hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ケミカルエピゲノミクスを指向したタンパク質メチル化可視化プローブ・阻害剤の開発

タンパク質メチル化は、環境に応答してダイナミックに変動する可逆的な修飾である。メチル化されたタンパク質を同定するためには、一般にメチル化リシン残基に特異的な抗体が必要である。このメチル化抗体はその作成が困難であるため、他の翻訳後修飾反応と比較しメチローム解析は遅れている。そこで本研究では、1)抗体を用いずにタンパク質メチル化を検出する方法論の構築、更には、2)その検出系を用いてタンパク質阻害剤を探索する手法を開発することを目指した。そこで本研究では、1)抗体を用いずにタンパク質メチル化を検出する方法論の構築、更には、2)その検出系を用いてタンパク質阻害剤を探索する手法を開発することを目指している。生体でのタンパク質メチル化反応では、S-methyladenosineがメチル源として用いられる。研究1年目に当たる本年度は、メチル基の代わりにプロパルギル基を導入したSAM誘導体ProSeAMの合成法の改良を行った。本化合物は、我々が開発したあたらしいメチル化基質の同定(PLOS One, 2014, e105394.)のための鍵化合物である。しかしながら、本化合物は不安定でありまたその合成及び精製法に改善の余地が残されていた。本年度は、合成及び精製法について系統的な検討を行い、これにより十分量のProSeAMを供給することが可能となった。生体で制御される複雑なタンパク質メチル化を制御するための基礎研究として、特定のタンパク質メチル化酵素のサブタイプを選択的に認識し、かつ細胞毒性の低い阻害剤の開発が求められている。従来のタンパク質メチル化阻害剤開発研究では、精製された1つの酵素及び1つの基質タンパク質のメチル化を指標に構造最適化が進められる。一方、本研究では開発したタンパク質メチル化の網羅的検出系に、化合物を添加することで阻害剤を探索する手法を検討した。その結果、特徴的な酵素選択性を示すいくつかの阻害剤を見出すことに成功した。検出系、阻害剤開発いずれについても研究計画に基づき順調に研究が進行中であるため。生体での複雑なタンパク質メチル化を制御するための基礎研究として、特定のタンパク質メチル化酵素のサブタイプを選択的に認識し、かつ細胞毒性の低い阻害剤の開発が求められている。しかし、従来のタンパク質メチル化阻害剤の開発研究では、精製された1つの酵素及び1つの基質タンパク質のメチル化を指標に、阻害剤の構造最適化が進められてきた。一方、本研究ではProSeAM (propargylic Se-adenosyl-L-selenomethionine)を用いた網羅的メチローム検出系を基軸として、これまで報告例のない基質タンパク質を標的とするタンパク質メチル化阻害剤の創出を目指した。昨年度(平成27年度)は、網羅的メチローム検出系における鍵化合物であるProSeAMの合成及び精製法を改良することで、本検出プローブを十分量供給することが可能となった。これらの結果に基づき、平成28年度は、ProSeAMを用いた網羅的検出系に阻害剤候補化合物を加えることでメチル化酵素あるいは基質候補を探索する手法について、更なる詳細な検討を行った。特に、ゲルアッセイにより見出したタンパク質メチル化阻害剤の候補化合物について、LC/MS-MSを用いたプロテオーム解析に焦点を当てた。その結果、我々が開発を進めてきたエピジチオジケトピペラジン型阻害剤の新規標的タンパク質基質の同定、さらにはそのメチル化サイトを同定することにも成功した。これにより、機能解析の進んでいない見逃されたタンパク質基質を標的とするメチル化阻害剤探索法のプロトタイプを確立できたと考えている。阻害剤の標的メチル化基質及びメチル化サイトを同定を可能とする一連の実験系を確立することができたため。これまでに、遺伝子の転写を司るヒストンタンパク質のメチル化反応について、多くの研究が報告されてきた。また、最近では、非ヒストンタンパク質のメチル化反応も生命現象の制御に重要な役割を果たすことが次第に明らかになり、注目を集めている。しかしながら、メチル化タンパク質を広く認識する抗体の作成が現在も尚困難であり、メチローム解析は遅れている。そこで本研究では、1)抗体を用いずにタンパク質メチル化を検出する方法論の構築、更には、2)その検出系を用いてタンパク質阻害剤を探索する手法を開発することを目指してきた。これまでに本研究課題では、検出プローブProSeAMの合成及び精製手法の改良に成功し、更には阻害剤探索を融合させることで、新規メチル化阻害剤の開発、更には、その標的基質を同定に成功した。本年度は、我々が合成した数種のエピジチオジケトピペラジン(ETP)型阻害剤について、ProSeAMを用いたi)ゲルアッセイ、ii) LC/MS-MS解析によるプロファイリングを検討した。その結果、これまでに報告例のないユニークな基質及び官能基選択性を見出すことができた。更には、新たに見出したETP型阻害剤のin vitroでのIC50値を算出し、また生細胞でのメチル化阻害活性についても知見を得た。これらの研究を通じて、到達目標として設定した非ヒストンタンパク質の新規阻害剤のプロトタイプを創出できたと考えている。

メチル化されたタンパク質を同定するためには、一般にメチル化リシン残基に特異的な抗体が必要である。このメチル化抗体はその作成が困難であるため、他の翻訳後修飾反応と比較しメチローム解析は遅れている。そこで本研究では、1)抗体を用いずにタンパク質メチル化を検出する方法論の構築、更には、2)その検出系を用いてタンパク質阻害剤を探索する手法を開発することを目指した。本年度得られた知見を基盤に、検出プローブおよび阻害剤のライブラリーを拡張する予定である。更には、そのタンパク質メチル化への影響についてより詳細な検討を行い、より体系的な知見を得る予定である。本年度得られた知見を基盤に、新たに見出した阻害剤についてIC50値を算出し、酵素・基質選択制について定量的な知見を得る。また、生細胞を用いた系でのタンパク質メチル化阻害活性についても検討する。有機合成化学、ケミカルバイオロジー本研究では、検出プローブの開発、それを基盤とする阻害剤開発への展開を目指した研究である。検出系、阻害剤開発いずれについても研究計画に基づき順調に研究を進行させることができた。そこで次年度は、本年度得られた知見を基盤に、検出プローブおよび阻害剤のライブラリーを拡張するために研究資金を繰り越すこととした。当初計画を効率的・効果的に進めた結果、直接経費を節約しながら、検出系・阻害剤開発研究いずれにおいても順調に進行させることができた。さらに、阻害剤の特性解明においては、これまでと異なる新現象を見出すことにも成功している。これらの新現象をさらに検討し、論文を投稿するための知見を詳細に集めるために、補助事業期間の延長が必要となった。検出プローブおよび阻害剤を合成するために、合成試薬、溶媒、ガラス器具、逆相HPLCで用いるカラムを購入予定である。プロテオーム解析でヒットしたタンパク質についてより詳細に検証するため、個別に発現、精製系を構築する。cDNAの入手、クローニングに掛かる経費、およびタンパク質の精製とそれを用いた諸実験等、主に生物系の実験のために使用する。
糖連結ポルフィリンの腫瘍細胞ターゲティング能と光毒性

