hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腸管内分泌Ｋ細胞における転写因子Ｒｆｘ６を介したＧＩＰ合成・分泌亢進機構の解明

世界的な過体重・肥満人口の急速な増加に伴い、肥満症や肥満関連疾患への対策は日本を含む世界の喫緊の課題である。肥満症の主要な成因として、食事における脂肪エネルギー比率の上昇が示唆されているが、過剰な脂肪摂取によって肥満が誘導される基礎的なメカニズムはいまだすべては明らかになっていない。平成27年度及び28年度に得られた結果より、7週令のGIP-GFPヘテロマウスを用いて短期間高脂肪食負荷を行い、肥満を来していない状態でも脂肪に対するGIP過剰分泌が確認された。その肥満準備状態におけるK細胞遺伝子発現プロファイルを解析したところ、高脂肪食群K細胞に有意な変化を認める因子として65の候補遺伝子を同定した。そのうち、膵臓の分化や発生に関与が示されているRegenerating gene (Reg)familyのひとつであるReg3に着目し解析を行った。同じファミリーのReg4は既報では腸管ホルモンであるGLP-1、secretin、PYY、やghrelinを含有する腸管内分泌細胞に発現が確認されており、Reg3がK細胞において発現し短期間高脂肪負荷時に発現変化している可能性を考えてRT-PCRにてK細胞内発現変化を評価した。結果は通常食および高脂肪食負荷後K細胞でReg3の発現を認めるものの変化を認めずアレイの結果とは異なる結果となった。残りの候補因子も含めて更なる検討が必要である。29年度が最終年度であるため、記入しない。背景:Gastric inhibitorypolypeptide (GIP)は、腸管内分泌K細胞から分泌されるペプチドホルモンであり、強力な催肥満作用が明らかとなっている。しかし、腸上皮細胞の中でK細胞は極めて希少であるがゆえにGIP合成・分泌の機構はいまだ不明な点が多い。これまでにK細胞を可視化したGIP-GFPマウスを作製し、K細胞に転写因子Regulatory factor X (Rfx) 6が高度に発現していること、高脂肪食負荷肥満状態でGIP分泌が亢進しRfx6発現が強く誘導されることを報告している。目的:GIP遺伝子発現に関与するRfx6の転写共役因子群を同定しGIP遺伝子転写制御機構の解明を目指しており、GIP制御による抗肥満作用を有する糖尿病および肥満の新たな治療法の開発につなげたい。方法:In vitroで、GIP遺伝子やRfx6遺伝子を発現しているK細胞モデルであるマウス腸管内分泌腫瘍株STC-1を用いた。Rfx6とRfx3のsmall intefering RNA(si NA)による共抑制またはexpression plasmidによる共過剰発現を行い、GIP遺伝子発現の変化を評価した。成果: Rfx6の抑制によってはRfx3発現に変化を認めなかったが、Rfx3の抑制によってRfx6は有意に発現が抑制された。しかし、Rfx6とRfx3共抑制によってはRfx6単独でのGIP遺伝子発現抑制と比較して変化を認めなかった。次に、IRESベクターを用いてRfx6とRfx3の共過剰発現によるGIP遺伝子発現の変化を測定した。Rfx6過剰発現によるGIP遺伝子発現亢進は再確認されたが、Rfx6とRfx3の共過剰発現によってもGIP遺伝子発現はRfx6単独過剰発現時と比較して同程度であった。以上の結果から、STC-1においてRfx3はRfx6遺伝子発現への関与は示唆されるが、Rfx6とRfx3のGIP遺伝子発現への共役は示されなかった。平成27年度はマウス腸管内分泌腫瘍株STC-1を用いてRfx6とRfx3の共役によるGIP遺伝子発現への関与を評価した。これまでのGIP-GFPヘテロマウス(GIP-GFP KIgfp+/-)を用いたK細胞解析結果から、Rfx6のみならず同じくRfxファミリーであるRfx3のK細胞における発現を確認していた。STC-1を用いて、転写因子Rfx6と他のRfxファミリーとの二量体形成によるGIP遺伝子発現調節の確認を行った。Rfx6は他のRfxファミリーと共役しながらGIPの合成・分泌に関与しているという仮説を検証したが、K細胞に発現を確認したRfx3とRfx6の共役は証明されなかった。一方で、質量分析法によるRfx6の新規co-factor同定のための実験系を確立しつつある。また、平成28年度に予定していたGIP-GFPマウスを用いた短期高脂肪食負荷によるK細胞発現遺伝子の評価はすでに進んでいる。すでにIn vivoでは、GIP-GFPヘテロマウスに高脂肪食負荷を行い、体重差のない非肥満状態において経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)または経口脂質負荷試験を開始している。K細胞を用いたRNAシークエンス解析も予定していることから、期待ほどではないがある程度の進展はあったと評価できる。7週令のGIP-GFPヘテロマウスを通常食群と高脂肪食群に分け、有意な体重差の生じない5日間という短期的な食事負荷を行った。両食事負荷後、体重差のない非肥満状態における耐糖能、GIP分泌能を経口ブドウ糖負荷試験または経口脂質負荷試験にて評価した。経口ブドウ糖負荷試験において、通常食GIP-GFPヘテロマウス群に比較して高脂肪食GIP-GFPヘテロマウス群で負荷後の血糖値とインスリン値の有意な上昇を認めたが、GIP値は差を認めなかった。一方で、経口脂質負荷試験において、通常食負荷GIP-GFPヘテロマウス群に比較して高脂肪食負荷GIP-GFPヘテロマウス群で負荷後のGIP分泌の有意な増加を認めた。

