hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
病巣内カンジダ症の種のレベルでの遺伝子診断法の開発

近年アゾール系抗真菌剤の使用により播種性カンジダ症の発生が減少しているが,これら抗真菌剤に耐性のあるC.albicans,C.tropicalis以外の従来は病原性がないとされてきたNon-albicans speciesによるカンジダ症や類似の酵母状真菌感染が増加している.病理組織診断は深在性真菌感染症の診断の際にも威力を発揮するが,「種」のレベルの診断や迅速性には限界があり,血清学的な診断や体液材料を用いた遺伝子診断に比べて発展が遅れている領域である.本研究では病理組織検体として固定,包埋処理されたカンジダ感染検体を用いて,「種」のレベルのカンジダ菌種の同定が可能か,またこれら菌種をPCR,in situ hybridizationにより組織診断できるかを検討した.まず剖検材料,生検材料,実験感染材料でカンジダ感染が確認された組織切片からC.albicans特異的なDNAの増幅が可能かを検討した.検索したC.albicansに特異的な遺伝子(BenR,CARE-1,CARE-2,CDR2)でパラフィン材料からの検出が可能であったのはBenRのみであった.BenRはnon-albicans speciesを初めとする病原真菌では証明されず,C.albicans特異的な遺伝子として診断に応用可能な分子である.しかし,剖検例など過固定された組織ではPCR法によっても診断困難な例が多かった.他のカンジダ種については構造遺伝子を含めて1種類の菌種に特異的なPCRによる増幅が可能な遺伝子は見い出されず,以後は組織切片でのC.albicansの特異的染色に焦点を絞った.最初に5.8SrRNAについてビオチン化プローブを用いた同定を試みたが実験感染例ではC.albicansとC.tropicalisを区別することはできなかった.また,通常の末端1塩基のみの標識では十分な染色感度が得られず,複数の塩基標識プローブの作成は経済性の点でも問題があった.BenRを対象にPCRにて特定の領域(400-600bpサイズ)をジコキシゲニン-11-dUTPを加えて増幅することで得た標識プローブを使用してin situ hybridizationを検討しているが,厳密な意味でのsense probeを用いたコントロールの設定など染色特異性を評価するための条件を整える必要がある.以上よりホルマリン固定された組織検体によるカンジダ症の遺伝子診断についてはC.albicansを中心に発展の可能であるが,他の菌種については薬剤耐性遺伝子など各種真菌に特異的な遺伝子のクローニングなど遺伝子情報の充実が診断への応用の過程で不可欠であると考えられた.近年アゾール系抗真菌剤の使用により播種性カンジダ症の発生が減少しているが,これら抗真菌剤に耐性のあるC.albicans,C.tropicalis以外の従来は病原性がないとされてきたNon-albicans speciesによるカンジダ症や類似の酵母状真菌感染が増加している.病理組織診断は深在性真菌感染症の診断の際にも威力を発揮するが,「種」のレベルの診断や迅速性には限界があり,血清学的な診断や体液材料を用いた遺伝子診断に比べて発展が遅れている領域である.本研究では病理組織検体として固定,包埋処理されたカンジダ感染検体を用いて,「種」のレベルのカンジダ菌種の同定が可能か,またこれら菌種をPCR,in situ hybridizationにより組織診断できるかを検討した.まず剖検材料,生検材料,実験感染材料でカンジダ感染が確認された組織切片からC.albicans特異的なDNAの増幅が可能かを検討した.検索したC.albicansに特異的な遺伝子(BenR,CARE-1,CARE-2,CDR2)でパラフィン材料からの検出が可能であったのはBenRのみであった.BenRはnon-albicans speciesを初めとする病原真菌では証明されず,C.albicans特異的な遺伝子として診断に応用可能な分子である.しかし,剖検例など過固定された組織ではPCR法によっても診断困難な例が多かった.他のカンジダ種については構造遺伝子を含めて1種類の菌種に特異的なPCRによる増幅が可能な遺伝子は見い出されず,以後は組織切片でのC.albicansの特異的染色に焦点を絞った.最初に5.8SrRNAについてビオチン化プローブを用いた同定を試みたが実験感染例ではC.albicansとC.tropicalisを区別することはできなかった.また,通常の末端1塩基のみの標識では十分な染色感度が得られず,複数の塩基標識プローブの作成は経済性の点でも問題があった.BenRを対象にPCRにて特定の領域(400-600bpサイズ)をジコキシゲニン-11-dUTPを加えて増幅することで得た標識プローブを使用してin situ hybridizationを検討しているが,厳密な意味でのsense probeを用いたコントロールの設定など染色特異性を評価するための条件を整える必要がある.以上よりホルマリン固定された組織検体によるカンジダ症の遺伝子診断についてはC.albicansを中心に発展の可能であるが,他の菌種については薬剤耐性遺伝子など各種真菌に特異的な遺伝子のクローニングなど遺伝子情報の充実が診断への応用の過程で不可欠であると考えられた.PCRを用いたカンジダ特異的遺伝子の証明をさまざまなCandida-specific primer pairを用いて行った.特に感染頻度の高いC.albicansについてcare-1,care-2,benR,cdr-

2について検討したところ,ベノミール耐性遺伝子であるbenRについてC.albicans特異的なDNAの増幅が安定して認められ,他の酵母状真菌では陰性であった.現在,300-400bp程度のsense,antisense probeの作成を行いin situhybridization(ISH)への応用を試みている.ATP-bindingcassette typeの多剤耐性遺伝子(cdr-2)についても同様な試みを行っている。一方,パラフィン包埋材料からのDNA抽出とPCRを用いたカンジダ特異的遺伝子は困難で,過去の剖検材料を用いた遺伝子診断は簡便なDNA抽出手段が可能になったとしても感度と特異性の高い遺伝子診断の材料には適さないと考えられる.カンジダ特異的遺伝子のうち18S,28SrRNAに対するビオチン標識DNAプローブを用いたDNA-RNAISHについては,実験感染材料のパラフィン切片を用いれば安定した診断結果が得られる.このことは他の真菌症,特にアスペルギルス症などについて証明されているが,「種」特異的な診断を行うには限界があることがわかった.以上より,少なくともC.albicansについて特異的な診断用のプローブの作成とパラフィン包埋材料を用いたISH法の実施を次年度の研究継続目標としたい.これまでのところ薬剤耐性遺伝子が種特異性が高く,プローブの作成に適していると考えられる.近年アゾール系抗真菌剤の使用により播種性カンジダ症の発生が減少しているが,これら抗真菌剤に耐性のあるC.albicans,C.tropicalis以外の従来は病原性がないとされてきたNon-albicans speciesによるカンジダ症や類似の酵母状真菌感染が増加している.病理組織診断は深在性真菌感染症の診断の際にも威力を発揮するが.「種」のレベルの診断や迅速性には限界があり,血清学的な診断や体液材料を用いた遺伝子診断に比べて発展が遅れている領域である.本研究では病理組織検体として固定,包埋処理されたカンジダ感染検体を用いて,「種」のレベルのカンジダ菌種の同定が可能か,またこれら菌種をPCR,in situ hybridizationにより組織診断できるかを検討した.まず剖検材料,生検材料,実験感染材料でカンジダ感染が確認された組織切片からC.albicans特異的なDNAの増幅が可能かを検討した.検索したC.albicansに特異的な遺伝子(BenR,CARE-1,CARE-2,CDR2)でパラフィン材料からの検出が可能であったのはBenRのみであった.BenRはnon-albicans speciesを初めとする病原真菌では証明されず,C.albicansに特異的な遺伝子として診断に応用可能な分子である.しかし,剖検例など過固定された組織ではPCR法によっても診断困難な例が多かった.ほかのカンジダ種については構造遺伝子を含めて1種類の菌種に特異的なPCRによる増幅が可能な遺伝子は見出されず.以後は組織切片でのC.albicansの特異的染色に焦点を絞った.最初に5.8SrRNAについてビオチン化プローブを用いた同定を試みたが実験感染例ではC.albicansとC.tropicalisを区別することはできなかった.
新規有機ケイ素反応剤の創製と環境調和型有機合成への利用

