hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非経験的手法からの系のモデル化手法の研究

物質の原子構造を精度よく取り扱える非経験的電子状態計算が与える力場から、マルチカノニカルアンサンブルを媒介にしてその熱力学が最大限保持されるようにモデル原子間ポテンシャルを導く手法について、物質の3つの結合様式(イオン、金属、分子)について代表(MgO、Cu-Zr、水)を選んで、その能力を熱平衡として扱える融解の性質と非平衡の性質であるガラス化について検証し手法の改良を行った。非経験的な電子状態計算による原子・分子シミュレーションには高精度に物性を予測する能力があるが、より原子数の大きな系での有意義な応用にはこの手法の計算コストの大きさに起因する4つの限界(空間、状態数、時間、電子相関)を同時に乗り越える必要がある。これは計算機能力の向上のみでは達成できない。本研究の目的は、これらの困難のうち、主として状態数、時間の2つの限界を、multicanonical ensemble法に基づく新しい系のモデル化手法を、multicanonical法自体の拡張と連携させることによって非経験性による系の描写の正確さと精度を維持しつつ打開することである。具体的な目的は以下の三つである。(1)凝縮系の結合様式は金属結合、イオン結合、分子結合、共有結合に大別できる。代表者の既存の業績では共有結合(シリコン)のみが扱われているが残り3つによる物質もそれぞれの多様な物性を持っている。したがって共有結合による物質以外について申請者が提案する手法を利用可能にする。(2)multicanonical ensemble法は効率の良い状態空間探索法として知られているが、万能ではなく、実際、代表者の研究では、これを状態密度を多変数へ拡張することではじめてシリコンの液体結晶間の転移温度をヒステリシスを避けて精密に計算することができている。この拡張はシミュレーションの効率を左右する重要な要素であるので、目的(1)にあげた系についてそれぞれ適切な拡張を検討する。(3)(2)の適切な拡張は再現したい系の変化にも依存する。この拡張には相変化(状態数の問題)のみならず、化学変化(時間の問題)をも含めることができる。時間の問題は大変重要であるから後者についても研究する。これらに加えて関連する第一原理計算プログラムなどの研究開発も行う。主な内容はイオン結合系の代表としてのMgOである。MgOは融点が高いため、その決定において電子系の熱励起効果が無視できない。これを提案してきた手法で扱うには近似が必要である。そこで、マルチカノニカル集団中の各サンプルを高精度計算で計算する際の温度をサンプルがもっとも物理に寄与する温度にとり、サンプルの自由エネルギーと内部エネルギーを与えるモデル原子間ポテンシャルを別々に与え、自由エネルギーを与える方で分子動力学などを実行し、潜熱など内部エネルギーの評価は後者を使う近似を開発した。こうして、MgOの融点、融解熱、融解時の体積変化を計算した。融点は電子系の熱励起効果で100Kほど下がることがわかったが、これは液体側で電子系のギャップが閉じるために熱励起による自由エネルギーの減少が大きいことを反映している。得られた融点はPBEを用いているにもかかわらず実験値に近く、かつ、得られた潜熱は実験的な推定値(直接測定ではないが)に近いものであり、これらの点は既存のLDAによる結果とは異なっている。また融解の圧力依存性についても同様に調べた。MgOの融点の圧力依存性は重要であるが、実験と理論が一致していない。計算の結果OGPaで得たモデル原子間ポテンシャルは、各圧力で最適化したそれらとほぼ同等の結果を与えることがわかり、提案している手法が有用であることがわかった。しかしながら結果そのものは既存の理論と一致するもので実験との矛盾は解消しなかった。新しい交換相関汎関数PBEso1との比較も行ったが実験との不一致は解消しなかった。その他に第一原理計算プログラムTAPPの開発も重要である。T2KシステムへのTAPPの移行を行った。この結果、1CPUソケット内はスレッド並列、CPUソケット間はMPI並列のハイブリッド並列が最も性能が良いことがわかった。また次年度の研究のための準備も行った。主な内容は金属結合系の例としてのCuとZrの融解転移である。CuZrの合金にはバルク金属ガラスができるものがある。バルク金属ガラスは金属系において近年注目を集めている系である。CuTiZrの三元合金によるバルク金属ガラスの研究において用いられた2体的モデル原子間ポテンシャル(H.Teichler 2007)の関数形を採用して本研究で提案している第一原理からのモデル化を実施したところ、以下のことが分かった。Cuに対してはこのポテンシャル形は比較的うまく融解転移を第一原理からモデル化できる。すなわち、原子間力の残差は比較的小さく、転移温度は1225K(実験値1357.7K)体積変化率は0.049(実験値0.043)が得られる。潜熱は8.9kJ/mol(実験値13.2633kJ/mol)である。一方、Zrではモデル化の過程そのものが不安定になる傾向がみられた。

このことに関連すると思われるが、原子間力の残差がCuに比べて大きく、またストレスの残差がモデル化の過程で不安定になった。暫定的に得られたデータは、転移温度1995K(実験値2127.85K)、体積変化率0.044(実験値0.011,0.016)潜熱19.0kJ/mol(実験値20.9978kJ/mol)であるが大変不安定で信頼性に欠ける。この不安定さの原因はポテンシャルの関数形にあるはずであるが、そこでここまでの計算で得られた第一原理計算のデータと3体以上の効果が入るEmbedded Atom Model形のモデル原子間ポテンシャル形の組み合わせの試験を行ったところ、Zrのストレスに対する残差が大幅に改善することが分かり、この方向が期待できることが分かった。プログラム開発において予定していたせん断歪など非等方的ひずみに対する応答の計算コードの開発は完了し、次年度以降での利用のめどがついた。CuZr系に本研究計画で提案している手法を適用し、この系のモデル化を行った。昨年度すでに2体的なモデル原子間ポテンシャルではうまくいかないことが判明しているので、本年度はEmbedded Atom Model型のモデル原子間ポテンシャルを試したところ、良い結果を得ることができた。この際、ポテンシャル生成が安定になるよう、短距離部分の形状を工夫する必要があった。Cu単体とZr単体について、その融解転移に着目してモデル化を行った上で、CuZr間の相互作用をCuZrの1:1糸の融解転移に着目してモデル化を行ったところ、それぞれの融解温度の実験値を100K以内の誤差で再現できた。潜熱は純粋な系(Cu,Zr)については2kJ/mol以内の精度が得られたが、CuZr 1:1系については5kJ/mol実験値と食い違った。得られたモデル原子間ポテンシャルを用いてCuZr系の液体からの急冷によるアモルファス化をシミュレートしたところCu_<60>Zr_<40>のCuが多い組成ではX線実験による二体相関関数を良く再現することができ、特にr=0.3nmのピークの右側に見られる肩をある程度再現できた。一方でCu_<50>Zr_<50>やCu_<45>Zr_<55>のZrが多い組成では、この肩が実験では大きく成長してピークになっていくのに対して、依然として肩のままである食い違いがある。また計画していた第一原理プログラムの改良も実施し、新しく切り替わった物性研究所スーパーコンピュータシステムのシステムBにおいて、pyrope 640原子系の計算が256CPUまでスケールするなど、その性能を十分に引き出せるプログラムとすることができた。提案している手法には非平衡の性質を一定程度保持する可能性がある。これを検証するべく昨年度作成したCuZr系に対する原子間モデルポテンシャルを用いて、この系のアモルファス化のシミュレーションを行った。組成Cu_6Zr_4,CuZr,Cu_<45>Zr_<55>に対して得られたガラス転移温度は、800K程度と実験の650Kから700Kに近い値となった。
ポリスリッピングを利用するリサイクルポリマーの合成

