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妄想的な加害感の生起メカニズムに関する研究

妄想的加害感とは「他者に不快感を与えている」と事実に反して悩む症状である.本研究の目的は,加害感の妄想性がどのように生じるのかを明らかにすることである。本研究の結果、加害感をなんとか抑えなければならないと考えていたり、加害感をコントロールできない、と捉えている人ほど確信度が強まっていることが明らかになった。確信度の高まりには、加害観念に対する認知的なコントロールへの態度や仕方が関係していると考えられた。加害感とは「他者に不快感を与えている」と悩む症状である.単に悩むだけでなく、強い確信をもって他者に不快感を与えていると信じている場合、社会的機能が非常に阻害されることが知られているが、他者に不快感を与えているという認知が妄想的になってしまう心理学的メカニズムは実証的に明らかになっていない.そのため,治療・改善につなげるための基礎研究が必要である.平成25年度は主に次の2つの研究を行なった.1)前年度にSA-DOS日本語版(Sasaki,2009)を使用して、加害感を3つの次元から測定を行った.本年度はこのデータに基づいて、量的・質的データの更なる分析を行った.このうち、量的研究に関する成果は、平成26年度に日本国内の心理学の学会においてポスター発表を行なう予定である.2)関係付け的思考が妄想性に寄与していることが事例研究から予想されるが、その実態や治療を考える際,それが発達による一時的なものか,継続的な認知特性であるのかを踏まえる必要がある.関係付け的思考の傾向を測定するREF尺度(Lenzenweger et al., 1997)の日本語版を使用して、関係付け的思考傾向の発達的な推移を探索的に検討するための予備的データセットを確立した.現在分析中の知見と平成26年度に収集予定のデータから、結論を出す予定である.妄想的加害感とは「他者に不快感を与えている」と事実に反して悩む症状である.本研究の目的は,加害感の妄想性がどのように生じるのかを明らかにすることである。加害感とは「他者に不快感を与えている」と過度に悩む症状である.悩みが妄想的になり訂正ができなくなると社会的機能が阻害されるが,その妄想性が生じる仕組みについては明らかになっていない.そのため,治療法につなげるための基礎研究がまず必要となる.平成24年度は,加害感の実態と妄想化のプロセスを検討した.Social Anxiety-Discomfort to Others Scale日本語版(SA-DOS; Sasaki,2009)を大学生200名程度に実施し,多次元アセスメント法(e.g., Garety & Hemsley, 1987)を用いて,加害感の頻度・確信度・苦痛度についての定量的な基礎データを得た.次いで,先行研究より,妄想化に影響を与えていると考えられる心理的傾向の尺度を3つ実施して関連を検討した.あわせて,数名に対して加害感が妄想的になるプロセスについて面接調査を実施した.本研究の結果,健常大学生においても高い確信度をもつ加害感が体験されていることが確認された.そして,加害感の体験頻度と確信度との間に比較的強い有意な正の相関がみられており,加害感のエピソードと妄想性との親和性が改めてうかがえた.現在,データ分析の途上ではあるが,加害感の苦痛度と確信度の成因に着目した分析を行なっている.本研究は,多次元アセスメント法を対人恐怖症研究に導入し,症状の頻度だけでなく症状の体験され方の成因を実証的に明らかにしようとしている点が意義深いと考えられる.加害感とは「他者に不快感を与えている」と事実に反して妄想的に悩む症状である.その妄想性によって患者の社会的機能が非常に阻害されるため,治療法につなげるための基礎研究が必要となる.妄想性をもつ患者には,他者の何気ないしぐさを自分に結びつける「関係付け的思考」が共通してみられることが指摘されていることから,本研究では,関係付け的思考が妄想的な加害感の生起に及ぼす影響を実証することを目的とする.平成26年度は主に次の2つの研究と発表を行った。1)関係付け的思考が妄想的な加害感の生起に及ぼす影響を実証するため、一般サンプル1000名を対象に,SA-DOSの頻度・確信度・苦痛度をはじめ,REF尺度日本語版と自己関係付け尺度(金子, 2000)等を実施した.現在、データを分析中である。2)日本心理学会第78回大会で研究代表者の研究室所属の大学院生と連名発表を行った。この研究では、SA-DOSの多次元アセスメントのデータを軸として、関係付け的思考以外の認知的特徴である、反すうやメタ認知が加害感の確信度を高めるかどうかを検討した。結果から、繰り返し考えること(反すう)が加害観念の体験頻度を増加させているものの、反すうが直接的に確信の度合いを強めているわけではないこと、また、加害観念をなんとか抑えなければならないと考えていたり、加害観念を統制できない、と捉えている人ほど確信度が強まっていることが明らかになった。現在、関係付け的思考とこれらの認知的特徴との関連性を検討しつつ、加害感の確信度がどのようにして高まるのか、総合的考察を行っている。臨床心理学

最終年度のデータ収集の参考のための予備的研究が予定通り進んでいるだけでなく、本研究の結果を国内学会の年次大会に報告する準備が整っている.得られた定量的データを詳細に分析している途上ではあるが,データ収集,専門家からの助言や関連文献のデータベース化をするための準備は終了しているため,おおむね順調に進展していると考えている.今後は本研究の成果を,H25年度の国際学会・国内学会・関連研究会にて報告する予定である.必要に応じて他の専門家からの専門的援助をうけつつ25年度に収集したデータの分析を終了させ、最終年度のデータ収集につなげたい.本研究課題は3つの研究から構成されている.H24年度で行なった研究1では,データ収集が順調に行われているため,次年度以降で国際学会・国内学会・研究会などでその知見について発表するとともに,専門家からのアドバイスを受けつつ,学術雑誌に投稿する予定である.次年度以降では調査会社を利用して研究2,3と行ない,研究1と同様に,得られた知見を公表できるように努めたい.本年度も家庭の都合によって当初予定の出張を行なうことが難しく,前年度からの繰越を消化するに至らなかったため、次年度使用額が発生した.次年度は最終年度であり、本研究課題の成果を学会等で発表予定であるのに加えて、研究データや文献等をまとめる作業や論文化する作業、他の専門家からの助言等を受ける予定である.本年度は家庭の都合によって,予定していた出張や作業を行なうことが難しい場合があり,次年度に研究費を繰り越す運びとなった.次年度は,調査会社を使った調査を行なうことを当初から予定しており,データ収集については特に問題がなく行える予定である.また,H24年度に控えた作業についても,順次行なっていく予定である.
文化財と現代社会

