hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
樹状突起内の中心体機能の検証―微小管重合核形成とマイナス端アンカー

ナイニンは中心体に微小管をアンカーさせるタンパクである。ニューロンではニューロン特異的ナイニンアイソフォーム(V6)が細胞質や樹状突起に存在していることを我々は報告してきた。今回はそのアイソフォームの機能を詳しく調べるため、神経株細胞であるNeuro2Aに発現させ、中心体と微小管の変化を調べた。まず、それぞれのアイソフォームのcDNAを作成し、神経株細胞に発現させた。免疫染色により、発現させたナイニンの局在を調べた結果、多くのバリアントでは中心体に局在するのに対して、exon20が欠けているニューロンタイプのバリアント(V6)のみ中心体に局在せず、細胞質に散在していた。このことから、ナイニンのexon20が中心体の局在に必要であることが分かった。Zhangの既報では、ナイニンのexon32のみが中心体局在に必要であるというと報告されたが、我々の研究ではexon32を欠けたアイソフォームでも中心体局在が見られた。更に、V6を過剰発現させることで、中心体が変化するのが観察された。中心体の変化は主にサテライトPCMの消失、PCMの委縮、消失がある。我々はこの変化を起こすナイニンの領域(496bp2012bp)を特定した。この領域はダイニンの結合領域と一致している。よって、ナイニンはこの領域を含むことによって、ダイニンの働きを阻害していると考えられる。また、V6を過剰発現させると中心体がまだある細胞でもゴルジ体が散り、微小管が放射状から網目状になってしまうことが観察された。これによりサテライトPCMが消失し、中心体の変化が起こると考えられる。また、微小管は中心体ではないところで安定化されていることが示唆される。樹状突起の微小管形成にかかわる分子のひとつであるナイニンの機能について、これまで予想されていなかった機能を示唆するデータが得られた。神経細胞においてナイニンが微小管の安定性を上昇させているのではないかというプレリミナリなデータに基づき、その仮説を証明する新しい実験を行う。また、別のタンパク質(CDK5rap2)についても、機能解析を進める。ニューロンの樹状突起の微小管が、突起内で重合核形成される可能性を検討した。まず、脳の発生過程におけるγ-tubulin環複合体(γ-TuRC)構成分子の遺伝子発現をRT-PCRで調べたところ、生後9週に至るまで発現は一定に保たれていた。次に、マウス大脳皮質の初代培養ニューロンを用いて、γ-TuRC調節因子として知られるGCP-WDとHAUS8の発現を調べた。作製した抗体を用いWestern blottingを行うと、どちらも突起形成の盛んな3DIVでは発現が見られたが、7DIVではほとんど見られなくなっていた。中心体が微小管形成を行わないニューロンにおいてγ-TuRCの構成分子とその活性調節因子が発現していることは、中心体以外の場所で微小管重合核形成が行われている可能性を示唆する。そこで、微小管重合核形成を可視化するため、初代培養ニューロンにおいて微小管を破壊したのちに再形成させる実験を行った。固定法を工夫することにより、細胞質全体で多数の微小な微小管が再形成されている様子が観察できた。このような微小管再形成は4DIVではよく見られたが、8DIVではほとんど見られなかった。再形成された微小管の先端にはγ-tubulinの染色が見られた。γ-TuRC構成分子であるMZT1の抗体を作製し、培養ニューロンの抽出物を用いて免疫沈降実験を行うと、γ-tubulinとMZT1は複合体を形成していた。従って、細胞質で再形成される微小管の先端にγ-TuRCが結合していることが示された。以上のことから、突起伸長期のニューロンでは、細胞質においてγ-TuRCを起点とする多数の微小管形成が起きていることが明らかになった。研究計画の根幹をなす仮説がおおむね立証できた。研究全体における第一関門を突破したと言える。

また、V6を過剰発現させると中心体がまだある細胞でもゴルジ体が散り、微小管が放射状から網目状になってしまうことが観察された。これによりサテライトPCMが消失し、中心体の変化が起こると考えられる。また、微小管は中心体ではないところで安定化されていることが示唆される。樹状突起の微小管形成にかかわる分子のひとつであるナイニンの機能について、これまで予想されていなかった機能を示唆するデータが得られた。マウス大脳皮質の初代培養神経細胞で観察された再生微小管が、γTURCを起点としていることを確認するために、γTURCの構成分子であるγ-tubulin(isoform 1と2)、GCP2、GCP3をsiRNAにより二重三重にノックダウンし、微小管再形成が起きなくなることを示す。次に、γTURC調節因子であるGCP-WDとCDK5RAP2をノックダウンして微小管再形成実験をおこなう。主としてどちらの分子が樹状突起内の微小管形成に関わるのかを明らかにする。また、これらのノックダウンが実際に樹状突起の成長を阻害することを示すため、shRNA発現ベクターを胎児大脳へインビボエレクトロポレーションによって導入する。一方、2017年度において、初代培養ニューロンにおける微小管再生が、BCNF処理によって増強されるという予備実験データが得られた。2018年度は、その可能性を立証したい。神経細胞においてナイニンが微小管の安定性を上昇させているのではないかというプレリミナリなデータに基づき、その仮説を証明する新しい実験を行う。また、別のタンパク質(CDK5rap2)についても、機能解析を進める。おおむね予定通りに使用したが、端数を次年度に繰り越す。
発達障害児における「やせ」・「肥満」とその治療経過に影響を及ぼす要因分析

