hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経細胞におけるカルシウムによるRas活性化機構の解析

このCREBリン酸化を指標にしたチャンネル機能の解析中に、米・仏の研究グループよりNeuron, Vol,40,775-784,に、NMDAレセプターのNR2BサブユニットとRasGRF1が直接結合するという研究結果が発表されたため、新たに、NMDAレセプターとの関連も視野に入れた研究も開始することとした。NMDAレセプターにより制御させる細胞内カルシウムとRasGRF1/2の活性化の検討に際しては、RasGRF1/2のノックアウトマウスを用いて検討をおこなっている。前年度に継続して、Rasの活性制御に対するRsaGRFのカルシウム結合ドメインの機能解析を培養細胞における膜電位依存型カルシウムイオンチャンネルを再構成した系で解析をした。一方、米・仏の研究グループから、Neuron Vol.40,775-784にNMDAレセプターのNR2BサブユニットにRasGRF1が直接結合する研究結果が報告されたことより、受容体共役型のイオンチャネルによる細胞内へのカルシウム流入の関与も想定された。これらを踏まえ、モデルマウスの作成、およびマウスの脳、初代培養細胞を用いた解析も行った。モデルマウスとしては、RasGRF1遺伝子欠損マウスが既存であったため、RasGRF1とRasGRF2の二つの遺伝子を欠くマウスを新たに交配により作成した。RasGRF1と高い相同性を持つRasGRF2はカルシウム依存性に活性増幅があるが、NMDAレセプターとの結合が見られないために、それぞれの遺伝子欠損をホモ、ヘテロで比較する事によりカルシウムイオンの細胞内の動向が解析可能と考えたからである。なを、RasGRF2の遺伝子欠損マウスは、すでに我々が作成していたが、正常に出生・成長し、異常を確認する事ができなかった(未発表事項)。作成されたRasGRF1/RasGRF2の遺伝子重複欠損マウスは、胎児致死とはならずに出生し、通常の成長を遂げることが示された。脳の薄層切片を短期培養する事により、生理活性因子の刺激による反応、電気生理学的反応を検討し、さらに、タンパク質レベルでの発現の解析を行った。タンパク質の発現については、RasGRF1とRasGRF2の発現が成長に伴い変化する事を見いだした。これにより、成長に伴い発現レベルが、GRF1優位からGRF2優位へ変化することが示され、脳・神経細胞でのカルシウムの制御機能が成長に伴い変化する可能性が示された。
遺伝子ターゲッティングを利用したトリプトファン高蓄積イネの開発

遺伝子ターゲッティング(gene targeting ; GT)は、標的遺伝子だけを狙い通りに改変することができる有用な技術である。本研究では、GTによってトリプトファン(Trp)合成の鍵酵素遺伝子OASA2を計画的に改変し、Trp高蓄積イネを作出することに成功した。メタボローム解析の結果、このイネでは、各種アミノ酸、Trpから合成されるセロトニン、ビタミンB群やインドールアルカロイドなども高蓄積していることが明らかになった。したがって、GTによる計画的変異導入技術は代謝改変作物の分子育種に利用できることが実証された。本研究では、相同組換え機構を使用した遺伝子ターゲッティング(GT)技術を用いて、トリプトファン(Trp)合成の鍵酵素をコードするOASA2遺伝子に目的の変異を導入した系統を作出し、Trp蓄積量やその栽培特性を評価することで、飼料米や高栄養米の育種母本となる高Trp系統の選抜することを目標とする。また、従来の遺伝子過剰発現アプローチで得られた個体とGTによる遺伝子改変アプローチで得られた個体について、Trp蓄積量やその栽培特性を評価するため、GTによるOASA2遺伝子改変個体と変異型OASA2遺伝子の過剰発現個体を用いて解析を行う。(1)遺伝子ターゲッティング(GT)によるOASA2遺伝子改変個体の作出とその評価まず、OASA2遺伝子のGT候補個体の解析方法について改良を加えた。これまで、GTに成功したと思われる再分化植物体を用いて遺伝子解析を行っていたが、今年度から再分化前のカルスを一部用いて解析を行った。これにより解析や培養が省力化できた。この方法を用いてGT実験を行った結果、内在性のOASA2遺伝子にSl26F/L530D、Y367A、Y367A/L530Dの変異が導入されたと予想されるGTカルスをそれぞれ3、5、11系統獲得することに成功した。これらのGT候補カルスの一部からは、再生植物体が得られた。次に、既に得られていたGT個体のアミノ酸分析を行った。S126F/L530Dの変異が導入された系統#3-4、Y367Aの変異が導入された系統#5-11について、カルス、幼苗、完熟種子での遊離アミノ酸量を測定した結果、いずれの系統も改変型OASA2遺伝子をホモでもつ系統は遊離Trp含量が増加していた。特に、#3-4の完熟種子では非形質転換個体の230倍もの遊離Trpが蓄積していることが明らかとなった。(2)過剰発現アプローチとGTアプローチの比較S126F/L530Dの変異を導入したOASA2遺伝子発現カセットを導入した形質転換個体のうち、導入遺伝子が1コピーであると考えられ、OASA2遺伝子の葉におけるmRNA量が野生型より高い個体を3系統選抜した。本研究では、相同組換え機構を使用した遺伝子ターゲッティング(GT)技術を用いて、トリプトファン(Trp)合成の鍵酵素をコードするOASA2遺伝子に酵素機能を向上させる変異を導入した系統を作出し、Trp蓄積量やその栽培特性を評価することで、飼料米や高栄養米の育種母本となる高Trp系統の選抜することを目標とする。(1)遺伝子ターゲッティング(GT)によるOASA2遺伝子改変個体の作出とその評価これまでに、遺伝解析やサザンブロット解析の結果から、内在性OASA2遺伝子を予想通りに改変した(すなわちOASA2遺伝子座においてtrueGTが生じている)系統を獲得することに成功している。そのうち、OASA2遺伝子にS126F/L530Dの変異が導入された系統#3-4、Y367Aの変異が導入された系統#5-11の完熟種子と幼植物体を用いて、Trp以外の遊離アミノ酸含量を測定した。その結果、どちらの系統においても、改変型OASA2遺伝子をホモで持つ個体は各種遊離アミノ酸含量が増加していた。特に、#3-4の改変型ホモ系統の完熟種子では、野生型の230倍ものTrpが蓄積していた。一方、Trp合成経路から派生して合成されるチロシンやフェニルアラニンをはじめ、Trp以外の遊離アミノ酸は野生型の210倍程度しか増加していないことが明らかとなった。このことから、OASA2遺伝子に酵素機能を向上させる変異を導入することでTrpを特異的に高蓄積させることが可能であることが示された。(2)過剰発現アプローチとGTアプローチの比較GTアプローチで作出した系統のうち、#3-4系統について農業特性を調査した。

