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ラウス肉腫ウイルスsrc遺伝子産物のドメイン構造の解析

ラウス肉腫ウイルスのがん遺伝子(src)産物"p【60^(src)】"は、その遺伝子の塩基配列から導かれたアミノ酸の一次配列が明らかになっているが、その高次構造についてはほとんど研究されておらず、その機能に関しても、タンパク質リン酸化酵素の活性をもつこと以外に明確になったものはない。本研究では、p【60^(src)】の高次構造を構成するドメイン構造を理論的及び実験的に解析し、その中での機能的ドメイン(リン酸化活性部位等)との対応関係を明確にすること、またその際、機能未知のドメイン構造の存在の可能性についても明らかにすることを目的とした。そのためにまず、精製p【60^(src)】を調製し、トリプシンによる限定加水分解を行った。その結果、p【60^(src)】のもつタンパク質リン酸化活性はトリプシン耐性であるのに対し、p【60^(src)】が同時に持っていると考えられていたイノシトールリン脂質をリン酸化する活性はトリプシン感受性であった。これらの活性を担うドメインは、再構成脂質膜への結合実験からも別々のポリペプチドに存在していると考えられたので、両者の分離を試みた結果、カゼインアガロースクロマトグラフィーを行うことによって、また、抗血清を用いた免疫沈降法によっても分離可能であることが明らかとなった。一方、コンピューターを用いた理論的構造解析からは、p【60^(src)】のいくつかの構造的特徴が明らかになった。その内の1つは、p【60^(src)】の一次構造上で、すでに知られていたcAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素(A-キナーゼ)とのホモロジーを示す領域以外の部位に、いくつかのタンパク質との局所的ホモロジーが見出されたことである。特に、A-キナーゼに次ぐ高いホモロジーを与えるものとして、ケラチン等の中間径線維タンパク質があげられる。抗ケラチン抗体を調製して行った予備的実験から、p【60^(src)】が抗ケラチン抗体と反応するという結果を得たので、現在さらに実験的検証を進めている。
Inflammasome抑制による薬物的大動脈瘤根治療法の開発

大動脈瘤は破裂死に至る臨床上重要な疾患であるが、発症原因は未だ不明である。本研究では、大動脈瘤壁細胞への異常な伸展刺激と大動脈瘤の中心病態である慢性炎症との関連を検討した。すなわち、マクロファージは、細胞進展刺激に応答して炎症シグナルを活性化し、さらに炎症性サイトカインの分泌を亢進した。また、このマクロファージの刺激応答は、自然免疫における炎症惹起蛋白複合体inflammasomeのエフェクター分子であるCaspase-1の阻害剤で抑制された。大動脈瘤罹患率は本邦においても増加傾向にあるが、外科手術が唯一の治療法である現状では、破裂死亡数の大幅な減少は期待できないため、病態解明と、より理想的な治療法開発が急務である。従来の研究から我々は、代表的ストレス応答分子c-Jun N-ternimal kinase(JNK)が、大動脈瘤治療における標的分子の一つであることを示した。実際ヒト大動脈瘤においてJNKは著明に活性化しているが、大動脈瘤の発症原因ならびにJNK活性化のメカニズムは不明である。研究代表者らは、大動脈瘤壁細胞の異常な伸展刺激がinflammasomeを介して大動脈瘤の中心病態である慢性炎症を引き起していると仮説した。平成19年度は、主たる大動脈瘤壁細胞であるマクロファージと血管平滑筋細胞の培養細胞を用いた伸展刺激実験系を確立した。10%の伸長変化かつ30Hz周期性の伸展刺激によって、マクロファージ及び血管平滑筋細胞のJNK活性化を認めた。同時にマクロファージにおいては、炎症性サイトカインの分泌が検出された。同実験系においてinflammasomeの抑制実験を行うために、inflammasomeの主要構成タンパクであるASCのsiRNA(RNA干渉法)の導入法を確立した。実際、Asc siRNA導入後には、ASC蛋白発現の顕著な抑制をウエスタンブロット法で確認している。また、ASCノックアウトマウスの入手を計画した。平成20年度は、siRNA法およびノックアウトマウスの利用によって、inflammasomeの抑制実験を行い、伸展刺激による炎症応答メカニズムにinflammasomeが必須であることを証明する予定である。同時に、マウス動脈瘤モデルにおいてinflammasomeを抑制し、仮説をin vivoにおいても証明する。従来の研究から我々は、代表的ストレス応答分子c-Jun N-ternimal kinase (JNK)が、大動脈瘤治療における標的分子の一つであることを示した。平成19年度は、主たる大動脈瘤壁細胞であるマクロファージと血管平滑筋細胞の培養細胞を用いた伸展刺激実験系を確立し、伸展刺激によるJNK活性化と炎症性サイトカイン分泌を認めた。平成20年度は、inflammasomeの構成要素であるASCの遺伝子欠損マウスを入手し、inflammasomeの抑制実験を行った。野生型マウス由来のマクロファージで観察された伸展刺激による炎症性サイトカインの分泌亢進は、ASC遺伝子欠損マウス由来のマクロファージでは、認められなかった。すなわち、伸展刺激による炎症応答メカニズムにinflammasomeが必須であることが示された。現在、大動脈瘤形成におけるinflammasomeの役割を検証するために、野生型マウスとASC遺伝子欠損マウスを用いて、瘤形成モデル実験を実施中である。
ヒトの随意的手指運動制御機構とその特性の解析

