hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
潰瘍性大腸炎患者に対する大腸内視鏡におけるリアルタイム自動診断

平成29年度は、超拡大内視鏡endoytoscopyを用いた、コンピュータ自動診断システムの開発を主に行った。プログラムの作成は18000枚以上の内視鏡画像と対応平成30年度内に超拡大内視鏡endoytoscopy画像40000万枚以上を学習画像としたモデルへと更新し、診断能検証においては、組織学的炎症/寛解の鑑別では感度82%,特異度92%,正診率90%、であった。プログラムの作成は18000枚以上の内視鏡画像と対応する病理情報をサンプルとして、作成した。完成したシステムは実際の内視鏡と診断コンピューターが完全に同期して接続されているシステムであり、内視鏡検査中のリアルタイム補助診断(診断所要時間0.2秒)を可能とするものである。なお、プログラム作成直後に行った、予備的診断能検証においては、組織学的炎症/寛解の鑑別では感度74%,特異度97%,正診率91%、であった。現在その結果を英文論文とし投稿中である。その後プログラムの修正および学習画像の集積をし更に高精度診断が可能となっている。現在、昭和大学横浜市北部病院の倫理委員会承認の下、本システムの診断精度を臨床試用中である。臨床応用にむけて、問題点の洗い出しを行っている。本研究では先行研究では成し得なかった、感度95%以上を実現すべく人工知能(AI)を利用することに着想し研究を開始した。平成30年度は、更なる学習画像の集積とプログラムの修正により更なる診断精度、特に感度の向上を目指す。研究計画において、平成27年度目標としていたコンピュータ自動診断システムの開発が予定どおり終了し、システムの検証目的の評価試験を平成28年1月から始めることができた。学習画像は4月末日で23000枚の集積をしている。6月中には学習画像30000枚の集積が達成が予想され、7月を目途に前向き試験を開始予定とし、現在はその試験プロトコールの作成を行っている。次年度(研究最終年度)については、自動診断システムの精度検証の研究結果の英文誌アクセプトを目指すとともに、国内外の学会にて本研究についての学術発表を行う予定である。診断精度向上のため、人工知能を機械学習させるための内視鏡画像の更なる集積および、プログラムの修正を行う。また、7月からは臨床応用に向けて問題点の洗い出しを目的とし、単施設の前向き試験を開始する予定である。次年度使用額が生じた理由としては、先行研究で使用していたアルゴリズムで期待していたよりも良い成績がでたため、新たにプログラムを作り直す費用がかからなかったこと、また、海外学会の参加旅費など一部の研究費の精算が終了していないためである。次年度は自動診断システムのプログラム修正のため、頻回の機械学習が必要であること、また、学習画像枚数が増えてきたため、現在のコンピューターでは対応できなくなったため、高性能のコンピューターの購入が必要である。更に、修正内容によっては外注が必要でありその謝金が必要となる。また研究成果の海外学会への参加や論文の英文校正やオープンアクセスに使用する予定である。
アセスメントの結果を発達障害リスク児の保護者にフィードバックする方法に関する研究

本研究の目的は、研究代表者らが開発した「延岡式得手不得手チェックシート」によるアセスメントの結果を発達障害リスク児の保護者にフィードバックするための保護者用フィードバックシートを考案し、保護者支援に資するツールとして、iPad版「延岡式得手不得手チェックシート」保護者用を開発することである。1保育者、及び保護者を対象とした「延岡式得手不得手チェックシート」によるアセスメントの実施;宮崎県、徳島県、和歌山県の保育所4カ所、幼稚園1カ所の5歳児クラスの保育者、及び保護者を対象に「延岡式得手不得手チェックシート」を実施した。2開発済みの保育者用フィードバックシートに関する保育者へのアンケート調査;「延岡式得手不得手チェックシート」の結果について、開発済みの保育者用フィードバックシートを用いて保育者にフィードバックを行い、図(レーダーチャート)、用語を理解できたかについて4件法(14)で無記名のアンケート調査を行った。保育者13名より回答が得られた。図については3.3、用語については3.03.3で「わかりやすい」が多かった。用語のうち「向社会性」が3.0と最も低い結果であった。3保護者用フィードバックシートの作成と保護者へのアンケート調査;2の結果をふまえて、平易なことばを用いた保護者用フィードバックシートを新たに作成した。作成した保護者用フィードバックシートを用いて保護者に文書によるフィードバックを行い、図、用語を理解できたかについて4件法で無記名のアンケート調査を行った。保護者138名より回答が得られた。図については2.7、用語については2.83.07で保育者より低い結果であった。用語のうち「振る舞い」が2.8と最も低い結果であった。4iPad版「延岡式得手不得手チェックシート」保護者用の開発;iPad版「延岡式得手不得手チェックシート」保護者用(試作版)を開発した。実施計画では、iPad版「延岡式得手不得手チェックシート」保護者用の開発は平成3132年度に行う予定であったが、開発に時間がかかることが予想されたため、試作版を平成30年度内に開発した。その作業が入ったため、平成30年度に予定されていた要支援児の保育者と保護者のペアマッチング、及び保育者から保護者への口頭によるフィードバックは、平成31年度に実施することとした。全体としては、おおむね順調に進展している。1保護者へのアンケート調査結果の分析;平成30年度に実施した保護者用フィードバックシートに関するアンケート調査結果のうち、自由記述について分析を行う。2要支援児の保育者と保護者のペアマッチング、及び保育者から保護者への口頭によるフィードバック;総合支援得点19点以上の要支援児について、保育者と保護者のペアマッチングを行い一致度を検討する。また、保育者用フィードバックシートと保護者用フィードバックシートの2種類を用いて、保育者が保護者に口頭でフィードバックを行い、どちらが説明しやすいかについて保育者を対象にアンケート調査を行う。3iPad版「延岡式得手不得手チェックシート」保護者用(試作版)の機能拡張;宮崎県の保育所2カ所で、保護者の了解の得られた要支援児を対象に保育巡回相談を実施し、平成30年度に開発したiPad版「延岡式得手不得手チェックシート」保護者用(試作版)の検証を行うとともに、不具合について修正するなど改良や機能拡張を行う。

その作業が入ったため、平成30年度に予定されていた要支援児の保育者と保護者のペアマッチング、及び保育者から保護者への口頭によるフィードバックは、平成31年度に実施することとした。全体としては、おおむね順調に進展している。1保護者へのアンケート調査結果の分析;平成30年度に実施した保護者用フィードバックシートに関するアンケート調査結果のうち、自由記述について分析を行う。2要支援児の保育者と保護者のペアマッチング、及び保育者から保護者への口頭によるフィードバック;総合支援得点19点以上の要支援児について、保育者と保護者のペアマッチングを行い一致度を検討する。また、保育者用フィードバックシートと保護者用フィードバックシートの2種類を用いて、保育者が保護者に口頭でフィードバックを行い、どちらが説明しやすいかについて保育者を対象にアンケート調査を行う。3iPad版「延岡式得手不得手チェックシート」保護者用(試作版)の機能拡張;宮崎県の保育所2カ所で、保護者の了解の得られた要支援児を対象に保育巡回相談を実施し、平成30年度に開発したiPad版「延岡式得手不得手チェックシート」保護者用(試作版)の検証を行うとともに、不具合について修正するなど改良や機能拡張を行う。平成30年度に作成した、iPad版「延岡式得手不得手チェックシート」保護者用(試作版)の検証を行うとともに、不具合について修正するなど改良や機能拡張を行うための費用として必要である。
自己骨髄細胞と肝幹細胞増殖因子による肝再生療法の基礎研究

