hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝癌前駆・幹細胞と癌微少環境構成細胞の解明：肝癌撲滅を目指して

癌は、原発巣及び転移巣において癌微小環境を形成し、癌組織内は癌細胞周囲の癌構成細胞が重要な役割を果たしている。原発巣及び肝転移巣において、癌関連線維芽細胞や腫瘍関連マクロファージの重要性が明らかとなった。癌細胞内のエクソソームが転移前に線維芽細胞に入り込み、転移する環境を形成することを証明した。また、血液中にも分泌され、エクソソームを介した癌細胞・周囲細胞間の存在を確認した。腫瘍細胞内のエクソソームが、癌形成時・転移時においての重要な役割を果たしていると証明された。本研究の最初の目標として癌細胞と癌微小環境構成細胞の役割について明らかにすることであった。先ず転移性肝癌において癌細胞と癌関連線維芽細胞の相互作用を画像上明らかにし、特に癌細胞が間質細胞に近接存在する状態下で癌細胞分裂像が認められることを視覚的に証明し論文報告した。また、転移性肝癌において非癌部よりも癌部および癌部辺縁にコラーゲン・線維性タンパクが多いことも証明し報告している。つまり、癌関連線維芽細胞が癌形成時に重要であることが証明され、癌形成時に重要な細胞であることが解明された。しかし、さまざまな癌種の癌転移時の微小環境を検討してみたが、転移部位によって癌微小環境の細胞構成が異なること、また癌腫により微小環境を構成する細胞が異なることがわかり、すべての癌において癌関連繊維芽細胞が重要であるとは限らないことが解明されたため、現在さらに詳細な検討をしている。次の目標として癌構成にて中心的役割を担う癌関連繊維芽細胞の性質を解明することであった。転移の際に癌エクソソームが転移巣を形成するときに、転移前に特に繊維芽細胞内に入り込み、転移する環境を形成することを視覚的に証明し、今年度学会報告したため今後論文化予定である。これら癌関連繊維芽細胞の性質については現在検討している最中である。また近年、脂肪肝・非アルコール性脂肪肝などが増加傾向にあるため、背景肝の違いによる癌形成時および転移性癌の癌細胞および癌形成周囲細胞の相互作用を解明していく予定である。癌構成における癌細胞と癌微小環境構成細胞の役割について明らかにすることが本研究の目標の一つである。転移性肝癌において癌細胞と癌関連線維芽細胞の相互作用を癌細胞・線維芽細胞をシングルレベルで画像化し、特に癌細胞が間質細胞に近接存在する状態下で癌細胞分裂像が認められることを視覚的に証明し、さらに転移性肝癌において非癌部よりも癌部および癌部辺縁にコラーゲン・線維性タンパクが多いことも証明し報告した。微小環境の細胞の中でも特に癌関連線維芽細胞が癌形成・転移時に重要であることが証明され、癌形成時に重要な細胞であることが解明された。さまざまな癌種の癌転移時の微小環境を検討したところ、転移部位によって癌微小環境の細胞構成が異なること、また癌腫により微小環境を構成する細胞が異なることが明らかになり、すべての癌において癌関連繊維芽細胞が重要であるとは限らないことが解明され論文報告した。癌構成にて中心的役割を担う癌関連繊維芽細胞の性質を解明することであった。転移の際に癌エクソソームが転移巣を形成するときに、転移前に特に繊維芽細胞内に入り込み、転移する環境を形成することを視覚的に証明し、今後論文化予定である。また近年、本邦では脂肪肝・非アルコール性脂肪肝などが増加傾向にあるため、背景肝の違いによる癌形成時および転移性癌の癌細胞および癌形成周囲細胞の相互作用を解明していく最中であり検討を進める予定である。癌発生時・転移時における癌細胞と癌微小環境構成細胞の役割について明らかにするために肝癌細胞に蛍光タンパクを導入し、脾注することで癌構成が明確になる肝臓癌担癌モデルを作成した。予想されたとおり中心的役割を担うのは癌関連繊維芽細胞や癌関連マクロファージであった。現在、癌細胞株による相違と分離した癌細胞株よりエクソソームのみを分離し、miRNAの解析を進行中である。癌構成における癌細胞と癌微小環境構成細胞の役割について明らかにすることが本研究の目標であった。昨年に続き転移性肝癌において癌細胞と癌関連線維芽細胞の相互作用を癌細胞・線維芽細胞をシングルレベルで画像化し、特に癌細胞が間質細胞に近接存在する状態下で癌細胞分裂像が認められることを視覚的に証明し、さらに転移性肝癌において非癌部よりも癌部および癌部辺縁にコラーゲン・線維性タンパクが多いことを報告した。さまざまな癌種の癌転移時の微小環境を検討したところ、転移部位によって癌微小環境の細胞構成が異なること、また癌腫により微小環境を構成する細胞が異なることが明らかになり、すべての転移部位において癌関連繊維芽細胞が重要であるとは限らないことが解明され論文報告した。さらに癌細胞と癌関連線維芽細胞の細胞融合している現象も突き詰め、特に腹水中にはその融合細胞の割合が多く、何らかの役割が有ると予想され引き続き検討中である。転移の際に癌エクソソームが転移巣を形成するときに、転移前に特に繊維芽細胞内に入り込み、転移する環境を形成することを視覚的に証明した。癌細胞株による相違と分離した癌細胞株よりエクソソームのみを分離し、miRNAの解析は未だ検討中である。

さらに脂肪肝・非アルコール性脂肪肝などが増加傾向にあるため、背景肝の違いによる癌形成時および転移性癌の癌細胞および癌形成周囲細胞の相互作用を解明し、現在論文化を進めている状況にある。癌は、原発巣及び転移巣において癌微小環境を形成し、癌組織内は癌細胞周囲の癌構成細胞が重要な役割を果たしている。原発巣及び肝転移巣において、癌関連線維芽細胞や腫瘍関連マクロファージの重要性が明らかとなった。癌細胞内のエクソソームが転移前に線維芽細胞に入り込み、転移する環境を形成することを証明した。また、血液中にも分泌され、エクソソームを介した癌細胞・周囲細胞間の存在を確認した。腫瘍細胞内のエクソソームが、癌形成時・転移時においての重要な役割を果たしていると証明された。癌発生時・転移時における癌細胞と癌微少環境構成細胞の役割について明らかにするためにHuh7,HepG2などの肝癌cell lineにGFPもしくはRFPの蛍光蛋白を導入し、脾注することで癌構成が明確になる肝臓癌担癌モデルを作成した。予想されたとおり中心的役割を担うのは癌関連繊維芽細胞や癌関連マクロファージであった。現在、培養癌細胞と分離した癌細胞よりエクソソームのみを分離し、miRNAの解析を進行中である。癌種の違いによる癌転移時の微小環境を検討で転移部位によって癌微小環境の細胞構成が異なること、また癌腫により微小環境を構成する細胞が異なることが明らかになり、すべての癌において癌関連繊維芽細胞が重要であるとは限らないことが解明されたため、この相違について検討する。その癌・非癌部のmiRNAは、治療の際の標的分子となりうると同時に癌の病状に関してその後の経過を占う予後因子として注目されている。マウスモデルから得られたデータからターゲットになりそうなmiRNAをReal-time PCRなどで発現状況の詳細な検討を行う。一般的に肝疾患の病態は1030年かけて慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進行するため、各病気のステージにおける評価は非常に重要なことである。将来発展可能なら当病院の倫理委員会に承認が得られた後、実際の組織あるいは血清で相違が見られるか、発現状況を詳細に調べる予定である。消化器内科miRNAは、治療の際の標的分子となりうると同時に癌の病状に関してその後の経過を占う予後因子として注目を浴びている。現在のマウスモデルから得られたデータからターゲットになりそうなmiRNAをReal-time PCRなどで発現状況の詳細な検討を行う。可能なら当病院の倫理委員会に承認が得られた後研究を発展させ、実際の組織あるいは血清で各肝疾患ステージで相違が見られるか、発現状況を詳細に調べる。今年度は本研究の準備段階と位置づけており、来年度以降にさらに詳細な実験などを計画している。そのため費用が今年度以上に必要であると考えられ、次年度への繰り越しが生じた。平成26年度は本研究の準備段階と位置づけており、平成27年度以降にさらに詳細な実験などを計画している。そのため費用が平成26年度以上に必要であると考えられ、次年度への繰り越しが生じた。主な支出用途としては実験器具、試薬を予定している。他に中間の結果を発表するための学会参加旅費などを検討している。
小児癌局所におけるHLA拘束性癌特異的キラーT細胞の解析

