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急性骨髄性白血病におけるプロテアソームの機能解明

プロテアソームは腫瘍で一般にその働きが亢進し、治療標的候補として古くから注目されているが、多くの腫瘍では治療標的としての意義は明らかではない。急性骨髄性白血病(AML)は代表的な難治性造血器腫瘍で、病態が徐々に解明されているが、治療成績は不良で、新たな治療標的の発見が期待されている。AMLでも多彩なタンパク質の発現制御に関わるプロテアソームは重要な役割を果たしている可能性が高いが、その病態における関与は不明な点が多い。我々はマウスモデルを用いてAMLにおけるプロテアソーム活性の制御を明らかにし、治療標的になりうるかどうかを検討した。特にMLL転座を有するAML細胞においては正常造血細胞と比較して、特に高い増殖活性を有する細胞分画でのプロテアソーム活性が高まっていた。AMLの治療に用いる化学療法剤に暴露することによって、AML細胞のプロテアソーム活性が抑制され、オートファジーが活性化されていた。遺伝学的にプロテアソーム活性を制御したAML細胞を作製し、あるいは薬理学的にAML細胞のプロテアソーム活性を高めたところ、プロテアソーム活性を抑制したAML細胞は化学療法剤に対して抵抗性を獲得し、逆にプロテアソーム活性を高めたAML細胞は感受性が高くなった。AML細胞ではプロテアソーム活性が亢進しているものの、抗がん剤などのストレスに暴露されるとプロテアソーム活性を抑制してオートファジーを活性化することでそれに対して抵抗性を獲得すること、この機序を阻害することがAMLの新たな治療標的になりうる可能性が示唆された。AMLにおけるプロテアソーム活性がどのように制御されているかを明らかにし、治療標的になりうるかどうかを改めて検討するために、プロテアソーム活性のレポーターコンストラクトを導入した複数のマウスAML細胞を用いて、プロテアソーム活性をモニターできるマウスAMLモデルを作製した。特にMLL転座を有するAML細胞においては正常造血細胞と比較してAML細胞、特に高い増殖活性を有する細胞分画でのプロテアソーム活性が高まっていた。AMLの標準的な治療薬であるシタラビンやダウノマイシンなどの化学療法剤に暴露することによって、AML細胞のプロテアソーム活性が一時的に抑制された。プロテアソームの構成因子であるPsme1やPsmb5、Psmb5機能欠失変異型の過剰発現、およびこれらの因子のサイレンシングによって遺伝学的にプロテアソーム活性を制御したAML細胞では、プロテアソーム活性を抑制したAML細胞は抗がん剤に対して抵抗性を獲得し、逆にプロテアソーム活性を高めたAML細胞は化学療法剤に対して感受性が高くなることがわかった。薬剤によりプロテアソームを活性化させたAML細胞も同様に、化学療法剤に対して高い感受性を示した。化学療法剤に暴露されたAML細胞ではこのようにプロテアソームの活性が抑制され、ストレス下での生存に有利になる一方で、非選択的なタンパク分解系であるオートファジーが活性化されていた。そこでオートファジー阻害剤によりオートファジーの活性化を阻害したところ、化学療法剤に対する感受性が増加した。
乳牛の消化管におけるECaC遺伝子の発現解析

【はじめに】乳牛の多発疾病として分娩前後の低カルシウム(Ca)血症が知られている。これまで、我々は低Ca血症の病態には消化管でのCa吸収機構が強く関与することを示してきた。一般に、.分娩時の消化管でのCa吸収には能動輸送が主役を演じるが、牛ではその制御因子の一つであるEpithelial Ca Channel(ECaC)について検討されていない。本研究課題において、前年度は、ECaC遺伝子が十二指腸で強く発現することを明らかにした。今年度は、乳牛の十二指腸におけるECaC遺伝子の発現量を解析した。【方法】(1)臨床上健康な乳牛20頭から十二指腸粘膜を採材し、ECaCのmRNA発現量を半定量的RT-PCR法にて解析し、月齢や血中成分濃度との相関関係を検討した。(2)分娩乳牛4頭から分娩直後から採血を行うともに、分娩後12時間に十二指腸粘膜を生検した。採取血液について血中Caおよび1,25(OH)_2D濃度の測定、十二指腸粘膜の生検材料についてECaCのmRNA発現量の半定量を行った。【成績】(1)ECaC mRNAの発現量は、乳牛の月齢ならびに血中1,25(OH)_2D_3濃度と正の相関を示した。血中Ca濃度との相関は見られなかった。(2)分娩乳牛では、分娩後12時間における血中Ca濃度が低値のものほど血中1,25(OH)_2D_3濃度は高く、十二指腸粘膜におけるECaC mRNA発現量も高値を示した。乳牛の多発疾病として分娩前後の低カルシウム(Ca)血症がある。これまでの研究において、その病態には消化管のCa吸収機構が深く関与することが示された。消化管でのCa吸収には能動輸送が関わるが、牛においてCa流入制御因子の一つであるEpithelial Ca Channel (ECaC)については検討されていない。したがって、本研究では、牛消化管におけるECaC遺伝子の発現状況を解析することを目的とした。臨床上健康なホルスタイン種乳牛1頭(3ヶ月齢,♂)を安楽殺し、第一胃から直腸までの各部位を採取した。粘膜組織からtotal RNAを抽出しcDNAを合成した。まず最初に、十二指腸のcDNAを用いて、ヒト、マウスおよびウサギECaCのPrimerペアを用いてPCRを行った。その結果、ヒトのECaC2のprimerペアでのみ予定サイズ(301-bp)の単一バンドが増幅され、ダイレクトシークエンス法での塩基配列の確認によって牛のECaC2の一部であることが確認された。このPCR産物はECaC2遺伝子の3'側に近い部位であったことから、3'-RACE法によって3'側の638-bpを増幅し、この配列から新たにprimerペアを設計した。次いで、この新しいprimerペアを用いて、第一胃から直腸までの各部位の粘膜から合成したcDNAについてPCRを行った。その結果、十二指腸においてとくに強い発現が認められた。本年度の研究によって、牛ECaC2遺伝子の配列の一部が明らかになった。また、消化管粘膜では、calbindin D_<9k>とほぼ同様に小腸近位に強く発現していたことから、同遺伝子はこの部位でのCaの能動的吸収に関与していることが示唆された。次年度は、消化管におけるECaC遺伝子の組織局在と発現量に影響を与える因子に関して検討する予定である。
ウイルス感染時に誘導されるRNAサイレンシング活性化機構の解明

植物は、RNAサイレンシングを利用してウイルス感染を防ぐ。近年の研究から、ウイルス感染に応答してRNAサイレンシング経路が活性化されることが明らかになってきた。しかし、植物がウイルスの何を認識して、どのようにRNAサイレンシング関連遺伝子の発現を誘導するのかは不明である。本研究では、RNAサイレンシング関連遺伝子の発現を誘導するのに必要なウイルス側の因子を同定し、ウイルス感染時に生じるRNAサイレンシング活性化の分子機構を明らかにする。また、RNAサイレンシングが活性化された状態で、ウイルスがどのようにRNAサイレンシングを回避して感染を成立させているのかを検証する。
セラミックスの電気伝導特性におよぼす電子励起、格子励起および電場の同時効果

