hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ケルセチン誘導体を用いたヒトがん細胞死誘導メカニズムの解明

ケルセチンのヒドロキシル基を化学修飾することで、直接的にその機能の検証を行うために、ケルセチンの3,7,3',4'位をアセチル基またはベンジル基で置換したケルセチン誘導体を合成し、これらの誘導体を用いたヒト大腸がん細胞(HCT116)におけるプログラム細胞死誘導のメカニズムの解明を行った。その結果、ケルセチンならびにアセチル化ケルセチンは有意にHCT116細胞の増殖を阻害した一方、ベンジル化ケルセチンはその機能を失っていた。また、ケルセチンならびにアセチル化ケルセチンによりミトコンドリア内活性酸素(ROS)が生じ、アポトーシスを誘導するほか、オートファジー誘導にも関与することが明らかになった。今年度は、はじめにケルセチンをベースに用いたヒドロキシル基の修飾を行った。次にそれらのケルセチン誘導体をヒト由来大腸がん細胞(HCT-116)に添加し、ヒドロキシル基の修飾の違いによるアポトーシスおよびオートファジー誘導能(プログラム細胞死)の変化の有無を検討した。その結果、修飾基の違いにより、ケルセチンが有するプログラム細胞死誘導能が全く失われる場合と、逆にケルセチンより強い誘導能を示す場合があることが明らかになった。また、がん抑制遺伝子p53への依存性および、アポトーシス・オートファジーのクロストークについても明らかになりつつある。よって、次年度はアポトーシスおよびオートファジー誘導の定量化を行い、さらに詳しい分子機構の解明を遂行すると共に、マウスを用いた動物実験を行うことで、ケルセチンならびにその誘導体の個体レベルでのがん予防効果の検討を行う。本年度は、前年度の結果を踏まえ、ケルセチンのヒドロキシル基を修飾置換した結果、ケルセチンよりもアポトーシス誘導が増加したアセチルケルセチンおよび逆に活性を示さなくなったベンジル化ケルセチンの二つを用い、オートファジー誘導の定量化ならびにアポトーシス細胞死とオートファジー細胞死のクロストークの解明、さらに動物実験を実施した。まず、オートファジー誘導の有無を定量化するために、申請者はRFP-GFP-LC3を安定発現させたヒト由来大腸がん細胞を用い、フローサイトメトリー法で解析を行った。結果、ケルセチンおよびアセチル化ケルセチン処理でオートファジーフラックスが見られたのに対し、ベンジル化ケルセチンはオートファジーを誘導しないことが明らかになった。次にアポトーシスとオートファジーのクロストーク機構を解明するにあたり、siRNAトランスフェクション法を用い、オートファジーに必須とされるAtg7をノックダウンした。この条件下で、アポトーシス誘導能の変化を観測したところ、ケルセチンおよびアセチル化ケルセチンを処理した両細胞において、アポトーシス誘導の割合に変化が無く、これらが引き起こすアポトーシスとオートファジーは互いに関与しない可能性が示唆された。また、動物実験では、サンプルを定期的に経口投与したマウスに化学発ガン物質であるアゾキシメタンの腹腔内投与および誘発大腸炎モデルに使用されるデキストラン硫酸ナトリウムの自由飲水を組み合わせ、大腸がんを誘発させる一方、さらに一定期間サンプルを投与し続けた。マウスの体重、腸管長、脾臓の重さにより炎症具合を測定すると共に大腸の腫瘍の数や大きさをコントロールマウスと比較した結果、ケルセチンおよびアセチル化ケルセチンを摂取させたマウスにおいて、わずかに腫瘍の数が少ない傾向が得られたが今後さらに詳細な検討が必要と考えられる。今年度遂行予定であったオートファジー細胞死の定量化が完了していないが、その他の研究計画であった、ケルセチンのヒドロキシル基の修飾およびプログラム細胞死誘導能の変化の検討、がん抑制遺伝子p53への依存性の有無についての解明は実施した。また、次年度に行う予定であるアポトーシスならびにオートファジーのクロストーク解明の実験もすでに着手している。農学アポトーシスおよびオートファジー誘導の定量化をを遂行すると共に、マウスを用いた動物実験を行うことで、ケルセチンならびにその誘導体の個体レベルでのがん予防効果の検討を行う。動物実験においては、当初、大腸がん誘発剤を用いたモデルマウスを用いる予定であったが、こちらの系では大腸がん誘発までに時間を有する可能性が示唆されていることから、他の大腸がん発現モデルマウスの作成も考慮に入れた実験を遂行する。
人類学領域における細胞ならびに遺伝子バンクの開発