小児癌に対する特異免疫機構の存在に関する研究はあまりされていなかった。そこで小児固形癌患児より自家癌特異的CTL株の樹立を行ない、免疫学的に未成熟な小児期においても腫瘍特異的免疫応答が誘導されているか否かを調べ、小児固形癌における特異的癌ワクチン開発の可能性を検討するために本研究を行った。我々は3ヵ月令のWilms腫瘍患者の癌局所内浸潤リンパ球(TIL)より細胞傷害性T細胞株を樹立した。この細胞傷害性T細胞株の膜表面表現型は、CD3+CD4-CD8+であり、HLA-クラスIの遺伝子型はA2402/A3302およびB4403/B4601であった。この細胞傷害性T細胞株は自家腫瘍を含むHLA-A2402陽性の種々の組織(大腸、胃、肺、卵巣)由来の腺癌や食道扁平上皮癌に対し特異的な細胞傷害活性を示した。しかしながら、HLA-A2402陰性腫瘍やK562赤芽腫細胞株、およびHLA-A2402陽性の正常細胞には細胞傷害性を示さなかった。これらの結果よりこの細胞傷害性T細胞株はHLA-A2402拘束性に癌細胞を認識している可能性が示唆された。そこで、HLA-A2402陰性卵巣腺癌細胞株KOC-7CにHLA-A2402cDNAをトランスフェクトした細胞に対する反応性をインターフェロンガンマ産生を指標として検討したところ、HLA-A2402拘束性が確認された。これらの結果より、HLA-A2402拘束性に癌細胞を認識し、特異的に傷害する細胞傷害性T細胞が小児のWilms腫瘍患者の腫瘍局所に存在していることが示唆された。このことは、小児固形癌における特異的癌ワクチンの可能性を支持するものであり、今後の開発研究に科学的根拠を賦与するものである。(目的)近年、ヒト癌細胞に対する腫瘍特異的キラーT細胞の存在が明らかにされその認識する癌退宿抗原も一部同定され、その癌退宿抗原を用いた腫瘍特異的免疫療法も臨床応用に向け研究されている。しかしながら、小児固形腫瘍における腫瘍特異的キラーT細胞の存在に関する報告はわずかである。今回、小児固形腫瘍よりキラーT細胞の樹立を試み、年少児における抗腫瘍免疫の存在と、腫瘍特異的免疫療法の可能性に関して検討した。(結果)得られたIL-2 activated Tリンパ球はHLA-A2402拘束性に細胞障害性を示し、他の癌細胞株及びヒト正常細胞株に対しては細胞障害性は示さなかった。細胞障害性は抗CD3抗原、抗CD8抗原で抑制された。IL-2activatedTリンパ球はHLA-A2402導入ヒト癌細胞株に対して細胞障害性を示し、そのHLA-A2402拘束性が証明された。(考察)3生月の乳児のWilms腫瘍組織漫潤リンバ球よりHLA-A2402拘束性腫瘍特異的細胞障害性キラーT細胞を誘導した。また、HLA-A2402発現各種ヒト癌細胞株に対しても細胞障害性を示し、このキラーT細胞の認識する癌退宿抗原が、他の癌細胞にも広く発現している事も示唆される。年少児においてもMHC class-Iに拘束した抗腫瘍免疫が存在し、腫瘍特異免疫治療の可能性が考えられる。
過酸化脂質をターゲットとしたホスホリパーゼA2のタンパク質工学的解析と応用

ハブ毒腺ホスホリパーゼA2(PLA2)の基質結合部位アミノ酸である67位Asn残基置換体の卵黄ホスファチジルコリンの過酸化脂質に対するリン脂質分解活性を調べた。過酸化リン脂質に対する分解活性は、いずれも非過酸化リン脂質に比べ低下していたが、Asp置換体など荷電をもつ変異体に対して、その傾向が顕著であった。このように過酸化脂質に対する特異性の変化がみられた。54位71位部分をランダムに変異させたものについては、構造的に重要な部位であるためかリフォールディンク効率などで問題が生じたため、量的に十分なものは得られなかった。過酸化脂質とアポトーシスとの関連が報告されていること及びよりin vivoに近い系での解析を行うため培養細胞を用いたassay系を導入した。PLA2アイソザイム間(Asp-49-PLA2およびBPI,BPII)でのBHK細胞に対する効果が異なり、BPIおよびBPIIは細胞毒性を示すが、Asp-49-PLA2は細胞毒性を示さなかった。また、BPIとBPIIは67位がAsnとAspの1残基のみ異なるが、BPIIの方が強い細胞毒性(約10倍)を示し、ここでも基質結合部位アミノ酸残基の重要性が明らかになった。しかしながら、Asp一49-PLA2と異なることから67位変異体のほかにC端側領域についても着目し、キメラ変異体を作成した。興味深いことにC端側部位をBPI/IIに置換したキメラ変異体とAsp-49-PLA2は、BHK細胞においてはBPIIの細胞毒性をさらに増強することがわかった。また、SkMC細胞をもちいた場合には、キメラ変異体は逆に阻害作用を示し、細胞によって異なる作用を示した。今後は、細胞種間でのリン脂質などの組成の違いなどを考慮し、解析する必要がある。本研究により新たなPLA2の機能および細胞への作用を見い出すことができた。本研究計画では、ハブ毒腺ホスホリパーゼA2(PLA2)の基質結合部位のアミノ酸残基をタンパク質工学的に変異させ、基質特異性に関する構造-機能相関を明らかにし、これをもとに過酸化脂質特異的なPLA2を作出することを目的とする。本年度は、PLA2変異体のデザインとその調製を主に行った。67位Asn残基をSer,Gly,Lys,Aspへと置換したPLA2変異体については、Ser置換体は卵黄ホスファチジルコリンミセルリン脂質および卵黄ホスファチジルグリセロールミセルリン脂質に対していずれも活性が弱く(20分の1以下)、Gly置換体は卵黄ホスファチジルコリンミセルリン脂質に対しては活性が弱くなっていたが(50分の1)卵黄ホスファチジルグリセロールミセルリン脂質に対しては変わらなかった。他の変異体は変わらなかった。高度不飽和脂肪酸であるアラキドン酸を2位に含むホスファチジルコリンミセルリン脂質に対しては、Ser置換体が活性を保持していたが、他の変異体は活性が弱くなっていた(2050%)。したがって、67位Ser置換体にアラキドン酸に対する特異性の増強がみられた。一方、リン脂質認識部位の一部である54位から71位についてランダムに変異を導入するために先ず、PLA2の5253位部分に制限酵素MunI siteおよび8182位に相当する部分に制限酵素ScaI siteをそれぞれ導入した。部位特異的変異は、PCR法により行った。MunIおよびScaI制限酵素での切断により、カセット法でランダムに変異を導入するためのベクターを構築した。54位から71位に相当するフラグメントDNAは、MunIおよびScaIを含みさらに66位のCys残基を保存する形で合成した。Ligation反応後、大腸菌JM109株に形質転換した。PLA2変異体の効率的大量発現のために、リフォールデイング反応の際、限外濃縮器とリザーバーを組み合わせた方法で行い、これまでの23倍の効率で行うことができた。

