hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高CO2・高水温環境下でのサンゴ礁群集の多様度維持機構：パラオ礁湖での事例研究

サンゴ礁生態系は,CO2濃度の増加によってもたらされる温暖化および海洋酸性化の影響を最も顕著に受ける可能性がある海域として危惧されている。しかし、今回パラオ国沿岸に位置するニッコー湾にて、海水中のCO2が周辺海域よりも高く、水温も高いにも関わらず、極めて被度および多様度が高いサンゴ群集が生息する海域を発見した。本課題では本湾の高CO2高水温環境をもたらす要因と、本湾で高被度および高多様度のサンゴ群集が生息を可能とする機構の解明を目的とする。初年度には、本湾の物理環境と炭酸化学環境を詳細に調査した結果、本湾内の海水の滞留時間が約70日と極めて長く、それによって湾内に生息する生物の呼吸によるCO2の排出およびサンゴなどによる石灰化によるアルカリ度の低下によって、湾内のCO2濃度が高く水温も高く維持されていることが解明された。本年度(平成29年度)には、なぜ高CO2,高水温環境を示す本湾にてサンゴが生息可能なのかを評価することを目的に、本湾内に最も有占するサンゴ種(Porites cylindrica)を用いて、湾内外での移植実験および、海水のCO2と水温を調整した水槽実験を行った。その結果、湾内外に生息するP. cylindricaはそれぞれ高CO2・高水温環境に対して異なる応答を示し、湾内のサンゴは常に湾外のサンゴよりも高い石灰化速度を示すことが明らかになった。さらに水温に対する耐性も異なることが明らかになり、その要因の一つとして、湾内に生息するサンゴは一部、異なるタイプの褐虫藻類を保持していることが明らかとなった。これら結果より、湾内に生息するサンゴは長期的に高CO2・高水温環境に晒されることによって、本環境に適応している可能性が示唆された。研究計画にて予定していたとおり、初年度にはパラオニッコー湾内の炭酸化学環境および底生生物群集の調査を終え、さらに今年度は、湾内のサンゴを用いた移植実験と水槽実験も実施することがきでた。さらに当初予定には無かったサンゴの加入量を調査するためのタイルも設置、回収をした。今後は、チャンバー実験や湾内の炭酸化学環境を詳細に測定することによって、湾内での群集代謝を評価する。さらに今年度設置回収したタイルの分析を進めると共に、湾内の生物群集調査によって得られた写真の解析から、本湾内でのサンゴ群集の構造とサンゴ加入量についての評価を行い、さらに初年度に得られた、湾内の環境データとを合わせて解析することによって、本湾内の詳細なサンゴ群集のマッピングと環境との関連性を明らかにすると共に、サンゴ群集の動態についても評価する。温暖化および海洋酸性化は、サンゴ群集に対して負の影響を与えることから、サンゴ礁生態系は気候変動に対して最も脆弱な生態系であると指摘されてきた。一方、申請者らはパラオ共和国沿岸のニッコー湾にて、海水中のCO2が周辺海域よりも高く、水温も高いにも関わらず、極めて被度および多様度が高いサンゴ群集が生息することを発見した。本課題では、本湾を利用して、生物による高CO2高水温環境への適応応答と耐性の獲得の可能性について評価し,サンゴ礁生態系のよる気候変動対する応答に関する新たな可能性と適応策の提言を目的とする。本年度は、パラオニッコー湾内外40カ所で昼夜の水質調査(pH、アルカリ度、全炭酸、栄養塩、クロロフィル、濁度)を実施した。その結果、本湾の水質環境は極めて複雑な空間パターンを示し、水温は29-32度、pHは7.6-8.0,またそのほかクロロフィルや濁度も場所によって大きく異なることが明らかとなった。さらに昼夜のアルカリ度とCO2の変異から本湾は、高い水温低pH環境を示すにもかかわらずその群衆代謝は湾外の値と同等かそれ以上であることが判明した。このことから、本湾の炭酸環境の複雑性は本湾の物理特性に加え、生物の代謝による複合的な要因であるものと予測される。さらに湾内外5カ所での底生生物調査の結果からは、湾内のサンゴの被度は場所によって異なるが平均70-80%と、湾外の被度よりも高いこと、さらにその多様性も極めて高いことが判明した。当初の予定通り、パラオニッコー湾の詳細な水質環境データ、さらに生物データを取得することができた。その結果、本湾は局所的な空間内で環境に極めて高い変異性をもっており、また生物の多様性も高いことが判明した。また当初予定していなかった、本湾でのサンゴの加入に関する調査が可能だと言うことが明らかとなったことから、新たに実施することとした。

初年度には、本湾の物理環境と炭酸化学環境を詳細に調査した結果、本湾内の海水の滞留時間が約70日と極めて長く、それによって湾内に生息する生物の呼吸によるCO2の排出およびサンゴなどによる石灰化によるアルカリ度の低下によって、湾内のCO2濃度が高く水温も高く維持されていることが解明された。本年度(平成29年度)には、なぜ高CO2,高水温環境を示す本湾にてサンゴが生息可能なのかを評価することを目的に、本湾内に最も有占するサンゴ種(Porites cylindrica)を用いて、湾内外での移植実験および、海水のCO2と水温を調整した水槽実験を行った。その結果、湾内外に生息するP. cylindricaはそれぞれ高CO2・高水温環境に対して異なる応答を示し、湾内のサンゴは常に湾外のサンゴよりも高い石灰化速度を示すことが明らかになった。さらに水温に対する耐性も異なることが明らかになり、その要因の一つとして、湾内に生息するサンゴは一部、異なるタイプの褐虫藻類を保持していることが明らかとなった。これら結果より、湾内に生息するサンゴは長期的に高CO2・高水温環境に晒されることによって、本環境に適応している可能性が示唆された。研究計画にて予定していたとおり、初年度にはパラオニッコー湾内の炭酸化学環境および底生生物群集の調査を終え、さらに今年度は、湾内のサンゴを用いた移植実験と水槽実験も実施することがきでた。さらに当初予定には無かったサンゴの加入量を調査するためのタイルも設置、回収をした。今後はニッコー湾内外のサンゴを用いて、移植実験および水槽実験を組み合わせ、湾何のサンゴの生理特性を評価するとともに、湾内との環境特性も同時に評価することにより、本湾の水質環境および生物群集がなぜ高い多様度を示し、それが維持されているのか、その機構を解明する。今後は、チャンバー実験や湾内の炭酸化学環境を詳細に測定することによって、湾内での群集代謝を評価する。さらに今年度設置回収したタイルの分析を進めると共に、湾内の生物群集調査によって得られた写真の解析から、本湾内でのサンゴ群集の構造とサンゴ加入量についての評価を行い、さらに初年度に得られた、湾内の環境データとを合わせて解析することによって、本湾内の詳細なサンゴ群集のマッピングと環境との関連性を明らかにすると共に、サンゴ群集の動態についても評価する。
軟骨由来成長因子エコジェニン/CTGFの4つのモジュールの機能の解明と医学的応用

