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ユーイング肉腫におけるp27蛋白分解促進機構の解析と分子標的治療への応用

EWS-Fli1発現をsiRNAのトランスフェクションにより抑制すると、ユーイング肉腫細胞内のSkp2の発現量が特異的に減少した。EWS-Fli1の発現量とSkp2の発現量はパラレルの関係にあった。また、各種ユーイング肉腫細胞株を用い、細胞内でのp27蛋白質のユビキチン化について免疫沈降法およびウェスタンブロット法にて検討した。EWS-Fli1によって、ユーイング肉腫細胞内のp27ユビキチン化が促進されることが判明した。以上の結果より、EWS-Fli1はskp2の発現を増強させ、その結果p27蛋白質のユビキチン化を起こし、蛋白分解を誘導している可能性が示唆された。ユーイング肉腫では、特異的染色体転座t(11:22)の結果異常な融合遺伝子EWS-Fli1が生じる。この融合遺伝子産物はユーイング肉腫の発がん原因と考えられている。これまでに我々は、EWS-Fli1が癌抑制遺伝子Rbに関係した細胞周期制御因子(p27,p21,cyclin E)を標的とし、これらの同定されたEWS-Fli1の標的遺伝子の中で、p27発現レベルの低下がユーイング肉腫患者の最も強い予後予測因子であることを明らかにした。しかし、EWS-Fli1によるp27発現抑制の分子機構は不明である。近年、p27の発現調節は主として蛋白質分解のレベルでなされており、その分解にはユビキチン・プロテアソーム系が関与していることが示された。また、いくつかの癌種において、ユビキチン系の活性異常が報告されているが、ユーイング肉腫に関する報告は殆どない。本研究の目的は、EWS-Fli1によるp27発現抑制のメカニズムとユビキチン経路の関与について明らかにし、ユーイング肉腫の新しい分子標的治療法の開発につなげることである。ユーイング肉腫細胞株にプロテアソーム阻害剤を投与すると、細胞内のユビキチン・プロテアソーム活性が抑制され、p27発現は有意に増加し、ユーイング肉腫細胞の増殖が抑制された。また、ヌードマウス皮下に移植した腫瘍に対しても、in vivoで腫瘍増殖抑制効果が確認された。一方、我々の樹立した多剤耐性ユーイング肉腫細胞株においては、プロテアソーム阻害剤による増殖抑制効果が認められなかった。これはプロテアソーム阻害剤が、薬剤排泄ポンプの基質となるためであり、ポンプ阻害剤の併用により、プロテアソーム阻害剤の耐性株に対する効果が回復した。ユビキチン・プロテアソーム活性の抑制は、ユーイング肉腫に対する有望な分子標的治療となりうると考えられた。
連邦国家理論と法人理論－多元的国家秩序の動態把握の枠組構築の試み

連邦国家理論と法人理論との密接な連関は、ラーバントが国家連合と連邦国家との区別を組合と法人の区別と同じだと説明したことからもよく知られている。その説明における法人とは、法主体という意味に過ぎないか、ラーバントは法人概念の核心を、構成員から観念的に分別された主体を構築することに求め、連邦国家の定義にもそれを応用した。オットー・マイアーは「観念的分別」という技術的規律を私法・公法を問わずあらゆる種類の団体に適用し、包括的な団体理論としての法人理論を構築した。分別のあり方は各種法人の内部構造を規定するもので、そこから得られる知見は諸団体の組織論的把握にも発展させ得るものである。多元的国家秩序の法の動態を適切に把握するための枠組構築のために、当年度においては、法人理論が団体の内部関係の把握にとってどのような意味を有し得るかを検討する材料として、オットー・マイアーの法人理論を検討した。オットー・マイアーは1908年に法人理論に関する詳細な論文を発表し、公法人のみならず私法上の社団法人・財団法人をも含んだ包括的な理論枠組としての法人理論を打ち立てた。その際にマイアーが法人格の機能として最も重視したのが、「分別」の機能である。私法上の法人にあっては、それは財産の分別を意味する。さまざまな社団法人や財団法人において、団体の財産をさまざまな関係者たちの処分権行使や影響から「分別」し、保護しようとするのかが、検討された後に、さまざまな公法人についても、同様の「分別」機能が析出される。マイアーはこの論文の後に改訂出版された主著『ドイツ行政法』第2巻の第2版(1917年)で、初版(1896年)とは異なって、国家は法人ではない、と主張するようになる。そのように見解を改めた理由は、マイアーが法人格を「分別」のための技術的法制度として純化したことに求められる。つまり国家を法人と呼んだところで、国家における何を何から「分別」するのかが明らかになるわけではない、ということである。従来マイアーの国家の法人性否認については、その政治的含意(たとえば共和制に対する距離感)が強調されてきたが、それ以上に法人格の技術的純化を貫いた、という理論的根拠が重要視されるべきであることが、今年度の研究から明らかになった。当初の予定では、この点に関する独立の論文を執筆することも今年度の予定に含ませられていたが、論文の執筆は次年度に繰り越されることになる。さらに次年度には、所期のとおり帝政中期の連邦国家理論の検討にも本格的に取り組む予定である。本年度においては、オットー・マイアーの法人理論を分析・検討するとともに、それを論文に纏めることを当初予定していた。マイアーの理論の分析・検討に関しては、科研費の執行を通じて必要な資料をかなり入手することができ、内容的にも大方の検討を済ませることができた。オットー・マイアーの法人理論の構造とその現代的含意についても、ほぼ論文に纏める材料を析出し得たと思う。ただし、具体的な論文執筆までには至ることができずにいるので、その限りで進捗状況としては「やや遅れている」という区分になる。しかし論文に書くべきことはほぼ明らかにされているので、それ程に致命的な遅延とは評価していない。現段階では、オットー・マイアーの法人理論についての論文をまとめる作業に入っている。当初の予定では、彼の見解をもっぱら理論内在的に把握することを目指していたが、彼が1908年に公法人のみならず私法上の法人をも含めた総合的な法人分析の枠組みを提示した意義を明らかにするためには、彼の法人理論が当時の諸法人のいかなる実態を念頭に置いて立てられたのかを明らかにすることが不可欠であると考えるようになった。その結果平成28年度の研究は、19世紀末から20世紀初頭のドイツの法人制度の実態の解明に向けられてきた。この時期には、次のような様々な領域で法人格を備えた団体が形成されるようになっていた。まずビスマルクの社会政策に対応して、社会保険・社会保障の分野での様々な団体が公法上の法人として設立された。次に私経済の分野では、商工会議所や農業協同組合などの種々の産業別・地域別の自治的団体に関して、法的制度が整備され、それらの団体に法人格が付与されることになった。さらに、その公共性ゆえに国家の規制の下に置かれた自由業、たとえば弁護士、薬剤師などについて、一方で国家の直接的規制から外して自治的団体(弁護士会など)を法人として組織させながら、それに外から規制を及ぼすという手法が採用された。こうした諸団体は、その系譜からすれば公行政の一端を独立させたものから、私的な領域から派生したものまで多様に及びながら、しかし法人格という共通の枠組みを与えられていた。マイアーが行政法学者でありながら、私法人までを射程に収めた総合的・網羅的な法人理論の構築を目指したのには、当時のこのような法人の実態があったということが明らかになった。研究遅滞の最大の理由は、これまでもっぱら理論内在的に分析すれば足りると考えてきたオットー・マイアーの法人理論について、その歴史的実態との対応関係の解明が不可欠であると考えるようになったことにある。マイアーの叙述は、体系書においても論文においてももっぱらドグマーティッシュに展開されていて、背景にある社会的実態への言及は断片的に過ぎない。

