hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肉食,草食,雑食各動物の膵とくに膵島・腺房門脈系の性状

ヒト,サル,ウシ,ブタ,イヌ,ネコ,ウサギ,モルモット,ラット,マウスの膵臓の血管鋳型を作製,これを微解剖して走査電子顕微鏡で観察した。マウスとラットでは,多くの膵島は小葉間とくに導管に沿って存在し(小葉間膵島),その輸出血管は靜脈に直接注ぐ。これらの動物の小葉内膵島は靜脈性導出路をもつほかに膵島・腺房門脈系をもって小葉内毛細血管叢に注ぐ。モルモットでも多くの膵島は小葉間膵島に属して小葉間靜脈に注ぐ一方、小葉内膵島はもっぱら膵島・腺房門脈を出す。ウサギ,ネコ,イヌ,ブタ,ウシには小葉間膵島はほとんどない。これらの動物では膵島は主として小葉内膵島であり,その輸出血管は全て膵島・腺房門脈として小葉内毛細血管叢に注ぐ。サルやヒトでも同様で,膵島のほとんどが小葉内膵島であり,もっぱら膵島・腺房門脈を脈出する。すなわち,ヒトやサルでは膵島から起って直接靜脈に注ぐ血管はない。小葉は動物が大きくなるにつれて大きくなる。一方膵島は動物の大きに関係なくほぼ一定の大きを保つ。従って,マウスやラットでは小葉のかなりの部分を膵島が占めることになり,これらの動物で認められる膵島・靜脈路は膵島・腺房門脈の一部が変形し膵島血管叢の側副導出路となっていると考えられる。すなわち,膵島・靜脈路は本来膵島・腺房門脈である。以上のことから肉食,草食,雑食各動物の膵の血管群には特記すべき有為の差はないといえる。モルモット等小動物で小葉間膵島が特異的に認められるのは外分秘部が未発達で各膵島を十分に包みこまれないためと考えられた。ラット膵をアルデヒド固定してパラフィン切片とし,これを鉄コロイド(pH1.020)で染色すると膵島・腺房門脈と膵島・靜脈路に沿う分分秘細胞に強い反応がみられた。このことは膵島が何んらかのかたちで外分泌部をコントロールしていることを示す所見と考えられた。
Ras、RhoファミリーGTPaseによる細胞内部位特異的シグナル伝達機構の解析

RasファミリーおよびRhoファミリーGTPaseは、細胞内シグナル伝達系において、分子スイッチとして重要な機能を担っている。近年、細胞内シグナル伝達系の細胞内部位特異的な調節メカニズムが注目されており、その解明が重要な課題となっている。本研究では、当該GTPaseのうち、Rac1、RhoA、Rap1に着目し、それらが関与する新規のシグナル伝達系における細胞内部位特異的な制御機構の解析を行った。本年度は、Rhoファミリーに対するグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)からなるDblファミリーに属する分子の一種であるARHGEF10の機能解析を進めた。まず、プルダウンアッセイによって基質特異性を検討し、RhoAを特異的な標的としていることを明らかにした。次に、siRNAによってARHGEF10をノックダウンすると、分裂装置が多極化することが明らかとなった。RhoAを部分的にノックダウンした場合にも、同様に分裂装置の多極化が観察された。また、ARHGEF10のノックダウンによる分裂装置の多極化は、活性型RhoAの異所性発現によって回復した。以上の結果より、ARHGEF10は、RhoAを介して、細胞周期進行に伴って中心体数が適正になるように制御していると考えられる。細胞分裂の際の中心体数の異常が起こる原因としては、中心体複製の異常と細胞質分裂の異常による多核化が考えられる。そこで、FACSにより検討したところ、ARHGEF10をノックダウンした細胞においても多核化の有意な上昇は認められなかった。したがって、ARHGEF-RhoA経路は、中心体の複製過程を調節しており、過剰な複製が起こらないようにしていると考えられた。さらにARHGEF10と相互作用する分子として、キネシン様モーター蛋白質の一種であるKIF3Bを同定した。特異的な相互作用は、酵母ツーハイブリッド法や共免疫沈降法により確認された。さらに、KIF3Bをノックダウンした細胞でも分裂装置の多極化が観察された。したがって、KIF3Bは、ARHGEF10の活性や細胞内局在を制御することで、RhoA依存的な中心体複製の負の制御系の調節に関与していることが示唆された。本年度は、骨格筋におけるインスリン依存性糖取り込みのシグナル伝達系の解析を行った。これまでの培養細胞を用いた研究から、このシグナル伝達系においてはRhoファミリーGTP結合蛋白質Rac1が重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。そこで、マウス骨格筋においても、インスリン応答性の糖取り込みにRac1が重要であるかどうか、検討を行った。エレクトロポレーション法により、糖輸送担体GLUT4のレポーターの発現ベクターをマウス骨格筋に導入した後、発現したGLUT4レポーターの細胞外領域のタグを免疫蛍光染色法により検出することで、GLUT4の細胞膜への移行(糖取り込み)を評価した。その結果コントロールマウスの骨格筋においては、尾静注により投与したインスリンに応答したGLUT4レポーターの細胞膜への移行が観察されたが、骨格筋特異的rac1ノックアウトマウスではそれが完全に抑制されていた。一方、恒常的活性型Rac1の発現により、コントロールマウスでも骨格筋特異的rac1ノックアウトマウスでも、インスリン刺激がない状態で、GLUT4の細胞膜移動が誘導された。以上の結果より、インスリン応答性の糖取り込みにRac1が重要であることが、マウス骨格筋においても示された。内在性のGLUT4分子の電子顕微鏡観察からも、同様の結論が導かれた。さらに、従来インスリン受容体の下流でGLUT4の細胞膜移行を誘導する重要なシグナル伝達分子と考えられていたセリントレオニンキナーゼAktとRac1との関係についても、マウス骨格筋の系で検討を行った。コントロールマウスおよび骨格筋特異的rac1ノックアウトマウスにインスリンを尾静注した後、単離した骨格筋におけるAktの473番目のセリンのリン酸化を解析したところ、両者に有意差は認められず、Rac1はAktの上流では機能していないことが示唆された。本年度は、骨格筋におけるインスリン依存性糖取り込みのシグナル伝達系の解析を主に行った。とくに、筋芽細胞株L6を用いて、我々が明らかにしたRac1を介する経路とセリントレオニンキナーゼAktを介する経路の関係について検討を進めた。昨年度までに、1.恒常的活性型Rac1の発現によりAktのリン酸化が誘導されない、2.インスリン応答性のAktのリン酸化は骨格筋特異的rac1ノックアウトマウスでも野生型マウスと同様に観察される、ことが明らかとなっていたが、これらの結果より、Rac1がAktの下流で機能している可能性が考えられるので、この可能性についてさらに検討を加えた。まず、恒常的活性型ホスホイノシチド3キナーゼ(Myr-PI3K)の異所性発現により、Rac1が活性化されることを確認した。

