hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞情報伝達における3量体G蛋白質の生理的役割

芳賀達也はムスカリン受容体の受容体キナーゼによるリン酸化がアゴニストだけでなくβγによっても促進されること、されはβγと受容体蛋白質との会合の結果であることを示した。浅野富子はγの遊離型とイソプレニル化型を分離精製することに成功した。一方、中畑則道はマストパランによるホスホリパーゼCの抑制におけるGiの関与について興味ある知見を得ている。宇井は、従来3量体G蛋白質が介在しないとされていた蛋白質チロシン残基リン酸化系で中心的役割を果すPI-3-キナーゼがG蛋白質を介して活性化されることを証明した。この証明は、好中球でG刺激に対する活性酸素生成応答を特異的に抑える糸状菌産生物ワートマニンの作用点としてPI-3-キナーゼを同定したことによる。新しいG蛋白質プローブの誕生である。既に確立したG蛋白質プローブである百日咳毒素を用いて、堅田はレチノイン酸が誘導する因子がG蛋白質を介してHL60細胞を分化することを見出した。シナプス可塑性の本体である神経細胞の分化に関してもG蛋白質の介在は野村によってPC12細胞において証明された。受容体、G蛋白質、効果器3者の共役のメカニズムについては、ホスホリパーゼCとDの活性化に関しては野沢が、また逆にホスホリパーゼCの抑制という珍らしい現象については中畑が、さらに、アデノシン受容体を介するホスホリパーゼA活性化系については岡島が、それぞれ細胞レベルで詳細に検討し、多くの新知見を得た。分子レベルの検討のため、市川はプロスタグランジンEの3種のサブタイプをすべてクローニングし、そのアミノ酸配列を明らかにし、それぞれに共役するG蛋白質と効果器系を同定した。芳賀はこの種の受容体とG蛋白質との共役を生理的に修飾する受容体キナーゼを精製し、リコンビナントのムスカリン受容体を基質として、このキナーゼが共役するG蛋白質のbetagammaサブユニットによって活性化されるというユニークな知見を得た。このbetagamma複合体のイソ体の発見とその精製、cDNAクローニング、機能的差異の検討は浅野によって行われた。G蛋白質の活性化に関与するNDPキナーゼに関する木村の詳細な研究とともに、受容体G蛋白質効果器の機能調節の分子機構の解明に、本研究班は顕著な貢献をしたものと評価されよう。
視覚障害者のスポーツ競技支援のための音響学的研究と訓練用アプリケーションの開発

2018年度は以下の3項目に取り組んだ.1)遠距離(数10m以下)からの到来音の訓練システム開発のための音響環境計測:特にゴールボールとブラインドサッカーを取り上げた.前者においては,ダミーヘッドマイクで録音されたボールの接近音を分析した.この際,ゴールボール競技経験者において,自身のどちらを通過しうるかを判定してもらった.この結果,自身の右側から左側,左側から右側にボールが移動するケースで判定が困難になることがわかった.一方で,ブラインドサッカーにおいては,まず日本代表チーム選手における聴力検査を実施し,単純な聴力では晴眼者と変わらないことを示した.また,競技環境の音響計測を行い訓練システム開発のための基礎データを得た.2)近距離(約5m以下)における到来音の訓練システムの開発:特にサウンドテーブルテニス(STT)を取り上げた.まずダミーヘッドマイクでサーブをレシーブする際のボールの到来音を計測し,ランダム提示する訓練システムを開発した.このシステムでは,自身の左右いずれに到来するか,レシーブすべきか見送るべきかを判定してもらうものである.STT経験者において,このシステムを繰り返して使ってもらった結果,左右の判定およびボールをレシーブすべきかの判定能力が向上することがわかった.VR空間での音源定位訓練結果が,実空間での音源定位能力の向上に寄与するという報告があるため,本システムによる訓練によってSTTにおける音源定位能力の向上の可能性が示された.3)密接距離(約1m以下)における訓練システムの開発:特にブラインドクライミングを取り上げた.最初に競技者にインタビューを行った結果,登攀コースが音で伝えられるため,わかりにくいケースがあると分かった.このため,点図ディスプレイと力覚提示システムを組合せた登攀コースの教示システムを開発し予備評価を行った.既に計画段階で提案した遠距離・近距離における音訓練システムの開発・評価を済ませており,密接距離においては音訓練ではないものの触覚提示を用いた訓練支援システムの開発・予備評価が出来ているため.また,当初の計画では想定していなかったブラインドサッカー競技での計測が行えたことの他,晴眼者における聴覚利用(バレーボール競技を取り上げた)についても検討できた.以上から,現状では当初想定した計画以上の進展があると評価できる.今後は,当初想定した3課題に加えて,4つ目の課題を加えることとする.具体的な実施内容は以下を想定している:1)遠距離(数10m以下)からの到来音の訓練システム開発のための音響環境計測:特にブラインドサッカー競技における聴覚訓練要素の抽出を行った上で,ブラインドサッカー競技者を想定した訓練支援システムの試作を行う.2)近距離(約5m以下)における到来音の訓練システムの開発:訓練システム上で特に効果があった場合や訓練に難があったケースなどを分析する.次に,音環境のバーチャルな作成が可能であるかについて確認する.この際,ヘッドホン・パソコン(またはスマートフォン)など普及型デバイスで稼働できる装置で稼働できるものでの作成を検討する.3)密接距離(約1m以下)における訓練システムの開発:前年度に開発したブラインドクライミング支援システムの評価を実施する.その上で,効果的な訓練を行うための改善要素を抽出し,システムの改良を試みる.4)晴眼者におけるスポーツ時の聴覚利用の検討:前年度にバレーボール競技における聴覚利用について検討した.今年度も引き続きこの際に得られたデータを追加で分析し,視覚障害者のみならず晴眼者においても,聴覚訓練による競技力向上要素がある点を示したい.2018年度は以下の3項目に取り組んだ.1)遠距離(数10m以下)からの到来音の訓練システム開発のための音響環境計測:特にゴールボールとブラインドサッカーを取り上げた.前者においては,ダミーヘッドマイクで録音されたボールの接近音を分析した.この際,ゴールボール競技経験者において,自身のどちらを通過しうるかを判定してもらった.この結果,自身の右側から左側,左側から右側にボールが移動するケースで判定が困難になることがわかった.一方で,ブラインドサッカーにおいては,まず日本代表チーム選手における聴力検査を実施し,単純な聴力では晴眼者と変わらないことを示した.また,競技環境の音響計測を行い訓練システム開発のための基礎データを得た.2)近距離(約5m以下)における到来音の訓練システムの開発:特にサウンドテーブルテニス(STT)を取り上げた.まずダミーヘッドマイクでサーブをレシーブする際のボールの到来音を計測し,ランダム提示する訓練システムを開発した.このシステムでは,自身の左右いずれに到来するか,レシーブすべきか見送るべきかを判定してもらうものである.STT経験者において,このシステムを繰り返して使ってもらった結果,左右の判定およびボールをレシーブすべきかの判定能力が向上することがわかった.VR空間での音源定位訓練結果が,実空間での音源定位能力の向上に寄与するという報告があるため,本システムによる訓練によってSTTにおける音源定位能力の向上の可能性が示された.3)密接距離(約1m以下)における訓練システムの開発:特にブラインドクライミングを取り上げた.最初に競技者にインタビューを行った結果,登攀コースが音で伝えられるため,わかりにくいケースがあると分かった.このため,点図ディスプレイと力覚提示システムを組合せた登攀コースの教示システムを開発し予備評価を行った.

