hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射線照射条件と細胞に依存した細胞応答とゆらぎ機構によるP53機能の解析

hiPS細胞を含む様々なヒト由来培養細胞を低-中線量率(10-1000 mGy/day)のγ線照射下で培養し、細胞の種類や照射線量率に依存した細胞応答現象とその分子機構を解析した。持続的放射線照射環境と次世代シーケンサや全自動画像解析装置などの革新的な網羅的解析を組み合わせた研究によって、細胞の持つ多様なゲノム安定性維持機構と新しいp53依存的な細胞応答の分子機構が明らかとなった。本研究課題では、iPS細胞を含む様々な細胞を低ー中線量率(10-1000 mGy/day)の低LET放射線照射環境下で培養し、細胞の種類や照射線量率に依存した細胞応答現象とその分子機構を解析する事で、細胞の持つ新しいゲノム安定性維持機構の概念を提唱し、その分子機構を包括的に解明する事を目的とした。iPS細胞、持続的放射線照射、DNA損傷応答(DDR)-p53経路の解析と革新的な次世代シークエンスシステムによる網羅的解析を組み合わせる事で、細胞の持つ多様な細胞応答の分子機構とゲノム安定性維持機構について、新しい観点から研究を行った。本研究により樹立された様々な細胞株とGenome Analyzerの解析データを用いて、異なる種類の細胞と様々な線量率に依存した細胞の応答機構の解析を行った。iPS細胞の放射線応答機構の解析を進めると共に、トランスクリプトームのデータ解析を行い、RT-PCRなどを用いてp53の機能を検証した。発現パターンの変化の解析から、線量率依存的な放射線細胞応答機構とその経路を同定することができた。本研究の解析によって、本研究課題の目的であった細胞種とDNA損傷誘発頻度に依存した新しいゲノム安定性維持機構が明らかとなった。異なる細胞種による異なるゲノム安定性維持機構の存在が明らかとなったことで、今後、新しい研究領域の展開が期待される。本申請研究課題では、ヒトのiPS細胞を含む様々な種類の細胞の放射線応答機構とその中でのDDR-p53経路の機能解析、及び、持続的な低LET放射線照射培養条件下での細胞の種類に依存したMDM2/MDMX-p53の機能解析と次世代シークエンスシステムを用いた網羅的遺伝子発現解析を行うことによってゲノム不安定性に対する細胞種に依存した細胞応答の分子機構を明らかにする事を研究の目的としている。本申請研究課題の目的を達成する為、I.細胞の種類に依存したp53の安定性制御の分子機構解析、II.放射線照射に対するp53の修飾及び転写機能の解析、III.アポトーシスと細胞周期制御機構におけるのp53の機能解析、IV. γ線照射と紫外線照射に対する細胞応答の比較解析、V.次世代シークエンスシステムを用いたトランスクリプトームの5つの実験計画を実施している。初年度である平成23年度は、研究計画に基づいて以下のような研究成果を得た。I.p53制御因子のsiRNA解析により、細胞内でのp53応答性のゆらぎが制御因子間の相互作用で行われていることを確認した。この結果から、p53の制御が異なる細胞の有するp53制御因子の分子量の比によって制御されていることを見出した。II.放射線の線量率依存的なp53の局在、活性について検討し、その結果放射線の線量率に依存したp53の機能が存在する事を明らかとした。III.持続的な放射線照射により、細胞種依存的な細胞周期分布の変化と応答性が存在することが明らかとなった。IV.γ線と紫外線の応答性の変化を経時的に解析した結果、それぞれに依存的な細胞周期の進行とアポトーシスが観察された。V.ヒト正常細胞を用いた線量率依存的なトランスクリプトーム解析を行い、そのデータ解析を行った。研究実施計画に基づき、次年度の研究に向けて意義のある結果を得ることができた。初年度である平成23年度は、研究計画通りに研究を進めた。達成度としては、概ね順調に進展している。研究成果としては、特に、持続的な低ー中線量率放射線照射下で細胞は照射線量率に対し、細胞種に依存して異なる細胞応答性を有する事が明らかになったことは、意義があるものと考える。それらの細胞応答性は、細胞の種類に依存して、応答機構そのものと感受性に明らかな違いが存在することが明らかになった。iPS細胞が有する細胞応答の特性も明らかとなったが、最終年度である来年度にその特性の分子機構を解析する予定である。また、次世代シーケンサを用いた解析によって、照射線量率依存的な細胞応答機構の違いが遺伝子発現量と相関しているものであることも明らかとなった。次年度の研究計画の遂行によって、異なる種類の細胞が有する放射線照射に対するゲノム安定性維持機構のメカニズムを解析することで、本研究課題の目的であるゲノム安定性機構における細胞応答機構の役割が明らかになるものと期待される。初年度は研究計画に基づいて研究を遂行し、予定通りの結果を得るこた。

