hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Foxp3遺伝子多型と細胞内シグナル解析による臓器移植の制御性T細胞応答の解明

制御性T細胞は拒絶時の抗ドナー免疫応答の抑制に寄与する細胞で、FOXP3はその機能的マスター遺伝子でありpolymorphismが存在する。本研究では、Foxp3遺伝子多型の同種異系(アロ)T細胞応答への影響について解析を行った。成果として、Foxp3遺伝子多型は、肝臓移植における、急性拒絶反応発症に伴うステロイド治療への感受性との相関を認め、臓器移植における個別化医療を行う上での有用なゲノム情報となり得る可能性を得た。本研究は、臓器移植においてアロT細胞応答の個体差に制御性T(Treg)細胞の制御機能がいかに関連するかを解明するために、Treg細胞のマスター遺伝子であるFoxp3の一塩基多型(SNP)と拒絶反応やウイルス性肝炎および移植後発がんとの関連を解析し、移植後の個別化免疫制御法を行う上で、Foxp3が重要なゲノム情報となり得るかを明らかにすることを目的とする。肝臓移植後早期においては、Foxp3-SNPは急性拒絶反応の発症率に関与を認めなかったが、拒絶反応の強度に関与していることを見出した。またHBV関連肝移植において、Rs3761548のCCは、HBV関連肝硬変症例に多く、A cariierでは劇症肝炎症例が多いことがわかった。HBV関連肝硬変のCCタイプは1か月以内の急性拒絶反応発症率が低率で、免疫抑制剤離脱可能な症例が存在した。以上から、HBV関連肝移植の予後にFoxp3-SNPが関与する可能性が示唆された。臨床肝移植および腎移植症例におけるFoxp3-SNP解析と術後早期における臨床解析はほぼ予定通り実施し得た。その結果肝移植後早期における急性拒絶反応に対する治療応答性にFoxp3-SNPが関与している可能性を得た。また、B型ウイル性肝炎肝移植の予後への影響を確認した。腎臓移植では、早期での拒絶反応発症が少なく、SNPによる影響を解析するのが困難であった。健常人ボランティア末梢血を用いたIL-2および抗CD3抗体によるTreg誘導アッセイによるFoxp3-SNPの個体差を評価したが、この系においてはSNPの関与を示唆し得なかったため、リンパ球混合試験によるアロ応答性でのTregの誘導および抑制能評価での解析が必要である。本研究は、臓器移植においてアロT細胞応答の個体差に制御性T(Treg)細胞の制御機能がいかに関連するかを解明するために、Treg細胞のマスター遺伝子であるFoxp3の一塩基多型(SNP)と移植後の拒絶反応、ウイルス性肝炎、発がん等との関連性を解析し、移植後の個別化免疫抑制療法を行う上で、Foxp3-SNPが有益なゲノム情報となりうるかを明らかにすることを目的とする。これまでの研究において、Foxp3の3種類のSNP(Rs3761547, Rs3761548, Rs2232365)の解析を肝臓移植、腎臓移植症例に行った。肝臓移植後の細胞性拒絶反応(ACR)において、FOXP3rs3761548のSNPによるACR発症との関連性は認めなかったが、FOXP3 rs3761548 A/C+A/A genotypeは、C/C genotypeに比べて有意にステロイド抵抗性拒絶反応の発症率が高いことを確認した。また、ACR発症例における術後1か月目のドナー特異的抗体産生(DSA)の発症頻度は、C/C genotypeで20%であったのに対し、A/C+A/A genotypeでは80%と高く、de novo DSAの発生にFOXP3-SNPの影響が示唆されることを確認した。Rs3761547やRs2232365と臨床所見との関連性および相乗効果は認めなかった。また健常人ボランティア末梢血を用いたHLAミスマッチ間や、移植後末梢血を用いたリンパ球混合試験によるアロ応答性において、FOXP3-SNPによるアロT細胞応答性やTreg細胞の存在比率には有意差は認めず、拒絶反応時におけるTreg誘導や機能に本SNPが関与している可能性が考えられた。臨床臓器移植における解析は順調に進行している。今回、新たにステロイド感受性とFOXP3遺伝子多型との関連性が示唆される結果を得たため、関連性についての基礎実験を計画している。移植後の経時的アロT細胞応答と血清サイトカイン評価を行った結果、術後2週間において拒絶症例では、IFN-γ値が非拒絶症例に比べ高値傾向にあったが、有意差にはいたらず、またFOXP3-SNPとサイトカイン産生において相関は認めなかった。

制御性T細胞は拒絶時の抗ドナー免疫応答の抑制に寄与する細胞で、FOXP3はその機能的マスター遺伝子でありpolymorphismが存在する。本研究では、Foxp3遺伝子多型の同種異系(アロ)T細胞応答への影響について解析を行った。成果として、Foxp3遺伝子多型は、肝臓移植における、急性拒絶反応発症に伴うステロイド治療への感受性との相関を認め、臓器移植における個別化医療を行う上での有用なゲノム情報となり得る可能性を得た。当初の計画通り、肝臓・腎臓移植症例の慢性期における免疫抑制剤減量の推移および慢性期における拒絶反応発症やDSA抗体出現とFoxp3-SNPとの臨床解析を行う。また術後末梢血中におけるTreg/Teffctor細胞の推移についての解析およびリンパ球混合試験での抗ドナー応答T細胞のSTATリン酸化解析を行い、Treg細胞の術後動態を評価する。平成27年度で実施した健常人ボランティア末梢血を用いた誘導Treg細胞のアロ応答への抑制能の評価を行う。さらに、誘導Treg細胞とnatural Treg細胞のTCR variantやDNA methylationを評価し、Foxp3-SNPとの関連を評価する。肝臓移植および腎臓移植症例については、慢性期における免疫抑制状態あるいはDSA出現、拒絶反応発症とFOXP3-SNPの関連解析を継続する。ステロイド感受性とFOXP3-SNPの関連が示唆されることから、アロ応答性に伴うTreg誘導にステロイド添加実験を追加し、SNPによる誘導効率について解明する。また、誘導Treg細胞におけるTCR variantやDNA methylationを評価し、関連性を解析する。移植免疫、腫瘍免疫Foxp3-SNPの個体差によるTreg誘導効率の違いを評価するためのTreg誘導実験を基にサイトカイン検索を行う予定であったが、誘導効率にFoxp3-SNPの関与を示唆する結果を認めなかったため、計画を変更してリンパ球混合試験におけるTreg細胞の抑制評価を行うこととしたため未使用額が生じた。このため、リンパ球混合試験におけるTreg細胞の抑制評価を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。
フラッグフットボールにおける対情況的な動きづくりの学習過程開発と実践及び検証

