hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
制がん活性を有する高分子プロドラッグの分子設計

生分解性高分子をキャリヤ-として選び、それら高分子キャリヤ-への5ーフルオロウラシル(5FU)の担持、および認識能を有する糖鎖の導入を行い、in vitroでのがん細胞増殖抑制効果とin vivoにおける担がんマウスの延命効果を評価して、5FUの高分子プロドラッグの分子設計について検討を加えた。そして、以下の結果を得た。1)生分解性高分子/5FU・コンジュゲ-トの合成:リンゴ酸ポリマ-、キトサン、ポリガラクトサミンをキャリヤ-とし、疎水性のヘキサメチレン鎖を介してアミド結合、エステル結合、カルバモイル結合などで5FUを担持した高分子コンジュゲ-トの合成法を確立した。2)認識能を有する糖鎖を導入した生分解性高分子(5FU・コンジュゲ-トの合成:キトサン、ポリガラクトサミンなどにはキャリヤ-自体の性質から特定細胞へのアフィニティが期待されるが、リンゴ酸ポリマ-ではそのようなことは期待できない。そこで標的指向性を賦与する目的で肝細胞に認識されるガラクトサミンなど種々の認識能を持つ糖鎖を5FUと共にリンゴ酸ポリマ-に担持した。3)薬物のリリ-ス挙動の評価:リパ-ゼ、エステラ-ゼなどによる酵素分解に伴う5FUのリリ-スは認められず、アルカリ性pH条件下で非酵素的な5FUのリリ-スが起こりやすくなることがin vitroで明かとなった。4)制がん活性の評価:生分解性高分子への5FUのコンジュゲ-ト化により、副作用が軽減し、p388担がんマウスの延命効果が大きくなることがわかった。またガラクトサミン鎖の導入は肝がん細胞SKーHepーlの増殖抑制効果をCell Specificに発現することも明かとなった。平成2年度は以下に示すように、PEG、リンゴ酸ポリマ-、キチン、キトサン、ポリガラクトサミン等生体内分解吸収性の高分子をキャリヤ-として選び、それら高分子キャリヤ-への5ーフルオロウラシル(5FU)の担持、および認識能を有する糖鎖の導入を試み、それらの合成法を確立し、in vitroでの5FUのリリ-ス挙動について検討した。1)生体内分解吸収性高分子/5FU・コンジュゲ-トの合成PEG、リンゴ酸ポリマ-、キチン、キトサン、ポリガラクトサミンをキャリヤ-とし、疎水性のヘキサメチレン基を介してアミド結合、エステル結合、カルバモイル結合などで5FUを担持した高分子コンジュゲ-トの合成を試み、それらの合成法を確立した。2)認識能を有する糖鎖を導入した生体内分解吸収性高分子/5FU・コンジュゲ-トの合成キチン、キトサン、ポリガラクトサミンなどにはキャリヤ-自体の性質から特定細胞へのアフィニティ-が期待されるが、PEG、リンゴ酸ポリマ-ではそのようなことは期待できない。そこで標的指向性を賦与する目的で肝細胞に認識されるガラクト-ス、ガラクトサミンなど種々の認識能を持つ糖鎖を5FUと共に、PEGおよびリンゴ酸ポリマ-に担持することを試みた。3)薬物のリリ-ス挙動の評価上記の方法で合成した高分子コンジュゲ-トの酵素系および非酵素系での加水分解速度を高速液体クロマトグラフィ-を用いて測定し、薬物のリリ-スを評価した。In vitroでは、リパ-ゼ、エステラ-ゼなどによる酵素分解に伴う5FUのリリ-スは認められず、アルカリ性pH条件下で非酵素的な5FUのリリ-スが起こりやすくなることが明かとなった。現在、がん化学療法に用いられている制がん剤5ーフルオロウラシル(5FU)は強い制がん活性を有するが、同時に強い副作用を有している。

そこで、昨年度は、5FUの副作用の抑制、薬効の特続性の向上、標的部位への薬物の選択的な運搬などを期待して、リンゴ酸ポリマ-、キトサン、ポリガラクトサミンなどの生分解性高分子に5FUを担持した高分子コンジュゲ-トの合成を行った。今年度は、このようにして合成した生分解性高分子/5FUコンジュゲ-トからの5FUのリリ-ス挙動とそれらの制がん活性の評価を行い、制がん活性を有する高分子プロドラッグの分子設計について検討を加えた。そして、以下の結果を得た。1)薬物のリリ-ス挙動の評価:合成した高分子/5FUコンジュゲ-トの酵素系および非酵素系での加水分解を37°Cでin vitroで行い、高速液体クロマトグラフィ-を用いて5FUのリリ-ス挙動を調べた。その結果、リパ-ゼ、エステラ-ゼなどによる酵素分解で起こる5FUのリリ-スは観測されず、アルカリ性pH条件下で非酵素的な5FUのリリ-スが起こりやすくなることが明かとなった。2)制がん活性の評価:上記のコンジュゲ-トの腸瘍増殖抑制効果をin vitroで調べ、p388白血病細胞担がんマウスに対する延命効果をip投与で評価した。その結果、生分解性高分子へ5FUをコンジュゲ-ト化することにより、5FUの副作用が軽減し、有効な延命効果が発現することがわかった。またガラクトサミン鎖のコンジュゲ-トへの導入、あるいはキャリア-としてのポリガラクトサミンの使用は、肝がん細胞SKーHepー1の増殖抑制効果をCell Specificに発現することが明かとなり、Targeting Moietyとして糖鎖が有用であることが示された。
ATP依存性プロテアーゼClpAPの1分子回転観察