一方、Myr-PI3Kにより誘導されるGLUT4の細胞膜への移行はAkt2のノックダウンにより阻害されるが、恒常的活性型Rac1により誘導されるGLUT4の細胞膜への移行は、同一条件下でも阻害されないことが明らかとなった。Myr-PI3Kにより誘導されるGLUT4の細胞膜への移行はAkt1のノックダウンによっては阻害されなかった。また、Myr-PI3Kにより誘導されるGLUT4の細胞膜への移行は、Rac1のノックダウンにより完全に阻害された。以上の結果より、PI3K-Akt2-Rac1というシグナル伝達を介して、GLUT4の細胞膜への移行が誘導され、糖取り込みが起こる可能性が支持された。
PCR法による歯石からのDNA型検出

歯石は白血球や口腔内上皮細胞を含み,歯の周囲に沈着して永く残存することから,白骨死体の個人識別の遺伝標識を検査する際にはかなり有用な試料である.そこで歯石DNAを試料として,MCT118(300-800bp)およびHLADQα(242/239bp)座位をPCR増幅してDNA型分析を試みた.また,性染色体上のDXZ1(131bp)およびDYZ3(172bp)をPCR増幅し性別判定を試みた.【試料・方法】〈歯石〉歯科治療時に採取した新鮮歯石,および抜去後1-17年間保存された性別既知の歯に沈着する陳旧歯石を用いた.歯石は十分洗浄し,0.5M EDTAで2448時間脱灰した後,フェノール・クロロホルム法でDNAを抽出した.〈PCR増幅〉MCT118座位はKasaiらの方法に,HLADQα座位はシ-タス社のAmplitype^<TM>システムに,性別判定はWitt & Ericksonの方法に準じた。〈DNA型検出〉MCT118型と性別判定は10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動・EB染色した後,UV照射下で型検出した.HLADQα型はリバースドットハイブリダイゼーション法により検出した.【成績・考察】歯石1.7-25.0mg(湿重量)から0.6-26.4μgの比較的高濃度のDNAが得られたが,高分子DNAは回収されず,かなり低分子化していた.歯石DNAのMCT118型は正しく検出された例が少なく,歯石を試料とする分析には不適当である(実験継続中)と考えられた.HLADQα型は20例について検討した結果,17年間保存した歯石からもDNA型検出は可能であった.DXZ1とDYZ3をPCR増幅して性別を判定した結果,男性歯石29例中26例は正しく男性と判定されたが,3例はDXZ1のみが増幅され女性と誤判定された.また女性歯石26例中24例は女性と判定されたが,2例はDYZ3も増幅され男性と誤判定された.誤判定例についてはアメロゲニン座位(X:218bp,Y:212bp)を増幅し検討した結果,性別は正しく判定された.性別判定は2種以上の検査法により行う方が良いと判明した.以上,低分子化した歯石DNAからのDNA型検出には,比較的bpの小さい領域について検査することが適していると考えられた.歯石は白血球や口腔内上皮細胞を含み,歯の周囲に沈着して永く残存することから,白骨死体の個人識別の遺伝標識を検査する際にはかなり有用な試料である.そこで歯石DNAを試料として,MCT118(300-800bp)およびHLADQα(242/239bp)座位をPCR増幅してDNA型分析を試みた.また,性染色体上のDXZ1(131bp)およびDYZ3(172bp)をPCR増幅し性別判定を試みた.【試料・方法】〈歯石〉歯科治療時に採取した新鮮歯石,および抜去後1-17年間保存された性別既知の歯に沈着する陳旧歯石を用いた.歯石は十分洗浄し,0.5M EDTAで2448時間脱灰した後,フェノール・クロロホルム法でDNAを抽出した.〈PCR増幅〉MCT118座位はKasaiらの方法に,HLADQα座位はシ-タス社のAmplitype^<TM>システムに,性別判定はWitt & Ericksonの方法に準じた。〈DNA型検出〉MCT118型と性別判定は10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動・EB染色した後,UV照射下で型検出した.HLADQα型はリバースドットハイブリダイゼーション法により検出した.【成績・考察】歯石1.7-25.0mg(湿重量)から0.6-26.4μgの比較的高濃度のDNAが得られたが,高分子DNAは回収されず,かなり低分子化していた.歯石DNAのMCT118型は正しく検出された例が少なく,歯石を試料とする分析には不適当である(実験継続中)と考えられた.HLADQα型は20例について検討した結果,17年間保存した歯石からもDNA型検出は可能であった.DXZ1とDYZ3をPCR増幅して性別を判定した結果,男性歯石29例中26例は正しく男性と判定されたが,3例はDXZ1のみが増幅され女性と誤判定された.また女性歯石26例中24例は女性と判定されたが,2例はDYZ3も増幅され男性と誤判定された.誤判定例についてはアメロゲニン座位(X:218bp,Y:212bp)を増幅し検討した結果,性別は正しく判定された.性別判定は2種以上の検査法により行う方が良いと判明した.以上,低分子化した歯石DNAからのDNA型検出には,比較的bpの小さい領域について検査することが適していると考えられた.
地方金融構造の実証的研究ー滋賀県の事例を中心として

1.本年度の研究は、地方金融構造の実証分析の対象として、まず滋賀県所在の八幡銀行(近江商人の設立)の預金分析に着手した。すなわち、すでに同行の定期預金については過去に分析済みなので、今回は特別当座預金(普通預金)と当座預金を対象に限定した。2.所蔵先の滋賀大学にたびたび出張し、両種預金の同行帳簿を選別し、必要箇所の複写を実施した。その分量は予想外に大量であり、予算上の制約からとりあえず明治期に限定せざるを得なかった。3.預金者を法人(会社・団体)と個人に分け、第1に大口預金者の性格の検証、第2に全預金者の金額階層別特徴の検出、第3に定期預金者との重複関係の有無、第4に貸付・割引との重複関係の有無、などの分析に目下取り組んでいる。4.これら分析は、デ-タ量がきわめて大きいので作業を電子計算機に依存するが、デ-タの入力を業者に発注した。すなわち、単に1時点の残高分析では預金者の性格・預金行動の特徴はあきらかにしえない。長期間の時系列分析が必要であり、そのためには一定期間ごとの積数の計算を要するが、それは電子計算機に依存する他はないからである。このような面倒な研究例は寡聞にして知らない。
高等植物の胚発生における配偶子効果の解析

