hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
特発性間質性肺炎(IIP)の肺癌合併における喫煙の影響について

疫学的研究IIPと診断された66例を1年から13年間経過観察した。その結果、IIPと診断された66例の患者から経過中11名(16。7%)に肺癌がみられ、その内10名が男性喫煙者であった。組織型では腺癌6例と多く、部位では末梢が多かった。またIIPの診断から肺癌の診断までの期間は平均で4.82年であった。肺癌合併IIPと非合併IIPの比較では、ステロイド未使用で、粉塵吸入歴を持ち、胸部写真上肺の縮みが少ないもの、つまりIIPの非定型例の要素を持つものに肺癌の合併が多かった。喫煙因子を除外するため、喫煙指数・性別をマッチした慢性閉塞性肺疾患患者を対照群(COPD群)として肺癌合併率を比較した。年齢・観察期間がCOPD群で高値であるのにも関わらず、肺癌の発生率ではIIP群で、66例の患者から経過中11名(16.7%)に肺癌がみられ、COPD群での95名中1名(1%)の肺癌合併率よりも有意に高かった。以上より、IIPそのものが喫煙から独立した肺癌の危険因子であることが唆さた。免疫組織化学的検討IIP合併肺癌で増殖機能が亢進している可能性が示唆されている。そこで線維化に関与すると考えられているEGF,EGF-Receptorの発現をIIP合併肺癌とそれ以外の肺癌の組織で免疫組織化学的に検討した。また、IIPの増殖因子とされるPDGFやEGFがc-myc.c-fosを活性化することが知られている。そこで、IIP合併肺癌におけるc-myc,c-fos癌遺伝子蛋白の発現も免疫組織化学的に検討した。その結果、1)EGFやEGF-Rは腫瘍細胞では両群間で有意差がなかったが、間質細胞ではIIP合併肺癌群でEGFの陽性率が有意に高く、IIP合併肺癌でその増殖にパラクライン機構が関係する可能性が示唆された。2)IIP合併肺癌およびIIP非合併肺癌群で癌遺伝子の発現に差はなかった。1。疫学的検討特発性間質性肺炎(IIP)に肺癌が高率に合併することが指摘されているが、肺癌合併症例はほとんどが男性で、喫煙者であることが当研究者その他から既に報告されている。そのため、IIPが喫煙から独立した肺癌発生危険因子であるかどうかを明らかにすることは重要である。それを調べるために、喫煙指数をマッチさせた2群を設定した。すなわち、同時期に当科に入院した慢性閉塞性肺疾患患者(COPD)群(対照群)およびIIP患者群である。これら2群について肺癌の発症率を比較検討した。その結果、IIPで肺癌発症率が有意に高いことが確かめられた。このことから、IIPそのものが喫煙から独立した肺癌発症の危険因子であると結論された。ただし、COPD129例中95例(74%)の予後を追跡調査できたが、他の症例については未検討であり、継続課題として残された。2。分子生物学的検討IIPは慢性に経過する症例が多いが、これには血小板由来成長因子(PDGF)やEGFが関与していることが知られ、一方、この増殖因子と癌遺伝子(c-fos、c-myc)が関与していることも知られている。

そこで、IIP・肺癌合併症例とIIPのない原発性肺癌症例について、EGFおよびその受容体であるEGF-Rを免疫組織学的に比較検討した。その結果、腫瘍細胞における両者の発現率に差はみられなかった。しかし、IIP・肺癌合併例の腫瘍周囲の間質にEGFが有意に多く発現していることが知られ、paracrine mechanismの存在が推測された。さらに症例を増やして検討することが必要と思われた。疫学的研究IIPと診断された66例を1年から13年間経過観察した。その結果、IIPと診断された66例の患者から経過中11名(16.7%)に肺癌がみられ、その内10名が男性喫煙者であった。組織型では腺癌6例と多く、部位では末梢が多かった。肺癌合併IIPと非合併IIPの比較では、ステロイド未使用例で、粉塵吸入歴を持ち、胸部写真上肺の縮みが少ないもの、つまりIIPの非定型例の要素を持つものに肺癌の合併が多かった。喫煙因子を除外するため、喫煙指数・性別をマッチした慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者を対照群として肺癌合併率を比較した。年齢・観察期間がCOPD群で高値であるのにも関わらず、IIP群の肺癌の発生率(16.7%)は、COPD群での95名中1名(1%)の肺癌合併率よりも有意に高かった。以上より、IIPそのものが喫煙から独立した肺癌の危険因子であることが示唆された。免疫組織化学的検討IIP合併肺癌で増殖因子のパラクライン機能存在の可能性を調べるために,EGF,EGF-Receptorの発現をIIP合併肺癌とそれ以外の肺癌の組織で免疫組織化学的に検討した。また、増殖因子であるPDGFやEGFがc-myc,c-fosを活性化することが知られている。そこで、IIP合併肺癌におけるc-myc,c-fos癌遺伝子蛋白の発現も検討した。その結果、1.EGFやEGF-Rは腫瘍細胞では両群間で有意差がなかったが、間質細胞ではIIP合併肺癌群でEGFの陽性率が有意に高く、IIP合併肺癌でその増殖にパラクライン機構が関係する可能性が示唆された。2.IIP合併肺癌およびIIP非合併肺癌群で癌遺伝子の発現に差はなかった。
RNAにより誘導される核内構造体の相分離メカニズムの解明

