hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カイコを利用した有用タンパク質大量生産のための分子機構解明および新技術の開発

2エンドグリコシダーゼを利用したin vitroでの糖鎖リモデリング3BmNPVとAcMNPVの多重感染による、組換えタンパク質の糖鎖改変項目1については、これまでのスクリーニング実験により絞り込まれた、組換えタンパク質の分泌・修飾に深く関与していると推測される8つの候補遺伝子についてノックダウン細胞のRNA-seq解析を行った。さらに、これらの遺伝子の過剰発現株を作製し、分泌・修飾への影響の確認を進めている。2については、昆虫型糖鎖構造を効率良く切断するためのツールとしてEndoDの改良と、カイコ由来エンドグリコシダーゼの生産を試み、カイコ由来糖鎖への一定の加水分解活性を確認した。現在、反応条件の検討および、カイコで生産した複数の糖タンパク質をターゲットとした糖鎖のリモデリングを進めている。3については、前年度、多重感染の利用で問題になると考えられる重感染排除について、カイコにおけるバキュロウイルスの重感染排除の原因因子候補をノックアウトウイルスを用いたスクリーニングで絞り込んでおり、これらのノックアウトが重感染排除を軽減することの再現性を確認した。現在、複数の因子をノックアウトあるいはノックダウンすることによる軽減効果の変化を確認し、ウイルスの最適化を試みている。加えて、ウイルス株の選択やプロモーター条件の検討により糖鎖改変用ウイルスを調整することで、カイコ個体での完全共感染を用いた糖鎖改変にも着手している。1スクリーニングによって絞り込んだ組換えタンパク質の分泌・修飾に関わる8つの遺伝子候補について、ノックダウン細胞を用いたRNA-seq解析を行った。これにより、各遺伝子の関係性についてある程度の知見を得ることができた。2課題となっていたカイコ由来糖鎖の切断のために、EndoDの改良およびカイコ由来エンドグリコシダーゼの開発に着手し、ターゲットとなる糖鎖に対して一定の加水分解活性を確認した。3前年度にスクリーニングによって絞り込んだ重感染排除の候補因子について、複数のカイコ培養細胞を使用して再現性を確認した。3つのテーマについて1エンドグリコシダーゼを利用した糖鎖加工については、引き続きカイコバキュロウイルス発現系を用いてエンドグリコシダーゼのクローニングおよび、その変異体の作成に取り組み、発現量や加水分解活性および糖転移活性の変化を確認した。また、新規酵素として、カイコ由来のエンドグリコシダーゼ(EndoBm)の開発に取り組んだ。その結果、EndoBmがカイコ内在性の特定の糖鎖構造に対して作用する可能性が確認された。2バキュロウイルスの多重感染による、組換えタンパク質の糖鎖改変については、これまでの研究において、カイコ個体および培養細胞においてバキュロウイルスの重感染排除が観察されたため、その原因因子を探索するためにBmNPVのノックアウトウイルスライブラリ(Ono et al., 2012)を用いてスクリーニングを行った。その結果、9つの遺伝子が原因因子候補として考えられた。今年度は、複数因子のノックアウト株を作成し、単独因子をノックアウトしたものに比べ重感染排除がさらに軽減される可能性が確認された。
膝前十字靭帯再建術後に再断裂を生じる重層的因子解明への新規アプローチ

本研究の第一の目的は、膝前十字靭帯(ACL)再建術後に再断裂を生じさせる重層的因子とその相対危険度を解明することである。まず、初回ACL損傷の骨形態的危険因子が再断裂にも大きく影響を与えると考えられるため、初回ACL損傷のリスクファクターとしての脛骨プラトー形態評価を行った。その結果、非ACL損傷例の膝CTと比較し、ACL損傷例では脛骨外側プラトーの後方部分が内側と比べて有意に小さく、さらに脛骨プラトー後方傾斜が大きいことが分かった。またACL再建後に大腿骨孔のPosterior Wall Blowout様現象がCTで確認できた場合、この現象がその後の膝関節の不安定性増悪や再断裂に関わる可能性があるが、画像上この現象を認めても、その後の経過で膝安定性や臨床スコアに有意な悪影響を与えず、ほとんどの例でその後に大腿骨骨孔の後壁の再構築が3DCTにて認められることが分かった。さらに今後、ACL再建後に再断裂を生じるリスクファクターについて一般的な幅広い項目を検討するためには、どうしても再断裂の症例数が多い必要がある。そのため当大学病院を中心にACL再建例についての多施設共同研究も同時に行っており、まず始めに半月板損傷発生のリスクファクターや術前主観的評価に影響を及ぼす因子について、ロジスティック回帰分析や重回帰分析を用いて検討した。その結果、内側半月板損傷発生のリスクファクターには術前患側Kneelax絶対値やPivot-shift testでのApprehensionなど、外側半月板損傷発生のリスクファクターには男性であることと下肢外反であることが挙がった。今後はこの研究内容についてさらに症例数を増やして再検討するとともに、当科での多項目の詳細な検討とは別に、多施設共同研究の症例においても本題であるACL再建後に再断裂を生じるリスクファクターの検討を開始する。本研究最初の1年間は追跡調査での結果がまだ出てこないため、初回ACL損傷のリスクファクターとしての脛骨プラトー形態評価を行った。またACL再建後に大腿骨孔のPosterior Wall Blowout様現象がCTで確認できた場合、この現象が術後の短期成績に影響を与えるものではないことも示した。この1年間で、ACL再建後の再断裂や機能不全に関与する可能性のある複数の項目について、ACL初回再建の約60例を調査することができた。さらに同時に進行している、当大学病院を中心としたACL再建例についての多施設共同研究では、術前評価項目と術中所見の比較について約300例を対象に評価を行い、半月板損傷発生のリスクファクターや術前主観的評価に影響を及ぼす因子を解明することができた。今後もそれぞれの研究において症例数を増やし、より詳細な評価を行っていく予定である。また2018年7月より、ナビゲーションシステムを用いた術中膝関節不安定性評価を16歳以上の全ての初回ACL再建例で行っている。ACL移植腱固定前と固定後において、幅広い屈曲角度での膝関節前方・回旋不安定性を術中に評価しており、この膝関節不安定性の定量評価が本研究課題の評価項目に加わった。さらにMRI下での膝前方・回旋不安定性評価のためのストレスデバイス使用による評価についても、ポルトガルより装置を購入した後に検査方法を確立し、2018年7月に倫理審査委員会を通してから現在までに7例の評価を行ってきた。今後継続して評価を行っていく。今回行なった初回ACL損傷のリスクファクターとしての脛骨プラトー形態のCT評価により、ACL損傷例では脛骨外側プラトーの後方部分が内側と比べて有意に小さく、さらに脛骨プラトー後方傾斜が大きいことが分かったため、今後はACL再建後の症例についてこれら2つの因子を再断裂や膝不安定性増悪の骨形態的リスクファクターの重要な候補として追跡する。脛骨プラトー形態評価や骨孔位置評価のためのCT検査、ナビゲーションシステムを用いた術中膝関節不安定性評価はACL再建患者全例で行っており、またKneelax-3による膝前方不安定性の評価やBiodexを用いた下肢筋力測定、膝関節固有感覚(運動覚)の評価、患者主観的評価、Pivot shift testなどの身体所見評価なども術前後で全例において行っているため、続けてこれらの項目がACL再建後に再断裂や膝不安定性増悪を生じるリスクファクターとなるかについて検討する。早期スポーツ復帰希望例に対しては、引き続き三次元動作解析システムと床反力計を用いた解析を継続し、再断裂や膝不安定性増悪との関連を追う。この動作解析の結果は脛骨プラトー形状などの解剖学的要素と関連している可能性もあるため、これについても検討する。またMRI下での膝前方・回旋不安定性評価のためのストレスデバイス使用による評価についても、術前検査として同意が得られた症例に対して続けて評価し、脛骨前方内旋ストレスでの大腿骨外側顆の後方亜脱臼と外側半月板の逸脱の程度を評価し、術前のPivot shift testとの関係や術後の膝関節不安定性進行などとの関連を調査する。さらに当大学病院を中心に行っているACL再建例についての多施設共同研究についても、当科での多項目の詳細な検討とは別に、ACL再建後に再断裂を生じるリスクファクターについて一般的な幅広い項目を検討していく。

