hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
粘土鉱物の摩擦特性に対する湿度・水溶液の効果

これまで湿度制御装置を二軸摩擦試験機に導入し,モンモリロナイトなどの粘土鉱物の摩擦特性への湿度の効果を検証し,粘土鉱物の摩擦係数は湿度の上昇とともに系統的に低下することを明らかにした。本年度は,白雲母やブルーサイトなど他の粘土鉱に対する湿度の効果を実験的に検証するとともに,摩擦係数に関する第一原理計算の結果と照合し,鉱物の摩擦特性を支配する要因を検討した。その結果,結晶接触面での原子間にはたらく静電的な力が,粘土鉱物の摩擦を支配することが明らかとなった。粘土鉱物は沈み込みプレート境界断層や内陸断層にも広く確認されることから,これらミクロな摩擦のモデルをマクロな地震発生プロセスに拡張し,地震発生を支配するメカニズムを今後提案していければと考えている。また,粘土鉱物の摩擦実験を行う際に地震波速度を測定し,粘土鉱物の配向などの構造変化によって地震波速度が変化することが明らかとなった。このことは,地震波干渉法などの物理観測によって断層の構造変化を捉えることができることを示唆しており,実験と観測を照らし合わせることで断層の状態(地震の準備過程)を把握することができると期待される。これらの現象は,今後より詳細な室内実験並びに理論・観測によって検証していきたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本申請課題の目的は,粘土鉱物の摩擦特性に対する湿度の効果を明らかにすることであり,本年度は二軸摩擦試験機に湿度制御装置を新規導入した。本装置では,2つの容器の温度を別途制御することにより,飽和水蒸気圧の違いから湿度をコントロールするものであり,そのような湿度を制御した環境で摩擦実験を行える装置は世界をみても大変ユニークなものである。これまでの予備実験の結果,湿度を5%から100%まで調整することが可能になり,各湿度での誤差は5%以内に収まることがわかった。これまでの予察的な摩擦実験では,モンモリロナイトの摩擦係数は湿度の上昇によって低下する傾向が示されたが,湿度100%であっても,水槽を用いた水飽和環境よりは摩擦係数が高い傾向が示された。そのことから,粘土鉱物の層間に取り込まれた水分子に加え,鉱物界面での吸着水の存在も摩擦係数を低下させる働きを持つことが示唆される。来年度は,本年度に立ち上げた湿度制御装置を用いて,粘土鉱物の摩擦係数に対する湿度の効果を定量的に評価する予定である。なお,Na型モンモリロナイトをはじめとしたいくつかの粘土鉱物では,層間距離が湿度上昇により不連続に増加することが知られており,層間距離と摩擦係数の関係についても評価したい。また,粘土鉱物界面での吸着水の影響をみるために,湿度制度環境下において垂直応力を変化させ,薄膜水の厚さと摩擦係数の相関関係も検討する予定である。初年度は湿度制御装置の導入を行い,予備実験により湿度を5%以内に制御した環境で実験を行えることを確認した。本年度は,二軸摩擦試験機に導入した湿度制御装置の改良を行い,湿度を制御した環境下での摩擦実験を幾つか行った。試験機の改良では,試料周りのコアホルダー内にスプリットフィルターを導入すること,またコアホルダー内の温度勾配を少なくするため上部にラバーヒーターを設置することにより,相対湿度をおおむね10%以内に制御して摩擦実験を行うことが可能となった。本システムを用いて,Na型とCa型のモンモリロナイトの予備実験を行ったところ,どちらも相対湿度の増加とともに摩擦係数が低下する傾向が見られた。また,層間陽イオンをCaに置換したモンモリロナイトの方が系統的に摩擦係数が低い傾向を示した。これらの結果は,粘土鉱物の摩擦係数が相対湿度や水溶液の組成に影響されることを示しており,粘土鉱物を含む天然の断層強度がこれらの化学環境によって変化することを意味している。今後は,摩擦挙動が湿度や層間陽イオンに依存する特徴から,粘土鉱物の摩擦を支配する要因について理論的な計算を含め検討する予定である。湿度制御した環境での摩擦実験に取り掛かり,粘土鉱物の摩擦に関する予備的な結果が出始めている。本年度は,昨年度までに開発した湿度制御装置を組み込んだ摩擦試験機によって,粘土鉱物の摩擦実験を行った。試料としては,イオン交換したCa型とNa型のモンモリナイトを準備し,異なる湿度条件で実験を行った。その結果,NaモンモリロナイトとCaモンモリロナイトともに、湿度が増加するのに伴って摩擦係数が減少する傾向を示した。湿度10 %ではNaモンモリロナイトが0.33、Caモンモリロナイトが0.25なのに対して、湿度90 %ではNaモンモリロナイトが0.062、Caモンモリロナイトが0.037であった。また、同じ湿度では常に、CaモンモリロナイトよりもNaモンモリロナイトのほうが高い摩擦係数を示した。CaモンモリロナイトがNaモンモリロナイトよりも高い摩擦強度を示す傾向は、Behnsen and Faulkner(2013)と同様である。彼らによれば、水和エネルギーが小さいほど層間の距離が近く結合力が強まるため、Ca2+よりも水和エネルギーの小さいNa+を層間にもつNaモンモリロナイトのほうが高い摩擦強度を示す。湿度の増加に伴って摩擦係数が下がる傾向は、水和状態を変化させた先行研究(Bird, 1984; Ikari et al., 2007)と調和的である。

水和に伴う摩擦係数の低下を説明する主なメカニズムとして、層間の膨潤に原因を求める説(Bird, 1984)と粒子間の膨潤に原因を求める説(Moore and Lockner, 2007)がある。今後は水和によって粘土鉱物の摩擦係数が下がるメカニズムについて検証する予定である。当初の予定通り湿度制御システムを開発し,湿度を制御した環境下での摩擦試験に成功し,いくつか成果も出始めている。これらの研究成果については論文を準備し,国際誌に投稿済みである。これまで湿度制御装置を二軸摩擦試験機に導入し,モンモリロナイトなどの粘土鉱物の摩擦特性への湿度の効果を検証し,粘土鉱物の摩擦係数は湿度の上昇とともに系統的に低下することを明らかにした。本年度は,白雲母やブルーサイトなど他の粘土鉱に対する湿度の効果を実験的に検証するとともに,摩擦係数に関する第一原理計算の結果と照合し,鉱物の摩擦特性を支配する要因を検討した。その結果,結晶接触面での原子間にはたらく静電的な力が,粘土鉱物の摩擦を支配することが明らかとなった。粘土鉱物は沈み込みプレート境界断層や内陸断層にも広く確認されることから,これらミクロな摩擦のモデルをマクロな地震発生プロセスに拡張し,地震発生を支配するメカニズムを今後提案していければと考えている。また,粘土鉱物の摩擦実験を行う際に地震波速度を測定し,粘土鉱物の配向などの構造変化によって地震波速度が変化することが明らかとなった。このことは,地震波干渉法などの物理観測によって断層の構造変化を捉えることができることを示唆しており,実験と観測を照らし合わせることで断層の状態(地震の準備過程)を把握することができると期待される。これらの現象は,今後より詳細な室内実験並びに理論・観測によって検証していきたい。次年度以降は,新規導入した湿度制御装置を用い,粘土鉱物の摩擦特性に対する湿度の効果を定量的に評価する予定である。これまでに立ち上げた湿度制御装置による摩擦実験を行い,粘土鉱物の摩擦を支配するメカニズムを検討する。また,理論計算により,よりミクロな摩擦プロセスの理解にも取り組む予定である。今後は,モンモリロナイトに加え,他の粘土鉱物の摩擦試験を湿度を制御した環境で行い,粘土鉱物の摩擦を支配する素過程を調べる予定である。なお,これまでの研究成果として、水和状態と層間陽イオンの影響が摩擦強度に大きな影響を与えることが分かった。今後はこれらの成果が地下深部での摩擦強度を考える上でどのような影響を及ぼすかについても検討したい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
中年期男性の脂肪肝・リポ蛋白粒子サイズ・潜在性動脈硬化進展度の追跡調査