細胞は特定の分子を集積させることで、特異的な反応を促進・因子の隔離などの機能する細胞内構造体を有しており、生命活動において必須の役割を果たしている。近年このような構造体の形成の原動力として、相分離機構の重要性が明らかになってきた。このうち一群の構造体は、その骨格としてRNAを利用している。しかし、このRNAに依存した構造体の形成機構や、RNAがどのようにタンパク質とともに構造体の生物理的性質を規定しているか、その詳細な機構は明らかではなかった。そこで、NEAT1 lncRNAが骨格となり形成される核内構造体パラスペックルをモデルとしてRNA配列を変えた際の構造体の性状をin vivoおよびin vitroシステムを用いて解析した。ヒト一倍体細胞を用いて、NEAT1のパラスペックル形成に必要な領域の絞り込み、パラスペックルの形成に必要な領域を同定した。この領域には、PAR-CLIP解析やin vitro RNAプルダウン実験によって、NONOとSFPQというパラスペックルの形成に必須のタンパク質が強く結合することが明らかになった。そこで、人為的にこれらのタンパク質を繋留すると機能を相補した。加えて、FRAP解析、1,6-hexandiolを用いた解析、機能RNAドメインを用いたin vitro相分離実験などによりパラスペックルが相分離により形成されていることを明らかにした。以上の結果から、NEAT1には複数のNONO・SFPQと結合するドメインがあり、それらの機能により相分離が誘導されることが明らかになった。この相分離誘導に重要なドメインだけでなく、パラスペックルが別の構造体からの独立性に関わるNEAT1の領域の絞り込み、この機構に関わるタンパク質の同定にも成功した。細胞は、分子をあるべき場所に区画化する機構を有しており、特定の分子を集積させることにより、特異的な反応の促進や因子の隔離を行うことで、生命活動に根源的な役割を果たしている。このような区画化は細胞膜によって隔てられた細胞内小器官だけではなく、細胞膜を持たない細胞内構造体によっても行われている。このような細胞内構造体については、これまでに核や細胞質に多様な構造体が存在することが明らかになってきている。近年、この構造体形成の原動力として、相分離機構の重要性が明らかとなってきており、細胞内でこのような構造体が液滴、ハイドロゲル、アミロイドなどの状態で存在し、周りの環境から相分離されていることが明らかになりつつある。この内、一群の核内構造体は、RNAが骨格として必須の役割を持つ。しかし、このRNAに依存した構造体の形成機構やRNAがどのようにタンパク質とともに構造体の性質を規定しているか、その詳細な機構は明らかではない。本研究では、まず、NEAT1 lncRNAが骨格となる核内構造体パラスペックルをモデルとして、RNA配列を変えた際の構造体の形成や性状をin vivo及びin vitroシステムを用いて解析を進め、そのメカニズムの解明を目指した。その結果、パラスペックルの形成、パラスペックル内部のRNAおよびタンパク質の配置、さらにパラスペックルが独立した構造体として存在するために必要なNEAT1 lncRNAの領域の絞り込みに成功した。さらに、RNA上へのパラスペックルタンパク質の繋留実験などにより、これらの機能を担うタンパク質の同定にも成功しつつあり、さらにその詳細なメカニズムの解析を進めている。これまでのCRISPR/Cas9を用いた変異体解析から、パラスペックルの形成に必要な機能RNAドメインを同定しており、その機能を支える因子を探索するため、NEAT1上に種々のパラスペックルタンパク質を繋留した。その結果、特定のパラスペックル構成タンパク質を繋留した場合にのみ、パラスペックルが誘導されたことを見出した。これは、RNA上に繋留されたタンパク質により、相転移が誘導された結果であると推察された。また、パラスペックル形成を誘導するタンパク質は機能RNAドメインに結合することもin vitroおよびin vivoにおける実験から明らかとなった。さらに、in vitroにおいて、この特定のタンパク質がNEAT1 lncRNAの特定の領域と結合することで高次構造体を形成することを示す新たな実験系の確立にも成功した。また、NEAT1はパラスペックル内で特徴的な空間的な配置を取ることがわかっているが、CRISPR/Cas9による樹立した変異細胞株と超解像度顕微鏡・電子顕微鏡を用いた解析から、この配置に必要な領域を明らかにすることにも成功した。また、パラスペックルの独立した形成に必要な領域の絞り込みも進んでいる。さらに、これらの領域と機能を共にするタンパク質の同定も進んでおり、NEAT1によるパラスペックルの形成および性状決定機構が見えてきつつあることから、計画通り順調に進行しているものと判断した。

この領域には、PAR-CLIP解析やin vitro RNAプルダウン実験によって、NONOとSFPQというパラスペックルの形成に必須のタンパク質が強く結合することが明らかになった。そこで、人為的にこれらのタンパク質を繋留すると機能を相補した。加えて、FRAP解析、1,6-hexandiolを用いた解析、機能RNAドメインを用いたin vitro相分離実験などによりパラスペックルが相分離により形成されていることを明らかにした。以上の結果から、NEAT1には複数のNONO・SFPQと結合するドメインがあり、それらの機能により相分離が誘導されることが明らかになった。この相分離誘導に重要なドメインだけでなく、パラスペックルが別の構造体からの独立性に関わるNEAT1の領域の絞り込み、この機構に関わるタンパク質の同定にも成功した。これまでに、NEAT1の特定のRNA領域が構造体の形成および性状維持に重要であることが明らかとなっており、さらにそれらの機能に関わるタンパク質も明らかになりつつある。そこで、このメカニズムをさらに深く理解するため、キーとなるタンパク質の結合に重要なRNA領域の結合サイトをin vivoおよびin vitroの実験系を用いて、配列あるいは構造的なモチーフにまで落とし込む。さらに、タンパク質側についても、どういったドメインや性質がこれらの機能に重要であるかを明らかにするため、変異体を用いた解析を進める。さらに、精製タンパク質を用いて、相分離に実験を進める。この際には、共同研究者の協力を得る予定である。また、生物理的な性質についても、これまでに確立した種々の変異NEAT1を発現する細胞株やRNA上への繋留による相補実験などを用いることで解析を進める。また、NEAT1以外のarcRNAについても解析を進めることで、RNAを骨格とする核内構造体がどのように形成され、その性質が決定されているかについて一般的なメカニズムの理解に繋げる。ほぼ計画通りの使用となったが、5万円弱の持ち越しとなった。この分については、今年度行う実験において、抗体、プライマー、細胞培養関連試薬などの購入が必要となることから、それに当てる予定である。
脳キナーゼＣｄｋ５の新規基質ＧＲＡＢによる小胞輸送を介した軸索伸長メカニズム

