hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
GNAS遺伝子改変マウスを用いたIPMN発症機構の解析

IPMNではKRAS、GNAS、RNF43変異が重複して見られるが、それらの相互作用は明らかでない。我々は膵特異的変異GNAS発現マウスを樹立し、このマウスは表現型を示さないが、変異Krasとの二重変異マウスでは生後4-5週齢に膵腫瘍、著明な腹水によって死亡することを報告している。この膵腫瘍は病理学的、生化学的解析からヒトIPMNとよく似た特徴を有していたことから、GNASとKRAS遺伝子の異常が協調してヒトIPMNと類似した膵腫瘍を生じることが判明した。このマウスでは変異GNASが細胞内cAMPの上昇を招くが、本来誘導されるはずのアポトーシスが、変異Krasによりキャンセルされ、IPMNを発症することが示唆され、アポトーシスがIPMN発症を強く抑制していると考えられる。本研究課題ではCRISPR/Cas9システムを用いてRNF43遺伝子ノックアウトマウスを作製し、解析を行った。RNF43はE3ユビキチンリガーゼをコードしており、Wntシグナル伝達を負に調節する。RNF43の短縮型変異は、マイクロサテライト不安定性のある腫瘍によく見られることも知られている。RNF43 KOマウスはメンデルの法則に従って、生まれ、その後の成長にも野生型と比較して、差は認めなかった。また膵臓にも病変は認めなかった。つまりRNF43の単独欠損では膵腫瘍の発生には至らないことが判明した。RNF43の体細胞変異が大腸がんおよび子宮内膜がんの18%以上に見られることから(Nat Genet 46, 2014)、アゾキシメタン(AOM)とDSSをマウスに投与し(AOM/DSSマウス)、大腸がん発がんに差が見られるか検討を行った結果、腫瘍の増大を認め、RNF43が大腸がんの進展を抑制する働きがあることが判明した。膵管内乳頭粘液性腫瘍(Intraductal Papillary Mucinous Neoplasm; IPMN)ではKRAS、GNAS、RNF43遺伝子変異が重複して見られるが、それらの相互作用は明らかでない。我々は膵特異的変異GNAS発現マウスを樹立し、このマウスが変異Krasと協調してヒトIPMNと類似した膵腫瘍を生じることを証明している。本研究では、変異GNAS/KrasマウスによるIPMN発症メカニズム、IPMN発症過程におけるアポトーシスの役割、さらに、変異GNAS、KRASに新規X遺伝子-/-、p53-/-を加えた多重変異マウス、細胞の表現型と信号伝達経路の役割を、in vivo, in vitroの両面から解明しようと試みた。変異GNAS;p53-/-マウスはほぼ正常で、病理学的検索では、変異GNASマウスと顕著な違いは(2ヶ月齢までは)見られなかった。しかし変異GNAS; X-/-マウスでは、膵臓が全体的に腫大し、病理学的解析では、膵内に拡張した膵管の過形成が確認され、IPMNの前状態を表している可能性が示唆された。今後さらに細胞内cAMPの濃度、アポトーシス細胞の数、等で変異GNAS/Krasマウスとの比較を行う予定である。また、腫瘍の形成時期に関して、変異GNAS/Kras;Ptf1a-creマウスは生後すぐから腫瘍形成が見られ、4-6週齢において、著名な腹水と急性膵炎によって死亡するが、その他のマウスに関してはIPMNの他臓器への浸潤、転移能を見るため、8週から1年程度の長期間の観察が必要であり、時間を要している。本研究課題では、これらの遺伝子が協調してIPMN発症にどのような役割をするのかを明らかにすることであるが、RNF43についてはまだ未解明であるため、特にRNF43の役割について、RNF43欠損マウスを樹立し、このマウスについての研究を行った。まず、この変異マウスでは、形態的に明らかな異常が見られないことを確認した。次に、我々が樹立した膵特異的変異GNASマウスおよび膵特異的変異KRASマウスとの二重変異マウスを作製し、現在解析中である。また、RNF43はIPMNだけでなく、大腸癌でも変異が確認されている。この機能を明らかにするため、上記の欠損マウスで、大腸癌モデルを作成し、解析を行った結果、大腸癌の発生が促進されることを見いだし、その機能解析を継続中である。遺伝子改変マウスの作出で、二重、三重変異マウスとなるため、計画段階でも時間を要することは予想できていた。

本研究課題ではCRISPR/Cas9システムを用いてRNF43遺伝子ノックアウトマウスを作製し、解析を行った。RNF43はE3ユビキチンリガーゼをコードしており、Wntシグナル伝達を負に調節する。RNF43の短縮型変異は、マイクロサテライト不安定性のある腫瘍によく見られることも知られている。RNF43 KOマウスはメンデルの法則に従って、生まれ、その後の成長にも野生型と比較して、差は認めなかった。また膵臓にも病変は認めなかった。つまりRNF43の単独欠損では膵腫瘍の発生には至らないことが判明した。RNF43の体細胞変異が大腸がんおよび子宮内膜がんの18%以上に見られることから(Nat Genet 46, 2014)、アゾキシメタン(AOM)とDSSをマウスに投与し(AOM/DSSマウス)、大腸がん発がんに差が見られるか検討を行った結果、腫瘍の増大を認め、RNF43が大腸がんの進展を抑制する働きがあることが判明した。様々な遺伝子改変マウス、培養細胞を用いて、その表現型と信号伝達経路がIPMN発症にどのように影響を及ぼすのか、in vivo, in vitroの両面から解明する。1)IPMN発症過程におけるアポトーシスの役割・・・変異GNASマウスにおいて、p53及びBax/Bak遺伝子を欠失させ、アポトーシスを抑制した場合、細胞内cAMP/PKA濃度の上昇、IPMNが促進されるのかを明らかにする。また変異KRASによるアポトーシス抑制効果の検討を行う。2) IPMN発症とRnf43に関する研究・・・X遺伝子変異がIPMNに特異的な遺伝子異常であるのか、また発症メカニズムを明らかにするため、X遺伝子-/-と変異GNAS及び変異KRASマウスを用いて、その場合のKRAS、GNAS、X遺伝子変異の相互作用を明らかにする。遺伝子改変マウスの長期生存における発がん率を、経時的に観察していく。pH測定機器の購入が不可欠であったが、本年度の購入額では足りなかったため。マウス維持の日程がやや遅れたため、次年度に新たにマウスが必要となる。消耗品、マウス購入費等に使用を予定している。試薬調整用の測定機器を購入するため。
擬アノソフ流のL関数と3次元多様体のイデール理論の研究