本研究は、リサイクルポリマーの新しい概念を創出するための一つの方法論を提供するために行われたもので、特にロタキサン構造をという機械的な結合の形成-開裂を鍵とするもので、これまでにない新しい方法である。ジスルフィド結合はチオールとの反応で速やかな結合開裂を起こし、比較的遅い平衡を形成する。可逆的な結合開裂をリサイクルポリマーに活かすために、まずトリチルスルフィド結合(Ph3C-S)のロタキサン形成への応用について検討した。片末端に3,5-ジメチルフェニル基、もう片末端にトリチルスルフィド基、並びに中央付近に二級アンモニウム塩構造を持つ分子と、ジベンゾ-24-クラウン-8-エーテル(DB24C8)とを適当な溶媒中で加熱した。数時間後、反応混合物中から、対応するロタキサンが最高97%の収率で得られた。この反応では、トリチルスルフィド結合の可逆的な開裂において、輪成分であるDB24C8がダンベル分子中に滑り込むように入っていく。(スリッピング)ことで、ロタキサンが生成した。新しいロタキサン合成法としても注目される。一方、輪のサイズと軸末端のエンドキャップ基のサイズ相補性を利用するスリップ法のようなロタキサン合成法のほかに、軸末端に大きなエンドキャップ基をもつジスルフィドを用いて、ダンベル分子中のジスルフィドの可逆的な開裂を利用して輪成分を導入しロタキサンを得るスリップ法があるが、本研究ではこの方法をポリマー合成に応用する方法の開発に関しても研究し、興味深い成果を得た。すなわち、軸成分として、鎖状分子中央にジスルフィド結合、両末端にかさだかい置換基を有するに二級アンモニウム塩型ダンベル型の分子を設計した。このついで、ジベンゾ-24-クラウン-8-エーテル(DB24C8)構造を両端に持つイソフタルアミド型分子とこのダンベル分子とを、触媒量のチオフェノールとともにアセトニトリル-クロロホルム混合溶媒中で反応させることにより、ポリ[3]ロタキサンを収率35%(分子量は35000)で得た。クラウンエーテル/二級アンモニウム塩からなるロタキサンの系を利用したポリロタキサンの系について検討した.今年度は,シクロヘキシル基とジベンゾ-24-クラウン-8-エーテルのサイズ相補性を利用した熱的押し込み法によるポリスリッピングを試みた.4-カルボキシ-ジベンゾ-24-クラウン-8-エーテル(1)とシクロヘキシルメチルアミンよりアミド(2)を得た.2の水素化リチウムアルミニウム還元により対応するアミンを得,これをヘキサフルオロリン酸と塩形成させることにより,一方の末端に24-クラウン-8-エーテルユニットを持ち,もう一方の末端にシクロヘキシル基を持つ2級アンモニウム塩(3)を得た.3をクロロホルムに溶解させ,40°Cで静置し,^1H-NMRにより重合の進行を追跡した結果,30日後にはポリ[2]ロタキサン(4)の生成が示唆された.種々の条件検討の結果から,この重合挙動はモノマーの仕込み濃度や,温度,溶媒等によりある程度コントロールできることが分かった.また,4を高極性溶媒中に浸すと速やかにデスリッピング(解重合)が起こり,定量的にモノマー(3)を与えることが分かった.以上のように,本手法はポリ[2]ロタキサンの新しい合成手法として有効であり,また,得られたポリ[2]ロタキサンは優れたりサイクル特性を持ち合わせていることが示された.本研究は、リサイクルポリマーの新しい概念を創出するための一つの方法論を提供するために行われたもので、特にロタキサン構造をという機械的な結合の形成-開裂を鍵とするもので、これまでにない新しい方法である。このついで、ジベンゾ-24-クラウン-8-エーテル(DB24C8)構造を両端に持つイソフタルアミド型分子とこのダンベル分子とを、触媒量のチオフェノールとともにアセトニトリル-クロロホルム混合溶媒中で反応させることにより、ポリ[3]
神経系特異的AP-3B複合体・μ3Bサブユニットによる細胞内輸送機構の解析

μ3Bに結合するcargo候補分子としては、前年度に引き続き行っていたyeast two-hybrid解析、及びμ3B KOマウスの解析から、小胞型亜鉛トランスポーターZnT3と小胞型GABAトランスポーターVGATに焦点を絞り、解析を行った。ZnT3のC末端側、もしくはN末端側細胞質領域を、Tac(IL2受容体α鎖)及びインバリアント鎖(Ii)に繋いだキメラ蛋白質を作成し、これらをPC12細胞に発現させ、それらの局在を詳細に調べたところ、それぞれの領域にはエンドソーム、及びシナプス様小胞(SLMV)に局在するシグナルが存在することがわかった。そこで種々の変異体を用いて詳細に解析を行ったところ、それぞれの領域には異なる細胞内局在を規定するジーロイシン・シグナルが存在することが判明した。特にC末端側細胞質領域は、トランスゴルジ・ネットワーク(TGN)から細胞膜を経由せず直接エンドソーム/SLMVへの輸送を担っている事も明らかになった。そこで、ZnT3とμ3サブユニットの直接の相互作用を検討するために、GST-ZnT3蛋白質、及び精製μ3A及びμ3B蛋白質を用いてSPR解析を行った1ところ、非常にわずかではあるが特異的な結合が検出された。これらのことからAP-3A/Bは、ZnT3のC末端側細胞質領域に結合し、TGNから直接エンドソーム/SLMVへの輸送に関与する可能性が考えられる。VGATに関してもZnT3と同様なキメラ蛋白を用いて解析を行ったところ、N末側、及びC末側に細胞内局在を規定するシグナルの存在を確認した。特にC末側にはジーロイシン様シグナルが存在し、VGATのエンドサイトーシス、及び細胞内局在に関与する事が明らかになった。μ3B遺伝子欠損(KO)マウスでは、HPLCを用いた遊離アミノ酸の解析からKCl刺激による海馬からのGABAの遊離が低下していること、これに伴いCA1領域でのLTP誘導の閾値が低下していること、さらに、野生型マウスではGABA作動性の抑制性神経細胞により抑制されている大脳皮質嗅内野からCA1領域へのtemporoammonic経路が、μ3BKOマウスでは抑制されずに興奮性の伝搬が見られること等の現象から、μ3BはGABAの遊離に関与する可能生が示唆された。そこで、近年同定された小胞型GABA輸送体(VGAT)に着目し、野生型及びμ3BKOマウスの海馬におけるVGAT蛋白質レベルを生化学的手法により比較したところ、μ3BKOマウスでは全海馬分画、及び海馬シナプトソーム分画いずれにおいても野生型に比して有意に低下していた。このことから、μ3BはVGATをcargoとしてシナプス小胞への輸送に関与する可能性が示唆された。この可能性をさらに検討するために、μ3Bにより制御を受ける可能性のあるVGATアミノ酸配列を検索しところ、C末端側の細胞質領域にLIというジ・ロイシン様シグナルを見いだした。そこで、このジ・ロイシン様シグナルをTac(IL-2受容体α鎖)の細胞質領域に連結したキメラ分子を作製し、FACS解析によりジ・ロイシン・シグナルとしての活性があるかを検討したところ、LI配列の4残基上流のSをDに置換した変異体において、非常に強いジ・ロイシン・シグナル活性を認めた。現在、脳ライゼートを用いたpull-down解析、酵母2-hybrid解析などにより、μ3BとVGATの相互作用を検討中である。また、初代海馬神経細胞培養系を用いて、VGATがVAMP2と共局在することが確認されたため、現在、μ3BKOマウス由来の初代海馬神経細胞培養系におけるVGATの局在を解析中である。
細胞老化における小胞体膜貫通型タンパク質OASISの役割