本研究では、電顕内「その場」観察下での電気伝導度測定法を確立し、絶縁性セラミックスの電気伝導性におよぼす電子励起、格子励起および電場の同時効果を評価し、その効果の機構を明らかにすることを目的とした。研究対象試料としては、Si、Ge、MgO、MgO・nAl_2O_3(n=13)およびZrO_2を用いた.1.セラミックス試料の電顕内「その場」観察...MgO・nAl_2O_3の電顕用薄膜試料を超高圧電顕内で高速電子とイオン照射および電圧(V)印加時の微細構造・組織変化を「その場」観察した。試料温度(T)を300800Kの範囲で設定し、電子励起効果の大きい電子(エネルギー:E)と、主に格子励起を誘起する30keVの重イオンを重量照射すると共にVを印加した。TとE、さらに、電子線束密度、イオン線束密度およびVを変数として微細構造・組織変化を観察した。その結果、SiおよびGeでは、イオン照射によるカスケード損傷の蓄積は、電子による点欠陥、誘起拡散または電子励起により抑制されるが、MgO・nAl_2O_3では逆に促進されることがわかった。2.電顕内での電気伝導度「その場」測定法の確立...超高圧電顕内での微小試料(3×1×5mm以内)の電気伝導度および誘電損失tanδ測定法を確立した。この装置の測定限界はそれぞれ2×10^<-5>/Ω/mおよび1×10^<-4>で、測定温度範囲は室温1000Kである。この装置を用いてZrO_2の電子照射下での格子励起による誘起伝導度とMgOの電子励起によるtanδの上昇を確認した。3.電子励起、格子励起および電場の同時効果...照射下におけるV印加時の陽・陰イオン分布を定性的にではあるが実験的に決定し、照射下における微細組織および物性におよぼすVの重要性を確認した。さらに、この現象を記述する現象論的理論を構築し、その定量的予測プログラムを完成した。さらに、定量的実験とその解析を進めている。研究対象試料としては、共有結合性結晶とイオン結合性結晶であるMgO、Al_2O_3およびこれらの化合物MgO・nAl_2O_3(n=13)を用いた。1.セラミックス試料の電顕内「その場」観察申請者らが開発した方法で作製した電顕用薄膜試料を超高圧電顕内で高速電子イオン照射および電圧(V)印加時の微細構造・組織変化を「その場」観察した。試料温度(T)を300800Kの範囲で設定し、電子励起効果の大きい電子(エネルギー:E)と、主に格子励起を誘起する30keVの重イオンを重畳照射すると共にVを印加した。TとE、さらに、電子線束密度、イオン密度および、Vを変数として微細構造・組織変化を観察した。

その結果、イオン照射によるカスケード損傷の蓄積は、電子による点欠陥、誘起拡散または電子励起により抑制されることがわかった。2.電顕内での電気伝導度「その場」測定法の確立電顕内での試料用空間は約3X1X5mmに限定される。申請者らは試料形状、電極材、測定回路の絶縁材と温度等を中心に試行錯誤の実験を繰り返し、超高圧電顕内での微小試料の電気伝導度測定法を確立した。この装置の測定限界は2X10^<-5>/Ω/mで測定温度範囲は室温1000Kである。この装置を用いてZrO_2の電子照射下および非照射下での電気伝導度を測定し、格子励起による誘起伝導度を確認した。3.今後の問題点V印加時の組織観察、測定限界の向上および1および2の同時測定とその結果を解析して表題の同時効果を追求する。本研究では、電顕内「その場」観察下での電気伝導度測定法を確立し、絶縁性セラミックスの電気伝導性におよぼす電子励起、格子励起および電場の同時効果を評価し、その効果の機構を明らかにすることを目的とした。研究対象試料としては、Si、Ge、MgO、MgO・nAl_2O_3(n=13)およびZrO_2を用いた。1.セラミックス試料の電顕内「その場」観察・・・MgO・nAl_2O_3の電顕用薄膜試料を超高圧電顕内で高速電子とイオン照射および電圧(V)印加時の微細構造・組織変化を「その場」観察した。試料温度(T)を300800Kの範囲で設定し、電子励起効果の大きい電子(エネルギー:E)と、主に格子励起を誘起する30KeVの重イオンを重畳照射すると共にVを印加した。TとE、さらに、電子線束密度、イオン密度およびVを変数として微細構造・組織変化を観察した。その結果、SiおよびGeでは、イオン照射によるカスケード損傷の蓄積は、電子による点欠陥、誘起拡散または電子励起により抑制されるが、MgO・nAl_2O_3では逆に促進されることがわかった。2.電顕内での電気伝導度「その場」測定法の確立・・・超高圧電顕内での微小試料(3x1x5mm以内)の電気伝導度および誘電損失tandelta測定法を確立した。この装置の測定限界はそれぞれ2×10^<-5>/OMEGA/mおよび1x10^<-4>で、測定温度範囲は室温1000Kである。この装置を用いてZrO_2の電子照射下での格子励起による誘起伝導度とMgOの電子励起によるtandeltaの上昇を確認した。3.電子励起、格子励起および電場の同時効果・・・照射下におけるV印加時の陽・陰イオン分布を定性的にではあるが実験的に決定し、照射下における微細組織および物性におよぼすVの重要性を確認した。さらに、この現象を記述する現象論的理論を構築し、その定量的予測プログラムを完成した。さらに、定量的実験とその解析を進めている。
大脳新皮質発生におけるニューロン分化と移動開始を結ぶメカニズムの解析