【研究目的】○フラッグフットボールにおける「動き」を分析・検証するために,発生論的運動学に基柢される運動分析からのアプローチを試みる。すなわち,フラッグフットボールに必要とされる動きを発生(動きを覚える),促発(動きを教える)させる指導法及び学習過程を開発することを目的とした。【研究計画】○過去12年間の実践データを整理・分析し,フラッグフットボールに有効な対情況的な動きを抽出する。○児童やチームの学習カード・作戦カードの記述から,対情況的な動きに関する内容を抽出し,写真・ビデオ映像の動きと比較・分析を行い整合性を検証する。○授業実践(4年生を対象)で上記2点の検証を行う【研究成果】○対情況的な動き(カン)に関する記述・映像を整理・分析し,具体的な動き方とその指導法を開発することができた。○デジタルカメラ及びムービーで対情況的な動きを連写・映像により記録し,フラッグフットボールでの有効な動き方を検証することができた。さらに,それらのデータを基に,実際の授業で活用することにより,児童もより有効な動きに気づき,技能が上達した。約5000枚もの写真データ(連写)を蓄積した。○フラッグフットボールにおける動き方を発生(動きを教える),促発(動きを教える)させる指導法及び学習過程を開発し,単著「ボール運動を10倍楽しくするフラッグフットボール-1年6年実践レシピ集」にまとめ,出版(明治図書)することができた。○第94回研究発表協議会(広島大学附属小学校主催)で,本研究をベースにした授業提案及び実践発表を行った。授業では全国から約300名の先生方の参観があり,その協議会においても,フラッグフットボールにおける対情況的な動きをどのように指導すればよいのか,盛んな意見交換と論議が行われた。○本年度の研究により,身体操作能力を小学校期から向上させる必要性が明らかになった。特に,対情況的な動きをするためにはバランス感覚や柔軟性を育成することが重要であり,新たな研究課題が明らかになり,次年度に繋げたい。
ナトリウムポンプα２サブユニット遺伝子の生体機能と片頭痛の病態

1家族性片麻痺性偏頭痛2型の患者で同定された、ATP1A2突然変異E700Kを導入したマウスについて、CSDの属性を比較した。変異マウスでは、CSDの拡散速度が大きく電位低下からの回復に長い時間がかかった。CSD誘起の閾値は、メスマウスにおいて低い傾向があった。初回CSDによる局所脳血流の低下には有意差がなかったが、その後の一時的な血流量の増加はオスマウスにおいて、増加していた。CSD後の神経興奮をc-Fos抗体染色で解析したところ、扁桃体において、変異導入マウスにおけるc-Fos発現が有意に高かった。2イメージングによるCSD誘導時の大脳皮質ニューロンとアストロサイトのCa動態の比較生体内でニューロン及びアストロサイトのCa濃度変化をGFPの蛍光で評価できるマウス(GLT-1)とAtp1a2欠損マウスとを交配した。脳表面にKClを滴下することでCSDを誘導し、ニューロン及びアストロサイトのCa濃度変化をAtp1a2欠損マウスと野生型とで比較観察した。アストロサイトは標識色素(Sulphorodamine 101)を用いて同定し、ニューロンとアストロサイトを別々に評価した。(1)CSD誘導後、Ca濃度の上昇を示したアストロサイト数は、Atp1a2欠損マウスで有意に多かった。ニューロンでは、有意な差は観察されなかった。(2)細胞間Ca濃度変化パターンは全ての細胞間(ニューロン・ニューロン間、ニューロン・アストロサイト間、アストロサイト・アストロサイト間)で、有意な差は観察されなかった。(3)アストロサイト細胞内Ca濃度変化パターンは、Atp1a2欠損マウスにおいて、細胞内領域間で有意に同調性が低かった。Atp1a2欠損ヘテロマウスで、大脳にKClを直接投与することによって誘起されるCSDの属性を比較したところ、野生型と比べてCSD誘起のKCl濃度の閾値が低下し、CSDの拡散速度が速く、DC電位の偏向からの回復が遅く,脳波の深い抑制が見られた。さらに、高い濃度のKCl投与によって繰り返しCSDが生じるが、ヘテロマウスでのCSD発生繰り返しの頻度は野生型より高い傾向にあった。CSDに伴う脳血流の変化には差が見られなかった。遺伝子欠損の方法が異なる2系統のマウスで、CSDの性質に違いが観察された。この結果はAtp1a2欠損ヘテロマウスがCSDをより起こし易く、その程度も野生型よりも大きいことを示しており、片頭痛のモデルマウスとして有効であることが明らかになった。一方、CSDを誘起後の脳での神経興奮の状況を調べるため、c-FOSの抗体染色を行なった。CSDを誘起した側では、皮質(特に、運動感覚野)ではほぼすべての領域でc-FOSのシグナルが観察された。加えて、大脳基底核および大脳辺縁系でもシグナルが見られた。CSDを誘起したのとは反対側の大脳半球において、c-FOSの発現が大きく低下した。一方、脊髄三叉神経核の尾および中隔核では両側でシグナル強度の差は見られなかった。これらの観察は、片頭痛の病態を考える上での新たな基盤的知見となる。ヒトの片頭痛患者で観察されるATP1A2の点突然変異3種類をマウスAtp1a2遺伝子に導入したトランスジェニックマウスを構築した。一部の系統のマウスでは、熱性痙攣への感受性が野生型よりも高かった。研究計画のうち29年度予定の一部を前倒して遂行した。一方28年度計画のうち、炎症マーカーの検索などの一部の実験は次年度に遂行する予定である。前倒しして行なった実験と、翌年度に繰り越した実験とは同程度の実験量であるため、概ね順調に進展したと言える。1家族性片麻痺性偏頭痛2型の患者で同定されたATP1A2点突然変異を導入したトランスジェニックマウスを構築した。(1)代表的な3種類の点突然変異(R202Q、E700K、M731T)をマウスBACクローンに導入し、各々複数のトランスジェニックマウスを作製した。(2)得られたマウスの熱性痙攣に対する感受性を調べた結果、野生型と比べ有意に痙攣発作の生じる時間が短いラインが得られた。また、最高血圧が有意に上昇したライン、及び心拍数が有意に増加したラインも確立することができた。(3) Atp1a2欠損マウスで解析したCSDについて、これらのTgラインでの比較解析を開始した。2脳内ニューロンとグリアの属性及び興奮性の比較(1)生体内でニューロン及びグリアのCa濃度変化をGFPの蛍光で評価できるマウス(GLTー1)とAtp1a2欠損マウスとを交配し、ニューロン及びグリアのCa動態の変化を野生型と比較観察した。(2)大脳感覚野において、200ないし400μの深さでCa濃度の変化をGFPの蛍光強度によって評価した。グリア細胞は特定の標識色素を用いて同定し、グリアと神経を別々に評価した。定常状態におけるCa濃度の変化について、ニューロン及びグリア共に有意な差は観察されなかった。(3)脳表面にKCLを滴下することで、脱分極を誘導し、CSD波を観察したところ、CSDからの回復時間に差が生じる傾向が見られた。(4)グリア細胞の炎症性マーカーとしてIba-1の発現を抗体染色で観察したところ、Atp1a2欠損マウスでの発現が亢進していた。研究計画のうちカルシウムセンサーマウスとAtp