肝不全に対する細胞療法を発展させるため、骨髄細胞で発現する肝幹細胞増殖因子を同定して、それらの肝再生に対する役割を見いだすことを目的に研究を行った。肝前駆細胞の分化や増殖を促進させる増殖因子として、ラット骨髄細胞と肝前駆細胞の共培養によりFGF2とEpireglinが明らかとなった。Epireglinは、EpCAM陽性肝前駆細胞の肝細胞方向性への分化誘導ならびに肝前駆細胞の増殖能の増加に関与し、C57BL/6マウスに0.1%3,5-dietoxy-1,4-dihydrocollidine(DDC)を含む飼料を与えて作成した肝障害モデルでは、肝前駆細胞で構成された偽胆管周囲の間葉系細胞を含むstem-cell nicheで発現し、肝障害の進行程度に応じて遺伝子発現量ならびに蛋白発現量が増加した。Epireglinは、肝前駆細胞の肝細胞への分化誘導ならびに肝前駆細胞の増殖に関与していることが示された。また、臨床例において、急性肝不全、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、健常者の各々の血清を用いて、血清Epireglin値をELISA法で測定した。血清Epireglinは、肝前駆細胞の出現が肝障害の回復に寄与するとされる劇症肝炎の急性肝不全例において、他の群に比較し有意な上昇を示した。本因子の肝前駆細胞刺激因子としての重要性が確認され、骨髄細胞が重症肝障害において肝組織の修復に重要な役割の一端を担うことが示された。更に、骨髄細胞などの多臓器分化細胞が及ぼす肝再生効果を他のモデルで検討するため、新規の大型動物モデルとして、ミニブタ、ゲッティンゲン種(月齢12ヶ月以内)を用いて、四塩化炭素を12週間腹腔内投与し肝障害モデルを作成した。ブタ肝組織には線維化が確認され、多臓器分化細胞などを用いた肝再生における肝組織修復効果を検討可能な大型肝障害モデルとなり得ることが示された。骨髄細胞と肝前駆細胞の共存下において、骨髄細胞で発現増加が期待される、いかなる肝幹細胞増殖因子が、肝前駆細胞の肝細胞方向性への分化・増殖促進作用を有するのか、を明らかにする目的で、半透明膜で2種の細胞を隔離して、液性因子を細胞間で往来可能とした共培養システムを構築した。骨髄細胞と肝前駆細胞であるhepatic stem-like cell (HSLC)をこの共培養システムを用いて培養することにより、HSLCは肝細胞方向性に分化したが、骨髄細胞側ではFibroblast growthfactor (FGF) 2とEpiregulinの遺伝子発現増加が確認された。そして、FGF2とEpiregulinは、肝前駆細胞の肝細胞方向性への分化誘導ならびに肝前駆細胞の増殖に関与していることが明らかとなった。即ち、FGF2は添加培養後のHSLCにおいて、アルブミン遺伝子やTAT遺伝子といった肝特異的遺伝子発現を増強し肝細胞方向性への分化誘導を促進することがRT-PCRで示され、用量依存的に細胞数も増加させることがWST-1assayにて示された。また、Epiregulinについても、WST-1assayにて用量依存的にEpCAM陽性肝前駆細胞の増殖能を増加させることが示された。臨床例において、急性肝不全、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、健常者について、各患者の血清を用いて、ELISA法により血清Epiregulin値を測定したが、血清Epiregulinは急性肝不全でのみ、コントロールや他の疾患群に比較し有意な上昇を示し、肝幹細胞の動員を必要とする高度肝臓障害時において、肝臓再生に深く関わっていることが示されたことから、本液性因子の骨髄細胞投与時における肝前駆細胞刺激因子としての重要性が示唆された。本研究の最終的な目標は、肝不全患者に対する自己骨髄細胞投与療法の有効性を高め投与法を発展させるため、骨髄細胞からの有効な肝幹細胞増殖因子を同定して、それらの自己骨髄細胞投与療法時の補完的な役割を見出すことである。現在まで、FGF2とEpiregulinが、自己骨髄細胞投与療法時の肝前駆細胞に対する治療有効性を高めるための肝幹細胞増殖因子として、肝前駆細胞の肝細胞性方向への分化、および肝前駆細胞そのものの増殖、の両面において、有効な液性因子候補である可能性が見出された。実際、Epiregulinは臨床検体においても、肝臓再生に肝幹細胞の動員を必要とすることが想定される急性肝不全症例で高値を呈することが示されていることからも、Epiregulinの肝再生における肝幹細胞増殖因子としての重要性が確認されたこととなる。Epiregulinは、肝幹細胞との共存下で骨髄細胞での発現が増加することが予想される新規の肝幹細胞増殖因子となりうる可能性が見出された。肝前駆細胞の肝細胞方向性への分化・増殖促進作用を有する肝幹細胞増殖因子として、骨髄細胞と肝前駆細胞(hepatic stem-like cell:HSLC))の共存下において、各々が産生する液性因子を細胞間で往来可能としたin vitro共培養システムにより、骨髄細胞側で遺伝子発現の増強が確認されたEpiregulinが、EpCAM陽性肝前駆細胞の肝細胞方向性への分化誘導ならびに肝前駆細胞の増殖能の増加に関与していることが明らかにされた。そこで、実際に肝組織内でのEpiregulinの発現を明らかにする目的で、C57BL / 6マウスに0.1%3.5-dietoxy-1.4-dihydrocollidine(DDC)を含む飼料を与え肝障害を起こし、肝前駆細胞出現を誘導した。

