hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
健常人嚥下遅延モデルの作成とその有用性の検討

食事によって嚥下能が低下することを見つけ、健常人で行える嚥下遅延モデルを作成した。この満腹による嚥下抑制は血糖値の上昇によるのではなく、胃の伸展によって引き起こされることを明らかにした。高齢者の嚥下機能低下患者で改善効果のある黒コショウの刺激はこのモデルでも有効であった。ラットに於いて満腹による嚥下抑制の中枢機序が調べられ、満腹物質であるグルカゴン様ペプチド1(GLP-1)の延髄背側複合核群への微量投与で反射性嚥下を抑制し、この作用はGLP-1拮抗薬によって、延髄背側部の内側孤束核の局所破壊によって消失した。従って満腹による嚥下抑制は延髄背側部の内側孤束核が関与すると考えられる。本研究の目的は嚥下障害者の嚥下を改善するための治療法の有効性をテストする簡便なモデルを考案することである。若年健常者を使って24年度は食事によって嚥下遅延が起こることを明らかにした。25年度は食事摂取によって引き起こされる嚥下遅延に関与する生理的要素を検討した。市販の弁当、ブドウ糖溶液、無糖ミルクティーで作った寒天、無糖ミルクティー液を摂取してもらい、それぞれ摂取30分前、直後、30分後、2時間後の計4回嚥下テストと血糖値測定を行った。その結果、弁当やブドウ糖溶液の摂取では、血糖値の上昇は摂取後2時間後まで続くが、嚥下遅延は弁当摂取後でのみ見られた。また無糖ミルクティーで作った寒天とミルクティー液では血糖値の変化はなく、嚥下遅延は寒天の方でのみ起こった。これらの結果から食事による嚥下遅延は血糖値の上昇より、胃の伸展によって引き起こされているものと思われる。一方、麻酔下ラットでの研究では、24年度は血糖下降作用をもつとともに満腹物質様作用を示すGLP-1(glucagon-like peptide-1)の第4脳室内投与により嚥下頻度が減少し、初回嚥下の潜時が延長することを明らかにした。25年度はGLP-1の作用部位について検討した。孤束周辺の嚥下起動神経群(いわゆる嚥下中枢)へのGLP-1投与では、嚥下頻度や初回嚥下潜時に変化は認められなかった。一方、延髄正中部(最後野、交連部及びその周囲の孤束核を含む部位)へのGLP-1投与により嚥下頻度減少と初回嚥下潜時延長が観察された。また、GLP-1アンタゴニストを同部位に前投与するとGLP-1投与の嚥下に及ぼす効果は消失した。以前の研究で摂食亢進ペプチドのオレキシン-Aは、この部位の交連部に作用することが明らかになっている。そこで交連部を電気焼灼したラットにGLP-1を投与したが、嚥下に及ぼす作用に変化はなかった。従って、GLP-1は最後野もしくはその周囲の孤束核に作用すると考えられる。今年度は健常人で生理的な刺激で嚥下能を低下させるものとして食事(満腹)に注目し、食事と嚥下能について調べた。あらかじめ反復嚥下のトレーニングを行った被験者に1分間、最大頻度で空嚥下を行うよう指示した。嚥下は、顎舌骨上筋群に装着した2極の電極でその筋電図を導出し、記録した。市販の弁当を食べることによって自発性反復嚥下頻度の減少がみられた。弁当の代わりに人工甘味料を用いた無糖ミルクティで作った寒天、ブドウ糖溶液を摂取しても嚥下頻度の減少がみられたが、無糖ミルクティ液そのものを摂取しても嚥下遅延はみられなかった。したがって、食事による嚥下能低下は胃の膨満および血糖値の増加によって引き起こされ、甘味の味覚による影響は少ないと考えられる。また食事による自発性反復嚥下抑制は嚥下遅延モデルとして利用できる可能性が示唆された。また麻酔下ラットに於いて、摂食抑制、胃排泄遅延、胃酸分泌抑制など満腹物質様作用を持つインクレチンGLP-1(glucagon-like peptide-1、アミノ酸30-31個)の嚥下への作用を調べた。その結果、第4脳室に投与したGLP-

1は上喉頭神経の中枢端刺激により惹起された反射性嚥下頻度を減少させるとともに、刺激後最初に現れる嚥下までの潜時も顕著に増加した。このことはラットに於いても満腹が嚥下を抑制することを示唆し、健常人被験者を用いた実験と同様の結果が麻酔下ラットでも得られた。本研究の目的は嚥下障害者の嚥下を改善するための治療法の有効性をテストする簡便なモデルを考案することである。若年健常者を使って24年度は食事によって嚥下遅延が起こることを明らかにし、25年度には食事摂取によって引き起こされる嚥下遅延は胃の伸展によって引き起こされると結論した。最終年度では寒天500 mLの摂食による嚥下遅延作用は、嚥下障害者の嚥下を改善するといわれているブラックペッパーの香りによって有意に抑制され、このモデルの有用性が示唆された。しかしながら、寒天摂食直前のカプサイシンフィルムの単回摂取では嚥下遅延を十分抑制しなかった。臨床現場では毎食前でのカプフィルムの接種が行われていて、複数回の摂取が必要であったと考えられる。また各実験開始時に脈波から自律神経系のパラメータ(心拍数、交感神経活性、副交感神経活性など)を計測し、嚥下遅延の程度との相関を検討したが、有意な相関は得られなかった。一方、麻酔下ラットでの研究では、平成25年度の研究で、Glucagon-like peptide-1(GLP-1)が背側迷走神経複合核群正中部(medial-DVC)のニューロンを介して上喉頭神経由来の反射性嚥下を抑制することを報告した。しかし、GLP-1がmedial-DVC領域のどの部位に作用して反射性嚥下を抑制するのか明らかになっていない。そこで今回、medial-DVC中の異なる3部位を破壊し、GLP-1微量注入に及ぼす効果を検討した。その結果、最後野及び孤束核交連部の破壊は効果をもたなかったが、最後野近傍の孤束核内側部破壊でGLP-1微量注入の効果は消失した。以上の結果より、GLP-1は孤束核内側部のニューロンを介して反射性嚥下を抑制すると示唆された。以前我々は、摂食亢進作用をもつのオレキシンが孤束核交連部を介して嚥下を調節することを報告したが、摂食抑制作用をもつGLP-1はオレキシンとは異なる部位に作用することが明らかとなった。生理学健常人被験者で行う当初研究実施計画はほぼ達成できた。26年度行う予定の自律神経と満腹状態や香りとの相関を解析するために必要となる自律神経指標の検討を行ってきた。これは昨年度加速度脈波計測システム(TAS9 view)を購入し、交感神経活性を上げる香り(アロマ)の検討、副交感神経活性を上げる香りの検討を行っている。カプサイシンの嚥下遅延改善効果の検討についても予備実験を始めている。動物実験の方も当初研究実施計画通り、満腹物質様作用を示すGLP-1を用いて、嚥下の抑制作用を示す作用部位の同定まで進展していて順調である。実施計画に於いて、嚥下は唾液分泌の影響を受けやすいので、データとして抽出するphaseについて検討するとしていたが、現在唾液分泌を抽出する手法を持ち合わせていないのでこれについては検討できていない。しかしながら、弁当、寒天、ブドウ糖液、人工甘味料の摂取時の嚥下頻度の計測は予想以上に順調に進み、嚥下頻度の減少は胃の膨満および血糖値の上昇によって引き起こされ、味覚の影響は少ないことを明らかにできた。麻酔下ラットにおける実験に於いても、満腹物質といわれるインクレチン(GLP-1)の嚥下への作用を明らかにでき、順調に進展している。健常人で行う実験では、嚥下障害患者の嚥下能を著明に改善させるといわれているカプサイシンとブラックペッパーの香りを健常人嚥下遅延モデルへの適応を行う。カプサイシンシート、ブラックペッパーの香りを与えて、若年健常被験者においても満腹時の嚥下遅延を改善するかどうかを確認し、モデルの有用性を示す。
2次元電気泳動法による特定遺伝子欠失変異株の遺伝子発現パターンの網羅的解析

