hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
TRF2依存性ORCリクルートによるテロメア維持機構の特異的変異体創出による解明

(4)次年度の解析に必要となる「FISHと免疫染色によるテロメアダメージの検出系」を立ち上げた。真核生物のゲノム複製は、複製開始点制御タンパク質ORCの染色体結合に依存して複製開始前複合体(pre-RC)が形成されることにより始まる。我々は、ORCとテロメア結合/保護因子TRF2が協調して、テロメアにpre-RCを形成する仕組みを解析してきた。本研究では、TRF2-ORC結合様式を詳細に解析し、その結合を特異的に欠損したTRF2変異体を創出し、ゲノム編集技術によってこの変異体置換型ヒト培養細胞株を樹立した。最終年度には、以下の表現型解析により、TRF2依存的ORCリクルートの阻害がテロメア恒常性・染色体安定性におよぼす影響を明らかにした。1.テロメアへのORC1結合量をChIP-qPCR法により評価した。その結果、TRF2変異体置換株においてORC1結合量がTRF2野生型置換株に比べて減少しており、TRF2-ORC1タンパク質間結合がテロメアへのORC1リクルートに重要であることが示された。2.上記置換株のテロメア長を測定した。その結果、ORC1リクルート阻害によるテロメア長への影響は認められなかった。3.上記置換株を複製ストレス誘導剤ヒドロキシウレアで処理し、テロメア配列を含む微小核の出現頻度を解析した。その結果、野生型置換株に比べてTRF2変異体置換株での出現頻度が有意に上昇していた。これは、テロメアのORC結合が複製ストレス下でのテロメアの堅牢な複製と染色体安定性に寄与するという仮説に一致する。また、本研究では、過剰発現によりTRF2-ORC1結合を競合的に阻害できるORC1フラグメントも作製した。これは、ゲノムワイドな複製活性を阻害しないことが示唆されたので、テロメアのORC結合を特異的に阻害することが期待できる。TRF2変異体を用いた研究の成果を相補することで、テロメア維持機構とその生物学的意義のさらなる解明につながると考えている。平成30年度は、TRF2依存性ORCリクルート阻害のテロメア恒常性・染色体安定性への影響を調べる。具体的には、TRF2-ORC相互作用特異的欠損型TRF2(またはORC1)変異体の置換細胞株を樹立し、以下の視点から、細胞の表現型解析を行う。なお、ORC1変異体を用いる場合には、テロメア以外の複製開始に影響がないかどうかに留意する。(1)樹立した細胞株において、ORCやpre-RCのクロマチン結合がテロメア特異的に抑制されているかを、ChIP-qPCR法で検証する。(2)テロメア複製効率の低下が、テロメアの染色体脆弱性を誘導することが知られている。そこで、間期およびM期テロメアにおけるDNA損傷(53BP1の集積等)を調べ、ORC結合阻害のテロメア染色体脆弱性への影響を検討する。(3)複製ストレス存在下で、テロメアのpre-RCが予備の複製開始点として重要になる可能性を検討する。すなわち、変異体置換細胞株を複製阻害剤ヒドロキシウレア等で処理し、テロメア複製、DNA損傷、細胞周期進行や細胞増殖への影響を検討することで、複製ストレス感受性を調べる。(4)サザンブロット法でテロメア長を解析し、テロメア長恒常性への影響を調べる
二酸化炭素の活性化を鍵とする触媒反応の開発

二酸化炭素は炭素化合物の燃焼最終生成物であり,熱力学的に安定な,不活性な化合物である.一方で,二酸化炭素は安価で豊富な炭素資源であり,その有効利用は科学的興味に留まらず,社会的にも大きなインパクトをもつ.二酸化炭素を活性化し有機合成にもちいるには,より安定な結合を生成する系を選び,かつ反応の活性化エネルギーを下げる触媒を開発しなければならない.本研究では,二酸化炭素の活性化を鍵とする以下の二つの反応について,新規9族金属錯体の開発に重点をおき触媒開発に取り組み、以下の成果を挙げた。1)二酸化炭素還元反応の高活性化と可逆性の検討われわれが開発したピンサー配位子をもつイリジウム錯体は,水酸化カリウム存在下での二酸化炭素と水素の反応で,これまでで最高の活性を示した.この塩基をトリエタノールアミンに変更することで逆反応であるギ酸の分解も行えることを示した。水素の安定的な貯蔵方法としてギ酸を用いる可能性を拓いた。2)エポキシドと二酸化炭素の交互共重合反応の触媒開発これまでの研究で最も高い活性を示していたクロムやコバルトのサレン錯体に代えて、チタンやゲルマニウムなどの錯体が触媒作用を示すことを明らかにした。クロムやコバルトが3価の金属であり、サレンがジアニオン配位子だったのを、チタンやゲルマニウムなどの4価金属に変更した際、配位子もトリアニオン性にしてトータルの電荷を保ったことが成功の鍵である。より低毒性の金属を用いられるようになったことで、生成物の利用範囲が格段に広がった。
神経系特異的RNA結合蛋白質Mouse-Musashiの標的配列認識機構

本研究は、哺乳類神経系に強く発現しているmouse-Musashi-1(以下、m-Msi-1)蛋白質の機能解析並びに構造生物学的解析を行うものである。m-Msi-1蛋白質は、N-末から、RNA結合ドメイン(2つタンデムのRRM;MotifA(アミノ酸番号21-100)、MotifB(110-189)を有する。<構造生物学的解析>MMA昨年までに確立したMMAタンパク質の大腸菌による大量発現系および精製系を使って、^<15>Nラベルの塩化アンモニウムを唯一の窒素源とするM9培地でMMAを発現させMMAの精製を行った。ここで得られた^<15>N標識MMAを使って2次元HSQCを測定したところ、充分な数のシグナルが適度に分散していたので構造解析に適したサンプルであることが確認された。しかし、非標識SB培地で培養したときに比べ発現量の顕著な低下が見られたので、発現方法並びに精製方法の改良を行っている。一方、非標識MMAの大量調製を行ったところSB培地中で大腸菌1L培養から9mgのMMAの精製に成功した。さらにこれを2mMまで濃縮し、1次元、2次元(NOESY、TOCSY、COSY)NMRの測定を行った。その結果、いずれのチャートからも良好なスペクトルを得られた。目下、これらのチャートを使ってアミノ酸残基のスピン系及び主鎖の連鎖帰属を行っているところである。<in vitroにおける機能解析>^★Northwesternブロット法により、MMA,MMB蛋白質でそれぞれのRNA結合能力について検討したところ、MMAのみがRNA結合能を有することが明らかとなった。^★ランダムな50merに相当するRNA分子をin vitro転写反応により調製し、m-Msi-1蛋白質のRNA結合ドメイン可溶性蛋白質との結合能を指標にm-Msi-1蛋白質が結合するRNA配列を同定し(in vitro selection法)、本蛋白質が、(G/A)U_nAGUというコンセンサス配列を持ったRNAと結合することを明らかにした。現在、ゲルシフト法により、結合解離定数を求めている。また、このコンセンサス配列を持ち、哺乳類神経幹細胞で発現している遺伝子の転写産物が、in vivoで本蛋白質と結合するかどうかについて免疫沈降反応とRT-PCRを組み合わせた方法により検討している。
小腸レチノール結合たん白質TypeIIの生理作用に関する研究

