hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高温カイラル磁性体における新奇スキルミオン状態の探索と解明

この新奇スキルミオン相は、β-Mn特有のフラストレートした反強磁性的なMnスピンが強磁性的なCoスピンに及ぼす揺らぎによって安定化されたと考えられる。この研究成果は、カイラル磁性体にフラストレーションが加わることでスキルミオンの安定性が増強されることを意味しており、スキルミオン研究において重要な発見である。この研究成果に関する論文がScience Advancesに掲載された。2Co-Zn-MnのFeドープ系であるCo8-xFexZn8Mn4の純良試料を作製し、共同研究を含む様々な測定を行った結果、Dzyaloshinskii-Moriya (DM)相互作用の符号(ヘリカル磁性やスキルミオンのスピンの巻き方向)がx=2.7付近で反転することを発見した。この実験結果は、共同研究による第一原理計算に基づく理論計算でも再現されており、この系の複雑なバンド構造内の電子数密度の変化で説明できることが分かった。これらの結果は、DM相互作用の著しい変化や符号反転は、バンドフィリングを制御できる金属カイラル磁性体に普遍的な現象であることを意味しており、金属におけるDM相互作用の理解に大きく貢献する。この研究成果に関する論文がPhysical Review Bに掲載された。【方針1.Co10Zn10の研究】これまでにCo-Zn-Mn合金で観測されている、スキルミオンの強い準安定性、四角格子スキルミオン、スピングラス相などはMnが重要な役割を担っていると考えられる。これらを確かめるためには、Mnを含まないCo10Zn10の研究が不可欠である。既に単結晶試料を得ており、今後、小角中性子散乱や交流磁化率測定を行う。【方針2.メモリー効果測定によるスピングラスの研究】Co-Zn-Mn合金のスピングラスの微視的機構を明らかにするために、メモリー効果測定を様々な組成に対して行う。メモリー効果は冷却時の待ち時間や温度を記憶した現象であり、スピングラスの複雑なエネルギーランドスケープの情報を引き出すことができる。【方針3.Co6.75Zn6.75Mn6.5の研究】Co6.75Zn6.75Mn6.5は、ヘリカル磁性相が消失する臨界点近傍に位置する組成であり、新奇なスキルミオン状態が発現する可能性がある。既に単結晶試料を得ており、今後、小角中性子散乱測定やローレンツ透過型電子顕微鏡観察を行う。次年度使用額が生じた理由は、前年度に予定していた物品(測定装置)の購入を見送ったためである。この繰越費用は、本年度の物品購入に充てる予定である。
細菌の六価クロム耐性機構の解明とクロム汚染防止技術への応用

緑濃菌よりクローニングした六価クロム耐性遺伝子の塩基配列の決定が終了した。決定された配列の長さは3297bpである。この配列内に523bpの二つの完全な相同配列が見いだされたが、元のプラスシドとのハイブリダイゼーションの結果からクローニングの段階で同一配列が二重に組みこまれたものであることが分かった。約1.2kbのORF1は今のところ考えられる唯一の構造遺伝子コード枠のようであり弱いが幾つかの膜結合型ATPアーゼとの相同性がある。このことは緑膜菌の六価クロム耐性遺伝子の支配する防御機能は六価クロムに特異的な陰イオンポンプの可能性を示している。六価クロムを三価クロムに変換する細菌Enterobacter cloacal HO1株を分離した。この細菌は嫌気条件下でのみ三価クロムへの変換を行う。細胞レベルで見るとこの変換は電子供与体として酢酸のほかにグリセロール、エタノール、リンゴ酸などを利用できる。透過型電顕により細胞外に電子密度の高い沈澱物の存在が見られた。X線解析からこの沈澱物がもっぱら金属クロムを含むこと及び細胞内にはクロムの蓄積は特に認められないことが解った。この六価クロム変換機能は細胞内膜に局在している。この細菌より調製した膜小胞は適当な電子供与体の存在下で六価クロム変換活性を示す。アスユルビン酸-PMSが電子供与体とロリアンチマイシンA又はHOQNOによる阻害はこの場合みられない。蛍光物質を用いた膜電位測定から、膜小胞に六価クロムを加えると膜電位が形成されることもわかった。以上のことからE.cloacae HO1の六価クロム変換機能が細胞内膜の電子伝達系と係わっていることが強く示唆される。この六価クロム変換機能は嫌気条件下におけるE.cloacae HO1の耐性機構のひとつと考えられる。E.cloacae HO1は六価クロムを三価クロムに変換し、細胞外に水酸化クロムの沈澱を形成して系から取り除くばかりか、六価クロムを細胞内に蓄積することも少ないから理想的な六価クロム除去が可能。
現代バリの病・障害・死生観を巡る身体論の研究－民俗医療と近代医療が交わる視座から

