hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
テニア科条虫の成虫に対する腸管粘膜応答を主体とした排除機構の解析

本年度は、エキノコックスと近縁テニア科条虫の実験系の確立のためエキノコックスと近縁種(猫条虫、T.crassicepsとT.polyacantha)の実験室内継代を実施した。また、国内分離株に加えて、アラスカその他の分離株(3種のテニア科条虫)の継代が可能となった。ゴールデンハムスターとスナネズミがエキノコックスとI.crassiceps終宿主となることを明らかにした。とくにゴールデンハムスターは無処置(その他は免疫抑制処置が必要)でI.carssiccpsの虫卵を産生することが明らかとなり、テニア科条虫の成虫に対する腸管粘膜応答を主体とした排除機構の解析が実験小動物を用いて初めて可能となった。このモデルは従来、テニア科条虫の維持には被食者(草食獣)--捕食者(肉食獣)間で成立し、終宿主のイヌ・ネコを必要としていたが齧歯類(キヌゲネズミ科)のみで生活環が維持可能となり意義は大きい。テニア科には家畜に対する病害のみならず、公衆衛生面からも重要な種が含まれる。従来、これらの条虫に対する宿主の抵抗性の研究は主に中間宿主のレベル、すなわち、幼条虫に関するものであった。その理由として、終宿主実験モデルが確立されていないこと、自然終宿主を用いた実験では人体への感染の危険があり、それを防止できる安全な施設を得ることが困難であったこと等があげられる。このため本研究ではテニア科条虫・5種:Echinococcus multilocularis(以下、E.m.)、E.granulosus,Taeniacrassiceps(同、T.c.)、T.saginata,T.hydatigenaを用いて代替終宿主としての齧歯類の可能性を実験小動物:ゴ-ルデンハムスタ-(以下、GH)、スナネズミ(同、MG)、と野外(米・ニュ-メキシコ)からの齧歯類について検討した。本年度は特にニュ-メキシコ大学S.Gardner博士の協力を得て肉食性のキヌゲネズミ科バッタネズミ(Onychomys sp.)を中心に、同地域の齧歯類10種を入手し、エキノコックスに対する終宿主の代替動物の可能性を検討した。その結果、正常のカンガル-ラット(Dipodomys spp.)、ポケットマウス(Perognathus spp.)、ウッドラット(Neotoma sp.)において感染初期に自然宿主・イヌに匹敵する回収率と一部虫体の発育が認められた(未発表)。すでに開発したGHやMGを用いた終宿主モデルと共に画期的な代替モデルを確立することができた。これらの実験系で初めて実験室内で齧歯類のみでT.c.とE.m.多包条虫の完全な生活環を維持することができ、虫体排除における抗体応答や腸管粘膜応答による再感染防御の存在が示唆された。今後、この代替モデルは免疫学的な虫体排除機構にとどまらず、薬剤スクリ-ニングシステム、条虫の受精様式の解明、さらに宿主動物やテニア科条虫の進化の解明への応用が期待される。
脳内広範囲薬剤送達技術を用いたChemicalSurgery確立に向けた基礎研究

1.投与薬剤の代謝経路解明昨年度の研究で脳内局所へ投与された薬剤は、投与部位には次第に代謝されながら96時間程度留まること、またそれ以外は体内へ分布した後に速やかに尿中,消化管中へ排泄されることが判明した。引き続いて、本年度は局所での薬剤分布に関して解析した。ラット脳内への局所投与に際して、薬剤ACNUと色素evansblueを混合投与し、その直後にラットを安楽死させ、脳切片を作成した。質量分析法を用いて、作成した脳切片上でのACNUの分布を可視化する条件を検討、同定し、可視化に成功した。実際の薬剤分布は、混合投与したevansblue色素の分布とほぼ一致していることが確認できた。2.生体内での薬物動態の可視化昨年度までの研究で、薬剤局所投与後、MRIにてT2mapを撮影し、投与前後で比較することで薬剤分布が可視化できる可能性を確認した。本年度は、当科で実施している脳幹部神経膠腫症例に対する薬剤局所投与の臨床研究症例において、薬剤投与前後のT2map画像を撮影した。現時点まで2症例での解析を終了したが、いずれの症例においても本法により薬剤分布を可視化できる可能性が示された。腫瘍を有する実際の症例においても本法により薬剤分布を可視化できる可能性が示されたことになり、さらに症例数を重ねてproof of conceptを得る方針である。3.新規超音波送達システムを用いる際の超音波が脳に与える影響の解明新規超音波システムの音場特性評価として水中における超音波の伝搬を測定しデータの集積を行った。1.投与薬剤がCED法による局所投与後に局所で実際に広く分布すること、また、代謝経路解明に関して、局所には比較的長くとどまりながら、対外へ排出された薬剤は速やかに代謝されていることが示された。これで、薬剤分布・代謝に関するproof of conceptが得られた。2.生体内での薬剤動態の可視化に関して、薬剤分布を確認する方法として有望なMRIシークエンスを昨年度に同定していたが、実際の臨床研究症例2症例でその方法が有用であることを確認し得た。引き続き、症例を集積してproof of concept獲得につなげる状況となっている。3.新規超音波送達システムを用いる際の超音波が脳に与える影響の解明水中における音場強度、減衰について評価を行い音場強度の水中における伝搬特性を確認している状況となっている。1.投与薬剤の代謝経路解明今年度までの研究で薬剤投与後の局所拡散、代謝経路に関して概ねデータ集積を終了した。2.生体内での薬剤動態の可視化:MRI撮像技術の開発薬剤投与を可視化するMRI撮像技術の開発を終え、今後は当科で実施している臨床研究症例での解析により症例集積を行う方針である。3.新規超音波送達システムを用いる際の超音波が脳に与える影響の解明シミュレーションにおける水中での音場強度、減衰等を検討し測定値との比較検討を行う計画としている。1.投与薬剤の代謝経路解明ラジオアイソトープ(RI)標識を行った薬剤(塩酸ニムスチン)をラット脳内に投与しオートラジオグラフィーにより薬剤の可視化を行った。投与直後、1時間後、2時間後、4時間後、8時間後、24時間後、48時間後、96時間後、168時間後、336時間後に画像確認を行った。投与後、膀胱,大腸内容物及び皮膚にわずかに放射能が認められたが、48時間後以後はいずれの組織にも放射能が認められなかった。投与局所(脳内)では塩酸ニムスチンは投与直後脳内に拡がりその後、96時間までは投与部位(脳内)に放射能を確認した。以上の結果より,投与部位から体内へ分布した放射能は速やかに尿中,消化管中へ排泄されることが確認でき、薬剤は投与部位に薬剤は96時間程度留まるが、それ以外は体内へ分布した後に速やかに尿中,消化管中へ排泄されると推察された。今後、画像データをより詳細に解析し、得られた結果をより詳細に解析し、また質量分析によるデータと比較検討し代謝経路を解明を試みる。2.生体内での薬物動態の可視化薬剤局所投与後、T2mapを撮影することで可視化できる可能性を確認し、今後、臨床症例で実用化を検討する方針とした。3.新規超音波送達システムを用いる際の超音波が脳に与える影響の解明超音波送達システムを実際の脳内投与に用いる際に、超音波がどの様に伝搬、減衰しているか確認するために、水中で機器使用時に発生する超音波の振動について評価した。針に沿って超音波強度が正弦波曲線状に分布し針先から離れるほど徐々に減衰している事を確認した。この結果は有限要素法によるコンピュータシミュレーションとほぼ同様の結果を示していた。この事からシミュレーションにより超音波の伝搬、減衰をあらかじめ検討する事が可能と考えられる。データの蓄積を進めて実測データとシミュレーションの比較検討を行う予定である。1.投与薬剤の代謝経路解明に関しては薬剤代謝産物の動態の追跡はできている状況となっており、今後はより詳細な解析を行う段階となっている。また、2.生体内での薬剤動態の可視化に関しては、薬剤分布を確認する方法として有望なMRIシークエンスが同定でき、実臨床でその有用性を検討する段階となった。さらに、3.新規超音波送達システムを用いる際の超音波が脳に与える影響の解明については、平成30年度の開始を予定していたが、平成29年度から実施しており、仮説としていたコンピュータシミュレーションとの類似性が確認され、必要となるデータの取得が行われている状況となっているため概ね順調に進展していると考えている。

