hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
窩洞形成後に歯髄細胞に生じるアポトーシスの歯髄創傷治癒における役割 -特にレジン系材料による覆髄・修復後に生じる歯髄反応への関与の検討-

今日までに私達は,歯髄創傷治癒における歯髄細胞の分化・機能発現にc-jun・jun-Bが重要な役割を果たしていることを示唆してきた(1999, J.Dent.Res., 78, 673-680).一方,歯髄創傷治癒における細胞死制御機構に,アポトーシス誘導が関与していることを明らかにした(2001, J.Dent.Res., 80, 1530-1534).さらに,歯髄アポトーシス誘導およびその後の歯髄における修復機構にJNK, c-Jun,およびHSP70が関与していることを明らかにした(2003, J.Dent.Res., 82, 91-95).これらの結果をもとに,窩洞のサイズや充填した各種覆髄材料が歯髄創傷治癒過程に与える影響をアポトーシスをマーカーとして検討したところ,1.窩洞サイズを変えることで創傷治癒過程に生じるアポトーシスの出現量が変化すること,また,2.覆髄材料の種類によって,アポトーシス細胞の量やその分布が異なることを明らかにした(2003, Operative Dentistry 28, 75-79; 2003, J.Endod., 29, 41-43).現在,歯髄アポトーシス誘導メカニズムを明らかにするため,培養歯髄細胞を用いてヒートストレスによるアポトーシス誘導を行い,そのメカニズムを解明するとともに,これらの結果を歯髄再生療法へ応用する試みをしている.今日までに私達は、歯髄創傷治癒における歯髄細胞の分化・機能発現にc-jun・jun-Bが重要な役割を果たしていることを示唆してきた(1997、J. Dent. Res.、76、822-830;1999、J. Dent. Res.、78、673-680)。一方、歯髄創傷治癒における細胞死制御機構を明らかにするため、ラット第1臼歯に窩洞形成を行い、TUNEL法、免疫組織学的手法および透過電顕を用いてアポトーシスの関与を検討したところ、1.窩洞形成により象牙芽細胞及び歯髄細胞に2段階でアポトーシスが誘導されること、また、2.窩洞形成後の歯髄創傷治癒において、障害を受けた細胞のアポトーシスによる処理機構が修復象牙質形成前に働くことも明らかになった(2001、J. Dent. Res.、80、1530-1534)。これらの結果をもとに、窩洞のサイズや充填した各種覆髄材料が歯髄創傷治癒過程に与える影響をアポトーシスをマーカーとして検討したところ、1.窩洞サイズを変えることにより、創傷治癒過程に生じるアポトーシスの出現量が変化すること、また、2.覆髄材料の種類によって、アポトーシス細胞の量やその分布が異なることを明らかにした(2001、J. Endod.、in press)。これらの成果は2001年秋季保存学会のシンポジウムにおいて報告している。現在、歯髄創傷治癒における細胞分化とアポトーシスの関連を明らかにするため、各種タンパク質の発現・活性化の状態を検討している。今日までに私達は,歯髄創傷治癒における歯髄細胞の分化・機能発現にc-jun・jun-Bが重要な役割を果たしていることを示唆してきた(1999, J.Dent.Res., 78, 673-680).一方,歯髄創傷治癒における細胞死制御機構に,アポトーシス誘導が関与していることを明らかにした(2001, J.Dent.Res., 80, 1530-1534).さらに,歯髄アポトーシス誘導およびその後の歯髄における修復機構にJNK, c-Jun,およびHSP70が関与していることを明らかにした(2003, J.Dent.Res., 82, 91-95).これらの結果をもとに,窩洞のサイズや充填した各種覆髄材料が歯髄創傷治癒過程に与える影響をアポトーシスをマーカーとして検討したところ,1.窩洞サイズを変えることで創傷治癒過程に生じるアポトーシスの出現量が変化すること,また,2.覆髄材料の種類によって,アポトーシス細胞の量やその分布が異なることを明らかにした(2003, Operative Dentistry 28, 75-79; 2003, J.Endod., 29, 41-43).現在,歯髄アポトーシス誘導メカニズムを明らかにするため,培養歯髄細胞を用いてヒートストレスによるアポトーシス誘導を行い,そのメカニズムを解明するとともに,これらの結果を歯髄再生療法へ応用する試みをしている.
Pb融液をTiの移送媒体に用いたTiCコーティング

PbはFeと反応せず、Pb融液中にFeはほとんど溶解しないので、Tiを添加したPb融液中でFeを加熱すると、TiだけをFeに拡散浸透させることができる。この操作を炭素鋼に施せば、内部からCの拡散が期待できるので、その表面にTiC被膜が形成する。本研究はこのような観点から、Tiを0.15mass%添加した11731373KのPb融液中における炭素鋼(S15C,S25C,S35C,S45C,S55CおよびSK5)のTiC形成反応を調べ、次のような知見と結論を得た。1.Pb-Ti融液中で炭素鋼を加熱すると、炭素鋼のC含有量のいかんにかかわらず、Ti添加量が0.5mass%以下のときはTiC層だけが形成し、1mass%以上のときはその上にTi┣D22PbC層が形成する。2.得られるTiC層の厚さはTi添加量が多いほど厚いが、1mass%以上の添加量では変わらない。3.Ti添加量が同じであれば、TiC層の厚さは炭素鋼のC含有量が多いほど、また加熱温度が高いほど厚く、加熱時間の平方根に比例して増大する。4.TiC層の濃度は化学量論的組成に近いが、素地近傍にFeやPbが若干濃化する。5.TiC層のビッカース硬さは30003500程度であり、Ti_2PbC層のそれは100程度である。6.TiC層の結晶粒は(220)面が素地に平行に配向したものが多く、そのためTi-炭素鋼拡散対に形成するTiCよりも成長速度が数倍速い。7.Pb-Ti融液浸漬法は複雑な装置を必要とせず、処理操作が簡単であり、得られる皮膜も優れているので、炭素鋼へのTiC被覆法として有望である。炭素鋼の場合、内部からC原子が供給されるので、表面からTiを拡散浸透すると、その表面にTiC皮膜が得られる。また、PbはFeと反応せず、Pb融液へのFeの溶解も少ないので、Pb-Ti融液中で加熱すると、Tiだけを炭素鋼に拡散浸透させることができる。本研究では、このような観点からPb-Ti融液による炭素鋼へのTiC被覆を試み、今年度はTiC皮膜の作製条件について検討した。すなわち、Tiを0.15mass%含有する10731373KのPb融液中でS15C,S25C,S35C,S45C,S55CおよびSK5試料を3.690ks加熱し、その表面に形成するTiC皮膜の厚さを調べた。得られた結果は次の通りである。1.Pb融液のTi含有量について...0.1mass%程度のTi含有量でもTiC皮膜が得られるが、TiC皮膜の厚さはTi含有量が多いほど厚い。しかし、Ti含有量が多すぎると、TiC皮膜の上にTi_2PbC層が形成するので、Pb融液のTi含有量は1mass%程度が良い。2.炭素鋼のC含有量について...0.2mass%程度のC含有量でもTiC皮膜は得られる。しかし、TiC皮膜の厚さはC含有量が多いほど厚い。3.加熱温度について...1100K程度の低温でもTiC皮膜は得られる。しかし、TiC皮膜の圧さは加熱温度が高いほど厚い。良好なTiC皮膜を短時間の加熱で得るためには、13001400Kの加熱温度が必要である。