近年学問の進展につれてヒトや実験動物の細胞あるいは遺伝子(DNA)を保存し,細胞バンク・遺伝子バンクを設立する動きが高まりつつある.しかしそれらはガン研究など絞られた目的にむけ設立されたため,対象が生物種ばかりでなく遺伝子も非常に限られたものにとどまっている.これに対し,我々は内外の動向に鑑み,希少試料の保存・供給も兼ねて,広く霊長類全般にわたり人類学領域における細胞ならびに遺伝子バンクの設立が急務であると痛感していた.そこで本研究では萌芽的一段階として,各種霊長類の培養細胞株ならびに遺伝子ライブラリーの作製をおこない,細胞ならびに遺伝子バンクの開発をめざし,以下の成果を得た.(1)細胞バンク細胞増殖因子(TCGF)あるいはDNA型(EBV)およびRNA型(HTLVI)腫瘍ウイルス等を用いて細胞の形質転換を行ない,主としてリンパ芽球様細胞株を樹立した.これまでに類人猿4属6種,旧世界ザル6属10種,新世界ザル2属2種,原猿1属1種より計72の細胞株を樹立した.(2)遺伝子バンクこれまでに主として末梢血リンパ球より類人猿4属5種(21個体),旧世界ザル5属14種(109個体),新世界ザル6属8種(22個体),原猿3属3種(11個体)の計163個体より高分子DNAを抽出した.これら高分子DNAを用い,ラムダファージをベクターとして,主として類人猿を中心に遺伝子ライブラリーを作製した.これら作製した培養細胞株および遺伝子ライブラリーの周辺領域の他の研究者への供給が行なわれ,バンクとしての機能が動き出している.近年学問の進展につれてヒトや実験動物の細胞あるいは遺伝子(DNA)を保存し,細胞バンク・遺伝子バンクを設立する動きが高まりつつある.しかしそれらはガン研究など絞られた目的にむけ設立されたため,対象が生物種ばかりでなく遺伝子も非常に限られたものにとどまっている.これに対し,我々は内外の動向に鑑み,希少試料の保存・供給も兼ねて,広く霊長類全般にわたり人類学領域における細胞ならびに遺伝子バンクの設立が急務であると痛感していた.そこで本研究では萌芽的一段階として,各種霊長類の培養細胞株ならびに遺伝子ライブラリーの作製をおこない,細胞ならびに遺伝子バンクの開発をめざし,以下の成果を得た.(1)細胞バンク細胞増殖因子(TCGF)あるいはDNA型(EBV)およびRNA型(HTLVI)腫瘍ウイルス等を用いて細胞の形質転換を行ない,主としてリンパ芽球様細胞株を樹立した.これまでに類人猿4属6種,旧世界ザル6属10種,新世界ザル2属2種,原猿1属1種より計72の細胞株を樹立した.(2)遺伝子バンクこれまでに主として末梢血リンパ球より類人猿4属5種(21個体),旧世界ザル5属14種(109個体),新世界ザル6属8種(22個体),原猿3属3種(11個体)の計163個体より高分子DNAを抽出した.これら高分子DNAを用い,ラムダファージをベクターとして,主として類人猿を中心に遺伝子ライブラリーを作製した.これら作製した培養細胞株および遺伝子ライブラリーの周辺領域の他の研究者への供給が行なわれ,バンクとしての機能が動き出している.近年学問の進展につれてヒトや実験動物の細胞・遺伝子(DNA)を保存し、細胞および遺伝子バンクを設立する動きが高まりつつある。しかし、それらはがん研究など絞られた目的にむけ設立されたため、対象が生物種ばかりでなく遺伝子も非常に限られたものにとどまっている。一方、霊長類を対象とした研究は急速な増大をたどり、試料分与の依頼は過密を極めている。これらの需要の多くは血液分与により要求に応じられているが、小型霊長類では頻回採血によるダメージは特に大きい。また希少な種に関しては特別な需要に対してしか応じられない現状である。そこで我々は、試料の無駄をなくし実験プロセスの短縮に役に立つばかりでなく生物の保護にとっても重要な、霊長類全般にわたる細胞バンクならびに遺伝子バンクの設立をめざした。細胞バンクを構成する各種細胞は、本来の細胞特性を可能な限り保持したまま半永久的な増植性が備わっていることが肝要である。今回、細胞増植因子(TCGF)、取扱いの容易なDNA型(EBV)及びRNA型(HTLV-I)睡瘍ウイルス等を用いて形質転換をおこない、主としてリンパ芽球様細胞株の樹立を行なった。これまでに類人猿3属6種、旧世界ザル6属9種、新世界ザル1属1種より、60の細胞株を樹立し、一部に関しては、軟寒天法・限界希釈法により種々のクローンを得た。これら樹立細胞株の特性を明らかにするため、細胞学的・ウィルス学的検索を行なった。一方、主として末梢血リンパ球より分離・精製した種々の霊長類の高分子DNAを制限酵素で分解の後、アガロース電気泳動法にて断片を分離、種々のファージをベクターとしてベクターのアームDNAとこれらのDNA断片とを結合した後、in vitro packaging法によりファージ粒子の中に組み込ませ、大腸菌に感染させることにより遺伝子ライブラリーを作製した。
神経伝達物質の可塑性

GABA,カテコールアミン及びアセチルコリンは,すべて,いわゆる古典的伝達物質であり,その中枢神経系における分布,機能については,数多くの研究がなされている.これらは,従来,相互作用はあるものの独立した系として考えられてきた.しかし,今回,免疫組織化学的に検討した結果,ラットの中枢神経系のかなりの部位で, GABAニューロンが同時にカテコールアミンニューロンあるいはアセチルコリンニューロンである場合があることが判明した.更に,このような古典的伝達物質の共存関係は発生過程で変化しうるかどうかの検討を,嗅球におけるGABAとカテコールアミンの共存関係に焦点を絞って行なった.嗅球においては成体ではカテコールアミンニューロンの約88%が同時にGABAニューロンであり,残りの約12%がGABA形質を示さない.しかしながら,生後発生を見ると,生後約1週まではカテコールアミンニューロンはすべてGABA形質を示し, 23週目でカテコールアミンニューロンの約5%がGABA形質を示していないことが明らかとなった.一方,細胞学的特徴よりGABA形質を示さないカテコールアミンニューロンは生後遅く発生するのではなく,出生前にすでに発生しているニューロンに相当していると考えられる.従って,このような結果は, GABA+カテコールアミンニューロンが,発生過程において, GABA形質のみを失ったという伝達物質発現の発生過程における可塑的変化の可能性を示唆している.更に,成体においても,共存しているカテコールアミン形質とGABA形質はそのニューロンへの入力によって,各々が異なった発現の制御を受けている可能性が,嗅球における機能的入力除去実験によって示唆された.GABA,カテコールアミン及びアセチルコリンは,すべて,いわゆる古典的伝達物質であり,その中枢神経系における分布,機能については,数多くの研究がなされている.これらは,従来,相互作用はあるものの独立した系として考えられてきた.しかし,今回,免疫組織化学的に検討した結果,ラットの中枢神経系のかなりの部位で, GABAニューロンが同時にカテコールアミンニューロンあるいはアセチルコリンニューロンである場合があることが判明した.更に,このような古典的伝達物質の共存関係は発生過程で変化しうるかどうかの検討を,嗅球におけるGABAとカテコールアミンの共存関係に焦点を絞って行なった.嗅球においては成体ではカテコールアミンニューロンの約88%が同時にGABAニューロンであり,残りの約12%がGABA形質を示さない.しかしながら,生後発生を見ると,生後約1週まではカテコールアミンニューロンはすべてGABA形質を示し, 23週目でカテコールアミンニューロンの約5%がGABA形質を示していないことが明らかとなった.一方,細胞学的特徴よりGABA形質を示さないカテコールアミンニューロンは生後遅く発生するのではなく,出生前にすでに発生しているニューロンに相当していると考えられる.従って,このような結果は, GABA+カテコールアミンニューロンが,発生過程において, GABA形質のみを失ったという伝達物質発現の発生過程における可塑的変化の可能性を示唆している.更に,成体においても,共存しているカテコールアミン形質とGABA形質はそのニューロンへの入力によって,各々が異なった発現の制御を受けている可能性が,嗅球における機能的入力除去実験によって示唆された.
コンテンツ産業の競争力強化に必要な社会資本整備に関する調査・研究

