hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モリブデン金属間化合物基合金の超高温特性の解明と材料設計原理の確立

これまでMo過剰なMo-Si-B合金では、1600°Cにおける三元系状態図がいくつか提案されているが、本合金の用途などから、より高温の状態図が求められていた。そこで本研究では、1800°CにおけるMo過剰側の三元状態図を実験的に定めると共に、凝固組織から熱処理組織への組織の発達について詳細を検討し、本合金に対する組織制御の指針を得ることができた。一方、このMo-Si-B合金にReおよびTiCを添加し、Mo-Re-Si-B四元系およびMo-Si-B-TiC五元系合金の1800°Cにおける状態図の検討を行った。Mo-Re-Si-B合金では、Re添加によってMo固溶体の体積率が増加し、逆にMo_3Si金属間化合物の体積率が減少すること、ReはMo固溶体中に優先的に固溶すること、Reの添加量が10at%を超えた辺りからMo-Re金属間化合物であるσ相が生成することなどを明らかにした。また、Reを添加することでMo固溶体中のSi濃度も上昇し、このSi量の増加によってMo固溶体は顕著に硬化し、その硬化率がLabusch限界に従うことなどを示すことができた。Mo-Si-B-TiC合金では、TiCが安定相として分離するため、Mo固溶体、Mo_3Si金属間化合物、Mo_5SiB_2ボライド、TiCカーバイドの四相合金となることを、世界で初めて見いだした。また、TiCの添加量を適正化することによって、微細でかつMo固溶体が母相となりうる組成が存在することを発見した。これによって、今後、Mo-Si-B基合金の合金開発と組織制御が大きく前進することが期待される。これまでMo-Si-B合金の凝固経路に関しては、Nunesら(2000)、Katrychら(2002)、Yang & Chang(2005)の報告があるが、各々の間にはいくつかの相違点が見られ、結論が得られていない状況であった。しかし本研究では、これらの問題のいくつかについて明確な結論を得ることができた。まずMo-Mo_5SiB_2の二相共晶点についてであるが、NunesらおよびKatrychらが実験的に得た共晶点と、YangとChangが熱力学計算で得た点には組成にかなりの違いがあった。このことに関して、Mo固溶体、Mo_5SiB_2、Mo_2B各相を初晶とする組成域は概ねYangとChangの熱力学計算結果が正しく、それを実験的に確認した。しかし彼らが言うところの、Mo固溶体とMo_5SiB_2とMo_2Bの初晶域が接する三重点をMo-Mo_5SiB_2二相共晶点とするのは間違いであり、この二相共晶点はMo_2B初晶域に存在することを確認した。したがって通常の溶解・鋳造法では、Mo-Mo_5SiB_2二相共晶点はMo_2B相の凝固を必ず経由することになり、Mo-Mo_5SiB_2完全共晶を得ることは無い。一方、YangとChangの熱力学計算結果で示されるMo固溶体とMo_5SiB_2とMo_2Bの初晶域が接する三重点では、Mo-Mo_5SiB_2二相共晶とMo-Mo_5SiB_2-Mo_3Si三相共晶の2つの領域によって構成されており、初晶の晶出が無いため微細で均質な凝固組織となることがわかった。また三重点から組成が離れるにつれ粗大な初晶が晶出し、凝固組織は不均質となる。特に、Mo_2B初晶域は、Mo-Si-B三元状態図におけるMo-Mo_5SiB_2二相域を一部覆っていることから、固体の平衡状態では存在しない準平衡相が粗大な初晶となって存在する。しかし本研究の結果、1800°Cで熱処理をすることにより準安定な初晶を完全に分解させることができることを突き止めた。

また、TiCの添加量を適正化することによって、微細でかつMo固溶体が母相となりうる組成が存在することを発見した。これによって、今後、Mo-Si-B基合金の合金開発と組織制御が大きく前進することが期待される。
中東・北アフリカ地域のイスラーム圏の少数派と弱者に関する総合的研究

