hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
OpenFlowによるサイクル構造に着目した高速障害復旧方式の開発

具体的には、制御負荷の軽減とシステム規模の拡張性を高めるため、分散配置された複数のコントローラが協調動作して効率的な運用を実現する発展的な手法を提案してきた。一般的にリング型のトポロジを用いた障害復旧技術は少ない制御メッセージ数で高速な障害復旧が可能であることが知られているが、適応可能なネットワークが限られている。そこで、この技術をメッシュネットワークへ適用する取り組みがなされており、リング構造(サイクル)を用いた障害復旧方式が提案されている。この方式では、全ての通信回線の障害に対応でき、かつ、予備経路を最大限に節約するサイクルの集合を求めることが非常に難しい。基本タイセット系による障害復旧を実現するために、予備経路の算出方法と障害が発生してから復旧するまでの一連の具体的動作を提案し、各ノードが所持するテーブルの作成法、および、テーブルに従ってどのように振る舞うかを定義し、OpenDaylightによる実装を進めた。成果として、(1)複数コントローラ環境の構築、(2)スイッチからコントローラへの通信量の削減、(3)スイッチ監視のための通信量の削減、(4)フローエントリ数の集約による削減、(5)ループ障害の復旧処理を達成することができた。高信頼なSDNを実現するために(1)コントローラへの負荷の削減、(2)コントローラとスイッチ間の制御チャネルの遅延低減、(3)SDN対応スイッチに登録するフローエントリ数の削減が必要となることを示した。次に、障害復旧に着目し、コントローラへの負荷を抑えつつ、フローエントリ数を削減する方式を提案した。また、この方式をOpenFlowを用いて実装し、実際のフローエントリ数削減効果を示した。さらに、分散データベースを用いた制御において、複数コントローラ間の情報共有のための負荷を削減するためのサイクルクラスタリングを提案し、実験から、コントローラの協調動作によって負担を軽減できることを示した。ネットワークが大規模化および複雑化すると集中処理による管理が困難になる。これまで、ネットワークを局所的な処理単位(ユニット)に分割し、管理上の問題を分散的に解決する方法を考案してきた。特に、ネットワークに内在するタイセットをユニットとして用いた障害復旧手法を考案してきたが、他のユニット構成を用いることや、障害復旧以外の処理に関する検証は不十分なものであった。
アムールオホーツク生態系の陸海統合管理とラムサール条約の適用可能性

ラムサール条約の実施過程における資料、具体的には、ラムサール条約締約国会議や科学技術検討委員会(STRP)における公式文書等の検討の結果、海洋沿岸域近くの湿地については海洋環境とのリンケージが確認されているものの、内陸部に位置する流域内湿地と海洋環境との関係については、流域からの汚染の問題を除いて、ほとんど議論されていないことがわかった。これは、ラムサール条約の解釈上の課題と並んで、科学者の中での湿地と海洋の認識論的な区別、あるいは湿地や流域を専門とする科学者と海洋を専門とする科学者との間の知識や認識のギャップも大きく作用しているように思われる。第1に、平成25年度においては、昨年度に引き続き、ラムサール条約の適用範囲、およびその射程についての理論的検討のため、資料、図書、また二次文献を中心に収集し、分析をおこなった。特に、ラムサール条約の実施過程に関する締約国会議や科学技術検討委員会(STRP)の公式文書を包括的に収集し、当条約が湿地帯以外の部分にまで適用されるか否かという点に関連する部分に焦点を当てて検討を行った。その結果、沿岸域に近い形で存在する湿地の保全については、海洋環境保護との連続性が認められ、当条約の適用範囲が海洋まで含まれるのではないかという結論を得た。第2に、上記の点につき、国内外の研究者と意見交換を行い、ラムサール条約の適用範囲に関する様々な知見を得た。具体的には、5月および10月に行われた国際法学会に参加した際に、環境法を研究する研究者と議論を行ったほか、6月にロシア・イルクーツクで行われたシベリア極東水会議にて研究発表を行い、環境法のみならずロシア極東地域の河川や湿地に関して研究する自然科学研究者、実務家などと協議を行った。特に後者においては、UNECE越境水路保護に関するヘルシンキ条約の2013年発効の改正によって、当条約がアムール・オホーツク地域の国際河川および湿地にも適用可能となり、さらに適用範囲を拡大することを狙いとしていることから、ラムサール条約だけでなく、国際河川に関する条約にもとづいて湿地と海洋の統合的管理を図る可能性について、大きな示唆を得ることができた。また、以上の検討を部分的に取り入れた形で、査読なし論文二編をまとめ、公表した。平成24年度においては、ラムサール条約の適用範囲およびその射程について理論的検討を行うべく、資料、図書および二次文献を中心に収集し、分析をおこなった。第1に、ラムサール条約の実施過程における資料、具体的には、ラムサール条約締約国会議等における公式文書の中から、条約の適用範囲の議論に関連すると思われる部分を抽出し、部分的ではあるが分析検討を行った。その結果、沿岸地域に比較的近い湿地の保全のケースでは、近接する沿岸の海洋環境との関連性が、少なくとも部分的には認識されている場合があることがわかった。第2に、ラムサール条約のような内陸環境の保全レジームとは別に、地域海洋レジームなどの海洋環境保護の条約の側から、内陸の環境保全との関連性がどのように認識されているかという点についても検討を行った。具体的にはバルト海の海洋環境保護レジーム(ヘルシンキ条約)の条約実施過程における文書を収集し、分析を行った。その結果、海洋環境レジームの側においても、比較的沿岸域に近い場所に存在する湿地の保全については、湿地と海洋環境との生態的関連性がある程度認識されていることがわかった。第3に、複数の条約間の関係性およびリンケージについて、国際法や国際関係論の一般理論における最新の理論状況を調査分析することによって、検討を行った。これは、ラムサール条約の射程範囲と海洋環境保護に関する条約の射程範囲が部分的に重なった場合、どのような処理がなされるべきかを検討する際に重要となる、予備的作業である。また、以上の検討を部分的に取り入れた形で、査読付き論文二編、および査読なし論文一編をまとめ、公表した。26年度においては、第1に、前年度までに行う予定であった中国黒龍江省におけるラムサール条約の実施状況やその他の湿地管理プログラムに関する現地調査を行った。その結果、黒龍江省においては、自治体レベルで湿地管理や復元のための積極的な取り組みが行われており、ラムサール条約や中国国内の環境法制の実施を意識した形となっていることが分かった。しかしこの取り組みが具体的に、ラムサール条約の解釈にどのような影響を与えるかについてまでは、明らかにすることができなかった。第2に、前年度に引き続き、ラムサール条約の適用範囲、およびその射程に関する理論的検討のため、資料や図書、二次文献などの読む込みと分析を行った。またラムサール条約の実施過程に関する締約国会議や科学技術検討委員会(STRP)の文書などを収集し、ラムサール条約が湿地帯以外のエリアにまで適用可能かどうかという問題に関連する部分に焦点を当てて検討した。その結果、前年度までと同様に、沿岸域の近くに存在する湿地の保全については、海洋環境保護との連続性が認められ、条約の適用範囲が海洋域まで含まれる可能性があることが分かった。