4.加熱時間について...TiC皮膜の厚さは加熱時間の平方根に比例して増大する。Pb-Ti融液浸漬法によるTiC被膜の作製法については、すでに基礎的な検討を終えたので、本年度は被膜の成長機構、微小硬度、結晶学的配向性などを調べた。また、比較のために、炭素鋼-Ti拡散対におけるTiC形成反応についても調べた。得られた結果は次の通りである。1.TiC被膜の成長機構・・・TiC被膜内ではC原子の拡散速度がTi原子と比べて著しく速い。そのため、TiC被膜は表面で成長する。すなわち、C原子が炭素鋼からTiC被膜中を拡散して表面に達し、そこでPb-Ti融液中のTi原子と新たな結晶格子を形成する。成長の律則過程も、皮膜内のC原子の拡散である。2.TiC被膜の微小硬度・・・ビッカース硬さは、バルク材のTiCとほぼ同程度の30003500の値が得られた。Pb-Ti融液中のTi濃度による差は認められなかったが、炭素鋼試料のC濃度が低すぎると、また加熱温度が高すぎると、ビッカース硬さが低下する傾向が見られた。3.TiC被膜の結晶学的配向性・・・TiC被膜を構成する結晶粒は、(220)面が鋼素地に平行に配向したものが多い。このような結果が得られたのは、TiC内では(220)面に垂直な方向へのC原子の拡散速度が著しく速く、C原子の拡散速度が速い方向へTiC皮膜が成長したためである。4.炭素鋼-Ti拡散対によるTiCとの比較・・・Pb-Ti融液浸漬法で得られるTiC被膜は炭素鋼-Ti拡散対に形成するTiCよりも成長速度が著しく速く、微小硬度も著しく高い。このような結果が得られたのは、Pb-Ti融液浸漬法で得られるTiC被膜は結晶学的な配向性が強く、濃度が化学量論的組成に近いためである。
睡眠病トリパノソーマのステージ特異的GPIアンカー生合成機構に関する研究

睡眠病トリパノソーマの細胞表面の主要タンパク質がGPIアンカー型タンパク質である。プロサイクリック型原虫のGPIアンカーは、糖鎖にポリラクトサミンの側鎖が結合していること、さらにその側鎖に宿主由来のシアル酸が付加されていることに特徴がある。トリパノソーマはシアル酸を合成することができないが、トランスシアリダーゼによって宿主成分から転移される。従来トランスシアリダーゼとして1つのタンパク質が同定されていた。我々は、トランスシアリダーゼ活性を持つ第2のタンパク質TS270bを同定した。GPIアンカーは、真核生物で広く用いられるタンパク質の膜結合様式であり、特に原虫においては細胞表面の主要タンパク質の多くがGPIアンカー型である。私たちは、以前、睡眠病トリパノソーマの血流型原虫にとってGPIアンカー生合成経路が生存に必須であることから抗トリパノソーマ薬開発の標的になることを示した。またプロサイクリック型原虫では、ツェツェ蝿中腸内での生存に、GPIアンカー型酵素であるトランスシアリダーゼによる宿主からのシアル酸の獲得が必須であることを示した。プロサイクリック型特異的GPIの特徴の一つは、ポリラクトサミン側鎖に複数のシアル酸が付加されることである。シアル酸は、トランスシアリダーゼによって宿主成分から転移されるが、従来トランスシアリダーゼとして1つのタンパク質(TSB38p)が同定されている。このタンパク質が酵素活性を有していることは我々も確かめているが、原虫表面のすべてのシアル酸の付加がこのタンパク質だけでは証明できなかった。トリパノソーマゲノムにはさらに7個の似た遺伝子が存在するので、これらをクローニングし、発現させたタンパク質に酵素活性があるか調べた。その結果、4つのアイソフォームを発現させることができ、そのうちの一つであるTS270bにトランスシアリダーゼ活性を確認した。あとの3つには活性が検出できなかった。以上のことから、睡眠病トリパノソーマは、少なくとも2種のトランスシアリダーゼを持っていることがわかった。GPIアンカーは、真核生物に広く用いられるタンパク質の膜結合様式であるが、特に原虫において多く用いられる。睡眠病トリパノソーマにおいては細胞表面の主要タンパク質がGPIアンカー型タンパク質であり、ツェツェ蝿中腸内で増殖するプロサイクリック型原虫の主要表面タンパク質であるプロサイクリンもGPIアンカー型である。シアル酸の付加はツェツェ蝿中腸内での原虫の増殖に必須である。従来トランスシアリダーゼどして1つのタンパク質が同定されていた。我々は、前年度にトランスシアリダーゼ活性を持つ第2のタンパク質TS270bを同定した。今年度は、可溶型にしたTS270bを精製し、その反応特異性を検討した。その結果、TS270bは、第1のトランスシアリダーゼと同じく、alpha2,3シアリルラクトースをシアル酸供与体に用い、alpha2,3結合したシアリル化産物を生成することがわかった。また、トランスシアリダーゼ活性を発現しないプロサイクリック原虫変異株に可溶型TS270bを発現させると、原虫表面にシアル酸が付加されたので、実際に原虫表面のシアル酸化に寄与している酵素であることが確かめられた。
マラリア原虫のステージ特異的宿主細胞感染機構の解明

