hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大強度負水素イオンビームの電子ビームによる荷電変換に関する研究

大強度負水素イオンビームの電子ビームを用いた荷電変換測定のため、本研究での使用を目的として、本件に使用する電子銃の性能を評価した。電子銃をオフライン試験機に取り付けてエミッタンスモニタを使用した電子ビームのエミッタンス測定及びビーム強度測定、電子銃使用時の真空圧力変化の調査を行った。その結果、購入した電子銃が本研究での要求性能を満足することを確かめた。また、J-PARC加速器に据え付ける予定の真空チェンバーを整備して来年度の電子銃据え付け調整作業の準備を行った。電子銃のオフライン性能試験を終えたのち、可能であれば電子銃をJ-PARC加速器のビームラインに設置する予定だったが、設置予定箇所の近くで本件とは関係のないビーム照射によるビームダンプ窓破損事象が発生し、その復旧作業と本件の電子銃設置作業予定日時が重複したため、本件の作業を来年度に延期した。性能評価が完了したJ-PARC線形加速器ビームラインに電子銃を設置し、負水素イオンビームと電子ビームの荷電変換効率測定のプレ試験を行うことを目指す。その後、プレ試験結果をもとにビーム観測系の整備を行い、より高精度なビーム試験を行うことで電子ビームによる負水素イオンビームの荷電変換効率の特定を目指す。大強度負水素イオンビームの電子ビームを用いた荷電変換測定のため、本研究での使用を目的とした電子銃の性能調査、及び、電子銃の購入を行った。次年度に購入した電子銃の性能評価試験をオフライン試験機にて行う予定であるため、既設オフライン試験機の整備、電子ビーム測定機器の据え付け設置及び稼働試験、電子銃の据え付け設置準備まで完了した。今年度は荷電変換用電子ビームについての要求スペックを勘案し、それに応じた電子銃を購入した。さらに次年度のオフライン試験に向けた試験機の準備を行い、電子ビームのサイズ等の測定器の据え付け及び駆動試験が終了し、残作業は電子銃の取り付けのみの状況である。以上、本研究は特に大きな問題なく、順調に進展している。次年度は、オフライン試験機を用いた電子銃の性能評価試験、及び、J-PARC線形加速器ビームラインに電子銃を設置する作業を行い、負水素イオンビームと電子ビームの荷電変換効率測定のプレ試験を行うことを目指す。電子銃が想定より安価に購入できたことにより、残額が出た。次年度にビームモニタ高精度化用の部品等で使用する。電子銃の取り付け作業を次年度に行うこととしたため、残額が出た。次年度分経費と合わせて電子銃の取り付け作業及びビームモニタ高精度化用の部品の購入等に使用する。
洪水による河道内樹林地の撹乱とその規模評価に関する研究

1.樹林地の撹乱・破壊形式とその規模評価前年度の研究成果から,洪水による樹林地の撹乱・破壊形式として,a)樹林地上流端および樹林地境界での流下物捕捉(遮蔽面積増加)による樹木の破壊,b)樹林地基盤層(細粒砂層)の河床撹乱によって生じる樹木の撹乱,c)低水路砂礫河岸の侵食とそれに伴う樹木流失のそれぞれが素過程として抽出された.こうした素過程を通じて過去の洪水がもたらした樹林地の撹乱・破壊を抽出し,そこでの樹林地の破壊規模,破壊率を評価した.すなわち,平成13,14年洪水による利根川水系渡良瀬川礫床区間を対象として,洪水前における水辺の国勢調査による植生分布,および洪水前後の航空写真から樹林地領域のベースマップを作成し,洪水後の地形から基盤撹乱(河床変動,河岸侵食)による樹林地領域の変化を求め,これにより木本,草本類の破壊率を算出した.また,一般化座標系平面流計算から洪水再現計算を行い,樹木にかかる流体力とモーメント破壊の可能性を考察,さらに河床変動計算から河岸侵食に伴う地形変化を評価し,計算から推定された破壊・撹乱と洪水痕跡調査とを比較することで,上記3つの素過程にもとついた樹木撹乱・破壊形式の区分の妥当性を示した.2.河床基盤の撹乱による樹林地の撹乱・破壊の評価と樹林地管理の基礎資料作成物理(河床)基盤の撹乱は,表層河床材料のどのクラスの礫径までが動き得たか(移動限界礫径)の推定と,基盤そのものの変化(河床変動と河岸侵食)から評価できる.この点に注目し,樹木粗度を形状抵抗として取り込んだ一般化座標系平面流計算を用いて,既往洪水での樹林地撹乱状況と対応する水理量を求めた.ここで,樹林地の破壊撹乱状況を,(1)草本類の剥がれ,(2)木本類の傾斜,根付き倒木,(3)根茎の破壊,樹木の流失,の3つのランクに分類し.これらの破壊・撹乱基準を表層河床材料の移動限界にもとづいて評価した.そして,樹林地の撹乱とその後の樹林地回復調査から,(2)の撹乱規模は動的樹林化より洪水後顕著な樹林地再生を生むことを示し,これらをまとめて樹林化河道における樹木管理に関する基礎資料を提示した.1.樹林地の撹乱・破壊形式とその規模評価前年度の研究成果から,洪水による樹林地の撹乱・破壊形式として,a)樹林地上流端および樹林地境界での流下物捕捉(遮蔽面積増加)による樹木の破壊,b)樹林地基盤層(細粒砂層)の河床撹乱によって生じる樹木の撹乱,c)低水路砂礫河岸の侵食とそれに伴う樹木流失のそれぞれが素過程として抽出された.こうした素過程を通じて過去の洪水がもたらした樹林地の撹乱・破壊を抽出し,そこでの樹林地の破壊規模,破壊率を評価した.すなわち,平成13,14年洪水による利根川水系渡良瀬川礫床区間を対象として,洪水前における水辺の国勢調査による植生分布,および洪水前後の航空写真から樹林地領域のベースマップを作成し,洪水後の地形から基盤撹乱(河床変動,河岸侵食)による樹林地領域の変化を求め,これにより木本,草本類の破壊率を算出した.また,一般化座標系平面流計算から洪水再現計算を行い,樹木にかかる流体力とモーメント破壊の可能性を考察,さらに河床変動計算から河岸侵食に伴う地形変化を評価し,計算から推定された破壊・撹乱と洪水痕跡調査とを比較することで,上記3つの素過程にもとついた樹木撹乱・破壊形式の区分の妥当性を示した.2.河床基盤の撹乱による樹林地の撹乱・破壊の評価と樹林地管理の基礎資料作成物理(河床)基盤の撹乱は,表層河床材料のどのクラスの礫径までが動き得たか(移動限界礫径)の推定と,基盤そのものの変化(河床変動と河岸侵食)から評価できる.この点に注目し,樹木粗度を形状抵抗として取り込んだ一般化座標系平面流計算を用いて,既往洪水での樹林地撹乱状況と対応する水理量を求めた.ここで,樹林地の破壊撹乱状況を,(1)草本類の剥がれ,(2)木本類の傾斜,根付き倒木,(3)根茎の破壊,樹木の流失,の3つのランクに分類し.これらの破壊・撹乱基準を表層河床材料の移動限界にもとづいて評価した.そして,樹林地の撹乱とその後の樹林地回復調査から,(2)の撹乱規模は動的樹林化より洪水後顕著な樹林地再生を生むことを示し,これらをまとめて樹林化河道における樹木管理に関する基礎資料を提示した.本年度は,主として,洪水によるハリエンジュ樹林地の撹乱状況の詳細調査および撹乱の物理機構の解明について検討した.得られた知見は以下のようである.樹林地の撹乱・破壊形式は,洪水の痕跡調査から,a)樹林地上流端および樹林地境界での流下物捕捉(遮蔽面積増加)による樹木の破壊b)樹林地基盤層(細粒砂層)の河床撹乱によって生じる樹木の撹乱c)低水路砂礫河岸の侵食とそれに伴う樹木流失のそれぞれが素過程として抽出された.