研究期間全体を通じて実施した研究の成果として、ラムサール条約の実施過程において、海洋沿岸域近くの湿地については海洋環境とのリンケージが確認されるものの、内陸部に位置する流域内湿地と海洋環境との関係については、流域からの汚染の問題を除いてほとんど議論されていないことも分かった。これは両者の生態学的つながりが明確にしにくいといった自然科学上の課題もあるであろうが、ヒアリング調査の結果として、科学者の中での湿地と海洋の認識論的な区別、あるいは湿地や流域を専門とする科学者と海洋を専門とする科学者との間の知識や認識のギャップも大きく作用しているように思われる。以上の点についてさらに詳細に検討し、英文雑誌への投稿を準備している。越境環境ガバナンス平成25年度においても、ラムサール条約の適用範囲、およびその射程に関する理論的検討については概ね順調に進展させることができた。ラムサール条約に関する締約国会議や科学技術検討委員会(STRP)の資料等の収集、分析については、予定通り進展している。また、国内外の研究者および関係者へのインタビューによって、ラムサール条約の効果的な適用が実際にアムールオホーツク地域で可能かどうかに関する検討を行う作業を行った。国内の環境法の研究者に対しては、国際法学会への参加の機会を利用する形で議論を行ったほか、ロシア・イルクーツクで開催されたシベリア極東水会議に出席し、ロシア極東や北東アジア地域の水の専門家と意見交換を行った。さらに、アムールオホーツク生態系の保護に関する日本、中国、ロシア、モンゴルの4ヶ国の研究者および実務家が参加した『アムール・オホーツク・コンソーシアム』第三回会合が10月にウラジオストクで行われ、別の研究資金によって研究発表を行い、意見交換を行った。他方、年度後半に中国の湿地管理に関する研究者を訪問し、中国国内におけるラムサール条約の実施状況、またその他の湿地管理プログラムを実地調査し、聞き取り調査を行う予定であったが、昨今の日中関係の悪化により、当初予定していた中国のカウンターパートへの訪問が実現できなかった。そのため、当初は平成25年度にて当該研究事業を終了する予定であったが、1年間の事業期間の延長を行う運びとなった。平成24年度においては、ラムサール条約の適用範囲およびその射程に関する理論的検討については概ね順調に進展させることができた。関連する資料および文献の収集は予定通り進展しており、資料の読み込みとそれに基づいた分析も着実に行っている。他方、平成25年度に予定している調査及びヒアリングの打ち合わせのために、総合地球環境研究所(京都)に加えてロシアおよび中国の両国を訪問する計画であったが、その部分は達成できなかった。ただ、ロシアについては、幸いにも別の研究資金によってハバロフスクを訪問する機会を得、関係する研究者から、ロシアの湿地保全状況を調査する際の資料収集方法、および訪問すべき研究協力者の紹介を受けることができた。中国については、近時の日中関係の悪化が大きく影響し、中国東北部において湿地保全に関与する研究者へのコンタクトが大変困難となった。しかし、年度末において、研究協力者である、ダ(中国簡体字のため省略)志剛氏(中国黒龍江省社会科学院
癌臨床研究におけるレスポンダーおよびシグナル検出のための統計的機械学習法の開発

本研究では,癌研究における個別化医療を志向した,統計的方法の研究を実施した,そこでは,(1)予測確度を重視した統計モデルの構築,(2)解釈の平易さを重視した統計モデルの構築の2個の相反する方向性のそれぞれにおいて新たな手法を開発した.(1)では,アンサンブル学習法,とくにルールアンサンブル法に焦点を当てた.その成果は,手法に関しては「応用統計学会平成25年度奨励論文賞」を受賞し,応用分野では「日本感性工学会2014年度事例研究賞」を受賞した.(2)においては,適応的ステップ回帰法,適応的指標モデルを生存時間研究に拡張した.さらに,書籍「樹木構造接近法」を執筆した.今年度の前半は,前年度に引き続き,生存時間研究におけるルール・アンサンブル法の開発を行った.そこでは,実際の臨床データへの応用を通して,その有用性を確認するとともに,前年度に開発したシミュレーションシステムを用いて評価を行い.学術論文誌「応用統計学」に投稿した.さらに,バイオマーカを伴う癌臨床試験のための統計的方法として,適応的指標モデルをとり上げ,その拡張を行った.そこでは,バイオマーカを伴う臨床試験のなかで問題になる,予後因子および効果予測因子について,プロダクションルールによる探索を行うことができるようにモデルを改善した.さらに,損失関数を回帰パラメータに対するスコア検定統計量から,モデル予測に焦点を当てた偏分残差に変更した.これにより,予後因子・予測因子の両方を同時に探索できる手法の開発に成功した.その成果は,学会発表とともに,学術論文誌「データ分析の理論と応用」に投稿した.後半は,生存時間モデルに基づく傾向スコアあるいはバイオマーカ評価のためのグラフィカル接近法として,時間依存型ROC曲線の開発を行った.そこでは,Hergerty et al.(2000)の時間依存型ROC曲線の結果を深く解釈するための新たな接近法として,予測性曲線をとり上げた.時間依存型ROC曲線では,生存期間とスコア(あるいはバイオマーカ)の関連性をグラフィカルに診断することに終始していたが,予測性曲線の適用は,任意の生存期間での死亡リスクを確率的に取り扱うことを可能にした.さらに,2値応答データに対する既存のルール・アンサンブル法が最小ランプ関数の最小化に基づく通常の重回帰モデルの形式をとっていたのに対して(アダブーストと同様の形式),提案手法では,ロジスティック回帰モデルの枠組みで拡張することにより,より予測確度に優れたモデルを構築することに成功した.今年度の前半は,昨年度に検討を開始した,ルール・アンサンブル法の2値応答への拡張とその評価について検討し,学術雑誌「Behaviormetrika」に投稿した.また,前年度に引き続き時間依存型ROC曲線の開発を行った.時間依存型ROC曲線では,生存時間分布と共変量の同時分布を用いる.前年度は,中途打ち切りを伴う2変量密度推定に基づくノンパラメトリック接近法を利用したが,本年度は,2変量ベキ正規分布に基づくパラメトリック接近法での開発を試み,2013年度統計関連連合大会のなかで発表した.今年度の後半は,CART法に基づく2種類の手法(多変量適応型回帰スプライン(MARS)法,自動2値ロジスティック推定法(ABLE))の拡張を拡張した.医学研究では,疾患の重症度を軽度,中程度,重度といった順序カテゴリカル応答で捉えることがある.そのため,本研究は,MARS法を順序カテゴリカル応答に拡張した.順序カテゴリカル応答に対するMARS法は,比例オッズ・モデルの共変量の線形結合をMARS法の打ち切りベキ乗基底関数に変更したモデル形式をとり,その偏分残差によってパラメータを推定する.この方法は,現在,学術論文誌「計算機統計学」に投稿中である.また,ABLE法の拡張では,比例ハザード・モデルの枠組みのもと,生存時間研究に拡張した.因にABLE法とはCART法と同様にステップ関数で近似する回帰手法だが,そのモデル形式はMARS法と同様である.この方法を生存時間データに拡張することで,共変量に基づいたプロダクションルールでハザード比の増加(減少)の程度が解釈できる.また,CART法では主効果の影響を把握することは困難だが,ABLE法ではその解釈も可能になる.この方法は,現在,学術論文誌「応用統計学」に投稿中である.本研究では,癌研究における個別化医療を志向した,統計的方法の研究を実施した,そこでは,(1)予測確度を重視した統計モデルの構築,(2)解釈の平易さを重視した統計モデルの構築の2個の相反する方向性のそれぞれにおいて新たな手法を開発した.(1)では,アンサンブル学習法,とくにルールアンサンブル法に焦点を当てた.その成果は,手法に関しては「応用統計学会平成25年度奨励論文賞」を受賞し,応用分野では「日本感性工学会2014年度事例研究賞」を受賞した.(2)においては,適応的ステップ回帰法,適応的指標モデルを生存時間研究に拡張した.さらに,書籍「樹木構造接近法」を執筆した.今年度の前半は,研究基盤の整備のためのシステムを構成した.先ず,数台のパソコンをクライアント・サーバ・システムで一元管理することで,大規模な統計的シミュレーションを行うためのシステムを開発した.また,論文執筆,資料整理,および諸種の生存時間データを保存・管理するためのNASおよびRAIDシステムを作成した.また,バイオマーカーによるレスポンダー/ノンレスポンダー識別評価のための統計的グラフィクスとして,ROC曲線に基づく諸種の方法を整備し,学術雑誌「応用統計学」に受理された.後半は,極限回帰法,およびアンサンブル学習法の研究に着手した.既存の極限回帰法は,生存時間分布に指数分布を仮定したもとでパラメトリック・ハザード・モデルの枠組みで開発を行っている.しかしながら,進行・再発癌では,このような仮定をみたすことがないことは,広く知られている.

