hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪由来幹細胞の治療効果増強のためのホーミング機序解明と制御

Hx+IR群はSham群(開腹のみ)と比較して肝内SDF-1発現(免疫染色)の増強とともに、CXCR4 mRNA発現が有意に上昇していた。SDF-1発現細胞は術後6時間では肝実質細胞と非実質細胞が同等であったが、術後24時間後には非実質細胞に有意にシフトしており、肝内にhomingしたADRCがでCXCR4(接着因子)を発現するとともに、肝再生過程におけるHomingターゲット細胞の変化が示唆された。しかしながらstreptozotocin(STZ)による糖尿病モデルマウスにSTZ投与5日後、ADRC(1.0×105 cells)を経静脈的に投与しても、傷害膵ではなく肝内にADRCの強い集積を認めた。さらに傷害膵にSDF-1局所投与によっても同様の結果であった。このことは、SDF-1/CXCR4 axisの肝特異的homing機構によるものが示唆された。消化器外科(理由)幹細胞の肝保護効果をin vivo致死モデルにおいても確認するとともに、傷害肝へのhoming効果も確認した。さらにHoming効果を左右するSDF-1/CXCR4 axisの関与とともに肝再生過程におけるSDF-1発現細胞の変化を同定した。このことは肝再生過程における様々な構成細胞の増殖スピードの違いを反映しており、ADRCは必要に応じて分化形態を変化させていく可能性がある。今後はこれらの遺伝子発現を中心に制御の可能性を検討するとともに、他因子の関与についても包括的遺伝子解析を用いて探索する予定である。(理由)幹細胞の肝保護効果をin vitro、in vivoともに確認するとともに、傷害肝(本研究では肝切除モデル)へのhoming効果も確認できた。さらにin vitroにおけるtrophic effectについても確認し、contact(-)共培養におけるADRCの肝細胞保護効果がVEGFが深く関与しているとともに、in vivoにおいてもhoming効果を左右するSDF-1/CXCR4 axisの関与についても確認できた。今後の推進方策:制御因子増強・阻害によるhoming effectに最も効果的な遺伝子を包括的遺伝子解析により同定する。それらの発現についてvalidityを行うとともに、阻害剤・誘導剤によるhoming効果の影響についても解析を行う。これら一連の検討によりADSCのhomingeffect制御機構の解明とともに治療効果向上のためのhoming増強が期待できる。次年度の研究費の使用計画:上記結果に加えて、今後は包括的遺伝子解析を加え、さらなる制御因子の同定とともに、それらの制御の可能性について、さらに検討を推進していく予定である。それらの発現についてvalidityをin vitro、in vivoにおいて行い、さらなる制御因子を同定する。
内視鏡治療への応用を目的とした凍結加温手術と熱的障害に関する研究

本研究では、悪性腫瘍に対する新たな低侵襲療法として凍結加温手術を提案し、凍結加温手術を実施可能な凍結加温手術装置を作製すること及び凍結加温手術の組織破壊性を明らかにすることを目的とした。凍結加温手術装置は、手術用プローブと冷媒循環装置、温調機能を有する電源を用いて作製され、性能評価実験において、手術用プローブ温度はー40°Cから45°Cの温度範囲で自動的に制御された。また、動物実験後の標本観察では、染色標本に壊死が観察され、凍結加温手術を実施できる可能性が示唆された。本年度では、研究計画に従い凍結手術と温熱療法の併用療法である凍結加温手術が施行可能な凍結加温手術装置の作製と無負荷条件での性能評価実験を行った。凍結加温手術装置の作製では、まずペルチェ素子用の温度制御機能付きの電源を選定し、実際に運転させることで凍結加温手術が実施できる可能性を確認した。次に、市販のアルミニウムボックスを、スターリングクーラ(SC)の先端冷却部に装着できるように機械加工した上で、熱伝導性接着剤を用いて先端冷却部に固定することで、冷媒の冷却が可能な冷媒チャンバを作製した。手術用プローブの作製では、銅製の丸棒材をカップ状に機械加工し、カップ底面にヒートシンクを取り付けると共に、カップ裏面にはペルチェ素子を熱伝導性接着剤で固定することで手術用プローブを作製した。最後に手術用プローブと冷媒チャンバをペリスタティックポンプ用のチューブで接続し、ペリスタティックポンプで冷媒を循環させる構造にすることによって凍結加温手術装置を作製した。本凍結加温手術装置の性能を評価するため、まず無負荷条件で稼働させた際の最低到達温度を調べた。冷媒には、ー60°C以下でも流動性が得られるエタノールを用いて実験を行った。実験では、T型熱電対とデータロガーを用いて装置稼働中の各地点における温度(手術用プローブ、SCの先端冷却部、エタノール冷媒、室温)を計測した。温度測定の結果、手術用プローブ温度はー45.3°Cまで低下し、凍結手術に要求されるー20°C以下になることを確認した。また、無負荷条件での温度サイクル評価試験の結果では、予め設定した凍結手術と温熱療法の温度帯でプローブ温度が固定され、複数回の凍結と加温過程が連続的に実現できることを確認した。しかし、冷媒のエタノール温度が経時的に上昇していたため、本装置に断熱材を装着し再評価したところ、エタノール温度の上昇が抑制された結果が得られた。本研究では、悪性腫瘍に対する組織破壊性を向上させるため、凍結手術と温熱療法を併用実施可能な凍結加温手術装置を開発し、本手術法の組織破壊効果を調べることを目的とした。平成26年度では、電気的に温度制御が可能なペルチェ素子を用いて手術用プローブを作製した。スターリングクーラ(SC)を用いて作製した冷媒循環装置とプローブをチューブで接続することで凍結加温手術装置を開発した。無負荷条件による冷媒にエタノールを用いた手術装置の性能評価実験では、プローブの最低温度は-45.3°Cに達したものの経時的な温度上昇が観測された。そこで断熱材を冷媒循環回路に装着した結果、温度上昇は緩やかになったが、温度上昇は継続したことから冷媒冷却能力及び断熱能力の向上が必要であることが明らかとなった。そこで、平成27年度ではプローブの最低温度の低下と冷媒の温度上昇を抑制する目的で、冷媒循環回路内に1台のSCを追加で設置し、また手術装置に断熱材を更に装着した。改良型の凍結手術装置の評価を平成26年度と同様に行った結果、プローブ温度は最低で-69.4°Cまで達し、その後の経時的な温度上昇は毎分0.1°C程度となりほぼ抑制することができた。他方、冷凍と加温を繰り返すサイクル試験において、プローブ温度が設定温度である-40°Cと+45°Cに自動的に3回繰返し制御された結果からサイクル法による凍結加温手術の実行性が示された。最後に生体組織に対する破壊効果を動物実験にて評価した。評価実験では、マウスの生体肝組織に対して凍結加温手術を施行し、手術後に摘出した組織を病理学的手法を用いて観察した結果、細胞核の消失や濃縮、染色性の低下が観察され、壊死したことが確認できた。以上の結果より、本研究で作製した冷媒循環型の凍結加温手術装置は手術時の自動温度制御が可能で、組織破壊効果も有することが明らかとなった。本年度の計画では、凍結加温手術装置を作製すること及びその装置性能を評価することを目的としている。

