hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
田園都市計画思想の世界史的展開に関する研究(発展途上地域(東南アジア)におけるその受容と変容)

E.ハワードが唯一現存する都市として言及したアデレードのC.C.リードとミッチャム・ガーデン(コーネル・ライト・ガーデン)については具体的調査をもとにした論考をまとめた。A.トンプソンとパインランズ(ケープ・タウン、南アフリカ)については論文をまとめる作業を続行中である。具体的な調査として、インドでカルカッタのガーデン・ハウスが面的に建設されたチョウリンギー地区、ムンバイ(ボンベイ)のチョウル密集地区、チェンナイのガーデンハウスについての資料を収集した。東南アジアについてはマレーシアおよびインドネシアについて資料収集を行った。来年度に向けて、以上の事例を中心として、「田園都市計画思想の世界史的展開」をめぐってまとめとしたい。昨年度からの作業として、R.ホームRobert HomeのOf Planting and Planning The making of British colonial citiesを翻訳刊行することができた。(植えつけられた都市英国植民都市の形成、ロバート・ホーム著:布野修司+安藤正雄監訳、アジア都市建築研究会訳,京都大学学術出版会,2001年7月)。具体的なまとめの作業としては、ケープタウンのパインランズについて、また、C.C.リードとコーネル・ライト・ガーデン(アデレード)について論文をまとめた。また、インドでカルカッタのガーデン・ハウスが面的に建設されたチョウリンギー地区について論文をまとめることができた。バーナムのバギオ、マニラ、リードのクアラルンプール、リチャーズのシンガポール、ポントのスラバヤ・マラン、カールステンのスマランなど、東南アジアをめぐっては、残念ながら論文をまとめるに至らなかったが、英領マラヤについて先行してある程度の情報を整理することができた。東南アジアのニュータウン計画の分析については、必ずしも十分な展開ができたとは言えない。特にターゲットとしたインドネシアが経済危機、政治危機で思うような資料が収集できなかったからである。
フォトニックインターネットのための大容量トラヒックの収容設計に関する研究

WDM技術によってネットワークに収容可能なトラヒック量が増大するにともない、ネットワーク機器の障害が発生した時のデータ損失量も大きくなる。そのため、障害からの復旧手法としてWDMを用いたプロテクション方式が考えられている。一方、光通信技術の進展にともない波長変換技術の実現が現実的になりつつあるが、波長変換の技術的な実現性が満たされたとしても、光パスネットワーク全体に波長変換器を導入するのは高コストとなる。本研究では、フォトニックネットワークにおいて信頼性を高めつつ、動的に変動するトラヒック要求に対応するための波長変換器配置問題に取り組んでいる。本年度は、波長分割多重技術に基づくWDMネットワークにおいて波長変換器の配置問題と経路選択手法を検討し、計算機シミュレーションにより評価を行った。まず、計算機シミュレーションを用いて波長変換器の不足しているノードに優先的に波長変換器を配置するアルゴリズムを提案した。次に、階層グラフを用いた波長ルーティングアルゴリズムを提案した。波長ルーティングアルゴリズムでは、利用可能な波長変換器を効率的に利用するように資源コストを設定することで、適切なプライマリパスとバックアップパスを選択している。計算機シミュレーションの結果、ノードの波長変換器数を25%に抑えたとしても、棄却性能の劣化がほとんどみられず、波長変換器が十分にある場合と同等の性能を達成できることを明らかにした。
生体系を模倣した刺激応答性ナノ分子システムの創製

本研究で目的とする多回膜貫通タンパク質を模倣した両親媒性マルチブロック分子構築において,親水部として利用するオリゴエチレングリコールを簡便に合成する手法について検討を行った。その結果,精製プロセスにおいて,クロマトグラフィーによる精製を一切使用せず,大スケールで目的とする単分散オリゴエチレングリコールを得る手法の開拓に成功した。実際,この手法により,オリゴエチレングリコール8量体,12量体,16量体を,短時間で数十グラムというスケールで得ることができた。これをもとに以下に示す両親媒性マルチブロック分子の構築を検討した。(1)多回膜貫通タンパク質を模倣した直鎖状両親媒性マルチブロック骨格の構築外部刺激応答性を有する両親媒性マルチブロック骨格疎水部として,オルト位に置換基を有するビピリジル部位,親水部としてオリゴエチレングリコールを有する直鎖状両親媒性マルチブロック骨格の構築を試みた。その結果,疎水部の繰り返し単位数が1および3の分子を得ることに成功した。さらに,副生成物として,疎水部に複数のビピリジル部位が導入された分子の合成にも成功した。これらを用いることで,刺激応答性に対する疎水部繰り返し数および分子長の影響について評価が可能になると期待される。(2)熱応答性を示す環状分子骨格の構築熱応答性を示す分子の構築を目的として,両親媒性マルチブロック構造を環状化した分子の合成を検討した。その結果,疎水部としてトラン骨格,親水部としてオリゴエチレングリコールを有する分子の合成に成功した。さらに,疎水部の構造を変化させた誘導体の合成にも成功した。これらにより,分子構造と熱応答性の相関について評価が可能になると期待される。本研究計画の遂行において,目的物質の合成ルートの確立は最も重要なプロセスである。対象物質が,水と有機溶媒の両方に親和性をもつ両親媒性分子であること,さらに分子量が比較的大きく,通常の小分子化合物とは異なる振る舞いをすることが予想される中高分子化合物であること,この二つの要因が目的物質の合成や取り扱いを困難にすることが予想された。このような背景のもと,親水部の最も重要な骨格である単分散オリゴエチレングリコールの大量合成法の確立に成功したことは,目的分子の合成ルート確立に向けた大きな進歩と言える。これにより,様々な分子設計が可能となった。さらに,実際に目的物質の基本骨格である直鎖状ならびに環状の両親媒性マルチブロック分子の構築にも成功している。当初想定された合成上の問題がほぼ解決されたと見なされることから,研究計画はおおむね順調に進展しているとの判断に至った。基本的な物質合成ルートについては目途をつけることができたため,今後は刺激応答性について検討する計画である。具体的には、以下について検討する。(1)光応答性の付与(2)リガンド応答性イオンチャネルの高機能化(3)熱応答性分子の構築(4)膜貫通回数の最適化本研究で目的とする多回膜貫通タンパク質を模倣した両親媒性マルチブロック分子構築において,親水部として利用するオリゴエチレングリコールを簡便に合成する手法について検討を行った。

基本的な物質合成ルートについては目途をつけることができたため,今後は刺激応答性について検討する計画である。具体的には、以下について検討する。(1)光応答性の付与(2)リガンド応答性イオンチャネルの高機能化(3)熱応答性分子の構築(4)膜貫通回数の最適化
我が国の少子化対策に貢献する在日コリアンコミュニティの家族形成の実態解明