大脳皮質形成の際、脳室帯において新生された神経細胞は脳表層側へと移動する。このとき神経細胞は、複数の神経突起を伸縮させた後、双極性の形態をとり先導突起の伸縮を繰り返しながら脳表層側へと移動する。すなわち、神経突起の伸縮は神経細胞移動に必須である。近年、メンブレン・トラフィックの神経突起伸長における重要性が明らかになってきている。しかし、神経細胞移動におけるメンブレン・トラフィック制御機構の多くは不明である。初年度において、Cdk5によるGRABのリン酸化は、Rab11-Rab8カスケードを介して神経突起伸長を制御することが明らかになった。本年度では、初年度に明らかにしたメンブレン・トラフィック制御機構に着目して、大脳皮質形成における神経細胞移動メカニズムを明らかにすることを目的とした。胎仔マウスの大脳皮質神経幹細胞において、子宮内電気穿孔法を用いてGRABをノックダウンしたところ、新生された神経細胞の移動が阻害された。さらに、この表現型はGRABのターゲットであるRab8やRab11のノックダウンにおいても同様に観察された。これらの結果から、GRABはRab8やRab11を介して大脳皮質形成に関わることが示唆された。次に、Cdk5によるGRABのリン酸化が神経細胞移動に与える影響を解析した。具体的には、GRABのノックダウンによる神経細胞移動の障害が、野生型GRAB、非リン酸化型GRAB変異体、もしくは擬リン酸化型GRAB変異体の共発現でレスキューできるのかを検証した。すると、野生型GRABを共発現させることで神経細胞移動の障害はレスキューされたが、非リン酸化型、もしくは擬リン酸化型の変異体ではレスキューされなかった。このことから、Cdk5によるGRABのリン酸化と、その脱リン酸化の両方が正常な大脳皮質形成に必要であることが示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。神経突起伸長の際、突起において細胞表面積の増大が必然的に伴う。つまり、神経突起が伸長するためには、突起先端部への脂質膜の供給が必須である。これに加えて、接着因子といった膜タンパク質も、突起先端部へ輸送される必要がある。こうした脂質膜の供給や、膜タンパク質の輸送は、全て「メンブレン・トラフィック」を介して行われる。しかし、メンブレン・トラフィックの視点で、神経突起伸長が研究され始めたのは、比較的最近であり、その制御機構の多くは明らかでない。そこで本研究では、メンブレン・トラフィックを介した新たな神経突起伸長メカニズムの解明を目的とした。申請者はこれまで、Rab8のGEFであり、Rab11の結合タンパク質であるGRABが、脳特異的キナーゼCdk5によってリン酸化されること、さらにこのリン酸化が軸索伸長を制御することを明らかにしていた。そこで本年度は、このリン酸化がGRABの機能に与える影響を解析した。GRABはRab8のGEFである。Cdk5によるGRABのリン酸化部位がGEFドメインの近傍にあることから、このリン酸化はGEF活性を制御することが予想された。そこで、このリン酸化がGRABのGEF活性に与える影響を解析したところ、GRABのリン酸化は、Rab8へのGEF活性を負に制御することが明らかになった。次に、リン酸化GRABの細胞内局在を観察したところ、リン酸化GRABは、Rab11陽性小胞と軸索において顕著に共局在していた。この結果は、リン酸化GRABがRab11陽性小胞と軸索内で共輸送されることを示唆する。実際に、ライブイメージングにより、GRABとRab11陽性小胞は、軸索内で共輸送されることが示された。これらの結果から、Cdk5によるGRABのリン酸化は、Rab8活性や、GRABのRab11陽性小胞へのリクルート制御を介して軸索伸長を制御することが示唆された。

すると、野生型GRABを共発現させることで神経細胞移動の障害はレスキューされたが、非リン酸化型、もしくは擬リン酸化型の変異体ではレスキューされなかった。このことから、Cdk5によるGRABのリン酸化と、その脱リン酸化の両方が正常な大脳皮質形成に必要であることが示唆された。本年度の研究で、Cdk5によるGRABのリン酸化が、Rab11-Rab8カスケードを担うことが明らかになった。今後は、申請者が見出したこの膜動態経路が、実際に生体内においても役割を果たしているのか検討する。具体的には、子宮内電気穿孔法を用いたマウス胎仔脳への遺伝子導入を行い、神経突起形成や、大脳皮質神経細胞移動における役割を解析する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
Runx3の下流遺伝子群の解析による悪性黒色腫に対する新規治療標的の創出

悪性黒色腫の治療において、近年登場した免疫checkpoint阻害薬は既存の薬剤に比べて、良好な効果を示しており、他癌腫への適応拡大が進んでいる。免疫checkpoint阻害薬の効果予測や正確な病勢判定は医療費抑制に重要である。また、効果不十分な症例に対する新たな治療標的の創出も重要であると考えられる。我々は、がん抑制遺伝子であるRunx3の過剰発現・発現抑制の実験から、悪性黒色腫の悪性度や転移能・生存能にかかわる可能性のある候補遺伝子を策定した。原発巣における候補遺伝子の発現や免疫checkpoint阻害薬の投与前後での発現変化を測定することで、候補遺伝子が悪性黒色腫の予後や治療への反応性に与える影響を評価する。さらにマウス・ヒト悪性黒色腫細胞株を用いたin vitro実験を併せて行うことで、臨床検体から得られた知見を補強し、可能であればその分子メカニズムを明らかにする。最終的には、候補遺伝子の測定を悪性黒色腫の予後予測、免疫checkpoint阻害薬の効果予測もしくは効果判定の一助として活用することを目指す。同時に、候補遺伝子が、悪性黒色腫の治療標的として有用であるかを評価する。上記を目標としていた。現状では候補遺伝子のうち2個について臨床検体を用いて、遺伝子発現の差をRT-PCRで検出した。また、in vitro実験のための、遺伝子導入用vectorの作成・精製を行っている。A.臨床検体を用いた候補遺伝子の評価候補遺伝子のうち2個に関してはRT-PCRにて、臨床検体を用いて遺伝子発現を検出することができた。そのうち1つに関しては、悪性黒色腫において遺伝子発現の増大が認められ、さらにメラノーマ細胞株でも発現の上昇が認められた。もう1つの遺伝子に関しては発現の差異がなく。2つの遺伝子に関しては遺伝子発現を検出することができなかった。B.マウス悪性黒色腫細胞株B16F10を用いたin vitro実験上記で差異がみられた候補遺伝子をまず第一候補と考え、遺伝子導入のためのVectorの作成・精製を行っている。A.臨床検体を用いた候補遺伝子の評価遺伝子検出ができなかった候補遺伝子2つにかんしては、保存検体(パラフィン切片)からの遺伝子抽出であり、検体のRNA量が少ないことが原因と考えている。そのために、新規検体(凍結標本)を採取して、検体量を増量することにより、再評価することを予定している。B.マウス悪性黒色腫細胞株B16F10を用いたin vitro実験上記で差異がみられた候補遺伝子をまず第一候補と考えており、精製したVactorを用いて、メラノーマ細胞株に遺伝子を過剰発現させ、表現型の変化を見る予定である。表現型に差がみられた場合は、マウスへの移植実験を行う予定である。

候補遺伝子の臨床検体における評価を第一に考えて、その中からさらに有力な遺伝子を絞り込もうと実験を行った。保存検体を用いて、4つの候補遺伝子をRT-PCRで評価したが、明瞭な差がみられたのは候補遺伝子のうち1つのみであり、保存検体(パラフィン切片)からのcDNA精製を複数回行い、評価の確認を行うことに注力した結果、当初より実験計画が遅れたため、実験に使う費用が少なくなってしまい、差額が生じた。
理科の見方・考え方が習得できる科学教育プログラム開発とICTを用いた評価指標構築

1.「理科の見方・考え方」が習得できるアクティブラーニング型教育プログラム開発NHK「カガクノミカタ」活用教育プログラム』を次期学習指導要領「理科の見方・考え方」により即するよう開発した。成果をPCST、科学教育学会、Science and You等で発表した。2.「理科の見方・考え方」の熟達度を測る設問項目例の調査分析次年度の評価指標開発の足がかりとして、PISA、我が国の全国学力・学習状況調査、大学入試問題等、国内外における「理科の見方・考え方」の熟達度を測る設問項目に関する調査分析を実施した。次年度に開発を予定していたコンピュータ適応型テストの開発に着手することができ、一部プロトタイプ制作まで到達できたため。すでに当初計画以上に進展しており、今後は昨年度と同様のペースで進めていく。
生体吸収性素材を用いた階層型ハイブリッド人工血管の開発に関する研究