随意的把握運動の際、我々は扱う物体により特定の把握形態を選択する。本研究の目的はこのような運動パターン選択に伴い運動に変化が生じるか、それはどのような神経系の変化を伴うかを明らかにすることである。正常被験者(n=7)に2枚の水平なplateを2本の指で保持してもらう。1回の試行では、pre-load、dynamic.(0.5s間romp状に3Nまで増加)、static(2s間3Nで加重)phaseからなるplateへの負荷(指から逃げる方向)が行われる。1種類のtest series中、左または右のみ、両方同時という3種類の加重がrandamな順序、間隔で出現するが、第1のseriesでは同時加重、その他では単独加重が高頻度である。同時加重時に2本の指がplateを押す力を記録しcross-correlation解析すると、右手の示指と中指を用いている場合、単独負荷予測で同時加重時のdynamic phoseの同期が低下する傾向(r=.09)があるが、pre-load(.23)とstatic(.21)phase中の運動は常に弱く同期する。両手の示指を用いると同期は一般に上述より悪いが(.13:pre-loadphase)、同時負荷予測(.36)はそれ以外(.22)よりdynamicphoseの同期を向上させた。両手タスク中の脳波記録(n=1)では、同時負荷予測時の左右の運動野(C3^1、C4^1)と左前頭葉(F3)に運動準備電位が観察された。部位間のcross-correlationを求めると、C3^1-C4^1(r=.84)とE3-C4^1(.83)間の相関が他のseries(.76と.74)より高い傾向があった。2本の指の運動間には相互作用が存在し、この作用は運動パターンにより予測的に変化することが示された。両手の場合、大脳皮質における適応的な変化を伴う可能性が示唆された。ヒトは扱う道具により握りの形態を変え、時に4本の指を1つの機能単位(a virtual finger)として円筒形の物体を握り、または1本の指でタイプを打つ。本研究の目的は様々な状況で変化する機能単位に応じて、脳が指の運動をコントロールする様式も変化するかを調べることである。Plateは時々モーターで指から逃げる方向に加重され、1回の加重はpre-load、dynamic(0.5s間ramp状に3Nまで増加)、static(2s間3Nで加重)phaseからなる。Plate毎に指がplateを押す力等を計測した。1回のtest series中、左又は右のplateのみ、両方同時という3種類の加重パターンがrandomな順序で出現する。但し第1のseriesでは同時加重、その他のseriesではどちらかへの加重が高頻度である。同時加重に対する2本の指の運動に対しcross-correlation解析を行った。右手の示指と中指を用いた場合seriesによらず、pre-load(r=0.23)とstatic phase(r=0.21)中に弱い正の相関が見られた。同時加重を予測している場合はdynamic phase中もこの相関は変化しなかった(r=0.28)が、その他の場合は相関が低下した(r=0.09))。左右の示指を用いた場合、相関は一般に片手の場合より悪い(r=0.13:pre-load phase)。しかし同時加重を予測している場合(r=0.36)、それ以外の場合(r=0.22)に比べdynamic phase中の両指の運動が同期する傾向が見られた。片手、両手共2本の指の運動は必ずしも独立してコントロールされず、被験者の予期で変化する相互作用が存在した。片手と両手の指間では、異なる機構が関与する可能性が示唆された。

部位間のcross-correlationを求めると、C3^1-C4^1(r=.84)とE3-C4^1(.83)間の相関が他のseries(.76と.74)より高い傾向があった。2本の指の運動間には相互作用が存在し、この作用は運動パターンにより予測的に変化することが示された。両手の場合、大脳皮質における適応的な変化を伴う可能性が示唆された。
非英語圏大学EMI（英語を媒介とする授業）プログラム実態調査と言語政策への提言

本研究の目的は、アジア非英語圏(日本を含む)で増加しつつあるEMI(English Medium Instruction、英語を媒介とする授業)に焦点をあて、(1)日本人学生と外国人学生の英語および現地語の言語習得やコミュニケーション活動の実態を把握し、また(2)EMIプログラム卒業生への調査を実施することによって、仕事で求められている言語使用とカリキュラムとの連関を分析し、言語教育への政策提言を行うことである。本年度については、国内にて授業観察、インタビューおよびフォーカスグループディスカッションを実施したほか、タイ、シンガポールでの、教員、学生、卒業生とのインタビュー、授業観察等エスノグラフィックスタディーを行った。今年度収録した、新規の録音データの文字化、ディスコース分析、録画データのコンテント分析に加え、昨年度までに実施したデータの整理、分析も行った。その中間結果については、ELF11, SS22, The 8th Waseda ELF International Workshop and Symposium, JASEC等で学会発表を行った。また、Routledge,早稲田大学教育総合研究所、JASEC等から関連論文を出版した。次年度は複数の国際学会にて研究発表を予定しており、それに向けたデータ分析、および7カ国共同研究プロジェクト(代表J. Jenkins,サザンプトン大学、A. Mauranen,ヘルシンキ大学)に向けたデータ収集、分析も継続した。その成果はRoutledge、Palgrave Macmillan、明石書店から出版される予定である。なお、本特定課題(基礎助成)研究は、科研(基盤(c)、研究代表者飯野公一)および科研(基盤(B)、研究代表者村田久美子)と関連を持ち実施された。研究計画のとおり、国内、タイにおけるデータ収集はほぼ順調に進展している。国内については新規調査先が参加予定である。また、台湾については新規の調査先と交渉する予定である。2019年度はAsiaTEFL2019(バンコク)、the 2019 Multidisciplinary Approaches to Language Policy and Planning Conference (トロント)、JASEC (東京)等での研究発表が予定されており、それらに向けた新たなデータ分析を進める。また、Palgrave Macmillanからのbook chapterの執筆、修正を完了するほか、関連するジャーナル等への投稿を行う。同時に、国内、海外において、研究計画に沿ってデータ収集を継続する。さらに、これまでの研究結果をまとめ、来年度以降に向けた次段階の研究計画を策定する予定である。2017年度については、国内(大阪大学、同志社大学、立命館アジア太平洋大学、早稲田大学他)にて授業観察、インタビューおよびフォーカスグループディスカッションを実施したほか、タイ(チュラーロンコーン大学、タマサート大学他)での、教員、学生、卒業生とのインタビュー、授業観察等エスノグラフィックスタディーを行った。その中間結果については、ELF10, AILA, EMI-ELF Workshop, JASEC, JACET等で学会発表を行い、参加者との意見交換を行った。さらに、明石書店、早稲田大学教育総合研究所等で関連記事を出版した。なお、2017年度JACET学術出版賞を受賞した。2018年度はELF11, SS22での研究発表が決定しており、それに向けたデータ分析、および7カ国共同研究プロジェクト(代表J. Jenkins,サザンプトン大学、A. Mauranen,ヘルシンキ大学)に向けたデータ収集、分析も継続した。なお、本研究は、科研(基盤(c)課題番号25370734、研究代表者飯野公一)および科研(基盤(B)課題番号26284083、研究代表者村田久美子)と関連を持ち実施された。研究計画のとおり、国内、タイにおけるデータ収集はほぼ順調に進展しているが、台湾については先方との調整から遅れている。なお、本特定課題(基礎助成)研究は、科研(基盤(c)、

