hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海事英語運用能力測定試験の開発

船舶を運行する航海士・機関士には、「世界共通語」である英語の的確な運用が必要不可欠である。本研究は、STCW条約の求める、船舶職員の海事英語能力を検定する試験制度の確立を目指すべく、(1)この職種を希望する者の英語運用能力を測定する試験に必要な海事英語資料の収集・分析を行い、(2)それに基づいた海事英語能力の測定試験を作成することを目的とした。フォーマットはTOEICの出題形式(ListeningとReadingの2セクションから成る)を踏襲し、コンテンツは甲板部・機関部業務に必要な内容で主にSTCW条約の海事英語を元にして作成することとした。問題に含めるべき文法・語彙・文章の難易度については英語を専門とする研究筆頭者および分担者2人が決定、し、海事を専門とする分担者1人の知識および海外の海事専門家への聞き取り・海事関係の書籍などを通して、具体的な問題を作った。プロトタイプを1セット作成した段階で本学学生の協力の下、試験を課してみた。その結果、Listening50問・Reading50問が適量であると判断。甲板部のための問題4セット(DeckA-D)200問、機関部のための問題4セット(EngineA-D)200問、合計400問を完成させた。さらに、問題の妥当性を確かめるため海外の海事専門家にアドバイスを求めて、必要な手直しを加えた。その上で、海外の海事教育機関の求めに応じ、問題の配布を行い、データ収集を行った。本研究で作成された問題は、最終年度末までの段階で、学生の海事英語学習の習熟度を測定するものさしの一つとして活用できるレベルに仕上がっている。今後は、違うセットを同じ被験者に課したり、海外の海事教育機関からのデータ分析を行ったりすることを通して、より完成度の高いものに仕上げていきたいと考えている。本研究では、STCW条約が求める、船舶を運行する航海士・機関士の英語運用能力を測定する試験制度の確立を目指している。今年度は、測定に必要なコンテンツについて、海事英語の多様性を鑑みて言語学的に取捨選択を行い(海事関係参考文献の分析);併せて、英語圏の船舶業務経験者の助言を受けた(高木がカリフォルニア海事大学にてCaptain J.M.Kleeverより)。これらの情報を基に、プロトタイプの問題を1セット、作成した。研究の具体的内容・成果1試験で測定する項目について:・船舶運行全般(港湾関係者・他船舶との無線交信、船舶内での運行に関わるやり取りなど)に必要な語彙力・会話能力・船舶運行および船舶内での生活を円滑に行うために必要な語彙力・会話能力・海路図誌、気象・海象図、法規、運行に必要な書類など、書かれた文章の読解力・理解力2測定試験のフォーマット:・Listening:写真描写問題(30問);質疑応答問題(30問);会話の内容理解問題(40問)・Reading:前後の文脈に合った単語・句を選ぶ(30問);Sailing Directionsの内容理解(30問);海事英語関係の文章の内容理解(40問)3問題作成にあたっては、極力、船舶運航に関する知識ではなく、「英語力」測定のための問題を作るよう留意した。4作成された英語問題は、来年度前学期に開講される航海英語IIの受講者を対象に試験運用する予定。その有効性・妥当性について検証を行い、次年度の研究へとつなげていく。
画像処理問題に於けるFracturePropagationの解析

特性関数項を含むエネルギー汎関数の定常、時間発展のそれぞれの問題について、特異項を滑らかな関数によって近似することによって考えられる変分収束近似理論を用いていくつかの性質を導きました。特性関数項には滑らかさおよび凸性がないため、直接既存の変分法的手法が使えません。そこで本研究のメインの手法として考えたのが、変文収束近似法の適用です。この手法は、特性関数項を滑らかな関数によって近似し、いったん第1変分(Euler-Lagrange方程式)での評価を導出し、それに基づいて目的のエネルギー汎関数の最小化関数の正則性を調べようという方法です。この方法はしかしながら近似指数を上げるにつれ、特異性が増すため、近似したエネルギー汎関数に対する評価は近似指数に関して「一様」でなければなりません。そのため、いくつかの工夫が必要になってきます。主要結果として、自由境界付近での近似最小化関数のグラフの非退化性を証明しました。また特性関数項の近似と空間変数の離散化との併用によりエネルギー勾配流の構成を1次元の場合に行いました。さらに時間変数の離散化との併用により一様連続性をもつMinimizingmovementの構成に成功しました。主に、以下の三項目について研究を進めました:[1]DeGiorgi-Ambrosioによって導入された画像処理問題の汎関数に対する時間発展の研究はGobbino, Chambolle-Doveriによる結果が知られていますが,このいずれも,Fractureの時間発展に伴う運動法則については未解決です.これに対して,当研究ではDeGiorgi提唱による,Fractureからの距離関数を含む時間差分近似項,を付加した形のエネルギー汎関数を基としたMinimizing movement methodにより,Gradient Flowを構成することに取り組みました.距離関数のためFractureの運動法則が計算できる反面,Minimizing movement methodの一般論を適用することができず,それを解決するのがこの研究の現在の目標です.このためには,いかなる「距離」を導入するか,が鍵を握ることになりますが,その候補を得るに至たりました.[2]自由境界汎関数が含む特異性をもつ特性関数項を,滑らかな関数を用いてGamma-収束近似し,区分的定数関数によって解を近似する方法によってGradient Flowを得ようとする試みです.この方法での解の構成に成功し,空間方向にはほとんどすべての時間でのリプシッツ連続性,時間方向には有界変動性といった正則性を導出することに成功しました.この結果は論文として出版予定です.[3]これまで,自由境界汎関数を直接用いた,空間一様有界微分をもつMinimizing movement法によるGradient Flowの構成は知られていません.現在のところ,空間方向微分が一様な「Discrete minizing movement」に成功しました.現在時間方向の一様評価の導出の研究に取り組んでおります.次の2項目について研究を進めました:[1]自由境界問題に対する特異項の近似[2]自由境界問題に対する時間発展解の構成[1]ここで扱う自由境界問題とは、1980年にAltとCaffarelliによって定式化されたエネルギー汎関数を基とする変分問題を意味します。その汎関数の特徴は、Frechet微分不可能な特性関数項をふくむことです。この特異項のため、エネルギー最小化関数は領域内部に自由境界をもった状態で安定します。さて、このエネルギー汎関数は、上記の意味で正則ではない、また凸ではない、という理由から対応する時間発展解を構成するために、よく知られたBrezisらを中心に構築されたmonotone operatorに対する時間発展解の構成方法を直接適用することは不可能です。そこで考えられるのが、特性関数項を何らかの意味で近似して、その上で既存の理論を適用する手法です。時間発展解のうちでも特に「変分流」(gradientf flow)の構成をめざしており、これに適した特性関数項の近似としてDeGiorgiを中心とするイタリア学派によって構築されたGamma収束の理論を適用する方向で研究を進めました。その結果、自由境界問題に特徴的な「非退化性」を弱い意味で保つ近似の方法について論文の形にまとめることができました。この手法は数値計算の基礎的理論としても意味を持つことが期待されるため、研究費(海外旅費)を用いて、ベルギーのルーベンKatholieke Universiteitにて2006年7月に開催されたInternational Congress of Computational and Applied Mathematicsに於いて口頭発表いたしました。

