hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アゲハとスズメガによる花色・花香への自然選択過程:花粉一粒PCRによる実証

送粉者の違いによる適応的種分化の過程について理解を深めるには,花色・花香などの誘引に関する形質と,柱頭や葯の位置などといった花粉授受に関する形質の両方について,送粉・受粉成功への貢献度を評価する必要がある。本研究では,送粉プロセスを通して花粉の移動を観察するために,キスゲ属を用いた混生集団において,柱頭に受粉された花粉の生産個体を特定した。主にアゲハチョウに送粉されるハマカンゾウは,昼咲きで香りのない赤い花をつける。一方,主に薄暮性および夜行性スズメガに送粉されるキスゲは,夜咲きで甘い香りのある黄色の花をつける。このハマカンゾウ24株とハマカンゾウとキスゲのF2雑種12株で構成された実験集団において,送粉者の訪花行動を観察した。さらに,アゲハチョウとスズメガの訪問毎に柱頭を採取し,付着した花粉一粒ずつの遺伝子型から花粉生産株を決定することで,実験株のオス繁殖成功・メス繁殖成功を測定した。これらを指標に,アゲハチョウとスズメガが花形質に与える選択圧を階層ベイズモデルを用いて評価した。その結果,アゲハチョウを介した送粉では,赤花と弱い花香が選択された:獲得他家花粉数において花色に対する安定化選択が,オス・メス成功の統合指標において花香に対する安定化選択が検出された。この結果は,主にアゲハチョウに送粉されるハマカンゾウが,香りのない赤花であることの理由となる。一方で,スズメガを介した送粉において,花色や花香に対する選択は検出されなかった。この結果は従来の「キスゲの黄花や甘い花香はスズメガに適応して進化した」という仮説を支持しない。少なくとも薄暮性スズメガに黄花や花香は選択されないことから,夜に送粉される花の進化は,黄花や花香の獲得よりも昼咲きから夜咲きへの開花時間のシフトをトリガーとした可能性が高い。昼と夜では,送粉者相だけでなく,非生物的な環境も大きく異なる。これらの違いが,キスゲの黄花や甘い花香の進化に影響したと考えられる。動物による送粉は,送粉者を花に誘引する過程と,訪花した送粉者と柱頭,葯間で花粉を授受する過程に分けられる。このため,送粉者の違いによる適応的種分化の過程について理解を深めるには,花色・花香などの誘引に関する形質と,柱頭や葯の位置などといった花粉授受に関する形質の両方について,送粉・受粉成功への貢献度を評価する必要がある。本研究では,それぞれアゲハとスズメガに適応したハマカンゾウとキスゲを用いて,各花形質の送粉・受粉成功への貢献度を測定した。室内にハマカンゾウとF2雑種で構成された実験集団を設置し,訪花未経験のナミアゲハ1個体を自由に訪花させた。訪花後,柱頭上の花粉を採取し,各花粉の遺伝子型を特定することにより,各株の送粉・受粉成功を評価した。訪花された株を入れ替え,ナミアゲハ計31個体について実験を繰り返した。アゲハは花色と花茎の高さに有意な選好性を示した。受粉成功は,花色・花茎の高さに加え,花柱の長さと花冠の向きに有意に影響された。一方,送粉成功では有意な効果のある形態形質はみられなかった。送粉・受粉成功を統合した指標では,花色,花柱の長さに有意な効果がみられた。すなわち,誘引形質(花色)と花粉授受に関する形質(花柱の長さ)がともに送受粉成功に影響していた。形態形質は受粉成功(雌適応度成分)のみに影響していた。この結果は,花柱が雄蕊より長いため,翅が葯よりも柱頭と接触しにぐいというキスゲ属の花とアゲハの関係を反映したものだろう。野外にハマカンゾウとF2雑種で構成された実験集団を設置し,訪れたアゲハとスズメガの行動を観察し,訪花された花から柱頭を採取した。柱頭上上の各花粉の遺伝子型を特定することにより,各株の送粉・受粉成功を評価した。アゲハは,弱い香りのある赤花を選好し,中間的な高さの花茎を持つ株によく訪花する傾向がみられた。他家受粉成功では花香強度と花茎の高さに安定化選択が,送粉成功では柱頭葯間距離に分断化選択がみられた。スズメガも,アゲハと同様赤花を選好する傾向がみられた。花粉授受では,柱頭葯間距離が小さいほど他家受粉を多く得ている傾向があったのに対し,送粉成功では柱頭葯間距離が大きい方が有利だった。

誘引と花粉授受を統合した指標を用いると,アゲハでは,花色への方向性選択,花冠の向きと花茎高さへの安定化選択,柱頭葯間距離への分断化選択がそれぞれ検出された。スズメガでは花色への方向性選択のみが検出された。スズメガによる訪花では,柱頭葯間距離にメス繁殖成功(他家受粉)とオス繁殖成功(送粉)介して逆方向の選択が検出された。これは性的対立を示唆している可能性がある。雌雄間での対照的な選択がはたらくは一般的であると予想されており,本研究はこの仮説を支持する。送粉者の違いによる適応的種分化の過程について理解を深めるには,花色・花香などの誘引に関する形質と,柱頭や葯の位置などといった花粉授受に関する形質の両方について,送粉・受粉成功への貢献度を評価する必要がある。本研究では,送粉プロセスを通して花粉の移動を観察するために,キスゲ属を用いた混生集団において,柱頭に受粉された花粉の生産個体を特定した。主にアゲハチョウに送粉されるハマカンゾウは,昼咲きで香りのない赤い花をつける。一方,主に薄暮性および夜行性スズメガに送粉されるキスゲは,夜咲きで甘い香りのある黄色の花をつける。このハマカンゾウ24株とハマカンゾウとキスゲのF2雑種12株で構成された実験集団において,送粉者の訪花行動を観察した。さらに,アゲハチョウとスズメガの訪問毎に柱頭を採取し,付着した花粉一粒ずつの遺伝子型から花粉生産株を決定することで,実験株のオス繁殖成功・メス繁殖成功を測定した。これらを指標に,アゲハチョウとスズメガが花形質に与える選択圧を階層ベイズモデルを用いて評価した。その結果,アゲハチョウを介した送粉では,赤花と弱い花香が選択された:獲得他家花粉数において花色に対する安定化選択が,オス・メス成功の統合指標において花香に対する安定化選択が検出された。この結果は,主にアゲハチョウに送粉されるハマカンゾウが,香りのない赤花であることの理由となる。一方で,スズメガを介した送粉において,花色や花香に対する選択は検出されなかった。この結果は従来の「キスゲの黄花や甘い花香はスズメガに適応して進化した」という仮説を支持しない。少なくとも薄暮性スズメガに黄花や花香は選択されないことから,夜に送粉される花の進化は,黄花や花香の獲得よりも昼咲きから夜咲きへの開花時間のシフトをトリガーとした可能性が高い。昼と夜では,送粉者相だけでなく,非生物的な環境も大きく異なる。これらの違いが,キスゲの黄花や甘い花香の進化に影響したと考えられる。訪花経験のないスズメガを用意できなかったため,スズメガが生得的に選好する花形質は調べられなかった。その一方で,前年度の結果から新たに生じた「黄花が優占している集団でスズメガがどう振る舞うか」という問題については野外実験を行い検証することができた。今後は,性的対立の可能性が示唆された柱頭と葯の位置について,その原因を明らかにするために,測定する形質を増やして訪花実験を行う。この実験では柱頭や葯の位置に十分な表現型分散を確保するためにF2雑種のみで構成された実験集団を用いる。また,野外でスズメガの幼虫・蛹を採集し,訪花経験のないスズメガを用いた実験を行う。これまでに得たデータをまとめて,国際学術誌に論文を投稿する。
赤外線サーモグラフィを用いた肺区域間面同定法の確立

