hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ビフィズス菌における含硫化合物生合成コンポーネントの探索と機能解析

細胞内では様々な化学反応が生じており、その多くは生体触媒である酵素によって司られている。酵素にはチアミン、ビオチン、鉄-硫黄クラスターなどの含硫補因子を必要とするものがある。ビフィズス菌の含硫化合物生合成機構を理解するためにL-[35S]システインによるトレーサー実験を行ったところ、硫黄受容能を示すタンパク質の存在が確認された。また、システインデスルフラーゼ活性はBad0711およびBad0714により増大することが明らかになった。これらのタンパク質によりシステインデスルフラーゼの[35S]標識量が著しく減少しており、システインデスルフラーゼのターンオーバーを促進している可能性が示唆された。生体内において含硫化合物はチアミン、ビオチン、リポ酸、鉄-硫黄クラスター、モリブドプテリンなどのように補因子として高い生理活性を有している。また、核酸塩基にも微量ながら存在が認められており、紫外線のセンサー分子としての役割を有する。含硫化合物の生合成に関わるタンパク質を同定し、反応機構を解明することができれば、含硫生理活性物質の効率的な生産システムを構築することが可能になると期待される。これまでの研究により、含硫化合物の硫黄原子がL-システインに由来しており、L-システインをL-アラニンに分解するシステインデスルフラーゼ(CDS)が含硫化合物生合成システムの初発段階を担っていることが明らかになっている。そこで、ビフィズス菌CDSであるBad0713に対して活性化をもたらすタンパク質を探索したところ、Bad0711およびBad0714がそれぞれ同定された。これらのタンパク質がどのようなメカニズムでCDSの活性化をもたらすのか、(1)タンパク質間相互作用の有無、(2)CDSのシステインデスルフラーゼ活性の速度論的解析、(3)硫黄原子の受け渡しの有無、の観点から解析を進めている。また、それぞれの解析において、還元剤(DTT、TCEP)存在条件下での結果と比較をすることで、各過程におけるペルスルフィド(ーSーSH)の関与を明らかにした。これらの結果からビフィズス菌Bifidobacterium adolescentisにおいても、CDSとアクセサリタンパク質が協調的に機能することにより、種々の含硫化合物の生合成に必要とされる硫黄を効率的に供給している可能性が示唆された。細胞内で硫黄原子はタンパク質中の含硫アミノ酸をはじめ、グルタチオン、コンドロイチン硫酸などの形で多量に存在している。それ以外に存在量は微量ながら、チアミン、ビオチン、リポ酸、鉄-硫黄クラスター、モリブドプテリンなどの補因子や、tRNAに含まれるチオウリジンなどの核酸塩基にも硫黄が含まれている。このような「含硫化合物」は、補酵素、酸化還元反応の活性中心、紫外線センサーなどの機能を有することが知られており、生理的に極めて重要な役割を担っている。含硫化合物の生合成に関わるタンパク質の同定と反応機構の解明がなされれば、含硫生理活性物質の効率的な生産システムを構築することが可能になると期待される。これまでの研究により、L-システインをL-アラニンに分解するシステインデスルフラーゼ(CDS)が硫黄原子の供給を司っており、基質由来の硫黄原子はCDS分子内にペルスルフィドとして保持された後、他のタンパク質に転移されていくことが明らかになっている。本申請課題では、ビフィズス菌(Bifidobacterium adolescentis)のCDSを対象としてCDS活性やペルスルフィド形成能に影響を与えるタンパク質群を解析した。CDS遺伝子クラスターに存在する5種の遺伝子の発現系をそれぞれ構築し,各遺伝子産物をそれぞれ添加してCDS活性の測定を行ったところ、Bad0710H6、Bad0712H6、Bad0715H6を酵素反応液に添加してもCDS活性に変化は見られなかったが、Bad0711H6、Bad0714H6を添加した場合にはCDS活性がそれぞれ5.4倍、5.2倍に上昇していた。また、オートラジオグラフィーを行った結果、Bad0711H6、Bad0714H6によってCDSの35S標識量が顕著に減少していたことから、硫黄原子の転移反応にこれらのタンパク質が関与していることが明らかになった。生命の営みを維持するために細胞内では様々な化学反応が生じており、その多くは生体触媒である酵素によって司られている。酵素のうちチアミン、ビオチン、リポ酸、鉄-硫黄クラスター、モリブドプテリンなどの含硫補因子を要求するものが多く存在することから、これらの低分子化合物の重要性は広く認知されている。本研究では含硫補因子の生合成に関わるタンパク質の同定と反応機構の解明を目指している。これまでの研究により含硫補因子中の硫黄原子がL-システインに由来しており、システインデスルフラーゼがこれらの硫黄原子を供給していることが明らかになっている。放射性化合物である[35S]

L-システインを用いてトレーサー実験を行った結果、システインデスルフラーゼ(Bad0713)が[35S]によって高い効率で標識されていることが確認された。このことは基質由来の硫黄原子を酵素分子内に一時的に保持することを強く示唆した。また、システインデスルフラーゼの活性化に関与するアクセサリータンパク質を共発現させてみたところ、[35S]の標識量が有意に減少することが分かった。このシステインデスルフラーゼの[35S]標識はジチオスレイトールによる処理により消失することも分かっており、ペルスルフィド(-S-SH)であるものと考えられた。一般に細胞内には高濃度のグルタチオンが存在しており、これらによってペルスルフィドが還元され他の分子に転移する可能性がある。しかしアクセサリータンパク質を低濃度で添加した場合においても効率よく[35S]転移が見られたことから、生理的な機能を有していると考えられた。遺伝子工学これまでに含硫化合物の生合成メカニズム、とりわけ硫黄原子のメタボリズムについて鍵酵素であるCDSを中心にして生化学的・分子生物学的な手法を用いて解析を行ってきた。その結果、システインデスルフラーゼ活性を有意に上昇させる効果を持つタンパク質群を見出すことができた。これらのタンパク質がどのようにCDSに作用しているか明らかにするため、タンパク質間相互作用の有無の確認やカイネティクス解析を通じた酵素化学的解析を行い、一定の成果を得ることができた。また、還元剤非存在条件下でSDS-PAGEを行い、オートラジオグラフィーにて各タンパク質の35S標識の様子を調べたところ、CDSの活性上昇は酵素活性中心に形成されたペルスルフィドの除去によりもたらされる可能性が極めて高いことが明らかになった。この35S標識に直接的に関与するアミノ酸残基の同定については、リジルエンドペプチダーゼによる部分消化後のペプチドの放射活性あるいは質量分析によって可能であり、現在解析を進めている。成果の研究発表については、当初の予定よりやや遅れている感が否めないが、早急に取りまとめて公開していきたい。硫黄を含有する新規生理活性物質の生合成メカニズムについて、ペルスルフィド形成能を指標に生化学的・分子生物学的な手法を用いて解析を行った。その結果、硫黄供給を司る酵素システインデスルフラーゼの活性を上昇させるタンパク質群を見出し、それらの作用機構について貴重な知見を得た。また、還元剤非存在条件にて行ったオートラジオグラフィーの結果、この活性上昇はCDS分子内に形成されたペルスルフィドの除去によるものであることを明らかにした。含硫化合物生合成システムのさらなる理解には、特定のアミノ酸残基を改変した変異型酵素の特性解析など詳細な分子メカニズムの解析が欠かせないが、これらについてもすでに着手している。今年度得られた知見を端緒として、より詳細な含硫化合物生合成システムの分子メカニズムの解析を推進することができると考えられる。以上の点により、上記の達成度と判断した。
暑熱下運動時における熱中症発症の新メカニズム検証と新予防法の提案

