hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウルトラマイクロ電極を用いた細胞内化学反応の探索

本研究で以下の結果を得た.1.先端系が5μm以下の白金ディスク電極を,電解エッチングによる白金の細線化,ガラスキャピラリ中への封入,先端の研磨の工程により作製した.作製した電極の挙動を種々の計測法により検討し,定電位アンペロメトリー,微分アンペロメトリーにより酸素還元電流を計測することにより,電極が存在する局所領域の酸素濃度を測定できることが明らかとなった.2.作製した電極を植物細胞であるハネモプロトプラスト内に挿入し,定電位アンペロメトリーにより細胞内酸素濃度計測を行った.この細胞に光照射を行ったところ,細胞内酸素還元電流が急激に増加し,光合成による細胞内酸素濃度変化をリアルタイムで計測できることが示された.また,微分アンペロメトリー細胞近傍の酸素濃度変化を詳細に測定し,光合成や呼吸に伴う酸素放出量や酸素吸収量を単一細胞レベルで決定できた.3.マイクロ電極を細胞膜類似物である脂質二分子膜に近傍させ,酸化還元電流を計測することにより,Ru(NH_3)_6^<3+>, Fe(CN)_6^3のイオンチャネル透過性を評価することができた.また,プロトプラストにマイクロ電極を近接させボルタンメトリーを行うことにより,フェロセニルメタノール,Ru(NH_3)_6^<3+>, Fe(CN)_6^3の膜透過性を,生きた単一細胞で評価することができた.4.マイクロ電極先端部にNiポルフィリンを固定したNOマイクロセンサおよびスーパーオキシドディスムターゼ/カタラーゼを固定したO_2を作製した.これらセンサをラット脳内に埋め込むことにより,生体内のNOおよびO_2の濃度計測に成功した.本研究で以下の結果を得た.1.先端系が5μm以下の白金ディスク電極を,電解エッチングによる白金の細線化,ガラスキャピラリ中への封入,先端の研磨の工程により作製した.作製した電極の挙動を種々の計測法により検討し,定電位アンペロメトリー,微分アンペロメトリーにより酸素還元電流を計測することにより,電極が存在する局所領域の酸素濃度を測定できることが明らかとなった.2.作製した電極を植物細胞であるハネモプロトプラスト内に挿入し,定電位アンペロメトリーにより細胞内酸素濃度計測を行った.この細胞に光照射を行ったところ,細胞内酸素還元電流が急激に増加し,光合成による細胞内酸素濃度変化をリアルタイムで計測できることが示された.また,微分アンペロメトリー細胞近傍の酸素濃度変化を詳細に測定し,光合成や呼吸に伴う酸素放出量や酸素吸収量を単一細胞レベルで決定できた.3.マイクロ電極を細胞膜類似物である脂質二分子膜に近傍させ,酸化還元電流を計測することにより,Ru(NH_3)_6^<3+>, Fe(CN)_6^3のイオンチャネル透過性を評価することができた.また,プロトプラストにマイクロ電極を近接させボルタンメトリーを行うことにより,フェロセニルメタノール,Ru(NH_3)_6^<3+>, Fe(CN)_6^3の膜透過性を,生きた単一細胞で評価することができた.4.マイクロ電極先端部にNiポルフィリンを固定したNOマイクロセンサおよびスーパーオキシドディスムターゼ/カタラーゼを固定したO_2を作製した.これらセンサをラット脳内に埋め込むことにより,生体内のNOおよびO_2の濃度計測に成功した.平成6年度の研究で以下の結果を得た。1.ガラスキャピラリー中に,カーボンを熱分解などにより析出させ,単一細胞内に挿入可能なウルトラマイクロ電極の作製に成功した.また,電解エッチングにより直径1μm以下の白金極微細線を作製し,溶融ガラスで先端部を被覆することによってもウルトラマイクロ電極を作製できた.作製した電極の特性をサイクリックボルタンメトリーにより評価したところ,安定で再現性の良い電極挙動を示すことが確認された.2.作製したウルトラマイクロ電極を,植物細胞であるハネモのプロトプラストに挿入し,酸素還元反応をボルタンメトリで計測することにより,単一細胞内酸素濃度計測に成功した.また,この細胞の光を照射した場合の挙動に関して検討した結果,ウルトラマイクロ電極を用いた細胞内酸素濃度計測により,急激な細胞内酸素濃度の変化を,リアルタイムで計測できることが明らかとなった.3.細胞外に設置したマイクロ電極と細胞間の距離を種々変化させ,ボルタンメトリーを行い,酸素濃度を決定した.その結果,暗所下の測定では細胞-電極間の距離が小さくなるにつれ酸素濃度は減少し,この挙動を解析することにより単一細胞が呼吸により消費する酸素量を求めることができた.また,光照射下での挙動を解析し,光合成による酸素発生量を決定することもできた.4.マイクロ電極を細胞膜類似物である物質二分子膜に近接させ酸素還元電流を計測することにより,ルテニウムアンミン錯体,鉄シアノ錯体のイオンチャンネル透過性を評価することができた.平成7年度の研究で以下の結果を得た.1.先端直径が5μm以下の白金ディスク電極を用いて酸素環原電流を再現性よく計測する手法の関して種々検討し,-400mVvs. Ag/AgClのパルス印加によるディファレンシャルパルスボルタンメトリー法を利用すると,再現性よく酸素還元電流を計測でき,またその値から局所領域の酸素濃度を計測できることが示された.この場合には、測定パルス間に1V程度のクリーニングパルスを印加した.2.上記手法を用いて植物細胞(ハネモプロトプラスト)および動物細胞(ヒト結腸腺がん由来のSW-480)の極近傍の酸素濃度計則を行い,呼吸による酸素吸収速度,光合成による酸素放出速度を単一細胞レベルで計測することに成功した.

また,ガラスキャピラリを動物細胞に刺入することにより,細胞の酸素消費量が一時的に増加することが示された.3.カーボンファイバー先端部にNiポルフィリンを固定することにより,NOマイクロセンサを作製した.このセンサをラット脳内の海馬部に固定し,生体内NO濃度計測に成功した.ラットにメチルアスパラギン酸投与したところ,脳内NO濃度は増加したが,予めメチルアルギニンを投与した場合には,NO濃度上昇は機構されなかった.4.金マイクロディスク電極上に,カタラーゼとスーパーオキシドディスムターゼを固定し,スーパーオキシドセンサを作製し,これをラット脳内の線条体に固定することにより,脳内スーパーオキシド濃度の計測に成功した.ラットを純酸素雰囲気化におくと,酸素ストレスにより脳内スーパーオキシド濃度が増加することが確認された.これらのセンサを細胞レベルの計測に供することにより,より詳細な気孔が明らかになるものと考えられる.
抗体によるウイルスの出芽阻害メカニズムに関する研究