そのため,本論文では,よりデータ(生存時間分布)に当てはまりのよいデータ適応型分布族の枠組みで捉えることにした.そこでは,ベキ正規分布を生存時間分布に仮定した「ベキ正規極限回帰法」を開発し,日本計量生物学会2011年度年会において,その結果を公表した.アンサンブル学習法では,ルール・アンサンブル法を生存時間分布に拡張した,「生存時間ルール・アンサンブル法」を開発した.そこでは,先ず,Boosting法の基本学習器にLeBlanc & Crowley(1992)のSurvival CART法を適用し,そして,比例ハザード・モデルに対するLasso法に基づいて生存時間ルール・アンサンブル法を開発した.そのとき,ルール・アンサンブル法のアルゴリズムには,Friedman & Popescu(2008)の方法ではなく,下川他(2011)の拡張型ルール・アンサンブル法を用いた.その成果は,第25回バイオ情報学研究発表会で公表した.最終年度は,これまでに提案した手法を精緻化することとともに,より複雑な生存時間データに対する拡張法を提案した.具体的には,次の3点である:1.適応的ステップ関数法(ABLE法)を生存時間研究に拡張した.この方法では,生存時間データに対する樹木構造接近法では捉えられなかった主効果の影響を評価できるとともに,実際の臨床研究で散見される「恣意的な2値化」を「統計的根拠に基づく2値化」に変更することができた.さらに,この提案手法は,競合リスクを伴う生存時間データへの拡張を試みた.2.ルール項および線形項を基本学習器としてもちいるルール・アンサンブル法を2値応答に拡張した方法を提案し,実際データに応用した.既存のルール・アンサンブル法において,2値応答に拡張する場合,最小ランプ関数を損失関数としたもとで,損失の最小化を行っている.ただし,この方法では,基本学習器の応答への影響をオッズ比で捉えることができない.これに対して,提案手法では,ロジスティック回帰モデルの枠組みでルール・アンサンブル法を構築し,偏分残差を損失関数に用いることで,基本学習器の応答への影響をオッズ比で捉えることに成功した.3.生存時間MARS法の後退ステップワイズ法の代わりに,前進ステップワイズ法後のパラメータ推定の過程においてlasso,elastic netといった縮小推定法を利用することを試みた.これらの研究により,3編の査読付き論文,6回の学会発表(計算機統計学会第28回大会,統計関連学会連合2014年度大会,日本行動計量学会第42回大会)で成果を発表した.また,日本感性工学会より,「事例研究賞」を受賞した.下川敏雄・杉本知之・後藤昌司(2013)の書籍
ウイルスベクターによる遅い軸索輸送解析

エピトープタッギングを行ったニューロフィラメントM遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込み,これをニューロフィラメントH+lacZの融合遺伝子が導入された、軸索中に中間径フィラメントを欠くトランスジェニックマウス(B6C3F2/44A)のL4の後根神経節へ注入し、その遺伝子産物の坐骨神経内での動態を形態学的に解析することを目的として、実験を開始した。共焦点走査型レーザー顕微鏡及び透過型電子顕微鏡による免疫組織化学法から、タグ付きニューロフィラメントM蛋白質は、確かに中間径フィラメントを形成することなく遅い軸索輸送の速さで座骨神経軸索内を輸送されること、及びラベルの先端部の位置は各軸索間でよく同期しており、かつラベルの軸索方向の強度分布はその先端部で極めて急峻な立ち上がりを呈することが観察できた。更に対照実験として中間径フィラメントを軸索内に有する正常の後根神経節細胞に遺伝子導入した場合、とくに細胞体から離れたラベルの先端部に近い部分でラベルが有意に微少管と共存することが判明した。以上の結果から少なくともニューロフィラメントM蛋白質の輸送に関しては、in vivoの単一軸索レベルでの高解像度下の観察によって(1)細胞骨格蛋白質の軸索輸送の為には細胞体内での重合が必要条件とはならず、単量体あるいはオリゴマーの形で運ばれ得る点でポリマースライディング仮説は成り立たないこと、(2)遅い軸索輸送にも微少管依存性モーター分子が関与する可能性の高いこと、及び(3)メタボリックラベリング法による結果を裏付ける形で、受動的拡散現象からは区別される、おそらくは各軸索間で共通したメカニズムによって能動的な輸送が行われていることが明らかとなった。
マウス歯髄由来Sca-1陽性微小細胞の幹細胞性の検証

