hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
燃焼系におけるラジカル錯体反応

アルキルペルオキシラジカル(RO_2)については、負イオン化質量分析装置によりCH_3O_2、C_2H_5O_2+NO反応の速度定数の測定を行った。また、H_2O-HO_2錯体の直接観測実験を行った。水素や炭化水素燃焼の着火特性・燃焼限界を支配するHO_2の関与する反応の速度制御法の開発が必要とされている。このためにはHO_2の反応について、特に付加反応中間体の生成とその速度定数に対する影響、HO_2-H_2Oの直接観測を含め、その生成過程の速度論的実験・錯合体機構の示唆されている反応の速度定数の決定を主体にして、このような錯合体機構を実験的に検証することが重要である。低温燃焼過程、大気中の炭化水素光酸化過程において重要な役割を果たす、CH_3O_2などのアルキルペルオキシラジカル(RO_2)についても、同様な錯合体機構の可能性がある。本年度は、これらのラジカル錯体反応の詳細を調べるために昨年度開発したHO_2用の流通型高温反応装置を用い、特にHO_2+HO_2反応におけるH_2Oの添加効果を測定した。HO_2の近赤外領域の吸収は禁制遷移であり、吸収断面積は10^<-19>cm^2以下と小さい。微弱吸収において高感度計測が可能になるように本研究では周波数変調吸収分光法を用いた。本実験装置により、HO_2の検出限界を求めたところ10^<11>-10^<12>moleculescm^<-2>以下と従来の吸収分光法に比べ数桁程度高感度にHO_2を検出でき、高精度の反応速度論実験が実施できることが示された。この結果から、HO_2ラジカルの自己反応の速度定数を280-350Kにおいて測定した。水の添加により速度定数が加速されることが見出されたが、さらにH_2O添加によりHO_2の初期生成量が減少することも見出された。このHO2の現象はHO2-H2Oラジカル錯体の生成に起因する。HO_2減少量に基づいて、ラジカル錯体生成の平衡定数をはじめて実験的に求めることができた。アルキルペルオキシラジカル(RO_2)については、前年度に引き続き負イオン化質量分析装置によりCH_3O_2、C_2H_5O_2+NO反応の速度定数の測定を行った。また、アルキルラジカルと酸素分子の生成物をGCMSにより直接検出し、反応機構を考察した。
非侵襲的かつ実用的な頭蓋内コンプライアンス測定方法の確立

頭蓋内圧(ICP)脈波は、頭蓋内血液量が心周期により変動することで発生する。従って我々は、duplex sonographyにより両側ICAと両側VAの血流速脈波を測定し、一心周期のおける頭蓋内動脈血液量(CBVa)の経時的変動を計算した。このCBVaの変動からICP脈波を解析し、コンプライアンス(C)を測定した。埋め込み式頭蓋内圧計(OSAKA telesensor)を頭部に設置したV-P shunt症例(n=3)を対象にした。方法:OSAKA telesensorにてICP脈波を、超音波断層装置(東芝社製,SSA-260A)の7.5MHzのパルスエコープローブで両側ICAと両側VAの血流速脈波と血管径を測定した。各血管の血流速と血管経から血流量を求め、心電図のR波のピークを基準とした一心周期における全脳血流量(CBF)の経時的な変動を計算した。毛細血管血流は、ほぼ定常流であるので、CBFから定常血流量を引いたものを積分し、一心周期におけるCBVaがどの様に変動するかを求めた。このCBVaの変動とICP脈波との関係を求め、更にはC=CBVaの変動/ICPの脈圧を計算した。結果:収縮期には、CBVaが直線的に増加(2.7±0.4ml)して、ICPはこれに比例して上昇した。その後拡張期に、CBVaが減少に転じた時点でICPも低下した。この時期には、緩徐にCBVaが減少するにも関わらず急激にICPが降下する時期と、それに続く、CBVaの減少に比例してわずかにICPが低下する時期があった。また、Cは1.35±0.19ml/mmHgであった。本法を応用することにより、頭蓋内圧計とドップラー血流計から非侵襲的なコンプライアンスの測定が可能であった。また、ICP脈圧とCBVaとの関係で見られた3 phaseの起源は不明であるが、頭蓋内圧環境の何らかの指標となるものと思われた。
電子非弾性散乱における干渉現象を利用した電子波動関数の位相プローブ法の開発