1)増殖期の枯草菌タンパク質の2D-PAGE上のクマジーポジティブスポットの中、約300個を固定した。グルコース添加条件下で消失した約40個のスポットのアミノ酸配列を決定した。これらの多くはカタボライト応答シス配列を有し、グルコースによるカタボライトレプレッション(CR)を受けるタンパク質である可能性が示唆された。既知遺伝子のほかにSucC,SucDやArginine utilizationに関与するRocA,RocD,RocFなどもグルコースによるCRを受けることが初めて明らかに出来た。2)枯草菌スポアの熱抵抗性などはスポア形成後期に合成される約20種のコートタンパク質がスポアコートを形成することで獲得される。yabG遺伝子は母細胞のSigK依存プロモーターを持ち、T_4から発現する。yabG遺伝子の機能をその欠失変異株を作成して解析した。この変異株は野生株とほぼ同様の熱、クロロホルム、リゾチーム抵抗性を示すスポアを形成した。yabG破壊株と野生株のスポアからSDSと2-ME存在下で蛋白質を可溶化しSDS-PAGEで分析した。可溶化された蛋白質にかなりの違いが認められた。yabG破壊株から特異的に得られたバンドのアミノ酸配列を決定した結果、野生株スポアからは可溶化されないSpoIVA,YrbA,YxeE,YeeK,CotTなどが含まれていた。野生株のSpoIVA,YrbA,CotTの各蛋白質はスポア成熟に伴って、SDS/2-MEに対して難溶性になるが、yabG破壊株スポアでは可溶性のまま存在することが確認され、yabG蛋白質は様々なスポア蛋白質を架橋することによって、難溶化に関与していることを示唆している。
反転分布の無いレーザー作用の概念の非線形光学への拡張

本年度は計画の最終年度であり系統的に実験を行った。その結果、レーザー場により媒質系の応答を制御することが非線形光学に新しい可能性を与え得ることが実証された。以下に、3項目について要点を述べる。(1)線形感受率の虚数部(共鳴吸収)の抑制結合レーザー光のラビ周波数がドップラー幅を越えると、線形感受率が極小化され共鳴吸収の中心が透明化していく様子を観測し、媒質の透明化と同時に和周波光強度がステップファンクション的に250倍と極めて大きく増大されることを実験的に示した。また、原子密度・相互作用長積を系統的に変化させ、和周波光発生の挙動を観測し、和周波光強度が非線形感受率の2乗に比例して増大していく様子を明確に観測した。(2)線形感受率の実数部(分散・屈折率)の制御強結合遷移に対して結合レーザー光を離調した場合線形感受率の効果は和周波光に対する吸収の影響としてではなく、分散が誘起双極子と和周波光との位相不整合をもたらすものとして現れる。この位相不整合も実効的結合ラビ周波数の増加分がドップラー幅を越えるよう結合強度を増加させれば、系の分散は位相不整合を相殺するようにふるまうことが理論的に示された。実効的結合光強度の増分がドップラー広がりを越えたとき、和周波光強度がステップファンクション的な強度増大を示すことを観測し、強結合と量子干渉効果により位相整合条件も制御可能であることを実証した。(3)強結合下の光イオン化過程和周波発生過程の立ち上がりとともにDressed Stateの励起過程には2光子励起過程と和周波光による1光子励起過程の双方が現れ、その間の競合・干渉が予測される。ここでは実験的にこの干渉効果を観測し理論の予測と定量的に比較した。なお、強結合下でのイオン化過程の干渉効果の観測はこれが最初の例である。本年は3年度からなる計画の第1年度であり、基本システムを立ち上げ基礎データを得ることを目的として研究を開始した。本計画の基本は、原子の準安定励起状態をその上準位とレーザー場で強く結合する事によりいわゆるドレストステートを形成し、実効的に共通準位に緩和していく2準位を創りだすことである。このような2準位は量子干渉効果を示すことが理論的に予測されており、非線形過程に対し種々の興味ある特性が実現しえる。本計画の最大の眼目はこの量子干渉効果を実験的に定量的に明かにすることである。本実験を成功させるための最大のポイントはドレストステートを形成するためのレーザー光の質であり、それが時間的、空間的、スペクトル的に高度に制御された高度の質を有することである。また非線形光学過程の観測には同時に2波長で発振することが必須である。初年度の最重要課題はこの条件を満たすレーザーシステムの立ち上げである。本年度において当研究室ではYAGレーザー励起の広帯域モードホップ無しで同調可能なパルス色素レーザーを開発し、それをコンピューター制御することにより上記条件を満たす2波長色素レーザーシステムを完成させた。本レーザーシステムは当初の目論見を十分に満たす内容で現在稼働している。水素原子系における量子干渉効果を含む非線形光学過程の実験は、本研究の先駆けとなったdc電場による水素原子の2倍高調波発生のシステムを利用することにより既に開始されつつあり、予備的なデータが蓄積されつつある。なかでも光イオン化信号による量子干渉効果の観測は極めて明暸な結果をもたらしつつある。その内容は、dc電場による効果とはやや異なり、レーザー場によるドレストステートの生成の特徴が明確になりつつある。

