hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自閉症モデルの病態生理解析

自閉症は1)社会的コミュニケーションや社会的相互作用の障害、2)行動、興味や活動の限局、繰り返しパターン、と定義される小児の精神疾患である。自閉症の遺伝的寄与率は他の精神疾患より高いため、特にヒト遺伝学からの研究が進み、遺伝的異常としては、脆弱性X症候群に代表される症候群性のもの、レア変異遺伝子、そしてコピー数多型(copy number variants, CNV)が知られている。我々の自閉症細胞モデルプロジェクトは、CRISPR/Cas(ゲノム編集技術)を用いた次世代染色体工学を利用して、自閉症のすべてのCNVのES(多能性幹)細胞モデルを構築しようとするものある。細胞モデルの表現型解析として、in vitroで分化した神経細胞を用いて形態・機能解析を行う。また、分化させた神経細胞を脳内に導入し、in vivoでのネットワーク解析に発展させるという計画も含まれる。マウスES細胞のin vitro神経分化系を確立した。本分化系では、種々の神経細胞だけでなくグリア細胞への分化も可能であることを確認している。細胞モデルに関して、CGH (comparative genomic hybridization)によるESの評価を行った。複数のCNVモデルのES細胞を神経細胞に分化後、神経突起などの形態学的解析およびKClやグルタミン酸に対するCa反応を見たところ、コントロールベクターを導入した神経細胞との差異を見出した。一方、in vivoでのネットワーク解析のためのトランスシナプス標識に関しては、ウイルス構成に必須のG膜タンパク質を除いてmCherryを導入した狂犬病ウイルス変異体と感染に必要なEnvA及びその受容体TVA等、トランスシナプス標識に必要なコンストラクト、ウイルスを作製した。また、実際に脳内にコントロールを接種するのに成功した。29年度が最終年度であるため、記入しない。我々の自閉症細胞モデルプロジェクトは、CRISPR/Cas(ゲノム編集技術)を用いた次世代染色体工学を利用して、自閉症のすべてのCNV例の細胞モデルを構築しようとする網羅的かつ野心的研究である。その研究計画の中で、in vitro differentiationでスパインレベルの解析を可能にする系を構築する。我々がESテクノロジーをベースにした染色体工学を用いて開発した自閉症CNVヒト型モデルマウスでのスパインレベルでの表現型との比較をすることにより、病態メカニズムの一般化を明らかにしようとするものである。また、神経幹細胞に分化させたものを脳内に導入し、in vivoでのネットワーク解析に発展させるという計画も含まれる。ウイルス構成に必須のG膜タンパク質を除いてmCherryを導入した狂犬病ウイルス変異体と感染に必要なEnvA及びその受容体TVA等、トランスシナプス標識に必要なコンストラクト、ウイルスは準備が完了した。またin vivo解析に用いるためのCGH (comparative genomic hybridization)によるESの評価を終えた。15q13, 16p11のCNV(copy number variation)モデルのES細胞を野生型とともにマウスに移植して、現在はin vivoでの分化過程を待っているところである。In vitro神経分化系の確立及びin vivoトランスシナプス標識法によるネットワーク解析のいずれも当初の予定通り順調に進行している。In vitro神経分化した細胞モデルの形態学的観察を行うとともに、逆行性トランスシナプス標識法を用いたin vivoでの細胞モデルの評価を行う。
海面の急激な上昇時におけるマングローブ林の立地の維持

すでに始まっているともいわれる地球温暖化が海面の上昇をひきおこしたとき,潮間帯の生態系であるマングローブ林が壊滅の危機にさらされるのではないかとの危惧が持たれている.しかしその立地には砂泥の流入・堆積があり,マングローブ自身が生産する有機物が泥炭となって地表を埋積するという作用もある.これらは海水準の上昇に抗して立地を維持するように働く,そもそも海水準の変動は過去に幾度もあり,後氷期にかぎっても,5千年前ころに最高位に達したあと一旦は下降し,2千年前頃から再び上昇して現在に至ったことが知られている.本研究はこのような海水準の変化の歴史,特に最近2千年の上昇に際して立地がどのように形成・維持され,その歴史を通じて確立された現在の立地がどのようにマングローブのあり方を規定しているかを究明しようとするものである.調査地にはミクロネシアとフィリピンを選んだ.前者は太平洋地域にあってその陸地は沈降傾向にあるとされている.従って海面の上昇は強調され,相対的に大きな値となっていることが期待される.対照として大陸縁辺に位置するフィリピンを選んだ.地形の解析とこれに関連して採取したサンゴ化石のC-14年代測定値やマングローブ林の地下に堆積している泥炭の年代測定値などを総合すると,ミクロネシアのコスラエ島では約3700年前頃に海水準がピークをむかえ,その高さは現在よりも1mほど高かった.その後低下に向かって約2000年前頃には現在の海面よりも逆に2m近く低くなり,その後ふたたび上昇に転じて約700年前頃にほぼ現在と同じ高さに達したと推定された.ほかにミクロネシアのポンペイ島やフィリピンのボホール島,ルソン島でも同様の年代測定をおこない,それぞれ基本的には同じような海水準変化を示す結果が得られた.マングローブ林はおよそ平均海面付近から高潮位付近までの範囲に成立し,泥炭の集積もこの範囲内にとどまるはずであるが,ミクロネシアではこれをはるかにしのいで,厚さ2m程度に達する泥炭層を広く見いだすことができた.その底はマングローブの生育可能な潮位範囲よりもはるかに下にあり,当時の平均海面はこの高さかそれよりも低位にあったとみるほかない.この泥炭層の最下部から採取した泥炭のC-14年代測定からは約1800年前のものという結果が得られた.約2000年前に下限に達した海面低下によって離水した土地にマングローブ林が成立し,その後の海面の上昇分を埋めるように泥炭が堆積し,立地が維持されてきたと読み取れる.泥炭層の厚さを年代値で割れば年あたりの堆積量が得られる.本調査で各地から得られたこの堆積速度を総合してみると,平均で年約2mmであった.これはとりもなおさずこの地域のマングローブ生態系が海面上昇に対して持っている立地維持能力である.ただしこれは平均値で,限界値としてはさらに大きな値を期待することができる.今回測定された最大値は年約5mmであった.ミクロネシアのマングローブ林には全体を通じてオヒルギとフタバナヒルギが生育しているが,これに加えてマヤプシキがめだって多い森林とマヤプシキが欠けてホウガンヒルギが混じる森林の二つのタイプに大別される.前者の立地には厚さ50cmから1m弱の泥炭層がみられるが,この発達に海面の上昇はかならずしも必要な条件ではない.現在の潮位の範囲内でもこの泥炭層の発達,ひいてはこのタイプのマングローブ林の成立は可能である.これに対してホウガンヒルギを含むタイプのマングローブ林ははるかに厚い泥炭層の上に成立していて,この泥炭層の形成には海面上昇が密接に関連したものと見られる.フィリピンのマングローブ林もマヤプシキ,フタバナヒルギ,オヒルギを主とする点で上記ミクロネシアのマヤプシキタイプに基本的には対応するものであった.泥炭層の厚さはせいぜい50cm程度で,海面が現在の高さに落ちつくとともに成立したものである可能性が高い.それ以前から継続するとみられるマングローブ林は見あたらなかったが,約2000年前に堆積が始まり,現在は粘土層に覆われた厚いマングローブ泥炭層をボーリング調査によって発見した.原植生でははここにも厚い泥炭層を基質にする別のタイプのマングローブ林が少なくとも局所的には存在していたものとみられる.すでに始まっているともいわれる地球温暖化が海面の上昇をひきおこしたとき,潮間帯の生態系であるマングローブ林が壊滅の危機にさらされるのではないかとの危惧が持たれている.しかしその立地には砂泥の流入・堆積があり,マングローブ自身が生産する有機物が泥炭となって地表を埋積するという作用もある.これらは海水準の上昇に抗して立地を維持するように働く,そもそも海水準の変動は過去に幾度もあり,後氷期にかぎっても,5千年前ころに最高位に達したあと一旦は下降し,2千年前頃から再び上昇して現在に至ったことが知られている.本研究はこのような海水準の変化の歴史,特に最近2千年の上昇に際して立地がどのように形成・維持され,その歴史を通じて確立された現在の立地がどのようにマングローブのあり方を規定しているかを究明しようとするものである.調査地にはミクロネシアとフィリピンを選んだ.前者は太平洋地域にあってその陸地は沈降傾向にあるとされている.

