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超平面配置とアローの不可能性定理の展開

本研究の主眼は,超平面配置の理論の社会科学研究への応用であった.しかし、異分野間の溝を越えるのには大きなエネルギーを要する.その突破口として研究代表者の19年の論文(Ad. Math.)を主題とする国際セミナーを23・24年度に行った.特筆すべき成果は,数学と社会科学をまたぐ協働作業の場が形成されたことである.具体的には,S. Settepanella(Labo. of Econ. and Man., Scu. Sup. Sant'Anna, Pisa, 25年8月から北大・理)と研究代表者を中心に,社会選択論・Decision Theoryへの超平面配置の応用を一層推進する環境が形成された.2年目の24年度には,11月910日に東大・情報理工で行われたワークショップ「超平面配置と統計学」と,それに引き続き,11月1213日に北海道大学大学院理学研究院で開催された勉強会「超平面配置と社会選択」において,情報交換と共同研究が進展した.東京大学大学院情報理工学系研究科でのワークショップには,Simona Settepanella氏(LEM: Laboratory of Economics and ManagementScuola Superiore Sant'Anna, Pisa, Italy), Gennaro Amendola氏(Telematica大学,Italy)がイタリアから参加,日本からは竹村彰通(東京大学・情報理工学系),阿部拓郎(京都大学・工)が参加した.北大・理の勉強会にはイタリアからの2名に加え,寺尾宏明,吉永正彦,陶山大輔(いずれも北海道大学・理)が参加し,活発な議論が行われた.イタリアの2人の研究成果はdecidability(決定可能性)とmanipulability(操縦可能性)とのトレードオフ関係を超平面配置の概念を用いて記述するという興味深いものであり,すでに論文が出版されている.この結果は数学と社会選択との融合領域におけるmajorな成果のひとつであるといえよう.上記ふたつの研究集会で情報を共有,かつ,数学的論点と課題が明らかになったことで次年度以降への進展に期待が持てる.25年度は,7月初旬に米国からJune Huh氏(ミシガン大)を北大に迎え,研究課題に関して研究打合せを目的にしたセミナーを行った.Huh氏はまだ20代ながら,米国のrising superstarsのひとりであって複数の著名な予想を鮮やかに解決し,将来を嘱望されている.セミナーでは超平面配置の代数幾何に関する深い結果が報告され,本研究課題の方向性に,大きな影響が与えられた.また,本研究の海外共同研究者のSimona Settepanella氏が25年度の8月から北大で特任講師に採用された.このことは23年度と24年度における本研究の活発な活動によって初めて可能になったことであり,本研究費のおかげである.結果として,Settepanella氏とさらに緊密な共同研究が可能になったため,今後の社会科学との連携が拡大するための基盤が築かれた.その効果は,25年11月に北大で行われた阿部拓郎(京大・工)を招いてのSettepanella氏と寺尾との研究打合せで発揮された.Settepanella氏の主導で社会科学(特に,社会選択論)と超平面配置との関連についてsessionが行われた.この成果はまだ論文としてまとめられていないが,論文の「核」は得られている.この基盤の上に,26年8月にはSettepanella氏を主たるオーガナイザーとして国内外の経済学者と数学者の共同Workshopを計画しており,豊かな成果が期待される.本研究の主眼は,超平面配置の理論の社会科学研究への応用であった.しかし、異分野間の溝を越えるのには大きなエネルギーを要する.その突破口として研究代表者の19年の論文(Ad. Math.)を主題とする国際セミナーを23・24年度に行った.特筆すべき成果は,数学と社会科学をまたぐ協働作業の場が形成されたことである.具体的には,S. Settepanella(Labo. of Econ. and Man., Scu. Sup. Sant'Anna, Pisa, 25年8月から北大・理)と研究代表者を中心に,社会選択論・Decision Theoryへの超平面配置の応用を一層推進する環境が形成された.当初の計画ではアローの不可能性定理のように超平面配置の理論と相性の良い社会科学理論を数学的に取り扱うことを目指しており,ほぼ目標通りに進展している.24年度はイタリア人の2人の研究者の社会選択に関する数学モデルを本格的に学ぶ機会を持ち,25年度での具体的成果につながる年となったと位置付け,(2)と評価した.当初の計画では,初年度は論文[1]に関して社会科学者の理解を深めてもらうべく努力することが中心だったが,結果的には,北大での11月のワークショップにおいて,SettepanlleやGaoの仕事が[1]を越えて発展していることが伺えたことは,期待を上回るものであった.一方,ワークショップへの社会科学者の参加者が十分でなかったことも事実であり,全体として(2)と評価した.研究計画の2年目の24年度は,国際共同研究者のSimona Settepanella氏とGennaro Amendola氏に研究代表者,阿部拓郎,吉永正彦,竹村彰通などの日本の有力研究者を加えた国際チームが生まれた年であった.

今後は取り組むべき課題も選定されたので,25年度は,より一層緊密な接触を深め,挑戦する.上記のように,研究の進展という面においては順調なスタートを切っており,次年度以降一層の深化をとげる可能性が高い一方で,社会科学者をどの程度巻き込むかという横の拡がりについてはやや足らざる面もある.しかし,本研究の主旨に鑑み,さらに深く超平面配置の応用的側面を数学的に厳密な手法で掘り下げることを優先しつつ,平行して優れた社会科学者と連携していく計画である.最終年度の25年度には,イタリア,あるいは日本で上記の国際チームの研究打合せを行いたい.25年度の助成金の額は100万円なので,上記の打合せでほぼ使い切る予定である.23年度は11月のワークショップの規模が想定より小さかったために残額321,339円が生じた.この金額は24年度の計画の中では,社会科学にバックグラウンドを持つ有力研究者への謝金・旅費等に用いて,社会科学との連携を強めていく予定である.
環境ストレスによるmRNA監視機構の変動と病態への影響に関する研究