それゆえ、彼の包括的な法人理論は、種々の法人(公法人と私法人、あるいは社団と財団など)についての法的枠組を網羅的・総合的に統括し得る理論枠組として位置づければ足りるものと考えてきたのである。もちろんそれはその限りで誤りではないが、何ゆえに行政法学者である彼がまさにその時点において、私法人をも組み込んだ包括的理論枠組を提示するに至ったのか、ということについての説明がなされなければならない。そして、そのような問題関心から、当時の法人をめぐる多様な実態を見てみるならば、この時代には公法・私法を縦断して多様な法人の発展が見られたことが明らかになった。法人制度はこの時期に、言うなれば公法と私法とが交錯する諸領域において顕著な展開を見せたのである。マイアーの法人理論は、まさにそのような実態に対応しつつ、理論としての普遍性を追求するものであったと考えられる。このように、研究遂行上は遅れをもたらした研究方針の変更であったが、その結果としてマイアー法人理論研究としては、格段の充実を図ることができるようになったと思われる。最終年度には、オットー・マイアーの法人理論を当時の諸法人の実態にも配慮しながら分析し、その全体像を明らかにするとともに、1880年代の連邦国家理論をイェリネック、リーベ、ツォルンらを中心に検討した。研究期間全体の成果としては、連邦国家理論と法人理論のそれぞれについての認識をほぼ獲得できて、両者を関連づけて多元的国家秩序の動態把握のための枠組を構築する準備が整ったと言える。本研究は何よりも、マイアーの法人理論について従来あまり知られていなかったその全体構造と、その多元的国家秩序把握にも生かされ得る理論的射程とを析出した。マイアーは国家は法人ではないと主張したが、その真意は殆ど理解されないまま異端説と位置づけられてきた。そうした評価は、マイアー説がもっぱら通説的な国家法人説との偏差という観点から読まれてきたことにおそらく起因する。マイアーは実は、法人制度の技術的効果としての財産分別が果たす機能を、公法人・私法人、財団・社団などを横断して検討した。商事会社等の社団法人では周知の通り、財産分別が会社債権者にとっての引き当てとなる会社財産が社員や社員の債権者によって取り崩されないための保障である。公的慈善アンシュタルトや公的年金機構では、寄進者や掛け金払い込み者たちという法人の部外者が財産分別の恩恵を受ける。それに対して財団法人や水利団体、職業団体などでは、寄付者あるいは団体構成員の出資金が目的外に使われないことを財産分別が保障している。しかし国家にはそのような分別という技術的効果の働く余地はないのである。注目すべきは、法人における財産分別という主として外部効果をもつ技術的機能が、団体類型ごとに異なった内部構造を基礎づけていることである。法人理論はこのように団体の外部関係と内部構造とを架橋する。この知見を利用しつつ、多元的国家秩序の把握のための枠組みを構築することが将来の課題となる。連邦国家理論と法人理論との密接な連関は、ラーバントが国家連合と連邦国家との区別を組合と法人の区別と同じだと説明したことからもよく知られている。その説明における法人とは、法主体という意味に過ぎないか、ラーバントは法人概念の核心を、構成員から観念的に分別された主体を構築することに求め、連邦国家の定義にもそれを応用した。オットー・マイアーは「観念的分別」という技術的規律を私法・公法を問わずあらゆる種類の団体に適用し、包括的な団体理論としての法人理論を構築した。
慢性閉塞性肺疾患管理に特化した自己効力感尺度の開発とその臨床応用可能性の検討

本研究は、第一に慢性閉塞性肺疾患(COPD)の管理に特化した自己効力感尺度を開発することを目的とする。第二に開発した尺度がCOPDの管理において、実際に臨床応用が可能であるかを検討する。具体的には対象者の有する疾患管理に対する自己効力感の程度と禁煙や呼吸リハビリテーション、薬物療法の取り組みの程度との関連を検証する。また、自己効力感の高い群および低い群に群分けし、両群の呼吸機能、身体機能、精神・心理機能の各指標を2年間の縦断的変化から比較することを目的とする。
GISを用いた積雪寒冷地の地震危険度総合評価システムに関する研究