本研究は、バリにおける「自然科学的な身体観」とは異なる「宗教的な身体観」を明らかにし、彼らの受療行動がいかにして実践されるか、その文化モデルを構築することを目的とする。彼らは医学的な機序だけをみて病を判断するのではない。不可視の世界のケガレから大きな影響を受けていると考え、多くの場合、治療には儀礼を必要とする。癒すための儀礼の背景には、個人、家族、地域共同体、死者という、ミクロからマクロ、可視の世界から不可視の世界を往還するコスモロジーが存在する。これらの儀礼にまつわる身体観について毎年フィールドワークを行い、学会発表等で成果を紹介している。2013年度の具体的なフィールドワークとしては、2013年9月にバリ島のウブドを中心に死者の浄化儀礼の調査によって死者儀礼にかかわる「見えない身体(魂)」の資料を採取することができた。この成果を2013年12月26日に総合人間科学研究会において以下のように成果を発表した。一般的な身体論が問題にする「成長」とは、生物学的な部分に終始することがほとんどである。しかし世界のさまざまな民族事例をみると、問題になるのは身体的成熟だけではなく、霊的・儀礼的な成熟が重要視していることが多いことがわかる。たとえば文化人類学におけるジェネップの通過儀礼の概念からすれば、個人は儀礼を経て社会的地位や社会的な空間を移動していくことになる。ある儀礼を経て子どもが大人になるということだが、実際これは人生が続く間に限らない。バリでは生きている間よりもむしろ死後の方に重点を置いて、死者に対してある種の「成長」を促す浄化儀礼をおこなう。なぜ浄化という概念が使用されるかというと、バリの人々にとって人間の肉体は本来穢れている物体であり、真の自我(atma)である魂は肉体という牢獄に閉じ込められていると考えているからである。そのためバリでは死は必ずしも悲しい出来事ではなく、魂の開放として喜ばれることが多い。人間が生きている間に為したカルマは身体の中の魂に蓄積され、どんどん穢れていくとされる。死んですぐの魂は穢れているため、浄化が必要とされるのである。ではなぜ死者の魂の浄化が必要かというと、穢れなき魂は祖霊神となり生きている子孫を守護する役目が与えられるからである。そして一定期間ゆかりのある生者を守護した後、再び輪廻転生するとされる。ゆえに死者本人だけでなく、生きている家族にとっても不可視の領域を安定させるためには、死者の浄化儀礼は不可欠となっている構造がある。来年度は学術論文として発表する予定である。本研究は、「自然科学的な身体観」とは異なるバリの人々の「宗教的な身体観」を明らかにし、彼らの(近代医療も含む)受療行動がいかにして実践されるか、その文化モデルを構築することが目的である。平成26年度の研究では、バリの呪術医(balian)とそのクライアントへの参与観察とインタビューをおこなった。その際、クライアントが頭から水をかぶって身体をきよめる浄化儀礼を中心に取材している。近代医療の視座からすると病に陥った身体に対して冷水を浴びせるのはおそらく奨励されることではないが、彼らの治療儀礼においては(健康を取り戻すためには)、必須と考える人々が多い。これを単純に迷信深い手間のかかる作業とはとらえず、彼らの身体観における浄と不浄の観念が、健康や病の認識に深く関係することを分析した。また浄ー不浄の観念は、個人の身体にとどまらず、家族共同体、地域共同体にまで敷衍できることがわかった。毎年、呪術医のところでの調査をおこなっているが、昨年は家族共同体における浄化儀礼、本年度は村落における地域共同体のケガレを払う儀礼を調査した。浄と不浄の観念は、個人の身体から、家族共同体、そして地域共同体へと浄と拡大していくという入れ子状のコスモロジーが基盤になることを明らかにした。このことはすなわち、個人の身体の問題(病)が、家族や地域へと飛び火する可能性を示すと同時に、共同体の宗教的問題(ケガレ)が個人に降りかかるというインタラクティブな関係にあることを示している。このような双方向性について、文化モデル化について考察していきたいと考えている。今年度は、昨年調査をおこなったインドネシア共和国バリ州カランガスム県ジャシイ(Jasi)において、二年に一度おこなわれているテルテラン(terteran)という儀礼についての追加調査および分析をおこなった。テルテランはバリ島全体が物忌みをおこなうニュピの前日におこなわれ、地を疾駆し人々にいさかいや災厄をもたらすブタ・カラを祓う儀礼である。もともとテルテランのテル(ter)は「投げる」という意味であり、テルテランと二度繰り返すことで「投げ合う」という意味に変化する。テルテランの形態は、火のついた松明を二手に分かれた集団が投げあうことで儀礼を遂行するのである。ゆえにテルテランは通称「火の戦い(perang api)といわれる。バリの中でもこのような形式の祭は少なく、特異な儀礼として高い知名度を誇っている。申請者は、テルテランの準備とこれにまつわる複数の儀礼、テルテランの儀礼内容の分析とその象徴的な意味を読み解き、バリ文化における地域共同体の浄化の概念、災厄や人間関係のいさかいなどを説明する民俗的機序、儀礼というパフォーマンスの遂行効果、マス・カタルシスの社会的機能について考察した。

バリの人々が考える「健康」が「自然科学的身体」のみならず、民俗的な浄と不浄の概念から想定される「霊的身体/魂」や、地域共同体の不浄の多寡によって、構成されていることが明らかになった。本研究が目的とするバリの人々の「健康観/病観」のモデル化に大きく寄与する調査と分析となった。本研究は、バリにおける「自然科学的な身体観」とは異なる「宗教的な身体観」を明らかにし、彼らの受療行動がいかにして実践されるか、その文化モデルを構築することを目的とする。彼らは医学的な機序だけをみて病を判断するのではない。不可視の世界のケガレから大きな影響を受けていると考え、多くの場合、治療には儀礼を必要とする。癒すための儀礼の背景には、個人、家族、地域共同体、死者という、ミクロからマクロ、可視の世界から不可視の世界を往還するコスモロジーが存在する。これらの儀礼にまつわる身体観について毎年フィールドワークを行い、学会発表等で成果を紹介している。本研究では、バリの人々の身体観とそれに関わる病観/健康観の概念を、彼らがおこなう儀礼から解読を試みようと考えている。呪術医によっておこなわれる治療儀礼の調査から、病と身体のケガレの関係性に関する資料を採取し、村全体をきよめることで災厄や疫病を避けることを目的とするテルテラン(terteran)儀礼の調査をおこなった。これらの調査によって、村落(地域)共同体ー家族共同体ー個人の身体が「きよめる」「穢れる」という概念によって入れ子状になっている、バリの人々のコスモロジーに関する基礎資料が集まったと考えている。この件に関して、暫定的な考察であるが、学会発表および学術論文の投稿を予定している。宗教学平成26年度は、ジャカルタのインドネシア大学においての研究者交流、バリ島におけるフィールドワークのための海外渡航をおこない、研究発表(平成26年12月総合人間科学研究会研究大会)での研究発表のための国内旅行をおこなった。また物品費等の諸雑費を適切に使用できたと考えている。平成27年度においても、昨年度の使用に準じた方法で研究費を使用する予定である。ただし本年度は研究成果をまとめることに専念するため、インドネシアだけではなく、シンガポールにある東南アジア研究所のISEASライブラリーにて文献渉猟をおこなうことを予定している。そのうえで国内における学会で随時フィールド資料の分析・考察のまとめを発表し、学術雑誌への投稿をおこないたいと考えている。本研究は、研究史的には民俗医療、儀礼論(通過儀礼、葬送儀礼)、死生観など、多岐にわたって展開する研究となっている。これらに通底するテーマが、身体観である。この身体観を明らかにするために、本研究の独創的な視座として、以下の2点を研究計画で述べた。(1)民俗医療の側面:身体を通してバリの人々の「健康観」「病観」が明らかになると考える。民俗医療者の語り、近代医療者の語り、クライアントの語り、家族の語りがどのように相互参照され、「病」の概念を形成するのかを明らかにする(2)儀礼の側面:バリの赤子に対する入魂儀礼、成人儀礼である削歯儀礼、結婚儀礼、葬送儀礼、祖霊の浄化儀礼において身体観を分析する。現在までの研究では、「ケガレ」という概念で分析されることが多かったが、本研究ではバリの人々がどのような語りと行動をもって、社会的成熟の印とするのか。儀礼と身体の成熟の関係性を、死後まで含めて考察する。
生体信号を利用した自走ロボット制御システムの製作

