hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
原発事故避難者が地元地域への帰還に際して経験する不安と受容に関する縦断的研究

2.行政的な避難(原発事故発生から時間的推移にしたがい展開されてきた避難指示区域の設定等)と、心理的な避難(地元地域との距離感や、地元地域への帰還の意思決定における当事者の意味付けの側面)とが異なる性質を持っていること。3.ひとつの自治体の中に、避難区域指定が解除された地域と、そうでない地域が混在する場合に、住民間での復興に向けた意識の醸成や、方針の構築に困難が生じやすいこと。上記1については発達心理学における「人生移行」の概念、上記2については文化心理学における「記号」および「becoming」概念による理論的な検討が必要と考えられた。そのため、これらについての文献検討、学会発表、論考の出版などを並行して実施した。上記3については、心理尺度の項目を構成する上で、社会生活上の要因(居住地域や、自治体内での役割等)を含める必要性を示唆するものであった。そのため、心理学だけでなく、社会学および疫学の研究者とも連携し、尺度項目の検討に着手した。なお書籍の分担執筆3件、学会発表1件を行った(書籍の分担執筆については、当該書籍が2018年度以降に出版されるため、今年度の業績には記載していない)。避難指示が解除された2017年3月・4月期の後にも、のべ5名に対して、継続したインタビューを実施することに成功した。これにより、避難区域指定が存在する段階・解除される(された)前後・解除された後、という3段階での、帰還に対する不安と受容の変容の有り様を記述的に検討することができた。また、帰還の意思と、実際の帰還の関係などについても、追跡的に探索し、データとして収集することができた。研究対象者の地元地域を避難区域ごとで分類し、その分類に基づいた課題の検討や展望の相違や変容を分析するなど、より多角的な視点から避難者の実際に迫るための基盤を構築した。一方、本年度の主たる目標は尺度構成およびパイロットスタディであったが、項目の検討ならびに背景となる情報の収集に留まった。理由として、以下2点が挙げられる。第一に、研究フィールドとしている自治体(A自治体)への帰還者が大変少なかったため、当該自治体の住民を対象にパイロットスタディを実施することが困難となった点。第二に、避難指示解除を機に、少なからぬ人数の研究対象者が他自治体・他都道府県への転居を行ったため、協力関係を構築している人々を対象としたパイロットスタディの実施も困難となった点である。これらの点は想定外であったが、現場・当事者の経験に即し、より丁寧な心情の記述と分析を実施する必要性を示す出来事でもあり、次年度のさらなる追究を図りたいと考えている。以上の点から、2017年度の進捗状況は「おおむね順調」と判断することが適切であると考えられる。研究計画に基づき、福島県内の原発事故避難者を対象としたインタビューを継続的に実施した。のべ3名、158分のインタビューを実施した。調査成果は以下のように整理される。1.調査フィールド(A自治体)の中で、帰還可能地区と不可能地区とが分かれてしまい、それが自治体内での住民の分断を生じていること。2.放射性廃棄物の処理(埋立て等を含む事実上の永続的な保管)の候補地として、上記の帰還不可能な地区が選定されつつあり、「他の地区の復興・改善のために犠牲を強いられる」状況が存在すること。
メタボリックシンドロームの合併症予防を目指したキマーゼ阻害の意義

メタボリックシンドロームの合併症として非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)や脳卒中易発性高血圧自然発症(SHR-SP)ラットにおけるキマーゼ阻害薬の効果を検討した。ハムスターNASHモデルでは、キマーゼ阻害薬による血漿中ASTおよびALTが改善され、肝臓組織中の脂肪滴や線維化の改善効果も示された。SHR-SPラットでキマーゼ阻害薬は血圧に影響なく抗酸化作用と血管内皮への炎症細胞浸潤防止を介して血管内皮機能障害を予防した。キマーゼ阻害薬は有意に生存期間も延長させた。これらの結果は、キマーゼ阻害がメタボリックシンドロームの合併症を予防するのに有用なストラテジーになることを示唆する。「研究の目的」は、メタボリックシンドローム合併症に対するキマーゼ阻害薬の効果を解析することで、メタボリックシンドロームの合併症発症および進展におけるキマーゼの病態生理学的役割を解明することであった。「今年度の研究実施計画」は、メタボリックシンドロームの合併症として、ストレプトゾトシン(STZ)誘発糖尿病ハムスターモデルを用いてキマーゼ阻害薬の影響を解析することであった。本モデルでは、STZ投与直後より血糖値が上昇を認めた。STZ投与後6週において血管内皮機能の指標であるアセチルコリン誘発の血管弛緩反応がプラセボ群では有意に減弱したが、キマーゼ阻害薬投与群により有意に改善した。その他の「今年度の研究実施計画」として、メタボリックシンドローム合併症の一つである脳卒中に対するキマーゼの動態解析を行うため、脳卒中易発性自然発症高血圧ラット(SHR-SP)を用いた。SHR-SPの血圧は、8週齢の時点で約180mmHg、12週齢の時点で約240mmHgであった。12週齢の時点で摘出した血管では、アセチルコリン誘発の血管弛緩反応が有意に減弱し、心肥大の指標である心重量/体重比の著明な増加を認めた。血管および心臓のキマーゼ遺伝子発現レベルは、共に同週齢の正常ラット(WKYラット)に比べて有意に増加した。また、炎症関連因子であるMonocyte Chemoattractant Protein (MCP)-1やTumor Neclosis Factor (TNF)-αの遺伝子発現も有意に増加した。一方、血中のアンジオテンシンII濃度は有意に減少していたことより、心血管組織におけるキマーゼの発現増加は、アンジオテンシンII産生には影響がないことが示唆された。これらのことより、キマーゼはアンジオテンシンII産生以外の作用を介してSHR-SPの心血管障害に関与している可能性が示唆された。メタボリックシンドローム合併症である非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)と脳卒中のモデル動物の経時的組織解析とキマーゼ阻害薬による効果を検討した。ハムスターのNASHモデルは、メチオニン・コリン欠損(MCD)食を与えることで作製し、NASHの病態進行に伴ってキマーゼ活性が増加することを見出した。MCD食を12週間与えてNASHを形成させたのちに、キマーゼ阻害薬投与を開始し、阻害薬投与後24週後に治療効果を解析した。キマーゼ阻害薬投与前に増加していた血中ASTおよびALT、肝臓組織中の脂肪滴や線維化の面積、コラーゲン発現量が有意に増加していたが、キマーゼ阻害薬投与後は、これらのすべてが正常レベルまで低下した(Masubuchi et al.,HepatolRes 2013,43:970-978)。脳卒中に対する予防効果は、脳卒中易発性高血圧自然発症ラット(SHR-SP)の4週齢よりプラセボまたはキマーゼ阻害薬を投与開始した。投与後8週にはプラセボ群で血圧が220mmHg以上に増加したが、キマーゼ阻害薬はその血圧上昇には影響しなかった。しかし、血管組織中のキマーゼ活性は、プラセボ群で有意に上昇したが、キマーゼ阻害薬群では抑制され、血管内皮機能障害が有意に予防されていた。また、生存期間に対する影響を検討した結果、キマーゼ阻害薬は血圧を低下させないが、脳卒中を起こして死亡するまでの期間を有意に延長させた。これらの結果は、第36回日本高血圧学会総会および第124回日本薬理学会近畿部会にて報告し、J Hypertensに受理された(2014年3月29日)。キマーゼ阻害薬は、メタボリックシンドロームの合併症に対して有用な薬物になることが期待される。「研究の目的」は、高脂肪食負荷で高脂血症を起こすハムスターを用いて、高脂血症、高血圧、糖尿病を合併した際に見られる血管機能障害および心機能障害とキマーゼとの関連性を解析し、そして、合併症に対するキマーゼ阻害薬の効果を解析することで、メタボリックシンドロームの合併症発症および進展におけるキマーゼの病態生理学的役割を解明することであった。

