hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高脂血症薬(スタチン)を用いた、変形性膝関節症に対する治療の試み

両膝前十字靭帯切離を施行した日本白色家兎32羽を用いて、片側の膝関節にスタチンを関節内投与し、対側の膝関節はコントロール群として比較した。関節内投与を週に1回、計6回行い、組織学的、生化学的に評価した。コントロール群の膝では、中等度から高度の軟骨細胞の消失などの重度の軟骨変性を認めたが、スタチンを関節内投与した群では、コントロール群と比較して組織学的な軟骨変性は軽度であり、軟骨変性抑制効果を認めた。高脂血症治療薬であるスタチンを関節内に注射することによって関節軟骨の変性を抑制できることを、家兎を用いて検討を行った。両膝前十宇靭帯切離を施行した日本白色家兎32羽を、メバスタチンの関節内投与量の違いで、無作為に次の3群に分けた:0.01mg/mL(n=8), 0.1mg/mL(n=16), 0.5mg/mL(n=8):メバスタチンは各濃度になるように生理食塩水に希釈し、体重あたり0.2mL/kgを片側の膝関節に関節内投与し、対側の膝関節には生理食塩水のみを投与しコントロール群として比較した。関節内投与を週に1回、合計6回行い、組織学的、免疫組織学的、生化学的に評価した。結果としては、コントロール群の膝では、軟骨の完全な欠損や中等度から高度の軟骨細胞の消失、サフラニン0での染色低下などの柔道の軟骨変性を認めた。一方、メバスタチンを0.1mg/mLと0.5mg/mLの濃度で関節内投与した両群では、コントロール群と比較して、組織学的な軟骨変性は軽度であり、軟骨変性抑制効果を認めた。しかしながら、メバスタチンを0.01mg/mLの低濃度で投与した群では、対側膝のコントロール群と比較してMankinスコアに有意差を認めなかった。メバスタチンは脂溶性で濃度依存的に細胞内に拡散し、競合的にメバロン酸経路を阻害するためスタチンの効果的な作用には、あるレベル以上を阻害できるスタチン濃度が必要であると考えられた。両膝前十字靭帯切離を施行した日本白色家兎32羽を用いて、片側の膝関節にスタチンを関節内投与し、対側の膝関節には生理食塩水のみを投与しコントロール群として比較した。関節内投与を週に1回、計6回行い、組織学的、免疫組織学的、生化学的に評価した。一方、メバスタチンを関節内投与した群では、コントロール群と比較して、組織学的な軟骨変性は軽度であり、軟骨変性抑制効果を認めた。またスタチンが滑膜細胞におけるMCP-1およびMMP-3の産生を抑制するか、in vitroでの実験を行った。家兎の滑膜細胞において、メバスタチン0,1,10,50μM含有のメディウムで前処置の後IL-1βを加え、MCP-1およびMMP-3の遺伝子発現、蛋白生成をRT-PCR、ELISAでそれぞれ評価した。50μMのメバスタチンの群で、MCP-1とMMP-3の遺伝子発現が抑制されており、蛋白生成も有意に抑制されていた。またヒト変形性関節症の滑膜細胞において、50μMのシンバスタチンで前処置を行った後IL-1βを加え、FFPおよびGGPPを添加することによるMCP-1の変化を計測した。シンバスタチンによるMCP-1の抑制効果は、FFPを添加しても抑制されたままであったが、GGPPを添加することで抑制がかからなくなった。さらに、RhoA kinase inhibitor(Y27632)の添加による前処置の後IL-1βを加え、MCP-1の変化をELISAで計測した。RhoA kinase inhibitorを添加したものでは、MCP-1は濃度依存性に抑制された。IL-1β刺激による変形性関節症滑膜細胞において、スタチンは、プレニル化、特にゲラニルゲラニル化の過程を阻害することによってMCP-1およびMMP-3を抑制することが可能であった。本研究より、Rho/Rho kinase経路の抑制が、スタチンによるMCP-1、MMP-3の抑制過程に関係している可能性が考えられる。

結果としては、コントロール群の膝では、軟骨の完全な欠損や中等度から高度の軟骨細胞の消失、サフラニンOでの染色低下などの柔道の軟骨変性を認めた。一方、メバスタチンを関節内投与した群では、コントロール群と比較して、組織学的な軟骨変性は軽度であり、軟骨変性抑制効果を認めた。また、スタチンが滑膜細胞におけるMCP-1およびMMP-3の産生を抑制するか、in vitroでの実験を行った。家兎の滑膜細胞において、メバスタチン0,1,10,50μM含有のメディウムで前処置の後IL-1βを加え、MCP-1およびMMP-3の遺伝子発現、蛋白生成をRT-PCR、ELISAでそれぞれ評価した。50μMのメバスタチンの群で、MCP-1とMMP-3の遺伝子発現が抑制されており、蛋白生成も有意に抑制されていた。またヒト変形性関節症の滑膜細胞において、50μMのシンバスタチンで前処置を行った後IL-1βを加え、FFPおよびGGPPを添加することによるMCP-1の変化を計測した。シンバスタチンによるMCP-1の抑制効果は、FFPを添加しても抑制されたままであったが、GGPPを添加することで抑制がかからなくなった。さらに、RhoA kinase inhibitor (Y27632)の添加による前処置の後IL-1βを加え、MCP-1の変化をELISAで計測した。RhoA kinase inhibitorを添加したものでは、MCP-1は濃度依存性に抑制された。IL-1β刺激による変形性関節症滑膜細胞において、スタチンは、プレニル化、特にゲラニルゲラニル化の過程を阻害することによってMCP-1およびMMP-3を抑制することが可能であった。本研究より、Rho/Rho kinase経路の抑制が、スタチンによるMCP-1、MMP-3の抑制過程に関係している可能性が考えられた。
日本人学校への教育相談支援体制の構築：新たな支援資源としての大学の役割

