hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電子顕微鏡像の新型干渉縞を利用した変態歪の精密計測

本研究は研究担当者らが電子顕微鏡観察で新型の干渉縞を発見したことに端を発している。この干渉縞は薄いマルテンサイト板を含む薄膜試料を電子顕微鏡で透過観察したときに見られるもので、マルテンサイトの変態歪に起因するものであることが明らかになっている。この干渉縞の縞間隔の計測によって、(1)変態歪そのものを求めることができ、また、(2)変態歪が既知の場合にはマルテンサイトの板厚を求めることができる。従来、変態歪は変態に伴う試料の形状変化から求めていたが、この方法では精度の良い値は得られなかった。またベイナイトのように変態生成物が小さい場合には変態歪の測定は不可能であった。このような経緯から、本研究では、新型干渉縞を利用して各種合金のマルテンサイトやベイナイトの変態歪を精度良く求めることを目的とした。なお、変態歪は形状記憶効果の基礎量として重要なものである。本研究は干渉縞間隔と変態歪および観察条件を表すパラメターとの関係を正確に定式化することからはじめた。得られた式について変態歪の実験値がすでに得られている銅合金マルテンサイトについて実験的に確かめた。次に銅合金のベイナイトについて変態歪測定をおこない、マルテンサイトとほぼ同じ変態歪を得た。これはベイナイト変態の変態機構がせん断歪を伴うものであることを立証する決定的証拠となっており、貴重な成果と考えられる。つぎに、銀亜鉛合金のベイナイトについても変態歪を測定し、この場合も銀合金のマルテンサイトの変態歪とほぼ等しい値を得た。つぎに、変態歪データの乏しいチタン合金のマルテンサイトについて変態歪の測定を行った。その結果、現象論の予測と矛盾しない値を得た。本研究は申請者が以前に見出した新型の電子顕微鏡干渉縞の利用に関するもので、これを用いてマルテンサイトの変態歪を測定することを目的としている。まず、この干渉縞と変態歪とを結び付ける理論式をさらに正確なものとするため、回折条件からのずれをも正しく考慮に入れた式を導出した。つぎに、Cu-Zn-Al合金のベイナイトの電子顕微鏡観察を行い、ベイナイト晶が薄いときに干渉縞が見られることを確かめ、この縞間隔の計測と上述の理論式とよりベイナイトの変態歪を求めた。変態歪として、せん断歪0.18-0.20を得た。この値は同じ合金のマルテンサイトの変態歪とほとんど等しい。このことはベイナイト変態の進行過程に重要な示唆を与えるものである。すなわち、ベイナイト変態については長年にわたる論争があり、せん断歪を伴うかどうかが議論されていたが、本研究によってせん断歪の存在は疑う余地のないものとなった。続いて、同様な研究をAgZn合金のベイナイト変態についても行った。このばあいもマルテンサイトと同程度のせん断歪の存在が明かとなった。つぎに、Cu-Zn-Al合金マルテンサイトの昇温による逆変態について電子顕微鏡観察を行い、同様な干渉縞を見出した。このことは、逆変態もせん断変形により進行することを示している。本年度は主として貴金属合金の場合について調べたが、次年度においては、貴金属以外の合金(Ti合金など)のマルテンサイト及びベイナイトについて、変態歪の有無およびその大きさを調べる予定である。さらに、貴金属合金においても、合金規則度が変態歪に与える影響などについて調べる。

従来、変態歪は変態に伴う試料の形状変化から求めていたが、この方法では精度の良い値は得られなかった。またベイナイトのように変態生成物が小さい場合には変態歪の測定は不可能であった。このような経緯から、本研究では、新型干渉縞を利用して各種合金のマルテンサイトやベイナイトの変態歪を精度良く求めることを目的とした。なお、変態歪は形状記憶効果の基礎量として重要なものである。本研究はまず干渉縞間隔と変態歪および観察条件を表すパラメターとの関係を正確に定式化することからはじめた。得られた式について変態歪の実験値がすでに得られている銅合金マルテンサイトについて実験的に確かめた。次に銅合金のベイナイトについて変態歪測定をおこない、マルテンサイトとほぼ同じ変態歪を得た。これはベイナイト変態の変態機構がせん断歪を伴うものであることを立証する決定的証拠となっており、貴重な成果と考えられる。つぎに、銀亜鉛合金のベイナイトについても変態歪を測定し、この場合も銀合金のマルテンサイトの変態歪とほぼ等しい値を得た。つぎに、変態歪データの乏しいチタン合金のマルテンサイトについて変態歪の測定を行った。その結果、現象論の予測と矛盾しない値を得た。
一過性骨髄異常増殖症の分子の細胞遺伝学的研究

一過性骨髄異常増殖症(TAM)の原因遺伝子の位置的単離のため以下の研究を行った。1.逆位切断点を含むYACのFISH解析:SISマーカー(G51E07,GA2G07)領域をカバーする5個のCEPH-YAC由来のコスミドサブクローンを用い患者の逆位染色体におけるFISH解析を行なった結果,YAC-330H1とYAC-73F6が切断点に近接し,切断点はG51E07とD21S215の間に存在することが判明した。2.逆位領域のコスミドコンティグ作製:73F6と330H1 YAC由来コミスドクローンをサザン解析およびEcoRI指紋解析し、IIVのクラスターにグループ化した。クラスターIとIIの間のギャップを埋めるため、コスミドアッセンブリー,コスミドポケット,21番染色体特異的コスミドライブラリーなどから単離したクローンを用いて,G51E07D21S215間のコスミドコンティグ(約150kb)を構築した。各コスミドのFISH解析およびサザン解析で患者逆位の近位切断点に一致するクローン(Q62E11)を単離した。患者の切断点(21q11.1)は21q22.1領域との相同性が従来同定されているホモロジー重複領域に近接していた。今回単離したクローンは,切断点に一致または近接するTAM遺伝子転写物の探索に有用であり、コスミドのサブクローニングおよびエクソントラッピングで転写物を単離する予定である。1.逆位切断点を含むYACのFISH解析:STSマーカー(G51E07,GA2G07)領域をカバーする5個のCEPH-YACのうち3個(73F6,796F2,330H1)のコスミドサブクローンを用い,患者の逆位染色体におけるFISH解析を行なった結果,それらのシグナルは切断点の近位(cen)と遠位(q)に別れて表出されたので330H1が切断点を含むと考えられた.2.コスミドサブクローンの解析と当該領域のコンティグ作製:330H1由来のコスミド160個をEcoRIで消化・電気泳動後ブロットし,各コスミドをプローブにしたサザン解析を行ない,陽性クローンをグロープ化した.各群由来の数個のコスミドを用いたFISH解析で,逆位染色体のcenとqに別れてシグナルを表出するクローン(1-57)を得た.クローン1-57,1-31,1-45はインサートの両端を切り出し,他はグループ化と同じ方法でこの領域のコンティグを作製した.1-45にはYACベクター配列がhybridizeするので,インサートの末端部分と思われた.クローン1-57,1-93,1-67は正常染色体上のFISH解析でcenに,逆位染色体上ではqとcen双方にシグナルが表出したので,切断点は本群中に含まれると考えた.しかし,この3種およびこれらのEcoRI断片をプローブとした患者DNAのサザン解析では切断点由来のextra bandが検出できなかった.これらの結果は,330H1-YACがキメラや欠失を有しているためか,または解析領域がalphoidDNAなどとの相同性を示すためだと思われた.3.21番染色体特異的ライブラリーでの解析:新たに他の方法で作製された21番染色体特異的コスミドライブラリーを入手し,G51E07/GA2G07間のSTS(D21S215と26FF3R)に相当するコスミドを取得した.これらのクローンを用いたFISH解析では,切断点はG51E07とD21S215の間に存在することが判明した.現在新たにマーカー間のコンティグを作製し解析中である.

