hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者の転倒による大転子骨折予防のためのエアバッグ式ヒッププロテクターの開発

本研究では大転子及び仙骨を保護するエアバッグ式ヒッププロテクターを開発することを目的とした。最終年度では、エアバッグトリガー閾値および、転倒方向と外傷の関係について検討した。まず、エアバッグ開放のトリガーとして腰部加速度の有効性を検証するために、不安定台からの前後および左右方向の転倒動作時の3次元腰部加速度(右大転子部)を計測した。いずれの転倒方向の最大加速度、最大振幅とも同程度の値を示した。また、各転倒方向のx,y,およびz軸の加速度間の相関はいずれも有意であった(最大加速度:r=0.56-0.78,最大振幅:r=0.57-0.84,p<0.05)。T字台牽引時に転倒したケースと代償的ステップにより転倒を回避したケースの加速度を比較した結果、転倒したケースの加速度が大きい傾向にあった。しかし、前方向の場合、加速度に顕著な差は認められなかった。現在、設計しているエアバッグ式ヒッププロテクターはエアバッグ開放までに約0.2秒要するため、開放トリガーはそれより前に転倒を感知しなければならない。各転倒方向において、x,y,z軸のいずれかの最大加速度もしくは最大振幅のなかで最も早く出現するものを採用していくと着床前0.4300.775秒の間であることが確認され、最大加速度、最大振幅はエアバッグ開放のトリガーとなりうることが示唆された。しかしながら、転倒時の最大加速度や最大振幅は個人差が大きく、開放閾値の設定にはさらなる検証が必要と判断された。次に、在宅高齢者1955名を対象に転倒発生時の外傷の有無と転倒方向について調査した。過去1年間で転倒した高齢者は386名(20.9%)で、そのうち257名(66.6%)が何らかの外傷を負い、37名(9.6%)が骨折した。転倒による外傷の有無と転倒の原因および転倒した方向に関する度数に有意差は認められなかった。一方で、転倒の方向と転倒の原因および外傷部位間に有意な関係が認められ(ψ=0.49と0.32)、骨折は側方の転倒において多く発生する傾向にあった。したがって、エアバッグ式ヒッピプロテクターは側方の転倒に対する防御を重視する必要性が示唆された。本研究では大転子及び仙骨を保護するエアバッグ式ヒッププロテクターを開発することを目的としている。本年度は,転倒時の動作特性を明らかにすることを目的として,静止立位姿勢,及び歩行において人為的に与えた転倒誘発から発生までの動作解析を行った。歩行時の転倒は,歩行中の遊脚期に足関節をひっかけて転倒を誘発させた。また,静止立位時の転倒は,台上で前方,側方,及び後方にて立位姿勢を維持し,台車を水平上に移動させ,マットに衝突させ,衝突時の慣性力で転倒を誘発させた。両実験とも,転倒を誘発するため若年男性を対象に実施した。転倒のきっかけから発生までの動作を三次元動作解析器(MA-2000,ANIMA)により測定した。この機器による測定データはサンプリング周波数60Hzにてコンピュータに保存された。動作解析の観点は以下の3点である。1)立位,歩行からの転倒はいかなる動作過程となり,着床の仕方はいかなるものであるか。2)転倒のきっかけから身体が着床するまでの時間はどの程度か。3)転倒のきっかけから身体が着床するまでにエアバッグ開放のトリガーとなる動作は存在するか。現在,すべての測定が終了し,動作解析中である。この検証により,各種転倒のきっかけに対して,エアバッグトリガーとなる動作,エアバッグ開放までのリミット時間,プロテクトすべき部位などを明らかにし,エアバッグの具体的設計の基礎資料とする。また,エアバッグ試作品製作を委託する企業を選定し,構想や設計の実現可能性について打ち合わせを進めている。本年度は、まず昨年度実施した転倒誘発局面の動作解析を実施し、転倒動作特性を明らかにした。動作特性として、腰より上部の動作が転倒時に特徴的な動作を呈することから、エアバッグ開放トリガーとして、腰部に焦点を当てて検証した。転倒発生時の腰部の落下速度、および加速度を明らかにするために、若年者を対象として転倒・転落実験を実施した。被験者は不安定台(T字台)上に静止立位姿勢を保持し、台足を急激に引き倒す外乱刺激を発生させた。外乱発生から転倒までの加速度を3軸加速度測定器(MA-3-20Ac, Microstone)によりサンプリング周波数200Hzにより測定した。加速度解析の結果、台からの転落時の最大加速度は12.5^-26.3m/sec^2、最大値に到達するのは着床前0.432^-1.478秒の間であることが確認された。エアバッグ開放までの時間が0.3秒程度であることから、最大加速度はエアバッグ開放のトリガーとなりうることが示唆された。しかしながら、転倒時の最大加速度は個人差が大きく、開放閾値の設定にはさらなる検証が必要と判断された。また、センサーを腰部に取り付けたため、股関節戦略で姿勢保持を図ろうとする場合、姿勢保持できていても腰部動作の加速度は大きかった。すなわち、開放閾値の設定によっては姿勢保持限界を突破する前に開放してしまう誤作動が生じる可能性がある。したがって、エアバッグ開放には腰部の加速度以外のトリガーを設定する必要があると考えられた。

今後、さらに転倒誘発局面の動作特性を検証し、エアバッグ開放トリガーとなる動作、閾値、およびプロテクトすべき部位などを明らかにする。本研究では大転子及び仙骨を保護するエアバッグ式ヒッププロテクターを開発することを目的とした。最終年度では、エアバッグトリガー閾値および、転倒方向と外傷の関係について検討した。まず、エアバッグ開放のトリガーとして腰部加速度の有効性を検証するために、不安定台からの前後および左右方向の転倒動作時の3次元腰部加速度(右大転子部)を計測した。いずれの転倒方向の最大加速度、最大振幅とも同程度の値を示した。また、各転倒方向のx,y,およびz軸の加速度間の相関はいずれも有意であった(最大加速度:r=0.56-0.78,最大振幅:r=0.57-0.84,p<0.05)。T字台牽引時に転倒したケースと代償的ステップにより転倒を回避したケースの加速度を比較した結果、転倒したケースの加速度が大きい傾向にあった。しかし、前方向の場合、加速度に顕著な差は認められなかった。現在、設計しているエアバッグ式ヒッププロテクターはエアバッグ開放までに約0.2秒要するため、開放トリガーはそれより前に転倒を感知しなければならない。各転倒方向において、x,y,z軸のいずれかの最大加速度もしくは最大振幅のなかで最も早く出現するものを採用していくと着床前0.4300.775秒の間であることが確認され、最大加速度、最大振幅はエアバッグ開放のトリガーとなりうることが示唆された。しかしながら、転倒時の最大加速度や最大振幅は個人差が大きく、開放閾値の設定にはさらなる検証が必要と判断された。次に、在宅高齢者1955名を対象に転倒発生時の外傷の有無と転倒方向について調査した。過去1年間で転倒した高齢者は386名(20.9%)で、そのうち257名(66.6%)が何らかの外傷を負い、37名(9.6%)が骨折した。転倒による外傷の有無と転倒の原因および転倒した方向に関する度数に有意差は認められなかった。一方で、転倒の方向と転倒の原因および外傷部位間に有意な関係が認められ(ψ=0.49と0.32)、骨折は側方の転倒において多く発生する傾向にあった。したがって、エアバッグ式ヒッピプロテクターは側方の転倒に対する防御を重視する必要性が示唆された。
原核生物での細胞分化の遺伝的制御

