hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
関節軟骨変性過程において鍵となる遺伝子発現制御因子の探索

変形性関節症や関節リウマチなど、関節軟骨が変性していく疾患において、軟骨変性に関与する遺伝子の発現調節の仕組みを解析することは重要である。転写因子C/EBPが、軟骨変性を引き起こす様々な遺伝子の発現調節で中心的役割を担っていることを発見した。C/EBPは患者の関節軟骨において、軟骨破壊酵素であるMMP-1, MMP-3, MMP-13の遺伝子発現を上昇させていることが証明された。また、主要な軟骨基質であるII型コラーゲンの発現を低下させた。さらに骨破壊を引き起こす破骨細胞を誘導する因子RANKLの発現を上昇させていた。関節軟骨変性の鍵となる遺伝子調節因子であることが示された。軟骨変性を引き起こす様々な因子の機能解析を行った。有力な因子が見つかってきており、MMP-3, 13, RANKLなどの重要な因子をコントロールすることが明らかとなった。現在、既知の他の因子との相互作用など、さらに継続して機能解析を進めている。関節リウマチにおいて関節破壊を引き起こす破骨細胞の活性化に必須の分子RANKLの発現が亢進している現象を調節する分子メカニズムとして、転写因子C/EBP betaが関与している。リウマチ患者から得られた滑膜細胞培養系をもちいてC/EBP bataがRANKLの発現を亢進させることを証明した。C/EBP betaの機能をコントロールすることでRANKLの発現を抑えることが出来ることも示した。C/EBP betaはMMP3やMMP13などの関節軟骨基質を破壊する酵素の発現を亢進させる作用もあり、関節リウマチの骨関節破壊に中心的な鍵となる因子であることが示された。これらの知見は日本軟骨代謝学会、日本リウマチ学会などで発表し、Annals of Rheumatic DiseasesやArthritis Rheumatismに論文投稿している。また、C/EBP betaは軟骨細胞の肥大分化にも重要であり、軟骨細胞においてII型コラーゲンの発現を抑制させ、X型コラーゲンの発現を亢進させること、また、RUNX2やindian hedgehogの発現を促進することも証明した。この知見も英文論文にまとめ、投稿中である。関節リウマチや変形性関節症での軟骨変性において、先行研究において、転写因子C/EBPの発現が、変性軟骨部と滑膜において亢進していることを明らかにした。今回の研究課題において、当該年度はC/EBPが軟骨変性部と滑膜においてMMP-3の発現を刺激していることを明らかにした。免疫染色にて両者の発現が認められることを示した。培養軟骨細胞において、C/EBPの発現増強が、MMP3の遺伝子発現を刺激し、その遺伝子プロモーター活性も増強することを明らかにした。さらに、C/EBPの発現を抑制すると、MMP-3の遺伝子発現も低下することを明らかにした。MMP-3プロモータのC/EBP結合領域を変異させると、このプロモータ活性の増強効果がなくなることより、C/EBPによるMMP-3プロモータの直接的な影響が示唆された。以上のことから、C/EBPは関節炎での滑膜と変性軟骨細胞にて発現が増強し、その標的遺伝子としてのMMP-3の発現が増強していることが明らかとなった。先行研究においてMMP-13でも、同様のメカニズムが存在しており、転写因子C/EBPが多機能性に、様々な軟骨変性関連分子の遺伝子発現に関与していることが示された。計画通り、有力なデータが出てきており、途中経過も学会発表を行った。当初の予想通りに結果が得られており、論文発表や学会発表も行った。さらに、軟骨の器質蛋白発現の変化についても解析が進んでいる。現在の研究をさらにすすめ、データの補充を行う。次年度は、軟骨変性におけるもう一つの特徴的変化である、軟骨細胞の器質蛋白発現の変化に注目して解析を進める。2型コラーゲンの発現低下と軟骨細胞の肥大化を生ずるメカニズムを明らかにしていく予定である。すでに予備実験による良好な結果が得られており、研究計画推進の見込みは立っている。研究試薬の購入、学会発表のための旅費、参加費、論文発表のための印刷費など引き続き、主として実験に用いる消耗品に対して使用する計画である。遺伝子発現解析の各種薬剤がその主な用途となると計画している。
疑似ランダム刺激による視覚性事象関連電位を利用したコンピュータ入力装置の開発

メニュー選択型の脳コンピュータインタフェースとして,より検出精度の高い方法論の開発を目指して,視覚性事象関連電位からP300と注視点情報を同時検出する方法を提案し,健常者を対象とした実測により提案法の妥当性を示した.注視点検出のための疑似ランダム刺激とP300検出のためのフラッシュ刺激とを同時提示したときの脳波を記録し,疑似ランダム刺激と脳波の相互相関関数から注視点を推定するとともに,線形判別分析からP300を同定することを試みた.健常者対象の評価実験から検出エラー率を低減できることが確認された.メニュー選択型の脳コンピュータインタフェースとして,より検出精度の高い方法論の開発を目指して,視覚性事象関連電位からP300と注視点情報を同時検出する方法を提案し,健常者を対象とした実測により提案法の妥当性を示した.注視点検出のための疑似ランダム刺激とP300検出のためのフラッシュ刺激とを同時提示したときの脳波を記録し,疑似ランダム刺激と脳波の相互相関関数から注視点を推定するとともに,線形判別分析からP300を同定することを試みた.健常者対象の評価実験から検出エラー率を低減できることが確認された.本年度は,新たな視覚刺激方法を提案し,その原理を実験的に確認した.実験にあたって必要なシステムの構築が主な課題となった.提案する疑似ランダム刺激を用いた測定で得られるERPにより,従来法で得られるERPとほぼ同等の応答および成分が検出できることを,実験的に確認した.従来のERP測定における視覚刺激の文字もしくは背景領域を,疑似ランダム系列に基づいて色度変調させた刺激とし,その際に記録された脳波信号と疑似ランダム系列との相互相関関数を算出する.この相互相関関数波形から,従来のERPに出現するP300に相当する成分が検出されるか否かを調査・検討した.その結果,P300の検出は可能であったものの,検出精度を検討するだけの十分なデータを得ることはできなかった.これらを踏まえ,実用的なシステムを実現する上で重要な条件となる測定時間および測定精度の点から,刺激パターンの改善も含めたさらなる検討が必要であると考える.特に,測定精度の面で,測定時の課題の内容および難易度を変えた場合に,従来のERPに現れる変動と同等の変動が,提案法のERPにも現れるかどうかを確認する必要があるが,この調査は,次年度の課題として残された.さらに,このような提案法を入力装置として実現した場合には,ユーザ(被験者)は長時間にわたって視覚刺激を注視することになる.したがって,目に負担の少ない刺激を選定しなければならないが,そのような安全な視覚刺激条件の調査も,次年度の課題として残された.本研究の目的は、コンピュータシステムへの入力手段として、ユーザの注視点と事象関連電位P300を同時に計測する新たな方法を提案し、入力装置開発のために必要な要件を明らかにすることである.本年度は、前年度の結果を受けて、視覚刺激パターンの見直しを行い、その原理確認と刺激パターンの最適化を検討した.従来のERP測定における視覚刺激(flash刺激)の周辺部を、疑似ランダム系列に基づいて色度変調させた刺激(PRBS刺激)とすることで、P300と注視点の同時検出を試みた.この刺激の間に記録される脳波信号から、flash刺激に対する加算平均(ERP)を求めることでP300が検出でき、疑似ランダム系列との相互相関関数を算出することで注視点を検出できる.実際の脳コンピュータ入力インタフェースを想定して、9個の視覚刺激を3行3列のマトリクス状に配置した刺激画面を用い、視覚疾患のない健常者2名を対象とした実測を行った.その結果、被験者が注目した1つの視覚刺激に対するERPにP300の出現を確認し、PRBS刺激により被験者の注視点が正しく検出できることを確認した.しかし、PRBS刺激による注視点検出は安定して行えるものの、P300が明瞭に出現しないケースが全体の60%程度あり、改善の必要が示唆された.刺激長、刺激サイズ、変調輝度のバランスを最適に調整が必要と考えられる.実測では、脳波測定部位は2箇所(Oz、Pz)としたが、この最適化については検討の必要がある.次年度は、刺激パターンおよび測定上の諸条件の最適化を検討するとともに、メニュー選択型の入力インタフェースを製作して、実用上の問題の解決法を検討し、本研究をまとめる予定である.本研究の目的は,コンピュータシステムへの入力手段として,ユーザの注視点と事象関連電位(ERP)P300を同時に計測する新たな方法を提案し,入力装置開発のために必要な要件を明らかにすることである.本年度は,前年度までに確定した刺激方法及び応答検出法に基づいて実測を行い,最適な刺激条件について検討した.実際の脳コンピュータ入力インタフェースを想定して,9個の文字視覚刺激を3行3列のマトリクス状に配置した刺激画面を用い,視覚疾患のない健常大学生を対象とした実測を行った.その結果,注視点とP300の同時検出により,最短5.11秒で被験者の意図した文字の検出ができ,そのエラー率は平均21%であった.エラー率は,被験者ごとのばらつきが大きく,前年度の結果と同様に,ERP波形(P300)の個人差が特に大きく影響していた.さらに,刺激提示位置によりエラー率に偏りがみられた.刺激提示位置および個人ごとに応答検出方法を最適化する必要性が示唆された.