既に計画段階で提案した遠距離・近距離における音訓練システムの開発・評価を済ませており,密接距離においては音訓練ではないものの触覚提示を用いた訓練支援システムの開発・予備評価が出来ているため.また,当初の計画では想定していなかったブラインドサッカー競技での計測が行えたことの他,晴眼者における聴覚利用(バレーボール競技を取り上げた)についても検討できた.以上から,現状では当初想定した計画以上の進展があると評価できる.今後は,当初想定した3課題に加えて,4つ目の課題を加えることとする.具体的な実施内容は以下を想定している:1)遠距離(数10m以下)からの到来音の訓練システム開発のための音響環境計測:特にブラインドサッカー競技における聴覚訓練要素の抽出を行った上で,ブラインドサッカー競技者を想定した訓練支援システムの試作を行う.2)近距離(約5m以下)における到来音の訓練システムの開発:訓練システム上で特に効果があった場合や訓練に難があったケースなどを分析する.次に,音環境のバーチャルな作成が可能であるかについて確認する.この際,ヘッドホン・パソコン(またはスマートフォン)など普及型デバイスで稼働できる装置で稼働できるものでの作成を検討する.3)密接距離(約1m以下)における訓練システムの開発:前年度に開発したブラインドクライミング支援システムの評価を実施する.その上で,効果的な訓練を行うための改善要素を抽出し,システムの改良を試みる.4)晴眼者におけるスポーツ時の聴覚利用の検討:前年度にバレーボール競技における聴覚利用について検討した.今年度も引き続きこの際に得られたデータを追加で分析し,視覚障害者のみならず晴眼者においても,聴覚訓練による競技力向上要素がある点を示したい.国際学会旅費の削減ができたことが原因の一つである.本研究の実績であるICCHP 2018での発表の際,他のプロジェクトの研究と共に採録されたため,この際にそちらの予算を使用したのが理由である.
メリステム形成と分化を制御する「場」及び「時」の情報伝達分子機構

サイトカイニン受容体AHK4の変異株を用いて、「サイトカイニン→受容体Hisキナーゼ→His-Aspリン酸リレー情報伝達→A型ARRsの誘導」に関して解析した。その結果、10種類のA型ARRのサイトカイニンによる転写誘導の中でARR15及びARR16のそれはAHK4に依存しており、この情報伝達経路の下流にリンクしている可能性が示唆された。また、プロモーター::GUS及び、LUC融合体を作製し解析した結果、ARR15及びARR16はAHK4と同様、根でそれらの産物が蓄積していることと、細胞内ではARR15は核にARR16は細胞質に局在していることが示唆された。11種類のB型ARRの内、ARR11に焦点をあてて解析した。その結果、ARR11はリン酸化されたAHPからリン酸基転移を受けることと、DNA上の特異的な配列(GGATT)を認識して結合することがin vitroで示された。ARR11は主として根で発現が高いことが観察された。ARR11のレシーバードメインを欠いたC末端側のDNA結合ドメインを構成的に発現させた植物体を作製したところ、子葉における組織分化異常や子葉近縁からの不定芽の形成を含む形態異常が観察されることを見出した。APRRクインッテットにおいて最初に発現ピークを迎え、光によって誘導される性質をもつAPRR9、発現ピークがクインテットの中心に位置するAPRR5の構成的発現体をそれぞれ作製し解析した結果、時計支配下の因子CAB2や時計調節因子ELF3に加えて、時計因子CCA1,LHY, APRR1/TOC1並びに他のAPRR因子群においてもその発現振動が異常になることを見出した。また、これらの構成的発現体は明暗サイクルに依存せず花成が顕著に促進されることを見出した。さらに、これら構成的発現体の芽生えにおいて赤色光に対する感受性が増加していることを見出した。
成熟霊長類の脳のどの部位にオリゴデンドロサイトの未分化細胞は存在しているか?

