hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電気化学センサーを用いる脳内グルタミン酸計測の高度化と応用

申請者らが開発したキャピラリー酵素センサーを用いる哺乳類脳内のグルタミン酸の計測に関して、電気化学センサーの信号と電気生理学的信号とを同時、かつreal timeに記録することを行う上での問題点を考察し、実際の実験に基づいて諸問題を解決した。本法が脳内のグルタミン酸濃度を計測する優れたツールになることを示した。グルタミン酸濃度の実測に基づいて、神経可塑性の分子機構に関して、前膜からのグルタミン酸放出の増加があることを支持する実験的証拠を示した。さらに、フロー系におけるグルタミン酸の化学イメージング法を提案した。本研究では、脳海馬断片を試料に用いて、電気化学センサーの信号と電気生理学的信号とを同時、かつreal timeに記録することを行い、脳内のグルタミン酸濃度を計測する優れた高度化されたツールを開発することを目指している。それと同時に、神経可塑性の分子機構に関して、グルタミン酸濃度の実測に基づいて、前膜からのグルタミン酸放出の増加があること(前膜説)の実験的証拠を積み上げることを行う。本年度は以下の点について検討した。(1)急性海馬スライスを対象に、電気および化学刺激を与えた時に放出されるグルタミン酸をガラスキャピラリー酵素センサーにより測定する際、電気的閉回路が形成されるために容量性電流が生じる。そのため容量性電流とグルタミン酸電流を識別する方法について検討した。その結果、高頻度刺激(100Hz)の終了直後に残存するグルタミン酸電流(容量性電流をふくまない)と電流サンプリング間隔1秒を用いて観測される電流値はほぼ一致することを見出した。即ち、電流サンプリング間隔1秒での測定が高頻度刺激で放出されるグルタミン酸の計測に有用なことが分かった。これらの結果をもとにマウス海馬断片のCA1神経領野で実測したグルタミン酸濃度は、長期増強現象が生起する場合は著しく高いことを見出した。(2)NOの関与する逆行性神経伝達経路とグルタミン酸放出の関係を検討するための手始めとして興奮性シナプス後電位の測定をNO酵素系の阻害剤の共存下で行った。その結果、興奮性シナプス後電位が抑制される場合と抑制されない場合の二通りに分かれた。今後、その理由をさらに検討する必要がある。本研究では、マウス脳海馬の急性スライスを用いて、電気化学L-グルタミン酸センサーの信号と電気生理学的信号をreal-timeに同時に記録し、L-グルタミン酸濃度を実測することにより、神経可塑性の分子機構に関してL-グルタミン酸が果たす役割を明らかにすることを目指している。(1)神経領野DGにおける容量性電流が電気生理学的刺激によって著しく高まることをインピーダンス理論およびL-グルタミン酸信号の実測によって示した。得られたセンサー信号から純にFaraday電流のみを引き出す方法として、容量性電流が十分に減衰する460 ms後の電流をサンプリングし、ボルタモグラムを再構成することが適切なことを示した。その結果、LTP生起後にL-グルタミン酸の放出濃度が高まることを示した。(2)神経領野CA1において、シナプス後膜のAMPAレセプターおよびNMDAレセプター阻害剤の共存下では、電気生理学的刺激によって誘起される容量性電流は著しく小さくなることを実験的に示した。それを基に低頻度刺激(2Hz)によって放出されるグルタミン酸濃度を阻害剤共存下で測定した。その結果、長期増強現象(LTP)が誘起された場合は、後膜の神経活動をブロックしてもL-グルタミン酸の放出が残存することを発見した。一方、LTPをAPVを用いてLTP生起をブロックした場合は、L-グルタミン酸の放出はほぼ完全に消失した。この結果は、LTPの生起に前膜からのL-グルタミン酸放出が寄与していることを示している。本研究では、マウス脳海馬の急性スライスを用いて、電気化学L-グルタミン酸センサーの信号と電気生理学的信号をreal-timeに同時に記録し、L-グルタミン酸濃度を実測することにより、神経可塑性の分子機構に関してグルタミン酸の役割を明らかにすることを目指している。(1)グルタミン酸センサーの応答に及ぼすタンパク質および阻害剤の効果を系統的に調べることによって本センサーの特性を明らかにした。その結果、タンパク質の影響は、キャピラリーを用いないセンサーに比較して著しく小さいことが分かった。一方、阻害剤11種のうち興奮性アミノ酸輸送体THAおよびTBOAは応答を阻害することが分かった。(2)得られたセンサー信号から純にFaraday電流のみを引き出す方法として(i)容量性電流が十分に減衰する460 ms後の電流をサンプリングし、ボルタモグラムを再構成する及び(ii)1秒間隔で電流をサンプリングする二つのアプローチについて、阻害剤CNQXの存在下で比較を行った。その結果、阻害剤の共存で容量性電流は著しく小さくなること及びその結果として、1秒間間隔でのグルタミン酸センサーの電流サンプリングが可能なことを示した。(3)前年度に引き続き、低頻度刺激(2Hz)によって放出されるグルタミン酸濃度が長期増強現象が生起する場合と生起しない場合に異なることについて、阻害剤を変えて検討を行った結果、GYKI52466においてもCNQXと同様な結果を得た。

