hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
臨床応用に向けた喘息におけるアクアポリン３の役割の解析

加えて、各種サイトカイン・メディエーターについて、網羅的な解析を行った。喀痰中のAQP3濃度については、3群間で有意な差は認めなかったが、AQP3と各種サイトカイン・メディエーター濃度との関係は各群で特徴的なパターンを認めた。全体解析でAQP3と関連の強いサイトカインはIL-7, IL-12, IP-10 (rho=0.540.41, p<0.0001)であった。健常人ではIP-10, IL-12, G-CSF, IL-8 (rho=0.670.54, p <0.03)、非重症喘息例ではIP-10, IL-7, MIP-1b, IL-9, MCP-1, IL-12 (rho=0.560.39, p<0.005)、重症アトピー型喘息例ではIL-12, IL-13, IL-10, IL-7, VEGF, Eotaxin, MCP-1 (rho=0.590.37, p<0.03)の各濃度がAQP3濃度と関連した。生理的環境下・非重症喘息例ではAQP3と2型炎症との関係は乏しいが、重症アトピー型喘息例ではIL-13やeotaxinなどとの関係が認められ、2型炎症への関与も示唆される結果を得た。今後、臨床指標との関連も検討していく予定である。健常人、非重症喘息、重症アトピー型喘息例を登録し、誘発喀痰上清中のAQP3の測定系を確立して、測定することができた。今、他のサイトカイン・メディエーターについて網羅的な解析を行っているところで、研究自体は、おおむね順調に経過することができた。登録症例に関して、喀痰上清中AQP3濃度を測定していき、好酸球性炎症、呼吸機能や喘息重症度などの臨床指標、炎症性メディエーター、喘息の増悪などとの関連について、主として相関関係を解析する。さらに、多重検定を考慮し有意検定を行う。マウスではAQP3と2型炎症との関連が示唆されており、ヒトでも関連が示されれば、アトピー性2型炎症を特徴とする喘息に対する新規創薬標的分子となりうることが示されるし、また、もし再現されない場合においても、網羅的に解析した炎症性メディエーター・臨床指標とAQP3についてクラスター解析、主成分分析などを行い最も関連性のあるメディエーター・炎症パターンを明らかにし、非2型炎症の病態解明に貢献する。このようにして、現在の登録、測定、解析検討を続けていく。またマウスの喘息モデルにおいては、M2マクロファージにおいて、AQP3が過酸化水素の取り込みを調整しながらケモカインの発現を制御していることを証明したが、ヒト喘息患者からもM2細胞を単離し、細胞実験を通して、同様の作用が起こっているのか検証することを目標とする。症例登録も完了し、研究の一番の主体であった誘発喀痰上清中のAQP3の測定も終了した。現在、いろいろなサイトカイン、メディエーターや臨床指標との解析を行っている。AQP3との関連について、重症アトピー型喘息例では、生理的環境下・非重症喘息例と異なり、IL-13やeotaxinなどとの関係が認められ、2型炎症への関与も示唆される結果を得ており、今後、さらに解析をすすめてsupportiveなデータがあれば追加して、2019年度にまとめて論文投稿ができるようにすすめていきたいと考えている。研究代表者である小賀が、年度途中で、所属が京都大学大学院医学研究科より、川崎医科大学呼吸器内科学教室へ異動となり、体制がかわり、状況を整えるのに時間を要して、環境がかわって、物品の購入の予定が当初よりかわってしまったことがおり、主な原因である。なお、研究自体は、連携研究員である京都大学の松本准教授を中心に検体採取・測定を終了しており、あとは、協力体制を整えながら、結果の解析、まとめへ進んでいくので支障はない。
高速高精度な選択反応モニタリング定量的質量分析法による大腸癌先制医療の確立

申請者は、独自の血液前処理法、血清ペプチドーム解析法により、大腸癌患者血中で変動するペプチドを同定、5種のペプチドによるマルチマーカー解析により感度83%、特異度92%で大腸癌を検出することに成功した。本提案課題の目的は、安定同位体標識内部標準を使用した選択反応モニタリング質量分析法(SID-SRM-MS/MS)を利用して、高速高精度マルチペプチド定量法を開発することと、それらペプチドバイオマーカーを大腸癌の早期診断、病期診断、予後予測、予防対策の分野で応用した大腸癌先制医療を確立するための基盤研究を進めることである。平成30年度は、健常人63人、大腸癌72名のペプチドデータから大腸癌リスクインデックスを統計学的手法により確立した。さらに検証的検討を進め、健常人60人、腺腫59人、大腸癌各ステージ14人x4を対象に大腸癌リスクインデックスによる血清解析を実施した。結果、大腸癌リスクインデックスによるAUCはステージI: 0.779、ステージII:0.949、ステージIII:0.082、ステージIV:0.973といづれも層別化可能であった。さらに1,697名の検診受診者を対象に便潜血反応との比較試験を実施した。結果、大腸癌の発見率は、リスクインデックスグレードA(低リスク)では0%、グレードB(中リスク):0.65%、グレードC(高リスク):1.01%であった。さらに、便潜血反応の陰性例から大腸癌が0.25%発見された。便潜血反応に比較してペプチドバイオマーカー法の優位性が確認された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画1:大腸癌早期診断のためのマルチペプチドマーカー解析と臨床評価ペプチド解析のための独自の血液前処置法を開発し、高速ペプチドーム定量法(BLOTCHIP-MS/MS)により、大腸内視鏡検査受診者の健常人と臨床病期3ー4期の大腸癌ペプチドマーカー比較において、5種のペプチドによるマルチマーカー解析を実施し、高感度、高特異度で大腸癌を検出できることに成功した。検診症例を集積し、Validation試験を実施中である。研究計画2:分子イメージング法、ペプチドワクチンに応用可能な大腸癌組織特異的ペプチドの同定7例の進行大腸癌患者から得た癌組織と周辺正常組織についてBLOTCHIP-MS/MS解析によるペプチド解析を終了し、各ペプチドピークの比較解析を行い、2群間に有意差のあるペプチドピーク199個を選出している。さらにAUC値が0.8以上の27個の大腸癌特異的ペプチド候補を得た。大腸癌リスク診断のための新規なペプチド解析、代謝物解析の中で、早期診断に有用なペプチドだけでなく、代謝物の変動を解析し新たなバイオマーカーを同定した。当初の研究計画に従っておおむね順調に進展している。わが国の大腸癌罹患率、死亡率は急増しており、その対策は緊喫の臨床的課題である。本提案課題の目的は、安定同位体標識内部標準を使用した選択反応モニタリング質量分析法(SID-SRM-MS/MS)を利用して、高速高精度マルチペプチド定量法を開発することと、それらペプチドバイオマーカーを大腸癌の早期診断、病期診断、予後予測、予防対策の分野で応用した大腸癌先制医療を確立するための基盤研究を進めている。平成29年度は、臨床情報既知検体を用いたマルチペプチドマーカー解析による大腸早期癌診断の妥当性検討し、2829年度に確立した5種のペプチドマーカーのSID-SRM-MS/MS法により、年齢・性をマッチングした健常人、大腸腺腫症例、早期大腸癌症例、進行大腸癌症例に対して、症例ー対照研究を実施し、論文化した(J Gastroenterol)。健常人を対象にした大腸癌のステージ毎の診断能(AUC)は、ステージ1 0.779、ステージ2 0.946、ステージ3 0.852、ステージ4 0.973と高感度であった。さらに、5種のペプチドマーカー以外のバイオマーカーについても探索的研究を進め、血清胆汁酸プロファイルによる大腸癌のリスク診断能、水溶性代謝物によるリスク診断についてもデータ解析が終了しており、よりビッグなデータの統合的解析に対する準備も始めている。臨床研究は概ね順調であり、30年度にはより大規模な臨床評価を実施できる予定である。

