hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
湖沼および海洋におけるツボカビの多様性と機能評価：検出方法の開発と物質流の定量化

湖沼および海洋に生息するツボカビの多様性を解明するために、Single Spore PCR法を開発・適用した。印旛沼や琵琶湖では、新規クレードを含む多様なツボカビやクリプト菌が特定の珪藻に寄生していることが明らかになった。ツボカビは宿主特異性が高いと考えられてきたが、一種の菌が複数の珪藻に寄生することも判明した。東京湾においては、クリプト菌など多様な菌類が表水層に存在することが明らかとなった。ツボカビ生物量とツボカビを介した物質流Mycoloopの定量化のために、幾つかの方法を検討した結果、定量PCR法と培養実験、数理モデルを併用することで、それらの重要性を定量的に評価できた。平成25年度は、1ツボカビのデータベース構築、2ツボカビの検出・定量方法の開発、3ツボカビを介した物質流Mycoloopの評価および4物質循環モデルの提示、に取り組んだ。検出方法として、ツボカビの胞子体(直径数μm)1個が寄生した珪藻からツボカビの遺伝子のみを解析する手法を開発した。培養している珪藻に寄生するツボカビを用いて、DNA抽出方法、DNAのPCR増幅に用いる酵素、及び試料の状態について検討し、最適な手法を検討した。次に、開発した方法を琵琶湖と印旛沼で採集した珪藻4種に適用したところ、ツボカビ目Rhizophidiumクレードだけでなく、2つの未記載の真菌類の系統、真菌類で最も祖先的な系統であり生態がよく分かっていないクリプトマイコータ、および酵母の塩基配列が得られた。ツボカビを含む真菌類の単一の系統が複数の珪藻種に付着または寄生することと、複数の真菌類の系統が単一の珪藻種に付着することから、淡水性真菌類と珪藻種の相互関係は入れ子構造をなしている可能性が浮かび上がってきた。Mycoloopのうち、花粉ー分解性ツボカビー動物プランクトン、について、培養系において定量化を行った。捕食実験から、ミジンコは花粉を直接捕食することはできないが、花粉を分解したツボカビの遊走子は捕食することが明らかとなった。また成長実験により、花粉のみではミジンコは殆ど成長しないが、分解性ツボカビがいると成長速度が高くなることが明らかとなった。この結果から、寄生性ツボカビだけでなく、分解性のツボカビも湖沼生態系の中で物質流(Mycoloop)を駆動している可能性が示唆された。ツボカビを考慮にいれた物質循環モデルの提示の第一歩として、ツボカビの生物量やMycoloopの重要性について、実験や数理モデルなどもふくめて、これまでの研究成果を総説としてまとめ、発表した。平成26年度は、1水圏のツボカビの多様性評価、2ツボカビの検出・定量方法の開発、3ツボカビを介した物質流Mycoloopの定量化、に取り組んだ。目的1については、平成25年度に開発した微量DNA解析方法を適用し、印旛沼や琵琶湖で昨年度に引き続き新しい系統を発見した。複数の単離培養株を得られる事ができ、珪藻に寄生するツボカビについては電子顕微鏡による形態観察を行い、新種や新属の発見と言えそうな結果が得られている。東京湾に関しては、表層中にもCryptomycotaなどの真菌類がいることは明らかとなったが、ツボカビは検出されなかった。ただし、DNA解析だけでは多様性が把握できない可能性が高いため、今後は次世代シークエンサーの活用を視野にいれ取り組んで行く予定である。目的2については、FISH法によるツボカビの検出方法を検討した結果、そもそも染色が難しい事が判明した。また定量PCR法に関しても、ツボカビ全般を検出するプライマーやプローブの設計は難しい事が明らかとなった。ツボカビの種特異的な検出・定量を試みるか、別の手法を開発する必要がある。モノクローナル抗体については、単離できたツボカビについては作成を進めており、今後は野外での適用可能性について検討する。目的3については、花粉ーツボカビーミジンコという流れ(第2のMycoloop)を培養実験で検討したものについて、ツボカビの質(CNP,脂肪酸組成)や生態転換効率を求め、再解析を行った。植物プランクトンーツボカビーミジンコの流れについては、ミジンコの消化管内のツボカビのDNAを検出する方法を開発したが、論文を投稿したところプライマーの特異性についての問題を指摘され再度開発したプライマーで実験を行った。平成26年度は、研究1ツボカビの野外における多様性評価、研究2野外におけるツボカビの生物量の定量化、研究3ツボカビを介した物質流の定量化に取り組んだ。研究1については、印旛沼、琵琶湖、東京湾において、多様なツボカビが存在していることが明らかになった。特に、印旛沼においては、特定の宿主(珪藻)に複数のツボカビが寄生していることが明らかとなり、本来宿主特異性が高いと考えられてきたツボカビの常識を覆す結果となった。印旛沼における季節変化を追ったところ、珪藻が増えるとツボカビも増え、さらにツボカビを食べると思われるワムシも増える傾向が検出された。このことはツボカビを介した物質流(Mycoloop)が印旛沼において顕著であることを示唆している。琵琶湖については、植物プランクトンに寄生するツボカビも含めて、多様な菌類の存在が示唆された。東京湾については、寄生性のツボカビは検出できなかったが、分解性のツボカビが表層水中にもいることが明らかとなった。研究2については、モノクローナル抗体をいくつか作成し、ツボカビ生物量の定量化に取り組んだ。培養している分解性のツボカビについては抗体が作成できたが、必ずしも特異的とはいえなかった。

