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含フッ素アート錯体の酸－塩基複合作用を利用した二酸化炭素の資源化法の開拓

これまでに、二酸化炭素の固定化反応として、オキサゾリジノン合成を促進する触媒の開発を行ってきた。当該反応は、天然アミノ酸から誘導可能なβ-アミノアルコールと二酸化炭素を原料に、不斉補助基等として重要なオキサゾリジノンを脱水的に合成する反応である。フッ化物イオンと含ケイ素化合物(例えば、シロキサン((Me2SiO)3)との組み合わせがオキサゾリジノン収率向上に関して相乗効果をもつことを示した。しかし一方で、上記反応は、比較的高温の反応温度が必要であった。より温和な条件で二酸化炭素の化学変換を達成するため、光触媒反応に着目した。その前段階として、バイオマス由来物質にも適用可能な光触媒反応の開発を行った。具体的には、光触媒によって促進される化学及び位置選択的なアリルアルコールのアルケンへの水素化分解反応の開発である(Scheme)。この反応では、パラジウムを担持した二酸化チタン(TiO2)を光触媒として用いることで、光照射下(λ> 365 nm)、室温でアリルアルコールの炭素-酸素結合を選択的に水素化分解しアルケンへと変換できる。アリルアルコールはバイオマス由来のグリセリン等の多価アルコールから生産可能である。水素源として安価なメタノールを使用でき、塩廃棄物を副生しない。一般的なパラジウム触媒では容易に水素化されうる炭素ー炭素二重結合とアリル位以外のアルコール部位は保持される。さらに、重要香料ラバンジュロールの合成へと応用したところ、これまで必要であった保護・脱保護や金属ヒドリド剤の利用を経ずに目的物質が短行程で合成可能であった。28年度が最終年度であるため、記入しない。二酸化炭素の資源化反応として、オキサゾリジノン合成を促進する触媒の開発を行った。本反応は、天然アミノ酸から誘導可能なbeta-アミノアルコールと二酸化炭素を原料に、不斉補助基等として重要なオキサゾリジノンを脱水的に合成する反応である。研究計画に示した、フッ素原子を含む化合物と二酸化炭素との親和性を考慮した触媒探索指針に基づき、含フッ素化合物を中心に触媒前駆体の探索を行った。その結果、フッ素化試薬TBAT (Bu4N+[SiF2Ph3]-)が触媒として効果的であることを見出した。脱水剤等といった添加剤は必要としない。低圧のCO2 (1-9 atm)条件下において種々の置換基をもつアミノアルコールからの光学活性なオキサゾリジノン合成を達成した。beta-アミノアルコールの絶対立体配置は、反応の前後でalpha位、beta位ともに保持された。アミノアルコールのヒドロキシル基が求核剤として働き、二酸化炭素に含まれる酸素原子のうち一つが脱離することを明らかにした。反応混合物のNMR及びMS測定により、フッ化物イオンと含ケイ素化合物(例えば、シロキサン((OSiMe2)3)との組み合わせがオキサゾリジノン収率向上に関して相乗効果をもつことを示した。これらを用いると、TBATを用いた場合と比べ、触媒量の削減と二酸化炭素圧の低減、オキサゾリジノン収率の向上、基質適応範囲の拡大が達成された。本研究成果は、含フッ素化合物が二酸化炭素の化学変換に対して触媒として有効であることを示した内容であり、今後、二酸化炭素を原料とする反応を開発する際の触媒設計指針となりうる。また、シロキサンをよりありふれた固体のシリカなどに置き換えることができれば、二酸化炭素の化学変換触媒の固定化へと発展させられる可能性がある。本反応は、天然アミノ酸から誘導可能なβ-アミノアルコールと二酸化炭素を原料に不斉補助基等として重要なオキサゾリジノンを脱水的に合成する反応である。この成果をふまえ、触媒活性種の同定を目指した研究を行った。反応混合物のNMR及びMS測定により、フッ化物イオンと含ケイ素化合物(例えば、シロキサン((Me2SiO)3)との組み合わせがオキサゾリジノン収率向上に関して相乗効果をもつことを示した。過去の系を用いた場合と比べ、触媒量の削減と二酸化炭素圧の低減、オキサゾリジノン収率の向上、基質適応範囲の拡大が達成された。二酸化炭素の化学変換の今後の研究として、真に環境負荷低減的な反応とするために、光エネルギーを活用した反応を目標としている。その一環として、光触媒反応の開発を行った。具体的には、光触媒によって促進される化学及び位置選択的なアリルアルコールのアルケンへの水素化分解反応の開発である。この反応では、パラジウムを担持した二酸化チタンを光触媒として用いることで、光照射下(λ>365 nm)、室温でアリルアルコールの炭素-酸素結合を選択的に水素化分解しアルケンへと変換できる。おおむね計画どおりに、二酸化炭素の変換反応を促進する含フッ素化合物触媒を開発できたため。環境負荷低減的な反応とするために、新しい触媒系の探索へと進んでいる。

これまでに、二酸化炭素の固定化反応として、オキサゾリジノン合成を促進する触媒の開発を行ってきた。当該反応は、天然アミノ酸から誘導可能なβ-アミノアルコールと二酸化炭素を原料に、不斉補助基等として重要なオキサゾリジノンを脱水的に合成する反応である。フッ化物イオンと含ケイ素化合物(例えば、シロキサン((Me2SiO)3)との組み合わせがオキサゾリジノン収率向上に関して相乗効果をもつことを示した。しかし一方で、上記反応は、比較的高温の反応温度が必要であった。より温和な条件で二酸化炭素の化学変換を達成するため、光触媒反応に着目した。その前段階として、バイオマス由来物質にも適用可能な光触媒反応の開発を行った。具体的には、光触媒によって促進される化学及び位置選択的なアリルアルコールのアルケンへの水素化分解反応の開発である(Scheme)。この反応では、パラジウムを担持した二酸化チタン(TiO2)を光触媒として用いることで、光照射下(λ> 365 nm)、室温でアリルアルコールの炭素-酸素結合を選択的に水素化分解しアルケンへと変換できる。アリルアルコールはバイオマス由来のグリセリン等の多価アルコールから生産可能である。水素源として安価なメタノールを使用でき、塩廃棄物を副生しない。一般的なパラジウム触媒では容易に水素化されうる炭素ー炭素二重結合とアリル位以外のアルコール部位は保持される。さらに、重要香料ラバンジュロールの合成へと応用したところ、これまで必要であった保護・脱保護や金属ヒドリド剤の利用を経ずに目的物質が短行程で合成可能であった。研究計画で示したように、含フッ素化合物の二酸化炭素との親和性を考慮した二酸化炭素の化学変換触媒の開発に成功しており、初年度の計画通りに進行している。これまでに、アミノアルコールと二酸化炭素からのオキサゾリジノン合成反応において、フッ化物イオンとシロキサン類との組合せが触媒前駆体として有効であることを報告した。この反応は、脱水的に進行し、原理的に塩廃棄物を生じない環境負荷低減的な反応といえる。一方、反応温度が高い点が、改善すべきであるといえる。そこで、来年度は、今回習得した固体触媒と光触媒に関する知識と技術を駆使し、半導体光触媒を用いた二酸化炭素の有機化合物への固定化反応の開発に着手する予定である。真に省エネルギー的な反応には、光触媒反応にすることが有効である。一つは、二酸化炭素の還元反応において、半導体光触媒の化学修飾の効果や、系中に添加したアミン類の効果を調査する研究である。化学修飾やアミン類は二酸化炭素と相互作用したり、化学的に二酸化炭素を固定化したりして、二酸化炭素の還元反応の促進効果が期待できる。一方、これまでの半導体光触媒を用いた二酸化炭素の変換反応は、一酸化炭素やギ酸への還元が中心である。申請者は、二酸化炭素を有用な有機化合物へと変化する手法の開発も目指す。この場合は、半導体光触媒は既製のものを利用し、新規反応の開発に注力する。より具体的には、アルケンと二酸化炭素からのカルボン酸合成等を目標の反応とする。28年度が最終年度であるため、記入しない。開発した触媒反応をより効率的に行うために、触媒の固定化を行う。
活性汚泥におけるPHA蓄積細菌群集の分子生物学的手法による解析

