hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
代替現実感システムを利用した深い没入感を有する訓練システムの構築

本研究では,以下の3点について研究を行った.1)訓練用代替現実感システムを構築するための市販のアクションカメラ4台を利用した両眼立体視全方位カメラを開発した.2)代替現実感システムに手映像を重畳する手法を開発し,Singular Spectrum Analysisを用いて映像のキーフレームの自動抽出を可能とした.3)高齢者向け訓練・計測システムを開発し,認知機能および歩行機能を客観的に評価した.1、深い没入感をもつ訓練用代替現実感システムの構築初年度は代替現実感システムの構築を進めた.理化学研究所で開発されたオリジナルのSRシステムでは,全方位カメラは,後に体験するユーザーの視点位置とほぼ一致させるように配置し,全方位カメラの近傍には人はいない,つまり過去映像において,全方位カメラの近傍に人は映り込まないという条件の元に構築されている.一方,今回研究を行っている訓練システムでは,過去映像が指導者の作業や自らの過去の作業を映したものであるため,作業を行っている様子を全方位カメラで撮影した際に,本人が映りこんでしまうという問題が発生する.初年度は,頭の方向により,自動的に現在映像に切り替える方法を適用した.切り替える位置により,現在映像と過去映像にずれが生じている問題があるものの,調整によりかなり自然に切替が行えていると考えている.2、高精度な手の動き情報取得および動きの意味認識技術の基礎検討SRシステムでは,過去映像を提示したとき,原理的に自らの体を見ることができないため,過去映像と気付いた途端,急激に没入感が損なわれてしまうという問題がある.そこで,この問題に対処するために,手の動きを取得し,取得した形状データを過去データに重畳することで解決する方法の検討を進める.手に装着物をつけることなく,手形状を取得することが理想的であるが,まずはデータグローブを使用して,手形状を計測することを検討した.結果,データグローブ領域を取得し,その部分をCGで現実モデルに重畳するシステムの構築を行った.また,当初計画では2年目に行う予定であった手に装着物無しで代替現実映像に重畳する検討も一部前倒しして行い,実映像を代替現実映像に重畳することも実現した.しかし,一部光の状況等によってノイズが発生しているため,この部分の対応が今後の課題である.本年度は手の解析の検討を主に進めた.Key frameを抽出する手法としてはSingular Spectrum Analysisを用いた.Singular Spectrum AnalysisによるKey frame抽出は,設定パラメータが少なく,ユーザーが変わったときに調整するパラメータの数が少ないという利点がある.本検討にあたり,まずはデータグローブを用いた手の動き解析を行い,その有効性を確認した.次に,操作者に特別なデバイスを装着させずに動きを認識する方法を検討した.今回は,ユーザーの上半身の動きの把握と,手,さらには指の動きによる意図を認識する方法について検討を行った.具体的には,上半身の動きの認識にMicrosoft Kinectを用い,手・指の動き認識にはLeap Motionを用いた.本システムを利用することにより,行動変化のKey frameの取得を可能とし,Head Mounted Displayを装着した状態で,構成された映像空間の操作を可能とした.28年度の段階で,ロボットを使った移動に対応した訓練システムの構築に着手している.そのため,計画以上に進展しているといえる.本年度は,主に移動を伴う訓練システムの基礎検討を行った.具体的には,対象を高齢者にしぼり,バーチャル環境を移動することで,自身の身体の状態を客観的に認識してもらうことを可能とするシステムの構築に関する研究を推し進めた.本年度構築したシステムは,特に高齢者の足首の角度に着目し,移動時の足の運びについてリアルタイム計測し,被験者にフィードバック可能なシステムを構築した.これは高齢者は家庭内での転倒に起因する骨折や死亡事故が少なくないという警察庁の統計がある.そこで,自身の身体状態をリアルタイムで把握することで,転倒事故を減らすことを可能とする訓練システムの構築を行うことを考えた.本システムは,Viconセンサーを複数使用したモーションキャプチャシステムから構成されている.被験者は足に複数のマーカーが付けられたシューズを装着し,バーチャル空間内にコンピュータグラフィックスを使って構築された家庭環境を歩行してもらった.また歩行結果を被験者にリアルタイム可視化可能なシステムも構築した.一方で,バーチャル環境での実験の妥当性を確認するためにコンピュータグラフィックスで作られたものと同じ環境を実空間でも構築した.実験の結果,バーチャル空間とリアル空間で足の運び,特に足を上げる高さに若干の違いが生じた.昨年度の実験では,バーチャル空間は摩擦の少ない床,リアル空間はカーペットと実験環境に違いがあったため,足の運びの違いが床材に起因するものなのか,もしくは立体映像を上から見たことによる影響なのか切り分ける研究を行うとともに,実映像を使った訓練空間も構築し,併せて評価していく予定である.移動環境における訓練システムに関する研究をのぞき,本研究の当初予定をほぼ終了しているため.本年度は,実環境における2つの訓練システムの検討および代替現実環境での利用を想定した表情認識AIの基礎検討を行った.まず,高齢者を対象とした家庭環境内の躓き環境のVR空間における再現および躓きを気づかせるためのV訓練システムの構築,およびVR空間における大きさ知覚に関する基礎検討を行った.今回,足首の角度に着目しVR空間における歩行動作の計測を行ったが,高齢者と若年者で有意差が出ず,今後も高齢者における躓き原因について引き続き研究をすすめ,最終的にはVRを使った訓練システムの構築を行う予定である.次に,自転車運転時の「ながら運転」シミュレータの研究を進めた.

これは近年問題となっている自転車を運転しながらスマートフォンを操作するといった作業をVRシステムを利用してもらい,危険度を認識してもらうシステムとして構築している.本システムを利用した体験者は「ながら運転」の危険について認識したものの,「別の作業を行っていない」体験者と「ながら運転」を行った体験者との間の行動の違いに有意な差が認められなかったため,今後周囲の環境をさらに検討することによって,自転車運転訓練システムの構築を目指すこととした.最後に,表情認識AIの基礎検討を進めた.上記のような個人利用のシステムでなく,複数人で協調作業を行う場合には,相手の表情を認識し,その際の感情を読み取る必要がある.そこで,相手の表情を読み取り,感情を数値化可能なAIエンジンの基礎検討を行った.特に不満を持っている場合のいわゆる「負の感情」を持っている場合の検出を試みたところ,基礎実験では80%程度の精度で「負の感情」が表出している場面を特定することを可能とした.本研究では,以下の3点について研究を行った.1)訓練用代替現実感システムを構築するための市販のアクションカメラ4台を利用した両眼立体視全方位カメラを開発した.2)代替現実感システムに手映像を重畳する手法を開発し,Singular Spectrum Analysisを用いて映像のキーフレームの自動抽出を可能とした.3)高齢者向け訓練・計測システムを開発し,認知機能および歩行機能を客観的に評価した.1、深い没入感をもつ訓練用代替現実感システムの構築本項目に関しては,初年度の予定をほぼ達成することができた.切替方法についても提示する環境,特に色々なものが置かれている環境下でユーザーに気付かれることなく,切り替えることは原理上かなり難しいが,均一な背景をもつ環境下ではかなりスムーズに切り替えることが可能となった.2、高精度な手の動き情報取得および動きの意味認識技術の基礎検討本項目については,初年度はデータグローブを用いた認識および代替現実感システムへの映像重畳を目的としていた.本目的については達成し,システムに導入することができた.さらに当初次年度以降の目的であった手に何も装着せず認識させる手法についても一部着手し,周囲環境によってはノイズが入ることがあるものの,ある程度実現可能となった.まずは移動に対応した訓練システムへの対応を行うとともに,実応用への準備にとりかかる予定である.応用システムの検討を行い,アンケート等によりフィードバックを得て,問題点を明確にしていく.移動環境を伴う訓練システムについて,直線かつ移動しながらの環境を代替現実感システムで作成することの意義,および効果的な環境を見つけ出すことが難しい状況にある.
放電マイクロマシニングセンターの開発