本研究は、地震災害の防災・被害軽減化に貢献する、積雪寒冷地の自然条件・社会条件を考慮した総合的な地震危険度評価システムの実現が目的である。この地震危険度評価システムは、秋田市を対象に選び具体的に展開し、積雪期における道路交通障害や住宅被害の実態等、地震危険度に関連する地理的・社会的要因を考慮し、すべての情報を地理情報システム(GIS)により統合・分析した上で、従来単一の要因にのみに依る評価法では見落とされる地震危険度を明らかにする。本研究は,積雪寒冷地の自然条件・社会条件を考慮した地震危険度評価システムの実現を目的とするもので,3年間に亘って計画される研究の初年度にあたる。以下3項目について研究を進めた。1.積雪寒冷地の地震危険度評価に関わる関連資料の収集・整備と防災課題の整理地震危険度評価に必須と思われる地盤資料や建築物・道路・人口分布等の資料収集を行い,これら膨大な量的・質的データを基にGISデータベースを構築するとともに,積雪寒冷地ならではの地震危険度評価に取り込むべき項目の抽出,整理を行った。その結果,堆積雪に伴う避難経路,消火・救急活動のための空間確保の困難等大きな問題を抱えている実態を把握することができた。2.積雪寒冷地における住宅の振動特性の把握住宅の地域特性について,秋田市および湯沢市(豪雪地域)を対象とし,木造住宅の常時微動観測を通じて積雪寒冷地における住宅の振動特性を検討した。観測された住宅の固有周期は0.2秒程度であり,他の地域よりも短いことが確認された。積雪時における住宅の微動測定は,平成18年度は暖冬であったことから,平成19年度の冬に行う事となった。3.道路ネットワークのデータベース構築応急復旧時の緊急車両や避難などソフト面の対応までを加えて評価に取り込むため,1のデータベースを利用し,秋田市の飯島,土崎,泉地区を対象をして,建築年代別建物および幅員別道路データベースを構築した。今後GIS上での道路ネットワーク解析を可能とするため,各ノードとリンクには,それぞれの座標,道路幅員の情報のほかに,道路と建物の位置関係のIDを持たせている。本研究は,積雪寒冷地の自然条件・社会条件を考慮した地震危険度評価システムの実現を目的とするもので,3年間に亘って計画される研究の2年目にあたる。1.積雪寒冷地における住宅の振動特性の把握(後半)秋田市飯島緑丘公民館(木造軸組2階建住宅)を対象として,「一般耐震診断法」に基づく耐震診断と常時微動測定を行い,積雪寒冷地における住宅の耐震性を検討した。耐震診断と微動観測の結果は同様の傾向を示した。しかしながら住宅の固有周期については,鉄板葺きの屋根が用いられていることなどから,他の地域に比べ耐震性能の低い建物(評価点0.29)についても短いことが確認された。2.積雪寒冷地における振動特性の季節変化の観測積雪寒冷地においては,地表面の凍結による卓越周期の変化などが考えられるが,これを実測的に計測した例はほとんどない。そこで,従来不変と考えられている地盤についても平成19年6月より4時間毎30分間の連続観測を継続的に実施している。観測は平成20年5月まで1年間行い,平成20年度に取り纏めを行う事とした。3.積雪期における道路交通障害シミュレーションシステムの開発建物倒壊と堆積雪の状況から,道路閉塞状況をシミュレーションするシステムを開発した。秋田市に適用した結果,積雪期地震時では閉塞率が3.5倍程度増加した。また,地震後の対応のために迂回を強いられる地域や孤立する地域もみられ,防災上問題を抱えている実態を抽出した。本研究は、積雪寒冷地の自然条件・社会条件を考慮した地震危険度評価システムを実現することが目的である。これまでに「積雪期の地震危険度評価に関わる関連資料の収集・整理」と「積雪期における道路交通障害シミュレーションシステム」が揃い、基盤となる仕組みを構築することができた。平成20年度は、実用性を検討するために、次の研究課題を遂行した。1.地震危険度総合評価システムの開発地盤に関するデータベースの補強を行うと共に、地盤情報、積雪期における建物(住宅)と道路の状況、避難場所や医療施設の情報を統合した地震危険度総合評価システムを開発した。シミュレーションを行う際は、地震時と積雪期地震時を選択することができ、結果は都市計画図上(1/2500)に表示される。また、道路閉塞率も自動で計算・表示できるようにした。さらに道路ネットワーク解析機能を追加することで、道路閉塞の影響で幹線道路からの車両の到達が不能となる道路や建物、避難場所等を抽出し、表示できるようにもなっている。2.市民・自治体を交えた地震危険度総合評価システムの啓発と検討秋田市都市整備部建築指導課と連携し、「自主防災学習会」、「積雪期の地震対策シンポジウム」等を実施することで、市民や自治体の職員を交えた地震危険度総合評価システムの啓発と検討を行った。

防災意識の高揚が図れた一方、過去に積雪期に発生した地震は非常に少なく、地震時の被害や対応、社会への影響について、既往の地震災害の理解をより深めたいとの要求が出された。また、耐震改修の優先順位を決定できるシステムに発展して欲しいとの要望も出た。
がんの悪性化に関与するTGF-βの標的遺伝子の研究

WNTのシグナル分子であるβ-cateninはc-mycの転写を亢進する。私達は、この転写活性化がc-myc遺伝子の転写調節領域内の新規TCF/LEF結合配列を介して起こることを同定し、この標的配列をTBE3と名付けた。また、TCFファミリーの転写因子のうち正常大腸上皮で発現しているTCF-4がTBE3に結合している時には、TGF-βシグナルによってTCF-4からβ-cateninが解離し転写活性が抑制されるが、大腸癌で高頻度に発現が亢進しているLEF-1が作用している時には、TGF-βシグナルによってLEF-1からβ-cateninが解離せず、c-mycの転写抑制が起こらないことを示した。この領域を介する転写活性は大腸癌細胞で亢進していた。さらに、TGF-βシグナルの異常は、増殖異常のみならず浸潤能の獲得にも関与することを遺伝子改変マウスをもちいて明らかにした。Apcヘテロ変異マウスは消化管に良性腺腫を多発する。一方、Smad2のヘテロ変異マウスには腫瘍の発生を認めなかった。しかし、Apcのヘテロ変異マウスとSmad2のヘテロ変異マウスを交配すると減数分裂時の交叉反応により、ApcとSmad2のシス複合ヘテロ変異マウスが約28%の割合で生まれてきた。これを利用して、Apcの欠失により腺腫が発生する際にSmad2を介するシグナルも同時に欠損するモデルマウスを作成した。このシス複合ヘテロ変異マウスでは、腫瘍の発生数、大きさ、消化管内の分布に、Apc単独の変異マウスと差がみられなかったが、Smad2の同時欠失によりApcの変異によって生じる大腸腺腫の組織異型度が増し、浸潤能を獲得することが示された。
マウス個体を利用したヒト免疫系の再構築

ヒト免疫機構とヒト由来癌細胞のせめぎ合いをマウス個体で再現することである。そのせめぎ合いを詳細に解析することにより、新規癌免疫システムを創出する事が期待される。それを達成するために、ヒト免疫系、特に癌細胞の排除に重要な役割を果たしているTリンパ球システムをマウスにおいて再構築する。
ナノ炭素材料を利用した水環境改善を目指したイオン除去・回収プロセス技術

