hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発生分化過程におけるｍｉｃｒｏＲＮＡシステムの動作原理と制御機構

本課題ではmiRNAによる抑制メカニズムをゼブラフィッシュというin vivoモデル系において統合的に理解することを目的とした。本年度は昨年度に確立したTALEN法を利用し、miRNA経路のエフェクタータンパク質であるTNRC6パラログのうちtnrc6b1のゼブラフィッシュ変異体の作成を試み、変異系統の樹立に成功した。tnrc6b1接合子ホモ変異個体は生存率や稔性に大きな異常は認められないが、母性ホモ/接合子ホモ変異胚(MZtnrc6b1変異胚)はMZtnrc6a変異胚と同様に発生の軽微な遅延とmiRNA活性の減少を示した。このことからtnrc6b1も初期発生においてmiRNA経路に貢献していることが強く示唆された。今後tnrc6a/tnrc6b1二重変異体の解析を行うことで、発生初期におけるtnrc6の寄与が明らかなると期待される。昨年度に作成したmiRNAによるmRNA分解に関わるcnot7とcnot8に対する高活性なTALENを用い、それぞれの遺伝子の変異系統を樹立した。cnot7変異体はホモ個体においても生存率、miRNA活性共に異常は観察されず、現在までに異常なく3世代継代できていることから、cnot7は個体の生存とmiRNA活性に必須ではないと考えられた。一方cnot8の接合子ホモ個体は胚発生期には異常は認められないが、受精後4日目(孵化後2日目)ごろに心臓や頭部の浮腫、浮袋の欠損が認められ、幼生期に致死となることが明らかとなった。これらの知見からcnot7/8の遺伝的変異体を用いたmiRNA機能の解析は技術的に困難であると判断し、miRNAによるポリA鎖の短縮に阻害的な効果を示すCNOT7の変異タンパク質を過剰発現させる実験を行った。その結果、miRNAによるポリA鎖の短縮はその後のmRNA分解に必ずしも必須ではない可能性が示唆された。25年度が最終年度であるため、記入しない。microRNA(以下miRNA)はmRNAに結合して翻訳抑制・mRNA分解・ポリA鎖短縮を引き起こす小型非コードRNAである。脊椎動物のゲノム中に存在する数百種類のmiRNA遺伝子は、タンパク質遺伝子の3050%を直接制御することで、時期・組織特異的な遺伝子発現に大きく寄与している。しかしmiRNAによる転写後抑制の分子メカニズムについての研究は生化学的な解析に留まっており、その生理的側面は明らかになっていない。またmiRNAシステム自身が受ける制御についての研究は緒に就いたばかりである。本課題では、生化学的手法を中心に解析されてきたmiRNAによる抑制メカニズムをゼブラフィッシュというin vivoモデル系において再展開し、その動作原理の統合的な理解を目指すことを目的として研究を進めている。本年度は、人工ヌクレアーゼTALENにより、miRNA経路のエフェクターとして機能すると考えられているTNRC6Aの遺伝子破壊を行った。その結果、TNRC6Aの接合子ホモ変異体は生存率、稔性、miRNA活性に大きな異常は見られないことがわかった。一方、母性ホモ/接合子ホモ変異胚(MZtnrc6a変異胚)は発生の軽微な遅延とmiRNA活性の減少が認められた。この結果はtnrc6が個体発生時にもmiRNA経路のエフェクターとして機能していることを支持すると同時に、tnrc6パラログ間で機能重複があることを意味している。そこで、他のパラログに対するTALENを作成し、tnrc6b1に関しては変異効率が50%を越える非常に活性の高いTALENを得ることができた。

また、miRNAによるRNA分解に関わることが報告されているcnot7、cnot8およびPAN2に対するTALENを作成し、cnot7とcnot8に関しては活性のあるTALENが得られた。本年度はTALENによるゼブラフィッシュ変異体の作成方法の確立に重点を置いて研究を進めた。その結果、当初予定していたtnrc6a遺伝子の変異体作成に成功し、研究開始後1年でTNRC6Aを欠いた胚においてmiRNAによる抑制活性を解析できる段階にまで到達することができた。また他の遺伝子を標的としたTALENも活性が高いものが複数得られていることから、ゼブラフィッシュにおいて遺伝的な変異体による逆遺伝学的アプローチを行う基盤は整ったと言える。初年度に本研究の中核となるゼブラフィッシュ変異体の作成技術をほぼ独力で確立できたことは、今後の研究を進める上で大きな進展であると評価できる。また作成したTNRC6A変異体の解析からは、培養細胞で報告されている「TNRC6はmiRNA経路のエフェクターである」という知見を個体レベルで支持する結果が得られた。このことから、主たる研究目的である「TNRC6の機能解明」が個体発生におけるmiRNA経路の理解に確かに貢献できる可能性が強く支持される。一方で、当初懸念されていたTNRC6パラログ間の機能重複が存在することも強く示唆された。この点に関しては、確立したTALEN法を用いて多重変異体を作成することで、次年度に対応が可能であると考える。当初予定していたmiRNA経路の自己制御機構については、本年度は予備的な実験を行うに留まった。しかしながら、初年度にTALENなどの技術的な基盤の開発に十分な投資を行ったことで、次年度以降に研究を加速することが可能であると見込んでいる。ゼブラフィッシュTNRC6パラログの多重変異体の作成と解析人工ヌクレアーゼTALENによりTNRC6Aの遺伝子破壊を行った結果、TNRC6Aの接合子ホモ変異体は生存率、稔性、miRNA活性に大きな異常は見られないことがわかった。一方、母性ホモ/接合子ホモ変異胚(MZtnrc6a変異胚)は発生の軽微な遅延とmiRNA活性の減少が認められた。この結果は、TNRC6Aの欠損だけではほかのTNRC6パラログが存在するためにmiRNA活性が完全には失われず、部分的な表現型に至っている可能性を示唆している。そこで本年度はTNRC6BとCの変異体の作成を行い、A、B、Cの多重変異体においてmiRNAの活性を検証する。同時に、変異胚の発生異常を解析し、TNRC6レベルの低下が個体発生にどのような影響を及ぼすのかを明らかにする。miRNAによる抑制現象に関わる因子の変異体の作成これまでのin vitroでの知見から、miRNAによる抑制が明らかになっている。そこで、ポリA鎖を短縮する2つの酵素(CNOT7、PAN2)のゼブラフィッシュ変異体を作成し、miRNAの活性に及ぼす影響を解析する。また、ポリA鎖の短縮酵素に酵素活性欠損変異を導入し、これを過剰発現させることでもポリA鎖短縮酵素のmiRNA経路における機能の評価を試みる。
カルシニューリンとIP3結合蛋白IRBITが及ぼす膵液重炭酸分泌の新制御機構