1:エコジェニン/CTGF(以下CTGF)の各モジュールタンパク質生産とモジュール特異的抗体を用いた解析システムの確立:まずBrevibacillusを用いたシステムで4つの単独モジュールを調製し、それらを用いて抗CTGF抗体のエピトープを探索した。その結果N末から順にIGFBP、VWC、TSP1、CT各モジュールに特異的な抗体/抗血清を最低一種類ずつ揃えることが出来た。本研究で確立したELISAシステムのうち、VWCとCTを認識するものは高感度で様々な形で利用されている。加えてN末2モジュールを含む断片の解析用、VWCを単独検出用システムも構築できた。2:細胞成長分化におけるモジュール構造の役割の解明:上記個別モジュールによるヒト軟骨細胞様細胞株HCS-2/8でのリン酸化情報伝達経路の活性化を検討したところ、複数の経路が特定のモジュールによって活性化された。別の細胞での結果は異なり、CTGFは複数のシグナル伝達経路を標的細胞によって使い分けているようである。またHCS-2/8にモジュール固有抗体を作用させたところ増殖は阻害されたが、プロテオグリカン合成能力はむしろ刺激された。これはモジュール変異体だけでなく抗体にも医学的応用の可能性があることを示している。続いて精製モジュールの細胞接着に対する効果を検証した結果、すべてが高濃度で接着を促進し、最も低濃度で効果を表したものはCTであった。またヒト線維芽細胞株293T細胞に、モジュール変異体を高度に発現させ細胞周期に及ぼす影響を検討した。その結果、TSP-CT連結体とCT単独の強制発現が細胞をM期に留める可能性が示された。この結果は医学的応用を考える上でCTを慎重に扱うべきであることを示している。3:上記成果の応用:変異体に先立ち精製全長CTGFを徐放性担体と共にラット関節軟骨損傷・欠損モデルに適用したところ、軟骨組織が再生した。本方法は変異体の効果判定に有用である。第1段階:エコジェニン/CTGFの各モジュールタンパク質生産とモジュール特異的抗体を用いた解析システムの確立:エコジェニン/CTGFは4つのモジュールで構成されている。まずBrevibacillusを用いたタンパク質分泌発現システムを応用し各モジュール単独精製タンパク質を得た。これらを用いて手許にある抗エコジェニン/CTGF抗体のエピトープをモジュール内に探索した。その結果最N末にあるIGFBPモジュールにエピトープを持つモノクローナル抗体(MoAb)は1種、続くVWCモジュールを認識するMoAbは2種、抗血清は1種見つかった。TSPモジュールに反応するMoAbは皆無で、合成ペプチドに対する抗血清だけが反応を示した。CTモジュールに対するMoAbも1つ得られ、これで一通りのモジュール特異的解析のための抗体/抗血清が揃ったことになる。既に確立したエコジェニン/CTGF定量化のためのELISAシステムは、VWCとCTを認識するMoAbを用いて全長エコジェニン/CTGFを高感度で定量化するものであり、現在様々な形で利用されている。第2のシステムはN末2モジュールを含む断片の解析のためのもので、こちらもほぼシステムの確立をみた。第3のシステムはVWCを単独で捕らえるものだが検出感度がまだ充分でなく、現在も改良を続けている。第2段階:精製モジュールタンパク質を用いた、細胞成長分化におけるモジュール構造の役割の解明:得られた個別モジュールを用い、各モジュールがヒト軟骨細胞様細胞株HCS-2/8における細胞内リン酸化情報伝達経路を活性化するか否かを検討した。

その結果エコジェニン/CTGFによって活性化される複数の経路が、それぞれ特定のモジュールによって活性化されることが明らかになった。また別の細胞を用いた同様の実験の結果はHCS-2/8細胞の場合とは異なっており、エコジェニン/CTGFが複数のレセプターとシグナル伝達経路を標的細胞によって使い分けていることがわかった。第2段階:エコジェニン/CTGFの精製モジュールタンパク質を用いた、主として軟骨における成長分化におけるモジュール構造の役割の解明:ヒト軟骨細胞様細胞株HCS-2/8自身がエコジェニン/CTGFを産生しているので、そこに前年度に確立したモジュール固有認識抗体を作用させてその影響をみた。その結果、細胞増殖はCTモジュールに対する抗体によりもっとも強く阻害された。ところが驚いたことに、プロテオグリカン合成能力はTSPを除く全てのモジュールに対する抗体でむしろ刺激された。これら結果はモジュール変異体だけでなく、それに対する抗体にも医学的応用の可能性があることを示している。第3段階:エコジェニン/CTGFの精製モジュール及び変異体発現プラスミドを用いた、各種組織の成長分化におけるモジュール構造の役割の解明:前年度で得た精製モジュールを用い、その血管内皮細胞の接着に対する効果を検証した。その結果、各モジュールすべてが高濃度で接着を促進したが、もっとも低濃度で効果を表した単独モジュールはCTモジュールであった。またヒト腎由来線維芽細胞株293T細胞に、コンビネーションモジュール変異体を発現プラスミドを用いて高度に発現させ、その細胞周期に及ぼす影響を検討した。その結果、TSP-CT連結体とCT単独モジュールの強制発現が、細胞をM期にとどめる可能性が示された。以上の結果は、エコジェニン/CTGF変異体の医学的応用を考える上で、CTモジュールは慎重に扱うべきであることを示している。第4段階:エコジェニン/CTGFのモジュール構造・機能連関分析結果の応用:変異体の応用に先立ち、精製全長エコジェニン/CTGFを、徐放性コラーゲンゲルを援用してラット変型性関節症および全層軟骨欠損モデルに適用しその効果をみた。その結果、エコジェニン/CTGFは通常は再生しない軟骨組織を積極的に再生に導くことが明かとなった。
アメリカ公立図書館の基本的性格をめぐる裁判事例の総合的研究