アジア・南米・北米に所在する4校の日本人学校において、日本の大学からの訪問型の教育相談支援活動を実施し、その貢献を検討した。日本人学校にかかわる教師・保護者・児童生徒のメンタルヘルスには、(a)地域社会の特徴(治安やリソース等)、(b)居住環境と人間関係の状況、(c)日本の生活・教育環境との連続性・継続性が関わることが示唆された。また、日本人学校は、現地邦人にとってメンタルヘルス支援の中核施設としての役割を担っており、教師の負担が大きいことが示唆された。つぎに、その外部性という特徴を生かすことを通して、アウトリーチによる教育相談支援活動は関係者のメンタルヘルスに貢献することが示唆された。1クアラルンプール日本人学校での実践調査(10月30日11月1日):通算5回目の訪問。保護者対象の講演会、保護者・児童生徒への教育相談、教師とのコンサルテーション、子ども理解のためのケースカンファレンス(幼稚部・小学校部)などを通して、学校関係者からの聴取と関与観察を行なった。2ニューヨーク日本人学校での実践調査(9月25日):通算2回目の訪問。教師対象の研修会、保護者対象の講演会、保護者への教育相談などを通して、学校関係者からの聴取と関与観察を行なった。3香港日本人学校(9月2426日):初訪問。授業観察、クラス担任へのコンサルテーション、保護者対象の講演会、保護者への教育相談などを通して、学校関係者からの聴取と関与観察を行なった。4平成26年度実施予定の調査項目の策定:上記13で得られたデータを参考にして、日本人学校の構造的特徴と学校関係者のメンタルヘルスの関連を明らかにするための量的調査に向けた項目の設定を行なった。5学会発表と論文発表:8月に横浜で開催された日本心理臨床学会において、「日本人学校へのメンタルヘルス支援の可能性の検討:複数の調査校からみえてきたメンタルヘルス上の課題の構造」というタイトルでポスター発表を行なった。また、これまでの成果を紀要論文「日本人学校での日常的なメンタルヘルス支援における一考察:南米の一都市にある日本人学校での実践調査活動から」、「日本人学校へのメンタルヘルス支援の可能性の検討( II):第2回実践調査からみえてきた保護者の期待と支援の方法」として発表した。1クアラルンプール日本人学校(JSKL)での実践調査:6月と11月の2回実施し、子どものメンタルヘルスに関する調査可能性について管理職と打ち合わせたが、当該年度内の実施はかなわなかった。また、日本人学校において有効なアプローチのメニュー作りに関して、いくつかの取組みを行うことができた。2アスンシオン日本人学校ならびにニューヨーク日本人学校への実践調査と視察:(a) JSKLでのリサーチクエスチョンの特異性、非特異性をもつかを検討する必要が生じたことと、(b) JSKLでメンタルヘルスの課題の調査を実施することの困難に直面しあらたな調査の方向性を見いだす必要が生じたことから、上記2校を訪問し、アスンシオンでは実践調査をニューヨークでは視察と今後の実践調査引き受けの打診を行った。(a)については多くの示唆が得られ、(b)に関しては日本人学校の設置されている地域環境をはじめとした構造上の側面とメンタルヘルスの関連について日本人学校勤務経験をもつ教師(帰国後の教師)を対象に行うことが、量的調査にも耐えるデータを得る点を含めて適切であるという結論に至った。3学会発表と論文発表:9月に愛知で開催された日本心理臨床学会において、「日本人学校へのメンタルヘルス支援の可能性の検討(II)」というタイトルでポスター発表を行った。日本国内から電話相談という形で日本人学校支援を行っている研究者とも交流を深めることができ、情報交換をすることができた。また、ここまでの成果を紀要論文「日本人学校へのメンタルヘルス支援の可能性の検討:予備的実践調査からみえてきた現状」としてまとめ発表を行った。以上、当初の研究目的に従いながらも、実際のアクションリサーチのなかで、研究実施計画とは若干の方向転換を図りながら柔軟に研究を遂行することができた。【平成26年度の研究成果】1日本人学校4校での実践調査をもとに作成した、日本人学校の構造的特徴と学校関係者のメンタルヘルスの関連に関する質問紙を、日本人学校に勤務経験をもつ学校教員を対象に実施。平成27年度中に、学会発表を行い、論文化の予定。2双方向遠隔通信サービスを利用した日本人学校の教師、保護者、児童生徒との教育相談を実施し、その課題と問題点を整理。平成27年度中に論文発表予定。3学会発表と論文発表:8月に横浜で開催された日本心理臨床学会において、自主シンポジウム「在外教育施設におけるメンタルヘルス支援を考える」を企画し、平成25年度までの活動をもとにした発表を行った。【研究期間全体を通じての研究成果】1実践調査:4校の日本人学校で、日本の大学からの訪問型の教育相談支援活動を実施。《目的1日本人学校におけるメンタルヘルス支援の必要性》

(1)日本人学校にかかわる教師・保護者・児童生徒のメンタルヘルスには、a)地域の社会構造とリソース、b)居住環境と人間関係、c)日本の生活・教育環境の維持などが関わることが示唆された。(2)メンタルヘルス支援の中核施設としての学校において、教師の役割と負担の大きさが示唆された。《目的2教育相談支援プログラムの開発》(1)アウトリーチの教育相談支援は様々な点で保護者や教師のメンタルヘルスに貢献すること、(2)個別面接・コンサルテーション・講演・カンファレンスなど多様なプログラムが実施可能であること、(3)訪問後、双方向遠隔通信サービス利用によっての教育相談も活用可能であること等が明らかになった。2日本人学校での実践調査をもとに作成した、日本人学校の構造的特徴と学校関係者のメンタルヘルスの関連に関する質問紙を、日本人学校に勤務経験をもつ学校教員を対象に実施。結果は、平成27年度中に、学会発表を行い、論文化の予定。臨床心理学「研究実績の概要」に記載した通り、研究目的に従いながら研究を進めてきているが、実践を通しての研究であるという研究遂行上の特性から、当初の実施計画を修正しつつ研究を進めている。昨年度、修正した研究の実施計画に沿って概ね順調に進展していると考えられる。具体的には、現場の教師、保護者、児童生徒への直接の質問紙調査が日本人学校側の判断により困難であることが明らかになったこと、日本人学校のある地域の特性がメンタルヘルスに大きく影響する可能性が示唆されたことから、1これまで訪問先での実践調査の他に、それ以外の地域の日本人学校への訪問の実施、2質問紙調査の対象を日本人学校を経験した教諭(帰国後の教諭)に変更することした。以上の諸点を鑑みて、上記の評価とした。「研究実績の概要」に記載した通り、研究目的に従いながら研究は進められているが、実践を通しての研究であるという研究遂行上の特性から、当初の実施計画を修正しつつすすめることになった。具体的には、現場の教師、保護者、児童生徒への直接の質問紙調査が困難になったことが、解決すべき研究遂行上の課題となったため、1JSKL以外の日本人学校への訪問の実施、2質問紙調査の対象を日本人学校から、日本人学校を経験した教諭(帰国後の教諭)に変更することとした。1日本人学校での勤務経験をもつ教師への質問紙の実施。2これまでの日本人学校での教育相談実践事例のまとめ。3学会発表と論文発表:日本心理臨床学会での発表と紀要論文の発表を継続するとともに、同学会で自主シンポジウムを開催する(既に受理され開催予定)。1JSKLでの実践調査の継続:2013年10月下旬に訪問し、教育相談活動を通した実践調査を継続する予定である。またその中で児童生徒へのメンタルヘルス調査の可能性を、管理職に再度交渉する。
北アメリカ北西部原住民(エスキモーとインディアン)の言語学的調査

