hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アゲハチョウ類の寄主認識に関与する化学受容機構と食性進化の解明

現在、ナミアゲハのシネフリン受容体の機能解析と同じ手法を用い、これら新規遺伝子の機能解析に取り組んでいる。今後は、1. TALENなど新規の解析技術の導入と、2.多種アゲハチョウのゲノムを解読し、ゲノムデータベースとして構築することで新規遺伝子の探索や比較ゲノム解析による食性進化の解明を促進する計画である。研究計画では、3年間で受容体遺伝子の発見とリガンドの特定を目標としていたが、in vitoro・in vivoの機能解析を通じて産卵行動に関与することまで解明できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、特定ゲノムの支援を受けてナミアゲハのゲノム解読が進行している。昆虫の味覚受容体遺伝子は実験的手法による探索は困難で、ナミアゲハのシネフリン受容体を除いて全てゲノムがら情報学的手法によって発見されている。ゲノム解読が進めば、新規の味覚受容体遺伝子の発見に期待が持てる。複数の味覚受容体遺伝子が発見されれば、アゲハチョウの食草認識機構の解明に重要な手がかりになると思われる。
消化管運動ペースメーカーとしてのカハール介在細胞の細胞生物学的研究

1.腸管平滑筋層を単離培養し、自動運動を計測する実験系を確立した。生後10-14日目のマウスの小腸平滑筋層を剥離し、酵素処理と物理的に細切することで自動運動能を保持した組織小片を単離し培養する事ができた。この培養系は薬理学的にも試薬投与による腸管平滑筋の機能変化をスクリーニングする上で大変有効であり、実用化に向けて特許を出願した(出願番号2002-64237)。2.単離培養系を用いて、カハールの介在細胞の細胞内カルシウム変動をカルシウムイメージング法により解析した。上記の組織小片を用いて、カルシウムイメージングを行い、L型カルシウムチャンネルの阻害薬を添加する事で、平滑筋のカルシウム変動をブロックし、カハールの介在細胞が示す周期的な細胞内カルシウム変動を選択的に記録する事に成功した。またこの周期的なカルシウム変動が本細胞のリズム発生機構に密接に結びついている事、その変動は細胞外からの非選択的陽イオンチャンネルの一つTRP4を介して生じる可能性を示唆した。3.マウス胚性幹細胞(ES)から自動運動能を持つ器官としての腸管(様)構造を分化させることに成功した。ESは様々な組織や細胞に分化する能力を持つが、器官とし機能する腸管様構造を形成させるうることを、世界で初めて明らかにした。その腸管様構造は自動運動能を有し、腸管上皮、結合組織、カハールの介在細胞や壁内神経を含む平滑筋層から構成されていた。今後、このESの分化システムを用いて、腸管形成のメカニズムやリズム発生機構の解析を行う予定である。1.カハールの介在細胞(ICC)を含む腸管筋層培養組織小片のカルシウムイメージング法の確立マウス小腸筋層を剥離し、これを細切の後コラーゲナーゼ処理を行ってコラーゲンコートガラスに静着させた。2-3日培養後にカルシウム指示薬10μM fluo4を添加し、37°Cで冷却CCDカメラシステムまたは共焦点顕微鏡により細胞内カルシウムの変動を記録した。その結果組織小片は自発性の規則的収縮(18-19回/分)が観測された。その約0.5秒前にカルシウム濃度が最高に達した。また平滑筋の収縮を抑制するdehydropylidineは平滑筋の収縮とカルシウム変動を抑制したが、免疫組織学的にカハールの介在細胞の存在が確認された部位からはカルシウム変動が継続して記録された。従ってdehydropylidine存在下でICCのカルシウム変動を選択的に検出する事が可能となった。またこのICCの細胞内カルシウム変動は細胞外電極法による同時記録から緩徐波と同調する事がしめされた。2.ペースメーカー機構に関わる因子の解析カルシウムイメージング法よりICCのリズム発生機構には非選択的陽イオンチャンネル、ストア依存性カルシウムチャンネルが関わることがわかった。この生理学的特徴に合致するチャンネルとしてICCには免疫組織化学的にtransient receptor potential like channel(TRP4)が強く発現している事が示された。これらは特にICCの細胞膜カベオレに集積していた。これらのデーターは現在投稿中である。1.単離培養系を用いて、カハールの介在細胞の細胞内カルシウム変動をカルシウムイメージング法により解析した。昨年度確立した組織小片を用いて、カルシウムイメージングを行い、L型カルシウムチャンネルの阻害薬を添加する事で、平滑筋のカルシウム変動をブロックし、カハールの介在細胞が示す周期的な細胞内カルシウム変動を選択的に記録する事に成功した。組織小片を用いた研究は有効である事が実証されたのでこの方法について特許を出願した(特願2002-64237)。

2.マウス胚性幹細胞(ES)から自動運動能を持つ器官としての腸管(様)構造を分化させた。ESは様々な組織や細胞に分化する能力を持つが、器官とし機能する腸管様構造を形成させるうることを、世界で初めて明らかにした。その腸管様構造は自動運動能を有し、腸管上皮、結合組織、カハールの介在細胞や壁内神経を含む平滑筋層から構成されていた。腸管様構造の形成過程はマウス胚における腸管の発生過程と基本的に同じであったので、ESによる腸管様構造の形成は腸管の発生を研究する上でよいモデルとなる事がわかった。さらにin situ hybridization法やdifferential display法を用いて消化管形成に関わる因子や自動運動能発現に関わる因子の探索を行った。
介護保険制度下におけるサービス提供事業者評価に関する研究