「数論的位相幾何学」の目的は,素数と結び目,代数体と3次元多様体の類似性を体系化し,色々な予想や手法を次々に見出だせるような自然な地平を切り拓くことである.我々は過去に,3次元多様体内の可算無限絡み目において,局所理論を束ねて大域理論を記述する「イデール的類体論」の類似を構成した.数論には代数側と解析側があり,過去の研究は代数側に当たる.本研究の目的は,擬Anosov流の閉軌道族の上でイデール理論と整合する解析数論を構成し,類似性の適用範囲を大きく拡げることである.付随して位相不変量の副有限剛性の問題を逐次考察し,低次元トポロジーへの応用や,数論側へのフィードバックに資する.「数論的位相幾何学」の目的は,素数と結び目,代数体と3次元多様体の類似性を体系化し,色々な予想や手法を次々に見出だせるような自然な地平を切り拓くことである.我々は過去に,3次元多様体内の可算無限絡み目において,局所理論を束ねて大域理論を記述する「イデール的類体論」の類似を構成した.数論には代数側と解析側があり,過去の研究は代数側に当たる.本研究の目的は,擬Anosov流の閉軌道族の上でイデール理論と整合する解析数論を構成し,類似性の適用範囲を大きく拡げることである.付随して位相不変量の副有限剛性の問題を逐次考察し,低次元トポロジーへの応用や,数論側へのフィードバックに資する.
播磨灘の栄養塩異変の科学的原因解明と陸圏からの栄養塩負荷量変動との関連

播磨灘に流入する河川流量は兵庫県播磨域(本州側)からの流入量が多く、海域におよぼす影響が強いことが定量的に示された。とくに、出水時の短期的な河川流出による影響が大きく、播磨灘の海域環境を考察する際には河川流量の空間偏差や出水時の短期的な河川流出の影響を考慮することの重要性が示された。これより、河川の水質・流量の変化・変動が播磨灘の栄養塩異変の一因である可能性が示唆された。海域の環境変化は陸域からの淡水流入が大きく関係している。瀬戸内海では漁獲量の低下やノリの色落ちなどの環境問題が多く発生しており、原因の究明が求められている。研究の結果、2002年と2003年における播磨灘に流入する河川流量のうち、兵庫県播磨域からの流入量が流域圏全体の85%をしめる結果が得られた。また、1年間に流入する総流量のうち出水時に流入する割合は出水日数を30日とした場合に、35-60%を占めていることがわかった。また、播磨灘の海域水質は出水直後に播磨域側では、ケイ素、リン酸、硝酸は約11倍に増加し、河川出水の影響を強く受けることが明らかとなった。また、平水時の栄養塩のモル比について河川と海域で比較を行った結果、海域の全地点のN/Pの平均値は6.6、河川のN/Pの平均値は37であり、海域では窒素、河川ではリンが植物プランクトンの増殖に対して制限因子になっていることが分かった。一方、出水直後の播磨灘では陸近くでN/Pが76に増加し、河川水の流入により海域の窒素とリンの比率が変化することが分かった。播磨灘に流入するCOD負荷量をC-Q式により推定した結果、1年間の出水日数を30とした場合、2002年においては年間総負荷量の約40%、2003年においては約70%を占める結果が得られ、出水時に海域に流入する負荷量が多いことが分かった。以上より、播磨灘水質には河川からの短期的な出水の影響が大きいことが明らかとなった。流域の各場所から発生する負荷量と流出量を考慮した河川水質の時間変動を推定することは、河川から海域への物質流入の非定常特性を理解する上で重要であり、降雨による海域への短期的な栄養供給課程や供給量を推定する上で重要である。海域の環境変化は陸域からの淡水流入が大きく関係しており、大阪湾を除く瀬戸内海では漁獲量の低下やノリの色落ちなどの環境問題が多く発生しており、原因の究明が求められている。本研究では、流域情報解析として、河川流域を斜面グリッドおよび河道グリッドによりメッシュ化し、流域地形モデルを作成し、さらに、負荷量解析、汚濁負荷流出解析、水文流出解析、河川水質解析を行う分布型流域水質モデルを構築した。本モデルの大きな特徴は、点源および面源から発生する負荷を、晴天時、雨天時、逓減時に分けて、負荷流出解析を行うモデルを導入した点にある。具体的には、対象域を一つのボックスとみなし、点源および面源から発生した負荷が流出する過程を解くことにより、ボックス内で河川に流入する負荷量の時間変化を算出した。晴天時には、点源による発生負荷量のほとんどが沈降・堆積し、面源による発生負荷量はすべて堆積するとした。一方、雨天時には、点源および面源による堆積物が掃流されるとした。流量逓減期には、晴天時と雨天時の半分の量が堆積・掃流されるとした。最後に、綾川に流入する時間毎の負荷量の合計値を、各地点に流入する負荷量の割合に基づいて分配することにより、対象域における汚濁負荷量の各地点の時間変化を算出した。上記の分布型流域水質モデルを用いて、香川県の綾川と対象とした水質シミュレーションを行った結果、各地点におけるCOD濃度の時間変化を推定することができた。
染色体工学を用いた精神疾患モデルマウスの統合的解析

