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高分子オルガノゲルのアメーバ様の電場変形と人工筋肉材料・デバイスへの応用

4光学駆動デバイスとしての機能を拡張するために光感応性色素を導入することで光応答性を導入する試みを行い、光電応答性を見いだした。この研究の展開に当たり、国際共同研究の申し入れがあり、外国の公的研究機閑との連携研究を展開し、関連特許を一件出願した。5本研究で対象としているクリープによるアメーバ様の変形には接触型の非変形電極を利用しているが、大変形に追随する柔軟電極材料の開発が、応用面で必要となり、新たな電極材料作製法を検討した。これにより、100%以上の変形に追随するカーボン・ナノファイバー導電性柔軟材料の作製が可能となった。関連特許を1件出願した。6この電極材料の開発に活用したカーボン・ナノファイバーをエラストマーに転用し、導電性高分子による被覆型電極膜を用いた場合に比較して数十倍の高効率化が可能であることを明らかにした。関連国際特許を出願中。平成17年度は現象の詳細解析を行ったので、平成18年度は引き続き現象の詳細解析・検証と応用化の基礎検討を行った。1アメーバ様変形に及ぼす可塑剤の影響について検討した結果、可塑剤の粘度と変形量に相関性があること、さらにアジピン酸系の可塑剤を含有したゲルは、フタル酸系可塑剤含有ゲルより応答速度が非常に速いことを示した。また、可塑剤種類・量とマトリックスポリマーの分子量を変えることでゲルのレイヤー化が可能となり、変形を制御できることを明らかにした。2応用化の探索として、4方向ベンディング駆動・アーム型駆動を利用したキャッチング動作、ローリング駆動による走行型動作を確認した。3デバイス化に関しては、企業との連携によって、光学デバイスの利用化を検討している。4これまでに光学駆動デバイスとしての機能を拡張するために光感応性色素を導入した材料の光電応答性を明らかしてきたが、色素の導入により熱遮断特性が発現することを新たに見出した。この研究に関し、国際共同研究の申し入れがあり、外国の公的研究機関との連携研究を展開し、関連特許を一件出願した。5アメーバ様変形を示すゲル材料は変形量が大きいため、ゴム状のエラストマーと複合化すれば大変形に追随できる新規のアクチュエータ材料の開発が可能となる。そこで、まずエラストマー単体での大変形駆動について検討を行った。電極にカーボンナノファイバー、エラストマーにポリウレタンを用いた結果、従来に比べて変位量が飛躍的に大きい曲げ歪約400%の大変形化を達成し、関連する論文を一報投稿した。6エラストマーの種類にとして、耐熱性が高いポリスチレン系エラストマーがあり、これを用いることで多方面の応用展開が期待できる。現在駆動特性を評価中であり、今後企業との共同研究も始める予定である。平成18年度に、現象の詳細解析とデバイス化への検討を行ったので、それに引き続いて関連する現象の解明とデバイス化の検討を試み、これまでの成果をまとめることとした。○本研究は、平成19年度より大型プロジェクト(グローバルCOE(拠点リーダー)、先端融合イノベーション拠点創出プロジェクト(副拠点リーダー)、知的クラスター事業(副研究統括)の発足に伴い研究が企業との連携研究分野に展開している。
非線形楕円型方程式の固有値問題と逆問題の解析

非線形常微分方程式の分岐曲線の漸近挙動の解析に関しては、生物学的・物理学的現象から導出された、自励系・非自励系の方程式の分岐曲線の大域的・局所的な漸近挙動の解析に取り組み、詳細な漸近公式を確立した。逆分岐問題に関しては、考察した方程式に含まれる定数が未知定数であると仮定したとき、方程式の分岐曲線の大域的挙動のみから未知の非線形項を決定できるか、などの研究課題にこれまでとは全く違う新しい視点から取り組み、成果を上げることができた。これらの成果により、今後の逆分岐問題の新しい切り口からの研究に対する基礎的結果を確立することができた。本年度は、非線形常微分方程式の分岐曲線の大域的・局所的な漸近解析と逆問題の研究を行った。特に常微分方程式に特有のアプローチにより、次の2つのテーマに関し、以下のような成果を得た。1.非線形常微分方程式の分岐曲線の漸近解析に関しては、大域的・局所的な振る舞いの研究を行った。まず、非自励の非線形項を持つロジスティック方程式に関し、解のノルムが無限大になるときの分岐曲線の漸近挙動を研究し、詳細な公式を得ることに成功した。また、分岐曲線の局所的な振る舞いに関しては、Crandall-Rabinowitzの古典的な理論によって、理論上は詳細な漸近展開は可能であることが知られてはいた。しかし、現実にその理論を適用すると、分岐曲線の局所的な漸近展開を求めるためには、解の漸近展開を求める必要があり、実際の計算を遂行する際にはかなり困難をともなう。そこで、自励系の常微分方程式に対して有力なアプローチであるTime-Map法を適用し、分岐曲線の局所的な漸近展開を容易に求めることに成功した。2.逆問題に関しては、1で求めた分岐曲線の大域的な漸近挙動から、ある条件下で、未知の非線形項を特定することに成功した。また、非線形項がべき乗タイプのロジスティック方程式に、無限大で指数的に減少するような非常に弱い摂動を加えた場合には、分岐曲線の大域的漸近挙動は、代数的減少というオーダーでは判別できないことが分かった。このことから、分岐曲線の大域的挙動から未知の非線形項を決定するには、あらかじめ、2つの未知の非線形項に関するなんらかの条件が知られている必要があることが判明した。本年度は、昨年度までに確立した分岐曲線に関する漸近展開公式を逆問題的視点から詳細に考察することを目標とした。さらに、特徴的な分岐曲線が現れる非線形項を持つ常微分方程式を考察し、詳細な漸近公式を確立することに取り組んだ。具体的には分岐曲線が無限回振動するような非線形方程式を考察した。この方程式は自励系なので、その分岐曲線の挙動はtime-mapを用いて考察可能ではあるが、実際の計算においてはいくつかの困難を伴う。それらの困難を巧みな積分計算により克服し、詳細な漸近公式を導いた。これらの順問題に対する成果を踏まえて、さらに逆分岐問題の解析に取り組んだ。考察する方程式に含まれる非線形項が未知であると仮定したとき、どのようなデータが与えられれば、未知の非線形項は特定できるか、またその精度はどのようにデータに依存するか、さらに考察する方程式に対して適切な逆問題の定式化とはどのようなものか、分岐曲線と非線形項が1対1対応であるための十分条件はどのようなものであるかなどの基本的な未解決問題を研究するためには、ある程度未知の非線形項の情報があらかじめ与えられている必要があること、さらにその条件はなるべく自然なものであることが望ましい。このことに着目し、本年度は、未知の非線形項があらかじめ与えられたべき乗の非線形項から摂動したものであるという状況下で逆問題を考察した。その結果、今後の非線形固有値問題の逆問題に関する研究の基礎となる一意性の結果を確立できた。さらに非線形項が3つの未知の係数を含む3次式であるとき、分岐曲線の大域的な漸近挙動と局所的な漸近挙動から、3つの未知の係数を特定できることを証明した。本年度は昨年度の研究を踏まえて、具体的な非線形項をもち、分岐曲線が無限回振動するモデル方程式に対する分岐曲線の漸近挙動およびその逆問題からの視点での研究を継続して行った。考察する方程式が自励系の常微分方程式であるので、いわゆるタイムマップ法を用いて問題の解析に取り組み、以下のような成果を得ることに成功した。分岐曲線が無限遠で大きく振動するもの、比較的小さく振動するもの、および単調減少的に振る舞う3つの非線形項に着目し、まずそれらの分岐曲線の大域的挙動について詳細な漸近公式を確立することに成功した。これらはタイムマップを精密に計算することにより確立することができた。さらに、この順問題に対する研究成果は、逆問題の研究に対する新しい視点からのアプローチにつながった。すなわち、非線形項が未知の関数であるとき、その分岐曲線の大域的な長さから未知の非線形項を決定することができるかどうか、といういままでの研究には現れてこなかったタイプの逆分岐問題を提唱した。そして分岐曲線の無限遠での振動が大きい場合には、その非線形項は単調減少する分岐曲線を与える非線形項と、分岐曲線の大域的な長さにより区別可能であることが判明した。この研究成果は、非線形微分方程式の分岐曲線の逆問題の研究に対する新しい切り口を与え、逆分岐問題が、単なる線形固有値問題に対する逆問題の数学的研究の拡張ではないということを示している。また、今後の研究課題である、生物学や物理学、工学に現れる様々な現象の解析に新しいアプローチを与えた意義のある研究であるといえる。