1.投与薬剤の代謝経路解明昨年度の研究で脳内局所へ投与された薬剤は、投与部位には次第に代謝されながら96時間程度留まること、またそれ以外は体内へ分布した後に速やかに尿中,消化管中へ排泄されることが判明した。引き続いて、本年度は局所での薬剤分布に関して解析した。ラット脳内への局所投与に際して、薬剤ACNUと色素evansblueを混合投与し、その直後にラットを安楽死させ、脳切片を作成した。質量分析法を用いて、作成した脳切片上でのACNUの分布を可視化する条件を検討、同定し、可視化に成功した。実際の薬剤分布は、混合投与したevansblue色素の分布とほぼ一致していることが確認できた。2.生体内での薬物動態の可視化昨年度までの研究で、薬剤局所投与後、MRIにてT2mapを撮影し、投与前後で比較することで薬剤分布が可視化できる可能性を確認した。本年度は、当科で実施している脳幹部神経膠腫症例に対する薬剤局所投与の臨床研究症例において、薬剤投与前後のT2map画像を撮影した。現時点まで2症例での解析を終了したが、いずれの症例においても本法により薬剤分布を可視化できる可能性が示された。腫瘍を有する実際の症例においても本法により薬剤分布を可視化できる可能性が示されたことになり、さらに症例数を重ねてproof of conceptを得る方針である。3.新規超音波送達システムを用いる際の超音波が脳に与える影響の解明新規超音波システムの音場特性評価として水中における超音波の伝搬を測定しデータの集積を行った。1.投与薬剤がCED法による局所投与後に局所で実際に広く分布すること、また、代謝経路解明に関して、局所には比較的長くとどまりながら、対外へ排出された薬剤は速やかに代謝されていることが示された。これで、薬剤分布・代謝に関するproof of conceptが得られた。2.生体内での薬剤動態の可視化に関して、薬剤分布を確認する方法として有望なMRIシークエンスを昨年度に同定していたが、実際の臨床研究症例2症例でその方法が有用であることを確認し得た。引き続き、症例を集積してproof of concept獲得につなげる状況となっている。3.新規超音波送達システムを用いる際の超音波が脳に与える影響の解明水中における音場強度、減衰について評価を行い音場強度の水中における伝搬特性を確認している状況となっている。1.投与薬剤の代謝経路解明前年度から継続し、質量分析法を用いて薬剤代謝産物の動態を追跡するための手法を構築しその後、質量分析により薬物動態の可視化を行いRI標識による投与薬剤の代謝経路と比較検討する。また、質量分析を用いて薬剤の剤形による脳内の薬剤拡散、代謝の違いを解明する。2.生体内での薬剤動態の可視化:MRI撮像技術の開発薬剤投与を可視化するMRI撮像技術の開発を行い薬剤分布、クリアランスの生体でのモニタリング法開発を目指し候補となるMRIシークエンスはT2WI, DWIである。T2map, ADCなどありそれぞれの適応性を確認する。3.新規超音波送達システムを用いる際の超音波が脳に与える影響の解明
酸素プラズマによる塩化物廃棄物の酸化物への転換

高温のプラズマ中でおこる高温気相反応を利用して、金属塩素化物を直接酸素化物に転換する方法を提案し、特殊な100%酸素プラズマを生成可能なマイクロ波プラズマ発生装置を開発し、これによって、様々な塩化物の酸素化実験を行った。また、廃棄物中に存在する塩化物に対して熱力学的平衡計算を行い。これら実験結果と比較し以下の結論を得た。1.実験では容易に酸化物が得られるもの(塩化アルミニウム、塩化ニッケルなど)、得られないもの(塩化ナトリウム、塩化ストロンチウム)があるが、これらは、熱力学的平衡計算の結果によってその特性を良く説明できることがわかった。2.我々の実験条件ではすべての塩化物を酸素化することはできなかったが、熱力学的平衡計算の結果では、温度条件を厳しく設定するなどすれば全ての塩化物を酸化物に転換できる可能性があることがわかった。また、これらの考察から酸素プラズマが塩化物の酸素化に極めて有効であることがわかった。3.廃棄物に含まれる元素の大部分の系に対して行った熱力学的平衡計算の結果から、酸素化の特性は、ストロンチウム型、マグネシウム型、セリウム型の3種類に大別できることがわかった。ストロンチウム型の元素では高温で気相の酸化物が得られ、クエンチングなどの技術が必要となる。マグネシウム型では塩素を取り出すために水素が重要な役割を果たす。セリウム型は容易に酸素化することが可能である。高温のプラズマ中でおこる高温気相反応を利用して、金属塩素化物を直接酸素化物に転換する方法を提案し、特殊な100%酸素プラズマを生成可能なマイクロ波プラズマ発生装置を開発し、これによって、まず比較的沸点が低い金属塩化物(塩化アルミニウム、塩化ニッケルなど)は容易に酸化物に転換されることを確認した。さらに以下の2つの問題点を解決すべく実験・解析を行った。(1)核分裂生成物の塩化物には、ストロンチウムなどのアルカリ土類元素、ランタン系元素などの塩化物の様に融点、沸点が高いために、プラズマを用いても容易に気相反応を起こすことができなかった物質に対して装置の改良を行った。具体的には、試料粉末を直接放電部に導入して反応に必要な温度域まで加熱する試験部を新しく作成した。これにより、ストロンチウム塩化物、ネオジミウム塩化物の酸素化実験を行い。ネオジミウム塩化物も酸素化できることを確認した。しかし、ストロンチウム等のアルカリ土類金属については依然として課題が残った。(2)反応に関わる酸素ラジカルの数密度を測定できないため反応機構が解明できなかったが、モデル化を行い、流れの方程式、エネルギー保存式、化学種の保存式、電磁場の方程式に酸素の反応、物性値を考慮したプラズマの放電場の数値解析を行うことにより、酸素ラジカルの数密度分布、温度分布の概略値を得ることに成功し反応機構解明の糸口をつかんだ。これらデータと平衡モデルの計算結果を利用して反応機構の解析を行っている。高温プラズマ中でおこる高温気相反応を利用して、金属塩素化物を直接酸素化物に転換する方法を提案し、特殊な100%酸素プラズマを生成可能なマイクロ波プラズマ発生装置を開発し、これによって、様々な塩化物の酸素化実験を行った。