過去の研究を通してウイルスに対する出芽阻害抗体を得たが、阻害機序や防御免疫への寄与は不明であった。本研究を通して、鼻腔内免疫によりインフルエンザウイルスに対する放出阻害抗体が誘導されることがわかった。また、誘導されたIgA抗体を介したウイルス粒子の架橋により、新生ウイルスが細胞上に繋留される事が示唆された。このウイルス放出阻害が鼻腔内免疫による亜型間交差防御の機序である可能性が示唆された。また、出芽阻害抗体の有する防御効果をマールブルグ熱の齧歯類動物モデルを用いて検討した。その結果、出芽阻害抗体投与群において予後の改善が見られた。よって、出芽阻害抗体が生体の感染防御に寄与するものと考えられる。フィロウイルス(エボラウイルス(EBOV)およびマールブルグウイルス(MARV))はヒトを含む霊長類に重篤な出血熱を引き起こす。一般的に、抗体によるウイルスの中和は、ウイルスの表面糖蛋白質に結合した抗体がウイルスの細胞侵入を阻害することによると考えられている。昨年度までの研究により、従来の中和活性を持たない抗体がMARVの出芽を著しく阻害することを報告した。本研究では抗体による出芽阻害のメカニズムおよび感染防御への寄与を明らかにし、フィロウイルス感染症に対する新たな予防・治療法の開発へとつながる知見を得ることを目指す。MARV同様、EBOVに対する出芽阻害抗体の存在が予想された。そこで、Zaire EBOVの表面糖蛋白質GPを有するウイルス様粒子をマウスに免疫し、従来の融合法によりGP特異的抗体を産生するハイブリドーマ細胞を計136クローン樹立した。各細胞の培養上清を用いて、産生抗体のZaire EBOVに対する出芽阻害活性ならびに中和活性についてスクリーニングしたところ、それぞれ32および24クローンが陽性だった(抗体存在下において、出芽効率もしくは細胞侵入効率が半減したとき陽性とした)。また、いくつかの抗体は異なるフィロウイルス種のGPに対して交差反応を示した。来年度は、各抗体を精製し、出芽阻害活性および中和活性について解析をする。出芽阻害抗体の感染防御免疫への寄与を明らかにする為にハムスターを用いた防御試験を計画した。EBOVと異なり、MARVにはハムスター馴化株が存在しない。そこで、本年度はハムスターを用いてMARVを継代し、MARVのハムスター馴化株を得た。来年度はMARVおよびEBOVのハムスター馴化株を用いて、出芽阻害抗体の受動免疫による防御試験を実施する。一般的に抗体によるウイルス中和はウイルスの表面糖蛋白質に結合した抗体が、ウイルスの細胞侵入を阻害することによると考えられている。また、研究を通して得られた抗体の診断法への応用を目指す。昨年度までの研究により、EBOVの表面糖蛋白質GPに対する136の単クローン抗体が得られた。ハイブリドーマ細胞の培養上清を用いたスクリーニングの結果、32クローンがEBOVに対する出芽阻害活性を示した。これら抗体を産生するハイブリドーマを単離し、マウス腹水から抗体を精製した。精製抗体を用いて出芽阻害活性を解析したところ、残念な事にいずれの抗体も出芽阻害活性を示さなかった。細胞単離の過程で出芽阻害活性を有する抗体の産生が低下した可能性が考えられる。また、出芽阻害抗体のMARVに対する感染防御免疫への寄与を明らかにする為にハムスターを用いた感染実験を実施した。その結果、出芽阻害抗体投与群において若干の予後の改善が見られた。出芽阻害抗体が生体の感染防御に寄与している可能性が示唆された。その他、不活化インフルエンザウイルスの鼻腔内接種による亜型間交差防御にIgA抗体によるウイルス粒子の放出抑制が関与していることがわかった。また、エボラウイルスの核蛋白質NPを認識する単クローン抗体が得られた。これら抗NP抗体のエピトープを決定すると共に、抗体を応用したエボラウイルス病に対する迅速診断キットを試作した。26年度が最終年度であるため、記入しない。ウイルス学26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究により、EBOVに対する出芽阻害活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の樹立を示唆する成果が得られた。これまでの研究を通して、抗体によるMARVに対する出芽阻害現象は報告していたものの、同じくフィロウイルス科に属するEBOVにおいても同様の現象が存在するか否かは不明であった。

本研究の目的は抗体による出芽阻害のメカニズムを解明するとともに、フィロウイルス感染症に対する新たな予防・治療法の開発へとつながる知見を得ることである。抗体による出芽阻害については、同じフィロウイルス科であっても、EBOVとMARVで異なるメカニズムを持つ可能性も考えられる。本年度の研究成果により、抗体による出芽阻害のメカニズムについてフィロウイルス全般を対象に研究する事が可能となった。また、本年度の研究によりこれまで報告の無かったMARVのハムスター馴化株の樹立に成功した。抗体による出芽阻害のメカニズム解明を目指す研究と同様に、出芽阻害抗体の感染防御免疫への寄与についてもEBOVおよびMARVの両ウイルスを対象に実験する事が可能になった。本年度の研究では、ハイブリドーマ細胞の培養上清を用いてEBOVGP特異的抗体の有する出芽阻害活性および従来の中和活性をスクリーニング的に評価した。来年度は、これら抗体を精製し、EBOVに対する各種活性を再評価する。なお、いくつかの抗体はZaire以外のEBOV種のGPにも反応性を示した。これらの抗体については種間交差性出芽阻害活性および中和活性を有するか否かを評価する。また、これまでの研究から得られたMARVおよびEBOVに対する出芽阻害抗体の受動免疫による感染防御効果を、ハムスターおよびハムスター馴化フィロウイルスを用いた感染実験により評価する。具体的には、ウイルス接種前後に出芽阻害抗体によりハムスターを受動免疫し、臨床症状・体重の変遷を継時的に記録するとともに、ハムスターの各種臓器におけるウイルス増殖を調べる。さらに、抗体による出芽阻害のメカニズム解明を目指す。現在、その仮説として、1抗体を介したGP分子の架橋による機械的な障害2抗体結合によるGPの出芽促進機能の阻害3抗体結合が誘導するシグナルによる出芽過程の停止、を予想している。これらの予想に従って、抗体存在下におけるウイルス様粒子の凝集の有無、各種欠損GPを用いたウイルス様粒子の出芽効率の解析などを実施する予定である。また、MARVおよびEBOVに対する出芽阻害抗体のエピトープ領域と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをマウスに接種し、得られた血清の出芽阻害活性を解析する。ポリペプチドの免疫によって出芽阻害抗体が効率よく誘導されるようであれば、これらポリペプチドがフィロウイルス感染症の予防に応用可能か評価する。
嚥下リハビリテーションモデルの開発

