hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヘリシティ概念の深化に拠って立つ成層・電磁流体回転流の3次元安定性

粘性流体中の反対符号の渦対の運動速度に対する渦核の有限太さの効果を、ナビェ・ストークス方程式に接合漸近展開法を適用することによって導いた。運動速度に対する補正項を、渦が楕円形に変形することによって生成される四重極の強さのみで書き下せるまでに簡略化することに成功した。アトマイズを起こす高レイノルズ数乱流ジェットの二流体モデルを、平板ガイド上で整流を受けた液脈流がエッジから跳び出す薄い平面層状のジェットに拡張した。液相と気相が十分に混合した動的平衡状態にあるとして、二流体全体に質量保存則と運動量保存則を適用し、平均密度、平均速度、平均圧力等を平板エッジからの距離の関数として導いた。層状のジェットが2方向に広がるとして、2つの広がり角度のみが恣意的パラメータである。ジェットの圧力が実験データと定量的によく合う。燃焼理論において、任意の波長に対して火炎面が線形不安定であるというダリウス・ランダウ不安定(DLI)は実験と矛盾する。DLIに対する圧縮性の効果を計調べた。領域をスケールの異なる反応層、予混合層、外部の流体力学的領域の3層に分け、接合漸近展開法を用いてナビェ・ストークス、熱伝導、反応物質拡散方程式を連立した方程式系を解き、流体力学領域における火炎面の攪乱速度の跳びを導いた。火炎面のゆらぎの分散関係を計算し、プラントル数と熱放射が十分大きければ、圧縮性の効果によってDLIの攪乱の成長が抑制されることを示した。オイラー・ポアンカレ形式を、成層流や電磁流体力学(MHD)に対して整備し、トポロジカル不変量であるクロス・ヘリシティを粒子ラベル付け替え不変性に対するネータ電荷として統一的に説明した。さらに、ハミルトン形式を南部括弧によって表現すると、クロス・ヘリシティの汎関数微分がリー・ポアソン構造を与えることが明示的に示せた。9月、これらについて、イタリア数理物理学会の夏の学校で連続講義を行った。リー・ポアソン構造の存在は、基本場の上に立つ波のエネルギーが正・負両方の符号を取りえることを示唆する。一般に、ハミルトン力学系の不安定性は、異なるエネルギーの符号をもつ2つのモードが共存することによって発生する。負エネルギーのモードを同定することによって、流れの不安定性に対する理解が大きく深められる。回転楕円体容器内の回転流の不安定性について、エネルギーの観点から理解を深めた。ラグランジァン流体力学を構築して、それによって相互作用する渦管の2次元運動を記述する一連のプログラムを完成し、渦対の運動速度の著しく簡便な一般公式を公表した。トポロジカル不変量は圧縮性・非圧縮性を区別しない。クロス・ヘリシティ(=カシミール不変量)の真価は、圧縮性流体を記述することによって発揮されると考えている。燃焼理論について結果を得ることで、その第一歩を踏み出せた。密度不連続面とそれを貫く質量流束がある場合、運動する界面の加速度あるいは重力がある臨界値を越えると界面の波状変形が発達する新しい不安定性を発見した。加速度あるいは重力が十分大きくなると、この新しい不安定性は、燃焼火炎面のダリウス・ランダウ不安定性や密度不連続面のレイリー・テーラー不安定性より速く成長する。層流予混合火炎面のダリウス・ランダウ不安定性に対する弱い圧縮性の効果を、マッハ数の2乗に関する展開の形で取り込んだ。
ALS病態誘導人工遺伝子によるALSモデルの確立と病態解明

一方、近年では、多くのALS原因RNA結合蛋白の構造上、C末端アルギニンーグリシンリッチドメインが、ストレス顆粒の形成や凝集性に重要であることが報告されている.本年度は、ALS病態誘導人工遺伝子の改良のため、RNA結合部位の下流に、アルギニンーグリシンーグリシン(RRG)リピート(12,20リピート)を挿入し、培養細胞に導入、封入体形成率、凝集性を検討した. 12,20リピートともに、封入体形成率(リピートなし:15.4±2.8%, 12リピート:10.3±1.8, 20リピート:12.1±2.4)、ウエスタンブロット上凝集性の上昇は認められなかった.以上より、人工遺伝子においては、RGGリピート挿入によるALS関連分子の生化学的、細胞学的特性の増強は認められなかった.上記結果より、RGGリピートを挿入しないcDNAを用いて、ALS病態誘導人工遺伝子発現モデル動物の作成を推進している。Cre/loxPシステムを利用した誘導発現をもつALS病態誘導人工遺伝子遺伝子改変用ベクターをROSA26遺伝子座へのノックインベクターを作製した. HEK293細胞では、Cre存在下で十分な発現を確認した.ROSA26遺伝子座への挿入により外来遺伝の安定的ユビキタス発現とホモマウスでの解析が可能となる.遺伝子改変用ベクターはすでに作成し、Crispr/cas9システムを用いた受精卵から直接ノックインマウスを行っている.本研究の申請後、下記2つの国際紙に論文掲載された。ALSの病態解明に向けて確かな進達を認めている。本マウスが樹立した場合、生化学的(SGマーカー、TDP-43、不溶分画、細胞質分画)、組織学的検査を行いその神経変性過程を検討する.特に、脊髄前角、末梢神経の変性は詳細に行う.行動解析としては生存曲線を比較するとともに、footprint、Rota-rod treadmill、hanging wire testを評価して運動能力、活動性を定量的に解析する.本研究により、ALS病態誘導人工遺伝子が神経変性のトリガーとなることをin vivoで証明するとともに、運動ニューロンの選択的変性の分子機構をin vivoレベルで解析が可能となり、新規治療戦略の確立、薬剤の評価への利用が期待できる.一方、すでに我々が確立しているALSモデル遺伝子改変マウス(△NLS-FUSのtgマウス)の解析も進めている.若年性ALSの変異を持つ本tgマウスは、8週齢より過活動、記憶障害、社交性の障害などFTDの表現型、12週より進行するALS様の運動障害を呈する.ゴルジ染色では、15週齢前頭葉、海馬にて樹状突起スパインの密度の低下、miniature excitatory postsynaptic currentの出現が低下しており電気生理学的な障害も確認できている.現在本マウスより、前頭葉、海馬、脊髄のRNA seq.を行い変動する遺伝子を網羅的に解析している.本研究により、ALS/FTDの病態への関連が示唆される遺伝子群の同定に成功し、バイオマーカーへの応用や治療ターゲットにつながる可能性が期待される.一方、近年では、多くのALS原因RNA結合蛋白の構造上、C末端アルギニンーグリシンリッチドメインが、ストレス顆粒の形成や凝集性に重要であることが報告されている.本年度は、ALS病態誘導人工遺伝子の改良のため、RNA結合部位の下流に、アルギニンーグリシンーグリシン(RRG)リピート(12,20リピート)を挿入し、培養細胞に導入、封入体形成率、凝集性を検討した. 12,20リピートともに、封入体形成率(リピートなし:15.4±2.8%, 12リピート:10.3±1.8, 20リピート:12.1±2.4)、ウエスタンブロット上凝集性の上昇は認められなかった.以上より、人工遺伝子においては、RGGリピート挿入によるALS関連分子の生化学的、細胞学的特性の増強は認められなかった.上記結果より、RGGリピートを挿入しないcDNAを用いて、ALS病態誘導人工遺伝子発現モデル動物の作成を推進している。本マウスが樹立した場合、生化学的(SGマーカー、TDP-43、不溶分画、細胞質分画)、組織学的検査を行いその神経変性過程を検討する.特に、脊髄前角、末梢神経の変性は詳細に行う.行動解析としては生存曲線を比較するとともに、footprint、Rota-rod treadmill、hanging wire testを評価して運動能力、活動性を定量的に解析する.本研究により、ALS病態誘導人工遺伝子が神経変性のトリガーとなることをin vivoで証明するとともに、運動ニューロンの選択的変性の分子機構をin vivoレベルで解析が可能となり、新規治療戦略の確立、薬剤の評価への利用が期待できる.一方、すでに我々が確立しているALSモデル遺伝子改変マウス(△NLS-FUSのtgマウス)の解析も進めている.若年性ALSの変異を持つ本tgマウスは、8週齢より過活動、記憶障害、社交性の障害などFTDの表現型、12週より進行するALS様の運動