マウス骨質および歯髄からVSEL様の小型細胞(微小細胞)を効率良く分離し、この微小細胞がVSELのような幹細胞性を持っているか検証した。微小細胞は骨質、歯髄共に存在が確認されたが、歯髄由来の微小細胞は得られる数が少ないことから、本研究では主に骨質由来微小細胞の検討を中心に行った。微小細胞はVSELと同様の形態等を示したが、VSELとは相違する点も多く、既報の幹細胞とは異なると考えられた。マウス歯髄由来微小細胞の解析を試みたが、得られる細胞数が非常に限られており、幹細胞性の正確な検証が困難であった。一方、マウス骨質からは骨質由来微小細胞を効率良く分離することが可能であることから、骨質由来微小細胞の幹細胞性を検証し、歯髄由来微小細胞の解析に至るデータの収集と、効率的な解析法の検討を行った。骨質由来微小細胞は、小型で核比の高い細胞であり、既知の組織幹細胞やES細胞などの多能性幹細胞とは異なる細胞であることが示唆された。一部の骨質由来微小細胞は血球細胞の培養系で増殖と血球細胞への分化を認めた。四塩化炭素投与による急性肝障害モデルマウスにGFPマウス由来の骨質由来微小細胞を移植した。その結果、レシピエントマウス肝臓中にGFP陽性細胞が認められ、障害肝への生着を示唆する結果を得た。マウス歯髄由来微小細胞と、以前報告したPDGFRαSca-1共陽性歯髄幹細胞(Nakatsuka et al. Cell Transplant.)のFACS解析による比較を行った。歯髄由来で小型のサイズの細胞のうち、Sca-1陽性細胞はPDGFRαを発現しておらず、また細胞の大きさもPDGFRαSca-1共陽性歯髄幹細胞と比べて小型であることが明らかとなった。一方、マウス骨質由来微小細胞の解析結果について、これまでに得られた知見をまとめ、論文報告を行った。マウス歯髄由来微小細胞が、PDGFRαSca-1共陽性歯髄幹細胞と異なる細胞であることが確認された。これは、マウス骨質由来微小細胞がPDGFRαSca-1共陽性間葉系幹細胞と異なる細胞とみなされることを明らかにしたこれまでの解析結果と一致するものであり、骨質由来微小細胞の解析結果が歯髄由来微小細胞の解析を進める上でも有用であると考えられる。また、マウス骨質由来微小細胞については、これまでに得られた知見をまとめ、論文報告を行ったことから、本研究が順調に進展していると判断した。生体組織中に、三胚葉系に分化可能な多能性組織幹細胞が存在するという報告があるが、これらの多能性組織幹細胞については、再現性に乏しいなどの問題も多く、存在を疑問視する意見も多い。Ratajczakらはマウス骨髄内に微小な多能性組織幹細胞(VSEL)の存在を報告している。本研究では微小細胞の幹細胞性を確かめるため、マウスからVSEL様の細胞(微小細胞)を骨、および歯髄から分離し、この細胞の幹細胞性を検証した。これまでの検討から、微小細胞は小型(直径69μm)で核比の高い細胞であったが、直径5μmの細胞は確認されず、VSELとは異なるサイズであった。表面抗原解析および遺伝子発現解析の結果、微小細胞は既知の組織幹細胞(間葉系幹細胞、造血幹細胞)やES細胞とは異なる細胞特性を示した。さらに、微小細胞ではVSELで報告されている多能性幹細胞マーカー(Oct4、Nanogなど)の発現は確認されなかった。微小細胞はVSELで報告されているようなG-CSFに対する遊走能を示さなかった。一方、VSELと同様に生体内では比較的ゆっくりと増殖していることが示唆された。微小細胞は血球細胞の培養系でごく一部が増殖し、血球系マーカーの発現が認められた。さらに肝障害モデルにおいて、BDSCは障害肝臓内で細胞融合、あるいは分化転換している可能性が示唆された。これらの結果から微小細胞として得られた細胞には何らかの組織幹/前駆細胞が含まれる可能性が考えられたが、詳細についてはさらなる検討が必要と考えられた。歯髄に由来する微小細胞の解析は、得られる細胞数がわずかなため目立った進展が見られなかったが、骨質に由来する微小細胞において、きわめて有用な結果が得られた。この結果は歯髄由来微小細胞の今後の解析においても非常に有用なものであり、研究において一定の進展が見られたことから順調に進展していると判断した。マウス歯髄由来微小細胞は得られる数がマウス骨質由来微小細胞に比べて非常に少ないため、解析が困難であったが、骨質由来微小細胞の解析結果を反映しながら進めることにより少ない数でも効率良く解析が進められると考えられる。

今後は骨質由来微小細胞の知見を元に歯髄由来微小細胞の解析を進める予定である。幹細胞生物学骨質由来微小細胞の解析により得られた結果をまとめ、報告することを予定している。また、歯髄由来微小細胞について、骨質由来微小細胞と同様の解析を進め、幹細胞性の検討を引き続き行う。マウス骨質由来微小細胞の解析結果を論文報告したが、論文にかかる費用が予定していたよりも低く抑えられたため、差額を次年度使用額として以降の研究費に充填することとした。第14回日本再生医療学会総会の出張旅費として支出を予定していたが、伝票の作成を次年度に持ち越したため次年度使用額が生じた。歯髄由来微小細胞の解析において、少量の細胞を用いて解析する必要があるが、少量の細胞を用いた解析に必要な試薬類に次年度使用額の一部を充てて使用する。それ以外の使用計画については研究当初の計画と変更なく行うことができる。第14回日本再生医療学会総会の出張旅費は次年度使用額と翌年度の助成金と合わせたうちから支出される。
ゲノム情報を用いた、マイコプラズマの滑走と細胞構築に関する構造の統合的理解

