hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
学びの基盤を育てる高大接続教育を創造する課題探求実践の推進

高校では、入試を意識せざるをえませんが、大学においては学問の追究に専心できる、自分が興味を持った事にどんどん打ち込める余裕(時間)が感じられて、学生が羨ましいと思いました。」であった。そして、本研究の総括として、高大連携活動に関するシンポジウム「高大連携への期待」を実施した。また、平成23年6月にイギリスのエジンバラ大学とロンドン大学を訪問してイギリスにおける後期中等教育と高等教育の高大連携活動や科学教育カリキュラムについて調査を行った。
間脳・下垂体ホルモン分泌におけるG蛋白制御型内向き整流性カリウムチャネルの意義

G蛋白内向き整流性K^+(K_G)チャネルは、下垂体前葉においてドパミン、ソマトスタチンによる細胞の興奮性、ホルモン分泌の抑制機構に関与していることが知られている。しかし下垂体K_Gチャネルの分子構成、局在については明らかではない。我々は、K_Gチャネルの主要サブユニットであるGIRK1/Kir3.1の特異的抗体を用いてその局在を検討した。(1)免疫組織学的手法(二重染色法)によって、各種ホルモン分泌細胞におけるGIRK1免疫活性を検討したところTSH産生細胞にのみその局在を認めた。(2)免疫電顕によって、GIRK1の細胞内局在を検討したところ、免疫活性のほとんどが分泌小胞膜上に認められた。(3) TRH投与下ではGIRK1免疫活性が分泌小胞の開口分泌によって細胞膜上に移行することが観察された。(4)以上より下垂体前葉においてGIRK1チャネルはTSH産生細胞の分泌小胞膜上に発現しており、TRH刺激による開口分泌によって、細胞膜上に移行することが示唆された。2. TSH産生細胞の分泌機構におけるGIRK1チャネルの役割上記の免疫組織学的データをチャネル機能の面から裏付けるためTSH細胞(単一細胞RT-PCR法を用いて後方視的に確認)の膜電流をパッチクランプ法および膜容量・膜電流同時測定法により計測した。(1)下垂体初代培養系において、ドパミン存在下でTRH投与によりカリウム電流が増幅される細胞を認めた。(2)これらの細胞よりバッチピペットを通して細胞質を吸引し、RT-PCR法にてGIRK1およびTSHmRNAの存在を確認した。3.以上より分泌刺激物質(TRH)はホルモン(TSH)分泌を促すだけでなく、K_Gチャネルを細胞膜上に移行させて逆に抑制機構を発現させるという新規のネガテイブフィードバック機構の存在が示唆された。G蛋白制御型内向き整流性K^+(K_G)チャネルは、下垂体前葉においてドパミン、ソマトスタチンによる、細胞の興奮性、ホルモン分泌の抑制機構に関与していることが知られている。しかし、下垂体K_Gチャネルの分子構成、局在については明らかではない。(1)免疫組織化学的手法(二重染色法)によって、各種ホルモン分泌細胞におけるGIRK1免疫活性を検討したところTSH産生細胞にのみ発現がみられた。(2)免疫電顕によってGIRK1の細胞内局在を検討したところ、免疫活性のほとんどが分泌顆粒上認められた。(3)TRH投与後では、免疫電顕下で、GIRK1免疫活性が分泌顆粒の開口分泌によって細胞細胞膜上に移行することが観察された。(4)以上より下垂体前葉においてGIRK1チャネルはTSH産生細胞の分泌顆粒上に発現しており、TRH刺激による開口分泌によって、細胞膜上に移行する事が示唆された。2.TSH細胞機能におけるGIRK1チャネルの役割上記に述べた免疫組織学的データをチャネル機能の面から裏付けるためTSH細胞の膜電流をパッチクランプ法で解析している。なおTSH細胞の同定は単一細胞RT-PCR法を用いて後方視的に確認した。(1)下垂体培養細胞系において、ドパミン存在下でTRH投与によりカリウム電流の増幅を認める細胞を認めた。(2)これらの細胞よりパッチピペットを通して細胞質を吸引し、RT-PCR法にてGIRK1及びTSH mRNAの存在を確認した。

(3)(1)(2)について更に実験を重ねてTSH分泌機能におけるGIRK1チャネルの役割を明らかにしていく予定である。G蛋白内向き整流性K^+(K_C)チャネルは、下垂体前葉においてドパミン、ソマトスタチンによる細胞の興奮性、ホルモン分泌の抑制機構に関与していることが知られている。しかし下垂体K_Cチャネルの分子構成、局在については明らかではない。我々は、K_Cチャネルの主要サブユニットであるGIRK1/Kir3.1の特異的杭体を用いてその局在を検討した。(1)免疫組織学的手法(二重染色法)によって、各種ホルモン分泌細胞におけるGIRK1免疫活性を検討したところTSH産生細胞にのみその局在を認めた。(2)免疫電顕によって、GIRK1の細胞内局在を検討したところ、免疫活性のほとんどが分泌小胞膜上に認められた。(3) TRH投与下ではGIRKl免疫活性が分泌小胞の開口分泌によって細胞膜上に移行することが観察された。(4)以上より下垂体前葉においてGIRK1チャネルはTSH産生細胞の分泌小胞膜上に発現しており、TRH刺激による開口分泌によって、細胞膜上に移行することが示唆された。2. TSH産生細胞の分泌機構におけるGIRK1チャネルの役割上記の免疫組織学的データをチャネル機能の面から裏付けるためTSH細胞(単一細胞RT-PCR法を用いて後方視的に確認)の膜電流をパッチクランプ法および膜容量・膜電流同時測定法により計測した。(1)下垂体初代培養系において、ドパミン存在下でTRH投与によりカリウム電流が増幅される細胞を認めた。(2)これらの細胞よりバッチピペットを通して細胞質を吸引し、RT-PCR法にてGIRK1およびTSHmRNAの存在を確認した。3.以上より分泌刺激物質(TRH)はホルモン(TSH)分泌を促すだけでなく、K_Cチャネルを細胞膜上に移行させて逆に抑制機構を発現させるという新規のネガティブフィードバック機構の存在が示唆された.
繊維強化複合材料のマイクロメカニックス研究