膵臓は重炭酸と消化酵素の分泌を司る臓器である。しかしその分泌機構が破綻すると、膵炎を発症し、重症化すると膵臓死のみなら多臓器不全を合併し、慢性化すると膵癌リスクまでも上昇することが知られている。我々は膵重炭酸分泌の複雑な調節機構に対しIP3受容体結合蛋白IRBITとcalcineurinに焦点を当てて研究を行った。その結果、ナトリウム重炭酸共輸送体NBCe1の活性化機構に、上記蛋白群がマスターレギュレーターとして作用しているのみならず、新たに見つかったリン酸化部位を介することも証明した。●ナトリウム重炭酸共輸送体NBCe1Bのアフリカツメカエル卵母細胞発現系を用いた機能解析驚くべきことに、CaMKは、NBCe1B+IRBITの共発現下において、抑制的に作用することが示された。更に、この抑制作用はCaMKのアフリカツメカエル卵母細胞へのRNA注入量に比例しておこることが示された。このことから、CaMKもまた新規regulatorとして重炭酸輸送に関与することが示唆された。●プルダウンアッセイ法を用いた蛋白相互作用の解析CalcineurinおよびCaMKについて、NBCe1B, IRBITとの相互作用があるかどうかをプルダウンアッセイ法を用いて検討した。NBCe1BのN末端部位にIRBITが結合することが知られているため、NBCe1BのN末端部位のみの変異体を作成し、結合部位を確認した。CalcineurinについてはNBCe1Bのアミノ酸96429番目、CaMKについてはアミノ酸195番目の部位により強く結合することが示唆された。重炭酸輸送において、Calcineurinと関連のある、新たなregulatorであるカルモジュリンキナーゼについて追加検討を加える必要が生じたため、アフリカツメカエル卵母細胞系を用いた機能解析について、当初想定されていたよりもより多くの実験検討を必要とすることになったため。また、現在カルモジュリンキナーゼを含むregulatorについて、当初共免疫沈降法を用いたが、想定された結果が得られず、蛋白相互作用をプルダウンアッセイ法により確認する必要に迫られた。そのため、実験計画の見直しが必要となった。【ナトリウム重炭酸共輸送体を制御するカルシニューリンの同定・機能解析】共免疫沈降法を用いてナトリウム重炭酸共輸送体とカルシニューリンの蛋白結合作用を確認した。その上で、パッチクランプ法およびアフリカツメカエル系卵母細胞測定系を用い機能解析を行った。カルシニューリンはナトリウム重炭酸共輸送体の活性化を促進することが認められた。そこで、細胞内塩素イオン濃度の変化により機能活性に影響が出るかを確かめたところ、細胞内高塩素イオン濃度の環境下で、ナトリウム重炭酸共輸送体の機能活性が著明に減弱する事を認めた。【ナトリウム重炭酸共輸送体の塩素イオン感知部位とカルシニューリンとの関係】そのためナトリウム重炭酸共輸送体における既知のリン酸化部位との関連、および塩素イオン感知部位motifとの関連、カルシニューリンの修飾蛋白との関連を調べることとした。カルシニューリンがナトリウム重炭酸共輸送体のアミノ酸12番目のセリンをリン酸化することで、アミノ酸194198番目の塩素イオン感知部位motifを制御することを、パッチクランプ法および共免疫沈降法で確認した。【新規リン酸化部位の発見とナトリウム重炭酸共輸送体の構造変化】この多段階にわたるカルシニューリンの制御により、ナトリウム重炭酸共輸送体のアミノ酸232,233,235番目のセリンが脱リン酸化され、ナトリウム重炭酸共輸送体の機能活性変化が起きることが分かった。アミノ酸232,233,235番目のセリンをアラニンに置換した変異体を用いることで、ナトリウム重炭酸共輸送体の機能活性が100%の完全活性型になったことから、同部位の脱リン酸化による立体構造の変化が起きたのではないかと想定した。【現時点での状況】現在上記データをScience Signaling誌に投稿、現在revise中である。現時点で得られている知見から想定される理論構築を強固なものとするため、アフリカツメカエル卵母細胞発現系における実験を推進する。また蛋白相互作用については、プルダウンアッセイ法により良好な結果が得られたため、同研究を継続することで、複雑に絡み合ったカルシウムシグナリングおよび重炭酸輸送の機能活性のメカニズムを解明していく。そのうえで、マウス使用も含めた実験を検討していきたいと考えている。生理学当初想定されていた研究に対し、アフリカツメカエル卵母細胞発現系機能解析実験およびプルダウンアッセイ法を用いた蛋白相互作用解析により注力して実験を行う必要に迫られた。そのため、アフリカツメカエル卵母細胞発現系機能解析実験に必要なRNA作成キット・およびプルダウンアッセイ法に関わるDNAプレップキット・細胞培養系を中心に使用することになり、相対的に次年度使用額が生じる原因となった。

当初の計画にもあったアフリカツメカエル卵母細胞発現系実験系・蛋白相互作用解析を行うのみならず、蛍光イメージング法をもちいたNBCe1Bの機能解析を行う事で、より理論構築を強固とする。また、in vitroの実験が終了したら、マウスを用いた実験についても検討を加える予定とする。そのため、既存のRNA作成キット・遺伝子導入に関わる物品のみならず、蛍光プローブやマウス飼育に関わる予算を計上する予定である。
大気中の二酸化窒素による植物バイタリゼーション原因遺伝子の共発現解析とその解明

