hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
波動吸収原理によるスマート柔軟アームの試作と設計法に関する研究

本研究では、薄肉構造物の境界からの反射波を吸収する波動吸収制御法を圧電フィルムの利用によって実現することを目的とした。制御対象モデルとして、柔軟回転アームなどにも適用可能な片持ばりをとりあげ、適切に形状を設計された圧電フィルムセンサとアクチュエータがその表面に貼付されて一体化されたスマート片持ばりを作製し、理論解析および実験によって複数の振動モードに跨る広い周波数範囲にわたって制御効果が期待できることを示した。また、実験では1次モードを中心とする低周波数ほど理論解析結果に相当する効果が得られ、回転アームに適用した場合には、回転に伴う慣性力の影響が本圧電素子系では対応困難であることを確認した。本研究では,構造物の境界からの反射波を吸収する波動吸収制御法の実現が,薄肉構造物の場合特に難しいという問題に対し,薄い圧電フィルムの利用によって実現させることを目的としている.制御対象モデルとして,柔軟回転アームなどにも適用可能な片持ばりをとりあげ,平成23年度はまず,適切に形状を設計された圧電フィルムセンサとアクチュエータがその表面に貼付されて一体化されたスマート片持ばりを作製し,センサおよびアクチュエータの形状は,長方形状および三角形状として,これらの基本特性の測定を実施し,自由振動制御実験を試みたが,センサに混入する電磁ノイズが制御効果およびシステムの安定性に大きく影響し,これに対処するため新たにフィルタを導入し検討したが,波動吸収制御効果を得るには至らなかった.また並行して,理論解析モデルの構築と,数値解析の実施により,圧電フィルムを貼付したはりの自由振動応答までを求めた.平成24年度はこれを受けて,まず波動吸収制御を適用した場合のはりの周波数応答を数値解析によって求め,長方形状フィルムと三角形状フィルムの組合せにより,複数の振動モードに跨る広い周波数範囲で制御効果が期待できることを確認した.次いで,実際に圧電フィルムセンサおよびアクチュエータの貼付された片持ばりを用いて制御実験を実施し,はりの基礎部に強制調和変位励振入力が加わる場合について,はり先端変位振幅で制御効果を評価した結果,1次振動モードを中心とする低周波数ほど理論解析結果に相当する効果が得られ,3次モード以上の高周波数になるに従って,種種の物理的影響によって実験による制御効果が理論解析結果よりも低下することが確認できた.本研究では、構造物の境界からの反射波を吸収する波動吸収制御法の実現が、薄肉構造物の場合特に難しいという問題に対し、薄い圧電フィルムの利用によって実現させることを目的とした。制御対象モデルとして、柔軟回転アームなどにも適用可能な片持ばりをとりあげ、平成23年度はまず、適切に形状を設計された圧電フィルムセンサとアクチュエータがその表面に貼付されて一体化されたスマート片持ばりを作製し、センサおよびアクチュエータの形状は、長方形状および三角形状として、これらの基本特性の測定を実施し、自由振動制御実験を試みた。センサに混入する電磁ノイズが制御効果およびシステムの安定性に大きく影響し、波動吸収制御の実現には至らなかった。また並行して、理論解析モデルの構築と、数値解析の実施により、圧電フィルムを貼付したはりの自由振動応答を評価した。平成24年度は、はりの周波数応答を数値解析によって求め、長方形状フィルムと三角形状フィルムの組合せにより、複数の振動モードに跨る広い周波数範囲で制御効果が期待できることを確認した。次いで、実際に積層化された圧電フィルムセンサおよびアクチュエータの貼付された片持ばりを用いて制御実験を実施、はりの基礎部に強制調和変位励振入力が加わる場合について、はり先端変位振幅で制御効果を評価した結果、1次振動モードを中心とする低周波数ほど理論解析結果に相当する効果が得られた。平成25年度は、さらなる制御効果の向上および回転アームへの適用について検討した。コントローラをディジタル信号処理で組み直して高精度化し、さらにはりの相対変位応答を基礎と先端の2点の高分解のセンサで正確に評価した。その結果、低周波側では波動吸収に近い状態が実現できることが確認され、また、回転アームに適用した場合には、回転に伴う慣性力が本圧電素子制御系では準静的観測信号となって対応困難であることを確認した。本研究では,構造物の境界からの反射波を吸収する波動吸収制御法の実現が,薄肉構造物の場合特に難しいという問題に対し,薄い圧電フィルムの利用によって実現させることを目的としている.制御対象モデルとして柔軟回転アームなどにも適用可能な片持ばりをとりあげ,平成23年度はまず,適切に形状を設計された圧電フィルムセンサとアクチュエータがその表面に貼付されて一体化されたスマート片持ばりを作製した.ここで,はりは厚さ0.5mm,長さ300mmのアルミニウム製の片持ばりとし,PVDF(ポリフッ化ビニリデン)圧電フィルムは厚さ40μmおよび100μmの2種類を考え,センサおよびアクチュエータの形状は,長方形状および三角形状とした.

まず,これらのセンサおよびアクチュエータの基本的特性の測定を実施し,自由振動制御実験を試みた.ここで,実験においてセンサ信号に混入する電磁ノイズが制御効果およびシステムの安定性に影響するので,フィルタの導入が必要となった.この点については,平成24年度以降により詳細に検討する.次に,従来の研究結果をもとに,このスマートはりモデルの理論解析モデルを構築した.圧電基礎式をもとに,エネルギー原理に基づき基礎方程式を導出して圧電フィルムが貼付されたはりの運動方程式およびセンサ出力式を導き,さらにモード空間での定式化を行った.この理論解析モデルをもとに数値解析を実施することで,圧電素子を貼付したはりの自由振動応答を求めることができた.平成24年度は,圧電フィルムが貼付されたスマート片持ばりについて,周波数応答解析を実施し,はりが基礎部に強制調和変位励振される場合について数値解析および実験を実施できたが,センサおよびアクチュエータ形状について,長方形状および三角形状の場合についてしか検証できておらず,また非定常入力の場合についてもテストを実施できていない.以上より本研究は,実験および数値解析による具体的な制御効果を検証できているものの,センサおよびアクチュエータの形状設計,および非定常励振入力形態についての検討が,当初実験計画に沿っては進んでおらず,進度がやや遅れていると考えられる.しかし,センサアクチュエータ形状設計に進むためのスマート柔軟はりシステムの理論解析モデルや数値計算方法,圧電フィルムを貼付した柔軟片持ばりの製作などの研究基盤およびノウハウは蓄積され,最終年度に向かって大きく展開できるものと考えられ、今後上記の形状設計および励振形態の2点に絞って最終年度の研究を遂行することで,研究の進度は修正され,当初計画に沿った研究課題の検討項目を網羅できる状態にできると考えられる.平成23年度は,圧電フィルムが貼付されたスマート片持ばりを作製し,センサおよびアクチュエータの基本的特性の測定,および自由振動制御実験の試みについては実施でき,また理論解析モデルの作成およびこれに基づく自由振動応答の数値解析を実施することができた.
皮質-線条体・視床投射系錐体細胞と抑制性介在神経細胞の皮質内局所回路の解析