自己の血管壁細胞と生体吸収性ポリマーを用いた人工血管を開発し、人工血管内腔面に生体血管類似の血管壁構造が再構築するにつれ、架体は生体に吸収され、その後は成長に伴い、血管径の自己制御が期待される新しい小児用人工血管を開発してきた。雑種成犬を用い、外頚静脈より内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞を採取し培養した。人工血管は内径5mm、長さ5cmの生体吸収性ポリマー(poly-L-lactideとpoly-caprolactoneの共重合体を基質としたpoly-glycolic acid)で作製したものを、さらに、吸収性のpoly-glycolic acidと非吸収性のpolypropyleneで作製したメッシュでらせん状に補強したものを用いた。次いで、その人工血管上に線維芽細胞層/平滑筋細胞層/内皮細胞層をin vitroで人工細胞外マトリックス(TypeI collagen)を用逐次的に構築し、細胞を採取した同一犬に移植した。移植後2週間で摘出したグラフトの光顕所見では、新生中膜に、円周方向へ配向した多数の平滑筋細胞と線維芽細胞を認めた。人工血管の基質部分はほぼ吸収されており、らせん部分のみが残存していた。また、移植後8週間では、層状のエラスチンの構築を認めた。透過電顕では2週では合成型平滑筋細胞が多数認められ、8週では収縮型平滑筋細胞が多数認められた。新生中膜の壁圧は2週で329±133μm、8週で99±28μmであった。しかし、血管径が8週間で6.5mmへと拡大傾向にあり、現在、さらに遠隔期における血管壁の状態を追跡中である。本グラフトは移植後早期に人工血管内腔面に生体血管類似構造が形成されるため、人工血管が生体に吸収された後においても、生体血管と同様の構築および制御過程を辿り、また、らせん状に補強された素材により、過度の拡張を防ぐことができる可能性があることが示唆された。次いで動物実験に移った。雑種成犬の外頚静脈より酵素法で血管内皮細胞を採取し、外植片法により平滑筋細胞、線維芽細胞を採取した。約2週間の継代培養を行った後に、それらをTypeIコラーゲンと混合し、線維芽細胞層、平滑筋細胞層、内皮細胞層の順に階層性に、生体吸収性人工血管上に構築した。2日間の追加培養の後、細胞を採取した犬の内頚動脈に移植した。現在のところ、移植後2週間の時点においてsacrificeし、組織学的に検討した。その組織学所見では、走査電顕で血管内腔面を観察したところ、完全に内皮細胞で覆われていた。また、それらの内皮細胞はすべて血流方向への配向を呈していた。中膜においては、平滑筋細胞、線維芽細胞が盛んに細胞分裂を繰り返し、新生中膜を作成しつつあった。それらの細胞の一部は円周方向への配向を呈していた。また、一部においては人工血管の外側より、線維芽細胞や平滑筋細胞が、人工血管を通して侵入してきている所見も認められた。人工血管に動脈瘤様の所見は認めなかった。光顕では人工血管の組織はまだ残存していた。しかし、組織を摘出する際、加圧固定を行ったところ、亀裂が入った部分があり、人工血管が吸収され、強度が弱くなった部位もあると考えられた。現在、さらに長期間移植モデルを作製中である。
細胞周期制御機構をターゲットとした新たな肥満・糖尿病治療の基盤確立とその応用

(1)p27Kip1ノックアウトマウス(p27Kip1KOマウス)は、体重あたりの脂肪組織重量には野生型マウスと変化はないが、個々の脂肪細胞の小型化と脂肪細胞数(総数)の増加を認め、良好なインスリン感受性を示す。このp27Kip1KOマウスに生活習慣の一つである高脂肪食を負荷すると、個々の脂肪細胞の小型化が消失し、野生型マウスの脂肪細胞と同じ大きさとなる。p27Kip1KOマウスでは脂肪細胞数(総数)が増加しているため、体重あたりの脂肪組織重量の急激な増加を認め、インスリン抵抗性を発症すると考えられた。(2)p27Kip1の発現を蛋白レベルで抑制するユビキチンリガーゼSkp2のノックアウトマウス(Skp2KOマウス)では、著明な脂肪細胞数の減少と高脂肪食負荷時の肥満形成の抑制が認められた。Skp2KOマウスでの脂肪細胞数の減少がエネルギー過剰状態での生体の糖代謝悪化に抑制的に作用することを明らかとした。(3)p27Kip1KOマウス及びSkp2KOマウスより得られた胎児線維芽細胞を用いた脂肪細胞への分化の検討により、p27Kip1は脂肪細胞分化に抑制的に働き、Skp2は脂肪細胞分化に促進的に働くことを明らかとした。以上のことから、肥満治療における分子標的としての脂肪細胞増殖の意義が明らかとなった。また、(4)肥満形成過程において、脂肪細胞増殖が活発に活性化されていることを明らかとした。さらには、この脂肪細胞増殖を細胞周期阻害剤で抑制することで、肥満の増悪抑制や糖代謝悪化に抑制的に働くことを明らかとし、細胞周期阻害剤の新たな抗肥満・抗糖尿病薬としての可能性を見出した。そこで通常食飼育p27Kip1KOマウス、野生型マウス、高脂肪食負荷p27Kip1KOマウスでの各種アディポサイトカインを測定したところ、通常食飼育p27Kip1KOマウスで、インスリン感受性を改善する作用をもつアディポネクチンの増加が確認され、小型脂肪細胞数増加による血中アディポネクチン濃度の増加が、良好なインスリン感受性の原因の一つであることが明らかとなった。さらに高脂肪食負荷p27Kip1KOマウスでは血中アディポネクチン濃度の減少と共に、著明な血中レプチン濃度の上昇が認められたが、インスリン抵抗性の発症を示唆する原因の特定には至っていない。(2)p27Kip1の発現を蛋白レベルで抑制するユビキチンリガーゼskp2のノックアウトマウス(Skp2KOマウス)では、著明な脂肪細胞数の減少と高脂肪食負荷時の肥満形成の抑制が認められた。Skp2KOマウスでの脂肪細胞数の減少がエネルギー過剰状態での生体の糖代謝悪化に抑制的に作用することが明らかとなったとなった。(3)p27Kip1KOマウス及びSkp2KOマウスより得られた胎児線維芽細胞を用いた脂肪細胞への分化の検討により、p27Kip1は脂肪細胞分化に抑制的に働き、Skp2は脂肪細胞分化に促進的に働くことが明らかとなった。