本研究「アメリカ公立図書館の基本的性格をめぐる裁判事例の総合的研究」は2つの大きな部分からなり、おのおの以下である。(1)公立図書館の基本的性格をめぐる裁判事例の研究。(2)そうした裁判事例を押さえたのち、諸判決の分析による個別的、総合的研究の実施。まず(1)「公立図書館の基本的性格をめぐる裁判事例の研究」については、Lexisデータベースなどでの検索と川崎のこれまでの研究の蓄積から、公立図書館の基本的性格に言及した裁判事例を網羅的に抽出した。本研究の報告書では各事例について個別的、客観的にまとめた。本研究のいわば第一部によって、この分野を研究する場合の基礎資料を構築でき、今後の研究の進展の基盤を形成できたといえる。次に(2)「諸判決の分析による個別的、総合的研究の実施」については、(1)を総覧したのち、次の2つについて研究論文という形でまとめた。まずは現在のアメリカ公立図書館で関心が高まっている利用者用インターネット端末の利用をめぐっての諸裁判事例を取り上げた。こうした裁判は公立図書館の理念、使命、目的を検討する豊かな資料になっており、そうした諸判決をまとめ、判決の系譜と課題を提示した。いま一つは1990年代から蓄積されてきた公立図書館についての考え、すなわち公立図書館を制限的パブリック・フォーラムと把握する解釈に関係する。本研究では2000年以降の特徴ある諸裁判事件を取り上げ、制限的パブリック・フォーラムという捉え方を基礎にしながらも、ゆらぎが生じていることを明らかにした。本研究はアメリカ公立図書館をめぐる裁判事件を網羅的に取り上げて、公立図書館の存在意義を図書館裁判を手がかりに検討する。具体的には、以下の点を明らかにする。a.公立図書館の使命や目的に関わる、裁判事例を網羅的に抽出する。b.そうした各判例について、事件の経過、論点、判決の結論をまとめる。c. (a)(b)を受けて、判例の流れを整理、分析して総合化する。平成17年度は、これまでに蓄積してきた文献やデータを改めて整理し分析するとともに、新しい文献や判例の収集、およびデータの把握に努めた。そこではデータベースを用いて、公立図書館の目的にかかわる判例を網羅的に抽出した。抽出した判例は200件にたっするが、そこから公立図書館の目的を中心にした判例、あるいは公立図書館の目的に重要な示唆をあたえる意見が表明されている判例を取り出し、そうした判例数約30を確定した。そうした判例の流れをマクロにみると、教育機関としての公立図書館という位置づけから、表現の自由を保障する機関としての公立図書館へと、図書館の基本的な役割が変遷していることが、明らかになった。本年度の業績としては、「アメリカ愛国者法と知的自由」がある。これは、ニューヨーク貿易センターへのテロ事件を契機に導入された「愛国者法」と、図書館との思想的関連をさぐったものである。また、単著『アメリカ公立図書館・人種隔離・アメリカ図書館協会』では、人種隔離にかかわる図書館裁判を含み、そうした裁判が持つ意味について実証的な記述を展開している。

こうした裁判は公立図書館の理念、使命、目的を検討する豊かな資料になっており、そうした諸判決をまとめ、判決の系譜と課題を提示した。いま一つは1990年代から蓄積されてきた公立図書館についての考え、すなわち公立図書館を制限的パブリック・フォーラムと把握する解釈に関係する。本研究では2000年以降の特徴ある諸裁判事件を取り上げ、制限的パブリック・フォーラムという捉え方を基礎にしながらも、ゆらぎが生じていることを明らかにした。
穀類の細胞壁マトリックス内ネットワーク形成

イネ科植物のジフェルラ酸形成では、細胞壁結合型ペルオキシダーゼの活性レベルが律速要因の1つであることが明らかになった。この酵素には複数のアイソフォームが存在し、分子サイズは35 kDa程度で、弱酸性条件で最大活性を持つことが示された。また、細胞壁のシュウ酸酸化酵素に関しては、過酸化水素の生成・供給を介してペルオキシダーゼ活性に作用し、細胞壁中でジフェルラ酸とリグニンの形成を促進することが示されたイネ科植物のジフェルラ酸形成では、細胞壁結合型ペルオキシダーゼの活性レベルが律速要因の1つであることが明らかになった。また、細胞壁のシュウ酸酸化酵素に関しては、過酸化水素の生成・供給を介してペルオキシダーゼ活性に作用し、細胞壁中でジフェルラ酸とリグニンの形成を促進することが示された本研究では、イネ科植物に特徴的なフェノール化合物による細胞壁内ネットワークの形成について、(1)細胞壁のマトリックス多糖分子間を架橋するジフェルラ酸の形成(重合反応)に関わる細胞壁ペルオキシダーゼの同定とその作用機作と、(2)ペルオキシダーゼ反応に必須の過酸化水素が、細胞壁内に存在するシュウ酸酸化酵素(germin)により供給される可能性を検証して、イネ科植物の細胞壁内ネットワーク形成の制御メカニズムを生化学的に明らかにすることを目的としている。目的の(1)については、暗条件下で数日間、発芽・生育させたイネとオートムギのシュートを材料として、細胞壁からペルオキシダーゼを抽出する条件を検討した。シュートを氷冷条件下で磨砕した後、残渣を十分に洗浄して得られた活性細胞壁標品を、1-3Mの塩化ナトリウムを含む緩衝液に懸濁することで、ペルオキシダーゼ活性が効率的に抽出された。この方法で活性を調べたところ、シュートの成長に伴い、細胞壁のペルオキシダーゼ活性が増加することが示された。一方、目的の(2)については、上記の方法で調製した活性細胞壁標品をシュウ酸あるいは過酸化水素を含んだ溶液中で処理することで、in vitro系で細胞壁中のジフェルラ酸量の変化を調べた。その結果、シュウ酸あるいは過酸化水素処理によりジフェルラ酸量が増加し、シュウ酸と過酸化水素は同程度の効果を示した。従って、細胞壁のシュウ酸酸化酵素は、過酸化水素の生成・供給を介してペルオキシダーゼ活性に作用し、細胞壁中でのジフェルラ酸形成を促進することが示された。本研究では、イネ科植物でのフェノール化合物を介した細胞壁内ネットワークの形成について、(1)マトリックス多糖分子間を架橋するジフェルラ酸の形成(重合反応)に関わる細胞壁ペルオキシダーゼと、(2)細胞壁内に存在するシュウ酸酸化酵素(germin)が、ペルオキシダーゼ反応に必須の過酸化水素の供給に関与する可能性を検証して、イネ科植物の細胞壁内ネットワーク形成機構を生化学的に明らかにすることを目的としている。目的の(1)については、黄化オートムギシュートを材料として、活性細胞壁標品から3Mの塩化ナトリウムを含む緩衝液により抽出したタンパク質画分を用いてペルオキシダーゼの精製を行った。硫安沈澱によりタンパク質を濃縮し、イオン交換カラムで分画したところ、活性は100-200mMの塩化ナトリウム濃度で溶出し、2つのシャープなピークに分離した。次に、それぞれのピークをゲルろ過カラム(Superose-12)に供したところ、両者とも単一のピークとして22-25kDaの範囲に溶出した。現在、別種のゲルろ過カラム等を用いて、ピーク画分の精製をさらに進めている。目的の(2)については、コムギ芽生えの根をシュウ酸あるいは過酸化水素を含んだ溶液中で処理することで、in vivoでの細胞壁のフェノール化合物量の変化を調べた。シュウ酸あるいは過酸化水素処理により、細胞壁中のフェルラ酸量が大きく減少し、逆に、リグニン量が有意に増加した。この時、細胞壁中のジフェルラ酸量はほとんど変化しないか、若干、減少した。従って、過酸化水素の供給が増加すると、細胞壁中ではジフェルラ酸形成よりも、リグニン形成が促進される可能性が示された。本研究では、イネ科植物でのフェノール化合物を介した細胞壁内ネットワークの形成について、(1)マトリックス多糖分子間を架橋するジフェルラ酸の形成(重合反応)に関わる細胞壁ペルオキシダーゼの同定と、(2)細胞壁内に存在するシュウ酸酸化酵素(germin)が、ペルオキシダーゼ反応に必須の過酸化水素の供給に関与する可能性を検証して、イネ科植物の細胞壁内ネットワーク形成機構を生化学的に明らかにすることを目的としている。目的の(1)については、昨年度、ゲルろ過カラム(Superose-12)上で単一ピークとして溶出された活性画分を、さらに別種のゲルろ過カラム(Superdex-75)に供したところ、タンパク質の溶出パターンと活性が重なった。そこで、得られた活性画分をSDS-PAGE電気泳動で分析したところ、36kDaと34.5kDaの2本のバンドが検出された。これまでに報告されている細胞壁ペルオキシダーゼは30-40kDaであることから、上記の2つはアイソフォームの可能性が考えられる。比活性でみると、この画分は約200倍に精製されていた。