環境ストレス、小胞体ストレスプレコンディショニングによりmRNA監視機構NMDは抑制され、早期終止コドンPTCを有する疾患遺伝子がコードする蛋白質が発現した。NMD抑制は、eukaryotic initiation factor 2αのリン酸化による翻訳抑制とNMD構成因子の発現抑制によって生じた。環境ストレスは、PTCを有する疾患細胞の表現型に影響を及ぼす因子となりうる。環境ストレス(酸化ストレス、小胞体ストレス)下におけるmRNA監視機構(NMD)の変動について、早期終止コドンpremature translation termination codon (PTC)をもつために通常はNMDにより分解されている蛋白質をコードしないRNAであるsmall nucleolar RNA host gene 1 (Snhg1)あるいはgrowth arrest specific 5 (GAS5)のmRNA発現を指標に検討した。環境ストレス感受性、非感受性筋芽細胞、ラット培養大脳皮質神経細胞、グリア細胞いずれの細胞でも、酸化ストレス、小胞体ストレス負荷により、Snhg1あるいはGAS5のmRNAの発現増加が認められたことから、環境ストレス(酸化ストレス、小胞体ストレス)によってNMDは抑制されると考えられる。そこで、環境ストレスによるNMD抑制がPTCを有する遺伝性疾患の病態に及ぼす影響について、PTCを有する疾患モデル細胞であるUllrich線維芽細胞を用いて検討した。Ullrich線維芽細胞に弱い小胞体ストレスを与えたところ、Snhg1 mRNAの発現は増加し、原因遺伝子のmRNA発現の増加と欠損蛋白質の発現が認められた。環境ストレスは、PTCを有する疾患細胞にNMD抑制をもたらし、その表現型に影響を及ぼす因子となりうることが推測された。環境ストレスによってNMDは抑制されることが明らかになったが、NMDの実行は、蛋白質の翻訳と密接に関係している。一方、細胞ストレス下では非ストレス蛋白質の翻訳は低下する。環境ストレス負荷時はNMD構成因子の一部は発現が低下した。環境ストレス負荷時のNMD抑制における欠損蛋白質の発現メカニズムについてさらに検討を進めている。環境ストレス下ではmRNA監視機構NMDは抑制され、早期終止コドンPTCを有する疾患細胞の欠損蛋白質が発現したことから、環境ストレスは、PTCを有する疾患細胞の表現型に影響を及ぼす因子となりうることが推測された。細胞ストレス下では非ストレス蛋白質の翻訳は低下し、ストレス防御に機能するストレス蛋白質の翻訳は亢進する。その中心的役割を担うのがeukaryotic initiation factor 2alpha (eIF2α)のリン酸化である。環境ストレス下でのNMD抑制におけるeIF2αリン酸化の意義について検討するために、リン酸化無効のeIF2α変異体を作成した。細胞ストレス下では、非ストレス下では合成されない転写因子ATF4が下流のストレス蛋白質の転写を活性化することから、ATF4はストレス応答におけるkey factorと考えられている。ATF4の発現動態にはNMDの関与が指摘されているが、siRNAを用いたNMD抑制細胞の環境ストレス下における検討ではATF4 mRNAは増加したがATF4蛋白質の発現増加は認められず、ATF4の発現は主にeIF2αのリン酸化に依存すると考えられた。さらにATF4 knockdown細胞では、ストレス下における小胞体シャペロンGRP78の発現がnon-silencing siRNA導入細胞よりも少なく、その発現は、peIF2α/ATF4 pathwayが関与すると考えられた。eIF2α変異体プラスミド導入細胞では、環境ストレス下で野生型に比しeIF2αのリン酸化が無効であることを確認した。NMD構成因子であるUpf1の発現は抑制された。環境ストレス下におけるNMD抑制とeIF2αのリン酸化の意義についてさらに詳細に検討するために、プロミシン選択性eIF2α変異体を作成し、検討を続けている。環境ストレス下ではmRNA監視機構NMDは抑制されることから、環境ストレスは、早期終止コドンPTCを有する疾患細胞の表現型に影響を及ぼす因子となりうる。NMDは、蛋白質の翻訳機構と関係することから、環境ストレス下におけるNMD抑制は、eIF2αのリン酸化による翻訳抑制によるものと想定されてきた。しかし、それのみが原因であるかどうかについては議論のあるところであった。環境ストレス下でのNMD抑制におけるeIF2αのリン酸化の役割について検討するために、eIF2αのリン酸化が無効なプロミシン選択性eIF2α変異体を作成し、細胞に導入後プロミシン選択を行い、変異eIF2α発現安定細胞株を得た。内因性eIF2αをsiRNAでブロックし、小胞体ストレスプレコンディショニングを行った。小胞体ストレスプレコンディショニングによって、野生株ではNMD抑制の指標であるsmall nucleolar RNA host gene 1 (Snhg1) mRNAが増加したが、変異株では野生株に比し有意に発現が少なかった。従って、ストレス下でのNMD抑制においてeIF2αのリン酸化は重要であると考えられた。しかしながら、変異株Snhg1 mRNAは小胞体ストレスプレコンディショニング下では非プレコンディショニング下に比し有意に増加した。この原因として、小胞体ストレスプレコンディショニング下におけるNMD構成因子Upf1、SMG-7の発現抑制とmammalian target of rapamycin (mTOR) pathwayの抑制が関係していると考えられた。siRNAを用いたmTORノックダウンによりNMDは抑制されることを確認した。

環境ストレス、小胞体ストレスプレコンディショニングによりmRNA監視機構NMDは抑制され、早期終止コドンPTCを有する疾患遺伝子がコードする蛋白質が発現した。NMD抑制は、eukaryotic initiation factor 2αのリン酸化による翻訳抑制とNMD構成因子の発現抑制によって生じた。環境ストレスは、PTCを有する疾患細胞の表現型に影響を及ぼす因子となりうる。環境ストレス下ではNMDが抑制されPTCを有する疾患細胞の欠損蛋白質が発現するが、その発現メカニズムについて検討を進めた。環境ストレス下ではeukaryotic initiation factor 2alpha (eIF2α)のリン酸化により、非ストレス蛋白質の翻訳は低下し、ストレス応答のkey factorと考えられる転写因子ATF4が発現してストレス防御に機能するストレス蛋白質が合成される。siRNAを用いたNMD構成因子のノックダウン研究から、NMD抑制下におけるATF4の発現動態を明らかにした。NMDの実行は蛋白質の翻訳と密接に関係する。環境ストレス下でのNMD抑制がeIF2αのリン酸化による蛋白質の翻訳抑制と関係するか検討するために、eIF2αのリン酸化が無効なeIF2α変異体プラスミドを作成し、細胞に導入して環境ストレス下で野生型に比しeIF2αのリン酸化が無効であることを確認した。環境ストレス下では、通常はNMDにより分解されている蛋白質をコードしないRNAであるSnhg1 mRNA発現が増加することをすでに明らかにしているが、Snhg1 mRNA発現を指標に、環境ストレス下におけるNMD抑制とeIF2αのリン酸化による蛋白質の翻訳抑制との関係についてさらに詳細に検討するために、選択培養のためのプラスミドを作成した。現在、安定変異細胞株を得るために選択培養を実施しており、本細胞株を用いて環境ストレス下でのストレス応答についてさらに検討して、環境ストレス下でのNMD抑制メカニズムを明らかにし、環境ストレス下でのNMD抑制におけるPTCを有する疾患細胞の欠損蛋白質の発現メカニズムの解明につなげる予定である。分子病態医化学平成26年度に作成したプロミシン選択性eIF2α変異体、野生体プラスミドを用いて、安定変異細胞株を作成し、環境ストレス下でのNMD抑制とeIF2αのリン酸化による蛋白質の翻訳抑制との関係についてさらに詳細に検討を続け、環境ストレスによるNMD抑制メカニズムを明らかにする。
大腸癌の新規治療標的としてのＧＡＴＡ－６分解システムの解析

