hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪滴蛋白質の操作による肝再生促進技術の開発

部分肝切除後の肝再生には脂肪滴の代謝が重要である。本課題では、脂肪滴上の蛋白質の分解を操作することによって脂肪酸代謝を制御し、肝再生促進に繋げる方法を探索することを目的として研究を行なった。我々はUBXD8とp97/VCPを脂肪滴局在蛋白質として同定し、この蛋白質複合体が脂肪滴上においてApolipoprotein Bの分解を制御していることを明らかにした。更に我々は、UBXD8が脂肪滴局在蛋白質の分解、及び脂肪滴の代謝へも関与する結果を得た。この成果は、更なる研究により肝再生促進技術開発に繋がることが期待できるものであった。脂肪肝は部分切除後の再生能が低いため、肝移植のドナーとして不適格であることが問題となっている。一方、正常な肝臓を部分切除すると、再生初期に脂肪滴が激増し、一過性に脂肪肝状態を呈する。脂肪滴形成にカベオラを形成するCaveolin-1が関与していることは、周知の事実である。Caveolin-1ノックアウトマウスにおいて部分肝切除を施すと、正常肝で観察される脂肪滴増加が抑制され、正常マウスより肝再生が顕著に遅延する。つまり、部分肝切除後の肝再生には脂肪滴の代謝が重要である。本課題では、脂肪滴上の蛋白質の分解を操作することによって脂肪酸の代謝を制御し、肝再生促進に繋げる方法を探索することを目的として研究を行なった。我々はUBXD8とp97/VCPを脂肪滴局在蛋白質として同定し、この蛋白質複合体が脂肪滴上においてVLDL (Very Low Density Lipoprotein)を形成するのに重要な働きをするApolipoprotein Bの分解を制御していることを明らかにした。最終年度は、更にUBXD8が脂肪滴局在蛋白質の分解、及び脂肪滴の代謝へも関与する結果を得た。この成果をもとに、UBXD8の肝臓特異的ノックアウトマウスも作製した。このマウスを用いた更なる研究により、肝再生促進技術開発に繋がることが期待できる。ヒトの脂肪肝は、組織学的には肝細胞内に中性脂質を蓄積した脂肪滴が多数存在している状態であり、最も一般的な肝障害の原因の一つである。脂肪肝は肝切除術後や肝移植後の肝再生を妨げる原因としても問題となっている。一方、正常な肝再生時にも肝細胞の脂肪滴形成が必要であることが報告されているが、脂肪肝に見られる脂肪滴との違いは明らかではない。本年度は、これまでの我々の実験で脂肪的分解への関与が示唆された脂肪滴局在タンパク質Protein XとProtein Yの発現量を変化させ、脂肪肝での脂肪滴を軽減させて肝再生を促進できるかどうかを見ることを目的として実験を行った。Protein XとProtein Yの発現量を減少させるために、siRNAのノックダウン効果をマウス繊維芽細胞を用いて確認した。その後、十分なノックダウン効果が得られたsiRNAをマウス尾静脈より導入した。肝臓全体および右葉/左葉/尾状葉/中間葉のそれぞれにおけるノックダウン効果を検討したが、現段階ではsiRNAの効果は見られていない。一方、Protein Xに関しては、Protein Xのエクソン1をloxP配列で挟んだマウスとAlbumin-Creマウスを交配させることで、肝臓特異的なコンディショナルノックアウトマウスを現在作製している段階である。部分肝切除術は習得できているので、尾静脈からのsiRNA導入による肝臓でのノックダウンマウスを作製することが急務である。尾静脈からのsiRNAの導入量や回数、更にはsiRNA配列やsiRNAでなくMorpholino-antisenseの検討を行うことが必要であると考えている。肝臓におけるノックダウンが出来次第、高脂肪食において脂肪肝を形成させたマウスを用いてノックダウンを行い、部分肝切除後に組織学的、生化学的に脂質量を計測することで肝再生の動態を検討する。脂肪肝モデルとしては、メチオニン-コリン欠乏食投与によるもの以外にも、長期高脂肪食負荷、レプチン及びレプチン受容体遺伝子変異によるob/ob/マウスやdb/dbマウスなど様々なマウスが使われており、それぞれインスリン耐性や炎症反応、肝組織繊維化/癌化などに違いがあることが報告されている。今後、研究課題を遂行するにあたり、長期高脂肪食負荷によるモデルマウスで検討し、他の脂肪肝マウスでの検討も行う。コンディショナルノックアウトマウスに関しては、長期高脂肪食負荷により脂肪肝の動態を組織学・生化学的に解析し、その結果をもとに部分肝切除をおこない、肝再生の動態を調べる。抗体、トランスフェクション試薬、siRNAやMorpholino-antisenseなどの薬品類、及び生化学実験に用いる器具類、マウスの購入やコンディショナルノックアウトマウス作製・維持費に使用する。更に、研究成果の発表のために使用予定である。
アミノ酸の筋肉蛋白質合成特異的促進能力を応用した飼料アミノ酸要求量の精密化