小胞体は核膜と連続した細胞内小器官であり、細胞の生理機能制御において核・核膜との連携が示唆されている。本研究課題では小胞体膜タンパク質OASISに着目して、DNAや核膜の損傷、またそれらに起因して誘導される細胞老化における小胞体・小胞体局在分子の役割を明らかにすることを目的としている。OASISは活性化すると膜内切断を受け、生成されたN末端断片は転写因子として機能する。DNA損傷によってOASISは転写レベルで発現が誘導されると同時にN末端断片の増加も見られた事から、本年度はOASISの転写因子としての役割に焦点を当てて解析をした。初代培養したアストロサイトにドキソルビシンを処理し、DNA損傷を起こすと細胞周期抑制因子であり、細胞老化のマーカーとしても使用されるp21やp16のタンパク量がDNA損傷依存的に増加した。一方、OASIS欠損(KO)アストロサイトにおいては増加は見られなかった。BrdUアッセイを行うと、p21やp16の発現量と一致して、WTアストロサイトではDNA損傷依存的に細胞増殖が抑制されたのに対し、KOでは細胞増殖速度の低下が見られなかった。細胞老化アッセイの一つであるSA-β-gal染色を行うと、WTではドキソルビシン処理後3日目に多くの細胞が染色陽性を示すのに対し、KOでは染色がほとんど見られなかった。また、DNA損傷を与えたアストロサイトを用いてRNA-seqを行った。その結果、KOにおいてDNA損傷依存的な発現増加が軽減した遺伝子には、細胞周期停止、小胞体ーゴルジ体間輸送および細胞老化関連分泌形質(Senescence-Associated Secretory Phenotype; SASP)に関係する遺伝子が多く含まれていた。以上より、アストロサイトの細胞老化においてOASISが重要な役割を担うことが明らかとなった。今年度は、DNA損傷時のOASISの発現誘導シグナルとOASISの役割について解析した。OASISが高発現する中枢神経系アストロサイトにドキソルビシンやX線照射によってDNA損傷を与えるを、OASISの発現が転写レベルで誘導された。OASIS転写誘導の上流分子を特定するため、DNA損傷応答シグナルに着目し各種阻害剤を使用して解析を行った。その結果、ATMを阻害した時のみにOASISの転写誘導が著しく抑制され、DNA損傷の際に活性化したATMの下流でOASISの転写が誘導される事が明らかとなった。次に、DNA損傷時のOASISの細胞内局在について調べた。ドキソルビシン処理やX線照射によりDNA損傷を与えると、核膜の一部が突出したような構造(Bleb)の形成と、Blebの膜表面にOASISが高密度に集積した細胞が散見された。Bleb形成は、ウイルス感染や微小核形成、部分的な核膜損傷など様々な局面で観察される。Blebに集積したOASISの役割を明らかにするため、OASIS欠損細胞にDNA損傷を与えると、DNA損傷応答シグナルが増大しており、損傷の程度が増加することがわかった。これより、OASISは損傷したDNAの排出や核膜の安定性などと関わることが推察された。計画通り、OASISの発現誘導シグナルとOASISの役割を明らかにすることができたため。OASISの機能の詳細と、疾患との関連性について解析を進めていく。
家庭系有害廃棄物の適正管理

14年度は、国内外における家庭系有害廃棄物(HHW)と家電製品の保管および自治体への排出状況について、調査した。回収・リサイクルの事例が見られる一方、製品や地域により取り組み状況は様々であること、家電リサイクル法の施行により、廃棄物処理施設に流入する家電製品量は減少したものの、その他の多種の家電製品がかなり流入していることがわかった。15年度は、市民アンケートによりHHWと家電製品の排出実態を調査した。「危険・有害ごみ」の多くは使用後も家庭内に少なからず保有されていること、また自治体の指定以外の、処分時にリスクのあるルートへ排出されるものがあることがわかった。しかしHHWに対する市民の関心は高く、リスクの情報を提示することで廃棄行動が大きく変わる可能性が明らかになった。また家電リサイクル法はよく知られているのに比べ、PCと携帯電話のリサイクル制度の認知度は低かった。家電製品の中には、使えるが使わずに置いている"退蔵"の割合が大きいビデオカメラなどや、ビデオデッキなど電池を残したまま廃棄する可能性の高い製品があることも明らかになった。16年度は水銀含有製品の物質フロー解析を行い、蛍光管の循環システムを検討した。わが国で流通している製品由来の水銀1020tのうち、約5tが蛍光管に由来し、また回収される水銀は約0.6tであった。京都市における水銀処理に伴うリスクは、水銀量(kg-Hg)を指標にして、焼却(34)、破砕(17)、埋立(21)、リサイクル(4)であった。蛍光管回収・リサイクルシステムを導入して全量をリサイクルするとリスクは47kg-Hgに削減されるが、そのためには、回収への高い参加率や閉鎖系での再生品利用を考慮に入れた循環システムが必要であり、情報周知や回収システムの検討に加え、新たな規制策や技術、ビジネスモデルの創出を検討すべきであると考えられた。本年度は、家庭系有害廃棄物の実態把握のため、自治体および関連団体へのヒアリングと既存調査の整理を行った。また、リスク評価の予備検討として、曝露シナリオの作成、燃焼実験および環境動態モデル構築を行った。<自治体および関連団体へのヒアリング>家庭系有害廃棄物の対象製品候補として、家庭用農薬、消火器、一次電池、二次電池、携帯電話を取り上げ、製品生産量・出荷量・廃棄量・処理ルート・有害物質の使用量・法規制の対応状況・業界による自主的取り組み状況・拡大生産者責任およびデポジット制導入に対する業界の意向などを、関連業界に対してヒアリング調査した。<既存調査の整理>前年度までに実施していた家庭系有害廃棄物の模擬回収調査および排出実態に関するアンケート調査で得た情報の整理を行い、これら情報をデータベース化した。<曝露シナリオの作成>家庭系有害廃棄物の候補として防虫剤(パラジクロロベンゼン)を取り上げ、防虫剤が都市ごみと混合して燃焼された場合のダイオキシン類の生成・環境への排出・人への曝露、を曝露シナリオとして想定した。<燃焼実験>パラジクロロベンゼンを含む防虫剤とRDF(都市ごみ由来燃料)との混合物を燃焼試料として、ラボ炉での燃焼実験を行い、排ガス中のダイオキシン類の測定を行った。<環境動態モデルの構築>ダイオキシン類(PCDD/DFs, Co-PCBs)29異性体を対象として、多媒体環境運命予測モデル(MackayレベルIIIモデル)および食物連鎖/摂取量算出モデルを作成し、環境排出された化学物質のうち人が摂取する比率(摂取比率)を算出した。大気へ環境排出した場合の摂取比率は、2378-TCDDで約0.1%、08CDDで約0.001%と試算された。