本研究では、文化影響力の市場拡大効果を計測する手法を提示した。第1に、コンテンツ産業の市場拡大効果を実証的に調べる手法を提示している。例として、韓国ドラマコンテンツの文化影響力と市場拡大効果測定を測定した。コンテンツ視聴が文化関心を高めて、市場拡大効果を持つかを調べるために、20項目にわたる文化関心程度について、現在と5年の2時点について質問した。そこで、韓流ブーム以前と以降での文化関心の変化を20項目について計算、20項目の文化項目を、主成分分析によって情報集約化し、文化影響力変数を作成した。その後、文化影響力変数の決定要因を重回帰分析によって分析し、韓国製自動車・液晶テレビへの支払い意志額決定要因を重回帰分析によって分析した。その結果、コンテンツの視聴自体は市場拡大効果を持たないが、コンテンツの視聴が文化影響力の深化をもたらす場合に、市場拡大効果があることが示された。次に、国際文化交流に基づく海外での文化影響力の深化を測定する手法を2つ提示した。一つは、CVMによるフィールド調査法である。次に、コンジョイント法による測定法である。これらの調査方法のメリットは、市場で供給されていない財の価値を測ることができることであり、国際文化交流のような、市場で取引ができない財の価値額を測る場合には、望ましい方法といえよう。また、海外での文化影響力の深化を図る上で、伝統文化とローカライズされた文化では文化受容性がどのように異なるかについて、北米(ミシガン州・グランドラピッド市)でCVMによるフィールド調査を行った。その結果、米国では、ドイツよりもローカライズされた日本伝統文化ではなく、純粋な日本伝統文化の受容性が高いことが示された。コンテンツ産業を通じた文化影響力の拡大と産業競争力の拡大の問題を考えた場合、コンテンツ産業を通じて伝えられる文化的影響が、国家に対する尊厳を含んだ意味での国家ブランドの向上と整合的なものとなるかは多くの議論を必要とすると考えられる。また、コンテンツ産業の競争力そのものが、芸術的文化創造活動とどのような関係にあるかについても多くの問題を含んでいると思われる。これらの問題に対して議論を深めることが、コンテンツ産業をどのように育成していくのか、そして文化影響力をどのように深めていくのかという政策的な議論を進める場合に必要になる。本研究の目的は、上記の問いに対して、議論を整理するとともに、文化影響力拡大を行う場合に、どのような方法が有効となるかについて実証分析に基づいた議論を進めることにある。分析の結果、国家ブランドを向上させるような文化影響力の拡大が、市場を通じて達成可能かどうかについて大きな問題が存在していることが明らかになった。特に、エンターテインメントではない、高級芸術の創造が、市場を形成できるためには、高級芸術の理解ができる教育を行う必要があり、それは市場のみで解決できる問題とは考えられない。さらに、国家ブランドを向上するために、伝統芸術を海外に広めるような文化交流を進める場合でも、それが海外で吸収されるための工夫を行わなければ、有効性を向上させることができず、そのための調査・研究を進めることが必要となろう。本研究では、この問題に対する調査手法を提唱した。今後、文化影響力の拡大を戦略的に進めるためには、各芸術分野の市場構造を分析し、最小の費用で、創造的活動の成果を市場化させる仕組みを構築していく必要があろう。研究成果として「国際文化交流による文化影響力拡大と評価手法」同志社大学経済学部ディスカッションペーパーNo.24等がある。本年度は、スポーツ施設の費用便益分析を行うことにより、スポーツ行政の評価を行い、スポーツ政策に対して科学的根拠を基にした政策提言を行うことを行った。具体的には、「札幌ドーム」の非利用価値の解明をすることと、スポーツスタジアムの費用便益、特に非利用価値の推定のためのCVMを利用した手法として確立することが本研究の分析面での貢献部分となる。

このことは、スポーツコンテンツの今後のあり方を考える上でも重要な学術的基礎を与えるものであると判断している。次に、海外での文化影響力の深化を図る上で、伝統文化とローカライズされた文化では文化受容性がどのようにことなるかについて、北米(ミシガン州・グランドラピッド市)でCVMによるフィールド調査を行った。すでに昨年までにドイツおよび日本での調査を行っており、今回の調査によって文化受容性に関するドイツと米国との間での国際比較が可能となった。その結果、米国では、ドイツよりもローカライズされた日本伝統文化ではなく、純粋な日本伝統文化の受容性が高いことが示された。次に、コンテンツ産業の市場拡大効果を実証的に調べる研究を行った。例として、韓国ドラマコンテンツの文化影響力と市場拡大効果測定を測定した。コンテンツ視聴が文化関心を高めて、市場拡大効果を持つかを調べるために、20項目にわたる文化関心程度について、現在と5年の2時点について質問した。そこで、韓流ブーム以前と以降での文化関心の変化を20項目について計算、20項目の文化項目を、主成分分析によって情報集約化し、文化影響力変数を作成した。その後、文化影響力変数の決定要因を重回帰分析によって分析し、韓国製自動車・液晶テレビへの支払い意志額決定要因を重回帰分析によって分析した。結果として、コンテンツの視聴によって、液晶テレビ、自動車共に支払い意志額を増大させることが確認されたが、コンテンツの視聴は直接的には市場拡大効果を持たないことも示された。文化影響力の深化が行われた場合にのみ市場拡大効果を持つという点が重要な結果として得られている。本年度は、2005年から続けている研究を英文論文"International Cultural Exchange and Economic Impact"にまとめた。英文論文では、文化影響力の市場拡大効果を計測する手法を提示している。第1に、コンテンツ産業の市場拡大効果を実証的に調べる手法を提示している。第2に、国際文化交流に基づく海外での文化影響力の深化を測定する手法を2つ提示した。一つは、CVMによるフィールド調査法である。次に、コンジョイント法による測定法である。これらの調査方法のメリットは、市場で供給されていない財の価値を測ることができることであり、国際文化交流のような、市場で取引ができない財の価値額を測る場合には、望ましい方法といえよう。
発電を伴う二次代謝産物生産リアクターの開発