結果、大腸癌リスクインデックスによるAUCはステージI: 0.779、ステージII:0.949、ステージIII:0.082、ステージIV:0.973といづれも層別化可能であった。さらに1,697名の検診受診者を対象に便潜血反応との比較試験を実施した。結果、大腸癌の発見率は、リスクインデックスグレードA(低リスク)では0%、グレードB(中リスク):0.65%、グレードC(高リスク):1.01%であった。さらに、便潜血反応の陰性例から大腸癌が0.25%発見された。便潜血反応に比較してペプチドバイオマーカー法の優位性が確認された。大腸癌メタボローム分析の結果、腸内フローラの関与する可能性がある代謝物を同定した。他研究でも大腸癌と腸内フローラの関連が示唆されているため、今後の研究においては腸内フローラの解析も進め、ペプチドマーカーとの相関についても解析する予定である。研究計画1:大腸癌早期診断のためのマルチペプチドマーカー解析と臨床評価:順調であり、30年度はより大規模試験を計画した。研究計画2:分子イメージング法、ペプチドワクチンに応用可能な大腸癌組織特異的ペプチドの同定:5種のペプチドのアミノ酸配列も同定しており、予定どおり進める計画である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
概念的クラスタリング法によるバイオデ-タベ-スからの知識獲得ータンパク質内部における電子伝達系の解明ー

本研究では、知識情報処理の方法論を取り入れてバイオデ-タベ-スを解析することにより,電子伝達系タンパク質分子内部の電子伝達経路を明らかにした.以下にその概要を述べる.1.一群のタンパク質分子のアミノ酸配列が与えられたとき,概念的クラスタリングの方法論により、アミノ酸配列の多重並置を行い,同時に分子群の分類樹を作成するためのシステムCLUSMOL/SをLisp言語により作成した.このシステムでは、specificなアミノ酸ばかりでなく、類似した性質を持つアミノ酸同士が並置される.しかも,分類樹の上位ノ-ドの構造としてgenericな配列が与えられるという機能を有している.2.CLUSMOL/Sシステムを,NBRF一次構造デ-タベ-ス中のCytochrome Cを始めとする各種の電子伝達タンパク質に対して適用した.その結果,specfic/genericな保存残基を容易に識別することができた.ついで,3次構造デ-タベ-スPDBに格納されているtuna Cytochrome c上での保存残基間の距離を検討した結果,分子表面から内部のヘムに至る3本の候補経路を得ることができた.これらの経路に関与する残基は,全て共役電子を構成することができるものばかりであった.さらに,これらの経路を構成する残基からモデルタンパク質分子を設定し,分子軌道法計算を実行したところ,3本の経路の中で,Tryー74,Trpー59,Tyrー67,Metー80により構成されるものが,残基間で大きな電子的相互作用を示すため,電子伝達に直接関与する部分であると結論づけることができた.同様の経路がCytochrome c550,c2およびブル-銅タンパク質に関しても得られている.本研究では、知識情報処理の方法論を取り入れてバイオデ-タベ-スを解析することにより,電子伝達系タンパク質分子内部の電子伝達経路を明らかにした.以下にその概要を述べる.1.一群のタンパク質分子のアミノ酸配列が与えられたとき,概念的クラスタリングの方法論により、アミノ酸配列の多重並置を行い,同時に分子群の分類樹を作成するためのシステムCLUSMOL/SをLisp言語により作成した.このシステムでは、specificなアミノ酸ばかりでなく、類似した性質を持つアミノ酸同士が並置される.しかも,分類樹の上位ノ-ドの構造としてgenericな配列が与えられるという機能を有している.2.CLUSMOL/Sシステムを,NBRF一次構造デ-タベ-ス中のCytochrome Cを始めとする各種の電子伝達タンパク質に対して適用した.その結果,specfic/genericな保存残基を容易に識別することができた.ついで,3次構造デ-タベ-スPDBに格納されているtuna Cytochrome c上での保存残基間の距離を検討した結果,分子表面から内部のヘムに至る3本の候補経路を得ることができた.これらの経路に関与する残基は,全て共役電子を構成することができるものばかりであった.さらに,これらの経路を構成する残基からモデルタンパク質分子を設定し,分子軌道法計算を実行したところ,3本の経路の中で,Tryー74,Trpー59,Tyrー67,Metー80により構成されるものが,残基間で大きな電子的相互作用を示すため,電子伝達に直接関与する部分であると結論づけることができた.同様の経路がCytochrome c550,c2およびブル-銅タンパク質に関しても得られている.
ボツリヌス毒素を用いたCa流入以降のトランスミッタ-放出過程の解明

ウシの脳からシナプス小胞を分離し、低分子量GTP結合蛋白質の局在化を調べた。この結果、シナプス小胞には3種の低分子量GTP結合蛋白質が存在することを明らかにした。このうちの1種類のGTP結合蛋白質は、ボツリヌス毒素によりADPーリボシル化される蛋白質であった。トランスミッタ-放出過程に対するこの蛋白質の役割を種々検討したが、現在のところまだこの蛋白質の役割を解明するには至らなかった。一方、ラット胎児脳初代培養細胞をジギトニン処理して膜透過性を増大させた標品を作製した。この系では、細胞外のCa濃度を変化させると細胞内のCa濃度を容易に変えられる利点がある。この方法で細胞内Ca濃度を変化させると、ノルエピネフリン、セロトニン、GABA等のトランスミッタ-の放出が起こるが、ボツリヌス毒素によりこの放出は完全に抑制された。したがって、ボツリヌス毒素がトランスミッタ-放出過程におけるCa流入以降のどこかに働いていることは確かである。また、ボツリヌス毒素は、各種のトランスミッタ-放出に共通の機構をブロックしていることも確かである。しかしながら、ボツリヌス毒素の細胞内タ-ゲットは、依然として不明である。またラット胎児脳初代培養細胞にグリア細胞由来の神経分化因子を作用させ、アセチルコリンの合成酵素の活性化を調べた。この結果、この因子を作用させるとアセチルコリン合成酵素の顕著な活性化が起こったが、コリンの細胞内への取り込み能は変化がなかった。すなわち、神経がコリン作動性に分化する際、アセチルコリン合成酵素とコリン取り込み能は、全く独立の機構で発達することがわかった。
閉塞性肺疾患病態におけるタフト細胞の関与およびその制御機構の解明