「今年度の実施計画」は、高脂肪食負荷で高脂血症を起こしたハムスターにストレプトゾトシンを腹腔内投与して糖尿病を合併したモデルの継時的解析を行うことと高脂血症を起こしたハムスターの左腎動脈を銀製のクリップにて狭窄して腎性高血圧を合併したモデルの継時的解析を行うことであった。「実施したこと」は、ハムスターに高脂肪食負荷を開始した1か月後より、明らかな高脂血症(総コレステロールおよびLDLコレステロールの有意な増加)が確認された。高脂血症モデルは、高脂肪食負荷後1および3カ月の時点でも高脂血症の状態が続いていた。しかし、ストレプトゾトシン3カ月後においても動脈硬化形成は軽微な状態で、血管組織のキマーゼ活性の変化はなかった。次に、高脂血症モデル作製後1か月の時点で、ストレプトゾトシンの投与を行った。ストレプトゾトシン投与後3日目で血糖値の有意な上昇が確認できた。また、その血糖値の上昇は、投与後2カ月においても確認できた。血管の内皮機能は、ストレプトゾトシン投与後1か月の時点で減弱しており、キマーゼ活性は、有意に増加していた。一方、心機能は、ストレプトゾトシン後2カ月においても変化がなく、心臓のキマーゼ活性にも変化を認めなかった。高血圧モデルとして、左腎動脈にクリップで狭窄させ、腎性高血圧モデルを作製した。2週後より2カ月後まで血圧上昇と血中レニン活性の増加が確認できた。一方、この時期にキマーゼ活性の上昇は、2か月後においても認められなかった。目的は、メタボリックシンドローム合併症とキマーゼとの関連性を解析すること、そして、キマーゼ阻害薬の合併症に対する影響を解析することであった。23年度は、ストレプトゾトシン(STZ)誘発糖尿病ハムスターモデルで血管内皮機能が減弱されること、そして、その部位でキマーゼ活性が有意に増加することを明らかにした。24年度は本モデルにおいて、キマーゼ阻害薬がSTZ投与後6週の時点の内皮機能減弱を有意に抑制することを示した。また、血管組織中のNADPHオキシダーゼの構成因子のp22phoxの遺伝子発現を有意に抑制し、マロンジアルデヒド(MDA)も有意に抑制していたことより、キマーゼ阻害薬は、血管の酸化ストレス軽減を介して内皮機能不全を予防したと考えられた。脳卒中易発性自然発症高血圧ラット(SHR-SP)を用いた実験では、8週齢の時点で180 mmHg、12週齢の時点で240 mmHgの血圧を示した。12週齢の時点で心重量/体重比(心肥大の指標)が有意に増加し、血管内皮機能が有意に減弱した。心臓および血管組織中のキマーゼの遺伝子発現が有意に増加し、炎症関連因子であるMonocyte Chemoattractant Protein (MCP)-1やTumor Neclosis Factor (TNF)-αの遺伝子発現も有意に増加した。これらのことは、心・血管組織のキマーゼ発現の増加が炎症を介して心血管障害と関連する可能性を強く示唆する。糖尿病の血管障害や高血圧による心・血管障害においてキマーゼ発現の増加が関連すること、そして、糖尿病による血管障害は、キマーゼ阻害薬により有意に改善されたことより、キマーゼ阻害薬がメタボリックシンドロームの合併症(血管障害)予防に有用である可能性を示唆できた。
低収縮性低粘性ウレタン系モノマーを用いたコンポジットレジンの開発

歯科臨床において成形充填材の使用頻度は高く、市販されているその種類も非常に多くなった。最近では特徴あるもので操作性のよい低い粘性と低い収縮性を持つコンポジットレジンが臨床で多く使われるようになった。そこで新規に開発した4官能性ウレタン系メタクリレートモノマーをベースとして新規希釈剤モノマーを用いた混合モノマーが低粘性、低収縮レジンとして、歯科において応用可能かどうかを従来型のBis-GMAと試作コンポジットレジンの機械的、物理的性質をしらべコンポジットレジンへの応用を調べた結果以下の結論を得た。1)従来型のBIS-GMA-TEGDMAの粘性が10,000mPasに対して、新しく開発したモノマーは300-600mPasと約1/20と非常に小さな値であった。2)フィラーの含まない状態の新しく開発したモノマーの機械的強度は従来型のBIS-GMA-TEGDMAのものよりより優れていた.3)新しく開発したコンポジットレジンは従来型のBIS-GMAをベースとしたコンポジットレジンより圧縮強さは強くなった。また、圧縮強さはフィラーの含有量が多くなると大きくなった。4)新しく開発したコンポジットレジンの間接引張強さは従来型のBIS-GMAをベースとしたコンポジットレジンよりも強くなった。また、フィラーの含有量が多くなると大きくなった。5)新しく開発したコンポジットレジンの曲げ強さは従来型のBIS-GMAをベースとしたコンポジットレジンよりも強くなった。6)硬化収縮も従来型のBIS-GMAをベースとしたコンポジットレジンよりも小さくなった。以上の結果、生体安全性に対しては今後の追加試験を必要ですが臨床上の強度に対して問題はないと考えています。低収縮性を目的とする、新規に開発した4官能ウレタン系メタクリリレートモノマーをベースとして新規希釈剤モノマーを用い、フィラー含有率向上のため、これら新規混合モノマーの低粘性化に有効な変性ビスフェノールAジアクリレート系混合モノマーを加え、フィラー含有率とこれらモノマーの粘性との関連について実験した。ベースモノマーに対してモルホリンアクリレートとジシクロペンタニルジアクリレートの混合物1:1の混合モノマーを用い、ベンゾイル型光重合開始剤(イルガキュア1700、チバ・ケミカルズ社)を用いた。変性ビスフェノールAジアクリレート系混合モノマーは、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、エチレンオキシド変性ビスフェノールAジアクリレートおよびプロピレンオキシド変性ペンタエリスリトールテトラアクリレートの混合モノマーとした。これら混合モノマーでの物性およびモノマー単独で重合したときの機械的性質を測定した。次に、フィラーを添加してコンポジットレジンを試作した。フィラーは、粒径約5μmの不定形溶融石英に、粒径50nmのマイクロフィラーを30%混合したフィラーをγ-MPTSでシラン処理しい、フィラー含有率を変えて数種のコンポジットレジンを作製した。試作したコンポジットレジンの重合収縮率、圧縮強さ、間接引張強さ等の機械的性質を調べ、従来のコンポジットレジンと比較した。この結果、モノマーの粘性は、300600mPaと従来のbis-GMA-TEGDMA系の約10,000mPaと比べて極めて低い値を示すことが明らかとなった。また、モノマー単独での重合体の圧縮強度も、100MPa前後と大きく、これをコンポジット化した場合には、従来のコンポジットレジンと同等の機械的強度を示すことが明らかとなった。このときのコンポジット化されたペーストの稠度は、フィラーの充填率が高いにもかかわらず、従来のものに比べて極めて粘性が低かった。