マラリア原虫の肝臓感染ステージであるスポロゾイトと肝内型原虫に着目して、新たな感染阻止法を開発することを目指している。肝臓感染に関わる遺伝子を同定するため、各感染ステージのESTデータベースを構築し肝臓感染ステージに特異的に発現する遺伝子を選択し、遺伝子欠損原虫を作出して機能解析を行った。この結果、蚊の吸血から肝細胞感染に至る過程で必須な多くの分子を同定することに成功した。特にスポロゾイトの細胞通過能とそれに関与する原虫分子が感染の成立に重要な役割を持つことを明らかにした。またスポロゾイトによる肝細胞の認識に関与する複数の分子を明らかにした。これらの成果により、これまでほとんど未解明であった「肝臓感染成立の分子機構」の一端を解明することに成功した。また、これらのうちいくつかの分子についてモノクローナル抗体の受動免疫により、感染阻止が可能であることを示した。新たに発見された原虫分子は感染阻止のための標的分子として有望であり、今後この成果をもとに感染防御法の開発を進めることができる。マラリア原虫はハマダラカによって媒介される。蚊の唾液腺スポロゾイトは吸血によって動物体内に入り、肝臓に感染する。この研究ではスポロゾイトの肝臓への感染に必須の分子を同定し、感染(寄生)の機構を明らかにするのを目的とした。このため、モデル実験動物としてネズミマラリア原虫P.bergheiを用い、スポロゾイトのEST(expressed sequence tags)を解析し、肝臓への接着通過寄生に関連すると考えられる遺伝子を一定の基準で選択しノックアウトした原虫を作製し、発現型の解析から、その遺伝子の機能の解析を行った。その結果、SPECT1、SPECT2、Pbs36及びPbs36pを原虫スポロゾイトの肝臓への感染に重要な分子であることを同定した。SPECT1及び2は原虫が肝臓の類洞壁クッパ-細胞を通過するのに必要な分子であり、Pbs36および36pは肝実質に達した原虫が肝細胞を認識し、通過から寄生への切り替えを誘導する分子であることを明らかにした。この研究により、原虫は肝臓類洞壁のクッパ-細胞を通過して肝実質に達すること、肝細胞を認識し寄生することを初めて明らかにした。CelTOSの遺伝子をノックアウトした原虫を作製した。このCelTOSノックアウト原虫(KO原虫)の表現形について様々な確度から検討した。KO原虫は、ハマダラカ中腸でのオオシスト形成が約300分の1になっていたが、唾液腺への侵入には影響を与えていなかった。KO原虫を感染した蚊の唾液腺からスポロゾイトを回収し、ネズミへの注射によって感染させたところ、感染効率が野生株原虫に比べて、約50分の1に落ちていた。このKO原虫スポロゾイトを用いin vitro系で培養肝細胞(HepG2)に感染させたところ、感染性に差はなかった。また、HeLa細胞への侵入・通過を調べたところ、500分の1以下になっていた。以上のことから、CelTOSはオオシスト形成と肝臓への感染に重大な機能を持つ分子であることが判ったが、その機構については、中腸細胞への侵入通過と肝細胞へ達する前の、類洞壁内皮細胞あるいはクッパー細胞への接着に関わるのではないかと考えている。
MiR-34aによるがん特異的エネルギー代謝調節機構の解明と臨床応用への試行

MIR34aを胃癌細胞株に導入すると顕著な増殖抑制効果が得られ、機序としてオートファジーの誘導が示唆された。MIR34aはSLC2A1、LDHAの発現制御を介し、ラクテート産生、グルコース取り込みを抑制することが示唆された。また臨床検体においてもLDHA、SLC2A1の発現亢進を認めMIR34aの脱制御によりこられの遺伝子の発現亢進が胃癌促進的に機能している可能性が示唆された。また副次的にDDX6がMYC発現を調節し胃癌促進的に機能することを見出した。更に、他のPTBP1標的遺伝子miRNAを同定した。これらの事象はWarburg効果を標的とした創薬開発に重要な所見である。第一に、胃がん細胞株にMIR34aを導入し効果を検討した。細胞株として、MKN45とKATOIIIを用いて検討を開始し、結果に基づきNUGC-3とHSC-39を加えて更に検証した。MKN45、NUGC-3、HSC-39においては導入効率が良好で非常に顕著な増殖抑制効果を認めた。HSC-39はWarburg効果に深く関与する、c-Mycの発現が増幅している細胞株であることが知られており、以降の実験ではMKN-45とHSC-39を用いて検討を進めた。MIR34aを導入するとLC3Bの発現がIからIIへ顕著に移行し、電子顕微鏡でもオートファジーの誘導が示唆された。更にその原因をがん特異的代謝機構に関連する遺伝子群から検証した。先ず、これまで我々が検証を進めてきた解糖系の律速酵素である、PKM isoformの発現(M2からM1へのシフトの存在)を解析した。MIR34aはデータベース上、PTBP1を直接標的にしないが、PTBP1の代表的転写因子であるc-Mycを調節することが知られているため検証に値すると判断した。c-Mycの発現は、MIR34aにより顕著に抑制されたが、PKM isoformのシフトは観察されなかった。このことはPKM isoformのシフトには、PTBP1を直接調節することが重要であるという事を示唆した。次に、Warburg効果に与える影響をPKM以外の遺伝子より解析した。解糖系の入口であるGLUT1及び、出口である乳酸産生に関わるLDHAに対して解析を進めた。MIR34aの導入により、GLUT1、LDHAの発現が抑制された。次年度は臨床検体での発現、及び、乳酸産生量、グルコース産生量などを中心に解析を進める。またc-Mycと関連の深い遺伝子にRNAヘリケースDDX6があるため検討を広げる。またPTBP1を直接標的とするmiRNAの検討も進める予定である。最も大きな理由は、KATOIII細胞株に対するmiRNAの導入効果が不良であったためである。これまで使用してきた細胞株であり、導入効率は比較的よいと判断していたが、今回検討した際には良好な結果を得られなかった。細胞形態が浮遊であり丸みを帯びているためやや導入しにくい細胞であることは確かである。これに関しては別の細胞株で検討することで対応した。前年度に引き続き、GLUT1、LDHAの発現を胃癌臨床検体を用いて解析した。更にTCGAなどのデータセットを用いてmRNAの発現を解析し数種のデータセットで胃がん組織における、両遺伝子の発現が亢進していることが明らかになった。またMIR34aはLDHAを直接標的とすることが、ルシフェラーゼレポーターアッセイ、及びMIR34aの阻害剤併用実験で示された。GLUT1の発現調節機構に関してはsiRNA-c-Myc及びMYC阻害剤を用いてGLUT1の蛋白発現が抑制された。そこで、c-Mycの転写因子としての機能を解析したがmRNAレベルでのGLUT1の発現は十分に抑制されなかった。GLUT1の発現調節として、MIR148aを検討したが有意な上昇は認められなかった。一方、機能的実験としてMIR34aを導入した際のラクテート産生量、グルコース産生量を測定し、MIR34aの導入により両産生量が有意に減少することが明らかとなった。オートファジー阻害剤である3-MAを併用し細胞死との関連を検証したが、MIR34aによるオートファジーの誘導が激しく十分な結果を得られなかった。今後、GLUT1の制御機構の解析を中心に研究を継続し、成果をまとめる予定である。また副次的に、RNAヘリケースDDX6がMIR34aの標的遺伝子で、Warburg効果に深く関与するc-Mycの発現を胃癌で促進的に調節していることが明らかとなったため、結果をまとめ報告した。更に臓器特異的に偏在している、MIR137、206がPTBP1を直接標的としPKM isoformを調節すること、MIR122が直接PKM2を調節することが判明したため結果を報告した。MIR34aは脳に豊富に分布しているmiRNAであるため、これらの事象は非常に重要な所見である。今後更に検証を重ね、miRNAのWarbugr効果における位置付けを解明する。

