hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生物種間を通じて共通して発現する生殖細胞特異的遺伝子群に着目した進化学研究

研究代表者は、これまで生殖細胞における'翻訳されるレトロポゾン化したイントロンレス遺伝子'に着目して研究を展開してきた。このような遺伝子について、平成14年度においてはこれまでの研究成果を哺乳類(マウス・ヒト)において発現臓器・発現量などについて体系化し、そのゲノム構造まで含めてまとめ、データベースとして公開した(http://dtbcog.gen-info.osaka-u.ac.jp/)。生殖細胞は世代を超え、あるいは太古の地球においては生物種を超えて生物進化と共に受け継がれてきた細胞である。生殖系列という考えのもとでは、生殖細胞の連続性は基本的には生命の起源にまで遡る。研究代表者は、これまでレトロポゾン化によるゲノムへの新規遺伝子の付加が生物の進化にどのような影響を与えてきたのかを探ることを目的として哺乳類→鳥類→両生類→魚類...と他生物種において進化を遡るようにこれら遺伝子のorthlogous geneの存在を探索してきた。平成14年度は東北大学臨海実験所の稲葉一男助教授と共同で、解読の終わったホヤゲノムシークエンスにおいて、これまでの解析からその重複時期が古いと推定されるイントロンレス遺伝子に関してorthologous geneの探索を開始し、すでに10個の遺伝子に関してホヤにおいてもイントロンレスであることを確認した。現在もマウス・ヒトにおけるデータベースの充実を図るとともに、ホヤにおけるイントロンレス遺伝子の探索を継続している。
東アジア地域におけるショウジョウバエ類多様性成立機構の解明

ショウジョウバエは多種多様な環境に適応放散しており、生物の適応進化を探求する上での極めて優れた分類群である。ショウジョウバエ科は、新生代第三紀初頭に、現在繁栄している多くの生物群と共に出現し、その後、始新世から漸新世にかけて東南アジア熱帯を中心に主要な系統群を分化させ、中新世以降北半球温帯域に進出していったと推定されている。ショウジョウバエ類がたどってきた歴史的、地理的過程は、多くの生物群にも共通している部分が多いものと考えられるが、豊富な生物学的情報や研究手法の導入が可能なショウジョウバエ類は、アジアグリーンベルトに沿った生物多様性成立機構の解明に最も優れた研究材料と言えよう。これまでの研究から、東アジア地域、特に中国南部は最もショウジョウバエの多様性に富む地域であり、ここから多くのショウジョウバエの進化系統が放散していったことが予想されることから、本課題が立案された。3年間の研究期間で行われた採集調査は延べ32名(593日)で、調査地点は中国9省17地点に及んだ。本研究での採集調査、および保管標本の分析によって、これまでのところ既知種は480種、新種とほぼ断定されるものが409種、疑問種を含めると800種以上にもおよんだ。既知種、未記載種を含めて雲南省では397種が採集され、東アジア南部がショウジョウバエ多様性の高い地域であろうという推測の正しいことがあらためて確認された。中国現地機関の協力を得て、これまで著しく情報が不足していたカブトショウジョウバエ亜科についての分類・系統学的研究と、ショウジョウバエ亜科のいくつかの主要グループについての進化遺伝学的研究を行った。研究は現在も継続中であるが、これまでに中国南部の多様な自然環境がショウジョウバエの多様性創出を導いてきたことを示唆する多くの重要な知見が得られている。本年度は中国のショウジョウバエ相の調査を行うための基盤つくりを中心課題に、計7回の海外派遣と、1回の班会議を実施した。第一次派遣から第四次派遣では、現地機関の協力要請と、幾つかの地域での採集調査を行った。訪問機関は、昆明動物研究所(昆明)、広東省昆虫研究所(広州)、湖北大学(武漢)、北京大学(北京)、東北師範大学(長春)、安微大学(合肥)、復旦大学(上海)である。班会議を開催し、各機関との協議結果、各機関の研究設備、採集調査面における立地条件、予備的採集調査結果などを詳細に検討し、本研究課題の遂行のために、研究年度を通じて、昆明動物研究所(張亜平教授)、湖北大学生物系(曾慶韜教授)の協力を仰ぐことを決定した。それらの現地機関にはあらためて具体的な研究計画を提示し、好意的な了解を得た。また、第五次派遣では韓国江原市の江原大学を訪問し、協力要請をした結果、金.勳教授、朴濟哲博士の協力が得られることになった。第二次派遣から第四次派遣では、予備的調査を目的として、現地の協力を得て雲南省自然保護区(鶏足山、大理など)、湖南省自然保護区(八大工山、天平山など)での採集を行った。得られた標本は、昆明動物研究所、湖北大学協力者に保管維持を要請し、その後の第六次、七次派遣で標本の同定作業を行った。予備調査ながら、非常に多くの標本が得られたため、全ての標本同定は次年度に持ち越されるが、いくつかの重要な知見が得られた。中でも特筆すべきは、雲南省自然保護区にて採集されたobscura種群である。

これまでに成された本種群の研究は多いが、本研究によって採集された種は明らかに新種かつユーラシア大陸での最南記録でもあり、本群の進化過程を論ずる際の非常に重要な研究対象となる。第六次、七次派遣ではまた、現地協力者に対して分子レベルでの研究、飼育交配実験などの技術指導を行った。昨年度の予備的調査結果を基に、東アジア地域のも最もショウジョウバエの多様性に富む中国南部を中心に本格的な採集調査および分類・系統学的研究を開始した。本年度は、合計6回の海外派遣と、1回の班会議を実施した。調査は、過去に本格的な調査が行われていなかった福建省と広西壮族自治区を中心に行われた。第一次派遣では、武漢市湖北大学曾慶韜教授他の協力を得て福建省武夷山自然保護区にて採集調査、および分類同定作業を行った。第二次派遣では、昆明動物学研究所張亜平教授、シャンユウ助手の協力の基に、広西壮族自治区の大明山、扶隆、平老山、桂林それぞれの自然保護区で大規模な調査を行った。得られた標本は昆明動物研究所に持ち帰り、大まかに分類する作業を行った。第三次、四次派遣では昆明動物研究所保管のそれらの標本についての同定作業、特定の種群に属する近縁種間の詳細な形態比較、交配実験と、動物研究所近郊での採集調査を行った。第五次、六次派遣では引き続き昆明動物研究所において形態による分類同定作業、新種記載作業を行うと共に、特定の種、種群についての分子集団・進化学的研究を行った。昨年の予備調査、本年度の調査で得られた標本は膨大な数にのぼり、一方で中国からの標本(未記載種)持ち出しが強く規制されていることなどから、分類作業、進化学的研究は標本のごく一部について行われたにすぎないが、興味ある知見が得られつつある。特に雲南省、広西壮族自治区でのショウジョウバエ多様性の高さは特筆すべきである。Drosophila属のobscura種群、virlis種群、Steganinae亜科では、合計20種を超える新種が含まれる。これらの新種についての系統解析は、東アジア地域のショウジョウバエ相の歴史を探る上での貴重な研究対象になるものと期待される。これまでに蓄積されたの研究と,昨年度,一昨年度の本課題における採集調査結果から,東アジア地域の中でも中国南部は最もショウジョウバエの多様性に富む地域であり,ここから多くのショウジョウバエの進化系統が放散していったことが確信された.最終年度である平成13年度は,これまでにも調査が行われ,ショウジョウバエ相に関して特に重要な情報が得られている中国南部(雲南省,広東省)を中心にさらに詳細な採集調査および分類・系統学的研究を行った(合計6回の中国派遣)得られた標本は,現地協力機関である昆名動物研究所(昆名市),華南農業大学(広州市)で分類同定作業を行うとともに,一部は飼育系統として確立し,細胞遺伝学的研究,交配実験,分子系統解析に供した.分担者が長期の滞在が出来ないため,交配実験など持続性を要する研究には困難が伴った.しかし,上記両機関には,日本側研究者が不在の期間も,系統飼育,基礎的データの収集に積極的に協力していただいた.また,従来は困難であった採集標本やDNAの日本への借り出しについて関係各機関へ働きかけ,許可を得ていただいた.3年間の採集調査で得られた標本は膨大な数にのぼった.現在それらを中国,日本で解析中であるが,1983年から10年間北川修(都立大名誉教授)によって行われた海外学術での既知種数440は,480種に増加した.さらに,疑問種,新種はそれに倍する890種に達するものと予想している.本研究での新種記載,進化学的研究はそれらのごく一部について行われたにすぎないが、興味ある知見が得られつつある。
肝類洞細胞に発現する特異蛋白のcDNAクローニングとその機能解析