寄生性のツボカビについて抗体の作成を試みている。定量PCR法についても、プライマーをデザインしなおし、改良を試みている。研究3については、植物プランクトンーツボカビーミジンコの流れ(Mycoloop)を定量するために、植物プランクトンに寄生するツボカビを対象に、湖水中およびミジンコの消化管内のDNAを定量する方法を開発した。DNAの中でもITS領域を対象としてプライマーを改良し、再実験を行ったところ、非常に精度高く検出できることが明らかとなった。再投稿し、一流の国際誌(Applied and Environmental Microbiology)に受理された。湖沼および海洋に生息するツボカビの多様性を解明するために、Single Spore PCR法を開発・適用した。印旛沼や琵琶湖では、新規クレードを含む多様なツボカビやクリプト菌が特定の珪藻に寄生していることが明らかになった。ツボカビは宿主特異性が高いと考えられてきたが、一種の菌が複数の珪藻に寄生することも判明した。東京湾においては、クリプト菌など多様な菌類が表水層に存在することが明らかとなった。ツボカビ生物量とツボカビを介した物質流Mycoloopの定量化のために、幾つかの方法を検討した結果、定量PCR法と培養実験、数理モデルを併用することで、それらの重要性を定量的に評価できた。本研究では、次の4つの課題に取り組んでいる。1ツボカビの形態分類とDNAシークエンス情報を完全に一致させたデータベースを構築し、これまで見過ごされてきた水圏のツボカビの多様性を評価する。2モノクローナル抗体と定量PCR法、FISH法を用いたツボカビの検出・定量方法を世界に先駆けて開発する。3開発した定量方法と、元素安定同位体分析、操作培養実験により、ツボカビを介した物質流Mycoloopの野外における重要性を定量的に評価する。4これらの成果をまとめてツボカビを多様性と機能を考慮にいれた水圏の物質循環モデルを提示する。目的1については、新しい系統も発見し、単離培養できた系統については、電子顕微鏡による形態分類とDNA解析による分子系等解析を一致させる事ができた。微量DNA解析手法については、論文が受理された。東京湾については、DNA解析だけではツボカビの多様性が把握できない可能性が明らかとなったため、平成27年度は単離培養や次世代シークエンサーの活用を視野にいれ取り組んで行く予定である。目的2については、FISH法や定量PCR法では色々と難しい点があるため、モノクローナル抗体など別の方法を探る予定である。目的3については、花粉ーツボカビーミジンコという流れ(第2のMycoloop)の培養実験を投稿予定であったが、再解析を行ったため、当初の予定より遅れ平成27年度に投稿する予定である。植物プランクトンーツボカビーミジンコの流れについては、ミジンコの消化管内のツボカビを検出する方法を開発し、投稿した論文の修正を行った。以上のように、計画以上に進展している項目もあれば、方法的に困難である事が判明し手法を見直している項目もあり、おおむね順調に進展しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。
血管新生阻害療法に対する腫瘍血管内皮細胞の抵抗性獲得の機序解析

平成22年度はマウス腫瘍モデルを用いて,腫瘍血管新生阻害効果を解析した.同じ治療に対して抵抗性を獲得したマウスの腫瘍と感受性のあったマウスの腫瘍を用いてin situにおける血管内皮において前年度のin vitroの解析でピックアップされた血管内皮薬剤抵抗性関連因子の発現を解析した.さらに腫瘍微小環境が血管内皮細胞の薬剤抵抗性獲得に及ぼす影響に関して検討した.腫瘍血管内皮細胞が薬剤抵抗性を獲得するメカニズムとして,腫瘍細胞と内皮細胞との相互作用による可能性,ならびに低酸素、薬剤による刺激などを考え,その機序について解析を行った.具体的にはがん細胞の培養上清による処理,またはがん細胞との共培養によって,血管内皮に薬剤抵抗性関連因子の発現亢進がおきるのかを検討した.がん細胞の培養上清によって正常血管内皮細胞の5-FUやpaclitaxelに対する薬剤抵抗性が表れること,さらに抵抗性関連遺伝子であるMDR-1の発現亢進などが起こること,MDR-1の転写因子であるYB-1の核内移行がおこることなどを見出した.さらに細胞内のAktのリン酸化亢進なども起こることをしめした.培養上清を熱処理するとこの現象は起こらなくなることから,培養上清中のサイトカインなどのタンパクが影響を及ぼす因子であることが示唆された.これらの結果より血管内皮細胞といえども環境により薬剤抵抗性を獲得しうるということが示唆された.血管新生阻害剤に対しても抵抗性が生じるメカニズムとして,腫瘍細胞における抵抗性だけではなく,腫瘍内の血管内皮細胞そのものが薬剤抵抗性を獲得する可能性があることを仮説として立案した.腫瘍血管内皮細胞における抵抗性獲得の機序を探り,血管新生阻害療法に対する抵抗性の回避のための方法ならびに治療前の抵抗性予測の可能性を探るためにこれまで分離培養してきた腫瘍血管内皮細胞に対して各種血管内皮標的薬剤によって処理した.その中で生存して生き残った細胞を分離して薬剤抵抗性腫瘍血管内皮細胞として用いた.親株の腫瘍血管内皮細胞と薬剤抵抗性獲得した腫瘍血管内皮細胞のmRNA発現を比較検討した.その結果,薬剤抵抗性関連遺伝子MDR1,YB-1や,さらに染色体構造異常をもたらす関連遺伝子などの発現が高いことが示された.また,細胞を低酸素条件下で培養し,これら薬剤抵抗性関連因子の腫瘍血管内皮における低酸素の及ぼす影響を解析した.薬剤耐性腫瘍血管内皮細胞は低酸素環境下においてアポトーシスをおこしにくいことが見出された.また,薬剤抵抗性のある腫瘍血管内皮と感受性のある腫瘍血管内皮,さらには正常血管内皮細胞の染色体構造をFISH,さらにはmulti-color FISHによって比較検討した.薬剤抵抗血管内皮細胞にはより高頻度に染色体異常が見られることがわかり,抵抗性をひとたび獲得した血管内皮細胞には正常にはみられない遺伝子の異常や染色体不安定性があることが示された.平成22年度はマウス腫瘍モデルを用いて,腫瘍血管新生阻害効果を解析した.同じ治療に対して抵抗性を獲得したマウスの腫瘍と感受性のあったマウスの腫瘍を用いてin situにおける血管内皮において前年度のin vitroの解析でピックアップされた血管内皮薬剤抵抗性関連因子の発現を解析した.さらに腫瘍微小環境が血管内皮細胞の薬剤抵抗性獲得に及ぼす影響に関して検討した.腫瘍血管内皮細胞が薬剤抵抗性を獲得するメカニズムとして,腫瘍細胞と内皮細胞との相互作用による可能性,ならびに低酸素、薬剤による刺激などを考え,その機序について解析を行った.具体的にはがん細胞の培養上清による処理,またはがん細胞との共培養によって,血管内皮に薬剤抵抗性関連因子の発現亢進がおきるのかを検討した.がん細胞の培養上清によって正常血管内皮細胞の5-FUやpaclitaxelに対する薬剤抵抗性が表れること,さらに抵抗性関連遺伝子であるMDR-1の発現亢進などが起こること,MDR-1の転写因子であるYB-1の核内移行がおこることなどを見出した.さらに細胞内のAktのリン酸化亢進なども起こることをしめした.培養上清を熱処理するとこの現象は起こらなくなることから,培養上清中のサイトカインなどのタンパクが影響を及ぼす因子であることが示唆された.これらの結果より血管内皮細胞といえども環境により薬剤抵抗性を獲得しうるということが示唆された.
性的二型回路シフト：シナプスレベルの性差とその発生機構