研究代表者飯野公一)および科研(基盤(B)、研究代表者村田久美子)と関連を持ち実施された。研究計画のとおり、国内、タイにおけるデータ収集はほぼ順調に進展している。国内については新規調査先が参加予定である。また、台湾については新規の調査先と交渉する予定である。2018年度はELF11(ロンドン), SS22(オークランド)での研究発表が決定しており、それに向けたデータ分析、および7カ国共同研究プロジェクト(代表J. Jenkins,サザンプトン大学、A. Mauranen,ヘルシンキ大学)に向けたデータ収集、分析を継続する。また、国内学会(JASEC, JACET等)発表準備、Routledge, SAGE等からの出版物の執筆を進める。2019年度はAsiaTEFL2019(バンコク)、the 2019 Multidisciplinary Approaches to Language Policy and Planning Conference (トロント)、JASEC (東京)等での研究発表が予定されており、それらに向けた新たなデータ分析を進める。また、Palgrave Macmillanからのbook chapterの執筆、修正を完了するほか、関連するジャーナル等への投稿を行う。同時に、国内、海外において、研究計画に沿ってデータ収集を継続する。さらに、これまでの研究結果をまとめ、来年度以降に向けた次段階の研究計画を策定する予定である。他の研究費予算と支払い時期の調整のため、本基金を主に次年度海外出張旅費として使用する予定。他の研究費予算と支払い時期の調整のため、本基金を主に次年度海外および国内出張旅費として使用する予定。
ベクトル束の間のK-morphismとその応用

ベクトル束の間のK-morphismと可微分多様体の間のK-mersionとの関係は既に得られており、その系として、ベクトル束の間の線形全射と沈め込み(submersion)の関係は次のようになる。可微分多様体の間の連続写像f:M→Nに対し、ベクトル束の安定類^τM-f^*^τNの分類写像M→BOのBO(dimM-dimN)へのliftのホモトピ-集合〔M,BO(dimM-dimN),t_M-f^*tN〕上に群Π_1(N^M,f)が作用し、その商集合と、fとホモト-プな沈め込みの正則ホモトピ-集合とが、もしMが開多様なら、1対1に対応する。上のliftのホモトピ-集合については、これを決定する方法があり、更に群Π_1(N^M,f)もこれを決定する方法があり、これら2つが共に計算できる例は多い。しかしΠ_1(N^M,f)-作用を決定するのは難しく、多くの結果は得られなかったが、M=RP^m-RP^<k-1>,N=RP^n(k≧n)の場合はΠ_1(N^M,f)-作用が完全に決定でき、従って沈め込みの存在とその正則ホモトピ-分類は解決できた。これは学会で発表し、プレプリントを作成した。M=CP^m-CP^<k-1>,N=CP^nの場合、M=L^<rn>(P)-L^<k-1>(P),N=L^n(P)の場合(k≧n)はより簡単に調べることができる。Π_1(N^M,f)-作用の考察は沈め込みの研究に有効であるのみならず、双対の関係にあるはめ込み(immersion)の研究にも有効なので、もう少し続ける価値があると思う。以上位相幾何の側から述べてきたが、微分幾何における沈め込みに関しては新しい結果は得られなかった。
CNTナノキラル構造が拓く新しいギガ周波数帯用電磁波吸収材料の創製と帯域特性制御

MWCNTを活用したギガ周波数帯用電磁波吸収材料創製ならびに吸収帯域制御の可能性を明らかにすることを目的として,MWCNTの直径寸法およびアルミナ母材中での分散状態が電磁波吸収特性に及ぼす影響評価を行った.直径の大きなMWCNTを配合した試料は,小さなMWCNTを配合した試料に比べて高い吸収特性を示す傾向が認められた.同一のMWCNT添加量において,低い分散性の試料は,高い分散性の試料に比べて良好な吸収特性が認められた.分散性の良好な試料は高周波数において吸収効果が高いことがわかった.これらの観察結果は,MWCNTの直径寸法ならびに分散性を調整することで吸収帯域制御の可能性を示すものである.多層カーボンナノチューブ(以降MWCNTと表記)の有するナノキラル構造を活用した新しいギガ周波数帯用電磁波吸収材料創製ならびに吸収帯域制御の可能性を明らかにすることを主目的として、MWCNTとアルミナからなるMWCNT/アルミナ複合材料を作製し電磁波吸収特性評価を行った。平成26年度は、異なるキラル指数、すなわち異なる平均直径寸法を有する2種類のMWCNTをそれぞれ配合したアルミナ複合材料を作製しSパラメータ方式を用いて電磁波入射に対する透過率、反射率ならびに吸収率の測定を行った。加えて、当該複合材料に含まれるMWCNT添加量の影響を明らかにする目的で、MWCNTをそれぞれ0.5, 1.0, 2.0 vol.%配合した複合材料を作製し電磁波吸収特性評価に供した。本研究で用いた測定周波数(0.5-18 GPa)において、作製したいずれの複合材料も周波数が高くなるにともない透過率は低下し、反射率ならびに吸収率が高くなる傾向が認められた。加えて、MWCNT添加量の多い複合材料は、少ない複合材料に比べて高い吸収率が観察されている。MWCNT添加量の増加に伴う吸収率の向上は、平均直径寸法の小さなMWCNT(約50 nm)を配合した複合材料に比べ、大きな平均直径寸法を有するMWCNT(約70 nm)を配合した複合材料に大きな向上が認められた。これらの観察結果は、MWCNTは電磁波吸収機能を有することを示唆するものであり、その機能の程度はMWCNTの添加量が多いほど大きいことを示唆するものである。多層カーボンナノチューブ(MWCNT)の有するナノキラル構造を活用した新しいギガ周波数帯用電磁波吸収材料創製ならびに吸収帯域制御の可能性を明らかにすることを目的として、外径約39 mmおよび内径約16 mmを有する円筒状のMWCNT/アルミナ複合材料の作製を行い、Sパラメータ方式にて誘電率と透磁率の測定を行った。特に、(1)MWCNTのキラル指数、すなわちMWCNTの直径寸法が電磁波吸収帯域ならびに吸収量に及ぼす影響、(2)MWCNTの分散状態が電磁波吸収特性に及ぼす影響に着目した研究を実施した。電磁波吸収特性は、0.5-18 GPaの周波数帯域において得られた誘電率と透磁率から算出した。直径寸法の差異が電磁波吸収帯域ならびに吸収量に及ぼす影響評価において、試料の厚みを薄くすることで吸収のピーク周波数は低周波数にシフトし、試料の厚みが約2 mmの際に高い吸収特性が得られた。吸収特性は試料の厚みに大きく依存するものの、平均直径寸法の小さなMWCNT(約50 nm)を配合した複合材料は、大きな平均直径寸法を有するMWCNT(約70 nm)を配合した複合材料に比べて高い吸収特性を示す傾向が認められた。MWCNTの分散状態が電磁波吸収特性に及ぼす影響評価では、異なる複合材料の作製方法を用いることでMWCNTの分散状態が異なる2種類の試料を作製した。MWCNTの配合量は2.0 vol.%から10.0 vol.%である。同一のMWCNT添加量において、低い分散性の複合材料は、高い分散性を有する複合材料に比べて良好な吸収特性が認められた。加えて、両者の吸収のピーク周波数に差異が認められ、分散性の良好な試料は高周波数において吸収効果が高いことがわかった。これらの観察結果は、MWCNTは電磁波吸収機能を有することを示すものであり、MWCNTの直径寸法ならびに分散性を調整することで吸収帯域制御の可能性を示すものである。MWCNTを活用したギガ周波数帯用電磁波吸収材料創製ならびに吸収帯域制御の可能性を明らかにすることを目的として,MWCNTの直径寸法およびアルミナ母材中での分散状態が電磁波吸収特性に及ぼす影響評価を行った.直径の大きなMWCNTを配合した試料は,小さなMWCNTを配合した試料に比べて高い吸収特性を示す傾向が認められた.同一のMWCNT添加量において,低い分散性の試料は,高い分散性の試料に比べて良好な吸収特性が認められた.分散性の良好な試料は高周波数において吸収効果が高いことがわかった.これらの観察結果は,MWCNTの直径寸法ならびに分散性を調整することで吸収帯域制御の可能性を示すものである.交付申請書に記載した平成26年度の研究実施計画に対して、研究実績の概要で記載した成果を挙げることができており、おおむね順調に進展していると判断している。工学本研究を遂行する上で特に大きな問題点は無い。したがって、平成27年度も研究計画を変更することなく、研究計画調書に記載した3つのプロジェクトを研究スケジュールに沿って遂行をしていく予定である。特に、作製した複合材料のMWCNT分散性と電磁波吸収特性との関係に着目した研究を進める。当初使用予定であった電磁波吸収特性評価のための装置に不具合が発生し、研究が予定通りに進まない恐れが生じた。研究計画を予定通りに進めるために、電磁波吸収特性評価を委託試験により行うことに変更した。これにより当初予定していた実験補助ならびにデータ整理を依頼する大学院生に対する謝金に余りが生じた。消耗品費:セラミックス焼成の際に使用する標準ガス(20,000円)