タフト細胞(tuft cell:刷子細胞)はIL-25産生を介して2型自然リンパ球(ICL2)を誘導することでアレルギー性炎症病態形成に重要な役割をはたす可能性が示唆されている。しかし、喘息をはじめとする閉塞性肺疾患およびその増悪病態におけるタフト細胞の関与は未だ不明である。そこでまずヒト気道上皮細胞を用いてタフト細胞のメディエーター放出機序について明らかにするためにタフト細胞への分化誘導についての検討をおこなった。初年度に引き続き研究で使用した気道上皮細胞は、肺癌疑いの手術対象者において十分な説明と文章による同意を得た上で癌組織より十分離れた部分の肺組織から分離培養し液体窒素化に保存したものを使用した。また、今年度も分離培養した健常非喫煙者の気道上皮細胞をair -liquid interface(ALI)環境下にて培養し検討をおこなった。初年度の検討ではrecombinant IL-13(rIL-13)10ng/ml刺激で杯細胞を示すMUC5AC発現の増強は確認できたが、タフト細胞を示すdouble cortin like kinase 1(DCLK1)発現は逆に抑制された。そこで、rIL-13によりMUC5AC発現がより優位に誘導された可能性を考え濃度を1ng/mlへ変更しMUC5AC、DCLK1、またタフト細胞により産生されるIL-25発現についても検討をおこなった。評価は7日目もしくは14日目に加えて21日目でも評価した。rIL-13刺激によりMUC5AC発現の増強は確認できたが、DCLK1の発現は増強せず、IL-25については測定感度以下であった。rIL-13単独刺激ではDLCK1発現増強は確認できないためIL-33等、別の刺激を加えることでDLCK1発現について検討を行う予定である。また、初年度に引き続き肺組織を用いてDCLK1発現の検討を免疫染色を用いておこなう予定であったが、本年度も十分な検体が集まらなかった。引き続き検体の集積を行う予定である。検討に必要なヒト気道上皮細胞の集積ができなかった。また、今までヒト気道上皮細胞培養に用いていた培養液の入手が困難となり追加の検討を行うことができなかった。引き続き手術肺検体の集積を行い肺組織および気道上皮細胞の集積を行い検討する。アレルゲン感作曝露喘息マウスモデルの肺組織検体を用いて刷子細胞についての検討を行う。タフト細胞(tuft cell:刷子細胞)はIL-25産生を介して2型自然リンパ球(ICL2)誘導によりアレルギー性炎症病態形成に需要な役割をはたす可能性が示唆される。気道上皮細胞は、肺癌疑いの手術対象者において十分な説明と文章による同意を得た上で癌組織より十分離れた部分の肺組織から分離培養し液体窒素化に保存した。分離培養した健常非喫煙者の気道上皮細胞をair -liquid interface(ALI)環境下にて培養し、無刺激もしくはrecombinant IL-13(rIL-13)刺激しタフト細胞を示すdouble cortin like kinase 1(DCLK1)発現もしくは杯細胞を示すMUC5AC発現について比較検討した。評価は7日目もしくは14日目の時点でおこなった。rIL-13刺激によりMUC5AC発現の増強は確認できたが、DCLK1の発現は予想に反して逆に抑制された。rIL-13単独刺激ではDLCK1発現増強は確認できないためIL-33等、別の刺激を加えることでDLCK1発現について検討しようと考えている。また、肺組織を用いてDCLK1発現の検討を免疫染色を用いておこなう予定であった。しかし、本年度は十分な検体が集まらなかった。検討に必要な手術肺検体および気道上皮細胞を集積することができなかったため。

そこで、rIL-13によりMUC5AC発現がより優位に誘導された可能性を考え濃度を1ng/mlへ変更しMUC5AC、DCLK1、またタフト細胞により産生されるIL-25発現についても検討をおこなった。評価は7日目もしくは14日目に加えて21日目でも評価した。rIL-13刺激によりMUC5AC発現の増強は確認できたが、DCLK1の発現は増強せず、IL-25については測定感度以下であった。rIL-13単独刺激ではDLCK1発現増強は確認できないためIL-33等、別の刺激を加えることでDLCK1発現について検討を行う予定である。また、初年度に引き続き肺組織を用いてDCLK1発現の検討を免疫染色を用いておこなう予定であったが、本年度も十分な検体が集まらなかった。引き続き検体の集積を行う予定である。検討に必要なヒト気道上皮細胞の集積ができなかった。また、今までヒト気道上皮細胞培養に用いていた培養液の入手が困難となり追加の検討を行うことができなかった。引き続き手術肺検体の集積を行い肺組織および気道上皮細胞の集積を行い検討する。手術肺検体の集積が困難な場合はOVA感作曝露喘息マウスモデル等を用いて刷子細胞の検討を行う。アレルゲン感作曝露喘息マウスモデルの肺組織検体を用いて刷子細胞についての検討を行う。肺組織を用いて免疫染色等による検討を行う予定であったが十分な検体を集積できず、次年度使用額が生じた。次年度使用額は引き続き肺組織の集積を行い免疫染色等に用いる消耗品の購入に使用する予定である。培養液が入手困難となりヒト気道上皮細胞による追加検討を行えなかった。また、肺組織を用いて免疫染色等による検討を行う予定であったが十分な検体を集積できず、次年度使用額が生じた。次年度使用額は引き続き肺組織の集積を行い免疫染色等に用いる消耗品の購入、マウスモデルでの免疫染色等に用いる消耗品の購入等に使用する予定である。
細胞融合装置を用いた精子-卵子の受精促進に関する研究

マウス体外受精の実験系を確立中である。培養液・添加血清・ガス濃度等の培養環境を設定中である。平成5年度にマイクロマニピュレーターが導入され、現在ヒト不妊症領域における重症男性不妊症患者の治療に応用している。今後、マウスにおいては研究計画調書に述べた細胞融合の至適条件の設定、安全性の確認を行ってゆく予定である。また、ヒトにおいては、重症男性不妊症患者の治療をマイクロマニピュレーターで行ないつつ、本機の操作技術の向上をはかる。
関節リウマチにおけるアディポサイトカインの臨床的意義