小腸の細胞質に存在する細胞性レチノール結合蛋白質TypeII(CRBP(II))の生理作用の解明を試み、以下の成果が得られた。1.CRBP(II)の精製・抗体の作製とCRBP(II)測定法を確立し、その生化学的性質を明かにした。CRBP(II)の抗血清を得て酵素免疫測定の定量法を確立した。ニワトリCRBP(II)は分子量が約17Kd、レチノールとレチナールの結合特異性、小腸局在性を示した。2.ニワトリ発達過程の小腸CRBP(II)の誘導を明らかにした。ニワトリ胚の小腸に存在せず、孵化1日前からその誘導が起こり48時間以内に10倍に増大し、成熟期まで続いた。3.ニワトリCRBP(II)の小腸絨毛および小腸部位における局在を解明した。CRBP(II)は小腸(十二脂腸)に絨毛基部に少なく中央部位から先端部に多く存在した。CRBP(II)は十二脂腸、空腸に多く存在した。4.孵化前後の肝臓におけるCRBP(II)の一過性誘導とその生理的意義を究明した。ヒナの孵化前後の肝臓にはCRBP(II)が一過性に誘導され、この時期に血中βカロテン値、肝のレチナール還元酵素活性、腸管腔内βカロテン量が増大し、肝でのβカロテン代謝へのCRBP(II)の関与が示唆された。5.小腸CRBP(II)量及びLRAT活性の栄養条件による変動を究明した。最近発見されたエステル化酵素Lecithin:retinol acyltransferase(LRAT)は、レチノール:CRBP(II)複合体を基質とするので、CRBP(II)とLRATの種々の栄養条件による変動を調べた。空腸-回腸バイパス手術を施したラット空腸切除残余部分ではCRBP(II)量が増大しビタミンA吸収増大がCRBP(II)を誘導する可能性を示した。ニワトリの発達過程で小腸LRAT活性が変動し孵化を境に上昇した。ラット小腸LRAT活性は食餌中のビタミンAの有無と蛋白質の質と量の影響を受けるが、CRBP(II)は受けない事を明かにした。6.ニワトリ小腸CRBP(II)のcDNAプローブを作製し、ニワトリ発達過程の小腸および肝臓におけるCRBP(II)遺伝子発現の変動を明かにした。1.ニワトリ及びラットの小腸レチノ-ル結合たん白質TypeII(CRBP(II))の精製・抗体の作製とCRBP(II)の測定法の確立を行い、さらにCRBP(II)のリガンド結合の特異性と臓器局在を明らかにした。ニワトリ及びラットの小腸CRBP(II)の測定にあたり、サンドイッチ型酵素免疫測定法(ELISA)による定量法を確立した。ニワトリCRBP(II)は分子量約1万7千でラットのそれと同じであった。レチノ-ルとレチナ-ルを特異に結合するが、レチノイン酸や脂肪酸(パルミチン酸)との特異的結合はなかった。

このCRBP(II)は小腸に局在し、他の臓器にはほとんど検出されなかった。2.ニワトリの発達に伴う小腸CRBP(II)量の変動を観察した。ニワトリ胚の小腸ではCRBP(II)量は極めて低値であり、孵化1日前からその誘導が起こり48時間以内に10倍に増大した。その後は増大した一定レベルを維持した。小腸の発達に伴うCRBP(II)の誘導は、二糖類水解酵素活性の誘導より1日早く、摂食開始とは無関係であった。3.ニワトリCRBP(II)の小腸絨毛における局在を解明した。小腸絨毛の先端部から基底部までをミクロト-ムを用いて10μmの凍結薄切片にスライスし、10-15枚ずつの切片からなる連続フラクションに分別して、CRBP(II)を定量した。CRBP(II)は絨毛の基部で少なく先端から中間部の細胞に多く含まれていた。4.小腸CRBP(II)量に及ぼすビタミンA欠乏の影響を観察した。幼若ラット及び成熟ラットにビタミンA欠乏食を投与し、短期間(2週)及び長期間(3ヵ月)飼育した。いずれの場合も、ラットがビタミンA欠乏状態に至る以前の早い時期に、小腸CRBP(II)量は減少した。従ってCRBP(II)量は食餌中ビタミンAによって変動することが示唆された。1.ニワトリ小腸のレチノ-ルエステル化酵素(LecithlinーRetinol Acyltransferase、LーRAT)の精製細胞性レチノ-ル結合蛋白質タイプII(CRBP(II))を結合したアフイニテイカラムを用い、ニワトリ小腸の粘膜ミクロソ-ム画分を可溶化して精製した。単一のLーRAT蛋白質が得られ分子量は約55,000であった。2.ニワトリの発達過程における小腸LーRAT活性の発達に伴う変動LーRAT活性は十二指腸と空腸に高く、回腸では低値であった。十二指腸と空腸のLーRAT活性はニワトリのふ化前にはこの酵素の誘導は見られないが、ふ化に伴いその活性は急速に上昇し8日齢で最高値を示した。その後活性は下降の傾向を示した。LーRAT活性のふ化後の誘導は食餌からのビタミンA吸収の開始との関連が推察された。3.ニワトリ小腸LーRAT活性に及ぼすビタミンA欠乏とレチノ-ル再投与の影響ふ化後のヒナにビタミンA欠乏食を投与すると、欠乏状態になる以前にLーRAT活性は低下した。ビタミンA欠乏状態のヒナに欠乏食からレチノ-ル添加食に切り換えると、血清レチノ-ルの低濃度が回復しない以前に小腸のLーRAT活性は回復し上昇した。LーRAT活性は食餌からのレチノ-ル吸収により誘導されることが明かとなった。4.ニワトリふ化前後の肝臓に出現する細胞性レチノ-ル結合蛋白質タイプII(CRBP(II))の生理的意義の解明ニワトリのふ化前後には腹腔内に入込んだ卵黄嚢からの供給により血中および小腸管腔内のβカロテン濃度が上昇した。CRBP(II)はレチナ-ルも特異的に結合するので、βカロテン濃度の上昇は、ふ化直前から一過性に肝臓に出現するCRBP(II)、肝臓でのレチナ-ル還元酵素活性の誘導と対応していた。故に小腸機能の未熟な出生直後には肝臓でもβカロテンのレチノ-ルの転換が行われるために肝臓での一過性のCRBP(II)出現が示唆された。1.ラット小腸のLーRAT活性とCRBP(II)量に及ぼす栄養条件の影響:18日齢の幼若ラット、または5週齢のラットをビタミンA無添加食で14日間飼育した場合、また5%カゼイン食と20%小麦グルテン食で14日間飼育した場合、LーRAT活性は有意に低下した。しかしながらCRBP(II)量は変動しなかった。
中学校数学の新領域「資料の活用」のカリキュラム開発に関する研究