凍結加温手術装置の作製では、計画の通りに温度サイクル用のプログラム温調機能付きの電源とペルチェ素子、スターリングクーラ、ペリスタティックポンプを用いて凍結加温手術装置を作製することができており、また性能評価実験としては最低到達温度の調査及び温度サイクル試験の結果からも凍結加温手術の実行可能性が示唆されているなど、おおむね順調に研究が進んでいる状態である。また、性能評価実験における温度測定の結果では、冷媒エタノールの温度上昇が確認されたため、本装置に断熱材を取り付けることでエタノールの温度上昇を抑制できた結果が得られている。したがって、当初予定していた計画通りの装置改良も順調に進んでいる状況にある。しかし、断熱材を装着した現状の手術装置においてもエタノール温度の上昇が確認されているため、チューブとポンプの摩擦熱が問題となるペリスタティックポンプを、摩擦熱が生じにくい歯車ポンプに変更することやスターリングクーラを冷媒チャンバの前段にもう一台追加する等の改良を施すことで冷媒としてのエタノール温度の上昇を抑制する対策をこれまでに考案しており、現在は上述の改良策を本手術装置に実装し、改良型の手術装置における手術用プローブ温度の最低到達温度や温度サイクル性能の調査を現状で実施できている状況であるため、研究計画通りに進行していると考えられる。医用生体工学今後は、本装置を動物実験に適用するための前実験として、本凍結加温手術装置を1時間程度運転させた際の、より詳細な手術用プローブやエタノール冷媒の温度推移評価実験や手術用プローブ温度を多段階に設定るすることによって複数回の温度サイクルに対する性能を詳細に評価するための実験を実施する予定である。また、38°C程度まで加温したファントムに対して凍結加温手術を実行し、手術用プローブの最低到達温度の調査や温度推移を調べるための実験を行い、それらから得られた結果に基づいて本手術装置の更なる改良を継続的に行う予定である。平成27年度では動物実験を予定しているため、その動物実験の倫理申請や環境整備を行うと共に、倫理申請承認後には本凍結加温手術装置を用いて凍結加温手術を動物実験に供することで、凍結加温手術の生体に対する影響を調べる予定である。生体に対する影響評価実験について、凍結加温手術の組織冷凍や加温に影響を与えると考えられる血流の動態を把握するため、近赤外線撮影装置を用いて血管の撮影及び抽出を試みることによって非侵襲的な血流動態の把握と凍結加温手術の生体影響の関連性を調べることを予定しており、現状は近赤外線撮影装置の検討・選定を行っている状況にある。また、手術直後には肉眼的にうっ血状態などの生体反応を観察すると共に、うっ血範囲を計測することで凍結加温手術中のプローブ温度の推移との関連を調べる予定である。さらに、手術後には病理学的な手法を用いて組織標本を作製し組織学的な評価を行うことで壊死状態を光学顕微鏡下で判別する予定である。これらの手術中、手術直後、手術後評価によって手術用プローブ温度とうっ血範囲、壊死範囲の関連性を明らかにする予定となっている。
分裂期細胞死による、発がん防御機構・生殖細胞の維持機構の解明

DNAポリメラーゼEta(Polη)の欠損は、色素性乾皮症バリアント(XP-V)を引き起こす。Rad18遺伝子の異常もXP-Vの原因である可能性がある。また、Rad18とChk2には遺伝的相互作用があると考えられる。マウスChk2およびヒトCHEK2はがん抑制遺伝子であり、欧米の人口の0.2-0.5%はへテロでCHEK2機能不全遺伝子をもつことが知られており、メラノーマなどのリスクが約2倍になることが知られている。しかしUV照射による皮膚がん発症において、CHEK2機能不全遺伝子がリスク要因であるか報告されていない。UV照射による皮膚がん形成試験およびマウス由来細胞を用いた細胞周期制御、細胞死の誘導、ゲノムDNAの安定性維持について調べることで、Rad18またはChk2がUV照射による皮膚がんの形成を抑制する機構を明らかにした。マウス皮膚がん形成試験により、UV照射由来の皮膚がん発症に関してRad18機能不全はリスク要因ではないが、Chk2/Chek2機能不全はリスク要因であることが示された。UV照射によりDNAが損傷され複製フォークの進行が停止すると、DNA鎖が切断される。切断したDNA鎖によりChk2/CHEK2が活性化しG1 / S期での細胞周期を停止することによって、損傷したDNA鎖を修復するための時間が確保され、それとともにアポトーシスを誘導することで損傷の程度が高い細胞を排除し、ゲノムの安定性を保つことが明らかとなった。今回の研究により、Chk2遺伝子をホモで欠損すると、UV照射による皮膚がん形成のリスクが有意に高くなる結果が得られたため、少なくともCHEK2機能不全遺伝子をホモでもつヒトは、日光暴露に対して注意する必要があることが推測される。これが臨床の場において検証され、CHEK2機能不全遺伝子をホモでもつヒトに対する生活指導につながることが期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。(1) Chk2による分裂期細胞死の解明:Chk2による分裂期での細胞死を解明するために、インキュベーター型蛍光顕微鏡を用いてマウスES細胞を培養しタイムラプス観察によるイメージング解析を行った。恒常的に安定してイメージングできる細胞を調製することに成功した。細胞にUVを照射してゲノムDNAを損傷させると、典型的なアポトーシス像ではなく、主に細胞分裂期で細胞死がおこることがわかった。さらに分裂中期に細胞の赤道線沿いに染色体が集積した後に核が崩壊して死に至るタイプと、分裂後期まで進行した後に核が崩壊するタイプの2通りの細胞死像が見られることがわかった。(2) Chk2による細胞周期制御機構の解明:ES細胞周期調節機構を定量的に調べるため、フローサイトメトリーを用いて細胞周期の解析を行った。subG1の割合はRad18欠損細胞で最も高く、Chk2を欠損するとその効果は打ち消された(相補された)。このため、Rad18欠損細胞ではDNA損傷によりChk2が活性化して細胞死を誘導することが示された。またG1/Sチェックポイントに関しても、Chk2により誘導されることが示された。(3) Rad18・Chk2によるテロメアなどの複製困難領域の複製促進制御機構の解明:Rad18またはChk2がゲノムDNAの安定性を維持するために、テロメアなどの複製困難領域の複製を促進する制御を行っている可能性を検証した。WT、Rad18欠損細胞ではテロメアが欠失している細胞がみられた。Chk2欠損細胞では逆にこのテロメア数が増加している染色体が観察された。このため、Rad18とChk2は異なる機構によりテロメアなどの複製困難領域の複製の支援を行っている可能性があることが示唆された。(1) Chk2による分裂期細胞死の解明:恒常的に核と細胞膜をモニターできるES細胞を調製できたため、分裂期で特異的におこる細胞死を観察できる系を構築できた。この結果は今回の研究目的だけでなく汎用性が高い。また、分裂期細胞死にも2つのタイプがあることがわかり、これは生殖細胞でも見られるか興味深い。(2) Chk2による細胞周期制御機構の解明:Rad18は複製後修復を中心的に制御する。この機能が欠損すると、Chk2による細胞周期制御機構が強く誘導されることがわかった。この結果は、この2つの遺伝子の相補的関係を裏付けるものである。(3)マウス精巣の生殖細胞維持における分裂期細胞死の役割の解明:精巣片を用いるin vitro培養系の構築に向けて準備している段階であり、今後の努力が必要である。(4)マウス受精卵の卵割または発生時におこる分裂期細胞死の役割の解明:核および細胞膜をモニターできるライブマウスを導入した。すでに人工授精して胞胚まで観察する系は立ち上げてあるので、理論的にはこの課題を遂行できる状態にある。1.細胞老化の誘導における、細胞周期制御・チェックポイントの役割の解明細胞に紫外線や放射線が照射されるとゲノムDNAに1本鎖DNA領域が形成され、DNAの損傷応答(DDR)を活性化する。DDR経路は、細胞周期の進行を制御する一方で、細胞老化を誘導してゲノムの安定性を保つ。細胞老化は発ガン抑制の役割を担う一方、生体の新陳代謝には不利益に働くという二面性があることより、細胞老化の誘導は厳密に制御されていると考えられる。