繊維強化複合材料を対象としたマイクロメカニックス研究によって、次の二つのテ-マの解明を試みた。1.宇宙環境温度下での炭素繊維強化複合材料(CFRP)の損傷と強度低下耐熱エポキシ樹脂を母材とするCFRP直交積層板を用いて、宇宙環境温度下(423K,298K,77K)でAE法を併用した破壊靭性試験を行い、その結果を詳細に検討して、損傷機構を再構築し、コンピュ-タ・シミュレ-ションを行った。得られた主な知見は以下の通りである。(1)AEエネルギ-の急増開始荷重から算出した破壊靭性値と5%オフセット荷重より求めた破壊靭性値は共に室温で最も大きく、低温および高温においてはより小さくなった。(2)コンピュ-タ・シミュレ-ションにより得られた巨視的き裂進展開始直前までの荷重ー切欠肩部開口変位曲線は、破壊靭性試験により得られたそれときわめてよく一致した。(3)繊維束のはく離応力および引抜け長さにばらつきを与えて、巨視き裂の進展ー停止挙動のコンピュ-タ・シミュレ-ションを行った結果は、実験におけるセレ-ション現象をよく説明した。2.酸環境下でのガラス繊維強化複合材料(GFRP)中のき裂進展速度ガラス繊維を強化材としエポキシ樹脂を母材とする直交積層板を用いて塩酸環境下で応力腐食によるき裂進展実験を行った。(1)その実験結果からき裂進展速度は、近似的にき裂先端での応力拡大係数のべき乗形で表わされることを確認した。(2)さらに、き裂進展機構を解明し、き裂進展の律速過程をマイクロメカニックス的観点から再構築して、き裂進展速度に関する理論式を導出した。その理論式を用いて、塩酸濃度、環境温度、繊維体積含有率等の影響をふまえた、き裂進展速度ー時間関係のコンピュ-タ・シミュレ-ションを行った。コンピュ-タ・シミュレ-ション結果は実験結果とよく一致した。1.宇宙環境温度下での炭素繊維強化複合材料(CFRP)の損傷と強度低下耐熱エポキシ樹脂を母材とするCFRP直交積層板を用いて、宇宙環境温度下(423K,298K,77K)でAE法を併用した破壊靭性試験を行い、CFRPの破壊靭性値に及ぼす温度の影響を明らかにした。また軟X線観察およびSEM観察を行って切次先端における微視破壊の様相を明からにした。(1)荷重一変位曲線は、低温では比較的線形であるが温度が高くなるにつれて非線形性を帯びてくる。またAE活性度は温度が低くなるにつれて高くなった。最大荷重については室温で最も高く、低温およびにおいてはより低くなった。(2)AEエネルギ-の急増開始荷重から算出した破壊靭性値と5%オフセット荷重より求めた破壊靭性値は共に室温で最も大きく、低温および高温においてはより小さくなった。また両破壊靭性値は低温の場合にはよく一致するが、高温になると一致しないことがわかった。(3)軟X線による観察から、直交積層板の切欠先端に形成される損傷域は、切欠に平行な方向および垂直方向に伸びていることが明らかとなった。また、温度が低くなると損傷域は大きくなることがわかった。

2.酸環境下でのガラス繊維強化複合材料(GFRP)中のき裂進展速度ガラス繊維を強化材とレエポキシ樹脂を母材とする直交積層板を用いて塩酸環境下で応力腐食試験を行った。実験結果からき裂進展速度は、近似的にき裂先端での応力拡大係数のべき乗形で表わされることを確認した。さらにこのべき乗則についてマイクロメカニックスの観点から考察を行い、塩酸濃度や環境温度がき裂進展速度に及ぼす影響について定量的な解明を行った。繊維強化複合材料を対象としたマイクロメカニックス研究によって、引続き次の二つのテ-マの解明を試みた。1.宇宙環境温度下での炭素繊維強化複合材料(CFRP)の損傷と強度低下耐熱エポキシ樹脂を母材とするCFRP直交積層板を用いた破壊靭性試験の結果を詳細に検討して、損傷機構を再構築し、コンピュ-タ・シミュレ-ションを行った。得られた主な知見は以下の通りである。(1)CFRP直交積層板のせん断弾性系数の非線形性を考慮した結果、コンピュ-タ・シミュレ-ションにより得られた巨視的き裂進展開始直前までの荷負一切欠肩部開口変位曲線は、破壊靭性試験より得られたそれときわめてよく一致した。また、最大荷重についてもほぼ一致した。(2)繊維束のはく離応力および引抜け長さにばらつきを与えて、巨視き裂の進展一停止挙動のコンピュ-タ・シミュレ-ションを行った結果は、実験におけるセレ-ション現象をよく説明した。2.酸環境下でのガラス繊維強化複合材料(GFRP)中のき裂進展速度ガラス繊維を強化材としエポキシ樹脂を母材とする直交積層板を用いて塩酸環境下で応力腐食によるき裂進展実験を行った。その結果から、き裂進展機構を解明し、き裂進展の律速過程をマイクロメカニックス的観点から再構築して、き裂進展速度に関する理論式を導出した。その理論式を用いて、塩酸濃度、環境温度、積層構造、繊維体積含有率等の影響をふまえた、き裂進展速度一時間関係のコンピュ-タ・シミュレ-ションを行った。コンピュ-タ-・シミュレ-ション結果は実験結果とよく一致し、応力腐食によるき裂進展速度に対する諸効果を本質的に明らかにすることができた。
プロテインキナーゼC分子多様性からみた吸入麻酔薬作用機構に関する研究

我々は吸入麻酔薬によるPKC抑制効果をin vivoで証明した論文(Nature,364:82,1993)を参考として本研究を計画した。我々の計画では、まずin vitroでのPKC測定実験系を確立し、ついで麻酔薬の作用機序を分子レベルで解析することを試みた。特にPKCには多様な分子種が脳神経組織に存在していることから、すでに確立されているcDNA発現システムを用いてPKC分子種による麻酔薬への反応性を検討した。しかし当初の我々の予想とは大きく異なり、PKC活性については再現性のある結果が得られず、我々が参考とした論文にあるハロセンのPKC活性抑制についても同じ結論は得られなかった。今回の研究が不成功に終わった大きな理由としては以下のことを考えた。1.in vivo実験系とin vitro実験系による席酔薬効果の違い:我々が参考とした論文は吸入席酔薬により平衡化した神経細胞におけるPKC活性を調べたものであったが、これは吸入麻酔薬の神経細胞への直接効果という証明は乏しいものであった。むしろ中枢神経という複雑なネットワークの一端をみていた可能性が十分考えられる。このことが単一細胞への遺伝子導入法では陽性対照のPKC活性抑制が認められなかった理由とも推測された。2.細胞系譜および種差による麻酔薬感受性あるいはシグナル伝達系の違い:吸入麻酔薬の作用細胞は神経細胞であり、この細胞におけるPKC活性が抑制されているというのが、本研究発案の基本になっていた。しかし、我々の実験系で用いた細胞は遺伝子発現の容易さからサル腎上皮細胞COS7であり、異種細胞でしかも神経細胞とはまったく異なる細胞系譜に属していた。このことから、神経細胞とサル腎上皮細胞の間には本実験を遂行するには大きな支障となりうるなんらかのシグナル伝達系の違いが存在していた可能性考えられた。以上の問題点を考慮して、本研究の途中から我々はin vitro実験システムにその限界をも予測し、同時にin vivo解析も試みた。実際、ハロセン、セボフルレン等で麻酔導入したラットを用いて脳組織内PKC活性の測定も試みたが、これまでの論文とは異なりハロセンによるPKC活性抑制は認められず、むしろPKC活性は対照よりも亢進していた。セボフルレン処理はPKC活性を抑制する傾向が認められた。6年度は、まず吸入麻酔薬の主たる作用点の一つがProteinkinase C(PKC)の抑制にあるという最近の報告についてトランスフェクション法(電気穿孔法)によってPKC各分子種への抑制効果を検討した。まず我々の研究方法によって、HalothaneのPKCの活性抑制効果について測定可能であることを確認した後、α、β、γのPKC分子種を含むcPKC(conventional PKC)についてHalothaneによる活性の変化を測定し、その抑制効果を確認しつつある。しかし、我々の研究では、これまでの報告とは一部、一致しない結果を得たので、現在、再現性についてcPKCの測定方法を含めて検討中である。また同時にHalotheneの活性に対する濃度効果、作用時間、可逆性についても検討中である。