その結果、非ACL損傷例の膝CTと比較し、ACL損傷例では脛骨外側プラトーの後方部分が内側と比べて有意に小さく、さらに脛骨プラトー後方傾斜が大きいことが分かった。またACL再建後に大腿骨孔のPosterior Wall Blowout様現象がCTで確認できた場合、この現象がその後の膝関節の不安定性増悪や再断裂に関わる可能性があるが、画像上この現象を認めても、その後の経過で膝安定性や臨床スコアに有意な悪影響を与えず、ほとんどの例でその後に大腿骨骨孔の後壁の再構築が3DCTにて認められることが分かった。さらに今後、ACL再建後に再断裂を生じるリスクファクターについて一般的な幅広い項目を検討するためには、どうしても再断裂の症例数が多い必要がある。そのため当大学病院を中心にACL再建例についての多施設共同研究も同時に行っており、まず始めに半月板損傷発生のリスクファクターや術前主観的評価に影響を及ぼす因子について、ロジスティック回帰分析や重回帰分析を用いて検討した。その結果、内側半月板損傷発生のリスクファクターには術前患側Kneelax絶対値やPivot-shift testでのApprehensionなど、外側半月板損傷発生のリスクファクターには男性であることと下肢外反であることが挙がった。今後はこの研究内容についてさらに症例数を増やして再検討するとともに、当科での多項目の詳細な検討とは別に、多施設共同研究の症例においても本題であるACL再建後に再断裂を生じるリスクファクターの検討を開始する。本研究最初の1年間は追跡調査での結果がまだ出てこないため、初回ACL損傷のリスクファクターとしての脛骨プラトー形態評価を行った。またACL再建後に大腿骨孔のPosterior Wall Blowout様現象がCTで確認できた場合、この現象が術後の短期成績に影響を与えるものではないことも示した。この1年間で、ACL再建後の再断裂や機能不全に関与する可能性のある複数の項目について、ACL初回再建の約60例を調査することができた。さらに同時に進行している、当大学病院を中心としたACL再建例についての多施設共同研究では、術前評価項目と術中所見の比較について約300例を対象に評価を行い、半月板損傷発生のリスクファクターや術前主観的評価に影響を及ぼす因子を解明することができた。今後もそれぞれの研究において症例数を増やし、より詳細な評価を行っていく予定である。また2018年7月より、ナビゲーションシステムを用いた術中膝関節不安定性評価を16歳以上の全ての初回ACL再建例で行っている。ACL移植腱固定前と固定後において、幅広い屈曲角度での膝関節前方・回旋不安定性を術中に評価しており、この膝関節不安定性の定量評価が本研究課題の評価項目に加わった。
転写モーターの1分子可視化実時間計測法による解明

転写モーターは、DNA上を運動するとき1)RNA合成を伴う自走と、2)結合部位探索のための受動的な滑り拡散の2つの異なる機構を使い分けている。滑り拡散は近年、自走のみを行うとされてきた筋肉モーター蛋白質にも見い出され始めた。そこで、蛋白質の種類による滑り運動の同一性・多様性を解明する一助として、T7RNAポリメラーゼ酵素およびEco RI制限酵素のDNA上における分子動態を顕微鏡で観察した。酵素は、ヘパリン樹脂存在下で蛍光修飾することにより活性を保持した分子だけを光点として可視化した。DNAは、スライド上に作製した薄膜電極間で一直線状に伸長しかつ両端で固定した。可視化されたEco RIを伸長固定化DNAに注入したところ、(A)DNA上の特定位置に結合した分子、(B)DNAの伸長方向に沿って直線的に滑り運動する分子が観察された。A群について、Eco RI分子が結合した位置はDNA上のEco RIの認識配列が存在する場所と一致した。これはEco RIの特異的DNA複合体を可視化したものと考えられる。B群の中には、DNA上の移動途中に特定位置で停止するものが含まれており、停止位置はA群での結合位置と一致していた。これは、速度論的研究で想定されているEco RIが滑りながら認識配列を探索して結合を果たすというモデルを実証したものと思われる。分子の一部は認識部位で停止することなく滑り運動を続けたことから、Eco RIは認識配列を見過ごす可能性を見い出した。可視化T7RNAポリメラーゼ分子にもA群が観察され、転写モーターが運動初期に行うバイナリー複合体形成であると考えられる。RNA基質を添加したところ、RNA合成を示す自走は観察されなかった。これは、スライド表面とバイナリー複合体との吸着により転写運動が阻害されたためであると考えられる。そこで現在溝つき電極による解決を試みている。
家蚕の機能開発の発生工学的研究