本研究の調査概要・対象者:スクリーニング調査で把握した要介護高齢者とその家族595人のうち、回答が可能であった高齢者本人。完了数344。・調査方法:訪問面接調査・調査実施時期:2002年4?5月結果のまとめ・事業者評価については、利用者の介護保険に対する全体満足度、ケアマネジャーに対する評価、各サービスに対する評価などの変数を軸として評価を行ったが、概ね肯定的な結果が得られた。特に、全体満足度については、70%近い人が満足しており、他の地方自治体の満足度調査の結果と同様、満足度が高いという結果となった。・サービス提供事業者については、事業者を社会福祉法人、その他の公益法人、医療法人、株式会社、有限会社、NPO法人・生協の6つに分類して分析を行った。本調査を通して明らかになったことは、ケアマネジャーをはじめ、ホームヘルプサービス、デイサービス、ショートスティサービスなど、各サービスによって提供する主要事業者のタイプが大きく異なるということであった。・事業者別に利用者の介護度の差をみたが、介護度にはほとんど違いがみられなかった。その一方で、サービス提供量は株式会社や有限会社などの民間企業の方が他の法人系の事業者と比べて多いという傾向がみられた。・ケアマネジャーの対応、サービス情報の提供、アフターケア、お世話の内容など、ソフト面での評価は全体的に高かった。一方、送迎や費用、サービス提供回数など、介護保険制度という制度上の運営と密接に関連する側面については、課題が残される。1.文献資料の収集及び研究介護保険制度関連及びサービス評価に関する国内外の文献・資料を収集し、それらをレビューした。2.全米老年学会での発表資料の準備2001年9月に起こったテロ事件の結果、シカゴで開催された全米老年学会に参加することができなかったので、直接学会において発表することはできなかったが、発表のために必要な抄録及び発表資料は作成した。3.本テーマに関する研究会の実施(1)本研究の調査内容について、研究分担者である杉原氏やその他のメンバーらと、東京都老人総合研究所において月1回程度の研究会を実施した。(2)本テーマの関連ある研究を行つている国内の他の研究者(善通寺、大阪・京都)を訪問し、テーマに関する仮説や研究手法について協議した。4.本テーマに関する調査の実施上記1、2、3の文献資料研究及び他の研究者との本テーマに関する協議の結果を踏まえて、2001年1月末から2月にかけて、東京都三鷹市の高齢者に対して、介護保険制度に関するアンケート調査を行った。調査実施そのものについては、調査会社に委託することとし、調査会社がアンケート調査を実施した。現在は、今後の分析のためにデータを入力し、チェック・クリーニングしている。5.今後の予定としては、データを分析し、介護保険制度及び介護保険サービス評価についての評価を行い、その研究成果を学会で発表したり、論文としてまとめる予定である。完了数344。介護保険制度がスタートし、ほぼ3年が経過しようとしているが、最近ではサービスの見直しと共に、介護保険制度の評価の必要性も叫ばれている。そこで、本研究は、介護保険制度の中でも、特に、介護サービスを提供しているサービス提供事業者に焦点をあて、利用者の満足度によって、サービス事業者の評価を行うことを目的とした。介護保険制度に関する調査は、東京都三鷹市の協力を得て、スクリーニング調査、介護保険制度の全体評価に関する調査を含めて平成13年から平成14年にかけて行われた。調査対象者は、要介護高齢者を抱える家族の中でも主介護者としたが、595人から有効な回答を得ることができた。結果としては、まず、介護保険制度の全体満足度、ケアマネージャーに対する満足度、ケアプランに対する満足度、要介護認定に対する満足度は、いずれもほぼ8割以上が満足していると回答しており、制度がスタートして3年が経過した現状では、介護保険制度に関して、肯定的な意見をもつ主介護者が多かった。次に、サービス提供事業者については事業者を社会福祉法人系、医療法人系、民間企業系、NPO系などのグループに分け、それらと様々な満足度との関係についてクロス集計を用いてみた。

結果をみると、各サービス提供事業者別の満足度には有意な差がみられなかった。なお、この事業者に関するデータについてはまだ十分に整理されていない部分があるので、今後、データを再加工し、さらに分析を進める必要がある。
う蝕進行および抑制に伴うフッ素動態の定量的解明

我々が開発したフッ素定量測定法を用いることにより、脱灰進行に際してのフッ素の動きをとらえることが初めて可能となり、歯質内のフッ素濃度が脱灰に際して影響があること、また歯質内のフッ素は脱灰されても放出されるだけでなく再度取り込まれていることが判明した。従来測定したフッ素取り込み量には、歯質に付着しているCaF2など歯質と結合していないものが含まれる可能性が示された。申請者らは、近年、核反応を用いた歯質内のフッ素定量測定法を新しく開発、改良して、新たな歯質内のフッ素定量測定法を確立してきた。本研究はこの確立した測定法を用いて、フッ素のより有効な歯科臨床への定量的な解析と応用、それに基づいた新たなフッ素徐放性歯科材料の開発を目的とする。フッ素徐放性歯科材料から歯質にフッ素が浸透することは、程度の差はあるがいずれの材料にも認められ、時間経過によってより深く浸透するが、フッ素の含有量、溶出量の多いものが必ずしも深く浸透するわけでもなく、またう蝕進行に伴いう蝕歯質内のフッ素濃度が高まるが、それらのフッ素がどこ由来のものかなどの詳細は明らかでない。本測定法で健全歯質およびう蝕歯質でのフッ素濃度やフッ素の経時的変化の測定が可能となったことにより、人工う蝕装置を併用し、う蝕進行に伴うフッ素の動態を現在検討中である。う蝕予防の観点から、日常生活でもフッ化物含有歯磨剤の使用やフッ化物洗口が推奨されており、それらの効果を検討した結果、フッ化物含有歯磨剤やフッ化物洗口併用によるう蝕抑制効果は有効と評価できたが、併用してもう蝕抑制効果が有意に増加しなかった。したがって、小中学生を対象にフッ化物洗口を学校で実施することが推奨されているが、フッ化物含有歯磨剤の使用法や回数などを考慮して実施を検討すべきと考えられる。また、一度歯質に取り込まれたフッ素はう蝕になって溶出しても再び利用されることが確認されたが、再石灰化に伴い歯質に取り込まれるフッ素が、それらの歯に浸透しているフッ素、材料からのフッ素、周囲に存在するフッ素からどのように影響をうけているかの検討が必要であり、測定試料作成中である。歯科でのフッ素の研究は従来から多くなされており、歯質内のフッ素の測定も、その研究の一分野であったが、精度の高いより適切な測定法は確立されていなかった。本研究の遂行により測定方法は確立し、定量測定の基礎となる標準試料も新たに作成することができ、測定手順も軌道に乗るようになった。また得られた測定値の解析に対しての見解が、多くのデータを得ることにより統一された。従来の歯質のフッ素濃度測定法では、測定後の試料は歯の形態が消失しており、同一試料の経時的変化を追うことができなかった。そのため、脱灰されるときのフッ素濃度の動きは測定できず、歯質内の周辺にフッ素が存在することが、う蝕抑制には必要と認識されていた。本測定法を用いることにより、脱灰進行に際してのフッ素の動きをとらえることが初めて可能となり、歯質内のフッ素濃度が脱灰に際して影響があること、また歯質内のフッ素は脱灰されても放出されるだけでなく再度取り込まれていることが判明した。さらに、歯質内のフッ素がどのような状態で存在するのかということも、従来のフッ素濃度測定法では確認することはできなかった。KOH浸漬後に残存するフッ素は歯質と結合していると考えられていることから、KOH処理前後のフッ素濃度を測定した結果、フッ素取り込み量は減少する傾向がみられた。このことより、従来測定したフッ素取り込み量には、歯質に付着しているCaF2など歯質と結合していないものが含まれる可能性が示された。このように従来のフッ素濃度測定法では捉えることができなかったフッ素の動態の一端が定量的にも明らかにされた。この測定法の活用は今後のフッ素の研究を発展させるものである。本測定法では健全歯質およびう蝕歯質でのフッ素濃度やフッ素の経時的変化の測定も可能となり、人工う蝕のフッ素の動態の検討も始めている。フッ素徐放性歯科材料から歯質にフッ素が浸透するのは、程度の差はあるがいずれの材料にも認められ、時間経過によってより深く浸透するが、フッ素の含有量、溶出量の多いものが必ずしも深く浸透するわけでもなく、またう蝕進行に伴いう蝕歯質内のフッ素濃度が高まるが、それらのフッ素がどこ由来のものかなどの詳細は明らかでない。