研究実績概要に記載のように、電気化学L-グルタミン酸センサーの信号と電気生理学的信号をreal-timeに同時に記録し、グルタミン酸濃度と神経可塑性の間の関係を明らかにする基盤を構築する研究の目的はおおむね順調に進行していると判断した。本研究では、マウス脳海馬の急性スライスを用いて、電気化学L-グルタミン酸センサーの信号と電気生理学的信号をreal-timeに同時に記録する方法を確立し、L-グルタミン酸濃度を実測することにより、神経領野CA1での神経可塑性の分子機構に関してグルタミン酸の役割を明らかにすることを目指している。最終年度の本年度は以下の点について検討した。(1)前年度に引き続き、得られるセンサー信号から純にFaraday電流のみを引き出す方法として(i)容量性電流が十分に減衰する460 ms後の電流をサンプリングし、ボルタモグラムを再構成する及び(ii)1秒間隔で電流をサンプリングする二つのアプローチについて比較検討を進めた。その結果、1秒間間隔での測定がグルタミン酸センサーの長時間の記録に有利であることを示した。(2)前年度に引き続き、低頻度刺激(2Hz)によって放出されるグルタミン酸濃度と長期増強現象が関連しているかについての考察を加えた。前述(1)の結果に基づいて、後膜阻害剤GYKI52466およびCNQXを使用して前年度の実験結果が適切であることを確認した。(3)最終年度として、これまでの成果を総括して今後の展望を考察した。CA1領域では長期増強現象が発現する場合後膜を阻害してもグルタミン酸の放出が増加することを結論した。本研究は電気計測と電気生理学的計測との融合の成果であり、今後の進展が期待される。申請者らが開発したキャピラリー酵素センサーを用いる哺乳類脳内のグルタミン酸の計測に関して、電気化学センサーの信号と電気生理学的信号とを同時、かつreal timeに記録することを行う上での問題点を考察し、実際の実験に基づいて諸問題を解決した。本法が脳内のグルタミン酸濃度を計測する優れたツールになることを示した。グルタミン酸濃度の実測に基づいて、神経可塑性の分子機構に関して、前膜からのグルタミン酸放出の増加があることを支持する実験的証拠を示した。さらに、フロー系におけるグルタミン酸の化学イメージング法を提案した。平成25年度においては、電気刺激がグルタミン酸センサーに与える影響について検討を進めた結果、長期増強現象を引き起こすのに必要な高頻度刺激の影響を受けずにグルタミン酸電流を計測することに成功した。それを基に長期増強現象が引き起こされる場合と起こらない場合の比較を行い、グルタミン酸濃度は前者の場合に著しく高いことを明らかにし、電気生理学分野において興奮性シナプス後電位の最大値の40%において計測を行うことの意味について、グルタミン酸の側から実験的根拠を与えた(公表済)。平成26年度は、そのアプローチを低頻度刺激(2Hz)刺激に展開し、神経領野DGにおいては前膜からのグルタミン酸放出の増加が長期増強現象の生起に関係していることをL-グルタミン酸濃度を正確に反映するFaraday電流に基づいて示した(公表済)。この結果は、Blissらによって報告されているin vivoでの結果を支持するものである。また、後膜の活性をブロックする阻害剤の共存下でL-グルタミン酸を計測することに成功し、LTPが生起する場合とそうでない場合にL-グルタミン酸の放出量が異なることを初めて示すことができた。
カーボンナノチューブ機能性プローブの開発とナノ計測応用

カーボンナノチューブ機能性プローブの開発に応用するために、酸化チタンと炭化シリコン基板上でのグラファイト膜の成長過程その場観察、およびパターン化した炭化シリコン基板上でのグラファイト膜成長とそのデバイス利用を目的として研究をおこなった。1,グラファイト膜の成長過程その場観察高温の酸化チタンおよび炭化シリコン基板上にエチレンガスを蒸着し、走査トンネル顕微鏡によるその場観察をおこなった。酸化チタン基板上ではエチレンガスの蒸着により酸化チタン表面ステップの成長が観察された。このことは、エチレンガスの供給が、雰囲気中の残留酸素の表面吸着を促進することを示している。また炭化シリコン基板上では1000°Cでグラファイトステップ構造の成長プロセスが観察された。2,パターン化した炭化シリコン基板上でのグラファイト膜成長とそのデバイス利用電子ビームリソグラフィにより炭化シリコン基板上をパターンエッチングし、その後真空中での加熱によりグラファイト膜を成長させた。このパターン化グラファイト膜を金/ポリイミド膜のスタンプにより炭化シリコン基板から引きはがし、別に用意した酸化シリコン基板に移し替えた。一方、パターン化しなかった炭化シリコン基板でも同様の実験をおこなったが、グラファイト膜を移し替えることはできなかった。パターン化によって炭化シリコン/グラファイト、およびグラファイト/金界面の吸着力が変化したものと考えられる。先鋭かつアスペクト比の高い形状をもつ導電性カーボンナノチューブ探針を用いた新しいナノ計測技術の開発を目的として、急峻な凹凸構造の精密プロファイリング手法、ナノ構造の原子スケール立体イメージング手法、およびナノスケール電気伝導計測手法を提案し、それぞれの有用性を検討した。1,ナノスケール電気伝導計測手法導電性カーボンナノチューブ探針を4端子電気伝導計測の測定プローブに応用して、コバルトシリサイドナノワイヤの電気伝導特性を測定した。その結果、探針間距離を最小30nmまで近づけて、4端子抵抗測定をおこなうことに成功した。また、導電性カーボンナノチューブ探針による測定は、試料の電気伝導特性に影響を及ぼすようなダメージを与えず、探針自体の形状も変わらないことがわかった。2,急峻な凹凸構造の精密プロファイリング手法カーボンナノチューブ探針を用いて急峻な凹凸構造を走査トンネル顕微鏡観察し、従来の金属探針を用いるよりも精密なプロファイルが得られることを実証した。凹凸構造の走査電子顕微鏡像と走査トンネル顕微鏡によるラインプロファイルの比較から、導電性カーボンナノチューブ探針の実効的な直径を見積もり、透過電子顕微鏡像から得られた探針の直径とほぼ一致することを示した。3,ナノ構造の原子スケール立体イメージング法導電性カーボンナノチューブ探針を用いて、エルビウムシリサイドナノ結晶の原子レベル立体イメージングをおこなった。その結果、ナノ結晶の四方を囲む側壁は(105)ファセット面、表面周期構造は1×1周期であることがわかった。走査トンネル分光測定の結果、ナノ結晶の頂上と側壁はいずれも金属的な表面状態密度を示したが、フェルミレベル直下に差をもつことがわかった。
歯肉縁下細菌叢の遷移に関する因子の分子生物学的解析

我々は、平成10年度から11年度にわたる科学研究費助成により、P.gingivalisの線毛の付着あるいは凝集に関する機能について研究を行った。平成10年度の研究では、P.gingivalis381株のfimA遺伝子のよる形質転換株で381タイプの線毛を新たに発現した株は、親株に比して自己凝集、共凝集、細胞付着性のいずれも低下することを明らかにした。このことは付着因子としての線毛を修飾する分子としてFimA以外の因子の存在を示唆している。平成11年度において、我々は線毛の骨格であるFimAタンパク以外の凝集や細胞付着性に関与する分子の存在を検索した。381タイプの線毛は、fimA遺伝子下流にコードされる50kDaおよび80kDaのタンパクにより修飾されている可能性が報告されており、形質転換により新たに発現した線毛の分子構成を解析すると、それら二つの分子が欠失していることが明らかとなった。また、細菌細胞の付着や凝集に対する影響をさけるために、精製した形質転換株線毛を用いてActinomyces viscosusに対する付着実験を行ったこところ、形質転換株の線毛は親株に比して明らかに付着性が低下することが判明した。加えて、培養歯肉上皮細胞に対する付着像を観察すると、天然型の線毛を発現している株(親株)は大きな凝集塊を形成して細胞に付着するのに対し、形質転換株の付着様式はまばらで、凝集塊が小さいあるいは凝集を示さなかった。以上の結果より、本菌が個々の菌体が持つ本来の付着性以外に、凝集という形で細胞表面に集積する可能性があることを示し、それら凝集には50kDaならびに80kDaの微量成分が関与することが示唆された。我々は、Porphyromonas gingivalisの主要な定着因子とされている線毛の付着あるいは凝集に関する機能に着目し、他菌株の主要線毛タンパク質(フィンブリリン、FimA)の遺伝子(fimA)による形質転換が線毛の形成やその性状にどのような影響を及ぼすかを検討した。研究ではP.gingivalis381株のfimA_<381>をプラスミドベクターpYH420に結合し得られたリコンビナントプラスミドpYHF1をW50、ATCC33277、BLO-1、O-131、BH18/10およびYH522の各株に伝達し、それらの菌株でのfimA_<381>遺伝子の発現状況ならびに血球凝集能およびActinomyces属やStrptococcus属との共凝集能を宿主株のそれと比較した。形質転換体におけるFimA_<381>発現量は、YH522およびO-131で多量の発現が認められた。一方元来381株と抗原的に交差性を有する線毛を持つ33277およびBH18/10では、前者は発現量に変化は認められず、後者は増加した。なおW50での発現量はYH522に比較して低かった。さらに、形質転換株に対して電顕的な検索を行ったところ、33277株を除くFimA_<381>を新たに発現した株では各菌株の保有する線毛とは区別可能な線毛様構造物の発現が確認された。また、これらの菌株では、宿主株が本来示す共凝集活性ならびに血球凝集活性が低下していた。P.gingivalisにfimA_<381>を形質転換することで発現した線毛様構造物かfimA_<381>のドナーである381株線毛と異なる性状を示したことから、付着因子としての線毛を修飾する分子としてfimA_<381>以外の因子の存在が示唆された。
スハルト政権下の放送政策の変容と報道内容にみるその影響