GATA-6は初期胚の分化・増殖に必須の転写因子である。近年では消化器系の癌の増殖や生存に関与することが知られている。本研究では、『癌化学療法における分子標的として、GATA-6分解系はどの程度有効であるか』を明らかにしたいと考え、具体的に2つの課題:(1)GATA-6の分解を誘導するシグナル伝達経路の解明、及び(2)GATA-6分解誘導による抗癌作用の検証、を設定した。課題(1)では、種々のリン酸化酵素(キナーゼ)のスクリーニングを行い、新規な分解経路を見出した。課題(2)では、GATA-6の分解誘導薬によって、大腸癌細胞の細胞周期を分裂期で停止させ、増殖を抑制する作用が認められた。転写因子GATA-6は、初期胚の分化・増殖に必須の因子であり、正常細胞ではその発現量は一定のレベルで調節されている。一方、消化器系の多くの癌細胞(大腸癌など)でGATA-6が高発現していることが知られているが、その代謝回転機構は未だ解明されてない点が多い。昨年度の研究成果から、転写因子GATA-6の分解を速やかに誘導するシグナル伝達系を明らかにし、その経路に関わる複数のキナーゼを特定することができた。本年度は大腸癌細胞を用いて、GATA-6分解誘導による抗腫瘍活性の効果を解析した。GATA-6分解誘導にはJNK活性化剤であるアニソマイシンを使用した。大腸癌の培養細胞にアニソマイシンを作用させると、GATA-6の分解が起きることが確認できた。同時に、細胞増殖が顕著に抑制されることも分かった。より生体に近い培養方法として、3次元培養の系においても同様の実験を行ったところ、アニソマイシンによって細胞増殖は抑制された。この現象はsiRNAを用いてGATA-6遺伝子をノックダウンした場合でも観察された。細胞増殖が抑制された現象について、フローサイトメトリーによりさらに詳細に解析を行った。その結果、アニソマイシンを作用させた細胞では、増殖のサイクル(細胞周期)が分裂期において停止した状態にあることが明らかになった。また、大腸癌の特徴の1つである細胞の浸潤能には影響しないことも分かった。昨年度および今年度の結果から、GATA-6は細胞周期の進行に関与することで細胞増殖を調節していると考えられる。この働きが、癌のみならず、発現量が一過的に増加する初期胚においても同様であるのかどうか興味が持たれる。転写因子GATA-6は細胞の分化・増殖に必須の因子であり、正常細胞ではその発現量は一定のレベルで調節されている。一方、消化器系の多くの癌細胞(大腸癌など)でGATA-6が高発現していることが知られているが、その代謝回転機構は未だわかっていない。本研究は、転写因子GATA-6の分解を速やかに誘導するシグナル伝達経路を明らかにし、その分解経路を大腸癌細胞に応用する。その結果から、『癌化学療法における分子標的としてGATA-6分解系はどの程度有効であるか』を解析することを目指している。本年度は、GATA-6分解に関わる遺伝子のスクリーニングを行い、スクリーニングの結果見出された遺伝子の、大腸癌細胞における機能を解析することを目的に実験を行った。当研究室で作成したGATA-6安定発現細胞を用いて、分解経路に関わるキナーゼを網羅的に探索した結果、4種類のキナーゼがGATA-6の分解に関与していることを新たに見出した(国際学術雑誌に投稿済)。これらキナーゼのうち、JNK(c-jun N-terminal kinase)に着目し、GATA-6分解機構の詳細を検討した。その結果、JNKが活性化されると核外輸送に関与する因子の発現量が増加し、GATA-6も核から細胞質へ輸送されることがわかった。細胞質に輸送されたGATA-6はその後、プロテアソームによって分解されることも分かった。このことから、GATA-6の細胞内局在を変化させることでその活性を調節できる可能性が示唆された。次年度ではこの現象を大腸癌細胞を用いて抗腫瘍活性とともに検証する。本年度は、GATA-6分解に関わる遺伝子のスクリーニングを行い、スクリーニングの結果見出された遺伝子の機能を調べることを当初の目的としていた。このための実験方法として、レトロウイルスを用いたジーントラップ法を予定していた。この方法では遺伝子破壊細胞の作成・選別し、遺伝子破壊部位を解析する(化合物による変異導入法に比べ、破壊した遺伝子の解析が容易であるなどの特徴がある)。実際にこの方法で実験を進めていく予定であったが、ウイルス感染後の細胞を選別していくステップで薬剤による選別(耐性株)がうまくいかないことがわかった(単離できるほどの大きさのコロニーになっても、培養していくうちに増殖が悪くなってしまう)。

このため当初の予想以上にコロニー単離の条件検討に時間を要するものと思われた。この点において達成度はやや遅れていると判断した。そこで、ジーントラップ法の条件検討を進めるのと同時に、探索する遺伝子をキナーゼファミリーに絞り込み、スクリーニングする方法を進めることにした。この方法は既存のキナーゼ阻害薬95種類をGATA-6分解解析系に添加して調べる方法で、遺伝子を網羅的に調べるという当初の目的とは異なるが、申請者が日常的に解析している方法であり、複雑な条件検討の必要が無く直ちに実験することができた。今年度得られた知見を大腸癌細胞に応用する。同定されたキナーゼの機能がGATA-6分解を促進するか否かをimmuno blotting等で確認する。以下の検討は、主に大腸癌細胞を用いる。(1)shRNAベクターにより同定したキナーゼの発現抑制を行い、cAMP依存的なGATA-6分解が起こらなくなるかどうかを確認する。(2)同定したキナーゼを発現するベクターを作成し、GATA-6分解が促進するかどうかを確認する。(3)A kinase経路との関連性を、種々のキナーゼ阻害薬の影響やリン酸化状態を解析することで調べる。(4)この経路がヒト大腸癌細胞(培養細胞:DLD-1、HCT15、Caco-2などを使用する)で共通性があるのかを検証する。(5)GATA-6がどのような遺伝子発現を制御しているのかをクロマチン免疫沈降法(ChIP)-on chip法により解析する。GATA-6の分解を促進することで腫瘍形成、及び抗癌剤感受性に与える影響を検証する。さらに、GATA-6分解を促すキナーゼを安定発現する細胞、及びGATA-6をノックダウンした細胞の増殖や、細胞外マトリクス存在下(三次元培養)における腫瘍形成能(大きさやコロニー数)を調べる。申請者らが見出したGATA分解促進薬(anisomycin)の効果も併せて検討する。また、抗癌剤を作用させた場合の感受性を、増殖抑制効果や、細胞死(アポトーシス)、腫瘍形成を指標に調べる。細胞増殖はトリパンブルー色素排除法を、アポトーシスはカスパーゼ活性化の検出や、フローサイトメーターを用いてアネキシンVを露出した細胞数を計測することにより解析する。当初の使用計画と大きな変更点は無いと考えている。大型の研究機器(遠心分離機、クリーンベンチ・細胞培養用インキュベーター、冷凍庫など)は講座で所有しているものを使用するので購入の必要は無い。申請者の実験では細胞培養消耗品及びイムノブロット関連試薬は実験に欠くことはできない。次年度の研究では、注目しているキナーゼの強制発現、及び発現抑制などの遺伝子操作が必要になる。そのために、プラスミド精製キットや各種制限酵素、遺伝子導入試薬などが必要になる。また、抗腫瘍効果の解析のために各種抗癌剤、フローサイトメトリー関連試薬、細胞生死判定試薬などが新たに必要である。また、研究成果発表及び最新の研究動向の把握・情報収集のために学会旅費を計上している。本研究で得られた成果は国際学術誌への投稿も考えているのでそのための投稿料も計上している。
イネの脱粒性における離層の形成と崩壊の分子機構の解明