前頭皮質は大脳基底核の入力部である線条体に強い出力繊維を送り、線条体の神経回路の活動を調節している。一方この活動の調節に重要な皮質の活動は、錐体細胞だけではなく、皮質内回路に存在する多種の介在性GABA細胞が回路の興奮性を微妙に調節している。今回の研究ではこれらの介在細胞の中で、特に錐体細胞の発火の調節に重要と考えられる高頻度発火型介在神経細胞(FS細胞)と線条体投射錐体細胞の神経結合を調べた。ラットの線条体に、蛍光色素が結合した逆行性のトレーサーを圧力注入装置により注入した。注入2日後前頭皮質部分の急性スライス標本を作製して、蛍光顕微鏡装置を搭載したパッチクランプ用電気生理実験装置下に、逆行性染色された錐体細胞とその近傍にあるFS細胞の2つの細胞から同時に全細胞記録を行い、シナプス伝達様式を記録した。記録した細胞は、予め電極にバイオサイチンを加えておくことにより記録後に細胞内染色を行った。またこれらの細胞をニューロルシダによる光学顕微鏡レベルの形態学的解析を行った。膜電位固定によりシナプス電流を計測すると、その振幅の大きさから結合の強さにはペア間にばらつきがあることが分かった。また、シナプス前細胞の連続的な2回の発火に対してシナプス電流の大きさはいずれも1回目に対して2回目は減弱を示し、その比率はほぼ一定していた。記録を行った細胞の3次元再構築を行うと、FS細胞は、細胞体へのシナプス結合比率から所謂バスケット細胞と考えられたが、シナプス結合部位は錐体細胞の細胞体周辺だけでなく、比較的遠位の樹状突起にもあることが分かった。ただ、樹状突起上への結合は主として基底樹状突起に見られ、尖頭樹状突起には少なかった。シナプス電流の振幅とシナプス結合の細胞体からの距離について調べてみると、結合の数とは相関が見られなかったが、最も近い距離とは相関が見られた。線条体は、前頭皮質領域から強い興奮性の入力を受けその活動が制御されている。特に線条体で観察される2つの膜電位状態の遷移は線条体では形成されず、皮質からの同種のリズムにより起こることが示唆されている。それゆえ皮質から線条体へ出力を送る細胞の活動が皮質内でどのように形成されるかは非常に興味深い。本課題では線条体に逆行性のトレーサーを予め注入したラットから、スライス標本を作製しパッチクランプ法により、皮質-線条体投射細胞と抑制性介在細胞の2細胞同時記録を行い神経結合を調べた。脱分極性の通電に対して高頻度の発火を示すタイプの抑制性細胞(FS細胞)には主として3種類あることが知られており、それぞれ錐体細胞の軸索起始部、細胞体、樹状突起と主な入力部位が分かれている。このようにFS細胞は錐体細胞に対してその細胞の興奮性に比較的強い影響を与えると考えられるので、まずこれについて調べた。電気生理学的に神経結合を有していることが確かめられたペアについて(FS細胞は主として樹状突起に入力するタイプ)は、抑制性シナプス電流の振幅には平均3pAから100pAまでばらつきが見られ、短時間反復刺激に対しては、減退を示した。電気生理の記録の後、細胞内染色を行い記録細胞の再構成を行うと、投射細胞上において、神経結合の部位選択性が見られる傾向があった。すなわち、いずれも主に樹状突起に付くタイプではあったが、そのつきかたは個別の細胞によって異なり、細胞体だけについたり樹状突起だけについたりと特異性を示していた。シナプス電流の振幅の大きさと神経結合の仕方についてその相関性を調べると、結合部位の細胞体からの距離と比例して、細胞体で記録されるシナプス電流の振幅が変化しており、距離的な相関が観察された。

ただ、樹状突起上への結合は主として基底樹状突起に見られ、尖頭樹状突起には少なかった。シナプス電流の振幅とシナプス結合の細胞体からの距離について調べてみると、結合の数とは相関が見られなかったが、最も近い距離とは相関が見られた。前頭皮質は大脳基底核の入力部である線条体に強い出力繊維を送り、線条体の神経回路の活動を調節している。一方この活動の調節に重要な皮質の活動は、錐体細胞だけではなく、皮質内回路に存在する多種の介在性GABA細胞が回路の興奮性を微妙に調節している。今回の研究ではこれらの介在細胞の中で、特に錐体細胞の発火の調節に重要と考えられる高頻度発火型介在神経細胞(FS細胞)と線条体投射錐体細胞の神経結合を調べた。ラットの線条体に、蛍光色素が結合した逆行性のトレーサーを圧力注入装置により注入した。注入2日後前頭皮質部分の急性スライス標本を作製して、蛍光顕微鏡装置を搭載したパッチクランプ用電気生理実験装置下に、逆行性染色された錐体細胞とその近傍にあるFS細胞の2つの細胞から同時に全細胞記録を行い、シナプス伝達様式を記録した。記録した細胞は、予め電極にバイオサイチンを加えておくことにより記録後に細胞内染色を行った。またこれらの細胞をニューロルシダによる光学顕微鏡レベルの形態学的解析を行った。膜電位固定によりシナプス電流を計測すると、その振幅の大きさから結合の強さにはペア間にばらつきがあることが分かった。また、シナプス前細胞の連続的な2回の発火に対してシナプス電流の大きさはいずれも1回目に対して2回目は減弱を示し、その比率はほぼ一定していた。記録を行った細胞の3次元再構築を行うと、FS細胞は、細胞体へのシナプス結合比率から所謂バスケット細胞と考えられたが、シナプス結合部位は錐体細胞の細胞体周辺だけでなく、比較的遠位の樹状突起にもあることが分かった。
PCR-SSCP法を用いた薬剤耐性結核菌の早期同定に関する研究

今年度,まず当院内科第二講座に入院された結核患者より得られた喀痰から培養された結核菌のうち,INH,RFP,SMにつき完全耐性が証明された菌,3種類を用いて,freeze-boiling techniqueにて結核菌の細胞壁,細胞膜を壊しそのままPCR(polymerase chain reaction)を行った。プライマーについては,INH,RFP,SM耐性について,それぞれkatG,rpoB,rpsL,につきすでにpublishされたプライマーの塩基配列と全く同じプライマーを作製した。PCRは25μlのスケールにて行った。得られたPCR産物を0.8%のアガロースゲルにて電気泳動したところ,非特異的なバンドは少なく,比較的単一なバンドが得られたおり,PCR-SSCP法は可能と考えられた。その後,PCR産物は非変性ポリアクリルアミドゲルにて泳動を行い,銀染色を行って,バンドの検出を行った。しかし,今回,泳動度の異なる異性なバンドは検出されず,今後,泳動温度の検討やPCRの条件の検討が必要と思われた。また,すでに,変異が確認された結核菌のpositive controlが必要であり,これらは,すでに論文を執筆している研究室に交渉し,入手していきたい。また今回はコロニーよりPCRを行ったが,現在,患者さんの了承のもと,喀痰より直接,PCRを行い耐性の検索を行えるよう検討中である。
III-VI族化合物半導体における空孔の配列制御と光学的異方性