現状では本計画は順調に推移しつつあり次年度に大きな発展が期待できる。本年度は3年度計画の第2年度にあたり、研究の計画の中心の年度である。第1年度で開発準備されたレーザーシステム等を用いて本格的な実験を開始した。本研究の中心的な課題はレーザー場により原子系をドレスしそれにより系に生ずる量子干渉効果を用いることにより、共鳴条件を完全に満たした非線形和周波発生過程において共鳴的に増強された非線形感受率とともに発生したコヒーレント光に対しゼロ吸収の条件を達成し高効率変換の可能性を実証することである。原子系としては理論的に厳密な取り扱いが可能な水素原子を用いた。水素原子の準安定2s準位と上準位3p準位をレーザー場により強く結合させ量子干渉効果が生ずる系を準備し2s準位に対し2光子励起を行うことにより3p準位と基底準位にたいして共鳴する波長103nmのコヒーレント光を共鳴吸収を取り除いたかたちで高効率に発生させる。水素原子は水素ガスをマイクロ波放電することにより発生させ、その数密度としては最大で2x1014cm-3を得た。3p-2s遷移に対する結合光の強度、原子数密度等に対する依存性を系統的に調べ、理論的な予測と十分な一致を実験結果において得た。また、量子干渉効果の指標として光イオン化信号を用いたがその過程にも別の種類の量子干渉効果が強結合光によるAutler-Townes分裂した2本の成分の強度の非対称性として生ずることを明らかにした。なお、この効果はドレスト状態が本質的に原子系の波動関数の線形結合として表したとき対称的なものと反対称的なものとなることに対応しているとして自然に理解できるものである。強結合下での光イオン化過程の干渉効果の観測はこれが初めての例である。本年度は計画の最終年度であり系統的に実験を行った。その結果、レーザー場により媒質系の応答を制御することが非線形光学に新しい可能性を与え得ることが実証された。以下に、3項目について要点を述べる。(1)線形感受率の虚数部(共鳴吸収)の制御結合レーザー光のラビ周波数がドップラー幅を越えると、線形感受率が極小化され共鳴吸収の中心が透明化していく様子を観測し、媒質の透明化と同時に和周波光強度がステップファンクション的に250倍と極めて大きく増大されることを実験的に示した。また、原子密度・相互作用長積を系統的に変化させ、和周波光発生の挙動を観測し、和周波光強度が非線形感受率の2乗に比例して増大していく様子を明確に観測した。(2)線形感受率の実数部(分散・屈折率)の制御強結合遷移に対して結合レーザー光を離調した場合線形感受率の効果は和周波光に対する吸収の影響としてではなく、分散が誘起双極子と和周波光との位相不整合をもたらすものとして現れる。この位相不整合も実効的結合ラビ周波数の増加分がドップラー幅を越えるよう結合強度を増加させれば、系の分散は位相不整合を相殺するようにふるまうことが理論的に示された。実効的結合光強度の増分がドップラー広がりを越えたとき、和周波光強度がステップファンクション的な強度増大を示すことを観測し、強結合と量子干渉効果により位相整合条件も制御可能であることを実証した。(3)強結合下の光イオン化過程和周波発生過程の立ち上がりとともにDressed Stateの励起過程には2光子励起過程と和周波光による1光子励起過程の双方が現れ、その間の競合・干渉が予測される。
未熟T細胞受容体の自発的会合がもたらす生理的意義

プレT細胞受容体(プレTCR)は、T細胞分化に必須の受容体であるが、リガンドの有無は長年不明であった。本研究では、近年我々が提唱した「プレT細胞受容体(プレTCR)が荷電アミノ酸を介した自発的多量体形成により、リガンド非依存的にシグナルを誘導する」というモデルをin vivoで検証するため、荷電アミノ酸を変異させたプレTCRのノックインマウスを樹立、解析した。その結果、未熟抗原受容体が電荷に依存して自発的にシグナルを伝達していることを、個体レベルで初めて証明した。プレT細胞受容体(プレTCR)は、獲得免疫応答に重要な役割を担うT細胞の初期分化に必須の受容体であるが、リガンドの有無およびシグナル誘導機構は長年不明であった。我々は近年、プレTCRが荷電アミノ酸を介した自発的多量体形成により、リガンド非依存的にシグナルを誘導するというモデルを提唱した。本研究では当該モデルをin vivoで検証するため、荷電アミノ酸を変異させたノックインマウスの樹立および解析を進め、プレTCRのリガンド非依存的シグナル誘導の分子基盤、更にはこの機構が実際にTCRの多様性獲得に寄与しているか否かを明らかにすることを目的としている。本年度は、樹立した変異体pTαノックインマウス(D22A/R24A/R102A/R117A)の解析を中心として行った。このノックインマウスでは、野生型と比較して、胸腺細胞数の顕著な減少が見られ、若週齢では末梢のリンパ組織である脾臓においてもT細胞数の減少が見られた。また、プレTCRシグナルにより誘導される、下流シグナルタンパク質のリン酸化、細胞増殖、ダブルネガティブ(CD4^-CD^8-)からダブルポジティブ(CD4^+CD8^+)細胞への分化が全て減弱していることが明らかとなった。さらに、野生型と比較して細胞表面におけるプレTCRの発現が高かったことから、野生型では荷電アミノ酸を介した自発的多量体形成によりプレTCRが恒常的に細胞内に取り込まれているものと考えられる。以上の結果から、変異体pTαノックインマウス(D22A/R24A/R102A/R117A)では、T細胞初期分化が障害されていることが明らかとなり、未熟抗原受容体が電荷に依存してシグナルを伝達していることを、個体レベルで初めて証明した。本研究は、近年我々が提唱した「プレT細胞受容体(プレTCR)が荷電アミノ酸を介した自発的多量体形成により、リガンド非依存的にシグナルを誘導する」というモデルをin vivoで検証すると共に、この機構が実際にTCRの多様性獲得に寄与しているか否かを明らかにすることを目的としている。昨年度、我々は樹立した荷電アミノ酸を変異させたプレTCRα鎖(pTα)ノックインマウス(D22A/R24A/R102A/R117A)の解析を行った結果、当該マウスにおいてT細胞初期分化が障害されていることを明らかにし、未熟抗原受容体が電荷に依存してシグナルを伝達していることを、個体レベルで初めて証明した。本年度は、当該マウスの解析を更に進めた。TCRβ鎖遺伝子再構成の抑制(allelic exclusion)における影響を調べたところ、ゲノムレベルでallelic exclusionが障害されており、タンパク質レベルでも2種類のTCRβ鎖を発現するT細胞の出現が顕著に認められた。また、T細胞初期分化が障害されている当該マウスを用いて、プレTCRの自発的シグナルが実際にTCR多様性獲得に寄与しているか否かを検討した。未熟T細胞の細胞表面染色により、TCRβ鎖レパトアを調べたところ、当該マウスでは野生型と比較して変化が見られた。更に、シークエンスにより100クローン前後のTCRβ鎖のアミノ酸配列を解析したところ、TCRβ鎖の多様性を生み出しているともいうべき配列部位(CDR3)について、野生型では様々な長さのものが比較的同程度あるのに対し、ノックインマウスでは偏りが見られた。以上の結果から、荷電アミノ酸を介した適切なプレTCRシグナルは、1個のT細胞がただ1種類のTCRを発現するという原則を担保していると共に、多様なTCRβ鎖の獲得と、適切なレパトアの形成にも寄与していることが示唆された。
原因遺伝子と酸化ストレスから見た肺高血圧の分子基盤:遺伝子改変マウスを用いた検討