本研究グループは、マウスにおいて異性や天敵など異なる化学シグナルが受容された際に、情動や行動において異なる変化が引き起こされる仕組みを、扁桃体・視床下部の神経回路のレベルで明らかにすることを目指した。この目的のために、ウイルス遺伝子工学を用いた脳中枢神経回路の可視化や操作のための技術を導入した。本年度はマウス幼若フェロモンESP22の生理活性とその神経基盤を解析した。2013年、幼若期のマウスが涙液に分泌するフェロモンESP22が雄マウスの幼若マウスへの性行動を抑制する“未成熟のシグナル"として機能することをHarvard大学との共同研究に明らかによって明らかにしていた(Ferrero et al., Nature, 2013)。本研究ではESP22が成熟雌マウスにも受容されることから、その機能の解明に取り組んだ。その結果、ESP22は仔マウスの周辺に居る母親以外の成熟雌マウスの性行動を顕著に抑制するフェロモン活性を有することを新たに発見した。実際、ESP22を長期間暴露した雌雄マウスの繁殖は有意に抑制された。ESP22の神経作用機構を解明するために受容体を探索し、単一のフェロモン受容体を同定した。さらにESP22による性行動抑制に関与する脳領域を特定し、扁桃体・分界条床核・視床下部腹内側核を含む専用の回線によって性行動の抑制が担われることを明らかにした。これらの成果は、雌マウスにおいて性行動を抑制する新たなフェロモンを見出したのみならず、異なるフェロモンがどのように異なる行動を引き起こすのかを明らかにする基盤となるものである。本成果は2018年秋にNature Communications誌に掲載された。(成果:Osakada et al., Nature Communications, 2018)平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。(成果:Osakada et al., Nature Communications, 2018)本研究グループは、マウスにおいて異性や天敵などに由来する異なる化学シグナルがどのように受容され情動や行動の適切な変化が引き起こされるのかを、末梢の受容器官と扁桃体・視床下部の神経回路のレベルで明らかにすることを目指した。該当年度には、マウス雄フェロモンESP1の作用神経回路の解析を完了した。本研究では、雄マウスの涙液に分泌されるタンパク質性の雄フェロモンESP1によって雌マウスの性受容行動ロードシスが促進されるという性フェロモン活性(Haga et al., Nature, 2010)の神経作用機構を明らかにした。具体的には、順行性ウイルストレーシングによってESP1受容体の下流に位置する神経核を網羅的に可視化し、それらについて薬理遺伝学な介入実験を行うことでESP1が機能するための神経回路を機能的に同定した。次に、逆行性トランスシナプス標識法や新規に開発した軸索マッピング法によって、同定した領域間の解剖学的な接続様式を明らかにした。さらに、遺伝学的なTRAP法と光遺伝学とを組み合わせて、視床下部のESP1反応ニューロンが雌マウスの性行動を促進する機能を有することを新たに発見した。これはフェロモンの入力が行動出力へと変換される仕組みを神経回路のレベルで初めて解き明かした成果で、国際主要誌Neuronにおいて3名の査読者全員から強い支持を受けて掲載された。(成果:Ishii et al., Neuron, 2017)異なる情報入力が異なる出力を返す仕組みを神経配線のレベルで明らかにすることを目指し、一種類のフェロモンESP1についてはその処理回路の概要を雌雄差を含めて明らかにすることができた。

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ESP1は雌マウスの性行動を促進するが、異なるフェロモンであるESP22はこれを顕著に抑制する。この正反対の活性に着目し、ESP22の受容体や責任神経回路を同定することによって異なるフェロモンが異なる行動出力を可能にするメカニズムを探索する。
てんかんモデルラットを用いたてんかん発症の分子機構の解明

イハラてんかんラット(IER)は、原因不明の自然発症ラット突然変異体である。このIERをてんかんのモデル動物として解析することで、てんかん発症の分子メカニズムを明らかにする。これまでに私共は、IERの原因遺伝子を同定することに成功し、遺伝子名をEpi-IERとした。そして、IERでEpi-IERのゲノムを調べた結果、イントロン上にSNPを見出した。このSNPにより、Epi-IERは転写の際にスプライシングに異常が生じ、発現が著しく低下することを明らかにした。さらに、Epi-IERの発現低下が原因で、IERの神経細胞の形態異常引き起こされることを明らかにした。また、生後2ヶ月までは明らかな発育遅延が認められ、自発運動の低下・記憶学習機能の不全などの精神発達障害が見られる。昨年度は、IERでみられる神経細胞の形態異常がEpi-IERの過剰発現でレスキューできるか検討した。IER由来の海馬初代培養神経細胞にEpi-IER遺伝子を導入し、樹状突起の伸長や分岐を観察した結果、IERでみられる神経細胞の樹状突起の伸長阻害・分岐抑制はEpi-IERの過剰発現でレスキューできることを見出した。従って、IERの神経細胞の形態異常がEpi-IERの発現低下だけで説明できることを明らかにした。今年度は、Epi-IERが発現低下するとなぜ神経細胞の形態異常やてんかんを誘発するのか分子メカニズムの解析を試みた。まず、Epi-IERのシグナル伝達系の解析をするために、マウス脳抽出液中からEpi-IERに結合する分子を免疫沈降法により精製し、液体クロマトグラフィーと質量分析による同定(ショットガン解析)を試みた。その結果、約300ものEpi-IER結合分子候補の同定に成功した。今後、新規Epi-IER結合分子を介したEpi-IERのシグナル伝達系の解析を試みる。そこで、IERでみられる神経細胞の形態異常がEpi-IERの過剰発現でレスキューできるか検討した。さらに、IERの扁桃体を詳細に解析した。免疫染色やゴルジ染色により、扁桃体の抑制性神経細胞の形態異常と局在異常を見出した。さらに、扁桃体のIPSC測定により、抑制性神経の機能低下を見出した。また、扁桃体キンドリングにより、容易にてんかん発作を惹起することを見出した。IERでみられる神経細胞の形態異常がEpi-IERの発現低下だけで説明できると考えられる。今後は、IERの脳への色素を注入することで、ニューロサーキットの形成機構を解明する。まず、IERでみられる神経細胞の形態異常がEpi-IERの過剰発現でレスキューできるか検討した。