これらの破壊形式が生まれた発生箇所を,河道の平面形状,砂州と低水路の位置関係,州内における樹林地の配置関係から整理し,破壊・撹乱形式の仕分けを示すマップを作成した.また,流下物捕捉(遮蔽面積増加)による樹木の破壊・撹乱については,流下物遮蔽面積を実測し,樹木降伏モーメントを基準にして破壊の有無を判定した.さらに,樹林地撹乱規模を(1)樹木の流失,(2)倒木,(3)根付き倒木,傾斜,(4)直立,の4つからクラス分けし,これらと発生箇所との関係も求めた.これら痕跡調査から得られた樹林地の破壊・撹乱の空間分布について,すでに開発した樹林地の形状抵抗を取り入れた一般化座標系平面流計算および平面河床変動計算を適用して,冠水深,流速,掃流力,移動限界礫径,河床変動(基盤の上昇・低下,河岸侵食域の予測),樹木にかかる流体力(流下物による遮蔽面積増分を考慮)等の水理量を求め,対応関係を求めた.こうした検討から,河道内樹林地の周辺の破壊・撹乱形式の仕分けがその規模を含めて評価できた.1.樹林地の撹乱・破壊形式とその規模評価前年度の研究成果から,洪水による樹林地の撹乱・破壊形式として,a)樹林地上流端および樹林地境界での流下物捕捉(遮蔽面積増加)による樹木の破壊,b)樹林地基盤層(細粒砂層)の河床撹乱によって生じる樹木の撹乱,c)低水路砂礫河岸の侵食とそれに伴う樹木流失のそれぞれが素過程として抽出された.こうした素過程を通じて過去の洪水がもたらした樹林地の撹乱・破壊を抽出し,そこでの樹林地の破壊規模,破壊率を評価した.すなわち,平成13,14年洪水による利根川水系渡良瀬川礫床区間を対象として,洪水前における水辺の国勢調査による植生分布,および洪水前後の航空写真から樹林地領域のベースマップを作成し,洪水後の地形から基盤撹乱(河床変動,河岸侵食)による樹林地領域の変化を求め,これにより木本,草本類の破壊率を算出した.また,一般化座標系平面流計算から洪水再現計算を行い,樹木にかかる流体力とモーメント破壊の可能性を考察,さらに河床変動計算から河岸侵食に伴う地形変化を評価し,計算から推定された破壊・撹乱と洪水痕跡調査とを比較することで,上記3つの素過程にもとづいた樹木撹乱・破壊形式の区分の妥当性を示した.2.河床基盤の撹乱による樹林地の撹乱・破壊の評価と樹林地管理の基礎資料作成物理(河床)基盤の撹乱は,表層河床材料のどのクラスの礫径までが動き得たか(移動限界礫径)の推定と,基盤そのものの変化(河床変動と河岸侵食)から評価できる.この点に注目し,樹木粗度を形状抵抗として取り込んだ一般化座標系平面流計算を用いて,既往洪水での樹林地撹乱状況と対応する水理量を求めた.ここで,樹林地の破壊撹乱状況を,(1)草本類の剥がれ,(2)木本類の傾斜,根付き倒木,(3)根茎の破壊,樹木の流失,の3つのランクに分類し.これらの破壊・撹乱基準を表層河床材料の移動限界にもとづいて評価した.そして,樹林地の撹乱とその後の樹林地回復調査から,(2)の撹乱規模は動的樹林化より洪水後顕著な樹林地再生を生むことを示し,これらをまとめて樹林化河道における樹木管理に関する基礎資料を提示した.
リン脂質シグナル伝達による神経細胞動態制御機構の解析

細胞膜微量構成リン脂質のホスファチジルイノシトール4-リン酸のイノシトール環5位をリン酸化してホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸を産生する脂質シグナル産生酵素ホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼ(PIP5K)の活性化機構と生理的役割についての解析を進めてきた結果、PIP5Kは低分子量G蛋白質のARF6により活性化されることを見出した。本年度は、以下に記載したように、ARF6→PIP5Kシグナル伝達系がスパイン形成を制御していることを見出した。マウス海馬の内在性PIP5Kβは、スパインマーカー蛋白質であるPSD95と同一の画分に分画され、また、マウスの発生過程におけるPIP5Kβの発現パターンはPSD95と類似していた。これらの結果は、PIP5Kβがスパインにおいて機能している可能性を示唆している。さらに我々は、マウス海馬神経細胞に野生型PIP5Kβを過剰発現させると、スパイン数が顕著に減少し、活性欠失型PIP5Kβを過剰発現させるとスパイン数は増大することを見出した。これらの結果から、PIP5Kβはスパイン形成を負に制御していることが示唆された。海馬神経細胞に活性型ARF6変異体を過剰発現させると、スパイン数は減少し、不活性型ARF6変異体を過剰発現させると、スパイン数は増大した。これらのARF6の効果はPIP5Kβの効果と類似しており、ARF6はPIP5Kβの上流で機能している可能性が想定される。活性型あるいは不活性型ARF6変異体をPIP5Kβとともに海馬神経細胞に共発現させると、活性型ARF6変異体がPIP5Kβと相互作用した。さらに、活性型ARF6変異体により減少したスパイン数は、PIP5Kβを共発現させることにより回復した。以上の結果から、ARF6→PIP5Kβシグナル伝達系は、スパイン形成を負に制御していると結論づけられた。
新規人工調整肺サーファクタントの開発及びフッ素・ハイブリッド型への新たな展開

