hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スーパーオキシドディスムターゼ遺伝子の発現機構解明と環境ストレス耐性植物育種

スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)遺伝子の発現調節機構を解明し、環境ストレス耐性植物を育種する事を目的として研究を進めた。その結果、同一植物(イネ)についての各種(SOD)発現応答を全体的に把握することが可能となった。さらに、SODと共役して活性酸素消去に関わる酵素の遺伝子単離と構造解析も進めた。本年度の研究の結果、イネ・プラスチド型Cu/Zn-SODのcDVA構造を明らかにし、発現機構の調査を行った。単子葉植物について特にトウモロコシからのプラスチド型SOD遺伝子の単離が米国で長年試みられてきたが成功しておらず、その発現機構も明らかではない。本研究により、単子葉植物のプラスチド型Cu/ZnのcDNA構造と、その発現機構の一部が初めて明らかとなった。単子葉植物のプラスチド型SODの発現は光により非常に厳密に制御されており、mRVAは光処理直後の極く限られた時期にのみに発現している。そのため、単離がこれまで困難であったと思われる。イネ・全SOD分子種のセットが揃い、さらに本年度はアスコルビン酸パーオキシダ-ゼ(APX)、グルタチオン還元酵素(GR)の遺伝子単離・構造解析も終了した。酸素ストレスに対するSOD分子種間、および、他の活性酸素消去系酵素との間での協調的応答の全体像の理解が今後、可能となる。スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)遺伝子の発現機構解明を終了し、環境ストレス耐性植物を育種するためには、同一種植物についての各種SODの発現応答を全体的に把握する必要がある。このことにより育種に必要なSODの分子種が特定できる。本年度の研究の結果、イネ・プラスチド型Cu/Zn-SODの遺伝子構造解析が順調に進むようになった。単子葉植物について特にトウモロコシからのプラスチド型SOD遺伝子の単離が米国で長年試みられてきたが成功していない。今回の本研究で明らかになったことは、単子葉植物のプラスチド型SODの発現は光により非常に厳密に制御されており、mRNAは光処理後の極く限られた時期にのみ発現しているため、単離が困難であったと思われる。本研究を通じてイネ・全SOD分子種のセットが揃ったので、酵素ストレスに対するSOD分子種の協調的応答の全体像の理解が初めて可能となった。本年度の研究の結果、イネ・プラスチド型Cu/Zn-SODのcDNA構造が明らかになった。単子葉植物について特にトウモロコシからのプラスチド型SOD遺伝子の単離が米国で長年試みられてきたが成功しておらず、本研究により、単子葉植物のプラスチド型Cu/ZnのcDNA構造が初めて明らかとなった。単子葉植物のプラスチド型SODの発現は光により非常に厳密に制御されており、mRNAは光処理直後の極く限られた時期にのみに発現しているため、単離が困難であったと思われる。イネ・全SOD分子種のセットが揃ったので、酸素ストレスに対するSOD分子種間、および、アスコルビン酸パーオキシダーゼとの間での協調的応答の全体像の理解が今後、可能となる。本年度の研究の結果、イネ・プラスチド型Cu/Zn-SODのcDNA構造を明らかにし、発現機構の調査を行った。単子葉植物について特にトウモロコシからプラスチド型SOD遺伝子の単離が米国で長年試みられてきたが成功しておらず、その発現機構も明らかではない。

単子葉植物のプラスチド型SODの発現は光により非常に厳密に制御されており、mRNAは光処理直後の極く限られた時期にのみ発現している。そのため、単離がこれまで困難であったと思われる。イネ・全SOD分子種のセットが揃い、さらに本年度はアスコルビン酸パーオキシダーゼ(APX)、グルタチオン還元酵素(GR)の遺伝子単離・構造解析も終了した。酸素ストレスに対するSOD分子種間、および、他の活性酸素消去系酵素との間での協調的応答の全体像の理解が今後、可能となる。
バルザック『セザール・ビロトー』の生成論的研究

フランス学士院図書館ロヴァンジュール文庫所蔵のバルザック『セザール・ビロトー』の生成資料の読解調査を行なった。この調査によって、特に小説内における二つの架空の広告文の導入がパリの産業界の描写に新たな広がりをもたらしたことを明らかにすることができた。調査結果は複数の国際研究集会等で発表し、バルザック研究や生成論研究の専門家と意見交換を行なった。1.バルザック『セザール・ビロトー』およびこれと緊密な関係を持つ同時期の作品について関連書籍や資料を参照し、テクスト成立のクロノロジカルな諸段階やまたとりわけ当時の受容の状況について情報の整理を行なった。また、生成論全般についての資料収集を行い、最新の調査方法論の進展を確認した。2.フランス学士院図書館ロヴァンジュール文庫で『セザール・ビロトー』の作品生成資料を参照した。同資料体に関するプレイヤード版の記述には何点か不正確な箇所があったため、これらについて再調査して正しい情報を整理するとともに、特に同作品内の二つの架空の広告文の成立について草稿および校正刷りの諸段階を整理し、関連箇所を転写する作業を行なった。3.2の調査記録をもとに同作品の生成過程の分析を行ない、研究ノートを作成し、また論文の準備を進めた。特に同作品の執筆中に途中で導入されたジャーナリストの登場人物フィノが『ニュシンゲン銀行』と『しびれえい』での再登場を経て『幻滅』第二部での新聞業界の黒幕の一人として準備されていく過程の解明を進めた。4.フランス・メーヌ大学で行なわれた国際シンポジウム「作家と印刷業者」に参加して同作品の生成過程についての論考を発表した。この作品の成立において架空の広告文の導入が重要な役割を果たしており、バルザックが執筆途上でこれを着想したこと、また印刷業の経験のある作者が数次の校正段階を経て美学的な印刷技法をこらした広告文の作成を実現したことを原資料にもとづいて提示し、シンポジウム参加者の文学研究者や書物史の専門家たちとの意見交換を行なった。1.バルザック『セザール・ビロトー』およびこれと緊密な関係を持つ同時期の作品について関連書籍や資料を広く参照し、テクスト成立のクロノロジカルな諸段階やまたとりわけ当時の受容の状況について情報の整理を行なった。2.フランス学士院図書館ロヴァンジュール文庫で『セザール・ビロトー』の作品生成資料を参照し、草稿および校正刷りの諸段階を整理し、関連箇所を転写する作業を行なった。またこの作品と関係の深い『ニュシンゲン銀行』の調査にも着手し、同じく生成資料の整理と重要箇所の転写を行なった。特に同作品と同時期に制作された『ニュシンゲン銀行』との関係についての分析を進め、『セザール・ビロトー』にも登場するニュシンゲン男爵の会話の表象の生成論的な分析と比較を行ない、『ニュシンゲン銀行』よりもむしろ『セザール・ビロトー』の制作段階においてこの人物の特徴的なアルザス訂ヒりの口跡が確立していったことを明らかにした。4.フランスの近代草稿研究院(ITEM)の主催による「セミネール・バルザック」に、コーディネーターでバルザック生成論研究の重鎮ステファンヌ・ヴァッション氏の招きに応じて講演者として参加し、『セザール・ビロトー』の広告文の生成過程に関する講演を行い、質疑応答や関係の専門家たちとの意見交換を行なった。さらにバルザックの全集に関する主要な版本についても調査を行い、作者没後の同作品の受容についても広く確認した。2.生成論全般についての資料収集を行い、最新の調査方法論の進展を確認した。名古屋大学文学研究科グローバルCOE主催の国際研究集会「哲学的解釈学からテクストの解釈学へ」で発表し、生成論の解釈学的射程についてこれまでに解釈学者からなされた批判を踏まえながら論点整理を行い、解釈学や十九世紀文学の専門家たちと意見交換を行なった。3.フランス学士院図書館ロヴァンジュール文庫で『セザール・ビロトー』の作品生成資料を参照し、草稿および校正刷りの諸段階を整理し、関連箇所を転写する作業を行なった。また、この作品と関係の深い『ニュシンゲン銀行』の調査を行い、同じく生成資料の整理と重要箇所の転写を行なった。この調査記録をもとに同作品の生成過程の分析を行ない、研究ノートを作成し、また論文の準備を進めた。4.水声社から刊行された松澤和宏編『テクストの解釈学』に寄稿し、バルザックにおけるパラテクストの問題系を論じ、この中で『セザール・ビロトー』の生成における題名のプログラム効果について分析を行なった。

