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ヴィエトナム・フエ・グエン朝王宮の復原および修復・保存方法に関する基礎的研究

本研究は,ヴィエトナム・フエ・グエン朝王宮の復原及び修復・保存方法に必要な学術的資料の収集を目的とし,フエ遺跡保存センターと共同で復原考察を行い修理保存の方法論の確立を目指すものである.復原考察は構造・形式,様式的分類の他,建築の本質に関わる建築理念,設計方法,生産組織と施工技術に着目し,それらを解明・比較考察することによって初めて得られる宮殿建築の特質を明らかにすることを目的とした.修復・保存の方法論の確立には,現地の遺跡管理者-研究者-職人が連携した総合的なプログラムの確立が必須の課題であり,そのような観点に立脚した修復保存事業に資するように計画された.平成8年度は,王宮の配置図作成のための測量を行い,配置寸法計画の分析を進めた.基準格子を王宮の伝統的な配置計画方法を勘案しつつ設定し,その整合性を検証した結果,1丈あたり4240mmを遺構尺度とした配置寸法計画を推定した.一方,単体の宮殿建築である肇祖廟・興祖廟の実測調査を行い,柱径と柱間寸法の比例関係や主要な住間相互の距離の逓減方法についての考察を進め,柱径に基づく単位長を前提とした平面計画方法について言及した.平成9年度は,歴代皇帝陵の悉皆調査と王宮内の宮殿建築の実測を中心に,その他,装飾床タイルの残存状況を写真撮影によって記録し,それらの分類を進めた.また,修理工事現場で散見される建築部材の接合部(継手・仕口)の写真撮影,木匠道具の分類を進めた.その他,大南-統志などの史料の電子情報化を進め,各々の宮殿の変遷を史料から読みとり図表として整理した.平成10年度は,皇帝陵の正殿の実測調査を行い,実測値の傾向を分析した.陵内の正殿の遺構尺どは,若干のばらつきがあるものの,1尺につき,380mm390mm程度の範囲に納まっている.その他,肇祖廟のスケール1/10の模型制作を行い,伝統的な施工手順に基づく復原考察を行った.本研究は,ヴィエトナム・フエ・グエン朝王宮の復原及び修復・保存方法に必要な学術的資料の収集を目的とし,フエ遺跡保存センターと共同で復原考察を行い修理保存の方法論の確立を目指すものである.復原考察は構造・形式,様式的分類の他,建築の本質に関わる建築理念,設計方法,生産組織と施工技術に着目し,それらを解明・比較考察することによって初めて得られる宮殿建築の特質を明らかにすることを目的とした.修復・保存の方法論の確立には,現地の遺跡管理者-研究者-職人が連携した総合的なプログラムの確立が必須の課題であり,そのような観点に立脚した修復保存事業に資するように計画された.平成8年度は,王宮の配置図作成のための測量を行い,配置寸法計画の分析を進めた.基準格子を王宮の伝統的な配置計画方法を勘案しつつ設定し,その整合性を検証した結果,1丈あたり4240mmを遺構尺度とした配置寸法計画を推定した.一方,単体の宮殿建築である肇祖廟・興祖廟の実測調査を行い,柱径と柱間寸法の比例関係や主要な住間相互の距離の逓減方法についての考察を進め,柱径に基づく単位長を前提とした平面計画方法について言及した.平成9年度は,歴代皇帝陵の悉皆調査と王宮内の宮殿建築の実測を中心に,その他,装飾床タイルの残存状況を写真撮影によって記録し,それらの分類を進めた.また,修理工事現場で散見される建築部材の接合部(継手・仕口)の写真撮影,木匠道具の分類を進めた.その他,大南-統志などの史料の電子情報化を進め,各々の宮殿の変遷を史料から読みとり図表として整理した.平成10年度は,皇帝陵の正殿の実測調査を行い,実測値の傾向を分析した.陵内の正殿の遺構尺どは,若干のばらつきがあるものの,1尺につき,380mm390mm程度の範囲に納まっている.その他,肇祖廟のスケール1/10の模型制作を行い,伝統的な施工手順に基づく復原考察を行った.1.本年度の研究実績概要本年度は、トゥアティエン省フエ市に現存するグエン朝城郭都市の宮殿建築を対象に、第一次現地調査(夏期一ヶ月)を行い、第二次現地調査(春期一ヶ月)および第一回比較調査(中国北京紫禁城)が進行中である。グエン朝の都城はおよそ2km四方の広域を形成し、三重の囲繞壁によって明確に区分されている。第一次現地調査においては、最も内側の領域である紫禁城の配置図を作成するために実測調査を進めた。その結果、現況を示す配置図は完成し、造営当初の単位長さを明かにする寸法分析を試みた。また、実測データと史料からは換算値を割り出すことができ、その結果から推測される遺構尺度と固有尺度についてのメートル尺度への換算を試みた。現時点では、量地尺として一尺あたり425mm、また、営造尺として一尺あたり400mmを数ミリ超えた値を認識するに至っている。王宮の配置計画は量地尺一丈を基準単位とした配置寸法計画が成されている可能性が認められ、また、個々の宮殿建築は営造尺から設計が試みられた傾向を認めることもできよう。第二次調査においては、単体の宮殿建築の実測調査を進め、平面・断面・立面計画を設計方法の解明という視点から調査中である。大工への聞き取り、道具の分類などと併せてヴィエトナム中部における建築技術の把握に努めている。