1.ジメチルシリル基を有する合成反応剤の開発と利用ジメチルシリルエノラートとアルデヒドのアルドール反応は、アルカリ金属塩あるいはアルカリ土類金属塩の存在下で効率良く進行した。様々な金属塩の反応加速効果について調べた結果、金属塩化物が高い活性を示し反応シリルエノラートの求核的活性化を経由していることがわかった。興味深いことに、本反応は水存在下でも効率良く進行し、ホルムアルデヒド水溶液との反応も可能である。塩化マグネシウム存在下、ジメチルシリルエノラートはα-エノンと反応し、マイケル付加体を効率良く与えた。また、金属塩存在下でのトシルイミン類とのマニッヒ型反応にも成功した。マニッヒ型反応は、水および触媒量のジイソプロピルアミンによっても促進され、高い立体選択性を示した。α-ジメチルシリルエステルとアルデヒドやケトンとのアルドール反応も、アルカリ金属塩あるいはアルカリ土類金属塩によって促進された。α-エノンとの反応では、マイケル付加ではなく、アルドール反応が優先した。ジメチルシリルエーテルやアミンは、アルデヒドやケトンの還元的エーテル化やアミノ化に有効な反応剤であることがわかった。2.インジウム触媒とヒドロシラン類を用いたラジカル反応触媒量の酢酸インジウム存在下、ハロゲン化アルキルにフェニルシランを作用させると、効率良く還元反応が進行して、アルカンを与えた。基質にエーテル、エステルのような極性官能基が存在しても、これらの官能基を傷つけることなく反応が進行する。本反応では、酢酸インジウムとフェニルシランの反応によりインジウムヒドリド種が発生し、これがラジカル還元剤として機能していると考えられる。この反応系中に電子不足アルケンを共存させると、分子間ラジカル付加反応が効率良く進行することもわかった。1.ジメチルシリルエノラートおよびその等価体の求核付加反応塩化カルシウムや塩化リチウムなどの金属塩存在下、ジメチルシリルエノラートやα-ジメチルシリルエステルが効率良くアルドール反応を起こすことがわかった。ジメチルシリルエノラートのアルドール反応は水存在下でも進行し、ホルマリンのような水溶性アルデヒドを用いることもできる。金属塩はルイス塩基として働き、対アニオン、特に塩化物イオンによるシリルエノラートの活性化がアルドール反応を促進していることが明らかになった。この反応は、ルイス塩基が水性アルドール反応を触媒するという点において、極めて新奇な反応である。ジメチルシリルエノラートは、塩化マグネシウム存在下、α,β-不飽和ケトンに対して効率良くマイケル付加した。これに対し、α-ジメチルシリルエステルは同様の条件下でアルドール反応とマイケル反応を併発し、基質によってはアルドール反応のみが進行した。また、これらのケイ素求核剤は、金属塩存在下で効率良くN-トシルイミンに付加することもわかった。2.ジメチルシリルエノラートを用いるジオールの合成フッ化物イオン触媒存在下、ジメチルシリルエノラートをアルデヒドに作用させると、アルドール反応と続く還元反応により1,3-ジオール類が高立体選択的に生成することがわかった。このように、二官能性ケイ素反応剤を用いる効率的なタンデム反応の開発に成功した。1.シリルエノラートのアルドール、マイケル、マニッヒ反応アルカリ金属塩あるいはアルカリ土類金属塩は、ジメチルシリルエノラートのα-エノンに対するマイケル付加を促進することがわかった。特に、塩化マグネシウムは非常に効果的な触媒として働く。様々な金属塩の反応加速効果を調べた結果から、この場合、金属塩まシリルエノラートとエノンの両反応剤の活性化に効いていると考えられる。α-ジメチルシリルエステルも同様の条件下でα-エノンと反応し、アルドール付加体とマイケル付加体を与えた。反応の位置選択性は、用いる金属塩と反応温度により、ある程度制御できた。

アミンあるいはアルカリ金属炭酸塩のような塩基存在下、ジメチルシリルエノラート、芳香族アルデヒド、トシルアミドの3分子はマニッヒ反応を起こし、β-アミノケトン類を効率よく与えることがわかった。2.ヒドロシラン類を用いたラジカル還元反応酢酸インジウム存在下、臭化アルキルあるいはヨウ化アルキルにフェニルシランを作用させると、効率よく還元反応が進行して、対応するアルカンを与えることがわかった。基質にエーテル、エステル、水酸基のような極性官能基が存在しても、これらの官能基を傷つけることなく還元反応が進行する。本反応では、酢酸インジウムとフェニルシランが反応してインジウムヒドリド種が発生し、これがラジカル還元剤として機能していると考えられる。1.ジメチルシリルエノラート、α-ジメチルシリルエステルの求核付加反応塩化カルシウムを促進剤とするジメチルシリルエノラートのアルドール反応は、水を溶媒としてもある程度進行するが、等量の塩化テトラブチルアンモニウムを用いることで反応効率を改善できることがわかった。α-ジメチルシリルエステルの求核付加反応について詳細に検討した結果、金属塩の適切な選択により、様々なアルデヒドやケトンの高効率的アルドール反応が可能となった。アルデヒドとのアルドール反応は、触媒として塩化リチウムを用いると高収率で進行した。一方、ケトンとのアルドール反応では、塩化マグネシウムが反応促進に効果的であることがわかった。共役エノンとの反応では、マイケル付加よりもアルドール反応が優先した。これによって生成するアリルジメチルシリルエーテルは、分子内でのヒドロシリル化や酸触媒によるδ-ラクトン合成に利用することができた。2.ヒドロシラン類を用いたラジカル還元反応酢酸インジウム(III)を触媒とするフェニルシランによるハロアルカン類のラジカル還元についてさらに検討した結果、エタノール中、室温という極めて穏和な条件下でも、ヨードアルカン類の還元が効率良く進行することが明らかとなった。本還元系はヨードアルカン類と電子不足アルケンの分子間ラジカル付加反応にも有効であり、有機スズ化合物や有害な有機溶媒を用いない、穏和な条件下での高効率的な分子間ラジカル反応の開発に成功した。
窒化ガリウムにおけるプラズマ照射誘起欠陥の導入・拡散・消滅機構の解明