電子非弾性散乱過程で生じる干渉現象を利用した分子軌道の位相観測法の実現を目指し、電子衝撃イオン化断面積および電子励起断面積の高精度測定による干渉構造の抽出と解析手法の開発を行った。六弗化硫黄などの比較的単純な分子を対象とした一連の研究の結果、電子運動量分布に現れる干渉構造を利用して分子軌道の位相や対称性、構成原子軌道の配向方向をプローブするための基盤技術を確立することができた。さらに、より定量的な干渉効果の解析を目的として、イオン化断面積や電子励起断面積に現れる分子振動の影響についても調べた。分子軌道が有するプラスやマイナスの符号(位相)が、分子の反応性を決定づける強力な要因の一つであることが広く知られている。本研究の目的は、電子衝突による特定の分子軌道からの電離過程やRydberg軌道への電子遷移過程における干渉現象を用い、電子波動関数の位相をプローブする手法を開発することにある。電子エネルギー損失分光(EELS)に基づく電子散乱断面積の観測から分子軌道の位相情報を確実に抽出するためには、通常のEELS実験が対象としていた約3 a.u.の移行運動量領域を79 a.u.程度まで広げねばならない。高い散乱角まで測定領域を拡張することでこの要請を満たすことが可能ではあるが、散乱角の増加に伴い急激に散乱強度が減少するという実験的困難が生じる。そこで、平成25年度では一定のエネルギー領域に亘る散乱電子を一挙に計測する多チャンネル型電子分析器をEELS装置に導入することで、検出効率の大幅な改善を図った。これにより、既存の実験セットアップに比べ約一桁の検出効率の向上を達成している。さらに、エネルギー分解能も1.5eVから1.0eVへと改善することにも成功し、個々のRydberg遷移に対するEELS断面積を広範な移行運動量に亘って測定するための基盤を固めることができた。これに加え、四塩化炭素や六弗化硫黄の価電子軌道からの電子衝撃イオン化断面積に現れる干渉効果を調べている。電子コンプトン散乱の動力学的完全実験である電子運動量分光(EMS)実験より得られた(e,2e)断面積を解析することで、上記分子の非結合性軌道を構成する複数のp原子軌道の方向やハロゲン原子間の距離に依存した干渉構造の変化をとらえることに成功した。分子軌道が有するプラスやマイナスの符号(位相)が、分子の反応性を決定づける要因であることが広く知られてきた。本研究の目的は、電子衝突による特定の分子軌道からの電離過程やRydberg軌道への電子遷移過程に現れる干渉現象を用い、電子波動関数の位相をプローブする新規手法を開発することにある。本年度は、干渉現象における分子振動の影響を明らかにすることを目的に研究を展開した。CH2F2分子やフラン分子を対象としたEMS実験から、核変位にともなう電子波動関数の歪みが電子運動量分布の低運動量領域において顕著な影響を与える場合があることを明らかにしている。さらに、N2O分子の価電子励起における振電相互作用の影響を解明した。これらの研究結果を、3報の学術論文として発表している。以上の研究に加え、電子衝突時における標的分子の配向を規定したより発展的な実験を行うために実験装置の改良を行った。これまでの実験では気体分子を標的としていたため、そのランダムな空間配向により得られる干渉パターンは分子の方向について平均されたものとなってしまい、異方性に関する情報が失われていた。そこで、電子衝撃イオン化で生成する分子イオンの後続解離過程で放出される解離イオンを電子と同時計測することで、空間平均の実験的困難の克服を図った。生成分子イオンが分子の回転よりも十分早く解離するaxial recoil条件において、解離イオンの飛行方向から電子衝突時における分子の配向方向を決定できる。これまで開発を進めてきた画像観測型イオン分析器による測定法を大幅に改良し、直線分子を対象とした配向分子の電子エネルギー損失分光実験を行った。現在、分子軸方向に依存した干渉現象の異方性を明らかにすることを目指し、研究を継続している。分子軌道が有するプラスやマイナスの符号(位相)が、分子の反応性を決定づける強力な要因の一つであることが知られてきた。本研究の目的は、電子衝突による特定の軌道からのイオン化過程やRydberg軌道への電子遷移過程において生じる干渉現象を用い、電子波動関数の位相を実験的に決定する新規手法を開発することにある。本年度は、電子衝撃イオン化断面積に現れる干渉効果より分子軌道形状の情報を抽出する解析法の確立を目指し、研究を展開した。この目的のため、六フッ化硫黄の非結合性軌道に着目し、電子運動量分光(EMS)実験より求めた干渉構造を詳細に調べた。六フッ化硫黄の5つの非結合性軌道は異なる方向を向いた複数のF 2p軌道の組み合わせにより構成され、その方向に応じた干渉構造を示す。実際、EMS実験より個々の分子軌道の形状を反映した特徴的な振動構造が得られ、我々の提案したモデルと実測値との比較から軌道の空間的な対称性を決定できることが分った。さらに、干渉構造の運動量原点での強度や振動の振幅から、分子軌道を構成する原子軌道の配向方向の揃い方や原子間軸に対する傾き角などに関する情報が得られることを明らかにしている。以上の研究に加え、干渉効果のより定量的な解析を目的に、分子振動に起因した核変位にともなう電子波動関数の歪みが干渉構造に与える影響を調べた。上記の六フッ化硫黄に加え、ジメチルエーテルについてもEMS実験を行い、分子振動による軌道毎の電子運動量分布の変化を詳細に検証した。

これらの研究結果は、学術論文として発表している。電子非弾性散乱過程で生じる干渉現象を利用した分子軌道の位相観測法の実現を目指し、電子衝撃イオン化断面積および電子励起断面積の高精度測定による干渉構造の抽出と解析手法の開発を行った。六弗化硫黄などの比較的単純な分子を対象とした一連の研究の結果、電子運動量分布に現れる干渉構造を利用して分子軌道の位相や対称性、構成原子軌道の配向方向をプローブするための基盤技術を確立することができた。さらに、より定量的な干渉効果の解析を目的として、イオン化断面積や電子励起断面積に現れる分子振動の影響についても調べた。実験装置を設置している建屋の耐震補強工事が平成26年度に実施されることになり、研究設備一式を一時移転先に移設する必要があったことにより、研究の遂行に若干の遅れが生じたため。化学改良を終えた画像観測型イオン分析器を利用した“配向分子の電子エネルギー損失分光実験"を継続して行い、それにより得られた結果から電子軌道の位相情報を抽出する手法を確立する。さらに、電子運動量分光実験をより複雑な分子に対して系統的に適用することで干渉効果に基づく位相プローブを行い、分子物性と電子波動関数の位相との関連を明らかにしてゆく。広範な移行運動量領域に亘るEELS断面積の特定で必要となる多チャンネル型電子分析器の開発過程において、分解能の改善を目的とする幾つかの改良の必要性がでてきたことにより、その完成に若干の遅れが生じたため。次年度使用額は、研究施設の耐震補強工事に伴う装置移転により分光器の改造に若干の遅れが生じたことと、今年度の研究を効率的に推進した結果により生じた未使用額である。s軌道やd軌道など、様々な原子軌道の混在により構成された分子軌道について、系統的にEELSおよびEMS実験を行う。それにより、p軌道のみで構成された分子軌道を対象に干渉構造を解析する目的で発展させてきた我々のモデルを分子軌道一般に拡張し、位相プローブ法としての基盤を確立する。平成27年度請求額とあわせ、平成27年度の研究遂行に使用する予定である。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進した結果により生じたものである。平成26年度請求額とあわせ、平成26年度の研究遂行に使用する予定である。
内在性非コードRNAを考慮した機能性RNAによるエピゲノム改変最適化の試み

近年、内在性、外来など様々な機能性の非コード(nc)RNAが標的遺伝子のエピジェネティック制御に関与する事が報告され始めた。内在性ncRNAは細胞種特異的発現を示すものも多く、機能性ncRNAの細胞への導入によるエピジェネティック改変(発現制御)の効率化には、内在性ncRNAの標的遺伝子同定と発現状態との総合理解が必須である。昨年度の解析から、ES細胞でncRNA生成に関わる酵素の欠損により、DNAメチル化状態が変化する遺伝子を多数同定した。ES細胞の多能性維持に重要なSall4遺伝子は、プロモーター領域に長い一本鎖アンチセンスncRNA(ASncRNA)が存在し、このASncRNAによりDicer非依存的にDNAメチル化制御を受けることが判明した。そこで今年度は、Sall4遺伝子のプロモーター領域に存在するASncRNAに注目し、機能解析を行った。マウス繊維芽細胞では、Sall4はプロモーター領域が高メチル化で発現が見られないが、Sall4 ASncRNAを一過的に強制発現させることで、プロモーター領域の脱メチル化を誘導できた。一方、内在性Sall4 ASncRNAの機能を解析するために、ES細胞でASncRNAを標的とするshRNAを導入することでノックダウンしたところ、本来低メチル化のSall4プロモーターがメチル化され、Sall4遺伝子の発現も減少し、ES細胞の自己再生にも影響を与えることが確認された。本研究により、内在性Sall4 ASncRNAは、オーバーラップする標的領域の低メチル化状態を維持し、遺伝子の活性化に重要であることが示された。また、卵特異的ヒストンや環境中に残存する化学物質とエピジェネティクス制御についてもSall4遺伝子を中心に明らかにした。本研究により、ncRNAによりDNAメチル化状態が維持される遺伝子を多数同定できたことから、今後は内在性ncRNAの強制発現やノックダウンにより標的遺伝子のDNAメチル化状態の改変(エピゲノム改変)を基盤として、有用細胞や病態モデル動物を作製するための新技術の確立につながると考えられる。本研究では、転写調節領域に存在する内在性ncRNA生成因子の欠損細胞を用いて、DNAメチル化変化を指標として標的遺伝子を全ゲノム的に同定し、内在性ncRNA発現パターンとエピジェネティック制御との関係を明らかにすることを試みた。Dicer欠損ES細胞については、解析した遺伝子のうち10遺伝子で、メチル化状態の変化が確認できた。興味深いことにDicer欠損細胞では、対照に比べて高メチル化(5遺伝子)、低メチル化(5遺伝子)の双方が検出され、このうちの多くはDicer欠損による遺伝子発現変化とDNAメチル化状況の変化が相関していた。これにより、Dicerを介して生成する短い二本鎖ncRNAによりDNAメチル化状態が制御される標的遺伝子を発見した。一方、Dicer欠損ES細胞の解析からは、Dicer非依存的にncRNAによりDNAメチル化状態が制御される遺伝子も検出された。このうちの一つでES細胞の多能性維持に重要なSall4遺伝子は、プロモーター領域に長い一本鎖アンチセンスncRNAが存在し、このアンチセンスncRNAによりDicer非依存的にDNAメチル化制御を受けることが判明した。近年、内在性、外来など様々な機能性の非コード(nc)