前年度にも確認されていたP300検出の改善については,既に多数提案されている検出方法の適用を検討したが,本研究実施期間中に十分な精度の改良案を確定するには至らなかった.以上より,メニュー選択型の入力装置のために新たな意図検出方法の提案とその可能性の確認はできたものの,実用に耐えうる精度をもった方法論の確定には至らなかった.研究期間終了後も引き続き,提案法の改善および最適化を検討していく予定である.
経皮ウイルス感染に対する生体防御機構の概日リズムの解析

2017年のノーベル生理学・医学賞は、「サーカディアン・リズム(体内時計)を生み出す遺伝子とそのメカニズム」が選ばれた。近年、生体の概日リズムをつかさどる時計遺伝子がアレルギー性疾患などの様々な疾患と密接に関連していることが明らかとなりつつある。最近我々は、朝あるいは夜に単純ヘルペスウイルス(HSV)をマウス皮膚に接種すると、両群の感染症状や死亡率が大きく異なるという知見を得た。本研究の目的は、研究対象を様々な皮膚関連ウイルス群に拡大し、ウイルスが経皮的に生体に侵入する時間帯により宿主の生体防御反応に差異が認められるか、すなわちウイルスに対する自然免疫・獲得免疫に概日リズムが存在するかを網羅的に検討することにある。本研究による皮膚の「時間ウイルス学」確立に向けた新たな試みは、感染予防学の観点から、あるいは抗ウイルス薬による時間差治療・より有効なワクチン接種法開発の観点からも、臨床医学的に重要な意義があると考える。具体的には、様々な皮膚関連ウイルスに対する宿主の自然免疫および獲得免疫によるウイルス排除能に概日リズムが存在するか否かについて検討することにある。本研究は今後のウイルス感染防御戦略に新しい方向を与えるものであり、トランスレーショナルリサーチ研究として、新規治療・予防法開発の基盤となりうる。また本研究は我々がこれまで開発してきたマウス/ヒト皮膚感染モデルおよび時計遺伝子関連実験技術を駆使したもので、極めて独創的であると考える。本年度の研究はまずウイルスワクチン接種による抗ウイルス免疫に概日リズムがあるのか、すなわち「ワクチンは何時に接種すると効果的か?」を解明することを目的に解析を行なった。現在までの進捗状況:まず、ワクチンの接種時間によって経皮的ウイルス感染に差違が生じるかについて検討した。2種類のHSVエンベロープ糖蛋白(gB, gD)を抗原とし、各種アジュバントと共にマウスに投与し、HSV獲得免疫が誘導されるかについて、条件検討を行った。HSV抗原としてはgBが、gDより免疫誘導能に優れており、またMPL, alumを特定の比率で混合したアジュバントを2週間おきに2回筋注することで、ワクチン接種後の経皮的なHSV感染症状が抑制されること(HSV獲得免疫が誘導されること)を確認した。次に、ワクチンを昼12時(ZT6)、夜12時(ZT18)に上記条件で接種し、その後HSVを経皮感染させ、感染症状を皮疹スコア、麻痺スコア、死亡率で評価した。ウイルス感染9日後における皮疹スコアは、抗原なし群(陽性コントロール):平均4、ZT18投与群:平均0.5、ZT6投与群:平均2であり、ワクチンの効果はZT18がZT6よりも約2倍増強していた。麻痺スコアは抗原なし群(陽性コントロール):平均1.67、ZT18投与群:平均0.25、ZT6投与群:平均1であり、ワクチンの効果はZT18がZT6よりも約4倍増強していた。死亡率は感染9日後の時点では優位な差は見られなかった。ZT18投与群はZT6投与群よりも、皮疹スコア、麻痺スコアいずれもワクチンの効果が増強(より強力なHSV獲得免疫が誘導されること)が明らかとなった。HSVワクチンによる宿主獲得免疫応答に概日リズムが存在することが判明した。今後は下記2点について解析を行う。1;ワクチンによるHSV獲得免疫の概日リズムを解明するために、ZT6, ZT18接種群のリンパ節内のウイルス特異的細胞傷害性T細胞数を経時的に比較する。さらに、ZT6, ZT18接種群のマウス皮膚からランゲルハンス細胞、真皮樹状細胞を調整し、na&iuml;ve CD4+ T細胞、CD8+ T細胞と共培養後、ウイルスペプチドで再刺激し、細胞傷害性T細胞誘導能を比較する。さらにCD4+ T細胞をフローサイトメトリー解析し、ウイルス特異的T細胞のプロファイルを明らかにする。2:皮膚ウイルス感染症の主要ウイルス(HIV、ヒトパピローマウイルスなど)において、同様の実験を行い、ウイルス免疫に普遍的な現象か否かを明らかにする。