大気中に含まれる二酸化窒素(NO2)による植物成長分化の促進=バイタリゼーションについて、原因遺伝子の一つであるVITA1および同遺伝子と協調的に発現する遺伝子についてシロイヌナズナを用いて研究した。第8葉の細胞動力学解析から、NO2処理は出葉期をNO2非処理区比で2日以上早めることが分かった。NO2は花成も促進するが、vita1変異体の解析からVITA1は花成阻害因子であることが分かった。タンパク質レベルの解析はVITA1の翻訳産物は2個存在することを示した。酵母ツーハイブリッド法は相互作用蛋白の存在を示唆した。マイクロアレイ解析は15個のVITA1共発現遺伝子の存在を示した。本研究の目的は、二酸化窒素(NO2)の植物成長促進作用(バイタリゼーション)について、原因遺伝子VITA1とその共発現遺伝子群の解析を通じたその全体像の解明である。本年度実施予定の計画は、(i)共発現遺伝子群の代謝マッピング、(ii)遺伝子のNO2応答の時系列解析および(iii)原因遺伝子候補の絞り込みである。(i)について、共発現する遺伝子は少なく、マッピングに至らなかった。(ii)の時系列解析は昨年度先行して実施した。以下(iii)を中心に報告する。昨年度絞り込まれた原因遺伝子候補のT-DNA挿入変異体について解析したが、VITA1に勝る遺伝子は見出されなかった。そこで、VITA1に絞ってさらに研究した。VITA1を破壊すると、バイタリゼーションは消失するので、VITA1はNO2のバイオマス生産促進作用の示現に必要な因子である。VITA1は、82アミノ酸残基からなるペプチドをコードする。VITA1:GFP融合タンパク質を発現させた植物から抽出したタンパク質の免疫学的解析から、VITA1は翻訳後修飾を受け、翻訳産物は2個存在することが分かった。各翻訳産物についてN末端アミノ酸配列解析を行った。他方、NO2は花成促進作用をもつことが新たに分かった。すなわち、NO2によるバイタリゼーションは、バイオマスの増加と花成の早期化からなることになる.この発見は重要である.一酸化窒素、ジベレリン、糖等など他種の環境シグナル刺激では、バイオマスの増加は花成の遅延化を伴う。また、VITA1を破壊すると、花成が促進されることが新たにわかり、VITA1は花成阻害因子であると推定される。故に、VITA1はNO2によるバイオマス生産と花成の両面に作用することが分かり、バイタリゼーション解明の重要な手がかりが得られた。本研究は、申請者の見出した二酸化窒素(NO2)の植物成長促進作用(バイタリゼーション)について、新規遺伝子VITA1の共発現遺伝子等について、代謝マップにマッピングして関連代謝経路を推定して、NO2の植物成長作用の全体像の解明を目指す。一般に遺伝子発現は、植物葉の成長段階、細胞の発達段階で変動するので、NO2効果の解析には、植物葉齢と細胞の発達段階との関係についての正確な把握が必須である。本年度はまず、50 ppb NO2を含む空気中(+NO2植物)、またはNO2を含まない空気中(-NO2植物)で栽培した野生株について詳細な成長解析を行った。+NO2植物および-NO2植物の第8葉の葉面積、細胞サイズ、細胞数について経時的(1735日齢)に解析した。その結果、+NO2植物では1721日齢が増殖期、2127日齢が細胞拡大期であった。-NO2植物では1723日齢が増殖期、2327日齢が細胞拡大期であった。23日齢までは葉面積、細胞サイズ、細胞数すべてが+NO2植物>-NO2植物であった。それ以降は、葉面積および細胞サイズは+NO2植物>-NO2植物であったが、細胞数は+NO2植物と-NO2植物でほぼ同じであった。VITA1遺伝子の発現量(mRNA蓄積量)は、増殖期(17ー21日齢)では-NO2植物、+NO2植物共に比較的強く発現しており、両者に有意差が観られなかった。しかし、細胞拡大期(23日齢以降)を通して、発現量は比較的安定で常に有意に+NO2植物>-NO2植物であった。+NO2植物では23日齢以降も高い発現量(23日齢以前の発現量に匹敵する)が維持されることが分かった。以上の結果から、VITA1はNO2で誘導される細胞拡大遺伝子またはその制御遺伝子であることが示唆された。本研究の目的は、大気中に含まれる二酸化窒素(NO2)によるバイオマス蓄積促進等植物成長促進作用(バイタリゼーション)の原因となる遺伝子と共発現する遺伝子群の解析を通じた同作用の分子機構の解明である。

まず、シロイヌナズナの第8葉について細胞動力学解析を実施し、NO2非処理区では播種後19-21、21-23および23-33日目にそれぞれ葉成長の第1、2および3 phaseにあることが分かった。また、NO2非処理区では全体に2日以上早くなることが初めてわかった。これまでの研究から明らかとなった原因遺伝子VITA1と共発現する遺伝子群について公開データベースを用いて調査した。しかし、共発現遺伝子の情報が少なく(VITA1は機能未知であるためと考えられる)、遺伝子を特定するには至らなかった。そこで、VITA1の遺伝子破壊株(vita1)と野生株について、NO2処理区および非処理区植物体について、マイクロアレイ解析した。その結果、vita1では概日リズム関連遺伝子の発現が野生株比で抑制されることが新たに分かった。また、これまでの研究からVITA1はバイオマス蓄積を促進するが花成は阻害する因子であることが分かっている。この結果から、VITA1タンパク質と相互作用する何らかの細胞内タンパク質の存在が予想された。すなわち、NO2処理によりVITA1タンパク質が増えバイオマス蓄積が促進されるが、同時にVITA1と相互作用する(花成阻害作用を抑える)細胞内タンパク質が増え、その結果花成が促進されると考えられる。そこで、最終年度においてVITA1と相互作用するタンパク質について酵母ツーハイブリッド法によりスクリーニングを行った。その結果,これまでに3つのポジティブなクローンが得られた。これらのクローンはバイタリゼーション作用分子機構の解明の有力な手がかりになると考えられる。植物分子生理学公開データベース上でのVITA1と共発現する遺伝子の情報は少なく、VITA1以外のバイタリゼーション制御遺伝子を特定するには至っていない。シロイヌナズナの属する草本植物におけるバイオマス生産は、主にとう(薹)立ち(花成)までの栄養成長期に限られている。そこで、NO2の花成に対する効果を調査し、その結果NO2は花成を早期化することが新たに見つかった。一般に、日長変化、低温処理、一酸化窒素、ジベレリン、糖等など他の環境シグナル刺激では、バイオマスの増加は遅咲き(花成の遅延)を伴う(逆に早咲きの場合はバイオマス減少を伴う)のが常であり、花成の早期化を伴うバイオマス増加現象は、NO2バイタリゼーションに固有の現象であることが新たに分かった。VITA1は、NO2に応答して発現レベルが増加し、バイタリゼーションにおけるバイオマスの増加に必要因子であることを既に報告したが、新たに、花成阻害(花成の遅延を促す)因子であることが分かった。すなわち、VITA1は、NO2に固有の花成の早期化を伴うバイオマス増加現象であるバイタリゼーションの鍵因子の一つであることが示唆され、その全体像解明の重要な手がかりが得られた。VITA1は、82アミノ酸残基からなるペプチドをコードする。VITA1:GFP融合タンパク質を発現させた形質転換植物から抽出したタンパク質をSDS PAGEで分離して抗GFP抗体を用いて解析した結果、抽出したタンパク質の免疫学的解析から、VITA1は翻訳後修飾を受け、翻訳産物は2個存在することが分かった。1個の翻訳産物についてアミノ酸配列を決定した.これら分子レベルでの情報は今後の機能解析の重要な手がかりが得られた。
デジタルレーダーデータを利用した実時間降雨・流量予測システムの関係