近年、光線力学的療法(PDT)は新しいガン診断治療法として期待されており、様々なPDT光増感剤が開発されている。本研究では腫瘍細胞ターゲティング素子への応用を目的として、生体内に豊富に存在する種々の糖質および糖鎖をテトラフェニルポルフィリン骨格に導入したポルフィリン誘導体の合成を行った。また、これらの糖連結ポルフィリン誘導体のPDT光増感剤としての有用性を検討するために、分光学的手法を用いて物理的性質について明らかにし、さらに、種々のポルフィリン誘導体の生体組織内への取り込みと光毒性をin vitro系で評価し、糖質の違いによる腫瘍細胞ターゲティング能について検討した。ポルフィリン環形成反応を亜鉛存在下で行うことで糖連結ポルフィリンの飛躍的な収率の向上を目指した。さらにポルフィリンからクロリンへの高収率な還元反応も検討した。in vitro系においてはHeLa細胞を用いたMTT assay法により光毒性を相対に評価し、さらに、化合物の細胞への取り込みに関して蛍光顕微鏡を用いた形態観察を行った。これらの研究結果より、種々の糖連結ポルフィリンの腫瘍細胞親和性および光物性、光毒性の相関性を評価した。糖鎖を連結したポルフィリン誘導体の光毒性について測定した結果、結合した糖鎖の本数により顕著な差違がみられた。これらのポルフィリン化合物の一重項酸素発生能評価およびHeLa細胞に接触させた場合の形態観察から、光毒性の違いは細胞親和力に依存することがわかった。さらに、化合物の分配係数の測定結果より、化合物の細胞への取り込みと親疎水性バランスに相関関係があることが判った。また、単糖連結ポルフィリン誘導体をクロリン誘導体へ変換することで光反応性が向上し、著しい光毒性の増加がみられた。
台形型MgO:LiNbO3結晶を用いた高感度フレキシブルテラヘルツ波分析器の開発

台形型MgO:LiNbO3結晶を用いた面放射方式により,1 kW以上のピークパワーを有する高出力テラヘルツ波発生および最大で70 dBのダイナミックレンジを有する高感度テラヘルツ波検出を実現した.また,台形型結晶を平行移動させてテラヘルツ波出力の結晶長依存性を測定することにより,テラヘルツ波発生・検出の光学系設計において重要な物理パラメーターであるパラメトリック利得の測定に成功した.本年度は,MgO:LiNbO3結晶を用いたテラヘルツ波発生・検出による分光分析システムの構築に向けて,台形型MgO:LiNbO3結晶を用いた面放射方式によって結晶内でのテラヘルツ波の伝搬距離を最小化し,吸収損失を低減することで特に2 THz以上の高周波数領域においてテラヘルツ波の高出力発生・高感度検出を狙った.実験の結果,1.1 THzから2.8 THzの広帯域な周波数領域において1 kW以上のピークパワーを有する高出力テラヘルツ波発生と最大で70 dBのダイナミクスレンジを有する高感度テラヘルツ波検出を達成した.続いて,テラヘルツ波発生・検出のさらなる高性能化を目指して,MgO:LiNbO3結晶のパラメトリック利得のテラヘルツ波周波数依存性の測定を行った.これまで実験的に明らかになっていないパラメトリック利得を測定することは,テラヘルツ波発生・検出を正確に設計する上で重要であり,理論計算値と比較することでさらなる高性能化が期待できる.実験では,台形型MgO:LiNbO3結晶を用いることで結晶長を連続パラメータ化できる点に着目し,テラヘルツ波出力の結晶長依存性の詳細を初めて測定した.測定の結果,テラヘルツ波出力は閾値結晶長を超えると指数関数的に増大し,パラメトリック利得と閾値結晶長はテラヘルツ波周波数に依存することを明らかにした.この結果からテラヘルツ波発生・検出を正確に設計することができるようになり,励起条件と結晶長の最適化によってピークパワーで1 MWを超えるテラヘルツ波出力ならびにダイナミクスレンジで100 dBを超えるテラヘルツ波検出の実現が期待できる.初年度の計画においては,本研究の礎である台形型MgO:LiNbO3結晶を用いた面放射方式によるテラヘルツ波の高出力発生・高感度検出の実証を最優先の目的とした.実験において,1 kW以上のピークパワーを有する高出力テラヘルツ波発生と最大で70 dBのダイナミクスレンジを有する高感度テラヘルツ波検出を達成したため,本研究課題はほぼ予定通りに進んでいる.本年度は,前年度に構築した面放射方式によるテラヘルツ波の高出力発生・高感度検出の実験系において,周波数領域分光への応用を目指した分光分析システム化に取り組んだ.特に高感度テラヘルツ波検出系の高性能化を目的とし,電子デバイスである共鳴トンネルダイオードからの連続波テラヘルツ波に対して非線形波長変換による高感度検出を行った.共鳴トンネルダイオードは電源供給のみで動作する小型テラヘルツ波光源動作であるため,実用的な分光分析システム開発の観点から有利である.実験の結果,発振周波数0.58 THz,0.78 THz,および1.14 THzの共鳴トンネルダイオードからの連続波かつマイクロワットレベルのテラヘルツ波出力の非線形波長変換を実現し,周波数1.14 THzのとき最小検出可能パワーとして約5 nWの高感度検出を室温で達成した.実験に用いた励起光のパルス幅(0.31 ns)を考慮すると,実際に波長変換に寄与したテラヘルツ波のフォトン数は約2700個に相当する.また,MgO:LiNbO3結晶のノンコリニア位相整合条件を利用することで,周波数の異なる共鳴トンネルダイオードとテラヘルツ波パラメトリック発生器からの複数周波数のテラヘルツ波の同時検出を行い,光源の周波数を切り替えることなく差分イメージが取得できることを実証した.これらの成果は,原著論文にまとめて発表した.本研究で用いた実験装置はすべて室温で動作するため,様々な応用分野で本成果の利用が期待される.台形型MgO:LiNbO3結晶を用いた面放射方式により,1 kW以上のピークパワーを有する高出力テラヘルツ波発生および最大で70 dBのダイナミックレンジを有する高感度テラヘルツ波検出を実現した.また,台形型結晶を平行移動させてテラヘルツ波出力の結晶長依存性を測定することにより,テラヘルツ波発生・検出の光学系設計において重要な物理パラメーターであるパラメトリック利得の測定に成功した.次年度においては,初年度に達成したテラヘルツ波発生・検出技術とテラヘルツ波の取り回しのための中空ファイバーを用いることで,フレキシブルなテラヘルツ波分析器の構築を行う.分光分析システム化の計画として,検出信号光であるアイドラー光を測定するために近赤外アレイセンサーを導入し,ノンコリニア位相整合条件に従ってテラヘルツ波の周波数と強度をアイドラー光の位置と強度で計測する予定である.そして,構築した分析器の実用性を評価するために,微小開口を持つ装置や水・ガラスといった高損失サンプルなど従来のテラヘルツ波分析器では測定できなかったサンプルに対する分光分析を行い,得られた結果から最適化へのフィードバックを進めていく予定である.レーザー光学,テラヘルツ波工学
投与線量検証を可能にする高精度光子ビーム照射シミュレーション実用化に関する研究