1.当初の計画どおり,夏の約2か月,アメリカ合衆国のアラスカ州とカナダのブリティッシュコロンビア州において,宮岡と早津はエスキモー語,大島はアリュート語,箕浦はアサバスカ語について,研究協力者(大学院生)の6名(渡辺,堀,笹間,宮岡[晃洋],および,現地参加の中山,市橋)もそれぞれのインディアン語(セイリッシュ語,ハイダ語,ツィムシアン語,ブラックフット語,ヌ-トカ語,マコ-語)について,各人のこれまでの調査進度に応じ,音声・音韻法,形態法,あるいは統語法のインフォーマント調査(聞き取り調査)を行ない,あわせて文献資料蒐集ならびに現地研究者との情報交換を行なうことができた.調査は,全員が前年度までにそれぞれ築きあげてきたインフォーマントとのラポールのおかげで順調に進み,これまで以上に質量ともに優った情報を得ることができ,3年計画の最終年度として,その進度に応じたそれぞれに纏まりのある成果を得ることができた.2.調査対象とした言語のうち:(1)エスキモー語については,統語法の的確な理解に必須である動詞について良質の情報が得られ,その結果,動詞の分類が精緻化した.くわえて,この言語に特異な形態法と統語法の関わりの実態,即ち,一般に他の言語では統語法に委ねられている文の創出的側面が形態法に食い込んでいる事実の細部が明らかになってきた.これはエスキモー語記述に欠くことのできない基本的な理解であるのみならず,一般言語学に理論的寄与をもたらし得る性質の問題であると言うことができる.かくして,宮岡はこれまでの調査と分析をふまえ,同言語の網羅的文法記述の纏めに着手することが可能になった.完成には数年を予定している.(2)アリュート語については,前年度までの調査で,音声面とりわけ母音脱落とそれに関連する音韻現象についての理解がほぼ得られたので,今年度は形態法と統語法の段階に調査を進めた.(3)アサバスカ語については,上タナナ・アサバスカ語方言の比較音韻論が完成したので,難解で鳴る形態法の調査と分析に着手した.しかし,言語事態の難解に加えて,同言語を取りまく調査の社会的条件は,極めて悪く,長期にわたる粘りづよい調査の必要が予想される.(4)研究協力者に委ねられているインディアン語については,渡辺と堀がセイリッシュ語とハイダ語の音韻論を修士論文の形で纏めえたので,渡辺は重複法と他動詞構文,堀は分類辞の一部に纏わる形態・統語法的問題の解明を行ない,笹間がツィムシアン語の音声・音韻法記述の完成を図り,宮岡[晃洋]がブラックフット語,中山がヌ-トカ語,市橋がマコ-語について,形態法に力点をおいた調査を行なった.加えて,中山は古老の熱意ある協力によって,多量の貴重なテキストを蒐集し,一部,その分析をも行なうことができた.(5)6名におよびこれら研究協力者が,計画の年次進行とともに,しだいに調査と分析に熟達し,それぞれの言語の研究を独自に行なう力量をつけてきた.この若手研究者の順調な成長は,すでに海外の研究者からも注目されはじめた彼らの成果の刊行とともに,本計画の貴重な収穫であり,斯界における重要な寄与でもある.この点に関しては,「危機に瀕した言語」についての関心がようやくにして芽生え,これら少数民族言語の調査研究の緊急性が認識されてくるなかで,国の内外から大きな期待が寄せられている.3.夏の調査より帰国後の11月には,W.ブライト博士を,年明けの1月には,J.リア博士を招聘し,研究協力者をふくむ各人が提示した調査結果と問題点について共同討議をくりかえし,それぞれの得た情報と知見について理解の深化をみることができた.あわせて,本計画の成果報告書の第2号(Languages of the North Pacific Rim.Vol.2)の遠からぬ出版について,意見の交換と具体的な計画について討議した.1.当初の計画どおり,夏の約2か月,アメリカ合衆国のアラスカ州とカナダのブリティッシュコロンビア州において,宮岡と早津はエスキモー語,大島はアリュート語,箕浦はアサバスカ語について,研究協力者(大学院生)の6名(渡辺,堀,笹間,宮岡[晃洋],および,現地参加の中山,市橋)もそれぞれのインディアン語(セイリッシュ語,ハイダ語,ツィムシアン語,ブラックフット語,ヌ-トカ語,マコ-語)について,各人のこれまでの調査進度に応じ,音声・音韻法,形態法,あるいは統語法のインフォーマント調査(聞き取り調査)を行ない,あわせて文献資料蒐集ならびに現地研究者との情報交換を行なうことができた.調査は,全員が前年度までにそれぞれ築きあげてきたインフォーマントとのラポールのおかげで順調に進み,これまで以上に質量ともに優った情報を得ることができ,3年計画の最終年度として,その進度に応じたそれぞれに纏まりのある成果を得ることができた.2.調査対象とした言語のうち:(1)エスキモー語については,統語法の的確な理解に必須である動詞について良質の情報が得られ,その結果,動詞の分類が精緻化した.くわえて,この言語に特異な形態法と統語法の関わりの実態,即ち,一般に他の言語では統語法に委ねられている文の創出的側面が形態法に食い込んでいる事実の細部が明らかになってきた.これはエスキモー語記述に欠くことのできない基本的な理解であるのみならず,一般言語学に理論的寄与をもたらし得る性質の問題であると言うことができる.

