hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固相法によるオリゴヌクレオチドブロックの合成研究

1.ヌクレオチド樹脂の合成ヌクレオチド3′リン酸基と樹脂との結合には中性条件下で亜硝酸イソアミルで除去できるアニシド結合でつなぐことを行った。そのために4-アミノフェニル酢酸のトリクロロエチルエステル体を5′-ジメトキシトリチルチミジン-3′-オルトクロロフェニルリン酸と縮合し、得られたエステル体を1%ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンに結合した。樹脂に結合したヌクレオチド量は、樹脂1g当り97μモルであった。この樹脂をピリジン-酢酸中亜硝酸イソアミルと反応した所、室温3時間で定量的に、5′ジメトキシトリチルチミジン-3′-オルトクロロフェニルリン酸が遊離した。2.キャッピング反応の条件検討上記で合成した樹脂を用い、固相ホスホトリエステル法でオリゴヌクレオチド(AAAT)の合成を行った。しかし縮合収率は1670%と良くなかった。この原因はジメチルアミノピンジン存在下、アセチル化の反応の際に、アニシド基のチっ素にアセチル化が起こり、P-N結合が切断した事が判った。しかし、ジメチルアミノピンジンを加えなければ、チッ素へのアセチル化は起こらずP-N結合は安定であることが判った。従ってジメチルアミノピリジンを加えずアセチル化反応を行う検討をした。その結果、4モル濃度の無水酢酸を用いると室温1時間で5′水酸基のキャッピングが完結することが判った。3.オリゴヌクレオチドの合成上記ヌクレオチド樹脂及びキャッピング反応を用い、固相ホスホトリエステル法でヘキサヌクレオチド(【T_6】)及びドデカヌクレオチド(CTATGTATCCCT)を合成した。3′末端リン酸のオルトクロロフェニル基を除き脱保護し、逆相シリカゲル高速液体クロマトグラフィーで3′リン酸のみ保護されたヘキサマー及びドデカマーを単離した。
糸球体上皮細胞による糸球体限外濾過の調節

糸球体から濾過される水の量(糸球体濾過値)は糸球体濾過圧と糸球体係蹄壁における水の透過性(糸球体限外濾過係数)により規定されている。そのうち糸球体濾過圧は糸球体輸入動脈と糸球体輸出動脈の収縮と弛緩で調節されているが糸球体係蹄壁を構成する細胞(糸球体内皮細胞,メサンギウム細胞,上皮細胞)で調節されていると推定される糸球体限外濾過係の調節機構はまだ不明である。しかし,糸球体疾患で糸球体濾過機能が低下するのは糸球体限外濾過係数が低下するためと考えられることからその調節機構の解明は腎臓病学の重要なテーマである。これまで糸球体限外濾過係数は血管平滑筋細胞に由来するメサンギウム細胞が収縮,弛緩することで調節されているとする仮説が一般的に受け入れられていた。しかし,糸球体上皮細胞もアクチンなどの収縮蛋白に富み,解剖学的にも水に透過性を調節するのに適した位置にあることから糸球体上皮細胞が糸球体限外濾過係数の調節に関与している可能性も残されていた。本研究では循環血液量の増加などで心房が伸展すると心房筋より分泌され腎臓に作用しナトリウム排泄や利尿を促進する心房性ナトリウム利尿ペプチドの受容体の腎臓内局在を検索することと糸球体上皮細胞を特異的に傷害する動物モデルで形態機能相関を調べることで糸球体限外濾過係数の調節における糸球体上皮細胞の役割を検討した。心房性ナトリウム利尿ペプチドの受容体は腎臓では糸球体と髄質内層に多いことがこのホルモンの結合試験で示されているが,どの細胞に受容体が局在しているかは明らかではなかった。また,cDNAクローニングによる研究から心房性ナトリウム利尿ペプチドの受容体には3種のサブタイプがあることが示され,それぞれの受容体を区別してその局在を検索することが必要であった。そこでこれらのサブタイプのmRNAの腎臓内発現部位をRNase protection assayで,発現細胞をIn situ hybridization法で検索した。RNase protection assayで糸球体にはタイプAとタイプC受容体mRNAがほぼ同量発現され,髄質内層にはタイプA受容体mRNAがそれらとほぽ同量発現されていることが分かった。その局在をIn SITU hybridization法で検索したところ糸球体のタイプAとタイプC受容体mRNAは両床とも糸球体上皮細胞に,髄質内層のタイプA受容体mRNAは集合管上皮細胞にあることが明らかになった。タイプA受容体は細胞内にguanylate cyclaseドメインをもちcGMPの合成を介して心房性ナトリウ利尿ペプチドの生物活性を発現する受容体であるがタイプC受容体は細胞内にこのようなドメインをもたないことから生物活性の無い受容体と考えられている。このことから心房性ナトリウム利尿ペプチドは糸球体上皮細胞にある受容体サブタイプのうち生物活性のあるタイプA受容体を介して糸球体限外濾過係数,さらに糸球体濾過値を増加させることで尿量を増加させるし髄質内層の集合管上皮細胞のタイプA受容体を介しその細胞のナトリウム再吸収を抑制すると考えられた。一方,抗糸球体上皮細胞抗体の投与により糸球体上皮細胞を特異的に傷害する動物モデルをマイクロパンクチャー法と超微形態研測法で機能形態相関を検討したところ抗糸球体上皮細胞抗体を投与し糸球体上皮細胞を傷害すると糸球体限外濾過係数が低下し,それに伴い糸球体上皮細胞容積が増加することが認められた。このことも糸球体上皮細胞が糸球体限外濾過係数の調節に関与していることを示している。以上の結果は糸球体限外濾過値は少なくとも糸球体上皮細胞が限外濾過係数を調整することにより調節されていること示した。また、本研究は分子生物学、腎臓病理学、腎臓生理学などの研究者の学際的国際共同研究で初めて可能になった。今後はさらに糸球体上皮細胞の細胞内レベルの糸球体機能の調節機構が解明される必要がある。