微生物燃料電池(microbial fuel cell:MFC)は、微生物が有機物等の基質を分解し、生じる電子を電極で回収し、電気エネルギーとして利用するシステムである。微生物を触媒として用いるため、様々な有機物が含まれる廃水等を基質として利用でき、廃水処理と同時に電力生産を行う応用が期待され、本研究では、MFCによる発電と同時に有用物質生産を行い、廃水処理及び電力生産、有用物質生産を同時に行うシステムの構築を目的とし発電と抗生物質の生産を同時に行うことに成功した。食糧生産の要は農業であり、その根源は肥料と農薬の使用にある。肥料、農薬ともに石油資源に依存するため、今後の石油資源の高騰や枯渇への対策として、バイオマスに依存する持続可能な農業が模索されている。このような背景の中、本研究では、植物の病原性微生物である糸状菌の抑制能を持つ微生物を用いた微生物燃料電池MFC(Microbial Fuel Cells)の開発を目的として研究を行っている。用いる微生物には植物病原菌の抑制活性があるため、増殖した微生物菌体、代謝産物を含むアノード槽の廃液、抽出される二次代謝産物のすべてが利用形態の異なる有効利用の可能性がある。先ず、植物病原性糸状菌に対して強い抗菌活性を示す菌株を用いた微生物燃料電池の構築を試みた。微生物燃料電池のアノード槽は、静置培養となるため、発電に用いる微生物の静置培養と振盪培養における抗菌活性物質生産量の比較をバイオアッセイにより行った。その結果、幅広い抗真菌活性を示す抗菌物質生産菌において、静置培養と振盪培養における抗菌活性が同等あるいはやや強いという結果が得られ、アノード槽の培養に適しているという結果が得られた。そこでこの菌を用いて微生物燃料電池を構築したところ発電が認められた。アノード槽にメディエーターとしてメチレンブルー(MB)を添加したところ、無添加時に比べて発電量の増大が認められた。この条件下において、抵抗を繋いだ発電時と開回路時の抗菌物質の生産性についての比較を行ったところ、発電時の方が開回路に比べて抗菌活性が同等かあるいはやや強いという結果が得られた。発電により菌体内電子が減少するため、抗菌物質生産にとってマイナスの影響が出ることが予想されたが、本菌の場合、影響がないか増大するという結果が示されたため、他の微生物や抗菌物質の生産においても同様の傾向が認められるのかという興味深い発見となった。持続可能な社会における農業として環境保全型農業が重要視されている。つまり、食糧生産の要となる農業において肥料、農薬ともに、石油資源への依存ではなく、バイオマスに依存する持続可能な農業が常用である。このように持続可能な食糧生産が重要視される中、本研究では、植物を病気にする植物病原菌を用いた微生物燃料電池MFC(Microbial Fuel Cells)の開発のために、植物病原菌抑制能を有する、微生物を用いた燃料電池の構築を試みた。その結果好気性菌の場合は、抗菌物質生産量が低くなるため、通性嫌気性菌が適していることが示された。このため、栄養価の変動にも強いと考えられる、低栄養条件下においても増殖可能な植物病原菌抑制能を持つ菌株を用いた微生物農薬の構築を試みたところ、前述の好気性菌を超える抑制能を示す菌が発電と抗菌物質の生産に適していることが示された。昨年度の実績では、アノード槽に電子の菌体から電極までの運搬にメディエーターとしてメチレンブルー(MB)を添加していたが、今回見出された菌の場合、メディエーターの添加なしの条件下においても発電と抗生物質を行うことが示された。このことは実用的な局面を考えた場合に非常に有利な条件になると考えられた。そこでこの条件下において、抵抗を繋いだ発電時と開回路時の抗菌物質の生産性についての比較を行ったところ、発電時の場合も開回路と比べて抗菌活性が同等であるという結果が得られた。発電により菌体内電子が減少するため、抗菌物質生産にとってマイナスの影響が出ることが予想されたが、メディエーターを添加しない条件においても発電が可能でかつ物質生産も行うという結果が示されたため、アノード廃液の有効利用が可能となることが示され、次年度の研究においてアノード廃液の微生物農薬としての直接利用という検証すべきテーマが明確になったといえる。昨年度見出された、植物病原菌に対して抗菌活性を示す微生物による微生物燃料電池の構築という点において、抗菌活性を示す物質生産と発電の両方が確認された微生物を超える抑制能と発電量を示す微生物が見出されたことから昨年度からさらに発展したと判断した。しかも、抵抗を繋いだ発電時においても抗菌活性を示す微生物による燃料電池は、開回路時の抗菌物質生産と同等であるという結果が示されたため、活性の強い微生物であることが示された。また、昨年度と異なり、メディエーターが不要であることが示されたため、アノード廃液を直接、微生物農薬として有効利用できる可能性が示された。このことから、アノード廃液を用いた植物病抑制実験が可能なところまで研究が到達したと考えられる。世界的な人口増加に伴い、持続可能な食糧生産は重要な課題となっている。本研究では微生物燃料電池(MFC)の新規利用方法の検討として、発電を行いながら有用物質の生産を試みた。有用物質生産菌としてはスクリーニングにより得られたKSとDEを用いて別々のMFCを構築し、発電による有用物質生産への影響を検討した。スクリーングされた両菌はともにグラム陰性菌であり、低栄養から高栄養まで、幅広い栄養条件下で良好な成長を行うことが出来た。また、広範囲の抗真菌ス

ぺクトルと強い抗真菌活性を示すことが知られているピロールニトリンを生産し、苗立枯れ病の原因である植物病原菌Rhizoctonia solaniの成長をin vitroで抑制することができた。MFCの簡素化と低価格化のためメディエーター無添加の条件でも発電および物質生産が行われたため、植物体を用い、発電後及び、非発電後の培養液による植物病感染防除試験を行った。その結果アノード槽の廃液を添加したポットでは感染は見られず、植物病原菌から植物体(キュウリ)を防御したことが示された。また、DE株の培養液を塗布する事によるキュウリへの悪影響は見られなかった。このことから、発電を伴う培養を行ったDE株の培養液も、植物病原菌から植物を防御する微生物農薬としての利用可能性が示された。廃棄物利用の可能性を探るため米糠およびモデル物質としてポリペプトンのみを基質とするDE株のMFCの性能評価と抗真菌活性試験を行ったところ、ポリペプトン添加条件ではコントロールと同程度の電力を示した。しかし、米糠添加時では濃度の増加に伴う電力生産の増加は認められず、抑制能力も減少したが、米糠による発電、抑制物質生産が行われた。これらのことから廃液をアノード槽に連続的に注入することで、アノード廃液を微生物農薬として用い、かつ廃液処理と電力生産を同時に行うことの可能性が示された。微生物燃料電池(microbial fuel cell:MFC)は、微生物が有機物等の基質を分解し、生じる電子を電極で回収し、電気エネルギーとして利用するシステムである。微生物を触媒として用いるため、様々な有機物が含まれる廃水等を基質として利用でき、廃水処理と同時に電力生産を行う応用が期待され、本研究では、MFCによる発電と同時に有用物質生産を行い、廃水処理及び電力生産、有用物質生産を同時に行うシステムの構築を目的とし発電と抗生物質の生産を同時に行うことに成功した。先ず、初年度の目標である植物病原菌に対して抗菌活性を示す微生物による微生物燃料電池の構築は可能かという点において、抗菌活性を示す物質生産と発電の両方が確認されたことからおおむね順調に進んでいると判断した。しかも、抗菌活性を示す微生物による燃料電池を構築したところ、抵抗を繋いだ発電時と開回路時の抗菌物質生産の比較において、発電時の方が開回路に比べて抗菌活性が同等かあるいはやや強いという結果が得られた。これは、発電により菌体内還元力の流出が起こり抗菌物質生産にとってマイナスの影響が出るのではという予測と逆の結果であり、他の抗菌物質生産微生物においても同様の傾向が認められるのか否かという興味深い問題提起がなされた。今後は、培地濃度の変更や、抗菌活性を示す微生物濃度の変更等を含むと燃料電池の作動条件の改良により、発電効率と抗菌物質生産能の向上を目指す。そして、その高い発電効率を示す条件下における抗菌物質を含むアノード廃液を微生物農薬として使用可能か検証する植物実験を行う。この植物実験と並行して電極表面のバイオフィルム形成能に着目することで、微生物燃料電池が、バイオフィルム形成を伴い、発電を行い、かつ有用物質を生産するというリアクターとしての機能を見出すことができるかについても着目する。生物工学
ドコサヘキサエン酸による血管細胞機能修飾機序に関する分子薬理学的研究