本年度の研究はまずウイルスワクチン接種による抗ウイルス免疫に概日リズムがあるのか、すなわち「ワクチンは何時に接種すると効果的か?」を解明することを目的に解析を行なった。現在までの進捗状況:まず、ワクチンの接種時間によって経皮的ウイルス感染に差違が生じるかについて検討した。2種類のHSVエンベロープ糖蛋白(gB, gD)を抗原とし、各種アジュバントと共にマウスに投与し、HSV獲得免疫が誘導されるかについて、条件検討を行った。HSV抗原としてはgBが、gDより免疫誘導能に優れており、またMPL, alumを特定の比率で混合したアジュバントを2週間おきに2回筋注することで、ワクチン接種後の経皮的なHSV感染症状が抑制されること(HSV獲得免疫が誘導されること)を確認した。次に、ワクチンを昼12時(ZT6)、夜12時(ZT18)に上記条件で接種し、その後HSVを経皮感染させ、感染症状を皮疹スコア、麻痺スコア、死亡率で評価した。ウイルス感染9日後における皮疹スコアは、抗原なし群(陽性コントロール):平均4、ZT18投与群:平均0.5、ZT6投与群:平均2であり、ワクチンの効果はZT18がZT6よりも約2倍増強していた。麻痺スコアは抗原なし群(陽性コントロール):平均1.67、ZT18投与群:平均0.25、ZT6投与群:平均1であり、ワクチンの効果はZT18がZT6よりも約4倍増強していた。死亡率は感染9日後の時点では優位な差は見られなかった。ZT18投与群はZT6投与群よりも、皮疹スコア、麻痺スコアいずれもワクチンの効果が増強(より強力なHSV獲得免疫が誘導されること)が明らかとなった。HSVワクチンによる宿主獲得免疫応答に概日リズムが存在することが判明した。今後は下記2点について解析を行う。1;ワクチンによるHSV獲得免疫の概日リズムを解明するために、ZT6, ZT18接種群のリンパ節内のウイルス特異的細胞傷害性T細胞数を経時的に比較する。さらに、ZT6, ZT18接種群のマウス皮膚からランゲルハンス細胞、真皮樹状細胞を調整し、na&iuml;ve CD4+ T細胞、CD8+ T細胞と共培養後、ウイルスペプチドで再刺激し、細胞傷害性T細胞誘導能を比較する。さらにCD4+ T細胞をフローサイトメトリー解析し、ウイルス特異的T細胞のプロファイルを明らかにする。2:皮膚ウイルス感染症の主要ウイルス(HIV、ヒトパピローマウイルスなど)において、同様の実験を行い、ウイルス免疫に普遍的な現象か否かを明らかにする。
レーザーCVD法による生体親和性セラミックスコーティングの高速合成

本研究では、有機金属化学気相析出法(MOCVD)およびレーザー援用したCVD法(LCVD)を用いてカルシウム系複酸化物膜を作製し、成膜条件が生成相、微細組織、成膜速度に与える影響を調べた。また、生体外試験として擬似体液中への浸漬実験を行い、骨類似アパタイトの形成挙動から膜の骨伝導能および生体適合性を評価した。MOCVD法により、CaTiO_3、HApおよびα-TCP単相膜が初めて合成された。平滑の表面組織を有するCaTiO_3膜では6週間、複雑な表面組織を有するCaTiO_3膜では3日、α-TCP膜では2週間、HAp膜では6時間の浸漬により、それぞれ表面全体がアパタイトで覆われた。アパタイトはいずれも膜の微細な窪みで優先的に形成され、セラミックス膜の骨伝導能のほかに、表面モルフォロジーが大きく影響を及ぼすことがわかった。LCVD法により、HApおよび□-TCP単相膜が得られた。Ca-P-0膜の生成相はレーザー出力の影響を強く受け、P_L=200Wではα-TCPが広く生成し、P_L=150Wでは低温領域ではHApが生成し、高温領域ではα-TCPが生成した。また、P_L=100WではHApが主相として広範囲で生成した。いずれの膜も断面は緻密な構造であった。成膜速度は、原料過飽和度、T_<dep>、P_Lの増加とともに増加し、P_L=200W、P_<O2>=0.6kPaで1200μm/hであった。HAp膜を被覆した試料のハンクス溶液中への浸漬実験では、浸漬6時間後からアパタイトが形成した。以上の結果から、CVD法を用いてCa-Ti-OおよびCa-P-O膜の合成が可能であり、合成条件が膜の生成相、微細組織および成膜速度に及ぼす影響が明らかになった。また、得られたCa-Ti-OおよびCa-P-O膜は非常に短期間でアパタイトが形成し、高い骨伝導能を示すことがわかった。Ca(dpm)_2およびTi(OiPr)_2(dpm)_2有機金属錯体を原料として,有機金属化学気相析出(MOCVD)を用いてCP-Ti基板上にチタン酸カルシウム(CaTiO_3)膜を合成した。T_<sub>=9731073K, R_<Ca/Ti>=0.780.95, P_<tot>=0.8kPaではCaTiO_3単相膜が得られた。膜の表面組織は,微粒子が凝集したカリフラワー状の構造であり,P_<02>の増加とともにカリフラワー状集合組織の粒径はサブミクロンから2×10^<-6>m程度まで増加した。また,R_<Ca/Ti>=0.58では(020)に強く配向した板状結晶で構成された膜が得られた。T_<sub>=873および973Kで合成した膜の断面構造は,緻密構造であったが,T_<sub>=1073Kで作製した膜は柱状晶であった。CaTiO_3膜の成膜速度は,P_<02>およびT_<sub>の上昇,またP_<tot>の減少とともに増大し,T_<sub>=1073K, P_<tot>=0.4kPa, P_<02>=0.32