従って海面の上昇は強調され,相対的に大きな値となっていることが期待される.対照として大陸縁辺に位置するフィリピンを選んだ.地形の解析とこれに関連して採取したサンゴ化石のC-14年代測定値やマングローブ林の地下に堆積している泥炭の年代測定値などを総合すると,ミクロネシアのコスラエ島では約3700年前頃に海水準がピークをむかえ,その高さは現在よりも1mほど高かった.その後低下に向かって約2000年前頃には現在の海面よりも逆に2m近く低くなり,その後ふたたび上昇に転じて約700年前頃にほぼ現在と同じ高さに達したと推定された.ほかにミクロネシアのポンペイ島やフィリピンのボホール島,ルソン島でも同様の年代測定をおこない,それぞれ基本的には同じような海水準変化を示す結果が得られた.マングローブ林はおよそ平均海面付近から高潮位付近までの範囲に成立し,泥炭の集積もこの範囲内にとどまるはずであるが,ミクロネシアではこれをはるかにしのいで,厚さ2m程度に達する泥炭層を広く見いだすことができた.その底はマングローブの生育可能な潮位範囲よりもはるかに下にあり,当時の平均海面はこの高さかそれよりも低位にあったとみるほかない.この泥炭層の最下部から採取した泥炭のC-14年代測定からは約1800年前のものという結果が得られた.約2000年前に下限に達した海面低下によって離水した土地にマングローブ林が成立し,その後の海面の上昇分を埋めるように泥炭が堆積し,立地が維持されてきたと読み取れる.泥炭層の厚さを年代値で割れば年あたりの堆積量が得られる.本調査で各地から得られたこの堆積速度を総合してみると,平均で年約2mmであった.これはとりもなおさずこの地域のマングローブ生態系が海面上昇に対して持っている立地維持能力である.ただしこれは平均値で,限界値としてはさらに大きな値を期待することができる.今回測定された最大値は年約5mmであった.ミクロネシアのマングローブ林には全体を通じてオヒルギとフタバナヒルギが生育しているが,これに加えてマヤプシキがめだって多い森林とマヤプシキが欠けてホウガンヒルギが混じる森林の二つのタイプに大別される.前者の立地には厚さ50cmから1m弱の泥炭層がみられるが,この発達に海面の上昇はかならずしも必要な条件ではない.現在の潮位の範囲内でもこの泥炭層の発達,ひいてはこのタイプのマングローブ林の成立は可能である.これに対してホウガンヒルギを含むタイプのマングローブ林ははるかに厚い泥炭層の上に成立していて,この泥炭層の形成には海面上昇が密接に関連したものと見られる.フィリピンのマングローブ林もマヤプシキ,フタバナヒルギ,オヒルギを主とする点で上記ミクロネシアのマヤプシキタイプに基本的には対応するものであった.泥炭層の厚さはせいぜい50cm程度で,海面が現在の高さに落ちつくとともに成立したものである可能性が高い.それ以前から継続するとみられるマングローブ林は見あたらなかったが,約2000年前に堆積が始まり,現在は粘土層に覆われた厚いマングローブ泥炭層をボーリング調査によって発見した.原植生でははここにも厚い泥炭層を基質にする別のタイプのマングローブ林が少なくとも局所的には存在していたものとみられる.本課題は過去の海面上昇、とくに最近2000年の現象として知られている海面上昇に対して、マングローブの立地がどのように維持されてきたかを、植生学、花粉分析学、地形学からの解析を総合して肥握することを目的としたものである。調査地としては著しい土地の沈降が知られ、したがって相対的に大きな海面上昇が見込まれる太平洋域のポンペイ、コスラエ両島(ミクロネシア)と、逆に土地は降起傾向にあり海面上昇が相対的に小さいと見込まれる大陸縁辺のセブ、ボホール両島(フィリピン)を選んだ。コスラエ島では2地点で、ポンペイ島では1地点で、地形断面・植生配列の記載、ボーリングによる表層
三線の製作課題解決に向けての生態音楽学的実践研究