今までのデータを基にして選択したフッ素徐放性歯科材料を用い、フッ素濃度は高いが浸透は浅い、濃度は低いが浸透は深いというフッ素分布が異なる歯質試料を作成した。その歯質にう蝕を想定した酸処理により脱灰を行った前後のフッ素分布を測定した。脱灰された歯質でのフッ素濃度は脱灰前のフッ素濃度より低くなることはなく、フッ素の増加量も脱灰前の歯質でのフッ素含有量により異なった。脱灰されたときに歯から溶出したフッ素は、歯質周辺に存在すれば容易に再度歯質に取り込まれると考えられるが、取り込まれる量は材料の影響を受けると考えられる。これらのことは一度歯質に取り込まれたフッ素はう蝕になって溶出しても再び利用されることを示唆している。さらに、人工う蝕作成の自動pHサイクル装置を使用し、う蝕歯質に取り込まれるフッ素が、歯に浸透しているフッ素、材料からのフッ素、周囲に存在するフッ素からどのように影響をうけているか検討するための適正な試料を作製中である。本年2月に日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所(TIARA)での測定が機械の故障で延期になったものの、4月にマシンタイムが獲得され、25年度の測定に繰り越してもらえたことにより、おおむね順調に進展している。測定を行っている若狭湾エネルギー研究センターの加速器故障、海外での修理につき、当研究センターでの23年度の測定は延期となり、日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所(TIARA)の加速器での測定のみとなったため、予定よりやや遅れている。若狭湾エネルギー研究センターおよびTIARAでのマシンタイムも前期分はすでに確定しており、測定も実施されるので、当初の研究計画に変更はない。試料作製も引き続き行われ、測定日に対応して準備されている。24年度の成果は、すでに国際学会などで発表しており、投稿論文作成中である。若狭湾エネルギー研究センターでの測定も7月から開始される予定で、現在マシンタイムを調整中であり、TIARAでの測定も続行されるので、当初の研究計画に変更はない。23年度の成果は、6月IADR(ブラジル)、7月ICNMTA(ポルトガル)の国際学会で発表の予定である。若狭湾エネルギー研究センターの測定も続行され、予定通りの研究を実施するため旅費および試料作製費などを計上する。日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所(TIARA)の測定も予定通り並行して行う予定であり、試料作製のための材料や器具が必要である。本研究における測定は大学ではできないので、特に若狭湾エネルギー研究センターへの旅費計上は不可欠である。情報収集、成果発表のための歯科保存学会、理工学会、国際学会への出席の旅費を計上している。当初予定していた若狭湾エネルギー研究センターでの測定が延期となったため、試料作製費や旅費として23年度の研究費に未使用額が生じたが、24年度に若狭湾エネルギーセンターでの測定も再開され、予定通りの研究を実施するため旅費および試料作製費などを計上する。情報収集、成果発表のための歯科保存学会、理工学会、国際学会への出席のための旅費を計上している。
新しい高分解分光法による無極性分子クラスターの分子構造の解明

本研究は少数多体系として、無極性分子から構成されるファンデルワ-ス錯体を研究対象として選び、クラスター内の分子配向を決定する分子間相互作用ポテンシャルとクラスター内分子運動のメカニズムを解明することを目標とした。従来の量子化学計算では最安定平衡構造すら確定していない状況なので、実験の指針となりうる信頼の高い計算を行うために、Gaussianの基底関数をcc-pVQZレベルにまで拡大し、配置間相互作用もCCSD(T)レベルまで入れた大規模なab initio計算を行った。その結果、最安定構造は従来報告されていたT型(C_<2v>)でもX型(D_<2d>)でもなく、45度の平行四辺形型(C_<2h>)となった。C_<2h>からC_<2v>を経由して等価な別のC_<2h>配置をとる反応座標はポテンシャル障壁が5cm^<-1>と著しく小さいことが分かった。これは2つのN_2分子が互いに歯車がかみ合うような協調内部回転運動(ギヤ運動)の存在を示唆するものである。このことを考慮して分子の平均構造を始め、振動エネルギー、振動遷移モーメントの見積りを再検討した。その結果、フンデルワールス伸縮モードのバンドオリジンは6600GHzとし、平均的な振動遷移モーメントの期待値として0.004Debyeに下方修正した。以上の量子化学計算の予測に基づき、実際に分子線中の振動回転スペクトルのサブミリ波分光測定を試みたが、予想通り遷移強度は小さく(N_2)_2クラスターの検出はできていない。そこで、(N_2)_2クラスターのように永久双極子を持たない分子の回転スペクトルを測定するために、2本のCWレーザーの差周波の位相を安定化した分光光源を開発した。Rb原子のD_2線の光-光2重共鳴信号を位相敏感検出することによって、マイクロ波遷移に対応する超微細構造準位間遷移の複素感受率の実部と虚部を独立して測定することができた。共鳴信号の線幅は4MHz程度である。この結果は光を使って無極性分子の純回転遷移をマイクロ波の精度で観測できる事を実証するものである。
好塩性微細藻類が分泌する硫酸多糖の生理活性評価と環境浄化への応用

本年度は、生理活性物質として有効性が示唆されている硫酸多糖を環境浄化へ応用することを目的とした。重金属の微生物除去においては、そのほとんどが菌体表面に吸着させる方法が用いられている。その吸着は、主に重金属と菌体表面のイオン結合によるものが多く、関与する成分には、多糖やタンパク質、脂質があげられ、特にカルボキシル基、硫酸基、アミノ基などが重金属の吸着に寄与している。藻類が生成する硫酸多糖や糖鎖骨格を有する化合物の機能を調べることで、新規生理活性物質としての応用、展開ができるだけでなく、重金属除去のような環境浄化への応用も可能になると考えられる。好塩性藍藻Aphanocapsahalophytiaの凍結乾燥菌体を用いて金属の吸着除去能を調べたところニッケルは除去されにくいが、六価クロム、スズについてそれぞれ75%、82%の高い除去率が確認された。一般に六価クロムは、アルカリ剤の添加によって沈澱物として除去することは困難であり、まず初めに還元剤を加えて、三価クロムとしてからアルカリ剤を添加しなければならない。そこで、この菌体を用いて六価クロムを効率的に除去することができれば、その有効性は高いと評価できる。次に、乾燥菌体への六価クロム(5ppm)の吸着時間について検討した結果、約3時間で除去量が一定になることが確認された。また、この時の乾燥菌体への六価クロムの最大吸着量は、15mgCr_2O_7^<2->/g dry cellsであった。次に、連続的な除去を目的として、乾燥菌体をアルギン酸ビーズに包埋した固定化菌体を用いてリアクターの構築を行ったところ、六価クロムの吸着量は0.26mgCr_2O_7^<2->/g dry cellsであった。生菌体を固定したビーズを含むリアクターを用いた時は、0.56mgCr_2O_7^<2->/g dry cellsであり、リアクターではなく、乾燥菌体のみを用いて六価クロムを吸着させ、遠心除去した時の値と同じであった。このことから、菌体をビーズに固定し、リアクターを作製することで、遠心集菌の操作を省くことが可能となった。
触媒活性部位での多元的協調作用を活用する人工酵素の開発