kPaで1.25×10^<-8>m/sの極大値を示した。チタン酸カルシウム(CaTiO_3)をコーティングしたCP-Ti基板をハンクス溶液へ浸漬し,ハイドロキシアパタイト(HAp, Ca_<10>(PO_4)_6(OH)_2)の形成の様子を調べた。基板温度が高い条件で被覆したCaTiO_3ほどハイドロキシアパタイトの形成が速かった。基板温度873Kで合成したCaTiO_3膜上へは6週間,973Kで合成したCaTiO_3膜上へは2週間,1073Kで合成したCaTiO_3膜上へは3日間の浸漬により,膜表面はハイドロキシアパタイトにより覆われた。1073Kで合成したCaTiO_3膜上には6時間の浸漬でハイドロキシアパタイトの前駆体であるリン酸オクタカルシウム(OCP, Ca_8H_2(PO_4)_6・5H_2O)が生成した。CaTiO_3、α-TCPおよびHAp膜をMOCVD法によりCP-Ti上に合成し、ハンクス溶液中へ浸漬してアパタイト形成の様子を調べた。T_<sub>=873KでCaTiO_3膜を被覆した試料では6週間、T_<sub>=973Kでは2週間、T_<sub>=1073Kでは3日でそれぞれ表面全体がアパタイトで覆われた。また、短期間の浸漬では、アパタイトの前駆体であるOCPが6時間後に確認された。α-TCPおよびHAp膜のいずれもアパタイトは膜の微細な窪みで優先的に形成した。レーザーCVD法を用いてCa-P-O膜を様々な条件において合成し、HApおよびα-TCP単相膜が得られた。Ca-P-O膜の生成相はレーザー出力の影響を強く受け、P_L=200Wではα-TCPが広い温度領域で生成し、P_L=150Wでは低温領域ではHApが生成し、高温領域ではα-TCPが生成した。また、P_L=100WではHApが主相として広範囲で生成した。α-TCP膜の表面構造は、原料過飽和度の増加とともに、ファセットからカリフラワー状組織へと変化したが、断面構造はいずれも柱状晶であった。HAp膜の表面構造は、P_L=150および200Wでは角ばった形状をした結晶であり、P_L=100Wでは粒状結晶であった。いずれの断面構造も緻密であった。HAp膜を被覆した試料のハンクス溶液中への浸漬実験により、浸漬6時間後からアパタイトが形成した。また、アパタイトはMOCVD法により膜と同様に、膜の窪みで優先的に形成・成長した。本研究により、CVD法を用いて合成したCaTiO_3、α-TCPおよびHAp生体親和性セラミックス膜は、いずれも高い骨伝導能を示した。
フロート型バイオリアクターによる藍藻と光合成細菌による水素生産

太陽光による光生物学的水素生産を実施する場所として農業と競合しない海洋面の利用が考えられる。本研究は、シアノバクテリアと紅色光合成細菌を利用して光生物学的に水素を海面上で生産することを最終目標として、そのシステム開発の基盤となる技術開発を行うことを目的とした。水素低透過性プラスチックを用いてバッグを作成し、内部にシアノバクテリアや紅色光合成細菌を入れて水素が蓄積することを実証した。また、シアノバクテリアのヘテロシスト形成頻度改変株、紅色光合成細菌の取り込み型ヒドロゲナーゼHupの破壊株など水素生産性が向上した改良株を作成した。水素低透過性プラスチック素材を用いてバッグ状に加工し、小規模のフロート型バイオリアクターを試作した。実際にバッグ内部に藍藻を入れ、硫酸マグネシウムで比重を調整した模擬海水を入れた大型水槽に浮かべ、模擬太陽光照射装置により光照射し蓄積する水素量を調べた。照射する24時間当たりの積算光量を同等にし、約12時間の明暗周期で照射する光の変動パターンを矩形波、正弦波と変えて培養したところ、屋外を再現した正弦波に近い照射パターンのほうが水素生産性が約3倍高くなる結果を得た。藍藻の水素生産性を高める目的で、藍藻Nostoc sp. PCC 7120において通常のモリブデン(Mo)を活性部位の中心金属に持つMo型ニトロゲナーゼの構造遺伝子nifDHKの大部分を欠失させた株に、中心金属がバナジウム(V)に置き換わっているV型ニトロゲナーゼの構造遺伝子を導入した株の作成に着手した。窒素源を含まず、Vを添加した寒天培地を用いてスクリーニングの条件を検討した。高濃度のV存在下では藍藻は生育しないが、低濃度をVを含む培地上に窒素固定能を持つ株が生育した。紅色光合成細菌Rubrivivax gelatinosus strain RL2株の取り込み型ヒドロゲナーゼHupの構造遺伝子hupLを破壊した株を作成した。培地組成を検討し、水素の生産活性が親株よりも優位に上昇する結果が得られた。R. gelatinosusにおいてもヒドロゲナーゼHupは水素生産よりも、むしろ、ニトロゲナーゼの反応により生じる水素の再吸収を担っていると考えられる結果を得た。しかし、R. gelatinosusにおけるHupの破壊による水素生産の上昇は藍藻NostocやAnabaenaほどは高くないことが示唆された。おおむね順調に進展している。水素低透過性プラスチックバッグを用いて試作した小型のフロート型バイオリアクター内部に実際に藍藻を入れて培養し、内部に水素が蓄積することを確認できた。V型ニトロゲナーゼを発現していると示唆される藍藻株を作成できた。取り込み型ヒドロゲナーゼHupを破壊した紅色硫黄細菌を作成できた。ニトロゲナーゼを利用した水素生産システム構築のための基礎的知見が得られた。以上の観点から概ね研究は順調に進展している。藍藻や植物のような酸素発生型光合成を行う生物は光化学系Iおよび光化学系IIと呼ばれる二つのタイプの光化学反応中心を持っている。これら二つの光化学系は反応中心複合体の主要な光を補足する色素としてクロロフィル(Chl)aを使用し、400 700 nmの波長領域の可視光を利用することができる。太陽光のうち、この波長領域に該当する部分は光合成有効放射(Photosynthetically active radiation、PAR)として知られ、地球表面が受ける太陽光エネルギー全体の45%を占める。そして、残りの55%の多くは近赤外光が占めている。Chl aを持つ光合成生物は、近赤外光の大部分を利用できないが、紅色光合成細菌は主要な光合成色素としてバクテリオクロロフィル(BChl)aを持ち、400 900 nm付近の波長領域の光を光合成に利用することができる。今年度は、まず、紅色光合成細菌Rubrivivax gelatinosusの取り込み型ヒドロゲナーゼHupを不活化した株を作成し、破壊株の水素生産性が向上することを確認した。次に、二層のバイオリアクターの上層に藍藻Anabaena sp. PCC 7120ΔHup株を、下層に紅色光合成細菌R. gelatinosusΔHup株を入れ、一定量の光量で白熱灯照射した。上層や下層で培養する藍藻の培養濃度や、上層と下層で培養する株の組み合わせなどを変えて、上層および下層から発生する水素量を調べた。その結果、単位面積当たりの水素生産量は上層に藍藻、下層に紅色光合成細菌を培養した場合に、光エネルギーの利用効率が有意に向上することが確認された。概ね順調に進展している。取り込み型ヒドロゲナーゼHupを破壊した紅色光合成細菌の作成を行い、の水素生産性や水素生産に影響する要因の解析を行った。水素低透過性プラスチックバッグを用いて試作した小型フロート型バイオリアクター内部に紅色光合成細菌を入れて培養し水素の蓄積が起こることを確認した。バイオリアクターを二層化し、上部に藍藻、下部に紅色光合成細菌を入れて培養し、単位面積当たりの水素生産量は上層に藍藻、下層に紅色光合成細菌を培養した場合に、光エネルギーの利用効率が有意に向上することが確認された。以上の観点から研究は概ね順調に進展している。本研究は、藍藻(シアノバクテリア)と紅色光合成細菌を利用して光生物学的に水素を海面上で生産することを最終目標として、そのシステム開発の基盤となる技術開発を行うことを目的として研究を行い、次のような成果を得た。