引き続き最終年度である平成24年度も申請した研究計画通り、I.細胞の種類に依存したp53の安定性制御の分子機構解析、II.放射線照射に対するp53の修飾及び転写機能の解析、III.アポトーシスと細胞周期制御機構におけるのp53の機能解析、IV. γ線照射と紫外線照射に対する細胞応答の比較解析、V.次世代シークエンスシステムを用いたトランスクリプトームの5つの実験計画を遂行する。現在までのところ、研究計画の遂行に問題点や課題はない。平成23年度では、実験計画に基づいて、iPS細胞及び初代培養正常線維芽細胞から目的の遺伝子を発現する細胞の作製を行ったが、実験には、平成23年度予算に計上したNeonTM遺伝子導入装置(Invitrogen社)を含む異なる遺伝子導入装置のデモ機を用いた。その結果、用いた細胞のうちiPS細胞においては、当初期待された遺伝子導入効率を得ることができず、より遺伝子導入効率の高い遺伝子導入装置NEPA21(Nepagene社)のデモ機を用いて実験した結果,期待した遺伝子導入効率を得ることができた。この結果から、平成23年度に購入予定であったNeonTM遺伝子導入装置の購入は行わず、平成24年度の実験を計画通りに行う為に、備品としてNEPA21の遺伝子導入装置の購入を平成24年度に行うこととした。なお、この機器購入の変更によって実験計画に変更は生じない。
口腔領域の組織機能保持細胞株の樹立-トランスジェニックマウスを用いて-

(1)歯肉上皮は解剖学的にjunctional epithelium,sulcular epithelium,そしてoralgingival epitheliumと分類され、それぞれに発現するケラチン蛋白が異なっている。既に得られている歯肉組織に由来する上皮細胞のうち主としてGE1とGE6の2株について、抗ケラチンモノクローナル抗体(k4,k10,k13,k19)と顆粒層の表層細胞の細胞膜肥厚の構成分子であるインボルクリン、そしてケラトヒアリン顆粒の構成分子のひとつであるフィラグリンの局在を免疫組織学的染色で検討し細胞学的特性を解析した。GE1とGE6細胞はどちらも通常の単層培養を1週間以上継続するだけで、多層となり、微細形態学的に重層扁平上皮類似の構造を形成した。GE1とGE6細胞両株のsuprabasal cellがk4とk13(粘膜上皮に特徴的)が陽性で、k19(単層上皮の特徴的ケラチン)は陰性であった。今回用いたsubmerged cultureでは電顕的には角質層は形成されなかったが、免疫組織学的染色では高分子量ケラチンであるk10陽性細胞がまれに重層化した細胞層の表層にみられ、またインボルクリンやフィラグリンも同様の部位に検出された。こららの結果からGE1とGE6はsulcular epitheliumの特徴をもち、さらに重層化した部位の表層細胞は角化の所見を示しているので、潜在的にはoral gingival epitheliumの特徴ももっているとみなされた。C57BL/6マウスに温度感受性突然変異株SV40LargeT抗原遺伝子(tsA38)を導入したトランスジェニックマウス(2.53か月メス)から歯肉粘膜、舌粘膜、切歯根端部、顎下腺の各組織を無菌的に採取し初代培養を行った。1.歯肉粘膜と舌粘膜は可及的に上皮下の結合組織を除き、0.25%トリプシン液で一晩(4°C)静置した後、翌朝、上皮と間葉組織を分離した。上皮組織をピンセットの背でしごいて、single cellsの細胞懸濁液を調製して培養した。培地は無血清合成培地(日水製薬、SFM101)に2%牛胎児血清とEGF(1μg/ml)を加えたものを用いた。その結果、約2週間後には上皮細胞のコロニーをみとめたが、紡錘形の線維芽細胞様の細胞も混在した。培養後52日めに96-wellプレートを用いて段階希釈法でクローニングを行い、葉肉粘膜由来の上皮細胞株5株と線維芽細胞様3株をえた。上皮細胞株の増殖の速い1種についてヌードマウスに移植した結果、この細胞に腫瘍原性(tumorigenesity)がないことを確かめた。舌粘膜組織を培養して得られた上皮細胞はプレート上に十分に進展した細胞で増殖率が低かったため、混在していた線維芽細胞が優勢となりついには消失した。2.顎骨を摘出し切歯根端部が露出するようにハサミで二分割して切歯根端部を採取し、組織を細切して培養した。培養後3日には組織片周囲から細胞が遊出し始めた。歯髄細胞に類似した(細胞質が豊富な点で結合組織由来の線維芽細胞と異なる)間葉系細胞と立方形の上皮様細胞が混在した。