ニワトリ胚筋芽細胞を用いて単一アミノ酸欠乏の影響を調べたところ、バリン及びメチオニンは筋肉蛋白質合成を刺激することが見出された。バリンは、筋肉細胞のインスリン様成長因子タイプ1レセプターの遺伝子発現を上昇させることにより蛋白質合成を促進していた。しかし、飼料へのバリン添加はニワトリの成長を促進しなかった。飼料を低蛋白質化し、メチオニンとグリシンを同時に添加したところブロイラーの飼料効率が改善された。本年度は、ニワトリ胚筋芽細胞培養系を用いて、培養液中の単一アミノ酸の欠乏が蛋白質合成および分解に与える影響を調査し、さらに、筋肉の成長を促進するインスリン様成長因子-I(IGF-I)とアミノ酸欠乏の関係について調査した。培養液はMedium199を基本とし、Medium199中に含まれる20種類のアミノ酸のそれぞれ一つずつを含まない、単一アミノ酸欠乏培養液を用いた。培養液中にトレーサーとして加えた〔^3H〕-フェニルアラニンの細胞への取り込み量を蛋白質合成の指標とした。その結果、分岐鎖アミノ酸のひとつであるバリン及び塩基性アミノ酸であるアルギニンが欠乏している培養液を用いて培養した筋芽細胞の蛋白質合成が低下した。また、バリン濃度がMedium199の50%となるように調製した培養液を作製し、筋芽細胞を培養したところ、蛋白質合成は通常のMedium199を用いて培養したものど同程度であった。以上の結果から、筋芽細胞の蛋自質合成にはバリンが大きく関与していることが示唆された。次いで、バリン欠乏時におけるニワトリ胚筋芽細胞から総RNAを抽出し、IGF関連遺伝子の発現量をリアルタイムPCRを用いて調査したところ、バリン欠乏時のIGF-I遺伝子の発現量が低下することが明らかとなった。しかし、IGF-II、IGFタイプ1レセプター、IGFタイプ2レセプターの遺伝子発現にはバリン欠乏の影響は認められなかった。アミノ酸には蛋白質代謝調節機能があり、平成19年度までの研究成果から、アミノ酸の中でも特に、バリン欠乏が蛋白質合成を著しく低下させることを明らかにした。本年度(平成20年度)では、バリンによる蛋白質合成制御機構の解明を目指し、以下の試験を行った。試験1では、筋芽細胞の培養液中におけるIGF-Iまたは-II濃度及びバリン濃度を段階的に変化させ、筋芽細胞の蛋白質合成に及ぼす影響を調査した。蛋白質合成は、培養液中ヘトレーサーとして[3H]フェニルアラニンを添加し、筋芽細胞蛋白質への取り込み具合を指標とした6試験2では、単一アミノ酸欠乏時(ロイシン、チロシン、バリン)における筋芽細胞のIGF関連遺伝子発現量を比較した。遺伝子発現の程度はリアルタイムPCRを用いて測定した。試験1より、バリン及びIGF濃度の低下に伴ってタンパク質合成が低下し、バリン欠乏時にはIGFによる蛋白質合成促進作用が観察されないことが明らかになった。また試験2では、チロシン欠乏時やロイシン欠乏時と比較して、バリン欠乏時にIGFtype-1レセプターの遺伝子発現量が著しく低下することが明らかとなった。さらに、バリン欠乏時におけるIGF-I1、IGF-II、IGFtype-2レセプターの遺伝子発現は、チロシン欠乏時やロイシン欠乏時と同程度であった。以上より、バリン欠乏による蛋白質合成低下の原因は、バリン欠乏によりIGF type-1レセプターが減少し、IGFの蛋白質合成促進作用が発揮されないためだと考えられた。ニワトリによる排泄窒素を低減させる目的で飼料を低蛋白質化し、不足するメチオニンなどの必須アミノ酸を添加すると、メチオニンの飼料含量が他のアミノ酸と比較して相対的に過剰となり、メチオニン過剰障害の発生が懸念される。そこで、メチオニンとともにメチオニン代謝におけるメチル基受容体となるグリシンを添加し、メチオニンとグリシンの同時添加がニワトリの成長に及ぼす影響を調べた。その結果、メチオニンとグリシンを同時に添加した場合より、メチオニンを単独で添加した場合の方が増大量が大きくなった。その原因を調べるために、ニワトリ胚筋芽細胞培養系を用いて、培養液中のメチオニン濃度とグリシン濃度を段階的に上昇させた。メチオニン単独の濃度上昇は筋芽細胞の蛋白質合成を低下させた。また、グリシン単独の濃度上昇も筋芽細胞の蛋白質合成を低下させた。さらに、メチオニンとグリシンを同時に上昇させると、相乗的に蛋白質合成が低下した。そこで、ニワトリ胚筋芽細胞におけるメチオニンアデノシルトランスフェラーゼの遺伝子発現を調べたところ、培養液中のメチオニン濃度の上昇及びグリシン濃度の上昇は共にメチオニンアデノシルトランスフェラーゼの遺伝子発現を低下させた。したがって、飼料中のメチオニン含量とグリシン含量を同時に上昇させることは、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼの遺伝子発現を著しく低下させ、メチオニン代謝が抑制されることにより筋肉蛋白質合成も低下し、結果としてニワトリの成長遅延を引き起こすものと考えられた。
量子気体顕微鏡を用いた光格子系におけるエントロピー制御

光の定在波が作り出す微弱なポテンシャル中に量子縮退に至った極低温の原子集団を捕捉した系は「光格子系」と呼ばれ、固体物性を量子的にシミュレートする理想的な系として着目をされている。系のパラメーターを自在に制御できる大自由度量子多体系と称される光格子系だが、実は単一原子あたりのエントロピーS/Nを十分に下げることが出来ず、高温超伝導やフラストレーション磁性に代表される固体物性の重要な課題にアプローチが出来ないという本質的な問題をかかえている。本研究では、適切な原子種、光波長を選定し、レーザーの強度雑音・周波数雑音を極限まで抑圧するとともに、Filter冷却を施すことで光格子系がもつこの問題を抜本的に解決することを目指す。具体的には、光格子中における単一原子あたりのエントロピーS/Nを0.35kBに比べて十分に低下させることを最終的な目的としている。平成30年度、我々は173Ybフェルミ原子気体がもつ6つの核スピン成分に対して適切な光ポンピングを行うことで、これを2成分にすることに成功した。また通常の蒸発冷却を通して系の温度を低下させ、フェルミ縮退領域に至らせることにも成功した。さらにフェルミ縮退した2成分原子気体を2次元光格子中に導入し、Mott絶縁体相を誘起することができた。量子気体顕微鏡によってサイトを分解した原子の空間分布画像を取得したところ、Mott絶縁体相特有のshell構造を確認することができた。本研究の最終目的は1原子あたりのエントロピーS/Nを0.35kBに比べて十分に低下させることにあるが、そのためには系がもつエントロピーをスピン由来のものも含めて正確に評価する技術を確立することが必須となる。H30年度の研究を通し、我々は2成分原子気体中で発現したMott絶縁体相を、量子気体顕微鏡を用いて実空間観測することに成功した。これにより光格子中の各サイトをYb原子が1個ずつ占有する状態を生成・確認することが出来るようになった。一度この状態が得られれば、光格子中の原子をスピン選択的に排除することでスピンの空間分布を原子の有無としてマッピングし、量子気体顕微鏡を使って系のエントロピーを評価することが可能となる。今年度の研究を通し、本課題の最終目的に到達するための重要な足がかりが得られたことから、研究は「おおむね順調に進展している」と判断した。系のエントロピーS/Nを0.35kBに比べて十分に低下させるためには、通常の蒸発冷却に加え、Filter冷却と呼ばれる手法を施す必要がある。具体的にはデジタルミラーデバイス(DMD)を使って現在使用している2次元光格子に適切なポテンシャルを加え、バンド絶縁体相と金属相とが空間的に分離された状況を作り出す。系の主たるエントロピーは金属相が有するため、これを排除した後、断熱的にポテンシャル形状を緩めることでMott絶縁体相を誘起する。実際には、系全体のエントロピーが十分に低い状態になっていることが予想されるため、原子系にスピン秩序が現れ、反強磁性相が得られることが期待される。レーザーによってスピン選択的に原子を排除した後、量子気体顕微鏡による実空間観測を行えば、系のエントロピーを評価することが可能となる。かくして、本研究の最終目的であるS/N << 0.35kBの実現を狙う。系のパラメーターを自在に制御できる大自由度量子多体系と称される光格子系だが、実は単一原子あたりのエントロピーS/Nを十分に下げることが出来ておらず、高温超伝導に代表される固体物性の重要な課題にアプローチすることが難しいという問題をかかえている。本研究では、適切な原子種、光波長を選定し、レーザーの強度雑音・周波数雑音を極限まで抑圧するとともに、Filter冷却と呼ばれる手法を施すことで、光格子系がもつ上記の問題を解決することを目的としている。光格子中で発現する量子相の中には、各原子が有するエントロピーが空間依存しているものがある(Mott絶縁体相)。高いエントロピーを有する原子を選択的に排除したあと、系が熱平衡に至るのを待つことで、S/Nを劇的に小さくすることが可能であり、これをFilter冷却と呼ぶ。研究の初年度である平成29年度は、Filter冷却を施すための実験準備を行った。まず、Ybのフェルミオン同位体(173Yb)をレーザーで作られた調和振動子型トラップに捕捉し、蒸発冷却を施すことでフェルミ縮退領域に至らせた。得られた温度はT/TF 0.15であり、ここでTは系の温度、TFはフェルミ温度をあらわす。得られた極低温フェルミ原子気体を光格子中に導入し、量子気体顕微鏡を用いて原子の実空間分布を観測したところ、Mott絶縁体相に特徴的なMott shellを確認することができた。平成29年度の研究目標は、Filter冷却の対象となるMott絶縁体相をYbのフェルミ同位体を対象として生成することにあった。実際に、Yb原子気体をフェルミ縮退領域に至らせるとともに、Mott絶縁体相の生成・確認にも成功したことから、研究はおおむね順調に進展していると判断した。