1β-プロテオバクテリアに属する紅色光合成細菌であるRubrivivax gelatinosus IL144株の取り込み型ヒドロゲナーぜHupの遺伝子破壊株を作成し、培地組成など生育条件を検討し、野生株に対して、30%程度水素生産活性が増大することを明らかにした。2シアノバクテリアは、光合成色素としてクロロフィルaを持ち、光合成に利用できる光(PAR, Photosynthetically Active Radiation)は可視域の光(400-700 nm)である。一方、紅色光合成細菌は光合成色素としてバクテリオクロロフィルaを持ち可視光に加えて700-900 nmの赤外光も利用できる。シアノバクテリア培養液を入れたフラスコの下に紅色光合成細菌R. gelatinosusを入れたフラスコを置くことにより、太陽エネルギー変換効率は、受光面の単位面積当たりの水素生産量として、シアノバクテリアの培養層を二つ重ねた時と比べ2.7倍近く増大した。3水素低透過性プラスチック素材を用いてフロート型バイオリアクターのプロトタイプを作製した。実際に、シアノバクテリアNostoc sp. PCC 7422のHup不活株や紅色光合成細菌R. gelatinosus IL144のHup破壊株をその内部に入れ、海水と同じ比重を持つ硫酸マグネシウム溶液の水面にバイオリアクターを浮かべて太陽光模擬照射装置で光照射し、内部に水素が蓄積することを確認した。太陽光による光生物学的水素生産を実施する場所として農業と競合しない海洋面の利用が考えられる。本研究は、シアノバクテリアと紅色光合成細菌を利用して光生物学的に水素を海面上で生産することを最終目標として、そのシステム開発の基盤となる技術開発を行うことを目的とした。水素低透過性プラスチックを用いてバッグを作成し、内部にシアノバクテリアや紅色光合成細菌を入れて水素が蓄積することを実証した。また、シアノバクテリアのヘテロシスト形成頻度改変株、紅色光合成細菌の取り込み型ヒドロゲナーゼHupの破壊株など水素生産性が向上した改良株を作成した。藍藻のV型ニトロゲナーゼ発現株についてはV型ニトロゲナーゼの発現を転写レベル、細胞レベルで調べる。V型ニトロゲナーゼの発現レベルと水素生産性を明らかにする必要がある。藍藻のヘテロシスト形成頻度を変えた改良株やアンテナ削減株の作成を進め、水素生産性についての研究を進める。紅色光合成細菌は複雑な代謝経路を持っているので、有機酸やアミノ酸等の培養液の組成や気相組成などの検討により光エネルギーが優先的に水素生産に振り向けられる条件を検討する。水素低透過性プラスチックバッグ素材の性能について検討し、耐久性、水素蓄積性、内部に入れる生物との親和性、加工性などを検討する。バイオリアクターの形状の改良も行い、紅色光合成細菌と藍藻のどちらにも対応したフロート型バイオリアクターの開発を進める。ニトロゲナーゼの活性部位がバナジウム、Feのみで構成されているタイプに置き換えた株の作成を継続中であり、スクリーニングを進める。
脊髄小脳変性疾患者のリハ訓練を小脳変性マウスに対し模擬訓練を代替し評価する研究

運動失調を示すB6-Wob/tマウスに対し、運動失調を軽減させるリハビリテーション運動の質と量について検討を行った。実験は、繰返し強制歩行訓練による運動効果の評価とした。さらに、環境enrichmentマウス飼育箱での自発的歩行訓練による運動効果の評価を行った。評価は協調歩行運動、脳重量、プルキンエ細胞の変性を観察した。その結果、繰返し歩行運動を行うことが重要で負荷の強さに関係しないことが示唆された。一方、小脳変性の原因遺伝子の探索を進めていたが、染色体構造異常が染色体10番目に見つかった。現在、脊髄小脳失調症発症患者の原因遺伝子と類似しyているか調査している。B6-wob/tは、小脳プルキンエ細胞の変性脱落による小脳萎縮でありその結果、小脳失調性運動障害のマウスとしてSCD患者に類似する病態を示す有望な候補である。回転かごによる強制運動を負荷した当該マウス運動有群は運動無群に対し、経時的にrotarod試験により判定された筋協調運動の改善がみられた。よって、申請者らは、運動の介入で歩行失調の改善に有効であると結論づけH25年度の研究を以下のように計画した。1)運動負荷運動による、筋肉、小脳、大脳の遺伝子産物(タンパク質)および遊離アミノ酸の解析。血中の内臓疾患マーカーの検索および解剖組織標本・病態生化学的解析を行うなど体液成分から病態の進行を判定する。また原因遺伝子を特定する。2)遺伝子解析を行い原因遺伝子の特定を行い、SCD患者との相同性を解析する。またモデル動物としての遺伝子改変を行い、遺伝病の診断の応用を検討する。その結果、1)筋肉、小脳における2次元電気泳動後のプロテオーム解析において、筋肉では、対照のB6マウスに対しアクチンの発現に減少する差が示唆された。小脳においては、雌雄に差は無かった。生後10日齢と6か月齢に差がみられた、リン酸化されたタンパク成分がみられた。それらは高分子タンパクに散見された。さらに小脳、大脳、橋・延髄中の遊離アミノ酸の解析においては、生後5、10日齢において、対照のB6マウスよりも大きく変動するアミノ酸がみられた。2)次世代シークエンスマウスExomeデーター解析の結果、B6-wob/tのホモHom wo/woに対しヘテロHet wo/-およびB6 Wild type+/+に変異の差の候補がいくつか挙げられたが、ヒトのSCD患者に関連する遺伝子情報は今回得られなかった。今後、追試を行い再現性を確認したい。B6-wob/tは、小脳プルキンエ細胞の変性脱落による小脳萎縮であり、その結果、小脳性運動失調マウスとしてSCD患者に類似する病態を示す有望な候補であると考えられる。26年度は1)強制運動歩行訓練回転かごにより、4ヵ月に渡り歩行訓練を負荷した.その結果当該マウス訓練有群は訓練無群に対し、rotarod試験により判定された協調運動の評価に改善がみられた。その結果を踏まえ、A)歩行解析、B)重心動揺解析を行ない、正常マウスと当該マウスの運動有無群との比較を行った。その結果1当該マウス用歩行解析装置を製作し、3者の比較を行ったところ、訓練有群の後肢歩隔と後肢角度は、より正常マウスに近づき、訓練無群よりもパラメータが小さくなった。2マウス用重心動揺計を製作し、移動、停止、静止時の重心軌跡長と床圧力を測定し、3者の比較を行ったところ、訓練有群の歩行軌跡は、移動時に小さくなり、訓練無群よりも有意にパラメータが小さくなった。2)運動負荷群の、小脳、大脳の遺伝子産物(タンパク質)を2次元電気泳動を用いたプロテオーム解析を行なった。現在、特異的関連タンパクの検索中である。また、血清中の遊離アミノ酸を測定した。血中の内臓疾患マーカーの検索および解剖組織標本・病態生化学的解析を行うなど体液成分から病態の進行を判定中である。3)原因遺伝子を特定するために、遺伝子解析を行い原因遺伝子の特定を行い、SCD患者との相同性を解析した。現在エクソン解析を進めている。4)リハ科専門医による当該マウスとSCD患者と類似する病態と特徴的な行動様式を抽出しパターン化するB6-wob/t-SCD stageの作成する。以上の研究が進行中である。我々は、運動失調を示すマウスを維持している。このマウスは、幼児型嚢包腎マウスC57BL/6-cpkの系統維持中、歩行異常を示す個体を発見した。直ちにC57BL/6nagoyaと戻し交配(N)およびインタークロス(IC)によるコンジェニック系統化を行なった。このマウスのphenotypeは、酩酊歩行、転倒、協調運動低下など運動失調である。病態観察では大脳、脊髄から末梢側の運動神経、内臓異常は見当たらず、生後10日齢で小脳プルキンエ細胞が変性・脱落する病理組織病変と小脳萎縮が観察された。よって運動失調の原因は小脳の神経変性によるものと考えている。ヒトにおいて、よろめき、ふらつきを示す歩行失調症の疾患に、脊髄小脳変性症が知られている。27年度の研究1は、常染色体劣性遺伝で小脳失調を示す当該マウスを神経変性疾患のモデルマウスとしてエクソーム解析により、疾患の原因変異を検討することとした。その結果、6つの候補を同定した。