免疫組織染色にて、腸管形態およびK細胞数を計測したところ、両食事群において腸管形態およびK細胞数に変化を認めなかった。両食事負荷後GIP-GFPマウスK細胞を分離回収し、K細胞内mRNA発現を評価した。通常食群および高脂肪食群K細胞において非K細胞に比較して有意なGIP mRNA発現を確認し、高脂肪食群K細胞において通常食群K細胞に比較して有意なGIP mRNA発現の増加を認めた。同じくインクレチンであるGLP-1についても同様の傾向であった。既報にてGIP遺伝子発現を調節するとされている転写因子Pdx1やRfx6についても評価したが、通常食群K細胞と高脂肪食群K細胞において差を認めなかった。次に、脂肪酸摂取・肥満状態の感知・細胞応答に関連するとされている遺伝子群についても評価したところ、高脂肪食群K細胞にて通常食群K細胞に比較してLiver X Receptor (LXR)βの有意な増加を確認した。また、遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイによっても解析し、通常食群K細胞に比較して高脂肪食群K細胞に有意な変化を認める因子として65の候補遺伝子を同定した。平成28年度は、GIP-GFPマウスに短期的な通常食または高脂肪食負荷を行い、両食事負荷後GIP-GFPマウスK細胞内の遺伝子発現をマイクロアレイにより解析し、Rfx6の活性調節機構に関与する因子を同定する計画であった。長期高脂肪食負荷肥満におけるK細胞では転写因子Rfx6の発現増加を認めたが、短期高脂肪食非肥満状態におけるK細胞ではRfx6遺伝子の発現に変化は無いことを確認した。しかし、短期高脂肪負荷による肥満準備状態において、K細胞内で発現変化する遺伝子を複数同定し得たので、今後は詳細な機能解析をマウス腸管内分泌腫瘍株によって検討していく予定である。また、在外研究によって細胞内リン酸化シグナル伝達解析の手技を獲得して今後にK細胞内におけるリン酸化シグナル評価を計画していることなどから、期待ほどではないがある程度の進展はあったと評価できる。世界的な過体重・肥満人口の急速な増加に伴い、肥満症や肥満関連疾患への対策は日本を含む世界の喫緊の課題である。肥満症の主要な成因として、食事における脂肪エネルギー比率の上昇が示唆されているが、過剰な脂肪摂取によって肥満が誘導される基礎的なメカニズムはいまだすべては明らかになっていない。平成27年度及び28年度に得られた結果より、7週令のGIP-GFPヘテロマウスを用いて短期間高脂肪食負荷を行い、肥満を来していない状態でも脂肪に対するGIP過剰分泌が確認された。その肥満準備状態におけるK細胞遺伝子発現プロファイルを解析したところ、高脂肪食群K細胞に有意な変化を認める因子として65の候補遺伝子を同定した。そのうち、膵臓の分化や発生に関与が示されているRegenerating gene (Reg)familyのひとつであるReg3に着目し解析を行った。同じファミリーのReg4は既報では腸管ホルモンであるGLP-1、secretin、PYY、やghrelinを含有する腸管内分泌細胞に発現が確認されており、Reg3がK細胞において発現し短期間高脂肪負荷時に発現変化している可能性を考えてRT-PCRにてK細胞内発現変化を評価した。
ALS患者M蛋白及びブチロラクトンIの神経細胞に対する影響の検討

当初、Delfsらの方法に準じて旋回培養法を用いて脊髄Organotypic cultureを確立する予定であったが必要機材などの理由で静置界面培養法を選択した。すでにRat海馬について確立されていた培養法をもとに実験を開始した。生後6日のRatより無菌的に脊髄を取出しMcllwain tissue chopperで350μmの厚さにスライスし6穴培養プレートにセットしたテフロン透明多孔膜(Milicell CM)において培養した。培養液はMEM50%、HBSS25%、Heat inactivatedhorse serum 25%、Glucose 6.5g/lを用い5%CO_2存在下に34度で培養した。培養後14日目の組織を検討したが対照として行った海馬切片では神経細胞の生存がみられたが、脊髄切片はほとんどがグリア細胞で神経細胞の生存が不良であった。胎仔を用いた方が神経細胞の培養に有利と考え胎生16日のRat胎仔を用いて同様の実験を繰り返したがやはり脊髄神経細胞の生存が不良であった。そこで神経栄養因子を加えた培養液を用いてみることにしF12/HAM培地に成長促進物質(プロゲステロン、インスリン等)を添加した培養液を用いて胎生16日胎児脊髄の切片培養を行い14日後において神経細胞が残存していることを確認していた。培養28弐血目の組織を現在病理的に確認中である。これよりこの培養条件で予定していたCdc2 kinase阻害薬ブチロラクトンIの培養脊髄神経細胞への影響の検討を開始するところである。
社会起業による福祉コミュニティづくりの活性化要因に関する日韓比較

日本と韓国における、1社会起業や福祉コミュニティづくりを支援する制度・政策の在り方、2社会起業の手法を用いた福祉コミュニティづくりの実践プロセスと成功要素、3福祉関連の社会的企業における経営活性化の要因について、文献研究、インタビュー及びアンケート調査を通して明らかにすることが出来た。これらの研究結果を踏まえ、日本の社会起業による福祉コミュニティづくりへの政策的・実践的な提言を行った。初年度である2014年度は、韓国における福祉コミュニティづくりと社会起業に関するフィールド調査を行った。具体的には、社会起業による福祉コミュニティづくりの先進事例と評価される複数の地域を訪問し、コミュニティの特徴や社会起業の状況等についてヒアリングを行った。特に、ソウルにあるソンミサン・マウルについては、コミュニティの関係者らに活動状況や課題等についてインタビューを行い、前年度から行ってきた調査の結果をも踏まえ、福祉コミュニティの生成プロセスや起業活動の促進要因についてまとめることが出来た。その結果については関連学会において研究報告を行うとともに、学術雑誌等に掲載している。また、韓国の複数の認証社会的企業を訪問し、事業内容及び関連制度・政策の効果や課題等についてインタビュー調査を行った。制度的なハックアップは企業の経営改善に大いに寄与しているが、その逆効果についても多く述べられた。具体的には、人件費中心の補助、支援の一時性、補助金への依存等である。次年度以降は、このような国家主導による社会的企業育成策の弊害についてさらに詳しく分析する必要があると考えられる。2015年度は、日本における福祉コミュニティ及び社会的企業へのインタビュー調査を進める予定である。2015年度は、前年度に続き、韓国における社会起業に関するフィールド調査を行うともに、これまでの成果をまとめて研究発表および投稿論文の作成等を行った。具体的には、韓国における社会的企業の中間支援組織に焦点をあて、「ソウル市社会的経済支援センター」および「ヨンドンポ区社会的経済支援センター」へのヒヤリング調査を行った。また、財閥を含む大企業による社会起業活動及び社会的企業支援の先進事例として、SKグループの「(株)幸福の翼(ヘンボックナレ)」へのヒヤリング調査を行った。さらに、これまでの調査の結果をまとめ、日本地域福祉学会の全国大会にて研究発表を行い論点や考察を深めた後、日本社会福祉学会の学会誌に原著論文として投稿し、現在査読中である。また、日本の社会起業に関する調査については、ソーシャルファームジャパン及びソーシャルファーム研究会、日韓社会的企業セミナー等に関わり、日本の社会的企業に関連する先進事例の情報を入手するとともに、国内外の社会的企業に関する先行研究等の文献レビューを通して日本における社会的企業の実態や特徴について整理を行った。また、日本における社会起業組織の特徴については、社会起業の財源や組織体制、市場範囲、意思決定方式等を基準とし、企業型、協同組合型、コミュニティ基盤型、複合型などと類型化を試みた。現段階では、仮説的なものであるが、今後、実証分析を含めて議論を深めて行きたい。2015年度は、韓国でのフィールド調査を計画的に進めることができた。また、これまで行ってきたヒヤリング調査について分析を行い、研究成果として報告・投稿することが出来た。さらに、次年度に予定している日本の社会起業についての事例調査に関する情報収集や研究仮説を導くことが出来た。2016年度は、日本と韓国における社会的企業の事例調査を行うとともに、これまでの研究成果を整理し、報告書及び投稿論文の作成を行った。韓国での事例調査については、農福連携による精神障害者の就労支援を行っている「ヒマン職場(希望の職場)」および、食品製造・販売を行っている社会的企業「トック・プリンス」を訪問し、起業の背景やプロセス、経営状況や課題等についてヒヤリングを行った。また、追加調査として、「ソンミサン・マウル」、「美しい店」、「韓国社会的企業振興院」を訪問し、前回の調査では十分に話を聞くことが出来なかった起業に関連する制度政策の影響や課題等についてヒヤリングを行った。韓国のおける社会的企業に関連する制度政策は初期段階の社会的企業の安定的な経営維持に大きく寄与しているが、課題として経営の継続性や期限付き・一律の支援方法等があげられた。次に、日本の事例調査については、NPO法人「どりーまぁサービス」および、社会福祉法人「共生シンフォニー」を対象に起業のプロセスや経営状況、地域社会との関係などについてヒヤリングを行った。社会起業を通して制度の狭間のニーズに対応するための事業展開における経営戦略やマーケティング手法等について多くの示唆を得ることが出来た。事例調査の結果については、前年度までの調査結果と合わせて現在分析を行っている。また、これまでの研究成果のまとめとして、「科学研究助成事業『社会的起業による福祉コミュニティづくりの活性化要因に関する日韓比較』調査研究報告書」を制作している。2014年度は、韓国でのフィールド調査を計画的に進めることができた。次年度以降は、初年度の韓国調査の結果を踏まえ、日本の先進事例等を中心にフィールド調査を行っていきたい。2016年度は、研究課題の最終年度である。今後の主な研究のすすめ方としては、日本と韓国におけるフィールド調査を引き続き実施するとともに、これまでの研究成果をまとめる作業を進めて行きたい。具体的には、9月までに日本のフィールド調査を行うとともに、8月には韓国のフィールドに対する補足調査を行う予定である。