一過性骨髄異常増殖症(TAM)の原因遺伝子の位置的単離のため以下の検討を行った。平成6年度研究で単離したTAM遺伝子座(G51E07-GA2G07)領域をカバーする5個のCEPH-YAC (73F6,852A4,796F2,849B10,330H1)のうち、73F6と330H1 YAC由来コスミドクローンをサザン解析およびEcoRI指紋解析し、IIVのクラスターにグループ化した。4つのクラスタークローンのFISH解析から、73F6由来コスミドが切断点より近位で、330H1は遠位だと判明し、さらにこの2つの座位間のギャップが明らかになった。ギャップを埋めるため、コスミドアッセンブリー,コスミドポケット,21番染色体特異的コスミドライブラリーなどから単離したクローンを用いて,G51E07D21S215間のコスミドコンティグ(約150kb)を構築した。各コスミドのFISH解析およびサザン解析で患者逆位の近位切断点に一致するクローン(Q62E11)を単離した。患者の切断点(21q11.1)は21q22.1領域との相同性が従来同定されているホモロジー重複領域に近接していた.今回単離したクローンは,切断点に一致または近接するTAM遺伝子転写物の探索に有用であり,コスミドのサブクローニングおよびエクソントラッピングで転写物を単離する予定である。
世界文化遺産・白川郷の持続的保全方法に関する研究

白川村荻町地区の自然景観を構成する植生構造を分析すると、広葉樹二次林は多様な樹種から構成され、サイズ的にも発達した林分て、集落内の屋敷林、水路法面、水田の畦、休耕田、屋敷の石垣、ため池なども植物の多様性が高い。これらの要素がビオトープネットワークシステムを形成して、多様な自然環境が維持されている。社会環境については、安房トンネルの開通や東海北陸自動車道の延伸などの交通環境の激変があり、生活空間と観光資源が一体化している白川郷に観光公害をもたらした。集落保全に対する住民意識の成熟を基盤に、交通需要マネジメントの実施に至らんとしている。合掌造り家屋の保全については、現状変更規制への住民組織の役割は大きく、茅葺き屋根の葺き替え労働にも伝統的な「結い」活動が維持されているが、屋根資材の調達における地元基盤の弱体化が大きな問題である。すでになされた合掌家屋の改変に対しては、修景が課題である。また、観光と地域社会の関連に関して、住民と観光客が「文化財・文化遺産」や「グリーンツーリズム」について認識を共有することが不可欠であり、そのための基本方向は、(1)交流・共感型の文化観光の構築、(2)活力ある地域社会の維持と展開、(3)合掌家屋・集落と伝統的生活文化の保存と顕彰、であることを明らかにした。文化環境のうち、地域の文学・文化遺産の発掘と保全の研究課題においては、奥飛騨出身の女性作家・江夏美好の長編小説「下々の女」の考察をとおして、地域文化を創造する契機としての〈風土〉の意義と、白川郷という〈風土〉の保全に果たす〈文学〉の役割を確認した。合掌家屋は産業考古学の題材でもあり、歴史的に塩硝の製造と養蚕業による富にその経済的基盤があった。とくに塩硝に着目し、現在保存されている道具等の検討をつうじて塩硝の製造方法と合掌家屋との関連を浮かび上がらせた。自然環境については、1957年と93年撮影の空中写真の解析から、白川村荻町周辺では、カヤ場と耕地の減少、人工林と雑木林の増加が顕著に認められた。また戸ケ野集落、鳩ケ谷集落では合掌家屋の減少と耕地の区画整理により景観が大きく変化し、荻町と対照的であった。社会環境のうち、合掌家屋の葺き替え資材と労働力は、長く「結い」によって調達されていたが、現在は「結い」が部分的となり、資材と労働力は主に個人的なルートか業者依存となっている。また葺き替えは、「伝達」政策による補助金と住民の文化財保全意識が、それを支えている。交通環境については、東海北陸自動車道の延長(1999年11月)、安房トンネルの開通(1997年12月)により交通量が増大しつつある。生活環境と観光資源が一体化している白川郷では、交通需要マネジメントが不可欠であることが明らかとなった。文化環境については、白川村出身の作家・江夏美好の作品『下々の女』や『わたしの飛騨高山』を考察し、合掌集落保全のためになされた作者の提言や社会的活動の内容を考察した。すなわちその作品や社会的活動自体が白川郷の文化遺産であり、その持続的保全の必要性と「郷土文学が地域振興に果たす役割」が明らかとなった。また岐阜県における発電用水車ケーシングの変遷を解明し、白川郷の御母衣ダムで使用されていた発電用水車の歴史的位置づけを明確にし、産業遺産を含んだ地域資源の持続的保全の方向性を明らかとした。