最近、大規模な発達障害患者のゲノムDNAデータを用いた遺伝学的解析により『15q25』の染色体領域の欠失が報告された.本染色体内の欠失領域は600キロベースを超える巨大なものであり,しばしば疾患との相関が報告される一塩基置換とは異なる.我々は,染色体レベルの変異と発達障害発症との関係を明らかにするため,本染色体領域を欠失した細胞および動物モデル作製を試みた.本期間内において,染色体工学的手法による染色体操作により,ヒト染色体欠失領域を忠実に反映したマウスES細胞を樹立した.これまで染色体改変ES細胞では際立った表現型は認められない.一方,本領域の染色体改変マウスモデルの作製も同時に進めている.本研究は,発達障害患者の大規模ゲノムデータから得られた,『発達障害と有意な相関が認められた新規CNV』を対象に,患者の染色体レベルの変異(欠失)を反映させた胚性幹(ES)細胞および発達障害モデル動物の作製を目的とした.ヒト患者のCNVを反映させたモデル動物の作製は,その技術的難解さから,成功例は未だ数例にとどまっている.しかし,CNVと精神疾患の関係は遺伝学的解析から近年報告が急増しているため,ヒトCNVを反映させた動物モデルの作製は『精神疾患の病態生理の理解』,『創薬』といった面で必須と言える.本研究で対象とするヒト15番染色体は,500キロベースを超える巨大な領域であり,7つの遺伝子を含む.領域に含まれる7遺伝子のうち3つの遺伝子は現在まで機能が未知,また5遺伝子についてはノックアウトマウスが作製されておらず個体レベルでの機能も不明である.ゲノム情報による解析を進めた結果,本研究が対象とする(ヒト)染色体領域は,マウスの7番染色体領域に高度に保存されている事が明らかとなった.なお実際に,ターゲットとしたマウス染色体の改変操作には,染色体工学を適用した.本手法は,マウスES細胞を用い,対象とする染色体領域両末端にLoxP配列を相同組み換え法により挿入,その後,Creタンパク質を強制発現する事によりターゲット染色体領域を除く技術である.今回,本技術を適用し,ターゲットのマウス7番染色体領域両末端にLoxP配列を挿入,Creタンパク質の発現によりターゲット染色体領域を欠損するES細胞を樹立した.これまで染色体改変ES細胞に際立った表現型は認められないが,さらなる解析をES細胞で進めるとともに,染色体改変マウスの作製も進める予定である.最近、大規模な発達障害患者のゲノムDNAデータを用いた遺伝学的解析により『15q25』の染色体領域の欠失が報告された.本染色体内の欠失領域は600キロベースを超える巨大なものであり,しばしば疾患との相関が報告される一塩基置換とは異なる.我々は,染色体レベルの変異と発達障害発症との関係を明らかにするため,本染色体領域を欠失した細胞および動物モデル作製を試みた.本期間内において,染色体工学的手法による染色体操作により,ヒト染色体欠失領域を忠実に反映したマウスES細胞を樹立した.これまで染色体改変ES細胞では際立った表現型は認められない.一方,本領域の染色体改変マウスモデルの作製も同時に進めている.近年,単一遺伝子の変異のみならず,染色体レベルでの重複・欠損が精神疾患をはじめとする各種疾患に認められている.特に自閉症,統合失調症といった精神疾患では,特定の染色体領域と疾患の間に有意な相関が報告されている.このため,精神疾患のさらなる解析には,これまで報告されたヒト患者と同様の染色体異常を有するモデル動物が必須と言える.この事から,本研究では,通常の遺伝子ターゲティング法を改良した染色体工学(Chromosome Engineering)を適用,遺伝的に精神疾患との相関が認められたヒト染色体領域を反映させたモデル動物を作製し,精神疾患発症のメカニズムを解析する事を目的とする.なお,染色体工学は,染色体レベルでの遺伝子改変操作を可能とする唯一の技術である.本研究が対象とする染色体は,小児発達障害(神経疾患,自閉症)患者ゲノムDNAから新規に見出された15q25.2-25.3の欠損である.初めに,バイオインフォマティクスによる解析の結果,本領域はヒト,マウス間で高度に保存された領域である事が分かった.この事は,本染色体領域がヒト型疾患モデルとして妥当な領域である可能性を示唆している.バイオインフォマティクス解析の後,ターゲット染色体領域を除くため,両末端にloxP配列を2段階の遺伝子ターゲティング法によりマウスES細胞にそれぞれ挿入,両者の挿入をPCR/シークエンス/サザンブロット法により確認,その後CreリコンビネースをES細胞に発現する事でターゲット染色体領域を除いた.当初の予定では,本期間中に2種類のターゲティングベクターのデザイン・構築,そして2段階の遺伝子ターゲティング,さらにはCreによるターゲット染色体領域の欠損を予定していたため,本年度は予定通りに進んだと言える.現在,モデルマウス作製に着手したところである.当初の予定(平成24年度の計画)は以下の通りであった.1.ターゲット染色体領域を破壊するため、ターゲット領域の両端に挿入するためのターゲティングベクターを2種類作製する.2.マウスES細胞を用い,ターゲット染色体領域の両端にloxP配列を含むターゲティングベクターをジーンターゲティング法によりそれぞれ挿入,両者の正確な組換えが確認できた後,Creタンパク質をマウスES細胞に導入する事によりターゲット染色体領域の破壊を試みる.Creタンパク質の細胞内への導入後には,実際ターゲット染色体領域が破壊されたか,PCR法/シークエンス/定量的PCR法/サザンブロット法により解析を行う.

3.ターゲットとする染色体領域が欠損したES細胞が得られた場合,本ES細胞をマウス受精卵に導入し,遺伝子改変マウス作製を開始する.当初予定していたこれらの事項は,予定通り平成24年度内に完了し,ターゲットとなる染色体領域を破壊したES細胞を得た.実際にターゲットとなる染色体領域が破壊されているかは,4種類の異なる方法,PCR,定量的PCR,サザンブロッティング,シークエンスにより確認を行った.現在この変異ES細胞をマウスの受精卵に導入し,遺伝子改変マウス作製を開始したところである.本研究は当初の予定通り,ターゲット染色体領域を改変した変異ES細胞を期間内に得る事が出来た.現在,遺伝子改変マウスを得るために,マウス受精卵へのインジェクションを試みている最中である.一方,本ES細胞は染色体工学を実施する上で,2回に渡る遺伝子操作(ジーンターゲティング),そしてCreリコンビネースの強制発現,さらには通常の遺伝子ターゲティング法を大きく上回る細胞継代数であるため,遺伝子改変マウスを得るための分化能を保持しているかは不明である.現在まで,変異ES細胞の貢献度が高いとみられるキメラマウスは得られていない.しかし,100個以上の変異ES細胞のラインを得ているため,順次形態の良いES細胞をセレクションし,マウス受精卵へのインジェクションを継続する予定である.平成25年度秋頃までには遺伝子改変マウスを得たいと考えている.一方,本手法は,必ずしもターゲット染色体を欠損した遺伝子改変マウスが得られるとは限らない.この場合,既に得られている15q25.2-25.3領域を欠損した変異ES細胞を用い,in vitroの疾患モデルとして神経幹細胞,または神経細胞への分化といった特定細胞における機能解析を行う予定である.「該当なし」
組体操を発達学的・体力学的観点から再評価する