本研究は,細線電極による放電表面改質、微細軸の瞬時成形、成形した電極での微細加工などを行い,さらに瞬時成形した微細軸の先端をプローブとして形状測定する複合加工機を開発するものである.平成13年度から15年度に亘る研究成果は以下の通りである。1)放電波形と電極先端形状の関係調査波形制御付きの放電電源を製作して、電極瞬時成形前の先端形状のばらつきや、加工液の分子量を変化させて微細軸成形のための最適放電条件を調査した。また分子動力学法によるプロセスシミュレーションを試み、微細化プロセスを追跡した。2)単発放電中の極間現象の観察時間分解イメージング法および高速度カメラを併用して、単発放電中の極間現象の連続観察を実行した。電極の溶融先端部は放電終了後に軸方向に移動して微細化が進行している。また、放電圧力による電極横振動が観察され、冷却後の先端形状に少なからず影響を及ぼしていることが推測された。3)放電マイクロマシニングセンターの製作おいび総合運転試験微粗動加工テーブルとピエゾスキャナーとを組み合わせた放電マイクロマシニングセンター駆動部を製作した。この機構部をコンピュータ制御し、微細加工を実施した。加工物は細分割ステッピングモータによるテーブルによって駆動し、電極はピエゾスキャナーに駆動する。実際の加工においては、上記2つの駆動源を同時に動作させてデュアルモード制御を実行した。これにより、単発放電によって瞬時成形した電極を用いたマイクロ加工が実現された。本研究は,細線電極による放電表面改質、微細軸の瞬時成形、成形した電極での微細加工などを行い,さらに瞬時成形した微細軸の先端をプローブとして形状測定する複合加工機を開発するものである.平成13年度は要素技術の完成を目指して以下の項目を実施した。1)微細電極およびプローブの形状測定既設の形彫り放電加工機を用いて微細電極およびプローブを多数成形し、SEMによって成形した形状の詳細な寸法測定を行った。成形微細軸の直径や軸との傾きなどの統計的なデータを採取し、最適な形状を得る条件を探査した。その結果、直径0.1mmのタングステン線を用いた場合の微細軸をうる条件は、投入エネルギが0.4Jであることが判明した。2)放電加工用電源および機構部の製作加工装置の放電電源として、電流100mA,パルス幅500nsの微細加工用電源と、電流100A,パルス幅10μsから400μsの電極成形用単発放電電源とを製作し,これらを加工プロセスの各段階に応じて切り換えて用いるよう工夫した。特に、微細電極やプローブの瞬時成形においては,微細電極保持機構を有し電極形状の機上計測を可能とする専用加工機構を製作した。電極の形状計測には、当面カッタの刃との電気的な接触検知方式を用いた。3)微細電極先端部の材料分析および単発放電中の極間現象の観察上記電極成形メカニズムの検討のために,先端部断面の金属組織の分析を行い、冷却過程を推測した。先端部は溶融冷却部と未溶融再結晶部とからなっていることが判明した。さらに電極瞬時成形のメカニズムを明らかにすると共に、最適加工条件を選択するために、時間分解イメージング法による単発放電中の極間現象を観察した。観察には,パルスレーザーを光源とし、油中、液滴、蒸留水や気中において実験を行った。これらことから、電極は先端が一旦溶融した後に軸方向に移動して微細化が進行していることが推測された。4)放電加工テーブルの試作モータ駆動の小型2軸テーブル(可動距離10mm,移動ピッチ1μm)上にSPMで用いられるピエゾチューブ(平面移動100μm上下動7μm)を搭載して、微粗動可能な2モードタイプの加工テーブルを試作している。現在各モードの試験中である。

本研究は、細線電極による放電表面改質、微細軸の瞬時成形、成形した電極での微細加工などを行い、さらに瞬時成形した微細軸の先端をプローブとして形状測定する複合加工機を開発するものである。平成14年度は平成13年度の要素技術に関する研究成果を踏まえて次の項目を実施した。1)放電マイクロマシニングセンター機構部の製作平成13年度に製作した微粗動加工テーブルとピエゾスキャナーとを組み合わせて放電マイクロマシニングセンターの機構部とし、総合的な駆動性能を調べた。細分割パルスを用いたステッピングモータ駆動によって、分解能20mのテーブル駆動が可能になった。またピエゾスキャナーの駆動により数nm以下の高速駆動が実現し、機構部の骨格が完成した。連続運転における電極繰り出し方式についてはさらに検討を要する。2)通常放電加工および微細放電加工の各モードの加工電源を改良し、これにより任意のパルス幅の放電を希望する回数発生させることが可能になった。3)SPM式機上モニタリングシステムの製作瞬時成形した微細軸の先端を測定プローブとして使用したSPM測定システムの試作を行った。検知方式として、プローブ加工物間の接触電圧と測定回路に流れる電流とを検知し、それぞれが一定になるようにプローブを変位させ、その変位量で形状を把握する。振動や表面酸化膜の影響のため、トンネル電流の領域を利用することは困難であると判断した。しかも試料に対する押し付け力がある範囲以上にならないと安定な接触電流が得られず、したがってAFM方式を採用する必要があることが判明した。4)放電波形と電極先端形状の関係調査平成13年度に作成した波形制御付きの放電電源を使用して微細軸成形のための最適放電条件を調査した。特に、対向する電極の形状や軸方向の気流の影響を検討した。さらにアルゴン雰囲気中で単発放電実験を実施し、酸化膜の影響の少ない滑らかな先端形状が実現できた。5)連続成形可能な電極ホルダーの製作とスイッチング回路の製作平成13年度に作成した単発放電電源を改良し、連続的に配置した多数の電極に順次放電電圧が印加される制御電源を製作して、プローブの連続瞬時成形を実施した。これにより、多数の成形プローブから希望する形状を選択することが可能になった。本研究は,細線電極による放電表面改質、微細軸の瞬時成形、成形した電極での微細加工などを行い,さらに瞬時成形した微細軸の先端をプローブとして形状測定する複合加工機を開発するものである.平成15年度は平成14年度までの研究成果を踏まえて次の項目を実施した。1)単発放電中の極間現象の観察時間分解イメージング法および高速度カメラを併用して、単発放電中の極間現象の連続観察を実行した。油中、液滴、蒸留水や気中において実験を行った結果、電極の溶融先端部は放電終了後に軸方向に移動して微細化が進行している。液滴の運動追跡により、放電終了後に電極に働く力を予測した。また、放電圧力による電極横振動が観察され、冷却後の先端形状に少なからず影響を及ぼしていることが推測された。2)通常放電加工における加工条件の設定および加工状態のモニタリングを、ジョイスティック操作を用いたコンピューアを介して実行するシステムの開発を行った。3)放電波形と電極先端形状の関係調査平成14年度までに作成した波形制御付きの放電電源を使用して、電極瞬時成形前の先端形状のばらつきや、加工液の分子量を変化させて微細軸成形のための最適放電条件を調査した。
大型核融合実験装置のプラズマ生成技術(共同研究)