カイコの貯蔵タンパク質および機能タンパク質7種を対象にその生理機能を考慮にいれながら、一次構造、遺伝子構造さらに遺伝子発現調節機構を研究した。貯蔵タンパク質に属するものとしては3種のタンパク質を取り上げた。1つはカイコ幼虫血清タンパク質(BmLSP)であり、このタンパク質の精製、一次構造の決定、さらに遺伝子構造の解析を完了した。さらに本遺伝子の発現がエクジステロイドで抑制されることを明らかにした。2番目は血清中に貯蔵される30Kタンパク質であり、本タンパク質の遺伝子構造を決定し、この発現調節に与るシスエレメントを検索した。その結果、多種遺伝子Bm1の上流域に位置していることが判明した。もう一つは貯蔵タンパク質1(SP1)であり、SP1遺伝子の発現調節のためのトランス要因を脂肪体の核分画から抽出し、S1マッピング法によって転写産物を定量した。その結果、トランス要因によるSP1遺伝子発現の活性化が証明された。機能タンパク質としてプロテアーゼインヒビターを取り上げ、この遺伝子構造とその発現調節を検討し、アンチトリプシン、アンチキモトリプシンの発現はエクダイソンと幼若ホルモンの両者によって調節されていることが判明した。アルドラーゼアイソザイムはカイコの胚発生期の後半で発現パターンが変化する。このスイッチの切り換えを明らかにするために両アイソザイムの精製を行った。ソルビトールデヒドロゲナーゼは休眠覚醒にともなって出現する。この出現は本酵素遺伝子の発現によることが転写物の定量実験から明らかにされた。カイコの精子に運動性を与える酵素が存在し、イニシアトリンと命名し、本酵素の精製を行い、cDNAの構造解析を進めた。ペプチドホルモンである前胸腺刺激ホルモン遺伝子の座位を第22連関群の2.7位と決定した。また休眠ホルモン遺伝子は第11連関群に座位することを明らかにした。カイコの卵特異タンパク質のcDNAをプロ-ブに用いて遺伝子のスクリ-ニングを行い,3個のクロ-ンを得た。塩基配列を2000個以上を決めた。5'側の上流域に68塩基の特異的な配列,ホルモン受容体結合配列,卵包細胞指定配列、が認められ、本遺伝子の発現調節に与っていると推察した。血清タンパク質とりわけ30KDaタンパク質ー1については遺伝子の構造が明らかにされた。このタンパク質はミクロビテリンと高い相同性を有していた。血中に一時的に蓄積される貯蔵タンパク質の遺伝子構造も明らかにされた。5'上流域にはホルモン受容タンパク質結合配列も存在しており、ホルモンによる発現調節が示唆された。プロテア-ゼインヒビタ-は生体防御の面からも注目されるようになり、プロテア-ゼ研究とならんで重要性が確認されてきている。カイコの体液中には大別して2型6種類のインヒビタ-が存在していた。このうちアンチトリプシンの完全鎖長cDNAをクロ-ンし,またアンチキモトリプシンインヒビタ-についても部分鎖長cDNAを得た。得られたアミノ酸配列を他の動物のものと比較したところ,C末端側にのみそれぞれの分子の特異性が認められた。NADーソルビト-ルデヒドロゲナ-ゼに対する抗体を得,脂肪体mRNAを用いてeDNAライブラリ-を作成し,全鎖長のcDNAクロ-ンを得た。アミノ酸配列は哺乳動物の肝臓ソルビト-ルデヒドロゲナ-ゼのものとよく類似していた。イニシアトリンを精製し,その特異抗体を作成した。また種々の外来遺伝子の導入のために初期発生卵への注射方法を検討し,注射時期ならびに注射後の保護方法を確立した。カイコ幼虫には蛹や成虫などには検出されない血清タンパク質が存在することが発見され,BmLSPと命名された。

このタンパク質の単離し構造をcDNAから決めた。cDNAを用いてBmLSPの遺伝子を同定し、遺伝子発見を促進する部位の構造を決めた。血清中には強力なキモトリプシンインヒビタ-が存在している。このインヒビタ-のcDNAを単離し組織ならびに発育時期特異的な遺伝子発現機構を推定した。幼若ホルモンによる発現調節は新規な発見であった。カイコが蛹に変態する時期には多量の貯蔵タンパク質の合成が始まる。貯蔵タンパク質のうちで30KPと呼ばれるタンパク質の遺伝子は染色体上に分散して存在し、その発現調節位はそれぞれの遺伝子の上流域の限られた塩基配列によっていることが判明した。アルドラ-ゼはエネルギ-代謝調節系上での鍵酵素であり、多くのアイソザイムが存在している。カイコの胚発生の過程でも酵素型の変換が認められた。両アイソザイムタンパク質を精製し、それぞれの抗体を作成した。ソルビト-ルデヒドロゲナ-ゼは卵休眠の代謝変動とのかかわりで興味ある酵素である。本酵素の遺伝子をcDNAから単離し、その構造解析を行った。その結果.10kbp以上のかなり大きな遺伝子であり、七個のイントロンを有していることが判明した。イニンアトリンは1種のプロテア-ゼであり、精子の活性化に与かっている。精包からイニシアトリンを精製し、その抗体を作成した。ウエスタ-ンブロッティングによって本タンパク質は成虫羽化前から出現し、交尾によって雌個体に移動することが判明した。FISH法によって数種のカイコの遺伝子の座位を決めることに成功した。カイコの貯蔵タンパク質および機能タンパク質7種を対象にその生理機能を考慮にいれながら、一次構造、遺伝子構造さらに遺伝子発現調節機構を研究した。貯機タンパク質に属するものとしては3種のタンパク質を取り上げた。1つはカイコ幼虫血清タンパク質(BmLSP)であり、このタンパク質の精製、一次構造の決定、さらに遺伝子構造の解析を完了した。さらに本遺伝子の発現がエクジステロイドで抑制されることを明らかにした。2番目は血清中に貯蔵される30Kタンパク質であり、本タンパク質の遺伝子構造を決定し、この発現調節に与るシスエレメントを検索した。その結果、多種遺伝子Bm1の上流域に位置していることが判明した。もう1つは貯蔵タンパク質1(SP1)であり、SP1遺伝子の発現調節のためのトランス要因を脂肪体の核分画から抽出し、S1マッピング法によって転写産物を定量した。その結果、トランス要因によるSP1遺伝子発現の活性化が証明された。機能タンパク質としてプロテアーゼインヒビターを取り上げ、この遺伝子機構造とその発現調節を検討し、アンチトリブシン、アンチキモトリブシンの発現はエクダイソンと幼若ホルモンの両者によって調節されていることが判明した。アルドラーゼアイソザイムはカイコの胚発生期の後半で発現パターンが変化する。このスイッチの切り換えを明らかにするために両アイソザイムの精製を行った。ソルビトールデヒドロゲナーゼは休眠覚醒にともなって出現する。
セラミックス焼結過程の高分解能その場観察技術の開発