研究目的近年,脳波や筋電図など生体信号を利用した福祉機器が開発・販売されるなど,生体信号の利用が注目されている.本研究では生体信号の応用例として,操作者の意思抽出に前腕部の筋電図(EMG)を利用し,操作者が左右の腕に力を入れることで,制御対象である自走車の前進・左折・右折の動作をさせることができる「自走ロボット制御システム」を製作する.完成した本システムは地域での科学イベントやオープンキャンパスなどにおいて,生体信号の応用例の紹介用として利用する.研究方法本研究では,操作者の筋電図波形から意思情報を抽出する判定プログラム,模型を利用したクローラー型の自走車,計装アンプを利用した増幅度・遮断周波数が可変の2CH生体信号測定用アンプ,および判定プログラムから出力された操作者の指令を送る無線送受信部を製作した.これらを組み合わせて,操作者が左・右の腕に力を入れることで,筋電図を利用して自在に自走車を操作することが可能になる.今回,筋電図波形から意思情報を抽出する判定プログラム作成は佐賀大学理工学部電気電子工学科システム制御研究室の協力を頂いた.研究成果・結果本研究により製作した自走ロボット制御システムは,生体信号の応用例として大学のオープンキャンパスのほか,地域貢献活動として地域で開催される科学イベントなどで,小中学生や高校生に対して紹介を行う予定である.また本研究の一部は佐賀大学理工学部電気電子工学科システム制御研究室の卒業研究課題としても採用され,技術的ノウハウが研究教育面にも活用された.研究目的近年,脳波や筋電図など生体信号を利用した福祉機器が開発・販売されるなど,生体信号の利用が注目されている.本研究では生体信号の応用例として,操作者の意思抽出に前腕部の筋電図(EMG)を利用し,操作者が左右の腕に力を入れることで,制御対象である自走車の前進・左折・右折の動作をさせることができる「自走ロボット制御システム」を製作する.完成した本システムは地域での科学イベントやオープンキャンパスなどにおいて,生体信号の応用例の紹介用として利用する.研究方法本研究では,操作者の筋電図波形から意思情報を抽出する判定プログラム,模型を利用したクローラー型の自走車,計装アンプを利用した増幅度・遮断周波数が可変の2CH生体信号測定用アンプ,および判定プログラムから出力された操作者の指令を送る無線送受信部を製作した.これらを組み合わせて,操作者が左・右の腕に力を入れることで,筋電図を利用して自在に自走車を操作することが可能になる.今回,筋電図波形から意思情報を抽出する判定プログラム作成は佐賀大学理工学部電気電子工学科システム制御研究室の協力を頂いた.研究成果・結果本研究により製作した自走ロボット制御システムは,生体信号の応用例として大学のオープンキャンパスのほか,地域貢献活動として地域で開催される科学イベントなどで,小中学生や高校生に対して紹介を行う予定である.また本研究の一部は佐賀大学理工学部電気電子工学科システム制御研究室の卒業研究課題としても採用され,技術的ノウハウが研究教育面にも活用された.
HCV蛋白とインターフェロン系との相互作用のFRET/BRET解析

C型肝炎ウイルス(HCV)のNS4B蛋白、インターフェロン(IFN)シグナル分子であるCardif、STINGの蛋白-蛋白間相互作用について検討した。その結果、CardifとHCV-NS4Bの間に弱い結合が見られた。一方で、STINGについても同様に解析した結果、BiFC解析で強い結合を認め、NS4BとSTINGの相互作用が示された。同じ結果を免疫沈降法、免役染色法でも確認下。以上の結果より、NS4BとSTINGは直接結合し、STINGを介したIFN発現誘導を抑制していることを示した。申請者の研究室で開発したHCV増殖・培養細胞系を用いて病原体侵入により惹起されるIFN産生系を抑制する蛋白NS4Bの分子間相互作用の解析を進める事を目的として研究を進め以下の結果を得た。1)既報の5カ所の膜貫通ドメインに従ってHCV-NS4Bを様々な長さにtruncateしたplasmidを構築し、構築した欠失NS4BプラスミドをCardifまたはRIG-I発現プラスミドと共にHuh7細胞で強制発現させ、IFN-βプロモーター・リポーター、及びISRE-リポータープラスミドを用いてIFN発現レベルを定量した。NS4Bのfull lengthのコンストラクトではISRE活性化は11%まで抑制され、これにつぐ抑制がNS4Bt1-156,1-186,131-260でそれぞれ50%程度みられた。抑制が見られなかったコンストラクトはN末端側を削った90-260,110-260で、これらの結果からISRE活性の抑制に関与する部位は、90-260,110-260に共通して欠けている構造、即ちNS4B1-90に至るN末端が抑制に関与している事が示唆された。また、1-156,1-186,でも50%と僅かながらも抑制がとれており、C末端の抑制への関与も示唆された。2)HCV-NS4BとCardifの局在と小胞体膜との位置関係を解析するべく免疫染色を行った。NS4B発現プラスミドとCardif発現プラスミドをHuh7細胞に遺伝子導入し、一次抗体としてそれぞれマウス抗Myc抗体、ラビット抗Flag抗体、二次抗体としてそれぞれマウス、ラビットに対する蛍光色素で標識した抗体を用いて染色したところ、共局在している部分を認めた。以上の結果よりNS4BとCardifが小胞体膜上での共局在が示唆された。生体発光共鳴エネルギー転移(Bioliminescence Resonance Energy ransfer)は生細胞を用いてタンパク質相互作用の時間的・空間的な変化を比較的用意に可視化出来る方法で、この手法を用いてHCV-NS4BとCardifの相互作用の解析を目的にRluc,GFPとの融合蛋白を作成した。以上より、NS4B蛋白はCardifまたはその直下のシグナルを抑制し、生体におけるウイルス持続感染に関与していると考えられる。IFN産生抑制に関わるNS4Bの機能ドメインを特定した。これらの経路に関連する分子・蛋白エピトープを治療標的とすることがHCVの病態制御に結びつくと考えられる。本研究において申請者は、生体における抗ウイルス免疫応答に中心的な役割を果たしているインターフェロン(IFN)系と、C型肝炎ウイルス(HCV)感染との関わりを解明するため、独自に開発したHCV増殖・培養細胞系を用いて分子イメージング技術により、病原体侵入により惹起されるIFN産生系を抑制するHCV蛋白、NS4BおよびNS34Aの分子間相互作用の解析をすすめ、以下の結果を得た。(1)NS4B、RIG-I,Cardif蛋白発現プラスミドに蛍光蛋白Kusabira-GreenのN末端側、およびC末端側の切断蛋白を癒合した発現プラスミドを構築し、細胞内強制発現にてそれらの分子間結合をBi-molecular Fluorescent Complementation(BiFC) assayにより検出したところ、NS4Bがインターフェロン誘導アダプター蛋白であるSTINGと強固に結合し、その活性を抑制することを見いだした。種々のエピトープを欠失したNS4B発現プラスミドを用いることにより、NS4BのN末端側1-72アミノ酸が相互作用に関連した領域であることを明らかとした。(2)HCV-NS4BとCardif,RIG-Iの免疫沈降:により、NS4B蛋白がSTINGとCardifの分子間結合を阻害し、インターフェロンシグナル活性化を遮断することを明らかとした。本研究の成果を元に、HCV感染細胞におけるインターフェロン不応性のメカニズムを明らかとしてNS4Bを標的とした新たな分子標的療法樹立に向けた研究を遂行する。HCV-NS4BとCardifの相互作用についてBimolecular fluorescence complementation (BiFC)アッセイにより検討した。PCRで増幅したNS4B, Cardifをそれぞれmonomeric Kusabira-green(mKG)ベクターに挿入し、N末端またはC末端をトランケイトしたmKGを融合したNS4B, Cardif発現プラスミドを作成した。