5.関西バルザック研究会にて発表を行ない、『セザール・ビロトー』を中心としてバルザックにおける諸作品間の生成がいかなる布置構造を形成していたかを原資料に基づいて考察し、本課題の成果を包括的に提示した。
サイトカイン細胞増殖シグナルにおけるSTAT3及びGab1,2の役割の解析

Gab1,Gab2は、PHドメインを有し、SH2,SH3結合配列を有するアダプター分子であり、増殖因子・サイトカイン刺激によりチロシンリン酸化され、シグナル伝達分子SHP2やp85PI3キナーゼと会合することが明らかとなっている。(1)Gab1遺伝子欠損マウスより調整した線維芽細胞を、SV40LargeT抗原遺伝子で不死化させた細胞株を樹立した。Gab1-/-細胞株においては、EGF,PDGF,サイトカインIL-6によるERKMAPキナーゼの活性化が減弱していた。さらに、Gab1-/-細胞では、EGFによるRasの活性化が減弱していることから(GTP結合型Rasの減少)、Gab1はEGF細胞内シグナルにおいて、Rasの上流で機能していると考えられた。ガン遺伝子v-erbB2及びv-srcによる形質転換能(軟寒天培地コロニーアッセイ、ヌードマウス腫瘍形成)を、Gab1-/-細胞を用いて検討した結果、Gab1はv-erbB2による腫瘍形成に必要であること、逆にGab1はv-srcによる腫瘍形成を抑制していることが明らかとなった。(2)Gab2遺伝子欠損マウスのおいては、胃粘膜及び皮膚において肥満細胞が減少していた。Gab2欠損マウス由来の骨髄性肥満細胞は、SCFに対する増殖応答性が減弱していること、SCFによるERK,AKTの活性化が低下していることを見出した。このことは、Gab2がSCFにシグナル及び肥満細胞の増殖に必要であることを示している。また、Gab2欠損マウスから採取したT細胞は、T細胞受容体刺激(CD3とCD28の共刺激)に対する反応性が亢進しており、Gab2欠損マウス血中抗体価が高値であることから、Gab2は、T細胞受容体のシグナル伝達を抑制していると考えられた。
高等植物における薬物代謝機構の遺伝子工学による解析

1.タバコ懸濁培養細胞株BY2に対する各種薬剤によるP450の誘導効果を検討した。BY2に、2,4-Dおよびクロロトルロンを添加した結果、P450含量は約1.5倍に誘導されることが明らかとなった。-方、酵素活性は、トランス珪皮酸水酸化活性と、7エトキシクマリン脱エチル化活性が約2倍に誘導された。2.BY2からP450の精製を行った。BY2から超遠心法を用いて調整したミクロソーム画分を、エマルゲン911を用いて可溶化した後、DEAEイオン交換、ヒドロキシアパタイト、CMイオン交換クロマトグラフィーを用いてP450を精製した。SDSゲル電気泳動で解析した結果、精製酵素標品は、約55000の分子量を持つことが判明した。また、この精製酵素標品にラットのP450還元酵素を添加し、再構成系の実験を行った結果、この精製P450はトランス珪皮酸水酸化反応を触媒することが判った。3.BY2からNADPH-P450還元酵素の精製を行った。BY2から超遠心法を用いて調整したミクロソーム画分を、エマルゲン911を用いて可溶化した後、Qセファーロス陰イオン交換、ADPセファロースアフィニティー、DEAE陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてP450還元酵素を均一精製した。SDSゲル電気泳動で解析した結果、精製酵素標品は、約79000の分子量を持つことが判明した。さらに、この精製酵素標品に対する抗体を作成し、親植物のタバコの各組織中での発現量をウエスタンブロット法を用いて解析した結果、本精製構想標品は根、芽、葉のミクロソーム画分に発現していることが判明した。4.P450還元酵素の部分アミノ酸配列を決定し、それをもとにDNAプローブを合成した。市販のcDNAライブラリーを用いてスクリーニングを検討した結果、6個の陽性のクローンを得た。現在、このクローンに対して検討を加えている。
ジルコノセン錯体の特異的反応性を基盤とする新規反応の開発