さらに、7年度にかけてsevofluraneやIsofluraneのPKC各分子種への抑制効果および濃度効果、作用時間、可逆性について検討し、さらに、現在同時に検討しているラットの脳について、enzyme linked immunosorbent assayによって直接PKC活性を測定する方法を確立し、それによってラット脳に対するHalothane,Sevoflurane,IsofuluraneのPKCの活性抑止効果を直接測定する方法についても引き続き、検討を続ける予定である。まず、我々の研究方法によってHalothaneのPKCの活性抑制効果が測定できることを確認した後、α、β、γのPKC分子種を含むcPKC(conventional PKC)についてHalothaneによる活性の変化を測定し、その抑制効果を確認しつつある。しかし、我々の研究では、これまでの報告とは一部、一致しない結果を得たので、現在、再現性について検討中である。また、同時にHalothaneのPKCの活性に対する濃度効果、作用時間、可逆性についても検討中である。SevofluraneやIsofluraneのPKC各分子種への抑制効果および濃度効果、作用時間、可逆性について検討するための実験についても現在準備中である。また、ラットの脳について、enzyme linked immunosorbent assayによって直接PKC活性を測定しHalothaneのPKC活性抑制効果を測定する方法についても検討した。さらにSevofluraneやIsofluraneについても同様の手法を用いてラット脳について直接PKC活性抑制効果を測定する予定である。
環境中ナノ粒子の脳老化、神経変性疾患への寄与に関する探索的研究

近年、ナノテクノロジーの画期的な進歩の影で、ナノリスク問題がクローズアップされてきている。平成20年度では、分子イメージングツールとして注目されている蛍光ナノ粒子:Quantum-dots(QDs)に着目して、脳組織へのQDsの取り込みをICP-MS(誘導結合プラズマ・質量分析)、組織切片を用いて証明した。QDsは、海馬、視床、大脳皮質、脳幹、髄膜の小血管内ならびに脳実質に微小な蛍光顆粒として確認された。血行性に脳内に移行し、血液脳関門透過性を有すると考えられた。平成21年度は、QDs-cap(captopril修飾、平均直径10nm)の慢性投与マウスモデルを作製した。マウス(ICR/Jcl系統)オスの腹腔内に、QDs-capをカドミウム量として30nano mol/日で10日間投与した。最終投与1日後に、経左心的にリン酸バッファーで灌流し、脳(嗅球、大脳皮質、基底核、海馬、視床、脳幹、小脳に分離)を摘出し急速凍結した。大脳皮質、視床よりtotal RNAを回収、酸化ストレス関連遺伝子約100に関して、cDNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現変動を解析した(RT^2 Profiler PCR Array System)。慢性投与10日後の大脳皮質、視床では、酸化ストレス関連遺伝子の発現変動は認められなかった。嗅球、大脳皮質、基底核、海馬、視床、脳幹、小脳から蛋白を抽出し、酸化ストレスマーカーとして、3-nitrotyrosine(3-NT)、4-hydroxy-2-nonenal(4-HNE)の脳内生成変動をウェスタンブロットで定量した。QDs投与群において、海馬、視床、嗅球、脳幹、小脳、大脳皮質で3-NT、4-HNEの有意な増加が見られ、海馬における3-NT、4-HNEがコントロールの10-20倍であることが明らかになった。ヒトへの応用に関しては、さらなる毒性検索が必須であると考える。平成20年度は、分子イメージングツールとして注目されている蛍光ナノ粒子:Quantum-dots(QDs)に着目して、脳組織、その他の臓器へのQdsの取り込みを証明した。QdsはZnSでコートされたCdSeのコアを有し、表面修飾により親水性となる。今回、QDs-cap(captopril修飾,平均直径10nm)を使用し、マウス(ICR/Jcl系統)オスの腹腔内に単回投与した(Cadmium:Cdとして50nM/shoot)。投与6時間後に、血液採取、次いで経左心的にリン酸バッファーで灌流し、脳(嗅球、大脳皮質、基底核、海馬、視床、脳幹、小脳に分離)、心、肺、肝、腎、脾、腹膜を摘出、凍結乾燥後、ICP-MS(誘導結合プラズマ-質量分析)を用いてQDsの臓器分布を同定した。Cdの分布は、脾、肝で高く、脳では、視床、脳幹、嗅球、大脳皮質、海馬で有意な取り込みが見られた。4%パラフォルムアルデヒドで灌流固定後、作製した凍結切片を用いて、レーザ顕微鏡によるQDsの組織内分布(peakemission636nm)を検討した。Qdsは、海馬、視床、大脳皮質、脳幹、髄膜の小血管内ならびに脳実質に微小な蛍光顆粒として確認された。脳内移行メカニズムは、血行性によるもので、血液脳関門(BBB)透過性を有すると考えられた。今後、Qdsが脳に及ぼす影響を酸化ストレス、DNA損傷などに着目して検索する予定である。

QDs投与群において、海馬、視床、嗅球、脳幹、小脳、大脳皮質で3-NT、4-HNEの有意な増加が見られ、海馬における3-NT、4-HNEがコントロールの10-20倍であることが明らかになった。ヒトへの応用に関しては、さらなる毒性検索が必須であると考える。
発光プローブ法によるマイクロエマルジョンの動的挙動に対する圧力効果

1次の系を選らびミセルおよびマイクロエマルジョン(ME)の静的および動的挙動を400MPaまでの圧力下で研究した.(1)O/W型ME:ピレンをプローブとして, SDSミセルとSDS/1-ペンタノール(POH)/ドデカン/水系を検討した.比較のため, SDSミセルとSDS/POH系swollenミセルについても実験した.(2)W/O型ME:Ru(bpy)^<2+>_3をプローブとして,主にAOT/ヘプタン/水系を検討した. (2)については第56回日化春季年会にて発表予定.2(1)高圧下でのマイコン制御発光スペクトル測定装置を製作した.(2)この装置によりSDSミセル, swollenミセルとO/W型ME中のピレン螢光スペクトルを測定し,微視的極性とその圧力依存性を検討した.その結果,ピレン分子は圧力に関係なくミセル, MEの表面近くに位置すると推定された.3動的挙動と会合数(N)は発光減衰の非指数関数解析によった。(1)O/W型ME:0.7MPOHを含むME中のピレンエキシマ-生成過程は約50MPaで極大値をとりその後単調に減少した。同条件のswollenミセルの場合も同様な圧力依存性を示した(極大値200MPa)が、0.25MPOHswollenミセルと通常のSDSミセル中では単調に減少した。これらの結果、Nの圧力依存性と項目2の結果から、極大値は圧力によるMEの形態の変化によるためであると推定した。(2)W/O型ME:Nの値から求めたME水殻の半径は含まれる水の量と共に直線的に増加し、300MPaまで変化しなかった。水殻中で起こる消光過程は10^8M^<-1>S^<-1>程度(バルク水3×10^<10>)であり、圧力により顕著に抑制された。水中での消光に対する圧力効果から、MEの水殻と通常の水との比較を行った。W/O型MEの特微的な動的挙動として含まれるイオンが水殻間の衝突によって交換される事が本研究によって明らかになった。この過程は圧力によって顕著に加速され(△V^<【thermodynamics】<-20cm^3>/mole)、水殻のサイズと共に増大する。圧力による媒体の粘度の上昇との関係を考察した。1次の系を選らびミセルおよびマイクロエマルジョン(ME)の静的および動的挙動を400MPaまでの圧力下で研究した. (1)O/W型ME:ピレンをプローブとして, SDSミセルとSDS/1-ペンタノール(POH)/ドデカン/水系を検討した.比較のため, SDSミセルとSDS/POH系swollenミセルについても実験した.(2)W/O型ME:Ru(bpy)^<2+>_3をプローブとして,主にAOT/ヘプタン/水系を検討した. (2)については第56回日化春季年会にて発表予定.2(1)高圧下でのマイコン制御発光スペクトル測定装置を製作した.(2)この装置によりSDSミセル, swollenミセルとO/W型ME中のピレン螢光スペクトルを測定し,微視的極性とその圧力依存性を検討した.その結果,ピレン分子は圧力に関係なくミセル, MEの表面近くに位置すると推定された.3動的挙動と会合数(N)は発光減衰の非指数関数解析によった。
マウス卵巣における卵胞閉鎖の全過程:形態学的研究