RNAが標的遺伝子のエピジェネティック制御に関与する事が報告され始めた。内在性ncRNAは細胞種特異的発現を示すものも多く、機能性ncRNAの細胞への導入によるエピジェネティック改変(発現制御)の効率化には、内在性ncRNAの標的遺伝子同定と発現状態との総合理解が必須である。昨年度の解析から、ES細胞の多能性維持に重要なSa114遺伝子は、プロモーター領域に長い一本鎖アンチセンスncRNAが存在し、このアンチセンスncRNAによりDicer非依存的にDNAメチル化制御を受けることが判明した。そこで今年度は、Sa114遺伝子のプロモーター領域に存在するアンチセンスncRNA(ASncRNA)に注目し、機能解析を行った。マウス繊維芽細胞では、Sa114はプロモーター領域が高メチル化で発現が見られないが、Sa114 ASncRNAを一過的に強制発現させることで、プロモーター領域の脱メチル化を誘導できた。一方、内在性Sa114 ASncRNAの機能を解析するために、ES細胞でASncRNAを標的とするshRNAを導入することでノックダウンしたところ、本来低メチル化のSa114プロモーターがメチル化され、Sa114遺伝子の発現も減少し、ES細胞の自己再生にも影響を与えることが確認された。本研究により、内在性Sa114 ASncRNAは、オーバーラップする標的領域の低メチル化状態を維持し、遺伝子の活性化に重要であることが示された。本研究により、ncRNAによりDNAメチル化状態が維持される遺伝子を多数同定できたことから、今後は内在性ncRNAの強制発現やノックダウンにより標的遺伝子のDNAメチル化状態の改変(エピゲノム改変)を基盤として、有用細胞や病態モデル動物を作製するための新技術の確立につながると考えられる。
ハイブリッド・シルクフィブロインによる組識吸収型ステント開発の基盤研究

表記研究課題の成果ならびに、研究経過中にあらたな展開の見られた課題とその成果は以下の通りである。1)繭殻を素材として、温熱処理により絹フィブロインと絹セリシンとの抽出を行った。2)上記試料を低温プラズマ処理にてフィルム上にサブミクロン厚にコーティングした。ダクロン人工血管内面へのコーティング実験を開始した。磁気共鳴装置にて試料の組成を分析した。3)絹セリシン2.5%および5%水溶液を作製し、アミノ酸の組成比率を明らかにし、蛋白質量分析を行った。4)薬剤の架橋封入については、現在詳細な実験計画のもとに試作を進めているが、まだ製品としての完成度は高くない。5)セリシン液についてはマウスにおける長期的実験で、以下のような注目すべき中間結果を得ている。ア)DMBA/TPA塗布による皮膚腫瘍の発生を極めて高率に抑制することが判明した。また、皮膚腫瘍の発育を抑制する作用が示唆された。病理組織学的検討で証明された。イ)加齢による体重の自然増を抑制することが示唆された。病理組織的な検索では、皮下脂肪ならびに結合組織に良好な影響を与えていることが判明した。ウ)免疫染色による血管壁の観察から、末梢循環動態を改善していることが判明した。エ)その他5)以上の成果をもたらす本質を明らかにするべく次の検討を企画する必要がある。新医療材料の開発は、同時に新薬の開発につながる可能性が出現し、今後は両面での基盤研究を推進するとともに、一日も早い前臨床試験に結び付けたい。平成14年度の研究実績は以下の通りである。1)医用高分子材料であるダクロン製人工血管の表面親水化を低温プラズマ処理にて行い、表面にナノミクロン厚のシルクフィブロイン・コーティングを成功させた。2)別にシルクフィブロインおよびシルクセリシンと、各種抗癌剤および抗生剤、水溶性ヨード剤との混和試験を実施、素材の変性を解析した。3)以上の解析結果から安全性を確認し、フィブロイン格子型固定材料に3種類の細胞組織活性物質(抗血栓剤・抗炎症剤、抗生剤)を封入することに成功、生体体温下にこれらの物質が時系列的に徐放される量を測定中である。すでに、予測どおりの徐放量が測定され始めた。4)ヌードマウス35匹を7群に分け、材料を皮膚に塗布し、皮膚変化を時系列的に観察中である。対照は発ガン物質DMBAおよびプロモータTPA塗布群で、病理学的および細胞免疫的に群間比較検討を行っている。5)高容量X線照射については詳細な実験計画を作成できたので、15年度4月より研究開始する。以上、ほぼ計画どおりの進行であり、2件の特許出願、一件の国内研究会発表、2件の国際学会発表を終えた。15年度のブタ血管内留置による各種実験の準備も周到に整ったので、研究を鋭意継続する計画である。1)温熱処理によって絹セリシンの抽出を行い、2.5%および5%水溶液を作製した。本試料を電気泳動および高速液体クロマトグラフィーにて組成分析し、特に各種アミノ酸の構成比率を明らかにした。現在は、ペプチド結合の分析を急いでいる。2)甲本研究室では、上記試料を低温プラズマ処理にてフィルム上にサブミクロン平均厚にコーティングすることに成功し、現在ダクロン人工血管内面へのコーティング実験を継続している。これと並行して、磁気共鳴駆使し試料の組成をさらに詳細に分析している。3)隈崎研究室では、上記電気泳動および液クロによる可視バンドのDNA分析を行い極めて興味深い結果を得た。また、薬剤の架橋封入については、現在詳細な実験計画を立てて進めているが、まだ製品としての完成度は高くない。