1.p27^<Kip1>の肥満形成における役割サイクリン依存性キナーゼインヒビターであるp27^<Kip1>を欠失させたマウスでは、対照マウスに比べ脂肪細胞数の増加と高脂肪食による肥満誘導が顕著となり、インスリン抵抗性が増悪することを明らかとした。脂肪細胞の過剰増殖した高脂肪食負荷p27^<Kip1>欠損マウスでは、肝臓における糖新生系酵素の発現誘導が確認されており、脂肪細胞の増殖による肥満が肝臓の糖代謝制御機構を破綻させ、インスリン抵抗性を発症させると考えられた。2.Skp2の肥満形成における役割p27^<Kip1>の発現を蛋白レベルで抑制するユビキチンリガーゼSkp2の欠損マウスでは、脂肪細胞数の減少がエネルギー過剰状態での生体の糖代謝悪化や肥満形成に抑制的に作用することを明らかとした。さらには、Skp2が膵β細胞の増殖において、細胞周期制御分子の発現を制御する必須の分子であることを明らかとした。3.肥満形成における脂肪細胞増殖と治療ターゲットとしての意義肥満形成過程において、脂肪細胞増殖が活発に活性化されていることを明らかとした。さらには、この脂肪細胞増殖を細胞周期阻害剤で抑制することで、肥満の増悪抑制や糖代謝悪化に抑制的に働くことを明らかとし、細胞周期阻害剤の新たな抗肥満・抗糖尿病薬としての可能性を見出した(特許出願済み)。4.脂肪分化に関与する新規転写因子の同定脂肪分化過程で促進的に働く新規な転写因子Kruppel-like factor 15(KLF15)を見出し、脂肪細胞分化機構における役割を明らかとした。さらに転写因子C/EBPβ活性化機構におけるMAPキナーゼの役割を明らかとした。
Dorfin-CHIP融合タンパク質による筋萎縮性側索硬化症(ALS)の治療

変異SOD1特異的ユビキチンリガーゼ(E3)であるDorfinの導入によりALSモデル動物である変異SOD1-Tgマウスの生存期間を延長しうるが、その効果は十分でない。Dorfinの半減期が短く、Tgマウスにおいて高発現を長期間維持することが難しいことが原因と考えられたため、我々はこのDorfinの欠点を克服し治療効果を高めるために、変異SOD1特異的結合能を保持しつつ、より安定して発現する人工E3の開発を試みた。DorfinのC末端側にある疎水性部位が変異SOD1結合ドメインであることを同定し、強力なE3活性を有するCHIPのユビキチン化活性部位と融合したキメラタンパク質を作製した。変異SOD1に対する結合力が強く、十分なE3活性を保持するためには、CHIPのU-Box部位をN末端側に持ち、Dorfinの変異SOD1結合部位をC末端側に有する必要があった。野生型Dorfinもユビキチン化活性部位をN末端側に有するため、N末端側にE3活性部位、C末端側に基質結合部位を有する構造が、変異SOD1特異的E3として機能するために重要であることが示唆された。本研究により野生型Dorfinに比べ、より強力な変異SOD1ユビキチン化・分解促進活性を有し、安定して発現するキメラタンパク質Lが得られた。キメラタンパク質Lは、Neuro2aに対する変異SOD1の毒性軽減効果も野生型Dorfinに比較して強く、このキメラタンパク質を導入することで、変異SOD1-Tgマウスの治療効果が野生型Dorfinを導入した場合よりも高まることが期待できる。遺伝子工学的手法を用いて、神経変性疾患の原因タンパク質を強力に分解する人工タンパク質を開発する手法は、ALSのみならず、パーキンソン病やアルツハイマー病などの異常タンパク質蓄積により生ずる神経変性疾患の治療戦略として今後有望であると思われる。
心不全および致死性不整脈に対する遠隔治療指針開発のための基盤研究

本邦における致死性不整脈発生のリスク層別化ならびに心不全および致死性不整脈に対する遠隔治療指針策定のための基盤づくりを目的に、蓄積されたデータを分析することで、本邦の植込み型ショックデバイス患者における致死性不整脈発生のリスク層別化を行う。また実際の遠隔モニタリングによる生体データをもとに心不全増悪因子および致死性不整脈発生関連因子の同定に関する研究を行う。
単層カーボンナノチューブの熱伝導特性の実験的研究

AFM(原子間力顕微鏡)サンプル台上でサンプル温度(3001000K)及び環境雰囲気(ガス種類やその圧力,流速など)の制御が可能である環境制御型AFM-ラマン散乱スペクトル同時測定装置を設計・開発した.この装置を利用し,単層カーボンナノチューブ(single-walled carbonnanotube, SWNT)のラマン散乱スペクトルの温度依存性を明らかにした.SWNTsサンプルのラマン散乱スペクトルに特徴的に現れてくるG-band, D-band及びRBMピークについて,真空中においてSWNTs温度を変化させながらそのスペクトルを測定したところ一般的なラマン散乱スペクトルの温度依存性(ラマンシフト(ピーク位置),ピークの幅及び散乱強度)が見られたが,温度上昇によりその強度が増加する特異な温度依存性をもつRBMピークが存在することが分かった.また,アルコール触媒CVD法(ACCVD法)におけるSWNTsの成長の様子をAFM測定及びその場ラマン測定により分析することに成功した.CVDを開始してからSWNTsが成長を始める前に待機時間が存在することや,使用する触媒金属によってその成長の様子(触媒寿命)が異なることが分かった.待機時間及び触媒寿命はCVD温度には依存せず,特に待機時間はエタノール圧に強く依存し,一定量のエタノールと反応後した後に触媒はSWNTsを生成し始めることが明らかとなった.単層カーボンナノチューブ(Single-walled carbonnanotube, SWNT)は,その特異な物性についでの基礎的研究のみならず,デバイスや工学的応用に向けても盛んに研究されている.未だ不明な点が多いその生成メカニズムの解明と伴に,より高度に制御(直径,構造,生成位置など)した生成技術の開発が益々重要となってくる.また,単層カーボンナノチューブの注目すべき特性の1つとして熱伝導特性が挙げられる.軸方向に非常に高い郵伝導率を持つとされ,実験的研究も行われてきているが,まだその手法は確立されていない.本年度は,単層カーボンナノチューブ生成機構の解明を目指し,成長途中段階での単層カーボンナノチューブの分析を行うことのできるラマン散乱測定システムを伴う真空チャンバー付原子間力顕微鏡(AFM)装置を開発した.この装置はCVD生成とラマン散乱測定及びAFM測定を1つの真空チャンバー内で行うことができる.この装置を用いて,電気炉やホットフィラメントなどを用いない簡易な装置によるCVD生成を実現し,CVD生成における成長段階にある単層カーボンナノチューブのラマン散乱を測定した.結果,単層カーボンナノチューブから生じるラマン散乱のピーク(G-band)強度はおおよそ時間と伴に増加していく様子が確認された.また,同じ装置で,ラマン散乱スペクトルの温度依存性を用いて測定を行った.ラマン散乱のピークが温度によってシフトをすることを利用し,そのピークのシフト量から単層カーボンナノチューブ自身の温度を測定することが出来た.単層カーボンナノチューブ(single-walled carbonnanotube, SWNT)は,その特異な物性についての基礎的研究のみならず,デバイスや工学的応用に向けても盛んに研究されている.単層カーボンナノチューブの多くの注目すべき特性の1つとして伝熱特性が挙げられる.軸方向に極めて高い熱伝導率を持ち,非等方的な伝熱特性が期待される.しかし,単層カーボンナノチューブが長さ数μm,太さ12nmと非常に微細な構造であるため,まだその測定手法は確立されていない.昨年までにラマン分光測定システムを伴う環境制御型原子間力顕微鏡(AFM)を開発し,この実験装置内で単層カーボンナノチューブのCVD合成やCVD合成中における成長段階にある単層カーボンナノチューブのラマンスペクトルの測定に成功した.ラマン分光とは単層カーボンナノチューブ試料の分析や物性研究に広く行われている分析技術であり,本年はこの実験装置を用い実験的熱物性の第一段階として単層カーボンナノチューブのラマンスペクトルの温度依存性について詳細に分析を行った.単層カーボンナノチューブのラマンスペクトルには3つの特徴的なピーク(G-band, D-band及びRBMピーク)があり,これらピークについてのピーク位置(ラマンシフト),ピーク幅及びピーク面積強度に関して,4K1000Kの広範囲の温度依存性を様々な手法で合成された単層カーボンナノチューブ試料について測定した.G-band及びD-bandのピークは通常のラマンピークにみられるような,サンプル温度の増加に伴うラマンシフトのダウンシフトとピーク幅の増加,シグナル強度の減少という温度依存性が見られた.一方,RBMピークについては大部分のピークは通常の温度依存性に従っているが,温度を増加すると強度が強くなっていくという特異な温度依存性を示すピークが存在することがわかった.AFM(原子間力顕微鏡)サンプル台上でサンプル温度(3001000K)及び環境雰囲気(ガス種類やその圧力,流速など)の制御が可能である環境制御型AFM-ラマン散乱スペクトル同時測定装置を設計・開発した.この装置を利用し,単層カーボンナノチューブ(single-walled carbonnanotube, SWNT)のラマン散乱スペクトルの温度依存性を明らかにした.SWNTsサンプルのラマン散乱スペクトルに特徴的に現れてくるG-band, D-band及びRBMピークについて,真空中においてSWNTs温度を変化させながらそのスペクトルを測定したところ一般的なラマン散乱スペクトルの温度依存性(ラマンシフト(ピーク位置),ピークの幅及び散乱強度)が見られたが,温度上昇によりその強度が増加する特異な温度依存性をもつRBMピークが存在することが分かった.