本研究では、中学校数学の「資料の活用」・領域において,「まんなか」という言葉で表される内容から平均値,最頻値,中央値へと分化していくカリキュラムを開発し,その効果を生徒の学習の様相に基づいて実証することを目的とした.本研究の目的を達成するために,まんなかからの分化の過程において,代表値の理解の質の向上を意図して活動を位置付けて作成したカリキュラムに基づいて実施した学習の様相を,ビデオ記録,音声記録および学習カードの記録等をもとに,カリキュラムの変更点が及ぼした効果を質的な研究方法で特定し,分析・考察した.その結果,まんなかへのとらえの相違を視点に子どもの追究の様子を分析すると,その過程では,個々の代表値の特性をとらえている姿が見られ,代表値が分化され,資料を解釈するための道具として位置付いていることが明らかになった.また,代表値同士の関係への着目を視点に子どもの追究の様子を分析すると、個々の代表値やヒストグラムの持つ特徴も考慮して,思考する様子が見られ,分化してきた代表値やヒストグラムといった知識が,実際の問題を解決する場面で活用されていることが明らかになった.以上のことから、カリキュラム開発において以下の2点考慮すべきであることが示唆された.1.集団の中における位置を考える活動,複数の資料を比較するという活動が,個々の代表値の意味理解を深めるとともに,代表値同士のかかわりについても着目することが可能であり,代表値の分化を支えている.2.実際の問題を解決するために,代表値や分布を使う場面で,分化してきた代表値がそれぞれの関係を意識されながら統合される場面がある.本研究では、中学校数学の「資料の活用」・領域において,「まんなか」という言葉で表される内容から平均値,最頻値,中央値へと分化していくカリキュラムを開発し,その効果を生徒の学習の様相に基づいて実証することを目的とした.本研究の目的を達成するために,まんなかからの分化の過程において,代表値の理解の質の向上を意図して活動を位置付けて作成したカリキュラムに基づいて実施した学習の様相を,ビデオ記録,音声記録および学習カードの記録等をもとに,カリキュラムの変更点が及ぼした効果を質的な研究方法で特定し,分析・考察した.その結果,まんなかへのとらえの相違を視点に子どもの追究の様子を分析すると,その過程では,個々の代表値の特性をとらえている姿が見られ,代表値が分化され,資料を解釈するための道具として位置付いていることが明らかになった.また,代表値同士の関係への着目を視点に子どもの追究の様子を分析すると、個々の代表値やヒストグラムの持つ特徴も考慮して,思考する様子が見られ,分化してきた代表値やヒストグラムといった知識が,実際の問題を解決する場面で活用されていることが明らかになった.以上のことから、カリキュラム開発において以下の2点考慮すべきであることが示唆された.1.集団の中における位置を考える活動,複数の資料を比較するという活動が,個々の代表値の意味理解を深めるとともに,代表値同士のかかわりについても着目することが可能であり,代表値の分化を支えている.2.実際の問題を解決するために,代表値や分布を使う場面で,分化してきた代表値がそれぞれの関係を意識されながら統合される場面がある.
スマートフォンを用いたマーカーレスモーションキャプチャーによる動作評価と訓練支援

本研究ではマーカーレスなモーションキャプチャーのシステムをスマートフォン及びタブレット端末を用いて実現すること、これとともに即時にキネマティックな動作解析を可能とするシステムを構築すること、小型・軽量・ウェアラブルな慣性センサーを動作解析に活用する事、そして動作データをデータベースとして整理し、得られた結果と即座に比較対照できる様にする事を目的とした。成果として、これらの全てを実現するソフトウェア・ハードウェアのシステムを構築した。これまでに、主として以下の3つの成果を挙げてきた。(1)画像処理の手法を用いて通常の映像からモーションキャプチャーを実施することを目指し、基本となるアルゴリズムを構築した。具体的には(a)通常のデジタルカメラを用いて撮影した画像から動作領域をロバストに抽出する事を可能にした。この手法を用いると背景が複雑な場合でも処理を行うことが出来る。(b)異なる時刻の画像を重ね合わせて表示することにより、動作の運動学的考察を容易に行える様にした。(c)動作領域に多リンク系の形状をフィッティングし、身体セグメントの位置と関節角度を計算出来る様にした。単リンクの形状としては凸多角形または楕円を選択でき、その辺や径の長さもフィッティングの中で微調整できるようにした。(2)慣性センサを用いて、全身運動中のセグメントの運動状態をリアルタイムに把握して動作解析を実施する事を目指し、基幹となるアルゴリズムを構築した。加速度センサとしては小型・軽量・ウェアラブルなものを用い、全身のセグメントに取り付けた。これらのセンサは無線でリアルタイムにデータを送信できるため、拘束の少ない動作が可能である。歩行・走行・椅子からの立ち上がり等、動作様式が既知な場合には、これらのセンサを用いて運動状態を評価することが可能であることを明らかにした。(3)Kinectを2台同時に用いたモーションキャプチャーを可能にした。1台のみを用いた場合はデータに大きな誤差がある事を確認しているが、複数台からのデータを統合した場合、台数に応じて誤差が減少すると考えられる。現在誤差を最小化する計測方法と処理アルゴリズムについて検討を行っている。本年度は下記3点について成果を挙げた。1.薄型・軽量かつタブレット使用も可能なラップトップコンピューターと赤外線を利用したセンサを用いて、マーカーレスなモーションキャプチャーを可能とした。ラップトップコンピューターのバッテリーと赤外線センサ用外付けバッテリーを用いて、屋外などでも容易にモーションキャプチャーを実施する事ができる。このモーションキャプチャーは完全にマーカーレスであり、キャリブレーションに要する時間・手間も最小限であり、子供や高齢者の被験者に対してもストレス無く適用する事が可能である。2.小型・軽量・ウェアラブルな無線加速度センサを用いて、走行動作・歩行動作を実施する際の動作特性を評価した。加速度センサは両下肢・体幹部・両上肢に取り付け、それぞれのセンサから送信される信号を相互に比較対照し、全身の運動特性を考察した。分析には多変量解析の手法を用いた。取得したデータから身体運動の特性を抽出するアルゴリズムを構築した。動作速度、性別、年齢(若齢者・高齢者)に応じて異なる特徴を抽出する事に成功した。3.様々なモダリティから取得したモーションキャプチャーデータに基づいて、関節発揮トルクや筋張力を計算するアルゴリズムを構築した。屋外での計測・フィードバックを迅速に実施するため、ラップトップコンピューターでもリアルタイムな計算が出来る様、簡略化した筋骨格系モデルと最適化計算のプログラムを構築した。モデルの自由度及び組み込む筋の数を、本質的に重要な情報が失われない範囲で低減する事でこれを実現した。このプログラムは1.で構築したマーカーレスなシステムとシームレスに接続する事が可能である。画像処理の技術を用いて、マーカーレスなモーションキャプチャーを可能にするシステムを構築した。このシステムではスマートフォン、デジタルカメラ、USBカメラ等、基本的に如何なるカメラで取得した画像でも処理することが可能である。被験者が映っているフレームと背景フレームとの差分を演算することにより被験者の身体の領域のみを抜き出す。そのデータに基づいた解析を行う。また、このシステムで得られるデータの検証を行った。歩行・走行の動作を対象とし、新手法と従来のモーションキャプチャーの手法で得られる値を比較することで妥当性を検証した。その結果、モーションキャプチャーで得られる値を真値と考えた場合、新手法の誤差は4%未満であることが明らかとなった。新手法はいかなるカメラを用いても適用可能である点、屋外でも容易にデータを取得できる点、被験者にマーカーを取り付ける必要が無い点等を考慮すると、4%未満程度の誤差を補って余りあるメリットが期待できると考えられる。今後この手法をより応用的な課題に適用していく予定である。またこれに関連し、ウェアラブルな加速度センサを用いた動作解析にも取り組んだ。前述の手法では最初に位置データを求め、これを微分することで速度・加速度を求める。一方で加速度センサを用いる場合には加速度データを直接的に取得して、これを積分することで速度・位置を求める。この加速度・速度データの波形が個々人の歩行・走行動作の特徴を反映していることが明らかとなった。身体に複数個装着したセンサからのデータを統合し有用な情報を抽出する手法も考案した。これについても今後様々な対象に適用し、研究を発展させて行く。

