hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
γ線照射による製剤中医薬品の活性変化に関する研究

代表的医薬品としてアクリノールおよび含糖ペプシンを用いて、γ線照射による製剤中のそれら医薬品の分解率または活性値の変化率を実験測定し、G値を算出する。さらに、製剤中の水分および賦形剤のG値への影響を検討し、医薬品製剤の放射線滅菌時における活性変化の推算方法を確立する。各年度ごとの検討項目および結果平成2年度:1)γ線照射時における試料の吸収エネルギー分布の測定材質の異なるバイアルを用いて、γ線照射によって発生する2次電子線と試料容器の材質、厚み、容量との関係を実験考慮し、吸収線量の補正巾を明らかにした。2)照射線量とアクリノールおよび含糖ペプシンの活性変化とG値の算出5300kGyのエネルギー吸収範囲におけるアクリノールの活性変化を測定し、単一固体および水溶液の2成分系製剤ににおける直接と共存水分の間接作用を別々に考え、分解量との関係式を誘導した。平成3年度:3)各種医薬品製剤における放射線分解量の推算方法の確立賦形剤および水分が共存する3成分系製剤におけるアクリノールの分解量を求め、2成分系における直接および共存水分中に発生するラジカルとの反応による分解の他、固相表面への吸着による活性変化の項を加えた推算式を誘導した。平成4年度:5)放射線滅菌(または、殺菌)における技術的問題点の整理医薬品の微生物汚染で問題となる菌種(薬事法第56条の製造販売の禁止の項において明記されている病原微生物のほか、特定菌;大腸菌群、緑膿菌、ブドウ球菌)のγ線に対する感受性は大きく、また、細菌および真菌ごとに定められている一般生菌数の限度レベルといくつかの医薬品原料汚染菌について調べた放射線感受性を参考にすると、食品照射における容認線量10kGyの線量で十分対処可能である。さらに、照射に伴う医薬品の分解率(又は、活性変化)は、上記の線量では分析の精度範囲内であり、これについても技術的には問題はない。また、主な放射線分解物の検出は必要量の約20倍に相当する線量でゲルろ過とHPLCを組合せた方法で検出可能である。平成2年度における研究計画はγ線照射条件の確立と単一成分系におけるG値の測定であり、以下に述べる研究成果を得た。1)γ線照射時における試料の吸収エネルギ-分布の測定と算出γ線照射時に用いる試料容器の材質(ガラス、ポリスチレンおよびポリエチレン)と容量の違いと充填される照射試料の吸収エネルギ-量の補正値をフリッケ線量計を用いて測定算出し、その結果、20、10、5mlガラスバイアルを用いる場合、+6%、+9%および+10%、8mlポリスチレンバイアルでは+7%、ポリエチレン袋では+6%の補正率の値を得た。2)アクリノ-ルおよび含糖ペプシンの分解G値^<60>Coγ線源を用いて、1.270×10^2C/kg(0.530MR)の照射線量範囲における粉末アクリノ-ルの分解率とペプシン原末(含水率5%)の活性率変化を実験的に求め、上項に述べた補正係数を使用して吸収線量との関係として算出し、回帰分析法により次式ただし、M:分子量、D:吸収線量である。に代入し、それぞれの分解および活性変化G値を算出し、次の結果を得た。アクリノ-ルG=1.25、ペプシンG=0.80以上、上記の2項目について、関連学会において発表報告済であり、その結果をまとめて研究論文として投稿中である。

平成3年度における研究計画は、前年度に得られた研究結果を基とし、複合成分系におけるG値の測定と活形変化の推算方法の確立であり、以下に述べる研究成果を得た。1)水溶液製剤中のアクリノ-ルの分解率の測定^<60>Coγ線を用いて5300kGyの線量範囲における水溶液製剤中のアクリノ-ルの分解率を実験的に求めた。2)含湿ペプシン製剤中の活性変化の測定上記と同じ線量範囲における含湿分の異なる製剤中のペプシンの活性値を実験的に求め、現在、活性変化G値を算出中である。3)γ線照射による水溶液製剤中の医薬品の分解または活性変化の推算法の確立湿潤ならびに水溶液製剤に放射線滅菌法を適用する場合の含有成分の残存率Rの算出法として、湿潤ならび水溶液製剤に放射線滅菌法を適用する場合の含有成分の残存率Rの算出法として、およびを誘導し,モデル医薬品としてアクリノ-ルを用いると、M=361であるので、前1)において得られたデ-タを基にして(2)式から分解定数kを算出し、(3)式から直後および間接作用によるG値を別々に算出し、Gs=1.25およびGw=0.80を得、これらのG値(1)式に代入することによって、含水および湿潤状態の異なる製剤おける放射線分解率または照射後の残存率の推算方法が確立できた。以上の成果については関連学会において発表し、Radioisotopes誌に投稿済である。平成4年度における研究計画は、平成2年度および3年度に得られた研究成果を基とし、医薬品製剤の放射線滅菌(または、殺菌)における技術的問題点の整理、具体的照射条件の提案、照射による医薬品の活性変化の推算法、ならびに放射線分解物の検出方法であり、以下に述べる研究成果を得た。1)放射線滅菌(または、殺菌)における技術的問題点の整理医薬品の微生物汚染で問題となる菌種(薬事法第56条の製造販売の禁止の項において明記されている病原微生物のほか、特定菌:大腸菌群、緑膿菌、ブドウ球菌)のγ線に対する感受性は大きく、また、細菌および真菌ごとに定められている一般生菌数の限度レベルといくつかの医薬品原料汚染菌について調べた放射線感受性を参考にすると、食品照射における容水線量10kGyの線量で十分対処可能である。さらに、照射に伴う医薬品の分解率(又は、活性変化)は、上記の線量では分析の精度範囲内であり、これについても技術的には問題はない。2)放射線滅菌(または、殺菌)における具体的照射条件の提案放射線源としてγ線を用いる限り、医薬品の原料および製剤のいずれにおいても照射そのものは簡便に実施できる。しかし、線源の規模が大きくなるので、各事業所の製薬工程に組込むことは経済的に得策ではない。したがって、原料を各製薬工場に入荷する前に殺菌操作を依頼するのが望ましい。さらに、被照射物中の含有水分量を予め知っておくことが必要である。3)照射による医薬品の活性変化の推算法これについては、昨年度のRadioisotopes誌に投稿報告した。さらに、酵素製剤への応用が可能であることを含糖ペプシンを用いて調べ、今年度のRadioisotopes誌に投稿報告した。4)放射線分解物の検出方法の確立γ線照射によって生じる放射線分解物の検出については、殺菌に必要な値の約20倍の線量ではゲルろ過とHPLC法を組合せることによって、検出が可能である。さらに、共存水分が関与する分解物ではより低線量で検出可能である。
mRNA安定性調節メカニズムを介した造血細胞のアポトーシス制御と白血病への関与