延髄より上位の脳を損傷した仮性球麻痺患者のうち,強い咬反射がある症例では開口が難しいだけではなく,咀嚼,食塊の移送,飲み込みといった摂食・嚥下の一連の作用を円滑に行えない場合が多い。このような仮性球麻痺患者で口腔後方部の粘膜を刺激すると,開口から嚥下に至る反射が誘発される。この刺激による開口反射は,開口に続く嚥下運動へと円滑に移行する。これは栄養確保や口腔ケアに寄与し、嚥下機能訓練法の効果的な手順の開発につながることが示唆された。開口反射誘発法としてのK-point刺激法の形態学的・神経学的所見を踏まえて、効果的な間接的摂食・嚥下機能訓練法を確立することが研究目的である。今年度は剖出過程において、神経細枝を切らないようにするために、水に浸し神経を浮かせながら剖出を進めた。さらに神経と血管との関係を明らかにするために、摘出標本の動脈に、着色樹脂を注入した。標本の固定状態や血管壁の脆さによっては、着色ゼラチン溶液やラテックスゴムの方が良好な結果を得られた。この手法を冠状動脈の形態解析に援用したところ、良好な結果が得られたので、副次的な英論文としてまとめることができた。今回の剖出所見では、全例に共通して舌神経の鼓索神経合流部ー顎下神経節交通枝間の高さで4-6本の細枝が前下方に向かって出ていた。口峡枝に相当すると考えられるこれらの枝は上下間で網目状の交通を形成し、口蓋舌弓付近の粘膜、臼後隆起および最後臼歯舌側部の歯肉に分布していた。従って、開口反射刺激点の粘膜を支配する感覚神経は、舌神経口峡枝であると同定した。つまり、K-point刺激による開口・嚥下運動は、正常システムが破綻して脳幹系システムの反射回路で行われる異常反射である。その詳細なメカニズムは、これまで説明されていないが、その一つの説明として、健常者では、K-point付近に一種の抑制がかかっていることが考えた。通常、咀嚼を行う時には、K-point付近には繰り返し機械的刺激が加わる。そこで、刺激のたびに開口が起こるのを防ぐための抑制機能が常に働いている。しかし、仮性球麻痺患者のように、延髄皮質路が損傷された場合ではこの抑制がとれてしまい、軽度の刺激でも開口反射が起こるという想定が可能である。従って、K-point刺激法は、開口抑制が機能しなくなっている点を利用していると推察した。研究目的は「開口反射誘発法としてのK-point刺激法の形態学的・神経学的所見を踏まえて、より効果的な間接的機能訓練法を探り、嚥下リハビリテーションモデルを構築する」ことにある。そこで開口・嚥下運動を誘発する臼歯後三角最後部内側における末梢神経レベルでの観察を重点的に行い、これまで曖昧に表現されてきた見解の統一を試みた。新規標本を採取して既存資料で立てた仮説の検証と例数の増加を図るため、標本を蓄積した。記録作業として、神経起始部や血管の位置・本数・痕跡枝の有無の確認、剖出図描画、写真撮影を行なった。剖出標本は、経験を積んだ現在の目で見ると染色法や剖出技術が劣る上、着目すべき部位がずれていたり、記録図が不十分だったりした。そのため、既存標本全体を再検査した。また、並行して、保管しているニホンザルの標本を用いて筋群、神経を剖出し、実体顕微鏡により支配神経の走行や栄養血管の分布状態、周囲組織との関係を観察した。次に、神経と血管との関係を明らかにするために、既存、新規を併せた摘出標本の動脈に、着色樹脂を注入してみた。頭側を結紮して、動脈の太さに応じた注射針(最細33G)を使って手圧で注入したが、固定標本であるため血栓等で滞る場合は、遠位に注射針を刺入する作業を繰り返した。この手法を実習中に偶然発見した大心静脈に援用したところ、良好な結果が得られたので、副次的に論文としてまとめた。最後に、神経と剖出した動脈、周囲の静脈を含む軟組織との関係を詳細に解剖図として記録した。特に進入部位、位置関係、動脈、他の動脈との吻合関係など、従来とは異なる視点で観察にあたった。剖出過程で随時、導入したマイクロスコープShuttlePixを使って写真撮影を実施して最終的な立体モデル作製の補正資料とした。高齢者には,認知症や高次脳機能障害や脳卒中による嚥下障害を抱えた仮性球麻痺の人が増加している。

K-point刺激法を含め摂食・嚥下訓練はある範囲で,看護師の裁量に任された看護技術となっているが,開口反射がなければ自己流とも言える看護師独自の判断で訓練が行われる場合がある。開口・嚥下運動を誘発する臼歯後三角最後部内側における末梢神経レベルでの解明結果を地域・老年看護に活用することが出来れば,画一的になりがちな摂食・嚥下機能訓練法においてエビデンスに基づいた手順の開発につながる。そこで,医療の現場において,本人または家族が希望する療養生活を過ごすための意識の向上・情報提供を目的とし,グローバル・スタンダードとなり得る啓発プログラムを創成し,広く周知する方法の検討に取り組んだ。延髄より上位の脳を損傷した仮性球麻痺患者のうち,強い咬反射がある症例では開口が難しいだけではなく,咀嚼,食塊の移送,飲み込みといった摂食・嚥下の一連の作用を円滑に行えない場合が多い。このような仮性球麻痺患者で口腔後方部の粘膜を刺激すると,開口から嚥下に至る反射が誘発される。このK-point刺激による開口反射は,開口に続く嚥下運動へと円滑に移行する。そこで,舌神経の分布領域への刺激が,開口によって栄養確保や口腔ケアに寄与するほか,嘔吐反射を引き起こす可能性が低い嚥下機能訓練法の効果的な手順の開発につながることが示唆された。地域・老年看護学当初計画案の通りに、研究機材を購入・使用して一定の成果がでている。その結果として分担研究者とともに英論文にまとめることが出来た。当初計画案の通りに、研究機材を購入・使用して一定の成果がでている。解析・計測用コンピュータおよびソフトウェアを用いて、神経分布の形態計測を行い定量的な測定値を得る。さらに、神経分布および形態を視覚的、数値的に比較・分析を進め、論文として発表する。さらに、神経分布および形態を視覚的、数値的に比較し、ヒトとニホンザルの相違について分析を進める。主要な研究機材は揃ったので、試薬購入、実験用消耗品と情報収集のための学会参加費用とする。
新規NMDA受容体チャネルブロッカー探索による脳機能改善薬の創製