成熟霊長類の脳内におけるオリゴデンドロサイトの未熟細胞の存在の可能性について、未熟なオリゴデンドロサイトを認識する各種の抗体を用いて免疫組織化学的に検討した。実験には成長したサルを実験動物として用いた。成熟サルを麻酔した後に屠殺し、脳を取り出して4%パラホルムアルデヒドで固定した後、脳室を含む前脳部分について前頭断凍結切片(厚さ10μm)を作製した。前年度に齧歯類のオリゴデンドロサイトを認識するモノクローナル抗体を用いて検索した結果をもとに、さらに陽性細胞の存在について検討を加えた。ラット脳の髄鞘部分の一部に特異的に反応する抗体については、サル脳においても同様に陽性反応を示すことが分かった。しかし、ラット脳においてオリゴデンドロサイトを未熟なものから成熟型にいたる段階を捉えることが分かった抗体が、サル脳においても同様な所見を示すかどうかについて、さらに固定液の変更などによって抗原を検出できるかの可能性を検討してみたが、確実な陽性所見を得ることができなかった。また、ステロイド代謝酵素である5α-リダクターゼに対する抗体を用いて、この酵素がサル脳においてもオリゴデンドロサイトに発現しているかどうかを検討したところ、多数の陽性細胞を検出することができた。細胞の形態などから、これらがオリゴデンドロサイトであると判断されたので、これら細胞の中に未熟なものが含まれているかどうかについて分裂期の細胞を認識する抗体を用いて検討したが、検出された5α-リダクターゼ陽性を示す細胞が分裂期であることを示す所見は現在までのところ得ていない。成熟霊長類として成長したサルを実験動物として用いて、脳内におけるオリゴデンドロサイトの未熟細胞の存在の可能性について、免疫組織化学的手法を用いて検討した。成熟サルの脳を、麻酔後に屠殺し、取り出した脳を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、脳室を含む前脳部分について厚さ10μmの前頭断凍結切片を作製した。免疫染色にはまず醤歯類のオリゴデンドロサイトを認識するモノクローナル抗体を用いて、陽性細胞を検索した。これらの抗体は、ラット脳においてオリゴデンドロサイトを未熟なものから成熟型にいたる段階を捉えることが分かっている。これらの抗体のうち、ラット脳の髄鞘部分の一部に特異的に反応する抗体が、サル脳においても同様に陽性反応を示すことが分かった。また、数は少ないが、陽性細胞も検出できた。他の抗体については、現在のところ、ラットで得られたような陽性反応を検出できていないが、固定液の変更ならびに抗原の賦活化などにより抗原を検出できるかどうかの可能性を検討しているところである。また、我々は、ステロイド代謝酵素である5α-リダクターゼが、オリゴデンドロサイトに発現することをラット脳において見出しているが、この酵素に対して作製した抗体を用いて検索したところ、サル脳内に多数の陽性細胞を検出することができた。細胞の形態等の所見から、これらがオリゴデンドロサイトであると判断された。これら検出された陽性細胞の内に、未熟なオリゴデンドロサイトが含まれているかどうかについて、現在検討しているところである。
NMR法を用いた精神分裂病・神経発達障害仮説の検証

本研究の目的は、NMR法を用いて分裂病患者脳における神経細胞膜の異常、脳内代謝の異常を探り、精神分裂病・神経発達障害仮説の検証することである。NMR測定には国立精神・神経センターにおいて開発された2テスラ・高磁場ヒト全身用NMR装置を使用した。ヒト脳の31P-NMRスペクトルでは線幅の広い成分が狭い成分に重乗するため、信号強度の定量性を損なわずにスペクトル分解能が向上するように、信号の後処理をNMR1ソフトを使い最適化した。0.3-30mMのリン酸のファントムを用いて、選択領域ISIS法(約125ml)で測定し、検量線を作成した(r=0.996)。対象は、健常人男性4名、女性5名の計9名である。前頭葉を選択領域(約125ml)に設定し、領域選択ISIS法を用いて31P-NMRを測定した。測定条件は、繰り返し時間3秒、加算回数1024回、全所要時間は約90分間である。細胞膜リン脂質の前駆物質であるフォスフォモノエステルの各構成成分であるα-グリセロフォスフェイト(α-GP)、フォスフォリルエタノールアミン(PE)、フォスフォリルコリン(PC)、崩壊物質フォスフォジエステルの各構成成分であるグリセロフォスフォリルエタノールアミン(GPE)、グリセロフォスフォリルコリン(GPC)、高エネルギーリン酸化合物であるフォスフォクレアチン(PCr)、α-、β-、γ-ATP、無機リン、の計10個のピークについて分析を行った。また、α-GP、PE、PC、GPE、GPC、PCr、等の水溶液(pH=7.0)を含むファントムを作成し、PCrを基準に化学シフト値を求めた。定量法はLuytenらの方法を基に改良を加えた。ピーク面積は非線形最小自乗法を用いたカーブフイッッテイングにより求めた。その際に、各々の化学シフト値を固定した。各成分のT1値は文献値を用い、飽和定数を求め強度を補正した。絶対濃度は、外部基準を仲介にして、10mMリン酸のファントムから被験者と同一の領域選択下で測定して得られた検量線から求めた。結果(mM、平均±標準偏差)は以下の通りであった。α-GP=0.11±0.02;PE=0.85±0.05;PC=0.75±0.04;Pi=1.56±0.06;GPE=1.21±0.05;GPC=1.37±0.06;PCr=3.26±0.11;ATP=2.23±0.08。PCr、Pi、ATP、の値は、文献値とよく一致した。従って、本研究によりはじめて分離定量されたα-GP、PE、PC、GPE、GPC、の値は妥当なものであると考えられる。分裂病の軽微な差異を検出するためには更なる精度が必要である。そのために、外部基準に緩和試薬を混入させることや、α-GP、PE、PC、GPE、GPC、各々のT1値と半値幅を求めることを検討している。α-GP=0.11±0.02;

PE=0.85±0.05;PC=0.75±0.04;Pi=1.56±0.06;GPE=1.21±0.05;GPC=1.37±0.06;PCr=3.26±0.11;ATP=2.23±0.08。PCr、Pi、ATP、の値は、文献値とよく一致した。従って、本研究によりはじめて分離定量されたα-GP、PE、PC、GPE、GPC、の値は妥当なものであると考えられる。分裂病の軽微な差異を検出するためには更なる精度が必要である。そのために、外部基準に緩和試薬を混入させることや、α-GP、PE、PC、GPE、GPC、各々のT1値と半値幅を求めることを検討している。
関数微分方程式の位相的及び解析的研究

1.区分的に定数である遅れ項をもった関数微分方程式に関する研究のまとめは次のようである。(1)解の振動性については,線形方程式に対して得られたアフタビザデ-・ウィ-ナ-・シュ-の結果を改良するなどの成果を得た。この最新の成果を10月に奈良で開催された関数微分方程式研究集会で口答発表した。(2)解の安定性と漸近挙動については,ラズミヒン法と独自の方法を用いて一様漸近安定性などについて成果を得た。これらは一部を島根大学理学部紀要に発表し,また別の一部を9月に京都で開催された関数微分方程式国際シンポジウムで口答発表した。(3)ヴォルテラ型積分微分方程式の非自明な周期解の存在と解の漸近挙動については研究を続行中である。2.レトラクト理論に関する研究では,σメトリックな層型空間について研究を続行中である。3.ファイバ-束のトポロジ-の一分野であるヤング・ミルズ場のトポロジ-に関する研究では,ホモトピ-論との関わりについて研究を続行中である。4.無限ネットワ-クに関する研究では,イデアル境界値成分に関する極値問題について成果を得た。5.数理続計学の分野では,微分幾何学的手法を用いて生物進化の統計学的研究を続行中である。同時に,一般共分散構造に対するテストに関する成果と,パラメ-タを含んだ試験統計の局所的パワ-比較に関する成果を得た。6.非線形発展方程式に関する研究では,バナハ空間における非線形ヴォルテラ方程式の解の非有界な挙動と収束性に関して成果を得た。また非線形発展方程式に対する線形化原理について研究を続行中である。
ユニバーサル接着システムにおけるリン酸処理に代わる新規歯質処理材の開発