小児期難病である肺高血圧の病態の為に、遺伝素因と環境因子に関係する酸化ストレスに着目し、それぞれの遺伝子改変マウスを用いて新しい動物モデルを作成した。各々単独の遺伝子欠損マウスでは、慢性低酸素刺激による肺高血圧を増悪しなかったが、両者の遺伝子欠損マウスでは、慢性低酸素暴露による肺高血圧を増悪した。この事は、酸化ストレスを介する機序が遺伝性肺高血圧発症に重要性を示唆し、新たな治療標的を提示する。1動物モデルの作成:BMPR2(+/-)マウス,Nrf2(-/-)マウス及びダブルノックアウトマウスに慢性低酸素暴露を行い動物モデルの作成を行った。BMPR2(+/-)の低酸素暴露肺高血圧は増悪せず,Nrf2(-/-)マウスは肺高血圧が増悪した。ダブルノックアウトマウスでは,Nrf2(-/-)の低酸素暴露肺高血圧がさらに増悪した。さらに,右室肥大,組織学的評価よる肺血管病変も増悪した。2Western blot,RT-PCR,免疫染色による解析:各種酸化ストレス関連蛋白は,低酸素暴露Nrf2(-/-)マウスで亢進し,さらにダブルノックアウトで亢進した。また,prepro-ET1産生,PDE5,はさらに亢進し,eNOS発現は低下した。3ゲルシフトアッセイ:NF-kB-DNA結合は,肺高血圧,血管病変と一致して,より増悪を認めた。1動物モデルの作成:BMPR2(+/-)マウス、Nrf2(-/-)マウス及びダブルノックアウトマウスに慢性低酸素暴露を行い動物モデルの作成を行った。BMPR2(-/-)の低酸素暴露肺高血圧は増悪せず、Nrf2(-/-)マウスは肺高血圧が増悪した。ダブルノックアウトマウスでは、Nrf2(-/-)の低酸素暴露肺高血圧がさらに増悪した。さらに、右室肥大、組織学的評価よる肺血管病変も増悪した。各種酸化ストレス関連蛋白は、低酸素暴露Nrf2(-/-)マウスで亢進し、さらにダブルノックアウトで亢進した。また、prepro-ET1産生、PDE5,はさらに亢進し、eNOS発現は低下した。受容体発現(BMPR1,BMPR2蛋白とmRNA)、下流の転写因子(Smad1/5のリン酸化)、遺伝子(Id3 mRNA)はダブルノックアウトマウスでさらに低下しており、MAPキナーゼ(p38,ERKのリン酸化)、BMPR2(+/-)の酸化ストレス、炎症への影響として、NF-/κB活性化、VCAM1発現、マクロファージ発現はさらに亢進していた3ゲルシフトアッセイ:NF-kB-DNA結合は、肺高血圧、血管病変と一致して、より増悪を認めた。以上をさらに数を増やし定量的解析を施行する予定である。
老化ラットにおける脳局所血流とその自律神経性調節

[目的]アルツハイマー病患者や高齢者において、前脳基底部マイネルト核に起始し、大脳皮質に投射するコリン作働性神経線維が変性することが知られている。また最近このコリン作働性神経が興奮すると大脳皮質血流が増加することが見出されている。高齢者における脳血流低下の原因として、マイネルト核のコリン作働性神経による大脳皮質拡張性調節機能の低下が考えられる。そこで今回ラットを用い、マイネルト核刺激による大脳皮質血流増加反応の加齢変化を調べた。[材料と方法]実験には、3カ月齢、26カ月齢、33カ月齢のWistar系雌性ラットを用いた。ラットをウレタンで麻酔して人工呼吸を行い、呼気ガス中の炭酸ガス濃度、血圧、心拍数、体温を常時モニターし、生理的状態に維持した。頭部を開頭し、ラットの脳アトラスに従って前脳基底部マイネルト核に刺激電極を挿入し、電気刺激(0.5ms,50Hz)を行った。前頭葉及び頭頂葉の局所血流をレーザードップラー血流計を用いて連続的に測定した。実験終了後、脳の組織切片を作成し、刺激部位の確認を行った。[結果]200μAで90秒間のNBM電気刺激を行うと、3カ月齢群の頭頂葉及び前頭葉の局所血流は、刺激開始後約10秒ですばやく増加し、刺激が終了するまで高いレベルを維持し、刺激終了後徐々にもとのレベルに回復した。26カ月齢群のラットでは、頭頂葉及び前頭葉局所血流は刺激開始後約10秒ですばやく増加してピークに達した後、刺激が持続しているにも関わらず、徐々に減少する傾向が見られた。33カ月齢群のラットでは、3カ月および26カ月齢群に比べて血流増加反応が著しく減弱していた。[結論]本実験の結果より、マイネルト核のコリン作動性神経による大脳皮質血管拡張性機能は、加齢により低下することが明らかとなった。
部位特異的RNAメチル化効率定量法の確立

これまで、m6Aメチル化RNAではDNAプローブの結合効率に若干差があることが報告されているが、その差が僅かであることから実用的ではなかった(Golovina et al, NAR, 2014)。そこで申請者は、この結合効率の差を広げる方策を練り、プローブ中のDNAの一部を人工核酸BNAに置き換えると(BNAプローブ)、結合効率の差が大きく拡大することを予備的に見いだした。このため、BNAプローブを一旦RNAに結合させ後に温度を上げ、RNAからプローブが50%解離する融解温度を測定すれば、この温度から任意の部位におけるRNAメチル化効率の定量が可能になるのではないかと着想し、実験を開始した。昨年度までに、合成短鎖メチル化RNAを用いたm6Aメチル化効率定量法を確立し、BNAプローブの融解温度を測定し、その温度から予測されるメチル化効率が、既知の割合と一致することを確認した。次に、本手法が、大腸菌rRNAにも適応できることを確認した。特に高速液体クロマトグラフ質量分析法(LC/MS法)を用いたメチル化効率の定量結果と一致していることも検証できた。その後、本年度に入って、特にmRNAなどの発現量の少ないRNAへの適応を目指した。感度の問題から、これを上げるためにRNA側の濃度を上げる、mRNAだけに濃縮する、プローブのデザインを変えるなどの改良を行ったが、最終的に高い定量性をもって測定することは困難との結論に至った。こういった手法の限界点も含めて、2年間の結果をまとめて論文として報告した(Oshima et al, ChemCom, 2018)。本年度は以下の2つの実験を進めた。1)合成短鎖メチル化RNAを用いたm6Aメチル化効率定量法の確立:短いメチル化RNAと非メチル化RNAを合成し、これを様々な割合で混合した。これらを標的として、BNAプローブの融解温度を測定し、その温度から予測されるメチル化効率が、既知の割合と一致することを確認した。2)大腸菌rRNAを用いたm6Aメチル化効率定量法の確立:次に、比較的発現量が多くメチル化部位が同定されている内在RNAとして大腸菌rRNAを選択した。メチル化酵素欠損株を入手し、あらかじめ高速液体クロマトグラフ質量分析法(LC/MS法)を用いてメチル化効率を定量することで、検証に役立てた。その結果、BNAプローブを用いたメチル化効率定量法が内在RNAにも適用できることを確認した。今後は、より発現量の少ないRNA、特にヒトのRNAを基質として選択し、更に定量化手法の確立を行う。本年度は、予定していた計画を順調にクリアしたため、順調に進展していると判断した。来年度は、より発現量の少ないRNAを基質として選択し、本手法の有効性を検証する。
新規パルミトイル化酵素群の活性制御機構の解明