ストロンチウム型の元素では高温で気相の酸化物が得られ、クエンチングなどの技術が必要となる。マグネシウム型では塩素を取り出すために水素が重要な役割を果たす。セリウム型は容易に酸素化することが可能である。
多重追突事故防止型自動運転技術の開発：先行車の減速意図予測に基づく車群安全の実現

本研究の目的は、(1)自車の前を走行する先行車の減速意図をその制動灯の点灯前に予測する技術を高精度化し、(2)予測された減速意図の呈示に伴う後続車の減速行動を実際のドライバによる被験者実験で明らかにした後、これを自動運転技術の枠組みでモデル化し、(3)その被害が顕著な多重追突事故防止への効果に対する提案技術のパフォーマンスを検証することである。本研究の遂行により、多重追突事故防止に資する基礎的な車群制御技術の確立を目指す。
可微分写像の特異点論における認識問題

二つの特異点における写像の局所的振る舞いが本質的に同じであるとき「この二つの特異点は同値である」と言われ、特異点の間の基本的な同値関係である。これはとても重要な同値関係であるものの、一般的な判定は非常に難しく、二つの特異点が同値かどうかを判定する問題は『認識問題』と呼ばれている。この認識問題が本研究の研究対象であった。長年にわたる研究の末、本研究の開始以前に、可微分写像の特異点論における認識問題に対して肯定的に答え得る新しい判定方法を研究代表者は発見しており、いろいろな形で既に発表していた。しかし、本研究開始当初は、その新しい方法は「十分普及してきた」とは言い難い状況であった。本研究の主要目的は、研究代表者による新しい方法(研究成果報告書第1章で概説してある)のさらなる普及を図ることとしていた。その目的のため、『可微分写像の特異点論』の様々な局面を研究している研究協力者(共同研究者も含む)の研究内容(研究成果報告書第2章第7章で概説してる)に対して、研究代表者の新しい判定方法を適用してみることにより、『可微分写像の特異点論』の様々な局面における研究代表者の判定方法の効用を理解してもらう、という方法を採用した。研究開始当初の予想を超えた普及が果たせ、成果があった。また、研究開始当初は全く予期しなかったことではあるが、代数幾何学におけるある問題との関連に関して新しい観点に気づいた。その観点での研究の現時点までの進展も研究成果報告書に加えた。本研究の研究目的は、認識問題に肯定的に答え得る、研究代表者によって発見された全く新しい方法に対し、(1)判定が容易になるように改良する(2)普及を図る(3)パラメータ付きバージョンなど様々なバリアントの構築の3点であったが、これらの目的に対して以下を実施した。a研究代表者の新しい方法を取入れた著書の出版((2)の実施)b Joachim Riege教授(マルティン・ルター大学、ドイツ)を招聘し、研究代表者の新しい方法を詳細に説明するとともに、Rieger教授の方法も詳しく教えてもらうなどの研究討論を何度も行った。((1)、(2)、(3)の実施)c北海道大学、鹿児島大学、琉球大学などに出張し、研究討論を行った((1)、(2)、(3)の実施)特にbにおいては、改良の望ましい方向について新しい見識を得たが、斬新な新しい改良にはいまだ結びついていないので、まだ論文としてまとめる段階ではない。また、cにおいては、本研究開始時点では想像すらしていなかった新しい展開も生まれつつある。代数幾何学において長年にわたって未解決問題として名高い「generic projectionのgoodness予想」との関連がそうであり、本研究の延長線上でこの予想の肯定的解決が可能かもしれない、との予感を得ている。すでに部分的な肯定的解決という結果は得られているが、現時点では完全な解決を目指しており、どの段階で論文として著わすかは未定である。本研究の研究目的は、認識問題に肯定的に答え得る、研究代表者によって発見された全く新しい方法に対し、(1)判定が容易になるように改良する(2)普及を図る(3)パラメータ付きバージョンなど様々なバリアントの構築の3点であった。この3点の目的のうち(2)については、a研究代表者の新しい方法を取り入れた著書による大学院生の指導b Bernard Teissier教授(数理科学研究所、フランス)を招聘し、研究代表者の新しい方法を説明し研究討論を行うなどを実践し、成果を得ている。特にaについてはオリジナルな修士論文を書かせるに至っている。3点の目的のうち(1)と(3)については、平成14年度において、改良の望ましい方向についての新しい見識を得たり新しい展開が生まれつつあるところであったが、これらについては平成15年度には大きく進展し、研究開始時点での予想を超越した形で結実した。以上の成果を研究成果報告書にまとめる予定である
種々の病因となるプロリン特異性ペプチダーゼ類に対する新規阻害剤の研究