今後の課題は、住民の生活の場そのものが文化遺産である荻町をはじめ、その他の集落を含めて、住民と住民組織の努力の側面から、『自然』-『社会(産業、労働、日常生活、交通、文化財保存政策)』-『文化(産業遺産、文学作品、人々の意識・想い)』を結びつけた「自然と人間の共存・共生する道」を解明したい。白川村荻町地区の自然景観を構成する植生構造を分析すると、広葉樹二次林は多様な樹種から構成され、サイズ的にも発達した林分で、集落内の屋敷林、水路法面、水田の畦、休耕田、屋敷の石垣、ため池なども植物の多様性が高い。これらの要素がビオトープネットワークシステムを形成して、多様な自然環境が維持されている。社会環境については、安房トンネルの開通や東海北陸自動車道の延伸などの交通環境の激変があり、生活空間と観光資源が一体化している白川郷に観光公害をもたらした。集落保全に対する住民意識の成熟を基盤に、交通需要マネジメントの実施に至らんとしている。合掌造り家屋の保全については、現状変更規制への住民組織の役割は大きく、茅葺き屋根の葺き替え労働にも伝統的な「結い」活動が維持されているが、屋根資材の調達における地元基盤の弱体化が大きな問題である。すでになされた合掌家屋の改変に対しては、修景が課題である。また、観光と地域社会の関連に関して、住民と観光客が「文化財・文化遺産」や「グリーンツーリズム」について認識を共有することが不可欠であり、そのための基本方向は、(1)交流・共感型の文化観光の構築、(2)活力ある地域社会の維持と展開、(3)合掌家屋・集落と伝統的生活文化の保存と顕彰、であることを明らかにした。文化環境のうち、地域の文学・文化遺産の発掘と保全の研究課題においては、奥飛騨出身の女性作家・江夏美好の長編小説「下々の女」の考察をとおして、地域文化を創造する契機としての〈風土〉の意義と、白川郷という〈風土〉の保全に果たす〈文学〉の役割を確認した。合掌家屋は産業考古学の題材でもあり、歴史的に塩硝の製造と養蚕業による富にその経済的基盤があった。とくに塩硝に着目し、現在保存されている道具等の検討をつうじて塩硝の製造方法と合掌家屋との関連を浮かび上がらせた。
核内受容体と翻訳後蛋白修飾を介するビタミンK標的分子ネットワークの解析

骨芽細胞におけるビタミンK作用として、メナキノン-4特異的なプロテインキナーゼAのリン酸化修飾による新しい作用経路を発見した。クロマチン免疫沈降を用いたゲノムタイリングアレイによるステロイド受容体結合部位のデータを活用し、骨芽細胞系におけるステロイド標的遺伝子を同定する手法を確立した。当グループが明らかにした骨におけるビタミンK作用点である核内受容体SXRについては、本研究により骨代謝における調節因子としての重要性が示唆された。本研究では、ビタミンKの骨芽細胞系における作用機構を複合的に理解する目的で、本年度はγカルボキシラーゼ(GGCX)を介する経路以外の作用に注目し、1)核内ステロイドX受容体(SXR)を介する作用経路と、2)SXR系の検討過程でクローズアップされてきた第3の経路について検討を行った。さらに、3)ビタミンKと同様に核内受容体に作用するが骨粗鬆症の原因となりうるステロイド(グルココルチコイド)に関して、骨芽細胞系におけるステロイド応答遺伝子の探索を行った。1)として、骨芽細胞系におけるビタミンK作動性のSXR標的遺伝子(TSK、CD14)について、これら遺伝子上流領域におけるSXR結合部位をクロマチン免疫沈降法(ChIPアッセイ)で検出した。SXR安定発現骨芽細胞系を用いて、網羅的にSXR結合部位ならびにSXRによるクロマチンDNAアセチル化部位を探索するChIP-on-chip法への展開を目指している。2)として、SXR安定発現細胞系とコントロールベクター発現細胞系の双方でビタミンK2(MK-4)により発現誘導され、かつSXR標的遺伝子でない遺伝子をMK-4特異的標的遺伝子としてとらえ、そのなかでTGF-βファミリーに属するGDF15とペプチドホルモンであるSTC2について発現解析を行った。これら遺伝子の発現はMK-4特異的であり、SXRリガンドのリファンピシンでは発現誘導されず、GGCXに対するsiRNAでは発現への影響はなかったことから、GGCXにもSXRにもよらないビタミンKの新たな作用が見出された。本作用経路のメカニズムとして、PKAのリン酸化の関与を示した。この内容はヨーロッパ内分泌学会誌であるJ Mol Endocrinolに論文発表を行った。3)として、骨芽細胞系におけるグルココルチコイド受容体(GR)結合部位の探索をChIPアッセイにより行い、その成果の一部は米国骨ミネラル研究学会で発表を行った。本研究では、ビタミンKの骨における作用機構を複合的に理解する検討を行うため、従来から知られているγカルボキシラーゼ(GGCX)を介する翻訳後蛋白修飾による機序以外の経路に注目し、1)核内ステロイドX受容体(SXR)を介する作用経路と、2)GGCXおよびSXR経路によらず、プロテインキナーゼA(PKA)のリン酸化修飾により活性する経路について、骨芽細胞系を中心として検討を進めた。ビタミンKは加齢性骨粗鬆症の他、骨量が高くても骨折が起きうるステロイド性骨粗鬆症に対しても治療効果があると考えられていることから、3)として、ビタミンK作用に対比される骨芽細胞系へのグルココルチコイド作用を検討した。1)として、マウスSXRオルソローグのPXR欠損マウスを用いて、骨密度測定による骨形態観察を行い、PXR欠損マウスでは骨量減少を認めたことから、SXRが骨代謝の調節因子として重要である可能性が示された。2)として、PKAを介して活性化されるビタミンK経路は、ビタミンKの中でも、ビタミンK2の1つであるMK-4特異的に誘導されることを明らかにし、その一例として、TGF-βファミリー分子のGDFI5とペプチドホルモンSTC2遺伝子の発現増加を示した。3)として、前立腺癌細胞におけるステロイド受容体のクロマチン免疫沈降のゲノムタイリングアレイ(ChIP-on-chip)データを活用し、骨芽細胞系におけるステロイド標的分子を効率的に同定する手法を確立した。
B細胞における細胞内シグナル制御因子の生理的機能の解明

