hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性虚血によって引き起こされる膀胱機能低下に対するcAMPの保護メカニズムの解明

ラット慢性虚血モデル(Arterial Endothelial Injury; AI)の手術による過活動病態モデルラットにおいて、フォルスコリン投与の効果を検討した。AI群に比べフォルスコリン投与群では、最大膀胱収縮力に差が無く、排尿閾値圧は増悪していたが、膀胱基線圧、排尿回数、排尿時膀胱内圧などは改善傾向にあったが有意差は認められなかった。以上より本研究では慢性的な虚血による傷害を受けて機能が増悪している膀胱に対して、フォルスコリン投与により有意に改善する作用はないと考えている。よって過活動膀胱の新たな治療ターゲットにはならないと考えている。我々は、膀胱の上流血管である両側腸骨動脈の内膜を2Fr Fogartyカテーテルで擦過傷害し、8週間の高コレステロール食で飼育したラット慢性虚血モデルを作製し、コントロール群、疾患群、薬剤を長期投与した薬剤群の3群で比較する研究モデルを考案し、排尿機能に関して比較検討を行った。今回はcAMPを強力に上昇させる薬剤であるフォルスコリンについて研究を行った。腸骨動脈内皮傷害(Arterial Endothelial Injury; AI)の手術による過活動病態モデルラットにおいて、0.1%フォルスコリン投与の効果は、AI群に比べフォルスコリン投与群では膀胱内圧測定(無麻酔非拘束下)実験において、最大膀胱収縮力に差が無く、排尿閾値圧は増悪していた。またフォルスコリン投与群は、膀胱基線圧、排尿回数、排尿時膀胱内圧などは改善傾向にあったが有意差は認められなかった。設定していた投与量では有意な差が出ず、投与量や投与経路などの検討に時間が取られたためと考えている。我々は慢性虚血ラットの頻尿がβ3受容体刺激薬によって予防されることをすでに報告しているが、その中で特にcAMPを中心としたメカニズムを解明することですでにダメージを受けた膀胱機能でも効果的に改善する作用があるかどうかをラット慢性虚血動物モデルにて機能および分子生物学的な側面から検討し、低活動膀胱への治療となるかどうかを確かめるために研究を行った。膀胱の上流血管である両側腸骨動脈の内膜を2Fr Fogartyカテーテルで擦過傷害し、8週間の高コレステロール食で飼育したラット慢性虚血モデル(Arterial Endothelial Injury; AI)の手術による過活動病態モデルラットにおいて、0.1%フォルスコリン投与の効果を検討した。よって過活動膀胱の新たな治療ターゲットにはならない。フォルスコリン投与量を増加(フォルスコリンの高い含有量のものを使用)し、同様な慢性虚血膀胱モデルにおいて膀胱血流測定と排尿動態およびオーガンバススタディなどの研究をすすめる。有意差をもって改善を確認できた条件下にて各種酸化ストレスマーカーや炎症マーカーの測定を行う。医学
ヒト化マウスを用いたVitaminD3、HSV-2のHIV感染への関与の検討

ヒトヘルペスウイルス2型(HSV-2)はHIV感染リスクを高めることが知られている。性行為HIV感染における初期ターゲット細胞であるランゲルハンス細胞(LC)のHIV感染性に対するHSV-2の影響を検討した。HSV-2は上皮細胞からのβディフェンシンやLL-37の産生を誘導したが、これら抗菌ペプチドの中でLCのHIV感染性に影響を与えるのはLL-37のみであった。実際にsiRNAを用いてLL-37をノックダウンした表皮細胞にHSV-2を曝露した培養上清はLCのHIV感染増強効果を失うことが確認された。これらの実験結果より、HSV-2は上皮細胞からのLL-37産生を誘導することによってHIV感染リスクを高めることが示唆された。(目的)前年度の研究結果からHSVは表皮細胞にCathelicidin(LL37)を誘導することによってHIVの生体内侵入を促進している可能性が示唆された。そこでこれらの知見をヒト皮膚を用いた実験系で確認し、またsiRNAを用いてLL37をノックダウンした表皮細胞を作製し、この表皮細胞にHSVを感染させてもランゲルハンス細胞のHIV感染に影響を与えないことを検証した。(方法)1.HSV-2をヒト皮膚水疱蓋より作成した表皮シートに2時間暴露後、HIV BaL(R5-HIV)あるいはHIV AD8, HIV JRFLに2時間感染させ、7日後、HIV感染mLC数を定量する。2.さらに、siRNAを用いてLL37をノックダウンした表皮細胞を作製し、正常表皮細胞とともにHSV-2に24時間曝露し、その培養上清の存在下でのランゲルハンス細胞のHIV感染への影響をHIV p24抗体染色およびフローサイトメトリーを用いて検討した。(結果)1.HSVをHIV曝露前の表皮水疱蓋に処理すると、表皮内ランゲルハンス細胞の有意な感染増強がHIV BaL, HIV AD8, HIV JRFLのいずれのR5 HIVにおいても観察された。2.LL37をノックダウンした表皮細胞のHSV感染後の培養上清によるランゲルハンス細胞のHIV感染増強効果は正常表皮細胞に比べて有意に低いことが証明された。3.さらにこのHIV感染増強効果はランゲルハンス細胞表面のHIVレセプターCD4/CCR5発現量をupregulateさせることによることもわかった。(意義)これら13の結果より、HSVは表皮細胞にLL37を誘導し、さらにLL37はランゲルハンス細胞表面のHIVレセプター発現を上昇させてHIVに対する易感染性を増加させることで、HIVの生体内侵入を促進している可能性が示唆された。(目的)微生物が上皮細胞からの抗菌ペプチド産生を介してLCのHIV感染に影響を与えるかを検討する。(方法)1.HSV-2をを正常ヒト表皮角化細胞(NHEK)に12時間暴露後、抗菌ペプチド(Cathelicidin、αDefensin5-6、βDefensin1-4)に対するreal-time PCRを行う。2.次に、monocyte- derived LC (mLC)を樹立した後、Cathelicidin, αDefensin5-6, βDefensin1-4をmLCに24時間暴露した後、HIV BaL(R5-HIV)に2時間感染させ、7日後、HIV感染mLC数を定量する。3.さらに、手術で余剰となった皮膚を患者の同意のもと提供して頂き、皮水疱蓋をプレート上に並べ、真皮側に少量のvolumeに調整した抗菌ペプチド液を4時間暴露する。表皮水疱蓋をPBSで洗浄後、HIVを2時間暴露する。洗浄後、表皮水疱蓋をmedium上に浮かべ3日間培養する。表皮水疱蓋からwellの底へ遊走するLCのHIV感染率をFACSで定量する。(結果)1.HSVの曝露によりNHEKにCathelicidin、βDefensin1-3の発現増強が認められたが他の抗菌ペプチドの発現上昇は認められなかった。HIVをNHEKに曝露してもすべての抗菌ペプチドの発現に影響を与えなかった。2.HIV曝露前に処理した抗菌ペプチドの中で、Cathelicidin (LL37)のみがmLCのHIV感染を有意に増加させた。3.Cathelicidin (LL37)をHIV曝露前の表皮水疱蓋に処理すると、表皮内LCの有意な感染増強が観察された。(意義)これら13の結果より、HSVは表皮細胞にCathelicidin (LL37)を誘導することによってHIVの生体内侵入を促進している可能性が示唆された。HSVの曝露によりNHEKにCathelicidinの発現増強が認められることや、Cathelicidin (LL37)がヒト表皮内LCのHIV感染を増加させることは、世界でも未だ報告がなく、全く新しい知見と考えられた。