その結果、草丈や分けつ数など栄養生長器官の生長には大きな違いは見られなかった。相同組換えを利用した遺伝子ターゲッティング(gene targeting;GT)は、標的遺伝子だけを狙い通りに改変することができる非常に有用な技術である。本研究では、トリプトファン(Trp)合成の鍵酵素であるアントラニル酸合成酵素(AS)をコードするOASA2遺伝子に対し、GTによって計画的に点変異を導入することで、Trp高蓄積イネの作出を試みるとともに、機能付加米育種への応用を探る。また、従来の変異型酵素遺伝子の過剰発現アプローチとGTによる標的遺伝子の計画的改変アプローチとの比較を行い、その相違について理解を深める。昨年度までの研究によって、GTを利用してOASA2遺伝子に目的の点変異(S126F/L530D、Y367A、Y367A/L530D)を導入したカルスを獲得することに成功した。これらのうち、変異型OASA2酵素の特性が大きく異なる2種類の変異(S126F/L530D、Y367A)が導入された個体の幼苗と完熟種子について遊離Trpを測定した。その結果、(1)改変型OASA2遺伝子をホモで有する個体はヘテロ個体よりTrp含量が高いこと、(2)in vitro解析で示された変異型OASA2の酵素活性とGT個体におけるTrp蓄積量に正の相関が見られこと、(3)GT個体の種子では茎葉部よりTrpが高蓄積していることが明らかになった。今年度は、Trpの高蓄積が確認されたS126F/L530Dを導入した系統の完熟種子について、メタボローム解析を行った。その結果、Trp以外の各種アミノ酸、Trpを基質として合成されるセロトニン、ビタミンB群やインドールアルカロイドなども高蓄積していることが明らかになった。この結果は、変異型酵素遺伝子の過剰発現アプローチで作出されたイネのメタボローム解析で報告されている結果と同様であった。以上の結果から、GTは過剰発現アプローチと同様に代謝改変イネを作出するのに利用できることが実証きれた。
新しい有機性廃棄物処理法を目指した環境循環型バイオマスの開発

基質特異性が異なるミミズ由来セリンプロテアーゼのうち最もプロテアーゼ活性が高く安定であるisozyme AのcDNAについて、前駆体型領域(オープンリーディングフレーム)と活性型領域をPCR法により増幅した。得られた792bpと774bpの遺伝子をそれぞれコムギ胚芽発現用ベクターに導入したプラスミドを構築し、コムギ胚芽無細胞発現システムを用いたタンパク質の発現を検討した。26°C、23時間反応した反応液をSDS-PAGEで分析した結果、前駆体型領域のプラスミドと活性型領域のプラスミドではそれぞれ約26kDaと約25kDaのタンパク質が合成されていることが明らかとなり、ミミズ由来セリンプロテアーゼ遺伝子が植物で発現することを確認した。そこで、活性型isozyme A遺伝子を植物発現用プロモータCaMV35Sの下流に連結したプラスミドを構築し、アグロバクテリウムに導入後シロイヌナズナに感染させてT1種子の取得に成功した。T1種子をカナマイシン含有MS培地で生育させたところ、生育する形質転換体は、1)正常な形態を示すもの、2)葉がブリーチングされるもの、3)葉の形態が異常になるもの、に分類できた。異なる形態を示す形質転換体の幼少葉から全RNAを抽出しRT-PCRを行った結果、2と3の形態を示す形質転換体でアイソザイムA由来遺伝子断片の増幅が起こり、ミミズ由来プロテアーゼ遺伝子が導入され発現していることが確認できた。2と3の形質転換体の生育を続けたところ、茎の伸長がおこらずT2種子の取得が不可能となった。次に、前駆体型isozyme A遺伝子を導入した形質転換体を作出し、T1種子をカナマイシン含有MS培地で生育させたところ,植物体は徐々にブリーチングし、葉が異形を示し、不稔など、ミミズ由来セリンプロテアーゼによる影響と考えられる変化が観察された。このことは、植物の生育に影響を及ぼさない器官や発現時期をコントロールすることにより、シロイヌナズナをはじめ植物にミミズ由来セリンプロテアーゼ遺伝子を導入して安定的にタンパク質を生産させ、バイオマスによる有機性廃棄物の分解に利用する可能性を示唆するものである。基質特異性が異なるミミズ由来セリンプロテアーゼのうち最もプロテアーゼ活性が高く安定であるisozyme AのcDNAについて、前駆体型領域(オープンリーデイングフレーム)と活性型領域をPCR法により増幅した。そこで、isozyme A遺伝子を植物発現用プロモータCaMV35Sの下流に連結したプラスミドを構築し、アグロバクテリウムに導入後シロイヌナズナに感染させた結果、T1種子の取得に成功した。フィブリンやカゼイン等の高分子タンパク質を加水分解するミミズ

由来セリンプロテアーゼアイソザイムAのcDNAの活性型領域を植物発現用プロモーターCaMV35Sの下流に連結したプラスミドを構築しアグロバクテリウムを用いて形質転換して得たシロイヌナズナT1種子をカナマイシン含有MS培地で生育させた。生育する形質転換体は、1)正常な形態を示すもの、2)葉がブリーチングされるもの、3)葉の形態が異常になるもの、に分類できた。異なる形態を示す形質転換体の幼少葉から全RNAを抽出しRT-PCRを行った結果、2と3の形態を示す形質転換体でアイソザイムA由来遺伝子断片の増幅が起こり、ミミズ由来プロテアーゼ遺伝子が導入され発現していることが確認できた。2と3の形質転換体の生育を続けたところ、茎の伸長がおこらずT2種子の取得が不可能となった。以上の結果から、シロイヌナズナで発現したアイソザイムAが生育に悪影響を与えることが示唆された。そこで、ミミズ由来セリンプロテアーゼアイソザイムAのcDNAの前駆体型領域を植物発現用プロモーターCaMV35Sの下流に連結したプラスミドを構築し、アグロバクテリウムに導入後シロイヌナズナに感染させ、T1種子の取得に成功した。フィブリンやカゼイン等の高分子タンパク質を加水分解するミミズ由来セリンナロテアーゼアイソザイムAのcDNAがコードする前駆体型領域(オープンリーディングフレーム)を植物発現用プロモーターCaMV35Sの下流に連結したプラスミドを構築しアグロバクテリウムを用いて形質転換して得たシロイヌナズナT1種子をカナマイシン含有MS培地で生育させた。生育する形質転換体は、活佳型領域を導入した形質転換シロイヌナメナと同様に、正常な形態を示すもの、葉がブリーチングされるもの、葉の形態が異常になるもの、に分類できた。形質転換体の幼少葉から全RNAを抽出しRT-PCRを行ったところ、アイソザイムA由来遺伝子断片の増幅が起こり、ミミズ由来プロテアーゼ遺伝子が導入され発現していることを確認したが、形質転換体の生育不良によりT2種子の取得が不可能となった。以上の結果から、CaMV35Sにより不特定部位で起こるアイソザイムAの発現が生育に悪影響を与えることが懸念された。そこで、アイソザイムAのcDNAの前駆体型領域と活性型領域を登熟期発現プロモーターの下流に連結して構築したプラスミドを導入した形質転換体T1種子の取得に成功した。T1種子を選択培地で発芽させたところ、生育不良は認められていない。
温度刺激が骨格筋の運動に対する応答に及ぼす影響：カルシウムイオン動態に着目して