本研究では、コリアタウンに居住する在日コリアンはその他の地域に居住する在日コリアンと比較して子どもの数が多いという先行研究結果に着目し、在日コリアンコミュニティ内にどのような子育て支援になりうる資源があり、子育て期の男女がどのようにその資源を活用しているのかについて明らかにすることを第1の目的としている。また、伝統的に家事育児の多くを担っている在日コリアン母親たちの育児支援のニーズを明らかにし、ニーズに沿った育児支援について検討することを第2の目的としている。その上で、それらの結果を育児期の日本人母親や日本の大都市コミュニティに当てはめることができるかどうかを考察し、日本のコミュニティで活用できる体制作りを検討することを最終目的としている。そのための第1段階として、在日コリアンコミュニティに居住する育児期の在日コリアン男女を対象とし、「現在の家族形成までの過程やその時々の思い」、「その際に活用していたソーシャル・キャピタルについて」、また「今後の家族形成の予定や希望」、「その際に活用していきたいソーシャル・キャピタルについて」、「自身の家族形成や育児を支えるソーシャル・キャピタルについて」などを聞き取り、明らかにする予定である。また、継続比較のための対極例として、在日コリアンコミュニティに居住する育児期日本人男女、在日コリアンコミュニティ以外に居住する育児期在日コリアン男女、日本人男女からも同内容を聞き取り、相違点と共通点について明らかにしていく。その結果を踏まえ、日本人と在日コリアンの家族形成の現状、意識、希望、不安やそれらに影響する要因(文化的背景や環境要因など)を量的な調査から明らかにし、家族形成に影響する項目の共通点と相違点を明確化し、今後の子育て支援の一助とする。文献検討および情報収集に時間を要してしまったこと、また当該分野の専門家からスーパーバイズを受けながら研究計画を再度見直し、修正しながら進めていることから、当初の計画よりもやや遅れている。しかし、当初予定していたインタビュー調査については、すでに学内での研究倫理委員会の承認を得ており、4月以降にインタビュー調査を実施するための対象者リクルートを行っている。コリアタウンに居住する在日コリアンおよび日本人男女、コリアンタウン以外に居住する在日コリアンと日本人男女のインタビュー調査については準備が整っているため、これからフィールドワークを実施する。在日コリアン母親および父親たちへの育児支援の一環として、在日コリアンの母親や父親たちが集う場所を利用した育児相談会の開催やセミナーの企画などを行っている。その際には、育児相談会と同時に母親たちがリラックスできる時間を提供する企画も同時に計画中である。また、その場を利用して、母親たちが活用しているソーシャル・キャピタルについての情報収集も同時に行うことを予定している。当初予定では、初年度にインタビュー調査とWebアンケート調査を予定していたが、再度情報収集を行いながら研究計画を再検討する中で、Webアンケート調査に先立ちインタビュー調査を実施し、そこから得た知見をもとに量的研究に取り組むことに計画を変更した。研究遂行にあたりスーパーバイズを受けながらインタビュー調査の準備を行い、研究対象者の選定方法や、インタビューガイドについてはすでに準備が整った段階である。
血管内皮細胞、線維芽細胞含有人工皮膚の作成

血管内皮細胞(EC)と表皮角化細胞(KC)からなるハイブリッド型人工皮膚の作製法としてFabrication法(組立法)とCoculture法(共培養法)とを検討した。Fabrication法ではKCとECとを別個に培養した後、コラーゲンゲルを添加したコラーゲンテンプレート上にECシートとKCシートを貼付して調整した。しかしFabrication法では堅固な培養皮膚を調整することは難しかった。一方Coculture法では、KCとECとの直接的な共培養は困難であり、真皮線維芽細胞(FB)の介在が必要であることがわかった。すなわち、血管内皮細胞を含有したBell型培養皮膚の構築法が、現時点では有効な方法と考えられた。次に、血管内皮細胞の同種移植の可能性を検討する目的で、インターフェロン-γ(INF-γ)処理前後におけるヒト血管内皮細胞(hEC)のT細胞活性化因子すなわち主刺激因子MHCクラスII分子や二次刺激因子B7などの発現を検索した。具体的にはチャンバースライド上で培養したECを100U/mlIFN-γで48時間インキュベーション後、4%パラホルムアルデヒドで固定し、抗HLA-DR抗体や抗B7抗体などを用いた免疫染色よりその発現を調べた。また、細胞接着分子ICAM-1やVCAM-1の発現も検討した。B7分子の表出しない非骨髄由来細胞がMHCクラスII分子を発現している場合、CD4^+T細胞の応答は、活性化ではなく免疫不応答になると言われている。マクロファージなどの骨髄由来細胞では、B7が陽性であるのに対してIFN-γ処理したECではB7は陰性であった。表皮角化細胞(KC)をIFN-γ刺激するとICAM-1やMHCクラスII分子は発現するがB7は陰性であり、ECもKCと同様な傾向を示している。同種EC移植によるCD4^+T細胞の応答は、活性化ではなく麻痺を誘導する可能性が示唆された。MHCクラスI分子の機能は低温処理により低下すると考えられているので、凍結保存したECはKCと同様に同種移植に利用できるものと思われる。Fabrication法ではKCとECとを別個に培養した後、コラーゲンゲルを添加したコラーゲンテンプレート上にECシートとKCシ一トを貼付して調整した。KCはShipley改変・BPE添加・高アミノ酸MCDB153(Clonetics,KGM)培地などで基底細胞を増殖した後、10%FBS添加DMEM(GIBCO BRM)でKCを重層化した。このKCシートをDispaseで剥離し、キチン膜をキャリアとしてコラーゲン型人工真皮上に移動した、一方、ECは、市販の細胞培養用ディッシュ上でBBE添加・改変MCDBl31(Clonetics,EGM)培地などで増殖させた後、感温性ディッシュ上に高播種密度で播種し、37°C、5%CO_2で24時間インキュベートして接着させた。コンシルエント状態のECシートを5°C、20minの低温処理して感温性ディッシュより剥離し、キチン膜をキャリアとしてコラーゲン型人工真皮上に移動した。しかし、Fabrication法では堅固な培養皮膚を調整することは難しかった。ー方Coculture法では、KCとECとの直接的な共培養は困難であり、真皮線維芽細胞(FB)の介在が必要であることがわかった。そこで血管内皮細胞を含有したBeII型培養皮膚の作成法を検討した。ヒト真皮線維芽細胞(FB)を播種密度1×10^5 cells/cm^2で0.2%コラーゲン中性溶液中に入れて37°Cでゲル化させ、10%FBS添加DMEM培地で7日間培養した後、収縮したFB含有コラーゲンゲル(培養人工真皮)をさらに1日だけEGMに培地変更して処理した。次に培養人工真皮中に高播種密度(3×10^4cells/cm^2)でヒト血管内皮細胞(EC)を注入してEGMで4日間培養した。最後に培養人工真皮上に高播種密度(6×10^4cells/cm^2)でヒト表皮角化細胞(KC)を播種してハイブリッド型人工皮膚(BeII型培養皮膚)を調整した。現時点では、有効な方法と考えられた。