DDCマウス肝を用い、Epiregulin発現ならびに肝前駆細胞発現を組織学的に検討したところ、Epiregulinは高度肝障害マウス肝で発現増加し、肝前駆細胞で構成された偽胆管周囲の間葉系細胞を含むstem-cell nicheから発現していた。Epiregulinは、肝前駆細胞の肝細胞方向性への分化誘導ならびに肝前駆細胞の増殖に関与していることが肝組織内においても確認された。臨床例において、患者血清を用いて、急性肝不全、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、健常者について、ELISA法により血清Epiregulin値を測定したが、血清Epiregulinは肝前駆細胞の出現が肝障害の回復に寄与するとされる劇症肝炎の急性肝不全例でのみ、コントロールや他の疾患群に比較し有意な上昇を示し、肝幹細胞の動員を必要とする高度肝臓障害時において、肝臓再生に深く関わっていることが示されたことから、本液性因子の骨髄細胞投与時における肝前駆細胞刺激因子としての重要性が確認された。本研究の目標は、肝不全に対する自己骨髄細胞投与療法の有効性を高め投与法を発展させるため、骨髄細胞からの有効な肝幹細胞増殖因子を同定して、それらの自己骨髄細胞投与療法時の補完的な役割を見出すことである。現在まで、FGF2とEpiregulinが、自己骨髄細胞投与療法時の肝前駆細胞に対する治療有効性を高めるための肝幹細胞増殖因子として、肝前駆細胞の肝細胞性方向への分化、および肝前駆細胞そのものの増殖、の両面において、有効な液性因子候補である可能性が見出された。そして、Epiregulinは高度肝障害マウス肝で発現増加し、肝前駆細胞で構成された偽胆管周囲の間葉系細胞を含むstem-cell nicheから発現していたことからも、肝細胞障害を受けている部位で、肝幹細胞へ分化・増殖を働きかけていることが肝臓組織内で確認された。血中のEpiregulin値は、臨床例の血清検体においても、肝臓再生に肝幹細胞の動員を必要とすることが想定される急性肝不全症例でのみ高値を示し、肝臓幹細胞の出現が乏しいか、あるいは無い予後良好の急性肝炎や長期間の経過の中で進行する慢性肝障害では上昇しないことから、Epiregulinの肝再生における肝幹細胞増殖因子としての重要性が確認されたこととなる。Epiregulinは、肝幹細胞との共存下で骨髄細胞での発現が増加することが予想される新規の肝幹細胞増殖因子となりうる可能性が、高度肝障害を有する肝組織内でも本因子が誘導される所見を加えて確認された。ラット骨髄細胞と肝前駆細胞(hepatic stem-like cell)の共存下において、各々が産生する液性因子を細胞間で往来可能としたin vitro共培養システムを開発し、骨髄細胞側で遺伝子発現の増強が確認されたFGF2とEpireglinが肝前駆細胞の肝細胞方向性への分化に重要であることを明らかにしている。Epireglinは、EpCAM陽性肝前駆細胞の肝細胞方向性への分化誘導ならびに増殖能の増加に関与し、C57BL/6マウスに0.1%3,5-dietoxy-1,4-dihydrocollidine(DDC)を含む飼料を与え作成した肝障害モデルでは、肝前駆細胞で構成された偽胆管周囲の間葉系細胞を含むstem-cell nicheから発現していることを確認しているが、更に、肝障害の進行程度に応じてその遺伝子発現量および蛋白発現量が増加することが示された。
投げ縄構造を有する抗結核ペプチド、ラリアチンの改変と化合物ライブラリーへの応用

ラリアチンAとBは放線菌Rhodococcus jostii K01-B0171株が生産する抗Mycobacterium活性を示すペプチド化合物で、ユニークな投げ縄構造を有している我々はこれまでに、ラリアチン生合成遺伝子をクローニングした。今回、ラリアチンのアミノ酸変異体の生産システムを確立し、ラリアチン生産能と構造活性相関を検討した。その結果、環状部分のG1, R7, E8と尾部のW9, V10, G11がラリアチン生産に重要であること、6番目および9番目の芳香族アミノ酸と7番目と17番目の塩基性アミノ酸と10V, 14Nはラリアチンの抗菌活性に重要であることが示唆された。昨年度に引き続き、ラリアチン変異体を作成し、構造活性相関について検討した。昨年度各種アラニン置換体の検討から明らかにしたラリアチンの生産および抗結核菌活性の発現に重要なアミノ酸残基について、アラニン以外に置換した場合の生産および抗結核菌活性を検討した。その結果、これらのアミノ酸残基の極性と活性に相関性があることが明らかとなった。また、投げ縄構造を維持するために必須と考えられるアミノ酸残基を同定した。これらの知見は強力なラリアチン誘導体を創生するための基盤となるとともに、ラリアチンの標的分子との相互作用を知るための有用な情報となると期待される。試験管内ラリアチン生産系を確立するために、ラリアチン前駆体タンパク質の大腸菌による発現系を構築した。すなわち。ラリアチン前駆体をコードするlarAを大腸菌発現ベクターpET42bに連結し、ラリアチン前駆体タンパク質のC末端にヒスチジンタグを付加した融合タンパク質を作成した。今後、larA欠損Rhodococcus jostiiの無細胞抽出液を用いてラリアチンの翻訳後修飾をin vitroで検討する予定である。プロペプチンはラリアチンと同様な投げ縄構造を有すが、Gly-Aspで環状構造を形成しており、両者では環化酵素の基質特異性が異なっていることが予想される。そこで、プロペプチン生産菌Microbispora rosea IFO14044のゲノムよりプロペプチン生合成遺伝子を取得を試みた。M. roseaIFO14044のゲノムDNAより次世代シークエンサーを用いてドラフトゲノム配列を取得した。これをプロペプチンのアミノ酸配列を用いて検索したところ、プロペプチン前駆体をコードする領域を見出した。さらに、その近傍にはラリアチン生合成遺伝子群と相同性の高いORFがあり、この領域にプロペプチン生合成遺伝子群がコードされていると推定した。昨年度外部への委託によって取得したプロペプチン生産菌Microbispora roseaIFO14044のドラフトゲノムを解析した結果、本菌が生産するプロペプチン生合成遺伝子クラスターを推定することに成功した。本年は、この遺伝子クラスターを異種微生物で発現させ、生合成遺伝子を同定することを目的に研究を実施した。また、Streptomyces avermitilis MA-4680のゲノム上に見出された未知のラッソペプチド生合成遺伝子クラスターの発現を行った。得られた情報と我々がクローニングしたラリアチン生合成遺伝子クラスターと比較し、プロペプチン遺伝子クラスターは前駆体ペプチド(PrpA)、環形成酵素(PrpB)、機能未知タンパク質(PrpC)、プロテアーゼ(PrpD)に対応することがわかり、ORFの並び方も両者で同一であることが明らかとなった。しかし、ラリアチンクラスターでは最も下流にコードされていたABCトランスポーターに相当するORF(LarE)はプロペプチンクラスターには見出されなかった。そこで、Prp生合成遺伝子クラスターをRhodococcus-大腸菌シャトルベクターのプロモーター下流につなげ、ラリアチン生産菌Rhodococcus jostii K01-B0171のラリアチン前駆体タンパク質欠損株に形質転換し、異種発現を試みた。一方、Streptomyces avermitilis MA-4680のゲノム上には2組のラッソペプチド生合成遺伝子クラスターが見出されており、本研究ではラリアチンと類似した遺伝子クラスターについて、Prp生合成遺伝子クラスターと同様な手法で異種発現させた。形質転換体の生産物をHPLCで分析した結果、元株にはない新たなピークが検出された。今後、このピークを中心に解析を進め化合物を同定することによって組み換えラッソペプチドの生産系が確立できるものと期待される。本研究の目的は、抗結核菌活性を有するペプチド抗生物質のラリアチンをたんぱく質工学の手法を用いて改変し、ラリアチンのアミノ酸配列のうち抗結核活性に強く影響している残基を同定し、新しい抗結核薬を開発するための基盤を得ようとするものである。