A.抗星細胞モノクローナル抗体の解析1.抗星細胞モノクローナル抗体を作製した結果,線維化の進展する肝に発現するエピト-ブを認識することが判明した.本分子はWestern Blotによる解析では分子量78 KDaである.本分子を同定するために,星細胞からcDNA libraryを作製し,pBluescript II (+)にligationしてpBR322細胞へとtransformした.得られたtransformantが作製する蛋白をnitrocellurose膜に写し取り,モノクローナル抗体と反応する蛋白を産生しているcloneをスクリーニングしたがpositive signalが得られなかった.この原因として,1)libraryの問題,2)Screeningの問題,の二つが考えられる.これらを克服するために,再びlibraryを作製し、今後はλgtllに組み込んで抗体でスクリーニングする方法へ転換した.現在スクリーニングを継続中である.B.星細胞のtransformationを制御する機構の解析A.抗星細胞モノクローナル抗体の解析1.抗星細胞モノクローナル抗体を作製した結果,線維化の進展する肝に発現するエピト-ブを認識することが判明した.本分子はWestern Blotによる解析では分子量78 KDaである.本分子を同定するために,星細胞からcDNA libraryを作製し,pBluescript II (+)にligationしてpBR322細胞へとtransformした.得られたtransformantが作製する蛋白をnitrocellurose膜に写し取り,モノクローナル抗体と反応する蛋白を産生しているcloneをスクリーニングしたがpositive signalが得られなかった.この原因として,1)libraryの問題,2)Screeningの問題,の二つが考えられる.これらを克服するために,再びlibraryを作製し、今後はλgtllに組み込んで抗体でスクリーニングする方法へ転換した.現在スクリーニングを継続中である.B.星細胞のtransformationを制御する機構の解析
離散変数を含むエネルギーシステム最適化問題の解法に関する研究

平成14年度の研究によって以下の成果を得た。本年度はエネルギーシステムの最適計画問題に対する高速化アルゴリズムについて検討を行った。それぞれの計画問題では設備の設置・非設置を0-1変数として定式化し、分枝限定法と内点法を適用した高速解法の検討を行った。まず、昨年度の運用問題と同様に線形な制約を持った問題に対する検討を行った。問題としてエネルギープラントの設置問題ならびに熱供給配管の設置計画問題を考え、昨年度と同様のアルゴリズムの有効性を検討した。数値実験の結果、それぞれの問題に対して数割程度の計算時間の削減ができることを確認した。また計算時間の削減効果の要因として、分枝限定法で生成される部分問題数の削減と個々の部分問題に要する計算時間の削減の両方があることを示し、それぞれの効果のある問題の特徴を明らかにした。次に、非線形特性を有する問題として、電力系統の潮流制御を目的とした直列制御機器の設置計画問題に対して検討を行った。この問題では、電力バランスや潮流制約などで高度の非線形性を有する。そのためアルゴリズムを非線形対応のものに拡張した。拡張方法として、逐次線形化する方式と非線形性を直接高次の微分係数を用いる方式の両方を検討した。逐次線形化した方式では多くの問題で高速に最適解が得られるものの、問題の非線形性によって解が収束しない場合があることを示した。逆に、高次の微分係数まで考慮した方式では時間がかかるものの安定した収束結果が得られることを示した。エネルギーシステムの運用最適化問題では、運用および停止を0-1変数として定式化する場合が多い。そのため、混合整数計画問題になる。本年度はまず、この問題に高速解法として注目されている内点法を適用した手法について検討した。内点法はコールドスタートで線形計画問題を効率的に解くものの、ホットスタートではあまり効果がない。それに対して、従来から用いられている単体法はホットスタートが有効である。そこで、分枝限定法の枠組みの最初の緩和問題を内点法で解き、下位の部分問題を単体法で解くハイブリッド手法を用いた。内点法の解から下位の問題の有効な初期端点を導出する手法を適用することにより、部分問題数を削減できることを定性的に示した。エネルギーシステム運用問題の一つであるコージェネレーション運用問題での数値実験により、最初の緩和問題の計算時間ならびに部分問題の生成数を削減できることを確認した。また、最適運用問題は複数の時間帯における運用量を決定する問題となるため、時間帯ごとの制約式はほぼ同じ構造をもっている。これに起動や停止、または運転量の増加量の上限制約のように複数の時間帯の変数に関係する動的制約が加わる。このため制約行列は、時間帯毎のブロック対角行列と動的制約の行列から構成される。このブロックアンギュラー構造を利用した高速化についても検討し、内点法の移動方向を高速化した手法を提案した。簡単な問題に対して数値実験を行った結果、24時間モデルで数割程度の計算時問の短縮が確認できた。
神経膠芽腫の浸潤能獲得における増殖因子を介したArf6活性機構の解析