本研究ではまず,Ga_2Se_3のMBE成長においてGa空孔の配列制御を試みた.その結果,(100)GaPおよび(100)GaAs基板上へのMBE成長において最適条件でGa空孔が1方向([011]方向)に規則配列し,VI/III比(SeとGaの供給比)によりGa空孔の配列が制御できることを明らかにした.次に,Ga_2Se_3の透過スペクトルの測定を行ない,Ga空孔が規則配列したGa_2Se_3では,そのバンドギャップ(約2.1eV)以上の波長範囲で吸収係数に大きな異方性があることを明らかにした.すなわち,[011]偏光に対する吸収係数が[011]偏光に対する吸収係数よりも大きく,特定の波長範囲(525nm付近)で吸収係数差が10^4cm^<-1>以上と極めて大きいことを明らかにした.さらに,反射スペクトルの偏光依存性から,屈折率にも異方性があること,すなわち複屈折を示すことを明らかにした.これらの光学的異方性はGa空孔が不規則に配列した場合には観測されなかった.この子とはGa空孔の規則配列により光学的異方性が現れたことを示している.また,Ga_2Se_3のフォトルミネッセンス(PL)測定を行ない,Ga空孔が規則配列したGa_2Se_3において,610nm付近のブロードな発光を観測した.また,このPLスペクトルの偏光特性において,[011]成分の発光強度に比べて[011]成分の発光強度が大きいことを明らかにした.これは,電子遷移の確率が[011]偏光に対する方が大きいことを意味しており,[011]偏光に対して[011]偏光の方が吸収係数が大きかったことと一致している.一方,Ga空孔が不規則に配列したGa_2Se_3では,610nm付近の発光はほとんど観測されなかった.このことから610nm付近のPL発光がGa空孔の規則配列に基づいていると考えられる.このようにGa_2Se_3は,半導体的性質を示し,かつ光学的異方性を示す材料系として特異な存在であることが明らかとなった.本研究ではまず,Ga_2Se_3のMBE成長においてGa空孔の配列制御を試みた.その結果,(100)GaPおよび(100)GaAs基板上へのMBE成長において最適条件でGa空孔が1方向([011]方向)に規則配列し,VI/III比(SeとGaの供給比)によりGa空孔の配列が制御できることを明らかにした.次に,Ga_2Se_3の透過スペクトルの測定を行ない,Ga空孔が規則配列したGa_2Se_3では,そのバンドギャップ(約2.1eV)以上の波長範囲で吸収係数に大きな異方性があることを明らかにした.すなわち,[011]偏光に対する吸収係数が[011]偏光に対する吸収係数よりも大きく,特定の波長範囲(525nm付近)で吸収係数差が10^4cm^<-1>以上と極めて大きいことを明らかにした.さらに,反射スペクトルの偏光依存性から,屈折率にも異方性があること,すなわち複屈折を示すことを明らかにした.これらの光学的異方性はGa空孔が不規則に配列した場合には観測されなかった.この子とはGa空孔の規則配列により光学的異方性が現れたことを示している.また,Ga_2Se_3のフォトルミネッセンス(PL)測定を行ない,Ga空孔が規則配列したGa_2Se_3において,610nm付近のブロードな発光を観測した.また,このPLスペクトルの偏光特性において,[011]成分の発光強度に比べて[011]成分の発光強度が大きいことを明らかにした.これは,電子遷移の確率が[011]偏光に対する方が大きいことを意味しており,[011]偏光に対して[011]偏光の方が吸収係数が大きかったことと一致している.一方,Ga空孔が不規則に配列したGa_2Se_3では,610nm付近の発光はほとんど観測されなかった.このことから610nm付近のPL発光がGa空孔の規則配列に基づいていると考えられる.このようにGa_2Se_3は,半導体的性質を示し,かつ光学的異方性を示す材料系として特異な存在であることが明らかとなった.本年度はまず、Ga_2Se_3のMBE成長においてGa空孔の配列制御を試みた。その結果、(100)GaP基板上へのMBE成長において最適条件でGa空孔が1方向([011]方向)に規則配列し、6/3比(SeとGaの供給比)によりGa空孔の配列が制御できることを明らかにした。すなわちSeの供給量が小さいときにはGa空孔が不規則に配列し、Seの供給量が大きくなるとGa空孔が規則配列する。また、成長温度に対しては低温で成膜した方がGa空孔の規則配列が起こりやすいことを明らかにした。次に、Ga_2Se_3の光学的特性の評価を行った。まず透過スペクトルの測定を行い、Ga空孔が規則配列したGa_2Se_3はそのバンドギャップ(約2.1eV)以上の波長範囲で吸収係数に大きな異方性があること、すなわち[011]偏光に対する吸収係数が[011]偏光に対する吸収係数よりも小さく、特定の波長範囲(525nm付近)で吸収係数差が10^4cm^<-1>以上と極めて大きいことを明らかにした。

これに対し、Ga空孔が不規則に配列した場合にはこのような吸収係数の異方性は観測されなかった。このことはGa空孔の規則配列により吸収係数の異方性が現れたことを示している。更にGa_2Se_3の反射スぺクトルの測定を行い、その偏光依存性を検討した。その結果、Ga空孔が規則配列した場合には2つの偏光方向で干渉ピークの位置が異なっていることから、Ga空孔が規則配列したGa_2Se_3は屈折率にも異方性を持つこと、すなわち複屈折をすることを明らかにした。一方、Ga空孔が不規則に配列したGa_2Se_3では、このような屈折率の異方性は観測されなかった。さらに、Ga_2Se_3薄膜のフォトルミネッセンスを初めて測定し、4.2Kにおいて610nm付近のブロードなピークを観測した。本年度は,昨年度の研究成果を踏まえ,SI-(100)GaAs基板上にMBE成長したGa_2Se_3のフォトルミネッセンス(PL)測定を行なった.Ga空孔が規則配列したGa_2Se_3において,610nm付近のブロードな発光を観測した.また,このPLスペクトルの偏光特性において,[011]成分の発光強度に比べて[011]成分の発光強度が大きいことが明らかになった.これは,電子遷移の確率が[011]偏光に対する方が大きいことを意味しており,[011]偏光に対して[011]偏光の方が吸収係数が大きかったことと一致している.また,透過型電子顕微鏡(TEM)により基板界面付近の構造を評価したところ,(011)断面にのみ,基板界面付近に(111)面上に多数の欠陥が観測された.これは,通常の積層欠陥とは面間隔が異なっており,層状のGaSeと類似のSe-Se結合により形成されていると考えられる.さらに,この様な欠陥の密度を源少させる目的で,ZnSeバッファ層上へのGa_2Se_3の結晶成長を試みたところ,Gs_2Se_3の成長温度が540°C以上のとき,ZnSe層とGa_2Se_3層の相互拡散により混晶化がおこり,欠損性カルコパイライト構造を有するZnGa_2Se_4がエピタキシャル成長することを見出した.また,層状構造を有するGaSeのMBE成長も試み,(111)GaAs基板上に成長温度350°Cでc軸配向したGaSeのエピタキシャル成長に成功した.しかし,十分な結晶性は得られず,PLは観測されなかった.結晶性改善のために成長温度を上昇させると,ファンデルワールス力を介した成長であるため再蒸発してしまい,膜の成長は見られなかった.そこで,(100)および(112)GaAs基板を用いて,成長温度540°CでGaのビーム強度を増加させたところ,基板と共有結合を介して成長し,結晶性が向上して2.01eVのDAペア発光が観測された.
吸入麻酔薬の作用機序-超短パルスレーザーを用いた神経細胞膜の動的変化による解析