そこで、損傷の量が少ない場合にはDNA修復や細胞周期制御によりゲノムの安定性が保たれ、細胞老化は誘導されず、損傷の量が多い場合には細胞老化が誘導されるのではないかと仮説をたてた。放射線照射後の細胞で細胞周期制御が起こるか確かめるために細胞周期の解析を行い、subG1(G1期よりDNA量の少ない分画:細胞死を反映する)、G1/Sチェックポイント、G2/Mチェックポイントについて、それぞれの結果を検討した。さらに活性化p53量をウエスタン解析により調べた結果、細胞周期制御(Chk2)とDNA修復(Rad18)の機能を二重に欠損した細胞ではp53が強く活性化されていたことがわかった。以上の結果より、DDR経路はDNAを損傷した細胞がS期からG2/M期に移行しないように細胞周期の進行を抑制するが、これが破綻した場合には、G2/M期でp53が強く活性化して細胞老化を誘導し、ゲノムの安定性を保つモデルを考案した。1.マウスChk2がUV照射による皮膚癌形成を防ぐ機構の解明CHEK2 1100delC変異をもつヒトは、乳癌およびメラノーマに罹患するリスクが約2倍高くなる。メラノーマの主要な原因はUVの照射である。しかしUV照射したモデル動物を用いて、CHEK2遺伝子機能の欠損が発癌リスクへ影響することを確認した研究は報告されていない。これまでに私は、ヒトCHEK2の相同遺伝子であるマウスChk2遺伝子を欠損したマウスに定期的にUV照射を行うことにより、このマウスが主に有棘細胞癌などの皮膚癌を形成しやすいことを明らかにした。また、野生型、Chk2欠損、Rad18欠損およびChk2・Rad18欠損マウス由来のES細胞を用いて試験を行った。UV照射後にChk2依存的に誘導されるアポトーシスおよび細胞周期制御が、ゲノムDNAを安定に維持して皮膚癌の形成を防ぐ役割を果たしていることを示唆するデータを得た。以上の結果をまとめて、J. Invest. Dermatol.に投稿する準備をしている。体細胞変異でのRad18の役割を解明するため、Rad18を欠損する細胞を用いて、Rad18とは異なる経路によりPCNAの一部がユビキチン化されることを示した。2017年度のDNA Repair誌に共著として報告した。3.分裂期細胞死による、生殖細胞の維持機構の解明生殖細胞を維持するために分裂期細胞死が果たしている役割を明らかにするため、各マウスそれぞれの受精卵を培養し、胞胚形成での異常の頻度を測定した。加齢した二重欠損マウスの受精卵では異常な卵割が見られた。また各マウス由来のES細胞にGFPヒストンを発現させた後にUV照射を行い、インキュベーター顕微鏡を用いて分裂期細胞死のイメージングを行っている。DNAポリメラーゼEta(Polη)の欠損は、色素性乾皮症バリアント(XP-V)を引き起こす。Rad18遺伝子の異常もXP-Vの原因である可能性がある。また、Rad18とChk2には遺伝的相互作用があると考えられる。マウスChk2およびヒトCHEK2はがん抑制遺伝子であり、欧米の人口の0.2-0.5%はへテロでCHEK2機能不全遺伝子をもつことが知られており、メラノーマなどのリスクが約2倍になることが知られている。
エデュテイメントの要素を取り入れた年少者用英語学習ツールの開発と応用可能性