97年から99年にかけておきたインドネシアでの政治事件のテレビ報道(主としてニュース)について、内容分析を試みた。具体的に入手した映像資料は、97年総選挙、98年5月のスハルト政権崩壊、99年総選挙、および大統領選挙である。報道内容の各局間の比較、および時系列的な変化を追っている。また、参考までに東チモール問題やアチェ問題、マルクにおける宗教対立など、国民統合に関わる政治問題についても資料を収集した。比較項目としては、報道時間量とテキスト内容の二点を中心とした。データはなお整理中ではあるが、概ね、政権崩壊を機に報道内容に大きな変化が見られ、報道の自由へと向かう大きな動きが確認された。とくに97年と98年の総選挙では、野党に対する扱いの違いが顕著であった。また、視聴率データからは政治ニュースに対する国民の関心の高さが確認できた。他方、この間に進んだ放送政策の変化の分析もすすめた。97年放送法と先行するいくつかの大臣令との異同を明らかにした。そのほか、現地の新聞や雑誌の分析を通して、90年代の放送政策とファミリー・ビジネスとのかかわりについて考察した。それぞれの民放の企業概要についても調査をおこなった。加えて、経済危機のなか経営が危ぶまれている民放局の動向を追跡した。また、98年のユヌス情報相の就任とその評価、99年のアブドルラフマン・ワヒドの政権誕生に伴う情報省の廃止などについて現地での調査をおこなった。ハビビ政権から現政権にかけて放送政策も自由化に向けた大きな変化が見られた。また、関連研究として、日本のマス・メディアが98年の5月政変をどうとらえていたかについても新聞の内容分析や送り手へのインタビュー調査を行った。昨年5月に、インドネシアでは32年間に及んだスハルト政権が崩壊するという大きな事件が起こった。平成10年度の研究は、この経緯を追うことと、実際に政変前後を通して現地で放送されたニュース番組を入手する作業を中心に進めた。当時のテレビ視聴率データの入手も行った。5月政変は、本研究の申請時に想定していたもっとも大きな政治的事件であり、非常にタイミングよく資料収集ができたといえる。ただし、それだけに資料の分量も多く、ニュース内容の分類をはじめとした分析作業はいまだに継続中である。5月政変以外にも、民族対立に関するニュース報道の収集なども進めている。その一方で昨年度は、1997年放送法の本文部分の翻訳と分析を行った。先行するいくつかの大臣令との異同を明らかにすることを通して、放送政策の特徴を明らかにすることに傾注した。それぞれの民放の企業概要についても調査中である。また、関連研究として、日本のマス・メディアが98年の5月政変をどうとらえていたかについても新聞の内容分析や送り手へのインタビュー調査を進めている。本研究は国営放送と民間放送とのニュース比較に焦点を置くものであるが、今後は政権交代の前後での比較という視点も取り入れて分析を進めるに進める。幸い、前回97年総選挙時のニュース映像が入手できたので、99年6月に予定されている総選挙の報道との比較を試みたい。
神経障害とその修復過程におけるサイトカイン・神経保護因子の役割

当該研究期間において、in vivoからin vitroにわたる広汎な研究を展開した。末梢神経、脊髄、脳において3種類の神経損傷モデル(CCl、脊髄損傷、脳虚血)を作成し、各種サイトカイン、神経栄養因子(NGF,BDNF,NT-3)、IEGs(fos family,jun family)発現の時間的・空間的分布とそれぞれの産生細胞について検討を行い、これらの物質が損傷/修復過程において果たす役割について考察した。次に、サイトカインの中でもneuropoietinとして知られるIL-6 family cytokinesに注目してその受容体の構成成分であるgp130,LIFRβ,I-6R,OSMRの脳での分布、またそのシグナル伝達に関与するJAK-STAT系の発現について検討した。小脳のPurkinje細胞では、これらの受容体構成成分が発現していた。LIFの過剰産生マウスを作成したところ、Purkinje細胞の樹状突起が著明に退縮していることを見い出した。また、上頚神経節ニューロンの樹状突起による局所回路の再構成に、血中の微量因子が関与していることを明らかにした。筋挫傷後の再生過程に、LIF、IL-6、CNTFなどが関与することをその受容体の発現から明らかにした。魚膜やレンズ、胃粘膜の直接損傷後の修復に関与する因子についても検討を加え、c-fos KOマウスやc-fos,c-junに対するアンチセンスODNを用いた実験から、これらの再生過程のトリガーとしてIEGsが重要な役割を果たしていることがわかった。血管平滑筋細胞を用いたin vitroの系においてAP-1は、BDNF遺伝子の発現を促進し、NT-3遺伝子の発現を抑制することを明らかにした。これらの実験に平行して、将来の遺伝子治療をめざし、AdVにGFPや各種栄養因子のcDNAを導入した組替え体を作成し、一次知覚伝達系を用いて基礎実験を行った。アデノウィルス(AdV)ベクターを用いた遺伝子導入法は、神経系など静止期の細胞への遺伝子導入に有効であり、従来、遺伝子導入が困難であるとされていた細胞、臓器への遺伝子治療技術の一つとして注目されている。東大医科研の斎藤教授らが開発したAdVベクターは、E1A、E1Bの2つの遺伝子を欠損させ、その欠損領域に組み込んだ外来プロモーターにより目的の遺伝子の転写を可能にしたものである。我々は、外来プロモーターとして最高の発現効率を示すCAGプロモーターと終止コドン及びrabbit βglobin polyA部位を組み込んだコスミドカセット、pAdex1CAwtを用いて組換えAdVDNAの構築を行った。我々がこれまでに構築したのは、末梢神経や中枢神経の生存維持や損傷修復に働くことが示唆されているBDNFとNT-3、これらの受容体であるTrkBとTrkC、神経系に作用するサイトカインのLIF、神経系の発生や分化に関与すると考えられているGDNFの各遺伝子を含む組換え体DNAである。まず、各遺伝子の最小発現単位の両末端を平滑化してベクターのSwaI部位に挿入し、正逆両方向のコスミドクローンを得た。各クローンについて、制限酵素による切断やsequencingにより構造確認を行った。次に、組換えAdV作製前にこれらの発現をin vivoで確認するため、不要なベクター領域を除去したプラスミドクローンを作製した。すなわち、SalIで切断、ligationすることによって、スペーサー内の部位からプロモーター直前までの発現単位を含む領域をクローン化した。今後、これらのプラスミドDNAを培養細胞にトランスフェクションし、その発現をmRNA、タンパク質のレベルで確認する予定である。発現確認後は、親ウィルスのDNA-末端タンパク質複合体を調製し、元の発現コスミドカセットと共に293細胞へトランスフェクションする。