枯草菌の胞子形成は最も単純化された細胞分化のモデル系として分子レベルで活発な研究が行われている.枯草菌の胞子形成は,約50種の胞子形成遺伝子の逐次的発現によって調節されているが,我々はこの遺伝子発現のネットワークを,分子レベルで明らかにすることを目的に,胞子形成過程の初期,中期,後期に関与している8種の胞子形成遺伝子をクローン化して解析をすすめている.本年度はその中のひとつspoVE遺伝子について解析した.1.spoVE遺伝子産物の同定2.spoVE遺伝子の時期特異的発現と調節因子の存在成育の各時期から調製した無細胞抽出液を用いて, 32k蛋白質の生合成をみると,胞子形成開始後2時間(T_2)の細胞から調整した抽出液で合成された.対数増殖期細胞の上澄液とリボソーム, T_2細胞の上澄液とリボソームを用いたヘテロの組合せ実験から, 32k蛋白質の合成を促進する活性は, T_2細胞の上澄液にあることがわかった.この調節因子は,上澄液を55°C, 10分または60°C, 5分加熱すると活性が50%低下すること,透析によって除かれないことから蛋白質であると予想された.3.発現調節因子の精製枯草菌の胞子形成は最も単純化された細胞分化のモデル系として分子レベルで活発な研究が行われている.枯草菌の胞子形成は,約50種の胞子形成遺伝子の逐次的発現によって調節されているが,我々はこの遺伝子発現のネットワークを,分子レベルで明らかにすることを目的に,胞子形成過程の初期,中期,後期に関与している8種の胞子形成遺伝子をクローン化して解析をすすめている.本年度はその中のひとつspoVE遺伝子について解析した.1.spoVE遺伝子産物の同定2.spoVE遺伝子の時期特異的発現と調節因子の存在成育の各時期から調製した無細胞抽出液を用いて, 32k蛋白質の生合成をみると,胞子形成開始後2時間(T_2)の細胞から調整した抽出液で合成された.対数増殖期細胞の上澄液とリボソーム, T_2細胞の上澄液とリボソームを用いたヘテロの組合せ実験から, 32k蛋白質の合成を促進する活性は, T_2細胞の上澄液にあることがわかった.この調節因子は,上澄液を55°C, 10分または60°C, 5分加熱すると活性が50%低下すること,透析によって除かれないことから蛋白質であると予想された.3.発現調節因子の精製
放射線誘発若年者甲状腺がんの分子疫学的研究

福島第一原発事故後,若年者の甲状腺スクリーニングは世界で初め実施され予想を越える甲状腺癌症例が発見された。その甲状腺癌の増加が放射線の影響かスクリーニング効果か結論は出ていない。チェルノブイリ事故後に多発した小児甲状腺がんでゲノム解析がなされてきたが、放射線特異的な遺伝子異常は未だ見いだされていない。本研究ではチェルノブイリ症例に加えて、福島第一原発事故後に周辺地域の検診で発見され切除された症例を加え、二つの異なる地域と異なる被曝線量を背景とした若年被曝による放射線誘発甲状腺がんの高リスク分子機構を、ゲノムDNA変異解析に加えエピジェネティックな変異解析の両面から解明することを目的としている。
遠隔交流学習支援メディア「超鏡システム」の教育的効果の検証

(1)実践事例における教育的効果の分析超鏡システムは遠隔地にある相手像に自己像を重畳表示し、遠隔地で交流する者同士は同一画像を見ながら対話を行うため、身振り、手振りなどの非言語情報や視覚位置情報を伝達しやすいという特徴に焦点を当てた教育的効果の分析を進めた。これまでに実施した超鏡システムを用いた教育実践のビデオ記録より、時間を入れたプロトコルデータを抽出し、通信回線を使用する場合に必ず生じる映像・音声遅延と超鏡システムを介した情報伝達との関係を分析することにより、超鏡システムの教育活動への利用方法とその教育的効果が明らかになってきた。本年度の見学校の実践においても同様の結果が示唆されている。(2)超鏡システムの利用に適した教育の文脈についての検証研究代表者は初等中等教育における超鏡システムの利用を中心に研究を進めてきたが、これらの実践を行う前に超鏡システムを用いて実施していた教員研修が超鏡システムの利用に適した教育の文脈ではないかとの指摘が研究発表の場でなされ、それを受けて多種の実践データの分析結果より、国際間遠隔授業を実施する際に、両校の教員による指導内容の確認や教材の交流といった教師教育につながる場面において超鏡システムの利用が適しているのではないかと示唆された。以上の研究成果は、論文としてまとめる予定である。(1)超鏡システムの利用により教育的効果が高まると予想される学習モデルの分類研究代表者がこれまでに行ってきた超鏡システムを用いた遠隔交流学習の実践事例より、超鏡システムを用いた遠隔交流学習の学習モデルの分類を行った。遠隔交流学習が行われる学習場面を大別すると「教科学習」「総合的な学習」の二つに大別できる。各学習場面における超鏡を利用した教授・学習活動を、実践事例のビデオ記録よりコンピュータを用いてライブラリ化したのち、それぞれの教授・学習活動場面を、超鏡システムの特性より分類した。これを暫定的な学習モデルとし、次年度の研究課題である教育的効果の検証を行う際の分析指標とする。(2)各学習モデルに関連する実践事例の蓄積超鏡システムを利用した遠隔交流学習の実践事例を蓄積するために、本年度は2実践の蓄積を行った。本年度の実践は「総合的な学習」における超鏡システムの利用であった。来年度は実験的な実践蓄積も必要になるため、本研究に協力していただける機関との遠隔交流学習実験が行えるようにするための環境整備を本年度は行った。また、実践の蓄積を行うためには超鏡システムを遠隔交流学習支援メディアとして利用するための授業設計の方法(授業デザインの方法)を説明する必要があるため、過去の実践事例をふまえ、超鏡システムを用いた遠隔交流学習の授業デザインの方法について提案した。
抑揚情報を利用した対話音声理解モデル構築のための基礎的研究

