hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規β-ヒドロキシアスパラギン酸変換酵素の探索

平成18年度はD-threo-3-ヒドロキシアスパラギン酸デヒドラターゼの探索と精製を行った。3-ヒドロキシアスパラギン酸(HO-Asp)はアスパラギン酸の構造アナログであり、4つの光学異性体を持つ。すでに4つの異性体のうちL-threo-HO-Aspに作用するデヒドラターゼがPseudomonas sp.T62から発見されている^<(1)>。本研究では、これまでに報告がないD-threo体を特異的に変換する酵素を探索し、その諸性質の解明をすることを目的とした。土壌よりD-threo-HO-Asp資化性菌を単離した。その後、TLCでD-threo-HO-Aspを減少させる速度が速い菌株を選抜し、無細胞抽出液のデヒドラターゼ活性を測定した。そのうち、最も高い分解活性を示したDelftia sp.HT23株からD-threo-HO-Aspデヒドラターゼを電気泳動的に均一に精製した。本酵素はMg2+やMn2+の金属要求性およびPLP依存性を示した。分子量はSDS-PAGE上で約41,000、ゲルろ過HPLC上で約36,000と見積もられモノマーと推定された。本酵素はD-threo体およびL-erythro体に対して高活性を示したが、L-threo体に対して微弱な活性を示した。このことから、本酵素はDL-threo-3-ヒドロキシアスパラギン酸の光学分割に利用できる可能性がある。本酵素はD-threo-HO-Aspに対して活性を示すデヒドラターゼの初めての例である。本酵素のN末端アミノ酸配列を解析した結果、本酵素のN末端はグラム陰性細菌のPutativeなアラニンラセマーゼなどと高い相同性を示した。【目的】3-ヒドロキシアスパラギン酸(HO-Asp)はアスパラギン酸の搆造アナログであり,2つの不斉炭素を持ち,4つの光学異性体を持つ.本研究では,光学分割にも有用であるD-threo-HO-Aspを特異的に変換する酵素を土壌中の好気性細菌から探索し,その諸性質の解明をすることを目的とした.【結果および考察】直接分離法で218株,集積培養法で219株のD-threo-HO-Asp資化性菌を単離した.TLCによって,それぞれから高分解活性を示した3株,14株を選択した.それらの株について,酵素活性測定を行ったところ,17株中16株はD-threo-HO-Asp dehydratase活性を持っていた.また,選択した株のうち15株はグラム陰性細菌Delftia属の菌であり,菌体レベルでの立体選択性は見られなかった.また,1株はグラム陰性細菌Pseudomonas属の菌であり,D-threo-HO-Aspと比べてL-threo-HO-Aspに高い活性を示した.平成18年度はD-threo-3-ヒドロキシアスパラギン酸デヒドラターゼの探索と精製を行った。
脳内における記憶情報の転送メカニズムの解明

脳内で記憶情報が転送されている直接的な証拠を示すために、1.特定の記憶を貯蔵している神経回路に遺伝子発現を誘導する技術、2.その神経回路が投射する脳内部位の神経回路を遺伝学的に追跡する技術、3.その投射先の神経回路を操作する技術、の3つを検討した。1について、海馬にて記憶貯蔵回路をCREB遺伝子によって誘導することは困難であることが判明した。そこで、光遺伝学を用いて人工的に記憶回路を誘導する技術を新たに考案した(未発表)。2についてWGA-Creを用いる方法が困難であったためVSVウイルスを使う方法を模索中である。3について、光遺伝学的手法を検討し、一定の成果を得ることができた。本研究は、脳内で記憶情報が転送されている直接的な証拠を示す点に有る。本研究を達成するためには以下の3つの要素技術が必要である。1.特定の記憶を貯蔵している神経回路に選択的に目的遺伝子の発現を誘導する技術。2.その神経回路が投射する他の脳内部位の神経回路を遺伝学的に追跡する技術。3.その投射先の神経回路を操作する技術である。1を達成するために、当初CREB遺伝子の強制発現を使う方法を模索したが、様々な条件検討の結果、海馬において記憶貯蔵回路をCREB遺伝子の強制発現によって誘導することは困難であることが判明した。そこで、光遺伝学を用いて人工的に記憶回路を誘導する技術を新たに考案し、それに対して一定の成果を得ることができた(未発表)。また、c-fos遺伝子を持つトランスジェニックマウスを用いる方法についても検討を開始した。2を達成するためにWGA-Creという遺伝子を用いる方法を模索したが、これについてもレンチウイルスを使って以前論文に発表された結果を再現することができなかっためVSVという別のウイルスを使う方法を現在も模索中である。研究半ばでは有るが、これらの成果が評価され、研究期間中に、筑波大学で独立した研究室を持つこととなり、本研究の完成を目指し現在も研究を継続中である。本研究は、PTSDなどのヒト疾患に応用することで、社会的に重要な意義を与えることができる。現在、筑波大学精神保健衛生グループ、国立精神・神経センター精神保健研究所との共同研究などにより、本研究の精神科領域への臨床応用可能性を模索中である。概要申請者は、記憶の転送メカニズムを光遺伝学により明らかにすることを目的としている。H24年度からの研究期間中、特に光遺伝学を用いた記憶の操作技術について、成果を上げることができた。例えば、光をマウス脳内に照射し海馬の機能を抑制させることで、実際にマウスの恐怖記憶の想起が抑制できることを示した。また、種々のセミナーでの研究発表、学会への参加(データについては未発表)、論文投稿等、精力的に研究活動を行った。来年度も継続して研究費の援助をいただけることで、本研究はさらに促進できることができると考えられる。具体的内容等本研究期間中に申請者は当研究に必須な要素技術の一つを完成させた。具体的には、神経活動を光により抑制可能な分子ArchTを脳内に発現するトランスジェニックマウス(ArchTマウス)を用いることで、恐怖記憶を一時的に消去することに成功した。このために、まずArchTマウスを文脈依存性恐怖条件付け課題(CFC)にて学習を行わせた。恐怖記憶の強さについては、標準的な基準であるマウスのすくみ運動を定量した。具体的には、文脈刺激となる箱にマウスを入れ、電気ショックを与えた。その24時間後にArchTが感受性のある光を、マウスの脳内に照射したまま、電気ショックを与えたのと同一の箱にマウスを戻した。通常、学習後に、電気ショックを与えた箱に戻すと、マウスはすくみ運動を示す。しかし、光を照射すると、このすくみ運動が起こらなかった。さらに24時間後に、同じマウスを光照射せずに同様に箱に戻した。すると、マウスはすくみ行動を示した。このことから、光刺激により恐怖記憶を一時的に消去できる、ということが示せた。本研究の必須要素として、神経結合部(シナプス)を超えて目的分子の発現を制御するシステムが必要となる。当初WGA-CREおよびTTC-CREを用いるシステムを、先行論文(Gradinaru et al., Cell, 2010,v141,p154)の方法とともに、さらに様々な改良を加えて検証したが、先行論文が示した結果を再現できなかった。