ならびに試薬等の合成用消耗品に使用する。旅費:委託試験先との打合せならびに成果発表の旅費に使用する。人件費・謝金:実験補助ならびにデータ整理を依頼する1名の大学院生に対する謝金に使用する(時給約1,000円、1名×5ヶ月間×2時間/1日=200,000円)。その他:主に電磁波吸収特性評価のための委託試験(432,000円、6試料)に使用する。
有限群のテンソル積表現中心化環とDiagram代数

本研究では、組合せ論、整数論などに共通して現れる各種の有限群Hとその部分群Kに対し、剰余類V = H/Kのテンソル積表現を調べ、符号理論、不変式論、モジュラー形式、Diagram代数、など数学の様々の分野との関係を解明することを目的とします。特に、符号理論と不変式との関係が最近明らかになった群達のテンソル積表現の中心化環の基底、生成元、関係式のDiagramによる表示を試み、さらには既約表現の構成を試みることで、中心化環の構造を明らかにします。
サーファクタントSCGB3A2の慢性閉塞性肺疾患治療薬の応用を目指した基盤研究

本研究では,セクレトグロビン(SCGB)3A2の慢性閉塞性肺疾患(COPD)治療薬への応用を目指した基盤研究を目的とした。COPDは長期喫煙による生活習慣病の一つと考えられる肺の疾患であり,末梢気道壁の肥厚・狭窄,肺胞壁の破壊などの特徴を示す。SCGB3A2は抗炎症作用,肺線維症の改善効果,肺発生における成長促進効果を有する。そこで,SCGB3A2はCOPDに対しても有効な効果を発揮することを期待した。主に,Scgb3a2遺伝子改変マウスを用いて作製したCOPDマウスモデルを用いてSCGB3A2のCOPDに対する改善効果を検証した。加えて,細胞培養系でのCOPD改善メカニズムの解明を行った。慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、主に喫煙によって気道と肺胞に慢性炎症が生じることで発症し、末梢気道壁の肥厚・狭窄、肺胞壁の破壊、肺胞マクロファージ数の増加などの特徴を示す。COPDは禁煙で進展を抑制するが、進展してしまったCOPDを根治させる治療は存在せず、気管支拡張剤吸入やリハビリテーションなどの理学療法による対処となり、QOLの改善は難しい。日本での死亡原因の第9位となっており、COPDに対する根治療法の開発が望まれる。一方、本研究で注目するSecretoglobin (SCGB) 3A2は、肺炎や肺線維症の改善効果、肺発生における細胞増殖や線毛の再生効果を有する。そこで、本研究ではCOPDに対するSCGB3A2の効果の検討を目的とした。そのために、主にScgb3a2遺伝子改変マウスを用いたタバコ煙曝露COPDマウスモデルの解析によってSCGB3A2のCOPDに対する効果を検証した。Scgb3a2の野生型(WT)マウス、欠損(KO)マウス、肺特異的過剰発現(TG)マウスの生理機能を調べた結果、タバコ煙非曝露条件下でのKOマウスの肺コンプライアンスは有意に増加した。さらに、タバコ煙曝露後の組織学的解析によってKOマウス肺での肺胞壁の破壊は顕著であり、KOマウスの平均肺胞壁間距離(Lm値)の有意な増加も認めた。一方、TGマウス肺ではタバコ煙曝露後のLm値も非曝露条件でのLm値と比較して統計学的有意差は認められなかった。以上の結果から、SCGB3A2のCOPD(肺気腫)に対する抑制的(改善)効果を初めて示した。このことは、進行したCOPDの治療薬が存在しない現在において、SCGB3A2のCOPD治療への貢献を示す重要な結果であり、医学分野において非常に意義の高い成果である。次年度以降はSCGB3A2のCOPD改善効果のメカニズム解明を進める。本研究ではCOPDに対するSCGB3A2の効果の検討を目的とし、Scgb3a2遺伝子改変マウスを用いたタバコ煙曝露COPDマウスモデルを作製し、SCGB3A2のCOPDに対する効果を検証した。初めに、SCGB3A2の野生型(WT)マウス、欠損(KO)マウス、肺特異的過剰発現(TG)マウスの生理機能を調べた結果、タバコ煙非曝露条件でKOマウスの肺コンプライアンスが有意に増加した。次に、組織学的解析によって、WTおよびKO肺のタバコ煙曝露による肺胞腔の拡大と肺胞破壊が観察され、WTとKOマウス肺胞のLm値は非曝露条件と比較して有意に増加し、KOマウスで最大であった。一方、TGマウス肺のLm値は、非曝露条件と比較して有意な変化は認められなかった。これらの結果から、SCGB3A2のCOPD(肺気腫)に対する改善効果が示唆され、この改善効果のメカニズムの一つとしてSCGB3A2の肺組織構への関与を考えた。そこで、弾性繊維の構成成分であるエラスチン線維とそのオーガナイザー分子であるfibulin 5に注目した。タバコ煙曝露実験モデルの各系統のマウス肺に対して、ビクトリアブルー染色によるエラスチンの可視化とfibulin 5に対する免疫組織化学を行った。この結果、曝露の有無にかかわらず、KO肺組織では他の系統より約10%のエラスチン陽性シグナルが低下した。Fibulin 5の発現は、非曝露条件下のKOマウス肺において、特に気管支上皮細胞とその近傍の血管上皮細胞での発現が非常に弱いことが明らかになった。Fibulin 5の発現はタバコ煙曝露条件で特に肺胞上皮細胞で顕著な変化が認められ、KOマウスでは著しい発現低下が観察され、TGマウスではタバコ煙曝露後も通常時の発現を維持していた。これらのことから、SCGB3A2はfibulin 5の発現を制御し、弾性繊維構築に寄与することが示された。以上により、おおむね順調に進展していると判断する。慢性閉塞性肺疾患(COPD)は主に喫煙によって気道と肺胞に慢性炎症が生じることで発症し、末梢気道壁の肥厚・狭窄、肺胞壁の破壊、肺胞マクロファージ数の増加などの特徴を示す。COPDは禁煙で進展抑制可能だが、進展したCOPDを根治させる治療は存在せず、気管支拡張剤吸入やリハビリテーションなどの理学療法による対処となり、QOLの改善は難しい。