平成13年度における成果をもとに,平成14年度研究実施計画に沿い,ジルコノセン錯体を用いたγ-アミノ酸誘導体(GABA誘導体)の新規合成法の開発,とりわけ光学活性体の合成を指向した反応開発についてさらなる検討を行った.すなわち,キラル中心を有する基質を用いるジアステレオ選択的な反応において,二つのアプローチによるGABA誘導体の合成について検討した.まず,本反応ではN-アルケニルカルバメート誘導体を基質として用いることから,アルケニル基上に置換基を導入することにより,キラル中心を有する化合物を合成した.このものを用いてジルコノセン錯体を用いたエステル転移反応で構築される新たなキラル中心の立体化学の制御を試みた.その結果,基質において窒素原子が結合している炭素上に比較的かさ高い置換基を導入すると良好なジアステレオ選択性(15:1程度)が発現することを明らかとした.種々の基質について同様に検討し,これらの生成物を用いて生理活性物質の合成素子となる,5位に置換基を有するピロリジン-3-カルボン酸誘導体に変換した.次に,カルバメート部位に不斉補助基を導入した基質を用い,ジアステレオ選択的な反応について検討した.その結果,不斉補助基として光学活性trans-2-phenylcyclohexanolを用いることにより,高いジアステレオ選択性をもって反応が進行し光学活性GABA誘導体を得ることに成功した.さらに,本反応をカルバメート基を有する芳香族化合物のオルト位にアリル基,ないしはビニル基を導入した化合物に適用することにより,エステル転移を伴った複素環合成にも成功している.これらの成果については現在論文を作成中である.申請した平成13年度研究実施計画に沿い,ジルコノセン錯体を用いた新規反応の開発について検討を行った.その一環としてジルコノセン-ブテン錯体を活性種として用い,容易に合成可能なN-アルケニルカルバメート誘導体からの分子内エステル転移反応を経たγ-アミノ酪酸誘導体の簡便な合成法の開発に成功した.すなわち,本反応は分子内に存在する炭素-炭素二重結合とカルバメート部位のカルボニル基との低原子価ジルコニウム錯体を用いた分子内カップリング反応による環化と,引き続くシクロプロパン化,さらに後処理段階におけるシクロプロパン環の開裂によって進行するものと考えられる.最初の分子内環化段階で6員環を形成するような基質を用いた場合,カルバメート部位のCBZ基,Boc基を選択することにより,CBZ基を有する基質では6員環の形成,さらにBoc基を有する基質ではジルコニウム-アルケン錯体がアルキル鎖上を移動し,5員環を形成することを明らかとした.後処理段階においてヨウ素を系内に加え,ヨウ素原子を含むγ-アミノ酪酸誘導体の合成し,さらにこのものを塩基で処理することにより,ピロリジン-3-カルボン酸誘導体など含窒素環状化合物の簡便な立体特異的合成法の開発に成功した.これらの成果については現在,欧文誌に投稿中である.次年度はさらに検討を加え,分子内にキラル中心を有する基質を用い,光学活性なγ-アミノ酪酸誘導体,さらには置換基を有するピロリジン誘導体の合成法の開発と,それを駆使した生理活性物質の効率的合成を行う予定である.平成13年度における成果をもとに,平成14年度研究実施計画に沿い,ジルコノセン錯体を用いたγ-アミノ酸誘導体(GABA誘導体)の新規合成法の開発,とりわけ光学活性体の合成を指向した反応開発についてさらなる検討を行った.すなわち,キラル中心を有する基質を用いるジアステレオ選択的な反応において,二つのアプローチによるGABA誘導体の合成について検討した.まず,本反応ではN-アルケニルカルバメート誘導体を基質として用いることから,アルケニル基上に置換基を導入することにより,キラル中心を有する化合物を合成した.このものを用いてジルコノセン錯体を用いたエステル転移反応で構築される新たなキラル中心の立体化学の制御を試みた.その結果,基質において窒素原子が結合している炭素上に比較的かさ高い置換基を導入すると良好なジアステレオ選択性(15:1程度)が発現することを明らかとした.種々の基質について同様に検討し,これらの生成物を用いて生理活性物質の合成素子となる,5位に置換基を有するピロリジン-3-カルボン酸誘導体に変換した.次に,カルバメート部位に不斉補助基を導入した基質を用い,ジアステレオ選択的な反応について検討した.その結果,不斉補助基として光学活性trans-2-phenylcyclohexanolを用いることにより,高いジアステレオ選択性をもって反応が進行し光学活性GABA誘導体を得ることに成功した.さらに,本反応をカルバメート基を有する芳香族化合物のオルト位にアリル基,ないしはビニル基を導入した化合物に適用することにより,エステル転移を伴った複素環合成にも成功している.これらの成果については現在論文を作成中である.
海氷・海洋結合データ同化システムを用いた極域海洋における基礎生産の予測可能性研究

極域海洋における基礎生産の予測可能性を評価する上で、海氷などの物理環境の予測精度を明らかにすることは重要な課題である。今年度は、夏季でも多くの海氷が残存する東シベリア海に着目し、北極海の海氷予測同化システム(TOPAZ4)の海氷予報情報に基づいて海氷厚分布の短・中期(1週間程度)の予測可能性を調べた。その結果、海氷予測の精度は夏季に低下することが分かった。特に、この時期の海氷厚分布の予測精度は3日目までは高いものの、4日目以降に著しく低下することがわかった。このような予測精度の急峻な低下の原因を調べた結果、海上風による力学的な漂流プロセスの誤差が大きく関与していることがわかった。この4日目の大気の予測誤差は、東シベリア海上の移動性低気圧の形成と関係していた。これらの研究結果より、海氷の短・中期の予測精度の向上には、大気の予測精度の向上が必要不可欠であることがわかった。これらの研究成果は欧州の国際学術雑誌The Cryosphereに2018年6月に受理された。さらに、過去3年間のTOPAZ4の海氷データ解析から示唆された大気の予報精度の重要性を確かめるために、各国の気象予報機関から提供されている大気予報データを用いたアンサンブル海氷予測実験を実施した。その結果、低気圧が発達する時期を境に各アンサンブルメンバーによる海氷予測の精度が著しく低下することが確かめられた。また、アンサンブル海氷予測のスプレッド情報から予報誤差の時空間分布特性を推定した。本年度は、TOPAZ4を用いた夏季北極海における海氷厚分布の定量評価、及び短・中期の予測可能性に関する研究成果を論文として取りまとめ、欧州の国際学術雑誌The Cryosphereに2018年6月に受理された。この研究成果は所属機関においてプレスリリースされ、国内の科学研究メディア(サイエンスポータル)でも紹介された。また、2018年7月より約6か月の間、ノルウェーのナンセン環境リモートセンシング研究センター(NERSC)に滞在し、共同研究者のLaurent Bertino氏の協力のもとで、海氷データ同化システム(TOPAZ4)の海氷海洋結合モデル(HYCOM)とそのデータ同化システムであるアンサンブルカルマンフィルター(EnKF)に関する技術を習得した。また、TOPAZ4を用いて、各国の気象予報現業機関から提供されている大気のアンサンブル予報データ(TIGGEデータ)を用いた北極海の海氷予報実験を実施した。このTIGGEデータの解像度は0.5度で比較的荒いものの、TOPAZ4による現業の海氷予測の結果と概ね同程度の結果を得ることが出来たため、来年度以降に実施する予定の基礎生産量の予測可能性を評価するための整ったといえる。来年度は、北極海における植物プランクトンの予測可能性を評価するために、今年度習得したTOPAZ4に低次生態系モデルを結合したものを使用して、2週間先までの予測実験を実施する。低次生態系モデルの習得と数値シミュレーションの実施のためのコードの書き換えや実験設定などについて議論するために、来年度もナンセンセンターで1か月程度滞在する。この実験では、海氷融解に伴う光環境の改善と融解水による栄養塩制限の影響を調べるために、2016年の海氷融解期に起こった北極低気圧の発達イベントの事例に着目した予報実験を実施する。また、北極海の基礎生産量の再現性を評価するために、比較対象に用いる現場観測データや衛星のクロロフィル画像データの整備と解析に着手する。昨年度はTOPAZ4システムを用いた数値実験を実施することはできたが、国内の大型計算機への移植作業は、リプレイス時期が重なったことなどの理由から、予定通り進めることが出来なかった。今年度はノルウェーでの研究期間が終了後、速やかに国内の大型計算機への移植作業を進める。内定年度:2017極域海洋における基礎生産の予測可能性を評価する上で、海氷などの物理環境の予測精度を明らかにすることは重要な課題である。