寄生性の真正バクテリアであるマイコプラズマは、細胞に極性を持ち、片方の端に膜が突きだした"接着器官"を形成する。マイコプラズマは接着器官で固形物の表面にはり付いたまま、未知のメカニズムで接着器官の方向に動く(滑走運動)。接着器官は細胞骨格様構造により維持され、それらの形成は細胞分裂と同調して起こる。本研究は、Mycoplasma pneumoniaeとMycoplasma mobileの2種を用いて、細胞骨格と接着器官の構成要素とそれらの構造を明らかにするべく行われた。M.mobileに関しては、これまでにそれぞれ、123、349、521キロダルトンという分子量を持つタンパク質、Gli123、Gli349、Gli521を接着器官の重要な因子として同定していた。本研究では、あらたに以下の知見を得た。(1)3つのタンパク質がGli123-Gli521-Gli349の順序に1:1:1の割合で複合体を形成していることを示唆した。(2)Gli349の分子内マッピングを行い、プロテアーゼに感受性のやわらかい部位と、抗体がアクセスしやすい部位、抗体が滑走を阻害する部位について位置を決定した。(3)Gli349分子を単離、精製してその分子構造を電子顕微鏡で観察した。Gli349は115ナノメートルの棒状の分子で3つの折れ曲がり点を持っていた。そのうち1つは固定角を、2つは自由角を有していた。M.pneumoniaeに関しては、(1)GFPラベル法を用いて、いろんなタンパク質の細胞内局在を調べ、2つのタンパク質が全く新しいパターンで接着器官に局在していることを見いだした。(2)それぞれのタンパク質を欠失した株を調べることにより、電子顕微鏡像における細胞骨格それぞれの構造がどのタンパク質で構成されているかを予測した。
一酸化窒素の慢性疼痛の診断・治療への応用のための基礎的研究

脊髄における神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)の活性化による一酸化窒素(NO)産生の増加が神経因性疼痛の維持に重要であること、nNOSの活性化にはNMDA受容体NR2Bザブユニットのチロシン1472残基でのリン酸化が重要であることを明らかにしてきた。本研究では、脊髄での神経可塑性を誘導するNMDA受容体-NO経路の機能的、可逆的変化について、ノックアウトマウスや各種プロスタグランジン(PG)、オピオイド、グルタミン酸アナログを用いて現在検討した。nNOS活性という生化学的な変化をNADPHジアホラーゼ活性(NADPH-d)を用いた酵素組織化学により組織学的に可視化、定量化して、それらのNO産生を神経因性疼痛の客観的指標にすることを成功した。さらに、インタクトな摘出脊髄標本とNADPH-d組織化学を用いて脊髄後角におけるnNOS活性の評価モデル標本(ex vivo標本)を作製することに成功した。ノシセプチン(N/OFQ)は、nNOSを活性化することによって神経障害痛みのメンテナンスに関与している。N/OFQは脊髄後角表層でnNOS活動を増大した。そのnNOS活性化の効果は、NMDA受容体阻害薬のAP-5やMK-801でブロックできたが、NR2B受容体の選択的阻害薬のCP101,606ではブロックできなかった。N/OFQのnNOS活性化効果は、NR2A受容体欠損マウスでは観察されず、NR2D受容体欠損マウスでは増強効果が観察された。N/OFQがNR2Aを含むNMDA受容体の活性化によって始められるカスケードによりnNOS活性化を刺激したことを示唆した。さらに、NO自身が逆行性メッセンジャーとしてシナプス前終末に働きnNOS活性にフィードバックをかけていることを明らかにした。脊髄における神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)の活性化による一酸化窒素(NO)産生の増加が神経因性疼痛の維持に重要であること、nNOSの活性化にはNMDA受容体NR2Bサブユニットのチロシン1472残基でのリン酸化が重要であることを明らかにしてきた。本研究では、脊髄での神経可塑性を誘導するNMDA受容体-NO経路の機能的、可逆的変化について、ノックアウトマウスや各種プロスタグランジン(PG)、オピオイド、グルタミン酸アナログを用いて現在検討中である。ノシセプチン(N/OFQ)は、nNOSを活性化することによって神経因性疼痛の維持に関与している。上記ex vivo標本システムを用いて脊髄でnNOS活性化に関与するN/OFQのシグナル経路を調べた。N/OFQは脊髄後角表層でNADPH-d酵素組織化学による染色を強め、nNOS活動を増大した。そのnNOS活性化の効果は、NMDA受容体阻害薬のAP-5やMK-801でブロックできたが、NR2B受容体の選択的阻害薬のCP-101,606ではブロックできなかった。

N/OFQがNR2Aを含むNMDA受容体の活性化によって始められるカスケードによりnNOS活性化を刺激したことを示唆した。疼痛は、その持続期間の長さから急性疼痛と慢性疼痛に分けて考えることが出来る。その病量を形成する要因としては、身体の器質的要因、機能的要因、心理的要因の3つが挙げられる。慢性化するにつれて、その病態に心理的要因の占める割合が大きくなることが多く、実際の臨床場面でも、検査で身体異常所見を認めないことから、治療者が「心因性疼痛」とみなしてしまう場合が多い。器質的・機能的障害に心理社会的因子が関与した病態と考える心身症としての見立てが有効となってくるのであるが、慢性疼痛患者の身体面での変化が解明される必要があり、NOの慢性疼痛の指標としての意義を明らかにすることを目的とした。脊髄における神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)の活性化による一酸化窒素(NO)産生の増加が神経因性疼痛の維持に重要であること、nNOSの活性化にはNMDA受容体NR2Bサブユニットのチロシン1472残基でのリン酸化が重要であることを明らかにしてきた。本研究では、脊髄での神経可塑性を誘導するNMDA受容体-NO経路の機能的、可逆的変化について、ノックアウトマウスや各種プロスタグランジン(PG)、オピオイド、グルタミン酸アナログを用いて検討した。nNOS活性という生化学的な変化をNADPHジアホラーゼ活性(NADPH-d)を用いた酵素組織化学により組織学的に可視化、定量化して、それらのNO産生を神経因性疼痛の客観的指標にすることを成功した。さらに、NO自身が逆行性メッセンジャーとしてシナプス前終末に働きnNOS活性にフィードバックをかけていることを明らかにした。本研究でNOを慢性疼痛の客観的指標として示すことが出来たので、臨床応用に向けた新たな次の研究段階への道を開くことが出来た。
考古科学の総合的研究