歯周病菌であるP. gingivalisが持つプロリルトリペプチジルペプチダーゼ(PTP)は歯周病のキー酵素である。天然物をスクリーニングした結果、米ぬかに高い活性を見出した。このPTP阻害タンパク質(PTPI)を米ぬか抽出物から精製した。更に、質量分析計と米データベースからPTPIは遺伝子Os05g0323900であることを同定した。この遺伝子をチオレドキシン(Trx)との融合タンパク質として大腸菌で発現し、シッテングドロップ蒸気拡散法で結晶化に成功した。これまで本申請者らは、プロリンは他のアミノ酸と性質が異なることから、プロリンに特異性を持つ種々のペプチダーゼを見出してきた。更に、疾病とプロリン特異性ペプチダーゼの関係を明らかにしてきた。これら疾病に対する治療薬の開発を目指し、特異的な酵素阻害剤を求め天然物をスクリーニングした。1、歯周病菌の持つプロリルトリペプチジルペプチダーゼ(PTP)に対する阻害剤;歯周病菌(P.gingibalis)は糖を代謝できず、アミノ酸を栄養とする特殊な菌である。そのため、コラーゲナーゼとともにPTPを持ち、歯肉のコラーゲンを分解して歯周病を起こすと考えられている。PTP阻害剤を培地に加えることにより、いわゆる兵糧攻めにより歯周病菌の生育を阻止する。2、腸のジペプチジルペプチダーゼ4(DPP4)の阻害剤;2型糖尿病は腸のDPP4が消化のシグナルとなるインクレチンを分解することで膵臓からのインスリンの分泌が抑えられ2型糖尿病になることが明らかになった。そのため、DPP4阻害剤を天然に見出した。3、セラチア菌の持つプロリルアミノペプチダーゼ(PAP)と院内感染;毎年のように外科病因でセラチア菌の院内感染が問題となり、多剤耐性の場合死亡者を出している。セラチア菌のペプチド代謝にPAPが必要で、PAP阻害剤をスクリーニングした。種々の病因となるプロリンに特異性ペプチダーゼの阻害剤を開発し治療や予防に役立てようとするものである。本年は歯周病菌P. gingivalisの持つプロリルトリペプチジルペプチダーゼ(PTP)が歯肉のコラーゲンを分解することから、PTPの阻害剤を天然物にスクリーニングした。その結果、エノキタケに見出し、タンパク質を精製してその性質を明らかにした。この結果を生物工学会で発表した。しかし、エノキタケには溶血因子が存在し、安全性に問題があることが明らかになった。そこで、更にスクリーニングを続け、米ぬかに強いPTP阻害活性を見出した。米ぬかは食用としての長い歴史から安全性がある。米ぬかからPTP阻害剤を精製し、アミノ酸配列を質量分析器で明らかにした。稲データベースの検索から24kDaのタンパク質(スーパーオキシドデスムターゼ)であることを明らかにした。更に、遺伝子を化学合成し、大腸菌で発現し、酵素阻害活性があることを確認した。歯周病菌のプロリルトリぺプチジルペプチダーゼ(PTP)は歯肉コラーゲンの分解に重要な酵素であることから、PTPに特異的な阻害剤が歯周病の治療薬となると考えられる。そのため、PTPに特異的に阻害する物質を求めスクリーニングの結果米ぬか抽出物に高いPTP阻害活性を見出した。米ぬか抽出物より硫安分画、疎水およびイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過により精製した。SDS-PAGEから分子量は約25kDaと推定した。この阻害物質はPTPに拮抗阻害するが、他のプロリン特異性ペプチダーゼ(プロリルオリゴペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ4、プロリルアミノペプチダーゼ)にはほとんど阻害を示さなかった。一方、阻害剤のP. gingivalisの生育に対する影響を調べた結果、PTP阻害剤が存在すると生育できないことが分かった。25Kタンパク質をSDS-PAGEゲルから抽出し、トリプシン分解の後TOF-MSによるアミノ酸配列決定を行い、米データベースからSOD様タンパク質(Os05g0323900)が得られた。アミノ酸配列を基にcDNAを合成し、最初pET-23dをベクターとし発現を試みたが可溶性区分に殆ど見られなかった。そのため、pET32aベクターを用い、チオレドキシン(Trx)との融合タンパク質(His6タグ付き)として大腸菌で発現させた。不溶性タンパク質が主であったが、可溶性区分をNi-アガロースで精製,濃縮し組換えタンパク質(Trx-25K)を得ることができた。この融合タンパク質がP. gingivalisのPTP活性を阻害するが、Trxは阻害しないことを確認した。次いでこの組換えタンパク質の結晶化を行った結果、PEG-1000を用いた沈殿剤で菱面体晶の結晶が得られた。米ぬかに歯周病予防タンパク質を見出した。このタンパク質を精製し、アミノ酸配列を決め、稲のデータベースから24kDaのタンパク質であることを明らかにした。

この塩基配列をもとに、DNAを化学合成し、大腸菌で発現し、PTPに特異的阻害剤であることを明らかにした。このように、目的を達成することができた。生物学歯周病菌の病因となっているプロリルトリペプチジルペプチダーゼの阻害剤として、米ぬかから見出した24kDaのタンパク質を今後大量生産し、阻害剤の立体構造をX線結晶解析で明らかにする。また、酵素-阻害剤複合体の構造解析も行う。一方、阻害剤が歯周病予防効果をP. gingivalisの増殖への影響で調べる。天然物や漢方薬原料などを対象としてスクリーニングを行った。スクリーニング法は96穴プレートを用い、各種酵素に対する特異的な基質を用い、阻害剤活性を、プレートリーダーで測定する方法を用い阻害力をスクリーニングした。1、歯周病菌の持つプロリルトリペプチジルペプチダーゼ(PTP)に対する阻害剤としてエノキタケに強い阻害活性を見出した。エノキタケから疎水クロマトグラフィーとイオンクロマトグラフィーで部分精製しタンパク質の阻害剤であることを見出した。この阻害物質は他のプロリン特異性ペプチダーゼには阻害せず、PTP特異的であることを確認した。2、2型糖尿病に関係するジペプチジルペプチダーゼ4(DPP4)の阻害として、アボカドの皮や種子に強い阻害活性を見出した。3、セラチア菌プロリルアミノペプチダーゼ阻害剤については、強いものはまだ見つかっていない。このように、これまで報告の無い阻害剤を見出し、大向け順調に進展している。歯周病菌の持つプロリルトリペプチジルペプチダーゼに対する米ぬかの阻害率を測定できたので、実験動物を用いた薬理効果の研究が必要なくなったことによる。1、天然に見出した阻害剤を単一に精製する;エノキタケやアボカドに見出した阻害物質を単一に精製する。それらのアミノ酸配列を部分的に明らかにし、遺伝子レベルの解析のためdDNAを得る。2、阻害剤の構造解析;単一に精製した阻害物質の結晶化を行い、X線結晶構造解析により阻害物質の構造を明らかにする。3、酵素ー阻害剤の複合体の構造解析;阻害物質を用い、酵素ー阻害物質の複合体の結晶化を行い、X線結晶構造解析により複合体の構造を明らかにする。4、予防薬としての開発研究;(1)歯周病菌の増殖阻害実験を行い予防効果を調べる。(2)DPP-4阻害剤をob/obマウスに投与して、血糖値を測定し、糖尿病予防効果を調べる。周病菌の持つプロリルトリペプチジルペプチダーゼに対する米ぬかの阻害率を測定できることから、阻害率測定のために有効使用する。プロリルアミノペプチダーゼ阻害剤のスクリーニングが少し時間がかかり、次年度に持ち越したことによる。プロリルアミノペプチダーゼの基質の購入に当てる。
ネスファチンーオキシトシンーPOMC系による摂食・代謝調節機構の解明