本計画研究は,核融合特別研究の各班の講座研究者により研究開発された成果を,大型核融合実験装置(ヘリオトロン,ミラー,レーザー)に適用し,両者の研究を相乗的に進展させることを目的としている.これを具体的に実施するとき,講座研究者の計画と大型装置独自の計画進行との相互調整が不可欠であり,このため常置委員会を設けている.本年度の計画遂行においてこの委員会の設割が大であった.すなわち,スケジュール上の無理が共同研究者にしわ寄せされたり,また講座研究者の独自性の確保に問題があったりした.それらをCASE BY CASEの対応により解決し,以下の成果を得た.ガンマ10においては, 2.45GHz,2KWのECR放電況浄法を適用し, (1)壁面洗浄時間の激減, (2)軽不純物及び水素リサイクリングの減少,(3)洗浄後第1ショットからのプラグ・バリア電位の形成・維持,などこれまでのパルスプラズマ洗浄に比べ顕著な改善がなされた.とくに(2)に関して,主プラズマショット時の壁からのリフラックスは,パルスプラズマショットの千回分以上に相当する値が洗浄直後から得られ,さらにその後には従来法では達し得なかった低い値まで得ている.ヘリオトロンEでは, IN SITUカーボンコーティングの改良が行われ,昨年度問題となったH粒子リサイクリングの増大を防ぐことが可能となった.これにより, NBI加熱時にも主プラズマの密度制御が容易となった.また,新しいイオン温度計測としての遠赤外レーザー散乱計測の実現性の調査研究を行い,その見通しや課題を明らかにした.激光XII号研究では,放射化法による中性子スペクトル計測法の開発と新しい燃料ρR推定法の提案,中性子TOF法計測の高度化の準備研究, X線リソグラフィーによる立体パターニングの実現,中性子輸送をとり入れた爆縮流体コードの改良,などの成果があった.本計画研究は,核融合特別研究の各班の講座研究者により研究開発された成果を,大型核融合実験装置(ヘリオトロン,ミラー,レーザー)に適用し,両者の研究を相乗的に進展させることを目的としている.これを具体的に実施するとき,講座研究者の計画と大型装置独自の計画進行との相互調整が不可欠であり,このため常置委員会を設けている.本年度の計画遂行においてこの委員会の設割が大であった.すなわち,スケジュール上の無理が共同研究者にしわ寄せされたり,また講座研究者の独自性の確保に問題があったりした.それらをCASE BY CASEの対応により解決し,以下の成果を得た.ガンマ10においては, 2.45GHz,2KWのECR放電況浄法を適用し, (1)壁面洗浄時間の激減, (2)軽不純物及び水素リサイクリングの減少,(3)洗浄後第1ショットからのプラグ・バリア電位の形成・維持,などこれまでのパルスプラズマ洗浄に比べ顕著な改善がなされた.とくに(2)に関して,主プラズマショット時の壁からのリフラックスは,パルスプラズマショットの千回分以上に相当する値が洗浄直後から得られ,さらにその後には従来法では達し得なかった低い値まで得ている.ヘリオトロンEでは, IN SITUカーボンコーティングの改良が行われ,昨年度問題となったH粒子リサイクリングの増大を防ぐことが可能となった.これにより, NBI加熱時にも主プラズマの密度制御が容易となった.また,新しいイオン温度計測としての遠赤外レーザー散乱計測の実現性の調査研究を行い,その見通しや課題を明らかにした.激光XII号研究では,放射化法による中性子スペクトル計測法の開発と新しい燃料ρR推定法の提案,中性子TOF法計測の高度化の準備研究, X線リソグラフィーによる立体パターニングの実現,中性子輸送をとり入れた爆縮流体コードの改良,などの成果があった.
教師の省察的実践の創造に資する校内研修プログラムと授業の臨床的研究のデザイン