1)発掘調査でより正確に、より多量の情報を得るための支援手段として理化学的機器を用いた遺跡探査の手法を開発研究した。研究成果の多くは、電波を地中に送ってその反射から地下遺構を探る地中レーダー利用の探査法に加えて電気探査法や磁気探査法を併用し、互いのデータを補足しあう方式を試みたこと、他のひとつは探査技術を総合的に評価するために、すべての探査手法を広域遺跡に応用することによって、個々の探査手法の有用性と限界を明らかにした。2)従来の動植物遺体と遺跡土壌の研究法をもとに、古環境復元と人間の環境利用技術の復元を行った。土壌分析によるトイレ遺構の検出とその内容物研究、動物遺存体に残るDNA分析によるブタとイヌの家畜種の系統解析、炭素・窒素の安定同位体による食性分析法によるイノシシの飼養問題やブタ・イノシシの判別法など考古科学的手法を応用した新たな共同研究をおこなった。過去の人間の生活によって生じた有機物が分解して生成された無機物質を遺跡土壌から抽出して遺構の機能を推定する方法を確立した。3)古年輪研究部門では、国内の研究資料に対しては、樹木年輪を使った古気象の復元的研究法を確立するため、現生の年輪データを集積する一方で、過去に遡っての樹種別、地域別の大量の年輪データを整理した。古建築史に関連したものでは、奈良県室生寺五重塔(国宝)の創建年代が奈良時代ではなく、平安初期(800年頃)と確定した例があげられる。4)考古学的研究と自然科学的研究を融合させた"考古科学研究"を推進するため、考古遺物の材料科学的・製作技術的な見地からの材質・構造などに関する研究を行った。これらの研究成果は、古代から歴史時代に至る製品の流通や交易・科学技術の伝播など、自然と人間に関する相互関係を明らかにするものである。保存材料開発等の基礎研究をさらに推進し、遺物・遺構に関する保存処理技術の開発を推進した。本研究は、我が国における考古科学関連の研究レベルを国際的に主導できるようにすることをめざし、遺跡調査法研究部門、考古環境研究部門、古年輪研究部門、保存科学研究部門の4分野の研究をおこなっている。1.遺跡調査法研究部門;(1)奈良時代窯跡である青森県・五所川原窯跡を研究対象に、2種類の磁気探査の方法を基本にして地中レーダーの方法との比較データを収集。集落遺跡の長崎県・原の辻遺跡では深い層位を探る有効な手法の確立を、群馬県・日高遺跡では広範な遺跡の全体像を求めることを課題とし、測定に伴う有効性と限界を遺構の実際と照合してデータを集積した。宮崎県・日守地下式横穴墓では、地下約3mもの深さに埋もれた玄室についてそれらを覆う土壌が火山灰であれば地中レーダーが有効に反応することを確認した。(2)研究会議を開催し、発掘調査の各段階において必要な作業と、その作業から得るべき情報の項目について詳細なデータとともに報告し、討議した。2.考古環境研究部門;(1)現世骨格標本については、ハクチョウ・ヒシクイなどガンカモ科を中心に収集・作成。(2)本年度調査した遺跡は、香川県・下川津遺跡や沖縄県・大里城などである。また、縄文時代の低湿地遺跡として、石川県真脇遺跡の古環境分析をおこなった。海外調査研究では、韓国における骨格生産に関する資料調査をおこなった結果、愛媛県・北斎院遺跡出土の骨格生産の起源は3世紀から4世紀にかけての朝鮮半島の南部にその系譜をたどれることを発見した。

(3)平成11年2月7日、奈良国立文化財研究所において国際シンポジウム「考古科学的手法から見た木の文化、骨の文化」を開催し、カナダ・アメリカ・ニュージランド・台湾・日本における先史漁労、狩猟文化を中心に比較討議した。3.古年輪研究部門;(1)中国東北部の小興安嶺地域のカラマツ・チョウセンマツを標本採取できたが、年輪データにはカラマツが有効であることを突き止めた。そして、それが白頭山のマンシュウカラマツの年輪パターンと同じであり、東アジアにおけるもう一つのネットワークを組める見通しを得た。(2)現生標本の測定に関しては、木曽ヒノキで現在から約1000年のデータを抽出、青谷上寺地遺跡出土のスギからBC5CAD2Cの年輪データを集積し、山陰地方の貴重なデータを得た。箱根芦ノ湖の湖底から採取したヒノキ、スギからBC2C.AD11C.のデータを集積した。これは、東海、南関東地域の重要な年輪データとなる。さらには、正倉院宝物からも年輪データを集積することができた。4.保存科学研究部門(1)考古遺物の材質的研究では、青銅製遺物の材質の変遷を調査している。最近発見された「富本銭」はこれまでにない銅-アンチモン系であることを確認。ガラス製遺物では弥生時代の末からインド系のガラスが出現すること、時代の変遷とともに材質が多様化することを確認した。また、出土品の絹織物の劣化度を赤外吸収スペクトルでも判定できることを突き止めた。(2)遺跡の露出保存に際しては、土の強化材料と防黴剤の耐候性と施工法について、青森県・三内丸山遺跡や宮崎県・西都原古墳群をはじめとする各地の遺跡で試験施工し、調査検討をおこなっている。鉄製遺物の劣化と塩化物イオンの反応形態を確認。出土木材では乾燥に伴う激しい収縮現象が細胞内腔の閉塞のみならず細胞壁を構成する成分の分解溶脱にも起因することを確認。考古学にかかわるあらゆる分野について自然科学的な手法を応用する、考古科学の研究内容をレベルアップし、国際的に主導できる拠点形成をめざし、遺跡調査法研究部門、考古環境研究部門、古年輪研究部門、保存科学研究部門の4分野に関する研究を推進している。1.遺跡調査法研究部門:(1)奈良県・平城宮跡東大溝と長崎県・原の辻遺跡において、従来応用できていなかった低周波のアンテナを用いた実験測定をはじめて試み、より深い層位を明らかにできる可能性を得た。また、少なくとも4mの深さから情報を引き出せることを確認できた。(2)佐賀県・吉野ヶ里遺跡では、甕棺墓を少なくとも86基発見した。しかも、探査の結果を判読することによって、それらの甕棺が原形をとどめて空洞を保つ状態にあるものと、崩落して甕が壊れた状態にあるものを区別できることもわかった。(3)アルチナッツオ(Arconazzo)遺跡(イタリア)は、ローマ時代のトラヤヌス帝の別荘である。ここでは、イタリア文化財保存研究所との共同研究として、地中レーダーを中心とした探査を実施。その結果、従来全く知られていなかった浴場の遺構と思われる建造物の一部を検出した。2.考古環境研究部門:(1)遺跡土壌の微細形態学的研究;青森市・野木遺跡、八戸市・砂子遺跡の平安時代の畑土壌の分析から、肥料用に炭化物を利用したことが判明。(2)遺跡土壌に含まれる無機化学物質の研究;長崎県・原の辻遺跡の住居址床面の土壌と住居址の外の土壌に含まれるリン・カルシウム・カリウムの含有量に差があることが判明。
アンチセンスRNAによる真核生物の遺伝子形質発現調節の可能性