我々は高精度吸収線量計算システム構築を研究目的として、超並列コンピュータシステムを利用した外部放射線治療のためのシミュレーションシステムの開発を行っている。このシステムの計算精度、計算速度および利便性を向上させ、ファントムと線量計を使用して行っている現状の投与線量検証をシミュレーション可能にするため、主に次の研究を行った。(1)ターゲットから放出される光子治療ビームの特性解析(2)治療ヘッドによる散乱現象解析(3)モニタ設定値計算法開発(4)計算の高速化のためのハードウェア我々は高精度吸収線量計算システム構築を研究目的として、超並列コンピュータシステムを利用した外部放射線治療のためのシミュレーションシステムの開発を行っている。(1)ターゲットから放出される光子治療ビームの特性解析(2)治療ヘッドによる散乱現象解析(3)モニタ設定値計算法開発(4)計算の高速化のためのハードウェア本研究は、光子ビームによる外部放射線治療で行われているファントムと線量計のみによる投与線量検証に、測定器の空間分解能、エネルギー特性などに理論的な裏づけを与えること、モニタ設定値計算までを可能にしたモンテカルロシミュレーションによる線量計算の実用化を研究の目的としている。外部照射装置の出力を決定するための計算パラメータの一つであるヘッド散乱係数はプライマリコリメータ、フラットニングフィルタ、モノブロックコリメータおよびマルチリーフコリメータによる透過と散乱に依存する量である。これまでは測定することが不可能だった強度変調放射線治療での小さなセグメントでのヘッド散乱線の寄与を明らかにするため、照射ヘッド内における治療ビームの透過、散乱過程をシミュレーションし、それぞれのコンポーネントからの透過と散乱を解析した。この結果から、X線発生源からの距離によるエネルギーフルエンスの減少、照射ヘッド内のモニタ線量計へのモノブロックコリメータからの散乱線の寄与などを考慮したヘッド散乱係数算出法を提案した。また、モンテカルロシミュレーションでの吸収線量計算精度は、照射野位置による光子エネルギースペクトルの変化、射野位置によるエネルギーフルエンスの変化、光子ビーム照射において照射ヘッドで発生する電子により決定される。照射野位置によるエネルギースペクトル、エネルギーフルエンスの変化は、体内吸収線量の精度を決定する重要なパラメータであるが、一方、計算時間を増大させるパラメータであり、シミュレーションを複雑にする要因でもある。このことから、各パラメータのビーム特性再現のための重要度の検討を行い、シミュレーションに最適な治療ビームモデルの提案を行った。我々は、超並列コンピュータシステムを利用し、高精度吸収線量計算システム構築を研究目的の一つとした、「放射線治療遠隔支援のための線量計算システム」に関する研究に参加してきた。モンテカルロ・シミュレーションプログラムの開発は終了しているが、医学利用のためにはさらにその精度、計算速度、利便性を向上させる必要があることが明らかになってきた。本研究では、光子ビームによる外部放射線治療ではファントムと線量計のみで行う現在の投与線量の検証における測定器の空間分解能、エネルギー特性などに理論的な裏づけを与え、さらにこれまで開発した線量計算プログラムと計算パラメータを最適化し、現在のファントムと線量計のみによる検証の不確かさを補う異なる検証システムへ発展させることを目的に研究を行った。この研究の成果として、・照射ヘッドからの治療ビームの特性を明らかにし、計算パラメータを最適化させることを目的に、ターゲットから放出される光子のエネルギー、放出方向に関する研究を行い、スリット法による実験データを裏付けるデータを提供した。・計算精度を向上させるため、ヘッド散乱の解析と新たな散乱係数算出法の提案を行った。・モンテカルロ法によるモニタ設定値計算のための絶対吸収線量計算法とコミッショニング方法の提案を行った。・モンテカルロ法線量計算の高速化と計算費用軽減のため、グラフィックスプロセッシングユニット(GPU)を利用した計算システムの提案を行った。
複合高周波電流駆動による逆シアープラズマ電流分布制御と高性能化に関する研究

