hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
MRI透視下における局所注入薬剤の経時的モニターのための基礎的研究

われわれは薬剤濃度と造影剤濃度がパラレルに変化すると仮定して生体内局所に混注した際の薬剤濃度とMR1信号強度の関係を調べ,薬剤と造影剤の混合液のMRI透視下の描出の最適化のために撮像シーケンスにっいての基礎的検討を行った。1 MRI用造影剤濃度と薬剤濃度の動態ついて動物モデルを作成して検討する予定であったが、適切な動物モデルの作成ができなかった。そのため、血流による希釈を無視できる環境での薬剤注入を臨床で行うこととした。3 MRDSAの基礎的検討:薬剤注入のコントラスト分解能を上げるためにMRI透視画像のリアルタイム差分画像を開発中である。これまでのところ1秒間隔の画像表示は実現したが、体積の小さい血管を描出するだけのコントラストがまだ得られていない。4臨床応用:血流による希釈を無視できる環境として従来より行ってきたlow-flow type血管腫患者で硬化療法を上記撮像シーケンスの応用して行い、良好な結果が得られた。薬剤濃度の推定の効用は経過観察により従来の方法による治療成績と比較して行う。現状では安全を期するために治療時間が長くなっているが、今よりも短い時間で安全に治療を行うためにはより高い空間分解能、コントラスト分解能、時間分解能を目指す必要がある1 MRI用造影剤濃度と薬剤濃度の動態の検討実験モデル作成中でまだ成果は出ていない.2低磁場MRI装置の透視シーケンスの開発予定よりも早く低磁場臨床MRI装置が導入されたので来年度の研究予定であった透視用シーケンスの開発を繰り上げて行った.透視用のシーケンスとしてはsteady state freeprecessionのechoによるT2強調画像とHalf fourierfast spin echoによるT2強調画像、spoiled GRASSによるT1強調画像を検討した.空間分解能をおよびSN比を犠牲にして、いずれのシーケンスでも4秒に1画像という最低線の表示速度を達成できた.ファントムおよび正常ボランティアの撮像でHalf fourierfast spin echo法によるT2強調画像はSN比が不十分であった.steady state freeprecessionのechoによるT2強調画像およびspoiled GRASSによるT1強調画像は相対的にSN比が高く、これらの時間分解能、空間分解能、コントラストの最適化を症例で行って臨床使用に耐えるかどうかを検討することとした.3症例における透視シーケンスの評価(一部のみ)MRI透視下の穿刺針の描出についてsteady state freeprecessionのechoによるT2強調画像およびspoiled GRASSによるT1強調画像の描出能を0.3T低磁場MRI装置にて検討した.いずれのシーケンスでも高磁場MRI用穿刺針は描出不良、通常ステンレス針はアーチファクトが大きすぎて透視下操作不能、0.2T用穿刺針はアーチファクトが大きいものの透視下操作は可能であった.今後、造影剤及び薬剤注入のMRI透視下の描出能の検討と動物モデルによる濃度推定精度検討を行う予定である.われわれは薬剤濃度と造影剤濃度がパラレルに変化すると仮定して生体内局所に混注した際の薬剤濃度とMR1信号強度の関係を調べ,薬剤と造影剤の混合液のMRI透視下の描出の最適化のために撮像シーケンスにっいての基礎的検討を行った。現状では安全を期するために治療時間が長くなっているが、今よりも短い時間で安全に治療を行うためにはより高い空間分解能、コントラスト分解能、時間分解能を目指す必要がある
「栽判員制度」の公判前手続に関する理論的・実証的研究

裁判員裁判の円滑な実施のためには、公判前整理手続において、訴因の明確化・変更、証拠の開示を踏まえて争点を整理しておくことが必要であり、公判前整理手続の充実が、裁判員裁判の正否の鍵を握っているという観点から本研究を行ってきた。公判前整理手続は、平成17年11月から、各単位庁で施行されてきたが、その実施状況(件数・内容)については、制度開始直後には、法曹三者の間の認識の違いから多少の混乱がみられたが、次第に定着をみせている。しかしながら、弁護士と検察官の間には、証拠開示に関して、依然として対立が存在している。特に、刑事訴訟法第299条の下で開示されていた捜査官の捜査報告書を巡って、それは捜査官のメモであって証拠ではないので開示の対象とはならないという検察側の主張と捜査官のメモであってもその内容が事実認定の基礎となるか又は特定の検察官請求証拠の信用性を判断する基礎となりうる資料であれば開示の対象となるとする弁護側の主張が対立しており、裁判所に裁定を求める例も増えてきた。裁判所の判断は、捜査報告書は、開示対象とはならないという判断を示した例が多いが、その理由付けには、若干の疑問がある。今後の判例の積み重ねが必要であろう。また、理論的な問題としては、刑事訴訟法316条の14以下の公判前整理手続における証拠開示と刑事訴訟法299条における証拠開示が並立する状態にある。裁判員裁判に付される事件に関しては、公判前整理手続が必要的な手続であるが、公判前整理手続は、決定でその他の事件にも適用可能であり、現在行われている公判前整理手続の多くは裁判員裁判の対象とはならない事件である。その関係を理論的に整理する必要がある。また、公判前整理手続においては、検察官のみならず、被告人・弁護人も主張を明示して証拠開示を行う必要があるが、公判前整理手続の主宰者が受訴裁判所であることから、裁判所と裁判員の情報ギャップの問題が指摘されている。このような問題について、下記の論文で明らかにすると共に、日弁連での検討会、新潟弁護士会での研修会で述べてきた。後者においては、報告者を務めた。更に、イギリス・フランス・ドイツを訪問して、公判前整理手続に関する情報収集と比較法的研究を行った。ドイツ・フランスは、糺問主義・職権主義の訴訟構造と取っているために、イギリスの制度を研究することが、最も多くの示唆を得られるという結論に達した。また、・ミュンスター大学で講演を行った。平成16年5月28日に「裁判員の参加する刑事裁判に関する法律」(以下、「裁判員法」という)が公布され、公布の日から起算して5年を越えない範囲内において政令で定める日から施行されることとなった。戦後刑事司法改革の最大の課題であった「国民の司法参加」が遂に実現することとなったという意味において、「裁判員法」の成立は画期的なものであると評価できる。