脂肪組織はアディポサイトカインと呼ばれる生理活性物質を分泌しており、申請者らは関節リウマチ(RA)における意義を検討した。中でもアディポネクチンは、ヒト滑膜細胞のIL-8産生(Biochem Biophys Res Commun.2009;378:218-223)やプロスタグランジンE2産生(Arthritis Rheum.2010;62:1641-1649)を増加させた。一方、RA患者のアディポネクチン、レジスチン、レプチン血清濃度は健常人よりも増加していた(Intern Med.2011;50:269-275)。即ち、アディポサイトカインはRAの病態形成に何らかの関与をしていることを示唆している。近年、脂肪組織は単なるエネルギー蓄積という機能のみならず、さまざまな生理活性物質を分泌するホルモン臓器として機能していることが明らかとなった。これらは一般に、アディポサイトカインあるいはアディポカインと呼ばれている。関節リウマチ(RA)は、自己免疫異常を背景とした原因不明の慢性炎症性疾患だが、その病態形成に関わる炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α、インターロイキン(IL)-1、IL-6などを標的とした生物学的製剤がRA患者で著効することが知られている。しかし、これらの最新治療にもかかわらず改善しない患者がなおも認められ、RAの全ての病態形成をこれらの炎症性サイトカインのみで説明することはできない。そこで申請者らは、アディポネクチン、レジスチン、レプチンなどのアディポサイトカインに注目し、倫理委員会の承認を得た実験計画でRA病態形成におけるこれらの意義を検討した。まず、RA患者における血清アディポサイトカイン濃度を検討したところ、アディポネクチンおよびレプチン濃度が増加していた。次に、ヒト滑膜細胞に対するアディポサイトカインの作用をin vitroで検討した。まず、ヒト滑膜細胞のIL-8産生に及ぼす作用を検討したところ、生理的血中濃度のアディポネクチンには、特異的受容体を介したIL-8産生増加作用が認められた。しかし、レジスチンおよびレプチンの生理的血中濃度ではIL-8産生は変化しなかった(Kitahara K, et al. Biochem Biophys Res Commun2009;378:218-223)。現在、他疾患も含めた種々の炎症性疾患における血清アディポサイトカイン濃度や、滑膜細胞における炎症マーカーに及ぼすアディポサイトカインの影響を検討中であり、本年度以降に公表する予定である。近年、脂肪組織は単なるエネルギー蓄積という機能のみならず、さまざまな生理活性物質を分泌するホルモン臓器として機能している。まず、RA患者における血清アディポサイトカイン濃度を検討したところ、アディポネクチンなどの血中濃度が増加していた。既に平成20年度の研究で、生理的血中濃度のアディポネクチンは、特異的受容体を介してヒト滑膜細胞のIL-8産生増加作用があることを見出した(Kitahara K, et al. Biochem Biophys Res Commun 2009 ; 378 : 218-223)。さらに平成21年度の研究で、アディポネクチンはヒト滑膜細胞のシクロオキシゲナーゼ-2と膜関連プロスタグランジンE合成酵素-1の発現増加を介してプロスタグランジンE2産生を増加させることを証明した(Kusunoki N, et al. Arthritis Rheum, Epub 2010 Mar 10)。これらの成績は、アディポネクチンは、少なくとも滑膜局所では炎症性サイトカインとして作用していることを示唆するものである。平成22年度は、これらの成績と臨床成績との関連をさらに検討する予定である。関節リウマチ(RA)は、自己免疫異常を背景とした原因不明の慢性

炎症性疾患だが、その病態形成に関わる炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α、インターロイキン(IL)-1、IL-6などを標的とした生物学的製剤がRA患者で著効することが知られている。しかし、これらの最新治療にもかかわらず改善しない患者がなおも認められ、RAの全ての病態形成をこれらの炎症性サイトカインのみで説明することはできない。そこで申請者らは、アディポネクチン、レジスチン、レプチンなどのアディポサイトカインに注目し、倫理委員会の承認を得た実験計画でRA病態形成におけるこれらの意義を検討した。まず、アディポサイトカインの作用をin vitroで検討した。生理的濃度のアディポネクチンは、特異的受容体を介してヒト滑膜細胞のIL-8産生(Biochem Biophys Res Commun. 2009;378:218-223)、およびシクロオキシゲナーゼ-2と膜関連プロスタグランジンE合成酵素-1の発現誘導を介したプロスタグランジンE2産生(Arthritis Rheum. 2010;62:1641-1649)を増加させることを見出した。H22年度はRA患者における血清アディポサイトカイン濃度を検討したところ、アディポネクチン、レジスチン、レプチンの血清濃度が増加し(Intern Med. 2011;50:269-275)、いずれも血清CRP濃度と有意に相関していた。これらの成績は、少なくとも一部のアディポサイトカインは、滑膜局所では炎症性サイトカインとして作用していることを示唆するものである。今後は、これらのアディポサイトカイン相互の関係や炎症誘発機序などの研究を進めたい。
P75遺伝子の神経再生における役割と治療への応用