本研究の目的は、生態音楽学の立場から、関係機関等との双方的なコミュニケーションを行いながら協同して、材料枯渇や製造技術伝承の危機といった沖縄県産三線の製作課題解決を図ることである。初年度の平成30年度は、沖縄県三線製作事業協同組合及びくるちの杜100年プロジェクトin読谷村実行委員会との連携強化が課題の1つであった。そのため、両事務局と連絡を密にとりながら「三線大学」の視察(6月)、県産三線ブランド化事業委員会会議の聴講(7月、11月)、札幌市での県産三線普及活動の調査(10月)、くるちの杜100年プロジェクトの植樹祭(10月)及びシンポジウムに参加し、沖縄県産三線を取り巻く現状と関連機関の取り組みの実態を把握した。沖縄県三線製作事業協同組合主催の「三線大学」には、全国からリピーターを含む参加者が製作費、旅費、宿泊費を自己負担して集まり、製作者と交流しながら手作りの三線を完成させていた。この調査の意義は、材料となる黒木の保全に関心をもちうる層として、製作そのものに関心をもつ一般市民がいることがわかったことであった。また、8月にはくるちの杜100年プロジェクトが第40回「サントリー地域文化賞」を受賞し、11月には沖縄県三線製作事業協同組合が推進してきた県産三線の国伝統工芸品指定が叶った。このように、協力機関による取り組みが評価されたことは、今後本研究を推進する上でも重要な背景となった。これらと並行して、伝統工芸品・福山琴の製作者(6月)、べトナム産三線の販売業者(10月)、ヴァイオリン製作職人への聞き取り調査(10月)をそれぞれ行った。これらにより、沖縄県産三線の製作独自の課題と世界の楽器製作に共有される課題とが明らかになった点で意義深かった。そして、世界の楽器製作現場が抱える課題解決のためのネットワークづくりの重要性が確認できた。平成30年度は、1楽器製作事業者の現状と課題把握、2くるちの杜100年プロジェクトin読谷村実行委員会による生態環境保全活動等の実態調査、3琉球大学農学部造林学研究室との協力関係の構築と情報収集、4学会等での島嶼地域における持続可能な生態環境保全と音楽文化の伝承に関する情報交換を計画した。1と2は成果概要で述べた通りの成果となった。3はくるちの杜100年プロジェクトのシンポジウム(10月)において、シンポジストとして生態音楽学的調査の意義を広く一般に周知する機会を得たことをきっかけに、琉球大学農学部造林学研究室との連携を強化することができた。その結果、黒木の保全にとどまらず、亜熱帯島嶼域における森林の維持、再生による音楽文化の持続可能性についての研究展開の可能性が見出された。4は、日本サウンドスケープ協会研究会(5月、12月)、国際小島嶼文化会議(6月:フランス)、日本島嶼学会(9月:東京都神津島)の研究大会において実施した。以上の理由により、研究計画した通り、おおむね順調に進展していると判断した。次年度は、主として昨年度の継続調査(1楽器製作事業者の現状と課題把握、2くるちの杜100年プロジェクトの生態環境保全活動等の実態調査、3くるちの生態や造林に関する情報収集および沖縄県内における実態調査)を行う。また、4研究会や国際学会等(日本サウンドスケープ協会研究会、ハワイ東西センター・シンポジウム、国際伝統音楽学会ICTM、日本島嶼学会、東洋音楽学会大会)に参加し、本研究について周知するとともにネットワーク構築に向けての準備を進める。

平成30年度は、1楽器製作事業者の現状と課題把握、2くるちの杜100年プロジェクトin読谷村実行委員会による生態環境保全活動等の実態調査、3琉球大学農学部造林学研究室との協力関係の構築と情報収集、4学会等での島嶼地域における持続可能な生態環境保全と音楽文化の伝承に関する情報交換を計画した。1と2は成果概要で述べた通りの成果となった。3はくるちの杜100年プロジェクトのシンポジウム(10月)において、シンポジストとして生態音楽学的調査の意義を広く一般に周知する機会を得たことをきっかけに、琉球大学農学部造林学研究室との連携を強化することができた。その結果、黒木の保全にとどまらず、亜熱帯島嶼域における森林の維持、再生による音楽文化の持続可能性についての研究展開の可能性が見出された。4は、日本サウンドスケープ協会研究会(5月、12月)、国際小島嶼文化会議(6月:フランス)、日本島嶼学会(9月:東京都神津島)の研究大会において実施した。以上の理由により、研究計画した通り、おおむね順調に進展していると判断した。次年度は、主として昨年度の継続調査(1楽器製作事業者の現状と課題把握、2くるちの杜100年プロジェクトの生態環境保全活動等の実態調査、3くるちの生態や造林に関する情報収集および沖縄県内における実態調査)を行う。また、4研究会や国際学会等(日本サウンドスケープ協会研究会、ハワイ東西センター・シンポジウム、国際伝統音楽学会ICTM、日本島嶼学会、東洋音楽学会大会)に参加し、本研究について周知するとともにネットワーク構築に向けての準備を進める。
UHV-TEMを用いたLa注入シリコンナノドットアレイ電界発光素子の開発

電子のエネルギーによるシリコン酸素間の結合を切ることで、電子線照射による直接露光で酸化シリコンにシリコンナノ粒子を形成する事ができる。ここに希土類のランタンを蒸着し、高エネルギーの電子照射によりランタンの注入を行う。間接遷移型のシリコンは発光効率が悪く、発光素子としては使用できないと考えられているが、ナノ粒子化することによりエネルギーバンド構造が変化し、さらに、発光中心となるランタンを注入する事により発光素子としての可能性が近年高まってきた。本年度は、ナノシリコンの発光を観察できるように、タングステンフィラメントのような発光を伴わない電界放出型の電子銃を備えた走査型電子顕微鏡を改造した。電子線照射による発光を観察する事で、発光しているシリコンナノ粒子を観察できるようになり、発光部位の特定を行う事が可能となった。そこで、ナノシリコンが多数含まれていると考えられている陽極酸化を用いたポーラスシリコンを作成し、電子線照射による発光の観察を試みた。ポーラスシリコンは紫外線照射により発光するが、その発光が認められない試料でも電子線照射により発光する試料があり、蛍光による発光とは異なったメカニズムで発光していると考えられるものが確認された。しかしながらこの発光は初期段階では強度の高い発光を示すものの、電子線照射と共に強度が減衰し、実用には程遠い寿命である事がわかった。また、発光の減衰した試料を大気中に放置する事で、完全ではないが発光強度が回復する現象も現われた。これは、電子線の照射によりナノシリコン周辺の酸素原子が飛び、シリコン粒子が大きくなる為だと考えられ、大気中で再度酸化が進み粒子径が小さくなり発光が回復すると考えられる。本年度は、ナノドットの形成ができる現有する超高真空透過型電子顕微鏡に、超高真空を破ることなくランタンの蒸着ができるように、試料予備排気室の改造を行った。アルミニウムを用いて蒸着状況を確認した所、真空度の若干の低下が見られたものの、マイナス7乗パスカルの真空度を維持することができた。試料以外の部分に蒸着金属が着き、真空内の可動部分の動作不良が発生したため、遮蔽版を追加して対処した。一方、この電子顕微鏡は透過型であるため、電子ビームの走査を行う事ができないため、偏向コイルを用いて電子線を走査できるように改造した。ビームブランカーが無いためナノ粒子作製位置より急速にビームを動かす事で対処した。また、停止位置での揺れが残存していたため、所望の位置にビームを固定する事ができなかったが、この原因は偏向コイルの応答が10kHz程度から鈍化するためであると判明したため、その分を補正した波形を加える事で対処することでこの問題の解決を行う事ができる。以上の改造を行い、次年度より実際のシリコンナノドットの作製を行い、ランタン注入による発光素子の開発を試みる。
カドヘリン特異的エンドサイトーシスによる癌細胞の集団的移動の制御機構と意義の解明