本研究では、研究期間内に、最新の手法であるレーザーマイクロダイセクション法を用いた離層特異的な組織由来サンプルのマイクロアレイ解析の結果から見いだした、新規脱粒性遺伝子OSH15およびOSH15の生物学的作用に関して、下流の候補遺伝子について、発現解析、過剰発現体の作出、遺伝子破壊系統等を用いた経時的な形態観察を行い、生物学的役割を明らかにし、脱粒性における離層の形成および崩壊の分子機構におけるOSH15遺伝子の貢献を明らかにした。脱粒性とは、穂から種子が脱粒する性質であり、自然界では、種子の拡散による繁殖戦略として重要な性質であるが、作物として考えた場合、強い脱粒性は、収穫量の減少につながる。そのため、栽培化の過程で、古代人によって最初の選抜の対象となった農業形質であると考えられてきた。また、脱粒性は、脱穀技術との関連が深いことから、今日でも重要な農業形質の1つである。これまでに、イネの農業形質と関わりのある栽培化遺伝子の単離および置換系統の作出においては、申請者らは、イネの脱粒性を制御する遺伝子として、栽培ジャポニカイネ品種「日本晴」と栽培インディカイネ品種「カサラス」の品種間差を利用した交雑後代を用いたQTL(Quantitative Trait Loci:量的遺伝子座)解析から、脱粒性に関与するQTLを明らかにしている。本研究では、候補遺伝子の機能解析および下流の候補遺伝子の組織特異性の発現解析、過剰発現体の作出、遺伝子破壊系統等を用いた経時的な形態観察により、各遺伝子の脱粒性における役割を明らかにすることを目的とした。これまでの経時的な形態観察により、イネの脱粒性は、離層形成の分化のステージと離層の崩壊のステージの2つの段階に大別してとらえることができる。そこで、本研究では、研究期間内に、最新の手法であるレーザーマイクロダイセクション法を用いた離層特異的な組織由来サンプルのマイクロアレイ解析の結果から見いだした、新規脱粒性遺伝子OSH15およびOSH15の生物学的作用に関して、下流の候補遺伝子について、発現解析、過剰発現体の作出、遺伝子破壊系統等を用いた経時的な形態観察を行い、生物学的役割を明らかにし、脱粒性における離層の形成および崩壊の分子機構におけるOSH15遺伝子の貢献を明らかにした。

本研究では、候補遺伝子の機能解析および下流の候補遺伝子の組織特異性の発現解析、過剰発現体の作出、遺伝子破壊系統等を用いた経時的な形態観察により、各遺伝子の脱粒性における役割を明らかにすることを目的とした。これまでの経時的な形態観察により、イネの脱粒性は、離層形成の分化のステージと離層の崩壊のステージの2つの段階に大別してとらえることができる。そこで、本研究では、研究期間内に、最新の手法であるレーザーマイクロダイセクション法を用いた離層特異的な組織由来サンプルのマイクロアレイ解析の結果から見いだした、新規脱粒性遺伝子OSH15およびOSH15の生物学的作用に関して、下流の候補遺伝子について、発現解析、過剰発現体の作出、遺伝子破壊系統等を用いた経時的な形態観察を行い、生物学的役割を明らかにし、脱粒性における離層の形成および崩壊の分子機構におけるOSH15遺伝子の貢献を明らかにした。脱粒性とは、穂から種子が脱粒する性質であり、自然界では、種子の拡散による繁殖戦略として重要な性質であるが、作物として考えた場合、強い脱粒性は、収穫量の減少につながる。そのため、栽培化の過程で、古代人によって最初の選抜の対象となった農業形質であると考えられてきた。また、脱粒性は、脱穀技術との関連が深いことから、今日でも重要な農業形質の1つである。これまでに、イネの農業形質と関わりのある栽培化遺伝子の単離および置換系統の作出においては、申請者らは、イネの脱粒性を制御する遺伝子として、栽培ジャポニカイネ品種「日本晴」と栽培インディカイネ品種「カサラス」の品種間差を利用した交雑後代を用いたQTL(Quantitative Trait Loci:量的遺伝子座)解析から、脱粒性に関与するQTLを明らかにしている。分子育種学H24年度は、出産により研究中断したため。論文投稿の準備を進める段階まできたため。候補遺伝子の機能解析および下流の候補遺伝子の組織特異性の発現解析、過剰発現体の作出、遺伝子破壊系統等を用いた経時的な形態観察により、各遺伝子の脱粒性における役割を明らかにすることができているため。1. OSH15下流の候補遺伝子の機能証明2.候補遺伝子の組織特異的な発現解析による機能証明追試や発展研究を行いつつ、論文投稿の準備を進める。1. OSH15下流の候補遺伝子の機能証明2.候補遺伝子の組織特異的な発現解析による機能証明繰り越し金が発生した状況:H23年度に、妊娠により、産前産休を取得したためH24年度:出産による研究中断
拡散燃焼における微粒子生成に関する研究