光の定在波が作り出す微弱なポテンシャル中に量子縮退に至った極低温の原子集団を捕捉した系は「光格子系」と呼ばれ、固体物性を量子的にシミュレートする理想的な系として着目をされている。系のパラメーターを自在に制御できる大自由度量子多体系と称される光格子系だが、実は単一原子あたりのエントロピーS/Nを十分に下げることが出来ず、高温超伝導やフラストレーション磁性に代表される固体物性の重要な課題にアプローチが出来ないという本質的な問題をかかえている。本研究では、適切な原子種、光波長を選定し、レーザーの強度雑音・周波数雑音を極限まで抑圧するとともに、Filter冷却を施すことで光格子系がもつこの問題を抜本的に解決することを目指す。具体的には、光格子中における単一原子あたりのエントロピーS/Nを0.35kBに比べて十分に低下させることを最終的な目的としている。平成30年度、我々は173Ybフェルミ原子気体がもつ6つの核スピン成分に対して適切な光ポンピングを行うことで、これを2成分にすることに成功した。また通常の蒸発冷却を通して系の温度を低下させ、フェルミ縮退領域に至らせることにも成功した。さらにフェルミ縮退した2成分原子気体を2次元光格子中に導入し、Mott絶縁体相を誘起することができた。量子気体顕微鏡によってサイトを分解した原子の空間分布画像を取得したところ、Mott絶縁体相特有のshell構造を確認することができた。本研究の最終目的は1原子あたりのエントロピーS/Nを0.35kBに比べて十分に低下させることにあるが、そのためには系がもつエントロピーをスピン由来のものも含めて正確に評価する技術を確立することが必須となる。H30年度の研究を通し、我々は2成分原子気体中で発現したMott絶縁体相を、量子気体顕微鏡を用いて実空間観測することに成功した。これにより光格子中の各サイトをYb原子が1個ずつ占有する状態を生成・確認することが出来るようになった。一度この状態が得られれば、光格子中の原子をスピン選択的に排除することでスピンの空間分布を原子の有無としてマッピングし、量子気体顕微鏡を使って系のエントロピーを評価することが可能となる。今年度の研究を通し、本課題の最終目的に到達するための重要な足がかりが得られたことから、研究は「おおむね順調に進展している」と判断した。173Ybの核スピンはI = 5/2であり、基底状態は6つのスピン成分を有する。高温超伝導と深いかかわりのある2次元フェルミ・ハバード模型の量子シミュレーションを行うためには、電子と同様、スピン成分を2つに制限する必要がある。平成30年度は、レーザー光を用いたスピン偏極を通して173Yb原子気体のスピンを2成分に制限する実験を行う。対象となっているのは電子スピンではなく核スピンであるため、磁場勾配を用いてスピン成分を空間分離・観測することは難しい。そこで、レーザー光を用いたOptical Stern-Gerlachと呼ばれる手法を使って、スピン偏極が実現したか否かを判断する。一方、Filter冷却を実現するには、光格子に適切な形状を有するポテンシャルを重畳する必要がある。この目的を達成するため、デジタルミラーデバイスを用いたポテンシャル形状の操作を実現する。以上の準備をふまえて、平成31年度以降にFilter冷却を行い、本研究の最終目的を達成する予定である。系のエントロピーS/Nを0.35kBに比べて十分に低下させるためには、通常の蒸発冷却に加え、Filter冷却と呼ばれる手法を施す必要がある。
大豆サポニンの組成、単離およびその構造