窒化ガリウム(GaN)結晶の表層のドナー原子が不活性化する現象の基礎物理を明らかにすることを目的として、プラズマ発光に着目して研究を進めた。光の影響は欠陥の導入過程ではなく拡散過程において顕著である。また、ドナーを不活性化している欠陥の増速拡散には電子-正孔対の発生・再結合が関係している。一方、アニールによってドナーは再活性化されるが,それには関与欠陥の電子励起に伴う荷電状態変化が重要である。本研究では,窒化ガリウム(GaN)において,プラズマ照射誘起欠陥が導入される過程における光照射の影響,および導入されてしまった欠陥がデバイス中で拡散・消滅するときに,光吸収に伴う電子励起過程が及ぼす影響を解明することを目的として研究を進めている.平成24年度に得られた主な研究成果は以下の通りである.(1)プラズマ照射誘起欠陥導入・拡散のメカニズムを解明するために,前年度に引き続き,プラズマ装置内でイン・プロセスに紫外光を付加的に照射する実験を行った.特に,付加光の照射のタイミングを,プラズマ照射の初期段階から終盤段階,そしてプラズマ照射終了後と変えて行った実験結果から,紫外光は,欠陥の導入過程ではなく,内部に導入された欠陥の拡散速度の増大を引き起こしていることを明らかにした.(2)前年度に引き続き,プラズマ照射誘起欠陥を含むショットキー障壁ダイオードを用いて,バイアスを印加することで欠陥の荷電状態をコントロールした上でアニール実験を行った.その結果をシミュレーションと比較することによって,ドーパントの不活性化を引き起こしている欠陥のアニール挙動は,その荷電状態に大きく依存するネガティブU型または両極性欠陥である可能性を明らかにした.(3)プラズマとして,HeからKrまでの質量の異なる4種類の不活性ガスを用いて欠陥導入の比較を行った.その結果,表面付近で最初に導入される欠陥は,原子衝突によって窒素原子が変位することに伴う真性点欠陥であることが示唆された.本研究では,プラズマ照射によって窒化ガリウム(GaN)結晶の表層のドナー原子が不活性化する現象の基礎物理を明らかにすることを目的とした.ドナーが不活性化される領域は,プラズマ中のイオンの注入飛程から予想される深さに比べて桁違いに大きい(増速拡散).本研究代表者は,その原因としてプラズマ発光に着目して研究を進めてきた.その結果,ドナーを不活性化している欠陥の増速拡散には,プラズマ発光を吸収して発生した電子-正孔対の再結合に伴うエネルギー放出が関係していることが示唆された.アニールによってドナーは再活性化されるが,それには関与欠陥の電子励起に伴う荷電状態変化が重要であることが明らかになった.本研究によって得られた主要な研究成果は以下の通りである.(1)欠陥の増速拡散に対するプラズマ発光の影響を実験的に検証するために,プラズマ装置内でイン・プロセスに紫外光を付加的に照射する実験を行い,光の影響は欠陥の導入過程ではなく拡散過程において顕著であることを明らかにした.また,プラズマ照射した結晶上に作製したショットキー接触ダイオードに紫外光を照射することで,室温においても短時間で欠陥が拡散することを見出した.この現象は禁制帯に満たない光子エネルギーでは起こらないことから,欠陥の増速拡散には電子-正孔対の発生が関係していると結論づけた.(2)ショットキー障壁ダイオードを用いてバイアスを印加しながら行った一連のアニール実験の結果から,ドーパントの不活性化を引き起こしている欠陥の挙動は,その荷電状態に大きく依存することを明らかにした.さらに,禁制帯の半分以下の光照射下の実験結果も併せて,ドナー・欠陥複合体の解離過程をモデル化し,プラズマ照射誘起欠陥がネガティブU型または両極性欠陥である可能性を示した.窒化ガリウム(GaN)結晶の表層のドナー原子が不活性化する現象の基礎物理を明らかにすることを目的として、プラズマ発光に着目して研究を進めた。本研究では,窒化ガリウム(GaN)において,プラズマ照射誘起欠陥が導入される過程における光照射の影響,および導入されてしまった欠陥がデバイス中で拡散・消滅するときに,光吸収に伴う電子励起過程が及ぼす影響を解明することを目的として研究を進めている.平成23年度に得られた主な研究成果は以下の通りである.(1)プラズマ照射誘起欠陥導入のメカニズムを解明するために,プラズマ発光と同じ波長帯の紫外光を,イン・プロセスで付加的に照射するための実験系を検討し,既存のプラズマ実験装置に実装した.この装置を用いて,プラズマ発光に比べ2桁以上の強度の紫外光を付加的に照射することで,プラズマ照射欠陥が通常の3倍以上も深く侵入することを見出した.さらに,禁制帯幅以下のエネルギーの可視光照射では,欠陥の増速拡散はほとんど起こらないことを明らかにした.(2)ワイドギャップ半導体の極めて深い準位の評価法として,光容量分光(PHCAP)法の高感度化・高精度化を実現した.この装置を用いて,n型GaNで共通に検出されるミッドギャップ領域の深い準位について,欠陥の基本的物性量である光イオン化断面積のスペクトル(波長依存性)を決定した.