発生期の哺乳類大脳新皮質において、未分化な神経系前駆細胞は脳室帯と呼ばれる脳の内側の領域で増殖し、やがてニューロンに分化すると脳の表層へ向かって移動する。正常なニューロン移動が大脳新皮質の正確な神経回路形成に必須の過程であることは良く知られている。一方、神経系前駆細胞がニューロンに分化すると必ず移動を開始するが、これまでニューロンの分化と移動の"開始"を結ぶメカニズムは全くわかっていなかった。本研究ではその制御メカニズムの一端を明らかにすることが出来た。大脳新皮質発生において、未分化な神経系前駆細胞から分化したニューロンはそれぞれ適切な位置へ移動する事により緻密な神経回路を形成する。しかし何故分化したニューロンが移動を開始するかは不明であった。申請者はこれまでに転写因子Scratch1がニューロン移動の開始制御に必須の役割を果たすことを示唆する結果を得ていた。H21年度は、まずScratch1がニューロン分化誘導に必須の役割を果たす転写因子Neurogenin1あるいはNeurogenin2の下流で発現する事を見出し、ニューロン分化に伴いScratch1が発現する事が示された。次に、Scratch1によるニューロン移動開始の制御メカニズムを明らかにするための実験を行ない、Scratch1の転写ターゲットとしてE-cadherinを同定した。Scratch1を過剰発現するとE-cadherinプロモーターの活性が抑制され、かつ、E-cadherinのmRNAあるいはタンパク質の発現量が減少した。一方、Scratch1の発現をRNAiにより抑制するとE-cadherin mRNAの発現量が上昇した事から、内在性のScratch1がE-cadherinの発現抑制に必要である事が明らかになった。そして、Scratch1ノックアウトマウスの作製に成功し、現在戻し交配を行なっている途中である。これらは概ねH21年度の研究計画通りに行なわれ、本研究課題は順調に進められている。また、学会にて口頭・ポスター発表を行い、これらの成果を発表した。申請者はこれまでにSnail superfamilyに属する転写因子Scratch1がニューロン移動の開始制御に必須の役割を果たすこと、Scratch1が細胞間接着分子E-cadherinの発現を抑制することを示唆する結果を得ていた。H22年度は、まずE-cadherinの発現が低下することがニューロン移動を開始することに必要であることを明らかにした。更に、Scratch1の下流でE-cadherinの発現が抑制されることがニューロン移動の開始に必要であることを見出した。以上の結果から、Scratch1がニューロン移動の開始を制御するメカニズムは、中胚葉誘導の際に用いられる上皮間葉転換というメカニズムに非常に類似していることが明らかになった。すなわち本研究は、未分化な神経系前駆細胞から産生されたニューロンが移動を開始するという現象は上皮間葉転換の一つとして捉えることができる、という全く新しい概念を提唱するものである。これらは概ねH22年度の研究計画通りに行なわれ、本研究課題は順調に進められた。そして現在、これらの成果をまとめ、国際学術雑誌に投稿中である。また、学会にて口頭発表を行い、成果を発表した。
OSNA残余検体を用いた乳癌リンパ節転移巣における遺伝子発現解析

原発性乳癌の手術中に、センチネルリンパ節(SLN)転移の有無をより客観的に解析し得る検査法であるone-step nuclear amplification (OSNA)法が近年導入された。解析後の残余検体を使用し、SLN転移巣における特定の遺伝子の発現を解析する手法を確立した。今回、リンパ節ではmRNAが発現しておらず、悪性度の高い乳癌原発巣において有意に発現しているmaspinという分子に着目した。OSNA;0(陰性コントロール)5例、OSNA;1+(2mm以下のリンパ節微小転移に相当)34例とOSNA;2+(2mmを超えるリンパ節転移巣に相当)59例のOSNA残余検体より、total RNAを抽出し、cDNAを合成後、maspinプローブを用いてリアルタイム定量PCR解析を行った。予め、4種類のヒト乳癌培養細胞を用いて、同様の解析を行い、MCF-7での解析結果を検量線作成用に使用した。SLN転移巣において、maspin mRNAの発現は46例(49.5%)に認められ、年齢、病理学的腫瘍径、リンパ管侵襲、組織異型度、エストロゲン受容体発現及びHER2過剰発現との有意な相関は見られなかった。maspin mRNAはOSNA2+に有意に発現が多く(p<0.0001)、非SLN転移が有意に多く認められた(p<0.0001)。非SLN転移の有無に関する多変量解析を施行した結果、maspin mRNA発現は、リンパ管侵襲及び病理学的腫瘍径とともに独立した予測因子であった(p=0.0015)。また、SLN転移巣におけるmaspin mRNAの発現は原発巣におけるmaspin蛋白の発現と有意に相関した(p<0.0001)。以上の結果より、OSNA法施行後の残余検体を用いたmaspin遺伝子の発現解析は非SLN転移を予測する上で有効な方法と成りえる可能性が示唆された。
８・９世紀キリスト教世界の変容とビザンツ制度教会

本研究では8ー9世紀を中心に、東西キリスト教会世界の関係性の変化を主にビザンツ側の視点から考察することを目的とし、東西教会世界を分裂の歴史としてだけではなく、具体的な交渉の内容やそれに関わった教会人たちの言説から、相互の影響や共有する認識とその変化を考察した。当該年度は前年度に引き続き、ビザンツ帝国と西ヨーロッパ諸国の、イタリア半島南部という境界地域を舞台にした8ー11世紀における政治的関係を分析した。その結果として、南イタリアの大司教区設立文書の分析からは、従来存在したとされるビザンツ側とローマ教会の対立は11世紀半ば頃まで現れず、むしろ当時のローマ教会が東西のキリスト教帝国の影響をそれぞれ受ける立場にあったと考察した。この一部は2017年6月の西洋中世学会第9回大会のポスター報告で報告し、また論文「10ー11世紀南イタリアにおける大司教区設立とビザンツ=ローマ関係」として2017年12月刊行の『史潮』第82号に掲載された。次にこのような政治的力関係の存在を前提として、政治=教会思想の観点から、従来の研究ではあまり論じられることの少ないキリスト教会の「一体性」の性質について、8世紀以降のヨーロッパ世界でどのような言説が発生したのかを考察した。第二ニカイア公会議と861年・879年の公会議の議事録、ビザンツの年代記史料、教会会議の記録集を用い、キリスト教世界の一体性がどのような形で表現されていたのかを分析した。その結果、8ー9世紀のイコン擁護派は東西教会が教義論争の際に皇帝からの迫害に共同して対抗したことを強調し、ローマ教会の側もこの言説を利用していたことを明らかにした。この研究成果は今後論文として投稿しつつ、博士論文の一部とする予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、9世紀のキリスト教世界の実態を、東西キリスト教会間の交渉と正教会の体制の変化から解明することをその目的としている。その方法として、東西キリスト教会の交渉を869年・879年の公会議決議やそれに関連する教皇書簡、総主教書簡を分析することによって、両教会の具体的な交渉内容と相手に対する認識を考察する。またそれだけではなく東西キリスト教世界の境界地帯である南イタリアの年代記や聖人伝などから、ラテン教会と正教会が入り混じる境界地帯の実態を解明する。本年度の研究成果として、9世紀の正教会の教会人の書簡や著作から、当時の教会人の西方教会への認識を解明した。9世紀の「フォティオスのシスマ」は従来東西教会の分離の始まりとして知られ、フィリオクェなど西方の慣習に対して非難をしたとされるが、実際にはローマ教会の慣習や教義を非難したのではなく、あくまでブルガリアで宣教活動を行なっていたフランク人の宣教師の活動に対する非難だった。ローマ教会と対立したフォティオスも、また皇帝との対立の中で教皇に支援を求めたストゥディオスのテオドロスも、ローマ教会の正統信仰を疑っていない。しかし、当時のローマ教会は後の西方カトリック世界の代表ではなく、フランクでは独自の慣習や教義解釈が生まれていた。そのため、9世紀のキリスト教世界は東西教会の対立というよりも、大まかに言えばローマ教会とビザンツを中心とする東方正教会、そしてフランク教会の三つの要素が存在していたと言える。本研究では正教会側の西方教会に対する意識から、9世紀のキリスト教世界の大まかな見取り図を解明し、その成果を研究発表および論文として発表した。研究計画では一年目には東西教会の交渉を主に分析するとしていたので、概ね計画通りに進展していると言える。一年目は9世紀の東西キリスト教会について分析したが、研究目的のキリスト教世界の変化について論じるには、より長いスパンの時代の分析が必要となることに気がついた。