この画分を用いてpH依存性を調べたところ、pH6付近で活性が最大になることが示された。目的の(2)については、調製した活性細胞壁標品をシュウ酸あるいは過酸化水素で処理するin vitro系で見られた、フェルラ酸量の減少について調べた。シュウ酸や過酸化水素で処理すると、細胞壁ペルオキシダーゼの活性が増加して多糖とフェルラ酸の間でエーテル結合が形成され、その結果、弱アルカリ溶液で抽出されるエステル結合性のフェルラ酸が減少することが示された。このエーテル結合性のものの増加が、リグニン量の増加として検出されたと考えられる。
哺乳動物の中枢神経におけるD-アミノ酸酸化酵素の生理的意義

本研究の目的は,哺乳動物の中枢神経系でD-アミノ酸酸化酵素の分布と生理的基質と考えられているチアゾリジンー2-カルボン酸(システアミンとグリオキシル酸と脱水縮合物)との関係を調べ,神経解剖学と神経生化学の両面から本酵素の生理的意義の解明をめざすことである.まず光学および電子顕微鏡の両方に適用可能なニッケルイオインを用いた鋭敏な共役過酸化法による本酵素の組織化学的検出法を,ラット腎臓・肝臓・脳の切断を用いて検討し,その方法を確立した.次に本法を用いてラット全脳での本酵素の神経解剖的分布を,連続固定切断を用いて調べた.本酵素は終脳には全く分布せず,間脳にもほとんど活性はなく,中脳以下の下位脳幹・小脳・脊髄のみに限局していた.その細胞は星状膠細胞(ベルクマン膠細胞を含む)であり,ニューロン成分には本酵素は全く存在しなかった.小脳に関しては電子顕微鏡による詳細な観察を行った.その結果,プルキンエ細胞の樹状突起と平行線維とのシナプス・ゴルジ細胞の樹状突起への各種ニューロンの終末・篭細胞の終末・小脳糸球など各種シナプスを取り囲むベルクマン膠細胞の突起や星状膠細胞の突起に強い活性を認めた.また,本酵素の組織化学的検出法をチアゾリジンー2-カルボン酸酸化酵素活性の検出のために適用し,この酸化酵素活性とD-アミノ酸酸化酵素活性の分布は一致することが判明した.一方,予備実験からD-アミノ酸酸化酵素活性が認められない終脳や間脳にD-アスパラギン酸酸化酵素活性が認められた.上の結果から,星状膠細胞の部位的分化およびペルオキヒソーム中の酵素分布の不均性が明らかになった.そして本酵素は代謝性エフェクターであるシステアミンの代謝やoxalyl thiol esterの生成に関与し,代謝調節に寄与している可能性が考えられる.特にシナプス周囲のグリア細胞の突起に活性が強いことは示唆的である.本研究の目的は,哺乳動物の中枢神経系でD-アミノ酸酸化酵素の分布と生理的基質と考えられているチアゾリジンー2-カルボン酸(システアミンとグリオキシル酸と脱水縮合物)との関係を調べ,神経解剖学と神経生化学の両面から本酵素の生理的意義の解明をめざすことである.まず光学および電子顕微鏡の両方に適用可能なニッケルイオインを用いた鋭敏な共役過酸化法による本酵素の組織化学的検出法を,ラット腎臓・肝臓・脳の切断を用いて検討し,その方法を確立した.次に本法を用いてラット全脳での本酵素の神経解剖的分布を,連続固定切断を用いて調べた.本酵素は終脳には全く分布せず,間脳にもほとんど活性はなく,中脳以下の下位脳幹・小脳・脊髄のみに限局していた.その細胞は星状膠細胞(ベルクマン膠細胞を含む)であり,ニューロン成分には本酵素は全く存在しなかった.小脳に関しては電子顕微鏡による詳細な観察を行った.その結果,プルキンエ細胞の樹状突起と平行線維とのシナプス・ゴルジ細胞の樹状突起への各種ニューロンの終末・篭細胞の終末・小脳糸球など各種シナプスを取り囲むベルクマン膠細胞の突起や星状膠細胞の突起に強い活性を認めた.また,本酵素の組織化学的検出法をチアゾリジンー2-カルボン酸酸化酵素活性の検出のために適用し,この酸化酵素活性とD-アミノ酸酸化酵素活性の分布は一致することが判明した.一方,予備実験からD-アミノ酸酸化酵素活性が認められない終脳や間脳にD-アスパラギン酸酸化酵素活性が認められた.上の結果から,星状膠細胞の部位的分化およびペルオキヒソーム中の酵素分布の不均性が明らかになった.そして本酵素は代謝性エフェクターであるシステアミンの代謝やoxalyl thiol esterの生成に関与し,代謝調節に寄与している可能性が考えられる.特にシナプス周囲のグリア細胞の突起に活性が強いことは示唆的である.本研究の目的は、哺乳動物の中枢神経系でのD-アミノ酸酸化酵素の分布と生理的基質と考えられているチアゾリジン-2-カルボン酸(システアミンとグリオキシル酸との縮合物)との関係を調べ、神経解剖学と神経生化学の両面から本酵素の生理的意義の解明をめざすことである。本年度はまず昨年度に確立したニッケルを用いる鋭敏な共役過酸化法によって、ラット全脳での本酵素の神経解剖学的分布を、連続固定切片を用いて光学顕微鏡下に組織化学的に調べた。本酵素は終脳には全く分布せず、間脳にもほとんど活性はなく、脳幹および脊髄のみに限局していた。その細胞はベルクマン膠細胞を含む星状膠細胞であり、ニューロン成分には本酵素は全く存在しなかった。また、小脳に関しては電子顕微鏡による詳細な観察も行った。すなわち、分子層ではプルキンエ細胞の樹状突起と平行線維とのシナプスの周囲のベルクマン膠細胞の突起に強い活性を認めた。また、ゴルジ細胞の樹状突起への各種ニューロンの終末の周囲の膠細胞にも本酵素は分布していた。プルキンエ細胞層では、プルキンエ細胞の細胞体やその軸索の反回側副枝の終末および籠細胞の軸索やその終末を取り囲むベルクマン膠細胞の突起に本酵素活性を認めた。顆粒層では、小脳糸球を取り囲む星状膠細胞の突起に本酵素は分布し、特に小脳糸球中のゴルジ細胞の終末の外側にしばしば強い活性を認めた。これらの事実は上述の各種シナプスを機能の点において隔離区画化する役割を本酵素が担っている可能性を示唆している。