また、SkMC細胞をもちいた場合には、キメラ変異体は逆に阻害作用を示し、細胞によって異なる作用を示した。今後は、細胞種間でのリン脂質などの組成の違いなどを考慮し、解析する必要がある。本研究により新たなPLA2の機能および細胞への作用を見い出すことができた。
ミクロネシアの民俗芸能に見る日本の植民地教育の影響に関する民族音楽学的研究

まず、昨年度の日本国内およびパラオにおける調査結果をさらに整理し、平成15年6月に英語による口頭発表"The adoption of Micronesiansong and Dance by Ogasawara Islanders"(Seventh AnnualAsian Studies Conference Japan、上智大学市谷キャンパス)を行った。また、昨年度のチュークにおける予備調査結果を受けて、中央東カロリン諸島における日本植民地教育の実態調査の必要性を感じ、8月にポナペおよびチュークで聞き取り調査を行った。その結果、行進踊りそもののの発祥地が東カロリン諸島周辺である可能性が明らかになり、日本統治時代にこの芸能に日本語混じりの歌が取り入れられていった経緯が明らかになった。またボナペでは、現在も日本語混じりの歌を伴う行進踊りが継承されているのに対して、チュークでは教会関係の行事を除くと、踊りの機会すらないことがわかった。これらと、昨年度のパラオにおける調査結果を合わせ、「海のルートと循環するルーツ-歌と踊りによるミクロネシアとの交流」(季刊誌『I-Bo』)で紹介するとともに、「行進踊りと日本語混じりの歌-ミクロネシアの民俗芸能に見る日本の植民地教育の影響に関する歴史的研究-」(『静岡大学教育学部研究報告』)としてまとめた。さらに、3月には1930年代にミクロネシアの行進踊りが伝播した小笠原諸島を訪問し、その後の日本文文化の様相について調査を行った。まず、東京学芸大学、神戸大学付属図書館等で戦前の唱歌および唱歌遊戯に関する資料収集を行い、当時の日本国内における音楽教育の指導法についての調査研究を行なった。その結果、唱歌指導と遊戯指導が一体化していたことがわかった。これを手がかりとして、平成14年8月に約2週間、日本植民地時代に南洋庁がおかれたパラオに滞在し、当地の民俗芸能の現状についての調査を行った。その際、まずパラオ国立博物館副館長のオリンピア・モレイ氏を訪問し、日本の植民地教育の影響を受けたと思われる芸能のサーベイ調査および文献、ビデオ・テープなどの資料収集を行った。また、パラオ文化庁退官後も民俗芸能(踊り)の創作・指導者として活躍しているリオサン・サルバドール氏(1937年生)を訪問し、1)パフォーマンスの普及・継承・機会など、2)パラオの人たちの日本文化への関心や日常生活上での影響、3)日本の植民地教育、などについての聞き取り調査、およびビデオ・テープなどの資料収集を行った。その結果、最近創作された民俗芸能にまで、広く日本の植民地教育(とくに唱歌踊り)の影響が見られることがわかった。また、別の調査目的で平成14年12月にミクロネシア・チューク諸島を訪問した際、デュブロン島在住の日本植民地時代とその芸能に詳しいライモン・レーベン氏(1933年生)ほかを訪問し、聞き取り調査を行った。以上から得られた資料の整理作業をすすめるかたわら、研究成果の一部を公表(口頭発表および論文発表)した。
同時計数運動量測定による強光子場中多原子分子ドレスト状態の解明