本研究の目的は脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)と正常血圧のウィスター系京都ラット(WKY)由来培養血管平滑筋細胞および内皮細胞の主に一酸化窒素(NO)産生に対するDHAとEPAの影響を分子薬理学的に検討することであった。SHRSPの血管平滑筋細胞ではWKYに比べてIL-1β刺激によるiNOS蛋白発現量が相対的に低下しているが、DHAとEPAはWKY由来血管平滑筋細胞のiNOS蛋白発現を亢進した。IL-1β刺激によるiNOS mRNA発現はWKYとSHRSP由来細胞間で差は認められなかったが、DHA及びEPAはWKY由来細胞においてその発現を促進した。しかしSHRSP由来細胞ではその作用が認められなかった。また、アラキドン酸代謝系についても検討したところ、DHA処理によりシクロオキシゲナーゼ(COX)-1は変化しないが、誘導型酵素であるCOX-2蛋白発現が増加した。IL-1β刺激によるCOX-2 mRNA発現はWKYとSHRSP由来細胞間で差は認められず、DHAはその発現に対してはWKY及びSHRSP由来細胞においても有意な影響を示さなかった。次に、SHRSP及びWKYの血管内皮細胞での検討を試みたが内皮細胞の単離、培養が困難であったため、ウシ血管内皮細胞を用いて検討を行った。その結果、DHAはIL-1β刺激および無刺激血管内皮細胞のNO産生に対してはわずかであるが抑制作用を示し、eNOS蛋白発現に対しては有意な影響を示さなかったが、iNOS蛋白発現に対しては促進作用を示した。以上、DHAの作用は細胞により異なること、血管平滑筋細胞ではDHAとEPAはiNOS遺伝子の転写以前で促進作用を示し、COX-2遺伝子には転写以後で促進作用を示し、これが多価不飽和脂肪酸の循環器疾患の有用性に関連することが示唆された。本研究の目的はDHAの循環器疾患に対する予防薬あるいは治療薬としての有用性を明確にするために、脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)と正常血圧のウィスター系京都ラット(WKY)由来培養血管平滑筋細胞および内皮細胞の細胞内カルシウム代謝と一酸化窒素(NO)産生に対するDHAの影響とその作用機序を分子薬理学的に検討することであった。本年度の目的は、SHRSPおよびWKY由来の培養血管細胞を用いて、ドコサへキサエン酸(DHA)のiNOSおよびeNOS蛋白発現量、mRNA発現量に対する影響を比較検討することであった。その結果、SHRSPの血管平滑筋細胞ではWKYに比べてIL-1β刺激によるiNOS蛋白発現量が相対的に低下しており、これがNO産生の低下の原因であることが示唆された。DHAはWKY由来血管平滑筋細胞のiNOS蛋白発現を亢進したが、SHRSPでは作用が認められなかった。現在、EPA及びアラキドン酸のiNOS蛋白発現に対しても同様に検討している。その結果、DHAはIL-1β刺激および無刺激血管内皮細胞のNO産生に対してはわずかであるが抑制作用を示した。さらに、eNOS蛋白発現に対しては有意な影響を示さなかったが、iNOS蛋白発現に対しては促進作用を示した。このことから、DHAのNO産生系に対する作用は細胞種やNOSのアイソフォームにより異なることが示唆された。mRNAの発現に関する検討は技術的検討の段階であり、次年度の課題として残された。

本研究の目的はドコサヘキサエン酸(DHA)の循環器疾患に対する予防薬あるいは治療薬としての有用性を明確にするために、脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)と対照動物のウィスター系京都ラット(WKY)由来培養血管平滑筋細胞および内皮細胞の細胞内カルシウム代謝と一酸化窒素(NO)産生に対するDHAの影響とその作用機序を分子薬理学的に検討することであった。平成11年度までの研究で、SHRSPではWKY由来血管平滑筋細胞に比べてNO産生が低下していること、WKY由来血管平滑筋細胞においてDHA及びEPAはIL-1β刺激によるNO産生、iNOS誘導を促進するが、アラキドン酸はNO産生に対してはむしろ抑制することが明らかとなった。そこで、前年度において実験条件の検討段階であったiNOS mRNA発現のRT-RCP法を確立し、多価不飽和脂肪酸の影響を比較検討したところ、IL-1β刺激によるiNOS mRNA発現はWKYとSHRSP由来細胞間で差は認められないこと、WKY由来細胞においてDHA及びEPAはその発現を促進すること、SHRSP由来細胞ではその作用が認められにくいことなどが明らかになった。また、前年度において、NO産生系とともに循環調節に重要なアラキドン酸代謝系についても検討し、シクロオキシゲナーゼ(COX)-1は変化しないが、誘導型酵素であるCOX-2蛋白発現がDHA処理において増加することも明らかにした。そこで、COX-2 mRNA発現に対する多価不飽和脂肪酸の影響についても検討したところ、IL-1β刺激によるCOX-2 mRNA発現はWKYとSHRSP由来細胞間で差は認められないこと、DHAはその発現に対してはWKY及びSHRSP由来細胞においても有意な影響を示さないことが明らかになった。従って、DHAはiNOS遺伝子の転写以前で促進作用を示し、COX-2遺伝子には転写以後で促進作用を示すことが示唆された。また、SHRSPではこれら誘導型酵素の転写以後の過程に障害があり、このことがSHRSPの病態に関連しているものと考えられた。
iPS細胞技術に骨再生促進化合物を応用した垂直的・広範囲の歯槽骨増生技術の開発