歯髄細胞様細胞はゆっくりとではあるが増殖を続けた。培養6ケ月後にクローニングを行い6個の株細胞を得た。混在していた少数の上皮細胞は増殖せず途中で絶えた。3.顎舌腺組織の培養は組織片培養と0.05%コラ-ゲナーゼによる分散法との2つの方法で行ったが、株化細胞は得られず方法の改良が必要であった。今後は得られた株細胞の増殖率や細胞の分化度などを検討しこれらの細胞の有用性を検討する予定である。前年度に得られた歯肉粘膜由来の上皮細胞株4株(GE1,GE5,GE6,GE7)についてその細胞学的特性を検討した。1.[^3H]thymidineの取り込みによる増殖率の検討では、播種2日後では細胞数がまきこみ数より減少したが、その後、許容温度の33°Cで指数関数的に増殖し始め、対数増殖期で倍加時間はいずれも32-33時間だった。コンフルエントになった後は増殖のカーブが緩やかになった。一方、4日目に非許容温度の39°Cに移した群では一過性に増殖の亢進がみられ、その後細胞数は減少した。上皮細胞株の増殖の速い1種についてヌードマウスに移植した結果、腫瘍は形成されずこの細胞は腫瘍原性(tumorigenesity)を持たないことを確かめられた。2.抗プレケラチン抗体と角化型扁平上皮のマーカーであるサイトケラチン10に対する抗体で免疫染色すると、33°Cと39°Cの両者において、重層した上層の細胞に局在がみられた。超微形態学的には33°Cにおいて、GE1細胞は4-5層に重層し細胞同士はデスモゾームで結合していた。基底層から上層に行くにつれて細胞内のトノフィブリルが増え、最上層の細胞内にはkeratohyaline顆粒が形成され、基底層から上層に向かって角化扁平上皮としての細胞分化がみるれた。3.一方、39°Cにおいては、細胞層は大体1-2層からなり、下層にapoptotic bodyがみられた。

TUNEL染色では重層した細胞にTUNEL陽性細胞が検出され、39°Cでより多く検出された。培養細胞と培養上清を一緒に集めて、アポラダーキット(タカラ)を用いてDNAを抽出しladder formationを検討した結果、39°Cで明らかなラダーがみられ、39°Cではapoptosisに基づく細胞死が起こることがをあきらかになった。GE1細胞とGE6細胞には33°Cにおいてかすかにラダーが認められ、さらに重層する部位には少数ではあるがTUNEL陽性細胞も存在したので、33°Cにおいても上層の細胞に軽度にアポトーシスがおこってることが示された。今後はこれらの細胞を用いて炎症時を想定した実験系を考え、炎症の発生と進行に際しての歯肉上皮細胞の役割を検討したい。(1)歯肉上皮は解剖学的にjunctional epithelium,sulcular epithelium,そしてoral gingival epitheliumと分類され、それぞれに発現するケラチン蛋白が異なっている。既に得られている歯肉組織に由来する上皮細胞のうち主としてGE1とGE6の2株について、抗ケラチンモノクローナル抗体(k4,k10,k13,k19)と顆粒層の表層細胞の細胞膜肥厚の構成分子であるインボルクリン、そしてケラトヒアリン顆粒の構成分子のひとつであるフィラグリンの局在を免疫組織学的染色で検討し細胞学的特性を解析した。GE1とGE6細胞はどちらも通常の単層培養を1週間以上継続するだけで、多層となり、微細形態学的に重層扁平上皮類似の構造を形成した。GE1とGE6細胞両株のsuprabasal cellがk4とk13(粘膜上皮に特徴的)が陽性で、k19(単層上皮の特徴的ケラチン)は陰性であった。今回用いたsubmerged cultureでは電顕的には角質層は形成されなかったが、免疫組織学的染色では高分子量ケラチンであるk10陽性細胞がまれに重層化した細胞層の表層にみられ、またインボルクリンやフィラグリンも同様の部位に検出された。こららの結果からGE1とGE6はsulcular epitheliumの特徴をもち、さらに重層化した部位の表層細胞は角化の所見を示しているので、潜在的にはoral gingival epitheliumの特徴ももっているとみなされた。
リンフォカインおよび腫瘍浸潤リンパ球(TIL)による尿路性器癌増殖抑制機序の解析