本研究は,組体操を「不安定な相手の身体とのかかわり合いの中で姿勢を維持する活動」と捉え,発達学的・体力学的観点から評価し,教材的価値を多面的に捉え直すことで,組体操の多様な行い方と評価観点を新たに提示することを目的とする.当該年度は,当初,組体操の姿勢制御にかかわる感覚統合機能に対するトレーニング効果およびコアトレーニングとしての効果を検討するために,健康な大学生を対象者とするトレーニング実験を実施する予定であった.長期間の介入試験を実施するため,予備実験により慎重に実験設定を検討したが,時間を要し,実験実施に至らなかった.このため,研究期間の延長を申請した.上記のように,実験により新たな知見を導き出すには至らなかったものの,これまでの研究成果を次のとおり公表した.板谷厚:組体操遊びが幼児の閉眼片脚立位保持時間に及ぼす影響.日本発育発達学会第17回大会予稿集,p.68,大妻女子大学,2019.3.【概要】組体操の多様な行い方のひとつとして運動遊びプログラム「ぼうけんくみたいそう」を開発した.「ぼうけんくみたいそう」は,ごっこ遊びの要素を強く打ち出したストーリー仕立ての組体操であった.組体操の効果を評価するために,保育所の年長児を対象にバランスの測定を実施した.プログラムのはじめと終わりに木のポーズ(閉眼片足立ち)を30秒間行い,木のポーズを最大で何秒間維持できたかを測定した.対応のあるt検定の結果,木のポーズ持続時間は終わりではじめよりも高い値を示した(はじめ: 8.17 ±8.33 s,終わり: 11.07 ±9.01 s, P = 0.022).したがって,「ぼうけんくみたいそう」は,幼児の閉眼片足立ち時間を即時的に向上させると考えられる.本年度実施予定の研究課題は被験者に相当の負担を強いる運動介入試験を要する.このため,慎重に予備実験を進めてきたが,介入運動および介入前後の測定条件の設定に想定以上の時間を要している.これにより,本年度中の介入試験実施が困難な状況になってしまったので補助事業期間の延長を申請した.組体操の姿勢制御にかかわる感覚統合機能に対するトレーニング効果およびコアトレーニングとしての効果を検討する.このために,健康な大学生を対象者として,トレーニング群(トレーニング運動として組体操を行う)および対照群(トレーニングなし)を設定し,介入試験を実施する.対象者は三人一組で実験に参加する.実験はpre測定,トレーニング介入(対照群はトレーニング介入なし),post測定およびトレーニング効果が保持されるかどうかを確認するための保持測定の順に実施する.さらに,小学校で組体操プログラムを実施し(児童を対象としたプログラムの実施が困難であれば,小学校の教員と指導案の検討会を開催し),組体操の発達学的・体力学的観点を取り入れた行い方と評価観点について議論する.本研究は,組体操を「不安定な相手の身体とのかかわり合いの中で姿勢を維持する活動」と捉え,発達学的・体力学的観点から評価し,教材的価値を多面的に捉え直すことで,組体操の多様な行い方と評価観点を新たに提示することを目的とする.当該年度は,組体操の運動効果として,姿勢制御にかかわる感覚統合機能の発達促進に着目し,組体操の姿勢制御にかかわる感覚統合機能に対する影響を検討した.特に,視覚入力に対する依存が低下することを実証することを試みた.具体的には,三人で行う簡単な組体操を実施し,その前後に開眼条件(EO)と閉眼条件(EC)における静止立位動揺を調査することで,立位制御における視覚入力に対する依存性が低下するかどうか検討した.若年成人女性15名を対象とした.対象者は3人一組で実験に参加した.まず各参加者はEOとECで30秒間の静止立位をそれぞれ2回ずつ実施し,足圧中心(COP)軌跡を記録した(pre).その後,3人組で行う組体操(ピラミッド,サボテンおよび扇)を,各対象者がすべての役割を経験するよう3回ずつ実施した.休憩の後,再び静止立位を実施した(post).COPの動揺速度を算出し,これらからロンベルグ率(EC / EO)を求めた.反復測定分散分析の結果,動揺速度において視覚条件×測定時間の交互作用に有意性が認められ,ECのみpostで低下した(p = .009).対応のあるt検定の結果,ロンベルグ率はpostでpreより低下した(p = .018).これらの結果から,組体操は立位制御における視覚入力に対する依存性を低下させ,その他の感覚入力に対する依存性を高めることが示唆される.したがって,組体操は,接している相手の身体の動きを感じながら姿勢を調節する,すなわち,体性感覚入力を積極的に用いる活動であり,子ども達の感覚統合機能の発達を促すと考えられる.本研究は,組体操を「不安定な相手の身体とのかかわり合いの中で姿勢を維持する活動」と捉え,発達学的・体力学的観点から評価し,教材的価値を多面的に捉え直すことで,組体操の多様な行い方と評価観点を新たに提示することを目的としている.当該年度は,組体操の姿勢制御にかかわる感覚統合機能に対する即時効果の検討を計画していた.現在まで,成人を対象に,簡単な組体操によって,視覚入力以外の感覚入力,特に体性感覚入力により依存した姿勢制御に変化することを実証することに成功している.この結果から,姿勢制御にかかわる感覚統合機能の発達促進に効果的であることが示唆される.

したがって,研究はおおむね順調に進展しているといえる.本研究は,組体操を「不安定な相手の身体とのかかわり合いの中で姿勢を維持する活動」と捉え,発達学的・体力学的観点から評価し,教材的価値を多面的に捉え直すことで,組体操の多様な行い方と評価観点を新たに提示することを目的とする.当該年度は,当初,組体操の姿勢制御にかかわる感覚統合機能に対するトレーニング効果およびコアトレーニングとしての効果を検討するために,健康な大学生を対象者とするトレーニング実験を実施する予定であった.しかし,旭川市立保育所の要請で幼児対象の運動遊びを実施する機会に恵まれたこともあり,三年目に予定していた組体操の多様な行い方と評価観点の提示についての研究を前倒しして実施した.組体操の多様な行い方のひとつとして運動遊びプログラム「ぼうけんくみたいそう」を開発した.「ぼうけんくみたいそう」は,ごっこ遊びの要素を強く打ち出したストーリー仕立ての組体操であった.物語の進行とともに,ひとりで行うポーズ(9種類)から2人組(5種類),3人組(2種類)へと段階的に複雑になるよう全16種類の組体操による演技を構成した.また,イメージをふくらませるために効果音や音楽を適宜用いた.組体操の効果を評価するために,保育所の年長児を対象にバランスの測定を実施した.プログラムのはじめと終わりに木のポーズ(閉眼片足立ち)を30秒間行い,その様子をビデオ撮影した.動画から30秒間の制限時間内に木のポーズを最大で何秒間維持できたかを測定した.対応のあるt検定の結果,木のポーズ持続時間は終わりではじめよりも高い値を示した(はじめ: 8.17 ±8.33 s,終わり: 11.07 ±9.01 s, P = 0.022).したがって,「ぼうけんくみたいそう」は,幼児の閉眼片足立ち時間を即時的に向上させると考えられる.また,閉眼片足立ち時間は,組体操の効果を評価する方法として有用である.本研究は,組体操を「不安定な相手の身体とのかかわり合いの中で姿勢を維持する活動」と捉え,発達学的・体力学的観点から評価し,教材的価値を多面的に捉え直すことで,組体操の多様な行い方と評価観点を新たに提示することを目的とする.当該年度は,当初,組体操の姿勢制御にかかわる感覚統合機能に対するトレーニング効果およびコアトレーニングとしての効果を検討するために,健康な大学生を対象者とするトレーニング実験を実施する予定であった.しかし,最終年度に予定していた組体操の多様な行い方と評価観点の提示についての研究を前倒しして実施した.予定変更の理由は,効果的で安全性が高いプログラムの開発を先行させないと学校現場での検証作業に支障が出る可能性があったからである.最終年度の研究課題である組体操の多様な行い方と評価観点の提示についての研究のために小学校で授業を実施したい旨を昨年度に打診したところ,組体操が現在の学習指導要領に記載されていないことや組体操事故が報道され,保護者が安全性に不安を抱えているため,協力は困難との返答であった.プログラムを開発し,効果測定と幼児でも問題なく実施できるほどの安全性を確認することで,学校現場の協力を得るきっかけとしたり,学校現場での検証作業の代替としたりできると考え,研究課題の前倒し実施を決断した.上記したように研究課題の前倒しが生じた.しかし,旭川市立保育所の協力のもと,組体操プログラムを開発し,効果検証と安全性の確認を行うことができた.
二次元NMR法による生体膜と薬物との相互作用に関する研究