校内での授業研究会において、授業者のみならず参観者が、授業や子どもの学びをとらえる際の自身の視点を自覚化できる支援-事後検討会における視点の可視化や、視点の意味づけ、問いの共有化-を行うことが、授業研究を通して同僚性を構築していく基盤となる。さらに、授業研究会で具体的な子どもの学びの事実を洞察し、教師同士で対話を継続していくなかで、自身の授業の見方・考え方、学習観や子ども観の変容(相対化)が促される。そのとき欠かせないことは、教師が自身の実践を一人称の言葉で書く・語るという営みである。本研究は、目的(1)1人ひとりの教師が自らの実践課題に即して省察・実践していくことを可能にする校内研修のあり方について、事例に基づいて明らかにすること、目的(2)校内研修を活性化し、教師相互の省察的実践を促進していく授業の臨床的研究のあり方を検討することを目的として研究を進めてきた。昨年度は特に校内授業研究会の運営方法についての検討と、個々の教師の実践課題との関連づけに焦点を当て、事例研究を行った。福島県内の公立小学校1校、公立中学校1校に加えて、宮城県内の公立小学校2校、栃木県内の公立小学校1校における校内研修の取り組みにアドバイザーとして参加しながら事例を蒐集・考察した結果、下記の2点が整理された。考察(1)授業研究の事後検討会では、1位のにおける<目的-手>連関の一般化や、教材による授業の目的達成の確実性の検証に解消されない、授業者自身のライフヒストリーに基づく実践課題に即した検討過程が位置づけられる必要があること。考察(2)授業研究においては、授業者のみならず参観者における実践課題に即した授業をみる視点、子どもの学びをとらえる視点を自覚化できる支援を行い、授業者と参観者がともに授業研究において学び合う関係(同僚性)を構築していくための素地を耕していくことが重要であること。以上の考察結果をもとに、本年度は(1)校内授業研究会の運営による個々の教師の省察過程の事例研究に加えて、(2)研修主任の果たす役割に関する考察を深めていく必要があることが確認された。昨年度は、研究協力校における校内授業研究の運営にかかわり、個々の教師の実践課題と学校の課題とのすり合わせを図ることを通して、具体的な授業改善のサポートを行った。一昨年度から引き続き研究協力校として連携している福島県内の公立小学校1校、宮城県内の公立小学校2校、栃木県内の公立小学校1校に加えて、長野県の国立(大学附属)中学校における校内授業研究の取り組みにアドバイザーとして参加しながら事例を蒐集・考察した結果、下記の点が整理された。考察(1)具体的な授業観察における児童生徒の学びの洞察に基づいた教師同士の対話を継続していくことを通して、児童生徒の学びをとらえる教師のまなざし・視点に対して、教師自身が自覚的になっていくことが、自身の授業の見方・考え方=授業観や子ども観、学習観などを相対化していく契機となること。このことを、今後も継続的に事例研究を進めていく上での研究の枠組みにしていく必要性を確認することができた。本研究は、目的(1)一人ひとりの教師が自らの実践課題に即して授業実践を省察、実践していくことを可能にする校内研修のプログラムの在り方について、研究協力校など具体的な事例をもとに検討し、必要となる条件について明らかにすること、目的(2)日常の授業を対象とした校内研修を活性化し、教師相互が省察的に実践を行うことを促す授業の臨床的研究の可能性について検討することを目的として進めてきた。昨年度は本研究の最終年度にあたるが、これまでと同様に研究協力校における校内授業研究の運営にかかわり、アドバイザーとして参加しながら事例の蒐集・考察を行ってきた。そのなかで個々の教師の実践課題と学校の課題とのすり合わせを図ることを通して具体的な授業改善に向けてのサポートを行った。さらに研究最終年度の検証を目的として研究協力校(中学校)における教師たちに対するアンケート調査を実施した。以上の結果、次の2点が整理された。考察(1)具体的な授業の観察においては、児童生徒の学びをどのような視点でみるかについて、校内研究テーマや学校教育目標、各教科の研究テーマと関連づけて教員相互に日常的に協議し、児童生徒の学びをとらえる視点について教師が自覚的になることが、授業づくりにおいて共通する/普遍的な実践的課題を、児童生徒の学びの事実から抽出・整理することを支援することになることが明らかになった。考察

(2)教師の授業実践における固有の課題を明らかにしていく、さらには自身の授業/学習/子ども観を見つめ直していく契機として、具体的な授業実践に関する授業研究の場での教師相互の対話に自ら参加する経験と、同僚や先輩教師からの助言とに、重要な意味を見出している教師の割合が高いことがアンケート結果から明確になった。今後は本研究の事例に基づく研究成果を複数の論文にまとめ、教師の省察的実践に資する授業研究のデザインについて具体的な問題提起を行っていく予定である。
中性子照射誘起拡散の精密測定のためのイオンビ-ムセクショニング装置の試作

高エネルギ-中性子による材料の照射損傷はボイドスウェリングや脆化の原因となり、照射材料の組織や機械的性質に関しては核融合炉材料工学とも関連して、広汎な基礎的、開発的研究が行なわれている。しかし、照射下での材料の組織形成、変化を津速する構成原子の輸送基礎過程、すなわち、拡散機構の詳細や拡散係数の大きさに関する知見は皆無に等しく、今後の研究に待つべき点が多い。本研究では中性子照射下での比較的低温における超低速拡散を放射性同位元素を用いて高精度に測定するためのマイクロセクショニング装置を試作した。本装置は超高真空中に取り付けたイオンガンからのAr^+イオンビ-ムによって照射拡散試料をスパッタし、そのスパッタ原子を約1020nmごとに堆積し半導体検出器によりその放射能強度を測定して拡散係数を高精度に測定するものである。このようにして試作された装置を用いて、中性子照射誘起拡散の測定法を確立することを本研究の主な目的とした。試料は超純度アルミニウムに鉄を約10nmだけ電気メッキによって付着させたものを用いた。試料の照射中の酸化を抑制するため、この試料をアルミニウムキャプセルに真空中で電子ビ-ム溶接によって封入した。JMTRにおいて次の2種類の材料照射実験を行なった。200Cおよび400Cの一定温度に保持してそれぞれ168hrおよび533hrの中性子照射を行なった。照射拡散後の試料を半導体検出器によって測定し、拡散原子種が放射化していることを確認した。作製したイオンビ-ムマイクロセクショニング装置を用いて照射誘起拡散係数を測定した。中性子照射損傷の基礎研究として本研究では中性子照射誘起拡散の測定およびその拡散機構の解明をめざしてイオンビ-ムナノセクショニング測定装置の試作研究を行ないつつある。平成2年度は、(1)オ-ジェ電子分光装置付きイオンビ-ムナノセクショニング装置の試作、および(2)JMTRによる中性子照射下拡散実験の計画と試料の作製を行なった。1.オ-ジェスペクトロメ-タ-付きイオンビ-ムナノセクショニング装置の試作本装置はイオンガンにより加速されたアルゴンイオンで拡散試料をスパッタさせ、基に蒸着させるスパッタセクショニングチェンバ-、オ-ジェ分析チェンバ-およびその連結部にタ-ボ分子ポンプを直結させたチェンバ-より構成される。両チェンバ-内を超高真空に保持したまま試料を移動させるトランスファ-ロッドも作製した。現在、これらのチェンバ-、タ-ボ分子ポンプ、イオンガン、試料ホルダ-回転部、蒸着基板部、オ-ジェ分折管の取り付けを完了し、チェンバ-内は当初の目標である10^<-9>Torrの真空度に到達した。オ-ジェ分析系の立ちあげも完了し分析可能な状態に至っている。2.JMTRによる中性子入射下拡散実験計画の具体化と試料の作製JMTRにおける材料照射実験として、原子炉内での温度ー中性子束履歴の制御など十分に行なうことのできる平成3年度JMTR照射計画の試料を本年度末に提出した。試料には、99.9999%の高純度アルミニウムを用い、中性子照射による放射化を極力おさえることにつとめた。拡散原子種には、Feを選び、(n,γ)反応により^<54>Mn, ^<59>Fe, ^<60>Coに放射化した元素の照射誘起拡散係数を同時に測定する予定である。以上のように、(1)および(2)について計画はきわめて順調に進行している。200-600Cという比較的低い温度でのJMTR照射下における小さな拡散係数を測定するには10^<-2> ^4m^2s^<-1>程度までの非常に小さな拡散係数を測定し得るセクショニング法として、イオンビ-ムによるスパッタリング技術を採用し、ナノオ-ダ-のスケ-ルの深さ方向での濃度分布を測定できる"マイクロセクショニング装置"を試作した。

