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トランスナショナル市民社会による「オルターナティブな地域主義」の比較研究

本研究では、欧州、南北アメリカ、南アジア、南部アフリカでトランスナショナル市民社会が推進する「オルタナティブ地域主義」の実態を実証的に把握した。そうしたトランスナショナル市民社会は、支配的な「新自由主義型地域主義」あるいは「国家中心的地域主義」に対して、市民社会の目線から地域を構築しようと試みている。本研究では、「オルタナティブな地域主義」の多様性を明らかにするとともに、地域主義における市民社会に関する理論的研究を進めた。本年度は、南アジアに焦点を当てて研究を遂行した。特に南アジア地域協力連合(SAARC)という地域機構に関わる市民団体の調査のためにネパールを訪問した。トラックIIとしては、「Regional Centre for Strategic Studies」(RCSS)、「South Asia Centre for Policy Studies」(SACEPS)、「Coalition for Action on South Asian Cooperation」(CASAC)、トラックIIIとしては、People's SAARCに注目し、それぞれの事務局を訪問し、関係者に聞き取り調査を行うとともに、関係する一次資料を入手した。調査を通じて、南アジアではトラックIIがSAARCの政策決定過程に影響を与えているが、トラックIIIの関与は低調であり、外部から政策提言運動を展開しているにとどまっていることが明らかとなった。これは、トラックIIIの関与が進んでいる東南アジアとは対照的と言える。研究成果は、比較分析の観点から、アジアの地域主義と市民社会に関わる論文2つを寄稿した。1つは『親密圏と公共圏の再編』(京都大学出版会)の1章であり、もう1つはその英語版(Brill出版)の1章であり、近日刊行予定である。加えて、本研究が注目するトランスナショナル市民社会をリベラリズム、コンストラクティヴィズム、ラディカリズムの視座から検討した論文を『国際関係論』(弘文堂、2013年2月)に寄稿した。3年目となる本年は南北アメリカにおいて「オルターナティブな地域主義」を掲げるトランスナショナル市民社会ネットワークの調査を行った。とくにアメリカとカナダに拠点を置く団体に焦点を当て、訪問調査を試みた。その結果、市民社会同士のネットワークだけでなく、地方自治体との協働関係が構築され、それも「オルターナティブな地域主義」の一部を構成しているという新たな知見を得た。また、前々年度の欧州の調査、前年度の南アジアの調査を踏まえつつ、比較地域主義に関する理論的分析を進め、日本国際政治学会の分科会において「サブ・リージョナリズムの国際政治理論」と題する学会報告を行った。加えて、批判的国際関係論の規範的立場から地域主義に関する思想的考察を行い「新自由主義グローバリゼーションと東アジアートランスナショナル市民社会の視座から」と題する論考を完成させた。本稿は『新自由主義グローバリズムと近代世界システム』(作品社)の1章を構成し、近日出版が予定されている。今年度は、地域主義におけるトランスナショナル市民社会に関する理論分析・実証分析を進めた。欧州での現地調査を踏まえ、合理主義と省察主義の統合から新たな理論的地平の開拓を試み、五十嵐誠一「地域主義研究の新たな理論的地平ートランスナショナル市民社会の分析に向けた予備的考察ー」『グローバル時代のマルチ・レベル・ガバナンスーEUと東アジアのサブリージョン比較(平成2123年度科学研究費補助金基盤研究B研究成果報告書)』2012年3月、を公表した。また、とくにアジアを事例に以下の研究成果も公表した。Seiichi Igarashi「The New Regional Order and Transnational Civil Society in SoutheastAsia: Focusing on AlternativeRegionalismfrom below in the Process of Building the ASEAN Community」『World Political Science Review』第7巻第1号、2011年9月、五十嵐誠一「東北アジアの新しい安全保障秩序とトランスナショナルな市民社会ー批判的国際関係論の視座から」『北東アジア地域研究』(北東アジア学会)第17号、2011年10月、五十嵐誠一「東南アジアにおける移民労働とトランスナショナル市民社会ーASEANおよびGMSにおける関与の実態と課題ー」『グローバル時代のマルチ・レベル・ガバナンスーEUと東アジアのサブリージョン比較(平成2123年度科学研究費補助金基盤研究B研究成果報告書)』2012年3月。最終年度となる本年度は、「オルタナティブな地域主義」を志向する市民社会ネットワークが発達を遂げる東アジアのメコン地域に注目し、欧州、南北アメリカ、南アジアの事例と比較しながら研究調査を進めた。メコン地域では市場を原動力に急速に開発が進み「新自由主義型地域主義」「開発志向型地域主義」が顕著である。これに対して、タイを中心に国境を越えた市民社会ネットワークが形成され、開発の負の側面に留意した多様な政策提言活動が展開している。タイに拠点を置く「生態系回復地域連合(Toward Ecological Recovery and Regional Alliance=TERRA)」や「メコンエネルギー環境ネットワーク(Mekong Energy and Ecology Network=MEE Net)」、「セーブザメコン連合(Save the Mekong Coalition=SMC)」などの市民社会ネットワークを訪問し、活動実態に関する聞き取り調査と資料収集を行った。加えて、これまでの各地域での事例を踏まえて、新地域主義アプローチ(NRA)とネオグラムアン・アプローチを援用しながら、地域主義におけるトランスナショナル市民社会に関する理論的枠組みを構築した。研究成果として、「もう1つのメコン地域主義ー市民社会の視座から」(多賀秀敏編『東アジアにおけるサブリージョナル・ガバナンスの研究ー拡大メコン圏形成過程を事例にー』20132015年度科学研究費補助金基盤B研究成果報告書、2016年3月)と題する論文を公表した。

