+アンチポーターは、NhaP(CPA1型、細胞質膜に局在するSOS1および液泡膜のNHX1が属する)、NapA(CPA2型)、NhaD型が存在すると予想されている。そこで、機能のわからないNapAタイプアンチポーターについて検討した。耐塩性ラン藻がもつ2個のNapA1アンチポーターはアルカリ性で活性が高く、1つはNa^+/H^+アンチポーター、もう一つはNa^+/(H^+,K^+)アンチポーターとしてはたらくことが明らかになった。カリウムイオンは細胞内に大量に存在し細胞の活性を阻害しないことから、浸透圧適合溶質としても働くと考えられていた。これまで、濃度勾配にしたがってK^+を細胞内へ排出するトランスポーターは知られていなかった。今回、K^+が細胞外に多量(過剰)に存在するストレス条件下で、VibrioのNhaP2アンチポーターが濃度勾配にしたがってK^+を細胞内へ排出することを見い出した。ラン藻のNa^+/H^+アンチポーターをストレスに誘導されて根で特異的に発現するプロモーターを用いて、タバコの細胞質膜で発現させることを試みた。その結果、形質転換植物は塩ストレスにより耐性であることが明かとなった。植物をはじめ多くの生物は、様々なストレスに曝されると、グリシンベタイン(ベタイン)などの適合溶質を蓄積して蛋白質、核酸の失活を防止することが知られている。本研究では、植物・ラン藻のベタインの合成・輸送・蓄積の分子機構を明らかにすることを目的とした。今年度は、私達が見い出したグリシンの3段階のメチル化によるベタイン合成経路の前駆体の効果についても研究を行った。その結果、グリシンの前駆体と考えられるセリンの供給を増加させることが、より強い耐塩性の付与に重要であることが明らかになった。植物の場合、Na^+/H^+アンチポーターがNa^+の動態に重要な役割りを果たす。植物のNa^+/H^+アンチポーターは、NhaP(CPA1型、細胞質膜に局在するSOS1および液泡膜のNHX1が属する}、NapA(CPA2型}、NhaD型が存在すると予想されている。そこで、ラン藻のSynNhaP1をタバコの根の細胞質膜に特異的に発現させることを試みた。その結果、形質転換植物の耐塩性が増加することが明らかになった。また、ラン藻のApNhaP1およびSynNhaP1のC末端に存在する可溶性部分の役割について検討したところ、C末端が輸送するイオンに対する特異性および親和性に関与するとともに、pH依存性にも関与することが明らかになった。
生物絶滅確率を指標とする水域環境保全手法の確立に関する基礎的研究

現在、人間による開発行為などにより,数多くの生物が自然のスピードの何倍もの速さで絶滅の危機にさらされている.近年,こうした状況の中で生態系の保全を図ろうとする動きが大きくなっている.しかし,その保全手法には未だ定性的なものが多く,保全手法を明確にし,開発現場での生態系の保全に応用するには,定量的である必要がある.とりわけ人間の暮らしには水が密接に関わっているので、水域の生態系への人間による影響は大きい.そこで,本研究では,水域生態系の生息環境の定量的な評価をし,最終的には,洪水等による環境改変や,個体群の人口学的なゆらぎを考慮した絶滅確率指標とする保全手法を確立することを目的とし、研究対象種として,宮崎県延岡市の五ヶ瀬川水系北川の感潮部に生息する稀少種カワスナガニを選定した.第一に,この北川感潮域に生息するカワスナガニの分布状況を把握するために,縦断方向の生息分布調査を実施し,河口から4.86.4kmの範囲にカワスナガニが多く生息することを明らかにした.また,第二に,カワスナガニの選好性を調査し,カワスナガニは中礫程度の礫床,低塩分、水温17°C程度の生息環境を好むことを明らかにし,それぞれの環境因子を統合し,定量的に評価し得た.第三にカワスナガニの生活史をモデル化し大量出生、大量死滅型の生物の保全手法を明らかにした。第四に未知であったカワスナガニの生活史を明らかにするために,カワスナガニの雌の卵を実験室で孵化させ,生育する実験を実施した.これにより,カワスナガニの幼生は,5期のゾエア期を経てメガロパ幼生になること、および、その形態を明らかにした.さらに,数値シミュレーションにより,北川感潮減での水理水質変動を再現し,ゾエア幼生の挙動を明らかにした。北川感潮域における縦断方向の生息分布に関する調査,横断方向の生息分布に関する調査,存在形態に関する実験,温度に関する選好性実験,流速に対する耐性実験により以下に示す結果が得られた。1.左右両岸共に河口より4.86.4kmの区間で高い生息密度を示していた.また右岸の方が左岸より高い生息密度を示しており,カワスナガニの生息に最も適している領域を把握する事ができた.2.常時淡水に曝されている水域にはカワスナガニは生息していない.3.甲幅程度からその数倍の粒径の堆積物が存在するところに多く生息する傾向にあり,泥質のところには生息しない.4.カワスナガニの採取地点のTPが-200cm以下になるとカワスナガニはほとんど生息しない.5.成体については甲幅が2mm11mmのものが存在していた.オスメスの比率は24mmではオスの割合が若干大きいが,9mm以上ではメスのみが確認された.6.5月から1月までの調査における総個体数を概算した結果,それぞれおよそ356万個体,227万個体,196万個体,178万個体,158万個体であり,5月以降減少を続けている.7.河川流心付近はカワスナガニの生息には適していない.9.最高水温が24°C程度までの場合,カワスナガニはより暖かい水温を好む傾向があった.10.路床に2mm以下の砂を貼り付けた場合および2mm以下の砂を敷設した場合は,流速が3055cm/sに達すると掃流された.礫を敷設した場合,礫中に隠れることができれば礫が掃流されるまで流れに耐え得ることが分かった.