大豆サポニンはその薬理作用が明らかにされて以来、注目されている成分であり、我々のこれまでの研究結果、Aグル-プサポニンとしてAaAfの6種類、Bグル-プとしてBa、Bb'、Bc、Bc'の5種類、Eグル-プとしてBd、Beの2種類、計13種類のサポニンを明らかにすることができ、その遺伝性、植物体における分布等多くの知見を得、大豆の食品加工上考慮すべき重要な成分でることがわかった。最終年度である本年度は、大豆サポニン各成分の量的調製を試み、動物実験、物性実験、ウイルス実験等への試料の供給を行った。醤油粕と胚軸にサポニンが濃縮していることに着目し、宮城県醤油醸造共同組合の協力を得て、サポニン分離プラントを試作することができた。得られた。粗サポニンからのサポニン各成分を単離し、山口大・医・山本直樹教授の協力で、エイズの原因ウイルスであるHIVへの影響を調べた結果、いずれのサポニン画分でもHIV増殖抑制効果がみられ、特にBグル-プにその活性の強いことがわかった。さらに、コレステロ-ル食を与えたラットへの影響を調べた結果、血中トリグリセライドの低下、すなわち、抗脂肪血作用のことも追認できた。大豆食品は胃癌、大腸癌等の低リスク食品であることから、サポニン等の配糖体成分の生理作用を追求することは今後も重要な課題であることがはっきりした。また、サポニン組成と遺伝との関係が明らかにばったことから、植物の分類マ-カ-としても有効であり、さらに品種の改良と判別にも応用され、新たな展開が期待される。簡便な抽出法とHPLCによる大豆サポニンの分離条件を検討した結果70%エタノールで配糖体物質を抽出することができ, pH4.5以下のブタノール層に定量的に移行させることができた.このエタノール抽出液又はブタノール層を試料にし, HPLCで各サポニン成分を分析することができた.この方法により,種子,葉,茎等のサポニン組成を調べた結果, AグループとしてAa,Ab,Ac,Ad,Ae,Afの6種類, BグループとしてBa,Bb,Bb ́,Bc,Bd,Beの6種類をそれぞれ明らかにすることができた.しかも部位によってその組成と含量が著るしく異なり,特にAグループとBaは種子の胚軸にのみ存在し, Ba以外のBグループは植物体全般に分布していることがわかった.続いて分画法を検討した結果,逆相シリカゲルクロマトグラフィーとセフアデックスLH20によるゲルロ過でサポニンをAとBグループに分画することができた.さらに分取用HPLCで各単離標品を得ることができた.これらの単離標品をHPLC等で同定した結果, Bbが既知のsoyasaponin I, Bb ́がIII, BcがII, Abがsoyasaponin A1のアセチル化体, AfがA2のアセチル化体にそれぞれ相当し, AグループとBグループのBa,Bd,Beは全く新規な物質であることがわかった.そこで,  ́H-NMR, ^<13>C-NMR, MS, IRで機器分析した結果, Aグループ成分は全てsoyasapogenol AのC-22位の末端糖鎖のみ完全アセチル化した特異な構造であり, Ba,Bd,Beはsoyasapogenol Bをアグリコンとし, BdとBeは不安定な物質であったが, Baの構造は3-0-〔β-D-gluconopyranosyl(1→2)-β-D-glucuronopyranosyl〕-soyasapogenol Bであることを初めて明らかにすることができた.次にAグループの末端糖鎖のアセチル基に注目し, CDで調べた結果, Abに著るしい負のコットン効果のあることがわかった.これらの結果に基づいて,次年度以降,品種間の差異,発芽と登熟における挙動,未確認サポニン等を調べる.大豆サポニンはその薬理作用が明らかにされて以来、注目されている成分であり、我々のこれまでの研究結果、大豆食品の量的摂取を無意識に阻害する不快味成分であることもわかった。また、大豆にはすくなくとも20種以上のサポニンが存在し、品種と部位によってその組成に著しい差異がみられ、多くの未確認サポニンを検出することができた。しかもその識別法と単離法を新たに開発することができ、均一な単離標品を得、機器分析等によりその化学構造を明らかにすることができた。さらに、大豆サポニンの成分組成における品種間および部位間の差異と登熟および発芽におけるその挙動を調べ、未確認サポニンの単離とその構造を明らかにすることができた。すなわち、約400品種の大豆種子をその種皮、胚軸および子葉に分け、その大豆サポニン成分組成を調べ、特に胚軸にのみ存在するAグループサポニン組成の差異に基づいて品種を分類することができた。続いて、成分組成を異にする品種を用いて、交配実験を行いサポニンAaとAbは共優性遺伝の関係にあることを明らかにすることができた。さらに、大豆サポニン組成に差異のある代表的品種について、登熟における根、茎、葉および種子、発芽における幼根、茎、子葉等のサポニン組成を調べた結果、Bグループサポニンはいずれの部位にも普遍的に分布し、成長部位のその濃度の極めて高いことが明らかとなった。引き続き、登熟および発芽における未確認大豆サポニン成分を単離し、その構造の解明を試みているが、特異なサポニンはまだ見つかっていない。

これらの結果にもとづいて最終年度である次年度に予定している大豆サポニン各成分の量的単離が容易となり、動物実験、抗変異原性、味覚実験などへの試料標品供給体制をとることが可能となった。大豆サポニンはその薬理作用が明らかにされて以来、注目されている成分であり、我々のこれまでの研究結果、Aグル-プサポニンとしてAaAfの6種類、Bグル-プとしてBa、Bb'、Bc、Bc'の5種類、Eグル-プとしてBd、Beの2種類、計13種類のサポニンを明らかにすることができ、その遺伝性、植物体における分布等多くの知見を得、大豆の食品加工上考慮すべき重要な成分でることがわかった。最終年度である本年度は、大豆サポニン各成分の量的調製を試み、動物実験、物性実験、ウイルス実験等への試料の供給を行った。醤油粕と胚軸にサポニンが濃縮していることに着目し、宮城県醤油醸造共同組合の協力を得て、サポニン分離プラントを試作することができた。得られた。粗サポニンからのサポニン各成分を単離し、山口大・医・山本直樹教授の協力で、エイズの原因ウイルスであるHIVへの影響を調べた結果、いずれのサポニン画分でもHIV増殖抑制効果がみられ、特にBグル-プにその活性の強いことがわかった。さらに、コレステロ-ル食を与えたラットへの影響を調べた結果、血中トリグリセライドの低下、すなわち、抗脂肪血作用のことも追認できた。大豆食品は胃癌、大腸癌等の低リスク食品であることから、サポニン等の配糖体成分の生理作用を追求することは今後も重要な課題であることがはっきりした。また、サポニン組成と遺伝との関係が明らかにばったことから、植物の分類マ-カ-としても有効であり、さらに品種の改良と判別にも応用され、新たな展開が期待される。
エリスロポエチン遺伝子および赤血球造血における低酸素応答機構の研究

近年、骨髄ストローマ細胞の中に神経幹細胞のマーカーであるNestinを発現している細胞が存在し、造血に重要な役割を果たしている可能性が示唆されている。そこで、Notchシグナルの下流遺伝子であるRBP-Jコンディショナルノックアウトマウスとのかけあわせを行い、解析した。RBP-JをNestin発現細胞でノックアウトすると、ホモノックアウト胎児は胎生後期に高度の貧血を呈し、赤芽球の分化が障害され、胎児肝におけるエリスロポエチンの発現が著明に低下していた。胎児肝のエリスロポエチン産生細胞はNestinを発現し、Notchシグナルが重要である可能性がある。また胎児肝のストローマ細胞は血球分化に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。研究代表者はエリスロポエチン遺伝子の制御下でGFPを発現する導入遺伝子を保持するトランスジェニックマウスを作製し、腎臓におけるエリスロポエチン(Epo)産生細胞を同定し、さらにEpo遺伝子のプロモーター領域に存在するGATA配列は、個体において恒常的にEpo遺伝子の異所性発現を抑制していることを明らかにした(Blood, 111 ; 5223, 2008)。今回の申請では、Epo遺伝子などの低酸素応答遺伝子に重要なHIF転写因子とNotchシグナルの関連・相互作用などをEpo遺伝子発現調節機構と赤血球造血において明らかにするのが目的である。現在はNotchシグナルの顆粒遺伝子であるRBP-Jノックアウトマウスなどの遺伝子改変マウスの造血に関与する様々な遺伝子発現解析およびCre遺伝子マウスとの掛け合わせを行っている。また、Epo産生細胞株で現在まで低酸素応答の研究に広く用いられているHep3B細胞をもちいてNotchシグナルとEpo遺伝子・HIF転写因子・Notch関連遺伝子などの発現解析を行っている。これらの実験・解析は今後定常状態と低酸素状態で比較して行う予定である。また、最近骨髄ストローマ細胞に神経幹細胞マーカーであるNestinが発現し、造血に重要な役割を担っている可能性が報告されている。申請者はヒト骨髄検体の免疫染色を行い、ヒトにおいてもNestin発現細胞が存在することを明らかにした。これらの実験によって赤血球造血における低酸素応答遺伝子・Notchシグナルの役割、発現制御機構の解明が期待できると考えられる。申請者はエリスロポエチン遺伝子の制御下でGFPを発現する導入遺伝子を保持するトランスジェニックマウスを作製し、腎臓におけるエリスロポエチン(Epo)産生細胞を同定し、さらにEPo遺伝子のプロモーター領域に存在するGATA配列は、個体において恒常的にEPo遺伝子の異所性発現を抑制していることを明らかにした(Blood,111;5223,2008)。今回の申請では、EPo遺伝子などの低酸素応答遺伝子に重要なHIF転写因子とNotchシグナルの関連・相互作用などをEpo遺伝子発現調節機構と赤血球造血において明らかにするのが目的である。また、Epo産生細胞株で現在まで低酸素応答の研究に広く用いられているHep3B細胞をもちいてNotchシグナルとEPo遺伝子・HIF転写因子・Notch関連遺伝子などの発現解析を行った。また、ヒト検体でも免疫染色・RT-PCRにてNestin発現細胞の解析を行い、造血不全疾患において骨髄中Nestinの発現が健常人と比較して大きく変化していることが明らかになった。
マウス視覚野におけるトップダウン注意信号入力のイメージング