従来の技術などでは除去・濃縮が困難な希薄なイオンを新規ナノ炭素材料を合成して、電気二重層吸着の原理を適応した除去プロセスの電極に用いることで極微量イオンの吸着・除去を試みた。本研究ではマイクロ孔より大きいメソ孔に着目し、メソ孔を制御したナノ炭素繊維を高密度で球状に合成し、合成した材料を電極に使用して希薄なセシウムイオンの吸着および脱着の性能評価を行った。極めて希薄な0.1mMのCsCl溶液でのCV測定による電気化学特性を評価した結果、およそ30nmのメソ孔をもつ球状ナノ炭素集合体では極めて希薄な条件にもかかわらず良好な電気二重層が形成され、希薄なイオンの除去・濃縮を行うことができた。水資源の開発、確保は地球環境保全にとって重要な問題である。近年の世界的な水不足や水質悪化の進行などにより、水環境の改善や維持がますます困難になってきている。我国で水資源の確保のため、排水基準値は厳しく規制され窒素やリンなどを含む富栄養化原因物質に対する規制、上水道中の鉛イオンなどの健康基準がより一層厳しくなることが予想される。また、近年では福島原発事故による極微量の放射性物セシウムイオンおよびストロンチウムイオンの除去が緊急の課題となっている。その他にも硬水の軟水化も重要な課題である。水中の硬度成分は、熱や濃縮により炭酸やケイ素と結合してスケールを生成し、日常生活においては水道管や住宅の排水管などの劣化を速めたり、洗濯機などの家電の寿命や効率を著しく低下させ、産業界では、ボイラーや熱交換器に付着したスケールが熱交換率を悪化させるなどの問題がある。従来から、これらの除去対策として、イオン交換、逆浸透膜、活性炭素吸着法などが採用されている。樹脂や吸着剤などの表面と被吸着物質間に作用する分子間引力、静電引力などにより、イオンや有機化合物を選択的に補足する。しかし、廃水中に含まれる鉛、銅、亜鉛、カドミウム、クロム、水銀、砒素などの重金属類の除去、とりわけ希薄水溶液中に存在するppmレベルやそれ以下のセシウム、ストロンチウムなどに対しては、従来法では有効に除去できない課題がある。本研究ではメソ孔性ナノ炭素材料を合成して電極に用い、従来の物理吸着、イオン交換、膜分離、凝集沈殿法などでは除去が困難な希薄な各種イオンを、電気二重層吸着の原理を適応した除去プロセスで水質の環境改善を目的とする。今年度は化学工学的手法を用いてナノ炭素繊維を合成し、それを電気二重層吸着の電極として使用して硬水の軟水化、セシウムイオン、ストロンチウムイオンなどのppm以下の極微量イオンの除去を行った。世界的に水資源の開発、確保は地球環境保全にとって重要な問題である。また、近年では福島原発事故による極微量の放射性セシウムイオンおよびストロンチウムイオンなどの除去が緊急の課題となっている。水中の硬度成分は、熱や濃縮により炭酸やケイ素と結合してスケールを生し、日常生活においては水道管や住宅の排水管などの劣化を速めたり、洗濯機などの家電の寿命や効率を著しく低下させ、産業界では、ボイラーや熱交換器に付着したスケールが熱交換率を悪化させるなどの問題がある。しかし、廃水中に含まれる鉛、銅、亜鉛、カドミウム、クロム、水銀、砒素などの重金属類の除去、とりわけ希薄水溶液中に存在するppmレベルやそれ以下のイオンなどに対しては、従来法では有効に除去できない課題がある。本研究ではメソ孔性ナノ炭素材料を合成して電極に用い、従来の物理吸着、イオン換、膜分離、凝集沈殿法などでは除去が困難な希薄な各種イオンを、電気二重層吸着の原理を適応した除去プロセスで水質の環境改善を目的とする。今年度はメソ孔性ナノ炭素繊維を合成し、それを電気二重層吸着の電極として使用し、セシウムイオン、ストロンチウムイオンなどの極微量イオンの除去を行った。従来から使用されているマイクロ孔性活性炭によるイオン除去は、電気二重層吸着において特に希薄溶液中ではマイクロ孔内でのイオンの二重層重なり効果などにより良好な電気二重層が形成できない為、ほとんど無力である。そのため、マイクロ孔性の炭素材料に代わる細孔が大きいメソ孔性の新しいナノ炭素材料の開発が急務である。本研究ではメソ孔性ナノ炭素繊維を合成するため、表面酸化ダイヤモンドに金属を担持した触媒を調製した。効率的にナノ炭素繊維を合成するため化学工学的手法を用いて横型回転式流動層反応装置を使用して上述の触媒による炭化水素の接触分解によるメソ孔性炭素繊維の合成を行った。合成したナノ炭素材料はメソ孔を有するナノ炭素繊維が球状に高密度に凝集したマリモナノカーボンが得られた。

このマリモナノカーボンを電気二重層吸着による希薄溶液中のCsイオン、Srイオン除去実験に電極材として使用したところ、比較試料として一般的に使用されているマイクロ孔性の活性炭よりも、理想的な電気二重層吸着特性を示した。さらに流通式除去実験においても活性炭よりも高い除去率を示した。メソ孔性炭素材料は希薄溶液中のイオン除去に有効であることが確認できた。電気二重層吸着の原理を適応した新規希薄イオンの除去プロセスの開発を目的として新規ナノ炭素材料を合成して電極に用い、従来の物理吸着、イオン交換、膜分離、凝集沈殿法などでは除去が困難な極微量のセシウムイオンの吸着・除去を検討した。一般的に希薄水溶液中に存在するppmレベルやそれ以下のセシウムに対しては、活性炭などのマイクロ孔性材料は単なる表面へのイオン吸着が支配的であるため有効に除去できない。また、電気二重層吸着においても特に希薄溶液中ではマイクロ孔内でのイオンの二重層重なり効果などにより良好な電気二重層が形成できない。そこで本研究ではマイクロ孔より大きいメソ孔に着目し、ナノ炭素繊維であるカーボンナノフィラメント(CNF)を高密度で球状にして、繊維間にメソサイズの空隙を持つ炭素材料を合成した。この球状ナノ炭素集合体の合成時に金属担持率を変えることで細孔サイズの制御を試みた。合成した球状ナノ炭素材料を電極に使用し、希薄なセシウムイオンの吸着および脱着の性能評価を行った。ナノ炭素合成時の触媒量を変えることで630nmの範囲でメソ孔を制御したカーボンナノフィラメントの選択合成に成功した。また、各種炭素材料を用いて極めて希薄な0.1mMのCsCl溶液でのCV測定による電気化学特性の評価した結果、マイクロ孔性の活性炭では電気二重層は形成できなかった。一方、およそ30nmのメソ孔をもつ球状ナノ炭素集合体では極めて希薄な条件にもかかわらず良好な電気二重層が形成され、希薄なイオンの除去・濃縮を行うことができた。一般的に水溶液の濃度が希薄になるほど電気二重層における拡散層の厚みは増すとされており、0.1mMの濃度における拡散層の厚みは約30nmであるため、球状ナノ炭素集合体では電気二重層形成に必要な空間を十分に確保できたため、良好な電気二重層を形成することができたと考えられる。従来の技術などでは除去・濃縮が困難な希薄なイオンを新規ナノ炭素材料を合成して、電気二重層吸着の原理を適応した除去プロセスの電極に用いることで極微量イオンの吸着・除去を試みた。本研究ではマイクロ孔より大きいメソ孔に着目し、メソ孔を制御したナノ炭素繊維を高密度で球状に合成し、合成した材料を電極に使用して希薄なセシウムイオンの吸着および脱着の性能評価を行った。極めて希薄な0.1mMのCsCl溶液でのCV測定による電気化学特性を評価した結果、およそ30nmのメソ孔をもつ球状ナノ炭素集合体では極めて希薄な条件にもかかわらず良好な電気二重層が形成され、希薄なイオンの除去・濃縮を行うことができた。従来から使用されているマイクロ孔性活性炭によるイオン除去は、電気二重層吸着において特に希薄溶液中ではマイクロ孔内でのイオンの二重層重なり効果などにより良好な電気二重層が形成できない為、ほとんど無力である。そのため、マイクロ孔性の炭素材料に代わるメソ孔性の新しいナノ炭素材料の開発が急務である。本研究ではナノ炭素を合成するため、ダイヤモンド表面へNi金属を担持した触媒を調製した。効率的にナノ炭素繊維を合成するため化学工学的手法を用いて横型回転式流動層反応装置を使用して上述の触媒によるエチレンの接触分解を行いメソ孔性炭素繊維の合成を行った。
ベイズ法を利用した多変量推測統計の新たなる理論展開と応用に関する研究