家庭由来の有害廃棄物の量的な把握と、中間処理時の化学物質の挙動を把握するため、京都市に大型ごみ等として排出される家電製品の種類と量を調査した。自治体の廃棄物処理施設における排出実態調査と、アンケートによる市民の環境意識調査を行った。排出実態調査としては、大型ごみ搬入施設で搬入ごみを目視で確認するとともに、がらくたごみとして引取要請のあったごみを展開して、排出されている家電製品を調べた。大型ごみ中には、掃除機や炊飯器、照明器具、ビデオデッキ、テープレコーダー、ラジカセなどが多く排出されており、全家電製品では1日平均で約380台が排出されていた。がらくたごみ135点を展開して調べたところ、ポット、アイロン、キーボード、電話、ゲーム機など、小型の家電製品を中心に50種類、161台が確認された。また廃棄された携帯電話や電話の子機、リモコン,ハンドクリーナー、おもちゃ類に電池が含まれたまま排出されており、中間処理過程で重金属類が混入する一因となっていることが確認された。また市民意識を調査するために、家電製品の1)保有や排出に関する実態、2)処理方法の現状に関する意識、3)新しい排出ルートが出来た場合の意識・行動変化、について、京都市内の547世帯を対象として、アンケート調査を実施した。冷蔵庫、エアコン、洗濯機などの大型家電製品は新規購入に当たって古い機種が廃棄されるが、携帯電話やパソコンは、古い機種を家に持ち帰り、使わないまま、家庭内にため込む"退蔵"の割合が1724%と高いことが分かった。これらは最終的にがらくたごみとして排出される可能性が高く、デポジットシステムなどが必要であると思われた。また電池については、含まれていることが意識されていないケースも多く、廃棄時の対応策について詳しい情報を提供していく必要があると思われた。最終年度である16年度は家庭系有害廃棄物の循環システム構築に向け,モデルケースとして水銀を含む蛍光管を取り上げ,水銀含有製品の物質フロー解析(Substance Flow Analysis : SFA)およびリスク評価により,蛍光管の循環システム構築の可能性と方向性を検討した。水銀含有製品のSEへの結果,日本において利用されている製品に由来する水銀は,ライフサイクルを通して年間1020t流通しており,そのうち約5tが蛍光管に由来していること,また回収されている水銀は約0.6tのみであり,大半が中間処理を経て最終処分されていることがわかった。つづいて,蛍光管の循環・廃棄過程に着目して,京都市を想定した水銀フローに基づいてリスク評価を行った。現在のリスクは水銀のフロー量を指標にして,焼却処理,破砕処理,埋立処分の工程がそれぞれ34kg-Hg,17kg-Hg,21kg-Hgと大きく,リサイクル工程に起因するリスクは4kg-Hgと小さかった。これに対して,蛍光管の回収・リサイクルシステムを導入した場合,究極的には全量をリサイクルする循環システムを構築することが可能であり,その際のリスクは水銀フロー量で47kg-Hgとなり,ほぼ半減できることが予想された。
サイトゾルにおける膜透過性ペプチド（CPP）のリアルタイムイメージング