脳腫瘍において、臨床的に悪性度を規定しているものは、その浸潤能にある。そこで、浸潤過程のできるだけ根幹を成す分子の候補として、分子量G蛋白質であるArf6の解析を分子生物学的手法により検証した。Arf6及び制御分子の蛋白質の発現は、神経膠芽腫細胞株のIn vitroでの浸潤活性と相関することを確認した。Arf6及びArf6制御因子に対するsiRNAによって神経膠芽腫細胞株での浸潤能は抑制され、AMAP1の相互作用のインターフェースに作用するpeptide及び低分子化合物によっても神経膠芽腫細胞株の浸潤能は抑制された。臨床検体での免疫染色における検討を行ったところ、Arf6及びArf6制御因子のなかで、免疫染色が可能であったAMAP1は神経膠芽腫にも発現されていることが確認された。さらに腫瘍細胞が正常脳へ浸潤していく局面で高発現されている傾向が観察された。また、再構成系を用いた免疫沈降法などでArf6活性の上流因子としてEGFRの関連が示唆されており、約40-50%に増幅や過剰発現が観察されている神経膠芽腫において非常に興味ある知見といえる。従って、上記研究結果よりArf6を介した分子メカニズムは神経膠芽腫の浸潤局面においても特異的に機能している可能性が高いと考えられ、神経膠芽腫に対する治療としての新たな分子標的となりうることが示唆された。具体的にはArf6及びArf6制御因子に対するsiRNAを神経膠芽腫細胞株に導入し発現を抑制させた場合の、in vitroでの浸潤能(Matrigel透過性)・接着能・運動能の詳細な評価、及びArf6制御分子であるAMAP1の相互作用のインターフェースに作用するpeptide及び低分子化合物の効果として浸潤能を評価した。Arf6及びArf6制御因子に対するsiRNAによって神経膠での浸潤能(Matrigel透過性)は抑制され、接着能・運動能には影響を与えなかった。AMAP1の相互作用のインターフェースに作用するpeptide及び低分子化合物によっても神経膠芽腫細胞株の浸潤能は抑制された。従って、Arf6を介した分子メカニズムはGlioblastomaの浸潤においても特異的に機能している可能性が高く、新たな分子標的となりうることが示唆された。次年度、臨床サンプルでの蛋白発現の評価など、更に詳細に検討を重ねていく予定である。平成20年度に、Arf6及び制御分子の蛋白質の発現は、神経膠芽腫細胞株のIn vitroでの浸潤活性と相関することを確認した。平成21年度において、臨床検体での免疫染色における検討を行ったところ、Arf6及びArf6制御因子のなかで、免疫染色が可能であったAMAP1は神経膠芽腫にも発現されていることが確認された。

従って、上記研究結果よりArf6を介した分子メカニズムは神経膠芽腫の浸潤局面においても特異的に機能している可能性が高いと考えられ、神経膠芽腫に対する治療としての新たな分子標的となりうることが示唆された。
新規C-Myc結合タンパク質MM-1がん抑制遺伝子産物としての機能

MM-1結合タンパク質として転写co-repressorであるTIF1βが同定された.MM-1-TIF1β複合体にはc-Mycに加え,HDAC1,mSin3が含まれており,MM-1のc-Mycの転写能抑制はHDAC1阻害剤であるTSAにより阻害された.また,TIF1βのMM-1結合領域のみはdominat negative体として作用し,MM-1のc-Mycの転写能抑制が解除されるばかりでなく,数十倍ものc-Mycの転写活性と軟寒天中でのコロニー形成能を示した.このことから,MM-1はc-MycとHDAC転写co-repressorを介在する因子であることが明らかとなった.更に,c-Myc-MM-1ターゲット遺伝子の探索をDNAマイクロアレイ法で解析し複数の候補遺伝子を見出した.次に,MM-1結合タンパク質としてユビキチン分解系のタンパク質であるelongin B, proteasomesubuinits Rpt3, Rpn12が同定され,c-MycはMM-1導入により分解され,アルギニン変異体はその活性が低下していた.さらに,c-Mycのユビキチン化に必要とされる58番目のスレオニンの変異体,及びMyc boxI欠損c-MycもMM-1により分解され,c-Mycのユビキチン化がMM-1により抑制されることより,MM-1はc-Mycのユビキチン非依存性分解系を活性化している可能性が考えられた.2)MM-1アイソフォームMM-1は癌化のホットスポットであるヒト染色体12q13に位置し,6つのエキソンからなる.スプライシングの違いにより,MM-1α,-β,-γ,-δの4種が存在し,更にN末13アミノ酸が14番染色体由来の融合型MM-1(Fu-MM-1)が存在し,いずれもc-Mycとの結合能を有しているが,各組織での発現が異なり,MM-1α,-γは核に1MM-1δはリソゾームに,他は核と細胞質に局在した.MM-1結合タンパク質として転写co-repressorであるTIF1βが同定された.MM-1-TIF1β複合体にはc-Mycに加え,HDAC1,mSin3が含まれており,MM-1のc-Mycの転写能抑制はHDAC1阻害剤であるTSAにより阻害された.また,TIF1βのMM-1結合領域のみはdominat negative体として作用し,MM-1のc-Mycの転写能抑制が解除されるばかりでなく,数十倍ものc-Mycの転写活性と軟寒天中でのコロニー形成能を示した.このことから,MM-1はc-MycとHDAC転写co-repressorを介在する因子であることが明らかとなった.更に,c-Myc-MM-1ターゲット遺伝子の探索をDNAマイクロアレイ法で解析し複数の候補遺伝子を見出した.次に,MM-1結合タンパク質としてユビキチン分解系のタンパク質であるelongin B, proteasomesubuinits Rpt3, Rpn12が同定され,c-MycはMM-1導入により分解され,アルギニン変異体はその活性が低下していた.さらに,c-Mycのユビキチン化に必要とされる58番目のスレオニンの変異体,及びMyc boxI欠損c-MycもMM-1により分解され,c-Mycのユビキチン化がMM-1により抑制されることより,MM-1はc-Mycのユビキチン非依存性分解系を活性化している可能性が考えられた.2)MM-1アイソフォームMM-1は癌化のホットスポットであるヒト染色体12q13に位置し,6つのエキソンからなる.スプライシングの違いにより,MM-1α,-β,-γ,-δの4種が存在し,更にN末13アミノ酸が14番染色体由来の融合型MM-1(Fu-MM-1)が存在し,いずれもc-Mycとの結合能を有しているが,各組織での発現が異なり,MM-1α,-γは核に1MM-1δはリソゾームに,他は核と細胞質に局在した.
ヒトiPS細胞を用いた人工胎盤の創成と胎盤機能再生医療の開発