パルミトイル化は他の脂質修飾とは異なり可逆的であり、外界刺激依存性にサイクリングしている。これまでに、我々は全23種類からなる新規パルミトイル化酵素群をゲノムワイドに単離し、その機能解析を進めてきた。今年度はパルミトイル化酵素ファミリーの活性制御機構を明らかにするために、DHHCパルミトイル化酵素に結合する蛋白質を脳組織から特異性高く精製し、高感度質量分析装置を駆使してその構成蛋白質を明らかにした。具体的にはDHHC2結合蛋白質としてDHHC20を含む複数の蛋白質を見出した。また、DHHC3結合蛋白質としてintegrinなど複数の膜蛋白質を同定した。さらに、DHHC8,DHHC21に結合する蛋白質を同様の手法を用いて次々に同定しつつある。これらの解析を通じて、パルミトイル化酵素群のサブファミリー特異的な活性制御機構の一端を明らかにした。一方、我々は前年度までに神経活動の下流でPSD-95パルミトイル化酵素DHHC2の活性がダイナミックに変化することを見出している。今年度はDendra2融合蛋白質を用いたphotoconversion法を駆使して、PSD-95やDHHC2酵素の動態を神経細胞で可視化し、これら蛋白質の動態制御機構を検討した。興味深いことに、神経活動を遮断することによりPSD-95はより膜近傍に集積し、AMPA受容体の恒常性維持に重要な役割を果たしていることを明らかにした。本研究課題は平成20年度科学研究費補助金(若手研究(S))に係る交付内定通知の受理(5月)に伴い、若手研究(S)に専念するため廃止した。パルミトイル化修飾はシナプス蛋白質PSD-95などの機能蛋白質にみられる可逆的な脂質修飾であり、蛋白質の動態を制御する。最近、私共はパルミトイル化修飾酵素をゲノムワイドに探索し、全てのパルミトイル化酵素を同定した。本研究ではこの新規酵素群の活性制御機構を明らかにすることを目的とする。今年度はPSD-95のパルミトイル化レベルが神経活動によりどのように制御されているかを明らかにするために、代謝ラベリング法とABE(Acyl-Biotin-Exchange)法を用いてパルミトイル化修飾を受けたPSD-95の量の変動を生化学的に検討した。海馬初代培養神経細胞をグルタミン酸受容体の阻害剤で処理したところ、PSD-95のパルミトイル化レベルは約4倍増加した。このパルミトイル化されたPSD-95の上昇はPSD-95パルミトイル化酵素(P-PAT)のドミナントネガティブ変異体により阻害された。さらに、全反射顕微鏡を用いてパルミトイル化修飾を受けたPSD-95を特異的に可視化することに成功した。グルタミン酸受容体の阻害剤で処理すると約2時間以内に膜近傍に存在するPSD-95-GFPの輝度および数が増加することが明らかになった。すなわち、P-PATの活性はグルタミン酸受容体の下流で負に制御されていることが示唆された。また、PSD-95に結合する蛋白質をラット脳から精製したところ、LGI1、ADAM22およびStargazinを見出した。これら3つの蛋白質の結合様式を解析した結果、分泌蛋白質であるLGI1は膜蛋白質ADAM22を受容体として結合し、ADAM22はPSD-95によりシナプスに裏打ちされることが明らかになった。今後、LGI1・ADAM22の下流でパルミトイル化酵素の活性が制御されうるか否かを検討していく予定である。このように、今年度の研究計画は達成できたと考えている。パルミトイル化脂質修飾はシナプス蛋白質PSD-95やシグナル伝達酵素eNOSなどの機能蛋白質にみられる可逆的な脂質修飾であり、蛋白質の動態や機能を制御する。昨年度は共同研究者Sessa博士(Yale大学)らと共にeNOSパルミトイル化酵素(DHHC21)の活性がCa^<2+>シグナルの下流で制御されていることを報告した(Fernandez-Hernandoら、JCB 2006)。今年度はPSD-95のパルミトイル化レベルが神経活動によりどのように制御されているかを明らかにするために、ABE(Acyl-Biotin-Exchange)法と全反射顕微鏡用いてパルミトイル化修飾を受けたPSD-95の量の変動を検討した。海馬初代培養神経細胞をグルタミン酸受容体の阻害剤で処理したところ、PSD-95のパルミトイル化レベルは著しく増加した。この増加はPSD-95パルミトイル化酵素群(DHHC2,3,7,15)の中でもDHHC2を介していることがノックダウン法により明らかになった。さらに、DHHC2の活性制御蛋白質を探索する目的でDHHC2に結合する蛋白質を独自の生化学的手法により精製した。今後、これら蛋白質を質量分析法にて同定し、P-PATの活性制御機構を明らかにしていく。また、多くの国際共同研究にてすでに30種類近くの基質に対し責任酵素をスクリーニングしている。これらの結果より未だ明らかになっていないパルミトイル化酵素の認識配列を決定したいと考えている。

パルミトイル化は他の脂質修飾とは異なり可逆的であり、外界刺激依存性にサイクリングしている。これまでに、我々は全23種類からなる新規パルミトイル化酵素群をゲノムワイドに単離し、その機能解析を進めてきた。今年度はパルミトイル化酵素ファミリーの活性制御機構を明らかにするために、DHHCパルミトイル化酵素に結合する蛋白質を脳組織から特異性高く精製し、高感度質量分析装置を駆使してその構成蛋白質を明らかにした。具体的にはDHHC2結合蛋白質としてDHHC20を含む複数の蛋白質を見出した。また、DHHC3結合蛋白質としてintegrinなど複数の膜蛋白質を同定した。さらに、DHHC8,DHHC21に結合する蛋白質を同様の手法を用いて次々に同定しつつある。これらの解析を通じて、パルミトイル化酵素群のサブファミリー特異的な活性制御機構の一端を明らかにした。一方、我々は前年度までに神経活動の下流でPSD-95パルミトイル化酵素DHHC2の活性がダイナミックに変化することを見出している。今年度はDendra2融合蛋白質を用いたphotoconversion法を駆使して、PSD-95やDHHC2酵素の動態を神経細胞で可視化し、これら蛋白質の動態制御機構を検討した。興味深いことに、神経活動を遮断することによりPSD-95はより膜近傍に集積し、AMPA受容体の恒常性維持に重要な役割を果たしていることを明らかにした。本研究課題は平成20年度科学研究費補助金(若手研究(S))に係る交付内定通知の受理(5月)に伴い、若手研究(S)に専念するため廃止した。
著作物とその変形に関する日常的認知の発達