視覚的注意が機能している時,高次皮質領域から出力されたトップダウン信号が視覚野に入力して,その活動を修飾すると考えられるが,その直接的な証拠は得られていなかった.本研究では,まず,視覚的注意を頭部固定状態のマウスにおいて惹起させるための課題システムの開発,次に,注意のトップダウン入力をシナプス終末におけるカルシウム信号として2光子イメージングで観察することを計画していた.しかし,研究開始後に同じコンセプトの研究が発表されたため,目的の達成レベルを上げるために後半部分を広域カルシウムイメージングの開発に方針転換した.それにより,注意にも関係する連合野における感覚統合メカニズムに迫ることができた.平成25年度は,主にマウス用の頭部固定型視覚的注意課題システムの開発を行った.視覚的注意を頭部固定下の覚醒マウスに惹起するための新しいタスクパラダイムを考案し,それを実現するためのタスク装置をデザインした.従来の方法,例えば5選択反応時間課題では,自由行動下のマウス扱うため皮質神経回路における神経活動のイメージングを同時に行うのは困難であり,さらにマウスの頭部や注視点の位置を制御できないため実際の視覚的入力と行動の結果を厳密に整合することはできなかった.本研究課題ではこれらの問題を解決し,さらにトップダウン注意を再現よく惹起して視覚野表層におけるその入力信号を2光子励起イメージングにより直接記録することを目的としている.新考案のタスクパラダイムでは,デュアルスポイトを用いた左右舐め分け課題において,関連付け視聴覚刺激を提示し音刺激と視覚刺激が一致するサイドをマウスに判断させるとき,正解のサイドを指示する先行刺激を与えた場合に与えなかった場合と比較して反応速度や正解率が高くなると推測されるが,これを視覚的トップダウン注意の影響と考えて定量的に評価する.また,先行刺激に「明示的」刺激と「非明示的」刺激を用意したとき,明示的刺激が提示された場合にのみトップダウン注意の影響が現れ,非明示的刺激の場合は注意をそらすような逆の影響が現れると推測される.タスク装置の設計は完了し,装置・制御回路および制御プログラムの試作をほぼ完了した.実際のマウスを用いたシステムの実質的な評価は平成26年度に持ち越す.さらに,前頭前皮質から視覚野1層への投射の区画化が欠損するためトップダウン信号の入力が各層へ分散され注意機能が欠損もしくは減弱すると考えられるネトリンG1大脳皮質特異的ノックアウトマウスの作製をネトリンG1のfloxマウスとEmx1-Creマウスを用いて行った.平成26年度はマウス用頭部固定型視覚的注意課題システムの開発およびその評価を行った.新たに提案した頭部固定化の覚醒マウスに視覚的注意を誘導するタスクパラダイムを実現するためのタスク装置と運用システムをデザインし構築した.実験システムには次に挙げる大きく分けて4つの機構を要する:(1)覚醒マウスの脳を定位固定するための機構,(2)マウスの判断を給水ポートの舐め分けとして検知するための機構,(3)視覚や聴覚の刺激を提示するための機構,および(4)それらを制御するためのシステムである.実験システムにおける各ブロックの機械設計および回路設計を行い,装置および回路基板を試作した.具体的には,脳定位固定のための機構および給水ポート舐め分けのための機構の機械設計を行い試作した.実験システムを制御する電子回路は以下に示す多段のブロックに分けられる:視覚刺激の出力を制御するブロック,音刺激を生成するブロック,舐め行動を検知するセンサーを制御するブロック,報酬となる水の吐出を制御するブロック,心拍および呼吸を測定するブロック,および全てのブロックを統御するブロック.これら全てのブロックの回路を設計し試作した.さらに,実験中の環境音を遮断するための遮音箱を設計し試作した.実験システムを構成するほとんどの装置と制御回路及び制御プログラムを自前で設計・作製することにより,市販品を組み合わせた時に比べてコストを約20分の1程度に抑えられ,大規模チャンネル化を安価に実現できるようにした.最後に,実際に覚醒マウスを固定しシステムが設計通り機能するかを評価したところ,概ね想定通りに機能することが確認された.最近本提案研究のコンセプトに近い研究成果(Pinto et al., 2013; Zhang et al., 2014; Makino & Komiyama, 2015; Wimmer et al., 2015)が発表され,方針転換を余儀なくされたため前年度予定した計画はほとんど実施できなかった.これらの研究は共通して抑制性回路の重要性を示唆しており,研究のトレンドとして細胞種特異的な神経活動を区別することが求められている.また,注意の機構に関与する神経回路は様々なアプローチで調べられているが,その多くにおいて2つのエリア間における相互作用を調べている.特に大脳皮質では複数の領域間でより複雑な相互作用が存在すると考えられるため,神経活動の広域同時記録が必要であると思われる.したがって,本提案の目的を堅持しつつ,既に発表された研究を凌駕するには下記のアプローチが必要と考えた:(1)細胞種特異的な広域皮質イメージング(2)慢性的な学習過程のイメージング(3)頭部固定下における注意タスク(1)に関しては提案者が別のエフォートで実施しているプロジェクトであり,こちらの完成を優先させることで本提案研究においても上記アプローチを導入でき,当初の目的達成の筋道から大きく外れずに済むばかりかそれ以上の発展につながると考えた.また,目的達成のために最も重要である注意タスクについては未だそのアイデアはオリジナルであるため,前年度までに試作したタスクシステムを実際のマウスを使って評価し完成させ,広域皮質イメージングを実施することを次年度の最低限の目標とする.前年度までに視覚的注意課題のタスクシステムは概ね完成した.