昨年度に得られた知見を国内学会にて発表し、またそれらを元に研究を発展させた。一般に歯科接着材料は、むし歯治療を想定した「切削面」を被着面とする事が多く、昨年度の研究も切削面をターゲットとした研究を行った。一方で近年の歯科臨床においては、より侵襲の低い治療を提供するために、むし歯の除去を必要としない審美領域の治療において、歯質の切削を行わずに歯科接着技術に頼った治療を行うことがある。しかし、歯質の一番外層にあたる部分は、耐酸性に優れ、歯科接着材の接着を確立することが難しいとされる。そこで本年度は「非切削」の歯質をターゲットとして研究を行った。非切削エナメル質と歯科接着材との接着界面を、脱灰液に浸漬することで得られる2次う蝕モデル試料を作製、走査電子顕微鏡で観察した結果、有機酸を主成分とした新規歯面処理材は、従来のリン酸を主成分とした処理材とは異なる接着界面を形成する可能性が示唆された。また、被着面のターゲットをエナメル質から象牙質へ拡大した研究も行った。従来よりリン酸処理材は象牙質の過脱灰を招き、接着に不利に作用すると報告されている。電子顕微鏡を用いた界面観察およびウシ歯を用いた接着強さ試験の結果、有機酸を主成分とする新規処理材はリン酸よりマイルドな脱灰のため、象牙質に過脱灰を引き起こさないこと、また接着強さ・接着界面に不利な挙動を示さないことが確認された。臨床において、リン酸処理材を象牙質へは触れさせずにエナメル質のみに塗布する手技は術者の技量に依存する部分が大きかったが、新規材料は象牙質へ不利に働かないため、このような繊細な手技を必要とせず、被着面のエナメル質・象牙質を一括に処理して構わないという術者のエラーを引き起こしにくい材料であることが確認された。本研究課題に関連する学会発表を4報、国際学術雑誌での発表を5報行った。歯質との反応に関する知見を数多く得る事ができた。今後は歯牙の主成分であるハイドロキシアパタイト単体との反応に着目して研究を進めて行く。わが国で使用されている歯質接着性ボンディングシステムの多くは、酸性の機能性モノマーを用いたセルフエッチングシステムに分類される。近年、歯質、特にエナメル質への接着を補うことを目的として、1液性セルフエッチングシステムであるユニバーサル接着システムを用いる前に、リン酸を用いた前処理を行う「マルチモード」という概念が提唱されている。しかしながら象牙質歯面に対するリン酸塗布は過度な脱灰を招く懸念があり、リン酸に代わる歯面処理剤の検討が必要である。そこで初年度はリン酸に代わる歯面処理剤として、有機酸を含むエナメルコンディショナー(松風)・機能性モノマーM-TEG-Pを含むマルチエッチャント(ヤマキン)がエナメル質との接着に及ぼす影響を検討した。エナメル質接着試料を作製、微小せん断接着試験および人工脱灰液処理後のエナメル質との接着界面を走査電子顕微鏡(SEM)を用いて観察することで接着界面の耐酸性を評価した。Kエッチャントおよびエナメルコンディショナーを用いた群で、微小せん断接着試験の結果が有意に向上し、SEM観察においても耐酸性に優れた界面が観察された。一方、コントロール群およびマルチエッチャント群においては、酸に対して脆弱部erosin領域が観察される傾向が認められた。以上よりエナメル質に対するリン酸およびエナメルコンディショナーを用いた前処理は、1ステップ接着システムにおける接着界面に有効であることがわかった。本研究課題に関連する国内発表を1報予定している。各種歯面処理材がエナメル質接着へ及ぼす影響、日本歯科保存学会2018年度春季学術大会(148回)(横浜、平成30年6月14,15日)。

臨床において、リン酸処理材を象牙質へは触れさせずにエナメル質のみに塗布する手技は術者の技量に依存する部分が大きかったが、新規材料は象牙質へ不利に働かないため、このような繊細な手技を必要とせず、被着面のエナメル質・象牙質を一括に処理して構わないという術者のエラーを引き起こしにくい材料であることが確認された。本研究課題に関連する学会発表を4報、国際学術雑誌での発表を5報行った。エナメル質に対する接着に関して一定の知見を得られたが、象牙質に対する接着については詳細な検討が行われていない。今後は象牙質との接着試験や、接着界面の耐酸性を評価を行う。あわせてハイドロキシアパタイトとの反応についても検討を加える。歯質との反応に関する知見を数多く得る事ができた。今後は歯牙の主成分であるハイドロキシアパタイト単体との反応に着目して研究を進めて行く。機器利用を計画的に行うことで機器使用料を予定より抑えることができた。また出張時の宿泊費、日当を計上しなかったことで経費を抑制したため。研究計画を遂行するため必要な材料、器材とSEMなど分析装置の保守・整備費などに研究費をあてる。予定していた国際学会での発表を1報、2019年度へ延期したため。2019年度に発表する際に使用する予定。
受容体および新規分子によるプラズマサイトイド樹状細胞の制御機構の解明