主にScgb3a2遺伝子改変マウスを用いたタバコ煙曝露COPDマウスモデルの解析によってSCGB3A2のCOPDに対する効果を検証した。Scgb3a2の野生型(WT)マウス、欠損(KO)マウス、肺特異的過剰発現(TG)マウスの生理機能を調べた結果、タバコ煙非曝露条件下でのKOマウスの肺コンプライアンスは有意に増加した。さらに、タバコ煙曝露後の組織学的解析によってKOマウス肺での肺胞腔の拡大は顕著であり、KOマウスの平均肺胞壁間距離(Lm)と肺胞破壊指数(DI)の有意な増加も認めた。一方、TGマウス肺ではタバコ煙曝露後のLm値もDI値も非曝露条件と比較して統計学的有意差は認められなかった。以上の結果から、SCGB3A2のCOPD(肺気腫)に対する抑制的(改善)効果を示した。このことは、進行したCOPDの治療薬が存在しない現在において、SCGB3A2のCOPD治療への貢献を示す重要な結果であり、医学分野において非常に意義の高い成果である。本年度はそのメカニズムの解明として、SCGB3A2はα1アンチトリプシン(A1AT)発現を制御することを見出した。本研究ではCOPDに対するSCGB3A2の効果の検討を目的とし、Scgb3a2遺伝子改変マウスを用いたタバコ煙曝露COPDマウスモデルを作製し、SCGB3A2のCOPDに対する効果を検証しSCGB3A2のCOPD(肺気腫)に対する改善効果を示唆する結果を示してきた。本年度は、改善効果の直接的なメカニズムに着目し、SCGB3A2のα1アンチトリプシン(A1AT)の発現制御への関与を検討した。まず、MLg細胞をSCGB3A2で刺激した際のA1AT,STAT1, STAT3の発現をウェスタンブロットで確認し、SCGB3A2によって全タンパク質の発現増加を確認した。STAT3は肝臓等でA1AT遺伝子発現を上方制御すること、STAT1はSCGB3A2の下流シグナルであり、STAT3と同じJAKを介することが報告されている。また、STAT1とSTAT3はヘテロダイマーを形成することが報告されている。続いて、SCGB3A2の刺激時間によるA1AT発現とSTAT1,STAT3のリン酸化を調べた。この結果、刺激1時間後には全てのタンパク質の発現が増加した。このことから、これらの分子はSCGB3A2により直接制御されている可能性が高いことが明らかになった。そこで、STAT1とSTAT3のsiRNAを用いてそれぞれをノックダウンした時のそれぞれのタンパク質発現とA1AT発現を確認した。この結果を裏付けるための過剰発現系を現在構築しているところであり、まだ不完全ではあるが、多くの興味深い結果が得られてきたため、計画以上の進展であったと判断する。慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、主に喫煙によって気道と肺胞に慢性炎症が生じることで発症し、末梢気道壁の肥厚・狭窄、肺胞壁の破壊、肺胞マクロファージ数の増加などの特徴を示す。新規サーファクタントSCGB3A2は、肺炎や肺線維症の改善効果、肺発生における細胞増殖や線毛の再生効果を有する。そこで、本研究ではSCGB3A2のCOPD改善効果の検証を行ってきた。主に(1)Scgb3a2遺伝子改変マウスを用いてタバコ煙曝露によるCOPDモデルの作製とマウスモデルを用いたSCGB
HCV遺伝子発現によるp53の細胞周期調節DNA修復アポトーシス誘導作用の変化