心房性ナトリウム利尿ペプチドの受容体は腎臓では糸球体と髄質内層に多いことがこのホルモンの結合試験で示されているが,どの細胞に受容体が局在しているかは明らかではなかった。また,cDNAクローニングによる研究から心房性ナトリウム利尿ペプチドの受容体には3種のサブタイプがあることが示され,それぞれの受容体を区別してその局在を検索することが必要であった。そこでこれらのサブタイプのmRNAの腎臓内発現部位をRNase protection assayで,発現細胞をIn situ hybridization法で検索した。RNase protection assayで糸球体にはタイプAとタイプC受容体mRNAがほぼ同量発現され,髄質内層にはタイプA受容体mRNAがそれらとほぽ同量発現されていることが分かった。その局在をIn SITU hybridization法で検索したところ糸球体のタイプAとタイプC受容体mRNAは両床とも糸球体上皮細胞に,髄質内層のタイプA受容体mRNAは集合管上皮細胞にあることが明らかになった。タイプA受容体は細胞内にguanylate cyclaseドメインをもちcGMPの合成を介して心房性ナトリウ利尿ペプチドの生物活性を発現する受容体であるがタイプC受容体は細胞内にこのようなドメインをもたないことから生物活性の無い受容体と考えられている。このことから心房性ナトリウム利尿ペプチドは糸球体上皮細胞にある受容体サブタイプのうち生物活性のあるタイプA受容体を介して糸球体限外濾過係数,さらに糸球体濾過値を増加させることで尿量を増加させるし髄質内層の集合管上皮細胞のタイプA受容体を介しその細胞のナトリウム再吸収を抑制すると考えられた。一方,抗糸球体上皮細胞抗体の投与により糸球体上皮細胞を特異的に傷害する動物モデルをマイクロパンクチャー法と超微形態研測法で機能形態相関を検討したところ抗糸球体上皮細胞抗体を投与し糸球体上皮細胞を傷害すると糸球体限外濾過係数が低下し,それに伴い糸球体上皮細胞容積が増加することが認められた。このことも糸球体上皮細胞が糸球体限外濾過係数の調節に関与していることを示している。以上の結果は糸球体限外濾過値は少なくとも糸球体上皮細胞が限外濾過係数を調整することにより調節されていること示した。また、本研究は分子生物学、腎臓病理学、腎臓生理学などの研究者の学際的国際共同研究で初めて可能になった。今後はさらに糸球体上皮細胞の細胞内レベルの糸球体機能の調節機構が解明される必要がある。糸球体内で糸球体限外濾過係数を変化させ限外濾過量を調節している細胞を同定するために次の2方向から検討した。1)糸球体限外濾過値を増加させる心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の受容体の糸球体内局在: ANPは糸球体限外濾過係数を増加させ濾過を促進するホルモンである。糸球体内でその受容体を持つ細胞は限外濾過係数を調節していると考えられる。現在までに、ANP受容体はA,B,Cの異なる3種類のサブタイプが存在することが分子生物学的手法で示された。私どもは牛肺よりANPアフィニティ-カラムでANPーC受容体を分離、精製し、この受容体に対する抗体を作製し免疫組織学的に腎内局在を検索した。その結果、ANPーC受容体は糸球体に最も豊富に、そのほかには動脈壁や髄質内層集合尿細管に存在した。さらに糸球体内では糸球体上皮細胞に局在することが免疫電顕で、糸球体のANPーC受容体の分子量は約70Kdでその量は血液中のANP量と逆相関することが示された。
真核生物におけるリボソームの分解経路とその制御機構の解明

本研究課題は、25S rRNAに変異を持つリボソームの分解機構25S NRDに着目した解析を行うことで、真核生物におけるリボソームの分解経路とその制御機構を明らかにすることを目的としている。本年度は、分解中間体の精製法の条件検討を行い、精製条件を決定した(1)。そして、決定した条件で精製した機能不全リボソーム分解中間体について、分解の標的となるタンパク質(鍵因子)の候補をSDS-PAGEと銀染色により見出した。そこで、鍵因子候補タンパク質を含むゲルバンドから抽出したペプチド、また、精製した機能不全リボソーム分解中間体について、LC-MS/MS解析により、鍵因子の同定を試みた(2)。(1)機能不全リボソーム分解中間体の精製法の確立昨年度に引き続き、機能不全リボソーム分解中間体の精製法の確立に取り組んだ。プラスミド由来rRNAを持つリボソームを回収するためのMS2コートタンパク質とアビジン-ビオチン相互作用を利用したプルダウンアッセイの際に用いるストレプトアビジンビーズについて検討を行った結果、磁性ビーズを用いることでバックグラウンドが減少することが明らかとなった。(2) LC-MS/MS解析による鍵因子の探索(首都大学田岡准教授との共同研究)(1)を用いて二つの異なる株から精製した機能不全リボソーム分解中間体について、SDS-PAGEによる分離、銀染色のバンドパターンの比較により、鍵因子の候補となるタンパク質のバンドを見出した。これらの候補タンパク質を含むと考えられるバンドと、精製した機能不全リボソーム分解中間体について、LC-MS/MS解析を行った。その結果、検出された大部分がリボソームタンパク質であったが、バックグラウンドが高かったため、鍵因子の候補について、はっきりとした結論は得られなかった。今年度は、昨年度に引き続き、機能不全リボソーム分解中間体の精製法の確立に取り組んだ。精製条件の検討の結果、バックグラウンドが以前よりも少なくなる条件を見出した。次に、精製されたタンパク質分解を受ける前後の機能不全リボソーム分解中間体について、銀染色により構成タンパク質のバンドパターンの比較を行った。その結果、いくつかのタンパク質が分解の標的となる可能性が示された。さらに、機能不全リボソーム分解中間体において分解の標的となるタンパク質を明らかにするために、銀染色で分解の標的となる可能性が示されたタンパク質を含むゲルと、精製した機能不全リボソーム分解中間体について、LC-MS//MS解析を首都大学の田岡准教授との共同研究として行った。しかし、今回の解析ではバックグラウンドの値が高く、分解の標的となるタンパク質についてはっきりとした結論は得られなかった。このことから、当初の予定よりも精製条件のさらなる検討を行う必要性が生じたため。機能不全リボソームの精製法について、プルダウンに用いる磁性ビーズの種類や量、ブロッキングの方法など、あらゆる条件検討を行う。バックグラウンドの低下が認められれば、昨年度と同様にLC-MS/MSを用いた解析を行い、機能不全リボソームの分解の指標となるタンパク質を決定する。本研究課題は、25S rRNAに変異を持つリボソームの分解機構25S NRDに着目した解析により、真核生物におけるリホボソームの分解経路とその制御機構を明らかにすることを目的としている。先行研究から、出芽酵母の25S NRDにおける機能不全リホボソームの分解は、プロテアソームによる数個のタンパク質の分解が引き金になると予想された。そこで、プロテアソームの標的分子をリボソーム分解の鍵因子と仮定し、機能不全リボソーム分解中間体が蓄積する出芽酵母株を用いた解析により鍵因子を特定することを目指す。本年度は、以下の2つの研究を行った。(1)機能不全リボソーム分解中間体の精製法の確立質量分析によりプロテアソーム作用前後の分解中間体の構成タンパク質を比較することで鍵因子を特定できると考え、まず、分解中間体の精製法の確立に取り組んだ。実験には、先行研究でプロテアソーム作用前後の分解中間体が蓄積することが確認されている株を用いた。はじめに、これらの株において、培養の条件、遺伝子の発現抑制の条件、機能不全変異rRNAの発現開始と停止の条件について検討を行い、分解中間体が蓄積する条件を決定した。次に、分解中間体を精製するために、アビジン-ビオチン相互作用を利用したプルダウンアッセイを確立した。このプルダウンアッセイにより、分解中間体を回収することが可能になった。(2)候補遺伝子アプローチによる鍵因子の探索先行研究により、機能不全リボソーム分解中間体の25S rRNAは末端から分解されることが示唆されている。そこで、60Sリボソームの結晶構造から25S rRNAの末端に位置するリボソームタンパク質をピックアップし、それらがプロテアソーム作用後の分解中間体に含まれているかどうかを免疫沈降により調査した。その結果、いくつかのタンパク質が分解中間体に含まれていないことが示唆された。本課題は、25S rRNAに変異を持つリボソームの分解機構25S NRDに着目した解析により、真核生物におけるリボソームの分解経路とその制御機構を明らかにすることを目的とするものである。今年度は、まず、機能不全リボソーム分解中間体の精製法の確立に取り組んだ。機能不全リボソームが十分に蓄積する条件と機能不全リボソームを回収する方法については予定通り確立された。しかし、回収画分に存在する内在性リボソームの割合が予想に反して高かったため、これについてのさらなる条件検討を進めているところである。