63年度研究は前年度の各種サイトカインの抗腫瘍性の検討を基に担癌実験動物腫瘍の作成と、各種サイトカインのこれら実験腫瘍に対する抗腫瘍性を検討するとともに腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の自己腫瘍に対する抗腫瘍性ならびにサイトカインによる抗腫瘍効果増強を中心に実施した。マウス線維肉腫細胞(Meth A)において、ILー2とシゾフィラン(SPG)の併用によるTILの最も強い抗腫瘍性が認められ、lymphocyte activated killer(LAK)活性の誘導が示唆された(丸茂)。一方マウス可移植腎癌細胞KUー2に対してTumor necrosis factor(TNF)は強力な抗腫瘍性を示し、この効果はacyinomycinーDにより相乗的に増強された(出口)。ラット可移植膀胱癌BCー47においてもTILに強い抗腫瘍性が認められTILのpurificationにより単球あるいはマクロファージ様細胞に最も強い抗腫瘍性が存在することが確認された(橘)。これらTILの抗腫瘍性を増強する目的でTILとILー2、Interferon(INF)およびILー1の単独あるいは併用による検討がなされ、現時点でILー1とILー2との併用により最も強い抗腫瘍効果が認められている(出口、馬場)。またこれらTILとリンフォカインとの混合培養により各種サイトカイン産生誘導が確認されており、これら内因性サイトカインの抗腫瘍性を検討中である(田崎)。またこれら知見を基に、進行性腎癌、前立腺癌・膀胱癌に対するリンフォカインによる治療が試みられている(田崎)。以上の研究成果は尿路性器癌増殖抑制にリンフォカインおよびTILは相互的に関連し増強していることを示していると考えられる。各種泌尿器科系悪性腫瘍に対するリンフォカイン単独ならびに腫瘍浸潤リンパ球(TIL)とInterleukinー2(ILー2)との混合培養により産生される抗腫瘍効果を示すeffector moleculeならびにキラー細胞の誘導を試みた.また, in vivoでの実験系におけるマウス肉腫細胞株Meth A,マウス腎癌細胞株MKUー2に対し, Interferon(INF), ILー2,シゾフィラン(SPG), Tumor necrosis factor(INF)の単独あるいは併用投与による抗腫瘍効果,生存率の検討を行なった.TILとILー2の混合培養液中には, γーINF, TNFの産生が確認され, TIL自体もnatural killer(NK)活性ならびにlymphocyte activated killer(LAK)活性の増強が示された.これらのキラー細胞が従来のNK細胞,あるいはLAK細胞と同一のものか否か,現在標的細胞の種類を変えて,その殺細胞性を検討し同定している.In vivo担癌マウスに対するILー2とSPGの併用療法は,腫瘍径測定による抗腫瘍効果ならびに生存率の比較において,それぞれの単独の投与に比し有意な増強効果が示された.一方, TNFはMeth A MKUー2に対し強い腫瘍壊死効果を呈し,この作用はINFとの併用により著しく増強された.同様にTILとILー2の混合培養により産生された内因性TNFは, in vitroにおいて各種癌培養細胞に対し抗腫瘍効果を示した.以上の結果は,腫瘍浸潤リンパ球とリンフォカインの反応が各種の抗腫瘍性を示すeffector moleculeならびにキラー細胞を誘導することが判明した.また各種リンフォカインの抗腫瘍性は,単独より併用により増強されることが明らかで,その効果的併用方法を検討中である.63年度研究は前年度の各種サイトカインの抗腫瘍性の検討を基に担癌実験動物腫瘍の作成と、各種サイトカインのこれら実験腫瘍に対する抗腫瘍性を検討するとともに腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の自己腫瘍に対する抗腫瘍性ならびにサイトカインによる抗腫瘍効果増強を中心に実施した。
東アジア諸国における消費行動の比較分析-家計調査ミクロデータによる数量分析-

モヴシュクの研究では、ライフサイクル仮説に基づく消費行動分析に関し、年齢効果に注目した新手法を提案した上で、6カ国(日本、米国、英国、イタリア、台湾、タイ)の家計調査ミクロデータを用いて比較分析した。この研究はノンパラメトリック分析であり、伝統的な先行研究結果と比較し、理論的な年齢効果に対してこの新手法がより適合していると判明した。ホリオカは、日本のミクロデータを用いて消費貯蓄行動の様々な研究を行い、以下3つの結果を得た。第一に、退職後の高齢者が貯蓄を取り崩しておりライフサイクル仮説と整合的であること。第二に、日本の貯蓄率は以前よりも高くはなく、負債が増大している。第三に、90年代日本の長期停滞時に、消費は景気を下支えしており、原因は民間投資停滞であって、政府政策に問題があった。澤田は、韓国のパネルデータを用いて、通貨危機に対する家計への影響分析を行った。そして、私的トランスファーと豪奢財消費削減が重要なリスク対処法であった事が判明した。