オキシトシンが延髄孤束核プロオピオメラノコルチン(POMC)ニューロンを活性化することはすでに報告したが、弓状核POMCニューロンへの作用は未検討であった。本研究ではオキシトシンは生理的摂食抑制因子であり、弓状核POMCニューロン活性化因子であることを明らかにし、オキシトシンのARC POMCニューロンの活性化作用はレプチン抵抗性動物でも正常であることが明らかになった。2006年に満腹ペプチドとして発見されたNesfatin-1は中枢内において室傍核(PVN)オキシトシン、延髄孤束核(NTS)POMCを介して摂食抑制を引き起こすことをすでに明らかにした(Maejima et al.2009)。POMCニューロンは脳内においてARC、NTSの2つの神経核に分布するが、Nesfatin-1-オキシトシン-ARC POMC系の摂食調節は未検討である。さらにNesfatin-1の摂食調節以外の機能についても明らかになっていなかった。そこで本研究ではNesfatin-1のすぐ下流で作用するオキシトシンのARC POMCニューロンへの作用を明らかにし、さらにNesfatin-1の摂食調節作用以外の生理作用、特にストレス反応への機能を明らかにすることを目的とした。オキシトシンの中枢投与はARC POMCニューロンを活性化させ、その活性は直接的なオキシトシンの作用であることを明らかにした。また、組織学的にもオキシトシンの軸索終末がARC POMCニューロンの細胞体に近接していることを明らかにした。さらにNesfatin-1ニューロンは摂食作用以外にもストレス反応に深く関与することが明らかになった。ストレス負荷により脳内のNesfatin-1ニューロンの活性化が認められ、Nesfatin-1の脳室内投与はPVNの副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)を活性化させ下垂体-副腎皮質系を賦活化させることも明らかになった。22年度の研究では摂食調節においてPVN(Nesfatin-1-オキシトシン)-ARC POMC系が存在する可能性が新たに示唆された。またNesfatin-1は摂食調節に加え、ストレス反応にも深くかかわるホルモンであることを明らかにした。申請者はこれまでに摂食抑制ペプチドNesfatin-1(Nesf)がオキシトシン(Oxt)がメラノコルチン依存的に摂食抑制する神経経路を明らかにした。POMCニューロンは脳内では弓状核(ARC)、延髄孤束核(NTS)に発現していることが知られており、この2領域の役割分担は不明であり、本研究はOxtを上流とするARCvs. NTS POMCニューロンの摂食調節における役割の解明を目的とした。Nesf-Oxtに経路によりNTS POMCニューロンが活性化し、摂食抑制することはすでに報告しているが、Oxtの効果系として、ARC POMCニューロンの関与の可能性も残されていた。そこでOxtの中枢投与を行ったところ、摂食抑制が見られ、ARCにc-FOS発現の増加が見られた。さらにPOMCニューロンの15%にc-FOSの発現が見られたことから、ARC POMCもOxtによる摂食抑制に関与していることが明らかになった。さらに単離したPOMCニューロンにOxtを作用させると、細胞内Ca^<2+>の増加が見られたことから、Oxtは直接ARC POMニューロンを活性化することが明らかになった。さらにOxtニューロンの軸索末端がARC POMCニューロンに接触していることも明らかになった。肥満病態であるZucker fatty Ratから単離したARC POMCニューロンでは、レプチンに対する反応性は低いにも関わらず、Oxtに対する反応性は対照であるZucker lean Ratと変わらなかったことから、OxtはARC POMCニューロンの活性化ペプチドであることが明らかになった。以上より、Oxtの効果系としてNesfが活性化した時にはNTS POMCニューロンの活性化が摂食抑制作用には重要であるが、他のOxt活性化因子が働いた時には、ARC POMCニューロンを介した神経経路の使い分けが中枢内で行われている可能性が示唆された。
カエルツボカビの日本在来種への影響とその対策

我々はアジア初のツボカビ症(Bd)を見出した。国内の野生両生類におけるBd浸淫状況と、病性鑑定および感染実験によって在来種のBdへの抵抗性を明らかにした。また、発症と保菌個体を用いて効果的で安全な治療法と除菌法を確立した。さらに、6つの両生類大量死事例よりラナウイルス2種類(RCV-JP、HNV)を見出した。そして、感染実験により11種類の在来種への両ウイルスの高致死性(死亡率84.0%)を明らかにした。申請者は、2006年12月、飼育下のカエルからアジア初のツボカビ症を発見した。そこで、本研究は、わが国に生息する両生類の種の保存と生物多様性および生態系の保全のために、カエルツボカビの日本在来両生類に対するリスク評価とその対策の確立を目的とした。2008年は、飼育下両生類の病性鑑定を行い、15のツボカビ症事例を見出し、国内繁殖施設から愛好家までの流通過程が広く汚染されていることを明らかにした(学会発表)。同時にアジア初のツボカビ症を論文公表した。野生下両生類におけるカエルツボカビの実態調査を共同研究者と行い、全国から約2,000サンプルを収集し検査した。その結果、陽性率は5%以下で、特定の種類での陽性率が高く、他の両生類では非常に低いこと、遺伝子型が数多くあり、見かけ上健康な両生類から検出されること、陽性個体が集中して検出される地域はなく、かつ拡散の様子もなく、当該地域の両生類の個体数の減少もないことを確認した(論文投稿中のため、詳細を割愛する)。また、野生下両生類の不審死、大量死35事例を病性鑑定し、野外でツボカビ症の流行が確認できないこと、さらに、野生ウシガエルの大量死から日本初のラナウイルス感染症を見出し、論文公表し(in press)、学会報告した。在来種へのリスク評価として、ツボカビ症発症個体の飼育水を用いた感染実験を行い、3種類の在来種がツボカビ症で死亡することを確認し、学会報告した。さらに、カエルツボカビの培養株樹立に成功した。この研究過程で、カエルツボカビとともにOIEに野生動物の監視すべき重要な疾患としてリストアップされているラナウイルス感染症の野外大量死事例を発見したことは重要で、早急に疫学調査などおこなう必要がある。また、カエルツボカビに関してはこの病原体の起源を探る上の重要な知見が得られたものと考えている。申請者は、アジア初のツボカビ症を発見した。そこで、本研究は我が国に生息する両生類の種の保存と生物多様性および生態系の保全のため、カエルツボカビ(以下Bd)の在来種へのリスク評価と対策の確立を目的とした。2009年は、Bd感染実験例を病理学的に解析し、外来両生類のツボカビ症と臨床および病理像が異なること、さらに、国内で初めて樹立したBd培養株を用いた感染実験により、ヌマガエルが高感受性であることを明らかにした。また、オオサンショウウオのBd感染状況を把握し、抗カビ剤を用いた安全かつ効果的な除菌方法を確立した。加えて、オオサンショウウオのBdのハプロタイプを明らかにして、Bdの東アジア起源説を提唱した。申請者は、上記実験と並行して、Bdの在来種への影響を評価するために、大量死野生両生類の病性鑑定を実施していたところ、カスミサンショウウオの大量死事例より、新たなるラナウイルスHNVを発見し、さらに、2009年9月にウシガエルの大量死を確認・検索した結果、2008年に国内で初めて発見したラナウイルス(RCV-JP)と同一のウイルスによるものと特定した。2年にわたって、ラナウイルス感染症のみられたエリアは、4都道府県5箇所に及んだが、半径35Km以内に限られており、一部、共通の水系であることがわかった。このため、環境省と地方自治体とともに、病原体拡散阻止のための対策を講じた。また、阿武隈山系のトウホクサンショウウオ産卵地において、皮膚メタセルカリア症の多発を確認し、遡及的および疫学調査を実施した。その結果、この疾患は2000年に初めて発見され、漸次、発見エリアおよび罹患率が上昇し、場所によっては100%に達することを明らかにし、さらに、この病原体の急増に、同地域のミンク、アライグマの増加が関与する可能性を示唆した。本研究は、わが国に生息する両生類の種の保存と生物多様性および生態系の保全のために、カエルツボカビを含む新興感染症の日本在来両生類に対するリスク評価とその対策の検討を目的とした。1.野生下両生類のツボカビ症を含む感染症のモニタリング野外での両生類の大量死、不審死8事例(6都道府県、7種類)を病性鑑定し、うち1事例がラナウイルスによる大量死であることを明らかにした。なお、ツボカビ症は確認できなかった。2.両生類の新興感染性病原体の在来種への病原性の検討