また、60Sリボソームの結晶構造から25S rRNAの末端に位置するリボソームタンパク質に着目し、これらが分解中間体に含まれるかどうかの調査を行った。その結果、いくつかのタンパク質がプロテアソームの標的タンパク質である可能性が示された。このように、当初の計画から若干遅れてはいるものの概ね研究は進展していると評価した。本研究課題は、25S rRNAに変異を持つリボソームの分解機構25S NRDに着目した解析を行うことで、真核生物におけるリボソームの分解経路とその制御機構を明らかにすることを目的としている。本年度は、分解中間体の精製法の条件検討を行い、精製条件を決定した(1)。そして、決定した条件で精製した機能不全リボソーム分解中間体について、分解の標的となるタンパク質(鍵因子)の候補をSDS-PAGEと銀染色により見出した。そこで、鍵因子候補タンパク質を含むゲルバンドから抽出したペプチド、また、精製した機能不全リボソーム分解中間体について、LC-MS/MS解析により、鍵因子の同定を試みた(2)。(1)機能不全リボソーム分解中間体の精製法の確立昨年度に引き続き、機能不全リボソーム分解中間体の精製法の確立に取り組んだ。プラスミド由来rRNAを持つリボソームを回収するためのMS2コートタンパク質とアビジン-ビオチン相互作用を利用したプルダウンアッセイの際に用いるストレプトアビジンビーズについて検討を行った結果、磁性ビーズを用いることでバックグラウンドが減少することが明らかとなった。(2) LC-MS/MS解析による鍵因子の探索(首都大学田岡准教授との共同研究)(1)を用いて二つの異なる株から精製した機能不全リボソーム分解中間体について、SDS-PAGEによる分離、銀染色のバンドパターンの比較により、鍵因子の候補となるタンパク質のバンドを見出した。これらの候補タンパク質を含むと考えられるバンドと、精製した機能不全リボソーム分解中間体について、LC-MS/MS解析を行った。その結果、検出された大部分がリボソームタンパク質であったが、バックグラウンドが高かったため、鍵因子の候補について、はっきりとした結論は得られなかった。今年度は、昨年度に引き続き、機能不全リボソーム分解中間体の精製法の確立に取り組んだ。精製条件の検討の結果、バックグラウンドが以前よりも少なくなる条件を見出した。次に、精製されたタンパク質分解を受ける前後の機能不全リボソーム分解中間体について、銀染色により構成タンパク質のバンドパターンの比較を行った。その結果、いくつかのタンパク質が分解の標的となる可能性が示された。さらに、機能不全リボソーム分解中間体において分解の標的となるタンパク質を明らかにするために、銀染色で分解の標的となる可能性が示されたタンパク質を含むゲルと、精製した機能不全リボソーム分解中間体について、LC-MS//MS解析を首都大学の田岡准教授との共同研究として行った。しかし、今回の解析ではバックグラウンドの値が高く、分解の標的となるタンパク質についてはっきりとした結論は得られなかった。
公民館再編動向にみるコミュニティ・ガバナンスと社会教育の相克と止揚に関する研究

少子高齢化と人口減少が進む現代、地方自治体は行財政改革を進めており、行政組織再編の動きが加速している。その中で地方自治体が条例に基づいて設置する公立公民館の廃止や統廃合が進み、公民館とは何か(教育施設か自治組織か等)が改めて問題となっている。本研究では、公立公民館の多様な再編動向に関する実態を調査し、社会構成主義的学習観を理論的枠組に据えながら、コミュニティで生成される学習過程から「自治」を実現するシステムを明らかにする。そして、住民による自治的な公民館運営による学習環境デザインと、住民の主体的な学習を育む条件整備という社会教育行政の役割を機能させる制度設計を示す。
財政危機下のアメリカ州・地方財政に関する実証的研究

1990年以降長びく不況のもとでアメリカの州・地方財政の多くは、1929年の世界大恐慌以来の深刻な財政危機にみまわれた。1970年代半ばにもニューヨーク市やクリーブランドでは事実上の破産を余儀なくされているが、近年の状況はそれをはるかに上回るものであった。1991年にコネティカット州のブッリッジポートが破産宣告をしたことに続いて、カリフォルニア州内のいくつかの地方政府やデトロイト、セントルイス、ピッツバーグなどその危機的状況は全米各地に広がっていることが明らかにされた。本研究では各州およびその代表的な都市について財政危機の原因となる経済的背景、一般会計収支、財政健全度(Fiscal Health)などについて検証し、さらにニューヨーク州とカリフォルニア州および州内の地方政府について詳細に検討した。そこで明らかにされたことは、まず第1に全体的に1989年をピークに収入が大幅に落ち込んでいること、第2に連邦補助金などの依存財源、財産税などの自主財源ともに大きく減少し、公共料金の引き上げや環境関連税を中心とした新税の導入など、受益者負担の強化によって賄わざるを得なくなっていること、第3に財政危機は、1970年第以来人口が実質的に減少するその一方でホームレスの急増、麻薬や犯罪発生率の上昇、エイズ(AIDS)の拡大などの深刻な社会問題、都市問題を抱える大都市に集中的にあらわれていることなどであり、市職員の大幅な解雇や市民向け行政サービス水準の低下などといった事態が検証された。わが国においても地方財政の多くは赤字財政を余儀なくされており、ビッグプロジェクトの計画縮小、公共料金の引き上げなどがおこなわれているが、1990年代のアメリカのケースはわが国の地方財政の将来を考えるうえでもきわめて貴重な教訓であるといえよう。
内核反射波による地球中心への地震学的挑戦