胎盤機能が妊娠中期(妊娠12-28週)に不全状態に陥ると、児は神経学的障害や発達障害を合併する頻度が高くなる。現在は待機療法が主流であるが、予後が不良な症例も多数存在しており、新規治療法の開発が待たれる状況である。2013年iPS細胞由来の肝細胞と血管内皮細胞、羊膜幹細胞を共培養することで3次元構造を有する機能的な人工肝臓を作成が成功したことが報告された。この報告に次いで、腸、肺、腎臓、心臓、脳など各種臓器の立体的器官芽作成が報告されたが、いまだ胎盤の作成に関する報告はなされていない。一方で、ES細胞やiPS細胞から絨毛様細胞を誘導する方法は確立されつつあるが、その細胞生物学的性質や分化過程は未だ不明な点も多い。本研究はiPS細胞を用いて機能的なヒト胎盤を創り出し、胎盤機能不全に対する「人工胎盤移植による胎盤機能再生医療」を開発し実臨床へ展開するための基礎的知見を得ることを目的とする。現時点での具体的な実績としては1.ヒトiPS細胞からの絨毛様細胞への誘導とその生物学的性質についての検討、2.試験管内での立体的胎盤器官芽(ミニ胎盤)の作成、3.作成した器官芽の免疫不全マウスへの移植の3点を遂行することができた。具体的過程については、1.ヒトiPS細胞から絨毛様細胞への分化過程における遺伝子発現パターンをqPCR法でiPS細胞の状態から誘導8日目まで2日毎に評価した。誘導4日目の細胞においてiPSマーカーのOCT4と絨毛幹細胞マーカーのCDX2が減少し、細胞性栄養膜細胞マーカーのCK7が増加している点から、誘導4日目の絨毛様細胞が初期の胎盤器官芽作成に至適であることを見出した。同様の結果を細胞染色法、ELISA法でも確認した。2.誘導したヒトiPS細胞由来絨毛様細胞に、当院の帝王切開患者より採取した臍帯由来の血管内皮細胞と羊膜由来の間葉系幹細胞を加え72時間共培養することで、胎盤の立体的器官芽を作成することに成功した。作成した器官芽の免疫染色を行い、1.で得られたものと同様の各種マーカーの発現を確認した。3.作成した器官芽を免疫不全マウスの子宮内に局注することで、局所への生着を確認した。また子宮に生着した器官芽には絨毛細胞のマーカーであるHLAGが発現していることを摘出子宮の免疫染色で確認した。胎盤機能不全に対する治療を研究のゴールに設定した場合、最終的な移植臓器は胎盤となる。妊娠免疫不全マウスの胎盤への器官芽移植を試みたが、4例施行したうち1例は術直後に流産となった。残り3例で胎仔45匹のうち23匹(約50%)は子宮内死亡となった。生体仔の体重はコントロール群の平均0.8gに対して0.4g前後と1/2程度の発育不全を認めた。胎盤重量に明らかな差は認められなかった。胎盤への移植は実験手技としての難易度が高く、手技の再検討を要すると思われる。病的胎盤に起因する早発型の重症妊娠高血圧症候群や胎児発育不全の児の予後は不良である。本研究は概ね順調に進展している。

一方で、ES細胞やiPS細胞から絨毛様細胞を誘導する方法は確立されつつあるが、その細胞生物学的性質や分化過程は未だ不明な点も多い。本研究はiPS細胞を用いて機能的なヒト胎盤を創り出し、胎盤機能不全に対する「人工胎盤移植による胎盤機能再生医療」を開発し実臨床へ展開するための基礎的知見を得ることを目的とする。現時点での具体的な実績としては1.ヒトiPS細胞からの絨毛様細胞への誘導とその生物学的性質についての検討、2.試験管内での立体的胎盤器官芽(ミニ胎盤)の作成、3.作成した器官芽の免疫不全マウスへの移植の3点を遂行することができた。具体的過程については、1.ヒトiPS細胞から絨毛様細胞への分化過程における遺伝子発現パターンをqPCR法でiPS細胞の状態から誘導8日目まで2日毎に評価した。誘導4日目の細胞においてiPSマーカーのOCT4と絨毛幹細胞マーカーのCDX2が減少し、細胞性栄養膜細胞マーカーのCK7が増加している点から、誘導4日目の絨毛様細胞が初期の胎盤器官芽作成に至適であることを見出した。同様の結果を細胞染色法、ELISA法でも確認した。2.誘導したヒトiPS細胞由来絨毛様細胞に、当院の帝王切開患者より採取した臍帯由来の血管内皮細胞と羊膜由来の間葉系幹細胞を加え72時間共培養することで、胎盤の立体的器官芽を作成することに成功した。作成した器官芽の免疫染色を行い、1.で得られたものと同様の各種マーカーの発現を確認した。3.作成した器官芽を免疫不全マウスの子宮内に局注することで、局所への生着を確認した。また子宮に生着した器官芽には絨毛細胞のマーカーであるHLAGが発現していることを摘出子宮の免疫染色で確認した。現時点では胎盤局所への移植が成功しておらず、今後は妊娠免疫不全マウス胎盤への器官芽移植を中心に研究を進めていく方針である。また並行して論文作成も進め、本研究終了後はその成果を速やかに共有することを目指す。胎盤機能不全に対する治療を研究のゴールに設定した場合、最終的な移植臓器は胎盤となる。妊娠免疫不全マウスの胎盤への器官芽移植を試みたが、4例施行したうち1例は術直後に流産となった。残り3例で胎仔45匹のうち23匹(約50%)は子宮内死亡となった。生体仔の体重はコントロール群の平均0.8gに対して0.4g前後と1/2程度の発育不全を認めた。胎盤重量に明らかな差は認められなかった。胎盤への移植は実験手技としての難易度が高く、手技の再検討を要すると思われる。
離島の文化に即した全人的災害時保健師活動モデルの考案