本研究の目的は、温める・冷やすといった温度刺激が骨格筋の運動に対する応答(損傷、肥大や萎縮)に及ぼす影響を明らかにすることである。骨格筋の損傷後にはアイシングを施すということは臨床において広く浸透している。しかし、アイシングが損傷筋に及ぼす影響は十分に解明されていない。温める・冷やすという処置は簡便な方法であるが、その温度刺激が組織に及ぼす影響は大きく、処置を誤ると症状の悪化など思わぬ結果をもたらす危険性がある。本研究では、この温度刺激が骨格筋の運動に対する応答に及ぼす影響を細胞内の情報伝達において非常に重要なカルシウムイオン動態に着目して明らかにする。
むずむず脚・周期性四肢運動障害の合併が多いナルコレプシーでの脳内鉄代謝の検討

ナルコレプシーでは髄液中のトランスフェリン(TF)と鉄イオン(Fe)が有意に高値であり,鉄代謝が昂進している可能性がある.周期性四肢運動の数とTF値の相関がある(r=0.61, p=0.045).フェリチンとTFの値に相関があることが判明している(r=0.51, p=0.038).Feと%BMIにも相関が認められた(r=0.63, p=0.02).この結果については,栄養状態が良いと想定される%BMIが高値の人ほど,Feも高値であると考えていたが、パーキンソン病で睡眠障害の有無での比較検討をした報告で,同様に睡眠障害群で髄液のTFとFeが有意に高値であり,睡眠障害に特有の可能性を考えている.ナルコレプシーでは髄液中のトランスフェリン(TF)と鉄イオン(Fe)が有意に高値であり,鉄代謝が昂進している可能性がある.周期性四肢運動の数とTF値の相関がある(r=0.61, p=0.045).フェリチンとTFの値に相関があることが判明している(r=0.51, p=0.038).Feと%BMIにも相関が認められた(r=0.63, p=0.02).この結果については,栄養状態が良いと想定される%BMIが高値の人ほど,Feも高値であると考えていたが、パーキンソン病で睡眠障害の有無での比較検討をした報告で,同様に睡眠障害群で髄液のTFとFeが有意に高値であり,睡眠障害に特有の可能性を考えている.(1)これまでに20例を検討している。頭部MRIでは、全例に間脳・視床下部周辺の両側性・左右対称性病変を認めた。睡眠学的には、いずれも過眠症状を呈していたが、情動脱力発作を呈した症例はいなかった(いずれの症例も早期に治療をしたことが情動脱力発作の発症を阻止した可能性がある)。髄液オレキシンは低値が6名、中間値が14名であった。これら髄液オレキシン値は、免疫抑制療法後にいずれも正常化した。間脳・視床下部と第四脳室周囲にはAQP4が高発現するため、この抗体を介した免疫学的機序による障害が生じ、さらに同部位に存在するオレキシンニューロンも二次的に障害され、過眠症・ナルコレプシーを来している可能性が考えられた。症候性ナルコレプシーの原因としてAQP4抗体を考慮すべきであることを示すとともに、早期に診断し、不可逆的な障害が生じる前に、ステロイドや免疫抑制療法によって治療介入することが重要であると考えられた。また稀にではあるが、VB1不足によって生じるWernick脳症において、間脳・視床下部周辺の両側性・左右対称性病変が生じることがある。そのような症例において、過眠症状を呈して、髄液オレキシンも測定限界以下の低値を示した症例を経験した。VB1の補充によって、画像所見と過眠症状とオレキシン値は徐々に改善を認めた。画像所見はAQP4抗体が陽性の群と似通っているとは考えていたが、病態機序については別個のものと考えていた。しかしながら、文献検索を行ったところ、Wernick脳症において認められる第3脳室周囲域の病変もAQP4に対するVB1不足によって起こりうるとの研究報告があり(Chan2004)、アクアポリン4(AQP4)関連により2次性の過眠症が起こる病態の1つであると考えられた。特発性のむずむず脚症候群の場合とは異なり、ナルコレプシーでは髄液中のトランスフェリンと鉄イオンが有意に高値であり、鉄代謝が昂進している可能性を考えている。この所見はオレキシン神経の脱落による1次的なものか、ドーパミン代謝の昂進の代償等による2次的なものであるのかは不明である。ナルコレプシーでは周期性四肢運動障害が高率にみられるが、治療薬への反応も異なるとされ、鉄代謝の病態生理と合わせて、病態は異なると考えられた。現在は詳細な検討を行っている途中であるが、周期性四肢運動の数(PLMS index)とトランスフェリンの値が正の相関があることが判明している(r=0.61, p=0.045, pearson's correlation)。次いで、血清中では正の相関は示さないと考えられるフェリチンとトランスフェリンの値に正の相関があることが判明している(r=0.508, p=0.038, Pearson (parametric), r=0.601, p=0.011, Spearman (non-para) )。鉄イオンと年齢と性別で標準化した%BMIにも正の相関が認められた(r=0.634, p=0.020, Pearson (parametric))。この結果については、栄養状態が良いと想定される%BMIが高値の人ほど、鉄イオンも高値であるのでは無いかと当初は考えていた。しかし最近のパーキンソン病の中で睡眠障害のある群と無い群の比較検討をした報告では(Yu, Plos One 2013)、我々のデータと同様に睡眠障害のある群では、髄液中のトランスフェリンと鉄イオンが有意に高値であり、睡眠障害に特有の可能性を考えている。精神医学、睡眠障害当初の計画よりは症例数は少なめではあるが、統計学的検討を行う症例数は集まっており、病態機序の検討は可能であると考えている。