平成20年度の実験では、活性汚泥に脱窒条件下で酢酸を摂取させ、PHA蓄積細菌の酢酸摂取速度を評価する実験を実施した。都市下水処理場活性汚泥試料に脱窒条件下で酢酸を摂取させ、酢酸摂取速度とPHA蓄積速度を測定した。また、活性汚泥中で酢酸を摂取した細菌とPHA蓄積細菌をそれぞれMicroautoradiography法および化学染色法で検出し、定量を行った。PHA蓄積細菌が摂取した酢酸の量は全摂取量の84%に及び、PHA蓄積細菌の酢酸摂取速度がその他従属栄養細菌よりも約30倍高いことを確認した。PHA蓄積細菌が脱窒条件下での有機物摂取に大きく寄与する細菌であることを明らかにしたが、ここで摂取された有機物が脱窒反応に効率的に利用されていることを今後確認する必要があった。また、活性汚泥中に存在するPHA蓄積細菌の群集構造を調査した。PHA蓄積細菌に特異的なFISHプローブを新たに設計し、8箇所の都市下水処理場活性汚泥について解析を行った。その結果、PHA蓄積細菌の群集構造が様々な細菌種によって構成されることを明らかにし、これまで知られていなかったPHA蓄積細菌を複数同定することに成功した。そして、PHA蓄積細菌の群集構造が処理場ごとに異なることを確認した。よって、PHA蓄積細菌群の全体像を把握するためには同様の解析をさらに実施し、知見を蓄積していく必要があることがわかった。また、密度勾配遠心分離法や電子顕微鏡観察を実施し、細胞内で蓄積されたPHA顆粒が細胞外へ漏れ出したと考えられる興味深い現象を捉えた。この現象は微生物生態系における意義および微生物を用いたPHA生産の観点から興味深い現象であり、このマシナリーの解明に向けた研究が今後必要であった。有機物除去は活性汚泥プロセスにおいて最も中心的な生物反応であり、有機物除去のメカニズムとしてこれまでは異化・同化代謝のみが考慮されてきた。しかし、近年、有機物除去の過程でPHA(ポリヒドロキシアルカン酸)を代表とする有機性一時貯蔵物質が蓄積することが知られるようになり、一時貯蔵プロセスも有機物除去メカニズムの一つとして考えられるようになってきた。本研究では一時貯蔵物質としてPHAに注目し、PHA蓄積細菌に関する微生物学的な知見を収集することを目的とした。続けて、PHA蓄積細菌の群集構造を詳細に調査するために、活性汚泥中のPHA蓄積細菌を密度分離法によって選択的に分離し、その試料を用いて16S rRNA遺伝子のクローンライブラリを作成した。4カ所の実下水処理場の活性汚泥試料からクローンライブラリを作成し、塩基配列を解読した結果、α-proteobacteriaおよびβ-proteobacteriaのグループ内でPHA蓄積細菌の群集構造に違いが見られた。現在、クローンライブラリから得られた塩基配列を用いて、PHA蓄積細菌を同定するためのFISHプローブを設計しており、一連のプローブを用いることでPHA蓄積細菌の群集構造を詳細なレベルで比較できるようになるであろう。
戦後日本企業形成の基礎:戦前・戦中の企業内(郵船、古河、王子製紙)会計制度の展開

本研究は戦前・戦中のわが国企業におけるの管理会計技法の定着と発展、変質を考察し、戦後の日本の高度成長の基礎過程を明らかにするために、日本郵船、古河鉱業、王子製紙樺太分社の戦前・戦中期の内部資料の収集と分析、検討を目的としていた。日本郵船については1881年(明治14年)から1897年(明治30年にかけての小樽出張所の資料を発見し、その資料の整理、分析を行なった。日本郵船では航路別の資本利益率を算出し各航路の管理を行なっていたのにたいして、各支店に対しては月次の「予算実算比較表」を作成させ、本社に提出させることで短期間な資金の管理をおこない、各支店費対収入運賃比率により中期的な各支店の効率を評価していたことを明らかにし、論文「日本郵船小樽出張所における予算実算勘定比較」を公表した。また、日本郵船本社に保管されている予算資料を整理、検討し、創立以来の予算規程を明らかにした。論文「日本郵船における予算規程」(印刷中)として公表し、郵船では一貫して支店において前年度の実績をもとにして予算が見積られたこと、創立以来の全社的収支予算から確実に統制可能な支店店費予算へと統制可能な科目に限定され、そのなかで精緻化されたこと、予算の対象科目の限定は日清戦争、第一次世界大戦等戦争による突発事象の頻発が契機になったこと、その結果1926年に経常費予算と臨時費予算の区別が行なわれ有効性を発揮したことを明らかにした。紙の博物館等における戦前の王子製紙の支店、工場の膨大な資料を整理し、まづ、王子製紙樺太分社における1928年から1944年における林業会計の実態を明らかにし、論文「王子製紙樺太分社における決算報告書」を公表した。同稿では、戦前における私有林における管理会計、帳簿組織を明らかにし、本支店会計の問題を指摘するとともに、かわしもの工場への振替価格が原価によらず、交渉によって設定されたことも明らかにした。
微生物炭素ポンプは土壌生態系においても駆動しているか－炭素長期隔離のキープロセス