1.研究設備の整備ワークステーションを導入、音声の抑揚解析表示ソフトウェア等を開発・整備した。2.研究進捗状況(1)a:NHK・FM放送のニュース音声(約10分間、男性アナウンサー)の抑揚を解析した。聞き取り易い構成とするために、ニュースのテーマが変る時点や、談話内での話しの流れの転換点での接続詞の使い方に、抑揚の主要要素である声の間(ポーズ)の取り方やピッチ周波数に大きな特徴があることが観察された(当初計画)。b:袋小路文(ガーデンパス文)と呼ばれる非常に複雑な文章に対する理解能力について、文字表記からの読み取りによる理解と音声からの聞き取りによる理解の比較実験を行い、抑揚情報を持つ音声からの理解が圧倒的に優れていることを確認した(追加研究項目)。(2)話し言葉(音声)と同様に自然対話言語である手話に注目し、両者を比較することにより自然対話言語の特質を明確にすることを計画、自然音声対話言語の特徴としての抑揚の持つと予想される役割(単語などの接続関係情報として実時間での意味把握を容易にする、など)に相当する情報が手話にも存在することを確認した。対話型自然言語としての手話に、音声の抑揚に相当する情報が存在するという仮説の下での工学的研究は内外にその例が見あたらないユニークなアプローチと思われ、手話学会、学振委員会などから講演招請を受けている(追加研究項目)。(3)これらの結果は、対話型自然言語理解の処理を行うには、音韻認識等の分節的情報の認識処理と抑揚等の情報から文の構造等を推定する処理を並行して行い、対話の進展を予測する機能などと合わせて協調分散処理を行うエージェント方式とすることが、本質的に重要であることを示唆している。(4)以上の結果を踏まえ、来年度は対話音声における対話制御に対する抑揚の検討などに着手する。
微動電極法によるラット海馬ニューラルネットの方法、場所、エピソード記憶機構の解析

これまで小さな実験動物(ラット)を用いた神経回路網の研究は、動物の脳が行動に伴って微妙に動くという難点のために主に麻酔下で行なわれてきた。しかし認識、記憶、思考そして行動制御といった高次脳機能は無麻酔下の行動動物を用いて調べる必要がある。脳の中でも空間記憶に関しては頭頂連合野から海馬への情報交換が重要で、海馬は特に記憶の初期形成過程に関与し、空間的な長期記憶(あるいは地図)は、頭頂連合野に形成されるという仮説が有力である。本研究では脳の空間記憶および識別機能の解明を目指し、平成5年度には当初の計画どうり、ラット用の頭部を無痛で無麻酔下に固定し、移動および回転可能な特殊回転移動装置を試作した。さらに本装置の周囲空間に6個の音刺激装置を設置し刺激の空間的方向の記憶に関する方向弁別遅延見本合わせ学習課題(空間作動記憶学習課題)を開発した。また水平移動タングステン記録電極を開発し、動きに伴う記録の不安定性の問題を解決した(微動電極法)。これらの計測技術を用いて、実際に方向弁別遅延見本合わせ学習課題遂行下ラットの脳内各部位(海馬及び後頭頂連合野)に微動電極を刺入し、空間記憶関連のニューロン活動を記録した。水平微動タングステン記録電極の卓越した特殊性能により、記録に際して思いもかけず、海馬の背側の後頭頂連合野に音の方向弁別遅延見本合わせ学習課題の遅延期間に有意の応答性を示す空間作動記憶関連ニューロンの存在が示された。しかし今までのところ海馬内には空間識別ニューロンはあるが、遅延期間に有意な応答性を示すニューロンは見つかっていない。この要因としては、新奇な刺激ではなく、よく聞き慣れた音刺激を用いたことによる可能性が考えられる。一方、ラットの向きを変えるという新奇な状況下で頭頂連合野の空間作動記憶関連のニューロン応答は増強され、海馬では遅延期間に有意な応答性を示すニューロンが出現した。空間記憶に関しては頭頂連合野-海馬ニューラルネット系の情報変換が重要視されており、本実験結果はプレリミナリーではあるが、海馬が記憶の初期形成過程に関与し、空間的認知の永続的な長期記憶は頭頂連合野に形成されると言う空間記憶仮説を裏付けるという興味ある知見が得られた。さらに理論的には、上記の神経生理学的知見を基にして、人工ニューラルネットを用いた計算機シュミレーションにより、物体の位置検出にもとずき物体を認識できる新しい人工ニューラルネット構造をプレリミナリーではあるが開発した。これらの成果は、ヒトや動物の脳に近い処理様式をもった新しいニューロコンピュータ開発のための糸口となることが予想され、今後さらに実験的および理論的研究を強力に推進する必要がある。
知的財産マネジメントが国際的な研究開発に果たす役割に関する研究

本研究の目的は、国際的な研究開発活動を促進した知的財産マネジメントを具体的かつ多面的に分析することによって、知的財産制度とイノベーションを媒介するものとしての知的財産マネジメントの役割を明らかにすることである。本研究ではラジオおよびテレビ技術の国際的な研究開発に対して、知的財産マネジメントがどのような役割を果たしたかを、RCAの事例分析を通して明らかにする。本研究の貢献は、国際的な知的財産制度とグローバルなイノベーションとの関係を分析する新たな枠組みを提起する点にある。
安全な生活道路空間創出に向けたISA普及のためのインセン ティブ施策の可能性検証

