hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インプラント周囲炎に関するリスク因子解析のための前向き研究

本研究の目的は,歯周炎患者に対するインプラント治療において,インプラント周囲軟組織の状態が予後に及ぼす影響について分析することにある.被験者は,歯周治療後にインプラントによる機能回復が終了し,3年以上メインテナンスを継続している患者109名を連続抽出した.インプラント周囲骨吸収に関与する因子の抽出にロジスティック回帰分析を行った結果,インプラント周囲骨吸収量が1.5 mm以上となる因子として性別(p = 0.002),および角化組織幅(p=0.0001)が抽出された.インプラントの長期的な安定性には,12 mm幅の角化組織が存在することが,適正である可能性が示唆された.現在インプラント周囲炎は、未だにどの治療法が優れているかという結論は導き出せていないため、この病変を未然に防ぐことは重要である。そこで本研究の目的は、インプラント周囲炎の発症前診断を確立するために調査する。本科学研究費申請期間においては、インプラント周囲炎の発症におよぼす全身的、局所的リスク因子の影響を明らかにする。この目的を達成するために昨年度実施した、明海大学歯学部付属明海大学病院歯周病科でインプラント治療が施された患者のデータベースを整理し、調査対象のリスク因子を決定するために文献的検討を行い、その結果から、インプラントの実態調査に関する前向き調査を開始した。った。その経過を以下に示す。当科において1998年2月から2012年3月までの14年1か月間にインプラント治療が施された患者は342名(男性104名、女性238名、平均年齢52.2 ±10.6歳、range 18 - 76歳)であった。また、埋入インプラント本数は1233本(1人あたり平均インプラント埋入本数3.6 ±2.8本)であった。想定されるリスク因子としては、全身的リスク因子、局所リスク因子を含む前向き調査を約60件実施した。拐取したデータをもとに解析を行うとともに、さらに調査、検査を精力的に追加している。現在インプラント周囲炎は、未だにどの治療法が優れているかという結論は導き出せていないため、この病変を未然に防ぐことは重要である。この目的を達成するために本年度は、1.明海大学歯学部付属明海大学病院歯周病科でインプラント治療が施された患者のデータベースの整理、2.調査対象のリスク因子を決定するために文献的検討を行った。その結果を以下に示す。想定されるリスク因子としては、全身的リスク因子として性別、年齢、喫煙歴、インシュリン依存型および非依存型糖尿病、種々の原因による骨粗鬆症、冠動脈疾患、ステロイド療法、化学療法または頭頸部放射線療法の既往である。また、局所的リスク因子として、口腔清掃状況、インプラント周囲ポケット深さ、インプラント周囲角化歯肉の有無、インプラントの部位・表面性状・直径、歯周病の既往、ブラキシズムの有無である。現在インプラント周囲炎は、未だにどの治療法が優れているかという結論は導き出されていないため、この病変を未然に防ぐことは重要である。そこで本研究の目的は、インプラント周囲炎の発症前診断を確立するために調査を実施し、そのリスク因子について明らかにすることである。この研究では、疾患発症にかかわる全身因子と局所因子の双方について調査を行うこととしている。すでに本施設でのインプラント治療終了時およびその経過についてのデータベース化を完了し、調査対象となる患者の選定、リスク因子の抽出をれ現在行っている。インプラント処置術前および術中のリスク因子としては、骨増大の併用や周囲隔靴粘膜の欠如、さらに名は埋入部位についても有意な差が出てきており、骨増大では特に自家骨移植を実施した症例について術後の骨レベルの変動が大き医という興味深い知見が得られ、現在データをまとめ論文を作成中である。また、インプラントの種類やその表面性状、補綴物の構造については現在解析中である。また、対象患者の全身状態についても詳しくデータを解析中で、年齢、性別、喫煙歴、インスリン依存型あるいは非依存型糖尿病、種々の原因による骨代謝障害、循環器系疾患さらには、様々な服薬状況についてもデータを蓄積し解析する予定である。さらに、最終年度である本年度は、全身因子や環境因子について蓄積したデータを解析し、全身、局所のリスク因子の解明に力を注ぎたい。

この目的を達成するために、1.明海大学歯学部付属明海大学病院歯周病科でインプラント治療が施された患者のデータベースの整理、2.調査対象のリスク因子を決定するために文献的検討を行った。その結果を以下に示す。1.当科において1998年2月から2012年3月までの14年1か月間にインプラント治療が施された患者は342名(男性104名、女性238名、平均年齢52.2 ±10.6歳、range 18 - 76歳)であった。また、埋入インプラント本数は1233本(1人あたり平均インプラント埋入本数3.6 ±2.8本)であった。2.想定されるリスク因子としては、全身的リスク因子として性別、年齢、喫煙歴、インシュリン依存型および非依存型糖尿病、種々の原因による骨粗鬆症、冠動脈疾患、ステロイド療法、化学療法または頭頸部放射線療法の既往である。また、局所的リスク因子として、口腔清掃状況、インプラント周囲ポケット深さ、インプラント周囲角化歯肉の有無、インプラントの部位・表面性状・直径、歯周病の既往、ブラキシズムの有無である。本調査の結果、性別およびインプラント周囲角化歯肉の幅においてインプラント周囲骨の吸収量と相関していることが明らかとなった。また、口腔清掃状況やブラキシズムの有無についてもインプラント周囲炎発症患者では多い傾向が認められた。本研究の目的は,歯周炎患者に対するインプラント治療において,インプラント周囲軟組織の状態が予後に及ぼす影響について分析することにある.被験者は,歯周治療後にインプラントによる機能回復が終了し,3年以上メインテナンスを継続している患者109名を連続抽出した.インプラント周囲骨吸収に関与する因子の抽出にロジスティック回帰分析を行った結果,インプラント周囲骨吸収量が1.5 mm以上となる因子として性別(p = 0.002),および角化組織幅(p=0.0001)が抽出された.インプラントの長期的な安定性には,12 mm幅の角化組織が存在することが,適正である可能性が示唆された.本研究の性格上、データベースの構築に時間を要することが事前より判っていたが、現時点ではこの目的はほぼ達成し、さらにこのデータから局所因子についての解析がほぼ終了することができた。さらに、全身因子についてのデータ解析を今後実施し、インプラント周囲炎発症にかかわるリスク因子を総合的に解析し、最終年度である今年度内にすべてのデータ解析を済ませ、結果の公表を行う予定である。歯周治療学今年度は、さらに解析の必要な全身因子について研究を進め、インプラント周囲炎発症に影響する局所、全身適因子について明らかにする。また、その結果について、公表を予定している。本結果で得られた発症に関わる因子を、事前に排除することにより、インプラント治療後のインプラント周囲炎八週リスクがどの程度低下するのかについては、今後の課題と考えている。本年度の目的は、患者のデータベースの整理および調査対象のリスク因子を決定することであり、この目的を果たせたと考える。このため、当初の計画通り順調に進展しているといえる。当該年度の調査実施中も研究全体の予算の有効使用に努め。その結果当初の計画よりもより少額の予算で予定通りの研究を実施することができた。その予算を次年度に有効活用し、より多くのデータ収集に充当したい。今後は、各患者のリスク因子をさらに抽出しデータベースを充実させる。
トランスクリプトーム情報を基盤にした骨芽細胞と脂肪細胞の分化機構の統合的解析