本研究は、「土壌生態系においても、細菌による難分解性有機物の生成を通した炭素の長期隔離が駆動しているか」を、実験的に検証するものである。まず、土壌細菌の有機炭素を計測する方法について検討した。さらに、細菌による安定な有機物の生成量を推定するため、培養実験を実施した。本実験では、炭素安定同位体(13C)で標識したグルコースを土壌中に添加した後に培養を行い、培養期間中の土壌有機炭素の濃度および13C同位体比の変化を明らかにした。土壌細菌に含まれる有機炭素量を計測するためには、ガラス繊維濾紙上に細菌を捕集する必要がある。土壌試料を超純水で懸濁した後、孔径0.3マイクロメートルのガラス濾紙で濾過することにより、約80%の細菌が濾紙上に捕集されることを確認した。これにより、土壌細菌が保有する有機炭素の測定が可能となった。土壌試料の培養期間中において、13C有機炭素濃度は培養開始後減少を開始し、30日後には初期値の約40%程度に低下した。これから、土壌に添加した13Cグルコースが土壌細菌により分解されたことが確認できた。一方、本実験で得られたグルコースの減少速度は、研究代表者らが実施した海水細菌を用いた培養実験に比較して低い値であった。低い分解速度の原因としては、土壌培養系における窒素・リン等の栄養塩類の不足や、土壌粒子へのグルコースの吸着などが考えられる。一方、培養終了時に残存した13C含有有機物には、グルコースのみではなく、細菌により生産された安定な代謝産物も含まれていると考えられる。このため、今後は、グルコース濃度を別途定量することにより、細菌により生産される安定な有機物の生成量を明らかにすることが可能となる。本研究は土壌生態系においても、細菌による難分解性有機物の生成を通した、炭素の長期隔離が駆動しているか否かを、実験的に解析するものである。本年度は、実験を実施するための基礎的情報を集めるとともに、培養実験の手法について検討を行った。第一に、土壌有機物の有機炭素・窒素濃度およびそれぞれの同位体比の測定方法について検討した。筑波大学アイソトープ環境動態センターおよび菅平高原実験センターより、土壌試料を採取し、乾燥後に元素分析計/同位体比質量分析計を用いて測定を行った。その結果、濃度に関しては、炭素および窒素ともに高い精度で測定できることを確認した。また、本実験で重要なパラメータとなる炭素同位体比に関しても、ススキ草原と松林で同位体比の差が明確に確認できる高い精度を有することが明らかとなった。土壌試料中の細菌細胞数の測定に関しては、プレートを用いた平板希釈法と、蛍光染料による染色および蛍光顕微鏡による直接カウント法について、検討を行った。その結果、複数の蛍光染料を用いることにより、染色された細菌細胞を、蛍光を有する土壌粒子とを区別して計数することが可能であることが示唆された。このため、以降の実験に関しては、蛍光染色法を用いることとした。細菌培養実験を実施する際には、土壌細菌を培養系に接種する必要があるが、その手法の検討を行った。その結果、土壌を超純水で懸濁し孔径0.7 μmの濾紙で濾過し、濾液を土壌に添加することにより、細菌を接種することとした。土壌細菌の培養実験を実施する際に必要となる、土壌有機炭素の濃度および同比体比の測定法、土壌細菌の細胞数計数法、さらに、土壌細菌の培養系への添加法に関して検討を行い、手法を確定することができた。土壌細菌の培養実験に関して検討し、当初予定していた自然土壌に加えて、人工粒子を用いたより単純な系を設定することを検討した。これにより、細菌により生産される難分解有機物の存在量を、より明確に求めることができ、本研究において重要な除法をもたらすと考えている。

このため、今後は、グルコース濃度を別途定量することにより、細菌により生産される安定な有機物の生成量を明らかにすることが可能となる。本年度の早い段階で、13Cグルコースを基質とした細菌の培養実験を開始する。培養実験は、人工粒子を用いた系と自然土壌を用いた2系を準備する。6ヶ月の培養実験を実施し、実験期間を通した、細菌数および有機物の13C同位体比の変化を明らかにする。最終的に残存する13C-有機炭素を難分解性有機物と判断し、実験開始時に添加した13Cグルコースに対する残存比を求める。得られた値を、海洋の細菌を用いた実験により報告されている残存率と比較し、土壌細菌による微生物炭素ポンプの効率について検討する。また、培養期間を通した細菌群集組成を、ゲノム情報を用いて明らかにし、微生物ポンプの効率と細菌群集組成の関係について考察する。得られた結果は、日本生態学会において発表を行う。
非線形発展方程式論の変分不等式と準変分不等式への応用

温度変化のもとで物質がその性質を変える相転移とよばれる現象に関連する数学的問題を研究した。この種の問題は単なる方程式ではなく、変分不等式と呼ばれる、不等式によって解に制約条件を課した複雑な構造をしている。無限次元の空間において問題を定式化し、発展方程式論という抽象的な方法を駆使して、解が存在すること、解がただひとつであること、時間がたつにつれて解がどの様に変化するか、などに関する成果を得た。非線形発展方程式論、特に時間依存劣微分発展方程式の理論と方法を応用して物理や工学上の数理モデルの解析を行った。得られた研究実績の概要は下記のとおりである。1.Neumann境界条件のもとでの非線形退化放物型偏微分方程式が解をもつための必要かつ十分な条件を初期条件と境界条件に与えた。2.時間依存制約条件をもつ準線形放物型偏微分方程式に関する一般理論を構築し、解の存在・一意性・比較定理などを証明した。3.Dirichlet境界条件のもとで、任意の極大単調グラフに関する非線形退化放物型偏微分方程式を研究し、解が存在するための境界値に関する必要条件かつ十分条件を与えた。4.熱流が温度に関する任意の極大単調グラフのBoussinesq系を研究し、弱解の大域的存在と温度に関する最大値原理を証明した。5.負の指数をもつSobolev空間上の凸関数をうまく定義することにより、劣微分発展方程式の理論によってDirichlet境界条件のもとでの任意の極大単調グラフに関する非線形退化放物型偏微分方程式を取り扱うことに成功した。6.多孔性媒質中の流れの数理モデルとしてあらわれる楕円・放物型変分不等式の時間大域的有界性と周期界の存在を証明した。7.楕円・放物型偏微分方程式に関する一般理論を構築し、解の存在・一意性・比較定理などを証明した。8.温度に関してDirichlet境界条件のもとでPenrose-Fife型の相転移ダイナミクスモデルを研究し、基本的なエネルギー等式を正当化した。1から6までの研究成果は学術論文として本年度中に公刊された。7と8の研究成果は現在投稿中である。さらに、これらの研究成果について、国内・国外の国際研究集会・学会などで招待講演・一般講演による発表を行った。劣微分発展方程式の理論を応用して放物型変分不等式の研究をおこなった。本年度得られた結果は以下のとおり。(1,2,3は論文を発表済。4,5は論文掲載受理。6,7,8は論文投稿中)1.任意の極大単調グラフに関する非線形退化放物型方程式のDirichlet境界値問題を生成する凸関数とその劣微分を定義し、劣微分発展方程式の理論を応用して解の存在を証明した。2.楕円ー放物型方程式に関して時間依存制約条件を持つ変分不等式の最適制御問題を研究した。3.任意の極大単調グラフに関する非線形退化放物型方程式およびPenrose-Fife型相転移方程式系のDirichlet境界値問題の解の存在を劣微分作用素の理論を応用して証明した。4.時間に依存するDirichlet境界条件のもとでPenrose-Fife型相転移方程式系の解の存在を証明した。5.楕円ー放物型方程式に関して時間依存制約条件を持つ変分方程式の周期解の一意性と漸近安定性を証明した。6.楕円ー放物型方程式に関して時間依存制約条件を持つ変分不等式の解の存在・一意性・比較定理を一般的枠組みで証明した。7.非線形で退化した熱流を持つ熱水分力学モデルのNeumann境界値問題の解が存在するための必要かつ十分な条件を求めた。8.双曲型方程式に関して時間依存制約条件を持つ変分不等式の強解の存在を証明した。非線形発展方程式の理論を応用して変分不等式の研究を行った。研究成果の具体的内容等は以下項目19の通りであるが,非線形発展方程式の理論、方法、アイデアを変分不等式の研究(特に解の存在、一意性と時間大域挙動)に効果的に応用することに成功し,その方法論の有効性を示すことができた。1.ヒステレシス現象を記述する数理モデルの制御問題の解の存在を証明した。2.一般的な時間依存制約条件下の楕円放物型変分不等式の解の存在を証明した。3.Neumann境界条件付退化熱方程式に関する水力学モデルの解の存在を証明した。4.一般的な時間依存制約条件下の楕円放物型変分不等式の周期解の存在を証明した。5.時間依存制約条件下の双曲型変分不等式の解の存在について抽象論理論を構築した。6.時間周期的制約条件下の準線形放物型変分不等式の周期的安定性を証明した。7.温度についてDirichlet条件の非等温相転移に関するPenrose-FIfeモデルの適切性(解の存在と一意性)を証明した。8.温度についてDirichlet条件を課した非等温相分離モデル(保存秩序度)の解の存在を証明した。