第一回比較調査においては、東アジアに通底する伝統的な配置計画を理解することを目的としており、風水による見立ての空間構成を解明する予定である。1.本年度の研究実績本年度は、トゥアティエン省フエ市に現存するグエン朝城郭都市の宮殿建築を対象に、第三次調査(夏期一ヶ月)、及び第四次調査(春期一ヶ月)を行った。第三次調査においては、都城中央南部に位置する皇城内の一区画である延壽宮区の配置図を作成するために実測調査を進めた。実測値の寸法分析の結果、紫禁域の配置計画と同様に、一尺あたり425mmを基準に計画が為されていた可能性が認められる。また、同時に、延壽宮正殿についての平面図、立面図、断面図の作成のために実測を行い、基準寸法の分析を試みた。その他、宮殿建築床部に残る装飾タイルについての調査を進め、分類・整理を試みた。その結果、内部床装飾は、幾つかの基本的パターンに還元され、その組合わせの相違によって多彩な細部様式を生み出している事が判明した。第四次調査においては、延壽宮正殿、世廟、肇廟、興廟等の単体の宮殿建築の実測調査を進め、平面・立面・断面等の設計方法の解明という視点から基準寸法の分析・考察を試みた。その結果、肇廟、興廟については、身舎柱の内転びが設計手法として認められ、そのことから基準寸法も柱頭間の長さ、もしくは大梁の長さを基準として設計が行われている可能性が高い。併せて、大工等伝統的技術保持者への聞き取り、大工道具等の分類・整理を行った。その結果、木造架構の仕口・継手・組手において、構造的負荷の大きい箇所とそうでない箇所に大別して、接合部の設計が基本的に異なることが判明した。本研究は、1994年より継続的に進められ、日本建築学会大会梗概集(1995年1997年)に研究成果の一部が記載されている。本年度はトゥアティエン省フエ市に位置するグエン朝城郭都市の宮殿建築を対象に第五次現地調査を行い第六次調査が進行中である。また,パリ及びエクサンプロパンスにおいて仏領植民地時代の古写真などの資料収集を行った。第六次調査の概要は以下の通り1城郭内の外朝区・内務府・幾暇園とグエン朝第二代皇帝明命帝陵の配置測量2下記の各遺構の実測調査城郭内の主要建物-太和殿・世廟/グエン朝歴代皇帝陵墓の寝殿と呼ばれる連棟式建築/フエ市内に現存するグエン朝時代建立の官史住宅-永祥群王祠・延福長公主嗣/亭建築-頼世亭3城郭内の全ての現存遺構の接合技法の調査4現地の工匠の用いる工具の名称と使用方法の調査も行った。これらの調査結果を国内で整理・分析を行うと共に、平面図・断面図を作成。分析の結果は以下の通り。1析により、遺構尺度が一尺につき424mm程度の範囲に収まるものと一尺につき384mm程度の範囲におさまる二種類の営造尺が認められた。2木造架構接合技法を接合形態による分類し、基本形とその合成により体系化を試みた。また、接合技法及び宮殿建築の架構技法の規模変化と編年を考察した。3ヴィエトナム大工道具の分類を用具の名称・使用方法を中心に分類・整理した。配置測量に基づく分析により、4240mm程度の範囲に収まる一丈を営造尺とすることが確認され、文献との比較により各区の編年を試みた。また、ユネスコ世界遺産登録制度への提言のために、3DCADを用いて王宮の主要建造物である勤政殿の架構復原図の作成を試みた。以上の成果は以下の通り。1「ヴィエトナム/フエ・阮朝王宮の復原的研究(その11-19)」1998年度日本建築学会大会・口頭発表・梗概集2早稲田大学大学院理工学研究科建設工学専攻建築史研究室1998年度修士論文「ヴィエトナム・フエ/阮朝時代の連棟式建築の設計方法の研究」
超音速旋回流を利用したコンデンセートガスの分離に関する研究

本研究は,凝縮性気体が加速膨張する際に生ずる均一凝縮現象と超音速環状旋回流の組み合わせによる流動場内の液相の挙動を調べることを目的としている.本研究より,旋回を有する場合,凝縮開始点が上流側へ移動すること,また装置出口近傍アウター壁側に液相が寄る傾向が顕著になること,さらに装置入口半径や装置下流開き角を大きくすることも液滴を寄せる効果があることを示した.また,流れに固体微粒子が含まれる場合の非均一凝縮による液相の挙動は,均一凝縮の場合の挙動とほぼ同様になることを示した.結論として,凝縮現象と旋回流の組み合わせにより凝縮性気体の分離・抽出ができること,また装置小型化の可能性を示した.近年,地球規模でエネルギー構造の高度化と環境問題の解決に直面している.このような状況に対して,石炭の代替エネルギーとしてクリーンで効率のよい天然ガスの普及が重要視されるようになっている.しかしながら,採掘された天然ガスの中にある凝縮性気体(コンデンセートガス)の分離・抽出のプロセスでは化学物質等が使用されており,環境汚染の問題が指摘されている.本研究は,化学物質を全く使用せず,流体力学的現象のみを利用した凝縮性気体の分離・抽出技術の確立に向けた基礎研究である.具体的には,空間中の凝縮性気体が加速膨張する際に生ずる凝縮現象とスワールフロー(旋回流)の組み合わせによる凝縮性気体の分離・抽出の可能性を調べることを目的としている.本課題の実施に関し,現時点では凝縮現象の理論的な取り扱い方法に比べ,効率的な旋回流を得るための計算手法が不足している.よって,初年度は,円形ノズル(アウターノズル)内部に柱状体(インナー)を同心状に挿入することで得られる円環ノズルを用いて圧力計測実験を行い,本研究に用いた3次元非定常方程式と相変化を解くための方程式を使用した数値計算プログラムの妥当性および本計算に好適な乱流モデルについて調べた.また,超音速環状中の非平衡凝縮現象に及ぼす旋回の有無,およびインナー開き角の影響について数値的に調査を行った.その結果,乱流モデルとしてk-omegaモデルを使用した場合の計算結果が実験結果に近い値を示し,流れを定性的に再現できることを明らかにした.また,旋回を伴う超音流れ場では旋回を伴わない流れと比べ,インナー壁側における音速線と凝縮の開始点は,上流側に移動し,旋回を伴う場合のノズル出口での液滴の質量流量分布は,旋回を伴わない場合と比較してアウターノズル壁寄りとなることを示した.さらに,この傾向は,開き角が大きい場合のほうが顕著となることを明らかにした.近年,地球規模でエネルギー構造の高度化と環境問題の解決に直面している.このような状況に対して,石炭の代替エネルギーとしてクリーンで効率のよい天然ガスの普及が重要視されるようになっている.しかしながら,採掘された天然ガスの中にある凝縮性気体(コンデンセートガス)の分離・抽出のプロセスでは化学物質等が使用されており,環境汚染の問題が指摘されている.本研究は,化学物質を全く使用せず,流体力学的現象のみを利用した凝縮性気体の分離・抽出技術の確立に向けた基礎研究である.具体的には,空間中の凝縮性気体が加速膨張する際に生ずる凝縮現象とスワールフロー(旋回流)の組み合わせによる凝縮性気体の分離・抽出の可能性,および装置の小型化の可能性を調べることを目的としている.本課題の実施に関し,初年度は凝縮現象の理論的な取り扱い方法に比べ,凝縮現象を伴う旋回流を効率的に解析するための計算手法が不足していることから,計算手法等の確立を行った.よって,本年度は,初年度に作成され妥当性が示された相変化を伴う3次元非定常方程式を使用し,超音速環状中の非平衡凝縮現象に及ぼす旋回の有無や環状ノズルの上流側(ノズル入口側)と下流側形状(ノズル出口側)の影響について数値的に調査を行った.その結果,ノズル上流側と下流側の形状に係らず,旋回を有する場合には凝縮開始点と音速線の位置は旋回がない場合と比較し上流側に移動すること,ノズル出口での液相の半径方向分布は旋回を有する場合には旋回がない場合より外管壁側に寄ることを示した.また,液相の半径方向分布比の値には出口形状と比較して入口形状が強い影響を及ぼすことを示すとともに旋回流の影響を効果的に得るのに最も好適な形状を明らかにした.当該年度の実施計画に対しての達成度を次に示す.(1)初年度に製作した実験装置の改良に加え旋回流を効果的に得ることができるノズルを製作した.また,圧力計測により非平衡凝縮が生じない場合の旋回流の有無が流れ場に及ぼす影響,および旋回の有無が非平衡凝縮流れに及ぼす影響を示した.(2)初年度に作成したプログラムを使用し,旋回流を有する場合の実験と同条件下で得られた結果との比較を行うことでその妥当性を検証した.また,旋回流の条件による凝縮生成物(液滴)の分布の空間的分布を示した.(3)スロート下流と上流側の形状が,流路内の液滴の分布に及ぼす影響を示すとともに旋回流の影響を効果的に得るのに最も好適な形状を明らかにした.上記(1)から(3)の結果を取りまとめ,成果の発表を行った.以上の達成状況から,おおむね順調に進展していると判断した.本研究は,化学物質を全く使用せず,流体力学的現象のみを利用したコンデンセートガス(凝縮性気体)の分離・抽出技術の確立に向けた基礎研究である.具体的には,空間中の凝縮性気体が加速