これまでの研究成果を踏まえ、具体的な背景をもつモデル方程式に対する逆問題を定式化し、それに対する結論を得たことで、今後の非線形固有値問題の逆問題の対するひとつのアプローチが得られた。したがって、おおむね順調に進展しているといえる。本年度はこれまでの3年間で得られた研究成果を踏まえ、特徴的な非線形項を持つ非線形常微分方程式の分岐曲線の大域的な漸近挙動の解析と逆分岐問題の研究を行った。特に自励系の常微分方程式に有効であるタイムマップを新しい視点から適用するアプローチを開発し、次の2つの研究課題に関して、以下の成果を得ることができた。(1)非線形常微分方程式の分岐曲線の漸近挙動の解析に関しては、分岐曲線の大域的・局所的構造の解明に取り組んだ。まず、自励系の非線形項を持つロジスティック方程式から派生する方程式を考察し、解の最大値ノルムが無限大になるときの分岐曲線とそれに対応する解の形状の漸近挙動に関する詳細な公式を得ることに成功した。非線形常微分方程式の分岐問題に関しては、研究期間を通して生物学的・物理学的現象などから導出された、自励系・非自励系の方程式の分岐曲線の大域的・局所的な漸近挙動の解析に取り組み、詳細な漸近公式を確立することができた。非線形常微分方程式の分岐曲線の漸近挙動の解析に関しては、生物学的・物理学的現象から導出された、自励系・非自励系の方程式の分岐曲線の大域的・局所的な漸近挙動の解析に取り組み、詳細な漸近公式を確立した。逆分岐問題に関しては、考察した方程式に含まれる定数が未知定数であると仮定したとき、方程式の分岐曲線の大域的挙動のみから未知の非線形項を決定できるか、などの研究課題にこれまでとは全く違う新しい視点から取り組み、成果を上げることができた。これらの成果により、今後の逆分岐問題の新しい切り口からの研究に対する基礎的結果を確立することができた。常微分方程式の分岐曲線の漸近解析に関しては、無限回振動する分岐曲線というきわめて興味深い研究対象を考察し、詳細な漸近公式を確立することができた。また逆分岐問題の研究においては、今後の非線形固有値問題の逆問題に関する研究の基礎となる、一意性の結果を確立できた。この3年間で得られた研究成果は、非線形方程式の逆分岐問題に対するいくつかの有力なアプローチを与えた。特に分岐曲線が無限回振動する場合の解析は数学的観点から非常に興味深いものである。そこで、これまでに得られた知見を十分に活用してこの現象の解明に取り組んでいく。数学解析この2年間の研究成果は、主として数学的に興味深い形状の分岐曲線が現れる方程式を考察して得られたものである。このことを踏まえ、生物学や物理学に現れる現象をモデル化した方程式のは多岐にわたるので、その中でも特に具体的背景をもつ非線形微分方程式の分岐曲線の順問題に関する研究を推進していく。そこで得られた成果を足がかりに、分岐問題の逆問題の研究を推進していく。分岐問題の順問題に関しては、目標であった大域的漸近挙動に関する公式を得た。逆問題については、未知の非線形項を分岐曲線の大域的性質で特徴づけが可能であるという成果を得た。
脂肪酸β酸化酵素における基質認識メカニズム