また、本研究で得られる成果をラリアチンと同様な"投げ縄構造"を有するペプチド化合物の発現に応用し、新しい化合物ライブラリーを構築するための基盤を確立することである。平成23年度は(1)遺伝子の改変によって作成した変異ラリアチンを効率よく発現するための宿主菌株の育種を行ない、次に(2) (1)で確立した微生物を利用した発現系を用いてラリアチンを構成するアミノ酸のうち一つをアラニンに置換した変異ラリアチンを作成し、その抗ミコバクテリウム活性を評価した。その結果、6か所のアミノ酸残基がラリアチンの生産に重要であり、4か所のアミノ酸残基が抗結核菌活性に重要であることを明らかにした。まず、ラリアチン生産菌Rhodococcus jostii K01-B0171の染色体にコードされているラリアチン生合成遺伝子クラスターlar ABCDEからラリアチン前駆体をコードしているlarAのみを欠失させた。得られたR. jostii K01-B0171ΔlarA株はラリアチンの生産能力を失ったが、larA発現プラスミドで形質転換するとラリアチン生産能力が回復した。この結果から本菌株は予定通りlarAのみが欠損し、翻訳後修飾に関与するlarBlarEは正常に機能していることが確認された。本菌株を宿主として、PCRを用いた変異導入法で作成したさまざまな変異larA発現プラスミドを導入し、ラリアチン変異体を作成した。各種アミノ酸変異体の作成と構造活性相関については当初予定していた成果が得られたものと考えている。In vitroラリアチン生産システムの構築は当初予定より約半年ほど遅れているが、大腸菌を用いた基質となる前駆体タンパク質の調製が終了した。プロペプチン生合成遺伝子に関して、次世代シークエンサーによるドラフトゲノム配列を取得し、生産菌のゲノム上にターゲット遺伝子を見出すことに成功した。本研究計画の基盤となる実験系として変異体を作成する簡便な方法を確立することが最初の課題であり、当初の計画通り、微生物を利用する方法と試験管内酵素反応を利用する方法について検討した。その結果、平成23年度は微生物を利用する方法を確立することに成功した。また、遺伝子の改変はPCRを用いた既存の手法を用いることで、1変異体あたり3日間で作成することができた。構造活性相関研究の成果から、最も強力な活性を示すと期待される変異体を作成し、生物活性を評価する。また、投げ縄構造を保持するために必須となるアミノ酸の位置を変えることによって、投げ縄部分の大きさが異なる変異体の作成を試みる。In vitroラリアチン生産システムの構築について、大腸菌で調整した前駆体タンパク質を用いて、生産菌の無細胞抽出液を用いたラリアチンの合成と生合成機構の解明へ進める。M. roseaIFO14044のゲノム上に見出したプロペプチン生合成遺伝子群を同定し、翻訳後修飾にかかわる酵素の機能を解析し、対応するラリアチンの生合成酵素と比較する。微生物による変異体作成方法を用いて、各種ラリアチン変異体を作成し、生物活性を評価する。生物活性を評価するために、変異ラリアチンを培養液から精製する必要があり、大量培養と精製の過程で予想以上の労力が必要であることが明らかとなった。
希土類触媒の特長を生かした新規物質創製反応の開発

本研究では、応募者の独自の知見に基づき、希土類元素の特性を最大限に活用した新規錯体触媒を開発するとともに、それらを基盤として、従来では実現困難であった、高効率・高選択的な有機合成反応や精密重合反応の開発、新機能性材料の創製などを行い、物質創製化学の新領域開拓や技術革新を目指す。具体的には、希土類錯体触媒の特性を生かしたC-H結合の活性化と不斉変換や機能性ポリマー創製への活用、希土類金属中心とヘテロ原子との相互作用特性を生かした極性オレフィンと非極性オレフィンとの精密共重合反応の開発と新規機能性ポリマーの創製など、触媒の設計・合成から、新反応・新機能性材料の開発まで一括して研究を進める。本研究は、希土類元素の特性を活用した新規錯体触媒を開発し、従来実現困難であった、高効率・高選択的な有機合成反応や精密重合反応の開発、新機能性材料の創製を行うものである。具体的には、C-H結合の活性化と不斉変換や機能性ポリマー創製への活用、極性オレフィンと非極性オレフィンとの精密共重合反応の開発と新規機能性ポリマーの創製などを行う。希土類元素の活用は興味深く、学術的に重要な研究課題である。研究代表者らの準備状況、具体的かつ的確な研究計画、及び、これまでの希土類元素触媒化学の分野での研究活動から判断し、新触媒開発を含めた合成化学分野への貢献に期待が持てる。
備前焼模様の材料科学的研究

備前焼粘土および稲ワラを種々の酸素分圧下で熱処理し、試料表面の色調と生成相および微細構造の関係について検討した。窒素中で熱処理した試料は黒色を示し、主な構成相はムライト(3A1_2O_3・2SiO_2)および石英(SiO_2)であり、大気中で熱処理した場合に生成するクリストバライト(SiO_2)は生成しないことが分かった。メスバウアー分光測定の結果、この試料中にはヘマタイト(α-Fe_2O_3)およびマグネタイト(Fe_3O_4)の生成は確認できなかった。この試料について電子顕微鏡観察を行った結果、ガラス相中に0.3μmの球状粒子が分散していることが分かった。電子線回折および元素分析の結果、この粒子は、α-Feであることが分かった。よって、この試料の黒色は、α-Feの生成によると考えられる。更に、稲ワラと接触していた試料表面にはリン化鉄(Fe_3P)が生成することが明らかとなった。備前焼粘土および稲ワラをN_2:O_2=99:1の混合ガス中で熱処理すると,試料表面はオレンジ色となることが分かった.備前焼模様の赤色は、ムライトの分解により生成するコランダム(α-Al_2O_3)にヘマタイトがエピタキシャル成長したコンポジット粒子の生成により発色するが、酸素分圧が1%の混合ガス中で熱処理した試料中には、このコンポジット粒子の生成量が少ないためオレンジ色となったと考えられる。酸素分圧の増加とともにコンポジット粒子の粒成長が確認され、ρO_2=5%で最大となることが明らかとなった。このコンポジット粒子の粒成長に伴い、試料表面の赤色も深みが増すことが分かった。備前焼模様「青備前」および「窯変」について,作家による作成条件を調査した結果,「青備前」は,備前焼粘土に稲藁を巻き、強還元雰囲気下で熱処理すると現れ,素地部は青味のあるグレー色となり,稲藁を巻いた部分が黒色となることが分かった.また,「窯変」模様は作品を窯の端部の角に置き,燃料として用いる赤松の灰に作品が埋もれることにより形成することが分かった.更に,「窯変」模様の形成にも酸素分圧の影響が大きいことが分かった.備前焼粘土のペレット状試料の上に稲藁を置き,種々の酸素分圧下で熱処理を行った結果,酸素0%のガス中で熱処理すると試料表面は「青備前」と同じ黒色となることが分かった.稲藁が無い場合は青味のあるグレー色となることから,黒色は稲藁の燃焼による強還元の結果であると考えられた.備前焼粘土は鉄分を多く含むため,Fe^<3+>の一部が還元され黒色のマグネタイト(Fe_3O_4)が生成したと思われたが,粉末X線回折(XRD)およびメスバウアー分光の結果,マグネタイトの生成は認められなかった.構成相は,ムライト(3Al_2O_3・2SiO_2)および石英(SiO_2)であった.還元雰囲気下ではクリストバライト(SiO_2)は生成しないことが分かった.備前焼粘土を酸素1%のガス中で熱処理すると,試料表面がオレンジ色となることが分かった.この色は,「窯変」模様のオレンジ色の部分相当する.XRDの結果,試料表面の構成相は,酸素0%のガス中で熱処理した試料と同じであった.酸素2%以上のガス中で熱処理すると,試料表面は「緋襷」模様の赤色となることが分かった.現在,電子顕微鏡観察(SEM,TEM)により上記模様の微細構造の詳細を検討している.備前焼粘土および稲ワラを種々の酸素分圧下で熱処理し、試料表面の色調と生成相および微細構造の関係について検討した。
オイゲン・フィンク現象学の問題史的・比較思想的研究