間葉系幹細胞は様々な細胞種への分化能を持ち、脂肪細胞と骨芽細胞への分化のバランスを調節するメカニズムは骨粗鬆症や生活習慣病の発症や病態と密接に関連する。脂肪細胞分化および骨芽細胞分化する際の調節に関るRNAバリアントやnoncodingRNA (ncRNA)を同定することを目的として、分化誘導刺激を加えた細胞を用いてトランスクリプトーム解析を行い、全遺伝子の各エクソンとncRNAの発現変動を網羅的に調べた結果、顕著な発現変動を示すRNAバリアントやncRNAを複数検出することができた。これらのRNAバリアントやncRNAの中に、実際に分化の制御に関わるものが含まれていると考えている。平成26年度では、間葉系幹細胞に脂肪細胞分化誘導刺激または骨芽細胞分化誘導を加え、経時的に細胞を採取して得られた全RNAを用いて詳細なRNA発現解析を行った。具体的には、まず解析対象のサンプルとしてマウス間葉系幹細胞系幹細胞であるST2細胞を用いて骨芽細胞分化と脂肪細胞分化を誘導し、その途中過程および誘導後の7点のタイムポイントにおいてそれぞれ細胞を採取した。分化誘導後のサンプルにおいてアルカリフォスファターゼ染色、BODIPY染色、及び分化誘導マーカー遺伝子発現定量を行い、骨芽細胞分化と脂肪細胞分化の誘導を確認した。2方向の分化誘導過程において異なる選択的スプライシング発現変動を持つRNAバリアントを同定するため、得られたRNAを用いてエクソン発現アレイ解析を行った。また、2方向の分化誘導過程において異なる発現変動を示すマイクロRNAを同定するため、エクソン発現アレイに用いたものと同じサンプルを用いてマイクロRNA発現アレイ解析を実施した。さらに、3' UTR長のバリアントと非コードRNAの発現変動の検出とエクソン発現アレイデータの検証のため、同じサンプルを用いてRNAシーケンスも実施した。エクソン発現アレイとRNAシーケンスの解析で、脂肪細胞分化誘導時に転写因子PPARγのバリアントの一つであるPPARγ2の特異的発現上昇を検出することができ、本解析は分化を制御するRNAバリアントを検出するための有効な研究手法であることが確認された。同様の解析により、それぞれの分化サンプルで顕著な発現変動を示すRNAバリアントや非コードRNA、マイクロを検出することができた。これらのRNAバリアント及びncRNAの中に、実際に分化の制御に関わるものが含まれていると考えている。前年度までに得られたMouse Transcriptome Array (MTA)のデータ解析を行った。個々のexon usageの変化を示す指標としてSplicing Index値を用い、骨芽細胞分化と脂肪細胞分化のタイムコースにおいて個々の遺伝子エクソンのSplicing Indexがどのように変化するかを解析した。またこのデータを用いて3Dグラフを作成し、個々の遺伝子ごとに360度視点を変化させて可視化できる動画を作成した。これにより、各方向への分化において特徴的なexon usageを持つ遺伝子をピックアップし、視覚的に分かりやすく表現することができるようになった。また、Splicing Index値と、個々の遺伝子レベルでの発現量値を用いて、クラスタリング解析とGO解析を実施した。その結果、骨芽細胞、脂肪細胞に関連するGene Ontologyの幾つかについて有意な変動を検出した。また、前年度までに得られたmiRNA arrayのデータ解析も実施した。骨芽細胞分化と脂肪細胞分化のタイムコースにおいて特徴的な発現変動を示すマイクロRNAを検出することができた。また本解析では同一サンプルでMTAとmiRNA arrayの両方のデータが得られていることから、これらを組み合わせて、細胞分化時にmRNAと高相関、あるいは逆相関のパターンで発現変動しているmiRNAの検出を試みた。その結果、miRNAとmRNAとの発現パターンの相関係数が-0.96以下という高い逆相関の関係にあるペアを複数見出した。これらは本研究で見出した新たなmiRNA-mRNA制御ペアである可能性が高い。このように、今年度はこれまでに得られたデータを活用して、骨芽細胞、脂肪細胞分化に関連する可能性が示唆される新たな遺伝子やmiRNA群を抽出することができた。現在までに得られているデータのうち、MTAとmiRNA arrayについて、一定のレベルで解析を実施し、骨芽細胞分化、脂肪細胞分化への関連・寄与が示唆される遺伝子やその特定のバリアント、マイクロRNAを抽出することができた。本結果を用いて現在論文化を進めているところである。また、前年度に前倒しで実施できたRNA-Seqのデータを用いて、3'UTRの長さの異なるRNAバリアントについて、その発現量が細胞分化時に変動しているものを幾つか検出することもできた。これらの結果については、当初予定よりも前倒しで進めることができた。ただし、RNA-SeqデータではlncRNAの解析など、より詳細なデータマイニングが可能であるため、次年度に更に解析を進めたいと考えている。これまでに得られたMouse Transcriptome Array (MTA)、small RNA Sequence、miRNAアレイ、RNA-sequenceのデータを統合的に解析した。個々の転写物の発現量を発現アレイと次世代シーケンサー解析データ間で比較した他、各遺伝子についてのエクソン毎の相対的利用量の変動をモニタリングした。またこのデータを用いて特定の遺伝子群について詳細な発現変動3Dグラフを作成し、個々の遺伝子ごとに360度視点を変化させて可視化できる動画を作成した。これにより、各方向への分化に於いて特徴的なexon usageを持つ遺伝子をピックアップし、視覚的に分かりやすく表現する事ができるようになった。また、Splicin Index値と、個々の遺伝子レベルでの発現量値を用いて、クラスタリング解析とGO解析を実施した。