本研究課題は期間内に、幼児および小学校の低・中学年の英語学習を対象とし、協働学習やエデュテイメントの要素を取り入れた仕組みの導入と、授業外学習時間の活用モデルを提案することを目指している。特に英語科教育導入の低年齢化、モバイル端末の普及やインターネット環境の整備を背景とし、英語初学段階の子どもたちを対象とした発音・文字・語彙学習用等のアプリ開発及び学習効果・情意面への影響・現場への応用可能性について検討するため、申請者によるこれまでの小学生や成人学習者を対象とした外国語音声の知覚・学習実験に関する実践研究で残された課題となっている、自宅等での学習体験の影響(個人差)、いかに授業外の時間を活用して限られた授業時間の中で高い効果を発揮させるか、理解・産出(発話)の能力の修得・向上に影響する要因について探索的に調査している。当該年度に実施した主な研究成果については、教育効果を評価するための観察の観点に関する調査;認知的能力のみでなく、経験の開放性(新しいことに関心をもってどんどんチャレンジする)、勤勉性、外向性、協調性、情緒安定性といった非認知的能力の育成が重視されている幼児教育段階への応用も可能にするため、アンケート用紙の質問項目に関する予備的調査が進展した。自己効力感を高める教育を目指し、特に英語初学段階の幼児・児童を対象とした発音・文字・語彙学習用等のアプリ開発については開発者と打ち合わせを行い、試用版の試作と動作チェックを重ねている。上記「研究実績の概要」にて言及した通り、子どもたちの英語能力データの定量的分析、研究のための基礎資料の拡充、研究の進展に伴い必要となる、データ収集・集計用ツール作成、教育効果検証の手段の一つとなるアンケート調査用紙の開発ともに所期の計画通りおおむね順調に進展している。基礎データの収集は年度前半までに完了し収束させる。データ収集と分析および分析結果を受けての教育方法の改善、ツール開発と思考及びフィードバックを受けての改善というように、実践と研究、開発と検証をスパイラルに進める。データベース構築の完成を目指し、既に過年度の児童について作成済のデータベースへの情報の増強を行う。ツール開発については進捗を適切に管理し、研究全体の進行を妨げないように行う。データ収集・集計を目的とした研究ツール、学習教材ツールの開発を完了する。教育効果の検討は観察やアンケート調査を通して実施することを予定しているため、新たにアンケート調査用紙を開発中である。認知的能力のみでなく、経験の開放性(新しいことに関心をもってどんどんチャレンジする)、勤勉性、外向性、協調性、情緒安定性といった非認知的能力の育成が重視されている幼児教育段階への応用も可能にするため、質問項目を新規に作成し精査している。自己効力感を高める教育を目指し、特に英語初学段階の幼児・児童を対象とした発音・文字・語彙学習用等のアプリ開発について、開発者と打ち合わせを行っている。

上記「研究実績の概要」にて言及した通り、子どもたちの英語能力データの定量的分析、研究のための基礎資料の拡充、研究の進展に伴い必要となる、データ収集・集計用ツール作成、教育効果検証の手段の一つとなるアンケート調査用紙の開発ともに所期の計画通りおおむね順調に進展している。基礎データは充分に蓄積できるよう注力する。データ収集と分析および分析結果を受けての教育方法の改善、ツール開発と思考及びフィードバックを受けての改善というように、実践と研究、開発と検証をスパイラルに進める。データベースの構築を継続し、余裕があれば既に過年度の児童について作成済のデータベースへの情報の増強も行う。ツール開発については進捗を適切に管理し、研究全体の進行を妨げないように行う。データ収集・集計絵を目的とした研究ツール開発を優先的に行い、年度後半には学習教材ツールの開発に着手できるようにする。基礎データの収集は年度前半までに完了し収束させる。データベース構築の完成を目指し、既に過年度の児童について作成済のデータベースへの情報の増強を行う。データ収集・集計を目的とした研究ツール、学習教材ツールの開発を完了する。
MPS法によるNIPTにおけるdiscordantな結果の解明とその臨床的意義

2017年3月までに報告された34246例について解析した結果、全体として判定保留となったのは110例(0.32%)であり、その20%が胎児DNA濃度が低いことによるものであった。また仮説の一つであった、判定保留におけるヘパリンの影響については、判定保留となった妊婦の11.8%に、抗凝血治療としてのヘパリン投与があることが確認された。また、母体の腫瘍性疾患によって判定保留となった症例においては、whole genome解析によって、そのゲノムプロファイルにおいて変化が見らることがわかった。さらに、ゲノムプロファイルに何等かの変化が見られた場合には、2回目の採血を行っても判定結果が得られる率は低かった(22%-33.3%)。判定保留の背景には様々な要因がありその一部の実態が明らかとなってきた。ヘパリンを投与されている妊婦は多いことから、NIPTの検査前のカウンセリングにおいては、結果が得られない場合があること、その背景としての要因や留意点についての説明が必要と考えられた。今後は症例を増やしてのデータ収集を続けるとともに、偽陽性例を中心に特に症例数の多い要因について詳細な解析(whole genome解析)を行う予定である。偽陽性、判定保留の要因について全体の40%超の要因が特定できたことに加え、判定保留の要因の一つであるヘパリン投与の影響についての詳細な結果を得ることができた。また、NIPTによって結果が得られにくい背景の一つにgenomic profileの変化が認められることがわかった。NIPTの受検者には不育症治療としてヘパリン投与を受けている妊婦も多数あることから採血の前に対策をとる必要があることが示唆された。また採血を繰り返しても結果が得られにくい症例があることは検査を希望する妊婦に伝えるべき有用な情報となると考えられる。判定保留例におけるヘパリン投与や腫瘍などの母体疾患によるNIPT結果へ影響を及ぼす要因の一部が明らかになるとともに、偽陽性例の背景についてのさらなる詳細な解析が必要と考えられるため、症例数の増加とともに解析を続けていく。さらに、ヘパリン投与に対する事前の周知やNIPTで結果が得られにくい場合があることの要因についての情報提供を含め、妊婦への遺伝カウンセリングのあり方や内容についての検討を行う予定である。母体血中のcell-freeDNAを用いたNIPTにおけるdiscordantな結果に着目しその原因を検討した。1胎盤に限局したモザイク(CPM)の影響で偽陽性となることがある、2Vanishing twinの影響で偽陽性となる場合がある、3母体由来のDNAの影響を受けるとの仮説を検証した。2017年11月までに報告のあったNIPTコンソーシアム35施設のデータを解析した。総検査数37243件、擬陽性は44例、偽陰性3例、判定保留122例であった。追跡可能であった疑陽性40例の原因としてvanishing twin,胎盤性モザイク,児のモザイクが確認され、14/40の原因を特定できた。うち胎盤性モザイクにおいては18トリソミーにおける症例数が多いことがわかった。この他、母体の病態(腫瘍性疾患、染色体異常)の影響により疑陽性となった症例も確認できた。一回目判定保留例(122例)においては、母体要因(ヘパリン投与,母体腫瘍,自己免疫疾患,母体のCNVs),児の染色体異常、胎盤性モザイク、vanishing twinなどの原因が特定された。2回連続判定保留となった症例(33例)では、母体要因、児の染色体異常、胎盤性モザイクが確認されている。このうちヘパリン症例についてのマイクロアレイ解析の結果、投与中と中断後でDNA断片長が変化することを確認した。今後は症例を増やしてのデータ収集を続けるとともに、特に症例数の多い要因について詳細な解析(whole genome解析)を行う。予定していた症例数をほぼ満たしたが解析可能であった過去症例も加えた結果である。疑陽性、判定保留の要因について全体の40%超の要因を特定できた。疑陽性、判定保留例の背景には様残な母児の要因が影響していることが確認された。疑陽性例に影響する18トリソミーの胎盤性モザイクは、その症例数も多く検査前および18トリソミー陽性結果の説明時に有用な情報提供となることが確認され、確定診断の必要性の裏付けとなった。また、特に判定保留例におけるヘパリン投与の影響について一定の結果が得られ、NIPTにおける判定保留例の減少のための有用な情報となると考える。