現代社会のなかで重要性を増しつつあると同時に,開発などとからんで多くの問題を提起している文化財が現代社会といかに調和して共存しうるかを研究し,理論化するための研究組織を立案することが本研究の目的である。この目的のため本研究が実施したのは,(1)文化財の歴史的評価についてのサンプリング研究,(2)文化財の現代社会におけるサンプリング調査,(3)諸外国における文化財に関する動向調査,(4)国際共同研究の立案,(5)研究企画議,以上の5点である。(1)に関しては、時代による評価基準の大きな違いのあることが判明し,その異動の傾向を大局的に把握することの重要会性が明らかとなった。(2)に関しては,文化財に対する社会的コンセンサスが必すしも確立しておらず,世代,社会階層,地域,価値感(宗教など)によってかなりの差異があることが判明した。文化財を積極的に評価するためには,最小限の社会的コンセンサスをつくることが重要であり,そのための具体的,効果的方策の探求が本研究の今後の課題であることも明らかとなった。(3)に関してはイタリアを中心に動向調査を行った。戦前から文化財行政を積極的に行ってきた同国は文化財自体の価値評価だけでなく観光資源としての評価も加えて文化財を活用する社会的コンセンサスが確立しており,わが国の文化財問題に多くの示唆を与えてくれることがわかった。今後とも文化財に関する先進国とそうではない国々の動向を調査する重要性が判明したことは,本研究にとって大きな意義があった。(4)についてはイタリア,フランス,ドイツなどとの協同研究の可能性を追求し,実現可能であることがわかった。以上の研究を推進したのが(5)における会議である。本研究の推進により具体的研究課題とその重要性,研究組織の可能性が明らかとなったため,2年ほどの綿密な計画立案期間を設け,平成六年度の重点領域研究で本格的研究を開始する予定である。
二相液体培養法による遺伝性赤血球膜疾患赤芽球細胞膜の発生分化に関する生化学的研究

遺伝性諸種膜異常症に表現されている膜病態を細胞発生学的見地から検討するために、まず正常赤血球および赤芽球における膜形成過程の形態学的・生化学的研究を行った。この研究に必須の赤芽球培養系の確立を試み、ほぼ純系の赤芽球系細胞群を末梢血に存在するBFU-Eを用いて、二相培養を行うことによって確立しえた。まず第一相は末梢血単核細胞からIL-3、FCMを用いて、7日間培養し、CFU-Eを得、この時点でマクロファ-ジなどを除去し、更に第二相としてエリスロポエチン存在下で710日間培養を続け、ほぼ90%余の純系赤芽球集団を得ることに成功した。しかも培養終期項には5090%の赤芽球は脱核し、網赤血球成熟赤血球群を得ることが出来た。この方法は従来の報告に比較して格段の進歩であり、すでにBlood75(21:505511、1990、Biomed.Biochim.Acta.in pressなどに発表し、第12回International Symposium on Structure and Function Erythroid Cells(Berlin、1989年8月)およびVCLA Symposium(Taos,1989年2月)において招待講演を行った。この系を用いて、ヒト赤芽球における膜表面形質の発生・発現を血液型物質をマ-カ-として諸種monoclonal抗体を使用して検討した。その結果、赤芽球成熟に準じて、まずglycophorin Aが発現し、次いでABO型物質、Lewis型やP型物質が発現することが判明し、すでに第51回日本血液学会総会(平成元年4月)、第37回日本輸血学会総会(平成元年5月)、第31回日本臨床血液学会総会(平成元年11月)などにおいて発表した。現在、この系を用いて赤血球膜のcytoskeletonの発現を、spectrin、ankyrin、band4.2などについて検索を進めている。
シャペロン分子により生存シグナルを増強させる画期的な肝グラフト修復法の開発

肝細胞株に14-3-3ζを遺伝子導入よって強発現させ、低温酸素化灌流を模した低温酸素化状態に静置し、細胞障害とエネルギー代謝に対する影響を精査した。14-3-3ζは低温下でATP産生、MTT代謝を促進し、ミトコンドリア膜電位を高値に保った。14-3-3ζの発現増強は低分子化合物でも可能であり、臓器灌流時に併用することで臓器を修復できる可能性が示唆された。また、NaHSによりAktのリン酸化、HO-1、TRX1の発現が増強され、14-3-3ζ発現増強物質との併用により、上記の"強く生きる"能力の全てが増強された。権利化,実用化を念頭に向けてメカニズムと臓器レベルでの効果を検証中である。ラット正常肝をUW液中に48時間冷保存後、あるいは、その後新規灌流液を用いて2時間の低温酸素化灌流(HOPE)を施し、あるいは、HOPE中に水素ガス投与を併用、あるいは、冷保存なしに、単離肝灌流装置で90分間再灌流した。再灌流後の胆汁産生量、門脈抵抗を単純冷保存群と比較すると、HOPE群では殆ど改善しなかたっが、HOPE中に水素ガス投与を併用すると有意に改善された。現在、phosphatase, 14-3-3ζおよび関連タンパクをウェスタンブロットで解析中である。マウス肝細胞株(AML12)を用いて14-3-3ζ高発現細胞の作製を試みたが、培養中に細胞の状態が安定しないため、比較的安定しているヒト尿細管上皮細胞(HK-2)を用いて14-3-3ζ安定高発現細胞を作製した。14-3-3ζ高発現細胞では、細胞増殖が加速され、細胞数当たりのATP量が有意に増加した。UW液による冷保存後にもATP量は高値を維持することが明らかになった。解糖やミトコンドリア複合体の阻害剤、あるいは、低温低酸素保存を行った結果、このATP量維持作用は代謝抑制によるものではなく、酸化的リン酸化の促進に起因していた。また、酸化的リン酸化の促進に伴い、酸化ストレスが増強され死細胞が増加した。抗酸化剤投与によってATP量はさらに増加したが死細胞数は減少し、逆に酸化ストレス源の添加によって、ATP量は減少し、死細胞数は著明に増加した。ラット肝臓から肝細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞を初代培養する系を確立した。これらの細胞を持用いて、冷保存・再灌流をmimicしたin vitro実験の系を確立した。現在、レンチウィルスベクターを用いて、これらの細胞に14-3-3ζを強発現させる系を検討中である。低温酸素化体外灌流後に移植するための至適グラフト処理、ラット肝移植モデルを作成した。ラットを心停止させ、30-45分後に肝を摘出し、UW液で6-24時間冷保存した。このグラフトを既存液(HTK液)を用いて2-6時間低温酸素化灌流(HOPE)した。心停止45分群では、37°Cで酸素化再灌流した際に広範な組織壊死、高度の障害を認め、肝修復効果を認めなかった。心停止30分、HOPE6時間では、再灌流後の組織壊死領域は縮小し、非心停止ドナーの48時間冷保存・再灌流時と同等程度の壊死範囲に抑えらえれた。しかし、胆汁産生は改善せず、37°C酸素化再灌流中の門脈抵抗は高値を維持した。HOPE中、あるいは、37°C再灌流時に水素ガスを投与すると、再灌流直後から門脈抵抗が軽減され、胆汁産生量が有意に増加した。水素ガスは温度やHOPE前、再灌流前の組織障害とは無関係に、門脈を弛緩させることが示唆された。すなわち、水素ガスのみでは障害機転を強力に抑制できなかったが、門脈弛緩により、グラフトのwashoutや酸素、エネルギー源、各種の薬剤を効果的に供給させるのに役立つと考えられた。また、新規灌流液を用いたHOPEでは肝保護作用が増強されたことから、水素ガスと新規灌流液の併用が有効と考えられた。HOPEの有用性を証明するために、単離肝灌流モデル、in vitro実験モデルを作成し、種々の条件の肝組織、細胞を採取し、現在タンパク解析、水溶性小分子を解析中である。また、HOPEにおける14-3-3ζの機能も解析中である。さらに、新規灌流液、水素ガス投与における14-3-3ζの動態が、肝移植後の個体の生存率向上に寄与するかを検証するために、動物モデルを作成中である。これらの結果を得るために、研究期間を1年延長するに至った。14-3-3ζ高発現細胞株の作成に難渋している、また、ラット肝移植モデルを作成できる研究協力者の大学院生が急遽留学したため、後進を育成するのに時間を要している。