NMDA受容体を分子標的としたポリアミン系チャネルブロッカーを開発し、脳機能改善薬のリード化合物創製を目指した。前年度の研究で、既存の開発中薬剤であるメマンチンの10倍程度の活性を持つジヒドロジベンゾアジピン-ホモスペルミン結合体(IC50=0.072μM)を見出した。しかし本シード化合物は体内動態、特に脳組織への移行性に問題を残した。そこで、活性を保持した脂溶性の高い化合物の探索研究を実施した。脂溶性を高めるため、シード化合物中のジヒドロジベンゾアジピン環にハロゲンを導入した誘導体を合成した。さらに、シード分子中の二つの2級アミンを環状構造を利用してアルキル化した化合物を数段階にて調製した。さらに、シード分子中のアミノ基を炭素原子に置き換えた化合物などを多数合成した。また、もう一つのシード分子(TB-3-4:トリベンジルスペルミン)のベンジル基をジヒドロジベンゾアジピンに置き換えた数種の化合物も合成した。これら化合物の活性評価の結果、TB-3-4誘導体においては活性が消失したが、ハロゲンを導入した化合物とアミノ基を炭素原子に置き換えた化合物類では、チャネルブロッカーとしての活性が保持された。今後、より詳細な生物活性評価と分子修飾による動態改善を行い、脳機能改善薬のリード化合物創製を目指す予定である。NMDA受容体はCa2+をニューロンに輸送することにより、記憶の形成、脳虚血時の症状悪化に強く関与している事から、本分子標的のチャネルブロッカーは脳機能改善に大きく寄与すると考えられる。我々は既にNMDA受容体チャネルの最も狭い領域に強く結合する化合物、即ちアントラキノンとポリアミンのハイブリッド型分子を見いだしている。そこでこれらシード化合物を基本として合理的分子設計により種々の誘導体を合成し、これらの活性評価と構造活性相関の検討を行った。NMDA受容体チャネル領域の三次元構造モデルをもとにin silicoでの分子設計の結果、アントラキノン母核に替わる官能基として、3環性複素環化合物のジベンゾアジピン環、ジヒドロジベンゾアジピン環、フェノチアジン環、カルバゾール環、β-カルボリン環、アクリドン環等を母核部として用いることとした。さらに、天然および非天然型のポリアミン類を合成し、母核部と結合することにより20種を越えるハイブリッド型チャネルブロッカーを創製した。以上のようにして得た化合物について、NMDAチャネルブロッカーとしてのIC50値を求めた。その結果、特に、ジヒドロジベンゾアジピンーホモスペルミン結合体はIC50=0.072μMを示し(既存の開発中薬剤であるメマンチンの10倍程度の活性)、その他のin vitro試験でも良好なデータを与えた。今後、薬物動態の改善を目指し、さらに分子修飾を進める予定である。
結晶粒界性格に注目した相変態・析出挙動と組織制御に関する研究

1.凝固柱状晶材からのFCC→BCC拡散変態FCC相で凝固してBCC相を析出しさらに室温にて母相が残存する合金としてNi-43%Cr合金を用い,これを真空溶解・金型鋳込みすることにより,0度から45度の種々の<100>傾角粒界を持つ柱状晶材を作製した.これを1573Kで均一化処理を施した後,FCC+BCC2相温度域で恒温保持しBCC相を析出させた.こられの試験片から粒界面が薄膜面に垂直になるように透過電顕試料を作製し,電顕観察により生成相のバリアントと粒界性格の関係を検討した.この結果,粒界面とFCC相{111}面のなす角度θが20度以下の粒界では,特定のバリアントが優先的に生成するのに対して,θが30度以上の粒界では特定のバリアントの優先性はなく複数のバリアントが生成することを見出した.すなわち,粒界析出物のバリアント選択は粒界面方位に強く依存することを明らかにした.2.マルテンサイト変態の核生成サイトとして働いた結晶粒界の性格室温以下の温度への適切な冷却により少量のラス状マルテンサイトが生成することを確認しているFe-26%Ni-2%Mn合金を用いた.さらにマルテンサイトの核生成場所として働いた結晶粒界の特定を容易にするため柱状晶組織を持つ試料を作製した.この試料をサブゼロ処理して少量のマルテンサイトを生成させ,結晶粒界が核生成サイトとして働くか否かを観察した.さらに核生成サイトとして働いた結晶粒界の粒界性格をSEM-ECP法により決定し,これよりマルテンサイト変態の核生成サイトとして働く粒界が特徴ある粒界性格を持つか否かを検討した.その結果,変態初期のマルテンサイトは全て結晶粒界から生成していた.また,マルテンサイトを生成した粒界とそうでない粒界があり,結晶粒界によって核生成サイトとしての能力の差があることが明らかとなった.マルテンサイトが生成していた粒界の特徴として,(1)粒界面方位が{100}に近いこと,(2)方位差角が1015度であることが挙げられた.1.凝固柱状晶材からのFCC→BCC拡散変態FCC相で凝固してBCC相を析出しさらに室温にて母相が残存する合金としてNi-43%Cr合金を用い,これを真空溶解・金型鋳込みすることにより,0度から45度の種々の<100>傾角粒界を持つ柱状晶材を作製した.これを1573Kで均一化処理を施した後,FCC+BCC2相温度域で恒温保持しBCC相を析出させた.こられの試験片から粒界面が薄膜面に垂直になるように透過電顕試料を作製し,電顕観察により生成相のバリアントと粒界性格の関係を検討した.この結果,粒界面とFCC相{111}面のなす角度θが20度以下の粒界では,特定のバリアントが優先的に生成するのに対して,θが30度以上の粒界では特定のバリアントの優先性はなく複数のバリアントが生成することを見出した.すなわち,粒界析出物のバリアント選択は粒界面方位に強く依存することを明らかにした.2.マルテンサイト変態の核生成サイトとして働いた結晶粒界の性格室温以下の温度への適切な冷却により少量のラス状マルテンサイトが生成することを確認しているFe-26%Ni-2%Mn合金を用いた.さらにマルテンサイトの核生成場所として働いた結晶粒界の特定を容易にするため柱状晶組織を持つ試料を作製した.この試料をサブゼロ処理して少量のマルテンサイトを生成させ,結晶粒界が核生成サイトとして働くか否かを観察した.さらに核生成サイトとして働いた結晶粒界の粒界性格をSEM-ECP法により決定し,これよりマルテンサイト変態の核生成サイトとして働く粒界が特徴ある粒界性格を持つか否かを検討した.その結果,変態初期のマルテンサイトは全て結晶粒界から生成していた.また,マルテンサイトを生成した粒界とそうでない粒界があり,結晶粒界によって核生成サイトとしての能力の差があることが明らかとなった.マルテンサイトが生成していた粒界の特徴として,(1)粒界面方位が{100}に近いこと,(2)方位差角が1015度であることが挙げられた.1.〈100〉傾角粒界を有する凝固柱状晶材からのBCC→FCC拡散変態Fe-26%Cr-7%Ni合金凝固柱状晶の作製し,適切な熱処理条件の決定を完了した.1423Kでの時効析出挙動の観察から以下のことを明らかにした.300sの析出初期段階では,FCC相が析出していない粒界と析出している粒界があり,析出速度は粒界性格に依存する.1.8ksの時効時間では,大角粒界ではほぼ全ての粒界でFCC相が析出するが,傾角が10度以下の小角粒界では析出が観察されない.Fe-32%Ni合金を用いて単結晶,多結晶,および5種の双結晶試料を作製し,それぞれの変態温度を測定した.この結果より,これまで優先的な核生成サイトであると考えられていたランダム大角粒界およびΣ3非整合双晶境界の核生成サイトとしての能力は高くないことを明確にした.特定の結晶粒界のマルテンサイト変態の核生成サイトとしての能力を定量的に明らかにした研究は全く初めてであり,本研究の成果は大きく評価できる.この結果の一部はすでに論文として投稿済みである.