2016年度の調査に基づき、離島における文化に即した災害時保健活動を、災害周期の各期に沿って分類整理したモデル案を作成した。文化の内容は、主に人々の紐帯、気質、時間感覚、島への愛着などだった。活動方法は、災害保健活動の方法とほぼ同様であるが、ニーズの引き出し方等に文化への配慮が特にみられた。作成した案を、数名の災害保健に精通する保健師へ確認したのち、災害周期を通底した案を作成し、2017年度には全国の離島の保健師へ、郵送調査により意見聴取した。2018年度は、2017年度の郵送調査の際に、インタビューに協力いただけるという回答を得た全国4つの離島の保健師へ、修正した保健活動案について聞き取り調査を行った。聞き取り調査の対象となった保健師は、離島での平均20年の活動経験を有し、離島に居住していた。文化に即した災害時保健活動案は、全体に合意が得られたが「支え合いが一時的に弱まる」の意味合いや「識字率」等の文言の適切性について、再検討を要した。また、2016年度の調査では語られなかった遺族へのケアの様式などについて、追加のデータが得られた。一方、2017年度に離島や災害に関する専門家・実践者の意見を聴取した際に、災害周期を通底した文化に即した保健活動が必要ではないかという助言に基づいて、災害周期を通底した案を作成し、その案と案に対する郵送調査結果を、2018年度の学会で発表した。学会参加者との種々の意見交換の後、モデル自体は災害周期ごとに整理をして示したほうが、実践的であろうとの方向性が得られた。2018年度は、全国の離島の保健師のうち、協力が得られる保健師へ、2017年度に作成した案を聴取する予定であった。しかし、豪雨災害等の影響で、聞き取り調査を行う予定の保健師の一部において調査が保留となった。そのため、一部の離島の保健師へ追加調査を実施し、データの追加等を行う必要が生じた。また、2017年度の専門家・実践者との検討会でいただいた助言を踏まえて、災害周期を通底した災害時保健活動案を作成し、2018年度の学会発表において公表した。学会会場における種々の討論の後、災害周期を通底した災害時保健活動案も理論上は重要ではあるが、災害周期ごとの保健活動を示すほうが実践的であるとの方向性が得られた。そのため、2019年度は分析結果を見直し、災害周期ごとの保健活動を抽出しなおし、全体の内容の精錬を図る必要が生じた。2018年度に保留となった離島の保健師に対するインタビュー調査を実施する。調査結果を共同研究者と共に分析し、2018年度に作成した案に追加修正を加えて内容を精錬する。精錬した内容を加味して、2018年度に公表した結果について、緊急対応期・急性期・亜急性期・中長期等の災害周期に応じて活動を分類整理する。再検討した内容を、先行研究や既存の知識体系と照らし合わせて新規性、有用性を検討する。さらに、災害看護・文化看護・離島保健活動等の実践家や研究職と検討し、内容の精錬を図るとともに実効性を高める。上記と並行して、国内外の各種学会等に参加し、情報交換や意見交換を行い、モデル構築の参考とする。九州南部の4つの離島における災害時保健活動の実態と住民の対応を調査した。急性期亜急性期の地域の文化を含む保健師の直接支援は<安堵感を優先した体制><紐帯の保持><清潔習慣の受容と助言>等だった。具体的には<清潔習慣の受容と助言>とは<タオルを共有しないことは他人行儀ではなく効用を説明する>だった。地域の文化を含む島民の自助共助は<移動手段を駆使した救出><開放的な関係を活用した安否確認><保管食材を活用した炊き出し>等が得られた。具体的には<移動手段を駆使した救出>とは<瀬渡し船を利用し川から園児を救出する>だった。慢性期の保健師の直接支援は<紐帯からの解放><住まい方の保持><購買習慣への配慮><飲酒習慣の受容と助言>等だった。具体的には<紐帯からの解放>とは<島民同士では吐けない弱音を受容する>だった。島民の自助共助は<伝達方法を駆使した情報共有><移動手段を活用した生活必需品の確保>等だった。具体的には<伝達方法を駆使した情報共有>とは<集落の区報を再開し一時帰島時の様子を共有する>だった。復旧復興期の保健師の直接支援は<行政手続きへの抵抗緩和><時間感覚を先読みした健康管理><紐帯の再構築>等だった。具体的には<行政手続きへの抵抗緩和>とは<支所以外の窓口での町営住宅申し込みに同行する>だった。島民の自助共助は<自然の在り方の受容><紐帯の代行依頼>等だった。具体的には<自然の在り方の受容>とは<前回の噴火後に山が回復していった様子を若い人に伝える>だった。調査はH28年10月からH29年2月に実施し、調査対象地域は、自然災害が多発する九州南部で最近数年以内に自然災害が発生した4島とした。

調査対象者は自然災害時に島民を直接支援した市町村保健師8名で、調査内容は支援の経過、及び考慮した地域の文化を聞き取った。次に島民6名に被災の経過、及び保健師の支援を聞き取った。分析は質的記述的方法を用い、聞き取り調査の逐語録から、地域の文化を含む保健師の直接支援、及び地域の文化を含む島民の自助共助に関する記述を抽出し、各々災害周期毎に分類整理した。それらの結果を、H29年8月までに有識者を含めて検討し、郵送調査に移る予定である。平成28年度に実施した離島の自然災害時における地域の文化に即した保健活動と住民の自助・互助について、分析し、日本地域看護学会学術集会で公表した。公表の際に、参加者や座長から受けたコメント等をもとに、分析結果を精錬し、離島の文化に即した災害時保健活動の素案を作成した。作成した素案を、研究者らのネットワークを活用して数名の保健師に文言や内容について確認してもらい、その結果を受けて、さらに修正を加えた。素案は「近所づきあいや婦人会・消防団などの住民同士のつながりを活かしたり考慮に入れる」「近隣の繋がりから漏れている被災者がいないか確認したりもれないようにする」等、21項目に整理された。修正した素案の妥当性を確認するために、全国の有人離島を管轄する149市町村の保健師へ郵送調査を行った。51人より返送があった(有効回答率35%)。離島の人口規模で、1万人以上との島と1万人以下の島で、回答を比較したところ、人口1万人以下の島では「遠慮しがち/遠慮がないなど、住民性に配慮してコミュニケーションのとり方等を工夫する」「話す速度や物事に時間をかけるなど、時間感覚に合わせる」など、コミュニケーションや価値観に関する優先順位が優位に高かった。その結果について、離島の生活や災害に精通する研究者2名に助言を受け、災害周期の区分を見直すこととした。平成29年度は郵送調査と、郵送調査で「追加のインタビューに協力する」と回答した5市町村の保健師へ聞き取り調査を行う予定だった。しかし、郵送調査の回答が遅れ、回答の期限を1か月延長したことと、インタビュー対象者との日程調整が難航したため、平成29年度中にインタビュー調査は、1町のみの実施にとどまった。平成30年5月には聞き取り調査を実施する調整がついたため、今後の調査は支障なく進むものと思われる。2016年度の調査に基づき、離島における文化に即した災害時保健活動を、災害周期の各期に沿って分類整理したモデル案を作成した。文化の内容は、主に人々の紐帯、気質、時間感覚、島への愛着などだった。活動方法は、災害保健活動の方法とほぼ同様であるが、ニーズの引き出し方等に文化への配慮が特にみられた。作成した案を、数名の災害保健に精通する保健師へ確認したのち、災害周期を通底した案を作成し、2017年度には全国の離島の保健師へ、郵送調査により意見聴取した。2018年度は、2017年度の郵送調査の際に、インタビューに協力いただけるという回答を得た全国4つの離島の保健師へ、修正した保健活動案について聞き取り調査を行った。聞き取り調査の対象となった保健師は、離島での平均20年の活動経験を有し、離島に居住していた。文化に即した災害時保健活動案は、全体に合意が得られたが「支え合いが一時的に弱まる」の意味合いや「識字率」等の文言の適切性について、再検討を要した。また、2016年度の調査では語られなかった遺族へのケアの様式などについて、追加のデータが得られた。
コラーゲンゲル包埋培養法による制癌剤感受性試験に関する研究