本研究では、欧州、南北アメリカ、南アジア、南部アフリカでトランスナショナル市民社会が推進する「オルタナティブ地域主義」の実態を実証的に把握した。そうしたトランスナショナル市民社会は、支配的な「新自由主義型地域主義」あるいは「国家中心的地域主義」に対して、市民社会の目線から地域を構築しようと試みている。本研究では、「オルタナティブな地域主義」の多様性を明らかにするとともに、地域主義における市民社会に関する理論的研究を進めた。最終年度となる今年度は、アフリカの地域機構とトランスナショナル市民社会についての調査を9月に予定していたが、伝染病の蔓延という現地の事情により延期を余儀なくされた。このため3月に再度調査を実行することを試みたが、関係者との連絡が取れなったため、調査の成果の見込みが低いと判断し、中止した。国際関係論1年間の研究期間延長を行い、比較対象として東アジアの市民社会ネットワークの調査を89月に実施することを予定している。1年度1地域という研究調査計画であり、現在までに2地域の調査を完了している。研究計画の予定通りに、引き続きオルターナティブな地域主義にかかわる市民団体を中心に関係団体・組織への聞き取り調査および一次資料・二次資料の収集に努める。今年度は南北アメリカの調査を行う予定となっていたが、南米の調査が時間的都合上十分に行えなかった。このため、関連する市民団体の指導者に連絡を取りながら、スカイプによるインタビュー調査等を適宜行う予定である。研究計画の予定通り、今年度は欧州での現地調査を行った。オランダー、ベルギー、スイスにてトランスナショナルなネットワークを構築する市民団体および国際機関において指導者および関係者への聞き取り調査と一次資料・二次資料の収集を行った。とくにオランダでは、世界各地でオルターナティブな地域主義を掲げるトランスナショナル市民社会ネットワークのハブとなる市民団体「トランスナショナル・インスティチュート」に訪問調査を行った。また、ベルギーとスイスでは、欧州でオルターナティブな地域主義、すなわち「もう一つの欧州(Another Europe)」を掲げる市民団体に訪問調査を行い、欧州でのトランスナショナル市民社会ネットワークの活動の実態とその方向性を詳しく把握した。伝染病の蔓延と関係者へのコンタクト不能を主たる理由として、研究調査を中止したため、次年度使用額が生じた。
急性胆道炎におけるメタゲノム解析による次世代型網羅的病原体検出

急性胆道炎の胆汁を用いて、100例以上の症例に対してメタゲノム解析を用いた網羅的病原体検出を施行した。いずれの解析においても検査開始から24時間で起因菌の同定が網羅的に検出可能であった。耐性菌の発症状況にはさらに24時間を要した。通常、細菌培養検査から抗菌薬感受性結果を得るのに5日程度必要であった検査過程を48時間に短縮することが可能であった。この手法は将来的に抗菌薬治療・選択を画期的に変革できる基礎研究であると考えられた。本研究期間中に初期の6例の解析結果を報告した(Kujiraoka M, Front Microbial 2017)。全症例の解析結果に関しても近日中に報告予定である。急性胆道炎は適切な抗菌治療が行われないと致死的となり得る急性感染症である.また,世界的にも抗菌薬耐性菌の蔓延は問題となっており,今後は経験的抗菌薬(empiric therapy)の選択が困難となることが予想される.われわれは胆汁細菌に関するメタゲノム解析による病原体同定に関する研究を立案した.この解析により通常は4-5日を要する細菌同定,抗菌薬感受性結果の確認を24時間以内で行えることが本研究の最大の特色である.胆汁採取方法に関しては,急性胆管炎の場合は内視鏡的・経皮的ドレナージ施行時の際に無菌的に採取を行った.急性胆嚢炎の場合は術前・術中に無菌的に採取して直ちに細菌学的検査に提出した.初年度は当院に来院した急性胆道炎症例において,インフォームドコンセントを取得後に検体集積を行った.各症例において患者情報を収集してまとめ,細菌培養検査をまとめた.その後,研究計画通りに胆嚢壁,胆汁,唾液,便の検体に関してメタゲノム解析を随時行った.メタゲノム解析結果と院内細菌培養検査結果と同様であることを確認し,メタゲノム解析結果の有用性,信頼性を確認している.通常,細菌培養検査を得るには4-5日必要であるが,メタゲノム解析では24時間以内に細菌情報を得ることができ,さらに抗菌薬耐性菌(ESBL)の判別も短期間で行えることも確認している.現在も症例・検体集積を行っている.また,急性胆嚢炎に関する学会発表,論文作成も積極的に行った(発表の詳細は別に示します).研究実績の概要に記したように,来院した急性胆道炎症例に関して検体集積を行っている段階である.予定通り症例集積は行われているが,メタゲノム解析の進行状況はまだ若干の遅れを認めているため.急性胆道炎は適切な抗菌治療が行われないと致死的となり得る急性感染症である。また、世界的にも抗菌薬耐性菌の蔓延は問題となっており今後は経験的抗菌薬療法(empiric therapy)における抗菌薬の選択が困難となることが予想される。われわれは胆汁細菌に関するメタゲノム解析による病原体同定に関する研究を立案した。この解析により通常は4-5日を要する細菌同定、抗菌薬感受性結果の確認を24時間以内で行えることが本研究の最大の特色である。胆汁採取方法に関して、急性胆管炎の場合は内視鏡的・経皮的ドレナージ施行時の際に無菌的に採取を行った。急性胆嚢炎の場合は術前・術中に無菌的に採取して直ちに細菌学的検査に提出した。初年度は当院に来院した急性胆道炎症例において、インフォームドコンセントを取得後に検体集積を行った。各症例において患者情報と細菌培養検査結果を収集した。研究計画通りに胆嚢壁、胆汁、唾液、便の検体に関してメタゲノム情報を随時行った。メタゲノム解析結果と院内細菌培養検査結果が同様であることを確認し、メタゲノム解析の有用性、信頼性を確認した。通常、細菌培養検査結果を得るには4-5日必要であるが、メタゲノム解析では24時間以内に細菌情報を得ることができ、さらに抗菌薬耐性菌(ESBLなど)の判別も同時間で行えることも確認した。昨年度は、まず初期の急性胆嚢炎6症例に関してまとめ、論文投稿を行った。現在、急性胆嚢炎50例以上の結果をまとめ、炎症程度との関連を解析、論文作成を行っている。また、現在は急性胆管炎症例を中心に症例・検体集積、解析を行っている。研究概要に記したように、来院した急性胆道炎症例に関して検体集積、解析を行っている。急性胆嚢炎の初期経験症例に関しては既に論文投稿を行っており、その後の急性胆嚢炎50例以上に関しては、局所炎症との関連を解析し、現在論文を作成している。急性胆管炎症例検体が少ないことは問題であり、現在も症例集積を行っているため。急性胆道炎は適切な抗菌薬治療が行われないと致死的となり得る急性感染症である.また,世界的にも抗菌薬耐性菌の蔓延は問題となっており,今後は経験的抗菌薬療法における抗菌薬の選択が困難となる可能性がある.われわれは胆汁細菌におけるメタゲノム解析を行い病原体同定に関する研究を立案し,平成2729年度に研究を行った.過去3年間で50例以上の急性胆道炎症例におけるメタゲノム解析を施行した.いずれの症例も研究計画書通りに診断し,重症度を評価した後にインフォームドコンセントを行い,検体を取得した.全症例とも胆汁検体の他に唾液,便のサンプルも集積し解析を行った.いずれの検体も24時間で起因菌の同定が網羅的に検出可能であった.また,耐性菌の遺伝子型を含めた耐性状況はさらに24時間(合計48時間)で検出可能であった.