地球中心部の構造を解明するためには,地震波データの蓄積は不十分である.本研究は,理論的視点と実際的見地から,有効な地震データの吟味とその観測方法を追求することを主眼とした.本年度が最終年度でなので,理論的見地と実際的見地から検討した結果,以下のような結論を得た.ダイレクト・ソリューション法(DSM)を用いて,伸張軸が真下を向く逆断層型の震源メカニズムをもつ深発地震の波形を計算し,0.51HZの周波数範囲で確認すると,内核の表面で反射してくるPKiKPと地球の中心を通過して内核の反対側で反射してくるPKIIKPを数値誤差が小さい範囲で確認することができる.その時のPKIIKP/PKiKP振幅比は約20分の1であった.しかし現実的な信号対ノイズ比(SN比)を考慮するとPKIIKPの検出機会はさらに厳しいものになると容易に予想できる.日本に超高密度の微小地震観測網(Hinet)が構築されてから10年間でPKiKPがもっとも顕著に見えた2001年7月3日マリアナ地震の記録から,PKiKPのSN比が2以上あり,かつ相互の波形の相似性が高い記録130本を選び出し,微小な時間のずれを補正して波形重合を行った.線形重合や非線形重合をおこなってSN比を100近くまで改善してもPKIIKPと見られる有意なフェイズを検出することはできなかった.これは,内核の減衰が強いことや内核境界の裏側の反射効率が低いことも考えられるが,ノイズが大きいために波形重合の効果が活かされなかった可能性も否定できない.本研究課題で検討した臨時地震観測のスタイルは,別のプロシェクトで実施されている中国における観測で採用された.まだデータの蓄積は十分ではないがノイズがとても小さいことを確認しており,本研究課題でも試した波形重合を適用して興味深い地震波を検出できるものと期待している.地球中心部の構造を解明するためには,まだ十分に地震波データが収集されているとは言い難い.本研究は,理論的視点と実際的見地から,有効な地震データとその観測方法を追求することを主眼とする.今年度は,主に三つの項目を遂行した.(1)内核からの反射を観測する簡易システムを構築するために,データロガーを導入して動作確認を行った.しかし,広帯域地震計(特にグラルプ社のCMG3T)にセンタリングやキャリブレーション信号を送る配線が,マニュアルに正確に記述されていなかったために,正しい動作を確認するのに手間取った.試行錯誤によって,現在は正しい配線を見出した.(2)既存のデータを用いた解析では,日本に展開されている高感度地震観測網から短周期記録を,広帯域地震観測網から長周期記録を用いて,内核からの反射波の探索を行った.短周期記録においては,PKiKP波が目視で見っけられるイベントもあったが,長周期記録ではそのような地震波は見出されていない.アメリカに展開されている機動地震観測網USArrayにおいて, PKiKP波を確認した.(3)地球シミュレータを用いた波形計算の結果,SKIIKP波はScSScP波というマントル内で多重反射・変換してくる地震波と誤認する可能性のあることが分かった.さらに,地形と地殻の不均質性を考慮した波形計算を行った結果,日本のような起伏に富んで複雑な構造を持つ地域より,中国のような大陸地域で観測する方が,地形などによる散乱波の影響が小さく,微小な信号を観測することに適していることを改めて実感した.地球中心部の構造を解明するためには,地震波データの蓄積は不十分である.本研究は,理論的視点と実際的見地から,有効な地震データの吟味とその観測方法を追求することを主眼とする.今年度は,以下の項目を遂行した.(1)地球シミュレータを用いた波形計算は,地殻やマントルの不均質構造を計算に取り入れることができるが,計算能力の限界から,0.2Hzより低い周波数までしか計算できない.そこで,占有可能な既存の並列計算機にダイレクト・ソリューション法(DSM)をインストールし,球対称の地球モデルならば,実用に耐えられる計算時間の範囲で2Hzまで計算できる環境を整備した.(2)東京大学地震研究所や防災科学研究所の協力をうけ,実際に簡易的な方法で地震計を設置して,テスト観測を実施した.地震研究所の施設において,深さ150cm,直径150cmの縦穴の底に底を抜いたプラスチック・ドラム缶を置き,コンクリートで固めた.広帯域地震計をドラム缶の中に設置して地中に埋めた.このような環境における地震動のノイズ環境を確認したところ,周期1秒から20秒まで良好であることを確認した.一方で,室内で運用していた場合とは異なり,GPSアンテナからの静電気ノイズでデータ収録がストップしてしまうという予想外のトラブルにも見舞われた.一方,防災科技研の施設では,屋屋内で地震計をウレタンで覆うことによって断熱を図った.このような方法でも,人里離れたところならば,広い周波数範囲で比較的に低ノイズが実現できることを確認した.地球中心部の構造を解明するためには,地震波データの蓄積は不十分である.本研究は,理論的視点と実際的見地から,有効な地震データの吟味とその観測方法を追求することを主眼とした.本年度が最終年度でなので,理論的見地と実際的見地から検討した結果,以下のような結論を得た.

ダイレクト・ソリューション法(DSM)を用いて,伸張軸が真下を向く逆断層型の震源メカニズムをもつ深発地震の波形を計算し,0.51HZの周波数範囲で確認すると,内核の表面で反射してくるPKiKPと地球の中心を通過して内核の反対側で反射してくるPKIIKPを数値誤差が小さい範囲で確認することができる.その時のPKIIKP/PKiKP振幅比は約20分の1であった.しかし現実的な信号対ノイズ比(SN比)を考慮するとPKIIKPの検出機会はさらに厳しいものになると容易に予想できる.日本に超高密度の微小地震観測網(Hinet)が構築されてから10年間でPKiKPがもっとも顕著に見えた2001年7月3日マリアナ地震の記録から,PKiKPのSN比が2以上あり,かつ相互の波形の相似性が高い記録130本を選び出し,微小な時間のずれを補正して波形重合を行った.線形重合や非線形重合をおこなってSN比を100近くまで改善してもPKIIKPと見られる有意なフェイズを検出することはできなかった.これは,内核の減衰が強いことや内核境界の裏側の反射効率が低いことも考えられるが,ノイズが大きいために波形重合の効果が活かされなかった可能性も否定できない.本研究課題で検討した臨時地震観測のスタイルは,別のプロシェクトで実施されている中国における観測で採用された.まだデータの蓄積は十分ではないがノイズがとても小さいことを確認しており,本研究課題でも試した波形重合を適用して興味深い地震波を検出できるものと期待している.
河川堆積物を用いた活火山地域における環境指標の確立と気候変動・噴火活動の検出

