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フランス現代文学にみる「他者性」あるいは「文学性」の再創造

とくに、パリ第八大学教授ミレイユ・カール=グルバー氏の召喚により、2ヶ月間パリ第八大学にて大学院向けの講義を担当し、報告者の課題である「フランス文学における「他者性」に関して発表することができたのは、非常に大きな成果である。平成16年度は、主にフランス現代作家パスカル・キニャールの作品研究を通して、現代フランス文学が直面する「文学性」の再定義の問題に取り組んだが、平成17年度は研究範囲をさらに広げ、マルグリット・デュラスとの比較において研究を試みた。これにより、現代フランス文学の特徴のひとつである言語表現の限界を探る試みと、そこから新たに創出される芸術表現のあり方が浮き彫りにされたといえる。この特徴は、キニャールにおいては哲学的思索を反映する「小論」や「エッセイ」、「断片」に色濃く現れていたのだが、デュラスにおいてそれは物語という虚構空間に溶け込んでいた。すなわち(物語表現の道具である)言語の限界というメタ世界が、デュラスの中では虚構世界そのものの描写としてみられるのだ。廃墟の空間で繰り広げられる物語は、物語内物語であると同時にその外部世界(言語の限界というエクリチュールの現場)のメタファーとしても機能していることを明らかにした。また、このように言語表現の限界を探る作家たちの試みは、必然的にその地平線に文学の「他者性」との出会いを経験することになる。キニャールやデュラスにとって文学表現の他者的存在は音楽であった。このことを踏まえて、今年度は特に文学と音楽の関係に焦点をあて、キニャール、デュラス文学と音楽とのかかわりを研究した。さらに、現代作家でブルースト以降、音楽と文学の新たな関係を模索するフランス現代作家の一例としてミシェル・ビュトールの作品に注目し、ビュトールの小説・エッセイ・テクストを分析した。特に注目すべきは、ビュトールの手法が、従来のように音楽の中で文学を語る(オペラ的試み)、あるいは文学のなかで音楽を語る(音楽の言語化)といった雛形を完全に放棄し、音楽と文学が相互の自律性を失わずに向かい合えるような装置を作り出したことである。そのため、ビュトールは音楽でもなく文学言語でもない「第三の言語」なるものが可能なテクストの形式を提案し、それをDialoguesと名づけた。今年度の主なテーマとなったミシェル・ビュトール研究の成果は、2007年10月、フランス国立図書館で行われたミシェル・ビュトールに関する国際学会で発表の機会を得た。世界第一線で活躍するビュトール学者たちと肩を並びえたことは報告者にとって実りの多い経験であった。また、今年度は科学研究費の最終年でもあることから、3年間の成果を一冊の本にまとめた。「他者性」と「文学性」をテーマにした論文集には『影の発明』というタイトルをつけた。
フランス・ロマン主義における「作者」像の成立と変容をめぐる総合的研究

フランス・ロマン主義の時代における「作者」像をめぐって、とりわけ重要なケースであるバルザックとネルヴァルを中心に据え、メディアの拡大、広範な読者層の成立および「私」の同一性を探求する詩学の展開との関連で、作品の起源であるとともに作品によって遡及的に生み出されるものでもある作者のありようを照らし出すことができた。具体的には、バルザックの創造的な力を形象化するヴォートランの物語に注目し『ゴリオ爺さん』『幻滅』『浮かれ女盛衰記』の三大長編の内容を一巻に凝縮した『バルザック』(集英社文庫)を刊行した。またネルヴァルに関する国際シンポジウムに参加し、流動的な「私」の記述が含む豊かな可能性を明らかにした。平成25年度は1先行研究の調査および分析検討、2重要な作家に関する研究・分析の遂行、3関連文献・資料の収集の3点を目標として研究を開始した。第1の点に関しては、多くの基礎文献に当たり、これまでフランスを中心になされてきた研究の概略をつかむことができた。またその中で、とりわけバルザック専門家であるジャン=リュイ・ディアズの、作家の「自己生成」をめぐる論考がもつ意義を確認することができた。ネルヴァル専門家であるジャン=ニコラ・イルーズとも緊密に連絡を取り、彼の責任編集により刊行中のネルヴァル全集をめぐって、従来の研究者たちのようにテクストと生を画然とへだてるのではなしに、生を複数化し「ロマン化」するものとしてのロマン主義的作者像を作品解釈の根底に置く可能性を検討することができた。第2の点に関しては、ルソー、バルザック、ネルヴァル、ランボー、さらにはヴァレリーといった重要作家に関する研究、分析を積み重ね、「個」と「共同体」が切り結ぶ局面において「作者」像が立ち上がってくるさまに注目しつつ、そこにロマン主義を越えて広く文学の在り方そのものを規定する諸条件を見出すべく努めた。同時に、そうした創造過程における自我の変容としての「作者」登場が、ロマン派の時期に限定された現象ではなく、現代にまで引き継がれた事象であることも明確に意識するにいたった。第3点については、18世紀から20世紀まで、文学に留まらずグローバルな視座のもと、有益な資料の収集に努めた。作家像の進展をうながすメディアとしての美術、さらには映画の重要性も改めて浮き彫りになった。以上のような活動を根本に据えて、メンバー各自は本研究と直接、間接に結びついたそれぞれの成果を著書、論文の形で広く世に問い、また重要な文学作品の翻訳紹介にも努めるなど、一般読者への発信も活発に行うことができた。前年度の成果を継承しつつ、重要作品の分析にいっそう力を入れ、ルソー、バルザック、ネルヴァル、ボードレール、ヴァレリーらのテクストをめぐって、先行研究との対話を重ねつつ考察を深めるべく努めた。また研究者たちとの交流ネットワークを広げ、シンポジウム等への参加や講演会の開催等によって意見交換の場を多くもつとともに、研究成果の発信も心がけた。とりわけ、国際ネルヴァル・シンポジウムでの発表や国際ボードレール・シンポジウムでの発表等をとおして、国外の研究者たちとの絆を深め、専門研究の最前線において開拓されているさまざまな主題との連関において、「作者」の問題系を考察するヒントを得ることができた。また、学会内のみならず、一般読者に向けての発信も常に心がけ、著書、翻訳、論集等の執筆・制作をとおして、研究内容を広く知らしめるべく努力を重ね、数多くの刊行物を世に送り出すことができた。同時に、ロマン主義における「作者」の問題が、フランス文学の現在における新たな展開と直結する意味をもつことを、ル・クレジオやモディアノ、ウエルベックといった現在世界的に活躍している作家たちの仕事の研究、紹介により明確化することができた。それと同時に、この問題が文学の領域に留まらない重要性をもち、たとえば音楽において、さらには映画において、先鋭的なテーマを提供しうることも、リヒャルト・ストラウスについて、あるいはアンドレ・バザンについての研究をとおして明らかになった。また、「翻訳」について考察することが「作者」を考えるうえで有効であることも確かめられた。ともあれ、現代に及ぶ大きな射程をもつ「作者」像の成立と変遷という問題がもっとも根本的な形で顕在化したのがロマン主義の時期においてであることは間違いなく、さらなる研究によって、ロマン主義的芸術=作者創造の現代性をより精緻に浮き彫りにすることができるはずである。フランス・ロマン主義の時代における「作者」像の成立と変容をめぐって、とりわけ意義深いケースと考えられるバルザックおよびネルヴァルに焦点をしぼり、メディアの拡大、広範な読者層の成立、さらには「私」の深層を探求する詩学の展開との関連で、作品の「起源」であるとともに、作品によって遡及的に生み出されるものでもある「作者」のありようを照射することができた。具体的には『人間喜劇』においてバルザック自身の創造的エネルギーの形象化として際立った重要性をもつヴォートランの物語に注目し、ヴォートラン像の建立と相即的に「作者」もまた成立したことを強調しつつ、『ゴリオ爺さん』『幻滅』『浮かれ女盛衰記』の三大長編の内容を一巻に凝縮した『バルザック』(集英社文庫ヘリテージシリーズ)を刊行した。また、現在フランスで刊行中の新しいネルヴァル全集を監修している、パリ第8大学教授ジャン=ニコラ・イルーズ氏と緊密に連絡をとりあい、イルーズ氏を招聘して講演会を開催、研究上の交流を深めるとともに、ネルヴァルにおける人生と創造をめぐり「ロマン化」という新たな概念を得ることができた。その成果を盛り込んだネルヴァルの主著『火の娘たち』の翻訳紹介を2016年中に実現する予定である(岩波文庫刊)。