(研究の目的と先行研究の状況)本研究の目的はオイゲン・フィンク(1905-1975)の思想を問題史的および比較思想的観点から解明することである。フィンクの思想は、従来、フッサール(1859-1938)とハイデガー(1889-1976)の影に隠れて十分には解明されてこなかった。しかし、近年、これまで未刊であった遺稿等の一次資料が徐々に整うに従い「主観性」および「主観性の存在」、「反省」(フッサール)、「存在」(ハイデガー)、更には「世界」、「仮象」や「言語」といった現象学的哲学全般に付きまとう難問を、フィンクは他の現象学者以上に自覚的かつ主題的に考察し、これらの問題に対して彼独自の解決案を提出していることが徐々に明らかになりつつある。とはいえ、基礎資料につきまとう問題から先行研究は未だ資料整理の段階を脱してはいない。このことから、1.上記のフィンク思想の主要問題群をその前史・由来と併せて体系的に解明(問題史的観点)し、2.フィンク思想の現象学運動における地位、歴史的役割と現代的意義を反省、確定(比較思想的観点)することが申請者の具体的な研究目的である。(平成25年度の研究実績)前年度、報告者は計画通り、フィンクにおける「主観性の存在」、「反省」、「仮象」をめぐる問題系の内的構造の主題化、問題そのものの由来と独自性を摘出(問題史的観点)、同時に、主にフッサールの思想と対比することで、フィンク思想自身がもつ歴史的役割と現代的意義をより広いアスペクトから明確化する作業をおこなった(比較思想的観点)。これらの研究成果は、学会発表等の形式で提示した。フィンク思想の独自性は、とりわけその「世界」概念に認められる。報告者は、このことをより具体的に、フィンクにおける「主観性の存在」の問いと「世界」の関係、その際、いわゆる近代的な「意識主観」が前提とされていないということを体系的に示した。平成25年度中に、当初の研究課題(フィンクにおける「主観性の存在」、「仮象」および「世界」という問題系の内的構造を摘出、その歴史的役割および現代的意義の提示)を達成するのみならず、それらの研究成果に基づいて、2014年3月、立命館大学大学院に学位申請論文を提出した(2014年9月取得見込)。よって、本研究は、当初の計画以上に進展しているとみなすことができる。報告者は、当初の予定通り、フィンク、そして現象学運動における中心的主題である「世界」概念の解明を継続する共に、今後は並行してカント以降の近代哲学におけるその歴史的位置づけ作業をおこなうものとする。併せて、現象学的な世界概念を、現代の心の哲学などにおける議論の文脈から再検討し、その現代的意義の解明作業に着手する。これらの計画は、報告者の研究の進展に伴って生じてきた課題であるので、根本的にみて研究方針に変更点はないといえる。(研究の目的と先行研究の状況)本研究の目的はオイゲン・フィンク11905-1975)の思想を問題史的および比較思想的観点から解明することである。フィンクの思想は、従来、フツサール(1859-1938)とハイデガー(1889-1976)の影に隠れて十分には解明されてこなかった。しかし、近年、これまで未刊であった遺稿等の一次資料が徐々に整うに従い「意識」、「反省」(フッサール)、「存在」や「現存在(人間存在)」(ハイデガー)、更には「世界」、「仮象」と「想像」、「言語」といった現象学的哲学全般に付きまとう難問を、フィンクは他の現象学者以上に自覚的かつ主題的に考察し、これらの問題に対して彼独自の解決案を提出していることが徐々に明らかになりつつある。このことから、1.上記のフィンク思想の主要問題群をその前史・由来と併せて体系的に解明(問題史的観点)し、2.フィンク思想の現象学運動におけ」る地位、歴史的役割と現代的意義を反省、確定(比較思想的観点)することが申請者の具体的な研究目的である。(平成24年度の研究実績)前年度、報告者は計画通り、フィンクにおける「意識」、「反省」、「仮象」および「言語」をめぐる問題系の内的構造の主題化、問題そのものの由来と独自性を摘出(問題史的観点)、同時に、主にフツサールの思想と対比することで、フィンク思想自身がもつ歴史的役割と現代的意義をより広いアスペクトから明確化する作業をおこなった(比較思想的観点)。その際に、フィンク思想の独自性は、上記の問題群および彼独自の「世界」概念を、いわゆる「意識主観」というものを前提とせずに解明することができる点に集約されることを体系的に示した。