[2]空間変数の区分的定数化と特性関数のGamma収束近似を同時に用いることによるGradient Flowの弱解の構成と、DeGiorgiによって考案されたMinimizing movement methodと特性関数のGamm収束近似を同時に用いることによるGeneralized Minimizing movement methodの構成の2つの方向で研究を進めました。前者については、Radon測度を含む弱い意味での方程式の構成までを論文の形にまとめ,Med.J.Mにて出版予定になっております。後者については、空間次元が1の場合に限り、Generalized Minimizing movement methodの構成までは完成しました。こうして得られる解は、Gradient Flowとして意味を持ちますが、空間全体を領域とする、いわばNeumann条件下で考えているため、Caffarelli Vazquezらによる近似解の極限関数との差異が明確ではありません。しかし、少なくともこの手法を有界領域のDirichlet条件下で適用すれば,Gradient Flowに特化した手法として意味を持つものと期待できます。現在その方向での意味づけの研究を行っております。研究課題である画像処理問題に於けるFracture Propagationの解析を行うため、準備段階としてこれまで研究対象としてきたもうひとつのFractureを生じる変分問題である自由境界問題をテーマとして、以下に述べる主に次の二つのことについて論文にまとめました:[1]エネルギー汎関数のガンマ収束に伴う自由境界の収束性[1]エネルギー汎関数がガンマ収束するとき、近似エネルギー汎関数の最小化関数に対するFracture(この場合自由境界)がどのような意味で被エネルギー汎関数の最小化関数のFractureに収束するかについて調べました。そもそもエネルギー汎関数がガンマ収束する際に、Fractureの収束性については一般的結果は知られておりません。そればかりか、近似汎関数の形にある工夫を施さないと、「近似」と呼べるような収束性を持たないことも、1次元問題の場合に精密に計算しました。この論文の結果によりエネルギー汎関数の特に特異関数項の近似として特異性の高い関数を選ぶことによって、調べたいFractureの存在と非存在についての十分条件が得られることがわかりました。本結果は定常状態でのFractureの解析という位置づけになりますが,研究課題にもある「Fracture Propagation」の解析を,当手法に加えて時間変数の差分化を合成した手法によって試みる際に、Fractureの解析に役立つものと期待されます。
自由電子レーザーによるLIPSS発現の研究

大阪大学産業科学研究所附属の量子ビーム科学研究施設にある遠赤外・テラヘルツ領域の自由電子レーザー(THz-FEL)および京都大学エネルギー理工学研究所にある中赤外領域のFELを用いて、半導体Siウエハ上に波長未満の微細構造であるレーザー励起周期表面構造(LIPSS: Laser Induced Periodic Surface Structure)の形成に関する研究をおこなった。パルス構造が異なるため単純には比較できないが、中赤外FELでは非線形応答と不可逆的破壊までの領域が非常に狭く、安定したLIPSS形成は観測されず、赤外線の波長に大きく依存する結果となった。今後、FEL運転モードを変更することでさらなる詳しい研究をおこなう予定である。THz-FELでは高速な検出器とオシロスコープを導入することでマクロパルスに含まれるミクロパルスごとの非線形吸収応答を分離できるようになり、LIPSS形成に関する時間応答が観測可能となった。同時に小型の赤外分光システムを構築し、照射条件下での分光特性の変化を観測できるようになった。今後、LIPSS形成過程を時間分解で観測することが可能となった。微視的な情報としては、顕微ラマン分光測定により、LIPSS形成に伴い結晶格子間隔が増大することを明らかにした。今後、光電子分光やESRにより、結晶構造に関する微視的な変化を詳細に調べる予定である。以上の結果を国内学会(日本物理学会、放射光学会、FEL研究会)、国際会議(主に招待講演)(ICSM2018, LEES2018, Superstripes2018, IRMMW-THz2018)で口頭発表した。大阪大学産業科学研究所附属の量子ビーム科学研究施設にある遠赤外・テラヘルツ領域の自由電子レーザー(THz-FEL)を用いて、半導体Siウエハ上に波長未満の微細構造であるレーザー励起周期表面構造(LIPSS: Laser Induced Periodic Surface Structure)の形成をおこなった。従来の近赤外領域(NIR)のレーザーで見られるLIPSSに比べ、THz-FELではLIPSS間隔が約1桁小さい波長比を示し、NIRレーザーで提案されてきたLIPSS発現機構が適用不可能であることが分かった。これにより新しい発現機構の構築が必要となった。LIPSS間隔とレーザーの様々なパラメータの間にどのような関係性があるのか詳しく調べるために、THz-FELの波長、強度、パルス数を系統的に変化させてSi表面に照射し、LIPSS間隔のパルス数依存性に自己組織化臨界現象で見られるスケール則が成り立っていることを発見した。これらの結果より、レーザー波長によらないユニバーサルなLIPSS発現機構の発見につながることが期待できる。以上を国内学会(日本物理学会、放射光学会、FEL研究会、他)、国際会議・セミナー(WIRMS2017, superstripes2017, Seminarlndustriali2018, etc)で発表するとともに(招待講演含む)原著論文として出版した[1]。THz-FELによるSi基板表面に形成されたLIPSSについて実験考察をおこない、第1報として原著論文の形でまとめた。国内学会および招待講演を含む国際会議での講演をおこなった。スケーリング則からLIPSS形成のメカニズムとして非線形領域での自己組織化臨界現象の可能性を示し、レーザー波長によらないLIPSS間隔の法則性を調べる必要性を提言した。LIPSS形成されたSi表面の破断面の観測や結晶性の変化など微視的状態を観測する。様々な物質に対する実験、および中赤外(MIR)FELなどの波長の異なる光源による実験をおこなう。LIPSS形成過程につて考察をおこなう。日イタリア科学技術協力エグゼキュティブ・プログラム(EP)により、行われた。当初予定していた調達物品よりも高性能なもの(高速応答、高時間分解能)を新たに計画していることと、これにより実験精度の向上が見込めるため、予備実験をおこなっていることにより最終的な調達に遅れが生じていることが理由である。
自己抗体が認識するDNA末端結合蛋白の生理活性と膠原病における病因的意義