そこで、別の方法として最近発表された(Beier et al., PNAS, v108,p15414, erratum PNAS, v109,p9219)、VSVという種のウイルスの組み換えウイルスを用いる方法を採用することとした。本方法は、多少システムが複雑であるが、より確実に目的遺伝子を、対象となる神経細胞に一回だけシナプス結合をまたいで輸送できるという大きな利点がある。申請者は、組み換えVSVの作成で世界的に有名な、東京大学の河岡義裕教授に協力を得ることに成功し、本研究において組み換えVSVを利用するための技術移管を行っている。H24年度に、筑波大学へ移動となり、新しい研究室のセットアップのために時間を要しているが、セットアップが完了次第テスト用のVSVをマウス脳内に摂取することで、上記システムの実行可能性を検証する。H24年2月より、筑波大学の国際統合睡眠医科学研究機構に異動し、現在も申請した研究を完遂すべく、研究課題を継続して行っている。海馬にて、記憶を貯蔵する神経回路を遺伝学的に標識する方法として、最近c-fos-tTAマウスを使う方法が報告された(Liu et al.,Nature,2012,vol484,p381)。この方法では、申請者が当初計画していたc-fos promoterを用いて、活性化した神経をマーキングする、という原理は同じで有り、しかもマウスが市販されている。そこで、申請者は、新しいマウスを作製するという当初の予定を変更し、Liuらが報告した方法で、記憶を貯蔵する海馬の神経細胞を遺伝学的に標識する方法に変更する。本年度は、前記の通り、VSVベクターを用いた、経シナプス性Cre酵素の発現システムの導入を確立する。既に河岡教授を始め、国内外の研究者よりVSV作製のためのパッケージング細胞やプラスミドを入手している。これらの実験材料を用い、まずはCreを発現するVSVベクターが、実際に経シナプス移行をするかを検証する。その後、ASLV/A/TVA-Rを使ったシステムで実際に、記憶を貯蔵する神経回路をターゲットに感染実験を行う。本研究は、PTSDなどのヒト疾患に応用することで、社会的に重要な意義を与えることができる。現在、PTSD研究の先駆者である東京農業大学の喜田聡教授、国立精神・神経センター精神保健研究所室長の中島聡美博士に協力を得、本研究の精神科領域への応用可能性を模索中である。昨年度、当初の研究費使用計画から17万円の繰越金が生じた。これは、本研究計画期間中に、理研から筑波大学への異動が有り、この異動が研究計画立案時点では予測できなかったためである。筑波大学への異動後も、必要な大型の設備は移動先に整備されているため、本年度の研究費は、消耗品費:67万円、薬品費:70万円、旅費:50万円とする。
血液像及びpH濃度による乳歯歯髄炎の鑑別診断に関する研究

乳歯歯髄炎の診断には、長坂の臨床診断基準があるが、現在臨床上、歯髄の炎症の波及状態を客観的に、的確に鑑別できる方法はない。そこで、歯髄内の血液象及びpH濃度による乳歯歯髄炎の鑑別診断について検討した。血液像による鑑別診断の研究に関しては、臨床診断後、生活歯髄切断処理が必要とされた乳歯齲飽歯100歯を対象とし、歯髄内の血液像と摘出した冠部歯髄の病理像を比較検討するとともに、処理後の経過観察を行い、以下の結果を得た。1.冠部歯髄内の血液像では、リンパ球の比率が特異的に高いものが多く、歯髄炎の指標になると考えられた。2.冠部歯髄の病理像では、炎症程度(-)はなく、(+)37例、(++)47例、(+++)16例だった。3.(+)(++)の症例の血液像は、リンパ球の比率は60%以上が多かったが、(+++)の症例はいずれも57%未満だった。4.生活歯髄切断処置を行った87例のうち、臨床的並びにX線学的経過観察が行えた46例について予後判定を行った結果、生活歯髄切断処置で適切と思われた(+)(++)では42例中12例(28.6%)が不良だったが、生活歯髄切断処置が不適切と思られた(+++)では4例中4例(100%)が不良だった。5.冠部歯髄切断後、止血困難と判断した症例は、(+)で37例中12例(32.4%)、(++)で47例中12例(25.5%)に対し、(+++)は16例中10例(62.5%)と高率だった。6.冠部歯髄切断後、止血困難でしかも、歯髄内血液のリンパ球の比率が57%未満である場合は、抜髄処置へ移行した方が良いと考える。pH濃度による鑑別診断の研究に関しては、まず極少量の血液のpHを臨床的に測定可能な方法について検討した。その結果、口腔内で露髄出血部位に微小電極を浸漬して測定する方法では、一定値が得られなかっが、ガラス毛細管にて採血し、蒸留水で稀釈したpHを測定する方法では、簡易に測定が行えた。今後、さらに臨床において症例を増やし、歯髄炎の波及状態との関連性を検討していく予定である。目的:小児歯科臨床において,乳歯歯髄炎の診断を的確に行うことは難しい.特に,歯髄切断処置か抜髄処置かを選択する客観的な歯髄診断法は確立されておらず,より適切な歯髄処置を行うためには客観的な歯髄診断法が必要である.そこで,今回,歯髄切断処置を前提とした乳歯〓

