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高度経済成長期に建設された高層鋼構造建物が保有する耐震能力の再現と再評価

『高度経済成長期に建設された鋼構造高層建物がもつ耐震安全性が,現在の鋼構造高層建物が有する耐震安全性に対してどの程度に位置するのかを「量」として示すこと』を命題とし下記の4課題を遂行する.(1):高層鋼構造建物の耐震安全性を支配する諸因子を抽出し,それぞれの因子が過去30年間にわたってどのように変遷してきたかを明らかにする;(2):因子ごとに昔と現在の(技術)差を分析・定量化,ついでこれらを統合することによって,当時の高層鋼構造建物が有する耐震能力を予測する;(3):約30年前に建設された鋼構造建物の一部を実際に切り出して製作した試験体に対する載荷実験を実施し,(2)の予測の確からしさを検証する;(4):(2)(3)の知見を集積し,当時の高層鋼構造建物と同じ耐震性能を有する鋼構造物(部分)を再現する技術的可能性を明示する.上記研究課題のうち(3)の一部と(4)を実施した.(3)に関連して,昨年に引き続き1980年に竣工した鋼構造建物の柱梁接合部の一部を譲り受け,これに対する繰返し載荷実験を実施した.載荷に先だって超音波探傷(UT)試験を,また載荷後は破断接合部を切り出してマクロ試験をそれぞれ実施した.昨年度の実験とは異なり,UT検査においてもほとんど欠陥は検出されず,また実験結果も変形能力に富む挙動を呈するなど,20数年を経た鋼構造物とは言え,溶接技能に応じてその性能が大きく異なることが明らかになった.(4)については,(3)で実施した接合部と同じ条件を有する接合部を製作して,再現性確認実験を実施した.UT試験からは欠陥がほとんど観察されず,また実験結果も(3)の実験結果より高い変形能力を示す結果となった.昨年度の検討結果とも併せ,(1)当時の接合部詳細は千差万別であって,現在のように標準化されていない,(2)接合部詳細や溶接技能によってその変形能力は大いに違いうる,(3)現在の材料と溶接技術を用いて当時の接合部性能を再現することは容易ではないという知見を得た.高度経済成長期に建設された鋼構造高層建物がもつ耐震安全性が,現在の鋼構造高層建物が有する耐震安全性に対してどの程度に位置するのかを「量」として示すこと』を命題とし下記の4課題を遂行する,(1):高層鋼構造建物の耐震安全性を支配する諸因子を抽出し,それぞれの因子が過去30年間にわたってどのように変遷してきたかを明らかにする;(2):各因子ごとに昔と現在の(技術)差を分析・定量化,ついでこれらを統合することによって,当時の高層鋼構造建物が有する耐震能力を予測する;(3):約30年前に建設された鋼構造建物の一部を実際に切り出して製作した試験体に対する載荷実験を実施し,(2)の予測の確からしさを検証する;(4):(2)(3)の知見を集積し,当時の高層鋼構造建物と同じ耐震性能を有する鋼構造物(部分)を再現する技術的可能性を明示する.上記研究課題のうち(1),(2),および(3)の一部を実施した.(1)に関連して比較の対象として,(a)設計地震力と耐震解析技術の変遷,(b)構法(含む接合部),(c)鋼材品質,(d)溶接材料品質,(e)鉄骨工事品質管理体制,(f)溶接施工(溶接技能者),(h)溶接検査をとりあげ,文献調査に加えて,1960年代に日本建築学会鋼構造委員会で活躍した当時のリーダー達へのヒアリングを実施した.その結果,現在の高層鋼構造理物の性能を1.0とすれば,当時のそれが平均にして0.8であるという結果を得た.技術が未成熟であったことによる失敗や欠陥が主たる負の要素,高度経済成長下で業界がいきいきしていたことによる活力が正の要素として浮かび上がった.また当時の高層鋼構造建物がもつ耐震性能を直接測るべく,1970年に竣工した鋼構造建物の柱梁接合部の一部を譲り受け,これに対する載荷実験を実施した。載荷に先だって超音波探傷(UT)試験を、また載荷後は破断接合部を切り出してマクロ試験をそれぞれ実施し、当時の接合部がもつ性能と品質を明らかにするとともに、UT試験の確からしさを検証した。UT検査の結果相当数の欠陥が検出されたにもかかわらず、0.06radまで接合部が破断することばなく、板厚が小さかったとは言え、思ったよりも高い性能を有していることが明らかになった。また載荷後の観察から、欠陥同定に関するUT検査の程度がいまなお検査員の技量に相当依存することが明らかになった。『高度経済成長期に建設された鋼構造高層建物がもつ耐震安全性が,現在の鋼構造高層建物が有する耐震安全性に対してどの程度に位置するのかを「量」として示すこと』を命題とし下記の4課題を遂行する.(1):高層鋼構造建物の耐震安全性を支配する諸因子を抽出し,それぞれの因子が過去30年間にわたってどのように変遷してきたかを明らかにする;

(2):因子ごとに昔と現在の(技術)差を分析・定量化,ついでこれらを統合することによって,当時の高層鋼構造建物が有する耐震能力を予測する;(3):約30年前に建設された鋼構造建物の一部を実際に切り出して製作した試験体に対する載荷実験を実施し,(2)の予測の確からしさを検証する;(4):(2)(3)の知見を集積し,当時の高層鋼構造建物と同じ耐震性能を有する鋼構造物(部分)を再現する技術的可能性を明示する.上記研究課題のうち(3)の一部と(4)を実施した.(3)に関連して,昨年に引き続き1980年に竣工した鋼構造建物の柱梁接合部の一部を譲り受け,これに対する繰返し載荷実験を実施した.載荷に先だって超音波探傷(UT)試験を,また載荷後は破断接合部を切り出してマクロ試験をそれぞれ実施した.昨年度の実験とは異なり,UT検査においてもほとんど欠陥は検出されず,また実験結果も変形能力に富む挙動を呈するなど,20数年を経た鋼構造物とは言え,溶接技能に応じてその性能が大きく異なることが明らかになった.(4)については,(3)で実施した接合部と同じ条件を有する接合部を製作して,再現性確認実験を実施した.UT試験からは欠陥がほとんど観察されず,また実験結果も(3)の実験結果より高い変形能力を示す結果となった.昨年度の検討結果とも併せ,(1)当時の接合部詳細は千差万別であって,現在のように標準化されていない,(2)接合部詳細や溶接技能によってその変形能力は大いに違いうる,(3)現在の材料と溶接技術を用いて当時の接合部性能を再現することは容易ではないという知見を得た.
ヒト口腔扁平上皮癌における癌-間質相互作用に関する研究