かくして,宮岡はこれまでの調査と分析をふまえ,同言語の網羅的文法記述の纏めに着手することが可能になった.完成には数年を予定している.(2)アリュート語については,前年度までの調査で,音声面とりわけ母音脱落とそれに関連する音韻現象についての理解がほぼ得られたので,今年度は形態法と統語法の段階に調査を進めた.(3)アサバスカ語については,上タナナ・アサバスカ語方言の比較音韻論が完成したので,難解で鳴る形態法の調査と分析に着手した.しかし,言語事態の難解に加えて,同言語を取りまく調査の社会的条件は,極めて悪く,長期にわたる粘りづよい調査の必要が予想される.(4)研究協力者に委ねられているインディアン語については,渡辺と堀がセイリッシュ語とハイダ語の音韻論を修士論文の形で纏めえたので,渡辺は重複法と他動詞構文,堀は分類辞の一部に纏わる形態・統語法的問題の解明を行ない,笹間がツィムシアン語の音声・音韻法記述の完成を図り,宮岡[晃洋]がブラックフット語,中山がヌ-トカ語,市橋がマコ-語について,形態法に力点をおいた調査を行なった.加えて,中山は古老の熱意ある協力によって,多量の貴重なテキストを蒐集し,一部,その分析をも行なうことができた.(5)6名におよびこれら研究協力者が,計画の年次進行とともに,しだいに調査と分析に熟達し,それぞれの言語の研究を独自に行なう力量をつけてきた.この若手研究者の順調な成長は,すでに海外の研究者からも注目されはじめた彼らの成果の刊行とともに,本計画の貴重な収穫であり,斯界における重要な寄与でもある.この点に関しては,「危機に瀕した言語」についての関心がようやくにして芽生え,これら少数民族言語の調査研究の緊急性が認識されてくるなかで,国の内外から大きな期待が寄せられている.3.夏の調査より帰国後の11月には,W.ブライト博士を,年明けの1月には,J.リア博士を招聘し,研究協力者をふくむ各人が提示した調査結果と問題点について共同討議をくりかえし,それぞれの得た情報と知見について理解の深化をみることができた.あわせて,本計画の成果報告書の第2号(Languages of the North Pacific Rim.Vol.2)の遠からぬ出版について,意見の交換と具体的な計画について討議した.1.本計画以前から(研究協力者をふくむ)各人がすすめてきた言語調査の資料整理と分析結果にもとづき、あきらかになった不足部分とあらたな分野について聞き取り調査(平均2ヵ月)をおこなった。一部地域では、火山爆発にともなう混乱のために調査の実施がいくぶん妨げられたが、全体としては、予定どおりの進捗がみられた。2.エスキモー語は、リードと協力しつつ、宮岡と早津が、日本語と著しい類似をしめす動詞のボイスの問題に、アリュート語は、大島が音声面とりわけ母音の脱落現象の問題に、解明の重点をおいた調査をおこなった。3.インディアン諸言語については、宮岡およびクラウスと協力しつつ、渡辺がセイリッシュ語の重複現象の音韻的・機能的整理を試み、堀がハイダ語、笹間がツィムシャン語の複雑な音声体系の闡明をすすめ、中山がヌートカ語、市橋がマコー語の語彙と文法面での基礎的調査を続行した。これら研究協力者は、それぞれ言語調査の実力をつけ、自立的な研究者として成長をとげてきている。4.現地調査は、予定どおり、一日約23時間のインフォーマントからの聞き取りによる資料蒐集を中心として、残り時間は、得られた資料の整理と分析にあてた。
オールオキサイド複合材料のマトリックス組織変化にともなう微視応力分布の測定・解析

オールオキサイド系複合材料は、マトリックスを熱膨張率の異なる繊維と複合化する時に結晶粒の異方性により連続体力学では予測しえない大きな内部応力が生じ、破壊抵抗を著しく低下させると同時に、マトリックス内部のクラックの生成あるいは繊維中の過大な引張り応力発生の要因にもなる。したがって、静的・動的な状態で結晶粒単位でのミクロな応力場を知り、その発生におよぼす結晶粒寸法・方位の影響を知りマトリックス組織を最適化することが必要である。平成12年度は、検出波長範囲400900nm、分解能1μmの走査型ミクロ応力測定顕微鏡の試作を行い、種々のCr含有率の材料を用いて静的な条件で蛍光スペクトルシフトの応力依存性のキャリブレーションを行った。Al_2O_3繊維強化CrドープAl_2O_3マトリックス複合材料を製造し、破壊抵抗におよぼす結晶粒度の影響を調べた。平成13年度は、分光器の高分解能化、応力分布および結晶方位測定結果のマッピングを行うためのデータ取得方法を確立した。試作した装置を複合材料の力学試試験が可能な横型引張り試験機と一体化させ、Al_2O_3繊維強化Al_2O_3の破壊試験時の応力分布のその場観察を行い、結晶粒径を変化させた場合の破壊試験時の材料中微視応力分布を求めた。その結果、界面の応力分布およびクラック進展開始応力は結晶粒径に依存し、界面せん断応力およびクラック進展開始応力が最大となる結晶粒径が存在することが明らかとなった。与えられた素材の組み合わせのもとで破壊抵抗を最大にする繊維の特性、寸法に対するマトリックス組織(特に結晶粒径)最適化の指針を得た。本研究では、セラミックス基複合材料の破壊試験時に進展するクラック近傍の応力のその場測定を可能にするため、不純物として含まれるCr^<3+>からの蛍光を利用して、短時間(1/30秒以内)で面積500mm^2の応力分布を空間分解能1μm以下、波長分解能0.1nm以下で、±10MPaの応力分解能で測定できる装置の試作を行った。また、特定スペクトルの強度比から結晶粒方位の同定も行った。試作した装置を用いてAl_2O_3繊維強化Al_2O_3系複合材料中の結晶粒単位での微視応力測定と破壊時の微視応力分布の変化を測定した。その結果から、破壊に及ぼす結晶粒単位の熱応力、力学異方性の影響を明確にし、与えられた素材の組み合わせのもとで破壊抵抗を最大にする繊維の特性、寸法に対するマトリックス組織(特に結晶粒径)最適化の指針を得た。したがって、静的・動的な状態で結晶粒単でのミクロな応力場を知り、その発生におよぼす結晶粒寸法・方位の影響を知りマトリックス組織を最適化することが必要である。

試作した装置を複合材料の力学試験が可能な横型引張り試験機と一体化させ、Al_2O_3繊維強化Al_2O_3の破壊試験時の応力分布のその場観察を行い、結晶粒径を変化させた場合の破壊試験時の材料中微視応力分布を求めた。その結果、界面の応力およびクラック進展開始応力は結晶粒径に依存し、界面せんだん応力およびクラック進展開始応力が最大となる結晶粒径が存在することが明らかとなった。与えられた素材の組み合わせのもとで破壊抵抗を最大にする繊維の特性、寸法に対するマトリックス組織(特に結晶粒径)最適化の指針を得た。
次世代シークエンサーのメタゲノミック解析を用いた新生児感染症の病原微生物の同定

