hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
量子化半導体超微粒子の化学的粒径制御に関する研究

ロックインアンプおよび光電子増倍管冷却装置を用いて,今まで用いて来たストップトフロ-分光装置を改良し,溶液を混合して作成する超微粒子の生長過程を効率よく追跡できるようになった。装置の試験をかねて,Pb^<2+>,Hg^<2+>,あるいはBi^<3+>イオンとI^-イオンのメタノ-ル溶液を用いて,金属ヨウ化物の形成について追跡した。これらの化合物超微粒子についての報告はいくつかあるが,新たにピ-クの帰属することができた。CdS超微粒子の粒径制御のためには,まず粒径制御剤として用いるメオ-ルの種類,およびpHを変えてその効果を調べた。その結果,メルカプトエチルアミンは形成速度を低下させるのに有効であり,メルカプトプロピオン酸はその効果が少ないことがわかった。化学量論的な粒径制御をおこなうためには,構造の決った金属のクラスタ-錯体を形成することが必要であるが,メルカプトエタノ-ル,システインにおいて,そのような傾向が見られた。メルカプトエタノ-ル(RSH)について^1HーNMRで注意深く観察すると,結晶構造の知られているCd_<10>核錯体の中の3価のSR配位子4個がS^<2->に置換するのが観察された。RSHがCdに対し過剰にある場合,cd(SR)^<2->_4錯体となり,S^<2->を加えることにより,はじめて280nmに吸収を持つ安定なクラスタ-錯体を形成することを見い出した。これはCdを中心にもつCd13核錯体と考えられる。しかし,それらの金属クラスタ-錯体は水溶液中では不安定なため結晶として軍離できず,凍結乾燥により粒末として取り出せるのみであった。今後,チオ-ル類および,溶媒を変えて,クラスタ-錯体を安定に取扱える条件を検策する必要がある。
Canonical Wnt経路と歯髄創傷治癒

分泌型タンパク質であるWntファミリーは歯の発生過程に発現し、各種細胞の増殖と分化をコントロールしていることが知られている。象牙芽細胞分化ならびに象牙質形成にWnt10aとEctodinがどのように影響するかを調べることを目的としてラット下顎切歯由来の歯髄培養細胞を用いて研究を行った。歯髄培養細胞にshRNA発現ベクターを導入しEctodinとWnt10aをknock downした細胞群(ectodin KD群ならびにWnt10a KD群)と対照群について象牙芽細胞様細胞への分化ならびに象牙質様石灰化結節の形成を解析し比較を行った。Ectodin KD群のEctodin発現とWnt10a KD群のWnt10a発現はそれぞれ対照群に比較して有意に減少し、knock down効果が確認された。Ectodin KD群とWnt10a KD群では象牙質石灰化結節の形成が抑制され、Runx2、DSPPの発現も対照群に比較して有意に抑制された。しかし、Wnt10a KD群ではEctodinの発現も抑制されたが、Ectodin KD群ではWnt10aの発現は抑制されなかった。これら結果からWnt10aとEctodinは象牙質形成に重要な作用を及ぼすことと、Wnt10aはEctodin発現に影響を与えるが、EctodinはWnt10aの発現に影響しないことが示された。また、Runx2はDSPPの発現を調節しており、そのRunx2の発現はWnt10aにより誘導されることから、Wnt10aはRunx2を介してDSPPの発現を調節していることが考えられる。一方で、Ectodin KD群でもRunx2、DSPPの発現が抑制されたがWnt10aの発現は影響を受けなかったことから考えるとWnt10aはEctodinの上流で象牙質形成を調節していることが示唆された。(目的)歯髄組織の創傷治癒や修復象牙質形成のメカニズムを研究、解明することは新たな直接覆髄法や断髄法など歯髄保存治療の発展に役立ち、国民のQOLに大きく貢献すると考えられる。歯の発生過程ではWntシグナルが重要な役割を果たしているが象牙質形成におけるその作用の詳細は不明である。今回、ectodinならびにwntシグナルが象牙質形成にどのように関わるかを調べる目的でラット培養歯髄細胞に対しectodinをknock downして実験をおこなった。(方法)8週齢のラットの切歯の歯髄から酵素分離法で初代歯髄細胞を分離し実験に用いた。Ectodinの作用を調べるためにsiRNAを発現ベクターに導入しectodinのknock down (KD群)を行い、空ベクターを導入した対照群細胞(Cont群)と比較検討した。これらの細胞を20日間培養し、形態学的に石灰化象牙質形成を調べるために、ALP/Von kossa染色を行った。また、ectodin, DSPP, BGP, wnt10, axin2のmRNAの発現を調べるためにリアルタイムPCRを行い解析した。(結果と考察)KD群におけるectodin mRNAの発現はCont群に比較して有意に減少し、knock down効果が確認された。KD群では象牙質石灰化結節の形成が抑制されDSPP, BGPの発現もCont群に比較して有意に抑制された。これに伴いwnt10aの発現も抑制されたがaxin2の発現は変化が認められなかった。これらの所見からectodinの発現を抑制すると象牙質形成が抑制され、このメカニズムにはwnt10a以外にも他のwntシグナルが関与することが示唆された。これらの結果からectodinはwntシグナルに作用し象牙質形成を制御することが示唆された。平成28年第144回日本歯科保存学会春季学術大会にて本発表を行った。In vitroでの象牙質形成過程を再現できる歯髄細胞の培養系が安定的に機能しており、象牙芽細胞様細胞分化に対するWntとectodinの作用を調べることがおおむねできている。今研究の研究目標に掲げたcanonical Wntシグナル経路の構成因子であるβ-cateninならびにlef1の発現も本実験の歯髄培養細胞で確認できており、ectodinのknockdownの実験にも着手できている。Knockdownの実験ではリアルタイムPCRの結果よりectodinの発現が抑制されていることが確認され、その結果、象牙芽細胞様細胞の分化が抑制されるという結果がもたらされた。これらのことから本研究はおおむね順調に進行していると考える。分泌タンパク質であるWntは、歯の発生過程において未分化外胚葉性間葉細胞の増殖と分化をコントロールし、歯胚や象牙質形成に重要な役割があると考えられている。今回、我々はWntシグナルのカノニカル経路のアンタゴニストであるectodinに注目し、培養歯髄細胞における象牙質様石灰化結節の形成と象牙芽細胞分化マーカーの発現に対するectodin遺伝子のknock downの影響についての解析を行った。培養歯髄細胞においてectodin遺伝子をknock downすると対照群に比較して象牙質様石灰化結節の形成が抑制され象牙芽細胞の分化マーカーの発現も抑制された。これらのことからWntのカノニカル経路が象牙質形成に影響を及ぼすことが示唆された。これらの結果をふまえ、実際に培養歯髄細胞にWnt1を作用させる実験を行った。