高強度超短レーザーパルスを集光して得られた強光子場との相互作用によって,CS_2,CO_2,N_2O等の3原子分子から生成したフラグメントイオンを位置敏感型イオン検出器を用いて観測した.それぞれのフラグメントイオンの持つ運動量は,検出器上での位置および検出器までの飛行時間からクーロン爆発事象ごとに決定した.強光子場(0.36PW/cm^2,60fs)におけるクーロン爆発過程CS_2^<3+>→S^+C^++S^+,によって生成したS^+,C^+イオンの運動量ベクトルp_1(S^+),p_2(S^+),p_3(C^+)をCMI法によって測定した.これらの運動量ベクトルに対して定義された角度パラメータXおよびθをプロットした運動量相関図には.「協奏的」3体爆発過程に対応するX=90°近辺の強い分布の他に,「段階的」過程に対応する2本の腕状の分布が明確に観測された.この腕状の分布は準安定CS^<2+>分子の自由回転を考慮した古典モデルに基づいて理解することができ,CS^<2+>の寿命がその回転周期(10ps)に比べて十分に長いことが明らかとなった.これは,S^+-CS^<2+>間距離が1μm以上離れてから最終的な3体解離が起こることを示している.また,「協奏的」3体爆発過程によって生成したS^+およびC^+の運動量ベクトルの平均値<P_1(S^+)>,<P_2(S^+)>,<P_3(C^+)>から,クーロンポテンシャルを仮定した古典計算に基づいて,クーロン爆発直前のCS_2^<3+>の構造決定を行った.その結果,C-S結合距離としてr2.5(1)Åが得られ,CS_2X^1Σ_g^+状態のr_0=1.555Åよりも1.61倍長いC-S結合距離を持つことが見いだされた.また分子軸周りの方位角平均をとったS-C-S結合角として<γ>=150(1)°が得られた.これは変角零点振動を考慮に入れたCS_2X^1Σ_g^+状態の値<γ>=174.5°と比べて小さく,クーロン爆発直前のCS_2^<3+>が屈曲座標方向に大きく変形した構造を持つことが明らかとなった.高強度超短レーザーパルスを集光して得られた強光子場との相互作用によって,CS_2,CO_2,N_2O等の3原子分子から生成したフラグメントイオンを位置敏感型イオン検出器を用いて観測した.それぞれのフラグメントイオンの持つ運動量は,検出器上での位置および検出器までの飛行時間からクーロン爆発事象ごとに決定した.強光子場(0.36PW/cm^2,60fs)におけるクーロン爆発過程CS_2^<3+>→S^+C^++S^+,によって生成したS^+,C^+イオンの運動量ベクトルp_1(S^+),p_2(S^+),p_3(C^+)をCMI法によって測定した.これらの運動量ベクトルに対して定義された角度パラメータXおよびθをプロットした運動量相関図には.「協奏的」3体爆発過程に対応するX=90°近辺の強い分布の他に,「段階的」過程に対応する2本の腕状の分布が明確に観測された.この腕状の分布は準安定CS^<2+>分子の自由回転を考慮した古典モデルに基づいて理解することができ,CS^<2+>の寿命がその回転周期(10ps)に比べて十分に長いことが明らかとなった.これは,S^+-CS^<2+>間距離が1μm以上離れてから最終的な3体解離が起こることを示している.また,「協奏的」3体爆発過程によって生成したS^+およびC^+の運動量ベクトルの平均値<P_1(S^+)>,<P_2(S^+)>,<P_3(C^+)>から,クーロンポテンシャルを仮定した古典計算に基づいて,クーロン爆発直前のCS_2^<3+>の構造決定を行った.その結果,C-S結合距離としてr2.5(1)Åが得られ,CS_2X^1Σ_g^+状態のr_0=1.555Åよりも1.61倍長いC-S結合距離を持つことが見いだされた.また分子軸周りの方位角平均をとったS-C-S結合角として<γ>=150(1)°が得られた.これは変角零点振動を考慮に入れたCS_2X^1Σ_g^+状態の値<γ>=174.5°と比べて小さく,クーロン爆発直前のCS_2^<3+>が屈曲座標方向に大きく変形した構造を持つことが明らかとなった.(1)位置敏感型イオン検出チャンバーの設置と性能評価新たに製作した位置敏感型イオン検出チャンバーを設置し,テスト用位置敏感型イオン検出器を取り付けて,チャンバー内真空度,レーザー強度,イオン引きだし電場,およびレーザー偏光方向などの最適化を行った.ターボ分子ポンプを用いてチャンバー内真空度を10^<-10>

Torr以下に保つことによって生成した強光子場(10^<14>-10^<15>W/cm^2)におけるクーロン爆発イベントを,残留気体からの擬コインシデンス信号を最小限にとどめて検出できることが分かった.またイオン引きだし電場を最適化することによって10x10^3amu m/s程度の高い運動量分解能を持つことが明らかとなった.(2)強光子場中(0.38PW/cm^2)におけるCS_2のクーロン爆発過程,CS_2^<3+>→S^++C^++S^+,に着目し,生成するすべてのイオンの運動量を同時に測定した.生成した2つのS^+イオンが持つ運動量ベクトルp_1(S^+),p_2(S^+)がなす角θ(S^+, S^+)はピークを135°に持つ分布(FWHM30°)を示した.これはCS_2X^1Σ_g^+状態の分子構造を保ったままクーロン爆発を起こした場合(ピーク165°)に比べて著しく狭く,強光子場中のCS_2^<z+>(z=0-2)において,変角振動方向に直線形から屈曲形へと大きな運動が誘起されたことが初めて見い出された.観測されたS^+およびC^+の運動量ベクトルの平均値<p_1(S^+)>, <p_2(S^+)>, <p_3(C^+)>から,クーロンポテンシャルを仮定した古典計算に基づいて,クーロン爆発直前のCS_2^<3+>の構造決定を行った.その結果,クーロン爆発直前のCS_2^<3+>が屈曲座標方向および結合伸長座標方向に大きく変形した構造を持つことが明らかとなった.強光子場(1PW/cm^2)中の分子は,光子場との強い相互作用によって多重イオン化し,クーロン爆発を起こすことが知られている.本研究では、コインシデンス運動量画像(CMI)法を用いて,単一の親分子イオンから生成したすべての原子イオンを同時検出し、さらにそれぞれのイオンが持つ運動量を決定することによって、強光子場における3原子分子のクーロン爆発過程を調べた.高強度超短レーザーパルスを集光して得られた強光子場との相互作用によって,CS_2,CO_2,N_2O等の3原子分子から生成したフラグメントイオンを位置敏感型イオン検出器を用いて観測した.それぞれのフラグメントイオンの持つ運動量は,検出器上での位置および飛行時間からクーロン爆発事象ごとに決定した.強光子場(0.36PW/cm^2,60fs)におけるクーロン爆発過程<CS_2>^<3+>→S^++C^++S^+,によって生成したS^+,C^+イオンの運動量ベクトルp_1(S^+),p_2(S^+),p_3(C^+)をCMI法によって測定した.これらの運動量ベクトルに対して定義された角度パラメータχおよびθをプロットした運動量相関図には.「協奏的」3体爆発過程に対応するχ=90°近辺の強い分布の他に,「段階的」過程に対応する2本の腕状の分布が明確に観測された.図に示すように,この腕状の分布は準安定CS^<2+>分子の自由回転を考慮した古典モデルに基づいて理解することができ,CS^<2+>の寿命がその回転周期(10ps)に比べて十分に長いことが明らかとなった.これは,S^+-CS^<2+>間距離が1μm以上離れてから最終的な3体解離が起こることを示している.また,「協奏的」3体爆発過程によって生成したS^+およびC^+の運動量ベクトルの平均値<p_1(S^+)>,<p_2(S^+)>,<p_3(C^+)>から,クーロンポテンシャルを仮定した古典計算に基づいて,クーロン爆発直前のCS_2^<3+>の構造決定を行った.その結果,C-S結合距離としてr2.5(1)Åが得られ,CS_2X^1Σ_g^+状態のr0=1.555Åよりも1.61倍長いC-S結合距離を持つことが見いだされた.また分子軸周りの方位角平均をとったS-C-S結合角として<γ>=150(1)°が得られた.
エンブリオジェニックカルスを用いたファレノプシスの形質転換系の開発