さらに、ランボー、ヴァレリーといった「私」の詩学に革新をもたらした詩人たちをめぐる研究を深める一方、フランスの現代小説(ル・クレジオ、ミシェル・ウエルベック)や映画論(アンドレ・バザン)の研究・紹介をとおして、ロマン派的作者の問題の現代における継承と展開を考察した。最後に、「翻訳」の観点を導入することで作者概念のゆらぎをとらえるべく、森鴎外の場合を分析し、国分学会において発表を行い、論集にその内容が掲載されたことも、本研究のもたらした成果として付言しておきたい。フランス・ロマン主義の時代における「作者」像をめぐって、とりわけ重要なケースであるバルザックとネルヴァルを中心に据え、メディアの拡大、広範な読者層の成立および「私」の同一性を探求する詩学の展開との関連で、作品の起源であるとともに作品によって遡及的に生み出されるものでもある作者のありようを照らし出すことができた。具体的には、バルザックの創造的な力を形象化するヴォートランの物語に注目し『ゴリオ爺さん』『幻滅』『浮かれ女盛衰記』の三大長編の内容を一巻に凝縮した『バルザック』(集英社文庫)を刊行した。またネルヴァルに関する国際シンポジウムに参加し、流動的な「私」の記述が含む豊かな可能性を明らかにした。第1に、狭義の「フランス・ロマン主義」に属する作家たちに関して、資料の収集や先行研究の検討に努めるとともに、代表的作品の分析を深め、「作者」像の成立と変容というテーマとの関わりにおいて新たな読解可能性を提示することができた。その成果の一部はすでに、国際ネルヴァル学会や国際ボードレール学会を含む、内外の各種学会での発表や、フランス語・日本語による論文の執筆によって公表する機会を得た。同時に、研究者たちとのあいだのネットワークもより豊かに広げることができ、研究にとって大きな刺激となった。なおバルザック、ネルヴァル、ランボーといった重要作家たちに関しては、研究の成果を織り込んだ新しい翻訳の刊行を鋭意、準備中だが、その作業をかなり進行させることができた。第2に、「フランス・ロマン主義」に根ざしつつも、時代・ジャンルを超えるものとしての「作者」像の問題の重要性を認識し、それにふさわしい横断的な研究の態勢を整えることができた。たとえば一方では音楽、映画に関して、他方では「作者」の問題を側面から照射する可能性をもった「翻訳」の問題に関して、論考を深め、フランス文学のみに留まらない、より一般性のある形で研究を提示していく方法を開拓することができた。また、そこで得られた知見を次々に活字化し、専門家のみならず、一般読者に向けても発信することができた。リヒャルト・シュトラウス論の刊行や、映画における「作家主義」の嚆矢とみなされるアンドレ・バザンの『映画とは何か』の翻訳の刊行はそうした成果の一部である。第3に、「作者」像の成立をめぐる事象を正面から検討するのと同時に、それを側面から照射しうるテーマとして「翻訳」の問題の重要性を認識し、考察を深めることができた。それに関しても、著書・論文等の形で成果を世に問うことができた。フランス文学3年間のプロジェクトをしめくくるべく、フランス文学・ロマン主義研究の最前線に立つ研究者を招聘しての講演会、シンポジウムといった催しを企画する。
吸収性かつ圧電性ポリ乳酸による骨形成に関する研究

電磁場発生装置が偽関節部の仮骨形成の加速などのために臨床応用されている。また、金属製プレートやワイヤなどが骨折内固定材として用いられている。本研究の目的は、歪みによって電気が発生するとともに体内で分解して吸収されてしまうポリ-L-乳酸を臨床でより広く利用するための基礎研究を行うことである。ポリ-L-乳酸は生体吸収性という大きな特徴をもっているが、その力学的性質と吸収性との関係、共重合によるそれらの特性の変化、光学活性度の影響、などはまだ詳しく調べられていない。本研究によって得られた主要な成果の概要は次の通りである。1)乳酸の重合条件を変えることによって初期引張り強度が大きく異なるポリ乳酸を合成することができた。2)吸収性材料からの担体の中に塩基性繊維芽細胞(bFGF)あるいはTGF-βを包含させてから、動物の体内に埋込むことによって骨形成を同所性のみならず、異所性においても引き起こすことができた。3)ラットの大腿骨にくさび状の磁化金属(サマリウム・コバルト)と同一サイズで同一組成の無磁化金属を打ち込んで静磁場の骨形成に対する効果を調べた。その結果、明らかに磁化金属のほうが骨形成を促進する傾向が認められた。4)ポリ乳酸の紡糸によってポリ乳酸繊維を得た。これとポリカプロラクトン繊維とを組合せることにより、骨接合材を作製した。これは、従来から使用されているステンレス鋼ワイヤに代わるものである。この繊維状骨接合材の締め付けは、ポリカプロラクトン繊維の熱癒着を利用して行った。その結果、時間とともに固定部がゆるんでくるということは起こらなかった。5)ポリ乳酸繊維をねじりながら束ねて作製した紐状ポリ乳酸を長さ方向に引張ったところ、電流が発生した。すなわち、圧電性を示した。平成7年度はほぼ計画に準じて研究が行われた。1) L-乳酸の開環重合によって分子量の異なるポリ-L-乳酸を合成し、フィルムとロッドに成形したものをさらに延伸装置によって一軸延伸した。2)分子を配向させたポリ-L-乳酸の諸物性を測定した。3)延伸したポリ-L-乳酸試料の圧電測定においては中空繊維状の試料を作成し、その内外に生じる電場を計測した。4)圧電定数の異なるロッドを用い、骨切りしたネコ大腿骨を固定した。仮骨の形成量をX線CT法と重量法によって測定し延伸した材料周囲の骨形成が盛んであることを確認した。5)骨形成量と試料の延伸量との関係を定量的に求めた。6)ポリ-L-乳酸試料による組織反応の有無を調べた。7)ポリ-L-乳酸試料の生体内における吸収速度を測定した。本年度においては、圧電性の本質をよりよく知るためにそれに付随した磁場の骨形成に対する影響を調べるとともに、ポリ乳酸系材料の吸収性に関しても検討した。まず、磁場の影響に関してはラットを実験動物に用い、その大腿骨に磁化した金属を埋込み、骨生成量を測定した。その比較として同じサイズの未磁化金属も埋込んだ。その結果、その差は大きくはないが、有意に磁化金属のほうが未磁化金属よりも骨形成を促進した。しかし、有意な差を得るためには、ラットの埋込み部位、埋込み方法、骨量の測定法などにいろいろと改良を加える必要があった。このように、ラットでは有意に磁場の促進効果が認められたが、小動物ではヒトとの隔たりが大きすぎるため、次にイヌを用いて同じような埋込み実験を行う予定であり、その練習実験を行っている。