口腔扁平上皮癌における浸潤の機序を解析する目的で、患者より当科で樹立したIF細胞(高悪性)及びHOSO(低悪性)2つの癌細胞株を用いて、以下の結果を得た。(1)ヌードマウスを用いた実験系でも、患者とほぼ同様の病理組織像及び病態が再現できた。(2)細胞運動性に関しては、IFは培養上清(CM)中にオートクライン運動性因子として、TGF-α、TGF-β1を産生していた。一方、HOSOは産生していなかった。(3)細胞接着分子に関しては、IFはCM中に細胞接着を減弱させる因子を産生していた。この因子は、マウス線維芽細胞(Fb)との共培養で、直接接触していない癌細胞でも細胞間接着が阻害したことから、Fbが産生するHGF(液性因子)である可能性が考えられた。一方、HOSOはそれらを産生していなかった。(4)細胞浸潤性に関しては、マトリゲル及びコラーゲンゲル基質を用いた実験結果から、TGF-αまたはTGF-β1添加群は非添加群と同様、嚢胞様構造(非浸潤性)を示したが、Fb-CMまたはHGF添加群では細胞間接着がなくなり、強い浸潤性を示したことから、TGF-α、TGF-β1ではなく、HGFが細胞浸潤性を規定する重要な因子であると推察された。そのHGFによる浸潤活性は、IFはHOSOの約4倍であった。(5)HGF産生に関しては、IF及びHOSOは直接HGFを産生していなかったが、パラクライン的に促進因子としてIL-1を産生していることがわかった。その量は、IFはHOSOの約3倍であった。(6)細胞増殖に関しては、G-CSF、TGF-αはオートクライン的に、HGFはパラクライン的に、IFの増殖因子として働いていた。TGF-βは増殖抑制効果を示した。本研究により、臨床的に高悪性のIFは、低悪性のHOSOに比べ、宿主線維芽細胞とより強く相互作用しながら、細胞運動性、浸潤性、増殖性や細胞接着分子などに影響を及ぼす多くの因子を、オートクラインあるいはパラクライン機構で多彩かつ巧みに制御しながら、腫瘍微小環境でより高い浸潤、増殖能を獲得している機序の一端が示された。我々は、口腔扁平上皮癌患者より2種類の細胞IFおよびHOSOを樹立した。IF(高悪性)は、in vivoにおいて、肺転移およびリンパ節転移を示したのに対し、HOSO(低悪性)は、肺転移およびリンパ節転移をおこさないという特徴を有している。invitroにおいて、IFは細胞培養上清(CM)中にMDCK細胞をscatterさせる因子および細胞接着因子(E-Cadherin)を減弱させる因子を産生していた。IFの産生するscatter因子は、中和抗体を用いたscattering活性抑制実験より、TGF-αおよびTGF-βであることが判明した。一方、HOSOはCM中に、MDCK細胞をscatterさせる因子およびE-Cadherinを減弱させる因子を産生していなかった。

また、IFまたはHOSOと線雑芽細胞(Fb)による共培養実験および抗HGF抗体を用いた実験から、IF細胞は自身の産生するTGF-αおよびTGF-βだけでなく、線維芽細胞(Fb)より産生されるHGFによりIF細胞の浸潤性はさらに増強されていることが明らかになった。また一方、HOSO細胞は線維芽細胞(Fb)より産生されるHGFにより浸潤性を示すことが明らかとなった。つまり癌細胞の腫瘍生物学的特性だけでなく、癌細胞と線維芽細胞との相互作用が浸潤能の獲得に極めて重要であることがわかってきた。来年度は、これらの現象がどのようなメカニズムで起っているのかを更に詳細に解明して行く予定である。細胞接着に関しては、IF(高悪性)は培養上清(CM)中にMDCK細胞をscatterさせる因子及び細胞接着を減弱させる因子(TGF-α、TGF-β)を産生していたが、HOSO(低悪性)がそれらを産生していなかった。マウス線維芽細胞(Fb)との共培養(HGF)で、IFでは細胞間の接着が粗になったが、HOSOでは密のままであった。次にFb-CMは、IF及びHOSOの増殖には影響を及ぼさなかったが、IFの増殖に対し、TGF-α、HGFは弱い促進、TGF-βは抑制を示した。次にヒトFbによるHGF産生は、IF及びHOSOともCM濃度依存的に促進され、IL-1受容体アンタゴニストで完全に抑性されたことで、ILはFbによるHGF促進因子としてIL-1を産生していることがわかった。次に、マトリゲルをコートしたトランスウエルを用いたIn vitro Invasion Assayで、TGF-αまたはTGF-β1は、明らかな浸潤活性を示さず、HGFのみが強い浸潤活性を示した。また、両者の浸潤性を、コラーゲンゲル基質中の培養で調べると、非添加、TGF-αまたはTGF-β1添加したものは嚢胞用構造の非浸潤性を示したのに対し、FbのCMまたはHGFを添加したものは細胞間接着がなくなり、浸潤性を示した。すなわち、HGFは、基底膜やコラーゲンへの浸潤を促進する活性を有することがわかった。IFのHGFによる浸潤活性は、HOSOの約4倍であった。このようにIFは、TGF-α、TGF-βによるオートクライン遊走因子及びFbが産生するHGFによるパラクライン遊走浸潤因子により強い浸潤活性を示すのに対し、HOSOはFbが産生するHGFにより弱い浸潤性を示すことが明らかとなった。本研究の結果、臨床的に高悪性のIFは、低悪性のHOSOに比べ、宿主線維芽細胞とより強く相互作用しながら、細胞運動活性、浸潤活性、増殖活性や細胞接着因子などに影響を及ぼす多くの因子を、オートクラインあるいはパラクライン構築で多彩かつ巧みに制御しながら、腫瘍微小環境でより高い浸潤、増殖能を獲得している機序の一端が示された。
多発性嚢胞腎と男性不妊を合併する新規副甲状腺関連遺伝子KANSL1-Lの解析