二次元(2D)NMR法を生体膜と薬物との相互作用研究へ応用した。1.二次元のNOE(NOESY)測定に際してはFIDにかけるウィンドウ関数について充分な配慮が必要であることが解った。この関数処理についてローレンツ-ガウス変換処理[g(t)=exp(t/RE)*exp(-t^2/AF^2)]を検討した結果、RE及びAF値を適当に選ぶことによって得られるサインベル様の関数グラフの中心(山)をFIDの取り込み初期の方向へずらす必要があると結論した。この関数処理の応用例として局所麻酔剤ジブカインを含んだレシチンベシクル重水溶液についてNOESYを測定した。その結果、ジブカインの芳香環プロトンとレシチンのコリンメチルプロトンのうち二重層の外側に存在するレシチンのそれとの間にNOEクロスピークが観測できた。このことはジブカインは二重層の内側には浸透して行かないことを意味する。この原因は小さなベシクル二重層の内側は外側に比べてPC分子が密に配列しているためかさばった分子構造を持つジブカインが安定に存在出来ない為と考える。2.二次元法は、一次元NOE差スペクトル法と比較して、イ)分子間NOEがほどんど検出されない、ロ)分子内NOEは、一次元法よりもはっきりと観測することが出来る。イ)は、分子間NOEが分子内NOEに比較してはるかに小さいこと及び薬物と膜との相互作用系に於ける^1HーNMRスペクトルの線幅がブロードであり、等高線表示法では微少なNOE交差ピークを検出出来ない為と考える。一方、ロ)は、二次元NMR法の本来の利点、即ち特定のピークを照射する場合の近傍のピークへの照射漏れの心配が無い、重なり合ったNMRピークの中からでもNOE相関ピークを拾い上げる事が出来るといった特長が現われた為と考える。3.緩衝液を含んだレシチンベシクルとジブカイン、テトラカインとの相互作用様式は緩衝液を含まない場合とで異なる。ジブカインはコンフォメーションが、テトラカインの場合膜中の存在部位の異なるものが検出出来た。本年度の研究実施計画の内"パルス系列の整備"については先ず初めにNOE相関二次元NMR法(NOESY)についてVarian XL-300NMR分光器に標準装備されているVER.5.2及び61cのソフトウェア内のNOESYのパルス系列及びそれによって得られる二次元NMRの等高線表示に必要なウィンドウ関数処理について検討した。その結果Ver.5.2に組込みのパルス系列はホモスポイルパルスを必要とする難点があり、またVer.6.1cのそれは、Jクロスピークを消去するためにミキシング時間τmを一定の範囲で変化さすルーチンを追加する必要があった。一方、関数処理についてはVarian社のソフトウェアに標準組込みされてあるローレンツ-ガウス変換処理[g(t)=exp(t/RE)*exp(-【t^2】/【AF^2】)]を検討した結果、標準組込みのコマンドPSEUDOによって得られるRE及びAF値は本研究におけるようなブロードな【^1H】NMRシグナルの処理には全く不適当であることが解った。ちなみに、同様にブロードなシグナルを与えるタンパク質の【^1H】NMRにおいては既にサインベル関数が最も良いとされている。そのでサインベル関数処理が可能なBruker社のAM400NMR分光器にて測定及び関数計算を行った結果ほぼ良好な等高線表示の二次元NMRスペクトルを得た。

サインベル関数処理ができないVarian社の装置ではPSBUDOコマンドによって得られるサインベル様の関数グラフの中心(山)をRIDの取り込み初期の方向へずらす必要があると結論した。この関数処理の応用例として局所麻酔剤ジブカインを含んだレシチンベシクル重水溶液についてNOESYを測定した。その結果、ジブカインの芳香環プロトンとレシチンのコリンメチルプロトンのうち二重層の外側に存在するレシチンのそれとの間にNOEクロスピークが観測できた。このことはジブカインは二重層の内側には浸透して行かないことを意味する。コリンメチルプロトンの化学シフト変化もNOEのデータを支持した。此の原因を膜に結合したジブカイン分子の立体構造にあると結論した。1.位相表示を前提とした測定法(Pure Absorption Phase 2D-NOE)による薬物を含んだレシチンベシクル溶液の二次元NMRスペクトル図に対するウィンドウ関数についてはサインベル関数処理の出来ない分光器においては絶対値表示法の場合と同様にローレンツーガウス変換関数のグラフの中心をFIDの取り込み初期の方向へずらす必要があると結論された.このことはt及びt_2軸方向への長い裾を引いた隆起(ridge)はNMRシグナルの分散形成分のみに由来するものではなく試料溶液のNMRシグナルが本来ブロードであることが本質的に影響していることを意味する.この解釈はレシチンベシクル溶液の^1H-NMRスペクトル中においてスピン拡散が観測できるという先に得られた結論(Kuroda, Y.et at.J.Am.Chem.Soc.1984,106,1-6)を考慮すれば妥当なものである.2.中性溶液に於ける薬物-レシチンベシクル相互作用に関して知見を得る為に緩衝液として酢酸-酢酸ソーダ混液を使用してNMRスペクトルを測定した.まず始めにこのBufferそのものの影響を知るためにpH4程度の酸性溶液にてテトラカイン,及びジブカインを溶解せしめたレシチンベシクル溶液を作成しNMRスペクトルを測定した結果テトラカインの場合,テトラカインの主成分によるNMRシグナル以外に2種類の少量成分によるNMRシグナルが観測された.これらはテトラカインの運動状態あるいは存在状態の違いを反映していると解釈出来, Boulanger等(Boulanger,Y.et al.Can.J.Biochem.1980,58,986-995)及びKelusky等(Kelusky,E.C.et al.Can.J.Biochem.Cell.Biol.1984, 62,172-178)による^2H-NMRの結果と対比して興味あるNMRスペクトルである.ジブカインに関してやはりpH4程度に於てBufferの有無,さらにpH4と中性溶液とでは,ジブカインのButoxy基のコンフォメーションが異なることが解った.1.薬物として局所麻酔剤であるテトラカイン、ジブカインの塩酸塩をそれぞれ取り込ませたレシチンベシクル溶液に関して(1)多量子遷移を利用した^1Hー^<15>Nシフト相関二次元NMRの測定はコリンメチル基プロトンとコリン基窒素とのスピン結合定数が小さい為現在スペクトルの観測がうまく出来ない状況にある。
貞観地震による津波災害の定量的評価