この研究成果は所属機関においてプレスリリースされ、国内の科学研究メディア(サイエンスポータル)でも紹介された。また、2018年7月より約6か月の間、ノルウェーのナンセン環境リモートセンシング研究センター(NERSC)に滞在し、共同研究者のLaurent Bertino氏の協力のもとで、海氷データ同化システム(TOPAZ4)の海氷海洋結合モデル(HYCOM)とそのデータ同化システムであるアンサンブルカルマンフィルター(EnKF)に関する技術を習得した。また、TOPAZ4を用いて、各国の気象予報現業機関から提供されている大気のアンサンブル予報データ(TIGGEデータ)を用いた北極海の海氷予報実験を実施した。このTIGGEデータの解像度は0.5度で比較的荒いものの、TOPAZ4による現業の海氷予測の結果と概ね同程度の結果を得ることが出来たため、来年度以降に実施する予定の基礎生産量の予測可能性を評価するための整ったといえる。来年度は、北極海における植物プランクトンの予測可能性を評価するために、今年度習得したTOPAZ4に低次生態系モデルを結合したものを使用して、2週間先までの予測実験を実施する。低次生態系モデルの習得と数値シミュレーションの実施のためのコードの書き換えや実験設定などについて議論するために、来年度もナンセンセンターで1か月程度滞在する。この実験では、海氷融解に伴う光環境の改善と融解水による栄養塩制限の影響を調べるために、2016年の海氷融解期に起こった北極低気圧の発達イベントの事例に着目した予報実験を実施する。また、北極海の基礎生産量の再現性を評価するために、比較対象に用いる現場観測データや衛星のクロロフィル画像データの整備と解析に着手する。昨年度はTOPAZ4システムを用いた数値実験を実施することはできたが、国内の大型計算機への移植作業は、リプレイス時期が重なったことなどの理由から、予定通り進めることが出来なかった。今年度はノルウェーでの研究期間が終了後、速やかに国内の大型計算機への移植作業を進める。
人体-車いす-空間連携による障碍者のための至適温熱環境設計に関する研究

体温調節機能が低下している障碍者およびその介助者の日常生活支援するため、人体-車いす-空間連携による温熱環境制御方法開発のための基礎的検討を行った。人工気候室内で頸髄損傷者を対象とした体温調節生理・心理反応実験により、その特性を把握した。制御用体温調節シミュレーションモデルを構築するために必要な人体と車いすの熱物性値を測定した。体温調節モデルによって脊損者の体温ならびに体温調節反応の予測を行い、実験値との比較を行ってその有効性を検討した。本研究では、いわゆる環境弱者としての車いすを使用する障碍者等を対象とした温熱環境設計・評価法の確立に関する研究を行う。具体的には、主に次の4項目を行った。1.障碍者(主として脊髄損傷者)の生活温熱環境実態と簡易改善方法の検討頸髄損傷者3名の自宅居室における温湿度等の温熱環境の実測調査を行って、その実態を把握するとともに暖冷房の使用状況等について把握・分析を行った。さらに、居室温熱環境の簡易改善方法として、熱損失の比較的大きい窓ガラスに気泡断熱シートを取り付けた場合の温熱環境改善効果を測定した。2.体温調節数値シミュレーションのための温熱環境に対する生理心理反応測定障碍者(主として脊髄・頸髄損傷者)の温熱環境に対する生理心理反応のデータを取得し、体温調節数値シミュレーションのための基礎データとするため、人工気候室内において頸髄損傷者1名および健常者1名を対象として、温熱環境条件(定常状態および非定常状態)に対する生理・心理反応を測定した。その結果、頸髄損傷者の深部体温は、体温調節機能の欠如によって環境温度に大きく影響することが確認された。また、末梢部の皮膚温変動について周波数分析を行った。3.体温調節支援システム構築のための体温調節数値シミュレーションモデルの検討と体温調節機能に障碍を持つ人々に対する体温調節支援システムを構築するために、既存の体温調節モデル(Stolwijkモデル)の改良と障碍者等の身体的特徴(皮膚分節、筋萎縮等)の影響について検討した。4.屋外環境における車いす乗車人体に対する熱的影響についての基礎的検討体温調節支援システムを屋外環境に応用するための基礎的検討として、車いすに対する日射の照り返しの影響について検討した。車いすに対する照り返し吸収率を定義し、屋外実験によって実測を行った。22年度は、主に次の3項目を行った。1.体温調節支援システム構築のための体温調節数値シミュレーションモデルの検討前年度までに、既存の体温調節モデル(Stolwi jkモデル)を改良して、頸髄損傷者の体温調節シミュレーションモデルの基礎を構築した。このモデルを用いて、人体と車いすとの熱伝導の影響として接触面積、および温熱環境条件の影響としての放射・対流熱伝達率の違いによる体温予測に対する影響について基礎的な検討を行い、その特性について把握した。さらに、体温調節ができない頸損者が実際に行っている暑熱・防寒対策としての局部冷却・加熱の効果についてシミュレーションを行い、その対処手法の体温に対する影響について検討した。2.体温調節数値シミュレーションモデルと被験者実験との比較検討構築したシミュレーションモデルと、頸損者を被験者とした温熱環境に対する生理(皮膚温等)・心理反応実験結果との比較検討を行った。その結果、モデルと測定結果との良い対応を得た。しかしながら、被験者数は1名であるので、今後さらに被験者を増やして、モデルの有効性について詳細に検討する必要がある。3.屋外環境における車いす乗車人体に対する熱的影響についての実験的検討体温調節支援システムを屋外環境(特に日射を受ける環境)に応用するための基礎的検討として、被験者(健常者)を用い、市街地を車いす乗車状態での走行した場合の生理(皮膚温等)・心理反応を測定し、その特性について検討した。また、市街地における照り返し等を含めた温熱環境についても測定し、測定装置および測定方法の妥当性について検討した。23年度は、主に次の3項目を行った。1.体温調節シミュレーションモデル応用の検討本研究で検討している人体-車いす-空間連携による体温調節支援システムは、障碍者の日常生活全般での活用を目指すもので、屋外での応用については、日射の影響、風速の影響等を考慮する必要がある。日射の影響については人体の日射投影面積が必要となるため、車いすに乗車した人体を対象とした写真法による実測を行い、太陽位置による日射投影面積を求めた。さらに風速の影響については、車いす乗車状態に対する対流熱伝達率を実測によって求め、その体温調節予測に対する影響を検討した。2.体温調節支援システム構築のための深部温代替部位の検討体温調節支援システムを構築するには、人体(障碍者)の深部温を常時モニタリングする必要がある。