障害を呈する.ゴルジ染色では、15週齢前頭葉、海馬にて樹状突起スパインの密度の低下、miniature excitatory postsynaptic currentの出現が低下しており電気生理学的な障害も確認できている.現在本マウスより、前頭葉、海馬、脊髄のRNA seq.を行い変動する遺伝子を網羅的に解析している.本研究により、ALS/FTDの病態への関連が示唆される遺伝子群の同定に成功し、バイオマーカーへの応用や治療ターゲットにつながる可能性が期待される.従来からの計画では本年度に、ALS病態誘導人工遺伝子発現モデル動物の作製費用を計上する予定であったが、近年の論文より人工遺伝子の改良の必要性がありモデル動物の作製依頼が半年ほど遅れることとなった。モデル動物作製費用は、成功報酬であり今年度の計上がなされず、予算の繰り越しを依頼するものである.
希土類-遷移金属ワイドギャップ酸窒化物のノンストイキオメトリ・粒子径依存色調制御

本研究では、LaTiO_2NのO/N比およびTi/La比を変化させ、Laの一部をSrで置換することにより、光学バンドギャップおよびその拡散反射率を制御し、有害な元素を含まない酸窒化物系の赤・黄・青色顔料を合成することに成功した。本研究では、ペロブスカイト型の基本構造を保ったままLaTiO_2 NのO/N比およびTi/La比を変化させることにより、可視光領域での光学バンドギャップおよび反射率の制御を通じてその色調の制御を試みた。また、O/N比やTi/La比などの非化学量論性が光学特性に及ぼす影響を、X線光電子分光法を使用しTiの電子状態の観点から検討した。O/N比が大きくなると基礎吸収端が短波長側にシフトし、試料の色調が変化した。また、Ti/La比が大きくなると基礎吸収端の波長位置はほとんど変化ないものの吸収端より長波長側の拡散反射率が低下し、試料の色の明るさ(鮮やかさ)が変化した。また、O/N比を変化させるとTiの平均原子価が高くなるが、Ti/La比を変化させてもTiの原子価には影響を与えていないことがわかった。窒化温度やメカニカルミリング法により粒子径の異なるLaTiO_2Nを合成しその光学特性を調べたところ、粒子径が小さいほど吸収端以降長波長側の拡散反射率が大きくなる傾向が見られた。朱(赤)色と黄色顔料は基礎吸収端の位置を変化させるだけで合成可能であるが、青色は吸収端の位置だけではその呈色を発現させることはできない。しかしながらLaTiO_2NのO/N比およびTi/La比を変化させ、Laの一部をSrで置換することにより、光学バンドギャップおよびその拡散反射率を制御し、有害な元素を含まない酸窒化物系の赤・黄・青色顔料を合成することに成功した。工学
ダムによる有機物フローの遮断が流域炭素循環と生物多様性に及ぼす影響の解明