蝕歯の冠部歯髄の血液像及びpH濃度による乳歯歯髄炎の鑑別診断について検討した.方法:長坂の臨床診断基準に従った臨床診査後,歯髄切断処置が必要とされた〓蝕歯を通法に従い,歯髄腔解放後,ガラス毛細管にて採血し,作製した薄層塗抹標本を顕鏡し,各種白血球の百分率を算出した.さらに,鋭匙にて可及的に摘出した冠部歯髄の病理組織像と血液像を比較検討した.また,血液のpH濃度については,少量の採血量でpHが測定できるように,あらかじめ健康な犬の静脈血を用いて,血液の希釈濃度とpHの関係を調べ,臨床的な血液のpH濃度測定方法を検討した.結果:1.歯髄切断処置が必要と診断された乳歯歯髄内の血液像では,リンパ球の比率が高かった.2.病理組織像では, 50症例中,炎症程度(-)はなく, (+)21例, (〓)21例, (〓)8例で, (+)(〓)は生活歯髄切断処置, (〓)は抜髄処置が適切と考える.3.(+)(〓)はリンパ球の比率は60%以上が多かったが, (〓)はすべて60%未満だった. 4.冠部歯髄切断後の止血困難症例数は, (+)4例(19.0%), (〓)5例(23.3%), (〓)6例(75.0%)だった. 5.冠部歯髄切断後,止血困難で歯髄内血液像のリンパ球の比率が60%未満の場合は,抜髄処置へ移行した方が良いと考える. 6.血液を蒸留水で希釈してpH濃度を測定した場合,濃度1%以下では濃度の増加に伴ってpHが上昇し,一定値をとらなかったので,今後,血液のpHを測定するにあたり,濃度を1%より高くする必要があると考える.目的:小児歯科臨床において、乳歯歯髄炎の臨床診断基準は確立されているが、未だ歯髄の炎症の波及状態を正確に把握することは難しい。しかし、より適切な歯髄処置を行うためには、歯髄の炎症の波及状態を客観的に、的確に診断する方法が必要である。そこで、生活歯髄切断処置を前提とした乳歯齲蝕歯の冠部歯髄内の血液像及びpH濃度による乳歯歯髄炎の鑑別診断について検討した。方法:対象は100症例に増やした。長坂の臨床診断基準に従った診査後、生活歯髄切断処置が必要とされた乳歯齲蝕歯を通法に従って髄腔開放後ガラス毛細管にて採血し、作製した薄層塗抹標本を検鏡して各種白血球の百分率を算出した。一方、鋭匙にて可及的に摘出した冠部歯髄の病理像を炎症程度別に(-)(+++)の4段階に分類し、血液像、冠部歯髄切断時の止血困難性、術後の臨床的及びX線学的経過観察結果と比較検討した。また、冠部歯髄内血液のpHについては、微小電極を用いて口腔内で直接に測定する方法と、採血後に稀釈して測定する方法を行い、検討した。結果:1.歯髄内血液像では、リンパ球の比率が高く、歯髄炎の指標とした。2.冠部歯髄の病理像では、(-)はなく、(+)37例、(++)47例、(+++)16例だった。3.血液像では、(+)(++)はリンパ球の比率は60%以上が多かったが、(+++)はいずれも57%未満だった。4.術後経過観察の結果、生活歯髄切断処置で適切と思われた(+)(++)は不良12例(28.6%)に対し、不適切と思われた(+++)は不良4例(100%)だった。5.冠部歯髄切断後の止血困難症例は(+)12例(32.4%)(++)12例(25.5%)に対し、(+++)は10例(62.5%)と高率であった。6.冠部歯髄切断後、止血困難かつリンパ球の比率が57%未満では抜髄処置へ移行した方が良いと考える。7.口腔内で直接歯髄内血液のpHを測定したが、一定の値を得られなかった。8.髄腔開放後、ガラス毛細管にて採血し、蒸留水で稀釈して血液のpHを測定する方法は、臨床応用が十分可能と考えられた。
先行学習における理解や思考を深める教師の働きかけ

2003年に鏑木は,先行学習を取り入れること提唱した。これは,市川(2004)の「教えて考えさせる授業」と軌を一にするもので,予習・授業・復習というサイクルで確かな学力の定着を図ろうとするものである。先行学習を取り入れた授業における解決課題は大別すると2つある。一つは予習内容すなわち理解確認課題である。理解確認課題は,教科書に掲載される基礎・基本的な知識であり,本時の目標でもある。これは授業前半に置かれる。他の一つは,理解深化課題である。これは,授業前半の理解確認場面終了段階において,わかったつもり状態(半わかり)になっている理解状況を,確かな理解(本わかり)に進ませるもので,授業後半に置かれる。本研究は,この「半わかりから本わかりへの橋渡し」を担う「理解深化課題の設定」に着目して,その具体を明らかにするものである。なお,本研究究の主たる分析対象は,20年度以前に実践した授業及び郡山市立橘小学校で開催した授業研究究会等を含む今年度実践した32回の飛び込み授業,計74(小学校70,中学校4)の学習指導における理解深化課題(算数・数学24,理科27,国語14,社会9)である。理解深化課題を分析するにあたっては,「(1)逆を考えさせる,(2)操作させる(3)極大極小を与える,(4)詳細に見る・考えさせる.(5)適用範囲の拡張を図らせる(6)不十分な条件を与える」の6観点を掲げ,その作り方の仮説とした。分析の結果,(1)14,(2)7,(3)5,(4)23,(5)19,(6)4となり,「該当せず」が2であった。該当しない2つの授業は国語の文学教材であった。この結果,仮説に該当するものが97.396となり,分析した授業に限ってではあるが,国語・文学教材以外の領域では,仮説を理解深化課題設定の観点として掲げることが適切であることがわかった。
実測航空機加速度を用いた空港滑走路の路面凹凸基準

本研究は,空港滑走路・誘導路の絶対的路面凹凸データの波長・振幅と,その上を実際に走行する航空機の走行中の挙動データ(速度・鉛直加速度・水平加速度)との定量的な関係を解明し,航空機の走行安全性を元にした空港滑走路・誘導路の路面凹凸の新しい評価手法・評価基準を構築することを目的として実施した.具体的には,1.航空機がどのような凹凸箇所を走行した場合に,走行時の鉛直加速度が大きくなるかを明らかにするために,東京国際空港C滑走路を北側および南側から離陸走行および着陸走行した航空機の時系列応答データを,航空機走行速度,走行時の鉛直加速度,走行位置,路面凹凸振幅,路面凹凸波長等に着目してデータ整理を行う.2.航空機走行時の応答を模擬可能な1自由度系モデルの基礎検討を実施する.3.上記1, 2を遂行するために必要となるデータの収集,実際の空港滑走路での計測および情報収集を実施する.平成20年度は,東京国際空港C滑走路の路面凹凸データを入手し,路面の波長分布,振幅分布の整理を行い,現状の滑走路の位置別凹凸性状について整理を行った.その結果,局所的に路面の凹凸が大きい場所があることがわかり,本研究において特に着目すべき位置であることを確認した.次に,実際にこの滑走路を走行した航空機の離着陸時の航空機加速度データ(速度・鉛直加速度・水平加速度)を入手し,路面の凹凸によって鉛直加速度が大きくなる位置,その位置での走行速度およびその加速度の大きさについて一部整理を行った.本研究は,空港滑走路・誘導路の絶対的路面凹凸データの波長・振幅と,その上を実際に走行する航空機の走行中の挙動データ(速度・鉛直加速度・水平加速度)との定量的な関係を解明し,航空機の走行安全性を元にした空港滑走路・誘導路の路面凹凸の新しい評価手法・評価基準を構築することを目的として実施した.具体的には,1.航空機がどのような凹凸箇所を走行した場合に,走行時の鉛直加速度が大きくなるかを明らかにするために,東京国際空港C滑走路を北側および南側から離陸走行および着陸走行した航空機の時系列応答データを,航空機走行速度,走行時の鉛直加速度,走行位置,路面凹凸振幅,路面凹凸波長等に着目してデータ整理を行う.2.航空機走行時の応答を模擬可能な1自由度系モデルの基礎検討を実施する.3.上記1, 2を遂行するために必要となるデータの収集,実際の空港滑走路での計測および情報収集を実施する.平成20年度は,東京国際空港C滑走路の路面凹凸データを入手し,路面の波長分布,振幅分布の整理を行い,現状の滑走路の位置別凹凸性状について整理を行った.その結果,局所的に路面の凹凸が大きい場所があることがわかり,本研究において特に着目すべき位置であることを確認した.次に,実際にこの滑走路を走行した航空機の離着陸時の航空機加速度データ(速度・鉛直加速度・水平加速度)を入手し,路面の凹凸によって鉛直加速度が大きくなる位置,その位置での走行速度およびその加速度の大きさについて一部整理を行った.
前脂肪細胞の分化誘導活性を指標とした2型糖尿病治療薬シーズの探索