肝細胞の癌化過程でのアポトーシス誘導の機序とHCV遺伝子発現の影響を解析することを試みている。肝臓癌由来培養細胞にマイトマイシンやエトポシドなどの抗癌剤で処理するとアポトーシスが起こる。アポトーシス死に先だってDNA障害がおこるが、この際にp53が核に集積する。癌抑制遺伝子p53は細胞周期の調節、サイクリンのリン酸化などと密接に関連している。肝臓癌由来培養細胞にp53遺伝子を導入し細胞増殖への影響やアポトーシスが誘導されるか否かを解析した。p53遺伝子を導入された肝癌細胞ではこの物質によるアポトーシスの誘導が抑制された。ヒト肝癌は血管に富む腫瘍である。血管新生抑制因子であるフマジリン誘導体はin vivoで肝癌の増殖を抑制しin vitroで肝癌細胞と血管内皮細胞にアポトーシスを誘導した。p53とこの誘導体はin vivoで肝癌の増殖を相加的に抑制した。ヒト肝癌細胞におけるアポトーシス誘導はras,Π-3キナーゼ経路の活性化とNF-kBの活性化を必要とする。p53やHCV遺伝子の発現はこの2つの経路に何らかの影響を及ぼしている可能性が考えられた。HCV遺伝子断片をRT-PCRにて増幅しレトロウイルス発現ベクターpZIPneoにくみこみ肝臓由来細胞で発現させ、HCV遺伝子発現がp53の作用をどう変化させ、ras,Π-3キナーゼやNF-kBを由来するアポトーシス誘導にどのような変化を及ぼすかを解析している。HCV遺伝子発言は癌抑制遺伝子の機能を変化させDNA修復を阻害しアポトーシスを抑制することなどにより肝細胞の癌化に寄与することが考えられる。この機序をin vitroで解析することがこの研究の目的である。肝臓癌由来培養細胞にマイトマイシンやエトポシドなどの抗癌剤で処理すると、アポトーシスによりこの癌細胞は死ぬ。アポトーシス死に先だってDNA障害がおこるが、この際にp53が核に集積することを確認した。調節肝臓癌由来培養細胞にp53遺伝子を導入し細胞増殖への影響やアポトーシスが誘導されるか否かを解析している。レトロウイルスベクターpZIPneoを用いてp53発現させた肝癌細胞の増殖はin vitroとin vivoとで抑制された。Rb遺伝子産物は蛋白キナーゼ阻害剤k252によりリン酸化が抑制されることがゲル電気泳動で確かめられた。Rb遺伝子産物のリン酸化脱リン酸化は細胞周期調節に重要な影響を及ぼしており、HCV遺伝子の関連した肝細胞の癌化における役割の解析をはじめている。HCV遺伝子を肝臓由来細胞で発現させるために、HCV遺伝子断片をRT-PCRにて増幅しレトロウイルス発現ベクターpZIPneoにくみこみ発現させる実験を行っている。HCV遺伝子発現がp53やRbの作用をどう変化させるかを解析している。HCV遺伝子発現は癌抑制遺伝子の機能を変化させDNA修復を阻害しアポトーシスを抑制することなどにより肝細胞の癌化に寄与することが考えられる。1)肝臓癌由来培養細胞にマイトマイシンやエトポシドなどの抗癌剤で処理するとアポトーシスが起こる。2)癌抑制遺伝子p53は細胞周期の調節、サイクリンのリン酸化などと密接に関連している。レトロウイルスベクターpZIPneoを用いてp53を発現させた肝癌細胞の増殖はin vitroとin viboとで抑制された。3)ヒト肝癌は血管に富む腫瘍である。

血管新生抑制因子であるフマジリン誘導体はin vivoで肝癌の増殖を抑制し、in vitroで肝癌細胞と血管内皮細胞にアポトーシスを誘導した。p53遺伝子を導入された肝癌細胞ではこの物質によるアポトーシスの誘導が抑制された。4)ヒト肝癌細胞によるアポトーシスを誘導はras,PI-3キナーゼ経路の活性化とNF-kBの活性化を必要たする。p53やHCV遺伝子の発現はこの2つの経路に何らかの影響を及ぼしている可能性が考えられた。HCV遺伝子断片をRT-PCRにて増幅しレトロウイルス発現ベクターpZIPneoにくみこみ肝臓由来細胞で発現させ、HCV遺伝子発現がp53の作用をどう変化させ、ras,PI-3キナーゼやNF-kBを経由するアポトーシス誘導にどのような変化を及ぼすかを解析している。
肝臓の初期発生および成熟段階における液性因子・細胞外マトリクスの関与

1.胚性幹細胞(ES細胞)・胎児肝幹細胞を用いた成熟肝細胞分化誘導系の構築マウスES細胞から胚様体を形成しHGF,OSMで刺激することでCYP7a1などの肝細胞特異的マーカー遺伝子の誘導が可能である。一方で、胎児期の肝臓には増殖性の高い肝幹・前駆細胞が存在する。そこで、これら幹細胞の増殖・分化を制御する因子の探索を行なった。その結果、ホメオボックス転写因子Prox1の強制発現によって、マウス胎生肝幹細胞の長期増殖・運動性が誘導されること、逆に、Prox1と結合する転写因子Lrh1が、肝幹細胞の増殖を抑制することを見出した。さらにProx1の強制発現によって、細胞周期のG1-S期の移行を制御するサイクリンの発現が誘導された。興味深いことに、Prox1によってサイクリンインヒビターの中でP16^<ink4a>のみが特異的に抑制された。そこで現在、ES細胞からの肝細胞分化系におけるProx1の機能を解析するために、RNAiによるノックダウンシステムを構築している。2.成体肝臓からの幹細胞分離と試験管内分化・増殖系の構築マウス正常肝臓を分散しFACSセルソーターを用いて細胞分画しコロニーアッセイを行った結果、CD49f^+CD45^-Ter119^-Scal^-c-Kit^-画分(肝非実質細胞画分の約0.09%)中に低密度培養でコロニーを形成する幹細胞様細胞が存在することがわかった。このコロニーは、アルブミンやαフェトプロテインといった初期肝細胞マーカーや胆管細胞マーカーcytokeratin19が発現しており二方向性の分化能を示し、幹細胞・前駆細胞の形質を示す。その一方で、成熟肝細胞特異的酵素群の発現は見られず未成熟な細胞集団と推測される。(1)ES細胞を用いた分化誘導系の構築マウスおよび霊長類ES細胞において肝分化を検出するための系の開発を行っている。この目的のため、アルブミンプロモーター下にDsRedを発現するレンチウイルスベクターを作成した。このウイルスをマウスまたは霊長類ES細胞に感染させ、肝細胞分化を誘導する系の構築を進めている。(2)胎生肝細胞の分化誘導の分子メカニズムの解析マウス胎生肝臓よりDlk^+CD45^-Ter119^-の肝幹細胞を分画し培養することで、肝幹細胞の増殖、分化を検出する系を構築した。これを用いて様々な転写因子等が肝幹細胞の分化、増殖に与える影響を解析しており、Hexなどホメオボックス転写因子等が肝細胞の増殖に影響を与えることを見出している。また、放射線照射と肝切除によりドナー側の肝再生を抑制した状態で移植を行うことで、この幼弱肝幹細胞が生着し増殖することを確認している。さらに本研究では、成体肝臓よりCD45^-Ter119^-Sca1^-c-Kit^-CD49f^+画分を分離して培養したところ、上皮細胞系の幹細胞が存在することがわかった。この細胞は培養開始直後はアルブミン陰性でCK19陽性の胆管系幹細胞であるが、オンコスタチンM、マトリゲルといった肝細胞分化誘導因子の刺激によって一部の細胞がアルブミン陽性の肝細胞へと分化することを見出した。これら成体の肝幹細胞と胎生期由来の幼弱肝幹細胞との機能的差異を検出するために、現在この細胞集団の解析を進めている。
ジヒドロ葉酸還元酵素のダイナミックスとループ機能解析