個体発生や癌の浸潤において多くの細胞は集団を形成して移動することが知られており、「細胞の集団的移動」と呼ばれている。本研究では、神経芽細胞の集団的移動に必須であるアクチン結合分子Girdinが癌細胞の集団的移動にも重要な分子である可能性について検証した。Girdinの新規結合分子としてβ-cateninを同定し、本分子複合体が癌細胞の集団的浸潤に重要であることを複数の実験モデルを用いて証明した。また皮膚癌の病理組織標本を用いた検証では、Girdinの発現はβ-cateninや細胞間接着分子E-cadherinの発現レベルと相関を示し、Girdin複合体の生物学的意義を示唆する結果であった。個体発生や癌の浸潤において、多くの細胞は個別的ではなく集団を形成して移動することが知られており、細胞の集団的移動と呼ばれている。申請者は過去の研究で、神経芽細胞の集団的移動に必須であるアクチン結合タンパク質Girdinを同定し、同分子が癌細胞にも高発現して浸潤を促進する分子であることを明らかにしてきた。また最近、Girdinが細胞間接着においてカドヘリン特異的な取り込みを制御する分子であることも報告した。以上の研究結果により、神経芽細胞・癌細胞に限らず集団的に移動する細胞群は、その細胞間接着の強度を適度に調節することによってお互いを足場にして移動するのではないか、という仮説を得るに至った。本研究では本仮説とこれまでの予備的実験データをもとに、カドヘリン特異的エンドサイトーシスによる集団的細胞移動の制御機構と癌進展における意義の解明を目的としている。本年度は下記の事項を明らかにした。(1)カドヘリン特異的エンドサイトーシスを制御する機序の一つとしてalphaおよびbeta-cateninに着目し、Girdinとcateninが生化学的に直接結合することを示した。GirdinのC末端ドメイン(アクチン結合ドメイン)がcateninの結合責任部位であることを示し、またcateninのGirdin結合ドメインも同定した。(2) Girdinの発現抑制がN-カドヘリンの動態に与える影響を検証した。神経芽腫細胞株でN-カドヘリン-GFPの安定発現細胞株を作成し、GirdinををRNA干渉法によって抑制したが、明らかな影響は観察できなかった。(3)一方で、Girdinの変異体を発現するノックインマウスの神経芽細胞を観察するとN-カドヘリンの局在の異常および発現低下がみられた。同変異体マウスでは神経芽細胞の集団移動が障害されており、その機序の一つと推定された。Girdinとcateninの結合に関する生化学的解析はおおむね順調に進展している。一方、本研究ではカドヘリン特異的エンドサイトーシスの制御機能を欠失した変異体Girdinの作成も目標としているが、Girdinのcatenin結合責任領域が予想より広いため、これに難渋している。個体発生や癌の浸潤において、多くの細胞は個別的ではなく集団を形成して移動することが知られており、「細胞の集団的移動あるいは浸潤」と呼ばれている。申請者は過去の研究で、神経芽細胞の集団的移動に必須であるアクチン結合分子Girdinを同定し、同分子が癌細胞にも高発現し浸潤を促進することを報告してきた。本研究ではこれまでの研究結果をともに、集団的細胞移動の制御機構と癌進展における意義の解明を目的としている。(1)昨年度までにGirdinの結合分子としてalphaおよびbeta-cateninを同定した。今年度は培養細胞株の細胞間接着部位においてGirdinとcateninが共局在することを示した。またGirdinのノックダウンによって細胞間接着の強度が減弱することを、細胞のEDTA感受性を調べるcell dissociation assayで検証した。(2) 3次元的な癌細胞の集団的浸潤をアッセイするためのorganotypic cultureのプロトコルを確立した。不死化した癌関連線維芽細胞を混じたマトリゲル上に癌細胞を播種し、ゲル内への癌細胞の集団的浸潤を検証した。Girdinの発現の抑制によって集団的浸潤が有意に減弱することを示した。癌細胞の集団的浸潤におけるGirdinの意義の解析についてはおおむね順調に進展している。一方、Girdinとcateninの結合の制御機構について、その上流のメカニズムについて複数の仮説を立てて検証中であるが、明快な結果を得られず難渋している。個体発生や癌の浸潤において、多くの細胞は個別的ではなく集団を形成して移動することが知られており、これを「細胞の集団的移動(collective migration)」と呼んでいる。単一細胞の移動のための分子機序は解明がすすんでいるが、集団的移動に特異的な分子機序は解明されていない。申請者は過去に、脳室下帯の神経芽細胞の集団的移動に必須な分子としてアクチン結合分子Girdinを同定し、同分子が多くの癌でも高発現していることを報告した。またその結合分子群を生化学的な手法で多数同定してきた。その結果、Girdinは神経芽細胞や癌細胞の集団的移動に共通の分子機序に関わる分子であると考えられた。

(1)昨年度までにGirdinの新規結合分子としてalpha-cateninおよびbeta-cateninを同定し、本結合が細胞間接着の増強に関わることを複数の細胞株を用いて示した。本年度はGirdinを発現抑制すると、細胞膜上に存在できる各catenin分子の量が減少することを見出し、E-cadherin/catenin分子複合体の細胞膜への局在にGirdinが重要であることを証明した。(2)昨年度までにorganotypic cultureモデルによって癌細胞の集団的浸潤を再現することに成功している。本年度はbeta-cateninのN末端ドメインの過剰発現が内因性のGirdin/catenin間の結合を競合的に阻害し、また上記モデルによって観察される集団的浸潤も阻害することを示した。これによって、Girdin/catenin間の結合が癌細胞の集団的浸潤に重要であることが示唆された(投稿中)。個体発生や癌の浸潤において多くの細胞は集団を形成して移動することが知られており、「細胞の集団的移動」と呼ばれている。本研究では、神経芽細胞の集団的移動に必須であるアクチン結合分子Girdinが癌細胞の集団的移動にも重要な分子である可能性について検証した。Girdinの新規結合分子としてβ-cateninを同定し、本分子複合体が癌細胞の集団的浸潤に重要であることを複数の実験モデルを用いて証明した。また皮膚癌の病理組織標本を用いた検証では、Girdinの発現はβ-cateninや細胞間接着分子E-cadherinの発現レベルと相関を示し、Girdin複合体の生物学的意義を示唆する結果であった。生化学的解析は当初の予定に従って遂行する予定である。Girdinのcatenin結合領域の絞り込みに成功した場合には、その領域の欠失変異体を作成し、細胞に導入後、細胞の運動能に与える影響を検証する。加えて当初の予定どおり、細胞を免疫不全マウスに移植し、細胞の浸潤能に与える影響を検証する。Organotypicculture modelを用いたアッセイを引き続き、再現性も含めて検証する予定である。またコラーゲンゲルをコートした培養皿上ではある種の癌細胞は集団的移動を示すことが知られており、本実験系を用いたタイムラプスイメージングを予定している。これによりGirdinおよびcateninの発現抑制がどのように細胞の集団移動に障害をもたらすか検証する。細胞の方向性およびスピード等の複数のパラメーターについて定量的な検証を行う予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。実験病理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
半没水型高速船に関する基礎的研究