また、NaHSによりAktのリン酸化、HO-1、TRX1の発現が増強され、14-3-3ζ発現増強物質との併用により、上記の"強く生きる"能力の全てが増強された。権利化,実用化を念頭に向けてメカニズムと臓器レベルでの効果を検証中である。ラット正常肝をUW液中に冷保存後に種々の臓器修復法を施し、その臓器修復効果を検討した。まず、冷保存に使用する液はUW液と新規保存液を比較し、さらに、再灌流時に水素ガスを溶存させるか否かを検討した。これらの検討により、新規保存液の有用性と、保存法を問わず再灌流時の水素ガス投与の有効性が明らかになった。次に、新規灌流液(新規保存液と同じ液)を用いて、UW液で冷保存後に2時間の低温酸素化灌流(HOPE)を施し、その後再灌流した。新液によるHOPEは灌流中の門脈抵抗を著明に軽減し、再灌流障害を軽減した。また、HOPE中の水素ガス投与、さらにその後の再灌流時の水素ガス投与は相加効果があると考えられた。これらの方策を組み合わせることにより、少なくとも正常肝の長期冷保存では、冷保存肝の修復効果があると考えられた。また、これらの臓器修復に関与すると予想されるシャペロン分子の高発現、ノックダウン肝細胞株を作成し、低温酸素化灌流を模した細胞実験を行ない、ある種のシャペロンが低温下での細胞生存、エネルギー産生に深く関与することが明らかになった。さらに、そのシャペロンの発現を増強させる可能性がある薬剤をスクリーニング、2種類の有望な物質を見出した。それらの薬剤を使用すると、1-3時間で保護性タンパクの活性が5-10倍に増されることが明らかになった。これらの結果は、肝グラフトの体外灌流中に薬剤性のコンディショニングが可能なことを示唆しており、コンディショニング効果が得られる温度、灌流時間、灌流液組成等の検討に着手するに至った。現在、特許出願に向けて詳細を検討中である。2年度で検討すべきモデルのうち、14-3-3ζの高発現肝細胞株以外のモデルは全て作成を終えた。当初予定していた、AML12細胞はInsuli, Transferin, Sodium seleniteの添加を要し、細胞密度が高くなると性質が大きく変わってしまう場合があり、ストレスにも比較的弱い。tet-on/offのような二重安定発現株の作成には適していないのかもしれない。それゆえ、他の検討に使用しているSD ratの初代培養細胞を用いた検討を行うべく、予定を変更した。初代培養の手技確立と初代培養細胞への遺伝子導入の効率の低さゆえに、in vitroでの検討がやや遅れている。予定通りの細胞実験を期間を延長して、H28年度に完結する。また、ラット肝移植モデルを作成できる研究者を引き続き育成する。H28年度に検討が困難であれば、治療効果の判定は単離肝灌流モデルと初代培養細胞で行うことに変更することも考慮する。移植外科単離肝灌流後の肝組織の解析を進める。肝移植によるProof ofConceptを完結する。肝構成細胞の冷保存、低温酸素化保存における14-3-3ζの機能を解析する。補助事業期間延長承認:平成28年3月22日.14-3-3ζ高発現細胞株の作成に難渋しており、また、ラット肝移植モデルを作成できる研究協力者の大学院生が急遽留学したため、動物実験よりも細胞実験を中心に行った。それゆえ、動物実験に要するコストが先送りされ、H27年度には余剰金が発生した。為替変動による誤差が原因。上記の如くH27年度には余剰金が生じたものの、全体構想の中で動物実験は不可欠であり、H28年度にモデル作成、効果検証を進める予定である。必要な消耗品の購入に、適切に充当する。
二重課題の機序解明によるヒト脳内の情報制御システムの理解:脳機能イメージング研究