われわれは、サイトカインがBim mRNAを不安定化することによりその発現量を減少させ、造血細胞の生存を維持することを見出した。本メカニズムは、ヒートショック関連タンパク質Hsc70複合体がmRNAを安定化することが核であるが、この調節メカニズムにmiRNAによるmRNA分解機構も関与すると推測し、解析を試みている。具体的には、細胞よりmiRNAが結合したままの状態でmRNAを抽出し、miRNAをプライマーとしてcDNAを合成する方法を用いている。合成されたcDNAの末端を確認することによってmiRNAの種類と結合部位が同定可能である。Bim mRNAは約4.5Kbと比較的長い3'非翻訳領域(UTR)を有しており、これまでに複数の候補miRNA配列が同定された。また各種データベース解析により、Bim3'UTR開始点から約200塩基の領域にmiR-181が結合すると推測された。この部位はヒト・マウス間で保存されており、miR-181がBim mRNA分解に関与するという作業仮説のもと解析を進めている。今後これらmiRNAの、Bim mRNA安定性制御へのかかわりを明らかにする予定である。またわれわれは、Hsc70タンパク質複合体の免疫沈降実験により、Hsc70複合体にmRNA安定化因子poly(A)-binding protein(PABP)が含まれる可能性が高い、という実験結果を得た。PABPはmRNA5'端のcap構造と3'端のpoly(A)鎖を橋渡しし、mRNAをループ状の構造にして安定化することが知られており、Hsc70複合体がPABPをmRNAにリクルートするなどのメカニズムを予想している。造血細胞はサイトカインによりその生存や増殖が厳密に制御されており、サイトカイン非存在下では速やかにアポトーシスを起こす。われわれはこれまでに、造血細胞がアポトーシスを起こす際にはアポトーシス促進タンパク質Bimが発現誘導されること、またこの発現調節がmRNAレベルであることを見出した。詳細な解析の結果、本メカニズムはヒートショック関連タンパク質のHsc70がBim mRNAに結合しこれを安定化するものであることが判明した。すなわち、サイトカイン存在下ではHsc70タンパク質複合体がBim mRNAに結合せず、Bim mRNAが不安定になり発現量が減少する。一方、サイトカイン非存在下ではHsc70複合体がBim mRNAに結合し安定化する結果、Bimタンパク質発現量が増加しアポトーシスが誘導される。Hsc70複合体の認識配列はBim mRNA3'UTRのうちヒトとマウスで高度に保存されている800bp程度のAU-richな配列であるが、同様にAU-richな3'UTR配列を有するfos mRNAはHsc70複合体に依存せず、サイトカインの有無にかかわらず不安定であったので、Hsc70はBim mRNA上のAU-richなコア・エレメント周辺にあるmRNA配列(シスエレメント)を認識し、結合特異性を発揮すると思われる。現在、Bim3'UTRにさまざまな変異を導入したmRNAを合成し、Hsc70複合体との結合能測定を行っている。またmRNAの安定性や翻訳制御にはmicroRNAが関与することが知られているが、われわれはHsc70複合体がmicro RNAと競合的にBim mRNAに結合し不安定化を妨げる可能性や、micro RNAの結合部位をHsc70複合体が認識して結合しmicro RNAの機能を阻害する可能性があると考え、Bim mRNAに結合するmicro RNAの同定を進めている。
有限体上のドリンフェルト・モジュラー曲線の塔から生じる超幾何関数の関数体類似

事前に異なる二つの方向の研究を行った.一つはドイリングの定理を「階数2ドリンフェルト加群」の場合に「関数体化」したもので,もう一つは同定理を「一般曲線」の場合に「高次元化」したものである.本研究では先行研究の前者の定理を「一般階数ドリンフェルト加群」の場合に高次元化する.基礎体を「関数体化」した定理の証明方法と,曲線を「高次元化」した定理の証明のアイデアとを,ベクトル的に足し合わせることによって進める.事前に異なる二つの方向の研究を行った.一つはドイリングの定理を「階数2ドリンフェルト加群」の場合に「関数体化」したもので,もう一つは同定理を「一般曲線」の場合に「高次元化」したものである.本研究では先行研究の前者の定理を「一般階数ドリンフェルト加群」の場合に高次元化する.基礎体を「関数体化」した定理の証明方法と,曲線を「高次元化」した定理の証明のアイデアとを,ベクトル的に足し合わせることによって進める.
高臨界磁界シェブレル相超伝導々体の長尺線材化に関する研究

現在、最高の臨界磁界(〉50Tat4.2K)を示すシェブレル相化合物(Pb【Mo_6】【S_8】)超伝導体は、高磁界マグネット用導体として実用化が注目されている新材料である。この材料の線材化が成功すれば、高磁物発生技術に大きな進展をもたらすものと期待される。最近、国内外の研究機関において、この材料の線材化、およびその臨界電流密度値の向上に関していくつかの研究が進められ、大きな臨界電流密度を持つものが得られ始めてきた。我々は、この材料の線材化に関する基礎研究を進め、臨界電流密度の高い導体の作製法に関する研究、またその特性改善のために、磁束ピンニングの機構の解明を行ってきた。その結果、短尺のテープ状導体においてB=15Tで1×【10^4】A/【cm^2】,20Tで5×【10^3】A/【cm^2】(at4.2K)また1.6Kでは、20Tで1×【10^4】A/【cm^2】と大きなJc値をもつ導体を得た。さらにまた、高融点金属の【Nb^-】をシース材とした線材を60年申請のドローベンチを用いて作製し、その臨界電流を測定した結果、従来報告されていた磁界依存性とはかなり異なる良好なものを得た。一方、テープ状試料において、結晶粒径を制御しうる導体作製法を見いだし、結晶粒径とピンニング力密度との間に強い相関があることを見いだした。これらの結果は、シェブレル相化合物超伝導体の実用化に向けて有意義なものと言え、今後の研究の進展が期待される。
中国回収衛星による化合物半導体の単結晶成長に関する研究