本研究では、中東・北アフリカのイスラーム地域における少数派・弱者を取り上げ、その過去と現状について3年の期間をかけて調査を行った。具体的には、少数派・弱者を(1)「イスラーム圏における少数派としてのキリスト教およびその他の宗教」、(2)「イスラーム圏における伝統的弱者としての女性」、(3)「イスラーム世界における異端」という3つの研究課題に分け、それぞれの課題について調査を行い、思想史的および社会学的手法を用いて考察した。当初の予定どおり、「イスラーム圏における少数派としてのキリスト教およびその他の宗教」、「イスラーム圏における伝統的弱者としての女性」、「イスラーム世界における異端」の3課題について研究を進めた。課題1「イスラーム圏における少数派としてのキリスト教およびその他の宗教」については、高橋および三代川がイスラームとキリスト教の思想的関係やエジプトにおけるコプト教会信徒の間での民族意識の変遷、中東地域の中でも政治的混乱が続くイラク、シリアなどにおけるキリスト教徒の置かれた現状についての研究を進め、その成果の一部を海外での学会等で発表すると同時に、キリスト教をはじめとする中東地域の少数宗教に関する資料収集およびエジプトでの現地調査を行なった。課題2「イスラーム圏における伝統的弱者としての女性」については、辻上および桑原が「国家におけるジェンダー関係の解明」、「家族法体系と実践に関する文献研究」、「外国人女性とインターセクショナリティ(交差性)に関する研究」の三つのテーマに沿って資料に基づく調査を進めると同時に湾岸諸国での現地調査を行い、国内外の学会および学術雑誌にて成果の一部を発表した。課題3「イスラーム世界における異端」については近藤および菊池が「前近代北アフリカのイバード派とスンナ派の知的交流についての文献学的研究」、「前近代シリア地域におけるシーア派諸派とスンナ派の交流に関する思想史的研究」の二つのテーマに沿って資料に基づく研究を進めると同時に、チュニジアにおいて現地調査を行い、成果の一部を論文として公表した。課題1「イスラーム圏における少数派としてのキリスト教およびその他の宗教」については、高橋および三代川がイスラームとキリスト教の思想的関係やエジプトにおけるコプト教会信徒の間での民族意識の変遷、中東地域の中でも政治的混乱が続くイラク、シリアなどにおけるキリスト教徒の置かれた現状についての研究を進め、その成果の一部を海外での学会等で発表すると同時に、キリスト教をはじめとする中東地域の少数宗教に関する資料収集および現地調査を行なった。課題2「イスラーム圏における伝統的弱者としての女性」については、辻上および桑原が「国家におけるジェンダー関係の解明」、「家族法体系と実践に関する文献研究」、「外国人女性とインターセクショナリティ(交差性)に関する研究」の三つのテーマに沿って資料に基づく調査を進めると同時に、湾岸諸国等での現地調査を行い、国内外の学会および学術雑誌にて成果の一部を発表した。課題3「イスラーム世界における異端」については、近藤および菊池が「近現代北アフリカのイバード派知識人によるスンナ派理解に関する文献学的研究」、「近現代の歴史的シリア地方におけるアラウィー派、ドゥルーズ派と他宗派との関係の究明」という二つのテーマに沿って資料に基づく研究を進めると同時に、レバノンにおいて現地調査を行い、成果の一部を論文等で公表した。また、これまでの研究の成果を発表する場として、レバノンのベイルートにて国際ワークショップを開催し、現地の研究者等から科研チームの研究に対する貴重な意見を得ることができた。研究代表者および分担者が各自ほぼ予定どおりに研究を進め、国内外の学会や学術雑誌、研究所等で成果の一部を発表するなど、研究はおおむね順調に進展している。当初の予定どおり、「イスラーム圏における少数派としてのキリスト教およびその他の宗教」、「イスラーム圏における伝統的弱者としての女性」、「イスラーム圏における異端」の3課題について研究を進めると同時に、3年間の研究成果をまとめるための作業を行った。課題1「イスラーム圏における少数派としてのキリスト教およびその他の宗教」については、前年度までの研究成果に基づき、13世紀以降の思想変遷が中東地域の実生活に及ぼしている影響について検証し、研究成果報告の準備を進めると同時に、湾岸地域、レバノン、欧州などで現地調査を行うと同時に、エジプトのコプト教会信徒の動向についての調査も進めた。課題2「イスラーム圏における伝統的弱者としての女性」については、前年度までの研究成果に加えて、湾岸地域、イラクおよび欧州における中東出身者の渡航先で現地調査を行い、当該地域の政治・法制度上の女性の地位、人種とジェンダーの交差性についての検証を進めた。課題3「イスラーム世界における少数派ムスリムおよび異端の活動」では、前年度までの研究成果を引き継ぎ、北アフリカのイバード派のイスラーム世界全体との関係に関する特徴、および、歴史的シリアにおけるアラウィー派、ドゥルーズ派の活動に関する特徴について研究を進めた。また、これまでの3年間の研究のまとめの場として福山市においてシンポジウムを開催するとともに、研究成果報告書の作成に向けての準備を進めた。研究代表者および分担者が各自ほぼ予定どおりにそれぞれの研究を進め、国内外の学会や学術雑誌、研究書などで成果の一部を発表するなど、研究はおおむね順調に進展している。

「イスラーム圏における少数派としてのキリスト教およびその他の宗教」、「イスラーム圏における伝統的弱者としての女性」、「イスラーム世界における異端」の3課題について引き続き研究を進めると同時に、これまでの研究成果をまとめて、公表する。課題1「イスラーム圏における少数派としてのキリスト教およびその他の宗教」については、これまでの研究成果を踏まえて、シリア正教会、コプト教会などのキリスト教諸派およびその他の少数派宗教の信徒の現状等についての研究を引き続き行うとともに、これまでの成果をまとめる。課題2「イスラーム圏における伝統的弱者としての女性」については、「国家におけるジェンダー関係の解明」、「家族法体系と実践に関する文献研究」、「外国人女性とインターセクショナリティ(交差性)に関する研究」の三つのテーマについてのこれまでの成果のとりまとめを行い、当該地域の政治・法制度上の女性の地位、人種とジェンダーの交差性について明らかにする。課題3「イスラーム世界における異端」については、これまでの成果に基づいて、北アフリカのイバード派のイスラーム世界との関係に関する特徴、および歴史的シリアにおけるアラウィー派、ドゥルーズ派の活動に関する特徴を明らかにする。また、これまでの研究の成果を発表する場として、国内でシンポジウムを開催すると同時に、成果の活字体での公表に向けて準備を進める。28年度が最終年度であるため、記入しない。文献学今年度以降も、昨年度に引き続き、「イスラーム圏における少数派としてのキリスト教およびその他の宗教」、「イスラーム圏における伝統的弱者としての女性」、「イスラーム世界における異端」の3課題についてそれぞれの班で研究を進める。課題1「イスラーム圏における少数派としてのキリスト教およびその他の宗教」については、前年度に行なった研究成果を踏まえてシリア正教会、コプト教会等におけるイスラーム思想の受容についての研究を進めると同時に、前年度に入手した資料を用いて宗教的少数派の状況の分析作業を行う。課題2「イスラーム圏における伝統的弱者としての女性」については、サウジアラビア、アラブ首長国連邦等での現地調査を行い、中東地域の国家におけるジェンダー関係の解明、家族法体系と実践に関する文献研究、外国人女性とインターセクショナリティ(交差性)に関する研究を継続して進める。課題3「イスラーム世界における少数派ムスリムおよび異端の活動」については、近現代北アフリカのイバード派知識人によるスンナ派理解に関する文献学的研究および近現代の歴史的シリア地方におけるアラウィー派、ドゥルーズ派と他宗派との関係の究明を進めると同時に、レバノンにおけるイスラーム少数派の活動についての現地調査を行う。
過去1,000年間における洪水履歴とそれに応じた微高地の地形発達過程