私たちが2つの作業を同時に行うとき、脳内では複数の情報処理をできるだけ円滑に進めるために情報制御システムが働くと考えられている。しかしながら、その神経機序の詳細はあまりわかっていない。本研究では、事象関連電位法や磁気共鳴装置など脳機能イメージング装置を用いて情報制御システムの神経機序の解明を試みた。これまでの実験データの解析から、単独条件(視覚刺激のみ)に比べ、2つの刺激を同時に与える二重課題条件(視覚・聴覚刺激)で、視覚刺激の知覚処理に関係する神経活動が低下することがわかった。そこで、別のモダリティー(体性感覚)についても知覚処理の影響を調べた。体性感覚の中でも、痒みなど侵害刺激は被験者が感じる刺激の強さといった行動指標を用いて知覚レベルの処理を容易に評価できる。そこで、痒み刺激装置を開発し、その装置を用いて実験を行った。単独条件に比べ、二重課題条件で痒みは知覚されるがその強さは減少した。また、視覚刺激と同様に、痒みの知覚に関係する神経活動も低下した。おそらく、知覚するのに必要最低限の処理能力のみ割り振られたために、そのような結果になったと思われる。そうすることで、2つの刺激を確実に知覚できるようにしているのかもしれない。更に、刺激に対して何かしら判断をするといった高次処理(例:視覚色弁別)についても検討した。その結果、高次処理に関係する脳部位(主に頭頂葉)の神経活動は、単独条件に比べ、二重課題条件で低下し、また、その活動の開始時間も遅延した。この遅延は、一方の刺激が処理される間、他方の処理は待機状態になるといった心理李のモデルと矛盾しない。そのような情報制御が頭頂葉における高次処理で起こっている可能性がある。以上のことから、.二重課題施行中、知覚野や頭頂葉などで行われる情報処理において情報制御が起こることや、情報制御のメカニズムが脳部位間で異なることがわかってきた。本研究では、二重課題(2つの異なる課題を同時に行う)の脳内メカニズムを解明することにより、ヒト脳内の情報制御システムの神経科学的理解を目指す。二つの課題を同時に行っているときに脳内ではある一定の規則に基づいて情報処理が行われることがこれまでの心理学的な研究から示唆されている。例えば、ボトルネックモデルやキャパシティーシェアリングモデルなどがある。しかしながら、実際に脳内で起こる情報処理がどのようなメカニズムなのかはほとんどわかっていない。本研究では、脳内の生理活動を非侵襲的に計測することができる機能的磁気共鳴装置(fMRI)や事象関連電位法(ERP)、ポジトロン断層映像法(PET)など脳機能イメージング法を用いることによって、二重課題施行中に脳内で起こる情報処理制御のメカニズムを明らかにする。本年度は、先行研究をもとに二重課題を作成し、健常被験者を対象に心理実験を行った。これまで心理学研究で報告された現象を確認し、脳機能イメージング実験用に二重課題を新たに作成した。作成した二重課題を用いて、課題遂行中の脳内の生理活動を計測するための実験環境のセットアップも行った。脳内で起こる様々な神経活動を反映する微弱な電気信号を頭表から計測するERP実験用に、その計測を可能にするための脳波測定装置や磁気シールドルームの設計・設置などをした。さらに、課題を作成・呈示するためのコンピュータや応答計測装置なども設置し、ERP実験ができるような環境を整えた。fMRIやPETについても同様に二重課題を呈示したり、課題に対する応答を計測したりするための装置の設計・設置などを行ってきた。次年度より、実際に実験データを収集・解析する。本研究では、脳内の生理活動を非侵襲的に計測することができる事象関連電位法(ERP)や磁気共鳴装置(MRI)、ポジトロン断層映像法(PET)など脳機能イメージング法を用いることによって、二重課題施行中に脳内で起こる情報処理制御のメカニズムを明らかにする。昨年度までに実験環境や実験課題、脳活動測定装置のセットアップをしたので、本年度は、実際に健常成人者を対象に二重課題施行中の脳活動を測定した。ERPを用いて脳活動の時系列変化を捉え、MRIを用いて脳の詳細な画像を撮影した。現在、得られた脳活動データを解析しており、新しい知見がいくつか得られている。例えば、これまで2つの課題を同時に行うときに、知覚レベルのような低次の処理では干渉をほとんど受けないという心理データが報告されているが、申請者の脳活動解析データは、知覚レベルで干渉の影響を受けていることを示唆した。来年度は、さらに解析を行い、また、実験を行うことによって、ヒト脳内の情報制御システムの神経メカニズムを解明する。

これまでの実験データの解析から、単独条件(視覚刺激のみ)に比べ、2つの刺激を同時に与える二重課題条件(視覚・聴覚刺激)で、視覚刺激の知覚処理に関係する神経活動が低下することがわかった。そこで、別のモダリティー(体性感覚)についても知覚処理の影響を調べた。体性感覚の中でも、痒みなど侵害刺激は被験者が感じる刺激の強さといった行動指標を用いて知覚レベルの処理を容易に評価できる。そこで、痒み刺激装置を開発し、その装置を用いて実験を行った。単独条件に比べ、二重課題条件で痒みは知覚されるがその強さは減少した。また、視覚刺激と同様に、痒みの知覚に関係する神経活動も低下した。おそらく、知覚するのに必要最低限の処理能力のみ割り振られたために、そのような結果になったと思われる。そうすることで、2つの刺激を確実に知覚できるようにしているのかもしれない。更に、刺激に対して何かしら判断をするといった高次処理(例:視覚色弁別)についても検討した。その結果、高次処理に関係する脳部位(主に頭頂葉)の神経活動は、単独条件に比べ、二重課題条件で低下し、また、その活動の開始時間も遅延した。この遅延は、一方の刺激が処理される間、他方の処理は待機状態になるといった心理李のモデルと矛盾しない。そのような情報制御が頭頂葉における高次処理で起こっている可能性がある。以上のことから、.二重課題施行中、知覚野や頭頂葉などで行われる情報処理において情報制御が起こることや、情報制御のメカニズムが脳部位間で異なることがわかってきた。
水チャンネル遺伝子の発現とイネの耐冷性との関係の解明

(1)水チャンネル遺伝子と耐冷性との関係:低温感受性のイネ品種「早生統一」のcDNAライブラリーから、3種類の水チャンネル遺伝子(rwc1,rwc2およびrwc3)を分離した。この中で、rwc3は根で特異的に発現している遺伝子で、低温下での根からの水の吸収を担っている。耐冷性イネ苗を低温処理した時や低温感受性イネ苗に脱水ストレスを与えて耐冷性を獲得させる処理を行うとrwc3が発現し、イネ苗が低温で脱水状態になって枯れるのを防いでいる。耐冷性を失わせる薬剤処理(カフェイン)でイネ苗を処理するとイネ苗は枯死するが、その時rwc3も発現が抑制されていた。このことから、水チャンネル遺伝子の発現とイネ苗の耐冷性の間には密接な関係があることが解った。rwc3を常時発現プロモータ(CaMV35S)につないで、イネに導入し、耐冷性を調べている。また、rwc1が脱水処理で発現することが解り、中国上海植物生理研究所と共同研究を進めている。(2)その他の解析:ゲノミックライブラリーからrwc3遺伝子のプロモーター約4kbpを分離・解読した。幾つかの特徴ある配列があった。これらが耐冷性を誘導する脱水ストレス条件で働く配列かどうか調べる目的で、プロモーター部分をレポータ遺伝子GUSにつないで、イネにパーティグルガンで導入し発現条件を検討した。現在予備的結果しか得られていない。また、水チャンネル遺伝子の膜露出部分のアミノ酸配列を合成し、ウサギを免疫して、抗体を得ることができ、細胞内局在性を調べた。(1)水チャンネル遺伝子と耐冷性との関係。低温感受性のイネ品種「早生統一」のcDNAライブラリーから、3種類の水チャンネル遺伝子(rwcl,rwc2,およびrwc3)を分離した。rwclおよびrwc2は根および葉のいずれでも発現している水チャンネル遺伝子であった。rwc3は根で特異的に発現している遺伝子である。rwc3について、イネの耐冷性との関係を調べた。rwc3はイネ苗を低温下に置くと発現しなくなる。しかし、0.5Mマニトールで前もって脱水ストレスを与えると低温下でもrwc3が発現し、その時、イネは耐冷性を獲得する。さらに、脱水処理後、カフェインを処理しすると、低温下でのrwc3の発現が抑制され、その時、イネは枯死する。このことから、低温下で水チャンネル遺伝子が発現するとイネは耐冷性を示すことが証明された。(2) rwc3プロモーターの解析。rwc3遺伝子が何故低温下で発現できないかを解明するために、ゲノミックライブラリーからrwc3遺伝子を分離した。プロモーターとして約4kbpの塩基配列を解読した。プロモーター部分をレポータ遺伝子GUSにつないで、イネにパーティグルガンで導入し発現条件を検討した。まだ、予備的結果しか得られていないので、来年度に正確な結果を出す予定である。(3)抗体を用いた組織分布の解析。水チャンネル遺伝子の膜露出部分のアミノ酸配列を合成し、ウサギを免疫して、抗体を得ることができた。水チャンネル遺伝子rwc3は根で特異的に発現している遺伝子である。rwc3遺伝子の発現とイネの耐冷性との関係について調べた。イネ苗が低温に強い状態の時にはrwc3遺伝子が発現していた。カフェインでイネ苗を処理しするとイネは枯死するが、その時rwc3の発現が抑制されていた。水チャンネル遺伝子の発現とイネ苗の耐冷性の間には密接な関係があることが解った。(2)rwc3プロモータの解析。rwc3遺伝子が何故低温下で発現できないかを解明するために、ゲノミックライブラリーからrwc