腎疾患はQOL(quality of life)を下げる代表的な加齢性疾患である。腎障害が進行して腎機能が低下、人工透析、腎移植となればQOLは著しく低下し、医療費は増大する。加齢性腎疾患の中でも多発性嚢胞腎は常染色体優性または劣性遺伝性疾患で、遺伝性腎疾患の中で頻度が高い。我々のこれまでの研究で、副甲状腺亢進症関連遺伝子としてKANSL1-Lを同定し、その遺伝子破壊マウスを作製した。そのKOマウスは多発性嚢胞腎の疾患モデルとなり得る形質を示した。さらにこのマウスは無精子症であり雄性不妊であった。この疾患マウスの病態解明と副甲状腺の関係を研究することで、ヒトの多発性嚢胞腎と男性不妊の発生機序を解明し、加齢性腎疾患の進行抑制物質や新たな男性不妊の遺伝的メカニズムの発見に結びつけることを目的とする。KANSL1-L遺伝子の解明。kANSL1-L遺伝子のコードする蛋白質が腎組織でどのような局在をしているかを知るため、免疫組織化学染色に使用する抗KANSL1-L抗体を作製した。抗体がうまくKANSL1-L蛋白と反応するかを知るため、遺伝子の発現が確認されている精巣、副甲状腺で免疫組織化学染色を行ったが、満足のいく染色結果が得られなかった。そのため組織の固定時間、条件の検討、染色条件の検討を行っている。尿細管およびボーマン嚢の拡張における加齢の影響の検索。腎機能を調べるため、週齢マウスの採血を行い、血中尿素窒素の測定を行った。野生型に比べKANSL1-L欠損マウスは尿素窒素濃度が高い傾向がみられた。男性不妊と腎嚢胞化の新たな疾患モデルの病態解明。腎、精巣以外の臓器でKANSL1-L遺伝子による組織変化を検索した。肺組織で肺胞壁が肥厚していた。組織固定条件を一定にして検討を続けている。免疫組織化学染色に用いる抗KANSL1-L抗体の作製、評価に予定より時間がかかっている。そのため腎でのKANSL1-L蛋白の局在の検索が行えていない。免疫組織化学染色はこの研究解析の重要な方法の一つであり、研究はやや遅れている。それ以外は順調に進んでいる。免疫組織化学染色に用いる抗KANSL1-L抗体の評価を行う。染色条件が決定できれば、腎、精巣、肺でのKANSL1-L蛋白の局在の検索を行う。腎、肺などの組織固定条件を一定にして、抗原性の保持された状態でサンプルを集める。尿、血清検体の生化学データ解析を行う。多発性嚢胞腎は常染色体優性、または劣性の遺伝性疾患で、両側腎臓に多数の嚢胞が進行性に発生、増大し、腎臓以外の臓器にも障害が生じる最も頻度の高い遺伝性腎疾患である。加齢とともに嚢胞が増加し、それに伴い腎機能が低下、70歳までに約半数が末期腎不全に進行する。常染色体優性多発性嚢胞腎は30007000人に一人の割合で発症し、本邦での透析患者のうち23%の原疾患である。これまでの研究で、ラットの二次性副甲状腺亢進症モデルより過形成副甲状腺に特異的に発現する遺伝子を発見し、クローニングに成功した。そのKANSL1-L(KAT8 Regulatory NSL Complex Subunit 1-Like)のKOマウスを作製したところ、腎臓は野生型と比べ、径、重量とも明らかに大きかった。また色調が明らかに野生型腎より白色調であった。組織学的にヒト多発性嚢胞腎と似た像であった。この疾患マウスの病態解明と副甲状腺の関係を研究することで、ヒトの多発性嚢胞腎と男性不妊の治療法開発を目指す。KANSL1-LKOマウスの腎嚢胞は生後すぐは認められず、加齢に伴い発生していた。野生型に比べかなり早い段階で発生した。腎嚢胞はボーマン嚢が拡張し糸球体が縮小したものと考えられ、ボーマン嚢の内皮細胞は肥厚していた。加齢KOマウスの尿中クレアチニン濃度は、同じ週齢の野生型と比べそれほど高くなく、腎機能は保たれていると考えられた。KANSL1-L蛋白を抗原とする抗体を作製し免疫組織化学染色を行ったが、強く発現していると思われる精巣の部位と陽性部が一致しなかった。平成28年9月より産前産後休暇、育児休業を取得したため研究が中断している。尿細管およびボーマン嚢の拡張における加齢の影響の検索については、加齢マウスの腎臓材料がそろい、パラフィンブロックにできた。その材料から特殊染色、免疫組織染色を行った。特殊染色はPAS反応、マッソントリクローム染色を行い、尿細管基底膜やボーマン嚢基底膜の厚みの変化を形態学的によく観察できた。免疫組織化学染色ではCD15、CD10、EMA抗体を用いて、遠位尿細管と近位尿細管の鑑別を目的に実施した。その結果、KANSL1-L遺伝子破壊マウスの腎では、生後2週齢、4週齢の早期段階で近位尿細管の拡張がみられた。尿細管拡張は高齢になるにつれ程度が増し、36週齢で最大となり、腎の径も最大となった。一方、野生型は60週齢で腎の径が最大であった。

KO腎は、以後の60週齢、96週齢を観察したが、腎の萎縮の影響か、腎の径はやや小さくなり、尿細管拡張は少なくなり線維化が目立った。また、野生型とKOの腎を比較すると、KOで明らかに線維化が進行していた。KO18週齢、36週齢では拡張した近位尿細管の一部に基底膜の肥厚がみられた。遠位尿細管内に円柱のみられ始めるのがKOで36週齢、野生型で96週齢であり、KO腎は野生型に比べ早期の腎機能低下を示唆した。拡張尿細管は近位尿細管が多いが、遠位尿細管も拡張がみられた(KO60週齢)。ボーマン嚢拡張もみられた(KO60週齢など)。腎機能を調べるため、KOマウスと野生型マウスから尿を採取し尿中クレアチニン濃度を測定した。その結果は、マウス個体差が大きく、KOと野生型で有意な差は認めなかった。高齢マウスの腎臓材料が順調に集まり、形態学的観察は計画通り進展している。抗KANSL1-L抗体の作製がうまく進まず当初の計画より遅れ、まだ満足なものはできていないが、それ以外はおおむね順調に進んでいる。腎疾患はQOL(quality of life)を下げる代表的な加齢性疾患である。腎障害が進行して腎機能が低下、人工透析、腎移植となればQOLは著しく低下し、医療費は増大する。加齢性腎疾患の中でも多発性嚢胞腎は常染色体優性または劣性遺伝性疾患で、遺伝性腎疾患の中で頻度が高い。我々のこれまでの研究で、副甲状腺亢進症関連遺伝子としてKANSL1-Lを同定し、その遺伝子破壊マウスを作製した。そのKOマウスは多発性嚢胞腎の疾患モデルとなり得る形質を示した。さらにこのマウスは無精子症であり雄性不妊であった。この疾患マウスの病態解明と副甲状腺の関係を研究することで、ヒトの多発性嚢胞腎と男性不妊の発生機序を解明し、加齢性腎疾患の進行抑制物質や新たな男性不妊の遺伝的メカニズムの発見に結びつけることを目的とする。KANSL1-L遺伝子の解明。kANSL1-L遺伝子のコードする蛋白質が腎組織でどのような局在をしているかを知るため、免疫組織化学染色に使用する抗KANSL1-L抗体を作製した。抗体がうまくKANSL1-L蛋白と反応するかを知るため、遺伝子の発現が確認されている精巣、副甲状腺で免疫組織化学染色を行ったが、満足のいく染色結果が得られなかった。そのため組織の固定時間、条件の検討、染色条件の検討を行っている。尿細管およびボーマン嚢の拡張における加齢の影響の検索。腎機能を調べるため、週齢マウスの採血を行い、血中尿素窒素の測定を行った。野生型に比べKANSL1-L欠損マウスは尿素窒素濃度が高い傾向がみられた。男性不妊と腎嚢胞化の新たな疾患モデルの病態解明。腎、精巣以外の臓器でKANSL1-L遺伝子による組織変化を検索した。肺組織で肺胞壁が肥厚していた。組織固定条件を一定にして検討を続けている。免疫組織化学染色に用いる抗KANSL1-L抗体の作製、評価に予定より時間がかかっている。そのため腎でのKANSL1-L蛋白の局在の検索が行えていない。免疫組織化学染色はこの研究解析の重要な方法の一つであり、研究はやや遅れている。それ以外は順調に進んでいる。産前産後の休暇又は育児休業の取得に伴う補助事業期間延長を申請する予定である。1.KANSL1-L蛋白の抗体を作製し直し、精巣および腎臓での存在と局在を証明する。2.抗老化遺伝子KlothoはKANSL1-Lと表現性が似ており、関連性が深いことが示唆される。
若齢期の食・運動習慣が肝臓・褐色脂肪の脂質代謝・熱産生関連遺伝子に及ぼす長期効果