9.温度について時間依存的内部制約条件を課した熱水力学に関する変分不等式の解の存在を証明した。(16は論文掲載済,7は掲載受理,8,9は投稿中)非線形発展方程式の理論と手法を応用して様々な数理モデルに現れる変分不等式の研究を行った。研究成果を以下に列挙する。これらの成果に関して2編の論文を発表し、5編が掲載受理、1篇が投稿中である。2.熱水力学モデルにおいて温度に片側および両側制約条件を課した問題の解が一意的に存在することを証明し、さらに大域アトラクターを構成した。(2編の論文)3.時間依存制約条件下の楕円-放物型変分不等式に関する解のデータに関する連続性と最適制御階の存在を証明した。4.非Penrose-Fife型の等温相分離モデルにおいて粘性の効果を考慮することにより、絶対温度にDirichlet境界条件を課した非線形偏微分方程式系の解の存在と一意性を証明した。さらに粘性項が消滅するときの極限を一般化された解を導入することにより捉える事に成功した。(2編の論文)5.時間依存制約条件下の変分不等式について双曲-放物型の特異摂動問題を研究し、特異摂動の存在を証明し、収束のオーダーを与えた。
電解還元法による二酸化炭素の有効利用

地球温暖化の元凶の一つである二酸化炭素を電解還元する事により有用な物質に変換する研究を行った。1.Bi金属は有機化合物の電解還元反応に対しては触媒作用を有することにもかかわらず、二酸化炭素の電解還元用電極としては、これまで研究されていなかった。そこで、本研究では、重炭酸カリウム水溶液中での二酸化炭素の定電位マクロ電解をBi電極を用いて行った。その結果、ギ酸が生成し、その電流効率はBi金属電極よりもBiメッキした電極の方が優れ、また、基板の種類に大いに依存した。特に、グラシーカーボンを基板としたBiメッキした電極では、非常に高い電流効率および部分電流密度でギ酸が生成する事を見いだした。2.火力発電所の排ガス中の二酸化炭素を直接気相状態で電解還元するシステムは回収装置が不用などの利点がある。そこで、イオン導電性の固体高分子電解質(SPE)電極を作製し、この電極を用いて、二酸化炭素をガス状で直接電解還元するシステムを検討した。この場合、二酸化炭素の直接電解還元とは云え、メタンやエチレンのような有用物質の生成を考えるなら、水素イオンの供給が不可欠である。従って、SPE材料としては、カチオン交換膜が適しているであろう。そこで、カチオン交換膜であるナフィオン膜からなるCu-ナフィオン電極を作製し、二酸化炭素の気相電解還元を行った結果、エチレンが選択的に生成した。他方、アニオン交換膜であるセレミオン膜からなるCu-セレミオン電極では、ギ酸が主生成物として得られた。さらに、上記の気相電解還元への排ガス中の二酸化炭素濃度や不純物の影響を調べた結果、排ガスの2倍以上の濃縮と亜硫酸ガスの除去が必要である事が分かった。
細胞分裂に伴う転写因子の非対称分配の解析

prospero遺伝子は、神経系の幹細胞から非対称分裂により生じる2次前駆細胞で、一過的に機能するホメオボックス遺伝子であり、神経発生に必須な役割を果たす。われわれは、prospero蛋白が転写因子であるにも関わらず、この神経幹細胞では細胞質にとどまり、細胞分裂に伴って2次前駆細胞に非対称に分配されることを示してきた。この知見は、転写因子の非対称分配という、細胞分裂にカップルした新しい分化の仕組を示すだけではなく、prospero蛋白が、神経幹細胞の非対称分裂のよいマーカーであることを意味する。そこで、神経幹細胞の非対称分裂を引き起こす細胞極性を解析することを目的に、prosperoとβ-galactosidaseの融合蛋白(pros-βgal)を発生過程の全ての細胞で発現するショウジョウバエ系統を作成し、このマーカー蛋白が、どの細胞で非対称に局在、あるいは分配されるかを検討した。初期胚の外胚葉と内胚葉を構成する上皮細胞では、本来、prosperoを発現しないが、これらの細胞でectopicにpros-βgal発現させると、分裂時には必ず、細胞のcortexに局在することを見い出した。さらに詳しく観察すると、細胞のcortexに局在したpros-βgalは、cortexのapical側からは排除され、basal側(あるいは、basal-lateral側)にだけ存在する。この観察から、上皮細胞、および、神経幹細胞でprosperoを局在させる活性は、上皮細胞に一般的なapical-basal極性に基づいていることが示唆された。prosperoの局在活性を指標として見る限り、幹細胞が非対称分裂を行う際の細胞極性は、上皮細胞の極性と共通の性質を持っている。従って、上皮細胞の極性という非常に一般的な細胞極性が、prosperoのような分化因子の非対称分配を介して、遺伝子発現のの非対称な調節に関わる可能性が浮び上がってきた。上皮細胞のapical-basal極性の形成と維持には、一層に並んだ上皮細胞間の相互作用が必要であるとされているが、非対称分裂を行う神経幹細胞や内胚葉幹細胞は、上皮細胞層から、細胞が離脱して形成される。その際、上皮細胞から幹細胞へ、いかにして、この極性が受け継がれるのかを解明することが、今後の課題であろう。
車両走行による道路橋及び鉄道橋の振動騒音の発生メカニズムと制御方法に関する研究