本研究では、大多数の卵胞を閉鎖させているにも関わらず、全く炎症性変化を伴わない卵巣の臓器特異性を形態学的に観察した結果、つぎのことを明らかにした。1)閉鎖卵胞ではアポトーシス細胞の出現頻度が高く、アポトーシス細胞を正常な果粒層細胞が貧食・消化する。2)アポトーシスに陥った果粒層細胞を貧食する細胞は、正常な果粒層細胞であり、免疫組織化学的結果から、マクロファージは閉鎖卵胞の退縮機構に関与しないと考えられる。3)閉鎖卵胞の卵細胞は、自己融解により変性するとともに、透明帯を侵入した正常な果粒層細胞により貧食される。4)準超薄完全連続切片の観察結果から、数個から100個程度の細胞が透明帯を貫いて侵入し、これらの細胞が変性し小片化した卵細胞を貧食する。5)透明帯を貫通する細胞の微細構造は、卵丘細胞や果粒層細胞に類似すること、ギャップ結合により侵入細胞どうしが連結していることから、侵入細胞は卵胞上皮細胞である可能性が高い。6)終末期の閉鎖卵胞では、卵胞の基底膜も不連続となり、やがて完全に消失することにより、透明帯は細胞間の基質と完全に同化し閉鎖が終了する。以上、マウスの閉鎖卵胞は高頻度に発現するアポトーシス細胞を正常な果粒層細胞が貧食することにより、また、卵細胞についても同様の機構で退縮させていることから、マウス卵巣の閉鎖過程にマクロファージは関与ない可能性が強く示唆された。したがって、大多数の卵胞を閉鎖させているにも関わらず、卵巣に炎症像を認めない理由を明らかにすることができたと考える。本研究は、排卵に向かう成熟卵胞と閉鎖する卵胞との構造上の違いを明確にし、さらに、大多数の卵胞を閉鎖させているにも関わらず、全く炎症性変化を伴わない卵巣の臓器特異性を免疫組織学を含む形態学的方法により解明しようとするもので、本年度の研究成果はつぎの通りである。1.生後05週齢の未成熟、610週齢の成熟マウスおよび老齢マウスの卵巣を形態学的に観察した結果、若い成熟マウス(68週齢)にさまざまな閉鎖過程の卵胞が多数観察され、排卵に向かう成熟卵胞に比較して、閉鎖卵胞により高頻度にアポトーシス細胞が出現することを確認した。2.成熟マウスの発情周期ごとに、卵胞上皮細胞および卵細胞におけるアポトーシス発現の頻度を精査した結果、発現頻度と周期との間に特別な関連性を認めなかった。3.自然周期のマウス卵巣において、排卵に到達する成熟卵胞の準超薄連続切片を作製し、アポトーシスに陥った卵胞上皮細胞の出現頻度を調べた結果、少数ながら発現しており、アポトーシス細胞の発現しない成熟卵胞の存在は確認できなかった。4.閉鎖するとみられる卵胞の卵細胞の退縮機構を明らかにするため、準超薄連続切片を観察した結果、数個から100個の卵丘細胞が透明帯を通過して卵細胞に接触し、これら上皮性細胞が変性した卵細胞を貪食する可能性が示唆された。5.初年度の研究計画にはなかったが、本研究の主たる目的である卵巣における臓器特異性を確認するため、マウスの卵管膨大部の上皮細胞における代謝更新について比較観察した結果、上皮細胞にもアポトーシスが発現しており、これらの細胞は隣接する正常な上皮細胞により貪食されるか、または膨大部の内腔に直接排出されることを確認した。1.閉鎖するとみられる卵胞における卵細胞の退化・消滅の機序を明らかにするため、準超薄完全連続切片を作製し詳細に観察した結果、数個から数100個の細胞が透明帯を貫いて侵入し、これらの細胞が、変性し小片化した卵細胞を貧食することを確認した。

2.透明帯を貫通し卵細胞に接する細胞の微細構造が、卵丘細胞や果粒層細胞に類似すること、ギャップ結合により侵入細胞どうしが連結していることから、これらの侵入細胞は卵胞上皮細胞である可能性が高い。3.透明帯を貫通する細胞のうち、極めてまれに好中球の存在を認めたが、マクロファージの存在を確認することはできなかった。4.いわば閉鎖系とみられる卵胞の退縮機構と比較することを目的に、開放系とみられる卵管上皮細胞の代謝更新の機序を観察した結果、卵胞上皮と同様、アポトーシスに陥った細胞を正常な隣接する上皮細胞が貧食するとともに、アポトーシスおよびネクローシスに陥った上皮細胞が卵管内腔にそのまま排出される像を確認した。以上の結果から、マウスの閉鎖卵胞は、アポトーシスに陥った果粒層細胞が同種の正常細胞による貧食され、また、変性した卵細胞も果粒層細胞により貧食され退化・消失することを明らかにした。この過程にマクロファージの関与は認められなかった。
金属支援超分子集合体を基盤とする新規分子機械の開発