1.レーダー雨量計による豪雨の特性に関する研究-池淵・高棹らは,レーダーデータがどの程度降水構造やその変動特性を表現しうるかを把握するため,カラーグラフィックスを用いて, 3次元的なエコーの強度分布を直観的に表現する画像表示システムを開発した.これにより,複雑な豪雨の3次元的特性を比較的容易に把握できることとなった.さらに,エコー強度分布高層観測データ,地上風および地形との関係を定性的に検討した.友杉は,レーダー反射因子Zと雨量強度Rの関係を規定するパラメタB, βをレーダ基本データの時間的変動性の効果を導入しながら同定する手法を提示した.2.実時間降雨・流量予測に関する研究-椎葉は,降雨の実時間予測手法として,移流ベクトルを位置座標の1次式で設定する移流モデルによって,レーダーデータを逐次解析し,降雨強度の空間分布を予測する手法を開発した.また,洪水流通の実時間予測手法として,有色ノイズ項を導入した確率過程的状態空間型流出モデルに,共分散行列の修正コレスキー分解と統計的二次近似手法を組み合わせたフィルタリング・予測手法を開発した.宝・高棹は,カルマン・フィルタ理論を流量予測に適用する際には,非定常ノイズを考慮した状態推定法用いれば予測精度が良くなることを検証した.小尻は,千数千km^2の面積をもつ大きな流域での3時間先流量予測を対象とした実時間洪水予測システムを開発した.3.流水管理・予報への適用性に関する研究-高棹・宝は,レーダー雨量計データを雨量に換算する際に用いるレーダー定数B, βを,流域内の多数の地上雨量計データを利用して実時間において逐次補正しながら,より正確な面積雨量の推定,さらには洪水流量予測を行なうシステムを開発した.由良川流域を対象として実時間補正の方法をいくつか試み,それらの流水管理予報への適用可能性を検討した.1.レーダー雨量計による豪雨の特性に関する研究-池淵・高棹らは,レーダーデータがどの程度降水構造やその変動特性を表現しうるかを把握するため,カラーグラフィックスを用いて, 3次元的なエコーの強度分布を直観的に表現する画像表示システムを開発した.これにより,複雑な豪雨の3次元的特性を比較的容易に把握できることとなった.さらに,エコー強度分布高層観測データ,地上風および地形との関係を定性的に検討した.友杉は,レーダー反射因子Zと雨量強度Rの関係を規定するパラメタB, βをレーダ基本データの時間的変動性の効果を導入しながら同定する手法を提示した.2.実時間降雨・流量予測に関する研究-椎葉は,降雨の実時間予測手法として,移流ベクトルを位置座標の1次式で設定する移流モデルによって,レーダーデータを逐次解析し,降雨強度の空間分布を予測する手法を開発した.また,洪水流通の実時間予測手法として,有色ノイズ項を導入した確率過程的状態空間型流出モデルに,共分散行列の修正コレスキー分解と統計的二次近似手法を組み合わせたフィルタリング・予測手法を開発した.宝・高棹は,カルマン・フィルタ理論を流量予測に適用する際には,非定常ノイズを考慮した状態推定法用いれば予測精度が良くなることを検証した.小尻は,千数千km^2の面積をもつ大きな流域での3時間先流量予測を対象とした実時間洪水予測システムを開発した.3.流水管理・予報への適用性に関する研究-高棹・宝は,レーダー雨量計データを雨量に換算する際に用いるレーダー定数B, βを,流域内の多数の地上雨量計データを利用して実時間において逐次補正しながら,より正確な面積雨量の推定,さらには洪水流量予測を行なうシステムを開発した.由良川流域を対象として実時間補正の方法をいくつか試み,それらの流水管理予報への適用可能性を検討した.2か年にわたる本研究の前半である本年度は、以下のような研究を行なった。【1】デジタルレーダーデータを利用した降雨予測システムの開発(高棹・友杉・椎葉)--(a)既に得られているレーダー雨量計データを整理するとともに、現在稼動中のレーダー雨量計システムによるレーダー反射因子データを入手し、長方形メッシュごとの雨量値に変換してファイル化した。(b)タブレットを利用してレーダー観測範囲の地図を記憶し、地図上の雨量強度の分布を色分けしてディスプレイするプログラムを作成した。(c)上記(a)のデータを気象原因別に整理し、豪雨の変化パターンを調べた。また、地形とエコーの生成・発達・衰弱の関係を分析した。(d)移流モデルによる降雨予測モデルを整備し、適用例をふやすことによって、メッシュサイズ,補外に用いるデータの時間間隔,リードタイムと予測精度との関係を調査した。【2】降雨予測システムと洪水流出予測システムの一体化のためのソフトウェアの開発(高棹・椎葉・宝)--時間的空間的相関構造をもつ降雨の確率的予測情報を洪水流出予測システムに組み込む理論を提示した。また、洪水予測にカルマンフィルタ理論を適用する際のノイズ項・状態量の取り扱いについて線型時系列モデルを用いて検討し、非定常性を考慮することの重要性を示した。【3】流水管理・予報のための降雨予測のあり方(高棹・地淵・小尻)--流水管理・予報のために適切な降雨予測情報の形式を分析した。そのため、河川管理機関からヒアリングを行なうとともに、降雨・流量予測システムに関連する資料を収集した。これらの研究に際して、デジタルレーダーデータ・流量データを収集し、磁気テープに収録した。また、TSSターミナルを介して、実時間での降雨流量予測のシミュレーション・プログラムを作成した。
有限群の部分群束と素数グラフ