今後は症例を増やしてのデータ収集を続けるとともに、偽陽性例を中心に特に症例数の多い要因について詳細な解析(whole genome解析)を行う予定である。偽陽性、判定保留の要因について全体の40%超の要因が特定できたことに加え、判定保留の要因の一つであるヘパリン投与の影響についての詳細な結果を得ることができた。また、NIPTによって結果が得られにくい背景の一つにgenomic profileの変化が認められることがわかった。NIPTの受検者には不育症治療としてヘパリン投与を受けている妊婦も多数あることから採血の前に対策をとる必要があることが示唆された。また採血を繰り返しても結果が得られにくい症例があることは検査を希望する妊婦に伝えるべき有用な情報となると考えられる。症例数を増やし、各要因別の詳細な検討を継続する予定である。特に症例数の多い要因については、検査結果および妊婦に与える心理的影響も大きいことからwhole genomeのアプローチからの検討を続ける。判定保留例におけるヘパリン投与や腫瘍などの母体疾患によるNIPT結果へ影響を及ぼす要因の一部が明らかになるとともに、偽陽性例の背景についてのさらなる詳細な解析が必要と考えられるため、症例数の増加とともに解析を続けていく。さらに、ヘパリン投与に対する事前の周知やNIPTで結果が得られにくい場合があることの要因についての情報提供を含め、妊婦への遺伝カウンセリングのあり方や内容についての検討を行う予定である。研究は予定通り進行しているが、18050円の残金となった。平成30年度分の予算と合わせて、研究試薬、キット等の購入を予定している。研究は予定通りに進行している.旅費について安価に調整できたこと,代表者が人件費として計上していた予算が,研究スケジュールの見直しにより人員確保が困難となったことにより本年度については残金として持ち越すこととなった.残金分については研究の最後の年度となるのでスケジュール調整を早期に準備し,学会発表,人件費,研究試薬等の購入で使用する予定である.
脂質ラジカル可視化技術によるミトコンドリアー核連関の解明と心不全治療への応用

不全心筋では、ROSが増大し、ミトコンドリアはその主たる産生源である。脂質はミトコンドリア膜および核膜をはじめとし、細胞内に大量に存在する。脂質は、ひとたび酸化されると、持続的に脂質ラジカルを生成し、高い反応性で連鎖反応(連鎖的脂質過酸化反応:右図1)を引き起こし、その結果産生された脂質代謝物は蛋白質と複合体(脂質タンパク質複合体)を形成し、それらは新たな生理活性を有すると考えられる。本研究においては、ミトコンドリア内で産生されたフリーラジカルによってミトコンドリアDNA (mtDNA)そのものの酸化障害により、脂質ラジカルが増加し、心機能障害を生じる、という仮説をたて、新たな心不全の病態メカニズムと治療法の解明を行うことを目的とした。ミトコンドリアー核連関のシグナル伝達のメディエーターやその作用を明らかにするために、ドキソルビシン心筋症モデルを用いて実験をすすめている。平成30年度は、心不全モデル動物を用いて脂質ラジカル消去剤による心機能への影響、さらには脂質ラジカルによって惹起されるフェロトーシスの関与および経路について明らかにした。ドキソルビシン心筋症によるモデルマウスにおいて、脂質ラジカルによる脂質過酸化傷害について心機能への影響について明らかにした。またドキソルビシンを単離した仔ラット心筋細胞に暴露すると、容量依存性に細胞死を認めたが、脂質ラジカルの制御によりそれらの細胞死が抑制されることが明らかとなった。平成31年度は、これらの詳細な細胞内シグナル伝達を含めた機序および治療ターゲットについて明らかする予定である。モデル動物の作成、脂質ラジカル同定に必要なプローブの作成について、当初の予定通りである。心不全モデルとして、in vivoにてドキソルビシンによる薬剤性心筋症モデルを確立し、本モデルにおいて脂質ラジカルが増加していること、脂質ラジカルをトリガーとして生じるフェロトーシスの関与について明らかにすることができた。また、生体内で脂質ラジカルの特異的消去酵素の発現によって脂質ラジカルのが制御されていることを明らかにすることができた。来年度は、脂質ラジカルの定性的定量的評価ならびに脂質ラジカルの細胞内局在と細胞内シグナル伝達の機序を明らかにすることで、不全心筋における脂質ラジカルの役割について明らかにする予定である。マウスを用いてその他の心筋症による心不全モデルでも、フェロトーシスが心筋収縮能にどのように関与しているかを明らかにする。その際に、フェロトーシス阻害剤であるフェロスタチン、新規に開発した脂質ラジカル消去剤を用いて、治療効果を明らかにする。研究を効率的に推進するために、(1)種々のマウスモデルにおいても、共通の病態基盤であるかどうかを明らかにする。(2)細胞死について、既知のアポトーシス、ネクローシスとどのような役割の違いがあるのか、明らかにする。(3)脂質ラジカルをターゲットとした治療の可能性について検討する。上記を細胞実験、遺伝子改変動物を用いて効率的にすすめる。脂質は、ミトコンドリア膜および核膜をはじめとし、細胞内に大量に存在するが、ひとたび酸化されると、持続的に脂質ラジカルを生成し、高い反応性で連鎖反応(連鎖的脂質過酸化反応)を引き起こし、その結果産生された脂質代謝物は蛋白質と複合体(脂質タンパク質複合体)を形成し、新たな生理活性を有すると考えられる。本研究は、連鎖的脂質過酸化反応によって産生された脂質代謝物が、心不全、心筋リモデリングの病態にどのように関与しているかを明らかにすること、特に、脂質ラジカルがメディエーターとしての役割を果たしていることを明らかにすることを目的とした。平成29年度は、不全心筋における脂質ラジカルの役割を明らかにするために、ドキソルビシン心筋症モデルを作成した。ヒトにおけるドキソルビシン心筋症に類似したモデルの作成に成功し、過酸化脂質の増加とともに、ミトコンドリア内の銕の増加、GPx4の有意な発現低下を伴っていた。脂質ラジカルを捕捉する新規ラジカルプローブあるいは脂質ラジカル消去剤である化合物Xをモデルマウスに投与したところ、脂質過酸化物の抑制とともに心筋障害の改善が得られた。また、ラット心筋細胞にドキソルビシンを投与することで、細胞死が生じるが、化合物Xの投与により有意に細胞死が抑制された。今後平成30年度以降は、引き続き、脂質ラジカル増加の機序ならびに細胞内レドックス関連因子の関連を明らかにする予定である。モデル作成ならびに脂質ラジカルの検出等が可能となり、細胞内の脂質ラジカルの局在、脂質ラジカルの定量的評価もできた。おおむね順調である。