強皮症-多発性筋炎重複症候群に特異的に出現する抗Ku抗体の対応抗原であるDNA末端結合蛋白(Ku抗原;p70/p80)の生理活性を追及し,膠原病における病因的意義を検討するために,1)Ku抗原エピトープの遺伝子構造および遺伝子多型,2)Ku抗原が結合するDNAの構造,3)Ku抗原とDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)との関連,について解明することを目的とした。1)Ku抗原のC末端抗原エピトープに相当するゲノムDNA領域(p70のアミノ酸545-609,p80のアミノ酸696-732)の構造を,PCR-SSCP法によって検討した。膠原病患者の自己抗原エピトープ構造は健常人と差がなかったが,色素性乾皮症と健常人の各1例は他と異なるp70遺伝子構造を示した。またp70は少なくとも2種類の遺伝子にコードされると考えられ,Ku抗原を規定する遺伝子ファミリーの存在が示唆された。2)抗ku抗体とHeLa細胞抽出物が形成した免疫複合体中のDNAをサブクローニングして,塩基配列を決定した。30個のDNAクローン(平均鎖長196bp)にはオクタマ-配列類似の配列[ATTT(G/T)(C/T)(A/T)T]が延べ37回,およびトランスフェリン受容体調節領域に見られる塩基配列[GAAGTNA(C/G)]が延べ18回認められた。このことは,Ku抗原がDNA末端のみならず,特定の塩基配列を認識して結合する可能性を示唆した。3)^<35>Sメチニオン標識HeLa細胞を抗Ku抗体で免疫沈降すると,Ku蛋白に加え350kD蛋白を同時に沈降した。この蛋白はDNA-PK(p350)に対する家兎免疫血清で認識され,DNA-PKの触媒サブユニットp350自身であることが確認された。Ku蛋白とp350の結合にはDNAが必要で,0.5M Naclで可逆的に解離した。DNA-PKの酵素活性にはKu蛋白とDNAの存在が必須であった。以上の結果はKu抗原がp350とともにDNA-PKホロ酵素を形成し,Ku抗原はDNA-PKの活性化サブユニットとして働く可能性を示唆した。【目的】我々は昨年度までに,膠原病患者に見いだされる抗Ku抗体が認識するDNA末端結合蛋白(Ku抗原)の80kDaサブユニット(p80)を規定する遺伝子に多型性があり,ある種の疾患と相関することを報告してきた.そこで本年度はKu抗原遺伝子のエピトープ領域の遺伝子構造および遺伝子多型を検討することを目的とした.【結果】1)p70およびp80のC末端エピトープ領域に相当する遺伝子は,PCR-SSCP法では1例を除き,健常人および膠原病患者ともに同一の電気泳動度を示し,塩基配列およびアミノ酸配列はすべて等しいものと考えられた.興味深いことに,色素性乾皮症の1例から得られたp70遺伝子のPCR産物は,他と異なる移動度を示した.2)PCR産物の塩基配列は,対象の6例間で有意の違いは認められなかった.

しかし,p70をコードする2種類のDNAが対象のそれぞれから得られ,1つは既に報告されたp70の塩基配列と完全に一到したが,他方は数ヵ所の塩基が置換され,それに相当するアミノ酸配列に違いが認められた.【結論】1)膠原病患者の自己抗原エピトープアミノ酸配列は健常人と差がなかった.2)p70は少なくとも2種類の遺伝子にコードされると考えられ,Ku抗原を規定する遺伝子ファミリーの存在が示唆された.強皮症-多発性筋炎重複症候群患者に見いだされる抗Ku抗体の対応抗原(Ku抗原)は70kD/80kDのヘテロ蛋白二量体から構成される二重鎖DNA末端結合蛋白であるが,これまでその生物学的機能は不明であった。本年度は,Ku抗原の生物活性を追求した。1)Ku蛋白結合DNAの分析:プロテインAセファロース粒子上に抗Ku抗体とHeLa細胞抽出物が反応して形成された免疫複合体中のDNAをフェノール抽出し、M13ベクターにサブクローニングして,その塩基配列を決定した。30個のクローン(平均鎖長200bp)を同定したところ,遺伝子データバンクに登録されたDNAとの相同性は認められなかった。しかし,これらのDNAにはオクタマー配列類似の配列(ATTTG/T C/T A/T T)が延べ25回,トランスフェリン受容体プロモーターなどに見られる塩基配列(G/A GAAGTNA C/G)が延べ10回認められた。このことは,Ku抗原がDNA末端のみならず,特定の塩基配列を認識してDNAに結合する可能性が示唆された。2)DNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)とKu抗原の関連:35〓Sメチオニン標識HeLa細胞を、生理的塩濃度(0.15M NaCl)で免疫沈降すると,Ku蛋白のみならず,350kDの大分子量蛋白を同時に沈降した。この蛋白はDNA-PK(p350)に対する家兎免疫血清で認識されることから,DNA-PKの触媒サブユニットp350自身であることが確認された。このKu蛋白とp350の結合にはDNAが必要で,0.5M NaClでは可逆的に解離した。DNA-PK基質であるGAL4-CTD融合蛋白のin vitroリン酸化反応は抗Ku抗体の存在によって特異的に阻害された。以上の結果は,Ku抗原がp350とともにDNA-PKホロ酵素を形成し,Ku抗原はDNA-PKの活性化サブユニットとして働く可能性を示唆した。【目的】抗Ku抗体は強皮症-多発性筋炎重複症候群患者に特異的に見いだされる自己抗体である。その対応抗原(Ku抗原)は70kD/80kDのヘテロ蛋白二量体で,2本鎖DNA末端に結合することを明らかにしてきたが,その生物学的機能については不明であった。近年,Ku抗原がDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の活性調節因子である可能性が報告され,さらにはKu抗原がDNAの修復や組換えに関与する可能性も報告されている。本年度は,Ku抗原の生物活性を追求するために,DNA-PKとKu抗原の関連性について検討した。【方法】1)HeLa細胞を^<35>Sメチオニンで標識し,その抽出物を抗Ku抗体結合プロテインAセファロース粒子と種々の塩濃度下で反応させ,免疫沈降物をSDS-PAGE分画後,オートラジオグラフィで検出した。2)精製DNA-PKとその基質(GAL4-CTD融合蛋白)をDNAおよび精製Ku抗原存在下で反応させ,in vitroリン酸化反応を検討した。ここに抗Ku抗体陽性患者血清を加えてDNA-PKの酵素活性への影響を検討した。【結果】
ES細胞およびマウスにおけるAID技術の確立