コラーゲンゲル包埋培養法は、癌化学療法の奏効率の向上と毒性の軽減を図るために、in vitro感受性試験として開発された。その結果、in vivoでの腫瘍組織内の制癌剤のAUC(area under the concentration and time curve)に基づいた至適接触条件の設定が確立された。これは、制癌剤の薬理動態を考慮した設定であり、in vivoの感受性試験と同じ結果が得られた。また、内分泌療法剤であるTamoxifen(TAM)およびMedroxyprogesteron acetate(MPA)については、17β-estradiolの添加の有無をも含めた環境下での接触条件を設定確立することができた。また、抗腫瘍効果の判定は従来より行なっている方法に改良を加え、neutral redを併用することにより生細胞のみの判定が可能となり、より精度を高めることが可能となった。さらに、ヒト乳癌細胞株に対する制癌剤と内分泌療法剤の併用療法を行ない、抗腫瘍効果の増強を確認した。つまり、乳癌に対して内分泌療法剤の併用により、制癌剤の投与量の減量が可能であることが示唆するデータが得られた。臨床への応用では、本法によりTAMに"感受性あり"と判定された症例では、"感受性なし"と判定された症例に比し、TAMの投与により生存期間の延長がみられた。これは、本法が臨床への応用の可能性を示唆する成果と考える。コラーゲンゲル包埋培養法による制癌剤感受性試験の至摘接触条件を設定するために、CDDP,VP-16,5-FUの実験的感受性と臨床有効率を比較し、さらにヌードマウス法との相関性を検討した。また担癌ヌードマウスでの制癌剤の腫瘍組織内濃度を測定し、area underconcentration curveを作成し、至適接触条件について実験を行なった。以上の結果より、コラーゲンゲル包埋培養法での至適接触条件が設定され、この条件下で制癌剤感受性試験は臨床面での応用が可能であると判断された。また、本法を乳癌の内分泌療法剤の感受性試験に応用すべく、乳癌細胞株を用いて至適接触条件の設定を検討し、各内分泌療法剤の抗腫瘍効果を求めている。本年度は、乳癌細胞株を用いて、コラーゲンゲル包埋培養法におけるホルモン療法剤、TamoxifenおよびMedoroxyprogesterone acetateの至適接触条件の設定を試みた.その結果、TAM 10^<-7>Mの持続接触にてreceptor陽性細胞株のT/C(%)は、陰性細胞株のT/C(%)に比べ有意に低値であった.更にTAM10^<-7>MのT/C(%)in vivoのT/C(%)とよく一致した.以上の基礎的データからT/C(%)値・60%以下を“感受性あり"と設定し、臨床材料について感受性試験を行なった.その結果は、TAM“感受性あり"判定された12例には再発は認められず、一方、TAM“感受性なし"と判定された8例中3例に再発を認めた.以上の如く、本法はホルモン療法剤においても、その選択と抗腫癌効果を予測する上で有用な方法であり、MPAについても、同様の検討を行なっている.また、内分泌療法剤であるTamoxifen(TAM)およびMedroxyprogesteron acetate(MPA)については、17β-estradiolの添加の有無をも含めた環境下での接触条件を設定確立することができた。
複製配置コストとアクセスコストを両立したデータセントリックストレージ

本研究では,従来の無線センサネットワーク上のデータセントリックストレージの欠点,(1)データアクセスコストの増大,(2)データアクセスコストの増大,を克服した実用的なデータセントリックストレージシステムの開発を目的としている.今年度は,昨年度に設計したアルゴリズムDynamic Replica Arrangement on Concentric circular Arcs(以下DRACA法,Dynamic Cache Arrangement on Concentric circular Arcsから名称変更)をシミュレータ上に実装し,性能評価を行った.DRACA法では,ハッシュによってマッピングされた地理上の点を中心とする同心円の円弧上のノードをデータの要求頻度に応じて複製配置先として選択し,これらのノードによって構成するツリーによって複製を管理することでアクセスコストとデータ更新コストの両者を低減する.シミュレーションの結果,特にデータ要求の局所性が高い場合において,提案方式は従来手法に対して高い通信コスト低減効果があることが確かめられた.加えて,昨年度に設計,開発したデータセントリックストレージとともに使用する広範囲に配置されたセンサネットワークの省電力化機構(Hierarchical Geographic Adaptive Fidelity:HGAF)に対して,実環境上でネットワークが動作不能になるまでの長期間稼働実験を行った.実験の結果,HGAFはセンセノードの密度が高い場合には,従来手法(GAF)に対して3倍以上のネットワーク寿命延長効果があることを確認できた.さらに,HGAFがノードのグループ化に用いる正方形の領域を6角形とし,起動ノードの選択法を工夫した方式を開発し,シミュレーションにより,この改良手法でさらなるネットワーク寿命延長効果が得られることを確かめた.本研究では,従来の無線センサネットワーク上のデータセントリックストレージの欠点,(1)データアクセスコストの増大,(2)データアクセスコストの増大,を克服した実用的なデータセントリックストレージシステムの開発を目的としている。今年度は,このための基本的なアルゴリズムDynamic Cache Arrangement on Concentric circular Arcs(以下DCACA法)の設計を行った。DCACA法では,ハッシュによってマッピングされた地理上の点を中心とする同心円の円弧上のノードをデータの要求頻度に応じて複製配置先として選択し,これらのノードによって構成するツリーによって複製を管理することでアクセスコストとデータ更新コストの両者を低減する。加えて,データセントリックストレージとともに使用する広範囲に配置されたセンサネットワークの省電力化機構(Hierarchical Geographic Adaptive Fidelity: HGAF)を設計,実装した。HGAFは,現在位置によってグループ化したセンサノード群を,さらに複数のサブグループに分割する。各グループ内のサブグループを周期的に選択し,選択されたサブグループの中からデータ中継用に起動するセンサノードを選定する。本手法は位置情報を用いた省電力化を行うという観点から,前出のDACAとの親和性が高い。開発した両手法の評価のために,MICAMote36台からなるセンサネットワーク用のテストベッドを構築した。HGAFの動作実験を行い従来手法(GAF)との比較により,その有効性を確認した。また,仮想ノードを用いたセンサネットワークエミュレーション環境の基礎設計を行った。今後,これらテストベッドを用いてDCACA法,HGAFそれぞれの評価・改良と,両者を組み合わせた実用的システムの設計を進める予定である。本研究では,従来の無線センサネットワーク上のデータセントリックストレージの欠点,(1)データアクセスコストの増大,(2)データアクセスコストの増大,を克服した実用的なデータセントリックストレージシステムの開発を目的としている.今年度は,昨年度に設計したアルゴリズムDynamic Replica Arrangement on Concentric circular Arcs(以下DRACA法,Dynamic Cache Arrangement on Concentric circular Arcsから名称変更)をシミュレータ上に実装し,性能評価を行った.DRACA法では,ハッシュによってマッピングされた地理上の点を中心とする同心円の円弧上のノードをデータの要求頻度に応じて複製配置先として選択し,これらのノードによって構成するツリーによって複製を管理することでアクセスコストとデータ更新コストの両者を低減する.シミュレーションの結果,特にデータ要求の局所性が高い場合において,提案方式は従来手法に対して高い通信コスト低減効果があることが確かめられた.加えて,昨年度に設計,開発したデータセントリックストレージとともに使用する広範囲に配置されたセンサネットワークの省電力化機構(Hierarchical Geographic Adaptive Fidelity:HGAF)に対して,実環境上でネットワークが動作不能になるまでの長期間稼働実験を行った.実験の結果,HGAFはセンセノードの密度が高い場合には,従来手法(GAF)に対して3倍以上のネットワーク寿命延長効果があることを確認できた.さらに,HGAFがノードのグループ化に用いる正方形の領域を6角形とし,起動ノードの選択法を工夫した方式を開発し,シミュレーションにより,この改良手法でさらなるネットワーク寿命延長効果が得られることを確かめた.
単分子膜と高分子超薄膜との状態相関に関する研究