今回の混合モノマーの歯科用への応用は極めて有望であると考える。次年度は種々のコンポジットレジンを試作しその所性質について実験を行う予定である。低収縮性があり低粘性をもつ新規に開発したTSR-4601X-01(4官能系ウレタン系メタクリレートモノマー)をベースとして新たに希釈剤モノマーを用い、これにモノマーの低粘性をだすためビスフェノールAジアクリレート系混合モノマーを加えフィラーの含有率の向上について調べた。ベースモノマーにジシクロベンタニルとモルホリンアクリレートを1:1に混合したモノマーを作製した。光重合開始剤はイルガキュア1700(チバ、ケミカル社)を用いた。作製したTSR-4601X-01光重合型モノマーと市販低収縮性レジンのジーシーユニフィルフロープラスと比較した。特に低収縮性を調べるため、超高速微小型レーザーセンサー(SUNX,HL-C1)を用いた。これは容積量を1.5gの試料長10-15mmを平滑ガラス板にセットし上方から光重合器(ジーシー、ハロゲン光)を使用し照射した。この結果,照射30秒後0.3-0.5mmの収縮を示しユニフィルフロー0.2-0.3mmにやや近い数値であった。光照射による実用硬化深度は30秒照射で1.5-2.0mmとほぼ平均的であった。また、粘性試験は垂直に立てたガラス板上に一定体積の試作コンポジットレジン1.0gを取り1分後にその流動距離を計測した結果2-10mmの幅であった。曲げ強さは1.0-2.3MPaでユニフィルフロー0よりやや大きな数値を示した。今後はフィラーの組成および充填率を変化させたり、操作性を調べるためコーンプレート型回転粘度計などで物性的な面を試験するつもりである。さらに作製したTSR-4601Xシリーズ3種について詳しく試験して行きたいと思っています。低収縮性がで、かつ低粘性をもつモノマーを新規に開発した。このものは前年度のを改良したTSR-4602X-02で多官能系ウレタン系メタクリレートモノマーをベースにして新たな希釈剤モノマーとして、これに低粘性を持たせるビスフェノールAシアノアクリレート系混合モノマーを加えた。フィラーは球状石英の平均粒径5μmと50μmのものを重量比で70:30にして用いた。そしてγ-MPTSを用いてシラン処理をし作製した。これをベースモノマーにシクロベンタニルとモルホリンアクリレートを1:1に混合した前記光重合型モノマーと混和してコンポジットレジンを作製した。そして市販低収縮性レジンのクリアフィルフロー(クラレメディカル)、エステライトフロー(トクヤマデンタル)、ビュティフルフロー(松風)など7種の市販コンポジットレジンと比較した。その結果、光による重合もシャープで、低収縮性では超高速度微小レーザー変位計によると市販の製品との違いはあまり明確ではないが、TSR-4602X-02は2.0%以下と小さな値であった。粘性に関しては問題はなかった。機械的強さでは、曲げ強さ2.5MPa圧縮強さで350MPa、間接引張強さで約40MPaとなり、市販のコンポジットレシンにほぼ対応する値となった。最終年度は同じシリーズのx-03,04について行う予定である。
in vivo、リアルタイムでのアポトーシス可視化システムの構築

様々な生物種において胚発生過程では、盛んな細胞増殖とともに、高頻度のアポトーシスが観察される。我々は胚胎が透明でGFPテクノロジーが適応しやすい胚発生期のメダカを用いて、アポトーシスのリアルタイムでの可視化を試みた。本研究の予備実験として、tunel法により発生過程でのアポトーシスを検出・計数を行った。研究の先行する他の動物の発生と同様にメダカでも、特に網膜・中枢神経に顕著なアポトーシスが起こる。また特に脳においてアポトーシスの実行酵素であるcaspase3Bが顕著に発現していることを見出し、caspase3Bによる発生期の網膜・中枢神経におけるアポトーシスの実行を推測した。(ActaHistochem Cytochem2007)。Nagaiらによって開発されたアポトーシス検出用のconstruct DNA iScat (CFP-caspase3の認識配列-YFP (VENUS))をメダカへ導入し、トランスジェニックメダカの創出を試みた。iScatは上述のcaspase3によってconstruct産物中央のcaspase3切断アミノ酸配列が切断され、CFPとVenus間のFRET消失によりによりcaspase3の活性化を検出するシステムである。受精卵へのconstruct DNAのインジェクションを行った結果として、一過的にiScatが発現し、中枢神経などでアポトーシスと判断されうる観察も得られたが、安定したトランスジェニック株として確立には至らなかった。これは注入DNA量などの工夫によって改善されうるものではなかった。その理由を以下のように推測した。生殖細胞の成熟にもcaspase3が制御するアポトーシスが必須であることが哺乳類において報告されているが、iScatが導入によりiScat産物が発現した生殖細胞系列において、iScatが競合的にcaspase3を阻害し、生殖細胞の正常な形成を妨げた可能性が挙げられる。この可能性については、今後iScat導入と、アポトーシスの頻度変化について厳密な検討を要する。様々な生物種において胚発生過程は、盛んな細胞増殖とともに、高頻度のアポトーシスが観察される。まず我々は胚発生期のメダカを用いて、アポトーシスのリアルタイムでの可視化を念頭に、基礎データとしてTUNNEL法による定量化を行い、以下の結果を得た。1)神経管由来の構造(網膜、脳、脊髄)において大半のアポトーシスが検出される。また尾の先端も多くのアポトーシスが検出される。2)網膜、脊髄のアポトーシスは胚発生の特定の時期に高頻度で起こる。3)網膜、脳においては多数のアポトーシスした細胞がクラスターを形成していた。4)脳、尾においてアポトーシスの実行酵素であるカスパーゼ3B,カスパーゼ3Aそれぞれが強く発現する。さらにFRETをもちいてin vivoにおけるアポトーシス全体像の可視化を行うため、トランスジェニックメダカの作製を現在進めている。
スターリニズムの言語のレトリック分析