出来上がった発現プラスミドを、相補的なmKG断片を持つ組み合わせでそれぞれHEK293細胞に遺伝子導入し24時間後に検討した。得られた蛍光陽性細胞をフローサイトメトリーで解析し、また共焦点顕微鏡で観察した。STINGについても切断したmKG蛋白とN末端もしくはC末端で融合した蛋白発現プラスミドを作成し、様々な組み合わせで遺伝子導入した。その結果全ての組み合わせで強い蛍光を認め、NS4BとSTINGの相互作用が示唆された。フローサイトメトリーでもNS4BとSTING-mKG融合蛋白の全ての組み合わせ強いBiFCシグナルを認めた。またコントロールと比較しNS4BとSTING-mKG群においてBiFC陽性細胞の存在比は有意に高くなっていた。更に免疫沈降ではCardifとSTINGの相互反応が確認され、NS4B存在化でこの反応は減弱していたことから、NS4Bによるこれらの相互反応の阻害が確認された。HCV感染細胞でインターフェロン応答シグナルを遮断するウイルス蛋白NS4BがSTINGの特定のドメインを標的とすることを世界で初めて明らかとしている。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の成果を元に、HCV感染細胞におけるNS4B、SN34Aを介したインターフェロン不応性のメカニズムを明らかとし、NS4Bを標的とした新たな分子標的療法樹立に向けた研究を遂行する。すでにNS4B阻害薬による抗ウイルス効果、インターフェロンシグナル抑制効果の解析準備を進めている。
常時微動観測に基づく超高層ビルの層間損傷定量評価手法の開発と適用性検討

本研究は、超高層ビルの構造安全性を精度よく評価することを目指し、常時微動(地震動以外の常に存在する微小振動)を用いて超高層ビルの上構造のみまたは各層の応答性能の評価手法を開発し、手法の適用性と応用限界などを実観測データに基づいて検討した。本研究では、従来の建物の応答は周波数領域において固有振動数が異なる振動モードの足し合わせの視点を覆して、波動伝播の視点から時間領域の解析手法(逆重畳法)を超高層ビルの常時微動記録から、建物の上部構造の水平方向に強い揺れをもたらすせん断波の伝播時間(速度)を抽出する手法を提案した。振動モードにより解析手法の有効性と応用限界および常時微動への適用性を検討した。本研究では、超高層ビルのヘルスモニタリングの高度化(高密度化と広域化)を目指し、地震計が設置されてない超高層ビルでも簡単な観測機器(ペアセンダー)で常時微動を測定し、逆重畳法によりビルの各層に伝播するせん断波の速度を抽出する手法の適用性および適用条件を2次元フレームモデルおよび実観測データの解析に基づいて検討した。(1)各層に曲げばねとせん断ばねが設置され、層毎のせん断モードと曲げモードが再現できる2次元フレームモデルを用いて、モデル1:建物全体は曲げーせん断モード;モデル2:低層部分は曲げモード、この上は曲げーせん断モード;モデル3:中間層は曲げモード、その他は曲げーせん断モードで振動して、せん断波の境界条件が異なる三つのモデルを構築し、振動モードが異なる場合、せん断波の反射、透過および干渉現象を数値セミュレーションして、振動モードが異なる場合、せん断波速度の抽出の有効性を予備的検討を実施した。(2)超高層ビルの常時微動記録には、伝播経路(高さ)が長いので風や人間活動等により生じたノイズが多く混入された時にせん断波伝播時間を精度よく抽出するため、必要な観測技術およびデータの整理手法を検討する。常時微動観測記録から抽出したせん断波伝播時間を地震記録およびモデルから抽出した結果と比較して、ノイズ成分の相互相関性が低いという特性を利用して、精度の良い解析手法を開発し、観測機材の感度と分解能によってせん断波速度の抽出に対する常時微動観測に必要な機材の最低限な観測能力を解明した。研究成果は、日本建築学会の権威学術誌に搭載された。(常時微動の鉛直アレイ観測に基づく超高層ビルにおける1次元波動伝播解析および層間せん断波速度の抽出、王欣、正木和明、入倉孝次郎、源栄正人、久田嘉章、日本建築学会構造系論文集、第80巻、第718号、pp. 1859-1868, 2015年12月)平成27年度の研究計画の通りで実施した。(1)振動モードが異なる層の境界でせん断波の反射、透過および干渉現象を曲げーせん断フレームモデルを用いて数値セミュレーションにより解明することが完成した。(2)ノイズが混入された相関性が低い常時微動記録から、せん断波伝播時間を精度よく抽出するため、必要な観測技術およびデータの整理手法を検討することが完成した。本研究では、超高層ビルのヘルスモニタリングの高度化(高密度と広域化)を目指し、地震計が設置されてない超高層ビルでも簡単な観測ききで常時微動を計測し、波動伝搬理論に基づく各層に伝搬するせん断波の速度を抽出する手法の適用性および適用条件を検討した。(1)せん断波伝播速度が超高層ビルの常時微動記録から抽出することの有効性を地震動、常時微動および3Dモデルにより実証した。建物の中心軸および平面に分散設置される地震計の常時微動記録から抽出するせん断波速度の結果を比較することにより、曲げ振動とねじれ振動の影響がある場合、層間せん断波速度抽出手法の有効性実証および本手法の超高層ビルへの最適化条件、他の振動モードの影響を評価する技術の確立を達成した。(2)基本モードと高次モードをそれぞれ解析を行う時に、各モードに対する周波数の解析範囲はせん断波速度の解析結果の精度についての影響を検討した。(3)本手法におけるせん断波伝播速度の抽出はせん断振動、曲げ振動およびねじれ振動が共存する建物への適用性と適用条件および効率的に抽出するため、周波数範囲の選択を系統的にあきらかとし、複雑な振動モードが有する超高層ビルの層間せん断波速度の抽出手法の有効性を実証した上、層間せん断波速度の変化により建物の健全性・被災度の評価手法を構築した。