本研究では,砂の堆積現象が最も広範囲に現われた869年貞観仙台沖地震津波による堆積物運搬の様式を粒度組成及び堆積相から類推し,津波による流れの水理学的実体を理解するための初期条件を求める堆積学的検討を行った。また,静岡県南伊豆町入間において東海地震津波によって形成された丘陵状の集積土砂堆積物も研究対象とし,堆積物運搬過程の検討を行った。申請設備備品であるレーザー回折式流度分析装置による粒子組成解析結果からは,貞観津波堆積層を構成する砂層の明瞭な陸側細粒化現象が検出された。この現象は堆積物の移動と集積を試行する水槽実験装置の再現結果と調和しており,堆積層の細粒化様式が溯上津波のエネルギー散逸を反映する重要な基準として扱い得る可能性が示されるとともに,水理学的結果と堆積作用の理解から,我が国において特に顕著な災害を及ぼした貞観地震津波・東海地震津波による破局的な流れの堆積学的作用が明らかにされた。この基準は,海岸とその後背平野の成り立ちを理論的に理解する自然地理的条件を与え,更に海岸平野に於ける都市・産業基盤整備に不可欠の知識を与えるものと期待される。また,タイ南西部海域において採取した堆積物試料を用いて古生物学的解析を行い,津波前後での底生有孔虫群集の変化を明らかにするとともに,引き波によって生じた混濁流が海底に津波の痕跡を残しうることを示した。したがって,海域における堆積物掘削により,津波発生の履歴を知ることが出来る。平成19年7月にイタリア・Perugiaで開催されたIUGG総会において,これらの結果を津波災害と堆積現象の実例として紹介し,注目を集めた。これまでの国内外の津波災害研究では,発生津波に関わる観測結果と事後の災害調査に主眼をおいた解析により進められて来た。津波災害の最も深刻な事態は、津波による物質の移動に伴って発生する。しかしながら、平野を埋め立てる広範な砂の堆積や丘陵をなす膨大な土砂の集積をもたらす水理学的・堆積学的機構に関しては多くが不明であり,科学的な説明は得られていない。強力な流れによる物質の移動機構の解明には,運搬される物質をミクロ的(粒子表面観察,粒子形状測定,粒度測定)及びマクロ的(堆積相解析,水槽実験,数値実験)に検討しなくてはならない。本研究では、砂の堆積現象が最も広範囲に現われた869年貞観仙台沖地震津波による堆積物運搬の様式を粒度組成及び堆積相から類推し,津波による流れの水理学的実体を理解するための初期条件を求める堆積学的検討を行っている。併せて、水槽実験により分級現象と削打現象を再現し,堆積情報と媒質流体の速度および密度の関係の数値的な対応を試みている。これらの堆積学的・水理学的結果に基づき,災害をもたらす劇的な堆積物運搬の現象が次第に明らかになりつつある。申請設備備品であるレーザー回折式粒度分析装置による粒子組成解析結果からは,貞観津波堆積層を構成する砂層の明瞭な陸側細粒化現象が検出された。この現象は堆積物の移動と集積を試行する水槽実験装置の再現結果と調和しており,堆積層の細粒化様式が溯上津波のエネルギー散逸を反映する重要な基準として扱い得る可能性が明らかとなった。この基準は,海岸とその後背平野の成り立ちを理論的に理解する自然地理的条件を与え、更に海岸平野に於ける都市・産業基盤整備に不可欠の知識を与えるものと期待される。平成17年度に行ったワシントン大学とイスタンブール大学での講義・講演では、これらの結果を津波災害の実態の解釈に適応して紹介し、注目を集めた。

しかしながら、平野を埋め立てる広範な砂の堆積や丘陵をなす膨大な土砂の集積をもたらす水理学的・堆積学的機構に関しては多くが不明であり,科学的な説明は得られていない。強力な流れによる物質の移動機構の解明には,運搬される物質をミクロ的(粒子表面観察,粒子形状測定,粒度測定)及びマクロ的(堆積相解析,水槽実験,数値実験)に検討しなくてはならない。本研究では、砂の堆積現象が最も広範囲に現われた869年貞観仙台沖地震津波による堆積物運搬の様式を粒度組成及び堆積相から類推し,津波による流れの水理学的実体を理解するための初期条件を求める堆積学的検討を行っている。併せて、水槽実験により分級現象と削打現象を再現し,堆積情報と媒質流体の速度と密度の関係の数値的な対応を試みつつある。これらの堆積学的・水理学的結果に基づき,災害をもたらす劇的な堆積物運搬の現象が次第に明らかになりつつある。申請設備備品であるレーザー回折式流度分析装置による粒子組成解析結果からは,貞観津波堆積層を構成する砂層の明瞭な陸側細粒化現象が検出された。この現象は堆積物の移動と集積を試行する水槽実験装置の再現結果と調和しており,堆積層の細粒化様式が湖上津波のエネルギー散逸を反映する重要な基準として扱い得る可能性が明らかとなった。この基準は,海岸とその後背平野の成り立ちを理論的に理解する自然地理的条件を与え,更に海岸平野に於ける都市・産業基盤整備に不可欠の知識を与えるものと期待される。平成18年度に福岡で開催された国際堆積学会での講演では,これらの結果を津波災害の実態の解釈に適応して紹介し,注目を集めた。本研究では,海岸域に劇的な環境改変の効果をもたらす津波に関して,物質運搬の現象を精密且つ高精度に理解すべく,特に貞観地震に伴う津波に注目して堆積学的・水理工学的な解析を試みた。これまでの内外の津波痕跡研究では,堆積層の発見と年代推定に注目されてきた。しかし,津波による物質の移動機構に関しては多くが不明であり,既述のように,巨大岩塊の移送や地形を埋積する膨大な土砂の集積に対して具体的な解釈は与えられていない。申請者は,物質の侵蝕・運搬・集積の各機構に注目し,移動する物質をミクロ的(粒度分析,削打痕測定,微化石分析)及びマクロ的(堆積相解析,数値解析)に検討し,津波による物質運搬メカニズムの学際的な究明を試みた。この試みに於いて,1983年に発生した日本海中部地震津波による海浜堆積物の移送現象の観測は,非常に教訓的な事例となった(Minoura and Nakaya,1991,Jour.Geol.,v.99,p.265-287)。本研究では,貞観11年(869年)地震津波により砂の堆積現象が広範囲に現れた仙台平野と,安政元年(1854年)東海地震津波が襲来し巨大な丘陵状の集積土砂堆を形成した南伊豆の入間を,マクロ的研究の対象フィールドとした。2004年インド大津波は、観測の行き届いた最適事例として、最も重要視した。野外でのトレンチ掘削による地質調査を両地域で広範に行い,壁面観察から堆積相情報を,また採集した堆積物試料より設備備品であるレーザー回折式粒度分析装置を用いてミクロ的データを,目的に応じて抽出した。具体的には,堆積物運搬の様式を粒度組成及び堆積相から類推し,堆積物に含まれる化石(軟体動物,珪藻,有孔虫)から堆積物の起源水深を特定し,海水の溯上過程と物質運搬の実体を主として水理堆積学的に考察した。
東南アジアの経済発展における家計行動と金融制度