P75神経栄養因子受容体欠損かつS-100蛋白GFP発現の両方の性質を持つマウスの作成に成功した。これらの遺伝子改変マウスに対して神経移植手術により髄鞘の再生を可視化する方法を改良中である。研究を進める中でP75欠損マウスの皮膚創傷治癒が大きく遅延する事象を認めたため、その線維芽細胞を用いた実験も行った。P75欠損線維芽細胞の遊走能・増殖能・分化能が野生型のそれに比べ低下している事を支持するデータを得たため、発表を行った。P75ノックアウトマウスの安定した繁殖に成功した。同時にS-100蛋白GFP発現マウスとのdouble transgenicマウスの作成を進め、これに成功した。これらの実験動物を用いて、次年度には次の実験を行う予定である。1手術により坐骨神経に欠損を生じたS-100蛋白GFP非発現マウスに対してGFP発現マウスの神経移植を行い、一定期間の後に摘出する。ドナー坐骨神経内に進入したGFPの蛍光を以て髄鞘の再生を可視化する。この評価をP75ノックアウト・野生型両タイプについて行い、P75の欠失がin vivoで髄鞘の再生に及ぼす影響を知る。2 S-100蛋白GFP発現マウスの神経組織から得た培養シュワン細胞を一定の条件下(wound healingassay又はボイデンチャンバー)で遊走させる。この評価をP75ノックアウト・野生型両タイプについて行い、P75の欠失がin vitroでシュワン細胞の遊走に及ぼす影響を知る。これら1、2の結果により、P75が末梢神経の再生に及ぼす影響を知ることで顔面神経麻痺などの治療に関する新たな知見に繋げることが期待できる。また、研究を進める中でP75ノックアウトマウスの皮膚創傷治癒が野生型に比べ遅延する事象を認めたため、その皮膚より培養した線維芽細胞を用いた実験でP75ノックアウトマウス線維芽細胞の遊走能・増殖能・筋線維芽細胞への分化が野生型のそれに比べ低下している事をin vitro/in vivo両面から示すデータを得た。本件に関しても次年度に論文投稿の予定である。P75^<NIK>ノックアウトマウスの安定した繁殖に成功した。同時にP75^<NIK>ノックアウト及びS-100蛋白GFP発現のdouble transgenicマウスの作成を進め、これの安定した繁殖に成功した。これらのtransgenicマウスに対して手術により髄鞘の再生を可視化する方法を考案し、実施した。具体的にはcommon peroneal nerveに10mmの欠損を生じさせたS-100蛋白GFP非発現マウスに対してGFP発現マウスの神経片移植を行い、一定期間の後に摘出する。レシピエントのcommon peroneal nerve内に進入したGFPの蛍光を計測し、シュワン細胞の進入距離とした。P75ノックアウト・野生型両タイプについて行い、P75の欠失がin vivoで髄鞘の再生に及ぼす影響を計測した。これらの結果により、P75が末梢神経の再生に及ぼす影響を知ることで顔面神経麻痺などの治療に関する新たな知見に繋げることが期待できる。P75ノックアウトマウスのcommon peroneal nerveが野生型に比べて非常に細いため、安定した吻合を行えるよう手技を改良中である。また、研究を進める中でP75ノックアウトマウスの皮膚創傷治癒が野生型に比べ遅延する事象を認めたため、その皮膚より培養した線維芽細胞を用いた実験を行った。P75ノックアウトマウス線維芽細胞の遊走能・増殖能・筋線維芽細胞への分化が野生型のそれに比べ低下している事をin vitro/in vivo両面から示すデータを得た。本件に関して論文投稿中である。P75^<NTR>ノックアウトマウスの安定した暗色に成功した。同時にP75^<NTR>ノックアウトマウス及びS-100タンパクGFP発現のdoublu transgenicマウスの作成を進め、これの安定した繁殖に成功した。具体的にはcommon peroneal neaveに10mmの欠損を生じさせたS-100蛋白GFP非発現マウスに対してGFP発現マウスの神経片移植を行い、一定期間の後に摘出する。レシピエントのcommmn peroneal nerve内に進入したGFPの蛍光を計測し、シュワン細胞の進入距離とした。P75ノックアウト・野生型タイプについて行い、P75の欠失がin vivoで髄鞘の再生に及ばす影響を計測した。これらの結果により、P75が未鞘神経の再生に及ぼす影響を知ることで顔面神経麻痺などの治療に関する新たな知見に繋げることが期待できる。P75ノックアウトマウスのcommon peroneal nerveが野生型と比べて非常に細いため、安定した吻合を行えるよう手技を改良中である。

また、研究を進める中でP75ノックアウトマウスの皮膚創傷治癒が野生型に比べ遅延する事象を認めたため、その皮膚より培養した線維芽細胞を用いた実験を行った。P75ノックアウトマウス線維芽細胞の遊走能・増殖能・筋線維芽細胞への分化が野生型のそれに比べ低下している事をin vitro/in vivo両面から示すデータを得た。本件に関して論文投稿中である。
発生時期による神経幹細胞の分裂パターンの変化を制御する機構の解明

哺乳類大脳が発生する過程で、神経幹細胞は、対称分裂から非対称分裂へとその分裂パターンを変化させていく。この神経幹細胞の分裂パターン変化がどのように制御されているかを知るべく、発生時期の異なるマウス大脳原基から神経幹細胞を取り出し、単一細胞レベルでの網羅的な遺伝子発現プロファイリングを行った。得られた結果の解析から、「ニューロン産生は既に始まっているが、神経幹細胞の分裂の多くが対称分裂をする増殖期」から、「非対称分裂による活発なニューロン産生期」へ移行する時期に、ダイナミックな遺伝子発現パターン変化がおこっていることが明らかとなった。発生過程で神経幹細胞の細胞分裂回数はほぼ決まっていることから、今回明らかとなった発生時期に応じた神経幹細胞の「時間軸遺伝子」の変化は、神経幹細胞自身が、細胞分裂をカウントするシステムを介して制御している可能性がある。そこで、Notch活性化により細胞の未分化性を維持させつつ細胞周期進行を停止させる操作を行い、神経幹細胞内でおこる時間軸遺伝子の発現変化を検討した。その結果、細胞分裂が行われなくても、時間軸遺伝子の発現変化は進行することが明らかとなった。一方、単一細胞レベルでの遺伝子発現情報の解析により、発生の同時期に胎生初期型と中期型の神経幹細胞が組織内で混在することはなく、時間軸遺伝子の発現の変化は、近隣の神経幹細胞集団内でほぼ一様に進むこともわかった。これらのことから、神経幹細胞内でおこる「時計の進行」を、発生進行の程度に応じるように外部から調整するシステムが存在する可能性が示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。哺乳類大脳において神経幹細胞は発生時期に応じて細胞分裂のパターンを変化させる。このパターン変化がどのような機構でおこっているのかを知るために、神経幹細胞の経時的な遺伝子発現の変化に注目し解析をおこなった。まず、これまでに得ているマウス胎生11,14,16日目の神経前駆細胞由来の単一細胞由来cDNAに加えて、胎生10,12,13日目の各発生ステージにおいても、単一細胞由来cDNAを作成した。DNAマイクロアレイの結果の主成分分析等から、神経幹細胞の時間軸変化を代表する遺伝子セット21個を同定することができた。この遺伝子セットを用いて、新たに作成したcDNAをより詳細に検討した結果、マウス大脳では、神経幹細胞は胎生12日目に、その遺伝子発現パターンを大きく変化させていることが明らかとなった。引き続いて、神経幹細胞の、発生時期に応じた時間軸に沿った遺伝子発現パターンの変化に、具体的にどのような因子が関与しているのかの検討を行った。胎生12日目に大きな遺伝子発現変化がおこることが明らかとなったため、その時期を挟んでの実験操作と解析が必要である。胎生10日目、11日目という初期胚への遺伝子導入が必要であるため、この時期へのエレクトロポレーションによる生体内遺伝子導入法の検討を行い、いくつかの手技の改良を行った。その後、まず、時間軸にそった遺伝子発現のパターン変化におよぼす細胞周期の影響について検討を行った。未分化性を維持させるために活性型Notchを強制発現、した下で、細胞周期関連遺伝子を操作し細胞周期進行を停滞させた場合に、神経幹細胞の遺伝子発現がどのように変化するのかを調べるために、胎生11日胚の大脳に遺伝子導入を行い、胎生14日目に遺伝子操作された神経幹細胞をピックアップし、複数個の単一細胞由来cDNAを作成することができた。単一細胞由来cDNAの追加作成と、神経幹細胞の時期依存的マーカー分子の定量的PCRによる解析は当初の予定どおり進行している。神経幹細胞の時間軸変化に関与する因子の研究については、その実験系と解析系を立ち上げることができた。