有限群Gの位数を割りきる素数の集合をπとする。πの部分集合π1とπ2に対し,"πi" -正則元の集まりをG_iとする。GのG_i上の類関数全体のなす代数をR_i (G),Gの類関数全体のなす代数をR(G)とおく。R_i (G)は|π_i |=1の場合のπ_i-Brauer指標環の類似である。部分群束・素数グラフの視点から二つの代数R_i (G) (i=1,2)の関係を明らかにすることが本研究の主たる目的である。有限群Gの部分群束L(G)をクイバーとみなしその表現としてGの部分群HにR_i (H)(またはR(G))を対応させ,定義域の制限写像を矢と考える。注目する点として,各R_i (H)から単位元(または、正則表現の制限,この場合は誘導写像で矢を定義する)を対応させることにより自然に部分群束L(G)を復元させることができる事実がある。前年度までの研究の成果として,クイバーL(G)を用いてR_i (G) (i=1,2)間の関係を明らかにする写像及びそれらを用いてCartan行列の一般化した行列の概念を得ている。上記の理由によりこの一般化されたCartan行列の研究により, π_i-"部分群束" L_(π_i ) (G)(i=1,2)の構造の関係解明が期待できる。有限群論では、p-部分群束とp'-部分群束との関係を調べることはSignalizer functorなどの様に伝統的な重要な問題である。よってこの方面での応用も期待できると考えている。2018年度の研究においては,前年度までの研究成果の整理・精密化を行うとともに|π_i |=1 (i=1,2)の場合について,すなわちp-Brauer指標環とq-Brauer指標環の間の一般化Cartan行列の基本的な観察を行った。この観察によって一般化Cartan行列の行列成分についていくつかの性質を見出すことができたが、これについて次年度の研究期間にまとめ公表する予定である。主たる目標である異なる標数における有限群の表現を比較する方法(一般化されたCartan行列)を具体的に見出すことができ,実際に具体例を計算することができている。またその計算を観察することによりその行列の一般的な性質を見つけることができている。これらは,十分な成果と思われる。これまでの研究を踏まえると、2素数がどの素数グラフの連結成分に属するかによってこれらの標数による表現の異なり具合が変わってくることが予想できる。このことについて調べることを目標に,クイバの表現の整理、前年度までの成果を整理するとともに,考察を進めていきたい。素数グラフは、有限群のべき零部分群束あるいは可換部分群束と密接に関係があり、可換性という視点から部分群の「まじりあい」を簡潔に表している。有限単純群の分類完成後に急速に研究が進んでいる。一方、部分群束の研究は、ティッツの理論に関連して一つの素数p(主に2,3)に焦点をしぼり研究が進められてきた。このほぼ独立に発展してきた2つの理論を有機的に結び付け、群の構造を深く解明することが本研究の目的である。具体的課題としては、素数p_1,p_2,...に対し各p_i-部分群束の関係を明らかにすること、べき零π-部分群束の構造を調べること、べき零π-部分群束の構造とモジュラー表現の関係を調べること、等である。本研究開始前までに、以上の研究を進める上で重要であろうと考えられるL_π-部分群の概念を見出し、その基本的な性質の研究を進めていた。次に挙げる2点が、2016年度における成果である。1.前年度に完成を見た対称群のL_π-部分群の分類アルゴリズムを基に一般線形群GL_n (q)のL_π-部分群の分類アルゴリズムを見出した。このアルゴリズムは、対称群の場合と同様に非常に明快であり、GL_n (q)のL_π-部分群の分類が実行可能であることを示している。2. Gを有限群とする。共通部分のない素数からなる集合π_1,π_2に対し,L_{π_1\cup π_2}(G)-L_{π_2}(G)とL_{π_1}(G)がホモトピー同値であることを見出した。またπ-部分群束のレベルでも同様の事実が成立することも検証した。またπ-部分群束の部分束gluing (π_1,π_2)-ポセットなる概念を見出すことができた。このことよりL_{π_1\cup π_2}(G)-L_{π_2}(G)のホモロジー群をL_{π_1}(G)とL_{π_2}(G)のホモロジー群に分解できることを示した。研究実績の概要に述べたように、2016年度においては十分な研究結果を得た。この成果は、本研究2016年度に得られると予定していた結果以上のものであると考えられる。有限群の構造を部分群束を用いて解明する際、部分群束を単体的複体と考えホモロジー群等を用いて幾何学的にアプローチする手法は、極めて有効である。

また、先行する研究において有限群の部分群束をクイバと考え、その表現として各部分群に対しその指標環を対応させることは、部分群複体のホモロジー群の計算をこのシステム上で実現できる等、有効であることを見出している。本年度の研究において、有限群の部分群束の構造を解明するために群指標をさらに有効に利用するための基礎理論の構築を図った。まず、有限群Gの部分群HにおいてX^n=1という基本的な方程式の解集合L_n (H)を考え、H,nを走らせて得られる(含有関係による)半順序集合Tを導入した。そして、クイバTに対し、各L_n (H)において指標環Z[Irr(H)]を制限して得られるMap(L_n (H),C)の部分環B_n (H)らを対応させるクイバの表現考え、B_n (H)達の間に誘導写像等を導入しFrobeniusの相互率の類似等が成り立つなどを示した。このことより群の構造について具体的に計算できる状況を構築した。例えば、この理論より標数の異なるmodular指標同士の比較が可能となった。分解行列を一般化し、既約Brauer p-指標と既約Brauer q-指標間の分解行列を得ている。そしてこの一般化行列より定義されるCartan行列などである。また、これらを基により一般化した理論の構築を進めた。研究概要に述べた通り、十分な結果を得た。また、本研究をより充実させるための状況整備(重要な課題、例えばQuillen予想へのアプローチ)なども進展している。有限群Gの位数を割りきる素数の集合をπとする。πの部分集合π1とπ2に対し,"πi" -正則元の集まりをG_iとする。GのG_i上の類関数全体のなす代数をR_i (G),Gの類関数全体のなす代数をR(G)とおく。R_i (G)は|π_i |=1の場合のπ_i-Brauer指標環の類似である。部分群束・素数グラフの視点から二つの代数R_i (G) (i=1,2)の関係を明らかにすることが本研究の主たる目的である。有限群Gの部分群束L(G)をクイバーとみなしその表現としてGの部分群HにR_i (H)(またはR(G))を対応させ,定義域の制限写像を矢と考える。注目する点として,各R_i (H)から単位元(または、正則表現の制限,この場合は誘導写像で矢を定義する)を対応させることにより自然に部分群束L(G)を復元させることができる事実がある。前年度までの研究の成果として,クイバーL(G)を用いてR_i (G) (i=1,2)間の関係を明らかにする写像及びそれらを用いてCartan行列の一般化した行列の概念を得ている。上記の理由によりこの一般化されたCartan行列の研究により, π_i-"部分群束" L_(π_i ) (G)(i=1,2)の構造の関係解明が期待できる。有限群論では、p-部分群束とp'-部分群束との関係を調べることはSignalizer functorなどの様に伝統的な重要な問題である。よってこの方面での応用も期待できると考えている。2018年度の研究においては,前年度までの研究成果の整理・精密化を行うとともに|π_i |=1 (i=1,2)の場合について,すなわちp-Brauer指標環とq-Brauer指標環の間の一般化Cartan行列の基本的な観察を行った。この観察によって一般化Cartan行列の行列成分についていくつかの性質を見出すことができたが、これについて次年度の研究期間にまとめ公表する予定である。主たる目標である異なる標数における有限群の表現を比較する方法(一般化されたCartan行列)を具体的に見出すことができ,実際に具体例を計算することができている。またその計算を観察することによりその行列の一般的な性質を見つけることができている。これらは,十分な成果と思われる。
ＤＮＡメチル化からみた胸腺腫瘍の新規腫瘍関連遺伝子の検索