初期胚の体軸形成における配偶子効果を調べるために、父性効果を示すSSP1と母性効果を示すAtMAGO遺伝子に着目し、それらの機能および関係性について分子生物学的解析を行った。その結果、AtMAGOが受精卵におけるSSP1タンパク質の極性を持った局在化に関与し、MAPキナーゼを局所的に活性化することを明らかにした。また、RNA結合タンパク質であるAtMAGOタンパク質も卵細胞内で極性を持って局在化することを見出し、mRNAの局在化を介した体軸形成の可能性を示した。平成25年度は初期胚の軸形成に重要な働きをするAtMAGOの機能解析と配偶子効果遺伝子の網羅的探索に向けた予備実験を行った。まずAtMAGOの機能解析では、AtMAGO遺伝子の発現領域の特定を行った。AtMAGOプロモーター制御化で、GUSおよび核にターゲットしたGFPを発現させたところ、雌性および雄性配偶体で発現することを見いだした。また、受精卵および初期胚においても発現が確認された。つぎに、AtMAGOタンパク質の細胞内局在を調べるために、ヒトMAGO抗体を用いた免疫染色およびAtMAGO-GFP融合遺伝子を自身のプロモーター制御下で発現させノックアウト変異体に形質転換を行った。免疫染色では体細胞において核局在が確認できたが、配偶体および受精卵では固定がうまくいかず確認できていない。今後固定法を検討する予定である。GFP融合タンパク質については、現在相補性の確認中である。ノックアウト変異体が非常に強い表現型を示し多くが配偶体致死を示すため、弱いアレルの作成を行った。ショウジョウバエにおいて報告されている4種の変異をAtMAGO遺伝子にそれぞれ導入しノックアウト変異体に形質転換したところ、初期胚の発生に重篤な異常を生じるが致死性を示さない系統が得られた。今後のこの弱い変異アレル系統を用いて表現型解析を行う。つぎに、配偶子効果遺伝子の探索に向け、各配偶子および受精卵特異的マーカーの作成を行った。各配偶子に特異的に発現する遺伝子のプロモーターを単離し、現在レポーター遺伝子に連結させている。受精卵特異的マーカーの作成に使用する予定であったシステムがうまく働かず、現在新たなシステムの構築を行っている。平成26年度は受精卵の不等分裂に重要な働きをするRAN結合タンパク質AtMAGOが結合するRNA候補SSPの解析とターゲットRNAの網羅的同定に向けた予備実験を行った。AtMAGOが受精卵において雄性配偶体由来のSSP mRNAと結合する可能性を検証するため、まずAtMAGOタンパク質とSSP mRNAの共局在性を調べようと試みた。AtMAGOタンパク質に関しては免疫染色およびMAGO-GFP融合タンパク質の局在解析を行うことで明らかとなったが、問題はSSP mRNAの局在解析である。受精卵に対するin situ hybridization法の確立を目指したが、固定組織において受精卵と卵細胞との違いを判断することは難しく、SSPの明確なシグナルを得ることはできなかった。そこで、RNA結合タンパク質PUMを人為的に改変しSSP mRNA特異的に結合するよう設計した遺伝子を植物体に導入することにした。現在、改変版PUMの作成中で今年度には植物体に導入できそうである。つぎに、卵細胞および受精卵におけるAtMAGOタンパク質のターゲットRNAの網羅的同定に向けて、それぞれの細胞特異的に発現誘導できるプロモーターの検討を行った。卵細胞特異的プロモーターに関しては前年度構築済みで、そのプロモーター制御下でMAGO-GFP融合タンパク質を発現する系統を確立することができた。しかし、受精卵特異的プロモーターに関しては特異性の乏しいプロモーターばかりで構築には至らなかった。一方で、卵細胞特異的プロモーター制御下でMAGO-GFPを発現させると受精卵にMAGO-GFPが持ち込まれることが明らかとなり、この現象を実験に利用することとした。卵細胞におけるAtMAGOのターゲットRNAの同定実験には卵細胞特異的プロモーター制御下でMAGO-GFPを発現する植物体の未受精胚珠をサンプルとし、受精卵におけるAtMAGOの結合RNAの同定実験には受精胚珠をサンプルとすることとした。ついに、AtMAGOのターゲットRNAの網羅的同定に向けた実験系を確立することができた。平成27年度はAtMAGOタンパク質の局在解析と、卵細胞および受精卵におけるRNAの局在解析を行った。AtMAGOタンパク質の局在解析に関しては、これまでにN末端側にGFPを融合させたGFP-AtMAGOタンパク質は機能を失うことが明らかとなっており、今年度はC末端にGFPを融合させたMAGO-GFPを作成し、atmago-1変異体に形質転換した。現在、atmago-1変異体背景でAtMAGO-GFPを発現する植物体を選抜中である。ヒトMAGO抗体を用いた免疫染色法では幾つかの固定法を試した。また、whole mountおよびsection免疫染色も行った。その結果、卵細胞の核においてシグナルが観察された。AtMAGO特異的なシグナルであるかを確認するため、現在atmago-1変異体における解析を行っている。卵細胞および受精卵におけるRNAの局在解析においては、RNA結合タンパク質PUMを人為的に改変し目的のmRNAに結合させる系の構築を試みた。改変型PUMタンパク質と目的のmRNAを培養細胞に発現させたところ、特異的な結合が観察されなかった。現在、mRNAを可視化させる新しい技術Click-iTを採用し植物細胞特に卵細胞および受精卵のmRNAの標識化を試みている。Click-iT技術はウリジンのヌクレオチド類自体5-

ethynyl uridineを活発なRNA合成の間にmRNAに取り込ませることによりmRNAを標識する。卵細胞および受精卵を含む胚珠に類自体を取り込ませる予備実験を行っており、植物細胞の卵細胞および受精卵においてmRNAを可視化する初めての系が構築されると期待している。これにより、mRNAの局在化におけるAtMAGOの機能解析が可能となるであろう。初期胚の体軸形成における配偶子効果を調べるために、父性効果を示すSSP1と母性効果を示すAtMAGO遺伝子に着目し、それらの機能および関係性について分子生物学的解析を行った。その結果、AtMAGOが受精卵におけるSSP1タンパク質の極性を持った局在化に関与し、MAPキナーゼを局所的に活性化することを明らかにした。また、RNA結合タンパク質であるAtMAGOタンパク質も卵細胞内で極性を持って局在化することを見出し、mRNAの局在化を介した体軸形成の可能性を示した。平成26年度にはSSP mRNAとAtMAGOの関係を明らかにするためSSP mRNAの局在解析を計画していたが、受精卵に対するin situ hybridization法がうまく働かず、代替案としてSSP mRNAに特異的に結合する改変型RNA結合タンパク質の局在解析を行う実験系に変更し、現在進行中である。また、本年度は卵細胞及び受精卵におけるAtMAGOのターゲットRNAの網羅的同定に向けた実験系の構築も計画していた。受精卵特異的にエピトープタグされたAtMAGOを発現させるための受精卵特異的プロモーターを作成することができなかったが、卵細胞特異的に発現させたタンパク質が受精卵に持ち込まれるという現象を発見し、卵細胞からの持ち込みを受精卵特異的プロモーターの代替えとした。以上のように、当初計画していたいくつかの実験系がうまく働かないことが明らかとなったが、代わりの実験系をすぐさま立ち上げることでおおむね順調に進展している。植物発生学最終年度である平成27年度は(1)受精卵におけるmRNA可視化技術の確立とSSP mRNAの局在解析、(2)卵細胞および受精卵におけるAtMAGOのターゲットRNAの網羅的同定を行い、卵細胞および受精卵における極性形成機構を分子レベルで明らかにする。計画(1)においてはSSP mRNAに特異的に結合する改変型RNA結合タンパク質とGFPの融合タンパク質を植物体において発現させ、受精卵において局在解析を行う。また、atmago変異体背景でも同様にGFP融合タンパク質を発現させその局在解析から、SSP mRNAの局在とAtMAGOの関係を明らかにする。計画(2)においては、卵細胞特異的にMAGO-GFPを発現させた植物体を用いて未受精卵を回収し、GFP抗体を用いてRNA免疫沈降を行う。回収したRNAをcDNA化した後にDNAマイクロアレイを行い、卵細胞におけるAtMAGOのターゲットRNAを同定する。
3次元フラクタル次元による下顎骨の骨塩定量の試み

