hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高比表面積をもつCaO-Bi2O3 系可視光応答触媒の創製

本研究では、高活性な可視光応答型光触媒を得るために、均一な組成と高い比表面積を持つ試料の調製方法を確立するとともに、詳細なキャラクタリゼーションと電子構造解析の実施により、光触媒能の発現機構の解明と可視光波長域において動作可能な光触媒の創製を行うことを目的とする。平成22年度までの研究の遂行により、クエン酸錯体法により合成したCaBi金属錯体は、空気中で熱分解すると、固相反応法よりも100度以上低温で単相のCa_4Bi_6O_<13>が生成し、高いメチレンブルー分解活性を示すことを明らかにした。平成23年度では、その他の有機酸として、マロン酸,リンゴ酸,シュウ酸等を使用してCa_4Bi_6O_<13>の合成を試みる一方、Ca_4Bi_6O_<13>のバンドギャップを狭窄化するために、Ca_4Bi_6O_<13>に対する不純物(Sr)の添加効果についても検討した。各有機酸を用いて得られた試料に関するXRD測定の結果から、クエン酸錯体法がCa_4Bi_6O_<13>の高純度粉体を得るための合成方法として最も優れていることがわかった。熱重量分析の結果から、有機酸と硝酸塩の熱分解温度との関係が重要であることが示唆された。クエン酸錯体法によりCa_4Bi_6O_<13>への不純物ドープを行うことにより、光触媒活性の向上を企図した。Sr系不純物の添加は、僅かではあるがバンドギャップの狭窄化及び光触媒活性の向上が確認できた。最近、酸化チタンよりも小さなバンドギャップを持つCaO-Bi2O3系酸化物が、可視光応答型光触媒として注目されている。本研究では、高活性な可視光応答型光触媒の調製方法を確立するとともに、詳細なキャラクタリゼーションと電子構造解析の実施により、光触媒能の発現機構を解明することを目的とする。平成24年度では、Ca4Bi6O13結晶に関する第一原理エネルギーバンド計算を実施するとともに、複素誘電関数を導出し、光学物性(光学伝導度,エネルギー損失関数及び吸収係数等)の理論値を導いた。エネルギーバンド計算から、Ca4Bi6O13は直接遷移型の固体物質であり、価電子帯の頂上及び伝導帯の底部付近のエネルギーバンドが分散していることが明らかとなった。状態密度解析から、伝導帯の底部は主にBi 6p - O 2p間の相互作用,上部はCa 3d軌道によって支配され、価電子帯の下部は主にBi 6s軌道,上部は主にO 2p軌道からなることがわかった。特に、価電子帯頂上では、Bi 6sとO 2pが混成するためバンド分散が大きいことが判明した。複素誘電関数では理論的な屈折率は2.30と見積もられ、価電子帯頂上と伝導帯底間のバンド間遷移には強い光学異方性が見られた。また、Ca4Bi6O13結晶は、歪んだBi配位多面体から構成されており、その多面体中に発生した電気双極子モーメントが光生成したホールと電子の分離を促進しているため、Ca4Bi6O13の高い光触媒活性が発現していると考えられる。有機酸、中でも特にクエン酸を利用した調製法が大変有効であることを見出した。また、不純物(Sr)を添加することでバンドギャップの狭窄化を実現し、それに伴い光触媒活性も向上することを確認した。このように、我々は十分な研究成果が得られていることから、研究は順調に進行していると判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。申請時は、CaO-Bi_2O_3系酸化物の調製は、エチルヘキサン酸塩法やアルコキシド法による調製を計画していたが、原料試薬が非常に高価であるため汎用的でなく、比較的安価に調製できる有機酸錯体法による合成に変更した。また、これまでの研究成果から、材料の高比表面積化も重要であるが、バンドギャップの狭窄化も光触媒の高活性化に大変有効であることを確認した。引き続き、不純物の添加効果にづいても検討を実施する。
上中咽頭癌における血清中遠隔転移決定因子の探求:放射線化学療法の最適化にむけて

頭頚部癌患者12名の血清を採取し、血管内皮増殖因子(VEGF)および血管新生抑制因子endostatinの放射線治療中の変化を観察した。それぞれEIAキットを用いcompetitive enzyme immunoassayにより血清濃度を照射前、照射中、照射後それぞれ測定した。またこれらの血清因子と腫瘍内ブドウ糖代謝の間の関連をみるため上咽頭腫瘍で治療前FDG-PETを施行した。照射前、照射1週間後、2週間後、照射終了時の血清VEGFの平均値は11.8ng/ml,19.4ng/ml,16.5ng/mlであり照射前に比較し照射中、照射後に高値となる傾向が得られた。再発は3例に認めその治旅前VEGF値はそれぞれ9.8ng/ml、24.7ng/ml、18.1ng/ml(平均17.5ng/ml)であり、高い治療前VEGF値が再発と関連している可能性がある。照射前、照射1週間後、2週間後、照射終了時の血清endostatinの平均値はそれぞれ7.38、7.25、7.89、7.120ng/mlであり大きな変動は認めなかった。しかし再発をきたした上咽頭腫瘍一例で照射開始後より一定の減少傾向を認め、照射による腫瘍縮小との関連が示唆される。FDGの集積(SUV)の平均値は6.8であった。上咽頭腫瘍のSUVおよびVEGFの平均値はそれぞれ7.5、13.2ng/mlであり、両者の間に明らかな相関は認めなかった。照射前、照射1週間後、2週間後、照射終了時の血清VEGFの平均値は11.8ng/ml, 19.4ng/ml, 16.5ng/mlであり照射前に比較し照射中、照射後に高値となる傾向が得られた。再発は3例に認めその治療前VEGF値はそれぞれ9.8ng/ml、24.7ng/ml、18.1ng/ml(平均17.5ng/ml)であり、高い治療前VEGF値が再発と関連している可能性がある。照射前、照射1週間後、2週間後、照射終了時の血清endostatinの平均値はそれぞれ7.38、7.25、7.8.9、7.20ng/mlであり大きな変動は認めなかった。
ルブリシン産生能の変調が顎関節OAを誘発する新規メカニズムの解明