すでに延伸したポリL-乳酸の圧電性が骨形成に有効に働くことがわかったため、次にその臨床応用の一つとして延伸ポリL-乳酸から繊維を紡糸し、それから紐状体を作成し、それの骨折固定材としての応用を考えている。この紐状体の圧電特性の測定は困難なため、その定量的研究は進めにくい。ポリL-乳酸は生体吸収性という大きな特徴をもっているが、その力学的性質と吸収性との関係、共重合によるそれらの特性の変化、光学活性度の影響、などがまだ詳しくは調べられていない。そこで、本年度においては、ポリ乳酸系材料の材料科学的研究も行った。その結果、ポリ乳酸は、他の吸収性ポリエステルとのブレンドおよび他のラクチド系モノマーとの共重合によっても、その吸収速度と力学強度が大きく変化することが明らかとなった。しかし、力学強度を高めようとすれば分解が遅くなってしまい、分解を速めようとすれば、整形外科用材料としての強度が不足するという結果であった。現在、偽関節部の仮骨形成の加速などのために電磁場発生装置が臨床応用されている。また、金属製プレートやワイヤなどが骨折内固定材として用いられている。本研究の目的は、歪みによって電気が発生するとともに体内で分解して吸収されてしまうポリ-L-乳酸を臨床でより広く利用するための基礎研究を行うことである。また、電気および磁気による骨形成の機構を解明することも、本研究の一つの目的である。ポリ-L-乳酸は生体吸収性という大きな特徴をもっているが、その力学的性質と吸収性との関係、共重合によるそれらの特性の変化、光学活性度の影響、などはまだ詳しく調べられていない。そこで、ポリ乳酸を他の吸収性ポリエステルとのブレンドおよび他のラクチド系モノマーとの共重合によって、その吸収速度と力学強度が大きく変化する材料を分子設計した。一方、臨床応用のための研究として、ポリ-L-乳酸を延伸することによって圧電性を付与したポリ乳酸繊維を作成し、それを金属製ワイヤの代替として骨折接合に利用する研究を行った。その結果、ポリ乳酸繊維で骨折部を締め付けたときに締めもどしが起こらないような工夫を行えば、骨折部の固定が十分に可能であることがわかった。骨折の再結合も問題なく進行した。しかし、繊維の圧電性測定が不可能なため、圧電性と骨折治療との直接的な相関性に関してはデータを得ることはできなかった。本研究によって得られた主要な成果の概要は次の通りである。1)ポリ乳酸の生体内分解吸収性速度を乳酸モノマーの種類、共モノマー、重合条件(温度、開始剤濃度、重合時間など)を変えることに大きく変化させることが可能であった。さらに、初期引張り強度なども変えることができた。2)吸収性材料からの担体の中に塩基性繊維芽細胞(bFGF)あるいはTGF-βを包含させてから、動物の体内に埋込むことによって骨形成を同所性のみならず、異所性においても引き起こすことができた。3)ラットの大腿骨にくさび状の磁化金属(サマリウム・コバルト)と同一サイズで同一組成の無磁化金属を打ち込んで静磁場の骨形成に対する効果を調べた。その結果、明らかに磁化金属のほうが骨形成を促進する傾向が認められた。4)ポリ乳酸の紡糸によってポリ乳酸繊維を得た。これとポリカプロラクトン繊維とを組合せることにより、骨接合材を作製した。これは、従来から使用されているステンレス鋼ワイヤに代わるものである。この繊維状骨接合材の締め付けは、ポリカプロラクトン繊維の熱癒着を利用して行った。
Mafa欠損MIN6細胞をもちいた膵β細胞の成熟機構の解析