完新世中後期(約10,000年前以降)における最近1,000年前以降の微地形発達の位置付けを明らかにすることを目的として,常総市石下地区において前年度に掘削した深度25mのボーリングコア(GS-JIS-9)についてコア解析を行い,すでに実施した岩相記載および軟X線写真撮影に加えて,粒度組成(含泥率,極細粒細粒砂の占める割合),含水率,帯磁率の測定および珪藻化石分析を行った.また,コア試料から採取した計9試料について14C年代測定を行い,堆積年代を明らかにした.コアは沖積層基底礫層と推定される礫層を覆って砂泥互層が堆積しており,過去数千年間において砂質堆積物が卓越する時期が繰り返し存在したことが明らかになった.地表面に分布する微高地を構成する堆積物の基底からは1,000 cal BP頃の年代測定値が得られ,これ以降に微高地の形成が進んだことが示唆される.さらに,標高ー2ー4 m付近に海水生珪藻の卓越する層準が認められ,年代測定結果から7,5007,900 cal BP頃に後氷期の海水準上昇に伴って海域が拡大したことが示された.また,人為改変以前の微高地の分布を定量的に明らかにするため,常総市石下地区・東野原地区を対象として空中写真測量を実施した.その結果,微高地が複数のローブ状の高まりとクレバスチャネルから構成されていることを明らかにした.さらに,GS-JIS-5, 6, 7, 8コアのレーザー回析式装置による粒度分析を実施した.その結果,GS-JIS-7コアに常総水害時の破堤堆積物に類似する構造が認められること,洪水氾濫堆積物が中粒砂以上の含有率が少なく現在に比べてやや細粒であることが明らかになった.また,昨年度までにGS-JIS-58コアからの解析から得られた成果について,地質標本館の特別展示に資料展示を行い,一般市民へ成果を還元した.平成28年度は,米軍撮影の空中写真判読および現地踏査を実施し,鬼怒川左岸に分布するクレバススプレー,クレバスデルタを中心に,微地形分類を行った.この微地形分類結果と,周辺で実施されている既存コア掘削地点を考慮し,常総市石下地区・東野原地区に分布するクレバススプレーの主軸部とこれを開析して伸びるより新しいクレバススプレー上の計4地点を選定し,それぞれ掘削深度5mのボーリング調査を実施した.調査の結果,保存状況の良好なオールコア試料が得られた.まだ詳細なコア解析は実施していないが,いずれのコア試料もシルト・粘土とそれを覆う層厚13m程度の砂層から構成される.この層序・層相は既存コア資料と同様の傾向を示している.コア中に認められる砂層は,鬼怒川の河道が現在の位置に移って以降,約1000年間の洪水堆積物と推定される.また,平成27年9月関東・東北豪雨での鬼怒川の破堤堆積物について,採取した堆積物試料の粒度分析を実施し,破堤堆積物の粒度組成が氾濫時の越水・破堤・氾濫水流入から収束にいたるまでの堆積プロセスの変化を反映している可能性が高いことを明らかにした。特に,破堤を伴う場合には,段波の発生・流下に伴って堆積物が上方細粒化傾向を示すと考えられる.この特徴は,本年度に採取したボーリングコアの解析にも有用であり,個々の洪水イベント堆積物の識別に活用できると期待される.この成果は第四紀研究に論文として取りまとめ,2017年2月に受理された.本年度は空中写真判読に基づく微地形分類作業とボーリング調査を実施し,良質なボーリングコア試料を採取できたが,微地形分類作業がやや遅れており,作業を完了した範囲が対象地域の一部にとどまっている.平成28年度に常総市石下地区および東野原地区で採取した浅層ボーリングコア試料について,岩相観察や粒度分析,放射性炭素年代測定などを行い,同地区における微高地が概ね34枚の氾濫・破堤堆積物から構成され,約7001000年前以降に堆積したことを明らかにした.この成果については,日本地理学会2017年秋季学術大会でポスター発表を行った.また,現在,これらのコア試料の一部について,平成27年9月関東・東北豪雨によって形成されたクレバススプレー堆積物との定量的な比較を目的として,レーザー回析式装置による粒度分析を実施している.これまでに掘削したボーリングコア試料を用いて微高地構成層の特徴がおおむね把握できたことや,掘削に適する土地が少ないことから,完新世後期のなかにおける最近1000年前以降の微地形発達の位置付けを探るため,常総市石下地区において掘削深度25mのボーリング調査を1地点で実施した.調査が順調に進んだことから,ボーリングコアの岩相観察,軟X線写真撮影,珪藻化石分析を実施した.コアの採取状況は良好である.コアは沖積層基底礫層と推定される礫層を覆って砂泥互層が堆積しており,過去数千年間において砂質堆積物が卓越する時期が繰り返し存在したことが示唆される.また,人為改変以前の微高地の分布を明らかにするため,常総市石下地区・東野原地区を対象として空中写真判読を実施し,微高地が複数のローブ状の高まりとクレバスチャネルから構成されていることを明らかにした.平成28年度に掘削したコア試料については当初の計画通りにコア解析作業を実施できている.また,本年度の研究計画では年度内にボーリングコアの掘削完了までを見込んでいたが,計画よりも早期に掘削を完了することができたため,計画を前倒ししてコア解析作業を実施した.

完新世中後期(約10,000年前以降)における最近1,000年前以降の微地形発達の位置付けを明らかにすることを目的として,常総市石下地区において前年度に掘削した深度25mのボーリングコア(GS-JIS-9)についてコア解析を行い,すでに実施した岩相記載および軟X線写真撮影に加えて,粒度組成(含泥率,極細粒細粒砂の占める割合),含水率,帯磁率の測定および珪藻化石分析を行った.また,コア試料から採取した計9試料について14C年代測定を行い,堆積年代を明らかにした.コアは沖積層基底礫層と推定される礫層を覆って砂泥互層が堆積しており,過去数千年間において砂質堆積物が卓越する時期が繰り返し存在したことが明らかになった.地表面に分布する微高地を構成する堆積物の基底からは1,000 cal BP頃の年代測定値が得られ,これ以降に微高地の形成が進んだことが示唆される.さらに,標高ー2ー4 m付近に海水生珪藻の卓越する層準が認められ,年代測定結果から7,5007,900 cal BP頃に後氷期の海水準上昇に伴って海域が拡大したことが示された.また,人為改変以前の微高地の分布を定量的に明らかにするため,常総市石下地区・東野原地区を対象として空中写真測量を実施した.その結果,微高地が複数のローブ状の高まりとクレバスチャネルから構成されていることを明らかにした.さらに,GS-JIS-5, 6, 7, 8コアのレーザー回析式装置による粒度分析を実施した.その結果,GS-JIS-7コアに常総水害時の破堤堆積物に類似する構造が認められること,洪水氾濫堆積物が中粒砂以上の含有率が少なく現在に比べてやや細粒であることが明らかになった.また,昨年度までにGS-JIS-58コアからの解析から得られた成果について,地質標本館の特別展示に資料展示を行い,一般市民へ成果を還元した.本年度に採取したボーリングコア試料について,層相記載および粒度分析,年代測定などを行い,堆積物の堆積過程や堆積年代を明らかにする.また,対象地域の微地形分類作業を進めるとともに,コア解析結果を考慮して,新規のボーリング調査地点を選定する.平成28年度に掘削したコア試料については,引き続きレーザー解析式装置による粒度分析を進める.また,微高地の形成過程に関する知見を論文として取りまとめる.平成29年度に掘削したコア試料については,14C年代測定や粒度分析,珪藻化石分析などを実施し,完新世後期における古環境変遷や洪水履歴を復元し,過去1000年間の微高地発達過程の位置付けや要因について考察を行う.コア掘削開始が予定よりも遅れたため、外注による測定を予定していたコア試料の年代測定費用が未使用となり、次年度使用額が生じた。ボーリングコア掘削費が当初想定していた金額よりも安価で実施できたため.コア解析作業を実施し、予定していた年代測定試料の採取と発注を行う。
光レオロジー：　偏光で見る生体のバイオメカニクス