2型糖尿病治療を改善する有力な鍵分子候補であるアディポネクチンの発現・分泌を促進する機能分子の探索とその作用機序の解析を行った。その結果、1.我々が確立したスクリーニング系を駆使して、ノビレチンがアディポネクチンの発現・分泌を促進することを突き止めたので、その促進機構を解明するためにperoxisome proliferator activated receptor γ(PPARγ)アゴニスト作用をまず解析したところ、ノビレチンにるアディポネクチン発現促進作用は、チアゾリジン誘導体とは異なりPPARγの活性化を介さない、という興味ある知見を見出した。またノビレチンのアディポネクチン発現促進作用に関与する分子中の官能基の同定も試み、一部明らかにすることができた。2.新しいスクリーニング系を用いて微生物培養エキスからST-13前駆脂肪細胞の分化誘導活性を示す化合物の探索をさらに行い、活性体として3種類の化合物の単離・同定に成功した。その中の1つである活性体についてはアディポネクチンの発現・分泌促進作用を定量的RT-PCR法ELISA、Western Blot法により解析したところ、本化合物が外因性のインスリン非存在下で、アディポネクチンのmRNAの発現量、またアディポネクチンタンパクの分泌量を濃度依存的に促進する傾向を示すことを見出した。3.アディポネクチンは血管新生に影響を及ぼすことが報告されている。そこでアディポネクチン分泌促進作用を示すノビレチンなどが血管新生に連結している内皮細胞機能にどのような作用を示すかを培養血管内皮細胞を用いて検討したところ、ノビレチンは血管新生に連結している複数の血管内皮機能を制御していることを示唆する知見を見出した。網膜症、動脈硬化症などの合併症を引き起こす糖尿病患者の約95%は、インスリン抵抗性を示す2型糖尿病である。従ってインスリン抵抗性改善作用を示す化合物は、2型糖尿病治療薬の新しい治療薬になる可能性を秘めているといえよう。しかし現在臨床応用されているインスリン抵抗性改善作用を示す2型糖尿病治療薬はチアゾリジン化合物しかない。それは、簡便かつ、一度に大量のサンプルを処理できるスクリーニング系がなかったからである。従ってもしチアゾリジン骨格とは異なる構造と作用機構をもち、かっインスリン抵抗性を改善する化合物をも検索できるスクリーニング系が確立されたならば、2型糖尿病克服の起爆剤になると期待できよう。我々はST・13前脂肪細胞の分化誘導活性を指標にすることによって、インスリン抵抗性改善薬シーズを検索できる新しいスクリーニング系を確立した。すなわち、インスリン抵抗性を改善する有力な鍵分子候補であり、脂肪細胞に特異的に発現している分泌蛋白であるアディポネクチンの発現・分泌を促進する機能分子の探索を本研究で行った。その結果、606種類の天然物由来の粗抽出物、精製化合物、合成化合物(最終濃度:単一化合物[10μM]、粗抽出物[400μg/ml])をアッセイしたところ、25種類(単一化合物あるいは粗抽出物)のサンプルがST-13前脂肪細胞を分化誘導することが顕微鏡観察によって判明した。そこでそのうちの一つであるノビレチンについて、その分化誘導作用をさらに詳細に検討した。中性脂肪含量はトリオレインを標準品にしてアセチルアセトン法によって、またタンパク量はウシ血清アルブミンを標準品にしてLowry法を用いてそれぞれ測定した。その結果、ノビレチンの濃度に依存して、処理した細胞中に含まれる中性脂肪含量が増加することが認められた。そこで、ノビレチンによりST-13前脂肪細胞が脂肪細胞に分化したかを分子細胞生物学的に明らかにするために、ノビレチンで処理したST-13細胞からmRNAを抽出しadipocyte protein 2(aP2)の発現をリアルタイムPCR(polymerase chain reaction法を用いて解析した。aP2は脂肪細胞に特異的に発現するタンパク質の一つであり、脂肪細胞の分化マーカーとして用いられているからである。

この測定の際、ハウスキーピング遺伝子であるGAPD且を用いて補正を行った。その結果ノビレチン処理したST13細胞では、ネガティブコントロールと比較してaP2の発現量が約220倍増加していた。このことから、ノビレチンは脂肪細胞への分化誘導作用を促進していることが分子レベルでも確認された。そこでアディポネクチンタンパク量をELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)を用いて、アディポネクチンmRNAの発現をリアルタイムPCR法を用いて解析した。その結果、ノビレチンは処理したST-13細胞中のアディポネクチンmRNA発現の促進を介して、細胞外へアディポネクチンタンパク質を分泌している可能性が示された。我が国においては、糖尿病患者の約95%はインスリン抵抗性を示す2型糖尿病である。しかし現在臨床応用されているインスリン抵抗性改善作用を示す2型糖尿病治療薬はチアゾリジン化合物しかない。従ってもしチアゾリジン骨格とは異なる構造と作用機構をもち、かつインスリン抵抗性を改善する化合物をも検索できるスクリーニング系が確立されたならば、2型糖尿病克服の起爆剤になると期待できる。我々はST-13前駆脂肪細胞の分化誘導活性を指標にすることによって、インスリン抵抗性改善薬シーズを検索できる新しいスクリーニング系を確立した。すなわち、インスリン抵抗性を改善する有力な鍵分子候補であるアディポネクチンの発現・分泌を促進する機能分子の探索とその作用機序の解析を本研究で行った。本年度は以下の点について研究を行った。1.我々が確立したスクリーニング系を駆使して、ノビレチンがアディポネクチンの発現・分泌を促進することを前年度見出した。そこでその促進機構を解明するためにperoxisome proliferator activated receptor γ(PPARγ)アゴニスト作用をまず解析した。その結果ノビレチンにるアディポネクチン発現促進作用は、チアゾリジン誘導体とは異なりPPARγの活性化を介さない、という興味ある知見を見出した。またノビレチンのアディポネクチン発現促進作用に関与する分子中の官能基の同定も試み、一部明らかにすることができた。2.新しいスクリーニング系を用いて微生物培養エキスからST-13前駆脂肪細胞の分化誘導活性を示す化合物の探索をさらに行い、活性体として3種類の化合物の単離・同定に成功した。その中の1つであるデクロログリセオフルビンについてはアディポネクチンの発現・分泌促進作用を定量的RT-PCR法ELISA、Western Blot法により解析した。その結果本化合物が外因性のインスリン非存在下で、アディポネクチンのmRNAの発現量、またアディポネクチンタンパクの分泌量を濃度依存的に促進する傾向を示すことを見出した。
筋タンパク質合成機構に対するアミノ酸投与と運動の効果に関する研究