本研究の目的は超伝導トカマク装置であるTRIAM-1Mを用いて逆シアー配位の生成、維持、高性能化に関する総合的な研究を行うことである。次の項日に関しての研究が目的である。1.複合スペクトルを持つ高周波による電流駆動効率の向上とその物理の解明2.複合スペクトルの組み合わせによる逆ンアー配位の生成とその物理の解明3.逆シアー配位の電流拡散時間をはるかに越える時間スケールでの制御法の開発と維持の確認4.逆シアー配位とプラズマ閉じ込めの関連とリサイクリング時間にわたる高性能状態の維持12年度-14年度の研究成果は以下の通りである。1.双方向に進行する低域混成波を用いて駆動電流が減少することを世界で初めて示せた。(この結果は論文1,2,3にまとめられている)2.複合スペクトルの重畳により駆動効率と閉じ込め時間の両者が同時に向上する現象を観測した。(この結果は論文1,2,4、12にまとめられている)3.長時間放電において密度の制御性を欠落が駆動電流の急激な減少を誘起する事を観測した。(この結果は論文5,10にまとめられている)4.単純トーラスプラズマにおいてECCD効果でない電流駆動機構の存在を実験的に見いだした。(この成果は2001年2月に行われた日米ワークショップにて発表された)(論文11)5.閾バワー近傍で改善モードヘの遷移現象の頻度を調べることに成功した。(論文6-9)6.ECHはイオン温度の減少を招く場合があり直接的に電流駆動効率改善モードのトリガーになっていないこと。(論文13)7.ECH入射により電流が増すが増分のECHパワー依存性は見られない。(論文13)本研究の目的は超伝導トカマク装置であるTRIAM-1Mを用いて逆シアー配位の生成、維持、高性能化に関する総合的な研究を行うことである。(論文13)平成12年度は次のような研究を行った。研究の概要170GHzジャイラトロンを新たに整備する事ができ、申請時よりさらに実験の応用範囲を広げることができた。当初予定していた高周波位相遠隔制御器は申請時以降別途手当てすることができたので、170GHzシステムの導入に関連して必要となった消耗品(導波管等)の購入に充てた。外国旅費を使用し図子、中村、坂本が第18回核融合エネルギー国際会議にて研究成果を発表した。12年度の研究成果は以下の通りである。(1)双方向に進行する低域混成波を用いて駆動電流が減少することを世界で初めて示せた。(この結果は論文1,2,3にまとめられている)(2)複合スペクトルの重畳により駆動効率と閉じ込め時間の両者が同時に向上する現象を観測した。(この結果は論文1,2,5にまとめられている)(3)長時間放電において密度の制御性を欠落が駆動電流の急激な減少を誘起する事を観測した。(この結果は論文4にまとめられている)(4)単純トーラスプラズマにおいてECCD効果でない電流駆動機構の存在を実験的に見いだした。(この成果は2001年2月に行われた日米ワークショップにて発表された)本研究の目的は超伝導トカマク装置であるTRIAM-1Mを用いて逆シアー配位の生成、維持、高性能化に関する総合的な研究を行うことである。次の項目に関しての研究が目的である。(1)複合スペクトルを持つ高周波による電流駆動効率の向上とその物理の解明(2)複合スペクトルの組み合わせによる逆シアー配位の生成とその物理の解明(3)逆シアー配位の電流拡散時間をはるかに越える時間スケールでの制御法の開発と維持の確認(4)逆シアー配位とプラズマ閉じ込めの関連とリサイクリング時間にわたる高性能状態の維持

本年度は高周波のスペクトルを重ね合わせることにより電流駆動効率改善に関する実験を行い、特に閾値パワー近傍での振る舞いを調べた。さらにECHを行い電子温度増加が電流駆動効率改善にどのようにかかわるのかについて調べた。以下の結果を得た。(1)閾パワー近傍で改善モードへの遷移現象の頻度を調べることに成功した。(2)ECHはイオン温度の減少を招く場合があり直接的に電流駆動効率改善モードのトリガーになっていないこと。(3)ECH入射により電流が増すが増分のECHパワー依存性は見られない。本研究の目的は超伝導トカマク装置であるTRIAM-1Mを用いて逆シアー配位の生成、維持、高性能化に関する総合的な研究を行うことである。次の項目に関しての研究が目的である。(1)複合スペクトルを持つ高周波による電流駆動効率の向上とその物理の解明(2)複合スペクトルの組み合わせによる逆シアー配位の生成とその物理の解明(3)逆シアー配位の電流拡散時間をはるかに越える時間スケールでの制御法の開発と維持の確認(4)逆シアー配位とプラズマ閉じ込めの関連とリサイクリング時間にわたる高性能状態の維持本年度は13年度に行った高性能電流駆動実験の結果の解析を行った。高性能状態の維持機構、遷移の統計性について研究をすすめた。その結果以下の成果を得た。(1)プラズマからの熱が局所部に集中してできる輝点(ホットスポット)から壁材料の鉄、クロム、ニッケルが蒸発によりプラズマ内部に混入し、高性能状態の維持に著しい悪影響を与えていたことを明らかにした。(3)閾値パワー近傍での遷移の統計的振る舞いを調べ、パワーの増加に対して確率が対数的に増大することを明らかにした。
ナノマテリアルを用いた有機・無機ハイブリッド熱電材料の開発と熱電デバイスへの展開

世界の総エネルギー消費の約9割は、化石資源に依存しているが、その約半分が利用されず、排熱として失われている。特に、排熱の大部分は200°C以下の低温排熱である。この低温排熱の有効利用法の一つとして、熱から電力を取り出す熱電変換技術が期待されている。これまでの研究で、カーボンナノチューブ(CNT)を主体とした有機・無機ハイブリッド熱電材料について報告している。この複合熱電材料の性能は、CNTの性能に依存する。本報告では、CNTおよび、ナノ粒子を利用した有機・無機ハイブリッド熱電材料の飛躍的な性能向上と、次世代有機熱電デバイスの開発について報告する。熱電材料の性能は、熱起電力のゼーベック係数、導電率、熱伝導率で評価され、ゼーベック係数と導電率が高く、熱伝導率が小さいことが望ましい。本研究では、CNTの導電率向上を目的として、導電性の高いパラジウムナノ粒子との複合を検討した。CNTの存在下で化学的手法でパラジウムナノ粒子を生成させることで、ナノ粒子がCNTの構造欠陥(活性点)に選択的に担持することを見出した。ナノ粒子を担持させることで、導電率を約2倍向上させることに成功した。これは、導電率を低下させる原因となるCNTの構造欠陥にパラジウムナノ粒子が担持することで、CNT内の構造欠陥が補修されキャリア移動度が向上したものと考えられる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
光学的計測/イメージング化による延髄孤束核における求心性入力情報の処理機構の解析

延髄孤束核(NTS)は、脳幹におけるいろいろな脳神経核の中でも、生体内の諸器官からの情報が集約的にインプットされる"gate"になっている点で特異的であり、かつ興味ある脳神経核である。本研究は、ニューロン活動に伴う内因性の光学的変化から脳皮質活動を光学的に計測する「内因性光学イメージング法」を"まるごと"のラット延髄孤束核に適用し、舌咽神経や迷走神経を通して伝えられた心血管系と呼吸器系からの入力情報が、孤束核内においてどのような機構により処理されているのかを、時空間的にシステマティックな側面から解析することを目的とする。(1)迷走神経関連核のイメージング:実験対象としてはadultのWistar ratを用いた。ウレタン麻酔下に、頚部で左右迷走神経本幹を露出し、末梢側を切断して刺激用電極を中枢側に装着した。人工呼吸下に脳幹背側部分の頭蓋骨、小脳を除去して脳幹を露出し、測定用チェンバーを歯科用セメントで固定して、その中をシリコンオイルで充たした。光学計測には、リアルタイム光量差差分増幅装置(IMAGER 2001,Optical Imaging Inc.,Israel)を用いた。直流安定化電源により駆動した250Wのタングステン・ハロゲンランプの光を、干渉フィルター(605±5nm)を通して準単色光にした後、光ファイバーを用いて脳幹部に照射し、slow scan CCD cameraを用いて、5秒間に8枚の画像を取得した。刺激に伴う内因性光学シグナルを反射光の変化として測定し、その変化分を測定開始時の反射光に対する比(ΔR/R)として表示してイメージングを行った。迷走神経を電気刺激(20Hz/1sec)すると、605nmの準単色光照射による測定では、刺激により内因性光学シグナルの大きさは増加(反射光の減少)し、刺激開始後約1.5秒でそのピークに達した。解剖学的位置との比較から、記録された応答は主に孤束核に対応すると考えられた。複数のratで同様の実験を行うと、応答領域は血管の走行とは無関係で、obexに対してほぼ同一の位置に出現することがわかった。しかしながら、応答領域の大きさは一様ではなく、個体差があることが明らかとなった(animal-to-animal variations)。(2)刺激条件と応答の関係:次に、血圧をモニターしながら刺激の強度/周波数を変えて内因性光学シグナルの画像化を行い、その変動を調べた。刺激の周波数を一定(20Hz)にした条件下で、刺激強度を変えた時に得られたイメージ画像と血圧の変化を比較し、(1)刺激強度を上げるにしたがって、応答領域は刺激側の孤束核がら交連部、さらには反対側の孤束核に広がっていくこと、(2)それに伴って迷走神経刺激による血圧の低下が大きくなっていくこと、(3)同じ血圧の低下が起こる刺激条件でも、応答領域は同じではなくtrialごとに差が見られること(trial-to-trial variations)、が明らかとなった。一方、刺激強度を一定にした条件下で、刺激の周波数を変えて実験を行うと、刺激の周波数を上げるにしたがって応答領域が交連部から吻側方向に徐々に拡がっていくことが明らかとなった。これは、孤束核に投射する求心性線維のタイプの違いを反映していると考えられる。