拡散燃焼において発生する微粒子は各種熱機関の高率を低下するばかりでなく,大気中に排出されるものは健康上,環境上有害であるため,その抑制を目指して現在多方面で生成機構に関する研究が進められている.本研究は燃焼過程中の濃度不均一場における微粒子の生成および消滅の過程を理論的ならびに実験的に解明するものであり,以下のことを行った.1.多成分化学平衡組成から求めたすす前駆物質濃度にもとづき火災内におけるすすならびに軽質有機微粒子の生成を予測し,加圧流動反応管を用いて発煙傾向の予測精度を実験的に検証した.さらに,均一核凝縮の理論を適用した平衡論モデルによってすす微粒子の生成量を定量的に予測できることを示すとともに,微粒子生成過程に及ぼす乱れの作用を示した.2.ディーゼル機関の燃焼ならびに汚染物質の生成に大きく影響を及ぼす噴霧の挙動について高速度撮影および高速ガス摂取による燃焼ガスの組成分析を行い,着火遅れ前の燃料の分解と酸化の新興について明らかにした.さらに,小形高速機関に多く用いられる深皿形燃焼室内の局所ガス組成を分析することにより,噴射時期,燃焼室形場およびスワール比の微粒子排出に及ぼす影響をガス流動と関連させて明らかにした.3.ディーゼル火災の高速度写真を画像処理することにより,微粒子生成に重要な役割を果たす燃焼中のガス流動とくに乱れを推定する方法について検討した.この方法を用いて火災の挙動を調べることにより,スワールならびに燃焼室形状が火災の挙動に及ぼす影響を明らかにした.4実験で得るられた知見にもとづいて乱流混合モデルを考察し,これによりディーゼル機関からの微粒子排出量を予測するとともにその低減を指針を示した.拡散燃焼において発生する微粒子は各種熱機関の高率を低下するばかりでなく,大気中に排出されるものは健康上,環境上有害であるため,その抑制を目指して現在多方面で生成機構に関する研究が進められている.本研究は燃焼過程中の濃度不均一場における微粒子の生成および消滅の過程を理論的ならびに実験的に解明するものであり,以下のことを行った.1.多成分化学平衡組成から求めたすす前駆物質濃度にもとづき火災内におけるすすならびに軽質有機微粒子の生成を予測し,加圧流動反応管を用いて発煙傾向の予測精度を実験的に検証した.さらに,均一核凝縮の理論を適用した平衡論モデルによってすす微粒子の生成量を定量的に予測できることを示すとともに,微粒子生成過程に及ぼす乱れの作用を示した.2.ディーゼル機関の燃焼ならびに汚染物質の生成に大きく影響を及ぼす噴霧の挙動について高速度撮影および高速ガス摂取による燃焼ガスの組成分析を行い,着火遅れ前の燃料の分解と酸化の新興について明らかにした.さらに,小形高速機関に多く用いられる深皿形燃焼室内の局所ガス組成を分析することにより,噴射時期,燃焼室形場およびスワール比の微粒子排出に及ぼす影響をガス流動と関連させて明らかにした.3.ディーゼル火災の高速度写真を画像処理することにより,微粒子生成に重要な役割を果たす燃焼中のガス流動とくに乱れを推定する方法について検討した.この方法を用いて火災の挙動を調べることにより,スワールならびに燃焼室形状が火災の挙動に及ぼす影響を明らかにした.4実験で得るられた知見にもとづいて乱流混合モデルを考察し,これによりディーゼル機関からの微粒子排出量を予測するとともにその低減を指針を示した.本研究では圧縮点火機関や各種燃焼装置から大気に排出される微粒子の低減を目指し、すすおよび軽質有機微粒子の生成および再燃焼の機構を明確にする目的で次のことを実施した。1.固形炭素を含む多成分化学平衡組成を求め、種々の燃料・温度・圧分条件でのすすならびに可溶有機成分(SOF)の生成量を予測した。すす粒子の生成は無核凝縮過程と扱い、粒子の表面自由エネルギを考慮して平衡組成を求めたところ、流動反応管を用いて得られた各種気体燃料熱分解時のすすならびにSOFの生成傾向を合理的に説明できることがわかった。このことから、実用燃料では火炎の高温から熱を受けること(過剰エンタルピ授受)によって微粒子が生成すると推定され、定容燃焼装置を用いて実験的に確めた。これにもとづいて、層流火炎では物質と熱移動の不均衡のため局所過剰エンタルピが多く微粒子の生成量が多いのに対し、これらが同時に起こる乱流火炎では過剰エンタルピが少なく微粒子の生成量が少ないことを推論した。2.ディーゼル機関内の非定常拡散燃焼における濃度不均一の時間推移を確率過程論モデルで表現し、すすが燃料の濃い部分から生じると考えてすす生成量を予測した。これによって容積膨張に伴って乱流混合が遅れることを考慮すれば、排気弁開時まで残る高濃度部から平衡析出するとしてすす生成量を予測できること、およびすす生成に及ぼす噴射と気流の作用が不均一性と乱流混合の立場から説明できることを示した。3.乱流混合に重要な役割を果すエンジンシリンダ内の乱れおよびスワールをレーザホモダイン法を用いて測定し、スワールがあると圧縮終わりではシリンダ軸近くにスケールの大きな強い乱れを生じることが示された。
食道癌におけるmicroRNA関連遺伝子の分子生物学的機序

食道癌臨床検体および細胞株におけるマイクロRNA関連遺伝子の発現解析と,食道癌細胞株への導入実験は2006年12月Clinical Cancer Researchで報告した通りである。本年度は食道癌臨床検体および食道癌細胞株におけるマイクロRNA発現プロファイルを、すでに抽出してある検体および細胞株のtotalRNAを使用し,試薬としてTaqMan[○!R]MicroRNA Assaysを用い食道癌におけるマイクロRNA発現パターン解析を行った。臨床病理学的データと照らし合わせ,統計解析し検討した。食道癌臨床検体30例にてマイクロRNA73種類について発現解析・臨床病理学的因子との検討を行なった。その結果,癌部での高発現群6種,低発現群4種認めた。また,各マイクロRNAと予後との検討を行なったところ,6種にて単変量解析にて有意な差を認めた。そのうちmir-129に関しては,多変量解析でも有意差を認め,独立した予後因子であることが示唆された。以上のtrainig cohortを基に,test cohortを12例について解析したが,同様な結果が得られた。予後マーカーとしての有用性や今後の創薬の可能性が考えられた。現在までに食道癌細胞株を用いた発現解析,発現抑制解析を行っているが,有意な結果は得られていない。食道癌のマイクロRNA発現量解析・臨床病理学的因子との検討については,現在論文作成し投稿中である。食道癌臨床検体を用いたマイクロRNA関連遺伝子の網羅的解析臨床病理学的背景の異なる、72症例の食道癌検体(癌部、非癌部)からのgenomicDNAおよびRNAを抽出し、cDNAの作成を行った。マイクロRNA関連遺伝子の発現解析を、広く定評のあるアプライドバイオシステムズ社のABI 9700 PCR system【○!R】,Applied Biosystems 7500FastリアルタイムPCRシステムおよびTaqMan【○!R】Gene Expression Assaysを用い、癌部および非癌部について、各遺伝子の発現レベルを定量した。マイクロRNA関連遺伝子としてマイクロRNAのブロセッシングの上流を担っているDICER1,DGCR8,RNASENの三種類を選択し、それぞれについて解析を行った。この三種類の遺伝子の中では特にRNASENにおいて非癌部に比べ癌部での発現レベルが高いことがわかった。また各臨床病理学的因子との関連を統計解析し、検討したところ、RNASENの発現が高値の群で予後に悪影響を及ぼすことが分かった。我々はこのRNASENに注目し細胞株を用い、RNAiの手法を用いRNASENタンパクの抑制実験を行った。RNASENの低下は細胞増殖に影響を及ぼすことが分かった。さらに、臨床検体と細胞株において免疫染色を用いた実験では、腫瘍でRNASENの発現を認め、腫瘍の先進部にRNASENの発現が特に強く認められた。またRNASENの発現は細胞質でも認められ、癌における局在異常の可能性も示唆された。今回我々は、マイクロRNAのプロセッシングを担う遺伝子の上流の検索を行い、上記結果を得ることができた。現在も、食道癌におけるマイクロRNA自体の発現のプロファイルについても研究を進めており、進行中である。
神経回路形成の分子機構