本研究は,高次元モデルの解析のような多変量推測統計の現代的な諸問題について,事前情報を利用するベイズ流の推測手法を中心に扱い,統計的決定理論の観点からの最適性をもつベイズ推定法や縮小推定法の開発と応用についての研究を目的としている。また,現代的な問題と古典的な推測問題との統計学的・数学的な関連性の解明や,現代的・古典的な推測理論における未解決問題の検討についての議論も本研究の目標としている。今年度は,独立変数に測定誤差を含む線形回帰モデルにおいて回帰係数や切片パラメーターの推定問題を中心に扱い,いくつかの成果が得られた。具体的には,まず,平均2乗誤差をリスク関数としたときの許容的推定量の導出に成功したことが挙げられる。この導出には,ある事前分布に関する事後平均について,リスクの有限性を示すことから接近した。研究成果の2つ目は,ある推定量の族に関する平均2乗誤差の改良である。最小2乗推定量を含む広い推定量の族を考え,この推定量の族について平均2乗誤差の基準の下で改良する方法を統一的に確立することができた。上記以外の成果としては,測定誤差モデルにおける最小2乗推定量のバイアスを補正する方法を考案したことが挙げられる。測定誤差を伴う線形回帰モデルでの推定問題は最尤推定法に関連した議論が多いが,最尤推定量は有限な積率を持たず,バイアスや平均2乗誤差についての議論ができない。そこで,積率が存在する最小2乗推定量に着目し,その構造に明らかにして,マクローリン展開を利用したバイアスの改良を考えた。高次のバイアス補正についても成功しており,最尤法のような大標本を前提にした手法では難しい,小標本の下での推定精度の改良法について提案することができた。いくつかの推定問題において,決定理論的な最適性をもつ新たな推定量の導出や,既存の推定手法の改良に成功している。また,これらの成果から新たな問題点も確認されており,研究の方向性について示唆が得られたと考えている。研究がおおむね順調に進んでいるため,当初の計画に沿って,引き続き研究を進めていく予定である。具体的には,高次元正規分布モデルに関連する新たなベイズ推定法や縮小推定法の開発及び拡張,非正規や非正則モデルのような複雑な統計モデルに関する推定手法の考案などの問題に挑戦する予定である。また,考案された推定手法について,シミュレーションによる数値的な検討や,実際のデータ分析への応用などの課題にも取り組んでいきたいと考えている。海外の書店から購入予定の書籍が前年度中に届かなかったため。次年度使用額分は,翌年度にその書籍の購入費にあてる予定である。
書写教育研究のためのパソコンによる字形評価の基礎システム

本研究は、書写教育の個別化・客観化を将来的な目標として、具体的には以下のように、字形の評価の客観化を目指したものであった。1.これまで大型計算機・ワークステーション等の大型で移動できない実験的環境でおこなってきた字形の測定・評価の計算を小型で可搬型のパソコン上でおこなうための、抽出すべき字形特徴の洗い出しとソフトウェアの検討およびそのプログラミング。2.これまで計算機の使用に熟達した者でないと入力・操作が難しかった部分に関して、分かりやすいメニュー選択形式とするなど、書写に即したマンマシンインターフェイスの検討とそのプログラミング。具体的な手順としては、小システム化に適する洗いなおしと、現実の書写に即した操作入力方法に関する検討。システムの該当部分の構成に関する考察および小容量化の為の検討、プログラミングといった作業。以上によって構成されたシステムを一般教員や生徒に使用してもらい、その結果としての使用に関する感想等および字形測定評価結果をフィードバックし、検討。となる。このうち、ワークステーション等で行っていた処理のうち主な処理を化搬型のパソコンにより処理できるよう内容の精選とそのプログラミングを達成できた。ただし、実際に一般教員や生徒による仕様とフィードバックの段階には、時間的な制約のため、至らなかった。したがって、上記2の項目については、研究を継続していく必要がある。今後は、評価内容の向上と同時に、一般教員等を対象に書写に即した利用しやすいシステム化をはかりたい。となる。
極微細SiドットPN接合素子の作製と擬一次元量子効果の解明

本研究は、極微細SiドットPN接合素子の作製とその擬一次元量子効果の解明を目的に行われた。まず、極微細細線の無損傷加工に対して、原子層デジタルエッチングを確立するための基礎となるフッ素(F)と水素終端Si(111)の表面反応をFTIR-ATR/XPS結合システムによるin-situ観察で研究した。F原子の暴露初期では、終端水素と反応除去せずにSiの最表面に侵入し、極く初期では、原子状として存在し、より多い曝露でSiF結合を5配位状態で形成することが判明した。しかし、より多い曝露では、Siは自発的にエッチングされた。そこで、低反応性のF_2分子の曝露を水素終端Si(111)に行った。その結果、F_2曝露がF_2:10^5L10^7Lの広範囲で反応が自己停止し、表面が1原子層のSiF_1層を形成することが発見された。次に直径の10nm以下のSiドットへのpn接合形成にイオン注入を用いる際に誘起される結晶欠陥をTEMで調べた。AsとBF_2イオン注入の両方のSi柱に対して、{111}面に平行な転位が、BF_2の高ド-ズ注入では、マイクロ双晶が観察された。直径が20nmより微細なSiドットの場合は、欠陥は誘起されなかった。この原因は、アニール中に極微細Siドット柱から欠陥が表面やSi/SiO_2界面に拡散して行くためと推察される。最後に、二重ゲートMOS細線、及びSIMOX基板等を用いたSOI細線を製作した。MOS細線においては、サイドゲート電圧の変化に対して、4.2Kにてクーロンブロケッドによるコンダクタンス振動を観測した。SOI細線、MOS細線の両方において、磁気抵抗測定により線幅の大きい場合には干渉効果による負の磁気抵抗を、また十分に細い場合にはホッピング伝導による正の磁気抵抗を観測した。また直接加工SOI細線を利用して微細PN接合を形成し、室温、2.5Vにて大きな負性抵抗を観測した。Siデジタルエッチングにおける自己停止反応を探求すべくF(フッ素)ラジカルをSi(100)表面に照射し、その反応を赤外反射吸収分光で研究した。まず、表面反応層の形成過程を基板温度を変えて調べたが、200Kでも徐々にではあるがエッチング反応が進行した。次に、140KでFラジカルを照射したところ、F/Si反応の進行が見られず、ラジカルの凝縮層と思われる吸収のみが観測された。そして、この表面を加熱していくと、200Kでこの層は気化し、でSiF_2,SiF_1の吸収が現れ、常温程度まではこれらの吸収強度は変化しなかった。このことは、FがSiの最上層原子とのみ反応し、F/Si系で自己停止反応が初めて見つけ出されたことを示唆しており、このSiF_2/SiF_1終端層の層毎の除去で、Siの原子層デジタルエッチングの実現が期待される。微細PN接合作成においては、Si基板を垂直エッチングで作成した微細柱を利用した縦方向PN接合と、SOI基板に形成した細線を利用した横方向PN接合の二通りで比較検討した。いずれも電子ビーム描画とドライエッチングにより最小直径100nm程度のパターンを形成した後、さらに熱酸化によりシリコンを細線化した。縦方向