また,アルコール触媒CVD法(ACCVD法)におけるSWNTsの成長の様子をAFM測定及びその場ラマン測定により分析することに成功した.CVDを開始してからSWNTsが成長を始める前に待機時間が存在することや,使用する触媒金属によってその成長の様子(触媒寿命)が異なることが分かった.待機時間及び触媒寿命はCVD温度には依存せず,特に待機時間はエタノール圧に強く依存し,一定量のエタノールと反応後した後に触媒はSWNTsを生成し始めることが明らかとなった.
外傷性咬合による骨吸収への静止期破骨細胞前駆細胞の関与と血管内皮増殖因子の影響

本実験はマウス上顎臼歯を過高な状態にし、下顎臼歯に咬合性外傷を付与する系を用いる。マウス大腿骨ならびに脛骨より採取した単球ーマクロファージ系の細胞(BMM)は破骨細胞の前駆細胞と考えられており、BMMにマクロファージコロニー刺激因子であるM-CSFの存在下で、破骨細胞形成に必要な破骨細胞分化誘導因子であるRANKL刺激を与えると72時間後に破骨細胞が形成される。しかしながら、咬合性外傷による破骨細胞の出現はそれよりも24時間早く確認できた。この24時間も早期に破骨細胞が出現する機序の一端を解明するために、本研究をおこなっている。本年の研究は平成31年度に発表できるように行った。具体的には、上顎左側第一臼歯咬合面にステンレスワイヤーを接着性レジンにて装着する上記の系において、0,1,2,3,4,5日目に屠殺を行う。脱灰、AMeX法による固定後、薄切を行った。その際、事前にBrdUを投与しているので、その検出を行うために蛍光免疫染色を行った。また、下顎左側第一臼歯を摘出して根分岐部が観察できるように組織切片を作製して、H.E.染色ならびに破骨細胞のマーカーの一つである酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)染色を行い、破骨細胞出現状態を病理組織学的に確認した。得られた結果としては、0日目と比較して、1日目には歯根膜に硝子様変性がおこり、2日目に破骨細胞が分岐部直下の根間中隔に出現していることが確認できた。さらに、BMMに対して各種サイトカインの影響を受けた際の破骨細胞形成の状態を学会発表を行った。実験計画通りに進捗している。中間報告として学会報告を今年度中に行うべく、まとめている段階である。実験計画通り使用したが、次年度使用額として8411円を計上してしまった。組織染色に必要な試薬の購入に充てる予定である。
ゴーシェ病の中枢神経障害への遺伝子治療

ゴーシェ病はグルコセレブロシダーゼの遺伝的酵素活性低下のため発症するリピドーシスであり肝脾腫、骨症状を主徴とし、神経症状の有無により1型(慢性非神経型)、2型(急性神経型)、3型(亜急性神経型)に分類されている。根治療法として骨髄移植、酵素補充療法が実際臨床で行われておりその有用性が確認されている。また、遺伝子治療も治験段階まで進んでいる。本症の臨床上の特徴は臨床表現型に異質性が存在することであり、この原因として遺伝子変異の多様性が推察されている。この臨床的異質性のため現在のところ治療法に一定の見解が存在しない。これら問題を解決するため我々は今回の研究で日本人ゴーシェ病の詳細な臨床症状の解析及び遺伝子型との相関、治療法の検討を中心に研究を行った。日本人1型ゴーシェ病35例の検討により骨合併症が諸外国に比較し高頻度に認められる事とともに急激な酵素投与量の減量が骨合併症を発症することを報告した。日本人ゴーシェ病のL444Pのhomozygote15例の検討によりこれら患者は従来1型にリンクすると報告されてきたが長期にわたる詳細な神経学的フォローアップを行うと3型であることを明らかにした。また、L444Pの点変異のみでなくリコンビネーションを合併すると2型を呈することを明らかにし遺伝子解析におけるリコンビネーションの重要性を報告した。神経型の中でも特異な臨床症状(水頭症、心弁膜症、角膜混濁など)を呈する3型の症例についてその神経所見、病理所見を詳細に検討、報告した。さらに小児期発症の1型ゴーシェ病13例について酵素投与量の差異による臨床効果を比較したところ重篤な小児期発症のゴーシェ病においては十分な臨床効果及びその状態を維持するには高単位しかも長期の酵素補充療法が必要であることを明らかにした。ゴーシェ病は発症年齢及び神経症状の有無により1型、2型、3型に分類されるが、このうち1型は酵素補充療法が有効で十分な臨床効果が得られるが、2型、3型という神経型には有効でない症例が多い。従って、これらを臨床表現型を遺伝子変異の上から鑑別することは重要であるが現在のところコンセンサスがない現状である。特にL444P/L444Pの遺伝子型の欧米症例は3型を呈するのに対し、日本人症例では1型を呈すると報告されている。本年度は、このような人種による臨床表現型の差異を明らかにするため日本人L444P/L444P症例15例の長期にわたる詳細な神経学的検索並びに偽遺伝子の相関を検討した。その結果1型と考えられる症例は3例にすぎず、他は何らかの神経症状を呈していた。2型を呈した3例は偽遺伝子をheteroallelicに持っていた。以上からゴーシェ病のgenotype/phenotypeの相関を検討する。際には長期的かつ詳細な神経学的検索が重要であると共に偽遺伝子の検索が重要であると考えられた(Human Genetics 105:120,1999)。ゴーシェ病は発症年齢及び神経症状の有無により1型、2型、3型に分類される。酵素補充療法はゴーシェ病の根治療法として臨床的に用いられているがその至適投与量についての一定した見解は確立していない。そこで今年度は日本人の小児期発症の1型ゴーシェ病13例について60単位/kg/回を初期投与量としてこの投与量を36ケ月継続した群(L-群)、60単位/kg/回を6ケ月投与しその後30単位/kg/回を6ケ月投与し、ついで15単位/kg/回を維持量として24ケ月継続した群(M-群)、60