発達障害を伴う児のやせと肥満の傾向をみると、年齢に伴って順次やせが減少する一方で肥満が増加し特に精神遅滞のある児に顕著にみられた。児の肥満には、発達障害を伴う児に特有な食行動・食嗜好、低運動、および肥満の家族歴が関連していた。可能な事例については面接・保健指導を実施し、肥満改善指導の継続のためには成長期の特性を活かし、家族も含めた目標の設定、評価・改善というフィードバックサイクルの重要性が示された。本研究では近年増加傾向にある発達障害を伴う児の身体状況調査に基づき「やせ」と「肥満」の改善支援のための要因について多面的に検討することを目的としている。初年度は本大学倫理委員会に申請し承認を得た上で今年度の計画に基づき対象者の選定と肥満頻度調査を実施した。対象は本大学付設診療所の発達外来を受診した肢体不自由のない小中学生である。性・年齢区分別肥満度別に見た場合、男性が女性よりも肥満者(肥満度20%以上のものと定義する)の割合は多く、男性では、58歳群で8.3%のものが肥満児で、912歳群では24.4%に増加し、13歳以上では17.2%と依然として肥満者が多い状態であった。一方女性では58歳群で9.4%、912歳群で10%とほぼ1割が肥満であった。また肥満度50%以上の高度肥満者は男性で58歳群ですでに存在し、912歳群では10.5%も占めていた。診断区分別に見た場合、高機能広汎性発達障害(PDD)に男女ともに肥満者が多く、知的障害を伴う男児の20%強が肥満者で、なおかつ高度肥満者も多いという特徴が見られた。また身長、体重、腹囲、体脂肪率を計測し、保護者に対して「本人の食行動・生活習慣」と「肥満の家族歴」に関するアンケートを実施した結果、不規則な生活習慣・不適切な食行動を示す場合および家族(兄弟、父母、祖父母)に肥満者がいる場合に体脂肪率は高くなる傾向を示していた。次年度は今年度の結果をさらに詳細に分析し、高度肥満者や肥満が継続している事例への働きかけに活かしていく予定である。平成22年度は平成21年度の結果をさらに詳細に検討し、新たに生活習慣チェックリストを開発し、対象者の生活習慣を含む家族環境要因との関連を検討した。1)生活習慣チェックリストの開発:項目数,回答選択肢の数はプレテストを実施し短時間でかつ効果的に選択できるように工夫した。疫学研究の専門家と協議した結果,最終的に35項目・4回答選択肢とした。内容は食事、運動、家族歴、行動の特性からなる。2)受診日に対象者の保護者に記入してもらい,希望する保護者自身にも実施した。3)生活習慣チェックリストと諸計測値との関連を検討した。35項目中19項目が体脂肪率に関連する有意な要因として認められた。間食、肉食、スナック菓子や菓子パンが多い、野菜が少ない等の食事内容、脂っこいもの、甘いものが好き等の食嗜好という従来から指摘されている内容や低運動性以外に特有な食行動が8項目抽出された。3)高度肥満者である事例への保健指導を実施し対象者への働きかけの示唆を得た。次年度はさらに詳細な要因分析と事例的保健指導を実施していく予定である。本研究においては近年増加傾向にある発達障害児の身体状況調査に基づき「やせ」と「肥満」の改善支援のための要因について多面的に検討することを目的とする。平成23年度は平成22年度に開発した生活習慣チエックリストを活用し、対象者の生活習慣を含む家族環境要因との関連をさらに詳細に検討し,また事例的に対象者への保健指導を継続して実施した。1.性・年齢区分別にみると男女ともに肥満者は年齢の上昇とともに増加(平成21年度報告)していたのに対しやせは低年齢層で高く,その頻度は年齢とともに男子で11%→9%→5%と減少し、女では8%→5%→0%と減少していく傾向にあった。2.診断区分別にみると男では知的障害を伴う者は他の診断区分と比べて肥満傾向が強く約3割が肥満であった(平成22年度報告)のに対しやせはADHDで12%で他診断区分の36%に比べてやせの頻度が高かった。3.発達障害を伴う児は幼いころ食の細さがあっても、ある年齢になって落ち着いて食事に向かうことができるようになるとやせは解消していく傾向にある。高学年になっても運動量が比較的少なく、食べることに執着するようになるとある時期(9歳頃から)急速に肥満に向かう傾向が観察された。

発達障害を伴う児においては一般の思春期女子で指摘されるやせの問題よりもどちらかといえば男女ともに肥満の問題が深刻であるといえる。4.継続保健指導を実施した事例では,成長期の特性を生かし家族が支援する方法の具体的な提示、疑問や不安に関する適切な対応、母親にも目標を設定することが親子で頑張るという新たな目標につながりこれらのことが中断に至らなかった要因と考えられた。
近代日本黎明期における薩摩藩集成館事業の諸技術とその位置付けに関する総合的研究

前期に研究した薩摩藩集成館事業の5技術分野に加え、熔鉱炉・磯窯(薩摩焼)・製糖技術などの分野を研究してきた。判明した主な結果の概要を記す。(1)建築:同事業に関わる遺構の旧鹿児島港港湾施設と集成館製造の南洲神社電燈について実測調査と文献調査を行った。前者は、江戸末期から明治、昭和の遺構が連続して現存し、石積技法が優れ、後者は、高い鋳造技術を示し、集成館が地域の近代化に資した好例である。(2)紡織技術:鍋島報效会所蔵『薩州見取絵図』に描かれている大幅機の絵図を詳細に検討し、それを復元するための製作図の作成をした。併行して当時この織機で織った帆布(尚古集成館所蔵)の組織分析も合わせ行い、織機の構造を解析した。(3)熔鉱炉:3回目の発掘調査を行い、これまでの結果とも考え合わせ、斉彬時代に建設された日本最初の熔鉱炉が『薩州見取絵図』に描かれた位置にあった可能性が高いこと。それを裏付ける石垣、水路跡、側溝跡などが絵図にある位置に対応して発見された。(4)磯窯:『薩州鹿児島見取絵図』に描かれた連房式登窯(磯窯)を検討した。燃焼室+1011室の窯では当時最大規模。輸出用陶磁器と反射炉用耐火煉瓦の生産用で産業志向が強い。反射炉用煉瓦は天草陶石と鹿児島在地の工人の磁器製造技術の導入で成功した。(5)製糖技術:奄美大島の在来黒糖製造技術について文献と現存する圧搾機の実測調査を行い、実態を明らかにした。一方、慶応年間に薩摩藩が同島内4カ所に建設した白糖製造工場の実態を現地調査した。立地条件・建築関連遺物(耐火煉瓦)について検討した。立地は山を背に、海に面し、近くに川を擁する共通点がある。総じて、斉彬が集成館事業により軍事技術と民需技術の両面の近代化を他に先駆けて展開した具体像をかなり明らかにできた。前期の薩摩藩集成館事業における5技術分野に加え、熔鉱炉・磯窯(薩摩焼)・製糖技術の分野を研究している。(1)反射炉;シンポジウムで佐賀・萩・鹿児島の反射炉と薩摩の熔鉱炉の報告を基に、3地域間の技術移転の具体像を議論した。(2)建築;唯一現存する鹿児島紡績所使用の鉄柱を実測し、紡績所の鉄柱を復元した結果、全長は4314mmで、柱脚とそこから伸びた円柱、四葉型に開いた板とそれを支える添え板よりなる柱頭を持つ形状となった。柱頭側面の平滑面は動力伝達用のシャフトを支えるシャフトハンガー取り付け用と見られる。(3)紡績技術;鍋島報效会所蔵の『薩州見取絵図』などに描かれた綿繰機の絵図を詳細に検討し、綿繰機を復元した。現在、広幅織機の復元のための準備作業中。(4)熔鉱炉;過去2回発掘調査を実施した。主な検出遺構は、石垣列、石組み遺構、突き固め遺構(仮称)が発見され、出土遺物、幕末近代の陶磁器・瓦・レンガ・耐火レンガ、鉄滓,石製鋳型など。また、ヒュゲーニン著『ロイク王立鉄製大砲鋳砲所における鋳造法』1826年の熔鉱炉図の由来について引用文献のハッセンフラッツ著『鉄冶金学』1812年を調査し、形状のかなり似た図面を発見。(5)磯窯(薩摩焼き):集成館事業の中で開窯された磯窯は、薩摩焼の陶工が関与し、反射炉用の耐火レンガを焼成した。その窯構造は『薩州鹿児島見取絵図』により、燃焼室+1011室の連房式登窯であり、その規模は同時期の薩摩焼の窯としては、最大規模のもの。基礎を石垣で構築するなど多大な労力が費やされており、きわめて産業志向の強い窯であった。反射炉建設に在来の窯業技術が深く関係していた。(6)製糖:薩摩藩が1858年に技術者を奄美大島に派遣し、4カ所に白糖製造工場を設置した。工場跡地からの煉瓦が5種類保存され、その内"COWEN"の刻印のものは、19世紀の英国Joseph Cowenの会社製の可能性が高い。4設置位置は特定でき、4ヵ所に共通する立地条件も明らかになった。