本研究の目的は,iPS細胞を補綴・インプラント治療において求められる垂直的骨増生技術として臨床応用するための研究基盤を確立することである。これまでに同定した小分子化合物は,マウスiPS細胞の骨芽細胞分化を促進し,成熟した骨芽細胞へ分化可能であることが明らかとなった。さらに,pNIPAAmゲルを用いて作製したiPS細胞集合体は,骨組織に特異的なリン酸カルシウムを含んでいることが明らかとなった。補綴・インプラント歯科治療において,広範囲かつ垂直的な骨欠損部位に対して,安全かつ確実に欠損骨を再生する「垂直的骨増生技術」が求められている。申請者は,個々の患者から作製可能なiPS細胞が,歯槽骨の再生医療に有用である可能性に着目した。本研究の目的は,ケミカルバイオロジーおよびスキャフォールドフリーのアプローチによって,数千種類もの生理活性化合物の中からiPS細胞の骨形成を強力に促す分子を同定し,さらには,補綴歯科治療において切望される垂直的な歯槽骨再生医療技術として臨床応用へと展開するための研究基盤を確立することである。これまでの研究成果により同定した骨芽細胞の分化を促進する小分子化合物を用いて,マウス間葉系幹細胞およびiPS細胞の骨芽細胞分化に及ぼす影響を検討した結果,同定した小分子化合物は,ハイドロキシアパタイトの結晶構造を有する成熟した骨芽細胞まで分化誘導可能であることが明らかとなった。また,三次元培養の確立へ向け,iPS細胞集合体を作製するモールドデザインについて検討し,三次元プリンタにてモールドを造形した。現在のところ,pNIPAAmゲルを用いたiPS細胞集合体の作製に必要な至適細胞濃度および凝集期間の検討を行なっており,詳細を検討していく予定である。補綴・インプラント治療において,広範囲かつ垂直的な骨欠損部位に対して,安全かつ確実に欠損骨を再生する「垂直的骨増生技術」が求められている。本研究の目的は,ケミカルバイオロジーおよびスキャフォールドフリーのアプローチによって,数千種類もの生理活性化合物の中からiPS細胞の骨形成を強力に促す分子を同定し,さらには,補綴歯科治療において切望される垂直的な歯槽骨再生医療技術として臨床応用へと展開するための研究基盤を確立することにある。これまでの研究成果により,同定した骨芽細胞の分化を促進する小分子化合物を用いて,マウス間葉系幹細胞およびiPS細胞の骨芽細胞分化に及ぼす影響を検討した結果,同定した小分子化合物は,ハイドロキシアパタイトの結晶構造を有する成熟した骨芽細胞まで分化誘導可能であることが明らかとなった。さらに,iPS細胞を移植する際に必要となる三次元培養法の検討を行うため,pNIPAAmゲルを用いたiPS細胞凝集体を作製し,骨芽細胞へ分化誘導を行った結果,骨組織に特異的なリン酸カルシウムの存在を認めた。以上の結果より,骨芽細胞分化促進作用を有する小分子化合物および細胞のみで構成される三次元的な集合体を移植材とする技術に,iPS細胞技術を応用することは,垂直的かつ広範囲の骨組織再生に適した新技術である可能性が示唆された。現在iPS細胞集合体の作製モデルまで検討しており,さらに三次元培養に向けた実験のセットアップを行なっているため。歯科補綴学・再生医学今後は引き続き三次元培養のセットアップを行なっていくのとあわせて,動物実験に向けて,さらなる研究成果の詳細を検討していく予定である。当初予定していた計画より研究進行が順調に進んだため。三次元培養システムのより詳細な条件検討を追加で行なう。
地方都市における孤島型ニュータウンの住替モデル構築に関する研究

本年度は孤島型ニュータウンにおける居住環境評価およびニュータウン及びその周辺への定住について、室蘭市の白鳥台N.Tの市営住宅および道営住宅を対象に調査を行った。居住環境評価では、45の市営住宅を対象に管理状況により4分類し、居住評価および定住意識の関連を把握した。調査結果より管理の善し悪しが居住環境評価と送還するのに対し、定住意識との相関までは見られなかった。定住意識および実際の定住に関しては、室蘭市にある2239戸の市営住宅を対象に、居住評価を把握し、その立地条件、居住者年齢などとの関連を把握した。居住者らは、自ら住んでいる地域への希望している場合は、その地が市街地であること、一方で希望していない場合は郊外地であることが把握出来た。一方で室蘭市から提供された「住替え住所」を把握する場合、郊外地の方が自地区内での引っ越しが多いことが明らかになった。不動産業者らの取引データなどを確認すると、郊外地では不動産価格が安く、そのことが郊外地での住替え、すなわち定住を結果的に多く促していることが明らかになった。室蘭市および北海道庁、そして室蘭市宅建協会らの協力があり、十分なアンケートおよびヒアリングが可能となったため、順調な進展となっている。ニュータウンにおける居住実態と愛着の把握を行うために、本年度では居住の定着に着目している。当初はいくつかのニュータウンを比較して行うところが、同一市内を対象に行うことで定着に関する要因を把握することができた。今後は昨年度に訪問調査を行っている帯広市青空団地、そして函館市旭山団地などを対象に、ニュータウン間の管理状況による居住者評価(特に愛着行動)について把握を行う。本研究は、北海道における孤島型N.T型(母都市に接しない離れたニュータウン)の居住実態とその特性を捉え、居住地としての持続可能性を把握することを目的とした研究である。本年度は北海道室蘭市の白鳥台N.Tを対象に、全3425世帯の住民基本台帳、および平成27年度の都市計画基礎調査を用いて、「調査1」では住民の流入・流出の悉皆調査を行った。また「調査2」では他のニュータウン(帯広市大空団地)を比較すると共に、白鳥台N.Tについては、コミュニティ活動・意識に関して全世帯へのアンケート調査を行った。調査1の結果より、1)白鳥台へは約40%が中古住宅へ手移入していること、2)また中古住宅の43%は公営住宅からの転入であること、つまりニュータウン内もしくは室蘭市内での異動が大半であること、特に公営住宅が人口流入のポンプ機能を持つことが明らかになった。また、調査2の結果では、3)白鳥台N.Tに関しては、5ー9歳の人口が流失していること、一方で大空団地では流入が見られること、4)特に白鳥台N.Tの公営住宅居住者ではコミュニティ活動が低いことを明らかにした。その他、白鳥台N.Tでは、地域住民の特に連合町内会で行う行事が大空団地に比べ少ないことなどが把握され、これらより、白鳥台N.Tの子持ち世代の流出、特に公営住宅の子持ち世代の流出には、これらの催事開催回数や町内会不参加などが関連していると想定している。当初は全道にある145地区(札幌以外は96地区)のN.Tを対象に分類を行う予定であったが、北海道立総合研究機構北方建築総合研究所らと協同で調査が行えることになり、また室蘭市の全面的な協力もあり、室蘭市白鳥台の調査を重点的に行えることになった。結果的には次年度以降行う予定の調査を前倒しして行うことができ、次年度以降行うべき研究課題も抽出することができたため、「順調に進行」という判断を行った。今後については、白鳥台での調査に関しては、1)町内会活動などの実体的なヒアリング調査、2)公営住宅居住者のコミュニティに関する意向調査、3)全住民におけるまちづくりの方針把握について調査を行う。また、白鳥台N.Tと同様な状況にある帯広市の大空団地を比較対象にし、4)大空団地における活発なコミュニティ活動の実態調査、5)これら活動による公営住宅居住者のコミュニティ指向の上昇効果について調査を行う予定。