本研究では、一般住民約300人を対象とした初回調査・その約7年後の追跡調査に付随し、両調査時の肝臓への脂肪沈着とNMR(核磁気共鳴)によるリポ蛋白プロファイルの変化との関連を検討した。結果、初回調査時及び追跡調査時の、LDL粒子サイズの小ささ・追跡調査時のLDL粒子数の多さが、追跡調査時の肝臓脂肪沈着の進展と関連していた。この研究により肝臓の脂肪沈着の進展と、リポ蛋白プロファイルの変化との経時的関連が明らかにされた。脂肪肝は異所性脂肪沈着のひとつであり、肥満と強く関連している。脂肪肝の形成には脂質代謝異常が関連し、メタボリックシンドロームも関連する。また、高度の肥満による非アルコール性脂肪肝(NAFLD)は、有病者の一部において非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)となり、肝硬変や肝癌を起こすことが知られている。また、LDL粒子サイズがより小さく粒子密度がより低いと動脈硬化に強く影響することが明らかになっているが、脂肪肝がこうしたLDL粒子サイズ・密度にどのような影響を与え、動脈硬化の進展と経時的にどのように関連するかは未だ明らかではない。我々は20022006年に40歳代男性を対象として潜在的動脈硬化進展度についての日米比較調査を行った。この調査では、CT検査を行ったため、そこに含まれる肝臓の画像よりCT値を調べ、客観的に脂肪肝を評価することが可能である。また、NMR(Nuclear Magnetic Resonance;核磁気共鳴)による脂質プロファイル分析を行っており、従来のLDLコレステロール濃度・HDLコレステロール濃度等の血清脂質分画に加え、平均LDL粒子サイズ、小粒子LDL数等を明らかにすることができる。2008年2009年に同じ集団に対し、他の研究費によって約7年後の追跡調査を行った。本研究の目的は、この追跡調査に付随する研究として、NMRによる脂質プロファイル分析及び、肝臓のCT画像よりCT値を調べ、脂肪肝を評価することで、中年期男性の脂肪肝およびリポ蛋白粒子サイズの長期変化およびこれらの潜在的動脈硬化との関連を明らかにすることである。平成21年度には本申請の基盤となる追跡調査が終了した。そこで、研究計画通り、肝臓CT値測定の準備および測定を開始した。結果解析用の特殊なソフトウエアを入手し、また、将来の国際比較を可能にするため、渡米し、計測方法の打ち合わせ・および情報収集を行った。現在、漸次、計測を開始している。脂肪肝は異所性脂肪沈着のひとつであり、肥満と関連している。脂肪肝の形成には脂質代謝異常やメタボリックシンドロームが関連する。また、高度の肥満による非アルコール性脂肪肝は、有病者の一部において非アルコール性脂肪性肝炎となり、肝硬変や肝癌を起こす。また、LDL粒子サイズがより小さく粒子密度がより低いと動脈硬化に強く影響するが、脂肪肝や動脈硬化がこうしたLDL粒子サイズ・密度とどのように関連するかは未だ明らかではない。我々は平成1418年度に40歳代男性を対象に潜在的動脈硬化進展度について日米比較調査を行った。また、NMR (Nuclear Magnetic Resonance;核磁気共鳴)による脂質プロファイル分析を行っており、従来のLDL・HDLコレステロール濃度等の血清脂質分画に加え、平均LDL粒子サイズ、小粒子LDL数等を明らかにできる。平成2021年度に同じ集団に対し、他の研究費によって約7年後の追跡調査を行った。当初の研究計画に基づき、平成21年度には上記追跡調査の実施に合わせて肝臓のCT画像を得た。平成22年度には血液検体を米国ラボに送付し、NMR脂質蛋白分析を実施するとともに肝臓CT画像の定量的解析を行った。また、画像解析の技術習得と標準化のため、米国の研究施設を訪問した。異所性脂肪沈着の一つである脂肪肝は、脂質代謝異常や、メタボリックシンドロームとも関連している。また動脈硬化と関連があるLDLコレステロールのリポ蛋白粒子サイズ(LDL粒子サイズ)がより小さく粒子密度がより低いと、動脈硬化に強く影響することが知られている。我々は、平成14平成18年に40歳代男性約300人を対象に潜在的動脈硬化進展度の日米比較調査行い、その際、脂肪肝の評価及びLDL粒子サイズの計測を行った。その後、同じ集団に対して平成20年平成21年に約7年後の追跡調査を行った。

本研究は、この追跡調査時に、被験者の脂肪肝の評価及びLDL粒子サイズの計測を行い、脂肪肝がLDL粒子サイズ・密度・動脈硬化の進展とどのように関連するかを明らかにすることを目的とした。今年度の平成23年は本研究の最終年度に当たる。1)昨年度までに収集したデータより、脂肪肝とLDL粒子サイズ・密度との関連を解析した。252名中、脂肪肝の発症率は7.5%であった。初回調査時のLDL粒子サイズが小さい群で、追跡調査時に脂肪肝が進行した者の割合が多かった(LDL粒子サイズを3分割(tertile)すると、粒子サイズ最小群で20.9%、最大群で11.1%)。初回調査時のLDL粒子密度が大きい群で、追跡調査時に脂肪肝が進行した者の割合が多かった(LDL粒子密度最大群で20.0%、最小群で9.1%)。また、追跡調査時のLDL粒子サイズが小さい群は、追跡調査時に脂肪肝が進行した者の割合が多かった(LDL粒子サイズ最小群で23.7%、最大群で10.1%)。追跡調査時のLDL粒子密度が大きい群は、追跡調査時に脂肪肝が進行した者の割合が多かった(LDL粒子密度最大群で27.1%、最小群で6.0%)。2)国内の学会に参加して情報収集を行い、成果公表の準備を行った。
ラット腹側被蓄野(VTA)の高頻度電気刺激によるキンドリング現象研究