本研究は胸腺上皮性腫瘍B3胸腺腫と胸腺癌の47万のCpGサイトのDNAメチル化を網羅的に解析し、特異的なメチル化CpGサイトを同定し、B3と胸腺癌のepigeneticな違いを明らかにするとともに、胸腺上皮性腫瘍の発癌過程に関わるメチル化遺伝子を同定することを目的としている。B3胸腺腫が8例、胸腺癌(扁平上皮癌)8例、神経内分泌腫瘍(NET)3例の計19例のDNA/RNAを手術標本から抽出した。Bisulfite処理を行い、infiniummethylation assayをおこなった。統計処理を行うと、RASSF1遺伝子はNETにおいて有意にDNAメチル化が胸腺癌・胸腺腫に比較して高度であった。それぞれのDNAメチル化はNET70.9±4.9%、胸腺癌22.2±20.0%、B3胸腺腫14.3±12.3%であった。(NET vs Cancer/B3 t-test:P<0.00001)。pyrosequence法でもvalidationを行い、NETでは24.0±13.1%、扁平上皮癌では3.0±0.5%、B3胸腺腫では3.0±0.9%とmethylation assayと同様の結果であった。Real time RT-PCRでmRNAの発現を確認したところ、正常胸腺との比率ではNETは0.48±0.31、胸腺扁平上皮癌は1.02±0.82、B3胸腺腫では2.13±2.93であった。( NET vs Carcinoma/B3 t-test:P=0.16)と有意差はでなかったもののmRNAの発現は低下傾向にあった。免疫染色でRASSF1の蛋白発現抑制率を検討すると、NETでは66%、扁平上皮癌では50%、B3胸腺腫では14%であり、RASSF1の蛋白発現が抑制されていた。胸腺神経内分泌腫瘍において、癌抑制遺伝子であるRASSF1のDNAメチル化は特異的な変化であると考えられる。
匂い位置検出ニューロンの活動動態の解明

匂いが嗅感覚器のどこに当たっているのかを検出する神経基盤について解剖学、生理学的手法を用いて精査した。その結果、1)ゴキブリの嗅覚求心繊維は触角内の細胞の位置に応じて糸球体中で組織化されているが、この組織化は幼虫期を通じて徐々に発達する、2)介在ニューロンの中には触角の特定領域の匂い刺激にのみ感受性を持つものがある、3)メスにも性フェロモンを特異的に処理する糸球体が存在するが、求心繊維の組織化の程度はオスよりも低く、出力するニューロン数も少ないことが明らかとなった。匂いの質の符号化様式についての飛躍的な情報の蓄積とは対照的に、動物が匂いの位置や方向をどのように符号化しているのかについての研究は極めて少ない。本研究では長い触角を持ち、積極的な匂い源定位行動を行う昆虫(ゴキブリ)を用い、介在ニューロンからの細胞内記録・染色法と組織学的手法を組み合わせることで位置依存的な匂い応答を示すニューロンの活動動態とその形態学的特徴を明らかにすることを目的とする。平成20年度においては当初の計画通り、匂いの位置検出に寄与する嗅覚介在ニューロンの網羅的同定に力点をおいた。ルシファーイエローを充填した微小電極を前大脳側葉に刺入し、触角葉(一次嗅覚中枢)中に樹状突起を持ち、軸索を脳高次ニューロパイルに伸ばす嗅覚介在ニューロン(投射ニューロン)からの細胞内記録を行いつつ、触角への局所匂い刺激を行った。その結果、触角の特定領域に受容野を持つものを数多く同定することに成功した。さらに触角神経に別の蛍光色素を注入することで、介在ニューロンの樹状突起と求心性繊維の軸索終末との位置関係を共焦点レーザー顕微鏡にて精査したところ、嗅感覚細胞の位置依存性投射マップと良い対応関係を持つことを明らかにした。形態学的に同定されたニューロンの中にはその全像が不明であった性フェロモン処理に特化した投射ニューロンも含まれる。さらに、完全変態昆虫(ミツバチ)においても嗅受容細胞が触角内の細胞体の位置に応じた組織化が存在することを発見し、これを国際誌に発表した(現在印刷中)。さらに世界に先駆けて、昆虫の一次嗅覚中枢の中に匂いの位置情報を表現しうる神経基盤が存在することを、日本の神経工学系の書籍の一節にて発表した。以上、本研究プロジェクトのアウトリーチ活動、実験の進捗状況ともに順調で、計画達成率は概ね90%と総括したい。昆虫の匂い源定位能力の高さがファーブル昆虫記で紹介され、すでに一世紀が経った。しかし、動物が時々刻々と変化する匂いの位置や方向をどのように符号化しているのかについては不明な点が多い。本研究では、視覚手がかりのない環境で正確な匂い源定位行動を行うゴキブリを用い、位置依存的な匂い応答を示す介在ニューロン(投射ニューロン)の活動動態とその形態学的特徴を明らかにすることを目的とする。平成21年度は介在ニューロンの生理学的同定に加え、嗅覚求心繊維と投射ニューロン群の軸索の束をそれぞれ異なる色素で標識することにより、個々の糸球体に樹状突起を伸ばす投射ニューロンの数を明らかにすることに成功した。通常の匂いを処理する常糸球体は1個の投射ニューロンの支配を受けるのに対し、性フェロモンを処理する糸球体は1個の大きな投射ニューロンと複数の小さな投射ニューロンの支配を受けていた。前者は触角全域に受容野を持つタイプ、後者は触角の一部に受容野を持つタイプと対応した。さらに、嗅覚求心繊維にみられる位置依存的組織化の発生学的背景を明らかにするために、1齢終齢幼虫の触角神経に色素注入することで糸球体への投射パターンを明らかにした。その結果、性フェロモン処理に寄与する大糸球複合体にみられる位置依存的組織化は高齢幼虫ほどより顕著になること、性フェロモンの出し手である雌にも大糸球複合体の相同糸球体があり、そこにも弱い位置依存的組織化が観察されることを明らかにした。さらに、アリの触角の嗅覚、温・湿度感覚子には形態学的タイプごとの偏在がみられ、これが位置依存的投射パターンを生じる一因となっていることを明らかにした。これらの研究は5本の原著論文、12の学会発表として結実した。以上、本研究のアウトリーチ活動、実験の進捗状況はともに順調で、計画達成率は95%と総括したい。視覚的手がかりの乏しい夜間に活動する動物は、しばしば匂いによるコミュニケーションを発達させている。昆虫がわずかな性フェロモンを触角で探り当てながら遠方の交尾相手に定位する能力はファーブルをも驚嘆させてきた。本研究では、長い触角を持ち、正確な匂い源定位能力をもつゴキブリをモデル動物として、匂いの位置検出に寄与する介在ニューロンの活動動態とその形態学的特徴を明らかにすることを目的とする。