肺区域切除において区域間面の同定は重要なプロセスである。研究代表者らは生体ブタを対象に赤外線サーモグラフィを用い、区域血管(肺動静脈)遮断後に肺表面温度の変化を観察する方法を確立し計4区域において肺区域間面の明瞭な描出同定に成功した。また実臨床において区域肺静脈が同定困難な区域切除を念頭に区域肺動脈のみを遮断することでも同様に区域間面が同定できることを明らかにした。本法で得られた区域間面と、現在広く受け入れられている区域間面同定法(含気虚脱ライン法)とを比較し、これらが一致することを示した。臨床応用にむけ、最低限必要な開胸創径の検討も行い、12cm程度の開胸創が必要であることを明らかにした。肺区域切除において、肺区域間面を同定する方法はいくつか報告されているが、それぞれの方法に特有の限界があり、より簡便な方法の確立が求められている。研究代表者らは予備実験において、肺切除術中に切除予定肺の血管(肺動脈、肺静脈)を切離することで切除肺の表面温度が低下することを確認している。この原理は肺区域切除術中の区域間面同定にも応用可能と考え、この温度差(=区域間面)をサーモグラフィカメラで同定できると想定した。当該年度においては、サーモグラフィカメラ(Infrec R300SR-S、日本アビオニクス社)を購入し、その使用法に習熟するとともに、まずブタ肺の区域解剖を文献的、およびブタ摘出心肺を用いて検討し、適切な切除予定区域を設定した。その結果、ブタの左肺がヒト左肺と類似しており、上葉においてはヒトと同じ上区と舌区、下葉においてはS6に相当するD2, S8に相当するL2区域が実臨床に則しており適切と考えられた。また当初予定していた摘出心肺を用いたサーモグラフィでの予備的実験については、温生食を用いた還流、加温が困難であり施行せず、次年度に予定していた生体ブタでの実験を前倒しして開始することとした。当該年度においては生体ブタを用いて計4回の区域切除を行った。その結果、ブタ肺左上区域切除については、肺動静脈切断後に区域間面がサーモグラフィカメラで観察可能であった。また下葉D2区域においては区域肺静脈を同定することが困難で、区域肺動脈のみの切断となったが、上区と同様に区域間面がサーモグラフィカメラで観察可能であった。これらの実験はすべて開胸下に行っており、次年度以降、他の区域切除で応用可能かどうか、また創を小さくしても区域間面が観察可能かどうか等、検討を進める予定である。また最も区域間面が明瞭に観察できるように、サーモグラフィの設定を最適化する検討も併せて進めたい。すでに生体ブタでの実験を開始し、区域間面の描出には成功しており、概ね順調に進展している。また、予算的な問題から実験可能なブタの数は当初の予定よりも減る可能性が高いが、限られた実験回数の中でサーモグラフィを用いた肺区域切除の実現可能性については十分検討可能と考えられる。肺区域切除術において、区域間面同定は非常に重要なプロセスである。研究代表者らは既存の方法とは違う新しいアプローチとして、切除予定区域血管を遮断することで、区域血流、さらには切除予定区域表面温度を低下させ、それを赤外線サーモグラフィカメラで描出することで区域間面が同定できると想定し検討を重ねた。当該年度においては、前年度に購入した赤外線サーモグラフィカメラ(Infrec R300SR-S,日本アビオニクス社)を使用し、生体ブタを用いて計3回の肺区域切除を行った。その結果、以下の新たな知見が得られた。1、すでに区域間面同定に成功した左前葉前区域、後葉D2区域以外に、右前葉(ヒト右上葉に相当)、および左後葉L2区域(ヒト左S8区域に相当)においても、区域肺動静脈切断後に区域間面を同定することが出来た。2、また右前葉、左L2, D2区域においては、区域肺動脈のみを先行して遮断し、肺動脈遮断のみで区域間面同定が可能かどうか検討したところ、区域肺動脈のみを遮断した場合も速やかに肺表面温度は低下し、区域間面を明確に同定できた。3、現在の臨床で主流となっている少開胸手術で本同定法が応用可能か検討するために、6cmから20cm程度まで開胸創を変更しながらサーモグラフィで胸腔内を観察したが、その結果肺表面温度を観察する最低限の開胸サイズは12cm程度(肋骨1本切断)であった。上記の結果から、本法による区域間面同定法が多くの区域で応用可能であることが示された。また肺動脈のみの遮断で、肺動静脈両方の遮断と同等の結果が得られたことから、肺動脈は同定容易であるが、肺静脈の同定が困難な区域切除、例えばヒトであれば下葉のS7、S9、S10などのより複雑な区域切除で本法が有用である可能性が示唆された。

本法で得られた区域間面と、現在広く受け入れられている区域間面同定法(含気虚脱ライン法)とを比較し、これらが一致することを示した。臨床応用にむけ、最低限必要な開胸創径の検討も行い、12cm程度の開胸創が必要であることを明らかにした。平成29年度については、さらに生体ブタを用いた実験を進め、以下の項目について検討を行いたい。1他の区域切除の際にも応用可能かどうか(L2区域等)。2開胸創を小さくした場合の区域間面観察の可能性、すなわちサーモグラフィ上区域間面同定可能な最小創径について(胸腔鏡下手術を念頭において)。3区域血管切断後の区域間面観察の最適なタイミングや区域間面を同定するために必要な条件(区域肺静脈切離が必ずしも必要かどうか)について。4将来的な臨床応用に向けた課題を明らかにする。呼吸器外科生体ブタを用いた実験にかかる費用を多めに見積もって請求したが、実際は予測よりも安価に実験施行することができたため次年度使用額が生じた。次年度も引き続き生体ブタを用いた実験を予定しており、次年度使用額もそちらの実験費用に充てたい。
樹状細胞による免疫療法が奏功した患者血清からのSEREX法による膵癌抗原の同定