先行研究において,若齢期の肥満・運動経験が骨格筋と白色脂肪組織中の遺伝子発現を長期に渡って変化させ,体内の糖・脂質代謝に影響を及ぼす可能性が見出されたが,特に脂質代謝系と熱産生系遺伝子に大きな変化が認められたことから,体内の脂質代謝・熱産生に関わる主要な臓器である肝臓と褐色脂肪組織中の遺伝子発現においても,長期的効果が生じている可能性が示唆された.そこで本研究では,肥満・運動経験により長期に亘って糖・脂質代謝に影響する肝臓・褐色脂肪組織の遺伝子発現における長期的効果と老齢期の健康・寿命に及ぼす影響について明らかにすることを試みる.先行研究において,若齢期の肥満・運動経験が骨格筋と白色脂肪組織中の遺伝子発現を長期に渡って変化させ,体内の糖・脂質代謝に影響を及ぼす可能性が見出されたが,特に脂質代謝系と熱産生系遺伝子に大きな変化が認められたことから,体内の脂質代謝・熱産生に関わる主要な臓器である肝臓と褐色脂肪組織中の遺伝子発現においても,長期的効果が生じている可能性が示唆された.そこで本研究では,肥満・運動経験により長期に亘って糖・脂質代謝に影響する肝臓・褐色脂肪組織の遺伝子発現における長期的効果と老齢期の健康・寿命に及ぼす影響について明らかにすることを試みる.
フェムト秒ポラリトンのソリトン的伝搬

本研究の目的は,個体中で光がポラリトンとして伝搬し,かつ非線形定数も波長に依存するような場合のパルス伝搬を記述する方法を確立させ,実際の非線形物質についてフェムト秒領域のポラリトン伝搬特性を理論・実験の両面で調べることにあった。以下,本年度の研究実績をまとめる。(1)非線形感受率として3次の非線形性のみを考慮した周波数領域のパルス伝搬方程式を立て,伝搬を数値計算した。本研究ではフーリエ成分の伝搬方程式を基礎にして周波数領域で伝搬を考えた。物質パラメーターの良く知られたCuClを例にとり,ポラリトン分散を線形分散として与え,励起子共鳴および励起子分子2光子共鳴による3次の非線形感受率を考慮してフェムト秒領域のポラリトン伝搬を数値計算で調べた。その結果,ポラリトン分散を打ち消すような2光子非線形分散が得られることがわかった。これによって,数10ミクロンの距離ならばフェムト秒ポラリトンは波形を崩さずに伝搬することが予想された。(2)試料としてCuClを用いて伝搬特性を実験で検証した。モードロックチタンサファイアレーザーより得られる200fsのパルスを10μmの厚さのCuClに入射し,パルスの透過波形を電場相互相関法で測定した。強度が弱い時は,透過波形はポラリトン分散のため2ピコ秒くらいに広がってしまう。強度を上げていくと,励起子分子の2光子共鳴による非線形分散がポラリトン分散を打ち消すようになり,透過パルスのパルス幅は狭くなりかつ群速度も速くなる。この結果は(1)の数値計算の結果と良く一致しており,本研究で発見されたポラリトンのソリトン的伝搬をデモンストレーションすることができた。
褥瘡の発生・進展および治療に関する研究 ー褥瘡の実験動物における検討ー

高齢化社会において褥瘡の予防・治療は重大な問題であり、褥瘡にかかる医療費はマンパワ-を含めて莫大である。圧迫による局所の細胞の壊死、各種の生理的および環境的因子による結合組織の破壊によって褥瘡が発生すると考えられているが、褥瘡の発生機序の詳細は不明である。予防・治療に有効な手段を構築するための基礎研究を行った。(1)血流が圧迫によって遮断される動物実験として家兎の耳介の血管の圧迫を行ったところ、皮膚温は褥瘡部位で上昇した。加圧力および加圧時間を変化させ、被圧迫部位の皮膚微小循環血流量はレ-ザ-ドプラ-血流計を用いて測定した結果、褥瘡の発生後血流は一過性に増加したが、圧力が高く、加圧時間が長い場合血流量の減少が認められた。(2)家兎の耳介に圧迫装置を装着し、加圧力を段階的に変化させた結果、著明な血管の破壊、浮腫、炎症がみられた部位では軟骨の融解が認められた。(3)家兎の耳介の被圧迫部位周辺の動・静脈から動・静脈血をそれぞれ採血し、微小循環血液諸因子である赤血球変形能・赤血球集合能・血漿粘度・血小板凝集能を測定したところ、赤血球集合能の亢進、血漿粘度の上昇、血小板凝集能の低下が認められ、微小循環障害が褥瘡部位で認められた。(4)家兎の耳介の褥瘡部位を潅流した血液中のTGFーβ1をELISAシステムで測定したところ、上昇傾向が認められた。今後、褥瘡部位を潅流した血液中のサイトカインについても検討し、大動脈からの血管内皮細胞と血管平滑筋の細胞培養によって血漿中の細胞増殖因子、サイトカインの増減をELISAシステムによって検討する予定である。(5)家兎の耳介の被圧迫部位周辺の新生血管の発生・進展およびその新生血管内を循環する血球を生体顕微鏡で1,000倍の拡大で詳細に観察したところ、その発生・進展の鍵を白血球、特に多型核白血球が握っていることが推察された。
超急冷膜を用いるその場合成法による高Tc超伝導テ-プの作製

我々はBi系超急冷酸化物と,銅基板上の酸化銅を反応させることにより,数分から数十分の極めて短時間で銅基板上にBi系超伝導厚膜を合成するプロセスを開発中である。この方法は融体と基板とを直接接触させ,その場(in situ)で反応させるので,本質的に連続化が可能であり,テ-プ状試料が直接作製できる可能性がある。本年度は超急冷した膜状試料を基板上にのせ,温度勾配のある炉中を移動させながら反応させ,配向した厚膜の合成の可能性をしらべた。その結果,Bi_2SrCaO_6組成の超急冷膜を銅基板にのせて840°860°Cの炉中に挿入して反応させれば,5分程度の短時間でも80K相の(OOl)配向膜が得られることが確かめられた。しかしながら,この方法において,Pbの添加,窒素雰囲気中での焼成,アニ-ルなどを行っても,生成相は80K相または半導体相であり,100K相は生成しないことがわかった。また,試料移動速度が速すぎると反応時間が不足して良好な膜が得られないこと,銅基板の表面は予め酸化しておかなくとも,反応中に表面酸化が起るので反応に必要な酸化銅が供給されることがわかった。さらに,c軸に配向した結晶相をa軸にもそろえて成長させるためには移動方向の温度勾配ばかりでなく,基板と垂直な方向の温度勾配も制御が必要であることが明らかになった。
盲ろう乳幼児と家族に対する超早期からの教育的支援プログラムの開発