今回の研究計画では、組織の偏光特性を計測する装置として光計測装置「偏光光コヒーレンストモグラフィー」を用いた。本研究の目的は、組織の微弱な複屈折の違いを通じて、組織の機械特性を類推することである。従来、偏光光コヒーレンズトモグラフィーを用いて組織の微弱な偏光の違いを計測するためには、複数回組織の同一部位の計測を繰り返し、その計測値を平均することでノイズの影響を低減し、複屈折計測を行ってきた。(この手法をmean estimatorという。)しかし、今回の研究の初期に行った数値解析により、偏光OCTにおいては、mean estimatorはどれだけ平均数を挙げて行っても推定値が真値(真の複屈折)に近づかない、いわゆるbiased-estimatorであることが分かった。そこで、この数値解析をさらに発展させ、特定の真値と特定のSN比を仮定した場合に計測値がどのように分布するかを詳細に調査した。さらに、その結果にベイズの定理を適用することで「ある複屈折計測値と、ある光コヒーレンストモグラフィーの信号強度」が計測された場合の「真の複屈折値の確率分布」を求めるアルゴリズムを作成した。最終年度では、これを用いて生きたヒト強膜における眼圧の上昇による機械特性の変化と複屈折の変化について検討した。これは、加齢黄斑変性治療のために硝子体内に抗VEGF製剤を注入する患者に対して、注入前後で強膜の複屈折を計測することで眼圧と複屈折変化の関連性を調べたものである。この時得られたデータの詳細は検討中である。当初の計画では豚眼を使用したin vitroの実験を中心に行う予定であったが装置の開始が順調に進み、ヒトを対象とした実験を行うことができた。今後は、今回定量計測の対象とした「複屈折」からさらに対象を広げ、組織の散乱特性(散乱計測)、血流までを視野に入れた定量的光コヒーレンストモグラフィーを作成する。さらに、in vivo組織に機械的負荷をかける「Optical cohernece elastography」装置を作成し、ヒト皮膚を対象としたバイオメカニクス・被侵襲フィジオロジー計測を行う。本研究課題は眼球組織の一つである強膜のバイオメカニクスを、その複屈折を計測することで定量評価する、というものである。ここで、強膜の複屈折、強膜のパイオメカニクスがともに強膜内部の微小構造(suporstructuro)に依存していることに注目する必要がある。この強膜のsuporstructureは強膜に印加される圧力、つまり眼圧によっても変化する可能性がある。つまり、我々が計測対象としている複屈折は強膜のバイオメカニクスだけではなく、眼圧変化による影響も受ける可能性がある。そこで、強膜の複屈折がどの程度眼圧変化の影響を受けるのかを調査する人眼スタディーを行った。ここでは、加齢黄斑変性治療のため眼内注射を行う患者を対照として、眼内注射前後で眼圧、および強膜複屈折の測定を行った。その後、その計測データ処理するための複屈折定量化アルゴリズムの開発に進んだ。○複屈折定量測定のためのアルゴリズム開発本課題では強膜の複屈折を「偏光感受型光コヒーレンストモグラフィー」(PS-09T)を用いて撮影する。上記のヒト強膜複屈折の定量計測を行う中で、ノイズの存在する中でのPS-OCTによる複屈折計測値が、真の複屈折値からバイアスを持って計測されることがわかってきた。そのため、2013年度後半は、まず、このバイアスの特性の定式化を行った。さらに,その定式に基づき、計測される複屈折の統計特性を記述し、それを用いて真の複屈折を推定するためのアルゴリズム(推計器)の設計・実装を行った。現在、この推計器はほぼ完成し、これらをまとめた包括的な論文が投稿直前段階まで完成している。さらに、現在、二の推計器を用いて上記人眼スタディーのデータを解析している。いまだ最終取りまとめの最中の中間的な結果であるが、すでに、人の眼圧変化を複屈折の関連を示す結果が示されている。

この時得られたデータの詳細は検討中である。当初の計画では豚眼を使用したin vitroの実験を中心に行う予定であったが装置の開始が順調に進み、ヒトを対象とした実験を行うことができた。今後は、今回定量計測の対象とした「複屈折」からさらに対象を広げ、組織の散乱特性(散乱計測)、血流までを視野に入れた定量的光コヒーレンストモグラフィーを作成する。さらに、in vivo組織に機械的負荷をかける「Optical cohernece elastography」装置を作成し、ヒト皮膚を対象としたバイオメカニクス・被侵襲フィジオロジー計測を行う。推計器の理論設計の中で、当初予定していた実装上の困難さが本質的に回避できることがわかったため。26年度は、筑波大学病院の協力の下、正常眼、緑内障眼、円錐角膜眼、およびその他の疾患により硝子体内注射を必要とする人眼の強膜の偏光感受型光コヒーレンストモグラフィー計測による症例蓄積を行う。ここで、硝子体内注射眼は、注射による短期的な眼圧の強膜の複屈折への影響を検討するためである。また、上記臨床計測と並行し、より高精度な複屈折定量化のための偏光感受型光コヒーレンストモグラフィー装置の装置改良および、定量化アルゴリズムの開発を行う。
担子菌がセルロース分解過程で生産する多様な菌体外酵素の網羅的解析

