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障がい児・者の運動学習に働きかける筋弛緩リハビリテーションプログラムの開発

本研究の目的は,中枢神経障害や整形外科疾患に存在する筋緊張異常を緩和するための随意的筋弛緩を誘発をするメカニズムを解析するとともに,それを可能にする有効刺激などの検討を行うことである.今回,上位運動中枢および下位運動中枢の筋弛緩を制御する上で,弛緩を発生させるための重要なトリガーである運動野の興奮性変化が弛緩直前に存在することを観察した.また,随意的な筋弛緩を誘発させるための操作として感覚入力の重要性さらには,弛緩課題を反復して行うことで学習による運動制御動態と学習経過に関して上位中枢の可塑的変化が生じることを明らかにした.中枢神経系障害や整形外科疾患のリハビリテーションにおいて障がい児・者の過剰な筋緊張異常や痛みの緩和は,機能回復の必須条件である.しかし,その方法は対処療法的な手段によるストレッチなどの治療が主流で,有効性に課題を有する.そこで,本研究では,障がい児・者の運動学習に働きかける筋弛緩リハビリテーションプログラムを開発し,臨床場面への応用展開を最終目標とする.具体的に健常成人を対象に,皮質運動野における筋弛緩制御メカニズムの検討を行い,弛緩に有効な電気刺激の特性および刺激タイミングを明らかにする.さらに,有効刺激を用いた弛緩学習によって生じる上位下位運動中枢における運動制御メカニズムの変化を検討し,学習効果を明らかにする.それを踏まえた上で障がい児・者を対象に,基礎研究で見出した皮質運動野の興奮性を抑制する運動と刺激パラメータを使用した介入を行い,その有効性と普遍性を明らかにする.本研究で新たな開発を試みる筋弛緩プログラムは,上位運動中枢に生じる筋弛緩制御メカニズムを根拠とした点が特色である.このような筋弛緩プログラムは,ストレッチングのような脊髄反射機構に生理学的根拠をもつ治療手技と比較し,永続的な筋弛緩を学習させる点に独創性を有する.このようなリハビリテーションプログラムが開発されれば,障がい児・者は筋緊張異常や痛みから生じる関節の拘縮・変形などの二次障害が予防され,より効果的なリハビリテーションの展開が可能となる.このことは,障がい児・者の機能回復から社会参加を促進させるだけではなく,医療機関での入院期間の短縮などの波及効果も期待できる.さらに,工学分野との連携により異常筋緊張を緩和する治療機器を開発できれば,新たなイノベーションの創造も期待される中枢神経系障害や整形外科疾患のリハビリテーションにおいて障がい児・者の過剰な筋緊張異常や痛みの緩和は,機能回復の必須条件である.しかし,その方法は対処療法的な手段によるストレッチなどの治療が主流で,有効性に課題を有する.そこで,本研究では,障がい児・者の運動学習に働きかける筋弛緩リハビリテーションプログラムを開発し,臨床場面への応用展開を最終目標とする.具体的に健常成人を対象に,皮質運動における筋弛緩制御メカニズムの検討を行い,弛緩に有効な電気刺激の特性および刺激タイミングを明らかにする.さらに,有効刺激を用いた弛緩学習によって生じる上位下位運動中枢における運動制御メカニズムの変化を検討し,学習効果を明らかにする.それを踏まえた上で障がい児・者を対象に,基礎研究で見出した皮質運動野の興奮性を抑制する運動と刺激パラメータを使用した介入を行い,その有効性と普遍性を明らかにする.このような筋弛緩プログラムは,筋弛緩プログラムは,上位運動中枢に生じる筋弛緩制御メカニズムを根拠とした点が特色である.このような筋弛緩プログラムは,ストレッチングのような脊髄反射機構に生理学的根拠をもつ治療手技と比較し,永続的な筋弛緩を学習させる点に独創性を有する.このようなリハビリテーションプログラムが開発されれば,障がい児・者は筋緊張異常や痛みから生じる関節の拘縮・変形などの二次障害が予防され,より効果的なリハビリテーションの展開が可能となる.このことは,障がい児・者の機能回復から社会参加を促進させるだけではなく,医療機関での入院期間の短縮などの波及効果も期待できる.さらに,工学分野との連携により異常筋緊張を緩和する治療機器を開発できれば,新たなイノベーションの創造も期待される。上位運動中枢に生じる筋弛緩制御メカニズムを詳細に分析することで,障がい児・者が受容しやすい感覚刺激を応用した筋弛緩プログラム確立することが,この問題の解決に必要不可欠と考える.そこで,我々は基礎実験として療法士の介入を電気刺激と想定し,筋弛緩誘発の可能性を見出すための先行研究を実施した(Sugawara, et al.2011).この研究を通して,当該研究では,健常人を対象としたさらなる筋弛緩にかかわる中枢神経系における抑制の時間的タイミングの検討と,末梢電気刺激がその抑制にどのように作用するのかという基礎研究と,これを用いた障がい児・者への応用的導入を行うことによる効果判定を行うことが大きな2つの目的である.この展開から,平成26年度の進捗状況として基礎研究部分における見解がほぼデータとして蓄積され発表および論文への作成段階となっている.平成27年度は,その更新および基礎知見の構築を含めたデータ収集と研究発表を行うとともに,論文化に着手している.さらに,基礎研究の展開から,弛緩を行う上で主動作筋と拮抗筋の相補性に関する知見を検討する必要性が生じ,その部分への検討も含めて行っている.中枢神経系障害や整形外科疾患のリハビリテーションにおいて障がい児・者の過剰な筋緊張異常や痛みの緩和は,機能回復の必須条件である.しかし,その方法は対処療法的な手段によるストレッチなどの治療が主流で,有効性に課題を有する.