その結果、骨芽細胞、脂肪細胞に関連するGene Ontologyの幾つかについて有意な変動を検出した。これらの結果をまとめて論文を作製し、科学雑誌に投稿した。また、前年度までに得られたmiRNA arrayのデータ解析も実施した。骨芽細胞分化と脂肪細胞分化のタイムコースにおいて特徴的な発現変動を示すマイクロRNAを検出することが出来た。また本解析では同一サンプルでMTAとmiRNA arrayの両方のデータが得られている。その結果、miRNAとmRNAとの発現パターンの相関係数が-0.96以下という高い逆相関の関係にあるペアを複数見出した。これらは本研究で見出した新たなmiRNA-mRNA制御ペアである可能性が高い。このように、平成28年度はこれまでに得られたデータを統合的に活用して、骨芽細胞、脂肪細胞分化に関連する可能性が示唆される新たな遺伝子やmiRNA群、特徴的なエクソン利用パターンを示す遺伝子を抽出することが出来た。現在までに得られているデータ、すなわちMTAとmiRNA array、RNA-sequence, small RNA-sequenceでーたについて、統合的に解析を実施し、骨芽細胞分化、脂肪細胞分化への関連・寄与が示唆される遺伝子やその特定のバリアント、マイクロRNAを抽出することが出来た。本結果を用いて論文を作製し、投稿することが出来た。平成28年度に、1)Mouse Transcriptome Array (MTA), Small RNA Sequence, miRNAアレイ、RNA-Sequenceのデータの統合的解析、2)個々の転写物の発現量を発現アレイと次世代シーケンサー解析データ間で比較、3)各遺伝子についてのエクソン毎の相対的利用量の変動についての解析、4)このデータを用いて特定の遺伝子群についての詳細な発現変動3Dグラフの描出、5)Splicing Index値と、個々の遺伝子レベルでの発現量値を用いたクラスタリング解析とGO解析結果について、科学雑誌に投稿した。その後平成29年度に入って、論文が受理されるために必要な様々な改善事項の指摘を頂いたので、それに沿って論文原稿の修正と追加の実験を実施した。また、これまでに、骨芽細胞分化と脂肪細胞分化のタイムコースにおいて特徴的な発現変動を示すマイクロRNAをmiRNA arrayデータ解析により検出した。さらに本解析では同一サンプルでMTAとmiRNA arrayの両方のデータが得られているため、miRNAとmRNAとの発現パターンが高い逆相関の関係にあるペアを複数見出し、新たなmiRNA-mRNA制御ペアである可能性が高いものであるとして論文作成を進めた。平成29年度は最終年度として、これまでに得られたデータを統合的に活用して、複数報の論文作成を進めた。
ファイトケミカルを含むインドール類縁体による難治性肺高血圧症病態制御の可能性

肺高血圧症(PH)は肺動脈圧が選択的に上昇する病態であり、無治療で経過すると右心不全を引き起こす。治療戦略の第一は、血管拡張薬により肺動脈圧を下げることである。申請者は、右心不全の原因となる右心室線維化を抑制すれば、必ずしも肺動脈圧が下がらなくても生命予後が改善され得ることを、PHモデル動物を用いた研究により見出した。線維化は慢性炎症と深く関わることから、抗炎症作用を有する化合物がPH治療補助薬になりうると考える。抗炎症作用をもつインドール類縁体に着眼し、これらがPH病態下での右室線維化を抑制しうるか、またPHモデル動物の生命予後を改善できるか否か、培養細胞およびモデル動物を用いて検証する。
トポロジカル絶縁体グラフェンにおける新奇物性の探索

スピントロニクスは次世代電子工学の一環として高い期待を集めており、中でもスピン軌道相互作用(SOI)はその多様な物性・素子応用創出への鍵である。また、SOIを持つ物質はトポロジカル絶縁体(TI)になり得る。しかし二次元炭素単原子層「グラフェン」は軽元素であるためSOI・TIの導入は困難であった。本研究では高質量原子(白金・ビスマステルル)の微量修飾によりグラフェンへの数10meVオーダーのSOI(スピンホール効果)の導入に成功した。さらに、二次元TIに基づく可能性を持つ特異な分数量子抵抗値を非局在抵抗において観察することに成功し、その発現機構をさらに調査中である。。軽元素である炭素原子からなるグラフェンにスピン軌道相互作用(SOI)を導入し、スピンホール効果を観測、最終的に2次元トポロジカル絶縁体状態の実現を目指した。このためにまず本年度下記2つの方法でSOI導入を試みた。両者共、結晶性を破壊しない程度の微量水素・フッ素修飾によりグラフェンの面直方向対称性を破壊することで、ラシュバ型SOIが期待できる。(1)電子線(EB)特殊レジスト(HSQレジスト)の塗布とEB照射(2)フッ素修飾まず(1)では水素原子を含むHSQレジストをグラフェン表面に塗布し、照射EBドーズ量を細かく振って0.1%以下の微量オーダーでグラフェン表面を水素修飾した。この修飾量はラマン散乱測定のDピークから行ったが、EB照射によりグラフェン表面に微量な欠陥も発生するため、必ずしも正確な水素量が見積もれるわけではないことがわかった。その結果、スピンホール効果(SHE)らしき特性は得られたが再現性は悪いことが分かった。そこで(2)では直接微量なフッ素でグラフェン表面を修飾し、現在SHEを観察中である。水素に比べ質量の大きいフッ素では、微量修飾でもより明確なSHEが観測されることが期待される。HSQレジスト塗布や電子線照射によりグラフェン表面に汚染や欠陥が微量に生じてしまい、その移動度が減少した。これによりスピンホール効果の再現性良い観測が困難になったため。炭素単原子層「グラフェン」に各種方法でスピン軌道相互作用(SOI)を導入し、2次元トポロジカル絶縁体(TI)状態を実現、それに基づく諸物理現象を探索する事を目的とした。前年度までにグラフェン表面の微量水修飾(< 0.1%)に成功し、それによる面直方向の対称性破壊がもたらすラシュバ型SOIの導入を実現、その有効磁場が拡散電気伝導領域におけるスピン位相の破壊を抑制する可能性を指摘した。今年度は、白金やビスマステルルといった質量が大きくSOIの強いナノ金属微粒子をグラフェン上に微量散布(<< 1%)する方法を新たに開発、その試料において非局在抵抗(RNL)のバックゲート電圧依存性を測定し、RNLピークの確認、つまりSOIの導入に成功した。観察されたRNLピーク値のチャネル長依存性、面内磁場印加によるRNLピークの振動的振る舞い(スピンのラルモア歳差運動)を過去の理論と比較してよく一致する事を確認、巨大なSOIが存在し、(逆)スピンホール効果が発生することを解明した。また、その発現機構を微粒子のp,d軌道スピンとグラフェンのディラック点との相関において議論した。ただしビスマステルルは3次元TIとして知られているにもかかわらず、今回の測定では量子SHEはまだ確認できておらず、グラフェンは2次元TI状態にはなっていない可能性が高い。ナノ微粒子化したビスマステルルがもはらTI状態を保持していないことがこの一因と考えられるが、今後この原因を究明しグラフェンならではの2次元TI化を実現、その特異な物性を究明したい。。フッ素修飾をメインにし、微量修飾量とスピンホール効果(SHE)の相関を詳しく観測する。さらにHanle効果やラルモア歳差運動など各種測定で、SHEの存在やスピンの挙動を観察する。その後、2次元トポロジカル絶縁体としての可能性を光電子スペクトル観測などで究明する。ナノサイエンス研究過程で、グラフェン表面の水素修飾のために塗布した電子線レジストへ電子線照射した場合予想上にダメージがグラフェンに入ることが分かり、条件の見直しなどに時間がかかったため。電子線照射の条件見直しとフッ素によるグラフェン修飾を行う事で、スピン軌道相互作用とスピンホール効果の導入、及び二次元トポロジカル絶縁体状態の発生探索を試みる。
自然再生事業評価のための植生機能定量化手法の開発