1a2欠損マウスとの交配を行い、カルシウムイメージングによる解析は予定通り行った。ヒトの偏頭痛の変異を有するTgマウスの構築とその解析については、平成30年度予定の一部を前倒しして遂行した。また、TgマウスのCSD属性については解析を開始した。1家族性片麻痺性偏頭痛2型の患者で同定された、ATP1A2突然変異E700Kを導入したマウスについて、CSDの属性を比較した。変異マウスでは、CSDの拡散速度が大きく電位低下からの回復に長い時間がかかった。CSD誘起の閾値は、メスマウスにおいて低い傾向があった。初回CSDによる局所脳血流の低下には有意差がなかったが、その後の一時的な血流量の増加はオスマウスにおいて、増加していた。CSD後の神経興奮をc-Fos抗体染色で解析したところ、扁桃体において、変異導入マウスにおけるc-Fos発現が有意に高かった。2イメージングによるCSD誘導時の大脳皮質ニューロンとアストロサイトのCa動態の比較生体内でニューロン及びアストロサイトのCa濃度変化をGFPの蛍光で評価できるマウス(GLT-1)とAtp1a2欠損マウスとを交配した。脳表面にKClを滴下することでCSDを誘導し、ニューロン及びアストロサイトのCa濃度変化をAtp1a2欠損マウスと野生型とで比較観察した。アストロサイトは標識色素(Sulphorodamine 101)を用いて同定し、ニューロンとアストロサイトを別々に評価した。(1)CSD誘導後、Ca濃度の上昇を示したアストロサイト数は、Atp1a2欠損マウスで有意に多かった。ニューロンでは、有意な差は観察されなかった。(2)細胞間Ca濃度変化パターンは全ての細胞間(ニューロン・ニューロン間、ニューロン・アストロサイト間、アストロサイト・アストロサイト間)で、有意な差は観察されなかった。(3)アストロサイト細胞内Ca濃度変化パターンは、Atp1a2欠損マウスにおいて、細胞内領域間で有意に同調性が低かった。29年度は点突然変異を導入したマウスの解析と、炎症に伴うマーカータンパクの発現解析を中心に行なう。グリア細胞の属性の変化や点突然変異を有するマウスのCSD属性の変化については、今年度に解析を完了させる。これまで得られた実験結果を総合し、Atp1a2変異による偏頭痛発症の機序のモデルを提出する。使用予定の実験試薬が研究計画よりも安く購入できたため、次年度に繰り越した。本年度の研究は、前年度までに購入した試薬や機器を用いて行うことが可能であったため、物品費の支出が予定よりも定額であった。次年度使用額は平成30年度において、物品及び人件費として適切に使用する予定である。繰り越した当該研究費を人件費/謝金として使用する。
新型ディラック電子系における新奇なスピン輸送現象の研究

この研究課題では1光学的、2電気的、3磁気的観点から軌道角運動量を持つディラック電子系(新型ディラック電子系)における新たな低消費な電子輸送現象を見つけ出し、その現象の微視的なメカニズムを明らかにします。この新型ディラック電子系とは、従来のディラック電子とは異なる特徴的な物理現象が期待されています。その特徴的な物理現象を見つけ出すことが、この研究課題の目標の1つです。さらに、私のこれまでのスピントロニクス研究の経験[PRB 91, 054422 (2015)]を生かし、新型ディラック電子系の物理とスピントロニクスを結びつける新しい道を切り拓くことを目指しています。
エンドトキシン疾患の診断法の確立と治療へのアプロ-チ

エンドトキシンにより引き起こされる種々の疾患の診断及び治療への応用の目的でエンドトキシンの化学的微量定量法の確立を行った。a)メチル化3ーヒドロキシミリスチン酸の、フリ-のOH基にアントラセンー9ーカルボン酸を縮合反応により導入し、蛍光ラベルした(M/Z=462:検出限界1ー2pg)。LPSを5%HCl/MeOH中100°C、3時間加水分解し、遊離したエンドトキシン結合脂肪酸のメチル化体蛍光ラベルしてエンドトキシンの定量を行ったところ、S型LPSでは、数十pg、化学合成リピドAでは、数pgのオ-ダ-まで測定が可能であった。b)LーグリセローDーマンノヘプト-ス(ヘプト-ス)をアミノピリジンで蛍光ラベルした(検出限界は80pg)。LPSを2NーTFAで100°C、8時間加水分解し、遊離したヘプト-スを本法を用いて蛍光ラベルした結果、S型LPSでは、800pgまで検出が可能であった。c)血清中の脂質を無極性溶媒で抽出除去後、5%HCl/MeOHで水解し遊離脂肪酸を得た。これを精製し上記法を用いることで血液中のエンドトキシン定量が可能となった。エンドトキシン活性の中のマイトジェン活性を指標として、リピドAを化学的に修飾することにより不活化した化合物のエンドトキシン活性抑制作用と化学構造とを調べた。化学修飾不活化体の中で、サクシニル化リピドAはエンドトキシンによるB細胞マイトジェン活性を特異的に抑制した。この作用は脾臓中の吸着細胞に非依存的に起こった。この作用は抑制物質を前処理した場合に最も効果的であり、マイトジェン添加前に抑制物質を除いても同様の抑制作用を示した。また、抑制効果は抑制物質/マイトジェンの分子比に依存し、比率が大きいほど強く現れた。抑制を示す物質の化学構造体は完全な大腸菌型のリピドAのサクシニル化体ではなく、モノリン酸化合物であろうと推定された。エンドトキシンにより引き起こされる種々の疾患の診断及び治療には、信頼できるエンドトキシンの定量法が不可欠である。ここではエンドトキシンを化学的手法により定量する方法として、エンドトキシンの特異的かつ普遍的な構成成分である3ーヒドロキシ脂肪酸に着目してその微量定量法の確立を行った。まず化学合成3ーヒドロキシミリスチン酸を用いて、メチル化後その3位のOH基に蛍光物質の酸クロリド誘導体を縮合反応により導入し蛍光ラベルした。得られたラベル体はFABーMSにより分子量462であり、めざす化合物が合成された事を確認した。この化合物は検討した溶媒の中で、ジクロロメタン中で最も強い蛍光を発し、最大励起波長、最大発光波長はそれぞれ、252nm、460nmであった。この条件下で、脂肪酸量にして1ー2pgまで測定可能であった。この方法を用いてエンドトキシン(LPS)の定量法に発展させた。すなわち、LPSを5%HCl/MeOH中、100°C、3時間の処理で結合脂肪酸をメチル化体で遊離させ、ヘキサンで抽出した後に上記の方法で蛍光ラベルした。反応液は順相、逆相、及び分子量と原理の異なった3種のカラムを用いてHPLCで分離・精製して目的物に対応する分画の蛍光強度を測定することにより定量化を行った。

