hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
雌の究極的な退化を伴うミノガ科の多様性に関する系統進化学的研究

これまで収集した国内産ミノガ科の材料のうち、雌が有翅有脚型で本科の中では原始的な国内未記録の属Eumasia属2新種について、新種記載とその系統的考察を行った論文を共著で生成し、日本蛾類学会誌TINEAに発表した。この3年間にわたる研究成果として、ミノガ科の形態退化のプロセスを系統発生との関連のもとに解明する為の系統資料を得る目的で、国内産16属19種と外国産2属3種のミノガについて、形態形質に基づく系統解析とmtDNAのND5領域の塩基配列に基づく系統解析を行なった。その結果、無翅無脚型のオオミノガ亜科は両解析で共に単系統性が支持され、またいくつかの単系統群の中でそれぞれ有翅有脚型と無翅有脚型が共に現れており、雌の退行的進化が複数回独立に起きたことが示唆された。この成果は日本昆虫学会第65回大会(岡山;9月)で発表した。アジア熱帯地域の熱帯山地性ミノガ科について資料収集の為に、マレーシアのボルネオ島にあるキナバル山にて、ミノガ科の生息環境、蛹化・羽化状況、幼虫の摂食物の探索など野外調査を行なった。その結果、新属新種を含めて20種以上のミノガを発見し、その中には従来のミノガ進化の定説を覆すような生活様式を行なう種も見出された。この調査結果は日本昆虫学会九州支部・日本鱗翅学会九州支部合同大会(大分;12月)で発表した。九州中央山地の照葉樹林の原生林にある巨大ウロ内に生息する新属新種となるミノガを発見し、このミノガは雌が原始的な有翅型であるにもかかわらず、成虫がミノ内で羽化した後にミノの外に脱出するという、特異的な生活様式を持っていることを明らかにした。本種は広い林内でも生息場所が非常に局限されているため、生息状況の調査を行い、その希少性が確認された。現在は、これまでの研究成果を論文として国内外の学会誌に発表するべく、執筆中である。これまで蓄積した東アジアのミノガ科の標本に基づいて得た形態及び生態データをまとめ、5つの新属新種について系統学的な論文を完成又は執筆中である。そのうちの1種は、春の調査で新たな生息場所を発見し、不足していた生態データを得るため飼育し、生態的知見も含めた系統分類学の論文を作成し、Entomological Scienceに投稿中である。この論文の一部を10月の日本昆虫学会大会にて発表した。また日本産未記載のEumasia属2種の論文もTineaに投稿した。早春から晩秋にかけて南九州中心に国内で材料収集及び現地調査を行った。得た幼虫個体の大半は飼育して生態等のデータを収集し、また翌年度の実験材料として成虫を得る作業を行った。これらの中には新属新種又は新種が含まれており、系統分類学的な考察を行うために詳細な生態データ収集と成虫を得るための慎重な飼育を行っている。飼育で得た成虫の一部は分子系統解析用の試料にした。11月下旬から国外の資料収集の為に、タイとベトナムでの現地調査を行い、生息場所、幼虫の摂食行動の観察、蛹化及び羽化状況の調査等を行った。すでに成虫が羽化したミノや幼虫の死亡したミノ等は回収して標本とし、生きた幼虫の一部は形態解析用または分子系統解析用の試料にした。また岡崎国立共同研究機構内にある基礎生物学研究所にて、分子系統解析の技術面の指導を受け、来年度以降につながる予備実験を行った。現在は国内産Diplodoma属群について形態形質と生態・行動形質をまとめており、今後、分子系統解析の実験を行い、その結果を加えて系統進化学的な考察を行い、研究成果の一部を8月にオーストラリアで開催される国際昆虫学会議で発表すると共に、論文執筆に取りかかる予定である。次年度は飼育により得られた成虫から形態データを収集すると共に、分子系統解析を本格に始める。また不足している材料収集を行いながら、実験等で得られた研究成果を国内外の学会大会や論文等にして発表を行う。これまで収集した温帯・亜熱帯性ミノガ科の材料から、1新属新種について形態学、生態・行動学的知見を含めた系統学の論文を作成し、日本蛾類学会誌TINEAに発表した。九州を中心に国内の野外調査で得た幼虫は飼育して生態データを収集し、羽化成虫は形態・分子系統解析用の試料とした。新属・新種については、生態データと多数の次世代成虫を得るために累代飼育中である。Diplodoma属単系統群についてmtDNAのND5領域の塩基配列を決定し、これに基づいて分子系統解析を行った。また形態データ、生態・行動データに基づく最大節約法で系統解析を行った。その結果、伝統的手法による系統関係を最大節約法による解析結果の樹形は類似し、また前者の系統関係を分子系統解析の結果の樹形は一致した。これらの3つの解析結果を比較して属間の系統関係を考察し、本群の進化学的考察を行った。この成果は第22回国際昆虫学会議(Australia, Brisbane ;8月)と第64回日本昆虫学会大会(札幌9月)で発表した。後者では、文科省科研費『北半球の温帯林に隔離分布する食材性・材穿孔性の昆虫類に関する系統生物地理学的研究』の研究集会で材穿孔固着性で紐状ミノを作るヒモミノガ類について生態・行動学的な研究結果を発表した。

11月中・下旬に南米(新熱帯区)の亜熱帯性ミノガ科の資料収集の為に、アルゼンチンで生息状況・蛹化・羽化状況等の野外調査を行った。すでに成虫が羽化した空ミノや幼虫の死亡したミノ等は回収して標本とし、羽化成虫は形態学・分子系統会解析用の試料にした。現在は日本産を中心に温帯・亜熱帯性ミノガについて形態形質の検討や生態・行動を纏め、分子系統解析の結果を加えて系統進化学的な考察を行い、逐次論文に書きあげる作業中である。これらの研究成果は、国内外の学会大会に発表すると共に、国際誌等に発表する予定である。これまで収集した国内産ミノガ科の材料のうち、雌が有翅有脚型で本科の中では原始的な国内未記録の属Eumasia属2新種について、新種記載とその系統的考察を行った論文を共著で生成し、日本蛾類学会誌TINEAに発表した。この3年間にわたる研究成果として、ミノガ科の形態退化のプロセスを系統発生との関連のもとに解明する為の系統資料を得る目的で、国内産16属19種と外国産2属3種のミノガについて、形態形質に基づく系統解析とmtDNAのND5領域の塩基配列に基づく系統解析を行なった。その結果、無翅無脚型のオオミノガ亜科は両解析で共に単系統性が支持され、またいくつかの単系統群の中でそれぞれ有翅有脚型と無翅有脚型が共に現れており、雌の退行的進化が複数回独立に起きたことが示唆された。この成果は日本昆虫学会第65回大会(岡山;9月)で発表した。アジア熱帯地域の熱帯山地性ミノガ科について資料収集の為に、マレーシアのボルネオ島にあるキナバル山にて、ミノガ科の生息環境、蛹化・羽化状況、幼虫の摂食物の探索など野外調査を行なった。その結果、新属新種を含めて20種以上のミノガを発見し、その中には従来のミノガ進化の定説を覆すような生活様式を行なう種も見出された。この調査結果は日本昆虫学会九州支部・日本鱗翅学会九州支部合同大会(大分;12月)で発表した。九州中央山地の照葉樹林の原生林にある巨大ウロ内に生息する新属新種となるミノガを発見し、このミノガは雌が原始的な有翅型であるにもかかわらず、成虫がミノ内で羽化した後にミノの外に脱出するという、特異的な生活様式を持っていることを明らかにした。本種は広い林内でも生息場所が非常に局限されているため、生息状況の調査を行い、その希少性が確認された。現在は、これまでの研究成果を論文として国内外の学会誌に発表するべく、執筆中である。
テネイシンCに着目したてんかん原性獲得過程の病態解明