固体表面近傍では高分子鎖は基板の影響をうけてコンホメーションや配向がバルク状態とは異なることが様々な手法を通じて検証されている。通常そうした研究では、無機固体材料表面や延伸ポリマー膜表面等の固い表面での高分子鎖の振る舞いが観測対象となっている。それでは、柔軟な有機分子でしきつめられたブラシ状表面では高分子鎖はどのように振舞うのだろうか?無機固体表面では、二次元の幾何学的束縛や原子レベルに近いごく微視的な領域でのエピタキシャル的な構造情報転写が想定できるが、分子ブラシのある柔軟表面では、柔軟部位同士のInterdigitate等の分子レベルでのトポロジカルな因子を含む協同効果が期待でき興味深い。分子ブラシ表面を構築するには、有機分子や高分子の水面単分子膜(Langmuir膜)あるいはそれを基板上に1層移しとったLangmuir-Blodgett法を利用することが膜の再現性の点で有利である。本研究はこうした着想により、水面単分子膜やLB膜で構成された分子ブラシ状の柔軟な界面での高分子鎖の挙動に係る知見を得る目的で進められた。研究の遂行によって得られた主たる結果は以下の通りである。1)<脂肪酸単分子膜>単分子膜の圧縮相転移(結晶化)がPDHSの結晶化を誘起する新しい相関現象を見出した。2)<液晶分子単分子膜>4'-pentyl-4-cyanobiphenyl(5CB)液晶分子を用いることで、全く疎水的であるPDHSの理想的な単分子膜が得られることを見出した。水面にて疎水性高分子の単分子膜形成が明確に実証された最初の例である。3)<フォトクロミック単分子膜>単分子膜中でのアゾベンゼンの光異性化反応により、PDHSの結晶化速度が顕著に制御できるとともに、偏光照射によって主鎖配向を制御できることを見出した。主鎖配向を光で明確に制御できることを示した最初の例である。こうした着想とアプローチにより、高分子超薄膜の研究領域における新たな視点や新たな高分子鎖の操作法を提出できた。アラキジン酸といった長鎖脂肪酸とポリシラン(ポリジヘキシルシラン(PDHS))を有機溶媒に同時に溶解し、これを同時に水面上に展開する。この膜を疎水的な圧縮していくと、疎水的なPDHSは脂肪酸の単分子膜上に押し出され数十ナノメータ膜厚のいわゆる高分子超薄膜が形成されることを既に見いだしている。今回、上記のプロセスはブリュースター角顕微鏡、および原子間力顕微鏡観測によって明らかにした。圧縮を進めるに当たり、脂肪酸単分子膜は液体凝縮相から固体結晶相へと相転移を起こすが、PDHS超薄膜の結晶化は、この単分子膜の相転移に伴って急激に進むことが判明した。上記現象を鎖長の異なる脂肪酸(C14C20)を用いて行った。PDHS超薄膜の結晶化が誘起される表面圧には脂肪酸鎖長の偶奇の効果があることを見いだし、偶数炭素数にて20-25mN/mであり、奇数炭素数のものはそれより明らかに低くなった。現在のところこの現象は脂肪酸アルキル鎖長の末端メチルの配向に違いによるものと推定される。さらに、流動的な液晶分子(4'-ペンチル-4-シアノビフェニル(5CB))について同様な操作を行った。PDHSの混合比を大きくなると低表面圧領域ではそれに正確に比例して面積が増大した。

ブリュースター角顕微鏡観測と併せ、PDHSの単分子膜が形成されることが明らかとなった。研究当初、脂肪酸単分子膜状でのポリシラン超薄膜の挙動の観測を想定して研究を開始したが、液晶分子単分子膜上にて完全に疎水的なポリシランが液晶分子上で理想的とも言える単分子膜を形成するという興味深い現象を見出したので、こちらに研究を傾注させた。本研究で単独では単分子膜の形成が不可能な疎水性ポリシラン、ポリ(ジヘキシルシラン)[PDHS]とポリ(メチルオクチルシラン)[PMOS]が、液晶分子(5CB)との共展開によって理想的な単分子膜を形成することを明らかにした。π-A等温線、ブリュースター角顕微鏡(BAM)、原子間力顕微鏡(AFM)観測の結果から、5CB単分子膜上に、膜厚12nmの均一なポリシランの単分子膜が形成されること示し、疎水性高分子であっても理想的な単分子膜の形成が可能であることがわかった。また、疎水性の炭素系高分子であるポリチオフェンおよびポリスチレンについても、液晶分子との混合共展開を検討した。これら高分子の広がった単分子膜の形成を明らかにし、液晶混合展開法が広範な高分子に適用できる一般性を示した。
ホログラフィック光重合によるナノ微粒子-ポリマー複合光機能素子の創成