この方法により、例えばサルモネラタイプのS型LPSでは、数十pgまで検出が可能であることがわかった。以上の方法を利用しての血清中のエンドトキシンの定量化のステップとして、血清中の大部分の脂質を無極性溶媒で抽出して除いた後、凍結乾燥し、同様にHCl水解で遊離脂肪酸を得た。このメチル化脂肪酸を更に逆相カラムで精製して、メチル化ー3ーヒドロキシミリスチン酸分画を分取する系を確立した。エンドトキシンは感染症に伴って生体に様々な致死的な障害をもたらすことから、臨床上の大きな問題となっている。近年、エンドトキシンのアナログで、活性を有しない化合物の中に、エンドトキシンに拮抗してその作用を抑える物質が存在することが見いだされている。この様な物質はショック等のエンドトキシン疾患の治療への応用や、レセプタ-、情報伝達の研究への利用が期待される。ここではエンドトキシン活性の中のマイトジェン活性を指標として、エンドトキシンを化学的に修飾することにより不活化し、それらのエンドトキシン活性抑制作用と化学構造を調べた。サルモネラ、及び大腸菌由来のエンドトキシンを種々のアルカリ処理により脱アシル化したりピドAや、リピドA部分のフリ-の水酸基にサクシニル基を導入したエンドトキシンは、いずれもマイトジェン活性は完全になくなると共に、活性型リピドAによるマイトジェン活性を抑制した。これらの物質のうち、アルカリ処理化合物による抑制は、B細胞マイトジェンのみならず、コンカナバリンAによるT細胞マイトジェンをも抑えることや、エリスロシン染色の結果から、脾臓細胞への直接毒性作用によることがわかった。一方、サクシニル化合物は細胞毒性は示さず、吸着細胞に非依存的に、エンドトキシンによるB細胞マイトジェン活性を特異的に抑制した。その作用は抑制物質を前処理した場合に最も効果的であり、マイトジェン添加前に抑制物質を除いても同様の抑制作用を示すこと、さらにはマイトジェンと抑制物質の分子比に依存することが明らかになり、活性体に拮抗して起こることがわかった。しかしながら純品である化学合成リピドAを用いた同様の実験ではサクシニル体はむしろそれ自体の活性が強くなり、抑制作用は示さないことや、天然のサクシニル化エンドトキシンの化学分析、及び薄層クロマトの結果から抑制物質はモノリン酸化合物であろうと推定された。
ヒ素化合物による白血病細胞のアポトーシス,分化誘導の分子制御機構とその臨床応用

ヒ素化合物は急性前骨髄球性白血病(APL)細胞のアポトーシス誘導を介して、実際にレチノイン酸耐性APLにも有効であることが知られ注目されているが、その分子作用機構については明らかでない。本研究においては、われわれが樹立したレチノイン酸耐性APL細胞株UF-1細胞およびヒトGM-CSFを産生するトランスジェニックSCIDマウスを用いたAPLマウスモデルを用いて、ヒ素化合物の作用機構をin vitroおよびin vivoにて解析するとともに、臨床応用を目指した新しいヒ素の投与法の開発に関する研究を施行した。ヒ素はレチノイン酸感受性APL細胞株NB4およびレチノイン酸耐性APL細胞株UF-1を細胞周期G1期に停止させ、アポトーシスを誘導した。ウエスタンブロットによる解析では、ヒ素はNB4細胞ではBcl-2の低下を、UF-1細胞ではBaxの発現上昇によりアポトーシスを誘導した。さらにAPLに特異的なPML/RARαキメラ蛋白は両細胞ともに濃度依存性に分解された。次いでヒ素のin vivoでの効果を検討するために、ヒトGM-CSF産生トランスジェニックSCIDマウスを用いての検討したところ、このマウスにおいてはAPL細胞の分化が誘導された。当該マウスでは血清中に高濃度のヒトGM-CSFが含まれるため、in vitroにおいてヒ素化合物とGM-CSFを併用したところNB4細胞、UF-1細胞ともに成熟顆粒球に分化誘導された。この両者の併用による分化誘導機構について検討したところGM-CSFはJak2キナーゼをリン酸化し、活性化することによりヒ素によるアポトーシスシグナルを阻止し、細胞分化を誘導することが明らかになった。これらの結果によりヒ素化合物の臨床応用に際しては、その毒性や発癌性を極力減じるためにも、GM-CSFの併用は効果的と考えられた。今後はこれまでの研究成果ふまえDNAチップ等の方法を用いてヒ素化合物の直接の標的遺伝子の単離、機能解析を継続していく予定である。ヒ素化合物は中国において急性前骨髄球性白血病の治療に用いられ,アポトーシス誘導を介して寛解誘導をもたらすことが知られ注目されている。しかしながら,その作用機構の解明やマウスを用いたin vivoレベルでの基礎的研究は遅れている。そこで,今年度はわれわれの樹立したレチノイン酸耐性急性前骨髄球性白血病細胞株UF-1および感受性細胞株NB4へのヒ素化合物の効果をin vitroおよびin vivoにて検討した。ヒ素化合物はNB4,UF-1細胞ともに,それらの増殖を細胞周期G1期に停止させることで抑制し,その後アポトーシスを誘導した。興味深いことに,ヒ素化合物はNB4細胞ではBcl-2の発現を低下させるのに対し,UF-1ではBaxの発現を増加させることでアポトーシスを誘導した。また,ヒ素化合物は急性前骨髄球性白血病に特異的なPML/RARαキメラ蛋白を分解しすることで,細胞増殖を抑制しアポトーシスを誘導するものと考えられた。次いでヒトGM-CSF産生トランスジェニックSCIDマウスを樹立し,UF-1細胞を移植した急性前骨髄球性白血病モデルマウスを作製し,ヒ素化合物のin vivoでの効果を検討した。ヒ素化合物はin vitroにおいては急性前骨髄球性白血病のアポトーシス誘導のみであったが,in vivoにおいてはアポトーシス誘導の他に,マウスによっては細胞分化が誘導されたものも存在した。次年度はin vivoにおけるこのアポトーシスあるいは分化誘導機構の相違について分子レベルで解析する予定である。