本研究では、(1)境界要素法による揚力物体周りの自由表面流の計算、(2)模型実験による運動解析と自動制御、(3)摩擦抵抗の軽減方法について研究した。その結果以下のような結論をえた。1.境界要素法の計算法として自由表面や下流境界条件およびKuttaの条件の扱い方について新しい方法を提案し、有効な計算法であることを確認した。翼付き半没高速船のいくつかの形状について計算し、自由表面と揚力面との干渉について興味深いいくつかの事実を発見した。計算によって最適形状指針うることができる。2.まづheaving,pitching,rollingとyawingを自由とした曳航模型により、安定走行とPD制御の可能性について調べた。その結果をもとに、さらに、自走模型による6自由度実験を行ない、一定の制御を導入することによって安定走行が可能であることが確認された。また波浪中の実験により波浪性能が優れていることがわかった。3.円筒物体の分離模型を用いて、微小気泡の摩擦抵抗の軽減に及ぼす影響について調べた。流速と放出気泡量がある値以上になると摩擦抵抗が軽減することが確かめられた。しかし、模型が小さいため、気泡放出に要する仕事量が抵抗軽減分を上回った。ただこれは実機では解決できる問題である。翼付き半没型高速船の流力特性について調べた結果、この種の船型が高速船として極めて有望であることがわかった。完全自走実験が残された課題である。境界要素法によって翼をつけた物体が水面下を航行する時の流場を解き、造波抵抗および沈下力を計算した。翼の影響について検討し、翼付高速船の形状について調査した。3次元運動方程式を解くことによって、翼付高速船の運動シミュレ-ションプログラムを開発した。主翼エルロン、水平および垂直尾翼の適当な制御によって、安定走行が可能であることが確かめられた。ヒ-ブ、サ-ジ、ピッチィングを自由にした3自由度曳航実験によって高速船の波浪中性能を調べた。その結果、半没型であるため波浪同調点の波長は長く、通常の波長域では、波浪の影響は第一義的に重要ではないことがわかった。これらの実験および計算結果をもとに、走行中、外部信号によって、エルロン、尾翼の迎角を自動制御できる曳航模型の製作にとりかかった。抵抗軽減のためのマイクロバブルの効果について実験的に調べた。マイクロバブルによって抵抗を軽減できることを確かめることができたが、マイクロバブルの放出部分の抵抗が増すことがわかった。これは非常に重要な発見である。LESを用いたダクト内乱流シミュレ-ションによってマイクロバブル放出時の流れと抵抗を求め、理論的な面からも考察した。計算では、流れのモデル化が重要であることがわかった。(1)境界要素法による流場のシミュレ-ション既に作成されている計算プログラムによって、没水深度、翼の長手方向位置、迎角を種々変更させ、揚力と抵抗を計算した.計算結果より、最適没水深度、形状について検討した。(1)運動シミュレ-ション6自由度実験に先立って,3次元運動方程式を解くことによって、運動シミュレ-ションを行った。流体力等は、実験値や簡便な推定法による値を用いたが、大略良好な結果をえた。主翼フラップ,水平尾翼,舵によって安定走行のための制御を行い、制御の効果を確認した。(3)曳航模型による3次元4自由度走行実験2m模型を曳航し、ヒ-ブ,ピッチ,ロ-ル,ヨ-運動を自由とした走行実験を行った。実験では、運動を計測し、変位および速度をもとにフラップ等の制御を行い、制御の効果について調べた。その結果,最も簡単な比例制御によっても、安定な走行の実現を確認することができた。(4)マイクロバブルの放出による摩擦抵抗の軽減についてマイクロバブルを放出する部分と、マイクロバブルでおうわれる部分とに分けて、それぞれの抵抗を計測して、マイクロバブルの抵抗軽減効果について調べた。

その結果、前者は、流速が十分大きくなければ、抵抗は増えるが、後者の部分については、有意な軽減が認められた。気泡放出のための必要仕事量と抵抗軽減量との和をとり、エネルギ-利得を計算したが、実験で用いた小型模型では、負の利得となった。しかしこれは、実機レベルでは問題とならない。本年度の研究では主として、(1)主翼エルロンおよび尾翼による安定走行のための自動制御システムの開発と走行実験、(2)運動制御へのニュ-ラルネットの応用、(3)境界要素法による翼形状および翼位置に関する計算シミュレ-ションを行った。それぞれについて以下のような結論をえた。1.rolling、pitchingおよびyawingをその角速度と変位角をもとに主翼エルロンおよび尾翼の変動量を算定するいわゆるPD制御により自動制御し、船速とyawingは目視によるマニュアル制御で安定走行実験を実施した。実験は自走状態で行なったが、十分安定に走行しうることが確かめられた。波浪中走行実験では、波浪外力による運動はほとんど制御され通常の水上船に比べて強制運動が非常に小さいことがわかった。2.半没水型高速船は複雑な3次元運動をする。その最適制御に、ニュ-ラルネットの応用の可能性について検討した。すなわち、これまでの実験結果をデ-タベ-スとし、数値シミュレ-ションによって運動を調べた。その結果、現在のレベルでは、6運動成分を連成して制御することは溶易でなく、1成分ごとに独立分離することによって制御が可能であることが確かめられた。3.すでに開発された境界要素法による没水揚力体周り流れの計算プログラムによって、翼位置、翼迎角および没水深度を変化させて揚力および抗力を計算し、最適位置や翼形状について検討した。その結果、自由表面と翼の干渉により、揚力が増加しても抗力は増加しないなど興味深い事実が見出された。
口腔癌再発に関わる骨髄単球細胞のマクロファージへの分化機構