本研究の主目的である自然再生事業評価のための定量的評価手法の開発するために、平成17年度は以下に示す研究課題を検討した。(1)湖沼沿岸域に生育する植物種31種を対象とした被度と乾燥重量の関係式の作成琵琶湖沿岸域に生育する大型抽水植物のヨシ、マコモ、オギ等をはじめ、群落内に生育する植物種(チクゴスズメノヒエ、ウキヤガラ、シロネ、アメリカセンダングサ等:合計31種)を対象に現存量調査を実施し、その湿潤重量および乾燥重量を測定した。測定数は279検体であり、各植物に関して関係式が得られた。(2)湖沼沿岸域に生育する植物種31種を対象とし含有成分率リストの作成粉砕器で各植物を粉末状にし、T-N、T-C、強熱減量、T-Pを104検体について測定した。(3)自然再生の目標となる自生ヨシ群落の物質量の算出夏季の琵琶湖周辺の11の自生ヨシ群落における乾燥重量、N, P含有量(g/m^2)の平均値は、488、6.6、0.8(g/m^2)であった。(4)琵琶湖沿岸のヨシ植栽事例の評価被度と乾燥重量の関係をBraun-Blanquet法による植生調査結果に適用し、自生群落との植物種構成比のユークリッド距離を元データにクラスター分析を適用することで、植栽群落の自然再生度を定量評価する手法を開発した。そして、本手法を琵琶湖沿岸域23の植栽ヨシ群落に適用し、針江、BiyoセンターEゾーン、湖北町、草津川河口北、安曇川、北山田は、単位面積あたりの地上部現存量が各指標とも自生群落の平均値に近似したこと、湖北町のヨシ群落の植物種構成がもっとも自生群落に近似し、木浜、山寺川河口北、今津、近江八幡白鳥川北,牧のヨシ植栽地の植生が、自生群落と著しくかけ離れていることを近似度により定量評価した。琵琶湖沿岸域では、ヨシ植栽による沿岸環境の修復事業が進められてきたが、修復は容易ではなく、ヨシ植栽後の評価事例も少ない。本研究では、琵琶湖沿岸の自生・植栽ヨシ群落において、植物社会学的調査法による植生調査および主要31種を対象にした各被度(+,15)別の植物乾燥重量、含有成分率(C,N,P,金属類等)分析を実施し、両調査結果を用いて評価法の検討を行った。そして、群落内の植生を考慮した自然再生評価手法を提案し、琵琶湖沿岸におけるヨシ植栽事例(湖北町、近江八幡牧、木浜、小野等)と自生ヨシ群落(近江八幡長命寺等)の植生を比較し、再生状況の定量評価を試みた。その結果、以下の主要な知見を得た。1)琵琶湖沿岸のヨシ群落は、植物種構成の特徴により、(1)チクゴスズメノヒエが優占した群落、(2)ヨシ以外の他植物が生育し多様な植生の群落、(3)ヨシとその他植物の割合が均等で多様性に富んだ群落、(4)ヨシとその他植物が生育し多様性のある群落、(5)群落内植物の大部分をヨシが占め他植物の進入があまり見られない群落に分けることができた。2)植物種別の植生被度と地上部現存量との関係および含有成分率を示し、それらの関係を用いた植物群落を定量評価するためのフローを提案した。3)琵琶湖沿岸の自生ヨシ群落を植生の異なる3つのタイプに分類し、植栽ヨシ群落が、再生目標とする群落のどの評価指標にどの程度近似しているかを評価できた。4)湖北町のヨシ群落の植物種構成がもっとも自生群落に近似し、木浜、山寺川河口北、今津、近江八幡白鳥川北,牧のヨシ植栽地の植生が、自生群落と著しくかけ離れていることを、近似度により定量評価した。今後は、各植物の季節別、地域別の成分含有率のデータを拡充し、より精度の高い評価手法の確立を目指す予定である。

そして、本手法を琵琶湖沿岸域23の植栽ヨシ群落に適用し、針江、BiyoセンターEゾーン、湖北町、草津川河口北、安曇川、北山田は、単位面積あたりの地上部現存量が各指標とも自生群落の平均値に近似したこと、湖北町のヨシ群落の植物種構成がもっとも自生群落に近似し、木浜、山寺川河口北、今津、近江八幡白鳥川北,牧のヨシ植栽地の植生が、自生群落と著しくかけ離れていることを近似度により定量評価した。
時間因子組込直線2次モデルとボロノイ図による癌放射線治療の効果的な照射方法の確立

放射線治療の効果を規定する因子として重要なものは1回線量、分割間隔、治療回数である。放射線治療の生物効果を表す指標として直線2次モデルが汎用されているが、このモデルでは1回線量と分割回数はパラメーターとして含まれているが、分割間隔と治療回数で表される治療期間が含まれていない。本研究では時間関数を組み込んだLQモデルを作成し、照射後の分裂死の様子を、ボロノイ図を用いて観察できることを示した。放射線治療の分割照射に於ける生物学的効果を定量的に表す方法として直線2次モデル(LQモデル)が汎用されている。近年の高精度放射線治療技術により超短期間の照射法が実現するに伴い、従来のLQモデルに時間因子が含まれないための矛盾があることがわかった。そこで、放射線照射後の細胞死を時間関数として導入することを試みた。離散的な照射に対して離散的に細胞死が起こると仮定するモデルは、照射後の細胞死が総てアポトーシスのような間期死による細胞死となり、総ての照射が終了した直後に総ての致死効果も終了するモデルになり実際の治療後の反応性と相違するものであった。従って照射後の細胞死は主として分裂死を遂げると仮定して照射後の細胞死の時間経過を指数あるいはロジスティク曲線に従うモデルを作製した。このモデルでは照射後の分裂死の半減期と、増殖分画と倍加時間の推定が必要である。過去の臨床的知見をもとにそれぞれの値を推定してモデルの妥当性を検討した。また、それぞれの値は変数として扱っているので組合せを自由に変えることで、悪性度の違いによる反応性を示すことができることがわかった。これらの、モデルを時間軸に沿って動かし、照射後の腫瘍の反応性を視覚的に見る方法としてボロノイ図を応用した。ボロノイ図を用いることで、ランダムに増殖する腫瘍と、ランダムに照射される腫瘍の細胞致死と増殖の様子を動的に確認でき、実際の分割照射による細胞動態を推定する助けになることが確認された。腫瘍細胞が放射線照射を受けてから細胞死にいたる過程は、多くの場合分裂死を遂げる。分割照射では分裂死が予測される細胞にも照射が繰り返される。この過程を経て腫瘍は経時的に縮小する。放射線の線量と生残率の関係はLQモデルでよく表されると言われるが、治療期間や照射間隔の異なる治療による生残率を求める上では、時間因子が組み込まれていないことが致命的である。そこで、研究者は照射後の分裂死を時間軸に沿った指数的な細胞死と仮定した時間組込LQモデル(LQT model)を作製した。更に、腫瘍は照射期間中もlabeling index (li)で表される比率でヴェアフルスト人口モデル(N(t))に従い増殖を続けると仮定したモデル(IIExp[-(αd+βd^2)・f(t-ti)]{N(t)}^*li/100)を作製した。このモデルの妥当性は2次元平面にランダム関数で発生された腫瘍細胞のシードを用いてボロノイ図を作成し、腫瘍へ分割照射を行うシミュレーションを行うことで、照射後も腫瘍が縮小を続けることを明示的に確認することができた。このモデルを発展させ経時的な腫瘍制御確率(TCP)を導き、その有用性を検討することができた。TCPは(1-S)^K=Exp(-S^*K)で表される。SはLQTモデルの生存率でKは腫瘍細胞のclonogen数と仮定できる。Kの値は文献的に報告されて前立腺癌の臨床データーの線量生存率から推定した。前立腺癌で外部照射単独の3DCRTとIMRTの症例の線量分布からLQTモデルにより生存率Sを求めた。このSとKからTCPを計算した。ここでは前立腺癌の低リスク群、中リスク群、高リスク群のα/βをそれぞれ3,7,10とした。IMRTでは3DCRTより中リスク群と高リスク群で有意にTCPが高かった(それぞれp=0.0217,p<0.0001)。高精度に照射する方法が確立した近年、従来の分割照射とは様相を異にした、自由度の高い分割様式での照射が行われるようになっている。一般的に用いられている生物効果を評価する方法として、DNAの1本鎖切断と2本鎖切断を説明に用いたLQモデルがあるが、分割照射でのLQモデルは分割回数を盛り込んでいるが分割間隔または総治療期間は含まれていない。このため、短期間に治療を行う定位照射と、通常の分割照射の同等性をLQモデルから説明することはナンセンスである。本研究では時間関数を組み込んだLQモデルを作成し、自由度の高い様々な分割照射を生物学的に比較することを試みた。時間関数として4つの因子を含めた。