平成22年度は研究の最終年度にあたり、データの解析と論文化に取り組んだ。オスの触角葉にはメスから放出されたフェロモンを特異的に処理するための大きな嗅覚糸球体が存在する。この糸球体から出力する介在ニューロンには触角全域に受容野を持つ1本の大きなニューロンと触角の異なる領域に受容野を持つ67本の小さなニューロンがあることをつきとめた。さらに、細胞内記録・染色により、3本の小さなニューロンの形態学的・生理学的同定に成功した。また、性フェロモンの出し手であるメスにおいては、オスの性フェロモン処理糸球体と相同領域に小さな糸球体が存在するが、そこから出力する介在ニューロンが性フェロモン特異的な興奮性応答を示すことを明らかにした。本成果はプレスリリースされ、地方新聞でも紹介された。また、ゴキブリの雌雄の全嗅覚糸球体の形態学的同定に成功した。比較研究からは昆虫の脳内のフェロモン情報処理領域が良く保存されていることも明らかになった。以上の研究成果は5本の原著論文として国際誌に発表した。匂いの位置を符号化する単一ニューロンの活動動態を解明することができ、当初目標は概ね達成したといえる。一方、触角運動と嗅覚介在ニューロンの活動の相関については技術的困難のため、十分な解析ができなかった。よって、計画の達成度は80%と総括したい。
肝細胞機能を有するヒト肝前駆細胞株の樹立

継代培養可能な肝幹細胞株の樹立を試みた。成熟ラット肝臓から分離培養した小型肝細胞コロニーからCD44抗体を用いて分離したCD44陽性小型肝細胞をMatrigel上で培養すると増殖しコロニー形成する細胞が出現し、その細胞は4回以上継代可能で4ヵ月以上増殖し続けた。細胞はAlbumin, HNF4αを発現し、形態的にも機能的にも肝細胞としての特徴を維持していた。Retrorsine/PH処置マウスへ移植すると肝細胞として生着する。またマウス小型肝細胞株の樹立に成功した。今後は、ラット・マウスで用いた方法を応用してヒト肝幹細胞の樹立を目指し、臨床応用に繋げたい。成熟ラット肝臓に存在する肝前駆細胞である小型肝細胞を分離培養し、小型肝細胞の大元の幹細胞を見出し、クローン化する手法の開発を行っている。小型肝細胞の特異的マーカーであるCD44に対する抗体を用いて小型肝細胞をソーティングし、2代目を細胞外基質をコートした培養皿で無血清培養を行った。小型肝細胞が特異的に増殖する細胞外基質を特定することができ、その基質上で小型肝細胞は4週間培養すると約3倍に増えることを見出した。増殖する細胞は肝細胞としての形態を維持し、albuminやHNF4alphaを発現している。肝細胞の特徴を維持しながら増殖する細胞であることを確認している。4週間目に細胞を分離し、3代目を同様に培養しても増殖を継続し、4週間で約2.5倍増加することを確認した。それらの細胞は肝細胞としての機能を維持し、Matrigel投与により、分化誘導可能でC/EBPalphaやCYPを発現するようになる。また、毛細胆管を形成し、Fluorescence Diacetateを投与するとFluorescenceを分泌できることを確認している。現在の所、同様の手法により、肝細胞の特徴を維持した細胞を5代目まで継代培養可能であることを確認している。これまでの研究成果により、肝細胞中にin vitroで50回以上分裂可能な細胞が存在していることが分かった。その細胞は、Matrigelに含まれる特定の細胞外基質に依存して増殖維持されることが分かった。特許化を目指しているので現時点では成果の詳細な公表を控えることとする。前年度に引き続き、継代培養可能なCD44陽性小型肝細胞(CD44-SHs)の特性について解析を行った。継代可能な肝細胞はMatrigel依存性で、増殖能は継代毎に低下したが、4ヵ月以上増殖し、理論上50回以上分裂可能な細胞が相当数存在していることが分かった。CD44でソートし生着した肝細胞は、3代の継代により3.17倍増殖した。継代培養したSHsは全てCD44陽性であり、albumin, HNF4alpha等の肝細胞マーカーを発現していた。肝細胞特異的蛋白や遺伝子発現は5代継代しても維持されていた。超微形態学的にもrERやミトコンドリアなどの細胞内小器官が豊富に存在し、グリコーゲン顆粒も見られた。またMatrigelの重層によりCD44-SHsは成熟化し、毛細胆管を形成した。Fluorescein diacetate投与によるFluoresceinの毛細胆管への分泌を確認した。またCYP3A活性が誘導された。Matrigel依存性にCD44-SHsが接着し増殖することから、Matrigelを構成するいずれの基質がCD44-SHsのself-renewalに関与しているか検討したところ、Laminin111が重要であった。Laminin111上でCD44-SHsは、肝細胞としての特徴を維持しながら増殖し、5継代しても増殖能の低下は少なかった。加えて増殖するCD44-SHsは、90%以上diploidの単核細胞であった。またCD44-SHsの胆管上皮細胞への分化誘導を試みたが、胆管上皮細胞には誘導できなかった。これらの結果からCD44-SHsは、肝細胞への分化がコミットされた肝前駆細胞と考えられる。我々は、本研究によりラット成熟肝細胞中に継代培養可能な細胞が存在することを示した。今後、本手法をヒトに応用することにより、継代培養可能なヒト肝前駆細胞株の樹立を目指す。計画した研究のかなりの部分を達成しつつある。小型肝細胞の大元となる幹細胞と推定可能な細胞を見出すことができた。現在、特許出願に向けて研究を進めている段階である。実験病理学来年度は、継代培養可能な小型肝細胞の特性を詳細に検討し、stemnessの維持機構を明らかにすることと、肝細胞への分化機序、in vivoでの肝細胞分化をモデルラット・マウスへの移植により明らかにしたいと考えている。また、同細胞が2分化性を持つ幹細胞か否かを検討するために胆管上皮細胞への分化能についても検討する。