本研究の前半部は,道路橋上を重車両が走行する際に発生する橋梁振動,及びそこから放射される低周波音の研究にあてられている。伸縮装置部における段差並びに橋梁路面の凹凸を有する単純支持桁及び連続支持桁の道路橋を検討対象とし,重車両の解析用モデルとしては,2種の4自由度系を採用している。連成系の動的応答解は,離散化した橋梁モデルと走行車両モデルの連成振動の支配方程式をモ-ド解析法と数値積分法の併用によって求めている。音響工学に基づく各種音源モデルの比較検討によって最適音源モデルの設定を行い,橋梁の振動速度のフ-リエ・スペクトルを用いて,橋梁振動から放射される低周波音の任意受音点における音圧レベルのスペクトルを求める簡便な手法を開発した。この解析手法に基づく一連の数値シミュレ-ションの結果から,任意受音点の音圧レベルに及ぼす各種要因(主桁支持形式,伸縮装置部の段差,路面凹凸,走行車両の特性,車両の走行速度など)の影響度合を系統的に評価した。これらにより,今後の低周波音対策に対して有用と思われる情報を提供した。本研究の後半部では,鉄道橋の振動・騒音の基本特性を把握するため,プレ-トガ-ダ-の衝撃問題を扱っている。まず,鉄道橋の主要な構造要素である1形及び箱形プレ-トガ-ダ-を平板の集成体と捉え,有限帯板法によって低次から高次までにわたる精ちな固有振動解析を行い,その結果を各波動パタ-ンごとの断面変形モ-ド図及び位相速度分散曲線にまとめた。また,衝撃的外力を受けるプレ-トガ-ダ-の動的応答を解析し,振動速度のフ-リエ・スペクトルによって,その衝撃応答特性を明らかにした。解析の有効性は,衝撃作用時間を変化させた衝撃実験によって検証した。道路桁橋に関して,車両が走行する際に発生する低周波音による騒音問題を検討する目的で,まず前・後輪2軸の4自由度系の重車両モデルと単純支持の標準的な鋼道路桁橋モデルを用い,橋梁端部と伸縮装置間の段差を考慮した数値解析によって連成系の振動持性を調べた。同時に,放射音解析に必要となる橋面任意点の振動速度のフ-リエ・スペクトルも求めた。重車両走行に伴う道路橋振動から放射される低周波音の音響場は,振動する橋面を微小要素に分割し,その個々の要素を無限バッフル中にある半球状の呼吸球音源と考えて解析した。その際,橋面の振動速度にはそのフ-リエ・スペクトルを適用することにより,任意受音点の音圧レベルのスペクトルを求める方法を開発した。さらに,橋桁の14次モ-ドの固有振動による放射音場を解析とモデルテストによって検証し,この解析手法の妥当性を確認した。この解析手法に基づき,橋梁端部の伸縮装置間の段差,橋梁支間長,車両の走行速度,車両重量,受音点の橋面からの距離等を変化させて音圧レベルのスペクトル図を描き,車両走行に伴う鋼道路桁橋から放射される低周波騒音に関する実用上極めて有用と思われる多くの情報を得ることができた。鉄道橋プレ-トガ-ダ-に関しては,列車走行に伴って発生するフランジプレ-ト及びウェブプレ-トの面外への高周波曲げ振動のメカニズムを解明する目的で、まず有限帯板法を用いて低次から高次までの広離にわたる固有振動モ-ドを解析し,その基本特性を明らかにした。また,解析と並行して実験室でのモデルテストを実施し,実験的な検証も行った。前年度に蓄積した研究実績を踏まえ,本年度は新たに次のような研究成果をあげることができた。

(1)道路橋上を車両が走行する際に発生する橋梁振動及び放射音の問題に関しては,新たに連続桁形式の橋梁も検討対象とし,橋梁路面の凹凸の組み込み,音響学に基づく各種音源モデルの比較検討による最適モデルの設定などを行った。これらを踏まえた一連の解析の結果,走行車両による道路橋の低周波騒音の発生メカニズムの解明,受音点の音圧レベルに及ぼす各種要因(主桁形式,伸縮装置部の段差,路面凹凸,走行車両の特性,車両の走行速度など)の影響度合の系統的な把握等により,今後の低周波音対策に有用な情報を提供し得た。(2)鉄道橋の振動・騒音に関しては,まず主要な構造要素であるI形及び箱形プレ-トガ-ダ-を平板の集成体と捉え,有限帯板法によって低次から高次にまでの広範にわたる,より精緻な固有振動解析を施し,その結果を各波動パタ-ンごとの断面変形モ-ド図及び位相速度分散曲線にまとめた。また,衝撃的外力を受けるプレ-トガ-ダ-の構成平板に対し動的応答解析を行い,さらにその振動速度のフ-リエ・スペクトルを通じて任意受音点の放射音圧レベルのスペクトルを求める簡便な手法を開発した。(3)上記の理論解析と並行してモデル実験を行い,解析手法の有効性や解析的に得られた各種の基本特性を検証した。すなわち、鋼平板による音源モデルの検証する音響実験,鋼I形はりによる固有振動特性を確認する自由振動実験,衝撃作用時間を変化させて行った衝撃実験等である。また,鋼平板に対する制振材の開発研究の一環として,ウレタンフォ-ムによる制振実験を行い,その制振特性を明かにした。
計算解剖モデルに基づく診断・治療の融合的支援