吸入麻酔薬の作用機序は、これまで色々な角度から検討されてきたにもかかわらず、未だ確定していない。超短パルスレーザーによる細胞膜の動的構造変化の解析は物理化学的手法の中でも高感度で、かつ生理学的条件に近い環境で測定できる方法であるが、これを用いて吸入麻酔薬の作用機序を検討した報告は内外に見あたらない。私たちはこの方法を用い、吸入麻酔薬の生体膜脂質に対する影響を検討した。平成15年度は、生体膜としてヒト赤血球膜脂質を採用し,セボフルラン濃度5%に対する膜脂質流動性変化でも、温度がわずか2°C上昇した時と等価であり、その変化は極めて小さいという結論を得た。平成16年度はセボフルレンとイソフルレンの人工脂質膜に対する影響について調べた。【方法】DPPC(Dipalmitoyl-L-α-Phosphatidylcholine)で単層脂質膜を作製した。吸入麻酔薬セボフルレンとイソフルレン溶解液はそれぞれ0.1,0.2,0.5,1,2,4mMに調製した。ガスクロマトグラフィで測定した溶解液の麻酔薬含有量はセボフルレン溶液では0.1mM≒0.7MAC,0.5mM≒2.8MAC、イソフルレン溶液ではそれぞれ0.5MACと2MACであった。脂質膜の粘性変化は蛍光偏光解消法により蛍光異光度を測定することで相転移温度を算出し評価した。【結果】麻酔薬未投与の場合、相転移温度は42°Cであったのに対して、濃度が0.2mM以下の場合もほぼ同じく42°Cと有意な変化を認めなかった。0.5mM以上ではじめて約2°C低くなり、相転移温度が40°C前後に低下した。【考察】臨床濃度(2MAC)での脂質膜流動性の変化は少なく、臨床濃度を超えた濃度ではじめて流動性亢進(粘性低下)が認められた。以上より、臨床濃度の吸入麻酔薬の膜脂質に対する影響は極めて小さく、作用機序としての膜脂質の可能性は小さいと考えられた。全身麻酔薬、特に吸入麻酔薬の作用機序は、電気生理、薬理学的、分子生物学的、物理化学的手法など、これまで色々な角度から検討されてきたにもかかわらず、未だ確定していない。今回、この方法を用い、吸入麻酔薬の生体膜脂質に対する影響を検討した。[方法]生体膜としてヒト赤血球膜脂質を採用し,Dodgeらの手法で作成した。吸入麻酔薬溶解液は臨床で使用されている閉鎖式回路を模倣し,持続的にセル内のBuffer液をバブリングすることで作成した。蛍光偏光解消法では,蛍光偏光計を利用し膜に埋めた蛍光物質の蛍光異方度を求めることで膜脂質流動性変化を測定した。今回、蛍光物質としてDPHを使用し、これをヒト赤血球膜脂質に埋め込み,33°C,35°C,37°C,39°C各温度において、セボフルラン濃度0,1,2,3,4,5%に対する膜脂質流動惟変化を測定した。各温度で一元配置分散分析を行い、有意差がある場合、post・hocとしてscheffe法を用いた。[結果と考察]各温度において、濃度依存性に膜脂質流動性は増加した。4%と5%では、0%と比較して各温度で有意な増加を認めた。しかし,5%における変化度は、温度が2°C上昇した時と等価であり、その変化は極めて小さいと考えられた。したがって、本法においても、臨床濃度のセボフルランの膜脂質に対する影響は、従来言われているように極めて小さいという結果となった。

0.5mM以上ではじめて約2°C低くなり、相転移温度が40°C前後に低下した。【考察】臨床濃度(2MAC)での脂質膜流動性の変化は少なく、臨床濃度を超えた濃度ではじめて流動性亢進(粘性低下)が認められた。以上より、臨床濃度の吸入麻酔薬の膜脂質に対する影響は極めて小さく、作用機序としての膜脂質の可能性は小さいと考えられた。
運動履歴が交通事故防止及び傷害の軽減に及ぼす影響