肺サーファクタント脂質の基本成分はDPPC/PG/PA(パルミチン酸)(=68:22:9, wt/wt/wt)を用いた。これは、羊水中の脂質組成と同様であり、最も有効な肺サーファクタント脂質混合物として多くの研究者によって用いられ、また臨床的にRDS治療薬にも適用されている。先ずin vitroで新規人工調製肺サーファクタント(DPPC/PG/PA/Hel 13-5:以下Helと略記)とRDS治療薬(Surfacten: TAと略記)の物性比較を行った。種々の表面物性解析法(π-A等温線、ΔV-A等温線、Hysteresis曲線、蛍光顕微鏡画像)で比較検討した結果、表面物性においてこのHelはTAに匹敵する結果が得られた。そこでこれらの結果をin vivoとの関連付けるために、それらの肺内物性を比較検討した。プロトコルとして、成熟Wistarラットに生理食塩水で肺洗浄を行い、肺サーファクタント欠乏モデルを作製した。その欠乏モデルに対し、100%酸素による人工換気下で、両調製物を気管内投与し、それぞれの経時肺コンプライアンス測定を行った。またその後、ラット肺を気胸させ、静的なP(肺内圧)-V(肺容量)曲線を測定し、肺サーファクタント効果の指標とした。以上より、実際の肺内物性においてもこの調製物HelはTAに匹敵することすることが見出された。表面物性及び肺内物性の両面からNRDS第一選択薬Surfactenに匹敵する人工肺サーファクタントが調製され、この研究の成果は呼吸における肺機能メカニズムの解明及びSP-BやSP-Cの模倣ペプチドを含有するRDS治療薬の開発等に大きく貢献すると考えられる。また、in vitroとin vivo物性の相関関係が確立されたことから、部分フッ素化両親媒性物質を組込んだハイブリッド型人工肺サーファクタント(2006年度研究実績報告書)への応用・展開が期待される。二種の部分フッ素化両親媒性物質(FCn)を人工調製肺サーファクタントに組込み、それらを気/液界面に展開しLangmuir膜の基本物性を系統的に測定した。これらの部分フッ素化両親媒性物質は、疎水性と疎油性を同時に有し、さらに温度安定性が高いというユニークな性質を示す。人工調製肺サーファクタントとして、DPPCとDPPC/Hel 13-5(肺サーファクタントタンパク質アナログ)混合物を用いた。DPPC単分子膜に対する添加効果は、1.FCnの添加によってDPPC単分子膜の凝縮が妨げられるが、膜の崩壊後FCnは不可逆的にDPPC単分子膜から排出され、下相液側からDPPC単分子膜を安定化する。2.長鎖FCnはDPPC単分子膜の凝縮を促進し、高圧においてDPPC単分子膜の充填剤として働き、膜の安走性を増加させる。肺胞呼吸に見立てた圧縮・拡張過程において、Hel 13-5はDPPC単分子膜から脱着、吸着を繰り返す。FCnの添加によって、この現象は以下のように促進された。1.FCnは膜の圧縮に伴ってHel 13-5と共にDPPC単分子膜から排出される。2.長鎖FCnは、Hel 13-5の排出現象を促進する。特に長鎖FCnを5-10wt%添加すると、高圧部においてDPPCと混合単分子膜を形成することにより著しい膜安定化作用を示した。これらのことから、部分フッ素化両親媒性物質(特に長鎖FCn)の添加によって高価なHel 13-5を少量化でき、さらに人工調製肺サーファクタントの薬効の増大が期待できる。また、in vitroとin vivo物性の相関関係が確立されたことから、部分フッ素化
エイジングによる肝再生能の変化と肝幹細胞の役割-肝移植の知見に基づく基礎的検討

慶應義塾大学病院で行われた生体肝移植ドナー手術において、術後1週間・1カ月後の肝再生能力を年齢別に検討した。ドナー手術は、ヒトにおける正常肝の肝再生が観察可能な唯一の臨床モデルであり、若年ドナー(30歳未満)の1週間後の残肝肥大率が、高齢ドナー(50歳以上)に比して有意に高いとの結果を得た。生体肝移植ドナー肝の生検検体または、切除された転移性肝腫瘍の正常肝組織の一部を患者の同意のもとに採取し、ヒト正常肝の幹細胞マーカーであるThy-1を使って肝幹細胞の分離を試みたところ、高齢になるにつれてThy-1陽性細胞のpopulationが低下する傾向を認めた。本研究によりヒトの肝再生能力が加齢に伴い有意に低下する事が示され、そのメカニズムにThy-1陽性細胞が関与している可能性が示唆された。当院における生体肝移植において、ドナー年齢が若いレシピエントの方が予後がよいとの結果を受け、肝再生能力に年齢が関与しているのではないかと考えた。そこで、実際に当院で行われたドナー手術において、術後1週間・1ヵ月後の肝再生能力を検討したところ、若年肝で有意に肝肥大率が高いとの結果が出た。この肝肥大率の差は、右葉graft、すなわち残肝volumeが小さい方がより顕著となる傾向があった。我々は、この年齢による肝肥大率の差について、肝前駆細胞とされるCD90(Thy-1)陽性細胞が関与しているかを検討している。ヒトの肝組織検体(過去の生体肝移植ドナーO-biopsy検体)のうち、30歳以下10検体と50歳以上10検体において、抗Thy-1抗体による免疫組織染色を施行、さらにCK19などの胆管系マーカーにおいても免疫染色を追加し、Thy-1陽性細胞の局在および年齢による存在頻度を検討した。Thy-1陽性となる細胞は門脈域に局在していたが、その数に関してはっきりとした年齢による相関を認めなかった。また、生体肝移植ドナー肝のO-biopsy検体または、転移性肝腫瘍の正常肝組織の一部を患者の同意のもと採取し(倫理委員会承認済み)、mince後collagenaseによる消化・分解を行い、その後、実質細胞と非実質細胞に遠心分離する。非実質細胞の細胞数をcountし、非実質細胞中に存在するとされるThy-1陽性細胞をMACS(magnetic activated cell sorting)にて識別・分離し、年齢別に割合を検討している。現在20例ほどの症例において、Thy-1陽性細胞の割合を検討したが、有意差を認めないも高齢になるにつれてThy-1陽性細胞の割合が低下する傾向を認めている。本研究は、肝再生能力が加齢に伴い低下し、そのメカニズムの一つに肝幹細胞が何らかの役割を果たしているという仮説を確かめるために立案した研究である。平成22年度は、昨年に引き続き、実際に当院で行われたドナー手術において、術後1週間・1カ月後の肝再生能力を年齢別に検討した。ドナー手術は、ヒトにおける正常肝の肝再生が観察可能な唯一の疾患モデルであり、臨床における肝再生を論ずるには最適と言える。その結果、若年ドナー(30歳未満)の1週間後の残肝肥大率が、高齢ドナー(50歳以上)に比して有意に高いとの結果を得た。術後1ヶ月後の残肝肥大率に関しては、若年ドナーと高齢ドナーとの間に有意な差を認めなかった。年齢による肝再生能力の違いに肝幹細胞が関与していることを確かめるために、生体肝移植ドナー肝の0-biopsy検体または、転移性肝腫瘍の正常肝組織の一部を患者の同意のもとに採取し(倫理委員会承認済み)、ヒト正常肝の幹細胞マーカーとして有用性が報告されているThy-1をマーカーにして肝幹細胞の分離を試みた。肝組織はmince後collagenaseによる消化・分解を行い、その後、実質細胞と非実質細胞に遠心分離し、非実質細胞の細胞数をcountし、非実質細胞中に存在するとされるThy-1陽性細胞をMACS (magnetic activated cell sorting)にて識別・分離した。年齢別にThy-1陽性細胞のpopulationを比較検討したが、症例の集積により、高齢になるにつれてThy-1陽性細胞のpopulationが低下する傾向を認めている。