計算解剖モデルを利用して医用画像をコンピュータが自動的に認識理解する技術を開発するとともに、それを利用して外科手術に至る診断治療の一連の過程を高度な可視化と情報統合により融合的に支援する手法の開発に成功した。ここでは、臓器領域の自動認識、解剖学的名称の自動認識、異常部位、あるいは、リンパ節の自動認識が行われ、それらの情報を利用して診断治療を支援するシステムが開発された。また、臨床の場における評価を行った。本研究では、本学術領域において総合的に研究される計算解剖モデルを基にして、診断から治療に至る過程を融合的に支援する手法を追求し、研究項目AO1、AO3と協力しながら計算解剖モデル応用の学理構築の一翼を担う。本年度は以下の研究項目を実施した。(1)計算解剖モデルに基づく融合的支援法の組織的整理ナビゲーション型診断治療融合的支援システムについて、特に「融合」をキーワードとし、ナビゲーション型診断治療融合的支援システムのあり方について検討を行った。(2)計算解剖モデルを利用した解剖学的構造実時間理解法の開発対象を胸部臓器と腹部臓器に限定し、医用画像から各臓器領域を精密に抽出する手法の開発を進めた。画像アトラスとグラフカットを併用した手法の開発を行った。(3)実時間可視化手法の開発診断治療融合的支援では、臨床医が必要とする情報をすばやくコンビュータが取り出し、目的に応じた形で可視化することが必要とされる。そこでGPGPUを利用した高速ボリュームレンダリング手法を実現し、臨床の場での評価を進めた。(4)計算解剖モデルを用いた診断治療支援システム開発診断治療融合的支援システムでは、診断モードと治療茎援モードが高度なレベルでシームレスに融合される必要がある。そこで「解剖学的構造による記述」を基にした意味的な統合により、診断治療融合的支援システムの基本的枠組みを検討した。そのひとつとして、内視鏡下手術支援画像上に解剖学的名称を表示する手法を検討した。(5)計算解剖モデルを利用した診断治療融合的支援手法の予備的評価研究代表者がこれまでに開発を進めた診断治療支援システムを臨床の場において運用し、本研究課題において、解決すべき課題などを臨床的側面から検討した。●計算解剖モデルのための高速画像変形手法の開発診断治療融合的支援で必要とされる画像変形手法を開発した。特に画像セグメンテーションの観点から、診断治療融合的支援で必要となる画像変形手法に関しての検討を行った。●計算解剖モデルのための解剖学的構造理解手法の開発診断治療融合的支援システムにおいて解剖学的名称の自動表示は融合的支援を行う上での鍵となる。そのため、高次元医用画像から取り出された血管領域に対して自動的に名称を付与する手法を開発した。●ナビゲーション型診断治療融合的支援システムための実時間対応付けの検討計算解剖モデルと実人体との実時間対応付け手法に関して検討し、その第1段階として内視鏡画像の自動分類、血管上への血管名自動表示について検討を行った。●計算解剖モデルを利用した診断治療融合的支援手法の予備的評価研究代表者がこれまでに開発を進めた診断治療融合的支援システムを臨床の場において運用し、ナビゲーション型診断治療融合的支援システム開発において、解決すべき課題や求められる性能などを臨床的側面から洗い出した。●診断治療融合的支援プロトタイプシステム開発の準備診断治療融合的支援システムのプロトタイプシステム開発に向け、これまで開発した手法のプログラムインタフェース統一を行い、プロトタイプシステムの開発効率向上を図った。●診断治療融合的支援システム開発腹部臓器を対象とした診断治療融合的支援システムを開発した。解剖学的な臓器位置を利用して精密な病変抽出を行い、この結果を治療支援へ応用可能とした。●診断治療融合的支援システムための解剖学的構造理解手法の開発診断治療融合的支援システムにおいて解剖学的名称の自動表示は融合的支援を行う上での鍵となる。本年度は、これまでに開発した高次元医用画像から取り出された血管領域に対して自動的に名称を付与する手法を改良し、より広範囲の血管領域への名称付与を実現した。また、表示方法も検討した。●計算解剖モデルを利用した診断治療融合的支援手法の予備的評価研究代表者がこれまでに開発を進めた診断治療支援システムを臨床の場において運用し、ナビゲーション型診断治療融合的支援システム開発において、解決すべき課題などを臨床的側面から洗い出した。●診断治療融合的支援システムの開発診断治療融合的支援システムの開発効率向上のため、これまで開発した手法のプログラムインタフェース統一を行った。上記臨床運用により得られた知見から、システムに必要な機能や性能などを検討した。また、胸腹部臓器を対象とした診断治療融合的支援システムを開発した。解剖学的な臓器位置を利用して精密な病変抽出を行い、この結果を診断治療支援へ応用可能とした。●多種高次元医用画像の統合法の開発診断治療融合的支援システムでは、多種の高次元医用画像センサ情報の統合が極めて重要である。そこで、空間的情報のみならず解剖学的構造情報と計算解剖モデルを利用した、多種高次元医用画像の知的統合処理手法に関して検討した。●診断

治療融合的支援システムのためのユーザインタフェースの検討診断治療融合的支援システムの手術室での利用を考慮し、タブレット端末の利用などユーザの行動を阻害しないインタフェースに関して検討した。医用画像から情報を最大限に取り出し、診断・治療のどの段階でも、手術シミュレーション、手術誘導、治療結果予測などを融合的に行うことのできる「ナビゲーション型診断治療融合的支援システム」の実現を目指し、平成24年度までに計算解剖モデルを利用した臓器認識、多種画像知的統合手法の開発、ユーザインタフェースの実現、診断治療融合的支援システムの実現を進めた。本年度は、実際の臨床現場での評価も含め以下の項目に関して研究を進めた。【解剖学的構造認識理解手法実現】昨年に引き続き解剖学的構造認識理解手法の改善を行った。臓器領域抽出、メタ解剖情報など幅広く検討した。【実空間・仮想空間対応付け手法実現】融合的診断治療実現のための実空間・仮想空間対応付けの手法について検討した。【診断治療評価手法の開発】計算解剖モデルに基づき治療が計画通りに行われているかを、手術ナビゲーション画像で検討できるようにした。【臨床の場における評価】研究項目A03と協力し、本申請課題で実現されたプロトタイプ機を臨床の場において評価した。実際の臨床例を処理することで、利点欠点等を洗い出し、その結果を開発段階ならびにA01へとフィードバックした。【解剖学的構造提示手法の開発】臨床現場からのフィードバックに基づき、計算解剖モデルにより認識理解された患者毎の解剖学的構造を、より効果的に医師へと提示する手法を開発を継続した。計算機による可視化技術のみならず、立体造形システムにより作成された立体モデルによる提示、さらには両者の融合による新たな提示方法も視野にいれた研究を進めた。【評価結果に基づくシステム改善】研究項目A03ならびに臨床系の研究分担者・連携研究者等を中心とする臨床研究者の評価結果を基に、診断治療融合的支援システムの改善行った。医用画像から情報を最大限に取り出し、診断・治療のどの段階でも、手術シミュレーション、手術誘導、治療結果予測などを融合的に行うことのできる「ナビゲーション型診断治療融合的支援システム」の実現を目指し、平成23年度までにシステム実現のための基本的手法開発、融合型システム基本機能開発に関する研究を進めた。本年度は実際の臨床現場で運用可能なシステム開発のため、融合型システム実現に関する、以下の研究項目を設定した。【計算解剖モデルを利用した臓器認識】大規模医用画像データベースを利用した画像セグメンテーション手法を開発した。【多種画像知的統合法の開発】外科領域を対象とした画像診断・治療計画作成では、多種高次元医用画像の統合が重要となる。
インラインネットワーク計測技術に基づく新たなトランスポートサービスの創出