これまでと同様に、山梨県北杜市のダム湖と流入出河川で炭素フラックスを毎月測定し,ダムによる流域炭素循環の変化を明らかにした.さらに、炭素安定同位体分析により湖内における温室効果気体(CO_2・CH_4)の生成・循環過程を明らかにした。流出入河川での測定から、ダムは河川を流下する有機・無機炭素の量と質を変化させることを明らかにした。ダムは季節を通じて陸上起源の粗粒有機物(CPOM)流下を遮断(最大2.3×10^5gC/d)していた.細粒有機物(FPOM)は流入と流出に差はないが、流入するFPOMが付着藻類起源であるのに対し、流出するFPOMは植物プランクトン起源と考えられた。また、ダム湖は下流域への無機炭素供給量を増加させていた。そこで,湖に蓄積する有機物の行方を追跡した.その結果、有機物分解により、主に深水層でCO_2とCH_4が生成していた。またδ^<13>C分析から、メタンはCO_2+4H_2経路で生成していることを示した。深水層に蓄積するDICには^<13>Cが多く、有機物分解で生成したCO_2のうち、^<12>CO_2がメタン生成に多く使われた結果と考えられた.ただし、この深水層における炭素ダイナミクスは、大気とのガス交換に大きく影響しなかった。湖面からのCO_2放出の季節変化は、表層の光合成活性に対応していた。一方、CH_4放出量は表層のメタン極大屑の大きさに対応していた。この表層のメタン極大層は深水層のCH_4とは起源が異なることから、動植物プランクトンがメタン生成に関与しているものと予想している。本課題により、ダムは流.下有機物を遮断することで、下流域の河川食物網を変化させること、また湖内において温室効果気体を生成することを明らかにした。また、大気へのガスフラックスには、湖表層の未知の代謝機構が関与している可能性を発見した.今後、これらの成果を雑誌論文に発表していく予定である。平成16年度は,山梨県北杜市のダム湖とその流入出河川で炭素フラックスを定量化し,ダムによる流域炭素循環の変化を明らかにした.712月に各河川とダム湖内で粒状有機炭素(POC)・溶存有機炭素(DOC)・溶存無機炭素(DIC)の流下量,総生産量およびCO_2・CH_4の大気への放出量(kgC/day)を測定した.その結果,利水供給に伴う河川流量の低下により湖から河川へ流出する炭素量が減少していることが明らかとなった.また,11月には湖へのPOC流入量が著しく増加した.炭素安定同位体比(δ^<13>C)はPOCが主に陸上起源であることを示しており,落葉期には450kgC/day以上の陸上由来Cが湖に蓄積していることを示していた.そこで湖内の炭素濃度をみると,POC・DIC・pCO_2・pCH_4ともに水温躍層下部で著しく高かった.また,DIC-δ^<13>Cは深水層の炭酸成分に陸上由来Cが多く含まれていることを示していた.このように,湖に流入した陸上有機物は深水層で炭酸やメタンへ分解されていると考えられた.そこで,CO_2・CH_4のガスフラックスをみると,ほぼ全ての月で湖面から大気へ放出されていた.その季節変化には湖水の上下混合や総生産が関わっており,生産が活発な7月にはCO_2放出量は少なく,深層水が上昇する11-12月の循環期にはCO_2・CH_4放出量が増加していた.調査期間中のガスフラックスの平均値は,CO_2とCH_4でそれぞれ33mmol m^<-2> d^<-1>および10.27mmol m^<-2> d^<-1>であった.このように本年度は,利水供給によりダム湖下流で炭素流量が大きく減少すること,また湖内に沈降する陸上有機物の一部は深水層でCO_2やCH_4に分解され大気に放出されることを示した.次年度は,このようなダムによる炭素フローの変化が水域の食物網構造に及ぼす影響を評価してゆく.昨年度と同様に、山梨県北杜市のダム湖とその流入出河川で炭素フラックスを定量化し,ダムによる流域炭素循環の変化を明らかにした.さらに、炭素・窒素安定同位体分析を用いてダム上下流の河川食物網の違いを明らかにした。412月に各河川とダム湖内で粒状有機炭素・溶存有機炭素・溶存無機炭素の流下量およびCO_2・CH_4の大気への放出量(kgC/day)を毎月測定した.また、湖内では動植物プランクトン、流入出河川では底生無脊椎動物を採集し、安定同位体比を測定した。その結果,ダム下流では陸上有機物の流下量が大きく減少していることが確かめられた.また,11-12月には湖へ粒状有機物が大量に流入し蓄積していたが、その多くは陸上起源であることも示された。このようなダムによる流下有機物の遮断によって、下流の食物網では腐食連鎖が大きく縮小していた。安定同位体分析による食物網解析の結果、ダム下流では陸上有機物を起点とし破砕食生物や採集食生物に至る炭素流量が大きく減少していた。

一方で、ダム湖から放水される植物プランクトンを起点とする炭素が下流の食物網内を流れており、腐食連鎖の縮小による負の影響は植物プランクトンによる補償によって抑えられていた。一方、ダム湖内からは、温室効果ガスの大気への放出が認められ、年間放出量はCO_2で4.3±1.1ton C、CH_4で0.30±0.05 ton Cと推定された.これら気体の起源は湖に堆積した陸上有機物と考えられたが、CH_4は動物プランクトンの腸管内からも放出されていると考えられた。また、ガス放出量の季節変動と動植物プランクトンのダイナミクスとの関係も認められた。次年度は,既に採集しているサンプルを分析することで、河川食物網の季節変化をダム上下流でより詳細に調べるとともに、ダム湖内の温室効果気体の生成・循環過程についても室内実験によって明らかにしていく予定である.これまでと同様に、山梨県北杜市のダム湖と流入出河川で炭素フラックスを毎月測定し,ダムによる流域炭素循環の変化を明らかにした.さらに、炭素安定同位体分析により湖内における温室効果気体(CO_2・CH_4)の生成・循環過程を明らかにした。流出入河川での測定から、ダムは河川を流下する有機・無機炭素の量と質を変化させることを明らかにした。ダムは季節を通じて陸上起源の粗粒有機物(CPOM)流下を遮断(最大2.3×10^5gC/d)していた.細粒有機物(FPOM)は流入と流出に差はないが、流入するFPOMが付着藻類起源であるのに対し、流出するFPOMは植物プランクトン起源と考えられた。また、ダム湖は下流域への無機炭素供給量を増加させていた。そこで,湖に蓄積する有機物の行方を追跡した.その結果、有機物分解により、主に深水層でCO_2とCH_4が生成していた。またδ^<13>C分析から、メタンはCO_2+4H_2経路で生成していることを示した。深水層に蓄積するDICには^<13>Cが多く、有機物分解で生成したCO_2のうち、^<12>CO_2がメタン生成に多く使われた結果と考えられた.ただし、この深水層における炭素ダイナミクスは、大気とのガス交換に大きく影響しなかった。湖面からのCO_2放出の季節変化は、表層の光合成活性に対応していた。一方、CH_4放出量は表層のメタン極大屑の大きさに対応していた。この表層のメタン極大層は深水層のCH_4とは起源が異なることから、動植物プランクトンがメタン生成に関与しているものと予想している。本課題により、ダムは流.下有機物を遮断することで、下流域の河川食物網を変化させること、また湖内において温室効果気体を生成することを明らかにした。また、大気へのガスフラックスには、湖表層の未知の代謝機構が関与している可能性を発見した.今後、これらの成果を雑誌論文に発表していく予定である。
温泉に生息するレジオネラに対するpHの影響および汚染源の解明

1.種々の液性を有する温泉源泉、浴槽および露天風呂の水を採取し、塩素添加による泉質の変化およびレジオネラの検出実験を行った。2.源泉のpHおよび温度を変化させた試料水にL.pneumophilaを添加し、生育への影響および生きてはいるが培養不能な状態(VNC)への移行性について検討した。(1)本菌はpHの低い状態では完全に死滅し、pHの高い状態では生育抑制が起こっていた。pH5ではVNCに移行していることが示唆された。(2)pH6.08.2、温度25°C42°Cの範囲では生菌数およびコロニー形成数が安定していた。(3)45°Cの温泉では生息不能と考えられていたが、VNCへ移行することで生息可能であることが示唆された。温度が50°C以上では速やかに死滅した。(1)残留塩素濃度0.4ppmでは本菌添加後1分以上生息していた。1.0ppmでは本菌を添加後直ちに死滅した。(2)残留塩素濃度5ppm以上ではAcanthamoebaに貧食された本菌は検出されなかった。しかし、この濃度ではAcanthamoebaは約40%生存していた。従ってAcanthamoebaがシスト化して生存している可能性が示唆された。4.温泉でのレジオネラ属菌の感染源および汚染経路の解明について検討した。(1)温泉および温泉周辺土壌から検出されたL.pneumophilaの中で血清群が一致していたものについてRAPD法を用いて菌の同定を行ったが遺伝学的な一致は見られなかった。(2)循環ろ過装置のろ材および浴槽から検出されたL.pneumophilaついて血清群の同一性に関わらずRAPD法を試みた。その結果、異なる血清群であっても同一のバンドパターンが認められた。この結果は汚染経路を明らかにする糸口となると考えられることから、さらにPFGE法を用いてこれまでの土壌を含め詳細に検討を行っている。(1)塩素殺菌を施している浴槽水の化学成分変化の1例として源泉の泉質がCa・Na-HCO_3であったのが浴槽ではCa・Na-SO_4に変化し、pHも9.26から7.68へとアルカリ性泉から中性泉に大きく変化しているものがみられた。このことは塩素殺菌および化学物質の浴槽水への添加は温泉のもつ本来の性質を著しく変えるものであることが明かとなった。(2)L.pneumophilaは26源泉から2箇所、18浴槽から8箇所、9露天風呂から5箇所検出された。血清型では4,5型が多く、これまでクーリングクワーで検出されてきた1型が少ない事は、汚染源と考えられる周辺土壌からの本菌との関係も含め興味深い結果であった。温泉水とクーリングタワーは温度、電導度に大きな違いがあり、このことが生息している本菌の血清型の違いに関係しているものと考えられた。また今回常法に従って詳細に実験した源泉周辺土壌からは本菌は検出されなかった。2.源泉のpH,温度および電導度を変化させた試料水にL.pneumophilaを添加し、生育への影響および生きているが培養不能な状態(Viable but Nonculturable:VNC)への移行性について検討した。