通常,細菌培養検査から抗菌薬感受性結果を得るのに5日程度必要であった検査過程を48時間に短縮することが可能であった.この検査手法は将来的に抗菌薬治療を画期的に変革するような基礎研究であると考えられた.本年度は最初の6例に関するまとめが掲載された(Kujiraoka M, Front Microbiol).その後に50例以上の症例集積の結果を解析し,学会発表を複数行った.現在,その結果に関する論文を作成中であり,近日中に投稿予定である.50例以上の解析結果では,細菌同定に関しては100%一致可能であった.また,興味深い点として,今回の解析では5%程度にESBL(extended spectrum β-lactamase)産生菌がキャリアーとして存在していた.ESBLは通常用いられるβラクタム系抗菌薬には効果がないので,国内のESBLキャリアーの状態を把握するうえでも重要な研究であったと考えた.本研究結果をもとに,今後はより簡便な細菌同定システムの開発を行っていく予定である.急性胆道炎の胆汁を用いて、100例以上の症例に対してメタゲノム解析を用いた網羅的病原体検出を施行した。いずれの解析においても検査開始から24時間で起因菌の同定が網羅的に検出可能であった。耐性菌の発症状況にはさらに24時間を要した。通常、細菌培養検査から抗菌薬感受性結果を得るのに5日程度必要であった検査過程を48時間に短縮することが可能であった。この手法は将来的に抗菌薬治療・選択を画期的に変革できる基礎研究であると考えられた。本研究期間中に初期の6例の解析結果を報告した(Kujiraoka M, Front Microbial 2017)。全症例の解析結果に関しても近日中に報告予定である。次年度は平成27年度と同様に症例集積を行っていく予定であり,また,7月以降ではより頻回にメタゲノム解析を行える予定となっているので,現在,若干遅れているメタゲノム解析が進行していくことが期待される.今年度も平成27、28年度と同様に症例集積を行っていく予定であり、若干遅れている急性胆管炎症例の検体を中心に集積する。現在作成中の論文に関しては今年度中に投稿可能と判断している。消化器外科本年度の研究時にかかった物品費が\260,496と予想よりも少ない金額であったことからこのような結果になったと考えられた.研究を行うにあたり、備品準備で\769,000を計上し、英語論文作成にあたり、英文校正料として\164,800を計上した。英文校正料が当初の見込みより少ない額であった為。次年度では実験回数の増加が予想され,それに伴い物品費の増額が予想される.最終年度でも同様に、必要物品の購入、英文校正料・掲載料、学会旅費を計上する予定である。
新規ｂＺＩＰ型転写因子による窒素欠乏応答制御メカニズム

私は、シロイヌナズナにおいて窒素不足環境における効率の良い窒素栄養吸収を担う高親和性硝酸イオン輸送体遺伝子(AtNRT2.4)の発現を制御する転写因子の探索を行い、一群のGARP型転写因子を同定した。また、これらの転写因子は転写抑制因子として働き、窒素充足条件でAtNRT2.4の発現を抑制することを明らかにした。本申請研究は、窒素栄養欠乏の感知・伝達・応答分子メカニズムの解明を目指したものである。具体的には、窒素欠乏環境への適応において重要な役割を果たす高親和性硝酸イオン輸送体NRT2.4の発現制御を担う転写因子の同定・解析を行うことにより、窒素欠乏応答を支える転写ネットワークを明らかにすることを目指した。申請者は、昨年度までに窒素欠乏応答に必要な最小プロモーター領域の絞り込み、この最小プロモーターを用いたYeast-One-Hybridスクリーニングによる転写因子群の単離に成功した。さらにトランジェントアッセイを用いて植物体内における相互作用を検証した結果、一群のGARP-G2型転写因子NSR(Nitrogen Starvation Regulator)ファミリーを有力な制御因子候補とした。シロイヌナズナには約40のGARP-G2型転写因子が存在するが、NSRファミリーはN末端側に転写抑制SRDXモチーフをもつのが特徴である。そこでトランジェントアッセイ法を用いて調べたところ、確かにNRSはこのモチーフの作用により、転写抑制因子として働くことを明らかにした。また、窒素栄養状態に応じた発現パターンを調べたところ、NSRファミリーのうち5種類が窒素欠乏により抑制され、NRT2.4の発現と負の相関を示すことを見いだした。さらに窒素栄養の種類や組織に応じて特徴的な発現パターンを示すものがあることも明らかにした。NSRの生理的役割を明らかにするため、T-DNA変異体と恒常的活性化型NSR発現体の解析を行った。シングルのT-DNA変異体では、明らかな表現型は見られないことから、NSRメンバー間で機能の冗長性があることが示唆された。恒常的活性化型NSR発現体では、NRT2.4の恒常的高発現とともに、窒素欠乏時に似た植物体の矮化が見られた。これらの結果から、NSRは窒素欠乏応答に関わる遺伝子の発現を負に制御する因子であることが強く示唆された。本申請研究は、窒素栄養欠乏の感知・伝達と応答の分子メカニズム解明を目指すものである。具体的には、窒素欠乏環境への適応に重要な役割を果たすAtNRT2.4の発現制御に関わる新規転写因子の機能解析により、その転写制御ネットワークの窒素欠乏応答における役割を明らかにすることを目標とした。申請者は、高親和性硝酸イオン輸送体遺伝子AtNRT2.4のプロモーターの削り込みを行い、窒素欠乏応答に必要な最小プロモーター領域(約300 bp)を同定した。そして、この最小プロモーター用いたYeast-One-Hybridスクリーニングにより、この領域に結合する転写因子群の取得に成功した。申請書作成の段階では、bZIP型転写因子だけであったが、その後のスクリーニングにより新規Myb型転写因子も取得したので、両者の機能解析を並行して行った。トランジェントアッセイ法により植物体内での結合を検証したところ、新規Myb型転写因子は最小プロモーターに結合することが確かめられた。しかし、bZIP型転写因子は植物細胞内では結合が非常に弱いことが明らかになった。そこで、研究計画を変更し、新規Myb型転写因子に焦点を絞って解析を進めた。まず、新規Myb型転写因子が転写活性化因子なのか抑制因子なのかをトランジェントアッセイにより調べたところ、転写抑制因子であることが分かった。また、窒素栄養に応答した発現パターン解析の結果、新規Myb型転写因子遺伝子とAtNRT2.4の発現の間には逆相関があることが明らかになった。これらの結果は、新規Myb型転写因子がAtNRT2.4の発現を負に制御する因子であることを示唆するものである。さらに詳細に機能解析を進めるため、現在、発現組織・細胞内局在性の解析、恒常的活性化型新規Myb過剰発現体と変異体の確立を鋭意進めている。申請書作成の段階ではbZIP型転写因子のみに着目していたが、この転写因子は、植物細胞内では最小プロモーターとほとんど相互作用しないことが判明した。そこで、その後のスクリーニングで取得し、植物細胞内での結合も確認されたMyb型転写因子にターゲットを移して研究を進めている。そのため、研究の進捗状況は予定よりやや遅れている。Myb型転写因子に焦点を絞り、当初の計画に従って研究を推進する。具体的には、発現組織・細胞内局在性の解析、恒常的活性化型転写因子過剰発現体と変異体の確立、クロマチン免疫沈降法によるin vivoにおけるMyb型転写因子ーAtNRT2.4プロモーター相互作用解析を行う。続いて、Myb型転写因子による窒素欠乏応答転写制御ネットワークを明らかにするため、変異体、恒常的活性化型転写因子過剰発現体を用いてマイクロアレイを行う。合わせて、転写因子ーレポーター(エピトープタグ)融合タンパク質発現形質転換体を用いて全クロマチン免疫沈降シークエンス(ChIP-Seq)を行い、Myb型転写因子が結合するクロマチン領域を明らかにする。