成長期における咀嚼を介した顎関節領域への刺激低下は、形態異常、筋力低下、不安定性および過剰な負荷等が原因となる変形性顎関節症(顎関節OA)の発症および進行との関与が注目されている。本研究において、5週齢から9週齢まで粉末飼料で飼育したラットに下顎を偏位させて実験を行った。トルイジンブルー染色の結果から対照群と比較して、偏位群の下顎頭外側部は表層軟骨の増加の傾向が認められた。また抗ルブリシン抗体による免疫組織化学染色の結果からも下顎頭外側部軟骨層においてルブリシン陽性部位の増加傾向を示した。変形性関節症(OA)は全身の関節に発症し、その罹患率は年齢とともに増加すると言われており、2060年には人口の約40%が65歳以上という超高齢社会を迎える日本にとって、OAのメカニズムを解明し、その予防法および治療法を考案することは重要な課題である。顎顔面領域における唯一の関節である顎関節におけるOAは、下顎頭の形態異常および下顎頭軟骨の変性を主たる特徴とするが、他の関節同様に未だ不明な点が多い。基礎研究として、成長期ラットの咬筋切断および液状飼料飼育により、実験的に咀嚼筋力を低下させた結果、下顎枝の高径減少、下顎頭軟骨の厚径減少および顎関節に分布する神経線維の低形成を引き起こすことが解明されている。また、咬筋切断後に機械的負荷をかけると、顎関節において滑膜炎が悪化することや、成長期ラットの液状飼料飼育による機能低下した脆弱な下顎頭において、機械的負荷をかけると形態学的・組織学的な低形成およびOA様変化を生じたことから、負荷に対する抵抗性が低下していることが明らかにされている。しかしながら成長期の咀嚼刺激低下に起因する顎関節周囲構造の低形成および潤滑機能異常が、機械的負荷に対する顎関節OA発症および進行のメカニズムに如何に関与するかを形態学的・組織生化学的観点から解析した報告は過去にない。そこで本研究では、成長期の咀嚼刺激低下が顎関節周囲構造である下顎窩、滑膜および関節円板における低形成を引き起こし、潤滑機能を担うルブリシン産生能の変調を生じることが、機械的負荷に対して顎関節OAを誘発する新たな経路であるか否かを解明していくことを考えた。動物実験開始前の事前準備として、ラットへの飼料および装着器具の変更が必要になる可能性が生じ、再検討を行ったため。また、組織学的解析、生化学的解析を行うためにサンプルの採取方法に関する新たな知見を得る必要が出たため。成長期における咀嚼を介した顎関節領域への刺激低下は、形態異常、筋力低下、不安定性および過剰な負荷が原因となる変形性顎関節症(顎関節OA)の発症および進行との関与していると考えられ、近年注目されている。本研究の目的は、成長期の咀嚼刺激低下が顎関節潤滑機能に関与するルブリシンの産生能変調を生じ、顎関節OAを誘発するメカニズムを、形態学的・組織生化学的に解明することである。5週齢のWistar系雄性ラットを対照群、偏位群、回復群の3群に分け、9週齢まで粉末飼料で飼育した。偏位群と回復群には斜面版を用いてラットの下顎を左方偏位させた。また回復群は7週齢から装置を撤去した。各評価は7週齢および9週齢の各群で行った。組織学的評価としてトルイジンブルー染色を行った。偏位2週間の7週齢において、対照群と比較して偏位群の下顎頭外側部は表層軟骨の増加の傾向が認められた。また抗ルブリシン抗体による免疫組織化学染色の結果から、下顎頭外側部軟骨層においてルブリシン陽性部位の増加傾向を示した。偏位4週間の9週齢においては、偏位群に7週齢時と同様の結果が得られたが、対照群および回復群に関しては著明な変化は認められず、軟骨層の変化やルブリシン陽性部位の増減は明らかではなかった。現在、実験動物モデルの確立および解析手技は向上し、各結果に傾向が出ているが、各群においてサンプル数が不足しているため、統計学的評価には至っていない。今後も継続的に実験を行い、生化学的評価を加えてより精度の高い結果を明らかにしていきたいと考えている。再検討したラットへの飼料、装着器具に関する実験手技を確立した後、組織切片を作製、各種染色へと移行する。具体的には、Toluidine blue染色にて下顎頭軟骨細胞層および滑膜組織等の顎関節周囲組織の形態変化を観察し、評価を行う。また、抗ルブリシン抗体の免疫組織化学染色および生化学的解析を行い、顎関節の潤滑機能の変調に関する観察を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。歯科矯正学29年度が最終年度であるため、記入しない。
p進線形微分方程式系の研究

正標数代数多様体上のp進局所系は過収束F-アイソクリスタルと呼ばれるリジッド解析空間の意味で標数0へ持ち上げた多様体上のフロベニウス構造付きの微分加群の層で表され、そのド・ラム複体のコホモロジーとしてリジッド・コホモロジーは定義される。当研究では、正標数代数多様体のリジッド・コホモロジーの有限性(有限モノドロミー予想)に関する幾つかの結果を得た。以下、主な結果を記す。A.J.de Jongのアルタレイションの理論を用いると、F-アイソクリスタルの射に関するTate予想が、完備離散付値体上のTate予想に帰着される。基本群に関する純性定理と完備離散付値体上の有限モノドロミー定理とを合わせると、一般の代数多様体上で過収束ユニットルートF-アイソクリスタルの局所有限モノドロミー性(generically finite monodromy)を得る。局所的な場合に、正規交叉因子に沿って対数極を入れた係数付きド・ラム複体と交叉因子を除いた部分へ制限した複体が導来圏の中で同型であることを示した。この対数的Monsky-Washnitzerコホモロジーに関する比較定理は、P.Deligneによる複素多様体における比較定理のリジッド解析版にあたり、大域的関数層と局所的関数層との比較をすることに得られた。その結果、係数付きリジッド・コホモロジーのGysin同型(コホモロジー的純性)が得られた。さらに、P.Berthelotによる方法で、過収束ユニットルートF-アイソクリスタル係数のリジッド・コホモロジーの有限性やPoincare双対性を得た。正標数(標数p)代数多様体上のp進局所系はoverconvergent F-isocrystalと呼べれるrigid geometricな意味で標数0へ持ち上げた多様体上のFrobenius構造付きの微分加群の層で表され、そのde Rham複体のcohomology(rigidcohomology)としてp進cohomologyは定義される。当研究では、正標数代数多様体のp-進cohomologyの有限性(有限モノドロミ-予想)に関する幾つかの結果を得た。まず第一に、局所的な場合に、normal crossing divisorに沿って対数極を入れた係数付きde Rham複体とdivisorを除いた部分へ制限した複体がquasi-isomorphicであることを示した。この比較定理は、P.Deligneによる複素多様体における比較定理のrigid analytic版にあたり、大域的関数層と局所的関数層との比較をすることに得られた。その結果、係数付きrigid cohomologyのGysin同型(cohomological purity)が得られた。Gysin同型はcohomologyの性質を調べるときに、次元に関する帰納法を利用するために欠かせない性質である。
代謝酵素複合体形成を介する花色発現・制御の解析