また、9月以降は、これまで行ってきたフィールド調査をまとめ、日韓の比較の視点から社会起業の実態や特徴についてまとめることとする。まず、日本のフィールド調査については、2015年度に行った社会起業の類型化の結果を基に、各類型に含まれる社会的企業を選定し、ヒヤリング調査を行う予定である。既に行っている企業も含めて9月までに10カ所を予定している。また、韓国のフィールドへの補足調査については、福祉コミュニティづくりに関連する公的および民間支援団体や、社会的経済基本法案の進捗状況に関する調査を行う予定である。以上の韓国での補足調査及び日本のフィールド調査の結果を基に、日韓比較の視点から、社会起業や福祉コミュニティづくりの特徴について比較分析を行い、両国における社会起業による福祉コミュニティに対する政策的および実践的な示唆を導く作業を進めて行きたい。今後の研究成果の報告については、2017年3月に行われる日本社会福祉学会関東大会及び韓日社会福祉研究会にて研究報告を行う予定である。さらに、研究報告での議論を踏まえ、研究論文を作成し関連学会誌等を通して研究結果を発信して行きたい。社会福祉学2015年度は、引き続き韓国におけるフィールド調査を通して事例分析を行うと共に、制度・政策の関係者らに対するインタビュー調査を進めることとする。また、日本における社会的企業の先進事例について文献調査及びインタビュー調査を行うこととする。当初計画より人件費等の支出額が少なかった。当初計画より旅費等の支出額が少なかった。次年度の資料整理や入力作業等のアルバイト費として使用する。前年度の基金残額を含め、日韓のフィールドへの旅費、調査の準備作業・資料整理等のアルバイト費、消耗品費等の物品費、報告書の印刷・製本費等などに使用する。
染色体安定性を保障するセントロメア形成に必須なヒストン修飾機構

動原体構築を制御する仕組みの解明を目的として、セントロメア領域に特異的なヒストン修飾を同定し、その役割について解析を行なった。網羅的なChIP-seq解析を行い、H4K20のモノメチル化修飾(H4K20me1)がセントロメアに存在することを発見し、この修飾が機能的な動原体構築に必須であることを明らかにした。また、H4K5とH4K12のアセチル化修飾(H4K5ac, H4K12ac)が、クロマチンに導入される前のCENP-A-ヒストンH4複合体に特異的に入ることを発見し、これら修飾がCENP-Aのセントロメア領域への正確な取り込み過程に必須であることを明らかにした。これまでの研究から、各種ヒストン修飾抗体を利用した網羅的ChIP-seq解析を行い、セントロメア特有なヒストンCENP-Aと極めて良く似たピークパターンを示す複数のヒストン修飾を見いだしている。平成26年度では、そのうちの一つの修飾「ヒストンH4の20番目のLys残基のモノメチル化(H4K20me1)」に注目して解析を行った。生化学的解析の結果、細胞周期のG1期初期にCENP-Aがクロマチンに取り込まれた後、CENP-Aヌクレオソーム内のH4K20が速やかにモノメチル化されることが明らかになった。このH4K20me1修飾がセントロメア形成にどのように関わるかを解析するために、セントロメア領域のH4K20me1修飾を特異的に除去できる実験法を開発した。まず、H4K20me1修飾の脱メチル化酵素(PHF8)とセントロメアタンパク質CENP-Uとの融合タンパク質を発現させ、セントロメア領域へ特異的に局在させた。その結果、セントロメア領域のH4K20me1修飾を特異的になくすことに成功した。セントロメア領域からH4K20me1修飾を除去した細胞では、セントロメア上に構築される構造体(キネトコア)タンパク質であるCENP-HやCENP-Tの局在が阻害されることが分かった。その結果、セントロメアの機能は失われ、染色体分配の異常が多数観察された。この実験からH4K20me1修飾は、機能的なセントロメア形成に必須であると結論できた。これまでの研究から、各種ヒストン修飾抗体を利用した網羅的ChIP-seq解析を行ない、セントロメア特有なヒストンCENP-Aと極めて良く似たピークパターンを示す複数のヒストン修飾を見いだしている。平成26年度において、そのうちの一つの修飾「ヒストンH4の20番目のLys残基のモノメチル化(H4K20me1)」が、機能的なセントロメア形成に必須であることを明らかにした。さらに、このヒストン修飾導入に関連することが示唆されたモノメチル化修飾酵素(HMTx)の条件的遺伝子破壊株の樹立をニワトリDT40細胞で行っていた。平成27年度では、このHMTxの遺伝子破壊株を用いて、H4K20me1修飾のセントロメア領域への導入に与える影響を解析した。その結果、HMTx遺伝子破壊によりセントロメア領域のH4K20me1修飾が著しく減少することが明らかとなった。よって、このモノメチル化修飾酵素HMTxがセントロメア領域のH4K20me1修飾の導入に関与することが示唆された。セントロメア領域に存在するヒストン修飾として見いだしていたヒストンH4の2種類のアセチル化修飾についても注目して解析を行った。生化学的解析の結果、この2種類のアセチル化修飾は主に、クロマチンへ取り込まれる前のCENP-A-ヒストンH4複合体に導入されることを明らかにした。研究期間中に明らかにする点として「セントロメア領域に特有なヒストン修飾が導入される意義」の解明を挙げた。これまで、予備的な実験から見いだしていた「セントロメア領域に特有な複数のヒストン修飾」の中の一つ「H4K20me1修飾」について、セントロメア形成における生物学的な意義を明らかにし、モデルとして報告した。また、研究実施計画で平成27年度に予定していた遺伝子破壊細胞株を利用した解析により、セントロメア領域のH4K20me1修飾の導入に関与する酵素の特定を行った。本成果は、セントロメア領域へのH4K20me1修飾の導入メカニズム解明の鍵となる知見である。加えて、ヒストンH4の2種類のアセチル化修飾は、主にクロマチンへ取り込まれる前のCENP-A-ヒストンH4複合体に導入されることを明らかにした。本成果は、セントロメアクロマチンに取り込まれる前のヒストン修飾の重要性に迫るきっかけとなる知見と考えている。以上の理由により、概ね順調に進展しているといえる。これまで、「セントロメア領域に特有なヒストン修飾」としてH4K20me1修飾が、機能的なセントロメア形成に必須であることを明らかにした。平成28年度では、DT40細胞で樹立したH4K20me1修飾導入に関与するモノメチル化修飾酵素(HMTx)の条件的遺伝子破壊株を使用し、HMTxの欠損によるH4K20me1修飾導入の阻害がセントロメア機能に与える影響を解析した。その結果、細胞周期S期の進行が阻害され細胞死が誘導されたが、本実験系では明瞭なセントロメア機能への影響は観察されなかった。現在、各細胞周期におけるHMTxの欠損によるセントロメア機能への影響を調べるために、短時間でタンパク質を分解できる実験系(AID法)を利用した解析を進めている。