プラズマサイトイド樹状細胞(pDC)は生体のIFN-α産生の大部分を担い、ウィルス感染のみならずさまざまな免疫疾患に関与することが示唆されているDC分画である。本研究では、抑制型および活性化型受容体によるpDCの制御機構を明らかにすることを目的とした。その結果、抑制型PIR-Bが、TLR9シグナルを直接抑制するのではなく、TLR9刺激によりオートクラインによって産生されるインターフェロンのシグナル伝達を抑制していることを明らかにした。細菌感染におけるpDCの制御機構の解明-プラズマサイトイド樹状細胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)は生体のインターフェロン(interferon, IFN)-α産生の大部分を担い、ウィルス感染のみならずさまざまな免疫疾患に関与する免疫担当細胞である。pDC上にはさまざまな受容体が発現しているが、本研究は自己の主要なマーカーであるMHCクラスI分子を認識する抑制型受容体PIR(Paired immunoglobulin-like receptor)-B^<1,2)>、およびFc receptor(FcR)をはじめとする活性化型受容体に会合する3種類のサブユニット分子FcRγ、DAP12およびDAP10の機能について、新規関連分子の同定を通じてシグナル伝達を中心に解析を行なうとともに、これまで全く知られていなかったレジオネラ菌感染におけるpDCの役割を明らかにすることを目的とする。平成22年度研究結果TLR9シグナル伝達の解析野性型マウス(C57BL/6)、Pirb^<-/->マウスおよびme/vマウス、さらにFcRγ^<-/->マウス、DAP12^<-/->マウスおよびDAP10^<-/->マウスよりpDCを誘導・採取。活性化型サブユニットについては単独欠損に加えてFcRγ/DAP12^<-/->マウスおよびFcRγ^<-/->/DAP12^<-/->/10^<-/->マウスからもpDCを誘導・採取し、TLR9下流のシグナル伝達経路について、ウェスタンブロット法もしくは抗体アレイにより検討した。-抑制型および活性型受容体によるpDC制御機構の解明-pDCは生体のIFN-α産生の大部分を担い、ウィルス感染のみならずさまざまな免疫疾患に関与することが示唆されているDC分画である。pDC上には多くの受容体が発現しているが、本研究でとりあげるPIR-Bは自己の主要なマーカーであるMHCクラスI分子を認識し、恒常的に細胞の自己反応性を制御する抑制型受容体である^<1,2)>。一方、FcRをはじめとする活性化型受容体に会合するサブユニット分子は3種類が存在しており、pDCにおいてはFcRγとDAP12は逆に抑制的に働くとされているが^<4)>、その機序は不明のままである。またDAP10についてはpDCにおける機能も不明なままである。一方、申請者らはごく最近になりこれら分子を欠損したpDCに共通して発現が変動している遺伝子をマイクロアレイにより選定している。平成22年度は研究代表者の異動に伴い研究の進行が遅滞したが、平成23年度では、PIR-Bおよび3種類の膜サブユニット分子を欠損したpDCにおいてTLR9下流シグナル伝達について検討した。その結果、PIR-BはTLR9シグナルを直接抑制するのではなく、TLR9刺激によりオートクラインによって産生されるインターフェロンのシグナル伝達を抑制していることを明らかにした。また細胞株による遺伝子選別も進行し、pDCのインターフェロン産生を制御する遺伝子を同定した。今後の研究発展につながる成果を得られたと考えている。ー抑制型および活性型受容体によるpDC制御機構の解明ーpDCは生体のIFN-α産生の大部分を担い、ウィルス感染のみならずさまざまな免疫疾患に関与することが示唆されているDC分画である。pDC上には多くの受容体が発現しているが、本研究でとりあげるPIR-Bは自己の主要なマーカーであるMHCクラスI分子を認識し、恒常的に細胞の自己反応性を制御する抑制型受容体である。一方、FcRをはじめとする活性化型受容体に会合するサブユニット分子は3種類が存在しており、pDCにおいてはFcRγとDAP12は逆に抑制的に働くとされているが、その機序は不明のままである。そこで本研究では、抑制型および活性化型受容体によるpDCの制御機構を明らかにすることを目的とした。平成22年度から23年度にかけてPIR-BはTLR9シグナルを直接抑制するのではなく、TLR9刺激によりオートクラインによって産生されるインターフェロンのシグナル伝達を抑制していることを明らかにした。さらに平成24年度は、PIR-Bの発現レベルがpDCの分化に伴い上昇しており、未熟pDCから成熟pDCに到る後期分化を制御していることを明らかにした。これら一連の成果をBlood誌(120: 3256-3259, 2012)に発表した。

またPIR-Bおよび活性化型受容体の欠損pDCにおいてマイクロアレイにより選別したインターフェロン産生を制御する遺伝子について、ノックダウン実験を行い、その機能について確認できた(投稿準備中)。pDCにおけるPIR-Bの制御作用を明らかにするとともに、今後の研究発展につながる成果を得られた。平成23年度計画ではpDCにおけるTLR9シグナルに免疫制御受容体PIR-Bが果たす役割を明らかにすることができた(投稿中)。さらにTLR9シグナルを制御する新規分子も同定することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度計画に予定している細菌感染について遂行する。また新規分子の機能の詳細について研究を進める予定である。
血管新生抑制因子(AIP)の構造・機能の解析とそれを応用した遺伝子治療

我々は血管新生を抑制することから癌治療に取りかかってきた.そこで,血管内皮細胞のHUVECの遊走能に着目し,この運動を制御する因子を見つけだし,これをAngiogenesis Inhibiting Protein(AIP)と名付けた.一時このwhole cDNAと考えられる2571個からなるcDNAをクローニングすることができた.しかしながら,これをトランスフェクションしてみても,一部の細胞でしか血管新生制御を行うことが不可能であった.また,スキッドマウスを用いたin vivoの実験においても,このAIPのwhole cDNAをトランスフェクションした細胞を移植してみたが,コントロール細胞と腫瘍の増殖,及び腫瘍への血管新生阻害という点で,有意な差は得られなかった.また,アデノウイルスを用いて,ヌードマウス移植腫瘍自身にAIPを発現させてみたが,腫瘍血管新生を阻害することは出来なかった.これらのことから、AIPが糖蛋白質複合体となって初めて、その生理的作用を獲得することが考えられた。つまり、この蛋白構造に修飾された糖鎖構造が、このような生理的現象を示している可能性が示唆され、抗体アフィニティカラムでAIPを精製し蛋白質部分と糖鎖部分をそれぞれ分離した。更に、この糖鎖部分に対する抗体を作製するとともに、NMRを用いてこの糖鎖構造を解析している。その結果、末端糖にシアル酸が付いており、この部に活性を見出し、詳細な構造を検討中である。しかしながら、もう一つの可能性としては、ラット角膜を用いた正常血管内皮細胞の新生阻止を行えるので、正常血管新生と腫瘍内血管内皮細胞の新生阻止とは、そのプロセスが異なることも示唆された。引き続きこれらの問題を検討していく予定である。癌の進展に伴い,血管形成を抑制することは癌治療において非常に大きな意味があると考えられる.そこで,我々は血管内皮細胞のHUVECの遊走能に着目し,その運動を制御する因子を見つけることにした.その手段として,機能性モノクローナル抗体を作成し,そのエピトープである遺伝子をクローニングしていくことにした.得られたHM7-3抗体のepitopeは分子量135K,105Kの糖蛋白質と考えられ,遺伝子クローニングを行ったところ,目的遺伝子の一部と考えられる511個の塩基配列からなるcDNAをクローニングした.現在,この構造はGenbankに登録されていなかったため,未知物質と考えられ,我々はこれをAngiogenesis inhibiting protein(AIP)と名付けた.その後,2571個からなるwhole cDNAを同定することができた.しかしながら,このDNAを血管内皮細胞にトランスフェクションしたが,血管内皮細胞の遊走,増殖はあまり抑制されなかった.そのため,むしろこの蛋白構造の一部に修飾された糖鎖構造が,このような生理的現象をもっている可能性がでてきた.現在,この抗体を用いて抗体アフィニティカラムを作製し,AIPの蚕白質部分と,糖鎖部分と精製してその構造を決定中である.我々は血管新生を抑制することから癌治療に取りかかってきた.そこで,血管内皮細胞のHUVECの遊走能に着目し,この運動を制御する因子を見つけだし,これをAngiogenesis Inhibiting Protein(AIP)と名付けた.一時このwhole cDNAと考えられる2571個からなるcDNAをクローニングすることができた.しかしながら,これをトランスフェクションしてみても,一部の細胞でしか血管新生制御を行うことが不可能であった.また,スキッドマウスを用いたin vivoの実験においても,このAIPのwhole cDNAをトランスフェクションした細胞を移植してみたが,コントロール細胞と腫瘍の増殖,及び腫瘍への血管新生阻害という点で,有意な差は得られなかった.また,アデノウイルスを用いて,ヌードマウス移植腫瘍自身にAIPを発現させてみたが,腫瘍血管新生を阻害することは出来なかった.