糖尿病の病因を解明するためには、膵ベータ細胞の持つインスリン分泌制御メカニズムをより深く解析する必要がある。本研究では、膵ベータ細胞の発生や成熟、インスリン分泌能、糖尿病の発症や進行に深く関わる転写因子Mafaを膵ベータ細胞特異的に欠損させ、この遺伝子がベータ細胞の分化成熟の過程や機能維持においてどのような役割を果たしているかを詳細に検討することを目的としている。これまでに樹立したMafaノックアウトベータ細胞株(MIN6-Mafa-KO細胞)に対し、Mafaを発現するアデノウイルスベクターやレンチウイルスベクターを感染させ、短期Mafa-rescueベータ細胞と長期Mafa-rescueベータ細胞を作製した。そして、短期Mafa-rescueベータ細胞と長期Mafa-rescueベータ細胞、各々についてMafa強制発現による遺伝子発現の変化をDNAマイクロアレイをもちいて解析した。さらに、新規に作成した成熟ベータ細胞株MIN6-CB4のRNAシーケンスのデータやMafaに対するChIPシーケンスのデータももちいて総合的に解析を行った。短期Mafa-rescueベータ細胞と長期Mafa-rescueベータ細胞の2群において共通に発現の変動している遺伝子群の中で、特に顕著に発現の増加している遺伝子で、かつMIN6-CB4における発現も高く、プロモーター近傍にMafAの結合領域のある遺伝子を選択した。その中から、インスリン分泌制御に関わる可能性のある遺伝子を絞り込んだ。そして、それらの発現ユニットを作成し、レンチウイルスベクターに組み込み、MIN6-Mafa-KO細胞に導入し、グルコース応答性インスリン分泌など、ベータ細胞機能がどの程度改善するかを詳細に検討した。糖尿病の病因を解明するためには、膵ベータ細胞の主な機能であるインスリン分泌制御メカニズムをより深く解析する必要がある。本研究では、膵ベータ細胞の発生やインスリン分泌能、糖尿病の発症や進行に深く関わる転写因子Mafaを膵ベータ細胞特異的に欠損させ、この遺伝子が成熟分化の過程や機能維持においてどのような役割を果たしているかを検討することを目的としている。インスリンプロモーター下でSV40のT抗原を発現するカセットが挿入されたトランスジェニックマウスIT-6と、Mafaノックアウトマウスをかけあわせ、MafaノックアウトIT-6マウスを得た。そして、そのマウスから膵臓を摘出し、インスリノーマを単離培養してMafaノックアウトベータ細胞株(MIN6-Mafa-KO細胞)を樹立した。この細胞は、オリジナルのMIN6細胞と比較し、コロニー形態がコンパクトであり、細胞の大きさも小さい傾向にあり、さらにグルコース応答性インスリン分泌能が著しく低下していた。MIN6-Mafa-KO細胞が未成熟なベータ細胞の性質を示している可能性があることから、まずrescue実験を行い、Mafaの短期過剰発現あるいは長期過剰発現による機能や遺伝子発現の変化を検討することとした。今年度はMafaを発現するアデノウイルスベクターやレンチウイルスベクターを作製し、それらをMIN6-Mafa-KO細胞に感染させ短期過剰発現rescue細胞と長期過剰発現rescue細胞を作製した。今後は、これらの細胞をもちいて詳細な機能解析を行っていく予定である。MIN6細胞にはアデノウイルスベクター(AdV)が非常に効率的に感染するため、短期過剰発現rescue細胞用に、CAG-MafaあるいはPGK-Mafaを組み込んだアデノウイルスベクターAdV-CAG-MafaとAdV-PGK-Mafaを作製した。コントロールとしてAdV-CAG-EGFPあるいはAdV-PGK-EGFPを用いることとした。AdVの発現期間は約1週間と短いため、長期過剰発現用にはレンチウイルスベクター(LentiV)をもちいることとした。レンチウイルス用にもLentiV-CAG-Mafa-IRES-puroとLentiV-PGK-Mafa-IRES-puroの2種類を作製した。コントロールとしてLentiV-CAG-EGFP-IRES-puroとLentiV-PGK-EGFP-IRES-puroをもちいることとした。10クローン得られたMIN6-Mafa-KO細胞の中から、平均的な性質を示す2クローンを選び、それぞれにウイルスベクターを感染させ、rescue細胞を得た。AdVを感染させた短期rescue細胞(MIN6-AdV-Mafa細胞)は感染後34日以内に必要な実験を行うこととした。長期rescue細胞(MIN6-LentiV-Mafa細胞)は約3週間puromycinで薬剤選択を行った。今年度予定していたrescue細胞の作製は順調に進んだ。MafaノックアウトIT-6マウスから樹立したMafaノックアウトベータ細胞株(MIN6-Mafa-KO細胞)は、オリジナルのMIN6細胞と比べ、細胞の大きさが小さく、グルコース応答性インスリン分泌能が著しく低下していることから、未成熟な性質を有している可能性が示唆された。そこで、分化成熟、機能維持における役割を検討するため、Mafaを発現するアデノウイルスベクターやレンチウイルスベクターを感染させ、短期過剰発現rescue細胞と長期過剰発現rescue細胞を作製した。今年度は、それらの細胞におけるグルコースなどに対するインスリン分泌能の変化や、増殖・アポトーシスへの影響、電子顕微鏡によるインスリン分泌顆粒の変化など、詳細な機能解析を行った。

一方でMafaによるmRNA発現の変化をDNAマイクロアレイなどを用いて解析した。短期過剰発現rescue細胞と長期過剰発現rescue細胞の2群において共通に変動している遺伝子群や、一方のみで変動している遺伝子群がそれぞれ多数得られた。今後は、このDNAマイクロアレイの結果をもとに、MIN6細胞のRNA seqのデータと比較し、Mafa ChIP sequenceのデータと組み合わせ、Mafaによるベータ細胞の成熟や機能維持に深く関係する遺伝子を探索する予定である。前年度に作製した短期過剰発現rescue細胞(MIN6-AdV-Mafa細胞)とコントロール細胞(MIN6-AdV-EGFP細胞)、長期過剰発現rescue細胞(MIN6-LentiV-Mafa細胞)とコントロール細胞(MIN6-LentiV-EGFP細胞)をそれぞれ用いて機能解析を行った。AdVを感染させた細胞は感染後34日以内に必要な実験を行った。Lenti-Vを感染させた細胞は約3週間puromycinで薬剤選択を行ったのちに、実験に使用した。MIN6-AdV-Mafa細胞とMIN6-LentiV-Mafa細胞におけるMafaの発現を免疫染色やqPCR、ウエスタンブロットにて確認した。これらの細胞をもちいて、グルコースなどの刺激に対するインスリン分泌能をELISAにて検討した。さらに、増殖やアポトーシスへの影響を調べた。また、電子顕微鏡にてインスリン分泌顆粒の状態を観察した。その結果、Mafa発現により、グルコースやKClなどに対するインスリン分泌反応が大きく改善していることが確認された。またMafa発現により、増殖能が増加し、apoptosisも低下していた。インスリン分泌顆粒については、Mafa KO細胞ではインスリン分泌顆粒の数も少なく、顆粒の密度も明らかに低い傾向があったが、Mafa発現によりこれらが改善していた。一方で、DNAマイクロアレイも行い、短期過剰発現rescue細胞と長期過剰発現rescue細胞の2群において共通に変動している遺伝子群や一方のみで変動している遺伝子群をそれぞれ抽出した。今年度予定していた実験は順調に進展した。糖尿病の病因を解明するためには、膵ベータ細胞の持つインスリン分泌制御メカニズムをより深く解析する必要がある。本研究では、膵ベータ細胞の発生や成熟、インスリン分泌能、糖尿病の発症や進行に深く関わる転写因子Mafaを膵ベータ細胞特異的に欠損させ、この遺伝子がベータ細胞の分化成熟の過程や機能維持においてどのような役割を果たしているかを詳細に検討することを目的としている。これまでに樹立したMafaノックアウトベータ細胞株(MIN6-Mafa-KO細胞)に対し、Mafaを発現するアデノウイルスベクターやレンチ
自由行動下動物のSCN細胞における概日リズム変動のリアルタイム計測