本研究は1930-40年代のソビエト全体主義(スターリニズム)の言語、レトリック構造を分析することを目的とするが、本年度は、前年度整理した理論的な枠組みに従って、具体的なテクストの分析を進めた。まず、1934年にスターリンがイギリスの作家H.G.ウェルズと行った対談のレトリック分析を行い、ソ連社会の公的言説の最も基本にあるテーマがいかに「論敵」との言葉の闘争の中で正当化されていくか、という点を明らかにした。つまり、「雄弁家」としてのスターリン個人のレトリックの一部を明らかにした。それに続いてスターリンの演説を、ソ連社会の言語空間における「先行テクスト」とみなす観点からレトリック分析した。まず、1935年5月のスターリンの重要な演説の詳細なレトリック分析を行い、それが「社会主義リアリズム」の典型的なプロット(「教育の物語」「英雄の物語」)を持ち、その中に「粛清」や「個人崇拝」を正当化させるようなレトリックが組み込まれていることを明らかにした。そのほか、同じような枠組みを持ちながらさまざまなテーマ(「民族」や「女性」)について語られたいくつかのスターリン演説を分析し、1930年代半ばという時期におけるソ連社会の言説の大枠を明らかにした。これまで単に個々の言葉遣いの問題に限定されて論じられてきたにすぎない「ソビエト語」研究に、まったく新しい視点を持ち込んだものである。そのほかに、新聞報道や大衆歌などの資料の収集も行い、現在はそれらの分析に取り組んでいる。
線溶系酵素群による骨髄内ニッチ制御機構

本研究では、骨髄内外の細胞動員あるいは浸潤を制御するマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)活性化機構における線維素溶解系(線溶系)因子プラスミノーゲン(Plg)/プラスミンの機能解析、また骨髄由来細胞の動員ないしは生着過程における骨髄内細胞外環境構成の解明を目標としている。今年度、研究代表者らはまずPlg遺伝子欠損マウス(Plg-/-)とその野生型を使用し、生体骨髄中のストローマを主とした微小環境において潜在酵素ProMMPからのMMPの生成が、Plg/プラスミン系によって制御されていることを確認した。さらにこれらのマウスに一定量の抗がん剤を投与した際、Plg-/-では骨髄組識再生に著しい障害が存在し、生存率にも有意な差が生じること、さらにこの原因としてPlg-/-生体の細胞外環境を構成する骨髄ストローマでは、MMPの活性化障害とこれに伴う造血因子Kit-ligandのプロセシングが抑制されていることを明らかにした。これらの実験結果から代表者らは、組織型Plgアクチベーター(tPA)を使用することによる線溶系の活性化を通じて、MMP活性化、Kit-ligand分泌の亢進を誘導し、骨髄ストローマの活性化と骨髄細胞の分化増殖が促進されることを示した。本研究によって生体内における線溶系の亢進は、MMPの活性化に直結すること、Kit-ligand等の細胞増殖因子の分泌、さらには血管新生、組織再生を促進していること、また前年度で報告した各種組織再生関連ニッチの構成細胞の末梢組織への動員及び浸潤も線溶系因子の活性化によって制御されている可能性も示唆された。従って本研究成果は、骨髄内の細胞外環境が、生体に加わる様々な生理学的ストレスに対応して、骨髄細胞の分化増殖を制御する生命機能維持中枢の一翼、生体内ホメオスタシス維持機能を担っていることを証明したと言える。今年度、研究代表者らは、患者検体を使用して顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)によって骨髄内ニッチから動員される末梢血中の単核球数と血漿中の線溶系酵素の一つである可溶型ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体レベルとの間に正の相関関係があることを報告した。またこの報告の中で、単核球中において特に好中球分画との相関性が強いこと、ここに起因する蛋白分解酵素が受容体プロセシングにおいて重要な役割を担っていることを示唆した。また今年度の研究において、生体内で巨核球系細胞を中心とする造血系細胞が、血管内皮増殖因子(VEGF)あるいはケモカインSDF-1(CXC1-12)を含む組織再生因子の担体として機能していること、さらにこれに関連してトロンボポイエチン(TPO)あるいはc-mp1遺伝子欠損マウスでは野生型と比較して傷害組織再生が明らかに障害されていることを報告した。加えて代表者らはこれらサイトカインの投与が、骨髄中の細胞外環境形成に深く関与するマトリックスメタロプロテイナーゼ群(MMPs)の活性化を通じて、骨髄ストローマ細胞からの生体因子分泌を促進し、骨髄内ニッチにおける造血幹細胞の分化及び造血前駆細胞の増殖、さらに末梢血中への各種組織前駆細胞を含み、かつ組織再生因子の担体として機能する骨髄由来細胞の動員を誘導すること、骨髄由来細胞のうち、VEGF受容体-1(VEGFR1)陽性CXCR4陽性分画に属するヘマンジオサイトが末梢組織再生におけるHUBとして機能していること等を示レた。現在、代表者らはプラスミノーゲン(Plg)の活性化によって生成するプラスミンが、骨髄内の細胞外環境中においてプロ酵素からMMPの活性型への変換を促進することに注目し、Plg遺伝子欠損マウスを使用して線溶系因子活性化の骨髄造血制御機構における機能解析とその臨床応用に関する基礎実験を継続中である。

従って本研究成果は、骨髄内の細胞外環境が、生体に加わる様々な生理学的ストレスに対応して、骨髄細胞の分化増殖を制御する生命機能維持中枢の一翼、生体内ホメオスタシス維持機能を担っていることを証明したと言える。
モジュライ空間の幾何学と位相的場の理論への応用