本研究では以下の3点について検討する目的で、文献研究を行い、幼児および成人の会話、描画描出場面について、半統制観察、自然観察を行った。著作物の変形の過程としては、発話の引用や描画の修正、描画に伴う発話の時制との関係などに焦点化し、著作物の変形に関する日常的認知を分析した。1、有形/無形物の所有比較による、発話帰属方略の検討:幼児(4歳6歳)と成人3-5人の小集団が個室で課題を行う場面をビデオ観察した。課題は、所有形態が無形の場合(会話のみ、映像視聴)と有形の場合(描画活動)を用意し、そのときの言語・非言語相互行為を比較した。2、有形/無形創作物についての各種変数操作による、創作活動と産物の関係の検討:対象者、データ収集方法、分析方法は1に準じ、変換操作を介在させた活動と産物の帰属を調べた。3、オリジナルと変形の根拠と関係の検討:対象者、データ収集方法、分析方法は1に準じ、変換操作の変数(動作主の有無の関係など)の影響を比較し、変形の根拠をより明確にした。当初の計画の発展として、子どもや大人が自ら映像制作という創造に関わることによって、映像対象や手段の意味づけに変化が予想されたことから、著作物の帰属の問題は、単に創作者と創作物の関係の問題だけではなく、メディアとしての著作物を利用する利用者のメディア・リテラシーの問題としても検討する必要があることに気づいた。その点から、著作権法の下位条項の各種概念と比較対照する試みを行い、さらに新しい研究構想を得て今後の研究課題の吟味と展望を行った。現行の著作権法の一部には、著作物には有形無形のものが含まれ、その加工、変形には原作者の了解が必要だという考えがある。本研究は、「成人の日常的認知を含めて、子どもにおいてこのような概念が自然発生的に生ずるのか、日常的認知は法律的概念とどのような違いがあるのか」を明かにすることを目的としている。この問題は、無形物の所有、公と私、自他、活動と活動の産物の帰属、オリジナルと変形の認知など、社会的認知発達上の重要概念と関わっている。本研究計画では、これらの概念を以下の3テーマに分け、幾つかの条件設定場面でのデータ収集・分析を行うことによって探究した。1、有形/無形物の所有を比較し、発話の帰属方略との関係を検討した。2、各種変数操作による有形/無形創作物について、創作活動と産物の関係を検討した。3、オリジナルと変形の根拠と関係を検討した。対象は幼児から成人までであり、方法は自然観察と半統制課題場面、インタビューであった。本年度のデータ分析はまだ終了していないが、現在までの結果は、テーマ1については、幼児でも無形物の所有行動が有形物に劣らないことが示唆された。テーマ2については、有形物としての描画について、創作活動に関わる自他の創作意志の異同が幼児においても区別されることを示唆する結果が得られた。テーマ3については現在分析途中である。平成18年度も引き続き、この3テーマについて、検討を進める予定で新たな研究計画を作成中である。I、有形/無形物の所有比較による、発話帰属方略の検討幼児(4歳6歳)と成人3-5人の小集団が個室で課題を行う場面をビデオ観察した。2、各種変数操作による有形/無形創作物について、創作活動と産物の関係の検討対象者、データ収集方法、分析方法は1に準じ、変換操作を介在させた活動と産物の帰属を調べた。3、オリジナルと変形の根拠と関係の検討対象者、データ収集方法、分析方法は1に準じ、変換操作の変数(行為主の有無の関係など)の影響を比較し、変形の根拠をより明確にした。

18年度のまとめと1718年度の総括:画像資料の非言語・言語の微視分析から、あらかじめ予想された複数の仮説の検討を行い取捨選択、修正を行い、また、平行して文献研究によって理論化を進めた。実際の子どもたちの環境に出向き、大人への聞き取りや現場の資料によって、無形物の所有、公と私、自他、活動と活動の産物の帰属、オリジナルと変形など、さまざまな重要概念に関係する現実の具体的な慣習や課題の参照を行った。またさらにデータを意味づけるために、現在は3種のテーマの観察・課題資料の背景の文脈を把握し、研究仮説と結果の妥当性について事後的検討を行っている。目的に応じた結果のまとめと、目的自体の修正を含む理論化を行い今後の研究課題の吟味と展望を行う。
唾液腺由来上皮細胞増殖因子の受容体機能に及ぼす細胞基質接着の役割

EGFの受容体機能に及ぼす細胞基質接着を解明する目的で、KB細胞において、細胞接着のチロシンリン酸化に及ぼす影響ならびに、EGFによるリン酸化への影響について調べた。その結果、130k,110k蛋白質は浮遊細胞ではリン酸化され、PSAレクチンに付着した細胞でのみリン酸化が減少し、またEGF添加により175kDa蛋白質はリン酸化されていた。これらのことから、130k,110k蛋白質は細胞基質接着とEGF受容体活性化とのシグナル伝達に関与していることが示唆され以下の実験を進めた。1)他の細胞基質接着に関わる110KDa,130kDaチロシンリン酸化蛋白質との関連p125FAKやp130CAS,ビンキュリンの抗体を用いて、免疫沈降を行った。FAK、CASは浮遊状態でチロシンはリン酸化されていたが、接着すると脱リン酸化された。PSAレクチンに付着した細胞でのみ脱リン酸化される130K,110K蛋白質は一つの蛋白質ではないと示唆され、この蛋白質の分離へと実験を進めた。2)PSAレクチンに付着した細胞で脱リン酸化される130K,110K蛋白質の分離、精製PSAレクチンカラムによりPSAに接着する蛋白質を分離し、260,230,200,170,150KDa蛋白質を得た。この中でConAレクチンに結合しないものは260,170KDaであった。3)目的遺伝子の発現クローニング変移源MNNGによって、PSAレクチンに結合できないKB細胞の変異株の分離を試みたが、PSAレクチンに結合しない細胞を得ることはできなかった。おそらく、この機能は細胞の生存、増殖の必須条件であり、PSAに結合できない変異株は死滅してしまうと考えられる。
スピン・電子ドープを用いたフラストレート磁性体の相競合機構の研究