本研究では,中国回収衛星を利用した微小重力場において,In_<1-x>Ga_xSb化合物半導体の単結晶成長実験を行い,結晶溶解・成長過程における拡散及び界面律速過程や面方位依存性を明らかにし,In_<1-x>Ga_xSb化合物半導体のみならず,各種化合物半導体単結晶の高品質化への知見を得ることを目的としている。本年度は1996年10月に実施した宇宙実験の試料及び地上対照実験試料を切断し,切断面におけるGaSb溶解領域及びIn_<1-x>Ga_xSb成長領域を電子線マイクロプローブ分析法(EPMA)により測定した。その結果,宇宙試料は長さ方向に平行に溶解し,地上試料は重力方向に末広がりに溶解していた。これは,地上試料では,比重の大きいInSbが重力方向に移動し,より多くのGaSbを溶解したものと考えられる。また,数値シミュレーションを実施した結果,実験結果と同様の結果が得られた。さらに,面方位依存性に着目してみると,両試料とも(lll)A面より(lll)B面の方がInSbに溶解し易いことが明らかになった。反対に,成長領域は,B面よりもA面の方が大きいことが明らかになった。なお本年度は,研究討論等を行うため,5月及び8月に延べ3名(早大:平田,村上,桜井)が中国に出張した。また,研究成果の発表のために,8月には中国,10月にはイタリアへ延べ2名(早大:桜井)が出張した。12月には2名(静大:早川,早大:桜井)が本研究の総括討論をするために,訪中した。本研究では,広範囲な赤外光に感度を有するために光デバイス作製上非常に重要な材料として期待されているIn_<1-x>Ga_xSb化合物半導体の単結晶成長実験を中国回収衛星を利用した微小重力場において行い,結晶溶解・成長過程における拡散及び界面律速過程や面方位依存性を明らかにし,In_<1-x>Ga_xSb化合物半導体のみならず,各種化合物半導体単結晶の高品質化への知見を得ることを目的としている。1996年10月には,2回にわたり,延べ4名(早大・常田,桜井;静大・熊川,早川)が中国に渡り,現地の研究分担者である中国科学院半導体研究所のZhong教授や中国宇宙技術院のXie助教授らと共に,回収衛星を利用した微小重力実験の温度シーケンスの設定・調整等を行った。微小重力実験は,1996年10月20日に打ち上げられた回収衛星内で1996年11月3日に実施した。実験は,GaSb-InSb-GaSbのサンドイッチ構造に作製した結晶成長試料を電気炉内で706°Cまで加熱した後,0.5°C/minで徐冷して結晶成長を行った。微小重力実験試料は1996年11月に2名(静大・岡野;早大・新船)が中国にて受取,日本に持ち帰った。微小重力実験試料は外観観察により,回収に伴う試料の破損がないことを確認した後,微小重力実験試料の表面濃度を電子線マイクロプローブ分析法により測定を行った。その結果,微小重力場において溶融・結晶成長が行われたことが確認された。また,1996年12月に1名(静大・早川)が中国に渡り,中国宇宙技術院・蘭州物理研究所にて微小重力実験と同様の温度プロファイルで地上対照実験を実施した。地上対照実験試料も日本へ持ち帰り,現在,微小重力実験試料・地上対照実験試料とも解析を行っている段階である。本研究では,中国回収衛星を利用した微小重力場において,In_<1-x>

Ga_xSb化合物半導体の単結晶成長実験を行い,結晶溶解・成長過程における拡散及び界面律速過程や面方位依存性を明らかにし,In_<1-x>Ga_xSb化合物半導体のみならず,各種化合物半導体単結晶の高品質化への知見を得ることを目的としている。本年度は1996年10月に実施した宇宙実験の試料及び地上対照実験試料を切断し,切断面におけるGaSb溶解領域及びIn_<1-x>Ga_xSb成長領域を電子線マイクロプローブ分析法(EPMA)により測定した。その結果,宇宙試料は長さ方向に平行に溶解し,地上試料は重力方向に末広がりに溶解していた。これは,地上試料では,比重の大きいInSbが重力方向に移動し,より多くのGaSbを溶解したものと考えられる。また,数値シミュレーションを実施した結果,実験結果と同様の結果が得られた。さらに,面方位依存性に着目してみると,両試料とも(111)A面より(111)B面の方がInSbに溶解し易いことが明らかになった。反対に,成長領域は,B面よりもA面の方が大きいことが明らかになった。なお本年度は,研究討論等を行うため,5月及び8月に述べ3名(早大:平田,村上,桜井)が中国に出張した。また,研究成果の発表のために,8月には中国,10月にはイタリアへ延べ2名(早大:桜井)が出張した。12月には2名(静大:早川,早大:桜井)が本研究の総括討論をするため,訪中した。
グアニン4重鎖(G4)とG4結合タンパク質Rif1による染色体制御機構の解明

進化的に保存された核因子Rif1は、遺伝子間に存在するグアニン4重鎖(G4)構造を認識・結合し染色体ドメイン構造を制御することにより複製タイミングを規定することを見出した。本研究では、Rif1とG4構造の相互作用を生化学的に詳細に解析するとともに、Rif1とG4相互作用が染色体高次構造を制御するメカニズムを解析した。これまで、分裂酵母Rif1は、N末端HEAT repeat構造及びC端にG4結合ドメインを有すること、C端91aaのみで多量体を形成することを見出した。Rif1は、パラレル型のG4に高い親和性で結合する。また、多量体を形成したG4に選択的に結合する。さらに、in vitroで複数個のG4構造に同時に結合できることを示した。これらのdataに基づき、Rif1また、hsk1変異をバイパスする2種類の点変異体(複製起点活性化抑制能の変異)を同定した。L848S変異は、ChIPアッセイにより染色体Rif1BSへの結合能が減弱していたが、R236H変異は、Rif1BS(結合部位)への結合は正常であった。従って、クロマチン結合のみでは、複製活性を抑制できないことが明らかである。Rif1BSはオープンクロマチン領域に存在するが、Rif1BS内のG4形成配列の変異によりクロマチン構造が復活する。このことは、クロマチン上でのG4形成が、ヌクレオソーム形成を阻害し、オープンクロマチンの形成に必要であることを示す。細胞内でのG4形成を検証するため、G4構造上に存在する一本鎖loopを標的として制限酵素を用い、G4形成を調べる新規技術を開発した。グアニン4重鎖(G4)構造は代表的な非B型DNA構造でありヒトゲノム上に35万カ所以上も存在すると推定されているが、実際それがゲノム上にどのように分布し、どのような生物学的な意義を有するかは未知であった。最近申請者らは複製タイミングを制御する進化的に保存された因子Rif1は、遺伝子間に存在するG4構造を認識・結合し染色体ドメイン構造を制御することにより複製タイミングを規定することを見出した。そこで本研究では、Rif1とG4構造の相互作用を生化学的に詳細に解析するとともに、Rif1とG4相互作用が染色体高次構造を制御するメカニズムを解明する。分裂酵母Rif1の種々の欠失誘導体を作製、精製しその活性を生化学的に解析した。その結果下記があきらかとなった。(1)C末端229アミノ酸(1172-1400)がG4と結合できる。(2)C末端90アミノ酸のみで多量体化(8, 16量体化)できる。(3)N末端444のアミノ酸(1-444; HEAT repeat構造)もG4と結合できるが、特異性および親和性が低い。(4)Rif1は同時に複数のG4DNAと結合できることをpull down assayで証明した。(5)C端に近い保存配列を変異すると、DNA結合能が大きく低下するとともに、8, 16量体化形成能が喪失した。(6)転写によりRif1BS(Rif1結合配列)上に形成されるG4構造にも、Rif1は結合できる。これまで順調に実験が進行し、Rif1の機能ドメインが明らかとなった。ただ、全長のRif1は分解しやすく、分解産物と完全に分離することがいまだ困難である。最近代表者らは複製タイミングを制御する進化的に保存された因子Rif1は、遺伝子間に存在するG4構造を認識・結合し染色体ドメイン構造を制御することにより複製タイミングを規定することを見出した。これまで、分裂酵母Rif1の種々の欠失誘導体を作製、精製しその活性を生化学的に解析しC端にG4結合ドメインおよび多量体形成ドメインがあることを見出した。また、N末端HEAT repeat構造もG4結合能を有するが特異性および親和性が低い。今回、hsk1変異のバイパス能を指標に変異体を探索し、バイパスできなくなった点変異を同定した。そのなかでL848S変異は、ChIPアッセイにより染色体Rif1BSへの結合能が著しく減少していた。しかし、精製したL848Sタンパク質は、in vitroでG4に結合できた。このことから、Rif1の染色体への安定な結合には、G4結合能以外の機能が必要とされることが示された。また、Rif1結合部位が実際に細胞内で形成されているかどうかを確認するために、G4のループ部位に人為的に導入したI-SceI制限酵素部位を用いて、G4構造形成を検出する系を確立した。この系を用いて、G4構造形成配列では、ループは1本鎖になり、I-SceI切断が検出されなくなることから、細胞内でG4構造が形成されている可能性が強く示唆された。分裂酵母Rif1の機能ドメインとその機能の概要を明らかにすることができた。また、複製タイミングの指標であるhsk1変異の相補能を喪失した点変異を同定することができた。