ヒ素化合物が投与されたマウスはいずれも有害な障害を認めず,また剖検によっても明らかな臓器障害は認められなかった。これらの結果は,ヒ素化合物が急性前骨髄球性白血病患者に安全に投与できることを示唆しており,臨床応用に向けた研究を併せて進める予定である。ヒ素化合物は急性前骨髄球性白血病(APL)細胞のアポトーシス誘導を介して、実際にレチノイン酸耐性APLにも有効であることが知られ注目されているが、その分子作用機構については明らかでない。ヒ素はレチノイン酸感受性APL細胞株NB4およびレチノイン酸耐性APL細胞株UF-1を細胞周期G1期に停止させ、アポトーシスを誘導する。ウエスタンブロットによる解析では、ヒ素はAPLに特異的なPML/RARαキメラ蛋白を濃度依存性に分解した。現在、その際に抗PML抗体あるいは抗RARα抗体で免疫沈降してくる分子の解析を現在施行中である。さらにヒ素のin vivoでの効果を検討するために、NOD/SCIDマウスを用いて解析したところヒ素単独ではAPL細胞のアポトーシスを誘導した。これに対しヒトGM-CSFを産生するトランスジェニックSCIDマウスを用いての検討ではAPL細胞の分化が誘導された。これらの結果より、in vitroにおいてヒ素化合物とGM-CSFを併用することでNB4細胞、UF-1細胞ともに成熟顆粒球に分化誘導された。この両者の併用による分化誘導機構について検討したところGM-CSFはJak2キナーゼをリン酸化し、活性化することによりヒ素によるアポトーシスシグナルを阻止し、細胞分化を誘導することが明らかになった。これらの結果によりヒ素化合物の臨床応用に際しては、その毒性や発癌性を極力減じるためにも、GM-CSFの併用は効果的と考えられる。今回の検討ではヒ素化合物が結果的にAPLに特異的なPML/RARαキメラ蛋白を分解することで、細胞分化、アポトーシスのシグナルを伝達することが明らかになったが、直接標的とする分子の同定には至らなかった。今後はこれまでの研究成果ふまえDNAチップ等の方法を用いてヒ素化合物の標的遺伝子の単離、機能解析を継続していく予定である。
シロサケ神経葉ホルモン遺伝子の発現調節領域の解析

本研究はサケ科魚類の神経葉ホルモンであるバソトシン(VT)とイソトシン(IT)のゲノム遺伝子の発現調節領域の構造解析と解析結果を使った分子進化系統樹の作成を目的とする。サケ科魚類が4倍体であるため、2種類ある遺伝子のうちのIの解析をおこなった。系統樹は前駆体cDNAについておこなった。シロサケのVT-Iの遺伝子は2個のイントロンと3個のエキソンからなる構造をとり、この構造は哺乳類のバソプレシン遺伝子と同様であった。5′上流域を哺乳類と比較した結果、プロモーター領域の転写開始構造に違いがみられ、エストロジェン受容体等の結合部位となる配列や、哺乳類のバソプレシン遺伝子にはない特徴的な配列が存在するなどの特徴が明らかとなった。また、IT-I遺伝子は全長の塩基配列決定までに至らなかったが、部分的解析で少なくとも2つのイントロンと3つのエキソンを持つことがわかった。ホワイトサッカーでは哺乳類と異なり、IT遺伝子にイントロンが無いと報告されている。シロサケのIT遺伝子解析により、魚類のITも種によっては哺乳類のようにイントロンを持つことが明らかとなった。一方、分子進化系統樹の作成は、神経葉ホルモンの前駆体遺伝子cDNAからのアミノ酸配列で、近隣節約法と最尤法を用いておこなった。そして、従来のホルモンのアミノ酸配列の比較による説とは異なる結果を得た。魚類のITから哺乳類のオキシトシンが、VTからバソプレシンが分岐したとする従来の説に対し、魚類のVTから両生類のメソトシンが分岐し、そこから哺乳類のオキシトンが分岐したとする系統樹が作成できた。神経葉ホルモンの発現調節領域の調節因子系が魚類で異なることを明らかにし、イントロンの存在が魚種により違うことがわかった。そして、前駆体遺伝子の構造の特徴が重複や遺伝子変換の良いモデルであり、その系統樹の作成で新たな知見が得られた。これらの観点からゲノム遺伝子での解析を進めれば、動物間での発現調節の違いや遺伝子構造の進化からホルモン作用の調節機構の解明にもつながることが期待できる。本研究はサケ科魚類の神経葉ホルモンであるバソトシンとイソトシンの遺伝子の発現調節領域の構造解析を目的とするものである。サケ科魚類が4倍体のためにそれぞれの遺伝子はIとIIの2種類が存在する。今年度はバソトシンI(VTI)についての解析を行った。すでに得られている数個のゲノム遺伝子のクローンから、その上流域を含むクローンを得るためにVTIの5'側に特異的な合成プローブを作成し、サザンブロット法で目的のクローンを選択した。制限酵素マッピングにより、このクローンは上流域の塩基を2Kbp以上含むことが分かった。今年度は全配列を決定するには至らなかったため、来年度も解析を進める。もう1つのゲノム遺伝子解析の目的である分子進化の解析は、まだ遺伝子配列が決定出来ていないので、すでに報告されている神経葉ホルモンの前駆体遺伝子のcDNAの配列を用いて神経葉ホルモンの分子進化系統樹の作成を試みた。近隣節約法と最尤法で解析を行った。計算には長谷川と足立が開発したアミノ酸配列による分子進化系統樹の解析プログラムを用いた。その結果、従来の説とは異なる知見が得られた。