しかし、深部温度を常時測定するのは実用上困難であるため、深部温度変動に追随して変動する皮膚温部位(深部温代替部位)を特定するために被験者実験(定常状態)よって検討した。厚手の布等で断熱した部位(下腿等)や、車いすとの接触部の皮膚温が深部温度と比較的良い対応を示し、深部温代替温度としての利用の可能性があった。3.体温調節シミュレーションモデルの改良と提示装置の検討前年度までに検討してきた脊髄(頸髄)損傷者の体温調節シミュレーションモデルについて、脊損者の健常部・麻痺部の温度をより詳細に予測できるように皮膚分節(デルマトーム)による部位分割によるモデルの構築を行った。このモデルの提示装置への組み込みの検討を行った。
P.gingivalisの歯周病原性に関する分子生物学的解析

本研究は歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalisの病原因子のうち線毛、血球凝集素、システインプロテアーゼおよび主要外膜タンパク質などの遺伝子を導入した形質転換株を作製することにより、それらの病原因子の性状を明らかにするとともに、各遺伝子と歯周病原性の関わりを明らかにすることを目的として行った。すなわち、細胞への付着や他の細菌との共凝集に関与すると考えられている線毛の遺伝子(fimA381)を他のP.gingivalis菌株へ形質転換することにより、線毛の機能について検討した。P.gingivalisの形質転換はfimA381を含むプラスミドpYHF1をプラスミド受容株であるYH522株に伝達して複製した後回収したpYHF1を用いてエレクトロポレーションにより行った。fimA381の遺伝子発現はSDS-PAGEにおける41kタンパクの発現と特異抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認し、菌体表層におけるリコンビナント線毛の発現は電子顕微鏡を用いたネガティブ染色像と特異抗体を用いたイムノゴールド法により確認した。その結果、供試した5株において381株由来の線毛の発現が認められた。次いで、形質転換株とそれぞれの親株を用いて、菌体表層の疎水性、細胞への付着能、他菌種との共凝集性および血球凝集能を比較したところ、リコンビナント線毛が形成された形質転換株はいずれも親株と比較して血球凝集能を除いて、菌体表層の疎水性、細胞付着能および他菌種との共凝集性が低下する傾向が認められた。これらの結果からfimA38本研究は歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalisの病原因子のうち線毛、血球凝集素、システインプロテアーゼおよび主要外膜タンパク質などの遺伝子を導入した形質転換株を作製することにより、それらの病原因子の性状を明らかにするとともに、各遺伝子と歯周病原性の関わりを明らかにすることを目的として行った。これらの結果からfimA38Porphyromonas gingivalisの歯周組織細胞への付着に同菌の線毛が重要な役割を果たしていると考えられているが、直接的証明は得られていない。そこで、本研究では、線毛遺伝子fimAを用いて遺伝子の相同組換えにより線毛遺伝子不活化株を作製することによりP.gingivalisのヒト細胞への付着性、ひいては歯肉溝内定着性における線毛の役割について分子生物学的に検討した。線毛不活化株の作製は、P.gingivalisのfimA遺伝子内にpE5-2由来のテトラサイクリン(Tc')、クリンダマイシン(Cc')、およびエリスロマイシン(Em')の耐性遺伝子を含む3.8kb EcoR1 DNA断片を挿入して作製した。即ち、3.8kb EcoR1 DNA断片をpUC13 Bg12.1中のfimA遺伝子のEcoT部分に挿入してプラスミドpEM1を作製し、さらにプラスミドpEM1の5.4mb Pvul断片をスイサイドベクターpGP704のSmal部分に挿入してpkDHを作製した。次いでpkDH1を接合伝達によりP.gingivalis ATCC33277株菌体内に入れ、遺伝子の相同組換えを行った。本実験において遺伝子の相同組換えにより作製した線毛遺伝子不活化株では、細胞付着に関与すると考えられている長い線毛(0.51.0μm)の欠損が確認された。またヒト培養歯肉線維芽細胞への付着状態を走査電子顕微鏡により観察したところ、親株では細胞表面に大きな菌塊を形成して付着しており、細胞からは微絨毛の出現が認められたが、線毛欠失変異株ではこのような現象は認められず、細胞全体にまばらに付着しているのみであった。一方、血球凝集性や細胞表面の疎水性については変異株においても変化は認められなかった。これらの結果から、線毛遺伝子fimAにコードされているP.gingivalisの線毛は、ヒト口腔由来の細胞への付着に関与する因子であることが分子生物学的に証明された。