しかしながら、応答領域の大きさは一様ではなく、個体差があることが明らかとなった(animal-to-animal variations)。(2)刺激条件と応答の関係:次に、血圧をモニターしながら刺激の強度/周波数を変えて内因性光学シグナルの画像化を行い、その変動を調べた。刺激の周波数を一定(20Hz)にした条件下で、刺激強度を変えた時に得られたイメージ画像と血圧の変化を比較し、(1)刺激強度を上げるにしたがって、応答領域は刺激側の孤束核がら交連部、さらには反対側の孤束核に広がっていくこと、(2)それに伴って迷走神経刺激による血圧の低下が大きくなっていくこと、(3)同じ血圧の低下が起こる刺激条件でも、応答領域は同じではなくtrialごとに差が見られること(trial-to-trial variations)、が明らかとなった。一方、刺激強度を一定にした条件下で、刺激の周波数を変えて実験を行うと、刺激の周波数を上げるにしたがって応答領域が交連部から吻側方向に徐々に拡がっていくことが明らかとなった。これは、孤束核に投射する求心性線維のタイプの違いを反映していると考えられる。延髄孤束核(NTS)は、脳幹におけるいろいろな脳神経核の中でも、生体内の諸器官からの情報が集約的にインプットされる"gate"になっている点で特異的であり、かつ興味ある脳神経核である。これまでの研究では、解剖学的手法やマイクロ電極法、さらにはパッチクランプ法の導入により、これらの反射系を構成するひとつひとつの要素に関して、細胞やチャネルのレベルにおいて解析が進められてきた。しかし、孤束核は多くのニューロンの機能的集合体であり、そこに要素論のみでは解決できないシステムとしての特有の機能が発現している。本研究は、膜電位感受性色素を用いた「ニューロン活動の光学的多領域同時計測法/蛍光測定」と、ニューロン活動に伴う内因性の光学的変化から脳皮質活動を光学的に計測する「内因性光学イメージング法」を"まるごと"のラット延髄孤束核に適用し、舌咽神経や迷走神経を通して伝えられた心血管系と呼吸器系からの入力情報が、孤束核内においてどのような機構により処理されているのかを、時空間的にシステマティックな側面から解析することを目的とする。実験には、"まるごと"の成体Wistarラットのin vivo脳幹標本を用いた。麻酔後、末梢ライン(血圧、血液ガスのモニターを行う)を確保し、人工呼吸器管理のもと、手術用顕微鏡下でまず腹側頚部よりアプローチし、舌咽および迷走神経、大動脈神経と頚動脈洞神経を同定した。次に脳定位固定して背側頚部からアプローチし、頭蓋表面にチェンバーを歯科用セメントで固定した。開頭後、小脳の一部を切開除去しobex周囲の脳幹を露出した。本年度は、神経刺激により誘発される応答領域の同定に重点を置き、解析をすすめた。まず、迷走神経本幹を電気刺激し、内因性光学イメージング法で孤束核内の応答領域を同定した。その際、同時に血圧をモニターし、刺激の最適条件や刺激頻度による応答領域の違いについて考察した。
宿主細胞によるウイルス由来RNA認識の構造生物学的研究

の核酸はTLR7,TLR8,TLR9受容体によって認識され,インターフェロンの産生を促し抗ウイルス反応を引き起こす。故に,抗ウイルス薬やワクチンのターゲットとして注目されており,これらTLR受容体によるリガンド認識の詳細機構の解明が待望されている。本申請課題では,これらウイルス由来の核酸を認識するTLR受容体によるリガンド認識機構やシグナル伝達機構を主にX線結晶構造解析により明らかにする。これは,ウイルスに対する宿主の応答を制御する薬剤の開発に大きく寄与すると考えられる。本年度は、さらに、ウイルス由来のRNA認識機構を明らかにするために、TLR8とRNA複合体の結晶構造解析を目指した。その結果、TLR8には2か所のリガンド結合部位が存在することが明らかになった。それら2か所の結合部位でRNA由来のリガンドを認識することで活性化することを示すことができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。自然免疫は微生物の感染に対する生体の初期防御反応である。微生物の構成成分はToll-like receptors (TLRs),NOD-like receptors (NLRs),RIG-I-like receptors (RLRs)などの受容体によって認識されることで様々な免疫応答を引き起こす。ウイルスや微生物由来の核酸はTLR7,TLR8,TLR9受容体によって認識され,インターフェロンの産生を促し抗ウイルス反応を引き起こす。また、TLR8/モノヌクレオシド(G、A、C、U、dT)複合体の結晶構造解析を行った。さらに、TLR8のZ-loopに変異を入れることにより、Z-loop未設団体を得てその性状解析、構造解析を行った。また、TLR7に関しても結晶化に適したサンプルの調製方法を検討し、高純度の精製標品を得ることに成功した。TLR8の構造解析については、モノヌクレオシドとの複合体の構造解析に成功した。これはRNA由来のモノヌクレオシドがTLR8のリガンドとなることを示唆している。また、Z-loop変異体を作成して、TLR8のZ-loop未切断体の性状解析と構造解析に成功した。以上のようにTLR8によるリガンド認識機構について大きく進展が見られた。TLR8については引き続きRNAとの複合体の構造解析を目指す。また、TLR7についても同様に構造解析を目指す。すでにサンプル調製法は確立しているので、結晶化条件を検討する。また、TLR9についても構造解析を目指す。
社会的ルールの知織構造が逸脱行為に及ぼす影響プロセスの検討