最終的には、以上の結果を総合化し、Myb型転写因子の転写制御ネットワークによる窒素欠乏応答統御メカニズムを明らかにする。研究の進捗状況が予定よりやや遅れたため、次年度への繰り越し(190,027円)が発生した。次年度はその遅れを取り戻し、申請書通りに研究を進める予定あるので、繰越額を含めた研究費は当初の計画通りに使用する。本申請研究は所属研究室の既存の設備で対応できるため、設備備品は計上しない。また国内だけでなく海外においても情報収集及び成果発表を精力的に行いたいと思っており、そのために国内および海外旅費を計上した。
たんぱく質のニトロ化・脱ニトロ化反応が歯肉炎を制御する可能性とその機序の解明

ヒト歯肉組織より線維芽細胞の培養系を確立し、培養マクロファージ(RAW)細胞系と個別、あるは、共培養することにより、炎症刺激が両者の細胞内たんぱく質機能の変化を細胞死という形でとらえた。リポポリサッカリド投与による炎症刺激では、歯肉線維芽細胞の単独培養では影響を受けなかったが、マクロファージと共培養した場合は、たんぱく質のニトロ化により誘導された線維芽細胞の細胞死が認められた。一方、一酸化窒素ドナーやペルオキシナイトライトおよびそのドナーの投与で検討した場合、線維芽細胞単独でも細胞死が認められた。さらに、RAW細胞では、リポポリサッカリド刺激により、一酸化窒素合成酵素の誘導が増加し、一酸化窒素の産生量の増加に伴う、ペルオキシナイトライトが形成され、これが自らの細胞内のたんぱく質ニトロ化を、さらに、共培養した歯肉線維芽細胞内のたんぱく質のニトロ化をきたすこと、また、それがたんぱく質の機能障害から細胞死につながることが明らかとなった。
ベイズ統計学と経済経営分析

本研究の主な目的は近年統計学において著しく発展をとげている「ベイズ統計学」についてのコンファレンスを開催することであった。当初の計画どおりに1988年9月初旬、3日間の日程で箱根において「ベイズ統計学とその応用」と題するコンファレンスを開催した。参加者は全国の国公立・私立大学と研究所に所属する統計学の研究者であり約40名程に達した。コンファレンスの内容はベイズ統計学の基礎理論、統計分析への応用上の諸問題、経済・経営分析への応用上の諸問題に大きく分けることができるが発表された論文は準備期間が約1年間あったことも幸いして力作が多かった。コンファレンスでは各報告論文に対して1名ないし2名の討論者が割り当てられた。討論者には事前に論文草稿が配布されていたため適確なコメントが多く出され、一般討論とともにしばしば議論は白熱したものとなった。コンファレンスで報告された論文はその後、討論者の意見及び編集者(鈴木雪夫・国友直人)の意見を考慮して改稿された。その論文は近日中に「ベイズ統計学とその応用(仮題)」として東京大学出版会から書物として出版される予定である。これまで「ベイズ統計学」をテーマとしたコンファレンスはほとんどなかったようであり、ベイズ統計学の研究者が一同に会して論文を発表する機会もなかったようである。この意味でコンファレンスの開催とその成果としての書物は我が国の統計学の発展に寄与し得るものと確信する次第である。
HIV感染免疫担当細胞の包括的遺伝子発現解析

感染症においてAIDSは現在世界的に観て最も深刻な感染症の一つである。原因ウイルスであるHIV (human immunodeficiency virus)の感染に伴う病態、AIDSへの進行機序を解明し、新たなAIDS予防/治療法を確立することは全人類的な課題と言える。これまで、HIV感染に伴い出現する様々な病態、血液/免疫異常を説明すべくin vitroにてHIV感染させたヒトT,マクロファージにおけるサイトカイン産生異常、転写関連遺伝子の発現上昇など知られているが、未だに、HIV(R5,X4,R5X4)をin vitroで感染したマクロファージ、樹状細胞における包括的遺伝子発現検索の仕事がなされていない。本研究では、まずHIV(R5,X4,R5X4)をin vitroで感染させたマクロファージ、樹状細胞の刺激/未刺激状態でのserial analysis of gene expression (SAGE)法を用いた遺伝子発現プロファイルの決定とHIV感染に伴う異常発現遺伝子の同定を目的とする。我々は現在まで、血液細胞を中心に遺伝子を解析し、それぞれの血液細胞特異的な遺伝子の発現を検討している。今後、SAGE法にによるデータをもとにHIV感染病態モニタリング用DNAマイクロアレイチップを作成し、国際共同研究によりウガンダから提供されたHIV感染者(AIDS発症、未発症群)の血液細胞のtotal RNAを用いて遺伝子発現パターンを解析し、様々なHIV感染病態とリンクする遺伝子群を同定する。今年度はマクロファージ指向性HIV(R5)をin vitroで樹状細胞に4日間処理し、LPSを加え24時間後の成熟樹状細胞おける遺伝子発現をSAGE法により行った。約9,000の転写産物について解析を行った結果、HIV未処理成熟樹状細胞の遺伝子発現パターンと非常に良く類似していた。このことは、HIV(R5)が樹状細胞への感染効率がきわめて低いため、遺伝子発現への影響が低かった為と考えられる。今後、さらに転写産物のシークエンスをし、解析精度を高めるとともに、マクロファージについても解析をすすめる。また、HIV感染細胞の包括的遺伝子解析結果と比較検討するため各種白血球(NK,ランゲルハンス様細胞の包括的遺伝子解析も同時に行った。
ラミニン活性ペプチドを用いた人工基底膜の創製