というのは、「裁判員制度」は、単に国民が司法に参加することになったというだけではなく、裁判の迅速化をもたらすのみならず、公判における口頭主義・直接主義の徹底化が図られるために、捜査手続・公判手続に与える影響は非常に大きいからである。語弊を恐れず言うならば、「裁判員制度」の導入は、戦後刑事司法改革において実現した当事者主義的刑事司法以上のインパクトを内包する大改革であるということができる。「裁判員法」の制定と時を同じくして「刑事訴訟法」改正が行われたのも、刑事訴訟法の改正なしには、裁判員裁判を円滑に行うことはできないことが明らかだったからである。この改正においては、被疑者国選弁護人制度の導入等幾つかの重要な改正が行われたが、公判前整理手続の新設は、裁判員裁判の帰趨を決すると言って過言ではない重要な改正であった。しかしながら、職業裁判官のみによる裁判制度に慣れ親しんできた法曹にとっては、「裁判員制度」の導入は、衝撃的な事件であり、多くの法曹は「裁判員裁判」についてのイメージすら理解していないのが実情である。そこで、平成16年度には、模擬裁判員裁判が実施されているが、旧来の裁判から脱却できてはいない。そのために、本年度の研究においては、「裁判員制度と国民の司法参加」が有する意義と課題を明らかにするために、弁護士を中心として意見交換を行った。また、従来の「国民の司法参加」を巡る議論を陪審制度との関係で整理した。更に、この間、イタリア・スペイン・ロシア等において「国民の司法参加」が実現したが、その際に各国は、イギリスの陪審制度から多くの知見を得てきたし、イギリスの法曹もその制度化に助言を与えてきた。従って、イギリスのこの経験を調査するために、3月18日から28日にかけて調査に赴いた。(1)平成17年4月13日以降、2週間に一度の割合で、「裁判員制度研究会」を開催し、主として公判前整理手続の研究を行った。すなわち、平成17年11月1日から改正刑事訴訟法の公判前整理手続に関する規定が施行される予定とされていたので、第1回目の研究会において、公判前整理手続において問題となることが予想される論点を整理し、派遣検察官である中川深雪教授、実務家教員で弁護士の設樂あずさ助教授と各論点についての研究発表を行った。(2)日本弁護士会裁判員制度実施本部・改正刑事訴訟法検証部会の新潟県代表として、部会に出席して、日弁連の対応状況について調査を行うと共に、福岡県弁護士会・名古屋弁護士会・大分弁護士会等を訪問して、地方の弁護士会における公判前整理手続への対応状況を調査し、意見交換を行った。(3)新潟地方裁判所・新潟地方検察庁・新潟県弁護士会が実施した第1回裁判員模擬裁判(平成17年5月30日公判前整理手続・同年6月6日、7日公判)及び第2回裁判員模擬裁判(平成17年10月5日・28日・31日公判前整理手続・11月14日16日公判)を傍聴して、実務においての問題点を調査した。(4)平成17年8月7日18日の日程で、イギリス及びフランスの裁判所・弁護士会・大学を訪問し、国民の司法参加が公判前整理手続及び公判に与える影響についての調査を行った。(5)裁判員制度に対する国民の意識を理解するために、市民講座等の講師を引き受け、市民との質疑・応答の中で、裁判員制度を円滑に運営するために、公判前整理手続で解決しておくべき問題点を把握した。平成18年度は、本研究の最終年度に当たるので、研究成果を取り纏めを行う必要があるが、平成17年11月1日から公判前整理手続が実施されはじめ、全国で、300件を超える事件が、公判前整理手続に付された。
眼内における神経系幹細胞の探索

眼科領域においては結膜および角膜に幹細胞が存在することが知られており、臨床に応用されているが、眼内においては、神経系幹細胞は検出されていなかった。毛様体は、手術損傷や炎症等でも修復が速やかに行われることが知られており、鋸状縁付近は、神経系幹細胞の検出部位として期待され、今回それらの部位において、その検出を試みた。動物モデルとして、白色ラット眼球を用いた。毛様体扁平部および鋸状縁硝子体に、30ゲージ針を数箇所にわたって刺入し、損傷モデルを作製、一週間後、眼球を潅流固定し、凍結切片を作製した。また、リポポリサッカライドを足掌部に注入し、エンドトキシン誘発ぶどう膜炎を発症させ、炎症モデルを作製、一週間後、眼球を潅流固定し、凍結切片を作製した。スクリーニングとして正常ラットの眼球を用い、潅流固定、凍結切片を作製した。神経系幹細胞に特異的と考えられる抗体nestin(中間フィラメント)およびEGF受容体抗体を用いて免疫染色をおこなったが、損傷モデル、炎症モデル双方においても、組織の二重染色は認められず、今回、神経系幹細胞を検出することはできなかった。神経系幹細胞は、その数が非常に少ないことが考えられるが、眼内、特に前眼部において検出することができれば、その採取は比較的容易であり、臨床に応用しやすいと考えられる。モデルの作成方法、検出方法等に対してさらに検討を加え、今後も引き続き眼内における神経系幹細胞の探索を継続する予定である。眼科領域においては結膜、角膜に幹細胞が存在することが知られており、臨床に応用されているが、眼内においては幹細胞は検出されていない。眼内、特に前眼部においてその検出を試みる。ラット眼球を用い、毛様体扁平部および鋸状縁硝子体に針を刺入し損傷モデルを、エンドトキシン誘発ぶどう膜炎を発症させ炎症モデルを作製し、1週間後、眼球を固定し、凍結切片を作製した。スクリーニングとして正常ラットの眼球を固定し、同様に凍結切片を作製した。神経幹細胞に特異な抗体nestin(中間系フィラメント)およびEGF受容体抗体を用いて免疫染色をおこなっている。また硝子体内にBrd-Uを投与しその取り込みを検出中である。nestinおよびEGF受容体が2重染色されBrd-U取り込みが確認できれば神経系幹細胞の可能性が高いと考えられる。
生理指標を用いた都市環境の快適性評価と環境計画への応用