本研究は、反社会的行動の予測における有効性が見出されている社会的情報処理アプローチの理論的枠組みを参考に、青少年における社会を捉える認識の問題を修正し、社会適応的な方向へと改善する方法を多面的に検討することを目的とする。本年度は、1.社会的情報処理に関する指標の発達的差異を検討することにより、適応的な方向での情報処理の様態を確認し、2.社会環境や社会システムが情報処理に与える遠隔的影響を検討するための調査を実施した。1.では、社会的ルールの知識構造と認知的歪曲を社会的情報処理の指標として捉え、各指標の発達的差異を中学生と高校生との比較により検討した。その結果、社会的ルールの知識構造における構造的側面の指標を中心として、中学生よりも高校生が高い値を示すという発達的差異が確認された。また、性差も存在しており、男子と比較し、女子の知識構造指標は高く、認知的歪曲指標は低い値を示すことが確認された。以上の結果から、向社会的行動との関連を検討した昨年度の研究と整合的に、構造的側面を中心とした知識の構造が適応性を促進する一方で、認知的歪曲は適応性を抑制することが明らかになった。2.では、対人的相互作用の希薄化や社会的規範の不明確化などに代表される社会環境や社会システムからの遠隔的な要因が、社会的情報処理に及ぼす影響を検討するため、具体的な調査の計画を立案した。これら社会環境や社会システムからの影響を直接的に比較するためには、比較文化的な研究が有効であると考えられるが、その前段階として国内の多様な地域で調査を実施することとした。調査では具体的に、集合的有能感と共同体資源(Sampson et al.,1997)から成る共同件の特徴が、反社会的行動の生起に及ぼす影響過程において、情報処理の個人差要因を媒介した過程と、反社会的行動を誘発する状況的要因(ルーチン・アクティビティ:Osgood et al.,1996)を媒介した過程の2つのルートを想定した因果モデルを検証する。さらに本年度は、文献精読と、社会文化的要因が社会的情報処理に及ぼす影響を検討するための次の段階である比較文化調査の準備として、共同研究者との打ち合わせを行った。上記の研究は、本年度開催の国際会誌や国内学会で発表され、2本の論文を学術雑誌に投稿・審査中である。本年度は、1.社会適応性のポジティブな側面との関連を検討することにより、適応的な方向での社会的ルールの知識構造の様態を確認し、2.知識構造を適応的な方向に改善するための認知的側面への介入を実施した。1.では、まず知識構造と社会的道徳判断との関連を検討し、知識構造の分化に関する側面が低次の道徳判断を抑制し、統合に関する側面が高次の道徳判断を促進する多層的な関係にあることが確認された。また知識構造及び認知的歪曲を情報処理の指標として捉え、各指標と向社会的行動との関連を検討した結果、知識構造の構造的側面の指標と向社会的行動との間に正の関連がある一方、認知的歪曲とは負の関連にあることが確認された。2.では、これまでの研究から得られた知見を踏まえ、知識構造を(構造的側面を中心に)向上させ、認知的歪曲を改善することを目的とした心理教育プログラムの実施と効果測定を中学生対象に行った。知識構造の向上が期待されたソーシャルライフ(吉田・廣岡・斉藤,2002,2005)と認知的歪曲の改善に有効なEQUIPプログラム(Gibbs et al., 1955)を参考にプログラムを作成・実施し、事前事後テスト計画による効果測定を行った。その結果、開発されたプログラムは、情報処理の各指標を向上・改善する上で有効であることが確認された。さらに本年度は、文献精読と、社会文化的要因が個人の社会的ルールの知識構造に及ぼす影響を検討する比較文化調査の準備として共同研究者との打合せを行った。上記の研究は、本年度開催の国際会議や国内学会で発表され、2本の論文を学術雑誌に投稿・審査中である。

2.では、対人的相互作用の希薄化や社会的規範の不明確化などに代表される社会環境や社会システムからの遠隔的な要因が、社会的情報処理に及ぼす影響を検討するため、具体的な調査の計画を立案した。これら社会環境や社会システムからの影響を直接的に比較するためには、比較文化的な研究が有効であると考えられるが、その前段階として国内の多様な地域で調査を実施することとした。調査では具体的に、集合的有能感と共同体資源(Sampson et al.,1997)から成る共同件の特徴が、反社会的行動の生起に及ぼす影響過程において、情報処理の個人差要因を媒介した過程と、反社会的行動を誘発する状況的要因(ルーチン・アクティビティ:Osgood et al.,1996)を媒介した過程の2つのルートを想定した因果モデルを検証する。さらに本年度は、文献精読と、社会文化的要因が社会的情報処理に及ぼす影響を検討するための次の段階である比較文化調査の準備として、共同研究者との打ち合わせを行った。上記の研究は、本年度開催の国際会誌や国内学会で発表され、2本の論文を学術雑誌に投稿・審査中である。
統計モデルにおける制約条件付きパラメータ推定とその安定性についての研究

本研究では、2次および1次の制約条件付きの相関係数最大化問題について研究を行った。これは、目的変数と説明変数ベクトルの重み付け和w'xとの相関が最大になるように、重みベクトルwを決定する問題である。ここでパラメータwに関しては、(w-w_0)'(w-w_0)≦r^2およびAw≦cという2次および1次の制約条件が付いている。これを解析的に解くために、標本空間で定義される相関係数や目的変数等の量を(I-Q)Z[Qは射影行列,Zは計画行列]の特異値分解により定まる線形変換によりパラメータ空間の諸量に変換し、2次および1次の制約条件を満たす集中楕円体を含む楕円錘を考えて幾何学的な考察も交えて最適解を求めた。次に、相関係数最適化解と最小2乗解との相違について検討するために、3次元の場合の人工データを系統的に作成し、これら2種類の最適解の差についての比較・検討を、数値的/幾何学的に行った。また、現実の入試データについてな数値的検討を行った。その結果、目的変数ベクトルをパラメータ空間に変換したベクトルが、制約条件を指定する集中楕円体からかなり離れている場合には、2種類の最適解は大きく異なり、したがってそれらに対応する相関係数の値も、例えば0.75と0.34等と大きな差のあることが分かった。さらにデータの微小変動によるパラメータ推定値への影響についても検討を行った。その結果、目的変数ベクトルをパラメータ空間に変換したベクトルと、原点と制約条件を指定する集中楕円体の中心を結ぶベクトルが直交に近いような状況の場合には、相関係数最適化解にカタストロフィックな変化が起こることが判明した。ただしこの場合には、目的関数(相関係数の絶対値)の値自体の変化はあまり大きくはない。これに対して、データの変動が極めて微小であっても、目的関数の値が大きく変化する可能性のあることも判明した。今年度は、2次の制約条件が付いている場合の相関係数最大化問題について研究を行った。具体的には、目的変数yと説明変数ベクトルxの重み付け和z=w'xとの相関が最大になるように、重みベクトルwを決定する問題である。ここでパラメータwに関して、(w-w_0)'(w-w_0)≦r^2という2次の制約条件が付いている場合について検討を行った。これは重回帰分析または最も簡単な場合の正準相関分析の問題と考えられる。2次の制約条件付きの同種の問題については、Golub & Van Loan(1989)が、最小2乗基準の下で最適解を得ているが、相関係数最大化基準の場合については未解決な問題であった。最適解を得る手順は、次の通りである。すなわち、まず標本空間で定義される相関係数や目的変数等の量を、(I-Q)Z[Qは射影行列,Zは計画行列]の特異値分解により定まる線形変換により、パラメータ空間の諸量に変換する。次に2次の制約条件に対応する集中楕円体を含む楕円錘を考え、幾何学的な考察も交えて最適解を求めた。さらに、最小2乗解x_<LS>と相関係数最適化解x^*との相違について検討するために、3次元の場合の人工データを系統的に作成し、これら2種類の最適解の差についての比較・検討を、数値的/幾何学的に行った。また、現実の入試データについても、数値的検討を行った。