そこで、十字軍の開始によって東西教会世界の交渉の形態が劇的に変化する11世紀終わりを区切りに、それ以前の両者の交渉の実態を分析するために、911世紀を研究の対象としたい。また、単にローマとコンスタンティノープルの交渉だけを取り上げるのではなく、境界地帯である南イタリアにおける両教会の分布や交渉、対立などの実態を、現地の年代記や証書、書簡などから分析し、911世紀の変化を解明したい。29年度が最終年度であるため、記入しない。
極限還元環境における化学認識機構の進化多様性に関する研究

熱水噴出域適応動物種の感覚能力の解明を試みた。高温耐性種の感覚細胞タイプ、入力経路、グリア細胞の支持構造が同定された。化学物質に対する応答実験では、過酸化水素について比較種よりも十倍の高感度で嫌悪性を示し、抗酸化ストレス効果をもつリナロールに対する強い嗜好性が明らかになった。また多種のRNA配列の解読により、各種感覚、熱、痛み、環境ストレスなどに関わる遺伝子の配列情報を得、特に恒常性維持に重要なTRPチャネル遺伝子の特異構造を得た。これらの結果は熱水優占種の感知能力の特徴として、酸化ストレスや恒常性維持に関わる特化した外界感知能力および神経系を進化させたものと考察された。熱水適応動物固有の感覚受容細胞および感覚システムの構造を解析した。基本的に単極型の感覚細胞であること、一般にストレス応答に関与するミトコンドリアおよび硫黄粒子と考えられる顆粒に富み、その情報伝達部位である軸索はグリア細胞で多重に被包、支持されていること、高次の情報処理中枢に記憶と学習に関与する小型細胞が識別され、それらの細胞体自身にも防御構造が見られる点で特色を示した。これらの細胞構造は、熱水適応種の特に最も還元環境に適応した動物で確認された。これまで熱水適応動物において、ほとんどまったく化学応答性についての研究はなされてこなかったが、本研究では、酸および活性酸素にたいする高感度能が定量的に同定された。これは、貧酸素環境に棲息する種は感覚系がより単純化し、化学物質に対する感度特性が鈍い方向に進化すると想定されたが、行動実験は逆の結果を示した。熱水噴出近傍とその周辺域では海水の化学組成の変動が激しく変動することから、致死状態を避けるために、酸性および活性酸素などの酸化ストレス物質に対してより高感度能が要求されると考察された。また、今回日本近海に棲息する熱水および深海動物種の大規模な遺伝子配列情報の取得に初めて成功した。従来DNAの小規模配列情報しか提供されていなかったが、今回次世代シーケンサを用いて数十ギガ塩基配列レベルで網羅的に行った。深海熱水噴出孔周辺域には通常の化学組成と大きく異なる海洋環境が存在する。高温高圧下で鉱物や元素成分が溶解し、溶存ガスは飽和濃度以上に含まれ、一般的にpHが低く酸性で還元性物質に富む。カリウムとカルシウムが多く含まれ、生体に有毒なメタンや硫化水素などが高濃度で溶存しており、二酸化酸素や水素を含む貧酸素状態でかつアンモニウム、鉄イオンなどが豊富でアルカリ度が高い。このような限定された環境下に特異的に適応した動物群は、特殊な感覚システム、特に還元物センサに依存した生態系を構築していることが十分期待されるが、現在においては化学受容や環境応答に関する研究例は極めて少ない。本研究では、熱水噴出孔の化学組成に対して帯状に分布、適応した動物相に注目して研究を行った。特にもっとも熱水近傍に適応したマリアナイトエラゴカイや長期飼育が可能なゴエモンコシオリエビなどの感覚系および脳中枢の組織および顕微形態を明らかにし、化学刺激物質に対する反応応答の類型化を行った。選択された熱水固有種のRNAから嗅覚・味覚受容体遺伝子をRNAseqの手法により網羅的に単離した。分子系統解析や発現場所からその機能を予測した候補遺伝子は、卵細胞や培養細胞への遺伝子導入を介して受容体の反応特性を規定する予定である。本研究によって、熱水適応種の化学受容機構の基礎的な機能が明らかになることにより、動物界での多様性や、さらには環境認識能力の限界を特定できることが予想される。また、産業的な観点から現在開発が進行している高感度生体センサのためのユニークな素子を提供し、高温・高圧耐性能を持った生体センサを開発するための基盤を提供する。高温高圧で有毒な硫化水素や重金属に富んだ極限環境である熱水噴出域の優占種に注目し、それらの感覚能力の解明を試みた。その概要は、1.船舶および潜水艇を利用して熱水噴出孔に適応した動物種の採集を行い、特に高温耐性を保持する種を中心とした化学受容に関わるとされる細胞タイプを同定した。2.熱水適応種を沿岸種と比較した際に特化した入力経路と思われる回路を同定し、さらに新規のグリア細胞から構成される多重の細胞体防御構造が発見された。また、3.アミン類、酸類、腐臭であるチオール類など合計35種の化学物質に対する応答実験では、活性酸素である過酸化水素について沿岸性の比較種よりも十倍の高感度で嫌悪性があることを示唆する結果を得た。一方、ビタミンE様の構造を持ち、抗酸化ストレス効果をもつリナロールに対する強い嗜好性が明らかになった。

さらに、4.今回が初めての試みとなる多様な熱水動物を対象とした網羅的な転写物すなわちRNA配列の解読により、各動物種80-200億塩基対の配列情報を得た結果、視覚、嗅覚、味覚、熱、痛み、環境ストレス応答などに関わる相同遺伝子の配列情報を得ることに成功した。その内、特に酸化還元、酸化ストレス、硫化水素、重金属、熱、痛み応答などの恒常性に重要なTRPチャネル遺伝子ファミリーのアミノ酸配列から特異構造を得た。最終的に刺激応答実験などの見解を踏まえると、これらの結果は熱水優占種の感知能力の特徴として、酸化ストレスや恒常性維持に関わる特化した外界感知能力および神経系経路における保護構造を進化させたものと考察された。進化形態学、分子神経学構造研究の面で適応的特徴を反映する構造を同定するという目的の主要部分は達成することができた。熱水動物固有の感覚受容構造の一端を解明した。それらの細胞構造は、熱水適応種の特に最も還元環境に適応した動物で確認された。またRNAシーケンスから、遺伝子の配列の取得、特異配列の同定、系統樹作製を行った。電気生理学的機器類を整備し、その生体解析を開始した。RNAシーケンスによる数種の配列決定が順調に解析が進展していること。化学物質の噴射刺激実験から、過酸化水素などのストレス物質など活性酸素に対する高感度受容能力を示唆する結果が得られたこと。それらにより、今後特定の遺伝子群に注目した解析に移行が可能である。本年度ではさらに焦点を絞りこみ、研究の過程で明らかになった酸性物質に対する反応や、活性酸素と関連した酸化ストレスに対する高感度の刺激応答についてさらに検証するために比較解析を充実させる。さらに、受容体の遺伝子ファミリーの系統解析による進化および特化過程の予測、推定アミノ酸の比較解析から特異な置換部位の同定をより多くの遺伝子で解析を行う。単一受容体での機能解析系を立ちあげ、そのチャネル機能の同定を試みる実験系の確立を目指す。網羅的に得られた遺伝子配列から相同遺伝子を単離して、系統関係および多様度合いを明らかにする。そのクラスター解析から、類似した機能を持った受容体ファミリーを特定する。化学噴射実験から得られた、高感度能とその受容体を他の動物の研究から推定し、熱水動物における相同遺伝子の全長を決定する。培養細胞などにその遺伝子を導入して、実際に単一遺伝子レベルにおける化学受容能力およびその高感度性を調べる。今後、生理学実験や遺伝子発現の解析に移行することから、当初の予定通り、関連する電気生理学関連機器および試薬を購入していく。また、RNAの発現解析による試薬を購入する。
陸上植物の共通祖先が持っていた発生システムの推定