PN接合にて透過電子顕微鏡観察により酸化及びイオン注入による損傷評価を行ったところ、熱酸化による損傷は特になく、また高濃度にAsを注入したSi柱において直径20nm以下では転位等の損傷が熱処理後に回復することが明らかとなった。0.1μm径縦方向PN接合にて選択CVDによりAl電極を形成し、これに金を表面コートしたAFMカンチレバーをプローブとして室温で電気特性を測定し、良好な整流特性を得た。また横方向PN接合作成の前段階としてSi細線を作成し低温磁気抵抗測定を行ったところ、低次元伝導特性を確認した。前年より引続き、(1)デジタルエッチングのためのフッ素(F)/Si単原子層反応と、(2)擬一次元細線pn接合形成の研究を行った。(1)RAS(反射吸収分光)とXPS(X線光電子分光)の結合システムを作製し、F原子と水素終端Si(111)表面との常温での反応をin-situ測定した。その過程で、F原子暴露量と共にSi-Hは5000Lまで減少して飽和するが、F原子はその間はSiと反応せず5000Lから急にSi-F1結合が形成すること分かった。そこでSi-H(2083cm^<-1>)をATR(減衰全反射)で調べたところ、F暴露と共にSi-Hの高波数側に、FがSiの格子間に入ったために生じたと考えられる新たなSi-H伸縮が現われ、水素がSiFHとして除去されたと考えられる。25000KまではSi-F1結合が飽和するが、これは自己停止反応なのか、原子層毎の除去かは現在は分からない。(2)擬一次元細線は、まずSIMOX基板を0.1μm程度のSi層に、EB描画及びRIEによりSi細線を形成し、下地SiO2を除去して細線を宙に浮かせ、熱酸化によりSi細線を細らせた。この細線に高濃度n型形成とPN接合形成の二種を作製した。線幅の異なる二種類の細線について4.2Kでの磁気抵抗を比較したところ、幅5μm、長さ5μmの細線では、弱極在を反映すると思われる明瞭な負の磁気抵抗が観察され、また幅0.24μm、長さ0.4μmの細線では、弱磁場では弱い正の磁気抵抗が観察された。一方、線幅50nmの微細PN接合の室温でのI-V特性の測定では、2.5V以上では発振が起き、明らかな負性抵抗特性を示してた。また、線幅120nmの細線PN接合の100KでのI-V特性では。0.45V付近、および0.9V付近にテラスが現われており、複雑な屈曲を示しているが、この理由はまだ十分明らかではない。なお微細PN接合に関しては提案した微細Si柱も並行して検討していく。本研究の最終年度として、当初の目的を果たすべく以下の3研究を行った。(1)デジタルエッチングにおける自己停止反応を確立するため、前年度に引続き、XeF_2の昇華で生じたフッ素(F)原子/水素終端Si(111)表面反応のFTIR/ATR-XPS観察から反応機構研究を行い、次の重要な知見を得た。F原子は少量暴露では、終端水素はF原子との反応で除去されず、Si(111)の最上層(subsurface)のセル中に単体として存在し、その半分は原子状で存在し、他の半分はH-Si結合の背後からSiと結合する。更にフッ素暴露ではSi-Fx(X=1-3)の高次反応によりエッチングが起こる。しかし次にF_2分子を水素終端Si(111)表面に暴露した所、10^5Lでは水素が全て除去されてもSiは最表層しかフッ化されず、Si-Fで終端されていることが分り、自己停止反応が起こったと考えられる。(2)微細SiドットへのPN接合形成で不可欠なイオン注入で懸念される結晶欠陥をTEMで調べた。
飽和炭素骨格上の任意の位置の炭素原子の同位体比を測定するための基礎的技術の開発

本研究の目的は、「熱分解型の前処理装置」を備えた軽元素用同位体質量分析計において、有機化合物の熱分解により発生するCO分子が、試料中に含まれる水酸基などの含酸素官能基中のOと、それに隣接するCに由来する、という原理に着目した、新しい分子内同位体比分布の測定法の開発にある。今年度は、分子内に複数のOH基やメトキシル基を持つセルロースおよびリグニンに着目し、その炭素同位体比を実際に同装置で測定して、その同位体比を従来の「燃焼型の前処理装置」を備えた質量分析計で測定した炭素同位体比と比べることで、分子内炭素同位体比の測定可能性の検討を続けた。また、その成果を実際の試料に応用するため、北海道内の異なる環境条件からなる日本海側と太平洋側の各所、および中国の乾燥地域など、様々なフィールドで採取された樹木年輪試料から、セルロースやリグニンを抽出し、その炭素同位体比を、酸素・水素同位体比と共に熱分解型および燃焼型の両前処理装置を装備した質量分析計にて測定した。その結果を、気温、降水量などの気候要素の時系列データと相関解析することにより、セルロース等の持つ炭素同位体比が、酸素・水素同位体比と共に、樹木の生息環境の中の様々な気候因子の経年的変動に対応して、規則的に変化していることが明らかとなった。熱分解-同位体質量分析計を用いて、有機分子の炭素・酸素・水素同位体比を計測することにより、このように、さまざまな環境情報が得られることが示された。本研究の目的は、近年開発された「熱分解型の前処理装置」を備えた軽元素の同位体質量分析計において、熱分解により発生する一酸化炭素分子(CO分子)が、元々の試料有機化合物の中に含まれる水酸基(OH基)などの含酸素官能基のみに由来する、という特徴に着目した、新しい分子内同位体比分布の測定法の開発である。つまり、発生するCO分子の炭素同位体比を測定することで、有機分子中の特定の位置(この場合はOH基の結合した部位)の炭素同位体比が測定できる可能性がある。飽和炭素骨格上の任意の炭素原子を測定対象とするためには、飽和炭素の任意の位置にOH基を導入して、それを熱分解-同位体比質量分析計に供することが必要であるが、今年度は、まずその準備として、既に分子内にOH基が存在している分子の炭素同位体比を、実際に同装置で測定し、その同位体比と旧来の「燃焼型の前処理装置」を備えた質量分析計で測定した炭素同位体比(これは、分子内の全炭素の同位体比の平均値に相当する)とを比べることで、分子内炭素同位体比の測定の可能性を検討した。測定に用いた分子は、セルロースである。セルロースの炭素の多くは、OH基と結合しているが、セルロース中の酸素原子に対して、炭素原子は、1つ余分に存在しており、この差が両方法による炭素同位体比の測定の差となって現れることが予想できた。2つの方法によって測定されたセルロースの炭素同位体比は、互いに高い正の相関を持つものの、その勾配は1ではなく、またサンプルによって、相関直線から系統的に外れるものが多いことが分かった。これらのことにより、両方法を組み合わせることで、試料(この場合はセルロース)毎の分子内炭素同位体比分布を計算できる可能性が、明らかとなった。本研究の目的は、「熱分解型の前処理装置」を備えた軽元素用同位体質量分析計において、熱分解により発生する一酸化炭素分子が、試料有機化合物の中に含まれる水酸基などの含酸素官能基とその隣接炭素原子のみに由来する、という原理に着目した、新しい分子内同位体比分布の測定法の開発にある。昨年度は、この原理の確認のため、分子内に既にOH基が存在しているセルロースに着目し、その炭素同位体比を実際に同装置で測定して、その同位体比を従来の「燃焼型の前処理装置」を備えた質量分析計で測定した炭素同位体比と比べることで、分子内炭素同位体比の測定の可能性を検討した。本年度は、その成果をフィールドにおける実際の試料に応用するため、北海道内の各所、ロシア・カムチャッカ半島、インドネシアなどのさまざまな環境下で採取された樹木年輪の試料からセルロース分子を抽出し、その炭素同位体比を、酸素・水素同位体比と共に、熱分解型および燃焼型の両前処理装置を装備した質量分析計にて測定した。その結果、セルロース分子の持つ炭素同位体比が、酸素・水素同位体比と共に、樹木の生息環境の中の相対湿度や気温、降水量などの様々な気候因子の経年的・地理的分布に対応して、規則的に変化していることが明らかとなった。