1.膵癌患者に対する樹状細胞を用いた免疫治療肝転移を有する切除不能膵癌患者に対し、術中放射線照射ののちに膵原発巣に自家樹状細胞を局所注入する免疫治療を20名に実施した。後半の10名は抗がん剤との併用を行った。同時期の同様な治療を行わなかった群に比べて生存率で有意差は得られなかったが、2例において肝転移の縮小、長期増悪抑制が得られた。樹状細胞がアポトーシスに陥った膵癌細胞を貪食している様子を捉えた。2. SEREX法による新規膵癌抗原の同定膵癌患者血清を用いてSEREX法を行い、染色体10p12に位置するKU-CT-1を癌・精巣に特異的に発現する抗原として単離した。膵癌における発現率は33%であり、特異的な抗体は6%の膵癌患者血清において確認された。膵癌の特異的な抗原として免疫治療に応用できる可能性が示唆された。3.膵癌における癌特異的抗原発現の検討膵癌切除標本からティッシューアレイを作成し、広範囲の腫瘍で発現することが知られているWT1,survivinの発現頻度を解析し、その発現頻度が40%前後であることを確認した。4.強い細胞性免疫に極性化された樹状細胞を用いた膵癌の免疫治療の臨床応用IFNα、IFNγ、TNFα、IL-1β、PolyI:Cにより成熟させた樹状細胞の表面抗原発現、IL-12p70の産生能を測定し、膵癌患者においても細胞性免疫に極性化した樹状細胞を誘導できることが示された。極性化した樹状細胞を足背リンパ管内に直接投与する臨床第1相試験を実施し、安全に施行可能な方法が確立され、がん特異的抗原を負荷して投与する臨床応用への展望が開けた。1.肝転移を有する進行膵癌患者に対する術中照射と樹状細胞腫瘍内局所注入療法の施行。東北大学倫理審査委貝会の承認と、文書による本人の同意を得て、肝転移を有する進行膵癌に対して、術中照射を行ったのちに原発巣に樹状細胞を1-5x10^7個注入する免疫療法の第1相試験を17例に施行した。生存期間中央値は5ヶ月で、対照群である術中照射療法のみの症例と有意差はなかったが、対照群の1年生存率が2.6%であったのに対し、樹状細胞注入群の1年生存率は11.8%であった。2.新たな強い細胞性免疫を誘導する機能を持つ樹状細胞療法の開発2004年末に東北大学にGMPグレードの細胞プロセッシングセンターが設置されたのを機に、臨床において投与する樹状細胞はすべて同センターにおいて作成している。利用に際して必要な技術を有する実験助手を当研究費により雇用した。肝転移あるいは術後再発があり、抗がん剤にも耐性となった進行膵癌を有する患者の末梢血50mLから単球を分離し、GM-CSFとIL-4存在下に樹状細胞を誘導。6日目にTNFα、IL-1β、IFNα、IFNγ、PolyI :Cを用いて成熟させ、表面抗原の変化ならびIL-12産生能の変化を測定した。東北大学倫理委員会の承認を得て、上記の条件で成熟させた自家の樹状細胞の足背のリンパ管内から投与する第1相、早期第2相臨床試験も開始した。この試験において獲得された血清も本研究における抗原同定のための血清として使用される。3.腫瘍細胞からのRNA抽出と発現プロファイル肝転移巣、原発巣、正常組織(筋肉、白血球)からのRNA抽出を行い、遺伝子数20000をのせたマイクロアレイにかけて発現プロファイルを解析した。

1.肝転移を有する進行膵癌患者に対する術中照射と樹状細胞腫瘍内局所注入療法の施行。東北大学倫理審査委員会の承認と、文書による本人の同意を得て、肝転移を有する進行膵癌に対して、術中照射を行ったのちに原発巣に樹状細胞を1-5x10^7個注入する免疫療法の第1相試験を20例に施行した。生存期間中央値は5ヶ月で、対照群である術中照射療法のみの症例と有意差はなかったが、対照群の1年生存率が2.6%であったのに対し、樹状細胞注入群の1年生存率は11.8%であった。2.新たな強い細胞性免疫を誘導する機能を持つ樹状細胞療法の開発2004年末に東北大学にGMPグレードの細胞プロセッシングセンターが設置されたのを機に、臨床において投与する樹状細胞はすべて同センターにおいて作成している。利用に際して必要な技術を有する実験助手を当研究費により雇用した。肝転移あるいは術後再発があり、抗がん剤にも耐性となった進行膵癌を有する患者の末梢血30mLから単球を分離し、GM-CSFとIL-4存在下に樹状細胞を誘導。6日目にTNFα、IL-1β、IFNα、IFNγ、PolyI:Cを用いて成熟させ、表面抗原の変化ならびIL-12産生能の変化を測定した。東北大学倫理委員会の承認を得て、上記の条件で4日間連続培養し、成熟させた自家の樹状細胞を足背のリンパ管内から投与する第1相、早期第2相臨床試験も開始した。この試験において獲得された血清も本研究における抗原同定のための血清として使用される。3.腫瘍細胞からのRNA抽出と発現プロファイル肝転移巣、原発巣、正常組織(筋肉、白血球)からのRNA抽出を行い、遺伝子数20000をのせたマイクロアレイにかけて発現プロファイルを解析した。1.新たな強い細胞性免疫を誘導する機能を持つ樹状細胞療法の開発2004年末に東北大学にGMPグレードの細胞プロセッシングセンターが設置されたのを機に、臨床において投与する樹状細胞はすべて同センターにおいて作成している。6日目にTNFα、IL-1β、IFNα、IFNγ、PolyI:Cを用いて成熟させαDC1を作成した。αDC1はCD80,CD86,CD40ならびIL-12産生能の産生にすぐれており、培養における新鮮な培地、サイトカインの使用がその性能に決定的な影響を与えることが判明した。東北大学倫理委員会の承認を得て、上記の条件で4日間連続培養し、成熟させた自家の樹状細胞を足背のリンパ管内から投与する第1相、早期第2相臨床試験を開始し、7名に10回投与した。大きな副作用・合併症なく投与施行できた。投与に伴う腫瘍増殖抑制効果および生存率の改善は得られなかったが、腫瘍特異的抗原を負荷した樹状細胞による抗腫瘍効果の確認へとっながる技術の開発ができた。2.ティッシューアレイの作成肝転移巣、源発巣、正常組織(筋肉、白血球)からのRNA抽出を行い、発現プロファイルを検索した。そのプロファイルに基づく免疫染色を効率よく行うために、膵癌臨床標本によるティッシューアレイを90人分作成した。ティッシューアレイを用いて、膵癌原発巣、肝転移巣におけるWT1, survivin, MHC class Iの発現を検討し、膵癌ではWT1, survivinの発現が減弱しており、とくに肝転移において弱くなっていることを見出した。
キャビテーション発生時に見られる発光現象の研究