ヒト乾燥頭骸骨の下顎小臼歯部を用いて、骨ミネラル量の減少と骨梁構造の変化との関係を検討した。骨ミネラルが減少すると、海面骨の皮質骨の両方の骨量が減少するが、海面骨の減少は骨梁の減少となって、視覚的に変化がわかる。本実験では、2-Na EDTA 10%水溶液(pH7.5)を用いて、骨ミネラル量の減少を実験的に行った。骨ミネラル量は乾燥重量を骨ミネラル量とした。EDTAによって順次骨を溶解させ、適当な時間ごとに溶液からとりだし、乾燥重量を測定した。重量の変化を骨ミネラル量の減少とした。また、それぞれの骨溶解のステージにおいて、デンタルX線投影を行い、骨梁構造の変化をみた。骨梁構造の変化は、著者らが開発した3次元modifiedpixeldilation法(参考文献参照)を用いて、関心領域の3次元フラクタル次元を測定した。関心領域は1×1cmで100mumのサンプリングでデジタル化を行い、100×100のマトリクスでフラクタル次元を測定した。骨ミネラル量の減少とフラクタル次元との関係は次のようになった。骨ミネラル量(g)0 0.547 0.718 0.977 1.11フラクタル次元2.322 2.3122.277 2.277骨ミネラル量が減少すると、視覚的に海面骨の骨梁構造が粗になってくる。その結果、フラクタル次元は減少する。本結果では、骨ミネラル量とフラクタル次元との関係は、2次曲線で負の相関(相関係数0.974)を認めた。本結果は、フラクタル次元が骨ミネラル量の変化を反映する数値として用いることができることを示唆している。
遺伝暗号改変による翻訳後修飾タンパク質の革新的生産技術開発

遺伝暗号の改変によって、翻訳後修飾等の化学修飾を望みの部位に導入したタンパク質を均一かつ大量に生産する技術の開発を行った。共同研究を通じて、開発された技術が他の研究者の研究にも有用であることを示すことも研究目標の1つである。非天然型アミノ酸のタンパク質への導入効率を高めるために、RF-1を除去し、ゲノムの大規模改変を施した大腸菌ホスト株の開発に成功し、ニトロチロシン、アセチルリジンなどの翻訳後修飾をタンパク質に自由に導入することを可能にした。農研機構との共同研究によって、シルクに非天然型アミノ酸を組み込むために、カイコの遺伝暗号の改変にも取り組み、アジド基含有シルクの高い生産性を実現した。古細菌由来のチロシルtRNA合成酵素(TyrRS)を改変して、ニトロチロシンをtRNAに結合させる変異体を開発した。この変異体(nYRS)を用いて、大腸菌で発現されるリコンビナント・タンパク質に効率良くニトロチロシンを導入できることを確認した。これまでに他の研究グループから報告されているnYRS変異体と導入効率を比較する実験を行って、ニトロチロシンを導入したタンパク質の生産量が10倍以上に改善されることが示された。従来の変異体の効率では実用的なタンパク質生産に利用することは事実上難しく、本研究で初めてニトロチロシン化タンパク質を効率良く生産できるようになった。タンパク質のチロシン・ニトロ化は生体のストレス応答に係っており、ニトロ化部位もタンパク質上の複数個所に及ぶことがある。次の段落で述べる修飾アミノ酸の導入に優れた大腸菌株(RFzero)を用いて、開発されたnYRSが効率の高い変異体であり、1つのタンパク質分子中の3か所まで同時にニトロチロシンを導入できることがわかった。nYRS-RFzeroシステムは、ストレス応答の分子メカニズムの解明に貢献すると考えている。翻訳後修飾を持つタンパク質の大量生産にさらに適合した大腸菌株の開発を行った。ニトロチロシンなどの修飾アミノ酸を遺伝的にコード化するためにUAGコドンを利用するが、UAGコドンに対する修飾アミノ酸の導入効率を高めるためには、UAGコドンを読み取ってタンパク質合成を終了に導く生体内因子RF-1を不活化する必要がある。研究代表者らは既にRF-1欠損大腸菌(RFzero株)の作製に成功していたが、さらにタンパク質生産に適した大腸菌株にするべく、ゲノム中のUAGコドンの置換によりRF-1除去が大腸菌の増殖に与える致死的な効果を抑えるための研究開発を進めている。非天然型アミノ酸をタンパク質に導入する効率の高い大腸菌株の作製を行った。これまでに翻訳終結因子の1つであるRF-1を除去した大腸菌株(RFzero株)を作製して報告していた。RFzero株では、ゲノム中に300個程度存在するUAGコドンのうち、必須遺伝子の翻訳終結に使われている7個のUAGコドンを他の終止コドンに改変することでRF-1の除去を可能にしていた。RFzero株の増殖活性の向上を図り、様々な非天然型アミノ酸の導入を促進するために、さらに多くのUAGコドンを改変した大腸菌株B-95.delAの作製を行った。最終的に300個のUAGコドンのうち、95個のUAGコドンを他の終止コドンに改変することで、低温における増殖速度を高め、合成培地での増殖を可能にして、翻訳後修飾アミノ酸を組み込んだタンパク質の生産系として優れた大腸菌株を作り出すことができた。実際に、トロンビンに硫酸チロシンを組み込んだ組換えタンパク質が、従来法にくらべて高い純度と生産量を持って生合成できることを示して、B-95.delA株の実用性を示した。アミノアシルtRNA合成酵素の基質特異性の改変も行なった。ピロリシルtRNA合成酵素(PylRS)に数か所の変異を導入して、ホモアルギニンを認識する変異体を作製することに成功した。この実験では、AGGコドンをホモアルギニンに割り当てることで、UAGコドンにはこれとは異なる非天然型アミノ酸を割り当てることを可能にしている。今年度の成果としてはAGGコドンにはホモアルギニン以外の非天然型アミノ酸を割り当てることには成功していないが、来年度以降の課題として取り組む予定である。また、この課題の直接の目的ではないが、非天然型アミノ酸導入技術を生かした共同研究を通じて翻訳後修飾されたヌクレオソームや、真核生物の翻訳開始因子の立体構造の解析にも貢献することができた。非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質を生産するための大腸菌ホスト株の作製については、計画通りよりも早く、期待した以上の成果が得られた。アルギニンの誘導体に対する特異的なアミノアシルtRNA合成酵素の改変については、アルギニルtRNA合成酵素(ArgRS)ではなく、PylRSを改変する計画に変更し、実際に1つのアルギニン誘導体に対して特異的な変異体の作製に成功した。1つのタンパク質に2種類の非天然型アミノ酸を導入することで、酵素(トランスグルタミナーゼ、TG)の自動活性化機構と耐熱化を同時に実現することに成功した。既に、RFzero株等の開発によって、1種類の非天然型アミノ酸であれば、UAGコドンを用いてタンパク質中の何か所でも導入することが可能になっていた。もう1種類の終止コドン(UAAまたはUGA)を利用することで、2種類目の非天然型アミノ酸を導入する試みは既に複数報告されているが、UGAコドンを利用する場合には非天然型アミノ酸の導入効率が低くタンパク質の大量生産が望めない。