しかし、近年、これまで未刊であった遺稿等の一次資料が徐々に整うに従い「主観性」および「主観性の存在」、「反省」(フッサール)、「存在」(ハイデガー)、更には「世界」、「仮象」や「言語」といった現象学的哲学全般に付きまとう難問を、フィンクは他の現象学者以上に自覚的かつ主題的に考察し、これらの問題に対して彼独自の解決案を提出していることが徐々に明らかになりつつある。とはいえ、基礎資料につきまとう問題から先行研究は未だ資料整理の段階を脱してはいない。このことから、1.上記のフィンク思想の主要問題群をその前史・由来と併せて体系的に解明(問題史的観点)し、2.フィンク思想の現象学運動における地位、歴史的役割と現代的意義を反省、確定(比較思想的観点)することが申請者の具体的な研究目的である。(平成25年度の研究実績)前年度、報告者は計画通り、フィンクにおける「主観性の存在」、「反省」、「仮象」をめぐる問題系の内的構造の主題化、問題そのものの由来と独自性を摘出(問題史的観点)、同時に、主にフッサールの思想と対比することで、フィンク思想自身がもつ歴史的役割と現代的意義をより広いアスペクトから明確化する作業をおこなった(比較思想的観点)。これらの研究成果は、学会発表等の形式で提示した。フィンク思想の独自性は、とりわけその「世界」概念に認められる。報告者は、このことをより具体的に、フィンクにおける「主観性の存在」の問いと「世界」の関係、その際、いわゆる近代的な「意識主観」が前提とされていないということを体系的に示した。平成24年度中に、当初の研究課題(フィンクにおける「意識」、「反省」、「仮象」および「言語」という問題系の内的構造を摘出、その歴史的役割および現代的意義の提示)の達成のみならず、平成25年度以降に研究を予定していた、フィンク独自の「世界」概念の研究を開始し、部分的にその成果を学会報告することができた。よって、本研究は、当初の計画以上に進展しているとみなすことができる。平成25年度中に、当初の研究課題(フィンクにおける「主観性の存在」、「仮象」および「世界」という問題系の内的構造を摘出、その歴史的役割および現代的意義の提示)を達成するのみならず、それらの研究成果に基づいて、2014年3月、立命館大学大学院に学位申請論文を提出した(2014年9月取得見込)。本研究は、当初の予定通り、前年度に着手されたフィンクにおける中心的主題である「世界」概念の解明を継続し、同時にフィンクの「想像」の分析の内実および問題自身の由来もしくは前史を体系的に摘出する(問題史的観点)。併せて、その独自の意義を、フッサールを中心とする現象学運動に属する他の哲学者の所見と比較することで歴史的、更に現代の議論という観点から明示化する(比較思想的観点)。よって、研究方針に変更点はない。報告者は、当初の予定通り、フィンク、そして現象学運動における中心的主題である「世界」概念の解明を継続する共に、今後は並行してカント以降の近代哲学におけるその歴史的位置づけ作業をおこなうものとする。併せて、現象学的な世界概念を、現代の心の哲学などにおける議論の文脈から再検討し、その現代的意義の解明作業に着手する。これらの計画は、報告者の研究の進展に伴って生じてきた課題であるので、根本的にみて研究方針に変更点はないといえる。
急性心筋梗塞モデルでeNOSを介する虚血領域縮小効果-分子学的機序の解明-

1.研究目的マウスAMIモデルを用いてischemic preconditioning(IP)による心保護効果と薬剤投与による心保護効果における分子学的機序について比較検討した。2.方法マウスAMIモデルを用いたIPによる心保護効果の検討。(1)AMI発症早期でのeNOS蛋白の発現と局在をWesternblot法により検討、(2)VEGF遺伝子およびeNOS遺伝子の発現をnorthern blot法およびreal time PCR法により検討、(3)AMI発症後6時間での虚血領域での血管径、AMI発症後6時間および3日での虚血領域と梗塞領域のサイズを計測、(4)AMI発症後3日での心組織における毛細血管数をCD31に対する免疫組織染色により評価、(5)マウスAMIモデルにおけるACE阻害薬、スタチンによる心保護効果の検討。3.結果(1)マウスAMIモデルにおいてもラットAMIモデルと同様に、IPによってAMI発症後3時間でのeNOS蛋白および遺伝子、VEGF遺伝子の発現増加が認められ、6時間後の虚血領域における血管拡張と虚血領域の縮小、および3日後の梗塞部における血管新生と梗塞サイズの縮小が認められた。(2)ACE阻害薬投与モデルおよびスタチン投与モデルにおいてもAMI発症後3日での梗塞サイズの縮小効果が認められた。(3)ACE阻害薬投与モデルではeNOSやVEGF遺伝子の発現増加は認められず、AMI発症後3日での梗塞部における血管新生も認められなかった。一方、スタチン投与モデルでは、eNOSおよびVEGF遺伝子の発現は増加傾向を示し、3日後には梗塞部における毛細血管数が軽度増加していた。以上の結果から、マウスAMIモデルにおいてもIPが心保護効果を示すことが明らかになった。さらに、ACE阻害薬やスタチンもAMIにおいて心保護効果を示すが、IPによる心保護効果とは異なった機序によることが推察された。1.研究目的2.方法3.結果(1)Western blot法により、IPによってAMI発症後3時間で虚血領域でのeNOS蛋白の発現が増加し、免疫組織染色により活性型eNOSおよびNOと結合したグアニル酸シクラーゼ(活性型グアニル酸シクラーゼ)の発現が虚血領域の血管内皮で増加していることが明らかになった。一方、inducible NOS(iNOS)蛋白の発現増加は認められなかった。(2)IPにより、虚血領域でのeNOS遺伝子の発現増加が認められた。(3)IPにより、AMI発症後6時間で虚血領域での血管拡張が認められ、虚血領域が縮小した。さらに、3日後には虚血領域と梗塞領域の縮小が認められた。(4)L-NAME投与によって、IP後に認められたeNOSの発現増加は抑制されなかったが、活性型グアニル酸シクラーゼの発現、血管拡張、および6時間後での虚血領域縮小効果は抑制された。しかし、3日後の虚血領域および梗塞領域縮小効果は抑制されなかった。一方、chelerythrine投与によっては、IPによるeNOSおよび活性型グアニル酸シクラーゼの発現、虚血領域での血管拡張効果は抑制されなかった。以上の結果から、early IP効果には、虚血領域での血管内皮におけるeNOSの発現増加と活性化により惹起される血管拡張が関与していることが明らかになった。さらに、このearly IP効果には、iNOSやPKCが関与していないことが明らかになった。
プロテインホスファターゼＰＰ２Ａによる骨形成と間葉系細胞分化機構の解明