さらにメイトペアライブラリを作成し、次世代シーケンサーによりおよそ3000万リードのデータを得て、両者を比較した。その結果、昨年の候補変異と同一の染色体上に、およそ140kbの欠失が存在することが明らかとなった。次に研究2において、小脳性運動失調マウスにD-セリンおよびD-サイクロセリン、D-セリンエチルエステル、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンを投与しロータロッド試験、ビームテスト試験を行ない協調運動の改善が見られた。また投与中止によて改善が低下した。そこでD-セリンはプルキンエ細胞のシナプス伝達シグナルに影響を及ぼす仮説を考えている。当該マウスの維持繁殖に時間か少しかかってしまった。しかしながらホモ、ヘテロを得ることができ、次世代シークエンサー解析を行うことができた。候補遺伝子のフェノタイプとの関連するデータベース情報が乏しく苦戦した。しかしながら、ペイトペア解析で遺伝子欠失が見つかった。その結果、27年度の研究目標にたどり着けた。次世代シークエンサー解析(NGS)を用いた神経変性マウスの遺伝子解析を目的として本年度の研究を進めた。平成25年度から始まった本研究課題において、自然発症型の運動失調を呈する当該マウスB6-wob/tは、ヒトの脊髄小脳失調症モデル動物としての有用性を期待して研究を始めた。これまでに、当該マウスに対し臨床で行うリハビリテーション運動を模擬して歩行訓練を行ってきた。運動は、回転ホーイルを用い1日60分(10分休憩を含)を3回行う強制歩行訓練群、環境エンリッチメント飼育箱を用いた自発的自然運動負荷群を通常ケージ群に対しロータロッド、ラーダー歩行試験、レーザービーム試験を用い歩行障害、平衡感覚の改善などを評価した。その結果、繰り返し運動を負荷する強制運動歩行訓練は著明な歩行パフォーマンスの改善が認められた。また、遊び場を飼育箱に配置した探索行動負荷運動による歩行パフォーマンスも同様の改善が認められた。しかしながら強制歩行訓練は、過度の運動負荷のためか個体に体重変動差があり、毛並みも悪く老化促進を伺わせた。以上の研究は、脊髄小脳失調症患者には強制歩行訓練の負荷よりも遊具や環境エンリッチメントを活かした運動トレーニング法の工夫の提案が適切かもしれない。以上、小脳失調症患者において運動負荷訓練の質と量を改善を提案するために、本年度は、当該マウスが、ヒトの小脳失調発症の原因遺伝子と類似しているか探索することは必須であったことから、平成26年度より準備を進めてきた結果、平成27年度において、野生型に対し欠失している遺伝子が当該マウスで発見された。現在ヒトの小脳失調症の原因遺伝子と類似するのか解析を行っている。運動失調を示すB6-Wob/tマウスに対し、運動失調を軽減させるリハビリテーション運動の質と量について検討を行った。実験は、繰返し強制歩行訓練による運動効果の評価とした。さらに、環境enrichmentマウス飼育箱での自発的歩行訓練による運動効果の評価を行った。評価は協調歩行運動、脳重量、プルキンエ細胞の変性を観察した。その結果、繰返し歩行運動を行うことが重要で負荷の強さに関係しないことが示唆された。一方、小脳変性の原因遺伝子の探索を進めていたが、染色体構造異常が染色体10番目に見つかった。現在、脊髄小脳失調症発症患者の原因遺伝子と類似しyているか調査している。
カナダ契約移民の輩出と渡航後の地域的展開をめぐる歴史地理学的研究