脳に損傷が加わることで神経細胞死がおこり、それが様々な機序で成熟することでてんかん原性が獲得され、将来てんかんを発症することが知られている。しかし、てんかん原性獲得機序の解明を目指した様々な研究が行われてきたが、未だ解明には至っていない。そこで、痙攣発作により発現するマトリセルラー蛋白の1つであるテネイシンCに着目し、てんかん重積マウスモデルを用いて、テネイシンCの発現を抑制することで海馬の神経細胞アポトーシスが抑制され、さらにてんかん原性獲得を防ぐことができるか検討する。加えて、テネイシンCが神経細胞アポトーシス及びてんかん原性獲得を起こす情報伝達機構を解明する。
ホスホイノシチド可視化マウスと遺伝子欠損マウスを用いた細胞遊走制御機構の解析

イノシトールリン脂質(ホスホイノシタイド:PIs)は細胞膜の微量構成因子であり、多様な細胞応答の制御分子として機能する。我々は,種々の細胞外シグナル分子によって活性化されてホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸(PIP3)を産生するPI3Kや,PIP3を脱リン酸化して分解するPTEN, SHIP1, SHIP2の遺伝子欠損マウスを作製・解析した。その結果,これらの酵素が個体内においても種々の細胞応答制御に重要であり,その欠損はがんなどの様々な疾病へとつながることを見出した。さらに本研究で、ホスファチジルイノシトール二リン酸の代謝酵素欠損が様々な病態を導くことを見出した。これまでの生化学的手法では不可能であった、初代培養細胞レベル、あるいは個体レベルでのPIs動態解析を現実のものとし、種々の遺伝子欠損により誘発される疾患とPIs代謝の関連を解明することを目的として、遺伝子改変技術を応用したPIs動態解析ツールの作製とその活用方法の確立を本研究で行った。今年度は、PIP3可視化マウスとPIs代謝酵素欠損マウスの交配により、4系統の二重変異マウスを作製した。それらから調製した好中球やマクロファージを用いて、細胞遊走と貪食応答の制御においてPIP3代謝が極めて重要であり、これを調節する二つの分子を同定した。また、遺伝子欠損マウスでの細菌感染実験を行い、リステリア抵抗性を左右する、イノシトールリン脂質代謝酵素を同定した。ホスファチジルイノシトールのイノシトール環3,4,5位水酸基に可逆的なリン酸化を受けた8種類のホスホイノシチド(PIs)は,脂質性シグナル分子として個々に固有の機能を持ち,多様な細胞応答を制御する。我々は,種々の細胞外シグナル分子によって活性化されてPI(3,4,5)P3(PIP3)を産生するPI3Kや,PIP3を脱リン酸化して分解するがん抑制遺伝子産物PTEN, SHIP1,SHIP2の遺伝子欠損マウスを世界に先駆け作製・解析した。これまでの生化学的手法では不可能であった、初代培養細胞レベル、あるいは個体レベルでのPIs動態解析を現実のものとし、種々の遺伝子欠損により誘発される疾患とPIs代謝の関連を解明することを目的として、遺伝子改変技術を応用したPIs動態解析ツールの作製とその活用方法の確立を本研究では行っている。今年度はそのような解析ツールとして、PI(4,5)P2特異的可視化マウス、PIP3/PI(3,4)P2可視化マウス、PIP3特異的可視化マウスの作製を完了し、各々複数の系統を樹立し、さらにPI(3,4)P2特異的可視化マウスの作製を開始した。また、これまで決して解析することが出来なかった、マウス個体内の臓器、組織を構成する状態のままの細胞におけるPIs動態を、PIs可視化マウスを用いることで検出し、解析することに成功している。また、これまでに不可能であった、単離好中球の遊走に伴うPIsの挙動をリアルタイム解析することで、PIP3およびPIP2が対照的な細胞内動態を示すことを見出した。このように,医学的にも学術的にも意義を持つ新規の知見を今年度の研究で得ることができた。我々は,種々の細胞外シグナル分子によって活性化されてPI(3,4,5)P3 (PIP3)を産生するPI3Kや,PIP3を脱リン酸化して分解するPTEN,SHIP1,SHIP2の遺伝子欠損マウスを世界に先駆け作製・解析した。さらに今年度は、ホスファチジルイノシトール二リン酸の代謝酵素欠損が様々な病態を導くことを見出した。今年度はそのような解析ツールとして新たに、PI(3,4)P2特異的可視化マウスとPI(3)P特異的可視化マウスの作製とホモ接合体系統の樹立を完了した。また、昨年度に作製を完了したPIP3特異的可視化マウスと、PIP3産生酵素欠損マウスおよびPIP3分解酵素欠損マウスの交配によって、細胞遊走の制御においてPIP3代謝が極めて重要であることを見出した。遊走細胞の先導端へのPIP3の局在化を規定する酵素群を同定し、これらの酵素が欠損した動物個体での、免疫異常に関する知見を得た。

我々は,種々の細胞外シグナル分子によって活性化されてホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸(PIP3)を産生するPI3Kや,PIP3を脱リン酸化して分解するPTEN, SHIP1, SHIP2の遺伝子欠損マウスを作製・解析した。その結果,これらの酵素が個体内においても種々の細胞応答制御に重要であり,その欠損はがんなどの様々な疾病へとつながることを見出した。さらに本研究で、ホスファチジルイノシトール二リン酸の代謝酵素欠損が様々な病態を導くことを見出した。これまでの生化学的手法では不可能であった、初代培養細胞レベル、あるいは個体レベルでのPIs動態解析を現実のものとし、種々の遺伝子欠損により誘発される疾患とPIs代謝の関連を解明することを目的として、遺伝子改変技術を応用したPIs動態解析ツールの作製とその活用方法の確立を本研究で行った。今年度は、PIP3可視化マウスとPIs代謝酵素欠損マウスの交配により、4系統の二重変異マウスを作製した。それらから調製した好中球やマクロファージを用いて、細胞遊走と貪食応答の制御においてPIP3代謝が極めて重要であり、これを調節する二つの分子を同定した。また、遺伝子欠損マウスでの細菌感染実験を行い、リステリア抵抗性を左右する、イノシトールリン脂質代謝酵素を同定した。
早産児の腸管マイクロバイオームと網羅的遺伝子発現の解析及び母体腟細菌叢移植の検討