口腔癌において、放射線治療後の再発、再増殖にCD11b+骨髄単球細胞が関与していることが示唆された。マウス実験において、CD11b+骨髄単球細胞は腫瘍が再発、再増殖を開始する直前に腫瘍内へと誘導されており、さらに、これらの細胞の一部は血管の安定化、正常化を担う血管新生誘導因子Tie2を発現したTEM(Tie2-expressing macrophage)であったことからも、CD11b+骨髄単球細胞が、照射後の腫瘍血管の再形成と、それによる腫瘍の再発、再増殖に深く関与していることが考えられる。また、誘導されたCD11b+骨髄単球細胞の多くがM2マクロファージで腫瘍増殖に寄与するものと思われる。昨年度に引き続いて骨髄細胞と腫瘍再増殖の関連性について解析を行った。臨床サンプルを用いて化学放射線治療を行った口腔癌患者から採取した治療前後の組織標本を用いて治療後に腫瘍内へ誘導されるCD11b+骨髄細胞の誘導率をサンプルの数を増やして解析した所、11例中8例で治療後の誘導が確認された。また動物実験では口腔癌OSC-19の皮下腫瘍モデルに対して放射線照射を行ったところ、腫瘍が再増殖するにつれてCD11b+細胞の腫瘍内への誘導が確認された。さらにHSC-3やYCUOC019など数種類の口腔がん細胞株を用いて同様の実験を行った。特に癌幹細胞は間質や骨髄細胞の取り込み能が一般的な樹立細胞株に比べて高い事から臨床検体の口腔癌組織から癌幹細胞をCD44およびALDHを用いて単離し、NOD-SCIDマウスに移植し、まずはその造腫瘍能を検証した。当初は期待されるレベルのものは得られなかったが、様々な試みを行った結果、安定した造腫瘍能が得られるようになった。同様に放射線照射後に骨髄由来のCD11b+細胞が腫瘍内へ誘導される事が確認された。さらにhypoxia-inducible factor-1(HIF-1)の活性化が放射線照射群で確認された。また予備実験の段階であるが、マクロファージをM1へ誘導する処理を行ったマウスでは腫瘍の再増殖が抑制された。現在はこれらのマクロファージの分化誘導に関わる分子メカニズムを解析中である。本年度も骨髄細胞と癌再発の関連性について研究を行った。口腔がん細胞を用いたマウス皮下腫瘍モデルではCD11b+骨髄細胞は腫瘍の再発、再増殖が開始する直前にあたる照射後2週目で最も多く腫瘍内へ遊走されていた。また、CD11b+細胞群のうち、より腫瘍の血管形成に関与するとされるTie2+の細胞群も照射後2週目の腫瘍において最も多く認めた。さらに、放射線治療だけではなく抗癌剤治療後の腫瘍に関する検討を加えた。同様の方法で担癌マウスを作製し、コントロール(未治療)群、ドセタキセル投与群、ドセタキセル+Carageenan(CAR)投与群に分け腫瘍の増殖を観察したところ、ドセタキセル単独では抗腫瘍効果は薄く投与後も腫瘍は増殖するが、マクロファージ枯渇作用を持つCARを併用投与した群においては、TXT投与後の腫瘍の増殖が著明に抑制された。このことから、ドセタキセル治療後の腫瘍の再増殖にマクロファージが関与していることが示唆された。続いて、マクロファージの分化系に関して検討した。骨髄由来単球細胞は末梢でマクロファージに分化されるが、マクロファージにはM1、M2の2つの分化があり、腫瘍の増殖にM2の分化系が寄与することが報告されている。様々な誘導物質で検討した結果、腫瘍の再発、再増殖がより促されていた検体において、全てのマクロファーにおけるM2マクロファージの占有率が高いことが免疫染色にて確認されたため、M2マクロファージと腫瘍の増殖には正の相関性があることが示唆された。本年度は、骨髄細胞と腫瘍の再増殖の関連性について解析を行なった。まず最初に横浜市立大学付属病院口腔外科にて2006年6月から2010年11月の間に化学放射線治療を行った口腔癌患者から採取した治療前後の組織標本を用いて治療後に腫瘍内へ誘導される骨髄細胞のうちCD11bを発現する単球細胞群について免疫染色を行なった。同一患者から採取された治療前および治療後(再発時)における腫瘍内のCD11b+細胞の陽性率を比較したところ、約72%で治療後の単球細胞の陽性率の上昇が認められた。次にOSC-19細胞株を用いて舌癌同所移植マウスモデルを作製し、放射線照射による微小環境変化を解析した。その結果、放射線照射後約4週間後においてCD11b+単球細胞の有意な誘導が確認された。興味深い事にこれらの細胞の多くがマトリックスメタロプロテアーゼ-9 (MMP-9)を高発現していた。

MMP-9は最近になり組織のリモデリングに作用している事が分かってきており、再注目されている分子である。本研究においてもMMP-9が骨髄細胞から分泌される事により血管内皮細胞の遊走に関わっているのではないかと思われる。今後更に解析を進める予定である。さらに、ヌードマウスを用いた背部皮下腫瘍モデルにおいても同様の結果が得られた。現在は誘導されたCD11b陽性骨髄単球細胞がさらにどのような分化系でマクロファージに分化していくのか解析中である。また本現象の普遍性を調べる為,数種類の口腔癌細胞を用いて同様の実験を行っている。今年度は数種類の口腔がん細胞株を用いて動物実験を行った。しかしながら贈腫瘍能が低下していたり、放射線感受性が予想以上に高かったなど予期せぬ結果が続き、至適照射量の決定や適正な口腔癌細胞の選定に時間を要した。口腔癌幹細胞は研究の主旨に同意を得た口腔癌患者の臨床検体の口腔癌組織から癌幹細胞をCD44およびALDHを用いて単離し、NOD-SCIDマウスに移植し、まずは造腫瘍能を検証した。当初は期待されるレベルのものは得られなかったが、様々な条件検討を行った結果、癌幹細胞特性を持った純度の高い細胞群が得られるようになった。本実験においても同様に放射線照射後に骨髄由来のCD11b+細胞が腫瘍内へ誘導される事が確認された。さらに予備実験の段階であるが、マクロファージをM1へ誘導する処理を行ったマウスでは腫瘍の再増殖が抑制されるなど本研究の主題にせまる結果が得られつつある。口腔扁平上皮癌におけるCD11bやF4/80、CD31の免疫組織学的染色法の条件検討とプロトコールの確立は抗体毎に行わなければならなかったが、これまでに安定して染色を行えるようになった。その後の解析で治療後の腫瘍においてCD11b陽性細胞の誘導が認められ、特に再発症例でその頻度が高い事が分かる等、非常に興味深い結果を得る事が出来た。一方で、当初の予定より症例数が低いことが予想外であった。治療前後のペアで収集しなければならず、現在までに約10対のサンプルを用いて解析を行ったが、今後条件を変更して検体数を増やしていく予定である。動物実験に関しては使用する抗癌剤の種類や投与量、放射線照射量やサンプルの採取時期等さまざまな条件を考慮しなければならなかった為,条件検討に時間を費やしたが最近になりMMP-9の発現の上昇等の興味深い結果が出始めている。これまでの研究から口腔癌の再発のメカニズムとしてCD11bを発現する骨髄単球細胞が重要である事が分かって来たが、今後はどのような分化メカニズムでマクロファージに分化するのか、また分化したマクロファージがどのようにして血管の再生や腫瘍の再発を導くのか、分子レベルで明らかにする予定である。具体的には癌細胞がどのような分化機構でマクロファージを分化させ、さらに血管の新生に関わっているのかを解析する。これまでに分かったこととして腫瘍内に誘導されてきたCD11b細胞の役割を把握するのみならず、腫瘍の再発に関わる腫瘍血管の再構築を誘導する細胞群について特定を行っていく。具体的にはCD11b陽性単球細胞がマクロファージに分化する際にインターフェロンガンマなどにより分化するM1タイプとインターロイキン4などにより分化するM2タイプがあり腫瘍再発にはどちらがより深く関わっているのか、何のサイトカインがその分化機構に主的役割を担うのか等を動物モデルを用いて解析する。マクロファージを誘導するサイトカインであるIL-
従属節における、節の内部構造と文内位置との相関に関する研究