キンギョソウの花色発現に関わるフラボノイド(アントシアニン・フラボン・オーロン)生合成関連酵素間の相互作用を酵母ツーハイブリッド法やBimolecularfluorescencecomplementation法などの各種の方法で解析した.その結果,キンギョソウ花弁細胞内でフラボンとアントシアニンの生合成酵素群が代謝酵素複合体を形成し,オーロン生合成関連酵素と空間的かつ機能的に仕分けられていることが強く示唆された.キンギョソウの花色発現に関わるフラボノイド(アントシアニン・フラボン・オーロン)生合成関連酵素間の相互作用を酵母ツーハイブリッド法やBimolecularfluorescencecomplementation法などの各種の方法で解析した.その結果,キンギョソウ花弁細胞内でフラボンとアントシアニンの生合成酵素群が代謝酵素複合体を形成し,オーロン生合成関連酵素と空間的かつ機能的に仕分けられていることが強く示唆された.キンギョソウ花弁細胞中でのフラボノイド生合成酵素間の相互作用をさまざまな角度から詳細に解析するための第1歩として,フラボノイド生合成における基幹的役割を果たすカルコン合成酵素(CHS),カルコンイソメラーゼ(CHI),カルコン4'グルコシルトランスフェラーゼ(C4'GT)およびオーロン合成酵素について,その小胞体局在性を解析した.キンギョソウ花弁の細胞破砕液からミクロソーム画分と可溶性画分を調製し,ウエスタンブロッティングにて各画分における酵素の存在を解析し,CHS,CHI,C4'GTは両画分に存在するが,ASは可溶性(液胞)にのみ存在することがわかった.また,代謝酵素複合体の基軸となると考えられる酵素(フラボン合成酵素,FNS;フラボノイド3'-水酸化酵素,F3'H;p-クマロイルCoA3-水酸化酵素,C3H)の遺伝子を取得した.これらのなかで,C3Hは花弁特異的に発現し,オーロンの生合成に関わる代謝複合体形成に重要であると考えられる.また,オーロン前駆体であるカフェオイルCOAの生合成に必須であると考えられるヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ(HCT)cDNAをキンギョソウ花弁から単離した.HCTはC3Hとともにオーロン生合成に特化した代謝複合体を形成するものと推定される.同酵素遺伝子を大腸菌の菌体内に異種発現させ,形質転換体の細胞抽出液を調製して酵素活性を高速液体クロマトグラフィーによって評価したところ,細胞抽出液中にHCT活性を認めることができた.以上のようにして本年度は,キンギョソウ花弁細胞中でのフラボノイド生合成における代謝複合体形成に関わると予想される酵素遺伝子のラインナップを達成することができた.HCTについて,キンギョソウ花弁のESTデータベースからタバコのHCTと配列類似性の高いESTを検索した.このEST配列をプローブにして黄色キンギョソウ花弁のcDNAライブラリーからプラークハイブリダイゼーションにより2種類の候補遺伝子を取得した.これらを発現ベクターに連結して大腸菌の菌体内に大量発現させた.AmHCT1について速度論パラメータを求めた.p-coumaroyl-CoAアシル基供与体としたときの両方向の反応の速度論量を比較したところ,この酵素はシキミ酸をより良好なアシル基受容体として利用することがわかった.一方,C3HについてはゴマのCYP98A20 cDNAをプローブにして黄色キンギョソウ花弁のcDNAライブラリーからプラークハイブリダイゼーションにより8種類の候補遺伝子を取得した.これらをメタノール酵母のゲノムに組み込んでメタノール添加により誘導発現させた.ミクロソーム画分を調製して酵素活性を調べたところ,ひとつ(AmC3H)に酵素活性が認められ,p-クマロイルシキミ酸を基質とした場合にNADPH依存的に反応生成物を与え,この分子量はカフェオイルシキミ酸のものと一致した.活性が確認できたHCTとC3H遺伝子について,キンギョソウの組織別発現を調べた.その結果,両遺伝子は花弁の分化の初期から発現し,分化とともに漸減するが,完全に開花した花で最大となった.また根・茎・葉にも発現が認められた.一般にこれらの遺伝子は,これまで多くの植物においてリグニン生合成との関連で発現解析がなされ,茎や根での発現が高く,花弁での発現はほとんど検出されない場合がほとんどである.キンギョソウではこれらの遺伝子が花弁でも有意に発現しており,リグニン生合成とPHC合成の両方に寄与している可能性も示唆されたが,花色発現への寄与に関し,今後さらに別の証拠を探す必要がある.キンギョソウのアントシアニンならびにオーロン生合成経路を構成するいくつかの酵素群(CHS,CHI,FNS,DFR,F3H,F3'H,C4'GT,HCT,C3Hなど)について,スプリットユビキチンシステムによる酵母ツーハイブリッドシステムによって総当たり的に相互作用を検索した.いくつかの酵素の組み合わせについては核内酵母ツーハイブリッドシステムを用いて相互作用を評価した.その結果,FNSとCHI,FNSとDFR,CHIとDFRとの間に相互作用が存在することが強く示唆された.当初,CHS,CHI,C4'GTの3酵素間での相互作用を介した代謝中間体の奪い合いによるアントシアニン生合成とオーロン生合成の分岐が予想されたが,この3酵素の間には有意な相互作用が観察されず,アントシアニン生合成経路とオーロン生合成経路は,キンギョソウ細胞内で,カルコン中間体を共有することなく独立に機能していることが示唆された.

またHCTやC3Hは,当初,オーロンの前駆体と考えられるpentahydroxychalcone(PHC)の生合成に関わる可能性が考えられたが,両酵素には調べたいかなる酵素とも相互作用しなかった.スプリットユビキチンシステムによる酵母ツーハイブリッドシステムによって確認された酵素間相互作用が,植物細胞内環境に近いin vivoでも存在することを確かめるため,BiFC法(bimolecular fluorescence complementation)を実施した.宿主としてはタマネギの表皮細胞およびタバコの葉を用いた.その結果,FNSとCHI,FNSとDFRの間に相互作用が存在することが明確に示された.この結果はキンギョソウのアントシアニン生合成系がFNSを足場とするメタボロンを形成している可能性を示唆している.24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度が最終年度であるため、記入しない。
青果物の長距離輸送におけるストレス処理を利用した品質保持技術の検討並びに評価