B細胞の分化・活性化を制御するCD40やToll様受容体のシグナル伝達を担うTRAF6は、B細胞において個体の適切な液性免疫応答を惹起するのに必要であるばかりでなく、特定のB細胞分化にも必須であることが明らかになった。一方、サイトカインシグナルの制御因子であるSOCS1は、IL-4/STAT6シグナルを抑制し過剰なIgE産生を抑えることで個体のアレルギー感受性を制御していることが明らかになった。本年度は、B細胞の分化・活性化を制御するCD40やToll様受容体のシグナルアダプター分子であるTRAF6と、IL-4やIFN-γのシグナル制御因子であるSOCS1のB細胞における生理的役割を解明するため、B細胞特異的遺伝子欠損マウスを作製し解析した。B細胞特異的TRAF6欠損マウスのT細胞依存的抗原反応を調べたところ、抗原特異的抗体のアイソタイプスイッチや長期生存型プラズマ細胞の誘導に障害が認められた。また正常血清中のIgMやIgG2bが有意に減少しており、T細胞非依存的抗原に対するIgMの産生も低下していた。さらに、このマウスは成熟B細胞が減少しており、予想外にも腹腔内のCD5陽性B1細胞(B1-a細胞)が欠損していた。B細胞内のTRAF6は液性免疫応答に重要であるだけでなく、特定のB細胞分化にも必須であることが初めて明らかとなった。一方、B細胞特異的SOCS1欠損マウスは、正常血清中のIgG1及びIgEが有意に上昇すること、また抗CD40抗体+IL-4共刺激による培養B細胞のIgE産生も亢進すること、更にこれらの表現型はSTAT6欠損マウスとのかけ合わせによって正常化することを見いだした。しかし、骨髄および脾臓、リンパ節でのB細胞の成熟分化には大きな影響がなく、メモリーB細胞の形成も正常であった。このマウスを各種抗原で免疫し抗原特異的抗体産生を調べたところ、Th1応答を優位に惹起するCFAをアジュバントとした場合、各アイソタイプ抗体産生量は野生型マウスと同程度であった。しかし、Th2応答を優位に惹起するAlumをアジュバントとした場合、抗原特異的IgEの産生が有意に上昇した。以上の結果から、B細胞においてSOCS1は、IL-4/STAT6シグナルを抑制し過剰なIgE産生を抑えていることが明らかとなった。前年度に引き続き、B細胞特異的SOCS1欠損マウスの表現型をin vivo及びin vitro系で評価し機能解析を行った。これまでの解析から、B細胞特異的SOCS1欠損マウスは、正常血清中のIgG1及びIgEが有意に上昇すること、および抗CD40抗体+IL-4共刺激による培養B細胞のIgE産生が亢進すること、またこれらの表現型はSTAT6欠損マウスとのかけ合わせによって正常化することを見いだした。また、B細胞特異的SOCS1欠損マウスの脾臓では胚中心の形成が亢進していた。一方、骨髄、脾臓およびリンパ節でのB細胞の成熟分化には大きな影響がなく、メモリーB細胞の形成も正常であった。B細胞特異的SOCS1欠損マウスを各種抗原で免疫し、抗原特異的抗体産生を調べたところ、Th1応答を優位に惹起するCFAをアジュバントとした場合、B細胞特異的SOCS1欠損マウスの各アイソタイプ抗体産生量は、野生型マウスと同程度であった。しかし、Th2応答を優位に惹起するAlumをアジュバントとした場合、抗原特異的IgEの産生がB細胞特異的SOCS1欠損マウスで有意に上昇していた。さらに、Active Cutaneous anaphylaxis(ACA)モデル実験や気道炎症モデル(喘息モデル)実験を試みたところ、B細胞特異的SOCS1欠損マウスはアレルギー高感受性であることが明らかになった。以上の結果から、B細胞においてSOCS1は、IL-4/STAT6シグナルを抑制し過剰なIgE産生を抑えることでアレルギー感受性を制御していることが明らかとなった。これまでの解析から、B細胞特異的SOCS1欠損マウスは、正常血清中のIgG1及びIgEが有意に上昇すること、および抗CD40抗体+IL-4共刺激による培養B細胞のIgE産生が亢進すること、またこれらの表現型がSTAT6欠損マウスとのかけ合わせによって正常化することを見いだした。本年度は、この変異マウスで正常血清中のIgG2cが有意に上昇していることを見いだし、この表現型がSTAT1欠損マウスとのかけ合わせによって正常化することを示した。

また、これまでにTh2応答を優位に惹起するAlumをアジュバントに用いて抗原を免疫した場合、抗原特異的IgEの産生が変異マウスで劇的に上昇することを明らかにしたが、新たに、Th1応答を優位に惹起するCFAをアジュバントとした場合、抗原特異的IgG2cの産生が変異マウスで亢進することを見いだした。さらに、抗CD40抗体+IFNγ共刺激による培養B細胞のIgG2c産生もSOCS1欠損B細胞で有意に上昇することを示した。従って、SOCS1はIFNγ/STAT1シグナルを抑制してIgG2cの産生レベルを調節していることが示唆された。また、アレルギー病態との関連を調べるため、これまでActive Cutaneous anaphylaxis(ACA)モデル実験や気道炎症モデル(喘息モデル)実験を行い、変異マウスがアレルギー高感受性であることを示したが、本年度ではさらに鼻炎モデルにおいてもアレルギー高感受性を示すことを明らかにした。以上の結果から、B細胞においてSOCS1は、IL-4/STAT6シグナルを抑制し過剰なIgE産生を抑えることでアレルギー感受性を制御していることが明らかとなった。
細胞接着シグナルのレドクス制御機構

過酸化水素誘導性遺伝子として分離したHic-5蛋白質は、繊維芽細胞では接着斑に局在し、細胞外基質からのシグナル伝達に関与すると考えられるが、酸化ストレスにより接着斑から核へ可逆的に移行する。類似体のパキシリンは移行しない。Hic-5の核での標的遺伝子を強制発現した細胞で検索したところ、c-fos遺伝子の発現が上昇することが明らかとなった。c-fos遺伝子ではHic-5応答領域は5'-上流約1.5kbにあり、ここには多くの転写エレメントが存在する。しかし、血清応答エレメントとは異なっており、Sp1配列を中心とするHic-5応答エレメントと予想された。c-fos発現は、AP-1を介して細胞外基質遺伝子の発現を制御すると考えられる。一方、既に相互作用因子として単離しているPTP-PESTに関し、酸化ストレスによるHic-5の核移行に対する効果を検討した。PTP-PESTの強制発現によりHic-5の核移行は有意に阻害され、チロシンホスファターゼ活性を欠失させた変異体でも同様な作用が見られた。PTP-PESTはHic-5のLIM3に結合することを既に明らかにしているが、この結合によりadapter蛋白質として作用している可能性が考えられる。Hic-5蛋白質は酸化ストレスにより局在を変化させるだけでなく、シグナル伝達の制御にも関与することが示唆された。さらに、Hic-5蛋白質がこのドメインを介してオリゴマーを形成することを見いだした。Hic-5同士の相互作用はLIM4ドメインが必要である。酸化ストレスにより、Hic-5の核マトリックスへの結合が顕著に上昇した。Hic-5は、他のLIM蛋白質、シグナル分子との相互作用に加えて、オリゴマーを形成して核マトリックスに局在し、遺伝子発現制御に関与する可能性が考えられた。活性酸素は炎症の際に放出され、異物の殺菌に関わるのみならず、IL-1、TFN-α、TGF-β1などの炎症性サイトカインのセカンドメッセンジャーとしての機能も持つ。本研究は、活性酸素による上皮細胞の接着シグナル変化を検討した。マウス乳腺上皮細胞(NMuMG細胞)に過酸化水素を低濃度(0.2mM)で継続的に処理すると2日目から細胞間接着が弱まり、繊維芽細胞様の形態を示した。この形態変化は、アクチンとE-cadherinの局在変化の結果と考えられる。アクチン骨格制御に関わるsmall G蛋白質のなかで、Rac1の活性化が処理後4日目に見られ、ERK1/2、p38の活性化が処理後2日目から起きていた。また、このときECM関連蛋白質MMP-13の発現誘導が見られ、この誘導はERK1/2、またはp38を阻害することで抑制された。このことから、過酸化水素によるMMP-13の発現誘導には、ERK1/2、p38の活性化が重要であると考えられた。過酸化水素の持続的な処理により、MAP kinaseの活性化及びMMP-13の発現が持続、増強し、細胞の形態変化の誘導につながったものと考えられる。さらに、組織浸潤能に注目し、invasion assayを行った。その結果、ほとんど浸潤能を持たないNMuMG細胞が、過酸化水素処理により浸潤能を示すようになった。これは、ECM系の分解に関与するMMP-13を含めたMMPの活性の上昇と、E-cadherinの局在変化による細胞間接着の喪失が関与しているものと考えられる。最近我々は、細胞接着斑蛋白質Hic-5が酸化ストレスにより可逆的に核へ移行することを見出した。