培養歯髄細胞にWnt1を連続的に作用させた群と対照群を比較したところ培養21日目における象牙質様石灰化結節形成に有意な差は認められなかった。一方でWnt1を間歇的に6時間作用させた群では培養21日目の象牙質様石灰化結節の形成が上昇した。これらの結果からWntシグナルのカノニカル経路とそのアンタゴニストであるectodinが培養歯髄細胞に供に作用し、象牙芽細胞様細胞分化と象牙質様石灰化結節形成をコントロールしていることが強く示唆された。さらにWntシグナルの作用時間が象牙質形成の制御に重要であることが示唆された。歯の形態形成においても様々な分泌タンパク質がspacio-temporalに発現し、相互作用を行っていることが示されている。培養細胞を用いた実験でも分泌タンパク質の作用時間が細胞の増殖と分化に重要な影響を与えることが報告されている。今後、リアルタイムPCRを用い、さらなるWntの歯髄の創傷治癒に対する作用を解析する予定である。In vitroでの象牙質形成過程を再現できる歯髄培養細胞系が安定的に機能していること。Ectodin mRNAのリアルタイムPCR解析の結果からectodinのknock downの効果が確認できていること。Wntシグナルのカノニカル経路の活性化のためのWnt1リガンドの入手ができていること。Wntシグナル関連遺伝子の発現ならび培養歯髄細胞の象牙質分化マーカーの遺伝子の発現解析がリアルタイムPCRにて行われ、Wntシグナルの象牙芽細胞分化と象牙質形成に対する作用が解析できていること。さらに必要な消耗品や試薬の購入も現在のところ順調に行えている。今回の研究の結果についてはこれまでに平成28年日本歯科保存学会春季学術大会と平成29年日本歯科保存学会秋季学術大会において発表を行っている。現在、これらのことを考え合わせ、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。分泌型タンパク質であるWntファミリーは歯の発生過程に発現し、各種細胞の増殖と分化をコントロールしていることが知られている。象牙芽細胞分化ならびに象牙質形成にWnt10aとEctodinがどのように影響するかを調べることを目的としてラット下顎切歯由来の歯髄培養細胞を用いて研究を行った。歯髄培養細胞にshRNA発現ベクターを導入しEctodinとWnt10aをknock downした細胞群(ectodin KD群ならびにWnt10a KD群)と対照群について象牙芽細胞様細胞への分化ならびに象牙質様石灰化結節の形成を解析し比較を行った。Ectodin KD群のEctodin発現とWnt10a KD群のWnt10a発現はそれぞれ対照群に比較して有意に減少し、knock down効果が確認された。Ectodin KD群とWnt10a KD群では象牙質石灰化結節の形成が抑制され、Runx2、DSPPの発現も対照群に比較して有意に抑制された。しかし、Wnt10a KD群ではEctodinの発現も抑制されたが、Ectodin KD群ではWnt10aの発現は抑制されなかった。
アポプロテインC-IIとC-IIIによる鶏脂肪組織リポプロテインリパーゼ反応の制御機構

(1)鶏、ラットおよびヒトの血漿から超遠心で分離したカイロミクロンおびVLDLからMorrisettらの方法によりApoproteinを調製した。分離したApoproteinを6M尿素で可溶化後、分子量1万の限外濾過により得たApo C群をMno Q^Rに供し、0.4MまでのNaCl直鎖グラディントで溶出した。各種動物から調製したいずれの試料も、0.10.2M付近にリポプロテインリパーゼ(LPLase)活性化作用を示すApo C-IIのピークが溶出した。さらに、ヒトでは、Apo C-IIIを含むと考えられる0.25M付近のピーク(Apo C-III画分)にはミルクLPLase阻害活性が確認されたが、ラットのApo C-III画分はラットLPLase活性に殆ど影響せず、鶏Apo C-III画分が鶏LPLase活性を逆に活性化した。(2)鶏Apo C-IIIの存在の有無を確認するために、逆相カラム(Resource RPC)を用いて鶏Apo C-III画分を分離精製し、N末端分析を行った。逆相カラムではメインピークと多数のマイナ-ピークが検出された。メインピークのN末端アミノ酸配列は鶏Apo A-Iと100%の相同性を示し、Apo A-Iの部分分解物であることが明らかとなった。PMSFなどのProtease阻害剤を添加しても、同物質がメインピークであることから、鶏リポプロテインにはApc C-IIIは存在せず、かわりにApo A-Iの分解物が存在して、しかもApo A-Iの分解物は鶏LPLase活性化作用がある可能性が示唆された。(3)トリオレインエマルジョンに鶏Apo C-IIおよびApo A-I分解物を30μg/ml添加したところ、鶏LPLaseのVmはいずれも上昇したが、Apo A-I分解物の上昇率はApo C-IIの約1/3であった。(現在、本結果の投稿を準備中である)(1)鶏、ラットおよびヒトの血漿から超遠心で分離したカイロミクロンおびVLDLからMorrisettらの方法によりApoproteinを調製した。(現在、本結果の投稿を準備中である)
カイコにおけるジーンターゲティングの分子機構とその効率向上