セラミックス材料の焼結や粒成長などの高温における素過程については、未だ多くのことが明確になっていない。本研究では、高温TEMその場観察法と高分解能電子顕微鏡法を組み合わせて、セラミックスの高温現象の素過程を動的に明らかにすることを目的としている。まず、TEM-CCDカメラとビデオシステムをTEM本体に組み込み、高温加熱ステージの高温安定性および温度補正法について検討し、その場観察の最適条件を見出した。次に、粉末試料を高温で安定に保持するための支持体の材質・形状を検討した結果、Ta製穴あきディスクあるいはW製ワイヤーが優れていることが分かった。以上の実験条件の検討を基に、ジルコニアとアルミナ粉末の高温その場実験を実施した。その際、各試料の状態を室温から1600°Cまで連続的に観察し、記録はビデオシステムを用いて行った。ジルコニア、アルミナともに連続的に粒成長・合体していく様子が明瞭に観察された。ジルコニアでは表面の数原子層が集団で運動する過程が観察されたが、これは表面拡散に対応するものと考えられる。また、ジルコニアに微量のシリカを添加した系についての高温観察も行った。その結果、約1000°Cでジルコニアとシリカは反応し、大部のシリカはジルコニア中に固溶して消失する現象が観察された。この試料を冷却すると約600°Cでジルコニア粉末表面からシリカ膜の析出が観察された。従来ジルコニアとアルミナは固溶しない系とされてきたが、今回の結果はジルコニアの極表面部においてシリカは固溶可能であることを示唆している。この結果は、シリカ添加ジルコニアの粒界において数nmのSi偏析相が存在するという高分解能観察・EDS分析の結果と一致する。また、粒界のEELS測定とSiの固溶をモデルとした分子軌道法の計算結果の比較もSiがジルコニア中に固溶していることを示した。以上のように、本手法によって、従来は不明であった幾つかのセラミックスの高温現象の素過程が明らかになった。今後、本手法をさらに種々の系に適用していくことによって、多くの不明確な高温現象が解明されることが期待される。
乳癌術後乳房再建における多角的検討 -QOLと費用対効果分析-

(目的)2006年4月から乳癌術後乳房再建術が保険適応となり、今後ますます増加傾向を示すものと思われる。しかし、乳房再建においても様々な問題点が山積しており、今後の動向を探る上でも現状を把握することが重要と思われる。そこで、乳癌術後乳房再建の現状を把握し、数量化することによりその特色と課題を知り、今後の方向性に資することを目的として形成外科医と乳腺外科医を対象としたアンケートによる実態調査を実施した。(方法)2007年1月に郵送によるアンケート調査を実施した。対象は、全国の日本形成外科学会認定施設、教育関連施設(322施設)および全国の日本乳癌学会認定施設、教育関連施設(609施設)とし、アンケート項目は、病院のプロフィール、乳癌治療の診療実態、乳房再建の診療実態、一期的乳房再建の診療実態、二期的乳房再建の診療実態、今後の乳房再建のあり方に関する内容とした。(結果)形成外科医の回答は322施設中212施設より得られ、回収率は65.8%であった。乳腺外科医の回答は609施設中356施設より得られ、回収率は58.5%であった。形成外科医と乳腺外科医の乳房再建に関する関心度はそれぞれ95.8%、98%であり、その高さが示された。しかし、関心度の高さが実施率には反映されておらず、実施率の低さは一期再建・二期再建とも際だっていた。この調査の結果は形成外科関連と乳癌関連雑誌に投稿し、2008年に掲載された。(考察)形成外科医と乳腺外科医にとって乳房再建は非常に興味深い分野であり、実施したいと考える医師も多いが、それを行うためのハードルも高いことが明らかとなった。それを乗り越えるために、乳腺外科と形成外科のチーム医療を行うことがお互いの共通認識として最重要課題であることが判明した。今後は乳房再建術後患者の再発率の問題や費用対効果分析などについて更なる研究を行いたい。乳癌術後の乳房再建は2006年4月から新たに保険適応となり、今後全国的に普及することが予想される。そこで、一期的乳房再建に対する診療実態及び意識調査のために、日本形成外科学会認定施設及び関連施設に対して郵送によるアンケート調査を実施した。アンケート内容は一期的乳房再建の是非を含む意識調査、現在の乳癌手術及び再建手術の詳細な実施状況に関する調査である。再建手術を実施していない施設では、実施しない理由についても調査を行い、形成外科医側からの乳房再建術に関する問題点を明らかにした。また、日本乳癌学会認定施設及び関連施設に対しても同様なアンケート調査を行い、乳腺外科医側の再建術に対する診療実態及び意識調査も行った。そして、乳腺外科医側からの乳房再建術に関する問題点を明らかにした。アンケート調査の結果は集計して、今後どのような条件が整えば一期的乳房再建が正しく普及するかについて検討した。また、平成18年に同一術者が行った乳癌術後乳房再建術は101例であり、総数は530例を超える数となった。乳房再建手術の内訳は、有茎腹直筋皮弁、下腹壁動脈穿通枝皮弁、広背筋皮弁、tissue expander+人工乳房の4種類であり、乳癌術式の内訳は、乳房温存手術、胸筋温存乳房切除術、Skin-sparing mastectomyの3種類である。それぞれの組み合わせに対する効果指標として、乳癌学会研究班で考案した"乳房の整容性に関する評価法"を指標として用いて、効果判定を行った。