(3)熔鉱炉:3回目の発掘調査を行い、これまでの結果とも考え合わせ、斉彬時代に建設された日本最初の熔鉱炉が『薩州見取絵図』に描かれた位置にあった可能性が高いこと。それを裏付ける石垣、水路跡、側溝跡などが絵図にある位置に対応して発見された。(4)磯窯:『薩州鹿児島見取絵図』に描かれた連房式登窯(磯窯)を検討した。燃焼室+1011室の窯では当時最大規模。輸出用陶磁器と反射炉用耐火煉瓦の生産用で産業志向が強い。反射炉用煉瓦は天草陶石と鹿児島在地の工人の磁器製造技術の導入で成功した。(5)製糖技術:奄美大島の在来黒糖製造技術について文献と現存する圧搾機の実測調査を行い、実態を明らかにした。一方、慶応年間に薩摩藩が同島内4カ所に建設した白糖製造工場の実態を現地調査した。立地条件・建築関連遺物(耐火煉瓦)について検討した。立地は山を背に、海に面し、近くに川を擁する共通点がある。総じて、斉彬が集成館事業により軍事技術と民需技術の両面の近代化を他に先駆けて展開した具体像をかなり明らかにできた。
力学的環境に結晶組織の影響を考慮した構造物の疲労寿命の革新的向上に関する研究

現在,力学環境のみで評価されている疲労亀裂伝播の領域を,結晶組織の影響も考慮した評価方法を検討して,構造物の疲労寿命推定の高精度化や,耐疲労亀裂伝播鋼の開発するための基礎的研究である。なお,研究の特徴は,一般的疲労試験条件で撮影した画像を処理して,伝播挙動への影響を直接分析することである。得られた成果は,疲労亀裂伝播中の動画を高速,高倍率で撮影し,この動画をPIV法を用いて亀裂先端近傍の変形のみを抽出して,亀裂先端の変形動画を作成すること,この画像を処理して,再引張り塑性域や再圧縮塑性域を算出することに,ほぼ成功し,疲労亀裂伝播経路と結晶組織の関係を3次元的に明らかにできたことである。本年度は,主に疲労試験機を導入して,今までに使用していた別の大型疲労試験機で可能であった疲労き裂先端近傍のヒステリシスループを新小型疲労試験機で可能なように冶具を含めた荷重軸を高精度に調整することや,疲労き裂の伝播経路の直進性を確認することであった。その結果,新小型疲労試験機においても,試験片幅150mmのCT型試験片において疲労き裂長さ80mm(き裂全長120mm)まで,ほぼ直選するよう調整を完了し,確認試験を実施して大型疲労試験機以上の精度でヒステリシスループの計測が可能となったことが確認できた。このことで,来年度実施する疲労き裂伝播試験における疲労き裂の屈曲が,鋼材の結晶組織の影響のみとする試験システムを構築できた。また,本研究の目的である伝播中の疲労き裂先端と鋼材の結晶組織の関係を明らかにするために,現有の動き解析マイクロスコープを用いて,エッチングした試験片表面における結晶組織と疲労ぎ裂の関係をマイクロスコープのズームレンズの最大倍率1,000倍で撮影を行った。その結果,ある程度の画像撮影は可能であったが,高倍率での撮影のため,PIV法での画像処理を行うとピントのずれによるノイズの影響が大きい部分があった。これは,荷重軸を合わせていても除荷時に試験片が面外にゆれていることが考えられ,PIV法による画像処理の精度を向上させるために改善する必要がある。今回導入した小型疲労試験機に取り付ける油圧チャックは,次年度導入予定であるために,鋼板板厚方向に伝播させる片側切欠き付薄板試験片を用いた疲労き裂伝播試験については,本年度は実施していない。来年度実施予定の高倍率での伝播中の疲労き裂撮影に向けた,そのほかの実施可能な疲労き裂伝播試験を行った。本研究は,現在,力学的環境のみで評価されている疲労亀裂伝播速度を,金属結晶学的な視点からの影響も加味した評価方法を確立して,構造物の疲労亀裂伝播寿命推定の高精度化や,耐疲労亀裂伝播鋼の開発に貢献するための基礎的研究である。なお,本研究の特徴は,従来の疲労試験環境(大気中,載荷速度10Hz)で,高倍率,高速撮影した画像を画像処理して,疲労亀裂伝播挙動への影響要因を直接分析するところにある。本研究により,取得した動画にPIV法を適用して疲労亀裂先端近傍の変形をベクトル表示することが可能となった。さらに,このPIV法によって疲労亀裂先端の変形挙動を積算することによって,載荷時の再引張り塑性域の範囲,及び除荷時の再圧縮圧縮塑性域の範囲を把握することが可能となった。求められた圧縮塑性域の亀裂先端方向の寸法は,豊貞九州大学名誉教授らが開発したFLARPシミュレーション解析法において示された,疲労亀裂伝播挙動を明確に表す再圧縮塑性域寸法を算出する式の結果と良い一致を見た。さらに,鋼板板厚方向に疲労亀裂が伝播した試験片と鋼板板幅方向に疲労亀裂が伝播試験片それぞれの表面を0.01mmごとに研磨しながら,静止画像を撮影し,それを50枚重ね合わせて3次元画像を作成した。この結果から,パーライト結晶組織と疲労亀裂の伝播経路の関係を明らかにした。これにより,疲労亀裂は出会った硬いパーライト組織を避けるように伝播すること,疲労亀裂がパーライト組織を断ち切るように伝播する場合には,その表面近傍のみにパーライト組織が存在して直下には軟らかいフェライト組織が深く,かつ大きく存在するか,パーライトがくびれて断ち切りやすいようになっていることを明らかにした。本研究成果の一部は,平成23年5月の日本船舶海洋工学会講演会で発表され,溶接学会FS委員会や日本溶接協会FTE委員会で技術報告として,発表した。昨年度,本科研費で購入した疲労試験システムに,今年度,油圧チャック,及びデジタル動ひずみ測定器を購入し,装備して稼働確認試験を実施した。その結果,自作した計測プログラムを含めて,所定の計測が可能であることを確認した。また,疲労き裂先端近傍のヒステリシスループも高精度で計測できていることを確認した。