本年度は、昨年度から継続してATP類似体の有用性について調べた。まずATP類似体の1つであるATPγSはATPに比べて50倍遅く加水分解されることを生化学的に明らかにした。F_1-ATPaseを用いた1分子回転観察でも、ATPγSはATPに比べて60倍遅く加水分解されることが分かり、生化学的な結果とほぼ一致した。次に別のATP類似体であるATPαSは、ATPに比べて3倍程度遅く加水分解されることも明らかになった。一般的に測定系を高速化するほど、得られる結果のシグナル-ノイズ比が低下し、正確な測定ができなくなる。ATPの類似体をもちいて、反応のある素過程を遅くすることで、測定系の高速化を避けることが可能になり、測定結果の精度が向上することが期待できる。実際、これらの類似体を用いることで、これまで高速で観察が難しかった現象を簡単に可視化することが可能になった。分子モーターたんぱく質の性質を詳細に調べる有用な方法の1つに、外力を人工的に与え、タンパク質分子の動きを調べる実験がよく行われる。本年度はこの手法の有用性を検証すべく、タンパク質分子に外力を与える実験もおこなった。具体的には、回転分子のF_1に磁気ビーズを結合させておき、外部から磁場を人工的に与えてたんぱく質に外力を加え、たんぱく質の運動がどう変化するか検証した。この結果、F_1の回転の待ち時間が外力の大きさ、向きによって大きく変化するのが確認できた。磁気をもちいた系は回転する,タンパク質分子に有用であり、つまり回転モーターと予想されるClpAPへの応用も期待できる。ClpAとClpPのリング間の動きを外力で制御することで基質の分解速度等を制御できる可能性がある本年度は,まず実験系の改良をおこなった.金粒子はタンパク質に非特異的に吸着するので実験が煩雑になっていた.金粒子の代わりに直径0.1μm-0.2μmのポリスチレン製のビーズを用いることにした.ポリスチレンビーズは金粒子に比べ扱いやすく,実験を簡便化することができた.またポリスチレンビーズの表面の官能基がアミノ基ではなくカルボキシル基のものを使うことでガラスへの非特異的な吸着も抑えることができた.さらに,光学系,記録装置の改良をおこなった.これにより記録時間が従来の系に比べ200倍以上にも延び,これまでの高時間分解能だが記録時間が短いという問題を克服することができた.さらに,記録する画素サイズの大きさを任意に変えることが可能になったので,データの容量も軽くすることができ,パソコン上での処理が容易になった.また本年度は,1分子観察系でのATPアナログの有用性を調べた.F_1ATPaseを材料にまずATP_γSの効果を調べ,これがATP同様に基質として働くことを1分子の回転で示した.しかも,ATP_γ-SはATPに比べ加水分解反応が著しく遅く起こるので,1分子で加水分解の過程を調べるのに非常に有用でみることを示すことができた.ATP_γ-Sの結果は,去年報告した加水分解が遅くなる変異体の結果と一致するものであった.ATPの結合と回転を1分子で同時に観察するために,蛍光ATPの1つであるCy3-EDA-ATPの作成を試みた.Cy3-EDA-ATPの2つの異性体を完全に分離するまでは至っていないが,作成したCy3-EDA-ATPを粗精製することができた.今後1分子観察への応用が期待できる.本年度は、昨年度から継続してATP類似体の有用性について調べた。ClpAとClpPのリング間の動きを外力で制御することで基質の分解速度等を制御できる可能性がある
超音波による抗腫瘍薬の生体内局所活性化

超音波の抗腫瘍作用及び薬物との併用による効果増加について照射条件の検討、作用機序解明、動物治療実験を実施し次の16の結果を得た。1.超音波単独、又は薬物との併用に於る抗腫瘍効果を、in vitro腫瘍細胞浮遊液で確認した。超音波と併用することにより殺細胞効果が発現、又は増強される薬物をスクリ-ニングした結果、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、フェオフォルバイド(クロリン誘導体)、アドリアマイシン、及びFAD104(アンスラサイクリン系制癌剤)で優れた増強効果を認めた。2.超音波の作用には物理作用と、キャビテ-ションを介して発生する活性酸素種による化学作用とがあると推定されるので、一重項酸素(^1O_2)の消去剤であるヒスチジンとス-パ-オキサイドラジカル(^-O_2)の消去剤であるス-パ-オキサイドジスムタ-ゼ(SOD)、及び水酸ラジカル(OH・)の消去剤であるマンニト-ルの添加のin vitro殺細胞作用に対する影響を、ラットascite hepatoma130(AH130)とマウスsarcoma180を用いて検討した。一重項酸素の消去剤であるヒスチジンの添加が、超音波とヘマトポルフィリン、又はアドリアマイシン併用処置の殺細胞効果を著しく抑制することを認め、殺細胞作用機序における一重項酸素の関与を確認した。この結果はJpn.J.Cancer Res.(1989)に公表した。3.超音波照射による水溶液中での活性酸素生成をラジカル生成を指標として電子スピン共鳴(ESR)により測定した。関与する活性酸素種は使用する特異的ESR試薬、及び特異的スカベンジャ-による阻害により推定した。^1O_2により4ーoxoーTEMPOラジカルになる2、2、6、6ーtetramethylpiperidineを含む空気飽和緩衝液に超音波を照射し、20KHz、及び2MHzの周波数で^1O_2の生成と超音波強度依存性を確認した。しかし、窒素ガス飽和下では4ーoxoーTEMPOの生成は認められなかった。以上の結果から、酸素ガス由来の^1O_2生成を確認した。活性酸素スカンベジャ-を用いた阻害実験では、4ーoxoーTEMPOの生成はヒスチジン、又はSODの添加によってのみ阻害された。故に^1O_2と^ーO_2の関与が示され、一方OH・、及び過酸化水素は関与していないことが示唆された。ヘマトポルフィリン、又はアドリアマイシン共存下で超音波による4ーoxoーTEMPOラジカル生成量は増加した。この増加分に対するヒスチジンの阻害効果から^1O_2の関与が大きいことが示唆された。この結果はSofiaでのPhotodynamic therapy国際学会(1989年)で公表済みである。4.超音波による薬物の活性化メカニズムを明らかにするために水に超音波を照射し発光スペクトルを測定し、さらに活性酸素の消去剤添加の影響を検討した。発光は、活性酸素の消去剤により影響を受けないことから、超音波による発光メカニズムとして、キャビテ-ションによりミクロ領域に生じる高温状態が考えられる。発光強度が超音波強度の二乗に比例することを認め、光の仲介によるヘマトポルフィリン励起の可能性が示された。5.動物腫瘍治療実験では、2MHzの起音波照射が、ラットAH130腫瘍体積増加を抑制し宿主ラット生存日数を延長することを確認した。ヘマトポルフィリンを予め静脈内投与したラットでは、ヘマトポルフィリンが腫瘍内に蓄積しており、そこへ局所的に超音波を照射することにより超音波の抗腫瘍効果が増加することを確認した。またマウス固形腫瘍、sarcoma180及びcolon26を用いた実験においても超音波とヘマトポルフィリン、アドリアマイシン、又はFAD104の併用が超音波単独、又は薬物単独と比べて著しい腫瘍増殖抑制を示すことを確認した。6.臨床使用を目的として位相差配列型(phased array)超音波照射装置を作製し、ラット肝臓を用いて深部到達性、及び集束性を確認し病理的検討を加えた。3次元的な超音波の集束部位のみに組織の壊死が認められ、集束部位以外には何らの影響も認められなかった。