その結果は日本形成外科学会や日本乳癌学会などでシンポジウムや一般演題として報告した。また、学会誌にも乳房再建術の論文として報告した。(目的)2006年4月から乳癌術後乳房再建術が保険適応となり、今後ますます増加傾向を示すものと思われる。しかし、乳房再建においても様々な問題点が山積しており、今後の動向を探る上でも現状を把握することが重要と思われる。そこで、乳癌術後乳房再建の現状を把握し、数量化することによりその特色と課題を知り、今後の方向性に資することを目的として形成外科医と乳腺外科医を対象としたアンケートによる実態調査を実施した。(方法)2007年1月に郵送によるアンケート調査を実施した。対象は、全国の日本形成外科学会認定施設、教育関連施設(322施設)および全国の日本乳癌学会認定施設、教育関連施設(609施設)とし、アンケート項目は、病院のプロフィール、乳癌治療の診療実態、乳房再建の診療実態、一期的乳房再建の診療実態、二期的乳房再建の診療実態、今後の乳房再建のあり方に関する内容とした。(結果)形成外科医の回答は322施設中212施設より得られ、回収率は65.8%であった。乳腺外科医の回答は609施設中356施設より得られ、回収率は58.5%であった。形成外科医と乳腺外科医の乳房再建に関する関心度はそれぞれ95.8%、98%であり、その高さが示された。しかし、関心度の高さが実施率には反映されておらず、実施率の低さは一期再建・二期再建とも際だっていた。この調査の結果は形成外科関連と乳癌関連雑誌に投稿し、2008年に掲載された。(考察)形成外科医と乳腺外科医にとって乳房再建は非常に興味深い分野であり、実施したいと考える医師も多いが、それを行うためのハードルも高いことが明らかとなった。それを乗り越えるために、乳腺外科と形成外科のチーム医療を行うことがお互いの共通認識として最重要課題であることが判明した。今後は乳房再建術後患者の再発率の問題や費用対効果分析などについて更なる研究を行いたい。
ナノ構造非晶質半導体における量子効果の研究

本研究では,人工的なナノ構造をもつ非晶質シリコン系膜であるa-Si_<1-x>N_x : Hバンド端変調構造膜ならびにa-Si : H/a-Si_<1-x>N_x : H超格子膜について,フォトルミネッセンスの寿命分布の測定を行い,電子状態や再結合過程に対する量子効果や閉じ込め効果について調べた.低温(11K)での励起光強度依存性の測定結果は,1.励起光強度の増加とともに短寿命側へのシフトが観測されるノンジェミネート再結合の特徴をもつもの2. 1ms付近にピークをもち励起光強度が増加しても寿命分布に変化がなく3重項励起子による発光と考えられるものに分けることができる.1.の結果は,バルクのa-Si : H膜,井戸層幅の広いa-Si : H/a-Si_<1-x>N_x : H超格子膜に対して,2.の結果は,a-Si_<1-x>N_x : H膜,a-Si_<1-x>N_x : Hバンド端変調構造膜,井戸層幅の狭いa-Si : H/a-Si_<1-x>N_x : H超格子膜に対して観測された.3重項励起子による発光が起こっているとみられる試料について寿命分布の温度依存性の測定を行った.窒素を多く含むバルクa-Si_<1-x>N_x : H膜では誘電率が小さくなり,電子正孔間のクーロン力が強いために,温度100Kでも1msの寿命の成分が残っており,高い温度でも励起子が安定になることを示す結果が得られた.井戸層幅の狭いa-Si : H/a-Si_<1-x>N_x : H超格子膜や周期長の短いa-Si_<1-x>N_x : Hバンド端変調構造膜では電子正孔閉じ込め効果が期待されるが,このような試料でも100Kで1msの寿命の成分が残っており,このことは励起子が2次元的になり,その基底状態が深くなって安定になることを示している.以上のように,ナノ構造非晶質シリコン系半導体において,3重項励起子の発光が起こること,閉じ込め効果により3重項励起子が2次元的になることが明らかにされた.本研究では,人工的なナノ構造をもつ非晶質シリコン系膜であるa-Si_<1-x>N_x : Hバンド端変調構造膜ならびにa-Si : H/a-Si_<1-x>N_x : H超格子膜について,フォトルミネッセンスの寿命分布の測定を行い,電子状態や再結合過程に対する量子効果や閉じ込め効果について調べた.低温(11K)での励起光強度依存性の測定結果は,1.励起光強度の増加とともに短寿命側へのシフトが観測されるノンジェミネート再結合の特徴をもつもの2. 1ms付近にピークをもち励起光強度が増加しても寿命分布に変化がなく3重項励起子による発光と考えられるものに分けることができる.1.の結果は,バルクのa-Si : H膜,井戸層幅の広いa-Si : H/a-Si_<1-x>N_x : H超格子膜に対して,2.の結果は,a-Si_<1-x>N_x : H膜,a-Si_<1-x>N_x : Hバンド端変調構造膜,井戸層幅の狭いa-Si : H/a-Si_<1-x>N_x : H超格子膜に対して観測された.3重項励起子による発光が起こっているとみられる試料について寿命分布の温度依存性の測定を行った.窒素を多く含むバルクa-Si_<1-x>N_x : H膜では誘電率が小さくなり,電子正孔間のクーロン力が強いために,温度100Kでも1msの寿命の成分が残っており,高い温度でも励起子が安定になることを示す結果が得られた.井戸層幅の狭いa-Si : H/a-Si_<1-x>N_x : H超格子膜や周期長の短いa-Si_<1-x>N_x : Hバンド端変調構造膜では電子正孔閉じ込め効果が期待されるが,このような試料でも100Kで1msの寿命の成分が残っており,このことは励起子が2次元的になり,その基底状態が深くなって安定になることを示している.以上のように,ナノ構造非晶質シリコン系半導体において,3重項励起子の発光が起こること,閉じ込め効果により3重項励起子が2次元的になることが明らかにされた.a-Si_1-_χN_χ:Hの窒素の組成χを膜の堆積方向に周期的に変調した、人工的なナノ構造をもつバンド端変調構造膜について、温度を11Kから150Kの間で変化させ、チョップした励起光に対して位相の90度ずれたフォトルミネッセンスの成分をロックイン検出する周波数分解スペクトルの測定を行い、電子、正孔の寿命の分布を調べた。