マーカーレスにモーションキャプチャーを実現するシステムを構築した。これは当初平成26年度内に実現計画していた通りであり、本研究の進捗は概ね計画通りであると言える。バイオメカニクス平成27年度には多様な被験者、多様な動作パターンに対し、これまでに構築したシステムを適用しデータ取得する。またそのデータをデータベース化し、後の研究においても容易に参照出来るリポジトリを構築する。これまでの進捗は概ね当初の予定通りであり、平成27年度についても計画通りに研究を推進する。通常のデジタルカメラから取得した画像に基づいて、画像処理の技術を用いてモーションキャプチャーを行うための基幹となるプログラムを開発した。この成果についてはすでに国内学会で発表している。また、小型・軽量・ウェアラブルな慣性センサやKinectを用いた計測・解析・評価も試み、成果を挙げてきた。これらの機器は拘束の少ない環境で使えるものであり、使用者の自然な動作を殆ど妨げない。更に、これらを用いることで画像データとは異なる性質の有用なデータを得ることが可能である。こちらの成果についても国内・国際学会発表や論文発表という形で報告している。そのため当初の計画以上に、多角的に研究を推進できていると考える。研究に必要な専門書を購入するため書店に注文をした。注文時に在庫が無く、入荷を待つ事になったため次年度の執行となった。今後は画像処理を中心としたアプローチ、慣性センサを用いたアプローチ、Kinectを用いたアプローチの全方面に研究を発展させていく。これらのアプローチはオーバーラップする部分も多く、得られた結果を統合的に解析して有用な情報を得るアルゴリズムも構築する。現在までは実験室の中で開発・検証を行ってきているが、屋外で使用できるシステムも開発する予定である。本研究で使用しているデバイスは基本的に電力消費量が少ないため、小型のバッテリーを用いての電力供給が可能である。屋外においては特に環境光の量と性質が実験室とは異なるので、環境光の状態が変化してもロバストにモーションキャプチャーを行えるアルゴリズムを考案する。注文していた専門書を既に受け取り、予算を執行した。
ヘリコバクター・ピロリ空胞化毒素遺伝子のDNA型別と毒素活性との関連

近年、Helicobacter pyloriの空胞化毒素の構造遺伝子であるvacA遺伝子にはシグナル(s)領域3タイプ、中間(m)領域2タイプの遺伝子型が存在し、s1やm1株はs2株やm2株と比較して毒素活性が高く、またs1株は潰瘍患者からより多く分離されることが報告されている(Atherton et al.1995)。今回、福岡大学病院で得られた菌株約170株ついて、vacA遺伝子のタイピングを行いin vitroの空胞化毒素活性と併せて胃十二指腸潰瘍患者群とNon ulcer dyspepsia(NUD)患者群との間で比較検討した。空胞化毒素活性は、培養3日目の液体培地を遠心して上清液を採取、その上清液を20倍に濃縮し、HeLa細胞を培養したwellに10mMmol/lの塩化アンモニウムを加えたfresh mediumと1:9の割合で混ぜ、24時間培養後、50%以上の細胞に空胞化を生じたものを空胞化毒素活性ありと判定した。その結果、vacA遺伝子のシグナル領域はほとんどの株がslaタイプであった。一方、中間領域では約半数がprimer領域の変異の為、既報のprimerを使用したPCRによるタイピングは不可能だった。タイピング可能な株の中では、m1株がm2株より多数を占めたが、潰瘍患者分離株とNUD患者分離株との間で両者の比率に有意差は認められなかった。また、空胞化毒素活性陽性率も両患者群分離株間で差がみられなかった。現在、別のprimerを用いたPCRおよびPCR-RFLP法による新しいvacA遺伝子型の分類と毒素活性価との関連を検討中である。
ゲノムデータベースの構築方法とユーザーインターフェースの改良