陸上植物に共通の発生システムを推定することを目的とし、ヒメツリガネゴケ無限成長分枝胞子体の無限成長と分枝を制御する分子機構を被子植物シロイヌナズナの無限成長と分枝を制御する分子機構と比較した。分枝する時にオーキシンが予定幹細胞に局在し、その後、クラス1KNOX遺伝子が誘導されることがわかった。被子植物の複葉形成と類似しており、これまで不明であった陸上植物に共通のボディープランにこの遺伝子系が関わっている可能性が明らかになった。(1)ヒメツリガネゴケ無限成長胞子体とリニア植物群化石の比較解析のため、連携研究者所有の高解像度X線CT(HRXCT)を用いて、ライニーチャート内のリニア類の分枝様式のCT解析を行った。しかし、解像度が十分でなく、はっきりとした画像が得られなかった。(2)ヒメツリガネゴケ無限成長分枝胞子体の無限成長と分枝を制御する分子機構解析のため、オーキシンシグナル可視化マーカーとしてGH3プロモーター制御の小胞体局在型青色蛍光タンパク質(Cerulean)発現系統を作出した。またppclf遺伝子破壊系統を元株にclass1KNOXタンパク質MKN4に融合した黄色蛍光タンパク質(Citrine)発現系統を作成した。これらのマーカー系統を用いることで生細胞におけるオーキシンシグナルおよびclass1KNOXタンパク発現の可視化が可能となった。さらに、オーキシンフローを可視化するために、ppclf遺伝子破壊系統を元株としてオーキシン排出キャリアタンパク質PpPIN5融合赤色蛍光タンパク質(tagRFP)発現系統を作出した。この系統を観察したところ、tagRFP融合タンパク質が分枝の基部付近の細胞膜上に局在することがわかった。従って、PpPIN5もシロイヌナズナPIN1タンパク質と同様に細胞膜にターゲットすること、PpPIN5が分枝基部付近のオーキシンフローに関わることが示唆された。UV照射による突然変異体作出を行った。致死率から適当なUV照射量を決定し、突然変異体の作出を開始した。しかし、まだ変異体が得られていない。リニア植物が陸上植物の共通祖先であり、リニア植物型ボディープランが陸上植物共通の発生システムであるという仮説の妥当性を検証することを目的に、ヒメツリガネゴケのポリコーム遺伝子欠失変異体の無限成長分枝胞子体様構造の無限成長と分枝を制御機構を解析した。オーキシンによる胞子体様頂端幹細胞の形成制御機構を調べるために、ポリコーム複合体II遺伝子欠失変異体にオーキシンシグナル可視化マーカーコンストラクトと胞子体頂端幹細胞分子マーカー発現コンストラクトを導入し、ライブイメージング観察を行った。その結果、(1)オーキシンシグナルの高活性化部位は胞子体様頂端幹細胞の形成部位に一致し、オーキシンシグナルの活性化が幹細胞の位置決定に関連すること、(2)胞子体様頂端幹細胞におけるオーキシンシグナル活性化部位は幹細胞マーカーが発現すると消失するため、胞子体様幹細胞にはオーキシンシグナル活性を消失させる機構が存在すること、(3)オーキシンシグナル活性化は胞子体様構造において表層の細胞に強く検出されることから、表層の細胞特異的にオーキシンシグナルを活性化する機構があることがわかった。現在、オーキシンシグナルの活性化領域の形成がオーキシン流入によるものか、合成と分解によるものかをオーキシンキャリア因子や生合成や分解の制御因子の発現を調べることで検討中である。また、無限成長と分枝パターンに異常を示す突然変異体を単離するために、プロトプラストへのUV照射による変異処理を行った。現在、継続してスクリーニングを行っており、突然変異体を収集中である。紫外線照射による突然変異誘発の作出系を確立し、分枝異常を示す突然変異系統が単離できた。

約750系統中2系統で分枝異常を示したことから、スクリーニングする系統の数を多くすることにより、複数の分枝異常突然変異体を見いだすことができると考えられる。また、胞子体様構造体が全く形成されないなど分枝異常以外の表現型を示す系統も観察された。従って、分枝異常突然変異体のみならず、他の形質に注目した突然変異体の単離にも使用できる。本法を用いて作出した分枝異常突然変異体から、超並立DNAシーケンサーを用いて責任遺伝子を同定する系の確立は今後の研究課題である。24年度が最終年度であるため、記入しない。
化学療法後の肝類洞閉塞症候群の分子機構解明と抗VEGF抗体療法の有効性の解析

本研究の目的は、化学療法後の肝類洞閉塞症候群(SOS)の発症とTSP-1の発現との関係及び抗VEGF抗体のSOS予防効果を明らかにすることである。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の増殖に、TSP-1が関与していたが、oxaliplatinをHUVECに投与してもTSP-1の発現が誘導されなかった。oxaliplatin単独またはoxaliplatin+bevacizumabによる化学療法後の大腸癌肝転移切除標本でTSP-1の免疫染色を行ったが、両群ともTSP-1の発現率に有意差を認めなかった。SOSの発症とTSP-1の発現は関係性が低い可能性がある。In vitroの実験においては、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の増殖にTSP-1の関与が確認されたが、oxaliplatinをHUVECに投与してもTSP-1の発現は誘導されなかった。また、oxaliplatin単独またはoxaliplatin+bevacizumabによる化学療法後の大腸癌肝転移切除標本でTSP-1の免疫染色を行ったが、両群ともTSP-1の発現率に有意差を認めなかった。これまでの実験結果からはSOSの発症とTSP-1の発現は関係性が低い可能性がある。研究計画書に提出したvivoの検証が終了しておらず、遅れていると判断する。In vitro及び大腸癌肝転移切除標本における実験結果から、本研究の仮説とは異なる実験結果がいくつか得られている。今後は仮説の変更を含めて実験計画を検討する。外科腫瘍学当初の想定通りに研究が進まず、研究計画が遅れてしまい、予定していた実験を行うことが出来なかったため。In vitro及び大腸癌肝転移切除標本における実験結果から、本研究の仮説とは異なる実験結果がいくつか得られているため、次年度は仮説の変更を含めて実験計画を検討する。その際のIn vitro実験関連購入費、及び、研究補佐員の人件費に使用する。
高速ガス流を利用した放電プラズマ光源用デブリシールド法の開発