ChIP解析により、それは染色体結合できるものできないものに分けられた。これらの解析から、Rif1は、染色体結合(および脱リン酸化酵素結合)以外に、複製タイミング制御に必要な機能を有することを示す。また、L848Sは染色体結合できないが、in vitroではG4に結合する。したがって、安定な染色体結合にはG4結合能のみでは不十分であることも示唆された。また、今回、Rif1BSが実際に細胞内でG4構造を形成することを示す実験結果を得た。この方法を用い、細胞内でのG4形成に必要な因子を探索することが可能になった。進化的に保存された核因子Rif1は、遺伝子間に存在するグアニン4重鎖(G4)構造を認識・結合し染色体ドメイン構造を制御することにより複製タイミングを規定することを見出した。本研究では、Rif1とG4構造の相互作用を生化学的に詳細に解析するとともに、Rif1とG4相互作用が染色体高次構造を制御するメカニズムを解析した。これまで、分裂酵母Rif1は、N末端HEAT repeat構造及びC端にG4結合ドメインを有すること、C端91aaのみで多量体を形成することを見出した。Rif1は、パラレル型のG4に高い親和性で結合する。また、多量体を形成したG4に選択的に結合する。さらに、in vitroで複数個のG4構造に同時に結合できることを示した。これらのdataに基づき、Rif1また、hsk1変異をバイパスする2種類の点変異体(複製起点活性化抑制能の変異)を同定した。L848S変異は、ChIPアッセイにより染色体Rif1BSへの結合能が減弱していたが、R236H変異は、Rif1BS(結合部位)への結合は正常であった。従って、クロマチン結合のみでは、複製活性を抑制できないことが明らかである。Rif1BSはオープンクロマチン領域に存在するが、Rif1BS内のG4形成配列の変異によりクロマチン構造が復活する。このことは、クロマチン上でのG4形成が、ヌクレオソーム形成を阻害し、オープンクロマチンの形成に必要であることを示す。細胞内でのG4形成を検証するため、G4構造上に存在する一本鎖loopを標的として制限酵素を用い、G4形成を調べる新規技術を開発した。今後、さらにC端のG4結合ドメイン、多量体化ドメインを短く限定するとともに、これらのドメインとG4の複合体の構造解析を行う。精製度の高い全長Rif1を精製するために、今後、切断が起こらないような変異Rif1を作製するなどして分解産物を含まないRif1の精製をめざす。これまでに得られた結果を基盤に、(1) Rif1の細胞内でのクロマチン結合に必要なドメインを限定し、生化学的に解析する。(2)C端のG4結合ドメイン、多量体ドメインの構造を、G4との複合体として決定する(九州大学神田大輔博士と共同)。(3)G4と全長Rif1タンパク質との複合体の構造をCryo-電顕で観察し決定する(Michigan大学Huilin Li博士と共同)。(4)細胞内のRi1BSのG4構造形成のために必要な因子を探索する。ヒストン修飾因子、トポイソメラーゼ、転写終結因子、RNaseH、などの変異体を用いてG4形成に及ぼす影響を調べる。また、転写阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、HDAC阻害剤、その他の阻害剤の影響を調べる。タンパク分解のため全長のRif1の精製に困難が生じた。
セラミックスコーティングを用いた核融合炉用先進的超伝導線材の開発と評価