これまでに検討により、特発性のむずむず脚症候群とは異なり、ナルコレプシーでは髄液中のトランスフェリンと鉄イオンが有意に高値であり、鉄代謝が昂進している可能性も考えられる。この所見はオレキシン神経の脱落による1次的なものか、ドーパミン代謝の昂進の代償等による2次的なものであるのかは不明である。ナルコレプシーでは周期性四肢運動障害が高率にみられるが、治療薬への反応も異なるとされ、鉄代謝の病態生理と合わせて、病態は異なると考えられた。現在は詳細な検討を行っている途中であるが、周期性四肢運動の数(PLMS index)とトランスフェリンの値が正の相関があることが判明している(r=0.61, p=0.045, pearson'scorrelation)。次いで、血清中では正の相関は示さないと考えられるフェリチンとトランスフェリンの値に正の相関があることが判明している(r=0.508, p=0.038, Pearson (parametric), r=0.601, p=0.011, Spearman (non-para) )。鉄イオンと年齢と性別で標準化した%BMIにも正の相関が認められた(r=0.634, p=0.020, Pearson (parametric))。この結果については、栄養状態が良いと想定される%BMIが高値の人ほど、鉄イオンも高値であるのでは無いかと考えている。今後とも計画に沿って、多数例の症例を集積して、脳脊髄液中の測定実験等をすすめて行く予定である。26年度は当初の予定より多くの症例で、オレキシン値、AQP4抗体を測定したいと考えている。またフェリチンとトランスフェリン、鉄イオンも対象疾患を広げての測定を検討する。
スマートグリッドにおける電気自動車のスマート充電・充放電技術に関する研究

電気自動車を電力系統にとっての高速デマンドレスポンス資源,分散型電力貯蔵として活用するための自律分散制御手法を確立した。また,地域エネルギーマネジメントと集約蓄電池としての運用を意識したアグリゲータによる協調制御手法を提案した。電気自動車の走行・充電パターンと電力系統の諸特性を連成させたシミュレーションにより有効性を検証するとともに,電気自動車の充電インターフェースに実装することで,制御・通信性能や実現性を明らかにした。プラグインハイブリッド自動車・電気自動車を電力システムにとっての分散型電力貯蔵として活用するV2G (Vehicle-to-Grid)は,スマートグリッドの中心技術の一つとして注目されている。本研究では,電気自動車のユーザ利便性である充電要求を最優先に,再生可能エネルギーの急峻な出力変動に対応する高速デマンドレスポンス資源として貢献させる, "スマートストレージ"の制御手法を設計した。多数台の電気自動車を,電力システムにとってのデマンドレスポンス資源として統合するためには,情報通信を介したアグリゲーションが不可欠となる。そこで,ローカル/グローバルな充放電出力と充電状態のマネジメントを考慮した, "クラウドパワーストレージ"としての運用を可能とする,多数台電気自動車のスマート充電・充放電の組み合わせ制御手法を提案した。数万台規模の自動車走行統計を用いた数値シミュレーションにより,個別充電要求を満たしながら柔軟な集約蓄電池としての運用が可能であることを確認した。電気自動車と電力システムの協調を実現するための制御・通信インタフェースについても,世界中で検討が始められている。本研究では, "スマートストレージ"と"クラウドパワーストレージ"の制御手法を実現する,電気自動車実車と双方向電力変換/情報通信を備えた試験システムを構成した。そして,提案制御手法を実装することで,その制御応答・効率や充電状態管理などについて検証した。電気自動車に対して,ユーザからの充電要求と電力システムの需給状況を勘案しながら充電サービスを実施するとともに,停車時に分散型蓄電池としてスマートグリッドの需給制御へ貢献させる,スマート充電・充放電技術に関する研究を行った。多数台の自動車の走行パターンを模擬することを特徴とした,電力システムの周波数制御シミュレーションを実施し,電気自動車バッテリの高速応答性に特化したPrimary Reserveとしての自律分散型制御手法と,電力システムのコントロールセンターからの充放電指令を受けるSecondary Reserveとしての協調型制御手法を設計した。また,地域的な電力潮流の管理を行いながら,電気自動車の分散型蓄電池を集約した一つのクラウドストレージとしての運用を可能とする,ユーザからの充電要求に応じたスマート充電と電気自動車間の電力授受でオフセットさせるVehicle-to-Vehicle,そして電力システムとの電力のやり取りであるVehicle-to-Gridを組み合わせた統合制御手法を提案した。充放電対応パワーコンデョショナ,急速充電口を搭載した電気自動車実車相当の実験装置,そして電気自動車/充電インフラ/電力システム間での通信制御を想定したスマートインターフェースから構成される実験システムを構築し,スマート充電・充放電に関する各制御手法の実装の準備を整えた。なお,電力システムシミュレーションをリアルタイムで実行し,電気自動車/充電インフラの実験システムと連成させた試験が可能な構成としており, H24年度には総合シミュレーション・総合試験が期待できる状況である。電気自動車と充電インフラの通信・制御には,実験の安全性や電気自動車との情報のやり取りの観点からCHAdeMOプロトコルを採用している。スマート充電・充放電制御手法の検討と電気自動車/充電インフラの実験装置の構築までが行われている。そして,単体実験装置と電力システムシミュレータを連成させた総合試験を実施する準備が整えられている。スマート充電・充放電制御手法については,再生可能エネルギーの導入や電力システムの需給や潮流のボトルネックの想定など,シミュレーションの詳細条件の追加・改善を重ねながら,国内外への成果発表を行う。電気自動車からのVehicle-to-Gridに関しては,電気自動車やスマートグリッドの分野での国際標準化の中心技術のひとつに挙げられているので, CHAdeMOプロトコルの採用や電力システムの需給制御への貢献についてのユースケースの研究成果を活用して,情報交換や海外規格との比較検討も実施する。国内・国際会議への成果投稿を中心に研究費を利用する。
光学的測定による骨格筋・心筋細胞内遊離マグネシウム濃度の定量とその変動の解析