本研究では,金銭的インセンティブ施策がドライバーの各種ISA搭載受容性に与える影響を分析するため,豊田市ゾーン30地区内に居住する被験者48名(高齢者20名)を対象として,約5ヶ月間の助言型ISAフィールド実験を実施した後,SP質問調査を実施した.結果として,高齢者はISA搭載受容性が高く,また生活道路のみを対象とした自発型(解除可能型)ISAであれば,年間15,000円程度のインセンティブにより搭載需要率が70%(高齢者は80%)を超えることが示された.また,ISA普及率が高くなるにつれて搭載受容性も高くなることが分かり,ある程度普及が進めば普及率が指数関数的に上昇する可能性が示された.助言型ISAに対する挙動面での受容性を分析するため,愛知県豊田市中心部を対象エリアとした助言型ISAフィールド実験(第1期)を実施した.被験者は,対象エリア内のゾーン30地区内に居住し日常的に運転している20歳48歳の20名であった.実験には,走行区間の最高速度情報を画像で提供するとともに最高速度を超過した際に音声および画像により警告を出す助言型ISA機能,および走行中の速度,位置などのデータを1秒毎に収集する機能を有するスマートフォンアプリを使用した.本アプリを実装したスマートフォンを被験者保有の車両に搭載し,まず助言型ISA機能をOFFで2ヶ月(フェーズ1),ONで2ヶ月(フェーズ3),再度OFFで1ヶ月(フェーズ3),日常的に走行してもらい,時々刻々の位置や走行速度等の挙動データを取得した.分析の結果,ゾーン30区間において,助言型ISAにより速度遵守距離割合が20%程度向上し,また助言型ISA解除後においても速度遵守距離割合がフェーズ1より高い割合を保ったことから,特にゾーン30における助言型ISAの挙動面での受容性が高いことが明らかになった.次に,金銭的インセンティブ施策が各種ISAの搭載受容性に与える影響を分析するため,実験に参加した被験者20名に対しSP質問調査を実施した.SP質問では,(1)ISAの種類(助言型,自発型,強制型),(2)ISAの対象道路(全道路,生活道路のみ,幹線道路のみ),(3)インセンティブの種類(自動車保険料減額,自動車税減税,燃料チケット),(4)インセンティブの大きさ(100024000円)の4条件因子の様々な組み合わせのもとで,当該ISAを自車両に搭載するか否かを回答してもらった.モデル分析の結果,生活道路のみを対象とした自発型ISAであれば,年間20000円のインセンティブにより搭載受容率が8割を超えることが示された.助言型ISAに対する挙動面での受容性を分析するため,平成26年度は2048歳の被験者20名を対象とした5ヶ月間の助言型ISAフィールド実験(第1期)を実施した.平成27年度は,さらに詳細な分析を行うため,65歳以上の高齢者20名を含む28名を新たな被験者として,同様の助言型ISAフィールド実験(第2期)を実施した.第1期のデータと併せて分析した結果,助言型ISAにより,ゾーン30区間および狭幅員道路(速度規制が無い幅員5.5m未満道路)において,速度30km/h遵守率(遵守距離割合)が10%程度向上し,ゾーン30ではない30km/h規制道路では15%程度遵守率が向上したことから,生活道路を対象とした助言型ISAに対する一定の受容性が確認された.また,速度遵守率について非高齢者と高齢者との比較を行ったところ,通常時(助言型ISA適用前)では高齢者の方が遵守率が5%程度高いのに対し,助言型ISAを適用すると両者間で遵守率が同程度(80%程度)になったことから,生活道路を対象とした助言型ISAによる速度遵守率には一定の上限がある可能性が示唆された.次に,金銭的インセンティブ施策が各種ISAの搭載受容性に与える影響を分析するため,第1期被験者に対して実施したSP質問調査と同様の調査を第2期の被験者にも実施した.加えて第2期の被験者には,ISA普及率が搭載受容性に与える影響を分析するためのSP質問調査を実施した.第1期,第2期の回答結果を併せて分析した結果,高齢者の方が搭載受容性が高いことが分かり,また生活道路のみを対象とした生活道路のみを対象とした自発型(解除可能型)ISAであれば,年間15,000円のインセンティブにより搭載需要率が70%(高齢者は80%)を超えることが示された.また,ISA普及率が高くなるにつれて搭載受容性も高くなることが分かり,ある程度普及が進めば普及率が指数関数的に上昇する可能性が示唆された.本研究では,金銭的インセンティブ施策がドライバーの各種ISA搭載受容性に与える影響を分析するため,豊田市ゾーン30地区内に居住する被験者48名(高齢者20名)を対象として,約5ヶ月間の助言型ISAフィールド実験を実施した後,SP質問調査を実施した.結果として,高齢者はISA搭載受容性が高く,また生活道路のみを対象とした自発型(解除可能型)ISAであれば,年間15,000円程度のインセンティブにより搭載需要率が70%(高齢者は80%)を超えることが示された.

また,ISA普及率が高くなるにつれて搭載受容性も高くなることが分かり,ある程度普及が進めば普及率が指数関数的に上昇する可能性が示された.当初はフィールド実験の被験者に高齢者も含める予定であったが,第1期と第2期に分け,まずは非高齢者を対象に実験を実施した.現在第2期の実験を実施中である.また,当初は平成27年度に実施する予定であった金銭的インセンティブ施策に関するSP質問調査を既に第1期の被験者に対し実施済みである.以上のことから,本研究はおおむね順調に進展していると自己評価している.交通工学・交通計画学現在,被験者として高齢者も含めた第2期助言型ISAフィールド実験を実施中であり,7月に実験を終了し,金銭的インセンティブ施策に関するSP質問調査を実施予定である.これらの結果をふまえて,非高齢者と高齢者との差に着目しつつ各種ISAに対する受容性に関する最終的な結論を出す予定である.一方,愛知県警提供の交通事故データを用いて,各種ISA導入による交通事故被害軽減効果を把握する予定である.また,ISAの長期的な利用によるドライバーの挙動や受容意識の変化を探ることも必要不可欠と考えており,当初計画にはなかったが,既にISAが一部導入されているスウェーデンを始めとする欧州諸国の状況視察を実施する予定である.計画時は,平成26年度中に高齢者も含めたフィールド実験を実施する予定であったが,第1期と第2期に分け,第2期を平成27年度に実施することから,被験者謝礼金を中心としたフィールド実験費用が次年度使用額として生じている.現在,被験者として高齢者も含めた第2期助言型ISAフィールド実験を実施中であり,7月に実験を終了し,金銭的インセンティブ施策に関するSP質問調査を実施予定である.これらの実験および調査費用に予算を使用する予定である.また,ISAの長期的な利用によるドライバーの挙動や受容意識の変化を探ることも必要不可欠と考えており,当初計画にはなかったが,既にISAが一部導入されているスウェーデンを始めとする欧州諸国の状況視察を実施する予定があり,こちらにも予算を使用する予定である.
網膜前駆細胞の空間配置と核・細胞体移動の研究：集団協調と細胞運命選択のメカニズム