平成30年度は「適応型ゲスト結合システム」について検討を行った.ピラー[5]アレーン空孔の両末端にそれぞれチアオキサクラウンエーテルユニットを導入して金属イオンを結合することができるようにしたピラー[5]-ビス-チアオキサクラウン(1)を3段階で合成し金属イオンによって選択性を制御することができる「適応型ゲスト結合システム」について検討した.化合物(1)ではチアオキサクラウンエーテル部位では金属イオンを,一方,ピラーアレーン部位では有機ゲストを捕捉することができ,ハイブリッド錯体を形成することが予想された.はじめに鎖長の異なるα,ω-ジシアノアルカン(N≡C-(CH2)n-C≡N, n=2(C2),n=3(C3),n=4(C4),n=5(C5),n=6(C6))との錯形成を1H NMRスペクトルによって検討したところ,n=6を除くゲストがピラーアレーン部位に包接されることが明らかになった.このときの安定度定数はC2>C3>C4>C5>>C6(C6はほぼゼロ)であった.また,n=26すべての錯体の結晶構造が得られた.一方,(1)に2当量の銀イオンを添加したところ,2個の銀イオンが上下のチアオキサクラウンエーテル部位に包接されることが明らかとなった.この銀錯体にn=26のジシアノアルカンを添加したところ,n=2と3のα,ω-ジシアノアルカンのみがピラーアレーン部位に包接されることがわかった.このときの安定度定数はC2>C3>>C4=C5=C6(C4,C5,C6はほぼゼロ)であった.以上のことからこの化合物は金属イオンの添加によって特定の長さのα,ω-ジシアノアルカンのみを選択的に包接する「適応型ゲスト結合システム」であることが明らかになった.本年度は適応型ゲスト結合システムについて検討を行い,研究成果としてまとめあげることができた.(1) I価のヨウ化物類は二核[Cu2I2]構造あるいは四核[Cu4I4]構造クラスターのどちらを形成するかによって,異なる波長の蛍光を発する興味深い化合物である.[Cu2I2]クラスターが溶液状態ばかりでなく結晶状態においてアミン部位へ結合すると強いオレンジ色の発光を生じることが知られている.本研究ではアミン-[Cu2I2]型MOFの強い発光が,第3の化学種の添加によって消光することを利用して,結晶状態で特定のアミノ酸のセンサーとして利用できるかを検討する.(2)ピラーアレーンに光駆動型官能基を導入した化合物を合成する.ピラーアレーンを構成する芳香環5個のうち2個にニトロベンゼンを1個ずつ導入した化合物を合成したのち還元して目的物を合成する.ゲスト分子添加後に紫外線を照射しながらUV-visやNMRを測定して異性化前後における包接能の検討を行う.平成30年度は「適応型ゲスト結合システム」について検討を行った.ピラー[5]アレーン空孔の両末端にそれぞれチアオキサクラウンエーテルユニットを導入して金属イオンを結合することができるようにしたピラー[5]-ビス-チアオキサクラウン(1)を3段階で合成し金属イオンによって選択性を制御することができる「適応型ゲスト結合システム」について検討した.化合物(1)ではチアオキサクラウンエーテル部位では金属イオンを,一方,ピラーアレーン部位では有機ゲストを捕捉することができ,ハイブリッド錯体を形成することが予想された.はじめに鎖長の異なるα,ω-ジシアノアルカン(N≡C-(CH2)n-C≡N, n=2(C2),n=3(C3),n=4(C4),n=5(C5),n=6(C6))との錯形成を1H NMRスペクトルによって検討したところ,n=6を除くゲストがピラーアレーン部位に包接されることが明らかになった.このときの安定度定数はC2>C3>C4>C5>>C6(C6はほぼゼロ)であった.また,n=26すべての錯体の結晶構造が得られた.一方,(1)に2当量の銀イオンを添加したところ,2個の銀イオンが上下のチアオキサクラウンエーテル部位に包接されることが明らかとなった.この銀錯体にn=26のジシアノアルカンを添加したところ,n=2と3のα,ω-ジシアノアルカンのみがピラーアレーン部位に包接されることがわかった.このときの安定度定数はC2>C3>>C4=C5=C6(C4,C5,C6はほぼゼロ)であった.以上のことからこの化合物は金属イオンの添加によって特定の長さのα,ω-ジシアノアルカンのみを選択的に包接する「適応型ゲスト結合システム」であることが明らかになった.本年度は適応型ゲスト結合システムについて検討を行い,研究成果としてまとめあげることができた.(1) I価のヨウ化物類は二核[Cu2I2]構造あるいは四核[Cu4I4]構造クラスターのどちらを形成するかによって,異なる波長の蛍光を発する興味深い化合物である.[Cu2I2]クラスターが溶液状態ばかりでなく結晶状態においてアミン部位へ結合すると強いオレンジ色の発光を生じることが知られている.本研究ではアミン-[Cu2I2]型MOFの強い発光が,第3の化学種の添加によって消光することを利用して,結晶状態で特定のアミノ酸のセンサーとして利用できるかを検討する.(2)ピラーアレーンに光駆動型官能基を導入した化合物を合成する.ピラーアレーンを構成する芳香環5個のうち2個にニトロベンゼンを1個ずつ導入した化合物を合成したのち還元して目的物を合成する.
神経原性肺水腫におけるneuropeptideYの透過性亢進作用機序の解明

1.ラビットの神経原性肺水腫モデルの確立をめざして、肺水腫発生率が100%近くとなる条件設定を探る実験:第4脳室にフィブリンとトロンビンを投与しても、ラットのように神経原性肺水腫を高率に作成することができず、ラビットでの脳室内フィブリン・トロンビン投与による神経原性肺水腫モデルの作成は困難であった。2.ラビットの部分肺還流標本の確立実験:そもそも1の実験で、神経原性肺水腫モデルが確立できなければ、この部分肺還流標本を確立しても神経原性肺水腫発生機序に迫ることができないので、この実験は中止した。3.血管内皮細胞の単層培養:ヒト肺血管内皮細胞の培養に成功した。その他冠動脈内皮細胞、大動脈内皮細胞の培養にも成功した。4.血管内皮単層培養での透過性変化の測定:ヒト肺血管内皮細胞単層培養の上下で蛍光標識した蛋白の移行を蛍光プレートリーダーにて読み取り、透過性変化の指標とする手技を確立できた。透過性に変化を与える条件として様々な薬物をスクリーニングした所、吸入麻酔薬であるイソフルレンに肺血管内皮細胞の透過性を亢進させる作用があり、セボフルレン、プロポフォールにはそのような作用が無いことが明らかとなった。イソフルレンによる透過性亢進がH-9(PKG阻害薬)、DY9760e(calmodulin阻害薬),ML-7(MLCK阻害薬)により抑制されることが明らかとなった。以上から、イソフルレンの透過性亢進は、Ca2+-PKGの関与した、cGMP系による細胞骨格変化およびMLCKの関与したMyosin contractionのメカニズムが透過性亢進に関与していると推察された。1.ラビットによる神経原生肺水腫モデルの確立を目ざした。腹腔内麻酔薬投与にて全身麻酔を導入した後、気管切開にて気道を確保して人工呼吸を行い、第四脳室にフィブリンとトロンビンを様々な濃度と量で注入した。これだけでは、神経原生肺水腫の発生率は25%以下であった。2.神経原生肺水腫の発生頻度を高めるため、迷走神経の切断等処理を加えても肺水腫の発生は50%以下であった。そこで、さらにノルアドレナリンの同時投与にて血圧を上げた状況での検討を行ったが肺水腫の発生率はあまり上がらず、現時点で肺水腫の発生が100%に近いラビットにおける神経原生肺水腫モデルの確立ができなかった。3.ラビットの部分肺還流標本の確立:ラビットを麻酔し、挿管人工呼吸とし、開胸して左肺動脈にカニユレーションして部分肺還流標本の作製を試みた。左肺動脈へのカニュレーション等は比較的容易であるが、静脈は複数本あるため、それぞれにカニュレーションするのは不可能に近く、また左心房レベルでカニュレーションすると、反体側から流入する血液との分離が困難であった。左心房圧が殆ど変化しなければ、肺動脈にかける圧を変えるだけで還流圧の調節が可能であるが、左心房圧が変化してしまうと還流圧を設定した一定の圧に保つ事が極めて困難であることが判明した。現在左心房圧が上がっても部分肺還流圧を一定に保つための工夫を検討中である。4.ラットの肺血管内皮細胞の単層培養:細胞培養のための器機の整備を進めた。5.単層培養での透過性変化を判定するための方法:文献的にさらに実験方法について検討を進めた。1.ラビットの神経原生肺水腫モデルの確立は非常に困難であった。2.神経原生肺水腫モデルの確立が困難であったため、ラビットの部分肺還流標本の確立には着手しなかった。目的:単離した血管内皮細胞のmonolayer透過性に対するDBcAMPの影響を検討した。