従って、IERの神経細胞の形態異常がEpi-IERの発現低下だけで説明できることを明らかにした。次に、Epi-IERのシグナル伝達系の解析をするために、Epi-IERに結合する分子を免疫沈降法により精製し、液体クロマトグラフィーと質量分析による同定(ショットガン解析)を試みた。その結果、約500分子を同定した。ショットガン解析の問題点としては、同定した分子が直接結合するのか、あるいは複合体の一部の分子として間接結合するのかが不明である。今後、精製した蛋白質を用いてin vitroの結合実験を行う。Epi-IERと協調的に機能するEpi-IER結合分子を見出したなら、そのノックアウトマウスを入手する。表現型やてんかん誘発剤(GABAのアンタゴニスト)の投与により、Epi-IERノックアウトマウス/IERとの相同点を探す。以上のような取り組みで新規てんかん発症関連遺伝子を同定できると期待している。神経科学(1)イハラてんかんラット(IER)でみられる異常部位の特定とてんかんの関連:In situ hybridization法や免疫染色法により、Epi-IERは脳全体に発現しており、特に扁桃体、海馬で高発現していた。さらに、発現している細胞種を調べた結果、神経細胞全般に発現しており、グリア細胞ではほとんど発現が確認できなかった。次に、IERのてんかん発作の焦点部位を調べた。海馬・扁桃体・大脳皮質に電極を刺し、最初に発火する部位の同定を試みた。その結果、いずれの部位でも発火は確認できたが、特に扁桃体での発火が頻発していた。扁桃体領域を抑制性神経細胞のマーカー分子の抗体を用いて免疫染色を行った結果、抑制性神経細胞の発達異常や配置異常が確認できた。さらに、IPSCを測定した結果、抑制性神経細胞の神経活動の機能低下が認められた。さらに、海馬由来の初代培養神経細胞を観察した結果、IERでは発生初期段階の海馬領域で神経細胞の発達が未成熟(樹状突起の伸長阻害・分岐抑制)であることを見出した。また、軸索と樹状突起が束化してしまう細胞も認められた。さらに、これら形態学的な異常は、Epi-IERの過剰発現でレスキューできることを見出した。(2)IER原因遺伝子産物の細胞内シグナル伝達系の解明:Epi-IERのシグナル伝達系の解析をするために、マウス脳抽出液中からEpi-IERへと結合する分子を免疫沈降法により精製し、液体クロマトグラフィーと質量分析による同定(ショットガン解析)を試みた。その結果、約300ものEpi-IER結合分子候補の同定に成功した。また、結合候補分子のノックアウトマウスで、IERに非常によく似た表現型を示す分子を見出した。以上の結果から、当初の予定通りに研究は進んでいる。(1)イハラてんかんラット(IER)でみられる異常部位の特定とてんかんの関連これまでに、てんかん患者において海馬での異常なシナプス活動が報告されている。
不整脈および除細動のための数学的基盤整備

本研究課題では,不整脈や除細動のメカニズム解明のための数学基盤を整備することを目的として,(1)非一様興奮場の伝播現象を取り扱う数学的基盤整備,(2)除細動メカニズム解明のための数学的基盤整備,(3)除細動,カテーテル・アブレーション等の臨床医学への応用についての研究を行っている.昨年度の研究において,フィッツフー・南雲型の反応拡散系の特異極限より得られる自由境界問題を導出し,1次元空間の場合に,この自由境界問題の古典解,弱解の定義を与え,初期値に制限を加えることで適切な問題になることを示し,更にその大域的存在および大域的挙動を示した.今年度は,この結果を論文にまとめて投稿するに至った.また,障害物のある2次元外部領域への拡張の可能性を調べている.一方.2次元外部領域上のフィッツフー・南雲型反応拡散系の複数波による伝播現象において障害物の影響について研究を始め,数値計算からいくつかの結果を得た.更に,3次元障害物の影響を考えるためには,問題の単純化が必要であり,多層界面方程式による解析手法を開発し,論文にまとめているところである.心筋梗塞を起こすと,部分壊死(ミクロな周期的非一様性)が起きている部位(マクロな障害物)がある状態になる.これは心筋梗塞巣と呼ばれる.国立循環器病研究センター倫理委員会の審査を受け,承認されたことにより,2013年から2017年までの診療録から,実際の生体データが利用できる環境が整い,現在,解析を始めたところである.2018年度9月から2019年度8月まで在外研究のため,海外の研究機関を訪問していたため,いくつかの研究に遅れが生じた.フィッツフー・南雲方程式の特異極限問題の弱解の定義を1次元空間の場合に与えた.更に,この弱解の大域的存在を示した.この研究は,論文にまとめ投稿するに至った.現在は,この特異極限問題の弱解を2次元空間において考察できるように研究を進めている.周期的障害物がある場合の伝播現象については,連携研究者・俣野と研究を始めたが,まだ論文をまとめるには至っていない.期外収縮や複数波の場合について,数値計算を行い始めた.これにより,単一波では見られない現象が起きることが分かってきた.現在,そのメカニズムを解析しているところである.心室内の瘢痕組織の形状と心室細動の発症の関係を明らかとするため,国立循環器病研究センター倫理委員会の承認を受けて,国立循環器病研究センターを2000年から2022年までに受診する患者を対象として,陳旧性心筋梗塞または特発性心筋症で心室細動を合併した患者のMRI画像を収集している.本年度は,2013年から2017年に陳旧性心筋梗塞または特発性心筋症で心室細動を合併して国立循環器病研究センターを受診した全ての患者について,MRI画像を調査した.陳旧性心筋梗塞または特発性心筋症で心室細動を合併した9例のMRI画像を得ることができた.また,比較資料として,同時期に国立循環器病研究センターを受診し,陳旧性心筋梗塞または特発性心筋症で持続性心室頻拍を合併した13例のMRI画像を抽出した.なお,除細動メカニズム解明に向けて,バイドメインモデルやEchebarria-Karmaモデルについて調べているところである.これまでの研究によって得られたフィッツフー・南雲型の反応拡散系の特異極限問題は,一般の初期値に関しては適切な問題ではないが,1次元空間の場合は,弱解の定義や大域的挙動まで解決したので,これを多次元空間に拡張していく.これにより,多次元障害物の幾何形状と自発的なスパイラル形成の関係を調べることが可能になると考えられる.複数の障害物がある場合の研究として,“周期的"環境下における伝播現象を,連携研究者・俣野と障害物の形状によりどのように変化するか調べており,いくつかの結果を得ている.まずはこの研究を論文にまとめていく.心筋梗塞を起こすと,部分壊死(ミクロな周期的非一様性)が起きている部位(マクロな障害物)がある状態になる.これは心筋梗塞巣と呼ばれる.MRI画像をもとに,その形状についての情報を集め,その中から何か一定の性質を導き出す予定である.理論的な結果とと生体データの関係を調べていく.また,複数波の影響や期外収縮の影響についての研究も進めていく.なお,除細動メカニズム解明に向けて,バイドメインモデルやEchebarria-Karmaモデルの簡略モデルの導出を行い,メカニズム解明を進める.不整脈とは,心臓が正常な収縮リズムを失い,心臓で異常な興奮伝播が発生している状態をいう.心房細動,心室細動はその一例である.不整脈の成り立ちを数理的に解明することは,臨床医学的にも大きな示唆を与えることが期待できる.本研究課題では,不整脈や除細動のメカニズム解明のための数学基盤を整備することを目的として,以下の3つのテーマの研究を行う.テーマ1:非一様興奮場の伝播現象を取り扱う数学的基盤整備テーマ2:除細動メカニズム解明のための数学的基盤整備テーマ3:除細動,カテーテル・アブレーション等の臨床医学への応用まず,非一様性には2種類ある.孤立した障害物があるような状態と線維化のようにある程度平均的に非一様な状態である.2次元興奮場における障害物の形状が与える影響を調べるために,フィッツフー・南雲型の反応拡散系の特異極限より得られる自由境界問題を導出した.この自由境界問題は,一般の初期値に関しては適切な問題ではないが,扱いやすい状況もある.