平成23年度は、昨年、一昨年に引き続き、実際に当院で行われたドナー手術において、術後1週間・1カ月後の肝再生能力を年齢別に検討した。ドナー手術は、ヒトにおける正常肝の肝再生が観察可能な唯一の疾患モデルであり、臨床における肝再生を論ずるには最適と言える。その結果、若年ドナー(30歳未満)の1週間後の残肝肥大率が、高齢ドナー(50歳以上)に比して有意に高いとの結果に確信を得た。術後1ヶ月後の残肝肥大率に関しては、若年ドナーと高齢ドナーとの間に有意差を認めなかった。この肝肥大率の差は、右葉graft、すなわち残肝volumeが小さい方がより顕著となる傾向があった。年齢による肝再生能力の違いに肝幹細胞が関与していることを確かめるために、生体肝移植ドナー肝の0-biopsy検体または、転移性肝腫瘍の正常肝組織の一部を患者の同意のもとに採取し(倫理委員会承認済み)、ヒト正常肝の幹細胞マーカーとして有用性が報告されているThy-1をマーカーにして肝幹細胞の分離を試みた。肝組織はmince後collagenaseによる消化・分解を行い、その後、実質細胞と非実質細胞に遠心分離し、非実質細胞の細胞数をcountし、非実質細胞中に存在するとされるThy-1陽性細胞をMACS(magnetic activated cell sorting)にて識別・分離した。年齢別にThy-1陽性細胞のpopulationを比較検討したが、高齢になるにつれてThy-1陽性細胞のpopulationが低下する傾向を認めた。これらの成果を英文でまとめ、欧文誌「Surgery」に投稿した。比較的major reviseが返されたが、ひとつひとつ丁寧に対応することにより、acceptされすでに掲載された。
新規大環状スルフィド類の固相開環重合による超高分子量を有する高分子の創製

本研究は、新しい大環状化合物の固相開環重合により超高分子量縮合系ポリマーの合成方法を確立することを目的とする。本研究では、ジブチルアミノトリアジン構造とo-,p-フェニレン構造を有する種々の大環状スルフィド類とジブチルアミノトリアジン構造とピリジン環を有する大環状スルフィド類の合成、性質、および固相での開環重合について検討を行った。希釈条件で2-ジブチルアミノ-4,6-ジメルカプトトリアジン(BADMT)とo-キシリレンジブロミドとの反応、p-キシリレンジブロミドとの反応を行い、それぞれ大環状2量体(o-,p-CS-2)と大環状3量体(o-,p-CS-3)を優先的に合成する条件を見出した。テンプレート剤としてNaPF_6を用いて、BADMTと2,6-ビスブロモメチルピリジンとの反応を検討し、対応する大環状2量体(CTPS-2)と大環状3主体(CTPS-3)を優先的に合成する条件を見出した。次に、種々の大環状スルフィド類の大きさと化学的、熱的性質の関係について明らかにした。重合触媒としてトテラフェニルホスホニウムクロリド(TPPC)5mol%を用いて、o-CS-2を粉末状態で窒素雰囲気下加熱を行った結果、250°Cで10分間加熱した場合、開環重合が進行し重量平均分子量(M_W)が18万のポリマーが得られた。同様にp-CS-2の開環重合を検討した結果、260°C、10分間の反応によりM_Wが25万のポリマーが得られた。さらに、ピリジン構造を有するCTPS-2の開環重合について検討した結果、TBPC5mol%を用いて240°Cで30分間加熱した場合、M_Wが12万のポリマーが得られた。TBPCを用いたCTPS-2の開環重合は、固相で進行することが分かった。以上のように、ジブチルアミノトリアジン構造とフェニレン構造、あるいはピリジン環を有する大環状スルフィドの合成法を確立し、固相あるいは溶融開環重合により高分子量ポリマーが得られることが明らかとなった。本研究は、新規な大環状化合物の固相開環重合による分子量の非常に大きい縮合系高分子の合成方法を確立することを目的とする。本年度は、ジブチルアミノトリアジン構造を有する大環状スルフィド類の合成、その性質、および固相での開環重合について検討を行った。2-ジブチルアミノ-4,6-ジメルカプトトリアジン(BADMT)とm-キシリレンジブロミド(m-XDB)との反応と引き続く液体クロマトグラフィーによる分離について検討を行い、大環状2量体(CS-2)と大環状3量体(CS-3)を優先的に合成する方法を見出した。CS-2とCS-3の溶解性や熱的性質を調べ、得られた大環状スルフィド類の環のサイズと化学的、熱的性質について明らかにした。CS-2を粉末状態で窒素雰囲気下加熱を行った結果、340°Cで10分間加熱した場合、転化率25%で重量平均分子量(Mw)5400、分子量分布(Mw/Mn)1.71のポリマーが得られた。