PP2トランスジェニックマウス(PP2A-Tg)およびPP2A発現を抑制した間葉系前駆細胞を用いて骨形成と脂肪細胞分化におけるPP2Aの役割について検討した。PP2A-Tgマウスは野生型に比べて、体重、骨量および骨髄内脂肪量の増加が認められた。PP2Aを抑制した骨芽細胞と共培養した未分化間葉系細胞では脂肪細胞への分化が促進された。また、PP2Aを抑制した骨芽細胞の培養上清は破骨細胞分化を抑制した。PP2Aは、骨関連因子の発現を介して骨形成を調節する重要な因子であることが分かった。さらに、骨芽細胞のPP2A発現は脂肪細胞や破骨細胞の分化に関与すると考えられる。様々な細胞種における現象と同様、骨芽細胞の分化・機能は蛋白質リン酸化酵素(プロテインキナーゼ)と蛋白質脱リン酸化酵素(プロテインホスファターゼ)による蛋白質のリン酸化・脱リン酸化により厳密にコントロールされている。PP2Aは真核生物において必須のセリン・スレオニンプロテインホスファターゼであり、細胞分裂、シグナル伝達や代謝などに必要な酵素である。本年度は、in vivoでの骨形成におけるPP2A Cαの役割とPP2A Cαによる骨芽細胞分化の調節機構について調べた。具体的には、マイクロCTを用いたPP2A-Tg (ドミナントネガティブPP2A Cα発現)マウスの骨量・骨密度の解析と摘出した脛骨の切片のHE染色サンプルによる骨形態計測を行った。PP2A Cαが骨芽細胞分化・石灰化をどのような転写調節因子を介して制御するかを解明するため、PP2A Cの発現を抑制した骨芽細胞を用いて、リアルタイムPCR、ウエスタンブロットやルシフェラーゼアッセイにより、転写調節因子の発現と機能を調べた。その結果、1) PP2A-Tgマウスの骨量・骨密度は、コントロールに比べて高く、脛骨の皮質骨厚も増加していた。2) PP2A Cαの発現を抑制した骨芽細胞では、分化・石灰化能が亢進し、骨に必須の転写調節因子Dlx5, Runx2およびOsterixの発現・転写活性が増加していた。3) PP2A Cαの発現を抑制した骨芽細胞でDlx5, Runx2およびOsterixの発現を抑制すると、骨芽細胞分化能が低下した。以上のことから、PP2A CαはDlx5, Runx2およびOsterixの発現を介して骨芽細胞の分化・骨形成を制御する重要な因子と考えられる。本年度の主な計画目標は、脂肪細胞におけるPP2A Cαの役割について調べることであった。前年度までにPP2A Cα発現が骨芽細胞の分化において重要な役割をもつことを明らかにした。そのためPP2A Cαが骨芽細胞以外の間葉系細胞である脂肪細胞の分化に関与するか調べた。マウス間葉系前駆細胞(C3H10T1/2)にレンチウイルスベクターを用いてPP2A Cα特異的shRNAを導入し、その発現を恒常的に抑制した細胞株を樹立した。作製した細胞を脂肪細胞分化誘導培地で培養し、Oil red O染色を行った。分化誘導した細胞からRNAを抽出し、脂肪分化マーカーの発現を調べた。これらの結果をコントロールの細胞と比較し、間葉系前駆細胞から脂肪細胞への分化におけるPP2A Cαの役割を調べた。その結果、PP2A Cαの発現およびPP2A活性は脂肪細胞の分化に伴って低下した。shPP2A細胞ではPPARγ, C/EBPαおよびAdiponectin等の脂肪分化マーカーの発現が増加し、脂肪細胞分化能が亢進していた。PPARγの発現抑制によりshPP2A細胞の脂肪細胞分化能が抑制された。shPP2A細胞では、Wnt10b発現の低下、GSK-3β活性の増加、β-cateninの活性低下が認められた。GSK-3β阻害剤はshPP2A細胞における脂肪分化マーカーの発現と分化能を抑制した。以上の結果から、PP2A Cαは、PPARγを含む転写調節因子の発現とWnt/GSK-3β/β-catenin経路を介して脂肪細胞の分化を調節する重要な因子であると考えられる。当初の計画における本年度の主な計画目標は、脂肪細胞と軟骨細胞におけるPP2A Cαの役割について調べることであった。前年度は計画どおりに、骨芽細胞の分化におけるPP2A Cαの役割をを明らかにしたので、PP2A Cαが骨芽細胞以外の間葉系細胞の分化に関与するか調べた。マウス間葉系前駆細胞(C3H10T1/2)にレンチウイルスベクターを用いてPP2A Cα特異的shRNAを導入し、その発現を恒常的に抑制した細胞株を樹立することに成功した。また、作製した細胞を脂肪細胞分化誘導培地で培養し、脂肪細胞への分化におけるPP2A Cαの役割を調べることができた。その結果、PP2A Cαの発現およびPP2A活性は脂肪細胞の分化に伴って低下すること、shPP2A細胞では脂肪分化マーカーの発現が増加し、脂肪細胞分化能が亢進することを明らかにできた。

また、当初の計画以上に、その分子機構についても調べ、PPARγの発現抑制によりshPP2A細胞の脂肪細胞分化能が抑制されること、shPP2A細胞では、Wnt10b発現の低下、GSK-3β活性の増加、β-cateninの活性低下が認められ、GSK-3β阻害剤はshPP2A細胞における脂肪分化マーカーの発現と分化能を抑制することなどを解明できた。しかし、軟骨細胞分化におけるPP2A Cαの役割については、分化誘導条件などの設定に時間がかかってしまったことから、引き続き検討が必要である。そのため、区分は、おおむね順調とした。骨は骨格運動系の中心であるだけでなく、カルシウム代謝や造血幹細胞の維持・分化など多様な役割を担っている。つまり、骨の恒常性は局所の硬組織疾患だけでなく、全身の代謝・循環器疾患にも影響を与える重要な要素と考えられる。細胞の分化・機能は蛋白質のリン酸化・脱リン酸化により厳密にコントロールされている。このうち、蛋白質の脱リン酸化に関わる酵素の一つがPP2Aであり、触媒サブユニットPP2A Cαを中心に多種類の調節サブユニットが会合し、様々な細胞内外の現象を制御している。PP2A Cαを欠失したマウスは間葉系組織の形成不全により胎生致死であることから、PP2A Cαは骨芽細胞や脂肪細胞の起源となる間葉系細胞の発生・分化に必須と考えられる。本研究の目的は、PP2A Cαによる骨形成と間葉系細胞分化のメカニズムを解明することであった。我々は、PP2A Cαが骨芽細胞の分化と機能に重要な役割をもつことを報告した。本研究では、in vivoでの骨形成および間葉系前駆細胞の分化におけるPP2A Cαの役割を中心に解析を行った。具体的には、PP2A CαトランスジェニックマウスおよびPP2A Cα発現を抑制した間葉系前駆細胞を用いてin vivoでの骨形成と脂肪細胞分化におけるPP2A Cαの役割について検討した。その結果、1.骨特異的にPP2Aを抑制したマウスでは骨密度が増加した。2. PP2Aの抑制によりWnt/GSK3β/β-catenin経路を介して脂肪細胞の分化が促進された。3. PP2Aの抑制により骨肉腫細胞の増殖・転移能が低下した。これらの結果は、骨芽細胞のPP2Aがその分化や機能を制御するのみならず、脂肪細胞の分化や骨肉腫の悪性化にも関与することが示された。PP2トランスジェニックマウス(PP2A-Tg)およびPP2A発現を抑制した間葉系前駆細胞を用いて骨形成と脂肪細胞分化におけるPP2Aの役割について検討した。PP2A-Tgマウスは野生型に比べて、体重、骨量および骨髄内脂肪量の増加が認められた。PP2Aを抑制した骨芽細胞と共培養した未分化間葉系細胞では脂肪細胞への分化が促進された。また、PP2Aを抑制した骨芽細胞の培養上清は破骨細胞分化を抑制した。PP2Aは、骨関連因子の発現を介して骨形成を調節する重要な因子であることが分かった。さらに、骨芽細胞のPP2A発現は脂肪細胞や破骨細胞の分化に関与すると考えられる。当初の本年度実験計画は、1. in vivoでの骨形成におけるPP2A Cαの役割を調べる。2. PP2A Cαによる骨芽細胞分化の調節機構について調べる。ことであった。PP2A Cαトランスジェニックマウス(PP2A-Tg)雌マウスと野生型のC57BL/6雄マウスと掛け合わせ、4週齢時にジェノタイピングを行った。約半数の割合でPP2A-Tgと同腹仔の野生型のマウスを得た。
カタユウレイボヤの消化管形成における細胞動態の解析