本研究の目的は、新生児感染症において次世代シークエンサーを用いたメタゲノミック診断法を確立し、今まで同定が困難だった病原微生物の同定を行うことであった。結果、次世代シークエンサーを用いたメタゲノミック解析系を確立し、新生児および小児感染症領域に応用した。乾燥臍帯で子宮内エコーウイルス7型感染を証明しえた新生児遷延性肺高血圧症の新生児、間質性肺炎を発症したエンテロウイルスD68感染症の小児、網膜血管吻合を伴う網膜炎を合併した先天性サイトメガロウイルス感染症の新生児などの新知見を得、英文ジャーナルに発表した。本研究の目的は、世界で初めて新生児感染症において次世代シークエンサーを用いたメタゲノミック診断法を確立し、今まで同定が困難だった病原微生物の同定を行うことである。そのために、まず本研究課題内容を神戸大学大学院医学研究科遺伝子解析研究倫理審査委員会に申請した。No.104「次世代シークエンサーを用いたメタゲノミック診断法の確立と周産期・新生児期・小児期における感染症の新規病原微生物遺伝子の同定」として承認を得た(平成26年9月29日付)。本年度は、1.研究のセットアップと2.すでに病原微生物を同定できている感染症を発症した既存サンプルを用いて、次世代シークエンサーによるメタゲノミック解析(後ろ向き解析)を行うことを目的とした。1.Miseq(イルミナ社)プラットフォーム、シークエンスに必要なライブラリ作成技術・シークエンスランや解析を行う研究環境を整えた。2.エンテロウイルスが同定されている既存サンプル(咽頭ぬぐい液、糞便)で、ライブラリ作成、シークエンスランを行い、ヒトゲノム参照配列を除外し、サンガー法でエンテロウイルスの配列を確認した。周産期・新生児感染症関連成果の学会発表、論文や著書を執筆掲載した。本研究の目的は、世界で初めて新生児感染症において次世代シークエンサーを用いたメタゲノミック診断法を確立し、今まで同定が困難だった病原微生物の同定を行うことを目指している。平成26年度にすでに本研究課題内容に関して神戸大学大学院医学研究科遺伝子解析研究倫理審査委員会の承認を得(no. 104、平成26年9月29日付)、研究のセットアップとすでに病原微生物を同定できている既存サンプルを用いて、次世代シークエンサーによるメタゲノミック解析(後ろ向き解析)で同定できることを確認した。平成27年度は、正常分娩であっても、分娩方法の違い(経腟分娩か帝王切開か)によって細菌叢が異なるかを検出するために、患者の同意のもと、種々の分娩方法での胎盤および臍帯を計8検体ずつ収集し保存した。また、先天性細菌感染症発症の胎盤を2検体収集保存にも成功した。さらなる次世代シークエンサーでの解析技術の習得を行った。周産期新生児および小児感染症、次世代シークエンサーに関連する研究成果の学会発表、論文や著書を執筆した。平成27年度は、正常分娩であっても分娩方法の違い(経腟分娩か帝王切開か)によって細菌叢が異なるかを検出するために、患者の同意のもと、種々の分娩方法での胎盤および臍帯を計8検体ずつ収集し保存できた。さらなる次世代シークエンサーでの解析技術の習得を行い、論文発表できた。本研究の目的は、周産期新生児感染症において次世代シークエンサーを用いたメタゲノミック診断法を確立し、今まで同定が困難だった病原微生物の同定を行うことを目指した。平成26年度に、本研究課題内容に関して神戸大学大学院医学研究科遺伝子解析研究倫理審査委員会の承認を得(no. 104、平成26年9月29日付)、研究のセットアップと、すでに病原微生物を同定できている既存サンプルを用いて、次世代シークエンサーによるメタゲノミック解析(後ろ向き解析)で同定できることを確認した。平成27年度は、正常分娩であっても、分娩方法の違い(経腟分娩か帝王切開か)によって細菌叢が異なるかを検出するために、患者の同意のもと、種々の分娩方法での胎盤および臍帯を計8検体ずつ収集し解析を試みた。また、先天性細菌感染症発症の胎盤を2検体収集し解析を試みた。平成28年度は、次世代シークエンサー解析技術を含む感染症の病原微生物のゲノム解析を行い、周産期新生児および小児感染症に関連する研究成果発表を行った。今回の科研費での研究を基に周産期新生児および小児感染症領域の病原微生物を検出するための次世代シークエンサーを用いたメタゲノミック診断法の応用や実用化を目指す。また、藤田保健衛生大学総合医科学研究所分子遺伝学教室倉橋浩樹教授や兵庫県衛生研究所感染症部との共同研究体制も構築できた。

乾燥臍帯で子宮内エコーウイルス7型感染を証明しえた新生児遷延性肺高血圧症の新生児、間質性肺炎を発症したエンテロウイルスD68感染症の小児、網膜血管吻合を伴う網膜炎を合併した先天性サイトメガロウイルス感染症の新生児などの新知見を得、英文ジャーナルに発表した。本研究課題を平成26年9月29日付で神戸大学大学院医学研究科遺伝子解析研究倫理審査委員会の承認を得た。Miseqプラットフォーム、シークエンスに必要なライブラリ作成技術・シークエンスランや解析を行う研究環境のセットアップを終えた。すでに病原微生物(エンテロウイルス)を同定できている既存サンプル(咽頭ぬぐい液、糞便)で、ライブラリ作成、シークエンスランを行い、ヒトゲノム参照配列を除外し、サンガー法でエンテロウイルスの配列を確認できた。周産期・新生児感染症関連成果の学会発表、論文や著書を執筆掲載した。病原微生物を検出するための次世代シークエンサーを用いたメタゲノミック診断法の確立の確立を目指す。平成27年度の保存した胎盤と臍帯検体を解析し、正常分娩時における細菌叢を同定する。続いて、先天性細菌感染症発症の胎盤を解析し、その細菌が同定できるかを検証する。その後、可能なら未知の病原微生物の同定を試みる。共同研究として藤田保健衛生大学総合医科学研究所分子遺伝学教室倉橋浩樹教授と共同でバイオインフォマティクスのアドバイスも受け、兵庫県衛生研究所との共同研究によりすでに確立された方法で既知病原微生物の同定を確認できる環境を整えていく。新生児医学、小児感染症学既知および未知の病原微生物を検出するための次世代シークエンサーを用いたメタゲノミック診断法の確立の確立を目指す。エンテロウイルスやその他の病原微生物を同定できている既存サンプルを用いてメタゲノミック解析を反復して行い、本診断方法をまず確立させる。続いて、従来法にて病原微生物を同定できなかったが感染症を発症した新生児の既存サンプルを用いて、今まで同定が困難だった既知の病原微生物や新規の病原微生物の同定を試みる。共同研究として藤田保健衛生大学総合医科学研究所分子遺伝学教室倉橋浩樹教授との共同研究でバイオインフォマティクスのアドバイスも受け、衛生研究所との共同研究によりウイルス分離や既知病原微生物の除外診断が可能であるため試料の提出の準備を整えていく。他研究費により物品試薬費用を充当できた。そのため若干の次年度使用額が生じた。引き続き、Miseqおよびシークエンスに必要なライブラリ作成・シークエンスランや解析のための試薬等に充当する。積極的に学会へ参加し最新の技術や知識の習得のために使用する。また、成果発表費用としても使用する予定である。
繰り返し構造を有するStarch-binding domainの構造と機能