細胞周期進行に関連する遺伝子のノックダウンと活性型Notchの導入を同時に行い、経時的に変化する21個の遺伝子セットの発現レベルの変動を調べることで、細胞周期進行が神経幹細胞の遺伝子発現パターンの経時的な変化にどのように関わっているのかの解析を行う。同様の解析系を用いて、既知のシグナル経路が経時的変化へおよぼす影響について調べる。また、発生時期に応じて変化する遺伝子群の中に、神経幹細泡の遺伝子発現パターンに関与している因子が含まれている可能性もあり、その因子を探索すべく、ノックダウン実験を中心にしたスクリーニングを行う。
幼若ホルモン受容体の探索

昨年度に続き、膜結合型幼若ホルモン受容体を検索するための発現クローニング法の確立を進めた。その結果、G-タンパク質共役型受容体についてはG-タンパク質やcAMP依存的Cl-チャンネルであるCFTRを共発現させたアフリカツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的手法でのクローニング系の確立に成功した。現在、様々な組織から調整したcDNAライブラリーについて、この発現系を用いて目的クローンの単離を目指しているが、これまでにポジティブなプールを見出すことはできていない。一方、クローニングのためのmRNAの材料、さらに細胞内情報伝達系など生化学的解析のためにJH受容体が確実に発現している細胞を見出すために昆虫培養細胞の検索を行った。昆虫細胞のいくつかは脱皮ホルモンであるエクジソンに反応して形態変化を起こすことが知られているが、これらの細胞に同時にJHを加えることでエクジソン単独では見られない変化が観察されるかどうかを検討した。現在までにJH添加の有無によって形態が変化する培養細胞は見出されていないが、これらの細胞についてもエクジソンカスケード系遺伝子の発現量の変化など形態以外の遺伝子発現量の変化について検討を行っている。膜結合型幼若ホルモン(JH)受容体を検索するため(1)哺乳類細胞、(2)アフリカツメガエル卵母細胞、を用いた発現クローニング系の構築を進めた。(1)膜結合型JH受容体はある種のG-蛋白質共役型受容体であるとの作業仮説のもとに、カルシウムイメージングによりJH受容体遺伝子をクローニングするために哺乳類細胞HEK293TにG15、G16を導入した細胞株の樹立、およびトランジェントな発現系の構築を行った。現在、細胞株は樹立できていないが、トランジェントな発現系ではHEK293Tの内在性β-アドレナリン受容体をIsoproterenolおよびcarbamylcholineで刺激することでG15、G16を介して細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることに成功した。今後この検定系を用いて膜結合型JH受容体の検索を行う予定である。(2)電気生理学的手法を用いたアフリカツメガエル卵母細胞による発現クローニング系確立のため、まず、内在性カルシウムチャンネルを開くlysophosphatidic acidを外液に加えることで卵母細胞の膜電位の変化が変化することを確認した。さらに、カイコの各組織から調整したmRNAを卵母細胞に注入し、一定時間培養した後外液にJHを加えることで膜電位が変化するかどうかを測定したが、現在までポジティブな結果は得られていない。今後JHをJH結合蛋白質と同時に加えること、また、GIRKを同時に発現してカリウム電流を検出するなど検定系の改良を試みる予定である。
多成分自己集合性分子システムの設計と構築

本研究では、巨大なπ共役系分子を特異的に認識するレセプターを、配位結合を利用した自己組織化によって効率的に構築する手法の開発およびレセプターの機能化を目指した。2年目は主にレセプターを用いた芳香族分子の有限集積と機能発現について調べたのでその研究の実績を以下に示す。2枚のパネル状有機多座配位子の間に、π-π相互作用を利用してπ共役系分子を集積可能なレセプターの構築を行った。実際、2枚のパネル状三座配位子間の距離を棒状の2座配位子(ピラー)の長さによって制御し、このパネルとピラーを遷移金属錯体によりつなぎとめることで配位結合性のレセプターを構築した。このレセプターを用いることで、芳香族分子をレセプターの内部空間にピラーの長さに応じて決まった数だけ取り込むことを可能にした。この手法により、パネル配位子と合計して、芳香族分子3から7分子の有限集積を達成した。これらのレセプターの構造はNMR、X線結晶構造解析、質量分析などの各種分析手法により決定した。次に、アクセプター性のレセプター内部にドナー性の芳香族分子を2分子集積したところ、2分子間の相互作用により、レセプターとの間の電荷移動吸収帯が1分子の場合に比べて長波長シフトする挙動が観測された。この知見をもとに、ダイマー状態の芳香族分子に由来する特異的な物性の観測を行った。具体的には、2分子のテトラチアフルバレン(TTF)をレセプターの内部に集積させ、その水溶液について2分子のTTFのうち1分子のみを電気化学的に酸化した。その結果、TTF2分子間で正電荷が非局在化したことを示す混合原子価状態に由来する吸収を近赤外領域に観測することに成功した。この挙動は、分子修飾を行っていないTTFにおいて溶液中では初めての観測例である。1年目は主に新規レセプターの構築を行ったのでその研究の実績を以下に示す。2枚のパネル状有機多座配位子の間に取り込むπ共役系分子が、パネル分子との間でπ-π相互作用するように距離を制御できる空間を設計した。そしてこの2枚のパネル配位子間の距離を一定に保つ柱となるように棒状の2座配位子(ピラー)を立てた。これらパネルとピラーを遷移金属錯体によりつなぎとめることで、パネルと取り込むπ系分子間でπ-π相互作用を働かせ、特異的にπ共役系分子を取り込むことが可能なレセプターの構築に成功した。このコンセプトをさらに拡張し、ピラーを伸長することで空間を拡張し、取り込む分子間においてもπ-π相互作用を働かせることができると考えた。その結果、ピラーの長さを変えることで、レセプター内部に2分子または3分子のπ系分子を積層させることに成功した。さらに、パネルの面積を拡大することによってより広い面積を持った内部空間を構築し、より巨大なπ共役系分子の認識および、複数のπ系分子を平面的な整列を検討した。この場合、パネル分子を大きくしたことにより、溶解度や平面性に問題を生じたため、ピラーを用いずにパネルの柔軟性を利用しパネル同士が直接金属を介してつながったレセプターを設計し実際に自己組織化を行った。この結果、パネルを大きくしたことによりトリフェニルベンゼン類など今までに例のない巨大なπ系分子を特異的に認識するレセプターを定量的に構築することに成功した。
ガスタービン高温部材の先進的冷却構造に関する研究