共形場理論を使ってモジュラー函手をJ.E. Andersenとの共同研究で構成していたが、ゲージ群がsl(n,C)の場合にこのモジュラー函手から構成される位相的場の理論(3次元多様体の不変量)はReshetikhin-Turaevが構成していた位相的場の理論を一致することを証明した。さらに共形場理論で構成される射影的平坦接続がHitchinが構成した射影的平坦接続と一つの例外を除いて一致することが証明されていたが、証明されいなかったsl(2,C)レベル1の場合に証明を完成した。また、標数p>0の場合に種数2の退化の図形Fを有する重複ファイバーpFの構成を行った。本年度はゲージ群がsl(n,C)の場合の共形場理論から作られる位相的場の理論の構造についての論文の再検討を行った。従来の議論ではモジュラー圏をスケイン理論から構成するBlanchetの議論を直接使っていたが、Hecke代数の表現に関するGNS構成を使ってBlanchetの理論を書き換えることに成功した。このことによって共形場理論から構成されるモジュラー函手と一般の位相的場の理論との関係が見やすくなり、これまで複雑な議論を重ねてゲージ群がsl(n,C)の場合に共形場理論から構成した位相的場の理論がReshethikin-Turaevの位相的場の理論と一致することの証明を行ってきたが、証明を見通しよい形に書き直すことが可能になった。この結果はプレプリントにして発表し、雑誌に投稿中である。また超楕円曲線の族の場合に共形場ブロック束の射影的平坦接続を具体的に記述することを試み、部分的に解決した。以上はJoergen E. Andersenとの共同研究である。曲線の退化に関しては、正標数の重複ファイバーに関する研究を継続し、種数2の場合に重複ファイバーを構成する一般的方法を見出した。リー環sl(n C)をゲージ対称性に持つ共形場理論から構成した位相的場の理論がReshetiken-Turaevの構成した位相的場の理論に一致することの証明の改良を行った。特別な場合、共形場ブロックのモノドロミー表現がヘッケ代数のWenzlが構成した表現へと拡張できることを使い、さらにこれらの表現の具体的な表示を使うことによって、これまでの証明がさらに簡約化され、またその意味づけが明確になった。さらに、種数2のリーマン面上のsl(2,C)をゲージ対称性に持つ共形場ブロック束のTUY接続とべくトル束のモジュライ空間を使って構成されるHitchin接続との関係を考察した。両者が一致することが未だ証明されておらず、その証明を目標としたが、一部証明が未完成であり、引き続き研究を続ける必要がある。以上の研究はデンマーク、オールフス大学のアンデルセン教授との共同研究である。本年度は主として位相的場の理論と共形場理論とについて研究した。前年度から引き継いで研究を続けていた超楕円曲線上の共形場ブロックのTUY構成とベクトル束のモジュライ空間による構成の双方に関して対応する共形場ブロックの射影的接続に関して両者が一致することを示した。これによって種数2の場合の例外がなくなり、すべての場合に共形場ブロックとその上の射影的接続が二つの異なる構成で一致することが最終的に確定した。さらに、ベクトル束のモジュライ空間に関してはレベル・ランク双対性が知られているが、そのことと関連して,レベル2のアーベル的共形場理論を使ってレベル1のsl(2,C)共形場理論を具体的に構成した。さらに複素単純リー代数をゲージ対称性に持つ共形場理論から構成される位相的場の理論に関してsl(n,C)以外の場合の考察を行った。この部分は次年度にさらに精密に考察する予定である。Tsuchiya-Ueno-Yamadaによるゲージ対称性を持つ共形場理論における共形場ブロック束の接続(TUY接続)とベクトル束のモジュライ空間をつかったHitchinによる共形場ブロック束の接続(Hitchin接続)の同型について、sl(2,C)でレベル1かつ種数2の場合には同型の証明が知られていなかった。ただしこの場合はHitchin接続はそのままでは定義できないので、修正して定義する必要がある。今年度の研究でこの二つの接続の同型を証明した。その証明のために一般レベルのアーベル的共形場理論を展開し、レベル2のアーベル的共形場理論とリー代数sl(2,C)をゲージ対称性に持つレベル1の共形場理論とを比較し、両者の共形場ブロックが同型であることを証明し、そのことをつかって両者の接続が同型であることを示すことができた。さらに,sl(n C)以外の単純リー代数をゲージ対称性に持つ共形場理論からも位相的場の理論が構成できることはJ.E. Andersenとの共同研究で確定しているが、それが実際にどのような位相的場の理論であるかの検討を行った。最終的には点付き射影直線上の共形場ブロックのモノドロミー表現を確定することに帰着されることを示したが、モノドロミー表現の計算は今後の研究課題として残された。

さらに共形場理論で構成される射影的平坦接続がHitchinが構成した射影的平坦接続と一つの例外を除いて一致することが証明されていたが、証明されいなかったsl(2,C)レベル1の場合に証明を完成した。また、標数p>0の場合に種数2の退化の図形Fを有する重複ファイバーpFの構成を行った。前年度から引き継いだ課題を解決し、さらに未解決の課題の解決についての道筋をつけることができた。複素多様体論次年度は最後のまとめの年にあたるので、これまでの成果をもとに研究を深める。Blanchetの理論をHecke代数の表現のGNS構成を使って書き換えることに成功し、GNS構成法が理論展開にきわめて有効であることが分かり、今後の展開の基礎となることが明白になった。また、超楕円曲線の場合に共形場ブロックに関してTUY理論の構成とベクトル束のモジュライ理論を使った構成との関係を詳しく調べることにより、共形場ブロックの二つの異なる観点からの取り扱いを明確にすることができ、今後の研究の基礎が確立した。さらに曲線の退化に関して正標数での重複ファイバーの一構成法を見いだしたことにより、多数の重複ファイバーの構成が可能になった。種数2の場合のTUY接続とHitchin接続の関係の考察が予定通りに進まなかった。アンデルセン教授との共同研究を推進するために招聘を行い、そのために国内旅費の使用をおさえた。超楕円曲線の族の場合の共形場ブロック束の接続に関してその記述法の研究を継続して行い、とくに共形場ブロックのユニタリ内積の具体的な表現を見いだす研究を継続する。また正標数の曲線の場合標数0の場合には持ち得ない自己同型をもつ曲線が存在する。この場合に退化と自己同型の関係を調べ、正標数での特有な現象の解明を行う。共形場理論から構成した位相的場の理論を、共形場理論から構成したことを生かす形で、モジュライ空間の研究に応用することを考える。また、超楕円曲線のモジュライ空間に制限した場合のTUY接続を具体的に記述する方法をみいだしてHitchin接続との関係を明確にすることを目標とする。情報収集のための国内旅費として使う。オールフス大学のアンデルセン教授の招聘、およびオールフス大学を訪問してアンデルセン教授との共同研究を行うのために、また国内の研究者と研究を宇移審するための情報交換を行うための旅費、および研究に必要な書籍の購入を行う。
糖尿病合併慢性腎不全、透析患者での心筋障害の発生機序の解明