組換えウィルスの増殖がみられたら、そのDNAを調製して制限酵素切断による確認を行い、最終的な目的ウィルス株を得る。以上の実験と平行して、LacZ遺伝子を発現するコスミドカセット、Adex1CALacZを用いて同様に組換えウィルスを作製し、in vivoでの遺伝子導入のための基礎実験を行う予定である。昨年度構築した各種神経栄養因子およびその受容体の各遺伝子を含む組み替え体DNAに加え、reporter遺伝子としてGFP遺伝子の組み替え体も作製した。これらのプラスミドDNAを培養細胞にトランスフエクションし、その発現をmRNA、タンパク質のレベルで確認した後、親ウィルスのDNA-末端タンパク質複合体を調製し、元の発現コスミドカセットと共に293細胞へトランスフエクションした。組換えウィルスの増殖がみられたので、そのDNAを調製して制限酵素切断による確認を行い、最終的な目的ウイルス株を得た。現在、in vivoでの遺伝子導入のための基礎実験を行っている。以上の実験と平行して、一次知覚ニューロンに対する各種神経栄養因子の役割と作用について基礎的検討を進めた。痛覚伝達に関与する小型のDRGニューロンには、SPやCGRPを含みNGFに依存するものと、GDNFに依存するものの2種類があり、それぞれの役割が注目されているが、我々はGDNF依存性のニューロンの化学的特徴について検討した。また、somatostatinを含有するニューロン群は、GDNF衣存性であることを明らかにした。ヒスタミンのH1-リセプター(H1-R)を発現するニューロンは、SP/CGRP産生細胞とは重ならないことから、これらもGDNF衣存性であると思われる。一方、NGF依存性のDRGニューロンはBDNFを産生するが、炎症時にはその産生が増加し、後角ニューロンの感作に関与する。一方、神経損傷時には小型ニューロンでのBDNF産生は低下し、NPY陽性の大型ニューロンで新たな産生が始まることがわかった。このような神経栄養因子産生の可塑的変化がneuropathic painの発症に関与する可能性が考えられ、来年度は上記のBDNF遺伝子を組み込んだAdVを使って、DRGでBDNFを過剰に産生させた時の動物の疼痛関連行動を観察することにより、痛覚伝達系におけるBDNFの役割を明らかにする。今年度は、脊髄・脳・末梢神経の損傷修復過程における種々のcytokineやニューロトロフィンの役割を明らかにするための基礎資料として、それぞれの因子の時間的、空間的発現について検討した。ラット脊髄圧迫損傷モデルにおいては、受傷後13時間をピークとしてc-fos,c-junなどのmRNAが損傷部位のミクログリアやastrocyteに発現、36時間をピークにミクログリアにIL-1β,TNF-α,IL-6のmRNAが発現した。その後2472時間にNGF,BDNF,NT-3のmRNAがastrocyteに強く発現し、長時間持続した。これらの遺伝子発現は、髄腔内へのステロイドの注入で著明に抑制された。脳ではラット局所脳虚血モデルを作製し、IEGs、ニューロトロフィンなどの遺伝子発現について検討した。
ナノ空間内に閉じこめられた水の挙動

細孔径を制御したシリカゲル(細孔径1.4nm45.7nm)に水および電解質水溶液を充填した試料の示差走査熱量(DSC)測定を行った。細孔径の逆数に比例して水の凝固点は降下した。細孔径が2.2nm以下では氷の融解は観測されず、細孔内で水が結晶化しない可能性が示唆された。またNaCl等の添加により、更に凝固点が低下するとともにし、細孔径3.1nm以下ではガラス転移が見出された。大気圧下で水を通常の方法で冷却した場合、液体として存在できる下限温度(均一核生成温度)は235Kであるが、その温度以下・高圧下において、水には低密度水と高密度水が存在する可能性が計算機シミュレーションによりを指摘されている。しかしながら水は235K以下で結晶化するため実験により2種類の水を観測した例はない。そこで、235K以下でも液体で存在する水を見出すべく実験を行った。水のバルク試料における融点はH_2O、D_2Oそれぞれ273.15K、276.98Kであるが、その水を一次元の細孔径を持つMCM-41型シリカゲルFSMに充填し示差走査型熱量計によりその融解挙動を測定した。細孔径3.1nm(FSM16)の試料においては、吸着した水の融点は、H_2O、D_2Oそれぞれ224K、229Kであり、水における長距離秩序の消失に伴う融点の低下が観測された。バルク試料と同様D_2Oの融点の方が高く、その差は約5Kであった。また融解エンタルピーの値は、細孔内に取り込まれた水の一部が結晶化せずに液体のまま存在している可能性を示唆している。細孔内の水には多孔質シリカ界面の影響を受ける界面水と、界面の影響を受けない内部水が存在する。界面水は結晶化しない可能性が示唆されているため、結晶化した水は内部水であると考えられる。また、細孔径2.2nm(FSM12)と1.4nm(FSM8)の試料では細孔内部の水の融解に関する顕著な熱異常は観測されなかった。これは、内部水も過冷却して110K付近まで結晶化しなかったことを示唆している。以上の結果から、シリカゲル細孔中に水を充填することにより、235K以下でも水を結晶化せずに存在させられることが明らかになった。バルクの水は235K以下で結晶化するため実験により2種類の水を観測した例はない。水の融点は273.15Kであるが、その水を一次元の細孔径を持つMCM-41型シリカゲルに充填し示差走査熱量分析(DSC)を行った結果、細孔径の逆数に依存して水の融点が低下することが見出された。また、細孔径2.2nmと1.4nmの試料では細孔内部の水の融解に関する顕著な熱異常は観測されず、水が過冷却して110K付近まで結晶化しない可能性を見出した。そこで、さらに融点を低下させるために、水に不純物としてNaClを混合し、DSC測定を行った。その結果、NaCl水溶液中の水の融解(凝固)、共融混合物の融解(凝固)、ガラス転移が観測された。NaCl水溶液中の水の融解は、バルクおよび細孔径の大きな試料で観測された。同じ細孔径の場合、水の融点は、NaClの添加量に比例して低下することが見出された。共融混合物の融解はバルクと細孔径の大きなシリカゲルで観測されたが、細孔径が3.1nm以下では共融混合物の融解が観測されず、代わりにガラス転移が見出された。このガラス転移は、サンプル中で結晶化しなかった液体成分の凍結に起因するものと考えられる。以上の結果、水に不純物を添加し、さらに細孔内に閉じ込めることにより、水の融点が大きく低下することが見出され、低温域でも結晶化しない水の存在が示された。水の融点は273.15

