hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ボランティア活動でのリーダーシップ経験を通した学習者能力と自信の育成に関する研究

研究者達は、2010年の春学期を用いて前年度の予備研究データ分析及び本研究に関連する最近の研究についての調査を行うと共に、2011年秋学期の教師トレーニングワークショップとボランティア活動のための準備を行った。9月には椙山女学園大学及び南山大学の学生14名を対象に、3回の教師トレーニングワークショップを実施した。各分野の専門家により小児の発達についての概論、初級言語レッスンの準備と授業管理についての講義が行われた。さらに学生達はデモンストレーションレッスンにも参加した。ワークショップの模様はビデオ録画され、参加者はワークショップの体験についてアンケートの記入、提出を行った。ワークショップに続き、トワイライトスクールでの毎週の授業準備として、研究者達は週2回の生徒とのミーティングにおいて短い授業デモンストレーションを提供した。デモ授業は学生の参考のためにビデオ録画された。ミーティングでは学生も授業演習を行い、デジタル録画される生徒同士のフィードバックセッションに参加した。参加者には研究者が作成した授業計画が与えられた。多くの学生は前年度にも同じプロジェクトに参加していたため学生間の習熟度に開きがあり、一部の学生は提供された計画に従って準備を行う必要があったが、他の学生は与えられた授業計画に自分なりの変更を加えて準備を行った。トワイライトスクールの実際の授業は10月から12月にかけて行われた。11人の参加者(元の14人のうち3人はスケジュールの都合で不参加)は名古屋市の4つの小学校(星ヶ丘小学校、西山小学校、伊勝小学校、千石小学校)の各校でそれぞれ8回、200人以上の小学生に授業を行った。各参加者は授業の後、考察文を作成し研究者達に提出した。11月後半、研究者達はJALT全国会議にて2010年のプロジェクトについて発表を行った。現在、研究者達は集計されたデータの分析を行っており、本研究についての最終報告は2011年に公開する予定である。●今年度前期、ハイアムは椙山女学園大学セルフアクセスセンターに於いて、学内生徒を対象に30分間の英会話ミーティングを主催運営するボランティア学生を募り、3年生及び4年生から18名の参加者を得た。この学生達に対し、ボランティア活動の開始前及び学期末に短文自由回答式アンケートを実施した。18名中14名が後期も引き続きこの活動を続けると回答し、更に新たな4名が参加する予定となっている。次学期開始時にこの4名にも前学期参加者と同様のアンケート調査を行い、研究再開後には新参加者を含む全員に最終アンケート調査を実施する。5月末から6月初めにかけ、ハイアムは米国バーモント州ブラッテルボローのSchool for International Training/World Learningに於いて二つの教員研修法に関するワークショップを受講した。ワークショップでは、教員研修に於けるアクションインクワイアリー及びICTツールの応用について履修した。また、米国ミズーリ州セントルイスのウェブスター大学にて、大学の組織による学生参加ボランティアプログラムの視察を行った。●春期、クロッカーは南山大学ワールドプラザ(セルフアクセスセンター)を頻繁に利用し、他のボランティア活動にも積極的に参加している学生数名にインタビューを行い、彼らのモチベーションを形成する主要な要素について調査を行った。●7月、クロッカーは南山小学校に於けるアフタースクールの運営責任者である浜名優美教授にインタビューを行った。当校では、英語を含む子供のための様々な知育アクティビティを取り入れている。本研究は正式には中断という形を取ることとなったが、引き続き2学期中に当校の授業視察を予定している。研究計画:2009年度の研究目標は以下の3点であった。1)名古屋市小学校の放課後に行うトライライト・スクール・プログラム「英語遊びボランティア」を行う大学生の訓練。2)当該ボランティア大学生のトワイライト・スクール・プログラムへの参加。3)学生のリーダーシップ、自信及びボランティアに対する熱意の発達程度についての評価を目的とした、学生の体験についての質的データー収集。研究活動:2009年度の研究活動は計画通り行われた。2009年9月、杉山女学園大学と南山大学の15人のボランティア学生を対象に、児童心理学、幼年期言語習得及び小学校クラス管理について3日間にわたるワークショップを行った。2009年9月から2010年1月まで週に12回程度、継続して学生の訓練を行った。トワイライト・スクールでの実際の授業は2010年2月から3月まで行われ、毎週4校の名古屋市の小学校で13人のボランティア学生が授業を実施した。データー収集:ボランティア大学生からの日録、インタビュー及びフォーカスグループを通して質的データーを収集し、初回データー分析を行った。また、国内会議1回と国際会議2回でプレゼンテーションを行った。重要性:本研究は、日本の若者が異なる世代間のボランティア活動を通じて如何にリーダーシップスキルと自信を養っていくかのプロセスを探求する。その体験の理解を深化させることにより、本研究は他の大学においても同様のボランティアプログラムを進める手助けとなり、延いては日本のさらなる強固な市民社会の発達を促進する。

ワークショップの模様はビデオ録画され、参加者はワークショップの体験についてアンケートの記入、提出を行った。ワークショップに続き、トワイライトスクールでの毎週の授業準備として、研究者達は週2回の生徒とのミーティングにおいて短い授業デモンストレーションを提供した。デモ授業は学生の参考のためにビデオ録画された。ミーティングでは学生も授業演習を行い、デジタル録画される生徒同士のフィードバックセッションに参加した。参加者には研究者が作成した授業計画が与えられた。多くの学生は前年度にも同じプロジェクトに参加していたため学生間の習熟度に開きがあり、一部の学生は提供された計画に従って準備を行う必要があったが、他の学生は与えられた授業計画に自分なりの変更を加えて準備を行った。トワイライトスクールの実際の授業は10月から12月にかけて行われた。11人の参加者(元の14人のうち3人はスケジュールの都合で不参加)は名古屋市の4つの小学校(星ヶ丘小学校、西山小学校、伊勝小学校、千石小学校)の各校でそれぞれ8回、200人以上の小学生に授業を行った。各参加者は授業の後、考察文を作成し研究者達に提出した。11月後半、研究者達はJALT全国会議にて2010年のプロジェクトについて発表を行った。現在、研究者達は集計されたデータの分析を行っており、本研究についての最終報告は2011年に公開する予定である。
磁場中単一顕微分光による一次元量子細線の励起子微細構造の研究