尿素合成に関与する酵素群の1つであるアルギニノコハク酸合成酵素(ASS)の異常はシトルリン血症を引き起こす。多くのシトルリン血症を解析する中で「量の異常型」(成人型、II型)という特異的な病態があることを見い出した。その特徴は、腎臓や培養皮膚線維芽細胞などでは正常量存在しているASSが肝臓でのみ欠損していること、しかし肝ASSmRNAは量・サイズ・構造等ほぼ正常であること、さらに塊状の異常な肝内ASS分布が認められることなどである。我々は50例に及ぶII型シトルリン血症を解析しているが、肝ASSのみ欠損する根本的な機構は未だ明らかでない。原核生物では翻訳段階で影響を与える調節因子としてその関与が知られているアンチセンスRNAがヒトなどの真核生物の遺伝子形質発現に関与するか否かを目的に、この特徴ある病態について解析を行った。SP6プロモーターでリボプローブを調整しII型シトルリン血症から抽出した肝RNAをドットブロット並びにノーザンブロットでアンチセンスRNAの存在の有無を検討したが、ポジティブな結果は得られなかった。恐らく別の機構により翻訳調節が行われているものと考えられる。最近PCRという新しい方法が開発されたので、この方法を用いてII型ASSmRNA及び遺伝子DNAの塩基配列を詳細に調べると同時に臓器固有(細胞固有)な発現に関与する調節因子を明らかにしてゆきたい。一方、II型シトルリン血症で異常な塊状を示す肝内ASS分布は、更に症例数を増やして検討した結果、予後が悪い症例に多く見られることが明らかになった。この異常な肝内ASS蛋白分布とASSmRNA分布を比較検討することはII型シトルリン血症の原因を明らかにする上で重要かつ興味あるところである。ラットを用いてin situ hybridization実験を行うことができたので今後肝切片の固定法を検討し、II型シトルリン血症に応用する。本研究の目的はヒトなど真核生物における遺伝子形質の臓器固有な発現機構に,原核生物ではその関与が認識されつつあるアンチセンスRNAが翻訳段階での調節に関わっているか否かを検討することにある.特に病態との関連においては重要である.アルギニノコハク酸合成酵素(ASS)を欠損するジトルリン血症の中のII型では腎臓や培養皮膚線維芽細胞などにおいて正常量存在するASSが肝臓でのみ欠損していること,しかしASSmRNAは量・サイズ・構造等ほぼ正常であること,塊状の異常な肝内ASS分布が認められることなど特異的な像を示すので,上記アンチセンスRNAによる翻訳段階での調節の可能性が考えられる.そこで,アンチセンスRNAとセンスRNA(mRNA)を区別するためのプローブを得るため, ASScDNA(pAS1)及びその制限酵素切断断片を各々にSP6プロモーターを持つベクターに入れた.正方向のものはSP64に,逆方向のものはSP65に入れ,センスRNAとアンチセンスRNAを産生するクローンを別々に単離することができた.しかし, pAS1はASSmRNAの5 ́末端領域を欠いているため,その領域を含む遺伝子DNAをクローニングすることにした. ASSには多数の偽遺伝子が存在するためスクリーニングには困難を要したが, pAS1に欠けている5 ́領域を含むクローンを得ることができた.往復式振とう培養機と微量高速冷却遠心機は上記の成果を挙げる上で大いに利用され非常に役立った.

一方,免疫組織化学的手法を用いてASSの肝内分布を更に症例数を増やし検討した.塊状分布を示す症例(解析25例中14例)は予後が悪い(12例死亡)ことを見い出した.肝内ASSmRNAの分布を検討する目的で〔^3H〕dCTPで標識したASScDNAをプローブにして,ラット肝を用いて固定法などの実験条件を確立するため予備実験を行っている.本研究の目的は、ヒトなど真核生物における遺伝子形質の臓器固有な発現機構に、原核生物ではその関与が認識されつつあるアンチセンスRNAが翻訳段階での調節に関わっているか否かを検討することにある。特にヒトの場合、これが病態を引き起こす要因となればその重要性は大である。我々はシトルリン血症(アルギニノコハク酸合成酵素:ASS欠損)の中で非常にユニークなII型を見い出している。このII型シトルリン血症は、腎臓や培養皮膚線維芽細胞などにおいて正常量存在するASSが肝臓でのみ欠損していること、しかし肝ASSmRNAは量・サイズ・構造等ほぼ正常であること、塊状の異常な肝内ASS分布が認められることなどの特異的な像を示す。そこでアンチセンスRNAによる翻訳段階での調節の可能性の有無を検討するため下記の実験を行った。アンチセンスRNAとセンスRNA(mRNA)を区別するためのプローブは昨年度SP6プロモーターを持つベクターを用いて準備した。II型シトルリン血症の肝臓からRNAを抽出し、上記リボプローブを使って、ドットブロット並びにノーザンブロット法でアンチセンスRNAの有無を検討した。しかしながら、II型シトルリン血症の肝臓にアンチセンスRNAが発現し翻訳レベルでの調節を行っているという確証は得られない結果であった。一方、II型シトルリン血症のもう1つの特徴である肝内ASSの異常分布をさらに追求することを目的に、ASSmRNAの分布をin situ hybridizationの手法を用いラットで予備実験を行った。ラット肝ASSmRNAの分布はASS蛋白の分布と一致した結果が得られた。この方法をヒトに応用していくとき、一番の問題点は肝細胞切片の固定である。今後更に固定法などの検討を加え、II型シトルリン血症の肝ASSmRNAの分布を明らかにしてゆきたい。
精子形成における多機能性ゲノム配列の網羅的探索と作用機序および生理的意義