本研究は青果物のストレス処理による品質保持効果を追究するとともに,処理青果物の分子マーカーによる品質評価を検討した.ストレス処理については,高温によるブルーベリーのアントシアニン生成と品質,UV-Bによるブロッコリーの過酸化水素生成・消去に関わる酵素遺伝子発現,エタノールによるトマトの追熟抑制とエチレン生成関連遺伝子の影響,並びに過酸化水素によるピーマンの抗酸化機構の活性化と品質保持への関わりを調べた.また,高温処理ブロッコリーの品質変化と鮮度マーカー遺伝子の発現変化から,分子マーカーによる品質評価の可能性が示唆された.さらに,タイライムのストレス処理による品質保持について共同研究を行った.26年度は,1各種ストレス処理による青果物の品質保持効果について,生理・生化学・分子生物学的側面から追究する研究,2ストレス処理された青果物の流通・貯蔵に伴う品質変化を外観,化学成分,分子生物学的マーカーにより多面的に捉え評価する研究,を実施した.1.ストレス処理の品質保持効果:1)高温処理については,ブルーベリーの成熟段階における高温処理の影響について調べ,成熟果実では果皮のしおれの発生が抑制され貯蔵期間の延長が期待できた.しかし,未熟果実では着色が進行し貯蔵期間が短くなる傾向がみられた.2)低温処理については,ブロッコリーでの低温ショック処理(氷水浸漬処理)1時間で黄化抑制効果がみられ,この効果は処理による一時的な過酸化物の生成が関与しているものと思われた.3)UV-B処理については,ブロッコリーを用い,分子シャペロンと膜安定性機能を持つ低分子熱ショックタンパク質(sHSP)のUV-B処理による影響ついて調べ,処理によりsHSP関連遺伝子とsHSP量が増大することを認めた.4)エタノール処理についてはエタノールとアセトアルデヒドの生成・変換を抑制したトマト形質転換体のホモ系統を行い,エタノールがエチレン非依存の追熟に及ぼす影響を調べた.5)過酸化水素処理については,ピーマンを用い,熟度の相違による過酸化水素の影響について調べた.過酸化水素含量は成熟に伴い増加し,一方,スーパーオキシドとスーパーオキシドディスムターゼ活性は緑熟からの追熟過程で一時的増大がみられ,それらの傾向には関連性が認められた.2.分子マーカーによる品質評価:1)ブロッコリーを用い,分子量の異なるHSPの遺伝子をクローニングし,高温処理に伴うそれら遺伝子の発現変化を調べ鮮度マーカーとしての可能性を検討した.27年度は昨年に引き続き,1.各種ストレス処理による青果物の品質保持効果について,生理・生化学・分子生物学的側面から追究する研究,2.ストレス処理された青果物の流通・貯蔵に伴う品質変化を外観,化学成分,分子生物学的マーカーにより多面的に捉え評価する研究を実施した.1.ストレス処理の品質保持効果:1)高温処理については,タイライムの温湯処理の最適条件を明らかにし,その処理条件を適用し,貯蔵に伴う内容成分(糖・酸)とクロロフィル分解物の変化を検討した.また,ブルーベリーの高温処理によるアントシアニン生合成について調べたところ,40°C,45°C,50°Cの1時間処理で促進は確認されたが,糖・酸など内容成分には影響しなかった.2)UV-B処理によるブロッコリーのアスコルビン酸-グルタチオン(AsA-GSH)サイクルおよびクロロフィル(Chl)分解関連遺伝子の貯蔵中の変化を調べ,UV-B処理はAsA-GSHサイクル関連遺伝子であるAPXの発現増大とChl分解関連遺伝子であるSGRとNYCの発現抑制に影響を及ぼしていることが明らかとなった.3)エタノールパッド処理効果については,今年度,バナナ並びにアボカドの貯蔵中の品質保持への影響を調べた.また,タイライムへのエタノールパッド処理と温湯処理の併用効果についても検討した.4)過酸化水素処理については,ナスを用いAsA-GSHサイクルへの影響を調べ,低濃度処理によりアスコルビン酸含量は約1.5倍増大した.2.分子マーカーによる品質評価:ブロッコリーを用い,高温処理時間を変えることによる熱ショックタンパク質(HSP)と鮮度マーカー遺伝子の変化を調べ,50°C温風2時間処理を行うことにより,貯蔵中のHSP遺伝子発現の維持がみられるとともに,鮮度マーカー遺伝子の発現が低下することが認められた.27年度の各研究者による試験研究はおおむね順調に進んでいる。タイからのカンキツの輸送を検討したが,植物防疫の問題などもありうまく進められなかった.その代替案として,タイの研究協力者と連携し,タイ国内での流通貯蔵を念頭においたタイ産カンキツのストレス処理による品質保持実験に着手し結果を得ることができた.ストレス処理による青果物の品質保持効果並びに品質評価に関する研究を実施するとともに,これまでの研究内容を中心にシンポジウムを開催した.1.ストレス処理の品質保持効果:(1)高温:ライムを用い脱緑抑制の最適温湯処理条件(48°C,5分)を調べるとともに,最適条件処理ライムの貯蔵に伴うクロロフィル分解物の変化と果汁品質の変化を検討した.次に,ブロッコリーおよびナスを用い,処理中と貯蔵初期における過酸化水素含量と生成・消去関連酵素活性の変化を調べ,過酸化水素の品質保持に関わる役割を検討した.さらに,ブルーベリーを用い,収穫後処理(4560°C,30分または1時間)を行ったところ,2週間程度の貯蔵期間では果実内成分(糖および酸)には影響を及ぼさず,外観を維持することができた.また,50°C,1時間の処理によりアントシアニン含量の増大を認めた.(2)エタノール:バナナ,アボカド,トマトを用い,エチレン生成に及ぼすエタノール蒸気処理の影響を調べた.追熟に及ぼす影響については一様ではなかったものの,すべての果実で処理によるエチレン生成促進効果が明らかとなった.

(3)過酸化水素:ピーマン果実切片を用い,処理によるアスコルビン酸ペルキシダーゼ(APX)の誘導とアスコルビン酸(AsA)代謝について検討した.処理濃度が1.5%まではAsA含量およびAPX活性が増加したが,それ以上では低下が認められた.また,APXが抗酸化だけでなく,AsA代謝と関連している可能性も示唆された.2.分子マーカーによる品質評価:ブロッコリーの高温処理(50°C,2時間)に伴うヒートショックタンパク質(HSP)遺伝子および鮮度マーカー遺伝子の貯蔵中の発現変動を比較した.処理により,貯蔵中のHSP遺伝子の発現増大と鮮度マーカー遺伝子の発現抑制が認められた.本研究は青果物のストレス処理による品質保持効果を追究するとともに,処理青果物の分子マーカーによる品質評価を検討した.ストレス処理については,高温によるブルーベリーのアントシアニン生成と品質,UV-Bによるブロッコリーの過酸化水素生成・消去に関わる酵素遺伝子発現,エタノールによるトマトの追熟抑制とエチレン生成関連遺伝子の影響,並びに過酸化水素によるピーマンの抗酸化機構の活性化と品質保持への関わりを調べた.また,高温処理ブロッコリーの品質変化と鮮度マーカー遺伝子の発現変化から,分子マーカーによる品質評価の可能性が示唆された.さらに,タイライムのストレス処理による品質保持について共同研究を行った.26年度は研究の初年度ということで当初計画に従って実験を進めた.対象とする青果物については変更もあったが,各処理に関しての調査もおおむね順調に進んでいる.また,27年度に実施予定のタイからの青果物の輸送に関しても,タイの研究者と打合せを行い実施計画を検討した.今年度の研究については以下のように進める.また,最終年度であるためタイの研究協力者を招きシンポジウム(11月を予定)を開催し,これまでの研究内容について広く意見を求める.1)高温処理:高温処理された青果物の黄化並びに低温障害抑制と活性酸素種,特に過酸化水素との関連性についてブロッコリーおよびナスを中心に検討する.また,ブルーベリーの貯蔵に有効な高温処理の温度・時間についても検討する.2)エタノール処理:バナナ,アボカドなどの熱帯果実のエタノール処理による品質保持効果について,その作用機作を調べる.また,トマト変異体を用い,エタノール処理の果実追熟に及ぼす影響について分子レベルで検討する.3)過酸化水素処理:パプリカの緑熟・成熟果実に過酸化水素処理を行い,熟度の相違によるアスコルビン酸-グルタチオンサイクルへの影響を比較検討し,過酸化水素処理効果の作用機作を明確化する.4)品質評価:青果物の鮮度マーカーとなる老化関連遺伝子と代謝反応との関連性を調べ,老化制御と強く関連する代謝を明確化するとともに,鮮度マーカー遺伝子の有用性を検討する.28年度が最終年度であるため、記入しない。園芸科学27年度はストレス処理による青果物の品質保持効果並びに品質評価について,以下の通り検討する.また27年度はタイの研究協力者を招きストレス処理による共同実験を進める.
免疫グロブリンアミロイドシスの発症機序におけるL鎖上の糖鎖の役割