4)開発試薬についてはラットにおける長期的実験で、以下のような注目すべき中間結果を得ている。ア)DMBA/TPA塗布による皮膚腫瘍の発生を極めて高率に抑制することが判明。また、発生した皮膚腫瘍の発育を抑制する作用が示唆されている。これらは病理学的な検討にて証明された。イ)加齢による体重の自然増を抑制する可能性が示唆された。この現象を示すラット群では、対照群と同量の食事を摂取し、同程度の運動量を消化している。病理組織的な検索では、皮下脂肪ならびに結合組織に良好な影響を与えていることが判明。ウ)免疫染色による血管壁の観察から、末梢循環動態を明らかに改善していることを示唆した。
中枢バソプレシンの循環機能調節因子としての役割

循環機能は神経性および体液性因子によって調節されている.私達はこれまで神経性の循環調節因子としてのタキキニン・ペプチドの役割を検討してきた.その結果,タキキニン・ペプチドは中枢から交感神経を介する系と,下垂体からのバソプレシン遊離による系との二つの機構によって循環調節を行なっているという興味深い結果を得た.そこで本研究ではその経験を生かし,バソプレシンの循環調節役割について,機能的および分子生物学的手法を用いて,総合的な解明を試みた.特にバソプレシンに注目したのは,最近,バソプレシンのV1およびV2受容体に選択性の高い拮抗薬が開発され,バソプレシンの生理的多様性が解明されているからである.平成6年と7年の2年間に亘る科学研究費補助金によって,十分に計画を推進することができた.私達はバソプレシン受容体結合実験やバソプレシン受容体mRNAの発現実験から,血管運動中枢の延髄の孤束核や視床下部,さらに海馬にバソプレシン受容体が存在していることを明らかにできた.また,脳のバソプレシン受容体は従来の末梢のV1およびV2とは異なる性質を有している可能性も示唆された.さらに,動脈圧受容器反射の感受性変化に対する脳幹のバソプレシン受容体の関与を検討した.その結果,正常血圧ラットの場合,動脈圧受容器反射の感受性は,最後野のV1受容体により抑制的に,V2受容体により亢進的に,それぞれ調節されていることが明らかになった.バソプレシン受容体mRNA発現実験の成績では,正常血圧ラットの最後野ではV1aまたはV2いずれのmRNAも検出できなかった.しかし,上記の高血圧モデルラットで,正常血圧ラットには認められなかった最後野のV2受容体mRNAが,高血圧発症中期の動脈圧反射の感受性亢進の時に発現した.一方,ある種の高血圧モデルラット(腎性体液過剰型高血圧モデルラット)の高血圧発症中期では,動脈圧受容器反射の感受性が強く亢進することを認めた.これは,昇圧反応に最後野のV2受容体の関与が示唆された.循環機能は神経性および体液性因子によって調節されている.私達はこれまで神経性の循環調節因子としてのタキキニン・ペプチドの役割を検討してきた.その結果,タキキニン・ペプチドは中枢から交感神経を介する系と,下垂体からのバソプレシン遊離による系との二つの機構によって循環調節を行なっているという興味深い結果を得た.そこで本研究ではその経験を生かし,バソプレシンの循環調節役割について,機能的および分子生物学的手法を用いて,総合的な解明を試みた.特にバソプレシンに注目したのは,最近,バソプレシンのV1およびV2受容体に選択性の高い拮抗薬が開発され,バソプレシンの生理的多様性が解明されているからである.平成6年と7年の2年間に亘る科学研究費補助金によって,十分に計画を推進することができた.私達はバソプレシン受容体結合実験やバソプレシン受容体mRNAの発現実験から,血管運動中枢の延髄の孤束核や視床下部,さらに海馬にバソプレシン受容体が存在していることを明らかにできた.また,脳のバソプレシン受容体は従来の末梢のV1およびV2とは異なる性質を有している可能性も示唆された.さらに,動脈圧受容器反射の感受性変化に対する脳幹のバソプレシン受容体の関与を検討した.その結果,正常血圧ラットの場合,動脈圧受容器反射の感受性は,最後野のV1受容体により抑制的に,V2受容体により亢進的に,それぞれ調節されていることが明らかになった.バソプレシン受容体mRNA発現実験の成績では,正常血圧ラットの最後野ではV1aまたはV2いずれのmRNAも検出できなかった.しかし,上記の高血圧モデルラットで,正常血圧ラットには認められなかった最後野のV2受容体mRNAが,高血圧発症中期の動脈圧反射の感受性亢進の時に発現した.一方,ある種の高血圧モデルラット(腎性体液過剰型高血圧モデルラット)の高血圧発症中期では,動脈圧受容器反射の感受性が強く亢進することを認めた.これは,昇圧反応に最後野のV2受容体の関与が示唆された.下垂体後葉ホルモンとしてのバソプレシン(AVP)の作用はよく知られているが、脳におけるAVPの神経伝達物質としての生理的意義に関しては不明な点が多い.本研究において,平成6年度は次の点に関して明らかにすることができた.1.脳におけるAVP受容体サブタイプとその性質放射ラベルの^3H-脳におけるAVPをリガンドに用いて脳,特に海馬や延髄の孤束核に注目して結合実験を行った.その結果,^3H-AVP結合は海馬および孤束核ともに,非ペプチド性のV_1受容体拮抗薬で強く阻害され,V_2拮抗薬での阻害は弱かった.しかしながら,中枢作用の強いAVPフラグメントのAVP_<4-9>は^3H-AVP結合に対してなんら阻害を示さなかった.次に末梢組織のAVP受容体のcDNAの塩基配列をもとに作成されたAVPのV_<1a>およびV_2受容体のプローブを用いて,中枢AVP受容体の発現をRT-PCR法によって検討した.その結果,興味深いことに,海馬や孤束核において,V_2受容体mRNAの発現が確認された.しかし,V_<1a>受容体mRNAの発現は認められず,結合実験の成績との間に矛盾が生じた.この点は次年度の研究課題である.