神経上皮という中枢神経系の起源組織がどう構造的および機能的に成立しているか問うため、「細胞の形態と近隣関係性の両方を考慮しつつ集団としての細胞挙動を問う」、「個別+三次元+全細胞」という新しく包括的なイメージングと組織(細胞集団)動態に関する解析をきわめて精力的に進めてきたが、実はこの問題は難題である.特定の分子を奪い去りその結果を組織単位で評価・判定するという、多くの従前研究がとってきたアプローチだけでは充分ではなく、「個」と「集団」の両方を動的にとらえた上での分析が求められる.これまでに、当初から計画していたライブ観察結果の丹念な定量解析等により、細胞集団の動きの分子機構の一端を明らかにし、さらに、細胞集団の流れが、これまで思いもしなかった力学的作用をもたらしていることもつかみつつある.こうした知見をH28年度に学会発表(分子生物学会,ポスター)を行い、優秀ポスター賞を受賞した.これらの結果に加えて,自らの観察を通じて着想した「力学的要因の関与」を新たに問うべく,具体的には、(1)培養細胞ストレッチ、または吸引装置を用い、培養組織を伸展、伸張させる(2)母体を生存させたまま、マウス胎児の脳や網膜にアガロースゲルを注入し、眼圧や脳室圧等を高くさせることにより組織を伸張させる等、物理的な力を組織の外側から加える事により、細胞密度や細胞形態を変化させる事に成功している.また、細胞の増殖を制御するYap遺伝子の活性化型を強制発現させる事で未分化性を維持し、細胞密度を変化させた時、同じ動物種でも、異なる組織及び領域により、多彩な相違をある事を明らかにした。この結果を現在、論文投稿中である。また、これまでに得た様々なイメージングの結果及び、力学的な要因群についての実測値を踏まえてシミュレーションを行った結果を、新たにもう一報今年度中に採択を果たす予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。網膜前駆細胞の集団において、細胞周期進行に伴って組織の丁端面(apical)と基底面(basal)間で細胞核の移動を行うINM(Interkinetic Nuclear Migration)は均質ではないと過去の自身の研究で知ったが、最近の同研究室による研究により、網膜と同じく中枢神経系である大脳において、マウスとフェレットという、異種動物間ではINMの挙動が大きく異なるという結果が、報告された(Okamoto et al. 2014:共著者)。これら違いはそれぞれの組織のもつ細胞密度の違いからもたらされているのではないかと同論文で同時に予測され事より、『いったい幾通りの異なるINMのパターンがあるのか?』という疑問がさらに深まりつつある。そこで、核や細胞膜標識するシステム、LoxP,Creプラスミドのelectroporation法などを用いての組織内の一定数の細胞を散発的標識、細胞周期のS期からM期を標識するシステムを組み合わせた、網膜及び大脳のスライス培養を用い、ライブイメージングし、トラッキングとMSD解析等を行っている。また、このINMがヘテロである理由に答えるべく(basal突起を相続した娘細胞が早く動くと考えるが他に理由はないか?)、例えば分化度と核移動様式の関係について明らかにするため、細胞の増殖を制御するHippo経路のコアクチベーターであるYap遺伝子の活性化型のプラスミドをelectroporationする事により未分化性を維持させた状態でINM軌跡を解析するなど、分化度を変化させる事によるINMの様式の変化なども網羅的に把握し,パターンを細胞形態(basal突起の相続や新生に注目する)、細胞分化度,細胞周期進行状況などとの関係に注目して分析・分類している。網膜前駆細胞の集団において、細胞周期進行に伴って組織の丁端面(apical)と基底面(basal)間で細胞核の移動を行うINM(Interkinetic Nuclear Migration)は均質ではないと過去の自身の研究で知ったが、最近の同研究室による研究により、網膜と同じく中枢神経系である大脳において、マウスとフェレットという、異種動物間ではINMの挙動が大きく異なるという結果が、報告された(okamoto, et al 2014:共著者)。これら違いはそれぞれの組織のもつ細胞密度の違いからもたらされているのではないかと同論文で同時に予測され事より、『いったい幾通りの異なるINMのパターンがあるのか?』という疑問より、核や組織すべての細胞膜を標識するシステム,LoxP,Creプラスミドのelectroporation法などを用いての組織内の一定数の細胞を散発的標識,細胞周期のS期からM期を標識するシステムを組み合わせた、網膜及び大脳のスライス培養を用い、共焦点顕微鏡によるタイムラプス撮影し、トラッキングとMSD解析等を行っている。また、このINMがヘテロである理由に答えるべく(basal突起を相続した娘細胞が早く動くと考えるが他に理由はないか?)、例えば分化度と核移動様式の関係について明らかにするため、細胞の増殖を制御するHippo経路のコアクチベーターであるYap遺伝子の活性化型のプラスミドをelectroporationする事により未分化性を維持させ、apical側で細胞密度を上昇した状態を作り出す事ができている。この状態でINM軌跡を解析するなど、分化度を変化させる事によるINMの様式の変化なども網羅的に把握し,パターンを細胞形態(basal突起の相続や新生に注目する),細胞分化度,細胞周期進行状況などとの関係に注目して分析・分類している。

神経上皮(あるいは脳室帯)という中枢神経系の起源組織がどう構造的および機能的に成立しているか問うため、「細胞の形態と近隣関係性の両方を考慮しつつ集団としての細胞挙動を問う」,「個別+三次元+全細胞」という新しく包括的なイメージングと組織(細胞集団)動態に関する解析をきわめて精力的に進めてきたが、実はこの問題は難題である.特定の分子を奪い去りその結果を組織単位で評価・判定するという,多くの従前研究がとってきたアプローチだけでは充分ではなく,「個」と「集団」の両方を動的にとらえた上での分析が求められる.これまでに、当初から計画していたライブ観察結果の丹念な定量解析等により、細胞集団の動きの分子機構の一端を明らかにしつつある.さらに,細胞集団の流れが,これまで思いもしなかった力学的作用をもたらしていることもつかみつつある.こうした知見をH28年度に学会発表(日本発生生物学会,ポスター)の予定である.これらの結果に加えて,自らの観察を通じて着想した「力学的要因の関与」を新たに問うべく,具体的には、(1)吸引装置を用い、培養組織を伸張させる。(2)培養細胞ストレッチ装置を用い、スライス培養の状態で組織に圧縮を加える。(3)母体を生存させたまま、マウス胎児の脳や網膜にアガロースゲルを注入し、眼圧や脳室圧等を高くさせることにより組織を伸張させる。その状態で数日間、飼育する事も可能である。等、物理的な力を組織の外側から加える事により、細胞密度や細胞形態を変化させる事に成功している。神経上皮という中枢神経系の起源組織がどう構造的および機能的に成立しているか問うため、「細胞の形態と近隣関係性の両方を考慮しつつ集団としての細胞挙動を問う」、「個別+三次元+全細胞」という新しく包括的なイメージングと組織(細胞集団)動態に関する解析をきわめて精力的に進めてきたが、実はこの問題は難題である.特定の分子を奪い去りその結果を組織単位で評価・判定するという、多くの従前研究がとってきたアプローチだけでは充分ではなく、「個」と「集団」の両方を動的にとらえた上での分析が求められる.これまでに、当初から計画していたライブ観察結果の丹念な定量解析等により、細胞集団の動きの分子機構の一端を明らかにし、さらに、細胞集団の流れが、これまで思いもしなかった力学的作用をもたらしていることもつかみつつある.こうした知見をH28年度に学会発表(分子生物学会,ポスター)を行い、優秀ポスター賞を受賞した.これらの結果に加えて,自らの観察を通じて着想した「力学的要因の関与」を新たに問うべく,具体的には、(1)培養細胞ストレッチ、または吸引装置を用い、培養組織を伸展、伸張させる(2)母体を生存させたまま、マウス胎児の脳や網膜にアガロースゲルを注入し、眼圧や脳室圧等を高くさせることにより組織を伸張させる等、物理的な力を組織の外側から加える事により、細胞密度や細胞形態を変化させる事に成功している.また、細胞の増殖を制御するYap遺伝子の活性化型を強制発現させる事で未分化性を維持し、細胞密度を変化させた時、同じ動物種でも、異なる組織及び領域により、多彩な相違をある事を明らかにした。この結果を現在、論文投稿中である。
氷薄膜の昇華機構と微視的・巨視的構造の相関解明