一重項酸素の消去剤であるヒスチジンの添加が、超音波とヘマトポルフィリン、又はアドリアマイシン併用処置の殺細胞効果を著しく抑制することを認め、殺細胞作用機序における一重項酸素の関与を確認した。この結果はJpn.J.Cancer Res.(1989)に公表した。3.超音波照射による水溶液中での活性酸素生成をラジカル生成を指標として電子スピン共鳴(ESR)により測定した。関与する活性酸素種は使用する特異的ESR試薬、及び特異的スカベンジャ-による阻害により推定した。^1O_2により4ーoxoーTEMPOラジカルになる2、2、6、6ーtetramethylpiperidineを含む空気飽和緩衝液に超音波を照射し、20KHz、及び2MHzの周波数で^1O_2の生成と超音波強度依存性を確認した。しかし、窒素ガス飽和下では4ーoxoーTEMPOの生成は認められなかった。以上の結果から、酸素ガス由来の^1O_2生成を確認した。活性酸素スカンベジャ-を用いた阻害実験では、4ーoxoーTEMPOの生成はヒスチジン、又はSODの添加によってのみ阻害された。故に^1O_2と^ーO_2の関与が示され、一方OH・、及び過酸化水素は関与していないことが示唆された。ヘマトポルフィリン、又はアドリアマイシン共存下で超音波による4ーoxoーTEMPOラジカル生成量は増加した。この増加分に対するヒスチジンの阻害効果から^1O_2の関与が大きいことが示唆された。この結果はSofiaでのPhotodynamic therapy国際学会(1989年)で公表済みである。4.超音波による薬物の活性化メカニズムを明らかにするために水に超音波を照射し発光スペクトルを測定し、さらに活性酸素の消去剤添加の影響を検討した。発光は、活性酸素の消去剤により影響を受けないことから、超音波による発光メカニズムとして、キャビテ-ションによりミクロ領域に生じる高温状態が考えられる。発光強度が超音波強度の二乗に比例することを認め、光の仲介によるヘマトポルフィリン励起の可能性が示された。5.動物腫瘍治療実験では、2MHzの起音波照射が、ラットAH130腫瘍体積増加を抑制し宿主ラット生存日数を延長することを確認した。ヘマトポルフィリンを予め静脈内投与したラットでは、ヘマトポルフィリンが腫瘍内に蓄積しており、そこへ局所的に超音波を照射することにより超音波の抗腫瘍効果が増加することを確認した。またマウス固形腫瘍、sarcoma180及びcolon26を用いた実験においても超音波とヘマトポルフィリン、アドリアマイシン、又はFAD104の併用が超音波単独、又は薬物単独と比べて著しい腫瘍増殖抑制を示すことを確認した。6.臨床使用を目的として位相差配列型(phased array)超音波照射装置を作製し、ラット肝臓を用いて深部到達性、及び集束性を確認し病理的検討を加えた。3次元的な超音波の集束部位のみに組織の壊死が認められ、集束部位以外には何らの影響も認められなかった。
プログラム評価理論・方法論を用いた効果的な福祉実践モデル構築へのアプローチ法開発

ソーシャルワークの領域でも科学的根拠に基づく実践(EBP)が重視される中、実践家が参画して実践現場から効果的プログラムモデルを形成・発展させる取り組みは少ない。本研究では、福祉各領域11プログラムへの適用経験から、「プログラム理論・エビデンス・実践間の円環的対話による、効果的福祉実践プログラムモデル形成のための評価アプローチ法(CD-TEP評価アプローチ法」という実践家参画型で効果的プログラムモデルを開発するアプローチ法を開発し、その有用性を示した。本研究の目的は、1980年代以降アメリカを中心として、理論的にも実践的にも急速に発展して来たプログラム評価の理論と方法論を用いて、新しく導入されつつある日本の社会福祉実践プログラムを、科学的根拠に基づく効果的なプログラムモデルとして構築するためのアプローチ法を開発・定式化し、社会福祉実践プログラムに関わる関係者間で共有することにある。そのために、高齢者福祉領域、児童・思春期福祉領域、障害者福祉領域、精神保健福祉領域の新しい実践プログラム開発に関わる関係者が合同の研究会を組織し、集中的な議論を重ねながら、各領域の社会福祉実践プログラムにプログラム評価の理論と方法論を適用して、それらが、より効果的なプログラムに発展するためのアプローチ法を検討し、関係者間で共有する。その上で、それぞれの領域で重要な位置づけを持ついくつかの新しいプログラムを取り上げ、検討したアプローチ法を適用して、より優れた効果を持つプログラムに発展する可能性を検証する。この検証結果を踏まえて、日本の社会福祉実践プログラム領域に適合的で、より効果の上がるプログラムモデルの開発・構築に有効なアプローチ法を提案し、社会福祉学関係者間における合意形成に資することを目指す。本研究では、近年アメリカを中心として理論的にも実践的にも急速に発展しているプログラム評価の理論と方法論を用いて、新しく導入された日本の社会福祉実践プログラムを、科学的根拠に基づく効果的なプログラムモデルとして構築するためのアプローチ法を開発・定式化し、社会福祉実践プログラムに関わる関係者間で共有することを目的に行われる。そのために、高齢者福祉領域、児童・思春期福祉領域、障害者福祉領域、精神保健福祉領域の新しい実践プログラム開発に関わる関係者が合同の研究会を組織し、集中的な議論を重ねながら、各領域の社会福祉実践プログラムにプログラム評価の理論と方法論を適用して、それらがより効果的なプログラムに発展するためのアプローチ法を検討し、関係者間で共有する。研究初年度の2007年度は、研究の第Iステージである「効果的モデル構築のためのアプローチ法検討と合意形成」(高齢者福祉、児童・思春期福祉など各領域の関係者が合同研究会を組織し、社会福祉実践プログラムにプログラム評価の理論と方法を適用し、より効果的なプログラムに発展させるためのアプローチ法を検討)、第IIステージの「予備的プログラム評価調査」(制度モデル・既存モデルに対する予備的評価を個別プログラムに実施)を行い、現在、第IIIステージ「暫定効果モデルの構築」(予備的プログラム評価および文献的・事例的検討から効果的なプログラム援助要素を抽出し、プログラム理論を適用して暫定効果モデルを作成)に取り組んでいる。精神保健福祉領域における退院促進支援事業と、障害者領域における就労移行支援事業が先行して進められ、各プログラム評価のモデルケースとなっている。本研究では、アメリカを中心として理論的にも実践的にも急速に発展しているプログラム評価の理論と方法論を用いて、新しく導入された日本の社会福祉実践プログラムを、科学的根拠に基づく効果的なプログラムモデルとして構築するためのアプローチ法を開発・定式化し、社会福祉実践プログラムに関わる関係者間で共有することを目的に行われる。そのために、高齢者福祉、児童・思春期福祉、障害者福祉、精神保健福祉領域の新しい実践プログラム開発に関わる関係者が合同の研究会を組織し、集中的な議論を重ねながら、各領域の社会福祉実践プログラムにプログラム評価の理論と方法論を適用して、それらがより効果的なプログラムに発展するためのアプローチ法を検討し、関係者間で共有する。研究初年度である2007年度に行った、研究の第Iステージの「効果的モデル構築のためのアプローチ法検討と合意形成」(高齢者福祉、児童・思春期福祉、障害者福祉、精神保健福祉領域の関係者が合同研究会を組織し、社会福祉実践プログラムにプログラム評価の理論と方法を適用し、より効果的なプログラムに発展させるためのアプローチ法を検討)、第IIステージの「予備的プログラム評価調査」(制度モデル・既存モデルに対する予備的評価を個別プログラムに実施)を基に2008年度は第IIIステージ「暫定効果モデルの構築」(予備的プログラム評価および文献的・事例的検討から効果的なプログラム援助要素を抽出し、プログラム理論を適用して暫定効果モデルを作成)を行った。本研究は、アメリカを中心として理論的・実践的にも発展しているプログラム評価の理論と方法論を用いて、新しく導入されつつある日本の社会福祉実践プログラムを、科学的根拠に基づく効果的なプログラムモデルとして構築するためのアプローチ法を開発・定式化し、社会福祉実践プログラムに関わる関係者間で共有することを目的としている。