近年、都市環境に求められる社会的ニーズも多様化しており、効率や論理を重視してきた環境整備から、快適な環境整備へのパラダイムの転換が求められている。そこで、本研究では、都市環境の快適性を向上させる要因を明らかにし、それらがもたらす生理的快適性増進効果を客観的に測定することにより科学的エビデンスを確保するとともに、快適な都市環境の整備に向けての提言を行うことを目的とした。快適性の増進させる環境要素として自然由来の環境要素に注目し、それらの環境要素に接する時の人の生理、心理的反応を実験により明らかにすることに注目し、室内実験ならびにとフィールド実験を実施した。研究の主な結果として、自然的環境要素は、不安のような負の感情を緩和させ、活気のような正の感情を高めることにより、主観的リラックス効果を増大させることが明らかになった。また、生理データから、自然環境での歩行は副交感神経活動を亢進させるとともに、交感神経活動を抑制させることが明らかになり、自然環境の生理的リラックス効果が実証できた。このような結果は、既往の森林浴研究と部分的に一致しており、都市公園のような自然環境がもたらすストレス軽減効果ならびに快適性増進効果の科学的根拠となる。現代社会において、ストレス管理が重要な社会的キーワードとなっており、QOL向上に向けての都市環境の整備が重要な社会的課題となっている中、本研究は自然環境のもたらす快適性増進効果を客観的、定量的に評価しており、自然環境が快適な都市空間の整備において非常に重要な要素になることを示している。したがって、より快適な都市環境を整備するためには、都市に存在する自然環境を活用し、それらを有機的にネットワーク化させ、人と自然との接触を増やせる環境を造ることが大事である。本研究は、そのための科学的データと概念的ツールを提供できたという点で評価できる。本研究では、人のこころや感性を重視した快適な都市環境の整備に向け、都市環境の快適感を客観的に評価することを目的とする。その一環として、都市環境を大きく人工環境と自然環境に分類し、それぞれの環境に対する人の生理・心理応答を調べた。特に、自然環境については、植生で構成される森林環境と、水で構成される河川環境に分けて検討を行った。今回は、環境を認識する上で最も重要な感覚器官である視覚を介して認識される景観に注目し、都市景観、森林景観、河川景観を見た時の人の生理・心理応答を、室内実験により検証した。被験者としては、20代の健常な男子大学生19名とし、実験は温熱環境の制御が可能な人工気候室内で実施した。自律神経活動の指標となる心拍変動性(HRV)を分析した結果、副交感神経活動の指標であるHF(2分間の平均)は、河川景観において、都市景観(p<0.05)と森林景観(p<0.01)に比べ、有意に高いことが明らかになった(対応のあるt検定)。また、主観評価の結果では、快適感、鎮静感、自然感において、森林景観と河川景観共に都市景観に比べて、有意に高い点数が得られた(p<0.01、ウィルコクソン符号付順位和検定)。これらの結果は、人は生理的にも、心理的にも自然景観と接したときに、リラックスすることを裏付けている。特に、心拍変動性を用いて河川景観の生理的リラックス効果を明らかにしたことは新知見である。本研究結果から、快適な都市環境を構築するためには、都市空間の中に自然的環境要素を積極的に取り入れた計画が重要であることが明らかとなった。一方、今回の研究は室内実験による結果であるため、実際の環境がもたらす生理的・心理的効果を明らかにするためにはフィールド研究による再検証が必要である。
健康診断を利用した自殺予防のためのうつ病スクリーニング有用性の検討

自殺は精神疾患の中で最も悲劇的な結末であり、自殺率は労働者で増加している。本研究では自殺とうつの予防戦略について認知行動療法(Cognitive Behavioral Therapy : CBT)、マトリックス分析の観点から考えたものである。CBTには労働者のうつ症状の悪化を防止する効果がある可能性が示唆された。また、マトリックス分析も自殺やうつ予防に適応可能であると考えられた。初年度の研究参加者は287人(男性239人、女性が48人)で年齢の平均(Mean)は39.9歳、標準偏差(SD)は10.0だった。CES-Dの合計平均得点は8.4,SD6.4(男性Mean8.3、SD5.8,女性Mean8.7、SD9.1)で、女性が高い傾向であったが統計学的に有意差はなかった(p=0.72)。CES-Dのカットオフ得点(16点)より高値を気分障害群とすると、全体で18人(男性15人、女性3人)が気分障害群と分類された。個別項目の20項目(煩わしさ、食欲低下、気が晴れない、自己評価低下、集中力低下、ゆううつ、面倒くささ、消極性、過去の事項の反芻、恐怖、不眠、不満感、口数の少なさ、寂しさ、関係妄想感、不幸感、感情の起伏の大きさ、悲しさ、被害妄想感、仕事への集中力低下)の質問のうちでは、自己評価低下(Mean1.4±SD1.2)、消極性(Mean1.3±SD1.1)、不満感(Mean1.2±SD1.2)、不幸感(Mean1.3±SD1.0)の項目の点数が高かった。男女別では、20項目中、女性の点数が男性に比べて有意に高かったのは食欲低下、自己評価低下、不満感、不幸感、感情の起伏の大きさの5項目であった(p<0.05)。今年度は心理士による介入群への認知行動療法がおこなわれている。認知行動療法は週1回を最低ラインとして、必要な回数実施している。来年度、介入群と非介入群を比較することにより認知行動療法の職域での効果判定を行う予定である。研究期間中の集団全体でのうつ状態を示すCES-Dの総合点は優位に上昇した。(平均±標準偏差,12.4±4.3 to 16.5±6.5, p<0.01).其々の群では、CBT介入群ではうつ状態に優位な変化がなかった(平均±標準偏差,14.2±11.7 to 14.0±12.1, p=0.90)、一方コントロール群ではうつ状態が優位に上昇した(11.8±4.6 to 16.4±6.7, p=0.02).CES-Dの20項目の内、2008年から2009年の期間で優位もしくは境界優位な変化があったのは、集中力の低下、抑うつ、面倒だ、の3項目であった(それぞれ、p=0.05, 0.08, 0.09).CBTによる介入とCES-Dスコアの上昇の関連は性別・年齢を調整後の一般化線形モデル(GML)分析でネガティブに優位な負の相関が認められた(OR 0.27, 95%CI 0.10-0.79).本研究によりCBTには労働者のうつ症状の悪化を防止する効果がある可能性が示唆された。
糖質化合物の実用的迅速合成法の開発

実用的な糖質合成法の確立を目指し,化学酵素的手法と有機化学的固相合成法による糖質の迅速合成法について検討した。糖加水分解酵素による糖転移反応を利用した酵素合成法は酵素の基質特異性が高くないので応用性は広いが,位置選択性の制御が難しい。そこで申請者は保護基の導入など化学的な手法を併用することでグリコシド化の收率ならびに位置選択性を制御することを検討した。複雑な糖鎖合成への応用を目指してまず天然プロテオグリカン中のグリコサミノグリカン糖鎖とコア蛋白質部分を結ぶ重要な糖鎖であるGal(β1-3)Gal(β1-4)Xyl(β)-L-Serの合成を行った。糖鎖の固相合成に向けて,チオグリコシドを用いた立体選択的なグリコシド化法について液相での検討を行い,PhIOとTMSClO_4またはMg(ClO_4)_2の組み合わせが高収率で対応するグリコシドを与えることを見い出した。糖鎖の固相合成を確立するためには水酸基の保護基ならびに糖を固相に繋げるリンカーの開発は不可欠である。申請者の開発したアシルアミノベンジル基がDDQによって脱保護できることに着目し,スペーサー部を導入したグリタリルアミノベンジルリンカーを開発した。さらにアルカリで切断できるリンカーも開発し,これらを用いて固相上でのグリコシド化反応について検討した。その結果,反応速度は液相中での反応に比較すると若干劣るものの目的のグリコシド化が進行した。一方保護基については3-クロロ-4-アジドベンジル基を開発し,固相合成に適用可能であることを示した。
水中電波テレメトリー法による魚類神経活動の記録・解析