視覚と聴覚に障害がある「盲ろう」は、重度の情報障害とコミュニケーション障害をもたらす。我が国における「盲ろう」の発生頻度は著しく低い。また、我が国では「盲ろう」が独自の障害と認められていないため、生後早期に我が子に「盲ろう」という障害があると分かった際、家族が養育に関する情報を入手することは極めて困難である。顔を見せても声をかけても、見えない・きこえないために反応が乏しい我が子を前に、どうすれば愛着関係を築けるのか、どう養育すべきかなどの情報がないが故に、より大きな不安の中に家族は置かれることになる。本研究では、海外の文献研究、事例研究、アメリカの学校の現地調査を通して、我が国における先天性盲ろう乳幼児とその家族に対する超早期からの教育的支援プログラムを開発することを目的としている。本年度は、国内における資料収集と海外の関連文献のレビューを行った。国内においては、盲ろう乳幼児と家族が定期的に母子通園している特別支援学校や、盲ろう乳幼児が入所している施設、盲ろう乳幼児を養育している家庭を訪問し、教育活動や生活の様子を観察、担当教員や施設職員、家族への聞き取りを行い、情報を整理した。また、アメリカ、カナダ、イギリス、北欧の文献を収集し、「早期介入」「早期支援」に視点をあててレビューを行った。海外の関連文献のレビューと並行しながら、国内の教育活動や家庭・施設における実際の生活を観察すること、盲ろう乳幼児はもちろん関係教職員および保護者のニーズを把握することにより、教育的支援プログラムの内容だけではなく、有益な情報提供のあり方をも検討することができたことは、大変意義深いと考えられる。
非線型放物型方程式系及び関連する楕円型方程式系の解析

当研究課題に関する今年度の研究成果は、半線型放物型方程式に対する結果と準線型放物型方程式に対する結果の二つに大別される。1.半線型放物型方程式の研究:研究の中心テーマにした反応拡散方程式系に関するものと流体問題に関するものについて述べる。(1)反応拡散方程式系、2個の未知関数が相互作用を及ぼし合う反応拡散方程式系を考える。解の大域的存在、一意性、正則性についてはよく知られているから、重要な問題となるのは、時間変数が無限に大きくなったときの解の漸近挙動と、関連する定常問題の解の安定性である。比較原理、スペクトル解析、分岐理論をうまく組合せることによって、解の漸近挙動が非常に詳しく理解されるようになり、既存の結果も整理統合された。この結果より、適当な物理量をパラメーターにとると、定常解の分岐や安定性の交代の様子が、分岐図のなかにきれいに描くことができる。特に、難問であった2重固有値からの分岐についても興味ある結果が得られた。(2)流体問題。熱対流の方程式を考え、初期値が滑らかでないとき、如何にして解を求めるか、また如何にして大域解を構成するかを調べた。方法は、抽象的発展方程式の枠組に問題を改め、種々の空間における基本解評価と非線型項評価を組合せることである。特に、時間変数が小さいときや大きいときの解の評価は興味ある結果だと思われる。まだ、不十分な点も多いから、今後の解析の余地は大きい。2.準線型放物型方程式:P-ラプラシアンに爆発項が加わった方程式を考える。指数が適当な関係をみたすとき、大域解の存在が保証されること、或いは、解が有限時間で消滅することなどが示された。このような退化型の方程式の研究は波動方程式についても行ない、大域解の存在条件を導いた。(2)流体問題。
漸近展開の誤差評価と確率分布の近似

数理統計学に於ける重要な問題の一つは与えられた確率分布F(x)からの大きさnの標本に基づく統計量の分布、いわゆる標本分布F_n(x)を決定することである。それが困難なとき、しばしば、n→∞の状態に於けるF_n(x)の近似が問題となる。例えばG(x)=limF_n(x)を決定すること、さらにF_nをGの周りで展開するなどである。この展開を確率分布の近似を与えるものと見做したときに問題になるのは、展開項を有限項(例えば最初のk項)で打ち切ったときの誤差の大きさを評価することである。用もよく知られたエッジワース展開の場合、一般論としてはn→∞としたときに、誤差の大きさがN^<-k/2>のオーダーである、という程度のことが分っているに過ぎない。実際、誤差の上限の大きさは分布F(x)に大きく依存しており、何らかの条件を仮定しない限り、その上限に関する具体的な情報を得るのは難しい。この研究の代表者はこれまでの研究成果を発展させる形で確率変数Xの尺度混合Y=σXの分布FをXの分布Gの周りで展開する問題を研究した。ここで、σはXと独立で正の値のみを取る確率変数である。σが1の近傍で変動するとき、Yの分布はXの分布Gに近いと考えられるから、これをGの周りで展開しそれを有限の項で打ち切ったときの誤差を出来るだけ正確に評価することによってF(x)のより良い近似を得ようという試みである。最大の困難は多変量の場合の扱いで、これまでの方法では満足な結果が得られない。今回の研究では分布関数の近似ではなく確率密度の精密な近似が与えられ、任意のボレル集合Aに対して確率Pr{YεA}を近似することが出来るようになった。このことは多変量の場合に重要な意味をもつ。今後の課題として残りはしたが、一つのアプローチの方法を提供するものとして期待される。また、この研究では各種の推定量の漸近的な性質をも論じ、いくつかのケースについてはその漸近分布を決定した。1.本年度の研究テーマのひとつは,ある特定の分布Gの尺度混合によって得られる分布Fの漸近展開に係わるものである.展開式の導出と,展開を有限の項で打ちきったときの誤差の評価が一貫して問われてきた課題であったが,予想に反して複数の自然な展開式が得られた.これらはある意味で同等なものであるが,分布の近似という意味では微妙な違いがあり,その意味付けは未だ明らかになっていない.多変量の場合は表現が複雑化するための困難がつきまとう.比較的一変量に近いケースについて若干の結果を得た.2.数式処理システムを利用して各種統計量の分布の漸近展開式を導出し,さらに,これらを近似の道具として利用するために収束速度を著しく向上させる方法を開発し,理論的・実際的な側面からの有効性を確めた.さらに,標本に対して対称性をもつ統計量のモーメントを求めるアルゴリズムなど,数式処理システムの有効利用のためのアルゴリズムを開発した.3.尺度共変推定量の一般形を与え,例として逆ガウス分布,正規分布-いずれも変動系数既知-の場合の平均値の推定量を与えた. nが十分に大きいときの推定量の性質やMLEとの関係等を論じた.4.経験分布関数の汎関数としての統計量の漸近分布に関する研究を行い,いくつかの新しい結果を得た.