a-Si:H膜では励起光強度が強くなると、non-geminate再結合が支配的になり寿命の分布は短寿命側にシフトすることが知られており、本研究でも同様の結果を確認したが、バンド端変調構造膜では今回測定した励起光強度の範囲では寿命の分布に顕著な変化はみられなかった。このことからバンド端変調構造膜では、a-Si:H膜に比べて、強い励起光強度でも、non-geminate再結合が支配的にならず、geminate-pairまたは三重項励起子による発光が起こることが示唆された。また、温度が上昇すると、a-Si:H、a-Si_1-_χN_χ:Hのバルク膜、バンド端変調構造膜とも寿命分布は短寿命側にシフトするが、バンド端変調構造膜のうち変調周期の短いものはその変化が少ないことが確認された。この結果と電子、正孔の変調ポテンシャルへの閉じ込め効果や量子サイズ効果との関連を現在検討中である。また、バンド端変調構造膜について、ラマン散乱の測定を行った結果、バルクの窒素合金膜と同様のスペクトルが得られている。このほか、バンド端変調構造膜について、AFMによる観察を行い、表面の構造について情報が得られている。本研究では,人工的なナノ構造をもつ非晶質シリコン系膜であるa-Si_<1-x>N_x:Hバンド端変調構造膜ならびにa-Si:H/a-Si_<1-x>N_x:H超格子膜について,フォトルミネッセンスの寿命分布の測定を行い,電子状態や再結合過程に対する量子効果や閉じ込め効果について調べた.低温(11K)での励起光強度依存性の測定結果は,1.励起光強度の増加とともに短寿命側へのシフトが観測されるノンジェミネート再結合の特徴をもつもの2.1ms付近にピークをもち励起光強度が増加しても寿命分布に変化がなく3重項励起子による発光と考えられるものに分けることができる.3重項励起子による発光が起こっているとみられる試料について寿命分布の温度依存性の測定を行った.窒素を多く含むバルクa-Si:H膜では誘電率が小さくなり,電子正孔間のクーロン力が強いために,温度100Kでも1msの寿命の成分が残っており,高い温度でも励起子が安定になることを示す結果が得られた.井戸層幅の狭いa-Si:H/a-Si_<1-x>N_x:H超格子膜や周期長の短いa-Si_<1-x>N_x:Hバンド端変調構造膜では電子正孔閉じ込め効果が期待されるが,このような試料でも100Kで1msの寿命の成分が残っており,このことは励起子が2次元的になり,その基底状態が深くなって安定になることを示している.以上のように,ナノ構造非晶質シリコン系半導体において,3重項励起子の発光が起こること,閉じ込め効果により3重項励起子が2次元になることが明らかにされた.
チョムスキー理論における完全解釈の原理を逸脱した文の文法性判断

Chomskyの生成文法理論における完全解釈の原理は母語話者の言語知識に帰属される.一方で,この理論は言語使用モデルに組み込まれるとも主張される.前者は理想的言語知識上での分析による主張であり,後者は実際の言語話者についての経験的主張である.この矛盾に対し,本研究では,完全解釈の原理を逸脱した非文法的な日本語単文(主として二重目的語構文)を材料にして,この原理の心理的実在性を検討することで母語話者の実際の言語知識状態を把握しようとした.その結果,以下のことが明らかになった.1.この原理を逸脱した非文であっても完全に非文法的であると判断されることはなく,むしろ中程度に文法的であると判断された(但し,文法性の判断は,逸脱が二重目的語構文のどの項に生じるかによっても異なる).2.逸脱項に句読法をかけると非文の文法性判断値が上昇した.3.二重目的語構文の語順を基本構文から変形構文に変えると文法性判断値は減少した.また,変形構文においては,逸脱項に強調をかけると文法性判断値が増大した.以上の結果は,母語話者の文法性判断が種々の実験的操作によって変化し,悉無的に適用されるはずの完全解釈の原理に従っていないことを示している.この事実は,完全解釈の原理の心理的実在性について疑義を提示するものであり,したがって,母語話者の「実際の言語知識」と言語学者の論じる「抽象的な言語知識」との間に大きな間隙があることを示唆する.Chomskyの生成文法理論における完全解釈の原理は母語話者の言語知識に帰属される.一方で,この理論は言語使用モデルに組み込まれるとも主張される.前者は理想的言語知識上での分析による主張であり,後者は実際の言語話者についての経験的主張である.この矛盾に対し,本研究では,完全解釈の原理を逸脱した非文法的な日本語単文(主として二重目的語構文)を材料にして,この原理の心理的実在性を検討することで母語話者の実際の言語知識状態を把握しようとした.その結果,以下のことが明らかになった.1.この原理を逸脱した非文であっても完全に非文法的であると判断されることはなく,むしろ中程度に文法的であると判断された(但し,文法性の判断は,逸脱が二重目的語構文のどの項に生じるかによっても異なる).2.逸脱項に句読法をかけると非文の文法性判断値が上昇した.3.二重目的語構文の語順を基本構文から変形構文に変えると文法性判断値は減少した.また,変形構文においては,逸脱項に強調をかけると文法性判断値が増大した.以上の結果は,母語話者の文法性判断が種々の実験的操作によって変化し,悉無的に適用されるはずの完全解釈の原理に従っていないことを示している.この事実は,完全解釈の原理の心理的実在性について疑義を提示するものであり,したがって,母語話者の「実際の言語知識」と言語学者の論じる「抽象的な言語知識」との間に大きな間隙があることを示唆する.Chomskyの完全解釈の原理を逸脱した日本語二重目的語構文(単文)を用いてこの原理の心理的実在性を検討した.その結果,母語話者の文法性判断はChomsky理論が予測する悉無律に従わず,種々の文型操作によって影響を受けることが判明した.この事実は,この理論が想定する母語話者の言語知識が実際の母語話者のそれと異なることを示唆する.実験1(発表論文1)文法的に正しい構文(例えば,総理が(S)各大臣に(D)指示を(O)与えた(V))における各項に不必要な項を追加して非文を作った.併せて,この追加項ともともとの項(以下,先置項)との関連性(追加項なし;追加項が先置項を限定・明示する;追加項と先置項が平行関係にある)を実験的に統制して,それぞれの文型に対する文法性判断を7段階評定で求めた.その緒果,(1)文法性判断は追加項のない文では高い判断値が得られたが,(2)非文の判断値は悉無律的になされす,文型操作によって違いが生じた.つまり,日本語話者はこの原理を逸脱した文を全くの非文として排斥することはなかった.実験2(発表論文1)目的格を2個含む点で完全解釈の原理を逸脱している文(例えば,「山下が戦後史を研究をしている」)を文法的な文(「山下が戦後史を研究している」)と比較した.その結果,非文の平均判断値は5を超え,文の判断値(6.68)との差が小さくなった.実験3(発表論文2)実験1の判断値を高めるため関連性要因の操作に修正を加えて同様の実験を行った.その結果,判断値は7段階評定で平均3レベルまで高まった.Chomskyの完全解釈の原理を逸脱した日本語二重目的語構文(単文)を用いて,この原理の心理的実在性を検討した.句読法や強調,語順を統制した結果,母語話者の文法性判断はChomsky理論が予測する悉無律に従わず,これらの統制変数の影響を受けることが判明した.この事実は,この理論が想定する母語話者の言語知識が実際の母語話者のそれと異なることを示唆する.(発表論文