フィリピンの家計パネルデータ分析では、90年代の貧困削減要因において、土地等の物的資産ではなく、人的資本と非農業所得の重要性が増大した事が分かった。野村は、ミクロデータを用いて、日本の流動性制約を検証した。日本の負債行動はライフイベント(結婚・出産・進学等)と関連しており、ライフサイクルを考慮した検証が必要である。住宅、教育・自動車、その他ローンについて、タイミングと金額を段階的に決定するモデルを構築し、流動性制約を考察した。山下の研究では、東アジア諸国における消費行動の比較に関し、所得格差と貧困に焦点をあて、金融危機が与えた短期的及び中期的な影響を分析した。そして金融危機後に各国が実施した社会保障政策の効果を検証した。Movshukの研究では、ライフ・サイクル・モデルに基づく消費行動分析に関し、年齢効果に注目した新手法を提案した上で、台湾とタイの家計調査ミクロデータを用いて分析した。ホリオカの研究では、様々なミクロデータを用いて、日本における家計消費・貯蓄行動(特に貯蓄目的、老後貯蓄、退職行動、遺産動機、親子関係、借入制約)に関する理論的・実証的分析を行ない、ライフ・サイクル・モデル、利他主義モデル等の家計行動に関する理論モデルが日本において成立しているかを明確にした。澤田の研究は、フィリピン国家統計局による19852000年の家計調査ミクロデータを用い、同国における貧困指標の作成と、経済成長が果たした貧困削減効果を定量的に分析した。野村の研究では、家計の負債残高と貯蓄率の関係について、マクロ経済データを用いて、日本・韓国・米国の比較研究を行い、集計量における関係を確認した。負債残高と貯蓄率との関係をより詳細に調べるために、日本のミクロデータを用い、各世帯のライフステージを考慮して、家計の貯蓄・借入行動をモデル化し、実証分析により検証した。周の研究では、中国都市部の家計データを用いて、失業リスクの有無が中国の都市家計の消費と貯蓄額に与える影響を検証した。その結果、失業リスクが貯蓄率に正で有意な影響を与えていることや、食費及び養育費が失業リスクに影響されやすいこと等が判明した。

この研究はノンパラメトリック分析であり、伝統的な先行研究結果と比較し、理論的な年齢効果に対してこの新手法がより適合していると判明した。ホリオカは、日本のミクロデータを用いて消費貯蓄行動の様々な研究を行い、以下3つの結果を得た。第一に、退職後の高齢者が貯蓄を取り崩しておりライフサイクル仮説と整合的であること。第二に、日本の貯蓄率は以前よりも高くはなく、負債が増大している。第三に、90年代日本の長期停滞時に、消費は景気を下支えしており、原因は民間投資停滞であって、政府政策に問題があった。澤田は、韓国のパネルデータを用いて、通貨危機に対する家計への影響分析を行った。そして、私的トランスファーと豪奢財消費削減が重要なリスク対処法であった事が判明した。フィリピンの家計パネルデータ分析では、90年代の貧困削減要因において、土地等の物的資産ではなく、人的資本と非農業所得の重要性が増大した事が分かった。野村は、ミクロデータを用いて、日本の流動性制約を検証した。日本の負債行動はライフイベント(結婚・出産・進学等)と関連しており、ライフサイクルを考慮した検証が必要である。住宅、教育・自動車、その他ローンについて、タイミングと金額を段階的に決定するモデルを構築し、流動性制約を考察した。山下の研究では、東アジア諸国における消費行動の比較に関し、所得格差と貧困に焦点をあて、金融危機が与えた短期的及び中期的な影響を分析した。そして金融危機後に各国が実施した社会保障政策の効果を検証した。
メガリンの近位尿細管での生理的・病的機能の解析とその分子特性の腎臓内科学的応用

メガリン(megalin)はLDL受容体ファミリーに属する巨大蛋白で、特に腎近位尿細管上皮細胞の管腔側に高発現し、糸球体を濾過する様々なリガント蛋白をエンドサイトーシスによって再吸収し代謝するための一種のスカベンジャー受容体である。私たちは、メガリンを高発現するラット卵黄嚢上皮由来培養細胞(L2細胞)を用いて、メガリンが、尿毒素蛋白であるβ_2-ミクログロブリンを、細胞内に取り込み代謝する受容体であることを明らかにした。腎不全になるとβ_2-ミクログロブリンは血液中に蓄積し、長期透析患者ではそれが透析アミロイドーシスの原因になる。そこで私たちは、メガリンのそのような分子特性を臨床に応用するため、メガリンを発現する細胞を腎不全動物個体に皮下移植し、β_2-ミクログロブリンを取り込み代謝する系を開発した。これは今後、透析療法の弱点を補い、患者のQOLと生命予後を改善させるための新しい再生医学的補助治療となりうる可能性がある。