その結果、目的変数ベクトルyをパラメータ空間に変換したベクトルbが、制約条件を指定する集中楕円体からかなり離れている場合には、2種類の最適解は大きく異なり、したがってx_<LS>,x^*に対応する相関係数の値も、例えばR_<LS>=0.34,R^*=0.75等と大きな差のあることが分かった。以上の研究により2次制約のある場合についての研究は終了したので、次に1次と2次の制約がある場合についても、現在検討を行っている。今年度は、主として「2次+1次の制約条件が付いている場合の相関係数最大化問題」についての研究を行った。この問題は、目的変数yと説明変数ベクトルxの重み付け和z=w'xとの相関が最大になるように、重みベクトルwを決定する問題である。前年度の研究では、パラメータwに関して、(w-w_0)'(w-w_0)≦r^2という2次の制約条件が付いている場合について最適解を導出し、数値的な検討を行った。ところで現実の場においては、2次と1次の制約が同時にある場合がしばしば起こるので、今年度の研究ではさらにAw≦cなるいくつかの1次の制約条件が付いている場合について検討を行った。最適解を得る手順は、次の通りである。すなわち、まず標本空間で定義される相関係数や目的変数等の量を、(I-Q)Z[Qは射影行列,Zは計画行列]の特異値分解により定まる線形変換により、パラメータ空間の諸量に変換する。ところで2次の制約条件と1次の制約条件を満たす領域は一般にはパラメータ空間における集中楕円体となるので、これを求めれば前年度の研究成果が適用できる。そこでこの集中楕円体を求め、これを含む楕円錘を考え、幾何学的な考察も交えて最適解を求めた。次に目的変数yもベクトルの場合についても研究を進めているが、この場合は制約条件付きの正準相関分析の問題となるため解決が困難であり、解析的に最適解を得るまでには至っていない。しかし上記の最適解の安定性の問題、すなわちデータの微小変動によるパラメータ推定値への影響を求める問題についても研究を行っており、こちらについては興味ある結果が得られつつある。すなわち制約条件がある場合には、制約条件がない場合と異なり、パラメータの微小変動により相関係数の値が大きく変化する特異な点が存在することが確かめられつつある。この詳しい解析は、研究の最終年度である平成15年度において行う計画である。今年度は第1に、前年度に得られた結果に基づいて、2次および1次の制約条件の下での相関係数最適化解及び最小2乗解について、幾何学的・数値的に比較・検討を行った。ここで解析方法としては、相関係数を規定する適当な行列の特異値分解を用いた。また検討の対象とした数値データとしては、系統的に作成した人工データおよび現実の入試データを用いた。その結果、2次の制約条件だけが付いている場合と同様、目的変数ベクトルをパラメータ空間に変換したベクトルが、制約条件を指定する集中楕円体からかなり離れている場合には、最小2乗解と相関係数最適化解とは大きく異なり、したがってこれら2種類の最適解に対応する相関係数の値にも大きな差のあることが判明した。第2に、重回帰分析および正準相関分析において2次/1次の制約条件が付いている場合について、データの微小変動によるパラメータ推定値への影響という観点から、推定方法の安定性について検討を行った。
プリ・パフォーマンス・ルーティンにおける動作パターンと課題動作に関する研究

本研究では、プリ・パフォーマンス・ルーティンの一定性と課題動作との関連を検討した。第一段階は、課題熟練者に対し、課題前の準備動作が一定の条件と不定の条件を設定し、その違いが課題動作に与える影響について検討した。実験の結果、準備動作が一定である場合は、不定である場合に比べて、関節角度に変動が少ないことが示された。第二段階は、非熟練者の学習段階にPPRを取り入れた影響を検討した。実験の結果、PPRが動作の再現性に影響があることが示唆された。平成27年度は、プリ・パフォーマンスルーティンの動作パターンの一定性が課題動作に与える影響について、準備動作パターンと各種運動パラメータとの関係を検討した。測定では、プリ・パフォーマンスルーティンの動作パターンの一定性について、対象者の準備動作パターンが一定・不定な条件を設定し、課題であるバスケットボール・フリースローを実施した。検討する運動パラメータは、課題動作のうち、シュート高、上肢・下肢の関節位置の軌跡、関節角度などの運動学的側面を対象とした。なお、測定は、2次元だけでなく、3次元で課題動作を検討できるように対象者の動作を撮影した。測定結果の分析では、最適な課題動作は個人によって異なる可能性があるため、各条件による各測定項目値を重ね書きすることにより個体内変化を検討した。測定の結果、準備動作が一定の場合は、そうでない場合と比べシュート成功率が高く、関節角度の推移のバラツキがわずかにあるが少ないことが示された。また、関節角度を複数の関節の関係性の中で分析した結果においても、バラツキが少ないことが認められた。一方で、シュート高、課題動作における各関節位置の軌跡には、対象者内で違いが認められなかった。現在までの測定によって、プリ・パフォーマンスルーティンの動作パターンの一定性が課題動作のどの部分に影響を与えているか見当をつけることができた。平成28年度は,プリ・パフォーマンス・ルーティンが,バスケットボール未熟練者のフリースロー課題習熟過程に与える影響について,課題動作の再現性の観点から検討を行った。実験では,バスケットボールを競技として実施したことがない非熟練者を対象に,一定期間のフリースロー練習を課した。この練習では,すべての練習投の準備行動において,対象者自身が設定した一定の準備動作(プリ・パフォーマンス・ルーティン)を実施するように教示した。この練習の効果は,実験前,プリ・パフォーマンス・ルーティン教示後,実験後に測定した課題動作の上肢の関節変化を分析して評価した。評価には,単関節変化の変動係数のみならず,Vector Cording法を用いて2関節の協調された変化を評価項目として用いた。分析の結果,変動係数は関節によって変化の傾向が異なっていた。2関節間の変化の値では,実験前,教示後,実験後の順でバラツキが少なくなっていく傾向が見られた。今後は,下肢の分析やパフォーマンス結果と課題動作の再現性の関連も加え,プリ・パフォーマンス・ルーティンが及ぼす影響を総合的に検討していく。平成28年度では、これまでに得られた結果をまとめていくとともに、プリ・パフォーマンスルーティンの動作パターンの一定性が、バスケットボール未熟練者のパフォーマンスに及ぼす影響を検討していく。未熟練者の学習過程においてプリ・パフォーマンスルーティンを加えることによる影響を検討することで、技能習得における課題動作の関係を検討する。そして2箇年における測定の結果をまとめ、プリ・パフォーマンスルーティンの動作パターンの一定性と課題動作の関係性を明らかにする。スポーツ心理学今年度は、学会等で研究発表を行わなかった。また、測定結果の解析を研究者自身で実施したため、その分の支出がなかった。次年度は、得られた成果を学会等で発表し,他の研究者からの意見を聴取する。
アドレノメデュリン(AM)受容体の役割の解明および新規AM受容体の探索

