hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
陸上植物の環境ストレス応答の進化における多重遺伝子族の形成・機能分化の役割

植物の環境ストレス応答は、適時に適切な応答を可能にする複雑なメカニズムによって制御される。本研究では、このような複雑な制御機構の構築に、複製された遺伝子が進化の過程でそれぞれ違う機能を獲得することで多様化に貢献したという可能性を検証した。特に、環境耐性を制御するABAとエチレンのシグナル伝達系で機能する2つの複製遺伝子に着目した。遺伝子発現解析や変異株解析により、この2つの遺伝子が同じ制御系で機能していながら、それぞれ別の作用を持つことを示すデータを、植物生理学的および分子生物学的手法で得ることができた。これにより、植物の環境ストレス応答の多様化の解明につながる貴重な結果が得られたと考える。陸上植物は、乾燥や水害などの環境ストレスに適応する耐性を持ち、その環境ストレス応答の多くはエチレンにより制御される。そのエチレンのシグナル伝達系の重要な制御因子の一つがCTR1タンパクであるが、CTR1に類似するタンパク(CTR1L)も存在し、その機能や役割は知られていない。26年度の研究では、被子植物のシロイヌナズナにおいてCTR1とCTR1Lの機能を比較し、CTR1多重遺伝子族の機能分化が、いかに陸上植物の環境ストレス応答の機能の拡大・多様化を可能にしたかを検証する。まず、CTR1とCTR1Lの発現パターンをqPCR解析により検証し、次のデータを得た。(1)CTR1とCTR1Lには発現量に差があり、CTR1の発現量がはるかに多い。(2)CTR1が植物のどの部位でも発現されていることに対し、CTR1Lは若い実生ではほとんど発現されていない。このことから、CTR1とCTR1Lが機能する部位や役割が異なることが示唆された。さらにctr1-1、ctr1l両変異株を比較したところ、どちらの変異株でもエチレン応答において異なる性質の異常が観察され、CTR1とCTR1Lそれぞれの機能についてのおおまかな知見も得られた。類似するタンパクは機能も類似するという一般的な傾向から外れた興味深い例として、価値のある結果が得られたと考える。機能解析をさらに進めるための重要なツールとなるctr1/ctr1l二重変異株を作成した。この変異株を用いて、環境ストレス応答、エチレン・ABA伝達系におけるCTR1とCTR1Lの役割を分子レベルで詳細に検証する研究に着手している。また、共同研究を行うハーバード研究室やラングデイル研究室(英国オクスフォード大学)を訪問し、実験試料の譲渡や今後の研究計画、投稿論文について有意義な意見交換をおこない、今後の協力体制に関して合意を得ることができた。陸上植物は、環境ストレスに適応する耐性を持ち、その環境ストレス応答の多くはエチレンやABAなどの植物ホルモンにより制御される。27年度は、エチレンのシグナル伝達系の重要な制御因子であるCTR1と、CTR1に類似する未研究の因子CRGの機能を比較し、環境ストレス応答への作用、ABAシグナル伝達系との連携作用を検証することで、CTR1多重遺伝子族の機能分化について新しい知見を得た。さらに、コケ植物のCTR1ホモログであるPpCTR1Lと比較することで、機能分化の進化的な経緯についても検証した。まず、ctr1, crg変異株とctr1:crg二重変異株の詳細な表現型解析を行ったところ、以下の具体的な機能分化の確証が得られた。(1)高塩濃度または高浸透圧の状況下では、CTR1は発芽を抑制するのに対し、CRGは促進する傾向を示す。(2)発芽時にABAまたはエチレン応答性を持つ遺伝子には、CTR1とCRGどちらかの影響を強く受けるものがある。上記からABA伝達系との連携が顕著であるため、ABAシグナル伝達因子との相互作用を検証したところ、PpCTR1L, CTR, CRGのいずれもABAシグナル伝達因子に結合するという知見が得られ、また、これらのタンパク質は類似する結合特異性を示したが、結合強度において差が見られた。さらに、CTR1とCRGの発現量の比較では、全体的な発現量はCTR1の方が100倍程高いが、環境応答性に関してはCRGの方がやや敏感であることが示唆された。興味深いことに、冠水ストレスにおいてはCTR1とCRGとでは逆に作用する現象がみられた。以上により、CTR1多重遺伝子族の機能分化が、ABAとエチレンのシグナル伝達クロストーク、そして発芽時の環境ストレス応答の多様化に貢献したことが示され、陸上植物の環境ストレス応答の機能拡大と多様化の解明につながる貴重な結果が得られた。26年度の実験計画のCTR1とCTR1Lの発現レベルの解析については計画通りに実行でき、有意義な結果をまとめることができた。変異株を用いた機能解析については、ctr1/ctr1l二重変異株の作成に想定した以上の時間がかかったために計画より少々遅れた。これは、変異株の生育が野生型に比べて著しく遅い上に、種子の形成が悪く種子の回収率が低いという、実施するまで気付くことができなかった理由による。

これにより二重変異株を用いた詳細な表現系解析が遅れたが、パイロット実験としてctr1-1、ctr1l両変異株を用いて表現系解析を始め、事前に実験手法やコンディションなどを検証し確定することができた。これにより、二重変異株も含めた解析も速やかに開始することができ、すでに着手している。27年度が最終年度であるため、記入しない。植物分子生物学26年度の発現レベルの解析から得られた知見をもとに、CTR1とCTR1L両タンパクが機能する植物の部位や器官を予想することができる。この部位を中心に、さらに詳しい機能解析を進める。まず、作成した二重変異株やctr1-1、ctr1l両変異株を用いて、ABAやエチレン、環境ストレス(乾燥、冠水、高浸透圧など)の影響下における生長の相違やストレス反応の有無について調べる。また、エチレンやABAによって発現が誘発される遺伝子群の発現パターンをも比較検証する。これによりABA応答やエチレン応答におけるCTR1とCTR1Lタンパクの機能分化について生理学的・分子学的なデータを得ることができる。同時に、CTR1タンパクとCTR1Lタンパクはそれぞれキナーゼドメインを持つが、そのリン酸化機能の標的基質を同定し比較する実験を行う。このために、プロテオーム解析法を用いた網羅的な探索を試みるほか、イーストツーハイブリッド法を用いて標的の候補と考えられるタンパクとCTR1・CTR1L両タンパクとの相互作用の有無や度合いを調べる。同様の実験を、ヒメツリガネゴケのCTR1Lタンパクについても行う。これらの実験によりCTR1・CTR1L遺伝子の機能分化や多様化に関する具体的なデータを得ることができ、また、同定された標的基質について調べることにより、CTR1またはCTR1Lタンパクによるリン酸化がストレス応答においてどのような役割を持つのか予想をたてることができる。
凍結融解作用を受けるコンクリートの物質透過性と鉄筋腐食に関する研究