また、細胞接着分子ICAM-1やVCAM-1の発現も検討した。B7分子の表出しない非骨髄由来細胞がMHCクラスII分子を発現している場合、CD4^+T細胞の応答は、活性化ではなく免疫不応答になると言われている。マクロファージなどの骨髄由来細胞では、B7が陽性であるのに対してIFN-γ処理したECではB7は陰性であった。表皮角化細胞(KC)をIFN-γ刺激するとICAM-1やMHCクラスII分子は発現するがB7は陰性であり、ECもKCと同様な傾向を示している。同種EC移植によるCD4^+T細胞の応答は、活性化ではなく麻痺を誘導する可能性が示唆された。MHCクラスI分子の機能は低温処理により低下すると考えられているので、凍結保存したECはKCと同様に同種移植に利用できるものと思われる。
プリオン高感度検出法を用いたヤコブ病タイプ鑑別診断法の開発とその分子機構の解明

プリオン病の一つである孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)はタイプにより予後の進行状況が異なる。本研究は孤発性CJDのタイプ分けを早期に鑑別可能とするパネルRT-QUIC法を構築するために行った。RT-QUIC法は、基質としてリコンビナントPrP(recPrP)を要するが、RT-QUIC法はこのrecPrPの配列に依存すると考えられている。そこで様々な変異recPrPを構築し、それを用いてQUIC法を試みた。その結果、リコンビナントやプログラム条件により、個々の脳乳剤間でわずかではあるがQUIC法感受性に様々な違いがみられた。本研究の目的は、孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)のタイプ分け(特にMM1とMM2)を早期に鑑別できるパネルRT-QUIC法を構築することである。RT-QUIC法は、異常型プリオン蛋白(PrP)を試験管内で増幅させる方法であり、超微量の異常型PrPが検出可能である。本法は基質としてリコンビナントPrP(recPrP)を要するが、RT-QUIC反応はこのrecPrPの配列に依存すると考えられている。そこで様々な変異recPrPを構築・精製し、プリオンタイプ特異的RT-QUIC法を構築する。平成26年度は、一アミノ酸を置換させた変異リコンビナントマウスPrPを作製した。変異PrPの遺伝子(マウスPrP(Q185R)、マウスPrP(Q218R)及びマウスPrP(Q218H)は当研究室に保存されている。これらの配列はPCRにより増幅後、リコンビナント作製用プラスミドpET11に挿入した。シークエンサーにより配列を確認した後、コンピテントセルBL21(DE3)に形質転換させた。これら大腸菌は大量培養し、変異recPrPを大量発現させ、精製した。精製したrecPrPsはRT-QUIC法に用いた。ヒトプリオンによる解析を行う前にマウス順応スクレイピー株(22L及びChandler)を用いてRT-QUIC法を行った。興味深いことに、recPrPの変異箇所の違いによりRT-QUIC法感受性において異なる結果が得られた。本研究の目的は、孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)のタイプ分け(特にMM1とMM2)を早期に鑑別可能とするパネルRT-QUIC法を構築することである。RT-QUIC法は、異常型プリオン蛋白(PrP)を試験管内で増幅させる方法であり、超微量の異常型PrPを数日で検出可能とする。本法は基質としてリコンビナントPrP(recPrP)を要するが、RT-QUIC法はこのrecPrPの配列に依存すると考えられている。平成27年度は、前年度までに構築・精製した一アミノ酸置換型recPrP(マウスrecPrP(Q185R)、マウスrecPrP(Q218R)及びマウスrecPrP(Q218H))を用いて様々なプリオン株でQUIC反応を調べた。マウス順応スクレーピー株(Chandler株及び22L株)を用いてQUIC法を行ったところ、興味深いことに、recPrPの変異箇所の違いによりQUIC法感受性において異なる結果が得られた。しかしながら、ヒトプリオン、CJD患者の髄液を用いてQUIC法を行ったところ、感受性において目立った違いは得られなかった。そこで、一アミノ酸置換型recPrPではなく、アミノ酸部分欠失型recPrP(デリーションミュータント)を構築した。今年度は、ヒトに注目し、ヒトrecPrPのデリーションミュータント(ヒトrecPrP(82-231)、ヒトrecPrP(97-231)、ヒトrecPrP(103-231)及びヒトrecPrP(121-231))の構築・精製を試みたところ、ヒトrecPrP(82-231)及びヒトrecPrP(97-231)の大量精製に成功した。変異recPrPの作製および解析など現在のところ順調に進んでいる。しかしながら、結果に差が観られたのはマウス順応プリオン株である。ヒトプリオン、CJDにおける株間を分離同定可能な変異体はまだ得られていない。急速な神経細胞変性をきたす致死性の疾患、プリオン病。その代表的な病気である孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)はタイプにより予後の進行状況が異なる。本研究の目的は、孤発性CJDのタイプ分けを早期に鑑別可能とするパネルRT-QUIC法を構築することである。そこで様々な変異recPrPを構築・精製し、プリオンタイプ特異的RT-QUIC法を導き出す。前年度までに、一アミノ酸置換型recPrPを数種類構築・精製し、様々なプリオン株(タイプ)を用いてQUIC反応を試みた。興味深いことに、マウス順応スクレーピー株においてrecPrPの変異箇所の違いによりQUIC法感受性において異なる結果が得られた。しかしながら、ヒトプリオン病、CJD患者の髄液を上記QUIC法に用いたところ、目立った違いはみられなかった。そこで平成28年度は、アミノ酸部分欠失型recPrPを数種類構築・大量精製した。