各磁性サイトにランダムな磁場が存在し、その総和がゼロとなる、ランダム磁場モデルが通常の磁性体とは異なる新奇な磁性を示すことが理論的に予想され注目を集めているが、そのモデルを実現する候補物質である希釈双極子イジング磁性体は今までLiHo_xY_<1-x>F_4(LHYF)の一つだけしか知られておらず、またこの物質は大きな超微細相互作用により低エネルギー励起が重要になる領域でモデルからずれるため、より理想的な物質による研究が待ち望まれていた。本研究では新たな希釈双極子イジング磁性体であるR_xY<1-x>(OH)_3(R=Dy,Ho)の単結晶育成を行い、低温磁化、比熱測定および、横磁場中低温磁化率測定により、その新奇な磁気基底状態の検証を行った。試料育成に関しては、Dy,Hoの両物質に対して、磁性イオン濃度をより細かく振り、またより希薄な濃度の単結晶も含めた試料育成(x=0.025-1)に成功した。それらの物質の低温物性測定から、横磁場を印加することにより基底状態の強磁性状態が、常磁性に量子相転移することを観測した。量子相転移自体はLHYFにおいても観測されていたが、超交換相互作用が小さいDyの系において、低エネルギー励起が重要になる領域においても、より顕著に観測され、本物質がより理想的なモデルであることを明らかにした。また、LHYFと同様に、磁性イオン濃度が減少するに従って、強磁性転移温度が低温に移行し、基底状態が強磁性からスピングラスに変化することを観測したが、スピングラス相の下にさらに低温に磁気相が存在することを発見した。まだその詳細は明らかになっていないが、LHYFにおいて観測される新奇なグラス相であるアンチグラス状態との関連性が予想される。通常、磁性イオンを非磁性イオンで一部希釈した磁性体は希釈量が増えるに従って磁気秩序が抑制され、RKKY相互作用、超交換相互作用によりスピングラス転移が発現すると考えられている。しかし、その予想に反し、双極子Ising磁性体の希釈系LiHo_xY_<1-x>F_4においてxの減少に従って、アンチグラスと呼ばれる新奇な基底状態の発現が見いだされ注目を集めている。また、この無希釈系はIsing軸に垂直な磁場下で、横磁場Isingモデルでほぼ説明可能な量子相転移を発現することが報告されているが、希釈系では、希釈により誘起されるランダム磁場によって無希釈系とは異なる臨界現象の発現が理論的に予想されており、新たなクラスの磁性体ではないかと注目を集めている。本年度は、新しい希釈双極子イジング磁性体の候補物質である希土類水酸化物R_xY_<1-x>(OH)_3(R=Dy,Ho)の単結晶育成を行い、その基礎物性測定を通して、上記の新奇物理現象の検証を試みた。これら物質は、同じ結晶構造で、クラマースイオンであるDyと非クラマースイオンであるHoを磁性イオンとして持つため、新奇な物理現象の検証に加えて、以前の物質では不可能であった、超微細相互作用の大小等を含めた磁性イオン依存性についての詳細な研究が可能である。また、上記に加え、幾何学的フラストレート磁性体の新奇物質探索も平行して行った。遷移金属が磁性を担うd電子系幾何学的フラストレート磁性体については、二次元、三次元系ともに様々な物質開発が行われ、軌道、スピン、電荷が織りなす多様な物性の起源が明らかにされつつあるが、f電子系については、三次元系のパイロクロア酸化物の研究に限定され、二次元性の強い物質は、GdPd_2Al_3,CePtAl,UNi_4Bなど数種類しか報告されていない。また、f電子の軌道に対応する四極子自由度のララストレーションに注目した研究はほとんどされておらず、それに関連した新奇物性の発見が期待される。本年度は、f電子系二次元幾何学的フラストレート磁性体の新たな候補物質で希土類元素変換による系統的な研究が可能なRbRSe_2に注目し、単結晶育成を試みた。

量子相転移自体はLHYFにおいても観測されていたが、超交換相互作用が小さいDyの系において、低エネルギー励起が重要になる領域においても、より顕著に観測され、本物質がより理想的なモデルであることを明らかにした。また、LHYFと同様に、磁性イオン濃度が減少するに従って、強磁性転移温度が低温に移行し、基底状態が強磁性からスピングラスに変化することを観測したが、スピングラス相の下にさらに低温に磁気相が存在することを発見した。まだその詳細は明らかになっていないが、LHYFにおいて観測される新奇なグラス相であるアンチグラス状態との関連性が予想される。
侵襲性新生児ＧＢＳ感染症予防のための母児ケアシステムの開発

早発型GBS感染症22例,遅発型GBS感染症4例,GBS 259株[児の血液/髄液由来発症株10株,児の咽頭等由来非発症株55株,妊婦および褥婦の腟由来株194株]を収集し,侵襲性新生児GBS感染症の発症要因について解析した.早発型GBS感染症22例においてGBSスクリーニングが実施されていたのは20例で,この20例の内GBS陽性であったのは5例のみであった.薬剤感受性試験では,penicillin系抗菌薬に全て感受性を示した.早発型GBS感染症の発症の背景にはpenicillin系抗菌薬への耐性ではなく,GBSスクリーニングによる偽陰性が要因の一つであることが示唆された.本研究は,新生児GBS感染症予防のために,どのような新生児が新生児GBS感染症を発症しているのか発症要因等を明らかにすること(第一研究),新生児敗血症髄膜炎発症GBS株と非発症GBS株の異同を明らかにすること(第二研究)を目的としている.平成24年度迄に,第一研究では早発型GBS感染症確定例11例,早発型GBS感染症疑い例15例を収集でき,早発型GBS感染症の発症率は0.19(出生千対)で,平均在胎週数38週6日,平均出生体重3,045g,Apgar score 1分値の中央値9点,分娩様式は経腟分娩8例,帝王切開3例(常位胎盤早期剥離2例,横位1例)であった.危険因子(在胎37週未満,破水後18時間以上経過,38度以上の発熱)を有していた症例は,早産(33週)1例のみであった.在胎週数,出生体重,Apgar scoreは正常で,危険因子がなくとも発症していた児が多かった.早発型GBS感染症確定例11例のうち10例はGBSスクリーニングを実施されていたにも関わらず発症していた.5例は陰性で,2例は妊娠中に抗菌薬による内服治療後に陰性となった症例であったことから偽陰性の対応が今後の検討課題と考えられた.第二研究では,新たに母児の臨床分離株38株を収集し,薬剤感受性試験,血清型の実施を完了した.薬剤感受性試験においてpenicillin系抗菌薬に耐性を示した株はなかった.病原性との関連から分子遺伝学的手法(MLST法)の解析が学内でできるよう整備し,現在までに入手できた発症株(血液・髄液・羊水由来)の解析を開始し解析中である.本研究は,新生児GBS感染症予防のために,どのような新生児が新生児GBS感染症を発症しているのか発症要因等を明らかにすること(第一研究),新生児敗血症髄膜炎発症GBS株と非発症GBS株の異同を明らかにすること(第二研究)を目的としている.第一研究では最終的に早発型GBS感染症確定例11例,早発型GBS感染症疑い例15例を収集できた.早発型GBS感染症の発症率は0.19(出生千対)で,平均在胎週数38週6日,平均出生体重3,045g,Apgar score 1分値の中央値9点,危険因子を有していた症例は,早産(33週)1例のみであった.早発型GBS感染症確定例11例のうち10例はGBSスクリーニングを実施されていたにも関わらず発症しており,偽陰性の対応が今後の検討課題と考えられた.新生児GBS感染症発症児とその母(症例)1例につき,新生児GBS感染症を発症しなかった児とその母(対照)3例を選定し,対照例の情報収集を行った.最終的に,症例(確定例と疑い例)26例に対して,対照例78例の情報収集を完了し,新生児GBS感染症発症の発症要因を検討した.第二研究では,児血液4株,児髄液2株,児髄液由来の母の腟由来1株,その他2株,合計9株の母児臨床分離株の収集が出来た.今年度の成果として,児の血液や髄液由来株および児髄液由来株と母腟由来株がセットで収集できたことは意義が大きい.最終的に,児と妊婦褥婦腟由来GBSの薬剤感受性と型別の年次推移を比較したところ(児血液髄液10株,児咽頭等55株,妊婦褥婦腟保菌194株),薬剤感受性試験ではpenicillin系抗菌薬に耐性を示した株はなかった.型別では,児咽頭等由来の非発症株においてIII型が増加し今後の動向に注意を要すると考えられた.早発型GBS感染症22例,遅発型GBS感染症4例,GBS 259株[児の血液/髄液由来発症株10株,児の咽頭等由来非発症株55株,妊婦および褥婦の腟由来株194株]を収集し,侵襲性新生児GBS感染症の発症要因について解析した.早発型GBS感染症22例においてGBSスクリーニングが実施されていたのは20例で,この20例の内GBS陽性であったのは5例のみであった.薬剤感受性試験では,penicillin系抗菌薬に全て感受性を示した.早発型GBS感染症の発症の背景にはpenicillin系抗菌薬への耐性ではなく,GBSスクリーニングによる偽陰性が要因の一つであることが示唆された.