マウスES細胞への導入に当たっては、まずユビキチンリガーゼOsTIR1を導入する必要がある。そのためのベクターを作成し、E14TG2a細胞のROSA26部位にOsTIR1の導入を行った。他のマウスES細胞株にいても同様の研究を進めており、そちらの方はOsTIR1の導入後、複数の因子にデグロンタグを付加することにも成功した。マウス個体への導入にあたっては、複数のIAAアナログを合成し、IAAと同等の分解誘導活性を持つアナログを複数同定した。本研究費受給者は、ヒト培養細胞においてオーキシンデグロン技術を確立した。この方法は、オーキシンの添加により標的とする因子を特異的に、30分程度で分解することを可能とした。本研究の目的はこの技術をマウスES細胞に導入し、さらにはマウス個体への応用を目指すことである。細胞にこのシステムを導入するためには、OsTIRというユビキチンリガーゼの導入と対象とする因子にデグロンタグを導入する二段階の遺伝学的改変が必要である。H28年度はマウスES細胞のROSA26領域にOsTIR1を導入するためのドナーおよびCRISPRプラスミドを作成した。さらにエディンバラ大学のVoigt Philippと共同でマウスES細胞株E14TF2aに導入し、安定発現株を樹立した。今後は、内在性MCM2をターゲットにデグロンタグの導入を進める。また、マウスへのオーキシン投与を検討するため、ヌードマウスにすでに作成したHCT116バックグラウンドのオーキシンデグロン株(MCM2株)のゼノグラフト実験を準備開始した。H28年度は研究論文作成に時間がかかり、実際のタグ導入まで到達できなかった。しかしながら、今後の研究に必要な準備実験はほぼ予定通り遂行することができた。今後は樹立したOsTIR1発現mES細胞を材料に、CRISPRによる実際のタグ導入を行い、当初提案の研究を遂行する。本研究費受給者は、ヒト培養細胞においてタンパク質レベルで分解速度を変化させることにより発現調節を行う、オーキシンデグロン技術を確立した。オーキシンデグロンタグを導入したタンパク質は、植物ホルモンオーキシンを添加することにより、半減期30分以下で分解除去される。本研究の目的は、この技術をマウスES細胞およびマウスに導入する技術を確立することである。マウスES細胞への導入に当たっては、スタンダードなE14TG2aを材料とし、研究室への培養技術の導入を行った。オーキシンデグロンを確立するにあたり、まずユビキチンリガーゼOsTIR1を導入する必要がある。そのためのベクターを作成し、ROSA26部位にOsTIR1の導入を行っている。また、共同研究により他のマウスES細胞株にいても同様の研究を進めており、そちらの方はOsTIR1の導入後、複数の因子にデグロンタグを付加することにも成功した。現在、オーキシン添加による分解の確認を行っている。マウス個体への導入にあたっては、一番の懸念材料は天然オーキシンインドール酢酸(IAA)の腎毒性であった。この問題を回避するため、複数のIAAアナログを合成し、IAAと同等の分解誘導活性を持つアナログを複数同定した。現在、マウスに投与して毒性試験を行っている。また、ゼノグラフト実験を行うために、マウスに細胞を注射して腫瘍形成実験を進行中である。今後は、オーキシンデグロンで増殖必須遺伝子を改変した細胞で腫瘍形成時を行い、オーキシンアナログを注射することで、腫瘍形成阻害が可能かどうかを試験する。提案研究をそのまま遂行できると予想している。まずは樹立したOsTIR1株にタグを導入して、MCM2に対するデグロン株を樹立することを目指したい。さらに同時並行で、マウスへのオーキシン投与実験を行う。マウスに関しては、マウス実験のノウハウを持つ共同研究者と研究を行う。細胞工学研究実績の進歩状況で説明した通り、多少当初の計画より研究が遅れているため、実際の使用予算額が多少少なかった。本年度は前年度の遅れを取り戻しつつ、予定通りの研究を行う。
ミトコンドリア機能異常によるがん形成・細胞増殖機構解析

1.ミトコンドリアセプチンによる傷害ミトコンドリアの認識機構の解析培養細胞に紫外線を照射して、ミトコンドリアの機能低下とミトコンドリアセプチンのミトコンドリア移行との相関性を調べた結果、トコンドリアセプチンは破壊され、ユビキチン化したミトコンドリアに特異的に集積していることが示された。さらに、ミトコンドリアセプチンが傷害ミトコンドリアのcompartment(仕切り)に関与していることが示唆された。セプチンファミリーの共通の役割が明らかになるかもしれない。2.ミトコンドリアセプチンによる酸化誘導機構の解析ミトコンドリアセプチンとペルオキシソーム、リソソームとの関係について共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析した結果、ミトコンドリアセプチンがリソソームと共局在していることが示された。ペルオキシソームとの関係についても解析してみたが、共局在は認められなかった。3.ミトコンドリアセプチンによるユビキチン化誘導機構の解析ミトコンドリアセプチン封入体はC末端に位置するコイルドコイル領域を介して封入体のユビキチン化を誘導する。私たちはミトコンドリアに特異的に局在するユビキチンリガーゼMITOLがこのユビキチン化を触媒しているのではないかと考え、解析したところ、MITOLは関与していない可能性が示された。他のユビキチンリガーゼが関与していることが推測される。4. MITOLの生理的基質の探索MITOLの結合分子を酵母のツーハイブリッド法を用いて検索した。その結果、興味深いタンパク質がいくつか同定された。今後、それらの会合の生理的意義について解析したい。さらに、理研との共同研究により、MITOL欠損マウスをCre-LoxPによるconditional targetingにより作製した。今後、様々な角度から表現系を詳細に解析したい。1.ミトコンドリアセプチンによる傷害ミトコンドリアの認識機構の解析培養細胞に紫外線を照射して、ミトコンドリアの機能低下とミトコンドリアセプチンのミトコンドリア移行との相関性を調べた結果、ミトコンドリアセプチンは破壊され、ユビキチン化したミトコンドリアに特異的に集積していることが示された。さらに、理研との共同研究により、MITOL欠損マウスをCre-LoxPによるcondltional targetlngにより作製した。
法整備支援を通じた制度改革による国家のガバナンス向上に関する開発法学的研究