現在、分岐鎖アミノ酸(BCAA)の生理作用の一つとして運動による筋肉痛や筋損傷に対する効果に多くの〓一般的に糖尿病ではBCAA代謝が亢進することが報告されている。これまでの糖尿病ラットの報告では1型糖尿病モデル動物を用いており、高インスリン血症である2型糖尿病についての報告はほとんどない。本研究では2型糖尿病モデルラットであるOLETFラットのBCAA分解の律速酵素(分岐鎖α-ケト酸脱水素酵素(BCKDH))活性の調節について検討し、BCAAの長期摂取がこの酵素に与える影響についても検討した。その結果、肝BCKDH活性および酵素量は、コントロールラットに比べてOLETFラットで有意に低下していた。これらの結果より、2型糖尿病ではBCAA代謝が抑制されていることが示唆された。さらに、これらのラットに高BCAA食を摂取させることで肝BCKDH活性が上昇したので、BCAA投与は2型糖尿病ラットのBCAA代謝を促進することが示唆された。分岐鎖アミノ酸(ロイシン、イソロイシン、バリン)は、筋タンパク質の必須アミノ酸の約35%、食事タンパク質の必須アミノ酸の40-50%もの多くを占めるアミノ酸である。分岐鎖アミノ酸は、タンパク質中の含量が高いこともあって、運動などによりエネルギー代謝が亢進した場合には比較的多く酸化分解されることが知られている。その他に、ロイシンについては、インスリンの分泌を刺激する作用、およびタンパク質合成を促進し同時にタンパク質分解を抑制する作用が知られている。このように、分岐鎖アミノ酸は必須アミノ酸であると同時に多様な生理作用を持つことが知られている。現在、分岐鎖アミノ酸の生理作用の一つとして運動による筋肉痛や筋損傷に対する効果に多くの関心が注がれている。我々は、非鍛錬女子学生16名を2群に分け、二重盲検クロスオーバーで被検者に5gの分岐鎖アミノ酸(Leu : Ile : Val=2.3:1:1.2)入り飲料あるいは等カロリー対照飲料150mLを摂取させ、その15分後にスクワット運動を負荷し、その翌日以降に大腿部骨格筋に発生する筋肉痛に対する効果を検討した結果、分岐鎖アミノ酸を運動前に摂取させることにより、有意に筋肉痛が軽減されることが認められた。この所見は、分岐鎖アミノ酸がスポーツに関連するサプリメントとして有用であることを示唆している。今後、これらの分岐鎖アミノ酸効果のメカニズムに関する詳細な検討が必要である。さらに、ラットにclofibrateを投与して分岐鎖アミノ酸代謝を促進し、血中の分岐鎖アミノ酸濃度を低下すると、肝臓におけるタンパク質合成が低下する可能性があることを発見した。分岐鎖アミノ酸(BCAA)は、筋タンパク質の必須アミノ酸の約35%、食事タンパク質の必須アミノ酸の4050%もの多くを占めるアミノ酸である。BCAAは、タンパク質中の含量が高いこともあって、運動などによりエネルギー代謝が亢進した場合には比較的多く酸化分解されることが知られている。このように、BCAAは必須アミノ酸であると同時に多様な生理作用を持つことが知られている。現在、BCAAの生理作用の一つとして運動による筋肉痛や筋損傷に対する効果に多くの関心が注がれている。我々は、非鍛錬女子学生12名を2群に分け、二重盲検クロスオーバー法で被検者に5gのBCAA(Leu:Ile:Val=2.3:1:1.2)入り飲料あるいは等カロリー対照飲料200mLを摂取させ、その15分後にスクワット運動を負荷し、その翌日以降に大腿部骨格筋に発生する筋肉痛に対する効果を検討した。その結果、BCAAを運動前に摂取させることにより、筋肉痛が有意に減少することが認められた。この現象に伴って、BCAA摂取により運動後の血清ミオグロビン濃度の上昇が抑制されたことより、BCAA摂取は運動による筋損傷を抑制することが明らかとなった。さらに、運動2日後に測定された脚伸展筋力は、コントロール実験では減少するがBCAA摂取により減少しないことも認められた。これらの所見は、分岐鎖アミノ酸がスポーツに関連するサプリメントとして有用であることを示唆している。さらに、骨格筋由来の培養細胞のBCAA分解系酵素発現をsiRNA法により変動させる実験において、BCAA代謝が促進される条件ではタンパク質合成が低下することを示唆する知見を得た。すなわち、BCAAがタンパク質合成を調節する重要な因子として作用することを支持する所見である。

分岐鎖α-ケト酸脱水素酵素(BCKDH)は,分岐鎖アミノ酸(BCAA)代謝の律速酵素であり,特異的なキナーゼ(BDK)によるリン酸化で不活性化される。BDKにはBCKDHに結合した結合型と遊離型が存在し,結合型のみが活性を示すことが知られている。これらの酵素活性は食餌や疾病などの影響を受けて変化し,BCAA代謝を調節すると考えられている。一般的に糖尿病ではBCAA代謝が亢進することが報告されている。一方でインスリンがBDKの発現量を高めるという報告がある。これまでの糖尿病ラットの報告ではインスリン欠乏性の1型糖尿病モデル動物を用いており,高インスリン血症である2型糖尿病についての報告はほとんどない。本研究では2型糖尿病モデルラットであるOLETFラットのBCKDH活性の調節について検討し,BCAAの長期摂取がこれらの酵素に与える影響についても検討した。OLETFラットを2型糖尿病モデルラットとし,LETOラットを正常の対照動物として用いた。8週齢時に食餌を標準食又はBCAA(5%)食に分け,[LETO/標準食],[OLETF/標準食],[LETO/BCAA食],[OLETF/BCAA食]の4群に分けた。19週齢時に肝臓及び血液を採取し,BCKDHとBDKの活性及びタンパク質量を測定した。肝BCKDH活性は,LETOラットに比べてOLETFラットで有意に低く,BCKDHの各サブユニットのタンパク質量も有意に減少していた。さらにOLETFラットにおける肝BDKでは,総タンパク質量が有意に減少しているにも関わらず,活性及び結合型のタンパク質量は有意な高値を示した。また,各ラットにBCAA食を摂取させることで肝BCKDH活性が上昇したが,BCKDHサブユニット量は変化しなかった。一方,BDKの総量,結合型量,およびBDK活性が有意に低下した。以上のことから,高インスリン血症であるOLETFラットでは肝臓におけるBCKDH活性の低下は,BCKDHの各サブユニット量の減少及びBDK活性の上昇に起因することが示唆された。また,BCAA食摂取によりOLETFラットのBCKDH活性が上昇したが,これは結合型BDK及びその活性の減少に起因することが示唆された。
集団における相互作用関係の解明と学級経営法について-学級崩壊の予防と対策-