今後、これまで得られた知見をさらに科学的に証明するため、NHEKのLL37遺伝子発現をsiRNAを用いて低下させ、その際のHSV曝露後のNHEK培養液がLCのHIV感染にどのように影響するかを検討する。また、臍帯血から比重分離により単核球を回収後、CD34 Progenitor Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec)を用いてCD34陽性血液幹細胞を調整する。8-12週令NOJマウスに移植する。ヒト化NOJマウス膣粘膜に化学的に粘膜欠損を作成し、1か月後その創傷治癒後の組織を免疫染色し膣上皮・粘膜下層にヒトLC/DCが存在するか検討する予定である。また、ヒト表皮をヒト化NOJマウスに移植することで経皮膚HIV感染モデルを作成する。今年度の研究に必要な物品費はすべて消耗品類(HIV,モノクローナル抗体,細胞培養液,培養器具,ELISA Kit,その他試薬)等の購入に使用する予定である。繰越金は上記の如く今後の「ヒト化NOJマウスの経皮膚HIV感染モデル」の検討のための消耗品等として使用する予定である。
3次元特異複素射影超曲面の位相的,解析的研究

(1)4次元複素射影空間内の、通常特異点(通常n重点、2≦n≦4、通常尖点、停留点)のみを持つ特異超曲面Yの(非特異)正規化Xのチャーン数c_1(X)^3、c_1(X)c_2(X)、c_3(X)を、YおよびYの特異点集合の数値的特性数を用いて表わす公式を導いた。さらに、応用として、X上の正則ベクトル場の層を係数とするオイラー・ポアンカレー指標を与える数値的公式を与えた。(2)4次元複素射影空間内の、(n,r_1,r_2,r_3,r_4)型と呼ばれる特異超曲面で、特異点として、通常n重点(2≦n≦4)、通常尖点、通常3重点の退化型特異点のみを持ち、その正規化が特異点として、変形によって剛直であるような、重複度4の孤立有理特異点のみを持つものを構成した。(3)P.A.Griffithsによる、複素射影空間上の非特異超曲面に極を持つ有理微分形式の積分に関する結果を一般化し、n+1次元非特異射影代数多様体Xと、その十分アンプルな非特異超曲面切断Yの組に対して次のことを示した。本年度の主たる研究成果は次の通りである。(1)X⊂P^4(C)を4次元複素射影空間内の通常3重点、通常4重点、および停留点以外の通常特異点(通常2重点、尖点)を持った超曲面、D : Xの2重曲面(特異点集合)、C : Xの尖点の集合、n=degX、m=dogD、γ=degC(それぞれX, D, Cの次数)としたとき、Xの非特異正規化モデルYのオイラー数χ(Y)は、次で与えられる:χ(Y)=n(n^3-n^2-4n+8)-(4n^2-3n-8)m-6(n-1)γ+2D・D+2π(C)-2ただし、π(C)は、Cの仮想種数を表わす。X⊂P^4(C)を4次元複素射影空間内の通常特異点(通常2重点、通常3重点、通常4重点、通常尖点、停留点)を持った超曲面、D:Xの2重曲面(特異点集合)、T:Xの3重点曲線、C:Xの尖点曲線、Σs:Xの停留点の集合、Σq:Xの4重点の集合、n=deg X、m=deg D、t=deg T、γ=deg C(それぞれX、D、T、Cの次数)としたとき、Xの非特異正規化Yのチャーン数∫_<_γC1^3>、∫_<YC3>は、次で与えられることを示した。ここで、k_cはCの標準類、#は個数を表す。更にリーマンロッホの定理より、χ(Y,K_γ)=-1/24∫_<YC1C2>であるから、χ(Y,K_γ)を計算することにより、チャーン数∫_<YC1C2>は、次で与えられることがわかる。ここで、O_DはDの構造層を表す。以上の結果の一つの応用として、リーマンロッホの定理より、Yの正則ベクトル場の層を係数とするオイラーポアンカレ特性数を与える次の公式が得られる。
復原的手法による高島炭鉱ＲＣ高層住宅の生活像把握

1高島炭坑の炭砿住宅関連図面620枚を収集し、約40棟の図面を確認し、うち4棟の建築物の残存を確認、また9棟の模型を制作した。29棟のうち3棟の居住経験者の存在確認しヒアリング調査を行った。3居住状況のうち寝室の変化は少なく、台所の電化、死別や別居室は納戸となる。旧来からの炭砿の浴場が炭砿のコミュニティとなり漁業や農業者とのコミュニティの場として機能し旧来の生活を維持することが出来た。1旧高島炭砿の長崎市高島の炭砿住宅、職員社宅の建築図面620枚を収集した。収集図面と現存施設の存在確認を行い、現在も4棟の旧炭砿住宅が存在していることが確認できたが、他は全て存在しないことが確認された。2収集した図面のうち、現存はしていないが当時の写真と一部の図面から大正中期には既に存在していた建物は明らかになった。このほか図面から9棟の建築の復原が可能でその概略模型を作製することが出来た。3前項で作成出来た9棟炭砿住宅模型のうち3棟の元居住者を確認し、居住時期、家族構成、生活状況についてのヒアリングを行った。この3棟は、1つが中廊下型7階建て2DKで公団51-Cに近いが浴室を持たない、他2棟は片廊下型6階建てで当時は6階に居住していたが、高齢単身のため現在は2階に移転している。居住3棟ともに居住時期は閉山前10年程度で現在も高島町内の居住者であり、家族構成は変化したが、寝室などの私室の位置は変わらず子供部屋等に使用した部屋が物入れへの変化で寝室の移動や改装はない。4当時の生活から台所の新たな電化製品の増加を除き変がない。旧来の平面型の完成度のままであるといえ、生活スタイルが高齢化にもかかわらず新たな生活への否適応と住戸平面の先進性がこれを許容してきたという傾向を仮説できた。5高島炭砿の中高層住宅に居住した経験者にとって先進的平面と人口減少にともなう2戸借り上げ対応によって人口変動に対応できた。また、閉山と流出による地域の大きな変化は、地域のインフラの必要性を生んだ、なかでも浴室を持たない大半の炭砿住宅居住者にとって浴場施設はコミュニティの場で有り、炭砿以外の居住者との交流の場であった。炭砿住宅の平面型がそのまま残存しながら旧世代と新しい世代、炭砿以外の農・水産業とを結びつける施設要素となったことは生活文化としても興味深い物といえる。建築計画
汚損湿潤面における局部放電の発光スペクトル特性に対する電解質の影響