浅間火山の濁川は山体南麓の炭酸泉から湧出した河川であり、その河床には縞状炭酸塩(トゥファ)が堆積している。本研究は、過去3年間2ヶ月ごとに現地水質調査、堆積物の縞の成長及び水の化学成分の監視を行なった。その結果、濁川トゥファの縞状構造は年縞であり、その化学成分は、水質や水の化学成分の季節変動を反映し、夏季の縞はMgに富む緻密な針状方解石、Mnの多孔質の方解石微粒子からなることを見出すことができた。また、トゥファの形成には、炭酸泉のアルカリ度が重要なファクタであることが、濁川と同じ炭酸泉から流出する蛇堀川の調査から明らかとなった。本年度は、初年度に引き続き、浅間火山南麓の濁川にて2ヶ月ごとの水文調査と地質調査を行った。これにより、初年度に得た炭酸塩堆積物の縞構造が1年に1枚の層(年層)で作られていることを、2ヶ月毎にサンプル採取と薄片観察を行って確認した。これと並行して、源泉から下流5キロメートルの範囲に設けた臨時観測点において、水質観測(水温、pH, EC, DO, ORP,アルカリ度)と採水を行った。そして、採水試料の陰イオン濃度をICP-AES分析で、陰イオン濃度をイオンクロマトグラフィーでそれぞれ定量し、飽和度指数ならびに無機炭酸沈殿速度を求めた。その結果、炭酸塩堆積物の堆積場は、年間を通じて方解石に対して過飽和な水環境であること、方解石の沈殿速度は冬季に比べて夏季に高いことを確認し、薄片観察で見られた縞の成長過程と整合する結果を得ることができた。さらに、火山地域における縞状炭酸塩の堆積条件を解明することを目的として、濁川源泉と同様の炭酸泉を持つ浅間火山の他の沢の水質調査と地形学的調査を実施した。結果、方解石が河床に沈積する条件として、源泉のアルカリ度が重要なファクターであることが明らかとなった。本年度は、浅間火山南麓の濁川において、源泉から下流の約5キロメートルの範囲に7つの臨時観測点を設け、年6回の隔月で水質調査を行った。現地において、水温、pH、Eh、導電率、溶存酸素濃度、二酸化炭素分圧、流量を計測した。採水した水の化学成分については、陽イオン濃度(ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、カリウム、カルシウム、マンガン、鉄、ストロンチウム)と陰イオン濃度(フッ素、塩素、硝酸、硫酸、リン酸)、安定同位体比(水素、炭素、酸素)となる。さらには、河床に方解石を主体とする堆積物の縞の成長のモニタリングを行った。その結果、源泉水の水質特性、ならびに化学成分の濃度は、一年を通じて、ほぼ一定に推移した。これに対して、河床に堆積物の沈積する場では、一年を通じて、方解石に対して過飽和であること(SIcが0.5以上)、水温、導電率、カルシウム、ストロンチウムで季節変動が見られ、このうち、カルシウムとストロンチウムについては、冬季に比べて夏季にイオン濃度が低下することが明らかとなった。一方、陰イオン濃度については、通常の陸水に比べて、塩酸と硫酸が高濃度であることが分かったものの、季節変動に対応する変化は見られなかった。河床堆積物の縞構造は、明色層と暗色層の繰り返しにより特徴づけられる。明色層は針状の方解石(長さ5-10ミリメートル)、暗色層は細粒の方解石(直径5ミリメートル以下)からなり、それらの粒子の間には、鉄水酸化物が所々に挟まれる。また、暗色層と明色層の間には、鉄水酸化物が濃集する。隔月で採取した堆積物の最表層の顕微観察した結果、夏季に明色層、冬季に暗色層が作られていることが明らかとなった。以上の水文学的・地質学的検討から、河床堆積物の縞構造は年層である可能性を示唆する結果を得ることができた。過去2年間の観測に引き続いて、浅間火山南麓の濁川にて2ヶ月ごとの水文調査及び地質調査と、濁川源泉と同様の炭酸泉を持つ蛇掘川の水質調査を夏季の期間に実施した。濁川と蛇掘川は共に、浅間火山南麓に位置する炭酸泉であるが、トゥファの生成は濁川のみに認められる。これは、濁川源泉のアルカリ度(67 meq/L)が蛇掘川の源泉に比べて2倍ほど高濃度で含まれることで説明することができる。また、濁川の水質及び化学成分については、水温とともに、アルカリ度、Ca2+、Mn2+、溶存酸素が季節変動を示し、これらの変動は後述の河床トゥファに記録されていることが明らかとなった。本年度は新たに、東京大学地震研究所の一般共同研究として、当研究所既設のEPMAを用いて、濁川トゥファの年縞組織の定量解析を行なった。

その結果、夏季の縞はMgに富む針状方解石、冬季の縞はMnに富む微粒状方解石からなることが明らかとなった。それらの2元素のモル比は夏季が(Ca0.97,Mg0.02,Mn0.01)CO3、冬季が(Ca0.97,Mg0.01,Mn0.02)CO3であった。夏季の縞のMg濃度上昇は、方解石生成時の水温とPWP-rate(方解石無機沈殿速度)の上昇に起因する。冬季のMnの高濃度は、方解石の沈殿速度と冬季の水のMn2+濃度の上昇で説明することができる。濁川では、冬季の溶存酸素濃度上昇時期に、水のMn2+濃度の上昇が認められる。これは、冬季の水温低下でマンガン細菌などの微生物活動による酸化機能が低下したことによると考えられる。地球環境システム学初年度の結果の妥当性を確認できた。これと並行して、河川水の同位体比分析、河床堆積物の化学分析、年代測定を開始し、堆積物の形成過程に関する知見を得ることができた。本年度の目標であった、河川水の化学成分の分析と河床堆積物の縞の成長過程の観察から、河床堆積物の縞構造が年層である可能性を導くことができたため。引き続き、濁川での観測を継続する。今年度は、河床堆積物の分析を中心に進めていき、そこに記録される環境変動ならびに火山活動イベントの指標の抽出を行う。引き続き、濁川での観測を継続し、本年度得られた結果の妥当性を検証していく。さらには、同位体比の分析結果、河床堆積物の縞の微細組織の解析などを実施し、堆積物の形成過程とその中に記録される環境情報、ならびに噴火活動などのイベントに関する情報についての詳細な検討を行う。また、河岸段丘崖から発見された堆積物の年代測定と縞の解析を行っていく。使用額の微調整を行わなかったため。予定している研究経費の使途は、施設利用費が100千円、実験器具及び試薬などの消耗品費が400千円、である。予定している研究経費の使途は、施設利用費が100千円、実験器具及び試薬などの消耗品費が100千円、同位体比測定費が300千円である。
庶民による語りからみた戦後の世相史の社会学的研究