膨張する際に生ずる凝縮現象と旋回流の組み合わせによる凝縮性気体の分離・抽出の可能性,および装置の小型化の可能性を調べることを目的としている.その結果,旋回を伴う超音速流れ場では旋回を伴わない流れと比べ,ノズル上流側と下流側の形状に係わらず,インナー壁側における音速線と凝縮の開始点は上流側に移動し,旋回を伴う場合のノズル出口での液滴の質量流量分布はよりアウターノズル壁寄りとなり,この傾向は開き角が大きい場合のほうが顕著となることを明らかにした.また,ノズル出口での液相の半径方向分布は旋回を有する場合には外管壁側に寄ることを示した.さらに,液相の半径方向分布比の値には出口形状と比較して入口形状が強い影響を及ぼすことを示すとともに旋回流の影響を効果的に得るのに最も好適な形状を示した.最終年度では,固体微粒子が多く含まれる場合の非均一凝縮現象を伴う超音速環状旋回流の流れを数値的に調べた.その結果,固体微粒子数と固体微粒子半径の値に係わらずスワール数の増加とともに核生成率が最大値となる位置は上流側に移動した.また,液相の半径方向分布比はスワール数に依存することがわかった.これらの傾向は,均一凝縮の場合と大きな差はないことがわかった.本研究期間において得られた結果より,旋回を有する場合には凝縮開始点の上流側への移動と液相の質量流量が増加すること,また装置出口近傍のアウター壁側に液滴が寄る傾向が顕著になること,さらに入口形状やノズル下流側に開き角を設けることも液滴を寄せる効果があることがわかり,凝縮現象と旋回流の組み合わせにより凝縮性気体の分離・抽出ができること,また装置の小型化が可能であることを示した.本研究は,凝縮性気体が加速膨張する際に生ずる均一凝縮現象と超音速環状旋回流の組み合わせによる流動場内の液相の挙動を調べることを目的としている.本研究より,旋回を有する場合,凝縮開始点が上流側へ移動すること,また装置出口近傍アウター壁側に液相が寄る傾向が顕著になること,さらに装置入口半径や装置下流開き角を大きくすることも液滴を寄せる効果があることを示した.また,流れに固体微粒子が含まれる場合の非均一凝縮による液相の挙動は,均一凝縮の場合の挙動とほぼ同様になることを示した.結論として,凝縮現象と旋回流の組み合わせにより凝縮性気体の分離・抽出ができること,また装置小型化の可能性を示した.本年度の具体的な3つの実施計画に対しての達成度を次に示す.(1)非平衡凝縮を伴う3次元非定常超音速流れに関する数値解析については,拡散方程式,乱流モデル,および相変化を含む3次元非定常方程式を組み合わせたプログラムを作成した.また,予備的な計算において,現象を精度よく予測するために必要な乱流モデルの選定を行った.さらに,旋回を伴う場合の予備的な計算を実施し,作成プログラムの動作確認等を行った.(2)実験装置の製作および予備実験については,上記(1)により得られた結果の妥当性を確認するための環状ノズルを含めた実験装置を製作するとともに,高精度の計測が可能であるかを確認した.また,作動気体に湿り空気を使用した場合の流れ場の詳細を把握する必要があるため,圧力計測実験を行った.(3)研究の総括については,上記(1)と(2)の結果を総合して,非平衡凝縮より発生する液滴の空間的分布と流れの流動特性について知見を得た.また,計算の妥当性および非平衡凝縮現象に及ぼす旋回流の影響に関して得られた知見をまとめ,成果の発表を行った.以上の達成状況から,おおむね順調に進展していると判断した.
長崎県対馬内山花こう岩類と熱水性鉛亜鉛鉱床との成因的関係

本研究は長崎県対馬の内山花こう岩体の物理化学的特性と、その周辺に分布する鉱脈の鉱化作用特性を明らかにし、両者間の成因的関係を実証的に考察することが目的であった。今回の研究成果は次の通りである。(1)内山花こう岩体は従来知られていたよりもかなり狭い露出範囲を示し、内山、浅藻、与良内院、久和、日掛の5地区に限って分布する。(2)花こう岩体の帯磁率は、2×10^<-6>922×10^<-6>emu/gの広範囲の値を示し、岩体中心から接触面に向かって高・中・低帯磁率ゾ-ンが帯状に配列する。(3)接触面近くで帯磁率が著しく低下する原因は、被貫入泥質岩中の炭質物が花こう岩マグマの酸素分圧をバッファ-したことによると考えられた。(4)大船越地区において新たに15の鉱脈露頭が見つかり、その試料が検討された。(5)当地区の鉱物組み合わせ及び脈構造・鉱石組織等は、佐須地区の安田・大正鉱床のそれと良く類似しており、同試料についての流体包有物の充填温度・塩濃度の値もそれを裏付けるものであった。(6)天熊鉱山の石英脈中に輝コバルト鉱がはじめて確認され、同様にその近くの3ケ所の旧坑鉱石中にもコバルトやビスマス元素が含まれていることから、佐須地区南部では花こう岩体に近接してコバルト・ビスマス鉱化帯が設定でき、それが与良内院地区まで延びる可能性がでてきた。(7)内山花こう岩体の石英中の流体包有物は、300°C520°Cの充填温度と3861wt%の高い塩濃度を有し、高密度高塩濃流体が金属鉱化作用に関連していたことが確認された。(8)内山花こう岩体を中心に発達した電気石グライゼン帯、コバルト・ビスマス帯、硫化鉄帯、鉛亜鉛帯という対馬下島での広域鉱化ゾ-ニングは、それに関与した鉱化流体の温度と塩濃度が天水との混合で漸移的に減少したという成因モデルを支持しているが、今後は流体包有物の酸素・水素同位体比測定等による検証がさらに必要である。本年度の研究計画は、対馬内山花こう岩体自身の地質学的並びに物理化学的キャラクタリゼ-ションを目標としてはじまったが、この目標はほぼ予定通り達成された。以下研究実績の概要を述べる。(1)現地踏査を実施した結果、内山岩体は対州層群(漸新世中新世初期)の背斜軸部に沿ってほぼコンコ-ダントに貫入したものであることが更確認された。(2)近年開設された林道等で、新鮮な露頭が観察され、ダ-クインクル-ジョンや硫化物、炭酸塩鉱物の産状が新たに詳しく記載され、同時に系統的サンプリングが実施された。(3)各露頭でカッパメ-タによる花こう岩類の帯磁率が測定された。その結果、帯磁率は2922×10^<-6>emu/gの広範囲をとり、しかも岩体周緑部(被貫入岩から150m以内)は低帯磁率帯、岩体核部(被貫入岩から350m以上はなれた部分)は高帯磁率帯となっていて、明瞭な異帯構造を示すことが明らかになった。(4)花こう岩類の化学組成はXRF法により得られたが、DI値が57.393.7を示し、しかも変化図上で同一トレンドをとることから、4地区に見かけ上分れて分布する花こう岩類はすべて1つのプルトンを形づくっていることが明らかになった。(5)花こう岩類中の石英に含まれる流体含有物は、冷却加熱装置下で測定され、均質化温度は320530°C、塩濃度は3760wt%NaCl相当濃度であることが判明した。(6)流体含有物の存在頻度を画像処理装置を用いて定量化することが試みられたが、プログラムソフトの改良によって、デ-タ処理上の基本的な問題は解決する見込みが得られた段階である。一方では、試料の観察断面域によって、流体含有物の大きさの分布、頻度分布が著しく異なることも明らかになり、このような不均質性をどう定量化してゆくか、新たな問題点も生じている。以上の結果は、研究課題の目的を達成するうえで基礎的で重要なものであり、次年度の研究計画の結果とともに総括して結論を導きたい。