次に、CS-2に触媒としてテトラブチルホスホニウムクロリド(TBPC、5mol%)を添加し260°Cで40分間加熱した場合、転化率49%でMw :108000、Mw/Mn :1.82のポリマーが得られた。同様に、CS-3にTPPC(5mol%)を添加して260°Cで20分間加熱した場合、転化率42%でMw :104700、Mw/Mn:2.69のポリマーが得られた。このように、CS-2とCS-3を無溶媒で加熱することにより、容易に分子量10万以上のポリマーが得られることが分かった。この大環状スルフィド類の開環重合は、固相で進行することを期待したが、加熱前後の形状変化の観察から、この開環重合は溶融状態で進行することが示唆された。本研究は、新しい大環状化合物の固相開環重合により超高分子量縮合系ポリマーの合成方法を確立することを目的とする。本年度は、ジブチルアミノトリアジン構造とo-,p-フェニレン構造を有する種々の大環状スルフィド類とジブチルアミノトリアジン構造とピリジン環を有する大環状スルフィド類の合成、性質、および固相での開環重合について検討を行った。希釈条件で2-ジブチルアミノ-4,6-ジメルカプトトリアジン(BADMT)とo-キシリレンジブロミドとの反応、p-キシリレンジブロミドとの反応を行い、それぞれ大環状2量体(o-,p-CS-2)と大環状3量体(o-,p-CS-3)を優先的に合成する条件を見出した。テンプレート剤としてNaPF_6を用いて、BADMTと2,6-ビスブロモメチルピリジンとの反応を検討し、対応する大環状2量体(CTPS-2)と大環状3量体(CTPS-3)を優先的に合成する条件を見出した。次に、種々の大環状スルフィド類の大きさと化学的、熱的性質の関係について明らかにした。重合触媒としてトテラフェニルホスホニウムクロリド(TPPC)5mol%を用いて、o-CS-2を粉末状態で窒素雰囲気下加熱を行った結果、250°Cで10分間加熱した場合、開環重合が進行し重量平均分子量(Mw)が18万のポリマーが得られた。同様にp-CS-2の開環重合を検討した結果、260°C、10分間の反応によりMwが25万のポリマーが得られた。さらに、ピリジン構造を有するCTPS-2の開環重合について検討した結果、TBPC5mol%を用いて240°Cで30分間加熱した場合、Mwが12万のポリマーが得られた。TBPCを用いたCTPS-2の開環重合は、固相で進行することが分かった。以上のように、ジブチルアミノトリアジン構造とフェニレン構造、あるいはピリジン環を有する大環状スルフィドの合成法を確立し、固相あるいは溶融開環重合により高分子量ポリマーが得られることが明らかとなった。
セクシュアリティの観点から見た近代フェミニズム思想の成立と展開

本研究の成果によれば、近代イギリスに生じたフェミニズムの言説は、ホラティウスのいう「男性的なサッポー」のような男性に匹敵する知性をもつ女性を理想像として提示したとき、そのセクシュアリティも「男性的な」(古来女性同性愛もしくは淫乱を含意)ことを否定し、むしろ異性愛関係において「無性的な」(情欲がない)ことを強調した。こうした男性的女性の無性化は、強制的な異性愛文化・社会の出現と関連があった。本研究の研究期間の初年度にあたる今年度は、研究基盤を確立するために、第一に、本研究に関連する基本的資料・文献・刊行物などを収集した。海外出張では、ウエールズのスランゴスレンにあるプラース・ネウィズ(18世紀末のロマンティックな友愛関係の代表的なカップルであるエレナー・バトラーとセアラ・ポンソンビィの家)において、当時の貴重な視覚的資料や手紙などの文献を調査研究した。またケンブリッジ大学のユニヴァーシティ・ライブラリーで、特にレアブックルームにて、18世紀イギリスにおけるセクシュアリティ関係の稀覯書を閲覧し、必要に応じて複写の形で収集した。第二に、収集した文献を精読・分析・解読し、それらをデータベース化して検索可能なかたちに変え、今後の研究が容易になるよう計った。今年度の研究成果の一部については次のように公表した。論文「舞台の上の異性装とジェンダー_マライア・エッジワースの『ベリンダ』」では、エッジワースが当時のロマンティックな友愛者や女性同性愛者(サフィスト)のように男装をし、サッポーのように両性愛者で、しかもウルストンクラフトのような「女性の権利」論者でもある女性登場人物を徹底的に戯画化して描いたことを考察した。論文「アン・リスターのレスビアン日記」では、セクシャルな女性同性愛者としての自覚があったアン・リスターの言説を分析し、女性の男性性と女性同性愛者の男嫌いとフェミニズムの関連を明らかにした。また、本研究にとって重要な情報を提供してくれる18世紀から19世紀初頭の文学・文化・社会状況を扱った書籍二点の書評を行った。最後に、「18世紀イギリスにおける女性とセクシュアリティ」をテーマに講演し、専門の異なる女性研究者らと貴重な意見交換を行った。本年度は、前年度に国内外で収集した女性同性愛関係、セクシュアリティ関係、ジェンダー関係などの基本的資料・文献・刊行物をより一層充実させるとともに、これらの資料等のデータベース化と緻密な分析の作業を進めた。本年度の研究成果の一部については、和・英文の論文を学会誌や共著の論集などで公表するとともに、国内の学会で口頭発表した。論文「ウルストンクラフトとサッポーと女性のセクシュアリティ」では、ウルストンクラフトのフェミニズムと伝統的なサッポーのセクシュアリティの言説の関わり、ゴドウィンによるウルストンクラフト伝とオウィディウスのサッポー、および彼女の投身自殺との連想について考察した。論文「『女性の夫』のジェンダー偽装とセクシュアリティ」では、18世紀における女性と結婚した女性の文化的現象とセクシュアリティについて分析した。また、男装のフェミニストの戯画化について考察した論文「男装の喜劇役者-マライア・エッジワース『ベリンダ』(一八〇一)」を18世紀の女性作家たちの作品を分析する論集(共著)に収めて刊行するとともに、“Cross-Dressing and Gender on the Stage: Maria Edgeworth's Belinda"を英文の論文集(共著)に収めて刊行した。訳書『グリーンライティング』の一部では、本論の研究に関連のある女性の権利を巡る言説を扱った。口頭発表「男装のサッポーとセクシュアリティ」では、ウィリアム・メイソンの叙情劇が、当時のフェミニストたちのセクシュアリティ観と相似していることを論じ、「親密な関係の女性たち」では、18世紀末期から19世紀はじめにかけての女性の友情関係と同性愛の言説を考察した。本研究の最終年度である本年度は、これまで国内外で収集した資料・文献・刊行物のデータベース化と総括的で綿密な分析の作業に取り組み、イギリスにおける近代フェミニズム思想の展開とセクシュアリティ観の諸関係について多角的に考察し、本研究の目的を達成した。具体的には、フェミニズムの言説の他に、反フェミニズムの言説、すなわち同時代の男性作家の批判的・嘲笑的言説も考察の対象にして個別的に検証し、国内外で口頭発表するとともに、論文を投稿した。日本バイロン協会談話会(平成21年6月27日、於愛知工業大学)における口頭発表では、「バイロンと『ブルーな』サッポー」という題で、反ブルーストッキングのバイロンの言説の中に18世紀末から19世紀初頭のサッポーの異性愛者化の文化・社会的傾向が色濃く反映されていることを論じた。第35回国際バイロン学会(平成21年9月9日、於ギリシャ・ミソロンギ市市民会館)では"Byron and Sappho"という題で、サッポーの受容史の観点から、バイロンが描くサッポーと同時代のブルーストッキングと呼ばれる女性作家たちの間のセクシュアリティの相違を明らかにした。