氷の昇華は、微視的には氷表面水分子の脱離現象という極めて基本的な過程であるが、その機構に対する分子論的な理解は未だ得られていない。こうした状況を鑑み、H29年度までの大きな成果として、同位体混合氷の昇華に着目する独創的なアプローチで、昇華過程に対する周囲分子の効果を世界に先駆けて明らかにすると同時に、液体水や氷といった水分子凝集体で顕在化する二種の核の量子効果の競合を実験的に初めて見出してきた。しかし、柔らかな分子性固体である氷の昇華機構をより詳細に理解するには、その反応場である氷表面の動的な振る舞いを明らかにする事も極めて重要である。そこで、H30年度は「プロトン移動過程」に着目し、氷表面と氷内部のプロトンの運動性の違いを精査した。分子スケールで起こるプロトン移動は、H/D交換反応(H2O+D2O⇔2HDO)を用いて可視化できる。そこで、清浄なPt(111)基板上に同位体積層D2O/H2O氷薄膜を結晶成長させ、表面敏感な等温脱離(ITD)とバルク敏感な赤外反射吸収分光(IRAS)の同時計測を行い、同反応の進行を観測した。両手法に基づき、反応進行度の時間変化を評価し比較したところ、ITDで観測している氷表面の方がH/D交換反応の進行が速いことが明らかとなった。さらに、反応速度方程式に基づく一連の解析の結果、氷表面近傍のプロトン移動速度定数は氷内部に比べて12桁大きいことが明らかとなった。これは、氷表面の水分子は内部に比べて低配位であるが故に束縛が弱く、並進変位が大きい事に起因すると考えられる。さらに本年度は、この研究をアモルファス氷へと応用し、「プロトン移動(H/D交換反応)」と「結晶化」の相関についても検討した。その結果、氷内でのプロトン移動が結晶化の進行前に十分活性化されている事を見出し、氷のガラス転移に伴うプロトン移動の促進を直接観測することにも成功している。H29年度までに、独創的なアプローチに基づき、昇華過程に対する周囲分子の効果を世界に先駆けて明らかにすると同時に、水分子凝集体で顕在化する二種の核の量子効果の競合を実験的に初めて見出してきた。H30年度は、氷の昇華の反応場である氷表面の動的な振る舞いを理解すべく、表面プロトンダイナミクスを精査した。表面敏感な等温脱離(ITD)とバルク敏感な赤外反射吸収分光(IRAS)の同時計測に基づき、氷表面・氷内部のプロトン移動を同時観測する手法を独自に確立し、氷表面におけるプロトン移動は氷内部に比べて桁で速いことを定量的かつ直接的に示すことに成功した。更に、アモルファス氷のガラス転移に伴うプロトン移動の促進を直接観測することにも成功するという予期していなかった成果も得られており、当初の計画以上に進展していると考えられる。まずは、蒸着条件(蒸着基板・蒸着温度)を系統的に変化させた同位体混合氷の昇温脱離(TPD)測定を行い、昇華過程の協同性を変調する蒸着条件を明らかにする。H29年度に精査したPt(111)基板に加えて複数のモデル基板で検証し、蒸着温度の制御で結晶氷とアモルファス氷を作り分ける。その後、H30年度に氷表面のプロトンダイナミクスに関する研究遂行と同時に立ち上げた、赤外反射吸収分光(IRAS)、和周波発生振動分光(SFG)、TPDの同時計測を可能とする装置を利用し、氷最表面のダングリングボンドとサブサーフェスの水素結合バンドをブロードバンドSFG分光で計測しつつ、IRASで氷試料全体の各バンドも同時計測し、氷バルク・氷表面の振動スペクトルの同位体効果を精査する。その後、特に精査が必要と判断した蒸着条件について、X線光電子分光(XPS)に加え、走査型トンネル顕微鏡(STM)・原子間力顕微鏡(AFM)も適宜併用し、氷薄膜のモルフォロジーを評価する。氷の昇華は、微視的には氷表面水分子の脱離現象という極めて基本的な過程であるが、その機構に対する分子論的な理解はほとんど得られていない。本課題では、昇華過程の協同性(水分子の脱離過程に対する周囲分子の効果)を、H2O、HDO、D2Oを混合した同位体混合氷の昇華における同位体効果として抽出し、更にその協同性と氷の微視的構造(水素結合状態)、巨視的構造(モルフォロジー)との相関を和周波発生振動分光法(SFG)やX線光電子分光法(XPS)を用いて解明することで、上記課題の実験的な解決を目的としている。そこでまずは、先行研究の豊富なモデル基板である、Pt(111)基板上に蒸着した同位体混合氷薄膜の昇華過程を、昇温脱離法(TPD)を用いて精査した。系統的に同位体混合比を変化させた氷薄膜のTPD測定結果から、水素結合の強さの指標である脱離活性化エネルギーEdの脱離種・同位体環境依存性を評価したところ、「脱離分子を重水素化する事はEdを増加させるのに対し、その周囲分子を重水素化する事は逆にEdを減少させる」ことが初めて明らかとなった。これはH2O氷に比べD2O氷の方が強い水素結合を形成するという周知の事実の裏に、二種の重水素置換効果の競合が潜んでいたことを強く示唆している。

同結果を遷移状態理論に基づいて詳細に解析したところ、Edの脱離種依存性は脱離分子の束縛回転モードのゼロ点振動エネルギー、同位体環境依存性は分子内OH伸縮モードと分子間OO並進モード間の非調和結合に対する核の量子効果の観点で説明される事が明らかとなった。本結果は、「重水素置換によって水素結合が伸びて弱まることが古くより報告されている多くの水素結合性結晶と異なり、液体水や氷といった水分子凝集体に対する重水素置換は水素結合を伸ばしかつ強める」という一見相反する従来の知見に対し、統一的理解を与えるものである。Pt(111)基板上に作製した氷薄膜の昇華に焦点を絞って、その同位体効果を精査した。その結果、二種類の核の量子効果が競合しているという従来にない知見を得た。またその起源についても、遷移状態理論に基づいて定性的な解釈を与えることに成功したことも踏まえ、全体を通しては概ね順調に進展していると考えられる。氷の昇華は、微視的には氷表面水分子の脱離現象という極めて基本的な過程であるが、その機構に対する分子論的な理解は未だ得られていない。こうした状況を鑑み、H29年度までの大きな成果として、同位体混合氷の昇華に着目する独創的なアプローチで、昇華過程に対する周囲分子の効果を世界に先駆けて明らかにすると同時に、液体水や氷といった水分子凝集体で顕在化する二種の核の量子効果の競合を実験的に初めて見出してきた。しかし、柔らかな分子性固体である氷の昇華機構をより詳細に理解するには、その反応場である氷表面の動的な振る舞いを明らかにする事も極めて重要である。そこで、H30年度は「プロトン移動過程」に着目し、氷表面と氷内部のプロトンの運動性の違いを精査した。分子スケールで起こるプロトン移動は、H/D交換反応(H2O+D2O⇔2HDO)を用いて可視化できる。そこで、清浄なPt(111)基板上に同位体積層D2O/H2O氷薄膜を結晶成長させ、表面敏感な等温脱離(ITD)とバルク敏感な赤外反射吸収分光(IRAS)の同時計測を行い、同反応の進行を観測した。両手法に基づき、反応進行度の時間変化を評価し比較したところ、ITDで観測している氷表面の方がH/D交換反応の進行が速いことが明らかとなった。さらに、反応速度方程式に基づく一連の解析の結果、氷表面近傍のプロトン移動速度定数は氷内部に比べて12桁大きいことが明らかとなった。これは、氷表面の水分子は内部に比べて低配位であるが故に束縛が弱く、並進変位が大きい事に起因すると考えられる。さらに本年度は、この研究をアモルファス氷へと応用し、「プロトン移動(H/D交換反応)」と「結晶化」の相関についても検討した。その結果、氷内でのプロトン移動が結晶化の進行前に十分活性化されている事を見出し、氷のガラス転移に伴うプロトン移動の促進を直接観測することにも成功している。H29年度までに、独創的なアプローチに基づき、昇華過程に対する周囲分子の効果を世界に先駆けて明らかにすると同時に、水分子凝集体で顕在化する二種の核の量子効果の競合を実験的に初めて見出してきた。H30年度は、氷の昇華の反応場である氷表面の動的な振る舞いを理解すべく、表面プロトンダイナミクスを精査した。表面敏感な等温脱離(ITD)とバルク敏感な赤外反射吸収分光(IRAS)の同時計測に基づき、氷表面・氷内部のプロトン移動を同時観測する手法を独自に確立し、氷表面におけるプロトン移動は氷内部に比べて桁で速いことを定量的かつ直接的に示すことに成功した。更に、アモルファス氷のガラス転移に伴うプロトン移動の促進を直接観測することにも成功するという予期していなかった成果も得られており、当初の計画以上に進展していると考えられる。まずは昇華過程の協同性について、蒸着条件依存性を優先的に明らかにする。
間葉系幹細胞に着目した腎間質線維化の機序解明と新規治療法の開発