本研究は,新生児GBS感染症予防のために,どのような新生児が新生児GBS感染症を発症しているのか発症要因等を明らかにすること(第一研究),新生児敗血症髄膜炎発症GBS株と非発症株のGBS株の異同を明らかにすること(第二研究)を目的としている.平成23年度は,名古屋市立大学看護学部研究倫理委員会の承認および研究協力施設5施設において病院長の承認を得て研究を開始した.第一研究では,早発型GBS感染症4例,遅発型GBS感染症1例の収集ができた.早発型4例はGBSスクリーニングを実施されていたにも関わらず発症していた.3例は陰性で,陽性であった1例は帝王切開であったため抗菌薬の予防投与が実施されていなかったことから,偽陰性や分娩様式による対応が今後の検討課題と考えられた.遅発型の多くは早産児と報告されているが,本研究でも同様に早産児であり,GBSワクチンの導入や水平感染予防が重要と考えられた.第二研究では,新生児血液6株(発症株),新生児保菌54株(非発症株),妊褥婦腟保菌173株を対象とし,薬剤感受性試験および血清型別の比較検討を行った.薬剤感受性試験では,全てのGBSにおいてpenicillin系抗菌薬に耐性を示した株はなかった.発症株と非発症株を比較検討した結果,耐性率に変化はなかった.20062008年(1期)と20092011年(II期)の2群に分けて血清型分布の比較検討を行ったところ,腟保菌株で発症株に多いIa,III型が増加しており今後の動向に注意を要すると考えられた.第一研究では予定していた研究協力施設5施設において研究対象となる早発型GBS感染症発症児の情報収集が完了し,多施設における早発型GBS感染症の発症率を算出することが出来た.多施設による発症率に関する報告は少なく意義深い結果を得ることが出来た.更に,発症要因を明らかにするために,新生児GBS感染症発症児とその母(症例)と新生児GBS感染症を発症しなかった児とその母(対照)を比較検討するにあたり,対照の選定方法について研究協力医師と検討を重ね決定し,対照例の情報収集を開始した.第二研究では,新たに母児の臨床分離株38株を収集し,薬剤感受性試験,血清型の実施を完了した.更に,研究協力施設において発症株(血液・髄液由来)5株の分与の手続きを完了し平成25年度早々に入手予定である.発症株を入手できることは病原性との関連から解析するにあたり意義が大きい.病原性との関連から分子遺伝学的手法(MLST法)の解析が学内でできるよう整備を完了し解析中である.第一研究では,研究協力施設として5施設の承諾を得て研究を開始することができた.多施設による早発型・遅発型GBS感染症の発症頻度に関する報告は少なく,多施設共同研究として研究を開始できた意義は大きい.5施設の内2施設において,新生児GBS感染症を発症した児とその母(症例)の情報収集を終了することができた.更に,発症要因を明らかにするために,新生児GBS感染症を発症児とその母(症例)と新生児GBS感染症を発症しなかった児とその母(対照)を比較検討するにあたり,対照の選定方法について研究協力医師と検討を重ね,研究精度の向上を図った.第二研究では,今年度は新たに母児の臨床分離株81株の収集し,内52株の薬剤感受性,血清型の実施を終了した.更に,最近の知見をふまえ研究協力医師と検討した結果,分子遺伝学的手法(MLST法)と病原性、血清型との相関についての検討を優先することとした.そこで,分子遺伝学的手法(MLST法)を用いて発症株と非発症株の比較検討するため,分子遺伝学的手法(MLST法)について研究協力医師および臨床検査技師から具体的な解析方法について習得した.第一研究では,まず,新生児GBS感染症発症児の母の情報収集を優先する.次に,新生児GBS感染症を発症しなかった児とその母(対照)の情報収集を行う.新生児GBS感染症発症児とその母(症例)と新生児GBS感染症を発症しなかった児とその母(対照)を比較検討し発症要因を明らかにする.第二研究では,発症株(血液・髄液・羊水由来)の分子遺伝学的手法(MLST法)の解析を優先して行い,発症株におけるMLST型の傾向を明らかにする.
新しいゲノム・サブトラクション法を用いたがん抑制遺伝子の探索

本研究の目的は新しいゲノムサブトラクション法であるIn-gel competitive reassociation(IGCR)法を用いてがん抑制遺伝子の単離・同定を行なうものである。本年度は、計画として当初予定していた様に腎がん組織のDNAを用いてIGCR法によりLOH部位の濃縮を検討した。腎がん患者2例より腎がん組織と正常組織を得、ゲノムDNAを抽出した後、IGCR法を用いてサブトラクションを行なった後、両組織間で異なるDNA断片を含むクローンのライブラリーを構築した。それぞれのライブラリーについてクローンを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、確かに両者で異なるパターンを示すクローンが得られていた。約800個のクローンについてさらに詳しく解析を行なった結果、これらのライブラリーのcomplexityは約3×10^4であり、クローンの3577%がLOHを示した。また、LOHは反復配列を含むクローンでも見られ、本方法が反復配列を含む多くのDNA断片に適用可能であることが改めて確認された。また、正常組織由来のDNAの混入率をマイクロサテライトDNAの多型を利用して調べたところ、混入はほぼ無いことが確認できた。以上の結果より我々の構築したライブラリーが有用であるとの確証を得たので、それぞれのクローンについてヒト/マウス雑種細胞由来のDNAを用いて染色体マッピングを行ないクローンの由来したDNA断片について染色体座位に特異性がないかを検討している。