今後は昨年度に訪問調査を行っている帯広市青空団地、そして函館市旭山団地などを対象に、ニュータウン間の管理状況による居住者評価(特に愛着行動)について把握を行う。当初は全道にある145地区(札幌以外は96地区)のN.Tを対象に分類を行う予定であったが、北海道立総合研究機構北方建築総合研究所らと協同で調査が行えることになり、また室蘭市の全面的な協力もあり、室蘭市白鳥台の調査を重点的に行えることになった。よって、他都市に関する文献調査が本年度以降当てることを予定する。昨年度は帯広市青空団地の実態調査も重点的に行う予定であったが、全市におけるニュータウンの位置づけの確認が先決となり、近い場での調査となり、交通費などの予算を一部執行できなかった。本年度は帯広を含め、全道的な視点で比較調査を行うため、旅費などでこれらの残余費を執行する予定である。
心拍RR間隔周波数解析の神経性ショック予防モニターとしての実用化

12年度の研究から神経性ショック前後の心拍RR間隔周波数解析パラメーターの特徴は明瞭化できた。しかし、Mem Calc^【○!R】による周波数解析には数時間から短いものでも数10分を要し、モニターとしての有用性に欠けていた。13年度は心拍RR間隔収集装置(メモリー心拍計LRR-03^【○!R】)を購入し、Tarawa/winシステム^【○!R】を用いパーソナルコンピューターと接続し、リアルタイムに解析結果をモニタリングした。本研究の目的・内容を理解し、同意の得られた患者を対象とした。神経性ショック予防モニター実用化のため、周波数解析より得られたパラメーターの有用性を、臨床応用から検討した。全身麻酔覚醒時には非脱分極性筋弛緩薬の拮抗薬として、抗コリンエステラーゼ薬あるエドロホニウム(エド)やネオスチグミン(ネオ)が用いられる。しかし、アセチルコリン受容体の反応には運動神経伝達をつかさどるニコチン作用と、副交感神経(PSN)刺激症状を示すムスカリン作用があるため、一般にPSN遮断薬である硫酸アトロピン(アト)が併用される。自律神経への作用機序が明らかなこれらの薬物を投与した時のRR間隔を周波数解析し、低周波帯域(LF)、高周波帯域(HF)、LF/HFおよびエントロピー(ENT)(理論上最もランダムなものを100%、等間隔なものを0%と規格化)の表す意義・有用性について検討した。その結果、1.アト投与により、HF減少の持続、LF/HF一過性の上昇を認めた。2.エドおよびネオ投与によりすべての症例で心拍数が減少した。心拍数の減少とHFの上昇に明らかな関係はなかった。3.ENTはHFの増加に同調し、アトによって低下したことから、PSN活動を反映することが示唆された。しかし、頻脈時は低値を示し、その解釈には、今後さらなる検討が必要である。これまでの研究から、神経性ショック前は過度の交感神経緊張状態(LF/HFの上昇)が観察され、ショック状態では逆にPNS亢進(HF上昇)(ENT上昇?)することが判明した。つまり、LF/HFを観察すれば神経性ショックの予防は可能ということになる。しかし、RR間隔の周波数解析から得られる数値は個人差が大きく、評価の基準が現在無いのが現状である。今後、ホルター心電図を用いた24時間正常値、負荷試験による変動観察、あるいは術中の変化率など、個人の評価をどのように行なうかの指標が発見されれば神経性ショックを予防するモニターが実用化できると思われる。歯科外来にて発生する全身的偶発症で最も頻度の高い神経性ショックを事前に予測し、回避することができるモニターの実用化を目的とした本研究において、12年度はTarawa/winシステムを購入した。Mem Calcの周波数解析より得られたLF/HF、HF、平均RR間隔、および同時測定した血圧や呼吸のパラメーターとENTがいかなる関係にあるか検討した。Mem Calcについて:心拍RR間隔変動について、LFとHFに分けて考えられる。HFは主として副交感神経活動の活性を、一方、LFは交感神経と副交感神経の活動を示すとされる。またパワー比(LF/HF)は自律神経のバランスの変動を示す指標であり、交感神経活動が抑制されるとLF/HFは低下すると考えられている。ENTについて:直近数拍のRR間隔からなるパルス時系列のエントロピーを理論上の最もランダムなものを上限(100%)、等間隔なものを下限(0%)と規格化したENTとする。その結果、LF/HFが安定しているにも関わらず、ENTが大きく変動する症例や、逆にLF/HFの変化に対しENTが変動しない症例もあり、一定の傾向がみられない現状である。しかし、ENTは0100の単位のない指標、周波数解析も対数表示(パワー)と一定表示(アンプリチュード)の場合ではトレンド観察において、変化の様相は大きく異ってくることと、個人差が大きいことが判明した。したがって、単位変化の意義が異なっている可能性がある。今後詳細な検討を加えることで、リアルタイムに表示されるLF/HF、HF、ENTの適切な評価がなされ、ショック回避モニターの実現が可能になるものと思われる。

自律神経への作用機序が明らかなこれらの薬物を投与した時のRR間隔を周波数解析し、低周波帯域(LF)、高周波帯域(HF)、LF/HFおよびエントロピー(ENT)(理論上最もランダムなものを100%、等間隔なものを0%と規格化)の表す意義・有用性について検討した。その結果、1.アト投与により、HF減少の持続、LF/HF一過性の上昇を認めた。2.エドおよびネオ投与によりすべての症例で心拍数が減少した。心拍数の減少とHFの上昇に明らかな関係はなかった。3.ENTはHFの増加に同調し、アトによって低下したことから、PSN活動を反映することが示唆された。しかし、頻脈時は低値を示し、その解釈には、今後さらなる検討が必要である。これまでの研究から、神経性ショック前は過度の交感神経緊張状態(LF/HFの上昇)が観察され、ショック状態では逆にPNS亢進(HF上昇)(ENT上昇?)することが判明した。つまり、LF/HFを観察すれば神経性ショックの予防は可能ということになる。しかし、RR間隔の周波数解析から得られる数値は個人差が大きく、評価の基準が現在無いのが現状である。今後、ホルター心電図を用いた24時間正常値、負荷試験による変動観察、あるいは術中の変化率など、個人の評価をどのように行なうかの指標が発見されれば神経性ショックを予防するモニターが実用化できると思われる。
ＧＰＩアンカーによるタンパク質選別輸送の制御機構の解明