ITER計画でも用いられている実用超電導線材であるNb3Sn超電導線材は、主に研究用の高磁場領域のアプリケーションで用いられている。超電導線材は、主に複合材の形をとり、特にNb3Snは銅やブロンズの割合が大きく、弾性域が小さく強度が確保できない問題がある。今後の核融合や素粒子研究などへの応用を考えると、さらなる高強度化と高性能化が求められている。そこで、本研究では、CrNを表面にコーティングすることで、残留応力のコントロールと高強度化を試み良好な結果を得た。また、フィラメント部について、世界で初めてX線応力測定も行うことに成功し、簡易的な残留応力測定法を確立することができた。本年度は、スタートの年度であり、主にアンモニア窒化装置の準備に充てていた。共同研究者所属の応用化学研究所の方で、窒化用の高温用ガス通過型の電気炉を試作的に導入した。これは、これまでの電気炉では、温度均一部が小さく、線材全体の均一に窒化処理することが困難であったためである。この電気炉の導入の結果、温度均一域が広くなり、長めの線材においても、窒化処理が可能となった。また窒化層の厚み向上のための、条件出しも開始しており、数um程度の窒化層は容易に生成できるようになった。さらなる厚みを目指して開発を続けたい。X線応力測定については、Nb3Sn線材を軸方向にハーフカットし樹脂埋め込みした状態でX線回折測定を試みた。Cu-Kα線を用いたところ、高角度域にNb3Sn単独ピークを確認しており、X線応力測定に有望な回折面である。ただし、セラミックス全体の問題であるが回折線が弱く、ローターターゲットを用いても、5本の線材から1回折線を測定するのに1時間程度必要となっている。当初目的の単一線での引張における測定は困難かもしれないことが明らかになった。放射光などの、他の高強度X線施設での実験も視野に入れてみたい。また、Nb3Snのフィラメントの中央部に残留のNbがあり、フィラメント自体に残留応力が含まれている可能性があることからX線応力測定を試み、ほぼ残留応力がないことを実験により明らかにした。十分な量のフィラメント単体では、問題なくX線応力測定が適用可能であることが示された。今年度は、前年度に引き続き、アンモニアガスによる窒化(アンモニア窒化)を継続的に行っている。アンモニア窒化については、断面写真およびX線回折によって評価を行っている。現在行っている620°C10時間の熱処理においては、4マイクロメートル程度の膜厚のCrNが生成されていることを確認できており、処理時間を増やすことにより、おおよそ7マイクロメートルの膜厚でCrNを生成できる見込みである。また、X線回折によって、条件によってはCr2N相ができることを確認しているが、条件により、ほぼ全量をCrNにできることがわかっており、時期に処理を行う引張試験用の試験片に適用したいと考えている。応力測定においては、前回の報告でも示したように、単線のNb3Snでは、15kWのローター管球のX線回折装置を用いても、十分な強度の1プロファイルを得るのに10時間程度が必要であり、強度的に実用的でないことが示された。これは元来Nb3Snの回折強度が弱いことに起因しており、X線回折装置での引張試験はほぼ困難であり、シンクロトロン放射光などの高強度X線が必要である。しかしながら、研磨面を用いて、室温にて残留している熱応力についてX線応力測定を試みたところ、Cu-Kα特性X線を用いて、Nb3Snの523面を測定することでNb3Snの残留応力をよい精度で測定できることを確認した。これは、試料を準備する際に6本を並べて研磨し、X線回折においても6本から同時に回折を得る手法としたため、精度向上につながっている。このように、室温の熱残留応力については、ラボX線においてもX線応力測定が適用できることを明らかにできた。次年度は、アンモニア窒化されたNb3Sn線材と未処理の線材との比較をX線残留応力測定法を使って評価を行っていきたい。アンモニア窒化は、実線材のに4マイクロメートル程度の窒化層を生成することに成功している。次年度は、引張試験を行えるサイズのやや長尺の試料の熱処理を行っていく計画である。回折強度の不足により単線での引張試験が行えなくなったという意味で、計画書と違いが出ており、その意味でやや遅れているとした。一方で、熱残留応力については、弱い回折強度ながら、本数を増やすことで高精度に測定できること確認している。ラボX線を用いたNb3Snの応力測定はこれまで前例がなく、新たな知見という意味では順調に推移していると考える。中性子やシンクロトロン放射光などを用いずとも、簡便な応力測定が可能となるため、ここに特化した研究を続けたい。今年度は、前年度に引き続き、アンモニア窒化を行って試料を作成した。時間短縮のために、熱処理時間を半分にした試料の試作も行い、十分にNb3Snが生成できていることを確認した。窒化層は、あらかじめ7μmコートしたCr層を、ほぼ完全に窒化することに成功した。試料ができたことにより、当初計画通り、X線応力測定を行った。

Nb3Snフィラメントは回折強度が弱く、15kWのロータ管球のX線装置でも、十分な回折強度が得られなかったが、6本並べて測定することと、1プロファイルを測定するのに、10回測定を行い3時間程度かけ後から、プロファイルを合成する手法で、十分な回折強度を得ることに成功し、X線応力測定を行うことができた。また、得られたNb3Sn線材の低温の線膨張係数測定も併せて行った。直径0.8mmのNb3Sn線材に、特注の極小ひずみゲージを貼り付け、線膨張係数を測定することに成功した。線膨張係数は、どの試料も、3回測定を行ったが、回数ごとに、異なる挙動を示すことを明らかにした。1回目と2回目と3回目で、線膨張係数が異なり、これは、銅部分の降伏により、弾塑性的な挙動が起こっていることを示唆している。得られた線材については、引張試験を行い、ヤング率、0.2%耐力ともに向上していることが確認できた。コーティングなしの線材のヤング率は89.5GPaであり、コーティングしたものは95.3GPaとなり、6.4%弾性定数が向上した。0.2%耐力はコーティングなしが119MPaからありのものが134MPaと12.6%も向上し大幅に改善できた。Nb3Sn線材の熱処理には、酸化防止のため、通常希ガスのガスフロー用いているが、これをアンモニアガスフローに置換するだけで、大幅な機械特性の改善が見込めることを証明することができ、今後、先進的な超伝導線材の強化技術として利用できると思われる。ITER計画でも用いられている実用超電導線材であるNb3Sn超電導線材は、主に研究用の高磁場領域のアプリケーションで用いられている。超電導線材は、主に複合材の形をとり、特にNb3Snは銅やブロンズの割合が大きく、弾性域が小さく強度が確保できない問題がある。今後の核融合や素粒子研究などへの応用を考えると、さらなる高強度化と高性能化が求められている。そこで、本研究では、CrNを表面にコーティングすることで、残留応力のコントロールと高強度化を試み良好な結果を得た。また、フィラメント部について、世界で初めてX線応力測定も行うことに成功し、簡易的な残留応力測定法を確立することができた。共同研究者所属の応用化学研究所の方で、窒化用の高温用ガス通過型の電気炉を試作的に導入した。これにより、線材用のアンモニア窒化装置が導入できたことから、アンモニア窒化の条件だし、および試作線材の開発が進むことが予想される。これからは、より厚みのある窒化層を生成できるよう開発を続けていきたい。今年度は、フィラメント自体に残留応力が含まれている可能性があることからX線応力測定を試み、ほぼ残留応力がないことを実験により明らかにした。フィラメント単体では、問題なくX線応力測定が適用可能であることが示された。ただし線材単体で、実験を行ったところ、5本の線を同時に測定にしたにもかかわらず、測定には、1時間以上かかっており、単線での実験では、回折強度問題は解決しなければならない問題である。高強度X線源として放射光の利用も考えていきたい。また、X線装置用の引張試験装置の製作は遅れているが、図面は起こしており、1年遅れで今年度製作したいと考えている。アンモニア窒化は、実線材のに4マイクロメートル程度の窒化層を生成することに成功しおり、引張試験ならびに臨界電流が行えるサイズの10cm程度の線材の処理を行う予定である。Nb3Sn線材は、臨界電流を得るためには、生成のための熱処理が必須であり、保守的な処理では570°C150時間に650°C100時間を連続して行うことが多い。
先天性四肢障害当事者の心理社会的支援のニーズに関する生涯発達研究