本研究は、魚類を材料に用いて、野外の河川で行う自然な行動に伴う中枢神経活動を、水中電波テレメトリー法により記録し、行動との対応を調べることを目的とした。とくに、(1)野外での計測に適した受信システムを開発すること、(2)われわれがすでに開発した脳波計測用の小型トランスミッターを用いて、野外の自然な河川で自由行動している魚から中枢神経活動(嗅球脳波)を記録することを目指した。本研究者のグループによる従来の水中電波テレメトリーシステムは、実験室内の水槽中からの微弱な生体信号(筋電図・脳波)を、ごく近傍の空中に置いたFMラジオのバ-・アンテナで受信するというものであった(Kudo & Satou 1990;Kudo et al.1992日本水産学会発表;Kudo et al.submitted)が、これを野外の広い環境に拡張するためには、信号の到達距離を飛躍的に伸ばす必要があった。電波は、水中で急速に減衰すること、また、空中へ放射されるのはそのまたさらに1部であることから、従来の空中アンテナで受信するという方式は捨てざるを得なかった。そこで、水中アンテナを川の中に張り、かつ、ブ-スター回路で信号を増幅するという新機軸のアンテナ(Aquaerialと命名)を考案した。この水中アンテナを用いて、野外の水路でテストしたところ、良好な結果を得た(Satou et al.1993;Kudo et al.1994日本水産学会発表;Kudo et al.submitted)。このように、本研究の特色・独創的な点は、従来からの夢であった野外の自然な環境における魚類の神経活動を、新機軸の水中電波テレメトリー技術を用いて記録した点にある。本年度は、野外での計測に適した受信システム(とくに、水中アンテナシステム)を実用化することを目指した。FM受信機へ信号を入力する水中アンテナ(“aquaerial"と命名)は、16cmの長さのプローブ部が11個連結したものを製作した。各プローブは、信号の受信と増幅を行い、2mの同軸ケーブルで直列に連結されている。水中アンテナの総延長は、20mである。この水中アンテナを、幅約3mの河川の底に設置し、自由に遊泳しているニジマスの嗅球(嗅覚系第1次中枢)からの脳波信号をテレメトリーすることを試みた。その結果、魚がアンテナに沿って移動しても嗅球脳波が安定して記録出来ることが判明した。平成5年度の目的であった(1)野外の自然な河川での水中電波テレメトリーに適した受信システム(特に、アンテナ系)の開発、(2)単一神経ユニット用のトランスミッターの開発、および、(3)野外の自然な河川で自由行動中の固体からの神経活動(脳波)の記録、のうち、(1)に関しては、実用的なものの開発がほぼ達成されたと考えている。(3)に関しても、脳波活動のテレメトリーに成功したと言える。(2)に関しては、単一神経活動記録用のトランスミッターの製作にまでは、到っていない。平成6年度には、是非試作してみたいと考えている。また、新たな問題点として、魚体への負担を最小限にするため、トランスミッターの電源として小型の電池(電卓用の電池2個)を用いたところ、せいぜい2日弱しか信号を安定して送信出来ないことが判明した。今後は、魚体への負担を最小限にして、かつ、さらに長期間(4日以上)の送信を目指すことを計画している。
ＨＬＡヘテロダイマー分子の多様性

本研究は、HLAクラスIIと関連する疾患のメカニズムを解明することを目的として行い、以下の知見を明らかにした。まず、HLAのタンパク質安定性の測定系を確立し、多数のHLAクラスIIアリル産物についてタンパク質安定性を推定した。その結果、自己免疫疾患(1型糖尿病)感受性と関連するHLA-DQアリルがコードするHLAタンパク質安定性が、他のアリル産物と比較して顕著に低いことを見出した。従来の研究ではHLAと自己免疫疾患との関連は、HLAタンパク質とペプチドとの結合性で説明されている。本研究で得られた知見は、自己免疫疾患発症の過程に、これまでの定説とは異なる発症機序が働いている可能性を示唆する。本研究は、HLAクラスIIと関連を示す疾患機序の分子機構を解明することを目的として実施している。平成22年度はHLA-DQ分子のα鎖、β鎖から成るヘテロ二量体のアリル特異的形成能の解析を行い、アリル特異的二量体化パターンを主要なすべてのHLA-DQハプロタイプについて明らかにすると共に、細胞表面発現量を指標としたタンパク質安定性測定系を構築し、各HLA-DQα/β二量体の安定性の定量とアリル間比較を行った。また、安定性に影響を与えるアミノ酸多型をアリル間の安定性比較と部位特異的変異体を用いた解析により同定し、ペプチド結合溝・T細胞受容体認識部位以外の領域に位置し、HLA-DQα/β二量体の安定性を有意に変動させる"安定化多型"3種類を同定した。これらの多型は1型糖尿病、セリアック病に対する疾患感受性と関連するHLA-DQテトラマーの特性を改良する上で有用であるため、新規組換え型MHCタンパク質として特許出願を行った。また、HLA-DQ以外のHLAクラスII分子についても、B型肝炎慢性化、インスリン自己免疫症候群に対する疾患感受性・抵抗性のメカニズムを解明するために、関与するHLAアリル産物の組み換えタンパク質発現系を構築した。具体的には、HBV,IASを対象としてHBV感受性・抵抗性・中立性HLA-DPA1,DPB1アリルのcDNAクローニング、及びバキュロウイルス発現系によるHLA組換えタンパク質発現を行った。また、インスリン自己免疫症候群感受性アリル(DRA^*01-DRB1^*0406)からなるHLAクラスIIテトラマーを作成するため、HLA-DR可溶性領域を昆虫細胞(Drosophila Schneider cell line)安定発現系、哺乳類細胞発現系を用いて発現し、培養上清中に可溶型二量体として産生した。HLAクラスIIは多くの自己免疫疾患、感染症の最も強い遺伝要因である。しかし、そのメカニズムは解明されていない。この最も顕著な例はナルコレプシーである。ナルコレプシーでは患者のほぼ100%が同一のHLAクラスIIアリルを持ち、ゲノムワイド関連解析でもHLAクラスIIとの顕著に強い関連が認められる。しかし、未だに自己抗原同定に至っていない。本研究はナルコレプシー、及び、同様にHLAクラスIIが最も大きい遺伝要因である一型糖尿病、慢性B型肝炎の病態機序解明を目的とする。具体的には病態に関与するペプチドの同定を目標としている。また、提示抗原が既知であるインスリン自己免疫症候群(IAS)を対象として、組換えHLAタンパク質の高密度発現系の構築・HLAテトラマー作成系の確立を行う。平成23年度は、組換えタンパク質の昆虫細胞発現、ペプチド結合測定、テトラマー作成を実施予定であった。このうち、組み換えタンパク質の発現は既に達成した。ナルコレプシーに関与する自己抗原の探索については、候補ペプチドを策定しペプチド結合測定を行うための予備実験を進行中である。一型糖尿病については、疾患感受性・抵抗性・中立性アリル産物の組み換えタンパク質発現を行い、自己抗原候補ペプチドを予測した。慢性B型肝炎についても、組み換えタンパク質の発現系を構築し、B型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質の配列を基に、疾患感受性・抵抗性に関与する可能性が高い抗原ペプチドを予測した。HLAテトラマー作成については、組み換えタンパク質の高密度培養系を構築した。これらの成果によってHLAが関与する疾患メカニズムの解析を引き続き実施するための材料・実験技術が整備された。各項目について、以下の点について解析を行った。インスリン自己免疫症候群の解析:DR0406テトラマーを作製、精製した。大量産生のためには、発現系の改変が必要である。1型糖尿病に関連する自己ペプチドの探索:DRB1*04:05,*08:02, *08:01, *15:01の組換えタンパク質を発現し、ペプチド結合アッセイ系を確立した。ZnT8タンパク質について合成ペプチドライブラリーを作製し、コントロールペプチド(ビオチン標識ペプチド)に対する、非標識ペプチドの競合アッセイを行い、DRB1*09:01タンパク質に結合するZnT8ペプチドを探索した。