腹側被蓋野(VTA)は、覚醒剤精神病や逆耐性現象の成立に重要な役割をもつ。我々は、ラットVTAの電気刺激に対する行動変化を分析し、異常行動がVTA刺激で一過性に出現し、また慢性覚醒剤投与後には、VTA刺激の異常行動誘発閾値が低下することを示した。今回我々は、VTAの反復電気刺激により、キンドリング現象が生ずるか否かを検討した。VTAキンドリングは過去に、Stevens et al.(1978)によって報告されているが、行動評価の定量化がなされていない。我々はメタンフェタミン(MAP)投与後の自発運動量の変化を、キンドリング前後で定量的に比較した。VTAキンドリング後には、10分後より自発運動量が増加し、キンドリング前よりも増加傾向を認め、MAP投与後240分間の合計自発運動量をキンドリング前後で比較すると、それぞれ6641±2030、8381±1307でありキンドリング後には有意に増加していた。以上より、中脳-辺縁系ドパミン系を反復電気賦活することで、MAP投与後の自発運動量の増強が2週間にわたり観察された。これはVTAキンドリングによって中脳-辺縁系機能が変化しドパミン系の過敏反応が出現した可能性がある。覚醒剤逆耐性現象メカニズムとして腹側被蓋野(VTA)から側坐核(NAC)へのドパミン(DA)神経伝達異常が考えられている.VTA-NAC神経回路のメカニズムを研究する目的で毎日VTAを電気刺激し覚醒剤(メタンフェタミン)に対する反応性を検討した。8週齢の雄性SD系ラットを使用し、ペントバルビタール麻酔下に両側VTAへ2極のステンレス製慢性深部電極を脳定位的に挿入手術した。術後1週間は回復期間とし、ハンドリングおよび観察ケージに十分馴らした。刺激前日の21時にラットを観察ケージに入れ、翌日に行動観察をおこなった。刺激条件は100Hz、2秒間の2相性矩形波を用い、10100μAまで10μA刻みで少なくとも3分以上の間隔をおいて両側刺激し、高頻度電気刺激に対する反応性を評価尺度に従い評価した。頚部の捻転やけいれん様の反応を示したものは除外した。十分な反応が得られたラットにMAP2mg/kgを腹腔内投与し、自発運動量の変化を赤外線感知器を用いて定量化した。キンドリングは100Hz,2sec,100μAの強度で1分間隔で1日20回刺激し、これを14日間反復した。最終刺激が終了して2週間後に再びMAP2mg/kgを腹腔内投与し、自発運動量を赤外線感知器にて計測して刺激前のものと比較した。VTAキンドリング前にはMAP投与によって約10分後より自発運動量が増加し、基礎値にもどるまでは数時間を要した。一方VTAキンドリング後には、同様に10分後より自発運動量が増加し、キンドリング前よりも増加傾向を認めた。また、MAP投与後240分間の自発運動量の合計をVTAキンドリング前後で比較すると、それぞれ6641±2030、8381±1307でありVTAキンドリング後には有意に自発運動量が増加していた。今回の結果から、中脳-辺縁系ドパミン系を特異的に反復電気賦活することで、MAP投与後の自発運動量の増強が2週間わたり観察された。この効果は、VTAキンドリングによって中脳-辺縁系機能の持続的変化が生じ、ドパミン系の過敏反応が出現した可能性がある。VTAへの覚醒剤反復微量注入によって逆耐性現象が生じたという過去の報告を考慮すると、精神病状態の発現機構に、VTAを中心とした神経回路の可塑的変化が重要であると考えられた。
低温における高分子からのX線の小角異常散乱の原因究明

当初の計画にしたがい、比較的分子構造の簡単な結晶性汎用高分子であるポリプロピレンについて、低温におけるX線小角散乱の測定を行なった。温度変化を観察するための基準としては室温における散乱強度を用いた。低温になるにしたがって散乱強度は次の2種類の変化を示した。(1)室温ではベクトルq=0.03A^<-1>付近(ブラッグスペースで約200A)に明瞭に観察されるショルダーが、低温になるにしたがって次第に消失していく。このため基準の散乱強度との差は低温になるにしたがい大きな負の値になる。これは結晶部分と非晶部分の熱膨張係数の違いにより、低温になると両者の間の電子密度差が小さくなるためであろうと推定される。(2)微小角q≦0.01A^<-1>において、基準散乱強度との差は温度の低下とともに急激な立上りを見せる。これが予備実験で既に明らにされていたX線の小角異常散乱である。この現象を定量的に把握するため、第一次近似としてギニエの法則を適用した。それによると、電子密度揺らぎの平方根2乗平均ρは温度の低下とともに急激に増加し、-50°Cでの値は-10°Cでの値の約10倍にもなることが判明した。一方、電子密度揺らぎの相関長λを同様の方法で見積もると、ρの変化とは逆に温度の低下とともに減少する傾向にあることが明らかになった。例えば-10°Cのときλ=32nm、-50°Cのときλ=190nm等々である。以上、本年度の研究により、低温におけるX線小角異常散乱に関する定量的なデータが得られ、平方根2乗平均電子密度揺らぎやその相関長を評価することができた。今後はこれらの変化が具体的に高分子のどの部分の構造変化に対応するのかを明らかにする必要がある。そのためにはモルフォロギーの単純な非晶性高分子も含めて測定を継続する必要があろう。以上の結果は適当な学術誌に投稿するため英意準備を進めている。
空間反転対称性を持たない新型結晶構造物質の超伝導状態

空間反転対称性が破れた結晶系では、超伝導クーパー対の対称性がパリティ混合状態になると考えられている。最近、本課題の申請者は、対称中心の無い新型の結晶構造を有する新しい超伝導体BaIrSi2(Tc 6 K)を合成発見した。本研究では、新物質BaIrSi2の詳細な物性解析を行い、その電子構造と超伝導状態を明らかにする。高圧合成による良質試料を用いて、結晶構造と超伝導特性を詳細に決定する。また、第一原理計算により、電子構造を明らかにする。さらに、NMR、mSR測定などを行い、超伝導ギャップ構造を明らかにする。
歯髄炎における痛覚系-交感神経系のクロストークと新たな疼痛制御理論