1.触媒的不斉分子内アミノカルボニル化反応の開発Pd-SPRIX触媒は、メタノール中、一酸化炭素雰囲気下、環化反応と一酸化炭素挿入反応が連続して進行することで、アルケニルアミドから環状□-アミノ酸誘導体を与える。よりルイス酸性の高いPd金属塩を用い、嵩高い置換基を有する配位子から調製したSPRIX系触媒を用いれば、さらに効率的かつ高エナンチオ選択的に反応が進行すると考えた。検討の結果、[Pd(CH_3CN)_4](BF_4)_2と(M,S,S)-i-Pr-SPRIXから調製した不斉触媒を用いると、アルケニルウレアから化学収率92%、不斉収率86%eeで二環式合窒素化合物が得られることがわかった。2.SPRIX配位子の効率的光学分割法の開発SPRIXとキラルなPd錯体とでジアステレオマー錯体を調製し、再結晶などの簡便操作によるSPRIX配位子の効率的光学分割を試みた。ラセミ体SPRIXに対してシクロパラデート化合物を0.5モル当量用いて、メタノール中で錯体生成反応を行い、4当量のNH_4PF_6で処理することにより、ジアステレオマー錯体混合物を収率87%で得た。この混合物を分別再結晶した後、1,2-bis(diphenylphosphino)ethane(dppe)との配位子交換反応により、光学的に純粋なSPRIXを得ることに成功した。3.新規スピロ型配位子のコンビナトリアル合成置換基とスピロ環サイズが異なり、さらに金属への配位部位としてイソオキサゾリン、イソオキサゾールを持った新規スピロ型配位子のコンビナトリアル合成を行った。マロン酸ジエチルを出発原料として、様々なハロゲン化ホモアリルとの反応により多様な新規スピロ型配位子の効率的合成に成功した。(1)二重活性化機構を持つ触媒系による不斉Morita-Baylis-Hillman反応の開発Morita-Baylis-Hillman(MBH)反応は、アミンやホスフィン類を触媒として進行するα,β-不飽和カルボニル化合物とアルデヒドの付加反応である。今回、二種の異なる金属を構成要素とする複合金属触媒とルイス塩基との二重活性化による、エナンチオ選択的MBH反応を検討した。我々が以前開発した、Al-Li-bis(plnaphthoxide)錯体(ALB)あるいは、La-Li_3-tris(binaphthoxide)錯体(LLB)をLewis塩基であるBu_3Pと組み合わせた場合には満足のいくエナンチオ選択性は見られなかったものの、BH_3・THF、BuLiおよび、BINOLを1:1:2の比で混合して調製したB-Li-bis(binaphthoxide)錯体(A型BLB;16mol%)とBu_3P(10mol%)を用いると、定量的に、46%eeで目的物が得られた。本反応において、Lewis塩基の添加は必須であった。ホウ素を含む錯体を種々調製して検討した結果LIB(s-Bu)_3HとBINOLを1:1で混合して調製したB-Li-binaphthoxide錯体(B型BLB)を用いると高い光学純度で目的物が得られた。B型BLBは、環状エノンを基質とするMBH反応において、高エナンチオ選択性を示す初めての触媒である。本触媒は、ある程度の基質一般性も示し、シクロヘキセノンとイソプロピルアルデヒドとの反応では99%eeを達成することができた。本反応の展開として、金属を含まない不斉有機分子触媒を酸-塩基型触媒と.して用い、α,β-不飽和カルボニル化合物とイミンとの付加反応であるaza-MBH反応の開発にも成功した。(2)二核バナジウム触媒による2-ナフトール類の酸化カップリング反応触媒的不斉酸化カップリング反応において、触媒を構成する二つのバナジウムがそれぞれ協調して2分子の2-ナフトール誘導体を活性化できれば、光学活性なビナフトール誘導体が得られる。触媒の溶解度やエナンチオ選択性の向上を期待して様々な二核バナジウム錯体を合成して、2-ナフトール誘導体の酸化的カップリング反応に適用した。ビナフチル骨格の触媒と比較して、活性の低下が見られた触媒もあったものの、エナンチオ選択性についてはいずれもビナフチル骨格をしのぐ結果が得られた。ラセミ体SPRIXに対してシクロパラデート

化合物を0.5モル当量用いて、メタノール中で錯体生成反応を行い、4当量のNH_4PF_6で処理することにより、ジアステレオマー錯体混合物を収率87%で得た。この混合物を分別再結晶した後、1,2-bis(diphenylphosphino)ethane(dppe)との配位子交換反応により、光学的に純粋なSPRIXを得ることに成功した。3.新規スピロ型配位子のコンビナトリアル合成置換基とスピロ環サイズが異なり、さらに金属への配位部位としてイソオキサゾリン、イソオキサゾールを持った新規スピロ型配位子のコンビナトリアル合成を行った。マロン酸ジエチルを出発原料として、様々なハロゲン化ホモアリルとの反応により多様な新規スピロ型配位子の効率的合成に成功した。
蝸牛有毛細胞の収縮における細胞内情報伝達機構と聴覚伝達機構との関係