結合する候補ペプチドは見出されたが、再現性の確認が必要である。ナルコレプシー自己抗原の同定:ナルコレプシー感受性・抵抗性に関連する組換えHLAクラスIIタンパク質を発現し、ペプチド結合解析を行い、DQB1*06:01, *06:03 (抵抗性)、DQB1*06:02(感受性)、DQB1*06:04(中立性)に対するオレキシンペプチドの結合性を調べた。オレキシンのシグナルペプチドについて、先行研究と一致する結果(DQB1*06:02への結合)を得た。今後は、他の自己抗原候補について、DQタンパク質への結合、および、アリル間の結合特異性を明らかにする。HLAクラスIIは多くの自己免疫疾患、感染症の最も強い遺伝要因であるが、そのメカニズムはHLAが関連する殆どの疾患について、解明されていない。本研究は、HLAクラスIIと関連する疾患のメカニズムを解明することを目的として行った。これまでにHLA-DQ分子のα鎖、β鎖から成るヘテロ二量体のアリル特異的形成能の解析を行い、自己免疫疾患(1型糖尿病)感受性HLA-DQアリル産物のタンパク質安定性が、中立性、抵抗性アリル産物と比較して顕著に低いことを見出した。また、この過程で安定性に影響を与えるアミノ酸多型を同定し、その機能的、進化的意義を解析した。H26年度は、これらの成果について追加実験を行い、論文発表を行った。また、組換えタンパク質を用いたHLA-ペプチド結合測定系、および、細胞表面へのHLAクラスIIタンパク質発現量を指標としたHLA-ペプチド結合測定系を用い、ナルコレプシー感受性と関連するHLA-DQアリル(HLA-DQA1*01:02-DQB1*06:02)産物が結合しうる領域を、オレキシンタンパク質を対象として検索した。HLAクラスIIは多くの自己免疫疾患、感染症の最も強い遺伝要因である。しかし、そのメカニズムは解明されていない。この最も顕著な例はナルコレプシーである。ナルコレプシーでは患者のほぼ100%が同一のHLAクラスIIアリルを持ち、ゲノムワイド関連解析でもHLAクラスIIとの顕著に強い関連が認められる。しかし、未だに自己抗原同定に至っていない。本研究はナルコレプシー、及び、同様にHLAクラスIIが最も大きい遺伝要因である一型糖尿病、慢性B型肝炎の病態機序解明を目的とする。具体的には病態に関与するペプチドの同定を目標としている。また、提示抗原が既知であるインスリン自己免疫症候群(IAS)を対象として、組換えHLAタンパク質の高密度発現系の構築・HLAテトラマー作成系の確立を行う。平成24年度は、ペプチド結合測定系の確立、及びナルコレプシーに関与する自己抗原の探索を行った。ペプチド結合測定系については、一型糖尿病を対象として、哺乳類安定発現株細胞抽出分画を用いたペプチド結合アッセイ系を構築した。一型糖尿病発症に関与することが報告されているZnT8タンパク質について合成ペプチドライブラリーを作成し、この系を用いてDR9アリル産物が結合するペプチドの探索を行った。
GPR15に着目した難治性消化器癌に対する新規治療法の開発

本研究は、リコンビナントトロンボモジュリン(rTM)がG-protein coupled receptor 15(GPR15)を介した難治性消化器癌に対する抗腫瘍効果とそのメカニズムを解明し、難治性消化器癌の新しい治療法を開発することを目的とする。また、rTMは現在本邦においてDIC治療薬として広く使用されている薬剤なので、本研究をもとに速やかにrTMを難治性消化器癌の新規治療薬として臨床応用ができると見込まれる。
高齢者住民が地域に住み続ける為のマルチメディア利用とユーザーネットワーク化