本報告書は、「戦争体験」を語り継ぐことを戦後の世相史の重要な側面であるという認識に立ち、ライフストーリー・インタビューで聞かれた「語り」と自分史作品という庶民の「語り」を分析し、「戦争体験」を語り継ぐごとの社会学的意味を考察している。本研究で研究対象としている「戦争体験」は、兵士として戦場に行った「戦闘体験」ではなく、子どもの頃に体験した空襲などを含む「銃後」の「戦争体験」である。まず、ライフストーリー・インタビューの方法論的議論を行い、「語りのちから」の持つ特徴を認識した上で、79歳の女性にライフストーリー・インタビューをした。子ども頃の「戦争体験」についての彼女の「語り」は書かれた証言とは異なり、語り手である彼女の「想い」が伝わるもので、多感な10歳代の目でみた当時の「戦争体験」がリアリティを持って描写できるものであった。次に、10歳代の「戦争体験」について書かれ、ベストセラーになった自分史作品を分析し、それぞれの自分史が書かれるようになった社会的要因と著者たちの「想い」の分析を行った。このような分析に基づき、「戦争体験」の語り継ぎの今後の可能性について最後に考察している。まず、児童書として出版されている「戦争体験」の自分史作品は、その対象が子どもであることで、今後も語り継ぎの方法として効果的であると思われる。次に、「語り」の持つオーラリティの特徴は語り継ぎには効果的であるので、映像として「語り」を保存する方法も効果的であろう。そして、「東京大空襲」資料センターのような民間施設を公式に認め、記念館として、「戦争体験」を伝えることも必要ではないかと論じた。本年度の前半は、自分史作品の講読と自分史に関する理論的文献のレビューに焦点をあて、「自分史」によって世相史を構築する枠組みについて整理しようと試みた。ただ、「自分史」の語りには、本人にとってもっとも重要な出来事を反省的に記述していく場合が多いので、テーマが限定される傾向が見られた。自分史を書いた人々にとって「戦争体験」は強烈な意味を持っていたので、戦争体験以外の自分史をして書いていたものは限りなく少なく、「自分史作品」の分析を通して戦後の世相史を分析することの限界が見受けられた。そこで、有名人の「自伝」または、経済人の「回想録」をレビューすることで、世相史の全体像を描写できるのではないかと考え、後半は、そのレビューを行ったが、さまざまな分野の人々の多様な視点を整理するのは簡単な作業でないと認識しながら、それらの作品をレビューしている過程である。本年度はまた「自分史サークル」への参加と聞き取り調査を計画していたが、「庶民の世相史」の何に焦点を合わせるかについての絞りこみがまだ不十分であるので、インタビューを試みたものの、世相史を描写するほどまとまったテーマ設定が定まらず、予備的なインタビュー段階にとどまっている。その予備的調査では、インタビュー対象者を「自分史サークル」参加者に限定することにも限界があるという印象が残った。そこで、本研究以前から継続している教育現象の時代的な変化に焦点を当てる方法で、戦後の世相史の一側面を描写する試みを行った。そこで見られた知見としては、教育現象と経済現象、政治現象がダイナミックな形で絡み合っているということであった。この教育現象からみた世相史の予備的作業の知見から、今後、より広い枠組みで戦後の世相史を多様な人々の「語り」あるいは自分史から考察することが来年度の課題である。本年度は昨年度に引き続き、自分史作品の分析を通して、戦後の世相史のさまざまな特徴を描写する試みを継続している。重要なテーマとして注目されたことは、1)戦争体験、2)戦後の貧しさ、3)家族関係の変化、4)高度経済と人々の関わりなどである。

自分史を書く人々が年配者であり、特殊な体験に意味づけしようしているので、それぞれのライフヒストリーの中の「問題」としてあったことを中心として描写しているという知見が得られた。この知見を基に戦後の世相史の流れを構築できるのではないかと考えている。昨年度から、有名人の「自伝」と経済人の「回想録」を購入し、総合的にレビューしてきているが、人々の心の問題を考える時に、小説家の「回想録」も重要ではないかと考え、本年度は、小説家の「回想録」を購入し、総合的にレビューし、有名人の「自伝」や経済人の「回想録」ではカバーされていないテーマを補完的に議論しようと分析を進めている。また、本年度は、著書の中の一部として自分史的エッセイを書いた大学教授にインタビューを行い分析しているが、世相史の社会学的分析を行うためには、「自分史サークル」に通う人々とは異なるタイプ人の語りを分析するが重要であると認識しているところである。以上、本年度もさまざまな「自伝」「回想録」のレビューに加え、インタビューを行い分析しているが、そこから得られた知見を全体的に整理し、論じるところまで展開していない。来年度は、いままでの知見を報告書としてまとめることが課題である。本年度は、さまざまな人々の自分史の中で「語られた」世相史の側面として重要なテーマである「戦争体験」について考察した。70歳代の二人のインタビュー調査の知見から、この世代にとって「戦争体験」、とくに、戦争当時10歳代の時の「戦争体験」は重要なテーマではないかと思われた。本年度の文献研究はこのテーマに焦点を当て、子どもの「戦争体験」を題材とした自分史的作品及び小説の分析を試みた。具体的には「東京大空襲」を経験した早乙女勝元氏や高木敏子氏の著作を手がかりとして、広島や長崎の被爆戦争体験とは異なって、これまで限られた議論しかされていなかった「東京大空襲」や地方都市の空襲被災体験について分析した。また、文献だけでなく、「東京大空襲」に関わるNHK制作のドキュメンタリーや2008年3月に放映されたテレビドラマの分析などを行い、庶民にとって記憶に残る世相史としての「戦争体験」を考察した。さらに、さまざまな自分史サークルが編集・出版している「戦争体験」に関わる自分史的エッセイも分析の対象として考察した。「戦争体験」といえば、一般的には大人の男性の「兵役体験」あるいは「戦場体験」が主で、戦争加害者としての「反省的語り」や「青春の回想」などという形式がほとんどであった。70歳代はそのような「戦場体験」ではなく、子どもとしての「戦争体験」の記憶を自分史の重要なテーマとして、いまふり返って語っていることが興味深い現象である。本年度は3年間の研究期間の最終年度であるので、その研究成果をまとめているところである。庶民によって語られた戦後の世相史全体を概説的に描写するのではなく、本年度に展開されたテーマである「戦争体験」を、庶民の語りから読み取れた重要な世相史の表象だとみなし、戦時中と戦後10年間ほどに限定した世相史の社会学的研究としてまとめる予定である。
ラット根管内における細菌バイオフィルムの作製、分析