免疫グロブリンアミロイドシス(以下「ア」症)は、多発性骨髄腫由来であることが多く、両疾患の境界・移行型を示唆する症例もあり、その関連性は深い。従って、「ア症」の病態を論じる場合は、多発性骨髄腫と同時に、比較検討することが望ましい。両疾患に共通する尿中BJPの分子特性を、従来とは異なった視点、即ち最近の分子生物学がもたらした重要な課題・糖鎖構造の観点から検索することが必要になる。BJP上の糖鎖には、2種類の3本鎖と、3種類の2本鎖を認めた。この3本鎖は新たに発見されたものである。形質細胞腫20症例で、病勢・病態とBJP上の糖鎖構造を比較検討すると、3本鎖は、形質細胞腫の腎機能障害、即ち血清クレアチニンと逆相関して、疾患の予後判定に有効な指標となることが判明した。BJPにおける3種類の2本鎖糖鎖は、複数の研究機関から既に発表されているが、その分子病理学的意義については、不詳のまま放置されていた。その原因は、これらの研究が散発的に解析されたに過ぎないからである、と考えられる。系統的且つ思惟的に行われた今回の研究の結果、2本鎖糖鎖の一つ、即ちfucocylated blantenarry oligosacchar ides、が「ア症」の尿中BJPにおいて有意に低値を示した。即ち、この糖鎖が組織沈着して「ア」症をおこしていると、考えられる。これらの事実から、BJP上の糖鎖構造の違いによって組織沈着の差異があることが示唆された。今後は、沈着臓器からBJPを抽出して、この示唆を実証する必要がある。提供されたBJPのサブタイプはκ型7症例,λ型4症例であったが,その全症例において5種類の糖鎖が存在することが明らかになった。この糖鎖の内訳は,2本鎖が3種類,3本鎖が2種類であった。3種の2本鎖はすべてλ型BJPにのみ存在すると報告されてきたが,κ型にも同様に存在することを,本研究代表者は明らかにしたことになる。3本鎖はBJPには存在しないと言われていたが,κ型λ型両方に存在することを初めて明らかにした。これら糖鎖の臨床血液学的意義について検討したところ,trigalactosylated and afucosylated triantennary(fucose結合のない3本鎖糖鎖)のみが臨床血液学的意義のあることが明らかになった。即ち,この3本鎖は,骨髄腫患者の血清クレアチニンと負の相関を示す(P=0.015,R=0.7078)ことが明らかになった。一般に血清クレアチニンとBUNは,腎障害の程度を示すパラメータとして知られ,且つ,同者は正の相関を示すことも周知のことである。本研究11症例のBUNと血清クレアチニンも正の相関(P=0.006,R=0.8068)を示し,これらと略々同等の係数で相関することは,腎障害(骨髄腫における)の予後を計る有力なパラメータであることを示している。更に,骨髄腫におけるcast nephropathyがBJPの沈着によるものであることから,この3本鎖糖鎖をもつBJPが尿中排泄され難いことを示唆している。このことは,本研究の目的であるAL-am-yloidosisにおけるBJP糖鎖の役割が,重要であることを証明している。更に,症例数を増やして研究を継続中である。

両疾患に共通する尿中BJPの分子特性を、従来とは異なった視点、即ち最近の分子生物学がもたらした重要な課題・糖鎖構造の観点から検索することが必要になる。BJP上の糖鎖には、2種類の3本鎖と、3種類の2本鎖を認めた。この3本鎖は新たに発見されたものである。形質細胞腫20症例で、病勢・病態とBJP上の糖鎖構造を比較検討すると、3本鎖は、形質細胞腫の腎機能障害、即ち血清クレアチニンと逆相関して、疾患の予後判定に有効な指標となることが判明した。BJPにおける3種類の2本鎖糖鎖は、複数の研究機関から既に発表されているが、その分子病理学的意義については、不詳のまま放置されていた。その原因は、これらの研究が散発的に解析されたに過ぎないからである、と考えられる。系統的且つ思惟的に行われた今回の研究の結果、2本鎖糖鎖の一つ、即ちfucocylated biantenarry oligosaccharides、が「ア症」の尿中BJPにおいて有意に低値を示した。即ち、この糖鎖が組織沈着して「ア」症をおこしていると、考えられる。これらの事実から、BJP上の糖鎖構造の違いによって組織沈着の差異があることが示唆された。今後は、沈着臓器からBJPを抽出して、この示唆を実証する必要がある。
新腫瘍マーカーグルタチオンS-転移酵素P型の基礎的,臨床的研究

ラット肝化学発癌過程での前癌病変(HN)の良いマーカーとして同定されたグルタチオンS-転移酵素P型(GST-P)およびこれと免疫学的関連性のあるヒト胎盤型GST-πの腫瘍マーカーとしての特異性を検討して以下のような成果を得た。1.ラット腫瘍マーカーとしてのGST-P:抗GST-P兎抗体を用いた免疫学的定量法や免疫組織化学的方法により、多くのラット肝化学発癌剤によって誘発されるHNは、GST-P陽性巣として極めて早期(投与数週間後)から検出可能で感度、特異性において従来知られているHNのマーカー酵素(例γ-GTP)より優れ、肝発癌過程の細胞レベルの解析に、またラット肝HNの誘発を指標とした発癌剤、発癌修飾因子の検索に役立ち、われわれの抗体は国内外の研究グループにより活用されつつある。GST-PはHN細胞の細胞質のみならず核質にも存在することが免疫組織化学的,免疫電顕的に示唆され、その機能の面から究明中である。肝以外の臓器では、ハムスター膵(前)癌のマーカーになることが判明しているが、ラットの自然または化学発癌による大腸癌には発現せず、ヒトの場合(後述)と異なり、発現する臓器に種差があることが注目される。2.ヒト腫瘍マーカーとしてのGST-π:ヒトGST-πは蛋白化学的にはラットGST-Pと異なるが、免疫学的共通抗原性を有し、特にN末端のホモロジーが高い。抗GST-π兎抗体を用いた免疫学的方法により、ヒト消化器(食道,胃,大腸,膵)の前癌および分化型癌、特に大腸の(前)癌組織に、また子宮頚部の異型上皮や癌組織に強く発現していることが判明した。肝では肝癌にはほとんど発現せず肝硬変に発現し、ヒトでも前癌ないし、癌関連病変に強く発現する傾向が認められる。3.最近、GST-P,GST-π共通エピトープを認識するモノクローナル抗体が開発され、その特異性,血清中の抗原の測定などの応用が検討中である。GST-π抗体も国内の研究グループにより活用されつつある。
新規糖代謝調節転写因子(ChREBP)の膵島細胞における細胞生物学的意義