前年度までに顕微分光を用いて励起子準位の微細構造を実験的に解明したことに続き、本年度はカーボンナノチューブにキャリアドーピングを行うことで励起子の性質の変化について調べた。カーボンナノチューブはキャリア間のクーロン相互作用が非常に大きいため、余剰キャリア(ホール)をドープすることにより、励起子とホールが結びついて3体の束縛状態(荷電励起子・トリオン)を形成することが期待される。本研究では不純物の少ない良質のカーボンナノチューブ試料に対してp型有機物ドーパントを用いることで、トリオンの吸収及び発光の観測に初めて成功した。これにより、カーボンナノチューブにおけるトリオン束縛エネルギーは約60meVと非常に大きいことが分かった。この値は従来の半導体ナノ構造物質と比較しても一桁程度大きく、室温でも安定にトリオンを形成することを示している。これはカーボンナノチューブにおいてキャリア間のクーロン相互作用が非常に強く働くためである。また他の化合物半導体とは異なり、短距離クーロン相互作用である電子-ホール間の交換相互作用が非常に大きいため、励起子とトリオンのエネルギーが大きく離れていることが分かった。これらの成果はPhysical ReviewLetters誌で出版されEditors' Suggestionに選出されており、さらにPhysics誌においてViewpointとして紹介される等の高い評価を受けた。3月末に予定されていた日本物理学会第66回年次大会が震災の影響により中止になったため、旅費が残金として残った。磁場中顕微分光測定系を用いて、単一(一本)のカーボンナノチューブにおける光学許容な(ブライト)励起子と光学禁制な(ダーク)励起子の発光を直接観測し、ブライト-ダーク準位間の励起子の分布とダイナミクスに関して調べた。3準位モデルのレート方程式を解いて解析すると、ダーク励起子の発光強度が熱平衡を仮定した場合に比べて小さいことが分かった。これは、ブライト-ダーク励起子の波動関数のパリティが違うために、励起子準位間のフォノンによる散乱が抑制され、散乱時間がダーク励起子の寿命に比べて無視できないほど遅くなっていることを示している。またこの実験結果を用いることで、極低温におけるナノチューブの発光が、従来考えられていた欠陥に起因するダーク励起子の発光ではなく、励起子の非平衡分布によるブライト励起子の発光であることが分かった。また、ブライト励起子から100meV以上も離れた低エネルギー側で観測される発光ピークの起源を明らかにすることを目的に顕微分光測定を行った。単一カーボンナノチューブの発光スペクトルの温度依存性、チューブ直径依存性を詳細に測定することで、異なる2つの起源を持つ発光ピークが存在することが分かった。1つはブライト励起子よりも高エネルギー側に存在する角運動量を持つダーク励起子がTOフォノンを介して発光していることが分かった。一方、強いパルスレーザー光を照射すると低エネルギー側に発光ピークが出現する。これは欠陥または水素原子等の不純物に誘起されてスピン三重項ダーク励起子が発光していると結論付けた。
脳室腹腔短絡術時の流量調節バルブに関する実験的および臨床的研究

モデル実験臨床上繁用させるシャント流量調節バルブ(ソフィーバルブ、メドスバルブ、MDMバルブ、オ-ビス・シグマバルブ(OS)、デルタバルブ)の特性および設置部位による差を検討した。デルタバルブは設置部位による特性の差が著明であり、頭部に設置した場合は通常の頭蓋内圧では流量が0であった。デルタバルブは患者個々に応じて設置部位を検討する必要がある。他の4バルブは設置部位による特性の差は認められなかった。この4バルブの抵抗がシステム全体の差圧に占める割合を検討した所、OSバルブが最も流れにくく、次いでMDMバルブで、ソフィーバルブ、メドスバルブは最も流れやすいバルブであった。いずれの頭蓋内圧(-20、5、20cmH_2O)においてもMDMバルブ、ソフィーバルブ、メドスバルブはそれぞれ40-70%、10-50%、15-40%の間で調節可能であったが、この調節範囲では不十分と考えられ、さらに調節範囲を拡げるとともに、閉鎖機構を付加する必要があると考えられる。臨床検討OSAKAtelesensor、流量調節バルブおよびon-offバルブを埋め込んだ患者4例において体位と頭蓋内圧、シャント流量について検討した。臥位においてはシャント流量はほぼ0であり、坐位では調節バルブの設定によらず0.6ml/分というほぼ一定の流量を示した。この値は見かけの髄液産生量と考えられた。また3例において腹腔内圧を同時に測定し、坐位時に腹腔内圧が上昇することを明らかにした。つまり坐位では頭蓋内圧の下降(約18cmH_2O)および腹腔内圧の上昇(約22cmH_2O)により、従来考えられていたサイフォン効果は約1/3にまで相殺されていることが判明し、アンチサイフォンデバイスの使用には十分な注意が必要と考えられた。また小児や痩せた患者では腹腔内圧の上昇程度が小さく、過剰排泄を来しやすい傾向にあると考えられた。将来の展望今後、シャント流量計を開発してin vivoでのシャント流量を測定し、ICPのデータと併せて、水頭症の病態の解明に努める。これらはシャントシステムをコンピューターシミュレーションする際の基礎データとしても有用である。これらを通じて理想的なシャントシステムの確立を目指したい。平成6年度計画調書の研究計画・方法に記載したV-Pシャントモデルを作成し、立立、座位において、ソフィープログラマブルバルブ(以下ソフィーバルブ)、コッドマン・メドスバルブ(以下メドスバルブ)、オ-ビス・シグマバルブ(以下OSバルブ)、デルタバルブ、MDMマルチパ-パスバルブ(以下MDMバルブ)の流量調節性を検討し、以下の知見を得た。1.デルタバルブ以外は頭部に設置しても胸部に設置しても流量調節性に変化はない。2.ソフィーバルブ、メドスバルブ、抵抗としてシャントシステム全抵抗に占める割合は20-50%であった。このことから両者とも比較的流れやすく、調節範囲も狭いバルブである。3.OSバルブは、シャント全抵抗の70%以上を占め、流れにくい設定である。