常時微動観測に基づく建物の層間で伝播するせん断波の速度の変化により層毎の損傷を定量的に評価する手法を、振動モードが複雑な超高層ビルの損傷評価や耐震改修・補強を実施するに当って、振動モードが異なる場合、層の境界におけるせん断波の反射、透過、干渉現象を数値シミュレーションにより完全に明らかにした。平成28年度に構造材料、構造形式、低層棟および制震と免震装置の有無により振動モードの解析およびせん断波速度の抽出手法の有効性と適用限界を観測実例と数値解析結果の比較により解明する。地震工学H28年度に、構造材料、構造形式、低層棟および制震と免震装置の有無により全部で24棟の超高層ビルの常時微動を観測し、逆重畳法により解析されたせん断波の反射、透過と干渉を2次元フレームモデル13の数値解析結果と比較して、それぞれの振動モードを解明し、層毎のせん断波速度を抽出する。波動干渉が存在する場合、せん断波伝播時間の抽出への影響および振動モードが異なる場合、せん断波速度の抽出手法の有効性と適用限界を24棟の超高層ビルの常時微動観測に基づいて実証する。時微動観測および観測計画についての打ち合わせや結果報告等の費用を旅費として計上している。常時微動観測は学生の協力が必要となるため、人件費として計上している。観測機械は観測地に運搬することに関する費用はその他として計上している。
慢性心不全における運動療法効果を阻害する因子の検討

慢性心不全に対する運動療法を含めた包括的心臓リハビリテーションにおいて、運動耐容能の改善の乏しい例や新規心血管イベント発生例(non-Responder)の背景因子を探索し、効果的なリハビリテーション介入ポイントを解明し、ホルター心電図でのT波オルタナンス(TWA)と心拍変動解析(交感神経活性と相関するLF/HFの評価)が運動療法の運動耐容能改善効果に与える影響を検討した。エントリー数30例中、解析可能だった18例について検討をおこなった(responder 10例、non-responder 8例)。各パラメータ-の単変量解析では、responderでPADが有意に多い結果となり(p値=0.0454)、また統計学的有意差はなかったが大腿四頭筋伸展力が、運動療法介入後から3か月、6か月にかけて増大する傾向がみられた。ホルター心電図でのTWA、LF/HFについては、有意差はなかったが、初回peakVO2と夜間のLF/HFの間には正の相関の傾向がみられた。TWA陽性患者が1名のみであり、TWAに関する統計学的評価は困難だった。今回の研究ではエントリー数、解析可能なn数がともに少なく、当初の目的の達成に至る結論を得られなかった。しかし、慢性心不全と心臓リハビリテーション(運動療法)、運動耐容能、予後、交感神経活性等については関連が示唆されており、今後も本研究を継続し、十分な母集団での解析と検討を行う計画である。洞調律でかつ最高酸素摂取量16ml/kg/min以下で心臓リハビリテーションを行う慢性心不全患者を対象に、ホルター心電図で計測したT波オルタナンスとLF/HFが、3ヶ月間の運動療法後の運動耐容能に与える影響を検討する前向きコホート研究を施行している。現時点で11例を登録し追跡している。11例中、4例がリハビリテーション3ヶ月後の2回目の心肺運動負荷試験終了し、いずれも、基礎値と比較して運動耐容能は改善した。心臓突然死の予後指標とされているT波オルタナンスは3例で陽性で、いずれも基礎心疾患が虚血性心疾患であった。交感神経活性の指標であるLF/HFは2例で1以上だった。今後登録を継続して統計学的な検討を行い、運動耐容能と、心臓突然死・致死性不整脈と相関する指標との相関を解析する。登録者数が少ない。運動療法初回導入の慢性心不全患者のうち、初回の心肺運動負荷試験での最高酸素摂取量16ml/kg/min以下でかつ洞調律が本研究のエントリー条件であるが、基準値以上に運動耐容能が維持されている患者や慢性心房細動の患者が含まれており、登録者数が伸び悩んでいる。洞調律でかつ最高酸素摂取量16ml/kg/min以下で心臓リハビリテーションを行う慢性心不全患者を対象に、ホルター心電図で計測したT波オルタナンスとLF/HFが、3か月間の運動療法後の運動耐容能に与える影響を検討する前向きコホート研究を施行している。現時点で13例を登録し、追跡中である。今後登録を継続し、運動耐容能と心臓突然死の予後指標とされているT波オルタナンス、交感神経活性の指標であるLH/HFの相関について統計学的検討を行う。登録患者数が少ない。ただいま産休中で登録数が伸びない状態であり、またエントリー対象は運動療法初回導入の慢性心不全患者のうち、初回の心肺運動負荷試験での最高酸素摂取量16ml/kg/min以下かつ洞調律の患者だが、運動耐容能の維持された患者や慢性心房細動患者が少なくないため登録者数が伸び悩んでいる。。育児休暇復帰後、対象患者のエントリーを再開したが、登録患者数が少ない。エントリー対象は運動療法初回導入の慢性心不全患者のうち、初回の心肺運動負荷試験での最高酸素摂取量16ml/kg/min以下かつ洞調律で、導入後も外来心臓リハビリプログラムを継続可能な患者だが、運動耐容能の維持された患者や慢性心房細動患者が少なくないことと、外来リハビリ継続の条件を満たす患者が少なかったことにより、登録者数が伸び悩んでいる。

ホルター心電図でのTWA、LF/HFについては、有意差はなかったが、初回peakVO2と夜間のLF/HFの間には正の相関の傾向がみられた。TWA陽性患者が1名のみであり、TWAに関する統計学的評価は困難だった。今回の研究ではエントリー数、解析可能なn数がともに少なく、当初の目的の達成に至る結論を得られなかった。しかし、慢性心不全と心臓リハビリテーション(運動療法)、運動耐容能、予後、交感神経活性等については関連が示唆されており、今後も本研究を継続し、十分な母集団での解析と検討を行う計画である。ひきつづき患者登録を継続し、フォローアップのデータ集積と解析を行う。運動耐容能の改善を阻害する因子の臨床背景や心肺運動負荷試験(CPX)をはじめとする各種検査、身長・体重(BMI)、大腿周囲径や大腿四頭筋厚、大腿四頭筋伸展力、携帯型心電図におけるLF/HF、T波オルタナンス測定、アンケートADL評価(METs換算)ならびに社会的背景調査で得られた各パラメーターを単変量解析で比較した後で多変量解析を行い、運動療法効果の独立した規定因子を探索する。運動耐容能の改善した群と改善しなかった群それぞれの心血管イベントフリー生存曲線をKaplan-Meier法を用いて推定し、その差をLog-rank検定を用いて検定する。交絡因子を調整したCOX比例ハザード分析でも解析を実施する。データの解析は、統計ソフトJMPを用いて行う。心臓リハビリテーション学会発表および英語論文投稿をもって、成果を報告する予定である産休が明けたら、引き続き患者登録を継続し、データ集積と解析を行う。運動耐容能の改善を阻害する因子の臨床背景や心配運動負荷試験(CPX)をはじめとする各種検査、身長・体重(BMI)、大腿周囲径や大腿四頭筋厚、大腿四頭筋伸展力、携帯型心電図におけるLF/HF,T波オルタナンス測定、アンケートADL評価(METs換算)ならびに社会的背景調査で得られた各パラメーターを単変量解析で比較した後で多変量解析を行い、運動療法効果の独立した規定因子を探索する。心臓リハビリテーション学会発表および英語論文投稿をもって、成果を報告する予定である。引き続き患者登録を継続し、データ集積と解析を行う。運動耐容能の改善を阻害する因子の臨床背景や心肺運動負荷試験(CPX)をはじめとする各種検査、身長・体重(BMI)、大腿周囲径や大腿四頭筋厚、大腿四頭筋伸展力、携帯型心電図におけるLF/HF,T波オルタナンス測定、アンケートADL評価(METs換算)ならびに社会的背景調査で得られた各パラメーターを単変量解析で比較した後で多変量解析を行い、運動療法効果の独立した規定因子を探索する。
神経細胞の運命決定におけるFgfシグナルの役割とその分子メカニズムの解明