多くの生理現象は、約24時間周期のリズムを示す。この概日リズムの中枢は、脳の視交叉上核(SCN)である。概日リズムの分子機構は、時計遺伝子Per1やPer2などによる転写・翻訳を介したネガティブフィードバックループ機構である。これらの発現振動は、行動リズムに反映される。そこで私たちは、Per1あるいはPer2のプロモーターでルシフェラーゼを発現する2種類のトランスジェニックラットを用いて、自由行動下のラットSCNに光ファイバーを挿入し、長期間にわたってPer1とPer2の転写発現リズムをリアルタイムでモニターすることに成功した。今後は、これらの転写変動と行動リズム変動の関連を解明したい。ホルモン分泌や血圧変動など、私たちの多くの生理現象は、約24時間周期のリズムを示す。この概日リズムは、脳の視交叉上核(SCN)と呼ばれる小さな神経核が、恒常的に時間情報を全身に発信することにより、形成されている。概日リズムの分子メカニズムは、時計遺伝子Per1やPer2などによる転写・翻訳を介したネガティブフィードバックループ機構である。興味深いことに、これらの発現振動は、概日行動リズムにまで反映される。したがって、私たちは、無麻酔・無拘束下の動物のSCNからPer1とPer2の転写発現をリアルタイムでモニターすることを試みた。Per1あるいはPer2のプロモーターでルシフェラーゼ(luc)を発現する2種類のトランスジェニックラット(Per1-lucラットおよびPer2-lucラット)のラットSCNに光ファイバーを挿入したところ、Per1-lucラットおよびPer2-lucラットのどちらを用いた場合でも、長期間にわたって明瞭な概日リズムを示す生体発光を計測した。これらの発光リズムを解析したところ、振動の大きさは共におよそ2倍であり、周期長はどちらも24時間であった。しかし、振動のピーク時刻は異なっており、Per1-lucの発光ピークは主観的明期の中頃に、Per2-lucの発光ピークはそれより3時間程度遅れていた。これらのピーク時間の違いは、SCNのサンプルを用いたリアルタイムPCR法による定量によっても示された。今後は、時差のようなSCNの時間恒常性が破綻するような環境下で、Per1やPer2がどのように変動するかをモニターし、これらの再同調過程や行動リズムとの関連を解明したい。時間生物学
舌下免疫療法の効果発現メカニズムを検討する

スギ花粉症に対する舌下免疫療法の効果発現メカニズムを検討するために、抗原提示が行われていると想定される口蓋扁桃上皮での各種蛋白mRNAの変化を評価した。いくつかのmRNAでは治療後にプラセボ投与群と比較して増加していた。今後、これらの蛋白の機能や効果発現にどのように関与するのか検討する必要がある。免疫療法は長期寛解や治癒を期待できる治療法である。しかし、現在本邦で行われている注射法による免疫療法では、長期間の通院が必要なことやアナフィラキシーショックを起こす可能性があるので一般医家には普及していない。安全な免疫療法を実現するために局所免疫療法の一つとして舌下免疫療法が考案されている。免疫療法の作用メカニズムは、従来の注射法の場合にはT細胞がアナジーになったり、リンパ球比率がTh2からTh1へと偏倚したりすることによってアレルギー反応が減弱すると考えられている。しかし、舌下免疫療法では、このような治療メカニズムが未だ十分には解明されておらず不明な点が多い。本研究では、治療効果のメカニズムの解明につながる免疫学的反応について、特に口腔粘膜局所での免疫細胞の動態について検討した。舌下免疫療法の効果発現に重要な細胞として口蓋扁桃の樹状細胞が有力であると考えられている。口腔粘膜に舌下投与した抗原が、ワルダイエルリング(リンパ組織)の主要な部位である口蓋扁桃において外来異種蛋白としてまず初めに認識される可能性がある。本研究では、第一段階としてスポンジで口蓋扁桃表層を擦過して得られる細胞成分をマイクロアレイによって網羅的に解析した。口腔内、特に扁桃組織には常在細菌も存在するので、どうしても細菌由来の成分が混入してしまう。症例によっては測定データに信頼性が乏しいものもあったが、今回4例中2例の測定を行い次のデータを得ることができた。2症例ともに増加した遺伝子は91、2症例ともに減少した遺伝子は216だった。これらの遺伝子の機能を検討することによって、舌下免疫療法の作用機序にかかわる現象について検討を加えたい。今後は有力な遺伝子を絞り、鼻粘膜上皮、口蓋扁桃上皮に発現するものをmRNAレベルで比較する予定である。舌下免疫療法は、注射法による従来の免疫療法に代わり、副作用の起きない方法として欧州ではすでに実用化されている。本邦ではスギ花粉症の患者の増加が社会問題化しており、人口の20%にも及ぶという報告もあり。スギ花粉症を薬物療法のような対症療法で治療するだけでなく、免疫療法によって根本的に治療することは他のアレルギー疾患の発症や合併をも阻止する可能性がある。しかし、舌下免疫療法を含め免疫療法の作用機序の解明は十分ではない。この研究では、投与部位(口腔粘膜)における免疫学的応答を研究し治療効果発現のメカニズムを解明したい。昨年度の研究では、口蓋扁桃粘膜からマイクロアレイによっていくつかの候補遺伝子がわかり、抗原の口腔粘膜への投与によって増加するものと減少するものが複数あった。本年度はこれらのうちどの遺伝子の関与が大きいのか検討する。抗原投与によって変化したものは、抗原提示に関与していると思われる。スギ花粉症の根治的治療法として免疫療法(減感作療法)が行われているが、現行の注射法では副作用のため普及しづらい。そこで副作用の起こらない方法として舌下免疫療法が有力であり実用化が最も期待されている。舌下免疫療法の効果発現メカニズムを検討するために、抗原提示が行われていると想定される口蓋扁桃上皮での各種タンパクの変化を評価した。
脳特異的なエネルギー代謝を担うヘキソキナーゼの機能制御機構解析と痴呆治療への応用