UAAコドンを利用する場合にはUAGコドンとの読みわけが困難であり、2種類のアミノ酸が互いのコドンに混入する問題が避けられない。そこで、2つのめ非天然型アミノ酸を導入する為に重複したセンス・コドンを利用した。アミノ酸2つめの非天然型アミノ酸を導入する為には、AGGコドンを翻訳するtRNA分子種の発現を特定条件下で抑制できるようなRF-1欠損株(B-95.delA株の誘導体)を作製していた。AGGコドンはアルギニンの6つのコドンの1つある。対応するtRNA分子種の発現を強く抑制すると同時に、AGGコドンを非天然型アミノ酸に翻訳するtRNAを一過的に発現させて、2種類目の非天然アミノ酸の導入を実現する。このRFzero誘導株は特定条件下では長く増殖を維持することはできないが、完全に増殖停止するまでの間に目的の修飾タンパク質を大量に生産することができる。このことを活用して、TGにヒドロキシ酸とハロゲン化チロシンを同時に導入した。ヒドロキシ酸はTGの活性化を抑制しているN末端領域の最後に部位特異的に導入することで、アルカリ条件下でこの領域を切り離すことで酵素を活性化することに成功し、ハロゲン化チロシンは酵素本体内の適当な部位を探索することで耐熱性を高めることができた。平成27年度に開発したアルギニン誘導体特異的なPylRS変異体を活用して作成した、2種類の非天然型アミノ酸を導入する大腸菌ホスト株を効果的に活用して、新しいタンパク質工学のアプローチを示すことができた。この点は予想外の成果であった。遺伝暗号システムの改変によって、翻訳後修飾などの化学修飾を望みの部位に導入したタンパク質を均一かつ大量に生産する技術の開発を目的として研究を進めてきた。共同研究を通じて、開発された技術を他の研究者に提供することも本研究の目標の1つであり、具体的には、寺本英敏博士(国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構)と共に、アジド基を持った非天然型アミノ酸をカイコのシルク・タンパク質に効率よく導入するための技術開発を行った。カイコ由来のフェニルアラニンtRNA合成酵素(BmPheRS)のアミノ酸結合部位に改変によってアジドフェニルアラニンの導入を目指した。報告されているヒトPheRSの結晶構造情報を元に、これまでに報告されているPheRS変異体も考慮して適切な変異部位を探索した結果、α鎖432位の変異がBmPheRSのアミノ酸特異性に影響を与えることを見出した。そこで、この部位のサチュレーション・ミュータジェネシスを実施した。アジドフェニルアラニンの導入レベルを調べるために、大腸菌のタンパク質にこの非天然型アミノ酸がランダムに導入された場合に生起する増殖阻害の程度を指標とセレクションを進め、効率よくアジドフェニルアラニンを導入する変異体PheRS(αA432)及びPheRS(αV432)を得ることができた。最後に、これらのBmPheRS変異体を絹糸腺特異的に発現するトランスジェニック・カイコを作製してシルクへの導入を確認した。変異体PheRSのアミノ酸結合部位の構造モデルを作製することで、効率的な非天然型アミノ酸の導入のメカニズムを推測した。本研究成果は、平成30年3月に論文で公表され(ACS Synthetic Biology誌)、理研と農研機構との共同プレスリリースを行った。
植食性昆虫における餌植物の地理分化に伴う多様化：虫こぶ形成昆虫をモデルとして

植食性昆虫は生態の多様性も種多様性も非常に高く、この多様性をもたらした要因の解明は、生物多様性分野の重要なテーマの一つである。申請者らは、その中でも、植物組織内の遺伝子発現を変えることで異常な形態変異を引き起こして虫こぶを形成する昆虫に着目した。本研究では、日本および世界で地理分化しているHamamelis属の植物に対して虫こぶを形成するアブラムシをモデルとし、植物の地理分化が虫こぶ形態の多様化とアブラムシの種分化をもたらしたことを遺伝子レベルで明らかにする。虫こぶを採集し、植物組織とアブラムシでの遺伝子発現を調べ、植物の地理分化と関連した虫こぶ形態と遺伝子発現パターンの進化を明らかにする。
昆虫の生態防御の分子機構