Fgf19はMAPK経路を活性化することにより神経前駆細胞のGABA作動性介在ニューロンおよびオリゴデンドロサイトへの分化に対して促進的に働くことが示唆された。また、Fgf16およびFgf22も前脳におけるGABA作動性ニューロンとオリゴデンドロサイトの分化に関与している可能性が示された。さらに、Fgf22は中脳と小脳領域の細胞増殖及び細胞の生存維持に関与しているだけでなく、中脳及び小脳に発現している遺伝子の発現を調節することにより、その領域の特性決定にも関与していることが明らかになった。1、脳形成過程においてFgf19により活性化される細胞内シグナル伝達経路の検討Fgfrはチロシンキナーゼ型受容体であり、その下流の代表的な細胞内シグナル伝達経路としてはMAPK経路が知られている。そこで、Fgf19がこのMAPK経路を活性化することにより脳形成に関与しているか検討するため、Fgf19機能阻害胚の前脳においてMAPK経路が活性化されているか否か検討した。指標としてMAPK経路の構成因子であるERK1/2のリン酸化について抗体を用いて検出したところ、受精後22時間の正常胚では前脳領域でMAPK経路が活性化していることが明らかになった。さらにFgf19機能阻害胚についても検討を行ったところ、前脳領域ではMAPK経路の活性化が認められなかった。従って、Fgf19はFgfr1あるいはFgfr2を介してMAPK路を活性化することにより神経前駆細胞のGABA作動性介在ニューロンおよびオリゴデンドロサイトへの分化に対しては促進的に働き、ドパミン作動性ニューロンへの分化に対しては抑制的に働くと考えられる。2、神経上皮細胞のGABA作動性ニューロン及びオリゴデンドロサイトへの分化におけるFgf16の役割の解明ZebrafishFgf16も24時間胚の前脳に発現していることを見出している。終脳腹側領域と腹側視床からは主にGABA作動性ニューロンとオリゴデンドロサイトが発生する。そこで、Fgf16機能阻害胚におけるGABA作動性ニューロンのマーカーgad1とオリゴデンドロサイトのマーカーolig2の発現パターンを解析することにより、両細胞への分化にFgf16が関与しているか検討した。その結果、終脳と腹側視床の両方においてgad1とolig2の発現が著しく減少していた。従って、Fgf16も前脳におけるGABA作動性ニューロンとオリゴデンドロサイトの分化に関与していることが示された。1、神経上皮細胞のGABA作動性ニューロンへの分化におけるFgf22の役割の解明Fgf22の発現解析を行った結果、24時間胚において終脳、中脳後方領域及び耳胞に発現していた。さらに、Fgf22機能阻害胚(MO胚)では前脳の形成不全が観察された。また、Fgf3,8機能阻害胚の前脳におけるFgf22の発現は増加していた。Fgf3,8は前脳においてGABA作動性ニューロンの分化に関与している。従って、Fgf22も前脳におけるGABA作動性ニューロンの分化に関与している可能性が示唆された。2、中脳・小脳形成過程におけるFgf22の役割の解明Fgf22 MO胚では前脳の形成不全に加え、中脳後脳境界領域の形成不全及び中脳と小脳の縮小が観察された。そこで、中脳及び小脳領域における細胞増殖活性及び細胞死について検討した結果、受精後16時間のMO胚の中脳において増殖細胞の数が減少していた。さらに、受精後16時間のMO胚の中脳及び小脳領域におけるアポトーシスが顕著に増加しており、Fgf22が神経細胞の生存維持にも関与していることが示された。また、中脳及び小脳領域に発現するotx2、mbx、her5、eng2の発現パターンを検討した結果、これらの遺伝子の発現量が減少していた。従って、Fgf22は中脳と小脳領域の細胞増殖及び細胞の生存維持に関与しているだけでなく、中脳及び小脳に発現している遺伝子の発現を調節することにより、その領域の特性決定にも関与していることが明らかになった。
粒界型応力腐食割れの発生および成長機構の解明