本研究では高齢者の運動の有無による身体能力と交通事故の関係に着目した.まず,65歳以上の高齢者を対象として大規模なアンケート調査を行い,特定の運動を行っている場合,運動をしていない場合と比較して道路上で自動車に出会った場合の回避行動がとれている可能性が見られた.さらに,テニスを行っている高齢者と運動していない高齢者を被験者とした道路横断シミュレーションを利用した実験を実施した.その結果,テニスをしている高齢者は道路を横断している最中より多くの回数左右確認をしているなど,事故を回避するための能力がある可能性が示唆された.交通事故における高齢者の致死率の高さには、身体能力の低下が強く影響していると考えられるが、それら体力低下に関する個々人の特徴の違いが、交通事故の遭遇可能性、及び傷害の程度にどのように影響するのか、ということについては、研究がなされていない。本研究では、高齢者の運動履歴による身体能力の向上と、交通事故との関係に着目し、疫学的調査からその関連性を探り、事故防止及び重傷の度合いを低下させる運動について検討することとした。平成27年度の研究実績の概要は、以下の通りである。1.文献調査:高齢者の交通事故と関連する、身体能力に影響する運動要素について整理し、高齢者へのヒアリング調査及びアンケート調査の設計を行うため、関連する既存調査研究の整理を行った。関連する研究として、高齢者事故の特徴に関する既存研究、事故と身体能力についての既存研究、及び運動によって向上が見られる身体機能についての既存研究について整理した。2.高齢者ヒアリング調査:文献調査の結果をもとに、運動と交通事故の関連性に関するプレ調査として、普段から運動をしている高齢者、普段は運動をしていない高齢者を対象に、交通行動に関するヒアリング調査を実施した。個人の運動履歴に加え、普段の交通行動の中で危険を感じた経験、危険を感じた場合の回避行動の詳細について、ヒアリング調査を行った。その結果、普段運動をしている高齢者では、運動をしていない高齢者と比べて、周囲をよく見ていなかったために障害物にぶつかる頻度が有意に小さいことなど、交通事故に関わると想定される違いが見られた。3.大規模アンケート調査の設計:ヒアリング調査結果、及びヒアリング調査から得られた各質問への回答の容易さを考慮し、WEBでのアンケート調査を想定した大規模アンケート調査の調査内容を検討した。当初計画では、平成27年度において、上述した高齢者ヒアリング調査をもとに、高齢者を対象とした全国規模の調査を実施し完了する予定であった。しかしながら、ヒアリング調査の実施過程において、人材センターへの依頼により「普段運動をしている高齢者の方」に来ていただき調査を実施した結果、実際には普段運動をしていない方が多く含まれており、再度、普段運動をしている高齢者の方を探していただき、ヒアリング調査を設定しなおす必要が生じた。そのため、ヒアリング調査の完了が遅れた。高齢者を対象とした全国規模の調査の実施においては、ヒアリング調査の結果をもとに調査の設計を行うこととしていたため、上記の遅れにともなって、遅れが生じ、平成27年度中の実施ができないこととなった。上記の理由により当初予定からは遅れるものの、大規模アンケート調査の設計は順調に進んでおり、平成28年度の第1四半期に完了する予定である。交通事故における高齢者の致死率の高さには、身体能力の低下が強く影響していると考えられるが、それら体力低下に関する個々人の特徴の違いが、交通事故の遭遇可能性、及び傷害の程度にどのように影響するのか、ということについては、研究がなされていない。平成28年度の研究実績の概要は、以下の通りである。1.大規模アンケート調査の実施:前年度のヒアリング調査結果、及びヒアリング調査から得られたデータをもとに、運動を行っている高齢者、および運動を行っていない高齢者を対象として、WEB調査による大規模アンケート調査を実施した。アンケート調査の結果の分析からは、普段から運動を行っているグループでは、運動を行っていないグループと比較して、道路上を歩いているときに危険を感じたときに何らかの行動を取れるという回答が多いなど、運動の実施が交通事故の防止に影響している可能性が示唆された。また、ジョギング、テニス、登山といった運動を行っているグループが特に体力が高い可能性が示唆された。2.歩行シミュレーターによる被験者横断実験:運動している高齢者と、運動をしていない高齢者の、道路の歩行時の行動特性について検証するため、歩行シミュレーターによる被験者実験を実施した。普段テニスをしている高齢者に被験者となっていただき、体の複数の部分マーカーをつけたうえで、歩行シミュレーター「渡りじょーず君」で自動車が通る道路の横断をしている様子を、高速度カメラで撮影し、歩行時の体の動きのデータを取得した。また、アイマークレコーダーを装着し、横断時の視線についてもデータを取得した。当初計画では、平成27年度において、高齢者ヒアリング調査をもとに、高齢者を対象とした全国規模の調査を実施し完了する予定であった。

高齢者を対象とした全国規模の調査の実施においては、ヒアリング調査の結果をもとに調査の設計を行うこととしていたため、上記の遅れにともなって、遅れが生じ、平成27年度中の実施ができないこととなった。上記の理由により当初予定からは遅れたが、大規模アンケート調査は完了した。また、歩行シミュレーターによる横断実験についても、運動をしていない高齢者の被験者の参加者を集めることに時間がかかることから、平成29年度の実施となる。本研究では高齢者歩行者自身を対象とした効果的な事故防止対策の構築が,今後の日本においてさらなる交通事故の低減に繋がると考え,高齢者の身体能力と交通事故の関係に着目した.運動の有無に着目した高齢者に対するヒアリング調査においては,運動を行っているグループは運動を行っていないグループと比べ,体力が高く,頻繁に外出することが分かった.その結果,外でのヒヤリハットや事故の経験も多くなる可能性が見られた.しかしながら,運動の種類と交通安全に関する,高齢者への大規模アンケート調査の結果からは,運動による体力の向上や維持効果は顕著であり,ヒヤリハットや交通事故に遭遇した場合でも,普段から運動を行っているグループは運動を行っていないグループに比べて,何らかの反応を取ることができる割合が多く,運動が事故の防止に役立つ可能性を示す結果が見られた.さらに,特にジョギング・テニス・登山などの運動を行っているグループは運動を行っていないグループとの体力差が大きく,事故の防止に役立つ運動としての可能性が考えられる.上記の結果をもとに2016年度2017年度にかけて,道路横断シミュレーター「わたりジョーズ君」を用いた実験を行った.被験者はテニスをしている高齢者,運動を行っていない高齢者,大学生(全て男性)である.運動を行っていない高齢者は,横断を開始するまでの時間が他のグループよりも長く,また,横断中に左右を確認する回数が少ない傾向にあることが分かり,横断中に歩行以外の動作を行う余裕がないことが示唆された.以上のように,本研究では運動が交通事故防止及び障害に及ぼす影響について検討し,観測調査やアンケート調査により運動を行うことによる事故防止の可能性を確認することが出来た.今後,日本における新たな事故防止対策の確立に寄与する可能性がある.本研究では高齢者の運動の有無による身体能力と交通事故の関係に着目した.まず,65歳以上の高齢者を対象として大規模なアンケート調査を行い,特定の運動を行っている場合,運動をしていない場合と比較して道路上で自動車に出会った場合の回避行動がとれている可能性が見られた.さらに,テニスを行っている高齢者と運動していない高齢者を被験者とした道路横断シミュレーションを利用した実験を実施した.その結果,テニスをしている高齢者は道路を横断している最中より多くの回数左右確認をしているなど,事故を回避するための能力がある可能性が示唆された.平成27年度に実施した高齢者ヒアリング調査をもとに、高齢者を対象とした全国規模の調査を実施する。調査内容は、個人の運動履歴(運動の種類、経験時期、経験期間、頻度等)、交通事故の経験、傷害の程度、普段の行動、普段の交通行動(自動車運転の有無、危険行動の有無)、生活スタイル(外出の頻度)とする。
魚類飼料としての共役リノール酸(CLA)の利用とヒトに対する栄養機能性