1.照射決定から治療効果判定までの時間、2.照射決定から照射開始までの待機時間、3.週間の分割回数と治療回数から得られる治療期間、4.腫瘍の時間増殖関係を導入した。放射線治療に伴う細胞死を分裂死および間期死があるとして、両者を相補的な関係で組み込んだ。以上よりLQモデルを一般化したため、一般LQTモデル(General LQT model)と命名した。このGLQTモデルを用いることで時間軸に沿った照射後の細胞死の様子を、ボロノイ図を用いて観察できることを示した。
高速液体クロマトグラフィー/質量分析計によるキノコ毒アマニチンの分析

本研究では、アマニタ属キノコの有毒成分であるα-アマニチンの人体試料からの抽出法と高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による分析条件を設定し、HPLC/エレクトロスプレーイオン化(ESI)-質量分析計(MS)による検出を行った。HPLC装置は島津製LC-10AをMS装置はフィニガンマット製TSQ7000を使用した。カラムはWakosil II 5C18HG(長さ250mm、内径4.6mm、粒径5μm)を用いた。移動相は0.02M酢酸アンモニウム-アセトニトリル(7:3, pH5)で、流量は1ml/分(EIS-MSの場合は0.3ml/分)とした。ヒト全血および尿1mlにα-アマニチン標準品50μgを添加し、蒸留水を全血には9ml、尿では4mlを加え撹拌した後、Sep-Pak C_<18>カートリッジにゆっくり通す。1%酢酸水溶液20mlでカートリッジを洗浄し、5mlのクロロホルム/メタノール(6:4)溶液でα-アマニチンを溶出させる。この溶液を窒素気流下にて蒸発乾固を施し、残渣を1mlの移動相で溶解した後、その20μlをHPLCに供した。α-アマニチンを303nmでモニターしHPLC検出を行ったところ、全血および尿抽出試料では不純ピークが検出されたが、α-アマニチンのピークとの重複は問題にならなかった。回収率は全血で約43%、尿で約60%であった。次に、MS装置のインターフェイスとして高速原子衝撃法、大気圧イオン法およびESI法にてα-アマニチンの検出を試みたところ、ESIインターフェイスの場合が最も検出感度が高かった。ESI-MSによるα-アマニチンのスペクトルではm/z919の擬分子イオンがベースピークとなった。検出限界は全血および尿において、それぞれ50ng/mlおよび38ng/mlであった。今回の結果から、ヒト全血および尿からのα-アマニチンの分析にはSep-Pak C_<18>カートリッジによる抽出と、HPLC/EIS-MSによる検出が良好であることが明らかとなった。現在、固相抽出法の回収率の改善を検討しており、高感度で定量性に優れた分析方法の確立を目指すと共に、法医実際例への応用を試みる予定である。
麻酔薬による脊髄保護効果の電気生理学的解析

胸腹部大動脈瘤手術における最も重大な合併症に脊髄虚血による下肢麻痺がある。電気生理学的手法を用いた本研究により、脊髄虚血は三相性のシナプス伝達の変化を引き起こし、これには活性酸素種が重要な役割を担っている可能性がある。麻酔薬である合成麻薬は脊髄前角ニューロンの興奮性ならびに抑制性シナプス伝達を抑制するが、虚血性神経細胞死には影響しなかった。抑制性神経伝達の調節が神経保護の観点からは重要であると推測される。1.研究成果(1)虚血性神経細胞死の電気生理学的解析を行った。虚血負荷によって自発性シナプス後電流は灌流投与直後にその頻度が増加し、その後数分間にわたって5070%まで減少、細胞死を示唆する巨大な内向き電流が誘起されるタイミングにおいては500700%にまで増加した。すなわち、虚血によりシナプス伝達は三相性の反応を示した。虚血性神経細胞死における重要なメディエータとして活性酸素種(Reactive oxygen species: ROS)が挙げられる。ROSの一種である過酸化水素を灌流投与すると、興奮性シナプス後電流の頻度は一過性に増加し、その後減少に転じて過酸化水素灌流投与終了後10分の時点でも頻度減少は続いた。(2)麻酔薬による神経保護作用の検討した。μ受容体活性化ならびに遮断が細胞死を示唆する急速な内向き電流が生じるまでの潜時を修飾するかどうかを解析した。μ受容体作動薬DAMGOとμ受容体拮抗薬ナロキソンを使用したが、いずれも潜時に変化は無かった。つまり、μ受容体活性化ならびに遮断による神経保護効果は無いと考えられた。2.研究結果の意義と重要性本研究により、脊髄前角ニューロンにおける虚血性神経細胞死の電気生理学的メカニズムが明らかになった。脊髄前角ニューロンにおいて虚血は三相性のシナプス伝達の変化を起こす。虚血性神経障害のメディエータである過酸化水素の灌流投与でも同様の変化を認めたことから、この反応にはROSが重要な役割を果たしている可能性がある。さらに麻酔薬として必須と考えられるμ受容体作動薬の脊髄前角ニューロンにおける作用を詳細に明らかにした。しかし神経保護効果については有用性を認めることができなかった。1.研究成果(1)脊髄前角ニューロンにおけるシナプス伝達の解析と麻酔薬の作用を調査した。幼若ラットより脊髄スライス標本を作製し、脊髄前角ニューロンよりホールセル・パッチクランプ記録を行った。膜電位をー70 mVと0 mVに固定することで、それぞれ自発性興奮性シナプス後電流と自発性抑制性シナプス後電流が観測された。テトロドトキシンを灌流投与すると自発性抑制性シナプス後電流の振幅と頻度が著明に抑制され、脊髄前角においては自発的な抑制性入力があることが明らかとなった。μ受容体作動薬であるDAMGOを灌流投与すると、約60%の脊髄前角ニューロンにG蛋白質を介する外向き電流を誘起した。さらに、DAMGOは興奮性ならびに抑制性シナプス後電流の頻度をそれぞれ73%と62%に減少させた。これは吸入麻酔薬に見られる作用(興奮性入力の抑制と抑制性入力の増強)とは異なる作用であった。(2)虚血性神経細胞死の電気生理学的解析を行った。虚血模倣液灌流投与による自発性シナプス後電流の変化を解析した。灌流投与直後にその頻度が増加し、その後数分間にわたって頻度5070%まで減少、細胞死を示唆する巨大な内向き電流が誘起されるタイミングにおいては500700%にまで増加した。これらの変化は興奮性・抑制性シナプス後電流の両者に認められた。2.研究結果の意義と重要性脊髄前角ニューロンにおけるシナプス伝達の基礎データを収集できたため、麻酔薬の作用や虚血の影響を解析することができるようになった。麻酔管理や集中治療において頻用される麻薬は脊髄前角ニューロンの神経活動を抑制する作用があることが明らかとなった。虚血において脊髄前角ニューロンのシナプス伝達に著明な変化が起きている事が明らかとなり、これを麻酔薬がどのように修飾するか調べることで神経保護効果のメカニズムを解析できるようになった。1.達成できた点(1)神経活動の主要な要素であるシナプス伝達について解析することができた。鎮痛作用に代表される脊髄後角ニューロンへの麻酔薬の作用は、シナプス伝達を修飾することによって発揮される。現在までの研究で脊髄前角ニューロンにおけるシナプス伝達がどのように行われているかを解析し、麻酔薬の影響を調査する基礎データとして集積できた。また、脊髄前角ニューロンにおける麻薬の作用を解析できた。麻薬は麻酔管理に必須の鎮痛薬である。同様の解析手法を用いることで、他の麻酔薬(吸入麻酔薬、静脈麻酔薬)の作用を調べることができるようになった。(2)虚血性神経細胞死におけるシナプス活動を解析できた。