Enterococcusfaecalis、Porphyromonas gingivalisを用いて、in vitroで細菌バイオフィルムの形成条件を調べた。その培養条件下、生きたラットの抜髄した根管にバイオフィルムの形成を試みたが、いずれにおいても認められなかった。原因には、十分な抜髄を行うことが困難で、免疫担当細胞に殺菌されたことが考えられる。In vivoでは、細菌叢からの持続的な感染が必要だと推察された。現在、根尖性歯周炎において、根尖部で細菌がバイオフィルムを形成しており、難治化、慢性化していることが示唆されている。これまで、単一細菌におけるバイオフィルムの形成能に関する基礎的研究は多く行われてきた。しかし、感染根管内は複数の細菌種が混在しており、複数の細菌種のバイオフィルムに関する研究は比較的少ない。また、感染根管という特殊な環境下でのin vivoの研究はまだ少ない。そこで、本研究は、複数の種類の細菌を動物(ラット)の根管内に混合感染させることによって、より臨床に近い状態で細菌バイオフィルムを形成させ、その構造を分析することを目的としている。本年度は、in vitroにおいて、細菌バイオフィルムが作製できることを確認するために、細菌の選択、最適培養条件の選定、バイオフィルムの作製および観察を行った。実施計画では、コラーゲンでコーティングされたプラスティックプレートを使用する予定であったが、より正確に観察するために、象牙質片を作製し、本研究に用いた。象牙質片は高圧蒸気滅菌された後、フィルター滅菌されたヒト唾液に37°C、24時間浸漬され、準備された。細菌株としては、う蝕細菌であるStreptcocccus mutansと歯周病関連細菌であるDorphyromonas gingivalisを用いた。Streptcocccus mutansは、嫌気状態下、37°C、5日間、Porphuromonas gingivalisは、嫌気状態下、37°C、7日間、また、それぞれの細菌を混合し嫌気条件下で37°C、7日間、象牙質片を浸漬し、培養した。培地は、定期的に交換した。象牙質片を取り出し、上昇エタノール系列で脱水後、凍結乾燥を行った。走査型電子顕微鏡で、細菌バイオフィルムの観察を行った。初年度、early colonizerとしてEnterococcus faecalis (E.f.)、late colonizerとしてPorphyromonas gingivalis(以下P.g)を用いて、in vitroでの細菌バイオフィルムの作製を行った。抜去されたヒトの歯牙から象牙質片を作製し、培養条件を変えつつ、細菌バイオフィルムの作製を作製し、走査型顕微鏡で観察を試みた。その結果、P.g.については、成熟したバイオフィルムは確認できなかったが、培養条件としては、E.f.については、37°C、24時間の嫌気培養、P.g.については、37°C、72時間の嫌気培養、共培養については、37°C、72時間の嫌気培養が適切であると思われた。そのため、本年はその培養条件の下、in vivoで、ラットの抜髄した根管に各細菌を感染させ、生きた動物の根管内にバイオフィルムの作製を試みた。ラットの切歯を抜髄し、細菌をそれぞれ単体で感染させた群と、両細菌を感染させた群(計3群)に分けて、接種した。仮封には接着性レジンを使用した。屠殺後、歯牙を摘出、分割を行った。4%パラホルムアルデヒドと5%グルタールアルデヒドの混合固定液で固定後、上昇エタノール系列で脱水を行い、走査型電子顕微鏡で観察した。その結果、いずれの根管壁においてもバイオフィルムは認められなかった。この原因としては、接種する細菌量に限界があるにもかかわらず、十分な抜髄を行うことが困難で、残存した歯髄に存在する免疫担当細胞に殺菌されてしまったことが考えられる。In vivoでは、無菌根管とはいえ、残存歯髄や根尖部歯周組織からの血液により免疫システムが機能するため、少量の細菌ではバイオフィルムは形成されず、う蝕やプラークのような細菌叢から持続的な細菌感染が必要であることが推察された。
短距離折返し走における折返し動作に関する基礎的研究

・疾走速度維持能力がパフォーマンスに強い影響を及ぼす球技(特にサッカー、ラグビー、ハンドボールおよびバスケットボール)に焦点をあて、「連続した折返し走」を実施することで、能力把握のために有用な測定項目のひとつを提示することができた。具体的には、幅広い競技レベルの選手を対象として有酸素能力を評価する為のシャトルランと同じような設定となる「連続した折返し走」を、最大疾走速度を維持する運動として行わせ、スピード持続能力を評価するための基礎的資料を得ることができた。実験:15m区間を連続して8往復半するトータルタイムを測定し、その際に「ラン・タイム」と「ターン・タイム」に区別し測定した。・競技レベルにより測定したトータルタイムには有意差が認められた。しかし「ラン・タイム」は競技レベルによる差はなく、「ターン・タイム」の差がトータルタイムに大きく影響していることが判明した。「ターン・タイム」のなかでも、前半部分(減速局面タイム)の差はなく、後半部分(加速局面タイム)の差が大きく影響していることが明らかとなった。・折返し動作に関する三次元的解析を行うことにより、運動効率のよい折返し動作を解明した。折返し1歩前に左膝関節を素早く屈曲させることで身体重心速度を減速させることが重要だということが判明した。この動作が、続く加速動作(左膝関節の素早い伸展)にスムーズに移行させる重要なポイントであった。本年度の研究実施計画に基づいて実験および解析をすすめた。・実験としては、球技選手を対象として「連続した折返し走」をサッカー部およびラグビー部の幅広い競技レベルで実施する計画だったが、実際には松江高専の学生のみを対象とした計測しかおこなえなかった。もうすこし競技レベルの高い選手を対象としたデータ収集を行いまとめることが必要となる。・同様に屋内競技であるバスケットボールおよびハンドボールの選手を対象とした「連続した折返し走」の実験を行った。距離・本数(時間)の設定を決定するために予備実験として行った実験では、有効な設定を確定することができなかった。原因としては、バスケットボール部とハンドボール部では普段の体力的なトレーニング実施状況が異なり、極端な二極化の傾向を示したことが考えられる。・本年度中に疾走速度維持能力評価のための指標(球技)を作成することはできなかったが、以前に作成した短距離走者を対象にした指標をもとにして継続して収集したデータをもとに「走り方」に関する研究報告を行った。(卒業研究:松江工業高等専門学校電気工学科5年桑原康太学会発表)・「連続した折返し走」を実施する際に、最初から全力で走る場合(急加速走)と、前半を抑えて走る(緩加速走)場合では、努力度合いには大きな違いがあるが、トータルタイムに有意な差は認められなかった。また、この傾向は競技レベルが低い場合に顕著であることがわかり、学会で報告した。(平成17年度電気・情報関連学会中国支部奨励賞)本年度の研究実施計画に基づいて実験および解析をすすめた。・折返し動作に関する三次元的解析を行うことにより、運動効率のよい折返し動作のポイントを解明した。実験:球技選手に求められる能力を評価可能な設定での「連続した折返し走」を実施幅広い競技レベルの選手を対象とした。予備実験により得られた資料から、サッカー、ラグビー、ハンドボールおよびバスケットボール選手に求められる疾走速度維持能力を評価する為に適した「連続した折返し走」を提案し、実際に測定した。タイムを測定する際に「ラン・タイム」と「ターン・タイム」に区別し測定した。また「ターン・タイム」も前半部分と後半部分に区別することで運動効率のよい折返し動作のポイントが明らかになった。また競技レベルによりそのタイムは変動することも判明した。

しかし「ラン・タイム」は競技レベルによる差はなく、「ターン・タイム」の差がトータルタイムに大きく影響していることが判明した。「ターン・タイム」のなかでも、前半部分(速度が0になるまでの局面)の差はなく、後半部分(速度0から加速する局面)の差が大きく影響していることが明らかとなった。
ヒストンH2AXの交換反応を介した損傷クロマチンダイナミクス