本研究は、末梢の痛覚系に交感神経が関与する事実を立証し、新たな疼痛制御理論を確立する試みである。まず、WGA-HRP順行性標識法を用いて歯髄における交感神経の動態について検索した。その結果、歯髄炎において、交感神経は象牙芽細胞層およびその直下に発芽することが示された。次に、発芽した交感神経が痛みを修飾するか否かについて調べるための疼痛マーカーについて検索した結果、P2X4遺伝子が急性痛のマーカーとして最も適していることが示された。実験動物は、910週齢の雄性Wistar系ラット54匹を用い、ジエチルエーテル吸入麻酔による非動化後、舌尖部左側にcapsaicin溶液を注射したcapsaicin群およびcapsaicinを含まない溶媒(vehicle)を注射したvehicie群を設定した。溶液注入後(5、15、30および60分)断頭し、躯幹(体幹)血液と視床下部室傍核(PVN)を採取した。コントロールとして無麻酔、無注射のNA-NI(no anesthesia-no injection : n=6)群を設定した。血漿ACTHおよびcorticosterone濃度はそれぞれECLIA法およびEIA法により測定し、摘出PVNのCRH hnRNAおよびmRNA発現量はreal time PCR法にて定量した。その結果、以下の点を明らかにした。(1)Capsaicin注入後30分において、capsaicin群の血漿ACTHはvehicie群に比べて有意に増加し、capsaicin注入後60分では、capsaicin群の血漿corticosteroneはvehicie群に比べて有意に増加した。(2)PVNのCRH hnRNA発現はcapsaicin注入後15分で3.2倍に増加した。-方、CRH mRNAはcapsaicin注入後60分で2.6倍に増加した。以上の結果より、舌へのcapsaicin注入は、CRH遺伝子をupregulateし、HPA axisを活性化することが示された。すなわち、三叉神経刺激は痛みストレスとして視床下部に情報伝達され、生体はストレス反応を起こすことが明らかとされた。また、hnRNA遺伝子発現解析はストレスの遺伝子転写活性の指標として有用であるとの結論が得られた。本課題は、歯髄炎における痛覚系-交感神経系のクロストークを証明し、新たな疼痛制御理論を確立することにある。平成20年度には、神経の順行性輸送を利用した神経回路標識法により直接的に交感神経を標識する方法を用い、実験的に作成した歯髄組織に確かに交感神経が発芽することを明らかとし公表した。しかしながら、発芽した交感神経が痛みをどのように修飾するかは明らかになっていない。その理由として、痛みを定量する確実な方法が存在しないことがあげられる。そこで平成21年度では、痛みの遺伝子マーカーとされているc-fos、神経ペプチドであるSubstance P(SP)およびCalcitonin gene-related peptide(CGRP)、神経栄養因子であるNerve growthFactor(NGF)とBrain-derived neurotrophic factor(BDNF)、さらにアロディニア関連分子であるLysophoshatidic acid(LPA)-1(LPA受容体)の遺伝子発現など、神経関連分子を指標として、舌に対するcapsaicin刺激が三叉神経節に及ぼす影響について多方面から検討した。その結果、1.三叉神経節c-fos遺伝子発現は、舌capsaicin刺激後30分から増加した。2.三叉神経節SP(tac1)遺伝子発現は、舌capsaicin刺激後60分以内で増加しなかったが、CGRP遺伝子発現は、刺激後30分で増加した。3.三叉神経節NGFおよびBDNF遺伝子発現は、共に舌capsaicin刺激後60分以内で増加しなかった。4.三叉神経節LPA-1遺伝子発現は、舌capsaicin刺激後30分で増加した。また、P2X_4遺伝子発現は、舌の針刺とvehicle注入圧による刺激の60分後にコントロールの2.75倍に増加し、capsaicin注入群では60分後にコントロールの5.49倍に増加した。この時、capsaicin群とvehicle群に有意差がみられた。その結果、Capsaicinの舌への注入により、三叉神経節において、1.c-fos遺伝子発現は、Control群の2.5倍(30分後)および2.16倍(60分後)に増加した。2.CGRP遺伝子発現は、Control群の1.57倍(60分後)に増加した。3.LPA_1遺伝子発現は、Control群の1.65倍(30分後)に増加した。4.P2X_4遺伝子発現は、Control群の5.49倍(60分後)に増加した。この増加量は他の分子と比較して有意に大きかった。

以上の結果より、Capsaicinの注入により、最も強く発現したP2X4遺伝子は、急性痛のマーカーとなる可能性が示唆され、今後の痛みに関する研究に応用が可能と考えられた。
マクロファージ遊走阻止因子の大動脈瘤形成に関わる役割

腹部大動脈瘤形成モデルの確立:野生型マウスに対して大動脈瘤作製処置を行い、大動脈径の拡大を観察した。瘤形成部位におけるMIF発現および血中MIF濃度を確認した。MIFの発現細胞をメッセージレベルおよび蛋白レベルで検討した。腹部大動脈瘤作製法: 3種類の方法を検討した(塩化カルシウム刺激法、アンジオテンシンII注入法、ApoEノックアウトマウス法)。塩化カルシウム刺激法が濃度依存性などの関係で本実験系に適していることがわかった。炎症機転、血栓、動脈硬化が形成機序である3種類の大動脈瘤モデル(野生型およびMIF以外の遺伝子改変マウス)において、炎症機転で形成される大動脈瘤部位にMIF発現が増加すること、さらに、同モデルにおいて血中MIF濃度が上昇することを確認中である。このモデルをMIF過剰発現(トランスジェニック)マウスに適用した際に瘤拡大進展速度が速くなり、一方、野生型マウスモデルに中和活性を有する抗MIF抗体を投与すると瘤形成進展が抑制されることを確認中である。MIF過剰発現マウスでは病変部におけるMMP9の発現、マクロファージの集積、およびVEGFなどの瘤形成・進展因子が野生型マウスに較べて増加していること、一方、抗MIF抗体を投与したマウスでは上記の因子の増加が抑制されていることを確認中である。VEGF中和抗体を投与したマウスにおいて大動脈瘤モデルを作製した際にはMIFは発現増加するが瘤形成・進展は抑制されることを確認中である。MIF過剰発現マウスに瘤作製操作を行なうとマクロファージ等の集積、中膜破綻、血管平滑筋のアポトーシス、弾性線維の破壊、vasa vasorum形成が促進されることを確認中である。(a.瘤形成部位の平滑筋や線維芽細胞なのか、マクロファージを中心とした浸潤細胞なのか、b.メッセージレベルの調節なのか否か)。腹部大動脈瘤作製法: 3種類の方法を検討した(塩化力ルシウム刺激法、アンジオテンシンII注入法、ApoEノックアウトマウス法)。大動脈瘤形成部位のMIFの発現をメッセージレベルとタンパクレベルで確認した。MIFの血中濃度の測定をELISA法により行った。野生型マウスに対して大動脈瘤作製を行なった際に瘤形成部位のMMP9およびVEGFの発現、およびマクロファージ(単核細胞)め集積を比較した。MMP9を阻害したマウス(MMP阻害薬投与野生型マウスおよびノックアウトマウスMmp9tm1Tvu)に対して大動脈瘤形成処置を行いMIFの発現と大動脈径の変化を検討する。Mmp9^<tm1Tvu>とMIF過剰発現マウスをmatingして得られたマウス(Mmp9^<-1->Mif^<+/+>)に対して同様の処置を行いMIF過剰発現マウスおよび野生型マウスにおける、大動脈径と比較する。VEGF中和抗体を投与した野生型マウスに対して瘤作製処置を行い、大動脈径を観察する。さらに処置領域のMIF発現を確認する。MIF過剰発現マウスに対して上記と同様にMIF中和抗体を用いてMIF過剰発現マウスおよび野生型マウスにおける大動脈径と比較する。
皮膚樹状細胞の活性化・遊走シグナルの解析と修飾、およびその治療への応用