本研究は、慢性腎不全や透析患者においてurea hydrogen peroxide(UHP)を介する糖酸化ストレスの亢進が心筋組織蛋白の糖酸化修飾を引き起こし、これが心不全発症に関与しているという仮説を証明する目的で遂行された。まず我々は、糖尿病、慢性腎不全、透析患者の剖検症例を用いて心、血管組織のコラーゲンやエラスチンの糖酸化ストレスと石灰化について検討した。慢性腎不全、透析患者のマトリックス蛋白質には糖酸化産物であるカルボキシメチルリジンとペントシジンが増加し、これら患者の心、血管組織における石灰化の亢進に密接に関連していることを明らかにした(Nephrol Dial Transpl 17:630,2002;18:1601 2003)。そこで、マトリックス蛋白やアルブミンをin vitroで修飾し、蛋白質の機能がどのように変化するか検討した。糖酸化修飾マトリックス蛋白(コラーゲン、エラスチン)のカルシュウム結合能は亢進し、糖酸化修飾アルブミンの抗酸化能は低下することを明らかにした(Heart Vessels 17:22,2002;J Vasc Res 40:567,2003)。第三に、腎不全患者剖検例と5/6腎摘慢性腎不全ラットの心筋組織のミオフィラメント蛋白の糖酸化修飾について検討したところ、いずれにおいても心筋ミオフィラメント蛋白のペントシジン含量は増加していた。さらに、心筋組織のUHP量も増加していた。そこで、尿素または透析患者血清濾液存在下で心筋組織をリボースと反応させると、ペントシジンとUHP量が尿素や透析患者血清濾液の濃度に依存して増加した。このことから、慢性腎不全患者では心筋ミオフィラメント蛋白がUHPを介して糖酸化修飾されている可能性が示唆された(Am Coll Cardiol 39:416B,2002;J Am Soc Nephrol, in print)。方法:研究1)糖尿病(DM群、5例)または慢性腎不全を有する非糖尿病剖検例(CRF群、7例)を用い、心筋ミオフィラメント蛋白質中のペントシジンとマロンジアルデヒド量を調べた。対照(C群、7例)には年齢をマッチさせた糖尿病および慢性腎不全のない剖検例を使用した。研究2)慢性腎不全で透析歴を有する剖検例(HD群、8例)と年齢をマッチさせた非慢性腎不全剖検例(C群、7例)の心臓組織中のUHP(urea hydrogen peroxide)量を測定した。結果:研究1)心筋ミオフィラメント蛋白質中のマロンジアルデヒド量はCRF群:2.30±1.19(ng/μg)、DM群:2.95±1.79(ng/μg)、C群:3.34±1.60(ng/μg)で3群間に差は見られなかった。一方、ペントシジン量はCRF群:5.46±4.33(nmol/mg)、DM群:2.59±3.02(nmol/mg)、C群:0.25±0.18(nmol/mg)で、CRF群においてC群に比べ有意に増加していた。しかし、DM群とC群との間には差は見られなかった。研究2)UHP量は、HD群(0.28±0.02μmol/g)でC群(0.11±0.025μmol/g)に比べ有意に増加していた。

結論:以上の成績は、ヒトの慢性腎不全患者において心筋ミオフィラメント蛋白質がUHPによる糖酸化修飾を受けていることを示している。今後は、in vivoおよびin vitroの実験系を用いてUHPによる心筋ミオフィラメント蛋白質の糖酸化修飾メカニズムを解明する予定である。方法:研究1)ストレプトゾトシン糖尿病ラット(DM群)、5/6腎摘腎不全ラット(CRF)および対照(C群)を作製し、4、8週間後の心筋ミオフィラメント蛋白質中のペントシジンと心筋組織のマロンジアルデヒド量を調べた。研究2)ヒト剖検例の心筋組織を尿素存在下または透析患者血清の限外濾過濾液存在下でリボースと37°C、4ないし8週間、in vitroで反応させ、UHP (urea hydrogen peroxide)量とペントシジン量を測定した。さらに、UHPによる糖酸化の亢進機序を解明するため、反応液にマニトール(100mM)、カタラーゼ、SOD(500U)を添加した場合のペントシジン量の変化を調べた。結果:研究1)ラット心筋組織中のマロンジアルデヒド量はCRF群:0.072±0.026(μmol/g)、DM群:0.055±0.015(μmol/g)、C群:0.017±0.008(μmol/g)でCRFとDM群で対照(C群)に比べ増加していた。一方、ペントシジン量はCRF群:1.25±0.76(nmol/mg)、DM群:0.39±0.21(nmol/mg)、C群:0.46±0.33(nmol/mg)で、CRF群においてC群に比べ有意に増加していた。しかし、DM群とC群との間には差は見られなかった。研究2)ペントシジンとUHP量は、4、8週間いずれにおいても尿素の容量または透析患者の血清濾液の尿素量に相関して増加した。この反応液にカタラーゼ、マニトールを添加するとペントシジンの形成は抑制されたが、SODにはこの抑制作用は見られなかった。結論:以上から、腎不全状態では心筋ミオフィラメント蛋白質がUHPを介して糖酸化修飾を受けること、またこの修飾にはヒドロキシラジカルが関与している可能性が示唆された。
YAC-トランスジェネシスを用いた突然変異レスキュー法の開発

一昨年度、咋年度とマウスのマウスチロシナーゼ遺伝子のYAC-DNAを用い、トランスジェネシスに有効なYACクローンの調整法の開発、ならびにYAC-トランスジェネシスを行ってきた。トランスジェネシスによりYAC-,やBAC-DNAの導入されたトランスジェニックマウスは多数得られたことから、技術自体の開発には成功した。しかし、残念ながら突然変異をレスキューできるまでには至らなかった。この原因がYACクローンに潜在的に存在する様々な長さの欠失によることが明らかになったことと、これまで入手可能なYACライブラリーからはレスキュー可能なチロシナーゼ遺伝子を含むYACクローンが見いだせなかった。そのため、今年度はチロシナーゼ遺伝子をあきらめ、他の遺伝子でこの方法を応用することにした。標的とした遺伝子は、内耳の有毛細胞に異常を持つジャクソンシェシェーカー(js)と呼ばれる突然変異である。この遺伝子は現在我々の研究室でポジショナルクローニングを行っており、この遺伝子領域約1.3メガ塩基対にわたる整列YACクローン群が構築されており、またそのYACクローンの分子生物学的性質が詳しく調べられているためである。解析の結果は、しかしながら、ほとんど全てのYACクローンに様々な欠失が見られ、やはりトランスジェネシスには適さないことが判明した。このため、これらの整列YACクローン群をもとに、欠失がほとんど存在しないといわれるBACクローンを新たに多数単離した。現在、これらのBACクローンを使ってjs突然変異のレスキューが可能か否かを検討している。疾患など固体のレベルでのみ発現する遺伝子(可視的表現型遺伝子)の候補をクローニングしたとき、その最終的な証明にはその野生型遺伝子を固体に導入することによって、その表現型がもとに復帰するということを示さねばならない。しかしながら、これまでの方法ではポシショナルクローニングという非常に時間と経費の必要な方法しか無かった。この点をより簡便にするため、巨大DNAをクローニングできる酵母人工染色体(YAC)を用い、トランスジェネシスを行う系の開発を試みた。今年度はマウスアルビノの原因となる遺伝子、チロシナーゼ遺伝子を含むYAC-DNAをマウスに導入し、有色の固体を得るための試みを行った。もし、YACに含まれる野生型のチロシナーゼ遺伝子が正常にマウス固体中で働けば、本来遺伝的にアルビノであるべきマウス固体は、野生型チロシナーゼ遺伝子のために体毛に着色することが期待できる。これまでに、この野生型チロシナーゼ遺伝子を含むYAC-DNAを用い、アルビノマウスによるトランスジェネシスを行った。これまでに、数百頭の産仔が得られたが、有色の固体はまだ観察されていない。その原因の1つはYAC-DNA中にしばしば生じる遺伝的欠失の可能性があるため、現在その点を含めて検討中である。ヒトの遺伝性疾患についての原因遺伝子の解明には、まずその遺伝子を分子生物学的に単離し、最終的に個体でその単離された遺伝子が果たす役割が理解されなければならない。多くのヒト疾患では、原因遺伝子の機能が不明な場合が多く、その様な場合には連鎖解析に基礎をおいたポジショナルクローニングが非常に有効である。現在のポジショナルクローニングでは、まず連鎖地図を基礎にして物理地図の構築し、その領域からの発現遺伝子の単離、多型解析による候補遺伝子の同定など、非常に時間と手間のかかる段階が必要である。本研究ではマウスをモデルにし、突然変異体にYAC-、あるいはBAC-などによって単離された巨大DNAを導入することで、直接その突然変異に関わるYAC-のクローンを単離し、そのクローンのみから発現している遺伝子を補足する技術開発を目指している。これまでに、トランスジェネシスに必要な高純度なYAC-DNAの精製法の開発には成功し、トランスジェネシスを行い、幾頭かのトランスジェニックマウスが得られた。このことから、YAC-トランスジェネシスの技術自体の開発はできたものと考えられる。しかしながら、これまでまだその表現型が野生型に復帰した個体は得られていない。