筋弛緩のリハビリテーションとしては,筋を伸張するストレッチングが臨床場面で広く普及している.しかし,その効果は一過性のもので,十分な成果を収めているとは言い難い.その理由としては,各種疾病の病態とストレッチングの生理的作用の不適合が背景にある.過剰な筋収縮を示す病態は,痛みに由来する防御的収縮,疲労,または中枢神経障害など多種多様な原因が存在する.それに対し,ストレッチングは下位運動ニューロンである脊髄反射機構に生理学的根拠をもつ治療手技であり,永続的な筋弛緩効果を得ることが難しい.そのため,療法士の加える介入(感覚入力)により上位運動中枢に生じる筋弛緩制御メカニズムを詳細に分析することで,障がい児・者が受容しやすい感覚刺激を応用した筋弛緩プログラムを確立することが,この問題の解決に必要不可欠と考え,生理学的にこれを検証する目的として着手している.そこで,本研究では,障がい児・者の運動学習に働きかける筋弛緩リハビリテーションプログラムを開発し,臨床場面への応用展開を最終目標とする.具体的には筋弛緩の学習を行うことで生じる弛緩直前の中枢神経の興奮性上昇に着目し,その時間的および学習効果に応じた修飾状況を詳細に検討している(Yoshida et al.2015, Suzuki et al. 2015, Sugawara et al.2015).これらに知見は,筋弛緩を得るための運動制御に重要な働きを及ぼすものであり,さらにこの修飾動態を詳細に検討し,健常者におけるモデルとして明らかにしているところである.現在まで,健常人を対象とした,筋弛緩メカニズムを詳細に検討してきた.さらに,ある筋の収縮を行うことによる,その拮抗筋の上位中枢における制御動態の検討を行っている.この知見においては国際学会(Sugawara et al.2016)において発表を行った.また,現在患者を対象とした治療の開発実験の前に,ある筋への振動刺激を行うことで,対象となる病態をモデル化して,筋収縮時の弛緩状態を検証している.中枢神経障害や整形外科疾患に存在する筋緊張異常を緩和する筋弛緩を誘発する理学療法技術を開発することを目的とした一連の研究を行ってきた.特に本年度の随意的筋弛緩に関わる基礎的な解明および新たな手技を構築する目的で研究を継続して行った.随意的筋弛緩を得るための治療手技に関わる問題点は,その状況における対照療法的な考え方に由来するものがほとんどであり,根治的な治療を提供するためには,まず筋緊張異常の生理学的な病態を検証することがまず優先的な課題であると考慮し,各種実験を行った.その上で,随意的な筋弛緩を行うことにとってもっとも重要な要因である,上位運動中枢および下位運動中枢の病態メカニズムを検討した.筋弛緩を制御する上で,弛緩を発生させるために中枢神経が一過性に興奮性を上昇するメカニズムが捉えられ,この現象が筋弛緩を円滑に生じるトリガーであることを追求した(Suzuki,Sugawara, et al.2016),また,随意的な筋弛緩を誘発させるための操作として感覚入力である経皮的な電気刺激を用いることで,随意的筋弛緩を制御する中枢神経に及ぼする作用を検証した(Sugawar et al 2016).
脳の性的二型形成におけるエストロゲン制御シグナル伝達経路の解明

本研究において、脳内エストロゲン暴露によって誘引される、脳の形態的性分化に関与する因子の同定及びその機序を調べる目的で、出生直後の雌ラットにエストロゲン処理を行い、内側視索前野の性的二型核を示す部位を含む脳切片を採取し、DNAマイクロアレイ解析、ウエスタン・ブロッテイング法、免疫組織化学法により、エストロゲンによって誘導されるシグナル伝達カスケードの同定を行った。その結果、細胞運動が脳の性分化に寄与することが明らかになった。本研究の目的は、性ホルモン環境によって制御を受ける脳の形態学的雌雄の分化について、周生期に脳の性分化を示すラットの脳を対象に、性ホルモン影響下での遺伝子発現をもとに、その分子機構を解明することである。本研究課題について、4年間で明らかにしたい研究目標を具体的に5点、[I][V]挙げた。平成22年度に実施した研究内容は、[I]脳の性分化の臨界期にある新生仔期において、エストロゲンに応答する遺伝子のマイクロアレイ法による検索、及び、[II-1]I]により選択された遺伝子の発現定量、の2点を実施した。具体的には、[I]検体である雌ラットを、出生直後にエストロゲン(100μg)皮下投与した群と未処理群とに分け、生後1日目、4日目に断頭し、解剖学的に雌雄に差異がある視索前野領域を含む脳切片を採取した。対象検体として、脳の性分化が完了した10日齢の雌ラットを用い、同処理を行った。これらの試料を用いて、ヒトで同定されたエストロゲン応答遺伝子群を基に、172個のラット遺伝子をスッポトしたカスタムDNAマイクロアレイを用いてエストロゲン応答遺伝子のプロファイリングを行った。その結果、172個の遺伝子の中で、時期特異的・部位特異的に応答する、appoptosis/migration関連の遺伝子14個を同定した。本研究の目的は、性ホルモン環境によって制御を受ける脳の形態学的雌雄の分化について、周生期に脳の性分化を示すラットの脳を対象に、性ホルモン影響下での遺伝子発現をもとに、その分子機構を解明すること、である。本研究課題について、平成22年度平成25年度の4年間で、明らかにしたい研究目標を具体的に5点[I][V]提示した。平成23年度に行った内容は、[II-2]:周生期のエストロゲン有無により形態学的性差が形成される、前腹側脳室周囲核(Anteroventral Periventicular Nucleus:AVPV)及び視索前野性的二型核(Sexually Dimorphic Nucleus:SDN-POA)において平成22年度に特定した遺伝子のタンパク質発現を、Western blotting(WB)法にて定量を行ったことである。WB法の結果から示唆されたされたことは、small GTP-binding proteinsのRho familyに属すタンパク質のうち、Cdc42は本領域で発現がみられず、RhoAは発現はあるものの、エストロゲン有無による発現量には差異が無かった。これに対し、Rac1はエストロゲン有無によって顕著なタンパク質発現量に差異を示した。殊に、生後5日目のSDN-POAを含む領域では、エストロゲン存在下で有意な発現上昇が見られた。Rac1については、平成24年度に課せられた問題点の一つとして、その活性定量が未解決となっており、解決法、キットの応用などの準備に着手している。本研究の目的は、哺乳類における性染色体による性の決定だけではない、性ホルモンによって制御される脳の形態的雌雄分化について、出生臨界期の性ホルモン(エストロゲン)によって制御をうけるラットの脳を対象に、エストロゲンの有無によって発現応答する遺伝子のプロファイリングをもとに、形態的雌雄差形成の分子機構を解明すること、である。本研究課題を達成するために、平成22年度から平成25年度の4年間で、明らかにしたい目標として5点[I]-[V]を提示した。初期段階では、形態的雌雄差がみられる代表的領域、内側視索前野の性的二型核と前腹側脳室周囲核を対象に実施していたが、real-time RT-PCR法によるエストロゲンへの応答性結果をみて、性的二型核に焦点をあてた。本領域でのタンパク質発現をWestern Blotting(WB)法にて調べた。出生直後に投与されたエストロゲン作用がタンパク質発現に顕著に現れるのは、予想していた24時間後ではなく96時間後であり、この採取試料に対し、一つのタンパク質について少なくとも5回はWBを実施してタンパク質の定量を行った。さらに、Immunohistochemistryにて局在の同定も行った。その結果、形態的雌雄差形成に関与するエストロゲン・シグナル伝達カスケードを確立することができた。シグナル伝達カスケードの最終タンパク質は、細胞運動に関わるcofilinタンパク質であり、本タンパク質はエストロゲンによって、リン酸化が抑制され(活性化)アクチンタンパク質のモノマー化を促進し、細胞が動的状態になっていることが示唆された。エストロゲンによる形態的雌雄差の原因は細胞運動に起因するものと考えている。