平成11年度末までに、電気刺激による内耳蝸牛外有毛細胞の遅い収縮は、収縮時には細胞の体積が減少する水の動きより起こっており、この水の移動には、ω-コノトキシン感受性カルシウムチャネルを介する細胞外カルシウムイオンの流入にて活性化されるBK型カリウムチャネルよりのカリウムイオンの流出とフロセミド感受性塩素イオンチャネルよりの塩素イオンの流出が各々独立して関与していることを解明した。さらにBK型カリウムチャネルの活性化にカルシウム・カルモデュリンカイネースIIが関与していることを解明し、タイプ1と2A蛋白セリン/スレオニン脱リン酸化酵素の阻害薬であるカリクリンAにより、外有毛細胞の電気刺激による収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化が消失することを解明した。この外有毛細胞の収縮に関与するカリウムチャネルの活性化にはオカダ酸感受性の蛋白脱リン酸化が抑制的に関与し、また塩素イオンチャネルの活性化にはカリクリンA感受性の蛋白脱リン酸化が関与していることが示唆された。また一般に蝸牛内有毛細胞は、収縮機能を持たないと考えられてきた。しかし、我々は外有毛細胞に加えたものと同様の矩形波電気刺激を負荷することにより収縮機能が蝸牛内有毛細胞にも存在することを確認した。その収縮は、外有毛細胞と同じように体積減少と細胞内塩素イオン濃度の減少を同期して伴っていることが解明された。実際、内有毛細胞と外有毛細胞の細胞膜やその下部構造は近いという報告は存在している。この内有毛細胞の収縮は、電気刺激の強度と刺激時間との積に対して外有毛細胞と同様に一定の閾値を持つことも解明された。今後、この内有毛細胞の収縮に関与する塩素イオンチャネルの解明を進めることにより各有毛細胞の機能の同位・相違点より聴覚機構を解明していきたい。平成9年度までに、電気刺激による内耳蝸牛外有毛細胞の遅い収縮には、ω-コノトキシン感受性PまたはN型カルシウムチャネルを介する細胞外カルシウムイオンの流入にて活性化される、BK型カリウムチャネルよりのカリウムイオンの流出とフロセミド感受性塩素イオンチャネルよりの塩素イオンの流出が各々独立して関与することを解明している。さらにBK型カリウムチャネルの活性化にカルシウム・カルモデュリンカイネースIIが関与していることを解明している。平成9年度は、前記の実験をさらに進めた。蛋白脱リン酸化酵素阻害薬:カリクリンA,オカダ酸,カンタリジン,デルタメスリン,ベンジルホスホン酸のうち、タイプ1と2A蛋白セリン/スレオニン脱リン酸化酵素の阻害薬であるカリクリンAにより、外有毛細胞の電気刺激による収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化は消失した。この阻害作用は、カリウムイオンコンダクタンスを高めるバリノマイシン存在下やカルシウムイオンコンダクタンスを高めるA23187存在下でも認められたが、塩素イオンの透過性を高めた状態では認められなかった。また蛋白セリン/スレオニン脱リン酸化酵素を活性化するNアセチルスフィンゴシンにより、外有毛細胞の電気刺激による収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化は消失した。この作用は、バリノマイシンやタイプ2A蛋白脱リン酸化酵素阻害薬であるオカダ酸存在下では認められなかった。今回の結果より外有毛細胞の収縮に関与するカリウムチャネルの活性化にはオカダ酸感受性の蛋白脱リン酸化が抑制的に関与し、また塩素イオンチャネルの活性化にはカリクリンA感受性の蛋白脱リン酸化が関与していることが示唆された。

平成10年度末までに、我々は、電気刺激による内耳蝸牛外有毛細胞の遅い収縮にはω-コノトキシン感受性PまたはN型カルシウムチャネルを介する細胞外カルシウムイオンの流入にて活性化される、BK型カリウムチャネルよりのカリウムイオンの流出とフロセミド感受性塩素イオンチャネルよりの塩素イオンの流出が各々独立して関与することを解明した。さらにBK型カリウムチャネルの活性化にカルシウム・カルモデュリンカイネースIIが関与していることを解明し、さらに蛋白脱リン酸化酵素阻害薬:カリクリンA,オカダ酸,カンタリジン,デルタメスリン,ベンジルホスホン酸のうち、タイプ1と2A蛋白セリン/スレオニン脱リン酸化酵素の阻害薬であるカリクリンAにより、外有毛細胞の電気刺激による収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化が消失することを解明した。この阻害作用がカリウムイオンコンダクタンスを高めるバリノマイシン存在下やカルシウムイオンコンダクタンスを高めるA23187存在下でも認められるが、塩素イオンの透過性を高めた状態では認められないことを確認した。また蛋白セリン/スレオニン脱リン酸化酵素を活性化するNアセチルスフィンゴシンにより、外有毛細胞の電気刺激による収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化は消失した。この作用は、バリノマイシンやタイプ2A蛋白脱リン酸化酵素阻害薬であるオカダ酸存在下では認められなかった。これらの結果より外有毛細胞の収縮に関与するカリウムチャネルの活性化にはオカダ酸感受性の蛋白脱リン酸化が抑制的に関与し、また塩素イオンチャネルの活性化にはカリクリンA感受性の蛋白脱リン酸化が関与していることが示唆された。一方で、同様の電気刺激による収縮機能が蝸牛内有毛細胞にも存在することが確認された。現在、その機能の解明と内有毛細胞持つ機構の解明を進めている。平成11年度末までに、電気刺激による内耳蝸牛外有毛細胞の遅い収縮は、収縮時には細胞の体積が減少する水の動きより起こっており、この水の移動には、ω-コノトキシン感受性カルシウムチャネルを介する細胞外カルシウムイオンの流入にて活性化されるBK型カリウムチャネルよりのカリウムイオンの流出とフロセミド感受性塩素イオンチャネルよりの塩素イオンの流出が各々独立して関与していることを解明した。さらにBK型カリウムチャネルの活性化にカルシウム・カルモデュリンカイネースIIが関与していることを解明し、タイプ1と2A蛋白セリン/スレオニン脱リン酸化酵素の阻害薬であるカリクリンAにより、外有毛細胞の電気刺激による収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化が消失することを解明した。この外有毛細胞の収縮に関与するカリウムチャネルの活性化にはオカダ酸感受性の蛋白脱リン酸化が抑制的に関与し、また塩素イオンチャネルの活性化にはカリクリンA感受性の蛋白脱リン酸化が関与していることが示唆された。また一般に蝸牛内有毛細胞は、収縮機能を持たないと考えられてきた。しかし、我々は外有毛細胞に加えたものと同様の矩形波電気刺激を負荷することにより収縮機能が蝸牛内有毛細胞にも存在することを確認した。その収縮は、外有毛細胞と同じように体積減少と細胞内塩素イオン濃度の減少を同期して伴っていることが解明された。実際、内有毛細胞と外有毛細胞の細胞膜やその下部構造は近いという報告は存在している。この内有毛細胞の収縮は、電気刺激の強度と刺激時間との積に対して外有毛細胞と同様に一定の閾値を持つことも解明された。
シナプス可塑性の可視化による脳統合機能マッピング