そのために、高齢者福祉、児童・思春期福祉、障害者福祉、精神保健福祉領域の新しい実践プログラム開発に関わる関係者が合同の研究会を組織し、集中的な議論を重ねながら、各領域の社会福祉実践プログラムにプログラム評価の理論と方法論を適用して、それらがより効果的なプログラムに発展するためのアプローチ法を検討し、関係者間で共有する。研究プロセスの第IIIIステージ、すなわちI)効果的モデル構築のためのアプローチ法検討と合意形成、II)予備的プログラム評価調査の実施、III)暫定効果モデルの構築については昨年度までに研究され、それらが実施できたプログラム評価班においては、第IVステージであるIV)全国プログラム評価調査を実施した。全国プログラム評価調査に参加する施設をプログラムごとに全国から選定し、暫定効果モデルに基づくプログラムを実施し、アウトカム評価とプロセス評価・フィデリティ評価を行った。参加施設の担当者には第IIIステージで作成した実施ガイドライン・マニュアルに基づいて研修会が開催され、プロセス評価・フィデリティ評価の施設調査も研究協力者である大学院生が施設・活動を訪問して、観察やヒヤリングに基づいて行った。障害者福祉領域における就労移行支援事業と精神保健福祉領域における退院促進支援事業が先行して進められ、各プログラム評価のモデルケースとなっている。本研究は、アメリカを中心として理論的にも実践的にも急速に発展してきたプログラム評価の理論と方法論を用いて、新しく導入されつつある日本の社会福祉実践プログラムを、科学的根拠に基づく効果的なプログラムモデルとして構築するためのアプローチ法を開発・定式化し、社会福祉実践プログラムに関わる関係者間で共有することを目的としている。これまで第Iステージ:効果的モデル構築のためのアプローチ法検討と合意形成、第IIステージ:予備的プログラム評価調査の実施、第IIIステージ:暫定効果モデルの構築、第IVステージ:全国プログラム評価調査の実施をしてきたが、本年度は第IIIVステージの研究をするとともに第V:効果的な提案モデルの構築、第VIステージ:効果的なプログラムモデル構築ためのアプローチ法の確立と提案を実施した。第Vステージでは、全国プログラム評価調査から、アウトカム指標とプロセス評価・フィデリティ評価項目との関係を分析し、各個別プログラムの効果的なプログラムについて提案モデルを作成した。第VIステージにおいては、アメリカから対人サービスのプログラム評価の専門家を招へいし作成したアプローチ法に対する意見を求めるとともに、国際シンポジウムを開催してアプローチ法の有効性について幅広く議論をした。本研究で確立した「効果的な社会福祉実践プログラムモデル構築のためのアプローチ法」をCD-TEP評価アプローチ法として定式化し、ホームページを作成し一般に公開をした。
中耳真珠腫組織における骨破壊誘導物質産生機構の解明

中耳真珠腫の産生する骨破壊誘導物質に関するこれまでの研究において不明瞭であった点につき、本年度購入したイムノリ-ダ-等を駆使してまず検討し、以下の結果を得た。すなわち培養真珠腫上清中のInterleukin-1α(以下IL-1α)レベルをELISA法にて定量し、培養5日間中23日にPeakとなること、培養時に加えたindomethacinはIL-1αレベルに顕著な影響は及ぼさないこと等を確認した。これらをふまえてさらに計画にもとづいた以下の研究を行なった。1.真珠腫組織内のIL-1αの産生細胞の同定:免疫組織化学的手法により真珠腫組織中の上皮細胞層にIL-1αが多量に存在することが明らかとなった。また上皮下肉等腫内にも、各種細胞間もしくは細胞膜上に局在が認められた。培養細胞を用いての実験ではケラチノサイトがIL-1αのを産生放出することを確認し、免疫組織化学との一致をみた。その他A431cell line等の細胞がIL-1αを産生することを明らかにした。2.IL-1αの産生促進機構:ケラチノサイト等を用い、IL-1α産生への影響を検討しつつ、かつケラチノサイトの長期培養法について実験を行なってきた。今のところendotoxin等によるIL-1αの産生への影響は認められない。3.ケラチンによる肉芽腫形成と骨破壊への役割:ラット空気襄炎症を用いて調べたところケラチン注入後1014日で顕著なgiant cell出現を伴なう肉芽腫形成に到ることがあきらかとなった。真珠腫組織の産生する骨吸収活性は抗IL-1α抗体で特異的に中和されにというこれまでの検討結果からIL-1αの存在に注目してきたが、冒頭にも述べたIL-1αのレベルの測定結果よりIL-1α骨吸収活性全てを説明するに足る量には至らないことも判明し、IL-1αに加え未知の因子の存在も考えられる。従って今後IL-1αの産生機構についての解明に加え、他の因子についてのケラチン肉芽腫等を用いて検索を行う予定である。
高精度熱量測定法によるモルテングロビュール構造安定化機構の解明