本装置を用いることによって、比較的低い温度でのJMTR照射下における拡散を測定することが可能になった。試料は超純度アルミニウムに鉄を約10nmだけ電気メッキによって付着させたものを用いた。試料の照射中の酸化を抑制するため、この試料をアルミニウムキャプセルに真空中で電子ビ-ム溶接によって封入した。JMTRにおいて次の2種類の材料照射実験を行なった。(i)400Cの一定温度に保持して533hrの中性子照射を行なった。中性子照射量は0.95x10^<20>nvtであった。(ii)水カラビットを用いて、推定温度150-200Cの下で168照射拡散後の試料を半導体検出器によって測定し、拡散原子種が放射化していることを確認した。上記で作製したイオンビ-ムマイクロセクショニング装置を用いて照射誘起拡散係数を測定した。
自己免疫性関節炎におけるα9インテグリンの機能解析

我々はこれまで、コラーゲン誘導性関節炎モデルを用いて、病原性のTh17細胞の分化誘導にα9インテグリンがどのように関与しているのか検討してきた。その結果、リンパ節のマクロファージやconventional dendritic cell(cDCs)がα9インテグリンを発現しており、α9インテグリンからのシグナルによって、これらの細胞によるTh17細胞誘導性のサイトカイン(IL-6やIL-23)の発現を亢進させることが分かった。我々は、この現象がTh17細胞誘導性のサイトカインに限定した効果であるのか検証するため、Th1誘導性サイトカイン(IL-12)やTh17分化に対し抑制的な効果を持つサイトカイン(IL-27)の発現に与える影響を検討した。その結果、α9インテグリン依存的なシグナルはToll like receptor依存的な刺激の有無にかかわらず、IL-12やIL27の発現には影響を与えないことが分かった。この結果は、α9インテグリンがTh17の分化に特異的な役割を担っていることを示すものであり、α9インテグリンがTh17依存的な自己免疫疾患の治療に有用な標的である可能性を示している。さらに、抗α9インテグリン抗体を投与されたマウスにおいて、Th17関連サイトカイン(TNF-α,IL-22)の発現を解析したところ、抗α9インテグリンの投与はリンパ節細胞におけるIL-22の産生を有意に抑制することが分かった。これはα9インデグリンの阻害によりIL-22を産生するTh17細胞の数が減少したことを示している。以上の結果は、これまでの我々のデータを補強、支持するものであり、これまでのデータの信頼性を裏付けるという点で非常に意義深い。細胞外マトリックス(ECM)のタンパク質はインテグリンなどの受容体を介して細胞にシグナルを誘導し、細胞の機能を制御することが知られている。特に、炎症や繊維化といった病変部においてECMタンパク質は発現亢進し、炎症や組織修復などに寄与していることが報告されている。しかしながら、リンパ組織において、免疫細胞の分化や機能に、これらの分子が担う役割については未だ不明な点が多い。本研究では、(1)オステオポンチン(OPN)やテネイシ-C(TN-C)などのECMタンパク質が免疫したマウスの所属リンパ節で速やかに発現亢進すること、(2)リンパ節内の古典的樹状細胞(cDC)や一部のマクロファージがα9インテグリンやそのリガンドであるOPN,TN-Cを発現していること、(3)α9インテグリン依存的なシグナルはToll様受容体(TLR)2やTLR4依存的なシグナルと相乗的に作用してcDCやマクロファージのTh17細胞誘導性サイトカイン(IL-6, IL-23)の産生を促進すること、(4)抗α9インテグリン阻害抗体の投与が所属リンパ節におけるIL-6やIL-23の発現を抑制し、Th17細胞の分化を阻害することで、コラーゲン誘導性関節炎の進展を抑制すること、(5)α9インテグリンの阻害はTh17細胞の局所への遊走に必要なケモカイン受容体(CCR6)の発現低下を引き起こし、Th17細胞の局所への遊走性を低下させること、(6)α9インテグリン依存的なIL-6の産生誘導には特定のシグナル分子(ERK)が重要であることを発見した。以上の結果は、これまで不明であったOPNやTN-C、およびその受容体であるα9インテグリンの自己免疫性疾患やリンパ組織における役割を明らかにしただけでなく、抗α9インテグリン阻害抗体がTh17細胞依存的な自己免疫性疾患に対する有望な治療薬として発展できる可能性を示した。
複製モデル教材ならびに進化教育教材の開発研究を中心とした新しい生物学教育の展開