その他、私たちは、メガリンのadvanced glycation endproduct(AGE)の細胞取り込み・代謝におげる関与について検討した。AGEは糖尿病において過剰に生成され、低分子量化したものは、糸球体を濾過し、近位尿細管上皮細胞で再吸収され代謝される。その過程が糖尿病性腎症、特に尿細管間質障害の発症・進展に関係する。さらにAGEは賢不全患者で血液中に蓄積し、尿毒素蛋白として透析アミロイドーシスや動脈硬化の発症に関与することが知られている。L2細胞を用いた解析により、私たちはメガリンがAGEの細胞取り込み・代謝に関与することを明らかにした。さらにその際、その細胞に発現して、AGEと結合し、メガリンと共役的に働いてAGEの細胞内取り込みに関わる分子を検索した結果、そのような特性を有する新規のAGE結合蛋白を発見した。その他私たちは、上記の研究に関連して、腎機能障害の進展機序についての解析を行った。1)糸球体から濾過され近位尿細管で再吸収される低分子量蛋白であり、腎不全時に蓄積し透析アミロイドーシスの原因となるβ_2-microglobulin(β_2-m)を^<125>Iで標識し、メガリンを発現するL2細胞における取り込みを検討した。その結果、β_2-mの取り込みは抗メガリン抗体によって特異的に阻害されること、すなわち、その取り込み過程にメガリンが関与することを明らかにした。さらにその取り込みは、メガリンの他の既知リガンドの取り込みを阻害する蛋白であるreceptor associated proteinでは阻害されず、他のリガンドの取り込みとは異なる機序が存在することが示唆された。今後、メガリンがβ_2-mの直接の受容体なのか、あるいはそのエンドサイトーシスに非特異的に関与するものなのかを明らかにしたい。さらにその取り込み機構を、腎不全の新しい血液浄化療法の開発に応用することを検討したい。2)ラットのメガリンの尿中排泄量を測定するためのELISA系を開発した。その系を用いて、近位尿細管上皮細胞(PTEC)障害モデルであるゲンタマイシン腎症を惹起したラットの尿中メガリン排泄量を経時的に測定した。その結果、既知のPTEC障害マーカーであるN-acetyl-β-D-glucosaminidase(NAG)およびβ_2-mよりも早期に増加することを明らかにした。すなわち尿中メガリン排泄量の測定は、PTEC障害早期マーカーになりうることが示唆された。現在、ヒトの測定系の開発も進めている。

3)メガリンの4つの機能ドメインに対する抗体を用いたHeymann腎炎惹起性についての論文を発表した(Yamazaki et el)。さらに、内耳の細胞におけるメガリンの発現の免疫組織化学的検討についての論文が受理された(Mizuta et al)。1)透析アミロイドーシスの原因蛋白であるβ_2-ミクログロブリンおよび他の低分子量蛋白がメガリンに結合することを、BIACOREを用いて明らかにした。またそれらが競合的にメガリンを介して細胞に取り込まれることを明らかにした。2)牛血清アルブミン(BSA)をadvanced glycation endproduct(AGE)化し、^<125>I標識して、BSA過剰存在下で、メガリンを発現する培養細胞(L2細胞)での、取り込み・代謝を検討した。その結果、L2細胞にはAGEについての選択的取り込み・代謝経路があり、その取り込み・代謝はメガリンに対する特異抗体で阻害されること、すなわちその取り込み・代謝にはメガリンが関与することを明らかにした。さらに他のAGE受容体との共役関係を検討中である。3)ラットおよびヒトにおける尿中メガリン排泄量のELISA測定系を開発した。ラットのゲンタマイシン腎症モデル(近位尿細管上皮細胞障害モデル)において、早期より尿中メガリン排泄量が低下することを明らかにした。ヒトの近位尿細管上皮細胞障害マーカーになりうるか、症例を集めて検討中である。4)私たちは昨年度までに、L2細胞を用いた実験系で、メガリンのエンドサイトーシス機能はP13キナーゼによって制御されることを明らかにしていた。本年度は、それがclass IA PI3キナーゼのdominant negative変異分子の遺伝子導入では抑制されず、class IB PI3キナーゼの特異的阻害剤である百日咳毒素によって抑制されることを見いだした。すなわち、メガリンの機能はclassIB PI3キナーゼによって制御されることを明らかにした。1)既に、メガリンが、透析アミロイドーシスを惹起する尿毒素蛋白であるβ2-ミクログロブリンを、細胞に取り込み代謝する受容体であることを明らかにしていたが、本年度は、メガリンを発現する細胞が、腎不全動物個体において、β2-ミクログロブリンを取り込み代謝する系を開発した。