寒冷地におけるコンクリート構造物はその気候的な条件(凍結融解作用)により、コンクリート組織の膨張、緩みあるいはそれに伴うひび割れの発生や崩壊として特徴づけられる、特有の凍害劣化を受けやすい環境にある。一方で、近年、凍結防止剤などの塩化物が存在する環境下では凍結融解との複合作用により劣化が促進され、表層2cm程度までがフレーク(薄片)状に剥げ落ちるスケーリング劣化(表層はく離)が顕在化してきている。さらに劣化が進行した段階では骨材が露出し、著しい場合には、表層数cm程度のコンクリート組織の剥落を招く。そして、外部劣化因子からの保護層としてのかぶり(表層部)コンクリートの機能が完全に低下し、内部の鉄筋が腐食するケースも多数報告されている。そこで本研究は、凍結融解作用を受けたコンクリートの物質透過性を明らかにするとともに、鉄筋腐食との関わりについて検討することを目的としたものである。本年度は、コンクリートの物質透過性の観点から、凍害の劣化の進行と、鉄筋腐食の形態や速度などとの関連性について実験的に検討した。さらに、コンクリート中への塩化物の供給条件が鉄筋腐食に及ぼす影響についても考察を加えた。得られた結果の概要を以下に述べる。1.スケーリング等の凍結融解作用による劣化が顕在化していない初期の時点においても、コンクリート表層部では塩化物イオン等の鉄筋腐食に関わる物質が拡散しやすく、その結果、鉄筋表面の不導体被膜を破壊する可能性があることを明らかにした。このような凍害劣化の進行の場合、鉄筋の腐食形態は、ミクロセル腐食が卓越するものと考えられる。2.自然電位測定により得られた電位値は、鉄筋腐食の状態をある確率で予測するものであり、腐食の進行速度や腐食面積率を精度よく推測することは困難であることが確認された。3.コンクリート中へ断続的に塩化物が供給される場合、コンクリート表面は著しい乾湿の繰り返しを受けることになり、その影響によりコンクリート組織が脆弱化し、塩化物イオン等の浸透を促進させることが確認された。本年度は、コンクリートの凍結融解劣化のレベル(程度)が、塩化物および空気などの物質透過性に及ぼす影響について検討した。1.凍結融解作用の増加に伴いコンクリート表層部の塩化物イオンの透過性は、大きく増大する傾向にある。また、コンクリート供試体の劣化面より、3cmの位置での塩化物イオン透過量は、5cmの位置のそれより著しく増加する傾向が確認された。2.塩化物イオンの透過量は、コンクリート供試体の相対動弾性係数が80%の時点においても100%の時点(凍結融解作用を受けていない健全な状態)と比較して1.5倍程度大きくることが確認された。これは、凍結融解作用を受けたことにより、コンクリート表層部の組織が脆弱化したものと考えられる。そして、凍結融解作用による変状の初期段階でも塩化物イオンの透過性は大きく影響を受けるものと思われる。3.凍結融解作用を受けるコンクリートの透気性は、塩化物イオンの透過性とほぼ同様の傾向が確認され、凍結融解の進行に伴い透気係数は著しく増加することが分かった。

このような凍害劣化の進行の場合、鉄筋の腐食形態は、ミクロセル腐食が卓越するものと考えられる。2.自然電位測定により得られた電位値は、鉄筋腐食の状態をある確率で予測するものであり、腐食の進行速度や腐食面積率を精度よく推測することは困難であることが確認された。3.コンクリート中へ断続的に塩化物が供給される場合、コンクリート表面は著しい乾湿の繰り返しを受けることになり、その影響によりコンクリート組織が脆弱化し、塩化物イオン等の浸透を促進させることが確認された。
グラヤノトキシンと関連生物毒の特性を利用したNaチャンネルの新しい分類の試み

グラヤノトキシン(GTX)はNa^+チャンネルの活性化過程の膜電位依存性を50mV過分極方向へ移動させる薬理学的特性を持っている。蛙の心室筋細胞を用いてGTXのNa^+チャネルへの作用がNa^+チャネルに対して特異的なものかどうかを同じ内向き電流を発生させるL型Ca^<2+>チャネルにおいて調べた。その結果Na^+チャネルに特異的修飾を起こす頻回刺激を与えた場合でもL型Ca^<2+>チャネルには一部の例で電流の減少が見られたが基本的には影響はなかった。従ってGTXのNaチャネルに対する特異性は高いことが明らかになった。GTXのNa^+チャネルの修飾機序を、イカ巨大神経で調べた。GTXの属するクラス2生物毒はNa^+チャネルの修飾する際にチャネルが開放状態であることが必要といわれている。GTXについてこの条件を検討したところ持続的脱分極によるチャネル不活性化状態でも進行することが解った。このことは従来の見解と対立する。しかしながらプロネース作用下では一層容易にNaチャネルの修飾が進行することから、やはりチャネル解放時にGTXは作用するというべきである。恐らく予想外の結果が出たのはイカ巨大神経Na^+チャネルの不活性化が不完全にしか起こらない特性に依存しているのであろう。GTXによるチャネルの修飾の進行は二つの時定数をもっていることが解った。GTXのNa^+チャネルからの解離は膜電位とGTX濃度とは独立に発生し大約の時定数は30s35sの間であった。これらの事実を基にして新たなGTXによるNaチャネル修飾モデルの構築を行った。グラヤノトキシンおよびその関連毒はNaチャネルの開放をおこす生物毒として知られている。まず、グラヤノトキシンおよびその類同体のうちgrayanotoxin I(GTX-I)とα-dihydro-grayanotoxin II(α-dihydro-GTX-II)のカエル心室筋Naチャネル及び後根神経節細胞(DRG)に存在するフグ毒感受性(TTX-s)、フグ毒非感受性(TTX-i)Naチャネルに対する作用について調べた。ホールセル電流記録の結果では、どちらのCTXも脱分極刺激を繰り返し与える事によりNaチャネルを修飾する事がわかった。DRG TTX-i Naチャネルが両GTXに感受性がもっとも高く、300μMGTX存在下でコントロールの35%程度のコンダクタンスを持ち低い膜電位より活性化されるゆっくりとしたNa電流が観察された。一方、心筋性Naチャンネルに対しα-dihydro-GTX-IIによる修飾では著しく小さな修飾電流しか観察できなかった。単一チャネル電流記録の結果では修飾を受けたチャネルはDRG TTX-i Naチャネルも心筋性Naチャンネルも両GTXに対して同じ様なコンダクタンスや開口確率を示した。この事はホールセル電流記録における両チャネルのGTXに対する作用の差は修飾を受けているチャネルの割合の大小で説明されることを意味する。また、哺乳類培養細胞(HEK)に発現させたラット脳および心臓のNaチャネルについても同様の実験を進め、カエルの場合と同様に繰り返し脱分極パルスにより修飾が引き起こされる事を観察している。カエルおよびラットのNaチャネルでは共に単一の持続パルスでは十分な修飾は得られておらず、α-dihydro-GTX-IIの修飾作用がイカ巨大神経Naチャネルにおいては単一の持続パルスにより引き起こされるのとは対照的であり、感受性と共に修飾様式においてもCTXによりチャネルを分類できる可能性が示された。Na^+チャネルは発現場所により構造的に差異がある事が判り、これを反映してTTXに対する感受性の差とかゲート機構の動きの差が明らかになって来た。グラヤノトキシン(GTX)がNa^+チャネルを修飾すると、活性化機構を50mV以上過分極方向へ移動させる。この特性を利用して現在未知なチャネル膜電位感知機構を明らかにする端緒をつかむためこの実験は企画された。