螢光Mg指示薬furaptraを蛙骨格筋単-筋線維内に注入し、細胞内螢光信号を測定して細胞内遊離Mg濃度([Mg^<2+>]i)を解析した(17°C)。furaptraの螢光励起スペクトルから求めた[Mg^<2+>]iの平均値は、塩溶液中で得られた解離定数(KD)(5.5mM)を用いて計算すると0.54mMであった。しかし、furaptraのKDは細胞内で増大する(約2倍)ことが期待されることから、[Mg^<2+>]iの真の値は約1.1mMであると推定した。細胞外を高Mg^<2+>濃度(20mM)または低Na^+濃度溶液で潅流しても、4分以内の短い時間範囲では[Mg^<2+>]iは有意に変化しなかった。(平成3年度)ラットの心臓から酵素処理により単離した心室筋細胞にfuraptraをAMIステルを用いて導入し、単一細胞からの螢光信号を測定して上述骨格筋細胞と同様の手法で解析した(32°C)。静止状態の単一心室筋細胞から得た[Mg^<2+>]iの推定値は0.8mM-1.3mMの範囲であった。細胞外液のMg^<2+>濃度を20mMに増大すると、[Mg^<2+>]iは16時間のゆっくりした時間経過で上昇した。この変化は可逆性であった。その他の細胞外条件下(細胞外低Na^+濃度、10μMイソプロテレノール、CO_2アシドーシス)では、[Mg^<2+>]iは有意な変化を示さなかった。しかし、アンカプラーでミトコンドリアの酸化的リン酸化を阻害すると、[Mg^<2+>]iは急速に上昇した。(平成4年度)これらの結果より、細胞内遊離Mg^<2+>濃度は異なるタイプの筋細胞(骨格筋、心筋)においても同様で1mM付近であることが示唆された。また[Mg^<2+>]iは非常によく1mM付近で制御されているが、細胞内ATPが枯渇した時には大きく変動し得ることが示された。Mg/Ca指示薬、furaptraのMg^<2+>およびCa^<2+>に対する解離定数(K_D)をin vitroの系で測定した。Mg^<2+>に対するK_Dは17°Cで5.5mM、32°Cで2.6mMであり、Ca^<2+>に対するK_Dは17°Cで44μMであった。溶液のpHを6.57.2の範囲で変化させても、furaptraの螢光励起スペクトルおよびMg^<2+>、Ca^<2+>に対するK_Dはほとんど影響をうけなかった。蛙骨格筋の前脛骨筋より単一筋線維をとり出し、17°Cに保ったRinger液でかん流した。筋線維自身の吸光度、背景蛍光強度を広い波長範囲(330um420um)で測定した後、微小電極の先端に充墳したfuraptraを細胞内に圧注入した。

furaptra注入後、細胞内からの蛍光励起スペクトルを測定した。このスペクトルを背景螢光と細胞による吸光の補正をして、細胞内furaprtaの螢光励起スペクトルを得た。furaptraの細胞内励起スペクトルはin vitroのそれと非常によく一致し、細胞内Mg濃度は(解離定数を5.5mMと仮定すると)約0.6mMであることが示唆された。細胞外Mg濃度を20mMに増加しても、また細胞外Na濃度を減少させても、furaptra螢光信号は数分以内には有意な変化を示さなかった。この結果はMg選択性電極を用いたBlatterの報告(1989)を支持しなかった。また高Mg溶液(20mM)に長時間(210時間)筋線維をインキュベ-トしても、furaptra螢光信号はわずかに変化したにすぎなかった。この結果より、骨格筋細胞内Mg濃度は0.51mMの静止レベル付近で比較的安定に保たれており、速い時間経過の細胞機能制御因子である可能性は低いと考えられた。また他の組織で示唆されているNaーMg交換系は骨格筋では重要な役割をはたしているとは考えにくい。ラットの心臓を酵素処理して単一心室筋細胞を単離した。螢光Mg指示薬furaptraを細胞内に導入し(細胞膜透過性AMエステルによる)、細胞からのfuraptra螢光強度を測定・解析した。細胞内furaptraの螢光励起スペクトルは、塩溶液中で得られたスペクトルと非常によい一致を示したので、螢光信号から細胞内遊離Mg濃度([Mg^<2+>]i)を求めた。螢光信号の解析の結果・細胞内ではfuraptra分子の約20%がMgと結合していると考えられ、塩溶液中で求めたMgに対する解離定数(5.5mM)を用いると、[Mg^<2+>]iは0.67mMと計算された。しかし、furaptraのMgに対する解離定数が細胞内で20100%増大すると考えられることから、[Mg^<2+>]iは0.81.3mMの範囲にあることが示唆された。ミトコンドリアのアンカプラー(1μM FCCP)によりミトコンドリアの酸化的リン酸化を抑制すると、速い時間経過で大きな[Mg^<2+>]iの上昇が観察された。[Mg^<2+>]i上昇にひき続いて細胞は持続的に短縮した。この結果は、細胞内ATPの枯渇によるMg-ATPの解離として説明することができる。同様な[Mg^<2+>]iの上昇はhypoxiの時にも起こり得ると推測した。
ゲームの発生と相互作用する動的認識ネットワークのダイナミクスの複雑さの研究