1.ラットミトコンドリアポーリンアイソザイム(VDAC1-3)をそれぞれ特異的に発現する酵母株を作製し,酵母ミトコンドリアにこれらポーリンアイゾザイムが機能的に発現していることを確認した。2.昨年度確立した大腸菌発現系より精製したラットI型ヘキソキナーゼの各VDACアイゾザイムを発現した酵母ミトコンドリアに対する結合実験を行った.しかしながら,いかなるラットVDACが発現した酵母ミトコンドリアにもヘキソキナーゼは結合しなかった.VDACがヘキソキナーゼのミトコンドリア結合サイトであることは,過去の報告でも立証されているため,酵母ミトコンドリアに発現したVDACの存在状態や立体構造がラットミトコンドリア中のそれとは異なっていると考えられた.現在,VDACが酵母ミトコンドリアにおいて外膜に発現しているか,電子顕微鏡を用いて検討中である.3.I型ヘキソキナーゼは活性制御ドメインであるN-halfと活性中心を含むC-halfの2つのドメインに別れ,これはリンカーとなるα-ヘリックスにより結ばれている.このα-ヘリックスを遺伝子工学的に延長した変異型ヘキソキナーゼでは,活性制御を引き起こすN-halfとC-halfの相互作用が解消されることを以前報告している.2.における大腸菌発現系で,この変異型を大量発現しようと試みたところ,野生型では可溶性画分に活性を保持して発現したのに対し,変異型は,封入体として発現した.この封入体をグアニジン変性させ,再フォールディングさせたが,タンパク質は再び凝集した.この結果から,分子間でのN-halfとC-halfの相互作用により,凝集体が生じたものと考えられ,より良い発現条件の検討を現在行っている.1.ラット脳に発現しているI型ヘキソキナーゼのcDNAを,PCRを用いたmutagenesisにより,開始コドン及び終止コドンだけを除去した配列に改変し,N末端にPelB配列,C末端にポリヒスチジン配列をつけることが可能な,pET-22dベクターに組み込み,大腸菌の培養液中に分泌され,培養液から金属キレートカラムで,簡単に精製できる発現系を構築し,1Lの大腸菌培養液から,1020mg程度の発現タンパク質を精製できるシステムを確立した.2.精製した酵素は,過去の報告で結合できるとされたラット肝臓ミトコンドリアにはほとんど結合しなかったが,グルコース6リン酸処理にて結合ヘキソキナーゼを除去したラット脳ミトコンドリアには,十分な結合が観察された.この結果は,ミトコンドリアの本酵素の結合部位であるポーリンの脳と肝臓で発現しているアイソザイム異なっているためではないかと考えられる.現在,ラット各ポーリンアイソザイムを特異的に発現する酵母株を作成中である.3.ラット脳細胞質を各種カラムで画分化し,ヘキソキナーゼをミトコンドリアに結合させる物質の同定を試みたが,in vitroでは,結合を促進する物質を発見できなかった.4.ヘキソキナーゼーポーリンと複合体を形成するミトコンドリア内膜のADP/ATP透過担体はN-ethylmaleimide (NEM)により阻害を受け,これが複合体の構造変化を起こすと考えられている.そこでNEMの結合部位Cys56の機能的役割について,部位特異的変異解析を行った.その結果,基質輸送の際,Cys56付近の配列が起こすヘリックス-ランダムコイル構造変換に対しNEMが立体障害を起こして阻害していることが強く示唆された.1.ラットミトコンドリアポーリンアイソザイム(VDAC1-3)をそれぞれ特異的に発現する酵母株を作製し,酵母ミトコンドリアにこれらポーリンアイゾザイムが機能的に発現していることを確認した。2.昨年度確立した大腸菌発現系より精製したラットI型ヘキソキナーゼの各VDACアイゾザイムを発現した酵母ミトコンドリアに対する結合実験を行った.しかしながら,いかなるラットVDACが発現した酵母ミトコンドリアにもヘキソキナーゼは結合しなかった.VDACがヘキソキナーゼのミトコンドリア結合サイトであることは,過去の報告でも立証されているため,酵母ミトコンドリアに発現したVDACの存在状態や立体構造がラットミトコンドリア中のそれとは異なっていると考えられた.現在,VDACが酵母ミトコンドリアにおいて外膜に発現しているか,電子顕微鏡を用いて検討中である.3.I型ヘキソキナーゼは活性制御ドメインであるN-halfと活性中心を含むC-halfの2つのドメインに別れ,これはリンカーとなるα-ヘリックスにより結ばれている.このα-ヘリックスを遺伝子工学的に延長した変異型ヘキソキナーゼでは,活性制御を引き起こすN-halfとC-halfの相互作用が解消されることを以前報告している.2.における大腸菌発現系で,この変異型を大量発現しようと試みたところ,野生型では可溶性画分に活性を保持して発現したのに対し,変異型は,封入体として発現した.この封入体をグアニジン変性させ,再フォールディングさせたが,タンパク質は再び凝集した.この結果から,分子間でのN-halfとC-halfの相互作用により,凝集体が生じたものと考えられ,より良い発現条件の検討を現在行っている.
自治体による医療通訳者養成と活用：＜あいち医療通訳システム＞検証と全国モデル構築

あいち医療通訳システム認定者にアンケート調査を行い、派遣実績調査報告書をまとめた。オーストラリアとニュージーランドにて医療通訳者にインタビューし、海外での実情を調査した。日本通訳翻訳学会第16回年次大会において研究発表を行い、あいち医療通訳システムの全国的周知が出来た。国際医療通訳シンポジウム&ワークショップを行い、国内外の現状、課題点について意見交換が出来た。日本語を話す世界中の医療従事者向けに「Introduction to Healthcare for Japanese-speaking Interpreters and Translators」を出版した。あいち医療通訳システム認定者の内、派遣実績のある人(5言語)にアンケート調査を実施し、45名分の回答を得た。この調査は3年間の振り返りとして行われたが、そこから見えてきたものは回答者の多くが日進月歩の医療知識、また最新の知識を学びたい、同時に通訳技術のスキルアップを目指したいと考えていることがわかり、現在、県主催の年1回実施しているフォローアップ研修をいかに充実させていくかが今後の課題であることが分かった。英語医療通訳者として認定された一部の人(10名前後)を対象として、上記の目的に合った研修会を4回実施した。ここでの内容は非常にレベルも高く、愛知県が主催する今後のフォローアップ研修に活かせる内容だと思われる。国内調査については、研究分担者が外国人患者の支援サービスをしている病院2か所を訪問し、担当者へのヒアリングを実施した。その結果、医療通訳者の質の担保と、訴訟に対する対応の整備の必要性が示唆された。以上のような国内調査研究に加え、海外(オーストラリア)に於いて医療関係者10名にインタビューを行った。大学での通訳翻訳コースの現状やシドニー周辺の病院での医療通訳システムについての情報(医療通訳者の資格・その更新について)を得ることが出来た。最後に、ベルリンに於いて開催されたthe XXth FIT World Congress, Berlin 2014(国際翻訳者連盟)にて、あいち医療通訳システムの構築過程について研究発表を行い、発表内容は論文のかたちで発行された。2015年8月には、ニュージーランドのオークランドにて3名の医療通訳者にインタビューを行った。また、アジア系住民を対象とした医療通訳派遣会社のマネージャーにもインタビューが出来、文化的背景についての貴重なテキストを入手でき、医療通訳養成講座での課題であった異文化をどのように受講者に教えるかに対して貢献が期待できる。前年度、あいち医療通訳システム認定者の内、派遣実績のある人(5言語)にアンケート調査を実施したことを元に、2015年9月12日に日本通訳翻訳学会第16回年次大会において「医療通訳経験者の派遣内容から見えてきたものーあいち医療通訳システムの今後の課題ー」と題して研究発表を行った。その結果、日本各地から参加した医療通訳関係者に医療通訳の重要性や現状、課題点などについてお互い意見交換をする良い機会となり、今後の研究の協力体制の輪が広がった。国内外の実務者、医療関係者、自治体担当者、研究者などとの意見交換を目的とした国際医療通訳シンポジウム2016年5月14日の開催に向けて、様々な準備を行った。また、2016年2月にはアメリカのロサンゼルスにおいて、地元で医療通訳をしている通訳者へのインタビューを行い、医療機関を訪問し、医療通訳制度や養成システムについて意見交換を行った。ニュージーランド及びアメリカに於いてインタビューを継続して実施することが出来た。研修会を3か月に1度実施し、さらにはフォローアップ研修で使用する教材として、John Benjamins出版より国際的なテキストを出版することが決まった。また、日本通訳翻訳学会第16回年次大会において「医療通訳経験者の派遣内容から見えてきたものーあいち医療通訳システムの今後の課題ー」と題して口頭発表することが出来た。2016年5月14日に名古屋外国語大学にて、国内外からシンポジストを招いて、国際医療通訳シンポジウムを開催することが決まった。そのシンポジウムにおいて、前年度より課題として残っていた医療と人権に関する分野について、シンポジストより発表していただき、内容をまとめることとする。2016年5月に「国際医療通訳シンポジウム&ワークショップ」を名古屋外国語大学にて開催し、当日は学内外から約200名の参加者を得た。第1部では、ニュージーランドのオークランド工科大学よりIneke H. M. Crezee博士を迎え、基調講演を行った。第2部では、愛知県多文化共生推進室より大橋充人様、大阪大学大学院より南谷かおり先生、ペドリサ・ルイス先生、日本大学医学部より押味貴之先生を招き、それぞれの専門分野からプレゼンテーションを行い、また「日本における医療通訳システムの展望ーあいち医療通訳システムをモデルとして」と題して、Crezee博士と共にディスカッションした。第3部の国際医療通訳ワークショップでは、会場の聴衆も参加し、Crezee博士及び押味先生と共にロールプレイを行い、充実した内容となった。参加者からは非常に有意義なシンポジウムであったと、高い評価を得た。2017年2月には「2015あいち医療通訳システム認定医療通訳者の派遣実績報告書」として2015年に実施したアンケート結果をまとめ、名古屋外国語大学ワールドリベラルアーツセンターより発行した。