加えて、ヒト正常肝臓から分離した細胞から継代可能な小型肝細胞を分離する手法を引き続き検討する。ラットにおいて肝細胞機能を有する肝幹細胞をクローン化することができれば、ヒト肝由来細胞においても実現も可能になると思われる。他の研究費で購入し目的に従って使用したが、使われずに余った細胞や試薬などを再利用することができたので、予定していた実験の一部は、本経費を使用することなく行うことができた。また、予備実験を多数行う必要があると思っていたが、予想以上に成果が順調に出たため、予定より少額で所定の成果を得ることができた。増殖する肝幹・前駆細胞の分子生物学的な解析や染色体解析も行うことにより、不死化や癌化の有無の検討を詳細に行うこと、また肝臓に移植することで病的肝臓の治療に使うことが可能か否かを検討するための動物実験に使用する予定である。
環境行政と市民の権利保護－大規模事業における多段階行政過程の検討を中心に－

平成27年度はまず、平成26年度に行ったドイツでの研究滞在で得た知見をもとに、『ドイツにおける空港周辺の飛行経路決定と航空騒音防止』と題する論文を執筆した。同論文は、空港整備事業に際して飛行経路(離着陸経路)が決定されるに当たり、航空騒音の影響を被る周辺住民の権利・利害がどのように行政過程へ取り込まれ、考慮されるべきかについて、先行する事業許可の段階における決定内容との関連性を念頭に述べたものである。飛行経路決定をめぐる議論は、昨今の裁判例を受けて今なお進行中であるところ、平成27年9月7日から15日までのコンスタンツ大学(ドイツ)での滞在中には、これについても引き続き情報収集を行った。空港整備事業の許可決定と同様に、上述の飛行経路決定も計画決定の性質を(も)有する。わが国の行政計画については、平成27年4月24日の行政判例研究会における口頭での報告をもとに、『廃掃法に基づく浄化槽汚泥の収集運搬業の許可申請に対する町長の不許可処分が一般廃棄物処理計画との適合性を審査していない等の違法により取り消された事例』と題する判例評釈を執筆した。そして平成27年度の最後には、これまでの研究成果の集大成として、『大規模事業における計画手法と環境保護ードイツの国土整備計画を素材としてー』と題する博士論文を執筆した。同論文は、主にドイツの国土整備計画をめぐる昨今の議論から、大規模事業の多段階行政過程におけるその役割について考察するものである。そこでは、空港整備事業や、直近ではエネルギー関連事業の事例から、とりわけ環境保護を含む諸利害を調整するための場として、この種の計画手法が今後益々重要性を増すであろうことを示した。同論文をより精緻化しつつ研究を発展させるため、平成28年3月10日から23日までコンスタンツ大学に滞在して資料収集を行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度は、4月から9月まで、コンスタンツ大学(ドイツ)にて資料収集を行った。その間、定期的に開催される判例検討会にも足を運び、行政法・環境法を含む公法領域の最新判例に関する知見を得た。滞在中から帰国後にかけて、これまでの研究の集大成となる論文を執筆し、平成27年3月にコンスタンツ大学へ提出した。同論文ではまず、今までの研究で明らかとなった多段階行政過程における課題、即ち計画の適法性確保の観点から、各計画段階に求められる衡量の内容・質を明確にしておくことの必要性を踏まえつつ、ドイツの空港整備事業に関する許可決定に際して、航空騒音の影響を被る周辺住民の権利・利益が市民参加手続を通じてどのように行政過程へ取り込まれ、考慮されるべきかについて述べた。その上で、違法な許可決定の取消しを求める周辺住民に対して、権利・利益侵害の様々な態様に応じて、裁判所がどのような救済可能性を与えているかについて論じた。更に、大規模事業の周辺住民の生活環境利害を巡る日本の法状況について著名な裁判例を挙げつつ言及し、ドイツ法との比較も盛り込んだ。平成27年2月24日から3月19日まで、上記論文を提出し、評価を得る目的でコンスタンツ大学に滞在するとともに、シュパイヤー行政大学院で開催された計画法学会へも参加し、ドイツにおける空港整備事業に関する事案で、近年、飛行方式の決定に伴う航空騒音の影響と市民の権利・利益保護の在り方を問う裁判例が蓄積していること等、最新の知見を得た。ドイツにおいて飛行方式の決定は、計画決定の性質を持つことが明らかになっているが、その適法性要件や裁判所の審査方法については未だ議論が多い。これについて、日本における研究はまだない。

ドイツでの資料収集は滞りなく進行し、現地の研究指導体制も充分に機能した。これまでの研究成果は論文の形式でコンスタンツ大学に提出されたが、更に精緻化され、わが国でも近いうちに公表されなければならない。従前、研究の大きな柱の一つとして、エネルギー関連の施設設置事業を巡る多段階行政過程の検討を予定していたが、研究の進行を経て、引き続き空港整備事業を中心に据え、エネルギー関連施設設置事業は必要な範囲内で簡潔に扱うこととした。立地決定から許可決定へという一連の過程を超え、立法上は分離した手続構造がとられているが、事業に関連性を有する行政決定にも着目する。それにより、一つの大規模事業をより多面的に、かつ一貫性をもって検討することが可能となるからである。研究課題の枠内におけるそうした若干の方向転換はあったものの、研究はおおむね順調に進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。ドイツでの研究滞在で得た知見等をこれまでの研究に取り入れつつ、ドイツのみならず、日本でもその成果を公表できるよう、準備を始めている。研究会への参加等を通じて、ドイツ法のみならず日本法の動向も観察し、行政計画に関連する判例評釈の公表も予定している。今後は更に、空港整備事業に伴うことの多い、空港周辺上空での飛行方式の決定過程について、論文を公表したいと考えている。飛行方式の決定自体は、周辺の航空騒音を大きく左右することから、既に研究を行った空港の立地決定と同様に、総合的観点から様々な対立利害を調整することが必要な一計画決定であるとされる。それが空港整備事業の許可決定過程と立法上・実務上どのような関係にあるかを明らかにした上で、周辺住民の権利保護の充実に不可欠ないくつかの課題を分析する。分析の観点として、例えば、環境影響評価手続・市民参加手続や、事業の許可決定との関係で求められる衡量内容の在り方等を考えている。