魚類のイソトシンからほ乳類のオキシトシンが分かれたとする従来の説に対し、今回の解析では魚類のバソトシンからまず両生類のメソトシンが分かれ、そこからほ乳類のオキシトシンが分かれる系統樹が作成された。解析中の魚類の神経葉ホルモンのゲノム遺伝子と報告されているほ乳類のものとを比較すればより確かな知見が得られると期待される。本研究はサケ科魚類の神経葉ホルモンであるバソトシンとイソトシンのゲノム遺伝子の発現調節領域の構造解析を目的とし、平成6年度の成果をもとに研究を更に進めた。昨年得たシロサケのバソトシンIの遺伝子のクローンについて、5′上流域2kbpを含んだ全長3.5kbpの制限酵素断片の塩基配列解析をおこなった。また、イソトシンIについては、5′上流域3Kbp以上とイソトシンIの全長を含む17Kbpのクローンをゲノムライブラリーより選択出来た。バソトシンIの遺伝子は2つのイントロンで区切られた3つのエキソンからなる構造をとり、この構造は哺乳類のバソプレシン遺伝子と同様であった。5′上流域を哺乳類と比較した結果、この遺伝子の特徴は、次のようであった。1)TATAボックスより上流でAP-2がみられない。2)CATボックスが複数存在する。3)エストロジェン受容体等の結合部位となる配列が存在する。4)哺乳類のオキシトシン遺伝子にはあるがバソプレシン遺伝子にはない特徴的な配列が存在する。また、ニワトリのバソトシン遺伝子の上流域とも比較し、その相違点を明らかにした。一方、イソトシンI遺伝子は全長の塩基配列決定までに至らなかったが、部分的解析で少なくとも2つのイントロンと3つのエキソンを持つことがわかった。ホワイトサッカーでは哺乳類と異なり、イソトシン遺伝子にイントロンが無いと報告されている。シロサケのイソトシン遺伝子はホワイトサッカーとは違っていて、魚類のイソトシンも種によっては哺乳類のようにイントロンを持つことが明らかとなった。以上の成果は、神経葉ホルモン遺伝子の分子進化の研究を、昨年度行った前駆体cDNAのレベルだけでなく、ゲノム遺伝子のレベルまで発展させる基礎となる。また、発現調節領域の調節因子系の解析により、動物間での発現調節の違いが明らかとなり、ホルモン作用の調節機構の解明にもつながると期待される。
心筋虚血時とそれからの回復過程における心室不整脈の発生機序と治療に関する研究

急性心筋虚血と,それからの回復過程で生じる異常興奮と収縮を単純化して観察するため,酵素処理により単離したモルモット単一心室筋細胞を用いた.細胞呼吸阻害薬(CN^-)を添加し虚血を模した環境下にさらし,次いで同阻害薬をwashoutする過程における電気興奮を微小電極法により観察すると同時に,テレビ画像処理法を用いた心筋細胞局所におけるサルコメア長変化の詳細な観察から得た細胞内Ca^<2+>動態を解析し,異常興奮の発生機序に関する検討を行った.1.CN^-による細胞内呼吸阻害時の膜電位と収縮動態の変化.1Hz電気刺激下に5mMCN^-を添加すると活動電位持続時間(APD)が次第に短縮し, 3070分後には活動電位を生じなくなった.APDの短縮にほぼ並行して心筋細胞の収縮も低下した.CN^-添加時には,膜電位振動や自発収縮は認められなかった.以上の変化は,細胞内ATPの枯渇によると考えられる.2.細胞呼吸再開により誘発される膜電位振動. CN^-をwash outすると, wash out直後から数分間にわたり,静止膜電位レベル(約-95mV)から生じる微小な脱分極が繰り返し観察された.この膜電位の脱分極は心筋細胞の局所的なサルコメアの短縮を伴っていた.振幅5mV以下かつ持続時間500msec以上の脱分極時には,細胞内の一カ所から波紋様に伝播する局所的なサルコメアの短縮(propagating contractile wave)が見られた.振幅5mV以上あるいは持続時間500msec以下の脱分極時には,細胞全体のサルコメアがより均一な短縮を示した.膜電位の微小振動が見られる時点で14Hzのトレーン刺激を加えると,刺激停止後一過性に膜電位振動の振幅が増大するとともに,より同期したサルコメア短縮が生じた.以上より一時的細胞呼吸阻害からの回復過程では,細胞質Ca^<2+>濃度の不均一な上昇による膜電位振動が生じ,このCa^<2+>濃度の上昇が同期されることにより脱分極が増大し異常興奮を誘発することが明らかとなった.急性心筋虚血と,それからの回復過程で生じる異常興奮と収縮を単純化して観察するため,酵素処理により単離したモルモット単一心室筋細胞を用いた.細胞呼吸阻害薬(CN^-)を添加し虚血を模した環境下にさらし,次いで同阻害薬をwashoutする過程における電気興奮を微小電極法により観察すると同時に,テレビ画像処理法を用いた心筋細胞局所におけるサルコメア長変化の詳細な観察から得た細胞内Ca^<2+>動態を解析し,異常興奮の発生機序に関する検討を行った.1.CN^-による細胞内呼吸阻害時の膜電位と収縮動態の変化.1Hz電気刺激下に5mMCN^-を添加すると活動電位持続時間(APD)が次第に短縮し, 3070分後には活動電位を生じなくなった.APDの短縮にほぼ並行して心筋細胞の収縮も低下した.CN^-添加時には,膜電位振動や自発収縮は認められなかった.以上の変化は,細胞内ATPの枯渇によると考えられる.2.細胞呼吸再開により誘発される膜電位振動. CN^-をwash outすると, wash out直後から数分間にわたり,静止膜電位レベル(約-95mV)から生じる微小な脱分極が繰り返し観察された.この膜電位の脱分極は心筋細胞の局所的なサルコメアの短縮を伴っていた.振幅5mV以下かつ持続時間500msec以上の脱分極時には,細胞内の一カ所から波紋様に伝播する局所的なサルコメアの短縮(propagating contractile wave)が見られた.振幅5mV以上あるいは持続時間500msec以下の脱分極時には,細胞全体のサルコメアがより均一な短縮を示した.膜電位の微小振動が見られる時点で14Hzのトレーン刺激を加えると,刺激停止後一過性に膜電位振動の振幅が増大するとともに,より同期したサルコメア短縮が生じた.以上より一時的細胞呼吸阻害からの回復過程では,細胞質Ca^<2+>濃度の不均一な上昇による膜電位振動が生じ,このCa^<2+>濃度の上昇が同期されることにより脱分極が増大し異常興奮を誘発することが明らかとなった.1.単一心筋細胞のサルコメアレベルにおける収縮動態解析のための画像処理システム及びソフトウェアの開発。単一心筋細胞の顕微鏡画像をTVカメラを通してビデオテープに記録した。その再生画像から画像データ収録装置を用いて任意の時点における画録を選択し、高速A/D変換した。次いで心筋細胞のサルコメア縞を抽出するためマイクロコンピュータで平滑化、端強調及び二値化処理を行った後、テンプレートマッチング法によりサルコメア縞を認識し、サルコメア長を計測した。以上の操作を画像データ収録装置の設定値を更新しながらくり返すことにより、1/60Secで進行する画像を連続的に処理した。このシステムを用いることにより、膜電位記録と同時点におけるサルコメア長変化を測定することが可能となった。2.モルモット単一心室筋細胞の好気的代謝阻害からの回復過程における膜電位及びサルコメアの動きの同時解析。タンパク分解酵素で処理して得たモルモット単一心室筋細胞を用いて、5mMC【N^-】で細胞の好気的代謝を阻害し、その回復過程における膜電位変化とサルコメアの動きを同時に観察した。好気的代謝阻害からの回復過程において、自発的かつ周期的なサルコメアの短縮が細胞の一部分から起こり細胞内を伝播した。