1.抗菌性タンパク質誘導に必要なバクテリア細胞壁ペプチドグリカンの最小構造の決定種々のグラム陽性菌よりペプチド架橋構造並びに,糖鎖長の異なるペプチドグリカン(PG)を調製し,カイコにおけるそれらの抗菌性タンパク質誘導効果を調ベ,誘導に必要なPGの最小構造を決定した.これらの研究により,一定構造のPGを認識するシステムが昆虫に存在することが明らかになった.2.ペプチドグリカン認識タンパク質の単離とその性質.カイコ免疫化体液から,PGと特異的に結合するタンパク質を単離し,分子量,N-末端アミノ酸配列並びにその諸性質を明らかにした.3.抗菌性タンパク質遺伝子発現誘導にかかわるシグナル伝達系の解明シグナル伝達系の様々な阻害剤を,カイコ脂肪体培養系に加えることにより,抗菌性タンパク質遺伝子の発現誘導にエイコサノイドが関与していることを明らかにした.4.カイコセクロピン遺伝子のクローニングとプロモーター領域の解析カイコゲノムライブラリーを検索し,セクロピンA遺伝子をクローニングした.この遺伝子のプロモーター領域には,哺乳動物の免疫系遺伝子に見いだされているNF-κB結合モチーフが存在し,このモチーフに特異的に結合するタンパク質が,免疫化脂肪体の核に存在することを見いだした.5.バクテリア感染によりエリ蚕で誘導される遺伝子の検索と同定バクテリアを接種したエリ蚕脂肪体に特異的に誘導される遺伝子をDifferential display法によって検索し,得られたDNA断片の塩基配列を決定し,リゾチーム及びセクロピンcDNAをクローニングした.6.エリ蚕アタシンの単離とcDNAのクローニングエリ蚕免疫化体液より,抗菌性タンパク質アタシンを単離し,N-末端アミノ酸配列並びに諸性質を明らかにした.アタシンの単離は,セクロピア蚕に次いで2例目である.さらに,このアミノ酸配列を基に,アタシンcDNAをクローニングし全塩基配列を決定した.1.抗菌性タンパク質誘導に必要なバクテリア細胞壁ペプチドグリカンの最小構造の決定種々のグラム陽性菌よりペプチド架橋構造並びに,糖鎖長の異なるペプチドグリカン(PG)を調製し,カイコにおけるそれらの抗菌性タンパク質誘導効果を調ベ,誘導に必要なPGの最小構造を決定した.これらの研究により,一定構造のPGを認識するシステムが昆虫に存在することが明らかになった.2.ペプチドグリカン認識タンパク質の単離とその性質.カイコ免疫化体液から,PGと特異的に結合するタンパク質を単離し,分子量,N-末端アミノ酸配列並びにその諸性質を明らかにした.3.抗菌性タンパク質遺伝子発現誘導にかかわるシグナル伝達系の解明シグナル伝達系の様々な阻害剤を,カイコ脂肪体培養系に加えることにより,抗菌性タンパク質遺伝子の発現誘導にエイコサノイドが関与していることを明らかにした.4.カイコセクロピン遺伝子のクローニングとプロモーター領域の解析カイコゲノムライブラリーを検索し,セクロピンA遺伝子をクローニングした.この遺伝子のプロモーター領域には,哺乳動物の免疫系遺伝子に見いだされているNF-κB結合モチーフが存在し,このモチーフに特異的に結合するタンパク質が,免疫化脂肪体の核に存在することを見いだした.5.バクテリア感染によりエリ蚕で誘導される遺伝子の検索と同定バクテリアを接種したエリ蚕脂肪体に特異的に誘導される遺伝子をDifferential display法によって検索し,得られたDNA断片の塩基配列を決定し,リゾチーム及びセクロピンcDNAをクローニングした.6.エリ蚕アタシンの単離とcDNAのクローニングエリ蚕免疫化体液より,抗菌性タンパク質アタシンを単離し,N-末端アミノ酸配列並びに諸性質を明らかにした.アタシンの単離は,セクロピア蚕に次いで2例目である.さらに,このアミノ酸配列を基に,アタシンcDNAをクローニングし全塩基配列を決定した.1.抗菌性タンパク質誘導に必要なバクテリア細胞壁ペプチドグリカンの最小構造の決定グラム陽性菌をペニシリン存在下で培養することにより,架橋のない直鎖上ペプチドグリカン(PG)を調製し,これをリゾチームで部分分解後液クロで分画して,種々の大きさのPGを得た.これを,カイコ幼虫に注射し,誘導されるセクロピンおよびリゾチーム活性を測定し,誘導に必要なシグナル分子としてのPGの最小構造を決定した.また,種々のグラム陽性菌よりペプチド架橋構造の異なるPGを調製し,それらの誘導効果を調べ,カイコが一定構造のPGを認識していることを明らかにした.2.ペプチドグリカン認識タンパク質の単離と同定プラズモン共鳴による,生体分子相互作用解析装置を用いたPGとタンパク質との特異的結合を検出するシステムを開発し,カイコ幼虫体液より,PGに特異的に結合するタンパク質を単離し,その性質を明らかにした.さらに,細胞膜に結合したPG認識タンパク質が幼虫脂肪体に存在することを,初めて見いだした.このタンパク質の性質の検討並びにその単離を試みているところである.3.抗菌性タンパク質遺伝子発現誘導に関わるシグナル伝達系についてカイコ脂肪体がPGをバクテリア侵入のシグナルとして認識した後,この情報がどのようにしてセクロピンおよびリゾチーム遺伝子へ伝わるのかを明らかにするため,カイコ幼虫脂肪体培養系を用いたin vitroの系と,カイコ幼虫を用いたin vivoの系を使い,この情報を遮断する阻害剤をスクリーニングした.その結果,プロスタグランディンなどのエイコサノイド代謝阻害剤が,PGによる抗菌性タンパク質遺伝子発現誘導を強く阻害することを見いだした.さらに,種々のエイコサノイド代謝阻害剤の影響を調べ,これらの遺伝子発現誘導にエイコサノイドが関与していることを明らかにした.1.エリ蚕のアタシンとリゾチームの単離とその性質エリ蚕(Samia cynthia ricini)免疫化

体液より,抗菌性タンパク質アタシンとリゾチームを単離した.アタシンの単離はセクロピア蚕のものに次いで2例目であり,そのN-末端アミノ酸配列は,セクロピア蚕のものと高いホモロジーを有していた.抗菌スペクトルその他の性質もセクロピア蚕ものと類似していた.また,リゾチームのN-末端アミノ酸配列もセクロピア蚕のものと特に類似していた.2.バクテリア感染によってエリ蚕で誘導される遺伝子の検索と同定バクテリアを接種したエリ蚕脂肪体に特異的に誘導される遺伝子をDifferential display法によって検索し,セクロピア蚕のリゾチーム並びにカイコのセクロピンB遺伝子とそれぞれ高いホモロジーを有する数種のDNA断片を得た.これらをプローブとしてリゾチームcDNAをクローニングしその塩基配列を決定した.その他にもバクテリア感染によって特異的に誘導される数種のDNA断片を得ており,これらの遺伝子のクローニングを進めている.3.ペプチドグリカン認識タンパク質の精製とその性質カイコ体液にペプチドグリカンと特異的に結合するタンパク質が存在することを,^<125>I-ペプチドグリカンを用いたフォトアフィニティー標識法により明らかにした.ペプチドグリカンとの結合特性,結合に対する金属イオンの影響などこのタンパク質の性質について検討した.4.カイコの成長・変態に伴うセクロピンおよびリゾチーム遺伝子の発現胚から成虫までの発生の各段階で,セクロピンおよびリゾチーム遺伝子の発現をノーザンハイブリダイゼイションにより調べたところ,幼虫および蛹の脱皮時期に脂肪体でセクロピン遺伝子が発現していることを見いだした.1.ペプチドグリカン認識タンパク質の単離とその性質カイコ免疫化体液から,ペプチドグリカン(PG)と特異的に結合するタンパク質を単離した.このタンパク質は,分子量37Kdで,そのN-末端アミノ酸配列は既知のタンパク質との相同性が無く,新規のPG認識タンパク質であると思われる.また,PG及びその構造類似多糖との結合特異性は,抗菌性タンパク質誘導の場合と一致した.2.抗菌性タンパク質遺伝子発現誘導に関わるシグナル伝達系の解明カイコ脂肪体がPGをバクテリア侵入のシグナルとして認識した後の情報伝達に,エイコサノイドが関与していることを既に明らかにしている.そこで,どの様なエイコサノイドが関与しているかを明らかにするために,様々なエイコサノイド生合成酵素の特異的阻害剤を用いてPGによる抗菌性タンパク質遺伝子発現誘導に対する影響を検討したところ,プロスタグランディンとロイコトリエンの両方が関与していることが明らかになった.3.エリ蚕アタシンcDNAのクローニングとその発現既に明らかにしたエリ蚕アタシンのアミノ酸配列を基に作成したDNA断片をプローブとして,免疫化エリ蚕脂肪体cDNAライブラリーをスクリーニングし,アタシンcDNAを単離し,その全塩基配列を決定した.
対人相互作用場面における温かさ・冷たさの感覚―身体化認知の適応的機能の検討