汚損・湿潤を受けた場合の放電現象の解明と関連して,前駆現象である局部放電について検討を行った。滞留性局部放電と進展性局部放電の発光スペクトルを観測し,電解質に起因するスペクトルならびに窒素分子のスペクトル分布から求めた放電空間の温度から放電形態について議論した。また,電解質を変化させて電解質の影響について検討した。その結果,いずれの場合も電流値が大きい場合にはアーク状の放電形態をとり,電流値が小さい場合にはグロー状の放電形態をとることを明らかにした。ただし,電流値が小さい場合には一時的にアーク状の放電形態をとることがあると推定した。また,放電空間の温度に対する電解質の影響が若干認められた。1.滞留性局部放電の放電部分の温度を求めるために,滞留性局部放電からの窒素分子の発光スペクトル(N2 2nd Positive Band)の観測を行った。得られたスペクトル分布と気体温度を仮定したスペクトル分布の理論的分布とを比較し,気体温度の算定を行った。対向させたガラス繊維ろ紙を電解質水溶液と湿らせて電極とし,その間に滞留性局部放電を発生させた。使用した電解質は塩化カリウム,塩化ナトリウム,塩酸である。また,放電電流を変化させるために電極系と直列に抵抗を挿入し,その値を変化させた。数種類の気体温度の算定方法を適用したが,最も誤差が小さくなったフィッティング法を用いた。その結果,次のことを明らかにした。1気体温度は放電電流によって変化し,2000K程度から10000K程度まで変化する。2塩化ナトリウムと塩化カリウムの場合,気体温度が高温の場合はナトリウムあるいはカリウムのスペクトルが観測されるが,気体温度が低くなるに従いそれらのスペクトルは著しく弱くなる。3以上のことより,滞留性局部放電は放電電流の値によっては,アーク的な性質もグロー的な性質も持ち得ることを明らかにした。2.進展性局部放電の温度測定のための装置を作製した。印加電圧波形の確認・調整ならびに沿面破壊電圧等の基礎データを取得した。また,予備実験を実施し,発光スペクトルを確認した。1.滞留性の局部放電のスペクトル分布の観測を行うための装置の組み立てを行った。また,スキャニング機能を有するCCDタイプの分光器を配置し,光学系の調整を行い,スペクトル分布取得を確認した。3種類の電解質(塩化カリウム,塩化ナトリウム,塩酸)を用いて,滞留性局部放電のスペクトル分布の観測った。得られた結果を基に,スペクトルの同定を行った。その結果,塩化カリウムおよび塩化ナトリウムの場合はカリウムおよびナトリウムと思われるのスペクトルが観測されたが,塩酸の場合は電解質に起因すると思われるスペクトルは観測されなかった。また,いずれの水溶液においても,窒素分子の発光スペクトル(N2 2nd Positive Band)が検出された。2.進展性局部放電のスペクトル分布の観測を行うための装置を組み立て,光学系の調整を行った。インパルス電圧を使用して進展性局部放電を発生させるとともに,フラッシオーバ試験を行い,沿面破壊電圧の確認を行った。進展性局部放電の発光は極めて短時間であり,繰り返し局部放電を発生させ,発光スペクトルの取得を確認した。また,発光スペクトルの取得に必要な局部放電の繰り返し回数のおおよその目安を取得した。3種類の電解質(塩化カリウム,塩化ナトリウム,塩酸)を用いて,進展性局部放電のスペクトル分布の観測を行った。印加する電圧は電解質水溶液面でのフラッシオーバ電圧の90%程度とした。その結果,塩化カリウム水溶液および塩化ナトリウムの場合,放電の根元付近でカリウムおよびナトリウムと思われるのスペクトルが観測されたが,放電先端付近では観測されなかった。塩酸の場合は電解質に起因すると思われるスペクトルは観測されなかった。電解質水溶液表面を進展する進展性局部放電の発光スペクトルを取得し,発光種の分析を行った。また,窒素分子の発光スペクトル(N2 Second Psitive band)のスペクトル分布について,別途解析的に求めた分布曲線に対して,最小2乗法を用いてフィッティングを行い放電空間の温度の推定を行った。電解質の種類と電解質水溶液の抵抗率を変えて以上の観測を行った。電解質としては塩化ナトリウム,塩化カリウム,塩化マグネシウムを用い,電解質水溶液の抵抗率を変えることによって電流を変化させた。検討の結果次のことを明らかにした。1電解質水溶液の抵抗率が高く(81Ωcm)電流が小さい(10A程度)場合,電解質に起因する発光スペクトルは観測されず,放電空間の温度は25005000Kであると推定された。

これらのことから,電流が小さい場合,進展性局部放電の放電形態はグロー状あるいはストリーマ状であると推定した。2電解質水溶液の抵抗率が低く(20Ωcm)電流が大きい(20A程度)場合,塩化ナトリウム以外の電解質の場合は電解質に起因する発光スペクトルは観測されなかったが,塩化ナトリウムの場合はナトリウムの発光スペクトルが観測された。また,水素の発光スペクトルも観測され,放電空間の温度は8000K以上であると推定された。これらのことから,電流が大きい場合,進展性局部放電の放電形態はアーク状であると推定した。高電圧工学計画にはなかったが,気体温度の推定誤差をできるだけ小さくするために,スペクトル分布から気体温度を算定する数種類の方法を試し,その中から最も誤差の小さい方法を選んだ。そのため,気体温度の推定に時間がかかった。また,滞留性局部放電の放電電流を変化させて気体温度の推定を行った。これも計画には予定していなかった実験項目である。そのため,時間がかかったが,新たな知見を得ることができた。計画していた内容はほぼ終了した。ただし,研究会への発表を考えていたが,発表者の予定が立たず投稿を断念した。この点では,計画を達成できなかった。以上より,おおむね順調に進展していると判断した。平成25年度から平成26年度にかけて予定していた,進展性局部放電の気体温度の推定を行う。できるだけ早く実験を終了し,データのとりまとめを行う予定である。当初の計画通りに研究を進める。なお,平成25年度は下記の4.の途中までを実施する予定である。1.放電空間の温度の推定を行うために,モノクロメータを用いた窒素分子の発光スペクトル(N2 2nd Positive Band)の測定系を組み立てる。放電空間からの発光のみを観測するために,スリットの製作を行う。電極系は前ページの電極系を使用する。また,モノクロメータの出力を高速のオシロスコープで観測するために,光電子増倍管による電気信号への変換および増幅を行う回路を製作する。さらに,モノクロメータの装置関数の取得を行う。2.滞留性局部放電からの窒素分子の発光スペクトルの詳細な観測を実施する。得られた結果を基に滞留性局部放電の温度の推定を行う。また,結果の検討・評価を行う。3.進展性局部放電の場合,局部放電が電解質水溶液の中央を進展する場合について観測を行う必要がある。その判別を行うために,局部放電の経路を観察する装置を製作する。4.進展性局部放電からの窒素分子の発光スペクトルの詳細な観測を実施する。得られた結果を基に進展性局部放電の温度の推定を行う。人件費・謝金が計画より少なくて済んだ。物品費(消耗品)として使用する。主な物品として,発光スペクトル観測用の高速ディジタルオシロスコープの購入を計画している。他は,薬品や材料等の消耗品と,情報収集のための旅費,実験補助の謝金を考えている。
放射線照射後血管内及障害におけるエイコサノイド活性変動に関する基礎的研究