これらのことから,正常血管内皮細胞の新生阻止と,腫瘍内血管内皮細胞の新生阻止とは,そのプロセスが異なることが考えられた.また,もう一つの可能性として,AIPが糖蛋白質複合体となって初めて,その生理的作用を獲得することが考えられた.つまり,この蛋白構造に修飾された糖鎖構造が,このような生理的現象を示している可能性が示唆されてきたために,我々は糖脂質及び糖蛋白糖鎖において,このAIPの本質構造を検討してきた.手段として,この抗体を用いて抗体アフィニティカラムを作製し,AIPの蛋白質部分と糖鎖部分をそれぞれ分離した.また,糖脂質構造にこのような生理的機能を持つ物質が存在するか調べた.その結果,糖脂質ではなく糖蛋白糖鎖がその機能を持っていると考えられたので,我々は現在,抗体アフィニティカラムを用い,この糖鎖部分に対する抗体を作製するとともに,NMRを用いてこの糖鎖構造を解析している.癌の腫瘍血管の新生を抑制することは癌の増殖、転移の抑制において非常に重要であると考えられ、我々は既知の物質とは全く違った血管新生制御因子を探求してきた。手段として、血管内皮細胞の遊走能に着目し、その運動を抑制するモノクローナル抗体を作製した。その中で、HM7-3抗体は、分子量135K、105Kの糖蛋白質を認識しており、新たな血管新生抑制因子だと考えられたので、AIPと名付けた。一時このcDNAと考えられる2571個からなるcDNAをクローニングすることができた。しかしスキッドマウスを用いたin vivoの実験において、このAIPのcDNAをトランスフェクションした癌細胞を移植してみたが、母細胞の形成する腫瘍への血管新生と較べ、血管新生数では有意な差は得られなかった。また、アデノウイルスを用いて、ヌードマウス移植腫瘍自身にAIPを発現させてみたが、腫瘍血管新生を阻害することは出来なかった。これらのことから、AIPが糖蛋白質複合体となって初めて、その生理的作用を獲得することが考えられた。つまり、この蛋白構造に修飾された糖鎖構造が、このような生理的現象を示している可能性が示唆され、抗体アフィニティカラムでAIPを精製し蛋白質部分と糖鎖部分をそれぞれ分離した。更に、この糖鎖部分に対する抗体を作製するとともに、NMRを用いてこの糖鎖構造を解析している。その結果、末端糖にシアル酸が付いており、この部に活性を見出し、詳細な構造を検討中である。しかしながら、もう一つの可能性としては、ラット角膜を用いた正常血管内皮細胞の新生阻止を行えるので、正常血管新生と腫瘍内血管内皮細胞の新生阻止とは、そのプロセスが異なることも示唆された。引き続きこれらの問題を検討していく予定である。
がんエンドオブライフを支える在宅ホスピスナーシングケア尺度の開発と課題の明確化

在宅ホスピスケアとは、患者の生活の場である“家"において実施されるホスピスケアであり、最後の日々を家で過ごしたいと願う患者や家族を援助し、その希望を叶えるためのケアである。本研究は、在宅ホスピスケアを受ける終末期がん患者に対する訪問看護師のケアを評価する尺度の開発と、ケアの実践に関連する要因を分析し、在宅ホスピスケアにおける課題を明確にすることを目的としている。具体的には、尺度開発のプロセスを踏んで「在宅ホスピスナーシングケア尺度」を開発する。その上で、開発した尺度および在宅ホスピスケアの実践に関連すると予測される要因を含めた質問紙を作成して調査を実施し、分析結果から課題を特定する。
放射線治療の副作用として生じる味覚障害に関する薬理学的研究

【背景】放射線治療による味覚障害の発症機序として、放射線照射によって口腔内の味蕾細胞が破壊されることで感覚性障害が生じると考えられている。さらに、放射線治療による味覚障害に対して、味蕾細胞の新陳代謝に必要不可欠な亜鉛を補充することで症状の改善が見られたと報告されている。一方、これら報告の多くが、味覚障害に対する治療効果のエビデンスが乏しい。我々は、これまでに放射線誘発口腔粘膜炎モデル(ハムスター)に対するバルプロ酸ナトリウムの有用性について検討し、口腔粘膜炎症状の改善効果を明らかにしている。そこで本研究では、バルプロ酸ナトリウムの味蕾細胞に対する治療効果を期待し、放射線誘発味覚障害モデルを用いた検討を行うこととした。【経過】味覚障害モデルの作製: 7週齢のICR系雄性マウスの頭顎部へ放射線の局所照射を行った。照射線量は0・5・10・15Gyの4群とし、照射後に苦味成分である塩酸キニーネを含む蒸留水(0.3mM)と通常の蒸留水との飲水量を経時的に比較し、味覚障害の発現有無について検討した。また、甘味成分であるスクロースを含む蒸留水(0.1M)においても同様に、0・15Gyの2群で比較検討した。【結果】4群全てで塩酸キニーネを含む蒸留水と比較して通常の蒸留水を多く飲水していることがわかった。一方、スクロースを含む蒸留水では、0Gyにおいてスクロースを多く飲水していたが、15Gyにおいては蒸留水と比較して飲水量に差はみられなかった。【考察】放射線照射に伴う味覚障害は、五味(甘味、塩味、酸味、苦味、うま味)で差が生じる可能性が示唆された。バルプロ酸ナトリウムの治療効果についての検討は、味覚障害モデルを用いて現在進行中である。
ケラチン点突然変異をモデルとした優性抑制解除法の開発