今回の研究では、これまでデータのない、日本における新生児の腸管細菌叢の正常形成経過および、形成阻害要因を検討することをまず目的としている。この目的のため、東京大学医学部附属病院で出生した正期産児約30名をリクルートした。これら研究参加者から、出生時と一か月検診時にそれぞれ便検体を採取し、16sリボソームRNAを用いたマイクロバイオーム解析を施行中である。一部のデータについては分娩形式などの産科要因をつきあわせ、関連の解析を開始している。また、マススクリーニング採血時に血液を採取し、網羅的遺伝子発現解析も行った。細菌叢確立と宿主の遺伝子発現の関連を検討しているところである。一か月健診の便検体採取の際に、生活習慣・体質・既往歴などに関するアンケート調査も行っており、回答が得られているので、マイクロバイオーム形成に関する要因があるかを解析検討を行っている。正期産児については目標エントリー数に達し、エントリーを終了した。便や血液の検体採取は完了し、解析は進行中である。正期産児の検体の採取は完了しており、残りのマイクロバイオーム解析と遺伝子発現解析を完了させる。その後、臨床データやアンケート結果との関連分析を進める。平行して、早産児のエントリーを行う。今回の研究においては、最終的には早産児の腸管マイクロバイオーム形成について検討し、網羅的遺伝子発現解析を行い、それらの関連について明らかにすることを目標としている。さらに介入試験として、帝王切開児に対して、母体腟細菌叢移植し、介入効果の検討を行う予定である。今年度は第一段階として、正常対照を定義することから開始することとなった。そこで、これまでにデータのない、早産児でない日本人正常新生児におけるマイクロバイオーム形成状況を明らかにするため、東大病院にて出生した新生児をリクルートし、出生後から検体を定期的に採取して時系列に検討するという計画を立案した。実際の研究開始にあたっては、最初に便検体の採取・保存・解析の最適化を検討する予備実験を行い、条件検討を行った。また、網羅的遺伝子発現解析のため、正常成人ボランティアの血液検体を使用して、サンプルの採取・保存・解析の条件検討を行った。次に、平成30年1月からは実際に新生児のリクルートを開始し、サンプル採取を開始している。平成30年4月25日現在19例の新生児がエントリーした。これらの新生児から出生直後にまず便検体を採取した。さらにマススクリーニング採血のタイミングで、網羅的遺伝子発現解析のための血液検体採取を行っている。さらに、研究参加者には、一か月健診の際に、新生児のマイクロバイオーム形成および遺伝子発現においてに交絡因子となり得るような生活習慣や体質や既往歴などに関するアンケート調査を配布し、それについても順調に回答を得られているところである。これまでのところ、予備実験において便検体の扱いを最適化でき、血液検体についても単核球分離を行うことで遺伝子発現解析を最適化できている。また、新生児のリクルート・検体採取も順調に行えている。引き続き新生児のエントリーを増やし、目標数に到達したところで一旦エントリーを打ち切り、解析に移行する。その後は早産児の検体採取および解析にとりかかり、早産児での特徴がある程度判明したところで介入試験の開始について検討する。
地域生活に根ざしたスポーツツーリズム論の構築をめざす社会学的基礎研究

グローバリゼーションが浸透した現代において、どのように持続的スポーツツーリズムが地域生活と共在関係を築くのか。この問いを鍛えるべく、竹内利美の「生活組織論」から地域生活の動態を捉える理論的整理を実施した。特に、漁村生活の社会的特性を、漁港や漁船の性能や規模などの「漁撈の手段」に規定された「漁組(漁撈労働の組織)」の個別化から把握する手法についての整理を行った。千葉県鴨川市で住み込み型フィールドワークを実施した。都会からの移住サーファーの日常生活(生業活動や地域組織での活動)と鴨川サーフィンの組織的展開をめぐる参与観察・聞き取り調査、大浦集落における住民組織、生産組織に同行し、参与観察、インタビュー、調査資料の収集を行った。それらを基に、最終年度のまとめに向けた基礎データとなる生産録、生産組織(漁組+漁業協同組合)、地域組織(氏子組織)をめぐる一次資料を作成した。スポーツやツーリズムフィールドワークおよび理論的整理を通じて、地域生活とスポーツやツーリズムが交錯する動的ありよう社会学的に分析していく足がかりを得た。最終的には、「地域活性化」という視角ではなく「生活組織化」という視角からの持続的スポーツツーリズムをめぐる政策提言の土台となる知見を導き出していきたい。おおむね順調に研究が進展している最大の理由は、充実したフィールドワークが実施できている環境にある。これまでの長期にわたる関係構築、恵まれた研究環境、家庭環境に感謝する。今後も、現場での「問い」と学術的「問い」を切り結ぶための理論的・方法論的模索を続ける。来年度からは「移動性」「生活組織化」をキーワードに研究を続けていく。この問いを鍛えるべく、ジョンアーリの「モビリティーズー移動の社会学」を中心にスポーツやツーリズムを「移動性」から捉える理論的整理を実施した。長期休暇を利用し、千葉県鴨川市における徹底した住み込み型フィールドワークを実施した。それらを基に、最終年度のまとめに向けた基礎データとなる生産組織、地域組織、年序性別集団をめぐる一次資料を作成した。さらに、漁業センサス、農業センサス、住民基本台帳等のデータ収取を実施した。上記したデータをとりまとめ、最終度の研究活動を念頭に、大浦集落の社会的特性を把握するための一次資料を作成した。フィールドワークおよび理論的整理を通じて、持続的スポーツツーリズムと地域生活が交錯していくプロセスを、移住サーファーが従事する生業や地域生活の場のリアリティに即しながら社会学的に分析から解明していく足がかりを得た。つまり「地域活性化」という視角ではなく「在地化」という視角から現象を再構成することで、新たな地域政策の土台となる知見を導き出していきたい。おおむね順調に進展している最大の理由は、長期間にわたる現地との「お付き合い」にある。その結果として、フィールドワークが順調に進んでいる。今後は、現場での「問い」と学術的「問い」を切り結ぶための理論的・方法論的模索にある。来年度も「移動性」というキーワードを追求しつつ、他の「キーワード」を模索したい。春季に計画指定していた現地調査を諸事情により実施できなかったため。本年度に、現地調査回数を増やす。2月に予定をしていたフィールドワークを諸事情により実施ができなかったため。来年度は、フィールドワークの回数を増やすことで対応する。
抑うつ状態で精神科に入院した患者の回復過程における認識