2年度で、大阪府下の各市町村に存在する高齢者の介護や福祉等サービスを行っている施設のデーターベース作成を試みた。施設側も利用者側もの双方向性になる様に、データーのテンプテートを作成し、データーのサーバーの管理のみを申請者とその研究協力者が行い、インターネット上で操作できる様にした。但し初年度は未だ介護保険も施行されていなかったので、大学と医師会のイントラネット内で試行した。翌年からはインターネット上で施設側は操作可能にし、利用者側は広く検索閲覧できる様にした。大阪府下276施設のデーターを入力されており、以下のサイトで検索閲覧出来る<http://scorpion.yurin.or.jp/kaigoasp>___-.このデータベースには、施設の一次資料として施設名称、所在地、連絡、管理者名等で、交通アクセス等の紹介もされ、276施設は大阪府庁の公表資料より作成した。二次資料は各施設が提供する介護・福祉サービスメニュー(訪問介護・看護、入浴介護、福祉用具貸与等の有無、生活介護等)の他に、実施されている場合は訪問診療や歯科訪問診療等の医療サービスの有無等、その受け入れ人数やその特色、施設勤務者の職種別人数等である。これは協力を得られた施設からの情報で、一部施設では、申請者が訪問し、実施を確認したが評価はしていない。実施を確認した施設では、実際のサービス内容を、静止画像及び動面で記録し、紹介という形で三次資料として充実を図った。無論、この三次資料まで全てインターネットで閲覧出来る。各施設特有のIDとPasswordを与え、申請者が管理するデーターベースのサーバーコンピューターにインターネット経由でアクセスし、リアルタイムで追加更新が理論的にも実際的にも出来ることになっている。しかし、公私立の施設間で、データー充実の協力に温度差が二次資料の拡充の頃より生じた。また、施設間のIT技術の整備とIT技能の格差が顕著で、その格差自身が話題となり協力体制に大きな歪みを生じ、データーベース充実が不十分のまま残っている。2000年4月からの介護保険が実施開始されると、地域での高齢者への介護・福祉関連の施設が何処にあり、どの程度の規模で、スタッフはどのくらいいて、どの様なサービスがいつどの位の人数提供されているか、またその手続き等はどうなっているかの情報の開示はますます重要になる。そして、その整備状況やサービスの質や量は住民、特に高齢者と同居する家族、あるいは高齢者と離れて暮らす家族には関心が高い。そこで、1999年6月末時点で大阪府下の各市町村に存在する高齢者の介護や福祉等サービスを行っていると思われる施設(特別養護老人ホーム等、老人保健施設等、訪問看護ステーション等)のデーターベース作成へのご協力依頼の趣意書と共に各種データー項目への記載票を発送し、その回収を以って検索型データーをMicrosoft社のAccessで作成した。現時点で大阪府下276施設のデーターを入力し、http://scorpion.yurin.or.jp/kaigoaspで検索閲覧出来るようインターネットへupした。施設住所や交通アクセス、施設概観、管理者等の紹介の他、介護・福祉サービスメニューの受け入れ人数やその特色、施設勤務者の職種別人数等が閲覧出来る。一部施設では、介護サービス風景の動画も見る事が出来る。現時点ではこれらのデーターは科研申請代表者である中園が入力し、追加更新しているが、夫々の施設から直接入力が出来、データーの追加更新が出来るようにプログラムされている。即ち、この276施設にはID,Passwordを与え、中園が管理するデーターベースサーバーにインターネット経由でアクセスし、リアルタイムで追加更新が出来ることになっている。現在、試験的に、中園らの守口市と研究協力者である大阪市城東区医師会および大阪市住吉区医師会ではデーターベースの画像、動画とも各施設より追加更新が可能であることが確かめられている。

しかし、公私立の施設間で、データー充実の協力に温度差が二次資料の拡充の頃より生じた。また、施設間のIT技術の整備とIT技能の格差が顕著で、その格差自身が話題となり協力体制に大きな歪みを生じ、データーベース充実が不十分のまま残っている。
大脳皮質5層・6層錐体細胞の生後発達

生後3日(P3)、P12、P28の子ラットを断頭し、脳を取り出し、液体窒素で冷やしたイソペンタンで冷凍した。クリオスタットで10μmの切片を作り、ライカのフォイル付スライドグラスに貼り、トルイジンブルー溶液で染色した。スライドグラスをLasermicrodissection systemに載せ、2つの大脳皮質領域(辺縁新皮質の代表として、帯状回後部皮質、一次感覚野の代表としてバレル皮質)の5層、およびコントロールとして2層を、レーザーマイクロダイセクション法を用いて、キアゲン社RNAeasy Mini KitのRLT bufferを入れたカップに回収した。RNAeasy kitのプロトコールに従い、RNAを抽出した。一部の溶液でアジレント2100バイオアナライザーを用いてRNAの質を確認した。良好な結果がえられたことを確認後、RNA溶液を2回amplifyした。アジレント社のbiotin direct label kitを用いて、kitのプロトコールに従いRNAをbiotin標識した。Biotin-LabeledしたcRNAサンプルをアフィメトリックス社rat GeneChipにHybridizationした後、Fluidics Station 400で洗浄、染色後GeneArray Scannerで蛍光を読み取った。これをGenechip解析ソフト、Genespringで解析し、各年齢、各領域、各層で特異的に発現している遺伝子が多数見つかった。その後、確認としていくかの遺伝子をin situ hybridizationを行い、かなりの一致が見られた。解析により、NT3、Fatなどの遺伝子が後部帯状回の2層のP3で特異的に発現していることを見いだした。この遺伝子の機能を調べるために、NT3をバレル皮質の2層に電気穿孔法を用い導入したところ、バレルの2層の細胞の錐体細胞の樹状突起が、帯状回の2層の細胞のように束を作ることを見いだした。このことはNT3が2層の錐体細胞の樹状突起の束の形成に重要であることを示していると考えら得る。本年度は、予定の通り生後3日(P3)、P12、P28の子ラットを断頭し、脳を取り出し、液体窒素で冷やしたイソペンタンで冷凍した。スライドグラスをLasermicrodissection systemに載せ、2つの大脳皮質領域(辺縁新皮質の代表として、帯状回後部皮質、一次感覚野の代表としてバレル皮質)の5層、およびコントロールとして2層を、レーザーマイクロダイセクション法を用いて、キアゲン社RNAeasy Mini KitのRLTbufferを入れたカップに回収した。Biotin-LabeledしたcRNAサンプルをアフィメトリックス社rat GeneChipにHybridizationした後、Fluidics Station400で洗浄、染色後GeneArray Scannerで蛍光を読み取った。その後、確認としていくつかの遺伝子をin situ hybridizationを行い、かなりの一致が見られた。解析を続行するとともに、これらの遺伝子を強制発現させたり、RNAi法を用いて、マニピュレーションを行い、遺伝子の機能解析をスタートさせている。

本年度は、昨年に引き続き予定の通り生後3日(P3),P12,P28の子ラットを断頭し、脳を取り出し,液体窒素で冷やしたイソペンタンで冷凍した。クリオスタットで10μmの切片を作り、ライカのフォイル付スライドグラスに貼り、トルイジンブルー溶液で染色した。スライドグラスをLasermicrodissection systemに載せ、2つの大脳皮質領域(辺縁新皮質の代表として、帯状回後部皮質、一次感覚野の代表としてバレル皮質)の5層、およびコントロールとして2層を、レーザーマイクロダイセクション法を用いて、キアゲン社RNAeasy Mini KitのRLT bufferを入れたカップに回収した。RNAeasy kitのプロトコールに従い、RNAを抽出した。一部の溶液でアジレント2100バイオアナライザーを用いてRNAの質を確認した。良好な結果がえられたことを確認後、RNA溶液を2回amplifyした。アジレント社のbiotin direct label kitを用いて、kitのプロトコールに従いRNAをbiotin標識した。Biotin-LabeledしたcRNAサンプルをアフィメトリックス社rat GeneChipにHybridizationした後、Fluidics Station 400で洗浄、染色後GeneArray Scannerで蛍光を読み取った。これをGenechip解析ソフト、Genespringで解析し、各年齢、各領域、各層で特異的に発現している遺伝子が多数見つかった。その後、確認としていくつかの遺伝子をin situ hybridizationを行い、かなりの一致が見られた。解析により、NT3、Fatなどの遺伝子が後部帯状回の2層のP3で特異的に発現していることを見いだした。この遺伝子の機能を調べるために、NT3をバレル皮質の2層に電気穿孔法を用いて導入したところ、バレルの2層の細胞の錐体細胞の樹状突起が、帯状回の2層の細胞のように束を作ることを見いだした。このことはNT3が2層の錐体細胞の樹状突起の束の形成に重要であることを示していると考えら得る。
肝癌部のC型肝炎ウイルスの発癌における役割