現代日本語・古典日本語について、従属節の内部構造が、母型文(主節)におけるその位置と相関を持つかどうかについて、可能な範囲でのケースワークを行い検討した。その結果、1対1の対応ではないが、従属節内部のあり方、特にテンス・アスペクトの形態・意味的あり方および述部への係り要素の一部の振る舞いが、その節が主節においてどのような位置にあるかにより影響を受ける、すなわち一定の対応があることと、その個別的実態を明らかにした。今年度中に行ったこと、明らかになったことは以下の通りである。疑問節については現代語データから例文の抽出を行い、統語(形態)的性質として名詞的性質の強いものと副詞的性質の強いものとの少なくとも2つのタイプがあること、外部との関係については同格的性質の強いものと述部に対し補充成分的に働くものとの2つのタイプがあること、このそれぞれの2つのタイプがクロス分類的を埋める形で存在し、計(少なくとも)4つの種類があることが明らかになった。(中間的カテゴリーを認めるかどうかについては現時点では保留)。条件文においては、反事実的条件文(反実仮想文)において従属節内のテイル系は、傾向としては反事実的であることを強めるが反事実的でない読みを完全に排除する働きをするわけではないのに対し、主節における過去事象を指さないタ形は反事実的であることをほぼ完全に保証することを明らかにした。また、反事実的条件文の定義に関し従来より厳密な定義を行い、反事実的条件文の中に、少なくとも文法的振る舞いの異なる典型的反事実的条件文・主節のみ反事実であるタイプ・修辞的反事実的条件文の3種があることを、具体的言語現象から明らかにした。この他、コーパスデータの構築と一部分析を進め、動詞と構文交替、中世語従属節のテンス・アスペクト現象へのアプローチを試みた。特に中世語従属節のテンス・アスペクト現象については基本形の機能負担の変化と、節内ウ・ウズル形の出現のしやすさとが相関することを明らかにした。各種日本語従属節の、個別的な内部構造上の性質と、主節中での位置を明らかにした上で、その相関に関する知見を得るのが本研究課題の主要な目的であるが、本年度(平成19年度)は主として以下のような実績・成果を挙げた。・コーパスデータについては、現代語については川野が、古典語データについては橋本が加工を含め、データの集積・精密化を行った。古典語データについては千年度から行っていた『天草版伊曽保物語』の入力・デバッグ・表記揺れの処理等をほぼ完成させ、分析可能な状態を実現した。また、中世語抄物資料のデータ化の検討・試行版作成に着手し、『中華若木詩抄』のテキスト校訂・試行的入力を行った(ただし抄物資料のデータ化についてのテキスト選定には一部問題も残されており、上記資料以外の抄物資料のデータ化を優先する可能性も残っており、外部のレビューも含め、打ち合わせを行っている)。・現代語従属節の意味論的分析については、疑問節・アト(ノチ)節・マエ節・ナガラ節について分析を行った。特に、従来起こらないというのが優勢な説であったアト節におけるテイル形の出現について、非能格動詞の持続読みでは比較的許容されやすいこと、動詞の純粋なアスペクチュアリティだけでなく、対応する非テイル形が許容されやすいとアスペクチュアリティと独立に許容度が上がることなどが、内省データ・コーパスデータ双方から明らかになった。最終年度として、以下のような成果を得た。1.現代語の内省データによる研究としては、主節に非過去を担うタ形を持つ、反事実的条件表現の成立条件について得た知見(より具体的には、先行研究で示される「運命の分岐点」の設定が、好ましくない状況であるほうが相対的に困難になるということ)をブラッシュアップ・改訂し公刊した。また、アト節におけるテイタ形の成立について、「アテリックな述部であること」「並行する(対応する)単純タ形が許容されにくいこと」が必要条件となっていることを、前年までよりも多数のデータと、修正された理論的検討によってより精度の高い形で明らかにし、一部公刊した(さらに印刷中の部分もある)。2.古典語については、既存のコーパスに加え、前年度までにある程度作成したキリシタン版伊曽保物語・キリシタン版平家物語について、専門的精度の高い電子データを完成させた。また、中世語の条件節を中心とした従属節の中に、いわゆる南の四段階における類別に従う(すなわち、ある形がある要素を内部に含み込むことができる/できない、ということが決まっているケースがある、ということが一定の確度で示された。3.周辺的成果として、従属節現象が主節より明確に現れる場合のあることを示し、文法教育・日本語作文教育に益する可能性のあることを示した。
双極子追跡法による聴性誘発反応の発生源推定

聴性誘発反応はおもに内耳以降の聴覚路の興奮によって起こる反応で、与えられた音刺激が最終的に認知、記憶されるまでの過程を反映しているが、現在のところその起源については不明な部分が多かった。今回の研究では、音刺激後90msec.付近(N1成分)と150msec.付近(P2成分)の反応で新たに起源が推定された。N1成分についてはその起源は2個と考えられその部位は両側の聴皮質であり、さらに双極子の向き(電流の向かう方向)は下方であると考えられた。P2成分については2種類の起源が考えられた。1種類はその起源が2個あり、その部位はN1成分と同様両側の聴皮質であり、双極子の向きは上方であると考えられた。もう1種類はその起源は1個あり、部位は帯状回であると考えられ、双極子の向きは上前方であると考えられた。また、音刺激条件を変化させ、検討を行なった。刺激音の立ち上がり時間や刺激持続時間、刺激音の周波数を変化させても双極子の位置、方向に変化はみられなかった。N1、P2成分は極めて安定した反応であると同時に、発生源の部位も限局していることが示唆された。臨床応用として、一側の伝音難聴を有する被験者にて検討を行なった。健側刺激での結果は前記と同様であり、また患側刺激では強大音の負荷にて同様の結果を示しており、このことから聴性誘発反応による聴力推定が可能であり、また双極子の位置や方向が変わらないことを確認することにより、推定した聴力に信頼性を持たせることが可能となる。これらの内容は、平成5年度の日本耳鼻咽喉科学会、日本脳波筋電図学会で発表し、現在論文投稿中である。
カソードルミネッセンスを用いた蛍光SEM法の腎組識への応用