平成30年度は、身体的な冷たさ、温かさが他者の心的状態の推測に与える影響ならびに、身体的な冷たさ、温かさの感覚と他者との関係の認知との関連について検討するための実験並びに調査を行った。29年度までに実施した研究については1件の学会発表を行った。(1)身体的な温かさ(冷たさ)の感覚が、他者を理解することができるという推測における過大視(過小視)、ならびに、自分が理解してもらえるという推測における過大視(過小視)に及ぼす影響を検討する実験室実験を行った。結果の信頼性を高めるために、実験を2回行ったが、結果が一貫しなかった。実験1では、理解に関する推測において過大視が生じる方向の結果が得られたが、実験2ではそのような傾向は認められなかった。個人差を含め詳細な分析を実施し、結果が一貫しなかった理由を検討中である。(2)前年度に引き続き、日常的に感じる冷たさ、温かさの経験や、冷たさ、温かさに対する感覚(選好や制御)と社会的な孤立および対人関係を求める傾向などとの関連についての質問紙調査を行った。個人の特性に加え、育った地域の気候(寒さ・温かさ)の影響を検討するため、過去の気象データを加えた分析を行った。分析は完了していないが、育った地域の気温の影響が認められたので、引き続き検討を続ける。29年度に実施した調査に関してはその一部を学会で発表した。以上に加え、計画していた実験のうち実験操作や従属変数の測定がうまくいっていないものについては引き続き改善を試みた。コミュニケーション課題を用いた実験の方法の検討に時間を要した。昨年度の検討では、PCを用いた課題に変更することを予定していたが、更に検討した結果、PC課題ではなく、当初計画していた対面のコミュニケーション課題が望ましいとの結論に至り、実験を計画し直したため。また、外気温が非常に高い時期に実施した実験等において、外気温の影響が生じていたと考えられたケースがあり、そのような時期を避けて再度実験をすることが望ましい。コミュニケーション課題を用いた実験に関しては、実際に対面して行う課題を用いた実験を実施する予定である。これまで大学生を対象として実施してきた調査を一般のサンプルを対象に実施する予定である。また、昨年度行うことができなかった国際学会での発表も実施する。また、これまで行った調査データについてはメタ分析を行う予定である。本研究の目的は、対人相互作用場面において働く認知過程が、そのときに体感される物理的温度(温かさ・冷たさ)によって調整されている可能性を実験的手法により検討することである。平成27年度は、当初、他者の心的状態の推論方略に体感される物理的温度が与える影響に関する実験の実施と、他者に対する共感および異なる立場の他者の心的状態の理解に体感される物理的温度が与える影響に関する実験の準備と予備的研究を進める予定であった。後者については、実験に必要な機材を入手し、実験を遂行できる環境を整え、平成28年度の実験実施へ向けた準備を進めた。前者については、計画を変更し、平成28年度に計画していた、冷たさ、温かさの感覚と社会的な排斥や孤立、受容との関係に関する研究に先に着手した。冷たさ、温かさの感覚と社会的な排斥や孤立、受容との関係を検討する目的で、実験室実験ならびに質問紙調査を行った。体感する温度を操作し、その後、潜在的指標(single category IAT)や、顕在的指標(所属欲求尺度など)によって、孤独感、拒絶感を測定したが、体感した温度による影響はほとんど認められなかった。しかし、他者の表情からその感情を推測する課題において、体感した温度の影響があり、冷たい温度を経験している方が感情の推測の成績が悪かった。これは、当初の予測とは逆の方向の結果であり更なる研究が必要と考えられる。質問紙調査においては、日常的に感じる冷たさ、温かさの経験と社会的な孤立や自己評価などがどのように関連しているのかを検討した。これについては次年度以降も引き続き検討を行う。さらに、体感する温度を操作し、他者の心的状態の推論に関する実験を実施したが、平成27年度内に十分な数の実験参加者を集めて実験を実施することができなかったため、引き続き平成28年度にも実験を行う予定である。平成28年度に実施予定であった計画を平成27年度に前倒しして実施したため、当初、平成27年度に実施予定であった計画の一部が平成28年度に持ち越されたが、全体としてみた場合、おおむね順調に進展していると言える。平成28年度は、冷たさ、温かさの身体感覚が他者の心的状態の推測に対して与える影響に関して、以下のような実験、調査を行った。(1)身体的な冷たさ(温かさ)を感じることが他者の心的推論における理解の過大視を抑制(促進)するかについて実験室実験を行い検討した。その結果、温かさを経験した場合は冷たさを経験した場合に比べて相手の心的状態が推測できると過大視する傾向が強まることが示された。一方、自分の心的状態が相手に理解されると過大視する程度については、身体的な冷たさ(温かさ)の経験は影響しなかった。前者の結果は予測に合致するものであるが、後者については、課題の特異性によるものなのか、検討が必要である。加えて他者の心的状態の推論において、体感する身体的な冷たさ(温かさ)が自身の心的状態を投影する傾向を抑制(促進)するかについて実験室実験を行い検討した。