前年度のカイコにおいてクロマチン制御機構が他生物と異なる可能性が示唆されたため,本年度はカイコHP1アイソフォームの機能的な相違に着目しながら,カイコにおけるクロマチン制御機構についてより詳細に解析を試みた.前年度構築した転写抑制効果測定系においてレポーター遺伝子のプロモーターより活性の強いものに変えた場合における転写抑制効果を検証した.HP1αにおいては転写抑制効果が認められなかったが,HP1βにおいては明らかな転写抑制が観察された.前年度の結果と一致するものであり,カイコのHP1はアイソフォームにより局所的な転写抑制活性が異なることが明らかとなった.HP1αは局所的な転写抑制活性は弱いものの,ヘテロクロマチンの拡張に関わるタンパク質との強い相互作用を有しており,構成的なヘテロクロマチン形成に関わると考えられる.両者は互いに相互作用することから,制御領域における両者の相対比による転写抑制活性を変化させ,様々な遺伝子の転写レベルを調整していることが推測された.今回の研究により,HP1アイソフォームの機能的な相違が明らかとなり,昆虫におけるヘテロクロマチン形成機構の基礎的理解が進んだと考えられる.人為的に局所的ヘテロクロマチン形成の阻害あるいはユークロマチンへの誘導を促進することが可能となれば,組換え効率の向上が期待でき,ひいてはジーンターゲティングの効率を向上させることが可能になると考えられる.クロマチン構造とジーンターゲティング効率の相関に注目し,まずクロマチン構造の解析を行う為にクロマチン関連因子のクローニングおよび機能解析を行った.クロマチン関連因子としてコアヒストン4種類そしてH2Aバリアントである,H2AX, H2AZ,およびH3 (H3.2)のバリアントであるH3.3をクローニングした。またヘテロクロマチンのランドマークとして知られているHP1α, HP1βのカイコホモログもクローニングした.ヒストンのアミノ酸配列はカイコにおいても高く保存されており,クロマチンリモデリングに重要なヒストンの翻訳後修飾も存在する.特にヘテロクロマチン形成に重要なHP1の標的として知られるH3の9番自のリジンのメチル化(H3K9me)も確認した.しかし,IPなどの相互作用解析ではカイコHP1との相互作用は検出できていない.HP1の機能解析をする上で,ヘテロクロマチン形成による転写抑制効果を検出する為に,Gal4-UASシステムを利用した新規測定系を構築した.この実験系を利用してカイコHP1の転写抑制効果を見たところ,他の生物で提唱されている転写抑制モデルとは異なる機構を有している可能性が示唆された.新規向上因子のスクリーニングに関しましては,ターゲテット細胞においてターゲティング後の変化が視覚的により判断しやすくするために,ゲノム上のコンストラクトの改良を行った.スクリーニングベクターについても,このベクターへcDNAライブラリーから多様な遺伝子を導入する際のバイアスの影響を軽減する為に,gateway technology (Invitrogen)を利用するものではなく,制限酵素によるdigestionとLigationによって遺伝子導入できるように改良した.これにより、よりランダムにそして簡便にターゲティング効率向上因子をスクリーニングすることが可能であると考えられる.前年度のカイコにおいてクロマチン制御機構が他生物と異なる可能性が示唆されたため,本年度はHP1に着目しながら,カイコにおけるクロマチン制御機構についてより詳細に解析を試みた.前年度構築した転写抑制効果測定系において各HP1のdsRNAを利用し,ノックダウン(KD)した場合における転写抑制効果を検証した.HP1α,HP1βは単独でも抑制効果かおることが示唆された.またGAL4DBD-Su(var)3-9発現区においては,抑制効果の解除がみられた.このことは免疫沈降法の結果と併せてSu(var)3-9はHP1αと協調して働いているがHP1βとは協調していないことを示唆している.興味深いことにHP1αKD時とは異なりHP1βKD時のGAL4DBD-HP1β発現区において,転写の抑制が維持され続けていた.HP1βがHP1αに比べ抑制効果が強くみられることから,KDし発現量が減少しても,残存している少量のHP1βで転写抑制が可能であり,このことはHP1αよりもHP1βの方が高い転写抑制能を有する可能性を示唆している.HP1のアイソフォームの違いによる転写抑制の差異についての報告は他の生物においても未報告であり,来年度からの研究でクロマチン制御機構に対する新たな知見が得られる可能性が考えられる.またジーンターゲティングの効率向上因子をスクリーニングするために,改良したスクリーニングベクターに適した形状を有するcDNAライブラリーを作製している.前年度のカイコにおいてクロマチン制御機構が他生物と異なる可能性が示唆されたため,本年度はカイコHP1アイソフォームの機能的な相違に着目しながら,カイコにおけるクロマチン制御機構についてより詳細に解析を試みた.前年度構築した転写抑制効果測定系においてレポーター遺伝子のプロモーターより活性の強いものに変えた場合における転写抑制効果を検証した.HP1αにおいては転写抑制効果が認められなかったが,HP1βにおいては明らかな転写抑制が観察された.前年度の結果と一致するものであり,カイコのHP1はアイソフォームにより局所的な転写抑制活性が異なることが明らかとなった.HP1αは局所的な転写抑制活性は弱いものの,ヘテロクロマチンの拡張に関わるタンパク質との強い相互作用を有しており,構成的なヘテロクロマチン形成に関わると考えられる.両者は互いに相互作用することから,制御領域における両者の相対比による転写抑制活性を変化させ,様々な遺伝子の転写レベルを調整していることが推測された.今回の研究により,HP

1アイソフォームの機能的な相違が明らかとなり,昆虫におけるヘテロクロマチン形成機構の基礎的理解が進んだと考えられる.人為的に局所的ヘテロクロマチン形成の阻害あるいはユークロマチンへの誘導を促進することが可能となれば,組換え効率の向上が期待でき,ひいてはジーンターゲティングの効率を向上させることが可能になると考えられる.
トレーサー内蔵ペレットを用いたプラズマ粒子輸送の新高精度計測

トレーサー内蔵固体ペレット(TESPEL)を用いることによって、大型ヘリカル装置(LHD)における不純物の粒子輸送特性を定量的に評価することを目的として実験を行った。CHS装置では実績のある局所的粒子輸送係数の導出を目的とした可視域における荷電交換分光(CXRS)計測についてはLHDでは有意なデータを得ることが出来なかったが、その原因の解明を行い、今後の実験において高い信号強度が得られると期待される不純物粒子種についての検討を行った。その結果、LHDにおける典型的な放電条件では、最適不純物粒子種はフッ素F、マグネシウムMg、及びアルミニウムAlが適当であることを示した。並行して、金属であるチタニウム(Ti)不純物をトレーサーとしたTESPEL入射実験を行い、チタンイオンからの線スペクトルK_α線を空間的に3コード(線積分値)、真空紫外域の線スペクトルを1コード、それぞれ20-50msの時間分解能で計測した。この観測結果と一次元不純物輸送コードMISTを使った計算結果とを比較することによって、ファクター2以内の精度で粒子輸送係数を得た。この手法によりLHDにおける不純物粒子輸送特性の密度依存性などについて定量的な評価を行うことができた。これらの成果により、高精度輸送計測手法の基礎を確立することができたと言える。今後の本計測手法における観測点の増加、時間分解能及びS/N比の向上によって局所的粒子輸送係数の導出まで十分期待できるものであり、磁場閉じ込め型核融合炉方式においてますます重要となっている粒子輸送の物理機構解明に大きく貢献することが期待される。粒子輸送の研究を進めるためにトレーサー内蔵ペレットの方式を提案し、この原理検証のため、CHSヘリカル装置においてトレーサー内蔵固体ペレット(TESPEL)を入射する実験を行った。TFCPELでは外殻が水素同位体でできており、内側コアが低Z材であるのに対して、TFSPELは外殻がポリスチレン(炭素と水素のみの重合体)で、内側コアがLiHである。従って、TESPELは室温で扱えるので、射出装置が簡単になりCHSのような中型装置で実験するのに向いている。典型的なTESPELではポリスチレン球殻の直径が300μm、厚さは50μmである。LiHのブロックは約50μm直径相当であるが、形状は必ずしも球形ではない。ペレットは10気圧程度の高圧ヘリウムガスで加速し、典型的なペレットの速さは300m/sである。CHSのターゲットプラズマは1MW程度のNBIで加熱される。このNBIは同時に荷電交換再結合分光(CXRS)観測のための中性ビーム源としても利用される。ペレットからの溶発中の光は光学系で集光され、ハーフミラーによって分割されたあと、フィルターを通して光電子増倍管で検出される。さらに、2台のCCDカメラでLiII(あるいはLiI)などの像を観測するようになっている。CCDカメラの画像によると、ペレットはプラズマ中心部まで到達し、LiIの強い発光領域は奥行き30mm程度内に局所的に観測される。光電子増倍管でのHαの信号は約500μs続き、その後LiIIが約50μsの間発光する。これらの結果からトレーサー粒子が局所的にデポジットされたことがわかる。LiIIICXRS光の発光強度は十分なものであることがわかった。LiIIICXRS光のピークに達する時間差δtと既知の検出器間の距離から、拡散係数を算出し、温度依存性などを見いだした。上記のようにTESPELを用いて粒子輸送の研究のための新しい計測方式が世界で初めて実験的に実施された。このCHSでの初期実験結果は局所粒子輸送の研究に有用な方法であることを示している。トレーサー内蔵固体ペレット(TESPEL)を用いた計測法の基本概念はプラズマ中で局所的にトレーサー粒子をデポジットし、輸送特性を局所的に計測することである。