また臨床検体においてもLDHA、SLC2A1の発現亢進を認めMIR34aの脱制御によりこられの遺伝子の発現亢進が胃癌促進的に機能している可能性が示唆された。また副次的にDDX6がMYC発現を調節し胃癌促進的に機能することを見出した。更に、他のPTBP1標的遺伝子miRNAを同定した。これらの事象はWarburg効果を標的とした創薬開発に重要な所見である。本年度は実験時間を捻出することにもやや苦労した。次年度は積極的に時間を確保し集中的に実験し研究を前進させる計画である。また本研究を進める過程で副次的な結果も得られているため、これ等についても十分に検討し本研究課題での成果を上げることを目標とする。29年度が最終年度であるため、記入しない。消化器外科、核酸創薬、分子生物学29年度が最終年度であるため、記入しない。一般・消化器外科学教室のホームページは随時更新予定である。
人工リーフやサンドバイパス工法による複雑な漂砂移動機構の解明とその予測技術の開発

本研究室の有する振動流装置を用いて,底面に砂を敷き詰めた移動床条件に対する漂砂移動と底面粗度の計測を実施した.計測には底面設置型の電磁流速計を側面に設置することにより,底面付近の流速を計測し,さらに,振動流装置の両側に差圧計を設置することによって,底面粗度抵抗により増加する圧力勾配を計測した.得られた計測データを断面積分した一次元運動方程式に導入し,底面摩擦損失係数とそれに対応する底面の相当粗度を見積もった.これにより,特に底面に砂漣が形成されるような条件においては,砂漣の形状に依存する関数で底面粗度を向上させる必要があることが明らかとなった.また,流速が増大すると砂漣形状が滑らかになり,徐々にシートフロー条件における底面粗度条件へと移行する様子が,実験を通じて再現することができた.以上より,振動流装置に差圧計や流速計を導入することにより,任意の条件下における抵抗則が計測可能となることを示し,外力場と砂漣の状態,それによる底面粗度との関係を整理した.ここで得られた知見を,静岡県浜名湖の今切口に適用させた数値解析を実施した.今切口では,潮汐に伴う流速と水位の時間変化,さらに,底面付近の濁度を計測したデータを所有していたため,このデータをモデルの検証に用いた.その結果,今切口における潮汐応答やそれに伴う漂砂移動,水路内に生じる非対称な流れ場や,それに伴う浜名湖内の局所的な土砂の堆積は,実際に現地で観測した砂漣による影響を考慮することによって,初めて説明することが可能であることが明らかとなった.海岸保全工法として近年用いられる事例が増えている人工リーフやサンドバイパスは,環境や景観へのインパクトが比較的小さい反面,周辺で生じる海浜変形現象は複雑で予測が難しく,その最適な設計手法は確立されていない.本年度の研究では,特に人工リーフ周辺における海浜変形を支配する外力条件となる波と流れの3次元構造を解明することに焦点をあて,以下に示す研究成果を得た.まず平面水槽に潜堤を設置し,その両側の潜堤から離れた位置に汀線と直交する2枚の導波板を置いた.この条件で様々な波形勾配の規則波を直入射させ,潜堤周辺における水位変動や流速場を計測した.ここで流速の計測にはPTV(Particle Tracking Velocimetry)法を適用し,比重の異なる粒子を用いることによって異なる水深における平均流速成分の平面分布を抽出した.さらに電磁流速計を用いて固定点における流速成分の時系列データを記録し,PTV法の妥当性を確認した.以上の実験結果より,入射波の波高や周期の条件によって潜堤岸側における流況は大きく異なり,条件によっては潜堤開口部から沖側へ向かう離岸流が卓越することが分かった.次に潜堤上の急激な水深変化に伴う反射や砕波,それに伴う海浜循環流,さらに波・流れ干渉といった,潜堤周辺における複雑な水理現象を同時に算定することのできるモデルとして,ブシネスク方程式法に透過層モデルを組み込んだ新しい数値モデルを構築し,上述の実験条件に適用した.その結果,一般的に用いられる拡散型の砕波減衰モデルでは砕波減衰量は妥当に再現できても,潜堤岸側に生じる海浜循環流を過剰に平滑化する傾向があることがわかった.これに対し,波向を勘案した異方性を有する拡散係数を用いることにより,波浪変形と海浜循環流を妥当に再現できるようになることが分かった.本研究室の有する振動流装置を用いて,底面に砂を敷き詰めた移動床条件に対する漂砂移動と底面粗度の計測を実施した.計測には底面設置型の電磁流速計を側面に設置することにより,底面付近の流速を計測し,さらに,振動流装置の両側に差圧計を設置することによって,底面粗度抵抗により増加する圧力勾配を計測した.得られた計測データを断面積分した一次元運動方程式に導入し,底面摩擦損失係数とそれに対応する底面の相当粗度を見積もった.これにより,特に底面に砂漣が形成されるような条件においては,砂漣の形状に依存する関数で底面粗度を向上させる必要があることが明らかとなった.また,流速が増大すると砂漣形状が滑らかになり,徐々にシートフロー条件における底面粗度条件へと移行する様子が,実験を通じて再現することができた.以上より,振動流装置に差圧計や流速計を導入することにより,任意の条件下における抵抗則が計測可能となることを示し,外力場と砂漣の状態,それによる底面粗度との関係を整理した.ここで得られた知見を,静岡県浜名湖の今切口に適用させた数値解析を実施した.今切口では,潮汐に伴う流速と水位の時間変化,さらに,底面付近の濁度を計測したデータを所有していたため,このデータをモデルの検証に用いた.その結果,今切口における潮汐応答やそれに伴う漂砂移動,水路内に生じる非対称な流れ場や,それに伴う浜名湖内の局所的な土砂の堆積は,実際に現地で観測した砂漣による影響を考慮することによって,初めて説明することが可能であることが明らかとなった.
動脈硬化を伴った攣縮血管に対する遺伝子組み換えヘルペスウイルスを用いた治療の研究