(1)本菌はpHの低い状態ではほぼ完全にまた迅速に死滅し、pHの高い状態では生育抑制が起きている事が明らかとなった。またpH5ではVNCに移行していることが示唆された。(2)pH6.08.2、温度25°C42°Cの範囲では生菌数およびコロニー形成数が安定していたことから本菌の育成に適しているものと考えられた。(3)これまで45°Cの温泉では本菌は生息不能と考えられていたが、VNCへ移行することで生息可能であることが示唆された。また温度が50°C以上では速やかに死滅する事が分かった。(4)本菌の生育にはある程度の電導度(電解質)が必要であることが示唆された。2.温泉でのレジオネラ属菌の感染源および汚染経路を明らかにするために、土壌や河川に生息するとされているレジオネラ属菌と温泉から検出されるレジオネラ属菌が同じ株由来か否かを検討することは重要であると考えられる。そこで今回、特に土壌を中心として、温泉での感染が報告されているL. pneumophilaに着目し、温泉およびその周辺土壌を採取して、Polymerase chain reaction(PCR)法やスライド凝集法にて菌種の同定を行った。さらに血清群が一致したL. pneumophilaについては、同一株由来か否か遺伝学的方法を用いて検討を行った。(1)温泉水中では11試料中10試料からL. pneumophilaが検出された。一方、温泉周辺土壌からは11資料中8試料からレジオネラ属菌が検出され、その内2試料がL. pneumophilaであった。さらにこの2試料は温泉氷中から検出したL. pneumophilaと血清群が一致した。(2)温泉およびその周辺土壌から検出され血清群が一致したL. pneumophilaについて、同一株由来か否かRandom amplified polymprphic DNA(RAPD)法を用いて遺伝学的見地から同定を行った。その結果、遺伝学的な一致は見られなかった。従ってこれらL. pneumophilaの起原が異なることから、本研究では汚染経路を特定するまでには至らなかった。(3)以上の結果から、温泉へのレジオネラ属菌の汚染経路を解明するためには、土壌からだけでなく、湯客の体に付着して浴槽内に侵入することなども考慮して検討する必要があることが示唆された。1.平成14年度に実施した温泉でのレジオネラ属菌の感染源および汚染経路の解明実験では、温泉およびその周辺土壌から検出された同一血清群のL.pneumophilaについて同一株由来か否かRandom amplified polymprphic DNA(RAPD)法を用いて遺伝学的見地から同定を行った。しかし、同一血清群を有していたにも関わらず遺伝学的な一致は認められなかった。そこで本年度は循環ろ過装置のろ材および浴槽から検出された本菌について血清群の同一性に関わらずRAPD法を試みた。その結果、異なる血清群であっても同一のバンドパターンが認められた。この結果は汚染経路を明らかにする糸口となると考えられることから、さらにpulesed-field gel electrophoresis(PFGE)法を用いてこれまでの土壌を含め詳細に検討を行っている。(1)本菌に対する塩素殺菌効果の検討では、残留塩素濃度0.4ppmでは本菌添加後1分以上生息していた。1.0ppmでは本菌を添加後直ちに死滅した。残留塩素濃度0.4ppmでのpHの変化による殺菌効果の検討では、pHが高くなるにつれて殺菌効果が減衰することが確認された。
細胞表層複合糖質の合成とその機能