光電子増倍管と光学フィルター(Hα、Li I、Li II)の組み合わせによりCHSにおいて計測したデポジション特性について、直径が220から300μmのTESPELを用いた時のトレーサー粒子のデポジション位置とデポジションの幅の実験データとプラズマ密度、温度などから計算したそれらの値との比較をした結果、用いたアブレーションモデルは実験結果と近いことが判明した。また、デポジションの幅はプラズマ半径の12%以下におさまっており、局所性は充分実現している。LiイオンのCXRSライン光として波長449.9nm(LiIII)を観測し、Li^<+3>の密度は明確に拡散特性を持っていることが分かったので、拡散係数Dを求めることができる。得られた拡散係数Dの絶対値は0.025m^2/sから0.17m^2/sの間に渡っている。また、Dの値は電子温度にともなって上昇している。これは経験的スケーリングと傾向が合っている。同一ショットで得られたDのプラズマ半径方向の依存性を見ると、外側にいくほど急激に上昇し、空間依存性についての初期データも得られた。LHDにおいてもTESPEL入射実験を開始した。500μmの直径のTESPELを用いて入射実験を行ったところ、ペレット侵入長はr/a=0.7程度であり、アブレーションのモデル計算ともほぼ合致する。トレーサー粒子の局所デポジションについてもCHSの場合と同様に実証できた。トレーサー粒子の振る舞いについては低密度プラズマの場合には観測できており、再結合光の減衰時間は粒子閉じ込め時間程度であった。今後システマティックな実験研究を行える見通しができた。トレーサー内蔵固体ペレット(TESPEL)を用いた計測法の基本概念はプラズマ中で局所的にトレーサー粒子をデポジットし、輸送特性を局所的に計測することである。LiイオンのCXRSライン光として波長449.9nm(LiIII)を観測し、Li^<+3>の密度は明確に拡散特性を持っていることをCHSで確認できたことを受けて、大型ヘリカル装置(LHD)においても同様な実験を開始したところ、計測にも兼用しているNBI加熱ビームのエネルギーが160keV程度と高い(荷電交換断面積の低下)ことや、ダイバータ部からの背景光が非常に強い(スクレープオフ層の厚さが原因と考えられる)ことが判明し、CHSに比べ可視域でのCXRS光観測が困難であることがわかってきた。これを克服するため、VUV域のCXRS光測定やX線領域の測定をトレーサー粒子追跡手段とすベキであると結論した。VUV域のCXRS光測定については真空紫外域の装置を組み立てる必要があり設計検討に入った。また、特性X線については、限られた視線ではあるが、価数のある程度高いトレーサー(チタンなど)についてX線パルス高分析器(X線PHA)によりトレーサーからの発光Kα線が明瞭に観測できるという結果を最近得た。そこでは電離進行特性と拡散特性が見られ、不純物輸送コードとの比較も始めた。チタンの局所デポジションから始まるこの一連の実験と不純物輸送の解析は世界で初めての成果である。しかも、これらの知見から計測原理実証を経て、粒子輸送の高精度計測へと発展させる準備は整ったと言える。
出芽酵母におけるホスファチジルエタノールアミンのリモデリング機構に関する研究

出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて生育に必須なリン脂質であるphosphatidylethanolamine(PE)のアシル鎖のリモデリング機構の解析を行った。これまでに、標識された短鎖PEが細胞内に取り込ませて、その代謝変換を調べた結果、短鎖PEのアシル鎖が正常な長さのアシル鎖を持つPEへリモデリングされることを〓〓にした。酵母にはPEのリモデリング機構が存在することが示唆された。そこで、リモデリングで由来したPEが細胞内に生理機能を〓っているかどうかについて〓べたところ、それらPEがPCへ変換されることを明らかにした。これらのことから、短鎖PEが細胞内に取り込まれた後、アシル鎖のリモデリングにより細胞内のPEブールに入って、普通な生合成で由来したPEと同様な代謝変換を受けることが示唆された。次に、sn-1位へアシル鎖を転位するacyltransferase活性をもち、lyso-PAの合成に関わるGpt2pとSct1pが短鎖PEのリモデリングに関与するかどうかについて調べたところ、GPT2とSCT1遺伝子の単独破壊株では、PEのリモデリングの欠損が見られていなかった。また、この2つ遺伝子はsynthetic lethalであるため、染色体上ΔGPT2ΔSCT1で、温度感受性なGpt2p或いはSct1pを発現するplasmidを持つ株を作製して、制限温度下でPEのリモデリングについて調べた結果、それら株でもリモデリングの欠損が見られていなかった。これらのことから、Gpt2pとSct1pがなくてもPEのリモデリングが正常にできることが示された(1)出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて生育に必須なリン脂質であるphosphatidylethanolamine(PE)のアシル鎖のリモデリング機構の解析を行った。標識短鎖PEが細胞内に取り込まれた後、まずsn-2位のアシル鎖が、次にsn-1位のアシル鎖がリモデリングされることを明らかにした。また、これまでに報告されたリソリン脂質アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ALE1とSLC1の欠損株が、in vivoで短鎖PEのリモデリングに欠損を持つことが示唆された。一方、標識短鎖PEを用いて、in vitroでPEのリモデリングを調べる系を構築した。その系を用いた解析の結果、ALE1とSLC1欠損株の細胞抽出液では、PEのリモデリング活性が大きく減少していることが示された。以上の結果により、ALE1とSLC1がPEのリモデリングに関わることが強く示唆された。(2)胞子膜形成における各脂質の役割の解析を行った。培地成分でPE及びPC合成を制御できる株を用いて、PE及びPCの合成を抑制し、細胞内リン脂質組成と胞子形成の効率を調べた。その結果、どちらのリン脂質の合成を抑制した場合にも胞子膜形成に欠損が見られ、PCとPEの合成が胞子膜形成に必要とされること、PE合成の減少はより大きい影響を与えることを明らかにした。これらのことから、Gpt2pとSct1pがなくてもPEのリモデリングが正常にできることが示された
有糸分裂期のDNA損傷の影響と応答