Kであるが、その水を一次元の細孔径を持つMCM-41型シリカゲルに充填し示差走査熱量分析(DSC)を行った結果、細孔径の逆数に依存して水の融点が低下することが見出された。そこで、シリカゲル内壁と水の相互作用を検証するためにMCM-41型のシリカゲルであるTMPS-4とその細孔壁面を3-aminopropyltriethoxysilaneで化学修飾したTMPS-4Mを用いてDSC測定及び窒素吸着による細孔径の測定を行った。TMPS-4の細孔壁面の修飾により充填された水の融点は低下し、融解ピークも幅広になることが明らかになった。壁面の修飾により融点が低下した原因としては(1)修飾により細孔径が小さくなったため、または、(2)修飾により壁面と相互作用する水(界面水)が増加したためと考えられる。そこでまず、融点の細孔径依存性からTMPS-4Mの細孔径を算出すると約3.3nmであった。次に窒素吸着測定による細孔径の算出を行った。TMPS-4は細孔径分布が狭く、均一的であるのに対して、TMPS-4Mは化学修飾により、細孔径分布が広がっていることが見出された。得られた平均細孔径はTMPS-4、TMPS-4Mそれぞれ3.9nm、3.3nmであった。TMPS-4Mの結果はDSCによって得られた結果と一致した。以上の結果は、細孔壁面の環境の変化は界面水の量に影響を及ぼさず、細孔内に充填された水の物性は、その細孔径のみに依存することを示唆している。
疎水化粘土による環境ホルモンの吸着機構の解明とそれに基づく移行拡散防止技術の開発

本研究は土壌中の環境ホルモン類の拡散を防止し、そのクリーンな処理法を開発することを目指して行った。環境ホルモンモデルとして、4-エチルフェノールおよびピレンを用い、粘土に対しての吸着特性を検討、この結果を基にした電解処理について検討し、次の成果を得た。1.粘土に、これらモデル物質が吸着されることを確認した。2.環境ホルモンの多くは平面構造をとり、このため、これら物質が粘土層間に入り込むことを確認した。3.粘土層間を疎水化することで、逆に、モデル物質の吸着量が減少。4.粘土中の結合水の状態解析から、疎水化により、水の状態が大きく変化することを見出した。5.粘土を微量分散させることで、モデル物質の電解が可能となった。以上より、電解法を用いた環境ホルモン処理系の可能性を見い出したので、今後発展させて行きたいと考えている。(1)疎水化粘土内の水の構造解析TDR法により測定した誘電緩和スペクトルを用いて,疎水化粘土内の水の構造を解析した。また,同時に界面分極についても解析し,疎水化が界面現象に及ぼす影響についても検討した。イオン交換法によって,Naイオン,NH_4イオン,テトラメチルアンモニウムイオンそれぞれで飽和したモンモリロナイト試料を作成した。それらの試料の1.5%(重量濃度)懸濁液の誘電緩和スペクトルを測定した。100MHz近傍で認められた結合水の回転運動に起因する緩和は、Naイオンで飽和した試料が最も大きく,NH_4イオンのそれは,約1/2,テトラメチルアンモニウムイオンのそれは約1割であった。誘電緩和スペクトルは,疎水性の評価に有効であることが明らかになった。界面分極についても,疎水化することによって,結合水に起因する緩和過程と同様に低下した。テトラメチルアンモニウム試料については,この緩和過程は検出されなかった。疎水基の相互作用が確認された。(2)内分泌かく乱物質モデルの吸着量および吸着平衡についての検討内分泌かく乱物質モデルとして4-エチルフェノールを用いて吸着実験を行い,親水性粘土と疎水性粘土を比較した。従来の知見では,内分泌かく乱物質の結合は疎水結合が主なるものであるとされてきたが,疎水化構造によっては,疎水化が吸着量の増大に寄与しないことが明らかになった。吸着等温線の作成:粘土と所定の濃度に調整した界面活性剤を透析膜に封入し、それを試験管に装着し、さらに試験管に同様な溶液を入れて、恒温水槽内で二日間振とう撹拌した。外液の吸光度を測定し、外液中の界面活性剤の濃度を検量線より決定し、吸着量を求めた。なお、吸着実験は35°Cで行った。実験に供した粘土鉱物は5種類(Naモンモリロナイト2種類,Naヘクトライト,Naバーミキュライト,Naカオリナイト)、界面活性剤は、アルキル基の数が異なる6種類のPyridinium bromideを用いた。実験結果:粘土鉱物の種類あるいは界面活性剤の種類に係わらず、吸着等温線は界面活性剤の濃度がある一定以上になると、吸着量が飽和するLangmuir型であった。Hexadecylpyridinium bromideを吸着させたときの吸着量の粘土間相違については、つぎのような結果が得られた。荷電量が大きいモンモリロナイトの飽和吸着量は449mM/100gを示し、荷電量が小さいモンモリロナイトの飽和吸着量はその86%、バーミキュライトの場合は56%、ヘクトライトの場合は54%、カオリナイトの場合は8%の吸着量であった。Pyridinehydro bromideの吸着等温線についても、上述の結果と同様な傾向が認められた。この事から、特にモンモリロナイト、ヘクトライトのようなスメクタイト鉱物やバーミキュライトは、汚染物質除去のための吸着媒として有効であると考えられる。荷電量が小さいモンモリロナイトを用いて、異なる数のメチレンを有するアルキル基の影響について検討した。Hexadecylpyridinium bromideの飽和吸着量384mM/100gであり、Tetradecylpyridinium bromideは96%、Dodecylpyridinium bromideは55%、Buthylpyridinium bromideは26%、Ethylpyridinium bromideは25%、Pyridinehydro bromideは22%の吸着量であった。この事から、メチレンの数が多いアルキル基を持ったPyridinium bromideほど、粘土に多く吸着されることが認められた。