現時点での考察として,脳におけるAVP受容体は末梢のV_<1a>受容体とそのシークエンスの一部が異なる新規AVPV_1サブタイプである可能性が考えられる.下垂体後葉ホルモンとしてのバソプレシンの作用はよく知られているが,脳におけるバソプレシンの神経伝達物質としての生理的意義に関しては不明な点が多い.本研究において,平成6年度は,中枢神経系のバソプレシン受容体について,その性質と分布を明らかにした.本年度は,主に脳におけるバソプレシンの生理的役割について研究を試みた.昨年度の研究から,中枢において、脳幹の孤束核(NTS)や最後野(AP)などにバソプレシン受容体が比較的多く存在することに注目した.孤束核や最後野などは動脈圧受容器反射において大切な部位と考えられているので,動脈圧受容器反射の感受性変化に対する脳幹のバソプレシン受容体の関与を検討した.その結果,正常血圧ラットの場合,動脈圧受容器反射の感受性は,最後野のV1受容体により抑制的に,V2受容体により亢進的に,それぞれ調節されていることが明らかになった.一方,ある種の高血圧モデルラット(腎性体液過剰型高血圧モデルラット)の高血圧発症中期では,動脈圧受容器反射の感受性が強く亢進することを認めた.これは,昇圧反応に最後野のV2受容体の関与が示唆された.バソプレシン受容体mRNA発現実験の成績では,正常血圧ラットの最後野ではVlaまたはV2いずれのmRNAも検出できなかった.しかし,上記の高血圧モデルラットで,正常血圧ラットには認められなかった最後野のV2受容体mRNAが,高血圧発症中期の動脈圧反射の感受性亢進の時に発現した.
クラミドモナスの遺伝子発現のリアルタイムモニタリング

クラミドモナスは単細胞性半数体の緑藻の一種であり、寒天平板上でコロニーを形成し、遺伝子学的解析が容易である。半数体であるため、突然変異体の分離も容易である。このような優れた特性から、クラミドモナスは「Green yeast」とも称されてモデル植物の一つとなっている。細胞の凍結保存法の開発、高効率の遺伝子移入法の開発、Expression tagの網羅的解析、整列コスミドクローンの整備、DNAチップの開発などのクラミドモナスの分子遺伝学、ゲノム学の研究基盤が日本で確立されつつある。また、クラミドモナスは核、葉緑体、ミトコンドリアをそれぞれ一つずつ持っており、これらの細胞器官のゲノムにそれぞれ遺伝子移入できる唯一の生物である。そのため、核、葉緑体、ミトコンドリアの三ゲノム間での遺伝子発現の相互作用を研究する上で最適の材料と言える。クラミドモナスは生物時計の研究材料としても用いられてきており、概日性リズムの変異体も報告されている。ところが生物時計の運行を容易に計測する手段が欠けている。そこで我々は、藍色細菌やシロイヌナズナで成功している人為的生物発光系の組み込みをクラミドモナスで試みた。現在、核と葉緑体への発光遺伝子の組み込みに成功しており、有意の生物発光を観察することに成功している。葉緑体発光株で生物発光リズム系の開発に成功したが、発光レベルが低すぎてまだ実用の域には達していない。クラミドモナスでは遺伝子発現を制御するDNA領域が必ずしもまだ明らかではないので、発光コンストラクトを詳細に解析することにより、生物発光リズム系を確立したい。一旦系が確立すれば、遺時計伝子クローニングへの道は遠くないと考えている。これと並行して、核、葉緑体、ミトコンドリアでDNAチップを開発し、発現リズムを示す遺伝子群の網羅的解析を進めており、得られた知見を発光コンストラクトの作製に生かしたい。
含ホウ素環状共役系化合物の合成と物性

3価ホウ素はカルボカチオンと等電子構造であると考えられる。この観点にたちアズレン等電子構造化合物として、チエノ[3,4-d]ボレピン(1),チエノ[2,3-d]ボレピン(2)あるいはピロロ[3,4-d]ボレピン(3)を設計、合成し、諸性質検討から、以下のことを見いだすことが出来た。1)反磁性環電流が発現していることから、上述の化合物は芳香族である。2)1)の結果は同時に、ホウ素がπアクセプターとして作用していることを意味している。すなわち1a、2a、3aはホウ素を負末端とする双極子を持つ。3)ケイ光スペクトルの溶媒効果から算出すると、1aと2aにおける励起および基底状態の双極子モーメントの差(μe-μg)はかなり大きい(--10デバイ)。4)一方、一連の化合物吸収スペクトルは、(μe-μg)の値が大きく変化しても長波長シフトを示さない。即ち、青色光透過性を保持する。さらにこれらの研究を基にし、NMRスペクトル、凝固点降下、蒸気圧浸透圧、X線構造解析によりジエチル(3-ピリジル)ボラン(4)を精査し、以下の結果を得た。1)4は、ピリジン環窒素のローンペアーとホウ素からなる分子間配位結合により、溶液および結晶中で環状四量体を形成している。self-assembly現象である。これらの結果を2個の論文を投稿中である。また、ピロロ[3,4-d]ボレピン(3)の窒素アニオン体(ピロール環窒素のアニオン)については、前駆体として、窒素原子をシリコンで保護したピロロ[3,4-d]スタネピンをすでに合成することが出来た。分子設計および分子軌道計算のためパソコンMacLIII4MB/HD80を使用した。合成に際し、デジタルバキュームコントローラーを用いて目的物精製を行い、器具乾燥器は通常の使用をした。旅費、謝礼は以上の成果発表と討論のために用いた。
高機能メタマテリアル電波吸収体の開発

電波吸収体の高機能化に向け、主に吸収特性の広帯域化と所望の入射角度および偏波に対応するための設計手法を開発する。検討する電波吸収体は複数の共振回路から構成されるため、電磁界および回路シミュレータを駆使して、その等価回路と物理的な構造の関係について明らかにする。またこれらの議論を踏まえ、開発した設計理論の適用限界を示す。
天然成分によるP53下流遺伝子を標的とした骨肉腫に対する新しい分子標的治療戦略