4.MDMバルブは、ソフィーバルブ、メドスバルブとOSバルブの丁度中間に位置するバルブである。5.デルタバルブは、設置部意により調節性が大きく異なり、患者個々の病態に応じて設置部位を決定する必要がある。以上のことから、シャントシステムにおいてチューブの抵抗がかなり大きい事が判明した。可変抵抗であるバルブ部分の抵抗を0-100%に変更できれば流量調節性はさらに良くなると考えられ、チューブを太くして抵抗を減じるなどの方策が必要と思われる。また本モデル実験では腹腔内圧の影響を考慮しておらず、検討を要すると思われる。モデル実験臨床上繁用されるシャント流量調節バルブ(ソフィーバルブ、メドスバルブ、MDMバルブ、オ-ビス・シグマバルブ(OS)、デルタバルブ)について、各バルブの抵抗がシステム全体の差圧に占める割合を検討した。なおデルタバルブは頭部設置時を想定した。頭蓋内圧が20cmH_2Oでは、OSバルブが75%で最も流れにくく、次いでデルタバルブ63%であった。MDMバルブは46-75%、ソフィー、メドス両バルブはともに10-35%の間で調節可能であった。頭蓋内圧20cmH_2Oでは、デルタバルブが84%で最も流れにくく、次いでOSバルブが80%、MDMバルブ、ソフィーバルブ、メドスバルブはそれぞれ40-70%、10-50%、15-40%の間で調節可能であった。臨床検討OSAKAtelesensor、流量調節バルブおよびon-offバルブを埋め込んだ患者において体位と頭蓋内圧、シャント流量について検討し、H6年度とほぼ同様の結果を得た。すなわち、臥位においてはシャント流量はほぼ0であり、坐位では調整バルブの設定によらず0.6ml/分というほぼ一定の流量を示した。また3列において腹腔内圧を同時に測定し、坐位時に腹腔内圧が上昇することを明らかにした。つまり坐位では頭蓋内圧の下降及び腹腔内圧が上昇によりサイフォン効果が従来考えられていた以上に相殺されていると考えられる。また小児や痩せた患者では腹腔内圧の上昇程度が小さく、オーバードレナージを来しやすい傾向にあった。
ストック・オプション発行量と報告利益管理の関係

本研究ではストック・オプションの利用が経営者の行動、とりわけ機会主義的行動を促すような影響があるかどうかを企業が公表する適時開示資料を元にデータを集め、実証することを目的としている。まず、適時開示情報をeolやバリューサーチから集め、そのデータを体系的に整理した。そしてストックオプションの付与時において株価が低くなるような機会主義的行動をとっているかどうかを検討した。結果は2014年度の管理会計学会において公表予定である。本研究はストックオプションの利用が経営者の行動にどのような影響を与えているかをわが国のデータを用いて検証している。ストックオプションはわが国においても報酬として使われて久しいが、それが経営者の行動にどのような影響を与えているかといった検証はなされていない。そこで適時開示情報からいつ、だれに、どのくらいのストックオプションを付与しているかを入手し、そのデータをもとに分析を行った。本期間において焦点を当てたのは、権利行使価格の決定時において、経営者が機会主義的行動、とりわけ株価が低くなるような行動をとっているかどうかである。多くの企業において権利行使価格は付与日前日の株価あるいは付与前一か月の平均株価のいずれか高いほうに1.05を乗じて決定される。そのため、自らの富を最大化したい経営者はなるべく権利行使から売却における期間において利益が大きくなるように、権利行使価格を低くしたいと考えるはずである。もしそうであれば、経営者は企業にとってネガティブなニュースを付与前の期間に流すことで株価を低くし、低い権利行使価格を確定させるような行動をとるかもしれない。そこで本研究では付与企業を対象にその企業の付与前の株価の動向を調査した。本分析の結果は2014年に開催される日本管理会計学会において公表する予定である。本年度はデータの取得と入力の作業を行った。ストックオプションに関するデータは適時開示情報などから直接入手するほかなく、データの取得に多くの時間を費やすこととなった。特に、ストックオプションの付与量のに関するデータと、誰に付与するのかのデータや行使価格などのデータが同一日に発表されていることは多くないため、それらを企業ごとに個別に探して入力することに多くの時間を費やすこととなった。また、当初予定してた大学院生の研究補助者を確保することができず、当該作業を自ら行わなくてはならなくなったことにより、計画の修正を余儀なくされた。入手したデータを基に本年度は経営者予想とストックオプションの関係を実証的に分析し、その結果の一部を日本経営分析学会第28回秋季大会において発表した。具体的には、ストックオプションの権利行使可能日前後に経営者予想の改訂が行われているかどうかを調査した。分析の結果は非常に弱い証拠しか発見することができず、さらなるデータの蓄積と、モデルの改良が必要になると思われる。当該発表はパイロットテスト的な意味合いが強いため、よりデータを拡張したのちに学会誌に投稿する予定である。本年度はデータの入力に予定していた研究補助者が使えなかったため、研究代表者自らがデータの収集と入力を行わなくてはならず、当初の計画よりは進捗が遅れているのが現状である。しかし、自ら入力したデータで、ある程度の基本となる研究は行うことができ、本年度は経営分析学会において当該データを用いた発表を行った。また、次年度における研究補助者の確保がすでにできているため、次年度においてのデータのチェック等の作業速度は大幅に改善され、当初の計画どおり遂行することができると見込まれる。研究代表者の負担が減るため、データ入力に用いる時間を文献の渉猟やさらなるモデルの改良に充てることができ、次年度中に十分な研究結果を公表できると思われる。今後は早い段階において、直近までのデータを構築することを目標としている。そして、当該データを用いた大規模で包括的な実証分析を行う予定である。特に、次年度においては研究補助者の確保ができているため、データの収集・チェックに関して研究代表者が時間を費やさなくてよくなったことが研究の進捗に大きな影響を与えると考えられる。そして、次年度前半にデータの収集を終え、それをもとに実証分析を行う。その結果は年末から年始にかけて行われる学会において発表し、発表を行った学会か、または研究代表者が所属するいずれかの学会の学会誌に投稿する予定である。次年度前半は研究補助者を用いた実証分析のためのデータを構築する作業を行うため、多くは人件費として支出される。また、ストックオプションに関する最新の文献の購入のための図書費などが大半を占めると思われる。次年度後半は前半に得たデータを基におこなった実証分析の結果を研究代表者の所属する学会において発表するための研究出張費が大半を占めるものと考えられる。どちらも研究を遂行する上で必要な経費として考えられる。
熱誘起相分離法を用いたポリ乳酸多孔質膜の開発とそのバイオプロセスへの応用