本研究では、ラミニン由来の活性ペプチドをキトサン膜に固定化させたペプチド-キトサン膜を「人工基底膜」として開発することを目指した。これまでに、開発したペプチド-キトサン膜ペプチド上では作用するレセプターにより細胞への作用が異なること、さらに作用レセプターの異なるペプチドを組み合わせてペプチド-キトサン膜に固定化することにより細胞形態をコントロールできる可能性を示すことができた。またペプチド-キトサン膜のin vivoで効果を検討した結果、表皮細胞を受傷部に効率よく生着させる細胞移植キャリアとして利用できることがわかった。これらの結果より、ペプチド-キトサン膜の実際の医療への応用の可能性を示してきた。本年度は、創傷治癒に深く関与する血管新生に注目し、血管新生を促進するペプチド-キトサン膜の創製を目的に研究を展開した。まず、これまでに同定されているラミニン由来細胞接着活性ペプチドの中から血管新生促進活性を有するペプチドを同定した。in vitro, ex vivo, in vivoの血管新生促進実験からラミニンα1鎖由来のAG73ペプチド(RKRLQVQLSIRT)が強い血管新生促進活性をもつことを明らかにした。またAG73-キトサン膜を作成し、漿尿膜(CAM)アッセイを行ったところ、AG73ペプチド単独で見られたのと同等の強い血管新生促進活性が確認された。この結果より、AG73ペプチドの血管新生促進活性はペプチド-キトサン膜上でも保持されること、ペプチド-キトサン膜の血管新生をターゲットとした医療への有用性を示すことができた。これらの結果は現在論文投稿中である。ラミニン活性ペプチドをキトサン(多糖類)の膜に固定化させたペプチド-キトサン膜を「人工基底膜」として開発することを目的に研究を遂行中である。キトサン膜にA99(AGTFALRGDNPQG),AG73(RKRLQVQLSIRT)など数種類のラミニン由来細胞接着活性ペプチドを化学的に固定化し、その生物活性を評価した。その結果、活性ペプチドがキトサン膜に化学的に固定化されることでその活性が増強されることがわかった。また、A99-キトサン膜はインテグリン、AG73-キトサン膜はシンデカンを介して細胞接着をすることが解明できた。このように細胞膜上の受容体に各々のペプチドが特異的に結合することにより、膜に細胞特異的な作用を付加させることができた。次に、キトサン膜に複数のペプチドを固定化させたペプチド-キトサン膜を作成したところ、1種類のみのペプチドを固定化させたものに比べ細胞接着に顕著な増強効果がみられた。またペプチドを組み合わせることにより細胞形態をコントロールできることを見いだした。これらの研究結果は、Mochizukiら、FASEB J.17:875-877(2003)などに報告した。さらにこの論文中の細胞形態の写真は、FASEB.Jの2003年5月号の表紙を飾ることができた。現在、A99ペプチドなどの細胞膜上のインテグリンに特異的に作用するペプチドを固定化させた数種類の膜を作成して、それらの膜上で細胞形態やそれに伴う細胞内シグナルタンパクのリン酸化の測定中である。また、動物を用いたin vivo実験に向けて、毒性の少ないクロロアセチル基を導入したクロロアセチルキトサン膜を開発した。現在このペプチド-キトサン膜を用いて受傷部に直接被覆する方法と、あらかじめ膜上に細胞を接着させてから被覆する方法を用いてin vivoでの創傷治癒効果を検討中である。本年度は、シンデカンあるいはインテグリンに特異的に結合する2種類の機能ペプチドA99(AGTFALRGDNPQG)、AG73(RKRLQVQLSIRT)を組み合わせてキトサン膜に結合させた膜を用いて細胞の接着や神経突起伸長促進作用を検討し、シンデカンとインテグリンの相互作用を検討した。その結果レセプターの異なるペプチドを組み合わせてキトサン膜に結合することにより効率的に細胞に作用できることが明らかになった。さらにAG73ペプチドを固定化したペプチド-キトサン膜を用いてin vivoで効果を検討した。ペプチド-キトサン膜を直接マウスに処置することにより、受傷部への表皮細胞の遊走促進がみられたことから創傷治癒効果が確認された。また、ペプチド-キトサン膜にヒト表皮細胞を接着させて、ヌードマウスに移植することにより、ヒト表皮細胞をマウスに移植できることがわかった。さらに、移植されたヒト細胞はマウス筋膜上で分化し角化を進行していることがをすることがわかった。これらの実験結果は「蛋白核酸酵素」2005年4月号にミニレビュー「人工基底膜の創製-ラミニンペプチドの新たなチャレンジ-」として掲載予定である。現在、ラミニンやフィプロネクチン、コラーゲン、スロンボスポンジンなどの細胞外マトリックス構成成分から同定されたインテグリンに特異的に作用するペプチドを十数種類合成し、それらを固定化させた膜を作成し、細胞接着活性を測定中である。細胞形態や細胞接着に関わるインテグリンの種類を同定し、インテグリンタイプが異なることで引き起こされる細胞応答の違いを評価している。これらの研究結果は、我々が同定したラミニン由来の機能ペプチドを化学的にキトサン膜に結合することにより、基底膜様の作用をもったペプチドマトリックスが作成できることを示すものである。

本研究では、ラミニン由来の活性ペプチドをキトサン膜に固定化させたペプチド-キトサン膜を「人工基底膜」として開発することを目指した。これまでに、開発したペプチド-キトサン膜ペプチド上では作用するレセプターにより細胞への作用が異なること、さらに作用レセプターの異なるペプチドを組み合わせてペプチド-キトサン膜に固定化することにより細胞形態をコントロールできる可能性を示すことができた。またペプチド-キトサン膜のin vivoで効果を検討した結果、表皮細胞を受傷部に効率よく生着させる細胞移植キャリアとして利用できることがわかった。これらの結果より、ペプチド-キトサン膜の実際の医療への応用の可能性を示してきた。本年度は、創傷治癒に深く関与する血管新生に注目し、血管新生を促進するペプチド-キトサン膜の創製を目的に研究を展開した。まず、これまでに同定されているラミニン由来細胞接着活性ペプチドの中から血管新生促進活性を有するペプチドを同定した。in vitro, ex vivo, in vivoの血管新生促進実験からラミニンα1鎖由来のAG73ペプチド(RKRLQVQLSIRT)が強い血管新生促進活性をもつことを明らかにした。またAG73-キトサン膜を作成し、漿尿膜(CAM)アッセイを行ったところ、AG73ペプチド単独で見られたのと同等の強い血管新生促進活性が確認された。この結果より、AG73ペプチドの血管新生促進活性はペプチド-キトサン膜上でも保持されること、ペプチド-キトサン膜の血管新生をターゲットとした医療への有用性を示すことができた。これらの結果は現在論文投稿中である。
有機金属イオンビーム法による炭化ケイ素薄膜形成における反応機構の解明