上記以外にシステアミンやその類縁化合物の代謝調節作用および薬理作用の研究も行い、興味ある結果が得られている。また、本酵素の活性発現にはフラビン(補酵素)が必須であるが、フラビンは自己会合系として存在し、血管から脳への輸送過程やアポ酵素への結合過程の解析においてこのリガンドの会合現象は重要であり、このような系の理論的解析も行った。
中世日本列島北部・サハリンにおける民族の形成過程の解明ー市場経済圏拡大の観点から

今年度は,(1)アイヌ文化・社会の定義の再検討と(2)オホーツク文化の担い手・集団の解明を中心に取り組んだ。前者では,鉄鍋や鉄鋼製品,木製品,ガラス玉について収集・分析を進めた。鉄鍋については14世紀半ば以降の製作地として能登仲居が推定できた。厚真町モイ遺跡のアイヌ期住居の年代査定では13世紀以降の中世と近世の2時期を抽出できた。ガラス玉では,北海道への4つの流入ルートが押さえられた。木製品では4367点の資料を206種の分類体系にまとめ分析した結果,中世と近世の間に大きな飛躍が捉えられた。一方,鉄器の普及に関しては,北海道と東北では擦文期後半に格差があることが判明した。地域間関係では,交易活動の活発化に伴って成立した擦文地域集団が中世アイヌに引き継がれ,日本海北部集団はサハリンアイヌの母体となったとの見方が出された。道北のチャシは古代に遡る可能性が指摘され,サハリンと北海道をつなぐ機能が想定されている。土器の中間的属性分析の結果から,道央と道南が擦文土器成立当初から比較的疎遠な関係であったことが捉えられた。他方,浜大樹2遺跡の竪穴住居祉の14C年代では10C後半11C前半となり,道東部太平洋側への擦文文化の波及という点で注目される。オホーツク文化の担い手・集団の解明については,7月に「国際シンポジウム骨から探るオホーツク人の生活とルーツ」を実施した。特に,形態小変異の解析からオホーツク人の道北・道東2グループの地域的・集団的違いが指摘され,古代DNA分析から,オホーツク人がニヴフやウリチに近縁であることが示された。考古学では,道東部と道北部のオホーツク集団が,成立当初からの文化的違いを背景にした複数集団により成立した可能性が指摘された。クマ送り儀礼に関する研究では,動物学,植物学,昆虫学,民族学,考古学,日本史学,文学,自然保護の専門家からなる『ヒグマ学入門』を上梓した。(1)宗谷湾奥の孤立丘稚内市「増幌チャシ」を測量調査した.この結果、1)頂部平坦面が3本の壕によって4つに区画されていること、2)各区画の中に方形の住居址状の段が残されていることが判明した。これは予想していたよりもかなり複雑で機能分化した構造をもつ施設であるので、擦文文化期ではなく、それ以降アイヌ文化期にいたる時期に属し、サハリンとの交易のために宗谷海峡を航行する舟を監視する目的で建設された、平地住居をともなう中世防御性施設である可能性が高くなった。(2)予備的研究として、オホーツク文化期の古人骨に関するDNA分析法の開発を行った。また、北海道のヒグマおよびエゾシカの古代DNA分析を行った結果、奥尻島の青苗砂丘遺跡出土のヒグマ骨の由来地を道南地方に推定することができた。(3)北海道域における擦文文化期終焉後の時間軸を確立するために、今年度は鉄鍋に関する調査を行った。本州各地の民具資料、並びに考古資料の調査を行い、主に東日本での中世から近世にかけての鉄鍋生産の動向について一定の見解を得るにいたった。A中世近世の鉄鍋製作方法は、畿内・北陸を中心地域と、東北太平洋側の地域で異なる。B東日本の日本海側地域では、14世紀後半以降、畿内・北陸型の製作方法をもつ職人の移住、もしくは接触によって、畿内・北陸型の製作方法による内耳鉄鍋が製作されるようになる。1.今年度はシンポジウム「蝦夷からアイヌへ」を11月13日・14日に実施し、蝦夷[エミシ]という一つの対象を、考古学と文献史学双方の専門家が直接に議論することによって、いくつかの問題について理解を深めた(『予稿集』90頁発行)。特に東北地方北部の古代続縄文集団(蝦夷)がヤマト勢力・古代律令国家そして中世権力と接触・交流する過程で成長・変容して地方豪族化したことを明らかにできた。またアイヌ文化が等質なものではなく、地方差をもつこと。その地方差は前時代の続縄文文化、オホーツク文化、擦文文化、土師器文化を基盤にして生み出された歴史的産物であることを確認できた。2.アイヌ民族の形成に関わるオホーツク集団の役割を解明するために、北海道大学医学部旧所蔵のモヨロ貝塚中心の人骨資料の整備、分析を進めた結果、石鏃を射込まれた人骨の確認などができ,当時の輸出資源をめぐる社会的緊張状況の存在を示唆できた。また、系統関係解明の鍵を握る形態分析・DNA分析にも着手できた。3.列島北部-サハリン地域における要害遺跡に関する研究の一環として行った稚内市の増幌川下流域に分布する「増幌チャシ」、「増幌川口2号チャシ」の測量調査によって、従来、チャシとされた遺跡がオホーツク文化、あるいは擦文文化期までさかのぼる可能性が強いことを指摘できた。これにより、交易資源をめぐる地域的緊張関係がアイヌ文化期前にさかのぼって生じていた議論を展開する条件を整えられた。4.ブリテン島北部のブリトン、スコット、ピクトの諸民族とローマの関係に焦点をあてて予備的調査を実施し接触関係を予察した。アイヌ文化の形成過程を解明するために、(1)「内地化した物質」(鉄鍋や鉄鋼製品、木製品、ガラス玉など)の生産と流通問題に取り組んできた。うち鉄鍋については14世紀半ば以降、能登半島の産地(中居など)からもたらされた可能性が大きいことを推定できた。