本研究課題は、脳内の情報の統合によって生じる記憶痕跡の存在様式を調べる事で、全く新しい視点での脳統合機能マッピングを作成する事を目的としている。まずは、海馬においてin vivoで慢性刺激電極を使って歯状回に長期増強現象(LTP)を誘導し、AMPA受容体サブユニットGluR1を特異的に標識したところ、新たにGluR1陽性となるシナプスが30%程度存在することが明らかになった。このことは、もしシナプス内に新たに取りこまれるGluR1を特異的に標識することが出来れば、テタヌス刺激によって可塑性が誘導されたシナプスを可視化することが出来る可能性を示している。そこで、GluRlをタグによってパルス標識し、記憶形成後一定時間にタグ陽性シナプスの分布を検索することを試みた。まずは、biotin ligaseによるパルス標識とCA6D4タグと新規化学プローブによるパルス標識を試みたが、現在のところまだ十分なシグナルノイズ比を得るところまで行っていない。並行してGFPでタグ化されたGluR1のLTP誘導後の動きを経時的に追跡しているところである。一方、小脳の平行線維-プルキンエ細胞シナプスの可塑性については、LTD誘導後に週から月単位にわたって持続する新たな電子顕微鏡的構造変化を見出した。これは、シナプス自体とスパインの消失である。水平性視機性眼球運動という単純な小脳運動学習のモデルと間欠的な学習プロトコルを用いることによって、わずか4時間で50%におよぶシナプスを消失させることが出来る。この現象は、LTD誘導に必須のmGluRlaをプルキンエ細胞で欠損しているマウスでは、認めることが出来ないことから、LTD誘導に引き続いて起こる記憶の安定化に関わっていると考えられる。シナプスの消失率が極めて高いことから、分子層の平行線維-プルキンエ細胞シナプス密度を計測することによって、記憶に関係している領域を特定することが可能となった。神経細胞は環境変化に反応し・適応するため、シナプス可塑性を持っている。本研究では、シナプス可塑性を可視化するために生体膜上分子の局在をナノスケールで可視化し、脳の統合機能の局在を明らかにすることを目的とする。本年度は膜タンパク分子の新しい可視化技術解析として、従来の凍結割断レプリカ免疫標識法に、新規ナノ粒子標識法を組み合わせ、高空間分解能をもった多重標識法の確立をめざした。極小(1.4nm)金粒子マーカーを直接可視化し、従来のレプリカ標識法に比べて高い標識効率を得られる可能性を示した:ラット・マウスの小脳および海馬を用いて凍結割断レプリカ試料を作製し、グルタミン酸受容体に対する標識を行った。これまでに、5nm^-、10nm^-、15nm^-の金粒子で標識した二次抗体を用いたレプリカ標識法が確立されているが、今回、新規の試みとして、1.4nm金粒子標識抗体を利用し、より高い標識効率と空間解像度を得ることを目指した。通常の透過型電子顕微鏡観察では1.4nm金粒子は観察できないが、STEM暗視野観察法によって粒子を直接可視化することに成功した。さらに、グルタミン酸受容体δ2サブユニットに対する標識において、5nm金粒子標識に比べて約3倍の標識効率を得られることが示された。今後、受容体内における複数のサブユニットを区別して標識するといった応用法が可能になると考える。
プロスタグランジンD合成酵素の立体構造決定と反応機構の解明

プロスタグランジンD_2合成酵素(PGDS)はプロスタグランジンH_2からプロスタグランジンD_2への異性化を触媒し、睡眠等の脳内活動の制御に関与する重要な酵素である。しかしながら、9,11-エピジオキシ基に特異的に作用するという興味深い性質を持つにも関わらず、その反応機構は解明されていない。PGDSはアミノ酸配列の相同性から疎水性低分子輸送に関与するリポカリンファミリーに属するが、このファミリー中で唯一酵素活性を有している。また、PGD合成酵素がレチノイン酸と強く結合することも示されている。そこで、本研究ではNMRを用いた溶液中の立体構造解析によりPGDSの反応機構を解明することを目的として、試料の大量発現系の構築及びNMRスペクトルの測定を行った。NMR測定に必要な20-40mgの試料を効率的かつ経済的に得るために、1-2Lの大腸菌培養でNMR測定に必要な量を確保出来るようにした。既にPGDSのcDNAはラットより純化DNAの形で単離され、大腸菌K2株の誘導体JM109をベクターとしてプラスミドpUC119に組み込まれているる培養条件、精製条件の検討を行いLB培地及びM9最小培地で目的蛋白質10mg/L-20mg/L以上の収量を達成した。そして、M9最小培地で大腸菌の栄養源に^<13>Cラベル化グルコース、^<15>Nラベル化塩化アンモニウムを用いて産出される蛋白質を100%NMR観測可能な安定同位体でラベルした。安定同位体ラベルした蛋白質のNMR試料を用いて2次元及び3次元NMRスペクトルの測定を行ない、PGDSのNMRシグナルの帰属を行った。多次元NMR法を用いることによりシグナルの分離が達成されシグナルの重なり合いの問題が解消された。得られたシグナル帰属をもとに主鎖間のNOE情報等によりPGDS中にローシート構造を見いだした。^<15>N-^1H HMQCスペクトルの結果から約3%の主鎖アミドプロトンのNMRシグナルに顕著な線幅増大が観測され、PGDS中にフレキシブルな領域が存在することが明らかとなった。このことはPGDSがレチノイン酸とPGH_2の両方と結合できることと関連していると考えられた。プロスタグランジンD合成酵素(PGDS)はプロスタグランジンH_2からプロスタグランジンD_2への異性化を触媒し、睡眠等の脳内活動の制御に関与する重要な酵素である。そこで、本研究ではNMRを用いた溶液中の立体構造決定によりPGDSの反応機構を解明することを目的として、試料の大量発現系の構築等を行った。既にPGDSのcDNAはラットより純化DNAの形で単離され、大腸菌K2株の誘導体JM109をベクターとしてプラスミドpUC119に組み込まれている。

培養条件、精製条件の検討を行いLB培地及びM9最小培地で目的蛋白質10mg/L-20mg/L以上の収量を達成した。そして、M9最小培地で大腸菌の栄養源に^<13>Cラベル化グルコース、^<15>Nラベル化塩化アンモニウムを用いて産出される蛋白質を100%NMR観測可能な安定同位体でラベルした。この時、ラベル化合物のコストを考慮してM9最小培地で必要なグルコース、塩化アンモニウムの量を最小限に抑えるようにした。^<15>N-^1HHMQCスペクトルではPGDSの立体構造を反映して各ピークの化学シフト値は分散していた。またβシートに特徴的な低磁場シフトしたCαHシグナルが観測された。現在、COSY、NOESY等の2次元NMRスペクトル及びNOESY-HMQC、TOCSY-HMQC等の3次元NMRスペクトルによりシグナルの帰属を行っている。プロスタグランジンD合成酵素(PGDS)はプロスタグランジンH_2からプロスタグランジンD_2への異性化を触媒し、睡眠等の脳内活動の制御に関与する重要な酵素である。しかしながら、9,11ーエピジオキシ基に特異的に作用するという興味深い性質を持つにも関わらず、その反応機構は解明されていない。そこで、本研究ではNMRを用いた溶液中の立体構造決定によりPGDSの反応機構を解明することを目的として、試料の大量発現系の構築及びNMRスペクトルの解析を行った。NMR測定に必要な20ー40mgの試料を効率的かつ経済的に得るために、1-2Lの大腸菌培養でNMR測定に必要な量を確保出来るようにした。既にPGDSのcDNAはラットにより純化DNAの形で単離され、大腸菌K2株の誘導体JM109をベクターとしてプラスミドpUC119に組み込まれている。培養条件、精製条件の検討を行いLB培地及びM9最小培地で目的蛋白質10mg/Lー20mg/L以上の収量を達成した。安定同位体ラベルした蛋白質のNMR試料を用いて2次元及び3次元NMRスペクトル(DQF-COSY,TOCSY,NOESY,3D HMQC-NOESY,3D HMQC-TOCSY,3D HNCO,3D HNCA)の測定を行ない、PGDSのNMRシグナルの帰属を行った。多次元NMR法を用いることによりシグナルの分離が達成されシグナルの重なり合いの問題が解消された。得られたシグナル帰属をもとに主鎖間のNOE情報等により主にβーシートより構成されるPGD合成酵素の2次構造が明らかになりつつある。プロスタグランジンD合成酵素(PGDS)はプロスタグランジンH2からプロスタグランジンD2への異性化を触媒し、睡眠等の脳内活動の制御に関与する重要な酵素である。しかしながら、9,11-エピジオキン基に特異的に作用するという興味深い性質を持つにも関わらず、その反応機構は解明されていない。PGDSはアミノ酸配列の相同性から疎水性低分子輸送に関与するリポカリンファミリーに属するが、このファミリー中で唯一酵素活性を有している。また、PGD合成酵素がレチノイン酸と強く結合することも示されている。
四肢の運動知覚における一次運動野および右半球の役割