1基礎的実験解析東京農工大学において、タービン翼の先進的な冷却構造の2種類、トランスピレーション冷却構造(複合冷却構造)、およびマルチスロット冷却構造を取り上げ、各種のアクリル樹脂製拡大模型、低速風洞、冷却空気供給用ブロワーを用い、流れのレイノルズ数、代表長さを系統的に変えて実験解析を行った。実験ではレーザー光源、高速度カメラを用いた粒子画像流速法(PIV法)を適用し、冷却空気流れ場を詳細に観察した。これらにより冷却構造と冷却空気流れとの対応をつけて冷却性能が検証できるデータベースを構築した。また、マルチスロット冷却構造については数値解析も行い、その有効性を検証した。2実機模擬環境における伝熱解析宇宙航空研究開発機構において、上記2種の先進的冷却構造について、高温風洞を用いて模擬実環境での伝熱性能を実験解析した。トランスピレーション冷却構造については曲率の大きい前縁部に適用した場合の実験解析も行った。フィルム冷却については流れ場と温度場を連成させて数値解析を行い、その有効性を検証した。また、IHIにおいてこれらの冷却空気流れを検証する数値解析を行った。これらの研究成果を論文発表、学会発表などするとともに、マルチスロット冷却構造については、共同で特許を出願した。1基礎的実験解析東京農工大学において、タービン翼の先進的な冷却構造の2種類であるトランスピレーション冷却構造、およびマルチスロット冷却構造を取り上げ、実験準備から解析、考察まで行った。実験準備としては、(1)低速風洞試験部の改修/整備、データ採取、処理装置の整備を行った。(2)アクリル樹脂製の拡大実験模型を製作した。(3)レーザー光源、高速度カメラ、画像解析ソフトからなる粒子画像追跡実験装置(PIV)を購入し、オイルミスト発生装置を作り、流れの可視化技術の習熟に努めた。次に実験解析として、(4)トランスピレーション冷却構造、マルチスロット冷却構造それぞれについて、実験模型、低速風洞、冷却空気供給用ブロワー等を用いて流れの可視化PIV実験を行った。(5)冷却構造の各部における冷却空気の流れをベクトル情報でとらえ、流量と冷却効果の因果関係を考察できるようになった。(6)今後、PIV技術の向上、各種試験模型の実験解析を行い、冷却空気流れの詳細な情報を蓄積する。2実機模擬環境における解析宇宙航空研究開発機構において、先進冷却構造の各種高温実験模型について、高温風洞による実機模擬実験を行って、サーモカメラによる表面温度分布計測データを取得した。これにより各種冷却構造における冷却性能と流量など各種条件との因果関係を解明した。さらにこれら実験検証データを比較考察するため、コンピュータによる数値解析の研究を行っている。冷却空気流れ場と固体壁部分の温度分布を同時に解析する連成解析を取り上げその手法の開発を行うが、今年度はその基礎段階として平板上の境界層流れの解析を進め、連成解析手法の目処をつけた。1基礎的実験解析東京農工大学において、タービン翼の先進的な冷却構造の2種類であるトランスピレーション冷却構造、およびマルチスロット冷却構造を取り上げ、アクリル樹脂製拡大模型、低速風洞、冷却空気供給用ブロワーを用いて実験解析を行った。具体的には試験体の圧力損失特性の解明と、レーザー光源、高速度カメラ、データ処理装置を用いた流れの可視化実験(PIV法)による冷却空気流れの解析を行った。これらの実験結果をまとめ学会発表した。今後は、それぞれの冷却構造についてPIV計測を系統的に行いまとめる。2実機模擬環境における解析宇宙航空研究開発機構において、先進冷却構造の一つであるトランスピレーション冷却構造をタービン翼の前縁に適用した模擬試験体の各種構造について、高温風洞により伝熱性能を解析した。また、これら先進的冷却構造の空力性能、伝熱性能を数値解析で評価するための基礎段階として、フィルム冷却構造について熱伝導解析と流れの解析を同時に行う連成解析を行い、結果が実験結果と定性的に一致する段階まで進んだ。マルチスロット冷却構造について伝熱性能解析をまとめ学会発表した。この冷却構造に関しては、今後、冷却空気流れの数値解析も行って、PIV計測結果と比較考察する。1基礎的実験解析東京農工大学において、タービン翼の先進的な冷却構造の2種類、トランスピレーション冷却構造、およびマルチスロット冷却構造を取り上げ、各種のアクリル樹脂製拡大模型、低速風洞、冷却空気供給用ブロワーを用いて系統的に実験解析を行った。

これらにより冷却構造と冷却空気流れとの対応により冷却性能が検証できるデータベースを構築した。また、マルチスロット冷却構造については数値解析も行い、数値解析の有効性を検証した。これらの結果をまとめ、国際学会にて発表した。2実機模擬環境における伝熱解析宇宙航空研究開発機構において、先進冷却構造の一つであるトランスピレーション冷却構造をタービン翼の前縁に適用した模擬試験体の各種構造について、高温風洞により模擬実環境での伝熱性能を解析した。これらをまとめ国際学会にて発表した。また、以前に行ったマルチスロット冷却構造の伝熱性能解析についても結果をまとめ国際学会にて発表した。
単純ヘルペスウイルス潜伏感染制御因子およびプロテインキナーゼの機能発現機構の解析