単位/kg/回を6ケ月以内に減量し以後15単位/kg/回を36ケ月まで継続した群(S-群)の三群に分類して臨床効果(ヘモグロビン値、血小板値、ACE値、酸性ホスファターゼ値、身長、体重)を比較した。治療前と36ケ月後の比較ではどの群においてもこれら臨床データは改善していたがすべてのデータが統計学的有意差をもって改善していたのはL-群のみであった。さらに各群の治療開始後一年、二年、三年時のデータを比較検討するとヘモグロビン値についてはL-群とS-群及びM-群ではL-群の方が統計学的有意差をもって改善が著明であった(L-群対S-群:一年、二年、三年時、L-群対M-群:三年時)。血小板値については三年時にL-群はM-群に比較して統計学的有意差をもって改善が著明であった。ACE値並びに酸性ホスファターゼ値は投与量依存性に改善が著明であった。
ケモカインと免疫抑制シグナル及び血管内皮前駆細胞との相互的な卵巣癌促進機構の解明

本研究では卵巣癌微小環境におけるケモカインシステムに着目し卵巣癌進展における役割を検討した。宿主におけるCX3CL1-CX3CR1およびCCR5の機能解析のためCX3CR1KO(ノックアウトマウス)およびCCR5KO(ノックアウトマウス)を用い、マウス卵巣癌細胞株ID8の腹腔内移植モデルにて解析した。CX3CR1KOでは腹膜播種・腹水量が有意に減少し、生存期間は延長、腫瘍内マクロファージの浸潤は減少した。CCR5KOマウスでは血管新生の減弱を認めた。宿主のCX3CR1あるいはCCR5欠損により腫瘍進展は抑制され、癌微小環境内でケモカインシステムが卵巣癌進展に有利な環境を作りだすことが判明した。卵巣癌は腹膜播種という進展形式をとる予後不良な疾患の一つである。近年癌微小環境の構築におけるケモカインシステムの関与が明らかになってきた。本研究では、ケモカインの1つであるフラクタルカイン(CX3CL1)及びそのレセプター(CX3CR1)に着目し、卵巣癌腹膜播種におけるCX3CL1-CX3CR1システムの役割を検討した。本年度は、宿主におけるフラクタルカインシステムの機能解析のためCx3cr1-/- (KO)マウスを用いて、マウス卵巣癌細胞株であるID8細胞(5x106個/マウス)を野生型C57Bl/6 (WT)及びKOマウスに腹腔内移植し、腹膜播種の程度、生存率及び腫瘍関連分子の発現を検討した。ID8細胞をWTおよびKOマウスに腹腔内移植後79日目では、WTマウスに比べてKOマウスの腫瘍形成数,腹水量が有意に減少した(P=0.001,P=0.001)。生存期間はWTマウスに比べてKOマウスで有意に延長した(中央値;101日vs. 94日, P<0.001)。腹膜播種腫瘍組織の免疫組織学的検討ではWTマウスに比べてKOマウスにおいて腫瘍内に浸潤するマクロファージの減少を認めた。またKOマウスではMMP-2,TGF-β産生細胞の減少を認め、免疫二重染色にてこれらの産生細胞は腫瘍内に浸潤するマクロファージであると判明した。以上より、宿主のCX3CR1欠損により腹膜播種の進展は抑制されることを証明した。本研究により、腫瘍細胞から分泌されるフラクタルカインが、受容体を発現するマクロファージの腫瘍微小環境内への動員に関与し、浸潤マクロファージがMMP-2やTGF-βを産生するtumor-associated macrophage (TAM)として卵巣癌進展に有利な環境を作りだすことが示唆され、フラクタルカインシステムに対する標的治療の可能性が示唆された.本年度はCXCケモカインであるフラクタルカイン(CX3CL1)とその受容体(CX3CR1),およびCCケモカイン受容体の1つであるCCR5に着目し,卵巣癌腹膜転移機構における役割を検討した.宿主におけるCX3CL1-CX3CR1およびCCR5の機能解析のため2つのノックアウト(KO)マウスであるCX3CR1-/-(CX3CR1KO)およびCCR5-/-(CCR5KO)マウスを用いた.マウス卵巣癌細胞株ID8を野生型C57Bl/6 (WT)及びKOマウスに腹腔内または皮下移植し,卵巣癌進展の程度,生存率及び腫瘍関連分子の発現を検討した.ID8細胞をWTおよびCX3CR1KOマウスに腹腔内移植後79日目ではCX3CR1KOマウスの腫瘍形成数,腹水量が有意に減少した.生存期間はCX3CR1KOマウスで有意に延長した.腫瘍組織の免疫染色ではCX3CR1KOマウスにおいて腫瘍内マクロファージの減少,MMP-2,TGF-β産生の減弱を認めた.ID8細胞をWTおよびCCR5KOマウスに腹腔内移植したところ、腫瘍形成数,腹水量は有意に減少した.一方,ID8細胞をWTおよびCCR5KOマウスに皮下移植したところ,CCR5KOマウスでは腫瘍が退縮し,Day20以降は腫瘍が消失した.CCR5KOマウスでは腫瘍内へのマクロファージの浸潤,線維化,血管新生の減弱を認めた.宿主のCX3CR1欠損あるいはCCR5欠損により腫瘍進展・腹膜転移は抑制された.癌微小環境内でこれらのケモカインシステムが腫瘍内へのTAMやCAFの動員を介して卵巣癌の腹膜転移進展に有利な環境を作りだすことが判明し,分子標的治療の標的となる可能性が示唆された.ノックアウトマウスを使用した動物実験が、計画通り進み、仮説にあったデータが出ている。論文作成も進行している。癌微小環境におけるtumor-associated macrophage (TAM)や腫瘍関連線維芽細胞(CAF)の重要性とそれらの動員におけるケモカインシステムの役割が注目されている.我々はフラクタルカイン(CX3CL1)の受容体CX3CR1およびもう1つのケモカイン受容体であるCCR5に着目し,卵巣癌進展における役割を検討した.方法はCX3CR1ノックアウト(CX3CR1KO)およびCCR5ノックアウト(CCR5KO)マウスを用いた.マウス卵巣癌細胞株ID8を野生型C57Bl/6 (WT)及びKOマウスに腹腔内または皮下移植し,卵巣癌進展の程度,生存率及び腫瘍関連分子の発現を検討した.ID8細胞をWTおよびCX3CR1KOマウスに腹腔内移植後79日目ではCX3CR1KO