1.凝固柱状晶材からのFCC→BCC拡散変態FCC相で凝固してBCC相を析出しさらに室温にて母相が残存する合金としてNi-43%Cr合金を用い,これを真空溶解・金型鋳込みすることにより,0度から45度の種々の〈100〉傾角粒界を持つ柱状晶材を作製した.これを1573Kで均一化処理を施した後,FCC+BCC2相温度域で恒温保持しBCC相を析出させた.これらの試験片から粒界面が薄膜面に垂直になるように透過電顕試料を作製し,電顕観察により生成相のバリアントと粒界性格の関係を検討した.この結果,粒界面とFCC相{111}面のなす角度θが20度以下の粒界では,特定のバリアントが優先的に生成するのに対して,θが30度以上の粒界では特定のバリアントの優先性はなく複数のバリアントが生成することを見出した.すなわち,粒界析出物のバリアント選択は粒界面方位に強く依存することを明らかにした.2.マルテンサイト変態の核生成サイトとして働いた結晶粒界の性格室温以下の温度への適切な冷却により少量のラス状マルテンサイトが生成することを確認しているFe-26%Ni-2%Mn合金を用いた.さらにマルテンサイトの核生成場所として働いた結晶粒界の特定を容易にするため柱状晶組織を持つ試料を作製した.この試料をサブゼロ処理して少量のマルテンサイトを生成させ,結晶粒界が核生成サイトとして働くか否かを観察した.さらに核生成サイトとして働いた結晶粒界の粒界性格をSEM-ECP法により決定し,これよりマルテンサイト変態の核生成サイトとして働く粒界が特徴ある粒界性格を持つか否かを検討した.その結果,変態初期のマルテンサイトは全て結晶粒界から生成していた.また,マルテンサイトを生成した粒界とそうでない粒界があり,結晶粒界によって核生成サイトとしての能力の差があることが明らかとなった.マルテンサイトが生成していた粒界の特徴として,(1)粒界面方位が{110}に近いこと,(2)方位差角が1015度であることが挙げられた.
ガン抑制遺伝子EXTL2によるプロテオグリカンの品質管理機構

ヘパラン硫酸は、遺伝性多発性外骨腫と呼ばれる常染色体性優性に遺伝する四肢長管骨の骨端に軟骨帽が多発する疾患の原因遺伝子がコードする糖転移酵素EXT1とEXT2の複合体によって合成される。さらに哺乳類では、EXT1やEXT2に高い相同性をもつEXTLfamily(EXT-like gene family)が3種類存在するが、その機能については不明な点が多い。本研究では、この3種類のEXTLfamilyのうちEXTL2に焦点を絞り、EXTL2がEXT1欠損時におけるヘパラン硫酸生合成に関与するN-アセチルグルコサミン転移酵素であることとプロテオグリカンによる品質管理に関わる可能性を示した。プロテオグリカンはグリコサミノグリカン鎖によって修飾された糖タンパク質であり、その機能発現には糖鎖が重要である。プロテオグリカンの品質維持のためには糖鎖修飾を管理しなければならないが、その機構は明らかではない。我々の研究は、プロテオグリカンの品質を維持する品質管理機構の存在とその仕組み、また、システムの動作不良が細胞や個体にどのような影響を与えるかについて理解することを目的としている。我々は、グリコサミノグリカンの合成に関連するが、機能の明らかでない2種の酵素、EXTL2とFamily with sequence similarity 20 member B(FAM20B)を独自にクローニングしており、これらの酵素がプロテオグリカンの品質管理に働く可能性を検討することで、プロテオグリカンの分泌や分解を司る新たな機構を発見できると考えている。グリコサミノグリカン鎖は、結合領域と呼ばれる四糖構造(GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser)を介してコアタンパク質に結合している。この四糖結合領域におけるXyl残基の2位は、一過的にリン酸化修飾を受けるが、Xyl残基をリン酸化する酵素やXyl残基がリン酸化される生理的意義は不明であった。そこで、FAM20Bの機能解析を行ったところ、FAM20Bは四糖結合領域のXyl残基の2位をリン酸化する酵素であることが判明し、FAM20Bの発現量によりグリコサミノグリカン鎖の本数が制御され、グリコサミノグリカン鎖の量が調節されていることが明らかとなった。昨年度はFAM20Bの機能解析を行い、FAM20Bはリン酸化酵素であり、FAM20Bの発現量によりグリコサミノグリカン鎖の本数が制御され、グリコサミノグリカン鎖の量が調節されていることを明らかにした。本年度は、もう一つの酵素EXTL2のノックアウトマウスのグリコサミノグリカン鎖を解析し、EXTL2がプロテオグリカンの品質管理に働く可能性を検討した。その結果、EXTL2のノックアウトマウスは野生型に比ベグリコサミノグリカン鎖の量が増えており、EXTL2が存在しないとより多くのプロテオグリカンが細胞に蓄積していることが判明した。さらに、そのプロテオグリカン上に存在するグリコサミノグリカン鎖の構造を解析すると、リン酸化された短いグリコサミノグリカン鎖が存在することが明らかとなった。
放射線適応応答に関与する非相同末端結合修復経路の解明と分子機構の解析