本研究の目的はゲームのダイナミクスを追求する新しいモデルを提案し、そのモデル・シミュレーションを通じて、学習や進化を考える上での新しい視点、相手のモデルの生成やゲームのルーそのものの生成やを論じようというものであった。2年間の研究期間を通じて次のような成果をあげることができた。1.ゲームのプレイヤーが相手のプレイヤーのモデルをつくり、そのモデルをもとに将来を予測しながらゲームをする状況を計算機の中で扱った。このモデルをもとに、囚人のジレンマゲームや空間ゲーム、さらに談話のモデルを扱った。また相手のモデルが時間とともに変遷してしまう問題をチューリングテストの力学系版モデルとして扱った。2.ゲームの規則と、ゲームの戦略をラムダ式で表現することで、規則と戦略の間に干渉を起こし、結果としてゲームの規則が書き換えられてしてしまうモデルを提案できた。その干渉の仕方から戦略のパターンが3つに分類できる。3.談話の時間発展を動的認識システムでモデル化し、談話規則の変遷を議論した。談話の数理的構造をきちんと扱った研究としては最初で、これらの結果は今年度中に複数発表予定である。4.戦略と規則の区別や、談話の規則と話者の意図の区別は、つねに外部から与えられているが、ここではそれを内部的に発生するものとして与えている。そのためにそうした区別は揺らいでしまう。こうした広く意味と文法の分離不可分な様相は、細胞の膜と内部反応の共進化や自己と非自己を認識する免疫系のモデルにみることができる。進化可能性はそうした中で再考されねばならない。ゲームの規則を与えても、ゲームの発展は規則からは予測分からないような動的な複雑さを示す。こうしたことは人工生命の研究のテーマでもあり、また複雑系が掲げる「Synthetic Complexity」の具体的な研究例となっている。これは相互作用がつくり出す複雑さであり、形式遺伝子の持つ組合せ的複雑さとは質的に異なるものである。さらに古典的計算論が示す(時間的)複雑さと力学系の示す複雑さを橋渡ししつつ、例えばカオス的遍歴現象などの力学系の新しい性質を、認知現象を理解するための概念装置として確立していくことが必要である、と考えている。本年度は、2つのことを中心に研究を押し進めた。最初に動的認識システムの力学系としての基本的性質を調べたこと、次に空間ゲームおよび3人ゲームへの応用を行なったことである。最初の項目に関し、動的認識システムをバックプロパゲーションにより学習させることの難しさを、ネットワーク荷重の初期値に対する鋭敏性と異なる汎化パターンを持つアトラクターの分布構造にみることができた。空間ゲームに関しては、相手のモデルを構成することの不安定性が研究の焦点である。相手のモデルが一意に確定せず、時間的に変動することで協調状態をつくり出すことが示された。また3人(仲間はずし)ゲームでは、お互いのモデルが確定するまでに非常に長い遷移状態を伴うこと、3人囚人ジレンマゲームでは2人ジレンマゲームでは見られなかった協調状態の獲得が、稀ではあるが、獲得されることが発見された。空間ゲームに関してはヨーロッパの人工生命国際会議で発表された。この研究の大きな目的はこれを認知科学の理論として発展させることにある。そのこころみのひとつとして、言語的相互作用のモデル化をこころみた。このモデルでは、会話における「連続性」を仮定することで、動的認識システムをもとに相手の次の言葉を予測し合うモデルを構成した。

その結果生じる談話のルールの生成や、会話の発展パターンなどについて解析中である。この結果は来る4月の「言語の起源」国際会議に受理され、発表予定である。また動的認識システムではなく、そのより抽象的なモデルを使った3人Imitation gameの解析も行なっている。これは多人数の信念の時間構造について考察したものであり、国際会議で発表済である。本年度は、1)動的認識システムの力学系としての性質、2)結合動的認識システムによる談話モデルの解析、3)λゲームの解析4)動的認識システムと剛体系との結合システムの解析5)レプリケータ方程式をもとにしたカオス遍歴現象の研究などをおもに行なった。1)動的認識システムは、時間認知を得意としている。ここでは空間認知として簡単に学習できる問題に関し、時間認知でどのように学習しようとするかを調べ、学習アトラクターのノイズに対する強さやリドルドなベイスン構造について解析した。特にノイズに対する安定性の閾値が2つ存在することと、学習に成功するアトラクターの方が壊れやすいことは興味深い発見である。この成果はNeural Network誌に投稿準備中である。2)談話をひとつのシステムと考えることで、2人の話者が談話のモデルをつくりながら会話する力学システムを調べた。やはり動的認識システムを用いるが、ゲームのように将来の得点を最適化するのではなく、モデルの連続性(なめらかさ)を保つように発話が行なわれる。その結果、会話の構造の間欠的な移り変わりや、発話パターンの変遷を解析した。1部が2000年4月のパリの言語の進化の国際会議で発表され、現在投稿準備中。3)λ式を用いてゲームをデザインし、ゲームと遊びの差であるゲームのルールの変更を扱うことができるモデルを囚人のジレンマゲームに関しデザインした。その結果メタゲーム戦略を3つの形に分類し、どのようなゲームを行ないうるかを解析できた。この他、動的認識システムと剛体系の相互作用4)を扱うことで、物理的制約の下での認知のモデルを探索中である。また今後ゲームと遊びをつなげていく研究の中で大事な概念であるカオス的遍歴5)を簡単なモデルで解析した。
正常肝、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌におけるプロテオーム解析-新しい診断、治療、発生予防の開発を目指して-

ヒトにおける正常肝、肝硬変、肝細胞癌の細胞周期関連分子を網羅的に解析した。ヒトの正常肝、肝硬変と比較し肝細胞癌において増強していたのは細胞周期のG1からS期に働くサイクリンA、E、D、サイクリン依存性キナーゼ4であった。特にサイクリン依存性キナーゼ4は極めて肝癌において顕著に増強していた。さらにサイクリンA、E、D、サイクリン4の活性のレベルは、未分化肝細胞癌及び進行肝細胞癌において極めて強いことも報告した(Hepatolgy;37:534-543,2003)。これにより、G1からS期に働く細胞周期のうち、特にサイクリン依存性キナーゼ4の阻害が、肝癌の進展阻止につながり、新薬の一つの標的分子になる可能性が示唆された.この報告は、肝癌進展過程における網羅的細胞周期分子解析を行った初めての報告である。また、肝細胞癌におけるサイクリン依存性キナーゼのインヒビターについても検討した。約半数の肝細胞癌においてサイクリン依存性キナーゼ4あるいはサイクリン依存性キナーゼ6の特異的インヒビターであるp18^<INK4C>の発現が消失しており、分化度が低くなるにつれその消失率が高くなり、p18^<INK4C>の消失した肝細胞癌は、予後不良であることも報告した(Hepatology;40:677-686,2004)。これにより、p18^<INK4C>の発現は、予後因子としての診断マーカーになりうることが示唆された。二次元電気泳動を用いたプロテオソーム解析より、肝癌の動物モデルであるLECラットおいて、癌化に伴い増強する候補蛋白の一つとして、アダプター分子の一つであるsrc homology and collagen (Shc)を見いだした。さらに、LECラットの2ヶ月の正常肝、6ヶ月の慢性肝炎と比べ12ヶ月の肝癌において、Shcのアイソフォームのうちp46Shcとp52Shcのタンパク質レベルが増強することをWestern blot法により確認した。またp46Shcは、免疫染色法により、癌細胞の核に特異的に強発現していることがわかった。一方ヒトにおいても正常肝、慢性肝炎、肝硬変、肝癌におけるShcの発現を検討したところ、悪性化に伴い、p46Shcとp52Shcのタンパク質レベルが増強し、さらにチロシンリン酸化も亢進していることがわかった。免疫染色法により、癌細胞においては、Shcが核に強く染色され、それが、p46Shcであることも示すことができた。また肝癌細胞においてもp46Shcとp52Shcは強くチロシンリン酸化を受けていた。肝癌細胞の核に存在しているp46Shcは、高分化肝癌に較べ未分化肝癌において、より増強していた。さらに核に存在しているp46Shcは、肝癌患者の、予後因子のマーカーになり得ることが明らかとなった。現在、肝癌細胞において、核に存在しているp46Shcが、どんなタンパク質と結合しているかをプロテインアレイを用いて、検索中である。これにより、G1からS期に働く細胞周期のうち、特にサイクリン依存性キナーゼ4の阻害が、肝癌の進展阻止につながり、新薬の一つの標的分子になる可能性が示唆された.