色々なNa^+チャネル間でGTXに対する感受性の差があればキメラを構成する事によりGTXの作用部位の特定が可能となるからである。そこで、蛙の心筋と脊髄後根神経節TTX感受性(TTXs)及び非感受性(TTXi)Na^+チャネル間でGTXによる作用差の有無を明らかにする試みを行った。GTXによりNa^+チャネル修飾を引き起こすためには、保持電位-120mVから-20mVに達する持続4ミリ秒の短形波を10003000回与える必要がある。修飾されたNa^+電流(I_<Na>)は-90mV辺りから発生し逆転電位は正常Na^+チャネルと大凡一致した。各Na^+チャネルの細胞当たりの発現数は異なるので、GTX作用下の膜伝導度を正常時の最大膜伝導度を用いて標準化した。TTXi Na^+チャネルについてのみ用量-作用曲線の作成が可能であった。EC_<50>と最大比膜伝導度はGTXIについて31μMと0.03でα-H_2-GTXIIについては41μMと0.41であった。その他のNa^+チャネルの感受性は著明に低かった。この差が何によるのか後根TTXiと心筋のNaチャネルで単一チャネル記録法を用いて調べた。開口確率と相対膜伝導度において二つのNa^+チャネル間に差が無かった。従って、GTXに対する感受性の違いは修飾されるNa^+チャネル総数による事が解った。
表面プラズモン支援型微小非線形光学素子の提案とナノフォトケミストリーへの応用

本研究では、非線形光学ポリマーと金属ナノ構造体から構成される表面プラズモン励起支援型非線形光学波長変換ナノフォトニクスのプロトタイプデバイスの開発とその性能評価を行った。金属ナノ構造体表面に発生する表面プラズモン増強光電場の周波数を、その上に積層した非線形光学ポリマーにより周波数変換することが提案するナノデバイスの基本動作原理である。研究の結果、非線形光学ポリマーの積層により、表面プラズモン共鳴条件下での金属ナノ構造体表面非線形光学波長変換効率を60%程度増強させることに成功した。回折限界よりも微細な空間領域において光操作を可能とするナノフォトニクスが大きな注目を集めている。ナノフォトニクスの基本原理は金属表面における伝導電子の集団励起状態である表面プラズモンに伴う増強光電場を光源として用いることにある。一般的に表面プラズモンの励起は金や銀微粒子表面で実現されるが、これらの金属材料を用いた場合の励起可能な周波数領域は可視光領域に限られる。励起可能な周波数領域を紫外線領域へ拡張することはその応用範囲を広げる上で大きな意義がある。本研究ではこの課題を解決する手段として表面プラズモン増強光電場のための非線形光学波長変換素子を提案し、その開発を行うことを目的とした。ここで提案する表面プラズモン支援型波長変換ナノフォトニクス(SP-NLO-WCNP)システムの基本構成は表面プラズモン増強光電場を発生するための金属微粒子と非線形光学波長変換相互作用を担う非線形光学ポリマーとから構成される複合構造体である。平成23年度は提案技術の基本原理の実証、すなわち、本当に表面プラズモン増強光電場により非線形光学波長変換動作を実現することが可能であるか否かについて検討した。研究では表面プラズモン増強光電場を発生するために銀もしくは金薄膜をコートしたプリズムを用いたクレッチマン型励起法を採用し、非線形光学材料として先行研究にて開発したアモルファス高分子強誘電体中に有機色素分子をドープしたホストゲスト高分子非線形光学材料を利用した。研究の結果、表面プラズモン共鳴条件にてフェムト秒光パルスを照射したところ、予想通り表面プラズモン増強光電場による高分子非線形光学材料中にて第二高調波発生を確認することに成功した。また、時間分解分光法により第二高調波の時間相関を測定したところ、SP-NLO-WCNPの非線形光学感受率の応答時間は光パルスのパルス幅である150fs以下であることを確認した。ナノサイズの金属ナノ構造体の光学応答が大きな注目を集めている。このような金属ナノ構造体に光を照射すると、表面プラズモンと呼ばれる伝導電子の集団振動状態が励起され、その表面に局在した高密度光電場が発生する。本研究では、この高密度な光電場の非線形光学への展開について検討した。これまでにも表面プラズモン増強光電場の非線形光学への応用について多数の研究が報告されているが、金属ナノ構造体表面に非線形性の大きな非線形光学(NLO)ポリマー材料を積層し、実効的な非線形性の増強を試みた点が、この研究の特徴である。平成24年度までに金属ナノ構造体の形状の調整により、表面プラズモン共鳴波長の制御に成功した。また、共鳴波長の異なるNLOポリマーの準備も進めている。平成25年度は、非線形光学ポリマーを積層した金属ナノ構造体の非線形光学波長変換効果を観測し、提案技術の優位性を実証した。非線形光学応答は、第二高調波法によって実施した。研究の結果、金属ナノ構造体の表面プラズモン共鳴波長と励起光の波長が一致すると、高効率での波長変換動作の実現に成功した。金属ナノ構造体自身も、その表面非線形性によって第二高調波光を発生しうるが、同じ条件でNLOポリマーを積層した場合と非線形光学ポリマーを積層しなかった場合とで測定した結果、第二高調波発生効率に有意な差が見られ、NLOポリマー積層による非線形性増大効果の優位性を実証した。NLOポリマーの共鳴波長が、励起光の波長に近づくのに従い、第二高調波発生効率が高くなることについても確認した。現時点では、NLOポリマーを積層による波長変換効率の増加は、60%である。しかし、小スケールながら、より励起光波長に近い共鳴周波数のNLOポリマーの合成に成功している。これらの利用により、より高効率での非線形光学波長変換動作が期待される。平成24年度は平成23年度に引き続き提案する表面プラズモン支援型微小非線形光学素子を支える2つの基盤要素材料である金属ナノ構造体および非線形光学ポリマーの開発を中心に推進した。金属ナノ構造体は局在表面プラズモンを励起するためのものであり、その形状を制御することにより共鳴励起周波数を調整することができる。本研究では非線形光学励起のための励起源としてモードロックチタンサファイアレーザーより発振する波長800nmの光パルスを利用する。