この特性を活かして,2次元障害物の幾何形状と自発的なスパイラル形成の関係を調べている.さらに,3次元障害物の形状による影響をこの方程式を用いて調べるための手法開発を行っている.後者の数学モデルとしては,“周期的"環境下における伝播現象が挙げられる.フィッシャー・KPP方程式やアレン・カーン方程式のような単独反応拡散方程式においては,さまざまな研究結果があり,中でも,周期的環境が進行速度に与える影響の研究が進んでいる.これらの研究状況を調査し,興奮場における伝播現象への応用を検討している.心筋組織における空間非一様な環境として,孤立した障害物があるような状態と線維化のようにある程度平均的に非一様な状態が考えられる.孤立した障害物による興奮波の切断について,2次元興奮場における障害物の形状が与える影響を調べるため,フィッツフー・南雲型の反応拡散系の特異極限より得られる自由境界問題を導出した.この自由境界問題は,一般の初期値に関しては適切な問題ではないが,扱いやすい状況もある.この特性を活かして,2次元障害物の幾何形状と自発的なスパイラル形成の関係を調べ,現在論文を執筆中である.特に,回転スポット解の構成など一部の研究は論文にまとめた.さらに,3次元障害物の形状による影響をこの方程式を用いて調べるための手法開発については,2次元多層界面方程式系を導入しているところである.次に,“空間周期的"環境下における伝播現象が挙げられる.フィッシャー・KPP方程式やアレン・カーン方程式のような単独反応拡散方程式においては,さまざまな研究結果が知られている.中でも,周期的環境が進行速度に与える影響の研究が進んでいる.これらの研究状況を調査しているところである.しかし,興奮場における伝播現象の理論的研究は少なく,数値計算による情報収集や興奮場への応用を検討しているところである.陳旧性心筋梗塞に合併した心室細動で平成26年から28年の間に国立循環器病研究センターに入院した患者について,MRI画像が存在するかを入院診療録から調査した.調査対象となった陳旧性心筋梗塞患者では,心室頻拍から移行して心室細動となった患者のMRI画像は存在したが,心室性期外収縮から直接に心室細動となった患者はいなかった.本研究課題では,不整脈や除細動のメカニズム解明のための数学基盤を整備することを目的として,(1)非一様興奮場の伝播現象を取り扱う数学的基盤整備,(2)除細動メカニズム解明のための数学的基盤整備,(3)除細動,カテーテル・アブレーション等の臨床医学への応用についての研究を行っている.まず,フィッツフー・南雲型の反応拡散系の特異極限より得られる自由境界問題を導出し,1次元空間の場合に,この自由境界問題の古典解,弱解の定義を与え,初期値に制限を加えることで適切な問題になることを示し,その大域的存在および大域的挙動を示した.複数の障害物がある環境下における伝播現象については連携研究者・俣野と障害物の形状により伝播現象がどのように変化するか調べ,いくつかの結果を得た.障害物の配置による伝播促進や伝播抑制については,リアレンジメントの手法や平均化法に関する研究を調査し,周期的障害物への拡張を始めた.3次元障害物の影響を考えるためには,単純化が必要であり,多層界面方程式による解析を行った.心筋梗塞を起こすと,部分壊死(ミクロな周期的非一様性)が起きている部位(マクロな障害物)がある状態になる.これは心筋梗塞巣と呼ばれる.
歯胚発生機序解明の新展開-歯堤の動態からの研究―

歯堤の動態を検証する事は歯胚発生初期を検証する事であり、この検証は再生歯胚ソース、再生期間の短縮、安全性などに寄与するのみならず、過剰歯、歯牙腫、歯原性腫瘍などの発生メカニズム解明にも寄与すると考えられる。しかし、歯堤の動態を検証する実験系が確立されていないため、これまで多くの知見は得られていない。そのため、本課題では歯堤の動態検証の実験系の確立に着手した。その結果、培養試料採取時期の決定と大量培養法を確立し、更に培養下で起こる分化を遺伝子レベルで解析出来る様になった。近年、歯の再生研究はマウス再生歯胚をつくるまでに至っているが、人へ応用するには、幹細胞をどこから得るか、再生期間の短縮、安全性など多くの課題がある。その一方で、過剰歯や歯牙種などの発生メカニズムも未だ不明であり、これを制御するに至っていない。しかし、この二つの問題は、歯胚発生初期である歯堤の研究により解明できるところが少なくないと思われる。そこで、本研究では、申請者らが従来から導入している歯胚培養法とビーズ法を組み合わせた手法により、歯胚発生の初期となる歯堤伸長期の細胞増殖や分化を局所的に促進または停止させることを試みて、歯胚の発生および誘導がどこまで可能かを検証することにした。この検証によって、歯胚発生で重要な歯堤の伸長や分岐などの具体的なメカニズムが解明され、歯の再生医療、臨床研究や歯原性腫瘍治療に寄与できる知見が得られるものと期待できる。初年度である平成26年度はマウスにおける歯堤の動態を確認した。マウス胎生10日は歯胚発生前であり、マウス胎生11日になって初めて上下顎共に肥厚期の歯胚を認めた。なお、肥厚期における間葉の集合はほとんど認めず、下顎は上顎に比してやや正中側で粘膜の肥厚が出現していた。マウス胎生16日になると、下顎第一臼歯(M1)および第二臼歯(M2)を認めた。連続切片では、M1の後端とM2の前端が連結する様に発生し、薄く葉状構造の歯堤でM2上部が粘膜上皮と歯堤でつながっていた。この所見は、マウスにおける総歯堤がM1からM2、M3へと分枝していく構造を示しており、ヒトの大臼歯群と類似した構造である。歯堤形成の初期であり、比較的採取しやすい大きさであることから、胎生16日が培養に適した時期である事が明らかとなった。初年度である平成26年度はマウスにおける歯堤の動態を確認し、ヒトの大臼歯群と類似した総歯堤がM1からM2、M3へと分枝していく構造を示したマウス胎生16日が比較的採取しやすい大きさであることから、培養に適した時期である事が明らかとなった。二年目となる平成27年度は歯堤の動態、分化、増殖を確認していくため、マウスおよびラットの歯胚分化マーカー、細胞マーカーになる遺伝子のプライマー作成を行った。歯胚発生に機能している遺伝子を検出できるよう、それぞれのRNA配列をEmblやNIHから得て、PCR用のプライマー(フォワード鎖とリバース鎖)を設計した。テンプレートとしては、ラットおよびマウスの歯胚から抽出したRNAをcDNA化したものを用いた。こうした作業の結果、現在、使用できる品質のプライマーがマウスで40種以上、ラットで40種以上作成し、これらを使って、培養下で起こる分化を遺伝子レベルで解析できるようになった。前記の如く、培養体採取時期の決定と前年度課題として挙げていた培養下での歯堤細胞の動態、増殖、分化の基礎的データ収集のための分化マーカーを作成することが出来た。しかし、歯堤の確実な伸長と分枝を得られる培養条件の設定に現状でも手間取っており、それに伴い、培養下での歯堤細胞の動態、増殖、分化の基礎的データが不足している。