TCPによるデータ転送の最中にそのコネクションが通過するパスの物理帯域・利用可能帯域がわかることで、さまざまな応用が可能となる。たとえば計測結果を上位アプリケーションに伝えることで、P2Pネットワークにおけるピア選択や、データグリッドにおけるダウンロードサーバの選択などである。本研究ではパスの帯域情報をデータ転送制御に用いるTCP Symbiosis方式の提案・評価を行った。本年度の研究においては、設定した2つの課題について、下記のような研究を行った。(1)BTC計測BTCをTCPコネクション内でインライン計測によって推測するためのアルゴリズムに関する検討を行った。具体的には、TCPを用いた長時間データ転送のスループットを、データパケットの送信間隔を動的に制御し、受信するACKパケットの到着を監視することによって推定する手法に関して検討を行った。(2)サービス創出TCPによるデータ転送時に、ネットワーク環境に依存せず一定のスループットを確保する手法に関する検討を行った。一般には、TCPコネクションのスループットは一般的にRTT(ラウンドトリップ時間)やパケット廃棄率に大きく影響を受けるが、インライン計測によって得られるネットワークの空き帯域に関する情報を基に、ウィンドウサイズを増加させる幅を動的に変化させることによって、どんな環境でも一定のスループットを確保することを可能とした。ネットワークの空き帯域を監視することによって、過剰な制御によってネットワークが破綻することも防止する。さらに、オーバレイネットワークにおけるトラヒックルーティングを支援するために、インライン計測結果を収集しネットワークで共有する手法に関する検討を行った。提案手法は、通常は計測のために必要となる計測オーバヘッドをほぼゼロに抑えつつ、計測結果の効率的な交換を行うため、ネットワーク全体で精度の高い利用可能帯域の情報を共有することが可能である。オーバレイネットワークがトラヒックの経路選択を行うために必要となる、経路の帯域情報を知るための、各オーバレイノードで分散的に動作する帯域情報収集システムImSystemを提案した。ImSystemは上述のインラインネットワーク計測を利用することにより、帯域計測用のトラヒックを減少させることができる。そのため、帯域情報収集のためにネットワークへ与える負荷が小さいという特長を持つ。シミュレーション評価結果により、提案システムが常に最新の帯域情報を高い精度で把握することが可能であり、かつ、ネットワークへ与える影響が少ないことを示した。また、オーバレイネットワーク上のトラヒック量が少ない場合においても、提案システムがそれを有効に利用し、計測用トラヒックを大幅に減らすことができることが明らかとなった。さらに、インライン計測結果を利用する輻輳制御方式にとって、計測誤差や環境変動が深刻な影響を与えることを指摘し、それらを回避・改善する手法として、1.計測誤差の大きさに合わせて制御パラメータを動的に設定する手法、および2.データ転送レートに対して常にノイズを載せることによって、定常状態においてもデータ転送レートが振動するようにすることで、突然の環境変動にともなう影響を緩和する手法、をそれぞれ提案した。また、それらの方式を、帯域計測に基くTCP輻輳制御方式であるTCP Symbiosisに適用した場合の性能評価をコンピュータシミュレーションによって行い、提案方式がボトルネックルータのバッファ溢れを防止すると同時にリンクの利用率低下を回避できること、また、環境変動によって発生し得るTCPのタイムアウトの発生頻度を最大で40%程度削減できること、また、変動発生後のリンク利用率を大きく改善できることがわかった。インラインネットワーク計測技術を用いたTCP輻輳制御機構において、計測誤差や環境変動がその性能に与える影響について、昨年度に加えてさらなる検討を行った。その結果、遅延時間の計測値を用いる手法よりも、帯域の計測結果を用いる手法は、計測誤差や遅延時間の影響をより大きく受けることが明らかとなった。それらを回避・改善する手法として、従来提案していた、1.計測誤差の大きさに合わせて制御パラメータを動的に設定する手法、および2.データ転送レートに対して常にノイズを載せることによって、定常状態においてもデータ転送レートが振動するようにすることで、突然の環境変動にともなう悪影響を緩和する手法、の性能評価を行い、TCP Symbiosis方式へ適用した場合における、それらの機構の有効性を確認した。さらに、環境変動の例として、無線LAN環境に着目し、そのネットワークの帯域・遅延変動がTCP輻輳制御手法に与える影響を評価し、特にフロー間の公平性が劣化することを指摘し、それに対する改善手法として、従来考えられてこなかった、ACK(確認応答)パケットの廃棄に対して輻輳制御を行う手法を提案し、シミュレーションによりその有効性を明らかにした。さらに複数種類のアクセスポイントやネットワークインフェースカードを用いた実機実験により、提案手法が無線LAN製品のベンダにかかわらず一定の性能を発揮できることを明らかにした。
根の屈性間相互作用・水分屈性発現機構の変化が根系形成と植物の生育に与える影響

分子生物学のモデル植物であるシロイヌナズナの系統間での重力屈性と水分屈性の強度の差異、および、根の水分屈性のオーキシン輸送阻害剤の感受性を比較し、ゲノムワイド関連解析(GWAS: Genome-Wide Association Studies)により、根の重力屈性と水分屈性の相互作用に影響を与える遺伝子、および、根の水分屈性のオーキシン輸送依存性に影響を与える遺伝子を探索・同定する。そして、見出した遺伝子での変異が根系の形成・発達と植物体の生育に与える影響を明らかにする。本研究の成果により、根の屈性・根系形成を遺伝的に制御し、植物の生産性を高める育種技術の開発につながると期待される。
YAP による臓器全体の物理特性制御の分子機構の解明

1. YAP標的遺伝子ARHGAP18による組織メカニクス制御機構の解明ARHGAP18に対するGEFあるいは、RhoAと結合する新規GAPを同定するため、大腸菌でRhoA野生型、RhoAT19N(ドミナントネガティブ型)、GST-RhoAQ63L(恒常的活性化型)の組換えタンパク質を作製し、精製した。GSTと結合させ精製した組換えタンパク質とヒト網膜色素上皮(RPE1)細胞のタンパク質抽出物を混ぜて、結合タンパク質を精製し、SDS-PAGEで分離した。分離したゲルを切り出し、in-gel digestionでペプチド消化し、質量分析装置でタンパク質の同定を試みた。その結果、RhoA野生型ではRhoGAPのSYDE2やARHGAP11Aが同定された一方、RhoAT19NではARHGEF15やRapGEFのRAPGEF1が同定された。さらにGST-RhoAQ63Lでは、ARHGAPとしてARHGAP31やARHGAP11Aが同定された。2.組織メカニクス制御に関わるARHGAP18以外のYAP標的遺伝子の同定ARHGAP18以外のYAP標的遺伝子を探索するために、ヒトRPE1細胞で作製した3Dスフェロイドを用いてmRNA seqおよびChIP seqを試みた。現在、両者の網羅的なデータを合わせて解析を進めている。3.肝星細胞による臓器全体のメカニクスの感知・制御メカニズムYAPの転写活性化を阻害するVerteporfin(VP)は、マウス肝硬変モデルにおいて線維化を抑制するが、YAPは細胞増殖なども促進するために副作用が問題となる。そこで我々は、肝星細胞特異的にVPを働かせるために、肝星細胞がVitaminAを取り込む性質を利用した薬剤デリバリーシステムを導入した。現在までにVitaminAを付加したリポソームにVPを取り込ませることに成功している。当初の研究計画に従い、YAP標的遺伝子ARHGAP18が組織メカニクスを制御する分子機構の解明に向けて、プルダウンアッセイなどのプロテオミクス実験が着実に進行している。また、ARHGAP18以外のYAP標的遺伝子の解析についても、mRNA seqおよびChIP seqによる網羅的なトランスクリプトーム解析が進行中である。以上から、本年度の進捗状況は概ね順調と判断できる。本研究はYAPによる臓器全体のメカノホメオスターシス制御機構の解明を目的としており、来年度も引き続きYAPを活用した臓器拡大・再生に向けて、分子・細胞・臓器の多階層レベルでの解析を行う。ARHGAP18による組織メカニクス制御機構の解明については、新規の相互作用タンパク質同定法であるBioID法を用いてRhoAおよびARHGAP18相互作用タンパク質を探索する予定である。ARHGAP18以外のYAP標的遺伝子については、来年度も引き続き網羅的な解析を行い候補遺伝子を同定する。また、YAPはエンハンサーに結合し遺伝子の転写を制御すると報告されている。そこで転写開始点から大きく離れたエンハンサーを介して転写制御する標的遺伝子を同定するために、Hi-C解析を用いて候補遺伝子の中からYAPの直接標的遺伝子を同定する。さらに同定したYAP標的遺伝子の組織メカニクス制御への関与を明らかにするため、ヒト3DスフェロイドでのノックダウンによりYAPノックダウンの表現型(スフェロイドの扁平化、アクチンの過重合など)と比較する予定である。同定した複数の遺伝子の同時ノックダウンによってYAPノックダウンの表現型を再現できるか、反対に強制発現によってメダカYAP変異体の表現型をより完全に回復できるかどうかについても検討する予定である。