虚血負荷によって興奮性ならびに抑制性シナプス伝達の変化が起きている事が判明したが、これらは虚血性神経細胞死に影響する因子であると考えられる。前述の通り、麻酔薬はシナプス伝達を修飾することで作用を発揮する。虚血病態におけるシナプス伝達をどのように変化させるかを知ることで、神経保護効果の作用機序を明らかにすることができる。2.達成を妨げた点虚血現象を解析する際に必須の機器である酸素分圧計を貸与元に返却しなくてはならなくなり、新規に購入したため、吸入麻酔薬の濃度測定に必要なガスクロマトグラフィーを今年度中に購入することができなかった。別の濃度測定の方法を検討すると共に他研究室とガスクロマトグラフィーの貸与について交渉中である。1.麻酔薬の種類や投与量による神経保護効果の解析ガスクロマトグラフィーを用いて吸入麻酔薬の濃度を調整する。吸入麻酔薬や静脈麻酔薬を灌流投与し、これらが虚血模倣液によって誘起される内向き電流に与える影響を解析する。内向き電流が起きるまでの潜時を測定することで、神経保護効果の有無を知ることができる。すなわち、潜時が延長した場合は神経保護効果があると言える。2.麻酔薬の神経保護効果のメカニズムの解析麻酔薬と虚血模倣液を同時に灌流投与し、麻酔薬が虚血によるシナプス伝達の変化にどのような影響を及ぼしているのかを解析する。具体的には、自発性シナプス後電流の振幅や頻度の変化をどのように修飾するかを解析する。もうひとつは虚血性神経細胞死のメカニズムとして活性酸素に着目し、まず、活性酸素供与体であるtBOOHを灌流投与して誘起される電流やシナプス後電流に対する効果を調査する。また、虚血模倣液と同時に灌流することで虚血によるシナプス伝達の変化をどのように修飾するかを観察する。さらに麻酔薬が活性酸素によるシナプス伝達の変化をどのように修飾するかを調査する。1.酸素分圧測定装置を購入したため、ガスクロマトグラフィーを購入できなかった。ガスクロマトグラフィーは灌流液中の吸入麻酔薬濃度を測定するうえで必須である。現在、他研究室と貸与もしくは購入について交渉中である。2.薬品としてはホールセル・パッチクランプ法による実験に必要な基本的薬剤と共に、虚血模倣液作製に必要なスクロース、窒素ガスを購入する。さらに、麻酔薬として吸入麻酔薬やプロポフォールなどの静脈麻酔薬を購入する。虚血のメカニズムと神経保護の標的として活性酸素に注目している。活性酸素供与体であるtBOOHもしくは過酸化水素を購入する。また、フリーラジカルスカベンジャーであるエダラボンを購入する。3.虚血実験においては効率良く灌流液を低酸素の状態にしなくてはならない。また、吸入麻酔薬の灌流投与においても灌流液からの拡散が小さい方が良い。小容量の記録用チャンバの新規購入や窒素ガスによる実験系の封入を考慮する。
泳動電着法による銅フタロシアニン薄膜の結晶構造制御

本研究では、銅フタロシアニン(CuPc)薄膜の形態を制御することを目的として、トリフルオロ酢酸溶液中のモノマー状のCuPcプロトン付加体の泳動電着によりCuPc薄膜の作成を試みた。吸光度の濃度依存の解析より、第一段階での生成物にはCuPcにトリフロオロ酢酸が2分子配位し、第二段階での生成物には4分子のトリフロオロ酢酸が配位していることが明らかとなった。薄膜作成にはトリフルオロ酢酸とジクロロメタンの混合溶液にβ-型CuPcを溶解した溶液を用い、泳動電着した結果、陰極側のITO上にCuPc薄膜が生成した。得られた薄膜をα-型で、得られた薄膜のSEM像写真より、いずれの薄膜も密な繊維状の結晶より構成されており、時間とともに太く大きくなっていた。一方、ミセル電解法や微粒子の泳動電着の場合では結晶の大きさは電解時間に依存しなかった。このように、結晶が時間とともに成長したのはモノマー状のCuPcが析出するためと考えられる。トリフルオロ酢酸の濃度が高いと得られる薄膜はより粗な繊維状の結晶より構成されていた。これは泳動で電着したプロトン付加体の中のCuPc・H_4^<4+>の割合が増加し、プロトンの還元により生成するCuPc結晶の成長が遅いことに起因すると考えられる。さらに、他のフタロシニン類(MPc,M=H_2,Fe,Ni,Zn,VO)の薄膜についても本法により作成できることが明らかとなっている。
乳酸菌オリゴDNAを有効成分とする経口用ナノカプセルを用いた免疫調節機構の解明