3遺伝子を分離した。プロモーターとして約4kbpの塩基配列を解読した。プロモーター部分をレポータ遺伝子GUSにつないで、イネにパーティグルガンで導入し発現条件を検討した。まだ、予備的結果しか得られていない。(3)抗体を用いた組織分布の解析。水チャンネル遺伝子の膜露出部分のアミノ酸配列を合成し、ウサギを免疫して、抗体を得ることができた。(1)水チャンネル遺伝子と耐冷性との関係:低温感受性のイネ品種「早生統一」のcDNAライブラリーから、3種類の水チャンネル遺伝子(rwc1,rwc2,およびrwc3)を分離した。この中で、rwc3は根で特異的に発現している遺伝子で、低温下での根からの水の吸収を担っている。耐冷性イネ苗を低温処理した時や低温感受性イネ苗に脱水ストレスを与えて耐冷性を獲得させる処理を行うとrwc3が発現し、イネ苗が低温で脱水状態になって枯れるのを防いでいる。耐冷性を失わせる薬剤処理(カフェイン)でイネ苗を処理しするとイネ苗は枯死するが、その時rwc3も発現が抑制されていた。このことから、水チャンネル遺伝子の発現とイネ苗の耐冷性の間には密接な関係があることが解った。rwc3を常時発現プロモータ(CaMV35S)につないで、イネに導入し、耐冷性を調べている。また、rwc1が脱水処理で発現することが解り、中国上海植物生理研究所と共同研究を進めている。(2)その他の解析:ゲノミックライブラリーからrwc3遺伝子のプロモーター約4kbpを分離・解読した。幾つかの特徴ある配列があった。これらが耐冷性を誘導する脱水ストレス条件で働く配列かどうか調べる目的で、プロモーター部分をレポータ遺伝子GUSにつないで、イネにパーティグルガンで導入し発現条件を検討した。現在、予備的結果しか得られていない。また、水チャンネル遺伝子の膜露出部分のアミノ酸配列を合成し、ウサギを免疫して、抗体を得ることができ、細胞内局在性を調べた。
『子供の生まれやすさ』と『感染症への罹りにくさ』をつなぐ分子メカニズム

からだの内側は、粘膜上皮に覆われ、ウイルスや細菌、微小粒子状物質(PM2.5)の侵入から守られている。我々が発見したマイクロエクソソームは、卵や、生殖器と泌尿器を含む管腔構造の粘膜上皮から分泌される。マイクロエクソソームは、エクソソームと共通の成分を含むものの、構造が全く異なる逆ミセル状の構造体である。我々の研究から、マイクロエクソソームは、2つの役割(細胞膜の修復とウイルスの捕捉)を担っていることが推測される。本研究ではマイクロエクソソームを手がかりに、一見別々に見え、我々にとって身近な『子供の産まれやすさ』と『感染症への罹りにくさ』をつなぐ分子メカニズムの解明をめざす。研究代表者が発見したマイクロエクソソームは、卵だけでなく、生殖器、泌尿器を含む様々な管腔構造の粘膜上皮、グリア細胞やニューロン、視細胞からも分泌される。マイクロエクソソームは、「細胞膜の修復」と「ウイルスの捕捉」を担っていることが推測される。このマイクロエクソソームを手がかりに、一見、別々に見える「子供の産まれやすさ」と「感染症への罹りにくさ」をつなぐ分子メカニズムを解明する。マイクロエクソソームの分子解明は興味深く、構造から機能までを追及する価値がある。その研究の上に、卵と精子の融合性、ウイルスの感染性に関する仮説を立て、一見別々に見える「子供の産まれやすさ」と「感染症への罹りにくさ」を実証するプロジェクトで独創性が高い。オンリーワンの成果が出る可能性がある研究である。
地域のまちづくりと連携したスケルトン型集合住宅における合意形成支援システムの開発