そのため、光パルスの発振波長において金属ナノ構造体が表面プラズモン共鳴効果を示す必要がある。研究では直方体形状のロッド型金属ナノ構造体を製作した。金属ナノロッドの縦横比を調整することにより連続的に表面プラズモン励起波長を制御することに成功し、また目的とする800nmに共鳴を示す金属ナノ構造体を用意することができた。一方、非線形光学材料は金属ナノ構造体表面に積層し、その非線形性を増強するために利用する。本研究で用意した非線形光学ポリマーはホストゲスト型と呼ばれる複合構造体より構成され、光との非線形光学応答を担うゲスト色素とそれを固定するホストポリマーより構成される。ゲスト色素の共鳴周波数は適切な分子設計を施すことにより自由に制御可能である。提案原理を実現するために非線形光学ポリマーの共鳴周波数が表面プラズモン共鳴周波数にできるだけ近づけることが望ましい。平成24年度はトリシアノフランと呼ばれる電子受容性の大きな部位を持つ色素の開発を進めた。研究の結果、汎用な色素よりも低周波数領域に共鳴を示す色素を開発することに成功した。表面プラズモン支援型微小非線形光学素子の二次非線形光学特性は第二高調波と呼ばれる分光計測法によって評価する予定である。平成24年度の研究ではそのための分光光学系の整備にも着手した。この研究で開発を目指す表面プラズモン支援型微小非線形光学素子の基本原理は金属表面に発生する表面プラズモンによりポリマー非線形光学材料中で波長変換動作を実現することにある。平成23年の研究によりプリズムを利用した表面プラズモンにより期待通りの波長変換動作を確認することができたことから、提案原理の証明に成功しており、平成23年度の目標は達成していると言える。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は提案する表面プラズモン支援型非線形光学波長変換素子のプロトタイプデバイスを製作し、その波長変換動作について調査することである。素子は表面プラズモン励起のための金属ナノ構造体と非線形光学相互作用を担うポリマー材料という二つの基盤材料より構成される。平成23,24年度の研究を通じて励起光源として利用する発振波長が800nmの光パルスに対して表面プラズモン共鳴条件を示す金属ナノ構造体を製作することに成功した。また、同時に非線形光学ポリマーの開発も進め、励起光源として利用する予定の波長800nmに対して大きな非線形性を示す材料の開発にも成功した。このようにこれまでの研究により本提案技術を実現するための2つの基盤材料を用意することができ、残された課題は製作された微小非線形光学素子の動作確認のみである。すでに非線形光学特性を評価するための分光計測系の整備も終了している。これらの点を考慮すると、最終年度の平成25年度1年間で十分に計画された研究項目を検討することができるものといえ、研究は順調に進んでいると言える。平成24年度は金属ナノ構造体表面に励起される表面プラズモン増強光電場を利用した非線形光学波長変換動作について検討する。
2次元型検出器系低速イオンビーム散乱装置による表面ナノ構造評価と応用

低速イオンビーム散乱分光装置を全自作した。具体的には、超高真空チェンバー、マニピュレータの設計、計測用プリアンプ、time-to-digital converter(4ch,100MHz)、pulse generator,検出器を回転させるためのステッピングモータ用電源、イオン源、イオン銃、計測用ソフトウェア等である。科研費補助金は、自作できない部分、即ち、超高真空チェンバー、真空配管等に使用した。現在、低速イオンビーム激動分光装置は、世界中どこのメーカーからも販売されていないが、以前に日本のメーカが販売していた価格が3000万円程度であったので、その1/10程度の金額で作ったことになる。ここで蓄積した多くのノウハウは今後広く公開し役立ててもらいたいと願っている。また開発した本実験では、2次元型検出器は高価で購入することができなかった。検出器1台500万円を超える価格であり予算が足らなかった。しかしながら、入射ビームに対して180°後方散乱用と1-150°まで回転できる2種類の検出器(MCP)を取りつけることが出来、正常に働くまで整備できた。2次元型の実験データは得られないが表面構造に依存した信号を十分捕まえることができた。またこの実験装置は、原子ビーム散乱も行えるように開発を発展させた。原子ビーム散乱とは電荷をもたないビームを試料に入射させ散乱された粒子を検出するものである。これは絶縁体試料の表面構造を解析するのに有効である。いまだ世界のどこにおいても市販されていない分析装置である。原子ビームを生成するにあたっては、イオンビームを気体の中を通過させることで電子交換反応を利用している。解析方法は入射ビームと標的原子との相互作用で生成されるシャドーコーン、ブロッキングコーンを利用できるが実際には3次元での軌道解析を行うことによって表面構造決定が可能となる。低速イオンビーム散乱分光法を発展させた装置の開発を行っている。イオンビームなどの荷電粒子線に替えて原子ビーム散乱法を試みている。測定法は飛行時間分解型である。今回の装置は、表面科学において盲点であった絶縁体の表面構造を解析できるところに新しさがある。荷電粒子線を入射させた場合、電荷をもつために絶縁体表面において電荷がたまるチャージアップ現象が生じる。たまった電荷を打ち消すように電子線を照射するのも1つの方法であるが実際にそれを行うのは極めて困難である。従って、最初から電荷をもたない原子ビームを入射プローブとして用いることを計画した。現在までに超高真空チェンバーの設計、真空排気系装置の準備、検出器系の主だった電子回路は出来上がった。今後は、これを実際に組み上げてスペクトルを取ることに主眼を置いている。そのために計測用のソフトを完成させなければならない。Visual Basic, C++の2つでプログラムを作っている最中である。実際にこの装置が完成すると得られる実験データのほとんどが過去に得られなかったものであることが期待できる。今回の研究成果は平成15年12月に材料科学国際会議(MRS)で発表した。飛行時間をデジタル信号に変換する電子回路、50Vのパルス信号を発信させる電子回路等について話をした。装置完成後には装置の作り方を広く公開する予定である。絶縁体系の表面構造、ナノ構造の計測に役立てばと願っている。具体的には、計測用プリアンプ、time-to-digital converter (4ch,100MHz)、pulse generator,検出器を回転させるためのステッピングモータ用電源、イオン源、イオン銃、計測用ソフトウェア等である。