この原因を追求するために、使用したYAC-DNAを調べてみた結果、YAC中に微小欠失が高頻度に起こっているためであることが判明した。現在、この点を解決するために、YACより遺伝的安定性の高いBACを代替として使用する系、およびYACの不安定性は染色体の領域により異なるので、YACが比較的安定に保たれている染色体領域に存在する突然変異を使用する方向で研究を進めている。一昨年度、昨年度とマウスのマウスチロシナーゼ遺伝子のYAC-DNAを用い、トランスジェネシスに有効なYACクローンの調整法の開発、ならびにYAC-トランスジェネシスを行ってきた。トランスジェネシスによりYAC-DNAの導入されたトランスジェニックマウスは多数得られたことから、技術自体の開発には成功した。しかし、残念ながら突然変異をレスキューできるまでには至らなかった。この原因がYACクローンに潜在的に存在する様々な長さの欠失によることが明らかになったことと、これまで入手可能なYACライブラリーからはレスキュー可能なチロシナーゼ遺伝子を含むYACクローンが見いだせなかった。そのため、今年度はチロシナーゼ遺伝子をあきらめ、他の遺伝子でこの方法を応用することにした。標的とした遺伝子は、内耳の有毛細胞に異常を持つジャクソンシェーカー(js)と呼ばれる突然変異である。この遺伝子は現在我々の研究室でポジショナルクローニングを行っており、この遺伝子領域約1.3メガ塩基対にわたる整列YACクローン群が構築されており、またそのYACクローンの分子生物学的性質が詳しく調べられているためである。解析の結果は、しかしながら、ほとんど全てのYACクローンに様々な欠失が見られ、やはりトランスジェネシスには適さないことが判明した。このため、これらの整列YACクローン群をもとに、欠失がほとんど存在しないといわれるBACクローンを新たに単離した。現在、これらのBACクローンを使ってjs突然変異のレスキューが可能か否かを検討している。
ファージウイルス群集改造理論に基づいた乾癬患者のＶｉｒｏｍｅ解析による病態解明

本研究は乾癬の患者検体を用いて細菌16SrRNA遺伝子のメタゲノム解析に加えファージウイルスをターゲットとしたVirome解析を包括的に行う事で乾癬の病因解明に繋がると期待するものである。本研究を推進するために、大学規定の生命倫理審査受理の後、実際に患者検体を採取・保管を行った。現時点までに、健常者および乾癬患者、約15名ずつのエントリーを行った。また、採取検体から効率よくViromeを解析するため、スピンカラムキットを用いたウイルス由来核酸抽出法の至適な条件を検討した。尋常性乾癬患者と健常者よりサンプルを採取するために倫理委員会の承認を得た。解析について、研究協力者より助言を得たため、当初の予定症例数10名以上という点を変更し患者及び健常者がそれぞれ20名を超えた時点でサンプル処理を行うように計画を変更した。本年度は得られたサンプルの情報を蓄積するため、患者末梢血のIL-17産生細胞およびIFN-g産生細胞につきフローサイトメトリーを用いて解析を行った。乾癬患者末梢血は健常人と比較し、IL-17細胞の分画の優位な上昇が認められた。IFN-g産生細胞の分画には優位な差を認めなかった。また、現在並行して行っている他研究の結果と、これまでに明らかとなった最新の論文を含め文献学的検討を行ったとことろ、ファージゲノムは皮膚サンプルから抽出し直接解析するよりも、皮膚細菌叢解析結果を参照の後、ターゲットとなる細菌の特定を行った後、全ゲノムからファージ関連遺伝子を比較する方法が最適であることがまず乾癬患者と健常人の各部位における細菌叢の比較解析を行った後、標的ファージのファージのサンプル中の解析を行うよう計画を変更した。細菌叢解析のサンプルも末梢血解析患者より同時に採取し、凍結保管を開始している。乾癬患者における皮膚でのIL-17細胞の浸潤様式なども解析する可能性を考え、生検皮膚組織を用いてIL-17産生細胞について検討を行い、IL-17産生細胞が乾癬患者病変部ひふで優位に増加していることを見出した。研究実績の概要にもある通り、並行して行っている他研究より得られた知見をいかし、より効率的に研究を推進するため、予定症例数の検体が集積されてから、検体の解析に着手するように変更している。倫理委員会の承認に予定よりも多くの期間を有したこと、また予定解析症例数を増やしたことで研究遂行に遅延が生じている。尋常性乾癬はTh1+Th17型の慢性炎症性疾患であるが、最近では常在細菌叢の定常状態が変化するといういわゆるDysbiosisの関与する疾患の一つと考えられている。一方、マウスを用いた研究では、TLR7のリガンドである核酸類似物質イミキモドの外用が乾癬モデルとして広く用いられるが、イミキモドがヒトの乾癬の病態で何を模しているのかは明らかでない。細菌16SrRNAメタゲノム解析に加え最近、バクテリオファージウイルスによる細菌叢の“Community Shuffling(群集改造)"が宿主のDysbiosisを引き起こすという理論が新たに提唱された。これは、バクテリオファージが環境ストレスにより優良な常在細菌内でより溶菌サイクルを引き起こし、病原性偏利共生菌が有利になるというDysbiosisサイクルのことを指す。そこで、ウイルス由来のssRNAがTLR7のリガンドであることを踏まえ、本研究は乾癬の患者検体を用いて細菌16SrRNA遺伝子のメタゲノム解析に加えファージウイルスをターゲットとしたVirome解析を包括的に行う事で乾癬の病因解明に繋がると期待するものである。また、採取検体から効率よくViromeを解析するため、スピンカラムキットを用いたウイルス由来核酸抽出法の、至適な条件を検討した。技術的な難しさにより遅延が生じているのではなく、症例蓄積により多くの時間を要しているので、本年度も引き続き症例の蓄積を行い、解析に着手する予定である。また、計画の遂行順を変更し、細菌叢解析を行った後、標的になるファージウイルスを絞込みサンプル中のファージゲノム解析に着手する予定である。研究遂行にあたってはこれまで同様、研究協力者らから助言を仰いでいく予定である。皮膚免疫学研究推進に遅延が生じているため、事業期間を1年延長し本年度も引き続き解析を行っていく予定である。ウイルスDNA・RNA、細菌DNA抽出とシークエンサーを用いた解析が本年度の中心となることから,この解析に関わる費用を遺伝子網羅解析用として使用する予定である。
肝細胞の増殖と分化を相反的に制御する分子実体の解明