第二次世界大戦以前、カナダへ渡った日本人の就業について、先行研究では漁業、製材業や商業が中心に描かれてきた。しかし、彼らの多くは自由移民であったが、決して少なくなかった契約移民の存在は無視できない。自由移民と契約移民との輩出・受容構造の差異を導く必要がある。本研究では、カナダ日本人移民史研究が看過してきた契約移民をめぐって、20世紀初頭における日本・カナダ両国の移民政策を背景にした輩出・受容構造、さらに渡加後の転業や再移動について歴史地理学的アプローチから明らかにする。2019年度では、バンクーバー島西岸のユクルーレットにおける日本人開拓漁村の考察を行なった。ここではスティーブストンからの移住者は、3ヶ所の小さな入江に住みついた。それらは自然地名、先駆者や先住者の名前によって入江西岸では北から砂浜湾、濱出(文治)湾とフレーザー湾、入江東岸には清水湾と箱田湾と名付けられた。西岸の3集落には、先駆者・上山又吉のように、スティーブストンで最多数の和歌山県、とくに三尾出身者が多かった。ただし、入江東岸の清水湾では彼らの地縁関係から東牟婁郡をはじめとする三尾以外の出身者が多かった。とくに、福岡県糟屋郡多々良村(現在の福岡県福岡市東区)出身の箱田直次の住む箱田湾だけは、三尾出身者が皆無であった。彼はカナダ太平洋鉄道への鉄道契約移民の1人であった。2名の静岡県出身者も同様であり、彼らは契約満了後にサケ缶詰産業へと転出してきたのである。ただし、最大の日本人漁業者の集住地であるスティーブストンでは従事できず、バンクーバー島西岸に活路を見出したのである。つまり、すでに居住環境が整っていた入江東岸には先駆者が居住し、三尾出身者は親日家の好意もあり対岸の西岸に居を構えた。そして、鉄道契約移民の転業など後発の日本人は、当時集落の縁辺の東岸南端に集住したのである。本研究では、(1)アメリカとかかわるカナダへの契約移民会社の成立、(2)日本における特定地域からの契約移民の輩出構造、(3)カナダにおける契約移民の組織化、(4)契約期間の終了後の転業や地域的拡散、の4点について実証的に解明することを到達目標とする。限られた期間において目的を達成するため、これまで等閑視されてきた東京移民合資会社をとりあげ、同社から多くの契約移民を輩出した宮城・栃木・神奈川・静岡・福井・福岡・熊本・鹿児島・沖縄県出身者の展開を把握する。そのうち、2015年度では福井県を中心とする鉄道契約移民について考察した。そして、2016年度には鹿児島県からの契約移民がサケ缶詰産業に転業した事例を説明した。2017年度では、熊本県から炭鉱夫として渡加した契約移民の転業を考察した。さらに、先住の沖縄県、後から他所から転入した福井県出身者が多くを占めていた米加国境付近に位置するホワイトロックでの製材業に関わる日本人移民について考察した。2018年度では、バンクーバー島西岸における日本人開拓漁村における鉄道契約移民の再移動・転業について検討した。ここでは和歌山県南部出身者、そして他地域出身者によって相互補完的に新しい移住漁村が形成されたことが明らかになった。今後は、日本の特定地域からの契約移民の輩出構造を把握する。外交史料館所蔵の「明治四十年移民取扱人を経由セル海外渡航者名」には、東京移民合資会社による約1,500名のカナダ契約移民が網羅されている。すでに入手している名簿を概観すると、彼らは宮城・栃木・神奈川・静岡・福井・岡山・福岡・熊本・鹿児島・沖縄県の10県に限定されている。ただし、出身地については県レベルまでの記載にとどまるため、同館所蔵の「海外旅券下附表」を精査し、市町村単位まで確認する必要が生じる。これらの資料には渡加目的が記されているため、炭鉱契約移民と鉄道契約移民との差異が見いだせる。つまり、特定の業種への就業種の違いを意図した契約移民の輩出構造に関わる地域性が見いだせるに違いない。事例とする炭鉱契約移民については、熊本県有明海沿岸出身者の関係者とは連絡がついているので、早急に資料整理・聞き取り調査などに着手する。最終年度の2019年度では、栃木県をはじめとする未着手の県からの輩出者についても検討を進めたい。第二次世界大戦以前、カナダへ渡った日本人の就業については、先行研究では漁業、製材業や商業が中心に描かれてきた。しかし、彼らの多くは自由移民であり、決して少なくなかった契約移民の存在は無視できない。2015年度では、鉄道契約移民として渡航した契約の悲劇について、当時の新聞報道から明らかにした。1910年3月4日、ブリティッシュ・コロンビア州(以下、BC州)の内陸部のセルカーク山脈に位置するロジャーズ峠で雪崩が発生した。カナダ太平洋鉄道の除雪作業に携わっていた70余名のうち、大規模な第二次雪崩災害によって58名の鉄道工夫が落命した。そのうち32名は日本人であり、彼らの多くは移民会社を介した契約移民として3年間の労働契約を結んだ、いわば出稼ぎ移民であった。前著では、被災者の出身地からこれまでのカナダ日本移民の輩出地と異なる契約移民の実態を捉えることに努めた。

そして、第二次世界大戦以前のカナダにおいて最大の日本語新聞『大陸日報』に掲載されたロジャーズ峠の雪崩災害の記事、とりわけ葬儀の様子から20世紀初頭のカナダ日本移民社会の諸相について考察した。そこでは、カナダ仏教会、日本人会や県人会の重要性、さらに、『大陸日報』の記者について紹介した。とりわけ、これまでカナダ日本人移民史で等閑視されてきた福井県出身者を中心に解明した。カナダへの契約移民について、鉄道契約移民の実態について、特にロジャーズ峠の雪崩災害について、当時バンクーバーで発刊されていた日本語新聞『大陸日報』の記事から事故の様子やその後の救援活動、特に日本人犠牲者に対する義捐活動や葬儀から看取できる日本人移民社会の諸相について明らかにした。今後は、炭鉱契約移民の実態を明らかに、契約移民の業種による差異を考察したい。2016年度では、日本の特定地域からの契約移民の輩出構造を把握した。事例となる契約移民輩出県をとりあげ、カナダ渡航後における彼らの組織化について、2つの事例から考察した。第一に、カナダ西岸のフレーザー河口南岸のブランスウィック・キャナリーに従事した鹿児島県出身者を事例とし、サケ缶詰産業における日本人移民の構造を紹介した。このキャナリーの日本人は、薩摩半島南部の出身者がほとんどを占めていた。彼らのなかには、1907年に東京移民合資会社による契約移民として渡航した鉄道保線工として契約期間を終えた者もいた。その後、彼らはサケ缶詰産業に従事するためBC沿岸部に移動することが多かった。しかし、先住の和歌山県出身者の多いスティーブストンのキャナリーに雇用されることは困難で、他の地域の新しくて規模の小さいキャナリーに雇われたのである。そのなかにあって、1905年に「商業視察」「研学」を目的として渡加した鹿児島県指宿出身の髙﨑幸助・幸男親子は、先住者として英語が理解できるため、キャナリーから動力船を賃貸され、日本人漁業が漁獲したサケを収集してキャナリーへ運搬していた。つまり、英語を理解できる先住者は、キャナリーにおける日本人漁業者のリーダーとなることが多いのである。次に、東宮殿下(後の昭和天皇)の渡欧を記念して1921年にカナダ・バンクーバーで発刊された『金田之栄ー東宮殿下御渡欧記念・邦人児童写真帖ー』について考察・復刻した。日本への訪問団の設立に合わせて、この写真帖の発刊が計画された。渋沢栄一、添田寿一や阪谷芳郎の題辞・序文を収めたこの写真帖は、カナダ日本人移民の今後の発展を期待する企画だった。『写真帖』の復刻では、解題だけでなく、収められた259家族・545人について氏名・父親の名前・出身地などのデータベースを添えた。また、東京移民合資会社による熊本県移民者の手記も収録した。本研究では、1:アメリカとかかわるカナダへの契約移民会社の成立、2:日本における特定地域からの契約移民の輩出構造、3:カナダにおける契約移民の組織化、4:契約期間の終了後の転業や地域的拡散、の4点について実証的に解明することを到達目標とする。限られた期間において目的を達成するため、これまで等閑視されてきた東京移民合資会社をとりあげ、同社から多くの契約移民を輩出した宮城・栃木・神奈川・静岡・福井・福岡・熊本・鹿児島・沖縄県出身者の展開を把握する。
腸内常在細菌叢の変化を介したアレルギー増悪機構の解明とアレルギー制御への展開