本研究は精子形成メカニズムの全容解明に向けて「減数分裂過程での一過的な遺伝子活性化機構」を明らかにすることを目指すものである。特にdual promoter-enhancer(DPE)と呼ばれる、プロモーターとしてもエンハンサーとしても機能するゲノム配列が重要であると考えて、その網羅的な同定を行って解析する。これまでの研究期間で、マウス精巣から単離した精原細胞と一次精母細胞ならびにマウス精母細胞由来のGC-2spd(ts)細胞における網羅解析が終了してDPE候補配列の分布が明らかになり詳細なメカニズムの解析に入った。今年度は以下のような成果を得た。まず、昨年度までに絞り込んだH3K4me1とH3K4me3が両方とも存在する3つのゲノム領域について転写活性を調べたところ、1つのみがGC-2spd(ts)細胞でエンハンサー活性を示し、3つとも明確なプロモーター活性を示さなかった。このことから、これらの配列はDPEではないものも多く含まれると考えられる。そこで、RNA-seq解析の結果を用いて、転写されている遺伝子の上流500塩基以内に存在するH3K4me1ピークを検出した結果、精原細胞で526箇所、一次精母細胞で4496箇所、GC-2spd(ts)細胞で121箇所の配列を新たなDPE候補として同定した。これらのうち11個の配列について転写活性を調べたところ、すべてがプロモーター活性を示し、6つがエンハンサー活性を示した。このうち1つをゲノム編集によってGC-2spd(ts)細胞内で削ったところ、周辺の複数遺伝子の発現量低下を確認した。したがって、これらの配列がDPEであることが判明し、DPEは一次精母細胞においてその数を劇的に増加させる重要因子であることが明らかとなった。そして、すでに同定済みであるTcam1遺伝子座のDPEについて、コア配列と結合因子の1つを同定した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は精子形成メカニズムの解明に向けて残された重要な課題の1つ「減数分裂過程での一過的な遺伝子活性化機構」の解明を目指すものである。特にdual promoter-enhancer(DPE)という、プロモーターとしてもエンハンサーとしても機能するゲノム配列が減数分裂過程で重要な役割を担うと考えて、DPEを網羅的に同定して解析するものである。研究期間のうち最初の2年間では、マウス精巣から単離した精原細胞と一次精母細胞およびマウス精母細胞由来のGC-2spd培養細胞を用いて網羅的な解析を行い、一次精母細胞で一過的な遺伝子活性化に寄与するDPEを網羅的に同定する予定である。研究の1年目である今年度は以下のような成果を得た。1.GC-2spd培養細胞を用いたChIP-seq(chromatin immunoprecipitation-sequencing)解析を行った。検出したのは、プロモーターの指標であるヒストンH3K4モノメチル化とエンハンサーの指標であるヒストンH3K4トリメチル化であり、その両方が見られるゲノム配列をDPEとして同定できる。1年間でデータ解析までは終了しなかったが、まもなくこの細胞におけるDPEが明らかになる見込みとなっている。2.精原細胞と一次精母細胞については、予想よりも細胞数が必要であることが判明したため、今年度は細胞を集めることに専念した。マウス精巣から網羅的解析に耐えうるグレードの細胞が集まりつつある状況となっている。計画では最初の2年間で網羅的な解析を行うことになっており、用いる3種類のサンプル中1種類ではほぼ解析が終わった状態にあり、残る2種類のサンプルも順調に準備できているため。研究期間のうち最初の2年間では、マウス精巣から単離した精原細胞と一次精母細胞およびマウス精母細胞由来のGC-2spd培養細胞を用いて網羅的解析を行い、DPEを網羅的に同定する計画である。計画2年目の今年度は、以下のような成果を得た。今年度はマウス精巣から精原細胞と一次精母細胞をそれぞれ10の5乗個以上集めることに成功して、プロモーターとエンハンサーのエピジェネティックマークを同定するためのChIP-seq解析を行い、そのデータ分析も行った。その結果を1年目にすでに行っていた解析結果と合わせたところ、次のようなことがわかった。精原細胞、一次精母細胞、GC-2spd細胞におけるH3K4me1とH3K4me3のピーク数は、それぞれ13077箇所と2995箇所、9286箇所と3036箇所、47209箇所と34872箇所であった。このうちH3K4me1とH3K4me3のピークが重なるDPE候補配列は、それぞれのサンプルで231箇所、178箇所、12048箇所あることがわかった。この中で、我々がすでに同定して報告したTcam1遺伝子座が一次精母細胞のDPE候補配列として同定されたので、今回の結果は信頼性の高いものであると考えられる。当初計画どおり各細胞におけるDPE候補配列の同定をほぼ終えたため。

本研究は精子形成メカニズムの全容解明に向けて「減数分裂過程での一過的な遺伝子活性化機構」を明らかにすることを目指すものである。特にdual promoter-enhancer(DPE)と呼ばれる、プロモーターとしてもエンハンサーとしても機能するゲノム配列が重要であると考えて、その網羅的な同定を行って解析する。研究期間のうち最初の2年間で、マウス精巣から単離した精原細胞と一次精母細胞ならびにマウス精原細胞由来のGC-2spd(ts)細胞における網羅解析が終了し、多くのDPE候補配列が得られた。これを受けて計画3年目の今年度は以下のような成果が得られた。まず、得られたDPE候補配列にはいわゆるリピート配列と重なっているものが多かった。周辺の遺伝子構成などから、リピートになっていないもの2つと、リピートになっているもの2つを選んで詳細に解析することにした。このうちリピートになっていない1つは、当研究室で哺乳類初のDPEとして同定したTcam1遺伝子座の配列であった。Tcam1遺伝子座のDPEについては、すでにそのプロモーター活性とエンハンサー活性が明らかであるため、DPE活性を生み出す分子メカニズムの解明を目指した。具体的には274塩基のDPE配列の一部を削った一連のコンストラクトを作製して、転写調節活性を測定した。その結果、この中の60塩基の配列がプロモーター活性とエンハンサー活性の両方を生み出すコアである可能性が高いことが判明した。その他のDPE配列については、そのプロモーター活性とエンハンサー活性を測定するためのコンストラクトが完成した。計画通りに最初の2年間で得られた多数のDPE候補配列から絞込みを行ってその詳細な解析をスタートし、1つのDPEについてはコア配列を絞り込む段階まで進めることができたため。これまでの研究期間で、マウス精巣から単離した精原細胞と一次精母細胞ならびにマウス精母細胞由来のGC-2spd(ts)細胞における網羅解析が終了してDPE候補配列の分布が明らかになり詳細なメカニズムの解析に入った。今年度は以下のような成果を得た。まず、昨年度までに絞り込んだH3K4me1とH3K4me3が両方とも存在する3つのゲノム領域について転写活性を調べたところ、1つのみがGC-2spd(ts)細胞でエンハンサー活性を示し、3つとも明確なプロモーター活性を示さなかった。このことから、これらの配列はDPEではないものも多く含まれると考えられる。そこで、RNA-seq解析の結果を用いて、転写されている遺伝子の上流500塩基以内に存在するH3K4me1ピークを検出した結果、精原細胞で526箇所、一次精母細胞で4496箇所、GC-2spd(ts)細胞で121箇所の配列を新たなDPE候補として同定した。これらのうち11個の配列について転写活性を調べたところ、すべてがプロモーター活性を示し、6つがエンハンサー活性を示した。このうち1つをゲノム編集によってGC-2spd(ts)細胞内で削ったところ、周辺の複数遺伝子の発現量低下を確認した。