ポリ乳酸に代表される生分解性ポリエステルは環境中での微生物分解及び生体内での分解が可能なことから環境に優しい高分子材料や医療用材料として注目されている。これらの生分解性ポリエステルは多孔質化することにより,濾過膜としての分離機能や細胞増殖用の足場材料としての機能を付与することが可能である。本研究では,熱誘起相分離法を用いてポリ乳酸をはじめとする各種生分解性ポリエステルの多孔質化を行い,各生分解性ポリエステルの物理化学的特性,溶液の組成および温度履歴などの多孔質化条件と相分離時における液滴の成長,さらに作製した多孔質体の孔径との関係を検討した。特にポリ乳酸,及び,ポリ乳酸-ポリカプロラクトン-ブレンドポリマーを用いてバイオプロセス用多孔質濾過膜を作製し,作製条件と作製した多孔質膜の濾過特性(濾過抵抗,粒子保持特性)について詳しく検討した。その結果,スクリーンフィルター型のポリ乳酸多孔質膜とデプスフィルター型のポリ乳酸-ポリカプロラクトン-ブレンド膜を開発することに成功した。後者は特に酵母懸濁液の濾過において低圧で高い濾過速度が得られることを示した。また,ポリ乳酸多孔質膜のバイオリアクターへの応用として,白色腐朽菌Trametes versicolorを用いた膜面液体培養法による酸化酵素ラッカーゼの生産を検討した。培養温度28°Cにてはポリ乳酸多孔質膜は安定であり,膜面上に増殖した白色腐朽菌を繰り返し培養することにより,著量のラッカーゼを生産することに成功した。本研究で進めた,多孔質化による高機能生分解性ポリエステル材料の開発とそのバイオプロセスへの応用研究が,持続的なバイオインダストリー(Sustainable Bioindustry)の発展や再生医工学(Tissue Engineering)などの医療工学の高度化に寄与することが期待される。熱誘起相分離法を用いたポリ乳酸多孔質分離膜を作製するため,各種有機溶媒(1,4-ジオキサン,クロロホルム,混合溶媒など)を用いて溶解性試験を行った。溶解性試験の結果より,0-90°Cで製膜操作が可能と考えられた1,4-ジオキサン-水-混合溶媒を溶媒として選択した。ポリ乳酸の濃度および混合溶媒の組成(水分含有率)を変化させて,曇点を測定し,バイノーダル線を求めて種々の温度におけるポリ乳酸-1,4-ジオキサン-水-系の相図を作成した。次にポリ乳酸膜の製膜を行った。相図を参考にして,主としてポリマー濃度10%,混合溶媒中の水分比率を13%の溶液を用いた。ポリ乳酸を80°Cで溶解後,ステンレス平板間にキャストし,いったん曇点よりも4°C高い温度まで恒温水槽上にて冷却した。続いて氷水冷却し,相分離と凝固を行った。生成したゲルを水で洗浄することにより,ポリ乳酸多孔質膜が作製できた。作製した膜は表面および断面を走査型電子顕微鏡にて観察した。ポリマー濃度は8-12%,溶媒中の水分の比率は12-14%の範囲で変化させて製膜実験を行った。作製した膜を用いて濾過実験を行い,膜の濾過抵抗測定と酵母懸濁液の濾過を行った。膜の濾過抵抗は市販の濾過膜と同程度であった。酵母懸濁液の濾過実験では膜面上で酵母のケークが形成され,濾液には酵母が漏出しなかった。酵母の粒径(5μm)程度の粒子を除去できる生分解性の濾過膜としての機能を有することが示された。次に濾過膜の孔径を制御するために,設備備品費で購入したホットステージを用いた相分離過程の解析に取り組んだ。

こちらの実験に関しては現在観察条件の確立を行っている。研究代表者の田中は平成15年度にポリ乳酸-1,4-ジオキサン-水-系溶液の熱誘起相分離現象を利用して透過性のあるポリ乳酸多孔質膜の作製に成功した。平成16年度はポリマーの分子量,ポリマー濃度及び冷却方法を変化させて製膜方法を検討した。ポリマー濃度8%以上では各種条件製膜した膜は直径5μmの酵母を阻止することが可能であった。分子量を変化させると膜の濾過抵抗も変化したが,液体窒素による急冷やポリマー濃度の減少により,濾過抵抗が減少することも示された。走査型電子顕微鏡観察により,濾過抵抗の減少は膜内部のセル間の貫通孔の多い膜が形成されるためであることが示された。谷口はポリ乳酸製濾過膜を用いて,白色腐朽菌カワラタケの膜面液体培養による酸化酵素ラッカーゼの生産を行い,液体懸濁培養や液体静置培養と比較して効率良くラッカーゼが生産されることを示した。また,生産されたラッカーゼはビスフェノールAなどのフェノール性環境汚染物質の分解に利用できることを示した。田中と青木,松山はホットステージを用いたポリ乳酸-1,4-ジオキサン-水-系の相分離過程の観察結果と熱的及び速度論的相分離過程の知見から,ポリ乳酸膜製膜過程の解析を行った。海外共同研究者のD.R.ロイド教授は通常は研究代表者の田中と電子メールや資料の郵送で情報交換を行っているが,日米科学協力事業共同研究(日本学術振興会,米国国立科学財団)により平成16年5月に来日した。5月26-29日には新潟に滞在し,本研究課題に関する討論を行った。本研究課題の成果の一部は,国際的な分離膜研究の学術雑誌であるJournal of Membrane Science誌に掲載された。また,研究成果の別の一部を2005年7月にイギリスのグラスゴーにて開催される第7回世界化学工学会議の研究発表として応募したところ,口頭発表講演として受理された。本年度は本研究の最終年度であり,データおよび理論的解析のまとめと研究成果発表を重点的に行った。研究代表者の田中は研究の統括と熱誘起相分離法を用いたポリ乳酸多孔質膜の作製と精密濾過膜としての特性評価を行った。田中は研究分担者の青木と松山の協力の下にポリ乳酸多孔質膜形成過程の熱力学的解析と速度論的解析を行い,製膜条件とポリ乳酸多孔質膜の精密濾過膜としての特性の関係をまとめた。多孔質構造の形成に関しては,化学工学シンポジウムシリーズ79「診断・治療システムにおける化学工学」(pp.46-51)に「熱誘起相分離法を用いた生分解性多孔質体の作製」として発表した。精密濾過膜分離膜としての研究成果は第7回世界化学工学会議(スコットランド,グラスゴー,口頭発表に選ばれた)及び国際膜会議(韓国,ソウル)にて発表した。前者の発表内容は酵母懸濁液の濾過実験データをさらに加えてJournal of Chemical Engineering of Japan誌に発表した。後者の発表では,ポリ乳酸と同じく生分解性ポリエステルでもあるポリカプロラクトンとを組み合わせた,生分解性ポリエステル-ポリマーブレンド製の高速デプスフィルターの研究が中心であるが,これについてはDesalination誌に発表した。研究分担者の谷口は昨年度成功したポリ乳酸多孔質膜を用いた白色腐朽菌の膜面液体培養について長期培養を行い,酸化酵素のラッカーゼの生産を行った。
皮膚親和性CD8Tリンパ球の分化とフコース転移酵素群の発現解析