本課題では、脂肪酸β酸化系酵素であるアシルCoAデヒドロゲナーゼ(ミトコンドリア)およびアシルCoAオキシダーゼ(ペルオキシソーム)における基質認識および活性化メカニズムの解明を目的としている。これまでに、筆者らは基質アナログとして3-ケトアシルCoAおよび3-チアアシルCoAを用いた分光学的研究に基づいて、反応活性の高い基質(基質アナログ)との結合においては、基質は触媒反応が進行する"活性型"として酵素に結合し、一方、反応活性の低い基質に対しては、"非活性型"として結合することを示した(Tamaoki et al.,1999)。すなわち、基質特異性の本質は、活性型複合体のポピュレーションであり、活性型複合体の減少が反応活性の低下をもたらすものとして理解された。本年度は、基質の酵素結合様式の鎖長依存的変化をX線結晶構造解析により検証するという観点から、アシル鎖長C4-C21をもつ基質アナログ3-チアアシルCoAと中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ(アシル鎖C6-C10に高活性)との一連の複合体の結晶化と構造解析を押し進めた。これまでに、鎖長の異なる2種のアナログ(アシル鎖C6およびC8)との複合体の結晶化に成功し、それぞれ2.4、2.3Aの分解能での立体構造を決定した。いずれのアナログにおいても、3-チアアシル鎖はフラビンとの相互作用部位で同一の立体配置をとることが明らかとなった。この配置は、アニオン型リガンド(電荷供与体)と酸化型フラビン(電荷受容体)の間の電荷移動相互作用をそれぞれの分子軌道の適切な重なりとして理解させ、複合体形成による長波長吸収(810nm)の出現と13C-NMRスペクトルに観測されたフラビンC4aの高磁場シフトを見事に説明した。さらに、3-チアアシルCoAに基質の遷移状態アナログとしての意義を与えた。本課題では、β酸化経路で最も重要な初発および律速段階を触媒するアシルCoAデヒドロゲナーゼ(ACD)およびアシルCoAオキシダーゼ(ACO)における基質認識および活性化メカニズムの解明を目的としている。本年度は、中鎖アシル鎖を有するアシルCoAに対して選択的な触媒活性を示す中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ(MCAD)を研究対象とし、アシル鎖3位を硫黄に換えた基質アナログ3-チアアシルCoAとの複合体の分光学的研究を行った。複合体形成に伴い観測される長波長の吸収(810nmに極大)は、3-チアアシル鎖長(炭素数7から20)に大きく依存し、長鎖になるに従いその強度を急激に減少させた。この吸収強度の鎖長依存性が、基質に対する酵素反応速度(Vmax)の鎖長依存性に酷似したパターンを示すことから、基質および基質アナログに対する認識、活性化メカニズムの共通性が示唆された。安定同位体13Cラベルされた基質アナログ・MCAD複合体のNMRスペクトルは、吸収スペクトルに観られる鎖長依存に関して、次のような分子論的解釈を与えた。(1)アニオン型、中性型の2種類の分子種が、結合型リガンドとして存在し、(2)その存在比率は、3-チアアシル鎖長により変化し、長鎖のアナログになるに従い中性型リガンドの比率を増加させること。また、共鳴ラマンスペクトルにおいてアニオン型リガンドとFADのラマンバンドが観測されることから、長波長の吸収は、αプロトン引き抜き反応を受けたアニオン型リガンドと酸化型FADとの間の電荷移動相互作用によることが明らかとなった。2種の結合型が存在することとその割合が鎖長依存するという事実およびpH変化に対する酵素複合体の挙動に基づいて、MCADの基質認識、活性化メカニズムに対する新規モデルを提唱した(Tamaokietal.,1999)。
アクリジン色素とストロボ光を用いた骨・軟部肉腫の同時・瞬間的診断治療戦略の開発

アクリジンオレンジ(AO)という色素はがんに特異的に集積して光が当たると蛍光を発生すると同時にがん細胞だけを瞬時に選択的に破壊します。これを利用して骨軟部腫瘍の蛍光による早期診断と治療を同時に行う方法の開発を行いました。その結果キセノン光源の青色ストロボ光を用いると皮膚に近い肉腫であれば蛍光で局在を診断でき、全光照射で強い腫瘍増殖抑制効果も得られることが分かり、この方法が肉腫の診断治療に応用できる可能性が示されました。今回平成19年度の研究計画に沿って,以下の実験を行い,その結果を報告する。検討項目:1)アクリジンオレンジ(以下AO)の静脈投与により骨軟部肉腫から発せられる蛍光の撮像について2)AOの急性毒性試験および50%致死量の検討3)骨軟部肉腫に対するAOを用いたストロボ光による光線力学的療法結果:1)マウス骨肉腫高肺転移細胞株を移植したヌードマウスにAOを0.1-5mg/kgの濃度で静脈投与を行い,それぞれの蛍光を,吸収フィルター(>520nm)を装着した高感度デジタルカメラにて撮影し,画像を解析した。その結果,アクリジン濃度は1.0mg/kgの投与でもっとも正常組織とのコントラストが明瞭であることが判明した。また,静脈投与の場合,蛍光強度は投与後30分が最高であったが,正常細胞も蛍光が強く,投与後2時間でもっとも最適なコントラストを得ることができた。2)AOの急性毒性試験および50%致死量の検討を現在三菱化学安全科学研究所にて現在行っている。予備試験ではマウスに対して18mg/kgのAOの静脈投与では変化なく,27mg/kgの投与にて6匹中が1匹死亡,40mg/kgの投与にて全例死亡が確認されている。LD50を30mg/kg前後と考え,現在本試験を行っており,平成20年3月に結果が出る予定である。3)骨軟部肉腫に対するAOを用いたストロボ光による光線力学的療法の効果を検討するため,LM8細胞を使用し従来の連続光における殺細胞効果とめ比較実験を行った。その結果,同じ光エネルギー量では持続光に比べて,ストロボ光の方がより強い殺細胞効果を認め,また同じ光照射時間でもストロボ光の方が強い殺細胞効果を認めた。このことより,ストロボ光による光線力学的療法の方が,持続光に比べ,より短い照射時間で強い殺細胞効果を認めることが判明した。平成19年度はアクリジンオレンジ(以下AO)をマウスに静脈内投与し、高解像デジタルカメラを用いてマウス骨肉腫の光線力学的診断(PDD)が可能であることを証明した。また強力なキセノンストロボ光源を用いたフラッシュ光線照射がマウス骨肉腫細胞に対し従来の持続光照射による光線力学的治療法(PDT)よりも強い殺腫瘍効果があることも明らかにした。さらにはAOの1.0mg/kgの静脈内投与はきわめて安全でPDDにもPDTにも有用であることが判明した。今年度はさらに研究をステップアップし、in vivoにおけるストロボ光照射の効果を検討した。その結果、in vivoでもストロボ光を用いたPDTは持続光よりも強い腫瘍増殖抑制効果があることが判明した。またその作用は遺伝子および免疫組織学的検索によりP21を介したアポトーシスによって引き起こされることが証明された。この結果から本手法は人悪性骨軟部腫瘍症例に対しても有用であると期待される。しかし、人体への静脈内投与にはさらなる臨床試験が必要であり現在製薬会社などとの提携について検討中である。局所投与によるストロボ光の照射は可能であり現在倫理委員会への申請を行なっている。肉腫以外の癌腫についても本治療法を応用するためにまずin vitroの系での実験を行い肺がん、乳がん、前立腺がんなどに対する強い殺細胞効果が確認できている。今後はさらに対象癌腫を拡大する予定である。以上の研究成果については下記の論文で公表した。本年度は3年間の研究の最終年度である。今年度はストロボ光とAOの静脈内投与による光線力学的診断と治療が同時に可能であることを最終的に検討した。マウス骨肉腫の実験モデルを用いてAOの静脈内投与後キセノンストロボ光源を用いた青色励起光のフラッシュ照射で高解像デジタルカメラによるPDDを行い、その後にキセノン全光フラッシュ照射を続けてPDTを行なった。その結果」AO濃度は0.1-1μg/mlで60-120分後にPDDを行った後にPDTを行うことにより効率よく腫瘍の局在診断と腫瘍増殖抑制効果が得られることが分かった。しかし、キセノンのフラッシュ光でも肺転移の体外からのPDDは困難であることも判明した。四肢の骨転移についてはマウスではPDDとPDTは同時に可能であった。この結果からは本手法を人体に応用する場合は皮下ないし筋肉内に発生した腫瘍もしくは手足の骨腫瘍等への応用の可能性が示された。