膜電位変化では、この自発的なサルコメア短縮に一致した数mVの脱分極が静止膜電位レベルにおいて認められた。電気刺激で活動電位を発生させると、サルコメアの短縮は、ほぼ細胞全体で同期し、それとともに脱分極の振幅も増大し、しばしばtriggered activityを生じた。以上の結果から単一心室筋細胞の好気的代謝阻害からの回復過程で出現する膜電位の一過性脱分極は、自発的かつ周期的な細胞質【Ca^(2+)】濃度の変動に基づく現象であり、この膜電位の一過性脱分極から生ずるtriggered activityが虚血からの回復過程において出現する不整脈の発生の重要な要因の一つであることが示唆された。
可積分性を用いた、重力理論と共形場理論との間の対応の研究

前年度までの研究では特に、CFT側のN=4 supersymmetric Yang-Mills理論におけるWilson loop上に挿入された演算子の相関関数の計算について研究してきた。即ち、可積分性を用いて如何にしてその相関関数を計算するか、という問いに対して定式化を試みた。その結果、私は海外の共同研究者と共に一つの方法を提案した[JHEP 11 (2017) 116]。この結果は、AdS側では開弦の相関関数に対応するが、この量についての計算方法を定式化したのは我々が初めてであり、その意義は大きい。今年度の研究では、私はその可積分性を用いて提案した方法をより深く理解することに努めた。前提として、我々の考えているセットアップの弱結合領域における量は、摂動論と呼ばれる可積分性を用いない方法においても計算することができる。そこで、両方法による定式化を弱結合領域の元で計算し、比較した[JHEP 02 (2019) 090]。この仕事による意義の一つに、我々の提案した定式化をより強固にできたことがある。二つ目に、可積分を用いた方法と用いない方法の間にある差異に対して、一つの重要な事実を発見することができたことがある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、可積分性を用いることで発展してきたAdS/CFT対応の研究について、より深い本質的な理解を与えることを目的としている。当初の研究初年度の予定では、AdS/CFT対応におけるCFT側の理論の3点関数について、特に弱結合領域に着目し解析を進めていく方針であった。しかしながら、近年、この3点関数の研究において素晴らしい進展が海外の研究者によってなされた。それは、可積分性を用いることで、任意の結合定数における閉弦に対応する3点関数が複合演算子の長さが長い極限の元で予想されたことである。この予想により、従来の研究では難しいとされていた有限の結合定数での理解が深まると期待できる。しかしながら、この予想は、複合演算子の長さが長い極限の元での結果であり、如何にして複合演算子の長さが短い時の効果を考慮するかについては、未だ課題が残る。更に、この予想では可積分性の巧みな技術を用いている。そのため、なぜ3点関数の値がそのように与えられるのか、という本質的な問いに対しては未だ理解が浅い。以上のことを踏まえ、今年度はより深く先行研究の予想を調べるために、本質的かつ素直な応用として、まずは先行研究を参考に開弦に対応する3点関数について調べることにした。その結果、閉弦の時と同様な予想を提案することができた。この予想では、閉弦の時と同様の構造を持ちながらも、閉弦とは全く異なった開弦の特徴も掴むことができた。さらに、この開弦のモデルを用いることで、閉弦の時に難しいとされた複合演算子の長さが短い時の効果を容易く計算することができることが分かり、実際にその効果を可積分性を使わずに計算することに成功した。この効果を、可積分性を用いずに計算する手法を与えたことは、今後、可積分性を用いた手法とそうでない手法の隔たりを埋める上で非常に有意であると考えている。本年度は、研究の最終目的に向けた具体的な手順としては計画と異なる研究を行った。しかしながら、最新の研究に柔軟に対応し、AdS/CFT対応の本質的な理解に向けた重要な結果を得ることができ、結果的に最終目的に近づく研究を行うことができた。そのため、今後の研究の発展に十分期待できると考えている。故に、本研究課題の進捗状況についてはおおむね順調に進展していると判断できる。私は、AdS/CFT対応の理解を目標にしている本研究において、特にその対応の性質の一つである可積分性に着目し研究を進めている。AdS/CFT対応は、AdS側が超弦理論であり、CFT側がゲージ理論の対応となっている。このAdS側の理論とCFT側の理論の対応を調べる上で、非自明な相互作用を含む基本的な物理量である三点関数が重要な研究対象になりうると考えている。その上、この三点関数は、超弦理論側として閉じた弦を考えるか開いた弦を考えるかによって、大きく分けて考えることができる。AdS/CFT対応の発見以来、これら3点関数の計算は大きな目標の一つになっていた。それに対して、2015年、可積分性の性質を巧みに使うことにより、閉じた弦に対応する三点関数をCFT側の言葉で計算することに成功した。このような研究背景を受け、私は、共同研究者のMinkyoo,Kim,Shota Komatsu, Takuya Nishimuraらとによる一連の論文を通して、開いた弦に対応する三点関数を、同じくCFT側の言葉で計算することに成功した。以上までが本年度の研究成果である。しかしながら、これらの成果は"AdS/CFT対応の理解"と言う目標には未だ至っていないと言える。その根拠は、物理的な描像が見えづらいからである。その原因として可積分性に頼りすぎているからであると考えられる。可積分性の力を借りることで結果を知ることはできたが、代わりに物理的な描像が見えづらい手法での計算となってしまった。そこで本年度からは、可積分性を用いた結果を可積分性の用いない手法から如何に再現するかに焦点を当てて研究に従事しようと考えている。