今年度は、分子内に複数のOH基やメトキシル基を持つセルロースおよびリグニンに着目し、その炭素同位体比を実際に同装置で測定して、その同位体比を従来の「燃焼型の前処理装置」を備えた質量分析計で測定した炭素同位体比と比べることで、分子内炭素同位体比の測定可能性の検討を続けた。また、その成果を実際の試料に応用するため、北海道内の異なる環境条件からなる日本海側と太平洋側の各所、および中国の乾燥地域など、様々なフィールドで採取された樹木年輪試料から、セルロースやリグニンを抽出し、その炭素同位体比を、酸素・水素同位体比と共に熱分解型および燃焼型の両前処理装置を装備した質量分析計にて測定した。その結果を、気温、降水量などの気候要素の時系列データと相関解析することにより、セルロース等の持つ炭素同位体比が、酸素・水素同位体比と共に、樹木の生息環境の中の様々な気候因子の経年的変動に対応して、規則的に変化していることが明らかとなった。熱分解-同位体質量分析計を用いて、有機分子の炭素・酸素・水素同位体比を計測することにより、このように、さまざまな環境情報が得られることが示された。
二次元電気泳動法による乳癌におけるゲノム解析とその臨床的意義

乳癌切除検体の癌部と非癌部から全ゲノムを抽出し、二次元電気泳動法を施行した。癌部と非癌部のスポット変化に着目し、特徴的な変化を示す十数個のスポットについてクローニングを行った。その結果、2つのスポットがGrowth factor receptor binding protein 7(Grb7)遺伝子、ならびにvoltage-dependent calciumchannel遺伝子に一致した。二次元電気泳動法におけるスポット変化は、ゲノムの点突然変異、あるいはメチル化などを反映するものであり、遺伝子領域にそのような変化が起きた場合、遺伝子の発現、欠失に直接関与する可能性がある。このうち前者は文献的にも細胞内のtyrosine kinaseとの関与が知られており、上皮増殖因子に1つであるerbB2との関連も示唆されている。そこで、これらの遺伝子の発現について、乳癌細胞株MCF-7,MDA-MB231,MDA-MB435,T47D, BT20,SKBR3を対象に、RNAを抽出し、RT-PCR法で検討した。この結果、Grb7については、MCF-7,MDA-MB231,MDA-MB435では発現を認めたものの、T47D, BT20,SKBR3では発現を認めなかった。ErbB2陰性のMDA-MB-231でもGrb7の発現が認められたことから、erbB2とGrb7は必ずしも同時発現するとは限らないということが判明した。次に、voltage-dependent calcium channelについては、MCF-7,MDA-MB-435で発現を認めたものの、MDA-MB-231,T47D, BT20,SKBR3では発現を認めなかった。その結果、2つのスポットがGrowthfactor receptor binding Protein 7(Grb7)遺伝子、ならびに5-hydroxytryptamine 6(5-HT6)遺伝子に一致した。この結果、5-HT6については、すべての細胞株で発現を認めなかった。次に、Grb7については、MCF-7,MDA-MB231,MDA-MB435では発現を認めたものの、T47D, BT20, SKBR3では発現を認めなかった。つづいて、遺伝子発現の変化がメチル化によるものか、あるいは他の変異によるかを検討するため、細胞株に脱メチル化を誘導する薬剤である5-aza-2'-deoxycytidineによる処理を加え、同様にRNAを抽出、RT-PCR法により遺伝子変化を検討した。この結果、5-HT6,Grb7ともに遺伝子発現に薬剤処理による変化は認められず、5-HT6,あるいはGrb7の遺伝子発現の調節はメチル化ではなく、他の要因によるものと考えられた。
内分泌攪乱物質のクリティカルウインドウ曝露による発生影響の精査