本研究期間中にウシガエルの大量死事例より国内初のラナウイルス感染症を見出した。本ウイルスは、カエルツボカビと同様にOIEリストに掲載される危険な病原体であることから、在来種12種を用いて病原性の検討を行なった。その結果、本ウイルスは供試動物すべてに致死的に働き、高死亡率を示すことを明らかにした。3.カエルツボカビおよびツボカビ症の消毒、除菌、治療法の検討自然発生性ツボカビ症および天然記念物であるオオサンショウウオを対象として、効果的および安全性の高い治療・除菌法を確立した。本法は希少種の生息域外飼育の際に推奨できる。4.ラナウイルスの疫学調査ラナウイルス感染症による大量死地域と非流行地で保菌動物の調査を行なった。その結果、複数個所で、様々な割合でラナウイルスを保菌する両生類を確認し、流行地以外にもラナウイルスが存在することを明らかにした。5.小型サンショウウオの皮膚メタセルカリア症阿武隈山系はもとより、茨城県、高知県および福井県でも本疾患が確認された。特に注目すべきは天然記念物のアベサンショウウオで感染が確認されたことである。以上の研究結果より、ラナウイルス感染症と皮膚メタセルカリア症は国内で感染拡大の様相を示しており、早急に実態把握をし、流行の発生機序の解明、対策の検討が必要である。
生体活性を有する新規PEEK複合体の開発

ヒト骨芽様細胞を、生体活性PEEK上および未活性PEEK上で培養したが、培養3週でosteopontinの発現が生体活性PEEK上の骨芽様細胞で亢進していた。白色家兎の脛骨にPEEK材を差し込み、引っ張り試験を施行した。12週後の両群間の引き抜き強度は生体活性PEEKが未活性PEEKよりおおきかったが、有意差は見られなかった。生体活性PEEKは骨芽様細胞の石灰化を促進していた。人工関節手術は年間約12万件以上行われており、年々その数は増加している。しかし、それにともない人工関節再置換術の頻度も増加している。これらの再手術では骨皮質が皮薄化し骨欠損の範囲も大きくなることが手術を難しくしている。生体材料の進歩により非荷重部の骨欠損に対してはある程度の対応が可能となったが、荷重部などの力学的強度を必要とする部分では生体材料の使用が制限される。海外では骨欠損部が大きい場合にはallograftを使用することができるが、日本ではallograftの供給源も少なく倫理的にも使用が煩雑である。そこで本研究の目的は、CaO-SiO_2 particleとpolyetheretherketone(PEEK)を用いて荷重部の骨欠損部に対して使用可能な新規生体材料を開発して評価することである。CaO-SiO_2 particleとPEEKを2:8で混合して150MPaを加えた後に360度で30分処理して、生体活性PEEKのディスクを作成した。変形性関節症患者から摘出したヒト骨芽細胞を、生体活性PEEK上および未活性PEEK上で3、7、21日間培養し、骨芽細胞分化マーカー(collagen type I、alkaline phosphatase、osteopontin、osteocalcin)のmRNA発現をリアルタイムPCR法にて検討した。その結果、生体活性PEEK上で培養したものにおいては成熟した骨芽細胞から分泌されるosteopontin、osteocalcinのmRNA発現量が、未活性PEEKに比べて高い値を示した。また、アリザリンレッド染色によって、生体活性PEEKの方が高い石灰化度を示すことが確認された。以上から、生体活性PEEKは骨芽細胞の分化を促進し、さらに、石灰化を促進する可能性が考えられた。人工関節手術は年間約12万件以上行われているが、それにともない人工関節再置換術の頻度も増加している。再手術では骨欠損があり、それを充填することが必用である。。生体材料の進歩により非荷重部の海綿骨の骨欠損に対してはある程度の対応が可能となったが、荷重部などの力学的強度を必要とする部分では使用が制限される。人工関節手術は年間約14万件以上行われているが、それにともない人工関節再置換術の頻度も増加している。そこで本研究の目的は、CaO-SiO_2particleとpolyetheretherketone(PEEK)を用いて荷重部の骨欠損部に対して使用可能な新規生体材料を開発して評価することである。変形性関節症患者から摘出したヒト骨様芽細胞とMC3T3細胞を、生体活性PEEK上および未活性PEEK上で3、7、21日間培養し、骨芽細胞分化マーカー(collagen_typeI、alkaline phosphatase、osteopontin、osteocalcin)のmRNA発現をリアルタイムPCR法、ウエスタンブロット法にて検討した。MC3T3細胞とヒト骨芽様細胞の両方で、培養3日のosteopontinの発現が、生体活性PEEK上で亢進していた。生体活性PEEKおよび未活性PEEKで作製した板状片を7週令雄の白色家兎の脛骨の内側から外側に差し込み、4週、8週、12週で回収して引っ張り試験を施行した。経時的に両群間の引っ張り強度は増加したが、生体活性PEEKと未活性PEEKで有意差は見られなかった。脛骨の内側から外側に差し込んだ場合、骨と板材との接触面積が少なく、PEEK材では金属材料を用いたときのような十分な固定性を獲得できないことが両群間で有意差がみられなかった原因と思われる。大腿骨顆部などのように海綿骨の豊富な部分に埋入して実験を行うことが望ましいと考えられる。
シナプス後部にmRNAが局在する新規分子(Dem)の遺伝子クローニングと機能解析