有機金属イオンビーム法は、有機ケイ素化合物であるジメチルシラン(SiH_2(CH_3)_2)から分子構造中にSi-C結合を有する有機金属イオン:メチルシリセニウムイオン(SiCH_3^+)を生成し、この有機金属イオンビームを前駆体として炭化ケイ素(SiC)薄膜の結晶成長を行う手法である。SiCH_3^+イオンビームを用いたSiC結晶成長法は、良質なSiCヘテロエピタキシャル膜の形成、SiCの低温結晶成長が可能であることをこれまでに報告してきた。その中で、有機金属イオンビームと固体表面の反応過程や、イオンビームの運動エネルギーが100eV以下の極低エネルギー領域におけるイオンビームと材料表面の相互作用に関する報告例は少ないため、極低エネルギーの有機金属イオンビームがSiC薄膜形成に与える効果についての議論は十分に行われていない。本研究課題の目的は、有機金属イオンビーム法による炭化ケイ素薄膜形成過程において、極低エネルギーのSiCH_3^+イオンと結晶成長するSiC薄膜の相互作用について知見を得ることにある。本年度では、前駆体であるSiCH_3^+イオンの持つ運動量・運動エネルギーがSiC結晶成長に与える効果に着目して研究を行った。エネルギー分析部にcylindrical mirror analyzer(CMA)を搭載したプラズマプロセスモニターによりSiCH_3^+イオンのエネルギー分析を行い、本研究で使用するイオンビームが単色的で揺らぎが小さいものであることを確認した。実験を行った結果、イオンビームの運動エネルギーを変化させることにより、基板上に形成されるSiC薄膜が立方晶系と六方晶系の異なる結晶構造を取ることが分かった。
ロシア所蔵中央アジア古代語文献の総合的研究

本研究の目的は、ロシア科学アカデミー東方学研究所サンクトペテルブルグ支所に保管されている古語文献を調査・整理してカタログを作成することと、主要文献を文献学的・言語学的に研究することであった。対象とした言語はウイグル語、コータン語、ソグド語、西夏語、蒙古語である。研究成果の主なもの掲げる:1.カタログ作成:(2)『サンクトペテルブルグ所蔵ウイグル語文献カタログ』京都大学2001年(印刷中)2.文献研究:(1)『ウイグル文Dasakarmapathavadanamalaの研究』松香堂1998年xii+377p.3.シンポジウム:「中央アジア古代語とチュルク系極小言語-死語と危機言語の研究-」京大会館・京都大学文学部羽田記念館1997年10月24日25日.以上のほか、文献研究においては研究代表者・分担者の提出した論文が総計約20点に及ぶ。また、日本とロシアで10回を越える研究討議もおこなった。今年度は本研究の初年度である。研究計画に沿って、まずロシア所蔵文献のマイクロフィルム資料の焼き付け等をはじめとする中央アジア古代語文献の整備・整理作業をおこなった。その一方で各研究分担者はカタログ作成を遂行しながら、各自の研究対象とする古代語文献の研究をおこなった。以下に具体的に今年度の成果を掲げておく。1.東洋文庫が購入、保管していたロシア科学アカデミー東方学研究所サンクトペテルブルグ支所所蔵中央アジア古代語文献のマイクロフィルムの中から本研究の研究対象としている文献(ウイグル語、ソグド語、コ-タン語、西夏語による文献)のマイクロフィルム1万数千点を選び、焼き付けしたのち、整理作業に着手した。マイクロフィルムの撮影があまり整理された状態で行われていなかったため、東洋文庫が購入した際の送付リストとのくい違い(重複や欠落)が多々あり、この整理作業には予想外の時間を要した。2.古代語文献のカタログ作成に関連しては、研究者招聘とともに日本側から研究分担者が渡航するなどにより検討と確認作業が進められている。3.研究代表者、分担者ともに各々の古代語文献の研究を進める中で、1997年秋には東方学研究所から招聘研究者を迎え、古代語文献研究についての研究会を行うなどの学術交流の機会をもった。来年度は今年度の作業及び研究を継続するとともに、東洋文庫が購入していないマイクロフィルムの確定作業、購入の準備等を進めていきたい。本年度は昨年度に引き続き、研究代表者・分担者各自がそれぞれ研究対象とする古代語文献の分析・整理・カタログ作成作業を続行した。いずれも順調に進んでいるが、やや具体的に今年度の実績を以下に記す:(1)ウイグル文献については庄垣内、梅村、藤代が総合的なカタログ作成にむけて、順次、分析・整理を継続している。また、カタログ作成に並行してウイグル語文献の校訂研究をも行っており、その成果は論文・著書等として発表した。(2)西夏語文献については総合的カタログ作成の基礎作業が今年度すでに最終段階に入った。秋に東方学研究所サンクトペテルブルグ支所からE.I.クチャーノフ教授(西夏学)を招聘し、カタログ作成作業のレビューを依頼し、西田とともにデータの電子ファイル化について打ち合わせを行った。来年度中に総合的カタログとして刊行の見込みである。(3)熊本はブラーフミー文字による文献の確認作業・整理を行った。それら文献にはサンスクリット語によるもの、コータン・サカ語によるもの、また、少数ではあるがトカラ語の文献も含まれることが確認できた。内容についても継続して分析中である。(4)吉田はソグド語文献全般の整理・分析をすすめ、その一方で、重要文献については個別の校訂研究をも続行している。来年度からは後半期に入るので、東洋文庫購入済みマイクロフィルムの補充作業なども軌道にのせ、実用的カタログ作成及び重要文献に関する研究をさらにすすめる。いずれも順調に進んでおり、特に今年度は『サンクトペテルブルグ所蔵西夏語仏教文献の総合的カタログ』(B5版XLIX+792p.)を発表することが出来た。今年度の成果を以下にやや具体的にあげる:(1)ウイグル文献については庄垣内、梅村、藤代が総合的なカタログ作成にむけて、順次、分析・整理を継続している。