今回構築した疲労き裂伝播試験システムを用いて,同じスラブ材から圧延条件を変えることによって,結晶粒寸法や結晶形状を変化させた2種類の鋼材の疲労き裂伝播試験を行った。試験片は,片側貫通き裂が鋼材の板厚方向に伝播するように製作したものである。また,疲労き裂伝播経路と結晶組織の関係を明らかにするために,試験片表面は10%硝酸アルコールでエッチングした。伝播試験中は,試験片表面を動き解析マイクロスコープで撮影して,疲労き裂の伝播状況を撮影した。試験片の撮影する表面とは反対側表面には,5連ひずみゲージを貼付して疲労き裂先端の変形を記録した。疲労き裂伝播試験終了後,疲労き裂周辺を0.01mmずつ研磨し,エッチングし,表面を撮影した。得られた50枚の画像を合成して,パーライト組織の3次元形状と疲労き裂伝播経路の関係を明らかにした。今年度の調査の結果,疲労き裂は,結晶粒寸法が大きい場合には,大きく,数少なく屈曲すること,結晶粒寸法が小さい場合には,小さく,数多く屈曲することが明らかとなった。また,軟らかいフェライト組織中を荷重直角方向に直線的に伝播し,前方に硬いパーライト組織がある場合には,それを避けるように伝播すること,フェライト組織中を伝播中に屈曲する場合には,内部にパーライト組織が存在すること,硬いパーライト組織を断ち切って伝播する場合には,内部でパーライト組織が細くなって1つの結晶粒の端部であったことが,今回明らかとなった。当初の予定でも油圧チャックの購入は第2年度に行うことにしていた。第1年度は,疲労試験機での疲労き裂伝播の直進性の確保や,き裂先端のヒステリシスループ計測のための調整を行うことが主目的であったことは完全に達成できた。また,既存の動き解析マイクロスコープの高倍率撮影の問題点も把握することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究で達成目標としていた,疲労き裂伝播経路と結晶組織の関係を明らかにするための疲労き裂伝播試験システム,及び疲労き裂の伝播経路を計測する技術を確立できた。さらに,疲労き裂伝播試験終了後に,疲労き裂伝播経路と結晶組織の形状を3次元画像として獲得するための方法を確立できた。また,構築した試験,計測システムを用いて,疲労き裂が屈曲しながら伝播する場合のパーライト組織の影響について,明らかにできた。最終年度には,確立できた試験,計測システムを用いて,鋼材の板幅方向へ伝播する疲労き裂伝播経路と結晶組織の関係を明らかにすること,数値解析モデルを作成して,屈曲伝播するき裂先端の力学的条件を明らかにすることを十分に行うことができる時間が確保できたことにより,本研究は,おおむね順調に進展しているものと判断した。第2年度に,第1年度に導入した小型疲労試験機に油圧チャックを設置して,薄板試験片の疲労き裂伝播試験が実施可能なようにする。第1年度の予備試験において明らかになったピントのずれを修正して,動き解析マイクロスコープでの高倍率撮影画像の鮮明化を図る。このことによって,PIV法による画像処理のノイズ除去を図る。また,疲労き裂伝播試験した鋼材を表面から研磨,エッチング,撮影を繰返し,疲労き裂伝播経路と結晶組織の関係を明らかにする予定である。
中東欧のオリエンタリズム―古典古代への憧憬と身体

1年目となる19年度においては,オーストリアとチェコにおけるオリエンタリズムの比較を行った。その素材として着目したのが,戦間期にヨーロッパ運動の担い手として活躍したチェコ地域出身の貴族,リヒャルト・クーデンホーフ=カレルギーとカール・アントン・ロアンの2人である。両者はヨーロッパ統合史のなかで重要な意義を持つ人物であるが,私は,彼らのヨーロッパ意識とその裏返しとしてのオリエント意識に注目し,オーストリアとチェコにおける「非ヨーロッパ」への眼差しを抽出する作業を行った。この点に関しては,東欧史研究会などで口頭報告を行い,既に論文を投稿しているが,今年度中に公にするには至らなかった。本報告書で挙げた2つの業績は,この作業の副産物と言えるものであるが,メインの成果ではない。今年度の反省点である。なお,私は19年2月より在スロヴァキア大使館の専門調査員に採用されたため,本研究は18年度で終了し,19年度と20年度については廃止せざるを得なくなった。私が若手研究(B)を途中でキャンセルするのはこれが2回目である。前回(課題番号14720059,H1416)の場合は,北海道大学法学部助手の任期が途中で切れたため,今回については,同大学スラブ研究センター助手の任期が18年度で切れたため,である。今回については,同機関で無給のポストを得,科研を継続できる見込みはあったが,生活が成り立たなくてはそもそも研究はできない。痛恨の極みである。無給のポストでも科研費を得られるという現在の制度については,多くの若手研究者が高く評価しているが,アルバイトなどで生活の糧を得ながら研究を遂行するには多くの困難が伴うのも事実である。今後は,科研費の「中断」などを可能にするなど,一層の柔軟な運用をお願いする次第である。痛恨の極みである。
C末端アンカー型膜蛋白質の局在化機構

膜蛋白質の重要なグループに、N-末端にシグナル配列を持たず、C末端の疎水的領域で膜にアンカーするC末端アンカー型膜蛋白質が存在する。C末端アンカー型膜蛋白質は種々のオルガネラに分布して、様々の重要な細胞機能を担っている。例えば、ミクロソーム型アルデヒド脱水素酵素(msALDH)は小胞体に局在するのに対して、小胞輸送に重要な役割を果たしているHPC-1(シンタキシン1)は細胞膜に局在する。本研究では、C末端アンカー型膜蛋白質の局在化機構を明らかにすることを目的として以下の研究を行った。1. HPC-1の細胞膜局在化機構。HPC-1の細胞膜局在化機構についてCOS細胞発現系を用いて解析した。その結果、HPC-1は、まず小胞体膜に挿入され、小胞体からゴルジ体を経由して細胞膜まで輸送されることが示された。さらに、大腸菌マルトース結合蛋白質(MTP)とのキメラ蛋白質を用いた解析から、HPC-1,msALDHのC-末端疎水的領域に各々、細胞膜、小胞体への局在化シグナルが存在することが示唆された。2. msALDHの小胞体残留機構の解析。緑色蛍光蛋白質(GFP)のC端末にmsALDHのC-末端疎水的領域を付加したキメラ蛋白質(GFP/msALDH)をCOS細胞、NRK細胞に遺伝子導入すると、GFP/msALDHは小胞体に局在した。フッ化アルミニウム処理により小胞体-ゴルジ体間のリサイクリングを阻害してもその分布に変化がないことから、GFP/msALDHキメラは静的に小胞体に残留すると考えられる。3.ラット小腸におけるmsALDHの分布。蛍光抗体法と免疫電子顕微鏡法とによって、msALDHが小腸粘膜の吸収上皮細胞の滑面小胞体に高密度で局在することが示された。“C末端アンカー型膜蛋白質"のうち、ミクロソーム型アルデヒド脱水素酵素(msALDH)は小胞体に局在し、HPC-1(シンタキシン)は細胞膜に局在する。本年度は、細胞膜に分布し小胞輸送に重要な“C末端アンカー型膜蛋白質"であるHPC-1の局在化機構についてCOS細胞発現系を用いて解析した。野生型HPC-1をCOS細胞に発現させた場合には、HPC-1はゴルジ体、および細胞膜に分布した。C末端の疎水的領域を欠損した異変HPC-1はサイトゾルに分布することから、C末端の疎水的領域が膜へのアンカーとして働いていることが示された。HPC-1のC末端側に糖鎖付加部位を持つキメラ蛋白質には糖鎖が付加され、それは細胞膜に分布した。以上の事実から、HPC-1は、まず小胞体膜に挿入されること、小胞体では、C末端側を小胞体内腔に、残りの部分をサイトゾルに向けた膜貫通構造を取ること、小胞体からゴルジ体を経由して細胞膜まで輸送されることが示された。大腸菌マルトース結合蛋白質(MTP)のC末端にHPC-1のC末端疎水的領域24アミノ酸残基を持つキメラ蛋白質は、野生型HPC-1と同じ細胞内分布を示した。一方、MTPのC末端にmsALDHのC末端35アミノ酸残基を持つキメラ蛋白質は小胞体に局在した。従って、HPC-1,msALDHのC末端疎水的領域に各々、細胞膜、小胞体への局在化シグナルが存在すると考えられる。