本年度は研究機関の最終年度にあたり、粘土に吸着した環境ホルモンの電気化学的処理システムの検討を行うことを主な研究課題としていた。前年度までと同様に、実験では、環境ホルモンモデル物質として、多環式芳香族化合物であるピレンを用いた。前年度までに、ピレンが粘土に吸着されることがわかっていたので、さらにその詳細な吸着様式を知るため、ピレンを吸着させた粘土(モンモリロナイト)のエックス線回折を測定したところ、粘土層間が2Å広がり環式平面状分子であるピレンが粘土層間にインターカレーションしたことがわかった。ダイオキシンも平面分子であり、ピレン同様に、粘土層間にインターカレーションすることが十分予測できる。以上の結果より、粘土を用いることで、微量の難溶性物質を集積できる見込みがついた。続いて、粘土修飾電極を用いたピレンの電気化学的処理の検討を行った。1MのKCl溶液(50%メタノール)にピレンを飽和になるまで溶解したものをサンプルとして用い、グラッシーカーボン(GC)電極を作用極として電解を試みた。未修飾のGC電極を用いた場合、ピレンの電解は困難であったが、モンモリロナイトを被覆したGC電極では、ピレンの電気的還元反応が進行していることが観測できた。次に、実際の処理の場面を想定した、粘土分散系を用いて電解反応を行った。上記サンプル溶液に、モンモリロナイトを添加、沈殿したものを除き粘土分散サンプル溶液とした。上記と同じく電解を行ったところ、今度は、未修飾のGC電極においても大きな電気的還元波を観測できた。さらに、モンモリロナイト被服GC電極では未修飾のものよりも低電位でピレンの還元が可能であることがわかった。以上より、3年にわたる本課題の目標としていた環境ホルモンの電気化学処理システムの原型が、本年度の研究で、ほぼ完成したと考えている。
Ti-Ni系高成形性形状記憶合金のコンビナトリアル物性評価

平成30年度は,当初の予定と変更し平成31年度(2019年度)に予定していた,コンビナトリアル法による生体適合性評価法の確立及び,高成形性形状記憶合金の成形加工性評価の確立を行い,加えて加工法のひとつとして接合加工の検討を行った.生体適合性のコンビナトリアル評価法として, JIS-T0302「アノード分極試験による耐食性の評価」に準じるコンビナトリアル評価基板を作製し,Ti-NiーZr, Ti-NiーCu高成形性形状記憶合金の耐食性の評価を行った.その結果,従来に医療用に用いられているTi-Ni二元系形状記憶合金と同等の耐食性を有する各高成形性形状記憶合金系の組成範囲を明らかにした.次に熱間成形加工装置を作製し,高成形性形状記憶合金の成形加工性評価を行い,粘性流動特性による加工条件を明らかにした.また成形加工後の形状回復可能な形状等を明らかにした.また,折り畳み可能な管構造の作製を試みるため,金属ガラス状態のサンプル同士の粘性流動特性及び超音波接合を用いて接合試験を行った.その結果,粘性流動特性を利用した接合を実施した場合,非晶質状態のまま接合することが可能で,結晶化させた後も,材料が塑性変形域に到達しても材料は破断せず,十分な強度を示すことを明らかにした.超音波接合の場合,接合には成功したが,材料は非晶質から結晶質に変化した.最後にデモンストレーションとして折り畳み可能な管構造を作製し,破損することなく,超弾性や形状記憶特性を示す管構造の作製に成功した.平成30年度は,当初の予定と変更し平成31年度(2019年度)に予定していた実施項目を行い,ほぼ計画通りに実施できた.本年度は30年度に実施予定の項目を実施するため問題ないと考える.2019年度は,2018年度に実施予定であった,コンビナトリアル法によるTi-Ni系金属ガラスの探索及び物性評価及び,コンビナトリアル法によるTi-Ni系高成形性形状記憶合金の物性評価を行う.コンビナトリアル法によるTi-Ni系金属ガラスの探索及び物性評価については,これまでの確立してきた手法を用いて新規Ti-Ni系金属ガラスの探索を行う.Ti-Ni系高成形性形状記憶合金の物性評価については,熱処理温度傾斜ライブラリの作製を行い,高成形性形状記憶合金の熱処理温度による各物性の評価を一括で行う.平成29年度は下記について,研究を行った.1.コンビナトリアル法によるTi-Ni系金属ガラスの探索及び物性評価多元同時スパッタ装置を用いて,すべての組成が異なるサンプル群からなる組成傾斜ライブラリを製作し,真空加熱炉内で結晶化するまで均熱加熱しin-situでガラス転移温度,結晶化温度のハイスループット評価を行った.評価法は基礎検討を行っていた電気抵抗測定によりガラス転移温度測定のハイスループット評価を実施した.その結果,金属ガラスとガラス転移を示さない非晶質合金で,昇温時の結晶化過程で電気抵抗変化の傾向が異なることを明らかにし,Ti-Ni系金属ガラスのハイスループット評価が可能であることを明らかにした.2.コンビナトリアル法によるTi-Ni系高成形性形状記憶合金の物性評価Ti-Ni合金は優れた生体適合性を示すため,本合金も同様な生体適合性を示すと考えられる.本合金の医療デバイスへの応用するためには,国際的な手術医療材料のASTMやJIS等の規格化が必要である.本合金の生体適合性を調べるために, JIS-T0302に基づくアノード分極試験用の評価基板の設計を行った.その結果,アノード分極試験の評価を実施できることは確認できたが,データのばらつきが大きく,再設計をする必要があることが分かった.再設計した評価基板は平成30年度に実施する予定である.3.高成形性形状記憶合金の成形加工性の評価予算的に成型加工装置の作製が難しい可能性があるので,冶具等を用いて簡易的に成形加工性の評価を行った.限定的な条件ではあるが,現在探索した材料のうち十分な成形性を示す材料及び加工条件を明らかにした.またデモンストレーションとして折り畳み可能なパイプ構造を作製し,成功した.予算の削減により,実施項目の取捨選択は余儀なくされたが,最重要課題である,Ti-Ni高成形性形状記憶合金のコンビナトリアル探索手法を確立できたため,おおむね順調に進んでいる.これにより,本年度新規の高成形性形状記憶合金の探索を実施することができる.また,平成31年度に実施予定であった,生体適合性のコンビナトリアル評価法の検討を,医学部の研究協力者の協力のもと前倒しで検討を始めることができたた.また成型加工性の検討を行い,折りたたみ可能な高成形性形状記憶送金のパイプ構造の作製に成功した.平成30年度は,当初の予定と変更し平成31年度(2019年度)に予定していた,コンビナトリアル法による生体適合性評価法の確立及び,高成形性形状記憶合金の成形加工性評価の確立を行い,加えて加工法のひとつとして接合加工の検討を行った.生体適合性のコンビナトリアル評価法として, JIS-T0302「アノード分極試験による耐食性の評価」に準じるコンビナトリアル評価基板を作製し,Ti-NiーZr, Ti-NiーCu高成形性形状記憶合金の耐食性の評価を行った.その結果,従来に医療用に用いられているTi-Ni二元系形状