シナプス後部にmRNAが局在する遺伝子(Dem遺伝子)を網羅的に同定しようとするプロジェクトにおいて発見した新規の遺伝子について,完全長cDNAのクローニングとそれらの性質,および機能解析を進め,以下のことを明らかにした.1.synUSP : cDNAの全長は5378bp.1036アミノ酸をコードするORFを持つubiquitin-specific protease (USP) familyに属する新規遺伝子である.USP活性を有していた.mRNAはdendriteに局在する.two hybrid法により,選択的に相互作用するタンパク質を同定した.何度かのトライののち,良質の抗体を作成することができた.2.synArfGEF : cDNAは5292bp.939アミノ酸をコードするORFを含む.exchange factor for ARF6(EFA6)familyに属する新規遺伝子。C末端でPSD-95,SAP97などと結合.特異抗体を持ちい,タンパク質の発現部位をラット脳で明らかにした.3.ssLRP : cDNAは約6.8kbp.コードされるタンパク質は膜貫通ドメイン1個を持ち,複数のEGFリピート等を持つ新規遺伝子で,エンドサイトーシスされるレセプタータンパク質をコードする.mRNAはdendriteに局在する.C末でPSD-95,SAP97と結合した.免疫組織染色で神経細胞の樹状突起に局在した.ligandを同定するための道具として,LRP null cellへのssLRPstable stransformantの作成を試みたが,合成されたssLRはtrans Golgiでトラップされて細胞膜にうまく組み込まれなかった。引き続き別の方法でligand同定を行う計画である。4.他のDemである,TANCとp55Lの完全長遺伝子をクローニングし,Pull-down法により,結合タンパク質を同定した。引き続き,免疫共沈法などを用いて結合タンパク質を明らかにする計画である。両タンパク質ともに,抗体を作成した。synUSPとssLRPについては,ノックアウトマウスを作成して,さらに生理機能,病態との関連を明らかにすべく計画している。シナプス後部にmRNAが局在する遺伝子(Dem遺伝子)を網羅的に同定しようとするプロジェクトにおいて発見した新規の遺伝子について,完全長のcDNAのクローニングとそれらの性質,および機能解析を進めた.いくつかの新規完全長遺伝子をクローニングし遺伝子登録を行った.3つの新規遺伝子について以下の事を明らかにした.(1)synUSP : cDNAの全長は5378bp.1036アミノ酸をコードするORFを含む,ubiquitin-specific protease(USP) familyに属する新規遺伝子である.また,GSTとのfusion proteinはUSP活性を有していたmRNAはdendriteに局在する.カイニン酸痙攣誘導により発現が増加する.(2)synArfGEF : cDNAは5292bp.939アミノ酸をコードするORFを含む.ホモロジーサーチとドメイン構造から,exchange factor for ARF6(EFA6)familyに属する新規遺伝子である.カイニン酸痙攣誘導により発現が増加する.C末端でPSD-95,SAP97などと結合した.(3)ssLRP : cDNAは約6.8kbp.コードされるタンパク質は膜貫通ドメイン1個を持ち,複数のEGFリピート等を持つ新規遺伝子で,細胞接着やそれに付随する細胞内シグナル伝達系に繋がる,ある種のレセプタータンパク質をコードすると予想される.mRNAはdendriteに局在する.カイニン酸痙攣誘導により発現が増加する.C末でPSD-95,SAP97と結合した.免疫組織染色で神経細胞の樹状突起に局在した.

シナプス後部にmRNAが局在する遺伝子(Dem遺伝子)を網羅的に同定しようとするプロジェクトにおいて発見した新規の遺伝子について,完全長のcDNAのクローニングとそれらの性質,および機能解析を進めた.いくつかの新規完全長遺伝子をクローニングし遺伝子登録を行った.新規遺伝子について以下の事を明らかにした。(1)SynUSP:脱ユビキチン酵素活性を証明した。またtwo hybrid法により,選択的に相互作用するタンパク質を同定した。何度かのトライののち,良質の抗体を作成することができた。(2)synArfGEF:特異抗体を持ちい,タンパク質の発現部位をラット脳で明らかにした。(3)ssLRP:外国との共同研究であるが,ligandを同定するための道具として,LRP null cellへのssLRPstable stransformantの作成を試みたが,合成されたssLRはtrans Golgiでトラップされて細胞膜にうまく組み込まれなかった。引き続き別の方法でligandを同定する計画を進めている。(4)他のDemで,PSDのscaffold proteinとしての機能が考えられるTANCとp55Lの完全長遺伝子をクローニングし,Pull-down法により,結合タンパク質を同定した。引き続き,免疫共沈法などを用いて結合タンパク質を明らかにする計画である。両タンパク質ともに,抗体を作成した。synUSPとssLRPについては,ノックアウトマウスを作成して,さらに生理機能,病態との関連を明らかにすべく計画している。
ショウジョウバエ神経幹細胞制御の分子基盤