2)既に、メガリンを発現する培養細胞(L2細胞)がadvanced glycationendproduct(AGE)を特異的に取り込み代謝すること、そしてその系にメガリンが関係することを明らかにしていた。本年度は、メガリンはその細胞において、AGEの直接の受容体ではないが、間接的にそのエンドサイトーシスに関与することを明らかにした。そこで、その細胞に発現して、AGEと結合し、メガリンと共役的に働いてAGEの細胞内取り込みに関わる分子を検索した。その結果、新規のAGE結合蛋白を発見した。3)尿中のメガリン排泄量を定量するための測定系を開発していたが、ラットに蛋白尿を惹起させるモデルにおいて、蛋白尿の出現に伴って、近位尿細管上皮細胞による蛋白再吸収が亢進する時期に、尿中メガリン排泄量が増加し、その後、近位尿細管上皮細胞の障害が出現するにしたがって、その排泄量が低下することを明らかにした。
コンポジット・スカフォールド導入による新規再生軟骨の開発

自己修復能に乏しい軟骨疾患に対する治療は、耐久性、感染、ドナーサイトトラブルなどといった問題点があった。新しい治療法として再生軟骨医療が登場し、現在は自家軟骨細胞移植が普及したが適応には限りがある。したがって本来臨床において必要とされる軟骨を作製するためには足場素材(スカフォールド)の使用が不可欠である。申請者らは生分解性ポリマーとハイドロゲルの両者の併用をすることにより欠点を補い、利点を生かした次世代型再生軟骨であるコンポジット・スカフォールドを用いた新規再生軟骨の検討開発を進めている。本研究では早期臨床応用を目指し、その足場素材の90%を占めるハイドロゲルの再生軟骨組織内の胴体を検索し組織反応を抑えた新規コンポジット・スカフォールドの確立を目指す目的で実験を施行している。実験計画をもとに現在は足場素材の分解機構と分解産物の分子的解析中である。軟骨細胞自身によるハイドロゲル分解機構を評価するため、各種ハイドロゲルとヒト軟骨細胞を混和し軟骨細胞ペレットを作製、再分化誘導因子を含んだ培地にて培養を行った。3W後に回収し、そのペレット上清液の炎症性サイトカインをELISA法にて解析した。また、得られた再生軟骨をリアルタイムPCR解析法で解析、また、これらの切片を作製し、免疫染色でMMPsやIL-1因子等を用い現在解析中である。また、気孔連通型の生分解性ポリマーによる様々な足場素材を用いて、ヌードマウス皮下に移植して作製した再生軟骨の切片を超音波顕微鏡で解析しマッピングすることによって、通常のHE染色やトルイジンブルー染色では得られない再生軟骨の力学的特性を解析中である。実験計画をもとに、現在高気孔率型のPLGA多孔体と併用するハイドロゲルの検索を行った。まず、ヒト軟骨細胞を第2継代まで培養し10^7cellを各種ハイドロゲル100μlに懸濁し、高気孔率型生分解性ポリマーに浸漬させヌードマウス皮下に移植し2ヶ月後に摘出、生化学的、組織学的検討を施行した。現在の時点ではアテロコラーゲンの軟骨再分化能が優れていると考えられ、追加実験を行う予定である。また、足場素材の分解機構と分解産物の分子的解析も並行して実験している。軟骨細胞自身によるハイドロゲル分解機構を評価するため、各種ハイドロゲルとヒト軟骨細胞を混和し軟骨細胞ペレットを作製、再分化誘導因子を含んだ培地にて培養を行い、再生軟骨を再現しハイドロゲルの分解機構を解析している。今現在、再生軟骨のタンパク分解酵素遺伝子発現のパターンをPCRにて検討したところMMP-1、9、13因子にてゲル間による差を認めたため、さらにリアルタイムPCRによる検索や、組織学的検索、ペレット培養液上清に含まれるタンパク分解酵素についても計測する予定である。
水産系廃棄物からカドミウムを分離する微生物酵素の開発

ホタテガイ中腸腺やイカ肝臓は、有害重金属であるカドミウムを高濃度に含むため水産系廃棄物として扱われている。本研究では、これら有機性水産廃棄物の大部分を可溶化し、かつカドミウムを溶液に選択的に遊離させる酵素の取得を目的として、市販酵素のスクリーニングならびにホタテガイ中腸腺やイカ肝臓を効率良く加水分解する微生物を自然界からスクリーニングし、その有効性を検討した。得られた成果を以下に示す。(1)種々の市販酵素を用いてホタテガイ中腸腺を可溶化し、カドミウム収着細菌によるその可溶化液からのカドミウム分離に対する酵素の効果について検討した結果、ホタテガイ中腸腺の可溶化率が80%を超える酵素が見出された。また、可溶化率は60%だが、その後の菌処理によるカドミウム分離率が96%の酵素も見出すことができた。(2)前年度にスクリーニングした結果得られた高活性菌株を用いて、モデル基質でのタンパク分解活性を調べた結果、強力なプロテアーゼ活性をもつ菌株が得られた。