昨年度は,応力腐食割れ(SCC)に関して,以下の二点に注目して研究を推進した.1)応力腐食き裂発生挙動のX線的評価:腐食環境に浸漬した状態で定荷重を受ける試験片について二次元検出器を有するX線回折装置を用い,単一粒界の逐次観察を行った.SCCき裂の発生前後におけるデバイ環に基づき転位密度等の変化を評価する予定であったが,腐食環境,pH,負荷荷重を変化させてもSCCき裂発生が十分に生じず,回折プロファイルの変化とき裂発生挙動の関係を見出すことができなかった.単一粒界だけを腐食液に暴露するように,単一粒界の周辺をプラスチックでコーティングしたが腐食に影響を及ぼした可能性がある.そこで暴露領域を増加させて実験を行うように現在検討中である.2)応力腐食割れ評価のための粒界腐食感受性の評価:1)を実施するにあたり,応力腐食割れが発生する粒界を予め特定しておく必要があった.そこで,粒界腐食感受性と粒界特性(ミスオリエンテーションや対応粒界)の関係を評価した.その結果,小傾角粒界についてはミスオリエンテーション,大傾角粒界の対応粒界については幾何学的特性を用いて粒界腐食感受性が評価できることが分かった.これまでに実施してきたSCCき裂発生挙動に及ぼす局所応力や粒界の長さ,粒界特性の影響に関する研究およびき裂進展速度に及ぼす等価応力拡大係数変化率の影響に関する研究をまとめ国際誌に投稿し,また,SCCき裂発生及ぼす局所ひずみの影響については国際会議で発表した.前述のように,単一き裂に着目したき裂発生挙動については,SCCき裂の発生前後におけるデバイ環に基づき転位密度等の変化を評価する予定であったが,腐食環境や力学条件を変更してみたがSCCき裂が十分に発生せず,回折プロファイルとき裂発生挙動の関係を見出すことができなかった.単一粒界だけを腐食液に暴露するように単一粒界の周辺をプラスチックでコーティングしたことが原因と考えられた.今後は,以下のようにプラスチックコーティングをなくすることによりSCCき裂発生を促進させ,同様の実験を継続する予定である.今後は,以下の二点について研究を推進する.1)実験装置の改良によるSCCき裂発生挙動のX線的研究:腐食環境中で引張治具による定荷重試験が可能とする持ち運び可能な小型冶具を作製し,試験中にビデオマイクロスコープを組み合わせることのよりその場観察システムを構築する.試験片に定荷重を負荷したまま腐食液に浸漬し,き裂挙動をビデオマイクロスコープを用いて表面の変化やき裂の発生の有無を観察する.定期的に腐食液から取り出し,X線回折装置を用いてX線回折パターンの測定を行い,き裂発生前後のデバイ環に基づき転位密度等の変化の観点から,き裂発生挙動の検討を行うことを計画している.さらに,き裂発生後についても逐次X線回折パターンを取得して,微視き裂の進展に関しても同様に評価を行う.2)SCCき裂進展挙動の評価:き裂進展挙動のその場観察を行う.本試験では,破壊力学試験片を用いて疲労き裂(もしくは腐食疲労予き裂)を予め導入し,さらに予き裂先端の微視組織を走査型電子顕微鏡(SEM)に取り付けられた電子線後方散乱回折(EBSD)装置により測定を行っておく.次いで,予き裂材の腐食環境中での定荷重試験を行い,き裂進展挙動のその場観察を行い,き裂進展挙動の結晶学的評価を行う.さらに,デジタル画像相関法によるひずみ分布測定を組み合わせることから,き裂進展方向の力学的評価を合わせて行う.そのことから,き裂進展挙動に及ぼす結晶学的・力学的因子の解明を目指す.昨年は,X線装置が納入され次第,SCCき裂発生挙動のX線的研究を実施する予定であったが,試験機の改造等のため最終的に12月に使用できる状態となった.よって,当初の実験計画の順番を変更し,X線装置を用いたSCCき裂挙動の評価に先立ち,デジタル画像相関(DIC)法により測定したひずみ分布とSCCき裂発生との関係性に関する評価を行った.まず,本研究室ではDIC法によるひずみ測定の手法のノウハウがなかったため,結晶粒オーダーのひずみ分布の高精度評価手法の構築を行った.その結果,負荷ひずみが0.8%から2.0%の間においては,負荷ひずみとDIC法により測定したひずみの平均値が一致し,比較的良い精度でひずみ分布の測定が行うことが可能となった.SCC試験には,鋭敏化オーステナイトステンレス鋼SUS304とテトラチオン酸水溶液を用いて,き裂発生のその場観察を行った.SCC試験の前に,試験で付与するひずみに相当する1%ひずみを与え,DIC法により結晶粒オーダーのひずみ分布を測定した.SCC試験後には,走査型電子顕微鏡(FE-SEM)に取り付けた電子線後方散乱回折(EBSD)装置を用いてき裂発生位置における結晶方位測定を行った.以上のことから,SCCき裂発生位置に関して,結晶方位,粒界性格およびひずみの関係について検討した.SCCき裂は,ほぼ全てがランダム粒界(大傾角粒界のうち周期性を持たない結晶粒界)であった.また,粒界における垂直ひずみ,せん断ひずみもしくはその両方が大きくかつ長い粒界にき裂が生じていることが分かった.X線回折装置が納入され次第,SCCき裂発生挙動のX線的研究を実施する予定であったが,その納入・改造等のため最終的に12月に使用できる状態となった.そのため,SCCき裂発生その場観察システムの構築を行うことができなかった.

そこで昨年度は,前述の通り,実験計画の順番を変更して実施し,ひずみ分布測定による微視き裂発生位置に関する検討を行った.本年度は,予定通りX線回折装置を用いてSCCき裂発生挙動のX線的研究を行う予定である.昨年度の予備検討の結果,SCC発生試験中のX線その場測定は困難であると結論し,SCC試験を中断・X線測定を繰り返すことにより,き裂挙動の評価を実施する.昨年度は,応力腐食割れ(SCC)に関して,以下の二点に注目して研究を推進した.1)応力腐食き裂発生挙動のX線的評価:腐食環境に浸漬した状態で定荷重を受ける試験片について二次元検出器を有するX線回折装置を用い,単一粒界の逐次観察を行った.SCCき裂の発生前後におけるデバイ環に基づき転位密度等の変化を評価する予定であったが,腐食環境,pH,負荷荷重を変化させてもSCCき裂発生が十分に生じず,回折プロファイルの変化とき裂発生挙動の関係を見出すことができなかった.単一粒界だけを腐食液に暴露するように,単一粒界の周辺をプラスチックでコーティングしたが腐食に影響を及ぼした可能性がある.そこで暴露領域を増加させて実験を行うように現在検討中である.2)応力腐食割れ評価のための粒界腐食感受性の評価:1)を実施するにあたり,応力腐食割れが発生する粒界を予め特定しておく必要があった.そこで,粒界腐食感受性と粒界特性(ミスオリエンテーションや対応粒界)の関係を評価した.その結果,小傾角粒界についてはミスオリエンテーション,大傾角粒界の対応粒界については幾何学的特性を用いて粒界腐食感受性が評価できることが分かった.これまでに実施してきたSCCき裂発生挙動に及ぼす局所応力や粒界の長さ,粒界特性の影響に関する研究およびき裂進展速度に及ぼす等価応力拡大係数変化率の影響に関する研究をまとめ国際誌に投稿し,また,SCCき裂発生及ぼす局所ひずみの影響については国際会議で発表した.前述のように,単一き裂に着目したき裂発生挙動については,SCCき裂の発生前後におけるデバイ環に基づき転位密度等の変化を評価する予定であったが,腐食環境や力学条件を変更してみたがSCCき裂が十分に発生せず,回折プロファイルとき裂発生挙動の関係を見出すことができなかった.単一粒界だけを腐食液に暴露するように単一粒界の周辺をプラスチックでコーティングしたことが原因と考えられた.今後は,以下のようにプラスチックコーティングをなくすることによりSCCき裂発生を促進させ,同様の実験を継続する予定である.SCCき裂発生クライテリアについて,材料・結晶学(X線,EBSD)・力学(ひずみ分布)・電気化学(電気化学ノイズ)に基づく多面的評価によるの構築のため,まずは,X線装置内におけるSCCき裂観察システムを構築する.構築したシステムでは,SCCき裂挙動の発生位置・ひずみ・電気化学ノイズについてはその場観察できるようにし,適宜試験を中断しX線回折測定を行うこととする.その結果,き裂発生前後における材料の変化(X線的に測定する転位密度など)や,き裂発生場所の粒界性格,ひずみ等を複合的に評価できるようになる.現時点では,単一粒界近傍のみにおけるX線回折測定の予備的実験のみを行っているが,デバイ環の計測に成功していない.より詳細に条件出しを行う必要がある.また,ひずみ分布の測定については,より高精度化を行うことを検討している.今後は,以下の二点について研究を推進する.
A.actinomycetemcomitansの線維芽細胞抑制因子のクローニング