体温上昇性の換気亢進による動脈血二酸化炭素分圧(PaCO2)低下が脳血流などの循環反応に及ぼす影響、さらに、意識的な呼吸調節によってPaCO2を増加させることで、脳血流量や血圧反応が改善されるかどうかについて検討した。暑熱下一定負荷運動時及び安静時体温上昇時において、深部体温上昇性の換気亢進反応を意識的な呼吸調節によって抑制できること、さらに,このように意識的に換気亢進を抑えることで、深部体温上昇に伴う脳血流量の低下が抑制されることが初めて示唆された。実験1:深部体温が1.0°C上昇するような一過性の安静加温が動脈伸展性および血管内皮機能に及ぼす影響を検討することを目的として、12名の健康な若年の被験者において、常体温時(加温前後)および深部体温上昇時(+0.5°C,+1.0°C)の各体温レベルで動脈伸展性並びに血管内皮由来の血管拡張機能を評価した。動脈伸展性の評価には動脈スティフネスの指標である上腕ー足首間脈波伝播速度(baPWV)を用い、血管内皮由来の血管拡張機能の評価には血流依存性血管拡張反応(FMD)を用いた。体温上昇時のbaPWVは,平均値では常体温時から変化しなかったが、常体温でのbaPWVが高い者ほど体温上昇時にbaPWVが大きく減少するという関係性がみられた。また,体温上昇に伴いFMDおよび血管壁への機械的刺激の程度の指標であるずり速度曲線下面積がともに増加した。これらのことから、一過性の体温上昇時に血管内皮由来の血管拡張機能が向上すること、また、動脈スティフネスが高い者においては一過性の体温上昇時に動脈スティフネスが低下する可能性があることが示唆された。実験2:暑熱下運動時において随意的に換気亢進を抑制できるのか、また換気亢進抑制ができた場合にもPaCO2ならびに脳血流反応がどのような影響を受けるのかに関して検討した。被験者は8名の健康な男性であり、室温37°C、湿度50%の暑熱環境下で一定負荷(50%VO2peak)持続的運動を、1換気量をコントロールし過換気を抑える場合、2自由に呼吸を行う場合の2条件で行った。その結果、暑熱下運動時において深部体温上昇に伴う換気亢進反応を随意的に抑制できること、さらに,随意的に換気亢進を抑えることで、深部体温上昇に伴う脳血流量の低下が抑制されることが初めて示唆された。実験Iとして、一回換気量と呼吸回数の両方を被験者にフィードバックすることで、安静加温時における深部体温上昇に伴う換気亢進反応の約90%を随意的に抑制でき、これにより低下した呼気終末二酸化炭素分圧(PETCO2)の約100%が回復し、脳血流速度(MCAVmean)低下の約90%を抑制できることが明らかになった。また実験IIとして、呼吸回数のみのフィードバックを用いた呼吸コントロールが安静加温時の換気および脳血流反応に及ぼす影響について検討した。随意的な呼吸コントロール方法として、被験者に対して加温5分目までの呼吸回数をメトロノームの音によってフィードバックし、一回換気量については加温前の量にできるだけ抑えるよう実験開始前に指示を与えた。体温上昇時において、通常呼吸(Nor-Breath)条件に比べて呼吸コントロール(Con-Breath)条件で、換気量は低値を、またPETCO2やMCAVmeanは高値を示した。安静加温終了時(Tes: 39.1°C)において、1. Con-Breath条件では、Nor-Breath条件で増加したVEのうち88%を抑制でき、2. Con-Breath条件では、Nor-Breath条件で低下したPETCO2のうち約110%が回復し、MCAVmean低下の約47%を抑制した。以上の結果から、随意的な呼吸コントロール方法として呼吸回数のみのフィードバックを用いた場合、健常男性は安静加温時における深部体温上昇に伴う換気亢進の約90%を随意的に抑制でき、体温上昇時に起こる脳血流量低下の約50%を抑制できることが、示唆された。これらのことから、呼吸回数のみのフィードバックで行う呼吸コントロール法を、熱中症や暑熱下の運動パフォーマンス低下に対する現場への手法として提案できる可能性が示唆された。1. 41°Cの温浴によって深部体温を上昇させてから30秒間の短時間高強度運動を行う場合(Heat条件)と,35°Cの浸水によって体温を変化させずに同運動を行う場合(Con条件)の計2条件を行い,自転車エルゴメーターの発揮パワー,呼気ガス,深部体温,心拍数,血中乳酸値を測定した.主な結果は,(1)運動前の深部体温はHeat条件で38.2°C,Con条件で37.3°Cであり,その後の短時間高強度運動時の最大パワー及び最小パワーはCon条件よりもHeat条件で有意に高くかったこと,(2)運動時におけるPETCO2 (PaCO2を反映)はHeat条件で低値を示した一方,VEおよびVO2に条件間の違いはみられなかったこと,(3)運動後安静時においてもPETCO2はHeat条件で低く,VEに条件間の違いはみられなかったこと,である.短時間高強度運動パフォーマンスは体温上昇によって向上し,これは無酸素性エネルギー供給系の亢進によるものである可能性が示唆された.