気体放電を用いたEUV光源の効果的なデブリシールド法として,超音速ノズルおよびディフューザから構成される超音速ガス流方式を提案し,その有用性を実験的に検証することを目的として研究を実施した.真空環境下での安定した超音速流の発生法と,ディフューザによる効率的なガス回収法を検討するために,レーザ誘起蛍光法によりカーテン流の可視化計測を実施した.また,レーザトリガ型放電電極の基礎実験を実施した.気体放電を用いたEUV光源の効果的なデブリシールド法として,超音速ノズルおよびディフューザから構成される超音速ガス流方式を提案し,その有用性を実験的に検証することを目的として研究を実施した.真空環境下での安定した超音速流の発生法と,ディフューザによる効率的なガス回収法を検討するために,レーザ誘起蛍光法によりカーテン流の可視化計測を実施した.また,レーザトリガ型放電電極の基礎実験を実施した.超音速ガス流方式によるデブリシールド法では,放電管内のピンチプラズマから放射されたEUV光が集光ミラーへ伝播する途中に,ヘリウムガスによる超音速ガス流を発生させ,電極部からのデブリをシールドする。また,ディフューザによりヘリウムガスを回収し,放射光伝播部を高真空に保つ。このような,プロセスを構築し,その有用性を実験的に明らかにすることを目的とし研究を実施した。平成19年度は、装置の構築を目指し、超音速ガス流発生用の超音速ノズルとディフューザの形状を解析的に決定し,ガス導入およびガス排気部を持つ超音速ガス流システムを設計・製作した。ノズルは,EUV光が通過する部分を極力少なくするようシート状の流れを発生できる形状にし,また,ディフューザを可変構造にした。次に、安定な超音速ガス流が生成されていることを確認するために,超音速ガスの流れを可視化する手段として,レーザ誘起蛍光法の適用準備をした。平成20年度には,シート状のノズル流の観測を実施し,デブリシールドとしての機能を調査する予定である。超音速ガス流を用いた放電光源用のデブリシールド法を構築し,その有用性を実験的に明らかにすることを目的とし研究を実施した。平成20年度は,前年度に製作した超音速ガス流システムを真空容器内に装着し,まず安定な超音速ガス流が生成されていることを確認するために,超音速ガスの流れをレーザ誘起蛍光法により観測した。レーザ誘起蛍光法のために,ヘリウムに一定濃度のアセトンを添加し,アセトンからの蛍光を観測した。結果として,大気圧下ではシート状に噴出するヘリウム流の観測に成功したが,真空下ではノズルから噴出直後に流れが拡散してしまい,シート状の流れを観測することができなかった。次に,超音速ノズルに対向した位置に単独の真空排気系を持つディフューザを設置しノズルからヘリウム流を噴出させたときの真空チャンバー内の圧力値の変動を計測した。ディフューザによるヘリウムガスの回収を期待したが,ディフューザの形状によらずノズルから噴出直後にヘリウム流が拡散してしまい,ディフューザの効果を得られなかった。今回用いた真空排気系の排気能力の限界のため必要量のヘリウムを流せなかったことが一因であるので,より排気能力の高い真空ポンプを設置し排気系を再構築する必要がある。また,本デブリシールドを設置するための放電光源として,固体スズを燃料とするレーザトリガ型放電光源の開発を行い,入射レーザ強度,電極間距離,印加電圧をパラメータとしてEUV光の放射特性を明らかにした。デブリシールド法の改良を急ぎ,放電光源とリンクした実験が急務である。
バイオミメティック潤滑界面を実装した次世代人工股関節に関する基礎研究

「高潤滑能をもつバイオミメティック人工股関節」を次世代人工股関節として実用化するための基礎研究を行った。具体的には、PMPC処理の金属・セラミックス表面への応用を目指し、PMPCによるナノ表面層について、処理方法および処理条件を変化させ、至適なプロセスを検索し、確立した。また、関節表面の潤滑性の向上を目指し、新規摺動面形状についての基礎検討を行った。これらの結果は、本技術の実用化を推進するための確信を得るに十分なものであった。本研究の目的は、次世代人工股関節として、「高潤滑能をもつバイオミメティック人工股関節」に関する基礎研究を行うことである。今年度は、以下の検討を行った。1.PMPC処理の金属・セラミックス表面への応用1)金属表面の至適PMPC処理条件の検索:PMPCによるナノ表面層について、処理方法および処理条件を変化させ、至適なプロセスを検索した。2)PMPC処理金属表面の潤滑性の評価:1)で構築したPMPC層について、摩擦係数からその潤滑性を検討した。さらに、手術後の歩行を再現する股関節シミュレーターを用い、PMPC処理したコバルトクロム合金面の耐摩耗性の評価を開始した。2.潤滑性の向上を目指した新規摺動面形状の開発1)溝つき人工股関節表面の潤滑性の評価:上記1.2)の検討とともに、ポリエチレンライナーの表面の機械加工痕の深さをかえたライナーを作製後、PMPC処理し、股関節シミュレーターを用い、コバルトクロム合金骨頭と組み合わせてその耐摩耗性の評価を開始した。2)陥凹部設計の因子が高潤滑能に与える効果の検討:PMPCによる表面層の構造、運動性について検討を行うため、ポリエチレン表面に存在する深さ約10μmの機械加工痕が摩擦係数に与える影響ついて検討した。3)関節窩構造を有する人工股関節摺動面の開発:生体の関節窩構造について、「関節液を貯留し潤滑を促進する構造」という解剖学的な視点から検討した。その結果に基づいて摺動面の形状変更を検討し、基本となるプロトタイプモデルを作製した。以上の結果は、「高潤滑能をもつバイオミメティック人工股関節」の実用化へ向けた基礎検討を推進するための確信を得るに十分な結果であった。平成24年度は、上記の検討を継続するとともに、効果的な骨頭の大きさ、摺動面材料の組み合わせ等についても検討を加える予定である。1.PMPC処理の金属・セラミックス表面への応用1)金属・セラミックス表面の至適PMPC処理条件の検索:PMPC処理によって形成するナノメーター単位の表面層について、処理方法および処理条件(重合開始剤濃度、溶液濃度、処理時間、紫外線強度など)を変化させ、プロセスの最適化を行った。2) PMPC処理金属表面の潤滑性の評価:対向する表面には、ポリエチレン、コバルトクロム合金、生体軟骨などを用いて国際標準化機構(ISO)、アメリカ材料規格協会(ASTM)の規格に準じた摩擦・摩耗試験を行った。関節面の摩擦係数・摩擦トルクの計測、サンプルの重量変化などからPMPC処理表面の潤滑性・耐摩耗特性を評価した。2.潤滑性の向上を目指した新規摺動面形状の開発1)溝つき人工股関節表面の潤滑性の評価:24年度に引き続き、ポリエチレンライナーの表面の機械加工痕(マシンマーク)の深さが、PMPC処理による高潤滑能に与える影響について、摩擦摩耗試験による潤滑特性の評価を行った。2)陥凹部設計の因子が高潤滑能に与える効果の検討:24年度までに検討した「関節液を貯留し潤滑を促進する構造(関節窩構造)」を有する人工股関節摺動面について、本研究にて処理条件の最適化を行ったPMPC処理と組み合わせて摩耗試験を行い、摩耗抑制効果について検討した。1.PMPC処理の金属・セラミックス表面への応用:1)金属表面の至適PMPC処理条件の検索:コバルトクロム合金のPMPCによるナノ表面処理について、処理方法および処理条件を変化させ、最適化を行った。2) PMPC処理金属表面の潤滑性の評価:摩擦試験を行い、1-1)で構築したPMPC層の潤滑性を評価した。コバルトクロム合金表面に形成したMPC層と、ポリエチレン、コバルトクロム合金、生体軟骨表面との摩擦特性を評価した。さらに、手術後の歩行を再現する股関節シミュレーターを用い、PMPC処理表面の耐摩耗性の評価行った。2.潤滑性の向上を目指した新規摺動面形状の開発:

1)溝つき人工股関節表面の潤滑性の評価:ポリエチレンライナーの表面の機械加工痕(マシンマーク)の深さが、PMPC処理による高潤滑能に与える影響について、摩擦摩耗試験による評価を開始した。2)陥凹部設計の因子が高潤滑能に与える効果の検討:陥凹部の大きさ・位置・深さが摺動界面においてどのような役割を果たすか検証した。その結果に基づいて、モデルとして考案される関節窩構造をもった人工股関節摺動面の形状の妥当性について検討した。3)関節窩構造を有する人工股関節摺動面の開発:23年度に作製した「関節液を貯留し潤滑を促進する構造」を有する架橋ポリエチレン製のライナーの関節摺動面にPMPC処理を加え、股関節シミュレーター試験による耐摩耗性の評価を開始した。以上の結果は、「高潤滑能をもつバイオミメティック人工股関節」の実用化へ向けた基礎検討を推進するための確信を得るに十分な結果であった。平成25年度は、上記の検討を継続するとともに、セラミックスについても検討を加える予定である。研究立案時の年次計画に沿って研究が進展しているため、25年度が最終年度であるため、記入しない。PMPC処理の金属・セラミックス表面への応用では、ナノメーター単位の表面処理について、至適処理条件を確立し、表面の潤滑が改善することを確認した。潤滑性の向上を目指した新規摺動面形状の開発では、マシンマークの深さ、関節摺動面の陥凹部設計(関節窩構造)について検討し、これらがPMPC処理による高潤滑能に与える影響についての解析を進めている。以上のように、本研究課題は、研究立案時の年次計画に沿って研究が進展しているため、おおむね順調に進展している。1.PMPC処理の金属・セラミックス表面への応用平成23年度に確立したPMPC処理方法についてさらに解析を進めるとともに、摩擦試験機、股関節シミュレーターをもちいて、その潤滑特性等につき評価する。2.潤滑性の向上を目指した新規摺動面形状の開発溝つき人工股関節表面の潤滑性の評価を進める。また生体の関節窩を模した陥凹部設計の因子が、高潤滑能に対して、どのように効果を与えるか検討する。さらに、平成23年度に作製した「関節液を貯留し潤滑を促進する構造」を有する架橋ポリエチレン製のライナーを用い、股関節シミュレーター試験による評価を行う。25年度が最終年度であるため、記入しない。1.ミクロな視点からのバイオミメティック:PMPC処理の金属・セラミックス表面への応用1)金属・セラミックス表面の至適PMPC処理条件の検索:PMPC処理によって形成するナノメーター単位の表面層について、プロセスの最適化を行う。処理方法および処理条件を変化させ、a)X線光電子分光分析、b)赤外分光分析、c)水による静的接触角測定、d)ローダミンで染色した表面の蛍光顕微鏡による観察、e)透過型電子顕微鏡による処理層の厚みの測定、を行う。2) PMPC処理金属・セラミックス表面の潤滑性の評価:ISO、ASTMの規格に準じた摩擦・摩耗試験を行い、以下の項目の評価により、PMPC処理表面の潤滑性・耐摩耗特性を評価する。対向する表面には、ポリエチレン、コバルトクロム合金、生体軟骨から選ばれる材料を準備して検討する。
紫外線をカットする材料の合成

1チアニアーシリカ複合酸化物の光酸化作用チタンテトライソプロポキシドとオルトケイ酸エチルの混合物を酢酸-エタノール溶液で加水分解して得たゲルを焼成してチタニアーシリカ複合酸化物を得た。酸素中で複合酸化物に紫外線を照射すると活性酸素(スーパーオキシド)が生成した。スーパーオキシドはESRのgzz成分がチタン含量によって違いが現われた。複合酸化物の表面はチタン20mol%以下では正四面体、それより高含量では八面体構造となっていると結論した(J.Mol.Catal.に投稿中)。その違いを化学反応性で確かめるためにプロピレンを加えたところ、生成物はアセトアルデヒド、アセトンの他にチタン低含量ではプロピレンオキシドが生成した。チタン高含量では炭酸ガスが多く、ついでイソプロパノールで、プロピレンオキシドは全く生成しなかった。チタニアーシリカ複合酸化物は紫外光を吸収し、酸素を励起させチタン含量によって異なる活性酸素を生成することが分かった。2ヒドロキシアパタイトの光化学特性ヒドロキシアパタイトを373-573Kで排気加熱して吸着水を脱着した後、77Kで光照射(超高圧水銀灯)するとO種が生成した。このものは223K以上で分解するほどに不安定であった。酸素を共存させるとO_3種が生成した。O_3種生成には350mm以下の波長領域の紫外光が有効であった。O_3種はエチレン、プロプレン、ベンゼンと速やかに反応するが、かさ高いイソブテン、トルエンは緩慢に反応した。これはO_3種がヒドロキシアパタイトのOH基が並ぶチャンネル内で生成し、立体効果が現れたものと考えられる。飽和炭化水素も反応し、メタンは緩慢に反応した。プロピレンの光酸化で生成したC3含酸素化合物中では、選択的にプロピレンオキシドが生成した。O_3種から生成した^3O(P)が活性種と推定した(日化会第72春季年会(1997)で発表予定)。1チタニアーシリカ複合酸化物の紫外線吸収作用チタン及びケイ素のアルコキシドの混合物を酢酸-エタノール溶液で加水分解して得たゲルを焼成してチタニアーシリカ複合酸化物を得た。それらの紫外-可視反射スペクトルからチタン含量が低いほど吸収極大が紫外域にシフトすること、吸収が起こり始める波長も低波長にシフトすることが示された。特に、チタン30モル%を境にその傾向が著しくなった。酸素中で紫外線を照射すると活性酸素種(スーパーオキシド)が生成した。スーパーオキシドはESRで3軸異方性を示し、gzz成分がチタン含量によって違いが現われた。チタニアーシリカ複合酸化物の表面はチタン低含量では正四面体、高含量では八面体構造となっていることが分かった。その違いを化学反応性で確かめるためにプロピレンを加えたところ、生成物はアセトアルデヒド、アセトンの他にチタン低含量でプロピレンオキシドが生成する顕著な差となって現われた。紫外線吸収作用と活性酸素種の反応性をさらに追究する予定である。2ヒドロキシアパタイトの紫外線吸収作用歯骨材であるヒドロキシアパタイトが紫外線によってカラーセンターを形成することを見いだした。酸素中で光照射すると速やかに活性酸素種(スーパーオキシド)が生成した。一方、スーパーオキシドはヒドロキシアパタイトを真空下あるいは酸素存在下で500°C以上に加熱し、その後酸素と反応させることによっても生成したが、その生成速度は緩慢であった。