本研究は、スケルトン・インフィル方式に「まちづくりとの連携」という現代的価値観を取り入れ、周辺地区環境を考慮したスケルトンに対する合意形成を行い計画されたスケルトン賃貸型集合住宅「アーバネックス三条」を対象として、第一に、同プロジェクトにおける合意形成プロセスの分析、第二に、オープンビルディングの主導者の一人、N・J・ハブラーケンMIT名誉教授による「Tissue method」理論を応用することによる空間構造のパターンの分析、第三に、まちづくりと連携したスケルトン型集合住宅の合意形成支援システムの開発を行なうことを目的とする。本研究における地域のまちづくりと連携したスケルトン型集合住宅における合意形成支援システムとは、「価値共有型建築規制・誘導システム」と「建物と空地の関係からみた建築ルール策定システム」から構成される。本年度の成果としては、前年度までの研究で明らかにした「価値共有型建築規制・誘導システム」を踏まえた上で、「建物と空地の関係からみた建築ルール策定システム」の実現可能性について検討を行った。具体的には、京都市都心部の職住共存地区の複数街区を対象に、「元学区」単位の建築ルールとして、(1)高さを緩和して空地を集中させる建築ルール、(2)高さを緩和して空地を分散させる建築ルール(3)通り景観を優先する建築ルール、(4)敷地奥空地を優先する建築ルール、という4つの建築ルールを設定し、各ルールの適合性が低い街区については、「町」単位の建築ルールを新たに策定し、「元学区」単位の建築ルールに重ね合わせるというシミュレーションを行った。その結果、「元学区」単位の建築ルールに「町」単位のルールを重ね合わせいくことで、「元学区」や「町Jというコミュニティの単位と一致しない、「街区単位」や「通り単位」といった空間単位に対して建築ルールを策定する手法を提示した。本研究は、スケルトン・インフィル方式に「まちづくりとの連携」という現代的価値観を取り入れ、住民・企業・行政のパートナーシップによる「地域共生の土地利用検討会」を組織し、周辺地区環境を考慮したスケルトンに対する合意形成を行い計画されたスケルトン賃貸型集合住宅「京都Aプロジェクト」を対象として、スケルトン・インフィル方式によるまちづくりとの連携という視点から、第一に、同プロジェクトにおける合意形成プロセスの分析、第二に、オープンビルディングの主導者の一人、N・J・ハブラーケンMIT名誉教授による「Tissue method」理論を応用することによる空間構造のパターンの分析、第三に、まちづくりと連携したスケルトン型集合住宅の合意形成支援システムの開発を行なうことを目的とする。今年度の研究実績は以下の通りである。第一に、「地域共生の土地利用検討会」で行なわれた一連の活動を関連資料から抽出し、個々の活動間の関係を明らかにすることで、京都Aプロジェクトにおける合意形成プロセスの把握を行った。第二に、「地域共生の土地利用検討会」で議論された計画案の変遷を把握し、また、地域の街区を構成する建築物の現地調査を行い、京都Aプロジェクトの周辺地域の空間構造と京都Aプロジェクトにおけるスケルトンの形態を分析し、既成市街地の空間構造に対して、京都Aプロジェクトにおけるスケルトンの形態との整台性についての検証を行った。第三に、「Tissue method」を用いた空間構造のパターンの分析を行った。「Tissue method」は現実の都市の空間構造を様々なパターンとして認識する分析・計画手法であるが、京都Aプロジェクトの周辺地域を対象として、「Tissue Method」による空間構造のパターン分析し、その結果を、3次元モデリングソフトと3次元レンダリングソフトを用いてデジタル・シミュレーション化した。

本研究は、スケルトン・インフィル方式に「まちづくりとの連携」という現代的価値観を取り入れ、住民・企業・行政のパートナーシップによる「地域共生の土地利用検討会」を組織し、周辺地区環境を考慮したスケルトンに対する合意形成を行い計画されたスケルトン賃貸型集合住宅「京都Aプロジェクト」を対象として、スケルトン・インフィル方式によるまちづくりとの連携という視点から、第一に、同プロジェクトにおける合意形成プロセスの分析、第二に、オープンビルディングの主導者の一人、N・J・ハブラーケンMIT名誉教授による「Tissue method」理論を応用することによる空間構造のパターンの分析、第三に、まちづくりと連携したスケルトン型集合住宅の合意形成支援システムの開発を行なうことを目的とする。今年度の研究実績は、まちづくりと連携したスケルトン型集合住宅の合意形成支援システムの開発のための基礎的検討として、「京都Aプロジェクト」が立地する京都の職住共存地区において、1990年から2004年の間に建設された集合住宅、及び、戸建住宅の建設動向についての分析を行った。その結果、第一に、2003年4月から職住共存地区において施行されている「京都市都心部の新しい建築のルール」により、職住共存地区における高層共同住宅の減少とともに、上層の壁面後退による通りからみたボリューム感の低減、短冊状敷地における5mを超えるセットバックの防止といった効果を確認した。一方で、意匠・色彩の調和、ゼロセットバックの実現といった、集合住宅建設の課題を把握するとともに、戸建住宅に対する規制・誘導を視野にいれた支援システムの構築が必要であることを明らかにした。本研究は、スケルトン・インフィル方式に「まちづくりとの連携」という現代的価値観を取り入れ、スケルトン・インフィル方式によるまちづくりとの連携という視点から、第一に、同プロジェクトにおける合意形成プロセスの分析、第二に、オープンビルディングの主導者の一人、N・J・ハブラーケンMIT名誉教授による「Tissue method」理論を応用することによる空間構造のパターンの分析、第三に、まちづくりと連携したスケルトン型集合住宅の合意形成支援システムの開発を行なうことを目的とする。今年度の研究実績は、住民・企業・行政のパートナーシップによる「地域共生の土地利用検討会」を組織し、周辺地区環境を考慮したスケルトンに対する合意形成を行い計画されたスケルトン賃貸型集合住宅「京都Aプロジェクト」が立地する京都の職住共存地区を対象として「地域共生の土地利用検討会」の合意形成プロセスを一般化するための条件を検討し、まちづくりと連携したスケルトン型集合住宅の計画における合意形成支援システムとして価値共有型建築規制・誘導システムを構築した。システムの構築にあたっては、2007年3月に、京都市において高さ規制・デザイン規制・屋外広告物の規制が見直された条例が成立し、職住共存地区の高さ規制については従来の31mから15m、幹線道路沿道地区では45mから31mに引き下げられることを視野に入れた検討を行った。さらに、このシステムに基づいて、京都の職住共存地区を対象として「Tissue method」の理論を応用した敷地内の建物と空地の関係についての分析を行った上で、敷地内の建物と空地の関係についてのルールに基づいた景観シミュレーションを行った。
肥満マウスを用いた高分子ポリフェノール摂取による肥満改善効果の検討