皮膚樹状細胞(ランゲルハンス細胞)の活性化と遊走シグナルは密に関連して合目的に制御されていると考えられる。今年度我々は、1)ハプテン外用後に生ずるランゲルハンス細胞の活性化(胞体の増大化と表皮内分布数の減少)は、既感作マウスと未感作マウスでは異なること、さらにステロイド、シクロスポリン、FK-506の外用は直接的にランゲルハンス細胞の活性化を抑制しうることを明らかにした(J Invest Dermatol(Synp Proc)4:164-168,1999)。ついで、2)ランゲルハンス細胞の真皮から表皮内への移入をex vivoで観察しうる実験系を確立し検討したところ、IL-6とTNF-aがともに促進的に関与していることが明らかになった(J Dermatol Sci19:166-174,1999)。3)表皮内有棘細胞癌であるボーエン病においては、PCNA陽性細胞数と真皮内単核球浸潤細胞数との間(r=0.730,p=0.0006)に、また核分裂細胞数とS-100陽性表皮内ランゲルハンス細胞数との間(r=0.763,p=0.0002)に強い相関を認めた。(J Dermatol Sci20:53-62,1999)。その後、パラフィン包埋切片においてもCD1a陽性ランゲルハンス細胞が染色可能となり、表皮内CD1a陽性細胞数は減少していたが、真皮内CD1a陽性細胞数は増加していた。真皮内CD1a陽性細胞数と表皮内CD3,CD4,CD68各陽性細胞数との間に、また真皮内CD1a陽性細胞数と真皮内CD8陽性細胞数との間に正の相関が認められた(現在投稿中)。しかも興味深いことに、ボーエン病ではランゲルハンス細胞と分裂細胞の隣接像がしばしば観察されることが明らかになった。4)現在、抗酸化剤の一つがマウスの接触皮膚炎を抑制し、その作用機序の一つがランゲルハンス細胞の活性化の抑制に起因することが明らかになりつつある。昨年度は、ハプテン外用後に生ずるランゲルハンス細胞の活性化の病態(J Invest Dermatol(Synp Proc)4:164-168,1999)、ランゲルハンス細胞の真皮から表皮内への移入におけるIL-6とTNF-αの役割(J Dermatol Sci 19:166-174,1999)について明らかにした。本年度は、1)表皮内有棘細胞癌であるボーエン病におけるCD1a陽性細胞と他の浸潤細胞ならびに腫瘍細胞の増殖マーカーを検討したところ、表皮内CD1a陽性細胞数は減少していたが、真皮内CD1a陽性細胞数は増加していた。真皮内CD1a陽性細胞数と表皮内CD3,CD4,CD68各陽性細胞数との間に、また真皮内CD1a陽性細胞数と真皮内CD8陽性細胞数との間に正の相関が認められた。しかも興味深いことに、ボーエン病ではランゲルハンス細胞と分裂細胞の隣接像がしばしば観察されることが明らかになった(Brit J Dermatol 143:1211-1216,2000)。2)現在、抗酸化剤の一つであるCX-659Sがマウスならびにモルモットの接触皮膚炎のいくつかのモデルを抑制すること、局所のIL-1bやTNF-a産生を抑制することを明らかにした(Int.Arch.Allergylmmunol 123:341-348,2000)。現在、表皮細胞のGM-CSF産生とランゲルハンス細胞の活性化に対する抑制効果を検討している。3)黒色腫においては腫瘍の浸潤や血管新生とマクロファージの浸潤が相関し、マクロファージから産生されるTNF-aやIL-8などが黒色腫細胞のVEGFの産生を促していることが明らかとなった(Int J Cancer 85,182-188,2000)。
水質悪化時期を含む近過去の環境復元手法の開発

彦根市北川の河口域堆積物の柱状コアサンプルより、落葉の葉脈等の集積層を指標として年層判読を行う技術を開発した。これにより、過去19年間にわたる年層を誤差3年で同定できた。それより過去については、その堆積速度や土砂のかく乱程度と河床工事履歴を比較することで、ある程度の復元に成功した。一方、各年層に吸着していた化学物質(たとえば全リン)濃度を、この河川で彦根市が計測していた河川水質データと比較したところ、良好な相関関係を認めなかった。土砂に吸着して堆積した化学物質が、その後に移動するプロセスを解明しないと、過去の水質を復元するには至らないことが判明した。平成24年度に採取した北川河口域堆積物の柱状試料中に挟まれている葉脈等集積層が年層である可能性が高いことを報告した。そこで、平成24年秋に堆積した落ち葉の上に土砂が堆積する様子について目視調査を継続した。その結果、落ち葉の上に土砂が堆積するのは、4月末から5月初めの代掻き期であることが判明した。このことより、葉脈集積層が年層として利用できることが確定的になった。また、平成24年度には、堆積物中の砂礫交り層が台風時に河口部より逆流して堆積したものであるとの仮説を立てた。そこで、平成25年秋の台風時に河口域に激しい風波がもたらされたときに、河口域での土砂流動を調べた。その結果、強い北西風で風波が立つと、河口域の砂礫が河口部上流側に掃流状態で運搬されていることが明らかになった。そこで、風速15 m/s以上の北西風が卓越した事象を気象庁のデータより検索した結果、堆積物中の2枚の砂礫交り層が堆積した事象を決定することができた。これらより、1990年以降の堆積物の堆積年を誤差3年で決定することができた。次に、堆積物に沈着した化学物質濃度の分析を行った。そのうえで、彦根市が北川河口域で採水した河川水水質調査結果との比較を行った。彦根市が計測したリン酸態リンの濃度年平均値と堆積物に沈着しているリン酸態リンとの比較を行ったところ、堆積物沈着リン濃度の年変動と、河川水中リン濃度の年変動の間に良好な関係は見いだせなかった。このことは、ある水質の影響を受けて堆積した土砂に吸着していたリンが、堆積後に堆積物中で移動していることを強く示唆している。すなわち、本研究で最終目的としている「近過去の水質変化を堆積物に沈着している物質濃度から推定する」ためには、堆積物が堆積した以降に化学物質が堆積物中をどのように移動しているのか、そのメカニズムを解明しなくてはならないことが明らかになった。本研究は、かつて水質が悪化していた時期からそれが改善して以降まで(現在から過去30年前まで程度)の堆積物が集積している水塊に着目する。そして、堆積物中に残存している化学物質量を測定し、これから近過去の水質変化を復元しようとするものである。さらに、堆積物中から年層を認めることができるなら、水質変化を年オーダーで復元できる。すなわち、堆積物中から年層を認める方法および堆積物中化学物質から水質を復元する方法の両者を開発しようとするものである。この条件に合致する場所として、研究対象地を彦根市北川の河口部とした。夏季には水位の高い状態が続き、堆積物試料採取ができなかったが、水位の下がった10月にはこの河床堆積物柱状試料採取に成功した。柱状試料の縦断面に対し、詳細な観察を行い、柱状図を作成した。そして、申請時の仮説に基づき、代掻き期に流出するであろう微細な堆積物の集積層を発見すべく、堆積物のスミアスライドを作成し、顕微鏡下で観察した。しかし、この手法では微細堆積物集積層を発見するには未だ至っていない。一方、柱状試料縦断面を22倍ルーペで詳細に観察した結果、葉柄の集積した層準を19層認めた。これに対し、以下のような仮説をたてた。堆積物試料採取地点周辺には落葉樹があり、晩秋には落葉が河床に堆積する。一方、春季から夏季には細粒土砂が堆積するとともに、河床に住む生物等の影響で葉身の主要部は分解される。しかし、葉柄や葉脈は分解されにくく、これは秋季に堆積した層準に取り残される。もしこの仮説が正しければ、この葉柄葉身集積層準を堆積物の年層指標として使用可能となる。また、堆積物を層別に切り出し、その後の分析に供する準備も完了することができた。本研究は、近年に水質変化が著しい河川の湛水域に着目し、そこに堆積した堆積物の柱状試料中に吸着している化学物質濃度から、その河川水質変化の復元を試みるものである。