さらに,細胞種特異的広域カルシウムイメージングのシステムも既に確立され稼働しており,すぐに本提案研究に追加できる状態である.本提案研究の目的達成までには,実際のマウスを用いたタスクパラダイムの評価とパラメータの最適化,タスクシステムの多チャンネル化,および2光子イメージングや広域カルシウムイメージングなどの生理学的実験が残されている。最近本研究のコンセプトに近い研究成果が発表されて(Pinto et al., 2013; Zhang et al., 2014; Makino & Komiyama, 2015; Wimmer et al., 2015; Schmitt et al., 2017),研究の方針転換を余儀なくされたが,その中でも最終年度においては「細胞種特異的な広域皮質イメージング」技術の開発とその確立に注力した.前述の研究では共通して注意メカニズムにおける抑制性回路の重要性が示唆された.また,注意機能に関与する神経回路を調べる際には2つの領域間における相互作用を調べることが殆どであるが,本質的には複数の領域間における相互作用が重要であり,それを広域的に同時記録する必要がある.これらを鑑み,細胞種特異的な神経活動を大脳皮質全体で記録する広域イメージング手法を用いることで,本提案の当初の目的を維持しつつ,既に発表された研究を凌駕することができると見込んだ.具体的には,広域イメージング行うためのマクロ顕微鏡システム(マウス頭部固定型全脳イメージングシステム)の開発とそのイメージングデータの解析手法の確立を行った.さらに,そのシステムの評価のための実験を行って論文を執筆し投稿した.その中で,多感覚刺激を入力した際に徐波振動が皮質全体にわたって位相同期することを発見し,感覚領野と比較して連合野の方が位相同期の程度が大きいことも分かった.投稿論文の査読コメントに対する改訂用の追加実験を行い,間もなく再投稿する予定である.本研究では前半でマウス用の頭部固定型視覚的注意課題システムのハードウェアとソフトウェアを開発した.さらに後半で,課題中の広域神経活動を記録するイメージングシステムを開発した.これらのシステムを組み合わせることで,より本質的な注意の神経メカニズムにアプローチできるようになると期待される.視覚的注意が機能している時,高次皮質領域から出力されたトップダウン信号が視覚野に入力して,その活動を修飾すると考えられるが,その直接的な証拠は得られていなかった.本研究では,まず,視覚的注意を頭部固定状態のマウスにおいて惹起させるための課題システムの開発,次に,注意のトップダウン入力をシナプス終末におけるカルシウム信号として2光子イメージングで観察することを計画していた.しかし,研究開始後に同じコンセプトの研究が発表されたため,目的の達成レベルを上げるために後半部分を広域カルシウムイメージングの開発に方針転換した.それにより,注意にも関係する連合野における感覚統合メカニズムに迫ることができた.
オピオイド増殖因子受容体を標的とした新規骨粗鬆症治療薬の創出に向けた基礎的研究

申請者はこれまでの予備実験で、骨芽細胞におけるMet-Enkとオピオイド増殖因子受容体(OGFR)のmRNA発現、Met-EnkによるOGFRを介した骨芽細胞の増殖抑制、およびOGFR遮断薬投与によるマウス大腿骨骨量の増大を既に見出していた。そこで平成30年度は主に骨芽細胞におけるMet-Enk-OGFRシグナルの生理的役割の詳細な解明を行なった。予備実験で用いたWST法は安価かつ簡便で再現性も高いが、あくまで生細胞数を計測する方法であり、細胞増殖能を直接測定しているわけではない。したがって、DNA複製を反映し、細胞増殖能を直接測定する方法であるBrdU法で詳細な検討を行った。その結果、WST法で得られた知見と同様に、Met-Enkが骨芽細胞の増殖を有意に抑制することが分かった。次に、遺伝子レベルで細胞増殖抑制メカニズムを解明するため、サイクリン遺伝子やサイクリン依存性キナーゼ阻害因子等の細胞増殖関連遺伝子の発現解析をqPCR法で行った。その結果、Met-enk-OGFRシグナルには、サイクリン遺存性キナーゼ阻害因子であるp21やがん抑制遺伝子であるp53が関与していることを明らかにした。さらに、細胞増殖だけでなく、分化や石灰化への影響も検討した。Met-EnkやOGFR遮断薬であるNaltrexoneを作用させた際の骨芽細胞の分化を遺伝子レベルで評価するため、アルカリホスファターゼ(ALP)やI型コラーゲン、オステオカルシンといった骨芽細胞分化マーカーの遺伝子変動をqPCR法で解析した。その結果、骨芽細胞におけるMet-enk-OGFRシグナルは分化や石灰化にはあまり影響を与えないことが分かった。研究は当初の計画通り進んでいる。ここまでは予期せぬ事態には遭遇しておらず、結果も順調に出てきている。平成31年度の研究計画として、マウスへのナルトレキソンの投与による骨量増加機構の解明を予定しているが、これまで積み重ねた予備実験の結果より問題なく結果が得られると信じている。もしそうではなくてもこれまでの細胞実験で得られた結果と比較することでさらに研究として深みが出るものと思っている。したがって、計画書どおりに研究を進めていきたい。研究結果が予定よりもスムーズに得られたため、当初購入予定であった試薬等の購入の必要がなくなったため次年度使用額が生じた。この使用額は次年度の動物購入費、消耗品費にあてる。
機械学習アルゴリズムの公平性に関する評価

機械学習を人間の関わる意思決定、例えば大学入試、就職面接、ローン審査に利活用することは、その意思決定の与える重大さを考えるとより挑戦的な課題である。機械学習アルゴリズムは過去のデータから学習を行うため、過去のデータにバイアスがある場合、未来の予測もそのバイアスに引きずられてしまう。このような問題を解決するために「公平性配慮型機械学習アルゴリズム」の研究が2000年代から始まり、多くの機械学習アルゴリズムでのバイアスを除去する試みがなされてきた。しかし、公平性配慮型アルゴリズムがもたらす結果に関しての検証は限定されている。本研究では、このようなアルゴリズムがもたらす結果に関しての検証を行う。
人の視覚情報処理過程における電気生理学的な機能評価法の研究