本研究の目的は、抑うつ状態の患者の回復過程の認識を明らかにすることである。抑うつ状態で精神科に入院療養後退院した患者14名(男性5名、女性9名、平均年齢52.2歳)に対し、倫理的手続きを踏んだ上で半構成的面接をした。データは、1.状態が改善したと感じた拠り所は何か、2.改善に役立った看護援助は何か、の2つの視点で質的帰納的に分析した。分析の結果、抑うつ状態患者の回復過程を、患者の《主体性》を中心概念とする、私らしさの再形成のプロセスとして明確化した。《主体性》とは、自ら考え・選択・決定し自分で実行する力であった。判断基準は、<行動の変化><症状の変化><抗うつ薬の影響><他者との相互作用>の4つで、判断スキルとして頻繁に用いられたのは<比較><時間>であった。回復過程は、判断基準と判断スキルを用いることにより主体性の高低が特徴づけられた3つの段階、<わからない私><試す・探す私><わかる私>を見出した。改善に役立つ看護の中心概念は《私に合わせる》であった。<私を見守る><私を尊重する><私に負担をかけない><私ができるために支える>の4つのカテゴリーと<気にかける>から<肯定的評価>迄の14のサブカテゴリーが見られた。《主体性》と対応しており回復段階に合わせた看護が改善に意義があったと認識されていた。以上のことより、抑うつ状態患者の看護は、患者がどの回復段階であるかを査定し、判断スキルを適宜用いられるような状況設定を行うと共に、患者が改善したと認識している部分に働きかけることが大切であると示唆された。今回、看護に対する患者からのフィードバックを得たことは、困難を感じている看護者の感情体験を支え有用感を高めると思われる。方法:抑うつ状態で入院療養後退院した患者に対し、倫理的手続きを踏んだ上でインタビューを行い質的帰納的に分析した。解釈を偏りなく行うために研究者間と精神科経験のある看護職者で検討を繰り返し、患者にも分析結果を示し確認した。結果及び考察:現場点での参加者は男性3名、女性7名の計10名。分析の結果、抑うつ状態患者の回復過程は"自分らしさの再形成"のプロセスであった。中心概念として《自己の主体性》が抽出された。第一段階:主体性が低下した<わからない自分>、第二段階:試行錯誤する<試す自分>、第三段階:主体的な<わかる自分>への変化が示された。回復過程の状態の認識として、4つのカテゴリー:<行動の変化><症状の変化><薬の効果><他者との相互作用>が抽出され、認識skillは<比較>や<時間>が見られた。行動は、できる・できないといった面から認識し、できるとはセルフケアや役割行動の自立を意味していた。<症状の変化>は身体と精神症状があり、悪化・改善の面から認識していた。<薬の効果>は症状に影響し状態の認識につながった。他患者・看護婦・医師・家族他などのく他者との相互作用>の中で認識が変化していた。病前と今の自分または他患者との<比較>をし、本来の自己を再形成していた。

患者なりの<時間>的感覚を持っており、その時々で状態を認識し判断した上で療養生活を送っていたことが分かった。分析結果から抑うつ状態の患者の主体性向上の時期を目安にアプローチすることが効果的ではないかと推察され、看護へのフィードバックにつながる意義ある研究成果を得た。以上の結果を平成13年度看護科学学会で発表した。今後は参加者を増やし、看護の認識についても分析を進めていく予定である。本研究の目的は、抑うつ状態の患者の回復過程の認議を明らかにすることである。抑うつ状態で精神科に入院療養後退院した患者14名(男性5名、女性9名、平均年齢52.2歳)に対し、倫理的手続きを踏んだ上で半構成的面接をした。データは、1.状態が改善したと感じた拠り所は何か、2.改善に役立った看護援助は何か、の2つの視点で質的帰納的に分析した。分析の結果、抑うつ状態患者の回復過程を、患者の《主体性》を中心概念とする、私らしさの再形成のプロセスとして明確化した。《主体性》とは、自ら考え・選択・決定し自分で実行する力であった。判断基準は、<行動の変化><症状の変化><抗うつ薬の影響><他者との相互作用>の4つで、判断スキルとして頻繁に用いられたのは<比較><時間>であった。回復過程は、判断基準と判断スキルを用いることにより主体性の高低が特徴づけられた3つの段階、<わからない私><試す・探す私><わかる私>を見出した。改善に役立つ看護の中心概念は《私に合わせる》であった。<私を見守る><私を尊重する><私に負担をかけない><私ができるために支える>の4つのカテゴリーと<気にかける>から<肯定的評価>迄の14のサブカテゴリーが見られた。《主体性》と対応しており回復段階に合わせた看護が改善に意義があったと認識されていた。以上のことより、抑うつ状態患者の看護は、患者がどの回復段階であるかを査定し、判断スキルを適宜用いられるような状況設定を行うと共に、患者が改善したと認識している部分に働きかけることが大切であると示唆された。今回、看護に対する患者からのフイードバックを得たことは、困難を感じている看護者の感情体験を支え有用感を高めると思われる。
自己免疫疾患発症におけるToll様受容体の役割

本研究では、toll like receptor (TLR)を介する自然免疫がベーチェット病をはじめとした自己免疫病態にどのような役割を担うかを解明することを主目的とし、ベーチェット病の病態における自然免疫系の関与を改めて検討した。また、自然免疫系の炎症制御に作用することが知られているheme oxygenase (HO)-1の病態への関与も検討した。その結果の概要は以下のとおりである。3)健常者末梢血単核細胞より分離した単球および単球細胞株THP-1を熱ショック蛋白(heat shock protein ; HSP)65kDで刺激するとTNF-α産生が誘導されるがその産生はTLR4に対する中和抗体により部分的に抑制された。4)ベーチェット病患者の末梢血単核細胞、多核白血球におけるTLR2,4,9の発現をreal time PCR法により半定量的に解析した結果、これらの発現には特に異常を認めなかった。5)抗炎症作用を有するHO-1の発現は、マクロファージ活性化症候群といわれる成人スティル病、血球貪食症候群などの単球でその発現が増強し、ベーチェット病では多核白血球(好中球)において増強していた。その意義について、さらに検討中である。自己免疫疾患の発症、病態形成に微生物抗原の分子擬態を介した交差反応が関与している可能性は以前より指摘されていたが、近年、Toll様受容体(Toll like receptor ; TLR)を介した微生物成分(リポ多糖体、DNA、熱ショック蛋白(heat shock protein ; HSP)など)に対する自然免疫系細胞の反応も重要な役割を果たしていることが想定されている。本研究では関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、ベーチェット病の病態形成にTRLの役割を明らかにすることが目的であるが、本年度はまず健常者末梢血単核細胞、THP-1単球細胞株を用いてTLRの発現およびHSP65に対する反応へのTLRの関与について検討した。RT-PCR法により解析したところ、健常者末梢血単核細胞、THP-1単球細胞株ではTLR2、3、4、9の発現が確認され、好中球はTLR4を発現していたが、フローサイトメトリーを用いた蛍光抗体法では検出レベルになかった。現在、ウェスタン法による検出法を検討中である。末梢血単核細胞よりマグネットソーティングで純化したCD14陽性細胞をHSP65で刺激するとTNF-αが産生されるが、この産生は抗TLR4抗体の共存により部分的に抑制されたが、抗TLR2抗体はほとんど影響しなかった。一方、最近、自然免疫系の活性化による炎症に対して、heme oxygenase (HO)およびその代謝産物のCO、ビリルビンが制御的に作用するという成績が蓄積されつつある。これまで研究代表者らもHO-1の誘導がCOX-2やiNOSの発現、炎症性サイトカインの産生の抑制をもたらすことを見出しており、現在、TLRの発現あるいはTLRのシグナル伝達系にいかなる影響をあたえるか解析中である。自己免疫疾患の発症、病態形成に対する病原微生物の関与には、分子擬態を介した交差反応とともにToll様受容体(Toll like receptor ; TLR)を介した自然免疫系細胞の活性化も重要視されている。本研究では自己免疫疾患の病態形成にTRLの役割を解明することを目的とした。今年度は自己免疫疾患の中でも自然免疫系の活性化が強く関与すると考えらるベーチェット病を対象とし、末梢血単核細胞および好中球のTLR2,4,9のmRNAの発現をreal time PCR法により定量的に解析した。その結果、いずれも健常者との差異はなく、疾患活動性、病型との関連も見出せず、TLRの発現量自体は病態を直接左右するものではなく、むしろそのリガンドの存在、あるいは細胞内シグナル伝達系の閾値が病態形成に寄与している可能性が示唆された。一方、本研究では誘導性のheme分解酵素であるheme oxygenase(HO)-1がその産物であるCO、bilirubinなどを介して炎症制御に作用することに着目し、各種膠原病を対象に末梢血単核細胞におけるheme oxygenase(HO)-1の発現をmRNAおよび蛋白レベルで解析した。その結果、血球貪食症候群や成人スティル病など病態にマクロファージ活性化が関与する病態において発現が増強していることを見出した。