この研究を行うためには、キャビテーションの観察が容易であり、発生場所が明らかである必要がある。今回は絞りを片側に寄せたアクリル製の偏向二次元絞りを用いて実験を行った。まず、この絞りにおけるキャビテーションを、写真、ビデオ、及びレーザ透過光量変化測定によって観察した。その結果、気泡は上流から流れてくるのではなく、絞り部近傍で発生していることが確かめられた。暗やみの中でこの絞りを観察した結果、発光はキャビテーション初生時から閉塞に至るまで見られ、キャビテーションが発達するにつれて発光強度が強くなり、後方にまで光が観察されることが分った。また材質の異なる絞りによる観察を行った結果、アクリル製の絞りによる発光が一番強かったのに対し、鉄では確認できるほどの発光は見られなかった。これは、両者の電気伝導性の違いによるものであり、絶縁体であるアクリルでは電荷が閉じ込められているのに対し、鉄では絞りの治具から逃げているからと考えられる。次に絞りの上にアルミ箔を接触させ、流量とその部分の電位の変化、及び発光強度を同時に測定し、波形記録装置(マルチデジタイザ)を用いてコンピュータに取り込んで解析を行った。その結果、流量を徐々に上げていくと、発光が起こる瞬間にアルミ箔の電位が大きく変化し、発光が起きている間その電位を維持する。その後流量を下げていくと、発光の消滅とともに電位が元の値に戻るということが確認された。この発光と電位との直接の原因は明らかではないが、キャビテーション初生時に生じる真空の空洞部でそれまで流動帯電によって蓄積していた電荷が放電するのではないかという仮説を得ることができた。
フロン代替溶剤の毒性解明と新しい分子、生物マーカーを用いたリスクアセスメント

(1)1-ブロモプロパンに曝露したラットから尿を採取した。尿100oμLに飽和食塩水400μL加え、酢酸エチルを500μLにて3回抽出した。無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、遠心濃縮器にて濃縮乾固し、40μLの酢酸エチルに溶解の後、20μLのMTBSTFAを加え、TBDMS誘導体化し、N-Acetyl-S-propylcysteineを同定した。代謝物N-Acetyl-S-propylcysteineは曝露量依存的であり、内部曝露指標として有効であることがわかった。(2)1-ブロモプロパンに2週間曝露したラットから血液を採取し、Actone-oxalic acid混液を用いてグロビン蛋白を抽出した。グロビンは無酸素下で酸加水分解を行い、LC-MS/MSにてS-propylcysteineを同定した。(3)1-ブロモプロパンに曝露したラットから麻酔下で、大脳、小脳、脳幹、脊髄を取り出し、ホモジェネートの後、可溶牲蛋白を分離した。サンドイッチタイプのEIA法にて神経特異蛋白γ-Enolaseグリア特異蛋白β-S100を定量した。さらに、グルタチオン(GSH、GSSG)を酵素サイクリング法にて測定した。その結果、γ-Enolaseが大脳で特異的に減少し、1-ブロモプロパンが中枢神経に強い影響を与えることが示唆された。(4)1-ブロモプロパン曝露ラットから麻酔下で精巣を取り出し、免疫染色にてα-エノラーゼを染めた。その結果、αエノラーゼはセルトリ細胞に特異的に発現し、他の精子形成細胞には見られないことがわかった。さちにEIA法にてα-エノラーゼの定量を行った結果、曝露量依存的にαエノラーゼが増えおり、セルトリ細胞に影響があることが示唆された。1.1-ブロモプロパン(1-BP)曝露マーカーN-acetyl-S-propylcysteineの解析2.1-BP暴露による中枢影響の分子マーカーを用いた解析36匹のウィスター系ラットを8匹ずつの4群に分け、3群に対し1-BP200ppm、400ppm、800ppmを1日8時間、7日間曝露した。残りの群は対照群として新鮮空気のみを与えた。実験の最後に麻酔下で賭殺し、中枢神経の生化学的分析を行った。神経特異蛋白質γ-エノラーゼ、総グルタチオン、非蛋白スルフヒドリル(SH)基は、大脳および小脳で減少した。クレアチンキナーゼ(CK)活性は、脳、脊髄の全部位で量依存的に減少したが、これは酵素免疫法で定量したCKB量の変化では説明できず、1-BP暴露によってCKの酵素阻害がおきていることが示唆された。3.2-BP暴露による生殖細胞アポトーシスラットに1350mg/kgの2-BPを1-5日間投与し、1回,2,3,5回投与後、最終投与後2または9日後に賭殺した。光学顕微鏡、電子顕微鏡観察、DNA断片のTUNEL法染色、低分子量DNA電気泳動、Bcl-2 family蛋白、FasレセプターおよびリガンドのWestern blottingを行った。その結果、2-BPが、精巣胚細胞のアポトーシスを引き起こし、その過程には、Bcl-2 family遺伝子とFasシグナルシステムが関与していることがわかった。1.40匹のWistar系非妊娠雌ラットを4群に分け、3群に200,400,800ppmの1-BPを一日8時間、週7日間で12週間吸入曝露し、対照群には新鮮空気のみを吸入させた。性周期を調べるために膣スメアを毎日採取した。

曝露終了後、断頭・解剖した。卵巣は10%緩衝ホルマリン固定、パラフィン包埋を行い、8μm厚の連続切片を作成し、HE染色を行った。5枚ごとの切片について正常形態の卵胞数を計測した。性周期は800ppm群で曝露第46週頃から不規則となり、第79週には全てのラットで不規則となるかまたは停止した。400ppm群では曝露第79週頃から不規則となるラットが有意に増加した。200ppm群では性周期への有意な影響はみられなかった。卵巣卵胞数の検討では、400ppm群で成長卵胞・濾胞卵胞の有意な減少が認められたが、始原卵胞には有意な数の変化はなかった。200ppm群では濾胞卵胞の有意な減少がみられた。本研究の結果からは1-BPの生殖障害の機序として、卵胞細胞の成熟過程の障害し、2-BPとは異なる機序で卵巣機能を障害することが示された。(1)48匹のウィスターラットを12匹ずつの4群に分け、1-ブロモプロパンに200、400、800ppm、新鮮空気に一日8時間、2週間曝露した。曝露終了時にラットを麻酔し、精巣、精巣上体を切り出し、右の精巣上体尾部を細切し、精子数と運動率の評価を行った。左精巣上体と精巣はCK-B、α-S100、β-S100、γ-エノラーゼをサンドイッチ型のEIA法にて測定するために用いた。精巣上体精子数は変化がなかった。しかし精子運動率は800ppmで有意に低下した。γ-エノラーゼは200ppm以上で量依存的に増加したが、精巣においては変化しなかった。対照的に、α-エノラーゼは400ppmと800ppmとで精巣で有意に増加していた。αS100は800ppmで精巣上体だけで有意に増加し、βS100は800ppmで精巣上体で増加していた。精巣上体におけるγ-エノラーゼと精巣におけるα-エノラーゼは精子指標より敏感であった。神経特異蛋白質は敏感で臓器特異的なバイオマーカーを提供するかもしれない。(2)32匹のウィスター雄ラットを8匹ずつの4群に分け、1-ブロモプロパンに50、200、800ppm、新鮮空気に曝露した。一日8時間2週間曝露を行った。2週間曝露終了後,麻酔下で腹部大動脈から全血採取し、同時に脊髄を取り、凍結保存を行った。血液からはグロビン、脊髄からはニューロフィラメントを含む分画を抽出し、LC-MSにて蛋白付加物を測定した。蛋白付加物S-Propylcysteineが曝露量とすぐれた相関をしていることが明らかとなった。
内耳の易受傷性と加齢変化に関する検討