糖尿病は、糖代謝を調節する種々の分子の異常によりインスリン分泌不全を引き起こし、発症に至ると考えられているが、その詳細ついては未だ解明されていない。近年、我々はラットの肝臓より新たな糖代謝調節に関与する転写因子carbohydrate responsive element binding protein (ChREBP)を同定した。その転写因子は解糖系主要酵素の一つであるliver-type pyruvate kinase遺伝子の転写活性を上昇させる特徴を持つ。本研究の目的は、ChREBPの細胞生物学的意義を解明することである。我々は、ChREBPの遺伝子導入により、インスリン分泌能を有するINS-1細胞のインスリン分泌能が変化する事を証明した。また、臨床的側面からのアプローチとして、2型糖尿病患者膵組織よりChREBPの遺伝子変異を検討した。ChREBPの調節に重要な役割を果たすとされているリン酸化部位を中心に遺伝子解析を行ったが、明らかなChREBPの遺伝子変異は認められなかった。ChREBPは肝臓において最も強く発現している。そこで、我々は膵島細胞と同様にChREBPを高発現している肝癌細胞株を用いて膵島のインスリン分泌を調節しているインスリン抵抗性について検討を行った。その結果、細胞膜表面に位置するインスリン受容体に変化は見られなかったものの、細胞内インスリンシグナルの中心分子である、insulin receptor substrate-1/2の発現の低下がインスリン抵抗性発現さらには膵島細胞からのインスリンの過剰分泌に関与することを明らかにした。本研究により、ChREBPはinsulin receptor substrate 1/2と同様にINS-1細胞のインスリン分泌およびHePG2細胞のインスリン抵抗性を調節する分子であり、糖尿病発症への関与が示唆された。インスリン分泌能をもつINS-1細胞にChREBP遺伝子導入を行い、インスリン遺伝子転写活性の変化をluciferase reporter assayで検討した。これまでに報告されていたインスリンプロモータ領域をレポーター遺伝子に組み込みluciferase活性の変化を検討したが、ChREBP遺伝子導入によって有意なluciferase活性の変化は認められなかった。しかし、新たに報告されたインスリンプロモータ領域"InsZ"をクローニングし、同様にluciferase活性の変化を検討したところChREBP遺伝子導入によって有意なluciferase活性の変化が認められた。また培養上清中のインスリン濃度もChREBP遺伝子導入群は非導入群に比べ有意に高かった。これらの実験データよりChREBPのインスリン分泌への関与が示唆された。INS-1細胞でのChREBPの存在を検討するためINS-1細胞のtotal RNAに対しreverse transciption-PCRを行った。ChREBPに特異的なプライマーにて目的遺伝子が増幅され、INS-1細胞におけるChREBPの存在が示唆された。次にINS-1細胞におけるChREBPの役割を検討するためChREBPに対するsiRNAをINS-1細胞にトランスフェクションすることによりChREBPをノックダウンし、ChREBPのインスリン遺伝子転写活性およびインスリン分泌における役割を検討を行った。しかし、これまでに作製したsiRNAではChREBPの転写活性を有意に抑制することはなかった。前年度迄に我々は、新規糖代謝調節転写因子(ChREBP)の遺伝子導入により、インスリン分泌能を有するINS-1細胞のインスリン分泌能が変化する事を証明した。本年度は、ChREBPの細胞内局在変化をgreen fluorescent protein融合ChREBPをINS-1細胞に遺伝子導入し共焦点レーザー顕微鏡にて検討した。ChREBPは低濃度グルコース培養下では細胞質に分布していた。一方、高濃度グルコース培養下ではChREBPは核内に観察された。ChREBPのN末端にはNuclear localization signal(NLS)サイトが存在する。NLSサイトに相当する遺伝子を欠くミュータントChREBPでは、グルコース濃度変化による細胞内局在変化は認められなかった。これらのことから、我々は、ChREBPがグルコース濃度変化によりその細胞内局在を変化させること、またその局在変化にはNLSサイトが重要であることを証明した。

次に、ChREBP過剰発現による細胞内小器官の形態的変化について電子顕微鏡を用いて検討した。ChREBP遺伝子導入群と非導入群の間には核・ミトコンドリア・小胞体に形態的変化を認めなかった。しかし、ChREBP遺伝子導入により、細胞内インスリン小胞数が増加しており、ChREBPのインスリン遺伝子転写活性への関与が示唆された。一方、臨床的側面からのアプローチとして、2型糖尿病患者膵組織よりChREBPの遺伝子変異を検討中である。現在までに明らかな遺伝子変異は同定できていない。しかしながら、症例数は十分でなく、継続して検討を行っている。また、我々は膵島細胞と同様にChREBPを高発現しているHepG2細胞を用いてインスリン抵抗性の検討を行い、insulin receptor substrate-1/2の発現の低下がインスリン抵抗性発現に関与することを明らかにした。前年度迄に我々は、新規糖代謝調節転写因子(ChREBP)の遺伝子導入により、インスリン分泌能を有する膵島細胞株(INS-1細胞)のインスリン分泌能が変化する事を示した。本年度、我々は臨床的側面からのアプローチとして、2型糖尿病患者におけるChREBP遺伝子変異の検討を行った。ChREBPの調節に重要な役割を果たすとされているリン酸化部位を中心に遺伝子解析を行ったが、明らかなChREBPの遺伝子変異は認められなかった。また、ChREBPに対する特異抗体を用い、膵島細胞における蛋白レベルでのChREBP発現の変化を免疫染色およびウエスタンブロッティングによる手法で検討した。ChREBPの発現量は両手法の検出感度以下であり、2型糖尿病患者におけるChREBP発現の変化を検討するにはさらに発現量の多い組織での検討が必要であった。ChREBPは様々な臓器において発現しているが、肝臓が最も強く発現している臓器である。また、肝細胞における糖質代謝関連酵素は膵島細胞のそれと類似しているだけでなく、肝臓は膵島細胞のターゲット臓器であるとともにインスリン抵抗性発現に深く関わる臓器である。そこで、我々は膵島細胞と同様にChREBPを高発現している肝癌細胞株を用いて膵島のインスリン分泌を調節しているインスリン抵抗性について検討を行った。
ホワイトニングの歯周組織に与える影響について