また、ベーチェット病においてはその活動期に、病態の中枢を形成する好中球においてHO-1の発現が増強しており、疾患活動性のマーカーとなりうることが示唆された。今後、こうしたHO-1発現増強がTLRをはじめとした炎症刺激の細胞内シグナル伝達機構にどう影響し、最終的な病態形成に関与しているのかを次の検討課題としたい。
自立のための日本帰属-沖縄・エスノナショナリズム運動としての「復帰」-

沖縄の戦後初期帰属議論の分析に対して以下2点からのアプローチを行った。(1)引揚経験と再移民の見通し:沖縄に帰還・流入した22万人余の引揚者が帰属意識に与えた影響を考えるため、引揚規模と時期の確認、戦前の経験、引揚後政治・社会活動、について先行研究をまとめた。また2009年5月にサイパン・テニアンを訪問し、同地を実際に見聞するとともに同道した引揚者から当時の話を伺う機会を得た。さらに、地元政党共和党の要綱と「うるま新報」「沖縄タイマス」に掲載された帰属議論の言説を、移民の記憶と再移民の可能性という観点から再整理した。その結果、帰属議論の一部に、過去の移民経験と将来の再移民可能性が影響している可能性が明らかとなり、将来の再移民の有利・不利という見通しが当時の帰属志向を規定する一要因であったのではないか、という仮説を得た。これは、戦前・戦争直後の沖縄の動態的な人口移動と経験の継続性から帰属議論を分析する視座を導入できたという点で、本研究にとって重要な進展である。(2)ハワイ沖縄系移民のリアクション:2010年1月から3月までハワイ大学を訪れ、日系紙『ハワイタイムス』と沖縄系月刊誌『更生沖縄』を閲覧・複写した。また当該時期にホノルルで生活していた人々から、戦後沖縄復興に対するハワイ側の反応と活動について聞き取りを行った。その結果、米軍を通じた沖縄救済運動や沖縄との通信内容から、ハワイの沖縄系移民の、沖縄の将来に対する深い関心を読み取ることが可能であることを確認した。またハワイと東京の間には、帰属問題の当事者ではないという自己認識と、現地沖縄人に対する苛立ちが共有され、両者と現地沖縄の間には認識上の権力関係が存在していたのではないか、という仮説を得た。沖縄の帰属問題へ、ハワイ沖縄移民という第三の側面からのアプローチを切り開くという点で有意義な研究であった。平成20年度は、戦後数年間の沖縄の帰属意識を明らかにする目的のもと、資料調査を行った。(1)福岡で1952年まで発行されていた「沖縄新民報」および鹿児島で発行されていた「新沖縄」という2つのメディアの読み込みを行い、当時の帰属意識が印刷媒体にどのように表われているかを調べた。その結果、沖縄以外の沖縄人コミュニティにおいて、帰属に関する議論や意思表明が積極的に行われていなかったことが明らかとなる一方、九州における疎開者や戦前からの沖縄人社会の状況について知見を深めることができ、また帰属の定まらない立場を表現する間接的な言い回し定型フレーズが流用されていたことが発見された。これらは、検閲や疎開による生活苦といった限られた条件の中で帰属という問題がどのように認識されていたのかを知る重要な手がかりである。沖縄外のメディアを精査することによって、これまで明らかにされていなかった沖縄と本土間の情報や物流の実態についても一端が明らかとなった。(2)沖縄と本土側の「復帰」主張の差異について調査を行った。沖縄地元紙で展開された帰属議論から「復帰」を支持した言説を沖縄と本土(主として東京)に分けて分析し、双方の「復帰後」の沖縄イメージに微妙な差異があることを明らかにした。行政的な「復帰」を第一とし、米軍の駐留継続を容認する傾向にあった東京側に対して、沖縄側には将来の基地の処遇に対する言及が殆どみられず、社会の「正常化」の契機として「復帰」がみなされていた可能性が浮かび上がった。(3)沖縄側で国連信託統治論を展開していた池宮城秀意の思想を探るため、未発表の原稿も含めたテキストの収集に当たった。本格的な分析はこれからであるが、1950年代前後において沖縄が抱いていた国際社会や国連に対するイメージ、および沖縄知識人の沖縄・セルフイメージを明らかにする上で重要な資料であると考えられる。

またハワイと東京の間には、帰属問題の当事者ではないという自己認識と、現地沖縄人に対する苛立ちが共有され、両者と現地沖縄の間には認識上の権力関係が存在していたのではないか、という仮説を得た。沖縄の帰属問題へ、ハワイ沖縄移民という第三の側面からのアプローチを切り開くという点で有意義な研究であった。
肝細胞癌の増殖、進展、転移における複合糖蛋白の糖鎖配列の分析と細胞機能の研究