また、AO-PDTを行ったマウスでは肺転移がコントロール群に比較して有意に抑制されることが判明し、その原因としてフラッシュ光が肺転移巣に到達してPDTの効果が得られていることが推察された。最近の治験ではAO-PDTで腫瘍細胞内のライソゾームが不活性化されて細胞外基質の破壊が障害されることによって腫瘍細胞の浸潤・転移が抑制されていることが分かってきた。AOの静脈内投与によるマウスの体内での代謝は主に肝細胞で行われきわめて迅速に尿中および胆汁中に排泄されることが判明し、正常細胞内での蓄積はほとんどないことも分かった。肉腫以外では肺がん、前立腺がん、胃がん、乳がんなどの培養細胞に対してもAO-PDTは強い殺細胞効果を有することが分かり、各種の転移性骨腫瘍への応用も期待できることが分かった。
In situ PCR法の開発とその組織化学染色法の確立

本研究の基本的な目的は、組織切片においてmRNAに特異的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)を行い、高い特異性と感受性を持つmRNA検出法を開発することである。まず、本研究初段階で、切片上の逆転写の至適条件を決定できたので、この技術を用いて切片内に含まれるcRNA(ビオチンなし)をその後のPCR法の鋳型として作成することに着手した。この技術の確立のためには、このcRNAを最も効果的に増殖し可視化するためのPCR至適条件を決定することである。具体的には、1)適正なPCR法の条件決定、2)効果的なビオチン化の条件PCR(標識をPCR伸長反応過程に導入または標識プライマーを使用)、3)標識産物の可視化の最適条件決定(免疫組織化学的手法の応用)、4)画像解析装置を用いた定量解析(マックアスペクト使用)、などである。このうち、1)に関してはほぼ満足のいく条件が決定できたが、通常の試験管内におけるPCR条件とはいくつかの点で異なっており、その理論的根拠を現在なお探索中である。次に2)のビオチン化の条件に関しては標識プライマーを用いるよりは標識をPCR伸長反応過程に導入する方が効率および安定性の面で勝っていることが明かとなった。ただし、過剰量のビオチンを導入した場合、PCR法におけるハイブリダイゼーションの効率が低下することも判明したので、感受性を向上するための導入比率を厳格に規定することが重要である。3)の可視化条件に関しては、研究の進展がみられ、浮遊切片を用いる独自のin situハイブリダイゼーション組織化学の確立ができると自身を持つことができた。4)の目標も基礎的な問題は解決し、単に染色部分の、面積を測定することばかりでなく、染色の濃淡をも定量解析できる方法の開発に取り組んでいる。以上、本研究の目的はある程度達成されたと言えるが、技術的に習熟すべき点が残されており、一般的な実用化にはいま少し時間がかかる。この最終段階の問題点を解決できれば、論文として発表可能と期待できる。生体の組織切片においてmRNAに特異的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を行い、高い特異性と感受性を有するmRNA染色法を開発し、さらに画像解析技術を適用して定量的測定を可能にするシステムを確立するのが本研究の目的である。具体的には、1)組織切片上でmRNAからの逆転写によるcDNA生成法の開発、2)各種の(ポリ)ペプチドをコードする特異的mRNAの鋳型作製4)可視化された産物の形態学的定量、の4点が3年間の計画で達成すべき技術である。本年度の研究目的は、組織切片上における逆転写酵素反応の最適条件を確立することにあり、1)逆転写酵素反応を至適条件で行うための最良の組織固定法の確立。2)RNA変性の防止法3)アンーリングおよび転写反応の温度設定と時間4)適正な5'プライマーの決定、について実験研究を遂行した。この段階まではPCR法を使わなくともコピー数の多いmRNAの代表としてバゾプレッシンを選べば判定が可能であった。その結果、従来の報告では全く顧みられることのなかったオスミウム酸による組織固定が上記の1)と2)を同時に満足する可能性があることが見出された。この発見をもとに実験を重ねているが、オスミウム酸固定の理論的詳細が不明なため、考えられる種々の還元剤を組み合わせを検討中である。

いずれにせよ、組織内細胞膜の脂質や蛋白質の固定とはかなり異なった化学反応が核酸分子との間に生じているものと想定され、その解析が重要であると考えられた。この組織固定法を用いた場合でも、3)および4)の条件は従来の方法でのそれが適用でき、染色標本を新しく作製したコンピュータプログラムによる画像解析が可能であった。本研究の基本的な目的は、組織切片においてmRNAに特異的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)を行い、高い特異性と感受性をもつmRNA検出法を開発することである。既に、前年度において、切片状の逆転写の至適条件を決定できたので、この技術を用いて切片内に含まれるcRNA(ビオチンなし)をその後のPCR法の鋳型として作成することに着手した。この技術の確立のためには、このcRNAを最も効率的に増幅し可視化するためのPCR至適条件を決定することである。具体的には、1)適正なPCR法の条件決定、2)効率的なビオチン化の条件(標識をPCR伸長反応過程に導入または標識プライマーを使用)、3)標識産物の可視化の最適条件決定(免疫組織化学的手法の応用)、4)画像解析装置を用いた定量解析(マックアスペクト使用)、などである。このうち、1)に関してはほぼ満足のいく条件が決定できたが、通常の試験管内におけるPCR条件とはいくつかの点で異なっており、その理論的根拠を現在なお探索中である。次に2)のビオチン化の条件に関しては標識プライマーを用いるよりは標識をPCR伸長反応過程に導入にする法が効率および安定性の面で勝っていることが明らかとなった。ただし、過剰量のビオチンを導入した場合、PCR法におけるハイブリダイゼーションの効率が低下することも判明したので、感受性を向上するための導入比率を厳格に規定することが重要である。3)の可視化条件に関しては、研究の進展がみられ、浮遊切片を用いる独自のin situハイブリダイゼーション組織化学の確立ができると自信を持つことができた。4)の目標も基礎的な問題は解決し、単に染色部分の面積を測定することばかりでなく、染色の濃淡をも定量解析できる方法の開発に取り組んでいる。本研究の基本的な目的は、組織切片においてmRNAに特異的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)を行い、高い特異性と感受性を持つmRNA検出法を開発することである。まず、本研究初段階で、切片上の逆転写の至適条件を決定できたので、この技術を用いて切片内に含まれるcRNA(ビオチンなし)をその後のPCR法の鋳型として作成することに着手した。この技術の確立のためには、このcRNAを最も効果的に増殖し可視化するためのPCR至適条件を決定することである。具体的には、1)適正なPCR法の条件決定、2)効果的なビオチン化の条件PCR(標識をPCR伸長反応過程に導入または標識プライマーを使用)、3)標識産物の可視化の最適条件決定(免疫組織化学的手法の応用)、4)画像解析装置を用いた定量解析(マックアスペクト使用)、などである。次に2)のビオチン化の条件に関しては標識プライマーを用いるよりは標識をPCR伸長反応過程に導入する方が効率および安定性の面で勝っていることが明らかとなった。
大気成分である硫化カルボニルの微生物分解とその分解酵素の土壌細菌における分布