本年度は、共役ドコサヘキサエン酸(CDHA)と共役エイコサペンタエン酸(CEPA)の魚類に対する生理作用を明らかにし、魚類飼料としての有用性について検討を行った。実験試料として用いたCDHAとCEPAはそれぞれDHAとEPAからアルカリ異性化により調製した。CDHAとCEPAをサクラマスに投与し、6週間飼育後、体重、体長などを測定した。採血・解剖後、臓器重量や各臓器中の脂質含量、脂肪酸組成、脂質代謝酵素活性などを測定した。その結果、CDHA投与では大きな変化はなかったが、CEPA投与で、内臓脂肪の減少が認められた。筋肉中の脂肪酸組成を分析したところ、CEPAとCDHA投与による、EPAやDHAの含量の低下はほとんどないことも認められた。また、CEPAとCDHA投与による体重などの大きな変化は認められなかった。以上より、魚飼料中にCEPAを添加することにより、飼料の可食部へのCEPAの移行、非可食部(内臓)中の脂肪の減少といった効果の得られることが初めて明らかにされた。こうした成果は、機能性栄養成分を多く含む養殖魚を創出する上で極めて有用な知見を与えるものと考えられた。本年度は、共役リノレン酸(CLN)の魚類に対する生理作用を明らかにし、魚類飼料としての有用性について検討を行った。実験試料としてはCLNを70%以上含むザクロ種子油を用いた。濃度の異なるザクロ種子油をサクラマスに投与し、6週間飼育後、体重、体長などを測定した。その結果、ザクロ種子油投与により、CLNが効率よく魚肉中に移行することが明らかになった。また、2%以下のザクロ種子油投与で、筋肉部分の増大、内臓脂肪の減少が認められた。筋肉中の脂肪酸組成を分析したところ、EPAやDHAの含量がコントロールと比較して増加することも明らかになった。ザクロ種子油飼料中の脂質にはコントロール脂質と比較して、EPAやDHA含量にほとんど差のないこと、また、n-3系高度不飽和脂肪酸の起源となるα-リノレン酸の含量は、ザクロ種子油群の方が少ないことなどを考慮すると、ザクロ種子油投与によるEPAやDHA含量の増大は、これら脂肪酸合成系の活性化に起因するものと考えられた。以上より、魚飼料中にCLNを添加することにより、飼料の可食部(筋肉部)へのCLNの効率的な移行、非可食部(内臓)中の脂肪の減少、機能性脂肪酸としてヒトに有用なEPAやDHAおよび共役脂肪酸(CLN)の増大といった効果の得られることが初めて明らかにされた。
炎症歯周組織における内因性アデノシンの抗炎症作用の解析

ラット実験的歯周病に対するアデノシンデアミナーゼ(ADA)阻害剤の影響の解析実験的歯周病モデルを用いて、同部炎症反応に及ぼす内因性アデノシンの影響をADA阻害剤を投与することにより検討した。実験動物は生後7週齢(体重200-300g)の雄性Wistar系ラットを用いた。10匹のラットを5匹ずつ2群に分け、実験開始日に0.5%メチルセルロースにて6.4mg/mlに調整したADA阻害剤あるいはメチルセルロースのみを、ラットに体重1kgあたり5mlの割合(32mg/kg)で経口投与し、ケタラール腹腔麻酔下において、上顎第二臼歯歯頸部に4-0号の滅菌された絹製縫合糸を結紮した。結紮処置は左側のみとし、右側を無処置対照側とした。結紮処置日からADA阻害剤あるいはメチルセルロースを1日1回32mg/kg経口投与し、結紮処置後7日目の段階で上顎骨を採取し、結紮側およびコントロール側の第二臼歯歯間乳頭部歯肉中のIL-1βの発現をRT-PCRにて解析した。その結果、ADA阻害剤投与群は、非投与群に比較して結紮部IL-1βmRNA発現の平均値が低値であることが明らかとなった。また歯槽骨吸収量は、歯肉採取後10%ホルマリンにて3日間固定し軟組織を実体顕微鏡下で除去した後、実体顕微鏡下で頬側および口蓋側からデジタル撮影を行い、NIHimageを用いてセメントエナメルジャンクションから歯槽骨頂までの面積を測定し、結紮側とコントロール側の差を算出した。ADA阻害剤投与群、メチルセルロース投与群、それぞれ8匹ずつ結紮処置を行い、実験開始後7日目に結紮糸が残存していた各群5匹ずつを評価の対象として解析に用いた。その結果、ADA阻害剤投与群は、非投与群に比較して結紮部位歯槽骨吸収量の平均値が、頬側、口蓋側ともに低値であることが明らかとなった。(1)細胞外アデノシンデアミナーゼ(ecto-ADA)によるアデノシンレセプター(AdoR)活性化制御機構の解析歯肉線維芽細胞(HGF)上のCD26およびecto-ADA分子の発現をフローサイトメトリーにて確認した。さらに、同細胞上のecto-ADA量は、細胞質内にADAを豊富に含有するJurkat lysateを外因性ADAとして用いて細胞を前処理することにより増加を認めた。そこでecto-ADAによるAdoR活性化制御機構を解析するために、ADA特異的阻害剤2'-deoxicoformycin(dCF)の存在、非存在下においてアデノシン(Ado)による細胞内cAMP産生量を検討した結果、Ado添加による細胞内cAMP産生量の増加は、Jurkat lysateにて細胞を前処理し細胞上のecto-ADA量を増加させることにより抑制され、その抑制効果はdCFを添加することにより阻害された。このことより、ecto-ADAによるAdoR活性化制御機構を検討するための実験モデルを構築することに成功した。(2)実験的歯周病モデルの確立雄性Wistar系ラットの上顎左側第二臼歯歯頸部に絹製縫合糸にて結紮を行い、結紮処置1日目、4日目、7日目に上顎骨を摘出し歯槽骨吸収量を測定した。その結果、結紮処置を行った部位は継時的に歯槽骨吸収量の増加を認め、結紮後7日目では対照部位に比較して有意に高い歯槽骨吸収量を示した。さらに、結紮処置1日目、4日目、7日目に結紮部位および対照部位より歯肉組織を採取しPCR法にてIL-1βmRNAの発現を解析した結果、結紮部位の歯肉組織中のIL-1βmRNA発現は、結紮処置1日目、4日目、7日目のすべてにおいて、結紮処置を行わない対照側に比較して、著明に高いことが明らかとなった。このことより、炎症性サイトカインの発現誘導と歯槽骨吸収を伴うラット歯周病モデルの確立に成功した。

また歯槽骨吸収量は、歯肉採取後10%ホルマリンにて3日間固定し軟組織を実体顕微鏡下で除去した後、実体顕微鏡下で頬側および口蓋側からデジタル撮影を行い、NIHimageを用いてセメントエナメルジャンクションから歯槽骨頂までの面積を測定し、結紮側とコントロール側の差を算出した。ADA阻害剤投与群、メチルセルロース投与群、それぞれ8匹ずつ結紮処置を行い、実験開始後7日目に結紮糸が残存していた各群5匹ずつを評価の対象として解析に用いた。その結果、ADA阻害剤投与群は、非投与群に比較して結紮部位歯槽骨吸収量の平均値が、頬側、口蓋側ともに低値であることが明らかとなった。
新規小頭症マウスの発見・原因遺伝子のポジショナルクローニングと系統樹立