記憶合金と同等の耐食性を有する各高成形性形状記憶合金系の組成範囲を明らかにした.次に熱間成形加工装置を作製し,高成形性形状記憶合金の成形加工性評価を行い,粘性流動特性による加工条件を明らかにした.また成形加工後の形状回復可能な形状等を明らかにした.また,折り畳み可能な管構造の作製を試みるため,金属ガラス状態のサンプル同士の粘性流動特性及び超音波接合を用いて接合試験を行った.その結果,粘性流動特性を利用した接合を実施した場合,非晶質状態のまま接合することが可能で,結晶化させた後も,材料が塑性変形域に到達しても材料は破断せず,十分な強度を示すことを明らかにした.超音波接合の場合,接合には成功したが,材料は非晶質から結晶質に変化した.最後にデモンストレーションとして折り畳み可能な管構造を作製し,破損することなく,超弾性や形状記憶特性を示す管構造の作製に成功した.平成30年度は,当初の予定と変更し平成31年度(2019年度)に予定していた実施項目を行い,ほぼ計画通りに実施できた.本年度は30年度に実施予定の項目を実施するため問題ないと考える.本年度は,これまでのコンビナトリアル評価技術を用いて,新規のTi-Ni高成形性形状記憶合金の探索を行う予定である.また,当初の予定通り形状記憶合金のコンビナトリアル物性評価として,熱処理温度傾斜ライブラリによる,結晶化条件や時効処理条件のコンビナトリアル探索を行う予定である.さらに,現在前倒しで進めた,生体適合性のコンビナトリアル評価法を確立して,本合金の有用性の評価を実施していく.本年度作製予定であった成形装置については,もともとの装置概算費用が7000千円であり,本年度の予算総額を超えているため,製作することは,困難である.現在機能を限定した装置の作製が可能か検討を行っている.2019年度は,2018年度に実施予定であった,コンビナトリアル法によるTi-Ni系金属ガラスの探索及び物性評価及び,コンビナトリアル法によるTi-Ni系高成形性形状記憶合金の物性評価を行う.コンビナトリアル法によるTi-Ni系金属ガラスの探索及び物性評価については,これまでの確立してきた手法を用いて新規Ti-Ni系金属ガラスの探索を行う.Ti-Ni系高成形性形状記憶合金の物性評価については,熱処理温度傾斜ライブラリの作製を行い,高成形性形状記憶合金の熱処理温度による各物性の評価を一括で行う.
高速度マシン使用による作業密度の増加と精神的負荷の関係

ソフトウェア開発に携わる10人の技術者のデータを、隔週で半年間に渡り採集した。ストレスの生化学的指標として、仕事時間中の尿、および正午の唾液を採集した。また、心理的(主観的)指標として、ZUNGのSDSを用いた抑欝症状、および不安、覚醒、だるさ、痛みなどの症状も評定尺度法で評価を得た。作業内容は、調査日については15分間隔で作業内容をコードで記入してもらった。また、調査日間の2週分(あるいは1週分)の仕事内容の概略も得た。その結果、ストレス指標は、作業密度、作業内容、仕事上のイベントに伴って変化することが示された。仕事上のイベントとの対応の検討結果は以下のとおりである。1.仕事上のイベントとアドレナリン値各個人ごと、各個人の平均値から週毎変動の標準偏差以上の変動を示した日は全181case中25caseであった。この25case中、22case(88.9%)に対応するjob-eventが存在した。eventのあるなしをevent1効果とし、個人差効果もふくめて2元配置分散分析を行った結果、アドレナリン値は、event1効果が有意(p<0.01)であることが示された。(後述のevent2効果は有意でない)2.仕事上のイベントとコルチゾール値各個人ごと、各個人の平均値から週毎変動の標準偏差以上の変動を示した日をpick-upすると、全181case中、24caseであった。この24case中、18case(75%)に対応するjob-eventが存在した。eventのあるなしをevent2効果とし、個人差効果もふくめて2元配置分散分析を行った結果、コルチゾール値は、event2効果が有意(p<0.01)であることが示された。(前述のevent1効果は有意でない)ソフトウェア開発に携わる10人の技術者のデータを、隔週で半年間に渡り採集した。(前述のevent1効果は有意でない)
路面情報に基づく車輪・作業機制御によるトラクタの転倒防止システムの開発

本研究の目的は、「3次元路面情報に基づく車輪・作業機制御によるトラクタの転倒防止システムを開発する」ことである。本研究の目的の達成には、トラクタが作業・走行する路面の3次元情報の把握と3次元路面情報を入力としたトラクタの挙動の把握と転倒に対する安定性を確保する制御を可能とするトラクタの挙動予測・制御モデルが必要となる。そこで、本研究では、ステレオカメラ、赤外線センサ、超音波センサ等を組みわせた高精度な路面の3次元情報の計測と再構築を行うシステムの開発を行う。得られた路面の3次元情報を入力としたトラクタの挙動予測シミュレーションを構築し、車輪・作業機を制御した転倒防止システムの開発を目指す。
２本の血管柄付き末梢神経移植による網膜－視覚中枢投射の再構築