目的:動脈硬化を伴った攣縮血管に血管平滑筋の増殖を抑制する遺伝子組み換えウイルスを投与して、その抑制効果を検討した。方法:Kurosawa and Kusanagi-hypercholesterolemicウサギの右総頚動脈周囲に血液を充満させ血管攣縮モデルを作成した。さらに血管平滑筋に特異的な遺伝子プロモーターで、このICP4遺伝子を発現するtransgeneをthymidine kinase locusを分断する形で導入し、増殖期の血管平滑筋のみで複製破壊をきたす単純ヘルペスウイルス(HSV) d12CALPを作成した。投与方法は血腫作成Day 0,1,2に血管内にウイルス(1×10^9 pfu/ml)を注入し15分間感染させた。それぞれの群を血腫作成7日目に灌流固定を行い、X-gal染色でウイルスの血管壁への感染の有無を組織学的に検討した。さらに血管内腔面積および内・中膜の厚さを測定し、反対側正常血管と比較した。結果:ウイルス投与をDay0および1に行った群では(それぞれn=5)、X-gal染色で染まる細胞は存在せず、ウイルスの感染は認めなかった。しかしDay2に投与した群では(n=5)、全例において陽性細胞を血管中外膜層に認めた。血管内腔面積はすべての群において血管内腔の縮小を認めず、ウイルスに感染したDay2群において有意な血管拡張傾向を示した(P<0.01)。考察:HSV d12CALPの感染は増殖した平滑筋細胞に起こることから、血腫作成2日後より内頚動脈平滑筋の増殖が活発となっていると考えられた。ウイルスが感染した群で血管内腔面積が他の群より拡大していたことより、平滑筋の増殖が血管攣縮に関与しており、その時期にウイルスを投与し血管増殖を抑制することが、血管攣縮の新しい治療法と成り得るのではないかと思われた。15月齢KHCウサギの右総頸動脈を露出し、シリコンチューブで動脈を巻き、26G針で穿刺し血管周囲に血液を充満させ、スパズムモデルを作成した。組み換えヘルペスウイルスウイルスの投与は、作成当日、1日後、2日後に行った。処置部分の中枢および末梢側をクリップでクランプし、24Gサーフローを挿入して、それより組み換えヘルペスウイルスを注入して15分間感染させ、その後クランプを開放することとした。スパズムモデル作成2日後および7日後に灌流固定を行い、X-gal染色してウイルスの細胞への感染の有無を確認、またNIHimage1.61を用いて血管内腔面積および中膜の厚さを測定した。ウイルスをスパズム作成当日および1日後に投与した群では、X-gal染色で染まる細胞は認めず、ウイルスの感染はなかった。2日後に投与した群では、X-gal染色で陽性の細胞を血管中膜層に認めた。このことから、血管平滑筋の増殖はスパズム作成2日後より起こっている可能性が高いと考えられる。血管内腔面積は、ウイルスを投与しないこれまでの実験データではスパズムモデル作成2日目に攣縮のピークが出現し7日目まで持続性を認めたのに対し、今回の実験では、当日、1日後、2日後にウイルスを投与したすべての群において出血7日目の血管内腔面積の拡大を認め、特にウイルスの感染を確認した2日後投与群において強い血管拡張を認めた。しかし、ウイルスがスパズムの改善(血管内腔の拡大)に関与しているのであれば、当日、1日後投与群でもウイルスの感染があると考えるべきであり、ウイルス以外の因子の関与も考慮に入れる必要があると考えられた。

今後ウイルスを用いない同様の処置を行うコントロール実験を行い比較すると共に、JWウサギのスパズムモデルにおけるウイルスの効果などを追加して検討する予定である。方法:15月齢のKurosawa and Kusanagi-hypercholesterolemic(KHC)ウサギの右総頸動脈を露出しシリコンチューブで巻いた後、26G針で動脈を穿刺し血管周囲に血液を充満させ血管攣縮モデルを作成した。血管増殖期において発現するカルポニンの遺伝子をプロモーターとしてICP4が発現し血管平滑筋を破壊する組み換えヘルペスウイルスを、血腫作成当日、1日後、2日後に投与した。投与方法は処置血管の中枢および末梢側をクランプし、24Gサーフローより組み換えヘルペスウイルス(1×10の9乗pfu)を注入し、15分間感染させた後クランプを開放した。それぞれの群を血腫作成2日目および7日目に灌流固定を行い摘出し、X-gal染色でウイルスの血管壁への感染の有無を組織学的に検討した。さらにNIHimageを用いて血管内腔面積および中膜の厚さを測定し、反対側血管と比較した。結果:ウイルスを血腫作成当日および1日後に投与した群(2日目と7日目に灌流固定、それぞれn=5)では、X-gal染色で染まる細胞は存在せず、ウイルスの感染は認めなかった。しかし2日後に投与した群(n=5)では、全例において7日目灌流固定標本のX-gal染色で陽性細胞を血管中膜層に認めた。血管内腔面積は、当日174%、1日後128%、2日後225%のすべての群において7日目において血管攣縮を認めなかったが、ウイルスに感染した2日後投与群において著明な血管拡張傾向を示した。考察:ウイルス感染は平滑筋細胞の増殖期に起こることから、血腫作成2日後より内頚動脈平滑筋の増殖が活発となっていると思われた。ウイルスが感染した群で血管内腔面積が他の群より拡大していたことより、平滑筋の増殖が血管攣縮に関与しており、その時期にウイルスを投与し血管増殖を抑えることによって血管攣縮も強く抑制されると考えられた。
絶対的な大きさ知覚の情報処理過程とその神経基盤についての検討

本研究は絶対的な大きさの知覚が"手の届く範囲"においてどのように行われるのかについて検討を行うものである。平成29年度に手の届く範囲における絶対的大きさの近くの正確性について検討したところ、意識的な言語報告課題では手の届く範囲内では大きさの恒常性が働き実際よりも刺激が小さく知覚された。一方、無意識的な運動報告では距離によらず正確な大きさ知覚が実現されていた。平成30年度は、まず平成29年度の実験1の問題点を改善して実験2を行った。すなわち、テーブルに投射する方法をあらためて前額平行面にディスプレイを設置し、その距離を操作して刺激を提示した。さらに報告方法として運動による報告に統一し、意識的な条件では回答する手元を見て刺激と比較するように、無意識的な条件では手元を見ないで答えるように教示した。また、明らかに手が届かない距離にディスプレイを設置する条件も加えた。その結果、無意識的な報告では実験1と同様に距離によらず正確な大きさ知覚が実現されていたが、意識的な報告では手の届く、届かないに関わらず大きさの恒常性の働きが認められた。さらに、手の届く範囲における知覚・認知機能の向上を検討する一環として、道具の習熟化と近傍空間に関する検討を行った。木製の手に握れる道具を利用し、先行研究に基づいたホッケーゲームを行わせた。その前後で手の近傍もしくは胴部の近傍で刺激の検出課題を行ったところ、手の近傍空間の成績向上が習熟後は道具近傍に移動することを確認した。これらの研究結果は第37回日本基礎心理学会大会、第82回日本心理学会ならびにPsychonomic Society Annual Meeting2017にて発表され、多くの研究者と意見交換をすることができた。平成29年度の問題点を改善した実験を行うことができた。また道具を用いた身体近傍空間に関する実験をあらたに始めることができた。ただし、予測とは異なる結果が得られていることもあり、運動による干渉を検討する実験ならびに空間周波数を操作する実験については準備の段階に留まっている。しかし実施した実験の結果については国際学会でも発表することができ、概ね順調に進展していると思われる。身体近傍空間での正確性についての追求と平行して、無意識的な知覚の正確性に対して運動による干渉、刺激の空間情報の操作、さらに神経基盤の検討を進めていく予定である。本研究は、絶対的な大きさの知覚が"手の届く範囲"においてどのように行われるのかについて検討を行うものである。行動実験に加えて、fMRIを用いて神経基盤についても検証する予定である。平成29年度は手の届く範囲における絶対的大きさの知覚が正確であるのかどうかについて検討を行った。参加者が大きなテーブルの前に座った状態で、プロジェクタからテーブルに投射される刺激の大きさを、言語もしくは運動(親指と人差し指を刺激の大きさに合わせて開く)で報告する課題を行わせた。参加者の手の届く範囲を測定し、刺激は手の届く範囲内に2箇所、手の届かない範囲外に2箇所提示した。実験の結果、手の届く範囲内では大きさの恒常性が働き実際よりも小さく知覚された。ただしその傾向は意識的な言語報告のみで認められ、無意識的な運動報告では距離によらず正確な大きさ知覚が実現されていた。ただし、手の届かない範囲を手がとどくギリギリの距離から最大で30cm遠くに設定したが、体を伸ばせばとどく距離であった。そこで第2実験としてより遠くに刺激を提示することを検討している。またテーブルへの投射ではなく前額平行面での提示方法でもう一度確認実験を行う予定である。なお、この研究結果は第36回基礎心理学会大会ならびにOPAM(Object Perception and visual Attention and visual Memory)2017にて発表され、多くの研究者と意見交換をすることができた。当初の計画では、絶対的大きさ近くの神経基盤を探る研究のきっかけとして、運動による干渉が生じるかどうかを検討する実験2まで行う予定であったが、実験1にて想定とは異なる結果になったため、実験1の確認実験を行う必要が生じた。そのため当初計画の実験2まで行うことができなかった。ただし、研究結果は解釈可能なものであり、国内と国際学会で発表することができたため概ね順調であると判断する。