そのためには、過去数十年にわたり水質測定がなされている河川の湛水域に注目し、ここの柱状試料中から年層を発見すること、また堆積物中に吸着している化学物質濃度と河川水の水質濃度を比較することが必須になる。彦根市の北川河口域で採取した堆積物柱状試料より、過去19年の年層を認定することができた。すなわち、湛水した河口域で、代掻き時期に田から流出した泥のみが堆積する環境のところに、秋季の落ち葉が堆積する。この落ち葉の葉脈等が縞状に堆積している部分が秋季の堆積層である。一方、この河川で彦根市が行った水質測定結果より、1990年代後半に北川水質の劇的な改善がなされたことがわかっている。そこで、この記録と、各年層の堆積物表面に吸着していた化学物質の濃度とを比較した。たとえば、河川水中の全リン濃度は、1990年代前半までは高濃度だったが、1990年代後半からは低濃度になった。ところが、堆積物に吸着している全リン濃度は、河川水の全リン濃度と有意な相関を示さなかった。一方、堆積物に吸着している他の化学物質濃度は、堆積物吸着全リン濃度と調和的変化を示した。このことは、堆積物に一旦吸着したのちに、当該化学物質が堆積物中を移動している可能性を示している。これらの研究結果について、2014年12月にアメリカ合衆国で開催された国際会議において口頭発表することができた。また、この会議のプロシーディングに論文を掲載することができた。地形学堆積物の堆積年代を、過去20年にわたり誤差3年で決定することができたことは大きな進捗である。一方、堆積物中の化学物質濃度の年変動が、河川水中の化学物質年変動と良好な相関関係がみられなかったことから、堆積物中の化学物質濃度からダイレクトに過去の水質変動を見出すことは無理であることを示している。すなわち、堆積後の堆積物中での化学物質移動のメカニズムを解明することが、当初目的完遂のために必要不可欠であることが判明した。このように、新たな問題に直面したため、すんなりと研究目的を達成することは無理であることが判明したが、本研究が挑戦的なものである以上、新たな研究課題を得たことは研究進展状態がおおむね順調であることを物語っていると考えている。また、すでにこれまでの研究成果は国内学会で発表する段階に来ており、平成26年度には国際会議でも発表する予定になっている。このことからも、研究進展状況を「おおむね順調に進展している」と判断する。研究に遅れが生じている最大の要因は、堆積物柱状試料の採取を2012年10月まで行なえなかったことにある。それまでの間、対象地の水位が高い状態が続き、良好な堆積物試料を安全に採取できる状態になかったためである。しかし、申請段階の仮説とは異なる手法で堆積物年層を確認する手法を見出しつつあること、および分析用試料の切り出しに終了していることから、研究2年目には水質指標となる分析項目の絞込みなどの成果が得られるものと考えている。前述のように、本研究遂行のためには堆積後の堆積物中化学物質移動メカニズムの解明が必要不可欠であることが判明した。今年度は、この問題解決のための試行錯誤を行う予定である。おそらく、なんらかの実験系を組み立て、そこでの実験的追究が必要になると思われる。今年度はこれまでの成果を公表すべく努力をする一方で、この実験系を含めた今後の研究進展方法について具体的検討を重ね、次回の科研費申請につなげたいと考えている。北川河口域で採取した堆積物試料に対する化学的分析および粒径分析を強力に進めていく。
ホルモン応答性の異なる各種前立腺癌細胞に対する化学療法剤の効果

ビスボスホネート剤が前立腺癌細胞に与える影響について明らかにする目的で(1)アポトーシス抑制に関わるbcl-2遺伝子の発現低下機序を解析した。さらに,(2)ビスホスホネート剤で細胞を先行処理した後の抗がん剤による細胞増殖抑制効果への影響について検討した。(1)前立腺癌由来培養細胞株PC-3細胞にビスホスホネート剤を作用させた結果,bcl-2遺伝子の顕著な発現低下が観察された。Bcl-2遺伝子の発現抑制作用は,ビスホスホネート剤処理24時間後より認められた。またBcl-2発現抑制作用は,イソプレノイド合成経路の中間体であるゲラニルゲラニオールを同時に添加することにより回復した。さらに,ゲラニルゲラニルプロテイントランスフェラーゼ阻害剤はbcl-2遺伝子の発現低下を引き起こした。一方,ファルネソールの同時添加およびファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害剤は,bcl-2の発現に影響を与えなかった。従って,bcl-2発現低下機序はビスホスホネート剤のゲラニルゲラニル二リン酸合成阻害作用により説明できる可能性が示唆された。(2)PC-3細胞に各種ビスホスホネート剤を作用させた後に,抗がん剤(パクリタキセル,ドセタキセルおよびエトポシド)を作用させた場合,抗がん剤単独で作用させた場合よりもより大きい細胞増殖抑制の傾向が観察された。殺細胞効果の増強の程度は,前処理しなかった場合に比べ10%から30%の増強であった。ビスホスホネート剤が前立腺癌細胞に与える影響について、(1)抗がん剤存在下におけるビスホスホネート剤の細胞増殖への影響について検討した。また、(2)ビスホスホネート剤によるアポトーシス関連因子および転移関連因子の発現変化について検討した。(1)前立腺癌由来培養細胞株LNCaPおよびPC-3細胞に各種抗がん剤(パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、エトポシド)および各種ビスホスホネート剤を作用させた場合、ビスホスホネート剤ではLNCaP細胞に比べPC-3細胞のほうが、また抗がん剤ではPC-3細胞に比べLNCaP細胞のほうがより強い細胞死誘導作用を示した。抗がん剤とビスホスホネート剤を同時に作用させた結果、そのほとんどの組み合わせにおいて、ビスホスホネート剤と抗がん剤による相加的な細胞死誘導作用が認められた。同時に作用させた場合の細胞死誘導作用はホルモン応答性の異なる二つの細胞間での相違は認められなかった。(2)PC-3細胞にビスホスホネート剤を作用させた結果、urokinase-type plasminogen activator(uPA)およびbcl-2の発現低下が観察された。uPA発現抑制作用は第二世代のパミドロネートを処理した場合に最も顕著であった。パミドロネートによるuPA発現抑制はイソプレノイド合成経路の中間体を同時に処理することにより、uPA発現抑制は回復した。また、ゲラニルゲラニルプロテイントランスフェラーゼ阻害剤によって、uPAの発現低下が引き起こされた。従って、uPAの発現低下機序の一部はビスホスホネート剤のイソプレノイド合成経路阻害作用により説明できることが示唆された。
精神疾患から紐解く新人と旧人の学習能力の違い