(1)病理組織学的研究により、小頭症発症個体の脳各部位で、成長が非常に遅れている事が明らかになった。大脳皮質:層構造が不明瞭。特に、外顆粒層、内顆粒層が消失していた。海馬:海馬・歯状回部位では、形成が極端に未熟か、消失していた。小脳:プルキンエ細胞層の上に皮質に相当する部分がなかった。嗅球:顆粒細胞層が未熟か、消失していた。(2)原因遺伝子を第5染色体まで絞り込んだが、候補遺伝子を決定できなかった。(3)小頭症モデルマウスの樹立化については、BALB/c及びC57BL/6系統へのコンジェニック化を進めている。なお、BALB/c系小頭症マウスは、理研バイオリソースセンターへ寄託済みである。病理組織用に確保した発症個体(2例)及び正常個体(2例)の脳を用いて、ホルマリン固定パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色後、組織像の観察をした。その結果、発症個体の成長が非常に遅れている事が明らかになった。1)大脳皮質:発症個体の層構造は不明瞭であった。特に外顆粒層、内顆粒層が消失していた。2)海馬・歯状回:発症個体ではその形成が極端に未熟か、消失した状態であった。3)小脳:日齢により大きな変化が確認でき、正常個体では、生体に近い構造を示し、顆粒細胞はプルキンエ細胞層の下へ移動していた例と、顆粒細胞の殆どが皮質表層下にあり、未熟な構造を示す例が認められた。一方、発症個体はプルキンエ細胞層の上に皮質に相当する部分が認められなかった例と、顆粒細胞が皮質下へ既に移動しているが、その数は非常に少ない例が認められた。4)嗅球:顆粒細胞層は、発症個体では未熟か、消失していた。なお、当実験動物施設は改築工事の為(H26年8月27年10月予定)、マウス飼育が不可能となったので、継代中の小頭症マウスを理研バイオリゾースセンターに寄託し、継代維持を依頼した。一方、原因遺伝子の解析は、保存していたDNAサンプルを用いて、DNAマイクロサテライトマーカーによるポジショナルクローニングを進めた。当実験動物施設(改装工事開始;平成26年8月)は、昨年12月末に完成した。その間、理研バイオリゾースセンター(理研BRC)に寄託し、繁殖維持を依頼していた本疾患モデルマウスは、SPF化に成功し、本年3月に小頭症の発症個体(ホモ)が確認できた。候補遺伝子のクローニングは、新たなマイクロサテライトDNAマーカーを用いてPCR解析を実施し、候補遺伝子を数個までに絞る事に成功し、現在、候補遺伝子について、免疫組織学的検討を行っている。当実験動物施設の改装工事が行われたため、マウスの飼育・繁殖が滞っており、コンジェニックマウス系統の樹立、及び行動様式の解析が非常に遅れている。しかし、候補遺伝子の探索と病理学的検索は、保存していたDNAサンプルおよび組織標本により解析を行った。免疫組織学的評価:病理組織用に確保した小頭症発症個体(2例)及び正常個体(2例)の脳を用いて行った。候補遺伝子と推定したZfp326蛋白質の抗体(市販品)を用いて、免疫組織学的解析を実施した結果、発症個体は、染色度合い(免疫反応)が弱かった。その原因は、各領域が未発達で、細胞数が少ない事が反映していると考えた。具体的には、ヘマトキシリンーエオジン染色による病理学的解析時に得られた結果、1)大脳皮質の層構造の不明瞭ないし顆粒層の消失。2)海馬ではその形成が極端に未熟か、消失。3)小脳ではプルキンエ細胞層の上に皮質がないか、顆粒細胞が非常に少ない。4)嗅球では、顆粒細胞層が非常に少ない。原因遺伝子のPCR解析:マイクロサテライトDNAマーカーを用いて実施し、最有力候補を第5染色体のZfp326遺伝子としたが、免疫組織学的結果では明確ではなかった。そこで、小頭症発症個体及び正常個体のZfp326遺伝子の塩基配列を比較した結果、12のエクソン領域は、全て同じ塩基配列を示し、Zfp326遺伝子は原因遺伝子ではない事が確認されたので、引き続き近傍の遺伝子解析を行う。小頭症モデルマウスの樹立:現在、BALB/cおよびC57BL/6系統へのコンジェニック化を進めている。なお、BALB/c系小頭症マウスは理研バイオリソースセンターに寄託済みである。今後は、初代培養細胞の樹立、及び行動様式の確認を行う。当動物実験施設の改装工事の為、平成26年8月から平成27年12月末まで、マウスの飼育が出来ず、当初の計画が遅滞した。

なお、BALB/c系小頭症マウスは、理研バイオリソースセンターへ寄託済みである。当実験動物施設改装工事中の為、マウスの飼育・繁殖が行えず、コンジェニックマウス系統の樹立、原因遺伝子の究明及び行動様式の解析が予定より遅れている。病理学的な分析はほぼ計画通り進んでいる。最終年度は、候補遺伝子について、遺伝子レベルでの解析、および病理・免疫組織学的解析を行う。コンジェニックマウスの樹立は、実験動物施設の改装工事のために、予定していた助成期間内での達成は困難であるが、理研BRCの協力の下に本モデルの系統樹立を優先し、引き続きコンジェニックマウス系統の樹立を目指す。実験動物学当実験動物施設完成後、理研バイオリゾースセンターから速やかにマウスを導入し、コンジェニックマウス樹立の再開と、樹立過程で発症する個体及び同腹正常個体を確保し、以下の内容の検討を行う。1)行動様式の検討。2)原因遺伝子のポジショナルクローニングの推進。3)病理・免疫組織学的分析の推進。
Aireによる胸腺内抗原提示細胞の機能制御の解析