グラム陽性菌のペプチドグリカン,グラム陰性菌細胞膜表層にあるリピドA,及び動物細胞表層に局在するガングリオシドは複合糖質であり,いずれの物質も細胞自体の生存にとって不可欠であると同時に,他生体に様々な影響をあたえる.本研究においては,これらの複雑な構造を有する化合物を有機合成化学的手法により単一な化合物として合成すること,ついでその生物学的作用や役割について検討することを目的とした.ペプチドグリカンに関しては,その活性本体と考えられているN-アセチルムラミルーL-アラニルーD-イソグルタミンの糖構造と活性,分子の立体配置と活性,分子の物理化学的性質と活性等あらゆる角度から検討を加えるために300種余の化合物を合成し,生物活性発現に対する立体要求性を解明することができ,この分子種の有する活性と毒性を分離することにも成功した.またグラム陰性菌内毒素成分リピドAに関しても100種余の類縁体を合成し,活性発現のための稀少構造を明らかにするとともに,毒性を有さず,免疫増強活性,感染防御活性及び制がん活性を有する化合物に達することができた.動物細胞の表層には糖蛋白質,糖脂質が存在し細胞の顔として,細胞間識別,抗源質の発現,毒素,ホルモンの受容体としての働きをしている.その中でガングリオシドと呼ばれているスフィンゴ糖脂質は脂質部分として,スフィンコシンの酸ラミド誘導体,糖鎖及びN-アセチルヤルーグリコリルーノイラミン酸が結合した複雑な化合物であり,分子多様性であり,その合成法が強く望まれている.このためにまず糖鎖の合成,スフィンゴシンの合成法,シラル酸及びその類縁体の合成に成功した.ついでこれらの各ユニットの特定の位置で,特定の立体化学での縮合方法について検討を加えた.その結果,最も困難とされていたシラル酸のα-グリコシドの合成に成功しガングリシドの系統的合成を可能とした.グラム陽性菌のペプチドグリカン,グラム陰性菌細胞膜表層にあるリピドA,及び動物細胞表層に局在するガングリオシドは複合糖質であり,いずれの物質も細胞自体の生存にとって不可欠であると同時に,他生体に様々な影響をあたえる.本研究においては,これらの複雑な構造を有する化合物を有機合成化学的手法により単一な化合物として合成すること,ついでその生物学的作用や役割について検討することを目的とした.ペプチドグリカンに関しては,その活性本体と考えられているN-アセチルムラミルーL-アラニルーD-イソグルタミンの糖構造と活性,分子の立体配置と活性,分子の物理化学的性質と活性等あらゆる角度から検討を加えるために300種余の化合物を合成し,生物活性発現に対する立体要求性を解明することができ,この分子種の有する活性と毒性を分離することにも成功した.またグラム陰性菌内毒素成分リピドAに関しても100種余の類縁体を合成し,活性発現のための稀少構造を明らかにするとともに,毒性を有さず,免疫増強活性,感染防御活性及び制がん活性を有する化合物に達することができた.動物細胞の表層には糖蛋白質,糖脂質が存在し細胞の顔として,細胞間識別,抗源質の発現,毒素,ホルモンの受容体としての働きをしている.その中でガングリオシドと呼ばれているスフィンゴ糖脂質は脂質部分として,スフィンコシンの酸ラミド誘導体,糖鎖及びN-アセチルヤルーグリコリルーノイラミン酸が結合した複雑な化合物であり,分子多様性であり,その合成法が強く望まれている.このためにまず糖鎖の合成,スフィンゴシンの合成法,シラル酸及びその類縁体の合成に成功した.ついでこれらの各ユニットの特定の位置で,特定の立体化学での縮合方法について検討を加えた.その結果,最も困難とされていたシラル酸のα-グリコシドの合成に成功しガングリシドの系統的合成を可能とした.動物細胞膜上に局在し、細胞の情報伝達や各種の生理活性を有しているスフィンゴ糖脂質のガングリオシドの機能を明確にする目的で有機合成を試みた。まずガングリオシドは脂質部分を形成する分子多様性なスフィゴシンのアシドからなるセラミド、N-アセチルノイラミン酸及び糖鎖から構築されており、これらの各フラクションの合成及びその類縁体の合成が必要である。第1にD-キシロース及びD-ガラクトースを出発点としてスフィゴシンの合成に成功した。これに各種の脂肪酸を結合させることによりセラミドの合成を完了することができた。ついでN-アセチルノイラミン酸の意義(生物学的)を解明する目的でN-アセチルノイラミン酸のα-チオグリコシドの合成法を開発するとともに、8-エビ体、選択的にアセチル化された化合物の合成、及びガングリオシド糖鎖のC-6位及びC-3位水酸基へのα-チオ配糖体の合成に成功した。ついでガングリオシド類を系統的に合成するために、多数存在する水酸基の選択的保護が必要である。そこでガングリオシドGM-4の糖は4,6-位をイソプロピリデン基1,2位をアセチル基,C-3位を反応に使用する為にトリフルオロメタンスルホンル基で置換したα-グロース透導体を合成し、2-チオ-α-シアル酸と縮合したのち、C-1位を選択的にヒドラジンアセテートにて加水解したのち、イミデート法にて先に合成したセラミドと縮合し、目的化合物を得ることができた。

一方【GM_3】の合成についても、ラクトースを出発物質としてC-位に【BF_3】で容易に加水分解できるトリメチルシリルエチルグリコシドを合成し、ガラクトース部のC-3位のみをスズ化法にてベンジルエーテルとし、4,6-イソプロピリデン化したのち、のこる水酸基をトリメチルシリルエトキシメチル基にて保護した。この化合物は将来複雑なガングリオシド類の合成に使用でるものである。
口腔悪性腫瘍における細胞周期制御、癌抑制遺伝子(p16/CDKN2)異常の検討

(目的)p16に代表されるINK4蛋白は、サイクリンD/CdK4,6複合体を阻害することにより、真核細胞のG1/S期を制御すると考えられている。またp16遺伝子が多くの悪性腫瘍において異常を起こしているという報告から、この遺伝子は新たな癌抑制遺伝子として注目されるようになった。さらに、近年、p16と相同性をもつINK4ファミリーのp15,p18についても検索がなされている。本研究においては、これらの細胞周期制御遺伝子の異常の口腔扁平上皮癌発生との関連について検索を行った。(対象.方法)当科にて手術、あるいは生検によって得られた48名の口腔扁平上皮癌患者の原発巣および、7例の口腔扁平上皮癌由来細胞株より得られたDNAを対象とした。p15,p16,p18遺伝子のそれぞれExon1,2についてPrimerを設定し、PCR-SSCP法にて変異の有無をスクリーニングし、SSCP-Positive症例に対しては、塩基配列決定法により点突然変異等の微少変異を検索した。(結果)PCR-SSCP法にて、p15,p16遺伝子についてそれぞれ6例、p18遺伝子について4例に異常バンドを認めた。これらのうちp18遺伝子については塩基配列決定法の結果、2例がフレームシフト変異であった。(考察)INK4ファミリーの悪性腫瘍における検索は、現在までに多くなされているが、p15,p18遺伝子の変異同定の報告は非常に少ない。しかし今回行った口腔扁平上皮癌について、p15,p16,p18のそれぞれに変異が認められた。以上により口腔扁平上皮癌発生には各遺伝子の異常が関与していることが示唆された。
家族性アミロイドポリニューロパチーの予防及び治療のための抗体医薬品の開発