われわれは、マウスを用いて、活性酸素除去能、オートファジーに代表される維持機構の状態が内耳恒常性維持に関与することを見出した。OGGと呼ばれる活性酸素除去能が低下したマウスに対して音響外傷を与えたところ、対照群と比較して内耳有毛細胞の障害が強かった。また、オートファジー7コンディショナルノックアウトマウスにおいて、内耳有毛細胞のせん毛が消失しており、有毛細胞維持にcriticalな因子であると考えられた。加齢変化を示すTBL-1ノックアウトマウスについては現在検討中である。内耳の易受傷性を確認するため、以下の遺伝子にターゲットをあてたマウスを用いて解析を行った。0GG1は活性酸素を消去するために必要な酵素であるため、欠損すると活性酸素の作用が長期化し障害が強く発生する可能性が考えられる。また、もう一つのTBL遺伝子は細胞の生存維持に重要な遺伝子であることが分担研究者である津田らが発見している。また、TBL遺伝子が不完全に発現しているとドミナントネガティブ効果によって生存維持機構を阻害することが知られている。そこでこの遺伝子が内耳特異的に発現するようなトランスジェニックマウスの開発を行った。1)OGG1ノックアウト(KO)マウスに関する研究OGGIKOマウスと野生型マウスでの内耳における強大音響曝露および加齢に伴う易受傷性を比較検討した。両群において、強大音響負荷(124dB,4kHz中心としたオクターブバンドノイズを2時間)したが、聴性脳幹反応(以下ABR)上、聴覚閾値の変化には有意差はみられなかった。一方、上記の両群マウスにおいて加齢変化を観察するために、生後9か月の時点でABRを施行したところ、OGGIKOマウスと野生型マウスに聴覚閾値上、有意差をもってKOマウスに悪化が認められた。現在は、内耳組織内でのDNA障害レベルを種々のマーカーを用いて、免疫染色学的にその発現の差を検討中である。TBLトランスジェニックマウスに関する研究2)20年度末に不完全長のTBL遺伝子を発現するマウスの繁殖が完成した。われわれは、今回、老人性難聴のうち有毛細胞、神経細胞を中心に、細胞維持と易受傷性という観点から老人性難聴の個体差が生じるメカニズムについて解明することを目的としている。Ebi遺伝子はハエ複眼の形成過程で必須な遺伝子であるが、ヒトでもTBL1というホモログが存在し、タンパク質の分解と転写抑制に働いている(Tsuda, L. et al., Cell 110 : 625-637、2002)。興味深いことにTBL1は加齢性聴覚異常疾患の一つOASD(ocular albinism sensorineural deafness)の原因因子でもある。Ebiはユビキチンリガーゼとしてタンパク質の分解に働くと同時に転写コリプレッサーとして転写を負に抑制する因子である。OASDモデルマウス(有毛細胞にのみ限局してebiを発現させている)を用いて加齢変化を検討した。まず聴性脳幹反応(ABR)にて8週齢では60±10.4dB(4kHz),73.4±3.2dB(12kHz),72.4±5.0dB(20kHz)、16週齢では89±5.8dB(4kHz),95±5.8dB(12kHz),95.8±4.8dB(20kHz)と有意に加齢に伴い進行する難聴を確認した。また電子顕微鏡により16週齢マウス蝸牛では有毛細胞脱落を認めた。次にOASDモデルマウスと野生型マウスについて易受傷性を比較するため、巨大音響負荷による変化を観察した。音響曝露の条件はBroadband noise(31.5Hz8kHz)、96dB SPL、2時間とした。また、OASDモデルマウスでは音響曝露後後の域値上昇が継続し、野生型マウスに比べ易受傷性の傾向を認めた。老人性難聴の聴力の程度には個体差が存在するが、その原因は不明である。われわれは、その個体差が細胞の維持機構や易受傷性に一因かおるのではないかと考えて検討したい。また、DNAの酸化障害である8-オキソグアニンを除去する酵素(8-オキソグアニン-DNAグリコシラーゼ)をコードするOgg1遺伝子が欠損したOGGノックアウトマウスと野生型マウスにおける聴力域値の経時的な変化を比較検討した。聴覚機能評価には聴性脳幹反応を用いて、生後8週齢と6カ月の時点で測定した。聴力域値変化の結果は、各周波数(4,8,16kHz)においてOGGノックアウトマウス(34.3,34,43.9dB)、野生型(24.1,17,28.6dB)と有意差をもってノックアウトマウスに聴力低下を認めたわれわれは以下のマウスを実験系に用いて内耳恒常性維持と受傷性について解析した。

1)OGGは活性酸素の除去を行う遺伝子であるが、その除去が行えないマウス(OGG KOマウス)において加齢変化が発生しやすいことが判明した(現在論文準備中)。2)TBLI遺伝子はショウジョウバエ眼において感覚器恒常性維持に重要であることがわかっており、TBL1遺伝子部分欠損とTBL1遺伝子全長の両者を有するマウスを作成して、ドミナントネガティブ効果をみる予定である。このマウスにおいて比較的強大音響を負荷した後にABRによる聴力測定をする予定である。3)オートファジーは細胞死、発生や加齢変化などに関与する。われわれは、オートファジーのサブタイプであるautophagy(atg)7を内耳特異的に欠損させることにより、感覚細胞である有毛細胞のせん毛が欠損し、ABR上で高度難聴を示すことを発見した。オートファジーが細胞内のカプセル化に関与する因子であるので、せん毛を作成する因子を運搬できないなどの問題が生じている可能性がある。現在マウスを増殖させて検討を加える予定である。内耳培養細胞も使用して解析しており、包括的にデータを報告する予定である(2010年アメリカ耳鼻咽喉科学会AAOポスター賞を受賞した)。以上の結果から、活性酸素除去能、オートファジーに代表される維持機構の状態が内耳恒常性維持に関与することがわかった。また、TBL1遺伝子の機構は不明な点も多いが、分担者である津田博士と継続してショウジョウバエからマウスまで解析していく予定である。
サルとヒトの顔認識の成立過程を探る実験的研究