研究者らは,ナノ秒,数キロボルトの高電界パルスをメダカ卵に印加することでメダカ卵膜の物質透過性を一時的に高め,容易に物質を導入する新技術を開発した.女性ホルモンであるエストロゲン(E2),E2様作用が疑われるビスフェノールA(BPA)およびビスフェノールS (BPS)等を導入し発生を観察したところ,濃度依存的に胚体,心臓,血球や血管の形成異常,孵化後の遊泳異常や骨格の奇形が見られた.また,DNAマイクロアレイにより各物質を導入したメダカ卵の遺伝子発現解析を行ったところ,各物質特異的に発現変動しており,特異的な形態異常や発生毒性に関連していると考えられる遺伝子群が検出できた.幼若生物に対する影響が懸念されているビスフェノールA(BPA)と環境中から多く検出されるビスフェノールS(BPS)を高電界パルスを用いてメダカ受精卵に導入し,その影響を観察した.未処理コントロール群の生存率は100%で,形態異常発生率は8.3%であった.パルス印加群は未処理コントロール群と同様に成長し,生存率,形態異常発生率はコントロールとほぼ同等で,パルス印加による影響はほとんどないと考えられた.BPAまたはBPSにつけただけの群も未処理コントロール群と同様に成長し,生存率,形態異常発生率は未処理コントロールと同等で,BPAまたはBPSにつけただけではメダカ卵の成長に影響を与えなかった.一方,パルス印加によりBPAまたはBPSを導入した群は,1日目に胚体ができ体が形成されていくが,4日目以降心臓はできても,血球と血管がほとんどできないものが現われた.5, 50 nMBPA暴露群の生存率はそれぞれ91.7,90 %であったたが,21.8, 31.5%にこのような形態異常がみられ,暴露濃度依存的に形態異常発生率が上昇する傾向が見られた.BPAはメダカ初期胚に毒性をほとんど示さない濃度で形態異常を発生させたことから, BPAの初期発生期の生物に対する影響を詳細に調査する必要があることが示唆された.BPS暴露群は低濃度側では影響が見られなかったため,BPAより高い濃度で暴露を行った.50, 500 μMBPS暴露群の生存率は84.4,80.2%であったが,形態異常発生率は13.6,16.9%であった.BPSはメダカ初期胚に形態異常を引き起こすが,細胞毒性のほうをより強く示し,BPAとBPSのメダカ初期胚に対する毒性の表れ方の傾向が異なることが観察できた.また,BPA, BPS暴露したメダカ卵のマイクロアレイ解析を行い,各群で発現量が変動している遺伝子を検出できた.研究者らは,ナノ秒,数キロボルトの高電界パルスをメダカ卵に印加することでメダカ卵膜の物質透過性を一時的に高め,容易に物質を導入する新技術を開発した.女性ホルモンであるエストロゲン(E2),E2様作用が疑われるビスフェノールA(BPA)およびビスフェノールS (BPS)等を導入し発生を観察したところ,濃度依存的に胚体,心臓,血球や血管の形成異常,孵化後の遊泳異常や骨格の奇形が見られた.また,DNAマイクロアレイにより各物質を導入したメダカ卵の遺伝子発現解析を行ったところ,各物質特異的に発現変動しており,特異的な形態異常や発生毒性に関連していると考えられる遺伝子群が検出できた.初年度はまずパルス波形を改良した.これまで物質導入のモデルとして用いていたタンパク合成阻害剤シクロヘキシミド(CX)を各種濃度に希釈し導入を試みたところ,これまでの2分の1の濃度のCXで,ほぼ100%のメダカ卵に成長の遅延が見られた.また,成長遅延の度合いも改良前よりも大きくなっており,改良前パルスによりCX導入したものは成長遅延が見られながらも7日以上生存するものが多かったが,改良パルスを用いるとCX導入後3,4時間後にほとんどのものが死亡したことからCX導入量効率が大幅に高くなったと考えられる.さらに,この改良後パルスを用いてメダカ卵のビスフェノールA(BPA)暴露を行った.受精直後のメダカ卵にBPAまたはE2をパルス印加により導入し,最小限の数のメダカ卵で解析を行うためにパルス印加後6日目まで培養した.メダカ卵6個をn=1とし,初期発生段階に発現している遺伝子を搭載したDNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行った.その結果,E2, BPAに共通して発現変動している遺伝子があり,これらは化学物質のE2様作用のマーカーとなると考えられる.また,E2またはBPA暴露でそれぞれ特有に発現変動している遺伝子があることが分かった.各遺伝子の機能および各遺伝子群の関連については現在調査中であるが,これらを手掛かりに今後BPAの初期発生影響を行うことを計画している.さらに研究協力者の研究により,改良パルスによりBPAを導入したメダカ卵400個からBPAの抽出を行い, LC-MSによりメダカ卵内に導入されたBPAの定量を行ったところ,非常に効率的にBPAがメダカ卵内に導入されていることが確認されており,導入を試みる物質の親水性,疎水性,電荷の状態等によりメダカ卵内への取り込み量が異なることも考えられる.外部刺激に対する防御機構が備わっていない初期発生期の生物は,化学物質等の暴露により成体より深刻な影響をうける可能性があることから,幼若生物を用いて詳細に初期発生影響を調査する必要がある.

卵性生物のメダカは低コストで容易に飼育でき,母体外で受精,発生し卵膜が透明であるため観察が容易であることから初期発生影響評価のモデルとして有望であるが,卵膜が固く外部から物質を取り込ませることが難しい.研究者らは,ナノ秒という極短時間に数キロボルトの高電界パルスをメダカ卵に印加することでメダカ卵膜の物質透過性を一時的に高め,外部から容易に物質を導入する方法を新規に開発した.メダカ受精卵に女性ホルモンであるエストロゲン(E2)を導入し発生を観察したところ,E2濃度依存的に骨格や胚体の形成異常や心臓・血管の形成の遅れや異常が見られたほか,孵化後に遊泳異常が見られるものもあらわれた.E2様作用および初期発生期の暴露と行動異常との関連が懸念されているビスフェノールA(BPA)および環境中から多く検出される類縁化合物ビスフェノールS (BPS),を同様の方法でメダカ卵に暴露したところ,BPA暴露群でメダカ初期胚に急性毒性を示さない濃度で心臓,血球や血管の形態異常や遅延が見られた.BPS暴露群もBPAと同様の形態異常が見られたが,BPS暴露群はBPA暴露群より死亡率が高くBPSは細胞毒性をより強く示し,物質特異的な影響が観察できた.また,DNAマイクロアレイによりE2,BPA,BPS,成熟メダカに対する急性毒性が高いビスフェノールCやビスフェノールAF,震災の影響による海洋汚染が問題となっているベンゾピレンやフェナントレンを導入したメダカ卵の遺伝子発現解析を行ったところ,各物質特異的に発現変動しており,特異的な形態異常や細胞毒性に関連していると考えられる遺伝子群が検出でき,初期発生期の生物に対する化学物質の影響解明に貢献できる結果が得られた.環境科学本年度は,昨年度行ったBPAの初期発生影響評価に続き,環境中から広範囲に検出されるBPS,エストロゲン受容体ERαおよびERβへの作用が異なることが報告されているビスフェノールAF (BPAF),メダカ成魚への急性毒性が高いビスフェノールC (BPC)および女性ホルモンのエストラジオール17-β(E2)をメダカ初期胚に暴露し,経過観察を行うとともに,各暴露群のマイクロアレイ解析を行った.形態観察の結果,BPA暴露群は血管形成の遅延,心臓肥大が見られるものが現われ,BPA暴露濃度依存的にこのような形態異常発生率は上昇する傾向が見られた.また,この他のビスフェノール類およびE2暴露群の形態異常発生率,形態異常の種類についても確認した.さらに,E2と共通して発現量が変動している遺伝子群および各ビスフェノール類特異的に発現変動している遺伝子群を検出できたことから,ほぼ最終年度の計画を終えた状態である.そこで本年度は機器の故障が原因で順序を変更した初年度分の計画を進めることにしている.初年度は当初の計画にはなかったが,最初に本研究課題の要となる部分である物質導入の際のパルス波形の改良を行った.物質導入を大幅に高効率化できたことから,以降の実験をより効果的に行うことができるようになった.24年度の計画ではメダカ受精卵のエストロゲン受容体(ER)サブタイプの分布の経時変化を調査することを計画し,プライマーの設計,測定条件の検討などを行っていたが,リアルタイムPCRの不調から修理が必要な状態となり当初の計画を変更せざるをえなかった.また,研究協力者によりメダカ受精卵へのBPA導入量の定量が行われているので,本来は25年度以降に行う計画であったBPA暴露を前倒しして行うこととし,改良パルスによりメダカ受精卵へBPAまたはE2を導入し,ごく初期に暴露される影響を調査した.受精直後のBPAまたはE2暴露により多数の遺伝子の発現変動が見られ,これらは今後発生影響評価の対象となり,各遺伝子の機能を調査することで研究の新たな展開も考えられることから,当初の計画とは少し異なるが意義の高い結果が得られたと考えている.