また、並行してウイグル語文献の校訂研究を行い、論文・著書等として発表した。秋にはサンクトペテルブルグ東方学研究所からトゥグーシェワ氏(ウイグル学)を招聘し、ウイグル文献カタログ作成について打ち合わせを行った。(2)西夏語文献については総合的カタログが完成した。秋に東方学研究所サンクトペテルブルグ支所から、E.I.クチャーノフ教授(西夏学)を招聘し、カタログ作成作業のレビューと最終校正を行った。さらに西田はカタログ出版にあたり、西夏仏典カタログ作成の諸問題について序論文を発表した。(3)熊本はブラーフミー文字による文献の確認作業・整理を行った。それら文献にはサンスクリット語によるもの、コータン・サカ語によるもの、また、少数ではあるがトカラ語によるものも含まれることが確認できた。内容についても継続して分析中である。(4)吉田はソグド語文献全般の整理・分析をすすめ、その一方で、重要文献については個別の校訂研究をも続行している。(5)ロシア所蔵の中央アジア古代語文献についてさらに情報を得るため、秋にサンクトペテルブルグ東方学研究所からサズィキン氏(モンゴル学)を招聘し、研究会をもった。これにより、ロシア所蔵のモンゴル語文献について多くの情報を共有することができた。昨年度に引き続き、研究代表者・分担者がそれぞれ研究対象とする古代語文献の整理と分析、さらにカタログ作成作業をおこなった。具体的には今年度の成果は以下のとおりである:1.庄垣内、梅村、藤代の3名はウイグル文献カタログの作成作業に従事し、『サンクトペテルブルグ所蔵ウイグル文献カタログ』を作成し、現在出版準備の最終段階にある。2.庄垣内はウイグル語文献の内容分析に従事し、およそ20葉の断片に関する研究結果を出版した。3.熊本はコータン語文献の内容分析に従事し、10葉を越える断片に関する研究結果を提出し出版段階にある。4.吉田はソグド語文献全般の整理・分析をすすめた。また重要文献については個別の校訂研究をおこない、論文として出版した。5.本年度は東方学研究所から、所長のE.I.クチャーノフ教授(西夏学)、上級研究員のL.Yu.トグーシェワ氏(ウイグル学)とA.G.サズィキン氏(モンゴル学)を招聘し、中央アジア古語文献について研究討議をおこなった。また愛媛大学の樋口康一教授らを招いてサズィキン氏を中心に「モンゴル語仏典の成立年代について」の題目のもとに公開の研究会をおこなった。6.本年度は最終年に当たるので、本研究に従事した研究分担者、海外研究協力者から研究成果の提出をもとめ、論文集Contribution to theStudies of Eurasian Languagesseries vol.3を作成し、現在印刷中である。この論文集は本研究でこれまでに出版した『ウイグル文Daskarmapathavadamalaの研究』(庄垣内・トゥグーシェワ・藤代・著)『サンクトペテルブルグ所蔵西夏語文献カタログ』(クチャーノフ編)に続く研究成果である。
多重ゼータ値および有限多重ゼータ値が生成する代数の構造の研究

多重ゼータ値と等号付き多重ゼータ値を補間した,いわゆる補間多重ゼータ値について研究を行い,主に3つの成果を得た.第一に,川島関係式の導出の成功で,系として巡回和公式の明示式も得た.第二に,ダブルシャッフル積構造の代数的定式化の成功であり,副産物としてホフマン関係式の明示式も得た.第三に,補間多重ゼータ値のq-類似の提唱と,そのある母関数の一般超幾何関数のq-類似を用いた表示式を得た.有限多重ゼータ値についても研究を行い,主に2つの成果を得た.第一に,和公式を証明した.この成果は有限多重ゼータ値の関係式の研究の先駆的結果となった.第二に,ボウマン-ブラッドレー型の特殊値が0になることを証明した.1 1変数tを用いて多重ゼータ値と等号付き多重ゼータ値を補間した多項式(t-多重ゼータ値)が,山本(2013)によって導入された.このt-多重ゼータ値における川島関係式にあたるものを,京都産業大学の田中立志氏との共同研究で示した(2016).山本によってt-多重ゼータ値の巡回和公式は証明されていたが,今回の田中氏との共同研究で巡回和公式を川島関係式に帰着させるという別証明を与えた.その後独自に研究を進め,t-多重ゼータ値のひとつの積構造として新たなt-シャッフル積なる積を導入し,その帰納的規則を得ることができた.t-調和積は既に知られていたが,今回のt-シャッフル積を用いるとt-多重ゼータ値における有限複シャッフル関係式を記述できる.さらにt-シャッフル積の帰納的規則を明示したことにより,t-多重ゼータ値のHoffman関係式にあたる関係式を証明することに成功した.この研究成果は現在投稿準備中である.2多重ゼータ値のq-類似がBradley(2005),奥田-竹山(2007)などによって導入された.このq-多重ゼータ値に関して様々な研究がなされており,中でも竹山(2012)によって川島関係式にあたるものが示されている.研究代表者は,上記のt-多重ゼータ値とq-多重ゼータ値の双方の拡張になっているt-q多重ゼータ値を定義した.これは,多重ゼータ値のq-類似のt-補間を構成するというものであり,tを0とするとq-多重ゼータ値,qを1に近づけるとt-多重ゼータ値に帰着するものである.このt-q多重ゼータ値における調和積構造を代数的に定式化し,川島関係式にあたるものを代数的に証明した.さらにこの川島関係式に帰着させることにより巡回和公式とHoffman関係式にあたるものを示した.この研究成果は現在投稿中である.平成27年度の研究計画として予定していた有限多重ゼータ値に関しての研究はやや遅れ気味である.特に,有限多重ゼータ値の母関数に関する研究に関しては,従来の手法を踏襲する形で研究を進めているが,母関数が満たす微分方程式を立てる際に有限ならではのずれが生じるため,どのような補正をするかなどの困難に直面しており,新たな視点が必要だと考える.有限多重ゼータ値の巡回和公式については,当初数値実験を交えて予想式を確立する予定であったが,それよりも有限でないさまざまな多重ゼータ値の巡回和公式を整備する目的で以下の研究を優先させた.t-多重ゼータ値のひとつの積構造として新たなt-シャッフル積なる積を導入し,t-シャッフル積の帰納的規則を明示したことにより,t-多重ゼータ値のHoffman関係式にあたる関係式を代数的に証明した.また,t-多重ゼータ値とq-多重ゼータ値の双方の拡張になっているt-q多重ゼータ値を定義し,このt-q多重ゼータ値における調和積構造を代数的に定式化した.その結果,代数的に川島関係式,巡回和公式,Hoffman関係式の明示に成功した.この結果は,平成28年度以降に予定していた多重ゼータ値および多重L値の代数的研究に相当するひとつの研究成果でもある.多少年度毎のずれが生じてはいるが,3年計画としての本研究は着実に進んでいる.山本(2013)によってt-多重ゼータ値が導入された.1変数tを用いて多重ゼータ値と等号付き多重ゼータ値を補間した多項式であり, t-多重ゼータ値における川島関係式(田中-若林, 2016),巡回和公式(山本, 2013,田中-若林, 2016),有限複シャッフル関係式およびホフマン関係式(若林,掲載予定)が証明されている.前年度, Bradley(2005),奥田-竹山(2007)などによって導入された多重ゼータ値のq-類似(q多重ゼータ値)に関して,山本(2013)と同様に1変数tを用いて多項式補間(t-q多重ゼータ値)を定義し,それらの間に成り立つ川島関係式,巡回和公式およびホフマン関係式にあたるものを証明した(若林, 2017).大野-ザギエ(2001),青木-昆布-大野(2008),李(2008),青木-大野-若林(2011)において,重さ,深さ, (一般の)