本研究では,先天性四肢障害を対象として,1発達段階で直面する課題や困難,2被支援経験とその有効性,3当事者の主観的障害観を明らかにした。研究期間には1ステークホルダーへのヒアリング、2父母へのアンケート調査、3当事者による手記の分析、4当事者へのライフストーリーインタビューを行った。その結果、先天性四肢障害児は発達に応じて定型的な困難が生じる、2歳ごろから段階的に自身の障害を認識する、学齢期および入園入学前後に困難が増える、当事者は身体的困難を認識しにくく受診行動や援助要請行動につながりにくい等が明らかになった。これらは軽度身体障害特有の課題である可能性が示唆された。【目的】本研究の目的は,1)先天性四肢障害当事者が発達段階に応じて直面する課題や困難,2)先天性四肢障害当事者および家族が受けてきた支援とその有効性,3)先天性四肢障害当事者の主観的障害観を明らかにすることである。【方法】24年度は主に,研究3に該当する障害当事者への聞き取り調査を行った。また,24年度より,先天性四肢障害当事者による自助グループ活動開始の動きがみられた。そのため,本研究計画当初にはなかった「当事者活動の展開に伴走する研究」を研究4として追加した。研究代表者がこれらの活動に参加し,情報収集を行った。【成果】先天性四肢障害当事者には,1)発達に伴う身体変化や二次障害,2)家族や親の自助団体との関係の複雑さ,3)当事者同士の障害程度の違いに伴う葛藤,4)親の介入が躊躇される成人後の困難への対応,といった課題があり,5)常に介助者を要さず支援の必要性も明確でないため自ら他人に支援を求める必要がある,6)他者に家族の障害について開示を受けやすい,といった特徴があることが確認された。特に1)では,本研究で当初重視していなかった発達に応じて生じる身体的変化や二次障害による生活困難についても着目する必要が確認された。本研究で対象とする先天性四肢障害は,生まれたときから当事者がもつ障害のある身体に適応した動作を獲得するため,「動作のしにくさ」が困難として認識されにくい。その結果,無理な身体動作を続け,関節痛や側弯などの二次障害を生じる者が一定数いると推察された。いずれの課題に対しても,これまで積極的な解決策は提示されてこなかったことが報告され,当事者同士の自助および専門的アドバイスにより何らかの改善が図られる可能性が示唆され,時機を得た当事者の自助活動開始の動きに伴走した研究を行うことが重要であると考えられた。研究1では,先天性四肢障害児者の生涯発達過程における困難や支援の現状について,自助団体関係者を対象に相談の多い事項についてヒアリングを行った。発達段階別にまとめると,乳幼児期(医療福祉制度,集団生活の場の選択,本人の障害への気付きと障害開示),学齢期(音楽やスポーツ等の道具利用),青年期(年金や自動車免許等の制度,就職),成人以降(結婚と出産・子育て,親子関係,仕事と就職,身体)の相談が多く寄せられていた。これらの結果をもとにアンケートを作成し,26年度に調査を実施する。研究2では,2004年から2013年までの機関誌に掲載された当事者の手記を収集した。1年間に平均9件の手記が掲載され,手記掲載数は経年増加傾向にあった。当事者の手記は,日常の体験を通した自身の障害の認識や社会に対する思いをつづった内容が多かった。手記のテーマは音楽が最も多く,ボランティア,スポーツ,就労,子育て,自助団体の活動参加,自動車免許などが取り上げられた。手記の内容からは,障害に対する認識として一部ネガティブな体験も記載されたものの,全般的に肯定的な障害認識が記載されていた。研究3として,前年度に引き続き当事者への聞き取り調査を行った。特に身体的困難に注目すると,当事者は身体的な不具合を感じているものの,解決に向けた受診行動や自助具の活用および援助要請行動につながりにくいことが明らかになった。受診行動を抑制する要因としては,自身の障害に起因する困難を明確に認識しにくいことが考えられた。自助具の活用を抑制する要因としては,過去の自助具使用時の満足度や有効性が低かったことや,自助具を用いないことに価値をおく生育環境があると示唆された。また,援助要請行動についても,生活動作の自立を求められた生育環境下で,援助要請に消極的な価値観が形成されていたことが示唆された。本研究の目的は,1)先天性四肢障害当事者が発達段階に応じて直面する課題や困難,2)先天性四肢障害当事者および家族が受けてきた支援とその有効性,3)先天性四肢障害当事者の主観的障害観を明らかにすることであり,23年度は障害当事者によって書かれた国内の文献資料の収集を行った。一般向けとしては,単著では成人した当事者による手記が6点出版されており,幼児から成人までの当事者による作文や聞き書きを中心とした複数の著者によるものが4点出版されていた。いずれも社会への啓発の意図が含まれており,ポジティブな視点から記載する傾向があった。その他,自助団体が発行した成人当事者による文集が発行されており,一般向け図書に比して,障害に対する考えや当事者にネガティブな影響を与えたエピソードが記載されていた。自助団体の機関紙は過去30年にわたり400回発行されており,特に近年,当事者による記事が増えていた。

これらのうち当事者が経験した1)困難,2)支援,3)主観的障害観に関する記述に着目して,手記の一部をデータ化した。以上のデータ収集は次年度以降継続して行っていく。また,取り上げられるエピソードの特徴から先天性四肢障害に起こりやすい発達課題を検討し,経験を踏まえた1)困難,2)支援,3)主観的障害観について分析を行っていく。当事者による手記の分析結果は,25年度以降実施される当事者を対象とした聞き取り調査の項目に反映される。研究3では、本人を対象としたインタビュー調査の分析を進めた。対象障害では受診行動や援助要請行動を抑制しやすい可能性が明らかになったが、一方で周囲の働きかけを契機として,周囲に手助けを頼むことをポジティブに捉え直す変化が生じた事例が確認された。この事例では、自立的に援助要請を行うことで友人や家族との関係性が好転していた。分析結果から、障害当事者が適切な援助要請ができるよう支援することで,障害当事者の主観的障害観や周囲との関係性を間接的に変容させる可能性が示唆された。研究1では、聞き取り調査の結果をもとにアンケートを設計し,先天性四肢障害児の親を対象に調査票を郵送した。障害当事者と親への聞き取り調査およびフィールド調査をもとに設定された項目は、1.子育て過程における全般的な課題とサポート、2.特定の発達時期に生じる課題(子どもの出生時の周囲への説明、入園時の困難、本人の障害認知、本人への障害の説明、学校生活における困難経験と相談経験、成人後の不安)、3.親としての子育てにおける意識と成長感であった。発達段階別の困難として、乳幼児期(医療福祉制度,集団生活の場の選択,本人の障害への気付きと障害開示),学齢期(音楽やスポーツ等の道具利用),青年期(年金や自動車免許等の制度,就職),成人以降(結婚と出産・子育て,親子関係,仕事と就職,身体)を想定したが、このうち社会・医療福祉制度や身体上の不具合についての言及が少なかった。一方で困難として多くあげられたのは、道具利用、入園入学に際しての拒否、友人関係におけるいじめやからかい、思春期における本人の障害認識の変化であった。また、親子間で障害について取り上げて話をした経験がなかった、本人からの訴えがなかった、との回答も一定数見られた。次年度にかけて調査票を回収し、分析を進める。【目的】本研究の目的は、1)先天性四肢障害当事者が発達段階に応じて直面する課題や困難、2)先天性四肢障害当事者および家族が受けてきた支援とその有効性、3)先天性四肢障害当事者の主観的障害観を明らかにすることである。【方法】27年度は、1)親へのアンケート調査の分析、2)当事者への聞き取り調査を実施し、研究期間全体の総括を行った。【成果】1)先天性四肢障害児の親に郵送による調査を行い、84名(26.6%)から回答を得た。困難の経験頻度が高いのは、幼児期・学齢期であった。幼児期には23歳ごろから子ども自身が自分の障害に気づき始め、その表現方法やきっかけは、本人および所属集団の認知発達や社会性・道徳性発達の段階との関連が示唆された。また、幼児期には高年齢ほど障害をネガティブに表現したエピソードが増えていた。
交尾刺激が制御する成虫エクジソン生合成機構の解明