酸化ストレスとしては、過酸化水素やSH剤であるN-ethylmaleimideで同様な効果があり、酸化ストレス以外に、ホルボールエステルやサイトカラシンによっても核移行が見られた。同じ条件でパキシリンは核へ集積しない。接着斑に局在するHic-5は、細胞をレプトマイシンBで処理すると核に集積することから、Crm-1依存的な核排出シグナル(NES)を持つことが予想された。C-末端のLIMドメインはHic-5、パキシリンのいずれも核移行能を持つことから、N-末端が細胞質への保持に関わることが示された。各種の変異体を作成して検討した結果、N-末端領域のLD3ドメインがNESとして機能することが明らかになり、酸化ストレスに応答して核へ移行するためには、LD2付近に存在するHic-5特異的な2個のCysが必要であることも示された。この周辺のアミノ酸配列は、酸化ストレスで核へ移行する酵母の転写因子Yap-1と相同性が見られた。核内でのHic-5の機能の一つは標的遺伝子の転写制御と考えられるが、c-fos遺伝子の発現に関しては、正常ヒト繊維芽細胞で過酸化水素で誘導される誘導が、dominant negative Hic-5(LIM-4欠損)により抑制されたため、酸化ストレス下の内在性c-fosの転写制御にHic-5が関与することが考えられる。c-fos遺伝子の5'上流を持つレポーターを用いて解析した結果、Hic-5応答領域は5'上流約1.5kbにあるSp1エレメントが少なくとも一つの標的となっていることが明らかになった。LIM蛋白質Hic-5は、細胞内のレドクス状態に感受性のNES (Nuclear Export signal)を持ち、細胞接着斑と核に局在し、インテグリンシグナル制御因子と転写共役因子としての両面の機能を合わせ持つ蛋白質である。構造上の特徴としてN末端側LDドメインを、C末端側にLIMドメインを4つ持っている。最近、Hic-5が酸化ストレスにより特異的に核へ移行することを見出し、この核移行の制御にはLDおよびLIMドメインがそれぞれ正・負に関与することが明らかになった。LIMドメインの機能の一つとして、Hic-5蛋白質がこのドメインを介してオリゴマーを形成することを見いだした。そこで本研究ではオリゴマー形成について、その基本的性質の検討とオリゴマー形成に関与するドメインの決定、およびその核マトリックスへの局在との関連について検討した。各種変異体を用いて免疫沈降法により細胞内での相互作用を検討した結果、LIM4ドメインがHic-5同士の相互作用に必要である事がわかった。核移行型を用いた結果から核内での相互作用もみられた。また、大腸菌に発現させたHic-5蛋白質を用いて架橋実験およびゲルろ過を行った結果、Hic-5は、2量体以上の会合体として存在することが示唆された。ついでHic-5とそのLIM4ドメイン欠損変異体(ΔLIM4)を細胞内に発現させて、核マトリックスを調製し、各々のHic-5の局在を調べた結果、ΔLIM4では、顕著に核マトリックスへの局在が減少していた。また、酸化ストレスにより、Hic-5の核マトリックスへの結合が顕著に上昇した。
黒毛和種牛と乳牛の種類による違いが仔牛及び初乳成分に与える影響について

母牛の飼養管理及び分娩管理は,生まれてくる仔牛の健康状態に影響を与える。牛の母子免疫の特徴として,初乳を介して免疫抗体が移行することが挙げられるが,初乳中免疫抗体の量と質は母牛の年齢・健康状態等によって異なると考えられる。しかし,仔牛への適正な初乳給与方法は十分に確立されておらず,特に黒毛和種牛の初乳についての情報は少ない。そこで,黒毛和種牛および乳牛の種類による初乳中免疫抗体量の違い,あるいは年齢・産次・栄養状態の違いが,新生仔牛への免疫移行およびその後の発育・増体等に与える影響を明らかにするための調査を行った。本研究では,宮崎大学農学部附属住吉フィールド(牧場)にて飼養され,平成23年6月から平成24年2月にかけて分娩した母牛36頭(乳牛14頭,黒毛和種牛22頭)および分娩後生存した仔牛34頭,すなわち計70頭の飼養牛を用いて試験を行った。試験母牛は分娩予定日の90日前から分娩日を含め分娩後60日まで15日間隔で1頭あたり計11回の採血を行うとともに,毎月1回はBCSを測定し,分娩時には初乳を採取した。試験仔牛は出生時,翌日,生後60日まで15日間隔で計6回の採血を行うとともに,生時体重および毎月1回の体重測定を行った。採取した血液は,ウシ・IgGプレート(放射免疫拡散法を用いたIgG定量用キット)により血中IgG濃度を測定するとともに,TP,アルブミン等の血液生化学的検査を行った。採取した初乳は,初乳中のIgG濃度を調べるため携帯型屈折計によりBrix値を測定した。本研究の結果により,分娩前後の母牛における血中IgG値およびBCSを指標とする栄養状態の推移が,出生後仔牛の発育に与える影響を明らかにすることができた。本研究の結果を学術雑誌等に発表するため,現在準備中である。
獲得免疫成立における活性酸素種産生酵素NOX1の新しい役割の解明