マウスの腫瘍形成数,腹水量が有意に減少した.生存期間はCX3CR1KOマウスで有意に延長した.腫瘍組織の免疫染色ではCX3CR1KOマウスにおいて腫瘍内マクロファージの減少,MMP-2,TGF-β産生の減弱を認めた.ID8細胞をWTおよびCCR5KOマウスに腹腔内移植したところ、腫瘍形成数,腹水量は有意に減少した.一方ID8細胞をWTおよびCCR5KOマウスに皮下移植したところ,CCR5KOマウスでは腫瘍が退縮し,Day20以降は腫瘍が消失した.CCR5KOマウスでは腫瘍内へのマクロファージの浸潤,線維化,血管新生の減弱を認めた.宿主のCX3CR1欠損あるいはCCR5欠損により腫瘍進展は抑制された.癌微小環境内でこれらのケモカインシステムが腫瘍内へのTAMやCAFの動員を介して卵巣癌進展に有利な環境を作りだすことが判明し,卵巣癌の新規分子標的治療の標的となる可能性が示唆された.本研究では卵巣癌微小環境におけるケモカインシステムに着目し卵巣癌進展における役割を検討した。宿主におけるCX3CL1-CX3CR1およびCCR5の機能解析のためCX3CR1KO(ノックアウトマウス)およびCCR5KO(ノックアウトマウス)を用い、マウス卵巣癌細胞株ID8の腹腔内移植モデルにて解析した。CX3CR1KOでは腹膜播種・腹水量が有意に減少し、生存期間は延長、腫瘍内マクロファージの浸潤は減少した。CCR5KOマウスでは血管新生の減弱を認めた。宿主のCX3CR1あるいはCCR5欠損により腫瘍進展は抑制され、癌微小環境内でケモカインシステムが卵巣癌進展に有利な環境を作りだすことが判明した。ノックアウトマウスを用いた機能解析が順調に進み、フラクタルカインの卵巣癌微小環境における役割が判明し、新知見を得られた。さらにもう1つのケモカインCCL5/CCR5システムの解明への同様の実験への基盤も作成できた。動物実験で得られたデータを基に、倫理委員会の承認のもと、ヒトの卵巣癌の手術検体においても、同様のケモカインやその受容体の発現の差異やその意義について検討する。これまでの基礎実験、動物実験の総括と、さらに足りない部分の補填をおこなう。婦人科腫瘍学平成27年度以降は、同様のノックアウトマウスモデルの系を用いて、もう1つの我々が直目しているケモカインシステムCCL5-CCR5の卵巣癌進展と腫瘍微小環境における機能解析を行う予定である。さらに、このようなシステムがヒトにおいても同様に存在し、標的治療のターゲットになり得るかどうかを検討するため、学内倫理委員会承認の下、ヒト卵巣腫瘍の手術検体を用いて,卵巣腫瘍組織における上記ケモカインシステムの発現を免疫組織染色およびRT-PCRにて検討する予定である。本年度は、動物実験が順調に進行し、データも得られたので、少し助成金を残して終了することができたので、これを次年度分に追加して、次年度(最終年度)は、研究の総括のため必要な追加実験をすすめる。平成26年度は、主に既存の試薬を用いて概ね順調に実験が遂行できたため、予定より消耗品の費用を抑えることができたため次年度(最終年度)は、研究の総括のため必要な追加実験をすすめる。また論文作成、投稿、成果の学会発表などを積極的に行う予算にあてる。平成27年度には、マウスの購入や新たな試薬や抗体の購入など、より多くの消耗品の費用が見込まれ、また国際学会での発表も予定しているので、平成27年度分として請求した助成金と合わせて使用する計画である。
微細加工における接着接合装置の研究・開発

現在、フォトファブリケーションなどのIC技術を用いて、μm単位の部品加工が可能になり、シリコン基板上に微小な歯車や軸を作製することができるようになっている。しかし、10μm100μm程度まででは、観察技術はあるが、ハンドリング技術に関して完全に確立していない把持不能領域であると言われている。そのため、上記のサイズをハンドリングするマニピュレータ(マイクロマニピュレータ)が必要となる。そして、そのマニピュレータを用いてハンドリングし、マイクロメカニズムを組み立てる際、微小パーツをはめあいで組み立てようとするならば、パーツの寸法公差の許容値を非常に小さくしなければならず、現実的ではない。マイクロ部材の接合には、寸法効果により、接着による接合で十分であると考え、接着剤で微小パーツを固定する方法を検討した。特に、接着剤の液滴の形状を球状と仮定して、直径が1.2μm、f1(1×10-15)単位の吐出可能にするシステムの開発を目指した。研究にあたってのいくつかの調査で、吐出装置の先端部分が非常に重要であることが判明したため、平成16年度は吐出部先端の作成方法と形状の検討を行った。吐出部先端の作成はガラス細管を加熱し、急速に引き抜くことによって得られるガラス細管を加工する方式が、比較的簡便・有効であることが各種実験を通して判明した。そこで、吐出部先端の内径が、吐出する液滴の大きさにどのように影響するか実験によって求めた。その結果、吐出部先端径を10μmから2μmまで減少させるに従い、吐出する液滴の大きさも減少し、特に5μm以下の場合、急速に減少し、直径10μm以下の液滴が観測されるようになった。平成17年度ではさらに先端部形状に、特徴的な工夫を行うことで、1μm程度の液滴の吐出が可能になり、マイクロ部材の接合に必要な、接着剤吐出装置先端部の作成方法と形状が判明した。それらの観察技術としては、光学顕微鏡を始め、走査型電子顕微鏡(SEM)、走査型トンネル顕微鏡(STM)、原子力顕微鏡(AFM)などがある。特に、接着剤の液滴の形状を球状と仮定して、直径が1.2μm、fl(1×10-15)単位の吐出可能にするシステムの開発を目指した。