世代を越えて文化や文明を伝えていくホモ・サピエンス(新人)には、コミュニケーションによる集団社会での学習が重要である。そして、集団社会での学習に関わると考えられる精神疾患に、他者とのコミュニケーションに障害が生じる統合失調症があげられる。この統合失調症に関わると見られる分子に、Siglec-11がある。Siglec-11は、細胞表面糖鎖末端に位置する単糖であるシアル酸を認識する受容体であり、ヒト特異的に脳ミクログリアでの発現を獲得し、神経保護機能をもつ。Siglec-11の進化および機能解析から、Siglec-11は、Siglec-11と同じ脳ミクログリアのシアル酸受容体であるSiglec-16とペアを組み、ともにポリシアル酸を認識すると見られるペア型受容体であることがわかった。ポリシアル酸は脳細胞に豊富に見られることから、このヒト特異的な脳内Siglecペア型受容体は、ヒト特異的な脳細胞間相互作用を生み出したと考えられる。脳ミクログリアやポリシアル酸の異常、ポリシアル酸を合成する酵素ST8SiaIIの多型は、統合失調症の発症に関わっていることから、脳内Siglecペア型受容体による脳細胞間相互作用は、集団社会での学習に関与しているとみられる。脳内Siglecペア型受容体の出現は、新人とネアンデルタール人など旧人の分岐の直前であるため、旧人も統合失調症を発症しえたと考えられる。そこで、新人と旧人の間での発症リスクの違いを検討すべく、ST8SiaIIの統合失調症に関わる多型について解析を行なった。その結果、発症抵抗型は新人特異的とみられ、新人と旧人との間で統合失調症の発症リスクが違う可能性が示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。世代を越えて文化や文明を伝えていくホモ・サピエンスには、コミュニケーションによる集団社会での学習が重要である。Siglec-11のヒト特異的な脳での発現獲得は、サピエンス(新人)とネアンデルタール人(旧人)の分岐の直前であり、神経保護による統合失調症のリスク回避が、新人や旧人の集団としての学習能力に関与している可能性がある。Siglec-11の進化を詳細に調べたところ、Siglec-11は、Siglec-11と同じ脳ミクログリアのシアル酸受容体であるSiglec-16とペアを組み、細胞機能を微調整するペア型受容体として働いていることがわかった。このため、Siglec-16もSiglec-11と同様、統合失調症に関わっていると見られる。以上のことから、Siglec-11のヒト特異的な脳ミクログリアでの発現獲得は、ヒト特異的なSiglec-11/Siglec-16ペア型受容体の獲得を意味し、このヒト特異的な脳内ペア型受容体は、集団としての学習能力に関わっているかもしれない。研究目的や研究計画に記した通り、平成25年度はSiglec-11遺伝子のヒト世界集団での配列決定を進めた。

一方で、Siglec-11の進化の解析から、Siglec-16についても検討する必要が生じてきたため、配列と機能の両面から解析を行い、ヒト特異的なSiglec-11/Siglec-16ペア型受容体の獲得と統合失調症の関係という新たな視点を得ている。当初の計画に加え、より多面的な研究を進め結果を得ていることから、順調に進展していると判断した。平成26年度は研究計画通り、ヒト世界集団でのSiglec-11遺伝子配列の決定とその集団遺伝学的・分子進化学的解析を進める。一方当初はSiglec-11とSiglec-16との密接な進化の情報がなく、Siglec-11のみを対象として研究を行う予定であった。しかし、Siglec-11とSiglec-16がペアで働くペア型受容体であることが判明し、Siglec-16と統合失調症との関係も期待されることから、解析対象にSiglec-16を含めることとしている。
筋肉の組織分化におけるミトコンドリア分裂因子Ｄｒｐ１の機能解析

ミトコンドリアは、細胞内では融合と分裂を頻繁に繰り返しながらダイナミックにその形態を変化させていることが知られている。本研究期間ではミトコンドリア分裂の筋細胞における生理的意義に着目し研究をおこなった。哺乳動物細胞を使った解析からミトコンドリアの形態変化とミトコンドリアDNA(mtDNA)のダイナミクスに関して新たな知見を得た。これら細胞レベルの解析から得られた知見を個体レベルの解析に応用し、ミトコンドリアの分裂が筋組織の機能維持に重要な役割を果たしていることを明らかにした。近年、ミトコンドリアの形態変化とその生理的な意義についての報告が積み重ねられつつある。今回、ミトコンドリア分裂因子であるDrp1の筋肉における生理的意義に焦点をあてて研究を進めた。まず本研究期間において、ミトコンドリアの形態変化とミトコンドリアDNA(mtDNA)のダイナミクスに関して新たな知見を得ることができた。mtDNAは核様体と呼ばれる構造体を形成し、ミトコンドリア内に存在することは古くから知られていたが、その挙動について詳細に解析されていなかった。我々は、ミトコンドリア分裂が核様体の分布を制御していることを明らかにした。ミトコンドリアの分裂を抑制した細胞では、ミトコンドリアの融合促進に伴い多数の核様体が集合し巨大化していく様子が観察されるとともに大きく膨らんだミトコンドリア(ミトバルブ)が多数出現した。さらにこのような核様体の動的な変化は、内膜クリステの構造異常やアポトーシスの進行を遅延させること分かった。この新たな知見とともに筋組織におけるミトコンドリアの分裂が重要な機能を果たしていることを明らかにした。申請者はミトコンドリア形態変化の生理的な意義を明らかにするため、ミトコンドリアが極めて特徴的な分布をとる筋組織のミトコンドリアに注目し、研究を行っている。筋肉ミトコンドリア分裂不全(筋KO)マウスは体重・行動はほぼ正常であるにもかかわらず生後8日ごろ心筋収縮力の低下により致死となる。ミトコンドリアは動的なオルガネラであり細胞内で融合と分裂を繰り返しているが、その動的構造変化の分子機構及び生理的意義は近年までほとんど理解されていなかった。当該年度は研究実施計画にあるようにこの筋KOマウスの解析を中心に進めた。このマウスの死亡時期が生後8日ごろと極めて限局していることからも、ミトコンドリアの分裂がある特定の時期の組織機能(特殊化した細胞群)の機能維持に重要であることが考えられる。そこで、週齢をおってマウス心筋におけるミトコンドリアの形態、さらにはそれら形態を制御する関連因子群の発現について検討をおこなった。また、ミトコンドリアの機能維持に重要なミトコンドリアゲノムコピー数の解析、核様体の大きさや分布などについてもあわせて解析を進めている。一方で筋KOマウス由来の初代心筋培養細胞とその同腹子の野生型マウスの初代心筋培養細胞を樹立し、薬剤に対する応答や細胞の増殖などを初代培養細胞レベルでも解析を進めることができた。これらマウス個体・組織での解析と細胞レベルでの解析からミトコンドリア分裂の生理的意義が明らかになりつつある。研究目的に沿っておおむね順調に進展している。個体におけるミトコンドリアの形態変化の生理的な意義については、筋組織の時期特異的な成長・分化に重要であるということが明らかになりつつある。ミトコンドリア分裂欠損による筋細胞の分化・成長シグナルの影響を分子機構のレベルで明らかにし、個体での研究にフィードバックすることでより発展的な成果を目指す。そのために次年度に向けての条件欠損マウスの構築やその他の研究材料についての準備も進めることができている。また申請者は研究協力者らとともに、培養細胞を用いた解析からmtDNAの分配機構の新たな知見を得ることができた。この知見については現在、国際学術誌に投稿し査読を受けている。このように目的達成のための研究実施体制についても構築できつつある。研究計画に従い、個体(組織)レベルの解析と細胞レベルの解析を両面から進め、得られた結果を互いにフィードバックすることでより研究を推進される。これまでに蓄積してきた結果を含めて本研究期間の成果として取りまとめ、国内外の学会、学術誌への投稿という形で発表する。本研究課題の研究領域の国際学会(DynaMito2013 10/2811/1)が沖縄で開かれることが決まり、領域を代表する研究者が世界中から集まる。申請者自身の研究も順調に進捗していることから本学会への参加を予定している。当初の計画には、国際学会参加に関する予算を組み込んでいなかったことから、今年度予算の一部を次年度に計上した。
雄特異的DNA断片による家畜の性判別に関する研究