マイクロサージェリーを利用した血管柄付き末梢神経移植が、視神経再生を促進するか否かを検討した。ラットの正中神経を栄養血管を保ったまま視神経切断端に移植吻合した。視神経を再生した網膜神経節細胞の数を、蛍光色素の逆行性標識法で検証したところ、血管柄付き移植群は、従来の血管柄無し移植群と比較して約1.7倍再生細胞が多かった。透過型電子顕微鏡で再生軸索の髄鞘を観察したところ、従来法に比べて成熟した有髄線維の割合が有意に多かった。血管柄付き末梢神経移植法の中枢神経軸索再生誘導に対する有効性が確かめられた。初年度に引き続き、末梢神経移植の成否を評価し、再生視神経数を同定する方法について検討した。代表者は、逆行性標識法として移植片に蛍光色素を標識し、移植片まで到達する再生視神経軸索を持つ網膜神経節細胞を網膜進展標本上で同定した。標識された細胞数を定量することで、再生視神経数を定量化する方法を用いてきた。一方で、順行性に網膜神経節細胞を標識し、再生軸索を視神経標本上で立体的に同定する方法を条件検討した。視神経の末梢から中枢方向の厚みのある標本を作製し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、蛍光ラベルされた視神経を同定した。しかし、視神経の縦軸方向への追跡が難しいだけでなく、視神経の断面あたりへの数学的算出に問題のあることが判明した。したがって、現時点では、順行性標識法よりも、これまで継続して用いてきた逆行性標識法の方が、より正確に視神経再生現象を定量化できると考えている。特に、2本の末梢神経移植法では、再生軸索の走行が移植片内で極めて不均一になる傾向があるため、特に逆行性標識を用いるべきとの考えに至った。一方で、再生軸索の髄鞘化については、低倍の電子顕微鏡観察を用いて評価を行った。髄鞘化を、1無髄線維、2未成熟な有髄線維、3成熟した有髄線維に分類し、電子顕微鏡写真上でカウントした。総計200本以上の軸索を評価し、1サンプルごとの割合を算出した。血管柄無し移植群と、血管柄付き移植群のそれぞれのサンプルについて、χ2乗検定および残差解析を行うことにより、それぞれのサンプルの髄鞘化の割合に、有意差があるかどうかを統計処理することに成功した。本法は、電子顕微鏡観察によって髄鞘化を1本1本の軸索について明確に評価できるだけでなく、統計処理によってサンプル間の優位差を検出することができ、極めて有意義である。以上の研究成果を踏まえ、最終年度の研究を遂行し、取りまとめていく予定である。初年度は、当初の研究実施計画に基づき研究を行った。(1)まず、ラット視神経を切断した。移植片として、より外径の大きな坐骨神経を栄養血管である大腿動静脈柄付き、及び皮弁を合併した形で剥離し、これを手術用顕微鏡下で視神経切断端に吻合した。さらに大腿動脈は外頚動脈に、大腿静脈は外頚静脈に吻合した。1ヵ月後移植片に、granular blueをラベルし、移植片に視神経軸索を伸長している網膜神経節細胞を同定した。現在、例数を増やして再生細胞の定量化を進めている。(2)再生細胞を同定するだけでなく、生存細胞を同定するためにC38抗体により網膜神経節細胞の標識を行った。血管柄つきの末梢神経移植後のラット網膜でも、再生軸索を持たない生存細胞が同定できることが判明し、こちらも現在定量化を進めている。(3)血管柄付き移植を施した末梢神経片を電子顕微鏡観察し、髄鞘の形成状態を、“無髄"“未成熟の有髄"“成熟した有髄"と3種類に分けてカウントすることで、髄鞘化の状態を定量化した。さらにχ2乗検定と残差解析を行うことにより、血管柄なし移植片と比較して有意に髄鞘化が進行することを同定できた。(4)血管柄付き正中神経移植により、再生視神経数の増加と、早期のミエリン化が促進された結果については英文論文にまとめ投稿し、受理された。(5)血管柄付き正中神経を、ラット眼球の耳側強膜を貫通する形で移植し、1ヵ月後、DiIで標識し軸索再生細胞を同定することを試みている。貫通移植は、眼球内に出血を来たすことが欠点であり、現在、その克服法について検討中である。遺伝子改変マウスにおける視神経再生実験は、多くの研究グループから報告されている。一方で、私のグループは、ラットを使って末梢神経移植による視神経再生に取り組んでいる。双方とも、再生した視神経の同定方法に問題をはらんでおり、弱点のない統一的な手法の確立が急がれている。昨年度に引き続き、マイクロサージェリーの技術を用いた末梢神経移植の成否を評価し、再生視神経を持つ網膜神経節細胞を同定する方法について検証した。これまで、逆行性標識法としてGranular BlueやDiI等の蛍光色素を移植片にラベルし、網膜の伸展標本上で蛍光色素を持つ細胞を、「再生視神経軸索を持つ網膜神経節細胞」として同定してきた。マウスで一般的に用いられている、順行性標識による視神経標本における再生視神経数の同定法よりも、1再生視神経軸索内における不均一走行の欠点を排除できること、2網膜標本上で、再生視神経を持つ細胞の分布を同定できること、の2点で特に優れていることが明らかになった。

逆行性標識法の欠点である、細胞死をきたした細胞の自家蛍光の誤認は、蛍光陽性細胞の形態、すなわち局在する網膜層の高さや細胞体の大きさ・形を一個一個丹念に観察し、網膜神経節細胞であることを確認することで解決できた。加えて蛍光色素に特異的な励起フルターでの観察に加えて、別フィルターでの観察で自家蛍光陽性細胞を除外することで、充分にこの問題を解決できることが明らかになった。遺伝子改変マウスを用いた視神経再生は、多くの研究グループから報告されている。しかし、マウスでは細かい手術が難しいため、視神経を挫滅することで軸索の再生を促す実験が行われている。その方法では、視神経の完全な変性の確証が得られないばかりでなく、再生した視神経の同定にも危険性をはらんでいる。代表者は、ラットを用いて視神経を直視下で完全切断した後、同一個体の末梢神経片を移植することで視神経再生を促す実験系を用いている。本研究では、代表者のグループが開発に成功した、栄養血管柄付きの末梢神経片移植法を完成させた。この手術により視神経再生が促進されることを証明した。再生視神経数は、血管柄移植法を施した例で対照群より1.7倍優位に増加していた。加えて、移植片中の髄鞘形成については、血管柄移植例において、成熟した髄鞘を持つ再生視神経軸索が優位に多かった。さらに、血管柄付き末梢神経移植を応用して、網膜ー視覚中枢への視神経の投射パターンの再構築を目指した。最終年度は、栄養血管柄付き末梢神経移植の術式の改訂を終了し、視覚中枢神経細胞との再シナプス実験を試みた。再生軸索を持つ網膜神経節細胞の同定には、マウスで行われている順行性標識による軸索片の3次元描出ではなく、逆行性標識による、網膜進展標本上での細胞体同定の方が優れていることが明らかになった。逆行性標識による細胞体同定では、他細胞種のミスラベリングが起こることがある。強拡大の顕微鏡観察による細胞体形態観察と、神経節細胞層の確認、ならびに、陽性蛍光波長の確認により、これらの弱点が克服できることが明らかになった。しかし、上丘に刺入した移植片を通って伸張した再生視神経軸索が、シナプス結合を再構築する視覚中枢ニューロンの位置情報同定には、やはり順行性標識も有益であった。今後、それぞれの標識法の利点を使い分けて視神経再生の促進法の開発を進めていく。マイクロサージェリーを利用した血管柄付き末梢神経移植が、視神経再生を促進するか否かを検討した。ラットの正中神経を栄養血管を保ったまま視神経切断端に移植吻合した。視神経を再生した網膜神経節細胞の数を、蛍光色素の逆行性標識法で検証したところ、血管柄付き移植群は、従来の血管柄無し移植群と比較して約1.7倍再生細胞が多かった。透過型電子顕微鏡で再生軸索の髄鞘を観察したところ、従来法に比べて成熟した有髄線維の割合が有意に多かった。血管柄付き末梢神経移植法の中枢神経軸索再生誘導に対する有効性が確かめられた。血管柄付き末梢神経移植による網膜ー視覚中枢投射様態の評価として、Eph-A、ephrin-Aの特異抗体による免疫染色、in situハイブリダイゼーションによるmRNAの同定、2種類以上の蛍光色素による順行性標識を組み合わせて取り組んできた。しかし、上記複数の手法を組み合わせて一枚の標本上で行う実験については、やや難航している。そのため、現時点で、満足できる実験データが得られていない。当初の目的を達成するために、研究期間の延長を申請した。視覚科学1本の血管柄付き末梢神経移植法については、ほぼ完成をみたので、現在英文論文を執筆中である。