本研究の目的は、出生臨界期の性ホルモン(エストロゲン)の環境によって制御をうけるラットの脳の形態的雌雄差について、エストロゲンの有無によって発現応答をする遺伝子のプロファイリングをもとに、その分子機構を解明すること、である。本研究課題について、平成22年度から平成25年度の4年間で、明らかにしたい研究目標を具体的に5点[I]-[V]提示した。平成24年度に実施した内容は、視索前野性的二型核(Sexually Dimorphic Nucleus: SDN-POA)領域に限定して、選択エストロゲン応答遺伝子のタンパク質発現をWestern Blotting(WB)法にて定量し、統計処理の為にそのN数を増やした。これまで、生後2日目と5日目から採集したタンパク質試料を用いていたが、エストロゲン作用がタンパク質発現に顕著に現れるのは、生後5日目の試料であることが分かり、5日目採集試料に対し、1タンパク質について、少なくとも5回はWBを実施した。その結果、SDN-POA領域における、エストロゲンのシグナル伝達カスケードを確立することができた。シグナル・カスケードの最終タンパク質は,細胞運動に関わるcofilinタンパク質であり、本タンパク質はエストロゲンによって、リン酸化が抑制され(活性化)アクチンタンパク質のモノマー化を促進し、動的状態になっていることが示唆された。平成22年度、マイクロアレイ法にて遺伝子発現のプロファイリングを行い、平成23年度には、遺伝子発現の定量を行い、平成24年度には、タンパク質発現にまで進行しており、シグナル伝達系の研究としては、段階を踏んだ研究進行であり、従来のアポトーシス説とは異なるエストロゲン機能が提唱される可能性がみえてきている。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成22年度は、マイクロアレイ法にてエストロゲン応答遺伝子の発現プロファイリングを実施した。平成23年度は、エストロゲン応答遺伝子を14個に絞り、遺伝子発現をreal-time PCR法にて定量を行った。平成24年度は、それら遺伝子のタンパク質発現をWestern Blotting法にて定量を行い、ラットの脳の性分化におけるエストロゲン作用のシグナル伝達カスケードを確立した。シグナル伝達系の研究としては、段階を踏んだ研究を進行しており、本時点で、論文に掲載された。Rac1について、標的タンパク質と結合するGTP結合型(活性型)を検出するPull-downassayによる定量が成功していない。原因として本法はできるだけフレッシュなタンパク質試料を多量必要とする為である。仔の脳切片タンパク質試料は極めて少ないので、実験回数を増やすことなどで、解決を試みる。エストロゲンのシグナル伝達カスケードは確立し、論文発表を行ったが、カスケードにおいて、最下流にcofilinタンパク質を同定した。本タンパク質は、細胞移動に関与するので、実際の機能解析を行う必要がある。初代培養系で、改良Boyden法などを用いておこなう。さらに、本タンパク質の上流タンパク質を薬剤で阻害した場合の、細胞の動きを観察する必要がある。
ユビキチン化と抑制性マイクロクラスターの分子イメージング解析

T細胞が抗原提示細胞と接着し情報の受け渡しを行う際、二つの細胞の接着面には、T細胞受容体(TCR)を核とするシグナル伝達分子の集合体TCRマイクロクラスターが形成される。TCRマイクロクラスターはT細胞活性化の最小ユニットとして働くが、抑制シグナルのドメインとしても機能することが分かってきた。本課題研究では、E3ユビキチンリガーゼc-ClbおよびCbl-bが形成する新規抑制性マイクロクラスターをイメージングし、TCRのインターナリゼーションやその下流のシグナル伝達分子の分解を介したTCRシグナルの終焉のメカニズム明らかにした。c-CblおよびCbl-b欠損マウスを用い、TCRおよびその下流のシグナル伝達分子のイメージング解析を行った。末梢のT細胞においては、Cbl-b欠損により、TCRマイクロクラスターの中心部への移動が遅延、TCR/CD3複合体のインターナリゼーションが障害をうけ、TCR/CD3は巨大な中心部超分子活性凝集(c-SMAC)となった。Cblの基質となりうるTCR下流のシグナル伝達分子の多くもTCRマイクロクラスターに凝集し、Cbl-b欠損による巨大なc-SMACへのリクルート、それによりT細胞活性化の遷延が引き起こされた。Cblのアダプター分子CIN85は、CIN85コンディショナル遺伝子欠損マウスから、単独での作用はなかった。TCRのインターナリゼーションに関与するダイナミンとクラスリンを解析した。ダイナミンはTCRマイクロクラスターとc-SMACの両方に、クラスリンはc-SMACに凝集することが分かった。Cblを介するTCRシグナルの抑制は、マイクロクラスターと-SMACの両方において、時間的空間的に行われていると考えられた。24年度が最終年度であるため、記入しない。T細胞の活性化は、T細胞と抗原提示細胞との接着面に形成される「免疫シナプス」で行われる。免疫シナプスは更に、数十個のT細胞受容体(TCR)とその下流のシグナル伝達分子が集合した「TCRマイクロクラスター」から構成され、マイクロクラスターはT細胞活性化の最小ユニットとしてT細胞の活性化を制御している(Nat.Immunol.2005)。T細胞には過剰な免疫応答を回避するための抑制機構も存在し、負の補助刺激受容体(Immunity 2008, 2010)や、フォスファターゼによる脱リン酸化、ユビキチンリガーゼによるタンパク分解などが知られている。今年度の当研究課題において、研究代表者は、抗原提示細胞を疑似化した人工脂質二重膜(プレイナーメンブレン法)を用いた、E3ユビキチンリガーゼc-CblおよびCbl-b分子のイメージング解析のための実験系を樹立し、c-CblおよびCbl-bがTCR刺激を契機にクラスターを形成し、TCRマイクロクラスターへと集積することを明らかにした。Cbl-bはc-CblよりもTCRマイクロクラスターへの停滞時間が長く、T細胞活性化後期には、TCRと共に免疫シナプスの中心部に蓄積したが、これはCbl-bのプロリンリッチドメインの働きであった。また、c-CblおよびCbl-bのエフェクター分子であるユビキチンも、TCRマイクロクラスターに凝集することが明らかとなり、末梢T細胞におけるユビキチンのクラスター形成は、c-CblよりもCbl-bに寄与していた。このことから、c-CblおよびCbl-bによるユビキチン化を介したT細胞受容体シグナル伝達の制御は、TCRマイクロクラスターにおいて行われていることが明らかとなり、また、TCRのインターナリゼーションもTCRマイクロクラスターを「場」として行われていることが示唆された。これまでTCRマイクロクラスターの可視化解析に用いていたプレイナーメンブレン法により、c-CblおよびCbl-bが形成するマイクロクラスターの可視化に成功した。

各分子のドメイン欠損変異体を用いた機能解析も進んでいる。c-CblおよびCbl-bのエフェクター分子であるユビキチンのイメージングにも成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。c-CblおよびCbl-b欠損マウスを用いたLoss of functionの実験を進め、イメージング解析と生物学的生理反応との相関関係を検討、E3ユビキチンリガーゼがマイクロクラスターに集積することにへの生理的意義を検討する。ユビキチンのTCRマイクロクラスターへの集積が、ユビキチンの持つ多様な機能の何に相当するか、変異型ユビキチン、cCblおよびCbl-bの変異体、上記遺伝子欠損マウスを用いて検討を行う。
ホルモン非依存性ヒト前立腺がん治療のための新しい分子標的の探索