これらリコンビナントを用いてCJD患者由来脳乳剤のQUIC反応を試みたところ、リコンビナントやプログラム条件により、個々の脳乳剤間でわずかではあるがQUIC法感受性に様々な違いがみられた。この現象が如何にして得られるかを確かめるために、さらに細かく欠失させたリコンビナントを設計・構築した。今後、これらのリコンビナントを大量精製し、様々なCJDタイプの脳乳剤に対するQUIC反応に用いることでどのような結果が得られるかを検討する。最終的には、孤発性CJDのタイプを診断可能とする組み合わせ(パネルRT-QUIC法)を導き出す。プリオン病の一つである孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)はタイプにより予後の進行状況が異なる。本研究は孤発性CJDのタイプ分けを早期に鑑別可能とするパネルRT-QUIC法を構築するために行った。RT-QUIC法は、基質としてリコンビナントPrP(recPrP)を要するが、RT-QUIC法はこのrecPrPの配列に依存すると考えられている。そこで様々な変異recPrPを構築し、それを用いてQUIC法を試みた。その結果、リコンビナントやプログラム条件により、個々の脳乳剤間でわずかではあるがQUIC法感受性に様々な違いがみられた。変異recPrPの作製および解析など現在のところ計画どおりであることからおおむね順調に進んでいる。今年度までに構築した変異recPrPについて、二次構造の相違点を比較する。また、高精度のパネルRT-QUIC法を完成させるために、構築したrecPrPを用いてRT-QUIC法を行い、CJDのタイプ、MM1とMM2を鑑別できるリコンビナントの組み合わせを調べる。分子生物学平成26年度に作製した変異recPrPについて、二次構造の相違点を比較する。また、高精度のパネルRT-QUIC法を完成するために、さらに変異recPrPを構築する。一アミノ酸置換型だけでなく部分欠失型recPrPについてもいくつか作製し、RT-QUIC法を行い、MM1及びMM2を鑑別できるリコンビナントを決定する。今年度までに5種類の変異recPrPの作製に成功した。現在、2種の作製を試みている。これら変異リコンビナントの大量精製の際に使用するNi-NTAスーパーフローアガロースが高額であり、かつ、その後の2次構造解析、RT-QUIC反応に用いる試薬が無数にあるため、次年度使用額が生じたと考えられる。平成26年度は変異recPrPを3種作製した。現在、さらに異なる変異のrecPrPの作製を試みている。しかし、これら変異体の蛋白精製はまだ行っていない。この大量精製の際に使用するNi-NTAスーパーフローアガロースが高額であるため、次年度使用額が生じたと考えられる。パネルRT-QUICの高精度化のために、変異リコンビナントの大量精製およびその後のRT-QUIC反応試薬調整は必須である。これらの解析を遂行させるために使用する。パネルRT-QUICの高精度化のためにさらに多くの変異recPrPを作製する必要がある。変異PrPの作製に使用する。
発生工学的トレーシングを用いた脳内の味覚機能地図の構築

苦味受容味細胞に選択的に経ニューロン性トレーサー(WGA-DsRed)を発現するトランスジェニックマウスにおいて、橋・扁桃体・網様体・視床下部の各脳領域で味細胞から移行したWGA-DsRedを受け取る苦味経路ニューロンの三次元的空間配置・細胞機能を単一細胞レベルで解析した。WGA-DsRedにより標識される苦味経路ニューロンの細胞体が、橋・扁桃体・網様体・視床下部の脳領域内でどのような三次元的空間配置を示すかをDsRedの蛍光検出により明らかにした。苦味経路ニューロンは橋結合腕傍核においては後方のmedial側と前方のexternal lateral側に局在しており、網様体では延髄孤束核後方部の苦味経路ニューロンに近接した領域に集積していた。苦味経路ニューロンは扁桃体においてはmedial amygdala領域に集積しており、視床下部ではparaventricular nucleus領域に集積していた。橋を含む新鮮脳スライス標本において、苦味経路ニューロンの樹状突起構造をWGA-DsRed標識ニューロン内へ蛍光色素を注入することにより明らかにするとともに、苦味経路ニューロンのシナプス伝達の分子機構とその修飾機構をホールセルパッチクランプ法により解析した。橋結合腕傍核では後方のmedial側と前方のexternal lateral側の苦味経路ニューロンにおいてneuromodulatorへの応答性に違いが観察された。橋・視床下部の各脳領域でWGA-DsRedにより標識される苦味経路ニューロンの発現分子を免疫組織化学的に検出し、苦味経路ニューロンのニューロン種を同定した。橋結合腕傍核の前方のexternal lateral側に局在するニューロンの一部はCGRPを発現するニューロンであり、視床下部領域に局在するニューロンの一部はCRHを発現するニューロンであることが検出された。苦味受容味細胞に選択的にWGA-DsRedを発現するトランスジェニックマウスにおいて、橋結合腕傍核領域を含む新鮮脳スライス標本を作製し、WGA-DsRedにより標識される苦味経路ニューロンの活性制御機構をホールセルパッチクランプ法により解析し、シナプス伝達の分子機構と神経ペプチド・neuromodulator等によるシナプス伝達修飾機構を解析している。数が少ないWGA-DsRed標識ニューロンに限定して、ホールセルパッチクランプ記録することが困難であるが、最初期遺伝子の発現を免疫組織化学的に検出することにより、各種刺激条件下で活性化される脳内ニューロンを検出することも併用し、苦味・甘味経路ニューロンの活性制御機構の解明を行う。苦味受容味細胞もしくは甘味受容味細胞に選択的にWGA-DsRedを発現するトランスジェニックマウスにおいて、橋・扁桃体・網様体・視床下部の各脳領域で味細胞から移行したWGA-DsRedを受け取る苦味・甘味経路ニューロンの三次元的空間配置・細胞機能を単一細胞レベルで比較解析することを継続する。WGA-DsRedにより標識される苦味・甘味経路ニューロンの細胞体が、橋・扁桃体・網様体・視床下部の脳領域内でどのような三次元的空間配置を示すかをDsRedの蛍光検出により明らかにするとともに、苦味・甘味経路ニューロンの樹状突起・スパイン構造および軸索投射先を、WGA-DsRed標識ニューロン内へ蛍光色素等を注入すること、および順行性・逆行性トレーサーを特定脳部位に注入し順行性・逆行性に神経経路をトレーシングすることにより明らかにする。苦味受容味細胞もしくは甘味受容味細胞に選択的にWGA-DsRedを発現するトランスジェニックマウスにおいて、延髄・橋・扁桃体・網様体・視床下部の各脳領域で、苦味・甘味受容味細胞から移行したWGA-DsRedを受け取る苦味・甘味経路ニューロンを、DsRed蛍光を指標として、生きた状態で、一細胞ごとに単離・回収し、それらの細胞からRNAを精製する。回収されたシナプス前後の2種のニューロン間で、そして苦味と甘味経路ニューロン間で、多次元的に、発現分子を比較する。それによりシナプス前後の2種のニューロン間の回路構築分子(細胞間接着分子、軸索・樹状突起ガイダンス分子、及びそれらの転写制御因子等)やシナプス伝達に関与する分子(受容体、神経伝達物質、神経伝達物質を合成する酵素)の組み合わせを解明し苦味・甘味経路の構築様式を導出する。