本年度は、昨年度実施した基礎的研究の成果を下に、現地調査を実施しヒアリングや現地でのデータ収集を行い分析の精緻化を図り、研究成果をあげることを目標として研究活動を実施した。この2年間の研究分析の結果は、消費構造は経済成長とともに旺盛な消費需要により高度化していることが判明した。また、輸入的消費も経済成長とともに増加しており、消費構造の高度化を裏付けしている。但し、所得格差、消費支出格差が都市部と地方では残存しており、成長の利益は都市部だけに限定されていることも判明した。この格差解消には、人的投資が長期的には有効であることから、理論分析では、既存の経済成長理論に人的投資を入れたモデルを考察し実証した。また、金融面においては、経済成長とともに金融深化が進展し家計貯蓄・消費者信用総額の伸びがみられ、経済成長に金融市場の整備が不可欠であること実証した。しかし、家計貯蓄の鈍化・外資依存体制の残存・金融基盤の脆弱性の残存、金融自由化の不完全性とその順序などになお問題点を残していることを指摘した。以上の研究結果から、ASEAN3カ国において家計行動の消費と貯蓄の増加が内需主導型の経済成長のエンジンとなり、これが継続的な経済成長につながることが実証できた。さらに、そこに於ける問題点も指摘し内需主導型の経済成長をさらに進展させる是正策も併せて示した。ただし、研究期間の制約と、研究対象国が多くしかも分析面が広いことから当初予定した研究範囲をすべてカバできなかったので、この点は今後の研究課題とする。本研究の目的は、東南アジア諸国の経済発展における金融制度の発達と家計行動との関わりを明らかにすることである。より具体的には,経済発展における金融深化と家計行動との関係性に、金融、貿易,所得分配といった複数の局面から検討を加えることである。本年度は国内において入手可能な関連資料を整理検討することによって基礎的な分析を行い、主に以下のような分析結果を得た。まず、金融面に関しては、マッキノン=ショウ・モデルをはじめとする金融深化と経済成長に関する先行研究の評価とその東南アジア地域への適用、ならびに金融制度に関する実証的な検討の結果、第一に、より効率的な資金循環を実現するためには、さらなる家計貯蓄の増大と金融深化が必要であること、第二に、日本など先進諸国の経験から、同地域の金融環境の整備と金融自由化(国際化)の順序と方法には、いくつかの問題点を指摘でき、より持続的な経済成長のためには、より安定的で追加的な金融自由化策が必要であること、などが明らかになった。また、貿易面に関しては、同地域各国の統計的分析から、経済成長に伴う国内消費構造の高度化が耐久消費財普及率、消費的輸入の増大といった面で顕著であること、またそうした消費構造の高度化が将来的に同地域経済各国の内需主導型経済への転換の可能性を多分に示唆するものであることなどが明らかになった。以上の検討過程で、これまで開発政策において見落とされがちだった家計行動の経済発展における役割の重要性についても明らかになったこれらの検討をさらに精緻化するためには、より詳細な関連データの入手・解析、ならびに東南アジア的特徴である大規模な未組織金融の存在や著しい所得格差の消費経済への影響などに関する実態把握等が不可欠である。これらについては国内では入手不可能なものも多く含まれることから、次年度では現地調査を行い、さらに検討を進めていきたい。

この格差解消には、人的投資が長期的には有効であることから、理論分析では、既存の経済成長理論に人的投資を入れたモデルを考察し実証した。また、金融面においては、経済成長とともに金融深化が進展し家計貯蓄・消費者信用総額の伸びがみられ、経済成長に金融市場の整備が不可欠であること実証した。しかし、家計貯蓄の鈍化・外資依存体制の残存・金融基盤の脆弱性の残存、金融自由化の不完全性とその順序などになお問題点を残していることを指摘した。以上の研究結果から、ASEAN 3カ国において家計行動の消費と貯蓄の増加が内需主導型の経済成長のエンジンとなり、これが継続的な経済成長につながることが実証できた。さらに、そこに於ける問題点も指摘し内需主導型の経済成長をさらに進展させる是正策も併せて示した。ただし、研究期間の制約と、研究対象国が多くしかも分析面が広いことから当初予定した研究範囲をすべてカバできなかったので、この点は今後の研究課題とする。
広エネルギー領域高分解能光電子分光による固体電子構造研究と新たな研究手法の開発

本研究では、3次元軟X線角度分解光電子分光、硬X線光電子分光、極低エネルギー光電子分光を有機的に組み合わせた広エネルギー領域光電子分光を実践し、強相関バルク電子構造の解明を行った。一方で硬X線光電子分光ではX線偏光制御技術と組み合わせた偏光依存硬X線光電子分光の開発に成功し、例えば金と銀では伝導電子の軌道対称性が定性的に異なることを解明するなど、価電子帯中原子軌道分布解明に道を開いた。直線偏光をスイッチして測定する硬X線光電子分光では、価電子帯中の原子軌道分布が実験的に判明する可能性が理論計算よりなされていたが、この研究課題において世界で初めてその実験に成功した。さらに多結晶金及び銀の偏光依存硬X線価電子帯光電子分光を行ったところ、銀では4d軌道がほぼ閉殻になっているが、金は5d軌道と6sp軌道が良く混じり伝導電子には半分程度5d成分が混じっていることが分かった。この両者の違いは相対論的効果もさることながら電子相関の違いにも由来することも局所的な電子相関を取り込んだ理論計算から判明した。さらにこの手法をLiRh_2O_4やLa_<2-x>Sr_xCuO_4,CuFe_<1-x>Ni_xO_2等の強相関酸化物やCeT_2Ge_2等の希土類化合物に適用し、価電子帯スペクトルの顕著な偏光依存性を観測した。極低エネルギー光電子分光では、研究室に建設した装置が完成し近藤半導体系Sm_<1-x>Eu_xB_6,Yb_<1-x>Lu_xB_<12>の高分解能光電子分光を行った。スペクトルの温度及びx依存性は両者で異なり、YbB_<12>系では12.5%のLu置換で微小ギャップが閉じるものの、SmB_6系では15%のEu置換においても微小ギャップが残る結果を得た。またYbB_<12>のスペクトルは5,15Kで殆ど違いが見られない一方で、SmB_6では5,15Kの間で明瞭なスペクトル形状の変化を観測した。以上のことから、YbB_<12>は古くから提唱されている混成ギャッップ模型で電子構造を説明できるが、SmB_6ではそれでは不十分で、さらなる効果を取り入れないと電子構造を説明できないことが判明した。価電子帯中の電子の軌道分布を実験的に抽出可能な直線偏光制御硬X線励起光電子分光を開発し、金と銀では電気伝導を担う電子の軌道対称性が電子相関の強さが異なる事に由来して定性的に異なるとと、さらにはTi,V酸化物では従来あまり注目されてこなかった遷移金属4s軌道分布が分かった。前者については記者発表を行い新聞報道もされた。後者については4s軌道が価電子帯全体に幅広く分布する一方で、電気伝導を担うフェルミ準位近傍の電子構造には4s軌道の影響を無視しても問題ないことが確認できた。またYbCu2Ge2についてはYbイオンが従来2価と考えられていたのに反して確かに3価が存在し、この物質が価数揺動状態にあることが判明した。軟X線角度分解光電子分光ではLaCu2Ge2,CeRhIn5 CeIrIn5等について測定を行い、LaCu2Ge2についてはバンド計算で予言されるようなフェルミ面を実験的に精密に観測することに成功した。測定によって得られたCeRhln5のフェルミ面及びバンド分散はLaRhln5のバンド計算と良く対応し、Ce 4f電子がよく局在していることが判明した。CeIrIn5についてはCe 4f電子が遍歴的とはいえない一方でCeRhIn5に見られるよう局在4f電子に由来するフェルミ面とも異なるようなフェルミ面を観測した。Fe3O4については、硬X線及び極低エネルギー光電子分光の結果から、いわゆる高温遍歴相内で電子状態が温度に対して徐々に変化し、Verwey転移直上では強い電子格子相互作用で絶縁体的になるものの室温付近で尽実効的な伝導電子数が増えていることが判明した。
企業支配権の価格に関する歴史分析：戦前日本の株式分割払込制度からのアプローチ