1.B.polymyxa由来β/α-アミラーゼの繰り返し配列の機能解析Bacilluspolymyxaのβ/α-アミラーゼは中央の約100アミノ酸からなるCBM25に分類されるデンプン結合領域(SBD)を2つ挟む形でN末端側にβ-アミラーゼ,C末端側にα-アミラーゼが連なった前駆体として合成される.この前駆体は菌体外へ分泌された後,SBDの前後でプロセッシングされ,β-アミラーゼとα-アミラーゼに分割される.これまでにこのSBDがN末端側のβ-アミラーゼに与える影響は明らかになっている.今回は,中央の繰り返し配列がC末端側に存在するα-アミラーゼに与える影響について検討した.ネイティブ状態に近い構造となるようにα-アミラーゼのN末端側にSBDを0,1,または2つ付加し,さらにそのN末端側にチオレドキシン(Trx)タグを付加した融合タンパクをそれぞれ作製したところ,活性のあるα-アミラーゼを発現させることに成功した.3種類の発現産物の精製およびTrxタグの除去を行い,各酵素の性質について検討したところ,α-アミラーゼにおいて本繰り返し配列は可溶性デンプンに対する酵素化学的な性質にほとんど影響を与えなかったが,繰り返し配列の数に依存して生デンプンに対する吸着性および分解活性は上昇した。以上のことから,本繰り返し配列がSBDとして機能することが明らかとなった.2.デンプン結合頒域(SBD)に付加された糖鎖がSBDの機能に与える影響Bacillus sp.no.195株由来α-アミラーゼ(BAA)はC末端側にCBM25に分類されるデンプン結合領域(SBD)を持つ。生デンプン分解能が低いと言われているタカアミラーゼA(TAA)に本SBDを付加したところ、TAAは明確な生デンプン分解活性を示したが,獲得した生デンプン分解活性は予想された値より低かった.その原因として、原核生物由来の本SBDを真核生物で発現させたために、本来存在しない糖鎖が付加され、デンプンへの結合に影響を与えたことが示唆された。今回、糖鎖がSBDの機能にどの程度影響しているかについて調べた。アミノ酸配列からSBDのN結合型糖鎖付加部位が3カ所予想されたので,それぞれについてPCRを用いて変異を入れることで糖鎖付加部位を明らかにするとともに、糖鎖が付加しないSBDを作製し、TAAのC末端に結合させるように遺伝子を設計した。これを糸状菌用高発現ベクターpNAN8142を用いたAspergillus oryzaeの系で発現させた.発現産物を精製し,生デンプン分解能について検討した結果,N型糖鎖はC末側の連続した結合部位のどちらかに結合していることがわかり,その影響で結合力が若干減少していることが明らかとなった.1.B.polymyxa由来β/α-アミラーゼの繰り返し配列の機能解析申請者らによって同定された繰り返し構造を有するCBM25に分類されるSBDに対してさらなる知見を得るためにB.polymyxa由来β/α-アミラーゼの繰り返し配列について,生デンプン結合活性,生デンプン分解能の付与等について検討を行った.本アミラーゼはN末端側からβ-アミラーゼ,繰り返し配列,α-アミラーゼの順に連なっており,菌体外に分泌された後に菌体外プロテアーゼでプロセッシングを受けてそれぞれ成熟型アミラーゼとなる.今回はβ-アミラーゼに対する繰り返し配列の影響を検討するため,β-アミラーゼのC末端側へ繰り返し配列を付加する形で発現ベクターを構築し,大腸菌にて発現させた.発現酵素を精製し,諸性質について検討を行った結果,繰り返し配列が生デンプン結合活性に関与することを証明した.しかも,本SBDは他のSBDと異なり,デンプン性基質以外にβ-1,6グルカンやxylanに対しても結合するというユニークな結合特異性を示した.しかし生デンプン分解活性を付与するかどうかについての明確な証拠を得ることはできなかった.(2003年度日本生物工学会大会発表)Gla Aには多くのアミラーゼに存在するCBM20に分類されるSBDが存在する.そこでCBM20とCBM25との比較や添加効果について検討するためGla AからSBDを除去したものにCBM25を付加したものや,野生型Gla AにCBM25を付加したものを作製した.その結果,生デンプン結合活性および分解活性とも,オリジナルのCBM20の方が人工的に付加したCBM25よりも若干高い活性を示したが,CBM20にさらにCBM25を付加したものは生デンプン結合活性および分解活性とも増強された.(日本農芸化学会2004年度大会発表)1.B.polymyxa由来β/α-アミラーゼの繰り返し配列の機能解析Bacilluspolymyxaのβ/α-アミラーゼは中央の約100アミノ酸からなるCBM25に分類されるデンプン結合領域(SBD)を2つ挟む形でN末端側にβ-アミラーゼ,C末端側にα-アミラーゼが連なった前駆体として合成される.この前駆体は菌体外へ分泌された後,SBDの前後でプロセッシングされ,β-アミラーゼとα-アミラーゼに分割される.これまでにこのSBDがN末端側のβ-アミラーゼに与える影響は明らかになっている.

今回は,中央の繰り返し配列がC末端側に存在するα-アミラーゼに与える影響について検討した.ネイティブ状態に近い構造となるようにα-アミラーゼのN末端側にSBDを0,1,または2つ付加し,さらにそのN末端側にチオレドキシン(Trx)タグを付加した融合タンパクをそれぞれ作製したところ,活性のあるα-アミラーゼを発現させることに成功した.3種類の発現産物の精製およびTrxタグの除去を行い,各酵素の性質について検討したところ,α-アミラーゼにおいて本繰り返し配列は可溶性デンプンに対する酵素化学的な性質にほとんど影響を与えなかったが,繰り返し配列の数に依存して生デンプンに対する吸着性および分解活性は上昇した。以上のことから,本繰り返し配列がSBDとして機能することが明らかとなった.2.デンプン結合頒域(SBD)に付加された糖鎖がSBDの機能に与える影響Bacillus sp.no.195株由来α-アミラーゼ(BAA)はC末端側にCBM25に分類されるデンプン結合領域(SBD)を持つ。生デンプン分解能が低いと言われているタカアミラーゼA(TAA)に本SBDを付加したところ、TAAは明確な生デンプン分解活性を示したが,獲得した生デンプン分解活性は予想された値より低かった.その原因として、原核生物由来の本SBDを真核生物で発現させたために、本来存在しない糖鎖が付加され、デンプンへの結合に影響を与えたことが示唆された。今回、糖鎖がSBDの機能にどの程度影響しているかについて調べた。アミノ酸配列からSBDのN結合型糖鎖付加部位が3カ所予想されたので,それぞれについてPCRを用いて変異を入れることで糖鎖付加部位を明らかにするとともに、糖鎖が付加しないSBDを作製し、TAAのC末端に結合させるように遺伝子を設計した。これを糸状菌用高発現ベクターpNAN8142を用いたAspergillus oryzaeの系で発現させた.発現産物を精製し,生デンプン分解能について検討した結果,N型糖鎖はC末側の連続した結合部位のどちらかに結合していることがわかり,その影響で結合力が若干減少していることが明らかとなった.
多様な流動・変形履歴による二軸配向非晶フィルムの配向結晶化挙動に関する基礎解析