家畜の受精卵移植の際の性判別は、胚の細胞の一部を生検し、その細胞中の微量のDNAをPCR法によって増幅して調べることができるようになり、実用化の段階にある。しかし、判定に用いる雄特異的なDNA断片の塩基配列はわが国において開発されたものではなく、特許の関係で商業的利用は制限されている。最近、ヒトやマウスに存在するY染色体上の性決定領域の塩基配列の一部が明かにされ、PCR法による研究から、これらの塩基配列の一部が哺乳類で共通に保有されていることが判明している。本研究では、このDNA部分に注目し、PCR法について種々の検討を行い、家畜の雄特異的DNA断片の検出方法について研究を行った。その研究成果として、ヒトやマウスのY染色体上の短腕部に存在する性決定領域にあるconserved motif部分を増幅するプライマー(5'-CCCATGAATGCATTCATGGTGTGGT-3',5'-TTATAGTTCGGGTATTTCTCTCTGTG;SRYF,SRYR)を用い、哺乳類の雄特異的DNAを高感度に増幅するPCR法を開発した。アニーリング温度と伸長反応時間を変えた2種類の増幅反応ステップを組合せた本法では、上記のプライマーを用いて多少のミスマッチがあっても、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ラットで雄特異的DNA断片を容易に増幅することができた。雌では、非特異的なアーティファクト産物が得られ、雌のマーカーとしての利用に有効と思われた。鋳型のDNA量が40pgの量のときでさえ増幅が可能であった。目的:家畜の受精卵移植の際の性判別は胚の一部の細胞を生検し、その雄特異的なDNA断片をPCRによって増幅し調べる方法が最も実用的な方法となってきている。しかし、現在知られているウシの雄特異的断片の塩基配列や、PCRのためのプライマ-は、わが国において開発されたものではなく、特許の関係から商業的利用は制限されている。そこで、新たに家畜の雄特異的断片の検出を試みるとともに、ブタにおいては、そのPCR用のプライマ-がまだ報告されていないことから、その検索とPCRの方法について検討した。結果:新たな雄特異的DNAの検出を非放射性の標識を用いて行う方法について、マウスを用いて実験した。まづ、Enrich delation法により雄特異的と思われるDNA断片を選びだし、pBR322にこれらを挿入した。大腸菌HB101に導入増殖後、DNAの一部を取り出し、非放射性の標識法であるジゴキシゲニン抗体を用いた方法により標識した。これらを雌雄のマウスのDNAとドットブロット法によって調べた結果、選び出した35の組換え体のうち3個体が雄のDNAとのみ反応した。これらは、雄特異的なDNA断片を含むものと思われ、これらの塩基配列について現在解析中である。次に、ブタにおいてPCR法により雄特異的DNA断片の増幅のためのプライマ-とその最適な検出方法について実験した。Genderーneutralな塩基配列の検出のためのプライマ-は、Akamatsu et al.(1989)の報告した塩基配列の15ー25番目と913ー933番目の塩基配列部分に基づき合成した。またmaleーspecificな塩基配列の検出のためのプライマ-はMcGraw et al.(1988)の報告した配列から1ー23番目と1166ー1188番目の塩基配列に基づき合成した。これらを用いて、PCRを行った結果、雄特異的な二本のバンドと雌雄に共通な一本のバンドが明かに検出でき、受精卵の性判別に使えることが明かとなった。目的:家畜の受精卵移植の際の性判別は、胚の細胞の一部を生検し、その細胞中の微量のDNAをPCR法によって増幅して調べることができるようになり、実用化の段階にある。しかし、判定に用いる雄

特異的なDNA断片の塩基配列はわが国において開発されたものではなく、特許の関係で商業的利用は制限されている。最近、ヒトやマウスに存在するY染色体上の性決定領域の塩基配列の一部が明からされ、PCR法による研究から、これらの塩基配列の一部分が哺乳類で共通に保有されていることが判明している。本研究では、このDNA部分に注目し、PCR法について種々の検討を行い、家畜の雄特異的DNA断片の検出方法について研究を行った。結果:ヒトやマウスのY染色体上の短腕部に存在する性決定領域にあるconserved motif部分を増幅するプライマー(5'-CCCATGAATGCATTCATGGTGTGGT-3',5'-TTATAGTTCGGGTATTTCTCTCTGTG:SRYF,SRYR)を用い、哺乳類の雄特異的DNAを高感度に増幅するPCR法を開発した。アニーリング温度と伸長反応時間を変えた2種類の増幅反応ステップを組合せた本法では、上記のプライマーを用いて多少のミスマッチがあっても、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ラットで雄特異的DNA断片を容易に増幅することができた。雌では、非特異的なアーティファクト産物が得られ、雌のマーカーとしての利用に有効と思われた。鋳型DNA量が40pgの量のときでさえ増幅が可能であった。