今年度は前年度までに構造情報を明らかにした酸性pH・高塩濃度条件でのウマシトクロムcの2つのモルテングロビュール状態(MG1,MG2)についての熱力学的性質を示差走査熱量測定(DSC)、等温酸滴定熱量測定(IATC)、圧力摂動熱力測定(PPC)を用いて解析した。IATC測定により塩化カリウム濃度500mM条件でのウマシトクロムcの天然状態(N)からMG1状態への熱力学量を複数温度で評価した。20°Cでの熱力学量は転移中点pH:3.56、エンタルピー変化ΔH:20kJmol^<-1>、熱容量変化ΔC_p:3.1kJK^<-1>mol^<-1>となった。DSC測定により塩化カリウム濃度を200-600mM条件でのMG1から変性状態(D)への転移の熱力学量を解析し塩濃度0mM条件での熱力学量を評価した。塩濃度0mM条件でのエンタルピー変化ΔHはMG1からMG2への転移、MG2からDへの転移ともに100kJmol^<-1>程度になった。MG1からMG2への転移における熱容量変化ΔC_pは0.4kJK^<-1>mol^<-1>と非常に小さな値を示し、2つのMG状態の水和量はあまり変化していないことがわかった。DSC,IATCにより評価した熱容量変化ΔC_pからMG1、MG2はともに天然状態(N)の50%程度の疎水領域を保持していることが示された。またこれまでの研究でモルテングロビュール状態の安定性・構造にはタンパク質表面の静電相互作用が重要であることがわかり、表面静電相互作用の安定性・機能への寄与を調べるため米国のペンシルヴァニア州立大学医学研究科(2007年8月からレンセリアー工科大学生物工学研究科)のG.I.Makhatadze博士の研究室においてタンパク質表面静電相互作用を最適化による高安定化タンパク質変異体の安定性の解析、タンパク質とαヘリックスペプチドの結合反応の解析を行った。シトクロムcには酸性pH、高塩濃度条件で2つのモルテングロビュール状態(MG1,MG2)が存在することが示唆されていたが詳細は不明であった。今年度の研究では酸性pH、高塩濃度条件でのシトクロムcのMG1から変性状態(D)への熱転移を熱測定(IATC,DSC,PPC)と円二色性(CD)測定、X線小角散乱(SAXS)で観測した。DSC測定を用いてシトクロムcのMG状態の熱転移に伴う熱力学量変化を評価し、各温度でのモル分率を決定した。その結果MG1D熱転移には中間状態(MG2)が存在することが確認され、50°C付近でモル分率は最大0.35になった。CDよりMG1、MG2ともにN状態と同程度のα-ヘリックス量を保持しており、MG2の3次構造はMG1よりも壊れていることがわかった。SAXSの結果は現在解析中である。PPCより高塩濃度存在条件での部分体積はMG2,MG1,天然状態(N)の順に減少することが観測され、蛋白質構造形成に伴い疎水性残基の脱水和がおきることが示唆された。また、これまで2状態転移と考えられてきたシトクロムcの低塩濃度条件でのND熱転移をDSCで観測し、中間(I)状態の存在を明確にした。I状態のモル分率はpH4.1、70°Cで最大40%となった。CDよりI状態では2次構造はN状態と同程度形成しているが、3次構造はNより壊れていることがわかった。また、SAXSよりI状態は球状でNと同程度にコンパクトであることがわかった。PPCよりI状態の部分体積はNとDの中間であり、部分的に水和した疎水コアの存在が示唆された。これらの結果よりI状態ではMG構造が形成されていることがわかった。従来シトクロムcのMG構造は高塩濃度などの特殊な条件下で観測されてきたが、本研究より、通常のフォールディング実験の条件(低塩濃度)でもMG構造が安定に存在することが明らかになった。前年度の研究により、これまで2状態転移と考えられてきた天然状態(N)変性状態(D)の転移に中間状態(1)が存在することが確認された。18年度は低塩濃度条件でのシトクロムcのND熱転移を分光測定と各種熱量測定を用いて詳細に解析し、熱転移中間状態であるI状態の構造と熱力学的安定化機構を明らかにした。円二色性(CD)測定によりI状態は2次構造をN状態と同程度保持しているが、側鎖のパッキングなどの3次構造はN状態より壊れていることがわかった。また複数温度で溶液X線散乱測定を行ない、熱測定により評価した各状態のフラクションを用いて解析し、I状態の散乱プロファイルを推定した。I状態が球状でN状態と同程度にコンパクトであることが明らかになった。これらの結果はI状態がモルテングロビュール(MG)状態であることを示している。酸滴定熱量測定と示差走査熱量測定により、NMG転移の熱容量変化は03kJK^<-1>mol^<-1>の範囲であることが評価された。これはN状態で内部に埋もれている疎水部分の多くがMG状態でも保持されていることを示しており、MG状態は主に疎水相互作用により安定化されていることが示唆された。

低塩濃度条件でのシトクロムcの相図を作成し、pH4以上でND熱転移の間にMG状態が存在することが示された。これは蛋白質分子表面の静電反発が弱い溶媒条件では低塩濃度でもMG状態が安定に存在することが示唆している。またpH4.1,低塩濃度,15°CでのNMG転移、ND転移のギブス自由エネルギー変化はそれぞれ922kJmol^<-1>、4145kJmol^<-1>となり、低塩濃度条件でのMG状態はN状態が安定に存在する溶媒条件でD状態よりエネルギー的に安定であることが明らかになった。これはMG状態がフォールディング中間体に近いエネルギー的性質を示すことが示唆された。今年度は前年度までに構造情報を明らかにした酸性pH・高塩濃度条件でのウマシトクロムcの2つのモルテングロビュール状態(MG1,MG2)についての熱力学的性質を示差走査熱量測定(DSC)、等温酸滴定熱量測定(IATC)、圧力摂動熱力測定(PPC)を用いて解析した。IATC測定により塩化カリウム濃度500mM条件でのウマシトクロムcの天然状態(N)からMG1状態への熱力学量を複数温度で評価した。20°Cでの熱力学量は転移中点pH:3.56、エンタルピー変化ΔH:20kJmol^<-1>、熱容量変化ΔC_p:3.1kJK^<-1>mol^<-1>となった。DSC測定により塩化カリウム濃度を200-600mM条件でのMG1から変性状態(D)への転移の熱力学量を解析し塩濃度0mM条件での熱力学量を評価した。塩濃度0mM条件でのエンタルピー変化ΔHはMG1からMG2への転移、MG2からDへの転移ともに100kJmol^<-1>程度になった。MG1からMG2への転移における熱容量変化ΔC_pは0.4kJK^<-1>mol^<-1>と非常に小さな値を示し、2つのMG状態の水和量はあまり変化していないことがわかった。DSC,IATCにより評価した熱容量変化ΔC_pからMG1、MG2はともに天然状態(N)の50%程度の疎水領域を保持していることが示された。またこれまでの研究でモルテングロビュール状態の安定性・構造にはタンパク質表面の静電相互作用が重要であることがわかり、表面静電相互作用の安定性・機能への寄与を調べるため米国のペンシルヴァニア州立大学医学研究科(2007年8月からレンセリアー工科大学生物工学研究科)のG.I.Makhatadze博士の研究室においてタンパク質表面静電相互作用を最適化による高安定化タンパク質変異体の安定性の解析、タンパク質とαヘリックスペプチドの結合反応の解析を行った。
大域最適化手法による離教的な最適化問題の実用的なアルゴリズムに関する研究