有糸分裂期は放射線感受性が最も高い細胞周期ステージであるが、その理由は明らかでない。本研究で用いたモデル系である分裂酵母のテロメア近傍には、DNA損傷応答遺伝子を含む、種々のストレス応答遺伝子がコードされているが、通常は、その発現が抑制(サイレンシング)されている。このサイレンシングには、染色体凝縮因子と、これをリン酸化する酵素が関与することを見いだした。この領域のDNA損傷応答遺伝子のサイレンシングにより有糸分裂期の損傷応答活性が低下するという新たな分子機構を見いだすことができた。凝縮した染色体が修復タンパク質の損傷部位へのアクセスを妨げる、あるいは染色体運動のため、二重鎖切断部位が互いに離れてしまい、修復不能であるといった理由が考えられる。また、有糸分裂期には、DNA損傷チェックポイントが機能しないとも考えられている。これらの予想は互いに排他的ではなく、有糸分裂期の高い放射線感受性は、これらの要因の総和の結果かもしれない。本研究の目的は、分裂酵母とヒト培養細のそれぞれの利点を活かし、1)有糸分裂期の損傷部位への損傷修復タンパク質の集積能の検定、2)有糸分裂期における損傷修復能の検定、3)有糸分裂期において損傷をうけた染色体の動態を解析し、そして、4)有糸分裂期の放射線応答に対するスピンドルチェックポイントの作用機序(特に損傷察知)を解析することにある。本研究の開始直後、ヒト培養細胞系では、有糸分裂期の損傷能が低下することで、テロメア同士の融合を防止することが報告された(SCIENCE VOL 344 11 APRIL 2014)。このため、26年度は、分裂酵母を用いた研究を優先した。特に、テロメア近傍のDNA損傷が引き起こす細胞応答に注目し、その結果、テロメア近傍に存在する種々のストレスに応答して発現する遺伝子群の発現制御にかかわるタンパク質Bdc1を同定した。また有糸分裂期の代表的なチェックポイントであるスピンドルチェックポイントの活性化の指標として、セキュリン(分裂酵母のCut2)の修飾(おそらくリン酸化)を見いだした。有糸分裂期は最も放射線に対する感受性が高い細胞周期ステージであるにもかかわらず、この時期の放射線応答研究は未着手であった。有糸分裂期の細胞が放射線に対する感受性が高い理由として、1凝縮した染色体が修復タンパク質の損傷部位へのアクセスを妨げる、あるいは、2染色体運動のため、二重鎖切断部位が互いに離れてしまい、修復不能であるといった理由が考えられる。また、3有糸分裂期には、DNA損傷チェックポイントが機能しないとも考えられている。本研究では、前年度に引き続き、分裂酵母のモデル系を用い、特にテロメア近傍に存在するDNA損傷修復遺伝子を含むストレス応答遺伝子群の発現メカニズムの解析を行った。26年度に同定したBdc1タンパク質は、このテロメア近傍の遺伝子発現の制御因子である。このタンパク質の欠損により、通常は抑制(遺伝子サイレンシング)されるストレス応答遺伝子群が発現する。27年度は、この遺伝子サイレンシングに、クロマチンの凝縮が関与することを示唆する結果を得た。目下、このクロマチン凝縮に寄与する因子の同定を進めている。有糸分裂期の細胞の放射線に対する高感受性の理由として、「凝縮した染色体が修復タンパク質の損傷部位へのアクセスを妨げる」ことが考えられてきたが、我々の結果は、「凝縮した染色体が損傷応答遺伝子の発現を抑制する」という新たな概念を提示するものである。テロメア近傍の遺伝子サイレンシングに、クロマチンの凝縮が関与するという新規性の高い結果を得た一方、その背後の分子メニズムの解明が完璧ではない。今年度は。このサイレンシングに染色体凝縮因子と、これをリン酸化する酵素が関与することを見いだした。興味深いことに、この酵素は有糸分裂期に活性がピークとなる。これらの結果は、有糸分裂期には、テロメア近傍のクロマチンが凝縮することにより、遺伝子発現がサイレンシングされることを示唆する。この領域にDNA損傷応答遺伝子もコードされているので、このサイレンシングのメカニズムにより有糸分裂期の損傷応答活性が低下することも示唆する。テロメア領域のクロマチンが緩んだ状態であると、テロメア同士、あるいはテロメアと核膜との相互作用により、有糸分裂期における染色体分配に悪影響を及ぼすことが考えられる。本研究で見いだしたサイレンシング機構は、この悪影響を回避するために重要であると考えられる。

この領域のDNA損傷応答遺伝子のサイレンシングにより有糸分裂期の損傷応答活性が低下するという新たな分子機構を見いだすことができた。開始直後の報告(SCIENCE VOL 344 11 APRIL 2014)により、ヒト培養細胞系で、有糸分裂期の損傷能が低下することが示された。よって、分裂酵母モデル系での研究を推進した。特に、テロメア近傍に存在するストレス応答遺伝子群の発現制御にかかわる因子(Bdc1)を同定したことは大きな収穫であった。これらの遺伝子群の中には、損傷修復に機能するものも含まれており、ヒト培養細胞系で有糸分裂期において損傷能が低下する現象と関連する可能性がある。また、損傷誘導時にスピンドルチェックポイントの活性を簡便に測定する指標としてセキュリンの翻訳後修飾を見いだした。この指標は次年度の研究の推進に大いに役立つ。クロマチンの凝縮に関与する因子について、その欠損が引き起こす影響について精力的に解析する。放射線生物学27年度も分裂酵母モデル系を用いた研究を推進する。特に、テロメア近傍に存在するストレス応答遺伝子群の発現制御にかかわる因子(Bdc1)の作用機序を明確にすること、またセキュリンの翻訳後修飾の実体を解明することを大きな目標としたい、本研究では、ヒト培養細胞と分裂酵母の実験系を用いる予定であった。しかしながら、開始当初に、ヒト培養細胞系における我々の疑問点が、他のグループにより解明・報告されたので、分裂酵母のモデル系における実験に専念した。このため、ヒト培養細胞を用いた実験に必要な経費が未使用となった。ヒト培養細胞系の研究を保留したこと、また内部経費により試薬等を購入できたことにより、26年度は使用額が計画を下回った。分裂酵母を用いた研究の推進のために技術補佐員を雇用する。また、実験に必要な試薬等を購入する。27年度は、分裂酵母モデル系の研究推進のため、試薬等の購入量と非常勤技術補佐員の雇用時間の増加を予定している。
トマト黄化葉巻病のリカバリー機構解明と新規防除法の確立