これまで自己反応性T細胞の負の選択においてAireが、1)どの細胞種の抗原提示を制御しているか、2)それはどのような機構であるか、について検討を行ってきた。その結果、Aire欠損下においても胸腺髄質上皮細胞(medullary Thymic Epithelial Cell : mTEC)は正常に抗原提示できること、そしてAireは骨髄由来抗原提示細胞(BM-APC)の抗原提示に影響することが示唆されている。我々が用いているRat insulin promoter(RIP)下でOvalbumin(OVA)を発現するRIP-OVAモデルは、mTECがOVA抗原を発現している。また、OT-2 T細胞の負の選択にAireおよびBM-APCの抗原提示を必要とすることから、mTECからBM-APCへの抗原受け渡しにAireが関与することが予想されてきた。しかし、このモデルで抗原受け渡しが実際に起こっているかどうかは不明である。そこで、骨髄移植によってmTECがRIP-OVAを発現し、BM-APCのみが抗原提示できる状態(正常骨髄→MHC II欠損RIP-OVA)を作製し、このキメラマウスの胸腺スライス上におけるOT-2制御性T細胞(Treg)産生を検討した。mTEC・BM-APCが共に抗原提示できる状態では、正常にTregが産生された。これに対し、mTECが抗原を発現しており、BM-APCのみが抗原提示できる状態では、正常なTreg産生は起きなかった。このことは、RIP-OVAモデルではmTEC・BM-APC双方の抗原提示が負の選択・Treg産生に必要であることを示唆している。以上の結果は、これまで想定されてきた抗原発現・抗原の受け渡しの制御とは異なるメカニズムで、Aireが負の選択におけるmTEC・BM-APCの強調作用を制御している可能性を示唆している。胸腺髄質における自己反応性T細胞の除去(負の選択)には、胸腺髄質上皮細胞(medullary Thymic Epithelial Cell : mTEC)・樹状細胞・胸腺B細胞といった様々な抗原提示細胞による自己抗原の提示が必要であると考えられている。またmTEC特異的な転写調節因子であるAireの欠損によって負の選択が障害されることがモデル系を用いた実験からわかっている。現在Aireが欠損するとmTECにおける自己抗原の発現が低下し、その結果負の選択が障害されるという仮説が立てられているが、Aireが自己抗原の発現制御を介して負の選択を制御しているのか?、またどの抗原提示細胞に作用して負の選択を制御しているのか?に関しては不明な点が多い。我々はAire欠損によって自己抗原の発現が低下しない負の選択モデルを用いて、mTECと自己反応性T細胞の相互作用をイメージングで解析した。用いたモデル系では自己抗原を発現するmTECと自己反応性T細胞の特異的な接着が観察され、mTECが自己抗原を提示していることが示唆されている。この実験系でAire欠損mTECも正常に自己反応性T細胞と接着するという結果が得られ、Aire欠損mTECも正常に自己抗原を提示できることが新たにわかった。今回イメージングで用いたモデル系は、Aire欠損によって負の選択が障害されること、負の選択に骨髄由来の細胞の抗原提示が必要であることがわかっている。Aire欠損下でもmTECにおける抗原発現・抗原提示は正常であるため、樹状細胞などの骨髄由来の抗原提示細胞がAireやmTECとどう関わっているかについて検討を加える必要がある。研究目的の一つであるmTECの抗原提示による負の選択にAireがどう関わっているのか?という問に答えるため、二種類の負の選択モデル系を用いて、従来行ってきた骨髄移植・胎仔胸腺移植実験に加えイメージング実験を行った。過去の報告では、in vitroの実験系からAireがmTECの抗原提示能を制御することが示唆されていたが、in vivoにおける検討はなされていない。今回の解析でin vivoにおいてAireの欠損がmTECの抗原提示能に影響を与えないことが明らかとなり、研究はおおむね順調に進んでいると言える。胸腺髄質上皮細胞(medullary Thymic Epithelial Cell : mTEC)に特異的に発現するAireがどのように負の選択を制御しているかを検討するために、2種類の負の選択モデル(抗原トランスジェニックモデル)を用いて研究を行っている。その1つであるRat insulin promoter(RIP)下でOvalbumin(OVA)を発現するRIP-OVAモデルは負の選択にAireを必要とする。我々の研究から、このモデルではmTECが負の選択におけるOVA抗原ソースであり、mTEC自身がOVAを抗原提示することが示唆されている。しかし、このモデルにおける負の選択には骨髄由来抗原提示細胞(BM-APC)が必要であり、BM-APCのMHC class IIが欠損した状態では負の選択が起きない。胸腺における主なBM-APCは樹状細胞とB細胞と考えられるので、このモデルにおいて、それらのBM-APCが負の選択に必要か検討した。その結果、樹状細胞欠損、もしくはB細胞欠損下でも負の選択は正常に起きた。このことから、この負の選択には樹状細胞・B細胞両者が重複して関わっている可能性、もしくは樹状細胞・B細胞以外の別の細胞種が関わっている可能性が考えられる。もう1つのAire promoter下でOVAを発現するAire-OVAモデルにおいて骨髄移植・胎仔胸腺移植実験を行った結果、こちらはmTECだけでなくBM-APCも負の選択における抗原ソースとなることが明らかとなった。

1)mTECが抗原ソースの場合、2)BM-APCが抗原ソースの場合、の負の選択におけるAireの必要性を検討した。1), 2)の両状態においてAireが欠損すると制御性T細胞の産生が低下した。特に2)の場合にmTECのAire欠損がBM-APCの抗原提示能に影響することを示唆する興味深い結果を得ている。2つの負の選択モデル(RIP-OVA, Aire-OVA)において種々の骨髄移植・胎仔胸腺移植実験を行い、それぞれのモデルにおける抗原ソースとなる細胞種・抗原提示細胞種を検討した。抗原ソースがmTECである場合、どちらのモデルにおいてもAireはmTEC自身の抗原提示能に大きくは影響しないことが示唆された。BM-APCの抗原提示に対するAireの影響に関しては、Aire-OVAモデルを用いた実験から、BM-APCが発現する抗原によって起こる負の選択にAireが必要であることが明らかとなった。これはこれまで提案されてきたmTECからBM-APCへの抗原受け渡しにAireが必要であるという仮説とは異なるメカニズムでAireがBM-APCの抗原提示に影響を与える可能性を示唆している。また、mTECからBM-APCへの抗原受け渡しを検討する実験系を新たに構築し、現在検討を進めている。以上のことから研究はおおむね順調に進展しているといえる。これまで自己反応性T細胞の負の選択においてAireが、1)どの細胞種の抗原提示を制御しているか、2)それはどのような機構であるか、について検討を行ってきた。その結果、Aire欠損下においても胸腺髄質上皮細胞(medullary Thymic Epithelial Cell : mTEC)は正常に抗原提示できること、そしてAireは骨髄由来抗原提示細胞(BM-APC)の抗原提示に影響することが示唆されている。我々が用いているRat insulin promoter(RIP)下でOvalbumin(OVA)を発現するRIP-OVAモデルは、mTECがOVA抗原を発現している。また、OT-2 T細胞の負の選択にAireおよびBM-APCの抗原提示を必要とすることから、mTECからBM-APCへの抗原受け渡しにAireが関与することが予想されてきた。しかし、このモデルで抗原受け渡しが実際に起こっているかどうかは不明である。そこで、骨髄移植によってmTECがRIP-OVAを発現し、BM-APCのみが抗原提示できる状態(正常骨髄→MHC II欠損RIP-OVA)を作製し、このキメラマウスの胸腺スライス上におけるOT-2制御性T細胞(Treg)産生を検討した。mTEC・BM-APCが共に抗原提示できる状態では、正常にTregが産生された。これに対し、mTECが抗原を発現しており、BM-APCのみが抗原提示できる状態では、正常なTreg産生は起きなかった。このことは、RIP-OVAモデルではmTEC・BM-APC双方の抗原提示が負の選択・Treg産生に必要であることを示唆している。