橋結合腕傍核では後方のmedial側と前方のexternal lateral側の苦味経路ニューロンにおいてneuromodulatorへの応答性に違いが観察された。橋・視床下部の各脳領域でWGA-DsRedにより標識される苦味経路ニューロンの発現分子を免疫組織化学的に検出し、苦味経路ニューロンのニューロン種を同定した。橋結合腕傍核の前方のexternal lateral側に局在するニューロンの一部はCGRPを発現するニューロンであり、視床下部領域に局在するニューロンの一部はCRHを発現するニューロンであることが検出された。苦味受容味細胞に選択的にWGA-DsRedを発現するトランスジェニックマウスにおいて、橋結合腕傍核領域を含む新鮮脳スライス標本を作製し、WGA-DsRedにより標識される苦味経路ニューロンの活性制御機構をホールセルパッチクランプ法により解析し、シナプス伝達の分子機構と神経ペプチド・neuromodulator等によるシナプス伝達修飾機構を解析している。数が少ないWGA-DsRed標識ニューロンに限定して、ホールセルパッチクランプ記録することが困難であるが、最初期遺伝子の発現を免疫組織化学的に検出することにより、各種刺激条件下で活性化される脳内ニューロンを検出することも併用し、苦味・甘味経路ニューロンの活性制御機構の解明を行う。苦味受容味細胞もしくは甘味受容味細胞に選択的にWGA-DsRedを発現するトランスジェニックマウスにおいて、橋・扁桃体・網様体・視床下部の各脳領域で味細胞から移行したWGA-DsRedを受け取る苦味・甘味経路ニューロンの三次元的空間配置・細胞機能を単一細胞レベルで比較解析することを継続する。WGA-DsRedにより標識される苦味・甘味経路ニューロンの細胞体が、橋・扁桃体・網様体・視床下部の脳領域内でどのような三次元的空間配置を示すかをDsRedの蛍光検出により明らかにするとともに、苦味・甘味経路ニューロンの樹状突起・スパイン構造および軸索投射先を、WGA-DsRed標識ニューロン内へ蛍光色素等を注入すること、および順行性・逆行性トレーサーを特定脳部位に注入し順行性・逆行性に神経経路をトレーシングすることにより明らかにする。苦味受容味細胞もしくは甘味受容味細胞に選択的にWGA-DsRedを発現するトランスジェニックマウスにおいて、延髄・橋・扁桃体・網様体・視床下部の各脳領域で、苦味・甘味受容味細胞から移行したWGA-DsRedを受け取る苦味・甘味経路ニューロンを、DsRed蛍光を指標として、生きた状態で、一細胞ごとに単離・回収し、それらの細胞からRNAを精製する。回収されたシナプス前後の2種のニューロン間で、そして苦味と甘味経路ニューロン間で、多次元的に、発現分子を比較する。それによりシナプス前後の2種のニューロン間の回路構築分子(細胞間接着分子、軸索・樹状突起ガイダンス分子、及びそれらの転写制御因子等)やシナプス伝達に関与する分子(受容体、神経伝達物質、神経伝達物質を合成する酵素)の組み合わせを解明し苦味・甘味経路の構築様式を導出する。
経食道脊髄超音波検査と遅延型脊髄虚血の発症について

経食道超音波装置を用いて脊椎椎間板を経て脊髄を観察できた。観察された脊髄は全周性に高輝度の反射に覆われ、左右の前根、後根の確認が可能であった。観察可能領域の下端は第2、3腰椎で観察が不可能となった。脊髄は神経根に支えられ脊髄空内の中央に位置し、脊髄空内面に接することはなかった。全例心拍の有無が脊髄の拍動に関与することがわかった。超音波造影剤を用いて前脊髄動脈の観察では全例超音波強度の増高は観察できなかった。遅延型脊髄虚血を予防するための抗血小板療法の開発として全身麻酔下でフルルビプロフェンを静脈内投与は散乱光法により大凝集塊の低下を認めた。血小板凝集能低下には二次凝集の抑制の関与が考えられた。経食道超音波検査による脊髄描出について現在のところ、下部頸椎から下部胸椎にわたる広い範囲で脊髄の描出が可能であることがわかった。しかしながら、食道の走行と脊椎の解剖学的位置関係が編位している場合、特に高齢者においてその描出率は低値となった。しかしながら、描出できた症例では脊髄が4本の神経根により脊髄液内に吊り下げられ、脊髄表面が硬膜内側と直接接触することを防いでいた。超音波造影薬による栄養血管の造影については、脊髄正中動脈の造影効果は検出できず、脊髄の血液灌流領域を評価することはできなかった。現状では経食道超音波検査による脊髄虚血は困難と言わざるを得ないことがわかった。遅延型脊髄虚血の発症への活性化血小板の関与について遅発型脊髄虚血の発症原因の一つと考えられる活性化血小板による血管閉塞に対しての治療法として、血小板の活性化の抑制することが考えられる。今回、静注用NSAIDs(フルルビプロフェン;F)を用いて血小板の凝集能の低下をもくろんだ。7例でF投与前後における血算、凝固系検査所見に有意差はなかった。F投与前の透過度は73.5±13.5(76)%に対し、F投与後は30.3±16.4(27.5)%で、透過度は有意に低下した。小凝集塊はF投与前が11.4±2.6×106(10.6×106)、F投与後は15.3±5.3×106(15.6×106)と増加傾向にあり、大凝集塊はF投与前が12.6±4.6×106(14.4×106)、フルルビプロフェン投与後は1.9±1.6×106(1.6×106)で有意に減少した。F投与により血小板凝集塊の増大が抑制されることがわかった。一方では小凝集塊の成長は抑制されないために、一時止血には影響を与えずに血小板凝集塊の成長による血管閉塞の可能性を軽減することができると期待される。臨床研究:分担研究者(三島康典、久留米大学)経食道超音波プローブを挿入し上部胸部脊髄から上部腰部脊髄までを観察を行った。その結果、経食道脊髄画像は下部頸髄から上部腰髄まで観察は可能であった。脊髄は心拍動と同期した動きが見られ、4本の脊髄路によりホールディングされている動画を捉えることができた。体外循環開始後、心筋保護液注入により心拍動の停止と同時に脊髄の拍動も停止したが、心拍動の再開ととともに脊髄の拍動も再開した。次に、直接的な血流の検出のために超音波コントラスト剤を投与し脊髄血液灌流領域の観察を行ったが、脊髄血液還流領域の描出が困難で、超音波反射強度の増強を見るこことはできなかった。基礎研究:代表研究者(渡邉誠之、九州歯科大学)術中フルルビプロフェンアキセチル静脈内投与による血小板機能抑制効果についてフローサイトメトリー法を用いた血小板凝集機能検査を行い、血小板凝集塊の形成過程を観察評価した。フルルビプロフェンアキセチル静脈内投与15分後には血小板凝集能の抑制を確認した。術中止血確認後のフルルビプロフェンアキセチル静脈内投与後の血小板機能抑制効果発現時間及び持続時間を検討した。フルルビプロフェンアキセチル静脈内投与後6時間経過後の血小板凝集能を確認したところ、明らかに凝集を抑制しており効果の持続性を確認した。術後の遅発性脊髄