平成15年度の結果ではホワイトニングにより歯周病関連菌数は有意に減少する傾向が認められたが、う蝕原因菌については有意な変化は認められなかった。本年度はさらにサンプル数を増加させ傾向を詳細に検討し、次のような結果を得た。ホームホワイトニング剤の主成分である10%過酸化尿素はフリーラジカルが細胞膜や核を破壊することによりクロールヘキシジン(Chlorhexidine, CHX)やポピオンヨード(Povidon Iodine, PVP-I)と同様に浮遊細菌を減少させる効果が確認された。しかしながら10%過酸化尿素は2.5-5.0%ポピオンヨードのようにバイオフィルムを形成した細菌を減少させる効果はあまり認められなかった。これらの結果から、バイオフィルムを破壊できるPMTC(専門家による機械的歯面清掃)は、ホワイトニングと併用するとう蝕や歯周病の予防に効果的であることが明らかとなった。愛知学院大学歯学部附属病院倫理委員会の規定に基づき(許可番号第14号)本研究の研究目的、内容、個人情報の保護について事前にインフォームド・コンセントを行い、同意の得られた患者7名の協力を得てホワイトニング前、ホワイトニング(オフィスホワイトニングとホームホワイトニングの併用)2週間後の歯肉溝内浸出液と唾液のサンプリングを行った。この結果、ホワイトニングにより歯周病関連菌数は有意に減少する傾向が認められたが、う蝕原因菌については有意な変化は認められなかった。本年度はそれらの結果の一部を日本保存学会、米国歯科保存学会等で発表した。来年度はさらにサンプル数を増加させ傾向を詳細に検討し、論文発表する予定である。また研究機関終了後も継続して、ホワイトニングにより歯周病関連菌数がどれくらいの期間減少しているのかについても検討していく予定である。
子宮頸癌・膵臓癌患者への放射線治療と抗癌剤低用量併用の基礎的検討とその応用

がん治療における放射線療法では、腫瘍縮小効果を期待して抗癌剤との併用療法が行なわれている。当施設に置いても子宮頸癌および手術不能な膵臓癌に対して局所制御や根治的治療を目的として化学放射線治療が実施されている。子宮頸癌ではシスプラチン(CDDP)が頻用され、膵癌では、ゲムシタビン(GEM)の静脈内投与やカペシタビン(CAPE)の内服が放射線治療と併用されている。放射線照射と抗癌剤の同時併用で明らかな治療効果が得られるが、治療を継続するために障害となるのが嘔吐や悪心などの副作用の発現である。制吐剤が投与されても症状の改善が認められない患者にとっては、治療の継続が困難である。そこで当施設では、投与総量と抗腫瘍効果が相関し、血中濃度に依存して副作用が発現するCDDPに注目した。すなわち放射線照射との併用による治療効果を維持し、副作用を軽減するCDDPの低用量(8mg/m2)の連日投与を実施した。この方法では、積算CDDP量が十分量投与可能であること、副作用が軽減され治療成績が週1回のCDDP投与(40mg/m2 )と比較して同等である。これらの症例は臨床治療成績として当施設より報告されている。本研究では、腫瘍細胞レベルにおける低濃度CDDPと照射線量の効果関係について、(1)短期間の効果として腫瘍細胞のDNA合成阻害に対する検討、(2)腫瘍細胞に対する比較的長期間の観察が必要なコロニー形成法による腫瘍細胞の生存率に対する検討、これらin vitroの実験結果より(3)マウスに移植した腫瘍細胞の放射線照射と抗癌剤併用による抗腫瘍効果の検討(in vivo)を実施し、臨床に寄与でき得る基礎的な知見を取得することを目的とする。平成30年度はHeLa-S3細胞のマウス移植時の細胞数の検討とエックス線単独照射における腫瘍縮小効果を確認し、シスプラチン(CDDP)併用による腫瘍増殖抑制効果実験の基礎とする目的で実験を実施した。移植実験には、4週齢雄マウス(BALB/c Slc, nu/nu )を用い、移植腫瘍細胞は当研究室にて継代培養しているHeLa-S3細胞(11から13代継代培養)をMEM液体培地(15%FBSおよび抗生物質を含む)にて培養した。腫瘍の移植はHeLa-S3細胞を継代培養し、培養3日目の細胞をマウスの右大腿部皮下に移植した。また、移植腫瘍の照射は、エックス線照射装置(MBR-1520R-3、(株)日立メデイコ)を使用して管電圧150kV、管電流20mAおよび線量率6.53Gy/分の条件でマウスの皮下腫瘍を照射した。照射時にはマウスを麻酔下にて腫瘍局所(照射野/約6x6mm)に実施した。HeLa-S3腫瘍細胞をマウスの右大腿部皮下に移植した。移植細胞数は0.1ml当たり165から200万細胞が適量であり、移植12日後には移植マウスの全てに腫瘍の発育が認められ、腫瘍体積が220から230mm3と成長してエックス線照射を開始した。照射総線量は18Gy、20Gy、40Gyおよび60Gyであり、2回から6回の分割照射を実施した。腫瘍体積は40Gyおよび60Gy(10Gy x 6分割照射)で初期体積の13から30%(照射20日後)にまで縮小が認められた。一方、18Gy(6Gy x 3回)と20Gy(10Gy x 2回)では、それぞれ照射前体積の1.92倍および3.48倍であった。これらの結果より、CDDPを併用する照射線量は、照射からの回復がみられる18Gyから30Gy(6Gy/回の分割照射)が適当と考えられた。平成31年度は、本研究の最終年度であり、マウスに移植した腫瘍細胞に対する放射線照射と抗癌剤の併用による傷害の程度を検討する。この併用効果が発現する作用機序および照射による細胞傷害に抗癌剤が相乗(相加)的な作用を示すか、抗癌剤による細胞への影響を照射が修飾するか否かを明らかにすることを目的とする。今年度は、マウスに移植した腫瘍に対するエックス線照射単独の腫瘍縮小効果を検討した。その結果、腫瘍体積が230mm3前後に成長した腫瘍に対して総線量40Gyおよび60Gyのエックス線局所照射で明らかな腫瘍の縮小が認められた。次年度は、照射2週間後に再増殖が認められた18Gyから20Gyの総線量と分割照射回数を検討し、抗癌剤併用の腫瘍縮小効果について投与量および回数も検討する計画である。また、実験終了時に腫瘍の組織標本を作製し、病理組織学的検討を行う。特に腫瘍辺縁の細胞に対する放射線照射の傷害程度は、抗癌剤併用効果の発現を予測する指標と思われる。