膜透過ペプチドは、細胞内へと様々な分子を導入することができる。しかし、それらの主な細胞内移行経路はエンドサイトーシスであり、導入物質の多くはエンドソーム内に留まる。本研究では、HEK293細胞のサイトゾルへ緑色蛍光物質(EGFP)および抗体(IgG)を移行させることができるペプチド配列を見出した。更に、このサイトゾルへの移行にはエンドサイトーシスが関与していることが分かった。タンパク質など高分子化合物の細胞内導入方法は、生体へのドラッグデリバリーを行う際に非常に重要な技術であると言える。しかし、その導入方法については様々な性質を持つ高分子に対してマルチに対応できる方法はもとより、イメージングに汎用されるGFPなど分子量23万程度の蛍光タンパク質の導入法でさえ未だ模索段階である。そこで本研究では、細胞内移行ベクターとして塩基性に富んだオリゴアルギニンからなる膜透過性ペプチド(CPP)を用い、細胞内への効果的な化合物の導入方法の開発を目指した。具体的には、サイトゾルに移行した分子のみを検出して評価できるリアルタイムイメージング法を確立し、最適導入条件の検討を行うことを目的とした。細胞内に導入されたタンパク質のみを検出する為に、蛍光タンパク質の再構成系を利用し、予め細胞内でN末端側を発現させておき、C末端側の断片を細胞内に導入することによって細胞内で再構成された蛍光を検出し、細胞内への導入効率を評価することとした。2013年度は、様々な種類のCPP、細胞種、蛍光タンパク質を用いてその組み合わせによる導入効率の違いについて比較検討を行った。更に、導入効率が良い組み合わせについて詳細な導入条件の検討を行うことにより、細胞内へ目的のタンパク質を高効率で導入することができる条件を見出した。この条件を用い、今後サイトゾル内へ導入されたタンパク質のリアルタイム検出を試みる。膜透過性ペプチド(CPP)を利用した高分子化合物の細胞への導入法は、薬物開発や臨床検査など様々な分野において注目されている。その理由として、特殊な装置や技術を必要とせず、約20アミノ酸残基からなるCPP配列に導入物質を付加することで簡単に細胞内へと導入可能である点が挙げられる。細胞がCPPを取り込む際の主経路はエンドサイトーシスが主であることから、サイトゾルへの移行効率の検討が課題の一つとなっている。これまでに、配列によってはCPP単独でサイトゾルへ移行する事が報告されているが、導入物質を付加した際のサイトゾルへの移行についてはあまり報告がない。そこで本研究では、サイトゾルへと移行した分子のみを検出して評価できるようなリアルタイムイメージング法の確立を目指した。具体的には、蛍光タンパク質の再構成を利用し、予め細胞内でN末端側を発現させておき、C末端側の断片を細胞内に導入することによって細胞内で再構成された蛍光を検出し、細胞内への導入効率を評価することとした。2014年度は、サイトゾル内へ導入されたタンパク質のリアルタイム検出を試みた。HEK293細胞において、導入タンパク質として用いた二種の緑色蛍光タンパク質のうち両方をサイトゾルへと移行させることができるCPP配列を見出した。複合体の形成条件や、細胞培養条件など様々な条件について検討を重ね、より高効率な移行を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察することができた。また、細胞内の蛍光についてリアルタイム観察を行ったところ、その導入メカニズムについて新たな知見を得ることができた。アルギニンペプチドなど膜透過性ペプチド(CPP)を用いたドラッグデリバリーにおいて、その主な細胞内導入経路はエンドサイトーシスである事から、導入物質のサイトゾルへの移行を如何に改善するかが大きな鍵となっていた。そこで本研究では、サイトゾルへの移行量を上昇させる為に、どのようなメカニズムでエンドソームから放出されサイトゾルへと移行しているのかを探る為に、サイトゾルにおけるCPPのリアルタイムイメージングを目的とした。今年度は、アルギニンペプチド(R12)へと付加することでタンパク質や抗体などの高分子(cargo)を高効率でサイトゾルへと高効率で移行させることができる配列(mPas)を見出し、詳細な検討により細胞内への導入メカニズムの一部を証明した。本課題の目的であるサイトゾル移行検出法の確立の目的は、CPPを用いたcargoの細胞内デリバリーにおいて、サイトゾルへの移行量が非常に少なく、ほとんど共焦点レーザー顕微鏡を用いた顕微鏡レベルでは確認できない事から、サイトゾル移行を証明する為に検出法の確立を目的とした。しかし今回見出したmPasによって、アルギニンペプチドを用いたサイトゾルへの移行量は劇的に上昇した。既に、EGFP、抗体(Alexa488で標識したIgG)などのサイトゾルへの移行を共焦点レーザー顕微鏡観察により検出することに成功している。また、導入メカニズムについては、各種エンドサイトーシス阻害剤を使用し、mPas-R12を用いたEGFPの細胞内導入量を、フローサイトメトリーと共焦点レーザー顕微鏡観察により解析を行った。現在のところ、エンドサイトーシスの一つであるマクロピノサイトーシス経路が導入に大きく関与しており、細胞内へ導入後は、初期エンドソームの段階でサイトゾルへと拡散されていることを示唆する結果を得ている。本課題の進捗状況については、導入物質のサイトゾルへの移行を劇的に上昇させるペプチド配列を見つける事ができた事が、研究の大きな推進力となった。生細胞への抗体導入は、分子量が大きく非常に難しいとされてきたが、サイトゾルへの移行を共焦点レーザー顕微鏡により確認することができた。また、mPas-R12を用いた細胞内デリバリーのメカニズムについても解析を進めることができた。様々な阻害剤を使用し、マクロピノサイトーシスの関与と、初期エンドソームからのサイトゾルへの拡散を証明することができた。

現在、これらのデータを論文としてまとめており投稿準備中である。膜透過性ペプチド(CPP)を用いたドラッグデリバリーにおいて、その主な細胞内導入経路はエンドサイトーシスであることから、サイトゾルへの移行効率の向上が課題であった。本課題では昨年度までに、アルギニンペプチド(R12)へと付加することでタンパク質や抗体などの高分子を高効率でサイトゾルへと移行させることができる配列(mPas)を見出していた。本年度はR12-mPasを用いて、HEK293細胞においてR12-mPasによる高分子(EGFP)のサイトゾルへの導入メカニズムについて解析を行った。アジ化ナトリウム存在下や低温条件下では、サイトゾルへの拡散が阻害されることが分かった。よって、細胞のエネルギー依存的にサイトゾルへと拡散していることが分かった。また、エンドサイトーシスの一種であるマクロピノサイトーシスの阻害剤として使用されるEIPAで細胞を処理したところ、サイトゾルへの拡散は阻害されなかった。しかし、サトカラシンDによって細胞骨格を構成するアクチンの重合を阻害したところ、サイトゾル拡散が阻害された。よって、R12-mPasによりEGFPはエンドサイトーシスで取り込まれ、アクチン骨格を利用した細胞運動によってサイトゾルへと拡散している可能性が示唆された。現在、これらの結果をまとめ現在学術雑誌へ投稿中である。また、生細胞内においてR12-mPasによる抗体導入による細胞内小器官へのターゲティングを試みた。ゴルジ体に局在するGiantinを認識する蛍光標識抗体を導入し、ゴルジマーカーとGianitin認識抗体が共局在している様子が共焦点レーザー顕微鏡観察により確認することができた。膜透過ペプチドは、細胞内へと様々な分子を導入することができる。しかし、それらの主な細胞内移行経路はエンドサイトーシスであり、導入物質の多くはエンドソーム内に留まる。本研究では、HEK293細胞のサイトゾルへ緑色蛍光物質(EGFP)および抗体(IgG)を移行させることができるペプチド配列を見出した。更に、このサイトゾルへの移行にはエンドサイトーシスが関与していることが分かった。計画では、2014年度までにCPPのサイトゾル移行検出法の確立を行う予定であった。しかし、確立するまでには至っていない。2014年11月に所属機関の異動を行い研究体制を整えるまでに多くの時間を費やした事が大きな理由である。計画していた系を立ち上げる事ができたが、リアルタイムイメージングへの応用は難しい事が分かった。しかし、より高効率でサイトゾルへと移行するCPP配列を見つける事ができた。今後は、細胞内オルガネラに対する特異的な抗体の導入を試みる。細胞内の標的を特異的に検出できるように条件検討を行いたい。
新規8員環形成反応を用いる抗腫瘍活性抗生物質FR-900482の合成研究