皮膚のウィルスからの感染防御は、主にCD8+ T細胞等が末梢血から皮膚へ浸潤(ホーミング)して行っているが、CD8+T細胞がどのように皮膚へ特異的にホーミングするのかはよく判っていない。我々はナイーブCD8T細胞をanti-CD3抗体で刺激し、in vitroで培養後、皮膚ホーミングレセプターのE-selectin ligand (ESL)、およびCutaneous Lymphocyte-associated Antigen(CLA)、そしてESLとCLAの合成を司るフコース糖転移酵素(FucT-VII)の発現を継時的に調べた。その結果、まずFucT-VIIの発現が高まった後ESLの弱い発現が認められた。一方、CLAの発現はCD3の刺激を中止するとCLAの発現が見られ、それに比例してESLの発現が高まった。ESLの発現が一番高い状態はCLA・ESL・FucT-VIIが発現している時で、その後FucT-VIIの発現が消失するとともに次第にCLA・ESLの発現は弱まった。さらに我々はこれらのフェノタイプのCD8+細胞が実際に皮膚へ浸潤しているのかを調べる為に、CD8が浸潤していることが判っている病変部分の組織標本をCD8およびCLA、FucT-VII抗体で染色した。その結果、浸潤している70%以上のCD8+T細胞がCLA+FucT-VII+のフェノタイプを示している事が明らかになった。すなわち、in vitroの実験で明らかになったCLA+ESL+FucT-VII+のフェノタイプが、実際に皮膚に浸潤している事が判った。なお、近年CLA上のCD43分子が真のESLではないのかと報告されたが、我々はESL、CLAおよび抗CD43抗体で染色した結果、CD43分子とこれらの分子発現に有意差は明らかにならなかった。常に種々の抗原や細菌・ウィルス・化学物質などの刺激に暴露されている皮膚は、生体の最前線のバリアーとして働いている。このバリアーは、様々な免疫担当細胞の存在によって担われており、末梢血から皮膚へ浸潤した皮膚親和性のリンパ球(メモリーT細胞)が関与している炎症反応は、最も一般的な"防御反応"である。特にCD8^+Tリンパ球はウィルスに対して主要な防御機構を担っており、ウィルスが感染した皮膚の局所へ特異的に反応するリンパ球が「ホーミング」して生体防御反応を行っている。CD8^+Tリンパ球の場合、皮膚ホーミングレセプターに関しての研究報告はCD4^+Tリンパ球と比較すると非常に少なく、CLA発現のup-regulation・down-regulation程度で、E-selectin ligand(ESL)発現のメカニズムや分化については殆ど判っていない。我々は最初にヒト健常末梢血リンパ球(PBMC)を用いてCD8^+T細胞のE-selectinおよびCLAの発現を調べた。PBMCをE-selectin/Human IgG/Fcキメラでインキュベート後、anti-human IgG/Fc mAb・anti-humanCLA mAb・anti-human CD8で染色し、フローサイトメトリーで測定した。その結果、同一健常人のCD4^+T細胞と比較すると、CLAの陽性率は約半分程度しか発現していなかった。一方、ESLの発現はCD4^+T細胞と同様に、すべてのCLA^+細胞がE-selectinと結合するわけではなく、CLA^+細胞の半分以下の細胞のみ(ESL^+CLA^+細胞)が結合することを見いだした。また、CLA^-細胞でもE-selectinと結合する(ESL^+CLA^-細胞)ことも同時に見いだした。次にPBMCからナイーブCD8^+T細胞を分離し、anti-CD3抗体で刺激してCLAとESLの発現を継時的に調べた。細胞が活性化するとESLのみ発現し、CLAは検出できなかった。この細胞を刺激が無いresting環境へ移すとCLAが発現した。以上の結果は、以前我々が見いだした皮膚ホーミングCD4^+細胞と同様な分化過程を示す事が予想され、次年度以降はESLやCLAの発現を制御するフコシルトランスフェラーゼの発現を継時的に調べ、皮膚ホーミングCD8^+T細胞の分化過程を明らかにする。

すなわち、in vitroの実験で明らかになったCLA+ESL+FucT-VII+のフェノタイプが、実際に皮膚に浸潤している事が判った。なお、近年CLA上のCD43分子が真のESLではないのかと報告されたが、我々はESL、CLAおよび抗CD43抗体で染色した結果、CD43分子とこれらの分子発現に有意差は明らかにならなかった。
生殖をモデルとした植物ホルモン機能拡張

植物ホルモンジベレリン(GA)は、核内受容体GID1により受容され植物の成長を促す。申請者らが、シダ植物の造精器誘導がこのGID1-GAシステムを介することを明らかにしたように(Science 2014)、GAは元来、生殖ホルモンとして機能していたと考えられる。さらに、我々はシダと被子植物GID1の構造を比較し、GID1とGAの共進化を提案した(Nature 2008).また、GAの不活化と合成酵素との間においては、生殖過程における進化的軍拡競争が起きていることが予想された。以上の研究背景に基づき、我々はシダから被子植物までの様々な進化段階におけるGID1とGAおよび、GA不活化・合成酵素について構造と活性の相関を調べ、共進化の分子機構を解析する。そのために、(1)シダから種子植物までの様々な進化段階におけるGID1受容体と多様なGA分子種との構造や結合特性の解析(2) GAの合成・不活化酵素の結晶化と解析(3)DELLAタンパク質の構造解析(4)生殖関連アソシエーション解析、を行う。本年度は、(1)GID1の感度に関係するドメインの進化学的解析を行い、論文を投稿した。(2)GA2酸化酵素の結晶化の結果は、本酵素がジベレリン依存的な4量体形成と活性化を示した。その詳細なメカニズムを明らかにするため、MDシミュレーション解析を行った。また、イネの花粉特異的なGA3酸化酵素については、イネ属の進化の中でいつから、花粉特異的になったかという点といつから、特異的なアミノ酸を保持するようになったのかということについて明らかにした。(3)DELLA蛋白質とIDDとの共結晶を試みた。(4)SPYの活性測定を行った。(1)GID1の感度に関係するドメインの進化学的解析を行った結果、そのような進化は、双子葉になった時から独立に何度も起こっていること、感度のよいGID1が根に発現し、低濃度のジベレリンに対する応答に必要なことを明らかにした。(2)GA2酸化酵素の結晶化の結果は、本酵素が活性中心のジベレリンだけではなく、酵素と酵素の間にもジベレリンが存在しており、このジベレリンが酵素活性の活性化に関わることを明らかにした。そのメカニズムを明らかにするためMDシミュレーション解析を行った。シミュレーションの結果、分子間に結合しているジベレリンが次の反応のための基質としてウェーティングしていること、そのためにKm値が小さくなっていることが分かった。そのことを確かめるために、関与しているアミノ酸の変異を入れたところ、反応速度定数の変化が見られ、そのことは、予想した反応メカニズムが正しいことを意味していた。(3)DELLA蛋白質とIDDとの共結晶を行った。DELLA蛋白質、IDD蛋白質の発現条件、結合のための最小フラグメントの同定等を行い、最適化した。最適条件下での複合体の共結晶に成功したが、構造解析にまではいたらなかった。その一番大きな原因は、IDD蛋白質がいろいろな長さで翻訳が止まっているペプチドの混合物であるためであると考えられた。そのため、N末タグだけでなくC末タグも付加し、全長のみを共結晶に用いることにした。(4)生殖関連アソシエーション解析により、ジベレリンシグナル伝達に関連する新たな因子SPYの発現が変化した品種を見出し、活性測定を行った。以上のように、どの課題も、順調に進展していると思われるが、それぞれの課題の論文化を急ぐ必要がある。(1)(2)に関しては、論文をまとめていく。GA2酸化酵素がリガンド依存的多量体形成が活性化に必要であったことから、他の2オキソグルタル酸依存性酸化酵素に関しても同様なメカニズムがあるかもしれないと考えている。この仮定に関する実験を行う。また、GA3酸化酵素に関しては、イネの進化の中で、どのようにして葯特異的な酵素が誕生したのかを調べていく。(3)DELLA蛋白質とIDDとの共結晶については、C末に別なタグをつける、プロテアーゼサイトをプレシジョンサイトに変更する、IDDの複合体に必要な領域を再検討する等を行う。(4)SPYに関しては、イネのGAシグナル伝達因子との位置づけをはっきりさせる。そのために、徒長型SLR1との形質の比較、SLR1を基質とした活性測定、等を行う。