放射線適応応答では、DNA2本鎖切断(DSB)修復の正確度が上昇していると考えられる。放射線適応応答に関与するDNA修復機構を明らかにするために、DSB再結合に関与するDNAリガーゼの発現抑制を行った細胞での放射線適応応答を検討した。その結果、非相同末端結合修復のうち、「古典的経路」(C-NHEJ)で作用するDNAリガーゼIVが関与していることが明らかになった。これらのことから、放射線適応応答にはDNAリガーゼIVが作用するC-NHEJが関与しているものと考えられる。放射線適応応答では、細胞の生存率の他に染色体異常や突然変異頻度が低下することから、DNA2本鎖切断修復の正確度が上昇しているものと考えられ、特に非相同末端結合修復(NHEJ)が関与していると推定される。NHEJには「古典的経路」と「代替経路」の2種類の経路があるとされているため、放射線適応応答の過程にどちらの経路が関与するかを検討した。「古典的経路」にはDNA切断の連結酵素の1種であるDNAリガーゼIVが関与していることが知られているが、「代替経路」の分子機構についてはDNAリガーゼIIIが関与しているものと推定されている。そこで、これら2つのDNAリガーゼの量を低下させた細胞を作成し、その細胞における放射線適応応答を分析することにした。細胞内のDNAリガーゼ量を低下させるには、RNA干渉法を用いた。DNAリガーゼIII及びIVについて、それぞれ3種類の干渉RNAを用いてRNA干渉を行い、最もDNAリガーゼ量を低下させることができる干渉RNAを検索した。昨年度はウェスタンブロット法を用いて検討したところDNAリガーゼの検出ができなかったため、本年度はRT-PCR法を用いて検出を試みた。その結果、DNAリガーゼIII及びIVともに発現を低下させる干渉RNAを見出した。これらを導入した細胞を用いて、X線照射後の生存率を指標として放射線適応応答を検討したところ、DNAリガーゼIVの干渉RNAを導入した細胞で適応応答が抑制されたことを示唆する結果が得られた。さらに、微小核形成を指標として放射線適応応答を解析したところ、やはりDNAリガーゼIVの干渉RNAを導入した細胞で適応応答が抑制されたことを示唆する結果が得られた。従って、放射線適応応答にはDNAリガーゼIVが関与している可能性が考えられる。「古典的経路」にはDNA切断の連結酵素の1種であるDNAリガーゼIVが関与していることが知られている。一方、「代替経路」の分子機構は未だ明らかではないが、DNAリガーゼIIIが関与しているものとこれまでに推定されている。そこで、これら2つのDNAリガーゼの量を低下させた細胞を作成し、その細胞における放射線適応応答を分析した。まず、両方のDNAリガーゼとも、それぞれ3種類の干渉用RNAを用いてRNA干渉を行い、最もDNAリガーゼ量を低下させることができる干渉用RNAを検索した。DNAリガーゼ量を分析するために、ウェスタンブロット法を用いたが、DNAリガーゼの発現量が低いためか、種々の条件検討を行ったが極めて薄いバンドしか検出できず、DNAリガーゼ量が低下しているかを明確にすることが非常に困難であった。そのため、ウェスタンブロット法以外に、伝令RNAを増幅するRT-PCR法を用いることにより検出することを試みているところである。一方、放射線適応応答に関して、DNAリガーゼ干渉用RNAを導入した細胞を用いて、X線照射後の生存率を指標として検討したところ、DNAリガーゼIVの干渉用RNA3種類のうちの1種類を導入した細胞で適応応答が抑制されたことを示唆する結果が得られた。従って、DNAリガーゼIVが関与している可能性が考えられるが、今後さらに確認する必要がある。放射線適応応答では、細胞の生存率が上昇し、染色体異常や突然変異頻度が低下することから、DNA2本鎖切断(DSB)修復の正確度が上昇していると考えられ、特に非相同末端結合修復(NHEJ)が関与していると推定される。NHEJには「古典的経路」(C-NHEJ)と「代替経路」(alt-NHEJ)の2種類の経路があるため、放射線適応応答の過程にどちらの経路が関与するかを検討した。C-NHEJにはDNA切断の連結酵素の1種であるDNAリガーゼIVが関与しており、alt-NHEJにはDNAリガーゼIIIまたはIが関与するとされている。そこで、RNA干渉法を用いて、これらDNAリガーゼの各々について発現量を低下させた細胞を作成し、その細胞における放射線適応応答について微小核形成を指標として分析した。

平成25年度までに、DNAリガーゼIV発現抑制細胞では適応応答が抑制されるが、DNAリガーゼIII発現抑制細胞では適応応答が抑制されないことを示唆する結果が得られたが、平成26年度にはさらに実験を重ねて、上記の結果を確認した。また平成26年度は、DNAリガーゼI発現抑制細胞についても検討したところ適応応答が見られたことから、DNAリガーゼIは適応応答に関与していないことが示唆された。これらのことから、放射線適応応答にはDNAリガーゼIVが作用するC-NHEJが関与しており、alt-NHEJの寄与は少ないものと考えられる。C-NHEJはalt-NHEJよりも修復の正確度が高いとされていることから、放射線適応応答においてはC-NHEJ活性が上昇することによって、修復の正確度が上昇しているものと推測される。また、試験管内DSB再結合反応での修復エラーを解析したところ、適応応答条件の細胞ではDNAの欠失範囲が小さくなることが明らかになり、このこともC-NHEJの関与を示唆している。放射線生物学昨年度は、DNAリガーゼの検出に手間取ったため、干渉RNAを導入した細胞で確かにDNAリガーゼが低下しているかが明らかでなかったが、本年度にRT-PCR法を用いて解析することにより、RNA干渉に有効な干渉RNAを明らかにした。また、放射線適応応答についても、これまでの生存率を用いた解析に加えて微小核形成を指標として検討したところ、生存率の場合と同様に、1種類のDNAリガーゼIV用干渉RNAを導入した細胞で放射線適応応答が抑制されたことを示す結果が得られたが、DNAリガーゼIII用干渉RNAを導入した細胞では、放射線適応応答に関与することを示唆する結果が得られなかった。従って、放射線適応応答にはDNAリガーゼIIIの関与は少なく、DNAリガーゼIVが関与していることが示唆され、これまで詳細な修復機構が明らかでなかった放射線適応応答の機構を解明する上で大きな前進であると言える。全体としては、大きな遅れはなく、おおむね順調に進捗していると考えている。DNAリガーゼIIIとDNAリガーゼIVについてそれぞれ3種類の干渉用RNAを導入したところ、1種類のDNAリガーゼIV干渉用RNAを導入した細胞で放射線適応応答が抑制されたことを示唆する結果が得られた。また、DNAリガーゼIII干渉RNAを導入した細胞では、いずれも放射線適応応答に関与することを示唆する結果が得られなかった。従って、放射線適応応答にはDNAリガーゼIIIの関与は少なく、DNAリガーゼIVが関与している可能性が示唆された。このことは、これまで詳細な修復機構が明らかでなかった放射線適応応答の機構解明に大きな前進であると言える。本年度は生存率を指標として用いたが、今後はその他の指標についても検討して、さらに詳細な実験を重ねて上記の結果の確認を行うことが必要であるが、順調に進捗していると言える。しかし、DNAリガーゼ量の検出が予想以上に困難であったため、検出の条件決定に非常に時間を要した。そのため、干渉用RNAを導入した細胞において、実際にどの程度DNAリガーゼ量が低下しているかが現在に至っても明確でなく、当初計画よりもやや遅れている。
インターロイキン-18欠損マウスにおけるインフルエンザウイルス感染防御機構