消化管は、動物にとって必須の基本構造である。脊索動物に属するホヤの若い成体(幼若体)にも明瞭な消化管構造があり、幼生が幼若体へと変態する間に形成される。幼生の尾部には、数十個の前後一列に並んだ細胞群があり、内胚葉索と呼ばれている。私はこれまで、内胚葉索を含む細胞群でKaedeを発現するカタユウレイボヤの系統(Zip-Kaede)用いて、内胚葉索の細胞が尾部から胴部左側に移動・集合すること、後方消化管に寄与することを明らかにした。しかし、移動中に細胞の形態や数がどのように変化するのか、集まった細胞群の中でどのような変化が生じて管の内腔ができるのか、は分かっていなかった。本年度は、昨年度確立した"Kaede蛍光と、細胞膜を可視化するファロイジンの蛍光を両方とも取得する方法"を用いて、Kaede発現細胞の配置と細胞形態に注目し、後方消化管を作る細胞の細胞形態変化について詳細に解析を行った.その結果、後方消化管に寄与する細胞は、尾部から胴部に移動すると、大きく形を変え、直方体から細胞の丈が高くなり、その後より細長く密に並ぶ上皮細胞様に変化してゆくことがわかった。また、胴部へ移動した細胞から細胞分裂を開始することもわかった。後方消化管細胞は、移動中に大きくその性質を変えてゆくが、移動開始からの時間による内在性のものか、胴部の他の細胞からの影響なのかはわからなかった。胴部に集合した細胞群にはファロイジン染色ポジティブのfociが認められ、この部分が将来の内腔になる可能性が考えられた。また、ホヤは初期発生では細胞分裂の同調性や個体差がないこと等が知られているが、変態期には個体によって多様性があることもわかった。28年度が最終年度であるため、記入しない。細胞が適切な時期に,適切な場所に移動することは,動物の発生に重要である。ホヤのふ化直後の幼生の尾部には,数十個の前後一列に並んだ細胞群があり,“内胚葉索"と呼ばれている。私はこれまで,内胚葉索の細胞が,1尾部が退縮するよりまえに,前方に動き,胴部の左側に集まること,2変態後の幼若体では消化管のうち,腸に寄与することの二点を,カタユウレイボヤを用いて明らかにした。しかし,内胚葉索の細胞がどのように制御されて胴部左側へ移動するのかは未だに分かっていない。本研究では,内胚葉索細胞を可視化して,移動中のより詳細な挙動を観察する方法を確立することと,移動の制御機構を明らかにすることを目的とした。まず,これまで行ってきた孵化後の幼生の観察では,内胚葉索の細胞が移動を開始する時期が特定できなかったため,発生を遡って調べる必要があると考えた。ただし,孵化前の胚を覆っているコリオンは左右非対称性の成立に必要であることが報告されているので,コリオンに包まれたままの胚を観察する必要がある。本研究で私は,固定胚でF-アクチンを可視化するファロイジン染色の条件やサンプルの透徹条件を工夫することによって,コリオン内の胚内部の細胞形態が観察できることを見い出した。一方,これまで内胚葉索を標識するのに用いてきた,Zipエンハンサーによるレポーター遺伝子では,早い時期での内胚葉索の判別には向いていないことが分かった。そこで,内胚葉索を標識する別の手法を検討している。細胞が適切な場所に移動することは、器官の形成に重要である。ホヤの孵化直後幼生の尾部には、数十個の前後一列に並んだ細胞群があり、“内胚葉索"と呼ばれている。私はこれまで、胴部内胚葉の一部と内胚葉索でKaedeを発現するカタユウレイボヤの系統(zip-kaede)を用いて、内胚葉索の細胞が胴部に移動・集合すること、zip-Kaede発現細胞が後部消化管に寄与することを明らかにした。しかし、一列に並んでいた細胞がどのような過程で集まるのか、管がどのような形態変化によってできるのか、は未だに分かっていない。本年度は、胴部内胚葉や移動して胴部に入った内胚葉索細胞がどのような形態変化を経て、後部消化管を形成するか調べることを目標にした。しかし、Kaedeは細胞質全体で蛍光を発するので、細胞数や個々の細胞の形態、胚内の配置を調べるには細胞膜を染色する必要があった。これまでホヤの細胞膜を可視化するには、固定胚をファロイジン染色する方法が用いられてきた。一方、Kaedeタンパク質はライブで見ることが多く、固定後にもKaede蛍光が検出できるかは不明で、UV照射の時間や固定の条件などを検討する必要が生じた。本年度の研究で、光転換したKaedeタンパク質の蛍光と、ファロイジンの蛍光を両方とも観察できる条件を得ることができた。これまでは孵化からの時間で内胚葉の動態を記載してきたが、孵化の時点ですでに発生段階の個体差が大きいという問題があった。今後は、胴部に入ったzip-kaede発現細胞の数で動態を記載する予定である。

Kaedeとファロイジンの蛍光を両方検出できる条件が見つかり、zip-kaede発現細胞の数、形態、配置を調べるための方法が定まったという点では研究が進展したが、当初予定していた内胚葉細胞の動態を記載するには至らなかったため、「やや遅れている」とした。消化管は、動物にとって必須の基本構造である。脊索動物に属するホヤの若い成体(幼若体)にも明瞭な消化管構造があり、幼生が幼若体へと変態する間に形成される。幼生の尾部には、数十個の前後一列に並んだ細胞群があり、内胚葉索と呼ばれている。私はこれまで、内胚葉索を含む細胞群でKaedeを発現するカタユウレイボヤの系統(Zip-Kaede)用いて、内胚葉索の細胞が尾部から胴部左側に移動・集合すること、後方消化管に寄与することを明らかにした。しかし、移動中に細胞の形態や数がどのように変化するのか、集まった細胞群の中でどのような変化が生じて管の内腔ができるのか、は分かっていなかった。本年度は、昨年度確立した"Kaede蛍光と、細胞膜を可視化するファロイジンの蛍光を両方とも取得する方法"を用いて、Kaede発現細胞の配置と細胞形態に注目し、後方消化管を作る細胞の細胞形態変化について詳細に解析を行った.その結果、後方消化管に寄与する細胞は、尾部から胴部に移動すると、大きく形を変え、直方体から細胞の丈が高くなり、その後より細長く密に並ぶ上皮細胞様に変化してゆくことがわかった。また、胴部へ移動した細胞から細胞分裂を開始することもわかった。後方消化管細胞は、移動中に大きくその性質を変えてゆくが、移動開始からの時間による内在性のものか、胴部の他の細胞からの影響なのかはわからなかった。胴部に集合した細胞群にはファロイジン染色ポジティブのfociが認められ、この部分が将来の内腔になる可能性が考えられた。また、ホヤは初期発生では細胞分裂の同調性や個体差がないこと等が知られているが、変態期には個体によって多様性があることもわかった。ふ化前の早い時期の胚について,細胞形態を観察するための方法はある程度確立できたが,内胚葉索を識別する手法の確立には至らなかったため,「やや遅れている」とした。本年度確立した方法で、zip-kaede発現細胞を指標として、細胞の集合課程、管形成課程を記載する。28年度が最終年度であるため、記入しない。内胚葉索の細胞や,その周囲の細胞を識別するために,新たなレポーターコンストラクトの作成,前駆割球への色素注入等を検討する。