生物の全遺伝情報を構築するゲノムの解析が実験的に可能になり、実際にヒトを始めとして酵母、大腸菌、枯草菌、線虫、ショウジョウバエなどの生物で研究が始められている。大腸菌では染色体全体の約40%の塩基配列のデータがgenbank等のデータバンクに登録されている。しかし、これらのデータは個々の遺伝子毎に登録されているものであり、本来の連続した染色体の構造に関してはこれからの解析と統合化を持たなければならない。本研究では大腸菌をモデルに、1)塩基配列データおよびそれに付随する遺伝子情報に関する統合化データベースの作製と、2)検索、解析ツールの開発を行った。1)ではa)Genbankの大腸菌に関するデータ、b)K.RuddらによるEcoSeq6、c)M.Kroegerらの大腸菌データベース(ECD)、d)B.BachmanによるLinkage Mapを相互に関連づけを行う事によりあらゆる方向から遺伝子情報の検索を行えるように統合化を行った。2)ではa)必要機能の洗いだし、b)処理するべきデータの洗いだしとデータの構造の決定、c)溝作画面の設計を行い、SUNワークステーション、X11R4、Motifの上で開発を行った。基本的にこのシステムはコンピューターの専門外のゲノムプロジェクト推進者を対象に作製を進めているので、全ての操作に共同するインターフェースの部分に重点をおいて開発を進めている。現在、そのインターフェースの部分は完成し、データ構造を決定した。1)で述べた統合化したデータを入力しこのツールの現場での応用を実際に大腸菌ゲノムプロジェクトにおいてテストし改良していく段階にある。今後、種々のデータの管理をどのような方法で行うかが課題である。特に管理の部分を含めて開発を行うのか、あるいはリレーショナルデータベース、もしくはオプジェクト指向データベースを利用していくのかが大きな課題の1つであると思われる。
高騒音環境で安全かつ正確に音声を伝えるための骨導ヘッドフォンの明瞭化

1)高騒音環境下では耳栓などの装着は義務付けられていることから、耳栓を装着した状態で騒音レベルが80と90 dBの環境で骨導ヘッドフォンから呈示された音声の書き取り試験を行った。その結果、なじみのある単語であれば、音声了解度はどちらの騒音条件でも90%を超えた。また、無意味な音声でも、70%程度であった。この結果は、高騒音騒音環境での作業において骨導ヘッドフォンが有効であることを示した。通常の作業環境では60 dBから70 dB程度の騒音が想定される。この環境では、耳栓を装着しない。そのため、耳栓を装着しない状態で60 dBと70 dBの騒音環境下で音声の書き取り試験を行ったところ、音声了解度はほぼ0 %であった。2)項目1で得られた結果の原因を分析するために骨導音と気導音のラウドネス特性の比較を行った。気導音のラウドネス特性と比較して、1000 Hz以下の低域では骨導音のラウドネス特性の値は小さくなった。これは、低域では大きな振動レベルで刺激を与えないと骨導音の知覚が困難であることを示した。しかし、この帯域で大きな振動レベルを参加者に与えると、皮膚の振動として呈示刺激が知覚されるため、入力レベルを増幅させるだけでは音声の聴き取りやすさに寄与しないことがわかった。3)項目2で得られた結果を説明するために聴覚末梢系のシミュレーションを行った。骨導音と気導音の間で応答パターンに変化がなかった。この結果から、耳栓を装着しない条件で骨導音が聞き取れなかった原因として、聴覚マスキングの存在が示唆される。聴覚マスキングは特に低周波数音の存在が高周波数音への知覚を妨害する原因である。骨導音は低周波数音を含んでいないことから、聴覚マスキングの影響を受けやすい。このことが耳栓を装着しない条件では骨導音を聞き取りづらくさせると結論づけた。ま騒音環境下において骨導ヘッドフォンを通じた音声の聞取り試験を行った。その結果、超高騒音環境での作業を想定し、耳栓を装着した状態では骨導ヘッドフォンは実用上問題のない範囲で使用することが可能であることが分かった。しかし、中程度の騒音レベルでの作業を想定し、耳栓を装着しない状態では骨導ヘッドフォンから提示された音声は聞き取ることができなかった。この耳栓を装着しない状態では骨導ヘッドフォンの明瞭度を向上させる必要があることを明確にできた。骨導ヘッドフォンの明瞭度を向上させるために、聴覚の周波数特性ともいえるラウドネス関数の推定を行った。その結果、呈示レベルを大きくすると、音声の特徴を多く含む1000 Hz以下の帯域では骨導ヘッドフォンの振動を触覚が知覚することがわかった。そのため、低い周波数帯域では呈示レベルを大きくすることが困難であることがわかった。これは明瞭度を向上させるためには、呈示レベルを大きくするだけでは不十分であり、前処理の必要性を指摘することができた。数値シミュレーションをもちいて、これまでの実験結果の説明を試みた。その結果、実験の結果をおおむね説明できた。これより、聴覚モデルベースで骨導音声の明瞭度を向上させる基盤を構築することができた。1)耳栓を装着する高騒音環境であれば、骨導ヘッドフォンは有効であることを確認した。ただし、コミュニケーションは双方向でなければ成立しない。騒音に頑健な骨導マイクロフォンと組み合わせることで双方向での通信を実現する。耳栓を装着しない程度の騒音環境であれば、気導音の低周波数成分の影響で骨導音声の聞き取りは困難になった。これに対しては、骨導ヘッドフォンから気導音の逆位相となる刺激を呈示してアクティブノイズコントロールを行い信号対雑音比の向上をはかる。これらの研究は実験的に行うためには、多くのパラメータを決める必要がある。現在聴覚モデルを提案しているため、このモデルを基盤とした研究を行うことでパラメータの設定を自動化する。2)耳栓の取り外しや周囲の音を聞きながらの作業が騒音環境では行われる。このような作業条件の中で骨導ヘッドフォンは常に装着した状態でいられることが大きなメリットである。本研究課題を通じて、騒音に頑健な骨導ヘッドフォンを開発し、骨導マイクロフォンと組み合わせることで、騒音の影響を受けない音声コミュニケーションが可能になる。音声コミュニケーションは安全な作業の基盤である。そのため、本研究課題を通じて、騒音環境での安全な作業の実現が可能になると考える。