健康人由来の、すなわち野生型のケラチン9(以下、正常ケラチン9と略す)と、患者由来の、すなわちアミノ酸の置換を生じるような点突然変異を持つ変異型のケラチン9(以下、変異ケラチン9と略す)をともに持つ細胞は、細胞内の細胞骨格を形成する最も重要なケラチン繊維に対して、野生型ケラチン9のみを持つ場合は光学顕微鏡のレベルできれいな繊維状の構造を示す事に対して、野生型でない変異ケラチン9をコードする遺伝子断片を挿入された細胞にあっては、ケラチン繊維が光学顕微鏡のレベルで、滴状ないしは短い繊維状の構造を示した。この事実は、我々の考えているモデルは、人にみられる細胞骨格の異常を、細胞のレベルで忠実に再現している事になる。この事実にもとづいて、細胞骨格の異常をもたらす機構が優性抑制である事から、それを解除する実験をおこなった。校正または、変異ケラチン9の分解の促進は、定性的には生じるが、現在までのところ、再現よく、かつ、定量性を持って一定の効果を発揮するとは結論しがたい。この事実は、「自然のおこなう遺伝子治療(natural gene therapy)」といわれている加齢による症状の緩和が、必ずしも遺伝子のレベルでの校正ではなく、かつ、分解過程の促進でもない事を間接的ながら示唆する所見である。以上のように、研究目的に対しては一定の成果を上げると同時に、更に、検討すべき新しい課題の発見につながったと考えられる。平成17年度におこなった実験内容と、その結果は以下のとおりである。健康人由来の、すなわち野生型のケラチン9(以下、正常ケラチン9と略す)と、患者由来の、すなわちアミノ酸の置換を生ずるような点突然変異を持つ変異型のケラチン9(以下、変異ケラチン9と略す)を比較して、1塩基の違いのある部分の前後を制限酵素で切りだして、変異ケラチン9を持つ組み換え体を作製した。作製された組み換え体は5'側から順にサイトメガロウィルスプロモーター、変異ケラチン9の一部、螢光蛋白、ポリAシグナルである。また、前述の変異ケラチン9cDNA断片の3'側に人工的にストップコドンを導入したcDNA断片を作製し、同じコンストラクトで組み換えDNA体を作製した。組み換え体を含まないベクターDNA、すなわちサイトメガロウィルスプロモーター、螢光蛋白、ポリAシグナルの順にコンストラクトされた発現ベクターDNAを用いて、線維芽細胞をトランスフェクションにより形質転換し、コントロール細胞を作製した。これらの組み換え体が正しく作製されたか否かは、制限酵素地図を作製することにより検証した。また、組み換え体DNAを持つ線維芽細胞は正しく螢光を発していることを螢光顕微鏡で観察することにより確認した。また形質転換効率も、おおむね満足できるものであった。このように平成17年度の研究計画は、おおむね順調に達成され、平成18年度には更なる進展がみこまれている。平成18年度におこなった実験内容と、その結果は以下のとおりである。健康人由来の、すなわち野生型のケラチン9(以下、正常ケラチン9と略す)と、患者由来の、すなわちアミノ酸の置換を生じるような点突然変異を持つ変異型のケラチン9(以下、変異ケラチン9と略す)を各々制御酸素できり出して、それらを各々蛍光を発する蛋白をコードするcDNAと連結し、組み換え体を作製し、それらを細胞にトランスフェクトすることにより、優性抑制の解除を検出しうるモデル細胞は平成17年度に作製した。このレポーターを内在的に持つ細胞に対して、1個の点突然変異(DNAのレベル)を認識し、校正しうる、あるいは干渉しうる実験系で実験をおこなった。予想されたように、干渉をおこなうコンストラクトを持っ外来性組み替え体DNAは、点突然変異ケラチン9の発現を抑制し、そのため病気の発症原因である優性抑制を有意に解除するが、その程度と頻度には、現在までのところ一定の規則性は乏しく、むしろ、ランダムに出しており、結果として総体的には効果の総和としての効果がみられている。このように平成18年度の研究計画は、おおむね順調に達成され、平成19年度には更なる進展がみこまれている。平成19年度におこなった実験内容と,その結果は以下のとおりである。

健康人由来の,すなわち野生型のケラチン9(以下,正常ケラチン9と略す)と,患者由来の,すなわちアミノ酸の置換を生じるような点突然変異を持つ変異型のケラチン9(以下,変異ケラチン9と略す)をともに持つ細胞は,細胞内の細胞骨格を形成する最も重要なケラチン繊維に対して,野生型ケラチン9のみを持つ場合は光学顕微鏡のレベルできれいな繊維状の構造を示す事に対して,野生型でない変異ケラチン9をコードする遺伝子断片を挿入された細胞にあっては,ケラチン繊維が光学顕微鏡のレベルで,滴状ないしは短い繊維状の構造を示した。この事実は,我々の考えているモデルは,人にみられる細胞骨格の異常を,細胞のレベルで忠実に再現している事になる。この事実にもとづいて,細胞骨格の異常をもたらす機構が優性抑制である事から,それを解除する実験をおこなった。校正または,変異ケラチン9の分解の促進は,定性的には生じるが,現在までのところ,再現よく,かつ,定量性を持って一定の効果を発揮するとは結論しがたい。この事実は、「自然のおこなう遺伝子治療(natural gene therapy)」といわれている加齢による症状の緩和が、必ずしも遺伝子のレベルでの校正ではなく,かつ,分解過程の促進でもない事を間接的ながら示唆する所見である。以上のように,研究目的に対しては一定の成果を上げると同時に,更に,検討すべき新しい課題の発見につながったと考えられる。
明・清朝の華南山間部統治に関する研究