(2)これに加えて、「物質の内地化」を可能にした生産体制(集落・領域の構造と形態)と集団(交流・交雑)も指標として欠かせない。道北地方の防御性施設のなかに擦文文化期にさかのぼる可能性が高い例の確認など、これらの課題の解明も進んできた。(3)文化の担い手・集団の解明もすすみ、オホーツク人の道北・道東2グループの分類が固まってきた。(4)これらの研究成果を、刊行物(『蝦夷からアイヌへ』,『ヒグマ学入門』,『オホーツク文化の研究3目梨泊』),大学学部教育(北大学総合博物館で学ぼうヒグマ学入門),市民講座(朝日カルチャー『ヒグマ学入門』),博物館展示などの形で公表・報告・活用しつつある。今年度は,(1)アイヌ文化・社会の定義の再検討と(2)オホーツク文化の担い手・集団の解明を中心に取り組んだ。前者では,鉄鍋や鉄鋼製品,木製品,ガラス玉について収集・分析を進めた。鉄鍋については14世紀半ば以降の製作地として能登仲居が推定できた。厚真町モイ遺跡のアイヌ期住居の年代査定では13世紀以降の中世と近世の2時期を抽出できた。ガラス玉では,北海道への4つの流入ルートが押さえられた。木製品では4367点の資料を206種の分類体系にまとめ分析した結果,中世と近世の間に大きな飛躍が捉えられた。一方,鉄器の普及に関しては,北海道と東北では擦文期後半に格差があることが判明した。地域間関係では,交易活動の活発化に伴って成立した擦文地域集団が中世アイヌに引き継がれ,日本海北部集団はサハリンアイヌの母体となったとの見方が出された。道北のチャシは古代に遡る可能性が指摘され,サハリンと北海道をつなぐ機能が想定されている。土器の中間的属性分析の結果から,道央と道南が擦文土器成立当初から比較的疎遠な関係であったことが捉えられた。他方,浜大樹2遺跡の竪穴住居祉の14C年代では10C後半11C前半となり,道東部太平洋側への擦文文化の波及という点で注目される。オホーツク文化の担い手・集団の解明については,7月に「国際シンポジウム骨から探るオホーツク人の生活とルーツ」を実施した。特に,形態小変異の解析からオホーツク人の道北・道東2グループの地域的・集団的違いが指摘され,古代DNA分析から,オホーツク人がニヴフやウリチに近縁であることが示された。考古学では,道東部と道北部のオホーツク集団が,成立当初からの文化的違いを背景にした複数集団により成立した可能性が指摘された。クマ送り儀礼に関する研究では,動物学,植物学,昆虫学,民族学,考古学,日本史学,文学,自然保護の専門家からなる『ヒグマ学入門』を上梓した。
少年少女漫画に関する実証的研究

この調査研究では、受け手である子どもたちが、青少年文化としての少年少女漫画をどのように読んでいるかというコミュニケ-ション行動を、(1)子どもの少年少女漫画への接触行動、(2)少年少女漫画に対する子どもの反応・充足、という二つの視点から明らかにしようと試みた。漫画への接触行動については、子どもたちは漫画を借りるよりも自分で購入するという入手方法をとる傾向が強い。また、漫画雑誌への接触と単行本への接触は相乗的な関係にある。漫画への接触を促す主な要因は友人とテレビアニメであり、テレビアニメへの接触と漫画への接触は相乗的に作用しあっていることがわかった。子どもの漫画の好みは多様化しているが、どちらかといえば写実的な絵よりも漫画的な絵を、現実的な内容よりも空想的な内容を好む傾向にある。漫画に対する反応については、子どもは好きな漫画であれ嫌いな漫画であれ、漫画の形式的側面(絵)と内容的側面(スト-リ-)の両方に興味・関心を抱き強く反応しているが、どちらかといえば低学年は形式的側面に、高学年は内容的側面により強く反応しがちである。漫画の内容の理解は受け手の知識水準や漫画接触経験の多寡により左右されると思われ、したがって学年が上がるにつれて理解度も高まると考えられるけれども、しかし実際には、わずかながらではあるが高学年ほど理解度が低くなっている。これは、高学年ほど漫画の内容的側面に興味・関心を持ち、そのためある程度内容の複雑な漫画を読むためだと考えられる。また、高学年より低学年が、男子よりも女子のほうが漫画の世界に自己を同一化させる度合が高く、行動面においても漫画の影響を受けやすい。子どもは漫画により主として娯楽的・逃避的充足を得ており、これに付随して友人関係を深めるという社会的相互交渉の充足がある。女子の場合には、新しい知識・情報を得るという充足もかなり大きかった。1.まず少年少女漫画に関する既存の調査研究文献および少年少女漫画の内容分析を行っている文献を収集した。また、受け手である子どもが少年少女漫画をどのように読んでいるかという子どもの漫画受容過程に関する調査研究文献を収集したが、漫画を読む主体である子ども自身を対象にした調査研究文献は実際には皆無であるため、漫画に限らず、テレビ・ラジオ・映画等をふくむマス・コミュニケ-ション一般の「受容過程分析」および「利用と満足研究」に関する文献もあわせて収集した。2.子どもの漫画受容過程に関する質問紙調査を効果的に実施するために、予備調査として、小学校4年生と6年生および中学校2年生の子ども数人を対象として面接調査を行った。調査内容は、少年少女漫画との接触状況、少年少女漫画を読む動機、よく読んでいる少年少女漫画(雑誌・単行本)、好きな少年少女漫画とその理由(どんなところがどのようにおもしろいか)、子どもの親の漫画に対する態度と子どもの反応などである。この面接調査を通して、子どもの少年少女漫画との接触状況および漫画に対する一般的な意識・態度の傾向を把握した。3.上記の面接調査の結果にもとづいて、来年度に実施する予定である子どもを対象とする質問紙調査票を作成した。なお、当初の計画では小学生・中学瀬・高校生の親をも対象として、少年少女漫画に対する意識・態度を調査する予定であったが、研究経費および調査期間等の事情により、小学生・中学生を対象とし、高校生と親を対象とする調査は割愛せざるをえなくなった。来年度は小学生・中学生を対象とする現地調査と少年少女漫画自体の内容分析を行う予定である。