この検証によって、歯胚発生で重要な歯堤の伸長や分岐などの具体的なメカニズムが解明され、歯の再生医療、臨床研究や歯原性腫瘍治療に寄与できる知見が得られるものと期待できる。初年度である平成26年度はマウスにおける歯堤の動態を確認し、ヒトの大臼歯群と類似した総歯堤がM1からM2、M3へと分枝していく構造を示したマウス胎生16日が比較的採取しやすい大きさであることから、培養に適した時期である事が明らかとなった。二年目となる平成27年度は歯堤の動態、分化、増殖を確認するため、マウスおよびラットの歯胚分化マーカー、細胞マーカーになる遺伝子のプライマー作成を試みた。その結果、現在、使用できる品質のプライマーをマウスで40種以上、ラットで40種以上作成し、これらを使って、培養下で起こる分化を遺伝子レベルで解析できるようになった。最終年度は歯胚培養手技の改善とデータ収集を試みた。注目していたSox2、Pax3、Slug、SHHといった因子の動態及び役割を特定するには至らなかったものの、細胞増殖解析に用いるBrdU取り込み条件の見直し及びこれまで効率的な培養が困難であった歯胚の大量培養の手順を確立した。歯堤の動態を検証する事は歯胚発生初期を検証する事であり、この検証は再生歯胚ソース、再生期間の短縮、安全性などに寄与するのみならず、過剰歯、歯牙腫、歯原性腫瘍などの発生メカニズム解明にも寄与すると考えられる。しかし、歯堤の動態を検証する実験系が確立されていないため、これまで多くの知見は得られていない。そのため、本課題では歯堤の動態検証の実験系の確立に着手した。その結果、培養試料採取時期の決定と大量培養法を確立し、更に培養下で起こる分化を遺伝子レベルで解析出来る様になった。前記の如く、培養体採取時期はほぼ決定出来たものの、歯堤の確実な伸長と分枝を得られる培養条件の設定に手間取っている。そのため、培養下での歯堤細胞の動態、増殖、分化の基礎的データが不足している。それに伴い、分化マーカーの確立も時間を要している。第一臼歯のみ取り出して器官培養を行う場合、その状態が良いほど、第二臼歯、第三臼歯へ歯堤の分枝が起こる。確実な歯堤の伸長、分枝が得られる培養体の取り出し方、培養方法、培地には今後も慎重な検討を要するものと想定される。なお、研究者の相互関係は前年度と同じである。医歯薬学現在、歯堤の分化マーカーとして各種蛋白を免疫染色で検討しており、これと平行して培養条件の設定を行っている。確実な歯堤の伸長、分枝が得られる培養体の取り出し方、培養方法、培地には慎重な検討を要するものと想定される。次年度使用額で発生した差額は培養条件設定の遅れに起因している。前記のため、推進方策で記載した通り翌年度分として請求した助成金と合わせて研究計画を順次実施していく。但し、歯堤の伸長および分枝がこの実験計画の最重要事項であるため、確実な歯堤の伸長、分枝が得られる培養体の取り出し方、培養方法、培地の検討は十分に行う必要がある。次年度使用額で発生した差額は分化マーカーの検討および培養条件設定の遅れに起因している。
電子波束を生成する複数準位からのアト秒トンネルイオン化過程の新規物理モデル構築