科研費補助金は、自作できない部分、即ち、超高真空チェンバー、真空配管等に使用した。現在、低速イオンビーム散乱分光装置は、世界中どこのメーカーからも販売されていないが、以前に日本のメーカが販売していた価格が3000万円程度であったので、その1/10程度の金額で作ったことになる。ここで蓄積した多くのノウハウは今後広く公開し役立ててもらいたいと願っている。また開発した本実験では、2次元型検出器は高価で購入することができなかった。検出器1台500万円を超える価格であり予算が足らなかった。しかしながら、入射ビームに対して180°後方散乱用と1-150°まで回転できる2種類の検出器(MCP)を取りつけることが出来、正常に働くまで整備できた。2次元型の実験データは得られないが表面構造に依存した信号を十分捕まえることができた。またこの実験装置は、原子ビーム散乱も行えるように開発を発展させた。原子ビーム散乱とは電荷をもたないビームを試料に入射させ散乱された粒子を検出するものである。これは絶縁体試料の表面構造を解析するのに有効である。いまだ世界のどこにおいても市販されていない分析装置である。原子ビームを生成するにあたっては、イオンビームを気体の中を通過させることで電子交換反応を利用している。解析方法は入射ビームと標的原子との相互作用で生成されるシャドーコーン、ブロッキングコーンを利用できるが実際には3次元での軌道解析を行うことによって表面構造決定が可能となる。
頭頚部臓器における多層構造再生技術の開発

本研究の目的は頭頸部臓器切除後の機能障害の回避とQuality of Lifeの向上をはかり、国民の健康に貢献することにある。頭頸部組織再生をはかるために、線維芽細胞を用いて早期に気管上皮を再生させることができた。歯肉由来線維芽細胞は上皮形成効果が高いこと、脂肪組織由来幹細胞は血管新生能があることを明らかにした。複数の細胞を導入して人工材料を作製し、これを移植し頭頸部の多層構造を同時に再生させる基盤技術を開発した。気管線維芽細胞の代わりに、気管上皮層の再生を促進し容易に採取可能な自家移植用の線維芽細胞の供給組織を検索することを目的とした。異なる組織に由来する線維芽細胞の採取・培養を行うために、実験動物としてラットを用い、同一個体から気管、皮膚、頬粘膜、歯肉粘膜および鼻粘膜より線維芽細胞をoutgrowth法にて採取し、培養した。線維芽細胞の増殖能、細胞外マトリックス合成、産生能の測定を行った。一定面積の組織片から採種できる各線維芽細胞の細胞数と継代後の増殖率を、血球計算板によるカウントとBrdU取り込み量の測定によって比較した。コラーゲンゲル内で培養した各線維芽細胞による細胞外マトリックス合成量をreal-time PCR、産生量をウエスタンブロッティングで定量した。上皮細胞と線維芽細胞の共培養を行った。線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に気管より酵素処理にて採取した上皮細胞を播種して共培養した。上皮細胞がコンフルエント到達後は、上皮細胞の分化を促進するため空気暴露した。線維芽細胞が上皮細胞の増殖、移動、構造に及ぼす効果を調べた。上皮細胞層の一部を剥離し、再び上皮細胞被覆するまでの時間、共培養した上皮細胞の増殖率を用いて上皮細胞の増殖、移動に及ぼす効果を評価した。線毛細胞、杯細胞および基底細胞に特異的な抗体による免疫組織学的手法、走査型電子顕微鏡による上皮表面の線毛被覆面積によって、構造に及ぼす効果を評価した。以上の実験で得られた結果から、歯肉粘膜由来の線維芽細胞が、形態的にも機能的にも正常の気管組織に近い組織再生を促進することが判明した。本研究の目的は、喉頭、気管、咽頭、食道など頭頸部組織の多層構造の再生をはかることにあり、自家移植用の線維芽細胞の検索、各種幹細胞移植による血管網形成を評価し、最適の細胞を含む人工材料を作製する。昨年度は、ラットの同一個体から気管、皮膚、頬粘膜、歯肉粘膜、鼻粘膜より線維芽細胞を採取し培養した。歯肉粘膜由来の線維芽細胞が、形態的にも機能的にも正常気管に近い組織再生を促進することが判明した。本年度はラットおよびウサギを用いて、線維芽細胞とコラーゲンスポンジからなるハイブリッド人工材料を作製し、これを移植して気管を再建した。内視鏡、摘出標本のH-E染色、電子顕微鏡による気管内腔面の観察、上皮細胞層の厚さについて評価した。線維芽細胞を用いることで、早期に気管上皮を再生させることが可能となった。ヌードラット皮下に脂肪組織由来幹細胞(ASC)を含むマトリゲルや人工材料を移植し、免疫組織学的にASCの血管新生促進効果を確認した。また、ASCとコラーゲンスポンジからなる人工材料を作製し気管欠損に移植したところ、早期に分化した気管上皮再生を得られることがわかった。層ごとに細胞を組み込んだ人工材料の作製および動物への移植実験を行った。細胞には、レシピエントと識別するために、レトロウイルスによるトランスフェクションによって緑色蛍光蛋白GFPや赤色蛍光蛋白mRFP1を発現させた。線維芽細胞をコラーゲンゲル中に播種し、脂肪組織由来幹細胞を隣接組織と線維芽細胞層の間のコラーゲンスポンジに含ませて、多層構造の人工材料を作製する技術を確立した。
3次元的動作解析による脊柱変形患者の立位・歩行バランスの評価

脊椎疾患そのものや、疾患に対する手術によって、実際の身体の動きや、関節にかかるストレスにどれくらいの影響があるかを3次元的なモーションキャプチャーシステムを用いて計測する。従来のX線検査では得られなかったデータを獲得することにより、適切な手術方法や、手術による矯正の目標を明らかにすることが本研究の目的である。
肝細胞と幹細胞より構成される可移植性自己再生型肝組織の開発