本年度は、AdS/CFT対応の理解に向けた一つの目標である三点関数の計算を行い、論文を出すまでの成果をあげた。また、国内外での研究発表も行い、特に海外の研究者達は我々の研究にとても興味を持っている。それ故、本研究課題の進捗状況についてはおおむね順調に進展していると判断できる。前年度までの研究では特に、CFT側のN=4 supersymmetric Yang-Mills理論におけるWilson loop上に挿入された演算子の相関関数の計算について研究してきた。即ち、可積分性を用いて如何にしてその相関関数を計算するか、という問いに対して定式化を試みた。その結果、私は海外の共同研究者と共に一つの方法を提案した[JHEP 11 (2017) 116]。この結果は、AdS側では開弦の相関関数に対応するが、この量についての計算方法を定式化したのは我々が初めてであり、その意義は大きい。今年度の研究では、私はその可積分性を用いて提案した方法をより深く理解することに努めた。前提として、我々の考えているセットアップの弱結合領域における量は、摂動論と呼ばれる可積分性を用いない方法においても計算することができる。そこで、両方法による定式化を弱結合領域の元で計算し、比較した[JHEP 02 (2019) 090]。この仕事による意義の一つに、我々の提案した定式化をより強固にできたことがある。二つ目に、可積分を用いた方法と用いない方法の間にある差異に対して、一つの重要な事実を発見することができたことがある。引き続き、本年度扱っていたモデルの解析を進める。具体的には、まず可積分を用いた場合と用いなかった場合のデータを集める。その後、両アプローチのプロセスを比較することで、可積分性による巧みな技術やそれによって導かれた様々な結果を可積分性を用いない方法に"翻訳"しながら、AdS/CFT対応の3点関数についてのより深い理解に取り組んでいく。引き続き、AdS/CFT対応の理解に向けた研究を行う予定である。その上で、本年度までで得た結果を用いながら研究を遂行して行く。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
がんのワールブルグ効果に関連するスプライシング異常の意義と機序

ピルビン酸キナーゼM(PKM)に関し、そのアイソフォーム変換を不可能とした細胞・マウスモデルの作製と解析を行った。Pkm1-KIおよびPkm2-KIマウスから単離した各種臓器、および胎児線維芽細胞(MEF: mouse embryonic fibroblast)のメタボローム解析や細胞外フラックス解析を行った結果、Pkm1-KIおよびPkm2-KIのいずれもが、細胞内代謝物のレベルに広範な影響を与えることが明らかになった。表現型解析により、Pkmスイッチを介した代謝制御が、細胞老化やがん化など、細胞の運命決定において重要な役割を果たすことが分かった。腫瘍細胞における代謝再プログラム化において決定的役割を果たす解糖系酵素、ピルビン酸キナーゼM(PKM; pyruvate kinase M)に関し、そのアイソフォーム変換を不可能とした細胞・マウスモデルの作製と解析を行った。平成25年度は、以下のような成果を得た;(i)前年度に樹立したPKM2(M2)-ノックイン(KI)ESCよりキメラマウスを作製し、さらにライン化を行ってヘテロM2-KIマウスを樹立した。ヘテロPKM1(M1)およびヘテロM2-KIマウス同士の交配により、ホモM1-およびM2-KIマウスを得た。当初の予想に反し、ホモM1-,M2-KIマウスは、いずれもほぼ正常に出生し、発育し、雌雄ともに繁殖可能であった。(ii)上記KIマウスから胎児線維芽細胞(MEF: mouse embryonic fibroblast)を単離し、不死化・形質転換実験を行った。その結果、M1-,M2-KI MEFのいずれもが、対照に比して、細胞老化-不死化のプロセスに異常をもつことがあきらかになった。初代培養MEFにSV40 T抗原を導入して直接不死化した場合には、いずれのKI-MEFも、ほぼ同様に不死化した。しかし、予想に反し、M1-KI MEFは、不死化した段階で、ある種の形質転換型表現型を示すことが分かった。メタボローム解析の結果から、KI変異によって多くの細胞内代謝物レベルが影響を受けていることが判明した。(iii)PKM-KIを、Gannマウスおよび活性化変異型Krasノックインマウスと交配し、多重変異をもつマウスを作製した。これらマウスを用い、in vivoにおける胃、および肺発がん実験に着手した。平成24年度は、以下のような成果を得た;(i)ヘテロPKM1(M1)-KIマウス同士の交配により、ホモM1-KIマウスを得た。当初の予想に反し、ヘテロおよびホモM1-KIマウスは、ほぼ正常に出生し、発育し、雌雄ともに繁殖可能であった。BL6系統への戻し交配をスピードコンジェニック法にて行い、通常の解析にはほぼ問題ない程度までコンジェニック化が進んだ。(ii)M1-KI胚性幹細胞(ESC)の解析から、増殖や未分化性維持といった、ESC自己複製におけるPKM2アイソフォーム(M2)発現の重要性が明らかになった。メタボローム解析から、ESCメタボロームに及ぼすM1-KIの影響が明らかになった。同様に、マイクロアレイ解析から、遺伝子発現に及ぼすM1-KIの効果が明らかになった。予想に反し、少なくともESCにおいては、M2と、低酸素関連転写因子HIF-1との協調を示す結果は得られなかった。(iv)KY1.1、およびRENKA ESC株を親株として、M2-KI ESCを樹立した。これらクローンをもとに、キメラマウスを作製した。平成26年度は、以下のような成果を得た;(i)前年度に樹立したPKM2(M2)-ノックイン(KI)マウスの戻し交配(C57/BL6に対して)を行い、コンジェニック化を完了した。(ii)Pkm1-KIおよびPkm2-KIマウスから単離した各種臓器、および胎児線維芽細胞(MEF: mouse embryonic fibroblast)のメタボローム解析や細胞外フラックス解析を行った。その結果、Pkm1-KIおよびPkm2-KIのいずれもが、細胞内代謝物のレベルに広範な影響を与えること、また、細胞の好気代謝に影響を及ぼすことが明らかになった。これらKI-MEFの表現型解析により、Pkmスイッチを介した代謝制御が、細胞老化やがん化など、細胞の運命決定において重要な役割を果たすことが分かった。(iii)

PKM-KIを、活性化変異型Krasノックインマウスと交配し、得られた二重変異にCreリコンビナーゼを発現するアデノウイルスを投与して肺がんを誘導する実験を開始した。また、いくつかの化学発がん実験も開始した(iv)マウス受精卵におけるゲノム編集により、Pkm1とPkm2のいずれも欠損するマウスの作製を試みた。ヘテロ欠損マウス同士の交配結果から、ホモPkm1/2欠損マウスは、着床後極めて早い段階で致死となることが示唆された。腫瘍生物学培養系での実験結果が、当初予想に反するものであったため、解析に予想以上の時間を要している。しかし、vivoの実験系が予想以上に順調に推移していることもあり、区分「2」とする。変異マウス同士の交配が十分に行えなかった点や、解析機器の導入遅れが生じた点があるものの、その他の点で当初の計画以上に進展した箇所もあり、区分「2」とする。おおむね当初計画に沿って研究を推進する。消耗品費が、予想よりも少額で済んだため。研究をより円滑に推進するため、消耗品費を計画よりも増額する。納入が遅れていた解析装置の支払に充てられるほかは、ほぼ、当初の計画通りの予定である。