我々は、さきに、C末端アンカー型膜蛋白質である、ラット肝ミクロゾーム型アルデヒド脱水素酵素(msALDH)の肝細胞内分布を詳細に解析し、ラット肝においては、msALDHあるいはそれと共通の抗原性を有するALDHが小胞体に加えてミトコンドリア外膜およびペルオキシソーム膜にも存在することを報告した。我々は、ラットの種々の組織におけるmsALDHの分布を調べ、本酵素が、肝に加えて、小腸吸収上皮細胞にも強く発現していることを見いだし、その細胞内分布をコンホーカル顕微鏡を用いた蛍光抗体法と免疫電子顕微鏡法とを用いて解析した。その結果、蛍光抗体法によって、msALDHは小腸粘膜の吸収上皮細胞に分布し、ゴブレット細胞には検出されないことが示された。吸収上皮細胞では、刷子縁直下の滑面小胞体の豊富な部位に高密度でmsALDHが局在し、msALDHの分布は小胞体の標識酵素であるプロテイン・ジスルフィド・イソメラーゼの分布とよく一致した。免疫電子顕微鏡法では、msALDHはおもに滑面小胞体に局在し、ゴルジ体、ミトコンドリアには検出されなかった。以上の事実は、msALDHの小胞体局在化機構が小腸粘膜の吸収上皮細胞においても強く働いていること、肝細胞とは異なり、小腸吸収上皮細胞においては、ミトコンドリア外膜にmsALDH様の蛋白質が発現していないことを示している。C末端アンカー型膜蛋白質は、シグナル配列を持たず、C末端の疎水的領域で膜にアンカーする蛋白質であり、種々のオルガネラに分布して、様々な重要な細胞機能を担っている。私達は、これまで、C末端アンカー型膜蛋白質の局在化機構を解析し、ミクロソーム型アルデヒド脱水素酵素(msALDH)の小胞体局在化シグナルが、そのC-末端35アミノ酸残基内にあること、シンタキシン1の細胞膜局在化シグナルが、そのC-末端24アミノ酸残基内にあることを明らかにした。本年度は、緑色蛍光蛋白質GFPのC末端にmsALDHのC-末端35アミノ酸、あるいはシンタキシン1のC-末端24アミノ酸を付加したキメラ蛋白質をCOS細胞とNRK細胞に遺伝子導入し、その細胞内分布を解析した。その結果、msALDHのC-末端を持つGFPキメラ蛋白質の蛍光は、小胞体に局在し、シンタキシン1のC-末端を持つそれは、ゴルジ体と細胞膜に分布し、それぞれが局在化シグナルとして働いていることが確認された。フッ化アルミニウム処理により小胞体-ゴルジ体間のリサイクリングを阻害しても、GFP/msALDHキメラの分布に変化がないことからGFP/msALDHキメラは静的に小胞体に残留すると考えられる。
哺乳類ＭＨＣ領域の多型の進化

免疫プロテアソームのプロテアーゼ活性を有するサブユニットの一つをコードするPSMB8遺伝子は、多くの顎口類において切断特異性を決定すると考えられる31番目の残基がアラニンのA型と、フェニルアラニンのF型の二種類のアレルが知られている。ところがこれまでに知られている真獣類のPSMB8は全てA型であり、当研究では有袋類、単孔類を調べることにより、哺乳類の進化過程のどの段階でF型の消失が生じたかを明らかにすることを目標にした。昨年は有袋類のワラビー、オポッサムおよび単孔類のカモノハシを解析し、A型しか存在しないと言う結果を得た。今年度は有袋類のタスマニアデビル、ウォンバット、コアラ、クァッカワラビー、セスジキノボリカンガルー、リングテイル、ハリモグラを解析した。オーストラリアの研究者から提供された、各種1から数個体の血球よりDNAを抽出し、PSMB8の様々なエクソン上に設計したuniversal primerを用いてPCRを行い、direct sequencingにより31番目のアミノ酸を推定することによりタイピングした。PCRでバンドが検出できなかったハリモグラを除く全ての種でPSMB8遺伝子の配列を得ることができたが、全てA型であった。半数以上の個体でイントロンに多型を検出することができ、両方のアリルともにA型であることが確認できた。以上より、F型の喪失は哺乳類の共通祖先で生じたと結論した。また、有袋類、単孔類のいくつかの種において、PSMB8とクラスI遺伝子の緊密な連鎖がたもたれていることから、真獣類に見られる両者の連鎖の喪失は、PSMB8遺伝子の二型の喪失にはるかに遅れて生じたことが明らかになった。24年度が最終年度であるため、記入しない。有胎盤類のMHCは、クラスI遺伝子と免疫プロテアソームサブユニットPSMB8遺伝子が緊密に連鎖しない点で派生的な遺伝子配置を示し、他の多くの脊椎動物で認められるPSMB8遺伝子の二型性が失われている点でも特異である。これらの特化が哺乳類の進化上、何時生じたかを明らかにする目的で、両遺伝子の緊密な連鎖を保持している単孔類のカモノハシ、有袋類のオポッサム、及び両遺伝子の緊密な連鎖を失っている有袋類のワラビーについて、PSMBS遺伝子の二型性の有無を検討した。オーストラリア、北米の研究者から分与された遺伝的な多様性を期待できるDNAサンプルを、カモノハシ、ワラビーは各20個体、オポッサムは23個体解析し、いずれからも31番目のアミノ酸残基がValであるA型のPSMB8遺伝子のみが検出された。ゲノムPCR後のダイレクトシークエンスでは、殆どの個体において主にイントロン内の数カ所に二重ピークが認められ、両アレル共にA型であることが強く示唆された。この結果は単孔類、有袋類にもPSMB8遺伝子の二型性は存在していないことを示し、二型性の喪失は哺乳類の共通祖先で生じたことを示唆している。従って、進化的にはPSMB8遺伝子の二型性の喪失が先行し、その後PSMBS遺伝子とクラスI遺伝子の緊密な連鎖が失われたというシナリオが考えられる。野生個体を含む、多様性の期待できるDNAサンプルを入手できたことにより、ほぼ結論を得ることが出来た。当初の予想とは異なる結論であったが、MHCの進化を考える上では重要な情報を与えるものと思われる。既に入手済みのサンプルについては、これまでに解析できたどの部分についても二重ピークを示さず、従ってF型の存在を否定できないものがある。解析を他のイントロンにも拡げて、結論を得たい。

また、現在シドニー動物園から他の有袋類の血液サンプルを入手すべく交渉中である。より多くの種を調べることにより、有袋類にはPSMBS遺伝子の二型性が存在しないことを確かなものにしたい。
イメージ情報に基づいた絵画データベース検索システム