本研究では、今までのネットワーク理論と異なり、全く違う視点から見た制御不可能フロー問題に焦点を当て、その問題の最適化を見つけ出す解法を大域最適化手法により開発された。初めのテーマとしては最小極大流問題を取り上げている。与えられたグラフG(V,E)とネットワークN(G,c)\に対して、最小極大流問題とは極大フローの中で最も値の小さいフローを見付け出す問題である。我々はネットワークフローの各枝に対して下限を入れて問題を解くことに試みる。Nが連結かつ閉路を含まなければ、この問題が凹関数を多面体の上で最小化することと等価であることが分かった。大域最適化の手法を用いてこの凹関数の最小値とその解を出すのは基本的な考え方である。フローの下界値を改良し最適解を求める二つのアルゴリズムを提案しいる。応用としてこの問題の特別なケースである最小極大マッチング問題も取り上げている。これによって、最小極大流問題はNP-困難であることを示した。提案したアルゴリズムに対して数値実験も行なっている。Nの枝の本数をmとすると、平均計算時間はおよそO(m^6)であるという結果を得た。分数計画問題は二番目の研究テーマである。扱っている問題は分子、分母共に非凸関数であり、一般的にNP-困難であることが知られている。従来、パラメーター法が分数計画問題に有効であるが、分子、分母にある関数が非凸のため、パラメーター法の適用は非効率にある。本研究では、epi-multiple関数を導入し、扱っている問題をd.c,(difference of convex function)最適化問題に置き換える。これによって大域最適的なアルゴリズムを提案した。このアルゴリズムの収束性を証明した。本論研究は主にネットワーク・フロー問題、計算幾何学などに関する幾つかの非凸最適問題を扱っている。この研究の目的は扱っている問題に対して効率的なアルゴリズムを提案することである。与えられたグラフG(V,E)とネットワークN(G,c)に対して、以下の条件を同時満たすNの実行可能フローζ′が存在しないとき、我々はNの実行可能フローζをNの極大フローという:1)任意のe∈Eに対してζ′(e)【greater than or equal】ζ(e)が成立する,2)ζ′(e)≠ζ(e)が成立するe∈Eが存在する。最小極大流問題とは極大フローの中で最も値の小さいフローを見付け出す問題である:γ^*=min{ζの値|ζはNの極大フローである}。フローの下界値を改良し最適解を求める二つのアルゴリズムを提案している。二番目の研究テーマとしては計算幾何学の問題である最小ノルム点問題を取り上げている。最小ノルム点問題は凸計画の問題であるが、扱っている問題の実行可能領域は与えられた複数の点の凸包とあるアフィン部分空間のわりであるという特徴を持っている。複数の点からできた凸包を不等式で表すという効率の悪い手法を避けるため、アフィン部分空間の制約のない最小ノルム点問題に対する既存の解法を拡張してアルゴリズムを提案している。このアルゴリズムはマルコビッツのポートフォリオ最適化問題に応用で、その適用方法も示している。提案しているアルゴリズムに対して、ランダムデータに対する数値実験と実際の日経225データによる数値実験を行ない、この有効性を本研究では、今までのネットワーク理論と異なり、全く違う視点から見た制御不可能フロー問題に焦点を当て、その問題の最適化を見つけ出す解法を大域最適化手法により開発された。

従来、パラメーター法が分数計画問題に有効であるが、分子、分母にある関数が非凸のため、パラメーター法の適用は非効率にある。本研究では、epi-multiple関数を導入し、扱っている問題をd.c,(difference of convex function)最適化問題に置き換える。これによって大域最適的なアルゴリズムを提案した。このアルゴリズムの収束性を証明した。
エイズウイルスの変異と薬剤耐性を識別する検査法の開発

後天性免疫不全症候群(AIDS)はHIV感染によって発症し、最も深刻な感染症の1つである。さらに、薬剤耐性を示す変異HIVの出現と拡散は、深刻な問題となっている。そのため、新たな薬剤耐性HIVの治療法や識別法が求められている。これまでに、代表者は、ペプチドに特異的な蛍光誘導体化反応をもとに、新規のHIVプロテアーゼ活性測定法を開発している。本研究では、この活性測定法を、さらに発展させた薬剤耐性HIVプロテアーゼ識別法への応用を試みた。その結果、本識別法によって、薬剤耐性を示す変異型HIVプロテアーゼを直接識別することができた。HIVプロテアーゼ(HIV-PR)は、HIVの複製に重要であり、その阻害剤がエイズ治療薬として臨床応用されている。HIVはゲノムとしてRNAを持つため、容易に変異を起こすが、HIV-PR遺伝子における変異は、薬剤耐性と密接に関係している。したがって、HIVの変異と薬剤耐性を識別する検査法は、診断や治療だけでなく、抗HIV薬開発においても重要である。これまでに、申請者は、ペプチドに特異的な蛍光誘導体化反応を用いた、新規HIV-PR活性測定法を開発してきた。この測定法は、HIV-PRによって基質から生成された分解ペプチドを蛍光誘導体化後、HPLCによって蛍光検出するものであるが、複数の基質を使用し、そのクロマトグラムパターンを比較することで、基質特異性が変化した変異型HIV-PRを識別できると考えられる。そこで、これまでの基質Ac-SGIFLETSに加えて、新たに2種類のアセチル化ペプチドを基質として使用した。それぞれの基質を用いて酵素反応を行い、蛍光誘導体化後、HPLCによって検出したところ、各基質から生成した分解ペプチドをそれぞれ検出することができた。さらに、これら3種類の基質を同時に使用したところ、それぞれの分解ペプチドを一斉に検出することができたことから、本法は、基質特異性の違いを利用して変異型HIV-PRを識別できると考えられる。HIV-PRにより分解されたペプチドをHPLCによって検出する場合、1回の測定に約20分間を要する。そこで、迅速な測定法を開発するために、HPLCの代わりにマイクロチップ電気泳動装置を使用した。その結果、測定時間を、約1分間に短縮することができた。現在、本検査法によって野生型と変異型のHIV-PRを識別できるか検証するために、変異型のHIV-PRを作製中である。エイズの原因であるHIVは、HIVプロテアーゼ(HIV-PR)や逆転写酵素など、ウイルスの複製に必要な独自の酵素を持っており、これら酵素の阻害剤がエイズ治療薬として臨床使用されている。しかし、長期間の投薬などによって、HIV-PR遺伝子に変異が起きると、これら薬剤に対して耐性を示す。したがって、薬剤耐性を獲得した変異HIVを識別する検査法は、エイズの診断や治療だけでなく、抗HIV薬開発においても重要である。そこで、申請者が開発したペプチドに特異的な蛍光誘導体化反応とHPLCを組み合わせた新規HIV-PR活性測定法を用いて、変異型HIV-PRを識別できるか調べた。既報を基に2種類の変異型HIV-PR(MaおよびMb)を作製し、野生型および変異型HIV-PRを発現している大腸菌抽出液を調製した。3種類のアセチル化ペプチドを基質として、それぞれの大腸菌抽出液と酵素反応させ、生成したペプチド断片を特異的に蛍光誘導体化した後、HPLCによって分離・蛍光検出した。それぞれのHIV-PRの基質分解パターンをHPLCによって調べたところ、野生型および変異型各HIV-PRは、それぞれ異なるHPLCパターンを示した。また、抗HIV薬のサキナビル(HIV-PR阻害剤)の野生型および変異型HIV-PRに対する50%阻害濃度を本測定法によって調べたところ、野生型:62.0 nM、変異型Ma:127.9 nM、変異型Mb:52.5 nMであった。この結果は、変異型Maはサキナビルに対して阻害を受け難い耐性を持ち、変異型Mbはサキナビルで阻害され易いという、これまでの報告と一致していた。以上の結果より、3種類の基質を同時に使用する本測定法は、変異に関する塩基配列の情報がなくとも、薬剤に対する変異型を識別できることを示しており、薬剤耐性HIVの診断や治療薬開発に有用と考えられる。エイズの原因であるHIVは、ウイルスの複製に必要なHIVプロテアーゼ(HIV-PR)や逆転写酵素など独自の酵素を持っており、これら酵素を標的とした阻害剤がエイズ治療薬として臨床応用されている。しかし、HIVゲノムは容易に変異を起こし、特に、HIVプロテアーゼ遺伝子における変異は、薬剤耐性と密接に関係している。このため、変異によって薬剤耐性を獲得したウイルスを識別する検査法は、エイズ治療だけでなく、新規治療薬の開発においても重要である。この検査法を開発するために、申請者が見出したペプチドに選択的な蛍光誘導体化反応とHPLCを組み合わせた、HIV-PR活性測定法を開発した。まず、HIV-PRの基質として4種類のN末端アセチル化ペプチドを合成した。