また、メイソンのサッポー像に同時代の女性作家のフェミニズム思想とセクシュアリテリ観がかいま見られることを論じた論文「男装のサッポーとセクシュアリティーウィリアム・メイソンの抒情劇詩『サッポー』」は査読を経て、『十八世紀イギリス文学研究(第4号)-交渉する文化と言語』(日本ジョンソン協会編、平成22年5月末出版予定)に収められることになっている。
セミソフトタイムウィンドウを有する動的配車配送計画の厳密解法に関する研究

動的な手法における集配送車両は,スケジューリング期間の最初に平均旅行時間に基づいた事前最適ルートにより運行を開始する.しかしながら,ルートは集配送車両が顧客に到達するたびに,更新された旅行時間に基づいて変更される.すべての顧客は,ルート変更した配送中の車両により初めて配送されるか,すでに配送されているかどちらかであり,初期の顧客集合から除去される.ルート変更時点において集配送車両の現在位置が,車両にとって新たなルートの始点として扱われる.本年度は,上述の動的な枠組みを備えたセミソフトタイムウィンドウを有する配車配送計画問題(D-VRPSSTW)に対する厳密解法のコード化を試みた.これまで行われてきたD-VRPTWに対する解法アプローチの多くは,挿入法や局所探索のような近似解法に基づいているものであったため,本研究で取り組んだ厳密解法を構築するにあたり,数理計画手法の調査を行い,最終的にMATLAB上で実行可能なコードを得た.得られたコードに対し,シミュレーションされたデータセットに加え,東京南部を対象地域の道路ネットワークを再現した実践的かつ大規模なデータセットを用いて検討を行った.得られた結果について,2009年5月にトルコにおいて開催された第4回貨物輸送・ロジスティクスに関する国際ワークショップおよび2009年6月にメキシコにおいて開催された第6回シティロジスティクスに関する国際会議において紹介し,国内外の学術的および実務的な物流従事者と議論した.2008年度後半において,提案した研究の初期段階に取り組んだ.最初に,時間枠制約を有する動的な配車配送計画問題(D-VRPTW)に関して広範に文献検索を行った.本研究の基礎となる多くの有用な研究を検索したが,本研究の目的であるセミソフトタイムウィンドウを有する配車配送計画問題(VRPSSTW)の厳密解法に対し,旅行時間の可変性を組み込むことに着手されていないことが確認された.さらに,既往の研究において,動的なモデルとして,大抵顧客の需要変動に集中していることも確認された.一方,一部の研究者はD-VRPTWにおいて旅行時間の可変性に焦点を当てている.さらに,D-VRPTWに対するほとんどの解法アプローチは,挿入法や局所探索のような近似解法に基づいている.セミソフトタイムウィンドウを有する動的な配車配送計両問題(D-VRPSSTW)の全般的な枠組みは,以下のように提案される.予測されたデータによる静的なVRPSSTWの列生成法に基づく厳密解から得られる事前最適ルートから始め,D-VRPSSTWを複数デポD-VRPSSTWに分解する.複数デポD-VRPSSTWは,車両がデポに割当てられた時点で,定められたルートに沿って最初の顧客をダミーデポとして考慮することによって得られる問題である.分割された資源制約,遅刻ペナルティ付き初等的最短路問題(ESPPRCLAP)が子問題として解かれる.この段階において,それぞれのデポにおいて車両の残りの容量を組み込む.子問題から生じる負の限界費用を有する候補のルートは,集合分割主問題における線形計画問題を増加させる.こうして,顧客の要求が生じるたびに,新たに得られた旅行時間に基づき,ルートが再び最適化される.上述の枠組みを,2008年11月シンガポールにおいて京都大学とシンガポール国立大学により共催されたシティロジスティクスに関するジョイントセミナーにおいて紹介し,議論した.来年度は,D-VRPSSTWにおける厳密解法をコード化し,シミュレーションされたデータセットだけでなく実践的なデータセットにおいても検討を行う.動的な手法における集配送車両は,スケジューリング期間の最初に平均旅行時間に基づいた事前最適ルートにより運行を開始する.しかしながら,ルートは集配送車両が顧客に到達するたびに,更新された旅行時間に基づいて変更される.すべての顧客は,ルート変更した配送中の車両により初めて配送されるか,すでに配送されているかどちらかであり,初期の顧客集合から除去される.ルート変更時点において集配送車両の現在位置が,車両にとって新たなルートの始点として扱われる.本年度は,上述の動的な枠組みを備えたセミソフトタイムウィンドウを有する配車配送計画問題(D-VRPSSTW)に対する厳密解法のコード化を試みた.これまで行われてきたD-VRPTWに対する解法アプローチの多くは,挿入法や局所探索のような近似解法に基づいているものであったため,本研究で取り組んだ厳密解法を構築するにあたり,数理計画手法の調査を行い,最終的にMATLAB上で実行可能なコードを得た.得られたコードに対し,シミュレーションされたデータセットに加え,東京南部を対象地域の道路ネットワークを再現した実践的かつ大規模なデータセットを用いて検討を行った.得られた結果について,2009年5月にトルコにおいて開催された第4回貨物輸送・ロジスティクスに関する国際ワークショップおよび2009年6月にメキシコにおいて開催された第6回シティロジスティクスに関する国際会議において紹介し,国内外の学術的および実務的な物流従事者と議論した.
コヒーレント偏極電子線による時間相関測定