研究代表者は、手首の腱への振動刺激によって惹起される手首の運動錯覚経験中に脳の運動関連領域が関与することを明らかにしてきた(Naito 2004 a, b ; Naito et al.1999, 2002 a, b ; Naito & Ehrsson 2001)。この錯覚は振動刺激が筋紡錘からの求心性Ia線維を活動させるために起こることが知られており、四肢が全く動かないにも関わらず被験者は明瞭な四肢の動きを経験する。古典的な研究(Penfield & Rasmussen, 1950)より、この運動関連領域には体部位再現があることが知られており、ある部位はそれに対応する四肢の動き制御に関係することが知られている。先行研究(Naito et al, (2005) J Neurophysiol)では、右手または左手の運動錯覚中に、反対側運動野、運動前野、同側小脳などの手領域が賦活すると同時に、手の左右にかかわらず両側の補足運動野と右半球の6野前部、2野、44野、縁上回(ip1野)及び頭頂弁蓋部(op1野)が賦活することを明らかにした。さらに右半球の6野、44野、縁上回及び頭頂弁蓋部は左半球の対応する部位に比べて有意に脳活動が高いことを示した。これを受けて、まず初めに、右手、左手、右足、左足で、被験者が運動錯覚を経験している最中に、筋紡錘からの求心性感覚情報処理に運動関連領域の体部位再現部がそれぞれ関与するかを機能的核磁気共鳴装置で調べた。この結果、それぞれの四肢の運動錯覚には反対側運動野、運動前野、補足運動野尾側部、帯状回運動皮質尾側部、同側小脳の体部位再現部位が関与することが明らかとなった。これらの事実は運動関連領野の体部位再現部位(ホムンクルス)が運動を実行することなく、対応する四肢からの動きに関するフィードバック情報処理にも関与することを意味している。従来まで、運動実行に関与すると考えられてきた(Penfieldら1950)、運動領域のホムンクルスに運動感覚情報処理機能があることを示した。加えて、四肢特有の情報は補足運動野および帯状回運動皮質吻側部において、両手からの情報、同側四肢(右手右足)からの情報が統合され、さらに前方部において最終的に全ての四肢からの情報が収束している事実を発見した。同時にNaito et al.(2005)で報告された右半球領域は右手、左手、右足、左足の錯覚中にも共通に賦活することも確かめられ、これらの領域が四肢特有の情報処理というよりは、さらに高次の機能を担うことが示された。この結果に関しては、既に複数の学会およびシンポジウムで発表されており、現在のところ論文投稿の準備をしている。人間が手や腕を正確に制御するためには、脳がそれらの位置を知っている必要がある。このとき重要になる感覚は筋骨格系からの情報である固有受容器感覚である。本研究では、右手首、左手首、右足首または左足首の腱に振動刺激を与え、その四肢の動きの錯覚を惹起し、そのときの脳内賦活部位を機能的核磁気共鳴画像法(fMRI)を用いて同定した。錯覚中は実際の手の動きを伴わない。その結果、錯覚を経験している四肢とは反対側の一次運動野、補足運動野、帯状回運動皮質および同側小脳のそれぞれの四肢に対応する体部位再現部位が錯覚経験に関与することが明らかとなった。これらの領域は通常それぞれの四肢の運動実行に関与することが知られており、四肢の動きのフィードバック情報が体性感覚領域ではなく運動領域で処理されることが明らかとなった。また四肢の相違にもかかわらず右半球の運動前野吻側部、2野、44,45野、縁上回が共通に錯覚経験に関与することも明らかとなった。さらに、経頭蓋磁気刺激(TMS)を用いて、運動錯覚経験への一次運動野の関与は、手首伸展筋の腱への振動刺激を停止した場合に起こるafter-effect経験中にも確認された。これらの一部は既に論文として掲載されている。

これを受けて、まず初めに、右手、左手、右足、左足で、被験者が運動錯覚を経験している最中に、筋紡錘からの求心性感覚情報処理に運動関連領域の体部位再現部がそれぞれ関与するかを機能的核磁気共鳴装置で調べた。この結果、それぞれの四肢の運動錯覚には反対側運動野、運動前野、補足運動野尾側部、帯状回運動皮質尾側部、同側小脳の体部位再現部位が関与することが明らかとなった。これらの事実は運動関連領野の体部位再現部位(ホムンクルス)が運動を実行することなく、対応する四肢からの動きに関するフィードバック情報処理にも関与することを意味している。従来まで、運動実行に関与すると考えられてきた(Penfieldら1950)、運動領域のホムンクルスに運動感覚情報処理機能があることを示した。加えて、四肢特有の情報は補足運動野および帯状回運動皮質吻側部において、両手からの情報、同側四肢(右手右足)からの情報が統合され、さらに前方部において最終的に全ての四肢からの情報が収束している事実を発見した。同時にNaito et al.(2005)で報告された右半球領域は右手、左手、右足、左足の錯覚中にも共通に賦活することも確かめられ、これらの領域が四肢特有の情報処理というよりは、さらに高次の機能を担うことが示された。この結果に関しては、既に複数の学会およびシンポジウムで発表されており、現在のところ論文投稿の準備をしている。
長鎖共役系不飽和炭化水素配位子を有する有機金属化合物の合成

長鎖不飽和炭化水素配位子を有する錯体の最もシンプルな例としてアレニルあるいはプロパルギル錯体が挙げられる。これらの錯体はη^1-の状態での配位においては末端炭素でしか反応しないが、η^3-アレニル/プロパルギルの配位状態の変換することで中心炭素においても反応することが知られている。これらの反応性はすべて単核錯体におけるものであり長鎖不飽和炭化水素配位子を有する錯体を安定に単離するには複核の錯体の方が有利と考えられる。しかし、それに対応するη^3-アレニル/プロパルギル二核錯体については、いくつかの例が知られてはいるものの、その数は非常に少ない。そこでまず、これらの二核錯体の合成、および構造と反応性の解明を行った。すでにη^3-アリルパラジウム錯体とパラジウムゼロ価錯体との反応においてη^3-アリルパラジウム二核錯体の合成に成功しており、これを応用することでη^3-アレニル/プロバルギル二核錯体の合成に成功した。このうち、置換基がすべて水素である錯体については、X線構造解析を行うことによりその配位様式を決定した。これらの二核錯体においては、η^3-アレニル/プロパルギル配位子は、直線構造を保っている。又、この錯体は、別途合成したη^3-アレニル/プロパルギルカチオン性錯体、及び中性錯体と、明らかに違う反応性を示した。
骨吸収過程における破骨細胞と骨芽細胞の役割の解析