本研究では、中等・高等教育における新学習指導要領に対応する生物教育のための教材の開発研究を、分子生物学ならびに進化学における教材開発に関して重点的に遂行した。その結果、新学習指導要領が目的とするミクロからマクロまでを効果的に結びつける生物学の新たな教材として、Origami Bird改良実験、分子系統樹作成実験などいくつかの生徒実験教材を開発した。これらの教材は、2013年度から始まる新科目「生物」(4単位)で用いられる教科書の一つに掲載された。本研究は、中等教育の現場や科学コミュニケーションの現場においてすぐにでも役立つ、斬新でユニークな分子生物学ならびに進化学に関する教材開発ならびに新しい科学コミュニケーション法の開発を目指している。平成22年度は、この目的に沿った4つのテーマのうち、次のテーマについて研究を行った。●生物多様性創出の理解を促進するための分子生物学教材の開発研究ヒトなど有胎盤類とオポッサムなど有袋類は、それぞれが適応放散によってお互いに共通した生態的地位や形態に分化した興味深い進化様式を有している。これを素材にし、ゲノム情報活用実験教材として、両ゲノムから両種に共通する遺伝子のセットを取り出し、それらの塩基配列を網羅的に比較解析するなどして、有胎盤類と有袋類の進化の流れを体験できる教材の開発を行うことを目的として研究を行った。平成22年度は、共通する遺伝子のうちDNA複製酵素の一つDNAポリメラーゼα遺伝子に着目し、両者由来の細胞(HeLaならびにOK細胞)を培養し、タンパク質を抽出してその構造に関する比較生化学的解析を行った。またDNA複製のしくみと、DNAポリメラーゼの複製エラーにより突然変異が生じるメカニズムに関するモデル教材、生徒実習教材の開発を行った。Origami birdは、アメリカで考案された、進化教育教材のための架空生物である。オリジナルでは、表現型の変化(羽の形、羽の胴体へのつき方等)がサイコロによるランダムな"変異"によって起こるため、進化において重要なDNAの突然変異との関わりが生徒に理解されないというデメリットがあったが、平成22年度は、こうしたデメリットを解消するための改良を行った上で、高校生に対して本教材を試し、教育効果を検討した。●分子系統樹作成を基本とする分子進化教材の開発研究平成23年度以降に予定していた研究テーマだが、上記Origami bird研究が予定より早く進行したため前倒しで研究を開始し、試行的ないくつかの生徒実習を開発した。平成23年度は、この目的に沿った4つのテーマのうち、次のテーマについて研究を行った。●生物多様性創出の理解を促進するための分子生物学教材の開発研究平成22年度に引き続き、ゲノム情報活用実験教材として、両ゲノムから両種に共通する遺伝子のセットを取り出し、それらの塩基配列を網羅的に比較解析するなどして、有胎盤類と有袋類の進化の流れを体験できる教材の開発を行うことを目的として研究を行った。平成23年度は、有袋類細胞(OK細胞)を培養し、mRNAを抽出した後にcDNAライブラリーを構築し、これを鋳型としてDNAポリメラーゼα遺伝子のサブクローニングを試みた。●人間のための生物学教育の充実と新しい科学コミュニケーション法の確立遺伝子組換え、DNA鑑定、DNA診断を、遺伝子のはたらきを通じて理解できる教材の開発を目的として、平成23年度はまず、遺伝子がどのように発現し、タンパク質を作り上げるか、すなわちDNA→RNA→タンパク質(セントラルドグマ)の流れがわかりやすく生徒に理解できるモデル教材の開発を行うための質問紙調査を行った。また、バナナからDNAを抽出する簡単な実験をベースとし、遺伝子組換えやDNA診断などの身近な社会問題に興味・関心を惹くような斬新な生徒実習法の開発を目的として、実験開発を行った。●分子系統樹作成を基本とする分子進化教材の開発研究身近な野菜を用いて、分子時計が一定と考えられているRuBisCO遺伝子の一部塩基配列をPCR法を用いて増幅し、増幅した塩基配列のシークエンス解析を行った。また分子系統樹作成ソフトウェアを用いて分子系統樹を作成し、野菜の分類学上の系統関係が反映されるかどうかを確認した上で、この一連の流れを教材化するために、フローチャートを作成した。さらに、高校生に、データベースから塩基配列をダウンロードし、分子系統樹を作らせる授業実践を行い、教育効果を検討した。平成24年度は、この目的に沿った4つのテーマのうち、次のテーマについて研究を行った。●生物多様性創出の理解を促進するための分子生物学教材の開発研究:平成23年度に引き続き、ゲノム情報活用実験教材の作成を目的として、有袋類細胞(OK細胞)から作成したcDNAライブラリーを鋳型として、DNAポリメラーゼαの触媒サブユニット遺伝子ならびに調節サブユニット遺伝子のサブクローニングを試みた。

また、平成22年度に引き続き、DNA複製のしくみとDNAポリメラーゼの複製エラーにより突然変異が生じるメカニズムに関するモデル教材の開発を行い、その基礎となるペーパークラフトモデルを作成した。●人間のための生物学教育の充実と新しい科学コミュニケーション法の確立:平成23年度に引き続き、遺伝子がどのように発現し、タンパク質を作り上げるか、すなわちセントラルドグマの流れがわかりやすく生徒に理解できる活動教材の開発を行った。また、実験が好きでない人もしくは文系と、我々理系との“共振"、そして芸術と科学の融合を目指した科学コミュニケーションの新たな試みとして、一橋大学の語学系・芸術系研究室との共同研究会を開催し、“文理共振"のための方法論の検討を行った。●分子系統樹作成を基本とする分子進化教材の開発研究:平成23年度に引き続き、身近な野菜を用いて、光合成に必要なRuBisCO遺伝子を利用した分子系統樹を描く生徒実験の改良を行い、人為選択の要素を取り入れた新たな生徒実験を開発した。また哺乳類を用いて、ヘモグロビンα鎖遺伝子を利用した分子系統樹を描く生徒実験の開発を行い、授業実践により教育効果を検討した。「●人間のための生物学教育の充実と新しい科学コミュニケーション法の確立」ならびに「●分子系統樹作成を基本とする分子進化教材の開発研究」については、交付申請書に記載した「研究の目的」ならびに「研究実施計画」通りに進展しており、特に後者に関しては当初の計画以上に進展している。しかし、「●生物多様性創出の理解を促進するための分子生物学教材の開発研究」に関しては、分子生物学的手法の進展が思ったより進んでおらず、当初計画に入っていたDNAの突然変異に関するモデル教材開発が遅れている。以上のことから、研究計画全体に関して言えば「(2)おおむね順調に進展している」と判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。上記「現在までの達成度」において述べたように、とりわけ「●生物多様性創出の理解を促進するための分子生物学教材の開発研究」テーマにおける研究進捗状況がかんばしくないことから、分子生物学的手法の見直しも含めて、研究方法を改良していく必要があると考えられるが、その他の研究テーマについては研究進展が良好であることから、このまま当初の計画通りに進めていくこととする。
難病患者家族の介護プロセスにおける対処方略の学習支援プログラム開発