平成27年度までに、2種のヒストン修飾「ヒストンH4の5番目、12番目のLys残基のアセチル化(H4K5ac, H4K12ac)」が、クロマチンへ取り込まれる前のCENP-A-ヒストンH4複合体に導入されることを見出していた。平成28年度では、その生物学的意義を明らかにすることを目的に、生化学的および細胞生物学的解析を行った。ヒストンH4の5番目、12番目のLys残基にアルギニン変異を導入しアセチル化修飾を阻害する実験を行ったところ、効率的なセントロメア領域へのCENP-Aの取り込みが阻害された。さらに、これら修飾を導入するアセチル化酵素複合体の構成因子RbAp48を欠損させたところ、H4K5, H4K12のアセチル化が阻害され、セントロメア領域へのCENP-Aの取り込みが阻害された。これら結果から、H4K5ac, H4K12ac修飾は、セントロメア領域へのCENP-Aの取り込みに必須な修飾であると結論し、報告した(Shang et al., Nature Commun., 2016)。動原体構築を制御する仕組みの解明を目的として、セントロメア領域に特異的なヒストン修飾を同定し、その役割について解析を行なった。網羅的なChIP-seq解析を行い、H4K20のモノメチル化修飾(H4K20me1)がセントロメアに存在することを発見し、この修飾が機能的な動原体構築に必須であることを明らかにした。また、H4K5とH4K12のアセチル化修飾(H4K5ac, H4K12ac)が、クロマチンに導入される前のCENP-A-ヒストンH4複合体に特異的に入ることを発見し、これら修飾がCENP-Aのセントロメア領域への正確な取り込み過程に必須であることを明らかにした。研究期間中に明らかにする点として「セントロメア領域に特有なヒストン修飾が導入される意義」の解明を挙げた。予備的な実験から見いだしていた「セントロメア領域に特有な複数のヒストン修飾」の中の一つ「H4K20me1修飾」について、平成26年度において生化学的および細胞生物学的な解析手法により、セントロメア形成における生物学的な意義を明らかにし、モデルとして報告した。これらの成果は国際的にも評価され、掲載誌の表紙に選ばれた。また、研究実施計画で平成26年度に予定していたヒストン修飾に関連する因子の遺伝子破壊細胞株の樹立に関しても進め、概ね順調に進展しているといえる。平成27年度に特定したセントロメア領域にH4K20me1修飾を導入する酵素HMTxに関連した研究およびヒストン修飾の構造基盤の解明に焦点を絞り、以下3項目について研究を推進する。1. HMTxの遺伝子破壊株の解析:HMTxの遺伝子破壊により、染色体分配異常や各種セントロメアタンパク質の局在異常を解析し、ヒストン修飾の意義を調べる。さらに、HMTxの遺伝子破壊によるセントロメア領域のヒストン修飾パターンの変化を、クロマチン免疫沈降と次世代型シーケンサーによる解析(ChIP-Seq法)により調べる。次世代型シーケンサーによる解析は、国立遺伝学研究所の豊田敦特任准教授の協力のもと行ない、得られた大量データの情報解析は、国立遺伝学研究所の池尾一穂准教授の協力を仰ぐ。2. HMTxと相互作用する因子の探索:FLAGタグを融合したHMTxを細胞内で発現させ、抗FLAG抗体による共免疫沈降法によりHMTxを含む複合体を精製する。
筋萎縮性側索硬化症およびモデル動物の組織内トランスグルタミナーゼ活性の変動

昨年度われわれは筋萎縮性側索硬化症(ALS)患者より死後摘出・凍結保存した脊髄標本のトランスグルタミナーゼ(TG)活性をH^3-プトレスチンがカゼイン・タンパク内へ組み込まれる放射活性量より測定した結果、非ALS脊髄の値と比べて1/2以下の低値が示された。また、ALS病期の中間で患者より採取した脳脊髄液中のTG活性値も非ALS患者の値と比べて、有意に減少していた。このような測定成績は、ALSの臨床症状の重症度に比例して、患者の脊髄内ニューロンの変性・脱落に対応して、組織中TG活性の低下がみられることを示唆している。ALSモデル脊髄標本を作製する試みの1つとして、成熟ラットを麻酔後、背部皮膚を切開して露出した頚・胸部脊髄を露出して後脊髄動脈の片側分枝を電気メスで焼灼・閉塞して、片側脊髄の変性・壊死を生じさせた。障害側脊髄内TG活性値は非障害側の値と比べて、術後13日で著明(約1.6倍)に増加したが、1週間後には元のレベルに戻り、30日後には約1/2にまで低下した。このことは、虚血による脊髄ニューロンの変性過程で、その組織内TG活性が平行して推移することが考えられた。体染色体8に変異が局在する遺伝的ALSモデル動物のMndマウスは、生後5ヶ月位までは正常な歩行が認められるが次第に後肢の麻痺が進行して、生後89ヶ月には四肢の運動麻痺を来して歩行および摂食困難となり生後10ヶ月以降には死亡する。組織化学的検索で、Mndマウス脊髄内灰白質ニューロンは運動麻痺症状の進行に伴って変性・脱落してまばらになるのが認められた。この動物脊髄内TG活性は、生後35ヶ月と次第に増加するが、79ヶ月目ではかえって減少する傾向が認められ、この変化は特に下部脊髄で著明であった。これらのモデル動物を用いた実験成績から、主としてニューロン細胞体内に局在するTG活性は、障害が与えられた初期の脊髄組織内で一過性に増大するが、長時間持続した傷害によってニューロンの変性・脱落が進行するに従って、その酵素活性の低下として認められることが示された。従って、ALS患者脊髄内でもモデル動物と同様なTG活性値の変動を示して、死後の患者脊髄内では極めて低い値が認められたのであろう。
プラズマCVD法によるシリコン結晶成長過程における水素原子の動力学に関する研究