本研究の目的は歯周病原細菌であるP.gingivalisの病原因子と考えられている線毛、血球凝集素、システインプロテアーゼおよび主要外膜タンパク質の遺伝子を単一あるいは複数不活化した変異株を作製することにより、それらの病原因子の性状を明らかにするとともに、各遺伝子と歯周病原性の関わりを明らかにすることである。本年度は、細胞への付着に関与する線毛の遺伝子fimAを不活化し、43kDaの線毛タンパク質を欠く変異株を作製した。変異株の作製は、まずクローン化された線毛遺伝子内にエリスロマイシン耐性遺伝子を挿入して、線毛遺伝子を不活化したエリスロマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片をsuicide vectorpGP704に挿入したプラスミドを作製した。この線毛遺伝子を不活化した断片を含むプラスミドを導入した大腸菌株とP.g ATCC33277株および381株を用いて共培養し、P.g ATCC33277株および381株に接合伝達させ、相同的組換えによる変異株の作製を行った。その結果、サザンハイブリダイゼーションによりP.g染色体DNA中に線毛遺伝子とエリスロマイシン耐性遺伝子のいずれにもハイブリダイズする断片の存在を確認されたことから線毛遺伝子を不活化した断片が染色体上に組み込まれたことが確認された。線毛欠失株の確認は、線毛に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより線毛蛋白質の有無を検討するとともに、電子顕微鏡観察により行った。すなわち、菌体を2% uranyl acetateで染色し、菌体表層の線毛の有無を観察し、さらに線毛に対する抗体を用いてイムノゴールド法により線毛の存在を確認した。本研究の目的は歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalisの病原因子と考えられている線毛、血球凝集素、システインプロテアーゼおよび主要外膜タンパク質の遺伝子を不活化した変異株やそれらの遺伝子を導入した形質転換株を作製することにより、それらの病原因子の性状を明らかにするとともに、各遺伝子と歯周病原性の関わりを明らかにすることである。本年度は細胞への付着や他の細菌との共凝集に関与すると考えられている線毛の遺伝子(fim A381)を用いて他のP.gingivalis菌株へ形質転換することにより、線毛の機能について検討した。P.gingivalisの形質転換はfimA381を含むプラスミドpYHF1をプラスミド受容株であるYH522株に伝達して複製した後回収したpYHF1を用いてエレクトロポレーションにより行った。fimA381の遺伝子発現はSDS-PAGEにおける41タンパクの発現と特異抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認し、菌体表層におけるリコンビナント線毛の発現は量子顕微鏡を用いたネガティブ染色像と特異抗体奪用いたイムノゴールド法により確認した。その結果、供試した5株において381株由来の線毛の発現が認められた。次いで、形質転換株とそれぞれの親株を用いて、菌体表層の疎水性、細胞への付着能、他菌種との共凝集性および血球凝集能を比較したところ、リコンビナント線毛が形成された形質転換株はいずれも親株と比較して血球凝集能を除いて、菌体表層の疎水性、細胞付着能および他菌種との共凝集性が低下する傾向が認められた。これらの結果からfimA381遺伝子の伝達により形成された線毛は恐らく天然線毛の骨格に相当するものであり、天然線毛の示すような活性を欠いている可能性が示唆された。
リアノジン全合成とカルシウム放出チャネルの機能研究

6連続4置換炭素を有するリアノジンABDE環部骨格の合成に成功した。またABDE環骨格構築の鍵反応となるα-ヒドロキシ化と渡環アルドール反応の収率、操作上の簡便性を大幅に改善することに成功した。以下詳細を示す。前年度100g合成した1,4-dimethyl-bicyclo[2.2.2]dec-8-ene-2,6-dioneを3工程27%でビシクロ[3.3.2]デカン骨格20gへと変換した。続いて、DMDO酸化によりビス(α-ヒドロキシケトン)とした後、触媒量のトリフリックアシッド(1mol%)を用いることで4工程71%の収率で渡環アルドール反応に成功した。酸化段階を上げてC2対称ビス(1,2-ジケトン)とした。また、同様の手法を用いてビス(1,2-ジケトン)の半分の構造を有するモデル1,2-ジケトンを合成し、C環部に相当する直鎖の4炭素ユニットと、A環側鎖に相当する分岐の3炭素ユニットの導入のモデル実験を行い、位置・立体選択的な求核付加反応が可能であることを見出した。本反応条件を最適化し、ビス(1,2-ジケトン)の非対称化反応へと応用した。しかし、ビス(1,2-ジケトン)はモデル化合物に比べて求電子性が遥かに高かったため、更なる検討を行った。種々検討の結果、マグネシウムアート錯体を用いた直鎖の4炭素ユニットが導入でき、74%の収率でC2対称化合物の位置・立体選択的な非対称化に成功した。最後に、トリケトンへ分岐の3炭素ユニットを位置・立体選択的に導入し、6連続4置換炭素を有するリアノジンABDE環部骨格を合成。リアノジン・コア骨格の短段階合成法を確立した。リアノジン・コア部は置換基の立体を含めてC_2対称性を有しているため、C_2対称化合物を原料に用いることで、二方向同時反応を利用した短段階コア骨格構築法の開発に成功した。C_2対称化合物である2,5-ジメチルハイドロキノンと無水マレイン酸の脱芳香環化型Diels-Alder反応により、四級炭素を有するビシクロ[2.2.2]-オクタン骨格を構築した。無水カルボン酸部への加水分解反応、四酢酸鉛を用いた脱炭酸反応によりオレフィン部を導入した後、ジケトン部への二方向同時環拡大反応(Tiffeneau-Demjanov転位反応)により、ビシクロ[3.3.2]-デカン骨格(1)を合成した。さらに、ジケトン部を渡環ピナコール反応により連結し、コア骨格を構築した。続いて、リアノジン・コア部の構築へ向けて、1への官能基導入を試みた。1のケトンをエノンへと変換し、チオールの1,4-付加反応により、ケトンのβ位へ立体選択的にスルフィドを導入した。得られたジスルフィドの渡環ピナコール反応では、スルフィドが脱離することなく、官能基化されたコア骨格の構築に成功した。さらに、数工程を経てジビニルスルフィドを合成した。また、Davis試薬により、1のケトンのα位へアルコールを導入した化合物2を得た。2の渡環ピナコール反応では、アルコールが脱離するのみであった。興味深いことに、2を酸で処理したところ、渡環アルドール反応が起こり、コア骨格が構築できた。以上のように、現在までに渡環ピナコール反応、渡環アルドール反応を鍵とした二種類のコア骨格構築法の開発に成功している。リアノジンABDE環コア炭素骨格の全ての炭素が官能基化されたC_2対称鍵中間体の合成に成功した。また鍵中間体までの収率、操作上の簡便性を大幅に改善することに成功した。以下詳細を示す。出発物質であるp-キシロキノンは、安価である2,5-ジメチルフェノールの過酸化水素を用いた酸化反応により、100gスケール61%での合成に成功した。得られた化合物をソディウムジチオナイト溶液で還元し、89%で2,5-ジメチルフェノールとした後、無水マレイン酸とのDiels-Alder反応により、26%で二環性骨格を合成した。無水カルボン酸部の加水分解、白金電極を用いた電解脱炭酸反応により68%でオレフィン導入を達成した。この5工程において、最終化合物以外はカラムが不要であり、操作上においても簡便な二環性骨格を合成した。この5工程において、最終化合物以外はカラムが不要であり、操作上においても簡便な二環性骨格大量供給法を確立した。続いて、ジケトン部をCorey法によってエポキシ化した後、アンモニアの付加、Tiffeneau-Demjanov反応により3工程43%でビシクロ[3.3.2]-デカン骨格を構築した。この環拡大反応においても最終化合物以外はカラムが不要であり、容易に八員環化合物へと変換できる方法を確立した。続いて、ジケトン部をTMSエノールエーテル化後、DMDO酸化によりビス(α-ヒドロキシケトン)とした後、トリフリックアシッド、ジクロロメタン65°Cで渡環アルドール反応を起こし、4工程46%の収率でコア炭素骨格を構築した。生じた1,2-ジオールのアセトナイド保護、DMP酸化により、2工程93%で再度C_2対称化合物へと変換した。