これまでに、ポリフェノールは肥満やメタボリックシンドロームの予防に寄与することが報告されている。生体利用性は、ポリフェノールの肥満抑制やエネルギーの恒常性のメカニズムを示す上で大変重要であり、低分子のポリフェノールについては生体利用性が比較的高く、生体内における作用機序も明らかになっている。しかし、高分子プロシアニジンの役割や生物学的機能性は、明らかになっていない。本研究で、我々は、食餌性誘発肥満マウスにおいて12週間の0.5%のPP摂取が肥満を改善し、脂質代謝に関連した遺伝子の発現に変化を及ぼしたことを明らかにした。またPP摂取は、肥満による炎症や腸管バリア機能を改善することを示した。まず、試料となる高分子ポリフェノールをリンゴより抽出した。常法に従い、りんご果汁から調製したプロシアニジン画分を順相クロマトグラフィー法を用いて重合度別に14量体までの低分子プロシアニジン画分と、5量体以上の高分子画分に分離し、これを試料とした。次に、4週齢のC57BL/6Jマウス(雄)に高脂肪高ショ糖食を摂取させ、食餌性肥満マウスを作成した。C57BL/6Jマウスに高脂肪高ショ糖食を3ヶ月間摂取させた。また、普通食モデルには、低脂肪・無ショ糖食を摂取させ、食餌性肥満マウス同様に3ヶ月飼育した。肥満が進行すると高血糖や脂質異常などメタボリックシンドローム様の症状の他、脂肪組織への脂質の蓄積が認められる。また脂肪肝が進行すると、酸化ストレスや炎症反応により肝障害を発症する。3ヶ月の飼育終了後、食餌性肥満マウスおよび普通食マウスから無作為に数匹選別し解剖を行ったところ、食餌性肥満マウスは、普通食を摂取させたマウスと比較して体重過多である事に加え、安定的に高血糖、高脂血症(高トリグリセリド血症、高コレステロール血症)、脂肪肝を示した。そこで、以後高脂肪高ショ糖食を摂取したマウスを「食餌性肥満マウス」として使用した。次に、食餌性肥満マウスを1コントロール食(普通食)群、2高脂肪高ショ糖食群、3高脂肪高ショ糖食+高分子ポリフェノール群、4高脂肪高ショ糖食+低分子ポリフェノール群、5高脂肪高ショ糖食+高分子・低分子ポリフェノール群の5群に分け12週間飼育した。12週間飼育後、解剖を行い、各種臓器・脂肪・血液等を採取した。以後、体重・血糖値・血中脂質(トリグリセリド・中性脂肪・NEFA)の測定、血漿中の肝機能マーカー(GOT,GPT、γ-GTP)の測定、血漿中のアディポサイトカインの測定などを行う予定である。昨年度行った、肥満マウスを用いた高分子ポリフェノール摂取による肥満改善効果について、各種臓器を用い、遺伝子解析による脂質代謝・脂質合成・解毒酵素・炎症・抗酸化などへの影響の検討を行った。体重・血糖値・血中脂質(トリグリセリド・中性脂肪・NEFA)の測定、血漿中の肝機能マーカー(GOT,GPT、γ-GTP)の測定、血漿中のアディポサイトカインの測定を行った。体重、血糖値、血中脂質については高分子ポリフェノール摂取により、改善が認められた。また摘出した肝臓の組織標本を作製しHE染色により、肝臓への脂肪蓄積状態を組織学的に評価した。さらに肝臓および脂肪組織からRNAを抽出し、肝臓組織では薬物代謝酵素(Cyp2e1,iNos)、細胞周期制御因子(Cdkn1a)、炎症関連因子(Tnf-α, IL-6)、脂質合成因子(Srebp1c, Fas, Cyp7a1, HMG-coa)、脂質代謝制御因子(Ampk, Cpt, Ppar-α)、抗酸化関連酵素(Cat, Sod)、また脂肪組織ではアディポサイトカイン(Adiponectin, Leptin, Tnf-α, IL-6など)脂質代謝制御因子(Ampk, Cpt, Ppar-γ)、抗酸化関連酵素(Cat, Sod)などをELISA法や定量Real-Time PCRにより分析した。現在、これら分析の詳細な結果について解析中である。血中脂質等の分析については概ね順調に進展し、高分子ポリフェノールの肥満改善効果が期待出来る結果を得られた。遺伝子解析については、試薬および機器類の不備、不具合が生じたことから、実験が計画どおりに始められなかった為、進捗がやや遅れている。これまでの食品成分の生体調節機能は、腸管で吸収され生体利用性が高いことが重要であると考えられており、生体利用性の低い成分は生体応答に関与しないとされていた。しかし、今回DIOマウスにおいて、高分子プロシアニジン摂取が腸内細菌叢を変化させ、F/B値の改善や、Akkermansisa muciniphiliaを増加させることが明らかになった。また、高分子プロシアニジン摂取によって慢性炎症の改善効果や腸管バリア機能の向上も認められたことからAkkermansisa muciniphiliaが重要な役割を担っていると考えられる。最近、リンゴ以外のポリフェノール類にもAkkermansisa muciniphiliaを増加させる効果があることが報告されているが、DIOマウスにおける腸内細菌叢の変動やバリア機能の向上効果は、本研究により初めて明らかになったものである。高分子プロシアニジンにより体重を減少させるまでの肥満改善効果は得られなかったが、肝臓の脂肪蓄積の減少、腸管バリア機能の向上、慢性炎症の予防・改善など肥満に伴う症状を顕著に改善することが明らかになった。食生活の欧米化が進み、肥満者およびその予備軍が増加している現在、肥満改善の視点からのアプローチは大変重要であると考えている。

プロシアニジン類に限らず、生体利用性の低い高分子ポリフェノールは、果実やワイン、お茶類など様々な食品に含まれており、これらの食品の生体調節機能に腸内細菌が関与している可能性が考えられる。今後、関与する腸内細菌種の特定や、腸管での作用機序の解明などを進めることにより、高分子ポリフェノールの肥満改善効果における役割について詳細に明らかにしていきたいと考えている。これまでに、ポリフェノールは肥満やメタボリックシンドロームの予防に寄与することが報告されている。生体利用性は、ポリフェノールの肥満抑制やエネルギーの恒常性のメカニズムを示す上で大変重要であり、低分子のポリフェノールについては生体利用性が比較的高く、生体内における作用機序も明らかになっている。しかし、高分子プロシアニジンの役割や生物学的機能性は、明らかになっていない。本研究で、我々は、食餌性誘発肥満マウスにおいて12週間の0.5%のPP摂取が肥満を改善し、脂質代謝に関連した遺伝子の発現に変化を及ぼしたことを明らかにした。またPP摂取は、肥満による炎症や腸管バリア機能を改善することを示した。本年度はマウスに投与する高分子および低分子ポリフェノール試料の抽出および食事肥満マウスの作成を行った。高分子・低分子ポリフェノールの抽出は、マウスに投与するのに必要十分量の抽出が終了した。また、食餌性肥満マウスの作成においても、体重および血中脂質・糖を安定的に高値を示し、肝臓への脂肪蓄積も認められ、以後の肥満改善効果検討の試験に使用できる食餌性肥満モデルマウスの作成に成功した。現在は、食餌性肥満モデルマウスに高分子および低分子ポリフェノールを投与し、肥満改善効果について検討を進めている。当初の計画どおりに概ね進展していると考える。今年度は1腸管上皮細胞における糖の吸収代謝機構の解明を行う。解剖後摘出したマウスの小腸組織を用い、DPP4活性の測定を市販のDPP4活性測定キットを用いて行う。また小腸組織中のRNAを抽出しDPP4および糖輸送体であるGLUT2およびSGLT1の遺伝子発現変化を解析する。さらに、採取した血液中のGPL-1濃度をELISA法を用いて測定する。次に2腸管上皮細胞における脂質の吸収代謝機構の解明を行う。解剖中および解剖後に糞便を採取し、糞便中の脂質含有量および胆汁酸含有量の測定を行う。また、近年脂質吸収代謝と腸内細菌との関連性が明らかになりつつあることから、今年度の計画の変更として、腸内細菌叢の解析を追加し、脂質の吸収代謝との関連性を明らかにする予定である。また、学会発表、論文発表を行う予定である。食品機能学現在は食餌性肥満モデルマウスを1コントロール食(普通食)群、2高脂肪高ショ糖食群、3高脂肪高ショ糖食+高分子ポリフェノール群、4高脂肪高ショ糖食+低分子ポリフェノール群、5高脂肪高ショ糖食+高分子・低分子ポリフェノール群の5群に分け飼育中である。今後は、体重・血糖値・血中脂質(トリグリセリド・中性脂肪・NEFA)の測定、血漿中の肝機能マーカー(GOT,GPT、γ-GTP)の測定、血漿中のアディポサイトカインの測定などを行う。また摘出した肝臓の組織標本を作製しHE染色により、肝臓への脂肪蓄積状態を組織学的に評価する。
食品機能成分による脂質ラフトの機能制御を介した免疫調節