本研究では,ニホンザル・チンパンジー・ヒトの乳児を対象とした,既知顔認識発達の比較実験を行った.ヒトでは生後10ヶ月までの縦断実験を4名の被験者に行い,チンパンジーは新生児3頭を対象とした生後10ヶ月までの縦断実験を行った,さらにニホンザルでは,人工哺育で飼育された個体2頭,自然哺育で飼育された個体2頭を対象とした,生後6ヶ月までの縦断実験を行った.各種において,(1)既知顔(母親顔)への好みがいつ頃成立するか,(2)母親顔と平均顔のどちらを好むか,を調べる実験を行った.実験では,いずれの種においても,養育者の顔をもとに,養育者(母親)顔・平均顔・養育者強調顔をCG合成し,それぞれの顔への注視時間を調べた.実験の結果,ニホンザルではヒトより既知顔成立時期が3倍早いことが判明した.さらに平均顔への好みの強さは,ヒト・チンパンジー・ニホンザルの順であったが,人工哺育のニホンザルは平均顔への好みが高いことが判明した.以上の実験結果から,顔認識の基盤となる"平均顔"の形成は,種により異なることが判明した.すなわち,顔認識は種による生得的なしばりを受けることが判明した.さらに自然哺育のニホンザルでは小さかった平均顔への好みが,人工哺育のニホンザルで強かった結果は,人工哺育のニホンザルで,自種でない個体の顔学習に圧があることを示唆するものであった.以上の結果は,顔認知発達には,生得的な要因の存在だけではなく,環境要因も重要であることを示唆するものであった.ニホンザルを対象にした実験は,2個体の人工保育群と,2個体の自然母子飼育群を対象に行った.人工保育群では,出生直後から生後2日間までの行動観察を行い,さらに生後6ヶ月まで,週2回の実験を行ない,発達初期に母親役の飼育者の顔を見る時間数と,飼育者の顔に対する好みを調べた.母子飼育群でも,生後2日間までの行動観察と,生後6ヶ月まで週1回の実験を行い,発達初期に母親サルの顔を見る時間数と,母親サルの顔に対する好みを調べた.ヒトを対象にした実験は,4名の被験者を対象に,生後10ヶ月まで,家族と主に母親の顔に対する好みを調べる実験を行った.ヒトを対象にした実験データから,既知顔の認識発達過程に2つの段階があることが判明した.第1の段階は生後3ヶ月に生じ,この時期はあらゆる顔を好んで見るため,既知顔に対する学習期と考えることができる.第2の段階は生後10ヶ月に生じ,既知顔に対する好みが成立することから,既知顔に対する学習完成期と考えることができる.このような経緯をたどってヒトの既知顔認識は学習されることが判明した.ニホンザルのデータは現在解析中ではあるが,ニホンザルはヒトと比較して,顔に対する好み自体が低い可能性が示唆されている.顔に対する興味の大きさの違いが,ニホンザルとヒトとの顔認識の違いを生み出している可能性が考えられる.次年度は,ニホンザルの既知顔認識の発達過程をより詳しく検討し,ヒトの顔認識の特異性を明らかにしていきたいと考える.本研究では,ニホンザル・チンパンジー・ヒトの乳児を対象とした,既知顔認識発達の比較実験を行った.ヒトでは生後10ヶ月までの縦断実験を4名の被験者に行い,チンパンジーは新生児3頭を対象とした生後10ヶ月までの縦断実験を行った,さらにニホンザルでは,人工哺育で飼育された個体2頭,自然哺育で飼育された個体2頭を対象とした,生後6ヶ月までの縦断実験を行った.各種において,(1)既知顔(母親顔)への好みがいつ頃成立するか,(2)母親顔と平均顔のどちらを好むか,を調べる実験を行った.実験では,いずれの種においても,養育者の顔をもとに,養育者(母親)顔・平均顔・養育者強調顔をCG合成し,それぞれの顔への注視時間を調べた.実験の結果,ニホンザルではヒトより既知顔成立時期が3倍早いことが判明した.さらに平均顔への好みの強さは,ヒト・チンパンジー・ニホンザルの順であったが,人工哺育のニホンザルは平均顔への好みが高いことが判明した.以上の実験結果から,顔認識の基盤となる"平均顔"の形成は,種により異なることが判明した.すなわち,顔認識は種による生得的なしばりを受けることが判明した.さらに自然哺育のニホンザルでは小さかった平均顔への好みが,人工哺育のニホンザルで強かった結果は,人工哺育のニホンザルで,自種でない個体の顔学習に圧があることを示唆するものであった.以上の結果は,顔認知発達には,生得的な要因の存在だけではなく,環境要因も重要であることを示唆するものであった.
新規解析系を用いた核-細胞質間タンパク質輸送経路同定と制御機構解析

熱ショック応答時には、Importin βファミリー分子依存的な核-細胞質間の分子輸送経路が強く抑制される。しかし一方で、分子シャペロンHsc70/Hsp70は細胞質から核に速やかに移行する。このHsc70/Hsp70の熱ショック応答性核内移行の分子機構は不明であった。本研究において、Hsc70/Hsp70の核内輸送に必須な新規機能分子の同定に成功した。さらに、この分子が全く新規な運搬体分子であることを強く示唆する結果を得た。熱ショック時には、通常の塩基性核局在化シグナル依存的なタンパク質の核内移行は強く阻害されるが、分子シャペロンHsc70などは、速やかに細胞質から核内た移行する。このような環境外刺激後の細胞内輸送システム変化が、細胞機能発現にどのように寄与しているのか、その解析はまだ十分にはなされてない。本研究は、Hsc70の核内移行メカニズムを明らかにするとともに、熱ショック等における細胞内輸送システム変化の機能解析を行うことを目的としている。本年度は以下のことを明らかにした。核-細胞質間輸送担体Importin βファミリー分子群は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって比較的簡単に細胞抽出液から吸収することが出来る(この細胞抽出液を吸収サイトゾルとする)。この吸収サイトゾルに、各Importin βファミリー分子のリコンビナントタンパク質を再添加することで、in vitro輸送系において、個々の輸送経路を再構築することが出来た。熱ショック処理したHeLa細胞からの細胞抽出液をin vitro輸送系に用いることで、Hsc70の核内移行を再構築出来たが、上記アッセイ系では、どのImportin βファミリータンパク質もHsc70の核内移行を促進しなかった。そこで、Hsc70の核内移行を促進する活性を指標として、細胞抽出液の分離精製を試みた。その結果、Importin βファミリーに属さない機能未知なタンパク質を同定した。この分子のリコンビナントタンパク質はHsc70核内移行を強く促進する活性を持つことを、in vitro輸送系で確認した。核-細胞質問の能動的タンパク質輸送の大部分は、運搬体分子群Importinβファミリーによって担われる。しかし、熱ショック応答時には、塩基性核局在化シグナル(NLS)に依存する輸送経路など正常時のタンパク質の核内移行が強く阻害されることが近年明らかになった。しかし一方で、分子シャペロンHsc70などは、熱ショックに応答し、細胞質から核に、その局在を速やかに変化させる。このHsc70核内移行の分子メカニズムはほとんど明らかになっていない。本研究では、熱ショック応答時におけるHsc70核内移行を解析するin vitro系を構築し、Hsc70の核内輸送機構の解析を行ってきた。熱ショック処理をしたHeLa細胞から細胞抽出液を調整し、Hsc70の核内移行を促進する活性を指標に、機能タンパク質の分離精製を行った。この分子は、酵母から人まで非常に高い相同性をもち、進化的に保存されている。しかし、どの生物種においても機能は不明であった。セミインタクト細胞での輸送系や培養細胞でのRNAi実験等から、この分子は、熱ショック時のHsc70/Hsp70の核内移行に必須であることがわかった。また、この分子は、運搬体分子の特徴である核膜孔通過活性をもつことがわかった。これらの結果は、この分子が、熱ショック応答時におけるHsc70/Hsp70の核内移行の運搬体分子であることを強く示唆している。本研究によって、熱ショック時に機能する核-細胞質問タンパク質輸送経路の同定に初めて成功した。細胞には恒常性を維持するため様々な防御機構が備わっている。本研究における核-細胞質問分子流通の制御もまた、それらの防御機構の一環と考えられ、今後のストレス応答研究等に重要な示唆を与える結果である。
脱細胞化組織を用いた子宮再生培養システムの構築