本研究では,(1)国家のガバナンスのあり方が,市場・企業のガバナンスおよび市民社会のガバナンスの問題と密接に関連していること,(2)国家ガバナンスを向上させるためには,法整備を通じた制度改革(institutional reform)が不可欠であること,(3)そのような制度改革を実現するためには,市場取引,企業活動および市民運動がグローバルなレベルで展開される現代社会においては,法整備のための国際協力(法整備支援ないし法整備協力)が不可欠であること,(4)そうした法整備支援活動を通じて行われる被支援国のガバナンス改革の経験は,支援国自体のガバナンス改革にとっても有益なフィードバックをもたらすこと,そして,(5)そのような形での法整備協力の積み重ねが,国際社会における秩序形成の当面の目標とされるべきグローバル・ガバナンスの構築を可能にするための最も着実な方法であることを明らかにした。そのうえで,本研究では,(6)国際機関,外国政府および日本政府が,被援助国のガバナンス向上のために実施してきた様々な法整備支援プロジェクトの方法や内容を検証した。その結果,それらは,(1)被支援国の立法改革,(2)司法制度を構成する組織および公務員(裁判官,検察官,弁護士など)の能力養成,および(3)市民社会の育成に分類することができること,その中では(1),(2)が比較的多いことが明らかになった。しかし,そこでは,(a)法整備支援の一貫性・体系性・計画性の欠如,(b)ドナー間の情報交換・協力体制の欠如,(c)法整備支援に携わる人材確保の困難さ,(d)プロジェクト期間の限定性と個別フェーズにおける評価の困難さ,(e)支援国と被支援国との考え方のずれ,(f)言語ギャップ,(g)被支援国の依存体質の助長といった問題点が存在することも明らかになった。しかしながら,(7)これらの課題は,今後,法制度改革を手段とする開発理論としての開発法学を構築するために格好の素材を提供している。1.開発法学におけるガバナンス理論の位置づけガバナンス理論は、近代化論的な法的自由主義に立脚した第1期開発法学(1960年代半ば1970年代半ば)と、そのアンチテーゼとしての従属論的な計画的介入主義に立脚した第2期開発法学(1970年代半ば1980年代半ば)との止揚として、新自由主義思想と新制度派理論に立脚した第3期開発法学(1980年代半ば以降)を特徴づける中心概念であることが検証できる。こうした開発法学史のコンテクストにおけるガバナンス理論の把握は、ガバナンス概念が現在注目されるに至った必然性を裏付け、その重要性を再認識させる。2.ガバナンス概念の定義ガバナンス概念は、市場ならびに企業、国家、および国際関係の3つのレベルの区別と相互関連を踏まえたうえで、定義されうる。すなわち、(a)コーポレート・ガバナンスとは、企業経営者の経営能力を向上させ、企業の活動を活性化する一方で、違法または非倫理的な行為を抑制すべく、株主、株主総会、従業員、メイン・バンク、市民社会などが企業活動を監視し、コントロールしうる全般的システム、(b)国家ガバナンスとは、市場および企業がそれらの本来的機能を発揮できるよう、政府が法的ルールの設定および執行を適正かつ確実に行う一方、そうした政府の権限行使の濫用・逸脱を回避すべく、行政部・立法部・司法部および市民社会が、政府の権限行使を監視し、コントロールしうる全般的システム、(c)グローバル・ガバナンスとは、国際関係における個人、企業、NGO、国家、国際機関などの様々な主体の活動を活性化する一方で、それらの違法または非倫理的な行動を抑制すべく、主権国家群が、世界政府をもつことなしに、コントロールしうる全般的システムとして、それぞれ定義することができる。

そして、第3期開発法学の実践目標としてのガバナンス概念は、グローバリゼーションが進行する中で、(c)による国際秩序の認識枠組を踏まえつつ、(a)を可能にする不可欠の手段として、(b)の実現に着目するものであることが確認される。こうした3レベルのガバナンスの相互連関的把握により、法整備支援活動の必然性と方向性が明らかになる。3.ガバナンス指標の設定法整備支援の目標と方法を明確にするためには、前記2(b)の国家ガバナンスの向上を測定するための具体的指標が必要である。そのためには、世界銀行、国連開発計画などが提示する諸規準も参考にしながら、市場・企業、政府および市民社会の諸組織が担う国家の3つの機能を測るガバナンス指標として、(a)民間部門スコア、(b)公的部門スコア、(c)社会部門スコアからなる3次元モデルを構築することが可能かつ有益である。1.日本の法整備支援の形態・方法・内容の特色を分析し、(1)法案作成間接支援型、(2)法案作成直接支援型、(3)法律問題コンサルティング型に分類し、それぞれの成果と問題点を整理した。ついで、様々な形態の法整備支援によって実現された形式的な法制度改革、それによって生じたガバナンス指標の変化を分析し、各種法整備支援手法の長所・短所を比較した。現時点の中間評価として、直接的支援は、目に見える成果に通じやすいが、政治的リアクションを引き起こしやすいのに対し、間接的な支援は、目に見える成果の評価は困難であるが、法制度改革に向けた国際的協力枠組の構築にとっては有効な手段となる可能性を示している。2.多様な形態で行われている法整備支援の共通目標である「良い統治」(good governance)、その一内容としての「法の支配」(the rule of law)は、各国の非形式的制度を十分顧慮し、そうした既存の制度枠組を用いながら、より普遍的な権利概念と基本原則に則った新しい形式的制度を取り込む形で、漸進的かつバランスのとれた改革政策を通じてのみ実現されうる。とくに、市場化のための法改革と民主化のための法改革との両立を支援側が最初から求め、支援の条件とすることには、慎重になるべきである。ミャンマーへの法整備支援に対する先進諸国の取組方法の相違は、この見方の妥当性を検証するための有益な材料となる。3.法整備支援が被支援国のガバナンス改革において、積極的成果を上げるためには、法制度改革を通じた良い統治の構築に向けた国際協力の意義にっき、認識を共有し、相互の尊重と信頼関係を構築したうえで、間接的なインフラ=《ルールを作るためのルール》(メタ・ルール)作りから着手する必要がある。
真核生物染色体DNA複製フォークの分子ダイナミズムとその破綻に起因する分子病態

ChIP (Chromatin-Immunoprecipitation)解析法を用いたこれまでのわれわれの研究から、出芽酵母染色体DNA複製に必須なDNAポリメラーゼεは複製開始に必須なCdc45-Sld3複合体、Dpb11-Sld2複合体、及びGINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3ヘテロ四量体複合体)の機能に依存して複製開始部位にロードされることが明らかになっている。本研究ではDNAポリメラーゼεが複製フォークにおいてどちらの鎖伸長反応(Leading鎖またはLagging鎖伸長反応)に関与しているかを決定することを目的として、出芽酵母粗抽出液を用いたIn vitro染色体DNA複製系の構築を目指している。その過程において先ず、Cdc45-SId3蛋白複合体を出芽酵母細胞粗抽出液より精製することを試みた。粗抽出液をQ-Sepharose、Cdc45-抗体カラム、及びHydroxylapatiteカラムクロマトグラフィーにかけてCdc45-Sld3複合体を精製することが出来た。こうして精製したCdc45-Sld3複合体がS-Cdk及びCdc7/Dbf4 protein kinase存在下で、pre RC複合体に直接相互作用し、複製開始部位のDNA unwinding反応を引き起こすかどうかG1期に同調した出芽酵母細胞から調製した粗抽出液を用いたin vitro pre RC形成法(原法はSeki & Diffleyによって開発されたが我々の研究室の川崎が改良した)を用いて現在検討中である。
ディ-ゼル排気中の黒煙粒子の細胞毒性、形質転換に及ぼすヒドロキシラジカルの役割の解析