初年度予定していたインターネットなどを利用した量的調査、内外の関係者に対する反構造化インタビューを実施し、さらにインターネットでのアンケート調査に関しては、今年度目標としていたアンケートの作成に留まらず、次年度予定していたウェブアンケートの実施も今年度中に行うことが出来た。また、次年度行う予定であった国際学会での研究発表もベルリンで開催されたFIT World Congressに於いて行うことが出来た。認定医療通訳者らとの研修会は予定どおり実施した。ただ、医療と人権に関する文献調査に課題が残った。上記のとおり、当初の計画以上に進展しているといえる。2016年5月14日国際医療通訳シンポジウムを開催するための準備を行う。これまでのアンケート結果のまとめと考察を冊子として出版する。通訳教育(医療通訳者養成)アンケートを分析しながらインタビューを継続して実施する。研修会を定期的に実施し、愛知県が行おうとしている今後のあいち医療通訳システムフォローアップ研修に向けての提言の方向性を検討する。国内外の実務者、医療関係者、自治体担当者、研究者などとの意見交換を活発に行う。今年度末までに患者ならびに医療機関に対するアンケートを実施し、中間的成果を発信する。-計画通りほぼ全額使用することができた。予定していた消耗品、備品等は研究施設のものを使用し、補充することなく研究を遂行することができたため。-平成28年度請求額と合わせて国際シンポジウムに向けて使用する。本年度、不十分であった文献研究に使用する。
カルモデュリンキナーゼの細胞内局在の分子機構と神経機能の解析

カルシウムシグナル機能の下流の中心的な機能分子である多機能型カルモデュリンキナーゼ(CaMK)のうち、CaMKIとCaMKIVは、上流の活性化酵素であるCaMKキナーゼ(CaMKK)とともにCaMKカスケードを形成し、CaMKKによるリン酸化により活性調節を制御される点で、自己リン酸化により活性調節をするCaMKIIとは異なる。本研究では、CaMKカスケードを構成するCaMKIの4つの分子種(α、β、γ、δ)、CaMKIV及びCaMKKの2つの分子種(α、β)の神経分化における機能を明らかにするために、海馬発達過程における遺伝子発現局在をin situハイブリダイゼーション法により検討した。その結果、CaMKIのうちβ2及びδ分子、CaMKIV,CaMKKαとβ分子の遺伝子発現は、特に海再神経細胞に豊富に認められ、生後発達に伴って増加し、生後2から3週齢にピークを示した。この発現のピークを示す時期が樹状突起が最も盛んに形成される時期に一致することより、恒常的不活性型変異遺伝子(dn)を初代海馬神経細胞に導入し、樹状突起の形成への影響を検討した結果、dn-CaMKIは樹状突起の伸長を有意に抑制し、一方dn-CaMKIVとdn-CaMKKは樹状突起の本数を有意に減少させた。これらの所見より、CaMKIとCaMKIVは、海馬神経細胞の樹状突起の形成の異なるステップに関与すること、さらに、CaMKIVの樹状突起への機能関与には、CaMKKによる活性化が必要であるが示唆された。これらの研究成果は、Neuroscience Res. 57:86-97(2007)に発表した。本研究では、カルモデュリンキナーゼ(CaMK)の細胞内局在のメカニズムと神経機能の解明を目指し、以下の成果を挙げた。(1)CaMKIδ分子の神経活動依存的細胞内局在の変化とその分子機構:初代海馬培養神経細胞にCaMKIδ遺伝子を導入し、グルタミン酸や脱分極刺激などのカルシウム刺激を加え、その細胞内局在の変化を検討した。その結果、カルシウム刺激により、核内局在を示す神経細胞が約2倍に増加した。さらに、CaMKIδ分子が、転写因子CREB(cAMP response element-binding protein)をリン酸化することにより、CaMKIδ分子が、神経活動依存性に核内に移行しCREBなどの転写因子のリン酸化を介した遺伝子発現の調節に関与している可能性が示唆された。(2)CaMKIの樹状突起の形成における機能:CaMKIの4分子の神経発達過程における発現をin situハイブリダイゼーション法を用いて検討した結果、4つの分子は時空間的に相異なる発現様式を示すことを明らかにした。なかでも海馬に豊富に発現するβ2及びδ分子の海馬での発現は、生後発達とともに増加し、生後2から3週齢にピークを示した。この発現様式は海馬神経細胞の樹状突起の形成時期と一致することより、不活性型変異CaMKI遺伝子(DN-CaMKI)を初代海馬神経培養細胞に導入し、樹状突起の形成への影響を検討した。その結果、DN-CaMKIの発現により樹状突起の伸長が有意に抑制されることより、CaMKIが樹状突起の伸長に深く関与する可能性が考えられた。

本研究では、CaMKカスケードを構成するCaMKIの4つの分子種(α、β、γ、δ)、CaMKIV及びCaMKKの2つの分子種(α、β)の神経分化における機能を明らかにするために、海馬発達過程における遺伝子発現局在をin situハイブリダイゼーション法により検討した。その結果、CaMKIのうちβ2及びδ分子、CaMKIV,CaMKKαとβ分子の遺伝子発現は、特に海馬神経細胞に豊富に認められ、生後発達に伴って増加し、生後2から3週齢にピークを示した。この発現のピークを示す時期が樹状突起が最も盛んに形成される時期に一致することより、恒常的不活性型変異遺伝子(dn)を初代海馬神経細胞に導入し、樹状突起の形成への影響を検討した結果、dn-CaMKIは樹状突起の伸長を有意に抑制し、一方dn-CaMKIVとdn-CaMKKは樹状突起の本数を有意に減少させた。これらの所見より、CaMKIとCaMKIVは、海馬神経細胞の樹状突起の形成の異なるステップに関与すること、さらに、CaMKIVの樹状突起への機能関与には、CaMKKによる活性化が必要であるが示唆された。これらの研究成果は、Neuroscience Res. 57:86-97(2007)に発表した。
デジタル型の応答曲線を示す蛍光性ｐＨセンサーの開発