コヒーレント偏極電子線を用いて強度相関測定を実施し、透過電子顕微鏡において真の量子干渉効果の観測を目指した。コヒーレント偏極電子線を用いた強度相関測定系を構築に成功し、スピン偏極電子/無偏極電子の切り替えによるアンチバンチングの変化測定を実施にするに至った。その測定系時間分解性能は、コインシデンス検出器を除く計測システムにおいて時間分解能48.3 psを実現した。次に、本計測器を用いて10%程度のアンチバンチング量を検出することに成功し、さらにスピン偏極度により増強効果が僅かながら現れることを実証した。これにより、空間電荷効果と2次の干渉効果が重畳したアンチバンチングであることが見出された。電子線はそのフェルミ統計により強度干渉においてアンチバンチングを起こす。しかしながら、フェルミ統計由来のアンチバンチングであるのか空間電荷効果によるものなのか明確な分離測定手法がない。一方、我々はスピン偏極透過電子顕微鏡の開発の成功により、高い偏極度、高い空間干渉性を持った電子線生成を実現し、バイプリズムによる一次相関測定に成功した。そこで、本研究ではこのコヒーレント偏極電子線を用いて強度相関測定を実施し、スピン偏極電子/無偏極電子の切り替えによるアンチバンチングの変化を測定する。スピン偏極度を操作することによりアンチバンチングの物理を明確にし、電子による強度干渉実験の実証を目指す。平成27年度は、以下の3項目について進めた。1検出器の設計・作成:スピン偏極透過電子顕微鏡の観察室および試料室に挿入可能な検出器の設計を完了した。電子線入射方向に垂直な面内で微調整機構を加えたもので100μm以下の精度でビーム中心に設置可能となる。一方、電子線バイプリズム装置に逆バイアスを印可し、干渉性を保ったまま電子線を2つに分裂させ、検出器にそれぞれ照射できるサイズすることに成功した。2コインシデンス測定のための回路作成:パルスジェネレータからの信号を疑似信号としてコインシデンスアナライザへ入力後、TAC回路を介して波高分析器(PHA)へ入力する回路の作成に成功した。出力信号から10ps以下の時間分解能が達成できることを確認した。3同時計数測定の確認とバンチング測定デモ実験:前置増幅器へ同時に微少パルス信号を入力し、一方にのみディレイラインを食らえることでTACからのシグナルがPHA上でバンチングしていることを確認した。またコインシデンス回路のタイムウィンドウに連動した計測可能時間、入力パルス周期に同期した信号検出を確認し、S/Nの向上が可能な回路作成に成功した。当初計画通り、検出器の開発および高速検出回路の作成に成功している。また、それぞれの性能は目標とする値を上回っており、次年度計画の実験に遂行するに過不足無い状況であるため。コインシデンス計測用検出器をスピン偏極透過電子顕微鏡へインストールすることに成功した。また、本検出器へスピン偏極電子を精度良く照射することに成功し、効率よく検出する物理的配置を実現した。次に、電子線照射した際の同時計数測定を実施した。まず、2検出器それぞれの単電子カウントができる増幅・スレッショルド条件を精査し、スピン偏極電子を用いた2電子相関実験を実施した。電子線発生用レーザーの円偏光度を制御することで電子スピン偏極度を90%から0%まで可変にし、スピン偏極度に依存してアンチバンチング効果に変化があるか計測した。その結果、アンチバンチングにはスピン偏極度により増強効果が僅かながら現れることを実証した。この結果、空間電荷効果と真の量子干渉効果の重畳したアンチバンチングであることが見出された。また、フェルミ統計によるアンチバンチング効果をコヒーレント偏極電子線を用いて検証することに成功した。これらを統合したシステムとしての性能を確認することで、インターフェイスにおける問題が無いか確認を行うことで、その後の精密実験に誤差を極力与えない工夫を加える。次に、検出器を当該電子顕微鏡にインストールし計測実験を進める。同時計数測定を実施するが、検出器同士のクロストークを抑えるため、コヒーレンスの無い電子波を用いて電子検出部分の性能評価を事前に行う。この後、同時計数測定によりアンチバンチング現象の検出に挑む。ここで電子生成に用いるレーザーを時間変調することで電子線の時間構造を変え、ノイズ成分の除去を実施する。次に、空間電荷効果によるアンチバンチング効果なのか量子効果によるものなのか検証すべく、スピン偏極度を変化させアンチバンチング深さのスピン偏極度依存性を測定する。これによりフェルミ統計に従う効果であるかを検証する。電子顕微鏡平成27年度では、検出器の設計を終了しており、実際の検出装置については平成28年度に購入を予定している。

しかし、検出器の価格が当初よりも高額となったことから、平成27年度予算を無理し使用せず次年度へ繰り越し、無理な設計変更を科すことで生じる性能劣化を抑止し、本研究の遂行を効果的に進め且つ予算を効果的に活用するに方針をとったため。平成27年度に詳細設計を行った新型検出器を導入し、既に作成に成功した同時検出用電子回路と組み合わせることで、強度干渉実験を実施する。
サイクリンG2:新しい細胞周期調節因子の口腔癌における発現および機能解析

【目的】Laser CaptureMicrodissection(LCM)法とDNAチップ(6800遺伝子/1チップ)を用い、同一患者のヒト口腔粘膜正常組織と癌組織のDNA解析を行ない、それらの間で遺伝子の発現に顕著に差異が認められる27遺伝子を同定した。なかでも細胞周期に関与していると考えられるサイクリンG2の発現が癌細胞で減少していた(Oncogene,20(43),2001)。細胞周期におけるヒトサイクリンG2の働きは不明確である。そこで本研究はヒトサイクリンG2の細胞周期調節因子としての役割を解明することを目的とした。【方法】サイクリンG2の発現をヒト正常口腔粘膜由来細胞、ヒト口腔扁平上皮癌由来細胞株、ヒト扁平上皮癌細胞株を用いて、ノーザンブロッテイング、ウエスタンブロッテイングで確認し、正常口腔粘膜組織、口腔癌組織を用いて免疫染色を行ない局在変化を確認した。さらに口腔癌細胞にヒトサイクリンG2を遺伝子導入した過剰発現細胞株や正常口腔粘膜由来細胞にsiRNAを組み込んだヒトサイクリンG2発現抑制株を樹立し、それらの細胞を用いて細胞周期におけるサイクリンG2の発現様相や増殖におけるサイクリンG2の役割を検索した。【結果】正常培養細胞でサイクリンG2の発現がみられ、癌細胞では発現の減少や消失が認められた。癌細胞株にヒトサイクリンG2を遺伝子導入し、過剰発現させるとコロニー形成率が低下し、さらに遺伝子導入後24時間でS期が減少し、G1期が増加し、細胞増殖率は減少した。この結果からサイクリンG2は癌細胞を増殖抑制する機能があることが示唆された。正常口腔粘膜細胞を不死化させた細胞にsiRNAを導入し、サイクリンG2の発現を抑えると、細胞増殖率が上昇し、siRNAを導入していないコントロール細胞と比較するとG1期が減少し、S期、G2期が増加していた。この結果から正常上皮細胞でのサイクリンG2の減少は細胞増殖を促すことが明らかになった。以上のことからサイクリンG2は口腔上皮細胞の形質転換に重要な役割を担っていると考えられる。【目的】Laser CaptureMicrodissection(LCM)法とDNAチップ(6800遺伝子/1チップ)を用い、同一患者のヒト口腔粘膜正常組織と癌組織のDNA解析を行い、それらの間で遺伝子の発現に顕著に差異が認められる27遺伝子を同定した。その中でも細胞周期に関与していると考えられるサイクリンG2が正常細胞に比べ、癌細胞で発現が減少していた(OncogeneVol.20(43)2001)。ヒトサイクリンG2の働きは未だ明らかになっておらず本研究は細胞周期調節因子としての役割を解明することを目的とした。【方法】遺伝子の発現解析として7組の同一ヒト正常口腔粘膜組織と口腔扁平上皮癌組織からtotal RNAを抽出し、Northern blotting法を行った。さらにヒト口腔正常粘膜組織、癌組織におけるサイクリンG2の細胞内局在を免疫染色法で観察し、サイクリンG2のタンパク発現はウエスタンブロット法を用いて定量的に調べた。免疫染色は正常口腔粘膜12例、口腔粘膜上皮異形成39症例、扁平上皮癌38症例を用い、ウエスタンブロット法には正常口腔粘膜由来細胞(OKF4,OKF6)、口腔癌由来細胞株(SCC4,SCC14,SCC66,SCC105)を用いた。【結果】サイクリンG2mRNAはヒト口腔扁平上皮癌の7例中5例で減少あるいは検出できなかった。