プラズマ照射にも,ミッドギャップ領域に深い準位は検出されるが,この欠陥に対する光イオン化断面積の値は,未照射結晶におけるミッドギャップ準位とは1桁以上も違うことから,欠陥構造は異なると推測される.(3)デバイスに導入されたプラズマ照射誘起欠陥のアニール実験を行い,荷電状態および電界強度に対する依存性を明らかにした.欠陥により不活性化されたドナーの再活性化速度には,顕著なバイアス依存性が見られ,その結果,再活性化にはドナー・欠陥複合体の荷電状態と電界が重要であることが示唆された.付加光を同時照射したプラズマ照射実験が順調に進んだこと,欠陥のアニール挙動について実験とシミュレーションとの比較検討ができたこと,さらに質量の異なる不活性ガスを用いた実験結果などを総合して,プラズマ照射欠陥の起源の絞り込みができたことによる.付加光を同時照射するためのプラズマ実験装置の改良が,比較的短時間に完了したこと,新しく高感度のキャパシタンスメータを導入できたことにより,光容量分光法の高感度化・高精度化が達成できたこと.ドーパントの不活性化の原因となっている欠陥種の同定に繋げていくために,ショトキーバリア・ダイオードを用いた測定では評価ができない極表面の欠陥について,高速電子移動度トランジスタ(HEMT)構造を用いた実験を展開する.また,プラズマ照射誘起欠陥の拡散が紫外光照射によって増速される機構について,再結合促進欠陥運動(反応)との関係を明らかにするために,関連する深い準位の性質を明らかにしていく.イン・プロセスでの光照射の実験を引き続き系統的に進め,欠陥の発生・拡散を抑制できるプラズマ装置の設計指針の構築に繋げていく.欠陥導入機構の解明のために,イン・プロセスでの光照射の実験を引き続き系統的に進め,欠陥の発生・拡散を抑制できるプラズマ装置の設計指針の構築に繋げていく.また,ショトキーバリア・ダイオードを用いた実験により,プラズマ照射誘起欠陥の拡散・消滅過程における荷電状態および電界依存性を明らかにし.理論家の報告結果との比較検討により,ドーパントの不活性化の原因となっている欠陥種の同定に繋げていく.物品費として50万円を充てる計画である.主として,GaN基板結晶およびAlGaN/GaNエピタキシャル結晶と電極用金属材料を購入する.30万円は,研究成果発表のための旅費および論文投稿料に充てる予定でいる.物品費として50万円を充てる計画である.主として,GaN基板結晶およびAlGaN/GaNエピタキシャル結晶と電極用金属材料を購入する.30万円は,研究成果発表のための旅費および論文投稿料に充てる予定でいる.
核膜形成機構：オルガネラ形成を規定する膜タンパク質動態制御

動物細胞の核膜は分裂期に崩壊し、染色体分離後に再形成される。崩壊時に小胞体(ER)に吸収された核膜タンパク質や核膜成分は、再形成時にERから選択的に供給されるが、そのメカニズムは不明な点が多い。分裂期のセミインタクト細胞利用して核膜形成初期の核膜タンパク質のERから染色体への局在化を観察した。本実験系で核輸送活性を持つ核膜を再構築することに成功し、核膜再形成のためには核膜孔の再形成の他に、少なくとも2種類の膜タンパク質LBRとエマリンの染色体への集積が必要であること、その集積のためにはそれぞれ異なる因子とATP、GTPが必要であること、反応中のリン酸化状態が重要であることを示した。細胞分裂後の染色体を足場として核膜が再形成される。ジギトニン処理によって得られた膜透過性分裂期ヒト培養細胞(セミインタクト細胞)を用いて、核膜タンパク質の局在変化を指標に核形成初期における制御因子の探索を試みてきた。分裂期染色体への局在化には核膜タンパク質によって異なる細胞質因子を必要とする可能性を示してきた。一方で、核内膜タンパク質であるラミンBレセプター(LBR)の染色体局在化については染色体の分離後には細胞質因子を必要としない。LBR染色体局在化制御について:上述の細胞質非依存的なLBRの染色体局在化はPP1阻害剤で抑制された。そこで、実際にPP1が染色体へ局在するかについてPP1-GFPの局在を指標に観察したところ、LBRの染色体局在と同条件下で染色体局在することが確認できた。再構築された核膜の核輸送活性獲得について:核膜タンパク質Emerinを分裂期染色体へ局在化させるには、分裂期から単離した細胞質画分が必要でさらに、CDK活性を阻害することが必要であった。この条件ではLBR、Emerinが分裂期中期、後期ともに染色体を取り囲むように集積するが、核輸送活性を示す核膜が効率良く構築されるのは後期染色体で観察される。核膜形成時の核膜孔構築効率の違いを反映していると予想され、実際に核膜孔複合体構成因子は中期染色体へ運ばれにくい。細胞質因子による違いではないため、染色体上の因子の違いを反映していると考えられる。セミインタクト細胞を用いたin vitro核膜再構成系を利用し、核膜タンパク質の染色体への局在化を指標として、核形成初期に関わる制御因子の検索を試みてきた。これまでに細胞質画分、ATP、GTPが必要であることを示して来た。核膜タンパク質LBRの染色体局在化における細胞質依存性が、細胞周期の進行で異なることが観察されていた。1.細胞質依存的な核膜タンパク質の中期染色体への局在化について:前中期同調細胞の細胞質、ATP、GTP存在下、CDK阻害剤を添加することで、LBRだけでなくEmerinも中期染色体周辺へ集積し、生細胞で観察される染色体周辺での両者の排他的な局在パターンも再現することができた。後期染色体においてはLBRとEmerinの集積だけでなく、NLS-BSAが核内へ輸送された。この結果は、核輸送活性を保持する核膜孔複合体が核膜上に構築されていることを示している。一方、中期ではLBR、Emerinは染色体に集積するが核輸送活性は殆ど検出されず、FG-Nupsも検出されなかった。核膜孔形成に関して、前期から中期にかけて染色体の状態が変化することを示している。2.細胞質非依存的なLBRの後期染色体への局在化について:セミインタクト細胞においては、後期染色体へのLBRの集積に細胞質成分を必要としないことを示して来た。このLBRの集積はキナーゼ阻害剤では阻害されず、オカダ酸で阻害されたため、ホスファターゼ活性を必要とすることが示唆されていた。そこで、PP1、PP2A/PP2B阻害剤である、Inhibitor-I、fostriecinを添加したところ、PP1特異的阻害剤でLBRの集積が抑えられた。後期染色体上に活性型PP1が局在するとの報告と合致しており、セミインタクト細胞中でもPP1活性が保持され、LBRの染色体への集積に関して正に制御する因子の1つであることが判った。核膜構造は細胞分裂期に崩壊し膜自体は小胞体に吸収された後、娘細胞へ分配された染色体を足場として再形成される。