1)肝細胞癌における血中、組織中糖脂質、糖脂質抗体の検討により、健常人と異なった、糖脂質抗原、抗糖脂質抗体のスペクトルを示した。2)細胞接着・細胞間相互作用に及ぼす糖脂質(ガングリオシドなど)の影響は、各種培養肝癌細胞に対し、ガングリオシド10μMの添加ではフィブロネクチン、ラミニンへの接着を阻害した。しかし、細胞数およびBrdUを用いての細胞増殖能の評価においては必ずしも一定の変化は与えなかった。3)肝細胞癌における尿中遊離型Fucose値は、癌の高度進展例では高値を示した。肝機能検査との相関、腫瘍マーカーとの関係、治療による変動、長期経過観察から、その上昇は肝機能低下による影響が主体と考えられ、腫瘍の発育、進展との関係は少ないように思われた。平成9年度研究状況Glycoscan Systemを用い、糖鎖分析のソフトを確立。細胞培養液、人血液、尿につき検討中。Glycoscan Systemは最近開発されたもので、各種糖分解酵素(遊離型糖を得る)と、蛍光ラベル後の電気泳動で複合糖質の糖鎖を解析する装置である。現在、同一検体を使用し、再現性の確認、解析手順の確立を行っている。肝細胞癌の増殖、進展、との観点より、癌細胞で活発な発現を認める複合糖鎖は細胞接着機能と密接な関係が認められており、ガングリオシドを中心に、細胞接着および細胞間の相互作用に及ぼす影響の確認を行っている。肝癌細胞としてはHepG2を使用、異なる条件下(細胞数、細胞周期別、血清、FCS添加の影響)にて培養液を採取、糖鎖分析開始している。なお細胞表面の複合糖質の分析にはフローサイトメトリイを用いた従来の方法では細胞膜の障害が問題となり、よりよい固定法につき検討中である。さらにラット肝癌発癌モデルを作成中、発癌に際しての細胞間情報をBrdU染色にて観察し、複合糖質への影響をみる。上記に平衡し、臨床的検討として肝細胞癌を含む各種肝疾患における血中Ganglioside(GM1、GM2、GM3など)の測定、および発癌との関係が重要とされているL-fucoseを尿中より遊離型Fucoseを指標とし、各種肝疾患および肝細胞癌症例にて検討中である。
南西諸島出土人骨の骨考古学的調査

南西諸島人骨格の形態と生活環境の関係を知るために、古病理学的調査と四肢骨の形態学的調査を行った。まず、石垣島の中・近世人骨を用いてストレス・マーカーの観察を行った。その結果、頭蓋骨については、鉄欠乏性貧血と関連することが知られているクリブラ・オルビタリアが6例(20例中)に認められ、全体に緻密質の菲薄化、板間層の拡大など、貧血傾向を示す所見が多くみられた。また、ほとんどの個体にエナメル質減形成が認められた。四肢骨については、骨折痕と思われるものが2例、前腕と下腿の骨髄炎が少なくとも2例にみられたほか、多くの四肢骨に骨膜炎の痕跡が認められた。さらに、少なくとも4例に肘関節の変形性骨関節症がみられるなど、生活環境の厳しさを示唆する所見が多数認められた。これらは、中・近世における八重山地方の人たちの生活の一端を示す興味深い事例と思われる。また、先史時代人の生活復元の試みとして、四肢骨形態の分析を行った。その結果、沖縄先史時代人は全体的に小柄ではあるが、上肢が良く発達したがっちりした体格であり、上下肢ともに相対的に遠位部が長い特徴を持つことが分かった。断面形の特徴は縄文人より弥生人に似ていたが、下肢に対して上肢が相対的に良く発達している点で弥生人とは違っている。沖縄先史時代人にみられる良く発達した上肢は漁労民の特徴と共通するものである。さらに、沖縄先史時代人では10%を越す頻度で外耳道骨腫が認められた。沖縄先史時代人における高頻度の外耳道骨腫は、彼等の生活と海との関係がそれだけ密接だったことを示していると思われる。本年度は、前半に、これまで琉球大学に収集することができた資料の整理を行い、観察と計測を行う予定であった。資料の整理はほとんど終えていたので、主に病変の有無について観察を行い、特に、石垣島の近世人骨に関節炎や骨膜炎が高頻度でみられるという、興味深い結果を得た。これらの知見については、平成11年3月の日本解剖学会全国学術集会において報告する予定である。後半に予定していたX線による病変部の観察は、X線写真撮影装置が予定より遅れて12月末に納入されたので少し遅れているが、現在、石垣島の資料を中心に観察を進めている。今年度、予想以上の収穫は、久米島の近世人骨を調査できたことである。人骨は保存状態も良く、100体以上のまとまった資料が得られる見込みで、沖縄本島周辺部の貴重な追加資料として、多くの情報を提供し得るものである。来年度以降、一部を琉球大学に運び、詳しい調査を行う予定である。本年度は、まず、昨年度から継続している八重山地方の中・近世人骨について古病理学的調査を行い、興味深い知見を得た。平成11年3月の日本解剖学会全国学術集会において報告した内容は以下のとおりである。南西諸島人骨格の形態学的研究の一環として、これまでほとんど知られていない生活面からの調査を行った。用いた資料は、石垣島蔵元跡遺跡(1516世紀)、登野城ナカヌハカ遺跡(1516世紀)、野底遺跡(1819世紀)、川平遺跡(1819世紀)などから出土した約23体の中・近世人骨である。これらは八重山地方の人骨としては、比較的まとまった資料であり、全身骨の観察が可能な好資料である。そこで、今回は、特に、ストレス・マーカーに焦点を絞り、観察を行った。

また、ほとんどの個体にエナメル質減形成が認められた。四肢骨については、骨折痕と思われるものが2例、前腕と下腿の骨髄炎が少なくとも2例にみられたほか、多くの四肢骨に骨膜炎の痕跡が認められた。さらに、少なくとも4例に肘関節の変形性骨関節症がみられるなど、生活環境の厳しさを示唆する所見が多数認められた。これらは、中・近世における八重山地方の人たちの生活の一端を示す興味深い事例と思われる。また、先史時代人の生活復元の試みとして、四肢骨形態の分析を行い、平成11年11月の日本人類学会において報告した。現在、これらをまとめて報告書を作成しているところである。
複雑な系の非線形動力学