(1)酸素吸着Si(100)表面における水素の吸着、脱離及び引き抜き反応のキネティクスを、昇温脱離スペクトル(TPD)及び質量分析計による表面脱離分子のその場観測を用いて調べた。その結果、水素原子の初期吸着確率は、吸着酸素原子の初期被覆量に対し、ほぼ指数関数的な減少を示した。また、水素のTPD測定から、その脱離障壁が酸素原子の被覆量の増加に伴い、高くなることがわかった。このことにより、酸素原子は、水素脱離に伴うシリコンのbucklingといった骨格変化を抑制することが示唆された。一方、気相H原子をD吸着表面に照射すると、清浄Si(100)表面と同様、直接引き抜き(abstraction, ABS)によりHD分子が、また、気相H原子の表面吸着により過渡的に形成された表面ダイハイドライド(SiD_2)の表面拡散を伴う反応(adsorption-induced desorption, AID)によりD_2分子がそれぞれ脱離分子として検出された。さらにABS反応は酸素原子の影響をほとんど受けないのに対し、AIDは酸素原子により効果的に抑制されることがわかった。また、チョッピングされたH原子線を用いて、HD生成におけるABSとAIDの寄与を時間的に分離したところ、酸素吸着表面では清浄表面の場合に比べ、HD生成におけるAIDの寄与が大きいことがわかった。(2)Si(100)表面への水素分子の解離吸着確率は、室温で10^<-10>以下と非常に小さく、吸着の障壁は1eV程度と推定される。しかし、レーザー照射による水素の急激な昇温脱離において、脱離水素分子は0.1eV(表面温度程度)の並進エネルギーしかなく、従って、脱離からみると、吸着の障壁が存在しないといった矛盾(barrier puzzle)が生じた。それを検証すべく、D吸着Si(100)表面での6K/sといった緩やかなTPD過程において、表面より脱離してくるD_2分子の並進エネルギーをクロスコリレーション法により、その脱離角度ごとに測定した。その結果、脱離水素は0.35eV程度の並進エネルギーを有し、また脱離角度ごとの平均並進エネルギー<E_<trans>(θ)>及び脱離収量Y(θ)は、Hoferらの水素吸着実験から得られたsticking関数S(E,θ)を用いると、Detailed Balance則から予想される計算結果とよく一致した。このことから、Si(100)表面における水素分子の吸着/脱離において、Detailed Balance則の成立が示された。[序]気相水素原子により誘起されるシリコン表面上での吸着水素の脱離反応は、プラズマCVD法によるシリコン結晶やアモルファスシリコン膜の成長過程において重要であることがわかっている。そこで、本研究では、シリコンの骨格構造変化が抑制される酸素吸着シリコン表面上での水素脱離反応を詳細に調べ、その脱離機構について考察した。[実験]サンプルとなるsi(100)表面は2×10^<-10>Torrの超高真空にある反応室内に保持した。そのシリコン表面に表面温度503Kで0原子を0.11ML、続いてD原子を0.3ML、si表面に照射した。さらに、この表面に気相から水素原子を照射し,表面より脱離してくるHD及びD_2分子を質量分析計により観測した。[結果及び考察](1)Eley-Rideal(ER)機構によるHD生成清浄シリコン表面と酸素吸着シリコン表面においてHD生成速度の時間変化を測定した。その減衰の速さから反応断面積を求めると、ER反応しか起こらない表面温度300Kにおいては、両表面での反応断面積はほとんど変わらず(2.3Å^2)、ERによるHD生成には、吸着酸素はほとんど影響を与えないことがわかった。このことは、ER反応においては、シリコンの骨格構造変化は重要な因子ではなく、反応に直接的に関与するH, D, Siの局所構造だけで決まってしまうことを意味している。(2)Collision-induced desorption(CID)機構によるD_2脱離清浄表面では表面温度500K付近からD_2生成がみられるのに対し、酸素吸着表面では630Kでようやくその生成が認めれる。このことは、その反応次数から提唱されている、シリコン表面の骨格構造変化を伴うdideuteride(SiH_2)の表面伝搬過程がD_2生成を主に支配していることのさらなる証拠といえる。

また、チョッピングされたH原子線を用いて、HD生成におけるABSとAIDの寄与を時間的に分離したところ、酸素吸着表面では清浄表面の場合に比べ、HD生成におけるAIDの寄与が大きいことがわかった。(2)Si(100)表面への水素分子の解離吸着確率は、室温で10^<-10>以下と非常に小さく、吸着の障壁は1eV程度と推定される。しかし、レーザー照射による水素の急激な昇温脱離において、脱離水素分子は0.1eV(表面温度程度)の並進エネルギーしかなく、従って、脱離からみると、吸着の障壁が存在しないといった矛盾(barrier puzzle)が生じた。それを検証すべく、D吸着Si(100)表面での6K/sといった緩やかなTPD過程において、表面より脱離してくるD_2分子の並進エネルギーをクロスコリレーション法により、その脱離角度ごとに測定した。その結果、脱離水素は0.35eV程度の並進エネルギーを有し、また脱離角度ごとの平均並進エネルギー<E_<trans>(θ)>及び脱離収量Y(θ)は、Hoferらの水素吸着実験から得られたsticking関数S(E,θ)を用いると、Detailed Balance則から予想される計算結果とよく一致した。このことから、Si(100)表面における水素分子の吸着/脱離において、Detailed Balance則の成立が示された。
アフリカにおける民主化とグッド・ガバナンス促進要因の研究