さらに、手の届く範囲における知覚・認知機能の向上を検討する一環として、道具の習熟化と近傍空間に関する検討を行った。木製の手に握れる道具を利用し、先行研究に基づいたホッケーゲームを行わせた。その前後で手の近傍もしくは胴部の近傍で刺激の検出課題を行ったところ、手の近傍空間の成績向上が習熟後は道具近傍に移動することを確認した。これらの研究結果は第37回日本基礎心理学会大会、第82回日本心理学会ならびにPsychonomic Society Annual Meeting2017にて発表され、多くの研究者と意見交換をすることができた。平成29年度の問題点を改善した実験を行うことができた。また道具を用いた身体近傍空間に関する実験をあらたに始めることができた。ただし、予測とは異なる結果が得られていることもあり、運動による干渉を検討する実験ならびに空間周波数を操作する実験については準備の段階に留まっている。しかし実施した実験の結果については国際学会でも発表することができ、概ね順調に進展していると思われる。今後は実験1の確認実験を行い(刺激提示距離と提示方法を変更)、身体近傍空間で大きさ知覚がどのように変化するかを検討する。また、運動が干渉するかどうかを検討する実験2と、空間周波数情報等の基本処理要素の関わりを検討する実験3を行う予定である。身体近傍空間での正確性についての追求と平行して、無意識的な知覚の正確性に対して運動による干渉、刺激の空間情報の操作、さらに神経基盤の検討を進めていく予定である。研究協力の人件費と英文校閲等のその他の項目に関わる支出が想定よりも少なかったため、次年度使用額が生じた。来年度は継続的な研究協力を依頼し計画的に使用する。本年度は新しい実験機材を購入せずに実験を遂行することができたため次年度使用額が生じた。次年度は新しい装置を購入する予定である。
整形外科領域の抗菌性生体材料の開発と感染性疾患の治療

本研究では過去の報告がない新たな再現性のある、定量的マウス骨髄炎モデルと軟部組織感染症モデルを作成した。また、整形外科領域における感染性疾患に対する新規抗菌インプラントと抗生物質を用いたドラッグデリバリーシステムを開発した。これらの技術は臨床現場で問題となっている感染症や手術部位感染症に対して極めて有効である。これらの技術を基に現在複数の企業と提携して、臨床応用へ向けた準備を進めている。初年度に引き続き、抗菌性生体材料の開発を実施した。研究計画で言及したように、銀イオンを用いて既存の生体材料(チタン合金と合成樹脂であるPEEK)への付加・修飾方法の確立が実現できた。抗菌性生体材料を抗菌加工をしていない生体材料(コントロール群)とin vitroとin vivoの環境下において、光イメージングでの細菌生存率や生体内局在、病理組織による検討、電子顕微鏡による検討を行った結果、抗菌性生体材料において有意な殺菌・抗菌効果をみとめた。さらには当初平成25年度に実施を予定していた抗生物質の分子標的治療の確立にも着手した。各種がん治療における分子標的治療法は、がん細胞と正常細胞の違いを遺伝子レベル・分子レベルでとらえ、がんの増殖を特異的に抑えて治療する。臨床上問題となる難治性感染症の1つにMRSA感染があるが、本病態も同様に高濃度の抗生物質の長期投与により多くの副作用を生じ、使用継続困難になる症例や多臓器不全に陥る症例も少なくない。今回は、平成19ー20年度の同研究費助成(課題番号:19500328)により達成された蛍光プローブを用いた炎症部位のイメージング法の結果を基としてプローブに抗生物質を付加し抗生物質を用いた新たな分子標的治療法の開発を行った。具体的には主にMRSAをターゲットとして、バンコマイシン(VCM)をプローブに付加した。プローブは炎症部位に特異的に集積し、予備実験では感染巣の細菌増殖の抑制効果が観察された。本研究では整形外科領域の骨髄炎などの感染症における細菌動態や病態解明ならびに治療効果、さらに新たな抗菌性生体材料の開発を目的とした。具体的に実施した研究は、1安定した細胞株の作製、2マウス骨髄炎モデルの確立、3抗菌性生体材料の作製、4抗菌性生体材料の機能評価、5抗生物質の分子標的治療の確立であり、そのすべてにおいて仮説と予備実験に基づいた結果を得ることができた。1にて安定してルシフェラーゼ発光を持つ細菌細胞株をクローニングした後に、安定した再現性を持つマウス骨髄炎モデルとマウス浅殿筋モデルの作製に成功した。マウス浅殿筋モデルを使用し5の抗生物質の分子標的治療実験を実施し、マウスでは良好な治療効果が得られた。少量のバンコマイシンのリポソーム内への内包化により、MRSA感染巣の集積をイメージング法にて確認し、細菌の消失すなわち感染の治癒が得られた。一方でマウス肺炎モデルなどのほかの感染モデルでは一定の効果のみ見られ、投与法に課題を残した。一方、3と4においては、3年間に渡る研究結果より抗菌加工過程において硝酸銀濃度の違いによりインプラント表面に異なる濃度の銀イオンをコーティングできることが可能となり、平成25年度の最終年は臨床応用へ向けた実験を行った。具体的には脊椎固定術で使用されている実際の合成樹脂ケージに抗菌加工を施し、その強度と毒性を調べ、その安全性が確認できた。現在、医療材料を扱う2社において臨床応用へ向けた既存医療材料(人工骨と合成樹脂)に対する抗菌加工の研究の前段階まで進行している。以上のように本研究3年間の研究成果は今後の臨床応用へ向けた大きな意味合いを持つ基礎的データとなった。引き続き、日本発の新規抗菌インプラント、新規感染予防・治療を臨床現場で実現したい。1.Bacterial luciferaseを発現する細菌株の作製:分子画像診断機器には米国Xenogen社のIVISシステムを使用。はじめに安定した増殖能とlucifererase発光を持つ黄色ぶどう球菌の作製とクローニングを行った。予備実験では、プレート上(in vitro)と生体内(in vivo)の細菌は安定してbioluminescenceを発現している。これらの長期にわたる生存や発光維持の評価ならびに定量分析を遂行した。2.マウス骨髄炎モデルの確立と評価:マウス大腿骨髄腔内に一定量の細菌を注入し、慢性骨髄炎モデルを作製。予備実験データで経時的に安定した細菌発光を確認している。さらにELISA法を用いて血中炎症性サイトカイン値とCRP値を測定し、同時に組織学的評価を行った。以上より研究期間中により安定した再現性のある動物モデルを完成させた。3.抗菌性生体材料の作製:生体材料の作製においては、現在広く使用されているチタン合金やPEEKなどのプラスティックなどの生体材料を中心に銀イオンにて最適なコーティング方法を開発。過去に多くの銀を使用した抗菌加工法があるが、いずれも酸化銀による活性酸素により抗菌性を有するため、生体内で抗菌効果は期待できない。本研究の銀イオンによる抗菌効果は抗菌作用機序が異なり、有用である。すでに試作品を開発し、in vitroで効果を発揮していた。