昭和63年から3年間に亘って実施された本重点領域研究「神経回路形成の分子機構」に於いては、神経発生学分野で、分子生物学の方法を積極的に利用している研究者と、神経回路形成の最終段階であるシナプスの研究を積極的に進めている分子神経生物学者を組織し、研究を進めた。その結果、神経系の発生分化、細胞接着、神経突起伸展、成長因子、シナプス形成機構、受容体等について多数の優れた成果を得、我が国の神経発生学に関する研究を著しく推進することが出来た。
子ども虐待におけるリスク予測と効果的対応のリコメンド：人工知能技術活用の基礎研究

背景:申請者はこれまで10年間、子ども虐待現場の問題を明確にするため、グラウンデッドセオリーアプローチにより現場のニーズと知見を仮説生成してきた。その結果、“現場では同じようなリスクレベルの事例でも、ケースの特性に合わせた対応ではなく、担当者の力量や管理職の考え方によって方針が異なることのほうが多い"という仮説をデータに基づき得た。得られた仮説から、同じような失敗(連携のミス、意思決定の不十分さ、リスク査定のバイアス)で虐待死亡事例がパターンとして起きているのであれば、似たようなパターンを検出できるAIを、人間による判断の補助として借りるほうが現場支援のニーズに効率的に答えられると考えた。本研究の目的:自治体の児童相談データを元に、再発事例と未再発事例を比較し、どのような意思決定と具体的対応が、再発事例に繋がるかを予測する。方法:5年間の1自治体の児童相談所の虐待対応データから、再発事例(児相が安全と考え終結したが、2年以内に再度通告となった事例で、虐待が繰り返されリスクが高い事例と判断)になるかどうかを、1基本属性及びリスクアセスメント(数値・論理値)データによるBayese Inference及びBayesian Network、2意志決定の説明責任(テキストデータ)と基本属性及びリスクアセスメントデータ(数値・論理値)について機械学習を用いた。結果:1傷アザがある場合、保護者が攻撃的・拒否的で話ができない場合、子どもや保護者が保護を求める場合、理由不明の傷アザがある場合などが再発事例に関係していた。2クロスバリデーションの結果、テストデータの正答率は90%程度であった。期待される成果:今回の結果から、確率モデリングによる再発有無に影響する説明要因、及び再発を予測する特徴量は把握できた。今後、これらの知見をさらに活用し、現場に補助として使ってもらうAI開発へ展開する。29年度が最終年度であるため、記入しない。山本恒雄・高岡昂太2017年度三重県児童相談データ分析報告書(未公刊)
狩猟採集民の学習における「教示の不在」―積極的関与はなぜ隠されるのか―

本研究では,狩猟採集民の学習実態の解明を見据え,狩猟採集生活を取り巻く環境と学習との関わりを視野に入れてきた。狩猟採集民にいまなお欠かせない狩猟採集の知識・技術を,子どもは狩猟採集実践に参与する中で獲得するとされる。狩猟採集社会における子どもの学習に関しては,生業活動への参与や,周囲との長時間の関わりなど,社会の柔軟性が強調されるが,では具体的にどのように達成されているのか,このような柔軟性と狩猟採集という生活様式がどう結びつくのか,いまだ実証的に示した研究はなかった。そこで報告者は,実際の狩猟採集活動で生起する微細な相互行為を検証する必要があると考えた。狩猟採集で代表的な活動である集団オニネズミ猟に注目したところ,子どもの参加を可能にする周囲の協力の3つの特徴を抽出した。[1]子どもの参入は,狩猟作業の妨げにならない機会が利用される。猟の進行中,偶然できた作業場のスペースに,子どもを配置させていた。しかしそこは,作業場のひとつとして重要な場所にちがいはなかった。[2]自発的に参入しようとする子どもの行為を承認する,また意味を与える。青年たちとの社会的状況へ自発的に参入しようとする子どもの行為に応答し,子どもの行為を共に解釈しなおしてやったり,質問に答えてやったりしていた。[3]資源へのアクセスを支える。作業に必要な道具,作業工程のなかで注目される環境の対象物,また経験者たちが狩猟中に用いることばといった異質で多様な資源に対して,大人や青年は子どもの接近を後押ししていた。変化し続ける狩猟の状況に応じて,実践へと学習過程を埋め込むその巧みさが明らかにされが,こうした彼らの行為の調整が,森の環境や活動の性質にうまく組み合わされることで達成されていることを示している。これは平等主義という社会規範に回収されがちな狩猟採集社会の子どもの学習研究に,新たな視座を提示したといってよい。フィールド調査とデータの確保により,研究課題で掲げた問題について,成果が上がっている。報告者は,国内外で情報発信を積極的に行い,国内学会とシンポジウムにて3件の発表を行った。また研究協力者として参加した「文部科学省科学研究費補助金(新学術領域研究)『交替劇』(ネアンデルタールとサピエンス交替劇の真相:学習能力の進化に基づく実証的研究)研究項目A-02『狩猟採集民の調査に基づくヒトの学習行動の実証的研究』」の報告書や図書を出版し,その成果の一部を発表した。カメルーン東部州に暮らす狩猟採集民バカ・ピグミーの大人一子ども間相互行為についての動画資料,および比較のための近隣農耕民ジメの大人一子ども間の相互行為についての動画資料を,引き続き収集・分析・分類する。以下の研究項目について今後の研究計画の基本方針を記す。「大人の行為調整における行為の分類」:大人が子どもに接する際に表出する関与の仕方は様々である。その行為がその場に応じてどのように生起するのかを点検し整理することで,狩猟採集という生業様式と大人の行為調整の関係を明らかにする。また,本研究では集団猟実践として,現在で唯一観察可能なオニネズミ猟に着目したが,民族誌資料などのさらなる検討,聞き取り調査により,オニネズミ猟とその他の集団猟に関する活動上の差異を明らかにし,諸活動と行為調整の関わりを体系的に整理する。アフリカ狩猟採集民の学習研究では,子どもは狩猟採集技術・知識は特定の個人によって教示されるのではなく,生業活動に参加し他者を模倣することで獲得され(Woodbum, 1982),他方大人も子どもにあまり関わらないとしばしば報告されてきた(Draper, 1976)。報告者の論点は,「狩猟採集社会の教示の存在の実証や,大人が子どもに関わらない動機を問うのではなく,むしろ大人が子どもに「関わらない」という〈見え〉を作り上げている具体的な行為そのものに着目する点にある。調査は,カメルーン共和国東部州に居住する狩猟採集民バカ・ピグミーの森のキャンプにて行われた。滞在中は各日に異なる子どもに同行し,朝6時から夕方18時までの行動記録を行った。その記録と同時に相互行為分析用として,子どもと大人の狩猟採集にかかわる共同作業の様子を動画に記録した。キャンプから戻った後, 2人のバカの男性の協力のもと,発話や,その意味の確認など,詳細な書き起こし作業を行った。対面相互行為の微細な分析から,大人の以下のような行為の調整が明らかになった。(1)狩猟採集作業への子どもの引き込み:参加の達成のために,大人は子どもが実践できる活動を状況に合わせてうまく配分したり,また作業が滞りなく進行するよう周囲の大人もまた,その大人を支えることが観察された。(2)子どもの自由な発話・行動の承認:大人が作業する横で,子どもたちだけで相互行為の枠組み構築を大人が承認したり,大人が子どもの発話を繰り返すことによって,子ども自身が主要な話し手であることを,当の子どもに示すなどの行為が確認された。(3)大人の視点の非強制,子どもの注視への信頼:採集植物を見つけた子どもに対し,子どもの応答をうまく引き出す質問を選択することで,共同注視を達成することが確認された。