配向したポリエチレンテレフタレート(PET)の結晶化速度を高速DSCを用い、熱収縮の影響を除くために予備熱処理を実施する方法を用いることで、定量的に解析する手法を確立し、配向様式及び配向度と結晶化速度の関係について考察を行った。その結果、一軸配向サンプルと等二軸配向サンプルとは異なるアブラミ指数を有し、結晶化速度の温度依存性も異なる事、等二軸配向サンプルにおいて面配向の固有複屈折を用いて配向度を算出すると、同程度の配向度を有する一軸配向サンプルよりも結晶化速度が遅い傾向があることが明らかとなった。超高速DSC装置を導入し、配向度の異なるポリエチレンテレフタレート(PET)繊維について超高速昇温下での結晶化挙動について測定を行った。その結果、配向したPET試料をガラス転移温度(約70°C)に加熱すると長さが短くなる収縮現象が観測された。配向したポリマー試料をガラス転移以上に加熱すると収縮が怒ることは非常によく知られた現象ではあるが、この収縮現象について超高速昇温下で観測された例はこれまでになく、その速度についても殆ど検討されたことはなかった。今回の実験結果は昇温に伴う収縮現象が極めて速い速度で進行することを示している。このような収縮は分子鎖の配向緩和がその主要因と考えられているが、ガラス転移付近における分子の緩和時間はそれほど早いとは考えられておらず、分子運動論的にも非常に興味深い発見と考えられる。その一方で、サンプルが加熱に伴い変形してしまうことは、変形に伴いサンプルが動いてしまうなど、結晶化挙動を正確に測定する上で障害となることも明らかとなった。このため、PETを他のポリマーと組み合わせ、複合繊維とすることで加熱時の変形を抑制することを試みた。その結果、PETとポリプロピレンを複合化することにより、加熱時の変形を大幅に抑制できることを見いだした。超高速昇温時でも変形が生じるとことは、超高速昇温過程において分子配向の変化が生じていることを示唆するものであり、形態の固定無くしては配向度と結晶化速度の関係を正確に把握することは不可能だと考えられる。今回、変形を抑制する方向性を見いだせた事は今後の研究推進にあたり非常に有意義であると考えている。昨年までの検討で、超高速DSCを用いることにより、配向試料の結晶化に対応した時間分解能での結晶化発熱の測定が可能であることが確認されていたが、非晶状態にある配向試料を加熱した際、結晶化よりも早く熱収縮が発生し、それによりDSC測定のベースラインが乱れてしまうことが問題となることが明らかとなった。本年度は、非晶状態にある配向試料の加熱時の収縮特性や、その際の熱の出入り、収縮後の結晶化挙動などを詳細に観測した。その結果、超高速DSCを用いて、試料のガラス転移点より1040°C高温まで急速加熱し、即座にガラス転移点より十分低い温度まで急速冷却すると、非常に早い現象である熱収縮はほぼ完了する一方で、比較的遅い現象である結晶化はほとんど進行しないことを見いだした。この熱収縮した非晶状態の試料をもう一度所定の昇温速度で昇温し、その際の熱の出入りを観測することにより、結晶化速度を精度良く観測することが可能となった。その結果、元となる試料の配向度が高いほど、熱収縮後の結晶化速度が向上していることが示され、元となる試料の配向度と結晶化速度に相関があることが示された。一般に、非晶状態にある配向試料を熱収縮させると、複屈折で観測される分子全体の平均的な配向度は0となりる事が知られている。今回の結果は、一度配向させた試料を熱収縮させ、分子全体の平均的な配向を緩和させても、結晶化速度が元々無配向の試料と比較して明らかに早いことを示している。これは、結晶化に影響を与える何らかの構造が熱収縮後も緩和せずに残っていることを示すものであり、配向試料の結晶化速度を考える際には、平均的な分子配向だけではなく、試料の変形履歴から来る、さらに高次の構造の配向まで考慮する必要があることを示すものである。本年度は、昨年度開発した予め収縮処理を施した後に高速DSCで結晶化速度を計測する手法について、収縮処理が結晶化速度に与える影響を定量的に評価すると共に、二軸延伸したpoly(ethlene terephthalate)(PET)フィルムの結晶化速度の定量的な解析を行った。さらに、一軸配向した繊維試料の解析結果と比較を行うことにより、二軸延伸による配向が結晶化速度に与える影響について考察を行った。まず、結晶化速度が比較的低い配向度0.09の繊維試料を用いて、従来型のDSCを用いて試料形態を拘束した場合と予め収縮処理を行う方法とで結晶化速度を測定した結果、120 °Cにおける未配向試料の結晶化速度を1とすると、予め収縮処理を行った試料の結晶化速度は6.7、試料形態を拘束した場合の結晶化速度が111であり、収縮処理により結晶化速度は低下するが、未配向試料と比較すると結晶化速度が高く、一度配向した履歴が結晶化速度に影響を及ぼすことが確認された。更に配向度の高い試料について、予め収縮処理を施した上で高速DSCを用いて結晶化速度の定量的な解析を行った。その結果、140 °Cにおける未配向フィルムの結晶化速度を1とすると、配向度0.39の等二軸配向フィルムの結晶化速度は247、0.53の等

二軸延伸フィルムの結晶化速度は2584となり、配向度によって結晶化速度が大幅に増加することが示された。一方で、140 °Cにおける未配向繊維試料の結晶化速度を1としたときの配向度0.23の一軸配向繊維試料の結晶化速度は354、配向度0.34の一軸配向繊維試料の結晶化速度は1556であり、同じ配向度で比較した場合、等二軸延伸フィルムの方が一軸配向繊維よりも結晶化速度が遅い事が示された。配向したポリエチレンテレフタレート(PET)の結晶化速度を高速DSCを用い、熱収縮の影響を除くために予備熱処理を実施する方法を用いることで、定量的に解析する手法を確立し、配向様式及び配向度と結晶化速度の関係について考察を行った。その結果、一軸配向サンプルと等二軸配向サンプルとは異なるアブラミ指数を有し、結晶化速度の温度依存性も異なる事、等二軸配向サンプルにおいて面配向の固有複屈折を用いて配向度を算出すると、同程度の配向度を有する一軸配向サンプルよりも結晶化速度が遅い傾向があることが明らかとなった。本研究の目的は、一軸配向だけでなく、二軸配向や一面配向など、様々な配向が結晶化速度にどのような影響を与えるかを定量的に解析することを目的としている。しかし、これまでの研究により、配向試料を結晶化させるために昇温する際には、結晶化よりも速度が速い熱収縮が先に発生し、結晶化速度の正確な測定を妨げることが明らかとなった。また、当初は三次元複屈折測定により分子の配向度を評価することを想定していたが、本年度の検討により、熱収縮後のサンプルにおいても、結晶化速度が向上していることが示され、複屈折では表すことのできない配向構造が結晶化速度に大きな影響を与えることが示された。これらの結果は、当初の目標である配向試料の結晶化速度の定量解析という点で見れば進捗を遅らせる事となった。その一方で、複屈折では表せない配向構造が結晶化速度に大きな影響を与えることを定量的に示すことができたことは、高分子の配向結晶化の解析において大きな進歩である。27年度が最終年度であるため、記入しない。高分子構造・物性(含繊維)本年度、熱収縮後のサンプルにおいても結晶化速度の向上が見られることが示されたことから、今後は、一軸配向に限らず、様々な配向様式で配向度の異なる試料を作製し、そのサンプルの熱収縮後の結晶化速度を測定することにより、結晶化速度に与える変形履歴の効果を明らかにする。また、熱収縮を示さない樹脂と複合する等の手法を用いることにより形態を固定し、当初の配向度を保った場合の結晶化速度の測定も同時に進め、当初の目的であった配向試料の結晶化速度の定量解析を進めると共に、熱収縮の有無による結晶化速度の変化などから、結晶化速度に影響を与える構造について、より深い考察を進める。超高速DSC装置の導入と立ち上げに関しては計画通り実施することができたが、その過程において、超高速昇温下においても配向試料については変形の影響が無視できないことが明らかとなった。この変形については研究開始前には想定しておらず、その変形を抑制する方法の探索に時間を要していることから、当初交付申請書に記載した目的に対する進捗はやや遅れている。昨年度の検討において、昇温時の変形を抑制する手段として他の素材との複合化が有効であることが示されているので、さらに多種類の素材との複合化を検討し、超高速昇温下において変形を抑制しつつ、結晶化挙動が正確に測定出来る系を探索する。
頬・口腔粘膜潰瘍モデルとしてのリーシュマニア症の病理・免疫学的研究