平成30年度は、心不全モデル動物を用いて脂質ラジカル消去剤による心機能への影響、さらには脂質ラジカルによって惹起されるフェロトーシスの関与および経路について明らかにした。ドキソルビシン心筋症によるモデルマウスにおいて、脂質ラジカルによる脂質過酸化傷害について心機能への影響について明らかにした。またドキソルビシンを単離した仔ラット心筋細胞に暴露すると、容量依存性に細胞死を認めたが、脂質ラジカルの制御によりそれらの細胞死が抑制されることが明らかとなった。平成31年度は、これらの詳細な細胞内シグナル伝達を含めた機序および治療ターゲットについて明らかする予定である。モデル動物の作成、脂質ラジカル同定に必要なプローブの作成について、当初の予定通りである。心不全モデルとして、in vivoにてドキソルビシンによる薬剤性心筋症モデルを確立し、本モデルにおいて脂質ラジカルが増加していること、脂質ラジカルをトリガーとして生じるフェロトーシスの関与について明らかにすることができた。また、生体内で脂質ラジカルの特異的消去酵素の発現によって脂質ラジカルのが制御されていることを明らかにすることができた。来年度は、脂質ラジカルの定性的定量的評価ならびに脂質ラジカルの細胞内局在と細胞内シグナル伝達の機序を明らかにすることで、不全心筋における脂質ラジカルの役割について明らかにする予定である。今後、心筋症にて脂質ラジアルが増加する機序の解明、ならびに脂質ラジカル反応で得られている脂質過酸化物の同定を目指す。マウスを用いてその他の心筋症による心不全モデルでも、フェロトーシスが心筋収縮能にどのように関与しているかを明らかにする。その際に、フェロトーシス阻害剤であるフェロスタチン、新規に開発した脂質ラジカル消去剤を用いて、治療効果を明らかにする。研究を効率的に推進するために、(1)種々のマウスモデルにおいても、共通の病態基盤であるかどうかを明らかにする。(2)細胞死について、既知のアポトーシス、ネクローシスとどのような役割の違いがあるのか、明らかにする。(3)脂質ラジカルをターゲットとした治療の可能性について検討する。上記を細胞実験、遺伝子改変動物を用いて効率的にすすめる。
心不全モデル動物における薬物治療と脂肪酸代謝

ミオシン注射による自己免疫性心筋炎のモデルラットにインターロイキン10(IL-10)を遺伝子導入し、死亡率と心筋炎の改善がみられた。この心筋炎後の拡張型心筋症様モデルラットにアンジオテンシン変換酵素阻害薬(ACE-I)のキナプリル及びエナラプリルを投与しその効果を検討した。それらの投薬により心重量と左心室拡張末期庄の低下、さらに線維化の減少が見られた。線維化に関係するTGF-β1とCollagen-IIIのmRNA発現は、心不全群で増加し投薬群で減少した。これらの改善はキナプリル群で著明であった。同じACE-Iでも作用の違いに注目すべきであることが明らかとなった。一方、ベータ遮断薬のビソプロロールの投与では、心機能改善が見られなかったが生存率が上がり抗不整脈作用によるものと思われた。ベータ遮断薬のカルベジロールの投与では、心臓交感神経機能の改善がみられた。ヒトCD36欠損症では心筋脂肪酸代謝のイメージング剤であるBMIPPが心筋に集積せず、遺伝子異常が見られた。ヒト虚血性心疾患患者では脂肪酸代謝と交感神経機能が傷害され、薬物治療により改善する群は予後良好であった。ミオシン注射による自己免疫性心筋炎のモデルラットにインターロイキン10(IL-10)を遺伝子導入し、死亡率と心筋炎の改善がみられた(Circulation.2001;104:1098-1100.に報告)。この心筋炎後の拡張型心筋症様モデルラットにアンジオテンシン変換酵素阻害薬のキナプリルを投与後、心機能の改善・線維化の抑制・各種遺伝子発現の変化が見られた(J Cardiobascul Pharmacol.2001;38:S51-S54.)。(J Cardiobascul Pharmacol.2001;38:S55-S58.)。ヒト虚血性心疾患患者では脂肪酸代謝と交感神経機能が傷害され、薬物治療により改善する群は予後良好であった(J Nucl Med. 2002;43(11):1476-1481.)。
コモンズと公共性の環境社会学的研究