赤外の高強度レーザーパルスによる複数準位の関与するイオン化過程の機構解明と制御のために、新たなアト秒光学系および測定法と理論的な構築を行った。初めに配向した気相分子に対して2波長高強度レーザーによる二次元高次高調波分光法を適用し、配向の制御によって複数準位のイオン化過程の測定とその制御を行った。またアト秒高次高調波と同期した高強度レーザーパルスによるイオン化過程に関して、特異的な量子状態制御が行われることを明らかにし、さらに位相を区別した波動関数イメージングを行った。同時にレーザー電場中の複数準位が関与するトンネルイオン化過程について多電子の効果を取り入れた理論的な定式化を行った。本研究課題は実験系と理論系の二つからなり、高強度レーザー電場中における原子や分子の複数準位からのトンネルイオン化過程について、波動関数の重なりやアト秒精度での波束の時間発展などについて新規モデルを構築することを目的としている。本年度は実験系では、数百アト秒以下の精度で測定が可能なレーザー光学系および多原子分子に対応可能な測定装置系の構築を行った。従来の出力1.8mJ/pulseレーザーシステムに2段増幅器を設置し、キャリアエンベロープ位相(CEP)]が十分に安定した状態で6.0mJ/pulse, 33fsのパルスの発生に成功した。CEPの安定度(ゆらぎ幅)<0.15 radian (r.m.s.)であることを確認した。また高強度に対応した高次高調波発生と光電子二次元画像観測装置の作成を行い、高次高調波の発生とそれによる気相原子・分子のイオン化によって発生した光電子運動量分布が測定できることを確認した。また、複数準位からのトンネルイオン化過程の制御を行うため、二次元高次高調波スペクトル測定と分子制御を組み合わせた測定光学系を構築した。これを用いて多原子分子について実験を行い、二つの順位からのトンネルイオン化確率が制御できることを示した。この結果について会議等で発表し、また学術論文として投稿中である。また理論系では、多電子系のトンネルイオン化について、弱い電場における理論の定式化を行い、計算コードを開発し、HeやH2といった2電子系の中心に分析を行った。得られた結果をまとめて学術論文および国際会議において発表した。また、関連する高強度レーザー場中のダイナミクスに関する理論的研究を行った。1.新規アト秒分光装置系の開発:本研究の目的である、多チャンネル過程が関与するトンネルイオン化過程についてアト秒時間精度で測定を行うため、新たにアト秒時間分解・角度分解光電子分光装置を開発した。本装置は極端紫外領域のアト秒高次高調波と高強度の赤外数サイクルレーザーパルスを位相を安定化させて組み合わせる装置と、それらのパルスの気相試料への照射によって生成した光電子の運動量を画像観測する装置からなる。本装置は、新たに開発した光学系により、安定して数アト秒の時間分解能でアト秒高次高調波と赤外パルスの時間差を変えることが可能である。本装置の開発について、論文を作成中である。2.希ガスからのアト秒時間分解光電子運動量分光法による測定:次に、開発した装置系を用いて、様々な希ガスや気相分子についてそのアト秒イオン化ダイナミックスの測定を行った。特定の希ガスについて、高強度の赤外光をアト秒高次高調波パルスと共に照射した場合、従来では観測されていない特異的な角度分布を持つ光電子放出過程が生じることがわかった。この実験結果を国際学会で発表し、さらに、多チャンネルイオン化の観点からも解析を行った。論文を作成中である。3.理論計算の発展:トンネルイオン化過程の多電子系の取り扱いとして、弱電場漸近理論の高次項に対する理論の理論の定式化をさらにすすめ、計算コードを開発してヘリウム・水素分子などの2電子系についての計算を進めた。また、2原子分子のトンネルイオン化についての弱電場漸近理論の主要項の計算を行った。これらの結果を学術論文・国際会議等で発表した。さらに高強度レーザー電場と極端紫外光を組み合わせた場合のイオン化過程の理論的な定式化と計算を行った。(1)選択的イオン化過程による波動関数イメージング法:高安定かつ高い再現性でアト秒高次高調波と同期した赤外光による光電子運動量測定装置およびそれと同時計測が可能な高次高調波分光装置を開発した。この装置系を用いて、極端紫外領域のアト秒パルスと比較的高強度(10^12W/cm2程度)の赤外光とをアト秒精度で組み合わせた場合、複数のイオン化過程の中で特定の量子数を持つイオン化過程が選択でき、明確な節構造を持つ電子運動量分布が得られることを見いだした。(2)高強度の赤外数サイクルパルスによって発生する高次高調波スペクトルのキャリアエンベロープ位相依存性についてのシミュレーションを行い、実測のデータと比較することで、トンネルイオン化過程が何度起こるのかを同定する方法を見いだした。(3)多原子分子からのトンネルイオン化過程とそのダイナミックスについて電子状態の変化の観点から測定するため、多原子分子(共役ジエン)からの高次高調波分光と、その時間分解測定に向けた光励起反応を測定した。(4)強静電場中の分子のトンネルイオン化について、解析的理論である「弱電場漸近理論」を開発し、その高次補正項の定式化を行った。この理論を簡単な2原子分子に適用し、トンネルイオン化レートの配向依存性における電場強度依存性について議論した。

また、時間に依存するレーザー場によるトンネルイオン化のダイナミクスを調べるため、円偏向パルスによる原子のイオン化スペクトルについての理論的研究を行い、スペクトルの特徴を現すピーク位置および幅についての詳細な議論を行った。さらに、トンネルイオン化電子が関与するダイナミクスのひとつとして、ヘリウム原子の非逐次2電子イオン化過程について調べた。また、レーザー場中の分子内の核と電子双方の相関を持った運動を記述するため、超精密な波動関数の理論的記述を行った。赤外の高強度レーザーパルスによる複数準位の関与するイオン化過程の機構解明と制御のために、新たなアト秒光学系および測定法と理論的な構築を行った。初めに配向した気相分子に対して2波長高強度レーザーによる二次元高次高調波分光法を適用し、配向の制御によって複数準位のイオン化過程の測定とその制御を行った。またアト秒高次高調波と同期した高強度レーザーパルスによるイオン化過程に関して、特異的な量子状態制御が行われることを明らかにし、さらに位相を区別した波動関数イメージングを行った。同時にレーザー電場中の複数準位が関与するトンネルイオン化過程について多電子の効果を取り入れた理論的な定式化を行った。おおむね順調である。前述のように新規に導入したキャリアエンベロープ位相安定化高強度レーザーシステムを用いた時間分解光電子分光装置が稼働し、いくつかの興味深い実験データを得ることに成功している。また理論計算においても、理論の定式化や計算結果についてのまとめを順調に発表している。27年度が最終年度であるため、記入しない。アト秒レーザー物理前年度まで、新規レーザーシステムの導入・アト秒測定装置の構築およびそれらを用いた希ガス原子についてのプライマリーな結果を得た。また理論計算の基礎的な構築を行った。そこで本年度は、研究結果の総括に向けて実験結果の解析と関連する実験を行う。1.アト秒時間分解光電子スペクトルの解析と理論モデル構築:本年度に測定したアト秒時間分解運動量スペクトルは、従来には観測されなかった特徴的な光電子の角度分布を持っている。これはアト秒高次高調波と組み合わせている赤外レーザー電場の強度が多光子遷移やトンネルイオン化過程に近い強度を持つことにより生じていると考えられ、従来の弱い電場による1光子遷移による物理的モデルによる取り扱いとは異なる。そこでこれらの新規な過程の定式化を行い、特に多チャンネルイオン化過程が段階的に起こっている可能性も含めて検討し、論文を作成する。2.多チャンネルイオン化間の相対的なアト秒時間差(位相差)の測定:本研究で開発した装置は、数アト秒の時間分解能で、複数のイオン化チャンネル間のイオン化における位相差(時間差)を角度分解の情報も含めて測定することが可能である。そこで時間分解の多チャンネルイオン化過程の解明に向けて、希ガスおよび分子に関して、測定と理論計算を行い、論文を作成する。3.多原子分子への応用:また、多原子分子の光化学反応に際して変化する分子軌道の測定に際して、異なる準位からのイオン化過程がどのように影響するかについて実験的に調べる。本年度はこれらのことを統合し、研究課題の総括を行う。実験:レーザーシステムの二段階増幅器の導入を行い、実際に予想されたスペックが達成されることがわかった。
ヒスチジン誘導体の糖代謝における役割