平成11年度は、アンケート調査の結果から児童・教員・保護者の学級に対する意識を探った。アンケート項目ごとの集計を児童・教員・保護者間で比較し相互関係(単独の集計度数から導けるものや児童教員・保護者の比較から導けるもの)を調べ分析した。また、それぞれの項目間の見えない関係を見いだすため相関関係(相関係数・クロス集計)を調べ、日常的に行う学級経営の実践を振り返るヒントとしてまとめた。平成12年度は、アンケート調査の結果を基に、「多変量解析」という手法によって、学級の状況に影響を与えると考えられる因子を統計分析で導き出し、そこから学級崩壊の予防につながる学級経営改善のための方策を探ることをめざして研究を行った。まず、平成11年度に実施した意識調査のデータを基に、多変量解析による因子分析や主成分分析の手法を用い、学級ごとの特徴を3つの指標(健康度・規範意識・満足度)の形で表した。それを2次元散布図にグラフ化したものを「特性因子投影図」と呼ぶことにし、調査を行った106学級について計算し図示してみると、学級の状況が3つの指標で捉えることができた。次に12の設問から構成される意識調査「ふりかえりシート」を作成した。12の設問は、新たに考案したものではなく、前述のアンケート設問項目の中から統計的手法により調査に必要な設問項目をとりだしたもので、特性因子投影図と合わせて使用することで、担任が子どもの意識を通して学級経営を振り返り、改善の方向を知ることができるようにしたものである。学級担任が使用しやすいように、質問の回答を入力するだけで自己診断できるようCD-ROMにも収めている。以上の研究は、子どもの変化の兆しを予見することができ、学級崩壊の予防にもつながる。学級における児童・教員・保護者の相互の意識を探るためアンケート調査を実施した。1アンケート調査(1)調査の時期平成11年11月中旬12月中旬(2)調査対象者大阪府内7地域の41校の小学校、第5学年106学級の児童・教員・保護者(3)回収数(1)児童3231名(回収率97.6%)(2)教員848名(回収率85.7%)(3)保護者3034名(回収率91.6%)(4)分析の方法(1)アンケート項目ごとの集計により三者の間の意識を調べる(2)項目間の相関係数を調べ、各項目間の隠れた関係を見いだす(3)多変量解析の手法を用いる2分析内容(一部抜粋)(1)三者の意識の比較から見えたもの・保護者は、担任が思っているほど教育方針や指導法を理解していない。等(2)クロス集計と相関係数から見えたもの・気持ちのわかってくれる友だちが多いほど、学校が楽しいと意識していることがわかった。等(3)学級状況の2次元散布図から見えたもの・学級の今ある姿を平面上に図示することで、現在の学級の状況についてを把握することができた。○以上の内容について、全国教育研究所連盟第16期共同研究和歌山大会にて発表した。アンケート項目ごとの集計を児童・教員・保護者間で比較し相互関係(単独の集計度数から導けるものや児童・教員・保護者の比較から導けるもの)を調べ分析した。

平成12年度は、アンケート調査の結果を基に、「多変量解析」という手法によって、学級の状況に影響を与えると考えられる因子を統計分析で導き出し、そこから学級崩壊の予防につながる学級経営改善のための方策を探ることをめざして研究を行った。まず、平成11年度に実施した意識調査のデータを基に、多変量解析による因子分析や主成分分析の手法を用い、学級ごとの特徴を3つの指標(健康度・規範意識・満足度)の形で表した。それを2次元散布図にグラフ化したものを「特性因子投影図」と呼ぶことにし、調査を行った106学級について計算し図示してみると、学級の状況が3つの指標で捉えることができた。次に12の設問から構成される意識調査「ふりかえりシート」を作成した。12の設問は、新たに考案したものではなく、前述のアンケート設問項目の中から統計的手法により調査に必要な設問項目をとりだしたもので、特性因子投影図と合わせて使用することで、担任が子どもの意識を通して学級経営を振り返り、改善の方向を知ることができるようにしたものである。以上の研究は、子どもの変化の兆しを予見することができ、学級崩壊の予防にもつながる。
バイオレメディエーションにおける遺伝子組換え微生物利用による生態系への影響評価

平成19年度は、GEMs導入に伴う環境中の病原/有害微生物および一般微生物の微生物構造の変遷の評価を中心として、研究を実施した。2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)模擬汚染土壌スラリーを作成し、フラスコサイズのマイクロコズムを構築して、ここに2,4-Dの部分分解遺伝子をコードしたプラスミドを保持した2,4-D分解菌Pseudomonas putida KT2440(pJP4)あるいはEscherichia coli HB101(pJP4)をモデルGEMsとして植種し、系内における微生物群集をT-RFLP法によって解析するとともに、病原微生物を、DNAマイクロアレイを用いて網羅的に検出、解析した。T-RFLP法による微生物群集の解析の結果、実験開始直後は導入菌(モデルGEMs)に由来するT-RFが優占していたが、実験開始40日あるいは70日後には、モデルGEMs由来のT-RFは検出限界以下となり、モデルGEMsを導入していないコントロール系とほぼ同様の微生物群集構造となった。また、DNAマイクロアレイを用いた病原微生物の検出、解析の結果、実験開始時には51種類の病原微生物が検出されたが、モデルGEMsを導入した系では、実験開始後20日あるいは70日後には、コントロール系に比べて、病原微生物が減少する傾向が確認された。以上の結果より、GEMs導入による微生物生態系へ与える影響はほとんどないものと考えられ、また、病原微生物の増加に伴うバイオリスクの上昇の可能性は低いものと考えられた。平成18年度は主としてGEMs導入に伴う遺伝子水平伝播頻度の定量評価に重点をおき、(1)環境中におけるGEMsから土着微生物への組換え遺伝子の水平伝播頻度の評価、(2)環境中における土着病原/有害微生物からGEMsへの病原/有害性に関わる遺伝子の水平伝播頻度の評価、の2点について検討を行った。モデルGEMsとして自己伝達性プラスミドpJP4、RP4、あるいは可動化プラスミドpBH500を保持させたEscherichia coli C600あるいはPseudomonas putida BH5を使用し、水環境や土壌環境を模擬した2,4-D汚染/非汚染マイクロコズムを用いて、環境中における接合伝達頻度を定量化した。その結果、可動化プラスミドではプラスミドの水平伝播は確認されなかったが、自己伝達性プラスミドでは、最大で10%程度の土着菌にプラスミドが水平伝播し、transcojugantが形成された。これらの中には、導入したGEMsと系統学的に異なる種に属する微生物も含まれており、接合伝達によるプラスミドの伝播が環境中の多様な種の微生物に対し生じたことが明らかとなった。また、病原微生物の多くがプロテアーゼ活性を有する点に着目し、プロテアーゼ活性を有しないモデルGEMsを導入して、マイクロコズム試験を行い、カゼイン含有培地におけるハロー形成能による、プロテアーゼ活性獲得GEMsの定量化を試みた。しかし、遺伝子水平伝播によるプロテアーゼ活性獲得GEMsは検出されなかったことから、GEMsの導入によって土着病原/有害微生物から病原/有害性遺伝子がGEMsへ接合伝達される頻度は、表現型手法での検出限界以下となり、極めて低いことが示された。
稼働世帯の被保護階層への流入と救済―現代的貧困の原点としての「エネルギー革命期」