(5)当地区の鉱物組み合わせ及び脈構造・鉱石組織等は、佐須地区の安田・大正鉱床のそれと良く類似しており、同試料についての流体包有物の充填温度・塩濃度の値もそれを裏付けるものであった。(6)天熊鉱山の石英脈中に輝コバルト鉱がはじめて確認され、同様にその近くの3ケ所の旧坑鉱石中にもコバルトやビスマス元素が含まれていることから、佐須地区南部では花こう岩体に近接してコバルト・ビスマス鉱化帯が設定でき、それが与良内院地区まで延びる可能性がでてきた。(7)内山花こう岩体の石英中の流体包有物は、300°C520°Cの充填温度と3861wt%の高い塩濃度を有し、高密度高塩濃流体が金属鉱化作用に関連していたことが確認された。(8)内山花こう岩体を中心に発達した電気石グライゼン帯、コバルト・ビスマス帯、硫化鉄帯、鉛亜鉛帯という対馬下島での広域鉱化ゾ-ニングは、それに関与した鉱化流体の温度と塩濃度が天水との混合で漸移的に減少したという成因モデルを支持しているが、今後は流体包有物の酸素・水素同位体比測定等による検証がさらに必要である。本年度の研究は長崎県対馬の内山花こう岩体周辺に分布する鉱脈の鉱化作用特性を明らかにし、花こう岩体との成因的関係を実証的に考察することが目的であった。研究成果は次の通りである。1)大船越地区(1)新たに15の鉱脈露頭が見つかり、その試料が検討された。(2)鉱脈の鉱物組み合わせは、基本的には磁硫鉄鉱及び石英からなり、硫砒鉄鉱、閃亜鉛鉱、黄銅鉱、方鉛鉱、黄鉄鉱、白鉄鉱、自然蒼鉛、緑泥石、方解石を随伴するが、鉱脈群による違いはほとんどない。(3)鉱脈の脈構造・鉱脈構成鉱物、鉱石組織等は、佐須地区の安田・大正鉱床のそれと良く類似する。(4)流体包有物の加熱冷却ステ-ジによる実験の結果、充填温度220゚380゚C、塩濃度は2.46.4wt%NaCl相当濃度が得られた。2)佐須地区南部(1)天の原、下県、元山道、古川、久根東部の各旧坑及び天熊鉱山探鉱坑道について鉱床調査を実施した結果、鉱脈の胚胎様式並びに鉱石鉱物の共生関係が判明した。(2)天熊鉱脈は'層面ひ'であって、石英ー黄鉄鉱脈からなるが、この脈には輝コバルト鉱が特徴的に伴なわれることが明らかになった。(3)下県、元山道、古川の鉱脈ではCo及びBi品位が0.1%程度確認されたことから、当地域にはCoーBi帯が広域鉱化ゾ-ニングとして設定出来る可能性が指摘された。3)内山花こう岩体と鉛亜鉛鉱化作用内山花こう岩体を中心に、電気石グライゼン帯、コバルトービスマス帯、硫化鉄帯、鉛亜鉛帯のゾ-ニングがあり、この鉱化作用に関与した流体は花こう岩マグマの後火成作用によりもたらされ、花こう岩体からの距離に応じて次第に天水との混合比が高くなって、その結果各種鉱脈の沈澱が生じたという成因モデルが成り立つことが明かになった。
ヒト分離胆道上皮細胞の胆管様管腔構造再生に及ぼす環境因子と人工胆道の開発について

(目的)ヒト正常肝臓から分離培養した肝細胞と胆道上皮細胞(BEC)をコラーゲン複層ゲル内で共培養するとBECが3次元の管腔様構造を形成するが、肝細胞の形態学的崩壊のため長期的な胆管再生の観察は困難であった。ヒト肝腫瘍由来有機能肝細胞株(FLC4)は、数ヵ月という長期間にわたり良好な培養が可能なためBECと共培養することで、胆管再生の長期的な観察が可能か検討した。(方法)1.コラーゲン複層ゲルの間にFLC4を5X10^5個とBECを共培養し経時的に位相差顕微鏡で形態学的変化を観察した。2.第1層目のコラーゲン・ゲルの上にFLC4または正常ヒト肝細胞株を5X10^5個蒔き、その上層にコラーゲン・ゲルの薄層を敷いた。この薄層上にBECを蒔き、経時的に位相差顕微鏡で形態学的観察をした。(結果)1.FLC4とBECとの共培養では、BECによる3次元の管腔様構造は観察されなかった。またFLC4はその数を急激に増し、短期間で細胞が過密状態となった。2.コラーゲン複層ゲル内で正常肝細胞またはFLC細胞がコラーゲン薄層を介し近接した状態でのBECの再生の過程を経時的に現在観察中である。(考察)培養液中にBECの増殖のため牛胎児血清、上皮成長因子や肝細胞成長因子を含有することが、FLC4の増殖を促進し短期間に過密状態となった。その結果としてBECとFLCとの細胞の比率は一定に保てず、viabilityの低下につながった事や組織適合性抗原などの相違が原因となり、BECの3次元胆管様管腔構造が観察されなかったと考えられた。方法2では、FLC4の腫瘍性増殖がBECの3次元管腔形成の障害になった可能性を考え、FLC4とBECとの間に薄層のコラーゲン・ゲルを敷いた。本法では組織適合性の問題は解決されないが、FLC4がその数を腫瘍性に増すことによる直接的な影響が排除されBEQの長期観察が期待される。われわれはヒト由来で同一個体の肝臓から分離培養した肝細胞と胆道上皮細胞をコラーゲン複層ゲル内で共培養すると胆道上皮細胞が3次元の管腔様構造を形成することを報告してきた。しかしこの管腔様構造は、肝細胞の形態学的崩壊が始まる培養7日目頃から崩壊が始まり長期的な胆管再生の観察は困難であった。これらの欠点を克服するために、数ヶ月という長期間にわたり良好に培養が可能なヒト肝腫瘍由来有機能肝細胞株(FLC)を胆道上皮細胞と共培養することで、胆管の再生を長期的に形態学的観察することが可能であるか検討した。直径35mmのカルチャープレート上にコラーゲン・ゲルを1mlずつひきコラーゲン・ゲル第一層を作成し、このゲルの上にFLCを5×10^5個蒔き、胆道上皮細胞共培養への準備とした。しかし培養液中にFetal calf serum(FCS)、endothelial growthfactor(EGF)やhumanhepatocyte growth