結果:DBcAMPはHAEC monolayerの透過性には影響を与えなかった。DBcAMPはHCEC monolayerの透過性を用量依存的に低下させ、特に、DBcAMP処置後2時間から4時間で有意差を示した。HCECでのDBcAMPの作用はcAMPの拮抗薬Rp-8-Br-cAMPSの前処置によって部分的に抑制された。考察:これらの結果から、DBcAMPは同じ内皮細胞でも部位によって透過性に対する影響は異なり、HCEC monolayerに対する血管透過性抑制作用は、細胞内cAMP濃度と関係があると考えられた。1.ラビットの神経原性肺水腫モデルの確立をめざして、肺水腫発生率が100%近くとなる条件設定を探る実験:第4脳室にフィブリンとトロンビンを投与しても、ラットのように神経原性肺水腫を高率に作成する事ができず、ラビットでの脳室内フィブリン・トロンビン投与による神経原性肺水腫モデルはうまく確立できなかった。2.ラビットの部分肺還流標本の確立実験:そもそも1の実験で、神経原性肺水腫モデルが出来なければ、この部分配管流標本を確立しても、神経原性肺水腫発生機序に迫る事が出来ないので、この標本の確立実験は中止した。3.血管内皮細胞の単層培養:ヒト肺血管内皮細胞の培養に成功した。その他、冠動脈内皮細胞、大動脈内皮細胞の培養にも成功した。4.単層培養での透過性変化の測定:単層培養の上下で蛍光標識した蛋白の移行を蛍光プレートリーダーにて読み取り、透過性変化の指標とする手技を確立できた。透過性に変化を与える条件として様々な薬物をスクリーニングした所、吸入麻酔薬であるイソフルレンが肺血管内皮細胞の透過性を亢進させることが明らかになった。その透過性亢進の細胞内機序にっき、Ca2+、PKG, MLCKの関与について検討したどころ、Ca2+、PKGはその透過性亢進機序に関与し、MLCKは関与していないことが明らかとなった。以上から、イソフルレンによる単層培養ヒト肺血管内皮細胞の透過性亢進は、Ca2+とPKGの関与した、cGMP系による細胞骨格変化が、その透過性亢進のメカニズムに関与していると推察された。
ナノテクノロジー技術の応用により自己再生能を賦活化する心筋再生治療法の確立

これまで、温度感応性培養皿を用いて、筋芽細胞シートを作成し、重症心不全に対する再生治療を具現すべく研究を重ねてきた。1.拡張型心筋症ハムスターに対する筋芽細胞シート移植拡張型心筋症ハムスターの27週齢時に、筋芽細胞シートを2層化して移植し、経時的に心機能を測定し、心筋構造蛋白の免疫染色を行った。筋芽細胞シートを移植した群は、従来の針による細胞移植法と比較して、有意な心機能向上効果を認め、左室壁の肥厚化を認めた。また、dystrroglycan,a,d-sarcoglycanの濃染性を認めた。また、筋芽細胞シート移植群は他群と比較して、生命予後は延長した。2.拡張型心筋症モデル犬に対する筋芽細胞シート移植ビーグル成犬に心室ペーシングを続け、拡張型心筋症モデルを作成した。ペーシング開始後4週後に自己筋芽細胞シートを心表面に移植し心機能の経時的変化を測定し、非移植群と比較した。シート移植群は有意に駆出率の増加、および内腔の縮小、壁厚の増大を認めた。また、組織学的検討では移植群において有意な心筋線維化抑制、apoptosis抑制効果を認めた。3.虚血性心筋症モデルブタに対する筋芽細胞シート移植ミニブタの冠状動脈左前下行枝をアメロイドリングを用いて結紮し、虚血性心筋症モデルを作成した。骨格筋筋芽細胞シートを移植し、心機能を評価した。シート移植群において他群に比して有意に良好な左室収縮能、壁厚の増大、内腔の縮小を認めた。またFDG-PETにて心筋の糖代謝能改善が認められた。thymidine kinase geneとHGF geneをNIH3T3細胞に遺伝子導入し、これを、SCID rat梗塞モデルに移植した。術後連日Ganciclovirを経口投与した群と、投与しない群を作成した。Ganciclovirを投与しない群は、HGFの永久発現を認め、腫瘍の形成を確認した。Ganciclovirを経口投与した群は、腫瘍の形成を確認せず、新生血管を認めた。1.拡張型心筋症の病態の解明左室補助人工心臓装着時に心筋組織サンプルを採取し、心筋構造蛋白(titin, desmin等)細胞外基質(laminin, alb7integrin等)の発現を検討した。拡張型心筋症は、正常心と比較して、titin, desminの発現が低く、左室補助人工心臓を装着し、左室負荷を軽減させることにより、心筋構造蛋白であるtitin, desminの発現が向上することが確認された。2.拡張型心筋症の病態に適応した心筋再生因子の検討電子顕微鏡で、ミトコンドリアの構造を検討したところ、HGF遺伝子導入群において、大小同じ大きさでサルコメアにそってきれいに配列しクリスタ構造も密のまま保たれていた。3.拡張型心筋症ハムスターへの筋芽細胞シート移植拡張型心筋症ハムスターの27週齢時に、筋芽細胞シートを2層化して移植し、経時的に心機能を測定し、心筋構造蛋白の免疫染色を行った。