分裂期染色体への核膜タンパク質の局在化には各核膜タンパク質によって異なる細胞質因子を必要とする可能性を示してきた。また、ラミンBレセプター(LBR)の染色体への局在化には分裂期のステージによって細胞質因子の依存性が変わること、PP1は細胞質制御因子の候補の1つであることを報告して来た。一方、Emerinを分裂期染色体へ局在化させるには、分裂期から単離した細胞質画分とCDK活性を阻害、もしくホスファターゼの添加が必要で、このことは分裂期細胞質内のリン酸化状態を低下させる条件の必要性を示唆している。しかし、CDK活性を阻害し、さらにホスファターゼを添加すると局在化は阻害されたため、ある一定の低レベルのリン酸化状態もしくは、一時的なリン酸化活性がEmerinの分裂期染色体へ局在化に必要である可能性が考えられる。本再構成系ではLBRの染色体への集積の後にEmerinの集積が観察される。再形成された核膜の輸送活性はEmerinが局在化して観察される。また、核膜孔構成因子群は分離前よりも分離後の染色体へより集積しやすい。これらの観察結果は、核膜タンパク質群、核膜孔複合体構成因子群がそれぞれ決まったステージで異なる制御機構によって染色体へ集積することで核膜が構築されることを示している。細胞生物学高活性の細胞質画分を安定して調製することが難しく問題点を解決できていないため、活性因子を生化学的に単離同定することができていない。しかしながら、反応前後のセミインタクト細胞の免疫染色、反応系への精製タンパク質の添加などによって、可溶化タンパク質の染色体への局在変化や指標となる核膜タンパク質の動態変化については解析を進めることができた。当初計画していた次年度の実験のいくつかを本年度実行することができた。1.核膜タンパク質局在化に関わる細胞質因子の検索について:細胞質画分の活性の不安定性といった問題点もあり、生化学的手法による候補因子の同定については進展させることが出来ていない。しかしながら、分裂期細胞質画分を用いて核輸送活性を示す核膜をin vitroで再構築することに成功した。再構成された核膜上に核輸送機能を持つ核膜孔が形成されたことを示している。生細胞内で観察されるLBRとEmerinの染色体周辺での排他的な局在パターンも再現していた。今後予定している、負・正の核膜形成制御因子の探索と平行して核膜孔形成制御についても検討できる条件を得たと考えている。2.細胞質非依存的なLBRの後期染色体への局在化について:特異的阻害剤を用いてホスファターゼの内、PP1の活性が必要であることを明らかにすることが出来きた。次年度は最終年度であるので、これまでの結果を基本として成果発表に向けた実験計画を実施する。細胞質調製の安定化については可能な範囲で実施する。その他は、これまで同様、セミインタクト細胞を用いたアッセイ系を利用して解析を進める。核膜・核膜孔形成に寄与する可能性がある候補因子について、それらのセミインタクト細胞内での挙動の他、阻害剤、過剰添加による影響などを調べる。細胞質制御因子の検索については生化学的解析の試みを継続する。その他、平成26年度の研究実施計画に予定した項目についても可能なものは本年度に実施する。研究実施場所が変わったが、これまでの試料や試薬を利用することができたため想定額を下回った。次年度使用額分については、細胞培養関連消耗品と成果発表の際に必要な経費に充る。他は研究予定に沿って器具、消耗品、試薬等の購入に使用する。共同利用などを通して、主に細胞培養に関しての消耗品や器具の購入分が予定より下回った。
戦略的環境アセスメントのための地域景観情報の総合化

本研究の最終年は,地域景観を生態系の種類,空間スケール,遺伝子などの調査から総括的にとらえた.生態学としては自然地域(特に河川),農村地域,都市とした.空間スケールでは地域全体を衛星写真のスケールから,植物個体群の遺伝子といったミクロのスケールまでを取り扱った.遺伝子においては,その生態系(植物群集)内における出現頻度の低い種の遺伝子のフローから,空間の構造を解明した.これらの情報を戦略的環境アセスメントの基礎資料とすることに努力した.自然地域においては物質の動態,流域内の水収支,魚類の存在様式などから,自然が本来有する構造と機能が調べられ,これらのシステムをいかに保全するかが検討された.農村地域でも同様に広域ではGISを利用し,詳細研究では耕地の雑草を指標とする研究がなされた.特にコウノトリの自然復帰(放鳥)を目標とした農村景観の研究はコウノトリを上位性の種としてとらえた場合,総合的に景観を評価するのに役立つものとなった.都市生態学では都市内の景観を生物の側から評価する指標を見出すことができた.多くの研究で指標性の高い生物群と,その挙動から都市内の緑地の構造の景観生態学的評価と,移動性,連続性,多様性保全等について確度の高い生態学的評価をすることができた.さらに,生態系全体の遺伝子構成を明らかにし,生物多様性の絶対的評価を可能にした.昨年度に続き,特定植物の遺伝子を解析し,生態系内の空間がどのように種によって利用されているか,外部との関係がどのようになっているかを植栽(メートルレベル)で評価できた.また別にEcoGISと称する環境アセスメントにおける「生態系」評価を実施するための基礎資料作成ツールを製品にすることができ,戦略的環境アセスメントに応用する道筋を構築した.これらを,系統的に総括した最終報告書を印刷中である.本研究の最終年は,地域景観を生態系の種類,空間スケール,遺伝子などの調査から総括的にとらえた.生態学としては自然地域(特に河川),農村地域,都市とした.空間スケールでは地域全体を衛星写真のスケールから,植物個体群の遺伝子といったミクロのスケールまでを取り扱った.遺伝子においては,その生態系(植物群集)内における出現頻度の低い種の遺伝子のフローから,空間の構造を解明した.これらの情報を戦略的環境アセスメントの基礎資料とすることに努力した.自然地域においては物質の動態,流域内の水収支,魚類の存在様式などから,自然が本来有する構造と機能が調べられ,これらのシステムをいかに保全するかが検討された.農村地域でも同様に広域ではGISを利用し,詳細研究では耕地の雑草を指標とする研究がなされた.特にコウノトリの自然復帰(放鳥)を目標とした農村景観の研究はコウノトリを上位性の種としてとらえた場合,総合的に景観を評価するのに役立つものとなった.都市生態学では都市内の景観を生物の側から評価する指標を見出すことができた.多くの研究で指標性の高い生物群と,その挙動から都市内の緑地の構造の景観生態学的評価と,移動性,連続性,多様性保全等について確度の高い生態学的評価をすることができた.さらに,生態系全体の遺伝子構成を明らかにし,生物多様性の絶対的評価を可能にした.昨年度に続き,特定植物の遺伝子を解析し,生態系内の空間がどのように種によって利用されているか,外部との関係がどのようになっているかを植栽(メートルレベル)で評価できた.また別にEcoGISと称する環境アセスメントにおける「生態系」評価を実施するための基礎資料作成ツールを製品にすることができ,戦略的環境アセスメントに応用する道筋を構築した.これらを,系統的に総括した最終報告書を印刷中である.研究1年目は各分担者に地域景観情報をGIS上で総合化するため一連の研究を行ってもらった。すなわち、日本各地で開発にさらされているか保全対象となっている生態系を含む景観システムにおいて野外調査にはじまり、当研究で初期の目標とするGISによる情報入力までを行ってもらった。都市や草地景観域では一部学術論文を発表することができた。特に日本とニュージーランドにおいて同一のGISシステムで研究を行い2国間の環境情報の標準化に成功したことは重要である。、研究代表者はこの研究に直接参加したので得るものが多かった。国内の分担者間においても完全に1つのGISシステムで情報を一元化する手法を開発できるかである。各分担者がそれぞれ小スケールから大スケールヘ研究を拡大してゆく方針であるため、個体群や物質に注目した比較的詳細な研究が成果として挙がっているが、同時に大スケールでも研究を展開しているので来年度からは戦略アセスメントに寄与できる研究成果が蓄積されてくると考えられる。また、本年度の研究成果は、代表者、分担者3人が演者に含まれる日本生態学会50周年記念シンポジウム(3月2日つくば)「景観の構造と機能一日本における景観生態学の総括と展望」の中でも中心的な話題となることになっている。以上のことから、研究は外部からも十分評価されていると考えている。研究2年目は代表者と各分担者で相互に密接に連絡をとり,総合化のためのGISの構築に努力した.その結果,現在日本の環境アセスメントで最重要視されている「生態系評価」を行なうためのコンピューターソフト(名称Eco GIS)を開発することに成功した.本ソフトは環境省の評価の後,本年4月に(株)電力計算センターから販売する予定になっている.