p53遺伝子は骨肉腫においても高率に不活性化しているきわめて重要な癌抑制遺伝子であるが,p53下流遺伝子の発現をp53遺伝子非依存的に調節できれば,p53遺伝子の不活性化を有する骨肉腫細胞に対しても強力な抗腫瘍効果を発揮することが可能である。本研究の目的,p53下流遺伝子を標的分子とした導入効率の高い天然成分を用いて,腫瘍組織選択的に強力な増殖抑制効果および殺細胞作用を有する新しい骨肉腫治療戦略を確立することである。前年度の実験では,ブロッコリーなどに含まれるイソチオシアネート類の化合物であるsulforaphane(SFN)が,p53下流遺伝子であるDR5(Death Receptor5)を誘導し,SFNとDR5のリガンドであるTRAIL(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand)との併用で,骨肉腫細胞選択的かつ相乗的に著明なアポトーシスを誘導することをin vitroで証明した。本年度の実験結果では,SFNはマウス骨肉腫細胞に対して,細胞増殖を抑制し,細胞周期停止とアポトーシスを誘導した。さらにヌードマウスを用いた実験では,SFN投与群の腫瘍体積は対照群に比べて有意に減少した。現在,in viroにおいてSFNによるp53下流遺伝子の発現の確認,安全性の確認,原発巣および転移巣に対する抗腫瘍効果の検討を行っている。また他の実験では,天然成分のスクリーニングの結果,シダ植物から抽出した化合物cryptolepineがp53下流遺伝子であるp21遺伝子の発現をp53非依存的に誘導することを明らかとし,p21の転写調節機構について検討した。本研究の結果から,上記化合物がp53の失活により治療に抵抗性となった骨肉腫に対して,今後新規の分子標的治療薬となる可能性があると考えた。p53遺伝子は骨肉腫においても高率に不活性化しているきわめて重要な癌抑制遺伝子であるが,p53下流遺伝子の発現をp53遺伝子非依存的に調節できれば,p53遺伝子の不活性化を有する骨肉腫細胞に対しても強力な抗腫瘍効果を発揮することが可能である.本研究の目的は,P53下流遺伝子を標的分子とした導入効率の高い天然成分を用いて,腫瘍組織選択的に強力な増殖抑制効果および殺細胞作用を有する新しい骨肉腫治療戦略を確立することである.天然成分のスクリーニングの結果,ブロッコリーなどに含まれるイソチオシアネート類の化合物であるsulforaphaneが,p53下流遺伝子のTNF(Tumor Necrosis Factor)レセプターファミリーであるDR5(Death Receptor 5)を骨肉腫細胞に著明に誘導することが明らかとなった。さらに,sulforaphaneとDR5のリガンドであるTRAIL(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand)との併用で,正常末梢血単核球細胞には影響を及ぼさずに,骨肉腫細胞選択的かつ相乗的に著朋なアポトーシスを誘導することをin vitroで証明した.現在,in vivoにおいてsulforaphaneによるp53下流遺伝子の発現の確認,安全性の確認,原発巣および転移巣に対する抗腫瘍効果の検討を行ろている.また,b53下流遺伝手であるp21遺伝手の発現を誘導する新規の天然成分を同定しており,この薬剤における抗腫瘍効果に関しても検討中である.p53遺伝子は骨肉腫においても高率に不活性化しているきわめて重要な癌抑制遺伝子であるが,p53下流遺伝子の発現をp53遺伝子非依存的に調節できれば,p53遺伝子の不活性化を有する骨肉腫細胞に対しても強力な抗腫瘍効果を発揮することが可能である。
ハムスターの冬眠調節機構と低体温時の細胞保護機構の解明

冬眠動物であるハムスターを用い、非冬眠時の中枢性体温下降機構を検討すると共に、冬眠時の体温下降機構、冬眠維持機構、冬眠からの覚醒機構の中枢性制御機構について検討を行い、以下の知見を得た。冬眠導入期(冬眠開始より17時間後)ハムスターの側脳室にアデノシンA1受容体選択的遮断薬CPT3nmolを投与するとハムスターの体温は自然に覚醒する場合と同様、約3時間で正常体温の37°Cまで上昇したが、冬眠維持期(冬眠開始より30時間後)に投与しても冬眠からの回復は見られなかった。一方、オピオイド受容体拮抗薬ナロキソン10nmolの投与は冬眠導入期においては体温上昇は起こさなかったが、冬眠維持期に投与すると自然に覚醒する場合と同様、約3時間で正常体温の37°Cまで上昇した。この結果は、冬眠導入期の体温下降には中枢アデノシン系が、冬眠の維持には中枢オピオイド系が重要な役割を演じていることを示している。また、TRHの側脳室内投与では冬眠導入期、冬眠維持期のどちらにおいても体温を上昇させた。従って、冬眠からの覚醒には中枢TRH系が重要な役割を担っていると考えられる。また、冬眠からの覚醒期における体温上昇には中枢TRH-交感神経系を介して褐色脂肪細胞の熱産生を促進させることが強く示唆された。ラット培養大脳皮質ニューロンにおいて、培養温度を22°C以下に低下させると、温度低下に依存したアポトーシス様の神経細胞死が発現した。18°Cの低温培養により発現する神経細胞死に対し、アデノシンは用量依存性に神経保護作用を発現させた。非選択的オピオイド受容体作動薬であるモルヒネも用量依存性の神経保護作用を発現させ、この効果はナロキソンにより拮抗された。さらにヒスタミン、セロトニンも神経保護作用を発現させた。これらの結果から、アデノシン、オピオイド類、ヒスタミン、セロトニンなどの冬眠制御物質は、冬眠時ハムスターの体温を下降、低体温を維持させるとともに、低温により誘発される障害から神経を保護し、神経機能を維持していると考えられる。【冬眠の神経調節機構の解明】自然冬眠導入期ハムスターの側脳室にアデノシンA1受容体拮抗薬を投与すると、体温が急激に上がり低体温から回復したが、オピオイド拮抗薬の投与では低体温からの回復は観察されなかった。一方冬眠期ハムスターの側脳室にオピオイド拮抗薬を投与すると、体温が急激に上がり冬眠から回復したが、アデノシンA1受容体拮抗薬の投与では冬眠からの回復は観察されなかった。TRHの側脳室投与では、冬眠導入期、冬眠期いずれの時期においても回復が認められた。これらの結果から冬眠導入期には中枢アデノシン系が、冬眠時の低体温維持には中枢オピオイド系が、低体温からの熱産生には中枢TRH系が関与していると考えられる。【冬眠時の神経保護因子の検索】ラット培養大脳皮質ニューロンにおいて、培養温度を22°C以下に低下させると、温度低下に依存したアポトーシス様の神経細胞死が発現した。18°Cで培養した場合、ラット(非冬眠動物)とハムスター(冬眠動物)の神経細胞では同様の時間経過で神経細胞死が発現した。

18°Cの低温培養により発現する神経細胞死に対し、アデノシンは用量依存性に神経保護作用を発現させた。アデノシンの神経保護作用はA1受容体拮抗薬およびA2受容体拮抗薬により減弱した。非選択的オピオイド受容体作動薬であるモルヒネも用量依存性の神経保護作用を発現させ、この効果はナロキソンにより拮抗された。さらにヒスタミン、セロトニンも神経保護作用を発現させた。これらの結果から、アデノシン、オピオイド類、ヒスタミン、セロトニンなどの冬眠制御物質は、冬眠時ハムスターの体温を下降、低体温を維持させるとともに、低温により誘発される障害から神経を保護し、神経機能を維持していると考えられる。平成13年度の成果において、冬眠導入期の体温下降には中枢アデノシン系が、冬眠の維持には中枢オピオイド系が重要な役割を演じていることを示した。また、TRHの側脳室内投与では冬眠導入期、冬眠維持期のどちらにおいても体温を上昇させることをた。従って、冬眠からの覚醒には中枢TRH系が重要な役割を担っていると考えられる。今年度は、中枢神経系における受容体レベルでの動態変化と、冬眠からの覚醒時の熱産生における末梢褐色脂肪細胞の役割を追究した。冬眠導入期(体温下降開始17時間後)、視床下部adcenosine A1受容体はdownregulationされていた。しかし時間が経過するにつれてコントロールレベルに近づいた値となった。一方、opioid μ受容体は全冬眠期間中の各期において、Bmax、Kdの変化は認められなかった。以上の結果より、導入期の体温下降は、A1受容体を介する中枢adenosine系の活性化により引き起こされていることが示唆された。また、冬眠維持期において、opioidμ受容体のBmax、Kdの変化は認められなかったが、維持期の低体温がnaloxoncで解除されること、opioidμ受容体作動薬が強力な体温低下作用を示すことから、冬眠維持期の低体温はopioidμ受容体を介する中枢opioid系により制御されることが強く示唆された。ハムスターの側脳室にTRHを投与すると直腸温度の上昇に先行してBAT温度が上昇した。また、BATを支配している交感神経線維を切除するとTRHによるBAT温度上昇は有意に抑制された。さらに、TRHによるBAT温度の上昇はb3受容体拮抗薬により抑制された。これらの結果から、TRHは交感神経を介してBATにおける熱産生をb3受容体を介して冗進させていることが示唆された。
人権条約実施状況の分析を通じた欧州地域秩序の「憲法化」構造の把握