近年、骨細胞生物学の進歩により骨改造過程が細胞レベルで明らかにされつつある。その中で特に注目されているのは、骨吸収過程における骨芽細胞と破骨細胞の役割を解析することである。そこで、本研究ではin vitroで骨芽細胞と破骨細胞の機能を解析することを目的として実験を行い、医科の結果を得た。骨芽細胞の機能の解析:骨吸収過程で骨芽細胞はコラゲナ-ゼを産生し、直接骨基質を破壊している可能性があるため、種々の実験を行い次のような結果を得た。(1)ラット骨肉腫細胞であるUMR-106と我々が新生児ラット頭蓋冠より樹立した5種類のクロ-ン化骨芽細胞様細胞におけるコラゲナ-ゼ産生能をウサギ抗体ラットコラゲナ-ゼ抗体を用いて免疫組織顎的に検索した。その結果、全ての細胞がコラゲナ-ゼを産生していることが明らかとなった。(2)洗剤型で分泌されたコラゲナ-ゼの活性窩過程で重要と考えられている組織プラスミノ-ゲンアクチ-タ-の産生能を免疫組織学的に検討した結果、前述した全てのクロ-ンで産生が認められた。(3)FITC標識コラ-ゲンを用いて核クロ-ンのコラゲナ-ゼ活性を測定した。その結果、この測定法ではPTH,1,25(OH)_2D_3などの骨吸収促進物質で細胞を刺激しても有意なコラゲナ-ゼ活性の上昇が認められなかった。そのため、さらに感度の良い〔^<14>C〕標識コラ-ゲンなどを用いて検討する必要があると考えられた。(4)〔^3H〕-プロリンで標識した新生児ラット頭蓋骨より骨芽細胞を除去後、その上で核クロ-ン化細胞を培養し、〔^3H〕-プロリンの培養液中への放出を測定することにより骨基質の破壊度を検討した。その結果、1,25(OH)_2D_3は、骨基質の破壊を促進することが示唆された。破骨細胞の役割の解析:(1)in vitroでマウス骨髄細胞より公立よく破骨細胞様細胞を形成できる系を樹立した。(2)この系を用いて、1,25(H)_2D_3,PTH,1L-1,PGE_2などは破骨細胞形成を促進し、calcitonin,interferon γなどは破骨細胞形成を抑制することを明らかにした。(3)マウス脾細胞と新生児マウス頭蓋骨より分離した骨細胞様細胞を1,25(OH)_2D_3とデキサメサゾン存在したで共培養すると、破骨細胞様細胞が形成されることを見い出した。この場合、破骨細胞様細胞の形成には骨芽細胞の存在が重要であることも明らかにした。

昭和63年度には以下のような研究を行った。1.骨芽細胞による骨基質の破壊について樹立した骨芽細胞様細胞およびラット骨肉腫由来のUMR 106-01のコラゲナーゼ活性を螢光標識コラーゲンを用いたアッセイキットで検討したが、明らかな活性が検出できなかった。その理由として次のことが考えられた。1)牛胎児血清を添加して培養したため、血清中のインヒビターがコラゲナーゼ活性を阻害した。2)骨芽細胞様細胞がコラゲナーゼインヒビター(TIMP)を同時に産出しているためコラゲナーゼ活性が検出できない。3)螢光標識コラーゲンを用いたアッセイ法の感度が低い。1の問題点に対しては合成無血清培地を用いて検討したが活性が検出できなかった。そのため現在2)の問題点にたいして培養液中のTIPMを単クローン抗体を用いて除去することを検討中で、3)にたいしては^1Cでラベルしたコラーゲンを用いたより感度の高いアッセイ法で検討中である。また、ラット新生児頭蓋骨の表層の細胞層を次亜塩素酸ナトリウム処理で除去後、その上で骨芽細胞様細胞を培養し、骨表層の類骨層の動態を観察した。さらに、^3C-プロリンでラベルした骨片上で骨芽細胞様細胞を培養し、培養液中に放出されるアイソトープ量を測定し骨基質の破壊の程度を検討した。しかし、両者の実験系も骨芽細胞による骨破壊能を同定出来なかった。この原因としても前述したコラゲナーゼ活性が検出できなかったのと同様のことが考えられるため、現在検討中である。以上のように今年度は培養骨芽細胞による骨破壊能を明らかにできなかったが、日本骨代謝学会誌(1989)に「骨のコラゲナーゼ」と題し、現在までの我々の知見と諸家の見解をまとめ総説として発表した。2.破骨細胞による骨吸収について共同研究者の高橋らは脾細胞からの破骨細胞様細胞の形成で、骨芽細胞様細胞が重要な役割をはたししていることを明らかにし、発表した。近年、骨細胞生物学の進歩により、骨改造過程が細胞レベルで明らかにされつつある。その中でも特に注目されているのは、骨吸収過程における骨芽細胞と破骨細胞の役割を解析することである。そこで、本研究ではin vitroで骨芽細胞と破骨細胞の機能を解析することを目的として実験を行い、以上の結果を得た。骨芽細胞の機能の解析:骨吸収過程で骨芽細胞はコラゲナ-ゼを産生し、直接骨基質を破壊している可能性があるため、種々の実験を行い次のような結果を得た。(1)ラット骨肉腫細胞であるUMRー106と我々が新生児ラット頭蓋冠より樹立した5種類のクロ-ン化骨芽細胞様細胞におけるコラゲナ-ゼ産生能をウサギ抗ラットコラゲナ-ゼ抗体を用いて免疫組織学的に検索した。その結果、全ての細胞がコラゲナ-ゼを産生していることが明かとなった。(2)潜在型で分泌されたコラゲナ-ゼの活性化過程で重要と考えられている組織プラスミノ-ゲンアクチベ-タ-の産生能を免疫組織学的に検討した結果、前述した全てのクロ-ンで産生が認められた。(3)FITCー標識コラ-ゲンを用いて各クロ-ンのコラゲナ-ゼ活性を測定した。その結果、この測定法ではPTH、1,25(OH)_2D_3などの骨吸収促進物質で細胞を刺激しても有意なコラゲナ-ゼ活性の上昇が認められなかった。そのため、さらに感度の良い[^<14>C]標識コラ-ゲンなどを用いて検討する必要があると考えられた。(4)[^3H]ープロリンで標識した新生児ラット頭蓋骨より骨芽細胞を除去後、その上で各クロ-ン化細胞を培養し、[^3H]ープロリンの培養液中への放出を測定することにより骨基質の破壊度を検討した。