この報告は、肝癌進展過程における網羅的細胞周期分子解析を行った初めての報告である。また、肝細胞癌におけるサイクリン依存性キナーゼのインヒビターについても検討した。約半数の肝細胞癌においてサイクリン依存性キナーゼ4あるいはサイクリン依存性キナーゼ6の特異的インヒビターであるp18^<INK4C>の発現が消失しており、分化度が低くなるにつれその消失率が高くなり、p18^<INK4C>の消失した肝細胞癌は、予後不良であることも報告した(Hepatology;40:677-686,2004)。これにより、p18^<INK4C>の発現は、予後因子としての診断マーカーになりうることが示唆された。
不活性メチル、メチレン及びメチル基の微生物酸化

植物ホルモンの一つであるアブシジン酸(ABA)は、環境ストレスに対応するホルモンとして、その生合成遺伝子、調節機構の解明が焦点となっている。しかし、この研究のために基質となるABA生合成前駆体キサントキシン(XAN)が必要であるので、前年度に引き続き微生物酸化を用いるXAN酸の調製法について研究した。容易に調製できる原料の(±)-エポキシ-β-イオニリデン酢酸を微生物酸化すると得られるXAN酸類の立体異性体比をキラルカラムを用いたHPLC分析により解析した。さらに、各々の立体異性体を同定するために4-オキソ-β-シクロゲラニオールのエチレンアセタール体をSharplessの不斉エポキシ化反応により調製した光学活性アルコールから6段階の反応をへて光学活性XAN酸メチルを合成し、微生物酸化により製造されたXAN酸メチル類と比較、同定した。その結果、Cercospora cruenta菌は原料基質の4'位を非選択的に水酸化し4種の立体異性体混合物を生成したが、Cunninghamella echinulata菌は原料基質の4'位を選択的に酸化して天然型XAN酸とそのエナンチオマーを与え、その生成比は培養条件(時間)によって異なることを明らかにした。さらに、ツユクサを用いた気孔開閉試験により天然型XAN酸は生物活性を示すが、その対掌体は活性を示さないことを明らかにした。1)最近の植物ホルモン、アブシジン酸に関する研究は、遺伝子、酵素レベルでの生合成機構の開明が焦点となっている。これらの研究の発展のためには、植物におけるアブシジン酸生合成中間体キサントキシンの基質の供給が強く望まれている。キサントキシンの有機合成法が開発されているが、実用性に乏しいので、微生物酸化を用いる簡便な効率的な製造方法を開発することを本研究の一つの目標とした。まず、容易に調製できる(±)-エポキシ-β-イオニリデン酢酸の化学的に不活性な4'-位メチレン基を微生物を用いて水酸化することを検討した。Cercospora cruenta菌体の懸濁液に基質のNa塩を加えて代謝させた。代謝物をメチルエステルとして分離した後、キラル・カラムを用いたHPLC分析に供し生成物を調べたところ、光学純度は高く無いが目標とする4'-位が水酸化された光学活性キサントキシン酸とそのエピー体が取れた。さらに効率的な微生物をスクリーニングするため種々の微生物を用いて変換反応を調べた。その結果、Aspergillus niger菌は基質のエポキシ環を開きジオール体を与えたが、Absidia coerulea菌は3'-位と5'-位水酸化物を与えた。Cunninghamella echinulata菌は目標とする高い光学純度のキサントキシン酸とそのエピー体を3:1の比で与えた。2)イチイ針葉からメタノール抽出によりタキシニンを単離し、セミカルバジドを用いる5'-位の脱シンナミル化により微生物酸化の基質タキシニンAを効率的に調製する方法を確立した。
誘電体球結晶でのフォトニック・バンド効果の実験的・理論的研究

本研究の目的は、球状の誘電体微粒子が規則的に配列した系について、その光学的性質(吸収、反射、発光)に影響を及ぼしていると予想されるフォトニックバンド効果を、実験的に検出するとともに、その結果を理論的計算に基づくフォトニック・バンド・モデルによって解析し、光の波長程度の周期的構造を有する誘電体媒質に固有のフォトニックバンド効果に関する基礎的知見を得ることである。本年度の研究において得られた主要な成果の概要は、以下のごとくである。[1]粒径のよくそろった球状高分子の微粒子(ラテックス)を原料として、種々な粒径(5.00.1μm)のラテックス粒子がガラス、あるいは金属表面に広範囲にわたって規則的に配列している薄膜を作製できた。[2]上記の方法によって作製したラテックス薄膜を走査型原子間力顕微鏡、レーザーによるブラッグ回折法、走査型近接場顕微鏡、光反射スペクトル測定など、多様な実験法によって詳しく解析し、その構造評価を行うとともに、規則的に接触している球形微粒子の間での電磁波の伝搬特性に関する実験データーを得た。特に、数%の濃度の蛍光性粒子を同じ粒径の母体結晶の中に添加した薄膜で、蛍光の励起強度の空間的分布を走査型近接場顕微鏡により詳しく測定することにより、2次元的フォトニックバンド効果の存在を確認することができた。[3]球面波展開法により高次散乱・干渉効果を取り入れた理論的方法により、ラテックス薄膜結晶での2次元的フォトニック・バンドを定量的計算により求め、上記の実験結果を理論的に解析することができた。
バクテリアのリジンアセチル化と翻訳制御に関する研究