本研究ではディ-ゼル排気粒子(DEP)をICR系マウスの肺に気管内投与すると0.9mgという微量で100%のマウスが死亡することを見いだした。この時の死因は血管内皮細胞傷害による肺水腫であることを病理学的検査で示した。血管内皮細胞は活性酸素や過酸化脂質に極めて敏感な細胞である。このことから、DEPの毒性は活性酸素のO_2や・OHあるいは過酸化脂質による可能性が考えられた。そこでDEP投与前にO_2異性化酵素のSODを尾静脈より投与してみるとその死亡率は2030%に抑制された。この事実から、DEP毒性はO^ー_2によるものであることが示唆された。そこで次に、血管内皮細胞がDEP由来のO^ー_2によって傷害されていることを更に培養血管内皮細胞で確認することを試みた。実験は通常培養系にSODを加えておくと生存率の向上が認められるかどうかを調べる方法で行った。その結果、ヒトの臍帯静脈由来細胞とラットの肺由来の細胞で調べたが、SOD添加による生存率改善効果は認められず、血管内皮細胞傷害がO^ー_2によっていることを示す結果は得られなかった。しかしその後、DEPに由来するO^ー_2は培地中の血清成分等にスカベンジ(消去)されて、O^ー_2の毒性が消えている可能性が考えられたので、細胞をコンフリュエントに培養後、培地をすてて、DEPのみあるいはDEPとSODのみを含む生理的緩衝液中で37°C、1時間インキュベ-ションしてから、再び培地を加えて培養し、増殖細胞数を調べると、DEP+SOD群の生存率がDEPのみを加えた群に比べて著しく多く,DEP由来のO^ー_2が血管内皮細胞を傷害していることが示された。また、この時EDTAやデスフェラ-ル等の鉄キレ-ト剤と一緒にDEPを投与するとマウスの生存率が向上することから、O^ー_2は最終的には・OHに変化して血管内皮細胞を損傷しているものと考えられる。このことは、DEPによる様々な呼吸器疾患発症の原因の説明になりえるメカニズムである為、今後のより詳しい研究の発展が望まれる。今年度は,ディ-ゼル排気黒煙粒子(DEP)からス-パ-オキシド(O^ー_2)やヒドロキシラジカル(・OH)が生成する条件の検討と細胞毒性に関する検討を行った。DEPが肺内に吸入されると,肺胞マクロファ-ジ(AMφ)が粒子を貪食し,それによってO^ー_2,H_2O_2を産生することが予想されるので,この点を調べた。AMφはDEPを極めて活発に貪食し,その活性はチモサン貪食の2倍にも達し,5×10^5AMφ/0.5ml当り0.1mgのDEP添加で95%以上のAMφが貪食能を示した。シトクロムC還元法によりO^ー_2産生能を調べたところ,O^ー_2産生はチモサン貪食の場合の約50%の活性を示した。さらに,H_2O_2産生を調べたところ,チモサン貪食の場合の約1/4に相当していることが判明した。次に,H_2O_2と電子供与体存在下でDEPによる・OH生成条件を検討した。その最適pHは7.0であった。

電子供与体としてはビタミンCが極めて高い・OH生成能を示し,次にシステインが有効であった。しかし,GSHは電子供与体としては働かなかった。VCやシステインは肺内にも多量に存在している物質であるので,DEP吸入によって肺内で・OHが生成し,これによって細胞傷害あるいは形質転換(細胞の癌化)が起こる可能性が考えられる。この可能性は,上記の反応系で,著しいDNA単鎖切断が認められたことから支持された。なお,このDNA鎖切断は・OHスカベンジャ-のDMSOや鉄のキレ-ト剤であるデスフェラ-ルなどの添加で効率よく抑制されたことから,この鎖切断は・OHによっており,かっこの・OHはフェントン反応によって生成していることが示唆された。ディ-ゼル排気粒子(DEP)の細胞毒性は予定を変改して,マウスの気管内投与によって調べた。DEPの1mg気管内投与で100%のマウスが肺水腫で死亡するが,このマウスにあらかじめO^ー_2を異性化する酵素のSODを尾静脈より投与しておくと死亡率は30%以下になった。O^ー_2が血管内皮細胞を傷害していることが示唆された。この詳細について検討中である。昨年度はディ-ゼル排気粒子(DEP)をICR系マウスの肺に気管内投与すると0.9mgという微量で100%のマウスが死亡することを見いだした。この時の死因は血管内皮細胞傷害による肺水腫であることを病理学的検査で示した。血管内皮細胞は活性酸素や過酸化脂質に極めて敏感な細胞である。このことから、DEPの毒性は活性酸素のO_2やOHあるいは過酸化脂質による可能性が考えられた。そこでDEP投与前にO_2異性化酵素のSODを尾静脈により投与してみるとその死亡率は2030%に抑制された。この事実から、DEP毒性はO_2によるものであることが示唆された。そこで今年度は、血管内皮細がDEP由来のO_2によって傷害されていることを更に培養血管内皮細胞で確認することを試みた。実験は通常培養系にSODを加えておくと生存率の向上が認められるかどうかを調べる方法で行った。その結果、ヒトの臍帯静脈由来細胞とラットの肺由来の細胞で調べたが、SOD添加による生存率改善効果は認められず、血管内皮細胞傷害がO_2によっていることを示す結果は得られなかった。しかしその後,DEPに由来するO_2は培地中の血清成分等にスカベンジ(消去)されて、O_2の毒性が消えている可能性が考えられたので、細胞をコンフリュエントの培養後、培地をすてて、DEPのみあるいはDEPとSODのみを含む生理的緩衝液中で37°C、1時間インキュベ-ションしてから、再び培地を加えて培養し、増殖細胞数を調べると、DEP+SOD群に生存率がDEPのみを加えた群に比べて著しく多く,DEP由来のO_2が血管内皮細胞を傷害していることが示された。また、この時EDTAやデスフェラ-ル等の鉄キレ-ト剤と一緒にDEPを投与するとマウスの生存率が向上することから、O_2は最終的には・OHに変化して血管内皮細胞を損傷しているものと考えられる。このことは、DEPによる様々な呼吸器疾患発症の原因の説明になりえるメカニズムである為、今後のより詳しい研究の発展が望まれる。
B. bigelowii 化石に基づいた海洋のMg/Ca変動の復元