本研究の最終的な目的は、エイコサノイドおよびこれにより調節されるサイトカインが放射線の抗腫瘍効果とどのように結び付いているかを明らかにすることで、放射線増感効果の臨床応用や放射線治療後に生じる晩期障害の応用可能か否かを検討することである。本年度は基礎実験として、サイトカイン測定の手技を安定なものにするために、正常ヒト血液中の単核球を用いてガンマ線に対する単核球のサイトカイン産生能を定量、分析した。方法としては、正常人ボランティアの血液より分離した単核球から更に単球分画のみをとり出し、ガンマ線9G_y照射後に培養液中に放出されるサイトカイン(TNF:Tumor Necrosis Factor,IL-2:Interleukin-2)量をELISA法にて定量した。この際、サイトカイン産生刺激物質として知られるLPS(Lipopolisaccaride)を加えた。この結果、LPS刺激後の単球からのTNF産生は、8時間後をピークとしてその後徐々に低下した。また対照として照射を行なわず、LPS刺激のみを加えた群では8時間後において照射群よりも有意に高いサイトカイン活性わ認めた。この結果はKrivenkoらによる先行実験の結果に反するものであったため、現在この結果の相違の原因を明らかにする追試験を計画中である。そこまで解決した段階で放射線の抗腫瘍効果に対するサイトカインの関与を検討する動物実験に進みたいと考えている。
脳において加齢及び運動により変化するニトロ化タンパク質のプロテオミクス

本研究では成熟ラットの海馬から細胞骨格や解糖系酵素を含む12個のタンパク質をニトロトリプトファン(6-NO_2Trp)含有タンパク質として同定し、それらのタンパク質のニトロ化されたTrp残基の位置の決定に成功した。また、海馬における6-NO_2Trp含有タンパク質は加齢により増加する傾向を示すこと、さらに中齢期のラットへの走運動負荷は海馬の6-NO_2Trp含有タンパク質の種類に大きな変化を生じさせないことが明らかとなった。脳において加齢により酸化修飾タンパク質の1つであるニトロ化タンパク質が増加し、その増加は加齢による記憶・学習機能の低下や神経変性疾患と関係していることが示されている。しかしながら、その過程やメカニズムについては十分に明らかにされていない。先行研究においてはニトロ化タンパク質のマーカーである3-ニトロチロシン(3-NT)が中齢期の脳の膜やミトコンドリア画分において既に増加していることが示されているが、どのようなタンパク質がニトロ化されているのかは明らかにされていない。本研究では中齢期のラットの海馬においてニトロ化されるタンパク質に変化が生じるのか否か、またタンパク質のニトロ化に関係している酵素の発現について検討した。実験動物は6ヵ月(6m)と12ヵ月齢(12m)の雄のF344/Nラットを用いた。Cu,Zn-SOD、Mn-SOD、EC-SOD、nNOS、eNOS、iNOS発現と3-NTは1次元電気泳動及びウェスタンブロッティング(WB)で測定した。また3-NTを含むタンパク質については2次元電気泳動とWBにより検出し、スポットの違いを比較した。6mと12mのMn-SOD、EC-SOD、nNOS、eNOS発現及び3-NTには変化が認められず、また両群においてiNOSの発現は観察されなかった。一方、Cu,Zn-SOD発現は6mに比べて12mで有意な増加を示した。両群間における3-NTのスポットの違いを比較したところ、いくつかのスポットに違いが認められた。現在、変化が見られたスポットについて質量分析装置を用いてそのタンパク質と修飾部位の同定を行っている。来年度は加齢及び身体運動による海馬における3-NTの変化について検討すると共に、我々が独自に開発した抗ニトロトリプトファン抗体を用いて、新規ニトロ化産物であるニトロトリプトファン含有タンパク質の変化をも検討する。脳において加齢によりニトロ化タンパク質の1つであるニトロチロシン含有タンパク質が増加し、その増加は加齢による記憶・学習機能の低下や神経変性疾患と関係していることが示されている。一方、我々は新規ニトロ化産物としてニトロトリプトプァン(6-NO_2Trp)含有タンパク質を見出し、培養細胞や炎症疾患モデルマウスにおいて6-NO_2Trp含有タンパク質を同定してきた。しかしながら、生体内の生理的過程においてどのようなタンパク質のトリプトファン(Trp)残基がニトロ化されているのか、また加齢や運動によりTrp残基のニトロ化に変化が生じるのか否かは明らかにされていない。そこで本研究では脳の中でも走運動により神経活動が活性化する海馬における6-NO_2Trp含有タンパク質を同定すること、また加齢及び走運動によるそれらの量的、質的な変化を明らかにすることを目的とした。6-NO_2Trp含有タンパク質は2次元電気泳動及び抗6-NO_2Trp抗体を用いたウェスタンブロッティング(WB)を行い、抗体に陽性のスポットをトリプシン消化後LC-ESI-MS/MS解析を行って、タンパク質の同定とニトロ化部位の決定を試みた。走運動はトレッドミルで行わせた。実験の結果、6mのラットの海馬から多くの抗6-NO_2Trp抗体陽性スポットが検出され、これらのスポットの中から解糖系の酵素などを含む12個のタンパク質を6-NO_2Trp含有タンパク質として同定し、生体内の生理的過程においても6-NO_2Trp含有タンパク質が存在することが初めて明らかとなった。次に加齢の影響を検討した結果、6mと12mでは6.NO2Trp含有タンパク質の含有量やスポットの変化は認められなかった。一方、走運動は海馬の6-NO_2Trp含有タンパク質を増加させる傾向を示した。
咀嚼機能と運動機能(特に筋出力系)の関連についての基礎的研究