最後に、TBSエノールエーテルを経由したm-CPBA酸化により2工程71%でケトンのα位に水酸基を導入し、C_2対称鍵中間体の合成に成功した。6連続4置換炭素を有するリアノジンABDE環部骨格の合成に成功した。またABDE環骨格構築の鍵反応となるα-ヒドロキシ化と渡環アルドール反応の収率、操作上の簡便性を大幅に改善することに成功した。以下詳細を示す。前年度100g合成した1,4-dimethyl-bicyclo[2.2.2]dec-8-ene-2,6-dioneを3工程27%でビシクロ[3.3.2]デカン骨格20gへと変換した。続いて、DMDO酸化によりビス(α-ヒドロキシケトン)とした後、触媒量のトリフリックアシッド(1mol%)を用いることで4工程71%の収率で渡環アルドール反応に成功した。酸化段階を上げてC2対称ビス(1,2-ジケトン)とした。また、同様の手法を用いてビス(1,2-ジケトン)の半分の構造を有するモデル1,2-ジケトンを合成し、C環部に相当する直鎖の4炭素ユニットと、A環側鎖に相当する分岐の3炭素ユニットの導入のモデル実験を行い、位置・立体選択的な求核付加反応が可能であることを見出した。本反応条件を最適化し、ビス(1,2-ジケトン)の非対称化反応へと応用した。しかし、ビス(1,2-ジケトン)はモデル化合物に比べて求電子性が遥かに高かったため、更なる検討を行った。種々検討の結果、マグネシウムアート錯体を用いた直鎖の4炭素ユニットが導入でき、74%の収率でC2対称化合物の位置・立体選択的な非対称化に成功した。最後に、トリケトンへ分岐の3炭素ユニットを位置・立体選択的に導入し、6連続4置換炭素を有するリアノジンABDE環部骨格を合成。
ディオクレティアヌス帝以降のローマ帝国における皇帝と軍隊の政治史研究

本年度はまず、前年度までに達成された研究成果の更なる発展を目標として研究を進めた。第一に後期ローマ帝国政治史に関する重要史料であるアンミアヌス・マルケリヌス『歴史』に関する先行研究の調査を進めることとし、5月23日から6月1日にかけて、イギリスのロンドン大学古典学研究所において文献調査を実施した。この調査によって国内では入手不可能であった多数の史料・研究文献を収集することができた。第二に昨年政治史的観点から分析を加えたシルウァヌス反乱事件に関して、文学史的観点からの分析を改めて加えた。この事件に関してはアンミアヌスの記述がその後の歴史叙述において受容されたことが判明している。本研究では、アンミアヌスの記述が事件の当事者による直接的証言であることと、ギリシア・ラテン語歴史叙述の伝統においてはそのような証言が信憑性を持つとして重視されたことに注目し、アンミアヌス記述を受容した後代のキリスト教徒著作家が、実は古代の伝統を継受する存在であることを明らかにした。この研究成果を国際会議にて口頭報告し、高い評価を得た。第三に後期ローマ帝国における書記官の活動について考察した。書記官は本来皇帝に仕える速記係であったが、時に罪人の逮捕などの特別任務に従事していた。本研究では特にコンスタンティウス2世支配期に活動した「鎖」のパウルスに注目し、その活動の実態を再構成するとともに、アンミアヌスによる記述の執筆意図にも考察を加えた。その結果、パウルスの特別任務の実態を詳細に再構成することに成功し、加えてアンミアヌスの記述に同時代史料が影響を与えた可能性をも見出すことができた。本年度はまず計画に従い、軍隊が帝国政治において最も強い影響力を及ぼし得たであろう場面である後期ローマ帝国における皇帝即位の事例を収集するため、一次史料と関連する研究文献の収集に努めた。この過程において、後期ローマ帝国における皇帝即位、あるいは皇帝擁立の背景や過程が非常に多岐にわたること、そして先行研究でも非常に困難な問題として扱われていることを確認した。しかしながら同時に、先行研究では皇帝即位の背景に専ら重点が置かれていることを発見し、いわゆる簒奪に対して皇帝がどのような対策をとり、どのように対応していたかという点が見過ごされていることを発見した。この発見を踏まえて、研究内容を深化させ、問題点の絞り込みと明確化を図るために、改めて対象とする時代を選定した。具体的には、対象とする時期を紀元後330年代から360年代まで、主に皇帝コンスタンティウス2世が支配した時期に決定した。この理由は、彼がコンスタンティヌス大帝による再統一後の帝国を受け継ぎ、20年以上にわたる長期政権を保った皇帝であり、その支配期間にはマグネンティウスの反乱をはじめとするいわゆる簒奪の事例が十分に認められること、また当該時代の研究は世界的に見ても未だ不足の状況にあり、その必要性が認められることなどである。こうした作業と並行して、研究史上軍隊の影響力がその結果を左右したとされてきたカルケドン裁判の背景について再検討を加え、軍隊の影響力は判決の結果には無関係であることを発見した。さらにこの裁判の背景に、コンスタンティウス2世からユリアヌスへの帝位継承に伴う権力基盤の変化があったことを論じ、この成果を研究会において口頭発表した(2010年8月、東北学院大学)。本年度はまず計画に従って、コンスタンティウス2世の支配期間に起こった内乱の一つである、軍団司令官シルウァヌス反乱事件について検討を進めた。この事件については4世紀の歴史家アンミアヌス・マルケリヌスの実体験に基づく詳細な記録が遺されており、この史料に依拠して数多くの先行研究が生みだされてきた。しかしながらそれらの先行研究はアンミアヌスの記録に依存するあまり、他の同時代史料を軽視しているという問題がある。この問題を解決するために、アンミアヌス史料以外の同時代史料を全て収集しかつ比較検討した。その結果、アンミアヌスの著作が公刊される前と後では、他史料におけるシルウァヌス反乱の叙述に変化が見られることが判明した。またその変化は著作家の沈黙によるものではなく、そもそも反乱の詳細が世間に知られていなかったために起こったことを論証した。この研究結果を学会で発表し学会誌に公表した。上記の研究過程において、本研究にとって必要不可欠の史料であるアンミアヌス・マルケリヌス著『歴史』の記録の信憑性が問題となった。当該史料の信憑性の判定は本研究に多大な影響を及ぼすため、計画を前倒しして、アンミアヌス研究の動向を網羅的に把握し整理する作業をおこなった。この結果、『歴史』の信憑性を判定するためには、各記述に対する個別作業を蓄積する必要があることが認められた。申請者の研究もこの作業の一つとして位置付けることができる。加えて、アンミアヌスその人についての議論、古典文学としての『歴史』についての議論など、アンミアヌスに関する研究動向を網羅的に把握することができ、この成果を学会にて報告した。