単純ヘルペスウイルス(HSV)は、ヒトに様々な病態を引き起こす。本研究ではHSVの2つの遺伝子発現制御因子、ICP0とUL13に焦点をあて、それぞれの機能発現機構を宿主因子との相互作用の点より解析した。また、本研究では、HSVと近縁なヘルペスウイルスのICP0およびUL13の機能的相同制御因子の機能解析を解析することにより、多角的に、HSV制御因子の機能発現機構を解明することを目的とし、以下の結果を得た。HSV ICP0と相互作用する宿主細胞因子の検索を行った結果、ICP0がbHLH-PASスーパーファミリーに属する宿主転写因子BMAL1と相互作用し、BMAL1特異的な転写を活性化することが明らかになった。また、細胞質におけるBMAL1の発現を安定化させることが示唆された。bHLH-PASスーパーファミリーに属する転写因子は、細胞外のストレス応答を制御していることが知られている。HSVは主にストレスによって再活性化することが知られている。再活性化を制御するICP0が細胞のストレス応答を制御する宿主細胞転写因子BMAL1と相互作用することは、この相互作用がHSVの再活性化において何らかの役割を果たしていることを示唆している。HSVと近縁なヘルペスウイルスである、Epstein-Barr virus(EBV)において、HSV UL13とアミノ酸レベルにおいて相同性を有するプロテキンキナーゼBGLF4に関して、BGLF4をバキュウロウイルス系にて大量発現・精製することに成功し、BGLF4がHSV UL13同様に翻訳因子EF-1δをリン酸化することが明らかになった。以上の結果は、HSV UL13による翻訳因子EF-1δのリン酸化の重要性を示唆するものと考えられる。EBVにおけるICP0の機能相同制御因子であるEBNA-LPに関して、このウイルス因子の核マトリックスへの局在やリン酸化がこのウイルス制御因子の機能発現に必須であることが明らかになった。HSV ICP0もリン酸化タンパク質であり、核マトリックスに局在することが示唆されている。ICP0の機能発現はリン酸化や核マトリックスの局在によって制御されていることが示唆された。本研究は単純ヘルペスウイルスの潜伏感染機構および遺伝子発現機構を2つの重要なウイルス因子であるICP0とUL13に焦点をあて、解析することを目的としている。本年度は特にICP0に関して以下の結果を得た。HSV ICP0と相互作用する宿主細胞因子のさらなる検索を行った。Two-hybrid screeningの結果、ICP0がbHLH-PASスーパーファミリーに属する宿主転写因子BMAL1と相互作用することが明らかになった。この相互作用は、GST-pull down法でも確認された。また、luciferase assayを用いた解析より、ICP0はBMAL1と相互作用し、BMAL1特異的な転写を活性化することが明らかになった。また、HSV-1感染細胞中においては、細胞質のBMAL1の発現が非感染細胞と比して著しく低下していることが明らかになった。ICP0欠損ウイルスを用いた解析によって、感染細胞中におけるBMAL1の消失にICP0が関与していることが明らかになった。

以上の結果よりICP0は宿主転写因子BMAL1と相互作用し、転写を活性化する、また、細胞質におけるBMAL1の発現を安定化させることが示唆された。bHLH-PASスーパーファミリーに属する転写因子は、細胞外のストレス応答を制御していることが知られている。HSVは主にストレスによって再活性化することが知られている。再活性化を制御するICP0が細胞のストレス応答を制御する宿主細胞転写因子BMAL1と相互作用することは、この相互作用がHSVの再活性化において何らかの役割を果たしていることを示唆している。本研究では、単純ヘルペスウイルス(HSV)の制御因子ICP0およびUL13の機能発現機構を宿主因子との相互作用の点より解析することによりHSVの潜伏感染機構および遺伝子発現機構の根本的な解明、また、新たな抗ヘルペスウイルス剤開発に有用な基礎的データーを蓄積することを目的とした。本年度は特に、HSVと近縁なヘルペスウイルスのICP0およびUL13の機能的相同制御因子の機能解析を解析することにより、多角的に、HSV制御因子の機能発現機構を解明することを試みた本年度の研究成果は以下の通りである(i)HSVと近縁なヘルペスウイルスである、Epstein-Barrvirus (EBV)において、HSV UL13とアミノ酸レベルにおいて相同性を有するプロチキンキナーゼBGLF4に焦点を当て研究を行った。まず、BGLF4をバキュウロウイルス系にて大量発現・精製することに成功した。また、精製されたBGLF4は、プロテインキナーゼ活性を有していた。我々は、過去にUL13が翻訳因子EF-δをリン酸化することを報告しているが、BGLF4もHSV UL13同様に翻訳因子EF-δをリン酸化することが明らかになった。以上の結果は、UL13による翻訳因子EF-δのリン酸化が、単にHSV感染のみで引き起こされるのではなく、全てのヘルペスイルスに共通な現象であり、そのリン酸化には全てのヘルペスウイルスで保存されているUL13ホモローダが普遍的に関与していることが明らかになった。この普遍性は、HSV UL13による翻訳因子EF-δのリン酸化の重要性を示唆するものと考えられる。(ii)EBVの制御因子はHSV ICP0と機能的に多くの共通点を有することが報告されておりICP0の機能相同制御因子であることが示唆されている。体研究において、HSV ICP0の新たな機能を、これら機能相同制御因子を解析することによって明らかにすることを試みた。EBNA-LPの核マトリックスヘの局在やリン酸化がこのウイルス制御因子の機能発現に必須であることが明らかになった、HSV ICP0もリン酸化タンパク質であり、核マトリックスに局在することが示唆されている。また、ICP0は核だけでなく細胞質に存在し、感染細胞の死に関与していることが報告されている。EBNA-LPの知見は、ICP0の機能発現はリン酸化や核マトリックスの局在によって制御されていることが示唆された。
模擬微小重力環境における筋萎縮・筋再生の機構に関する研究

ラットを宙吊りにする模擬微小重力環境の系を用いて、筋萎縮と回復(筋再生)の機構を以下の如く解析した。1.ラットを10日間宙吊りにすると筋萎縮が、宙吊り解除後ケージ上で通常の飼育を数日間行なうことで筋再生が生じた。特に、ヒラメ筋における重量の変動が顕著であることが判明した。2.筋重量の変動を簡便にモニターする指標として、尿中クレアチニン排泄量を測定した。これはヒフク筋の重量変動と良く相関し、宙吊りに伴う筋重量の変動の指標として優れていることが判明した。3.ストレスの指標として、副腎や胸線の重量、血中グルココルチコイド量、尿中アスコルビン酸量を測定した。その結果、宙吊り初期にはストレスが生じていたが、宙吊り解除後ではストレス反応は極めて少なかった。4.筋肉からRNAを抽出し、ノーザンブロット法によってミトコンドリア遺伝子の転写活性を測定した。ヒフク筋のミトコンドリア遺伝子の転写は宙吊りによって影響されなかった。しかし、ヒラメ筋のミトコンドリア遺伝子のうち、H鎖の転写活性は宙吊りで減少し、宙吊り解除で増加した。一方、L鎖の転写活性は宙吊りで増加し、宙吊り解除で減少した。この現象の機構の解明が期待される。5.サテライト細胞増殖因子を検索するためのソースとして、宙吊り中、宙吊り解除後の様々なステージのラットのヒラメ筋よりホモジネートを調製した。6.成熟期のラットのヒラメ筋よりサテライト様細胞の単離には成功したが、その細胞を継代することは出来なかった。従って、本細胞を用いたサテライト細胞増殖因子の検索は出来なかった。以上、本研究では、宙吊りによるミトコンドリア遺伝子の転写活性の変動を新たに見いだすことができた。