本研究の成果により、担子菌Phanerochaetechrysosporiumがセルロース分解培養系において分泌する菌体外酵素について、二次元電気泳動法による分離、さらに分離されたそれぞれの酵素についてのLS-MS/MS解析、また、これらより得られたアミノ酸配列情報について同菌のゲノム塩基配列データベースへの検索により、網羅的に同定することが可能であることが示された。また、それぞれの研究目的に応じて必要な酵素について対応する遺伝子をcDNAとして取得し、さらにそれを発現ベクターに挿入して酵母菌Pichia pastorisに形質転換することにより、組換え酵素として生産することが可能であることも示された。これらの成果に基づき、本研究では種々のセルラーゼおよび関連酵素を組換え酵素として生産することに成功した。また、その中で、新規な酵素としてGHファミリー45ならびに74に属するエンドグルカナーゼならびにキシログルカナーゼについて、それぞれの酵素機能を詳細に解析した。さらに、セルロース分解培養系の中で生産されている菌体細胞壁β-1,3/1,6-グルカン分解に関与すると考えられるGHファミリー16に属する酵素Lam16Aについても、その機能を明らかにするとともにスウェーデン農科大学との共同研究とてその三次元構造を明らかにした。さらに、同酵素の部位特異的変異により作成した変異酵素を用いて新規シクログルカンの合成にも成功した。以上、本研究の成果により、担子菌P.chrysosporiumから種々の酵素を組換え酵素として生産して、バイオマス変換利用に資する一連の技術を確立した。木材腐朽菌として知られる担子菌によるセルロース分解機構の解明は,生態系での炭素循環プロセスを正しく理解するため,それが生産する酵素によるセルロースの有用物質への変換を考える上で極めて重要である。そこで,本研究では,担子菌Phanerochaete chrysosporiumがセルロース分解培養系において菌体外に生産する主要な酵素タンパク質の同定をめざしたプロテオーム解析を試み,ここで同定された菌体外酵素についてはその対応遺伝子のcDNAが取得を行い,さらに酵母菌Pichia pastorisの発現系に形質転換し,組換え体としてそれぞれの酵素を生産することを試みる。また,得られた組換え酵素について基質特異性やその反応速度など触媒機能などを解析するとともに,その結晶化と三次元構造の解析を行なう。本年度は,セルロース分解培養系ならびにこれに少量のキシランあるいはマンナンを添加した培養系から得た菌体外液に対して二次元電気泳動を行い,そこで分離された主要なタンパク質をトリプシン消化後,マススペクトル解析に供した結果,糖質加水分解酵素ファミリー6(GHF6)に属する酵素1種,GHF7に属する酵素4種,GHF12に属する酵素1種,GHF16に属する酵素2種,GHF43に属する酵素1種,GHF61に属する酵素1種,GHF74に属する酵素2種などを同定することに成功した。このうち,GHF6に属する酵素1種(Cel6A),GHF16に属する酵素1種(Lam16A),GHF43に属する酵素1種(Gal43A),GHF61に属する酵素1種(Cel61B),さらにGHF74に属する酵素2種(Cel74AおよびCel74B)については酵母菌Pichia pastorisの発現系を利用して組換えタンパク質として生産することに成功した。さらに,得られた組換え酵素について,その機能解析を行った。担子菌Phanerochaetechrysosporiumがセルロース分解培養系において生産する主要な酵素タンパク質についてプロテオーム解析を試み,ここで同定された糖質分解酵素の対応遺伝子をcDNAとして取得し,さらに異種発現系を用いて組換え体としてそれぞれの酵素の生産を行った。また,得られた組換え酵素について基質特異性やその反応速度など触媒機能などを解析するとともに,その結晶化と三次元構造の解析を試みた。前年度までに行った結果に基づき,本年度は担子菌P.chrysosporiumがセルロース分解培養系の中で生産する糖質加水分解酵素ファミリー(GHF)1,16,55および74について組換え体酵素を生産し,その機能と構造を解析した。

GHF1については,2種の酵素(BGL1AおよびBGL1B)を大腸菌の発現系で組換え酵素として生産し,相互の構造ならびに機能解析を比較検討した。その結果,両酵素においてはセロビオースに対する活性が大きく異なることを示し,さらに三次元構造の解析により酵素活性中心においてセロビオースの還元末端側残基を認識する部位に特徴的な差異のあることを明らかにした。GHF16についは,菌体壁成分であるβ-1,3/1,6-グルカンの代謝に関わると思われる酵素Lam16Aを組換え体として生産し,その機能を解析したLam16Aはラミナリンを基質とした場合,6-O-グルコシル-ラミナリトリオースを分解生成物として定量的に与えた。したがって,Lam16Aはβ-1,6-側鎖構造の存在を認識しており,加水分解反応を触媒するためには少なくとも側鎖を持たないラミナリビオース様のβ-1,3-グルカン構造が必要であることが明らかとなった。また,Lam16Aの結晶を取得し,その三次元構造を解析した。GHF55に属するβ-1,3-グルカナーゼならびにGEF74に属するキシログルカナーゼについても,組換え体として発現生産することに成功した。これらの酵素の機能ならびに酵素解析については次年度の課題とする。担子菌Phanerochaetechrysosporiumがセルロース分解培養系の中で生産する糖質加水分解酵素ファミリー(GHF)のうち,機能的にGHF1に属する2つのβ-グルコシダーゼおよびGHF74に属するキシログルカナーゼ74Bについて組換え体酵素として生産し,その機能を精査した。まず,キシログルカナーゼ74Bは活性中心ドメインと糖質結合モジュールCBM1によって構成される酵素であることを明らかにした。また,その酵素機能としては,キシログルカンに対して活性特異性が高く,側鎖をもたない主鎖残基のグルコシド結合の加水分解を選択的に触媒することを明らかにした。また,本酵素は既知のキシログルカナーゼとは異なる基質認識を示し,DP16-18のキシログルカンオリゴ糖を中間生成物として与える性質を特徴とすることを示した。GHF1に属する2種のβ-グルコシダーゼうちの一つであるBGL1Aについて結晶を取得し,その3次元構造を明らかにした。また,BGL1BについてもBGL1Aの構造に基づくモデリングによって,その3次元構造を推定した。その結果,両者では,活性中心を取り巻くアミノ酸残基は-1サイトでは完全に保存されていたのに対して,+1サイトにおいては5つのアミノ酸残基に相違が認められた。そこで,BGL1Aについてこれらのアミノ酸残基をBGL1Bに対応するアミノ酸残基に置き換えを行った部位特異的変異体を作成し,その反応特性に与える影響について解析を行った。その結果,D229N変異体においては,反応のpH依存性を著しく改変することに成功した。
脳と松果体・相互調節機構の解明