電子線が試料に照射された際に、微弱な陰極蛍光(カソードルミネッセンス:CL)が発せられることが知られており、昨年度に引き続き、まず生体自体が発するCLをはるかに上回るCL強度を持ち、しかも電子線に対して安定な標識色素の探索を目的として、いくつかの試行錯誤を繰り返したが、昨年度静注により肝のKupffer細胞に取り込まれた蛍光体粉末のCL陽性像を認めることに成功した無機蛍光粉末(p43)を超えるものは選定できなかった。組織の処理に関する条件としては、金属で薄くコートして高真空状態で観察したほうが、コート無しで低真空状態で観察するより良好な像が得られることも確認された。一方今年度も引き続きネフリン、ポドシン、CD2APに加えて新しく当教室で同定に成功した新しいスリット膜ないし糸球体上皮細胞関連分子についての特異的ウサギ抗血清の作成には成功しているので、抗ウサギ抗体に上記の条件を満たす色素を標識することが必要な段階となった。走査電子顕微鏡(SEM)にCL検出器を組み合わせたバイオ蛍光SEMをもちいてウサギ抗糸球体基底膜抗体により蛍光免疫染色を施したラットの腎臓のCL像の観察への試みは失敗に終わり、基底膜がCLを発している像を観察することができなかったことに鑑み、スリット膜を中心とした各対象分子のCL像と表面形状像(二次電子像ないし反射電子像)の良好な組み合わせ画像を得る試みのin vivoないし臨床材料への応用のためには、より適切な蛍光色素とその抗体への標識条件の確立を待たざるを得ないと結論付けられた。電子線が試料に照射された際に、微弱な陰極蛍光(カソードルミネッセンス:CL)が発せられることが知られており、CLを生物研究の分野でもちいた過去の報告には、馬杉腎炎を惹起した腎臓に蛍光免疫染色をした標本のCL像を観察したとの報告がある。そこで今年度は、低真空SEMにCL検出器を組み合わせたバイオ蛍光SEMをもちいてウサギ抗糸球体基底膜抗体により蛍光免疫染色を施したラットの腎臓のCL像の観察を試みた。蛍光色素には過去の報告で使われたFITCを用いた。その結果、一般の蛍光顕微鏡では染色された基底膜の蛍光像が観察されたが、バイオ蛍光SEMによるCL像の観察では、基底膜がCLを発している像を観察することができなかった。我々のほかの実験結果からも、既存の蛍光色素は単体ではそのCL観察は可能であるが、生物試料に免疫染色した場合は、蛍光色素からのCL像が観察されず、生物試料の持つ固有のCL像が観察されることが判明した。この原因としては、蛍光色素のCL強度が生物固有のCL強度に比べて十分な強度を持たない、または蛍光色素は生体自体に比べて、電子線の照射によるダメージを受けやすいなどの可能性が考えられた。以上の結果から、免疫染色した標本のCL像を観察する場合には、標識色素として生体自体のCLをはるかに上まわる強度のCLを発する電子線に対して安定な色素が必要になると考えられた。来年度には、このようなCL観察に適した色素の探索を行い、その色素を用いて免疫染色する方法の樹立を目指し、この方法を樹立することで、特定の蛋白質などの物質の機能と組織の構造との関連の解析を実現させたい。また実施計画に予定されたスリット膜関連諸分子(ネフリン、ポドシンなど)に対するウサギ多クローン抗体の作製には成功している。電子線が試料に照射された際に、微弱な陰極蛍光(カソードルミネッセンス:CL)が発せられることが知られている。昨年度は、低真空SEMにCL検出器を組み合わせたバイオ蛍光SEMをもちいてウサギ抗糸球体基底膜抗体により蛍光免疫染色を施したラットの腎臓のCL像の観察を試みたが蛍光色素の不適切さから基底膜がCLを発している像を観察することができなかった。そこで本年度は、まず生体自体が発するCLをはるかに上回るCL強度を持ち、しかも電子線に対して安定な標識色素の検討を第一の目的とした。いくつかの試行錯誤の結果、無機蛍光粉末(p43)を選定し、応用への試みとして、ラット尾静脈よりこの蛍光体粉末を注入し、24時間後に2%グルタールアルデヒドにて動物を還流固定後、肝臓を対象として検索した結果、肝のKupffer細胞に取り込まれた蛍光体粉末のCL陽性像を認めることに成功した。組織の処理に関する条件検索では、金属で薄くコートして高真空状態で観察したほうが、コート無しで低真空状態で観察するよりも、CL像と表面形状像(二次電子像ないし反射電子像)の良好な組み合わせ画像を得ることができた。腎のメサンジウム細胞にも取り込み能のあることが知られていることから、今後はまず同様の処理を施したラット腎を対象として、三次元的な蛍光陽性部位の観察が可能か否かを具体的に検索する予定である。また実施計画に予定されていたスリット膜関連諸分子(CD2APなど)に対する新たなウサギ多クローン抗体の作製には成功している。

組織の処理に関する条件としては、金属で薄くコートして高真空状態で観察したほうが、コート無しで低真空状態で観察するより良好な像が得られることも確認された。一方今年度も引き続きネフリン、ポドシン、CD2APに加えて新しく当教室で同定に成功した新しいスリット膜ないし糸球体上皮細胞関連分子についての特異的ウサギ抗血清の作成には成功しているので、抗ウサギ抗体に上記の条件を満たす色素を標識することが必要な段階となった。走査電子顕微鏡(SEM)にCL検出器を組み合わせたバイオ蛍光SEMをもちいてウサギ抗糸球体基底膜抗体により蛍光免疫染色を施したラットの腎臓のCL像の観察への試みは失敗に終わり、基底膜がCLを発している像を観察することができなかったことに鑑み、スリット膜を中心とした各対象分子のCL像と表面形状像(二次電子像ないし反射電子像)の良好な組み合わせ画像を得る試みのin vivoないし臨床材料への応用のためには、より適切な蛍光色素とその抗体への標識条件の確立を待たざるを得ないと結論付けられた。