制吐剤が投与されても症状の改善が認められない患者にとっては、治療の継続が困難である。そこで当施設では、投与総量と抗腫瘍効果が相関し、血中濃度に依存して副作用が発現するCDDPに注目した。すなわち放射線照射との併用による治療効果を維持し、副作用を軽減するCDDPの低用量(8mg/m2)の連日投与を実施した。この方法では、積算CDDP量が十分量投与可能であること、副作用が軽減され治療成績が週1回のCDDP投与(40mg/m2 )と比較して同等である。これらの症例は臨床治療成績として当施設より報告されている。本研究では、腫瘍細胞レベルにおける低濃度CDDPと照射線量の効果関係について、(1)短期間の効果として腫瘍細胞のDNA合成阻害に対する検討、(2)腫瘍細胞に対する比較的長期間の観察が必要なコロニー形成法による腫瘍細胞の生存率に対する検討、これらin vitroの実験結果より(3)マウスに移植した腫瘍細胞の放射線照射と抗癌剤併用による抗腫瘍効果の検討(in vivo)を実施し、臨床に寄与でき得る基礎的な知見を取得することを目的とする。平成29年度(初年度)では、先ず子宮頸癌の腫瘍細胞としてHeLa細胞を用いて抗癌剤シスプラチン(CDDP)に関する基礎的検討を実施した。CDDP濃度は、体表面積1.5m2を基本とし、8mg/m2 (12mg/body)からCDDP血漿最高濃度を6.7μg/mlと設定した。エックス線照射や抗癌剤投与が、それぞれ単独にて腫瘍細胞に傷害を与える線量および薬剤濃度について腫瘍細胞のDNA合成阻害(3H-TdRの取り込み)を指標として検討した。HeLa細胞に対するエックス線単独照射(0-6Gy)では、6Gy照射72時間後に3H-TdRの取り込みが非照射細胞の約半数に減少した。また、CDDP単独では2.5μg/mlの濃度で非処置細胞の約半数の取り込みであった。腫瘍細胞に対する照射と抗癌剤の併用効果を腫瘍細胞のコロニー形成能を指標として検討した。この方法は放射線生物学実験で使用されているが、細胞が約3週間を費やして増殖する能力は、照射による損傷を修復した結果であると考えられている。エックス線単独照射(2、4、6、8および10Gy)細胞に対する照射とCDDP(2.5および5.0μg/ml)併用の生存曲線からCDDP濃度と処置時間(HeLa細胞に対する接触時間)を検討した。CDDP2.5μg/ml濃度では6時間以上の接触時間が必要であり、5.0μg/mlでは接触2時間で十分な腫瘍細胞の生存率抑制効果が認められた。がん治療における放射線療法では、腫瘍縮小効果を期待して抗癌剤との併用療法が行なわれている。当施設に置いても子宮頸癌および手術不能な膵臓癌に対して局所制御や根治的治療を目的として化学放射線治療が実施されている。子宮頸癌ではシスプラチン(CDDP)が頻用され、膵癌では、ゲムシタビン(GEM)の静脈内投与やカペシタビン(CAPE)の内服が放射線治療と併用されている。放射線照射と抗癌剤の同時併用で明らかな治療効果が得られるが、治療を継続するために障害となるのが嘔吐や悪心などの副作用の発現である。
グリオーマ幹細胞のニッチ特性の解明とそれを標的とした治療戦略の考案

2年以下の生存しか望めない膠芽腫において、その幹細胞(Glioma stem cells:GSC)を標的とした新しい治療戦略が期待されている。GSCの自己複製、未分化能を担保するニッチの阻害はGSCの根絶に繋がると考えられているが、ニッチの特性はまだ十分に解明されていない。これまでの研究で、同一腫瘍内のGSCには酸素への依存性が異なる分画が存在することを見出し、そのことからニッチにも異なる性質のものが存在する可能性があると考えた。本研究では、GSCとニッチのライブイメージングを行い、ニッチが形成される条件、ニッチの種類、性質及び構成成分を明らかにすることを目標とした。さらに、GSCとニッチの相互作用を分子レベルで解析し、GSCの自己複製を阻害しうるニッチ関連因子の同定を目指した。最終年度であった本年度では血管性ニッチに関して主に制御候補因子の機能解析を行い、低酸素ニッチについてはその分子基盤の解析を遂行した。血管性ニッチについては前年度同定した制御因子の候補とヒト膠芽腫の各種遺伝子の局在別発現様式において血管近傍に発現が高い因子に注目し、共通している因子を絞り込んだ。阻害剤が開発されている分子については薬理学的な機能阻害を行い、阻害剤が開発されていない因子についてはCRISPR/CAS9を用いたゲノム編集実験を施行した。その結果、その機能阻害によって腫瘍内の異常血管と共にGSCも有意に減少する因子(代謝関連酵素A)の同定に成功した。低酸素ニッチの解析では5%以下の酸素濃度下で蛍光を放つインジケーターを用いて、in vitro及び脳切片における低酸素領域のリアル・タイム検出に成功した。さらに、低酸素に曝露されたGSCの遺伝子発現解析を行い、1%の酸素で生存するGSCの制御因子の候補を絞り込んだ。浮かび上がった因子については機能解析を予定している。本研究では、GSCとニッチのライブイメージングを行い、ニッチが形成される条件、ニッチの種類、性質及び構成成分を明らかにすることを目標とする。さらに、GSCとニッチの相互作用を分子レベルで解析し、GSCの自己複製を阻害しうるニッチ関連因子の同定を目指している。膠芽腫(Glioblastoma,以降GBM)において血管性ニッチ、低酸素ニッチの存在が報告されている。当該年度においては血管性ニッチの可視化及び特性解析を実施した。腫瘍形成過程の全期間における血管性ニッチの成立時期、局在、構成成分を明らかにするため、マウスの自然発生GBMモデルを用いて、腫瘍形成過程の複数の段階(早期、中期、後期)から培養脳切片を作成し、リアル・タイムで血管を可視化し、腫瘍細胞の血管に対する親和性を評価した。その結果、腫瘍形成早期では血管に向かう腫瘍細胞及び血管に沿って遊走する腫瘍細胞がみられるものの、繊維に沿って遊走している細胞が多いことがわかった。一方、腫瘍塊が存在する時期では、血管に沿って浸潤する細胞が多く確認された。それぞれの切片より腫瘍細胞を単離し、培養維持を行い、現在、各々の分画に含まれる幹細胞の割合を測定している。また、二つの分画の特性解析も開始している。自然発生GBMモデルを用いて、移植モデルでは不可能であった、正常細胞が悪性化する過程の観察、挙動解析を行うことに成功した。以前の研究では腫瘍幹細胞をマウスの脳に移植する場合は移植直後より血管への親和性が高く、血管性ニッチが成立することが分かったが、今回は悪性化途中の細胞では血管への親和性がまだ低いことを示唆する所見が得られた。今後は腫瘍形成過程の初期をさらに詳細することにより、血管性ニッチ成立の具体的な時期が同定できると考えられ、おおむね順調に進展している。前年度につづき、マウスの自然発生GBMモデルを用いてGSCと血管性ニッチとの相互作用について解析を行った。培養脳切片における血管に沿った浸潤の可視化に関する成果を論文にまとめ、報告した。また、自然発生したGBMより樹立した複数の脳腫瘍幹細胞分画についてミトコンドリア予備能、酸素消費を測定し、酸素利用が高いGSCと低いGSC集団を複数同定した。それぞれの集団について遺伝子発現解析を行い、その比較より酸素利用型のGSCにおいて発現が高いミトコンドリア代謝関連因子、マットリックス接着因子、血管内皮細胞制御関連因子の候補を絞り込んだ。