また、dystroglycan, a,d-sarcloglycanの濃染性を認めた。また、筋芽細胞シート移植群は他群と比較して、生命予後は延長した。これまで、温度応答性培養皿用いて心筋細胞および筋芽細胞を組織化し、これをラット梗塞心に移植した。両細胞のシートとも、ラット梗塞心に血管新生を伴って生着し、心機能は向上することを証明した。これらの実験データをもとに、多分化能を有する脂肪間葉系幹細胞の心筋細胞等への分化をvitroにて検討しており、また、この幹細胞のシート化を行っている。この細胞はラット梗塞心に移植すると心機能を向上させ、血管新生を誘導することが判明した。この細胞の心筋細胞分化に関しては検討中である。筋芽細胞シート、心筋細胞シートの電気伝導性をMEDシステムにて確認したところ、心筋細胞は1点より電気的興奮が発生し、これが同心円状に波及することが判明したが、筋芽細胞シートにおいては、幼弱ラットより作成した筋芽細胞シートは、ランダムに電気的興奮が発生し、この興奮は伝播しないことが判明した。またvivoにおいて、心筋細胞シートをラット梗塞心に移植すると同部位の電位活性が向上したが、筋芽細胞シートにおいては、向上しなかった。ブタ梗塞モデルに自己筋芽細胞シートを移植したところ、心機能は向上し、PETシンチにても、梗塞部位の代謝活性の向上を認めた。筋芽細胞シートを梗塞心に移植し、Sca-1、CD34、c-kit陽性細胞の集積を検討したところ、同細胞がコントロール群に比し、有意に集積しており、RT-PCR法にてStromal derived factor-1とCXCR4 receptorの発現を検討したところ、筋芽細胞シート移植群にて両者の有意な発現向上を認めた。また筋芽細胞シートにて有意にHGF、VEGFの発現を認めた。これまで、温度感応性培養皿を用いて、筋芽細胞シートを作成し、重症心不全に対する再生治療を具現すべく研究を重ねてきた。1.拡張型心筋症ハムスターに対する筋芽細胞シート移植拡張型心筋症ハムスターの27週齢時に、筋芽細胞シートを2層化して移植し、経時的に心機能を測定し、心筋構造蛋白の免疫染色を行った。筋芽細胞シートを移植した群は、従来の針による細胞移植法と比較して、有意な心機能向上効果を認め、左室壁の肥厚化を認めた。また、dystrroglycan, a,d-sarcoglycanの濃染性を認めた。2.拡張型心筋症モデル犬に対する筋芽細胞シート移植ビーグル成犬に心室ペーシングを続け、拡張型心筋症モデルを作成した。ペーシング開始後4週後に自己筋芽細胞シートを心表面に移植し心機能の経時的変化を測定し、非移植群と比較した。シート移植群は有意に駆出率の増加、および内腔の縮小、壁厚の増大を認めた。また、組織学的検討では移植群において有意な心筋線維化抑制、apoptosis抑制効果を認めた。3.虚血性心筋症モデルブタに対する筋芽細胞シート移植ミニブタの冠状動脈左前下行枝をアメロイドリングを用いて結紮し、虚血性心筋症モデルを作成した。骨格筋筋芽細胞シートを移植し、心機能を評価した。シート移植群において他群に比して有意に良好な左室収縮能、壁厚の増大、内腔の縮小を認めた。またFDG-PETにて心筋の糖代謝能改善が認められた。
早期の経験および神経系の成熟が顔の動きの模倣に及ぼす影響

本年度は満期産新生児と、神経系の成熟期間のほぼ等しい胎齢40週前後の現在32名に集積された早産児データの模倣と注視反応を比較分析し、胎内(満期児成熟)と胎外(早産児、早期経験)の経験の質が異感性間協応に寄与する意味を探った。1.模倣生起率(1回でも模倣が生起した人数/その刺激を受けたのべ人数)は満期産新生児では動作条件が静止条件よりも高く、動作条件では正顔が乱顔より選好された(p〈.05図1)。早産児においても動作条件が静止条件より高いが、刺激間では動作条件において正顔、目顔が輪郭顔より高〈P〈.05)、正顔と乱顔に有意差は無かった。満期産児を比較すると、早産児は正顔、目顔乱顔に生起率が高く、これらに差が見られなかったが、満期産児では早産児より目顔、乱顔、正顔の生起率が低かった。胎外経験の長い方が、全体的に舌出し生起率は高いが、正顔選好Face prefe renceが明瞭(正顔が乱顔より選好)なのは胎内経験の長い方であった。2.総注視時間は満期産児では動作条件において目顔、乱顔、正顔が輪郭顔より長かった動作条件では「目」と「舌」が、静止条件では「目」が注視された(図2)。早産児においても総注視時間は動作条件が静止条件より長く(F_<1、31>=12.365,p〈.01)、刺激間(F_<3.93>=17.138,p〈.05)では各動作、静止条件において、正顔、目顔、乱顔が輪郭顔より長く注視された(Tukey IISD p〈.05)。満期産児と早産児を比較すると、全体的に総注視時間は早産児(胎外経験の長い)方が長く、動く「舌」が長く見られた。3.微笑生起率(微笑が一回でも生起した人数/のべ人数)は満期産児では正顔動作図版に14人中4人みられたが、全体的に少なかった(図3)。早産児では全体にどの刺激にも微笑が生起し、かつ乱顔には拒否(こわばり、退き、渋面)が現われ、対人的反応を想定させた。4.満期産児には模倣と注視の選好パターンの近似は認められにくかった。早産児では模倣と注視の選好パターンの近似が、早期胎外経験が視覚-触運動協応を準備させることを示唆した。5.微笑の生起は満期産児、早産児両者において、模倣や注視の図版選好パターンと異なっていることからこれらと発生が別系統であることを示唆させた。満期産児の更なるデータの補完と、早産未熟児に関してより多くのデータを集積し、在胎週数(32週以下、以上)により群化し、諸測度の検討を行なえば、舌出し模倣の現象を通して、初期コミュニケーションと異感性間協応のメカニズムが明らかにされる。

早産児では模倣と注視の選好パターンの近似が、早期胎外経験が視覚-触運動協応を準備させることを示唆した。5.微笑の生起は満期産児、早産児両者において、模倣や注視の図版選好パターンと異なっていることからこれらと発生が別系統であることを示唆させた。満期産児の更なるデータの補完と、早産未熟児に関してより多くのデータを集積し、在胎週数(32週以下、以上)により群化し、諸測度の検討を行なえば、舌出し模倣の現象を通して、初期コミュニケーションと異感性間協応のメカニズムが明らかにされる。
膠原病に伴う肺動脈性肺高血圧症の病態における骨髄由来細胞の役割の解明