本研究では、(1)フィールドからの知見を、本研究の趣旨である"コモンズと公共性"という観点から照らしなおした報告を順次行い、同時に(2)コモンズと公共性についての理論的および政策論的な議論を行なった。(4)さらに、それをふまえて、成果を商業出版すべく、各自の執筆活動を行なった。知見としては、次の諸点が浮かび上がってきた。(1)コモンズを考えるときに、ある自然資源とある地域集団との問の一対一の資源管理上の関係に限定して考えるべきはなく、コモンズの重層性、身体性、さらにはダイナミズムへの視点が大事であること、(2)コモンズをめぐるルールやしくみは、実はあいまいであることが、その地域社会における創発性を喚起するということ、(3)環境における公共性を考えたとき、誰がその環境への権利をもち、誰がそれを認めるか、という問題、すなわち「レジティマシー(legitimacy、正統性/正当性)」の問題が鍵になるということ、(4)正統性の問題を考えるときに、注目すべきポイントとして、「正義」の問題、正統性の根拠としての「歴史」がどう生成されるかという問題、「発言力」の問題、「シナリオ」の生成と定着の問題、などがあること。平成17年度内にこの成果を『レジティマシーの環境社会学』(仮題)(宮内泰介編、新曜社)として商業出版する予定である。本年度の研究は、(1)フィールドからの知見を、本研究の趣旨である"コモンズと公共性"という観点から照らしなおした報告を順次行い、同時に(2)コモンズと公共性についての理論的および政策論的な議論を行なった。数回にわたる研究会、共通のフィールドを歩く試み(沖縄本島および滋賀で実施)、さらにはメーリングリストを使った討論により、議論は非常に深まった。(1)コモンズを考えるときに、ある自然資源とある地域集団との間の一対一の資源管理上の関係に限定して考えるべきはなく、コモンズの重層性、身体性、さらにはダイナミズムへの視点が大事であること、(2)コモンズをめぐるルールやしくみは、実はあいまいであることが、その地域社会における創発性を喚起するということ、(3)環境における公共性を考えたとき、誰がその環境への権利をもち、誰がそれを認めるか、という問題、すなわち「正統性」の問題が鍵になるということ、(4)正統性の問題を考えるときに、注目すべきポイントとして、「正義」の問題、正統性の根拠としての「歴史」がどう生成されるかという問題、「発言力」の問題、「シナリオ」の生成と定着の問題、などがあること。これらの成果を踏まえ、次年度は、当初の計画通り、研究成果の出版へ向けて、各人が論文を書き、それをもとに議論を行う予定である。本年度の研究は、(1)昨年度に引き続き、フィールドからの知見を、本研究の趣旨である"コモンズと公共性"という観点から照らしなおした報告を順次行い、同時に(2)コモンズと公共性についての理論的および政策論的な議論を行なった。(3)そして、本年度は、最終年度に当たるので、総括的な議論に力点を置き、(4)さらに、それをふまえて、成果を商業出版すべく、各自の執筆活動を開始した。(1)コモンズを考えるときに、ある自然資源とある地域集団との間の一対一の資源管理上の関係に限定して考えるべきはなく、コモンズの重層性、身体性、さらにはダイナミズムへの視点が大事であること、(2)コモンズをめぐるルールやしくみでは、実はあいまいであることが、その地域社会における創発性を喚起するということ、(3)環境における公共性を考えたとき、誰がその環境への権利をもち、誰がそれを認めるか、という問題、すなわち「正統性」の問題が鍵になるということ、(4)正統性の問題を考えるときに、注目すべきポイントとして、「正義」の問題、正統性の根拠としての「歴史」がどう生成されるかという問題、「発言力」の問題、「シナリオ」の生成と定着の問題、などがあること。平成17年度内にこの成果を商業出版する予定である。
応力蓄積過程での断層間相互作用を考慮した動的破壊過程の研究

本研究は,長期にわたる応力蓄積過程と短時間の動的破壊過程との間の相互作用を考慮することにより,幅広い時間スケールでの断層系のふるまいを理解することを目的としている.今年度は,より複雑な形状の断層上での動的破壊過程を計算できるようにするための第一歩として,折れ曲がりのある断層上での破壊過程を差分法で計算する手法を開発した.走向方向に折れ曲がりのある断層に沿ってとった座標系を,座標変換を用いて直交座標系へ投影することによって,差分法で問題を解けるようにした.折れ曲がりの角度や外部応力場を変えてシミュレーションを行った結果,折れ曲がり部分より先に破壊が伝播するかどうかは,折れ曲がりの角度によって決まる静的な応力場に支配されていること,また,折れ曲がり付近でのすべり量の分布は,すべりによって生じる動的な応力変化によって撹乱されることがわかった.折れ曲がりの角度が大きくなるにしたがって,断層面にはたらく剪断応力は小さく,法線応力は大きくなるため,破壊は進展しにくくなる.差応力値の観測結果を用いて仮定した応力場中にある断層では,折れ曲がりの角度が10°程度の場合,折れ曲がり部分より先の破壊速度が減速し,20°程度の折れ曲がりでは,破壊がほぼ停止するという計算結果が得られた.この結果は,現実の断層形状と地震の破壊過程との関係とよく一致している.なお,これらの研究成果は,AGU(アメリカ地球物理学連合)秋季大会において発表し,現在,投稿論文にまとめている.本研究は,長期にわたる応力蓄積過程と短時間の動的破壊過程との間の相互作用を考慮することにより,幅広い時間スケールでの断層系のふるまいを理解することを目的としている.今年度は,六甲・淡路断層系を対象とし,観測されている活動履歴と断層形状,推定される周囲の応力場から断層面にはたらく応力分布,および,動力学的破壊過程を推定し,最新の地震(1995年兵庫県南部地震)の破壊過程と比較することによって,断層形状やテクトニックな応力場が,断層系の活動性や動的破壊過程をどのように支配しているのかを調べた.推定される断層面にはたらく応力分布を兵庫県南部地震のすべり分布から求められる応力分布と比較すると,震源付近では異なっている.そのため,推定される破壊過程は,断層面の分割の仕方や破壊開始点の位置に非常に敏感であり,正解(兵庫県南部地震の破壊過程)だけを導くのは困難であることがわかった.断層形状や応力場,過去の活動履歴を観測誤差,および,推定誤差の範囲内で様々に変化させると,多様な破壊過程が導かれてしまう.特に,淡路側では地表まで大きなすべりが生じるのに対し,六甲側(神戸市直下)では深いところでのみすべりが生じる,という不均質なすべり分布を忠実に再現するのは難しい.現状では,前回の活動から兵庫県南部地震までの応力蓄積の再現が不十分であり,断層面にはたらく応力分布を十分に推定できていないためと考えられる.この点をより現実的なものにすることによって,破壊過程の再現性も改善されると考えられる.なお,これらの研究成果は,日本地震学会秋季大会,AGU(アメリカ地球物理学連合)秋季大会において発表し,現在,投稿論文にまとめている.本研究は,長期にわたる応力蓄積過程と短時間の動的破壊過程との間の相互作用を考慮することにより,幅広い時間スケールでの断層系のふるまいを理解することを目的としている.今年度は,より複雑な形状の断層上での動的破壊過程を計算できるようにするための第一歩として,折れ曲がりのある断層上での破壊過程を差分法で計算する手法を開発した.走向方向に折れ曲がりのある断層に沿ってとった座標系を,座標変換を用いて直交座標系へ投影することによって,差分法で問題を解けるようにした.折れ曲がりの角度や外部応力場を変えてシミュレーションを行った結果,折れ曲がり部分より先に破壊が伝播するかどうかは,折れ曲がりの角度によって決まる静的な応力場に支配されていること,また,折れ曲がり付近でのすべり量の分布は,すべりによって生じる動的な応力変化によって撹乱されることがわかった.折れ曲がりの角度が大きくなるにしたがって,断層面にはたらく剪断応力は小さく,法線応力は大きくなるため,破壊は進展しにくくなる.差応力値の観測結果を用いて仮定した応力場中にある断層では,折れ曲がりの角度が10°程度の場合,折れ曲がり部分より先の破壊速度が減速し,20°程度の折れ曲がりでは,破壊がほぼ停止するという計算結果が得られた.この結果は,現実の断層形状と地震の破壊過程との関係とよく一致している.なお,これらの研究成果は,AGU(アメリカ地球物理学連合)秋季大会において発表し,現在,投稿論文にまとめている.
病態モデル膀胱上皮細胞の伸展刺激に対するＡＴＰ放出のメカニズム