(2)さらに、27年度に実施した実験のうち、予測と異なる結果が得られていたものについて、方法を改変した実験を行なった。具体的には、体感する温度が他者の表情から感情を推測する課題に関して、実験刺激を変更して実験を実施した。現在の時点では、分析が完了していないが、分析が終了したものにおいては、体感した温度による効果は認められなかった。今後個人差を含めた検討も行う予定だが、実験刺激の再検討が必要である。(3)日常的に感じる冷たさ、温かさの経験と社会的な孤立および対人関係などがどのように関連しているかを質問紙調査を用いて検討した。その結果、所属欲求が高い(他者とのつながりを求める)ことと、日常生活の中で温かさを求める傾向に関連が認められた。27年度に実施した調査結果については国際会議において発表した。上記に加え、29年度に実施予定の潜在的態度の測定に用いるための写真刺激を撮影し、予備調査を行った。平成28年度に実施予定だった実験のうち一部は年度内に本実験の実施がまで至らなかったものがあるが、平成29年度に実施予定の実験の準備を進める事ができたので、全体としてみた場合、おおむね順調に進展していると言えるだろう。しかし、実験結果が一貫しない部分もあるため、その点については当初の計画を変更し、平成29年度において、方法を変更した実験を行うかどうか、データの再分析、刺激や手続きの見直しを含めて検討する必要がある。平成29年度は、身体的な冷たさ、温かさの感覚が他者の心的状態の推測に与える影響ならびに、身体的な冷たさ、温かさの感覚と他者との関係の認知との関連について検討するために実験ならびに調査を行った。また、28年度までに実施した研究については、2件の学会発表を行った。(1)身体的な冷たさ(温かさ)を感じることが他者の心的状態の推論における理解の過大視を抑制(促進)するかについて実施した実験室実験の結果(温かさを経験した場合は冷たさを経験した場合に比べ、相手の意図が理解できる程度を過大視するが、自分自身が相手に理解される程度については過大視が生じない)をまとめ、学会発表をおこなった。共感性などの個人差についても分析を行ったが、大きな影響を与えていなかった。(2)28年度に引き続き、身体的冷たさ(温かさ)の感覚が、他者の感情を表情から推測することにおける敏感さに与える影響を検討する実験を行った。表情刺激、体感する温度の操作方法を複数検討したが、経験する身体的冷たさ(温かさ)による違いは検出できていない。(3)28年度に引き続き、日常的に感じる冷たさ、温かさの経験や、冷たさ、温かさに対する感覚(選好や制御)と社会的な孤立および対人関係を求める傾向などとの関連についての質問紙調査を行った。調査データはまだ分析の途中であるが、所属欲求に加えて寂しさと日常において温かさを求める傾向との間にも関連が認められた。28年度の調査結果については、その一部を国際学会で発表した。これまで行ってきた実験を改良する形での実験や、調査についてはほぼ予定通り実施することができたが、新たに実施を予定していたコミュニケーション課題の実施において当初の予測よりも実験者が必要となり、その確保ができず実験を進めることができなかった。そのためPCを用いた課題への変更を検討した。その際、新たな実験プログラムを作成する必要が生じ、予想よりも準備に時間を要したため。
両生類試験法による歯科材料の内分泌攪乱作用評価に関する研究

本研究は、甲状腺ホルモンおよびエストロゲン作用撹乱化学物質のin vitroおよびin vivoバイオアッセイを両生類(アフリカツメガエル)を使って確立し、歯科材料として用いられる可塑剤および重合開始剤、紫外線吸収剤、歯科用消毒剤について実験を行った。その結果、両生類試験法は内分泌撹乱作用評価にとってきわめて有効な試験法であることが判明した。本試験法によって、歯科用レジンに含まれる重合開始剤および紫外線吸収剤、さらに、仮封材およびティッシュコンディショナーに含まれる可塑剤の中には、エストロゲン活性および甲状腺ホルモン様作用を示す化学物質の存在が明らかにされた。歯科材料から溶出する内分泌撹乱化学物質については、酵母や細菌を使ったエストロゲン受容体(ER)に対する活性を評価するin vitro試験が実施されており,個々の化学物質の安全性が検討されている。一方,エストロゲン活性としてとらえられてきた内分泌撹乱物質の人体への影響は,最近の研究により、脳の発達に影響を与える甲状腺ホルモンの異常がより重大視されるようになってきた。甲状腺ホルモン作用の評価試験法についても、甲状腺ホルモン受容体(TR)や甲状腺ホルモン輸送タンパク(TTR)やTRとヘテロダイマーを形成するレチノイドX受容体(RXR)に対する活性を評価するin vitroの試験系が開発されている。しかしながら,口腔内のように,より高度な安全性が求められる揚合には,in vivo試験での検討が不可欠となる。そこで,本研究は、甲状腺ホルモンおよびエストロゲン作用撹乱化学物質のin vitroおよびin vivoバイオアッセイを両生類(アフリカツメガエル)を使って確立し,口腔内で溶出する内分泌撹乱物質の安全性の評価に応用するものである。よって本年度は、(1)歯科材料に含まれる化学物質のなかで、内分泌攪乱化学物質作用を示す物質の探索を従来用いられている酵母系アッセイで行った。その結果、歯科用レジンに含まれる重合開始剤および紫外線吸収剤にエストロゲン活性および甲状腺ホルモン様作用の存在が明らかにされた。(2)(1)で検出された化学物質の溶出濃度でカエルの肝細胞による内分泌攪乱化学物質様作用の検出をビテロジェニン量の測定(in vitro)より行った。その結果、酵母系バイオアッセイで検出された内分泌攪乱化学物質様作用は、カエルを使用した本実験系では検出されなかった。以上の結果より、今後、化学物質の代謝経路の解明および両生類試験法のin vivoでの検証を行う予定である。しかしながら,口腔内のように,より高度な安全性が求められる場合には,in vivo試験での検討が不可欠となる。そこで,本研究は、甲状腺ホルモンおよびエストロゲン作用撹乱化学物質のin vitroおよびin vivoバイオアッセイを両生類(アフリカツメガエル)を使って確立するために、前年度に行った紫外線吸収剤に加えて、歯科材料として用いられる可塑剤および重合開始剤、歯科用消毒剤についても実験を行った。その結果、歯科用レジンに含まれる重合開始剤および紫外線吸収剤、さらに、仮封材およびティッシュコンディショナーに含まれる可塑剤の中には、エストロゲン活性および甲状腺ホルモン様作用を示す化学物質の存在が明らかにされた。以上の結果をふまえ、今後、化学物質の代謝経路の解明および両生類試験法のin vivoでの検証を行う予定である歯科材料から溶出する内分泌撹乱化学物質については、酵母や細菌を使ったエストロゲン受容体(ER)に対する活性を評価するin vitro試験が実施されており,個々の化学物質の安全性が検討されている。

そこで,本研究は、甲状腺ホルモンおよびエストロゲン作用撹乱化学物質のin vitroおよびin vivoバイオアッセイを両生類(アフリカツメガエル)を使って確立するために、歯科材料として用いられる可塑剤および重合開始剤、歯科用消毒剤、紫外線吸収剤に加えて、PCBについても実験を行った。その結果、歯科用レジンに含まれる重合開始剤および紫外線吸収剤、さらに、仮封材およびティッシュコンディショナーに含まれる可塑剤およびPCBの中には、エストロゲン活性および甲状腺ホルモン様作用を示す化学物質の存在が明らかにされた。