幹細胞性は近傍にある細胞や組織に大きく依存し、その細胞群はニッチと呼ばれる。本研究はショウジョウバエ幼虫期脳の神経幹細胞をモデルに、神経幹細胞の増殖能を制御するグリア細胞ニッチの同定及びその分子メカニズムの解明を目的に行い、神経幹細胞ーグリア細胞間相互作用が存在すること、またグリピカンがグリア細胞上に発現し、神経幹細胞で発現する形態形成分子と相互作用することにより神経幹細胞の増殖制御が行われていることを明らかにした。申請者は、ショウジョウバエ幼虫期脳の神経幹細胞(ニューロブラスト)をモデルに、神経幹細胞の発生過程におけるグリア細胞ニッチの必要性、神経幹細胞の増殖能を制御するニッチ細胞及びその分子メカニズムを解明することを目的に、1神経幹細胞の発生時系列におけるグリア細胞ニッチ動態のライブイメージング、2神経幹細胞の増殖能を制御するグリア細胞ニッチの分子基盤、3神経幹細胞膜上においてグリア細胞由来シグナルを受容する分子基盤の網羅的探索の3つの課題に取り組み、以下の結果を得た。GFP再構成法を用いることにより、神経幹細胞ーグリア細胞間相互作用が存在すること、またその時空間的配置を明らかにした。グリピカンがグリア細胞上に発現し、神経幹細胞で発現する形態形成分子と相互作用することにより神経幹細胞の増殖制御が行われていることを示した。網羅的探索を行うことで、神経幹細胞で増殖制御因子として機能する可能性のある候補遺伝子を同定した。近年ショウジョウバエグリア細胞が血液脳関門として機能していることが明らかになってきた。しかし一方で体液性成長因子が神経幹細胞増殖機能を持つことも示されていて、いかに体液性因子が血液脳関門として機能しているグリア細胞層を通過し神経幹細胞増殖を担うのかは不明である。本研究によって得られて知見により、ショウジョウバエグリア細胞をモデルに血液脳関門の機能解明の可能性が期待できる。申請者は、ショウジョウバエ幼虫期脳の神経幹細胞(ニューロブラスト)をモデルに、神経幹細胞の発生過程におけるグリア細胞ニッチの必要性、神経幹細胞の増殖能を制御するニッチ細胞及び、その分子メカニズムを解明することを目的に3つの課題に取り組み、以下の成果を得た。1,神経幹細胞の発生時系列におけるグリア細胞ニッチ動態のライブイメージング;GFP再構成法を用いて、発生経過におけるGFPシグナル観察を行った結果、神経幹細胞ーグリア細胞間相互作用は発生初期から形成されていること、広範の神経幹細胞でGFP再構成法を用いたのにもかかわらず、実際のGFPシグナルは特定の神経幹細胞にのみ限局していることが明らかになった。2,神経幹細胞の増殖能を制御するグリア細胞ニッチの分子基盤;申請者はグリア細胞の分泌機構を阻害することにより、神経幹細胞の増殖能が減少することを見出した。このことは、神経幹細胞の増殖能がグリア細胞膜に提示される分子によって制御されている可能性を示唆していたが、その分子基盤は不明であった。申請者はグリピカンが神経幹細胞のニッチであるグリア細胞膜上で発現し、神経幹細胞の増殖制御機能を持つこと、また神経幹細胞側でグリピカンと相互作用することによりその増殖制御を行なっている分子を同定しその機能を明らかにした。3,神経幹細胞膜上において、グリア細胞由来シグナルを受容する分子基盤の網羅的探索;本研究では、神経幹細胞膜上に提示させるグリア細胞由来の増殖シグナル受容分子同定することを目的に、誘導型RNAiを用いて、シグナル受容分子の網羅的探索を行った。申請者はすでに複数の候補遺伝子の同定に成功していたが、探索を続け新たな候補遺伝子の同定を行った。1,神経幹細胞の発生時系列におけるグリア細胞ニッチ動態のライブイメージング;GFP再構成法を用いることにより、神経幹細胞ーグリア細胞膜の相互作用が「いつ」「どこで」形成されるのかという課題は概ね達成された。2,神経幹細胞の増殖能を制御するグリア細胞ニッチの分子基盤;神経幹細胞の増殖能が、グリア細胞膜に提示される分子によって制御されている可能性について、グリア細胞、神経幹細胞、それぞれの細胞で排他的に発現している分子を同定し、それらの神経幹細胞増殖機能の解析を終了した。3,神経幹細胞膜上において、グリア細胞由来シグナルを受容する分子基盤の網羅的探索;申請者はすでに、複数の候補遺伝子の同定に成功している。分子探索は次年度も続行し、同定した遺伝子については、順次、変異体を用いた神経幹細胞増殖に対する機能解析を行う。課題1、2は概ね終了した。次年度は課題3に注力する。消耗品;課題3「神経幹細胞膜上において、グリア細胞由来シグナルを受容する分子基盤の網羅的探索」に使用するショウジョウバエRNAi系統の購入とショウジョウバエ系統維持費として、飼育ビンの購入費と餌作成費を賄う。分子生物学実験のために、分子生物学実験キット、各種酵素を購入し、PCRプライマー合成、シークエンスの外注のための費用。

生化学実験のために化学薬品等購入費、組織化学実験のために、一次抗体、二次抗体を購入する。書籍購入費として、実験教科書、学術教科書を購入する。旅費;研究成果発表を、国内では日本分子生物学会年会、海外ではアメリカショウジョウバエ研究会で行う。その他;研究成果の学術雑誌への投稿料、論文校正費。
ストレスシグナル伝達機構の時空間的解析と疾患分子機構への応用

細胞が受けるストレスは、癌、炎症性疾患、免疫疾患、骨疾患など多くの疾患の原因となり、そのストレス受容機構の一つとして、ASK1(JNK、p38MAPK経路を活性化し、アポトーシスや細胞分化を誘導するMAPKKK)がある。ASK1依存的ストレスシグナル伝達経路の生理的意義については、その重要性が発癌・骨形成・虚血性疾患・自然免疫応答・脳神経疾患において強く示唆されている。そこで、ASK1の活性化状態を細胞内で可視化するプローブを作製し、さらにマウス個体に応用することにより、ASK1依存的ストレスシグナル可視化マウスを作成し、様々な疾患モデル動物との交配実験により疾患発症リアルタイムイメージングを可能にし、疾患分子機構の時空間的解析を目指した。基礎的研究として、ASK1活性化機構解明を目的として、小胞体ストレス、自然免疫機構におけるASK1活性化の分子メカニズムを明らかにすることに成功し、論文・学会発表において報告した。特に、小胞体ストレスにおけるASK1活性化機構としては、小胞体膜受容体IRE1の活性化依存的にアダプター分子TRAF2が小胞体膜近傍にリクルートされ、そこにASK1が結合することによって活性化される。これらの結果は、ストレスを受容してASK1が小胞体膜近傍という、限局した空間での活性化を示したものである。今後は、以上の結果を踏まえ、ASK1活性化可視化マウスの疾患モデルマウスへの応用を検討する。具体的な実験としては、本研究の第一段階としてin vitro実験系により最もFRET効率の高いCFP/YFP標識タンパク質(ASK1、TRX)の一次構造を決定することを試みた。ASK1のN末端はTrxとの結合領域であるために、N末端にCFP/YFPを付加したものを精製し結合させ、両者の結合の見られるものを作成した。また、同時にストレスシグナルを可視化するために、ASK1を活性化する刺激として、アルツハイマー病の原因であるアミロイドβ、LPSなどを作用させASK1の活性化、ならびにストレスの可視化として活性酸素種を細胞内で測定し、それらの相関性を検討し論文に報告した。