近年我々は脱細胞化子宮組織を用いた生体内でのマウス子宮再生モデルを樹立し、生体内での部分的子宮再生の成功や、再生過程で転写因子STAT3が重要な役割を果たしていることを報告したが(JCI insight, 2016)、野生型マウスと子宮特異的STAT3ノックアウトマウスの上皮再生過程の差異に着目し、再生を制御する分子生物学的機序に関する解析を行ったところ、ある液性因子がSTAT3の下流で子宮内膜の再生を制御している可能性が示唆された。また昨年度は、不妊治療研究の一環として、不妊症との関連が示唆される子宮腺筋症のマウスモデルの作成も行った。子宮腺筋症の病因として、子宮内膜爬術などの子宮手術に関連する群が存在するという報告に着目し、マウス子宮内腔から筋層にかけて微小な傷を人工的に作成することで子宮腺筋症様の病変を誘導することに成功し、子宮内膜の異所性発育においてもSTAT3が重要な役割を果たしていることが示唆された。昨年度は上記に加え、脱細胞化組織を用いて試験管内でマウス子宮細胞を培養する還流装置の開発を行った。採取したマウス子宮を細切しコラゲナーゼで処理し回収した上皮・間質・筋層が混合した末梢分化細胞を懸濁液として注射器を用いて脱細胞化組織内に注入し、密閉された還流系のなかで培養液を脱細胞化組織内に浸透させたところ、3日間の還流培養に成功した。今後はこの技術を洗練させ、成長因子や化合物をもちいた子宮再生培養系の確立を目指す。昨年度はさらに、不妊症の解明のため、上記の研究以外にも、遺伝子改変マウスモデルを用いて卵子の成熟や受精卵の着床に関する分子生物学的解明を行った。これらの研究成果は、J Clin Invest. (Matsumoto L,etal.2018)やFASEB J. (Haraguchi H, et al. 2019)などの著明な科学雑誌に掲載された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、子宮再生医療の確立に向け、本研究員が近年報告した脱細胞化子宮組織を用いた生体内でのマウス子宮再生モデル(JCI insight, 2016)を応用し、試験管内での子宮再生培養系の樹立を目標としたものである。子宮特異的STAT3欠損マウス(ΔSTAT3)の子宮再生能が低下していたことから、1ΔSTAT3を解析し、STAT3の下流における子宮再生制御機構を解明する2脱細胞化組織を用いて試験管内で子宮細胞を培養する技術を確立し、1で得た知見をもとに、より最適な培養条件下で(再生を促進する化合物の同定・添加など)効率的に組織培養を実現することを目標としている。1については、野生型マウス(WT)とΔSTAT3の上皮再生過程の遺伝子発現の差異に着目し、解析を行った。具体的には、移植後3日目に、<a.移植した脱細胞化組織表面に再生された上皮>、<b.移植した脱細胞化組織周囲の上皮>、<c.移植を行っていない、対側子宮角の上皮>の三群の上皮を、レーザーマイクロダイセクションを用いて回収し、RNAシークエンスを行った。その結果、WTの<a>において、分泌タンパク質であるオステオポンチン(OPN)がΔSTAT3と比較し、約4倍発現が上昇していることが明らかとなった。また、RNAシークエンスや免疫染色の結果、OPNの発現は、WTの<b>よりも<a>において上昇が認められた。OPNは線維芽細胞や免疫担当細胞の遊走に関わることが知られており、肝臓など他臓器における損傷からの再生過程に重要な役割を果たしていることが知られていることから、OPNがSTAT3の下流で、子宮の間質や筋層の再生に関わっている可能性が示唆される。2に関しては、現在、脱細胞化組織の深部にまで培養液を浸透させ、細胞を長期培養するための還流培養装置を開発中である。まずは3日間の還流培養実験を試みている。本研究課題の達成目標は、1マウス脱細胞化組織移植モデルを用いた生体内での子宮再生機序の解明、2脱細胞化組織を用いた試験管内での子宮細胞の培養、の二つに大別される。本研究員はこの1年間で、子宮再生能が低下した子宮特異的STAT3欠損マウスの遺伝子発現解析を行い、転写因子STAT3の下流において、線維芽細胞や免疫担当細胞の遊走を制御し他臓器の再生への寄与が報告されているオステオポンチン(OPN)が、子宮再生において何らかの機能を有していることを示唆する研究成果を上げた。今後は、OPNが子宮再生に果たす機能についてより詳細な研究を行う予定であり、子宮再生と免疫担当細胞の関与が明らかになる可能性や、子宮再生を促進する化合物の同定につながる可能性があり、今後の発展が大いに期待される。また、2に関しては、現在、脱細胞化組織を用いた試験管内での還流培養装置の開発に取り組んでいる途上であり、もしこの技術が確立されれば、1で得られた知見を活用し、より効率的な子宮再生培養系の樹立が期待される。総じて、この一年間の研究成果としてはおおむね期待通りの進展が得られたものと評価できる。近年我々は脱細胞化子宮組織を用いた生体内でのマウス子宮再生モデルを樹立し、生体内での部分的子宮再生の成功や、再生過程で転写因子

STAT3が重要な役割を果たしていることを報告したが(JCI insight, 2016)、野生型マウスと子宮特異的STAT3ノックアウトマウスの上皮再生過程の差異に着目し、再生を制御する分子生物学的機序に関する解析を行ったところ、ある液性因子がSTAT3の下流で子宮内膜の再生を制御している可能性が示唆された。また昨年度は、不妊治療研究の一環として、不妊症との関連が示唆される子宮腺筋症のマウスモデルの作成も行った。子宮腺筋症の病因として、子宮内膜爬術などの子宮手術に関連する群が存在するという報告に着目し、マウス子宮内腔から筋層にかけて微小な傷を人工的に作成することで子宮腺筋症様の病変を誘導することに成功し、子宮内膜の異所性発育においてもSTAT3が重要な役割を果たしていることが示唆された。昨年度は上記に加え、脱細胞化組織を用いて試験管内でマウス子宮細胞を培養する還流装置の開発を行った。採取したマウス子宮を細切しコラゲナーゼで処理し回収した上皮・間質・筋層が混合した末梢分化細胞を懸濁液として注射器を用いて脱細胞化組織内に注入し、密閉された還流系のなかで培養液を脱細胞化組織内に浸透させたところ、3日間の還流培養に成功した。今後はこの技術を洗練させ、成長因子や化合物をもちいた子宮再生培養系の確立を目指す。昨年度はさらに、不妊症の解明のため、上記の研究以外にも、遺伝子改変マウスモデルを用いて卵子の成熟や受精卵の着床に関する分子生物学的解明を行った。これらの研究成果は、J Clin Invest. (Matsumoto L,etal.2018)やFASEB J. (Haraguchi H, et al. 2019)などの著明な科学雑誌に掲載された。上述のように、本研究の目標は1再生能が低下した子宮特異的STAT3ノックアウトマウス(ΔSTAT3)を解析し、STAT3の下流における子宮再生制御機構を解明する2脱細胞化組織を用いて試験管内で子宮細胞を培養する技術を確立し、1で得た知見をもとに、より最適な培養条件下で(再生を促進する化合物の同定・添加など)効率的に組織培養を実現すること、の二点に大別される。1に対しては、RNAシークエンスによりオステオポンチン(OPN)が同定されたため、今後は子宮再生に関するOPNの機能について解析する予定である。具体的には、OPN欠損マウスの子宮再生の表現型解析や、ΔSTAT3に移植する脱細胞化組織にOPNを浸漬させることで再生が救済されるか、などの実験を計画している。2に対しては、脱細胞化組織を用いた試験管内での還流培養装置の開発に取り組んでいる途上である。用いる細胞については、採取したマウス子宮を細切しコラゲナーゼで処理し回収した上皮・間質・筋層が混合した末梢分化細胞であり、この細胞を含んだ懸濁液を注射器を用いて脱細胞化組織内に注入し、まずは3日間の還流培養実験を試みる。もし系の確立に成功すれば、肝臓における報告のように、脱細胞化組織をを用いた試験管内の還流培養系で最長の21日を目標とする。この時、1で得られた知見を活用し、組織再生培養に最適な条件を模索する方針である(OPNの添加など)。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
サル前頭眼野内の弓状溝深部における機能構成