脱皮ホルモン・エクジステロイドは節足動物の発育や卵形成に必須のホルモンである。吸血性で大型のダニであるマダニの雌では、吸血と交尾の刺激によってエクジステロイド生合成が誘導される。本研究はマダニのエクジステロイド生合成における交尾の役割を明らかにすることが目的である。本年度は、トランスクリプトーム解析を用いたマダニのエクジステロイド生合成酵素の同定、質量分析計を用いたエクジステロイド種の特定及び脂質取り込みに関わる因子の探索を行った。エクジステロイドは原料のコレステロールから少なくとも7つの酵素の働きにより生合成される。マダニではどこでどのようにエクジステロイドが作られるか全くもって不明であったが、昨年度までに2つの生合成酵素を同定し、その発現解析から卵巣が生合成組織であることを突き止めている。そこで、卵巣を用いたトランスクリプトーム解析を行い、新たに4つの生合成酵素のホモログを見出した。また、質量分析計を用いてマダニのエクジステロイド種を解析し、研究対象のマダニOrnithodoros moubataは血中にエクジソンと20-ヒドロキシエクジソンを持つことを明らかにした。以上からマダニのエクジステロイド生合成過程の大部分について、生合成酵素、エクジステロイド種の両面から明らかにすることに成功した。また、トランスクリプトーム解析をもとに、コレステロールの取り込みに関わるリポフォリン受容体を同定した。交尾刺激で影響を受ける因子の特定には至らなかったが、本研究では原料の取り込みから実際のステロイドの挙動まで一連のエクジステロイド生合成過程についての知見を得ることができた。本研究はクモ鋼で初めてエクジステロイド生合成過程を明らかにしたものであり、今後エクジステロイド生合成機構を進化的に解明するために大きく貢献するものである。26年度が最終年度であるため、記入しない。吸血性の大型のダニであるマダニは雌において、吸血及び交尾によってエクジソン生合成が誘導される。本研究はマダニのエクジソン生合成における交尾の役割を明らかにすることを目的としている。マダニのエクジソン生合成酵素を同定するため次世代シークエンスによるde novo解析を行い、エクジソン生合成酵素のうち、spook及びshadeのホモログの配列を得た。エクジソン生合成酵素は生合成組織特異的に発現すると考えられるため、マダニの様々な組織を用いて発現解析を行った所、卵巣においてspookの発現が見られた。質量分析器LC-MS/MSを用いたステロイド分析により、卵巣でエクジソン中間体の1つである7-dehydrocholesterol(7dC)の存在が確認されたため、マダニでは卵巣でエクジソンを生合成する可能性が高い。一方、エクジソンを活性型に変換するshadeは卵巣、中腸及びマルピーギ管において発現が見られたため、エクジソン活性型への変換はこれらの組織で起こると考えられる。さらに、交尾刺激がエクジソン生合成のどの部分に影響するかについても検証した。エクジソンはコレコレステロールを元に生合成されるが、コレステロールや1段階変換された7dCについては交尾・未交尾雌間で吸血後の量変動に差異は見られなかったため、交尾刺激は7dC以降の反応やエクジソン分泌過程に影響すると考えられる。マダニを含めたクモ綱生物ではエクジソン生合成酵素の同定が行われておらず、その組織も特定されていなかったため、本研究で得られた結果は昆虫以外の節足動物におけるエクジソン生合成の理解への大きな一歩となる。また、交尾刺激が影響する部分も絞り込めたため、成虫におけるエクジソン生合成メカニズムのうち、交尾による影響の一端を明らかにできたと考えられる。吸血性で大型のダニ、マダニは哺乳類から吸血し病気を媒介するため衛生・畜産害虫として警戒されている。マダニに関する生理学的な知見は少ないが、その成長や生殖は他の節足動物と同様にホルモンに制御される。中でも脱皮ホルモン・エクジソンはマダニの発育や卵成熟に重要な働きを持つ。マダニの雌では吸血と交尾がエクジソンの生合成誘導に必要であり、本研究は特にマダニのエクジソン生合成における交尾の役割を明らかにすることが目的である。マダニはエクジソン生合成に関わる分子についての知見が存在しなかったが、次世代シークエンスにおけるde novo解析により、エクジソン生合成酵素ホモログSpook及びShadeを見出した。両酵素がマダニのエクジソン生合成に関わることを検証するため、両酵素の機能解析を行った。S2細胞を用いたステロイド変換活性試験において、マダニShadeは基質のエクジソンを20-ヒドロキシエクジソンに変換することを確認し、またRNAiによる発現抑制により脱皮に異常が生じることを明らかにした。spookもRNAiによる機能解析を行い、spook発現抑制により完全に脱皮が阻害されることを明らかにした。以上からマダニSpook及びShadeはエクジソン変換酵素として働き、脱皮・変態に重要な働きを持つと示唆される。今後これらエクジソン生合成酵素の発現を指標としたバイオアッセイ系を立ち上げることで、エクジソン生合成における交尾の影響を評価できると考えている。マダニを含めたクモ綱生物ではエクジソン生合成においての知見がほとんど存在しなかったが、本研究によりマダニのエクジソン生合成組織の特定が進むとともに、分子レベルで生合成機構の一端を明らかにすることが出来た。これは、昆虫以外の節足動物におけるエクジソン生合成の理解への大きな一歩である。吸血性で大型のダニ、マダニはヒトを含む哺乳類から吸血し、病気を媒介することで時に宿主を死に至らしめる。