この調査研究では、受け手である子どもたちが、青少年文化としての少年少女漫画をどのように読んでいるかというコミュニケ-ション行動を、(1)子どもの少年少女漫画への接触行動、(2)少年少女漫画に対する子どもの反応・充足、という二つの視点から明らかにしようと試みた。漫画への接触行動については、子どもたちは漫画を借りるよりも自分で購入するという入手方法をとる傾向が強い。また、漫画雑誌への接触と単行本への接触は相乗的な関係にある。漫画への接触を促す主な要因は友人とテレビアニメであり、テレビアニメへの接触と漫画への接触は相乗的に作用しあっていることがわかった。子どもの漫画の好みは多様化しているが、どちらかといえば写実的な絵よりも漫画的な絵を、現実的な内容よりも空想的な内容を好む傾向にある。漫画に対する反応については、子どもは好きな漫画であれ嫌いな漫画であれ、漫画の形式的側面(絵)と内容的側面(スト-リ-)の両方に興味・関心を抱き強く反応しているが、どちらかといえば低学年は形式的側面に、高学年は内容的側面により強く反応しがちである。漫画の内容の理解は受け手の知識水準や漫画接触経験の多寡により左右されると思われ、したがって学年が上がるにつれて理解度も高まると考えられるけれども、しかし実際には、わずかながらではあるが高学年ほど理解度が低くなっている。これは、高学年ほど漫画の内容的側面に興味・関心を持ち、そのためある程度内容の複雑な漫画を読むためだと考えられる。また、高学年よりも低学年が、男子よりも女子のほうが漫画の世界に自己を同一化させる度合が高く、行動面においても漫画の影響を受けやすい。子どもは漫画により主として娯楽的・逃避的充足を得ており、これに付随して友人関係を深めるという社会的相互交渉の充足がある。女子の場合には、新しい知識・情報を得るという充足もかなり大きかった。
支配株主が会計数値の特性に与える影響に関する実証研究

本研究では、(1)利益情報の有用性、(2)会計上の保守主義、(3)配当政策という3つの観点から、支配株主の機会主義的行動について検証した。研究(1)では、支配株主の存在は総じて利益情報の有用性を高めるものの、最大株主がアウトサイダーの場合、その持株比率が一定水準を超えると利益情報の有用性が低下することが示唆された。研究(2)では、最大株主持株比率が高い企業ほど保守的でない会計利益を報告し、役員派遣と相対的規模がそれに影響を与えているという証拠が提示された。研究(3)では、最大株主がインサイダーかアウトサイダーかによって、配当の水準、および最大株主持株比率と配当の関係が異なることが示唆された。本研究の目的は、支配株主の存在がペイアウトや会計数値の特性に与える影響を実証的に検証することである。平成24年度は、平成23年度に執筆した「支配株主と利益情報の有用性」を『企業会計研究のダイナミズム』の1章として公表した。さらに、以下2本の論文を英語で執筆し、国内学会で報告を行った。2.Corporate Shareholders and Accounting Conservatism: Evidence from Japan(旧題:Controlling Shareholders and Earnings Quality: Evidence from Japan)。これは、最大株主企業と被所有企業が両方とも上場している状況に注目し、最大株主と会計上の保守主義の関係について分析した研究である。分析の結果、最大株主持株比率が高い企業ほど、保守的でない会計利益を報告していることが示唆された。また、最大株主が役員を派遣している企業、相対的に規模が大きい企業ほど、持株比率と保守主義の間の負の関係が強いことも示唆された。本研究については、2012年8月に一橋大学で開催された、日本会計研究学会の全国大会で報告を行った。支配株主が存在する企業では、支配株主による機会主義的行動の抑制がコーポレートガバナンス上の大きなテーマとなる。本研究では、そうした機会主義的行動がとられているのかを、(1)利益情報の有用性、(2)会計上の保守主義、(3)配当政策という3つの観点から検証した。研究(1)では、支配株主の存在は総じて利益情報の有用性を高めるものの、最大株主がアウトサイダーの企業では、その持株比率が40%を超えたあたりから利益情報の有用性の低下を招くことが示唆された。一方、最大株主がインサイダーの企業では、こうした利益情報の有用性の低下は確認されなかった。以上の成果をまとめた論文は2012年度に『企業会計研究のダイナミズム』の1章として公表された。最大株主企業と被所有企業が両方とも上場している状況に注目した研究(2)では、最大株主持株比率が高い企業ほど、保守的でない会計利益を報告するという証拠が提示された。以上の成果をまとめた論文はInternational Journal of Accountingに投稿され、2014年5月時点で査読審査中である。研究(3)では、最大株主がインサイダーの企業は、最大株主がアウトサイダーの企業に比べて、多額の配当を支払っていることが示唆された。また、前者の企業では最大株主持株比率と配当の関係が逆U字型になっているのに対して、後者の企業では両者の関係がU字型になっていることも示唆された。以上の成果をまとめた論文はInternational Review of Financeに投稿され、2014年5月時点で査読審査中である。本研究の実証結果は、わが国のコーポレートガバナンス、とりわけ少数株主保護を考える際に、一定の示唆を与えるものと期待される。本研究の目的は、日本企業のデータを用いて、支配株主の存在が会計数値の特性に与える影響を実証的に検証することである。平成23年度は、最大株主のデータベースを構築し、各企業の最大株主をインサイダー(経営者)とアウトサイダー(経営者以外)の2つに分類したうえで、以下の3つの実証分析を実施した。1.支配株主と利益情報の有用性:分析の結果、最大株主がインサイダーの場合には、その持株比率が高いほど利益情報の有用性も高いのに対して、アウトサイダーの場合には、両者の関係が非線形(逆U字)になっていることが示唆された。2.支配株主と利益の質(利益調整および会計上の保守主義):分析の結果、最大株主がインサイダーの企業の利益は、アウトサイダーの企業の利益よりも総じて利益の質が高いことが示唆された。3.支配株主と配当政策:分析の結果、最大株主がインサイダーの企業はアウトサイダーの企業よりも多くの配当を支払う傾向にあることが示唆された。さらに、最大株主がインサイダーの場合には、その持株比率が高いほど多くの配当を支払うのに対して、アウトサイダーの場合には、正反対の関係が存在することが示唆された。

これらの研究から、最大株主がインサイダーかアウトサイダーかによって、会計利益の特性や配当行動が異なることがわかる。この原因としては、わが国の法制度の下では、経営者は(たとえ大株主であっても)会社に対する忠実義務を負っているのに対して、アウトサイダーである支配株主はそうした義務を負っていないことが考えられる。申請者の知る限り、こうした点に注目した実証研究は存在せず、会計やファイナンスの研究領域に対する大きな貢献になると考えられる。さらに、本研究の実証結果は、わが国のコーポレートガバナンス、とりわけ少数株主保護の制度を考える上で重要な示唆を与えるものと期待される。国際学会で報告するという観点からは遅れているものの、2本の論文を英語で執筆し、それぞれ国内学会で報告することができた。討論者やオーディエンスからもらったコメントを受けて論文を修正し、研究の質を高めることができたと実感している。実証研究に必要な最大株主のデータベース構築に、予想以上に時間がかかってしまった。そのため、American Accounting Association AnnualMeetingやEuropean Accounting Association Annual Congressの応募締め切りに間に合わず、交付申請書で掲げていた、平成24年度にこれらの学会で報告するということができなくなった。しかし、それ以外の点では、支配株主と利益情報の有用性、支配株主と利益の質、支配株主と配当政策という3つの研究を実施し、いずれも意義のある検証結果を得ることができた。したがって、学会報告という観点からは遅れてしまったものの、研究自体は順調に進んでおり、平成24年度・25年度で挽回することは十分に可能だと考えている。最終年度にあたる平成25年度は、平成24年度に執筆した2本の論文を海外の査読付ジャーナルに投稿し、アクセプトされることを目指す。具体的な計画は以下の通りである。1.How Does the Largest Shareholder Affect Dividends?については、2013年7月に東京で開催されるInternational Review of Finance誌のカンファレンス“Japanese Financial Markets: Corporate Finance, Institutions, and Investments"での報告に応募したが、残念ながらリジェクトされた。しかし、同誌のエディターによると、カンファレンスの特集号に論文が掲載される可能性は残っているようなので、そちらに改めて投稿する予定である。2.Corporate Shareholders and Accounting Conservatism: Evidencefrom Japanについては、2013年8月に米国で開催されるAmerican Accounting Association AnnualMeetingでの報告に応募したが、残念ながらリジェクトされた。
染色体複製開始及び分配制御に関与する新規ヒストン結合蛋白質GRWD1の解析