1.今年度に残された課題の一つは多変量正規分布(N(O,I))の尺度混合分布の漸近展開である。すなわち、正規変量Xとこれと独立に変動する正定値行列Σについて、確率ベクトルY=Σ^<1/2>Xの分布関数FをN(O,I)の分布関数Φの周りで展開することである。展開式をG_kとする。多変量分布の場合にあって問題になるのはsup|F(x)-G_k(x)|は誤差評価の基準として余り意味をもたない、ということである。任意のボレル集合Aに大してpr{YεA}をdG_kに関する積分で近似した場合の誤差評価がどうしても要求される。1次元の場合に使った方法が多変量分布の場合は使えない、という問題があった。本年度の研究の中で分布関数Fではなくて、確率密度関数fの漸近展開とその精密な誤差評価に成功した。1次元の場合に限っていえば、ある程度分っていることの別証明を与えたに過ぎないが多変量の場合に使えそうだという期待がある。昨年度には複数個の展開が得られること報告されたが、今年度のこの方法では2つの自然な展開が得られることが明らかになった。多変量の場合について具体的な成果は得られなかったが、アプローチの為の道具が得られたことは評価してよいであろう。2.最尤推定量にふくまれない情報は尤度の2回微分で一部回復し、それは補助統計量として扱われる、というフィッシャーの注意がある。逆ガウス型分布にそのよい例を見ることが出来ることを示した。標本の大きさが中程度の所で問題になる議論である。3.連続分布Fからの標本に基づいてFに関するある種の仮説検定を行うことを考える。この仮説は特別の場合としてFの対称性を含むものである。適当な検定統計量を構成し、nが十分大きいときのこの統計量の分布を決定した。すなわち、この分布について確率密度、分布関数を決定し、さらに幾つかのパーセント点を数値的に求めた。
インターロイキン33の活性化と皮膚炎の病態に関する研究

申請者らは、角化細胞でIL-33を高発現させた遺伝子改変マウス(hK14mIL33tg#1)においてアトピー性皮膚炎に類似した皮膚炎が自然発症することを報告している。このマウス系列の皮膚における活性型IL-33の構造がFull lengthのIL-33であることをウエスタンブロッティング法などで同定した。また、hK14mIL33tg#1とRAG2ノックアウトマウスの交配を開始し、T、B、NKT細胞がない条件下で角化細胞にIL-33を高発現するマウス系列“Rag2KO/IL33Tgマウス"を樹立したところ、やはり肉眼的に皮膚炎が発症し、Th2細胞ではなく2型自然リンパ球の関与が示唆された。申請者らは、遺伝子改変マウス(hK14mIL33tg#1マウス)を作出することにより、インターロイキン33を角化細胞で高発現させると自然リンパ球(ILC2)が産生するTh2型サイトカインによりアトピー性皮膚炎(AD)様の皮膚炎が生じることを見いだした。つまり、IL-33はADなどのTh2皮膚炎に深く関連したサイトカインと考えられた。しかし、その作用の詳細は不明であったため、本研究では、申請者らのチームが樹立した遺伝子改変マウス(hK14mIL33tg#1マウス)を用いて、IL-33のスプライシング・限定分解や活性化機構や、IL-33活性型アイソフォームの解析と構造決定などによって誘導されるTh2型の皮膚炎の病態を明らかにし、新たな治療標的の開発に寄与することを目的としている。1.hK14mIL33tg#1マウスとRAG2ノックアウトマウスの交配について本学は、RAG2ノックアウトマウスの飼育に適したSPF飼育室を有している。次年度の解析に向けて、SPF環境下にて、本年度中にhK14mIL33tg#1とRAG2ノックアウトマウス(RAG2KO)の交配を開始し、T、B細胞がない条件下で角化細胞にIL-33を高発現するマウス系列“hK14mIL33RAG2KO"を樹立することに成功した。今後、このマウスの解析を行う予定である。2.IL-33活性型アイソフォームの解析についてhK14mIL33tg#1マウスの皮膚炎組織のホモゲネートから可溶性タンパクを抽出し、現有のマウスIL-33 C末端抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、hK14mIL33tg#1マウス皮膚炎組織で過剰に見られるIL-33活性型アイソフォームの同定に成功した。角化細胞特異的にIL-33を高発現するマウス(hK14mIL33tg#1)の皮膚におけるIL-33の発現について解析した。hK14mIL33tg#1マウス皮膚炎組織のホモゲネートから可溶性タンパクを抽出し、抽出した可溶性タンパクをウエスタンブロッティング法で検討したところ、IL-33は途中で切られること無く、全長で発現していることが判明した。つまり、このマウスのIL-33は全長のまま角化細胞の核に移行してalarminとして蓄えられることが判明した。IL-33はTh2細胞を活性化することから、Th2細胞が病因細胞であろうとの仮説を立てることができる。そこで、Th2細胞の存在しないhK14mIL33tg#1マウスの作成を試みた。具体的には、hK14mIL33tg#1マウスをRAG2ノックアウトマウスと交配した。しかし、驚くべきことに、通常のhK14mIL33tg#1マウスと同様に、hK14mIL33tg#1マウスをRAG2ノックアウトマウスと交配したマウスもアトピー性皮膚炎様の皮膚炎を自然発症した。RAG2ノックアウトマウスはT細胞もB細胞も欠損しているためリンパ節はほとんど認められないが、hK14mIL33tg#1マウスをRAG2ノックアウトマウスと交配したマウスにおいてはリンパ節腫脹が認められ、その大部分が2型自然リンパ球であった。従って、予想とは異なり、conventionalなT細胞ではなく自然リンパ球などの他の細胞がhK14mIL33tg#1マウスの皮膚炎を誘発している可能性が示唆された。当初は精子保存であったため、最初のRAG2ノックアウトマウスの作成に時間を要したものの、hK14mIL33tg#1とRAG2ノックアウトマウスの交配を開始し、T、B細胞がない条件下で角化細胞にIL-33を高発現するマウス系列“hK14mIL33RAG2KO"を樹立することに、既に成功している。

皮膚ホモゲネートからIL-33をウエスタンブロッティング法で解析する手技は、他からは発表されておらず、非常に多くの最適化を必要とする高度な技術であるが、既に手技の確立に成功している。皮膚科学、皮膚免疫学、皮膚放射線医学作出に成功したhK14mIL33RAG2KOマウスについて、皮膚炎の有無を経時的に肉眼的および組織学的特徴を観察する。組織学的解析として、ヘマトキシリン・エオシン染色とトルイジンブルー染色を行う予定である。皮膚から細胞を単離し、炎症細胞の増加について、フローサイトメーターにより細胞数の変動を解析する。血清および血漿中の、IgE濃度、ヒスタミン濃度測定をELISAを用いて実施する。皮膚組織ホモゲナイズ、血清中のケモカインやサイトカインの濃度は、プロテインアレイにより網羅的に測定していく。2型自然リンパ球の細胞数と分布については複数のマーカーに対する抗体を用いてフローサイトメーターで解析する。このように、hK14mIL33RAG2KOマウスについて、皮膚炎の発症における、通常のTならびにBリンパ球や、2型自然リンパ球の役割について検討する。
日本産古生代後期有孔虫類の種多様性と群集組成の時空分布