20種類のカロテノイドが免疫担当細胞に与える影響について、脂質ラフトに注目して評価した。その結果、肥満細胞の脱顆粒抑制反応については6種類、B細胞受容体のキャッピング反応に対しては12種類、マクロファージの一酸化窒素産生については15種類のカロテノイドが抑制作用を示すことを見出した。それぞれの細胞について、リガンド刺激後の受容体および脂質ラフトの局在を可視化したところ、細胞の活性化を抑制した全てのカロテノイドは、受容体の脂質ラフトへの移行も抑制した。これらの結果より、カロテノイドは受容体および脂質ラフトの局在に影響を与え、免疫調節作用を示すことが示唆された。本研究は、食品機能成分であるカロテノイドによる免疫反応の制御について、脂質ラフトの機能制御の観点から作用メカニズムを解析することを目的とした。まず、マスト細胞の高親和性IgE受容体(FcεRI)、マクロファージのToll様受容体4(TLR4)、B細胞のB細胞受容体(BCR)について、食品機能成分であるカロテノイドが、これらの受容体の脂質ラフトへの移行や免疫応答に与える影響を調べた。その結果、シフォナキサンチンなど5種類のカロテノイドは、肥満細胞、B細胞、マクロファージの活性化を抑制し、それぞれの受容体の脂質ラフトへの移行を阻害した。一方、いずれの細胞の活性化に対しても影響を与えないカロテノイドやマクロファージの活性化のみを抑制するカロテノイドも確認された。上記で得られた知見をもとに、マスト細胞の高親和性IgE受容体(FcεRI)の抗原刺激による脂質ラフトへの移行について、脂質ラフトの主要な成分の1つであるスフィンゴ脂質に着目し、その量的変動を調べることで、その作用機序の解明を試みた。その結果、抗原刺激により、スフィンゴミエリン、グルコシルセラミド、セラミド量がそれぞれ増加し、脱顆粒を阻害するカロテノイドは、スフィンゴミエリンの増加に影響を与える可能性が示された。以上の結果から脂質ラフトを介した免疫担当細胞活性化の抑制作用はカロテノイドの化学構造によって異なることが示され、またカロテノイドによる脂質ラフトを介した受容体応答の抑制機構にはスフィンゴ脂質代謝の変化が関わることが示唆された。本年度は、マスト細胞の高親和性IgE受容体(FcεRI)、マクロファージのToll様受容体4(TLR4)、B細胞のB細胞受容体(BCR)について、食品機能成分であるカロテノイドが、これらの受容体の脂質ラフトへの移行や免疫応答に与える影響を調べた。肥満細胞のモデルとしてラット好塩基球性白血病細胞株RBL-2H3を用い、抗原刺激に伴う脱顆粒反応を評価した。同様にB細胞のモデルとしてヒトバーキットリンパ腫細胞株Ramosを用い、抗BCR抗体刺激に伴うBCRのキャッピング形成を評価した。また、マウスマクロファージ様細胞株RAW264のLPS刺激に伴うNO産生を評価した。受容体の脂質ラフトへの移行は蛍光免疫染色を用いて調べた。以上の結果から脂質ラフトを介した免疫担当細胞活性化の抑制作用はカロテノイドの化学構造によって異なることが示され、またカロテノイドによる脂質ラフトを介した受容体応答の抑制機構は細胞の種類によって異なることが示唆された。本年度の計画通り、20種類以上のカロテノイドを精製し、脂質ラフトを介した免疫担当細胞の受容体を介した免疫応答に対する影響を評価した。得られた結果から、応答の抑制と受容体の脂質ラフトへの移行には相関があることが判明し、カロテノイドは構造の違いによって、その活性が異なることも明らかとなった。したがって、本研究の目的を達成するために、本年度の成果は目標をほぼ達成しているといえる。平成23年度の検討から脂質ラフトへの移行阻害が明らかになったものについては、カロテノイドが脂質ラフトそのものの機能に与える影響を解析するために、その構成成分を解析する。前述のように脂質ラフトは、スフィンゴ脂質とコレステロールに富むマイクロドメインである。

そこで生化学的手法により調製した脂質ラフトの脂質組成について、研究代表者が以前に確立したHPLC-ELSDによる定量解析法(Lipids34, 1231, 1999; J. Oleo. Sci. 59, 509, 2010)とLC-MS/MSによる化学構造の解析法(Lipids 45, 451,2010; J. Oleo Sci. 59, 387, 2010)の応用を試みる。さらに受容体の脂質ラフトへの移行を指標とした免疫制御機能成分の新規スクリーニングアッセイについて、蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)反応を利用した開発を試みる(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 8143-8148, 2006)。それぞれ免疫担当細胞を用い、細胞に特異的な受容体と脂質ラフトをドナーとアクセプターの2種類の蛍光色素(5-FAMと5-TAMRAあるいはAlexa Flour532とQSY7のペアなど)でラベリングし、蛍光プレートリーダーを用いて、受容体が脂質ラフトに移動したときにFRET反応によって増強された特定波長の蛍光を検出することで、高感度かつハイスループットに定量する方法を検討する。最適な実験条件を確立し、脂質ラフトを介した免疫機能制御物質の探索へと応用する。次年度の研究を推進するにあたり、研究用試薬、培養細胞関連消耗品、実験動物などの研究用消耗品を購入する。また成果発表のための旅費としても使用する。なお、次年度は実験の性質上、比較的高価な試薬(抗体、蛍光標識薬など)が必要となる可能性が生じたため、平成23年度の当初の予算を一部繰り越し、次年度に使用することとした。