硫化カルボニル(COS)の対流圏濃度は500pptv前後であり、硫黄化合物の中では大気中で最も豊富に存在する化合物である。COSは成層圏硫酸エアロゾルの主要な原因物質のひとつであり、地球環境に与える影響が予想されることからその動態の解明が急務となっているが、自然界の物質循環の基礎となる土壌微生物による分解についての研究はきわめてわずかである。本研究は土壌微生物の働きによるCOS分解を比較することで、大気微量成分であるCOSの消長における微生物の役割を明らかにすることを目的とする。気体状硫黄化合物であるCOSの分解菌密度を計数する方法を考案し、それを用いて富士山、唐沢山、三宅島をはじめ複数の土性の異なる土壌のCOS分解菌を調べた。その結果、特に土壌有機物含量の高い土壌では分解菌密度も高く、また遺伝情報を用いた方法でその種類を調べたところ、きわめて多種類の菌によって構成されていることが明らかとなり、土壌微生物が大気COSの吸収源として機能していることが示された。分離された菌株を用いてCOS分解をみたところ、ppmvオーダーを分解する菌株に比べ大気濃度である数百pptv前後のCOSを分解する細菌はその種類が限られ、しかもその多くが土壌環境に広く生息することが知られる放線菌のグループに属するものであることが明らかとなり、大気COSの消失に直接機能する微生物であることが示唆された。これらの細菌株の中からMycobacterium sp. THI401株を選び、その分解酵素をすでに精製が成功しているThiobacillus Thioparus THI115のCOS分解酵素と比較するために、分離を試みたところ粗抽出液に比べ約17倍まで活性が高められた。T. thioparus THI115のCOS分解酵素遺伝子のクローニングを行い、大腸菌細胞における大量発現とそこからの酵素精製に成功した。[1]COS分解細菌の分離三宅島、富士山、本学演習林をはじめ、各地の土壌から細菌を分離し、COS分解活性の有無について試験管培養を用いた簡便法によって調べた。その結果、分離された菌株数に対して75-90%という高い頻度の菌株において、30ppmCOSを分解する活性が保持されていることが確認され、一般に土壌にはCOS分解細菌が広く分布していることが明らかとなった。これらの菌株の数種類について、地表と大気間の微量ガスの移動を考察する場合に重要となる大気レベルの濃度のCOSに対しても分解活性が見られるかどうかについて調査を行なったところ、THI410株を含む複数の菌株で低濃度COSに対しても分解活性を示すことが確認された。Thiobacillus thioparus THIl15のCOSaseの遺伝子解析の結果をもとに、上記菌株の中から特に高いCOS分解活性を保持する菌株を選びサザンブロティングを行なったところ、いずれにおいてもCOSaseと相同性のある遺伝子が保持されていることが確認された。また、同様にCOSaseに対するポリクローナル抗体を用いて調べたところ、THI401株ではT.thioparus THI115と共通抗原性のあるタンパク質が含まれているが明らかとなった。ppmレベルならびに大気レベルの両方の濃度のCOSに対して分解活性を示すTHI401株の細胞を用いて、COS分解酵素を精製するための条件検討を行なった。Carbonic anhydraseなどの酵素には、基質類似化合物としてCOSに対しても触媒活性を示すことが知られている。しかし、これらの酵素にはエネルギー代謝とリンクした反応は知られていない。T.thioparus THI115はCOSをエネルギー源として利用することから、既知の酵素との関連性について主にKm、阻害剤の影響など、酵素化学的な性質を中心に解析を行なった。

[3]COS分解細菌の検出とその分布気体を利用する細菌を、それを利用することに伴う生育を基にMPN値を求めることは困難である。そこで、従属栄養培地を用いて培養した細胞によるMPN法を工夫することで、いろいろな土壌におけるCOS分解微生物の計数を可能とした。硫化カルボニル(COS)の対流圏濃度は500pptv前後であり、硫黄化合物の中では大気中で最も豊富に存在する化合物である。COSは成層圏硫酸エアロゾルの主要な原因物質のひとつであり、地球環境に与える影響が予想されることからその動態の解明が急務となっているが、自然界の物質循環の基礎となる土壌微生物による分解についての研究はきわめてわずかである。本研究は土壌微生物の働きによるCOS分解を比較することで、大気微量成分であるCOSの消長における微生物の役割を明らかにすることを目的とする。気体状硫黄化合物であるCOSの分解菌密度を計数する方法を考案し、それを用いて富士山、唐沢山、三宅島をはじめ複数の土性の異なる土壌のCOS分解菌を調べた。その結果、特に土壌有機物含量の高い土壌では分解菌密度も高く、また遺伝情報を用いた方法でその種類を調べたところ、きわめて多種類の菌によって構成されていることが明らかとなり、土壌微生物が大気COSの吸収源として機能していることが示された。分離された菌株を用いてCOS分解をみたところ、ppmvオーダーを分解する菌株に比べ大気濃度である数百pptv前後のCOSを分解する細菌はその種類が限られ、しかもその多くが土壌環境に広く生息することが知られる放線菌のグループに属するものであることが明らかとなり、大気COSの消失に直接機能する微生物であることが示唆された。これらの細菌株の中からMycobacterium sp.THI401株を選び、その分解酵素をすでに精製が成功しているThiobacillus thioparus THI115のCOS分解酵素と比較するために、分離を試みたところ粗抽出液に比べ約17倍まで活性が高められた。T.thioparus THI115のCOS分解酵素遺伝子のクローニングを行い、大腸菌細胞における大量発現とそこからの酵素精製に成功した。
動的因子を再現したラット圧迫性脊髄症モデルの開発