平成11年、12年にわたって、ウガンダ、タンザニア、ケニヤ、モザンビーク、ボツワナに赴き、民主化およびグッドガバナンスについて聞き取りおよび資料収集を行った。その成果としては、冷戦終結以後、おしなべてアフリカ諸国は政治的民主化、経済的市場主義化に向かい、一部では経済的好転が為されるなど、それらの成果は上がっているともいえる。しかし反面で国有企業の民営化に伴う失業の増大、都市における諸物価の高騰、さらには治安の著しい悪化など、社会的な混乱や秩序の動揺などが顕著になっている。それ故に、アフリカ内外から民主化の定着とガバナンスの改善が真剣に模索され始めており、これらの課題はここ当分のアフリカ諸国内での大きな争点として位置づけられるものといえる。その意味では本研究のテーマはアフリカの実情を研究するうえで欠くべからざるものであり、上記訪問国の時勢を把握することが出来たと思っている。しかし、如何にしても流動的、状況的なアフリカ情勢だけに数度となく追跡調査が必要であり、その意味では本研究の報告は途中経過的報告の内容にとどまっていると言わざるを得ない。しかしながら、ガバナンス研究の最近の進捗過程において、本研究の意義は大きいと確信しており、例えば、日本国際問題研究所などの研究機関において、その成果の一部を報告した結果に鑑みれば、相応の研究上の進捗を果たすことが出来たと思っている。いずれにせよ、今後はさらに調査対象国を広げるとともに、ガバナンスに関するアフリカサイドの概念形成の実態と内容、そして主張などを緻密に調査し、アフリカに適合的なガバナンスの在り方、内容など、さらに研究を進めていきたいと考える次第である。初年度(平成11年度)における研究の中心は、研究課題に関する雑誌など資料情報の収集整理をおこなった。また、海外調査対象国としていずれも近年民主化の深化に取組んでいるケニア、ウガンダ、タンザニア(ザンジバルを含む)を選定し、平成12年2月11日より27日までの期間訪問をした。例えば、ケニアでは国民会議員R.A.Odinga氏、同M.Y.haji氏、腐敗防止局長G.A.Ringera氏など、ウガンダでは同じく国会議員のT.Lwanga氏、マケレレ大学政治学教授、Dr.Olum氏など、タンザニアでは国会議員秘書P.Masami氏、議員E.R.Kasembe氏など、合計20名程の人物にインタビューし、一部資料の提供を受けた。第二年度にあたる平成12年度は,前年度と同様に研究テーマに関連する文献・資料の収集と整理・解読にあたる一方,(財)日本国際問題研究所の研究会(「現代アフリカの紛争問題及び紛争解決の模索」)に委員として参加し,紛争,民主化,ガバナンスなどの相互関連性について研究を進めた。また,相互開発研究機構による研究プロジェクト(「アフリカにおける紛争予防」)に参加し,アフリカにおける紛争管理という観点から寄稿した(同プロジェクトの成果は平成13年6月に刊行予定)。(このプロジェクトの成果は今年中に韓国にて刊行予定)なお,平成12年度分の海外調査国として,年間研究計画の遅延から,平成13年3月10日より23日までの期間,モザンビーク,ボツワナを訪問し,研究を行うことになった。
新しい環化反応による光学活性イソキノリンアルカロイドの全合成

テトラヒドロイソキノリンやテトラヒドロ-β-カルボリンを基本骨格とする天然アルカロイド化合物は数多い。これらの化合物の多くは、窒素原子と芳香環に挟まれた炭素に不斉中心を持っており、その不斉中心にはR配置とS配置の両方が存在する。従って、これらの不斉中心を任意に制御してテトラヒドロイソキノリン(THI)環を含むアルカロイドの合成を行なう事は重要な課題であり、このような背景のもと以下の研究を行った。当研究室では2価パラジウムを用いて、完全に立体化学を制御出来る2,6-二置換ピペリジン環の合成法を見いだした。しかしこの方法による1位置換テトラヒドロイソキノリン合成は不満足な結果に終った。この問題を検討した結果、Bi(OTf)_3触媒や中性スルホン酸エステルであるCF_3SO_3CH_3を触媒に用いる分子内環化に成功し、光学活性1位置換テトラヒドロイソキノリンの合成が可能となった。得られた1位アルケニル置換光学活性テトラヒドロイソキノリンを原料に用いて光学活性1位アルケニル置換THI環を合成する方法を確立した。次に1位アルケニル基を変換して天然テトラヒドロイソキノリンアルカロイド類を合成した。そしてピロロイソキノリンアルカロイドである(S)-(-)-trolline,(R)-(+)-trolline(oleracein E)を合成できた。また、アルケニル基をスルポニルメチル基に変換後、Julia-Kocienskiオレフィン化反応により炭素-炭素結合形成を行なったところ1位立体化学が保持されたアリール置換アルケニル体が得られた。以下5段階を経て(S)-(+)-dysoxylineを光学活性体として得ることができた。同様に(S)-(+)-colchiethanamineおよび(S)-(+)-colchiethineも合成する事が出来た。これらは最初の全合成として評価された。一方、(-)-emetineの合成においてはA,B,C環まで合成で来たが、その後の共役付加反応が効率的に進まず、そこまでで止まる結果となっている。3つのイソキノリンアルカロイドを全合成し、この環化によるアルカロイド合成の有用性を示すことが出来た。これらの成果は一部論文に発表した。残るデータも近々投稿予定である。本課題研究は終了した。1位置換テトラヒドロイソキノリンは天然アルカロイド類におおく見られる基本骨格であり1位不斉中心には、R-中心およびS-中心を有する両鏡像異性体が天然に存在する。テトラヒドロイソキノリン類は医薬品の代表的な骨格でもあり、多くの光学活性体合成がなされて来たが、我々が開発して来た骨格合成法はシンプルでよりフレキシブルな一連のイソキノリンアルカロイド合成法となると考えられる。この半年で6位ピバロイルオキシ基7位にメトキシ基を有し1位にプロペニル基を有する(S)-テトラヒドロイソキノリンを合成する事ができた。1位アルケニル基をオゾン酸化し、アルデヒドを経由し、Wittig反応により炭素鎖を伸長し、その後還元、官能基変換を経て、(+)-dysoxylineおよび(+)-homolaudanosineを合成することができた。しかしながら、その問題点として、中間アルデヒド体におけるラセミ化の扱いが微妙であり、その取り扱いが今後の課題として浮かび上がってきた。その手段として、オゾニドをアルコールまで還元し、緩和な酸化方法でアルデヒドに導き、素早くWittig反応を行う事を考えている。また、1位置換テトラヒドロイソキノリンへの環化では、Bi(OTf)_3の他、TfOHまた過塩素酸など用いても高い1,3-不斉転写率で環化が進行することがわかった。実際に、本基質においてトリフルオロメタンスルホン酸や過塩素酸が緩和な環化触媒として使える事がわかった。当研究室ではBi(OTf)_3触媒を用いる分子内窒素原子の環化反応に成功し、この環化反応による光学活性1位置換テトラヒドロイソキノリンの合成に展開した。そして、これまで、6位にピバロイルオキシ基、7位にメトキシ基を有し、1位にプロペニル基を有する(S)-テトラヒドロイソキノリンを合成する事ができた。その後、1位アルケニル基をオゾン酸化し、アルデヒドを経由し、Wittig反応により炭素鎖を伸長し、続いて還元、いつくかの官能基変換を経て、(+)-dysoxyhne、(+)-colthietanamhleおよび(+)-homolaudanosineを合成することができた。しかしながら、アルデヒドの段階における取り扱い如何によって、ラセミ化することが判明した。そこで、アルデヒドをメチレンスルホニル基に変換し、Julia-couplingによる結合形式法に切り替えたところ、光学純度よく上記天然アルカロイドを得ることが出来た。続いて、本来のターゲット化合物である(-)-emetineの全合成に取り組んだ。中間体のテトラヒドロイソキノリンをグラムのレベルで持ち上げ、窒素上の官能基変換を行ってN-3-butenoyi基を導入後、続いて分子内アルケンメタセシスを用いてC環を合成することが出来た。生成したアルケンは塩基で容易に異性化させエノンへと導くことが出来た。また、最近我々のグループで見出された有機触媒によるテトラヒドロイソキノリンへの環化反応を適用したところ、この条件下でも立体選択性、収率共によく環化体を得ることが出来た。