近交系マウス(Balb/c)の頬・口腔粘膜下及び背部皮内にLeishmania amazonensis(La)またはL.gyanensis(Lg)のプロマスチゴ-ト(Pm)・2x10^8を接種し、接種局所に生じた病巣の経時的変化について肉眼的および病理学的に観察を行った。接種直後の局所の腫脹(Pm懸濁液の接種局所での貯留)は、1時間以内にほぼ消失し、La接種マウスにおいては接種10日前後から腫瘤の形成が認めるようになり、またLg接種マウスではLa接種マウスより3-4日遅れ腫瘤の形成が確認できた。腫瘤は観察期間中、時間の経過とともに増大し、腫瘤登頂部の皮毛の消失が認められ、La感染マウスの中で皮膚潰瘍を形成するものもいた。血中の抗リーシュマニア抗体価は、接種1週間程から上昇し、時間経過とともに抗体価の上昇が認められ観察期間中漸次上昇し続けた。血中IgE量および血中ならびに唾液中の抗リーシュマニアIgAの増加は今回の実験期間中では明らかでなかった。接種局所の病理組織標本の観察では、単核細胞の高度浸潤を認め、結合組織、筋組織がこれら浸潤細胞で置換されたような肉芽腫様病巣を呈していた。また単核球系の貧食細胞に取り込まれた複数のリーシュマニアや組織間に散在する多数のリーシュマニア(アマスチゴ-ト)が認められるとともに、それら細胞周囲に好酸球ならびに肥満細胞の集積が認められた。病巣局所におけるIgEの分布状態は、対照固体と比較において明らかな違いは認められなかった。
腫瘍の診断治療を目的とした抗血管新生因子抗体の開発

腎細胞癌と膀胱癌を対象として腫瘍血管の新生と血管新生因子の関連について検討した。腎細胞癌では6割にVEGF(とくにVEGF_<121>VEGF_<165>)遺伝子の発現高進が認められ、その発現程度は腫瘍内微少血管密度と有意な相関を示した。VEFG蛋白のN末端のオリゴベプチドでウサギを免疫し、抗VEGF血清を作成し免疫組織染色を行った。VEGFは腎細胞癌の胞体に陽性であった。同様に膀胱癌では4割が正常膀胱粘膜と比較して高度のVEGF遺伝子発現をした。また、蛋白レベルではVEGFは膀胱癌細胞に強く発現することが示された。これらの腫瘍では受容体遺伝子もVEGFと相関して高発現しており、パラクライン機構による血管の新生が惹起されていると考えられた。多様なVEGF関連遺伝子(VEGF-A,B,C,D)ならびにそれらの受容体遺伝子があいついでクローニングされたので、腎細胞癌におけるこれらの遺伝子の発現を検索した。その結果、腎細胞癌ではVEGF-Aと受容体(VEGFR-1とVEGFR-2)が血管新生に重要な役割を果たし、VEGF-BとCの関与は小さいとみなされた。これらの結果を基に血清VEGF濃度を腎細胞癌患者と非坦癌健常コントロールで比較した。その結果、血清VEGF濃度は腎細胞癌患者で有意に高値を示すことが明らかになった。また、術後は術前に比較して有意に血清VEGF濃度の低下が認められた。血清VEGFは腫瘍容積、転移、ならびに腫瘍進展に有意に相関した。ROC解析の結果から血清VEGFのカットオフ値を100pg/mlに設定すると感度と特異度はそれぞれ80.0%と72.5%となった。これらの結果から腎細胞癌はVEGFを血中に遊離し、血清VEGFは腎細胞の悪性度の指標になると考えられた。以上の成績は腎細胞癌の診断と治療を目的とした抗血管新生因子抗体の開発のための基礎的資料となるものと考えられる。腫瘍の増殖と進展には血管新生が密接に関わっており、腫瘍細胞が産生する多様な生理活性物質が血管新生を促進することが知られている。そのなかでも、basic-fibroblast growthfactor(bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子acidic-fibroblast growthfactor(aFGF)、血管内皮増殖因子vascular endothelial growthfactor(VEGF)は代表的な血管新生因子として位置づけられてきており、これら血管増殖因子がヒト悪性腫瘍の有力なマーカーとなり、かつ治療にも応用可能なことが強く示唆されてきている.本研究では分泌型血管増殖因子(VEGF)と非分泌型血管増殖因子(bFGF)に着目し、腫瘍の診断と治療に実用可能な血管増殖因子抗体を開発することを目的としたが、まずその臨床的価値の妥当性を確認する目的で、泌尿器科領域の代表的悪性腫瘍である腎細胞癌、膀胱癌に着目しこれら腫瘍における血管増殖因子の重要性に関して検討した.本年度の検討では、表在性膀胱癌におけるVEGF、bFGF、aFGFの発現とその病理学的パラメータとの関連においては、これらの発現量と腫瘍全体における血管の増生形態との間には有意な関連は認められなかったが、腫瘍の基底膜下浸潤には局所の血管新生因子の発現増加を伴うことが示され、腫瘍の浸潤や転移抑制における利用価値が示唆された.また、腎細胞癌においては、腎癌患者の血中VEGF濃度は正常対照と比較して有意に高値を示すことが判明した.