本年度は、(1)に関し、双子葉植物におけるGID1の進化について詳細に解析した。ビアコアを用いた新しい測定方法により、よりin vivoに近いGA結合活性測定が可能となった。その結果、双子葉植物の登場とともに生じたあるタイプのGID1受容体が、その後の様々な双子葉植物の高感度GID1受容体の原型となり、双子葉植物の多様なGA応答を可能にしたことを明らかにした。(2)GA2酸化酵素と3酸化酵素の精製と結晶化ができているので構造解析を行っている。また、GA3酸化酵素1に関しては、特にイネの花粉、花糸、鱗被に特異的に発現しているノックアウト変異体の表現型調査(4)生殖関連アソシエーション解析により、ジベレリンシグナル伝達に関連する新たな因子SPYの発現が変化した品種を見出した。(1)ビアコアを用いた新しい測定方法により、よりin vivoに近いGA結合活性測定が可能となった。このことは、GID1とリガンドの関係を詳細にみることが可能になったことを意味し、その意義は大きい。また、受容体の感受性を調べた結果、双子葉植物の登場とともに生じたあるタイプのGID1受容体が、その後の様々な双子葉植物の高感度GID1受容体の原型となり、双子葉植物の多様なGA応答を可能にしたことは、予想外の結果であった。本研究成果の論文を作成している。(2)特にイネの花粉、花糸、鱗被に特異的に発現しているGA3酸化酵素1ノックアウト変異体の表現型を詳細に調べ、本酵素が雄性生殖の様々な過程で重要な機能を果たすことを明らかにした。また、表現型と構造との関係についても明らかにしつつあり、順調に進展している。(4)生殖関連アソシエーション解析により、ジベレリンシグナル伝達に関連する新たな因子SPYの発現が変化した品種を見出したことは、予想以上の進展であった。植物ホルモンジベレリン(GA)は、核内受容体GID1により受容され植物の成長を促す。申請者らが、シダ植物の造精器誘導がこのGID1-GAシステムを介することを明らかにしたように(Science 2014)、GAは元来、生殖ホルモンとして機能していたと考えられる。さらに、我々はシダと被子植物GID1の構造を比較し、GID1とGAの共進化を提案した(Nature 2008).また、GAの不活化と合成酵素との間においては、生殖過程における進化的軍拡競争が起きていることが予想された。以上の研究背景に基づき、我々はシダから被子植物までの様々な進化段階におけるGID1とGAおよび、GA不活化・合成酵素について構造と活性の相関を調べ、共進化の分子機構を解析する。そのために、(1)シダから種子植物までの様々な進化段階におけるGID1受容体と多様なGA分子種との構造や結合特性の解析(2) GAの合成・不活化酵素の結晶化と解析(3)DELLAタンパク質の構造解析(4)生殖関連アソシエーション解析、を行う。本年度は、(1)GID1の感度に関係するドメインの進化学的解析を行い、論文を投稿した。(2)GA2酸化酵素の結晶化の結果は、本酵素がジベレリン依存的な4量体形成と活性化を示した。その詳細なメカニズムを明らかにするため、MDシミュレーション解析を行った。
南北両半球へのオ-ロラ粒子エネルギ-流入動態の研究

本研究は、ダイナミックに変動するオ-ロラ粒子流入動態や、それに伴うプラズマ波動を1本の磁力線で結ばれた観測点(地磁気共役点)である南半球の南極昭和基地付近と北半球のアイスランド国内の多点観測網で同時観測する。この両半球における多点同時総合観測と我が国のオ-ロラ総合観測衛星EXOSーDによる磁気圏内の直接観測デ-タとを組合せることにより、オ-ロラ粒子エネルギ-の南北両半球への流入動態、及びオ-ロラ現象の生成・伝播機構解明の手がかりを得ることを目的とする。この目的にそって進めてきた観測・研究経過と3年間の研究実績を以下にまとめる。「平成元年度の観測・研究経過」*オ-ロラ現象に伴う地磁気変動の時間的・空間的変動を詳細に調査するために、アイスランド国内で多点観測を実施した。PC5と呼ばれる長周期地磁気脈動に注目し研究を進めてきた。*昭和基地の共役点であるアイスランドのフッサフエルとチョルネスにおいて高感度オ-ロラTVカメラを用いて可視オ-ロラの同時観測を実施した。*VLF帯自然電磁波動の方向探査観測器の予備観測を実施し、本観測へ向けての諸条件が確認できた。*地磁気変動、リオメ-タ、プラズマ波動のモニタリング観測を通年にわたり実施した。「平成2年度の観測・研究経過」*アイスランドのチョルネスにイメ-ジングリオメ-タを設置した。この観測装置により、昼夜天候に左右されることなくオ-ロラ高エネルギ-降下粒子の空間的・時間的変化を観測することができるようになった。また、このリオメ-タとTVカメラによるオ-ロラとの同時観測により、オ-ロラのタイプ別での比較を行ない、その有効性が明らかになった。*高感度TVカメラによるオ-ロラの共役点観測では、脈動オ-ロラやコロナ状オ-ロラの興味深いデ-タが得られた。*モニタリング観測も前年に引き続き通年観測を実施した。「平成3年度の観測・研究経過」*地磁気多点観測を平成元年度に引き続き本格観測を実施した。*VLF方向探査の本観測をフッサフエルにおいて実施した。*イメ-ジングリオメ-タの性能検査を航空機を用いて実施した。*地磁気活動が活発な年であり、赤いオ-ロラが昭和基地とアイスランドとで同時観測できた。*オ-ロラの発光高度を精密に測定するためのオ-ロラ立体観測をアイスランドのフッサフエルとエフリの2ヶ所で実施した。*モニタリング観測は前年度に引き続き実施した。「3年間で得られた研究実績と今後の見通し」*イメ-ジングリオメ-タは天候に左右されることなくオ-ロラ粒子観測ができることから最も有効な観測手段の一つであることが確証できた。この装置は平成4年2月に昭和基地にも設置され、共役点観測が可能となり、多くの興味深い研究成果が得られるものと期待している。*可視オ-ロラの共役点観測は最も興味深いものである。しかし、天気の不一致から毎年数日間しか同時観測できないのが現実である。今迄に得られた貴重なデ-タ解析は進んでいるが、今後とも観測を継続し、サンプル数を増やす必要がある。*モニタリングデ-タによる統計的解析からは、日変化、季節変化、年変化等の多くの興味深い結果が得られた。特に日照効果と太陽活動の効果がオ-ロラ現象に及ぼす影響については、この共役点観測・研究により初めて明らかにした。*共役点位置の自然現象から導出する方法を、可視オ-ロラ、地磁気脈動、VLF波動等を用いて研究した。今後は、リオメ-タ観測デ-タも含めて実施することにより、多くの新しい事実が明らかになるものと期待している。*今後はオ-ロラのスペクトル、発光高度の共役点同時観測が重要になると考えている。