トマト黄化葉巻病はトマト黄化葉巻ウイルス(TYLCV)による病気で、トマト栽培に大きな被害を与えている。ウイルス病であるため、一度感染してしまうと治療することはほぼ不可能である。しかし、高温時にまれに罹病植物から病徴のない葉が出る現象(リカバリー)が見られる。そこで、この現象を人工的に促進することが出来れば新たな防除法となるかもしれない。そこで、本研究では生育温度を高温にすることでリカバリーを引き起こすことが出来るのか検討したところ、30°Cにおいて、約半数の植物がリカバリーを起こした。また、リカバリーを起こしてもウイルスがいなくなるわけではないことが確認された。近年日本ではジェミニウイルスであるトマト黄化葉巻ウイルス(TYLCV)がトマトで激発し、エマージングウイルスとして最重要病害となっている。病徴は葉の黄化と葉巻に加え、茎頂付近の生育が阻害され萎縮するため大幅な収量減となる。しかし、一度発病した苗でも低頻度ながら病徴が回復(リカバリー)し、あたかも健全な生育を示すものが見受けられる。本研究課題では、このリカバリーした植物がウイルス抵抗性を持つのかどうか、また、、ウイルス抵抗性を持つ場合は実用化が可能であるか検討する。そこで本年度は人為的にリカバリーを誘導することができるのか検討を行った。まず、トマトにTYLCVの感染性クローンを接種し、発病を確認した植物を30°Cおよび35°Cの人工気象器に移したところいずれの植物からもリカバリーが確認できた。しかし、若干生理障害が認められたため、今後、最適な日照条件やより低い温度での検討が必要である。また、これらのリカバリーした植物からはPCRによりウイルスが検出されたことから、リカバリーした部位はウイルスフリーになったわけではないことが示された。日本はもとより世界中のトマト圃場ではトマト黄化葉巻ウイルス(TYLCV)による病気が激発しており、その対策が求められている。そこで本研究課題では、まれに発病トマトから病徴を示さない葉が展葉する現象(リカバリー)に着目し、そのメカニズムと治療法の開発を検討することを目指した。昨年度は30°Cおよび35°Cにおけるリカバリー現象の出現を検討したが、高温による生理障害が発生した植物が多く、また、リカバリーした植物の数も少なく、35°Cではその傾向がより顕著だった。そこで今年度は栽培条件を30°Cに設定し、給水などの栽培環境の改善に加え、より多くの植物を用いてリカバリーの観察を行った。まず、24°CにおいてTYLCVの感染性クローンを接種し、発病を確認したトマトを30°Cに移行したところ、移行してから17日後には8株中2株でリカバリーが確認された。また45日後ではさらに2株のリカバリーが確認できた。このことから、30°Cにおいてリカバリーは一定の割合で発生するもののその頻度は約50%と低く、高温に移行するだけでは実用的な防除法とはならないものと考えられた。また、リカバリーした葉からはPCRによりTYLCVが検出されたことから、リカバリーではウイルス移行が抑えられないことが確認された。高温条件下でリカバリーした植物に加え、健全植物にも若干生理障害が起きたため、日照時間や温度条件などの検討が必要になった。植物病理学リカバリーした植物は、保毒虫の吸汁によりウイルスの感染を防ぐことが出来るのか検討する。また、リカバリーした葉ではウイルスフリー化しているわけではないことが明らかになったため、高温の状態から室温まで戻した時に、再度病徴が出ないか確認する必要がある。栽培条件検討に時間がかかり、若干実験に遅れが生じたため、使用しきれなかった試薬代を来年度に繰り越した。遅れた分の実験は今年度行うため、本年度の予算は計画通り使用する予定である。
校長の文化的リーダーシップの構成要因に関する研究

平成8年度においては、まず初年度(平成7年度)の連続として、校長、教員の双方を対象にした(同一校)学校改善を規定する学校文化の要因に対する意識調査を行って、校長、教員の学校文化に対する認識の相違の比較を整理した。その結果、校長が文化的リーダーシップを発揮していく上で校長が認識しているわが校の文化観と教員の文化との間にはかなりのちがい(ズレ)があり、このズレから生じるコンフリクトが校長がリーダーシップをとるうえでの難題となっていることがわかった。特に校長のリーダーシップに対する校長自身の理想と現実、教員のそれらとの間には大方の領域においてかなりの認識のズレのあることがわかり、「期待されている」リーダー行動をとることが校長にとっては容易ではないことがつかめた。次に本年度は、校長のリーダーシップスタイルのモデル化をはかり、これを実証するために新たに民族誌的(エスノグラフィ)方法を使ってのフィールドワーク(福岡県、兵庫県の小・中・高校4校)を行った。リーダーシップのスタイルに関しては、技術的リーダーシップ、文化的リーダーシップ、教育的リーダーシップの3つを策定し、これらのスタイル間を調和する点にすぐれたリーダーシップを発揮することによって学校改善が進むというパラダイムを設定した。そのための実証方法としては、従来の統計調査の方法ではなく、校長の日常レベルでの行動観察と言説とを詳細に記述することを通して、その資料に基づいての分析、解釈を試みようとした。しかしながらこの研究方法は、校長職に適用するには全く新しい研究方法ということもあって、リーダーシップのスタイル化と、さらに記述化自体にかなりの精力と時間を費やした。従ってその分析、解釈は今後の大きな継続的課題(来年度科研申請)として残された。記述化の資料は今後の分析、解釈にあたってきわめて重要なものであるので、別冊として活用可能なものとして整理した。本年度(初年度)は校長の文化的リーダーシップを構成する学校改善と学校文化との関連要因のフレームワークの作成とそれに準拠したところの校長対象の悉皆調査を行った。関連要因の抽出のために文部省研究開発学校の校長(8人)を対象にした聞きとり調査をフィールドワークとして行いフレームワーク作成の基礎資料とし研究協説会を4度にわたって開催した。次に作成したフレームワークにもとずいて福岡市の義務制学校の校長(234名)を対象にした文化的リーダーシップ形成の意識調査を行った(回収率52%)、学校文化の定着期に調査時期を設定する必要があったので(1996年3月)、目下その結果分析を行っているところであるが仮説はほぼ検証されつつある。さらに本年度はフレームワーク作成のためにアメリカの校長の文化的リーダーシップのケーススタディーを比較のために文面調査によって行いその成果も発表した。来年度は意識調査の結果をもとにしていよいよ事例研究を展開していくことにする。

リーダーシップのスタイルに関しては、技術的リーダーシップ、文化的リーダーシップ、教育的リーダーシップの3つを策定し、これらのスタイル間を調和する点にすぐれたリーダーシップを発揮することによって学校改善が進むというパラダイムを設定した。そのための実証方法としては、従来の統計調査の方法ではなく、校長の日常レベルでの行動観察と言説とを詳細に記述することを通して、その資料に基づいての分析、解釈を試みようとした。しかしながらこの研究方法は、校長職に適用するには全く新しい研究方法ということもあって、リーダーシップのスタイル化と、さらに記述化自体にかなりの精力と時間を費やした。従ってその分析、解釈は今後の大きな継続的課題(来年度科研申請)として残された。記述化の資料は今後の分析、解釈にあたってきわめて重要なものであるので、別冊として活用可能なものとして整理した。
Wnt/βカテニン経路に対する麻酔薬とオピオイドの作用に関する研究