1.ラジカル前駆体の合成FR-900482は芳香環上に水産基及びホルミル基を有している。これらの官能基に変換可能な置換基を有するラジカル前駆体を合成するために5-methylcyclohexane-1,3-dione(1)を出発物質として用い、これを文献既知の方法により2位にアリル基を導入した。続いて2-allyl-5-methylcyclohexane-1,3-dione(2)を還流ベンゼン中、触媒量のp-toluenesulf-onic acid存在下にbenzylamineと縮合して2-allyl-3-benzylamuino-5-methyl-2-cyclohexenone(3)を収率良く得ることができた。次に3のdichloroacetyl chloride及びbis(phenylthio)acetyl chlorideによるN-アシル化を種々の条件下に検討したがいずれの場合も原料回収に終わった。これは3の窒素原子の求核性が低いためと考えられ、現在、ベンジル基の代わりにスルホニル基を導入した化合物について検討中である。2.環化成積体の化学変換(1-ベンズアゾシン誘導体の5位への官能基導入)ラジカル環反応績体1-(p-methoxybenzyl)-3-phenylthio-3,4,5,6-tetrahydro-1-benzazocin-2(1H)-one(4)を酸化して1-(p-methoxybenzyl)-3-phenylsulfiny1-3,4,5,6-tetrahydro-1-benzazocin-2(1H)-one(5)とした後、2,6-lutidine存在下トリフルオロ酢酸無水物で処理することにより、1-(p-methoxybenzyl)-3-phenylthio-5,6-dihydro-benzazoxin-2(1H)-one6(70%)に変換した。また、5をキシレン中還流することにより1-(p-methoxybenzyl)-5,6-dihydro-1-benzazoxin-2(1H)-one7(76%)に変換した。6のフェニルチオ基を再度酸化してスルホキシドとした後、その2,3-シグマトロピー転位により5位への酸素官能基導入を検討したが、転位体は得られなかった。現在、7を塩基で処理して生成するジエノレートの5位炭素のハロゲン化やアルキル化反応について検討中である。3.1-ベンズアゾシン誘導体の簡便合成法の確立1.ラジカル前駆体の合成FR-900482は芳香環上に水産基及びホルミル基を有している。3.1-ベンズアゾシン誘導体の簡便合成法の確立
健常児と広汎性発達障害児の心の理解能力の教育可能性に関する実験的研究

児童および成人の広汎性発達障害の中核症状である自閉症スペクトラム傾向の個人差を測定する尺度として、Autism-Spectrum Quotient(AQ)の一般用と児童用の日本語版を作成し、標準化を行った。この検査では、その得点によって、児童・成人とも90%程度の精度で自閉症スペクトラム状態(ASC)群を定型発達群から識別することが確認された。また、定型発達群にも、一定の割合で自閉症スペクトラム状態に該当する児童が存在することも明らかになった。これらの結果は、自閉症スペクトラム連続体仮説や超男性脳理論を支持するものである。次に、Baron-CohenのE-S理論に基づくEmpathy Quotient(EQ)とSystemizing Quotient(SQ)の日本語版を作成し、これを定型発達群と高機能自閉症スペクトラム群を対象に実施して、その結果を比較した。その結果、EQでは、高機能自閉症群が定型発達群よりも得点が低く、SQでは、高機能自閉症群が定型発達群よりも得点が高かった。人の顔の目の部分の写真を使用して、目からその人の心的状態を推測する能力を測定する課題(Eye Task)と、素朴物理学的な理解能力を測定する課題を作成し、定型発達児と大学生を対象に実施した。その結果、Eye taskでは、児童、大学生とも女性の方が男性よりも得点が高く、素朴物理学課題では、年齢が上昇するほど得点が高くなるという結果が示された。最後に、自閉症スペクトラム群を対象に、Eye taskと素朴物理学課題を実施した結果、Eye taskの得点が年齢と知能を対応させた定型発達群より明らかに低く、素朴物理学では、両群の得点に違いは認められなかった。動画を使用した他者の心的状態を推論させる課題では、アナログASC群と年齢を対応させた統制群に対して、それぞれ2群に分けた上で、一方に心的状態の理解についての学習経験を与え、学習の効果を比較した結果、いずれの群とも明確な学習の効果は認められなかった。本年度は,健常成人および健常な児童を対象とした自閉症スペクトラム傾向の測定と,自閉性障害圏(自閉性障害,アスペルガー障害,PDDNOS)とDSM-IVの基準にもとづいて精神科医によって診断された知能が健常範囲の成人と児童を対象とした自閉症スペクトラム傾向の測定を実施した,また,併せて,自閉症のExtreme Brain Theoryに対応するE-S Theoryにもとづいた2つの因果認知的傾向empathizingとsystemizingについても,その個人差を測定する目的で作成された尺度について,オリジナル版をもとに日本語版を作成し,標準化を行うとともに,これらの尺度を,上記の対象のうちの成人群(健常者と自閉性障害者)に実施し,その妥当性を検討した.その結果,自閉症スペクトラム傾向については,児童,成人ともに,臨床群(自閉症スペクトラム群)と健常群の分布が大きく異なり,実質上ある得点水準で2群に分かれること,また,健常児・者群では,自閉症スペクトラム上の個人差が正規分布し,個人の適応状態の予測に有効性を持っ可能性が示唆されるとともに,自閉性障害のアナログ研究が,児童・成人ともに可能であることが示唆された.また,empathizingとsystemizingについては,成人についてのみではあるが,自閉症スペクトラム傾向と同様に,2つの次元で臨床群と健常群で得点分布が乖離することが示され,自閉症スペクトラム群のsystemizing傾向の優位性とempathizing傾向の脆弱性が明らかになった.この傾向は,E-Sモデルにおける理論的仮説と一致していることから,この2つの因果

認知的傾向が自閉症スペクトラム研究上妥当な指標であることが確認された.また,健常者群では,この2つの次元上の得点分布が,ほぼ正規性を示したことから,一般健常者についてもE-Sモデルに基づいた個人差研究が可能であることが示唆された.なお,これらの研究成果については,現在複数の国際誌(英文)に投稿中である.登場人物の表情の変化などの視覚的手がかりによって他者の心的状態を判断する心の理解課題(視覚的心の理論課題)と,登場人物の発話のイントネーションなどの聴覚的手がかりによって他者の心的状態を判断する心の理解課題(聴覚的心の理論課題)を,健常者と知的水準の対応した広汎性発達障害者を対象に実施した。またそれとは別に,Empathizing-Systemizing(E-S)理論(Baron-Cohen,2002)に基づく2つの基本的な因果認知の指向性を測定する「EQ/SQ」を一般大学生,有職者,知的水準が健常範囲の広汎性発達障害者に実施した。その結果,まず,視覚的・聴覚的心の理論課題の成績では,健常者群では,同一場面での課題の成績を比較することによって,視覚的手がかりによる他者の心的状態の判断の方が聴覚的手がかりによる判断よりも容易であることが明らかになった。また,聴覚的心の理論課題では,女性の方が男性に比べて統計的に有意に得点が高いことが示された。なお,現時点では,広汎性発達障害者群については実験が継続中であるため,両課題の成績については明確な結果は明らかではない。次に,EQ/SQの結果では,健常群は,Empathizing, Systemizingともに得点は正規分布するものの,Empathizingでは女性の得点が有意に高く,Systemizingでは男性の得点が有意に高いという性差が確認された。そして,EQとSQの得点にもとづくBrain typeの出現頻度では,男性にS type,女性にE typeが多いことが明らかになった。これに対して広汎性発達障害群では,Empathizingでは低得点側に,Systemizingでは高得点側に得点分布が偏っており,Brain typeの出現率は,S typeが圧倒的に多く,E typeはいなかった。この特殊なBrain typeの出現パターンは,健常群とは統計的に異なるものであり,E-S理論に一致するものであった。児童の自閉症スペクトラム傾向の個人差を測定する尺度として、Autism-Spectrum Quotient (AQ)児童用の日本語版を作成し、標準化を行った。この検査は、その得点によって90%程度の精度で自閉症スペクトラム群を定型発達群から識別することが確認された。また、定型発達群にも、一定の割合で自閉症スペクトラム状態に該当する児童が存在することも明らかになった。これらの結果は、自閉症スペクトラム仮説や超男性脳理論を支持するものである。次に、Baron-CohenのE-S理論に基づくEmpathy Quotient (EQ)とSystemizing Quotient (SQ)の日本語版を作成し、これを定型発達群と高機能自閉症スペクトラム群を対象に実施して、その結果を比較した。その結果、EQでは、高機能自閉症群が定型発達群よりも得点が低く、SQでは、高機能自閉症群が定型発達群よりも得点が高かった。
放射光を用いた短ミリ波帯テフロン導波管回路の開発とその集積化に関する研究