今年度の研究は、昨年度構築した風景写真のカラー画像データベースを基に、色彩情報を用いた類似画像検索機能を組み込んだ。四つの領域分割法を用いてそれぞれの画像を小領域に分割し、Lab値を基にした各領域の特徴量を求める。領域分割法は入力画像に適した方法を自動的に選択し、算出された特徴量から、1枚の入力画像に対して類似画像を決定する。また、類似画像を決定する際に一定重みの他にガウス重みを用いることによって、ユーザの意思が反映した画像を検索することができた。このシステムの有効性を証明するために、全探索との比較を行ない。その結果、全探索に比べ約三分の一の手間で所望の画像を検索できることが確認できた。「心象イメージ」と色彩情報が密接な関係にあり、芸術家は配色の知識を持ち、その規則にしたがった対象の選択、構図を行い、一枚の作品を完成させていく。本研究の発展として、特定の芸術家の制作活動をすべて計算機に入力し、その行為を定量化することで、芸術家の「心象イメージ」の解明を試みる。今年度の開発では、市販のCD-ROMカラー画像データをサンプルにデータベースの機能検証を行った。WebサーバのCGIプラグイン機能を用いて、インターネット上での検索システムを実装した。カラー画像データは市販のストックフォト検索用CD-ROMから4000枚使用した。保存すべき画像データを芸術写真や絵画、イラストレーションに置き換えれば、直ちに人文科学研究に有効なものである。
骨髄異形成症候群の造血障害・遺伝子変異細胞クローン性拡大とNKG2D免疫との関連

申請者らは79名の骨髄不全(BFS)患者を対象に血清中の可溶性NKG2Dリガンド(sNKG2DL)を測定し約5割の患者がsNKG2DL陽性で、sNKG2DL陽性と血球減少に相関があることを見つけた。本研究では検討数を増やしMDS診療におけるsNKG2DLの臨床的意義を確立する。一方、申請者らは若年発症MDS患者にLIG4(DNA ligase IV)遺伝子の新規変異を見つけた。本患者のLIG4変異を模したlig4変異マウスを作成したところ、骨髄細胞密度低下・白血球数低下・MDS類似形態異常を示す白血球を生じた。このマウスを使い、MDS病態形成とNKG2D免疫との関連を調べる。
核融合用先進超伝導線材特性の向上と実用導体特性の評価

核融合特別研究第4班(超伝導マグネット)では、これ迄の9年間にわたり、核融合用超伝導マグネットの開発に必要な研究として、種々の超伝導線材の開発とその基礎研究、磁束のピン止め機構と電磁現象、及び超伝導マグネット技術の研究を進めて来た。超伝導材料・線材班は初期の頃は線材開発に必要な材料物性の研究から始め、中期に於てはTi添加によるブロンズ法線材の特性向上に成功し、また種々の共通試料に関する研究で、測定方法と線材製造プロセスの標準化を行い、後期は低ACロス導体を含む先進超伝導線材の開発と高磁界特性、耐歪特性、中性子照射効果の評価に力点を置いて来た。本計画研究班は、これ迄の9年間の材料・線材開発の研究を踏まえ、(1)実用化に最も近い先進超伝導材料を集中的にとりあげて、1年間で実用化が可能である事の実証をする、(2)実用並びに近実用線材の特性の向上をはかる、(3)低ACロス導体を開発する、(4)種々の線材・導体の超伝導特性、耐歪特性、照射効果を評価する、事を目的として研究を進めて来た。以下に主たる成果のみを述べる。[1]最近発見されたCCE法Nb_3Al線材で、第3元素を添加する事により、第1熱処理の温度を下げ、その時間を長くして、大量生産により適した条件とした。[2]ジェリーロール法Nb_3(Al、Ge)線材をEB照射によって作製し、高T_cで且つ高磁界での高J_c特性を得た。[3]CaOるつぼ溶解で得たCuNb鋳塊を伸線する事により、高強度、高伝導率の複合材を得た。[4]最近ようやくシェブレル相線材で、20T以上の高磁界で10^4A/cm^2以上のJ_c特性が得られる様になった。[5]核融合炉に実用するためには、超伝導線材の中性子照射効果を評価する事は必須である。
犬の脊髄損傷症例に対する嗅神経鞘細胞(OECs)移植による脊髄再生療法の臨床治験

本研究目的は、犬の脊髄損傷症例に対して神経再生能を有する鼻粘膜由来の細胞(OECs)を自家移植し、その有用性を検討することであった。しかし研究期間内に飼主の同意を得て実際に臨床応用することはできなかった。したがってその他の研究成果として、従来の方法よりも侵襲が少ない経鼻腔内視鏡による鼻粘膜採取法を確立した。さらに適応症例の選択や治療効果を判定するための硬膜外電極を用いた電気生理学的検査法を検討した。本研究では犬における自然発症の脊髄損傷症例に対する嗅粘膜OECs自家移植療法のphase I(安全性評価)、そしてphase II(有用性の評価)を目的として研究を実施した。しかし適応症例との遭遇機会が少なく、本年度、実際に臨床治験を実施することは困難であったため、臨床治験実施のために改善すべき検討項目について研究を行った。具体的に本年度実施した研究は以下の通りである。(2)経鼻内視鏡による嗅粘膜採取法の検討現在、移植細胞の材料となる嗅粘膜は開頭術によって採取しているため、侵襲性が高い。そのため飼主の同意を得ることが難しく、臨床治験を実施できる機会が少ないのが現状である。人においては経鼻的に嗅粘膜を採取し、移植OECsを得ている。したがって、犬においても開頭術を行わずに内視鏡を用いて経鼻的に嗅粘膜採取ができるかどうか安楽死犬を用いて検討した。その結果、途中経過ではあるが経鼻的に内視鏡を使用して嗅粘膜を採取でき、移植材料であるOECsを非侵襲的に採取できることが判明した。今後は検体数を増やし、実際に生体での有用性ならびに副作用に関して検討を行った上で臨床応用する予定である。(2)硬膜外カテーテル電極設置による脊髄伝導速度の評価OECs移植後、客観的な機能評価の方法として、人で行われている硬膜外カテーテルによる電気生理学的診断が犬においても有用であるかどうか検討中である。犬における情報が少ないため、正常犬における上行性脊髄路の伝導速度、振幅等のデータを採取・分析中である。本研究では犬における自然発症の脊髄損傷症例に対する嗅粘膜由来嗅神経鞘細胞(OECs)自家移植療法のphase I(安全性評価)そしてphase II(有用性の評価)trialを目的とし、OECs移植による脊髄再生療法の臨床治験を試みた。しかしながら適応症例との遭遇機会が少なく、また現状の嗅粘膜採取方法では前頭洞部位における開頭手術の実施が必要であり侵襲性が高いため、美容的観点からも飼い主の同意を得にくかったため、実際に臨床応用を実施することが困難であった。したがって採取法の問題点を解決するために内視鏡による経鼻腔嗅粘膜採取法の検討を実施した。安楽死犬(本研究とは関係なく安楽死処置がとられた犬)の鼻腔より内視鏡を挿入し、(1)内視鏡下で嗅粘膜を認識可能かどうか、(2)バイオプシーにより嗅粘膜を採取可能かどうか、(3)バイオプシーにて採取した粘膜中に、組織学的にOECsが存在しているかどうか、そして(4)採取した粘膜からOECsを培養し、精製可能かどうかを検討した。結果、9頭の犬で実施し、全ての犬において内視鏡下で嗅粘膜の存在を確認することが可能であった。またバイオプシーにて採取した粘膜中にOECsが存在することが免疫染色(p75,S100)によって判明し、さらに採取した組織を培養・精製することによって移植に必要なおよそ5×10^6個のOECsを獲得することが可能であった。以上の結果より、嗅粘膜の採取が従来のように侵襲性の高い開頭術ではなく、内視鏡を用いて鼻腔から採取できることが判明した。したがってこの方法を用いることで飼い主からの同意を得やすくなることが予想され、今後、臨床応用を実施できる症例が増加すると考えられる。
肝細胞-伊東細胞混合培養系を基盤とする有極性化学プラント型人工肝臓の開発