今回の研究では肝細胞シートとともに線維芽細胞シートを作製しその手技を確立した。線維芽細胞シートは体腔内に移植可能であり、生着率も極めて良好なことが確認された。肝切除断端に貼付した場合に得られた結果として1)断端の組織学的修復の促進、2)組織内に肝前駈細胞と考えられるoval cellの誘導を確認した。線維芽細胞シートが幹細胞を内包する可能性については支持する結果は得られず、障害を受けたレシピエントからの幹細胞の誘導に作用する結果をレシピエント特異的マーカー発現で確認した。また、肝細胞シートとの重合は可能なことを確認したが肝細胞シートに線維芽細胞シートを重合しても生体内移植のような前駆細胞の出現は得られず重合組織片は研究期間内では成熟組織片としての認識に留まった。幹細胞を誘導する可移植性組織として線維芽細胞シートは有力な候補である成果を得た。研究成果(ラット肝細胞シートの作成)東京女子医大先端生命科学研究所(岡野光夫教授、夫橋一夫准教授)の技術指導のもと、温度応答性培地を用いたラット肝細胞シートの作成にまず着手した。Two step collagenase法により肝細胞を分離し、温度応答性培地上で培養、シート状に発育した同細胞を回収し、viableであることを確認した。(上記ラット肝細胞シートの至適生着部位の確認)上記ラット肝細胞シートが、生体内のどの部位で最も生着するかを確認した。DPPIV陽性ラットをドナー、DPPIV陰性ラットをレシピエントとした。前者より肝細胞を分離して温度応答性培地で培養し、シートを作成後、後者の皮下および腹腔内(大網、肝葉間、後腹膜上、陽間膜)の各部位へ貼付し、2日、7日、8週間後に犠牲死させ、発育状況を確認した。皮下組織では肝細胞は脱核・壊死傾向にあり、機能的肝組織の形成を認めなかった。一方、肝表面・大網では、好塩基性細胞質を保つ健常肝細胞による層状組織形成を認めた。これらの結果は、腹腔内部位は肝細胞の生着を支持しうる部位であることを示唆した。(肝障害モデルに対する肝細胞シートの治療効果)無アルブミンラットに肝障害性のある2-アセチルアミノフローレンを持続皮下投与し肝障害モデル作成、同ラットに30%肝部分切除を行い肝細胞増殖刺激を誘導した上で、SDラットより作成した肝細胞シートを大網および肝表面に移植した。移植群でアルブミンが産生される傾向は認めたものの結果が安定せず、治療効果の確認はできていない。(ラット線維芽細胞を用いた細胞シート作成)肝細胞シートと同様の方法で線維芽細胞を用いたシートの作成を試みた。シートの回収は可能であり、そのviabilityを現在確認中である。以上、3次的な肝組織構築の前段階として、2次元的な細胞シートの作成・治療効果の検討を継続中である。研究実績概要末期的肝疾患の治療としての肝移植は深刻な提供者不足にあり、生体提供者に大部分が依存している。この解決のため細胞を用いた再生医療が研究されている現状にある。肝再生医療においては細胞マーカーを用いた幹細胞の分離・同定や、in vitroでの肝様組織の構築が報告されてきたが、生体内でこれらの結果が得られるかは未だ不明な点が多い。臓器不全は、再生の観点からは組織・生体内の幹細胞領域に端を発する修復・再生機構が破綻しているために生じるのであり、ここに幹細胞を外因的に動員しても機能するかどうかは疑問であるためである。近年確立しつつある初代細胞によるin vitro組織構築技術に幹細胞を加えることで肝機能補助と幹細胞による組織修復効果を生かし、移植可能組織を作製しその機能を検証することを目的に研究を行った。肝細胞をシート化するとともに線維芽細胞もシート化し内部に幹細胞様細胞が存在することを確認した。またこれら2種の細胞をシート化し重層することで組織片作成の可能性が確認された。線維芽細胞シートの効果は培養上清による細胞増殖効果が確認されマトリックスや増殖因子の産生を確認し、肝切離面に対しては創面の治癒を促進するのみならず貼付面に肝細胞以外の細胞の出現や肝組織形成が促進されることから障害臓器に対して再生を誘導することが確認された。これらの結果から肝細胞以外の細胞から構成されるシート単独でも使用可能であり可移植性のある組織片の確立に大きく寄与する成果となった。肝細胞は組織重合は可能であったが組織内に組み込むことに関しては本研究期間内では条件設定の検討に留まった。研究成果

今回の研究では肝細胞シートとともに線維芽細胞シートを作製しその手技を確立した。線維芽細胞シートは体腔内に移植可能であり、生着率も極めて良好なことが確認された。肝切除断端に貼付した場合に得られた結果として1)断端の組織学的修復の促進、2)組織内に肝前駈細胞と考えられるoval cellの誘導を確認した。線維芽細胞シートが幹細胞を内包する可能性については支持する結果は得られず、障害を受けたレシピエントからの幹細胞の誘導に作用する結果をレシピエント特異的マーカー発現で確認した。また、肝細胞シートとの重合は可能なことを確認したが肝細胞シートに線維芽細胞シートを重合しても生体内移植のような前駆細胞の出現は得られず重合組織片は研究期間内では成熟組織片としての認識に留まった。幹細胞を誘導する可移植性組織として線維芽細胞シートは有力な候補である成果を得た。研究成果の意義・重要性組織・生体内の幹細胞領域に端を発する修復・再生機構が破綻するために生じる病態が臓器不全である。この病態に対し、外的な細胞シート移植がこれを改善する可能性が示された。従来支持されてきた幹細胞そのものの作用による改善ではなく、間葉系細胞である線維芽細胞によって組織の幹細胞・前駆細胞が誘導された点がきわめて重要な発見であり、幹細胞周辺の基幹細胞でなくても病んだ細胞および臓器環境を改善することが可能であることを示した点において、細胞治療分野にの新しい概念を提示したものと考えられる。
環境政策導入のタイミングに関する政治経済学的モデル分析

環境対策から生じる分配問題、例えば地球温暖化がもたらす損害の地域的分布や排出権の配分などが、環境政策導入のタイミングに与える影響について、政治経済学的モデルを作成、定量分析を行った。自発的公共財供給の動学ゲームを応用、分配問題が環境政策導入のタイミングにどの程度影響を与え得るのか、に関して数理モデル化を行った。さらに、損害に関する情報が不完全である場合や、グループ間での所得格差拡大の影響など、に関して定性的、および定量的に分析するため、モデル定式化を行った後、気候変動政策に応用し実証研究とシミュレーションを行った。環境悪化がもたちす損害の地域的分布や排出権の配分など,環境対策から生じる分配問題が環境政策導入の意志決定に与える影響について,政治経済学的モデル分析を行った.具体的には,自発的公共財供給の動学ゲームを導入し,分配問題が環境政策導入のタイミングにどの程度影響を与え得るのかについて数理モデル化した.各グループ間で相手が環境悪化からどの程度損害を被るのかに関する情報が不完全である場合や,グループ間で所得格差が拡大する場合には,損害の大きいグループが費用負担をする期待が生じ,各グループが意志決定を遅らせるため,環境政策の導入が遅れてしまう可能性があることを定性的,および定量的に分析するため,モデル定式化を行った後,気候変動政策に応用し実証研究を行った.本年度研究の詳細については,まず環境政策導入のタイミング,政治経済学モデルの既存研究に関してサーベイをより詳細に行い,既存研究の問題点を明確化させ,本研究の差別化を行った,次に,環境政策導入のタイミングに関する政治経済学理論モデルを作成した.詳細には,1)排出削減に要する総費用の違いが,政策導入時期に与える影響,2)所得格差拡大の影響,についてそれぞれ定式化,論文"Distributional Conflicts and the Timing of Environmental Policy"としてドラフトが完成した.現在,英文ジャーナルInternational Environmental Agreements誌に投稿中である.環境対策から生じる分配問題,例えば地球温暖化がもたらす損害の地域的分布や排出権の配分などが,環境政策導入のタイミングに与える影響について,政治経済学的モデルを作成,定量分析を行った.自発的公共財供給の動学ゲームを応用,分配問題が環境政策導入のタイミングにどの程度影響を与え得るのか,に関して数理モデル化を行った.さらに,損害に関する情報が不完全である場合や,グループ間での所得格差拡大の影響など,に関して定性的,および定量的に分析するため,モデル定式化を行った後,気候変動政策に応用し実証研究を行った.環境対策から生じる分配問題、例えば地球温暖化がもたらす損害の地域的分布や排出権の配分などが、環境政策導入のタイミングに与える影響について、政治経済学的モデルを作成、定量分析を行った。
4次元ノイズ低減法を教師とした拡張知能によるノイズ低減法の心臓CTへの応用研究