活性酸素産生酵素NOX1/NADPHオキシダーゼは大腸上皮細胞に高発現するが、脾臓細胞においても恒常的な発現が認められる。本研究では、未だ明らかでないNOX1の免疫細胞における役割を明らかにすることを目的とし解析を進めた。本年度は、NOX1が各種免疫疾患に及ぼす役割を明らかにするために野生型およびNox1遺伝子ノックアウトマウスを用いてオボアルブミン誘発性喘息モデルおよびコラーゲン誘発性関節炎モデルを作製した。本実験にはこれらの疾患モデルに抵抗性とされるC57BL/6系統を用いたが、これまでの報告を参照し条件を検討することで病態モデルを作製することができた。なお現在解析中であるため、これらの結果については最終報告書に記載する。当初の計画に従って2種の免疫疾患モデルを作製し、解析を進めることができた。1.免疫細胞にはNOX1およびNOX2が発現するが、同じROS産生能を有するこれらのアイソフォームとその機能がどのように住み分けられるのか興味深い。それぞれの会合分子であるNOXA1, NOXO1あるいはp47phox, p67phoxの発現を指標に調べる。2.NOX1の転写誘導に関わるサイトカインを比較解析する。活性酸素産生酵素NOX1/NADPHオキシダーゼは大腸上皮細胞に高発現するが、脾臓組織においても恒常的な発現が認められる。本研究では、未だ明らかでないNOX1の脾臓における役割を明らかにすることを目的とし解析を進めた。正常マウス脾臓よりB細胞とT細胞を分取しリアルタイムPCR法にて遺伝子発現を解析したところ、いずれの細胞分画でもNOX1は発現していた。特にB細胞ではT細胞に比して約2倍量のNOX1遺伝子発現が認められた。NOX2も同等の発現様式を示した一方、NOX4の発現は極めて低かった。次に、NOX1が抗体産生に及ぼす役割についてNox1遺伝子ノックアウトマウスを用いて解析した。DNP-KLH/alumおよびDNP-Ficoll抗原をマウスに単回腹腔内免疫し、2週後の血清IgM, IgG1, IgG3を定量評価した。現段階では例数は少ないが、野生型およびノックアウトマウスで同等の抗体産生が認められる傾向にある。今後の追加実験が必要である。ノックアウトマウスが多く得られず、特に抗体産生の実験については抗原量やアジュバントの変更を課題として残しており、初年度で充分な解析を終えることができなかった。1.抗体産生について追加実験を行う。初年度の解析では充分な抗体価上昇が認められなかったDNP-LPS抗原については抗原を増量して評価する。2.B細胞およびT細胞におけるNOX1遺伝子発現および活性酸素産生について、TLRアゴニストや各種細胞刺激の影響を調べる。3.喘息モデルマウスを確立し、抗体産生および肺組織中サイトカインや免疫細胞の浸潤を指標にNox1遺伝子欠損の影響を調べる。ノックアウトマウスが多く得られず、特に抗体産生の実験については抗原量やアジュバントの変更を課題として残しており、初年度で充分な解析を進めることができなかった。2年目に持ち越して実験を行う。僅かだが、予定よりも費用がかからなかった。次年度に持ち越して使用する。
ものづくり企業における人事部門の歴史的発展

日本企業における人事部門は、国際的に見て、人事管理領域において強い権限を有している点で特徴的である。本研究は、人事部の機能を歴史的に分析し、日本における民間企業の人事部門は大正期に、(1)労働争議への対策、(2)劣悪な労働条件の改善、(3)人的資源の集中管理の必要性から徐々に広まり、戦後も労働運動対策の中心的組織として、また、企業内での人材配分の調整機構として大きな役割を果たすことで独特の特徴を維持してきた。人事部門は企業内において人的資源を管理・活用する上で中心的役割を果たしている。特に,日本企業においては部門ごとにコアの従業員にかかわる採用・解雇権限が委譲されておらず,相対的に人事部門が強い権限を行使してきたといえる。また,人事部門は人事制度の様々な制度設計において主たる役割を担っており,日本型人事労務管理の形成に大きな役割を果たしてきた。このような重要性にもかかわらず,国内研究において人事部門の歴史的な実態解明は断片的で,立ち後れたものになっている。特に,その集権的性格,人材の調達と育成,現場部門との権限関係については,日本型の人事管理の将来展望を考える上でも重要であるが,実態と理論化の双方において不十分な状態にある。本研究は,日本企業における人事部門の発展を明らかにすることで,この課題にこたえるものである。本研究がめざす人事部門の通史的研究は,これまで国内には存在しておらず,本研究の知見は,単に国内の学界に留まらず,人事部門・人的資源管理の国際比較において,極めて重要な一次資料となりうると考えられる。初年度は資料調査及び経営者団体の協力を得ながらプレ調査をおこない,近年の傾向について概括的な理解を進めることをおこなった。2000年代に入り,日本企業の人事部門は様々な要因から縮小される傾向がみられるようになった。人事部門では業務のアウトソーシングが進む一方で,自部門のスタッフ育成をはじめとして様々な課題を抱えることになってきた。次年度以降はこのような変化を歴史的な変遷の中で捉えることを課題としたい。本研究の目的は,日本企業における人事部門の発展を明らかにすることで,日本型人事労務管理の形成に独特な役割を果たしてきた人事部の機能を歴史的に分析することにある。日本における民間企業の人事部門は大正期に、(1)頻発する労働争議への対策、(2)社会問題化していた劣悪な労働条件の改善、(3)社員および職工を集権的に管理する必要性から徐々に広まり、第二次世界大戦に入り、軍需関連工場に大量の動員が必要になるとより整備されたかたちで拡大していった。敗戦直後は、労働運動対策の中心的組織として、また、長期安定雇用が広まると企業内での人材配分の調整機構として大きな役割を果たしてきた。今日の人事部門の主たる機能は、以下の3つに要約される。(1)内部労働市場の管理(内部労働市場機能)部門や事業所内での昇進・昇格などの「タテの内部労働市場」に加え,部門を越えた異動などの「ヨコの内部労働市場」を管理すること。「タテの内部労働市場」の管理がもっぱらラインの管理職に担われているのに対し,本社人事部には「ヨコの内部労働市場」を管理する「強い人事権」が与えられている。(2)労使関係における使用者代表機能(労使関係機能)企業別労働組合との協調的な関係を重視する日本的労使関係おいて本社人事部は最も中心的な役割を担う部署と位置づけられている。(3)採用や賃金・雇用制度構築における強い権限(全社的雇用管理機能)基幹従業員である正社員の採用にあたっては本社人事部が権限を有しており,実際の採用プロセスにおいても実質的な権限を行使している。以上、日本の人事部門は歴史的に異なった経営環境に対して、独特の形で組織内外の課題を解決する部門として展開しており、これが日本型人事部の重要な構成要因となっていることが明らかとなった。
テストステロン投与不応性記憶障害の病態解明と治療法の研究