本研究の目的は、先行研究で抽出した難病患者家族の方略項目の信頼性・妥当性を検討することと、自己実現を志向する家族が必要とする方略を獲得するための学習支援プログラムを開発することである。先行研究で抽出した24の対処のうち、必要度をみると家族の支持率の高かった項目は、「ネットワークを拡げる」「自分の時間を大切にする」「気持ちをコントロールする」などであった。この結果を踏まえて、難病患者を介護する家族のための学習支援システムについて検討し、家族と看護者用の手引きの2種類を作成した。19年度は、(1)難病患者家族の体験記や研究論文等の文献から家族の方略項目を抽出(2)難病ケアを担当しているA県内の保健所保健師4名、訪問看護ステーションの看護師5名を対象にグループインタビュー調査を行い、看護者が観察した介護プロセスにおける家族の方略項目を抽出した。訪問看護師の調査から【外部資源を上手に活用する】方略において<問題解決につながる専門職を選別し相談する>、【気持ちをコントロールする】方略において<看取り後も発病に対する否認や怒りをも持ち続ける>などの具体的内容が抽出されたが、新たな項目は抽出されなかった。先行研究で抽出した22の方略項目は、家族が現在置かれている状況をどのように認識しているのかを理解する手がかりとなり、介護者の方略を早期にアセスメントするための測定用具としても活用できると考えられる。22の方略項目の信頼性・妥当性の検討を目的に、家族の介護プロセスにおける困難な状況ごと(発病の頃、確定診断の頃、介護負担増大前、介護負担増大以降、看取り後)に構造化し、項目の必要度と実施度を把握する質問紙を作成した。20年度は、この質問紙を用いてA県内の神経難病患者家族の会の会員約00名を対象とし、郵送自記式質問紙調査を実施する予定である。1.自己実現を志向する難病患者家族が必要とする対処方略として抽出された24項目の妥当性の検討を目的とし、患者会の家族会員40名を対象として、家族の介護プロセスにおける困難な状況ごと(発病の頃、確定診断の頃、介護負担増大前、介護負担増大以降、看取り後)に対処方略の実施度と必要度を把握する質問紙を用いて聞き取り調査を実施した。その結果、実施度が7割以上の項目は「介護負担増大前」4項目、「介護負担増大以降」8項目、必要度が7割以上の項目は「確定診断の頃」3項目、「介護負担増大前」9項目、「介護負担増大以降」13項目、「看取り後」2項目であった。実施度と必要度共に7割以上の項目は、「介護負担増大前」の「生活を守るために努力する」「気持ちをコントロールする」「自分の健康を維持する」の3項目、「介護負担増大以降」の「生活を守るために努力する」「気持ちをコントロールする」「介護を自分の役目とする」「外部資源を上手に活用する」「自分の健康を維持管理する」「悔いの残らないよう介護する」の6項目であった。2.難病患者家族の介護プロセスにおける対処方略の学習支援プログラムを検討することを目的とし、訪問看護師5名と保健所保健師4名から、介護プロセスにおける困難な状況ごとに療養者と家族のニーズについて聞き取り調査を実施した。その結果、専門医や相談窓口、病気と治療、病初期からのリハビリテーション、予期的不安への対処などの学習支援、介護体験の意味づけの支援があげられた。また、訪問看護師・保健所保健師の課題として、担当者の異動や社会資源偏在に起因する看護継続の困難さなどがあげられた。1.2から、家族を対象とした学習支援プログラムを開発していくために、個別性・継続性を基盤とする具体的な知識提供、関係機関・職種との協働のための仕組みづくりの検討が必要であると考える。1.難病患者家族の対処方略の学習支援プログラムの開発を目的とし、個別性・継続性を基盤とする看護者と家族のための実践の手引きを試作した。家族向けの手引きは、「診断前後の不安・落胆期」「リハビリ期待・病状進行期」「医療的管理意思決定時期」「長期化した介護時期」における医療福祉情報や介護保険・自立支援制度の情報、不安や葛藤に対する対処方法を示した。看護者向けの手引きは、各期における患者家族への知識提供とコンサルテーションの方法を示した。2.研究者及び保健所保健師、訪問看護師が手引きを用いた学習支援と関係機関・職種との協働の仕組みづくりについて検討した。

その結果、確定診断前であっても気兼ねなく相談できる場、治療の選択の頃に安心して相談できる場、長期化した家族介護者の精神心理的変化を早期発見する場が必要であり、それは病院の相談室、保健所のような行政機関、病院の外来などであり、そこで看護者が意図的に関わる必要性が明らかになった。また、担当者の異動においてはケア会議を開催して看護の継続を図ることや、病初期から療養者と家族の精神心理的変化を把握する意図を持つことなどの課題が明らかになった。1、2から、個々の家族に対する看護介入が必要な状況の把握、方略の必要性、支援内容について事例分析を行い、難病患者家族の対処方略の学習支援プログラムの修正を加えた。今後は、グループに対する学習支援プログラムについて検討し、個別性と共通性を考慮した実践の手引きを作成することが必要であると考える。
新たに同定したPDE3B結合性リン酸化蛋白のクローニングと機能解析

本研究は、PDE3Bに相互作用しインスリンによりリン酸化されるp50のクローニングおよびそのその解析を目的とし、そのアプローチとしては1)yeast two-hybridにて既に得られている候補クローンの網羅的解析、2)燐酸化p50の分離、質量分析による同定を計画した。平成工8年度は、平成17年度に引き続き、yeast two-hybridにて既に得られている候補クローンの解析を主に行った。平成17年度にyeast two-hybridの2次スクリーニングおよびin vitroのreticulocyte lysateで合成した^<35>S標識PDE3Bを用いたGST pull downによりPDE3Bとの相互作用を確認した11クローンについて、ラット脂肪細胞の内因性PDE3Bとの相互作用の解析を行った。これら11クローンそれぞれのGST融合蛋白およびラット副睾脂肪細胞の可溶化膜分画を用いGST pull downを行い、抗PDE3B抗体を用いたWestern blot法ににより相互作用を検討した。その結果、11クローン中、キナーゼおよび転写因子を含む7クローンでラット脂肪細胞の内因性PDE3Bとのin vitroでの相互作用が確認された。さらに、11クローンについてそれぞれの蛋白に対する抗体を、GST融合蛋白をウサギに免疫することにより作成した。これちの抗体を用いて、得られたクローンの脂肪細胞内でのPDE3Bとの内因性の相互作用について、免役沈降法、Western blot法により、一部を解析した。本研究により、p50の候補としてキナーゼおよび転写因子を含む7クローンを限定した。さらに、本研究によりPDE3Bはp50および我々がすでに報告した14-3-3β以外に複数の蛋白と相互作用することが示唆された。脂肪組織における脂肪分解調節の破綻は血中遊離脂肪酸(FFA)の上昇をもたらし、その結果インスリン抵抗性が惹起される。インスリンの抗脂肪分解作用の機序としてインスリンによる脂肪細胞phosphodiesterase 3B(PDE3B)の活性化が考えられている。インスリンは、PDE3Bを燐酸化と共に活性化し、細胞内cAMP濃度の低下とホルモン感受性リパーゼの活性低下させ、中性脂肪の分解を抑制する。最近、ラット脂肪細胞において、インスリン依存性に燐酸化される分子量50kDaのPDE3B結合蛋白(p50)の存在を見出した。本研究ではp50をクローニングし、PDE3B,活性調節の分子メカニズムを明らかにすること目的とする。本研究は、1)yeast two-hybridにて既に得られている候補クローンの網羅的解析、2)燐酸化p50の分離、質量分析による同定の2つからなる。平成17年度は、目的1を中心に進めた。我々は、マウスPDE3Bをbaitとしたyeast two-hybridスクリーニングでPDE3Bに相互作用する14-3-3β蛋白を同定した。その際得られた陽性クローン中にp50が存在すると考えられる。今回、1次スクリーニング陽性の約80クローンについて2次スクリーニングを行い、陽性クローン11個を得た。これらのGST融合蛋白をE.Coliで合成し、reticulocyte lysateで合成した^<35>S標識PDE3Bとの相互作用をGST pull downにより検討した。その結果、11個のクローン全てについてPDE3Bとの相互作用をin vitroで認めた。一方、ラット脂肪細胞において、インスリンによるp50の燐酸化がワルトマニンにより阻害されること、p50の燐酸化がセリンおよびすスレオニンのリン酸化であることを見出した。さらに、ゲルろ過等を用いて、p50とPDEのキナーゼ分画にAktが存在することを証明した。