大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をモデルタンパク質として,そのミクロ構造が分子全体のダイナミックス(揺らぎ)や安定性,機能発現とどのように関わっているかを明らかにすることを目指し,生物構造学的研究を行った。活性部位から遠く離れた3つのフレキシブルループ中のGly67,Gly121,Ala145を種々のアミノ酸置に置換し,その安定性,断熱圧縮率,酵素機能,X線結晶構造を野生型DHFRと比較した。その結果,わずか1アミノ酸置換により圧縮率が大きく変化し,構造の揺らぎが影響を受けること,また,変異部位から遠く離れた部位の温度因子やキャビティー分布が変化しており,変異の影響は長距離にまで及んでいることが明らかになった。圧縮率の小さい変異体ほどキャビティー量が少なく酵素活性が低下することから,構造の揺らぎが機能発現にとって重要な因子であることがわかった。高圧NMRの実験から,補酵素の結合ドメインを含むヒンジ領域とフレキシブルループ領域が圧力により敏感に影響を受け,高圧下では2つのコンフォマー間の平衡がコンパクトな構造へとシフトすることがわかった。DHFRの酵素反応中間体として存在する種々のリガンド複合体の断熱圧縮率は,基質と補酵素の結合や脱離にともなって大きく変化し,その変化量と分子内キャビティー量との間には良い相関があることを見出した。このように,圧縮率を指標とすることにより,アミノ酸置換やリガンド結合による局所構造の変化が,原子のパッキング状態の改変をとおして分子全体の揺らぎに影響を及ぼすとともに,これまで重要視されてこなかったループ領域が,揺らぎと機能の発現において重要な役割を演じていることが明らかとなった。大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)には活性部位Met20を含むループ以外に大きくゆらいでいる3つのフレキシブルループが存在する。本研究ではこれらのループが構造のゆらぎや機能発現にどのような役割を演じているかを解明するため、それぞれのループ中で最もゆらぎの大きいGly67,Gly121,Ala121の変異体を作製し、その構造安定性・酵素機能・圧縮率・X線結晶構造を調べた。145位変異体(A,T,R,G,S,H,V,F)では酵素活性に大きな影響は与えなかったが、その構造安定性は導入アミノ酸の疎水性が増すほど低下した。このような逆疎水性効果は、この部位の側鎖が分子表面に露出しているため、未変性状態に比べて変性状態の化学ポテンシャルの増加が小さいためと考えられた(J.Biochem.123,839(1998))。67位と121位での二重置換体では、ほとんどの変異体で構造安定性と活性に加成性が見られなかった。両部位のα炭素間距離は27.7Åも離れていることから、これらの部位でのアミノ酸置換の影響は長距離にまで及んでおり、分子全体のゆらぎを変化させていることが示された(J.Biochem.123,33(1998))。これらの点を確認するため、各変異体の断熱圧縮率β_sを測定したところ、1アミノ酸置換によりβ_sは大きく変化することを見出した。67位変異体G67A,G67V,G67LのX線構造解析の結果、67位ループの温度因子が変化するだけでなく、他のループの温度因子も変化しており、分子内キャビティーの数・体積も圧縮率変化に対応して変化することがわかった(論文作成中)。これらの結果は、アミノ酸置換による局所構造の違いが、分子全体の構造のゆらぎに影響を及ぼしていること、また、本酵素の機能発現にフレキジブルループが重要な役割を演じていることを示している。大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の部分比容と断熱圧縮率をの温度依存性は、他のタンパク質に比べて23倍大きく、円二色性や蛍光スペクトルの温度依存性との相関が認められた。

このことは、DHFRは天然状態においてすでにモルテングロビュール様の構造にあることを示している(Chem.Lett.507(1999))。天然状態のDHFRと各種リガンド複合体の圧縮率は、X線結晶構造から得られた分子内キャビティー量とよい相関があり、キャビティーがゆらぎの発現に重要な役割を演じていることがわかった(Biochim.Biophys.Acta印刷中)。3つのフレキシブルループ中に存在するGly67,Gly121,Ala145を種々のアミノ酸に置換したところ、圧縮率が大きく変化しており、ゆらぎを大きくする変異は酵素活性の上昇をもたらすことがわかった(J.Biochem.投稿中)。67位変異体の水素/重水素交換速度を質量分析計で測定したところ、圧縮率の大きい変異体ほど交換速度が早いことを見出した(学会発表済)。また、変性の自由エネルギー変化の小さい(安定性の低い)変異体ほど、分子シャペロンGroELとの相互作用が強いことがわかった(学会発表済)。X線構造解析の結果、67位や121位での変異により、遠く離れた部位での温度因子やキャビティー分布が変化することがわかった(学会発表済)。これらの結果は、リガンドの結合やアミノ酸置換による局所構造の違いが、キャビティーの変化をとおして分子全体の構造のゆらぎに影響を及ぼしており、本酵素の機能発現にフレキシブルループが重要な役割を演じていることを示している。大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の酵素反応中間体として存在する種々のリガンド複合体の断熱圧縮率を測定した結果,基質と補酵素の結合・脱離にともなって構造の揺らぎが大きく変化し,その変化量はX線結晶構造から得られた分子内キャビティー量と良い相関がることを見出し,キャビティーが揺らぎと機能の発現に重要な役割を演じていることがわかった(Biochim.Biophys.Acta,1478,257(2000))。DHFRの3つのフレキシブルループ中に存在する,Gly67,Gly121,Ala145を種々のアミノ酸に置換したところ,圧縮率が大きく変化しており,わずか1アミノ酸置換により構造の揺らぎが影響を受けることがわかった。また,圧縮率の大きい変異体ほど酵素活性が上昇することから,構造の揺らぎが機能発現に有利な作用していることがわかった(J.Bjochem.,128,21(2000))。これらの変異体のX線構造解析を行った結果,変異部位から遠く離れた部位の温度因子やキャビティー分布が変化しており,圧縮率の小さい変異体ほどキャビティー量が少ないことがわかった。この結果は,アミノ酸置換の影響が原子のパッキング状態の改変をとおして分子全体の揺らぎに影響を及ぼしていることを示している(論文作成中)。また,G67A変異体の低温X線構造解析より,温度の低下に伴いループ部分の温度因子が大きく減少することを見出した(論文作成中)。DHFRの葉酸複合体の構造に及ぼす圧力の効果を,高圧NMRを用いて3000気圧までの圧力範囲で測定した。その結果,補酵素(NADPH)の結合ドメインを含むヒンジ領域とフレキシブルループ領域が圧力により敏感に影響を受け,2つのコンフォマー間の平衡が圧力により影響を受けることがわかった(Biochemistry,39,12789(2000))。
白麹菌の特徴を規定する転写制御因子の同定と機能解明