本研究では、放射光エッチング製作プロセスに基づき、サブミリ波領域(300 GHz)へ直接応用できるテフロン導波管集積回路技術の確立を目的に、機能回路への発展と集積化(複数回路の一体化)を試みた。2つのE面方形空胴方向性結合器が接続された構造、E面電力分配器とホーンアンテナ2個の一体構造、十字型カプラと横断回路を組み合わせた4×4バトラーマトリクスを周波数180 GHzで試作・評価した。測定によりこれら回路特性を確認することができ、短ミリ波帯E面およびH面導波管機能回路の集積化が可能であることを明らかにした。本研究課題は,放射光直接エッチングを利用してテフロンの微細加工を行い,得られるテフロンパターンに金属膜を蒸着させることで短ミリ波帯導波管回路を開発・集積化する内容である.26年度は,まず,短ミリ波帯(G帯, 140-220GHz)をターゲットにして,その帯域で動作可能なテフロン導波管機能回路を設計した.例としてE面導波管型方形空洞カプラの設計を行った.なお,放射光エッチングプロセスを用いるこれまでの試作は,寸法・露光時間等の制限ですべてH面導波管型回路であった.本年度の研究で初めてE面導波管型回路の設計と製作を試みた.E面導波管回路はいわゆる縦置きの回路形状で,H面導波管よりコンパクトにできるため,集積化に適している.E面導波管型方形空洞カプラは,方形寸法や入出力導波管の接続位置などをパラメータとするE面内の2次元界分布で回路特性が決定される.設計は,E面平面回路法で実施した.比誘電率2.04で満たされたE面導波管寸法を0.40 mm×0.80 mmに選び,TE10モードがG帯で伝搬するようにした.これを基に,中心周波数180GHzで3dB結合器を設計した.結合器は4ポート回路であるが,伝送特性のみ評価可能な測定環境を用いる都合上,結合器2個を接続して再度合成された出力を評価することとした.また,分離ポートの終端は短絡とした.これを基に,テフロンシート(厚0.80 mm)上に結合器パターンを写したマスクを設置し,ニュースバル放射光施設BL2で放射光直接エッチングを行った.その後,テフロン表面にAuの蒸着と電解めっきを施すことで金属導波管構造を得た.そして,V帯信号を3逓倍して得たG帯信号を試作した結合器に入力し,伝送特性のみを検波器で測定した.シミュレーションと比較して,測定結果には176GHz,183GHzに落ち込みが見られたが,再度合成された3dB結合器の出力をG帯域内で確認できた.測定結果に含まれる特性劣化の原因調査は,今後の課題と考えている.27年度は,まず,放射光エッチングおよびマスク精度検討のため,これまでに試作例のあるバンドパスフィルタに対して,マスク寸法誤差を考慮したテフロン導波管回路の製作評価を行った.その際,電磁界シミュレータの計算値と比較することで寸法誤差を推定した.また,バンドパスフィルタは微小パターンを多く含むため強度不足で形状を維持できない.この問題に対処するため,掘り込みを設けたアクリル板にフィルタ回路を入れて,樹脂で固着する構造にして測定を行った.この構造によりテフロン導波管回路を集積化できる可能性を示した.製作したバンドパスフィルタの周波数特性および寸法精度の評価については,電子情報通信学会論文誌へ投稿した.次に,26年度中に行っていたテフロンE面導波管の試作を受けて,27年度は複数の機能回路を集積化したものとして,短ミリ波帯のE面2電力分配器とE面ホーンアンテナを一体化したパターンの試作を行った.放射光エッチングでテフロンシートの微細加工を行い,その表面に金をスパッタ蒸着させた.その後,アンテナ開口面の金属膜を手作業で除去することでアンテナとしての機能を完成させた.試作した分配器とホーンアンテナは,180GHzにおけるE面およびH面指放射パターンを測定することで評価した.放射パターンは,電磁界シミュレータの結果と大よそ一致していることが確認できた.これにより,分配器とホーンアンテナという2つの機能回路を一体化したテフロン導波管回路が実現できることを明らかにした.また,本製作プロセスを用いた更なる集積化を検討するため(来年度の準備のため),H面十字型3dBカプラとH面横断回路(0dBカプラ)を組み合わせた180GHz帯バトラーマトリクス回路の設計を行った.26年度は,測定器の制御プログラム等の再確認が必要との認識を示し,やや遅れているとの判断をした.27年度中に測定器の不確かさを改善するには至っていないが,測定の不確かさを避けるような回路を実験対象に選ぶことで,当初の研究目的を達成できる状態になった.27年度の主テーマであるアンテナの指向性特性は周波数固定で測れば良く,差し当たり周波数特性の測定精度を除外できるからである.本研究課題は,放射光直接エッチングを利用してテフロンの微細加工を行い,得られるテフロンパターンに金属膜を蒸着させることで短ミリ波帯導波管回路を開発・集積化する内容である.28年度は,集積化された短波ミリ波帯テフロン充填導波管バトラーマトリックスの製作を試み,課題の目的をほぼ達成するに至った.マルチビーム形成回路は,高度アンテナシステムにおいて重要なコンポーネントである.