秋吉石灰岩の石炭紀後期ーペルム紀前期の有孔虫群集(主にフズリナ類)を再検討し、筆者の手元にある国内外のそれらとの相違を比較検討した。飛騨外縁帯や美濃帯でも同様の研究を行った。秋吉石灰岩の上部石炭系から下部ペルム系は12のフズリナ化石帯に区分される。AkiyoshiellaやCarbonoschwagerinaに代表される環太平洋域に特徴的なフズリナ類は古太平洋海山列のプレート運動や東アジアの造構論に制約条件を与える。有孔虫多様度は下位の5化石帯で低く、その後徐々に高くなり、ペルム系最下部(10番目の化石帯)で極大になる。この結果はフズリナ類の進化・適応放散と深くかかわっていると考えられる。本研究は日本産古生代後期の有孔虫化石の生層序分布や種単位での群集組成をもとにして、地域間・地帯間におけるそれらの種多様度、群集組成の相違や相関関係を明らかにすることを目的としている。本年度はペルム紀付加体の石灰岩ブロックを代表する秋吉石灰岩で2回(2013年4月と2014年3月)にわたり9日間、石炭系陸棚石灰岩を代表する飛騨外縁帯の一の谷層で2013年6月に5日間地質調査とサンプリングを行い、前者で2013年4月に採集した172石灰岩サンプルから2442枚、後者からの76サンプル1172枚の岩石薄片を作成した。それらの鏡下観察と写真撮影も終了した。秋吉石灰岩では今年度が通算9年目の調査にあたり、薄片総数は約15,000枚となり、調査地域は限られてはいるものの、ようやく秋吉石灰岩全体の生層序分布と群集組成の詳細が判明されつつある。それらの結果は美濃帯の赤坂石灰岩と同様に(Kobayashi, 2011, Revue de Paleobiologie)、低角衝上断層の繰り返しによる石灰岩体の断片化が顕著で、従来考えられていたような比較的単純な地質構造の大幅な再検討を迫ることとなった。秋吉石灰岩のような層理面の認定が難しい石灰岩では多量の薄片の顕微鏡観察によるサンプルの年代決定が不可欠である。これまでの実績によりようやく地質構造の全貌が判明しつつある。有孔虫類の組成とそれらの時間的変化は系統分類学的・古生物地理学的に国際的視野から極めて重要である。一の谷層の再調査と石灰岩薄片の鏡下観察から、同層下部の下部石炭系と上部石炭系は断層関係にあり、上部石炭系最下部(Bashikirian下部)が欠如していること、同層中部の上部石炭系Moscovianにはこれまでに見逃されてきた断層により同層中部が構造的に重複していると考えられる。昨年度の研究成果と体験から、本年度は秋吉石灰岩層群の、特に石炭系-ペルム系境界層に的を絞り、野外調査と石灰岩サンプリングを行った。石灰岩岩石薄片作成と顕微鏡観察、フズリナ類と石灰岩相のデジタル画像作成を行い、文献調査と並行して、筆者の手元にある国内外の同時代のそれらと比較検討した。今年度の成果は以下の3点に要約される。1.石炭紀後期からぺルム前期(MoscovianからAsselian)の秋吉石灰岩層群は13のフズリナ化石帯に区分され、相対的な時間軸が設定される。2.Moscovian前期・中期とGzhelian中期・後期では日本に特有なフズリナ群集が識別される。一方、Moscovian後期からGzhelian前期とAsselianではテーチス海域の要素が少なからず認められ、これらを基にしてフズリナ化石帯や群集組成の国際対比が可能となる。3.群集組成の多様性に関しては、MoscovianからKasimovian中期では多様度が低い。Kasimovian後期から徐々に多様度を増し、Asselianでピークに達する。その後、Sakmarianになると多様度は再び低くなる。次のArtinskian前期で一時的に回復する。フズリナ化石群集の多様度の盛衰の背後にはフズリナ化石の進化機構やゴンドワナ氷床の拡大・縮小による汎世界的な海水準変動が色濃く反映されていると考えられ、これらの論証や議論に制約条件を与えることになる。本研究は日本産古生代後期の有孔虫化石の生層序分布や属・種単位での群集組成をもとにして、地域間・地帯間におけるそれらの属・種多様度、群集組成の相違や相関関係を明らかにし、古生物地理の視点から海外の同年代のものと比較することにより、それらの意義と特性を明らかにすることを目的としている。筆者の45年以上の研究体験と最近の国際的な研究動向から、最近3年間は研究素材が豊富な秋吉石灰岩層群の、特に石炭系-ペルム系境界層に的を絞り、野外調査と石灰岩サンプリングを行った。石灰岩岩石薄片と顕微鏡観察、フズリナ類と石灰岩相のデジタル画像作成を行い、文献調査と並行して、筆者の手元にある国内外のそれらと比較検討した。秋吉以外では、飛騨外縁帯や美濃帯の石灰岩でも同様な調査・研究を進めている。

最近3年間の野外調査は31日、採集石灰岩サンプルは約650点、作成薄片は11,618枚に達する。それらの多くは秋吉石灰岩のものである。薄片作成に多大な時間を要した。秋吉石灰岩での成果は以下のように要約される。秋吉石灰岩若竹山周辺の上部石炭系(Moscovian)から下部ペルム系(Asselian)は12のフズリナ化石帯に区分され、国際対比に有用な多くの化石記録が保存されている。同一の化石帯が何度も繰り返し現れることなどから、同地域の地質構造は以前考えられていたよりもはるかに複雑であること、秋吉石灰岩の少なくても東半分は大局的に逆転していることがフズリナ生層序から明らかになった。AkiyoshiellaやCarbonoschwagerinaに代表される環太平洋域に特徴的なフズリナ属は古太平洋のプレート運動論や東アジアの造構論に制約条件を与える。有孔虫多様度は下位の5化石帯で低く、その後徐々に高くなり、ペルム系最下部(10番目の化石帯)で極大になる。この結果はフズリナ類の進化・適応放散と深く関わっていると考えられる。秋吉石灰岩の石炭紀後期ーペルム紀前期の有孔虫群集(主にフズリナ類)を再検討し、筆者の手元にある国内外のそれらとの相違を比較検討した。飛騨外縁帯や美濃帯でも同様の研究を行った。秋吉石灰岩の上部石炭系から下部ペルム系は12のフズリナ化石帯に区分される。AkiyoshiellaやCarbonoschwagerinaに代表される環太平洋域に特徴的なフズリナ類は古太平洋海山列のプレート運動や東アジアの造構論に制約条件を与える。この結果はフズリナ類の進化・適応放散と深くかかわっていると考えられる。石灰岩薄片作成と顕微鏡観察、特に薄片作成に1日平均8時間で計6カ月近くを要した。今年度の石灰岩サンプル数は510、薄片枚数は4557に達した。薄片作成に多大な時間を要することから、初年度に実施した一の谷層を含め、当初予定していた調査地域での研究は秋吉石灰岩の研究が一段落してからに延期することにした。研究の目的に変わりはないが、調査地域を限定したほうが精度と信頼度の高い研究ができると判断したからである。秋吉石灰岩での長年にわたる研究成果の蓄積もあり、「研究成果の概要」に記したように国際的な関心を呼ぶような成果があげられたと考えている。このようなことから当初の目標はほぼ順調に進展していると考えている。数物系科学、地球惑星科学・層位・古生物学秋吉石灰岩層群全体に及ぶ一連の研究が一段落するにはもうしばらく時を要すると考えている。とはいえ野外調査・薄片作成・鏡下観察に明け暮れているわけにはいかない。まずは研究成果の一部を国内外に問いたいと思い、同石灰岩石炭紀後期-ペルム紀前期のフズリナ類に関するモノグラフ刊行を意図し、昨年末から日々原稿作成に励んでいる。一方、原稿作成中に国内の石炭紀後期とペルム紀前期後半の群集組成の再吟味と追加資料の必要性が生じてきた。このため、2015年度は、美濃帯数地(郡上八幡、濃飛国境、舟伏山、敦賀)での調査研究を計画している。石灰岩薄片作成に多大な時間を要すること(一日10時間かけても20枚が限度、今年度は3614枚なので薄片作成だけで180日以上)から交付申請時の調査地域を当面は秋吉石灰岩と一の谷層に絞ることにした。研究の目的に変わりはないが、調査地域を限定したほうが精度と信頼度の高い詳細な研究ができると考えたからである。秋吉石灰岩では、これまでの長年の研究成果の蓄積もあり、当初の目標をほぼ達成できたと考えている。
新規口腔がん担がんマウスの作製とmiR-223による抗腫瘍効果の検証