DNA複製反応の正確な制御は、遺伝情報の完全生を保つために必須である。Cdt1はORC及びCDC6と協調して、複製ヘリカーゼMCM複合体を複製開始点に結合させる。GRWD1は新規Cdt1結合蛋白として同定された。本研究で以下のことが明らかとなった。(1) GRWD1はCDC6及びCdt1と結合し、複製開始点に集積する。(2) GRWD1は新規ヒストン結合蛋白質であり、ヒストンシャペロン活性を持つ。また、GRWD1は実際にクロマチン構造のopenness(一般にオープン構造は、種々の反応を促進すると考えられている)を制御している。(3) GRWD1をsiRNAで抑制するとMCM結合が抑制される。よって、GRWD1は複製制御において重要な役割を担っているであろう。Cdt1はORC/CDC6と共に、複製ヘリカーゼMCMの染色体へのloadingを行っている。Cdt1は強くMCM loadingを促進する。そのCdt1の新規結合蛋白として同定されたのがGRWD1である。ほとんど解析がなされていなかったGRWD1について、Cdt1との結合を介してMCM結合を促進しているとの仮説のもと検討を進めている。本年度は以下の結果が得られた。(1)GRWD1は新規ヒストン結合蛋白質であり、予備的な結果はヒストンシャペロン活性を持つ事を示唆した。今後さらに高い精製度の標品を得て、この結果を明確にしたい。(2)クロマチン免疫沈降の結果、GRWD1はCdt1依存的に複製開始点に結合していることが示唆された。そして、(3)GRWD1をsiRNAで抑制するとMCM loadingが部分的に抑制された。以上から、GRWD1はCdt1との結合を介して複製開始点に集積し、ヌクレオソームの構造を制御することでMCMのクロマチン結合を制御しているとの仮説が考えられ、さらに検討を進めている。また、ヒト細胞においてGRWD1の抑制はM期進行の異常も惹起するが、そのメカニズムの解析はあまり進んでいない。一方、上記したGRWD1のS期および分裂期制御への関与を、S期とM期を独立して解析する事が容易なカエル卵抽出液による試験管内複製・分裂の実験系を用いて解析する為に、アフリカツメガエルGRWD1(XGRWD1)のクローニングを行い、組換え蛋白質の作成を行った。そして、精製XCdt1とXGRWD1の結合が試験官内で確認された。現在、抗体作成を試みており、抗体が得られればGRWD1免疫除去を行い、S期及び分裂期への影響を解析する予定である。GRWD1はCdt1との結合を介してMCM結合を促進しているとの仮説の基で検討を進めている。昨年までの結果と併せて以下のことが明らかとなって来た。(1)GRWD1は新規ピストン結合蛋白質であり、この結合にはN末のAcidic domainが重要である。(2)GRWD1はmononucleosomeを形成するヒストンシャペロン活性を持つ。この活性へのAcidic domainの寄与を検討中である。(3)クロマチン免疫沈降の結果、GRWD1はCdt1依存的に複製開始点に結合していることが示唆された。(4)GRwD1の複製開始点への結合はG1期で増加し、G2/M期で減少する。(5)GRWD1をsiRNAで抑制すると複製開始点でのMCM loadingが部分的に抑制された。以上から、GRWD1はCdt1との結合を介して複製開始点に集積し、ヌクレオソームの構造を制御することでMCMのクロマチン結合を制御しているとの仮説が考えられる。Acidic domain欠損変異型GRWD1のMCM loading促進能が低下するのかどうかの確認が重要な実験となってくるであろう。一方、S期とM期を独立して解析する事が容易なカエル卵抽出液による試験管内複製実験系を用いて、GRWD1のS期への関与を解析する為に、アフリカツメガエルGRWD1(XGRWD1)のクローニングを行い、組換え蛋白質の作成を行った。そして、精製XCdt1(及びXCDC6)とXGRWD1の結合が確認された。特異的抗体を作成し、抽出液からXGRWD1免疫除去が可能なことを確認したので、そのS期への影響を解析する予定である。

Cdt1はORC/CDC6と協調して、複製ヘリカーゼMCM複合体を染色体へloadingする。Cdt1は強くこの反応を促進する。GRWD1は新規Cdt1結合蛋白として同定された。これまでの研究から以下のことが明らかとなった。(1)GRWD1は新規ヒストン結合蛋白質であり、ヒストンシャペロン活性を持つ。(2)GRWD1はCDC6/Cdt1と物理的に相互作用し、これらに依存して複製開始点に結合する。(4)GRWD1の複製開始点への結合はG1期で増加し、G2/M期で減少する。(5)GRWD1をsiRNAで抑制すると複製開始点でのMCM loadingが抑制される。以上から、GRWD1はCDC6/Cdt1との結合を介して複製開始点に集積し、ヌクレオソームの構造を制御することでMCMのクロマチン結合を制御しているとの仮説が考えられる。この過程には、我々が同定したCdt1結合性クロマチンリモデラーSNF2Hも関与しているだろう。GRWD1のsiRNAによる抑制が実際に複製開始領域のクロマチン構造に影響を与えるのかどうか、合わせてGRWD1が複製以外でもクロマチン構造制御において重要な役割を演じているのかどうかを明らかにすることを目的に、次世代シークエンサーを用いてFAIRE-Seqを行った。その結果、いくつかの複製開始領域を含む多くの領域でGRWD1がクロマチン構造のopennessに影響を与えていることを示唆する結果を得つつある。今後、GRWD1抗体等を用いた、ChIP-Seqも予定している。プロテオミクスアプローチによりGRWD1の新規結合因子を網羅的に同定したところ、いくつかの転写因子も同定され、FAIRE-Seqの結果とあわせ興味深い。この解析では、他に種々の興味深い因子が同定されており、GRWD1のクロマチン/細胞周期制御における重要性を支持する。一方、カエル卵抽出液試験管内複製系においても、XCdt1及びXCDC6とXGRWD1の結合が確認された。特異的抗体によるXGRWD1免疫除去のS期への影響を解析している。