大麦を原料とした麹造りにおいて発現変動する白麹菌の推定転写制御因子を7遺伝子(nosA、rosA、atfA、atfB、AKAW_01957、AKAW_02766、AKAW_02903)同定した。これらを、白麹菌の糖質加水分解酵素やクエン酸の生産を制御する可能性がある転写制御因子として解析した。各推定転写制御因子の遺伝子破壊株を構築して表現型を解析した。その中でもnosAとrosAの二重破壊株は、菌糸伸長は正常であったが顕著な分生子形成能の低下が見られた。また、NosA-GFPとRosA-GFPは核に局在することが示唆された。白麹菌は焼酎の醸造に用いられる麹菌である。本研究は、白麹菌の特徴である"多様な糖質加水分解酵素の生産とクエン酸の高生産"の制御に関わる転写因子を同定し、その機能を解明することで、白麹菌のもつ有用な生理機能を分子レベルで理解することを目的として行っている。本年度は、まず、大麦を原料とした麹造りにおける白麹菌の遺伝子発現データ(DNAマイクロアレイによる)からクエン酸高生産に関わる転写制御因子を推定した。麹造りにおいて、40°Cから30°Cへの温度低下をきっかけとして、白麹菌はクエン酸の高生産を開始することが知られている。そこで、製麹開始後25時間目に40°Cから30°Cへ温度を低下させた通常の条件(クエン酸生産誘導条件)と、40°Cを維持した条件(クエン酸生産非誘導条件)における遺伝子発現を比較して、2倍以上顕著に発現量が上昇あるいは減少した推定転写制御因子を計7遺伝子(上昇: 2遺伝子、減少: 5遺伝子)同定した。これらをクエン酸高生産の制御に関わる可能性のある解析対象遺伝子とした。各遺伝子が白麹菌のクエン酸生産性に及ぼす影響を評価するために各遺伝子の破壊株の構築を行った。白麹菌(Aspergillus kawachii IFO 4308株)の高効率相同組換え宿主であるΔligDΔargBΔsC株とargB遺伝子マーカーを用いてプロトプラスト-PEG法により各遺伝子の破壊を進めた。現在までに5遺伝子の破壊株の取得をコロニーPCRにより確認した。前年度は、麦麹造りにおける白麹菌の遺伝子発現情報をDNAマイクロアレイにより取得して、製麹過程でクエン酸生産を誘導(40度から30度への温度低下)した際に顕著に発現変動する推定転写制御因子遺伝子(発現上昇:2遺伝子、発現減少:5遺伝子)を同定した。また、これらの遺伝子破壊株の構築をはじめた。本年度は、昨年度に破壊できなかった残りの遺伝子破壊株を取得した。また、これらの中でクエン酸生産誘導時に発現が上昇した2遺伝子(nosAとrosA)の機能解析を行った。NosAとRosAは、モデル糸状菌Aspergillus nidulansにおいて有性生殖に関与することが報告されていたが、白麹菌には有性世代は見出されておらず、これらの推定転写制御因子が白麹菌においてどのような生理機能をもつのかについては報告がなかった。そこで、nosAとrosAの単独遺伝子破壊株と2重遺伝子破壊株を構築した。nosAとrosAは温度変化時に発現変動する遺伝子として同定されたが、各遺伝子破壊株のM平板培地での生育(経時的なコロニー径の増大)は、25、30、37、42度の異なる温度において野生株と同様であった。一方、分生子形成能については、rosA破壊株は野生株と同様の表現型を示したが、nosA破壊株とnosA rosA二重破壊株は、分生子形成能が顕著に低下(nosA rosA二重破壊株は、野生株の約20%)した。次に、各遺伝子破壊株を宿主として、Tet-OnプロモーターによりNosA-GFPおよびRosA-GFPを発現する相補株を構築し、蛍光顕微鏡により局在を観察した。その結果、NosA-GFPとRosA-GFPは核に局在することが示唆された。したがって、NosAとRosAは白麹菌において分生子形成に関わる遺伝子発現制御に関与する可能性が示唆された。昨年度までにクエン酸高生産誘導時に発現変動する計7の推定転写制御因子遺伝子を同定し、各遺伝子の破壊株を構築した。本年度は、遺伝子破壊株のなかで最も分生子形成能が低下したnosA遺伝子破壊株を解析した。まず、NosAが発現を調節している遺伝子を同定するために転写解析を行った。コントロール株とnosA遺伝子破壊株を液体培地で培養した後、菌体を寒天培地に移して分生子の形成を誘導した。得らえた菌体からRNAを抽出して、RNA-seq解析を行った。その結果、nosA遺伝子の破壊により発現変動する293遺伝子(上昇: 128遺伝子、減少: 165遺伝子、q-value < 0.05)を同定した。次に、白麹菌のゲノム注釈情報の改善を目的として、推定転写制御因子のマニュアルアノテーションを行った。モデル糸状菌Aspergillus nidulansにおいて機能解析された転写制御因子の情報を用いて、白麹菌のゲノムに計114の推定転写制御因子遺伝子を同定した。この結果と昨年度までの解析結果に基づいて、クエン酸高生産誘導条件において計12の推定転写制御因子遺伝子の発現が変動したことが示唆された。

大麦を原料とした麹造りにおいて発現変動する白麹菌の推定転写制御因子を7遺伝子(nosA、rosA、atfA、atfB、AKAW_01957、AKAW_02766、AKAW_02903)同定した。これらを、白麹菌の糖質加水分解酵素やクエン酸の生産を制御する可能性がある転写制御因子として解析した。各推定転写制御因子の遺伝子破壊株を構築して表現型を解析した。その中でもnosAとrosAの二重破壊株は、菌糸伸長は正常であったが顕著な分生子形成能の低下が見られた。また、NosA-GFPとRosA-GFPは核に局在することが示唆された。解析対象遺伝子の選定(前年度計画)から、各解析対象の機能解析(本年度計画)に予定通り進めているため、"おおむね順調にすすんでいる"とした。応用微生物学解析対象の遺伝子破壊株の有機酸生産能を、液体培養と固体培養において評価する。また、温度感受性、分生子形成能などの諸性質の解析を継続する。さらに、各推定転写制御因子がどの遺伝子を発現制御しているのかをRNA-seqとリアルタイムRT-PCRにより解析する。白麹菌における推定転写制御遺伝子の破壊株を効率よく取得できたため。解析対象としている遺伝子破壊株(2遺伝子)の構築を継続する。並行して、これまでに取得した遺伝子破壊株の解析を進める。クエン酸高生産に関わるかどうかを評価するために、クエン酸を含む有機酸の生産量を測定する。また、解析対象としている遺伝子は麹造りにおいて温度変化によって発現変動した遺伝子であるため、温度感受性等に注目して表現型を観察する。本年度は遺伝子発現解析と解析対象遺伝子の破壊株の構築が予定よりも順調に行えたため410,581円の繰越額が発生した。次年度は、本繰越額も含めて今後の研究のために必要な試薬、実験器具の購入と研究成果の発表経費に使用する。