インターロイキン-18(IL-18)はT細胞に作用してガンマー型インターフェロン(IFN-γ)産生を誘導するサイトカインである。さらにT細胞増殖促進、NK細胞活性化、炎症性サイトカイン産生誘導、Fas ligandやperforinを介する細胞傷害活性増強、抗腫瘍性を示す。IFN-γはマクロファージ活性化、NK細胞活性化、MHC発現増強、細胞増殖調節などTh1サイトカインネットワークを形成する。したがって細胞内寄生性病原体に対して治療・予防効果を示す。IgE産生を抑制することからアレルギー反応を抑える可能性が示唆されるが、一方ではTh1リンパ球に作用して炎症性過敏反応を惹起する。そこで本研究ではIL-18ノックアウトマウスを使用し、インフルエンザウイルス感染病理、ウイルス特異的免疫応答、Th1系、及びTh2系の各種サイトカイン産生動態を明らかにして、IL-18のインフルエンザウイルス感染に対する治療薬として、またワクチン予防効果賦活剤としての臨床応用に発展させることを目的とした。IL-18が欠損するとインフルエンザウイルスの肺内増殖は増大し好中球による肺への細胞浸潤がおこり、NO産生が亢進する。IFN-γ産生誘導は抑制される代わりにIL-12が代償的に高値を示すが、依然としてNK細胞介在細胞傷害活性はほとんど低値にとどまる。ウイルス特異的免疫反応誘導には全く影響をもたらさない。すなわち、IL-18はウイルス感染の早期からIFN産生やNK細胞を活性化させることによって、ウイルス特異的免疫反応出現以前に、肺におけるウイルス増殖を抑制する。なお、IL-12もIL-18と同様な生物活性を示すが単独ではIL-18の全ての機能を担うことはできない。
犬血清タンパク質PT60の変動と診断的意義の検討

我々は殺ミクロフィラリア薬である塩酸レバミゾ-ルを犬糸状虫寄生犬に経口投与したところ血清中にポリアクリルアミドゲル電気泳動でトランスフェリンの陽極側に著しく増加するタンパク質のあることを認めた。このタンパク質をPT60と仮に名づけ、そのタンパク質がなんらかの肝障害を反映するタンパクである可能性を第110回日本獣医学会で指摘した。本研究では、(1)PT60を多量に産生している犬の血清からPT60を分離精製し、分子性状を明らかにすること、(2)PT60のアミノ酸末端の構造を試み、既知のタンパク質との異同を調べる、(3)薬物投与、肝疾患等によりPT60がどの様に変動するかを経時的に測定し、肝臓機能の変化とPT60の出現との関係を明らかにすることを企画した。1.Milbemycin Oxime内服犬の血清中PT60の変動を調査したところ、増加が確認された。PT60の分子量はゲル濾過では100KDaで、SDSーPAGEでは57KDaであった。このタンパク分子は、分子サイズ19KDaと37KDaの二つのサブユニットから成り、ホモグロビンと結合して複合体を形成した。二重免疫拡散法で、このタンパク質に対する抗血清は犬のハプトグロビンと反応した。このタンパク質の二つのサブユニットのN末端アミノ酸配列は、犬のハプトグロビンのそれとそれぞれ一致した。これらの分子性状から、我々はタンパク質をハプトグロビンと同定した。2.四塩化炭素内服で実験的肝障害を作出させた犬の血清についてPT60の変動をポリアクリルアミドゲル電気泳動法で経時的に調査した。薬物投与後、血清酵素AST、ALTは顕著に増加したが、Pt60の増加は著明ではなかった。
イヌの椎間板ヘルニア発症メカニズムの解明

イヌでは品種別に椎間板髄核の構成成分が異なり、軟骨異栄養型および非軟骨異栄養型とに分類され、その変性時期や椎間板ヘルニアの羅患率は異なっている。本研究においてはイヌの椎間板ヘルニアの発症メカニズムを解明する目的で、椎間板ヘルニア羅患犬を軟骨異栄養型および非軟骨異栄養型に分類して椎間板髄核MRIで検索し、さらに椎間板髄核に対して生化学的にアプローチした。山口大学農学部附属家畜病院に来院した椎間板ヘルニアが疑われた65症例のMRI検査から、T2強調画像での信号強度変化率は軟骨異栄養型が55.9%と、非軟骨異栄養型の39.5%よりも有意に低下すること、すなわち、両者では椎間板の水分含有量に差があることが判明した。その原因として軟骨異栄養型は、髄核内に軟骨組織を有するという点であり、その軟骨の変性が椎間板ヘルニアの発症に何らかの要因となっていることが示唆された。そこで髄核に軟骨細胞を含む軟骨異栄養型犬種であるビーグルの椎間板の髄核と線維輪における、細胞内蛋白質代謝作用を有するシステインプロテイナーゼ活性の特性を比較検討した。その結果、ビーグル犬の腰椎椎間板ではシステインプロテイナーゼの一種であるカテプシンLの酵素活性がカテプシンBよりも高いことが判明した。また椎間板の中心にある髄核の方が周辺部の線維輪よりも高い酵素活性が認められた。さらにカテプシンLは酸性領域で活性を有することから椎間板ヘルニアの発症の要因として局所特異性やpH特異性が考えられた。これらの結果は、イヌの椎間板ヘルニア発症メカニズムを解明する上で重要な発見である。イヌでは品種別に椎間板髄核の構成成分が異なり、軟骨異栄養型と非軟骨異栄養型とに分類され、その変性時期や椎間板ヘルニアの罹患率は異なっている。椎間板ヘルニアの発症と椎間板髄核の変性との関連性が重要視されているが、現在までのところその全容は明らかになっていない。本年度は、MRIによるイヌの変性椎間板の描出を目的とした研究を実施した。MRIは当大学に設置されている永久磁石型MRI(日立メディコ社製MRP-20、0.2Tesla)を使用し、軟骨異栄養型犬種(例:ダックスフンド、ビーグル、シーズー)の椎間板髄核と非軟骨異栄養型犬種(例:マルチーズ、狆)の椎間板髄核のMRlを比較。今回検討した症例は1993年9月から1997年4月までの3年8カ月間に椎間板ヘルニアと診断されたイヌ65症例で、その内訳は軟骨異栄養症48例、非軟骨異栄養症17例である。撮像方法は、T2強調矢状断面像(TR/TE=2000/90 msec)を基準像とした。椎間板の信号強度はその髄核部分に関心領域を設定した。その結果、信号強度変化率は軟骨異栄養症が55.9(±19.9)%であったのに対し、非軟骨異栄養症は39.5(±22.4)%となり、有意差(P<0.05)が認められた。今回基準としたT2強調画像における信号強度変化率は主として椎間板内の水分含有量の変化を示していると考えられる。軟骨異栄養症と非軟骨異栄養症とで信号強度変化率が異なった原因として、軟骨異栄養症の椎間板髄核は遺残脊索と軟骨組織もしくは類軟骨組織から構成されているのに対し非軟骨異栄養症の髄核は遺残脊索のみで構成されており、これがMRlの信号強度の変化に反映されたものと考えられた。