気導音のラウドネス特性と比較して、1000 Hz以下の低域では骨導音のラウドネス特性の値は小さくなった。これは、低域では大きな振動レベルで刺激を与えないと骨導音の知覚が困難であることを示した。しかし、この帯域で大きな振動レベルを参加者に与えると、皮膚の振動として呈示刺激が知覚されるため、入力レベルを増幅させるだけでは音声の聴き取りやすさに寄与しないことがわかった。3)項目2で得られた結果を説明するために聴覚末梢系のシミュレーションを行った。骨導音と気導音の間で応答パターンに変化がなかった。この結果から、耳栓を装着しない条件で骨導音が聞き取れなかった原因として、聴覚マスキングの存在が示唆される。聴覚マスキングは特に低周波数音の存在が高周波数音への知覚を妨害する原因である。骨導音は低周波数音を含んでいないことから、聴覚マスキングの影響を受けやすい。このことが耳栓を装着しない条件では骨導音を聞き取りづらくさせると結論づけた。ま騒音環境下において骨導ヘッドフォンを通じた音声の聞取り試験を行った。その結果、超高騒音環境での作業を想定し、耳栓を装着した状態では骨導ヘッドフォンは実用上問題のない範囲で使用することが可能であることが分かった。しかし、中程度の騒音レベルでの作業を想定し、耳栓を装着しない状態では骨導ヘッドフォンから提示された音声は聞き取ることができなかった。この耳栓を装着しない状態では骨導ヘッドフォンの明瞭度を向上させる必要があることを明確にできた。骨導ヘッドフォンの明瞭度を向上させるために、聴覚の周波数特性ともいえるラウドネス関数の推定を行った。その結果、呈示レベルを大きくすると、音声の特徴を多く含む1000 Hz以下の帯域では骨導ヘッドフォンの振動を触覚が知覚することがわかった。そのため、低い周波数帯域では呈示レベルを大きくすることが困難であることがわかった。これは明瞭度を向上させるためには、呈示レベルを大きくするだけでは不十分であり、前処理の必要性を指摘することができた。数値シミュレーションをもちいて、これまでの実験結果の説明を試みた。その結果、実験の結果をおおむね説明できた。これより、聴覚モデルベースで骨導音声の明瞭度を向上させる基盤を構築することができた。1)耳栓を装着する高騒音環境であれば、骨導ヘッドフォンは有効であることを確認した。ただし、コミュニケーションは双方向でなければ成立しない。騒音に頑健な骨導マイクロフォンと組み合わせることで双方向での通信を実現する。耳栓を装着しない程度の騒音環境であれば、気導音の低周波数成分の影響で骨導音声の聞き取りは困難になった。これに対しては、骨導ヘッドフォンから気導音の逆位相となる刺激を呈示してアクティブノイズコントロールを行い信号対雑音比の向上をはかる。これらの研究は実験的に行うためには、多くのパラメータを決める必要がある。現在聴覚モデルを提案しているため、このモデルを基盤とした研究を行うことでパラメータの設定を自動化する。2)耳栓の取り外しや周囲の音を聞きながらの作業が騒音環境では行われる。このような作業条件の中で骨導ヘッドフォンは常に装着した状態でいられることが大きなメリットである。
災害救援活動に従事した看護者のストレス・コーピング及び長期的適応プロセスの構造化

東日本大震災で救援活動を行った看護師を対象に得られた量的データと熊本地震及び広島土砂災害で救援活動を行った看護師を対象に半構成的面接調査にて得られた質的データとの統合を行い、災害救援看護者の長期的な適応に至るプロセスの検討を行った。質的データの分析には、災害看護学及び質的研究の専門家にスパーバイズを受けて行った。その結果、災害救援看護者の救援活動に伴うストレス反応はLazarus & Folkmannのストレス理論によって説明ができ、救援活動後の不適応には、被災地でのストレスの認知的評価と、活動直後の否定的な感情が強く影響しており、災害救援看護者には救援活動の初期段階からの介入とプロセスに沿った支援の必要性が明らかとなったさらに、質的データ分析の結果、災害救援看護者の救援活動におけるストレスの認知的評価には、救援者の価値観や信念、他者との関わり等の人的要因と非日常的な環境や二次災害の危険性などの状況的要因が関与していた。また対処行動には、ストレスの内容に応じて問題焦点型と情動焦点型を選択していることが明らかとなった。災害現場という対処行動を実施するには非常に困難状況においても積極的な対処行動をとられていたことが、救援活動後の安堵感や自らの活動に対する肯定的評価に繋がっていた。その一方で、否定的感情として疲労感や後悔、他者評価への不満がその後のストレス反応に繋がる可能性があることから、救援活動後の休息の確保や周囲の肯定的評価等の支援体制構築が不可欠であることが示唆された。本研究は、災害救援看護者の救援活動におけるストレスの認知的評価から活動後の感情の変化、長期にわたる適応・不適応に至るまでのプロセスを構造化することを目的とした。研究対象は、東日本大震災の被災県以外から被災地に入った535名の災害救援看護者であり、構造モデルは、Lazarus & Folkmannのストレス理論を基に、ストレスの認知的評価、活動後の感情の変化、適応・不適応の3段階に分け、各段階に影響を及ぼす要因を設定しSEM(Structural Equation Models with observed variables)を用いて作成した。構造モデルの内生変数の関係はストレスの認知的評価と活動後の感情の変化、活動後の否定的感情と長期にわたる不適応は強い関連が認められた。外生変数は、ストレスの認知的評価には性別(女性)(β=1.31)、婚姻(既婚)(β=1.23)、救援活動の時期(発災後2週間以内)(β=0.25)、避難所での活動(β=0.95)、問題焦点型対処行動特性(β=0.21)であり、活動後の否定的感情には、正当な他者評価(β=-0.22)、活動中の対処行動(冗談を言って笑う)(β=-0.13)であり、長期にわたる不適応には、否定的な自己評価(β=0.97)、情動焦点型対処行動特性(β=0.39)であった。構造モデルの適合度は、CFI=0.888、RMSEA=0.064、SRMR=0.036であり、一定の基準を満たしており臨床的にも有用であり活用可能であると判断できる。Lazarus & Folkmann(1984)のストレス理論を基に作成した構造モデルを概観したとき、救援活動後の不適応には、被災地でのストレスの認知的評価と、活動直後の否定的な感情が強く影響していることが明らかとなった。平成27年度計画であった災害救援看護者の活動に伴うストレスの認知的評価から対処行動、活動後の感情の変化や現在の心理(適応・不適応)状態及びそれらに影響を及ぼす要因や関連を明らかにしたうえで、そのプロセスの構造モデルを作成した。現時点において、当初の計画通りに研究は進んでいる。災害救援看護者の救援活動におけるストレスの認知的評価から活動後の感情の変化、長期にわたる適応・不適応に至るまでのプロセスを性別で検討し、男女の構造モデルを作成した。研究対象は、東日本大震災の被災県以外から被災地に入った女性393名・男性140名の災害救援看護者であり、Lazarus & Folkmanのストレス理論を基に、ストレスの認知的評価、活動後の感情の変化、長期にわたる適応・不適応の3段階に分け、各段階に影響を及ぼす要因を明らかにした。構造モデルの内生変数は、男女ともストレスの認知的評価と活動後の感情の変化、長期にわたる不適応であった。影響要因である外生変数は、女性の構造モデルは、婚姻、救援活動の時期、救援活動内容(避難所の活動)、活動中の対処行動(冗談を言って笑う)、対処行動特性、活動後の対処行動(同僚との会話)、正当な他者評価であった。一方、男性の構造モデルは、救援活動内容(救命活動)と否定的な自己評価の2要因のみであり、性別により構造モデルに大きな相違が認められた。また、構造モデルの適合度は、女性はCFI 0.909、RMSEA 0.064、SRMR 0.032、男性はCFI 0.955、RMSEA0.077、SRMR0.050であり一定の適合を示した。本研究結果より、女性は周囲との関わりと周囲のより肯定的な評価がストレス軽減に効果的であり、男性は「自分はもっとできたのではないか」といった救援活動に対する後悔の思いのみが活動後の感情やその後の適応に大きく影響していることが明らかとなった。