私は,研究計画に沿い,当該研究課題において,きわめて重要な位置を占める档案史料(満平・漢文)及び地方志・文集の収集と解読に引き続き重点をおいた。その成果として,まず明から清への王朝交替期の華南山間部における郷約・保甲・新県設置等の諸政策のあり方を分析するために,順治期の清朝による当該地域に対する統治の実態究明に取り組んだ。その結果,順治期の華南山間部において,清朝と旧明勢力が拮抗するなかで,清朝にが地方有力者を当該地域の地方官に任命したり,八旗に編成することによって,彼らを国家体制の中に組み込もうとした事例を確認した。さらに,上記に事例を含め,明初より清初まで(14世紀末17世紀中葉)の華南山間部における郷約・保甲・新県設置の実施状況を表す事例を丹念に収集・分析したことに基づき,明朝及び清朝の当該地域の統治の特徴として,以下のような論を導き出した。すなわち,明朝は多くの場合郷約・保甲・新県設置を個別に実施しており,そのとき地方政治を実際に担う地方官・紳士の歩調の乱れを背景にして,徴税及び軍事体制に混乱を生じさせたため,郷約等の諸政策は十分機能したといえず,効果が局所的かつ短期的なものにすぎなかった。一方,清朝は,華南平定戦を行った順治期以来,地方官の不正の摘発及び地方有力者の取り込みを着実に推し進めるとともに,徴税及び軍事体制の改善に努め,郷約等の諸政策を実施する基礎を築いた。その上で,郷約・保甲・新県設置の三者を,相互に関連させることを指向し,雍正期の直隷州設置にみられるように,徴税及び軍事体制と絡み合わせながら効果的に実施したことにより,華南山間部を安定させるに至ったと見通すことができのである。私は、研究計画に沿って、前年度の成果を補充するために、本研究課題において、極めて重要な位置を占める档案史料(満文・漢文)及び地方志・文集の収集・解読を引き続き重点的に行った。その成果として、『明朝档案』が、明末の地方統治に関して多様でしかも重要な情報をもたらす史料であること、また、満文史料である『密本档』が、清初の地方統治全般に亙る未だかつてない詳細な内容を多く含んでいることを確認できた。そして上述の史料に依拠しつつ、明初から清初まで(14世紀末17世紀中葉)の華南山間部に対する統治政策の一つとして、新行政区画の設置、具体的には新県設置がいかなるプロセスで行われたかを分析した。その結果、特に明代中期以降、新県設置が、華南山間部統治に大きな障害となっていた山寇(山賊)に対する有効な施策として、当該地域の紳士層及び地方官に強く望まれており、その背景として、強力に組織化された山寇に対抗するために、紳士層・地方官の間に、新県の下で郷約・保甲に基づく組織を作ろうとする意図があったことを見出した。また、明末の広東東部地域における新県設置の具体的事例を分析することを通して、治安不良の状況下で、紳士層を中心とする住民の強い推進・協力によって県が設置されるという新県設置のスタイルが、華南地域において普遍的に存在していたことを示した。その一方で私は、地方官の動向に注目し、明末の広東東部地域における新県設置が、財政状況の悪化・民衆の困窮という状況に配慮して、費用の大部分を地方官が負担するかたちで実行され、山寇の活動の抑止に効果をもたらしたが、行政区画変更に伴う賦税徴収体制の混乱や当時の広東の地方官界の乱れを反映して、行政上十分な機能を果し得なかったことをより詳細に解明した。
一卵性双生児のリンパ芽球を用いた躁うつ病候補遺伝子の網羅的探索研究

双極性障害(躁うつ病)は遺伝的負因のみられる難治性精神疾愚であり、最も解明が待たれる疾患の1つである。本研究は、従来と異なる方法でアプローチを行い病因解明を試みた。一卵性双生児躁うつ病不一致例2組のリンパ芽球様細胞においてDNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現探索を行った。不一致例でのみ差がみられた遺伝子、すなわち疾患に関与している可能性のある遺伝子として、17遺伝子が見出され、XBP1及びHSPA5の小胞体ストレス応答に関わる遺伝子の低下が認められた。このカスケードが躁うつ病に関与していると考えられたため、タプシガルギンによる小胞体ストレス下での反応(XBP1及びHSPA5の上昇)を調べたところ、患者由来の細胞では健常者由来の細胞に比して低下していた。さらにXBP1遺伝子の発現を制御している上流の配列にXBP1遺伝子自らが結合する配列を既知のもの以外に見出し、その結合配列を失わせる多型が患者で多くみられることを発見した。この多型の違いにより小胞体ストレス応答が異なること、またプロモーターアッセイによりXBP1の結合が異なることを確認している。以上から、XBP1遺伝子の多型により、小胞体ストレス反応におけるXBP1遺伝子のポジティブフィードバック機構が低下することが双極性障害の遺伝的リスクを増加させると考えられた。双極性障害の治療薬は現在リチウム、バルプロ酸、カルバマゼピンの3種類が知られているが作用機序は不明で、治療効果も個人個人で異なることが知られている。これらの気分安定薬について小胞体ストレス反応への影響を調べたところ、バルプロ酸のみがXBP1の上流遺伝子であるATF6の発現量をふやし、小胞体ストレス反応を増強させることが判明した。小胞体ストレス応答の神経系における役割の探求が双極性障害の病因解明につながる可能性がある。理化学研究所・脳科学総合研究センターにおける倫理委員会承認のもと、一卵性双生児不一致例2組、対照例1組(いずれもボランティア)に口頭及び書面にて研究の意義、方法を十分に説明した上で同意を得た上で末梢血を採取した。末梢血からリンパ球をFicollにて分取、B95-8細胞株由来EBウイルスを用い芽球化した。芽球化したリンパ球は、培養を行い、採血後8週間の時点でTrizol (Gibco BRL)に回収した。その後total RNAを抽出し、Superscript Choice system (Gibco BRL)にてcDNAを作製、さらにRNA Transcript Labelling Kit (ENZO)を用いてビオチン化cRNAを合成しDNA microarray実験に供した。DNA microarrayは、Affemetrix社のGeneChip protocolに従って行った。Test2chipにてRNAのqualityを検定後、Hu95FLチップを用いhybridizationを行っている。得られたデータの解析は解析ソフトGenespring (Silicon Genetics)を用いて行い、現在解析中である。なおそれぞれの双生児において一卵性の確認を行っている。リンパ球よりDNAを抽出し、卵性診断キット(Applied Biosystems)を用いて卵性診断を行ったが、全遺伝子マーカーが一致しており一卵性の可能性が高いと判断された。今後DNA microarray結果の解析から得られた遺伝子の中から病因候補となりうるものを選び、関連研究を含め検討を行っていく予定である。