また生態系評価を行なうための環境地図の作成技術についても基礎から綿密に再検討し,航空写真のオルソ化の技術と地形標高モデル(DEM)を作図過程でラスター型GISによって活用することが正確な環境地図作成のために重要であることを確認した.近年,我が国の環境行政で着々と進む法整備(アセス法1997;実施1999,新・生物多様性国家戦略2002,自然再生法2003)で,常に議論されつつも不明確だった点は,目標すなわちゴールがどのようなものであるかという点に尽きる.よって戦略的環境アセスメントには,理念としての健全な環境の保全・創出ではなく,長期的ビジョンのもとでより具体的に国内各地における自然保全と開発のバランス,その連続性や独自性の確保,数値的目標を示すことが求められている.このため本年度は,共同研究者と生態系評価の理念および方法を標準化するために,対象生態系を河川・流域,田園,都市林,及び湿地等にとり,北海道,本州,四国で生態系評価の試みを推し進めた.さらに比較対象としてマレーシア,ニュージーランド,中国などの諸外国でも同様の研究を行った.以上の成果は,本科研の代表者,分担者5人が演者,指名討論者に含まれる日本景観生態学会第14回大会公開シンポジウム(3月20日)「景観生態学と戦略的環境アセスメント」で最重要課題となって公表され大きな反響をよんだ.以上から本研究は社会的にも十分評価されたと考えている.本研究の最終年は,地域景観を生態系の種類,空間スケール,遺伝子などの調査から総括的にとらえた.生態学としては自然地域(特に河川),農村地域,都市とした.空間スケールでは地域全体を衛星写真のスケールから,植物個体群の遺伝子といったミクロのスケールまでを取り扱った.遺伝子においては,その生態系(植物群集)内における出現頻度の低い種の遺伝子のフローから,空間の構造を解明した.これらの情報を戦略的環境アセスメントの基礎資料とすることに努力した.自然地域においては物質の動態,流域内の水収支,魚類の存在様式などから,自然が本来有する構造と機能が調べられ,これらのシステムをいかに保全するかが検討された.農村地域でも同様に広域ではGISを利用し,詳細研究では耕地の雑草を指標とする研究がなされた.特にコウノトリの自然復帰(放鳥)を目標とした農村景観の研究はコウノトリを上位性の種としてとらえた場合,総合的に景観を評価するのに役立つものとなった.都市生態学では都市内の景観を生物の側から評価する指標を見出すことができた.多くの研究で指標性の高い生物群と,その挙動から都市内の緑地の構造の景観生態学的評価と,移動性,連続性,多様性保全等について確度の高い生態学的評価をすることができた.さらに,生態系全体の遺伝子構成を明らかにし,生物多様性の絶対的評価を可能にした.昨年度に続き,特定植物の遺伝子を解析し,生態系内の空間がどのように種によって利用されているか,外部との関係がどのようになっているかを植栽(メートルレベル)で評価できた.また別にEcoGISと称する環境アセスメントにおける「生態系」評価を実施するための基礎資料作成ツールを製品にすることができ,戦略的環境アセスメントに応用する道筋を構築した.これらを,系統的に総括した最終報告書を印刷中である.
歩行機の振動特性を巧みに利用した適応力の高い3次元2足動歩行の実現

本研究は,歩行機の身体的特徴である振動特性に注目し,これを巧みに利用しながら3次元2足動歩行を実現することを目的とする.2足歩行の手法は,動力を一切用いず,重力と身体的特徴および路面との相互作用で実現される受動的動歩行を規範とするもの,数理モデルに基づき,何らかの方法で予め与えられた関節軌道に追従するというものである.本研究では,強制的な膝の伸縮によって3次元2足歩行が励起されるという現象を利用し,これにバックドライバブルな股関節トルクを導入し,足裏の接地感覚情報をフィードバックすることで左右の歩幅を意図的に変化させ旋回することおよび路面の微妙な凹凸への適応などを実現した.生物が状況変化に対して身体的特性を巧く利用しながら適応することは知能の興味深い特徴の一つである.本研究の目的は,2足歩行動作において歩行機の身体特性の一つである振動特性を巧く利用し,かつ高い適応力を与えることにある.本年度は,これまでの研究成果である膝関節の周期的蹴り動作により身体特性に合わせて励起される3次元2足動歩行に対して,まず,環境適応力を与えるための感覚フィードバックを導入することが目標である.【目標1:歩行の周波数特性および歩行モードの解析】まず,これまでに開発してきた歩行機RW04に6軸FTセンサ(ニッタ,既存設備)を導入し,接地感覚情報を取得可能となるように改良を施した.このFTセンサを用いて受動歩行機で確認された歩行中における足裏圧力中心点の軌跡が人と同様に8の字を描くことを確認した.さらに,これまでの得られた膝の周期入力に対する歩幅の増幅率である歩行ゲイン特性に加え,位相特性を明らかにした.その結果,周波数が大きくなるにしたがって位相が反転することが示唆される結果が得られた.【目標3:歩行中の姿勢取得可能な新たな歩行機の設計製作】感覚フィードバックを用いたCPG手法の導入にあたって必要となる歩行機の姿勢をはじめとした状態取得のために小型慣性計測装置を実装した新しい3次元2足歩行機RW05を設計製作した.また,このRW05にRW04同様の膝振動を与えることで2足歩行動作を実現した.生物が状況変化に対して身体的特性を巧く利用しながら適応することは知能の興味深い特徴の一つである.本研究の目的は,2足歩行動作において歩行機の身体特性の一つである振動特性を巧く利用し,かつ高い適応力を与えることにある.具体的には,これまでの研究成果である膝関節の周期的蹴り動作により身体特性に合わせて励起される3次元2足動歩行に対して,まず,感覚フィードバックを導入することで歩行機に環境適応力を与える.次に,従来研究ではできなかった歩行振動数を学習もしくは最適化することで歩行の獲得を目指す.また,得られた制御系が状況や身体特性の変化に対して適応力を持つかどうか評価する.【目標1:周波数応答特性および歩行モードの解析】まず,これまでに開発してきた歩行機RW04に6軸FTセンサ(ニッタ,既存設備)を導入し,接地感覚情報を取得可能となるように改良を施した.このFTセンサを用いて受動歩行機で確認された歩行中における足裏圧力中心点の軌跡が人と同様に8の字を描くことを確認した.さらに,これまでに得られた膝の周期入力に対する歩幅の増幅率である歩行ゲイン特性に加え,位相特性を明らかにした.2015年度は,昨年度破損したFTセンサに変えて,感覚フィードバックを実現するために圧力センサを導入した新しい歩行機RW05を実現し,膝の伸縮による2足歩行を実現した.【目標2:歩行中の姿勢取得可能な新たな歩行機の設計製作】2014年度は感覚フィードバックを用いたCPG手法の導入にあたって必要となる歩行機の姿勢をはじめとした状態取得のために小型慣性計測装置を実装した新しい3次元2足歩行機RW05を設計製作した.また,このRW05にRW04同様の膝振動を与えることで2足歩行動作を実現した.2015年度はさらにこのRW05に故障したFTセンサの代替センサとして圧力センサを導入すると共に2足歩行を実現した.2014年度終わりに発生したFTセンサの故障は最終的に修理不可能という結論に至ったため,足裏の接地情報を取得する新しい圧力センサの導入を試みた.修理の可否の確認や新たなセンサの選定,導入などに今年度の大半を費やすことになったため遅れが生じている.2脚(もしくは2足)による受動歩行は2本の脚(および足)を持つ歩行機が適当な初期条件を与えることで動力無しで緩斜面を下る現象である.その歩容は身体の動力学特性と環境との相互作用によって創発され,身体形状や環境の変化によって変化する.現在,さまざまな動力2足歩行を実現するヒューマノイドが存在するが,基本的に転倒を防ぐように与えられた関節角度の目標軌道に追従する制御を行っているため,身体の動力学特性や環境との相互作用にあわせた歩容を生成することは困難である.我々は受動歩行を規範とし,これを実現する身体形状を持つ歩行機に対し,膝の強制的な振動によって水平面の歩行を実現してきた.膝の伸縮以外は歩行機の動力学特性とと環境との相互作用のみで運動するため歩行機の身体形状にあった歩容が創発される.しかし,膝の伸縮だけでは路面の凹凸に対して適応することが困難であり,さらに進行方向の変化や歩幅の増加を目指したよりロバストで適応的かつ動力学的特性の強い歩行を実現することが困難であった.このような歩行は,能動制御を伴わない受動歩行やそれを規範とする歩行機の問題点である.