スーパーオキシドの反応性をESRを用いて調べた結果、(1)室温ではかなり安定で、徐々に解離した後再度酸素を導入すると、一部スーパーオキシドが再生した。(2)大気中の一酸化炭素や炭酸ガスと即座に反応し、安全な化学種になることが判明した。ヒドロキシアパタイトの光活性寿命などについてさらに検討する予定である。1チタニアーシリカ複合酸化物の光酸化作用チタンテトライソプロポキシドとオルトケイ酸エチルの混合物を酢酸-エタノール溶液で加水分解して得たゲルを焼成してチタニアーシリカ複合酸化物を得た。酸素中で複合酸化物に紫外線を照射すると活性酸素(スーパーオキシド)が生成した。スーパーオキシドはESRのgzz成分がチタン含量によって違いが現われた。複合酸化物の表面はチタン20mol%以下では正四面体、それより高含量では八面体構造となっていると結論した(J.Mol.Catal.に投稿中)。その違いを化学反応性で確かめるためにプロピレンを加えたところ、生成物はアセトアルデヒド、アセトンの他にチタン低含量ではプロピレンオキシドが生成した。チタン高含量では炭酸ガスが多く、ついでイソプロパノールで、プロピレンオキシドは全く生成しなかった。チタニアーシリカ複合酸化物は紫外線を吸収し、酸素を励起させチタン含量によって異なる活性酸素を生成することが分かった。2ヒドロキシアパタイトの光化学特性ヒドロキシアパタイトを373-573Kで排気加熱して吸着水を脱着した後、77Kで光照射(超高圧水銀灯)するとO^-種が生成した。このものは223K以上で分解するほどに不安定であった。酸素を共存させるとO_3^-種が生成した。O_3^-種生成には350mm以下の波長領域の紫外光が有効であった。O_3^-種はエチレン、プロピレン、ベンゼンと速やかに反応するが、かさ高いイソブデン、トルエンは緩慢に反応した。これはO_3^-種がヒドロキシアパタイトのOH基が並ぶチャンネル内で生成し、立体効果が現れたものと考えられる。飽和炭化水素も反応し、メタンは緩慢に反応した。プロピレンの光酸化で生成したC3含酸素化合物中では、選択的にプロピレンオキシドが生成した。O_3^-種から生成した^3O(P)が活性種と推定した(日化会第72春季年会(1997)で発表予定)。
体幹部外傷時の大量出血に対する超分子ゲルを用いた一時的止血効果に関する基礎的実験

ダメージコントロール手術(DCS)において、ガーゼやタオルが臓器の損傷面に固着することで生じるパッキング除去時の再出血を回避するために、シクロデキストリン(CD)を用いた超分子ゲルの研究に着目した。βCD-アダマンタンゲルをブタの損傷肝のパッキングに用いたところ、複雑な形状の損傷面への密着性にはゲルの細片化が有効であること、同ゲルにはパッキングの除去時の再出血を回避できる可能性があることが判明した。本研究によって、βCD-アダマンタンゲルが新たなパッキング素材として利用できる可能性が示された。研究の初年度は、大阪大学大学院理学研究科高分子化学専攻超分子科学研究室と、実験に使用する高分子ゲルの性状を中心としたディスカッションに多くの時間を費やした。♯まず、実験目的に合致する高分子ゲルの性質について再確認を行った。1.ゲルの性状は、複雑に凹凸のある臓器の損傷部位に密着できるだけの粘性が必要であること(端的に言えば、液体に近い性状では不適であり、かつ形状が決定してしまっている固体に近くても不適)、2.ゲルには出血の圧力に打ち勝つだけの強度が必要であること、3.一方で、簡単に亀裂が生じればそこから血液が流入し止血効果が減じるため、脆弱性が少ないこと、4.損傷部位からの除去が容易である必要があること、5.将来的に、生体に対する有害性がないこと♯以上の条件を踏まえながら、アクリルアミド+ビスアクリルアミドによるゲル作成を通して、適正な架橋度について議論を行った(上記13)。また、損傷部位からの除去については本研究の基本的課題であることから、ホストゲル-ゲストゲル反応による着脱の実用性を追求する(上記4)。今後、アクリルアミド+ビスアクリルアミドによるゲルで基礎実験を行う方針とした。臓器の損傷面にfitする適正なゲルの組成を確定することを中心に実験を行った。具体的には、N,N'-メチレンビスアクリルアミド(BIS)を含むポリアクリルアミドと、シクロデキストリン(CD)もしくはアゾベンゼン(AZ)によるポリマーゲルを数種類作成し(大阪大学大学院理学研究科高分子科学専攻高分子機能化学研究室提供)、それらの性状とラット肝臓で作成した損傷面とのfittingについての確認を行った。その結果、CDゲルでは硬度が高すぎ、パッキングには適さないが、BISの含有率2.0%にAZゲル1.0%の比率のAZゲルでは硬度も適性で肝損傷面からの離脱にも適していることが明らかとなった。この結果、βCD-Ad pAAmgelによる止血デバイスとしての利用可能性が高いことを明らかにすることができた。今後のゲルの改良ポイントおよび課題としては、ゲルの生体への影響の確認と臨床応用のための実験の必要性が挙げられるが、前者に対しては、シクロデキストリンは医薬、食品として使用可能であることが判明している。後者については、ゲルの更なる改良と実際に凝固障害の生じている環境下での効果を確認することが次の課題である。実験に使用するゲルの提供に若干の時間がかかるため、当方の実験予定日とのズレが生じているため。外傷外科学臓器の損傷面にfitする適正なゲルの組成を確定し、光応答性によるパッキング効果を確認したい。実験目的に合致する高分子ゲルの基本的性状を決定する過程で、生体の止血に有効であるか否かの想定と実際のゲルの状態に差が存在するため、このギャップを埋めることに苦労している。臓器の損傷面にfitする適正なゲルの組成を確定するための実験とゲルの提供に時間差が生じ、実験の遂行が滞ったため。本年度は、動物実験による止血効果の高い高分子ゲルの適切な性状を決定し、CD-ゲルとAzo-ゲルによるホストーゲスト共存ゲルの合成に繋げていきたい。平成26年度の実験により概ね適正なゲルの組成が絞り込まれているため、これを量産し最終的な止血効果を確認する。高分子ゲルの性状に関するディスカッションに時間を要し、予定していた動物実験が次年度に持ち越しとなったため。26年度は動物実験を開始する予定。