1)たとえば,「社長が会社のトップが部下に指示を与えた」において,解釈不能な付加項(「会社のトップが」)を句読法(コンマ)で囲まない場合と囲む場合(「社長が,会社のトップが,部下に指示を与えた」)とで文法性判断を比較した.両文型はいずれも完全解釈の原理を逸脱しているにもかかわらず,コンマで囲まれた文型は囲まれない文型に比べて文法性判断値が上昇した.この現象は,付加項の文法的役割(主語,間接目的語,直接目的語)とは無関係に生じた.(発表論文2)1.「社長が社長が部下に指示を与えた」のように付加項(2番目の「社長が」)が正規項(1番目の「社長が」)の反復であるような文型を用いた.この付加項に強調を加えた場合(「社長が社長が部下に指示を与えた」)と加えない場合(アンダーラインを欠く)とで比較したが,両文型の文法性判断に差はなかった.2.「指示を部下に社長が社長が与えた」と「指示を部下に社長が社長が与えた」と語順を変えて検討した.この操作によって,同時に,文法性判断に及ぼす原因が付加項の文法的役割(主語,直接目的語)にあるのか,あるいは語順にあるのかも検討した.その結果,(1)後者の文型で強調の効果が得られた,(2)両文型において,付加項が直接目的語である場合の文法性判断値が主語である場合に比べ高かった,(3)後者の文型が前者の文型に比べ文法性判断値が低かった.
哺乳類概日時計の位相調節関連タンパク質のプロテオーム解析による検索

本研究では、哺乳類の脳内時計中枢である視交叉上核由来の細胞株を用いて、体内時計の時刻同調(時計の針の時刻合わせ)機構に関与するタンパク質の検索を試みた。時計の針を動かす薬剤刺激を与えたときに発現量が変化するタンパク質を検索し、得られたタンパク質の機能阻害実験をおこなったところ、時刻同調機構に関与する可能性があるタンパク質を複数種類得ることができた。体内時計の入力系メカニズムの解明に結びつく発見となった。環境サイクルの変化に対して位相を時刻依存的に同調(前進または後退)させることは、概日時計のもつ必須機能のひとつである。概日時計の発振機構が分子レベルでかなり明らかにされているのにくらべて、位相調節機構に関しては解明が進んでいない。哺乳類の脳内時計中枢である視交叉上核(SCN)由来の細胞株の概日リズムの位相は、forskolin刺激によって時刻依存的に前進もしくは後退することが知られている。この現象は、新たな遺伝子の転写及び翻訳が必要とされる、光刺激に対してSCNが示す位相変位応答と類似している。そこで本研究では、forskolinによりSCN由来細胞株の位相変位を誘導したときに、時刻特異的に発現変動を示すタンパク質の同定を、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動解析システムを使用した高解像度のプロテオーム解析により試みた。その結果、観察した約4400個のタンパク質スポットのうち、約230個のスポットがforskolin刺激により発現量の変化を示した。質量分析による固定をおこなったところ、発現変動を示すタンパク質スポットは約50種類のタンパク質に対応することがわかった。これらのタンパク質の内訳は以下のようになった:細胞骨格系、情報伝達系、代謝系酵素、タンパク質分解系、タンパク合成系、膜輸送系、ヒートショックタンパク質、抗酸化系など。現在は、siRNAを用いたRNA1法により、上記タンパク質の機能阻害が概日時計の制御機構(概日リズムの振幅や周期、位相変位応答)に与える影響を観察している。そして今後は、これらの実験結果に基づき、細胞レベルでの概日リズム形成に機能を有することが予測される因子についてさらなる機能解析を進め、概日時計の時刻同調機構の解明を目指す。本研究では、「哺乳類の脳内時計中枢である視交叉上核(SCN)由来の細胞株を用いて、プロテオーム解析によって概日時計の位相調節機構関連タンパク質を包括的に検索し、哺乳類概日時計の未知の入力系を発見すること」を目標とした。今回実験対象としたラットSCN由来細胞株の概日リズムの位相は、forskolin刺激によって時刻依存的に前進もしくは後退することが知られている。そこで先ず、forskolin刺激によりSCN由来細胞株の位相変位を誘導したときに、発現変動を示すタンパク質の同定を、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動解析システムを使用した高解像度のプロテオーム解析により試みた。その結果、観察した約4400個のタンパク質スポットのうち、約230個のスポットが位相変位刺激により発現量の変化を示した。質量分析による同定をおこなったところ、発現変動を示すスポットは約50種類のタンパク質に対応することがわかった。次に、同定されたタンパク質のうち、情報伝達系やタンパク質分解系など、位相調節機構に関与する可能性があると推測された約20種類ものに対して、対応遺伝子のsiRNAをデザインし、機能ノックダウン実験をおこなった。すると、興味深いことに、Dyncli2、Ubal、Zyxinの、3つのタンパク質では、機能阻害により、位相変位応答能が大きく低下することがわかった。現在は、上記の位相調節機構関連タンパク質候補が概日時計の制御機構にどのように関与しているかを、分子レベルで精力的に解析している。
飲酒の抗血栓作用に関連する血小板TRPチャネルの分子機構