蛍光特性の変化によって周辺のpH変化を知らせる蛍光性pHセンサーは、生細胞やマイクロ流路など微小空間のpH計測に広く利用されている。本課題では、従来の蛍光性pHセンサーと比較して、極めて小さいpH変化で蛍光応答が完了する、すなわち、デジタル型の応答曲線を示す蛍光性pHセンサー(以後、デジタル型蛍光性pHセンサーと略す)を開発し、その機能発現のメカニズムを解明するとともに一般性を実証した。この全く新しいデジタル型蛍光性pHセンサーによって、これまでに捉えることのできなかったわずかなpH変化の検出が可能となった。計画通り、本年度は昨年度に得られた成果の発表を以下の2つの学会にて行った。(1)第73回分析化学討論会(2013年5月18日19日、函館)これまでに予定されていた全ての検討を終え、実験データの整理やそれらに対する考察は終了している。現在、順番を待って学術論文の執筆を開始するところである。おおむね申請書に記載したとおり研究を遂行し、平成24年度には次の成果を得た。1デジタル型の応答曲線を示す蛍光性pHセンサー(デジタル型蛍光性pHセンサー)における構成ユニット比と応答曲線の関係解明...モデルセンサーとして、様々なモル比のNIPAM(疎水性モノマー), DMAPAM(水素イオン結合モノマー), DBD-AA(蛍光性モノマー)を原料とする共重合体を合成し、pHを変化させた際の蛍光応答曲線を確認したところ、DMAPAMユニットが全体の10%程度であるときに、デジタル型の鋭いpH応答を発現することが分かった。一方、DMAPAMユニットが30%以上になると、pH応答自体が消失することも分かった。2機能メカニズムの解明...モデル蛍光団ならびにモデルpHセンサーを用いた検討により、デジタル型蛍光性pHセンサーの機能は、水素イオン結合ユニットにおける水素イオンの結合(解離)によってセンサーの三次元構造が変化し、それとともに水素イオン結合性ユニットの塩基性度が協同的に変化することに由来していることを明らかにした。3機能pHの異なるデジタル型蛍光性pHセンサーの網羅的開発...構造(塩基性)の異なる水素イオン結合モノマーを新たに4種類合成し、それらとNIPAM, DBD-AAとの共重合体を調製した。現在、これらの機能を確認中である。本申請課題の最大の目標であった、デジタル型蛍光性pHセンサーの機能メカニズムの解明を完了できたため。また、新たな水素イオン結合モノマーを合成することで、様々な機能pH範囲をもつデジタル型蛍光性pHセンサーの開発が可能となり、今後の検討項目として本課題の申請書に記載していなかった生細胞内への応用を企画するまでに至ったため。当初は平成24年度中に成果発表を行う予定であったが、本課題における最も重要な検討項目であった機能メカニズムの解明において、申請書に記載していなかった補足的な実験検討を行う必要が生じたため、計画を変更し、これを平成24年度の当初予定に追加して行うこととした。これに伴い、本事業に関する成果発表を次年度に繰り越し、第73回分析化学討論会(2013年5月1819日、函館)および26 th International Conference on Photochemistry(ICP2013、2013年7月2126日、ルーベン、ベルギー)にて行い、その後、原著論文にまとめる予定である。
再生医学へむけての発生・細胞工学的造血研究

胚性幹細胞(ES細胞)をOP9ストロマ細胞と共生培養することにより、血液細胞へと分化誘導する方法(OP9システム)では、造血前駆細胞を産生することはできるが、自己複製能のある造血幹細胞を産生することはできない。そこで、まず、造血前駆細胞において転写因子をコンディショナルに発現させるシステムの開発をおこなった。その方法を駆使することにより、造血能を改善することを目的とした研究をおこなった。未分化な造血細胞に発現するzincfinger型の転写因子であるGATA-2を、テトラサイクリンによるコンディショナルな遺伝子発現系(Tetシステム)を用いて、造血前駆細胞において強制発現させる実験をおこなった。その結果、造血前駆細胞のコロニー数、ならびに、コロニーあたりの造血細胞数が増加すること、さらに、より未分化な造血コロニーの比率が増加すること、が明らかとなった。このことは、GATA-2によりOP9システムによって発生する造血細胞の造血能を高めることができたことを示している。従来の研究から、GATA-2は血液細胞の終末分化を抑制するものと考えられていた。しかし、本研究の結果は、赤血球系・巨核球系への分化は抑制ではなく促進することを示していた。終末分化の抑制は、GATA-2ではなく、GATA-2とエストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン(GATA-2/ER)の融合転写因子の研究から得られた結果であったので、OP9システムとTetシステムをあわせた我々の方法においてGATA-2とGATA-2/ERの機能解析をおこなったところ、両者は、ほぼ逆の機能を持つことがあきらかとなった。今後、本研究において有用性が明らかになった、OP9-Tetシステムを用いて、造血細胞の分化機序を明らかにできるとともに、よりいっそうの造血細胞の機能改善に用いることが期待できる。胚性幹細胞および、胚性幹細胞から血液細胞への分化誘導法を用いて、転写因子およびその変異体をコンディショナルに発現させる実験を行なった。以下にその概略を示す。MybのDNA結合ドメイン、ショウジョウバエengrailedのレプレッサードメイン、タモキシフェン(4-OHT)に特異的に結合する変異エストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン、の融合タンパクMERT、は、4-OHT存在下でのみ、Myb遺伝子ファミリーの転写能を抑制する。胚性幹細胞は、Myb遺伝子ファミリーのうち、B-Mybのみを発現しており、MERTによって、胚性幹細胞におけるB-Mybの機能を明らかにする実験を行なった。その結果、B-Mybは、従来報告があった細胞周期のみでなく、細胞接着の維持にも非常に大きな役割をはたしていることが明らかになった。MERTを導入した胚性幹細胞を血液細胞へと分化誘導を行ない、その過程において経時的に4-OHTを添加して機能阻害実験を行なったところ、未分化な血液細胞の段階でのみ、c-Mybの機能が重要であることが明らかとなった。(3)GATA遺伝子群の造血前駆細胞の増殖・分化における機能の解析テトラサイクリンの存在下において遺伝子発現が抑制されるTet-Offシステムを用いて、GATA-1、GATA-2遺伝子を、胚性幹細胞から血液細胞への分化誘導過程において発現させ、その機能を解析した。GATA-2を造血前駆細胞において発現させると、造血前駆細胞の数が顕著に増加することが明らかになった。このようなシステムを用いることにより、造血前駆細胞の増幅が可能となり、再生医学への応用が期待できる。