狩猟採集社会における子どもの学習に関しては,生業活動への参与や,周囲との長時間の関わりなど,社会の柔軟性が強調されるが,では具体的にどのように達成されているのか,このような柔軟性と狩猟採集という生活様式がどう結びつくのか,いまだ実証的に示した研究はなかった。そこで報告者は,実際の狩猟採集活動で生起する微細な相互行為を検証する必要があると考えた。狩猟採集で代表的な活動である集団オニネズミ猟に注目したところ,子どもの参加を可能にする周囲の協力の3つの特徴を抽出した。[1]子どもの参入は,狩猟作業の妨げにならない機会が利用される。猟の進行中,偶然できた作業場のスペースに,子どもを配置させていた。しかしそこは,作業場のひとつとして重要な場所にちがいはなかった。[2]自発的に参入しようとする子どもの行為を承認する,また意味を与える。青年たちとの社会的状況へ自発的に参入しようとする子どもの行為に応答し,子どもの行為を共に解釈しなおしてやったり,質問に答えてやったりしていた。[3]資源へのアクセスを支える。作業に必要な道具,作業工程のなかで注目される環境の対象物,また経験者たちが狩猟中に用いることばといった異質で多様な資源に対して,大人や青年は子どもの接近を後押ししていた。変化し続ける狩猟の状況に応じて,実践へと学習過程を埋め込むその巧みさが明らかにされが,こうした彼らの行為の調整が,森の環境や活動の性質にうまく組み合わされることで達成されていることを示している。これは平等主義という社会規範に回収されがちな狩猟採集社会の子どもの学習研究に,新たな視座を提示したといってよい。フィールド調査とデータの確保により,研究課題で掲げた問題について,成果が上がっている。報告者は,国内外で情報発信を積極的に行い,国内学会とシンポジウムにて3件の発表を行った。また研究協力者として参加した「文部科学省科学研究費補助金(新学術領域研究)『交替劇』(ネアンデルタールとサピエンス交替劇の真相:学習能力の進化に基づく実証的研究)研究項目A-02『狩猟採集民の調査に基づくヒトの学習行動の実証的研究』」の報告書や図書を出版し,その成果の一部を発表した。カメルーン東部州に暮らす狩猟採集民バカ・ピグミーの大人一子ども間相互行為についての動画資料,および比較のための近隣農耕民ジメの大人一子ども間の相互行為についての動画資料を,引き続き収集・分析・分類する。以下の研究項目について今後の研究計画の基本方針を記す。「大人の行為調整における行為の分類」:大人が子どもに接する際に表出する関与の仕方は様々である。その行為がその場に応じてどのように生起するのかを点検し整理することで,狩猟採集という生業様式と大人の行為調整の関係を明らかにする。また,本研究では集団猟実践として,現在で唯一観察可能なオニネズミ猟に着目したが,民族誌資料などのさらなる検討,聞き取り調査により,オニネズミ猟とその他の集団猟に関する活動上の差異を明らかにし,諸活動と行為調整の関わりを体系的に整理する。フィールド調査とデータの確保により,研究課題で掲げた問題について,少しずつ成果が上がりつつある。報告者は,国内外で情報発信を積極的に行い, 3件の国内学会とシンポジウム,また2件の国際学会と国際シンポジウムにて発表を行った。
老化ならびにアルコール摂取に伴う脳内ストレス蛋白質の発現の変化

ストレス蛋白質は分子シャペロンとして細胞内での蛋白質レベルの恒常性を維持し、細胞の機能変化に伴う疾病や老化の防御に関与している可能性が考えられる。そこで本研究は脳内のストレス蛋白質、特にHsp70の生体における役割を更に明らかにするため、加齢に伴う発現の変化について検討した。その結果以下の点が明らかとなった。(1)5週齢から120週齢までのラット(Wistar系、雄性)において、脳内のHsp70発現量は加齢に伴い増加することが明らかとなった。一方、肝臓ではそのような加齢に伴う変化は観察されなかった。(2)脳内の各部位(小脳、中脳、大脳皮質、海馬、線条体、視床、視床下部、延髄・橋)によりHsp70の発現レベルは多少違いがあることも見いだされた。(3)食事制限を行った結果、同じ週齢(96週齢)の自由食群のラットに比べ、食事制限群のラット脳内ではHsp70の顕著な低下が認められたことから、脳内蛋白質の変化を引き起こすようなストレスが加齢に伴い増加し、食事制限はそのようなストレスをある程度抑制する効果があることが示唆された。(4)長期アルコール摂取による脳内ストレス蛋白質の発現への影響を検討した結果、120週齢の高齢ラットで脳内ストレス蛋白質の発現の増大が観察され、加齢に伴うストレス応答の変化が認められた。以上、本研究により脳内Hsp70の発現レベルは加齢、食事制限、アルコール摂取等により変動することが明らかとなった。Hsp70の発現レベルの変化は、ストレスの程度を反映しているとともに、Hsp70D自身の加齢による変化の可能性も考えられ、生体におけるストレス応答の制御が、脳の老化を抑制する重要な鍵となる可能性が示唆された。ストレス蛋白質は細胞内蛋白質の発現時から輸送、機能発現、分解に至る全過程においてその補助を担う重要な役割が明らかとなり、ストレス蛋白質と生体各組織における蛋白質の機能発現、恒常性維持ならびに疾病との関与について大きな関心が集まっている。本研究は、加齢に伴う脳の機能低下にどのようにストレス蛋白質が関与しているかを明らかにすることを目的として行われた。5週齢から96週齢までのラットを用い、加齢に伴う脳内のストレス蛋白質レベルの変動について調べた。本年度はストレス蛋白質の中で、量的に最も多く、機能についての研究が進んでいる70kDaのストレス蛋白質、hsp 70、について検討した。その結果、脳内のストレス蛋白質の発現レベルは加齢に伴い徐々に増加することが明らかとなった。これまで肝臓等においては、加齢に伴うストレス蛋白質の発現レベルの変動は報告されていない。この違いは成熟神経細胞が寿命の最も長い細胞であることに起因しているものと考えられる。脳において加齢に伴う細胞内の変性蛋白質の増加は、ストレス蛋白質の発現レベルが増加することによりある程度防がれ、生体の恒常性を維持するよう機能しているものと考えられる。また、老齢ラットでは脳内の部位によってhsp 70の発現レベルが異なることも見いだされた。これらの結果を基に来年度は、ストレス蛋白質の発現と脳内の酵素活性との変化との関連について更に検討し、ストレス蛋白質の発現調節における老化防御への可能性を探る。