目的)C型肝炎ウイルス(HCV)感染における発癌機構、特にHCV自身が発癌性を有するのか否かは不明である。著者らは、肝細胞癌症例の肝組織(癌部、非癌部)において(-)鎖HCV-RNAを検索し、癌部において、非癌部と等量のHCV-RNAを認めた。そこで癌部より抽出したHCV-RNAの性状(genotype及びRNA polymeraseをコードすると思われるNS5部の塩基配列)を決定し、非癌部のHCV-RNAと比較し、HCV-RNA自身が発癌と関連しているか否かを検討した。方法)対象はHCV陽性肝細胞癌症例5例の癌部及び非癌部である。対照として、C型慢性肝炎6例において斑紋部を狙撃生検し、非斑紋部と比較検討した。肝組織内HCV-RNAの性状の検索として、(1)腹腔鏡、手術あるいは剖検により得られた凍結肝組織の癌部及び非癌部よりRNAを抽出し、(2)HCV-RNAのウイルス量を、RT-PCRを用いた半定量法で測定した。(3)HCV-RNAのgenotypeを決定した(岡本の方法)。(4)HCV-RNA(NS5部nt 7966-8481)の塩基配列をPCR後、direct sequencing法で決定した。成績)対象の4例において、HCV genotypeは、II型3例、III型1例であり、血中、癌部、非癌部間で同一であった。HCVの塩基配列を検討した1例において、癌部、非癌部間で1カ所のみ塩基置換を認めた。対照群においては、肝組織中HCV-RNA量は、(+)鎖は5例、(-)鎖は2例において、斑紋部で非斑紋部に比べ減少していた(1/10-1/1000)。しかし、両部から得られたHCVの塩基配列は差を認めなかった。結論)肝癌部と非癌部のC型肝炎ウイルスは、その性状に差を認めず、肝癌部に存在するHCV自身に発癌性は乏しいと思われた。
複雑形状管内の非接触駆動研磨除染方式の考案と装置の開発に関する研究

微粒子あるいは気泡が音波の定在波のノードの位置に捕捉される現象は,音響浮揚(Acoustic Levitation)として,以前から広く知られている.音波をエネルギ源に物質の浮揚,移動が非接触で可能で,化学やバイオの分野において音響浮揚技術の応用が広がりつつある.本研究では,この音響浮揚技術を用いて,非接触で粒状除染剤を駆動し,制御可能な運動を与えて,原発の配管内面のようなアクセスが極めて困難な箇所のクリーニングや除染を行なうと同時に,除染後の汚染物質分別・分級を行う方法の考案と装置の開発を目指している.本研究は,音響浮揚(Acoustic Levitation)の原理に基づいて,音波をエネルギ源にして,非接触で粒状除染剤を駆動し,制御可能な運動を与えて複雑形状の管内の研磨・除染および分離・分級を行なう方法の考案及び装置の開発を目指す.本年度前半では,まず音響浮揚に関する理論式を見直し,定在波の生成条件及び浮揚力を高精度で計算できるようになった.次に昨年度に開発したツイン振動子からなる第2世代音響浮揚システムが生成した音響場における音圧及び粒子速度を計測し,音響場の可視化を行った.その結果,従来の単振動子音響浮揚システムに比較して,1)音波減衰に影響されにくく,良質の定在波が形成できること,2)多重反射による音響の強度が1/(1-β)「β<1:減衰率」に比例して大きくなることを明らかにした.この装置を使って,直径3.0mm,密度2.6g/cm^3のガラス玉を浮揚させることができた.管内の研磨・除染において,汚染物質を高精度で分離・分級することが求められている.本年度後半では,開発したツイン振動子音響浮揚装置を微粒子の分級に応用した.1)振動子出力(振幅、周波数),2)微粒子のサイズ,3)微粒子の密度,4)微粒子の初期位置と速度が音響場における微粒子の運動軌跡に与える影響を理論的,実験的に明らかにした.最後に,実験を通して,50μmまでの微粒子について粒径にかかわらず,物質の密度(種類)のみによる分級を連続的に行うことを実証した.微粒子あるいは気泡が音波の定在波のノードの位置に捕捉される現象は,音響浮揚(Acoustic Levitation)として,以前から広く知られている.音波をエネルギ源に物質の浮揚,移動が非接触で可能で,化学やバイオの分野において音響浮揚技術の応用が広がりつつある.本研究では,この音響浮揚技術を用いて,非接触で粒状除染剤を駆動し,制御可能な運動を与えて,原発の配管内面のようなアクセスが極めて困難な箇所のクリーニングや除染を行なうと同時に,除染後の汚染物質分別・分級を行う方法の考案と装置の開発を目指している.本研究は,音響浮揚(Acoustic Levitation)の原理に基づいて,音のエネルギーにより非接触で粒状除染剤を駆動し,制御可能な運動を与えて複雑形状の管内の研磨・除染を行なう方法の考案及び装置の開発を目指す.本提案の加工法は音波を介して非接触で砥粒に運動エネルギーを与えるため,砥粒及び工作物の材質に制約がなく,これまで培った砥粒加工のノウハウがフルに活用できる.さらに機械運動機構が必要としないため,加工装置が簡単かつ小型になり,特に原発の配管内面のようなアクセスが極めて困難な箇所のクリーニングや除染が可能になると期待される.本年度では,位相シフトが可能な第2世代の実験装置の開発を中心に,以下の研究課題を取り組んだ.1)音響理論に基づいて放射と反射による多重反射による定在波の生成条件を明らかにし,速度ポテンシャル場から得られる浮揚力の理論計算を行った.2)コンフィギュレーションについては,単一振動源(放射板/反射板の組合せ)と位相シフト可能なツイン振動源(放射板/放射板の組合せ)を比較し,定在波生成および浮揚力における後者の優位性を明らかにした.3)上記の理論計算に基づいて,単一振動子およびツイン振動子からなる実験装置を2台設計・製作した.4)粒子の浮揚及び位置制御に関しては,理論計算とほぼ同じ結果を実験より確認した.5)一方,浮揚粒子のサイズ及び比重の閾値においては,理論値と実験地の隔たりが大きく,次年度の研究指針を得ることができた.実験計画に従って,音響理論に基づいて放射と反射による多重位相を持つ音波の定在波形成条件およびその速度ポテンシャル場の理論計算を行い,浮揚条件などを明らかにした.また,配管内面研磨を想定したテスト用装置を設計し,単一振動源(放射板/反射板の組合せ),位相シフトが可能なツインの振動源(放射板/放射板の組合せ)からなる実験装置を2台制作・開発し,その動作確認をした.上記の研究成果を国内外の学会で公表した.H25年度前半には,上記開発した加工装置に実際の粒子を実装して,浮揚実験および砥粒運動の制御とその計測を行なう.まず,砥粒の浮揚及び運動に対する1)振動子出力(振幅、周波数)の影響,2)工作物形状の影響,3)媒体(気体,液体)の影響について調べて,特に画像処理技術を駆使して砥粒運動軌跡を計測し,その制御因子を抽出する.また実験結果と上記シミュレーション結果により砥粒の浮揚及び運動制御条件の最適化を行なう.