また、HIV-PRが発現している大腸菌の抽出液を酵素溶液として使用した。酵素溶液とそれぞれの基質を反応させた後、蛍光誘導体化反応を行い、HPLCおよび蛍光スペクトロメーターによって蛍光検出した。その結果、Ac-SGIFLETSを基質として使用した場合、HPLCにおいてLETSに相当するピークが観察された。このとき、基質を使用しなかったブランクでは、ピークが観察されなかった。また、蛍光スペクトロメーターにおいても、ブランクと比較して、蛍光強度の増大が観察された。今回使用した酵素溶液には、HIV-PR以外にも、多数の大腸菌由来の酵素が含まれているため、これらの結果は、本法が特異的にHIV-PRを測定できることを示している。また、HPLCを用いることで、HIV-PRによって分解されたペプチド(LETS)が、分離・検出できたことから、本法は、複数の基質ペプチドを同時に使用できることを示している。目的とする検査法は、複数の基質を使用し、基質特異性の違いを利用して、変異型HIV-PRを識別するため、現在、別の基質ペプチドを設計中である。現在、ペプチドに特異的な蛍光誘導体化反応を応用した、HIVプロテアーゼの新規活性測定法を開発しており、この測定法は、複数の基質を同時に使用できることを確認している。また、HPLCに加えて、マイクロチップ電気泳動装置も使用できることが確認できたため、迅速な変異型HIV識別法の開発が期待できる。現在、HIV-Iプロテアーゼ遺伝子を大腸菌に組み込み、発現させることに成功している。3種類のプラスミドを用いて発現HIVーIプロテアーゼの酵素活性の最適反応条件について検討した結果、ペプチドに選択的な蛍光誘導体化反応とHPLCを組み合わせることで、特異的なHIVプロテアーゼの新規活性測定法を開発した。今後、基質となるペプチドの種類を増やすことで、目的とする変異型HIV識別法の開発が期待できる。遺伝子組換え技術によって、種々の変異型HIVプロテアーゼを作製し、それらの基質特異性や阻害剤(治療薬)に対する感受性を調べることで、基質特異性の違いを基にした薬剤耐性能を有する変異ウイルス識別法を開発する。また、短時間での測定が可能なマイクロチップ電気泳動装置を用い、識別法のハイスループット化を行う。HIVプロテアーゼの基質となるペプチドを新たに設計・合成する。また、変異型HIVプロテアーゼの作製とその基質特異性を調べ、基質特異性の違いを基にした変異ウイルス識別法を開発する。手法として、マイクロチップ電気泳動装置を用いて、数分以内にHIVプロテアーゼによって生成されたペプチド断片を分離検出できる手法を開発し、これにより、実用的なHIVプロテアーゼ活性測定法を開発する。次年度への繰り越しは、今年度の研究成果を学会発表するための費用として使用する。次年度の研究費は、当初の計画通り、消耗品費、旅費、謝金等に使用する予定である。
新規評価尺度による大うつ病性障害の臨床評価に関する研究

気分障害の経過中にみられるうつ状態の重症度を評価する目的で開発されたInventory of DepressiveSymptomatology-Cliniciansversion(IDS-C)は,全30項目で構成され,各項目は0, 1, 2, 3の4段階で評価される精神症状評価尺度である。この研究では,観察者によって評価されるIDS-Cの日本語版を作成し,その評価者間信頼性を検証した。公益財団法人神経研究所附属晴和病院に入院中のうつ状態を呈していた患者14名(男8名,女6名,平均年齢55歳)を対象とし,これらの患者に対して,申請者らのグループが翻訳および逆翻訳を行って作成したハミルトンうつ病評価尺度併用のIDS-C構造化面接日本語版を用いて,精神科医2名の同席による評価面接を行った。IDS-Cの30項目のうち,全てのアンカーポイントについての重症度評価の検討が行われたのが27項目であり,残りの3項目は最重度を呈する症例の評価が存在しなかった。評価面接の一致率については,各評価項目の分散分析級内相関係数(ANOVA ICC)が0.85-1.0の範囲にあり,概ね良好な結果が得られた。評価が不一致がみられた例としては, 1)症状の重症度や持続時間についての被験者の回答がアンカーポイントの重症度分類に当てはまらないケース, 2)一つの症状が複数の評価項目の重症度評価で考慮できるケース, 3)抗うつ薬によると考えられる症状の評価,等が挙げられた。本研究の結果から, IDS-C日本語版の評価者間信頼性はおおむね高い一致率が得られた。評価のばらつきが想定される症状項目の取り扱いを十分に検討し,十分な評価トレーニングを行うことにより,本尺度はうつ病患者の重症度を測定する有用な尺度であると考えられた。Inventory of Depressive Symptomatology(IDS)は,DSM-IVで診断される大うつ病性障害の重症度を評価するための評価尺度であり,全30項目で構成され,各項目は0-3の4段階で評価される。本研究は,観察者によって評価されるIDS-C (C : Clinicians)の日本語版を作成し,その評価者間信頼性を検証した。対象は,晴和病院に入院中のうつ状態を呈していた患者14名(男8名,女6名,平均年齢55歳)である。これらの患者に対して,我々が原著者の承諾のもとで翻訳および逆翻訳して作成したハミルトンうつ病評価尺度併用のIDS-C構造化面接日本語版を用いて,精神科医2名の同席による評価面接を行った。評価面接の一致率については,各評価項目の分散分析級内相関係数(ANOVAICC)が0.85-1.0の範囲にあり,概ね良好な結果が得られた。評価が不一致がみられた例としては,1)症状の重症度や持続時間についての被験者の回答がアンカーポイントの重症度分類に当てはまらないケース,2)一つの症状が複数の評価項目の重症度評価で考できるケース,3)抗うつ薬によると考えられる症状の評価,等が挙げられた。本研究の結果から,IDS-C日本語版の評価者間信頼性は全体的に高い一致率が認められた。評価のばらつきが想定される症状項目のり扱いを十分に検討し,十分な評価トレーニングを行うことにより,本尺度はうつ病患者の重症度を測定する有用な尺度であると考えられた。大うつ病性障害やうつ病エピソードの重症度を評価する目的で開発されたInventory of Depressive