これまで我々は、内分泌療法が効かない抵抗性の前立腺がんの治療法の一つとして分化誘導療法の基礎的検討を試み、ヒト前立腺がん細胞TSU-Pr1をホルボールエステルのTPAによりミクログリア様細胞に、スタウロスポリンにより神経様細胞に分化誘導することに成功した。本研究では、これら分化誘導に関わるシグナル伝達経路や分子について解析を進めた。その結果、PKCあるいはMAPK阻害剤との同時処理により、TPAによる分化誘導が抑制されることが明らかとなった。次に、TPA処理後の各PKCの細胞内での局在をウェスタンブロット法で調べ活性変動を検討した。その結果、PKC α、γ、εについて、TPA処理5分後に、細胞質から細胞膜への移行が検出され、これらのPKCアイソザイムが活性化していることが示唆された。また、TPA処理によるMAPK経路の活性化も確認した。さらにPKC、MAPK経路の下流遺伝子の一つであるp21遺伝子がTPA処理で誘導され、PKCあるいはMAPK阻害剤との同時処理によりその誘導が抑制されることを明らかにした。また、p21遺伝子を過剰発現させたTSU-Pr1細胞では、増殖抑制、TPA処理時と同様の形態変化、エステラーゼ活性の上昇等が検出された。以上の結果より、TPAによるTSU-Pr1細胞での分化誘導は、p21遺伝子が非常に重要な役割を果たしていることが示された。また、ディファレンシャルディスプレイ法によりこの分化誘導過程で発現変動を示す6種の遺伝子を同定した。一方、スタウロスポリンの系では、関与するシグナル伝達経路を同定することはできなかったが、分化誘導過程での増殖抑制が、CDK inhibitorであるp21、p27のCDK2への結合量増加によるkinase活性の抑制によって起きている可能性を示した。
TRPチャネルを標的とした口腔癌に対する新規診断・治療法の探索

細胞内のカルシウムは、がんの進展・転移に重要な役割を担う。本研究ではカルシウム透過性の高い非選択的陽イオンチャネルであるTRPチャネルの口腔癌における機能を調べた。高分化型扁平上皮癌であるHSC4には機能的なTRPV4チャネルが高く発現していた。TRPV4の機能的なノックダウンにより細胞間接着分子の局在が変化し、遊走能が亢進した。HSC4へTRPV4アゴニストを添加すると、濃度依存的に細胞数が減少し、細胞死誘導のシグナル分子であるJNKおよびp38のリン酸化が増強された。以上の結果より、TRPV4分子が口腔癌の新しい治療ターゲットとなる可能性が示唆された。細胞内へのカルシウム流入は、癌の発生や進展・転移過程において非常に重要な役割を担う。TRP(transient receptor potential)チャネルは高いカルシウム透過性を有し、その活性化により細胞の増殖・分化・細胞死など多様な生理応答を調節する。近年、TRPチャネル活性化が、がん細胞の機能制御に関与することが報告されている。しかしながら、口腔癌の病態発生や浸潤・転移機構におけるTRPチャネルを介した機能調節は明らかにされていない。本研究では、TRPチャネルが口腔扁平上皮癌の発生および悪性化に与える影響を解析し、本チャネルをターゲットとした口腔癌の新しい診断および治療法の開発を目的とする。本年度はまず悪性度および分化度の異なる複数の口腔癌細胞株(OSCC)を用い、温度感受性TRPチャネル群の発現をmRNAおよびタンパク質レベルで調べた。細胞株を選定後、Caイメージング法にて機能的なTRPチャネルの発現を確認した。選定した細胞株に熱刺激やTRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4をターゲットとしたアゴニスト刺激を加えると、上皮成長因子受容体や各シグナル伝達経路(ERK-MAPK、PI3-Akt、p38、JNK)において、刺激に応じたリン酸化が確認された。本年度は学部の耐震改修工事に伴い、実験施設の使用に関して物理的・時間的制約が多かった。そのため当初予定していた一部の解析が未完了であるが、本年度計画した研究内容は概ね遂行できた。また、次年度に予定している実験の予備検討(実験系の構築、試薬の条件検討)をすすめた。以上より本年度の研究はおおむね順調に進展していると判断した。近年、TRPチャネルの活性化が、がん細胞の機能制御に関与することが報告されている。ヒト口腔扁平上皮癌細胞株(HSC2、HSC3、HSC4)の中で、高分化型扁平上皮癌であるHSC4にはTRPV4がmRNAおよびタンパクレベルで高く発現していた。カルシウムイメージングでは、HSC2およびHSC3と比較して顕著で持続的な細胞内カルシウム濃度上昇を認めた。また、HSC4へのTRPV4アゴニスト投与により濃度依存的に細胞死が誘導された。この細胞死はHSC2やHSC3では誘導されず、HSC4への阻害剤添加やsiRNAによる機能的ノックダウンにより抑制された。さらにHSC4へのTRPV4-siRNA導入により、細胞間接着分子であるE-cadherinやβ-cateninの局在が変化し、細胞間接着が減弱した。また細胞の遊走能が亢進する傾向があった。今年度選定した細胞を用いて、当初予定していた解析をすすめていく。また、今年度予定していた未完了の実験も併行して行っておく。siRNAによる機能的knockdownは今年度に実験系を構築しており、次年度にスムーズに移行できると考える。28年度が最終年度であるため、記入しない。外科系歯学28年度が最終年度であるため、記入しない。
途上国における石鹸を用いた手洗い行動普及のためのポジティブデビエンス・アプローチ

途上国の農村では、下痢症は主要な健康問題の一つである。下痢症罹患エピソードの30%前後は、石鹸を用いた手洗い行動によって予防可能といわれている。しかし、その行動は普及していない。本研究の目的は、途上国の農村にて、石鹸を用いた手洗いを日常的に行っている住民(ポジデビ)に注目し、手洗い行動の促進・維持に関与していると推定されるポジデビの特徴を発見し、その特徴を他の住民が取り入れることによって、村全体に手洗い行動を普及させることができるかどうかを調べることである。ラオス国セポン郡の5村に住む住民(合計おおよそ1,0002,000人)を対象者とする。研究期間は2019年2021年である。
血液凝固第VIII因子欠損マウスを用いた血友病Aに対する免疫寛容誘導療法の開発