円石藻Braarudosphaera bigelowiiの石灰質鱗片と現場海水の微量元素組成の関係を調べるため、長崎県古江湾(1回)、鳥取県泊港(4回)、高知県春野漁港(24回)、高知県池の浦漁港(2回)、青森県関根浜(2回)、北海道小樽市小樽築港(1回)、北海道小樽市祝津漁港(1回)から海水試料を取得した。サンプリングのタイミングをつかむのが難しく、石灰化した個体が見つかったのは、春野漁港で2回、池の浦漁港で1回にとどまったが、長崎県古江湾の海水から、Braarudosphaera bigelowiiseusu strictoの状態の良い非石灰化・遊泳細胞をみつけ、その培養株の確立に成功した。さらに、培養環境下において株の石灰化に複数回成功した。確立したB. bigelowiiの株の分子系統解析を行い、株が18S rDNA Genotype Iであること、窒素固定細菌UCYN-A2を内包することを確認した。また、その株によって形成された石灰質鱗片の溶解実験を行った結果、鱗片の裏側に、石灰化に直接的に関与すると考えられている、酸に不溶な有機質の膜状の構造物があることを確認した。FIBを用いて石灰質鱗片の切片を作成してTEM観察を行った結果、その膜状の構造が石灰質鱗片の内部にまで入り込んでいることを確認した。化石のB. bigelowiiの研究のため、「ちきゅう」の完熟航海で採取された、C9001Cコアより堆積物の試料を120個を採取して、各堆積物試料からのスメアスライドを作成した。現在は、スメアスライドの偏光顕微鏡観察に基づいて、堆積物中のB. bigelowii化石の相対比と大きさの変遷を調べているところである。当初の研究計画では、B. bigelowiiは培養が不可能で、かつ、研究室内環境での石灰化の見通しが立たないという前提のもとで、自然環境から得られた試料のみを用いて実験をする予定であった。具体的には、B. bigelowiiが石灰化を行われている瞬間の海水を取得して、その石灰質鱗片の微量元素組成と海水環境との関連を調べ、得られた関係式を新たな古海洋環境指標として使用することを目的としていた。しかしながら、B. biglowiiが石灰化する瞬間に海水を採るということが想定以上に困難で、今年度も十分な個体数の石灰化細胞の入手は出来なかった。その一方で今年度は、予期せずB. bigelowiiの培養株の確立とその石灰化に成功した。その結果として、予測が難しい現場環境での石灰化細胞の採取ではなく、環境をコントロールした研究室内で生じた石灰質鱗片の研究に道が開けた。当初の予定とは違うが、これは研究目的遂行のためによりよい結果である。ただし、現時点では数ミリリットル程度の少量の培養液で細胞を管理しているうえに、石灰化するのは一部の細胞にとどまっているため、分析に十分な個体数の石灰質鱗片はまだ得られていないので、その点の改善が必要である。また、株は長崎県から採取された細胞に由来するものだけで、個体差が殻の微量元素組成に与える影響が考慮できないという問題が残っている。化石試料の研究は、「ちきゅう」によって青森県下北半島沖より採取された、第四紀のC9001CコアにおけるB. bigelowiiの形態観察と個体数のチェックを、順次進めている。今後は(1)現場海水の微量元素組成並びに、そこで石灰化している自然環境のB. bigelowii個体の石灰質鱗片の科学組成の分析、(2)昨年度に確立した培養株との比較のための、他の産地に由来する新しいB. bigelowii培養株の確立、(3)大量培養の実施と、培養環境下で形成された石灰質鱗片と培養液の微量元素組成の関係の解明と、その関係式の確立、(4)現生・培養試料から得られた関係式の、化石B.bigelowii試料の微量元素分析の結果への応用、を行う。異なった個体に由来する複数の株によって形成される石灰質鱗片の微量元素組成を比べることにより、微量元素組成に石灰化を行った個体による違いがあるのかどうか、またその違いがどの程度なのかを、調べることが出来る。そして、培養実験ならびに現場試料分析の結果に基づいた、微量元素組成と石灰化環境の換算式を確立することによって、沿岸の古海洋環境の復元にパワフルかつ信頼性の高い新たな環境復元のツールを手に入れることが出来る。そして、実際に、下北半島沖から得られた堆積物中のB. bigelowii化石の分析結果と、先行研究で明らかになっている同じ堆積物試料中の有孔虫化石の酸素同位体比(既に公開されているデータ)を比較し、B. bigelowii化石の微量元素の古海洋環境指標としての実用性を立証する論文執筆を目指す。白亜紀後期から現在まで継続した化石記録を持つ円石藻Braarudosphaera bigelowiiの石灰質鱗片のMg/Ca比は、石灰化時の周辺海水環境の影響を受けて変化すると考えられている。B. bigelowiiが石灰化鱗片を形成するのは初夏のみ(日本周辺では6月頃)であるため、B. bigelowiiの石灰化鱗片のMg/Ca比は、初夏の古海洋環境の復元に利用できる可能性が高い。本研究の目的は、B. bigelowii化石のMg/Ca比を、新たな古海洋環境指標として実用化することである。

この目的を達成するために、平成29年度は、以下の研究を行った1)B. bigelowii化石のMg/Ca比から古水温・古環境を復元するための換算式を確立するために、高知県土佐市・池の浦漁港と鳥取県東伯郡泊漁港のB. bigelowii現生細胞と、石灰化が生じている際の海水試料のサンプリングを行った。2)現生のB. bigelowiiのよりよいサンプリング地点を探すため、高知県沿岸各地の漁港と、鳥取県東伯郡湯梨浜町の泊漁港並びに夏泊漁港、そして、愛知県伊勢湾の底泥の顕微鏡観察を行い、B. bigelowii遺骸の分布状況を調べた。3)北西大西洋から採取されたODP Leg 164, site 994Cの堆積物中に含まれるB. bigelowiiの形態・サイズの多様性を偏光顕微鏡観察によって調べ、将来的なB. bigelowii化石の化学的分析に使用可能なサンプルの選定を行った。また、化石試料のFIBでの切断、表面クリーニングの予備実験を行った。4)津軽暖流の影響下にある襟裳岬沖より採掘されたC9033Cコア中の石灰質ナノ化石の顕鏡を行い、B. bigelowii化石の産出状況を調べた。高知県土佐市・池ノ浦漁港を中心にサンプリングを行ったが、非石灰化細胞は多数見つかったが、石灰化細胞は5月15日の一度のサンプリングでしか見つからなかった。池の浦漁港の試料のサンプル処理に予想外に時間がかかり、鳥取にはサンプリングに行くことができたが、北海道と長崎には行くことが出来なかった。平成29年度は現生細胞の数が不十分だったため、古水温・古環境を復元するための換算式の確立まで到らなかった。石灰化細胞の出現数が多い、よりよいサンプリング地点を探すため、高知県と愛知県の港湾の底泥試料の顕微鏡観察を行った結果、高知市春野漁港から多数のB. bigelowiiの遺骸を発見した。C9033Cコアの顕鏡の結果、十分な数のB. bigelowii化石が見つかり、津軽暖流域がB. bigelowii化石の研究に適していることが分かった。ODPLeg 164, site 994Cの北西大西洋の堆積物を顕鏡した結果、新種のBraarudosphaera化石を発見した。また、同堆積物から単離したB. bigelowii化石の、FIBによる切断・表面クリーニングの予備実験の過程で、100万年を経過した化石の内部にも、石灰化に関連すると考えられている有機質からなる膜状物質の痕跡が残されていることを発見した。この結果は、FIB-SEMによる化石の内部構造の観察が、Braarudosphaera化石の石灰化過程と形態進化の研究に重要であることを示している。円石藻Braarudosphaera bigelowiiの石灰質鱗片と現場海水の微量元素組成の関係を調べるため、長崎県古江湾(1回)、鳥取県泊港(4回)、高知県春野漁港(24回)、高知県池の浦漁港(2回)、青森県関根浜(2回)、北海道小樽市小樽築港(1回)、北海道小樽市祝津漁港(1回)から海水試料を取得した。サンプリングのタイミングをつかむのが難しく、石灰化した個体が見つかったのは、春野漁港で2回、池の浦漁港で1回にとどまったが、長崎県古江湾の海水から、Braarudosphaera bigelowiiseusu strictoの状態の良い非石灰化・遊泳細胞をみつけ、その培養株の確立に成功した。さらに、培養環境下において株の石灰化に複数回成功した。
衝撃圧縮によるフラーレンから準安定炭素相の凍結と機能性新物質の合成