口腔がんの発症進展におけるmicroRNAの果たす役割は明らかにされつつあるが、その成果を臨床に応用するためのトランスレーショナル研究はまだ少数に過ぎない。本研究では、我々が世界に先駆けて口腔がん抑制遺伝子と同定することができたmiR-223を、臨床におけるヒトの口腔がん組織に局所投与して腫瘍抑制効果を検証し、治療薬としての可能性を明らかにする。そのため、(1)手術時に摘出したヒトがん組織検体から直接トランスファーさせた新規口腔がん担がんマウス(PDXモデル: patient-derived xenograft)の樹立を試み、そのモデルを用いてmiR-223の抗腫瘍効果を検証すること、及び(2)検体から得られた一部の口腔がん細胞塊(CTOS:Cancer Tissue Originated Spheroids)の培養系を樹立し、miR-223の応答性を検討すること計画した。本年度は、マウスPDXモデルの作製条件を検討したところ、腫瘍細胞(塊)のマウスへの生着率が2次元培養細胞(70%)>3次元培養細胞(40%)>細切した腫瘍塊(30%)ことが示唆された。また、CTOSの調製方法及び培養条件を検討したところ、患者から切除された口腔がん腫瘍塊の培養成功率が動物モデル由来の腫瘍塊の培養より低かったことが明らかとなった。今後の口腔がんにおけるCTOS法による薬剤感受性試験の展開の困難さが示唆された。1)計画とおりにマウスPDXモデルの作製条件やCTOSの調製培養方法を検討するため、ヌードマウスを用いて、2次元や3次元培養した口腔がん細胞株Ca9-22細胞及び動物モデルから切除された口腔がん腫瘍塊の移植実験を行った。その結果、培養細胞より腫瘍塊のマウスへの移植生着率が低いことを示され、臨床に向けたPDXモデルの作製の成功には更なる工夫必要があると考えられた。2)計画とおりにCTOSの調製方法及び培養条件を検討した。マウス移植腫瘍からの大量のCTOSが調製・培養できたが、臨床口腔がん患者からのCTOS培養は短期間しか維持できなかった。3)口腔がん患者からCTOSの作製やmiR-223の抗腫瘍効果の検証が、検体数の不足とmiR-223の腫瘍塊へのデリバリー問題で計画より遅れた。miR-223をCTOSへデリバリーするために、我々のこれまでの動物実験で樹立したmiR-224のデリバリー法を利用する予定であったが、CTOSへの導入効率が非常に低かった。そのため、臨床患者由来のCTOSの大量作製およびmiR-223の抗腫瘍効果の検証を年度内に実現することはできなかった。1)早急に研究対象者数を増やし、大量のCTOSを調製・培養する。具体的に、県内他の病院を連携して、多くの研究対象者の協力を得る。また、患者からのCTOSを調製・培養しながら、少量の検体から高い成功率で、短期間に、正確に維持・利用できるようなCTOSを調製する方法を確立する。2)miR-223の抗腫瘍効果を臨床的に評価するために、早急にmiRNAのCTOSへの効率的デリバリー条件を決める。具体的に、si3D-Fect(OZ Biosciences社)やAteloGen(高研社)など多様なトランスフェクション試薬を用いて、最適なmiRNAデリバリー方法を確立し、miR-223の抗腫瘍効果を臨床検体によって検証する。3)口腔がん

患者からCTOSの作製やmiR-223の抗腫瘍効果の検証が、検体数の不足とmiR-223の腫瘍塊へのデリバリー問題で計画より遅れた。miR-223をCTOSへデリバリーするために、我々のこれまでの動物実験で樹立したmiR-224のデリバリー法を利用する予定であったが、CTOSへの導入効率が非常に低かった。そのため、臨床患者由来のCTOSの大量作製およびmiR-223の抗腫瘍効果の検証を年度内に実現することはできなかった。1)早急に研究対象者数を増やし、大量のCTOSを調製・培養する。具体的に、県内他の病院を連携して、多くの研究対象者の協力を得る。また、患者からのCTOSを調製・培養しながら、少量の検体から高い成功率で、短期間に、正確に維持・利用できるようなCTOSを調製する方法を確立する。2)miR-223の抗腫瘍効果を臨床的に評価するために、早急にmiRNAのCTOSへの効率的デリバリー条件を決める。具体的に、si3D-Fect(OZ Biosciences社)やAteloGen(高研社)など多様なトランスフェクション試薬を用いて、最適なmiRNAデリバリー方法を確立し、miR-223の抗腫瘍効果を臨床検体によって検証する。施設の都合もあり、検体収集が十分に行われなかったため、物品費が少なかった。そこでは施設を増加させて今年度分と併せて検体収集を行う計画である。
アネキシン型レクチンの認識ドメイン同定と相互作用の解析

これまでにグリコサミノグリカン(GAG)認識生体分子が数多く報告されているが、ほとんど全てがヘパリン/ヘパラン硫酸結合能を持つタンパク質である。申請者が発見したアネキシン型(A型)レクチンは、ヘパリン/ヘパラン硫酸以外のGAGも認識する珍しい性質を持つタンパク質である。本研究ではA型レクチンの生物学的機能解明のための基礎として、レクチンのGAG認識ドメイン同定と相互作用の解析、アネキシンファミリーのタンパク質の一般的なリガンドであるリン脂質やカルシウムイオン結合部位との関連解明、通常細胞内に存在するアネキシンが細胞外へ分泌される機構解明、内在性リガンドの検索を研究課題として、平成9年度は以下に記す成果を得た。(1)ネオプロテオグライカンを用いた固相アッセイ法の開発各種のGAGをもつネオプロテオグリカンを調製し、これらをマイクロタイタ-プレートに固定化して、アネキシンとの結合試験を行う方法を考察し、より短時間でより簡便にGAG結合活性を半定量的に測定することに成功した。(2)アネキシンのGAG認識部位のマッピングアネキシンI、II、IV、V、VI、XVIのGAG結合活性を調べることにより、A型レクチンのGAG認識部位はN末端側ドメインではなく、C末端側の繰り返し構造中にあることが示唆された。(3)最近データベースに登録されたアネキシンIVとVのデータを利用してアネキシン分子の立体構造における塩基性アミノ酸残基の配置を観察したところ、GAGと静電気的に結合することが予想される塩基性アミノ酸残基の連なりが、繰り返し1と2にわたって1ヶ所、繰り返し3と4にわたって1ヶ所の合計2ヶ所存在した。GAG結合部位を特定するための部位特異的アネキシン変異体の設計に今後役立つと考えられる。