高さを固定した(等号付き)多重ゼータ値の和に関する母関数の研究がなされ, (等号付き)多重ゼータ値と(一般)超幾何関数との関連が指摘され,結果の特殊化により和公式などの既存の関係式の別証明を与えている. q多重ゼータ値においても奥田-竹山(2007),竹山(2009),李(2010)などによって類似の研究がなされている.本年度はt-多重ゼータ値およびt-q多重ゼータ値に関する母関数の研究を行い,期待される結果を得ることができた.特にt-q多重ゼータ値に関しては,重さ,深さ,一般の高さまで固定したt-q多重ゼータ値の和に関する母関数が一般超幾何関数のq-類似を用いて表されることを示すことができ,大野-ザギエ(2001)から派生したこの系統の母関数の研究を網羅的に取り扱うことに成功した.この研究成果は同済大学の李氏との共同研究であり,現在投稿準備中である.平成28年度の研究計画として予定していた大野-ザギエ型母関数に関しての研究は進展が見られた.予定していた母関数に関する研究は,多重L値および有限多重ゼータ値(平成27年度より引き続き)に関するものであったが,それぞれにおいて予期せぬ困難性に直面し,新たな視点が必要であると考えている.そのため,現在得られている多重ゼータ値の母関数に関する研究を統一的に扱うことを目的とし,以下のt-q多重ゼータ値の母関数の研究を優先させた.多重ポリログのq-類似と等号付き多重ポリログのq-類似を補間するt-q多重ポリログを定義し,その和を係数に持つ母関数が一般超幾何関数で表されることから,重さ,深さ,一般の高さまで固定したt-q多重ゼータ値の和に関する母関数が一般超幾何関数のq-類似を用いて表されるというものである.この研究は同済大学の李氏との共同研究であり,現在投稿準備中である.この研究により,多重ゼータ値,等号付き多重ゼータ値およびそれらのq-類似に関する今までの大野-ザギエ型母関数の研究を統一的に扱うことが可能になり,多重L値および有限多重ゼータ値の大野-ザギエ型母関数の研究の進展に少なからず影響を与えている.特に多重L値に関しては特別な場合に大野-ザギエ型母関数が一般超幾何関数と関連することを示すことができている.この結果は,平成27および28年度に予定していた大野-ザギエ型母関数の研究に相当するひとつの研究成果でもある.多少年度毎のずれが生じてはいるが, 3年計画としての本研究は着実に進んでいる.q-類似多重ゼータ値の1変数tを用いた多項式補間を定義し,そのシャッフル積構造を明示し,川島関係式,巡回和公式,ホフマン関係式とそれらの間の包含関係を示した(若林, 2017).この研究をさらに遂行し,補間q-類似多重ゼータ値の母関数の研究を行った.同済大学の李忠華氏と共同研究を行い,多重ポリログのq-類似の多項式補間とその和を係数とする母関数が満たす微分方程式を構成し,ある補間q-類似多重ゼータ値の和を係数とする母関数の一般超幾何関数のq-類似の特殊値を用いた具体表示を見つけた.この補間q-類似多重ゼータ値の母関数の研究成果は,多重ゼータ値およびそのq-類似のある種の母関数に関する既存の研究結果を包括する結果である.この研究成果は現在投稿中である.さらにこれらの研究を多重ゼータ値の他のバリエーションに応用すべく研究を遂行した.特にmod 2の多重L値や他のq-類似多重ゼータ値の多項式補間の研究を継続中である.近畿大学の中村弥生氏との研究打合せを行い,有限多重ゼータ値の母関数に関する研究を行った.この研究は,多重ゼータ値に関する母関数に関する既存の研究を有限多重ゼータ値にて行うというものである.有限多重ポリログなるものを新たに定義し,それにマッチした有限超幾何関数なるものとの関連をみつけることを目標に行い,現在も継続中である.
網羅的リン酸化タンパク質解析のための３次元電気泳動イメージング技術の構築

本研究では,研究代表者らが独自に開発したリン酸化タンパク質分離解析のためのリン酸親和性電気泳動法,フォスタグSDS-PAGEを3次元電気泳動法に適用させた。3次元目の電気泳動としてフォスタグ電気泳動を行うことによって,タンパク質翻訳後修飾の詳細な分離分析が可能となった。さらには,蛍光ディファレンシャル電気泳動に応用することにより,複数の細胞内ンパク質のリン酸化種を高感度に検出することに成功した。申請者はこれまでに,リン酸基を特異的に捕捉する亜鉛錯体(フォスタグ)にアクリルアミド基を導入した誘導体を分子デバイスとして利用することで,リン酸親和性電気泳動法(フォスタグSDS-PAGE)を開発している。本研究では,タンパク質の分離分析において活用される2次元電気泳動法を発展させ,独自に開発したフォスタグSDS-PAGEの原理を加えることで,電気泳動法における新しい3次元軸の構築を行う。これにより,深耕拡大する生体内の「リン酸化ワールドとシグナルネットワーク」を短時間(1回の電気泳動)で一網打尽に浮き彫りにするための新たな分離イメージング技術を創出する。当該年度では,リン酸化修飾と他の翻訳後修飾の同時検出を行うための3次元電気泳動解析の検証を試みた。以下に具体的な成果を記述する。Wntシグナルの構成分子であるβ-カテニンは,プロテアソーム阻害剤存在下のHEK293細胞において,ポリユビキチン化され,1次元目の等電点電気泳動法と2次元目のSDS-PAGEで分子量の増加を検出できた。3次元目のフォスタグSDS-PAGEを用いて展開すると,β-カテニンにはリン化酸状態の異なる少なくとも9つのリン酸化フォームが混在しており,そのうちの2つがユビキチン修飾に必須なリン酸化フォームであることが判明した。3次元展開で観察されたその2つのリン酸化フォームから分子量シフトを示す複数のスポットが派生しており,これらがユビキチン化タンパク質であることは,抗ユビキチン抗体によるウェスタン解析によって確認した。当該年度においては,高次複合体プロテオームの質的・量的ダイナミクスの解明を視野に入れた3次元モニタリング法の確立を目指した。リン酸化が関わる複合体形成など,複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能になることを証明することで,本技術の有用性を立証した。具体的には,ブルーネイティブ電気泳動(生体内の複合体を未変性で分離)とSDS-PAGE(分子量で分離)を2次元展開の要素とし,3次元展目にフォスタグSDS-PAGEを導入することでリン酸化が関わる複合体形成など,複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能となった。また,タンパク質を検出する際に,ウェスタンブロットにおけるフォスタグゲルからの標的タンパク質の転写効率を改善させる必要が生じた。セミドライ法では,フォスタグゲルのEDTA処理により改善された。ウェットタンク法では,通常のゲルとフォスタグゲルの差異はないが,ゲルに残存するタンパク質バンドが認められた場合,転写緩衝液に0.1% w/wSDSを添加することで,ゲルからの溶出量が増大することが判明した。さらには,細胞内において極めて発現の低いリン酸化タンパク質を検出する際に,フォスタグアガロースを用いた分離濃縮の前処理操作を行うことで,その検出感度が有意に改善されることを証明した。細胞内において極めて低発現のリン酸化タンパク質については濃縮による前処理操作の有効性を示すことができた。