平成28年度計画は、量的調査研究の結果作成した災害救援看護職者のストレスの認知的評価から活動後に至る心理的プロセスの構造モデルの妥当性を検証するため、質的データ収集であったが、性別による構造モデルの検討と海外学術誌への投稿のため、質的データ収集の実施が遅れている。災害救援看護者を対象にアンケート調査にて作成した、救援活動におけるストレス・コーピング及び長期的適応プロセスの構造モデルの妥当性を検討するため、インタビュー調査を実施した。インタビューの対象者は、熊本地震及び広島土砂災害において救援活動を行った看護者15名、救援活動に伴うストレス及びコーピングの実際と現在の救援活動に対する思いを半構成的面接法にて実施した。対象者は、男性9名、女性6名、40代9名、30代6名であった。13名が熊本地震で救援活動を実施していた。また、派遣組織はDMATが最も多く8名であり、他は災害支援ナース及び施設支援チームであった。活動内容は患者搬送及び救護所支援、避難所支援等であった。インタビューにて得られたデータより、活動中のストレスは救援活動に対する不安や不全感、支援組織に対する不満、非日常的な生活、二次災害への危機感などが抽出された。活動中のコーピングは、休息時間の確保、救援者同士の会話や日常的な行動などであった。次に救援活動直後の思いとしては、救援活動に対する達成感、活動終了に伴う安心感や救援活動に対する罪責感、疲労感などが抽出された。また、救援活動後のコーピングは自らの言葉で活動を意味づける、救援者同士の会話、普段通りの日常生活を送るや第3者の肯定的評価を受ける等であった。さらに、救援活動を振り返って、現在の思いとして救援活動を継続したいといった前向きな思いと今後の活動に対する戸惑いや距離を置きたいといった感情が明らかとなった。平成29年度に質的データ収集は終了したが、データの解釈・分析及び災害看護専門家、質的研究者のスーパーバイズを受ける必要がある。また、研究成果の公表の実施に至っていない。東日本大震災で救援活動を行った看護師を対象に得られた量的データと熊本地震及び広島土砂災害で救援活動を行った看護師を対象に半構成的面接調査にて得られた質的データとの統合を行い、災害救援看護者の長期的な適応に至るプロセスの検討を行った。質的データの分析には、災害看護学及び質的研究の専門家にスパーバイズを受けて行った。その結果、災害救援看護者の救援活動に伴うストレス反応はLazarus & Folkmannのストレス理論によって説明ができ、救援活動後の不適応には、被災地でのストレスの認知的評価と、活動直後の否定的な感情が強く影響しており、災害救援看護者には救援活動の初期段階からの介入とプロセスに沿った支援の必要性が明らかとなったさらに、質的データ分析の結果、災害救援看護者の救援活動におけるストレスの認知的評価には、救援者の価値観や信念、他者との関わり等の人的要因と非日常的な環境や二次災害の危険性などの状況的要因が関与していた。また対処行動には、ストレスの内容に応じて問題焦点型と情動焦点型を選択していることが明らかとなった。災害現場という対処行動を実施するには非常に困難状況においても積極的な対処行動をとられていたことが、救援活動後の安堵感や自らの活動に対する肯定的評価に繋がっていた。その一方で、否定的感情として疲労感や後悔、他者評価への不満がその後のストレス反応に繋がる可能性があることから、救援活動後の休息の確保や周囲の肯定的評価等の支援体制構築が不可欠であることが示唆された。
皮膚特異的発現IL-18トランスジェニックマウスを用いたアレルギー性皮膚炎の解析

我々の研究グループはIL-18がTh1誘導だけでなくTh2誘導及びIgE誘導に関与していることを世界に先駆け証明した。また最近の研究でIL-18がヒトのアトピー性皮膚炎の発症に関与していることが判明した。我々はヒト・ケラチノサイトプロモーター(K5)を用いC57BL/6バックグラウンドの皮膚特異的発現IL-18トランスジェニックマウス(K5/IL-18TG)を樹立した(Kawase, J Invest Dermatol, 2003,121(3):502-509)。K5/IL-18TGマウスがアトピー性皮膚炎様皮膚炎を自然発症することが判明した。この皮膚炎発症パターンは生後10日に発症のピークを迎え4週でいったん治癒し、15週以降また皮膚炎発症するという2つのピークを持つ。発症パターン、病理像がヒトアトピー性皮膚炎に似ていた。その上、抗NK細胞抗体である抗AsialoGM1抗体(Wako)2mg及び抗マウスNK1.1抗体(PK136)0.5mgを腹腔内投与しNK細胞を抑制・除去するとこのアトピー性皮膚炎様皮膚炎はほぼ完全に抑制された。Dexamethasone塗布は皮膚炎を弱く抑制したがマウスの成長を著明に抑制した。しかしながら抗マウスCD4抗体(GK1.5)や抗マウスCD8抗体(2.43)の腹腔内投与は皮膚炎を全く抑制しなかった。これらの結果はNK細胞がアトピー性皮膚炎発症に関与している可能性を示唆した。抗NK細胞抗体は皮膚炎の治療剤効果がDexamethasoneよりも優れているにも拘わらず副作用もなく、極めて優れた予防・治療剤として有用であることが分かった。アトピー性皮膚炎は今日現代病または国民病と言われるくらい多くの国民が難治性皮膚炎症状に悩んでいる。現在の治療法はステロイドから最近開発が進んでいる抗アレルギー剤またはFK506を含む免疫抑制剤と進歩を遂げてきた。しかしながらいまだアトピー性皮膚炎の原因は不明である。またアトピー性皮膚炎の動物モデルはNC/Ngaマウスらがあるが最近の研究でこれらのマウスは必ずしもヒトアトピー性皮膚炎と一致しないことが判明した。そのため新規アトピー性皮膚炎マウスモデルが求められている。我々はヒトkeratinocyte promoter(K5)を用い皮膚特異的発現IL-18トランスジェニックマウス(K5/IL-18TG)、新規ヒトアトピー性皮膚炎マウスモデルを樹立した。このK5/IL-18TGマウスはTNCB, croton oilで誘導される接触皮膚炎が正常マウスに比べ著明に発症する(Kawase et al., Journal of Investigative Dermatology, 2003)。その上このK5/IL-18TGマウスはアトピー性皮膚炎様皮膚炎を自然発症した。その皮膚炎発症パターンは生後10日に発症のピークを迎え4週でいったん治癒し、15週以降また皮膚炎発症するという2つのピークを持つ。つまりK5/IL-18TGマウスは発症パターン、病理像がヒトアトピー性皮膚炎に非常に似ている。このアトピー性皮膚炎様皮膚炎は抗NK細胞抗体(asialoGM1)、抗NK1.1抗体や抗LY49D抗体(4E5)で抑制された。しかしながら抗CD4やCD8抗体では抑制されなかった。T細胞とB細胞が欠損したB6 background rag-1 deficient(-/-)K5/IL-18Tgマウスは皮膚炎を起こすが、Balb/c background K5/IL-18Tgマウスは皮膚炎を起こさない。このことはIL-18で活性化されたNK細胞はMHC拘束性に皮膚炎を発症させることが示唆された。
イソニトリル代謝の分子レベルでの解明

