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遅延フィードバック制御における安定化理論の構築とその応用

遅延フィードバック制御(DF制御)法の理論的枠組みの構築を目的として,2011年の我々の成果における制約を緩和することと遅延誤差を含む場合の解析に取り組んだ.完全なる解決には至らなかったが,新たなる3つの成果を得た.(1)離散時間システムに対する遅延フィードバック制御において,1ステップ時間進めた遅延フィードバック制御(EchoタイプDF制御)が有効であることを示した.(2)ゲインが単位行列の実数倍に限るが,DF制御によって安定化可能な周期解のFloquet乗数の必要十分条件の証明.(3)Banach空間上の周期発展作用素から生成される周期的非同次項をもつ線形方程式の周期解の存在条件の証明.本年度は研究計画として,以下の2点を挙げていた:P1)制御ゲインに対する可換条件を排除した場合の安定化条件の導出.P2)遅延時間に誤差を持つDF制御方程式の周期解の存在証明への手掛かりの模索.これらを明らかにすべく取り組んだ.以下の4つの課題について取り組んだ.P1)については,Fiedleret. al.(PRL 98, 2007)で取り上げられたモデルを参考に,解析の可能性を試みている.一方で,離散系に対するDF制御法,特にechoタイプのDF制御に対して,連続系と同様の議論展開によりゲインに可換条件を付したC-map定理が得られる(RIMS講究録No.1702)ことが分かっているが,この場合に可換条件を排除した解析も検討してみることとした.P2)に関連して,非線形摂動項を含む周期系発展方程式の周期解の存在と解の表現を与え,投稿中である.これらの結果をP2)へつなげる見通しは今のところ立っていない.そこで,平均加法をはじめとした摂動法の適用も検討中である.特に,今年度研究計画として取り上げていなかったが,単位行列の実数倍をゲインとするDF制御法により,周期解の安定化が可能となる制御前の特性乗数の必要十分条件を導出し,得られた結果から特性乗数が実数でない場合についても安定化が可能であることを具体例から明らかにした.また,安定化可能なゲインの必要十分条件の証明にも取り組んだ.P1)については,予想していた通り計算テクニックでは行き詰まりがあり,新たな視点として,離散系と対比させるということに取り組み始めた.P2)については,当初からH28も継続して行う予定である.本年度は研究計画として,当初から以下の3点を挙げていた:P1)制御ゲインに対する可換条件を排除した場合の安定化条件の導出.P2)遅延時間に誤差を持つDF制御方程式の周期解の存在証明への手掛かりの模索.P3)生態系システムの自己調節機能としてのDF制御法の意味づけP1)については,昨年度得られた知見について,可換条件を付した場合の安定化可能な特性乗数に対する必要十分条件の証明の不備が見つかりそれを修正し投稿準備ができた.また,本結果をもとに,可換条件を排除した場合について,可換条件を付した場合の具体例を用いて上記条件がどのように変化するかについて,具体例を用いての数値的検証に着手した.また,昨年度新たな視点として追加した,離散系に対する検討の第一段階として,エノン写像に対する遅延フィードバック制御の安定化可能性について,可換条件を付した場合について検討を行った.P2)に関連して,昨年投稿した非線形摂動項を含む周期系発展方程式の周期解の存在と解の表現についての論文が掲載に向け受理された.また,線形主要項のスペクトルと周期的摂動項のスペクトル及び時間遅れについての関連性に着目し解析を試みることとした.その手始めとして,時間遅れがない場合についての関連性についてまとめ投稿中である.また,P1と同様,遅延時間の誤差についても数値的検証の準備を行った.P3)については,実際の生態システムで見られる周期的変動についての研究グループとともに,研究に着手し数学的解析部分を担当しその成果が専門誌に出版された.本来の計画のうち,もっとも重視したいP1のH27年度成果に不十分な点が見つかりその修正に時間を要ししたため.本年度は研究計画として,当初から以下の3点を挙げていた:P1)制御ゲインに対する可換条件を排除した場合の安定化条件の導出.P2)遅延時間に誤差を持つDF制御方程式の周期解の存在証明への手掛かりの模索.P3)生態系システムの自己調節機能としてのDF制御法の意味づけP1)については,昨年度に引き続き可換条件を排除したゲインについて,具体例を用いての数値的検証を行っているが,解析的結果には結びついていない.しかし,線形化システムにおいて,未制御方程式の線形化システムにおける基本解行列を用いて変換された方程式は,遅延のない基本的な非自励線形システムとなる.このようなシステムについては,古くから数多くの研究結果が存在する.中でもW. A. Coppel (1965)の成果を参考にした解析が可能ではないかという新たな方向性を得ることができた.P2)に関連して,フーリエ解析などの信号解析の手法の適用について検討を開始した.現時点では,特筆すべき結果は出ていない.

しかし,フーリエスペクトルから不安定システムに埋め込まれている解の周期を拾い出し,その周期を遅延時間に設定しDF制御を実施することは,数値的には自然の事柄であり,この点を理論的に整備することが急務であるという,新たな課題の発見につながった.P3)については,生態システムにおける周期的変動について研究しているグループとの共同研究において,数学的解析部分を担当しその成果が専門誌に出版された.遅延フィードバック制御(DF制御)法の理論的枠組みの構築を目的として,2011年の我々の成果における制約を緩和することと遅延誤差を含む場合の解析に取り組んだ.完全なる解決には至らなかったが,新たなる3つの成果を得た.(1)離散時間システムに対する遅延フィードバック制御において,1ステップ時間進めた遅延フィードバック制御(EchoタイプDF制御)が有効であることを示した.(2)ゲインが単位行列の実数倍に限るが,DF制御によって安定化可能な周期解のFloquet乗数の必要十分条件の証明.(3)Banach空間上の周期発展作用素から生成される周期的非同次項をもつ線形方程式の周期解の存在条件の証明.H27年度に取り組み始めたが,研究計画として,新たに離散系で解析してみることを追加する.それ以外は,当初の計画に従って進めていく予定である.最終年度でもあるため,当初の計画のうち,特にP1の数値的検証を進めていく.その際,・安定化成功の評価基準・時間遅れを持つ線形システムのスペクトルの数値的近似手法について整備していく必要がある.それらを遂行するため,平均化法さらにはフーリエ解析などの適用を検討していく.関数微分方程式論交付内定が10月だったため,共同研究者との打ち合わせのための出張計画が遂行できなかったことによる.昨年度の成果の修正に時間を要したため,新たな研究着手への研究打ち合わせ旅費を十分に消化できなかったこと.国際会議への参加が研究協力者(申)のみの参加となったため.H28年度,特に8月から9月にかけて分担者との研究打ち合わせを集中的に実施する.また,当初の研究計画にはなかったが,7月に実施されるICDEA2016に参加し発表を行う.数値計算を強化するため,パソコンを購入する.分担者との研究打ち合わせを8月,9月に集中的に実施する.
頚動脈小体感覚神経終末のグルタミン酸による化学受容調節機構の解明

頚動脈小体で感受した血中ガス分圧の変化を伝える頚動脈洞枝は、頚動脈洞にも分布して動脈圧を受容する感覚神経終末として機能しているが、その分布と形態の詳細は不明である。そこで、P2X3型ATP受容体の発現を指標としてラット頚動脈洞における神経終末の分布と形態を解析した。P2X3陽性神経終末は、頚動脈分岐部から約1mm離れた内頚動脈壁に局所的に認められた。神経終末は、分岐を繰り返すP2X3陽性神経線維と葉状および平板状の軸索終末部で構成されており、血管壁に対して平面的に分布していた。軸索末端部はS100陽性反応およびS100B陽性反応を示す終末シュワン細胞によって緊密に取り囲まれていた。また、一部のP2X3陽性軸索末端部にはP2X2型ATP陽性反応および小胞性グルタミン酸輸送体2(VGLUT2)陽性反応が認められたことから、頚動脈洞に分布する感覚神経終末においてもグルタミン酸が小胞分泌されている可能性が示唆された。生体ラットの内頚動脈において神経終末の分布領域を電気刺激すると、反射性の血圧低下が認められたことから、本研究で認められたP2X3陽性神経終末は動脈圧受容器であると考えられた。さらに、免疫組織化学によって頚動脈小体におけるNMDA型グルタミン酸受容体GluN2AおよびGluN2Bの局在を精査した。GluN2AおよびGluN2B陽性反応は、チロシン水酸化酵素陽性反応を示す一部の化学受容細胞において認められた。また、GluN2AおよびGluN2B陽性化学受容細胞の周囲には、点状のVGLUT2陽性反応が観察された。以上の結果から、頚動脈小体感覚神経終末から小胞分泌されたグルタミン酸は一部の化学受容細胞に発現するNMDA受容体に作用していることが示唆された。免疫組織化学法によってラット頚動脈小体における感覚神経終末の形態学的特徴を解析した。その結果、頚動脈小体に分布する感覚神経終末はP2X2型およびP2X3型ATP受容体の陽性反応を示しており、平板状の末端部を形成して化学受容細胞の集団を緊密に取り囲んでいた。神経終末の立体再構築像により、一部の神経終末は樹枝状や杯状といった多様な末端部を形成して化学受容細胞と接していることが分かった。多重染色により感覚神経終末と化学受容細胞との関係性を調べると、チロシン水酸化酵素(TH)陽性反応を示す細胞には神経終末が認められるが、ドパミンβ-水酸化酵素(DBH)陽性の細胞には神経終末は密に分布していなかった。したがって、化学受容細胞に発現するカテコールアミン合成酵素の分子によって神経支配に違いがあることが示唆された。さらに、頚動脈小体の化学受容細胞と感覚神経終末に発現するグルタミン酸受容体について検索した。グルタミン酸受容体のうち、頚動脈小体ではAMPA型1-4、カイニン酸型GluK2,3,5、NMDA型GluN1,2A,2B、代謝型mGluR1,5,7のmRNA発現が認められた。一方で、感覚神経の神経細胞体が集合する舌咽神経遠位神経節ではAMPA型1-4、カイニン酸型GluK1-5、NMDA型GluN1,2A,2B、代謝型mGluR1-7のmRNA発現が認められた。以上から、グルタミン酸は頚動脈小体の化学受容細胞と感覚神経終末の双方に作用する可能性がある。平成28年度は、頚動脈小体に分布するP2X陽性感覚神経終末の形態学的特徴を解析して論文等で公表することができた。また、頚動脈小体等に発現するグルタミン酸受容体の分子種の解析も進み、現在は受容体の組織局在を特定するために形態学的解析を進めている。その一方で、化学受容細胞のカルシウムイメージングと頚動脈小体に分布する感覚神経(頚動脈洞枝)の活動記録実験の進捗が遅れている。胎仔期および生後ラット頚動脈小体におけるP2X2型およびP2X3型ATP受容体(P2X2、P2X3)の免疫組織化学的分布を解析した。胎齢16日から20日までは頚動脈小体内に点状のP2X3陽性反応およびP2X2陽性反応が散在しており、P2X3陽性反応はP2X2陽性反応と一致していた。P2X3陽性反応の一部はチロシン水酸化酵素(TH)陽性反応を示す化学受容細胞の周囲に認められた。生後1日では点状のP2X3陽性反応がTH陽性の化学受容細胞に沿って分布していた。生後5日ではP2X3陽性神経線維が認められ、化学受容細胞の集団に接する部分で平板状の終末部を形成して周囲を緊密に取り囲んでおり、生後5日以降はP2X3陽性神経終末の分布は同様であった。以上のことから、生後1週以内に認められた化学受容細胞に対するP2X型ATP受容体の分布変化は、頚動脈小体の機能発達と関係していることが示唆された。さらに、前年度の生化学的解析によって遺伝子発現が確認されたグルタミン酸受容体に対する抗体を用いて、頚動脈小体と舌咽神経遠位神経節における免疫組織化学的分布を調べた。グルタミン酸受容体のうち、NMDA型受容体GluN1,2A,2Bの免疫反応性が頚動脈小体の化学受容細胞に認められたことから、グルタミン酸はNMDA受容体を介して化学受容細胞に作用している可能性がある。

生化学的解析によって遺伝子発現が確認されたグルタミン酸受容体に対する抗体を用いて頚動脈小体における局在を調べているが、安定した結果が得られず難航している。また、カルシウムイメージング法を用いた化学受容細胞に対するグルタミン酸の反応特性を解析しているが、頚動脈小体に分布する感覚神経の活動記録実験の進捗が遅れている。頚動脈小体で感受した血中ガス分圧の変化を伝える頚動脈洞枝は、頚動脈洞にも分布して動脈圧を受容する感覚神経終末として機能しているが、その分布と形態の詳細は不明である。そこで、P2X3型ATP受容体の発現を指標としてラット頚動脈洞における神経終末の分布と形態を解析した。P2X3陽性神経終末は、頚動脈分岐部から約1mm離れた内頚動脈壁に局所的に認められた。神経終末は、分岐を繰り返すP2X3陽性神経線維と葉状および平板状の軸索終末部で構成されており、血管壁に対して平面的に分布していた。軸索末端部はS100陽性反応およびS100B陽性反応を示す終末シュワン細胞によって緊密に取り囲まれていた。また、一部のP2X3陽性軸索末端部にはP2X2型ATP陽性反応および小胞性グルタミン酸輸送体2(VGLUT2)陽性反応が認められたことから、頚動脈洞に分布する感覚神経終末においてもグルタミン酸が小胞分泌されている可能性が示唆された。生体ラットの内頚動脈において神経終末の分布領域を電気刺激すると、反射性の血圧低下が認められたことから、本研究で認められたP2X3陽性神経終末は動脈圧受容器であると考えられた。さらに、免疫組織化学によって頚動脈小体におけるNMDA型グルタミン酸受容体GluN2AおよびGluN2Bの局在を精査した。GluN2AおよびGluN2B陽性反応は、チロシン水酸化酵素陽性反応を示す一部の化学受容細胞において認められた。また、GluN2AおよびGluN2B陽性化学受容細胞の周囲には、点状のVGLUT2陽性反応が観察された。以上の結果から、頚動脈小体感覚神経終末から小胞分泌されたグルタミン酸は一部の化学受容細胞に発現するNMDA受容体に作用していることが示唆された。平成29年度は、グルタミン酸に対する頚動脈小体化学受容細胞の反応特性を中心に解析する。形態学的解析については、mRNAの発現が確認された受容体に対する抗体を用いた免疫組織化学法を行い、頚動脈小体におけるグルタミン酸受容体の局在をタンパク質レベルで決定する。免疫組織化学的手法による受容体の局在解析が難航しているため、今後はカルシウムイメージング法とグルタミン酸受容体に対する作動薬・拮抗薬を用いた薬理学的解析によって化学受容細胞に発現しているグルタミン酸受容体を特定する。消耗品費の残額が生じた。平成29年度の物品費に使用する。
植物アルカロイド・フェブリフジンの生体代謝物を鍵物質とする新規抗マラリア剤の開発

多剤耐性マラリア原虫が出現し拡散していることから、マラリアの治療には新たな薬剤の開発が強く求められている。生薬・常山のアルカロイド・フェブリフジンは以前から抗マラリア剤の候補物質として注目されていたものの、強力な副作用も同時に発現することから臨床の場に供されることはなかった。したがって、フェブリフジン関連物質の医薬品としての可能性は、副作用がより軽減された化合物の分子設計にかかっている。本研究では、副作用が軽減された化合物の分子設計のヒントをマウスにおけるフェブリフジンやDf-1の生体代謝物に求めた。次いで、熱帯熱マラリア原虫に感染したヒト血液を用いたin vitroスクリーニングにより代謝物の抗マラリア活性を評価した。その結果、Feb-Aは強力な抗マラリア活性と高い選択性を示し、その値はフェブリフジンと同等であった。Feb-Cは、抗マラリア活性はフェブリフジンに若干劣るものの、その選択性はきわめて高かった。一方、Feb-B,Dの抗マラリア活性、選択性はともに期待されるものではなかった。4種の代謝物Feb-A,B,C,Dのマラリア感染ネズミを用いたin vivo実験では、in vitro実験で良好な結果を与えたFeb-A,Cはフェブリフジンよりは活性が劣るものの、腹腔内、経口投与によりクロロキンより強い活性が認められた。それらの毒性に関しては、正確なLD_<50>値は得られていないが、フェブリフジンに比べて1/10程度に軽減されている。
Xバンドレーダを用いた沿岸波浪の計測と研究解析用データセットの作成

船舶においてレーダを用いる場合には雑音とみなされる海面からの反射は、それをリアルタイムに除去するための方法はまだ確立されていない。実現のためには、船舶レーダの信号に含まれる波浪の特徴を詳細に検討し、波の向き、高さなとの状況を考慮した信号処理の開発が必要となる。視点を変えれば、レーダ信号から波に関する情報が得られる可能性もある。これまでは各研究者独自に大きな労力を払って収集してきたレーダのデータを、ここでは、個々の目的に応じた信号処理に利用できるデータのセットとしてまとめた。統一フォーマットでまとめることにより、各研究者の信号処理アルゴリズムの定量的な比較・評価にも利用できるものである。観測は新潟県上下浜周辺および弥彦山周辺、静岡県御前崎周辺および駿河湾、神奈川県相模湾および東京湾、富山県新湊周辺、千葉県九十九里浜、茨城県霞ヶ浦などで行なった。さまざまな気象・海象状況において、波に対する向きおよび海面からの高さなどを変えて収集・記録した。レーダ信号の記録と同時に、気象・海象情報、波浪状況の記録も行なっている。レーダ信号は方位方向に約0.1度間隔、距離方向に15cm間隔を基本として収集したため膨大な量のデータとなったが、バイナリーデータでCR-RあるいはDVDに記録することにより比較的容易に提供可能な形式とすることができた。また一部のデータはインターネットによる公開、配布も可能である。平成13年11月に採択通知を受け、急ぎ研究計画の検討と準備に取りかかった。舶用レーダでの海面からの反射信号データと比較するための基準となる波高計測の具体的な方法を検討した。安価でしかも取り扱いの容易な方式として、海底に重錘から伸ばした半没水型の竿の水面位置を海岸から望遠型テレビカメラで観測し画像処理で波の高さを収録する方式と、圧力センサを使用して直接電気的に計測する方式を採用し予備実験を行った。望遠型テレビカメラで観測する方式では、500m離れた位置から4cmの変化を読み取る事ができた。さらに分解能高めるために安定なカメラ台座を準備する事で分解能を高めたい。また、水圧式波高計では比較的安価な圧力センサを組み合わせることで破損や紛失時の負担を軽減する。測定値の校正は造波水槽において行ない、さらに自動的に計測記録できるようにシステムを調整中である。レーダの観測位置と波高の観測位置とが離れる(2Km以内)ので、この間を無線LAN方式でデータを即時に伝送する観測形式を構築するよう機材の準備を進めた。観測に使用するレーダや反射信号の計測記録のための機材の整備調整を行い、機器の正常な動作を確認した。観測データの提供メディアとしてはDVDを予定しており、レーダ信号と共に観測条件や気象・海象データと観測当時の撮影映像(動画)を含める計画である。当面使用する機材の取得も済み、操作の習熟に努めている。観測計画立案中に海上保安庁でも波浪観測の計画が進行中である事がわかり同時観測の日程を調整している。沿岸波浪の計測として、平成14年度は新潟県上下が浜における観測を3回、静岡県御前崎で1回、霞ケ浦の湖面の波の観測および伊良湖水道における波とシークラッタの観測を各2回、九十九里海岸における観測を1回、合計8回の現場観測を実施した。これらのデータは、レーダのアンテナの旋回角度にして0.1度毎、標本化周期は2ナノ秒を基本設定として収集されている。観測範囲は、レーダの設置位置(観測用レーダ車)から約4海里(約7.5km)である。また、観測時のアンテナの高さは、観測用レーダ車を移動させて複数の高さのデータを収集することに努めている。機材の準備状況が充実してからは、風向と風速データもあり、また、観測当時の波浪の大きさおよび波向の方向等のビデオ映像もカメラで撮影しているので、これらの映像をひとつのパッケージとしてDVD, CD-Rのメディアで提供するように準備している。

観測データはさらに蓄積を重ねていく予定であり、平成15年度においても現場観測できる機会を捉えて実施し、従来には得られなかったようなX波帯のレーダでの波浪観測データを研究者に提供することとしたい。観測データには船舶やブイ、小型の漁業用のブイなどを含んでいるデータもあるので、クラッタ処理アルゴリズムや波向、波高のデータ処理アルゴリズムの評価を行える標準データの作成を平成15年度の目標としている。研究業績沿岸における波の観測は、船舶にも港湾施設や沿岸施設の設計にも不可欠な情報だが、意外と観測データは少なく関係者は自ら独自に観測記録が行われている。そこで、信号の処理目的に応じたデータを多数観測して、デジタルデータの状態でデータを提供し、観測機材から準備しなければならない状態を解消し、広くソフトウェア処理による波浪関連研究の便宜を図るために多くのレーダ観測を行い、観測した海面等の状況写真も合わせて整理した。レーダ観測データは、新潟県上下ヶ浜、静岡県御前崎周辺、霞ヶ浦、九十九里浜、東京湾横浜、相模湾、駿河湾清水市、富山県新湊港、新潟県弥彦山からの高度を変えての観測など観測状況を変えた多数のものがある。これらのデータは観測データを添えて整理している。観測データは海岸に配置した観測用レーダ車のXバンドレーダで行っており、水平ビーム幅0.9度のファンビームアンテナを使用し、送信出力25kW、パルス幅は0.07から0.3μSである。アンテナ高は、観測位置の海抜によるが、可能な限りほぼ同様な位置で高さを買えたデータも収集した。最低高さ6mから10m、30m、山からの観測では600mまでのデータがある。観測は波だけでなく、データ処理の目的に応じて検出対象として、小型船、大型船、ブイ、遭難救助に使用されるレーダ信号(SART)を含むデータもあり、信号検出の処理アルゴリズムの評価にも使用できるデータセットを目標としている。データ観測は多くの機会において実施したが、観測の機会ごとに追加しさらに充実を図っているデータはDVDないしはCD-Rで提供する予定であるが、一部のデータはインターネットでの公開を予定している。波浪の高さや周期のデータは、観測ブイや観測塔あるいは水圧式観測データとの比較を行いたいがなかなか観測の良いタイミングや観測の機会に恵まれない。
転写調節を介したインスリンの新しい血管平滑筋作用-C/EBP活性化とその意義

我々は血管平滑筋細胞(VSMC)において、インスリンの細胞内シグナルはPI3-kinaseの活性化を介すると報告してきた。本研究ではPI3-kinaseの持続的な活性化のVSMCでの遺伝子発現調節における役割を組み替え型アデノウイルスを用いて検討した。PI3-kinaseのcatalytic subunitであるp110-αを組み替え型アデノウイルス(p110CAAX)を用いて、SDラットの胸部大動脈より単離したVSMCに過剰発現した。発現ウイルス量依存的にVSMCでのmonocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)のmRNA発現が15-20倍に増加した。従来、MCP-1の発現は、転写因子NF-κB, AP-1によって調節されることが報告されており、これらの転写因子の活性化をゲルシフト法を用いて検討した。その結果、転写因子NF-κB, AP-1はともにp110CAAXの過剰発現では活性化されなかった。そこでMCP-1遺伝子の上流域3.6kbをクローニングし、そのプロモーター解析を行った。転写開始点上流2.6-3.6kbにPI3-kinase依存性転写調節部位が確認でき、転写因子の認識配列の検索からこの領域に2ケ所のC/EBPコンセンサス配列の存在を認めた。さらにゲルシフト法、Northern blot解析、核蛋白のウエスタンブロット解析、組織染色解析より、p110CAAXの過剰発現が核内のC/EBP-β,δの発現を増強することを確認した。また、C/EBP-βおよびδの発現ベクターがMCP-1プロモーターの活性を増加させること、NF-κB認識部位の塩基置換は影響しないにも関わらず、C/EBP認識部位の塩基置換によってPI3-kinase依存性のMCP-1プロモーター活性が低下することを確認した。以上、VSMCにおいてPI3-kinaseの特異的持続的活性化は転写因子C/EBPの核内発現を増加させ、proinflammatory geneの発現を誘導しうることを明らかにした。この現象は高インスリン血症の動脈硬化発症進展の機構を解明する上で興味深い結果と考えられた。転写開始点上流2.6-3.6kbにPI3-kinase依存性転写調節部位が確認でき、転写因子の認識

配列の検索からこの領域に2ケ所のC/EBPコンセンサス配列の存在を認めた。さらにゲルシフト法、Northern blot解析、核蛋白のウエスタンブロット解析,組織染色解析より、p110CAAXの過剰発現が核内のC/EBP-β,δの発現を増強することを確認した。また、C/EBP-βおよびδの発現ベクターがMCP-1プロモーターの活性を増加させること、NF-κB認識部位の塩基置換は影響しないにも関わらず、C/EBP認識部位の塩基置換によってPI3-kinase依存性のMCP-1プロモーター活性が低下することを確認した。以上、VSMCにおいてPI3-kinaseの特異的持続的活性化は転写因子C/EBPの核内発現を増加させ、proinflammatory geneの発現を誘導しうることを明らかにした。この現象は高インスリン血症の動脈硬化発症進展の機構を解明する上で興味深い結果と考えられた。昨年までの研究よりインスリンは血管平滑筋細胞において、転写因子C/EBPを活性化させることにより炎症関連遺伝子発現を増強させることを明らかにした。本年度はさらに、血管機能に影響する遺伝子発現へのC/EBPの役割解明を試みた。遺伝子プロモーターの検索の結果、血管収縮に関わるセロトニン2A受容体がC/EBPによる調節を受ける可能性が見いだされた。1)ルシフェラーゼ法によるプロモーター解析の結果、C/EBPβの過剰発現およびPl3-kinaseの持続的活性化によりセロトニン2A受容体プロモターはそれぞれ約3倍有意に上昇した。2)SDラット大動脈より単離、培養した平滑筋細胞(VSMC)のセロトニン2A受容体mRNA発現はインスリン10nM存在下で100%有意に(P<0.05)増加し、この増加はPI3-kinase阻害薬のワルトマニンで阻害された。3)組み換え型アデノウイルスを用いてPI3-kinaseを持続的に活性化させた状態でも、VSMCでセロトニン2A受容体mRNA発現が増加した。一方、4)高インスリン血症を呈するZucker Fatty (ZF)ラット胸部大動脈でのセロトニン2A受容体のmRNA発現は対照群に比し約5倍に増加していた。5)胸部大動脈での等尺性張力測定では、内皮の有無に関わらずセロトニンは容量依存性に血管を収縮させ、セロトニン1μM以上において対照(C)群と比較しZF群で収縮性が有意に(P<0.01)亢進していた。以上、インスリン/PI3-kinase系の活性化は転写因子C/EBPを活性化により血管平滑筋でのセロトニン2A受容体の過剰発現を誘導して、セロトニンによる過剰収縮を引き起こすことが考えられた。
モティヴィック積分とスタックの双有理幾何学

19年度は、17,18年度に研究した高次ナッシュ爆発の類似物であるF爆発について主に研究を行った。F爆発は正標数の代数多様体に対しフロベニウス射とヒルベルト・スキームを使って定義される。トーリック曲面のF爆発をグレブナー基底を使って計算したところ、最小特異点解消が得られることを発見した。それにより、F爆発が興味深い研究対象であると分かり、本格的な研究を始めた。その後、F爆発は様々な良い性質を持つことが分かった。まず、その自然な構成法から、F爆発は良い関手性をもつ。例えば完備化、積、スムーズ射、基礎体の拡大と可換になる。また、ある特異点のクラスに対しては、F爆発は良い特異点解消を与える。まず1次元の代数多様体に対しては、常に特異点解消を与える。また、商特異点に対しては、Gヒルベルト・スキームからF爆発に自然な射がある。さらに有限アーベル群による商のときは、それが同型になることを示した。これにより、ある特異点のクラスに対して、F爆発がクレパント特異点解消になることを示した。この事実は、F爆発はマッケイ対応と関係があることを示唆しているように思えるが、これは今後の研究課題だ。各自然数eに対し、e次F爆発がある。1次F爆発、2次F爆発、...という列の性質に関しても、いくつかの結果が得られた。次の場合に列が安定であることをしめした:1.1次元。2.商特異点。3。正規トーリック多様体。それから、正規とは限らないトーリック多様体に対して、列がある一つの爆発で押さえられることを示した。これはフロベニウス射が同時平坦化可能であることと同値だ。この事実は、フロベニウス射を使う様々なテクニックを特異点を持つ代数多様体に適用するのに役に立つと思う。また、弱正規な代数多様体に対してe+1次F爆発からe次F爆発に自然な射があることを証明した。双有理幾何学において、特異点解消は非常に基本的な問題である。広中は全ての標数0の体の上の代数多様体は爆発と呼ばれる操作を繰り返すことで特異点解消可能であることを証明した。そこで自然に「全ての代数多様体は一つのステップで特異点解消可能か?」という問題が考えられる。私はナッシュ爆発の高次版である高次ナッシュ爆発という手法を考案し、これを使い一つのステップで特異点を解消する可能性に注目した。そして、曲線の場合にこれが実際に可能であることを証明した。高次ナッシュ爆発は与えられた代数多様体の部分スキームのモジュライ空間になっているので、良い特異点解消のモデルとなることが期待される。また、エタール射と可換であるために、Deligne-Mumfordスタックの高次ナッシュ爆発も自然と定義され、スタックの双有理幾何学への応用も考えられる。また、葉層構造を備えた代数多様体の研究のなかで、形式的スキームの部分スキームに関する病的な現象を観察した。Grothendieckにより導入された形式的スキームは無限小解析を行うために重要な概念だが、その基礎付けはまだ十分になされていないことがわかった。そのなされるべき基礎付けのひとつとして、形式的スキームの部分スキームについて考察を行い、理論を整備した。部分スキームより一般な概念、擬部分スキームという概念を定義し、その中で初めてスキーム論的な閉包をとることができることを示した。平成17年度に行った高次Nash爆発と形式スキームについて、平成18年度はさらに研究を進めた。高次Nash爆発については、一つの0次元部分スキームを考える代わりに、0次元部分スキームの旗を考えることで、旗高次Nash爆発という双有理変換にたどり着いた。この新しく定義した双有理変換は積や滑らかな射と可換であるという非常に綺麗な性質を持つ。この性質から、Artinスタックに対して旗高次Nash爆発を定義できることが分かる。あmた、私は高次Nash爆発、旗高次Nash爆発のいずれによっても、代数多様体の全ての解析的分岐が曲線の積になる場合に、特異点解消が可能であることを示した。これにより、私の高次Nash爆発による特異点解消予想を指示する状況証拠が増えたことになる。その後、より一般の状況で予想を確かめるために、曲面の特異点の場合にGroebner基底を使って計算を行ったり、変形理論やホモロジー代数を使ったアプローチを模索している。形式スキームについては、アディックやネーター的でない形式スキームやその部分スキームについて17年度に行った研究を、さらに発展させ、擬連接層の基本的性質を示し、理論の基礎を固めた。擬部分スキームの閉包の存在に関する定理を、擬連続層の拡張に関する定理に一般化した。また、擬連接層のなす圏はアーベル的でない事などを示し、この弱点を克服するために、プロ連接層を考え、その圏はアーベル的であることを示した。

まず、その自然な構成法から、F爆発は良い関手性をもつ。例えば完備化、積、スムーズ射、基礎体の拡大と可換になる。また、ある特異点のクラスに対しては、F爆発は良い特異点解消を与える。まず1次元の代数多様体に対しては、常に特異点解消を与える。また、商特異点に対しては、Gヒルベルト・スキームからF爆発に自然な射がある。さらに有限アーベル群による商のときは、それが同型になることを示した。これにより、ある特異点のクラスに対して、F爆発がクレパント特異点解消になることを示した。この事実は、F爆発はマッケイ対応と関係があることを示唆しているように思えるが、これは今後の研究課題だ。各自然数eに対し、e次F爆発がある。1次F爆発、2次F爆発、...という列の性質に関しても、いくつかの結果が得られた。次の場合に列が安定であることをしめした:1.1次元。2.商特異点。3。正規トーリック多様体。それから、正規とは限らないトーリック多様体に対して、列がある一つの爆発で押さえられることを示した。これはフロベニウス射が同時平坦化可能であることと同値だ。この事実は、フロベニウス射を使う様々なテクニックを特異点を持つ代数多様体に適用するのに役に立つと思う。また、弱正規な代数多様体に対してe+1次F爆発からe次F爆発に自然な射があることを証明した。
我が国の広葉樹二次林における生産量および炭素固定機能の評価

本研究は森林の炭素固定機能を全国的な規模でより正確に評価することをめざし、全国の大学演習林にある多様な広葉樹二次林内に試験地を設置して、地下部を含めた物質の現存量や生産量を把握する。プロジェクト最終年の研究活動として、以下の調査研究を行った。(1)固定試験地の設定と資料収集(a)固定試験地の設定:広葉樹二次林の成長経過を把握するための固定試験地の設定。全国をカバーできる試験地網の構築を目指し、既設の試験地のないまたは少ない地域や林相の森林に固定試験地を設定し、調査項目の標準化を行った。(h)土壌、土壌生物の調査:広葉樹二次林の地下部を支え、物質循環の場となる土壌や土壌動物等の把握。既設または上記(a)で新設する固定試験地のように現存量や成長量のデータがある試験地を対象(2)広葉樹二次林の生産量、炭素固定機能量推定(b)材積表の調製:広葉樹の材積表は樹種や地域を限定したものが多く、材積を求める際に問題が生じる。本研究で生産量や炭素固定機能の評価を行うためには正確な材積が必要で、枝量を考慮した材積推定が必要であるので、広葉樹二次林を構成する主要樹種の資料を収集し、新たに精度の高い材積表を調整した。(c)樹種別容積密度の測定:炭素固定機能の評価には、材積から重量への換算が必要となるので、樹種ごと容積密度を測定(d)地下部(根系)の評価方法の検討:根系は炭素貯蔵器官として重要であるが、調査等に労力がかかるため、あまりデータが得られていない。根系の現存量調査を行い、地下部の評価方法をまとめた。(3)全国規模での推定(e)全国レベルの広葉樹二次林の現存量把握:森林簿、リモセン資料、空中写真などの資料を収集し、全国レベルで広葉樹二次林の現存量を把握。(4)モデルの開発(f)炭素固定モデルの作成:バイオマスの現存量から炭素固定量把握のため、炭素固定機能モデルを開発した。対象は各地の広葉樹二次林を構成する主要樹種であり、葉量などの現存量から生産、固定される樹体量や炭素量を推定するモデル式をまとめた。(g)二次林の成長モデルの作成:現在の林分構造をもとに将来を推定するための成長モデルを開発した。対象は単木、林分の両者が考えられる。上記(f)とあわせて、広葉樹二次林の生産量、炭素固定量の推定、評価を可能するためのモデルである。

本研究は森林の炭素固定機能を全国的な規模でより正確に評価することをめざし、全国の大学演習林にある多様な広葉樹二次林内に試験地を設置して、地下部を含めた物質の現存量や生産量を把握するため今年度は1)広葉樹研究が未整備の大学演習林の広葉樹二次林に固定試験地を設置して、共通の調査手法による現存量調査を開始した。固定試験地の条件として、最低20m×20mの広さの広葉樹二次林で、樹種、胸高直径、樹高の測定を5年目ごとに実施できる管理体制があり、測定部位のマーキング、樹木位置図の作成が望ましいとした。2)各大学演習林の所有する森林現存量・成長量調査の試験地、調査結果の資料の有無、内容について予備調査を実施した。再度各大学にアンケート調査を行い、サブプロジェクトに伴って収集済みデータの提供依頼、調査地としての利用依頼等があったとき、積極的に協力、受け入れる意思があるか否かを把握した。3)本研究課題を実行するための以下のサブプロジェクトのうち実行可能なものを立ち上げ、重点的に経費を回して成果を得ることとした。(1)固定試験地の設定、(2)材積表の調製、(3)容積密度の測定、(4)地下部(根系)の評価方法の検討、(5)全国レベルの広葉樹二次林の現存量把握(リモセン、森林簿)、(6)炭素固定モデル(生産力)の作成、(7)二次林の成長モデルの作成、(8)土壌生物の調査。アンケート調査から林分現存量、成長量については既存の調査が利用できるが、土壌動物、葉面積、根系部、容積密度、リモートセンシングに関しては既存資料の利用が困難であることが判った。本研究は森林の炭素固定機能を全国的な規模でより正確に評価することをめざし、全国の大学演習林にある多様な広葉樹二次林内に試験地を設置して、地下部を含めた物質の現存量や生産量を把握する。プロジェクト2年目の研究活動として、以下の調査研究を行った。(1)新たな試験地の設定と資料収集(a)固定試験地の設定:広葉樹二次林の成長経過を把握するための固定試験地の設定。基本的には全国をカバーできる試験地網の構築を目指しながら既設の試験地のないまたは少ない地域や林相の森林について新たに固定試験地を設定。調査項目の標準化(h)土壌、土壌生物の調査:広葉樹二次林の地下部を支え、物質循環の場となる土壌や土壌動物等の把握。既設または上記(a)で新設する固定試験地のように現存量や成長量のデータがある試験地を対象(2)広葉樹二次林の生産量、炭素固定機能量推定(b)材積表の調製:広葉樹の材積表は樹種や地域を限定してつくられたものが多く、材積を求める際に問題が生じる。本研究で生産量や炭素固定機能の評価を行うためには正確な材積が必要で、枝量を考慮した材積推定が必要であるので、広葉樹二次林を構成する主要樹種の資料を収集し、新たな材積表を調整する。(c)樹種別容積密度の測定:炭素固定機能の評価には、材積から重量への換算が必要となるので、樹種ごと容積密度を測定(d)地下部(根系)の評価方法の検討:根系は炭素貯蔵器官として重要であるが、調査等に労力がかかるため、あまりデータが得られていない。根系の現存量調査を行い、地下部の評価方法をまとめる。(3)全国規模での推定(e)全国レベルの広葉樹二次林の現存量把握:森林簿、リモセン資料、空中写真などの資料を収集し、全国レベルで広葉樹二次林の現存量を把握。(4)モデルの開発(f)炭素固定モデルの作成:バイオマスの現存量から炭素固定量把握のため、炭素固定機能モデルを開発する。対象は各地の広葉樹二次林を構成する主要樹種であり、葉量などの現存量から生産、固定される樹体量や炭素量を推定するモデル式をまとめる。(g)二次林の成長モデルの作成:現在の林分構造をもとに将来を推定するための成長モデルを開発する。対象は単木、林分の両者が考えられる。上記(f)とあわせて、広葉樹二次林の生産量、炭素固定量の推定、評価を可能するためのモデルである。
難治性疼痛に対する仮想現実鏡治療の効果検証

我々はバーチャルリアリティ応用・鏡療法(VR/MVF)を開発し、様々な鎮痛方法でも痛みが軽減しない幻肢痛やCRPS(複合性局所疼痛症候群)患者での鎮痛効果を確認・報告した。当該研究ではVR/MVFの鎮痛効果をより継続させるためVR/MVF治療を音情報に変換し音楽を作成するシステムを開発した。我々はVR/MVF治療では体内に備わる痛みを和らげる機構(内因性オピオイドシステム)が活発になると考えていて、VR/MVF治療中に作成した音楽を家に持ち帰り日常生活の場で聴くことで、体内に備わる痛みを和らげる機構が再び活発となり痛みが和らぐと期待している。岡山大学病院ペインセンターでは平成17/18年度萌芽研究<仮想現実・擬似体験訓練による神経因性疼痛治療に関する研究>によりバーチャルリアリティ応用・鏡療法(VR/MVF)を開発した。当該年度にあたる平成20年8月にはイギリス・グラスゴーで開催された世界疼痛学会にて<VIRTUAL REALITY BASED MIRROR VISUAL FEEDBACK THERAPY FORCRPS AND THE MODULATION OF THE PAIN PERCEPTION AS ITS PUTATIVE MECHANISMOF ANALGESIA>と題して難治性疼痛に対する鎮痛効果を発表した。当該研究の最終的な目的は、VR/MVF治療中のタスクの進行状況を音情報に変換することで音楽を作成し、タスク実行中にその音楽を聴くことで、治療で賦活される内因性オピオイドシステムと音楽とを関連づけるシステムを開発することである。また治療中に作成された音楽を持ち帰り日常生活の場で聴くことで、治療中に関連づけられた内因性オピオイドシステムが再賦活化し鎮痛効果をえることである。平成20年度は現行システム(健常側に装着したサイバーグラブからの情報がモニター画面では患側の動きとして描出され、大きさ(難易度)の異なる対象物を掴んで棚に移動させるtarget-oriented motor task)に改良を加えた。3種類の大きさの異なる対象物に加えて、掴むことで形が変形し、更に音が発生する対象物機能を付加した。患者は視覚的フィードバックのみならず聴覚フィードバックを得ることでタスク遂行が容易となるとともに<成功報酬>という形で内因性オピオイド賦活を助長する効果が期待される。また当該研究の最終目的を達成するために対象物が仮想空間内で自由に動き回る(対象物同士が衝突すると跳ね返る)機能を開発し実際の治療に応用し始めた。この対象物の運動軌跡を音情報へ変換する方法としてヤマハTENORI-ONを購入し音への変換システムの開発を開始した。岡山大学病院ベインセンターでは平成17/18年度萌芽研究〈仮想現実・擬似体験訓練による神経因性疼痛治療に関する研究〉によりバーチャルリアリティ応用・鏡療法(VR/MVF)を開発した。またそのシステムは平成20年から22年度の基盤研究C〈難治性疼痛に対する仮想現実鏡治療の効果検証〉により更に改良が加えられた。システム(健常側に装着したサイバーグラブからの情報がモニター画面では患側の動きとして描出され、大きさ(難易度)の異なる対象物を掴んで棚に移動させるtarget-oriented motor task)に加えられた改良は、3種類の大きさの異なる対象物に加えて、掴むことで形が変形し、更に音が発生する対象物機能を付加した。また対象物が仮想空間内で自由に動き回る(対象物同士が衝突すると跳ね返る)機能を開発した。岡山大学病院ペインセンターにおいて幻肢痛やCRPS(複合性局所疼痛症候群)の患者に我々はそのシステムを応用して痛みの治療を行ってきた。その成果はpain medicine誌に〈Non-immersive virtual reality mirror visual feedbacktherapy and its application for the treatment of complex regional painsyndrome : An open-label pilot study.〉としてacceptされた。また機械学会の第37回バイオサロンでは招聘講演として〈バーチャルリアリティで手の痛みを治す〉と題し我々が行っている治療の様子と将来的な展望を発表した。バーチャルリアリティを応用したシステムは高額となるためその治療場所は岡山大学病院ペインセンターに限定されてしまう。我々は患者がいつでも治療を行えるよう、家庭版システムも並行して開発中である。実現すればより高い鎮痛効果が期待できる。この対象物の運動軌跡を音情報へ変換する方法としてヤマハTENORI-ONを購入し音への変換システムの開発中である。平成21年度にはそれまでに開発していた対象物が仮想空間内で自由に動き回る(対象物同士が衝突すると跳ね返る)

機能をもとにその跳ね返る面をヤマハTENORI-ONのバーチャル版として作成して、治療中に物体が衝突した部分が音(音楽)として演奏されるシステムが完成した。当該研究の最終年度にあたる平成22年度にはそのシステムを実際の治療に応用しその効果を検証する予定である岡山大学病院ペインセンターでは平成17/18年度萌芽研究<仮想現実・擬似体験訓練による神経因性疼痛治療に関する研究>によりバーチャルリアリティ応用・鏡療法(VR/MVF)を開発した。またそのシステムは平成20年から22年度の基盤研究C<難治性疼痛に対する仮想現実鏡治療の効果検証>により更に改良が加えられた。システム(健常側に装着したサイバーグラブからの情報がモニター画面では患側の動きとして描出され、大きさ(難易度)の異なる対象物を掴んで棚に移動させるtarget-oriented motor task)に加えられた改良は、3種類の大きさの異なる対象物に加えて、掴むことで形が変形し、更に音が発生する対象物機能を付加した。また対象物が仮想空間内で自由に動き回る(対象物同士が衝突すると跳ね返る)機能を開発した。岡山大学病院ペインセンターにおいて幻肢痛やCRPS(複合性局所疼痛症候群)の患者に我々はそのシステムを応用して痛みの治療を行ってきた。その成果は2010年のPain Medicine誌に<Non-immersive virtual reality mirror visual feedback therapy and its application for the treatment of complex regional pain syndrome : An open-label pilot study.>として掲載された。また第2回備後運動器疼痛疾患研究会では招聘講演として<岡山大学病院ペインセンター・バーチャルリアリティ鏡治療>と題し我々が行っている治療の様子と将来的な展望を紹介した。バーチャルリアリティを応用したシステムは高額となるためその治療場所は岡山大学病院ペインセンターに限定されてしまう。我々は患者がいつでも治療を行えるよう、家庭版簡易システムも並行して開発し実用化が可能な段階である。当該研究の最終的な目的は、VR/MVF治療中のタスクの進行状況を音情報に変換することで音楽を作成し、タスク実行中にその音楽を聴くことで、治療で賦活される内因性オピオイドシステムと音楽とを関連づけるシステムを開発することである。また治療中に作成された音楽や映像を持ち帰り日常生活の場で聴くことで、治療中に関連づけられた内因性オピオイドシステムが再賦活化し鎮痛効果をえることである。この対象物の運動軌跡を音情報へ変換する方法としてヤマハTENORI-ONを購入し音への変換システムの開発してきた。
種差に起因する疾患発症の遺伝様式メカニズムの解明

ヒト/マウスとラット間に存在する白内障発症責任遺伝子Mipの変異による病態発症の遺伝様式の種差を実証するため、新たなMip変異マウスおよびラットを樹立し、表現型を解析し、以下の主要な結果を得た。1)MIP欠損ラットKFRS4と類似したMip変異をもつモデルマウスをゲノム編集により作製・解析した結果、変異マウスはラットとは異なり、優性の白内障発症が認められた。また、2)ENUにより2系統のMipミスセンス変異ラットを樹立・解析した結果、両ENU変異ラットのヘテロ個体においては白内障発症が確認できなかった。これらの結果から、Mip変異によるラットの白内障発症は厳密に劣性遺伝するものと予想された。Mip (major intrinsic protein of eye lens fiber)欠損ラットであるKFRS4の白内障発症は厳密に劣性遺伝するが、これまでヒトおよびマウスで報告されているMip変異による白内障発症はすべて優性遺伝し、特に、MIP欠損マウスは、ハプロ不全によりヘテロ個体においても白内障を発症することが知られている。そこで本研究は、それらの報告に基づき、Mip変異に起因する病態の遺伝様式には「種差」が存在することを予想し、新たなMip変異マウスおよびラットを樹立することでこの遺伝現象を検証することを目指して実験を行い、以下の結果を得た。1) KFRS4同様のMip変異をもつマウス変異体の樹立:研究開始当初からES細胞を介した変異マウス作製を試みていたが、より迅速に変異マウスを作製するため、CRISPR/Cas9を利用したMip変異体の作製を実施した。その結果、ラットKFRS4変異とほぼ同様の欠損型変異体を得ることに成功し、その変異体のヘテロ個体は12週齢で散瞳剤点眼により水晶体混濁が確認され、ハプロ不全によって優性の病態発症を示すことが予想された。2)ヒトMip優性変異と類似したラット点突然変異体の樹立:ヒトMip優性変異と類似したラット変異を同定するため、ナショナルバイオリソースラットのENUミュータジェネシスライブラリーからの変異スクリーニングを実施した。その結果、コーディング領域内に2種の変異(c.511G>Cおよびc.565T>G)を同定した。これらの変異はMIP蛋白質の171番目のグリシンをアルギニンへ、189番目のフェニルアラニンをバリンへ置換するミスセンス変異であり、ヒトの優性白内障の患者において変異が検出されている部位と近傍に存在していた。そこでこれらのENU変異ラットのヘテロ個体を樹立し、白内障の発症を経時的に観察した結果、その発症は認められず、正常な水晶体構造を示していた。研究実績の概要Mip (major intrinsic protein of eye lens fiber)欠損ラットKFRS4(Kyoto Fancy Rat Stock 4)は、ヒト白内障モデルラットである。面白いことに、Mip変異をもつヒトおよびマウスの白内障発症が優性遺伝するのに対し、KFRS4の白内障発症は劣性遺伝する。この遺伝様式の差異はこれまでの遺伝学の定説では説明できず、「種差」が遺伝様式決定に関与しているものと推定された。そこで本研究はこの種間の遺伝様式の差異を実証するため、3つの検証実験を実施した。第1の実験としてKFRS4が愛玩用ラット由来であることから、その遺伝的背景が遺伝様式の差異に影響を与えている可能性を予想し、遺伝的背景が異なる3系統のラット近交系と戻し交配し、得られた個体について白内障発症の発症を観察した。その結果、Mip変異をヘテロでもつ個体はすべて正常な水晶体構造を示し、さらに高齢までその形態は維持されており、KFRS4の遺伝的背景の遺伝様式への関与は否定された(Watanabe et al. PLoS One 2012)。第2の実験としてKFRSのMip変異部位が白内障発症に影響を与えている可能性を予想し、KFRS4とは異なる領域にMip変異をもつラットのENUラットライブラリーからの単離を行った。Mipの4つのエクソンについて、4,608 DNAサンプルをスクリーニングした結果、第4エクソンにT>Gの変異が検出されたが、この変異は3'の非翻訳領域に検出された。第3の実験として、KFRS4に生じたMip変異(第一エクソンに5 bp挿入変異)が遺伝様式に影響を与えた可能性を予想し、KFRS4のMip変異を導入したノックインマウスの作製を行っている。現在までにBAC改変によりそのコンストラクトが完成し、ES細胞への導入を試みている。しかしながら、本申請課題の主要な目的であるMip変異ラットのスクリーニングおよびMipノックインマウスの作製については達成できなかった。

Mip変異ラットのスクリーニングにおいては、平成24年度内に変異ラットの樹立を達成目標としていたが、4,608のDNAサンプルのスクリーニングを行ったにもかかわらず、Mip変異はみつかったものの、その変異部位は非翻訳領域であった。一方、Mipノックインマウスの作製についても同様に平成24年度内に変異マウスの樹立を達成目標としていたが、KFRS4ラットの変異を導入したコンストラクトの構築に手間取ったため、その構築が大幅に遅れた。試行錯誤のうえ、最近BAC改変によりコンストラクトが構築でき、現在ES細胞への導入を行っている状況にある。1.ラットKFRS4変異を導入したMipノックインマウスの作製:現在コンストラクト導入中のES細胞をスクリーニングし、C57BL/6J (B6)マウスの胚盤胞にインジェクション、キメラマウスを作製し、B6へ交配後、生殖系列への伝播が確認された個体を選択し、系統化を進める。また、得られた個体のホモ個体およびヘテロ個体の白内障発症の観察および水晶体の表現型解析を実施する。また、本研究の目的は、マウスにラットKFRS4のMip変異の導入により、白内障発症が優性遺伝するか否かを検証することである。そこで予備実験として作製したコンストラクトのトランスジェニックノックインも同時に進める。2.Mip変異ラットのスクリーニング:本年度はさらに、ENUライブラリーから5,000のDNAについてMipの4つのエクソン領域の変異スクリーニングを実施し、翻訳領域内におけるミスセンス変異およびナンセンス変異の同定を目指す。得られた個体は早急に系統化を進め、表現型解析を実施する。研究代表者・吉川は助成頂いた研究費の60%、研究分担者・多屋は研究費のすべてを、ラットKFRS4変異を導入したノックインマウスの作製に使用する。また、吉川はそのMipノックインマウスおよびMip変異ラットの表現型解析のための電子顕微鏡試薬、包埋試薬、細胞染色マーカーなどに20%の研究費を使用する。研究分担者・庫本はENUライブラリーからのMip変異ラットスクリーニングに研究費のすべてを使用する。また、研究分担者の和田は庫本からラットの分与を受け、その飼育費および表現型解析に研究費を使用する。加えて、研究成果を発表するため、吉川または研究協力者である筑波大学大学院生・渡部(研究代表者所属の教育研修生)の学会旅費、論文投稿のための費用に20%の研究費を使用する。