欧州では、人権条約制度、EUおよび各国は、価値の共有意識を基盤として、制度的にも緊密な関係を保ち、一種の「憲法秩序」としてのまとまりをもっている。しかし、この憲法秩序においては、人権条約制度ないしEU制度が階層的秩序の頂点に立つというような、近代国内憲法(学)が想定するようなヒエラルキー構造は存在しない。内部的な各国との緊張関係のゆえに、人権裁判所も介入を可能な限り価値中立的に行おうとする。比例原則の一般化はそれを示す代表例である。しかし他方、外部との関係では、人権の原則的な保障を確保しようというモーメントが強く働く。ノン・ルフールマン原則の解釈適用でもその傾向が現れている。研究員・技術補佐員各1名(いずれも非常勤)を雇用し、連絡網の整備・研究会ホームページの作成準備を含め、研究会の体制を整えることを重視するとともに、判例研究の基礎作業として、研究対象判例候補の選定のための基礎資料作りに着手した。判例研究を主として各研究参加者のイニシアチヴで開始し、それぞれの研究発表に生かすとともに、一部については、研究会での報告・討論の対象とした。ストラスブール(フランス)およびフライブルグ(ドイツ)でのシンポジウムおよびセミナーを共催し、本研究参加者が主として本研究の基礎となる着想および今後発展させるべき概念について報告を多数組織して行い、主としてヨーロッパ側の参加者からコメントを得た。これらの活動の結果として、現在のところ考えられている着想および概念は、次の通りである。ヨーロッパ・レヴェルの人権秩序は、各国の基本権保障秩序の調和にとって最も重要なフォーラムを提供するものであるが、後者の上位に立ち、後者を併呑していくような性質のものとはいえない。その意味で、ヨーロッパ人権秩序は多(重)層的あるいは多元的なものであり、国際法と国内法の関係について従来論じられてきた一元論も二元論もこうした事態をうまく説明するものではない。こうした事態は、ヨーロッパ・レヴェルの秩序および各国法秩序の双方に困難な問題を提起する。従来、これらの法秩序は、それぞれ自らの一貫性をほとんど最優先の課題として追求してきたが、多元化によりその見直しが迫られているからである。この問題の解決については、法理論として十分な対応を見いだすには至っていないが、一つの着想として従来国際私法で議論されてきた観念が有効ではないか、というものが提示されている。ヨーロッパ人権裁判所の近年の判例の全体動向をレヴューし、より詳細な研究対象とする判例を選定した。選定された判例について、研究参加者が分担して研究を進める体制を構築し、一部については、判例報告を研究会で検討した。その過程で、いくつか判例研究として公表した。人権裁判所や判決執行監視制度の改革については、研究代表者を中心に資料収集と聞き取りにつとめ、研究会でたひたび議論したほか、さしあたり第15、第16議定書については、翻訳して検討した。より広く、EU法との関係や地域秩序自体の「憲法化」については、研究参加者の個別研究の形で精力的に研究成果の発表がすすめられている。そこで注目される視角としては、多元主義的憲法化(憲法多元主義)や、(国際的・国内的審級の間の)司法的対話といったものがあげられる。個別分野の研究としては、EUを中心とした刑事司法制度のハーモナイゼーションをめぐる議論が注目される。これらの研究成果を研究会全体の議論に結びつけていくことが課題となっている。本年度は、ヨーロッパ人権条約(以下、条約)の実施過程、とりわけヨーロッパ人権裁判所の判例の研究を進めると同時に、「憲法化」構造の把握という研究目的に即して研究のとりまとめにとりかかった。判例の分析からは、対テロ措置と人権という世界共通の課題とともに、「周辺」や「外部」との関係で、これまでの国内的な人権保障では見られなかった困難な問題を抱える一方で、それに対する「人権」という観点から新たな解決を与えようとする努力がみられることが分かった。それは、EU司法裁判所とともに、(世界とも緊張を含む関係を維持しつつ)欧州全域に公共的な秩序を打ち立てようとする努力とも評価できる。もっとも、こうした努力は、とりわけ人権裁判所の判例実施にあたっての欧州評議会閣僚委員会の活動にも支えられていることに注意が必要である。この状況においては、一方で、世界全体の(あるべき)秩序、他方で、国内で強固に確立している各国の憲法秩序、との緊張関係を生じさせている。ロシアとの関係の冷え込みやイギリスの保守党政権の条約からの脱退の意思表明は、後者の現れでもある。前者との関係では、条約(および人権裁判所の判例)の影響が、アジアを含む諸国にも顕著に及び、このスピルオーバー現象をどう評価するかという困難な問題を提起するようになっている。

こうした新しい動向とりわけ最後の問題について、ウィーン経済大学との共催でウィーンでEuropean Human Rights System beyond Europeというテーマでワークショップを開催し、研究会のメンバーが多く報告し、また、ヨーロッパ各地の招聘者と議論を深めた。26年度が最終年度であるため、記入しない。国際法学26年度が最終年度であるため、記入しない。10月末に追加採択の通知があり、とくに研究員および技術補佐員の雇用は12月ないし1月にならざるをえず、H24年度は研究会の体制作りに重点を置かざるをえず、十分な判例研究の体制的な準備ができていなかった。理論研究に着手する予定であったが、仮説の提示(それ伴うレビューの受信)や上記の理由により情報収集にとどまった面が強い。研究全体のベースとなるヨーロッパ人権裁判所判例の分析作業のために、その基礎的作業として判例の全体動向のレヴューを計画し、実施しているが、近年、判例の量的・質的拡大は予想以上に著しく、この作業に時間をとられた。詳しい検討を行う判例の選定がようやく終了したが、他方で、ヨーロッパ人権裁判所の「ヨーロッパ憲法秩序」における位置づけについての分析作業は、まだ手を付けられた段階となってしまっている。判例研究という地道な活動を引き続き重視する。そのため、早期に研究会の「判例レビュー・セッション」を開催して研究対象判例の特定につとめる。理論研究をよりいっそう推進するため、先頃文案確定した欧州連合(EU)のヨーロッパ人権条約への加入についての研究や人権裁判所改革をめぐる議論についての研究を重視して、取り組む。ヨーロッパの研究者・実務家との交流を引き続き重視する。ヨーロッパ人権裁判所の近年の判例について、選定された重要判例についての検討をすすめ、分担された判例解説の原稿について集団的な議論を集中的に行う。個々の判例を超える問題について、EUや各国裁判所との関係などの研究をすすめ、2014年度後半を中心に、分担者の成果を集団的に議論する。以上の過程で、編集企画ができあがっている『ヨーロッパ人権裁判所の判例II』の編集・刊行準備をペースメーカーとして、研究を推進する。9月にウィーンで国際ワークショップを開催し、これまでの研究成果について、研究会内外の・国際的な検討を行い、研究成果のとりまとめをすすめる。
感染性牛白血病ウイルスの新規高感度検出法の開発