家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)は、トランスサイレチン(TTR)遺伝子の変異によって、全身の諸臓器に不溶性のアミロイド線維が沈着し、諸臓器の機能不全から死に至る重篤な遺伝性の疾患である。現在FAP対しては肝移植や、TTRの4量体安定化剤による治療が試みられているが様々な問題点がある。従って、肝移植によらない、FAPの新規治療法の開発が望まれている。そこで、アミロイド線維形成メカニズムに基づき、アミロイドを形成するTTRにのみ反応する抗体を創出し、アミロイド線維の重合を防ぎ、毒性の発現や沈着の進展を効果的に抑制する抗体療法の基盤を構築することを目標とする。この様な特性を有する抗体は、アミロイド化した異型TTRとのみ反応するため、副作用が少なく安全性に優れ、これまで肝移植しか治療の道が無かったFAP患者に対して、新たな治療法を提供することが期待される。平成26年度の研究進歩について:1.トランスジェニック(Tg)ラット(ATTR V30M)を用いたiPS細胞由来のマクロファージを加えた抗体のTTR沈着減弱効果の検討我々の開発したTgラットは、TTR沈着が生後12-16ヶ月目から認められるが、これに正常者の皮膚線維芽細胞から作成したiPS細胞由来のマクロファージおよびcryptic epitopeであるTTR115-124monoclonal抗体を加えるとTTR沈着が軽減する傾向が認められた。2.マウスにATTR V30Mアミロイドを移植するモデルを用いた抗体効果の検討現在のTgラットはTTRの沈着は認められるが、アミロイド沈着は認められないため、TTR沈着に対する効果は検証できるが、アミロイド沈着の軽減効果は検証できない。そこで野生型、トランスジェニック(Tg)マウス(ATTR V30M)、もしくはSCIDマウス背中の皮下にFAP患者組織から抽出するアミロイド線維を移植する動物モデルの作製を検討している。本研究課題は平成26年度で廃止となったため、記入しない。現在FAP対しては肝移植しか有効な治療法がなく、深刻なドナー不足に加え、病状が進行した患者には肝移植も無効であるなど多くの問題点がある。平成25年度の研究進歩について:1.トランスジェニック(Tg)ラット(ATTR V30M)を用いて抗体効果の検討[FAP発症を予防する研究]我々の開発したTgラットは、TTR沈着が生後12-16ヶ月目から認められることから、候補抗体の予防効果を検討するため、本抗体を生後3ヶ月目のラットに投与し、その6ヶ月後、TTR抗体を用いた免疫染色を行い、モノクローナル抗体投与を行わなかったTgラットのTTR沈着の程度と比較検討し、本法が有用かを検討した。今年度の結果により、本抗体を投与後、コントロール群に比べ、抗体を投与したTgラットのTTR沈着が減少した傾向を確認できた。2.マウスにATTR V30Mアミロイドを移植するモデルを用いて抗体効果の検討[沈着したアミロイド沈着に対するアミロイド沈着減少効果に関する研究]野生型、トランスジェニック(Tg)マウス(ATTR V30M)、もしくはSCIDマウス背中の皮下にFAP患者組織から抽出するアミロイド線維を移植する動物モデルの作製を検討している。

2.マウスにATTR V30Mアミロイドを移植するモデルを用いた抗体効果の検討現在のTgラットはTTRの沈着は認められるが、アミロイド沈着は認められないため、TTR沈着に対する効果は検証できるが、アミロイド沈着の軽減効果は検証できない。そこで野生型、トランスジェニック(Tg)マウス(ATTR V30M)、もしくはSCIDマウス背中の皮下にFAP患者組織から抽出するアミロイド線維を移植する動物モデルの作製を検討している。本研究課題は平成26年度で廃止となったため、記入しない。FAP発症を予防することを検討するために、3が月齢のTgラットを用いて、投与を行った。解析の結果により、有効の傾向を確認できた。また、マウスにATTR V30Mアミロイドを移植するモデルも作製している。今後、FAPに対する抗体治療は今、市販している薬品より、効果の優位を証明するために、Tgラットを用いて、市販の薬品を投与し、モノクローナル抗体投与の効果と比較する。そして、iPS細胞由来のマクロファージを用いて抗体免疫効果及び機序の検討、分子間相互作用定量QCM装置を用いてアミロイド重合を阻害する効果の検討、分子間相互作用定量QCM装置を用いてアミロイド重合を阻害する効果の検討、また、アミロイドは神経、様々な臓器及び血管周囲などに沈着するため、神経、血管平滑筋細胞などの細胞株を用いた、抗体治療の効果の検討を行う。
新発見の粘度センサーの作用機構

Ig-Hepta/GPR116は,膜7回貫通型受容体のサブファミリーであるAdhesionファミリーに分類されるオーファン受容体である。この受容体の機能を明らかにするためにノックアウトマウスを作製したところ,驚いたことに,Ig-Hopta/GPR116が無くなると肺胞内に過剰のサーファクタントが蓄積することが明らかになった。昨年度,このKOマウスの表現型,特に肺の組織化学的所見とサーファクタント脂質の経時的変化を明らかにしたのに引き続き,本年度は(i)サーファクタントタンパク質の変化と(ii)定量PCRによる種々のmRNA量の変化を解析した。その結果,サーファクタントを分泌している肺胞II型細胞に多く発現しているIg-Hepta/GPR116は,主として翻訳レベルでの調節を介してサーファクタントタンパク質の量を調節しているらしいことが明らかになった。野生型とKOマウスの肺胞洗浄液中のサーファクタントタンパク質Surfactant protein A, B, C, D (SP-A, SP-B, SP-C, SP-D)の量を比較すると,いずれも数倍数十倍KOマウスの方が多かったが,mRNAレベルでは大きな差は見られなかった。これは予想外の結果で,サーファクタント(脂質とSPの複合体)の生合成系には脂質成分とタンパク質成分のバランスをとるための調節系が翻訳レベルで組み込まれていることを示唆し興味深い。野生型とKOマウスの肺からRNAを単離し,アレイ解析を行った。上記定量PCRの結果と一致するデータとともに,予想外の結果も得られた。すなわち,Serum amyloid A3, Matrix metallopeptidase 12, ChemokineなどのmRNAがKOマウスで著増していることが明らかになった。膜7回貫通型のオーファン受容体の中でもN末端が長いという特徴を看するIg-Heptaにの機能に関する研究を行い以下の成果を得た。(1)サーファクタントの生合成とそのIg-Heptaによる調節:肺胞の上皮は約95%が扁平なI型細胞からなり,ガス交換の場となっている。残り5%を占めるのがII型細胞で,サーファクタント(表面活性物質)を合成・分泌し,I型細胞の表面を薄く覆うことによって表面張力を低下させている。私たちは既に,KOマウス(Ig-Hepta^<-/->)ではII型細胞のIg-Heptaが消失しており,これに伴いサーファクタント量が著しく増加していることを見出している。これはセンサーが無くなったために,肺胞表面を覆うサーファクタント量がモニターできず,サーファクタントを分泌し続けるためと考えられる。このことを証明するために,正常とKOマウスの腹腔内にサーファクタントの原料となる[^3H]コリンを投与し,^3H標識されたサーファクタントの量を調べたところ,KOマウスではサーファクタント脂質の生合成が亢進している事が分かった。(2)マクロファージによるサーファクタントの分解との関係:肺胞表面のサーファクタント量は,II型細胞による分泌の他に,肺胞常在性のマクロファージによる分解によっても調節されている。正常とKOマウスの肺胞洗浄液からマクロファージを単離しサーファクタントの分解能を比較したところ,差異が認められなかった。このことは,KOマウスで見られるサーファクタント量の増加は,マクロファージの活性低下によるものではないことを示しており,マクロファージにはIg-Heptaが発現していない事実とも一致する。(3)KOマウスでは肺の大きさと重量が1.3倍になっていることが明らかになった。
虚血に伴う心筋イオン・チャネル活性変化の分子機構ー哺乳類単離心筋細胞での研究ー