平成29年度後半平成30年にかけて新しいシート2枚挿入モデルの妥当性、および動的因子の再現による影響を検証するため、先行研究のシート1枚挿入モデルを対照群とし、それぞれをn=6として比較実験を計画、開始した。前回同様、行動学的評価および組織学的評価を行った。感覚機能評価としてvon Frey filamentsを用いた検討も追加した。最終的にSham群も含め3群18匹での検討となった。行動学的評価であるFLS score、BBB score平均値は、術後全期間で2枚シート群は1枚シート群より低値、すなわち重症であった。von-Freytestでは、2枚シート群はSham群に対して著明な痛覚閾値の上昇を認めた。2枚シート群のみの集計では、FLS scoreと疼痛閾値の負の相関が見られ、前肢機能が重症な個体ほど痛覚鈍麻が高度であった。組織評価では、前角神経細胞数、皮質脊髄路髄鞘面積のいずれも2枚シート群での減少がより高度であった。現在までの結果からは、シートを2枚挿入したラット圧迫性脊髄症モデルは、シート1枚挿入モデルと比較し、より重度の脊髄症を認めた。モデルの設計と作成技術向上は進んでおり、現在妥当性の検証を進めている。平成31年度は引き続き組織学的評価を進める。神経系の免疫染色を用い、神経系細胞の残存や神経線維の残存につき評価を行う。余裕があれば、さらに、確立したモデルを用いた神経保護薬の投与実験や、脊髄症発症後に除圧術を行い神経機能回復を評価する実験を検討中である。本研究の第一の目的は、これまで臨床の病態を忠実に再現した理想的なモデルが無かった圧迫性脊髄症の動物モデルを確立することである。第一段階として今回考案した、物理的な脊髄圧迫に加え動的因子をも再現するラット脊髄症モデルの妥当性を探索、検証することに焦点を当てた。圧迫の程度、シートの厚さ、2つのシートの距離等の影響を検討し、最適なモデル作成の条件を確立することを目標とした。平成27年度はまず膨張シートの入手および新規のシートの探索を行った。シートは以前報告にあるものと、今回新規のものを1つ使用した。以前の報告にあるものは現在入手困難な状況であることがわかり、代用となる新規シートを探索し、候補となる物質(シート)を1つ入手した。シートの厚さの調整は専門の工業製品加工業者に委託した。挿入実験には8週齢雌性SDラットを用いた。動物実験はすべて大学院医学研究院動物実験委員会の許可のもと、動物実験ガイドラインを遵守して施行した。ラット頚椎の椎弓切除を行い頚椎圧迫モデルを作成した。またラット胸椎の椎弓切除による胸椎圧迫モデルも併せて作成した。頚椎、胸椎そろぞれのラットで数種類の厚さのものを挿入し、厚みの検討(先行実験)を行った。シートは水分に触れると膨張することを確認した。現在、膨張率や膨張するスピード、脊髄の圧迫の程度をラット硬膜外で確認する実験を進行中である。また、長期に行動評価を行ったラットでは、挿入操作による侵襲で一旦神経学的な悪化をみるも、その後ほぼ正常まで回復を示し、挿入後亜急性期慢性期に再度神経症状が悪化するパターン(慢性圧迫性脊髄症)が明らかとなった。応募当初の目標として「平成27年度は様々の大きさ、厚さのシートを、いくつかの脊髄高位に挿入し、その影響を行動学的、組織学的に観察する。」とした。現在、2種類の材質のシートで、種々の厚みを作成し行動学的な観察を進めている。今後シートの厚みを確立したところで本実験とし行動学的評価と併せ、組織学的評価も行い、平成28年度当初目標である「ラット圧迫性脊髄症モデルの確立」を達成したい。平成28年度は前年度に引き続き、最適な頚椎圧迫性モデル作成についての検証を行った。先行研究として最適なシートの厚さを検討した。本実験では膨張率2.0倍のシートと3.5倍のシート、それぞれ0.5mm厚と0.7mm厚のものを使用し、4群で比較検討を行った。行動学的評価では膨張率2.0倍のシートにおいて期待していた緩徐進行性の脊髄症を示した。0.5mm厚のものと0.7mm厚のものとでは、0.7mmのものがシート挿入から約3週で脊髄症を発症することが分かった。0.5mmのものはやや遅れて5ー6週で脊髄症を発症してくることがわかった。行動学的評価ののち、組織学的評価を行った。脊髄症モデル群では髄鞘染色にて皮質脊髄路の脱髄が観察された。圧迫性脊髄症動物モデルとして、脊髄への重錘落下モデルやクリップによる脊髄の一定時間の圧迫(虚血)モデルが報告されている(Lee, 2012)が、これは比較的急性発症の外傷モデル、すなわち急性脊髄損傷モデルの代用である。圧迫性脊髄症は急性脊髄損傷とは、脊髄への外力によるダメージという点では類似するが、病態としてはやはり異なる部分も多い。今回作成を試みている経時的に膨張するシート挿入による圧迫性脊髄症モデルは、緩徐進行性に圧迫が強くなることから、重錘落下モデルやクリップによる虚血モデルよりも臨床の病態には近い。圧迫性脊髄症の病態把握や、新規治療法の開発に関する研究を行うことができるため、その社会的意義は大きいと考える。平成27年度、28年度のモデルはシートを1枚挿入したモデルであった。