枯草菌由来の翻訳伸長因子EFTuを対象に、翻訳制御におけるアシル化修飾の役割を明らかにすることを目的とした。安定同位体を用いたプロテオミクス解析により、EFTuのアセチル化及びスクシニル化修飾が培地条件や培養フェーズによって大きく変動することを見いだした。EFTuのアセチル化及びスクシニル化修飾部位をMS解析により同定し、その機能を変異体を用いて明らかにした。EFTuのスクシニル化修飾による翻訳制御の可能性が示唆された。タンパク質のリジンアセチル化は、バクテリアからヒトまで進化的に保存された翻訳後修飾として近年注目されている。バクテリアにおけるリジンアセチル化の役割として代謝酵素の活性調節、走化性、ストレス応答との関連が知られているが、翻訳制御における役割についてはまだ報告がない。本研究では、翻訳伸長因子EFTuを中心に翻訳制御におけるリジンアセチル化の意義を明らかにすることを目指している。前年度までに、枯草菌の主要なアセチル化タンパク質としてEFTuを同定し、枯草菌EFTuはアセチル化だけでなくスクシニル化修飾も受け、それらの修飾レベルが培地条件や培養フェーズによって大きく変動することを明らかにしている。本年度は、EFTuの修飾部位の同定と詳細解析を中心に行った。SILACを用いたアセチローム/スクシニローム解析により、MMグルコース条件とMMクエン酸条件におけるアセチル化とスクシニル化修飾の変動を網羅的に調べた。その結果、EFTuを初めとする翻訳関連因子やリボソームタンパク質のアセチル化/スクシニル化修飾レベルは培地条件によって変動しており、およその傾向として、グルコース条件でアセチル化が多く、クエン酸条件でスクシニル化が多い傾向が見られた。EFTuについて、GTPase活性を担うGドメインやtRNAとの相互作用ドメインにアセチル化およびスクシニル化修飾が見いだされ、各修飾部位は特徴的な変動パターンを示すことが明らかとなった。EFTuは必須タンパク質であるため、変異解析を行うにはコンディショナルな条件での評価系を構築する必要があり、そのような株を構築した。各修飾部位の単独変異体を作成して37°C、LB培地条件での生育を評価したが、これまでのところ顕著な表現型を示す変異体は見つかっていない。今後は多重変異体を作成して、37°Cでの生育のほか温度感受性や胞子形成についても調べていく予定である。リジンアセチル化は、バクテリアからヒトまで進化的に保存された翻訳後修飾として近年注目されている。バクテリアにおけるリジンアセチル化の役割として、代謝酵素の活性調節、走化性、ストレス応答との関連が知られているが、翻訳制御との関連は知られていない。本研究では、翻訳伸長因子EF-Tuを中心に翻訳制御におけるリジンアセチルの意義を明らかにすることを目指す。最近、スクシニル化を初めとする短鎖アシル化修飾の存在が見いだされている。クエン酸回路から生じるスクシニルCoAを基質とするスクシニル化は、アセチル化と並んで栄養や代謝に応答したタンパク質の機能調節に重要な関わりを持つ可能性が考えられる。そこで、スクシニルリジン抗体の作成に着手した。スクシニル化したBSAを抗原としてウサギに免疫し得られた抗体は、未処理のBSAには反応せず、スクシニルBSA特異的に反応することを確認した。これを用いて様々な培地条件によるEF-Tuのスクシニル化の検出を試みた。これまでに、EF-TuはLやMMグルコース培養の対数期で強くアセチル化されるが、MMコハク酸やMMクエン酸培地ではアセチル化が起こらないことを見いだしている。後者の培地条件では、アセチル化の代わりにスクシニル化が起こっていることがウェスタン解析結果から示唆された。また、培養フェーズにおけるアシル化修飾の変化についても検討した。上述のとおり、L培養の対数期ではEF-Tuのアセチル化が強く起こるが、定常期に入るとすみやかに脱アセチル化される。その後、スクシニル化が誘導されることがウェスタン解析から示唆された。以上のことから、EF-Tuの翻訳後修飾は、培地条件や培養フェーズによって複数のアシル化修飾が入れ替わることが示唆された。現在、スクシニル化部位の同定を進めている。アセチル化に代表されるタンパク質のアシル化修飾は、バクテリアからヒトまで進化的に保存された翻訳後修飾として近年注目されている。バクテリアにおけるアセチル化の役割として代謝酵素の調節、走化性、ストレス応答との関連が知られているが、翻訳制御における役割についてはまだ報告がない。本研究では、翻訳伸長因子EFTuを中心に翻訳制御におけるアシル化修飾の意義を明らかにすることを目的とした。前年度までに、枯草菌由来EFTuはアセチル化だけでなくスクシニル化修飾も受けており、それらの修飾レベルが培地条件や培養フェーズによって大きく変動することを明らかにした。また、EFTuにおけるアセチル化及びスクシニル化部位をMS解析により同定した。今年度は、tRNAとの相互作用ドメインに位置するスクシニル化部位に着目して、その機能解析を行った。

該当するリジン残基に対し、グルタミン酸置換(スクシニル化模倣)またはアルギニン置換(非修飾模倣)を導入した変異株を作成した。変異の影響をより自然な形で評価するために、変異導入はゲノム上のオリジナル位置に対して行った。増殖に対する影響を評価したところ、スクシニル化模倣変異体はLB及びグルコース最少培地で増殖の低下を示した一方で、非修飾模倣変異体では影響は認められなかった。次に、変異株より粗リボソーム画分を調製し、in vitroで翻訳活性を測定した。その結果、スクシニル化模倣変異体では野生型や非修飾模倣変異体と比較して30%まで翻訳活性が低下していた。以上の結果から、EFTuのtRNA相互作用ドメイン内のスクシニル化部位は、スクシニル化修飾を受けることにより翻訳活性が負に制御されることを明らかにした。応用微生物学EFTuのアセチル化/スクシニル化修飾部位の同定に成功し、培地条件での変動を明らかにすることができた。EFTu変異解析のための評価系の構築に成功したので、今後残りの単独変異体や多重変異体を作成して、解析を進めていく。24年度計画では、EF-Tuアセチル化部位の変異体作成と表現型解析を予定していた。これまでに同定しているアセチル化部位について複数の変異体を作成し、ウェスタン解析でアセチル化レベルを評価したが、主要なアセチル化部位を同定できておらず、表現型解析まで達成できていない。EF-Tuに付加したアフィニティータグの影響も考えられ、タグの変更を含めて再検討する。一方、EF-Tuにスクシニル化修飾が起こっているという新たな知見を得ることができた。これまでに単独変異株で表現型が見られていないので、多重変異株を構築して表現型を調べていく。同時に、各種培地条件、高温・低温での温度感受性、胞子形成など幅広い条件で調べる必要がある。スクシニル化修飾の部位の同定を含め、EF-Tuの変異解析を早急に進める。EF-Tuのアシル化制御を解明するために、アセチル化/スクシニル化酵素の同定を進める。該当なし