虚血とくに心筋梗塞に伴う不整脈は、その致命率が高いにも関わらず、発生機序が現在、十分に解明されているとはいえない。一般に、局所的な心筋不応期dispersion(ばらつき)が障害心筋と健常心筋との間に生じミクロ・リエントリ-回路が形成されることが一因とされる。心筋不応期はその活動電位の持続時間(APD)に対応するので、虚血時に想定されるカテコラミンの上昇が単離心筋細胞レベルでの再分極過程にどの相な影響を与えるのか、より生理的と考えられる細胞内Ca暖衝力のもとでパッチ・クランプ法ならびにfuraー2による細胞内Ca測定により検討した。使用したカテコラミン濃度は10nM以下で、より生理的という点に留意した。モルモット単一心室筋細胞を用いたパッチ・クランプの実験において、細胞内ca環境が生理的に近い条件(pCa7,lowEGTA)のもとでは、低濃度のイソプロテレノ-ル(Iso)はβアドレナリン・レセプタ-刺激によりAPDを短縮した。一方EGTAを加えCa濃度を下げたり、緩衝力を増加するとIsoはAPDを延長した。これらは心筋不応期の短縮および延長に対応する。より生理的細胞内Ca環境におけるAPD短縮は、Isoにより誘発される内向きのCa電流より外向きのK電流の増加の防が大きいために、結果的に外向き電流が増大するためと考えられた。このIsoにより誘発される外向き電流は比較的、早い活性化過程を有し、細胞内Ca濃度およびCa緩衝力により影響を受けることがfuraー2を用いた細胞内Caの測定実験で明かとなった。従来の遅い活性化過程を有する「遅延整流K電流」がIsoによるβレセプタ-刺激を介するcAMP依存性キナ-ゼによる燐酸化で活性化状態が促進されるのか、あるいは全く異なるチャネルが存在するのか今後さらに検討を進める予定である。
中世フランス語の時間表現に関する総合的研究

「朝」,「午前」,「午後」,「夕方」,「昼」,「夜」といった日本語の表現を,中世フランス語ではどのように表現しているかを調査し,その語彙および表現を通して,中世フランス人の「時間」に対する認識の仕方を探ろうとした。これらの作品に見られる,時間に関する語彙および表現をできるだけ綱羅的にリスト・アップし,それらをカード化した。そしてこれらのカードを(1)時点を表わすもの,(2)期間(ある一定の長さの時間)を表わすもの,(3)その他に分類し,さらにそれらを(a)一年,一月,一週,に関するもの(b)一日に関するもの,(c)その他,に下位分類した。こうして収集・分類された用例をもとに,中世フランス人の時間のとらえ方と,その表現に関する分折・研究の基礎資料とした。その中で,一日のリズムに関する語彙および表現を詳細に検討した結果,明け方から夜中まで,実に多様な表現が見られ,中世フランス人の一日の時間の変化,とくに太陽の運行および明かるさの変化に対するとらえ方の繊細さの一端がうかがえた。「朝」、「午前」、「午後」、「夕方」、「昼」、「夜」といった日本語の表現を、中世フランス語ではどのように表現しているかを調査し、この語彙および表現を通して、中世フランス人の「時間」に対する認識の仕方を探ろうとした。まず評料として、ひじょうに時間表現が豊富に見られるG.Perrie Williams(ed),Renaut de Beanjeu,Le Bil Inconnu(Champion:Classiques fransais du mopen age)1967をとり上げ、この作品に用いられている時間に関する表現を、一日のリズムに関するもののみでなく、一週間、一月、一年、季節に関するもの、また時点を表わすもの、期間を表わすものをすべて抜き出してカ-ド化した。これらのカ-ドのうち、本年度はまず一日のリズムに関する表現のみを取り上げることとし、それらのうち「朝」および「夜明け」に関する表現と、「夕方」および「夜」の表現から調査することとした。「夜明け」について言えば、le matin「朝」、an matin「朝に」などの単純形と、quant l'aube del jor crevee「暁が現われると」、(an matinetl'aube crever「明け方暁が現れると」などの複合表現とが区別される。そして複合表現の種類や表現方法の豊富さや複雑さを通して、中世フランス人の「暗い時(夜)」と「明かるい時(昼)」と、その移行時である「朝(明け方)」と「夕(暮れ方)」との区別に対する観察の詳細さと認識の精密さとか明きらかにされた。平成3年度のつづきとして、調査対象の文学作品の範囲を広げ、それらのなかに見られる、時間に関する語彙;および表現を、できるだけ網羅的にリスト・アップし、それらをカード化した。とくに下記の作品は集中的に調査した。上記により集められたカードを、以下の3つのグループに分類した。(1)時点を表わすもの(2)期間(ある一定の長さの時間)を表わすもの(3)その他さらにそれらを、以下の3つのグループに下位分類した。(a)一年、一月、一週、に関するもの(b)一日な関するもの(c)その他こうして収集・分類された用例をもとに、中世フランス人の時間のとらえ方と、その表現に関する分析・研究の基礎資料とした。その一部は「中世フランス語の時間表現に関する総合的研究」研究報告書の4.参考資料の項に掲載した。また、さらに詳細に整理した結果を、『広島大学文学部紀要』53巻(1993年発行予定)にも発表する予定でいる。
ヒト体液を用いた精子無力症原因因子の簡易検査法の開発