平成29年度はさらに臨床の病態に近い動的圧迫モデル(シートを椎間を中心にして脊髄の長軸方向に縦に2枚留置し、シートの間の部分における可動性による動的な脊髄圧迫を惹起するモデル)の作成を試みる。当初目標では平成28年度中に「動的因子を加味した新しいラット圧迫性脊髄症モデル」を確立するとしていたため、研究はやや遅れてはいるものの、動的モデルの先行として行った静的モデルについては順調に結果が得られており、計画は推進している。平成29年度は、先行研究として行ってきた、頚椎椎弓下に水吸収ゴムシートを1枚挿入したラット圧迫性頚髄症モデルの作成を確立した。前年度からの検証の結果、膨張率2.0倍、厚さ0.7mmのシートがモデルとして最も適切であった。行動学的評価にて緩徐進行性の脊髄症を示し、組織学的評価にて圧迫部位での脊髄前角細胞数減少および皮質脊髄路の脱髄が観察された。続いて、このシート1枚挿入モデルを基に、動的因子を加味した新しいラット圧迫性頚髄症モデルの作成、検証を開始した。使用するシートは、先行研究の結果を踏まえて膨張率2.0倍、厚さ0.7mmを引き続き採用した。実際の臨床に近い病態を再現するため、C4/5椎間を中心に、C4,C5椎弓下に1枚ずつシートを留置し、椎間板高位で接した頭尾側2枚のシート間に可動性が生じることを意図して作成した。臨床においては、頚椎症性変化に伴う局所の椎間可動性増大が脊髄症発症に影響すると考えられているが、本モデルにおいても、局所可動性を再現するため、C4/5椎間関節に切開を加えてC4/5椎間の可動性を増やした。この操作によって、副次的にC4椎弓とC5椎弓との距離が開大し、椎弓切除を行わなくてもC4/5椎間からのシート挿入が可能となった。さらに最大圧迫高位で最も動的影響が大きくなるように挿入するシートの形状を工夫し、C4/5椎間板高位が最大圧迫部位となる嘴状のシート設置(最大厚は0.7mm)とした。新しいシート2枚挿入モデルの妥当性、および動的因子の再現による影響を検証するため、先行研究のシート1枚挿入モデルを対照群とし、それぞれをn=6として比較実験を計画、開始した。前回同様、行動学的評価および組織学的評価を行う。感覚機能評価としてvon Frey filamentsを用いた検討も追加する。先行研究である1枚シート挿入による静的圧迫モデルの確立は完了したが、主眼となる「動的因子を再現した」新しいラット圧迫性頚髄症モデルの確立にやや時間を要している。モデルの設計と作成技術向上は進んでおり、現在妥当性の検証を進めている。平成29年度後半平成30年にかけて新しいシート2枚挿入モデルの妥当性、および動的因子の再現による影響を検証するため、先行研究のシート1枚挿入モデルを対照群とし、それぞれをn=6として比較実験を計画、開始した。前回同様、行動学的評価および組織学的評価を行った。感覚機能評価としてvon Frey filamentsを用いた検討も追加した。最終的にSham群も含め3群18匹での検討となった。行動学的評価であるFLS score、BBB score平均値は、術後全期間で2枚シート群は1枚シート群より低値、すなわち重症であった。von-Freytestでは、2枚シート群はSham群に対して著明な痛覚閾値の上昇を認めた。2枚シート群のみの集計では、FLS scoreと疼痛閾値の負の相関が見られ、前肢機能が重症な個体ほど痛覚鈍麻が高度であった。
古代宮都・宮衛遺跡における上水・下水施設の研究

まず、上水施設の起源について研究を進展させた。その成果としては、各地の木樋資料を集成し,少なくとも畿内では纏向遺跡の千世紀前半をさらに遡って、すでに弥生後期にその利用が始まっていることを明らかにしたことがある。その木樋は一木の刳り抜き式で,古墳時代以降の組合せ式とは構造を異にし,その発展の方向を予想することが出来た。また,弥生時代の事例は水田への用水の給水用として利用したものであり、古墳時代における水道施設としての利用の背景に,弥生時代以来の水利用の経験の蓄積があったことを知ることが出来た。飛鳥地域の水道施設については,従来の知見を収集・分析し,また今年度の石神遺跡の発掘成果を調査した。その結果,飛鳥における石組暗渠,土管,木樋暗渠等を用いる水道施設は7世紀前半に,飛鳥のいくつかの施設で個々別々に始まっていることを明らかにした。そして斉明天皇の時代に飛鳥の都づくりが大規模・本格化するとともに広範囲にわたる組織的な上水道網が整備されるに至り,この時代が水利用の上でも一つの画期であることを明らかにした。藤原宮,平城宮,平安宮等においてはその立地が飛鳥ほど高燥でないことと関連して,飛鳥のように大規模な水道施設を整えることなく、むしろ中心は井戸利用であったことを明らかにした。都市において水道施設を本格的に整えるのは江戸においてである。竹樋水道管の利用例について小田原城ほか各地の城下町発見例について集成し,それが広く普及していた様相を明らかにした。中国の関連資料についても集成し,木樋,竹樋,土管の通水管利用は古代日本を基本的に共通することを明らかにした。樋内の通水を塞き止める技術,サイフォン利用の技術,揚水技術などの日本への影響についても考察,検討を進めた。排水路,運河に関す研究成果について,その一部を「明日香風」39・40で簡単に公にした。上水用の導水施設としては石組溝・石組暗渠・木樋・瓦製土管が古代から公的施設で用いられていることが判明した。一部で銅管も利用された。木樋は古墳時代に始まる。奈良県纏向遺跡(4世紀前半)には木樋暗渠,開渠による通水管と木製水槽による浄水施設が,群馬県三ツ寺居館遺跡(6世紀前半)には木樋による水道管と水道橋とがある。初期大和政権所在地や大豪族の居住地では小規模ながら規格性のある水道施設が存在したことになる。これら技術の起源・系譜,飛鳥時代以降の水道施設との関連等の解明が今後の課題となる。飛鳥の都では石組溝を甚幹水路として,これに木樋暗渠,瓦製土管暗渠の通水管を結んで広範囲に導水した上水道綱が整備されていたことが判明した。これらは飛鳥の各地にあるが、飛鳥寺の南方からその西北の水落・石神遺跡周辺では南北500m以上にわたる大規模、かつ規格性の高いものである。水時計施設・噴水石(石人像・須弥山石)もそれと一貫した施設であることが判明。揚水機としては水車が用いられたらしい。これらは斉明天皇の時代に属し,この時代に飛鳥の都づくりが本格化したことと関連し,水道施設の整備もその重要な要素であったことが判明した。中国古代の水道利用の実態の解明も進めているが,飛鳥の都における通水管の技術・揚水技術・噴水装置などは中国系の技術が導入されたものであり,飛鳥時代は水利工学的科学技術の上でも大きな画期であったことも判明した。しかし,藤原宮以降の都城大宰府・多賀城等では,むしろ井戸利用が目立つ。さらに実態の解明を進め,それぞれの宮都・官街遺跡の特殊性を明らかにしていくことも今後と課題となる。小田原城三の丸遺跡において発掘を実施し、木桶による浄水施設と竹管による通水管を用いた水道施設を発見した。その技術は古代と大きく異なるところがない。今後は中・近世の水道施設についても検討を進め,古代技術との関連の解明を進めたい。

竹樋水道管の利用例について小田原城ほか各地の城下町発見例について集成し,それが広く普及していた様相を明らかにした。中国の関連資料についても集成し,木樋,竹樋,土管の通水管利用は古代日本を基本的に共通することを明らかにした。樋内の通水を塞き止める技術,サイフォン利用の技術,揚水技術などの日本への影響についても考察,検討を進めた。排水路,運河に関す研究成果について,その一部を「明日香風」39・40で簡単に公にした。
極端な幼形成熟を行うシラスウオ科魚類の多様性と進化