我々は、TIP60ヒストンアセチル化酵素複合体が、ヒストンH2AのバリアントであるH2AXをアセチル化し、DNA損傷部位でH2AXの交換反応を促進することを見出している。しかしながらこの交換反応が、損傷領域のクロマチン構造にどのように影響し、またDNA損傷応答を制御するのかについては未だ不明な点が多い。本研究課題において、TIP60と連携して働くクロマチン構造変換因子を同定し、その連携機構の詳細を明らかにする。そしてH2AXの交換反応が、DNA損傷部位での高次レベルでのクロマチンのopeningに関与することを実証し、その分子メカニズムと意義を探ることを目的とする。これまでにG1/S期にのみGFP-H2AXが、損傷領域に集積することをUVマイクロ照射法(405nm)で確認し、この集積が、TIP60によるH2AXのアセチル化に依存していることを示した。さらにH2AXの交換反応に関わるクロマチンリモデリング因子FACTと新たにヒストンシャペロンを同定し、TIP60によるH2AXのアセチル化がFACTとH2AXとの解離を促すことが、H2AXを損傷領域のクロマチンにdepositするために必要であることをバイオレイヤー干渉法により明らかにした。さらにこのH2AXの交換反応の促進が、結果としてTIP60の損傷領域への集積を促し、損傷クロマチン領域のヒストンのアセチル化が促進され、損傷部位のクロマチン構造が弛緩することを明らかにした。また細胞内でTIP60によるH2AXのアセチル化を阻害すると、S期でのBRCA1のDNA損傷部位への誘導が阻害されることを見出した。これらの結果からTIP60によるH2AXのアセチル化は、クロマチンリモデリング因子FACTと連携してH2AXの交換反応を促し、相同組換え修復を促進することが明らかになった。29年度が最終年度であるため、記入しない。TIP60ヒストンアセチル化酵素複合体とTIP60と結合するヒストンシャペロンとのFeedback制御によるヒストンH2AのバリアントであるH2AXの交換反応の促進が、クロマチンの弛緩とDNA損傷応答関連因子の集積という一見、相反する事象を同時に行うことを可能にし、このクロマチンの動的制御が、細胞周期S期での相同組み換え修復の選択に必要であることを明らかにした。本課題では、H2AXのacidic patch領域に着目し、この領域に結合する因子を同定することにより、DNA損傷領域でH2AXの交換反応が、どのように高次レベルでクロマチン構造を弛緩させるのかを明らかにする。さらにH2AXの交換反応と細胞核内の配置、特にPML bodyなどの核構造との関係についても検討を加え、H2AXの動的な変化が染色体ダイナミクスに与える影響を探ることを目的とする。本年度は、タンパク質複合体精製のためのH2AXの発現細胞及びクロマチン免疫沈降に用いるDR/GFPカセットを導入した細胞にLANA遺伝子を導入し、安定発現細胞株を樹立した。LANAを発現させた細胞からH2AXを複合体として精製し、H2AXのacidic patchに結合すると考えられる候補因子の同定に成功した。さらにin vitroでこの候補因子とH2AXとの結合を確認した。またバイオレイヤー干渉法を用いて、TIP60とヒストンシャペロンとの結合を検討し、これら因子の結合にはH2AXの存在は必要不可欠であることが明らかになり、これまでのin vivoでの実験結果をin vitroの再構成実験で検証することに成功した。またこのバイオレイヤー干渉法を用いた再構成実験により、TIP60によるH2AXのアセチル化とヒストンシャペロンとの関係が明確になった。タンパク質複合体精製のためのH2AXの発現細胞及びクロマチン免疫沈降に用いるDR/GFPカセットを導入した細胞にLANA遺伝子を導入し、安定発現細胞株の樹立に成功した点と、さらにLANAを発現させた細胞からH2AXを複合体として精製し、H2AXのacidic patchに結合すると考えられる候補因子の同定に成功し、in vitroでこの候補因子とH2AXとの結合を確認した点は当初の予定どおりである。この因子のノックダウン細胞を用いてのH4のアセチル化の検討やFRAPとmicro-irradiationを用いた実験については、やや遅れているが、当初予定していた実験は、ほぼ終了し、遅れている実験に関してもその準備は終了している。また今回、バイオレイヤー干渉法を立ち上げ、これまでタンパク質複合体解析やFRAP解析などで得たin vivoの実験結果を再構成実験によって検証した。その結果、TIP60とヒストンシャペロンとの結合にはH2AXの存在が必要不可欠であることが明らかになり、これまでのin vivoでの実験結果をin vitroの再構成実験で検証することに成功した。これらのことからおおむね実験計画は、順調に進展していると言える。

そしてH2AXの交換反応が、DNA損傷部位での高次レベルでのクロマチンのopeningに関与することを実証し、その分子メカニズムと意義を探ることを目的とする。これまでにG1/S期にのみGFP-H2AXが、損傷領域に集積することをUVマイクロ照射法(405nm)で確認し、この集積が、TIP60によるH2AXのアセチル化に依存していることを示した。さらにH2AXの交換反応に関わるクロマチンリモデリング因子FACTと新たにヒストンシャペロンを同定し、TIP60によるH2AXのアセチル化がFACTとH2AXとの解離を促すことが、H2AXを損傷領域のクロマチンにdepositするために必要であることをバイオレイヤー干渉法により明らかにした。さらにこのH2AXの交換反応の促進が、結果としてTIP60の損傷領域への集積を促し、損傷クロマチン領域のヒストンのアセチル化が促進され、損傷部位のクロマチン構造が弛緩することを明らかにした。また細胞内でTIP60によるH2AXのアセチル化を阻害すると、S期でのBRCA1のDNA損傷部位への誘導が阻害されることを見出した。これらの結果からTIP60によるH2AXのアセチル化は、クロマチンリモデリング因子FACTと連携してH2AXの交換反応を促し、相同組換え修復を促進することが明らかになった。今年度は、H2AXのacidic patchに結合すると考えられる候補因子ののノックダウン細胞を用いてのH4のアセチル化の検討やFRAPとmicro-irradiationを用いて、ヒストンシャペロンの損傷クロマチンとの結合ダイナミクスを検討する。TIP60のアセチル化変異体を発現させた細胞あるいはH2AXのアセチル化を抑制した細胞を用いた時のヒストンシャペロンの損傷クロマチンとの結合ダイナミクスへの変化が同様であるか否かを検証する。これによりTIP60によるH2AXのアセチル化が、高次クロマチン構造変換を介していることが示唆できると思われる。また当初予定していたLANAタンパク質が、H2AXのacidic patchに結合できないH2AXの変異体遺伝子を発現させた細胞の樹立も行い、損傷領域でのH4のアセチル化の増幅は阻害されるか否かについても検討を加える。さらに我々は、制限酵素I-SceIで人工的にDNA二本鎖切断を一カ所誘導するカセットとその近傍にLacO配列をタンデムに導入した細胞を用いてDNA損傷領域をDsRed-Lac Iで可視化する系を立ち上げているが、この系を用いて、1) TIP60あるいはH2AXのアセチル化を抑制した場合、2)今回同定したH2AXacidic patch結合因子、あるいはヒストンシャペロンをノックダウンさせた場合、DNA損傷を受けた染色体とPML bodyとの共局在に影響を与えるか否かについて蛍光免疫組織学的解析で検討する。あるいは細胞核内での挙動について、コントロール細胞と比較して違いがあるのか、についてreal timeで軌跡を追うことにより検討する。これらの実験により、H2AXの交換反応とDNA損傷を受けた染色体の核内配置との関係を探る。29年度が最終年度であるため、記入しない。