2011年4月の段階では、代表者と分担者の2名で抗菌性生体材料の開発と感染性疾患の治療の研究・実験を行う予定であったが、優れた研究成果が得られ、企業との共同研究と情報交換を開始し、臨床応用を目指している。特に企業との国内外での共同研究の遂行が必要不可欠となり、新たに研究分担者を追加し承認を得た。臨床現場における日本発の新たな治療法の確立も実現可能かと考える。特に企業との国内外での共同研究の遂行が必要不可欠となり、新たに研究分担者を追加申請中である。将来的には本抗菌技術を日本あるいは欧米で臨床応用すべく、企業へのライセンス活動に移行する。日本発の新たな治療法の確立も視野に入れている。生体内に埋没する抗菌性生体材料と抗生物質の分子標的治療の確立(本年度予備実験すみ)はともに新規の発明であり、是非とも臨床応用を目指したい。1.抗菌性生体材料を用いて、前述の感染症動物モデルにおける生体材料の抗菌における機能的評価を行う。さらに経時的炎症性サイトカイン値とCRP値を測定し、同時に組織学的評価を行い比較検討する。2.抗菌性生体材料の臨床応用へ向けての試作品の作製3.抗生物質の分子標的治療の確立:平成19ー20年度の同研究費助成(課題番号:19500328)により達成された蛍光プローブを用いた炎症部位のイメージング法の結果を基としてプローブに抗生物質を付加し抗生物質を用いた新たな分子標的治療法の開発を行う。具体的には主にMRSAをターゲットとして、バンコマイシン(VCM)をプローブに付加する。実験用試薬の輸入に時間を要し繰り越し金が発生した。来年度はこれらの試薬に加え、動物の購入や抗菌性生体材料の試作品開発費に本研究費を使用する。また、研究の進度によっては、データ解析の委託費用、コンピュータ、ならびにソフトの購入を検討している。また、研究の進度によっては、データ解析の委託費用、コンピュータソフトの購入を検討している。
地震波観測と第一原理物性モデリングによる地球深部マントルの異方性と不均質性の研究

地球深部のマントルの地震波速度不均質や異方性の原因は、未だ多くの謎が残されている。本研究課題は、地球のダイナミクスの解明に向けて地震波観測のみならず第一原理計算に基づいた数値シミュレーションを行い、双方を組み合わせた新しい解釈をすることを目的として研究を行った。特に、D"層内の速度変化及び異方性に注目して研究を遂行した。最下部マントルD"層にはV_<sv><V_<SH>型Transverse Isotropy (TI)の地震波速度異方性があることが広く知られているが、その原因は未解決である。ポストペロブスカイト相(PPv)は、単相でのモデリングは行われていたが、他成分を加えた多結晶体としての異方性はまだ調べられていない。また、S波スプリッティングによる異方性の深さ方向の分布やD"層直上の領域について調査している例はない。そこで本研究では、東南極に新たに設置された観測点のデータを使い、南極海の下の最下部マントル全域についてS波スプリッティング解析をするとともに多結晶体の弾性を計算するプログラムを開発し、異方性の数値モデリングを行った。まず、本研究領域でも同様にV_<SV><V_<SH>型異方性が観測され、その強さは約2.0%であった。また、D"層直上の領域についても異方性の存在が確認された。これは、今まで考えられてきたPPvの結晶選択配向(LPO)だけが、異方性の原因ではないことを示唆している。そこでペロブスカイト(Pv)及びMgOに注目し、(Pv+MgO)及び(PPv+MgO)多結晶体の弾性異方性を解析し、LPOの方向及び度合いを様々変えてモデリングした。尚、第一原理計算によって得られた圧力120GPaの弾性定数を使用し、多結晶体の体積割合は、PPv(Pv):MgO=7:3とした。その結果、PPvの[001]方向が鉛直に向いたTI aggregate (TIA)が、最も少ないLPOの度合いで2%のV_<SV><V_<SH>型異方性を再現できることが分かった。D"層の異方性の主な原因はPPvのLPOである可能性が高い。次に少ないLPOのパターンは、MgOの[100」方向が鉛直に向いたTIAであった。MgOは割合が少ないにもかかわらず、十分に少ないLPOで異方性を再現できることが分かった。MgOはD"層より上にも存在するので、D"層直上の異方性の主原因である可能性が高い。Pvの[100]方向が鉛直に向いたTIAも、異方性の原因である可能性が高いことが分かった。これまでは、PvはV_<SV><V_<SH>型異方性を再現できないことが報告されていたが、本研究によってD"層直上の異方性を説明できる可能性が高まった。昨年度開発した多結晶体の弾性を計算するツールを用いて、上部及び下部マントルの地震波走時解析で得られた上部マントルの異方的なS波速度構造のモデリングを行った。しかし、観測波形における震源側の上部マントルの異方性についての補正及び、地震波走時解析のみで得られた速度構造の信頼性に問題があった。そこで、それぞれの震源の最近接の観測点についてSKS波を用いた解析を適用し、震源側の上部マントル異方性についての問題を解決した。この補正による最下部マントルの異方性への影響は0.3s1.0sであったが、全体として観測されていたV_<SV><V_<SH>型異方性の分布に顕著な差は見られなかった。次に、信頼性の問題をクリアするために、新たに地震波形そのものを用いた波形モデリング解析を行った。波形モデリングの利点は、波の立ち上がりだけを用いる走時解析と違って、振幅や形を用いるために情報量が多く、より詳細な構造を決定することができる。理論波形計算に時間がかかるが、波形計算コードのチューニング及び計算機環境を整備することで解析を可能にした。その結果、最下部マントルの異方性は深ざ2400kmから現れ、D"不連続面の上では最大0.5%のV_<SV><V_<SH>異方性があることが分かった。またD"層内では、最大2.5%の異方性があり、核-マントル境界にいくにつれて減少するモデルが得られた。CMB付近で異方的でなくなっていくのは、上部のようにせん断応力によってLPOが発達するという単純なモデルでは説明できない可能性を示唆している。
野鳥由来A型インフルエンザウイルスが豚細胞内で増殖可能となる要因の研究