虚血の発症原因として、血管内血液凝固による血流障害が原因の一つと考えられるため、一回投与により血小板凝集抑制効果を継続できる効果は術後遅発性の血液凝集による虚血発現の抑制の可能性を示した。遅延型脊髄虚血を予防するための抗血小板療法の開発として全身麻酔下でフルルビプロフェンを静脈内投与の血小板活性化および血小板凝集塊の育成についての影響を調べた。【対象・方法】全身麻酔下の成人予定手術患者7例(ASA 1, 2)を対象とし、抗血小板・抗凝固療法中の患者は除外した。出血コントロール後にフルルビプロフェン(F)50 mgを静脈内投与した。F投与直前と投与から15分後に採血を行い、PA200を用いて7分間血小板凝集能を測定した。惹起物質はコラーゲン(最終濃度2ug/mL)とし、血小板凝集塊(小・中・大)のシグナル強度と、透過度(%)を経時的に測定した。【結果】7例でF投与前後における血算、凝固系検査所見に有意差はなかった。F投与前の透過度は73.5±13.5 (76)%に対し、F投与後は30.3±16.4(27.5)%で、透過度は有意に低下した。小凝集塊はF投与前が11.4±2.6×106(10.6×106)、F投与後は15.3±5.3×106 (15.6×106)と増加傾向にあり、大凝集塊はF投与前が12.6±4.6×106(14.4×106)、F投与後は1.9±1.6×106(1.6×106)で、有意に減少した。【考察】透過度の低下は血小板凝集能が抑制されたことを示し、その原因に凝集塊のサイズが十分に増大されない可能性が示唆された。フルルビプロフェンはCOX1選択性が高いと報告され、本研究ではこの作用により血小板凝集は抑制したと考えられた。【結論】全身麻酔下でのフルルビプロフェン静脈内投与は出血に関与する小血小板凝集塊の育成には影響を与えず、血管閉塞を来すような血小板大凝集塊への育成を抑制した。術後遅延型脊髄虚血の発症原因の一つと考えられる血管内血小板凝集及び凝集塊の増大を抑制するため遅延型脊髄虚血を予防に有用である可能性が示唆された。麻酔学一部予測した研究結果とは異なる結果の部分(経食道超音波検査による脊髄虚血の検出)はあるが、研究の進行度としてはほぼ予定通りである。臨床研究の目的のうち一部は確認できたが、予想に反し血流の評価が困難であることが分かった。評価できるかどうかを含めての昨年度の研究であったので、目標は達成できたが、来年度以降の臨床研究の方法を変更せざるを得なくなった。経食道超音波検査による脊髄虚血の検出は現実的に描出ができなく断念せざるを得ない。一方、今後は有意な結果が出ている活性化血小板の凝集能抑制に関する研究をつづけ、発表論文作成まで到達したい。超音波コントラスト法による脊髄血流の評価が困難であることが判明したため、機能障害発生の機序における血流の関与が明確に示すことが困難となった。今後は組織ドップラー法などを用い脊髄の虚血障害による拍動性の検討等を行い補完したい。今年度から血管内皮機能と血小板凝集能の基礎研究へ重点を置く。微小血管還流装置を稼働し、血管内皮機能の障害の程度と内皮に接着する血小板を評価する。またコラーゲン惹起による血小板凝集能を測定する。特に血小板凝集塊の発育過程とNSAIDs投与による凝集能抑制について検討を行う。基礎研究として血管内皮機能障害と血小板凝集に焦点を当てた実験を計画する。そのための消耗品および測定記録装置の購入に研究費を充てる。今年度から国際学会への発表を行っており、その旅費などにも充てる。
ラット歯周炎モデルによる歯周病原細菌の口腔内定着機序に関する研究

P.gingivalisには、41K線毛と67K線毛の2種類の線毛が存在し、それぞれの線毛の役割を明らかにするため、それぞれの線毛遺伝子についてDNAレベルで解析を進め、線毛タンパク質をコードする遺伝子断片を用いて線毛欠損変異株を作製した。感染症は、病原微生物の宿主細胞への付着が不可欠である。P.gingivalisの培養上皮細胞への付着性と細胞侵入性に関わる線毛の役割を明らかにする目的のため、線毛欠損株を作製した。上皮細胞への付着性および侵入性と歯槽骨吸収との関わりを明らかにするため、ラットを用いた感染実験を行った。線毛欠損株は、各々の線毛遺伝子を不活化して、41K線毛を欠損させた菌株(MPG1)、67K線毛を欠損させた菌株(MPG67)、41K線毛と67K線毛の両方を欠損させた菌株(MPG4167)の3種類を作製した。これらの菌株を用いて、ラット口腔内へ直接接種する歯周炎モデルにより、口腔内定着および歯槽骨吸収量について線毛欠損株と親株とを比較検討した。歯周病の原因細菌であるP.gingivalisの41K線毛については、主に菌体の凝集に関わることが明らかになってきた。線毛欠損変異株を用いて、その結果、両線毛を欠損した菌株では、口腔内定着率が著しく減少し、一種類の線毛が欠損するだけでも親株に比較して、定着率が減少した。短い線毛を欠損させた変異株では、長い線毛により菌体の自己凝集性が増加し、大きな菌塊を形成することが電子顕微鏡観察により確認された。ラットを用いてP.gingivalis口腔内へ接種する実験的歯周炎実験から、ラットの歯槽骨吸収量は、細菌の口腔内への定着率に相関しており、線毛欠損株は親株の線毛保有株よりも減少した。口腔上皮の培養細胞を用いた付着実験でも線毛保有株に比較して、線毛欠損株は培養細胞への付着率が減少したことから、P.gingivalisの67K線毛は、口腔内定着因子として働き、歯肉溝内で定着・増殖して歯槽骨破壊に直接、間接的に関与している可能性が示唆された。短線毛欠損変異株の作製は、薬剤耐性遺伝子の挿入箇所を詳細に検討して、クローン化された遺伝子内にエリスロマイシン耐性遺伝子を挿入して不活化したエリスロマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片をsuicide vectorpGP704に挿入して作製した。遺伝子不活化プラスミドを導入した大腸菌株とP.g ATCC33277株を共培養して不活化された遣伝子をP.g ATCC33277株に接合伝達させ、相同的組換えにより変異株を作製した。線毛遺伝子不活化の確認は、サザンハイブリダイゼーションによりP.g染色体DNA中に線毛遺伝子とエリスロマイシン耐性遺伝子のいずれにもハイブリダイズする断片の存在を確認した。線毛欠失株の確認は、短線毛に対する抗体を用いて短線毛蛋白質の有無をウェスタンブロッティングで確認した。また、菌体を2% uranyl acetateで染色し、表層の線毛を電子顕微鏡観察した。短線毛抗体を用いてイムノゴールド法により、短線毛の存在を検討した。