試作に先立ち,まずテフロン導波管で十字型3 dB方向性結合器および横断回路(0 dB方向性結合器)を180 GHzで設計した.これは平面回路法および電磁界シミュレータHFSSを用いることで行った.次に,ホーンアンテナを一体化した4×4バトラーマトリクスを設計した.この設計は,180 GHz帯テフロン導波管の管内波長を基に,HFSS上で位相調整することで行った.これを基に,テフロンの放射光エッチング,金のスパッタ蒸着と電解めっきによりバトラーマトリクスを試作した.本導波管バトラーマトリクスはテフロンベースで薄く小さく十分な機械強度がない.本研究課題では回路形状を保持する目的で,アクリル容器内に固定させた.なお,ホーンアンテナの開口は,手作業でAu膜を切除することで実現した.最後に,バトラーマトリクスの放射パターンを測定し,設計結果と製作プロセスの妥当性を確認した.測定評価は,周波数3逓倍器を利用してV帯信号源(50-75 GHz)からG帯周波数(140-220 GHz)を得る環境を用い,デテクタによる受信電力の検波出力を用いて放射パターンを得ることで行った.これにより,測定結果の主ビームの方向が信号入力ポートに応じて変化していることを確認した.そして,それらの結果は,HFSSを使ってシミュレーションした結果と一致していることを確認した.本研究では、放射光エッチング製作プロセスに基づき、サブミリ波領域(300 GHz)へ直接応用できるテフロン導波管集積回路技術の確立を目的に、機能回路への発展と集積化(複数回路の一体化)を試みた。2つのE面方形空胴方向性結合器が接続された構造、E面電力分配器とホーンアンテナ2個の一体構造、十字型カプラと横断回路を組み合わせた4×4バトラーマトリクスを周波数180 GHzで試作・評価した。測定によりこれら回路特性を確認することができ、短ミリ波帯E面およびH面導波管機能回路の集積化が可能であることを明らかにした。26年度は,測定の不確かさを改善する目的でG帯ミキサを導入し,ダウンコンバートした信号を測定できる環境を構築する計画であった.このシステムを構築して実際に測定結果(周波数特性)も得られたが,これまでの検波器による測定と比べて有意な改善が見られなかった.測定器の制御プログラム等の再確認が必要と感じていることからやや遅れているとの認識である.28年度は,H面十字型3dBカプラとH面横断回路(0dBカプラ)を組み合わせた180GHz帯バトラーマトリクス回路の試作と評価を行う.製作プロセスは,これまでと同様の放射光直接エッチングによるテフロンパターンの加工と,金のスパッタ蒸着・めっきによる導波管構造の実現であるが,H面導波管構造を用いるため,E面の場合より回路が薄くなる.そのため,バンドパスフィルタに対して施したように,アクリル材に樹脂で固着させる.バトラーマトリクス回路は,指向性特性を評価する.4入力に対する4つの指向性特性が測定できることが望ましいが,露光スケジュールを見ながら,1ないし2入力に対する評価を目指す.マイクロ波ミリ波工学27年度は,測定器の制御プログラム等の再確認を行った後,引き続き26年度と同様の手順でG帯テフロン導波管機能回路の試作を行う.微小パターンを含むテフロンが(特に測定時に)強度不足で形状を維持できない問題に対処するため,テフロン導波管回路をアクリル板に樹脂等で固着させる方法を試みる.アクリル板はテフロン導波管回路の厚み・大きさに応じて掘り込みを設け,テフロン導波管回路が収納できる形状とする.
卵巣明細胞腺癌に特異的に発現するGIypican3の分子標的治療の確立

Glypican-3(GPC3)は細胞表面上に存在するGPIアンカーである。我々はGPC3が卵巣明細胞腺癌に特異的に発現していることを発見した。そこで、GPC3の分子標的治療について検討した。Sh-RNA法を用いて卵巣明細胞腺癌細胞株KOC7CでGPC3の発現抑制を行った所、タキソールに対する感受性は発現抑制群で増強し、アポトーシスは亢進していた。マウスを用いた腹膜播種モデルでも発現抑制群ではタキソール治療後の腹膜播種は、コントロール群よりもサイズは小さかった。このことから明細胞腺癌においてGPC3発現抑制とタキソールとの併用療法の有効性が示唆された。卵巣明細胞腺癌の特異的に発現するGlypican3の機能解析を行っているが、最初にsiRNAを用いたin vitroの実験では卵巣癌のキードラッグであるタキソールの感受性がGlypican3の発現抑制で回復することが確認できたが、ヌードマウスを使った腹膜播種モデルではsiRNAを用いた手技ではsiRNAがtransientな抑制効果しかないためGlypican 3発現抑制によるタキソール感受性の回復の確認ができなかった。そこでGlypican3のStable Knockdownを行うためshort hairpin RNA(sh RNA)を導入した。shRNAでGlypican3の発現を抑制した卵巣明細胞腺癌細胞株を投与したマウスではコントロールと比較してタキソール投与後の腹膜播種は明らかに抑制されていた。又腹膜播種組織は採取し、アポトーシスを調べたところ、Glypican 3抑制群ではアポトーシスの増加を認めた。このことからin vivoでもGlypican 3抑制によりタキソールの感受性の回復しアポトーシスが亢進していることが確認できた。現在この感受性回復にどのアポトーシス関連分子、シグナル関連分子が関与しているかをWestern blotで確認し、どのようなメカニズムでGlypican 3がタキソール感受性の回復に関わっているのかを検討している。またGlypican 3を標的としたペプチドワクチン療法に関しても現在、愛知県がんセンターと共同で研究を行っている。上皮性卵巣癌の中で明細胞腺癌にのみ特異的に発現しているGlypican-3の機能解析を行うために、卵巣明細胞腺癌細胞株KOC7Cにshort hairpin RNA法を用いてstable knockdownしたところ、Glypican-3発現抑制群ではタキソール感受性が野生株と比較し、亢進していた。またTUNNEL染色でアポトーシスを検討したところ、発現抑制群ではアポトーシスが亢進していた。このことからGlypican-3はアポトーシスを介してタキソールの感受性に関与していることが示唆された。また卵巣明細胞腺癌患者52例の手術検体のGlypican-3発現を検討するため、免疫組織染色を施行したところ、52例21例でGlypican-3の発現を認めた。Glypican-3発現症例は早期の症例に多い印象であった。予後との関連を検討したところ、明らかな相関は認めなかった。しかし病期をステージ1に限って検討すると、Glypican-3発現群は非発現群と比較して無病生存率は優位に低かった。Glypican-3と増殖の関連を検討するため、Ki-67染色を行った所、Glypican-3が発現している部位は、Ki-67は染色されず、Glypican3非染色部位ではKi-67の染色を認めた。このことからGlypican-3は卵巣明細胞腺癌では増殖抑制に働いている可能性が示唆された。明細胞腺癌の薬剤耐性には癌細胞のslow growthが関与しているという報告が散見される。これまでの自分のデータを加味すると卵巣明細胞腺癌ではGlypican-3は細胞増殖抑制に働くことでタキソールに対して抵抗性を示している可能性が示唆された。