本研究では、転写活性化因子Taxの高活性型変異株を用いてシンシチウムアッセイ用高感度標的細胞の開発を行った。高活性型Tax発現ベクターを構築し、HeLa細胞に導入して細胞内局在、細胞周期のG1期停止およびアポトーシス誘導能が野生型と変わらないことを確かめた。加えて網羅的発現解析によりTax発現がアポトーシス、細胞周期、転写活性化、細胞増殖、免疫関連の遺伝子の発現を制御していることを確かめた。牛白血病ウイルス(BLV)感染は近年拡大の一途を辿っており、それに伴いBLVが生乳や生肉などの畜産物やウシ由来の生物製剤、ワクチンなどへ迷入するリスクは非常に高くなっている。感染細胞や感染性ウイルス粒子が、このような環境中へ拡散した場合は、大きな社会問題となることは疑いないが、現時点で高感度に環境中の感染性BLVを検出する方法は存在しない。そこで本研究では、申請者らが発見したBLV転写活性化遺伝子taxの高活性型および開発したリアルタイムPCR法による高感度BLV検出法を駆使して、環境中に迷入した微量な感染性BLVを検出・定量可能な方法を新しく確立する事を目的とした。はじめに高活性型BLV転写活性化遺伝子tax(TAX D247G)をHeLa細胞に導入し、その発現を確認をFlag-tagを用いて確認し、続いてLuc assayにより、Wild typeよりTax D247Gが高い転写活性化能を有する事を確認した。しかしながら、Tax蛋白は高いアポトーシス活性を有することが知られており、安定発現株の調整は非常に困難であった。そこで、Taxの発現による細胞への効果を調べるために、Tax導入細胞のmRNAをもちいて、マイクロアレイによる網羅的発現解析を行い、Tax D247Gの発現により、計139遺伝子の発現に変化が起こることを明らかにした。これら遺伝子は転写/翻訳、シグナル伝達、細胞増殖、アポトーシス、ストレス応答および免疫応答に関与するものであった。特に高活性化型Taxは多種類の遺伝子を幅広く制御していた。また新たに、Tax遺伝子が自然免疫系の抑制を行ったり細胞のストレス応答を誘導していることが明らかとなった。これらの結果を利用して今後Tax安定発現株の作成に取り組む予定である。本研究の目的は高転写活性型BLV-Tax変異体発現細胞を用いた高感度BLV検出法の構築である。はじめに、野生型Tax(WT)、高活性型Tax(D247G)および低活性型Tax(S240P)をPCR法を用いて増幅し、その増幅産物を真核細胞発現用ベクター(pCAGGS)にサブクローニングした。得られたTax組換えプラスミドを、BLVLTR領域を有するレポータープラスミドpGV-BLTRと共にHeLa細胞に導入したところ、Taxの発現はTaxWT, TaxD247GおよびTaxS240Pで同程度であったが、ルシフェラーゼ法により測定した転写活性化能はD240G>WT>>S240Pであり、構築したプラスミドが有効に機能している事を確かめた。さらにTax発現の効果を調べるために、cDNAマイクロアレイ解析を行った。その結果、転写、シグナル伝達、細胞増殖、ストレス応答の発現誘導および免疫応答遺伝子の発現抑制が認められた。続いてウシ由来細胞23CLNに野生型Tax、高活性、低活性型Taxの3種類をそれぞれ導入して、マイクロアレイ解析で有意に変動のあった遺伝子の発現量の変化を調べたところ、免疫応答に関与する遺伝子のうちIFIT3はTaxWTで、他の変異体と比較して著しく高い応答を示していた。本年度は、Tax発現細胞作製用プラスミドの構築に成功し、動物種の違いによりどの細胞側の因子が異なるかの解析を行った。H24年度はこの情報を基盤に細胞種を選定し、高感度にBLVを検出可能な細胞株を作製する。また本年度は、BLV感染の検出系として用いるBLV-CoCoMo-qPCRの検出感度の改良に取り組んだ。CoCoMo-qPCRではプライマーが高い縮重度を有する事に由来する難点が見いだされたため、プライマー濃度の検討やDNA量の検討、プライマー配列の再検討を通して、大幅に感度を上昇させる事に成功した。H23年度は、高活性型Tax発現プラスミドの構築に成功し、それが有効にBLVの発現を効率的に誘導している事を確かめた。さらに、自然宿主であるウシにおいてはヒト細胞とは異なり、免疫応答に関与する遺伝子の促進が見られた事から、高感度にTax遺伝子を検出する細胞は、ウシではなく、ヒトをはじめとした異種の細胞が適している事を見いだした。これらの情報はBLV検出に最も有効な細胞の効率的な選定が可能となった。一方、検出に用いるCoCoMo-qPCRの感度の改良にも成功しており、順調な進展が見られていると判断した。H23年度の成果により、プラスミドの構築および細胞種選定のためのルシフェラーゼ法の確立に成功した。

一方、BLV-CoCoMo-qPCRの検出感度は、H23年度に大幅な向上が見られたため、H24年度は構築された細胞を用いてBLVの高感度検出に着手する。Tax発現により免疫応答が強く誘導されるとBLVの感染が見えにくくなる可能性があるため、IFIT3をはじめとした免疫応答遺伝子の発現を指標として、最も適した細胞株の選定を行う。具体的には、以下のように実験を進める予定である。1.様々な動物種由来の細胞種に高活性型Tax遺伝子を発現させ、ルシフェラーゼ法による転写活性化能の測定およびIFIT3の発現解析を行う。2.選定された細胞株について、Tax安定発現細胞株を作製する。3.細胞株からDNAを抽出し、CoCoMo-qPCRによりBLVの検出および定量を行う。4.乳清や血清、そして市販のワクチンや生物製剤にBLV粒子を添加し、BLVの迷入の検出試験を行う。次年度は、細胞購入費(20万円)、細胞培養試薬購入費(30万円)、遺伝子導入試薬購入費(20万円)、プラスミド精製試薬購入費(10万円)、DNAシークエンス・PCR試薬の購入費(30万円)、リアルタイムPCR試薬購入費(30万円)、検証用生物製剤購入・輸送費(20万円)を使用予定である。