オリゴDNAは、胃酸や酵素による分解を受けることから、経口投与は難しいとされてきた。研究代表者は、乳酸菌オリゴDNAを腸管粘膜へ効率的に運搬する「DNAナノカプセル(DNA微粒子:DNanocap,オリゴDNAを包摂したカルシウム性ナノ粒子)」の開発に成功している(Mol Ther., 23:297, 2015)。2018年度は、プロバイオティック乳酸菌(LGG株)のゲノムDNAより発見されたCpGオリゴDNA(ID35, Cell Microbiol., 7:403, 2005)を包摂したDNanocap(ID35cap)を、健常マウスへ経口投与することで、その後化学物質(デキストラン硫酸ナトリウム, DSS)に誘発される実験的大腸炎(DSS腸炎)が、軽減されることを発見した。すなわち、健常な腸管粘膜上皮に送達された乳酸菌オリゴDNAが及ぼす極めて初期段階に展開される免疫制御機構を解明する必要性が生じた。また、2017年度までに気管支喘息モデルマウスに対する乳酸菌オリゴDNAの自由摂取試験の結果から、優れた抗アレルギー作用が見出されたことから、腸管内容物および糞便をサンプルとする16Sメタゲノム解析を行った。その結果、乳酸菌オリゴDNA自由摂取群の菌叢構造は、気管支喘息モデル群のそれと比較して、著しく異なっていることが示唆された。また、これら2群間では、いくつかの門に属する細菌の存在比率が有意に異なることが明らかになった。今後は、乳酸菌オリゴDNAの自由摂取による菌叢構造の変化と抗アレルギー効果の関連についてさらに解析する必要がある。オリゴDNAは、医薬分野において実用化(核酸医薬など)に最も近い中分子核酸化合物の一つとされている。本研究は、オリゴDNAの経口利用を目指す上で、これまでに得られた免疫系の制御機構解明に焦点を絞ったものである。乳酸菌DNA微粒子を経口投与することによる新たな知見として、腸内菌叢の変動という視点からデータが得られた。また、腸管粘膜の管腔側に送達されることの意義を示すデータが得られた。すなわち、腸管局所に送達されたオリゴDNAが免疫系を制御する機構を明らかにする上での強力なデータが得られたと捉え、当初の計画以上に進展していると判定した。腸管粘膜管腔側に送達された乳酸菌オリゴDNAの有用性を示す動物実験のデータを踏まえ、その作用機序の解明を目指す。研究代表者は、プロバイオティクス由来のゲノムDNAや、DNA断片の化学合成配列を用いた免疫活性試験により、免疫調節作用を有するオリゴDNAを用いた研究を進めてきた。オリゴDNAとは、化学合成されたDNA短鎖であり、含まれる塩基配列により多彩な免疫機能を発揮する機能性核酸素材である。しかしながら、経口的に摂取すると、胃液や消化酵素の影響により分解されてしまうことから、経口投与による実績は極めて少ない。研究代表者は、「食べるオリゴDNA」を掲げ、経口的な腸管送達システムの構築を目指し、胃液に分解されず腸まで届くDNAナノカプセルの開発に成功した。2017年度は、DNAナノカプセルの経口投与に伴う遺伝子の動きを網羅的に解析するとともに、DNAナノカプセルを混合した特別飼料を作製し、実験用マウスにおける投与試験を実施した。具体的には、気管支喘息モデルマウスにDNAナノカプセルを含む特別飼料を70日間自由摂取させ、アレルギー関連のバイオマーカーについて解析を行った。結果として特別飼料の自由摂取により、気管支喘息モデルマウスにおけるアレルギー反応を有意に抑制することが示された。すなわち、DNAナノカプセルを通常飼料に配合した特別飼料の自由摂取は、全身性免疫系だけではなく、気管支局所においても免疫調節機能を発揮することが示された。またDNAナノカプセルの経口投与試験を実施し、脾臓における発現変動遺伝子を同定し、2018年度に詳細な解析を行う計画である。DNAナノカプセルを含有する特別飼料を用いた自由摂取試験を実施し、全身免疫系が制御されることを示すデータが得られた。胃内挿管による強制給餌以外で、免疫調節作用が得られたことを踏まえ、当初の計画以上に進展していると判定した。

また、これら2群間では、いくつかの門に属する細菌の存在比率が有意に異なることが明らかになった。今後は、乳酸菌オリゴDNAの自由摂取による菌叢構造の変化と抗アレルギー効果の関連についてさらに解析する必要がある。オリゴDNAは、医薬分野において実用化(核酸医薬など)に最も近い中分子核酸化合物の一つとされている。本研究は、オリゴDNAの経口利用を目指す上で、これまでに得られた免疫系の制御機構解明に焦点を絞ったものである。乳酸菌DNA微粒子を経口投与することによる新たな知見として、腸内菌叢の変動という視点からデータが得られた。また、腸管粘膜の管腔側に送達されることの意義を示すデータが得られた。すなわち、腸管局所に送達されたオリゴDNAが免疫系を制御する機構を明らかにする上での強力なデータが得られたと捉え、当初の計画以上に進展していると判定した。近年急速に開発が進められている「核酸医薬」は、認可件数が少なく開発途上と言われている。これまで注射器により投与されてきたオリゴDNAを、経口ルートなど新たな投与方法を開拓し、安定的に機能性を発揮できる可能性を示すことができれば、オリゴDNAの利用性が飛躍的に発展するだろう。とくに本研究で取り組む「食べるオリゴDNA」の実現に向け、経口的に摂取されたオリゴDNAが体内でどのような挙動を示すのか、またどのような作用機序で効果を発揮するのか明らかにする。腸管粘膜管腔側に送達された乳酸菌オリゴDNAの有用性を示す動物実験のデータを踏まえ、その作用機序の解明を目指す。
c-mplを介する巨核球分化の分子機構に関する研究

トロンボポエチン(TPO)は巨核球系細胞の増殖と分化において最も重要な造血因子である。TPOの刺激は、巨核球系細胞においてSTATs、ras、PI-3Kなどの各種のシグナル伝達分子を活性化することが報告されているが、TPOによる増殖・分化誘導におけるこれらの分子の機能の詳細については明らかではない。本研究では、まず、ヒトのIL-3依存性赤白血病株F-36PにTPO受容体c-mplを導入した。このうちの一つのクローンF-36P-mplにおいて、TPOは一過性に増殖反応を誘導し、その後ほとんどの細胞に成熟巨核球への分化を誘導した。F-36P-mplにdominant negative(dn)-STAT1,3,5,dn-rasをLac-inducible Systemを用いてinducibleに発現させ、TPOによる増殖、分化の誘導がこれらの分子によって阻害されるかどうか検討を行った。その結果、TPOによる増殖誘導はdn-STAT5とdn-rasによって各々約30%抑制された。また、分化誘導はdn-rasによってのみ阻害された。更に、活性型rasをF-36P-mplにinducibleに発現させるとTPO非存在下でも成熟巨核球への分化が誘導された。活性型rasの発現時間と巨核球への分化誘導効果との関連を検討すると活性型rasを約24時間発現させることが巨核球への分化誘導には必要かつ十分であると考えられた。rasのシグナルはTPO以外にもIL-3やG-CSFなどの各種の造血因子によって活性化されるが、TPOは、IL-3やG-CSFなどと比較すると持続性に約24時間にわたってrasを活性化した。これらの結果から、TPO特異的に誘導される持続性の長いrasの活性化が巨核球への分化誘導には重要であると考えられた。
教科書教材をふくらませて「算数の力」を育成する教材開発法の構造化に関する研究II