サイクリンG2のタンパク発現は正常口腔粘膜培養細胞で発現していた(2/2)が口腔癌培養細胞株では発現が減少あるいはみられなかった。免疫染色ではサイクリンG2の発現はすべての正常口腔粘膜(12/12)と口腔粘膜上皮異形成症例の41.0%(16/39)に核に強く見られ、46.1%(18/39)が核と細胞質に陽性、5.1%(2/39)が細胞質のみに陽性であった。一方、口腔扁平上皮癌の症例では32%(12/38)が核と細胞質に陽性で、34%(13/38)が細胞質のみ陽性で34%(13/38)が陰性であった。さらにヒトサイクリンG2とp53との関連性を検索するために培養細胞をアクチノマイシシDで処理後、サイクリンG2とp53の発現をウエスタンブロット法で検索した。p53の発現の有無にかかわらずサイクリンG2の発現には変化が認められなかったことよりヒトサイクリンG2活性はp53依存性ではないということが考えられる。次年度はCDKとサイクリンG2との関連性、細胞へのG2遺伝子導入後の細胞周期調節機構の解明を行う予定である。【目的】Laser CaptureMicrodissection (LCM)法とDNAチップ(6800遺伝子/1チップ)を用い、同一患者のヒト口腔粘膜正常組織と癌綿織のDNA解析を行ない、それらの間で遺伝子の発現に顕著に差異が認められる27遺伝子を同定した。なかでも細胞周期に関与していると考えられるサイクリンG2が正常細胞に比べ、癌細胞で発現が減少していた(Oncogene, vol.20 (43) 2001)。ヒトサイクリンG2の働きは細胞周期においての役割が未だ明確ではない。そこで本研究はヒトサイクリンG2の細胞周期調節因子としての役割を解明することを目的とした。【方法】ヒト正常口腔粘膜由来細胞(OMK)、ヒト口腔扁平上皮癌由来細胞株(HSC4)、ヒト扁平上皮癌細胞株(Hela)を用いて、細胞周期関連タンパクである,CDK2 (Cyclin Depelldent Kinase 2),CDK4,CDK6とサイクリンG2タンパクとの結合性を免疫沈降法で検索し、遺伝子発現解析や機能解析のためにサイクリンG2を過剰発現させた細胞株の樹立を試みた。【結果】免疫沈降の結果からサイクリンG2はCDK2,CDK4,CDK6と結合していなかった。以上のことから前回の結果であるp53非依存性と考え合わせるとサイクリンG2は単独で作用しているか、CDK2,4,6以外のタンパクと結合している可能性がある。またサイクリンG2の過剰発現細胞株の樹立が困難である原因の一つとしてコロニー形成率の低下や細胞増殖能の低下があり、サイクリンG2は細胞周期の負の制御因子であると考えられる。さらにサイクリンG2過剰発現細胞株樹立を進め、機能解析を進める予定である。【目的】Laser Capture
３次元細胞集合体の内部における生存機能を可視化する革新的イメージング技術の創出

平成30年度は、細胞の生存機能を可視化するための基盤技術開発を行った。モレキュラービーコン(MB)は、細胞内で様々な生物機能を制御するmRNAを汎用的に可視化するための核酸イメージングプローブである。そこで、MBを細胞内に効率よく導入し、その細胞内動態を制御することで、細胞の生存機能を可視化することを試みた。アポトーシス細胞(=死細胞)でのみ特異的に発現するカスパーゼ-3のmRNAを検出するMBを設計し、生体吸収性高分子であるゼラチンからなるナノ粒子にMBを内包させた。MB内包ゼラチンナノ粒子をin vitroで単層培養された間葉系幹細胞に取り込ませることで標識し、アポトーシスを誘導した。その結果、MB内包ゼラチンナノ粒子は、既存のアポトーシス検出方法に比較して、より初期かつ低レベルのアポトーシスを細胞非破壊的に可視化することができた。さらに、ゼラチンナノ粒子の分解性を材料学的に制御することで、より長期にわたってMBを細胞内で徐放し、細胞内mRNAの検出活性を長期化することができた。以上の研究成果より、MB内包ゼラチンナノ粒子は、細胞死可視化センサーとして有効に機能することがわかった。また、細胞死可視化センサーの細胞死応答性および細胞死検出期間の観点から、その作製条件および細胞標識条件は既に最適化され、次年度以降の研究をスムーズに遂行することができる。当初の計画通り、細胞死可視化センサーを作製し、その作製条件について最適化を行った。作製された細胞死可視化センサーは、間葉系幹細胞のアポトーシスを感度よく検出することができた。さらに、細胞内徐放技術を適用することで、その検出活性を長期化することができた。MB内包ゼラチンナノ粒子は細胞死可視化センサーとして有効に機能することがわかった。しかしながら、本研究課題の目的である細胞集合体内部やin vivoにおいて、その蛍光強度および細胞死に対する応答性に問題が生じた場合に備えて、activatable量子ドットを用いた検討を引き続き行う。次年度以降は、細胞死可視化センサーによって標識された細胞から、異なるサイズや形状をもつ細胞集合体を構築し、共焦点レーザー顕微鏡を用いることで集合体内部における細胞死を非破壊的にイメージングする。細胞死可視化センサーの性能を基に、集合体内部における死細胞数と細胞死の位置(深さ)との相関を評価する。集合体のサイズと形状が、集合体内部の細胞死(細胞数・内部の深さ・いつ細胞死が起こるか)に及ぼす影響についても調べる。