ファレノプシスのエンブリオジェニックカルス(EC)からは多数のPLBが形成される.そこで,ECにパーティクルガンを用いて遺伝子導入を行い,再生したPLBから遺伝子組み換え体の選抜を試みた.Phalaenopsis Richard Shaffer'Santa Cruz'のPLB切片より誘導したECを供試し,プラスチックシャーレにろ紙を敷き,その直径30mmの円内にEC(500600mg)をのせた.まず,パーティクルガンの発射圧力がβ-グルクロニダーゼ遺伝子(gus)の一過性発現に及ぼす影響を調べた.その結果,プラスミドDNApBI221の場合には140kg/cm^2,pWI-GUSでは170kg/cm^2のときに,発現数はそれぞれ最大となった.また,いずれのベクターでも140kg/cm^2になるとgusの一過性発現数は明らかに多くなった.次に,遺伝子組み換え体選抜のため,ピアラホス耐性遺伝子(bar)をもつDNApMSP38とともに,gusをもつDNApWI-GUSをECに撃ち込んだ(発射圧力;140kg/cm^2).遺伝子導入したECをVW培地に移植したところ,約15,000個のPLBが分化した.0.5および1.0mg/lのビアラホス添加培地にこれらを2週間ごとに移植し,さらに5mg/lビアラホス添加培地への移植を2回行った結果,緑色または黄緑色の6個のPLBが得られた.これらをビアラホス無添加培地に移植したところ,うち5個体は枯死し,1個体は緑色を回復して2個のPLBを形成した.これらの2PLBは,その上部切片より小植物体を形成し,下部切片からはそれぞれ8個,14個のPLBが形成された.しかしながら,これらの生存2個体由来の小植物体から抽出したDNAを鋳型としておこなったPCRでは,gus,barのいずれについても増幅断片は認められなかった.温度条件を変えてPCRを行ったが,結果はネガティブであった.また,gus発現検定においても,これらの植物体では呈色反応は観察されなかった.ファレノプシスのエンブリオジェニックカルス(EC)からは多数のPLBが形成される.そこで,ECにパーティクルガンを用いて遺伝子導入を行い,再生したPLBから遺伝子組み換え体の選抜を試みた.Phalaenopsis Richard Shaffer'Santa Cruz'のPLB切片より誘導したECを供試し,プラスチックシャーレにろ紙を敷き,その直径30mmの円内にEC(500600mg)をのせた.まず,パーティクルガンの発射圧力がβ-グルクロニダーゼ遺伝子(gus)の一過性発現に及ぼす影響を調べた.その結果,プラスミドDNApBI221の場合には140kg/cm^2,pWI-GUSでは170kg/cm^2のときに,発現数はそれぞれ最大となった.また,いずれのベクターでも140kg/cm^2になるとgusの一過性発現数は明らかに多くなった.次に,遺伝子組み換え体選抜のため,ピアラホス耐性遺伝子(bar)をもつDNApMSP38とともに,gusをもつDNApWI-GUSをECに撃ち込んだ(発射圧力;140kg/cm^2).遺伝子導入したECをVW培地に移植したところ,約15,000個のPLBが分化した.0.5および1.0mg/lのビアラホス添加培地にこれらを2週間ごとに移植し,さらに5mg/lビアラホス添加培地への移植を2回行った結果,緑色または黄緑色の6個のPLBが得られた.これらをビアラホス無添加培地に移植したところ,うち5個体は枯死し,1個体は緑色を回復して2個のPLBを形成した.これらの2PLBは,その上部切片より小植物体を形成し,下部切片からはそれぞれ8個,14個のPLBが形成された.しかしながら,これらの生存2個体由来の小植物体から抽出したDNAを鋳型としておこなったPCRでは,gus,barのいずれについても増幅断片は認められなかった.温度条件を変えてPCRを行ったが,結果はネガティブであった.また,gus発現検定においても,これらの植物体では呈色反応は観察されなかった.ファレノプシスのエンブリオジェニックカルス(EC)からは多数のプロトコーム状球体が形成されることが知られている.遺伝子導入後により多くの再生植物体を得られれば,その中に遺伝子組み換え植物体が含まれる可能性も高くなることが期待される.そこで,本年度は,ECにパーティクルガンを用いて遺伝子導入を行うための条件について検討した.実験には,Phalaenopsis Richard Shaffer′Santa Cruz′のECを供試した.プラスチックシャーレにろ紙を敷き,その直径30mmの円内にEC(生体重500600mg)をのせた.DNAの導入はレーボック自動空気式遺伝子導入装置(モデル-260,レーボック商工株式会社)によって行い,発射圧力を55,140,170または190kg・cm^<-2>とした.また,大腸菌由来のプラスミドDNApBI221,およびジェミニウイルスDNAを改変して作製されたpWI-GUSを用いて,ECにおけるβ-グルクロニダーゼ遺伝子(gus)の一過性発現を調べた.

その結果,撃ち込み48時間後のgus発現は,発射圧力55kg・cm^<-2>のときにはほとんど認められず,pBI221では140kg・cm^<-2>,pWI-GUSでは170kg・cm^<-2>のときに一過性発現数がそれぞれ最高であった.発射圧力が同じならば,pBI221に比べてpWI-GUSを用いたほうが概して発現数が多かった.また,いずれのベクターを用いても,発射圧力が140kg・cm^<-2>になるとgusの一過性発現数は明らかに多くなった.しかしながら,それ以上の圧力では発現数にほとんど差が認められなかった.これらのことから,今後,目的遺伝子および選抜マーカー遺伝子を導入するにあたっては,ジェミニウイルスベクターを140kg・cm^<-2>の圧力で撃ち込むことが妥当であると判断された.ファレノプシスのエンブリオジェニックカルス(EC)からは多数のプロトコーム状球体(PLB)が形成されることが知られている.そこで,本年度は,ECにパーティクルガンを用いて遺伝子導入を行い,再生したPLBにおいて遺伝子組み換え体の選抜を試みた.実験には,Phalaenopsis Richard Shaffer 'Santa Cruz'のPLB切片より誘導したECを供試した.プラスチックシャーレにろ紙を敷き,その直径30mmの円内にEC(生体重500600mg)をのせた.遺伝子組み換え体選抜のため,パーティクルガン(レーボック商工製)により,ビアラホス耐性遺伝子(bar)をもつプラスミドDNApMSP38とともに,gusをもつプラスミドDNApWI-GUSをECに撃ち込んだ.このときの発射圧力は,昨年度の実験結果から,140kg/cm^2とし,シャーレあたり2回ずつ撃ち込んだ.シャーレは12枚供試した.遺伝子導入したECをVW培地に移植したところ,約15000個のPLBが分化した.0.5および1.0mg/lの除草剤ビアラホスを含む培地にこれらのPLBを2週間ごとに移植し,さらに5mg/lビアラホス添加培地への移植を2回行った結果,6個のPLBまたはPLB集塊が緑色ないしは淡い黄緑色を維持していた.これらを生存していると見なしてビアラホス無添加培地に移植したところ,うち5個体は生長することなく枯死した.生存した2個のPLBは,その上部切片より小植物体を形成し,下部切片からはそれぞれ8個,14個のPLBが形成された.しかしながら,これらの生存2個体由来の小植物体から抽出したDNAを鋳型としておこなったPCRでは,gus,barのいずれについても増幅断片は認められなかった.温度条件を変えてPCRを行ったが,結果はネガティブであった.また,gus発現検定においても,これらの植物体では呈色反応は観察されなかった.
ハシリショウジョウバエを用いた光周性の新規な順遺伝学モデルの構築