男性不妊症のおよそ80%を占める精子無力症発症の原因遺伝子変異を特定する手法の開発を目指し、精子無力症患者精子に対して数種類のマーカー精子タンパク質の変動を基準とするスクリーニング方法を確立した。開発した手法によって実際におよそ200例の精子無力症患者の中から、ヒトGALNTL5遺伝子上に母親由来と推測されるヘテロの1塩基欠損によって精子無力症を発症した患者を一例同定することに成功した。更に次世代シークエンサーの導入で、感度の高い遺伝子変異検出が可能になり、精子幹細胞に生じた極僅かな割合のヒトGALNTL5遺伝子変異が原因とされる、極めて稀な精子無力症発症例の検出にも成功することができた。精巣精子細胞特異的に発現するGalntl5遺伝子ヘテロ欠損マウスで観察された精子運動能低下による雄性不妊の表現型は、ヒト男性不妊症の一つである精子無力症の症状に酷似している。そこで、ヒトゲノムにも存在するGALNTL5遺伝子上の変異によって精子無力症を発症した患者を効率良く同定する手法の開発を試みてきた。Galntl5遺伝子欠損マウス精子では複数の精子タンパク質分子の量が野生型マウス精子に比べて減少する特徴から、これら精子タンパク質をマーカーに、精子無力症患者の精子を対象としてタンパク質量の変動を指標としたスクリーニング方法を我々は開発した。実際に200例の精子無力症患者の中からGALNTL5遺伝子上に母親由来と推測されるヘテロの1塩基欠失を持つ精子無力症患者を同定することに成功している。本年度はGALNTL5遺伝子変異に起因する精子無力症患者をより効率良く同定するために、指標とするマーカー精子タンパク質の分子数を増やすことを目標に研究に取り組んできた。その中で、これまでの論文報告を基にヒトの精子のみに存在するアミノペプチダーゼ分子がマーカー分子に成り得るか検証を試み、購入した抗体でアミノペプチダーゼタンパク質分子を検出する系を確立した。GALNTL5遺伝子変異を起因とする精子無力症患者同定に対して有用なマーカーに成り得る可能性も示されたが、より詳細な検証が必要であると考えられる。更にGalntl5遺伝子欠損マウスの精巣を用いて新たなマーカー精子タンパク質の検索、同定に取り組んでいる途中である。一方、ヒトGALNTL5遺伝子上の変異を高感度に検出する系として次世代シークエンス法による遺伝子変異検出法の確立を現在目指しているところである。精巣精子細胞特異的に発現するGalntl5遺伝子のヘテロ欠損マウスは、精子運動能低下による雄性不妊の表現型が観察され、ヒト男性不妊症の一つである精子無力症の症状に酷似していることを我々は報告してきた。そこで、ヒトゲノムにも存在するGALNTL5遺伝子上の変異によって精子無力症を発症した患者を効率良く同定する手法の開発を試み、Galntl5遺伝子欠損マウス精子では複数の精子タンパク質量が野生型マウス精子に比べて減少する特徴から、これら精子タンパク質をマーカーとして、精子無力症患者精子を対象にタンパク質量の変動を指標としたスクリーニング方法の開発に成功した。実際に本スクリーニング手法で、200例の精子無力症患者の中からGALNTL5遺伝子上に母親由来と推測されるヘテロの1塩基欠失を持つ精子無力症患者を同定することに成功している。昨年度に引き続き、本年度もGALNTL5遺伝子変異に起因する精子無力症患者をより効率良く同定するために、指標とするマーカー精子タンパク質の分子数を増やすことを目標に研究に取り組んできた。その中で、これまでの論文報告を基にヒト精子のみに存在するアミノペプチダーゼ分子、さらにPP2B-B2タンパク質分子の抗体が精子無力症原因因子スクリーニング用マーカーとして使用できることを明らかにした。しかし、GALNTL5遺伝子変異を起因とする精子無力症患者のスクリーニングに使用できるかは不明のままである。一方、ヒトGALNTL5遺伝子上の変異を高感度に検出する手法として次世代シークエンス法による遺伝子変異検出法を確立できた。そこで、これまでに取集された370例の精子無力症患者精子のうち、従来のスクリーニング方法によってGALNTL5遺伝子変異が推測された45例の精子無力症患者精子について次世代シークエンス法を行い、遺伝子データの集積を試みた。現在詳細なデータ解析を行っている。次世代シークエンサーの導入によって、精子無力症患者精子に存在する非常に微量な割合で存在する遺伝子変異を同定できる可能性が示されたことから、新たな精子無力症原因因子の同定に次世代シークエンサーが有効であることが示されたため。精巣精子細胞特異的に発現するGalntl5遺伝子のヘテロ欠損マウスでは、精子運動能低下による雄性不妊の表現型が観察され、この表現型がヒト男性不妊症の一つである精子無力症の症状に酷似していることを我々は報告してきた。そこで、精子無力症の発症原因を効率良く同定するために、ヒトゲノムにも存在するGALNTL5遺伝子の変異によって発症した精子無力症の検出方法の確立をモデルとして、Galntl5遺伝子欠損マウス精子で観察された複数の精子タンパク質量の変動を基に、精子無力症患者精子を対象にマーカータンパク質量の変動を検出するスクリーニング方法の開発を試みた。開発した手法を用い、実際に200例の精子無力症患者の中からヒトGALNTL5遺伝子上に変異が推測された45例の精子無力症患者の選別し、その中から実際に母親由来と推測されるヘテロの1塩基欠失によって精子無力症を発症した症例を同定することに成功した。

更に次世代シークエンスサーによる感度の高い遺伝子変異検出法の導入によって、極僅かな精子幹細胞の遺伝子変異が原因と推測される極めて稀な精子無力症発症例の同定にも成功することができた。一方、精子無力症の発症原因因子の同定を容易にするマーカー精子タンパク質の数を増やすことを目標に、最終的に本年度終了までに10個の分子マーカータンパク質抗体を有効に使用できる条件を確立した。GALNTL5遺伝子変異を起因とする精子無力症患者のスクリーニングのみならず、他の精子無力症の発症原因因子同定に10個の分子マーカータンパク質抗体が有効に機能するか、今後200例の精子無力症患者精子を対象にマーカータンパク質の変動を観察すると共に、次世代シークエンスサーを用いた遺伝子変異の検出によって開発手法の有効性を検証したい。男性不妊症のおよそ80%を占める精子無力症発症の原因遺伝子変異を特定する手法の開発を目指し、精子無力症患者精子に対して数種類のマーカー精子タンパク質の変動を基準とするスクリーニング方法を確立した。開発した手法によって実際におよそ200例の精子無力症患者の中から、ヒトGALNTL5遺伝子上に母親由来と推測されるヘテロの1塩基欠損によって精子無力症を発症した患者を一例同定することに成功した。更に次世代シークエンサーの導入で、感度の高い遺伝子変異検出が可能になり、精子幹細胞に生じた極僅かな割合のヒトGALNTL5遺伝子変異が原因とされる、極めて稀な精子無力症発症例の検出にも成功することができた。精子無力症原因因子同定を患者精子を対象に行う際に抗体を用いることを検討してきたが、実際に論文で報告されていた精子タンパク質の抗体が有用なマーカーに成り得る可能性を確認することができている点から。また次世代シークエンサーを用いたヒトGALNTLT5遺伝子上の変異を検出する系の確立に展望があることから。本年度は薬剤誘導によってGALNTL5タンパク質を発現するマウス精子細胞様培養細胞株を樹立することで、GALNTL5タンパク質と相互作用するタンパク質の同定を通じて新たなマーカータンパク質の検出を試みたい。更にそれによって精子形成過程におけるGALNTL5の機能を明らかにしたいと考えている。分子発生学本年度は精巣内精子を用いて精子形成におけるGalntl5遺伝子の分子メカニズム解明を通じて、精子運動能が低下するGalntl5遺伝子欠損マウスに再度着目し、精子運動能の低下を及ぼした精子形成異常をもたらしたタンパク質分子の同定を試みていきたいと考えている。本年度中に納品が困難であった抗体試薬等の次年度購入のために繰り越さざるを得なかったため。本年度中に納品がされなかった試薬分の費用が次年度へと繰り越されている点と、特定の試薬(抗体)については販売がされていない事例が存在したため。抗体試薬等の購入費用として使用を予定している。必要な抗体については外部委託にて作成を行う予定である。