心臓CTにおける臨床的な課題を解決するためには強力で汎用性のあるノイズ低減法の開発が必要である。そのために、現在我々が持つ技術の弱点は、機械学習を用いた拡張知能により補完することが可能であると感がている。本研究の目的は、4次元ノイズ低減法を適応した教師データを用いて学習を行った拡張知能による新たなノイズ低減法の開発とその原理的妥当性を評価し、臨床的課題の解決に向けての実際の臨床の画像へ応用できることを実証することである。
１次元２階微分作用素のスペクトル漸近定理とその拡散過程への応用

時間とともに変動する偶然量の数学モデルが確率過程であり、中でも拡散過程は連続的に変動する偶然量の基本的なモデルであり、多くの分野で応用されている。拡散過程は2階の微分作用素(生成作用素)で記述され、そのスペクトル関数はこの確率過程の様々な性質や量の記述に重要な役割をもつ。本研究ではスペクトル関数の漸近的挙動と微分作用素のドリフト係数の相互関係を明らかにした。また、半直線上での議論を全直線上の話しに拡張するための道具としてタウバー型定理を得た。本研究の目的は、1次元2階微分作用素について、スペクトル関数の漸近挙動を調べることである。この作用素は拡散過程に対応するので、拡散過程へ応用することができる。1次元拡散過程でもっとも基本的な確率過程はブラウン運動であるが、これに次いでベッセル過程も非常に重要な確率過程である。なぜなら、種々の極限定理の極限過程として現れるのは自己相似過程であることはよく知られているが、自己相似な拡散過程はベッセル過程であるからである。よって本研究は、いわば「ベッセル過程の吸引域」を求めることに相当している。すなわち、ベッセル過程についてはスペクトル関数や推移確率密度等、さまざまな量が具体的に詳しく計算されているので、これを拡張して、漸近的にベッセル過程に近い拡散過程を研究するのが目標である。得られた主な結果は次のとおりである。ラプラシアン(ブラウン運動)にドリフト項がついた形の2階微分作用素の場合、フェラーの標準測度が正則変動する(すなわち、ベッセル過程の吸引域に属する)ためのドリフト項に関する必要十分条件を求めることに成功した。これは、推移確率やスペクトル関数の正則変動のための必要十分条件と言っても同じことである。この結果の主要部分は24年度に得られたが、細部を詰めて論文にまとめ上げ、投稿する作業は25年度になった。また、研究の続きとして、半直線上での議論を、全直線上の話に持ち込むための研究も行った。これは2つのHerglotz関数の調和平均に関するタウバー型の定理に帰着され、現在論文にまとめる段階である。本研究の目的は、1次元2階微分作用素について、スペクトル関数の漸近挙動を調べ、拡散過程に応用することである。問題自身は古典的問題ではあるが、本研究の新しい点は逆問題に重点をおく点に加えて、次の2点である。(1)従来は各種の量を、正則変動関数のクラスで考えることが必須と思われていたが、この条件を外したい。(2)従来、Fellerの標準形の標準測度の言葉で与えられていた条件を、古典的な微分作用素の形のままで表現することを考えたい。研究のスタートラインは、数年前の渡辺信三氏との共同研究で得られた、一般化2階微分作用素(確率論的にはフェラー生成作用素)と、ブラウン運動のある加法的汎関数、および(スペクトル関数を与える)Herglotz関数の対応関係である。本年度は、初年度であり、拡散過程のKolmogorovの古典的微分作用素のドリフト係数とフェラーの標準形における標準測度(speed measure)の相互関係をタウバー型定理の形でまとめてみた。詳しく説明すると、1次元拡散過程のひとつの典型であるBessel過程の場合は、標準測度やスペクトル関数、確率推移密度等が特殊関数を用いて具体的に計算されているが、漸近的にBessel過程に近い場合はどうなるか、またその逆はどうなるかを研究した。得られた主な結果は次の通りである。ラプラシアンにドリフト項がついた形の2階微分作用素の場合、標準測度が正則変動するためのドリフト項の必要十分条件を求めることに成功した。これらは現在論文にまとめている段階であり、一部は関西学院大学の小谷眞一氏との共同研究である。本研究の目的は、1次元拡散過程について、スペクトル関数の漸近挙動を調べることである。この作用素は拡散過程に対応するので、拡散過程へ応用することが出来る。1次元拡散過程においてはブラウン運動がもっとも基本的であるが、これに次いで重要なのはベッセル過程であり、様々な量が具体的に特殊関数を用いて計算されている。本研究では、それらを拡張して、漸近的にベッセル過程に近い場合、あるいは同じ事であるが、ベッセル過程を少し摂動させたときに、スペクトル関数がどのように変わるかを調べている。とくに、スペクトル関数の漸近挙動から拡散過程のドリフト係数の挙動を求めるタイプの逆問題に重点をおいている。主要な結果は、スペクトル関数が正則変動するための条件は、基本的にはドリフト係数が漸近的にベッセルの場合に近いことであり、その厳密な表現は25年度までに得られたが、26年度に論文として仕上げることができ、投稿の結果、掲載が決まった。また、前年度までは半直線上で考えたが、26年度には両側の場合への拡張にも成功した。本研究の目的は、1次元2階微分作用素について、その係数とスペクトル関数の漸近挙動(とくに原点近傍での挙動)の間の相互関係を調べ、さらにその結果を1次元拡散過程に応用することである。前年度までの研究の中心的関心事は次の通りである。まず、この微分作用素をフェラー標準形で表したとき、そこに現れる標準測度やスケール関数の(遠方での)漸近挙動と、もとの作用素の係数との関係を明らかにし、これにより、問題をM.G.KreinやS.Kotaniのスペクトル理論の話しに帰着することに成功した。この結果、ベッセル過程を摂動させた拡散過程の遷移確率密度の漸近挙動が明らかになり、また逆問題にも成果が得られた。