下垂体前葉細胞における脱分極によるプロオピオメラノコルチン(POMC)産生に対する静脈麻酔薬の作用を解析した。静脈麻酔薬プロポフォール、チオペンタール、ミダゾラム、ジアゼパムは、L型Caチャネルを抑制してCa流入を低下させるとともに、Protein kinase AのサイクリックAMP感受性を低下させてPOMC産生を抑制することが示唆された。アストロサイトにおける低酸素によるエリスロポイエチン誘導に対するミダゾラムの作用について検討した。ミダゾラムが低酸素誘導因子(HIF)-1alphaの核内移行を抑制することにより低酸素によるエリスロポイエチン発現誘導を抑制することが示唆された。Wnt蛋白は中枢神経系の発達における様々な段階で重要な役割を果たしている。Wnt蛋白が活性化する情報伝達系には、Wnt/βカテニン経路とβカテニン非依存性経路(Wnt/Ca2+経路、平面細胞極性経路)があるが、Wnt/βカテニン経路の解明が最も進んでいる。神経障害性疼痛の成立においてグリア細胞においてWnt/βカテニン経路が活性化すること、Wnt/βカテニン経路の抑制によって神経障害性疼痛の成立が抑制されることが報告された。一方、幼少期における全身麻酔薬投与の副作用として注目されている神経毒性には、神経発生過程に対する薬物の影響が関与する可能性があると考えられているが、詳細な機序は不明である。神経発生に重要な役割を果たすWnt/βカテニン経路やグリア細胞が全身麻酔薬の神経毒性に関与する可能性については、ほとんど注目されていない。本研究ではこれまでに、静脈麻酔薬であるミダゾラムがアストロサイトにおいて低酸素により誘導されるエリスロポイエチンの発現が低下すること、この現象にはミダゾラムによる低酸素誘導性因子の核内移行の抑制が関与していることを明らかにした。本研究ではこれまでに、静脈麻酔薬であるミダゾラムがアストロサイトにおいて低酸素により誘導されるエリスロポイエチンの発現が低下することを明らかにした。これまでにWnt/βカテニン経路は、細胞の遺伝子発現の調節、細胞増殖や分化に影響を及ぼし、神経系の発生および様々な中枢神経系の病態、すなわち脳虚血、精神疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかんなどに関与することが報告されている。神経障害性疼痛の成立においてマイクログリアにおいてWnt/βカテニン経路が活性化すること、Wnt/βカテニン経路の抑制によって神経障害性疼痛の成立が抑制されることが報告された。しかし、神経障害性疼痛の治療に使用される薬物のWnt/βカテニン経路に対する影響は不明である。神経発生に重要な役割を果たすWnt/βカテニン経路が全身麻酔薬の神経毒性に関与する可能性については、ほとんど注目されていない。本研究では、静脈麻酔薬ミダゾラムの作用によりアストロサイトにおいて低酸素により誘導されるエリスロポイエチンの産生が低下すること、この現象にはミダゾラムによる低酸素誘導性因子の核内以降の抑制が関与することを明らかにした。グリア細胞における情報伝達機構に対する麻酔薬の作用を生化学的方法や免疫組織学的方法を用いて解明する予定である。麻酔科学
破骨細胞の分化と機能発現の制御による骨代謝研究の確立

培養破骨細胞の分化と骨吸収機能の発現に対する破骨細胞分化因子(RANKL)と破骨細胞分化抑制因子(OPG)の作用,またH-ATPaseやカテプシンKに対する特異的な阻害剤の生物学的作用を中心に研究するin vitroおよびin vivoでの実験を行った.主な研究方法は,破骨細胞前駆細胞および成熟破骨細胞の培養,共培養した象牙質切片の反射電子像を基にした画像解析による吸収量の定量的評価,破骨細胞の微細構造観察,液胞型H-ATPase,カテプシンKの分子発現の光顕・電顕的免疫組織化学,細胞構造と吸収窩の走査電顕観察などであった.その結果,それぞれのサイトカインや阻害剤の特異的作用を明らかにすることが出来た.in vitroの実験系では,単核の破骨細胞前駆細胞を象牙質切片上に培養し,成熟破骨細胞への細胞分化の過程と吸収機能の発現に対するRANKL, OPGの作用およびH-ATPaseとカテプシンK特異的阻害剤の作用を解析した.また多核化した成熟破骨細胞を象牙質切片上に培養し,細胞構造,生存時間,吸収機能の発現に対するこれらの物質の作用について明らかにした、さらに骨細胞前駆細胞を骨,脱灰骨、硝子軟骨の各切片上で培養し,成熟破骨細胞への細胞分化と骨吸収機能の発現が基質の特性によって異なることを明らかにした.in vivoの実験系では,エストロゲン欠乏型骨粗鬆症や薬物療法における破骨細胞の分布と構造・機能変化を定性的かつ定量的に解析した.骨吸収の抑制に対するOPGならびにビスホスフォネートの作用機構を定量形態学的・免疫組織化学的に解析し,これらの分化因子や薬剤が破骨細胞の分化と機能発現に及ぼす生物学的作用を明らかにした.これらの研究を通じ,in vivoおよびin vitroの実験系における破骨細胞による骨吸収機構を組織化学的・免疫組織化学的に解明する解析法が確立され,さらに破骨細胞の細胞分化と機能発現を調節することによって,種々の代謝性骨疾患における骨改造・骨代謝の制御がOPGによって可能となることが示唆された.培養破骨細胞の分化と骨吸収機能の発現に対する破骨細胞分化因子(RANKL)と破骨細胞分化抑制因子(OPG)の作用,またH-ATPaseやカテプシンKに対する特異的な阻害剤の生物学的作用を中心に研究するin vitroおよびin vivoでの実験を行った.主な研究方法は,破骨細胞前駆細胞および成熟破骨細胞の培養,共培養した象牙質切片の反射電子像を基にした画像解析による吸収量の定量的評価,破骨細胞の微細構造観察,液胞型H-ATPase,カテプシンKの分子発現の光顕・電顕的免疫組織化学,細胞構造と吸収窩の走査電顕観察などであった.その結果,それぞれのサイトカインや阻害剤の特異的作用を明らかにすることが出来た.in vitroの実験系では,単核の破骨細胞前駆細胞を象牙質切片上に培養し,成熟破骨細胞への細胞分化の過程と吸収機能の発現に対するRANKL, OPGの作用およびH-ATPaseとカテプシンK特異的阻害剤の作用を解析した.また多核化した成熟破骨細胞を象牙質切片上に培養し,細胞構造,生存時間,吸収機能の発現に対するこれらの物質の作用について明らかにした、さらに骨細胞前駆細胞を骨,脱灰骨、硝子軟骨の各切片上で培養し,成熟破骨細胞への細胞分化と骨吸収機能の発現が基質の特性によって異なることを明らかにした.in vivoの実験系では,エストロゲン欠乏型骨粗鬆症や薬物療法における破骨細胞の分布と構造・機能変化を定性的かつ定量的に解析した.骨吸収の抑制に対するOPGならびにビスホスフォネートの作用機構を定量形態学的・免疫組織化学的に解析し,これらの分化因子や薬剤が破骨細胞の分化と機能発現に及ぼす生物学的作用を明らかにした.これらの研究を通じ,in vivoおよびin vitroの実験系における破骨細胞による骨吸収機構を組織化学的・免疫組織化学的に解明する解析法が確立され,さらに破骨細胞の細胞分化と機能発現を調節することによって,種々の代謝性骨疾患における骨改造・骨代謝の制御がOPGによって可能となることが示唆された.培養破骨細胞の分化(多核化)と機能発現(波状縁形成と吸収能の獲得)に対するRANKLとOPGの作用,またH-ATPaseやカテプシンKに対する特異的な阻害剤の生物学的作用を中心に研究するin vitroおよびin vivoでの実験を行った.主な研究方法は,破骨細胞前駆細胞および成熟破骨細胞の培養,共培養した象牙質切片の反射電子像を基にした画像解析による吸収量の定量的評価,破骨細胞の微細構造観察,液胞型H-ATPase,カテプシンK,カルシトニン受容体の分子発現の光顕・電顕的免疫組織化学,細胞構造と吸収窩の走査電顕観察などであった.その結果,それぞれのサイトカインや阻害剤の特異的作用を明らかにすることが出来た.in vitroの実験系では,単核の破骨細胞前駆細胞を象牙質切片上に培養し,成熟破骨細胞への細胞分化の過程と吸収機能の発現に対するRANKL, OPGの作用およびH-ATPaseとカテプシンK特異的阻害剤の作用を解析した.また多核化した成熟破骨細胞を象牙質切片上に培養し,細胞構造,生存時間,吸収機能の発現に対するこれらの物質の作用について明らかにした.in vivoの実験系では,(1)OPG遺伝子欠損マウスでの軟骨内骨化の解析と歯の移動実験による歯槽骨の構造変化の形態学的解析を行い,OPGの重要性を解析した。