現在移植以外に方法のない非代償性肝硬変症に対する再生医療への期待はますます大きくなっている。現在のところ人工肝臓の開発はブタ肝細胞を利用したプロトタイプが開発されてきているがいずれも大型で肝細胞の生存時間にも問題があった。我々は小型でかつ肝細胞の生存時間の長い在宅型の人工肝臓を開発するため、コンピューターの半導体の基盤製作に利用されている、マイクロファブリケーション法(微細加工技術)を応用した。このテクノロジーはあらゆる電化製品の小型化・軽量化に大変寄与した画期的な方法である。この方法により肝細胞と非実質細胞を混合培養することがより効率的に行うことが可能となった。さらに通電法により細胞をシート状にしてこれを3次元的に積み重ねる方法を取り入れることによりより効率的に立体的構築を築くことが可能となった。本研究ではこれらの成果をもとにして組織幹細胞を肝細胞に誘導分化しより現実的なヒトの体内に埋め込むことが可能な人工肝臓の原型となる実験装置を開発した。具体的には組織幹細胞を実際に扱い実績のある共同研究者の協力を得て肝臓よりいわゆるside population(SP)細胞を得る。さらにこれを用いて幹細胞の特徴である「多分化能」と「自己複製能」を分子生物学的に研究するとともに、肝臓という臓器の組織形成、再生過程を再現することにより、再生医療への応用の可能性を実現した。さらに、組織幹細胞(SP細胞)の自己複製機構をシグナル伝達、細胞周期の観点から解明しその知見を再生医療展開のための基盤研究に結びつけるためSP細胞を単離、増殖する方法を検討した。肝臓にはおよそ0.6%のSP細胞が存在し形態的には骨髄のSP細胞とほぼ同じであることが確認された。次にそれらに発現し必須な遺伝子群を同定し、それを利用して肝臓前駆細胞の増殖・分化をコントロールした。一方、接着基質上での培養肝細胞応答の検討も行い、アシアロ糖タンパク質をモデル化した人工基質PVLAのコーティングでは、培養肝細胞の接着形態が変化し、増殖能と分化能も相反的に変化した。また、増殖能と多分化能のある細胞として株化したマウス骨髄幹細胞をレトロウイルスベクターでGFP標識し、C3Hマウスに部分肝切除を施した後に、脾臓あるいは下大静脈に注入したところ、GFP陽性細胞の肝内への集積を確認できた。これにより、豊富に存在する自己骨髄細胞の応用で人工肝に必要な莫大な細胞ソースを確保できる可能性が開けた。肝灌流系の生体顕微鏡的観察より、肝小葉内の酸素分布に対応した障害分布を検討し、肝細胞機能に及ぼす胆汁分泌の重要性や伊東細胞の形態変化が類洞血流を調節することを解明した。研究分担者の赤池らは、培養肝細胞の増殖と分化機能について、接着基質上での細胞応答の検討を行い、アシアロ糖タンパク質をモデル化した人工基質PVLAのコーティングで、培養肝細胞の接着形態が変化し、増殖能と分化能も相反的に変化した。細胞の選択の一つとして株化した骨髄ステムセルを用いた検討を行った。

つまり、C3Hマウスに部分肝切除を施し肝再生を惹起した後に、このマウスの脾臓にGFPラベルしたマウス骨髄ステムセルを局注し、肝再生部位の病理組織所見とGFP免疫染色の肝内分布の相関を検討し、GFP陽性細胞の肝内へ集積を確認した。これにより、豊富に存在する自己骨髄細胞の応用で人工肝に必要な莫大な細胞ソースを確保できる可能性が開けた。一方、分化した細胞での検討も行い、株化繊維芽細胞(Rat J2)や株化伊東細胞を用い初代培養肝細胞と混合培養を行った結果、どちらの細胞を用いても肝細胞の比率を下げるほどに機能は保持され、培養40日までアルブミン産生は認められた。また、集積回路作製に用いられるマイクロファブリケーション技術を用いて肝細胞を100um径の島に限局させ、その間を線維芽細胞や伊東細胞で囲むようにすると肝細胞比率を上げることができ、この時アルブミン産生は49日まで保持された。肝細胞を限局させる島の直径は100umが最小で、機能維持も最もよく、直径を大きくするとアルブミン産生は減少し、特に島中央部に局在し、他の細胞種と接触できない肝細胞からのアルブミン産生能は著明に減少した。このように初代培養肝細胞と間葉系細胞との混合培養法を樹立し長期間の培養においても特異的肝機能を維持させることができた。今後、人工マトリックスや伊東細胞の生成するコラーゲンなどに着目し人工肝単位での培養条件を検討する予定である。肝灌流系の生体顕微鏡的観察より、肝小葉内の酸素分布に対応した障害分布を検討し、肝細胞機能に及ぼす胆汁分泌の重要性や伊東細胞の形態変化が類洞血流を調節することを解明した。赤池らは、培養肝細胞の増殖と分化機能について、接着基質上での細胞応答の検討を行い、アシアロ糖タンパク質をモデル化した人工基質PVLAのコーティングで、培養肝細胞の接着形態が変化し、増殖能と分化能も相反的に変化した。そこで、増殖能と多分化能のある細胞として株化した骨髄幹細胞を用いた検討を行った。つまり、C3Hマウスに部分肝切除を施し肝再生を惹起した後に、このマウスの脾臓あるいは下大静脈にレトロウイルスベクターを用いGFP標識したマウス骨髄間葉系幹細胞(KUM2)を局注し、肝再生部位の病理組織所見とGFP免疫染色の肝内分布の相関を検討し、GFP陽性細胞の肝内への集積を確認した。しかし、この肝小葉内の分布形式は一定ではなく、GFP陽性細胞数も非常にわずかであるため、組織ブロック全体でのPCR法では検出されなかった。一方、他の肝再生モデルとしてacetoaminofluoride(AAF)錠の皮下埋め込み持続浸透モデルで、肝再生を化学的に抑制した状態で、KUM2を脾臓内注入したが、肝内にGFP陽性細胞の存在は認められなかった。伊東細胞は肝臓における最大の脂肪貯蔵細胞であり、人工肝臓の脂肪沈着による機能不全を防止するために混合するべきであると考えられる。そこで、株化線維芽細胞(RatJ2)や株化伊東細胞を用い初代培養肝細胞と混合培養を行った結果、どちらの細胞を用いても肝細胞の比率を下げるほどに機能は保持され、培養40日までアルブミン産生は認められた。
ＴＬＲ／ＴＡＣＩ－ＭｙＤ８８経路による唾液腺のＩｇＡ産生形質細胞の出現制御機構