そこで,受動的歩行を規範とするより適応的な2足歩行を実現するために膝関節の振動に加え,バックドライバブルな股関節の駆動装置と感覚フィードバックを導入した.股関節入力は足底の接地感覚から生成され,歩幅に合わせて一定の駆動力を発生するのみである.これにより,路面の凹凸によって歩幅が大きくばらついたり転倒を招いていた従来方法に対し,よりばらつきの少ない適応的な2足歩行が実現された.また,左右の出力調整により旋回動作も実現している.また,派生的に周期的な脚運動と受動関節を持つ多足ロボットを実現している.本研究は,歩行機の身体的特徴である振動特性に注目し,これを巧みに利用しながら3次元2足動歩行を実現することを目的とする.2足歩行の手法は,動力を一切用いず,重力と身体的特徴および路面との相互作用で実現される受動的動歩行を規範とするもの,数理モデルに基づき,何らかの方法で予め与えられた関節軌道に追従するというものである.本研究では,強制的な膝の伸縮によって3次元2足歩行が励起されるという現象を利用し,これにバックドライバブルな股関節トルクを導入し,足裏の接地感覚情報をフィードバックすることで左右の歩幅を意図的に変化させ旋回することおよび路面の微妙な凹凸への適応などを実現した.ケーブルなどの影響の問題:受動歩行メカニズムに基づく歩行は外部からの影響を強く受ける傾向がある.路面の凹凸などは歩行機の適応性などを向上させることで対処することを目指すが,接続されたケーブルの影響を受けるなど歩行を取り扱う上で不自然な外乱の存在がある.こういった影響は歩行特性(例えば位相特性)を明らかにする上で想定していた以上に問題となることが明らかになってきた.したがって,初年度に得られたデータはケーブルの影響を強く受けているため歩行機の本質的な特性として用いることがむずかしい.また,感覚フィードバックを用いた適応的歩行の実現にも影響を与えることが懸念された.したがって,初年度に製作を完了した新しい歩行機RW05について,初年度途中に次年度の目標である程度の無線化を前倒しして行うことでこの問題の解消を試みている.FTセンサの問題:感覚フィードバックを導入するためには遊脚の接地や支持脚時の足裏の圧力中心点の位置を感覚情報として観測する必要がある.これまでは既存の設備であるFTセンサをもちいて足裏圧力中心点を観測していたが,このセンサに問題が生じたため,初年度行う予定であった感覚フィードバックの導入に遅れが生じた.したがって,装置の改良や修理を行う必要がある.以上の理由から,初年度の目標2である新たな歩行機の実現とその歩行特性としての振動特性と足裏圧力中心軌跡の解析は実現されたが,感覚フィードバックの導入による適応的歩行の実現ができていないという意味でやや遅れていると判断した.2015年度末に圧力センサの動作確認を完了すると共に,このセンサを実装した状態での2足歩行が実現できた.
増殖因子受容体の分解機構の解析