衛生・畜産害虫として警戒されるものの、その生態学・生理学的な知見が少ないのが現状である。マダニの成長や生殖は他の生物と同様にホルモンに制御されており、中でも節足動物に共通の脱皮ホルモン・エクジソンが重要な働きを持つことが知られている。マダニの雌におけるエクジソン生合成には、吸血と交尾が必要であり、本研究は特にマダニのエクジソン生合成における交尾の役割を明らかにすることが目的である。本研究において、マダニのエクジソン生合成に関わる生合成酵素(Spook及びShadeホモログ)を見出している。両者の発現量を交尾・未交尾雌で比較したところ、エクジソン生合成過程の前半で働くSpookに関しては、吸血後の交尾・未交尾雌間で発現パターンに差は見られなかった。一方、エクジソンを活性型に変換するShadeの発現は、交尾雌がエクジステロイドを体液中に放出する吸血後数日間において、交尾雌で高い傾向がみられた。よって、交尾刺激による生合成制御は生合成過程の後半に影響を及ぼす可能性がある。さらに、エクジソン生合成にはSpook、Shade以外に数種のシトクロームP450酵素(CYP)が関与することが知られているため、マダニのWhole body由来mRNAを用いたトランスクリプトーム解析により見出されてきた14種類のCYP酵素について、発現組織の特定を行った。その結果、Spookと同様に卵巣原基で高い発現を示すCYPを見出すことができた。得られたCYP及び更なる候補を見出し、交尾・未交尾雌における発現変動を明確にすることで、交尾刺激により制御を受けるエクジソン生合成に関わる分子についての特定を進められると考えられる。脱皮ホルモン・エクジステロイドは節足動物の発育や卵形成に必須のホルモンである。吸血性で大型のダニであるマダニの雌では、吸血と交尾の刺激によってエクジステロイド生合成が誘導される。本研究はマダニのエクジステロイド生合成における交尾の役割を明らかにすることが目的である。本年度は、トランスクリプトーム解析を用いたマダニのエクジステロイド生合成酵素の同定、質量分析計を用いたエクジステロイド種の特定及び脂質取り込みに関わる因子の探索を行った。エクジステロイドは原料のコレステロールから少なくとも7つの酵素の働きにより生合成される。マダニではどこでどのようにエクジステロイドが作られるか全くもって不明であったが、昨年度までに2つの生合成酵素を同定し、その発現解析から卵巣が生合成組織であることを突き止めている。そこで、卵巣を用いたトランスクリプトーム解析を行い、新たに4つの生合成酵素のホモログを見出した。また、質量分析計を用いてマダニのエクジステロイド種を解析し、研究対象のマダニOrnithodoros moubataは血中にエクジソンと20-ヒドロキシエクジソンを持つことを明らかにした。以上からマダニのエクジステロイド生合成過程の大部分について、生合成酵素、エクジステロイド種の両面から明らかにすることに成功した。
カベオリン発現ウイルスベクター・リポソームを用いた口腔メラノーマの遺伝子治療

遺伝子治療は、欧米ではすでに脳腫瘍や卵巣腫瘍に対して臨床応用がなされており、また、口腔癌においてもその有用性が示されている。しかし、これらの研究においては、ウイルスベクターの細胞毒性や、免疫原生の問題があげられる。本研究は、これらの問題を解決するためにメラノーマに対するウイルスベクター・リポソームを用いたCaveolin-1(Cav-1)遺伝子導入による遺伝子治療の有効性と安全性の基礎実験を行った。(1):pEGFP-Cav-1およびpMyc-Cav-1を導入しクローンを採取。Cav-1安定発現細胞株を作成した。(2):優位に細胞増殖能が抑えられていた。(3):細胞運動の試験を行った結果Cav-1遺伝子導入細胞では、優位に運動能が低下していた。(4):ウエスタンブロットにて導入細胞株すべてにおいてCaveolinの強発現を確認した。(5):Cav-1遺伝子導入細胞ではp130Cas,paxillinのリン酸化が優位に抑制された。(6):Cav-1遺伝子導入によりraftにおけるgangliosid:GD3の局在がnon-raftにも分散された。(7):免疫染色を行なった結果GD3が細胞膜全周に拡散された。(8):細胞の移動能に関与するleading edge形成の異常が見られた。(9):遺伝子導入によるGD3の局在の変化は不飽和な脂肪酸をもつGD3の増加によるものであることが確認された。以上のことよりCaveolin-1を導入することにより細胞増殖の抑制、運動能の低下が見られCaveolin-1遺伝子導入による遺伝子治療の有効性が示唆された遺伝子治療は、欧米ではすでに脳腫瘍や卵巣腫瘍に対して臨床応用がなされており、また、口腔癌においてもその有用性が示されている。これらの問題を解決するためにメラノーマに対するウイルスベクター・リポソームを用いたCaveolin-1遺伝子導入による遺伝子治療の有効性と安全性の基礎実験を行った。本年度は、in vitroにおいて培養ヒトメラノーマ(SK-MEL-28)に対するCaveolin-1遺伝子導入による(1)Caveolin-1安定発現細胞株の作成(2)Caveolin-1遺伝子導入による腫瘍増殖の抑制(3)Caveolin-1遺伝子導入による細胞運動能(4)Caveolin-1遺伝子導入による遺伝子発現の検討を行った。(2):WST-8をもちいてコントロール群と比較を行った。結果Caveolin-1遺伝子導入群において優位に細胞増殖能が抑えられていた。(3):細胞運動の試験を行った結果Caveolin-1遺伝子導入細胞では、優位に運動能が低下していた。(4):ウエスタンブロットにてCaveolin-1遺伝子導入細胞のカベオリンの発現を検討し、導入細胞株すべてにおいてCaveolinの強発現を確認した。以上のことよりCaveolin-1を導入することにより細胞増殖の抑制、運動能の低下が見られCaveolin-1遺伝子導入による遺伝子治療の有効性が示唆された。遺伝子治療は、欧米ではすでに脳腫瘍や卵巣腫瘍に対して臨床応用がなされており、また口腔癌においてもその有用性が示されている。しかし、これらの研究においては、ウィルスベクターの細胞毒性や、免疫原生の問題があげられる。これらの問題を解決するためにメラノーマに対するウィルスベクタへ・リポソームを用いたCaveolin-1(Cav-1)遺伝子導入による遺伝子治療の有効性と安全性の基礎実験を行なった。前年度までの研究で、Cav-1を導入することによりメラノーマの癌形質(細胞の増殖能、移動能)抑制が認められた。本年度はその分子機構について詳しく検討を行った。(1)Cav-1遺伝子導入細胞では、p130Cas, paxillinのリン酸化が有意に抑制された。(3)Cav-1,GD3の免疫染色を行なった結果、Cav-1導入細胞ではGD3が細胞膜全周に拡散されていた。(4)Cav-1遺伝子導入により、細胞の移動能に関与するleading edge形成の異常が認められた。(5)Cav-1遺伝子導入によるGD3の局在の変化は、不飽和な脂肪酸を持つGD3(d18:1-24:1)の増加によるものであることが、Masss pectrometryにより確認された。さらに本年度は、in vivoにおけるCaveolin-1遺伝子導入による抗腫瘍効果および免疫組織学的検討を行った。(5):Cav-

1遺伝子導入細胞ではp130Cas,paxillinのリン酸化が優位に抑制された。(6):Cav-1遺伝子導入によりraftにおけるgangliosid:GD3の局在がnon-raftにも分散された。(7):免疫染色を行なった結果GD3が細胞膜全周に拡散された。(8):細胞の移動能に関与するleading edge形成の異常が見られた。(9):遺伝子導入によるGD3の局在の変化は不飽和な脂肪酸をもつGD3の増加によるものであることが確認された。以上のことよりCaveolin-1を導入することにより細胞増殖の抑制、運動能の低下が見られCaveolin-1遺伝子導入による遺伝子治療の有効性が示唆された