これまでの研究においてラット松果体複合体には1)交感神経,2)脳神経(三叉神経)および3)脳からの直接枝の起源を異にする3種の神経が分布することを明らかにしてきた。本年度はこれらの神経分布の個体発生学的発達状況を明らかにすべく電子顕微鏡的に追求した。生直後の松果体複合体は一連の細胞柱として認められ、腺主部の膨大は見られるが、介在板、茎の区別は明瞭でなく、少数の無髄神経線維が起始部に散見されるのみである。生後3日では、複合体の形成に大きな変化はないが、主腺部の血管周囲腔に少数の神経線維の分布が見られる。しかしこれらの線維に茎方向への延長は認められない。生後1週目では松果陥凹が茎の半ばまで及び、手綱部に向かう茎前脚に無髄神経線維の発達が目立つ。しかしシナプス構造は認められない。腺主部においては被膜部に無髄線維による大小の線維束の分布が明瞭になり、実質中の血管周囲腔には大小の顆粒小胞を含んだ神経線維が増加し、成熟動物における支配様式に近づく。生後2週目では松果陥凹は後退するが、茎の構築は松果体細胞が主体をなしており、脳直接枝、交感神経共に茎への進入は進んでいない。また、シナプス形成も認められない。腺主部では被膜線維束に有髄線維が出現し、実質中の神経線維の形状、分布様式共に成熟動物のそれと変わらない。以上の所見から、松果体複合体において、腺主部における交感神経及び脳神経による神経支配は、生後2週目までに一応完成される。しかし、この時期複合体全体としてみた場合、その形態形成は完成されておらず、特に脳からの直接枝(大部分は手綱部に由来すると思われる)による支配様式は確立されていないと考えられる。1.松果体における神経分布の種差に関する研究の一環として、これまで報告の少ないコウモリ(キクガシラコウモリ)について追究し、下記の結果が得られた.(1)松果体茎を経て直接松果体主部へ到る脳由来のセロトニン神経含有線維の分布が確認された.(2)松果体には他の動物同様非常に豊富なノルアドレナリン(NA)線維が分布していた.ラット(1983発表)、イヌ(1983発表)ではこれらの線維は、松果体細胞由来のセロトニンの取り込み能を有しているが、コウモリのNA線維は、サル(1986発表)と同様、その能力を欠いていた.(3)豊富なアセチルコリンエステラ-ゼ(AChE)反応陽性線維の分布が松果体に証明された.これはその分布様式からNA線維(交感神経節後線維)と一致すると考えられる.NA線維、AChE線維共に脳実質へ進入することはなかった.(4)電顕的に松果体中の神経線維の大多数は、実質細胞の細胞間隙を走行していた.2.ラットについて、松果体茎を中心として脳由来の神経線維分布について検索した.(1)ラット松果体茎には脳由来のセロトニンおよびNA含有神経線維が認められたが、これらは腺主部にまで進入することはなかった.(2)松果体茎に分布する神経線維は、茎起始部に向かうにつれて増加した.(3)上顎神経節切除ラットにおいて、松果体にCGRP含有神経線維の分布が確認された.これらは脳神経に由来すると考えられ、分布域は主腺内に限られていた.Wistarラット松果体を電顕的連続切片によって詳細に追究した。(1)松果体茎には非常に多くの神経線維の分布が認められたが、その数は個体差に富んでおり(茎中央部付近で約4001400)、分布様式も多くの例では散在性であったが、神経束を形成する例も見られた。(2)神経線維の数は、遠位部(腺近傍)および近位部(起始部近傍)で多く、中央部付近で減少していた。(3)松果体茎被膜には茎に伴行する数本の神経線維束が認められた。これらの茎外線維も数は少ないが個体差に富んでいた(茎中央付近で約20200)。またその数は茎近位部に向かうにつれて漸減した。(4)5-OHDA(ドーパミン疑似物質)、あるいは5,6-DHT(セロトニン疑似物質)の投与実験により、神経線維・終末の一部(最大値5-OHDA:13%、5.6-DHT:22%)にこれら物質の取り込みが見られた。この値は近位部に向かうにつれて減少したが、減少率に両者の差は認められなかった。(5)茎内線維には大型で基本顆粒と思われる顆粒を有するものがごく少数認められた。これは免疫組織化学的に検出されるバゾプレシン線維に相当すると思われる。(6)松果体茎にはその全長にわたって松果体細胞が分布していた。これらの細胞には時としてシナプスを形成する神経終末が認められた。このような構造はラット腺主部では見出されていない。(7)松果体茎には12本の毛細血管が分布するが、腺主部とは異なり内皮細胞は有窓性を示さず、血管周囲腔に神経終末の分布も見られない。(8)上頚神経節を切除すると茎内外の線維は減少するが、その減少率は遠位部において顕著であった。これまでの研究においてラット松果体複合体には1)交感神経,2)脳神経(三叉神経)

および3)脳からの直接枝の起源を異にする3種の神経が分布することを明らかにしてきた。本年度はこれらの神経分布の個体発生学的発達状況を明らかにすべく電子顕微鏡的に追求した。生直後の松果体複合体は一連の細胞柱として認められ、腺主部の膨大は見られるが、介在板、茎の区別は明瞭でなく、少数の無髄神経線維が起始部に散見されるのみである。生後3日では、複合体の形成に大きな変化はないが、主腺部の血管周囲腔に少数の神経線維の分布が見られる。しかしこれらの線維に茎方向への延長は認められない。生後1週目では松果陥凹が茎の半ばまで及び、手綱部に向かう茎前脚に無髄神経線維の発達が目立つ。しかしシナプス構造は認められない。腺主部においては被膜部に無髄線維による大小の線維束の分布が明瞭になり、実質中の血管周囲腔には大小の顆粒小胞を含んだ神経線維が増加し、成熟動物における支配様式に近づく。生後2週目では松果陥凹は後退するが、茎の構築は松果体細胞が主体をなしており、脳直接枝、交感神経共に茎への進入は進んでいない。また、シナプス形成も認められない。腺主部では被膜線維束に有髄線維が出現し、実質中の神経線維の形状、分布様式共に成熟動物のそれと変わらない。以上の所見から、松果体複合体において、腺主部における交感神経及び脳神経による神経支配は、生後2週目までに一応完成される。しかし、この時期複合体全体としてみた場合、その形態形成は完成されておらず、特に脳からの直接枝(大部分は手綱部に由来すると思われる)による支配様式は確立されていないと考えられる。
内在ゲノム領域におけるヒストン修飾動態のリアルタイムイメージング