1)網膜局所の視覚刺激とそれに対する誘発電位の記録には、E.Sutterによって開発された多局所誘発電位解析装置(VERIS II system:トーメー社製)と生体アンプを組み合わせて行った。網膜黄斑部を中心に視覚約25度の範囲を60ヵ所のエレメントに分割して刺激を行った。後頭葉に置いた電極より、刺激される網膜の位置に対応する誘発電位60個を抽出した後、視野を上下左右の四象限に別け、各象限内のエレメントの反応を加算平均した結果につき検討した。視野の下方を刺激した場合の方が上方を刺激した場合より大きな反応が得られる傾向があり、またその極性が反転する現象が認められた。視野の鼻側と耳側ではほぼ同等の反応が得られる傾向が認められた。これにより、従来の方法では困難であった視野の上下左右4象限の範囲に相当する視覚誘発電位の記録を行う事に成功した。2)脳磁図(MEG)を用いた眼科領域における機能評価方法は確立されたものはまだない。視覚誘発脳磁場(visual evoked magnetic field:VEF)計測のための視覚刺激装置の開発を行い、従来視覚誘発電位(visual evoked potential:VEP)で行われてきた基本的な刺激(Flash刺激やパターン刺激など)を用いて健常被験者のVEFの記録を行った。VEFから電流双極子ベクトルを推定すると、Flash刺激、パターン刺激ともに後頭葉の左右半球の鳥距溝付近(第一次視覚野)に一ヵ所づつ得られた。これにより固視の悪い症例においてもFlash刺激を用いて容易に半盲の検出が可能であることがわかった。研究目的:ヒトの網膜から視覚一次中枢までにおける視覚情報の並列処理の過程を分離して機能評価する。黄斑部を中心に視角約30度の範囲を60から100に分割し、それぞれの局所網膜に対応する視覚誘発電位を記録することにより視覚一次中枢におけるretinotopic responseを解析する。これにより黄斑部からの情報処理過程(主としてparuvocellular-pathway)と周辺網膜からの情報処理過程(主としてmagunocellular-pathway)の機能評価を検討する。対象および研究方法:対象は眼疾患を持たない健康な男女。充分なインフォームドコンセントをとり被験者とした。網膜局所に対する視覚誘発電位の記録は多局所網膜電図解析装置(VERISII:トーメー社製)を視覚誘発電位記録用に改造し施行した。刺激画面は視角約30度の範囲を103カ所および60カ所のエレメントに分割し、約4分間から8分間の記録を行った。pseudorandamをもちいたm-sequence法のアルゴリズムで解析を行い、各エレメントの刺激に特異的な反応の抽出を行った(多局所視覚誘発電位)。結果(本研究によって得られた新しい知見):(1)視野の中心10度以内の視覚誘発電位の反応は非常に大きく位相もそろっているのに対して15度以上では場所により波形が異なる事。(2)15度より周辺での反応では視野の上半分と下半分で極性が逆向きになっている事。(3)比較的視野の下側のほうが反応性(振幅)が大きい事などが明らかになってきた。また刺激のエレメントを輝度変化の刺激よりパターン反転刺激に変えると得られる反応は大きくなった。以上の結果より視野の中心10度以内での情報処理過程と15度より周辺からの情報処理過程になんらかの質的な違いがあるのではないかということが推定された。
血液凝固第Ⅸ因子のactivation peptideによる低酸素耐性誘導

われわれは、血液凝固第IX因子が活性化する際に分離するactivation-peptideを使用し、低酸素による臓器障害を改善する薬剤の開発に向けた研究を行う。外傷や感染など様々な要因により身体が低酸素状態に曝されると、低酸素脳症をはじめとする臓器障害を起こす。われわれは、血液凝固第IX因子のactivation peptideの静脈内注射が、敗血症モデルマウスで生じた低酸素血症への耐性を上げることを発見した。本研究ではactivation peptideの持つ低酸素耐性誘導能について検討し、血管内皮細胞において低酸素耐性が生じる機序を明らかにする。従来の酸素投与を主眼とした挿管や気管切開という治療法と比較して、静脈注射は技術的に簡便であるためこの研究がより多くの患者や医療者のために役立つと思われる。器材の購入や既存の機器の修理等でIn vivoの実験はやや遅れているが、In vitoroの実験では細胞内のATP量およびグルコースの取り込みは低酸素条件下で増加していた。解糖系におけるPFK活性や酸化的リン酸化でのNADHの測定を進めいていく予定である。なお、われわれは血液凝固第IX因子のactivation peptideの投与が外傷性脳障害モデルにおいて血液脳関門の機能維持に役立つことを発見した。よってIn vivoの実験では当初の計画に追加して低酸素脳症の際の血液脳関門への効果に関しても観察を行う予定である。当初の計画では、H29年度に実験機材の購入とラットを用いた実験の一部を行う予定であったが、機器の購入、搬入に時間がかかりIn vivo実験の開始が遅れてしまった。さらに既存の機器の修理等も重なり実験が予定通り進まなかったため、ラットを用いたF9-APによる低酸素耐性実験を次年度も行うこととし、延長申請を行った。低酸素モデルラットの解析では、生命予後、バイタルサイン、臓器障害について解析していく。当初の計画では、低酸素による組織の細胞の形態的障害は、脳下垂体と副腎では重量の増加が、光学顕微鏡下での観察では、副腎や胃、腎臓など複数の臓器で血管のうっ血や血管外への赤血球の漏出がみられるとの報告があるためその観察を行っていくが、われわれは血液凝固第IX因子のactivation peptideの投与が外傷性脳障害モデルにおいて血液脳関門の機能維持に役立つことを発見したため、低酸素脳症の際の効果に関しても観察を行う予定である。本研究では、血液凝固第IX因子が活性化する際に分離するactivation-peptide(F9-AP)の新たな機能に注目し、低酸素による臓器障害を改善する薬剤の開発をめざす。われわれは、F9-APの静脈内注射が、敗血症による低酸素血症モデルマウスの予後を改善することを発見した。本研究では、ラットを用いてF9-APの低酸素耐性誘導能を評価する。また、培養細胞を用いて低酸素耐性が生じる機序を明らかにする。平成29年度に低酸素モデルラットを作製し、F9-APの投与による効果について分析する計画であったが、機材の購入・搬入に時間がかかり、低酸素モデルラットの作製のための条件設定などについて検討している最中である。ラットの実験開始が遅れたため、平成30年度に行う予定であった、低酸素条件下で細胞を培養し、F9-APによる内皮細胞の低酸素耐性の誘導機序の解析を進めている。低酸素条件で増加すると思われる乳酸や、ATPの産生量を測定したところ、F9-AP添加で細胞内のATP量は増加を示している。減少すると思われグリコーゲン量とグルコースの取込みついても測定を行っていく。酵素活性については、F9-AP添加で解糖系におけるホスホフルクトキナーゼ(PFK)活性は減少を示している。この結果は低酸素下ではF9-APにより解糖が亢進しているという仮説にあったものである。酸化的リン酸化でのNADH測定も行っていく。遺伝子発現に関しては、低酸素組織において低酸素誘導性因子が遺伝子発現を調整している。例えばglucose transporter1(GLUT1)の発現誘導によりグルコースの取り込みを上昇させ、lactate dehydrogenase A(LDHA)はピルビン酸を乳酸に変換する。これらの遺伝子発現様式を評価するために、細胞からm-RNAを抽出しDNAアレイによる解析を行う予定である。当初の計画では、平成29年度に低酸素モデルラットを作製し、F9-APの投与による効果について分析する計画であったが、機材の購入・搬入に時間がかかり、低酸素モデルラットの作製のための条件設定どについて検討している最中である。ラットの実験開始が遅れたため、平成30年度に行う予定であった、低酸素条件下で細胞を培養F9-APによる内皮細胞の低酸素耐性の誘導機序の解析を進めている。遺伝子発現に関しては、低酸素組織において低酸素誘導性因子(hypoxia-inducible factor:HIF)が遺伝子発現を調整している。