線毛欠失株(変異株)と線毛保有株(親株)について血球凝集能、菌体表層の疎水性、細胞付着性を比較した結果、血球凝集活性および菌体表層の疎水性には線毛が関与しないことが明らかになり、細胞への付着性においては重要な働きをしていることが判明した。実験動物による口腔内感染実験は、生後3週のラットを使用して、ラット口腔内への親株、線毛欠損株の感染実験を行った。本結果については、現在まだ結果が得られていないが、細胞への付着性が異なることから歯槽骨吸収に違いが出ると考えている。本研究では、歯周病の特徴的病態である歯槽骨の吸収に関するP.gingivalisの役割とその機序について明らかにするとともに歯周病の予防法を確立することを目的とした。歯周病の原因細菌であるP.gingivalisの41K線毛については、主に菌体の凝集に関わることが明らかになってきた。P.gingivalisには、41K線毛と67K線毛の2種類の線毛が存在し、それぞれの線毛の役割を明らかにするため、それぞれの線毛遺伝子についてDNAレベルで解析を進め、線毛タンパク質をコードする遺伝子断片を用いて線毛欠損変異株を作製した。線毛欠損変異株を用いて、ラット口腔内へ直接接種する歯周炎モデルにより、口腔内定着および歯槽骨吸収量について線毛欠損株と親株とを比較検討した。その結果、両線毛を欠損した菌株では、口腔内定着率が著しく減少し、一種類の線毛が欠損するだけでも親株に比較して、定着率が減少した。短い線毛を欠損させた変異株では、長い線毛により菌体の自己凝集性が増加し、大きな菌塊を形成することが電子顕微鏡観察により確認された。ラットを用いてP.gingivalis口腔内へ接種する実験的歯周炎実験から、ラットの歯槽骨吸収量は、細菌の口腔内への定着率に相関しており、線毛欠損株は親株の線毛保有株よりも減少した。口腔上皮の培養細胞を用いた付着実験でも線毛保有株に比較して、線毛欠損株は培養細胞への付着率が減少したことから、P.gingivalisの線毛は、口腔内定着因子として働き、歯肉溝内で定着・増殖して歯槽骨破壊に直接、間接的に関与している可能性が示唆された。
異なった生理的条件下の筋小胞体カルシウムATPaseの三次元構造解析

本研究では、カルシウムATPaseの異なった状態での三次元構造を、氷包理電子顕微鏡法によって解析し、能動輸送の構造的実体を明らかにすることを目標とした。まず、ATPとカルシウムがともに結合していない状態のチューブ状結晶から14A分解能で三次元構造を解析し、Natureに発表した。この結果、膜内構造は3つのセグメントからなるユニークなものであることが判り、アミノ酸配列から予想される二次構造ともかなりの対応がつけられた。さらに、加水分解されないATPのアナログであるクロミウムATPを結合させた状態の構造を、やはり14A分解能で解いた。両者のチューブ状結晶においてらせん対称性の同じものを選ぶことができたので、ATP非存在下のものと詳細な比較が可能であった。その結果、ATP結合部位と予想していたポケットが埋まり、そのすぐ上の領域が蓋のように動いたことが認められた。また、膜内のA、Bセグメント、内腔側にも明瞭な変化が認められ、ATPの結合による構造変化が内腔側まで伝わることが確かめられた。高濃度のカルシウイオン存在下で生成する三次元微結晶に関しては、10Aを越える分解能で、膜に沿った方向の像を得た。以上の研究によって、次の段階である時間分解構造解析の基礎を作ることができた。一方、チューブ状結晶の歪みを補正するための一連のプログラムは、一応実用になる段階に達し、カルシウムATPaseのチューブ状結晶にも適用したところ、回折パターンの著しい改善が認められた。従って、個々のらせんを可視化できる可能性は非常に高くなった。本年度はまずバナジン酸存在下で作製したチューブ状結晶の氷包埋クライオ電子顕微鏡法による三次元構造解析を分解能14A^^°で完成した。この結果、脂質二重膜中の構造が明らかになり、一次構造との対応もある程度つけられるものであった。従って、イオンの膜内の通路の位置を予想することができ、また、ATPが結合する位置に関しても候補が得られた。以上の結果は、現在ネーチャー誌に印刷中である。この結果を踏まえて、次の目標を、ATP結合部位の同定とATP、Caイオン結合時の構造変化に置き、そのためにATPのアナログである、クロミウムATPの合成を行った。このアナログはCaイオン存在下でCa-ATPaseに結合し、加水分解されない。バナジン酸存在下でチューブ状結晶をクロミウムATPが結合したまま作れるかどうかが鍵であった。その検定のためにいくつかの方法を試したが、ATP分解活性を測ることと、原子吸光を測定することによって、少なくとも80%のCa-ATPaseはクロミウムATPを結合したままでいることを確認できた。現在、氷包埋法を用いて、データ収集を開始した。一方、高濃度のCaイオン存在下で形成される三次元結晶に関しては、うまく再現できない状態が続いた。これは、Ca-ATPaseを色素カラムを用いてアフィニティ精製するさいに酵素が失活してしまうことや、脂質の取扱いが問題であることが判明した。この結果、二重膜が多数積み重なったタイプの結晶に関しては、8A^^°分解能の像が得られたが、まだ数が足りない。他の像に関してはどの方向から結晶を見ているかが問題になり、ソフトウエアの開発を急いでいる。本研究では、カルシウムATPaseの異なった状態での三次元構造を、氷包埋低温電子顕微鏡法によって解析し、能動輸送の構造的実体を明らかにすることを目標としている。本年度は、昨年度に引き続き、クロミウムATPを結合させた状態での三次元構造を解析した。クロミウムATPを結合させるためには、カルシウムが必要であり、このカルシウムは、膜内に閉じ込められた状態になる。しかし、チューブ状結晶を作製するためには、EGTA、バナジン酸が必要であり、チューブ状結晶ができた時点で、クロミウム、ATP、カルシウムが結合したままでいるかが問題であった。

ATPase活性、クロミウムの原子吸光、カルシウムのトレーサー実験を行い、クロミウムとATPは結合しているが、カルシウムは抜けてしまっていることがわかった。この状態のチューブ状結晶を、ATP非存在下と同じ14A分解能で解析し、三次元構造を得た。らせん対称性の同じものを選ぶことができたので、ATP非存在下のものと詳細な比較が可能であった。その結果、ATP結合部位と予想していた細胞質側のくぼみが埋り、そのすぐ上の領域が蓋をするように動いたことが認められた。また、膜内のA、Bフラグメント、内腔側にも明瞭な変化が認められ、ATPの結合による構造変化が内腔側にまで伝わることが確かめられた。一方、チューブ状結晶の歪みを補正する一連のプログラムは、一応実用になる段階に達し、カルシウムATPaseのチューブ状結晶にも適応したところ、回折パターンの著しい改善が認められた。従って、個々のらせんを可視化できる可能性は非常に高くなった。
クロザピン適正投与設計を目的とした母集団薬物動態解析