Symptomatology-Cliniciansversion(IDS-C)は,全30項目で構成され,各項目は0,1,2,3の4段階で評価される精神症状評価尺度である。本研究では,観察者によって評価されるIDS-Cの日本語版を作成し,その評価者間信頼性を検証した。公益財団法人神経研究所附属晴和病院に入院中のうつ状態を呈していた患者14名(男8名,女6名,平均年齢55歳)を対象とし,これらの患者に対して,申請者らのグループにより原著者の承諾のもとで翻訳および逆翻訳して作成したハミルトンうつ病評価尺度併用のIDS-C構造化面接日本語版を用いて,精神科医2名の同席による評価面接を行った。IDS-Cの30項目のうち,全てのアンカーポイントについての重症度評価の検討が行われたのが27項目であり,残りの3項目は最重度を呈する症例の評価が存在しなかった。評価面接の一致率については,各評価項目の分散分析級内相関係数(ANOVA ICC)が0.85-1.0の範囲にあり,概ね良好な結果が得られた。評価が不一致がみられた例としては,1)症状の重症度や持続時間についての被験者の回答がアンカーポイントの重症度分類に当てはまらないケース,2)一つの症状が複数の評価項目の重症度評価で考慮できるケース,3)抗うつ薬によると考えられる症状の評価,等が挙げられた。本研究の結果から,IDS-C日本語版の評価者間信頼性は全体的に高い一致率が認められた。評価のばらつきが想定される症状項目の取り扱いを十分に検討し,十分な評価トレーニングを行うことにより,本尺度はうつ病患者の重症度を測定する有用な尺度であると考えられた。気分障害の経過中にみられるうつ状態の重症度を評価する目的で開発されたInventory of DepressiveSymptomatology-Cliniciansversion(IDS-C)は,全30項目で構成され,各項目は0,1,2,3の4段階で評価される精神症状評価尺度である。この研究では,観察者によって評価されるIDS-Cの日本語版を作成し,その評価者間信頼性を検証した。公益財団法人神経研究所附属晴和病院に入院中のうつ状態を呈していた患者14名(男8名,女6名,平均年齢55歳)を対象とし,これらの患者に対して,申請者らのグループが翻訳および逆翻訳を行って作成したハミルトンうつ病評価尺度併用のIDS-C構造化面接日本語版を用いて,精神科医2名の同席による評価面接を行った。本研究の結果から,IDS-C日本語版の評価者間信頼性はおおむね高い一致率が得られた。
RNAポリメラーゼII転写とリンクするp53制御機構

p53はヒトがんにおいてもっとも高頻度に変異が認められるがん抑制因子である。一方、PolIIを脱リン酸化し、新たな転写開始に向けてリセットする酵素の一つがFCP1であるが、本研究課題において、当該年度に以下の点を明らかにした。1.HeLaCellにおけるFCP1ノックダウンによって細胞増殖が著名に抑制され、p53が蓄積し、p21が活性化していた。さらにFCP1とp53のinvivoでの結合も示された。このことからgeneralな因子であるFCP1とp53に何らかのリンクが存在することが強く示唆された。2.FCP1には、RAP74(TFIIF)結合ドメイン、BRCTドメイン、FCPHドメイン、FCP1specificドメインがあるが、このp21の誘導にはTFIIF結合ドメインは必須ではなく、BRCTドメインは必要であることが分かった。一般にBRCTドメインはリン酸化タンパクと結合することが知られており、ここにFCP1の未知の基質が結合する可能性が示唆された。3.Breastcancercellline(MCF7)におけるDoxorubicinによるDNA傷害時には、FCP1ノックダウンによってp21誘導が抑制された。これらから、FCP1がPolII以外に脱リン酸化の基質を持ち、p53シグナル系の中で何らかの制御に関わっていることが強く示唆された。われわれは、これまでにRNAポリメラーゼ脱リン酸化酵素FCP1をノックダウンしても、細胞全体としてメッセンジャーRNAの量やRNAポリメラーゼのリン酸化に大きな影響を及ぼさないことを見出していた。一方で、FCP1ノックダウンにより、細胞増殖能が極端に低下することも見出していた。本年度は、FCP1のより詳細な生物学的な役割を知るため、レトロウィルスを用いたFCP1ノックダウンを行い、マイクロアレイによる発現解析を行った。興味深いことに一部のp53標的遺伝子の発現上昇がみられ、その結果はタンパクレベルでの発現上昇とも一致した。この結果から、FCP1とp53には何らかの機能的なリンクが存在することが強く示唆され、その関連の解析に着手した。まず、FCP1aとFCP1bについて、野生型とその脱リン酸化機能を欠失した変異体それぞれの組み換えタンパクを、バキュロウィルスを用いた発現系で作成した。この組み換えタンパクを用いて来年度は機能的なかかわりを解析する予定である。また、p53を欠失したヒト大腸がん細胞株をもちいて上記同様のFCP1ノックダウンを行ったところ、p53を保持している野生型の細胞株で上昇が確認された因子は上昇しなかった。この結果から上述の発現アレイの結果はFCP1がなんらかのメカニズムを通じ細胞のゲートキーパーであるp53の機能を制御しているためであることが考えられた。「がん」は日本人の死因の1位となって30年以上が経過したが、その克服の糸口さえ見えない状況が続いている。p53の制御機構は複雑であるが、がんの発症、進展のメカニズムを知り治療に応用する点からも、その解明は重要である。われわれは、RNAポリメラーゼIICTD脱リン酸化酵素であるFCP1による細胞増殖制御機構をp53機能の観点から解明しようとしている。これまでに、FCP1のノックダウンによって細胞増殖が強く抑制されること、その際、p53が蓄積し、p21が誘導されることを見出している。p53を欠失もしくはsiRNAによってノックダウンした細胞株ではこれらのフェノタイプがみられないことから、細胞増殖抑制はp53によるものであると考えられる。本年度は、細胞増殖機能におけるFCP1の機能ドメインを明らかにするために、種々のdeletion mutant発現ベクターを作成し、FCP1ノックダウン細胞株にこれらmutantFCP1を最導入して細胞増殖能に必須のFCP1ドメインを探索した。その結果、フォスファターゼ活性をつかさどるDXDXT配列は必須であったが、それに加えて、リン酸化タンパク結合のプラットフォームになると考えられるBRCT domainも重要であることが分かった。一方、TFIIFとの結合部位となるRAP74 domainは細胞増殖に必須ではなかったが、これまでの報告と異なりPolIIとの結合そのものには、この領域が必要であった。