平成17年度に引き続き琉球列島各地および小笠原諸島で採集したシラスウオ科魚類について形態学的な比較とミトコンドリアの16S rRNA領域の塩基配列を基にした分類学的な検討を行い、この結果を2006年10月に静岡で開催された日本魚類学会年会において以下の研究発表を行った。昆健志・西田睦・吉野哲夫.幼形進化的シラスウオ属魚類の隠蔽種をいかに命名・記載すべきか?日本魚類学会2006年度年会,東海大学,静岡.2006年10月8-9日.この発表では日本近海に分布する21種の本科魚類の分類について報告した.いずれの種もハワイ産やオーストラリア産の全ての既知種(3種)とは異なる未記載種であること、琉球列島と小笠原諸島との間では遺伝的に共通する種が極めて少ないなどの点が明確になった。これらの未記載種各種は形態学的な形質だけでは判別が困難であり,新種記載に際してはミトコンドリアDNAの塩基配列情報を分類形質として取り扱う必要があるとの提言を行った.発表に対して得られた意見を基に実用的な記載論文を現在作成中である。またシラスウオ科魚類(スズキ目)とは別の目に分類されると考えられるが,同様の海産幼形成熟魚の1種が平成18年初頭にフィリピンのボホール島沿岸のサンゴ礁域から採集された.本種は眼後部側面に内耳胞(prootic bulla)と頭部側線管の合流部が接するrecessus lateralisを持つことなどからニシン目ニシン亜目に属する魚類であると判断された.本種はこれまでの形態比較およびDNA解析の結果から,科・属・種いずれも未記載のものと考えられ,今回初めて発見されたものである.本種の発見はシラスウオ科魚類とともに熱帯沿岸域での幼形成熟魚の多様性を示す顕著な例と判断される.この結果についても2006年度日本魚類学会年会で以下の発表を行った。吉野哲夫・川口亮・石森博雄・J.Apurado.ニシン目と推定される特異な形態の幼形成熟魚.日本魚類学会2006年度年会,東海大学,静岡.2006年10月8日.平成17年度に引き続き琉球列島各地および小笠原諸島で採集したシラスウオ科魚類について形態学的な比較とミトコンドリアの16S rRNA領域の塩基配列を基にした分類学的な検討を行い、この結果を2006年10月に静岡で開催された日本魚類学会年会において以下の研究発表を行った。吉野哲夫・川口亮・石森博雄・J.Apurado.ニシン目と推定される特異な形態の幼形成熟魚.日本魚類学会2006年度年会,東海大学,静岡.2006年10月8日.琉球列島や小笠原諸島に分布するハゼ亜目シラスウオ科魚類について、新しく購入した実体顕微鏡を使用して詳細な形態的学比較を行った。筋節数や鰭条数などの計数形質に加えて雄の泌尿生殖突起の形態は重要な形質であり、形態レベルでは14種以上の種判別が可能となった。並行してmtDNAの12S rRNA域の塩基配列の一部を予備的に比較した所、分子レベルでは約20種の存在が確認され、本科魚類の隠れた多様性が一層明確になって来た。この結果の一部は2005年5月に台北で開催される国際シンポジュウムであるインド-太平洋魚類会議で報告を行う予定である。2004年7月にヨーロッパの博物館を訪問し、所蔵されている本科魚類の模式標本(シンタイプ)の再検討を行った。とりわけオーストリアのウィーン国立自然史博物館には2種類のシンタイプがそれぞれ600個体以上と約60個体残されていた。その結果、大部分が雌個体から構成されており、雄個体が極めて少なかったこと、両種のシンタイプにはそれぞれ複数の種が含まれていることなどが明らかになった。

今後の分類学的な混乱を避けるためにそれぞれの種に対してレクトタイプの指定を行う必要がある。この結果についても2005年5月に台北で開催される国際シンポジュウムであるインド-太平洋魚類会議で報告を行う予定である。なおシンタイプの個体数が極めて多いことから未観察の標本が一部残されている。そのために2005年度に短期間の再訪問を行う予定である。また両種のシンタイプはともにハワイ島産であり、琉球列島や小笠原諸島で採集されている本科魚類とは共通種が存在しない点も明確になり、各種の分布がかなり狭いことが想定される。平成16年度に引き続き琉球列島各地および小笠原諸島で採集したシラスウオ科魚類について形態学的な比較とミトコンドリアの16S rRNAおよびコントロール領域の塩基配列を基にした分子系統学的な比較を行い、この結果を2005年5月に台北で開催された第7回Indo-Pacific Fish Conferenceにおいて以下の2題の研究発表を行った。この発表では日本近海には21種以上の本科魚類がが分布しており、いずれもハワイ産の既知種とは異なる未記載種であること、琉球列島と小笠原諸島との間では遺伝的に共通するものが極めて少ないなどの点が明確になった。また台湾やフィリピンにおいても各1回採集を試みたが、標本を得ることはできなかった。なお、ハワイ産の標本が少数得られたので遺伝子の解析を行う予定である。またシラスウオ科魚類9種の核ゲノムサイズをフローサイトメトリー法で測定した結果、種間で3倍以上におよぶ変異が認められた。そのうち最小のものは0.38(C値)で、これまで最小と考えられてきたトラフグとほぼ同じであり、本科魚類は体サイズだけでなく、一部に種ではそのゲノムサイズも脊椎動物で最小クラスであることが明らかになった。この結果については2005年度日本魚類学会年会で以下の発表を行った。昆健志・宣野哲夫・西田睦.極端な幼形成熟魚シラスウオの小さなゲノムサイズ.日本魚類学会2005年度年会,東北大学,仙台.2005年9月23-24日.平成17年度に引き続き琉球列島各地および小笠原諸島で採集したシラスウオ科魚類について形態学的な比較とミトコンドリアの16S rRNA領域の塩基配列を基にした分類学的な検討を行い、この結果を2006年10月に静岡で開催された日本魚類学会年会において以下の研究発表を行った。昆健志・西田睦・吉野哲夫.幼形進化的シラスウオ属魚類の隠蔽種をいかに命名・記載すべきか?日本魚類学会2006年度年会,東海大学,静岡.2006年10月8-9日.この発表では日本近海に分布する21種の本科魚類の分類について報告した.いずれの種もハワイ産やオーストラリア産の全ての既知種(3種)とは異なる未記載種であること、琉球列島と小笠原諸島との間では遺伝的に共通する種が極めて少ないなどの点が明確になった。これらの未記載種各種は形態学的な形質だけでは判別が困難であり,新種記載に際してはミトコンドリアDNAの塩基配列情報を分類形質として取り扱う必要があるとの提言を行った.発表に対して得られた意見を基に実用的な記載論文を現在作成中である。