【研究目的】近年、海外でクロザピン血中濃度の有効治療域と毒性域の存在が報告され、当院もクロザピンのTDM(Therapeutic Drug Monitoring)を行うことを目的に血中濃度の測定を開始した。クロザピンの血中濃度測定に止まらず、血中濃度シミュレーションを行うことが可能になれば、クロザピンの治療効果を得ながら、重篤な副作用を未然に防ぐための処方支援を行うことができる。そこで、血中濃度シミュレーションに必要な日本人の母集団薬物動態パラメータを推定することを目的として、クロザピンの母集団薬物動態解析の実施を計画した。【研究方法】書面で同意を得られた患者から採取した血液を遠心分離して得られた血漿を、固相抽出法(強力カチオン交換モード)によりクロザピンを抽出し、それをサンプルとして高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にてクロザピン血漿中濃度(ng/mL)を測定する。母集団薬物動態解析は、薬物動態解析ソフトPhoenix®NLME(Pharsight社)を用い、PPK(population pharmacokinetics)モデルを構築する。また、構築した最終モデルの妥当性をブートストラップ解析により検証する。【研究成果および今後の計画】クロザピンの血漿からの抽出に固相抽出カラム(Bond Elut PlexaおよびPCX)を用いていたが、クロザピンおよび内部標準物質として用いていたloxapineの回収効率を現状以上に向上させる可能性のある抽出法(液-液抽出法)を見出したため、抽出方法自体の変更を余儀なくされた。そこで新たなクロザピンの抽出方法を-から確立し直しながら、併せてPhoenix®NLMEを習熟したが、母集団解析に必要な血中濃度データを満たすことができず、結果として解析の実施までには至らなかった。今後は、引き続き測定精度の高い血中濃度データを蓄積し、改めて母集団薬物動態解析を実施する予定である。
線維前駆中間体の解析を基軸としたアミロイド線維の伝播性および毒性の構造基盤の解明

アミロイド線維は、自らの末端構造を鋳型として正常タンパク質をアミロイド構造へと変換し構造伝播する。本研究では、鋳型構造の実体および核が形成され伝播性が発揮されるまでのタンパク質構造形成メカニズムを明らかにするため、「線維前駆中間体」の存在に注目し、これを安定に蓄積させたうえで解析する。さらにオリゴマー段階で示す毒性発現機構にも注目し、線維前駆中間体の解析を通してアミロイド線維の伝播性と細胞毒性の発現機構をタンパク質構造の見地から明らかにすることを本研究課題の目的とする。これまでに、インスリン、インスリン由来ペプチド断片、アミロイドβタンパク質、トランスサイレチンを解析対象とした線維前駆中間体の捕捉および構造的特徴の解析を試みてきた。その結果、インスリン由来ペプチド断片では、線維前駆中間体を経由した反応経路が明らかになり、CD、DLS、SAXSを用いた時分割的な構造変化を通して線維前駆中間体が構造発達するプロセスを明らかにした。また、反応条件を変えることで異なる線維前駆中間体を観察できる可能性も分かった。さらに、この線維前駆中間体がフィブリノーゲンと相互作用することによりアミロイド線維形成が阻害されるメカニズムを検討し、論文を投稿した。アミロイドβタンパク質については、線維前駆中間体の捕捉には成功していないものの、今後線維前駆中間体の毒性に関する知見を得るためにリポソームの破壊とアミロイド線維形成を同時計測できる実験系を準備した。トランスサイレチンについては、フィラメント状のアミロイド様凝集体の線維前駆中間体の存在が確認された。線維前駆中間体を経由したアミロイド線維形成反応をいくつか観察できつつあり、核形成に関わるタンパク質分子の集合や構造変化の実態に近づいている。特にインスリン由来ペプチド断片については、線維前駆中間体が準安定状態として蓄積する利点を持つだけでなく反応条件に応じて異なる線維前駆中間体が生成する可能性が示唆されており、線維前駆中間体の構造特性を明らかにするための有用な題材を見出したと考えている。一方でアミロイドβタンパク質やトランスサイレチンでは線維前駆中間体の捕捉がなかなか難しいのが現状であるが、少なくともトランスサイレチンに関してはフィラメント状凝集体における中間体が得られているのでこれを糸口として探索を継続し、アミロイド核形成の根底にある分子機構をより包括的に追究したいと考えている。インスリン由来ペプチド断片の解析を進展させ、従来注目してきた中間体に加えて新しい反応条件で生成する中間体も解析対象として構造の比較を行う。それと同時に、核形成プロセスについても小角X線散乱を用いた中間体の構造的特徴の解析と生成過程の時分割観察を試み、類似点および相違点を明らかにする。アミロイドβタンパク質については、オリゴマーの生成が多数報告されており中間体捕捉の実現が期待されるので、探索を継続する。さらに、リポソームを用いた脂質膜破壊の実験系も準備したので、これを利用して線維前駆中間体の毒性に関する構造知見も得る。トランスサイレチンについては、上述のとおりフィラメント状のアミロイド様凝集体の線維前駆中間体の存在が確認されたので、これの詳細な解析を進めるとともに、ファイバー状のアミロイド線維が得られる条件を探索したうえで改めて線維前駆中間体の捕捉を試みる。以上の解析の後に観測できた様々な線維前駆中間体の性質を総合評価しアミロイド核形成メカニズムを議論する。初年度である平成28年度は、過去のインスリンについての線維前駆中間体の捕捉実績を参考にして、いくつかのアミロイド性タンパク質およびペプチドを解析対象として線維前駆中間体の捕捉を試みた。その結果、インスリン由来ペプチド断片とアミロイドβタンパク質において、新たな線維前駆中間体を安定捕捉することが可能な線維化条件を見つけることができた。インスリン由来ペプチド断片については、CDとDLSによる解析を実施することで段階的な構造発達の様子を確認した。さらにほかのタンパク質を添加すると、線維前駆中間体と弱く相互作用することによってそれ以上の構造発達を抑制し伝播性の発現を阻害する可能性があることも発見した。アルツハイマー病に関与するアミロイドβペプチドについても伝播性に重要な配列領域を特定するため、当ペプチドの発現および精製系を構築したうえで、予備的な変異導入を行い、その影響の検討も実施した。いくつかの線維前駆中間体の捕捉の成功により、捉えどころの少ない核形成過程の手がかりを得られたものと考えている。今後はこれらの詳細な構造特性の解析を進め、伝播を担う鋳型構造を形成するためにどのタンパク質領域のどのような構造形成が重要なのか解明したいと考えている。またアミロイドβペプチドについては、アルツハイマー病に関与し特にオリゴマー種の細胞毒性が疾病に強く関与することが指摘されているため、毒性発現メカニズム解明にも寄与することが期待される。