N-末端アミノ酸配列から、これに相当する合成DNAを作製し、A.actinomycetemcomitansY4株から染色体DNAを分離後、制限酵素処理に断片化し、合成DNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼイション法により、FIFを含むDNA断片の検索を行った。合成DNAについては、N-末端より8番目から13番目、つまりAla-Ile-Asp-Gln-Val-Alaに相当すると考えられるDNAを作製した。コドン使用については、Kraig等により報告されたA.actinomycetemcomitansJP2株のロイコトキシンのDNAシークエンスの結果を参考にして、5^1-GCXATTGATCAAGTXGC-3^1(X;イノシン)を作製した。Smith等の方法に準じてA.actinomycetemcomitansY4から染色体DNAを分離後、Bam HIあるいはHindIIIにて完全分解させ、合成プローブを^<32>P-gammaATPを用いてラベルし、通法に従いサザンハイブリダイゼエーションを行った。この結果、Bam HI及びHindIIIを用いた場合、各々2.5kb、2.2kbのDNA断片が確認された。確認されたDNA断片を回収後、各々ベクターpHSG 399に挿入し、現在制限酵素地図の作製中である。今後、E.coliにおけるFIFの発現を確認すると共に順次サブクローニングを行い、FIFのDNAシークエンスをする予定である。
水疱性類天疱瘡抗原反応性T細胞株の樹立と応用

C57BL/6マウスにマウスCOL17を免疫しても、低力価の抗マウスCOL17抗体しか得られないことが多い。そこで、本研究では、ヒトCOL17反応性T細胞株を樹立を試みている。ヒトCOL17NC16A領域の病原性エピトープをカバーする合成ペプチド(R7)を用いてC57BL/6マウスのFoot padsに免疫し、膝窩リンパ節と脾細胞を採取して培養し、R7ペプチドで刺激を加えながら細胞株の樹立を試みたが良好な結果は得られなかった。そこで、R7ペプチドのサイズが小さいため免疫原性が低かった可能性を考え、免疫原をNC16A領域全体をカバーするNC16A全長タンパクに変更した。免疫したマウスからリンパ節を採取し、R7ペプチドで刺激したfeeder細胞とT-STIMを加えて培養したところ、細胞のクラスターが出現した。サイミジン取り込みが確認できたウェルの細胞を限界希釈し、更にR7ペプチドで刺激したところ、Day3542頃から細胞クラスターが出現し、その後も良好な増殖示す細胞株が20ライン得られた。これらの細胞株の5つからmRNAを採取しcDNAに変換したのちPCR法でT細胞受容体(TCR)遺伝子を増幅させたところ、数個のバンドが見られたため、得られた細胞株はオリゴクローナルであると考えた。また、細胞株の表面マーカーをフローサイトメトリー法で解析したところ、全てCD4+T細胞であり、かつCD44highCD62Llowのeffector phenotypeを呈していた。サイトカイン産生を解析したところ、60-70%の細胞がIFN-gを産生していたが、IL-4やIL-17Aを産生する細胞はみられなかった。これらのT細胞株を精製し野生型のB細胞と共にRag-2KO/COL17ヒト化マウスに野生型マウスに共移入したが、T細胞の生着はみられなかった。平成30年度の目標であったCD4+T細胞株からのTCR遺伝子のクローニングには至らなかったので計画よりはやや遅れていることになる。ヒトCOL17反応性CD4+T細胞株を得てin vivoに移入するところまでは到達したが、良好な生着が得られなかった点が予想外であった。理由としてT細胞株のviabilityが低下している可能性や、R7ペプチド反応性のT細胞株は生体内に移入された時に生体内のヒトCOL17で活性化されない可能性が考えられた。これらの点を改善することでより良い成果が得られると考えている。今年度は、最初の免疫に用いる抗原と培養細胞の刺激の際に使用する抗原を変更する。具体的には、ヒトCOL17を皮膚に発現するトランスジェニックマウス皮膚を野生型マウスに植皮し、そのマウスから皮膚所属リンパ節あるいは脾細胞を採取する。または、植皮した野生型マウスの脾細胞をRag-/-/COL17ヒト化マウスに移入してBPを誘導し(アクティブBPマウスモデル)、day7-9のリンパ球を回収する。これらの方法で、in vivoでヒトCOL17に反応するリンパ球が得られる可能性が上昇すると考えている。培養細胞の刺激の際に使用する抗原タンパクとしてこれまでR7ペプチドを用いてきたが、サイズが小さいため抗原提示される効率が低い可能性がある。そこで新たに哺乳類細胞でNC16A全長タンパクを作製し(大腸菌由来ではエンドトキシンが混入しin vitroで使用するのが困難なため)、培養細胞の刺激に用いる。これらの方法で良好なクラスターが得られた場合は、それがモノクローナルであるかどうか確認するために、T細胞受容体のタイプをPCR法で確認する。また、そのT細胞株の表面マーカー(CD3, CD4, CD8)やサイトカイン産生プロファイルをフローサイトメトリー法で解析する。樹立したCD4+T細胞株のin vivoでの病原性を評価するために、T細胞株をヒトCOL17タンパクで免疫したマウスのB細胞とともにRagノックアウト/COL17ヒト化マウスに移入する。レシピエントマウスにおける抗体産生や、皮膚の臨床的および病理学的変化、脱毛や白毛化の有無、血中抗ヒトCOL17抗体価や抗体サブクラスを評価し、CD4+T細胞株による病原性の差について検討する。病原性のあるT細胞株が得られた場合にはTCR遺伝子をクローニングし、トランスジェニックマウスの作製に進めていく。ヒトCOL17NC16A領域の病原性エピトープをカバーする合成ペプチド(R7)と強力なアジュバント(TiterMax)を混合し、2週間おきに2回、C57BL/6マウスのfoot pad(50ug)およびtail base(50ug)に免疫したところ、全てのマウスに抗ヒトCOL17NC16A抗体が得られた(n=10)。その脾細胞を免疫不全COL17ヒト化マウスに移入すると、全てのマウスに抗ヒトCOL17抗体が産生され(n=6)、うち4匹で脾細胞移入後6週に皮疹が出現した。以上より、R7ペプチドにより誘導された抗ヒトCOL17NC16A抗体には病原性があることが明らかとなった。