本課題は、ゲノムDNA配列上の任意の領域を認識する細胞内プローブを構築し、細胞分化過程における特定の遺伝子領域のヒストン修飾動態を観察することを目的とした。ゲノムDNA配列上に散在する中程度反復配列を抽出し、TALEsプローブの構築を試みたところ、生細胞で標的特異的に可視化できるものは得られなかった。一方で、ヒト培養細胞に導入したANCHORシステムと活性化型RNAポリメラーゼ特異的mintbodyにより、特定の遺伝子領域の転写活性化状態を生細胞で観察することが出来た。本研究は、ゲノムDNA上の特定の領域を生細胞で可視化する新しいプローブを開発し、細胞分化過程における特定の遺伝子領域のエピジェネティクス動態を観察することを目的として行っている。平成25年度は、生細胞中で内在性ゲノム領域を可視化するためのプローブ作製を試みた。まず、任意の特異的配列を認識して結合するTranscription Activator-Like Effectors (TALEs)を設計するための標的配列候補を、ヒトおよびマウスのゲノムDNA配列から探索した。DNA配列の網羅的解析から、ヒトおよびマウスのゲノム配列上には、中程度に反復する(101105回)配列が全域にわたって散在することがわかった。この中から、領域特異的に存在する反復配列を抽出し、ヒト第9番染色体上の80回反復配列、およびマウスX染色体上の129回反復配列に注目した。これらの配列に特異的に結合するGFP融合型TALEタンパク質発現ベクターを作製し、ヒトおよびマウス由来の培養細胞へ導入して生細胞の蛍光観察を行った。各培養細胞に発現させたヒト第9番染色体およびマウスX染色体検出用GFP融合TALE(GFP-TAL-h9およびGFP-TAL-mX)は、培養細胞中で細胞核内への局在がみられたが、予想に反して多くの分子が核小体へ濃縮されていた。また核小体以外のfociにも蛍光シグナルがみられたが、Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)による解析の結果、非常に結合時間が短く、非特異的結合であることが示唆された。したがって、今回注目したヒトおよびマウスの配列は、領域特異的な可視化には適していないことが示唆された。今後、異なるDNA領域についても検討していく予定である。平成26年度は、生細胞中でヒストン修飾動態を計測するための蛍光プローブmintbody(modification-specific intracellular antibody)の作製と、分子構造の解析を試みた。ヒストンH4Lys20モノメチル化修飾特異的抗体を産生する3種のハイブリドーマ細胞からRNAを抽出し、cDNAを合成して抗体可変領域のscFv(single-chain variable fragment)を取得した。このscFvを、GFP融合型として培養細胞に発現させたところ、3つのうちのひとつ(v1)は核内で標的に特異的に結合したが、他の2つ(v2、v3)は細胞内で安定に発現しなかった。3種の抗体の可変領域のアミノ酸配列を比較したところ、v1とv2の間には5個、v1とv3に間には20個のアミノ酸置換がみつかった。v2のアミノ酸を一つずつv1型に置換する変異を導入して細胞内で安定に発現するかどうか調べたところ、フレームワーク領域内のアラニンがグリシンに置換することで細胞内における安定性が損なわれることがわかった。また、v1のscFvの結晶構造からこの部位はベータバレル構造の一部を構成することが明らかとなった。本研究によりヒストン修飾可視化プローブを細胞内の条件下で安定な構造を保つために必要な構造を解明することが出来た。本研究は、ゲノムDNA上の特定の領域を生細胞で可視化する新しいプローブを開発し、細胞分化過程における特定の遺伝子領域のエピジェネティクス動態を観察することを目的としている。これまで内在ゲノム領域を可視化する目的で、任意の中程度反復配列を認識するTALEsプローブの作製を試みてきたが、生細胞内で特異的に機能するものは未だ得られていない。また、生体内でのゲノム可視化のために、ゼブラフィッシュを用いた系の検討も行った。平成27年度は、Kerstin Bystrichy博士(トゥールーズ第三大学)との共同研究により、ANCHORシステムを用いた特定遺伝子座のライブセルイメージングと併せて、転写活性化の可視化を試みた。ANCHORシステムとは、グラム陰性菌Burkholderia cenocepacia J231のDNA結合蛋白質ParBとその標的配列である約1kbのparS(INT)との結合を、ヒト培養細胞に導入したシステムである。ANCHORシステムにはさらに、MS2/MCP (MS2 coat protein)による転写産物の可視化系も組み込まれている。本研究では、ヒト乳がん細胞MCF7のエストロゲン応答遺伝子の転写活性化を、翻訳後修飾特異的抗体由来プローブによる可視化系(Fab-based Live Endogenous Modification Labeling; FabLEM)を用いてライブ観察した。その結果、転写の活性化に伴いH3K27ac特異的プローブがエストロゲン応答遺伝子座に集まる様子が観察できた。一方で、活性化型RNAポリメラーゼIIの集積の有無は、解像度が低いため判別が難しかった。今後STORM等を導入することにより、より解像度の高いライブイメージングを行う予定である。

本課題は、ゲノムDNA配列上の任意の領域を認識する細胞内プローブを構築し、細胞分化過程における特定の遺伝子領域のヒストン修飾動態を観察することを目的とした。ゲノムDNA配列上に散在する中程度反復配列を抽出し、TALEsプローブの構築を試みたところ、生細胞で標的特異的に可視化できるものは得られなかった。一方で、ヒト培養細胞に導入したANCHORシステムと活性化型RNAポリメラーゼ特異的mintbodyにより、特定の遺伝子領域の転写活性化状態を生細胞で観察することが出来た。新たなヒストン修飾特異的蛍光プローブの細胞内発現に成功した。また、細胞内で安定に機能するために必要なアミノ酸残基を同定し、この部位について分子構造学的な考察を加えることが出来た。細胞生物学特定のゲノム領域に特異的な蛍光プローブの作製を進める。CRISPR/Cas9システムを用いた可視化系を検討する。またヒストン修飾特異亭蛍光プローブを発現する遺伝子改変マウスを作製し、in vivoイメージング系の構築を行う。生細胞可視化のための蛍光プローブが、核小体へ局在しやすい傾向がある事が判明した。またプローブの標的配列として設定した配列が、遺伝子領域特異的な可視化に適切でない可能性が示唆された。研究目的の達成には、これらの問題点を解決することが必要である。本研究はゲノムDNA上の特定の領域を可視化する新規プローブを開発し、特定の遺伝子座のエピジェネティクス動態を生体内で観察することを目的として行っている。本計画ではヒストン修飾可視化マウスを使用する予定であるが、今年度は大阪大学から東京工業大学への研究室移設にともなう移動のため、繁殖を停止しなければならなかった。現在、マウスの移動が完了し繁殖を再開したので、次年度に期間を延長することで研究を遂行できる。遺伝子領域の可視化プローブとして、Crisper-Cas9システムを導入する。本システムでは、gRNAによりプローブの局在化することが可能である。gRNAは比較的安価に合成することが出来るため、複数の標的候補配列を検討できる。既に抽出したヒトおよびマウスゲノムDNA配列上の、中程度反復配列を複数試すことで、目的に合ったプローブを作製できると考える。ヒストン修飾特異的プローブmintbodyを発現するマウスを用いて、発生過程におけるヒストン修飾動態を観察する。当初の研究計画通りの結果が得られず、方針を変更したため。任意の遺伝子領域を生細胞で可視化するため、Crisper-Cas9システムによる新たな蛍光プローブを作製する。遺伝子領域プローブとヒストン修飾プローブを組み合わせて、任意の遺伝子領域におけるヒストン修飾動態を、生きた細胞の中で経時的に観察する。
遺伝的価値のある疾患モデル動物と野生動物の精子保存および体外受精に関する研究