脳の内側扁桃体核には、男性ホルモンであるテストステロンから女性ホルモンであるエストロゲンを作り出す芳香化酵素と、2種類のエストロゲン受容体(ERαとERβ)が発現している。したがって男性の脳は女性以上にエストロゲンの作用を受けていることが予想される。男性更年期のモデルとして雄ラットから精巣を摘出すると、ERαの量は増加した。精巣を摘出されたラットに、テストステロンやエストロゲンを投与するとERαは再び減少した。一方で、男性ホルモンの一種であるジヒドロテストステロンの投与は、ERαの量に影響を与えなかった。ERβの量は精巣摘出やホルモン投与の影響を受けず安定していた。テストステロンを補充しても症状が回復しないテストステロン不応性記憶障害の原因として、内側扁桃体核におけるエストロゲン合成能力の減退が、記憶障害を引き起こしているという仮説を立てた。加齢による脳内アロマテースの発現変化を明らかにするため、9週2年齢の雄ラットの、内側扁桃体核および分界状小床核のアロマテースを染色し評価した。その結果、1年齢から2年齢にかけてアロマテース免疫反応性が減少傾向にあった。さらに、更年期あるいはホルモン投与治療環境下を想定して、内側扁桃体核が持つ性ステロイド感受性を明らかにするため、内側扁桃体核に発現するエストロゲン受容体(ERα、ERβ)の蛋白量の変化を免疫組織化学およびWestern blotにより評価した。その結果、テストステロンおよびエストロゲンによりERαの有意な減少が観察された。一方でERβについては、使用したすべての性ステロイド存在下においても有意な量的変化を認めなかった。また、実験動物を選定する予備実験段階において、アンドロゲン受容体を高発現する種特異的な神経核を複数同定し、さらにこれらがいずれも性的二型を示すことを明らかにし、論文を発表した。男性の更年期障害に対する安易な性ステロイド投与治療によっては、かえってその感受性を失うことも考えられる。そのため、各種の性ステロイドホルモン投与状況で、扁桃体のエストロゲン受容体の発現変化も明らかにしていく必要があため、各群間のラットの扁桃体領域を採取し、ERαおよびERβタンパクに対するWestern blotを行った結果、Castration+Vehicle群ではSham operated+V群と比較して、精巣摘出によるERαタンパクの増加が認められた。Castration+Vehicle群に対し、Castration+DHT群のERαタンパク量には有意な変化はなかったが、テストステロンまたはエストロゲンの投与により著しいERαの減少を示した。これに対して扁桃体領域ERβタンパク量は、精巣摘出および各性ステロイド投与のいずれにも影響を受けなかった。複数の神経核群からなる扁桃体領域の、いずれの神経核において、前述のエストロゲン受容体量の変動が生じているのかをさらに詳細に検討するため、扁桃体領域の連続切片を作製しERαおよびERβに対する免疫組織化学を行った。その結果、ERα、ERβともに内側扁桃体核後背側部においてその発現を認めた。性ステロイド環境をコントロールされた各群ラットの内側扁桃体核後背側部におけるERαおよびERβ免疫反応性の比較評価を行ったところ、Western blotと同様の結果が、形態学的解析によっても得られた。これによって内側扁桃体核後背側部における各性ステロイド環境におけるERαの変動と、ERβの安定的発現を明らかにした。2年間の研究期間のうち初年度に計画した、更年期モデル動物における扁桃体の性ステロイド感受性の変化の検討は、予定通りに終了したが、加齢によるアロマテース発現神経細胞数の変化に関しては、若干例数を加える必要がある。一方で予備実験段階のデータに関して、すでに論文発表まで至った。神経組織学平成27年度は、アロマテース遺伝子導入とアロマテース阻害剤を用いた培養細胞系において、前年度に得られたERα蛋白量の変化に対するアロマテースの影響を検討すると同時に、ERα蛋白量の変化が発現抑制よるものか蛋白分解系の亢進によるものかを定量PCRおよびプロテインキナーゼ阻害剤添加条件下でのWestern blotを用いて明らかにする。また、aromatase阻害剤やエストロゲン受容体作動薬を内側扁桃体核へ局所注入したラットを用いて、局所的に産生されるエストロゲンが記憶能力に与える影響を、行動解析により検討する。
新規病原体レセプター制御分子が司る消化管恒常性維持機構の解明

先行研究により、病原体レセプターであるToll-like Receptor(TLR)2に会合するだけでなく、その過剰発現に伴い、自然発症性腸炎を誘起する新規分子を発見した。当研究では、対象分子によるTLR制御機構の詳細な解明だけでなく、対象分子の生理的意義の解明を目指した。なお、腸管の免疫制御システムは、全身性の免疫制御システムと大きく異なっており、腸管とTLRの関係性について深く研究しているコロンビア大学Ghosh教授の指導が大きく役立った。細胞株を用いたin vitro実験において、対象分子をノックダウンした場合、TLRリガンド応答によるサイトカイン産生が亢進した。対象分子とCre蛋白質を全身で強制発現させたtransgenicマウスは、特に雄マウスに高率に、劇的な腸炎を呈した。ただし、対象分子とCre蛋白質を、マクロファージや血球で特異的に強制発現させた場合、腸炎は認められなかった。対象分子を全身で欠損させたマウスにおいても、腸管に異常は認められなかった。加えて、いずれのマウスから調整した免疫担当細胞を用いて、TLRリガンド応答を検証しても異常は認められなかった。一方で、対象分子とCre蛋白質を全身で強制発現させ、かつTLR応答に必須な分子であるMyD88を欠損させた場合、高率で胎生致死になったことから、TLRシグナル・対象分子発現量・Cre蛋白質発現量のクロストークは生体の恒常性維持において、決定的な役割を果たしていると考えられた。対象分子はTLRに特異的に作用し、表現形を誘発すると予想していたが、TLR以外の分子に対しても大きな影響力を持っていると考えられた。今後は対象分子に対する質量分析をはじめとした網羅的解析が求められる。26年度が最終年度であるため、記入しない。先行研究により、病原体レセプターの一つであるTol1-1ike Receptor 2に会合するだけでなく、その過剰発現に伴い、特に雄マウスで高率に、自然発症性腸炎を誘起する新規分子が発見された。当研究課題では、対象分子によるTol1-1ike receptor制御機構の詳細な解明に加え、対象分子の過剰発現を可能とするconditional transgenicマウスの解析を通じて、対象分子の生理的意義の解明を目指している。今年度は、対象分子がTol1-like receptorを制御するメカニズムの解明を試みた。具体的には、全身で対象分子を強制発現させたconditional transgenicマウスから、各種免疫担当細胞を調整し、ex vivoにおけるTol1-1ike receptor応答を観察した。しかし、各種Tol1-like receptorの表面発現量や、各々のリガンドに対するサイトカイン産生、共刺激分子発現、細胞増殖速度に関しては、顕著な違いは見られなかった。一方で、標的分子をノックダウンさせた細胞株を用いて、Tol1_likereceptorリガンドでの刺激実験をin vitroにおいて行った場合においては、そのサイトカイン産生応答に顕著な違いが観察された。対象分子のin vitroでのノックダウン実験結果、および対象分子とTol1-1ike receptor 2が会合することと合わせて考察すると、対象分子がTol1-like receptor応答を制御する可能性は高いと考えられる。細胞株を用いた実験と異なり、同conditional transgenicマウスから調整した免疫担当細胞で、Tol1-1ike receptor制御に異常が見られない原因の一つとして、腸炎に由来する体調不良に伴い、間接的に機能不全に陥っている可能性が考えられた。現在、環境因子を含めた実験条件の最適化を行っている。同時に、同conditional transgenicマウスで利用可能なCre-loxPシステムを用いて、マクロファージや血球細胞といった細胞集団特異的に対象分子の発現量を調整した上での、ex vivoにおけるTol1-1ike receptor応答の解析、および個体レベルでの表現系解析を進めている。先行研究により、病原体レセプターの一つであるToll-like Receptor 2に会合するだけでなく、その過剰発現に伴い、特に雄マウスで高率に、自然発症性腸炎を誘起する新規分子が発見された。当研究課題では、対象分子によるToll-like receptor制御機構の詳細な解明に加え、対象分子の過剰発現を可能とするconditional transgenicマウスの解析を通じて、対象分子の生理的意義の解明を目指している。なお、腸管の免疫制御システムは、全身性の免疫制御システムと大きく異なり、その解析には専門的な知識および実験設備が不可欠である。そのことから、今年度より、腸管とToll-like receptorの関係性を深く研究しているコロンビア大学Sankar Ghosh教授の元で指導を受け、その研究手法を学んでいる。該当conditional transgenicマウスで利用可能なCre-loxPシステムを用いて、細胞集団特異的に対象分子の発現量を調整することで、Toll-like receptor応答を始めとした表現系解析を行った。しかし、マクロファージまたは血球特異的に対象分子を過剰発現するconditional transgenicマウスから調整した各種免疫担当細胞においても、ex vivoにおけるToll-like receptor応答に顕著な差は見られず、また、それらのマウスにおいては、全身で対象分子を過剰発現させた際に観察できる腸炎は見られなかった。一方で、対象分子とCre蛋白質を全身で過剰発現させたマウスでは、対象分子のみを強制発現させた場合のみと比較して、劇的な表現形が観察された。このように、同conditionaltransgenicマウスの表現形において、対象分子の発現量異常に伴うToll-like receptor制御異常以外にもメカニズムが示唆された。