○研究の目的本研究では「算数を生み出す力」のうち,さらに「1算数できまりや方法などを見つける力(主に帰納・類推), 2算数で前提をもとに確かめる力(主に演繹)」に焦点をしぼって,その「つけたい力」を育成するための教科書教材のふくらませ方について分類・整理し,構造化することを目的とした。○研究方法・帰納,類推,演繹的推論に関する先行研究および,実践的研究を調べる。・多数の先行研究実践から帰納,類推,演繹的推論を引き出す教材化の工夫を言語化して分類,整理していくことで構造化をはかる。・実験授業を通して,検証することで構造化の有効性をたしかめる。・実験授業の検証方法は, WigginsとMcTigheの提唱する「逆向きの設計(backward design)」(Wiggins & McTighe, 2005)の考えをもとに行う。具体的には,学習目標(「望まれている結果」)を児童がどの程度達成したのかを具体的に示す「承認できる証拠」として,パフォーマンス課題及びルーブックを作成し,研究授業を行う。その効果をパフォーマンス課題の結果および,授業記録,児童のノートやワークシート,作品などにより分析し,成果と課題をまとめていく。○研究成果先行研究実践から,帰納的推論を引き出す教材化の工夫として「試行の場」→「整理の場」を授業構成で仕組むことが有効ではないかという仮説をたて,実験授業で有効性を確かめた。「試行の場」とは,まずは全員で問題にあたり試行してみる場面である。ここでは,全員が簡易に確かめられるシンプルな問題設定が望ましい。試行するなかで,複数のデータが集約される。次に「整理の場」では,集約されたデータを分かりやすく整理する場面をつくる。整理することが数量間の共通性の発見につながり,帰納的推論を引き出す。一方,類推的推論を引き出すに教材化の工夫として「条件不足」の問題提示が有効であることが明らかになった。問題解決に必要な条件をあえて隠すことで,類推的推論を引き出す。演繹的推論に関しては本年度だけではまとめることができなかった。来年度も,引き続き実践を重ね,その成果と課題を生かして教科書教材のふくらませ方について構造化を図っていきたい。
ストレス感受性および最大応答度の調節による老化および肥満解消方策の確立

栄養需要と供給のインバランスは老化や肥満の原因となり、同時に全身的なストレスを誘発する。研究代表者は、環境応答転写因子Nrf1によって活性酸素種や小胞体ストレスなどに対する応答能を調節することで、加齢や肥満が解消されることを複合遺伝子改変マウスで見出した。本研究は、Nrf1の有無で、老化や肥満モデル、それぞれの表現系解消に作用した分子実態を同定し、新たな老化や肥満介入方策を立案する基礎的研究である。同定した作動分子は、老化や肥満解析で実績がある線虫およびゼブラフィッシュを活用して老化や肥満が改善されたかについて遺伝学的に評価し、将来的化合物にを得ることで老化や肥満に対する補正戦略を提唱する。
ホヤ胚細胞分化の分子機構

ホヤ胚における細胞分化のメカニズムを分子生物学的に解明することを目的として、次のような研究を行った。本研究の開始以前にすでに我々はマボヤ胚の筋肉細胞および表皮細胞の分化マーカーとなりうる特異的なモノクローナル抗体を得ていた。そこで本研究ではまず、尾芽胚のmRNAに対するcDNAライブラリーを発現ベクターを用いて作製した。そして特異的抗体を用いてそれらの抗原分子をコードするcDNAクローンをスクリーニングした。その結果、筋肉細胞特異的分子および表皮細胞特異的分子に対するcDNAが得られたが、後者に関してはまで確定的なものになっていない。筋肉細胞特異的抗原は分子量約220KDaの単一のポリペプチドで、分子量からミオシン重鎖であろうと推定されていた。この分子に対するcDNAを得て、その塩基配列を決定したところ、ラットやショウジョウバエのミオシン重鎖遺伝子のそれと、90%以上(アミノ酸レベルで)の類似性を示した。したがって得られた遺伝子のcDNAはミオシン重鎖のものと結論された。ノザンブロットによって、発生に伴ってこの遺伝子の転写産物がいつから出現してくるかを調べてみると、のう胚期から出現することがわかった。さらに、サザンブロットによる解析から、この遺伝子はゲノムあたり1コピーしか存在しないことが推測された。インサイチュウハイブリダイゼーションによって調べると、転写産物は予定筋肉細胞の割球にのみ出現する。現在、プライマー伸展法によって、この遺伝子の5′上流域を含むプローブの作製を進めている。表皮細胞特異的遺伝子のcDNAプローブを作製するために、現在もう一回初めから、表皮細胞特異的抗体の作製から取りくんでいる。これまでの研究において,(a)マボヤ胚の分化マーカーとして使える筋肉細胞特異的および表皮細胞特異的モノクローナル抗体を作製し,また(b)尾芽胚のポリ(A)^+RNAに対するcDNAライブラリーを発現ベクターで作製した.本研究では,この両者を駆使して,それぞれの遺伝子の断片を含むcDNAを単離し,それをプローブとしてそれぞれの遺伝子の発現が時間的・空間的にどのように制御されているかを解明することである.1.(b)のcDNAライブラリーの発現を誘起して蛋白質を合成させ,合成された蛋白質をニトロセルロース・フィルターに移してそこで筋肉細胞特異的抗体と反応させたところ,ポジティブな反応を示すクローンが幾つか得られた.その中の一つをサブクローニングしλHrMM1(約1, 7kb)と名付けた.そして更にλHrMM1のEcoRI断片約200bをもとに,アンチセンスRNAプローブcHrMM1を作製した.この遺伝子の発現が発生のいつ起こるかを,各発生段階の胚からポリ(A)^+RNAを抽出し, cHrHH1プローブとのノザンブロットにより調べたところ,のう胚期で初めてわずかながら薄いバンドが認められ,神経胚期では明確なバンドが認められた.したがって,この遺伝子の活性化はのう胚期に起こるものと思われる.現在,塩基配列の決定により,この遺伝子の本体を深る努力と,in situハイブリダイゼーションによる空間的発現の解析をすすめている.2.同様の方法で,表皮細胞特異的抗原をコードする遺伝子の断片を含むcDNAプローブを単離する努力をした結果,λHrEP1プローブを得ることができた.筋肉のプローブと同様に約100bのアンチセンスRNAプローブcHrEP1を作り,現在ノザン・ブロットによりこの遺伝子の発現の時間を解析しているところである.ホヤ胚における筋肉細胞分化のメカニズムを分子生物学的に解明する目的で次のような研究を行い、また進めている。1、筋肉細胞特異的遺伝子群の解析:筋特異的遺伝子として、ミオシン重鎖、アクチン、アセチルコリンエステラーゼの3つの遺伝子を選び、それぞれの遺伝子のcDNAプローブを作製する努力を続けている。