アルコールによる血小板機能抑制機序の詳細は不明である。本研究では、血小板の容量性Ca2+流入(CCE:capacitativecalciumentry)およびジアセルグリセロール(DG)依存性のCa2+流入および凝集におよぼすエタノール及びメタノールの影響について検討した。エタノールによる血小板凝集抑制作用は刺激の種類によらず非特異的に認められ、SFP変法による全血凝集においても同様の結果が得られた。一方、エタノールはCCE及びDG依存性Ca2+流入へは相反する作用を示し、トロンビンによる生理的血小板活性化機構へのエタノールの作用にはこれら両者が関与することが示唆された。一方、メタノールはCCE及びDG依存性Ca2+流入、thrombin刺激時のCa2+流入のいずれにおいても影響を及ぼさなかった。しかしながら、メタノール添加によりthrombin刺激による血小板凝集は有意に亢進した。[目的]アルコールによる血小板機能抑制機序の詳細は不明である。本研究では、血小板の容量性Ca^<2+>流入(CCE : capacitative calcium entry)およびジアセルグリセロール(DG)依存性のCa^<2+>流入および凝集におよぼすエタノールの影響について検討した。[方法]洗浄血小板を用いて血小板内Ca^<2+>濃度および血小板凝集能を測定した。血小板刺激剤としてCa^<2+>-ATPase阻害剤であるthapsigargin及びDGアナログである1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol(OAG)を用い、また生理的アゴニストとしてthrombinを用いた。さらにCCEの受容体拮抗剤であるSKF-96365の影響も検討した。[結果]thapsigargin刺激によるCCEおよびそれに伴う血小板凝集は0.5%以上のエタノールにより抑制された。一方、DG依存性Ca^<2+>流入およびそれに伴う血小板凝集は0.5%以上のエタノールにより増強された。thrombin刺激によるCa^<2+>流入はエタノール(0.5-2%)前処置により有意な変化を示さなかったが、thrombin刺激時の血小板凝集は0.5%以上のエタノールにより抑制された。SKF-96365処置によるCCE抑制下での血小板のthrombin刺激にによるCa^<2+>流入はエタノール(0.5-2%)により有意に増強された。[結論]エタノールによる血小板凝集抑制作用は刺激の種類によらず非特異的に認められた。一方、エタノールはCCE及びDG依存性Ca^<2+>流入へは相反する作用を示し、トロンビンによる生理的血小板活性化機構へのエタノールの作用にはこれら両者が関与することが示唆された。[目的]同じアルコール類であるエタノールとメタノールではその生理的意義はまったく異なる。これらのアルコール類の血小板への効果の比較はまだ報告されておらず、今回我々は血小板凝集およびカルシウム流入機能へのエタノール及びメタノールの影響について検討を行った。[結果]thapsigargin刺激で惹起されたcapacitativeCa^<2+>entry(CCE)はエタノール(0.5-2%)の添加により濃度依存的に有意に抑制され、血小板凝集は0.5%以上のエタノールの添加によって有意に抑制された。逆にOAGによるDG依存性Ca^<2+>流入はエタノール(0.5-2%)の添加により濃度依存的に有意に増強され、血小板凝集はエタノール(0.5-2%)の添加により濃度依存的に抑制された。thrombin刺激により惹起されたCa^<2+>流入はエタノール(0.5-2%)の添加により有意な変化を示さず、血小板凝集はエタノール(0.5-2%)の添加により有意に抑制された。メタノール(0.5-2%)添加によりthrombin刺激による血小板凝集は亢進したが、CCE及びDG依存性Ca^<2+>流入には影響を及ぼさず、thrombin刺激時のCa^<2+>流入もメタノールの影響を受けなかった。[結論]エタノールによる血小板凝集抑制作用は刺激の種類によらず認められた。一方、エタノールはCCE及びDG依存性Ca^<2+>流入へは相反する作用を示し、トロンビンによるCa^<2+>流入には影響を及ぼさなかった。またメタノールによりCa^<2+>流入はその流入経路に係らず影響を受けず、メタノールはCa^<2+>

流入に非依存性の血小板凝集亢進作用を有する可能性が示唆された。[目的]血小板でのアルコールの作用は明らかでない。我々は、4種類の血小板凝集惹起剤を用いて異なる血小板活性化経路へのアルコールの影響について検討を行った。[結果]従来法ではthrombin濃度が0.2 U/ml以上で凝集が認められ、エタノールは血小板凝集を抑制した。一方、全血凝集測定では、エタノールによる血小板凝集抑制はthrombin濃度が0.05 U/mlから認められた。さらに全血凝集では、thapsigarginによるCCEを介する凝集で、エタノールは比較的低濃度(0.5%)から著明な血小板凝集抑制効果を示したのに対し、OAGによるDG依存性カルシウム流入による血小板凝集では、エタノールは高濃度(2%)においてもその抑制効果は軽度であった。thrombin及びADPによる凝集に対するエタノールの抑制効果の程度は、thapsigargin凝集とOAG凝集の場合に見られた抑制効果のほぼ中間のレベルであった。[結論]エタノールは血小板凝集を抑制した。全血凝集は血小板凝集の検出感度が優れていた。さらに、thapsigarginとOAGによる凝集では、エタノールの影響に差が認められたことより、血小板活性化経路の差異によりエタノール感受性が異なる可能性が示唆された。種々の活性化シグナルによって、エタノールの影響がそれぞれ異なった反応を示し、それが異なったTRPチャネルを介することが示唆されたと言う結果を得る事が出来た事は、本研究にとって大きな進展であると考える。メタノール等の他のアルコール類での反応についても学会報告を行ったが、興味深い結果が得られているので、さらにこの成果を発展させるべく研究を継続したい。24年度が最終年度であるため、記入しない。メタノールの血小板活性化に対する影響はエタノールと異なり、その活性化シグナルによる差異を示さなかった。メタノールの血小板に対する影響は現在まで報告がなく、研究の継続により薪知見を得る事が出来ると考えている。血小板凝集に対する影響についての検討はまだ不十分であるため、これらについても継続して研究を行いたい。さらに血小板活性化に対して他のアルコール類についても検討を行い、TRPチャネルへの影響を含め、血小板活性化シグナル及びそれに伴う血小板凝集能に対する体系的な影響を検討できればと考えている。