イヌは品種別に椎間板髄核の構成成分が異なり、軟骨異栄養型と非軟骨異栄養型に分類され、その変性時期や椎間板へルニアの罹患率も異なるといわれているが、その詳細は不明である。本研究では、昨年度に実施した65症例のMRI検査から、T2強調画像での信号強度変化率は軟骨異栄養型が55.9%と、非軟骨異栄養型の39.5%よりも有意に低下すること、すなわち、両者では椎間板の水分含有量に差があることが判明した。その原因として軟骨異栄養型は、髄核内に軟骨組織を有するという点であり、その軟骨の変性が椎間板へルニアの発症に何らかの要因となっていることが示唆された。そこで今年度は、髄核に軟骨細胞を含む軟骨異栄養型犬種であるビーグルの椎間板の髄核と線維輪における、細胞内蛋白質代謝作用を有するシステインプロテイナーゼ活性の特性を比較検討した。実験は1-3歳齢、体重6.8-9.8kgの腰椎椎間板を用いて、(1)蛋白分解酵素の特異姓、(2)各種阻害剤による酵素活性変化、(3)カテプシンL特異抗体による酵素活性変化を行った。その結果、ビーグル犬の腰椎推間板ではシステインプロテイナーゼの一種であるカテプシンLの酵素活性がカテプシンBよりも高いことが判明した。また椎間板の中心にある髄核の方が周辺部の線維輪よりも高い酵素活性が認められた。さらにカテプシンLは酸性領域で活性を有することから椎間板へルニアの発症の要因として局所特異性やpH特異性が考えられた。これらの結果は、イヌの椎間板ヘルニア発症メカニズムを解明する上で重要な発見である。
コロイド化学的手法による舗装材料の性状評価

アスファルテンの荷電状態を、成分を抽出回収せずに評価できるか調べるために、アスファルト懸濁液の荷電特性を検証した。実験には通常のストレートアスファルトと促進劣化させたアスファルト(劣化アスファルト)を使用し、電気泳動移動度からゼータ電位を算出し、荷電特性を評価した。その結果、両者の懸濁液共にゼータ電位はほぼ0に近い値となった。ストレートアスファルトについては、pHが中性付近でアスファルテンがほぼ0に近い値であったが、劣化アスファルトはほぼマイナスに帯電していたことから、異なる荷電特性を示したと言える。これは、アスファルト懸濁液の荷電特性は、アスファルテン単体だけでなく、他の成分(飽和分、芳香族分、レジン分)との相互作用の影響が反映されたことが示唆された。また、今回はトルエンをバルクとして測定を行ったため、溶媒の影響についても検証が必要である。ポリマー改質アスファルト(PMA)懸濁液中のアスファルテンのコロイド安定性に対する、スチレンーブタジエンースチレンブロック共重合体(SBS)濃度の影響を検証した。異なる2種類のPMAを使用し、ストレートアスファルトのアスファルテンと同様の方法で懸濁液を調製した。その結果、SBSの濃度に関わらず、PMAのゼータ電位は低pH側でプラスに、高pH側でマイナスに帯電しており、pH依存性があることが明らかとなった。また、低pH側で凝集沈殿し、高pH側では分散しており、ストレートアスファルトと同様のコロイド安定性を示した。劣化アスファルトのアスファルテンのゼータ電位がpHによらずほぼ一定値で、マイナスに帯電していた。この性状と劣化に伴う官能基の変化との関係を調べるため、赤外分光分析を行った。その結果、カルボニル基が変化しており、それ以外の官能基の変化は認められなかった。1.アスファルト懸濁液およびポリマー改質アスファルト懸濁液のコロイド化学的性質の検証アスファルテンの荷電特性を比較するために、アスファルト懸濁液の電気泳動移動度を測定し、ゼータ電位を算出した。アスファルトを溶解可能なトルエンをバルクとした。ストレートアスファルト(StAs)及び劣化アスファルト(劣化As)のゼータ電位はほぼ0に近い値を示しており、劣化Asの方はアスファルテンのゼータ電位とは明らかに異なっていた。そのため、トルエンをバルクとしたアスファルト懸濁液のゼータ電位は、アスファルテンと相互作用しているレジン分などの他成分との相互作用の影響が示唆された。ポリマー改質アスファルト(PMA)懸濁液のコロイド安定性を調べるために、まずPMA中のアスファルテンのコロイド安定性について検証した。試験にはスチレンーブタジエンースチレンブロック共重合体(SBS)濃度の異なる2種類のPMAを使用し、StAs同様の方法で懸濁液を調製した。また、pH側で凝集沈殿し、高pH側では分散し、StAsと同様のコロイド安定性を示した。2.劣化に伴うアスファルトの性状とコロイド化学的性質との相関関係の評価劣化に伴うアスファルトの性状変化として、アスファルテンの赤外分光分析を行った。劣化Asのアスファルテンは、カルボニル基が変化しており、それ以外での官能基の変化は認められなかった。しかし、劣化Asのアスファルテンのゼータ電位がpHによらずほぼ一定値で、マイナスに帯電していたため、劣化に伴う酸化の他に、pHの変化に伴うH +の吸着能の変化が少ない、官能基の変化が示唆された。以上より、研究目的に対して、全体として概ね順調に進展している。1.劣化と再生利用の繰返しによる性状回復の評価現状に即したアスファルトの性状を評価するため、劣化方法の異なるアスファルトや繰り返し再生したアスファルトを対象とした試験を行う。劣化したアスファルトを再生利用する(軟化する)ためには、オイル系再生用添加剤をアスファルトに加えて針入度を回復させる。物理性状の回復だけでなく、化学性状の回復を評価するために、繰返し劣化・再生したアスファルトから抽出回収したアスファルテンのコロイド化学的性質を調べる。なお、再生便覧や土木研究所の既往研究に基づき、アスファルトの劣化・再生試験方法、再生条件を決定する。また、供用中のアスファルト舗装、もしく屋外暴露したアスファルト混合物のアスファルテンのコロイド化学的性質を調査する。供用中のアスファルトの劣化要因は熱や酸素だけでなく、紫外線も挙げられる。そのため、室内で紫外線による促進劣化した供試体を作製し、熱劣化した場合と紫外線劣化した場合とで、アスファルテンのコロイド化学的性質が異なるのか検証する。室内での促進劣化は劣化要因をある程度絞れるのに対して、供用中の劣化は複合的であるため、屋内促進劣化したものと、供用中のアスファルテンのコロイド化学的性質にどの程度相関があるか評価する。2.アスファルト懸濁液の荷電特性に対するバルク成分やバルク中の他成分の影響に関する検証トルエンをバルクとしたアスファルト懸濁液の荷電特性がアスファルテンと異なっていることが明らかとなった。そのため、アスファルテンと他成分との相互作用がアスファルト懸濁液の荷電特性に影響を及ぼすものと考えられる。そこで、トルエン以外の溶媒とした場合のアスファルト懸濁液のゼータ電位の測定や、アスファルテンと最も相互作用していると考えられるレジン分を含めた状態での荷電特性の検証を行う。アスファルトの構成成分であるアスファルテン等を分離し、コロイド化学的性質として、分散・凝集挙動や荷電特性を検証した。