本研究は、PDE3Bに相互作用しインスリンによりリン酸化されるp50のクローニングおよびそのその解析を目的とし、そのアプローチとしては1)yeast two-hybridにて既に得られている候補クローンの網羅的解析、2)燐酸化p50の分離、質量分析による同定を計画した。平成18年度は、平成17年度に引き続き、yeast two-hybridにて既に得られている候補クローンの解析を主に行った。平成17年度にyeast two-hybridの2次スクリーニングおよびin vitroのreticulocyte lysateで合成した^<35>S標識PDE3Bを用いたGST pull downによりPDE3Bとの相互作用を確認した11クローンについて、ラット脂肪細胞の内因性PDE3Bとの相互作用の解析を行った。これら11クローンそれぞれのGST融合蛋白およびラット副睾脂肪細胞の可溶化膜分画を用いGST pull downを行い、抗PDE3B抗体を用いたWestern blot法ににより相互作用を検討した。その結果、11クローン中、キナーゼおよび転写因子を含む7クローンでラット脂肪細胞の内因性PDE3Bとのin vitroでの相互作用が確認された。さらに、11クローンについてそれぞれの蛋白に対する抗体を、GST融合蛋白をウサギに免疫することにより作成した。これらの抗体を用いて、得られたクローンの脂肪細胞内でのPDE3Bとの内因性の相互作用について、免役沈降法、Western blot法により、一部を解析した。本研究により、p50の候補としてキナーゼおよび転写因子を含む7クローンを限定した。さらに、本研究によりPDE3Bはp50および我々がすでに報告した14-3-3β以外に複数の蛋白と相互作用することが示唆された。
量子ランダムウォークの調和解析の研究

種々の代数的構造の上のランダムウォークについて、調和解析的な方法を用いて研究を行った。特に、量子ランダムウォーク(quantum random walk)をこのような視点に基づいて調べることを主眼とした。一般に、ランダムウォークの分布は時間が経つにつれて平衡状態に収束していくが、その収束の過程を詳しく記述することは、物理学や統計学への応用において中心的な位置を占める問題である。古典的なランダムウォークに関する結果を踏まえて、量子ランダムウォークの平衡状態への収束の仕方の特徴を捉える方法を考察した。代数的構造の面で言えば、カッツ代数の理論が重要な役割を担うことがわかった。量子ランダムウォークを生成するホップ代数の構造に加えて、調和解析の方法の礎になる双対性を有することが効いている。多少未完成な形ではあるが、そのあたりの事情は別紙記載の論文に発表した。その中で、古典的なランダムウォークと対応させながら、量子ランダムウォークの推移作用素や不変測度について述べ、平衡状態への収束の過程を記述する問題を定式化した。このような立場に関連して、グラフやアソシエーションスキームの上のランダムウォークについても、新しい知見が得られる。すなわち、状態空間をなすグラフやアソシエーションスキームに付随して自然に定まるある種の作用素の族を考え、それらをオブザ-バブル(量子確率論的観点から見た確率変数)とみなして、確率論的な挙動を調べるのである。たとえば距離正則グラフのように高い対称性をもつ状態空間を扱う場合には、指標や球関数の性質についての詳しい情報が得られ、調和解析の方法がうまく機能する。このあたりの話題に関しては、現在論文を準備中である。
副腎皮質培養細胞系を用いる抗ストレス薬評価を目的としたステロイド類定量法の開発

ヒトはストレスによってコルチゾールをはじめとするストレスホルモンを過剰分泌するため、これらを適度に抑制することは生体機能維持に重要と考える。本研究では、ステロイドホルモン合成の律速段階となるプレグネノロンおよび17-ヒドロキシプレグネノロンの簡便で再現性のよいセミミクロHPLC定量法を開発した。この定量法をウシ副腎皮質培養細胞系を用いて、抗ストレス薬(薬用人蔘サポニン代謝物)の評価法として応用した。長期間の過剰なストレスは、副腎皮質からのコルチゾール等の過分泌を引き起こし、消化器症状、高血圧、糖新生の亢進、免疫機能の低下などが引き起こされる。このようなコルチゾールの過剰分泌に対して適度な抑制を行い、ステロイドホルモンの濃度を調節し、生体機能を維持することは重要である。コルチゾールの分泌機構は、コレステロールより側鎖切断酵素チトクロームP450sccを介してプレグネノロンが産生され、これが律速段階となってコルチゾールなどのホルモンが分泌される。そのため、プレグネノロン、そのほかのステロイドホルモンを分離、定量することは、ストレスやCushing症候群の病態、ホルモンの生成メカニズムの解明、これらの疾患の治療薬の模索に重要である。中でもプレグネノロン定量することは、P450scc活性の定量を行う上で、また、ステロイドホルモンの生成過程の律速段階となる物質であることなどから、特に重要である。本年度は、汎用されているHPLCを用いてプレグネノロンおよび17-ヒドロキシプレグネノロンの簡便で再現性の良い定量法の開発を行い、測定法の信頼性を確認した。プレグネノロンはUV吸収を持たないため、平衡化された固定化酵素リアクター中で酵素変換を行い、プロゲステロンに変換し、トラップカラムで捕集後、分離カラムを用いる定量システムを開発した。開発したこの方法とGC/MS法とを比較し、測定法を確認した。この開発した測定方法を用いて、ウシ副腎皮質培養細胞にACTHで刺激を行い、ステロイドホルモンを産生させた。この際、トリロスタン(3β-HSD阻害剤)を用いてカスケードをとめることで、プレグネノロンが蓄積され定量できた。この培養細胞系に薬用人蔘サポニン代謝物のM4(20(s)-protopanaxatriol)を添加すると、プレグネノロンの産生が抑えられ、ステロイドホルモン生成抑制効果が認められた。この過剰のコルチゾール産生に対して適度な抑制を行い、ステロイドホルモンの濃度を調節し、生体機能を維持することは重要である。昨年度開発したプレグネノロンおよび17-ヒドロキシプレグネノロンのセミミクロHPLC定量法を用いて、ウシ副腎皮質培養細胞中のプレグネノロン定量に応用した。ウシ副腎皮質培養細胞にACTHで刺激を行い、さらにトリロスタン(3β-HSD阻害剤)を用いてカスケードをとめることで、プレグネノロンを蓄積させ、定量した。細胞数を一定にして培養液量を変えてプレグネノロンおよび17-ヒドロキシプレグネノロンを定量することで、細胞内から細胞外へのプレグネノロンの放出過程が、単純拡散によるものであることが推察された。この培養細胞系にコルチゾールの産生抑制作用が認められている薬用人蔘サポニン代謝物のM4(20(s)-protopanaxatriol)を添加し、細胞内外のプレグネノロンおよび17-ヒドロキシプレグネノロンを定量して、その抑制効果を評価した。その結果、細胞内外において、M4がプレグネノロンおよび17-ヒドロキシプレグネノロンの産生を抑えることを明らかにした。M4のコルチゾール抑制作用は、細胞内におけるコレステロールからプレグネノロンの変換過程において作用するものと推察された。