今年度は、主として資料収集を集中的に行い、具体的には飯塚市、直方市議会事務局、田川市立図書館、福岡県議会図書館などにおいて資料収集を行った。それと並行して生活保護制度、社会保障制度、労働政策、産炭地域振興政策に関する図書、資料を購入した。研究成果としては、まず、論文については、本研究と関連した「被占領期地方における生活困窮者救済:新潟県都市部の比較検討から」を『現代社会文化研究』に投稿し、さらに日本地域政策学会『日本地域政策研究』には「産炭地域振興政策の構想と挫折:北茨城市における重油専焼火力発電所の誘致計画を事例として」を投稿し、掲載されている。つぎに、学会報告については、資料収集とその成果を「筑豊炭田における炭鉱閉山と生活困窮者の救済:福岡県飯塚市を事例として」(日本社会福祉学会、2018年9月)、「筑豊炭田における生活困窮者救済:筑豊三都の比較検討から」(政治経済学・経済史学会、2018年10月)として、研究報告を行った。これらの研究と関連して、「『内発的発展」による産炭地域振興政策の展開:福島県旧内郷市の沼田市政を事例として」(日本地域政策学会、2018年7月)、「常磐炭砿茨城砿業所の閉山対策:磐城砿業所との比較から」(日本地域政策学会、2019年1月)の2つの報告も行った。なお、本研究に関連した炭鉱離職者対策と産炭地域振興政策に関する2論文が、現在、査読付き雑誌に投稿中である。また、2019年6月の日本地域政策学会において、「『外発的発展』と『内発的発展』との相克:北海道夕張市の産炭地域振興政策を事例として」の研究報告が内定し、さらに日本社会福祉学会における口頭発表を予定している。研究初年度である今年度は、当初予定どおり、「筑豊三都」である福岡県田川市、直方市、飯塚市において各議会資料調査を中心として行った。事前に予備調査を実施していたため、必要となる資料は概ね入手することができた。3市の調査により、田川市、直方市が地方財政再建促進特別措置法に規定される財政再建団体に指定されていることが確認できた。このことから「エネルギー革命期」における産炭地の被保護階層の膨張について、新たに財政再建との関係を論じる必要が生じた。そのため2019年度に実施予定であった福岡県嘉麻市(旧山田市)、中間市議会における各種調査を前倒して行った。その結果、田川市、直方市、中間市の3市が19501960年代にかけて石炭不況の関係から財政再建団体に指定されていた。具体的には、財政再建団体に指定されたことにより、現業員(ケースワーカー)の増員に制約がつけられたため、各種調査が不十分となり、その結果として被保護階層の膨張がみられている。したがって、先行研究で指摘されるように、炭鉱閉山による炭鉱離職者の被保護階層への流入という要因のみならず、行財政面の影響が、被保護階層の膨張に強い影響をあたえていることが示唆される。なお、財政再建団体との関係は、査読付き雑誌への投稿を予定している長崎県松浦市の事例でも確認することができる。また、学会報告に対しては、生活困窮者からの視点が弱いという有益な指摘を得られたので、新たに各議会陳情書の分析に着手している。今年度の調査では、台風の影響をうけ、調査予定地に赴くことができない期間が生じた。そのため予定を変更し、大牟田市立図書館における予備調査を前倒して実施した。今年度の調査によって蒐集した資料をもとに、次年度は、今年度以上に積極的に研究報告、論文を執筆を行い、早期的に成果を出すように心がける。とくに、筑豊5市に関する議会資料が早期に入手することができたため、これらの資料をもとに町村合併、財政再建団体指定と筑豊地域における生活保護制度の運用について、より詳細な分析を行いたい。上記の研究と並行して、次年度に調査予定としていた福岡県北九州市、旧5市(小倉市、八幡市、若松市、戸畑市、門司市)の議会資料、『西日本新聞』などの資料閲覧のため、北九州市立文書館、北九州市立中央図書館への訪問を予定している。とくに旧5市議会資料は、事前調査時と所蔵が異なり、すべての資料が北九州市立文書館に所蔵されたことから、当初予定よりも資料収集が容易になることが予想される。

これらの研究と関連して、「『内発的発展」による産炭地域振興政策の展開:福島県旧内郷市の沼田市政を事例として」(日本地域政策学会、2018年7月)、「常磐炭砿茨城砿業所の閉山対策:磐城砿業所との比較から」(日本地域政策学会、2019年1月)の2つの報告も行った。なお、本研究に関連した炭鉱離職者対策と産炭地域振興政策に関する2論文が、現在、査読付き雑誌に投稿中である。また、2019年6月の日本地域政策学会において、「『外発的発展』と『内発的発展』との相克:北海道夕張市の産炭地域振興政策を事例として」の研究報告が内定し、さらに日本社会福祉学会における口頭発表を予定している。研究初年度である今年度は、当初予定どおり、「筑豊三都」である福岡県田川市、直方市、飯塚市において各議会資料調査を中心として行った。事前に予備調査を実施していたため、必要となる資料は概ね入手することができた。3市の調査により、田川市、直方市が地方財政再建促進特別措置法に規定される財政再建団体に指定されていることが確認できた。このことから「エネルギー革命期」における産炭地の被保護階層の膨張について、新たに財政再建との関係を論じる必要が生じた。そのため2019年度に実施予定であった福岡県嘉麻市(旧山田市)、中間市議会における各種調査を前倒して行った。その結果、田川市、直方市、中間市の3市が19501960年代にかけて石炭不況の関係から財政再建団体に指定されていた。具体的には、財政再建団体に指定されたことにより、現業員(ケースワーカー)の増員に制約がつけられたため、各種調査が不十分となり、その結果として被保護階層の膨張がみられている。したがって、先行研究で指摘されるように、炭鉱閉山による炭鉱離職者の被保護階層への流入という要因のみならず、行財政面の影響が、被保護階層の膨張に強い影響をあたえていることが示唆される。なお、財政再建団体との関係は、査読付き雑誌への投稿を予定している長崎県松浦市の事例でも確認することができる。また、学会報告に対しては、生活困窮者からの視点が弱いという有益な指摘を得られたので、新たに各議会陳情書の分析に着手している。今年度の調査では、台風の影響をうけ、調査予定地に赴くことができない期間が生じた。そのため予定を変更し、大牟田市立図書館における予備調査を前倒して実施した。今年度の調査によって蒐集した資料をもとに、次年度は、今年度以上に積極的に研究報告、論文を執筆を行い、早期的に成果を出すように心がける。とくに、筑豊5市に関する議会資料が早期に入手することができたため、これらの資料をもとに町村合併、財政再建団体指定と筑豊地域における生活保護制度の運用について、より詳細な分析を行いたい。上記の研究と並行して、次年度に調査予定としていた福岡県北九州市、旧5市(小倉市、八幡市、若松市、戸畑市、門司市)の議会資料、『西日本新聞』などの資料閲覧のため、北九州市立文書館、北九州市立中央図書館への訪問を予定している。とくに旧5市議会資料は、事前調査時と所蔵が異なり、すべての資料が北九州市立文書館に所蔵されたことから、当初予定よりも資料収集が容易になることが予想される。本年度は、追加調査が必要となったため、前倒し支払請求を行ったが、なるべく安価となるように渡航計画を組んだ。そのため使用額が当初計画額よりも若干ながら下回った。
新規脳保護因子としてのC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の研究