これらの化合物の多くは、窒素原子と芳香環に挟まれた炭素に不斉中心を持っており、その不斉中心にはR配置とS配置の両方が存在する。従って、これらの不斉中心を任意に制御してテトラヒドロイソキノリン(THI)環を含むアルカロイドの合成を行なう事は重要な課題であり、このような背景のもと以下の研究を行った。当研究室では2価パラジウムを用いて、完全に立体化学を制御出来る2,6-二置換ピペリジン環の合成法を見いだした。しかしこの方法による1位置換テトラヒドロイソキノリン合成は不満足な結果に終った。この問題を検討した結果、Bi(OTf)_3触媒や中性スルホン酸エステルであるCF_3SO_3CH_3を触媒に用いる分子内環化に成功し、光学活性1位置換テトラヒドロイソキノリンの合成が可能となった。得られた1位アルケニル置換光学活性テトラヒドロイソキノリンを原料に用いて光学活性1位アルケニル置換THI環を合成する方法を確立した。次に1位アルケニル基を変換して天然テトラヒドロイソキノリンアルカロイド類を合成した。そしてピロロイソキノリンアルカロイドである(S)-(-)-trolline,(R)-(+)-trolline(oleracein E)を合成できた。また、アルケニル基をスルポニルメチル基に変換後、Julia-Kocienskiオレフィン化反応により炭素-炭素結合形成を行なったところ1位立体化学が保持されたアリール置換アルケニル体が得られた。以下5段階を経て(S)-(+)-dysoxylineを光学活性体として得ることができた。同様に(S)-(+)-colchiethanamineおよび(S)-(+)-colchiethineも合成する事が出来た。これらは最初の全合成として評価された。一方、(-)-emetineの合成においてはA,B,C環まで合成で来たが、その後の共役付加反応が効率的に進まず、そこまでで止まる結果となっている。既に、3つのイソキノリンアルカロイドを全合成し、この環化によるアルカロイド合成の有用性を示すことが出来た。データが揃えば論文に投稿できるレベルである。3つのイソキノリンアルカロイドを全合成し、この環化によるアルカロイド合成の有用性を示すことが出来た。これらの成果は一部論文に発表した。残るデータも近々投稿予定である。終了時まで6ヶ月で、(-)-emetineの不斉全合成を達成出来ると考えている。本課題研究は終了した。
早期新生児における哺乳行動と吸啜圧の経時的変化

早期新生児の吸啜圧の強さについては経日的変化は統計的に認められなかった。また、哺乳行動アセスメントツールにて評価された、哺乳行動の経日的発達との関連も認めなかった。しかし、圧波形パターンでは出生直後にはあまりみられない持続的陰圧が出生後1、3日目からみられるようになっていた。つまり、吸啜圧を増大させて哺乳できるようになるのではなく、効果的な哺乳行動ができるようになるものと考えられる。効果的な母乳育児支援を行うための、哺乳行動を中心とした母乳育児の評価指標を示していくことを目的に、早期新生児の吸啜圧と圧パターンの経時的変化を観察し、既に作成し信頼性と妥当性の検討を行った哺乳行動アセスメントツール(以下、BBAツール)との関連性を検証する。そのために本年度は、(1)早期新生児の哺乳行動に関する最近の知見を整理すること、(2)早期新生児の吸啜圧測定のための機器の準備、(3)吸啜圧測定手技の習得、(4)本研究に向けてプレテストを計画し、実施した。(1)については、児の乳汁の飲み取りには舌の蠕動運動よりも、むしろ軟口蓋付近の陰圧によるものの方が重要であることが報告されていた(Hartmann,2009)。(2)、(3)については、吸啜圧測定機器としてデータ収集・解析システム(PowerLab26TML856,BPアンプML117)を購入し、測定用品の準備および測定手技の確認を行った。(4)については、研究協力を頂いた産科施設2ヶ所にて、実際の授乳場面にて吸啜圧測定を実施すると同時に、BBAツールによる授乳の評価をプレテストの目的で実施した。その実施に際し研究協力者への倫理的配慮としては、聖母大学研究倫理委員会の承認(受付番号24)を得、書面と口頭での説明を行い、同意を得られた母児を対象とした。結果は、8組の母児に対して、分娩後24時間以内(分娩後2時間分娩後18時間)、分娩後24時間以降、分娩後3日目、分娩後5日目の4時点で吸啜圧を測定し、入院中毎日1回/日においてBBAツールによる授乳の評価を行った。データ分析については今後着手予定であるが、プレテスト実施による課題や研究方法の再検討を行い、次年度の本研究に向けての準備を行っていく。効果的な母乳育児支援を行うためには、その授乳が適切に行われているかを判断するための評価指標が必要である。しかし、新生児が出生後からどのように哺乳行動を発達させ、どのように哺乳ができれば、適切な哺乳行動であると判断できるのかは未だ標準的な指標はない。そこで、本研究の目的は、早期新生児の吸啜圧および圧パターンと哺乳運動中の児頬筋の筋電位を測定することによって、哺乳行動の発達過程を明らかにすることである。さらに、すでに開発している哺乳行動アセスメントツール(以下、BBAツール)との関連性を検証し、BBAツールの有用性の強化を図りたいと考えた。平成22年度はプレテストを行い、出生後入院中の母児の授乳に立会い吸啜圧測定を実施し、出生後から経時的に吸啜圧が変化していることが検証できた。また、医療施設内で出生直後の母児に対して、研究手順での実施が可能であることも確認できた。平成23年度は研究計画書に従い、本研究データ収集を平成23年5月7日から5月16日、平成24年2月22日から3月1日、平成24年3月11日から3月27日までの3回に渡り、母児31組の分娩直後から出生後5日目までの毎日のBBAツールによる授乳状況の観察と、出生0日目、1日目、3日目、5日目の4時点での吸啜圧と筋電位測定を実施した。また、前回プレテストの考察から、吸啜圧とその圧パターンには乳汁分泌状態、乳頭の高さなどの乳房の状態にも関連があることが予測されたので、本研究データにはそれらも合わせて収集することとした。本年度はこれまで収集したデータの分析と、成果発表を行なっていく予定である。新生児の哺乳行動の研究は海外でも行われているが、現時点においては出生直後から5日間における継続的な新生児の吸啜圧測定のデータはない。したがって、国内外の研究者から示唆を得ながらデータ分析を行なっていきたいと考えている。母乳育児推進のためには、乳房の状態と共に、児の吸着や吸啜および適量な母乳の飲み取りをアセスメントできる客観的な指標をもとに、一貫した支援を行なっていく必要がある。そして、近年、児の哺乳行動の研究において、乳房から乳汁を哺乳するためには、咀嚼筋の運動により生じる陰圧、つまり吸啜圧が重要であることがわかってきた。