factor(hHGF)が含まれているとFLCはその数を腫瘍性に増殖し、短期間でカルチャープレート内に細胞が過密状態になってしまうことが判明した。このため胆道上皮細胞との細胞数の比率も一定にすることができず、結果としてviabilityの低下を起こすこともしばしばであった。これらの問題を解決するためFLCの増殖能に対応したより大きなカルチャープレートでの培養系の確立も考えたが、胆道上皮細胞との細胞比率の問題が解決できなかった。現在はFLCの培養系に加え、コントロールとして市販されている正常ヒト肝細胞のCell Systemを使用した培養系も比較することで、至適な細胞増殖因子の選択や胆管様腔構造再生に影響を及ぼす至適環境条件の検討を予定している。(目的)ヒト正常肝臓から分離培養した正常肝細胞と胆道上皮細胞(BEC)をコラーゲン複層ゲル内で共培養するとBECが3次元の管腔様構造を形成するが、肝細胞の形態学的崩壊のため長期的な胆管再生の観察は困難であった。ヒト肝腫瘍由来有機能肝細胞株(FLC4)は、数ヵ月という長期間にわたり良好な培養が可能なためBECと共培養することで、胆管再生の長期的な観察が可能か検討した。またコントロールとして正常ヒト肝細胞株(NKNT-3)を用いた。(方法)1.コラーゲン複層ゲルの間にFLC4またはNKNT-3を5X10^5個とBECを共培養し経時的に位相差顕微鏡で形態学的変化を観察した。2.第1層目のコラーゲン・ゲルの上にFLC4またはNKNT-3株を5X10^5個蒔き、その上層にコラーゲン・ゲルの薄層を敷いた。この薄層上にBECを蒔き、経時的に位相差顕微鏡で形態学的観察をした。(結果)1.NKNT-3株は培養7日目にはviabilityが著しく低下した。FLC4とBECとの共培養では、BECによる3次元の管腔様構造は観察されなかった。しかし培養7日目頃からBECは束状に集積し徐々に厚みを増すと同時にFLC4を圧排した。さらにBECの塊同士は細い突起を出して互いに連結していった。2.NKNT-3株またはFLC細胞がコラーゲン薄層を介し近接した状態でのBECの再生の過程を経時的に観察したが、BECを単独で培養した場合と形態的学に差は無かった。(考察)FLC4とBECを共培養しても、BECの3次元胆管様管腔構造は観察されなかった。しかし培養7日目以降BECが束状に塊を形成し、その塊同士が細い脚を出して癒合していく様子は新たな様式での胆管の再生を想起させた。間葉系細胞は比較的拒絶反応の問題も少ないといわれるが、今後もBECとの共培養系を作成して胆管の再生の可能性について検討していきたい。
アジア人種型糖尿病黄斑症の分子機構の解明

本研究は、糖尿病黄斑症、とくにアジア人種の2型糖尿病患者に見られる糖尿病黄斑症の分子メカニズムを明らかにすることを研究目的として実施した。また糖尿病黄斑症の治療薬として硫化水素ドナーが有用であるか明らかにすることを目的として実施した。1アジア人種型糖尿病黄斑症モデル動物の作製・・・Cdkal1欠損マウスに高脂肪食を60日間常食させ、糖尿病を惹起させた。高脂肪食負荷により2型糖尿病を発症したCdkal1欠損マウスの眼底に糖尿病黄斑症の特徴であるドルーゼン形成が認められた。さらに糖尿病を惹起させたCdkal1欠損マウス網膜において、脈絡膜に新生血管の形成、および網膜色素上皮細胞間に離間している部位が認められた。2アジア人種型糖尿病黄斑症モデルマウスの網膜色素上皮細胞におけるtRNA修飾とERストレスの検証・・・1で作製したアジア人種型糖尿病黄斑モデルマウスから網膜色素上皮を単離し、同上皮におけるtRNALys(UUU)のチオメチル化修飾について野生型マウスと比較検討した。糖尿病黄斑症モデルマウスの網膜色素上皮では、チオメチル化修飾が野生型マウスと比較して有意に低下していた。またERストレスマーカー遺伝子の発現について定量PCR法にて比較検討した。アジア人種型糖尿病黄斑症モデルマウスの網膜色素上皮では、Bip、Xbp1、Gadd34の発現が有意に上昇していた。3硫化水素ドナーの糖尿病黄斑症抑制効果の検討。。。アジア人種型糖尿病黄斑症モデルマウスならびに野生型マウスから網膜色素上皮にNaHSを添加し、チオメチル化修飾について質量分析法にて検討した。しかし、いずれの濃度のNaHSもチオメチル化修飾に影響を及ぼさなかった。同様に8-nitro-cGMP-HSも効果を示さなかった。以上の結果から、硫化水素ドナーは糖尿病黄斑症を抑制する効果は無いと結論づけた。26年度が最終年度であるため、記入しない。現在、2型糖尿病はアジア圏で爆発的に増加しており、それに伴いアジア人種の糖尿病黄斑症は増加している。また元来アジア人種は糖尿病性黄斑を発症しやすいことが知られていたが、その分子機構は未だ不明である。本研究では、我々がこれまでに作製したアジア人種型2型糖尿病モデルマウスを用いて、糖尿病黄斑症の分子機構を明らかにし、同疾患の治療薬の候補となる化合物、分子の同定を行う。特にぶどう糖毒性により網膜色素上皮細胞が変性、細胞死を起こす分子機構を明らかにすることを目的として、研究を実施する。今年度は、上記目標を達成するために、アジア人種型糖尿病黄斑症モデル動物の作製を行った。具体的には、我々がすでに作製しているCdkal1欠損マウスに高脂肪食を60日間常食させ、糖尿病を惹起させた。その後、空腹時血糖、糖負荷試験、さらにぶどう糖応答性血中インスリン濃度を測定し、2型糖尿病を発症していることを確認した。高脂肪食負荷により2型糖尿病を発症したCdkal1欠損マウスおよびコントロールの野生型マウスの網膜を検眼鏡的にドルーゼン形成が認められるか検討した。糖尿病黄斑症の特徴である眼底にドルーゼン形成が認められた。一方、コントロールの野生型マウスではドルーゼン形成が認められなかった。さらにこれらマウスから網膜を摘出し、組織切片を作製した。H.E.染色を行い、糖尿病黄斑症の特徴である脈絡膜新生血管形成、網膜色素上皮細胞間の接着構造障害が認められるか検討した。すると、糖尿病を惹起させたCdkal1欠損マウス網膜において、脈絡膜に新生血管の形成、および網膜色素上皮細胞間に離間している部位が認められた。以上のことから、高脂肪食を負荷したCdka11欠損マウスは、アジア人種型糖尿病黄斑症モデル動物として有用であることが明らかになった。今年度は、上記目標を達成するために、昨年度作製したアジア人種型糖尿病黄斑モデルマウスから網膜色素上皮を単離し、同上皮におけるtRNA^<Lys (UUU)>のチオメチル化修飾について野生型マウスと比較検討した。糖尿病黄斑症モデルマウスの網膜色素上皮では、細胞質tRNA^<Lys (UUU)>ならびにミトコンドリアtRNA^<Lys (UUU)>のチオメチル化修飾が野生型マウスと比較して有意に低下していた。またアジア人種型糖尿病黄斑症モデルマウスならびに野生型マウスから網膜色素上皮を上述の方法で採取し、同上皮からRNA抽出した。その後、ERストレスマーカー一遺伝子(Bip、chop、Elf2、xbp1のスプライシングフォーム,全長Xbp1、Gadd34)の発現について定量PCR法にて比較検討した。