1,不安定性を持つ非線形系に対して,ソリトン理論を拡張した。特に不安定系において,振幅変調がどのように記述されるかを考察した。通常の非線形シュレディンガー方程式の代りに,時間tと空間xを入れかえた非線形発展方程式が導びかれる。この方程式は不安定系の非線形波動を記述する点において普遍的であり,我々は不安定非線形シュレディンガー方法式と名づけた。不安定非線形シュレデインガー方程式は完全積分可能系であり,初期値問題を解くことができる。物理系への応用として,レーリー・テイラー不安定系と電子ビーム・プラズマ系を考察した。局在波の存在は,プラズマにおける実験で最近観測された。2.不安定非線形シュレディンガー方程式は,小さま波数kに対して,上限なしの不安定性を持つ。数学的には,「適切でない」問題とよばれる。逓減摂動法を適用することによって,新たに1つの微分項がつけ加わることを示した。この新しい振幅方程式は,完全積分可能系ではない。一方,カオス現象とソリトン現象の橋渡しをする方程式であることが期待される。この方程式の数値解析が,米国の2つのグループで進行中である。3.非線形媒質において,不均一性がある場合,どのように非線形波動が伝播するかを考察した。深さが一定でないときの浅水波や密度が一定でないときのプラズマ波等が,その例である。一様でない質量分布を持つ1次元非線形格子に対する運動方程式から出発し,ゆっくり変動する非線形波動と,振幅変調の非線形波を調べた。そのおのおのの波に対して,ランダム性や不連続性の影響を調べることができた。さらに模型を一般化し,2次元格子において,不連続線がある場合の非線形発展方程式を導出することができた。不連続領域で波動場をつなげる関係式が得られる。ソリトン解に対して,その関係式を用いることにより,どのようにソリトンが透過,反射,屈析を行なうかを調べることができる。こうして,波の透過,反射,屈析現象に対する非線形理論を提出した。4.ランダム行列は,複雑な量子力学系や量子カオス系のエネルギー準位を記述する模型として注目を集めている。実験に,実対称行列,エルミート行列,自己双対4元数行列の場合に,準位相関関数を計算し,それらが共通の性質(普遍性)を持っていることを示した。また,直交多項式に関係したアンサンブルにおいて,アンサンブル平均と各アンサンブルの等価性(エルゴード性とよぶ)を証明することができた。5.非線形シュレディンガー方程式は,光ファイバーを伝播する光ソリトンを記述する。応用においては,2つの偏光を考える必要がある。非線形シュレディンガー方程式を2成分系に拡張して,それらの性質を考察した。2つの偏光が結合した孤立波を求れることができた。そのような光ソリトンの験証は将来の興味深い研究課題である。6.2次元空間内の1次元物体(ひも)の運動は,物理的にも数学的にも興味深い。数学的には,非線形発展方程式の幾何学的記述を与える。物理学的には,渦系の運動,界面成長,炎面の伝播,化学反王等の模型と考えられる。ひもの速度が物理法則から決められるとき,ひもの曲率がどのような非線形発展方程式に従うかを一般的に議論した。この方法式系は,固有値をゼロとする逆散乱形式と等価であることがわかり,よって,積分可能系と非積分可能系の両方を含んでいる。特に,変形KdV方程式に帰着させる場合において,どのような閉曲線が得られるかを考察した。その結果,円環と8の字型に2種の曲線を得た。同様に,3次元空間内の1次元物体の運動は,曲率とねじれ率に対する非線形発展方程式に帰着される。その一例は,既に橋本英典氏によって見出された渦系の方程式(非線形シュレディンガー方程式)である。さらに,3次元空間内の2次元物体(面)の運動を記述することに成功した。これらの定式化は一般的であり,流体力学や生体物理への応用を準備している。7.厳密に解ける模型と結び目理論の関係を明らかにし,新たに色つき不度量を提出した。また,ランダム・ウオークのトポロジー的解析を行ない,そせらの生成確率を計算した。3.非線形

媒質において,不均一性がある場合,どのように非線形波動が伝播するかを考察した。深さが一定でないときの浅水波や密度が一定でないときのプラズマ波等が,その例である。一様でない質量分布を持つ1次元非線形格子に対する運動方程式から出発し,ゆっくり変動する非線形波動と,振幅変調の非線形波を調べた。そのおのおのの波に対して,ランダム性や不連続性の影響を調べることができた。さらに模型を一般化し,2次元格子において,不連続線がある場合の非線形発展方程式を導出することができた。不連続領域で波動場をつなげる関係式が得られる。ソリトン解に対して,その関係式を用いることにより,どのようにソリトンが透過,反射,屈析を行なうかを調べることができる。こうして,波の透過,反射,屈析現象に対する非線形理論を提出した。4.ランダム行列は,複雑な量子力学系や量子カオス系のエネルギー準位を記述する模型として注目を集めている。実験に,実対称行列,エルミート行列,自己双対4元数行列の場合に,準位相関関数を計算し,それらが共通の性質(普遍性)を持っていることを示した。また,直交多項式に関係したアンサンブルにおいて,アンサンブル平均と各アンサンブルの等価性(エルゴード性とよぶ)を証明することができた。5.非線形シュレディンガー方程式は,光ファイバーを伝播する光ソリトンを記述する。応用においては,2つの偏光を考える必要がある。非線形シュレディンガー方程式を2成分系に拡張して,それらの性質を考察した。2つの偏光が結合した孤立波を求れることができた。そのような光ソリトンの験証は将来の興味深い研究課題である。6.2次元空間内の1次元物体(ひも)の運動は,物理的にも数学的にも興味深い。数学的には,非線形発展方程式の幾何学的記述を与える。物理学的には,渦系の運動,界面成長,炎面の伝播,化学反王等の模型と考えられる。ひもの速度が物理法則から決められるとき,ひもの曲率がどのような非線形発展方程式に従うかを一般的に議論した。この方法式系は,固有値をゼロとする逆散乱形式と等価であることがわかり,よって,積分可能系と非積分可能系の両方を含んでいる。特に,変形KdV方程式に帰着させる場合において,どのような閉曲線が得られるかを考察した。その結果,円環と8の字型に2種の曲線を得た。同様に,3次元空間内の1次元物体の運動は,曲率とねじれ率に対する非線形発展方程式に帰着される。その一例は,既に橋本英典氏によって見出された渦系の方程式(非線形シュレディンガー方程式)である。さらに,3次元空間内の2次元物体(面)の運動を記述することに成功した。これらの定式化は一般的であり,流体力学や生体物理への応用を準備している。7.厳密に解ける模型と結び目理論の関係を明らかにし,新たに色つき不度量を提出した。また,ランダム・ウオークのトポロジー的解析を行ない,そせらの生成確率を計算した。1)不安定性を持つ非線形系に対して、ソリトン理論を拡張した。特に、不安定系における振幅変調に対する詳しい解析を行なった。通常の非線形シュレディンガ-方程式の代りに、時間tと空間xを入れかえた非線形発展方程式が普遍的に得られる。この方程式を、不安定非線形
次世代シークエンサーを用いた死後microRNAの網羅的検索とその法医学的応用