また、ARHGAP18以外のYAP標的遺伝子の解析についても、mRNA seqおよびChIP seqによる網羅的なトランスクリプトーム解析が進行中である。以上から、本年度の進捗状況は概ね順調と判断できる。本研究はYAPによる臓器全体のメカノホメオスターシス制御機構の解明を目的としており、来年度も引き続きYAPを活用した臓器拡大・再生に向けて、分子・細胞・臓器の多階層レベルでの解析を行う。ARHGAP18による組織メカニクス制御機構の解明については、新規の相互作用タンパク質同定法であるBioID法を用いてRhoAおよびARHGAP18相互作用タンパク質を探索する予定である。ARHGAP18以外のYAP標的遺伝子については、来年度も引き続き網羅的な解析を行い候補遺伝子を同定する。また、YAPはエンハンサーに結合し遺伝子の転写を制御すると報告されている。そこで転写開始点から大きく離れたエンハンサーを介して転写制御する標的遺伝子を同定するために、Hi-C解析を用いて候補遺伝子の中からYAPの直接標的遺伝子を同定する。さらに同定したYAP標的遺伝子の組織メカニクス制御への関与を明らかにするため、ヒト3DスフェロイドでのノックダウンによりYAPノックダウンの表現型(スフェロイドの扁平化、アクチンの過重合など)と比較する予定である。同定した複数の遺伝子の同時ノックダウンによってYAPノックダウンの表現型を再現できるか、反対に強制発現によってメダカYAP変異体の表現型をより完全に回復できるかどうかについても検討する予定である。
超好熱性アーキアから発見された新規エンドヌクレアーゼによるDNA修復経路の解明

これまでにin vitroで損傷DNAに作用することを証明してきたタンパク質をコードする遺伝子について、Thermococcus kodakarensisの遺伝子の多重変異を含む破壊株の作製を進めていった。脱アミノ化損傷に関係する遺伝子ではendoQ、endoMS、endoV、udg、およびAPendoをターゲットとしている。endoQ遺伝子の破壊株に対して、さらにendoV, endoMS, udg, APendoそれぞれの遺伝子破壊を導入し、二重変異株を作製した。また、同様にendoQ、endoMS、endoV、udgそれぞれの遺伝子の破壊株に対してDNA修復に関わると予想されるpolB遺伝子の破壊をおこない、二重変異株を作製した。また停止した複製フォークに関わる遺伝子で互いに相互作用することがわかっているhefとhanについて二重変異株を作製した。それぞれの一遺伝子破壊株において、他の遺伝子の発現量がどうなるのかをRT-PCRを用いて解析した。至適培養条件下ではいずれの遺伝子の破壊株においても、他の遺伝子の発現量に有意な差はみられなかった。もう一つの課題であるEndoMSタンパク質の修復経路の解明について、T. kodakarensis由来Mre11、Rad50、HerA、NurAの遺伝子クローニングをおこない、組換えタンパク質の高純度標品を得た。EndoMSによる2本鎖切断後にこれらのタンパク質が、どのように働くのかを調べるために、蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いて基質を作製し、切断反応の解析をおこなった。予想した5'末端の切断ではなく、3`末端のエキソヌクレアーぜ活性が検出されたが、エンドヌクレアーゼ様の産物も検出されるので、さらなる解析が必要である。EndoMSと相互作用するタンパク質の探索は、候補となる組換えタンパク質の作製途中である。嫌気性超好熱性アーキアT. kodakarensisの遺伝子操作実験が順調に進行し、二重変異を含む多数の遺伝子破壊株を作製することができたので、遺伝学的解析に向けて、予定以上の種類の破壊株を用いることができるように準備ができた。しかし実験に不可欠な嫌気チャンバーの不具合(故障し、新規更新)のため、様々なDNA損傷を与える薬剤を使用したプレートによる実験ができなかった。その代わりにRT-PCRで遺伝子の発現量解析を実施し、13種類の遺伝子破壊株について、それぞれ10種の遺伝子の発現量解析をおこなった。この実験が順調に進み大量のデータが取得できた。EndoVとEndoQそれぞれが、脱アミノ化塩基損傷を含むDNAに対して切断した後、PolBが伸長合成して修復を完了させるモデルにもとづいて、in vitroにおける再構成実験を開始しており、三種の組換えタンパク質の調製が終わり、順調に予備実験へと進められた。またT. kodakarensis由来Mre11、Rad50、HerA、NurAの組換えタンパク質の作製は、タンパク質精製のステップで、不溶化沈殿等のトラブルがあったが、これにも対応できるようになり、高純度な精製標品を得るための方法を確立することができた。多数作製した遺伝子破壊株について、種々の温度における増殖解析を行う予定である。至適温度の85度では差異が見られない株も、90度以上の高温では感受性を示すものがあると期待される。DNA損傷に用いる薬剤を検討し、表現型を観察できるよう条件検討を行う予定である。また細胞の変異率の測定を6メチルプリン耐性を利用し定量する実験系を確立させることが当初の計画であるが、次世代シークエンサの利用を視野に入れて、細胞の変異を定量するだけでなく変異スペクトルの解析までできるようにしたい。継代した細胞の変異の蓄積を直接ゲノムシークエンスをすることにより、解析可能であると考えられるので、計画的に継代とゲノム調製をおこない遂行する。EndoMSの修復経路のin vitroにおける探索は、精製した組換えタンパク質との相互作用解析、切断反応の詳細な解析を引き続きおこなう。相互作用因子の候補で、まだ精製タンパク質を調製できていないものがあるのでそれを進めるとともに、ゲノム上のEndoMSにHisタグを付加して、細胞抽出液から天然の複合体を調製することも検討したい。予想した