アジア人種型糖尿病黄斑症モデルマウスの網膜色素上皮では、Bip、Xbp1のスプライシングフォームならびにGadd34の発現が、野生型マウスと比較して有意に上昇していた。一方、Chop、Elf2、全長Xbp1の発現は、野生型マウスと同レベルであった。以上の結果から、アジア人種型糖尿病黄斑症の網膜色素では、tRNA修飾の低下が起こり、その結果異常なタンパク質の翻訳が生じ、小胞体ストレスを誘発することが示唆された。本研究は、糖尿病黄斑症、とくにアジア人種の2型糖尿病患者に見られる糖尿病黄斑症の分子メカニズムを明らかにすることを研究目的として実施した。また糖尿病黄斑症の治療薬として硫化水素ドナーが有用であるか明らかにすることを目的として実施した。1アジア人種型糖尿病黄斑症モデル動物の作製・・・Cdkal1欠損マウスに高脂肪食を60日間常食させ、糖尿病を惹起させた。高脂肪食負荷により2型糖尿病を発症したCdkal1欠損マウスの眼底に糖尿病黄斑症の特徴であるドルーゼン形成が認められた。さらに糖尿病を惹起させたCdkal1欠損マウス網膜において、脈絡膜に新生血管の形成、および網膜色素上皮細胞間に離間している部位が認められた。2アジア人種型糖尿病黄斑症モデルマウスの網膜色素上皮細胞におけるtRNA修飾とERストレスの検証・・・1で作製したアジア人種型糖尿病黄斑モデルマウスから網膜色素上皮を単離し、同上皮におけるtRNALys(UUU)のチオメチル化修飾について野生型マウスと比較検討した。糖尿病黄斑症モデルマウスの網膜色素上皮では、チオメチル化修飾が野生型マウスと比較して有意に低下していた。またERストレスマーカー遺伝子の発現について定量PCR法にて比較検討した。アジア人種型糖尿病黄斑症モデルマウスの網膜色素上皮では、Bip、Xbp1、Gadd34の発現が有意に上昇していた。3硫化水素ドナーの糖尿病黄斑症抑制効果の検討。。。アジア人種型糖尿病黄斑症モデルマウスならびに野生型マウスから網膜色素上皮にNaHSを添加し、チオメチル化修飾について質量分析法にて検討した。しかし、いずれの濃度のNaHSもチオメチル化修飾に影響を及ぼさなかった。同様に8-nitro-cGMP-HSも効果を示さなかった。以上の結果から、硫化水素ドナーは糖尿病黄斑症を抑制する効果は無いと結論づけた。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画していた研究をすべて実施することができた。そしてこれまで存在しなかったアジア人種型糖尿病黄斑症モデル動物の作製に成功した。そしてアジア人種型糖尿病黄斑症モデル動物においてtRNA修飾が減少していること明らかにした。本成果は、同疾患の原因解明に繋がることが期待でき、研究は順調に進展していると考える。当初計画していたとおりの研究を実施する。具体的には、平成24年度に作製したアジア人種型糖尿病黄斑症モデル動物を用いて、同マウス網膜色素上皮におけるtRNA修飾と小胞体ストレスについて、コントロールマウスと比較検討する。tRNA修飾については、我々が開発したtRNA直接逆転写PCR定量法で、また小胞体ストレスについては、小胞体ストレスマーカー遺伝子の発現について定量PCR法にて比較検討する。
高配位典型金属化合物の異常原子価

超原子価をもつ4配位(10-X-4)・5配位(10-X-5)・6配位(12-X-6)のリン・アンチモン・ビスマスを中心原子とする有機典型元素化合物をMartinリガンドを用いて安定化し,合成・単離に成功した。アート錯体であるアンチン・ビスマスの10-X-4化合物をX線回折により構造を精密に解析した。(秋葉)スルホニル基とビスマス原子の渡環相互作用による超原子価結合の生成を鍵段階とする立体選択的反応を開発した。(鈴木)ナフタレンの1,8-位に電子求引基をもつシリル基とジメチルアミノ基を配置すると,ケイ素一窒素間に超原子価結合が生成することを証明し,ケイ素上の置換基のカップリング反応を行った。(玉尾)生理活性物質プロスタグランジン合成の鍵反応の中間体として超原子価をもつスズアート錯体(10-Sn-5)が存在することを見い出した。基本的構造をもつスズアート錯体を合成・単離し,メスバウアー効果・X線回折・DynamicNMR等により構造および結合の性質を解明した。(野依)異常原子価をもつジオキサチアペンタレン類が生体内において活性酸素種O^-_2を生成することを見い出した。大腸菌存在下で,各種のジオキサチアペンタレンが多量のO^-_2を生成することをスーパーオキシドディスムターゼ添加実験等から明らかにし,大腸菌生育に対する阻害効果と活性酸素増産能,ジオキサチアペンタレンの酸化還元電位との間によい相関があることを明らかにした。(広部)トリメチルシリル基をフッ素アニオンで脱離させ,反応系中に活性な1,3-双極子を発生させ,ヘテロ原子を含む各種5員環化合物の新規合成法を開発した。(細見)超原子価をもつ4配位(10-X-4)・5配位(10-X-5)・6配位(12-X-6)のリン・アンチモン・ビスマスを中心原子とする有機典型元素化合物をMartinリガンドを用いて安定化し,合成・単離に成功した。(細見)
ラット実験モデルによる拘縮時の組織変化に対する神経系の関与についての検討