アモルファスダイヤモンドは各種のスペクトロスコピーによって長距離オーダーではアモルファスであり、短距離オーダーではダイヤモンドであると評価される新物質である。既に、C_<60>フラーレンを50万気圧、2000度の超高圧・超高温に衝撃圧縮することによってこの新物質の合成に成功していた。物質を衝撃圧縮すると高い残留温度が生じ、高圧相はじめ遷移状態や準安定相を凍結するためには10^<10>K/sオーダーの超急冷がが必要である。本年度はフラーレンからアモルファスダイヤモンドを再現性よく合成する超急冷衝撃圧縮技術を確立した。また、C_<60>フラーレンからアモルファスダイヤモンドへ転換する過程を、すなわち、C_<60>フラーレンの崩壊からsp^3結合形成過程を、明らかにした。この転換過程は結晶構造と電子状態の変化を電子線回析と電子線エネルギー損失スペクトルを測定することによって行った。C_<60>フラーレンは23の遷移的な状態を経てアモルファスダイヤモンドに転換する。第1の遷移状態ではfcc構造はほとんど変わらないがクラスターの接近によってπプラズモンが妨げられ、この状態はcompressedC_<60>fullereneと考えることができる。第2の遷移状態は、電子のバンド間遷移が著しく強調された状態であり、クラスターの更なる接近によってクラスター間結合が生じていることが示されている。C_<60>クラスターの基本構造は保持されており、一種のC_<60>-ポリマーと解釈することができる。第3の遷移状態では基本構造が崩壊しアモルファス化するが、一方では、局所的にsp^3結合が形成されている。sp^3結合が増加しそのまま結晶成長することなしに凍結されアモルファスダイヤモンドの状態に至る。
移植肝障害発生機序の解明と新らしいviability判定法の検討(エネルギー産生能と脂質過酸化障害からの検討)

1.保存ならびに移植血流再開による肝障害発生機序の解明についての研究成果;肝移植において、再潅流障害の発生機序を、ミトコンドリア電子伝達系ならびに好中球に焦点をあてラットを用いてフリーラジカルと脂質過酸化障害の面から検討した。その結果、1)ミトコンドリア電子伝達系からのラジカル発生量は、阻血、保存により減少し再潅流時の脂質過酸化障害の原因になり得ない。2)肝実質細胞は保存後再復温酸素化するとスパー・オキサイドを発生するが、非実質細胞はその発生を認めない。3)潅流液に好中球を添加した場合フリー・ラジカルの発生が観察され、脂質過酸化量も著名に増加した。脂質過酸化量は、保存時間の長い肝においてより高値を示した。一方、リンパ球や、血清を潅流液に添加した場合はフリーラジカルの発生や脂質過酸化量の増加は認めなかった。以上の結果から、肝の再潅流障害において好中球が活性酸素の発生源となり、生じたフリー・ラジカルが脂質過酸化障害を惹起し、保存時間が長い場合ほどその障害は大きいと考えられるとの結論が得られた。しかし、再潅流障害におけるクッパー細胞の役割についての検討は今後の課題とした。2.新しい肝viability判定法の開発についての研究成果;初年度はミトコンドリアの膜電位を正しく測定できる蛍光色素の濃度、基質の濃度、pHなどの検討を行った。2年目は従来ミトコンドリアのATP産生能の指標として用いられている呼吸調節率(RCR)との比較ならびに、conventionalなATPase測定法で得られた結果と比較した。RCRならびに従来の測定法で得られたATPaseの結果と非常に良く相関したことから、ATP産生能がATPaseによって規定されること、および、蛍光色素を用いたミトコンドリアATPase測定法の信頼性が証明された。1.保存ならびに移植血流再開による肝障害発生機序の解明今年度は1)冷保存後復温酸素化によりミトコンドリア電子伝達系からラジカル発生が増加するか(NBT還元法)、2)実質細胞と非実質細胞を分離培養し冷保存の後復温酸素化の条件を与えラジカル発生の程度に差があるか(DCFH負荷蛍光測定法)、ならびに、3)再潅流開障害におけるフリー・ラジカルの主な発生原因と考えられる好中球が脂質過酸化障害にどのように関与しているかについてラットを用いて検討した。[結果]1)ミトコンドリア電子伝達系からのラジカル発生量は、ミトコンドリアのATP産生能の低下とともに低下し再潅流時の脂質過酸化障害の原因になり得ないと考えられた。2)実質細胞は保存後再復温酸素化するとスパー・オキサイドを発生するが、非実質細胞はその発生を認めなかった。3)潅流液に好中球を添加した場合フリー・ラジカルの発生が観察され、脂質過酸化量も増加した。以上のから、肝の再潅流障害において好中球は活性酸素の発生源となり、脂質過酸化障害を惹起するものと考えられた。2.新しい肝viability判定法の開発今年度はミトコンドリアの膜電位を正しく測定できる蛍光色素の濃度、基質の濃度、pHなどの検討を行った。アンチミシンで電子伝達系をブロックした後ATPを加えると電位変化を認めこの電位変化はオリゴマイシンにて消失した。