臓器線維化は全身臓器において慢性的な組織障害に付随してくる共通した病態であり、その重症度が予後を規定することが報告されている。臓器線維化とは創傷治癒における一つの転帰であり、あらゆる臓器の慢性疾患や老化による機能不全状態において普遍的に認められる組織変化である。腎臓においてはステージの進行した慢性腎臓病における腎繊維化がそれに当たる。我々は線維化に深く関与する筋線維芽細胞のソースの一つとして間葉系幹細胞(Mesenchymal stem/stromal cell;以下MSC)の重要性を見出し、最近MSCに特異的なマーカーとしてMeflin(特願2015-153712)を同定した。MSCがfibroblastやmyofibroblastへ分化するとMeflinの発現が低下あるいは消失する。本研究ではMeflinと腎線維化の関係に着目し、腎線維化におけるMeflinとMSCの詳細な細胞系譜解析を行い、線維化疾患の病因・病態解明を行い、新規治療の開発を目指している。正常腎あるいは線維化した腎臓におけるMeflinの発現量と局在を検討した後に各種腎線維化モデルを惹起し、経時的に腎組織を採取しMeflinの発現量や局在を検討した。またMeflinノックアウトマウスを作成し、このマウスにおいても各種腎疾患モデルを作成し、予後や線維化に関わる分子群の検討を行っている。同様にこのMeflinノックアウトマウスの腎臓より単離してきた線維芽細胞を用いた検討も行っている。Meflinの発現をより明確に確認するためにMeflin発現レポーターマウスを作成し、Meflin陽性細胞を特異的にdeletionすることのできる遺伝子改変マウスも作成したため、今後はこれらのマウスを用いた実験系もすすめていく。正常腎あるいは線維化した腎臓におけるMeflinの発現量と局在を検討している。尿管結紮モデル(UUO;Unilateral Ureteral Obstruction)、アデニン腎症モデルに加え、抗糸球体基底膜腎炎モデルなどの各種疾患モデルを惹起した後に経時的に腎組織を採取し、間質や糸球体周囲の線維化の進展具合をReal time PCR法にてMeflinの発現量を、また組織学的にはin situ hybridization法を用いてMeflinのmRNAの発現分布を検討した。またMeflinノックアウトマウスを用いて上記と同様な種々の腎疾患マウスを作成し、それぞれ経時的に組織の線維化の進展具合を検討し、野生型と比較している。各種腎臓由来の細胞株や初代培養細胞を用いたin vitroの系でもMeflinの発現を検討しているが、これらの系において低酸素やTGFbetaなどを用いて線維化を誘導した場合のMeflinの発現量の変化を確認している。更にこれらの細胞に低酸素やTGFbeta刺激を用いて線維化を誘導し、細胞形態の変化、Meflinの発現量、線維化に関係するマーカーの変化も検討している。これらの実験に加え、作成したMeflinノックアウトマウスの腎臓より線維芽細胞を分離し、同じく野生型マウスの腎臓より分離した線維芽細胞との形態や各種線維化にかかわるマーカーの分布の違いを比較検討している。これまでに、Meflin陽性細胞が特異的に光るマウスのほかにMeflin陽性細胞を選択的に消失させるマウスの作成にも成功している。当初に計画していた実験計画通りよりやや遅れているが、興味深い知見が得られており、本年度はより詳細な病態への関与の解明をすすめ、治療法の開発へとつなげたい引き続きMeflinノックアウトマウスと野生型のマウスに作成した各種腎疾患モデルの検体を丹念に比較検討していく。経時的な経過や予後、また局在的にMeflinの発現と線維化の進展との関連を探索する。組織学的な方法としては今までと同様にin situ hybridization法を用いる。またこれらのマウスの腎臓より組織を採取し、Real time PCR法やWestern blot法を用いてmRNAや蛋白の発現量を確認する。またMeflinノックアウトマウスより単離した線維化芽細胞を用いて、野生型マウスより単離した線維芽細胞との比較検討もすすめていく。両細胞群における主に線維化にかかわる分子の検討をしていく。その他にも腎臓に関連する細胞株にsiRNAを用いたMeflinのノックダウンやウイルスを用いたMeflinの強制発現をおこし、Meflinと線維化の関連を追及していく。新たに作成したMeflinレポーターマウスを用いてMeflinの発現と局在をより明らかにしていく。このマウスを用いてより詳細なMeflinの局在が視認できるので、まずはこのマウスの発生に伴う経時的なMeflinの局在の移動を確認する。その後にこのMeflinレポーターマウスに各種腎疾患モデルを惹起して腎線維化を誘導し、Meflinの発現との関連性を探索していく。更にはMeflin陽性細胞を選択的にdeletionすることのできるマウスを開発したため、経時的にまた各種腎疾患モデルマウスにおいてMeflin陽性細胞を選択的に消失させ、線維化におけるMeflin陽性細胞の意義を検討していく。我々は線維化に深く関与する筋線維