ラット脊髄損傷モデルにおける、関節構成体および坐骨神経周囲の病理組織学的変化について、キルシュナー鋼線を用いたラット膝関節拘縮モデルと比較した。結果、膝関節拘縮モデルで出現した、関節構成体の進行性の病的変化は、脊髄損傷モデルではほとんど見られなかった。一方、坐骨神経周囲の変化は類似していた。この結果から、拘縮時の関節構成体の病的変化には、体性神経and/or自律神経の何らかの関与が示唆される。ラット脊髄損傷モデルを用いて、正常コントロール群、脊髄損傷群、脊髄損傷+関節固定群間の比較を行ったところ、脊髄損傷群では、損傷1週での滑膜では、微小血管の拡張およびうっ血像、滑膜の乳頭状増生が確認された。損傷2週では、軽度の小型リンパ球の浸潤を認めた。これらの変化は損傷2週でさらに進行し、増加を認めたが、損傷4週では減少に転じ、8週、12週では減少された状態が維持されていた。関節軟骨の状態として、損傷1週において紡錘型細胞からなる膜状の組織が大腿骨および脛骨の軟骨表面を覆うように増生を認めた。この増生は損傷2週でさらに進展を認めたが、損傷4週では損傷2週と同様でそれ以上の増生を認めなかった。損傷8週および12週では、増生変化の減少を認めていた。損傷1週の脂肪細胞は、対象群と比較して脂肪細胞に変化を認めなかった。損傷2週では脂肪細胞の萎縮および線維化を認めた。損傷4週では正常化傾向に転じ、損傷8週および12週の脂肪細胞は、軽度の萎縮で維持されていた。このような組織学的変化は、脊髄損傷+関節固定群においても、ほぼ同様の結果となり、先行研究にて、ラット関節拘縮モデルで見られた、関節軟骨の変成と置換、軟骨表面を覆う膜状組織と滑膜の癒着、関節空の狭小化、脂肪体の脂肪細胞の萎縮と線維化といった進行性の変化は、ごく軽度にとどまるか、ほとんど観察されなかった。以上の結果から、ラット関節拘縮モデルで観察されていた進行性の病的変化には、神経系が関与しており、神経系の関与により病的変化が引き起こされること、逆に神経系の関与を排除すると、この病的変化が抑制されることが示された。今後は、この関与の実態について、それが感覚入力に依存したものなのか、自律神経に依存したものなのか、あるいは神経系のコントロールを離れることによる、局所環境的な要因なのかについての見当が必要と考えられる。2012年までにおけるラットを用いた実験の結果、大腿神経切断群および大腿神経切断+固定群の関節軟骨は、コントロール群と同様の硝子軟骨からなり、変性像や不整は見られなかった。この結果は、先行研究における関節固定モデルで観察された、関節軟骨の変性や滑膜組織の肉芽様の増生、癒着などの変化とはまったく異なっており、大腿神経の切断によってこれらの変化が大きく抑制された可能性が示唆された。この結果は、本実験系の成果により初めて明らかにされたことであり、関節拘縮時における関節構成体の組織学的変化の機序に、何らかの神経系の関与があることを示している。このまったく新しい知見により、関節拘縮の予防や治療についての今後の研究に、大きく貢献するものと期待される。また、現在論文を作成し、投稿中である。【対象と方法】対象は9週齢のWistar系雄性ラットを使用した。ラットを無作為に大腿神経切断群(n=6)、大腿神経切断+固定群(n=6)、対照群(n=6)の3群に分けた。大腿神経の切断は大腿前部より切開し、大腿神経を切断した。大腿神経切断+固定群においては神経切断後にキルシュナー鋼線と長ねじによる創外固定を用いて膝関節屈曲120°で固定した。実験群は全てラットの右後肢に施行した。飼育期間および実験期間は2週間とした。実験期間終了後、膝関節を矢状断にて切り出し、ヘマキシリン・エオジン染色を行い、光学顕微鏡下で膝関節の関節構成体を病理組織学的に観察した。なお、本実験は金沢大学動物実験委員会の承認を受けて行われたものである。【結果】大腿神経切断群では、関節軟骨はコントロール群と同様の硝子軟骨からなり、変性像や不整は見られなかった。大腿神経切断+固定群においてもこれらの所見と差異はなく、コントロール群と同様であった。【考察】先行研究において、大腿神経切断モデルの関節構成体を観察したところ、その変化は極めて軽微にとどまり関節固定モデルでの関節構成体の変化とは大きく異なっていた。そこで本研究では、大腿神経の切断に膝関節固定を施行し、受動運動が関与しないモデルを作成した。

大腿神経切断に膝関節固定を施行し、後肢に加わる受動的な運動を抑制しても、大腿神経切断群や対照群と類似した結果となり、先行研究における関節固定モデルで観察された関節軟骨の変性や滑膜組織の肉芽様の増生、癒着などの変化はほとんどみられなかった。つまり、大腿神経の切断によってこれらの変化が大きく抑制された可能性が示唆された。研究実績の概要に示した如く、ラット脊髄損傷モデル、ラット拘縮モデルを組み合わせることにより、関節拘縮時の関節構成体に起こる進行性の病的変化に、神経系が深く関与していることが示され、研究の目的は概ね達成されつつある。後はこの結果を論文発表し、かつ国際学会で発表することで、研究者の間でのディスカッションを行って行くことで、さらなる知見を深めたい。ラット抹消神経切断モデルと創外固定拘縮モデルを組み合わせることで、関節拘縮時に発生する関節構成体の進行性の変化、具体的には関節軟骨表面に形成される膜状組織、滑膜の増生と軟骨の置換、癒着、関節腔の狭小化などの変化が、大腿神経を切断することで大幅に抑制されることが示され、関節拘縮における関節構成体の病態に、神経系の要素が関与している可能性が示された。今後は、この神経系の関与の実態がどのようなものなのか、感覚入力の喪失によるものなのか、自律神経の異常によるものなのか、それとも神経系のコントロールの喪失そのものに伴う、局所環境の変化(能動的or受動的?)に伴うものなのか、新たな仮説の元に、その検証が可能な実験系についての検討を行う。今後は、関節構成体だけでなく軟部組織、とりわけ坐骨神経周囲の変化について検討する。ラット創外固定拘縮モデルを用いた検討により、拘縮時の坐骨神経束は神経周膜最内層と密着すること、同心円状構造をした神経周膜同士も密着し肥厚することを報告してきたが、これが大腿神経切断による影響を受けるどうかを検討する。また、この神経束と神経周膜の密着が「接着」であるかどうかを、免疫染色を用いて検討する。今年に引き続きラットを用いた動物実験を行う。また、拘縮時の坐骨神経周囲に発生する密着について、NCAM、カドヘリン、インテグリン、ラミニン、フィブロネクチン等の免疫染色を行うことで、それが「接着」であるのかどうかを検討する。また、学会発表を行う。
細胞周期が白金製剤と光化学治療の併用に及ぼす影響に関する研究