また、このリオメ-タとTVカメラによるオ-ロラとの同時観測により、オ-ロラのタイプ別での比較を行ない、その有効性が明らかになった。*高感度TVカメラによるオ-ロラの共役点観測では、脈動オ-ロラやコロナ状オ-ロラの興味深いデ-タが得られた。*モニタリング観測も前年に引き続き通年観測を実施した。「平成3年度の観測・研究経過」*地磁気多点観測を平成元年度に引き続き本格観測を実施した。*VLF方向探査の本観測をフッサフエルにおいて実施した。*イメ-ジングリオメ-タの性能検査を航空機を用いて実施した。*地磁気活動が活発な年であり、赤いオ-ロラが昭和基地とアイスランドとで同時観測できた。*オ-ロラの発光高度を精密に測定するためのオ-ロラ立体観測をアイスランドのフッサフエルとエフリの2ヶ所で実施した。*モニタリング観測は前年度に引き続き実施した。「3年間で得られた研究実績と今後の見通し」*イメ-ジングリオメ-タは天候に左右されることなくオ-ロラ粒子観測ができることから最も有効な観測手段の一つであることが確証できた。この装置は平成4年2月に昭和基地にも設置され、共役点観測が可能となり、多くの興味深い研究成果が得られるものと期待している。*可視オ-ロラの共役点観測は最も興味深いものである。しかし、天気の不一致から毎年数日間しか同時観測できないのが現実である。今迄に得られた貴重なデ-タ解析は進んでいるが、今後とも観測を継続し、サンプル数を増やす必要がある。*モニタリングデ-タによる統計的解析からは、日変化、季節変化、年変化等の多くの興味深い結果が得られた。特に日照効果と太陽活動の効果がオ-ロラ現象に及ぼす影響については、この共役点観測・研究により初めて明らかにした。*共役点位置の自然現象から導出する方法を、可視オ-ロラ、地磁気脈動、VLF波動等を用いて研究した。今後は、リオメ-タ観測デ-タも含めて実施することにより、多くの新しい事実が明らかになるものと期待している。*今後はオ-ロラのスペクトル、発光高度の共役点同時観測が重要になると考えている。平成2年度に実施した新たな観測項目は、アイスランドのチヨルネスにイメ-ジングリオメ-タを設置したことである。この新たな観測手法により興味深い多くの新たな知見を得ることができた。この観測は前年度まで実施してきた観測項目、研究経過と有機的に結ばれたため良い結果が得られた。以下に平成2年度の研究経過・成果を具体的に示す。*昭和基地の地磁気共役点に最も近い、アイスランドのチョルネスにイメ-ジングリオメ-タを設置した。リオメ-タは銀河電波の強度を観測することにより高エネルギ-オ-ロラ粒子の降り込み量を間接的に観測することができる。この観測装置により、昼夜、天候に左右される事なく、天頂より100kM四方を64区分の空間分解能でオ-ロラ高エネルギ-降下粒子の空間的・時間的変動を観測できる。*可視オ-ロラとイメ-ジングリオメ-タとの直接的な比較観測により、イメ-ジングリオメ-タ観測の有効性を確認することができた。*朝方から午前中に出現するPc3ー5(周期30ー250秒)地磁気脈動にともなう高エネルギ-オ-ロラ粒子の時間的空間的変化がイメ-ジングリオメ-タにより初めて明らかになった。
グローモードプラズマ源を用いた放電洗浄法の研究

超高真空を迅速に得るために有力な方法であるグロー放電洗浄には、磁場を用いず、装置が簡便であるなどの利点があるが、陰極降下が300Vと大きいために、プラズマイオンのボンバードメントによる容器壁のスパッタリングや、放電ガスの容器壁へのトラッピングが起きること、それに放電洗浄時のガス圧力が数パスカルと高いために、真空排気系の排気速度が遅いという問題点がある。そこで、このグロー放電洗浄法を改善するために、熱陰極を用いたグローモードプラズマ源(GMPS)を補助プラズマ源として放電洗浄を行い、上記の問題点の改善に取り組んだ。その結果、放電ガス圧力は0.2Paと従来より12桁下げられるようになった。また、陰極降下における壁とプラズマとの間の電位差も数10ボルトまで下げられることを確認した。また、放電ガスとしてアルゴン、水素、重水素などを用い、放電中の不純物の各ガス分圧の時間変化から、放電中の不純物の壁からの脱離機構について研究した。その結果、短時間の放電では不純物の脱離は物理的なボンバードメントによる寄与が大きいが、長時間の放電では化学反応による脱離量が大きくなってくることがわかった。以上の結果から、GMPSを補助プラズマ源としたグロー放電洗浄は、従来のグロー放電洗浄の欠点を改良し、しかも洗浄効果が大きいという結論に達した。さらに、超高真空でのこの方法の有効性を研究する基盤ができた。1.本年度は科研費の示達、交付が12月にあり、直ちに本研究の為の主要装置である超高真空用の真空容器、真空排気装置、超高真空に対する真空計、および残留ガス分析装置を設計した。真空容器は特に昨年度までの高真空の為のグローモードプラズマ源を用いた放電洗浄(特許)のデータをベースにそれから2桁ほど良い超高真空に拡張できるように考慮し、容器サイズ、仕様、部品の性能を決めた。2.設計完了後直ちに発注した。製作過程に置ける注意も払った。3.納入後組立、調整、および試験運転を開始した。その結果、ベーキング、及び放電洗浄により実験目的を達成するための超高真空を得る可能性を見いだした。4.次年度で購入する予定のデータ処理系の検討を進めた。超高真空を迅速に得るために有用な方法であるグロー放電洗浄には、磁場を用いず、装置が簡便であるなどの利点があるが、陰極降下が300Vと大きいために、プラズマイオンのボンバードメントによる容器壁のスパッタリングや、放電ガスの容器壁へのトラッピングが起きること、それに放電洗浄時のガス圧力が数パスカルと高いために、真空排気系の排気速度が遅いという問題点がある。また、放電中の不純物の脱離の機構を調べるために、放電ガスとしてアルゴン・水素・重水素を用い、放電中の不純物の各ガス分圧の時間変化について研究した。その結果、アルゴン放電と水素放電を比較した結果、水素放電では化学反応の寄与が物理的なボンバードメントよりも大きいか同程度であるということが分かった。さらに、超高真空でのこの方法の有効性を研究する基盤が出来た。
シェーグレン症候群における免疫抑制シグナル分子の機能解析