2.暑熱下一定負荷運動時において,深部体温上昇時の換気亢進に伴うPaCO2の低下をCO2吸入によって一時的に通常レベルに戻した場合の呼吸・脳血流反応を検討した.PETCO2の回復によって,(1) Tes上昇時におけるVEが有意に増加し,(2)このVE増加は,Tes上昇が1.5°CまではVT,Tes+2.0°C時においてはVTとfの両方の増加によるもので,(3) Tes上昇に伴うMCAVの低下は,69%から47%回復した.これらの結果から,暑熱下での最大下持続的運動時において,深部体温上昇時の換気亢進反応はそれに付随するPaCO2の低下によって抑制されていること,さらに体温上昇時の脳血流低下反応はPaCO2の低下によって大部分が説明できることが示唆された.当初の計画通り2つの研究すなわち、短時間高強度運動パフォーマンスに及ぼす体温上昇の影響に関する実験と、暑熱下一定負荷運動時における深部体温上昇時の換気亢進に伴うPaCO2低下の影響に関する実験をそれぞれ終了し、上述(研究実績の概要)したような結果を得ており、順調に進んでいると言えるため。被験者は健康な男子大学生9名で,高強度間欠的自転車運動(10秒の全力運動1回及び10秒の一定負荷運動4回を30秒の休息を挟んで行うものを1セットとし,これを8セット)を暑熱(Hot条件: 37°C)及び常温(Cool条件: 15°C)環境下で行った。測定項目は発揮パワー,食道温(Tes),皮膚温,呼吸代謝パラメーター,心拍数(HR),血中乳酸濃度及び主観的運動強度であった.全力運動1回目の平均発揮パワーはHot条件でCool条件よりも高値を,6-7回目の平均発揮パワーはHot条件でCool条件よりも低値を示し,平均発揮パワーの低下率はHot条件でCool条件よりも高値を示した.このことから,暑熱環境下では高強度間欠的運動の初期における発揮パワーが常温環境下より高まるが,運動後半のパフォーマンスの低下が常温環境下よりも大きくなることが示唆される.Tes及びHRはHot条件でCool条件よりも高値を示した.このことから,今回のような高強度間欠的運動時を暑熱環境下で行うと,深部体温の顕著な上昇やHRの増大が起こることが示唆される.また,VO2は条件間で顕著な差は見られなかったが,全力運動4及び6回目直後の血中乳酸濃度はHot条件でCool条件よりも高値を示した.このことから,Hot条件においてCool条件よりも無酸素性代謝が亢進していたことが考えられる.さらに,換気量は全力運動6回目以降の一定負荷運動後の休息時においてHot条件でCool条件よりも高値を示し,呼気終末二酸化炭素分圧(PETCO2)は全力運動2回目以降においてHot条件でCool条件よりも低値を示した.また,Tesと換気量(一定負荷運動時)との間に正の相関関係がみられたことから,Hot条件ではTesの顕著な上昇に関連した換気量の増加が起こり,その結果PETCO2が低下したと考えられる.体温上昇性の換気亢進による動脈血二酸化炭素分圧(PaCO2)低下が脳血流などの循環反応に及ぼす影響、さらに、意識的な呼吸調節によってPaCO2を増加させることで、脳血流量や血圧反応が改善されるかどうかについて検討した。暑熱下一定負荷運動時及び安静時体温上昇時において、深部体温上昇性の換気亢進反応を意識的な呼吸調節によって抑制できること、さらに,このように意識的に換気亢進を抑えることで、深部体温上昇に伴う脳血流量の低下が抑制されることが初めて示唆された。体温上昇時における換気亢進反応を、意識してコントロール可能かどうかに関する、上記2つの実験を行い、生理学的およびスポーツ科学的にも極めて興味深い知見が得られているため。
大脳における神経回路形成メカニズムの解明

レセプター型チロシンキナーゼであるEphは,リガンドであるephrinが結合すると,双方向性に主に反発作用を引き起こすことで,細胞移動や軸索伸長など神経発生において重要な役割を担うことが分かっている。本研究では,胎生期マウス前脳において,in situハイブリダイゼーションと免疫染色を行い,EphA3のRNAと蛋白質の詳細な発現プロファイルを作製した。その結果,EphA3 mRNAが視床背側核に発現し,内包・大脳皮質中間帯に蛋白質を認めたことから,EphA3が視床皮質投射形成に関わっている可能性が考えられた。そこで,遠心性神経線維のマーカーであるTAG-1とEphA3,また遠心性及び求心'性神経線維のマーカーであるL1とEphA3の免疫染色を行ったところ,EphA3蛋白質が主に視床皮質線維に局在し,遠心性のTAG-1陽性線維の一部にも局在することが分かった。さらに,外側嗅条や前交連・脳梁といった交連線維にもEphA3蛋白質を認めており,EphA3は,視床皮質投射のみならず,様々な神経回路網形成にも関わっている可能性が考えられた。これまでの報告で,EphA3遺伝子は細胞外ドメインのみの分泌型と全長からなる膜貫通型EphA3の2つのアイソタイプをコードしていることが知られている。そのためRNAと蛋白質の分布が違う原因が分泌型EphA3の発現に起因する可能性も考えられた。そこで,分泌型と膜貫通型EphA3のそれぞれに特異的なRNAプローブを作製し,in situハイブリダイゼーションを行った。その結果,分泌型EphA3は検出されず,膜貫通型のみが検出されたことから,胎生期の大脳では膜貫通型のみが発現し,EphA3RNAと蛋白質の分布の相違は,翻訳された蛋白質が,すぐに軸索へ輸送されるためである可能性が考えられた。
遺伝子組換え高分泌性酵母を用いた担子菌リグニン分解酵素大量生産システムの開発

土壌、河川、海洋などの自然界物質循環サイクルによっては分解し難い難分解性物質のうち毒性を呈する物質はその環境残留性が深刻な社会問題に繋がることが危惧されている。化学製品由来成分中、量的に多い芳香族難分解性物質と自然界難分解性物質リグニンの構成要素との間には化学構造、官能基には共通する部分が多い点に注目し、本研究では、難分解性物質分解用生体触媒として白色腐朽菌担子菌コフキサルノコシカケElfvingia applanataが分泌するリグニン分解酵素の要となっているマンガンペルオキシダーゼ(MnP)の遺伝子のクローニングおよびメチトローフ酵母Pichia pastorisによる当該遺伝子大量分泌発現システムの構築を目標とした。酵母にはP.pastoris GS115(ATCC20864)、ベクターにはpPIC9K(Invitrogen)を用いた。分泌実験用マーカーとして大腸菌ヌクレアーゼEcoRIr^+遺伝子がコードするEcoRIを使用した。これをpPIC9Kに組換え、エレクトロポレーションにより酵母ゲノム内に挿入した。ダイレクトPCRによりゲノム内挿入が確認できた菌を単離し、メタノール存在下で培養、上清を限外ろ過濃縮しSDS-PAGEを行った。その結果、推定分子量35kDaの位置にEcoRI(分子量31.8kDa)である可能性の高い分泌タンパク質を大量に獲得することができた。一方、前年度に担子菌E.applanataより取得したMnP遺伝子は364アミノ酸残基から構成されており、推定アミノ酸配列には、ペルオキシダーゼ活性部位、マンガン結合部位、リグニン様低分子化合物結合部位などが保存されていた。発現解析を行った結果、同遺伝子の発現量はマンガンイオン(II)または2,5-キシリジンの添加により上昇した。なお、E.applanata培養中のリグニン分解量もマンガンイオン(II)または2,5-キシリジンの添加により上昇した。推定アミノ酸配列からE.applanata-MnPはヘム蛋白であることも明らかと成ったが、E.applanataヘム合成遺伝子はクローニングされていないため、P.pastorisによるE.applanata-MnP遺伝子の活性発現はこの段階では困難であることが判明した。今後、担子菌自身へのクローニングの検討が必要と考える。維管束植物の木部に特に多く含まれているリグニンは、ヒドロキシフェニルプロパン単位(C6-C3)を基本単位として重合した天然高分子物質であり、これが細胞壁に沈着することにより木部組織は強固化され植物支持体としての役割が可能となっている。木質材料の主たる用途であるパルプ製造プロセスでは塩素系の薬剤を導入して脱リグニン反応を行い脱色操作を行っており廃液中の塩素の存在が製造コストを高めている。自然界においてリグニン分解作用を担っているのは主として白色腐朽菌であり、同菌は菌体外に酵素を分泌することによりリグニンを含む難分解性芳香属化合物を巧みに生分解している。本研究ではこの点に着目し、脱リグニン反応用のリグニン分解酵素を大量生産するために、担子菌コフキサルノコシカケElfvingia applanata(Ganoderma applanatum SMC700)株が産するヘムタンパク質マンガンペルオキシダーゼ(Mnp、マンガンイオン依存性リグニン分解酵素)に注目し、その遺伝子をクローニングすると同時に遺伝子発現の機構を考究し、メチトローフ酵母宿主系などを活用してマンガンペルオキシダーゼを大量発現させる手法の確立を目的としている。平成11年度においては、担子菌E.applanata株のリグニン分解反応の活性はマンガンイオンに依存していることをまず確認した。次にE.applanata株の全RNAから、幾つかの白色腐朽菌において単離され報告されているMnPのアミノ酸配列をもとにPCR法でDNA断片を増幅し、これをプローブとしたプラークハイブリダイゼーションを行いクローンを取得した。取得クローンはEcoRIで消化、サザンハイブリダイゼーションを行いMnPとしての確度が最も高いクローンを選抜した。DNAシーケンサー(主要設備品)を用いて選抜したクローンの塩基配列を決定した。このcDNAは1,095bpからなるORF領域をもち、その推定アミノ酸配列(365 a.a.)には、既知のMnPで保存されている領域が幾つか確認できておりMnP遺伝子が取得できたと考える。

その結果、推定分子量35kDaの位置にEcoRI(分子量31.8kDa)である可能性の高い分泌タンパク質を大量に獲得することができた。一方、前年度に担子菌E.applanataより取得したMnP遺伝子は364アミノ酸残基から構成されており、推定アミノ酸配列には、ペルオキシダーゼ活性部位、マンガン結合部位、リグニン様低分子化合物結合部位などが保存されていた。発現解析を行った結果、同遺伝子の発現量はマンガンイオン(II)または2,5-キシリジンの添加により上昇した。なお、E.applanata培養中のリグニン分解量もマンガンイオン(II)または2,5-キシリジンの添加により上昇した。推定アミノ酸配列からE.applanata-MnPはヘム蛋白であることも明らかと成ったが、E.applanataヘム合成遺伝子はクローニングされていないため、P.pastorisによるE.applanata-MnP遺伝子の活性発現はこの段階では困難であることが判明した。今後、担子菌自身へのクローニングの検討が必要と考える。土壌、河川、海洋などの自然界物質循環サイクルによっては分解し難い難分解性物質のうち毒性を呈する物質はその環境残留性が深刻な社会問題に繋がることが危惧されている。化学製品由来成分中、量的に多い芳香族難分解性物質と自然界難分解性物質リグニンの構成要素との間には化学構造、官能基には共通する部分が多い点に注目し、本研究では、難分解性物質分解用生体触媒として白色腐朽菌担子菌コフキサルノコシカケElfvingia applanataが分泌するリグニン分解酵素の要となっているマンガンペルオキシダーゼ(MnP)の遺伝子のクローニングおよびメチトローフ酵母Pichia pastorisによる当該遺伝子大量分泌発現システムの構築を目標とした。酵母にはP.pastoris GS115(ATCC20864)、ベクターにはpPIC9K(Invitrogen)を用いた。分泌実験用マーカーとして大腸菌ヌクレアーゼEcoRIr^+遺伝子がコードするEcoRIを使用した。これをpPIC9Kに組換え、エレクトロポレーションにより酵母ゲノム内に挿入した。ダイレクトPCRによりゲノム内挿入が確認できた菌を単離し、メタノール存在下で培養、上清を限外ろ過濃縮しSDS-PAGEを行った。その結果、推定分子量35KDaの位置にEcoRI(分子量31.8kDa)である可能性の高い分泌タンパク質を大量に獲得することができた。
一次元ナノ構造体を利用した電界効果トランジスタによるオンチップバイオセンサ構築

バイオおよび医療分野で用いられるオンチップバイオセンサ等へのナノ粒子の適用を目的として、スペルミンなどの生物由来のポリアミンを利用したマグネタイト(Fe_3O_4)ナノ粒子の新規合成手法の開発を行ってきた。前年度は、マグネタイト(Fe_3O_4)ナノテトラポッド、ナノロッド、及びナノ粒子の温度制御によるナノ構造の合成ルートを確立した。本年度はナノ粒子の生体への応用の検討として、ナノ粒子の細胞内取り込みによる遺伝子導入能力の評価を行った。共焦点顕微鏡、蛍光標示式細胞分取器(FACS)、及び透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、乳癌細胞(MCF-7)の中へのマグネタイトナノ粒子の取り込み量が正常細胞である臍静脈内皮細胞(HUVE)のものよりはるかに多いことを示した。ナノ粒子の細胞中への選択的取り込みのためにはナノ粒子の表面設計、特に表面電荷が重要なパラメータであることを示した。ナノ粒子-DNA混合物の電気泳動において、Fe_3O_4-スペルミンでは結合させたDNAが解離するが、Fe_3O_4-キトサンではDNAの解離が見られず、安定した複合体が形成されることが示された。そこで、我々はFe_3O_4-キトサンナノ粒子を用いて、マウスES細胞と乳癌細胞(MCF-7)へのナノ粒子の取り込みの研究を行った。Fe_3O_4-キトサンナノ粒子分散液に緑色蛍光タンパク質の遺伝子をコードしたDNA(AcGFP-1-c)を添加し、異なるナノ粒子/DNA比のFe_3O_4-キトサン-DNAナノ粒子分散液をそれぞれの細胞に加えて培養し、形質転換したものが発する蛍光から評価したところ、形質転換細胞の割合はナノ粒子/DNA比の増加に伴って上昇した。緑色の蛍光は一週間以上全く強度を落とさなかった。このように本研究において、マグネタイトナノ粒子を用いて効果的に外部遺伝子を導入し細胞内に定着させるための系を確立した。ナノ粒子のセンサ応用を目的として、スペルミンやスペルミジンなどの生体ポリアミンを利用したマグネタイト(Fe_3O_4)ナノ粒子の新規合成手法の開発を行ってきた。ここで合成したマグネタイトナノ粒子は以下に示す特徴を有する。(i)粒子サイズは約42nmで走磁性細菌中に存在するマグネタイトと同等の粒径を有する。(ii)粒子は鎖状構造を形成する傾向がある。(iii)単磁区構造の粒子である。種々の技術により系統的な分析を行った結果、マグネタイトナノ粒子が生体適合性を有し、良好な水中分散性を示すことが観察された。また、その飽和磁化は室温で84emu/gを示した。さらに、DNAセンシングへの応用を考慮し、マグネタイトナノ粒子の3-aminopropyltriethoxysilaneによる表面修飾の検討も行った。一方、高アスペクト比を有する単結晶ヘマタイトナノロッドの合成を行い、X線回折、透過電子顕微鏡、X線光電子分光、および超伝導量子干渉計を用いて試料の分析を行った。スペルミンを含むFeCl_2水溶液を室温下で反応させる簡便な反応により、ヘマタイトナノロッドの合成を達成した。この手法では、初めに多量の自己集合したFeOOHナノロッドが形成される。そのロッドの直径は9nmで長さは300から600nmにわたる。このナノロッドを焼成することにより、ヘマタイトナノロッドが生成する。高純度のFe_2O_3ナノロッドを用いれば電界効果トランジスタを設計することが可能になると思われるが、ナノロッドの電気伝導性などに関する検討は現在進行中である。電界効果トランジスタの電気特性を制御するためには、Fe_2O_3ナノロッドに亜鉛イオンなどをドープする方法が考えられる。今後は、DNAバイオセンサの構築を目的として、このような1次元ヘマタイトナノロッドの電界効果トランジスタへの適用を検討する。バイオおよび医療分野で用いられるオンチップバイオセンサ等へのナノ粒子の適用を目的として、スペルミンやスペルミジンなどの生物由来のポリアミンを利用したマグネタイト(Fe_3O_4)ナノ粒子の新規合成手法の開発を行ってきた。前年度に新しい合成ルートを開発したマグネタイト(Fe_3O_4)ナノ粒子、及びレピドクロサイト(γ-FeOOH)ナノロッドの2つを中心にして、ナノ構造体の主要成分となる材料、合成条件、及びナノ構造体の形状等の選定と評価を進めた。ナノ構造体の形状制御に関する検討として、形状に影響を及ぼすと予想される合成条件の各種パラメータを変化させた。特に反応温度を40°Cから70°Cに上げるに従って、マグネタイトナノテトラポッド、ナノロッド、及びナノ粒子が反応温度によって観測され、温度によるナノ構造制御の可能性を示した。合成された磁性ナノ構造体の諸特性の評価(構造、磁気特性、プロセス適合性)を行った。生成物の磁気特性は形態、結晶性、及びアモルファスのオキシ水酸化物の存在に依存していた。透過型電子顕微鏡(TEM)による形状の観察、及び電子線回折、X線回折装置(XRD)による結晶構造解析などによって、レピドクロサイトナノロッドは高アスペクト比(=70)を示し、いくつかの単結晶性ナノロッドの束からなることが分かった。また、室温で超常磁性を示すことが示唆された。前年度にマグネタイトナノ粒子が良好な生体適合性と水中分散性を有することが示された。それを利用したドラッグデリバリーシステム等の生体への応用の検討として、乳癌細胞と静脈内皮細胞への磁性ナノ粒子の取り込みに対する細胞表面電荷および形状の影響を研究した。

今後は磁性ナノ粒子の構造制御技術を、DNAセンサ等の電気化学的センサに応用することを検討する。バイオおよび医療分野で用いられるオンチップバイオセンサ等へのナノ粒子の適用を目的として、スペルミンなどの生物由来のポリアミンを利用したマグネタイト(Fe_3O_4)ナノ粒子の新規合成手法の開発を行ってきた。前年度は、マグネタイト(Fe_3O_4)ナノテトラポッド、ナノロッド、及びナノ粒子の温度制御によるナノ構造の合成ルートを確立した。本年度はナノ粒子の生体への応用の検討として、ナノ粒子の細胞内取り込みによる遺伝子導入能力の評価を行った。共焦点顕微鏡、蛍光標示式細胞分取器(FACS)、及び透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、乳癌細胞(MCF-7)の中へのマグネタイトナノ粒子の取り込み量が正常細胞である臍静脈内皮細胞(HUVE)のものよりはるかに多いことを示した。ナノ粒子の細胞中への選択的取り込みのためにはナノ粒子の表面設計、特に表面電荷が重要なパラメータであることを示した。ナノ粒子-DNA混合物の電気泳動において、Fe_3O_4-スペルミンでは結合させたDNAが解離するが、Fe_3O_4-キトサンではDNAの解離が見られず、安定した複合体が形成されることが示された。そこで、我々はFe_3O_4-キトサンナノ粒子を用いて、マウスES細胞と乳癌細胞(MCF-7)へのナノ粒子の取り込みの研究を行った。Fe_3O_4-キトサンナノ粒子分散液に緑色蛍光タンパク質の遺伝子をコードしたDNA(AcGFP-1-c)を添加し、異なるナノ粒子/DNA比のFe_3O_4-キトサン-DNAナノ粒子分散液をそれぞれの細胞に加えて培養し、形質転換したものが発する蛍光から評価したところ、形質転換細胞の割合はナノ粒子/DNA比の増加に伴って上昇した。緑色の蛍光は一週間以上全く強度を落とさなかった。このように本研究において、マグネタイトナノ粒子を用いて効果的に外部遺伝子を導入し細胞内に定着させるための系を確立した。
骨髄幹細胞由来培養細胞上清を用いた放射線性皮膚炎治療法の研究

頭頸部癌治療において放射線性皮膚炎は,重篤な副作用の一つである。近年、ヒト由来骨髄間葉系幹細胞培養上清は多くの組織修復に関与する成長因子を含有することが報告されている。本研究では,放射線性皮膚炎に対する治療のために、ヒト由来骨髄間葉系幹細胞培養上清の有効性を評価した。放射線性皮膚炎モデルを作成し、これに各種条件(皮下注射、塗布、経静脈投与)で培養上清を投与して、実際の治療を行った。しかし、その結果は仮説とは異なり、治療効果は明らかではなかった。乳歯歯髄遺憾細胞の培養を行い、培養上清を作製した。培養上清は原液で使用した。ラット大腿部にガンマ線の放射線照射30Gyを行い、放射線性皮膚炎モデルを作製した。放射線の照射量、回数は過去の論文に従って行った。放射線照射した部位に培養上清を局所注射した群と対照群としてリン酸バッファーを局所注射した。照射後1日、12日、56日で実験動物を屠殺し、試料の作製を行った。試料は放射線照射した部位の皮膚からのタンパク質と組織標本の作製を行った。タンパク質の抽出は7M尿素にて行い、組織標本は、4%パラホルムアルデヒドで固定した後にパラフィン包埋にて行った。臨床的な放射線性皮膚炎の治癒を見るSkininjury scoreを計測したところ、両群において治癒の速度に違いは認められなかった。組織標本を作製しヘマトキシリン-エオジン染色を行い、組織学的に評価を行ったところ、培養上清投与群と対照群とでは違いは認められなかった。タンパク質を抽出し、SDSーPAGEにて電気泳動を行ったところ、タンパク質の発現に大きな違いは認められなかった。また、ウェスタンブロッティングにてコラーゲンタイプIの発現量を比較したところ、両群に違いは認められなかった。現在までの実験で、培養上清を原液で局所投与する投与方法に問題があると考えて、投与方法、濃度の検討を行っていく予定である。また、放射線性皮膚炎の実験モデルにも改良の余地があると考え、改善を行っていく予定である。現在までにラット大腿部への放射線照射を35Gy行い、放射線性皮膚炎の動物モデルは完成している。病理組織標本では、既存の報告どおり上皮組織の肥厚が認められ、また、間質組織は結合組織が増加している像が認められた。さらに、トルイジンブルー染色にて肥満細胞が増加していることも明らかにした。しかしながら実験結果は仮説と異なり、培養上清は放射線性皮膚炎に明らかな効果は認められなかった。そこで、平成26年度からは本疾患の病態解析を行っている。現在、放射線性皮膚炎の病理組織学的解析を行っている。放射線照射の効果には、細胞内の主に水に作用することにより遊離基(free radical)を発生させ,これがDNAを損傷する間接作用がある。しかしながら、これらは生体組織内に活性酸素を生じ、線維化を促進することが明らかにされている。そのため、放射線照射による皮膚組織の線維化を調べるために近年報告された線維化のマーカーであるxylosyltransferase-1免疫染色を行ったところ陰性であった。さらに、組織の線維化には、組織内に含まれるタンパク質の中で糖鎖構造を持つプロテオグリカンが増加する報告があり、クロマトグラフィー法にてプロテオグリカン量を定量したところ、放射線照射された皮膚は、プロテオグリカンの量が増加していることが明らかになった。そこで、プロテオグリカンの糖鎖をアミノ酸に付与するChondroitin 4-O-sulfotransferase 1とChondroitin 6-sulfotransferase-1の免疫染色を行ったところ、ともに陰性であった。いままでに培養上清を用いた放射線性皮膚炎の治療法を探索してきた。当初計画にある、腫瘍細胞に対する培養上清成分の安全性の検討を行った。培地に培養上清を添加した群と添加していない群では、腫瘍細胞の増殖能に変化は認められなかった。この結果から、培養上清成分は腫瘍細胞に対して異常増殖を促す効果はないことが明らかになった。次いで、放射線性皮膚炎の動物実験モデルを作成し培養上清の局所投与を試みたが、それに対する治療効果は認められなかった。そこで、培養上清の投与方法に着目し、その検討を行った。これまでの投与法は培養上清の皮下注射であったが、表皮への塗布、経静脈的投与を試みた。しかし,放射線性皮膚炎に対しての治療効果は認められなかった。また、培養上清の濃度も検討を行ったが、治療効果は認められなかった。そこで、培養上清を作製する細胞の種類の変更を試みた。いままでは、骨髄間質細胞由来の培養上清を使用していたが,歯髄幹細胞に変更をした。同様に動物実験を行ったが、治療効果は認められなかった。治療効果判定を臨床所見の分類のみで行っており、その判定の信用性にかける点があったため、放射線性皮膚炎の分子マーカーの探索を行うこととし、放射線性皮膚炎発症のメカニズムの検討を行った。本研究にて放射線性皮膚炎の治療効果判定が困難であり、その原因は、放射線性皮膚炎の分子マーカーがないことであると考えられた。これを探索していくことは今後、診断、治療指針、予防法に応用できる可能性があるため有意義であると考えられた。

本研究では,放射線性皮膚炎に対する治療のために、ヒト由来骨髄間葉系幹細胞培養上清の有効性を評価した。放射線性皮膚炎モデルを作成し、これに各種条件(皮下注射、塗布、経静脈投与)で培養上清を投与して、実際の治療を行った。しかし、その結果は仮説とは異なり、治療効果は明らかではなかった。現在までにラット大腿部への放射線照射を35Gy行い、放射線性皮膚炎の動物モデルは完成している。病理組織標本では、既存の報告どおり上皮組織の肥厚が認められ、また、間質組織は結合組織が増加している像が認められた。さらに、トルイジンブルー染色にて肥満細胞が増加していることも明らかにした。しかしながら実験結果は仮説と異なり、培養上清は放射線性皮膚炎に明らかな効果は認められなかった。このために,進捗状況としてはやや遅れているとした.口腔外科放射線照射の研究は腫瘍に対する効果を調べる研究は多い反面、その副作用に関する研究は少ない。そこで、今後の研究の推進方策は、引き続き放射線性皮膚炎の分子マーカーの探索を行うこととする。いままでは、放射線照射後の皮膚組織の線維化に関するマーカーを探索していたが、過去の報告と一致するものもあれば不一致のものもあった。この方法で研究を続けていくことは、時間的、資金的な損失と、人的資源が不足している。そこで、動物実験モデルにおける放射線性皮膚炎のタンパク質の発現を網羅的に探索することとする。方法は、二次元電気泳動と質量分析を組み合わせた、プロテオミクス解析によって行う。そして、放射線照射後の皮膚組織と正常皮膚組織を比較し、2つの実験群にてタンパク質の発現を比較する。さらに、RT-PCR法による遺伝子発現とウェスタンブロットによるタンパク質の発現を確認する。その後に、放射線性皮膚炎を発症に関与するタンパク質を抑制する薬剤の選択を行っていく。頭頸部領域における悪性腫瘍の治療方法ではさまざまな理由で術前放射線治療が適応になる場合があり、その後に再建手術が行われるときもある。そして、放射線照射による組織の変化は皮弁移植などの再建手術に悪影響をおよぼすことは経験的に知られている。そこで、放射線性皮膚炎の分子マーカーを見つけることにより、放射線照射後の再建手術適応の可否を判断する材料の一つを見つけることができると考えられる。本研究計画は、最終的には放射線性皮膚炎の治療を目指しているが、その病態に関しては明らかにされていない部分が多い。そこで、病態を明らかにし、その問題となっている点を改善することにより治療法を開発していくこととする。現時点で、培養上清を放射線照射部位に局所注射したところ、効果はなかったと考えられる。その理由は、局所注射を行うことにより、放射線照射部位に炎症反応を引き起こすことによって著しく炎症反応が増強することが明らかになった。そこで、投与方法を皮膚に直接噴霧する、もしくは、静脈注射にて行うことを検討している。また、投与する培養上清の濃度の検討も必要であると考える。さらに、顎顔面領域の皮膚炎の治療を目指しているので、顎骨周囲の放射線照射を検討している。放射線照射部位の大腿部から顎骨周囲への変更をおこなう。投与する培養上清の濃度、量、投与方法の検討を行う。
アクティブラーニングを取り入れた「特別の教科 道徳」の指導法と評価法の開発

本研究は,本格的に実施される「特別の教科道徳」の指導法を試行,開発を目的として行った。小学校は平成30年,中学校は平成31年から「特別の教科道徳」と位置づけられる背景として,学校教育の中核と位置づけられていながら,教育課程の中では有機的に機能されにくい状況にあったり,僅々の課題としていじめ問題の対応が求められたりしているからである。そこで,次期学習指導要領答申の中に盛り込まれている「主体的,対話的で深い学び」,つまりアクティブラーニングの視点で道徳の授業を再考した。ここ数年,本校の研究テーマは「協同的問題解決学習」をキーワードとして研究推進されている土壌があり,道徳の授業においてもアクティブラーニングの視点で授業構成することに適していた。今年度道徳教育のさまざまな研修に参加し,道徳の授業方法について精査する中,「協同的問題解決学習」の手法を道徳の授業に用いることは極めて有効であろうという仮説のもと研究授業を実施した。総体的に生徒はこれまでの生活の中で,自分なりの道徳的価値を確立してきているものの,これからの歩みの中でさらに有意なものへと発展させる可能性を持っている。研究授業では,小グループで個の持つ道徳的価値(規則遵守)について交流する場面を仕組んだ。各グループでの交流では,新たな道徳的価値の視点を生み出す生徒の姿を見出すことができた。例えば,「規則遵守」と「人としてのやさしさ」についてのすみわけの難しさを感じていた生徒が,多様な道徳的価値観に触れることで,「規則遵守こそが人へのやさしさに通じるもの」と変化したことがあげられる。こうして自分の世界観のなかで育まれる道徳的価値は,道徳の授業,それも小集団を活用したアクティブラーニングの手法を用いる授業の中で多様性を帯び,生きざまを変化させる授業の創造へと飛躍させることが明らかとなった。
非侵襲的頭蓋骨欠損治療法の開発-衝撃波を用いた頭蓋骨形成誘導の検討-

本研究は衝撃波による従来から四肢長管骨を中心に報告されている衝撃波による骨形成誘導効果を頭蓋骨欠損部に対して応用することにより、異物に依存しない非侵襲的治療方法を開発する試みである。頭蓋骨・脳近傍で衝撃波を私用するに際しては、この環境に適した衝撃波発生装置と脳保護手段の欠如が問題であった。そこで、われわれはこの条件を踏まえた簡易型衝撃波照射装置・脳保護手段を開発した。特に前者に関してはHo:YAGレーザーの水中細管内発振を応用することにより(Ho:YAGレーザー誘発キャビテーション衝撃波現象として報告)、将来的に内視鏡導入も可能な装置を開発し、小型化および焦点の局在化に関する技術として特許申請した。一方、衝撃波照射部位の直下に存在する脳組織の保護法としては、脳表硬膜面を衝撃波緩衝材にて被覆することとし、緩衝材の特性を同定し、動物実験にてその有効性を検討した。以上の基礎実験を踏まえ、簡易型衝撃波頭蓋骨部分欠損動物モデル(成長期ラット)に対して衝撃波緩衝材保護下に衝撃波照射実験を行い、頭蓋骨形成誘導の有無を検討した。1.衝撃波モデル照射実験:成長期ラット頭蓋骨を用いて動物モデル実験を行った結果、衝撃波照射により頭蓋骨形成誘導は生じることが示された。衝撃波照射の至適条件としては、照射方向(骨欠損部周囲骨に対して鉛直方向からの照射が適している)、照射回数(回数依存性に骨形成度が増加する)ことが明らかになった。衝撃波照射4週間後の頭蓋骨組織標本では頭蓋骨内板を中心に骨形成が認められた。今後の臨床応用に向けて骨形成能力の劣る成人ラットでの検討、衝撃波の伝播特性が異なる大動物での検討とともに衝撃波による骨形成誘導効果の機序の解明が必要である。2.安全性の検証:頭蓋骨欠損モデルの骨欠損部直上から衝撃波を0.510MPaまで変化させて圧依存性の組織学的損傷を評価した結果、1MPa以下では組織学的損傷は認められなかったものの、15MPaでは脳表血管の破綻による硬膜下出血が認められ、5MPa以上では脳内血管の破綻による血腫形成が認められた。一方、脳表を被覆する衝撃波緩衝材の検討の結果、脳外科手術で頻用するGORE-TEX人工硬膜に著明な衝撃波減衰効果があることが物理実験・数値解析により明らかとなり、動物実験においてもその安全性が組織学的に確認された。これまでの検討を基に、頭蓋内におけるさまざまなアプリケーションに対応可能な衝撃波緩衝材を開発を継続する予定である。平成13年度は頭蓋照射に適した衝撃波照射装置を試作し、頭蓋模擬モデルならびに頭蓋骨部分欠損動物モデルを用いて実験を行った。骨断端面に衝撃波を照射し、頭蓋骨形成誘導の有無、脳損傷の程度、頭蓋骨、硬膜、脳脊髄液、脳実質に伝播する衝撃波の圧力測定と観察を行った。

1.衝撃波照射装置の作成:衝撃波発生源としてはHo-YAG laser、Nd-YAG laser、半導体レーザーについて比較検討した結果、低エネルギーかつ効率的な衝撃波の発生が実現できると点で、Ho-YAG laserを選択した。また、レーザエネルギーによる熱損傷を最小限に抑えるため、本レーザーを水中細管内で発振させることで発生するレーザ誘発液体ジェットにより最大過剰圧100気圧の衝撃波を発生させることが可能となり実験に用いた。この方法では、周囲組織に対して非侵襲的に目的とする頭蓋骨欠損部まで到達することが可能となり、さらに、頭蓋骨欠損部断端に照射する衝撃波のピーク圧を自在に調節できるということが判明した。一方、今年度の研究結果から、本衝撃波発生装置は神経内視鏡との併用が可能性が示唆され、その機械特性と安全性を検証中である。2.衝撃波モデル照射実験:動物モデル実験を行った。頭蓋骨形成誘導は衝撃波照射により誘導されることが示された。さらに衝撃波骨形成誘導に関する至適照射条件、頭蓋照射後の頭蓋骨・脳組織における組織学的変化について解析を加えている。衝撃波照射部位の直下に存在する脳組織の保護法としては、脳表硬膜面を被覆する衝撃波緩衝材を試作中である。来年度は我々が開発した衝撃波照射装置を用いた頭蓋骨形成誘導後の頭蓋骨の成長過程と脳を含めた照射部周囲組織への長期的影響に関して、レントゲン、組織像、血液生化学検査を用いて検討するとともに、骨歪みセンサーを用いて本治療法の力学特性、脳組織損傷作用についての解明を行う計画である。平成14年度は前年度に試作した脳・頭蓋骨近傍における衝撃波照射に適した簡易型衝撃波照射装置を改良し、頭蓋骨部分欠損動物モデル(成長期ラット)に対して衝撃波照射実験を行った。また、衝撃波照射部位の直下に存在する脳組織の保護法としては、脳表硬膜面を衝撃波緩衝材にて被覆することとし、緩衝材の特性を同定し、動物実験にてその有効性を検討した。本衝撃波発生装置の衝撃波発生機序はHo : YAGレーザー誘発キャビテーション現象として報告し、神経内視鏡への導入も可能な衝撃波発生装置の小型化および焦点の局在化に関する技術として特許申請した。1.衝撃波モデル照射実験:成長期ラット頭蓋骨を用いて動物モデル実験を行った結果、衝撃波照射により頭蓋骨形成誘導は生じることが示された。衝撃波照射の至適条件としては、照射方向(骨欠損部周囲骨に対して鉛直方向からの照射が適している)、照射回数(回数依存性に骨形成度が増加する)ことが明らかになった。衝撃波照射4週間後の頭蓋骨組織標本では頭蓋骨内板を中心に骨形成が認められた。今後の臨床応用に向けて骨形成能力の劣る成人ラットでの検討、衝撃波の伝播特性が異なる大動物での検討とともに衝撃波による骨形成誘導効果の機序の解明が必要である。2.安全性の検証:頭蓋骨欠損モデルの骨欠損部直上から衝撃波を0.510MPaまで変化させて圧依存性の組織学的損傷を評価した結果、1MPa以下では組織学的損傷は認められなかったものの、15MPaでは脳表血管の破綻による硬膜下出血が認められ、5MPa以上では脳内血管の破綻による血腫形成が認められた。一方、脳表を被覆する衝撃波緩衝材の検討の結果、脳外科手術で頻用するGORE-TEX人工硬膜に著明な衝撃波減衰効果があることが物理実験・数値解析により明らかとなり、動物実験においてもその安全性が組織学的に確認された。
後期近代英語期の辞書に見る意味と形態の変遷：新語義の足跡と作家の創意を照査して

本研究では,英国近代小説勃興期の作家が用いた特徴的な語彙の「形態」,「語源」・「語義変化」を,17世紀末から19世紀初頭までに出版された「英語辞書」に照らし合わせて調査することを課題とし,必要に応じては,前時代の作家が創造した新語とも比較・分析を試みたものである。特に最終年度では, “half"という語に焦点を絞り,この語が当時の辞書に,どの程度慣用句や副詞・連結形の用法として記載されるようになったのか,2017年度のアプローチと同様,当時の主な辞書の調査により導き出すと共に,Richardsonの3つの書簡体小説及び『模範書簡集』(Familiar Letters)に見られる“half"の例を,他の代表的作家の場合と比較・考察することで,Richardsonの“half"使用法の技巧を浮き彫りにした。本研究は,英国において近代小説黎明期の作家が使用し始めた「新語」「造語」の形態や語義変化を,18世紀初頭から19世紀中庸までに出版された「辞書」に照らし合わせて調査・分析することで,後期近代英語期に特有の語彙の傾向・特徴を明らかにしようとするものである。四年間の研究期間のうち,初年度にあたる平成26年度には,主に近代小説の祖と称される作家についてOxford English Dictionaryの初例になっている語や新語義として初出となっている独自性の高い語を中心に収集し,必要に応じては,それらの語を語形成の面より分類していった。所属学会では,通時的視座により吟味・考察された研究発表の司会を務めることで,自らの研究に結びつく学術的な情報,分析上のヒントを得た。論文の形での発表としては,「語学的文体論に基づく大学英語教育ー二篇の英詩を教材としてー」(岡山英文学会:Persica 41号)である。英語学と英語教育の接点に関わる論考であるが,二編の英詩に用いられている重要語の意味(比喩的意味も含め),形態,音の象徴等について,教育的な観点を交えて精査した。伝統的手法で書かれた英詩に見られる古語用法とその文体的効果を指摘したが,これにより,本研究を遂行する上での視野を広げることができた。本研究は,イギリスにおける小説勃興期の作家が用いた「新語」の形態,及び,その時代に特有な語彙の「語源」「語義変化」について,18世紀初頭から19世紀中庸までに出版された代表的な「辞書」に照らし合わせて調査・分析するものである。なお,今年度の論文としての発表は,「英語教科書の歴史に辿る教材としての英詩ー有海(1938)再考ー」(岡山大学大学院教育学研究科研究集録:160巻)である。勤務校での最優先業務等のため,当初の計画より遅れたことによる。本研究では,18世紀を中心とする英国小説勃興期の作家に特有な語彙について,当時出版された代表的な「英語辞書」に照らし合わせて考察することを目的としている。四年間の研究期間のうち,三年目にあたる平成28年度には,まず,これまでの研究の一部について口頭発表を行い,フロアからのコメントを頂くことで意見交換をし,同領域の専門家と研究情報を共有した。続いて,かねてより実地調査を計画していた英国ケンブリッジ大学中央図書館(所属はWolfson College)に赴き,現地ならではの情報や文献・資料を直接収集した。ここで得た資料を参考に,18世紀の代表的な作家であるSamuel Richardson (1689-1761)の3つの書簡体小説に見られる特徴的な複合語(とりわけ複合名詞や複合形容詞)を,前時代のShakespeareの場合と比較・考察することで,特定の複合語を通じて,初期近代英語から後期近代英語の時代にかけての言葉の推移の一端を探った。勤務校の優先業務遂行のため,当初の計画より遅れたことによる。本研究の課題は,イギリスの小説黎明期の作家の使用した特徴的な語彙について,当時出版された代表的な「英語辞書」に照らし合わせて考察することにある。前年度(平成28年度)には,主に17世紀から18世紀前半のDr. Johnsonの「英語辞書」以前の辞書を調査したが,平成29年度には,これらの辞書から躍進を遂げたDr. Johnsonの「英語辞書」を中心に調査・分析していった。特に,Dr. Johnsonの独特の定義を浮き彫りにすること,及び用例とした作品の傾向などを探り出そうとした。他方,個人的に研究対象としているSamuel Richardson(1689-1761)について,彼が3つの書簡体小説の中で使用した特徴的な語彙(例えばOxford English Dictionaryで"rare," "nonce word"とされているものや"dilly-dally"のようなreduplication <加重字,加重音節>から成る語等)が,Dr. Johnsonの辞書を含め,当時の辞書においてどのように取り扱われているのかについて調査していった。資料が広範囲にわたる中,これらの調査は現段階においても継続中で,その分析結果についてはまだ発表に至っていない。1年の補助事業期間延長が承認されたことにより,最終年度が平成30年度となり,この年度に向けて,口頭発表,もしくは論文の形にまとめたいと考えている。また,平成29年度には,18世紀や19世紀の文学作品を英語学の知見を援用して読み解くことが,英語教育にどのように資するかについて,関連学会のシンポジウムの講師として口頭発表した。この発表においては,作家の特徴的な語彙についても取り上げたが,その点が今回の課題である辞書の考察にも繋がった次第である。