1.AM受容体の機能を特異的に抑制する手段の確立(主として江藤胤尚と桑迫健二が行う):(1)AMの受容体結合を抑制する遺伝子の探索:我々は、AM受容体の修飾蛋白である3つのRANP1,-2,-3にはAMの結合部位はなく、これらがbinding pocketの形成に不可欠であることを明らかにしてきた。AMの結合部位はその受容体の構成蛋白であるCRLRに存在していると考え、この責任領域を特定すべく、CRLRとVIP2受容体(ともにClassBのG蛋白共役型受容体に属すが、RAMPはVIP2受容体に作用できない)のキメラ蛋白(9種)を独自に作製した。これらのキメラ蛋白のN末端にV5タグを付加して、各RAMPとの共発現後の細胞膜発現をFACS解析により定量化した。さらに、^<125>I-AMの結合性やAMによるcAMP反応性を検討することにより、AMの結合に重要なCRLRの領域を大まかに同定することが出来た。今後、その領域を標的に種々の変異体(キメラ蛋白/欠失体/1塩基置換体)を順次作製して、最終的に責任領域を同定したい。(2)AM結合に重要なRAMP領域を認識する抗体の作製:上記(1)の検討から、AMはCRLRの細胞外のN端領域と第1ループに結合していると考えられるため、その領域をHEK-293細胞に過剰発現させたものを抗原としてポリクローナル抗体の作製を試みているところであり、まだ最終結果は得られていない。(3)AM受容体の蛋白合成を阻害するアンチセンスとsiRNAの作製:これらに関しても、現在検討中である。2.新規AM受容体の探索(主として北村和雄が行う):上記1の手段をすべて確立した後に、本研究を行う予定である。1.AM受容体の機能を特異的に抑制する手段の確立(主として江藤胤尚が行う):(1)AMの受容体結合を抑制する遺伝子の探索:本研究では、まずWister ratの肺からAM受容体の構成蛋白であるCRLRと2つのRAMP(RAMP2およびRAMP3)をPCR法を用いてクローニングした。現在、遺伝子導入効率の高いHEK-293細胞を用いて、2つのラットAM受容体(CRLR/RAMP2およびCRLR/RAMP3)の過剰安定発現系を作製中である。さらに、ラットのcDNAライブラリーをAMが豊富に発現している組織(まず主要な組織を選択)と発現していない組織に分けて作製中である。最近、内在性のAM受容体の機能を抑制するdominant-negative RAMPsをヒトに加えてラット(D93-99およびD58-64)でも同定した。(2)AM結合に重要なRAMPの領域を認識する抗体の作製:AM結合に重要なヒトRAMPの領域(RAMP2;86番目から92番目の領域、RAMP3;59番目から65番目の領域)をウサギに免役して高力価のポリクローナル抗体を作製した。現在、これらの抗体を2つのヒトAM受容体の過剰安定発現系に投与し、ラジオレセプターアッセイを用いてAM結合の抑制効果を検討中である。(3)AM受容体の蛋白合成を阻害するアンチセンスの作製:現在、内在性のヒトRAMP2やRAMP3の蛋白合成を特異的に阻害するアンチセンスのデザイン中である。(4)2つのAM受容体の機能を選択的に抑制するdominant-negative CRLRの同定:CRLRと相同性のあるカルシトニン受容体とCRLRのキメラ蛋白を8つ作製した。現在、これらを用いて検討中である。1.AM受容体の機能を特異的に抑制する手段の確立(主として江藤胤尚が行う):(1)AMの受容体結合を抑制する遺伝子の探索:我々はAMに特異的な2つの受容体(CRLR/RAMP2及びCRLR/RAMP3)の機能を抑制するdominant-negative RAMP2/3を同定してきた。しかもAMがCGRP1受容体(CRLR/RAMP1)にも十分に結合することを証明したが、2003年度にはRAMP1のCGRPとAMの結合に不可欠な領域を同定し、その領域を欠如した欠失体がCGRP1受容体のdominant-negative蛋白として機能することを明らかにした。しかし、3つのdominant-negative RAMPは3つのAM受容体に競合的に結合するため選択性に乏しいことが判明した。従って、この問題点を解決するには、CRLRとVIP受容体(CRLRと同様Class BのG蛋白共役型受容体に属するが、我々はAMとRAMPがこの受容体に結合しないことを明らかにした)のキメラ蛋白を作製してdominant-neative CRLRを同定することが不可欠と考え、現在、独自に作成(9種)して検討中である。なお、昨年度にCRLRと相同性のあるカルシトニン受容体(CTR)とCRLRのキメラ蛋白(8つ)を作製したが、CTRにAMとRAMPが結合することが判明したので、現在、これらの蛋白をAM受容体の細胞内動態の機能解析に用いている。さらに、ラットAM受容体の過剰安定発現系を樹立したので、ラットのcDNAライブラリー(AMが豊富に発現している組織とそうでない組織に分けて作製)をこれらに導入し、ラジオレセプターアッセイを用いて、AMの結合を特異的に阻害する遺伝子の単離・同定を試みている。