昨年度までに、GPIアンカー型レポータータンパク質の細胞表面発現が低下するC41変異株について、責任遺伝子の同定を行い、ドリコールリン酸マンノース利用に関わる遺伝子MPDU1が責任遺伝子であることを明らかにした。さらに、GPIマンノース転移酵素遺伝子の一つであるPIGVによってもC41の一部の表現型が回復した。今年度はさらにこの理由について解析を行い、PIGVが3つのGPIマンノース転移酵素のうち、基質であるドリコールリン酸マンノースの制限下において、律速段階となっていることを示した(Hirata et al (2013) J. Biochem.)。また、半数体細胞と遺伝子トラップ法を利用したGPIアンカー型タンパク質の輸送変異細胞群の取得を行い、変異細胞群から遺伝子変異部位の同定を網羅的に行った。その結果、GARPコンプレックスと呼ばれる4つの因子のうち、VPS51、VPS52、VPS54の3つの遺伝子上にトラップベクターが有意に挿入されていることがわかった。GARPコンプレックスはエンドソーム由来の輸送小胞をトランスゴルジネットワーク(TGN)に融合させる際に必要なtethering factorである。これらの遺伝子について、RNAiによるノックダウン、さらにCRISPR/Cas9によるノックアウトを行い、タンパク質順行輸送の遅延、特にゴルジ体から細胞膜への輸送遅延を引き起こすことを確認した。これらの結果より、エンドソーム-TGNの逆行輸送阻害がTGN-細胞膜の順行輸送に影響を与えることを明らかにした。高発現によってGPIアンカー型タンパク質を細胞膜から遊離させる機能未知遺伝子についても解析を行い、GPIアンカーを切断する新規な酵素遺伝子であることを明らかにしつつある。ノックアウトマウスの作製を行い、胎生致死を示すことが分かった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。これまでにGPIアンカー型タンパク質と結合するタンパク質として、p23、p24タンパク質を見出しており、本年度は両者の結合について、さらに詳しく調べた。GPIアンカーの構造変化を行う酵素変異細胞株(pgap1, pgap5, pgap2&3)を用いて、p23,p24の結合を調べたところ、pgap1およびpgap5変異細胞株でGPIアンカー型タンパク質との結合が減少した。すなわち、小胞体で行われる2つのGPIの構造変化(PGAP1によるイノシトール脱アシル化、PGAP5による側鎖エタノールアミンリン酸の除去)がp23、p24タンパク質との効率的な結合に必要であることが明らかとなった。これに対して、ゴルジ体で行われるGPI脂肪酸リモデリングに欠損があるpgap2&3変異細胞では、GPIアンカー型タンパク質とp23、p24との結合は野生株と同様であった。またp23をノックダウンした細胞ではGPIアンカー型タンパク質の小胞体出口部位へのソーティングに異常が生じており、小胞体からゴルジ体への輸送が遅延した。GPIアンカー型タンパク質とp23、p24タンパク質の結合はpH依存的であり、中性および弱塩基性では結合が見られるのに対し、弱酸性条件下では解離が見られた。GPIアンカー型タンパク質とpH依存的に結合するタンパク質として、上記のp23、p24に加えて、同じp24ファミリーに属するp25、p28を同定した。これらの結果はp24ファミリータンパク質がGPIアンカー型タンパク質の小胞体からゴルジ体への輸送を担う積荷受容体として機能していることを示すものである。また、GPIアンカーの脂肪酸リモデリングに関連する遺伝子として、機能未知遺伝子を取得した。この遺伝子を細胞に高発現するとGPIアンカー型タンパク質の細胞表面での発現が減少することまで明らかにしている。GPIアンカー型レポータータンパク質の細胞表面発現が低下する変異株C41について、性状分析と責任遺伝子の同定を行った。

その結果、GPIアンカー型レポーターのみならず、CD59やPLAPといったGPIアンカー型タンパク質の細胞表面発現あるいは活性が部分的に低下していることが明らかとなった。GPI生合成中間体を調べたところ、正常細胞に比べて、GPI中間体の蓄積が見られた。GPI生合成異常およびCD59の細胞表面発現が回復する遺伝子を同定し、変異解析から、MPDU1が責任遺伝子であることを明らかにした。MPDU1の詳細な機能は不明であるが、MPDU1に欠損がある場合、ドリコールリン酸マンノースを小胞体内腔で利用できなくなることが知られている。興味深いことに、この変異株においてMPDU1とともにGPIマンノース転移酵素IIであるPIGVを高発現することによってもGPI生合成異常、GPIレポーターおよびCD59の細胞表面発現が回復した。これらのことから、GPI生合成過程において、PIGVはドリコールリン酸マンノース利用が制限された際の律速段階となっている可能性が示唆された。またGPIアンカーの脂肪酸リモデリングに関連する機能未知遺伝子PGAP6aについて解析を進め、GPIアンカー型タンパク質の細胞膜から培養中への遊離を促進することを明らかにしている。この遺伝子産物の基質特異性や酵素活性の解析を進めると共に、生理的役割を解析するため、遺伝子欠損マウスの作製を開始した。GPIアンカーの構造依存的にp24ファミリータンパク質と効率的に結合することが分かり、p24ファミリータンパク質がGPIアンカー型タンパク質の積荷受容体として機能することを示すことができた。ゴルジ体からの選別輸送については、変異株を取得しており、責任遺伝子の発現クローニングに取り組んでいる。またGPIアンカーのプロセシングに関与する新規の遺伝子についても解析を行っている。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。GPIアンカーによるタンパク質の輸送・局在調節機構について、本年度は変異細胞株の取得(C41)と性状分析、GPIアンカー型タンパク質の細胞膜局在に関わる機能未知遺伝子(PGAP6a)の解析を進めており、おおむね順調に進展していると考えている。引き続き、GPIアンカーのプロセシングを行う新規遺伝子について解析を行う。単離されたGPIアンカー型タンパク質の輸送変異株についても引き続き、性状解析と責任遺伝子の発現クローニングを行う。発現クローニングは、別途調製したcDNAライブラリーを試してみる。これまでのレポータータンパク質(GalA-GPI)に加えて、別のリソソームタンパク質をGPIアンカー型にしたレポータータンパク質を作製し、より感度良くトランスゴルジネットワークからのGPIアンカー型タンパク質の選別輸送をモニターできる系を構築する。