本研究は、コーポレートガバナンス論の分野で重要なテーマの1つである企業支配権の価格について、戦前日本の株式分割払込制度に着目した分析を行うことを課題とする。株価の一部を構成する企業支配権の価格を計測することは決して容易ではないが、戦前日本の株式分割払込制度において、払込金額の異なる複数の株式(旧株と新株)が併存したことに着目することで、企業支配権の価格を計測することが可能になると期待される。
光酸化法による体外からの中枢神経制御技術の確立

脳内では複数の神経ネットワークが同時進行ではたらき、複雑な情報処理を行っている。それらの情報処理を担っている各神経ネットワークを組織外あるいは体外から可逆的に遮断し、情報が統合される様を描出する手段として、光酸化法を確立してきた。平成11年度の研究計画としては、光酸化法における光増感色素とHRPタンパクとの結合物を作製し、色素を特定の神経終末だけに運ぶ方法の確立(研究実施計画1)、そして光酸化反応を引き起こさせるために用いてきた白色光源に代わり、より強力なメタルハライド光源を用いて効率よく酸化反応を進行させること(研究実施計画2)、さらに組織化学法による酸化領域の可視化(研究実施計画3)を挙げた。そして以下の結果を得た。(研究結果1)光増感色素(Azure C)をHRPに過ヨウ素酸法にて結合させ、結合物をラット線条体内各領域へ投与した。結果、結合物を投与領域から神経投射に沿って黒質内軸索終末へ運搬させることに成功した。運搬された色素とHRPとの結合物は抗HRP抗体を用いた免疫組織化学法あるいはDAB・過酸化水素との直接反応によって可視化された。現在、本結合物を投与した後、選択的・可逆的シナプス伝達抑制を実現するための適切な照射強度・時間を探っている。(研究結果2)光源としてメタルハライドを用いることにより、現在使用の光増感色素(ローズベンガル)の吸収波長領域の照射強度が3-5倍に増幅され、それに伴って脳内での光酸化反応の進行速度も同程度に加速された。(研究結果3)対象組織をパラホルムアルデヒドにより固定し、暗室中にシッフ試薬と数分反応させた結果、脳スライス領域内あるいは脳内の酸化部位・強度を可視化することに成功した。脳内中枢神経伝達を体外から自由に制御するため、対象領域への光増感色素の投与と光照射を組み合わせて組織を急激に酸化し(光酸化)、一定期間シナプス伝達を遮断することを試みた。ラット海馬スライス標本を用いた実験で、細胞外液中への増感色素投与後、ハロゲン光(32.5mW/cm^2)を数十秒照射すると照射領域内の興奮性シナプス伝達を可逆的に遮断できることを以前から示してきた。今回、この光酸化法を麻酔下もしくは無麻酔下の動物の脳に応用し、体外から脳内中枢神経伝達を可逆的に抑制できるか検討した。麻酔下のスナネズミ背側海馬,(Stratum Radiatum)に刺激電極、記録電極、光増感色素投与用ガラス管を挿入し、興奮性シナプス後電位(EPSP)を記録しながら増感色素を注入した。その後、直径1mmのグラスファイバーを用いてハロゲン光(3.26W/cm^2)を体外から十数分照射すると神経伝達が完全に抑制されることが確認できた。抑制された神経伝達は数時間後には完全に回復し、光の照射強度、照射時間と神経伝達抑制効果との関係はスライス実験のそれとよく一致した。次に本法を自由行動下のスナネズミ片側線条体に応用したところ、海馬でのシナプス伝達抑制効果と時間的に一致する行動変化を観察することに成功した。すなわち、体外からの約十分間の光照射で光酸化側への旋回運動が観察され、さらに数分の照射を加えると自発運動が消失した。しかし、数時間後には行動は完全に正常化し、このことは海馬からのEPSP記録実験と時間的にもよく相関していた。その後、本実験で使用している光増感色素の吸収波長にピークを持つメタルハライド光源を用いて同様の実験を行ったところ、光酸化効果を数倍に増幅することができた。以上より、光酸化法がスライス標本だけでなく、麻酔・無麻酔下の動物にも応用可能なこと、抑制効果の発現に要する時間は色素の吸収波長域の光エネルギー量に相関すること等が明らかとなった。今後、多光源化するなどして、本法による神経伝達抑制効率を増輻すると同時に、色素の投与法を工夫して特定神経投射間の選択的な神経伝達抑制を実現したい。

(研究結果3)対象組織をパラホルムアルデヒドにより固定し、暗室中にシッフ試薬と数分反応させた結果、脳スライス領域内あるいは脳内の酸化部位・強度を可視化することに成功した。
新規神経ペプチド(HCNP)受容体の同定と単離および構造改正

ラット脳組織と氷冷0.32Mショ糖溶液中でホモジェナイズ後、遠心法でP1(核画分)、P2(mitochondria-synaptosome画分)、P3(microsome画分)及び可溶性画分に分離した。ラットHCNPをBolton-Hunter法でヨード化し、0.3%BSAを含むRRA溶液(50mM Tris-HCL,pH7.6)で希釈して標識リガンド(^<125>I-HCNP)とした。200μlの画分に0.342MBqの^<125>I-HCNPを50μl、RRA溶液または非標識リガンド溶液(50μl)を加え300μlとし、30°Cで30分インキューベーションした。氷冷RRA溶液1mlを加えWhatman GF/Fフィルターを用い非結合を除去し、標識リガンドの結合が非標識リガンド(1nmol/assy)で置換された結合を特異的結合とした。可溶性成分のRRAは反応後、30%の氷冷PEG600を加え遠心法で非結合リガンドを除去して測定した。2.HCNP受容体の性質^<125>I-HCNPの結合成分は、(1)P1画分に9.0%、P2画分に74.9%、P3画分に14.9%、可溶性画分に1.2%分画され、(2)大脳皮質に多く、小脳や線条体には少ない。また、(3)^<125>I-HCNPの受容体への結合は濃度依存性に増加し50nM近傍で飽和した。(Bmaxは9.4nM/mg,Kdは3.53×10^<-11>M)。(4)HCNP受容体は高親和性の単一受容体である。(5)^<125>I-HCNPはそのC末端近傍が受容体への結合する。(6)HCNP受容体はCHAPSで可溶化される。3.HCNP受容体精製における問題点とその解決法(1)HCNP受容体は不安定で凍結下でも長期保存が困難。(2)上記RRA系のBacl groundを低下し、assay系を縮小し使用蛋白量を減量するのに、標識リガンドの純度を上げることやGF/Fフィルターを0.3%免疫グロブリンで前処置することが効果的であった。2.可溶化細胞膜成分のRRA系の確立:Mannon,P.J.et.al.(J.Neurochemi.56;1804-9,1991)に準じ各種蛋白分解酵素阻害剤を含む氷冷20mM HEPES buffer A(pH7.4)中で1.5ヶ月齢ラット脳をホモジナイズ後、遠沈法で粗膜成分を調製。5mgの粗膜成分に0.5%のCHAPSを含む1mlのbuffer Aを添加4°Cで90min攪拌、受容体成分の可溶化を試みた。