ホログラフィックナノ微粒子アセンブリング法によりナノ微粒子?ポリマーコンポジット中に記録した体積ホログラムが高い熱的安定性を持つことを実証した。また、チオール・エン系モノマーへのSiO_2ナノ微粒子分散によるナノ微粒子?ポリマーコンポジット中に記録した体積ホログラムの重合収縮率を0.2%まで低減出来ることを実証した。さらに、CdSe半導体量子ドット?ポリマーコンポジット中に回折効率がほぼ100%の体積ホログラムを記録することに成功した。加えて、ナノ微粒子?ポリマーコンポジット中に記録した体積ホログラムにより冷中性子ビームに対する50%?50%ビームスプリッター動作を実証した。本研究はフォトポリマー中に均一分散したナノ微粒子の空間的分布をホログラフィック露光により純光学的にアセンブルする手法(以降、ホログラフィックナノ微粒子アセンブリングと略記)の確立とそれを利用した新規光機能素子の創成を目的とする。本年度に実施した研究の成果は以下の通りである。第一に、時間依存Ginzburg-Landau方程式により2次元空間でのホログラフィックナノ微粒子アセンブリングの動力学を相転移ダイナミクスの観点から定式化するとともに数値シミュレーションを行った。その結果、光重合に伴う相転移ダイナミクスのナノ微粒子初期濃度や相互作用パラメータ値への依存性について明らかに出来た。第二に、ナノ微粒子-ポリマーコンポジット中に記録されたホログラムの熱的安定性について実験的に究明した。その結果、従来の有機フォトポリマーに比べて熱膨張率を1/3程度低減出来ることが出来、それに伴いホログラム記録多重度を増大出来ることを明らかにした。第三に、記録光に光吸収の殆ど無い水素供与体/受容体を増感剤としてZrO_2ナノ微粒子-ポリマーコンポジットに添加することで、ホログラフィック記録感度を1桁程度増大できることを実証した。第四に、チオール・エン系モノマーへのナノ微粒子分散により記録したホログラムの体積収縮率を0.4%程度まで低減できることを実証した。第五に、実時間フーリエ変換赤外分光光度計によりナノ微粒子-ポリマーコンポジットの光重合過程への影響を究明し、重合速度および重合変換率へのナノ微粒子分散の影響は少ないことを明らかにした。第六に、ZrO_2ナノ微粒子-ポリマーコンポジットのホログラフィック多重光記録特性について究明し、角度多重法と面内回転多重法を併用することにより膜厚500ミクロンで100枚以上の均一なホログラム多重記録を実証した。第一に、チオール・エン系モノマーへの有機および無機ナノ微粒子分散により記録した体積ホログラムの重合収縮率を0.2%程度までに低減することに成功した。また、その体積ホログラムの熱的安定性についても実験的に究明し、無機ナノ微粒子を分散した場合には熱膨張率を大幅に低減出来ることがわかった。第三に、青紫色波長(404nm)でのナノ微粒子-ポリマーコンポジットの体積ホログラム記録特性について実験的に究明した。その結果、ZrO_2ナノ微粒子-アクリルポリマーコンポジットならびにSiO_2ナノ微粒子-チオールエンポリマーコンポジットにおいて得られた屈折率変調および記録感度がホログラフィックデータ記録メディアとしての要求値を十分満足することを実証した。第四に、実時間フーリエ変換赤外分光光度計と示差走査熱量計によりナノ微粒子-ポリマーコンポジットの光重合過程を究明し、最大重合速度を与える最適ナノ微粒子分散濃度が存在することを明らかにした。第五に、CdSe半導体量子ドットをイオン性モノマーへ一様分散したナノ微粒子-ポリマーコンポジット中に回折効率ほぼ100%の体積ホログラムを記録することに成功した。第一に、チオール・エン系モノマーにおいてのトリアジン骨格エンモノマーの使用により、概エンモノマーの自己重合効果により光重合時の重合速度と架橋密度がアリルエーテルエンモノマーの使用の場合に比べて大幅に増加できることを実時間フーリエ変換赤外分光光度計と示差走査熱量計を用いて実験的に明らかにした。

第二に、概エンモノマーを用いたチオール・エン系モノマーへのSiO_2ナノ微粒子分散によるナノ微粒子-ポリマー複合材料に記録した体積ホログラムにおいては重合収縮率が0.4%程度までに低減出来ることを実証した。また、その体積ホログラムの熱的安定性についても、有機ナノ微粒子を分散した場合に比べて熱膨張率を大幅に低減出来ることを示した。加えて、概エンモノマーを用いたナノ微粒子-ポリマー複合材料により高忠実度のページデータ記録が可能であることも実証した。第三に、金属(Au,Pt)-ハイパーブランチポリマー複合ナノ微粒子を用いたナノ微粒子-ポリマー複合材料における3次の非線形光学効果を測定して、局所プラズモン効果による非線形光学効果の増大を見出した。第四に、SiO_2ナノ微粒子を用いたナノ微粒子-ポリマー複合材料に記録した体積ホログラムにより冷中性子ビームに対する50%-50%ビームスプリッター動作を実証し、ナノ微粒子-ポリマー複合材料を用いたホログラフィック中性子光学素子の可能性を世界に先駆けて実証した。
神経細胞におけるカルシウムによるRas活性化機構の解析

Rasの活性制御に対するRsaGRFのカルシウム結合ドメインの機能解析を培養細胞における膜電位依存型カルシウムイオンチャンネルを再構成した系で解析をした。一方、米・仏の研究グループから、Neuron Vol.40,775-784にNMDAレセプターのNR2BサブユニットにRasGRF1が直接結合する研究結果が報告されたことより、受容体共役型のイオンチャネルによる細胞内へのカルシウム流入の関与も想定された。これらを踏まえ、モデルマウスの作成、およびマウスの脳、初代培養細胞を用いた解析も行った。モデルマウスとしては、RasGRF1遺伝子欠損マウスが既存であったため、RasGRF1とRasGRF2の二つの遺伝子を欠くマウスを新たに交配により作成した。RasGRF1と高い相同性を持つRasGRF2はカルシウム依存性に活性増幅があるが、NMDAレセプターとの結合が見られないために、それぞれの遺伝子欠損をホモ、ヘテロで比較する事によりカルシウムイオンの細胞内の動向が解析可能と考えたからである。なを、RasGRF2の遺伝子欠損マウスは、すでに我々が作成していたが、正常に出生・成長し、異常を確認する事ができなかった(未発表事項)。作成されたRasGRF1/RasGRF2の遺伝子重複欠損マウスは、胎児致死とはならずに出生し通常の成長を遂げることが示された。脳の薄層切片を短期培養する事により、生理活性因子の刺激による反応、電気生理学的反応を検討し、さらに、タンパク質レベルでの発現の解析を行った。タンパク質の発現については、RasGRF1とRasGRF2の発現が成長に伴い変化する事を見いだした。これにより、成長に伴い発現レベルが、GRF1優位からGRF2優位へ変化することが示され、脳・神経細胞でのカルシウムの制御機能が成長に伴い変化する可能性が示された。また、胎児期では、ヌクレオチド交換因子であるSOSがRasGRFより優位に働く事を示唆する結果も得られた。神経疾患との関係も含めた今後の研究が期待される。我々が新たに見い出したRasGRF1の機能ドメインの一つと考えられるカルシウム結合モチーフとRas活性化の関係を解析するため、カルシウム結合モチーフを欠失した変異体の細胞発現系を作成し、変異体の細胞内局在の変化、活性化能変化を検討した。カルシウム結合モチーフを欠く変異体はその活性化能が低下するものの、細胞内局在も変化しており、局在に因る活性化能の低下であるか、分子機能としての低下であるかの判断が困難であった。培養細胞の種類を変えた幾つかの実験系に於いて、局在と活性化能を検討したところ、活性化能の変化はカルシウム結合ドメイン欠失よるためだけでなく、細胞内局在の変化による影響も高いことが示唆された。そのためカルシウム刺激に因る細胞内局在の系時変化検討のため、蛍光タグ付き分子を用いて現在解析中である。加えて、カルシウムイオンチャンネル:L型、N型の各チャンネルの解析を行った。(L型)α1c、α2b、β3a(N型)α1b、β1bの構成サブユニットの発現ベクターの作成、COS7、293Tの各培養細胞に於けるサブユニットの発現の確認、さらにこれらの構成サブユニットが機能ユニットとして細胞膜上に再構成されチャンネルとして機能する事を確認するため、脱分極刺激によるチャンネル開閉を行い、CREBのリン酸化を指標としたチャンネル機能を検討した。