光周性とは、生物が一日あたりの日照時間を測定し、その長さに応じて生理的な反応を引き起こすメカニズムである。動物の光周性は、遺伝子操作が可能なモデル動物が存在しないため、分子レベルでの理解が進んでいない。本研究ではまず、ハシリショウジョウバエ(Chymomyza costata)をモデル動物として確立することを試みた。しかしながら同種は大量飼育と採卵が困難であったため、他のショウジョウバエ種も検討した。その中で、D. putridaの季節性体色変化が光周性を示すことを発見した。また、飼育の容易さではD. bifasciataがもっとも優れており、同種が遺伝学モデルとして最適であると結論された。光周性は、生物が1日当たりの日照時間を測定し、その長さに応じて生理的な反応を引き起こすメカニズムのことを言う。本研究の目的は、遺伝学実験が可能な新たな光周性のモデル生物を確立することにあった。ショウジョウバエ科(Drosophilidae)の昆虫は、世代時間が短く、室内での大量飼育が可能なため、遺伝学モデルとして最適である。私は、光周性を示すことが報告されている複数のショウジョウバエ種を収集し、モデル生物としての飼育の難易度等のモデル生物としての適性を比較検討した。マエグロハシリショウジョウバエ(Chymomyza costata)は、短日条件において幼虫休眠を行うことが知られている。私自身も継代飼育及び光周性休眠の誘導に成功した。また、光周性に関わるとされる神経回路の免疫染色にも成功した。しかしながら、同種は世代時間が1ヶ月程度とやや長く、産卵数も少ないため、大量飼育が困難であることがわかり、遺伝学実験に適しているとは言えないと判断した。次に注目したのがDrosophila putridaである。同種は春に羽化した個体と夏に羽化した個体で体色が異なることが知られていた。私はこの体色の変化が光周性によって制御されていることを発見した。これは双翅目における光周性体色変化の初めての例である。飼育培地の最適化により、D. putridaの大量飼育法の確立にも成功した。同種を用いて化学変異原による変異誘発のパイロット実験を行った。約2000ゲノムをスクリーニングした結果、yellowやwhite等の変異体が得られた。D. putridaにおけるトランスジェニック作成も試みた。D. melanogasterと同じ方法でDNA微量注入を行ったところ、ほとんどの胚が死んでしまった。今後、方法の最適化が必要である。動物の光周性における日長測定システムは、分子メカニズムがほとんど未解明の一大テーマである。申請者の長期的目標は、順遺伝学的手法により日長測定に関わる遺伝子を網羅的に同定し、システムの全貌を一挙に解明することである。当研究課題においては、そのためのモデル生物として、光周性の順遺伝学的解析に最適と考えられるショウジョウバエ種を新規遺伝学モデル生物として確立する。研究計画調書では、光周性幼虫休眠を起こすハシリショウジョウバエ(Chymomyza costata)を用いることを提案したが、C. costata以外にも様々な光周性行動を示すショウジョウバエ種が存在する。実際に大規模実験を行う上では、飼育の容易さが非常に重要なポイントになることから、光周性を示すショウジョウバエ種を複数飼育し、「飼いやすさ」の観点から比較検討を行った。光周性卵巣休眠を起こすDrosophila triauraria、Drosophila bifasciata、季節性体色変化を起こすDrosophila putridaを飼育・観察した。光周性における日長測定には概日時計が関与することが示唆されている。C. costataの脳において概日ニューロンがどのような構成をしているかを明らかにするため、キイロショウジョウバエの概日時計関連タンパク(Period, Clock, Pdf)に対する抗体を用いて免疫染色を行った。Pdfニューロンの染色パターンはC. costataとキイロショウジョウバエでよく保存されていた。GAL4/UASシステム等のツールを整備することは遺伝学モデル確率の上で必須である。ショウジョウバエ種でトランスジェニックを作成するための一連のベクターを構築した。ベクターにはPiggyBacシステムを用いた。C.costataは過去の報告の通り、18°Cの飼育条件下で極めて明確な光周性休眠を示した。しかしながら、一世代が30日と長いこと、産卵数がそれほど多くないことから、大量飼育が困難であり、本種を用いた突然変異体スクリーニングは断念した。D. triauraria、D. bifasciataの二種は大量飼育に適するものの、卵巣休眠が外部形態としては評価できないので、スクリーニングには向いていないと判断した。

D. putridaは春・秋に生まれた個体と、夏に生まれた個体で、色彩が異なることが知られている。今回、この季節性多型が日長に依存して変化することを見出した。同種は世代時間が20日と短く、飼育も比較的容易であることから、同種を用いて光周性異常変異体のスクリーニングを開始した。これまでに、X染色体についてENU処理をした2000系統をスクリーニングしたが、まだ光周性変異体は得られていない。キイロショウジョウバエのwhite, yellow, vermilionに相当する変異体は得られており、変異原処理については方法論を確立することができた。キイロショウジョウバエのPdf, Per, Clkタンパクに対する抗体を用いてC.costataの幼虫脳における免疫染色を行い、Pdfニューロンの走行パターンを明らかにした。Per, Clkは染色がうまく行かなかった。形質転換ベクターとして、PiggyBacをバックボーンとするベクターを多数構築した。現在D. putridaにマイクロインジェクションを試みているが、キイロショウジョウバエと同じ方法では生存率が極めて低いことが判明した。今後方法論の最適化が必要である。引き続きD. puturidaを用いて光周性異常を示す突然変異体のスクリーニングを行う。D. triauraria, D. bifasciataは、飼育が極めて容易であることから、トランスジェニックを用いた解析に適していると期待される。平成25年度は、これらの種のための形質転換ベクターを開発し、トランスジェニック系統の作出を行う。C. costata, D. triauraria, D. bifasciataには、生息地の緯度に依存して臨界日長の異なる地域集団が存在する。昨年度、フィンランド、スイス、北海道由来の地域集団を入手したので、臨界日長の差を生むQTLの解析にむけて予備実験を行う。該当なし。
全ゲノム相関解析を用いたクローン病関連遺伝子の同定および病態解明