そのため、MyD88といったToll-like receptor応答に必須な分子をノックアウトし、かつCre蛋白質と対象分子を強制発現させたマウスの樹立を進めている。先行研究により、病原体レセプターであるToll-like Receptor(TLR)2に会合するだけでなく、その過剰発現に伴い、自然発症性腸炎を誘起する新規分子を発見した。当研究では、対象分子によるTLR制御機構の詳細な解明だけでなく、対象分子の生理的意義の解明を目指した。なお、腸管の免疫制御システムは、全身性の免疫制御システムと大きく異なっており、腸管とTLRの関係性について深く研究しているコロンビア大学Ghosh教授の指導が大きく役立った。細胞株を用いたin vitro実験において、対象分子をノックダウンした場合、TLRリガンド応答によるサイトカイン産生が亢進した。対象分子とCre蛋白質を全身で強制発現させたtransgenicマウスは、特に雄マウスに高率に、劇的な腸炎を呈した。ただし、対象分子とCre蛋白質を、マクロファージや血球で特異的に強制発現させた場合、腸炎は認められなかった。対象分子を全身で欠損させたマウスにおいても、腸管に異常は認められなかった。加えて、いずれのマウスから調整した免疫担当細胞を用いて、TLRリガンド応答を検証しても異常は認められなかった。一方で、対象分子とCre蛋白質を全身で強制発現させ、かつTLR応答に必須な分子であるMyD88を欠損させた場合、高率で胎生致死になったことから、TLRシグナル・対象分子発現量・Cre蛋白質発現量のクロストークは生体の恒常性維持において、決定的な役割を果たしていると考えられた。対象分子はTLRに特異的に作用し、表現形を誘発すると予想していたが、TLR以外の分子に対しても大きな影響力を持っていると考えられた。今後は対象分子に対する質量分析をはじめとした網羅的解析が求められる。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度の主な目標は、標的分子の過剰発現に伴う腸炎の責任細胞の同定であった。その目標達成のために最も優先度の高い実験であった、全身で標的分子を過剰発現させたマウスから調整した免疫担当細胞を用いたToll-likereceptor応答性の検証を一通り行うことが出来、次の段階に進むための問題点が発見できたと言える。加えて、個体レベルで責任細胞を同定する目的で、Cre-loxPシステムを用いて細胞集団特異的に標的分子を過剰発現するマウスの作製も進んでいる。今年度の主な目標は、表現形における個体レベルでの責任細胞の同定であった。その目標達成のために最も重要であるconditional transgenicマウスでの解析を進めることが出来、次の段階に進むための問題点が発見できた。
血清HGF activatorの測定系の確立とその臨床的意義

Hepatocyte Growth Factor(HGF)の非活性型から活性型へのプロセシングを触媒するHGFactivatorの免疫酵素測定法(ELISA)を確立することを目的とした。ELISA測定系は、マウスモノクローナル抗HGFactivator抗体をプレートに固相化し、サンプルを添加した後、2次抗体にHRP標識マウスモノクローナル抗HGF activator抗体を用い、OPD発色後、波長490nmにて吸光度を測定した。まず、0.625ng/mlから100ng/mlまでの精製HGFactivator標品を用いて標準曲線を作成したところHGFactivator蛋白濃度として1ng/mlより40ng/mlの間で良好な標準曲線がえられた。つぎにこのHGFactivatorELISA系を用いて急性肝障害患者の血漿HGF activator濃度を測定した。正常者血漿HGFactivator蛋白濃度は15ng/mlであったが、血清HGFレベルが3.36ng/ml、2.59ng/mlと上昇している劇症肝炎患者血漿のHGFactivator蛋白濃度はそれぞれ16.0ng/ml、29.2ng/mlとあきらかに上昇していた。また正常サルの臓器におけるHGFactivator蛋白レベルは、脾臓、腎臓ではほとんど検出されないが、肝臓におけるそのレベルは著しく高かった。四塩化炭素を経口投与して作製した急性肝障害サルでは、肝臓におけるHGF activator蛋白レベルはやや増加した。我々が確立したHGFactivator ELISA測定系は臨床的にも応用可能と思われ、さらには各種肝疾患患者における肝再生の病態解析に有用であると考えられる。