犬の精液保存については、低温(4°C)保存後の受精能(透明帯侵入能)を簡便に確認できる方法を開発するため、マウス、牛、豚の卵子と、犬精子を共培養して、精子の透明帯への付着および侵入を検討した。その結果、牛や豚の卵子に比べて、マウス卵子が犬精子の透明帯侵入能を評価するのに適していることが示された。この方法を用いて、ジブチルヒドロキシトルエン(BHT)を添加および無添加の保存液で犬精子を低温保存した場合、BHTを添加して保存した精子の方がマウス透明帯への侵入能が高いまま維持されていることが明らかとなった。アムールトラの人工授精については、今回初めてホルモンによる発情誘起を行った。PMSG投与により雌トラの発情は誘起され、投与から5日後の人工授精時には卵巣内に直径1cm程度の発育卵胞が確認できた。電気刺激により、活力の高い精子が得られ、経腟で人工授精を行った。受精結果は本年6月に判明する。本研究により、犬精子の保存後の受精能検査法が開発され、冷蔵保存にはBHTの添加が有効であることが判明した。また、従来行われてきた猫体外受精の改善点が明らかとなり、猫科動物の体外受精系の改良・開発に有意義な情報を提供した。これらを野生動物の入工繁殖へ応用するためには、一日も早く成功例を報告し、数多くの症例を集めることが重要である。アムールトラからは電気刺激によって活性の高い精子を安定して採取可能であることが確認できた。これらの精液の凍結融解後の活性は凍結前のおよそ40%まで低下していたものの、体外で成熟させた猫卵子と共培養したところ、透明帯への精子の付着および侵入が確認され、一部の卵子では受精も確認された。このことからアムールトラの凍結融解精子は受精能を保持しており、人工授精に使用可能であることが示唆された。また、新鮮精液を用いた人工授精を2回試みたが、妊娠にはいたっておらず、人工授精時の雌における排卵誘起に問題のあることが示唆された。雌から定期的に採血を行い血中ホルモン測定を行うことは不可能であるため、糞中ステロイドホルモンの測定を試みた。その結果、エストロジェンは測定できなかったものの、プロジェステロンは発情時には低値を示し、発情終了後に上昇することがわかった。この結果から、妊娠に至っていないものの排卵は誘起できており、発情終了後に偽妊娠状態となることが示唆された。エゾヒグマでは電気刺激による精液の採取を実施した個体のおよそ半数から活性の高い精子を得ることができた。活性の高い精子を得ることのできない個体では、尿の混入による急激なpH低下のために精子が死滅した。尿の混入を避けるため、形状の異なった直腸プローブ(電気刺激用)を作製し、試験を行ったが、確実に精子を採取できるプローブを開発するには至っていない。また、精子を採取できたとしても、精液に多量の白血球が混入し、白血球と精子頭部が付着することによって先体の損傷が見られ、凍結融解後の精子活性が低くなることが示された。ヒグマにおいても新鮮精液を用いた人工授精を計3回試みた。2例は妊娠にいたらなかったが、1例は現在経過を観察中である。昨年同様、アムールトラからは電気刺激によって活性の高い精子を安定して採取可能であることが確認できた。採取精液をペレットあるいはストロー内で凍結保存したところ、融解後の活性は両群間に差がなく、体外で成熟させた猫卵子と共培養したところ、およそ50%の猫卵子にトラ精子が侵入することが確認された。このことからアムールトラの凍結には取り扱いが容易なストロー内凍結が有効であることが示唆された。また、新鮮精液を用いた人工授精を本年度は1回試みたが、妊娠にはいたらなかった。猫科動物の体外受精系を確立するため、避妊猫の卵巣から取り出した未成熟卵子の最適体外培養時間を検討したところ、従来報告されている24時間培養よりも30時間培養の方が核成熟率が高く、凍結融解精子を用いた体外受精率も30時間の方が高いことが分かった。体外成熟培養30時間後の卵子を体外受精させ、体外で6日間培養したところ、およそ30%の胚が胚盤胞まで発育した。しかし、体外受精のために卵子と精子を共培養する時間を18時間と設定した場合、多精子侵入が高率に認められ、共培養時間を検討する必要性が示唆された。犬射出精液を凍結あるいは低温(4°C)保存する際に、ジブチルヒドロキシトルエン(BHT)を添加した場合、無添加に比べて精子の運動性および精子先体の保存状態の良いことが示された。しかし、39°Cの培養条件下で同様にBHTを添加した場合は精子に毒性を示し、無添加区に比べて精子生存率が著しく低下した。現在、これらの精子の受精能を体外で確認するため、犬精子を用いた受精系の作製を検討している。

この方法を用いて、ジブチルヒドロキシトルエン(BHT)を添加および無添加の保存液で犬精子を低温保存した場合、BHTを添加して保存した精子の方がマウス透明帯への侵入能が高いまま維持されていることが明らかとなった。アムールトラの人工授精については、今回初めてホルモンによる発情誘起を行った。PMSG投与により雌トラの発情は誘起され、投与から5日後の人工授精時には卵巣内に直径1cm程度の発育卵胞が確認できた。電気刺激により、活力の高い精子が得られ、経腟で人工授精を行った。受精結果は本年6月に判明する。本研究により、犬精子の保存後の受精能検査法が開発され、冷蔵保存にはBHTの添加が有効であることが判明した。また、従来行われてきた猫体外受精の改善点が明らかとなり、猫科動物の体外受精系の改良・開発に有意義な情報を提供した。これらを野生動物の入工繁殖へ応用するためには、一日も早く成功例を報告し、数多くの症例を集めることが重要である。