芽細胞のソースの一つとして間葉系幹細胞(Mesenchymal stem/stromal cell;以下MSC)の重要性を見出し、最近MSCに特異的なマーカーとしてMeflin(特願2015-153712)を同定した。MSCがfibroblastやmyofibroblastへ分化するとMeflinの発現が低下あるいは消失する。本研究ではMeflinと腎線維化の関係に着目し、腎線維化におけるMeflinとMSCの詳細な細胞系譜解析を行い、線維化疾患の病因・病態解明を行い、新規治療の開発を目指している。正常腎あるいは線維化した腎臓におけるMeflinの発現量と局在を検討している。各種腎線維化モデルを惹起し、経時的に腎組織を採取しMeflinの発現量や局在を検討した。正常腎でもMeflinは発現するが、各種疾患モデルを惹起するとMeflin陽性細胞の局在が変化し、発現量が上昇することを見出した。各種腎臓由来の細胞株や初代培養細胞を用いてもMeflinの発現を検討している。マウスの実験と同様にこれらの細胞でもMeflinの発現を確認できている。更にこれらの細胞に線維化を誘導し、Meflinの発現量の確認や線維化に関係するマーカーの変化も検討している。Meflinの機能をより明確にするために、Meflin欠損マウスを作成した。また発現をより明確に確認するために、Meflin発現レポーターマウスを作成することとした。まずは正常腎あるいは線維化した腎臓におけるMeflinの発現量と局在を検討している。尿管結紮モデル(UUO;Unilateral Ureteral Obstruction)、アデニン腎症などの各種腎線維化モデルを惹起し、経時的に腎組織を採取しReal time PCR法にてMeflinの発現量を、また組織学的にMeflinの局在を検討した。当初は抗Meflin抗体での免疫組織染色を試みたが非特異的な染色が多く十分な解析ができなかった。そこでin situ hybridization法を用いてMeflinのmRNAの発現を検討した。Meflinの発現に関する情報はある程度得られたが、より詳細な解析が今後も必要である。各種腎臓由来の細胞株や初代培養細胞を用いたin vitroの系でもMeflinの発現を検討している。in vivoの系と同様に、腎臓由来の細胞株や初代培養細胞でもMeflinの発現を確認できている。これまでに、Meflin陽性細胞がTomatoで強烈に光るマウスの作成に成功している。当初に計画していた実験計画通りにほぼ進行しており、本年度はより詳細な病態への関与の解明をすすめ、治療法の開発へとつなげたい。
好中球免疫系の作動機序の統合的解明と細菌由来分子による好中球免疫の制御方法の検索

肺炎球菌は,高齢者肺炎で主たる病原菌として知られている.その肺炎球菌には,細菌内部にニューモリシンと呼ばれる毒素が内在している.しかし,その毒素をヒトに向けて放出するポンプ装置は保有していない.そこで,本研究では,まず,細菌が自己溶菌することで毒素を外界へ漏出させることを示した.次いで,ニューモリシンは肺胞上皮細胞ではなく,肺に浸潤した免疫細胞である好中球をターゲットにしていることを明らかにした.最後に,好中球の内在性エラスターゼを阻害する薬剤により好中球免疫の恒常化を図れば,免疫機能の正常化を誘導できることも提示した.NETs免疫系を作動させる肺炎レンサ球菌由来分子の候補ライブラリーの構築三ヶ年計画の初年度は,研究計画全体で使用する試料の調整と各種顕微鏡の観察条件の至適化を中心に実施した.肺炎レンサ球菌の細胞壁画分,および分担研究者として参画している他の研究課題で得られた種々の病原因子の組換え体の余剰試料に加え,以下の手順でゲノム情報から推定される種々の細菌タンパクを組換え体として作製した.(1)レンサ球菌の菌体表層タンパクは,C末端側に保存されたモチーフがある.そのモチーフを指標として,ゲノムデータベースから推定のA群および肺炎レンサ球菌の菌体表層タンパクを選出し,組換えタンパクを作製した(担当:寺尾・土門).この際,グラム陽性菌であるレンサ球菌属の組換えタンパクは,グラム陰性菌である大腸菌で発現・精製することが困難であると予測した.そこで本研究では,種々の宿主や発現ベクターを組み合わせて,肺炎レンサ球菌の組換えタンパク調整方法の最適化を試みた(担当:寺尾・小田).(2)続いて,上記手順(1)で作製した組換えタンパク溶液を,ヒト好中球に滴下した.この混合液を37°Cで1時間培養した後に,スライドグラスに塗抹し,高速スキャン型原子間力顕微鏡および蛍光顕微鏡試料とした(担当:寺尾・大学院生2名).(3) NETsの構成物質は,好中球の染色体DNAと内因性プロテアーゼであることが明らかにされた.そこで,蛍光顕微鏡試料については,SYBRgreen等の核酸結合性の蛍光試薬で染色した.そして,現況の顕微鏡下で,NETs展開を認める肺炎レンサ球菌の組換えタンパクの同定を行った(担当:寺尾・小田).(4)さらに,上記手順(3)でスクリーニングした肺炎レンサ球菌のタンパクに対応する遺伝子の欠失変異株を作製した.(担当:寺尾・大学院生2名).誤嚥性肺炎を包含する肺炎は,耐性菌の増加と人口動態の高齢化に伴い増大・重症化する傾向にある.ついに昨年度は,わが国の死因疾患トップ3が入れ替わり,肺炎が第3位となる事態が生じている.医科領域では,重症化肺炎に進行してから患者が入院してくることもあり,大量の抗菌薬を使用し救命に努めざるを得ない.当然の帰結として,薬剤耐性の肺炎球菌が増大し院内感染の起因細菌へ転帰し,次なる治療を困難にしている.難治化・長期化する肺炎治療は,医療費の膨張,患者QOLの低下,医師の激務へと悪循環のサイクルを加速させている.特に,ペニシリン耐性の肺炎球菌の分離は著しく,2016年4月1日付けで日本政府は具体名を挙げてペニシリン耐性肺炎球菌の対策も決定した.臨床の場に立つ医療従事者には衝撃的なことに,あと4年で抗菌薬の使用を3分の2に減らす数値目標までが設定された.言い換えると,極端な数値目標や追加ガイドラインの策定が急務なほどに,肺炎等の感染症が高齢化社会では問題になってきている.申請者は,肺炎起因菌を含めたレンサ球菌属に対する免疫システムのイメージング解析研究を開拓し,好中球の新たな免疫システムNETsを解析している.好中球は,微生物感染に対して最初に作動する重要な免疫系を形成するにも関わらず,世界的に見ても研究する人口が少ない免疫細胞である.したがって,好中球免疫については統合的な解析はこれまでに無く,かつ同細胞を制御して病原微生物を排除する方法も検索されていない.そこで本研究では,好中球免疫系解析の実験手技とアプリケーションを用いて,さらに新たな免疫担当細胞に存在するNETs系免疫システムの同定と可視化を目指した.最終的には,抗生剤と併用可能なNETs免疫誘導の感染制御を目指している.好中球のNETs免疫系を現有のタイムラプス型蛍光レーザー共焦点顕微鏡を使用して解析し,肺炎球菌Streptococcus pneumoniaeの代謝系酵素であるalpha-enplaseが1ug/mlでNETs誘導を効率的に果たすことを見出している.またさらに,結核菌の菌体表層成分をモデルにした無毒な化学合成標品にもNETs誘導能があることを明らかにした.この際に,ヒト末梢血から好中球細胞を分離すると,材料の供給上,頻回な実験が行えない問題が生じた.そこで,ヒト末梢血由来の好中球細胞と同様のNETs誘導の挙動を示す研究用の培養細胞株をスクリーニングした.その結果,好中球様と称される2種類の培養細胞株のうち,HL-60Ast.3細胞はNETs誘導が弱いものの,THP-1細胞株では比較的NETs誘導が観察されることが明らかになった.