(1)5週齢から120週齢までのラット(Wistar系、雄性)において、脳内のHsp70発現量は加齢に伴い増加することが明らかとなった。一方、肝臓ではそのような加齢に伴う変化は観察されなかった。(2)脳内の各部位(小脳、中脳、大脳皮質、海馬、線条体、視床、視床下部、延髄・橋)によりHsp70の発現レベルは多少違いがあることも見いだされた。(3)食事制限を行った結果、同じ週齢(96週齢)の自由食群のラットに比べ、食事制限群のラット脳内ではHsp70の顕著な低下が認められたことから、脳内蛋白質の変化を引き起こすようなストレスが加齢に伴い増加し、食事制限はそのようなストレスをある程度抑制する効果があることが示唆された。(4)長期アルコール摂取による脳内ストレス蛋白質発現への影響を検討した結果、120週齢の高齢ラットで脳内ストレス蛋白質の発現の増大が観察され、加齢に伴うストレス応答の変化が認められた。以上、本研究により脳内Hsp70の発現レベルは加齢、食事制限、アルコール摂取等により変動することが明らかとなった。Hsp70の発現レベルの変化は、ストレスの程度を反映しているとともに、Hsp70自身の加齢による変化の可能性も考えられ、生体におけるストレス応答の制御が、脳の老化を抑制する重要な鍵となる可能性が示唆された。
コレステロール動態調節に関わる新規遺伝子noppera-boの機能解明

申請者は、ステロイドホルモン生合成に関わる新規分子Noppera-boの機能解明を目指した。ショウジョウバエとカイコガを用いた機能欠損個体の表現型解析から、Noppera-boがステロイドホルモン生合成器官でのコレステロールの挙動調節に関わることを示した。さらに、Noppera-bo組換えタンパク質と酵素活性検出用蛍光プローブ、低分子化合物ライブラリーを組み合わせたスクリーニング系を利用して、Noppera-boがある種のステロイドと結合することによって酵素活性を変化させることを見出した。この結果は、Noppera-boの内在性基質は何らかのステロイド類であることを示唆する重要な成果である。本研究は、申請者らが同定したコレステロール動態の調節に関わる新規タンパク質Noppera-bo(以下、Nobo)の機能を、キイロショウジョウバエを主材料に明らかにすることを目指している。本年度は、研究実施計画に挙げた3つの主要なアプローチのうち、Noboタンパク質を用いた生化学的な基質探索、およびnobo機能低下個体の機能解析と基質探索を実施した。Noboタンパク質を用いたアプローチについては、Noboによってグルタチオン化されるタンパク質の候補、およびNoboタンパク質と相互作用するタンパク質の候補を、SDS-PAGEのバンドレベルで10カ所以上見出し、それぞれのバンドに含有されるタンパク質の同定を質量分析機器を利用して行った。現在、これらの中のいずれかが真の基質であるかの絞り込みを行っている。一方、nobo機能低下個体を用いたアプローチにおいては、これらの個体の表現型がコレステロールの蓄積異常にあることを分析化学的に確認したと共に、細胞内のコレステロール動態調節に関わる既知候補分子(ニーマンピック病原因遺伝子タイプ1分子、Rabファミリー)のnobo機能低下個体における挙動の追究とおよびタンパク質相互作用の検討を行った。一方で、研究実施計画に挙げていたもう1点のアプローチであるメタボローム解析については、解析に要する一定量以上のキイロショウジョウバエの組織(ステロイドホルモン生合成器官)の収集が想像以上に困難であることが分かった。より大型昆虫での解析が妥当であると判断し、カイコガのnobo遺伝子のノックアウト個体の作出を実施した。カイコガのnobo遺伝子の完全機能欠損株の候補の分離には成功し、幼虫期致死であることを確認した。本研究は、コレステロール動態の調節に関わる新規タンパク質Noppera-bo(以下、Nobo)の機能の解明を目指している。研究実施内容として、Nobo組替えタンパク質を用いた生化学的解析、nobo機能低下個体の機能解析と基質探索、そしてメタボローム解析を用いたアプローチの3つの計画を立てた。このうち、Nobo組替えタンパク質を用いたアプローチについては、Noboの酵素活性を簡便に追尾する試験管内反応系の確立に成功し、Noboの活性を変化させる因子の1つがステロイド類であることを見出した。すなわち、Noboの酵素活性は、ステロイドホルモン生合成器官内に存在するステロイド類そのもので変化を受ける可能性を見出すことができた。ショウジョウバエnobo機能低下個体を用いたアプローチにおいては、nobo個体の表現型解析とコレステロール動態調節に関する細部にわたるデータを整備し、原著論文の公表を実現させた。一方、ショウジョウバエnobo機能欠損個体において、昨年度までに見出した基質候補分子のグルタチオン化状態の検討を行ったが、明瞭な結論を得るに至ることはできなかった。最後に、メタボローム解析については、昨年度の段階で解析に要する一定量異常のキイロショウジョウバエの組織の収集が困難であることを認識した。このことから、より大型昆虫での解析が妥当であると判断し、カイコガのnobo遺伝子のノックアウト個体を作出し、本年度はその表現型解析に努めた。カイコガのnobo遺伝子の変異体は幼虫期致死であること、その致死性がエクジステロイド生合成の低下によるものであること、そして変異個体の前胸腺ではステロールの顕著な蓄積が認められることを明らかにした。本年度中に記載論文の投稿を済ませた。本研究は、コレステロール動態の調節に関わるタンパク質Noppera-bo(以下、Nobo)の機能解明を目指した。昨年度までに、カイコガのnobo遺伝子のノックアウト個体を作出して表現型解析を実施し、noboが昆虫種を超えてコレステロール動態調節に関与することを明らかにした。本成果は本年度に論文として公表した。併行して、Noboの内在性基質を解明するために、Noboの生化学的および構造生物学的な研究に従事した。昨年度までに、Nobo組換えタンパク質を用いたNoboの酵素活性を簡便に追尾する試験管内反応系の確立に成功した。今年度は、哺乳類女性ホルモンであるエストラジオールが、試験管内反応系においてNoboの酵素活性を強く阻害することを見出した。この成果は本年度に論文として公表した。エストラジオールはステロイドであることを踏まえて、多様なステロイド類のNoboへの阻害活性を検討した。その結果、ステロイド類の一部、特に昆虫の主要ステロイドホルモンであるエクジステロイドの生合成前駆体の一部が、Noboの酵素活性を強力に阻害することを発見した。また、これらのステロイドがNoboと物理的に直接結合すること、そして構造的にもNoboの特定のタンパク質部位と特異的な相互作用をすることを確認した。これは、ある種のステロイド類がNoboの阻害活性を持つことを示すとともに、昆虫発生時のNoboの内在性基質はステロイド類であることを示唆する重要な成果である。