そこで27年度は、上述した前年度までの研究の発展として、1次元拡散過程のfirst hitting timeへの応用を考えた。ベッセル過程の場合は分布のラプラス変換が各種の特殊関数を用いて具体的に表されることを用いてHamana-Matsumotoが末尾確率を計算したが、本研究ではより一般の拡散過程に対して彼らの結果の一般化となる定理を得ることができた。成果はすでに論文にまとめ雑誌に投稿済みである。本研究結果の意義は次のとおりである。ブラウン運動やベッセル過程は、推移確率密度や各種汎関数が各種の特殊関数を用いて具体的に表すことが出来るのでその挙動は調べやすいが、ベッセル過程を少しでも摂動させた場合にどうなるかについては不明となる。そこで、本研究では生成作用素の係数の摂動が拡散過程にどのような影響を与えるかを明らかにした。また、部分的ではあるが、逆問題にも解答を与えたことになる。時間とともに変動する偶然量の数学モデルが確率過程であり、中でも拡散過程は連続的に変動する偶然量の基本的なモデルであり、多くの分野で応用されている。拡散過程は2階の微分作用素(生成作用素)で記述され、そのスペクトル関数はこの確率過程の様々な性質や量の記述に重要な役割をもつ。本研究ではスペクトル関数の漸近的挙動と微分作用素のドリフト係数の相互関係を明らかにした。また、半直線上での議論を全直線上の話しに拡張するための道具としてタウバー型定理を得た。拡散過程の生成作用素にはコルモゴロフ式の古典的な表現と、フェラーの標準形が代表的であるが、前者は直観的に理解しやすくまた確率微分方程式の枠に納まり易く、また後者は逆問題などを扱うのに適している。ゆえに、漸近挙動を両者の形で表現したときの相互関係を求めることは重要である。本研究では各種極限定理に必要な両者の関係をほぼ完全に解決し、当初の目的をほぼ達成といえる。現在はさらにその発展と応用に取り組んでいる。数学(確率論)スペクトル関数の漸近挙動に関する基本的な定理はすでに論文として仕上がり、掲載が決まっているが、そこで得られた結果や手法は応用が広いので、その方向に研究を発展させたい。とくに1次元拡散過程のfirst hitting timeの末尾確率の計算に役に立つことに気がついたので、ベッセル過程について最近知られるようになった結果を、より一般の拡散過程に拡張するとともに、逆問題に取り組みたい。拡散過程の生成作用素の表現方法にはコルモゴロフ型の古典的な形とフェラーの標準形などがあり、フェラーの標準形における標準測度が正則変動になるための必要十分条件をコルモゴロフ式の作用素におけるドリフト係数の言葉で表すことが研究目標のひとつの柱であるが、24年度に主要な計算が済み、25年度に論文にまとめ上げることが出来た。特に、逆問題についてもほぼ完全な答えが得られたことは大きな成果である。また、片側拡散過程についての結果を両側の拡散過程に適用するための重要な結果についても目処がついたのも大きな成果といえる。拡散過程の生成作用素の表現方法にはKolmogorov型の古典的な形とFellerの標準形などがあり、24年度はFellerの標準形における標準測度が正則変動であるための必要十分条件をKolmogorov型の表現で求めることであった。
コレステロールへの糖修飾によるパーキンソン病発症の制御メカニズムの解析

ニワトリ胎児脳から糖脂質・β-コレステリルグルコシド(β-CG)の精製に成功し、脳におけるβ-CGの存在を初めて明らかにした。高速液体クロマトグラフィー/質量分析法(LC/MS)を用いてβ-CGの解析システムを開発し、パーキンソン病モデル動物の脳、およびパーキンソン病患者剖検脳におけるβ-CG発現量を解析した。パーキンソン病モデル動物の脳ではコントロールと比較してβ-CGが増加し、パーキンソン病患者剖検脳では大きな差はなかった。本研究の目的は、酸性グルコシルセラミド分解酵素GBA1を介したパーキンソン病(PD)発症の制御メカニズムを明らかにすることである。近年、GBA1の機能破綻がPD発症を引き起こすことが明らかになりつつある。申請者は最近、GBA1がグルコシルセラミド分解活性だけではなく、コレステロールへのグルコース転移活性を有し、新規生理活性糖脂質・β-コレステリルグルコシド(β-CG)を合成することを明らかにした。本研究は、GBA1によるβ-CG合成という新しい視点からPD発症の制御メカニズムの解明を目指し、1)β-CG解析システムの立ち上げ、2)疾患モデル分析、3)疾患発症の制御メカニズムへのβ-CGの関与の検証、4)疾患治療へのβ-CGの応用の可能性の検討という4つのステップで研究を進める。平成26年度は、ステップ1に取り組み、高速液体クロマトグラフィー/質量分析法(LC/MS)を用いてβ-CG解析システムを開発した。LC分離モードに、従来の順相および逆相では困難であった糖構造の異なる脂質間の分離が可能な親水性相互作用クロマトグラフィーを用いた新たな脂質分析系を構築した結果、マウス脳においてβ-CGの存在を見出した。β-CGの組織分布はこれまでほとんど明らかになっておらず、脳におけるβ-CGの存在は本研究によって初めて明らかになった。これまで、脳に存在する糖脂質は詳細に研究されてきたのにも関わらず、β-CGの存在が明らかになっていなかった原因は、β-CGが脳に多量に存在するガラクトシルセラミドに埋もれていたことが考えられる。LC/MSによる詳細な分析によって、ガラクトシルセラミドはβ-CGの約100倍存在することが明らかになった。今回開発したβ-CG解析システムを用いて、PDモデル生物を用いた脂質分析(ステップ2)に着手しており、今後詳細な解析を進めていく。本研究は、GBA1によるβ-CG合成という新しい視点からPD発症の制御メカニズムの解明を目指し、1)β-CG解析システムの立ち上げ、2)脳からのβ-CGの精製および構造決定、3)疾患モデル分析、4)疾患発症の制御メカニズムへのβ-CGの関与の検証、5)疾患治療へのβ-CGの応用の可能性の検討という5つのステップで研究を進める。平成27年度は、まずステップ2に取り組み、脳からのβ-CGの精製および構造決定に成功した。β-CGはヒト線維芽細胞に存在することが以前に報告されているが、完全に構造決定がなされた例はない。今回、β-CG精製の出発材料にはニワトリ胎児胚脳を用い、順相クロマトグラフィー、および2段階の逆相クロマトグラフィーを駆使して精製を行った。β-CGのステロール部分の構造決定、特に環構造内の二重結合の位置を決定することは、エレクトロスプレーイオン化法を用いた質量分析、および一次元NMR分析では困難を極めた。そこで今回は、二次元NMR、およびスパイラル型の工学系を搭載したマトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計を用いてステロール部分の構造決定を行い、精製した脂質がβ-CGであることを確認した。続いてステップ3に取り組み、β-CG量がPDモデル生物の脳において変動していることを明らかにした。本研究は、GBA1によるβ-CG合成という新しい視点からPD発症の制御メカニズムの解明を目指し、1)β-CG解析システムの立ち上げ、2)脳からのβ-CGの精製および構造決定、3)疾患モデル分析、4)疾患発症の制御メカニズムへのβ-CGの関与の検証、5)疾患治療へのβ-CGの応用の可能性の検討という5つのステップで研究を進めていく。平成27年度終了時点で、ステップ13の実施が完了しており、平成28年度はステップ4、5を実施する予定であることから、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。