これらの遺伝子発現様式を評価するために、細胞からm-RNAを抽出しDNAアレイによる解析を行う予定である。われわれは、血液凝固第IX因子が活性化する際に分離するactivation-peptideを使用し、低酸素による臓器障害を改善する薬剤の開発に向けた研究を行う。外傷や感染など様々な要因により身体が低酸素状態に曝されると、低酸素脳症をはじめとする臓器障害を起こす。われわれは、血液凝固第IX因子のactivation peptideの静脈内注射が、敗血症モデルマウスで生じた低酸素血症への耐性を上げることを発見した。本研究ではactivation peptideの持つ低酸素耐性誘導能について検討し、血管内皮細胞において低酸素耐性が生じる機序を明らかにする。従来の酸素投与を主眼とした挿管や気管切開という治療法と比較して、静脈注射は技術的に簡便であるためこの研究がより多くの患者や医療者のために役立つと思われる。器材の購入や既存の機器の修理等でIn vivoの実験はやや遅れているが、In vitoroの実験では細胞内のATP量およびグルコースの取り込みは低酸素条件下で増加していた。解糖系におけるPFK活性や酸化的リン酸化でのNADHの測定を進めいていく予定である。なお、われわれは血液凝固第IX因子のactivation peptideの投与が外傷性脳障害モデルにおいて血液脳関門の機能維持に役立つことを発見した。よってIn vivoの実験では当初の計画に追加して低酸素脳症の際の血液脳関門への効果に関しても観察を行う予定である。当初の計画では、H29年度に実験機材の購入とラットを用いた実験の一部を行う予定であったが、機器の購入、搬入に時間がかかりIn vivo実験の開始が遅れてしまった。さらに既存の機器の修理等も重なり実験が予定通り進まなかったため、ラットを用いたF9-APによる低酸素耐性実験を次年度も行うこととし、延長申請を行った。低酸素モデルラットを作製し、F9-APの投与による効果について分析する。F9-APの投与量に関しては、敗血症モデルマウスに対し静脈内投与で行った実験で、3mg/kgで有効性が認められたため、この値を参考に決定していく。単純な低酸素モデルではF9-APによる効果が予想通り認められない場合、内毒素を併用して低酸素への効果を評価する。低酸素モデルラットの解析では生命予後、バイタルサイン、臓器障害について解析する。鹿児島らは、低酸素による組織の細胞の形態的障害は、脳下垂体と副腎では重量の増加が、光学顕微鏡下での観察では、副腎や胃、腎臓など複数の臓器で血管のうっ血や血管外への赤血球の漏出がみられると報告している。また、ストレスや低酸素により血中のACTHが増加することが知られている。これらの知見をもとに光学顕微鏡、電子顕微鏡下での臓器の観察を行っていく。また、酸欠により誘導されることが知られている低酸素誘導性因子(HIF)やその下流遺伝子の発現を、RT-PCRやWestern blotにより解析する。
マイクロウェーブを利用したトマトの水ストレス状態の非破壊的検出法の開発

マイクロウェーブを応用した測定システムは,本質的に,対象とする物質の物理的特性(印加された電場に対する物質の分極の時間応答遅れによる誘電率の周波数依存性,誘電緩和現象)を利用する。この物理的特性の測定法は,時間領域あるいは周波数領域における方法に2分される。時間領域の解析法にTDR(Time Domain reflectometry)法がある。TDR法では,非破壊的な計測ができないこと,測定対象に直流電圧を印加する方法のため,金属電極表面に電気化学プロセスによるイオン伝導や電気分解が生じる試料の場合は測定が難しいとされる。植物の生体組織が電解質を含んでいることから測定には向いていないと考えられ,研究代表者らは採用していない。周波数領域の解析法(研究代表者らが採用している手法)では,このような問題はなく正確な測定が可能である。周波数領域の測定手法は8種類あり,植物体を非破壊的に測定できる手法は,一対のホーンアンテナを使用し,アンテナ間のマイクロウェーブの伝播を測定するFree Space法と同軸ケーブルの一端を測定対象に接触させ,マイクロウェーブ信号を送り,端面からの反射信号を測定し信号処理するOpen-ended Coaxial Probeによる方法の2種類のみである。研究代表者らは,これまでの研究で,Free Space法により,トマトの水ストレス状態を非破壊的に検出することが可能であることを示した。しかし,この手法では,ストレス進行に伴う植物体全体の姿勢や,水分状態,化学的な組成の変化など,すべての要因が渾然一体として検出され,その検出メカニズムを科学的に解明ができなかった。そこで,研究代表者らは,植物体の局部的な誘電特性を,非破壊的に測定可能なOpen-ended Coaxial Probeを利用する方法を用いた測定実験を行った。Open-ended CoaxialProbeを用いて水ストレス状態に置かれたトマトの葉の誘電特性を測定したところ,時間経過に伴って,誘電率及び誘電損失が大きく増加する現象が観察された。水ストレスを受けた結果,少なくとも水分含有量の増加がありえないにもかかわらず,誘電率と誘電損失が同時に増加するという誘電率と水分含有量の関係と大きく矛盾した現象が観察された。この現象は,トマトが水ストレスを受けることによって浸透適応物質であるアミノ酸類(誘電率を増加させる)の代謝産物の生成と塩イオン(誘電率を減少させ,誘電損失を増加させる)の放出の影響を検出していることが考えられる。また,水ポテンシャルと複素誘電率の間には強い相関関係が存在し,植物の誘電特性を測定することにより,水ポテンシャルを推定することの可能性,すなわち水ストレス状態を非破壊的にかつ短時間で正確に推定できる可能性が示されたといえる.マイクロウェーブを応用した測定システムは,本質的に,対象とする物質の物理的特性(印加された電場に対する物質の分極の時間応答遅れによる誘電率の周波数依存性,誘電緩和現象)を利用する。また,水ポテンシャルと複素誘電率の間には強い相関関係が存在し,植物の誘電特性を測定することにより,水ポテンシャルを推定することの可能性,すなわち水ストレス状態を非破壊的にかつ短時間で正確に推定できる可能性が示されたといえる.