強皮症に伴う肺動脈性肺高血圧症(PAH)は予後不良の難治性病態であるが、その詳細なメカニズムは明らかでない。そこで、血管修復過程で重要な働きを担う血管内皮前駆細胞(EPC)の異常がPAH病態に関与する仮説を検証した。その結果、強皮症患者ではEPCの血管修復能が低下し、一方で線維化を促進する活性が高かった。これらの傾向はPAH例で特に顕著で、さらにPAH例ではEPCの組織への浸潤活性が高かった。以上より、EPCが強皮症のPAHを含む血管病変に対する新たな治療標的となることが明らかにされた。肺動脈性肺高血圧症(PAH)は、膠原病、特に強皮症において生命予後を悪化させる重篤な臓器病変のひとつである。病態の基本は肺動脈の内腔狭窄病変であり、血管平滑筋および内皮細胞の増殖と線維化からなるリモデリングによって形成される。その機序を追究するため、血管内皮のみならず平滑筋や線維芽細胞など間葉系細胞への分化能を有するとともに、各種成長因子や血管新生因子を分泌することで組織リモデリングを促進する単球系血管内皮細胞(EPC)の量的、質的評価を行った。強皮症患者23例(うちPAH7例)を対象とし、性、年齢や動脈硬化の危険因子を一致させた関節リウマチ(RA)患者22例、健常人21例をコントロールとした。単球系EPCは強皮症患者でRAや健常人比べて有意に増加し、その傾向はPAHを有する例で顕著であった。単球系EPCをヒト臍帯静脈内皮細胞とともにマトリゲル中で培養すると、強皮症由来細胞はコントロールに比べて有意に管腔構造形成を促し、angiogenesis誘導活性が上昇していた。さらに、ヒト単球系EPCをマウス大腸癌細胞と共に免疫不全マウスの皮下に移植すると、強皮症由来細胞の移植で形成された腫瘍は健常人由来細胞の移植に比べてサイズが大きく、新生腫瘍血管数も多かった。ただし、強皮症患者由来の単球系EPC自身が血管内皮細胞に分化する能力はきわめて低く、むしろコラーゲン産生細胞(線維芽細胞)への分化傾向を示した。以上の強皮症患者にみられた単球系EPCのangiogenesis促進作用、血管内皮分化能低下、線維芽細胞への分化傾向はいずれもPAH症例で高かった。したがって、単球系EPCの機能異常が強皮症病態、特にPAHなど血管病変形成に関与することが明らかとなった。肺動脈性肺高血圧症(PAH)は膠原病、特に強皮症において生命予後を悪化させる重篤な臓器病変のひとつである。その機序を追究するため、血管内皮のみならず平滑筋や線維芽細胞など間葉系細胞への分化能を有する末梢血単球に着目した検討を行っている。昨年度はPAHを有する強皮症患者の末梢血単球で血管内皮への分化能が低下し、多量のコラーゲンを産生する線維芽細胞への分化効率が高いことを明らかにした。そこで、今年度は末梢血単球の遺伝子発現を網羅的に検討することで、膠原病に伴うPAH病態における単球の役割を追究することを目的とした。背景因子を一致させたPAHを有する例とPAHのない例から末梢血CDI4+単球を分離し、PCRアレイ法を用いてケモカイン、細胞外マトリックス、TGFβ/BMPシグナル、血管内皮に関与する計318遺伝子の発現を比較した。その結果、PAH群で発現が上昇していた16遺伝子(CCL7、CCR2、CCRL1、CXCL10、IL1A、NOS3、TGFBR3、ITGA1、ITGA6、ITGB5、LAMB1、MMP15、NCAM1、THBS2、VTN)を抽出した。これら遺伝子はいずれも細胞遊走・接着に関わる既知の遺伝子クラスターに含まれており、末梢血単球が遊走や接着能の亢進を介して肺動脈局所にリクルートされ、血管リモデリングに積極的に関わる可能性が示唆された。肺動脈性肺高血圧症(PAH)は膠原病、特に強皮症において生命予後を悪化させる臓器病変である。病態の基本は肺動脈における血管平滑筋の増殖と線維化からなる血管リモデリングであるが、その詳細な機序は明らかでない。本研究では血管内皮、平滑筋、線維芽細胞への分化能を有することが最近明らかにされた末梢血CD14+単球と血管内皮前駆細胞に注目し、それらのPAH病態への関与を追究した。これまでの検討から以下の点が明らかにされた。

1.強皮症患者の末梢血CD14+単球は血管内皮への分化能が低下し、コラーゲン産生細胞への分化効率が高かった。また、PAHを有する例で特にその傾向が顕著であった。2.末梢血CD14+単球における遺伝子発現プロフィールを遺伝子アレイによる網羅的解析を行ったところ、PAHあり強皮症でPAHなし強皮症、健常人に比べて発現が上昇していた遺伝子としてCCR6、LTBP-1、OCLN、発現が低下していた遺伝子としてCCL5、PIGFが同定された。これら遺伝子はいずれも細胞遊走、血管内皮の維持、線維化に関わる。3.PAHを有する強皮症患者の末梢血中の血管内皮前駆細胞はPAHなし強皮症、健常人に比べて少なく、成熟血管内皮細胞への分化能も障害されていた。強皮症では血管内皮前駆細胞による脈管形成機転が障害されており、傷害血管の修復が十分におこらない。そのため骨髄から血管修復作用を有する単球が動員されているが、それら細胞はむしろ線維化を促進することで血管リモデリング進展に積極的に関わる可能性が示唆された。本研究成果は、末梢血単球を標的としたPAHに対する新たな治療ストラテジーへの応用につながる。
輸送機等の乗員保護装置(緩衝機構)に関する研究

航空機のクラッシュ時の乗員・乗客の生存率を高めるためには、衝撃吸収エネルギーを吸収する緩衝装置の開発が重要である。本研究においては緩衝装置の基本要素となる緩衝機構として、パイプのスプリット破壊を利用した機構、軸圧縮を受けた円管に発生する連続的局部座屈(いわゆる提灯座屈やダイヤモンドバックリング)を利用した機構、ハニカム材の圧壊を利用した機構の3つの基本要素を取り上げその力学的挙動を実験および数値解析により調べ、それらの特性を明らかにするとともに3つの要素をエネルギー吸収効率の点などから比較した。その結果次の事実が明らかとなった。(1)パイプのスプリット破壊は比較的安定して破壊が進行する特定の亀裂本数がパイプの材質・寸法毎に存在し、亀裂の進展中圧壊荷重の変動は極めて小さい。またその特定亀裂本数で圧壊荷重が最小となる。荷重変動が小さい反面、荷重レベルは低く素材単位重量(あるいは単位体積)あたりのエネルギー吸収能は低い。(2)スプリット破壊に関して、エネルギー吸収能を算定するために必要な圧壊荷重の予測式を導出することができた。従来の予測式では荷重は亀裂本数とともに増大するがこれは実験事実と異なっていた。本予測式によればこの矛盾点が解決され精度のよい予測が可能となった。(3)円管の座屈を利用する機構については、素材単位重量あたりのエネルギー吸収能は高い反面、崩壊時の荷重変動が大きい。円管の座屈過程の崩壊荷重予測は数値解析により可能である。ハニカム材を利用する機構については、素材単位重量あたりのエネルギー吸収能は円管の座屈に次いで高く、荷重変動はパイプのスプリット破壊と同様小さく安定している。ハニカム材の崩壊荷重を予測する理論式は現状ではまだ得られておらず今後の課題である。航空機等の輸送機の事故時における乗員の保護を目的とした衝撃エネルギー吸収のための緩衝機構として、パイプのスプリット破壊を利用した緩衝材を取り上げその基礎的力学特性を実験と解析から検討した.本年度実施項目1.各種条件でのスプリット圧壊試験(1).材質による影響純アルミ1050、アルミ合金6063(2).板厚の影響(3).子亀裂導入による最適スプリット数探索試験(4).導入溝底深さ試験2.数値シミュレーションによる検討および解析による圧壊荷重の予測得られた主な結果1.材質、寸法により安定して亀裂が進展する最適スプリット数が存在する.2.その最適スプリット数近傍で圧壊荷重は最小となる.3.破壊に要するエネルギーを主として亀裂を進展させるためのものと、帯板を曲げ変形させるためのものからなるものとして圧壊荷重の予測式を導出することができた.またその予測式によれば荷重が最小となるスプリット数もある程度予測可能でとなった.これらによりパイプのスプリット破壊を利用した緩衝機構の設計指針を得た.航空機のクラッシュ時の乗員・乗客の生存率を高めるためには、衝撃吸収エネルギーを吸収する緩衝装置の開発が重要である。