1本鎖のノンコーディングRNAであるmicroRNA(miRNA)は,鎖長が約20塩基と非常に短いため,死後,安定して残存するものがある.そこで本研究ではラットを用いた動物実験により,死後経過時間と生前のストレス程度を反映する生体マーカーとなるmiRNAの探索を行った.心臓ではmiR-16,肝臓ではmiR-21,血液ではmiR-451を内部標準とすると,死後経過時間と不安定な細胞質RNAとの間に良い相関が得られた.また,ラットにストレス(飲酒・運動・拘束)を与えて次世代シークエンサーで解析したところ,ストレスで増減する数種類のmiRNAが検出された.ノンコードRNAであるmicroRNA(miRNA)は,約20塩基の非常に短い一本鎖RNAであるが,遺伝子発現を制御する機能を持ち,高次生命現象や病態への関与が注目されている.短いがゆえに死後も体内に残存することがこれまでの実験で確認されており,法医実務に有効なバイオマーカーとなりえる可能性を持つ.本年度は,ラットを用いて死後経過時間と死後残存するmiRNAの相関を観察し,死後経過時間推定のマーカーとしてのmiRNA確立を目的とした.実験方法としては,週齢10週のSDラット18匹(平均重量439g)を過剰麻酔で安楽死させ,その直後から死後72時間までの間を0h,12h,24h,36h,48h,72hの3匹6群に分けた.それぞれのラットの心臓および肝臓を試料とし,市販のRNA抽出キットを用いてトータルRNAを抽出した.これまでの研究結果で死後も安定して残存しているmiR-16,miR-21を内在性コントロールとして選択し,ターゲットを6種のmiRNA(Let-7d*, miR-207, miR-346, miR-758, miR-872*, miR-346),およびU6snRNAとした.TaqMan microRNA Assay法により検討した結果,心臓ではmiR-16が,また肝臓ではmiR-21がそれぞれ死後も安定して一定の残量を示したことからこれを内在性コントロールとした.7種のターゲットの解析結果は,いずれもU6snRNAをターゲットとしたものが最も相関関係がよく,それぞれの相関係数は心臓(コントロールmiR-16)でR2=0.8814,肝臓(コントロールmiR-21)でR2=0.6088を示した.U6snRNAはmiRNAではないが,逆に106塩基とある程度の長さを持ち,死後経過時間とともに適度に分解されていくことが,相関を良くした理由であると推察される.ノンコーディングRNAであるmicroRNA(miRNA)は,約20塩基の一本鎖RNAであるが,遺伝子発現を制御できる機能を持ち,高次生命現象や病態への関与が注目されている.これまでの我々の研究でmiRNAは死後もある程度残存することが確認されており,法医実務に有効なバイオマーカーとなり得る可能性をもつ.本年度は,ラット血液を用いて死後経過時間推定マーカーの確立を目的とした実験を行った.生後9週のSDラットを過麻酔にて安楽死させた後,死亡から血液採取までの時間により,死亡直後,6,12,24,36, 48時間後の6群に分けそれぞれ3匹,計18匹から血液を採取し,試料とした.市販のキットを用いてtotal RNAを抽出し,TaqMan法にてmiRNAの発現量(残存量)の比較解析を行った.解析したターゲットは通常内部標準として用いられている,U6 snRNA, U87, Y1, 4.5S RNA(AY228147),4.5S RNA(AY228151)の5種,およびmiR-16,miR-451の2種のmiRNAである.死後のmiRNA発現解析は,何をターゲットとし,何をコントロールとして補正するかが非常に重要なポイントとなる.今回は血液を試料としていることから,血中での発現量が安定しているmiR-451をコントロールとし,5種の内在性コントロールを今回はターゲット候補として解析を行った.その結果,4.5SRNA(AY228147)(R2=0.944)が最も成績がよく,次いでY1(R2=0.934)であった.これらはそれぞれ91塩基,および74塩基の長さを持つ,ラット特有の低分子量細胞質RNAである.臓器と血液ではその残存量,すなわち分解速度に大きな差があり,血液の方が分解されにくいことが,同じU6 snRNAをターゲットとした今年度の実験で判明した.マイクロRNA(miRNA)は約20塩基の1本鎖ノンコーディングRNAであるが,様々な生命現象や病態への関与が注目されている.そのmiRNAは短いがゆえに死後も残存することが確認されており,法医実務に応用可能な新たなバイオマーカーとなる可能性を持つ.

そこで本年度は,ラットに肉体的なストレスを与えた後に安楽死させ,心筋を試料として次世代シークエンサーによるmiRNAの網羅的検索を行った.与えたストレスは,アルコール摂取後にトレッドミルで運動させ,さらに2kg水袋による抑制である.過剰麻酔による安楽死後,心筋からtotalRNAを抽出し,次世代シークエンサーIon PGM Systemにて塩基配列データを得た.500種を超えるmiRNAの中からKruskal-Wallis検定の結果,7種のmiRNAにおいて,コントロールとストレス群間に有意差が見られた.すなわち,miR-126a-3p, 143-3p, 6-5p, 26a-5pの4種は発現量が有意に増加し,逆にmiR-22-3p, 29a-3p, 29b-3pの3種は減少した.これらの中でmiR-143-3pと22-3pは最も顕著にストレスに対して増減が大きく,これらがストレスマーカーと言えよう.また,これまでにラット血中miRNAを用いたTaqMan法による死後経過時間の推定に適したmiRNAを同定してきた.注目すべき点は,通常の実験とは逆に安定しているmiRNA(miR-451)を内在性コントロールとし,4.5S RNA(AY228147)をターゲットとする方が死後経過時間と極めて良い相関(R^2=0.934)が得られたことである..以上のように本研究ではラットにおける「死後経過時間推定マーカー」及び「ストレスマーカー」としてのmiRNAが同定された.さらにヒト試料を用いての検証を経て法医実務に応用可能となるであろう.1本鎖のノンコーディングRNAであるmicroRNA(miRNA)は,鎖長が約20塩基と非常に短いため,死後,安定して残存するものがある.そこで本研究ではラットを用いた動物実験により,死後経過時間と生前のストレス程度を反映する生体マーカーとなるmiRNAの探索を行った.心臓ではmiR-16,肝臓ではmiR-21,血液ではmiR-451を内部標準とすると,死後経過時間と不安定な細胞質RNAとの間に良い相関が得られた.また,ラットにストレス(飲酒・運動・拘束)を与えて次世代シークエンサーで解析したところ,ストレスで増減する数種類のmiRNAが検出された.ラット死後のmicroRNA(miRNA)の挙動はまだまだデータ不足であると言える.しかしながら,これまでのラットを用いた実験から, miRNAの死後経過時間推定のマーカーとしての可能性が見出されている.昨年は心臓,および肝臓を使用して,そして今年度は血液を試料として有効なコントロールおよびターゲットの確立に成功している.心臓,および肝臓を試料とした場合は,ターゲットをU6 snRNAとし,それぞれmiR-16,およびmiR-21をコントロールとすべきであることが判明した.また,血液を試料とした場合には,4.5SRNA(AY228147)をターゲットとし,miR-451を用いて補正することでより正確な死後経過時間の推定が可能となる結果が得られた.このコントロール,およびターゲットとは,解析方法として採用したTaqMan法には必須のものである.通常は発現量を求めたい遺伝子をターゲットとし,どの細胞においても常に発現量が大きい遺伝子を内在性コントロールと用いて補正することで正確な発現量の比較等が行えるのである.しかし,この点が死後の試料を用いたときには大きく異なっている.つまり,個体が死亡すると徐々に生体分子の分解が起こり,通常のコントロール領域もその意味を失ってしまう.そこで逆に,死後もある程度の時間は安定して残存しているmiRNAをコントロールとし,通常コントロールとして用いていた遺伝子群をターゲットとした方が,死後経過時間との相関が顕著によい結果となった.この点を新たに見出せたことがこれまでの成果であると言える.さらに,心臓,肝臓でターゲットとなったU6 snRNAであるが,血液ではよい結果が得られなかった.これは臓器中と血液中での残存量の違いに加え,その存在状態に違いがあることから,分解される進み方に違いが出るのだと思われる.以上がこれまでの研究成果である.