肝臓STAT3は、中枢神経性肝糖新生調節の肝臓作用分子であり、活性化に伴い肝糖産生を抑制する。我々は、肝臓STAT3が、タンパク質摂取に伴う高ヒスチジン血症に伴い、活性化される事を見出した。ヒスチジン投与により肝臓STAT3は活性化し、インスリンによる肝糖産生抑制を増強する。ヒスチジンによる肝糖産生調節作用は、中枢神経ヒスタミンH1受容体阻害により消失した。ヒスチジンが、インスリンと同様に、中枢神経ヒスタミン作用を介して、肝臓STAT3を活性化し、肝糖新生酵素遺伝子発現を抑制する事を示唆している。中枢神経で、ヒスチジンとインスリンの作用は、肝糖産生抑制に関しては相加的に作用することも見出した。蛋白質・ペプチド・アミノ酸の摂取も、個体糖代謝に多大な影響を及ぼすことが知られている。代表者は、ヒスチジン誘導体が糖代謝を改善することを見出しているが、そのメカニズムは十分に解明されていない。そこで、本研究課題では、ヒスチジンの糖代謝改善作用を解明することを目的とする。本年度は、ヒスチジンによる糖代謝改善作用の責任臓器の同定を行った。インスリン作用臓器において、肝臓は糖産生・糖取り込み・グリコーゲン合成・脂肪合成燃焼蓄積、筋は糖取り込みと糖脂肪利用、脂肪は糖取り込みと脂肪蓄積を、それぞれの異なる役割を有している。そこで、高インスリンクランプ法を用いて、ヒスチジン投与下での臓器ごとの糖代謝調節についての検討を行った。その結果、ヒスチジン投与により肝糖産生が抑制されることを見出している。また、ヒスチジンによる肝糖代謝改善作用は肝臓STAT3活性化に伴うものであることを明らかにしている。さらに、肥満動物におけるヒスチジン作用を検討したところ、ヒスチジンによる肝糖産生改善作用は減弱傾向を示した(予備検討)。本年度には、肥満動物によるヒスチジン依存性の肝臓STAT3活性化の障害メカニズムに、肝臓小胞体ストレスが関与する可能性を見出し、その検討結果に関して、Diabetes誌に報告を行った。ヒスチジンは脳内ヒスタミンを増加させることが知られている。ヒスチジンによる肝糖産生抑制作用は、脳内ヒスタミン作用阻害によって、消失した。この結果は、ヒスチジンにより糖代謝改善作用が脳内ヒスタミン作用であることを示唆している。ヒスチジンにより耐糖能が改善するが、このヒスチジン作用は肝糖産生抑制によるという結果を見出している。また、ヒスチジン投与は、肝糖産生を抑制する肝臓STAT3活性化を誘導することを明らかにしている。また、ヒスチジン作用による肝糖産生抑制が肝臓STAT3に依存的であること、さらには、ヒスタミンH1受容体欠損マウスでは、ヒスチジン投与による肝糖産生抑制作用は障害されることも見出している。これらの結果から、脳内H1R阻害剤投与などの検討から、ヒスチジンによる肝臓STAT3を介した肝糖産生抑制作用は脳内ヒスタミンH1Rを介することが示唆される。そこで、脳内ヒスチジン作用と同じく、肝糖産生を抑制することが知られている脳内インスリン作用との関連を、インスリンとヒスチジンの両者の脳室内投与により検討した。既報のごとく、インスリン脳室内投与に伴い、肝糖産生は抑制され、脳室内ヒスチジン投与により、肝糖産生抑制は増強した。脳室内に、インスリン、またはヒスチジンを投与すると、肝臓STAT3がリン酸化され、両者を投与することにより、肝臓STAT3リン酸化は増強した。これらの結果から、中枢神経におけるヒスチジンの投与により、中枢神経インスリン作用による肝糖産生抑制が増強する事が示唆された。蛋白質・ペプチド・アミノ酸の摂取が、個体糖代謝に多大な影響を及ぼすことが知られている。本研究課題では、ヒスチジンの糖代謝改善作用を解明することを目的としている。ヒスチジン投与により脳内ヒスタミンが増加することが知られており、ヒスチジンによる肝糖産生抑制作用が、脳内ヒスタミン作用阻害によって消失することも見出している。

この結果は、ヒスチジンにより糖代謝改善作用が脳内ヒスタミン作用であることを示唆している。本年度は、肝臓特異的STAT3欠損マウスおよびヒスタミンH1受容体欠損マウスを用いた検討を行った。ヒスチジン投与によっても、肝臓特異的STAT3欠損マウスにおいて、肝糖産生は抑制されなかった。このことは、ヒスチジン作用による肝糖産生抑制が肝臓STAT3を介して行われることを示唆している。次に、ヒスタミンH1受容体(H1R)欠損マウスを用いた検討を行った。H1R欠損マウスでは、ヒスチジン投与による肝糖産生抑制作用は障害されていた。このことは昨年度に見出した脳内H1R阻害剤投与によるヒスチジン依存性の肝糖産生抑制作用の阻害を支持する知見である。ヒスチジン投与による肝臓STAT3活性化における、H1Rの役割を検討するために、H1R欠損マウスおよび脳内H1R阻害剤投与による検討を行った。H1R欠損マウスまたは脳内H1R阻害剤投与により、ヒスチジン投与による肝臓STAT3活性化は障害された。ヒスチジンは、脳H1Rから肝臓STAT3を介して、肝糖産生を抑制する可能性が示唆された。当初予定していたヒスチジン長期投与による糖代謝改善作用については、本年度には実施できなかったが、このことは、ヒスチジンの脳内作用の詳細なメカニズムの検討が可能となったための、計画変更に伴うもので、次年度の計画変更にはつながるものの、おおむね順調に進展していると言える。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度には、ヒスチジンの糖代謝改善作用における脳内ヒスタミン作用の役割を明らかにした。ヒスチジンの糖代謝改善作用とインスリンなどの液性因子との関与および、自律神経との関与については、現在検討を進めており、おおむね、実験計画通りに進捗している。ヒスチジン作用による糖代謝改善作用については、主に野生型マウスを用いての検討を本年度には実施した。次年度以降には、肝臓特異的遺伝子改変マウスやヒスタミン受容体欠損マウスを用いて、ヒスチジン作用の検討を行う。ヒスチジンにより糖代謝改善作用については、長期投与による作用についての検討も行い、さらに、メカニズム解明のために、in vitroでの検討も行う。ヒスチジンの糖代謝改善作用と、インスリンなどの液性因子との関与を、中枢神経インスリン投与法または中枢神経インスリン受容体欠損マウスなどを用いて検討する。また、自律神経との関与について、自律神経阻害剤、または迷走神経切除モデルを用いて検討を行う。本年度に当初実験計画通りに進捗しており、今後も研究計画に沿って研究を進展していく予定である。