野鳥由来A型インフルエンザウイルス(島根株)を豚肺胞上皮細胞で低温条件で連続継代すると、PB2遺伝子に1箇所、PB1遺伝子に2箇所に塩基置換が起こる。これらの内、PB1遺伝子の1箇所以外は、非同義置換であった。これらのアミノ酸置換を単独又は両方導入した変異型と野生型をリバースジェネティクス法により作出した。野生型は、低温側よりも高温側での増殖能が高かったが、非同義置換を導入した変異型には、顕著な温度感受性は認められなかった。さらに、PB2及びPB1遺伝子に導入される非同義置換が、それぞれ低温側でのウイルスポリメラーゼ活性の上昇と高温側でのポリメラーゼ活性の低下を起こすことを明らかにした。本研究は、鳥由来A型インフルエンザウイルスが豚に定着、維持される為に必要なウイルス側の要因を宿主体温の違いに着目し明らかにすることを目的としている。これまでの研究により、野鳥から分離されたA型インフルエンザウイルスA/teal/Tottori/150/2004(H5N3)(鳥取株)を豚の肺胞上皮細胞で低温条件で継代を繰り返し、低温で高い増殖能をもつウイルスを得ている。平成26年度の研究実績については、以下の通りである。鳥取株の野生型、低温条件で6代継代後ウイルス、14代継代後ウイルスの全ゲノムを次世代シーケンサーを用いて比較した。その結果、低温順化に伴って、PB2遺伝子に二箇所、PB1遺伝子、PA遺伝子、HA遺伝子及びNP遺伝子に各一箇所ずつ塩基置換の蓄積が認められた。PB2とPA遺伝子には、A型インフルエンザウイルスで保存されていると考えられている非翻訳領域に同義置換が認められた。PB2、PB1及びNPに起きた非同義置換は、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体(RNAポリメラーゼとNPとウイルスRNAの複合体)におけるPB2-PB1結合部位及びNP-ウイルスRNA結合部位であった。これらのアミノ酸置換はウイルスポリメラーゼ活性に影響を与えている可能性がある。HAタンパクに認められた非同義置換は、HA2領域にあり、ウイルスと宿主細胞との膜融合に関与する部位の近傍のため、膜融合活性に関与している可能性がある。鳥取株の野生型遺伝子(8本)及び低温順化株に認められたPB2、PB1、PA、HA、NP遺伝子に各塩基置換を導入したpHW2000プラスミドを作製し、リバースジェネティクス法による野生型ウイルス及び各塩基置換を導入したウイルスの作製を試みた。本研究は、鳥と豚の宿主体温の違いに着目し、鳥由来A型インフルエンザウイルス(AIV)が豚で長期間維持されるために必要なウイルス側の要因を明らかにすることを目的としている。これまでに、豚肺胞上皮細胞で低温条件で継代を繰り返すことにより、低温で高い増殖をもつA/teal/Tottori/150/2002(H5N3) (鳥取株)とA/whistling swan/Shimane/580/2002(H5N3) (島根株)の二つのAIVを得た。昨年度までに、鳥取株の低温順化に伴う塩基置換の解析と鳥取株の野生型遺伝子及び低温馴化に伴う塩基置換を導入したpHW2000を作製し、ウイルス作製を試みた。平成27年度においては、昨年度に引き続き、リバースジェネティクス法による鳥取株の野生型及び変異導入型ウイルス作製を試みた。しかしながら、Transfection及びTransfection後のウイルスレスキューの条件検討を行ったが、いずれの方法においても鳥取株を作製することができなかった。そのため、もう一方の低温順化株である島根株を用いて以下の実験を行った。島根株の野生型、低温条件で6代継代後ウイルス、14代継代後ウイルスの全ゲノムを次世代シーケンサーを用いて比較した結果、低温順化に伴って、PB2遺伝子に1箇所、PB1及びHA遺伝子に2箇所ずつ、NA遺伝子に4箇所の塩基置換が蓄積していくことが確認された。島根株の野生型遺伝子(8本)及び低温順化株に認められたPB2、PB1、NA、HA遺伝子に各塩基置換を導入したpHW2000プラスミドを作製した。野生型島根株及びリボヌクレオプロテイン複合体を形成するPB2、PB1に認められた塩基置換を導入したウイルスを作製し、MDCI細胞における温度感受性試験を実施した。その結果、PB2とPB1遺伝子に認められた塩基置換がウイルスの低温増殖能に関与している可能性を得た。研究実施計画では、野生型及び変異導入した鳥取株を作製し、低温順化に関連する遺伝子同定を目標としていた。しかしながら、野生型及び変異導入した鳥取株をレスキューすることができなかったために、当初の実験計画通りの進行が困難となった。そのため、年度途中よりもう一方の低温順化株である島根株をターゲットとする実験方針に切り替えた。島根株においては、低温順化に伴う塩基置換の解析と野生型及びポリメラーゼ遺伝子変異型ウイルスの作製が終了したため、今後は実施計画に基づいた温度感受性試験やポリメラーゼ活性測定を実施することが可能となった。鳥由来A型インフルエンザウイルス(AIV)の豚での増殖能の獲得は、パンデミックウイルス出現の重要なステップの一つであると考えられる。これまでに鳥と豚の体温の違いに着目し、AIVを豚肺胞上皮細胞で低温条件で連続継代することで、低温で高い増殖能を持つAIVを得た。本研究では、低温馴化に伴ってウイルス遺伝子に導入される塩基置換の機能を明らかにし、AIVが豚で長期間維持されるために必要なウイルス側の要因を明らかにすることを目的としている。