臨床で最も使用されている白金製剤の一つであるシスプラチン(CDDP)と光化学治療(Photodynamic therapy : PDT)の併用についてHeLa細胞を用いた研究を行った。CDDPの併用はPDTの前後で行い殺細胞効果を比較した。研究の結果からは、CDDPとPDTを併用すると、それぞれ単独の場合に比較して明らかに殺細胞効果の向上が認められた。併用効果はCDDPの濃度と併用順序に相関が認められた。CDDPの濃度が高くなるにつれ、殺細胞効果の向上が認められた。併用順序に関してはPDTの前にCDDPを作用させた場合が、PDTの後にCDDPを作用させるよりも殺細胞効果が高いとの結果が得られた。フローサイトメーターを用いた細胞周期の解析では、CDDPの濃度の上昇、および接触時間の延長にともない、細胞全体がS期に集積する傾向が認められた。PDTはS期の細胞に最も効果が高いと言われている。本研究の結果はPDT前のCDDPとの接触により、細胞周期がS期に同調されたことによるPDT効果の増強によるものと考えられた。本研究の結果は、実際の臨床の場においてもCDDPの事前投与、あるいは持続投与を行いながらのPDT施行の有効性を示唆すると考えられた。さらに二つの治療方法を併用することで、薬剤濃度を減量させても治療効果の向上が期待され、副作用の軽減にも役立つものと考えられた。結果1)PDTとCDDPを併用するとPDT単独の場合と比較して、有意に殺細胞効果の増強が認められた。結果2)PDTとCDDPの併用順序に関してはPDTに先立ちCDDPと細胞を接触させておくことで、PDT後にCDDPと接触させた場合と比較して有意に殺細胞効果の増強が認められた。結果3)PDTとCDDPの併用ではPDT前にCDDPと接触させた場合は相乗効果を示し、PDT後に接触させた場合は相加効果を示した。結果4)上記の結果は感光色素、CDDPの濃度を変化させた場合も同じであった。結果5)濃度を変化させた場合は、感光色素、CDDPともに高濃度の組み合わせが高い殺細胞効果を示した。結果6)CDDPを先行させた場合に殺細胞効果が高くなる理由として、CDDPによる細胞周期S期への集積が原因と考えたがフローサイトメーターでの解析では細胞のS期への集積は認められなかった。以上の結果について以下の学会で発表した1:第10回国際光線力学学会日本支部研究会2000年6月岩見沢2:第21回日本レーザー医学会総会2000年11月東京現在検討中の項目現在以下の項目について検討中である。項目1)CDDPの併用順序による殺細胞効果の違いについてCDDP接触後の細胞の細胞周期とPDT後の細胞の細胞周期の違いを解析中。項目2)併用療法における細胞内標的器官の特定について経時的に電子顕微鏡標本を作成し検討を行っている。現在までの範囲では早期からミトコンドリアの変化が認められており、ミトコンドリアが標的器官の一つと考えられる。さらに細胞質内にも変化が認められる。
悪性中皮腫細胞の細胞運動能におけるヒアルロン酸とCD44の関与機序の解明

上皮型のヒト悪性中皮腫に由来する悪性中皮腫細胞HMMMEを用い、ヒアルロン酸と断片化ヒアルロン酸、また、ヒアルロン酸の主たるレセプターであるCD44の相互作用が、浸潤能の高い悪性中皮腫細胞の細胞運動能に如何に関与しているかを検討してきた。ヒアルロン酸投与下で運動能の増加を認め、これはCD44のブロッキング抗体で抑制された。また、ヒアルロン酸投与によりCD44の発現が高度に誘導されることを見いだした。以上のことから、ヒアルロン酸投与により発現が誘導された細胞表面のCD44と、ヒアルロン酸の結合が運動能の増加をもたらすことが考えられた。また、各CD44のvariantに対する抗体を用いたWestern blotting解析の結果、運動先端部分の細胞では、standard formのCD44の発現の減弱と相まって、variant3(v3)の発現が誘導されることがわかり、悪性中皮腫細胞の運動能にはCD44のvariant form特にv3が関与することが示唆された。さらに、各細胞分画に分けて検討したところ、特に、細胞膜でのV3の発現に顕著な誘導を認めた。一方、断片化ヒアルロン酸投与では、運動能の増加は認められなかったが、CD44のブロッキング抗体を処理して断片化ヒアルロン酸を投与すると約20%の運動能の増加を認め、運動能に断片化ヒアルロン酸が関与することが示唆された。そこで、悪性中皮腫細胞において、ヒアルロン酸の細胞内への取り込みにCD44が関与し、さらに細胞内でヒアルロニダーゼによる消化を受け断片化ヒアルロン酸が産生されているか、否かを検討するために、zymographyによりヒアルロニダーゼ活性を検討した。この結果、ヒアルロン酸投与により悪性中皮腫細胞のヒアルロニダーゼ活性が上昇することが示され、CD44のブロッキング抗体処理によりそれが阻害された。上皮型のヒト悪性中皮腫に由来する悪性中皮腫細胞HMMMEを用い、ヒアルロン酸と断片化ヒアルロン酸の中皮腫細胞の細胞運動能の関与についてwound assayにより検討した。ヒアルロン酸投与下で約25%の運動能の増加を認め、これはCD44のブロッキング抗体で抑制された。一方、断片化ヒアルロン酸投与では、運動能の増加は認められなかった。また、wound assayのシステムを用いて、運動している細胞においてCD44の発現がどのように変化するかを免疫組織学的に検討したところ、運動最先端の細胞膜に有意にCD44の高発現を認めた。レーザー焦点顕微鏡を用いた細胞内局在の詳細な観察ではCD44は、運動最先端の細胞で高発現であり、phalloidinを用いたf-actinとCD44の二重染色では、運動先端部のphyllopodiaの細胞膜でCD44とf-actinの共存を認めた。以上の結果は、悪性中皮腫細胞において完全型ヒアルロン酸とCD44の相互作用が細胞運動能に関与することを示唆する結果と考えた。さらにCD44の内どのvariant formが特に細胞運動と関与するかを知る目的で、CD44 variant 3 (v3),CD44v4/5,CD44v6に対する各抗体を用いて、免疫細胞学的検討した結果、運動先端部分の細胞ではvariant3(v3)の発現が細胞全体に有意に誘導されることを見いだした。そこで、western blot法により、運動している細胞としていない細胞とでのCD44の発現様式の違いがあるか否かを検討した。運動していないconfluentcellでは、standard formとvariant formの発現を認めたが、wound assay後の細胞では、variant formが有意に増加し、逆にstandard formは減少した。

この結果、ヒアルロン酸投与により悪性中皮腫細胞のヒアルロニダーゼ活性が上昇することが示され、CD44のブロッキング抗体処理によりそれが阻害された。
遺伝的ブロック単位の探索と、その重合化によるタンパク質立体構造再構築の試み

タンパク質の構築原理の問題に迫るアプローチの1つとして、試験管内タンパク質創成系実験を用いた構成的な研究アプローチが考えられる。前述したように、現存するタンパク質・遺伝子の観察からは、「繰り返し」が重要な意味を持つらしいことが示唆される。では、単一の遺伝的ブロック単位を単純に「繰り返す」ことから、タンパク質・遺伝子らしきものが試験管の中で発生するのであろうか?マイクロ遺伝子重合法を用いた方法からこの問題にアプローチした。これは、DNAポリメラーゼがもつDNA連結反応を利用したもので、1対のオリゴヌクレオチドとDNAポリメラーゼを用いたサイクル反応からなる簡単な反応系である。1対のオリゴヌクレオチドは、それらのプライマーダイマーがマイクロ遺伝子配列を再構成するように、互いの3′領域で相補塩基対を形成するようにデザインしておく。オリゴヌクレオチドの3′末端にミスマッチ塩基を付加しておくことが、効率よくMPRを進行させるポイントとなる。サイクル反応の後、マイクロ遺伝子の重合した巨大DNAが得られるが、マイクロ遺伝子の連結部には、ランダムに塩基の欠失・挿入がおこるため、得られたDNAは分子多様性集団としての性質をもつ。すなわち、このようなマイクロ遺伝子重合体から翻訳されるタンパク質は、マイクロ遺伝子のもつ複数の読み枠のコンビナトリアルな重合体産物となる。種々の長さ、組成をもつマイクロ遺伝子を出発材料とし、これらを重合して得られたNDAライブラリー大腸菌の中で産出するタンパク質をいくつか調べた。その中の1つ、クローン320は、CD測定から、2次構造を形成していることが示唆された。「繰り返し」を制約文法にすることによって、自然のタンパク質に似た人工タンパク質が意外と簡単に試験管の中で創発するのかもしれない。