得られたイソニトリルヒドラターゼの結晶について、X線回折データ収集を行った結果、良好な回折データを得ることができ、空間群はP1であることが分かった。s位相を決定するため、昨年度得られたSe-Met誘導体結晶の回折データを用い初期位相の決定、さらに初期モデルの構築に成功した。まず、分解能1.8Åで構造精密化を行った結果、立体構造に関する新しい知見が得られた。イソニトリルヒドラターゼ分子は単位格子中にホモダイマーとして存在しており、そのモノマー分子間は非結晶学的2回軸によって関係づけられていた。中でも最も特徴的な部分は(アミノ酸残基167228に相当する)C末端領域の大きなアーム構造であり、その部分はダイマー構造における分子間において互いの主鎖をクロスさせた構造をとり、そのダイマー構造をより強固なものとしていると考えられる。本構造は、一次構造で24%の相同性を示したPH1704には存在しておらず、全く新規な構造である可能性が示唆された。さらに、分子の表面には基質の大きさに対して少し大きめのくぼみが存在し(直径約7Å、ダイマーあたり2つ存在)、その底には活性中心と予測されるシステイン残基101が位置していた。本システイン残基の周辺を精密に解析した結果、興味深いことに、(相同性のあった)PH1704とは全く異なる新規活性中心構造を形成していることが判明し、新規な反応機構の存在が強く示唆された。イソニトリルヒドラターゼと低いながらも相同性があるアーキア由来の細胞内プロテアーゼは既に立体構造が明らかとなっており、反応に関与する活性中心アミノ酸残基および周辺に位置する電荷を持つアミノ酸残基も判明しているため、それらに相当する(Pseudomonasの)イソニトリルヒドラターゼのアミノ酸残基7カ所に対して部位特異的変異法によりアミノ酸置換を行った。それぞれの変異タンパク質用の発現プラスミドを構築し、大腸菌を宿主として変異酵素を発現させた。最適条件下で大量に培養して得られた形質転換大腸菌体を超音波破砕処理し、無細胞抽出液を調製した。各変異酵素のイソニトリルヒドラターゼ活性を測定した結果、17番目のアスパラギン酸残基が101番目のシステイン残基とともにイソニトリルヒドラターゼ反応の活性中心を構成することが示唆された。大腸菌での組換え体からイソニトリルヒドラターゼの大量精製酵素標品を調製した。ハンギングドロップ蒸気拡散法を用い、結晶化条件の最適化を行った結果、大きさ約0.4x0.2x0.2mm程の板状結晶を得ることに成功した。また、M9の最少培地にセレノメチオニンを入れた培地を用いて、メチオニン要求株の大腸菌を培養することによって、メチオニンをセレノメチオニンに置換した組み換え体酵素の調製を行った。しかし、既に確立した大量発現方法ではセレノメチオニンの毒性のためか十分な酵素量が得られないため、培養温度や誘導剤添加時間、誘導剤添加後の培養時間などの様々な条件を検討した。その結果、最適な発現条件を決定することができ、セレノメチオニン置換組換え体酵素を大量に調製し、既に精製を終え、現在、並行して結晶化を試みている。イソニトリルヒドラターゼは培地中に誘導剤として基質を添加することにより誘導発現される。この結果より、本酵素遺伝子上流には誘導型プロモーターの存在が示唆されるが、この領域のシークエンスは完了していない。顕著なイソニトリル分解微生物を新たに育種することを目的として、放線菌を宿主とするイソニトリルヒドラターゼの大量発現を試みた。既に構築に成功している(放線菌で複製するチオストレプトン耐性)誘導型高発現ベクターpSH19のマルチクローニングサイトに、イソニトリルヒドラターゼ構造遺伝子を導入した発現ベクターを作製した。これを放線菌に導入した形質転換体について、誘導剤ε-カプロラクタム添加の有無でイソニトリルヒドラターゼの発現を検討した。その結果、誘導剤の添加により誘導的にイソニトリルヒドラターゼが生成しており、SDS-PAGEで見ても過剰発現したバンドが確認できた。イソニトリルヒドラターゼを(誘導的に)発現させることで、もともとイソニトリル分解活性を持たない放線菌に著量のイソニトリル分解能を保持させることができた。すなわち、毒性が高く刺激臭のあるイソニトリルを速やかにN-置換ホルムアミドに分解・変換することのできる微生物の育種に成功した。前年度最適結晶化条件を決定し、得られた結晶について、X線回折データ収集を行った結果、良好な回折データを得ることができた。さらに位相を決定するため、得られた結晶の重原子誘導体の調製ならびにメチオニン要求株を用いたSe-Met誘導体の調製を試み、その結果Se-Met誘導体を用いて良好な回折データが得られる結晶を作製することに成功した。

イソニトリルヒドラターゼ分子は単位格子中にホモダイマーとして存在しており、そのモノマー分子間は非結晶学的2回軸によって関係づけられていた。中でも最も特徴的な部分は(アミノ酸残基167228に相当する)C末端領域の大きなアーム構造であり、その部分はダイマー構造における分子間において互いの主鎖をクロスさせた構造をとり、そのダイマー構造をより強固なものとしていると考えられる。本構造は、一次構造で24%の相同性を示したPH1704には存在しておらず、全く新規な構造である可能性が示唆された。さらに、分子の表面には基質の大きさに対して少し大きめのくぼみが存在し(直径約7Å、ダイマーあたり2つ存在)、その底には活性中心と予測されるシステイン残基101が位置していた。本システイン残基の周辺を精密に解析した結果、興味深いことに、(相同性のあった)PH1704とは全く異なる新規活性中心構造を形成していることが判明し、新規な反応機構の存在が強く示唆された。