増殖因子により活性化された増殖因子受容体はエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、エンドソームを経由してリソソームへと運ばれ分解される。これらの受容体はユビキチン化を受け、エンドソームにおいて一連のユビキチン結合蛋白質複合体により認識される。エンドソーム上で機能するマシーナリー蛋白質のうちいくつかはモノユビキチン化を受けており、ユビキチン化によりそれらの蛋白質の機能調節およびエンドソームにおける選別輸送の調節が行われていることが示唆されている。今年度はUBPYがこれらのエンドソーム蛋白質の機能調節を行っている可能性について検討した。UBPYの酵素活性部位変異体発現細胞、およびRNAi法により内在性のUBPYをノックダウンした細胞ではユビキチン化蛋白質が主に初期エンドソーム上に蓄積した。さらに、UBPYの機能阻害細胞では初期エンドソームの形態変化が引き起こされた。電子顕微鏡観察により、エンドソームの形態変化はエンドソームの凝集であること、凝集したエンドソーム間には高電子密度の領域が存在することが明らかになった。次に、モノユビキチン化を受けることが報告されているエンドソーム蛋白質(Hrs, STAM, Eps15, Tsg101)のユビキチン化レベルをUBPYが調節している可能性を調べた。その結果、UBPY機能阻害細胞ではEps15のユビキチン化レベルが大きく上昇していることを見いだした。UBPYは細胞内でEps15と結合し、UBPYの酵素活性部位変異体ではその結合が増強されること、UBPYがin vitroでEps15の脱ユビキチン化を行ったことから、Eps15はUBPYの基質となり得ることが示された。またEps15はUBPY機能阻害細胞において凝集したエンドソーム上に蓄積し、ユビキチン化蛋白質と共局在した。以上の結果から、UBPYはエンドソーム上の蛋白質のユビキチン化レベルを調節し、その調節がエンドソームの形態維持に必要であることが示唆された。このダウンレギュレーションのプロセスは受容体からの過剰なシグナルを遮断するための重要な調節機構である。受容体はリガンド依存的にユビキチン化を受け、このユビキチン化がリソソームへの選別輸送シグナルとして機能することが近年明らかにされた。リソソームへの分解経路への選別は、エンドソーム膜上に局在するHrs/STAM蛋白質複合体がユビキチン化受容体を認識することによって行われる。私達はHrs/STAM複合体の解析を行う過程で、STAMが脱ユビキチン化酵素UBPYと結合することを見出している。本研究では増殖因子受容体のダウンレギュレーションにおけるUBPYの機能について解析を行った。まずUBPYがユビキチン化受容体の脱ユビキチン化を行うか検討した。その結果、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)のリガンド依存的なユビキチン化レベルは、UBPY過剰発現細胞において大幅に減少した。精製したユビキチン化EGFRとUBPYをin vitroで反応させることによってもEGFRの脱ユビキチン化が観察された。さらにRNAiにより内在性のUBPYをノックダウンした細胞では、EGFRのリガンド依存的ユビキチン化レベルの上昇が見られた。これらのことからUBPYは直接EGFRの脱ユビキチン化を行うことが示された。また、UBPYを過剰発現した細胞ではEGFRのダウンレギュレーションが抑制された。以上の結果から、増殖因子受容体のダウンレギュレーションはCblによるユビキチン化に拮抗して、UBPYによる脱ユビキチン化により負の調節を受けていることが示唆された。すなわちUBPYが受容体の分解を遅らせることで、受容体からの細胞増殖シグナルの強度、あるいは持続時間の調節を行っている可能性が考えられた。分解経路に選別される受容体はユビキチン化を受け、ユビキチン化を受けた受容体はHrs-STAM複合体、ESCRT複合体と呼ばれる一連の蛋白質複合体により認識される。Hrs-STAM複合体は脱ユビキチン化酵素UBPYと結合能を有するが、結合の意義やその機能は不明であった。本研究では上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)のダウンレギュレーションにおけるUBPYの機能について解析を行った。その結果、EGFRのリガンド依存的なユビキチン化レベルはUBPY過剰発現細胞において大幅に減少し、RNAi法によりUBPYをノックダウンした細胞で上昇した。精製したUBPYはユビキチン化EGFRをin vitroで脱ユビキチン化した。また、EGFRのダウンレギュレーションがUBPY過剰発現細胞では抑制され、UBPYノックダウン細胞では促進された。UBPYはエンドサイトーシスされたEGFRと細胞内で結合し、その結合にはHrs-STAM複合体が必要であった。さらに、UBPYの酵素活性部位変異体はHrs-STAM非依存的にエンドソームに局在し、EGFRと共局在した。

以上のことから、UBPYはエンドソーム上でEGFRを脱ユビキチン化することにより、受容体のダウンレギュレーションを負に調節することが示された。増殖因子により活性化された増殖因子受容体はエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、エンドソームを経由してリソソームへと運ばれ分解される。これらの受容体はユビキチン化を受け、エンドソームにおいて一連のユビキチン結合蛋白質複合体により認識される。エンドソーム上で機能するマシーナリー蛋白質のうちいくつかはモノユビキチン化を受けており、ユビキチン化によりそれらの蛋白質の機能調節およびエンドソームにおける選別輸送の調節が行われていることが示唆されている。今年度はUBPYがこれらのエンドソーム蛋白質の機能調節を行っている可能性について検討した。UBPYの酵素活性部位変異体発現細胞、およびRNAi法により内在性のUBPYをノックダウンした細胞ではユビキチン化蛋白質が主に初期エンドソーム上に蓄積した。さらに、UBPYの機能阻害細胞では初期エンドソームの形態変化が引き起こされた。電子顕微鏡観察により、エンドソームの形態変化はエンドソームの凝集であること、凝集したエンドソーム間には高電子密度の領域が存在することが明らかになった。次に、モノユビキチン化を受けることが報告されているエンドソーム蛋白質(Hrs, STAM, Eps15, Tsg101)のユビキチン化レベルをUBPYが調節している可能性を調べた。その結果、UBPY機能阻害細胞ではEps15のユビキチン化レベルが大きく上昇していることを見いだした。UBPYは細胞内でEps15と結合し、UBPYの酵素活性部位変異体ではその結合が増強されること、UBPYがin vitroでEps15の脱ユビキチン化を行ったことから、Eps15はUBPYの基質となり得ることが示された。またEps15はUBPY機能阻害細胞において凝集したエンドソーム上に蓄積し、ユビキチン化蛋白質と共局在した。以上の結果から、UBPYはエンドソーム上の蛋白質のユビキチン化レベルを調節し、その調節がエンドソームの形態維持に必要であることが示唆された。
血小板活性化因子(PAF)と細胞接着因子

(1)ラットPAFアセチルヒドラーゼlbcDNAクローニングを行った。ラット脳よりcDNAライブラリーを構築し、ウシlb型各サブユニットcDNAをそれぞれプローブとしてスクリーニングを行った。その結果、αで5クローン、βで4クローン、γで2クローンのウシα、β、γサブユニットcDNAと相同性を有するcDNAが得られた。複数のクローンが共通の配列を有しており、実際、N末端を含むと予想されるβ、γサブユニットのクローンを発現させた大腸菌でPAFアセチルハドラーゼ活性が確認できたことから,これらのクローンの配列をラットα、β、γサブユニットの塩基配列と断定した。この塩基配列より予想されるアミノ酸配列を決定し、他の種との相同性を比較したところ、哺乳動物種間で非常に良く保存されていることが明らかとなった。(2)ラット胎児の発生段階での各サブユニットの発現量の変化について検討を行った。胎児頭部において各サブユニットの発現パターンを調べた結果、α、βは発生過程を通じて変化がみられなかった。それに対してγは脳の形態形成の始まる胎生13日目から発現し始め、15日目には発現のピークが見られ、その後の発現量は減少していくという点で他のサブユニットとは異なっていた。実際、PAFアセチルハドラーゼ活性も胎生15日目にピークを示すことを確認した。発生過程の脳の形態形成におけるγサブユニットの調節的役割が示唆された。