本研究における実験結果から、膀胱上皮に発現するVNUTが膀胱知覚神経伝達(尿意知覚)に関与していると考えられた。さらに、排尿障害を背景に持つヒト膀胱上皮にもVNUTが発現していることを確認し、初期尿意との関連性が示唆された。従って、膀胱上皮におけるVNUTを制御することで過活動膀胱などの排尿障害に対する新しい治療薬の開発に繋がることが期待される。目的;過活動膀胱に代表される蓄尿障害に対して、有効かつ副作用の少ない治療法を開発するために蓄尿期における求心路生理メカニズムを解明することが重要である。本研究では、小型ヌクレオチドトランスポーター(VNUT)に着目し、VNUTが膀胱上皮にも発現し伸展刺激に対してATP放出応答していることを確認した。WTとVNUT geneを特異的にKnock downさせたVNUT KD由来の上皮培養細胞(当細胞を病態モデルとした)における上記メカニズムの意義に関して検討した。結果;VNUTKD由来の膀胱上皮培養細胞はWT由来のもと比較して有意にVNUTのmRNAレベルでの発現量が少ないことを確認した。また、蛋白レベルでもKD群の蛋白量が少ないことを確認した。次に、KD由来とWT由来の膀胱上皮培養細胞を作成し、伸展刺激によるATP放出能を比較したところ、KD群で有意にATP放出量が少ないことを確認した。更に、我々は背景として排尿障害を持つヒト膀胱上皮におけるVNUTのmRNAの発現量及び各種排尿パラメータの関連に関して検討を行った。VNUTは排尿障害を持つヒト膀胱上皮において強く発現していることを認め、またfirst desire to void(FDV)とVNUT mRNAの発現量に負の相関を認めた。以上より、VNUTは病態時に尿知覚に関して重要な役割を果たしている可能性があることが示唆された。本研究では、小胞型ヌクレオチドトランスポーター(VNUT)に着目し、VNUTが膀胱上皮にも発現し伸展刺激に対してATP放出応答していることを確認し、WTと病態モデルマウス(VNUT KOマウス、炎症膀胱モデル、閉塞膀胱モデル)における上記メカニズムの意義に関して検討した。結果;まずWTマウス膀胱上皮において、組織学的免疫染色やmRNA、タンパクレベルで検討しその発現を確認した。次に、マウス膀胱上皮培養細胞において、伸展刺激を加えることによりルシフェリン・ルシフェラーゼassayを用いたPhotonscanning法においてATP放出を可視化し確認した。次年度以降は病態モデルマウス(VNUT KOマウス、炎症膀胱モデル、閉塞膀胱モデル)を用いて、膀胱上皮培養細胞におけるVNUTのメカニズムがWTと比較してどのように変化しているかを検討したい。当初の予定より計画が遅れているため繰越金が発生した。現状のままではATP Photon Counting機器が不安定な状態であるため、当該機器の修理および、付属機器(PC等)の新規購入に使用する予定。
試料走査タイプ共焦点走査型透過電子顕微鏡の開発と評価

共焦点原理を電子顕微鏡に応用した共焦点走査型透過電子顕微鏡(共焦点STEM)による三次元イメージングに世界で初めて成功した。本研究では、光学系は固定したまま、試料のみを動かす試料走査システムを開発し、共焦点STEM観察を行った。また、ダイレクトビームでなく、散乱電子のみで像を形成させる環状暗視野-共焦点STEM法を採用することにより、深さ分解能を著しく向上させることができた。さらに、この方法を用いて、カーボン構造体の三次元構造や担持ナノ粒子の三次元分布などを観察・解析した。透過型電子顕微鏡(TEM)を使った3次元観察方法として、トモグラフィーがよく知られているが、近年、共焦点原理をTEMに応用した共焦点走査型透過電子顕微鏡(共焦点STEM)が注目を集めている。しかし、世界初の共焦点STEM装置は、照射系と結像系に電子線走査システムを用いていたため、三次元断層像の取得が困難であった。そこで、本研究では、光学系を固定し、試料のみを走査することによって画像を得る試料走査タイプの共焦点STEMを開発することを目的とした。本年度は、ピエゾ駆動機構をもつTEM試料ホルダーを利用し、試料走査システムを開発した。試料ステージの移動の制御、さらに検出器で検出した画像信号との同期は、コンピュータプログラムにより行った。また、焦点位置以外からの電子線を排除するピンホールを検出器直上に配置した。開発したシステムの評価は、ナノ粒子の観察を通して行った。粒子の格子が観察できたことから、横方向については原子分解能を有することを確認した。つまり、システムの試料走査の安定性や制御性が高いことが示された。しかしながら、深さ方向に関しては、ナノ粒子は500nm以上にわたって伸びて観察された。ピンホールの大きさ、観察条件などを変えながら観察したが、三次元断層像が得られるような分解能は得られなかった。現状の共焦点STEMでは、プローブサイズから予想される深さ分解能が得られないことが分かり、次年度の課題となった。共焦点原理を透過型電子顕微鏡に応用した共焦点走査型透過電子顕微鏡(共焦点STEM)は、試料の深さ情報が得られる可能性を有することから、近年、注目が集まっている。本研究では、光学系を固定したまま、試料のみを走査することによって画像を得る試料走査タイプの共焦点STEMを開発し、実際に試料の三次元観察を行うことを目指した。まず、ピエゾ駆動機構をもつ試料ホルダーを利用し、試料走査システムを開発した。しかしながら、これだけでは、期待するような深さ分解は得られず、光軸方向に像は1μm近く伸びた。共焦点STEM像のシミュレーションでも、同様な結果が得られた。そこで、ダイレクトビームではなく、散乱した電子のみで像を形成させる方法を考案した。実際には、集束イオンビーム法で作製した円環暗視野(ADF)絞りを対物絞り位置に挿入した。このADF-共焦点STEM法により、深さ分解能を劇的に向上させることができ、ナノ粒子の像の伸びを約100nmに抑えることができた。また、試料走査システムを用いていることから、通常の水平画像だけでなく、任意の場所の垂直断面像も直接的に取得することができ、観察時に試料の三次元解析が行える。さらに、カーボンナノ構造体や担持体に分散した触媒粒子などを実際に観察し、得られたスライス像から三次元構造の構築にも成功した。