クローン病(Crohn Disease: CD)の疾患関連遺伝子を同定するため、全ゲノム相関解析を行った(CD 374名VS健常人3,389名)。相関を示したSNPについて別の日本人集団(CD 1,151名VS健常人15,800名)にて再現性を確認したところ、既報の3領域(MHC,TNFSF15, STAT3)に加え、新たに「4p14」、「13q14 (SLC25A15-ELF1-WBP4)」を新たなCD関連領域として同定した。クローン病(Crohn's disease ; CD)は原因不明の慢性腸疾患であり、遺伝要因の強い多因子疾患である。欧米より報告された関連遺伝子の多くに人種差があるため、日本人検体を用いたクローン病の解明が必要である。我々は約55万SNPを用いた全ゲノム相関解析を行い、下記実施計画に基づき研究を遂行した。a)別サンプル集団を用いた新規CD関連SNPの検証新たな疾患関連候補領域を検証するため、国内の大学・医療機関と連携をとり、新たに約1000名のCD患者ゲノム検体・ジェノタイプ情報を得た。得られた結果を解析し、候補領域約70SNPより、新たなCD関連領域が1か所同定された。b)関連領域周辺のSNP探索および高密度SNP地図の作成a)にて同定した領域について、CD患者検体を用いたSNP探索を行った。得られたSNP情報をもとに、ゲノム検体をタイピングし、高密度SNP地図を作成した。その結果、スクリーニングで用いたSNPよりも強い相関を示すSNPが2カ所同定された。これらの関連SNPはCD病態に何らかの関与をしている可能性がある。a)b)より、新たなCD関連領域を同定した。相関を示したSNP周辺には遺伝子が無く、関連領域とCD病態との関係は未解明である。今後、機能性SNPを同定し、関連領域がCDの病態にどのような影響を与えるのか、調べる予定である。最後に、昨年末欧米人集団を用いたCDの大規模メタ解析により71カ所のCD関連領域が報告された(Franke et.al 2010)。しかし本領域は含まれておらず、日本人を含む東アジア人CD特異的な関連領域である可能性を示唆した。この結果は日本人CD患者を用いたGWASの必要性を再確認させるものであるといえる。今後も検体数を追加収集することで、より多くの関連領域を同定していく予定である。クローン病(Crohn's disease CD)は原因不明の慢性腸疾患であり、遺伝要因の強い多因子疾患である。我々は約55万SNPを用いた全ゲノム相関解析(GWAS))を行い、下記実施計画に基づき研究を遂行した。a)別サンプル集団を用いた新規CD関連SNPの検証b)関連領域周辺のSNP探索および高密度SNP地図の作成昨年度a),b)を終了したものの、GWAS使用検体の変更に伴い、a),b)を再度施行した。新規関連領域がふえ、計2か所同定した。また、本来の実施計画に基づき、下記研究を行った。c)疾患関連SNPとクローン病の関係を調べるための機能解析同研究により同定された「真の疾患SNP」の機能的意義の検討を行う。昨年同定した非遺伝子領域について、解析を行っている。非遺伝子領域内に登録されているESTについて、全長をクローニングし新規ノンコーディングRNA(ncRNA)を同定した。CD関連遺伝子の最重要候補と考え、機能を解析中である。d)クローン病関連遺伝子改変マウスを用いたクローン病病態解析我々はすでにTNFSF15を日本人クローン病発症にかかわる重要な遺伝子として報告している。現在、TNFSF15のノックアウトマウス、ノックインマウスを作成済みである。DSS経口投与による腸炎誘導による病理学的、そして免疫学的な検討を行い、クローン病モデル動物としての妥当性を検討している。欧米人集団を用いたCDの大規模メタ解析により71カ所のCD関連領域が報告された(Franke et.al 2010)。同じ疾患でも関連遺伝子が違うことも含め、検討していぐ予定である。クローン病は原因不明の慢性腸疾患であり、遺伝要因の強い多因子疾患である。1)全ゲノム関連解析を用いたクローン病関連領域の同定我々は約55万SNPを用いた全ゲノム相関解析(GWAS))を行った。手順としてa)別サンプル集団を用いた新規CD関連SNPの検証、b)関連領域周辺のSNP探索および高密度SNP地図の作成、c)全ゲノム領域imputation(遺伝子型の推定)解析である。

2)欧米人と日本人のクローン病遺伝的背景の違い欧米人集団を用いたCDの大規模メタ解析により71カ所のCD関連領域が報告された(Franke et.al 2010)。しかし本領域は含まれておらず、日本人を含む東アジア人CD特異的な関連領域である可能性を示唆した。当該SNPが日本人検体を用いて人種共通のクローン病関連遺伝子であるかどうかを検討した。その結果、71SNPのうち11SNPで強い関連を確認した。また自然免疫に関与する遺伝子の多く(NOD2, IRGM, ATG16L1)で関連を確認することはできなかった。(Hirano et al. 2013)研究デザイン変更に伴い、当初目的としていたGWASを用いたCD関連遺伝子の報告が予定よりも遅れてしまっているが、近日論文投稿予定である。また、機能解析等については順調に進んでいるため、自己採点は「(2)おおむね順調に進展している」とした。24年度が最終年度であるため、記入しない。計画通り、下記2課題を中心に研究を推進する予定である。c)疾患関連SNPとクローン病の関係を調べるための機能解析d)クローン病関連遺伝子改変マウスを用いたクローン病病態解析機能解析は、CDの発症機序の解明、ついては治療薬開発の上で最重要課題と考えている。そのため、作成した遺伝子改変マウスをもちいた腸炎発症機序の解明等を中心に研究を進行する予定である。
点変異mtDNA導入によるmtDNA改変マウスの作製と病態発症機構の解明

様々な点変異mtDNAsがミトコンドリア病、糖尿病、神経変性疾患の患者、さらには老化個体から見出されている。しかし、両者の因果関係や点変異mtDNAに起因する詳細な病態発症機構の解明はほとんどなされておらず、効果的な治療法の探索などは皆無に等しい。このような現状を打開し、臨床に応用可能でかつ有効な治療法を確立するためには、モデルマウスを用いた研究戦略が最も有効である。前年度、点変異mtDNAを導入した病態モデルマウス(mito-mice^<COI>)の作製に世界に先駆けて成功している。このマウスは、ES細胞を介して呼吸鎖酵素複合体の一つである、チトクロームcオキシダーゼ(COX)のサブユニットCOI遺伝子のミスセンス変異をマウス個体内に導入することにより作製することができた。本年度はmito-mice^<COI>のより詳細な病態解析を行ったところ、このマウスは全身に100%の割合でこのミスセンス変異を有しており、様々な組織のCOX活性低下、高乳酸血症を呈していた。しかし、それ以外の重篤な臨床症状は呈していない。そこで、mito-mice^<COI>の様々な組織のATP量を測定したところ、野生型とほとんど同程度のレベルであった。つまり、COX活性低下によるエネルギー不足を補うために、解糖が亢進し、ATP量を正常レベルに維持していることがわかった。また、この解糖の亢進により、高乳酸血症を呈していると思われる。点変異mtDNA導入によるミトコンドリア遺伝子疾患モデル作出のために,薬剤処理により点変異mtDRAを有したマウス培養細胞を得る試みを続けていたが,呼吸鎖酵素複合体の一つである,チトクロームcオキシダーゼ(COX)のサブユニットCOI遺伝子のミスセンス変異(T6589C)が報告された(Acin, P.R.et al.2003 Human Molecular Genetics).そのため,この点変異を濃縮し,ES細胞を介してマウス個体への導入を行った.その結果,T6589C変異を有するキメラマウスの作製に成功し,それらの交配により全身でこの変異を100%で有するマウスの作出に至った.このマウスでは,1)低週齢時における体重減少,2)血中乳酸値の上昇,3)脳,心臓,肝臓,骨格筋におけるCOX活性の低下が認められた.ヒトにおいてCOXのミトコンドリアコードのサブユニットの変異による症例は数多く報告されており,高乳酸血症も呈している.したがって,作製したT6589C変異を導入したマウスは,疾患モデルマウスとして有用であるといえる.この結果は,Human Molecular Genetics(2006,vol.15,No.6)に報告した.今後は,この作製したマウスのより詳細な病態解析を行い,効果的な治療法の探索・確立を目指したいと考えている.また,T6589C変異よりもCOX活性を低下させるrat mtDNAを,ES細胞を介してマウス個体へ導入することも試みたが,高率でマウス個体内に蓄積させることはできなかった.このことから,ES細胞を用いて疾患モデルの原因となりうる点変異mtDNAをマウス個体に蓄積させるには,rat mtDNAほど呼吸機能を低下させる変異mtDNAでは,ES細胞の分化能を著しく低下させ,モデル作出には至らない可能性がある,という重要な知見も得られた.様々な点変異mtDNAsがミトコンドリア病、糖尿病、神経変性疾患の患者、さらには老化個体から見出されている。
雑種不妊(稔)性生物を利用した減数分裂の制御機構の研究