サルの大脳皮質前頭葉には弓形の深さ5-7mmに達する溝(弓状溝)がある。この溝に沿った直前の皮質領域は、電気刺激によって刺激半球側と反対に向かうサッケ-ド眼球運動が生じる事から、前頭眼野と呼ばれて来た。最近、前頭眼野は弓状溝の前壁深部に広がっている事がわかって来た。本研究の目的は、弓状溝前壁深部も含め、前頭眼野の1.正確な範囲、2.各部位で誘発されるサッケ-ドを明らかにする事であった。その為に、無麻酔覚醒下の日本ザル(5頭)を用い、頭を動かない様に固定し、弓状溝前壁皮質にエルジロイ微小電極を種々の角度から刺入し、0.5mm進める毎に皮質内微小電気刺激(幅1ms、振幅70μA以下、間隔5msの負の10発矩形液電流)し、サッケ-ドを生じさせた。眼の動きの記録には、我々が開発した角膜反射像を利用した装置を用いた。刺激部位を同定する為に電極先端を電気分解し、組織に沈着させ、後に沈着物の発色処置を行い刺激部位を組織学的に再構築した。本研究によって以下の事が明らかになった。1.前頭眼野は主溝後端から弓状溝最深部まで吻尾側に広がり、主溝後端の2-3mm内側から後端の5-8mm外側まで広がっていた。2.皮質表面に対し垂直に深さを変えると、どの深さでもほぼ同方向・同振幅のサッケ-ドが誘発された。3.一般に、皮質上の部位が異なると生じるサッケ-ドも異なった。サッケ-ドの振幅は30度以下で、方向は反対側視野の上から下まであった。4.サッケ-ドの振幅は前頭眼野の内側部で小さく、外側部で大となった。サッケ-ドの方向は前頭眼野の吻側から尾側に行くに従って変化した。しばしば同じ方向が離れた場所で2度再現されていた。この為、前頭眼野内のかなり離れた部位で同様のサッケ-ドが生じることがあった。以上の結果に基づき、前頭眼野がサッケ-ドに果たす役割を考察した。前頭眼野は大脳皮質前頭葉にあり、弱い電気刺激でサッケード眼球運動を引きおこすことのできる部位である。マカクザルでは前頭眼野は弓状溝前部から溝前壁深部まで広がっている。本研究の目的は前壁深部を含めた前頭眼野全体でサッケード出力に関する機能的構成の有無を明らかにすることである。そのため本年度は、無麻酔の日本ザルを用い、脳表面に直角にすなわち弓状溝前壁部を溝と平行に横切るようにエルジロイ微小電極を穿入し、0.5ミリ毎に皮質内微小電気刺激を行い、生じるサッケードの振幅・方向・潜時・閾値等を調べた。目の動きの測定は我々が開発した角膜反射像を利用した眼球運動計測装置を用いて行った。脳内の正確な刺激位置を知るために、エルジロイ微小電極先端を電気分解によって溶かし脳組織に沈着させ、潅流固定液に加えたフェロシアン化カリによって沈着部位はを発色させ、脳組織切片上でそれを調べた。

このようにして弓状溝前壁を含む前頭眼野全体として次のようなサッケードに関する機能的構成の有ることが明らかとなった。1.-側の前頭眼野は上・反対・下側のいずれかに向かう振幅30度以内のサッケードを再現していた。2.前頭眼野内の近くの部位は似た方向・振幅のサッケードを再現していた。3.前頭眼野の前内側部は大きな振幅のサッケードを再現し、そこから後方および外側のいずれにゆく場合も再現されるサッケードの振幅は小となった。次年度は前頭眼野弓状溝前壁各部でサッケードに関する皮質の層的機能構成を調べる計画である。このため本年度に、電極穿入角度を自由に変えられるマイクロマニプレータを開発した。大脳皮質の前頭眼野を電気刺激するとサッケ-ド眼球運動が生じる。また、前頭眼野にはサッケ-ドに先立って活動するニュ-ロンがある。これらの事から、前頭眼野はサッケ-ド眼球運動を司る大脳皮質領域と考えられている。本研究の目的は、日本ザルを用い、前頭眼野の皮質内微小電気刺激によってサッケ-ドを生じさせ、前頭眼期におけるサッケ-ド眼球運動の性格な地図を作製することである。日本ザルの前頭眼野は、深さ5-8ミリもある弓状溝の前壁皮質に位置する。したがって、前壁深部の刺激部位を正確に再構築することは極めて難しい。この困難を克服するために、刺激部位のマ-キングが可能なエルジロイ微小電極を用い、実験を行った。昨年度は電極を弓状溝に沿って、即ち前壁皮質の層とほぼ平行に進め、0.5ミリごとに皮質内微小刺激を行い、前壁深部でマ-キングを行った。本年度は、皮質の層と垂直に近い方向から電極を進め、昨年度の結果を確かめるとともに、皮質層でのサッケ-ドの構成を調べた。結果は次の通りである。1.一側の前頭眼野の微小電気刺激で反対側に向かう成分を持つ振幅30度以下のサッケ-ドが生じた。2.刺激部位が前頭眼野の外側から内側に行くに従って生じるサッケ-ドの振幅は次第に大となった。3.前頭眼野の吻側から尾側に行くに従ってサッケ-ドの方向は地代に変化した。前頭眼野内の離れた2ヶ所の領域に同方向のサッケ-ドが再現されている場合もあった。4.皮質表面と垂直な深さにはほぼ同様の大きさ方向のサッケ-ドが再現されていた。