本研究の目的は、細胞内シグナル伝達分子であるMyD88が唾液腺に存在するIgA産生形質細胞の出現に及ぼす影響を基盤的研究として解析することにより、口腔免疫機構の一端を解明することである。計画の遂行により明確になったのは、MyD88欠損は唾液腺でのIgA産生にはほとんど影響しないということである。一方、予想外に明確となったのは、雌マウスでみられるシェーグレン症候群様の病態形成がMyD88欠損により顕著に抑制されることである。研究期間中に当初の計画目標に到達はできなかったが、基盤研究としては一定の成果を挙げることができた。本基盤を活かしながら、今後も継続して研究を進展させていく予定である。細菌やウイルスなどの病原体の多くは粘膜を介して感染する。従って、外分泌液中の分泌型IgAは粘膜感染防御機構で重要な役割を果たす。新型インフルエンザなどの新出病原体が跋扈し、高齢社会化が深刻さを増す現代では、有効ワクチンの開発とともに、気道の入口である口腔で「抗原特異的IgA」をいかに効率良く誘導できるかという概念が非常に重要な意味を帯びてくる。腸管の粘膜免疫における分泌型IgA産生とは異なり、口腔の分泌型IgA産生は唾液腺に依存する。実際、口腔粘膜ではIgA産生形質細胞はほとんど見られないのに対し、唾液腺ではIgA産生形質細胞が腺房や導管の周囲に認める。しかしながら、これらのIgA産生形質細胞の特徴や由来、ホーミング機構などについてはほとんど理解されていない。本研究では、自然免疫機構で中心的な役割を果たす受容体であるToll様受容体、あるいはB細胞のクラススイッチにおいて重要な役割を果たす受容体であるTACI、そしてこれら受容体の下流のアダプター分子であるMyD88がT細胞に非依存的にIgA産生B細胞への分化誘導に関与することに着目し、唾液腺のIgA産生形質細胞の出現にどのような影響を及ぼすのかを解明することを目的とした。また、口腔微生物の存在と関連付けながら、唾液腺のIgA産生形質細胞の出現機構の解明を目指す。この際、免疫学的、組織学的、分子生物学的な解析を行なうことで総合的に研究計画を進行させ、口腔における未知のIgA産生機構を明確にしていくとともに、そのIgA型形質細胞の出現を人工的に制御する方法を追及していく。本研究では、Myd88遺伝子を欠損したマウスを利用することにより、唾液腺の免疫学的機能にMyD88がどのように関与しているのか検討してきた。昨年度までの成果として、MyD88は唾液腺におけるB細胞の浸潤の制御に関与していることが明らかになりつつあった。その後の詳細な解析により、野生型の雌マウスの唾液腺では、シェーグレン症候群様の病的変化が徐々に誘導されてくるが、MyD88欠損マウスではそのような変化が見られないことが分かってきた。特に、三次リンパ組織と呼ばれる異所性のリンパ組織形成の機序が雌マウスの唾液腺では緩やかに誘導されるが、この際に起こる高内皮細静脈特異的な細胞表面タンパク質であるGlyCAM-1の発現上昇や、GlyCAM-1の翻訳後修飾に関与する硫酸転移酵素(GlcNAc6ST-2)の発現上昇、ケモカインCXCL13やCCL19の発現上昇、あるいは動脈周囲に観察されるリンパ球浸潤がMyD88欠損雌マウスではほとんど観察されないことが分かった。しかしながら、野生型マウスで観察されるこれらのシェーグレン症候群に類似した病的なリンパ組織形成機序は解剖学的には明確でなく、個体差もかなり大きいことから、本年度途中からシェーグレン症候群のモデルマウスであるNODマウスを使用し、これらのマウスとMyD88欠損マウスとのコンジェニックマウス系統の作製に取り掛かった。現在、どのようにMyD88が唾液腺における異所性リンパ組織形成に関与するのかその分子機序が徐々に分かりつつあり、現在製作中のマウスが、今後の研究展開に非常に重要な役割を果たすものと期待しているところである。本研究課題の研究計画は本年度が最終年度であったが、特定の研究成果が得られたというよりは、むしろ今後の研究展開につながる重要な基盤が整ってきた形になった。当然ながら、これまでの3年間の計画で得られた研究基盤を最大限に生かしながら今後も研究を継続していく予定である。MyD88は自然免疫系を調節する細胞内シグナル伝達を発動する上で重要な細胞質タンパク質である。実際、Toll様受容体やTACIの下流でMyD88はアダプター分子として機能しており、様々な免疫応答の開始と制御に関与している。そのような背景から、当然MyD88は口腔領域の免疫応答にも関与すると考えられるが、その具体的な役割は明らかにされていない。

本研究では、Myd88遺伝子を欠損したマウスを利用することにより、唾液中抗体のベースレベルや、唾液腺における抗体産生と関連する免疫応答にMyD88がどのように関与しているのか検討している。MyD88を欠損したマウスでは野生型のコントロールマウスと比較して唾液中のIgAとIgG1のベースレベルが上昇しているのに対し、IgMとIgG3のレベルは減少している。顎下腺から抽出した全RNAのマイクロアレイ解析により、MyD88を欠損したマウスでは、Cd19、Ms4a1、Igh-VJ558やIgjなどのB細胞に関連する遺伝子群の強い発現の上昇が認められ、B細胞浸潤が起こっていることが示唆された。また顎下腺から分離した細胞の解析により、MyD88を欠損したマウスの顎下腺ではB220陽性細胞が増加しており、またCD5+CD23-及びCD5-CD23-であることから、B-1系統(B-1a・B-1b)のB細胞であることが分かった。さらに、組織学的解析により、顎下腺の結合組織の被膜を有する集合導管の周囲にリンパ球浸潤が見られることが分かった。また、マイクロアレイ解析ではGlycam、Cxcl13やCcl9の発現が強く上昇していることから、これらの発現がB細胞の浸潤を誘導する原因となっている可能性が示唆された。以上、本年度までの研究成果により、唾液中の抗体産生の調節や唾液腺におけるB細胞の浸潤の制御にMyD88が関与していることが分かってきた。平成23年度中には、唾液腺からのIgA産生に関連して多角的な解析を行ってきた。その成果として、MyD88を欠損したマウスの唾液腺においてB細胞に関連した異常が発生しており、DNAマイクロアレイ解析の結果から、その原因に関してもほぼ特定できてきた。今年度からはそのエビデンスを強化させる予定であり、このような計画は当初の計画にほぼ準じている。以上の理由により、達成度としては順調に進展していると判断する。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度中は、昨年度までに得られた研究エビデンスを強化させる予定であり、開始当初はほぼ順調に研究計画が進行していたが、年度途中から予想外の解析機器の故障やマウス個体数の確保の難航などが重なってしまい、徐々に研究計画に遅れが出始めたため。平成23年度の研究計画はおおむね順調に遂行されているため、平成24年度以降の研究の推進方策としては、現状維持とする。平成24年度中の研究進展度に応じて、順次学会発表や論文作成が行えるように準備を進める。平成24年度中には、研究成果をwebページで公表できる状況まで進展させる予定である。また、研究発表欄に記述したように、MyD88の分子作用機構に関する知見が得られてきているため、研究の進展度に応じてこちらへの対策も講じる必要があるかもしれない。平成24年度には、研究計画に予想外の遅れが生じ始めているため、最終年度に当たる平成25年度の研究の推進方策としては、難航している研究内容を根本から見直し、分担研究者の入れ換えを含めて、研究計画遂行のための検討が必要であると考えている。キメラマウスの作成等も難航しているため、最終年度では、進展の無い研究内容の大幅な見直し、代替法の検討や、内容の入れ換えなどを行いながら、研究計画の遂行を目指す予定とする。幸い、これまでの研究データをもとに論文作成を行うことができたが、さらなる研究進展のために多角的な工夫を行っていく必要がある。