近年、咬合力や咀嚼に代表される口腔機能は人々の健康・維持にも大いに関与していることが社会的に認識されはじめている。食物を咀嚼するということは単に消化・吸収を助けるだけでなく、顎口腔系機能の発育や口腔内感覚器官を介して脳の活性化をもたらしている。例えば小児においては咀嚼筋活動の減少は顎骨の成長に影響を及ぼすし,高齢者のなかでは歯牙を喪失して咀嚼能力が低下すると骨吸収がおこることから骨粗鬆症をもたらす可能性も考えられる。スポーツ領域においては顎口腔領域の様々な機能と身体全身機能や運動能力との関係について深い関心が寄せられている。本研究では体育学部男子大学生を対象に顎口腔系機能と身体運動機能(骨密度,筋のH反射)との関連性について検討した。その結果1)骨密度を目的変数に、重回帰分析をおこなうと顎運動機能との間に正の相関関係が得られた(p<0.05)。特に下顎下縁長は骨密度と正の相関(p<0.01)を示した。2)咬合機能を説明変数とした重回帰分析では骨密度と咬合機能(咬合力,咬合力バランス)との間には有意な相関関係は認められなかった。しかし,本実験では下顎下縁長と骨密度との間に有意な正の相関関係を得ている。下顎骨の発達には咀嚼筋の影響を強く受ける。したがって顎骨が発達している学生では骨塩量も高いという本実験結果は間接的に咀嚼機能と全身骨密度が関連していることを裏付けると考えられる。さらに3)咬合力バランスの改善にはボリカーボネイトを用いたバイトプレートタイプのマウスプロテクターが有効であった。一方、加熱重合型シリコーンを用いたソフトタイプは弾性に富み歯や歯根膜に与える違和感が少ないため咬合力を著しく増大させた。4)下顎安静位(上下顎歯が接触する寸前の状態)と比べて最大随意性咬合力(最大の力で噛みしめた時)を発揮したときの方が、ヒラメ筋H反射の促通量は増加した。しかし、この噛みしめを継続させるとむしろH反射は減少した。5)マウスプロテクターを装着する方が装着前と比較し,噛みしめ時のH反射促通量の増加が顕著であった。この理由としてはプロテクターを着用することにより閉口時の咬筋筋紡錘や歯根膜の圧受容器からの入力に変化が生じ、ヒラメ筋の脊髄単シナプス反射が変調したと考えられる.本研究によって,咀嚼力に影響を及ぼす顎骨の発達したものほど骨塩量が高いこと,プロテクター装着による顎口腔機能の変化は筋出力系に影響を及ぼすことが観察された。

近年、咬合力や咀嚼に代表される口腔機能と身体運動機能との関連に関心が寄せられている。これまで、我々は体育学部男子大学生の咬合状態の評価を行うと同時に噛み合わせおよび顎運動の口腔診査を実施し、双方の関連性について様々な検討を加えてきた。本研究ではマウスプロテクターの装着による咬合状態の変化が口腔機能並びに運動機能にもたらす影響について検討を加えた。その結果、1)歯列によく適合したカスタムメイドのマウスプロテクターを装着すると、上下歯の噛みしめによる咬合力が増加することがわかった。また、左右咬合力バランスにも改善が見られた。2)咬合力バランスの改善にはポリカーボネイトを用いたバイトプレートタイプが有効であった。一方、加熱重合型シリコーンを用いたソフトタイプは弾性に富み歯や歯根膜に与える違和感が少ないため咬合力を著しく増大させた。3)下顎安静位(上下顎歯が接触する寸前の状態)と比べて最大随意性咬合力(最大のカで噛みしめた時)を発揮したときの方が、ヒラメ筋H反射の促通量は増加した。しかし、この噛みしめを継続させるとむしろH反射は減少した。4)マウスプロテクターを装着する方が装着前と比較し、噛みしめ時のH反射促通量の増加が顕著であった。この理由としてはプロテクターを着用することにより閉口時の咬筋筋紡錘や歯根膜の圧受容器からの入力に変化が生じ、ヒラメ筋の脊髄単シナプス反射が変調したと考えられる。これらの結果はプロテクター装着による運動機能の向上のメカニズムを知る上できわめて重要だと考えられる。特に、口腔からの情報の変化が速やかに全身の運動機能に影響をもたらす点は興味深く、今後詳細な検討が必要であると思われる。最近,咬合力や咀嚼に代表される口腔機能は人々の健康・維持におおいに関わっていることが社会的に認識されはじめた。食物を咀嚼するということは単に消化・吸収を助けるだけでなく、顎口腔系機能の発育や口腔内感覚器官を介して脳の活性化をもたらしている。近年,小児に多く見られる交叉咬合の原因の一つに咬合力の低下すなわち咀嚼筋活動の少なさがあげられている。咀嚼筋活動の減少は顎骨の成長に影響を及ぼすと考えられている。一方,歯牙を喪失して咀嚼能力が低下すると顎骨では骨吸収がおこる。したがって高齢者における咀嚼能力の低下は骨粗鬆症をもたらす可能性もある。本研究では体育学部男子大学生を対象に咬合機能,顎運動機能と骨密度の関係について検討を加えた。その結果,1)咬合力の平均値は282.2N,咬合力バランスは43.1%,ゴニアル角度は135度であり,下顎下縁長は98cmであった。被験者の骨密度は平均1.19g/cm^2で1.56g/cm^2から1.03g/cm^2と広域に分布していた。2)骨密度を目的変数に、顎運動機能を説明変数にして重回帰分析をおこなうと正の相関関係が得られた(p=0.0303)。特に下顎下縁長は骨密度と正の相関(p=0.0146)を示した。3)咬合機能を説明変数とした重回帰分析では骨密度と咬合機能(咬合力,咬合力バランス)との間には有意な相関関係は認められなかった。しかし,本実験では下顎下縁長と骨密度との間に有意な正の相関関係を得ている。下顎骨の発達には咀嚼筋の影響を強く受ける。したがって顎骨が発達している学生では骨塩量も高いという本実験結果は間接的に咀嚼機能と全身骨密度が関連していることを裏付けると考えられる。さらに,口腔領域において歯牙を喪失して咀嚼機能が低下すると急速に顎骨が退化することから顎口腔機能の発達は顎骨の骨密度を増加させる働きがあると考えられる。本研究によって,咀嚼力に影響を及ぼす顎骨の発達したものほど骨塩量が高いことが明らかとなった。このことは,咀嚼機能の維持も骨密度低下予防のひとつとして考えられ,顎口腔機能は全身機能に影響を及ぼすことが示された。
日本海第四系の高分解能層序学-暖流系種の消長に基づく時間面の確立-