H25年度後半には,実際に配管内面研磨加工実験を行い,除去率,表面品位などの研磨加工結果について評価する.一方,加工結果に及ぼす加工条件の影響を解明するとともに,本加工方式における除去メカニズムを考察し,今後の研究の方向付けを行なう.当初想定していた超磁歪(GMM)振動子をランジュバン型に変更したため,H24年度20万円ほどの残高が生じた.一方,H25年度には,開発した2台の実験装置を使って配管内面の除染・洗浄実験を行う予定のため,工作物の配管,砥粒などの消耗品にかかる費用が増えると予想される.前年度の残金を消耗品費に充てる予定である.
純化PGCライブラリーを用いた生殖系列遺伝子発現の研究

生物を構成する細胞の中で生殖細胞は唯一、次世代に受け継がれると言う意味で不死であり、また全能性を有するという点で、非可逆的な分化を行う体細胞とは大きく異なり、生物種の存続、進化を考える上で非常に重要な細胞である.しかし、その分子的実体の殆どが不明である.これは、生殖系列の各ステージでどのような遺伝子が発現するかという基本的知見の欠如に起因するところ大である.そこで、本研究では、始原生殖細胞(Primordial Germ Cell;PGC)を純化単離し、そこに発現する遺伝子を網羅し、他の細胞と比較することによって生殖系列発生過程に発現し、利用される遺伝情報を明らかにし、始原生殖細胞の成立、維持、その属性を規定するための遺伝子的基礎を追究していくことを目的とする.今年度はOct-GFPトランスジェニックマウスの胎生11.5日,12.5日,13.5日の雌雄胚それぞれからPGCを単離し,ライブラリーを作製し,各ライブラリーから1万クローン,計6万クローンをピックアップしタイタープレート中に凍結保存した.これらのクローンを用いて、高密度にコロニーを整列させたmacroarray blotを作製した.また、TNAPマウス由来の胎生13.5日雌雄PGC cDNAクローンの配列決定を行った.この配列情報を用いて詳細なcDNA解析を行った.(nr)データベースに対するblastn(核酸配列レベルの検索)検索の結果、既知909,既知遺伝子に相同性のあるもの261,相同性のないもの356,計1526,これを自己相同性検索にかけると,それぞれ286,247,343,計876となり,redundantなもののほとんどが既知のものに集中していることがわかる.既知配列を除いた未知の549配列を用いてblastx(アミノ酸配列レベルの検索)で検索したところ,185は既知のものと(他生物種の遺伝子を含む)相同性が認められた.blastxでも未知のもののうち202クローンをESTデータベースに対して検索を行ったところ、164は様々なライブラリー由来のESTに対して相同性が認められた.その結果、全く新規な配列は38となった.生物を構成する細胞の中で生殖細胞は唯一、次世代に受け継がれると言う意味で不死であり、また全能性を有するという点で、非可逆的な分化を行う体細胞とは大きく異なり、生物種の存続、進化を考える上で非常に重要な細胞である.しかし、その分子的実体の殆どが不明である.これは、生殖系列の各ステージでどのような遺伝子が発現するかという基本的知見の欠如に起因するところ大である.そこで、本研究では、始原生殖細胞(Primordial Germ Cell;PGC)を純化単離し、そこに発現する遺伝子を網羅し、他の細胞と比較することによって生殖系列発生過程に発現し、利用される遺伝情報を明らかにし、始原生殖細胞の成立、維持、その属性を規定するための遺伝子的基礎を追究していくことを目的とする.今年度はOct-GFPトランスジェニックマウスの胎生11.5日,12.5日,13.5日の雌雄胚それぞれからPGCを単離し,ライブラリーを作製し,各ライブラリーから1万クローン,計6万クローンをピックアップしタイタープレート中に凍結保存した.これらのクローンを用いて、高密度にコロニーを整列させたmacroarray blotを作製した.また、TNAPマウス由来の胎生13.5日雌雄PGC cDNAクローンの配列決定を行った.この配列情報を用いて詳細なcDNA解析を行った.(nr)データベースに対するblastn(核酸配列レベルの検索)検索の結果、既知909,既知遺伝子に相同性のあるもの261,相同性のないもの356,計1526,これを自己相同性検索にかけると,それぞれ286,247,343,計876となり,redundantなもののほとんどが既知のものに集中していることがわかる.既知配列を除いた未知の549配列を用いてblastx(アミノ酸配列レベルの検索)で検索したところ,185は既知のものと(他生物種の遺伝子を含む)相同性が認められた.blastxでも未知のもののうち202クローンをESTデータベースに対して検索を行ったところ、164は様々なライブラリー由来のESTに対して相同性が認められた.その結果、全く新規な配列は38となった.
癌細胞および正常細胞における熱ショック蛋白質発現機構とその修飾因子に関する研究

当研究班の目的は、温熱療法の際に出現する熱耐性の機構を探り、それを基礎として熱耐性誘導を抑えること、もって温熱療法のより効果的な運用方法を探ることにある。そのような目的のため、熱耐性を担っていると考えられている熱ショック蛋白質に焦点を絞り、熱ショック蛋白質の誘導機構、また熱ショック蛋白質の誘導阻止、および温熱感受性の修飾剤の効果を探ることを当面の目標にしている。本年度の成果として、次のようなものがあげられる。植物フラボノイドの一種が、熱ショック蛋白質の発現を特異的に阻害することを発見した。誘導剤の報告は多いものの、阻害剤についてはこれまで報告されたことがなく、温熱療法の効果的運用という側面からきわめて興味深い。今後、このフラボノイドが熱耐性の誘導を抑えるか否かについて検討を加える予定である。新しい2つhsp(hsp37,hsp40)が見つかった。また、主要hspであるhsp70を発現していない変異株が分離され、hspと温熱耐性との関係をさぐる上で、興味深い細胞になると期待される。また、細胞質のステロイドホルモン受容体がhsp90を介してアクチンと相互作用することが示され、遺伝子発現におけるhsp90の重要性が再確認された。hspが温熱耐性発現にどの様な機構で関与するのか、またそれを抑えるには何が有効なのかを、今後も検討していきたい。