成熟肝細胞の増殖と分化は細胞密度によって相反的に制御されている。(1)高細胞密度でHGFによるLARの活性化機構として、Furin様プロテアーゼの関与を明らかにした。(2) TDOプロモーター制御下でGFPを発現するトランスジェニックマウスの解析から、種間で保存されている相同性領域を見出し、結合する転写因子としてC/ EBP-αを同定した。(3)肝細胞増殖に必須であるプロリンは、コラーゲン合成を介してサイクリンD, Eの蓄積を引き起こすことを見出した。成熟肝細胞の増殖能と分化機能は、細胞密度に依存して相反的に変化することが分かっている。(1)LARの細胞密度依存的な活性化機構の解析肝細胞の増殖は細胞密度に依存しており、高細胞密度の培養条件下では肝細胞増殖因子(HGF)刺激を加えても細胞増殖は起こらない。この現象は、生体内で臓器恒常性の維持のための重要な分子機構であると言える。我々は、高細胞密度ではc-Met/HGFレセプターのリン酸化が持続せず、LARによって脱リン酸化されることを明らかにしてきた。LARは細胞密度に関係なく発現しているが、その活性化は高細胞密度培養下でHGF刺激に依存して引き起こされる。そこでLAR活性化機構を解析したところ、LARはFurin様プロテアーゼによってsheddingされて活性化することが明らかになった。(2)TDOの発現誘導機構の解析TDOは成熟肝細胞で強く発現しており肝細胞の最終分化マーカーとされている。さらに、TDOの発現は細胞密度が高まるほど強く誘導されることが知られている。TDOの発現調節機構を解析するため、TDOプロモーター制御下でEGFPを発現するトランスジェニックマウスを作製した。その結果、TDO遺伝子の5'上流約22kbpの範囲のうち、-10kbpから-22kbpの領域がTDOの肝臓特異的発現に重要であることが明らかになっている。この領域をさらに詳細に解析したところ、ヒト、マウス、ラット種間で保存されている領域を見出した。現在、ChIP assayとcircular chromosome conformation capture(4C)法により、染色体構造とTDO遺伝子発現制御の相関性について解析を行っている。(1)肝細胞の増殖に必須なプロリンの作用機構の解析初代培養肝細胞は増殖因子刺激に呼応して速やかにDNA合成を開始するが、その培養液中にプロリンが含まれることが必須であることが明らかにされている。そこで、プロリンの作用点を解析したところ、細胞周期G1/S期のサイクリンであるcyclin Eの蛋白レベルでの発現蓄積を引き起こすことを見出した。さらに増殖因子の存在に関わらず、プロリン添加のみで肝細胞のcyclin Eの蓄積が認められたことから、増殖因子→cyclin D発現上昇→cyclin E発現上昇という経路以外にプロリンが作用していることが示唆された。(2) TDOの発現誘導機構の解析TDOの発現は肝実質細胞の分化状態を反映しているおり、肝細胞の最終分化マーカーとして用いられている。TDO遺伝子の5'上流領域の解析から、マウス、ラット、ヒトの種間で保持されている相同性領域を見出しており、マウスでは約-15kbの領域に存在する。この領域に結合する転写因子をTFSEARCHプログラムにより検索したところ、C/EBP-αが候補に挙げられた。さらに、肝細胞内における結合はChIPアッセイにより確認した。次に、C/EBP-αがTDOの転写活性に影響を及ぼすかどうかを調べるため、ルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、マウスの約15kbの領域を含むコンストラクトはC/EBP-αに依存してルシフェラーゼ活性が上昇した。以上より、TDO遺伝子の上流に存在する相同性領域は、C/EBP-αを介してTDOの発現に関与していることが示唆された。「肝細胞の増殖に必須であるプロリンの作用機構の解析」初代培養肝細胞の細胞周期は通常GO期に維持されているが、増殖因子刺激に呼応して速やかに増殖(DNA合成)を開始する。この時、培養液中にプロリンの存在が必須であることが明らかにされている。私達は、プロリンが細胞周期G1/S期のサイクリンであるcyclin Dおよびcyclin Eの蛋白レベルでの発現蓄積を引き起こすことを見出した。cyclin Eの蓄積は、増殖因子からのシグナルにより発現誘導されたcyclin Dの下流で起こる細胞増殖に必須な現象である。しかし、プロリンの作用は増殖因子の存在に関わらず、プロリン添加のみで肝細胞のcyclin Eの蓄積が認められる。さらに、cyclin Eの蓄積は転写レベルの亢進ではない。cyclin Eはcdk2と結合しS期への進行に関与するが、その後、GSK-3βおよびcdk2によってリン酸化されることでcyclin Eのユビキチン化が起き、速やかにプロテアソーム系で分解される。GSK-3βの活性はAktによって負に制御されていることが知られているので、Aktの上流であるPI3K阻害剤を用いてプロリンの効果を調べた。

その結果、PI3K阻害剤によってプロリンの効果は完全に消失した。また、プロリンはコラーゲンの主要構成アミノ酸であり、コラーゲン合成阻害剤によって初代培養肝細胞のDNA合成は阻害される。そこで、コラーゲン合成阻害剤がcyclin Eの発現に及ぼす影響を調べたところ、プロリンによるcyclin Eの蓄積は認められなかった。以上の結果より、プロリンから合成されたコラーゲンによってPI3K/Akt経路が活性化され、cyclin Eの蓄積に関与していることが示唆された。