本研究では、アンミアヌスの記述が事件の当事者による直接的証言であることと、ギリシア・ラテン語歴史叙述の伝統においてはそのような証言が信憑性を持つとして重視されたことに注目し、アンミアヌス記述を受容した後代のキリスト教徒著作家が、実は古代の伝統を継受する存在であることを明らかにした。この研究成果を国際会議にて口頭報告し、高い評価を得た。第三に後期ローマ帝国における書記官の活動について考察した。書記官は本来皇帝に仕える速記係であったが、時に罪人の逮捕などの特別任務に従事していた。本研究では特にコンスタンティウス2世支配期に活動した「鎖」のパウルスに注目し、その活動の実態を再構成するとともに、アンミアヌスによる記述の執筆意図にも考察を加えた。その結果、パウルスの特別任務の実態を詳細に再構成することに成功し、加えてアンミアヌスの記述に同時代史料が影響を与えた可能性をも見出すことができた。本年度は計画通りシルウァヌス反乱について、一次史料であるアンミアヌス・マルケリヌスの記録を検討し、その記録が古代末期の歴史叙述において果たした役割を解明することができた。加えてアンミアヌスに関する研究動向の把握・整理をおこない、現在までの研究史を網羅的に把握することができ、次年度の研究の基盤が構築された。まずは今年度研究を進めたシルウァヌス反乱事件についてさらに検討を進める。帝国が反乱事件に対してとった方策を具体的に明らかにし、当時の皇帝であるコンスタンティウス2世はなぜそのような方策をとったのか、またそれがコンスタンティウス2世政権のいかなる特色をあらわしているのかを明らかにする。次いでこれまで検討してきた研究内容を総合するべく、コンスタンティウス2世支配期の高位官職者らについて検討を進める。具体的には、彼らの出身階層、活動内容、法制上の位置づけなどに着目する。彼らはコンスタンティウス2世の支配期を特徴づける存在であり、本研究においてその検討は不可欠と思われる。
テロメラーゼをターゲットとした肺癌遺伝子治療の開発

ヒト細胞が無限に増殖するためにはテロメラーゼが活性化する必要がある。この活性は、生殖細胞、不死化した癌細胞とある種の幹細胞および末梢血リンパ球に存在し、殆どの正常体細胞には存在しない。癌細胞のテロメラーゼ活性を阻害することは、多くのヒト悪性腫瘍に有効で正常体細胞に対して副作用の少ない抗癌戦略となることが期待される。1.各種癌細胞株におけるテロメラーゼ活性の抑制効果をみるため、テロメラーゼRNA部分(hTR)及びcatalytic domain(hTRT)に対する相補的配列をもつpeptide nucleic acids(PNA)を作製し、テロメラーゼ活性を持つ癌細胞株、HeLa,LoVo,A549,SW403,VMRC-LCDに添加培養後テロメラーゼ活性を測定したが、活性に変化はみられずPNAの移入効率向上の必要があった。2.サイトメガロウイルスのプロモーターによってhTRTの塩基配列に対するアンチセンスRNAを発現するアデノウイルスベクターを構築し、前述の癌細胞株に感染させ生細胞率とテロメラーゼ活性を測定した。LoVo,VMRC-LCDにおいては生細胞率の低下がみられたがテロメラーゼ活性はどの細胞株でも低下せず、組み換えアデノウイルスの構造の改善が今後の課題として残された。3.正常体細胞に対して副作用の少ない抗癌戦略として癌胎児性抗原(CEA)のプロモーターで自殺遺伝子を発現するアデノウィルスベクターを構築し前述の癌細胞株に感染させたところ、CEA産生癌細胞株LoVo,A549に選択的な細胞毒性がみられ、腫瘍選択的プロモーターの使用はテロメラーゼ活性抑制との併用でさらに正常体細胞に対して副作用のより少ない抗癌戦略になりうると考えられた。今後の研究継続により、従来の治療では予後の改善が得られなかった治療抵抗性の肺癌に対する全く新しい治療戦略となることが期待される。方法と結果1.ヒトテロメラーゼRNAの鋳型領域を含む塩基配列をRT-PCRにて増幅した。2.ヒトテロメラーゼのcatalytic compornentの塩基配列を翻訳開始点を含むようにRT-PCRにて増幅した。4.3で得られたDNA断片をアデノウイルス作製のためのプラスミドpXCJL-1にサブクローニングした。5.4で得たプラスミドを制限酵素で切断し、その塩基配列を平成9年度購入備品であるジェネティックアナライザー(ABIPRISM310)で確認した。6.正しい塩基配列のプラスミドを大量調製した。7.6で得たプラスミドをカルシウムーリン酸法にてアデノアイルス前ゲノムを含むプラスミドpJM17と共に293細胞に遺伝子導入した。8.1及び2で得られたDNA断片をコスミドベクターにセンスまたはアンチセンス向きに発現するようにサブクローニングした。9.現在,形成されたプラークからアデノウイルス抽出中であり、スクリーニング終了後、各種肺癌細胞に遺伝子導入実験を行い、テロメラーゼ阻害作用と細胞増殖阻害能を検討する予定である。また、コストドベクターを用いたアデノウイルス作製も継続予定である。ヒト細胞が無限に増殖するためには、テロメラーゼが活性化する必要がある。テロメラーゼ活性は、生殖細胞、不死化した癌細胞とある種の幹細胞および末梢血リンパ球に存在し、ほとんどの正常体細胞には存在しない。われわれはテロメラーゼ活性が肺癌組織の80%以上で検出されることを見い出しており、肺癌細胞のテロメラーゼ活性を阻害することは、多くのヒト悪性腫瘍に有効でかつ正常体細胞に対して副作用の少ない抗癌戦略となることが期待される。

1.癌細胞株におけるテロメラーゼ活性の抑制効果をみるため,テロメラーゼRNA部分(hTR)及びcatalytic domain(hTRT)に対する相補的配列をもつpeptide nucleic acids(PNA)を作製し、テロメラーゼ活性を持つ癌細胞株、HeLa,LoVo,A549,SW403,VMRC-LCDの細胞膜を処理した後に加え、培養した後テロメラーゼ活性を測定した。しかし,hTR及びhTRTのセンスあるいはアンチセンスPNA添加培養にてテロメラーゼ活性に変化はみられなかった。これはPNAが癌細胞に十分取り込まれなかったためと考えられ,移入効率の向上が今後の課題として残された。2.サイトメガロウイルスのプロモーターによってhTRTの塩基配列に対するアンチセンスRNAを発現するアデノウイルスベクターを構築し、前述の癌細胞株に感染培養後、生細胞率、テロメラーゼ活性を測定した。LoVo,VMRC-LCDにおいては生細胞率の低下がみられたがテロメラーゼ活性はどの細胞株においても変化しなかった。これは組み換えアデノウイルスの構造上の問題によるものと考えられ,ベクター構造の改善が今後の課題として残された。