雑種生物は相同染色体の対合と交叉がうまく進まず、生殖細胞形成に失敗するため、雌雄ともに繁殖出来ない例が殆どである。モンゴル国の重要家畜であるヤクとウシの雑種では雄だけが不稔となり雌は稔性をもつ。性染色体以外は雌雄に染色体/遺伝子には差がないと考えられるので、性による稔性差は遺伝子そのものより生殖細胞形成過程に原因を考え、その由来を探究した。ヤクとウシのF1雄では厚糸期を中心に減数分裂崩壊が観察され、精細管内は空洞状であり、精子細胞はまれにしか観察できなかった。即ち多くの異種間雑種やX-Λ転座個体に一般的な厚糸期或いはそのすぐ後のステージで起る細胞死が誘導されていると考えられた。厚糸期までの精母細胞に対して、減数分裂前期特異的に発現する遺伝子(^*LIM9,10,13,15,18)の蛋白質に対する抗体を用いてウエスターン法、FlSH法により解析をした結果、これらの遺伝子産物の発現の時期と量に関して、ヤク、ウシ、雑種(F1,F2,F3)の間に差は見られず、電子顕微鏡観察によるシナプトネマ構造(SC)、核構造等にも注目すべき差がなく、此処までの過程は正常に進んでいるものと考えた。稔性を持つ雌の卵巣および卵母細胞には、ヤク、ウシ、その雑種の間に差を見出せなかった。今後の問題として、雑種雄の減数分裂崩壊の誘導因子の探究が残された。戻し交配による稔性回復はこの因子を物質として分子生物学的に捉えうる可能性を示唆している。本研究はモンゴル国の畜産育種経の応用と、減数分裂の基礎研究に貢献するものである。(*オリジナルにはユリ花粉母細胞より分別ハイブリッド形成法により単離されたが、その後高い保存性が示されつつある)雑種生物は相同染色体の対合と交叉がうまく進まず、生殖細胞形成に失敗するため、雌雄ともに繁殖出来ない例が殆どである。(*オリジナルにはユリ花粉母細胞より分別ハイブリッド形成法により単離されたが、その後高い保存性が示されつつある)試料の入手:韓国ソウル経由と中国北京経由では採取した試料の没収があるので、5月より週一回土曜日に運行されるモンゴル航空便を利用した。精巣(減数分裂解析用)、その外部組織と血液(比較のための体細胞分裂解析用)1)染色体観察用、2)スプレッド法によるシナプトネマ構造(SC)観察用、3)減数分裂特異的遺伝子産物の抗体による抗原蛋白の分布と定量用の試料を固定液と液体窒素凍結により確保した。細胞の現地での分画処理のため、遠心分離機、細胞ろ過機、そお運転のために必要な携帯用発電機は緊急調達した。牧畜家、獣医への支払は予想より高かった。結果:ヤク、ウシ、その雑種F1、F2、F3の雄2個体ずつの試料を解析した。1)精巣のサイズは、ヤク、ウシはほぼ同一、F1は顕著に小型で、F2、F3の順に大きくなる。個体と精巣の発生のステージは総て同じであり、精巣の体細胞組織は量的にも組織学的にも同一であるから、精巣のサイズは生殖細胞の量に比例している。2)F1の精細管内では減数第二分裂に入っている細胞が見当たらず、第一分裂で停止し、細胞が崩壊死滅するか、この時期に異常に長い時間留まる。も少し発生の進んだ試料を調べる必要がある。ヤク、ウシではこの様な事はなく、F3の精巣では可なりの数の精子細胞が見られ、減数分裂の回復がある。3)F1、F2のSCを銀染色してみると、SCの断片化と異常が観察でき、減数第一分裂の崩壊は、対合不全と組み換え異常又は欠損に由来すると推定出来た。染色体自体の断片化や異常は厚糸期までは殆どなく、あっても軽微なものである。

4)減数分裂特異的LIMシリーズ遺伝子産物の検出を試みた。抗アクチン抗体をコントロールとしてLIM15,LIM18の抗体で遺伝子産物の存在を検出したが、定量化、局在決定は再実験が必要となっている。評価:新鮮な試料、より適切な細胞分画、固定法等の改良とより多くの試料の入手が一部のデータの確認と次年度計画に必要となった。雑種生物は相同染色体の対合と交叉がうまく進まず、生殖細胞形成に失敗するため、雌雄ともに繁殖出来ない例が殆どである。モンゴル国の重要家畜であるヤクとウシの雑種では雄だけが不稔となり雌は稔性をもつ。性染色体以外は雌雄に染色体/遺伝子には差がないと考えられるので、性による稔性差は遺伝子そのものより生殖細胞形成過程に原因を考え、その由来を探究した。ヤクとウシのF1雄では厚糸期を中心に減数分裂崩壊が観察され、精細管内は空洞状であり、精子細胞はまれにしか観察できなかった。即ち多くの異種間雑種やX-A転座個体に一般的な厚糸期或いはそのすぐ後のステージで起る細胞死が誘導されていると考えられた。厚糸期までの精母細胞に対して、減数分裂前期特異的に発現する遺伝子(^*LIM9,10,13,15,18)の蛋白質に対する抗体を用いてウエスターン法、FISH法により解析をした結果、これらの遺伝子産物の発現の時期と量に関して、ヤク、ウシ、雑種(F1,F2,F3)の間に差は見られず、電子顕微鏡観察によるシナプトネマ構造(SC)、核構造等にも注目すべき差がなく、此処までの過程は正常に進んでいるものと考えた。稔性を持つ雌の卵巣および卵母細胞には、ヤク、ウシ、その雑種の間に差を見出せなかった。今後の問題として、雑種雄の減数分裂崩壊の誘導因子の探究が残された。戻し交配による稔性回復はこの因子を物質として分子生物学的に捉えうる可能性を示唆している。本研究はモンゴル国の畜産育種経の応用と、減数分裂の基礎研究に貢献するものである。(*オリジナルにはユリ花粉母細胞より分別ハイブリッド形成法により単離されたが、その後高い保存性が示されつつある)