まず正常マウスの骨組織におけるRANKLとOPGの局在を,光顕・電顕レベルで免疫染色する.次に正常マウスとOPG遺伝子欠損マウスの軟骨・骨組織の解析を行った.(2)卵巣摘出,(OVX)マウスにおける破骨細胞性骨吸収,破骨細胞数,破骨細胞構造,吸収機能の発現にOPGがいかに作用するかを組織学的・微細構造学的に研究した.また同じ実験系のマウスにビスフォスフォネート)を投与し,OPGの作用と比較検討した。実験ではマウスにOVXまたは偽手術(Sham)を行い,骨吸収の亢進による12週間後の骨量減少を確認した.対照群のマウスはOVXまたは偽手術後,無処理のまま飼育した.実験群では,OVXまたは偽手術時からOPGまたはBPを連日腹腔内投与し,骨吸収の抑制効果を検討した.培養破骨細胞の分化と骨吸収機能の発現に対する破骨細胞分化因子(RANKL)と破骨細胞分化抑制因子(OPG)の作用,またH-ATPaseやカテプシンKに対する特異的な阻害剤の生物学的作用を中心に研究するin vitroおよびin vivoでの実験を行った.主な研究方法は,破骨細胞前駆細胞および成熟破骨細胞の培養,共培養した象牙質切片の反射電子像を基にした画像解析による吸収量の定量的評価,破骨細胞の微細構造観察,液胞型H-ATPase,カテプシンKの分子発現の光顕・電顕的免疫組織化学,細胞構造と吸収窩の走査電顕観察などであった.その結果それぞれのサイトカインや阻害剤の特異的作用を明らかにすることが出来た.in vitroの実験系では,単核の破骨細胞前駆細胞を象牙質切片上に培養し,成熟破骨細胞への細胞分化の過程と吸収機能の発現に対するRANKL, OPGの作用およびH-ATPaseとカテプシンK特異的阻害剤の作用を解析した.また多核化した成熟破骨細胞を象牙質切片上に培養し,細胞構造,生存時間,吸収機能の発現に対するこれらの物質の作用について明らかにした.さらに骨細胞前駆細胞を骨,脱灰骨,硝子軟骨の各切片上で培養し,成熟破骨細胞への細胞分化と骨吸収機能の発現が基質の特性によって異なることを明らかにした.in vivoの実験系では,エストロゲン欠乏型骨粗鬆症や薬物療法における破骨細胞の分布と構造・機能変化を定性的かつ定量的に解析した.骨吸収の抑制に対するOPGならびにビスホスフォネートの作用機構を定量形態学的・免疫組織化学的に解析し,これらの分化因子や薬剤が破骨細胞の分化と機能発現に及ぼす生物学的作用を明らかにした,これらの研究を通じ,in vivoおよびin vitroの実験系における破骨細胞による骨吸収機構を組織化学的・免疫組織化学的に解明する解析法が確立され,さらに破骨細胞の細胞分化と機能発現を調節することによって,種々の代謝性骨疾患における骨改造・骨代謝の制御がOPGによって可能となることが示唆された.
マウスモデルを用いた子宮の細胞分化・増殖による胚受容能調節機構の解析

過去の知見から子宮の細胞増殖・分化は子宮の胚受容能の指標と考えることができるが、着床に機能的に関与するかどうかは不明である。その科学的理解が着床のしくみの解明や着床障害・不育症(習慣流産)の治療へつながる可能性があるため、本研究では、子宮内膜細胞の分化・増殖機構に着目し、子宮の細胞増殖能を調節しているRB(Retinoblastoma)遺伝子を欠損したマウスモデルを用いて、着床における上皮・間質細胞の分化・増殖の機構と、着床障害における細胞分化障害の機構を明らかにする。
多糖型シアリダーゼ阻害剤開発のための合成化学基盤

申請者は、新規シアル酸誘導体が効果的なシアリダーゼ阻害剤となることを見出している。これまでの本シアル酸誘導体の合成は、シアル酸に施した修飾が要因となり、その効率が低く、工程数を要していた。本年度は、まずこれらを解決できる効率的な有機合成法の確立に取り組んだ。低収率の原因と今後の展開を考慮し、最終段階でシアル酸の修飾を施すような合成法を立案した。終盤でのシアル酸修飾は、多糖構造の分解などを防ぐため、穏やかな条件下で実施できる前駆体を設定した。この前駆体を、修飾の足がかりとなる置換基Aをもつシアル酸誘導体と、アクセプター糖鎖とをグリコシル化で連結して合成する計画である。本年度は、この置換基Aを導入したシアル酸誘導体をC-H挿入反応を利用して合成することを中心に検討した。最初に設定したC-H挿入反応の前駆体は、シアル酸から11工程で問題なく合成できた。これをRh触媒を種々用いて、C-H挿入反応を検討したが、望む位置に置換基Aを導入することはできず、主に2位に導入したSPh基との反応が進行した。2位の立体化学を反転させた新たな前駆体を同様に合成し、さらに検討したがこの場合も目的物を得ることができず、副反応のみが進行した。主な副反応は、5位NHAc基とのN-H挿入反応であったことから、5位のアミノ基をアジド基に変更した前駆体を合成し、C-H挿入反応をさらに検討したが、アジド基との反応のみが進行した。また、別法での置換基A導入も種々検討した。いずれも、目的物を得ることが出来なかった。計画したC-H挿入反応による前駆体合成が、想像以上に困難であることが判明したため、予定よりもやや遅れ気味である。C-H挿入反応は、5位置換基の選択が重要であり、現在徹底的に検討しようと考えている。また、これとは別に置換基Aの導入手法の検討を進める予定である。置換基Aの導入に成功すれば、次の課題であるグリコシル化とその変換反応に取り組む。