出生後早期に血液凝固第VIII因子を投与することにより特異的かつ永続的な免疫寛容が誘導される可能性について、血液凝固第VIII因子欠損新生仔マウスを用いて検討した。その結果、(1)生後24時間以内の新生仔マウスに対して、全身麻酔下で実体顕微鏡を用い頸静脈内にヒト第VIII因子を安全かつ確実に投与する手法を確立した。(2)0.05単位/g体重のヒト第VIII因子を出生後24時間以内に投与した場合に免疫寛容が成立するが、投与量を増加させた場合や初回投与時期を遅らせた場合にはいずれも高力価のインビヒターが生じることから、免疫寛容を成立させるための至適な抗原量、投与時期が存在することを明らかにした。(3)本寛容マウスモデルに対してヒト第VIII因子以外の異種抗原感作を行うと、暴露抗原に対する抗体が速やかに生じることから、免疫寛容はヒト第VIII因子特異的であると考えられた。(4)免疫寛容を誘導したマウスのリンパ球は、ヒト第VIII因子刺激によりIL-2産生がみられるものの、IL-4、IL-10、IFN-γの産生がなく増殖能も有さないが、IL-12の添加により増殖能ととともにIFN-γの産生能が回復したことから、成立した免疫寛容がIFN-γ依存性T細胞性アネルギーよることを明らかにした。(5)本寛容マウスモデルに対して、humanα1-antitrypsinプロモーター下流にB領域欠損ヒト第VIII因子cDNAを搭載したアデノ随伴ウイルスベクター(AAV8)を1×10^<12>gc/bodyで投与すると、1-2%の第VIII因子が持続産生された。これらの結果は、本免疫寛容誘導療法と遺伝子治療法との組み合わせによりインヒビター産生を回避しながら第VIII因子が持続的かつ安定発現される可能性を示唆するものである。本研究の成果は、将来の遺伝子治療の臨床応用に向けた基盤となるものと考えられる。血友病新生児に対し血液凝固第VIII因子製剤を投与することにより、永続的な免疫寛容を誘導する可能性について、第VIII因子欠損新生児マウス(新生児血友病マウス)を用いて検討した。(1)第VIII因子特異的免疫寛容血友病マウスモデルの作製:生後24時間以内の血友病マウスに対して、全身麻酔下で実体顕微鏡を用い頸静脈内にヒト第VIII因子を投与した。(2)新生児血友病マウスへの第VIII因子の投与量および初回投与時期の検討:新生児血友病マウスへのヒト第VIII因子の暴露時期および暴露量を検討した結果、0.05単位/kg体重のヒト第VIII因子を、出生後24時間以内に経静脈的に投与した場合に免疫寛容が成立するが、投与量を増加させた場合(0.1-0.5単位/kg体重)や初回投与時期を遅らせた場合(生後24-48時間,48-72時間)には、高力価の抗第VIII因子インヒビターが生じた。(3)本寛容マウスモデルに対してヒト第VIII因子以外の異種抗原(破傷風トキソイド等)の感作を行うと、投与された抗原に対する抗体が速やかに生じることから、成立した免疫寛容はヒト第VIII因子特異的であると考えられた。(4)新生児免疫寛容モデルから得た脾臓リンパ球は、in vitroでのヒト第VIII因子刺激によりIL-2の産生があるもののIL-4,IL

-10,IFN-γの産生がなく、かつ増殖能も有さないが、IL-12の添加により増殖能の回復とIFN-γの産生が得られた。本年度の研究では、血友病マウス新生児に対してヒト第VIII因子特異的な免疫寛容を成立させる投与時期および投与方法を確立し、本モデルにおける免疫寛容の成立機序がIFN-γ依存性T細胞アネルギーであることを明らかにした。次年度は、ヒト第VIII因子特異的免疫寛容血友病マウスモデルを用いて、ヒト第VIII因子cDNAを単一遺伝子として搭載可能なウイルスベクター(simian immunodeficiency virus等)による遺伝子導入を組み合わせて、抗体産生を回避ながら持続的発現が可能な方策について検討する予定である。生後早期に血液凝固第VIII因子を投与することにより特異的かつ永続的な免疫寛容が誘導される可能性について、血液凝固第VIII因子欠損(血友病A)新生仔マウスを用いて検討した。その結果、生後24時間以内に0.05単位/グラム体重のヒト第VIII因子を経静脈的に投与することにより、暴露抗原(ヒト第VIII因子)特異的な免疫寛容が成立し、その機序がIFN-γ依存性T細胞アネルギーであることを明らかにした。さらに、第VIII因子特異的な免疫寛容をきたした血友病Aマウス由来脾臓CD4陽性T細胞において、CD25(IL-12受容体α鎖)の発現は、第VIII因子単独もしくはIL-12単独刺激を加えても増加せず、第VIII因子とIL-12の共刺激を加えることによってのみ増加した。これに対して、CD154(CD40リガンド)の発現は、第VIII因子とIL-12との両者の刺激を加えても全く増加しなかった。これらの結果から、本モデルにおけるT細胞性免疫不応答の直接的な作用点が、抗原刺激に対するCD40リガンドの機能的な発現亢進の欠落に起因することを明らかにした。次に、0日齢の新生仔血友病Aマウスに対して、humanα1-antitrypsinプロモーター下流にB領域を除いたヒト第VIII因子cDNAを組み込んだアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)1X10(12)gc/bodyを、0.05単位/グラム体重の第VIII因子とともに経静脈的に投与し、遺伝子導入後の第VIII因子の持続発現およびインヒビター産生の有無について検討した。その結果、観察期間10週齢までにおいて1-2%の第VIII因子が持続産生され、この免疫寛容誘導療法と遺伝子治療法との組み合わせによりインヒビター産生を回避し第VIII因子が持続的かつ安定発現される可能性が示唆された。
清代中央官制の研究-内閣・翰林院・都察院を中心として-

本研究の課題は清朝の中央官制について、内閣・翰林院・都察院を主たる素材として検討し、これら三機関を中心とした政治現象がいかなる主体によって、いかなる政治的資源に基づき、いかなる過程によって導き出されるのかということを明らかにし、清朝の政治過程における各機関の役割・機能を相互関連的に分析することである。中国における「政治」の持つ意味を歴史的に展望することが可能となる。内閣については、制度的変遷を概述し、その文書行政システムの中の位置づけを行った。清初期において、清朝は皇帝権伸張のため、漢人を利用して明代の制度である内閣制度を導入し、有力な満州人貴族を牽制したが、清中期に至り、内閣から生み出される満州語文書は、満州人政権たることの存在証明として政治的な機能を果たした。都察院については、科道官の政策提案事例の数値化をはかり、その政治的機能のあり方を検討した。結果として、雍正乾隆期には政策提案は活発に行われず、嘉慶期以降に科道官の政策提言件数が増大していることが判明した。乾隆期は、科道官は、大きな政治勢力となることはなかった。しかし、嘉慶期以降、官僚の不正等が社会の不安定要因となり、清朝の求心性が低下してくる。そのような中でとった手段の一つが、「民意」をくみあげる、という政治的姿勢であり、それを清朝の政治統合のシンボルとした。また、内閣制度の核となる文書行政システムにおける、各レベルの行政機関における文例集を分析して清代行政の全体像を明らかにし、中央と地方の集権-分権、あるいは融合-分離のあり方を考えた。ただ、文書システム自体からわかることは、政治や行政の一部に過ぎず、現実の政治過程はより人格的なあり方において進行する。清朝の政治史・制度史研究を進めるためには、さらに多用な史料の活用を模索していくことが課題である。これらの作業を通じて、伝統中国の社会システム全体の中での内閣・翰林院・都察院等の中央行政機関の占める位置を明らかにし、中国における「政治」の持つ意味を歴史的に展望することが可能となる。平成16年度における、本研究の具体的研究実績としては、「方観承とその時代-乾隆期における一知識人官僚の生涯-」という論考を『東洋文化研究』に投稿し、査読を経て掲載された。この研究は、科挙を経ることなく内閣の書記官である内閣中書として任官し、乾隆期にその資格で軍機処の書記官である章京として活躍し、さらに地方官に転出後は直隷省(現河北省)の長官である直隷総督にまで昇進して、治水や通貨政策等に多くの業績を残した一人の特異な経歴をもつ漢人官僚の生涯とその官僚としての事績を分析したもので、清代官僚制における内閣の機能の一端を明らかにし、さらには前近代中国官僚の属性である知識人としての一面を描き出した。また、その他の関連する研究実績としては、『歴史学辞典』12、王と国家(弘文堂、2005)に、本研究の課題であるところめ「翰林院」を含め、官僚制に関わる4項目の執筆を行った。

本研究の課題は清朝の中央官制について、内閣・翰林院・都察院を主たる素材として、これら三つの中央行政機関を中心とした政治現象がいかなる主体によって、いかなる政治的資源に基づき、いかなる過程によって導き出されるのかということを明らかにし、清朝の政治過程における各機関の役割およびその機能を相互関連的に分析することである。本年度の具体的研究実績としては、Documents in Thirteenth-CenturyChinaをThe Haskins Society Journal, JAPANに、「清代文書行政における内閣の政治的機能について-日本・琉球関係襠案を素材として-」を東京大学史料編纂所研究紀要に投稿し、掲載された。前者は、13世紀の安徽省の土地売買文書を分析しその位置づけを明らかにするとともに、17世紀清代の史料との同質性を指摘した。本研究の基礎となる史料学研究である。後者は、清代の内閣の制度的変遷を概述し、その文書行政システムの中の位置づけを、内閣が関わった題本や移会などの日本・琉球関係の清代行政文書史料を素材として検討したものである。清初期において、清朝は皇帝権伸張のため、漢人を利用して明代の制度である内閣制度を導入し、有力な満州人貴族を牽制したが、清中期にいたり、内閣から営々と生み出される満州語文書は、むしろ満州人政権たることの存在証明として政治的な機能を果たした、と結論づけ、翰林院との関係にも言及した。都察院の研究が課題として残るが、来年度に研究成果を発表するためのデータ整理にすでに着手している。本年度の具体的研究実績としては、「清代都察院の政治的機能について-雍正道光期における科道官の政策提案事例を中心として-」を熊本大学教育学部紀要・人文科学に投稿し、掲載された(西村嘉史との共著)。前年度までの残された課題としての都察院の研究を具体的成果として発表したものであり、『清實録』などの史料を網羅的に調査することによって、政策提案事例の数値化をはかり、その結果をもとに、時代ごとの都察院の政治的機能のあり方を検討した。結果として、清代全盛期とされる雍正乾隆期には政策提案は乾隆初期の例外を除いて活発に行われず、清朝の斜陽が始まったとされる嘉慶期以降に逆に科道官の政策提言件数が飛躍的に増大していることが判明した。このことについては、以下のように結論づけた。雍正乾隆期は清朝政権の求心性が高い時期であり、ことさらに政治を全面に押し出す必要がなかった。その背景には、経済が好況状態にあり、全体が経済的に豊かになるなかで階層を問わず富が応分に配分され、そのこと自体が政権の求心性を支えた.「地大物博」の中華の「盛世」という認識は、清朝の統合のシンボルとなりえた。乾隆末年以降に官僚の腐敗として非難の対象になる陋規などの「非正規」収入・餽送、さらには賄賂でさえも、経済の好況の中では、ある程度社会の適正な富の再分配機能を果たしていた.このような中、科道官の発言は単発的に有意であることはまま見られたが、先述の経済状況を背景とした統治権力の自信の前に、大きな政治勢力となることはなかった。しかし、嘉慶期以降の不況下に社会全体の富が縮小してくると、官僚の不正や既得権益による富の偏在が、社会の不安定要因となり、現に清朝の求心性が低下してくる。そのような中でとった手段の一つが、「民意」をくみあげる、という政治的姿勢であった。
スポーツ傷害における遺伝的背景の解明ー性ホルモン関連遺伝子群に着目した検討ー

本年度の検討では、トップレベルの日本人アスリート1311名を対象として、ケガの既往歴と遺伝子多型解析のための唾液サンプルの採取を行った。ケガの既往歴については先行研究をもとに作成したアンケートを用いて実施し、遺伝子多型についてはTaqMan法を用いてESR1(rs2234693およびrs9340799)を解析した。その結果、ESR1 rs2234693のCアレルを有するアスリートにおいて、過去の筋損傷の受傷率が有意に低く、競技種目や競技歴で補正後も有意な関連が認められた。また、これらの関連は、男女別に検討を行った場合にも同様の結果が得られた。次に、エストロゲン受容体αが筋のケガの受傷に関連する機序を調査するために、若年者261名を対象として筋損傷のリスクファクターである筋スティフネスとESR1 rs2234693の関連を検討した。その結果、ESR1 rs2234693のCアレルを有する対象者において、筋スティフネスが有意に低く筋損傷のリスクが低いことが明らかにされた。女性ホルモンであるエストロゲンは、運動によって引き起こされる筋損傷(muscle damage)に保護的に作用することが示唆されている。そこでエストロゲンの作用に関連するESR1 rs2234693およびCYP19A1rs936306と長時間運動による筋損傷マーカーの変動について検討を行った。その結果、CYP19A1のTアレルを有する者において筋損傷マーカーの変動が有意に小さいことが明らかにされた。また、ESR1 rs2234693のCアレルを有する者において筋損傷マーカーの変動が小さい傾向が認められた。これらの検討結果から、エストロゲンの作用に関連する遺伝子多型は一過性の長時間運動による筋損傷マーカーの変動に関連する可能性が示された。本年度の研究では、性ホルモン、特にエストロゲンの働きに関連するエストロゲン受容体の遺伝子多型と筋損傷の関係について検討を実施し、エストロゲン受容体の遺伝子多型が筋損傷の受傷歴に関連することを明らかにした。また、長時間運動による筋損傷(muscle damage)とエストロゲン受容体およびアロマターゼの遺伝子多型の関連も明らかにしており、研究はおおむね順調に進行していると考えられる。次年度以降の研究では、本年度の研究で着目した筋に関するケガだけでなく、骨や靭帯に関連するケガについても検討を実施する予定である。また、本年度の研究は横断的な調査であったが、次年度以降はアスリートを対象とした追跡研究を実施し、遺伝子多型とケガの発症の関連についても検討を実施する予定である。本年度実施予定であった研究を十分に遂行できたため、直接経費の一部を次年度に繰り越した。
HIV侵入の動的超分子機構とフィードバック機構をターゲットとした抗HIV剤の創製

HIV感染症・AIDSの治療薬の開発において、CXCR4阻害剤等のHIV侵入の動的超分子機構をターゲットとした阻害剤やその他新規の作用機構をもつ薬剤の開発を行った。1. Xylene骨格を有する全く新規なCXCR4アンタゴニストおよび高活性な二価型CXCR4アンタゴニストを創出した。2.低分子型CD4ミミック誘導体を創出し、顕著なHIV侵入阻害活性と中和抗体の結合能が上昇することを明らかにした。3. Vpr断片ペプチドからインテグラーゼ阻害剤を見出した。4. Matrix断片に細胞膜透過性配列を付加した抗HIVペプチドを創出した。HIV感染症・AIDSの治療法としては、逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤の2,3剤を併用する療伝((HAART)が多大な成功を収めたが、耐性ウイルスの出現や重篤な副作用の発現、治療費の高騰などの問題点もあり、他の作用点を有する薬剤の開発も推進されている。本研究では、CXCR4阻害剤等やHIV侵入の動的超分子機構をターゲットとした薬剤、及び今までに着手されていない作用機構を標的とした薬剤の開発を行なった。1.CXCR4はHIV感染の後期に主流になるT細胞指向性HIV株(X4-HIV-1)が主に使用するコレセプターである。今までに強力なCXCR4アンタゴニストである14残基のペプチドT140とその低分子誘導体である環状5残基のペプチドFC131、および、それほど高活性ではないが、低分子非ペプチド性アンタゴニストを創出している。これらを基に、より医薬品としてのプロフィールの優れた化合物を開発した。2.CD4はHIVが細胞に感染するときの第一受容体であり、soluble CD4等のCD4関連物質はHIVの感染を阻害することが知られている。われわれの開発した低分子型CD4ミミック誘導体を創出し、顕著なHIV侵入阻害活性があることを見出した。さらに、CD4ミミックはHIV外皮蛋白gp120のコンフォメーション変化を誘起すること、また、この構造変化によりコレセプター結合領域を認識する中和抗体(抗V3 loop抗体)の結合能が上昇することを明らかにした。CD4ミミックのさらなる活性上昇とT140誘導体とのコンジュゲート(dual drug)の創製を行い、高活性な化合物を見出した。3.インテグラーゼ阻害剤:現在までに他のHIV構造蛋白Vprの部分ペプチドから、インテグラーゼに結合してmicro molarレベルの阻害活性を示す6アミノ酸残基からなる顕著なアミノ酸配列モチーフを有するペプチド断片を得ている。本研究で、高活性なインテグラーゼ阻害活性を有するペプチドミメティク、非ペプチド性化合物の創製を行なった。本研究では、HIV感染症・AIDSの治療薬の開発において、CXCR4阻害剤等やHIV侵入の動的超分子機構をターゲットとした薬剤、及び今までに着手されていない作用機構を標的とした薬剤の開発を行なった。Xylene骨格を有する全く新規なCXCR4アンタゴニストを見出すことができた。また、高活性な二価型CXCR4アンタゴニストを創出した。われわれの開発した低分子型CD4ミミック誘導体を創出し、顕著なHIV侵入阻害活性があり、CD4ミミックはHIV外皮蛋白gp120のコンフォメーション変化を誘起すること、また、この構造変化によりコレセプター結合領域を認識する中和抗体(抗V3 loop抗体)の結合能が上昇することを明らかにした。CD4ミミック誘導体のピペリジン環の窒素原子周辺、およびフェニル部位の構造活性相関を行った。今後のCD4ミミックの分子設計に有用な情報を得た。3.インテグラーゼ阻害剤:Vpr断片ペプチドからインテグラーゼ阻害剤を見出し、構造活性相関を展開した。今後ペプチドリード医薬へ展開できる可能性がある。4.Matrix断片に細胞膜透過性配列を付加した抗HIVペプチドを創出し、イメージングで細胞内導入を確認した。本研究では種々のカテゴリーに属する抗HIV剤の開発研究を行い、最適な治療法と考えられる多剤併用療法において使用できる薬剤を増やすことを目的とした。

また、HIV侵入の動的超分子機構をターゲットとした薬剤、及び今までに着手されていない作用機構を標的とした薬剤の開発も行った。1.CXCR4はHIV感染の後期に主流になるT細胞指向性HIV株(X4-HIV-1)が主に使用するコレセプターである。今までに強力なCXCR4アンタゴニストである14残基のペプチドT140とその低分子誘導体である環状5残基のペプチドFC131、および、それほど高活性ではないが、低分子非ペプチド性アンタゴニストを創出している。これらを基に、より医薬品としてのプロフィールの優れた化合物を開発した。Xylene骨格を有する全く新規なCXCR4アンタゴニストを見出すことができた。また、高活性な二価型CXCR4アンタゴニストを創出した。2.CD4はHIVが細胞に感染するときの第一受容体であり、soluble CD4等のCD4関連物質はHIVの感染を阻害することが知られている。われわれの開発した低分子型CD4ミミック誘導体を創出し、顕著なHIV侵入阻害活性があり、CD4ミミックはHIV外皮蛋白gp120のコンフォメーション変化を誘起すること、また、この構造変化によりコレセプター結合領域を認識する中和抗体(抗V3 loop抗体)の結合能が上昇することを明らかにした。CD4ミミック誘導体のピペリジン環の窒素原子周辺、およびフェニル部位の構造活性相関を行った。今後のCD4ミミックの分子設計に有用な情報を得た。3.インテグラーゼ阻害剤:Vprの断片から見出したインテグラーゼ阻害ペプチドのヘリックス増強ミメティックを合成し、構造活性相関を展開した。4.抗HIV活性があることを見出しているMatrixタンパクの断片に細胞膜透過性配列を付加したペプチドの構造活性相関研究を行い、イメージングで細胞内導入を確認した。
空間識検査法の確立と臨床応用

従来のめまい診療は眼振を中心とした誘発検査が主流であり,めまい患者のめまい感を定量的に評価する検査方法はあまりなかった。そこで,外界空間に関する認知(視覚入力)と身体位置に関する認知(前庭入力・深部知覚入力)のズレ,即ち空間識の異常を定量的に調べる空間識検査法を考案し,臨床応用するために本研究を行った。検査装置は.ヘッドマウントディスプレイ,角度センサー,ノートパソコンで構成され,被験者コンピュータグラフィックスの映像空間に合わせた頭部運動を指示し,この時の頭部傾斜角度を計測した。今年度は、以下の点について研究を行った。1.正常値についての検討本検査装置を用いて,健康成人30名(男性18名,女性12名,平均年令29.8歳)について調べた結果,頭部傾斜角度の平均は18.0±2.0度,左右差の平均は1.5±1.2度であった。この結果から正常値(平均値±2SD)について,頭部傾斜角度の範囲は14.022.0度,左右差は3.9度以内とした。2.臨床奨励における検討上記の正常値を元に,当科めまい外来を受診しためまい患者25例について本検査を施行した結果,25例中17例(68%)に異常値を認めた。本研究から,空間識検査法を用いて空間識の異常を調べることで,めまい患者のめまい感を定量的に評価することが可能であると考えられた。そこで,外界空間に関する認知(視覚入力)と身体位置に関する認知(前庭入力・深部知覚入力)のズレ、即ち空間識の異常を定量的に調べる空間識検査法を考案し、臨床応用するために本研究を行った。検査装置は,ヘッドマウントディスプレイ,角度センサー,ノートパソコンで構成され,被験者にコンピュータグラフィックスの映像空間に合わせた頭部運動を指示し,この時の頭部傾斜角度を計測した。今年度は、以下の3点について研究を行った。1.臨床検査装置として使用するためのプログラム開発被検者の理解の容易さから,提示するコンピュータグラフィックスは,左右の傾斜にするものがよいと考えられた。また,検査時間の短縮やそれに伴う被検者の疲労軽減ため,コンピュータグラフィックスの動きは,左右へ20度傾斜の2種類とし,検査パラメータは,左右傾斜をそれぞれ3回行った際の最大頭部傾斜角度の平均値とした。2.健康成人についての検討上記の方法でインフォームドコンセントの得られた健康成人13名について検討した結果,頭部傾斜角度の最大値の平均値は,右傾斜時17.5±1.6度,左傾斜時18.1±2.5度であった。3.パラメータについての検討検査パラメータとしては,頭部傾斜角度の最大値の他に,頭部傾斜運動開始までの時間,最大傾斜角度に到達するまでの時間などが利用可能であると考えられた。次年度は,臨床症例について検討する予定である。
電子基板上の部品群の高精度３次元形状計測技術の開発

電子基板に対して波長可変レーザー光を照射し,スペックル干渉計を通して多数の干渉像を取込み,微小振動が残る環境下でも3次元形状を計測できる方法を開発した.ランダム振動環境下で干渉像を多数枚取り込むと,画像間の位相シフト量はランダムな変化となる.画像内の異なる2画素における光強度の最大値・最小値を利用した2回規格化からこの位相シフト量を計算し,取り込んでいる光強度の変化から最小二乗近似で干渉像の位相値をカメラの全画素で計算する.実験ではレーザー波長を7種変えて全体で140枚の干渉像を取込み,6種の波長変更に伴う6種の位相変化分布から電子基板の3次元形状を計算した.電子基板上の部品群の3次元形状を高速で計測するには光とカメラを使った距離計測法が必須である.本研究では距離計測に波長走査を用いた干渉応用法を選んでいる.電子基板を検査する場所では環境に微細な振動が残るので,振動環境下でも使える干渉像の位相分布測定法の独自開発を試みてきた.ブルーレーザ光源と高速ラインカメラを用いて振動による光路差変化を高速抽出し振動影響をキャンセルする方法や,視野全域を撮した干渉像から振動による位相変化量を抽出して振動影響を位相分布から除去する方法を試した.その結果,後者の方法が非常に有効と分かった.そこでレーザ光源の発振波長を778nmにして振動環境下で干渉像を20枚以上取込み最初の1枚目の干渉像の位相分布を抽出し,レーザ波長を長波長側に0.05nm変えて干渉像を取込み同じく位相分布を抽出し,さらに長波長側に0.5nm変えて干渉像を取込み位相分布を抽出して,波長を変える時の位相差変化からカメラの各画素での光路差を抽出してみた.その結果,雑音信号は残るものの電子基板の3次元形状を垂直方向から測定できた.この雑音の原因を追及したところ,レーザがある波長域になると位相差マップで雑音が大きくなり,その波長での光源の発振特性に理由がありそうだと分かった.そこで,雑音が大きくなる波長域を避けて計測する方法を検討し低雑音化を図った.その結果,0.1mmの距離分解能で3次元形状計測が可能となった.電子基板に対して波長可変レーザー光を照射し,スペックル干渉計を通して多数の干渉像を取込み,微小振動が残る環境下でも3次元形状を計測できる方法を開発した.ランダム振動環境下で干渉像を多数枚取り込むと,画像間の位相シフト量はランダムな変化となる.画像内の異なる2画素における光強度の最大値・最小値を利用した2回規格化からこの位相シフト量を計算し,取り込んでいる光強度の変化から最小二乗近似で干渉像の位相値をカメラの全画素で計算する.実験ではレーザー波長を7種変えて全体で140枚の干渉像を取込み,6種の波長変更に伴う6種の位相変化分布から電子基板の3次元形状を計算した.波長可変レーザと光干渉光学系ならびに振動影響除去技術を用いて,「振動環境下でも使える電子基板上の部品群の高精度3次元形状計測(2次元カメラの各画素での光進行方向の距離計測)技術の開発」を行っている.このため平成24年度の前半には,購入した波長可変レーザ光源を単純化した干渉光学系に組込み,波長走査を用いた乱反射面までの距離計測実験を行った.この実験は導入した波長可変レーザ光源が距離計測用の干渉応用光学系で正しく動作すること,またその測定精度を確認するものであり,測定対象には外部からの振動が殆ど加わらないように工夫している.一般に波長走査を用いた距離計測では,光路差を一定に維持した条件の下で波長走査に伴う干渉位相変化の総量から距離を計算する.このため外部振動は波長オーダーの振幅であっても位相変化が発生するので距離計測の精度を大きく低下させる.この振動影響を高精度に補正できる手法の開発がこの研究ではキーとなる.振動影響の補正手法に関して幾つか解決案を持つが,その一つに関してシミュレーション実験をその後に行った.その結果,試した補正法がかなり有効と確認できた.振動影響を実際の実験機で正しく補正出来るようにするためには,振動の変位状態を高速高精度に抽出できる機能が要る.この機能実現のため,計測光学系にブルーレーザ光源と高速ラインカメラを組込みつつある.複雑な光学系となるため,迷光や不要反射光の除去が課題である.ブルーレーザ光源と高速ラインカメラを用いる振動変位状態の高速高精度計測には,干渉計の参照ミラー面を位置制御する必要も有る.ミラー面位置のピエゾ制御に向けた準備も実施中である.基板上の段差形状を持つ部品群の3次元形状を高精度計測するために,波長走査を用いた.そして微細な上下振動に対してその振動影響を受けにくい干渉像の位相分布測定法の開発を通して最終的に3次元形状を計算した.具体的には,最大振幅10μmのランダム上下振動環境下でレーザ光源の発振波長を778nmから780.2nmまでゆっくり変えながら,7種の特定波長付近で干渉像をそれぞれ20枚以上取込み,各波長域での最初の1枚目の干渉像の位相分布をその波長域での他の干渉像をも用いて抽出した.そして,波長のみが変わる時の位相変化量を計算し基準画素に対するカメラの各画素での光路差変化を抽出し,電子基板の3次元形状を得た.この方法での雑音の原因を追及し,雑音発生波長域でのデータ処理法を改良し,0.1mmの高さ分解能で3次元形状計測を可能とした.