黒潮水域に分布中心をもつ生物種-暖流系種-が,150万年前以降,間氷期ごとに日本海に現われた.暖流系種の出現は,間氷期になり対馬海流が日本海に流入したためで,一方,その後の気候寒冷化が日本海における暖流系種の死滅をもたらした.この暖流系種の出現と死滅が日本海スケールで同時におきたならば,それらを時間面として,氷河性海水準変動に伴う日本海の海洋環境,堆積物,生物の変動様式を数万年オーダの時間分解能で解明できる.そこで,暖流系種の出現・死滅の同時性を検討し,さらにその有用性を高めるため,2つの研究を行った.1,暖流系種の出現・死滅の同時性を検討するため,大桑層と同時代の青森県下北半島の浜田層を調査した.2,貝化石の産出が散在的な地層で,暖流系種の出現層準を認定するには,他の生物に頼りざるをえない.その生物としては表層水中に住む暖流系浮遊性有孔虫が最適である.そこで,貝化石から暖流系種の出現層準が判明している大桑層において,その出現層準と暖流系浮遊性有孔虫の出現層準との層位関係を解明する.その結果,1,浜田層の岩相・貝化石群集の検討により,従来の研究結果(Kanazawa,1990)を確認でき,さらに氷期-間氷期サイクルに伴う3つの堆積サイクルを認定できた.浜田層より採取した試料ならびにその地質時代については解析中である.2,暖流系浮遊性有孔虫の出現層準と暖流系貝化石の出現層準とは,必ずしも一致しないことが分かった.1つの例では,前者は後者よりも約1m下に位置する.これは,前時代の遺骸の混入もしくは極一時的にしか対馬海流が流入しない時代が続いたかのどちらかであろう(有孔虫よりも寿命の長い軟体動物が生存可能なほどには,対馬海流が流入しなかった).いずれにせよ,この不一致は,暖流系種の出現・死滅の層準を認定する時に,基準に用いる生物種の違いを考慮しなくてはならないことを意味し,この研究結果は重要である.黒潮水域に分布中心をもつ生物種-暖流系種-が,150万年前以降,間氷期ごとに日本海に現われた.暖流系種の出現は,間氷期になり対馬海流が日本海に流入したためで,一方,その後の気候寒冷化が日本海における暖流系種の死滅をもたらした.この暖流系種の出現と死滅が日本海スケールで同時におきたならば,それらを時間面として,氷河性海水準変動に伴う日本海の海洋環境,堆積物,生物の変動様式を数万年オーダの時間分解能で解明できる.そこで,暖流系種の出現・死滅の同時性を検討し,さらにその有用性を高めるため,2つの研究を行った.1,暖流系種の出現・死滅の同時性を検討するため,大桑層と同時代の青森県下北半島の浜田層を調査した.2,貝化石の産出が散在的な地層で,暖流系種の出現層準を認定するには,他の生物に頼りざるをえない.その生物としては表層水中に住む暖流系浮遊性有孔虫が最適である.そこで,貝化石から暖流系種の出現層準が判明している大桑層において,その出現層準と暖流系浮遊性有孔虫の出現層準との層位関係を解明する.その結果,1,浜田層の岩相・貝化石群集の検討により,従来の研究結果(Kanazawa,1990)を確認でき,さらに氷期-間氷期サイクルに伴う3つの堆積サイクルを認定できた.浜田層より採取した試料ならびにその地質時代については解析中である.2,暖流系浮遊性有孔虫の出現層準と暖流系貝化石の出現層準とは,必ずしも一致しないことが分かった.1つの例では,前者は後者よりも約1m下に位置する.これは,前時代の遺骸の混入もしくは極一時的にしか対馬海流が流入しない時代が続いたかのどちらかであろう(有孔虫よりも寿命の長い軟体動物が生存可能なほどには,対馬海流が流入しなかった).いずれにせよ,この不一致は,暖流系種の出現・死滅の層準を認定する時に,基準に用いる生物種の違いを考慮しなくてはならないことを意味し,この研究結果は重要である.
細胞内に物理的摂動を与える分子の作成

光を照射することで物理的な動きを誘起する物質の光化学的効果は、近年注目されている。中でも染料であるアゾ化合物への紫外光照射による光異性化は良く知られている。アゾ化合物のうち可視光のみで光異性化をおこす化合物に蛍光色素と、細胞膜透過性ならびに細胞内微小器官への局在性を向上させるためにホスホニウム塩を導入した化合物を合成し、その物性評価と細胞内動態の観察を行った。細胞は核や小胞体、ミトコンドリアなどの微小器官の集合であり、それらは脂質膜により他の微小器官と隔てられている自己組織化したナノ集合体の集まりと考えることができる。これらは、一見、無秩序に配置されているように見られるものの、細胞内での損傷に対する修復の迅速さや、シグナル情報伝達の正確さを鑑みると、微小器官の集合体である細胞の中でその微小器官の存在する位置、あるいはタンパク質の遊走する場所に意味を考えることを禁じえない。本研究では、細胞内の特定の微小器官に対して、薬物による化学的刺激ではなく、分子生物学的手法による過剰発現やノックアウトでもない、アゾベンゼン骨格の光異性化を利用した物理的摂動を加えることのできる分子の作成を行う。細胞膜およびミトコンドリアに局在化するアゾベンゼンの合成:細胞内微小器官のひとつであるミトコンドリアに局在化するアゾベンゼンとしてホスホニウム塩を導入した化合物を合成した。目的とする化合物は、保護された4-アミノ-4'-ヒドロキシアゾベンゼンをもとに合成を行った。目的骨格となるジアリールアミノヒドロキシアゾベンゼンは、中野らにより報告されている合成法(J. Mater. Chem., 2007, 17, 4953-4963)を参考に4-アミノ-4'-ヒドロキシアゾベンゼンの置換アリールハライドとのUllmann反応により行い、ヒドロキシ基の脱保護の後、塩基存在下でホスホニウム塩部位およびアルキル部位の導入を行った。本目的化合物の構造決定並びに光学的特性の詳細な検討を行い、本化合物は430nm付近の光および500nm付近の光により光異性化を起こすことが明らかになった。ホスホニウム塩を導入することにより水溶性が向上し今後、今後細胞導入実験を行う予定である。生体内で光や濃度勾配などの外部エネルギーを機械的な動きに変換する分子を生体内分子モーターと呼ぶ。分子モーターの働きによって細胞は変形・移動し、細胞内では様々な高分子の輸送が行われる1)。なかでも光照射に応答して化学構造を異性化させるフォトスイッチング機能は近年、有機材料等に応用できるフォトクロミック分子として注目されている。アゾベンゼンあるいはその誘導体は、色素(アゾ色素)として有名であるが、光照射による構造異性化を生じる代表的な化合物でもある。紫外光照射にてπ-π*遷移し、トランス体からシス体へと異性化し、逆に可視光照射にてn-π*遷移することで、シス体からトランス体に異性化させる。特定波長の光を制御しながら照射することで構造異性化を繰り返し、分子モーターとしての活躍が期待される。本研究は、アゾベンゼン誘導体を細胞内に局在化させ、光異性化による影響を観察した。細胞内微小器官局在化部位として分子内にホスホニウム塩を導入した分子を設計し、溶液中での光異性化実験を行ったところ当初の予定通り可視光領域の光照射によって異性化を確認できた。さらに、細胞内での分子の局在化を確認するために蛍光色素であるBODIPYを導入した分子も合成し細胞内導入の後、光異性化に必要な波長領域の光照射を行った。その結果、まず細胞内局在化部位については、当初の狙いであったミトコンドリアへの局在は観測されずリソソームへの局在が観測された。光照射実験に関しては、目的分子を導入した細胞に光照射を行ったところ、コントロール実験と有意な差で細胞死が観測できた。この細胞死が引き起こされた原因は色素への光照射による一重項酸素の発生ではない事は明らかで、その直接的な原因について検討を行っている。有機化学細胞形質膜、ミトコンドリア、ならびにリソソームに局在あるいは凝集を促すプロモータ部位を配したアゾ基を有する2系統の化合物を合成する。ひとつはアゾベンゼン骨格を有するもので、もうひとつは、細胞小器官を形成する生体分子との相互作用を増大させるために上記のプロモータ部位をより多く配したジアゾベンゾクラウンエーテルである。これらの分子を細胞内の特定の器官に局在化あるいは凝集させて平面偏光照射による光異性化を行い、細胞に物理的摂動を加えることを目的としている。現在、合成に成功している分子は、速やかに細胞導入が可能であると考えられる一方で細胞内のどの微小期間に導入されているかが現化合物ではわからない。局在化している細胞内微小器官が特定できるような官能基の導入が必要である。今後、目的化合物が導入されている微小器官を特定するために、近赤外領域に蛍光波長をもつ色素を導入した。

アゾベンゼン誘導体の合成を行い、その、光特性を確認した上で、細胞導入実験を行う。細胞導入直後から一定の時間は、細胞形質膜への局在化が見られ、その後、リソソームに凝集するペプチドを導入したアゾベンゼン誘導体の合成を行う。本合成に関しては、アゾベンゼンとペプチド鎖の結合にクリック反応を用いる。以上の行程で得られた化合物が導入された細胞のミトコンドリア、核やリソソームなどいくつかの微小器官を蛍光色素により染色し、観察細胞を作成する。現有の蛍光顕微鏡にレーザー光源を適当な入射角をもつように装着し、一定間隔で光照射を行い、蛍光染色した微小器官の挙動を観察することで、導入した化合物の効果を検証する。
Nrf2ノックアウトマウスを用いた酸化ストレス性発がんメカニズムの解析

薬物代謝系第2相酵素群の統一的転写因子として知られるNrf2を人工的に欠いたトランスジェニックマウスを用い、げっ歯類腎発がん剤である鉄ニトリロ三酢酸(Fe-NTA)が引き起こす急性腎毒性と酸化的障害の遺伝子型による感受性差異を比較し、酸化的ストレスに対する生体防御機構におけるNrf2の役割を調べた。その結果、Fe-NTA投与による病理組織学的な腎毒性の発現は、-/-個体の方が+/+個体より早期、かつ顕著であった。また酸化的ストレスの指標とされる脂質過酸化(TBARS)、及び酸化的DNA損傷(8-oxodG)のレベルは、Fe-NTA投与後1時間において-/-個体の方が+/+個体より強く上昇した。生体内抗酸化物質として知られるグルタチオンの組織含有量、およびその合成調節酵素であるγ-ガルタミルシステイン合成酵素の活性は-/-個体の方が+/+個体より有意に低かった。従って、マウス腎臓における酸化的細胞障害に対して、Nrf2を介した防御機構が重要な役割を担っていることが示唆された。マウス肝発がん剤であるPentachlorophenol(PCP)について、肝臓での代謝課で、程発生する酸化的ストレスによるin vivo遺伝子突然変異誘発の可能性を、肝発がん嫌発(C57BL/6)、及び好発(B6C3F1)系統gpt deltaマウスを用いて調べた。その結果、PCPの用量依存的(0,600,1200ppm)に肝重量、8-oxodG量、及び欠失変異頻度の上昇が認められ、その程度はC57BL/6系統よりB6C3F1系統のほうが顕著であった。一方で点突然変異頻度は対照群と比べ、投与群に有意な上昇は見られなかった。従って、PCPの酸化的ストレスを介した肝発がん機構に、8-oxodGに起因する点突然変異ではなく欠失変異が関与する可能性が示唆された。発がん機序が異なると考えられる数種のラット肝発がん物質について、in vivo変異原性アッセイのモデル動物であるgpt deltaラットを用いた実験を行ない、それぞれの変異頻度と変異スペクトラムを明らかにし、化合物特異的な発がんメカニズムについて考察した。この内容はMolecular Carcinogenesis 42:9-17(2005)に発表された。薬物代謝第2相酵素群の統一的転写因子Nrf2の欠損マウスを利用し、酸化的ストレスによる発がんが示唆されているマウス肝発がん物質Pentachlorophenol(PCP)の影響を解析した。Nrf2欠損マウスにPCPを1200ppmで4週間投与した結果、酸化的DNA損傷のひとつである8-OHdG量が肝臓において有意に増加した。一方で変異原性アッセイ動物gpt deltaマウスにPCPを13週間投与した結果、発がん用量である600ppmおよび1200ppmにおいて変異原性は認められなかった。また同じく酸化的ストレスの関与が知られる鉄ニトリロ三酢酸による腎発がんモデルを用い、Nrf2欠損マウスにおける酸化的損傷を解析する実験を行い、組織の採取を完了した。脂質過酸化の指標であるTBARSを測定した結果、雄で投与2時間後に顕著な増加が見られ、雌では変化が乏しかった。今後8-OHdGの定量や、脂質過酸化生成物の抗体による検出など、酸化的損傷の度合いを野生型個体と比較し、酸化的ストレスに対する第2相酵素群の関わりを検討する。またNrf2欠損マウスとgpt deltaマウスとの交配により得られるNrf2^-/gptマウスを利用し、酸化的ストレスと遺伝子突然変異の関係について解析する予定である。in vivo変異原性アッセイの技術習得を目的に、発がん機序が異なる数種のラット肝発がん物質の変異頻度と変異スペクトラムを比較する実験をgpt deltaラットを用いて行い、発がん物質特異的なin vivo変異スペクトラムを明らかにした。この成果は平成15年度日本癌学会総会第62回大会を始め、国内外の学会おいて発表され、現在学術論文として投稿中である。また発がん研究において必要とされる毒性病理学的な知識や研究手技を学ぶため、同研究部で行っている様々な毒性試験や発がん研究のデータ解析および論文作成に携わった。

その結果、PCPの用量依存的(0,600,1200ppm)に肝重量、8-oxodG量、及び欠失変異頻度の上昇が認められ、その程度はC57BL/6系統よりB6C3F1系統のほうが顕著であった。一方で点突然変異頻度は対照群と比べ、投与群に有意な上昇は見られなかった。従って、PCPの酸化的ストレスを介した肝発がん機構に、8-oxodGに起因する点突然変異ではなく欠失変異が関与する可能性が示唆された。発がん機序が異なると考えられる数種のラット肝発がん物質について、in vivo変異原性アッセイのモデル動物であるgpt deltaラットを用いた実験を行ない、それぞれの変異頻度と変異スペクトラムを明らかにし、化合物特異的な発がんメカニズムについて考察した。この内容はMolecular Carcinogenesis 42:9-17(2005)に発表された。
頭頸部扁平上皮がんリンパ節転移における遅延型 TGFβ の活性型変換機構の解析

頭頸部扁平上皮がんのリンパ節転移の抑止を目指し、その分子過程におけるナトリウムイオン・プロトン交換輸送体1 (NHE1)の寄与をTGFbeta1活性化機構に注目して追及してきた。この過程でNHE1の集団的細胞運動への寄与を見出し、当該領域における新規かつ重要な概念を提示した。われわれの観察結果は、NHE1の喪失によって細胞集団が運動の極性を失っていることを示唆していたが、この分子がどのようにして集団的細胞運動を実現しているかについてはいまだ解明には遠い。NHE1が細胞内pHを制御する因子であることに着目して集団内pH分布を検討し、細胞集団の辺縁で低いという新知見を得た。頭頸部扁平上皮がんのリンパ節転移の抑止を目指し、その分子過程におけるナトリウムイオン・プロトン交換輸送体1 (NHE1)の寄与を、TGFbetaの活性化機構に注目して追及している。NHE1がTGFbeta活性化機序の一端を担うことを示すデータをすでに得ているが、本年度は、それが実際にヒトの頭頸部扁平がん組織においても機能しうるのではないかというデータを得た。ヒト臨床検体を入手・検討する機会を得たことから、実際のヒトの頭頸部扁平上皮がんにおいてNHE1の発現亢進が起こっていることを確認することができた。このことは、本研究が目指しているがん転移に対するNHE1の関与が、in vitroの仮説にとどまらない臨床的意義を持つものであることを強く示唆する。さらにこの病理学的観察は、このNHE1発現亢進が頭頸部扁平上皮がん細胞の集団での運動(集団的細胞運動: collective migration)における重要性を想定させ、実験的にそれを証明・論文投稿にいたった(Oncotarget誌、revise中)。がん転移の基本的分子機構として「上皮-間充織形質転換: epithelial -mesenchymal transition : EMT」知られながく重視されてきたが、昨年末それが必須過程でないことが報告され、集団的細胞運動の重要性が指摘されてきている。この細胞運動様式におけるNHE1の関与は既報がなく、当該領域における重要な新知見としてレフリーから評価を受けている。当初予定の進捗状況との比較においては、やや遅れていると評価せざるを得ないと考えている。理由は前項に示した通り、新規の観点が見出されてきたからである。集団的細胞運動においてNHE1がどのような役割を果たしているのかという問いは、EMTに対する評価が見直され始めた現在となっては、重要性を増している。これまでに、NHE1発現亢進によって細胞内pH (pHi)が上昇していることが確認されることに加えて、運動している細胞集団におけるleading cellと呼ばれる細胞群において、pHが低いことを見出している。NHE1がプロトンを排出する分子であることから、その発現亢進によるpHiの上昇は理解しやすいが、leading cellにおけるpHiの低下は興味深い。Leading cellとは細胞集団の外縁を形成する一列の細胞群で、集団内部を形成するfollowing cellとは異なって細胞&#8211;細胞接着をもたない細胞膜部位を保持し、この細胞膜部分は運動性の高いラッフル膜を形成しうる。pHiが相対的に低いことは、leading cellにおけるNHE1がpH制御以外の機能を積極的に担っていることを想起させる。現在この一連の報告を完成させるべくやや予定外の解析を行っているが、早期にこれを完了させ、予定の解析に復帰する予定である。本研究では、ナトリウムイオン/プロトン交換輸送体1 (NHE1)が、その細胞内pH (pHi)制御活性を介してTGFbeta1の活性化に寄与する可能性、及びそのメカニズムの追求を行っている。今年度はこの過程で、重要な新知見を得た。すなわち、扁平上皮がん細胞などの細胞運動において観察される運動様式である、集団的細胞運動においてNHE1が必須の因子であることの発見であり、このことは既に論文発表にも至っている。NHE1は、E-カドヘリン同様上皮細胞の細胞ー細胞間接着部位に集積する。集団的細胞運動はE-カドヘリン接着を保持したまま上皮細胞集団が組織内を移動したり、脈管に侵入したりする現象であるが、NHE1の寄与については類例の報告が一切なかった。われわれはNHE1ノックダウンにより頭頸部扁平上皮がんが集団的細胞運動によって長距離を移動することが不能になることを見出した。細胞集団自体の運動は、同一部位で回転するように継続するため、この現象は細胞極性の喪失であろうと考えられる。in vitroにおいては、NHE1ノックダウンにより重篤な浸潤性の低下も観察され、がんの悪性度の低下も期待された。事実、NHE1ノックダウンによりマウス転移モデルにおいて転移性の減少が観察され、さらには、実際のヒトの頭頸部扁平上皮がん組織におけるNHE1の発現亢進を認めたことから、がん転移抑制治療の標的としてのNHE1の可能性が示された。また後述の通り、細胞集団内でのpHi分布についても興味深い知見を得ており、今後の重要な進展が期待できる状況となっている。概要欄に記載した重要な知見を得たので、当初予定のTGFbeta1活性化機構解析については進行がやや遅れている。しかしながら前述の知見は、現在に至っても実現していないがん転移抑制治療への道を拓くものである可能性があるため、研究自体の価値は極めて高いと考えられる。この価値について更に述べると、NHE1が寄与することが判明した集団的細胞運動という運動機構は、これまでがん転移の主たる機構とは考えられてこなかった。

上皮ー間充織形質転換(Epitjelial - Mesenchymal Transitoin : EMT)と呼ばれる形質転換により、上皮細胞がE-カドヘリン接着を破棄して単一細胞へと遊離することこそが、がん転移の根本原理であると長く信じられてきており、その分子機構解析、および阻害に多くの努力が払われてきていた。その結果、2015年にある一つの結論が、独立した二グループからの連報としてNature誌に掲載された。それは驚くべきことに、EMTはがん転移に必須の過程ではなくむしろ薬剤耐性獲得において重要な過程である、というものであった。がんの悪性化におけるEMTの重要性は変わらないものの、がん転移におけるそれは強く再考を促されている。こうしたなか、集団的細胞運動こそが、がん転移そのものに関しての根本の機構である可能性が浮上してきており、その中心的分子機構に迫る可能性を今般われわれが呈示したNHE1がになっている可能性が高いのである。頭頸部扁平上皮がんのリンパ節転移の抑止を目指し、その分子過程におけるナトリウムイオン・プロトン交換輸送体1 (NHE1)の寄与をTGF beta 1活性化機構に注目して追及してきた。この過程でNHE1の集団的細胞運動への寄与を見出したため、その論文報告、および派生する問題に研究期間の後半を費やしてきた。業績欄に示す通り最終的にBiochem. Biophys. Res. Commun.誌への論文報告が完了したが、この解析は多くの重要な示唆を与えた。集団的細胞運動は個体発生や創傷治癒などの生理学的過程においても観察される一方、上皮がんの浸潤において観察されることから遠隔転移との関連も考慮されてきた。がんが転移するうえでは血管やリンパ管への侵入が不可欠と考えられるが、そのためには腫瘍細胞が単一の状態になっていることが有利と考えられることから、上皮ー間充織形質転換(EMT)という過程が必須と長らく信じられてきた。しかしながら、その前提に再考を促す報告が2015年秋になされ、がん転移における集団的細胞運動ががぜん注目を集めることとなってきた。われわれの報告はNHE1がこの運動様式の実現において必須の役割を果たしていることを明らかにしており、当該領域における新規かつ重要な概念を提示した。しかしながた、この分子がどのようにして集団的細胞運動を実現しているかについてはいまだ解明には遠い。われわれの観察結果は、NHE1の喪失によって細胞集団が運動の極性を失っていることを示唆していた。NHE1が細胞内pHを制御する因子であることから、pH分布の制御が運動極性と関連するのではないかと考え、pH測定系を樹立し測定したところ、細胞集団の辺縁で低く、内部で高いというpH分布を見出した。現在、このpH分布の動態と運動極性の関連について、解析を継続している。頭頸部扁平上皮がんのリンパ節転移の抑止を目指し、その分子過程におけるナトリウムイオン・プロトン交換輸送体1 (NHE1)の寄与をTGFbeta1活性化機構に注目して追及してきた。この過程でNHE1の集団的細胞運動への寄与を見出し、当該領域における新規かつ重要な概念を提示した。