そこで、本研究の目的は、早期新生児において分娩直後から生後5日までの哺乳中の吸啜圧を測定し、経時的な吸啜圧の変化を分析することにより早期新生児の哺乳行動の発達過程を明らかにすることである。さらに、すでに開発している哺乳行動アセスメントツール(以下、BBAツール)を用いた哺乳行動の発達との関連を分析し、BBAツールの授乳の評価指標としての妥当性を検討した。研究方法は、正常な妊娠、分娩期を経ており、研究内容について理解し、参加への同意を確認できた29組の母児を対象に、分娩直後1時間以内、生後3日目、生後5日目の3回にわたり授乳中の吸啜圧の測定および、BBAツールでの授乳の評価を行った。なお、吸啜圧の測定にはADInstruments社のPowerLab4/26を用いた。吸啜圧の経日的変化は、分娩直後1時間以内で-139.8±79.7mmHg、生後3日で-140.2±91.5mmHg、生後5日で-146.7±70.6mmHgであり、統計的に経日的差は認められなかった。しかし、圧波形については新生児の吸啜圧で特徴的な持続的陰圧(hold pressure)は出生直後ではほとんど認められないが、出生後2日目以降から見られるようになっていた。これは新生児が、口腔内で乳頭を吸着できるという哺乳行動の発達を示しているものと考えられる。また、この持続的陰圧が確認された児の授乳では、BBAツールの得点も高い傾向があった。計画当初としては研究対象者数を50例程度と予定していたが、現時点では31例にとどまっている。これは、研究協力を承諾した者の中にも産後の疲労や、新生児が黄疸や感染症の治療が必要になり研究を中断せざるを得ないケースがあり、データ数の確保が難しかったためである。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は国内外の学会に参加し、母乳育児に関する研究者から示唆を得ながら、昨年収集した母児31組のデータ分析を行う。その際、データ収集時に新たに生じた課題として、吸啜圧測定中の新生児の上下口蓋、舌など口腔内の動きを超音波断層撮影法にて同時に撮影し吸啜圧や圧波形を合わせて解析することができれば、データ分析の妥当性の確保ができるのではないかと考えている。この点も踏まえて、実施計画を立ててく。
Ca Preconditioningによる心筋内Ca動態と虚血耐性の機序

研究目的:摘出灌流心の虚血再灌流モデルを用いて、Ischemic(IP)およびCa preconditioning(CP)を施行、蛍光イオン指示薬を用いて細胞内Ca動態を観察した。CPの心筋保護機序として虚血・再灌流における細胞内Ca過負荷の抑制効果ならびに抗不整脈効果の有無を検討した。方法:1)摘出灌流心標本と血行動態300-350gの雄性Sprague-Dawleyラット摘出心をLangendorff法、Ca^<2+> 2mMのHEPES-Tyrode液にて定流灌流した。冠灌流量を10%に減少させるlow-flow ischemiaを誘発し、同時にペーシングを加えた。左室圧・心電図をモニターした。2)細胞内Ca^<2+>動態([Ca^<2+>]I)の測定蛍光指示薬4μM fura-2を経冠動脈的に心筋に負荷し,340nm/380nmのUV励起光による500nmの蛍光強度比を光ファイバー照射測光ユニット(日本分光CAF110)を用いて測定。3)Ca preconditioningの作成高Ca溶液による(CPHC):灌流条件を通常のTyrode溶液から高Ca,Tyrode溶液(Ca^<2+>:3.5mM)に1分間変換し、再び通常の灌流液に戻した。低Na溶液による(CPLN):灌流液をTyrode溶液から、低Na,Tyrode溶液(Na^+:70mM,Tris:70mMに調整)に1分間変換した。低Na灌流によりreverse mode Na/Ca交換系が刺激され、Caの細胞内流入が起こる。4)実験プロトコール。4群に分けて検討。虚血10分、再灌流15分の対照群(n=6)に対して、CPHC群(n=6)、CPLN群(n=6)ともにCa preconditioningを2回施行後、虚血10分、再灌流15分施行。さらにIP群(n=6)としてIschemic preconditioningを2回施行後、虚血再灌流を行った。結果:CPHC群、CPLN群、IP群いずれもpreconditioningにより、一過性の細胞内Caの上昇がみられた。虚血10分及び再灌流1分の細胞内Caの上昇率は対照群の107.7±9.4%、57.1±13.7%に対して、IP群61.1±3.0%(p<0.01)、22.4±3.9%(p<0.05)に抑制された。CPLN群、CPHC群においても再灌流1分で21.5±10.1%(p<0.05)、23.8±7.4%(p<0.05)と抑制効果がみられた。いずれのpreconditioning群においても、再灌流後の不整脈発生頻度の減少と、rate-pressure productの回復傾向がみられた。結論:CPの保護効果として細胞内Ca過負荷の軽減が一部関与する。またIschcmic preconditioningの心筋保護効果発現のtriggerとして、一過性の細胞内Ca上昇が重要と思われた。研究目的:方法:1)摘出灌流心標本と血行動態300-350gの雄性Sprague-Dawleyラットの摘出心をLangendorff法、Ca^<2+>2mMのHEPES-Tyrode緩衝液にて定流灌流した。虚血は冠灌流量を10%に減少させるlow-flow ischemiaとし、同時にペーシングを加えた。さらに左室圧、心電図を同時モニターした。2)細胞内Ca^<2+>動態([Ca^<2+>]i)の測定蛍光指示薬4μM fura-2を経冠動脈的に心筋に負荷し,340nm/380nmのUV励起光による500nmの蛍光強度比を光ファイバー照射測光ユニット(日本分光CAF110)を用いて測定。高Ca溶液による(CPHC):灌流条件を通常のTyrode溶液から高Ca,Tyrode溶液(Ca^<2+>:3.5mM)に1分間変換し、再び通常の灌流液に戻した。4)灌流実験プロトコール。4群に分けて検討した。虚血10分、再灌流15分の対照群に対して、CPHC群、CPLN群ともにCa preconditioningを2回施行後、虚血10分、再灌流15分施行。さらにIP群としてIschemic preconditioningを2回施行後、虚血再灌流を行った。結果、結論:CPHC群、CPLN群ともにpreconditioningにより、一過性の細胞内Caの上昇がみられた。虚血時の細胞内Caの上昇はCPLN群にて抑制された。再灌流後のrate pressure productはいずれのpreconditioning群においても回復傾向が得られた。CPの保護効果として細胞内Ca過負荷の軽減が一部関与する。