初代培養アストロサイトにおいて、基礎状態ではほとんど認められなかったCNP mRNAはPACAP添加により経時的・用量依存的にその遺伝子発現は増大していった。さらに、CNP特異的radioimmunoassayを用いて、培地中のCNPの分泌量を測定したところ、遺伝子発現と同様に、PACAP添加により、経時的・用量依存的にCNPの分泌量は増大していった。対して血管内皮やマクロファージにおいてCNPの産生を増大させるTGF、TNF、IL-16、LPS、TPAなどの因子ではアストロサイトにおいてはCNPの産生は増大しないことから、中枢神経と末梢組織でのCNP生合成・分泌の調節機構は異なることが明らかになった。次に、中枢神経におけるCNPの機能について検討を行った。初代培養アストロサイトや神経細胞において、CNP添加を行うと経時的・用量依存的に細胞内のcyclic GMPの産生が増大することが明らかになった。また初代培養神経細胞及び、アストロサイトにおいて実験的虚血条件下培養下におけるCNPの作用について検討、まず低酸素条件で初代神経細胞4時間、アストロサイトは6時間培養を行った後、虚血条件を解除、グルコース、血清を添加し引き続き24時間培養した。結果、神経細胞においてCNPは実験的虚血条件下培養に対し用量依存的に細胞保護作用を有することが明らかになった。また、アストロサイトにおいても神経細胞に対する作用より弱いものの保護作用を有することが判明した。これらの結果よりPACAPの神経保護作用の一端をCNPが関与していることが示唆された。C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)は脳に最も高濃度に分布するにも関わらず、中枢神経作用はあまり明らかにされておらず、中枢での生合成分泌動態も不明のままである。そこで、CNPの中枢神経系における分泌動態及びその中枢神経作用を、神経-グリア-血管の機能連関の観点から解明することを本研究の目的とした。まず、ラット初代培養アストロサイトにおいてPACAP添加によりCNP遺伝子の発現が用量依存的・経時的に増大するのをRT-PCRで確認した。次に、CNP特異的RIAを用い、PACAP添加により用量依存的・経時的にCNPの分泌が増大することを明らかにした。また、血管内皮においてCNPの分泌を増大させるIL-1β、TNF-α、TGFは、アストロサイトにおいてCNPの分泌を増大させなかったことから、中枢神経系におけるCNPの生合成調節機構は血管内皮など末梢組織におけるそれとは異なることが示唆された。このように、PACAP特異的にCNPがアストロサイトから誘導されることから、PACAPの中枢神経作用へのCNPの関与が示唆された。また、CNPの血管内皮細胞保護作用が報告されていることから、PACAPの神経保護作用へのCNPの関連性の有無の検討を開始した。ラット初代培養神経細胞及びアストロサイトにおいてCNPの受容体であるGC-Bの遺伝子発現をRT-PCRにて確認し、CNP添加により細胞内cyclic GMP産生が用量依存的・経時的に増大されることを確認した。神経細胞の実験的虚血条件下培養に対する保護作用の有無を検討したところ、濃度依存的に神経細胞を生存維持させることを確認した。現在、アストロサイトにおいても、同様にCNPの細胞保護作用の有無を検討中である。今後CNPの神経細胞保護作用のメカニズムを解明するために、cyclic GMP以下の細胞内シグナルの検討を行う予定である。これまでの研究で我々は、初代培養アストロサイトにおいてはPACAP添加によりCNPの発現が遺伝子レベル並びにペプチドレベルで用量依存・経時的に増大するのをRT-PCR及びCNP特異的RIAを用いて確認したが、PACAP以外のNGFやBDNFなどの神経栄養因子や、血管内皮においてCNPの生合成を増大させるIL-1βやTNF-α・TGFは、CNPの生合成を増大させないことがわかった。これらの結果から、中枢神経系におけるCNPの生合成機構は血管内皮など末梢組織におけるCNPの生合成機構とは異なることが明らかになった。

次に、初代培養アストロサイト及び神経細胞においてCNPの受容体であるGC-Bの遺伝子発現をRT-PCRにて確認し、CNP添加によりcyclic GMPが用量依存・経時的に活性化されることを確認した。近年、cyclic GMPの活性化による細胞保護作用が報告され、CNPのアストロサイトに対する細胞保護作用が示唆されているが、我々はアストロサイトに対するグルタミン酸の細胞毒性に対するCNPの細胞保護作用の有無について検討を行い、濃度依存的にグルタミン酸の細胞毒性に対し細胞保護作用を有することを確認した。現在、我々はアストロサイトにおいて実験的虚血条件(低酸素・無グルコース・無血清)下培養に対するCNPの細胞保護作用の有無を検討しており、保護作用を有する傾向があることを確認している。
新規材料の素材としての不安定分子種の設計

標記研究課題について、班員9名の研究実績は以下のとおりである。阿波賀はαーニトロニルニトロキサイドにピリジン環、ピリジニウム環を導入したものが、強磁性的分子間相互作用を有することを新たに見いだし、結晶構造からその原理を明らかにした。伊藤は二次元ポリカルベン型ヘキサキスカルベンを合成し、これが有機分子としては最高のスピン多重度を持つ基底十三重項分子であることを、単結晶ESRにより証明した。沢木はジアゾ化合物の一電子酸化で生ずるπーラジカルカチオンがσーラジカル構造に変換すること、またこれがクラウンエ-テルの存在で安定化されることを見いだした。竹内は種々のシクロプロペニリウムイオンと超安定炭素陰イオンとの反応で、炭化水素塩と共有結合体の生成を精密に制御することに成功し、炭素陽イオンの安定性と塩生成の関係を明らかにした。戸部は[6]パラシクロファンおよびそのナフタレン、アントラセン誘導体と求核種との反応が、一般アルキルベンゼンとは異なり芳香核で起こることを見いだし、立体歪みと反応性の関係を明らかにした。富岡は極低温不活性ガスマトリックス条件下で基底三重項カルベンと酸素との反応を詳細に検討し、反応中間体における光異性化の機構を明らかにした。中垣は4ーニトロー1ーナフトキシ骨格とアニリノ基をもつメチレン鎖連結系の光酸化還元反応の磁場効果を検討し、分子内反応と分子間反応との分岐比が外部磁場の影響を受けることを明らかにした。務台は電子受容基と電子供与基をメチレン鎖で連結した化合物を合成し、光励起電子移動が結合経由で起こること、また、これが長いメチレン鎖で有利であることを実証した。山口は有機強磁性体パラニトロフエニルニトロキシドの磁性発現機構を量子化学計算によって解析し、HOMOのエネルギ-レベルがスピン分極に著しく影響することを示した。