本研究では腸内常在細菌叢とアレルギー発症の関連性、授乳期の抗原摂取が仔の免疫応答に及ぼす影響について動物モデルを用いて検討した。DO11.10マウスをOVAの経口投与により感作すると、腸内細菌叢が変化することがわかった。母が摂取した飼料が仔の腸内細菌叢形成にも影響し、ひいてはアレルギー発症にも影響する可能性が示された。さらに、授乳期に母が摂取した抗原は未分解のまま一部が母乳に移行し、仔を感作するが、それだけではアレルギー発症を惹起せず、生育後のアレルギー重症度にも影響しないことが示唆された。本研究では申請者らが確立したDO11.10マウスにおける食物アレルギー動物モデルを用いて、1経口抗原感作による腸内常在細菌叢変化を明らかにし、2この菌叢変化とアレルギー増悪との関連性を明らかにするとともに、3腸内常在細菌叢の改変によるアレルギー抑制の可能性を探ることを目的としている。今年度は2の解析中に明らかとなった、授乳期間中の親世代への抗原の経口投与が、仔マウスにおいても感作を誘導するという新たな現象について集中的に解析を行った。BALB/c雌性マウスとDO11.10(+/+)雄性マウスを交配し、出産直後から母マウスに抗原投与を行い、仔の4週齢時の特異的抗体価を調べたところ、授乳中の抗原投与により仔での顕著な特異的抗体価の上昇が見られた。また、抗体価の上昇は投与する抗原量が同一であっても、投与のパターンにより異なり、抗原投与に休止期間を設けずに連続的に投与した群で最も高値を示した。観察された抗体価の上昇は一過的であり、10週齢時の特異的抗体価は、母への抗原投与を行わなかった群と同程度までに低下した。調製した仔の脾細胞を抗原で再刺激したところ、母への抗原投与によりIgE産生量が上昇する傾向が見られた。現在、この動物に抗原特異的なアレルギー症状を誘導し、母への抗原投与の影響を調べている。3に関しては、AIN93Gをベースとした精製飼料と非精製飼料をDO11.10 (+/+)マウスに投与・飼育した結果、両群の腸内細菌叢が異なることをDGGE解析により明らかにするとともに、抗原特異的アレルギー症状の程度が異なる可能性が示唆され、現在詳細な検証を行っている。今年度は2の解析中に明らかとなった、授乳期間中の親世代への抗原の経口投与が、仔マウスにおいても感作を誘導するという新たな現象について昨年度に続いて解析を行った。BALB/c雌性マウスとDO11.10(+/+)雄性マウスを交配し、出産直後から母に卵白アルブミン(OVA)を投与した。その結果、授乳された仔の胃内容物に未分解のOVAが検出され、授乳中の抗原投与により仔で顕著な特異的IgE, IgG抗体価の上昇が見られた。しかし、見られた特異的IgEの上昇はアレルギー性皮膚反応を惹起するレベルではなく、追加感作後の抗体産生量、アレルギー症状の程度に母へのOVA投与の影響は認められなかった。以上より、本モデルにおいては、授乳中に母親が摂取した抗原の一部は母乳に移行し、授乳された仔を感作するが、それだけではアレルギーは誘導されず、成長後のアレルギー発症には影響しないことが示唆された。また、3についてはAIN93Gをベースとした精製飼料あるいは非精製飼料でDO11.10 (+/+)マウスを飼育した後に交配し、離乳後の仔へも精製飼料あるいは非精製飼料を摂取させて、アレルギー症状の重症度を比較した。その結果、母が摂取した飼料によりアレルギー重症度が異なること、飼料の違いによって腸内細菌叢が異なることが明らかとなった。この結果は、とりわけ発育初期の腸内細菌叢が生育後のアレルギー重症度に影響することを示唆するものであった。本研究では申請者らが確立したDO11.10マウスにおける食物アレルギー動物モデルを用いて、(1)経口抗原感作による腸内常在細菌叢変化を明らかにし、(2)この菌叢変化とアレルギー増悪との関連性を明らかにするとともに、(3)腸内常在細菌叢の改変によるアレルギー抑制の可能性を探ることを目的としている。(1)に関しては、抗原未感作群と抗原感作群の盲腸内容物から抽出したDNAを鋳型とし、16S rRNA配列に基づくPCR-DGGE法を行ってバンドパターン解析を行うことにより、両群の菌叢が異なることを示した。

Bifidobacteriaおよびlactobacilli特異的プライマーを用いた定量PCRにおいては、感作の有無による差は認められなかった。現在、特徴的に変動したDGGEバンドの塩基配列解析、16S rRNAクローンライブラリの構築により感作によって特徴的に変化する菌種の特定を行っている。(2)については、DO11.10マウスの繁殖効率の問題から進行が遅れ気味であるが、親世代の抗原感作が仔でのアレルギー発症に及ぼす影響を解析している際、授乳期間中に抗原を経口投与すると仔マウスにおいても感作が誘導されることが新たに明らかとなった。すなわち、BALB/c雌性マウスとDO11.10(+/+)雄性マウスを交配し、出産直後から母マウスに抗原投与を行い、仔の4週齢時の特異的抗体価を調べたところ、授乳中の抗原投与により仔での顕著な特異的抗体価の上昇が見られた。来年度は当初の計画に加え、観察された仔での免疫応答変化および生育後のアレルギー発症への影響を詳細に検討するとともに、感作が分泌される母乳に含まれる抗原によるものか、抗原投与期間中の血中OVA濃度を測定することにより検討する予定である。平成24年8月より平成25年8月まで長期在外派遣のため、期間を平成25年度までに延長し研究を実施している。派遣のため達成度はやや遅れているが、上記記載の実績の概要の内、2については、計画には記載していなかったが、授乳期間中の抗原投与により仔が抗原感作を受ける可能性が示され、その詳細な解析を実施している。また、3についても飼料の違いにより腸内細菌叢変化を介してアレルギー症状の程度が変化する可能性が示唆され、25年度は詳細な解析を実施する予定である。上記記載の実績の概要の内、(1)については経口抗原感作により腸内細菌叢が変化することをPCR-DGGE法を用いて明らかにすることができ、さらに詳細な菌叢解析を実施しているところである。(2)については、マウスの繁殖効率が悪く計画と比較して進行がやや遅れているが、繁殖効率の問題は解決されつつあり、来年度以降は計画に基づく実施が可能となるものと考えている。また、計画には記載していなかったが、授乳期間中の抗原投与により仔が抗原感作を受ける可能性が示され、その詳細な解析を今後実施する予定である。研究に用いるマウスの繁殖効率が改善し、母の腸内細菌叢変化や授乳中の抗原感作が、仔世代での免疫応答に及ぼす影響の解析が研究計画に基づき可能になると考えている。また、幼少期の腸内細菌叢の解析に実績のあるニュージーランドオタゴ大学Tannock教授との研究連携を開始し、塩基配列を元にした菌叢解析のみならず、マウス消化管内容物からの菌の分離、その投与によるアレルギーへの影響の解析等も可能になると考えている。今年度、マウスを効率的に繁殖させるために飼育環境をはじめとする条件を検討し、繁殖効率が改善した。来年度以降は、母の腸内細菌叢変化や授乳中の抗原感作が、仔世代での免疫応答に及ぼす影響の解析が研究計画に基づき可能になると考えている。また、幼少期の腸内細菌叢の解析に実績のあるニュージーランドオタゴ大学Tannock教授との研究連携も検討している。本研究課題は平成25年度まで延長して実施することとなった。本研究課題の推進のため、次年度の研究費は、物品費・旅費に使用する。本研究課題の推進のため、次年度の研究費は、交付申請時の計画どおり、物品費・旅費に使用する。