本研究では唾液腺・涙腺における自己免疫病変の発症機構における補助シグナル分子であるPD-1,PD-L1/PD-L2の働きをSS疾患モデルNFS/sldマウスを用いて検討した。まず、モデルマウスにおける末梢T細胞の活性化状態について検討するため、脾細胞および頸部リンパ節から分離したCD4陽性T細胞を用いてFACS解析を行ったところ、生後3週齢以降からnonTx群と比較してTx群のCD4陽性T細胞上に活性化マーカーとされるCD44,CD45RBlow, Mel-14low, CD69ならびにCD25の発現増強が認められた。さらに、脾細胞ならびに頸部リンパ節から分離したCD4陽性T細胞上におけるPD-1発現を同様にFACS解析を用いて検討した。結果、生後8週齢であるTx群の頸部リンパ節から回収したCD4陽性T細胞上において、対照群に比較してPD-1分子の発現上昇傾向が認められた。PD-1発現上昇は脾細胞由来のCD4陽性T細胞においてはほとんど認められなかった。また、病態が悪化する生後12週齢の段階においては、CD4陽性T細胞上のPD-1分子発現は減退していた。さらに、唾液腺に浸潤したCD4陽性T細胞上におけるPD-1発現検討では、生後8週齢で最も顕著なPD-1分子発現が確認された。唾液腺組織におけるPD-L1/PD-L2分子発現を免疫組織化学染色で検討したすると、唾液腺腺房細胞にPD-L1発現が認められた。以上の結果からPD-1/PD-L1シグナルがSS疾患モデルであるNFS/sldマウスの病態発症に関与している可能性が示された。
Intravital Cell Imaging法の開発と脳科学への応用

【目的】生体内で細胞レベルのイメージングを行う方法を開発し、これによって培養細胞(single cell)での知見をin situで検証し、脳科学への応用可能性を検討した。【方法】顕微鏡下に連続して脳を観察しながら4血管閉塞(前脳虚血)を負荷できるラットのモデルを用いて、虚血性神経細胞死の信号伝達をin situで観察・評価した。標識方法としては、脳内の任意の部位に蛍光色素を加圧注入し観察した。観察方法としては、共焦点蛍光顕微鏡による脳表面の観察と、ファイバー共焦点顕微鏡[ニポーディスク式共焦点ユニットCSU21,Yokogawa)にイメジングファイバーバンドルをカップルさせたもの]による脳深部(海馬CA1領域とCA3領域)の観察を行った。【結果】大脳皮質で、一過性脳虚血時のラジカル(スーパーオキシドおよびヒドロキシラジカル)産生、消去剤によるラジカルの消退をイメージングにより検証することができた。また、虚血時(血流低下に伴う)の蛍光強度そのものの変化を補正する方法を開発し、血流の影響を加味したイメージングに評価が可能になった。虚血時にはラジカル産生は変化せず血流再開後に産生は増加することが明らかとなった。海馬では、CA1領域とCA3領域のカルシウム反応が明らかに異なり、CA1では血流再開後に持続的な細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が見られ、CA3では上昇がなかった。また関連する研究として、光線力学療法(光増感剤投与後に光照射し腫瘍を殺傷する)時に一重項酸素の発生をモニターし、照射エネルギーが強く一重項酸素の発生ピーク値が高く短時間しか持続しない場合には腫瘍細胞はネクローシスで、ピーク値が低く長時間発生する場合はアポトーシスで死滅することがin situでも確認できた。【まとめ】脳神経疾患の治療法の開発研究に役立つと思われる生体内細胞イメージング法を開発した。【目的】蛍光色素・蛍光蛋白(fluorescent protein)による標識法の発達と、共焦点顕微鏡・全反射型蛍光顕微鏡など顕微鏡による観察法の発展により、培養細胞レベルでの詳細な細胞内信号伝達の解析が可能となったが、未だに培養細胞と個体レベルの差は大きい。本研究では、個体レベルでの詳細な細胞内・細胞間信号伝達を解析するために"Intravita Cell Imaging法"を開発することを試みた。【方法および結果】脳の標識方法としては、脳へのin situ lipofection法による蛍光蛋白発現法と蛍光色素投与法の開発、観察方法としては、共焦点蛍光顕微鏡とファイバー共焦点顕微鏡による蛍光観察法の開発を目標とした。共焦点Unit(CSU21,Yokogawa)を装着した正立顕微鏡、(BX50WI, Olympus)により観察し、Image IntensifierおよびCCD Cameraにより共焦点蛍光画像を取得し解析した。ラット(300g、オス)に慢性脳室カニュラを設置し、Plasmid DNA(50μg/kg)をLiposomeと共に脳室内に1回投与後2日目に観察すると、両側の大脳皮質・基底核・海馬に観察可能な発現が見られた。また、全麻下にラットの頭蓋骨にcranial windowを設け、硬膜外からカルシウム指示薬であるCalcium Orange(1mMx1h)を投与、硬膜外にカバーガラスを固定し共焦点顕微鏡で観察すると、10分間の前脳虚血を顕微鏡観察下に負荷し、脳表カルシウムイオン濃度の持続的上昇が観察可能であった。【まとめ】硬膜外からの蛍光色素投与、脳室内へのPlasmid DNA投与により、生きているラットで脳表からの共焦点蛍光像の観察が可能になった。今後の問題点として: