hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
間葉系細胞ＳｅｌｅｃｔｉｖｅＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙＭｏｄｕｌａｔｏｒの探索

再生医療における最も有力な細胞源である間葉系細胞の欠点、すなわち継代による分化能の低下という欠点は未だ解消されていない。そこで、本研究では、間葉系細胞分化多能性維持に重要かつ臨床応用にあたって安全な因子を同定することにより細胞数の限界という問題を解消し、骨・軟骨再生医学の適応範囲を広げることを目的に研究を行った。その結果、Nfatc1、Runx1、Runx3が間葉系細胞分化多能性に重要であることが明らかとなった。従来、口腔外科臨床における患者の負担軽減ならびに移植成績向上を目指して、β-TCPやPRPを腸骨などに混ぜて移植する治療などが行われてきたが、必ずしも十分満足のいく成績が得られていない。そのため、必要最小限の組織採取で移植を可能とする再生医療技術の導入に向けてさまざまな研究が行われるようになっている。しかし、再生医療における最も有力な細胞源である間葉系細胞の欠点、すなわち継代による分化能の低下という欠点は未だ解消されていない。そこで、本研究では、間葉系細胞分化多能性維持に重要かつ臨床応用にあたって安全な因子を同定することにより細胞数の限界という問題を解消し、骨・軟骨再生医学の適応範囲を広げることを目的としている。前年度では、間葉系細胞に対して各種遺伝子を導入して作成した分化多能性維持因子導入細胞と非導入細胞との間で発現変化が認められる遺伝子を検索する目的でマイクロアレイ法を行ったが、今年度はマイクロアレイ法によって遺伝子発現が増加あるいは減少する可能性が認められた遺伝子の中から、本研究の目的に合致した臨床応用において安全な候補を絞り込む作業を進めた。まず、文献検索とデータベースとの照合を行い、そこで決まった優先順位に基づき、細胞内での遺伝子発現をreal time PCRで検証した。さらに、マイクロアレイとreal time PCRの結果が一致した遺伝子に対してはsiRNAによる遺伝子ノックダウンを行うことで細胞内機能解析を行った。現在のところ、Runt-related familyに属する遺伝子をはじめとした、いくつかの転写因子が臨床応用において有望である可能性を示唆する結果を得ている。そこで、本研究では、間葉系細胞分化多能性維持に重要かつ臨床応用にあたって安全な因子を同定することにより細胞数の限界という問題を解消し、骨・軟骨再生医学の適応範囲を広げることを目的として研究を遂行した。前年度までに、間葉系細胞に対して各種遺伝子を導入して作成した分化多能性維持因子導入細胞と非導入細胞との間でマイクロアレイ法を行い、マイクロアレイ法によって遺伝子発現が増加あるいは減少する可能性のある分子の絞り込む作業を行っていたが、今年度も引き続きその解析を進めた。その結果、分化多能性維持因子導入細胞においてはRunx1とRunx3の発現が誘導されることが明らかとなった。その一方で、Runx1とRunx3と同様にRunt-related familyに属するRunx2の発現は早期には誘導されなかった。さらに、機能的意義を検討する目的でsiRNAによって分化多能性維持因子導入細胞のRunx1あるいはRunx3をノックダウンすると、初期の骨分化マーカーであるtypeI collagenの発現が抑制された。これらの実験結果から、間葉系細胞の分化多能性維持にはRunx1とRunx3が重要である可能性が示唆された。口腔外科臨床における患者の負担軽減ならびに移植成績向上を目指して、β-TCPやPRPを腸骨などに混ぜて移植する治療などが行われてきたが、必ずしも十分満足のいく成績が得られていない。そのため、必要最小限の組織採取で移植を可能とする再生医療技術の導入に向けてさまざまな研究が行われるようになってきた。しかし、再生医療における最も有力な細胞源である間葉系細胞の欠点である継代による分化能の低下という欠点は未だ解消されていない。そこで、本研究では間葉系細胞分化多能性維持に重要かつ臨床応用にあたって安全な因子を同定することにより細胞数の限界という問題を解消し、骨・軟骨再生医学の適応範囲を広げることを目的とする。今年度は、間葉系細胞に対して、各種ベクターを用いて間葉系細胞分化多能性維持因子を導入して作成した間葉系細胞分化多能性維持因子導入細胞(分化多能性維持因子導入細胞)と非導入細胞を用いて、間葉系細胞分化多能性維持因子の下流遺伝子を網羅的に検索した。具体的方法としては、分化多能性維持因子導入細胞と非導入細胞との間で発現変化が認められる遺伝子を検索するために、マイクロアレイ法を行った。マイクロアレイ法によって遺伝子発現に増加あるいは減少が認められた数千の遺伝子については文献的考察をもとに候補を絞り込んでいる途中である。

その候補のうちのいくつかに関しては、real time PCRで結果を検証するとともに、既知のデータベースとの比較を行っている。この作業を通じて癌化をはじめとした様々なシグナルネットワークにおける位置付けを確認して、臨床応用に際して安全性が高いと想定される因子の選択を実行している。分化多能性維持因子の下流についての解析は、おおむね当初予定した通りで、既に複数の分子を同定するとともに、その機能解析まで進んでいるため。間葉系細胞分化多能性維持因子導入細胞(分化多能性維持因子導入細胞)と非導入細胞との間で発現変化が認められる遺伝子を検索するために、マイクロアレイ法を行い、両者において遺伝子発現に増加あるいは減少を認める遺伝子(数千遺伝子)を見出した点で、当初の計画はおおむね順調に進展しているものと考える。非常に効率的な実験遂行がなされており、無駄な実験が少ないために当初の見込みよりも研究費の使用が遅れている。研究そのものは順調なので、大きな問題はないと考えている。実際に臨床応用可能な、効果選択性の高い間葉系細胞分化多能性維持因子の下流にある安全な因子(Selective Pluripotency Modulator: SPM)を同定するために、昨年度の研究成果を基に候補分子の絞込みを行っていく。今後は高額試薬の購入や遺伝子過剰発現・遺伝子抑制に必要なベクターの作成等を外注するなどして、本研究室での作業を軽減することを考慮して、更なる研究の発展に努める予定である。本研究のために必要な設備、備品は既に研究者の教室で所有しているため、新たに設備、備品を購入する必要はない。したがって、本研究費は主として実験試薬などの消耗品と情報収集・成果発表のための旅費に充当する予定である。
国語科と英語科の連携による教員と学習者のための教科内容高度化プログラム開発

本研究は、「ことば」の学習としての共通基盤をもつ国語科と英語科の文法教育を連携させるための具体的方策を考察するものである。初期の段階で、研究全体の内容的な基礎資料となる単行本を刊行し、内容の準備に関して十全の状態を整えることができた。最終年度には、言語教育に関する単行本の原稿を仕上げるとともに、小学校との接続を視野に入れ、小学校における国語(日本語理解)と英語(外国語活動)との間で相互に有益な事象を取り上げて具体的な事例に基づく指導事例案を作成した。本研究プロジェクトは、国語科と英語科との連携を目的に具体的な教育内容の充実を図るものであるが、全3ヶ年のうちの1年目にあたる平成24年度において本研究プロジェクトの基礎文献となる単行本を刊行し、予定を上回るペースで進んだことから、2年目に当たる平成25年度は、研究代表者の勤務校(兵庫教育大学)に大学院生として在籍する小学校教員、中学校・高校の国語科教員および英語科教員との意見交換の機会をつくり、教育現場との互換性を高めるための検討を重ねた(下記[1])。併せて、言語学習や言語理解に関する基本概念を専門用語事典の中で更新した(下記[2])。一方で、社会文化学的な視点(下記[3][4])やと日本語教育の知見(下記[5])を援用し、柔軟なアプローチを取り入れる方策を志向しているところである。[1]菅井三実2014「文章作成指導へ言語学的アプローチ」『月刊兵庫教育』(兵庫県立教育研修所),平成26年3月号, pp.28-31, [2]辻幸夫・菅井三実(ほか)2014『新編・認知言語学キーワード事典』研究社出版, [3]八木橋宏勇2013『世界の英語と社会言語学ー多様な英語でコミュニケーションする』慶應義塾大学出版会.(Yamuna Kachru and Larry E. Smith, Cultures,Contexts,and World Englishes. Routledge, 2008.)の共訳), [4]八木橋宏勇「ことわざの定型性と創造性」日本ことわざ学会(2014年3月23日), [5]八木健太郎「中国人留学生の言語的実践についての一考察ー就職活動場面等における日本人学生との違いからー」留学生教育学会第18回研究大会. (2013年8月24日)本研究は、「ことば」の学習としての共通基盤をもつ国語科と英語科の文法教育を連携させるための具体的方策を考察するものである。本研究は、「ことば」の学習としての共通基盤をもつ国語科と英語科の文法教育を連携させるための具体的方策を研究するものである。本年度の研究実績は以下の通りである。第1に、初年度となる平成24年度は、研究プロジェクトの基礎資料を完成させることを最大の目標とし、その成果として、研究プロジェクト開始前から取り組んできた単行本を上梓した(下記[1])。第2に、事例研究として、英語学習と日本語学習における多義と慣用句の理解を取り上げた。英語学習と日本語学習に共通基盤を求め、現在、外国語学習の手法を古典学習に応用する方策を探求しているところである(下記[2][4])。第3に、言語研究においてはコミュニケーションという観点を見失ってはならない。認知科学の立場から、コミュニケーションに関する考察を進め、特別支援教育への貢献を視野に成果を整理した(下記[5])。[1]菅井三実2012『英語を通して学ぶ日本語のツボ』開拓社. [2]八木橋宏勇「聖書の引喩と文体的効果」日本文体論学会第101回大会, 2012年6月24日.[3]八木橋宏勇「ことわざの暗示引用」第24回ことわざフォーラムシンポジウム「ことわざと言語学」, 2012年11月10日.[4]橋本功・八木橋宏勇2012『聖書起源のイディオム42章』慶應義塾大学出版会. [5]辻幸夫「コミュニケーションと心・言語:認知科学の立場から」東京都公立学校難聴・言語障害教育研究協議会における招待講演, 2012年10月24日.平成26年度の活動内容としては、当初の計画に沿って、学習者向けの視覚教材の作成に取り組むとともに、現職教員との検討会を随時開催した。また、2011年度からの小学校外国語活動(英語教育)の必修化を受けて、小学校での英語教育が注目されていることから、小学校における国語教育と英語教育の連携にも視野を広げて取り組んだ。内容としては、認知言語学の知見にならい、視覚情報を抱負に挿入するため、パワーポイントによる教材を含め、動画や音声を取り入れた解説教材をデジタルベースで作成した。(下記[1][2])これにより、例えば、多義化(比喩的拡張)のプロセスを視覚的に理解できるようにし、英語と同じ原理で日本語の言語現象が理解できるよう配慮している。作成中のデジタル教材の妥当性に関して現職教員の意見を取り入れるため、検討会を開催する。また、作成したデジタル教材の妥当性を検証するため、試行的に実践授業での実際を参観し、効用を検討した。

[1]八木橋宏勇「英語科教員養成における対話型事例シナリオを活用したPBL教育」『杏林大学教職課程年報』創刊号, pp.1-8. [2]菅井三実「言語理論と教育実践との相互作用的アプローチ」(日本英文学会関西支部第9回大会英語学部門シンポジウム(2014年12月21日,立命館大学衣笠キャンパス)理論言語学言語教育当初の計画から大きな問題はなく、平成25年度も計画通り進んでいる。研究全体の基盤的文献となる著書が刊行され、次年度以降に具体的な研究活動を進める上での大枠が示されたほか、各共同研究者も着実に事例研究を重ねている。これまで当初の計画から大きな問題はなく、基本的に計画通り進んだ。平成24年度に上梓した単行本を基礎資料としつつ、平成25年度における教育現場との意見交換会の成果を積極的に加味し、最終年度に当たる平成26年度では具体的な教材開発に取り掛かる。これまで当初の計画から大きな問題はなく、基本的に当初の計画通り、25年度は日本語と英語を連携させ、26年度では具体的な教材開発に取り掛かる。平成25年度末に発注した消耗品等の支払いが翌年度払いになったことによる。支払いが翌年度になったことによるものであって、年度末に納品はされていることから、研究計画に大きな変更は必要ないと判断される。該当なし
高蓄積性PCB代謝物メチルスルフォン体の生成機構とその毒性評価

3-及び4-メチルチオ(MeS)-2,5,3',4'-四塩素化ビフェニル(CB70)をモデル化合物とし、動物肝ミクロゾーム(Ms)によるS-酸化反応、すなわちMeSO_2体の生成を調べた。これまでにS-酸化に関与する酵素としてチトクロムP450(P450)とフラビン含有モノオキシゲナーゼ(FMO)が知られているが、酵素の誘導剤や阻害剤を用いた検討から、本反応にはP450が主に関与していることが明らかとなった。また、MeSO_2体の生成活性の強さは動物間で大きく異なっており、モルモット≧ハムスター≫ラットの順であった。さらに、性差を調べたところ、ラットでのみ観察され、♀の活性は♂の約20%程度と低かった。これらの結果と、抗P450抗血清を用いた検討結果から、本反応に関与するP450分子種として、ラットではCYP1A1、CYP2B1及びCYP2C11が、またハムスターではHPB-1(CYP2B)が、さらにモルモットではCYP2B18が重要であることが明らかとなった。次にヒトリンパ芽球様細胞系によって発現されたヒト肝P450及びFMOを用いて、S-酸化活性を調べた。P450はCYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9*1、CYP3A4の7種類を、FMOはFMO1、FMO3、FMO5の3種類を使用した。その結果、MeS→MeSOへの反応はCYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9*1及びFMO1によって触媒された。このうち、CYP2B6とCYP2C9*1は、4-MeSO体よりは3-MeSO体の方を多く生成した。またFMOのうち、FMO1は4-MeSO体のみを選択的に生成した。一方、MeSO→MeSO2への反応は、CYP1A1とCYP2C9*1によって触媒された。なお、CYP2C9*1は3-及び4-MeSO2体を同程度生成したが、CYP1A1は4-MeSO2体のみを生成した。これらの結果から、ヒトを含めた動物肝では共通してCYP1A、CYP2B及びCYP2Cサブファミリーに属するP450がMeS体のS-酸化反応に関与しうる可能性が示唆された。また、ある種のヒトFMOもMeSO体の生成に関与しうることが示された。3-及び4-メチルチオ(MeS)-2,5,3',4'-四塩素化ビフェニル(TCB)を合成し、これらを基質として、ラット肝ミクロゾーム(Ms)によるS-酸化反応を調べた。

さらに、この酸化経路にチトクロムP450(P450)あるいはフラビン含有モノオキシゲナーゼ(FMO)のどちらが強く関与しているかを明らかにするため、以下のことを行った。まず、反応液のpHの影響について調べたところ、3-及び4-メチルスルホン(MeS0_2)体の生成はいずれもP450の至適pHであるpH7.4で最大になった。次にP450誘導剤(PB、MC)の影響について調べた。PB及びMC前処理により3-及び4-MeS体から、いずれもメチルスルホキシド(MeSO)体及びMeSO_2体の生成が促進された。特に、MC前処理による4-MeSO_2体の生成増加は顕著であった。このことから、MC誘導性のP450は3-MeS-TCBより4-MeS-TCBをよく酸化することが明らかになった。以上の結果から、2,5,3',4'-TCBのMeS体からMeSO_2体への酸化経路において、P450の方がFMOよりずっと強く関与することが明らかになった。本年度は3-及び4-メチルチオ(MeS)-2,5,3',4'-四塩素化ビフェニル(CB70)を用いて、肝ミクロゾーム(Ms)におけるMeS体→MeSO体及びMeSO体→MeSO_2体へのS-酸化活性をラット、ハムスター及びモルモットで比較するとともに、チトクロムP450(P450)及びフラビン含有モノオキシゲナーゼ(FMO)の関与の割合を各種動物で検討した。まず、S-酸化活性の動物種差を比較したところ、いずれの反応も、モルモットで最も高く、次いでハムスター、ラットの順であった。ラットの活性はモルモットの数10分の1と低いものであった。また、モルモットとハムスターでのMeSO_2の生成はラットと異なり、PB前処理により、未処理の数倍から14倍に増加した。次にP450阻害剤であるSKF525-A及びN-benzylimidazoleの影響を調べた。いずれも1mMの添加で、ハムスター及びモルモット肝MsによるMeSO_2体の生成をほぼ完全に阻害された。一方、FMO阻害剤methimazole0.15mMの添加により、ハムスターで約30%阻害されたが、モルモットでは0.45mMの添加でも全く影響を受けなかった。また、Msを50°Cで1分間温度処理した場合には、MeSO_2体の生成がハムスターでは阻害されたのに対し、モルモットでは全く阻害されなかった。以上の結果から、2,5,3',4'-TCBのMeS体からMeSO_2体への酸化経路において、モルモットではP450が主に関与しており、FMOの関与はかなり少ないことが示唆された。また、ハムスターではP450が主ではあるが、FMOもS-酸化活性全体の数10%は寄与していると考えられる。なお、P450誘導剤の結果から、P450分子種としてモルモットではCYP2B18が、ハムスターではHPB-1(CYP2B)が重要であると考えられる。昨年度までに3-/4-メチルチオ(MeS)-2,5,3',4'-四塩素化ビフェニル(CB70)の動物肝ミクロゾーム(Ms)によるS-酸化反応(MeSO2体の生成)を調べ、本反応に関与するチトクロムP450(P450)として、ラットではCYP1A1、CYP2B1及びCYP2C11が、またハムスターではHPB-1(CYP2B)が、さらにモルモットではCYP2B18が重要であることを明らかにした。そこで本年度はヒトリンパ芽球様細胞系によって発現されたヒト肝P450及びフラビン含有モノオキシゲナーゼ(FMO)を用いて、S-酸化活性を調べた。P450はCYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9*1、CYP3A4の7種類を、FMOはFMO1、FMO3、FMO5の3種類を使用した。その結果、MeS→MeSOへの反応はCYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9*1及びFMO1によって触媒された。このうち、CYP2B6とCYP2C9*1は、4-MeSO体よりは3-MeSO体の方を多く生成した。
推定量のロバストネスの研究

以前からある分布の中央値の推定について古伝的なものとして,標本の中央値で推定するので通常である。そこでその分散の推定量は,ジャックナイフ推定量では成功しない.そこでブ-ツストラップ法で求めると自然な推定量がEfronによって'79年に求められている.しかしこの推定量の結果はMart_3等によって8年に得られている。これはnyの標本に基づく経験分布関数の逆関数を用いて作られるものである。その逆関数は(0,1)区間をn等分した区間上で順序統計量が値としてある。そこで報告者は(0,1)区間をn等分するのではなく(0,1)上の一称分布で(n-1)ケの標本に基づく分割を行う.その関数の1/2の時の値の分散で中央値の分散を推定する.この考え方を平均を取ると分布の中央値の別の推定量が得られる.それは別型な順序統計量で,その係数は2項確率であたえられる.そこで古伝的なもに,マリツ等によるものと,2項係数によりもの3種類について,分布を標準正規分布,(-1/2,1/2)上の一称分布および指数分布の下で,平均目乘誤差を求め,ほぼ2項係数に基づくのが良いことがわかった。なお古典的なものは,通常良く用いられているにもかかわらず最も良くないことがわかった。また古典的な推定量の分散の推定についても同様の分布の下で計算を行ない2項係数に基づくのは悪くないことがわかった。また共分散行例に関する検定の分布を一般の分布の下でその漸近展開を求めた.この結果は今までよく仮定された正規分布,だ円分布など含まれるが,例として多次元も分布の下でこれを求めた。その結果は簡学であり正規分布以外の分布での検定間の比較について新しい見地が見い出される可能性が得られた.また検定力の計算としてブ-ツストラップ法を用いて計算を行なった。
ゲノムリシーケンスデータに基づくウシ脂肪交雑を支配する遺伝子変異の網羅的探索

GWASにより同定された脂肪交雑に対する候補領域について、ゲノムリシーケンスにより領域に存在する変異の網羅的探索を行った。本研究では、GWASにより同定された3つの候補領域のうち7番染色体の10-30Mbpを対象に行った。ゲノムリシーケンスには兵庫県黒毛和種肥育牛集団1836頭の内からGWASに用いた上下群の200頭から8頭を選出した。上位100個体からGWASでの最有意SNP(NO.1 SNP)の遺伝子型がGG型(優良アリル)を持つ去勢牛4個体、下位100個体からAA型(劣性アリル)を持つ去勢牛4個体を選択した。サンプルの8個体とデータベース上のヘレフォードの塩基配列を比較したところ、127,090個の多型を検出した。全多型をNO.1 SNPとの連鎖不平衡の度合いについて分類し、高い連鎖不平衡の関係にある(遺伝子型の一致度が16/16ー13/16)20,102個の多型を抽出した。次にこれらの多型をアノテーション(遺伝子外の多型か、遺伝子内の場合遺伝子上のどこにあるか)ごとに分類し、タンパク質の機能に影響する可能性が比較的高いと考えられる遺伝子上流、遺伝子下流、5'UTR、3'UTR、非同義置換に位置する多型をリストアップした。それらは全部で1653多型であり、179の遺伝子に含まれていた。そこで、過去の研究報告やデータベースによりリストに存在する遺伝子の機能について調査した。最終的に遺伝子の機能や遺伝子の含まれるパスウェイより、脂質代謝に影響すると考えられた8個の遺伝子、TECR、GCDH、PLIN3、DPP9、SIRT6、ACSL6、SLC27A6を候補遺伝子として抽出した。本研究は3年計画であり、各年度の大まかな目標は以下の通りである。<平成30年度>ゲノムリシーケンスによる候補多型の網羅的検出。全多型に対して、連鎖不平衡および遺伝子の機能の観点から候補多型の絞り込み。<平成31年度(令和元年度)>絞り込まれた候補多型に対して、集団での効果の検証。<令和2年度>集団で効果の見られた責任変異有力候補多型について遺伝子の機能解析。今年度は計画通りゲノムリシーケンスを行い、候補領域に存在するおよそ12万の多型を検出した。それらに対して、候補となる多型の絞り込みを行ったところ8つの候補遺伝子を抽出することができた。この時点で、次年度以降の対象となる有力な候補多型が全く検出されない可能性も危惧されたが、いくつか検証に値すると考えられる多型が検出されたため、上記計画と照らし合わせてみて概ね順調であると言える。しかしながら対象となる多型が一年で検証するには少し多いため、検証実験における優先順位の設定や、遺伝子を絞り込むためのより包括的な手段の検討が必要であると考えられた。今回リシーケンス解析によりリストアップされた8遺伝子は、脂肪の合成や分解といった脂質代謝に機能的に含まれる遺伝子であり、結果的に脂肪交雑に影響を及ぼす可能性が見込まれる。また、遺伝子の機能発現に影響を与えうる遺伝子上流や遺伝子下流、3'UTR、5'UTR、非同義置換といった多型を持つことから、この中に責任遺伝子がある可能性が高いと考えられる。なかでも脂肪として蓄積される長鎖脂肪酸の取り込みに関わるSLC27A6遺伝子においては、8遺伝子のうち唯一アミノ酸置換を伴う非同義置換多型が存在しており、現時点で最も有力な候補と考えられた。今後は、上記の候補多型について、兵庫県集団539個体に対して遺伝子型判定を行い、脂肪交雑との関連解析を行う。本集団はGWASと同じ兵庫県集団より種雄牛や形質データの分散等を考慮して選択したものであり、DNAは準備済みである。次に、兵庫県集団において効果の見られた遺伝子変異について、遺伝的背景の異なる集団を用いた効果の検証を行い、実際の肥育牛集団に対する選抜マーカー適用の可能性について調査する。用いる集団は宮崎県及び岐阜県において出荷された黒毛和種肥育牛、各597頭及び461頭を用いる。また、異なる集団における効果の普遍性を調査することにより、より高い確度で候補変異が脂肪交雑に対する責任変異であるかを確認することができると考えられる。8遺伝子多型について順次検証を行っていき、どの集団においても高い効果が確認された多型については、次年度以降の機能解析の対象としてピックアップする。

次にこれらの多型をアノテーション(遺伝子外の多型か、遺伝子内の場合遺伝子上のどこにあるか)ごとに分類し、タンパク質の機能に影響する可能性が比較的高いと考えられる遺伝子上流、遺伝子下流、5'UTR、3'UTR、非同義置換に位置する多型をリストアップした。それらは全部で1653多型であり、179の遺伝子に含まれていた。そこで、過去の研究報告やデータベースによりリストに存在する遺伝子の機能について調査した。最終的に遺伝子の機能や遺伝子の含まれるパスウェイより、脂質代謝に影響すると考えられた8個の遺伝子、TECR、GCDH、PLIN3、DPP9、SIRT6、ACSL6、SLC27A6を候補遺伝子として抽出した。本研究は3年計画であり、各年度の大まかな目標は以下の通りである。<平成30年度>ゲノムリシーケンスによる候補多型の網羅的検出。全多型に対して、連鎖不平衡および遺伝子の機能の観点から候補多型の絞り込み。<平成31年度(令和元年度)>絞り込まれた候補多型に対して、集団での効果の検証。<令和2年度>集団で効果の見られた責任変異有力候補多型について遺伝子の機能解析。今年度は計画通りゲノムリシーケンスを行い、候補領域に存在するおよそ12万の多型を検出した。それらに対して、候補となる多型の絞り込みを行ったところ8つの候補遺伝子を抽出することができた。この時点で、次年度以降の対象となる有力な候補多型が全く検出されない可能性も危惧されたが、いくつか検証に値すると考えられる多型が検出されたため、上記計画と照らし合わせてみて概ね順調であると言える。しかしながら対象となる多型が一年で検証するには少し多いため、検証実験における優先順位の設定や、遺伝子を絞り込むためのより包括的な手段の検討が必要であると考えられた。今回リシーケンス解析によりリストアップされた8遺伝子は、脂肪の合成や分解といった脂質代謝に機能的に含まれる遺伝子であり、結果的に脂肪交雑に影響を及ぼす可能性が見込まれる。また、遺伝子の機能発現に影響を与えうる遺伝子上流や遺伝子下流、3'UTR、5'UTR、非同義置換といった多型を持つことから、この中に責任遺伝子がある可能性が高いと考えられる。なかでも脂肪として蓄積される長鎖脂肪酸の取り込みに関わるSLC27A6遺伝子においては、8遺伝子のうち唯一アミノ酸置換を伴う非同義置換多型が存在しており、現時点で最も有力な候補と考えられた。今後は、上記の候補多型について、兵庫県集団539個体に対して遺伝子型判定を行い、脂肪交雑との関連解析を行う。本集団はGWASと同じ兵庫県集団より種雄牛や形質データの分散等を考慮して選択したものであり、DNAは準備済みである。次に、兵庫県集団において効果の見られた遺伝子変異について、遺伝的背景の異なる集団を用いた効果の検証を行い、実際の肥育牛集団に対する選抜マーカー適用の可能性について調査する。用いる集団は宮崎県及び岐阜県において出荷された黒毛和種肥育牛、各597頭及び461頭を用いる。また、異なる集団における効果の普遍性を調査することにより、より高い確度で候補変異が脂肪交雑に対する責任変異であるかを確認することができると考えられる。8遺伝子多型について順次検証を行っていき、どの集団においても高い効果が確認された多型については、次年度以降の機能解析の対象としてピックアップする。
人間の相互作用研究のための多言語会話コーパスの構築とその語用論的分析方法の開発

本研究の主な成果は,以下の5点である。(1)自然会話分析のための文字化入力支援及び基本的な分析項目の自動集計ツールの作成(2)「BTSJによる日本語話し言葉コーパス(2011年版)」の作成(3)BTSJによる多言語話し言葉コーパスのデータベース構築(4)話し言葉コーパスの無料配布、及び、研究成果をホームページに発表することによって、他の研究者のニーズに資するようにした。(5)談話研究、中間言語語用論等にかかわる基礎的研究を行い、語用論的分析方法、を精査し、「会話教育」に生かすための提言を行った。本研究の目的は、以下のとおりである。1.「人間の相互作用の研究」に適した質の高い「多言語自然会話コーパス」を構築する。2.「人間の相互作用の研究」に適した科学的語用論研究の方法論を開発する。3.より大規模で体系的な「多言語自然会話コーパス」を構築することによって、他の研究者のニーズに資するとともに、この分野の発展に寄与する。4.コーパスを活用した談話研究、中間言語語用論等にかかわる基礎的研究を行い、その成果を「会話教育」に生かすための提言を行うなどして、日本語教育との有機的統合を図り、日本語教育の体系化と、談話理論に基づく効果的な会話教育実践に貢献する。平成20年度は、以下のことを行った。(1)「多言語、多目的別の自然会話コーパスの構築」に関する予備調査・資料収集(3)既存データのデータベース化、及び、新規データの収集(4)特に、会話の状況、インストラクション、データ提供者の背景的情報などの研究への取り入れ方について分析・検討した。(5)作成済みの多言語自然会話データ、及び、他の資料も活用して、談話研究、語用論、会話教育等についての基礎的研究を行った。平成21年度は、以下のことを行った。<人間の相互作用研究のための多言語自然会話コーパスの構築>(1)「BTSJの入力支援ソフト」の改定(2)コーパス作成用「データベース・システム」の改定(3)新規データの収集と上記システムを用いた既存のデータの整備(4) BTSJの入力支援ソフトの使い方や、コーパスを用いた語用論的研究の方法論についてのデモンストレーションを行った。(日本語学会。2009年10月)(5)会話データだけでなく、会話の状況、インストラクション、データ提供者の背景的情報などもコーパスに体系的に含む統制された「質の良い」データの構築をめざし、コーパスに付与する情報構成などを検討し、入力した。<コーパス・データの語用論的分析方法の開発>(1)様々な観点、特に、会話の状況、インストラクション、データ提供者の背景的情報などの研究への取り入れ方について分析・検討を行った。<談話研究、異文化コミュニケーション研究、中間言語の語用論的研究>(1)談話研究、中間言語語用論的研究、ことばとジェンダー関係の研究、及び、会話教育等についての研究を行った。1.「人間の相互作用の研究」に適した質の高い「話し言葉コーパス」を構築する。3.より大規模で体系的な「話し言葉コーパス」を構築することによって、他の研究者のニーズに資するとともに、この分野の発展に寄与する。最終年度である平成22年度は、以下のことを行った。〈人間の相互作用研究のための話し言葉コーパスの構築と文字化入力支援・集計システムの開発と完成〉(1)「BTSJの入力支援ソフト」の保存形式を多様化し、自動集計機能を強化した完成版として「BTSJ入力支援・集計ソフト」を作成した。(2)コーパス作成用「データベース・システム」の改訂版を作成した。

(3)新規データの収集と上記システムを用いた既存のデータの整備を行い、「BTSJ話し言葉コーパス」を完成させた。(4)成果発表として、BTSJの入力支援・集計ソフトの使い方や、コーパスを用いた語用論的研究の方法論についての講義、デモンストレーション、ワークショップを行った。〈コーパス・データの語用論的分析方法の開発〉(1)会話データだけでなく、話者の関係、会話の状況、インストラクション、データ提供者の背景的情報などもコーパスに体系的に含む統制された「質の良い」データの構築をめざし、コーパスに付与する情報構成などを検討し、拡充した。〈談話研究、異文化コミュニケーション研究、中間言語の語用論的研究〉(1)談話研究、ポライトネス理論研究、中間言語語用論的研究、ことばとジェンダー関係の研究、及び、会話教育についての研究、及び、その発表を行った。
自然免疫系を標的とした急性期・晩期放射線性消化管症候群の治療戦略の開発

電離放射線に被曝した臓器は、その感受性に応じて様々な機能障害を起こす。人体において、消化管は放射線に対する感受性がとりわけ高く、放射線事故や癌の放射線治療において高線量の放射線に曝されると、急性期から晩期に渡って多様な障害が引き起こされる。これまでに研究代表者は、マウスにおいて好酸球の遺伝子欠損が放射線誘導性小腸線維症の症状を、またTLR3の遺伝子欠損が放射線誘導性口腔内粘膜炎の症状を顕著に抑えることを見出しており、本研究課題ではその仕組みについて解析した。H29年度には放射線誘導性小腸線維症に好酸球が寄与する仕組み、ならびにその治療手段についての研究成果を論文発表した。放射線誘導性口腔内粘膜炎については、TLR3の阻害剤による口腔内粘膜炎の予防効果についてさらに解析を進めた。本研究課題では、放射線誘導性小腸線維症については病態メカニズムの解明および当該知見に基づいた予防法の検証に関する研究成果を平成29年度に論発表した。口腔内粘膜炎の解析では、平成30年度の目標であるTLR3阻害剤の効果の追加検討、またTLR3が誘導する下流の情報伝達機構についての解析を進めた。平成31年度も口腔内粘膜炎の解析に集中して解析を行う。平成30年度での解析をさらに進めることに加えて、放射線化学療法に伴う口腔内粘膜炎に対するTLR3阻害剤の効果の検証、舌上皮細胞の3次元培養を活用したin vitro解析法の準備を進める。これらについて成果が得られれば、引き続き国内外の学会、学術誌を通して研究報告を行う。放射線誘導性小腸線維症に好酸球が寄与する仕組みについて、H28年度に設定した解析により、1放射線照射を受けた小腸では陰窩上皮細胞が慢性的な壊死を起こしてATPを細胞外に漏出すること、2ATPで活性化した陰窩近傍の筋繊維芽細胞がCCL11を産生し、CCR3依存的に好酸球を誘致すること、3活性化した筋線維芽細胞はGM-CSFを産生して好酸球を活性化し、それにより活性化した好酸球はTGF-βを発現して筋線維芽細胞のコラーゲン産生を促すことが分かった。これらの結果に従い、H29年度では放射線誘導性小腸線維症を防ぐ手段としてATP受容体拮抗剤、CCR3中和抗体、さらに好酸球除去効果を持つIL-5受容体α抗体を試験したところ、いずれも顕著な予防効果を示した。放射線誘導性口腔内粘膜炎について、TLR3の阻害剤による口腔内粘膜炎の予防効果についてさらに解析を進めた。これらに関して国内外の学会ならびに学術誌において研究報告を行った。本研究課題では、平成29年度の研究計画として、線維症の解析では好酸球を標的とした薬剤の治療効果を検討することを目標とした。研究代表者はH28年度に明らかにした病態メカニズムに従い、予防効果が期待される薬剤としてATP受容体拮抗剤、CCR3中和抗体、さらに好酸球除去効果を持つIL-5受容体α抗体を評価したところ、いずれも腹部照射後にマウスに反復投与によって小腸線維症を劇的に押さえることができた。ここまでの研究成果を学術論文にまとめ、science translational medicineに投稿し、採択された。一方で、口腔内粘膜炎の解析では、平成29年度の目標であるTLR3阻害剤の効果の検討について、期待通りに阻害剤が顕著に口腔内粘膜炎を抑えることを明らかにした。また、TLR3が誘導する下流の情報伝達機構についても問題なく準備を進めている。これらの成果を国内外の学会で研究報告するとともに、国内の学術誌に総説を寄稿した。以上のように、おおむね申請時の計画の通りに研究は進展している。

これまでに研究代表者は、マウスにおいて好酸球の遺伝子欠損が放射線誘導性小腸線維症の症状を、またTLR3の遺伝子欠損が放射線誘導性口腔内粘膜炎の症状を顕著に抑えることを見出しており、本研究課題ではその仕組みについて解析した。放射線誘導性小腸線維症に好酸球が寄与する仕組みについて、H28年度では1好酸球の線維化部への流入を誘導する機構、2好酸球の活性化を誘導する機構、3好酸球による線維化促進機構を解析した。放射線を受けたマウスの小腸では、繊維化部において活性化した筋線維芽細胞がCCL11を発現し、CCR3依存的に好酸球を誘致することが分かった。さらに、活性化した筋線維芽細胞はGM-CSFを産生して好酸球を活性化し、それにより活性化した好酸球はTGF-βを発現して筋線維芽細胞のコラーゲン産生を促すことが分かった。放射線誘導性口腔内粘膜炎について、TLR3がいかにして上皮傷害を起こすかを調べた。放射線を受けたマウスの舌での炎症細胞の浸潤を評価したところ、上皮構造が破たんして潰瘍化した部分でのみ浸潤が認められたことから、TLR3が炎症細胞を誘致して上皮傷害の起こすわけではないと考えられた。合成リガンドであるpoly(I:C)をマウスに投与したところ、糸状乳頭の基底細胞に細胞死が誘導されたため、おそらくは放射線照射後に発生したTLR3リガンドにより細胞死が亢進することが、上皮構造の破たんに拍車をかけていると考えられた。さらに、TLR3の阻害剤が口腔内粘膜炎を顕著に抑えることも確認した。これらに関して国内外の学会ならびに学術誌において研究報告を行った。本研究課題では、平成28年度の研究計画として、線維症の解析では1好酸球の線維化部への流入を誘導する機構、2好酸球の活性化を誘導する機構、3好酸球による線維化促進機構を明らかにすることを目標とした。研究代表者は上記の計画を平成28年度のうちにすべて達成し、詳しくは1繊維化部において活性化した筋線維芽細胞がCCL11を発現し、CCR3依存的に好酸球を誘致すること、2活性化した筋線維芽細胞がGM-CSFを産生して好酸球を活性化すること、3活性化した好酸球はTGF-βを発現して筋線維芽細胞のコラーゲン産生を促すことを明らかにした。一方で、口腔内粘膜炎の解析では、平成28年度の研究計画として、TLR3が上皮細胞に誘導する傷害の形態を明らかにすることを目標とした。結果として、TLR3は上皮の細胞死を誘導していることを明らかにした。さらに、平成29年度の目標であるTLR3阻害剤の効果の検討を先に行い、期待通りに阻害剤が顕著に口腔内粘膜炎を抑えることを明らかにした。これらの成果を国内外の学会で研究報告するとともに、国内の学術誌に総説を寄稿した。以上のように、おおむね申請時の計画の通りに研究は進展している。平成31年度も口腔内粘膜炎の解析に集中して解析を行う。
レドックス反応に基づくグルタミン酸神経機能イメージング法の開発

腎不全で蓄積した尿毒素は、グルタミン酸受容体の一つであるNMDA受容体を活性化し、グルタミン酸神経の機能異常を示すことが示唆されている。本研究では、Overhauser-enhanced MRI(核・電子間の2重共鳴法;OMRI)を用いた、腎不全モデルマウス脳内におけるレドックスイメージングを行った。腎臓摘出後2、4および8週間後のマウスについて評価を行った。脳内酸化ストレスの指標としては、腎不全マウス(8週)のみ、脳内8-OHdGの蓄積が認められた。放射状水迷路による脳機能の評価では、摘出8週において学習障害が認められたが、2及び4週においては正常マウスと同等の学習能力を示した。また、OMRIを用いて脳レドックスイメージングを行ったところ、4週において造影剤であるmethoxycarbonyl-PROXYLのレドックス反応亢進が認められたが、8週においては正常レベルであった。以上の結果から、OMRIによる脳機能評価では、行動変化や酸化物蓄積に先立つ病態変化をとらえることが出来る可能性が示唆された。本年度は、下記の2点について検討を行った。(1)腎不全マウス脳内におけるレドックスバランスの評価腎不全マウス脳内の酸化ストレスは、DNAの酸化物である8-OHdGの免疫染色によって評価した。腎摘出後、2、4及び8週間経過したマウスの脳を摘出し、8-OHdGの免疫染色したところ、8週群において脳内860HdGの蓄積が認められた。脳機能は、放射状水迷路を用いて評価したところ、同様に8週群のみ学習障害が確認された。また、血漿中においても脂質過酸化物の蓄積や過酸化水素の上昇が認められた(2)NMDA型グルタミン酸受容体を介した尿毒素によるレドックス反応の評価尿毒素によるグルタミン酸神経系へ直接的な作用を検討するために、慢性腎不全マウスから得られた血清を徐タンパクした後、マイクロダイアリシス法にて脳内灌流し、グルタミン酸動態や過酸化物蓄積を評価した。血清の脳内灌流においては、グルタミン酸及び過酸化水素の変動は認められなかった。この原因として、毒性を発揮する尿毒素の濃度が低いことが考えられた為、これまでに中枢性に障害を与えると報告されている尿毒素、Methylguanidine及びGuanidinosuccinic acidを、マイクロダイアリシス法を用いて脳内灌流した(てんかん発作を誘発することが知られている濃度:各1mM)。脳内グルタミン酸濃度は、いずれの化合物についても灌流時に低下が認められた。また、Methylguanidine灌流時においては、過酸化水素の生成がベースラインの1.5倍程度の上昇を示した。以上の結果から、尿毒素の種類によっては、脳内において過酸化水素を生成し酸化ストレスを惹起する可能性が示唆された。前年度の結果をふまえ、平成21年度は、以下の点について検討を行った。(1)腎不全モデルマウスにて生成する活性種とニトロキシルラジカル反応性の検討前年度の研究結果から、腎不全モデルマウスの脳内において過酸化水素を生成する可能性が示唆された。我々は、酸化ストレスモデルマウスにおいて過酸化水素が生成した場合、さらにヒドロキシルラジカルが生成すること、その際に生体内でニトロキシルラジカルと反応し、ニトロキシルラジカルがヒドロキシルアミン体へと変換することを明らかにした。(2) OMRIを用いたグルタミン酸神経機能の画像解析尿毒症モデルマウスにおける脳機能は、腎摘出2、4、及び8週後に放射状水迷路によって評価した。摘出8週において学習障害が認められたが、2及び4週においては正常マウスと同等の学習能力を示した。一方で、OMRIを用いて脳レドックスイメージングを行ったところ、4週において造影剤であるmethoxycarbonyl-PROXYLのレドックス反応亢進が認められたが、8週においては正常レベルであった。フリーラジカル反応については、L-band ESRを用いたスペクトル解析についても同様に検討を行った。その結果、OMRI測定と同様に、腎臓摘出4週間群のみにて、フリーラジカル反応の亢進が認められた。前年度に行った8-OHdG免疫染色による酸化ストレスの評価では、8週群においてDNA酸化物の蓄積が認められている。
ATP感受性K^+-channelとその遺伝子の局在に関する組織学的解析

inward-rectifying K^+ channelのひとつのuK_<ATP>-1は、ubiquitous typeのATP感受性K^+ channel(K_<ATP>)であり、そのmRNAは脳、骨格筋、心臓、腎臓などに広く分布するが詳細な局在は解明されていない。ラット脳と腎臓、およびそれぞれの発生過程におけるK_<ATP>の蛋白とmRNAの発現局在をインサイトハイブリダイゼーション法と免疫組織化学により解明した。uK_<ATP>-1のmRNAと蛋白はラット腎臓においては胎生15日より腎盤の原基に弱い局在が観察された。胎生18日では分技している集合管の細胞質全体が明瞭なuK_<ATP>-1の活性を示した。成獣では尿細管が中等度の活性を示し、さらに糸球体にも弱い活性が観察され、uK_<ATP>-1が尿細管や集合管の成熟に関与する可能性が考えられた。一方ラット脳においては胎生15日以降に発現し、成獣では殆どの神経細胞、神経核に広く存在し、嗅球、海馬、脳幹の諸核、小脳などで中等度以上の発現が見られた。さらに脳梁と小脳白質でも小型細胞がmRNAと蛋白とも陽性であり、グリア細胞における局在が確認された。腎臓、脳のいずれにおいても蛋白は顆粒状の陽性像を示したが、電顕観察によりミトコンドリアであることが確認され、、ミトコンドリアの容積調節などの基本的な機能に関わることが考えられた。uK_<ATP>-1と同じsubfamilyの属するBIRの局在を観察すると、脳ではuK_<ATP>-1と同様に神経細胞とグリア細胞の両者に陽性であった。(本研究で使用した抗体は千葉大学の清野進教授の御好意による。)inward-rectifying K^+ channelのひとつのuK_<ATP>-1は、ubiquitous typeのATP感受性K^+ channel(K_<ATP>)であり、そのmRNAは脳、骨格筋、心臓、腎臓などに広く分布するが詳細な局在は解明されていない。)inward-rectifying K^+channelのひとつのuK_<ATP>-1は、ubiquitous typeのATP感受性K^+channelであり、種々の臓器にそのmRNAが存在するが、このチャンネルの蛋白の局在に関して、詳細な報告はなされていない。胎生15日、18日、20日、生後0日4日、16週ラットを灌流固定後、凍結切片を作成し、抗uK_<ATP>-1抗体を用いてABC法により腎臓におけるuK_<ATP>-1の局在を観察した。胎生15日には、腎盤の原基に弱い活性が観察された。胎生18日では、nephrogenic mesenchymeに向かって分技している集合管の細胞質全体が、明瞭なuK_<ATP>-1の活性を示した。腎皮質では、いくつかの尿細管や糸球体の原基が弱い活性を示した。生直後では多くの尿細管が明瞭な活性を示し、皮質の表層よりも深部の方が活性が強い傾向がみられた。また陽性の構造は細胞内で顆粒状を呈していた。成獣ラット腎臓では、尿細管と集合管の活性に比較して、血管平滑筋と糸球体の活性がより強く発現していた。uK_<ATP>-1が胎生18日頃から集合管の機能に関与し、また尿細管や集合管の成熟に関与する可能性が考えられた。(一次抗体は千葉大学医学部の清野進教授の御好意による。)ATP-感受性K^+チャンネルの一つuK_<ATP>-1は、細胞内のエネルギー状態と膜電位とを関連づける特徴を有するといわれ、そのmRNAは脳、骨格筋、心臓、腎臓などに広く分布するが詳細な局在は解明されていない。ラット脳におけるuK_<ATP>-1のmRNAと蛋白の局在をインサイトハイブリダイゼーション法と免疫組織化学により検索した。成獣ラットを灌流固定し一部は未固定で凍結切片を作成した。

抗uK_<ATP>-1抗体を用いてABC法により染色を行なった。uK_<ATP>-1の蛋白は種々の神経細胞、神経核に広く存在した。前嗅核、脳幹の諸核たとえば赤核、動眼神経核、三叉神経中脳路核、蝸牛神経核、下オリーブ核、顔面神経核などで中等度から強度の発現が見られた。松果体や脈絡叢でも強い陽性像を示した。小脳ではプルキンエ細胞のみならず小型の細胞も陽性であったが、顆粒細胞における発現は明白ではなかった。大脳では海馬錐体細胞、歯状回顆粒細胞に発現がみられ、新皮質の各層に発現していたが、VVI層がやや強かった。全体として殆どの神経細胞に顆粒状の陽性像を示し、既に報告した尿細管のミトコンドリアにおける局在(解剖誌、73、p.73、1998)と同様であった。またmRNAの発現も上記の蛋白の局在とほぼ一致することが確認された。抗uK_<ATP>抗体は千葉大学の清野進教授の御好意による。
上皮性歯胚における細胞質シアリダーゼの不均一な局在とシアロ複合糖質との関連

(研究目的)細胞質シアリダーゼの存在意義を追求するため、本酵素の遺伝子発現が、上皮性歯胚を構成する3種の細胞において、大きく異なる事実に注目し、次の2点を検討した。(1)エナメル髄の上皮細胞が、再び細胞質シアリダーゼを発現すること無くそのライフサイクルを終えるのか否か(免疫および遺伝子組織化学的手法を用いて)。(2)細胞質シアリダーゼの遺伝子発現量の変化に同調するシアロ複合糖質の量的または質的変化が、上皮性歯胚に認められるか否か(レクチン組織化学的手法を用いて)。(研究結果)ラット第一臼歯のエネメル質の形成前、形成期、成熟期、歯根形成期の上皮性歯胚について観察した。本酵素の発現は、遺伝子組織化学の結果では内外のエナメル上皮に比べエナメル髄において極めて低いが、電子顕微鏡を用いた免疫組織化学(免疫電顕)の結果では同じ程度であった。また、歯牙の形成過程に沿って経時的にみても、本酵素の発現は量的変化に乏しく各時期において同じ程度であった。一方、シアロ複合糖質の量は経時的に変化した。シアロ複合糖質の量は、形成期エナメル芽細胞と形成期初期の中間層細胞においても最も多かった。それ以外の時期、および部位においては相対的に少なかった。シアロ複合糖質の質的変化(シアル酸残基の結合部位が異なるタイプへの変化)は認められなかった。(考察、結論)本研究で観察したシアロ複合糖質は、主として細胞表面や細胞外基質に局在するものと考えられる。そのシアロ複合糖質の量的変化に本酵素の量的変化が明確に同期しないことから、本酵素が細胞表面や細胞外基質のシアロ複合糖質のライフサイクルに関与する可能性は低いと考えられる。今後は、細胞内のシアロ複合糖質の量的変化に注目し、それと本酵素との因果関係を検討する必要がある。
破骨細胞の分化と機能を阻害する低分子化合物の関節リウマチ治療への応用

本申請者は、分泌型糖タンパクであるWnt5aが受容体型チロシンキナーゼであるRor2を介しRANKLにより誘導される破骨細胞分化を促進することを発見した。関節リウマチ(RA)滑膜にはWnt5aが過剰に発現しているとの報告があったことから、RAによる骨破壊を抑制する目的で、RAモデルに対し本経路を阻害する可溶型Ror2の投与実験を行った。その結果、組織学的に骨組織のみならず軟骨組織も保護されていることが、偶発的に明らかとなった。本経路は炎症性サイトカインやmatrix metalloproteinase(MMP)の産生にも関与するとの報告が散見される。現在、RAの治療は生物学的製剤が用いられているが、そのほとんどは炎症性サイトカインを標的としたものである。骨代謝、炎症性サイトカイン産生およびMMP産生の3つに共通した経路を分子標的とすることは、骨破壊、炎症による痛みおよび軟骨破壊のそれぞれの病態を改善させると考える。本研究の目的は、Wnt5a-Ror2経路を阻害する低分子化合物が新規RA治療薬として応用可能かどうかを検討することである。当初、野生型/Wnt5a KO/Ror2 KOマウスの胎仔より胎仔線維芽細胞(MEF)を調製し、それぞれの細胞を、TNFαで刺激し、炎症性サイトカイン、ケモカインおよびMMPの産生をリアルタイムPCR、ELISAなどで検討する予定であった。遺伝子欠損マウスを用いた実験を施行する前に、細胞株を用いた実験を先行実験を行っている。本実験に入る前のこれらの実験に、予想以上時間がかかったため、進捗状況はやや遅れている。細胞株を用いて行う実験で、使用する炎症性サイトカインやリアルタイムPCR用のプライマーは、今後遺伝子欠損マウス由来の細胞を用いて行う実験と共通のものである。細胞株を用いた実験で、一定の傾向が見いだされれば、速やかに動物実験開始許可の手続きに移り、本実験を開始していく予定である。冒頭でも述べたように、当初、野生型/Wnt5a KO/Ror2 KOマウスの胎仔より胎仔線維芽細胞(MEF)を調製し、それぞれの細胞を、TNFαで刺激し、炎症性サイトカイン、ケモカインおよびMMPの産生をリアルタイムPCR、ELISAなどで検討する予定であった。本実験に入る前のこれらの実験に、予想以上時間がかかったため、進捗状況はやや遅れているため、次年度繰越金が生じた。今年度は遺伝子欠損マウス由来の細胞を用いて実験を行えるよう善処する。