実際のホタテガイ中腸腺タンパク質の可溶化試験ならびにイカ肝臓タンパク質の可溶化試験を行った結果、ホタテガイ中腸腺系では1種の菌株で、イカ肝臓系でも、1種の菌株に高い可溶化率(コントロール試験に比較して)が得られた。スクリーニングした高活性菌株を同定した結果、一般的に高いタンパク分解活性をもつことが知られているBacillus属の細菌が存在した。(3)カドミウムを含まない水産廃棄物であるホタテガイ生殖巣を可溶化する微生物のスクリーニングも検討した結果、高い可溶化活性をもつ微生物が得られた。さらに、市販酵素でホタテガイ精巣を可溶化した結果、ゲル状の物質が得られるという興味深い現象を発見した。本研究では、これら有機性水産廃棄物の大部分を可溶化し、かつカドミウムを溶液に選択的に遊離させる酵素の取得を目的として、今年度は、ホタテガイ中腸腺やイカ肝臓を効率良く加水分解する微生物を自然界からスクリーニングした。(1)道南地方50箇所で採取した土壌試料と活性汚泥を微生物源として、ホタテガイ中腸腺・イカ肝臓をそれぞれ炭素源・窒素源とする液体培地中で集積培養した。植え継ぎを12回線り返し、単集落分離法により菌を単離した。その結果、ホタテガイ中腸腺集積培養系からは8種類の菌株が、イカ肝臓集積培養系からは8種類の菌株が得られた。これらの菌株の細胞形態ならびにグラム染色性を観察した。(2)これらの菌株のタンパク質分解活性を評価するために、スキムミルク含有Luria-Broth寒天培地上でのハロ形成能力、ならびにAnson-荻原氏変法によるミルクカゼインの分解消化能力の測定を行った。その結果、高いタンパク分解活性をもつ菌株が、ホタテガイ中腸腺培養系からは2株、イカ肝臓培養系からも2株得られた。(3)(2)で得られた高活性菌株を用いて、実際のホタテガイ中腸腺タンパク質の可溶化試験ならびにイカ肝臓タンパク質の可溶化試験を行った。その結果、ホタテガイ中腸腺系では1種の菌株において、また、イカ肝臓系では、2種ともに高い可溶化率(コントロール試験に比較して)が得られた。次年度は、これら、高活性菌の、培養上清から硫安処理による沈殿生成、生成タンパク質の各種精製操作を行い、酵素粉末の取得を行う。

本研究では、これら有機性水産廃棄物の大部分を可溶化し、かつカドミウムを溶液に選択的に遊離させる酵素の取得を目的として、市販酵素のスクリーニングならびにホタテガイ中腸腺やイカ肝臓を効率良く加水分解する微生物を自然界からスクリーニングし、その有効性を検討した。得られた成果を以下に示す。(1)種々の市販酵素を用いてホタテガイ中腸腺を可溶化し、カドミウム収着細菌によるその可溶化液からのカドミウム分離に対する酵素の効果について検討した結果、ホタテガイ中腸腺の可溶化率が80%を超える酵素が見出された。また、可溶化率は60%だが、その後の菌処理によるカドミウム分離率が96%の酵素も見出すことができた。(2)前年度にスクリーニングした結果得られた高活性菌株を用いて、モデル基質でのタンパク分解活性を調べた結果、強力なプロテアーゼ活性をもつ菌株が得られた。実際のホタテガイ中腸腺タンパク質の可溶化試験ならびにイカ肝臓タンパク質の可溶化試験を行った結果、ホタテガイ中腸腺系では1種の菌株で、イカ肝臓系でも、1種の菌株に高い可溶化率(コントロール試験に比較して)が得られた。スクリーニングした高活性菌株を同定した結果、一般的に高いタンパク分解活性をもつことが知られているBacillus属の細菌が存在した。(3)カドミウムを含まない水産廃棄物であるホタテガイ生殖巣を可溶化する微生物のスクリーニングも検討した結果、高い可溶化活性をもつ微生物が得られた。さらに、市販酵素でホタテガイ精巣を可溶化した結果、ゲル状の物質が得られるという興味深い現象を発見した。
自閉症スペクトラムを対象とした感情コントロール促進プログラムの開発

本研究の目標は、高機能自閉症スペクトラム障害の青年・成人を対象とした感情コントロール促進プログラムを開発することである。2010年2011年度に、先行研究を参考にプログラムを開発した。プログラムは、自閉症スペクトラム障害の特徴について学習する内容とThe Cognitive Affective Training(CAT)kit(Attwood,2008)を用いた感情コントロール訓練の内容からならる認知行動療法である。2012年には、このプログラムを45人からなる小集団で実施し効果を検証した。その結果、感情理解や生活全体の機能の改善が認められた。本研究の最終目的は,高機能自閉症スペクトラムの青年・成人を対象とした感情コントロール促進プログラムを開発することである。本年は,その基礎研究として,自閉症スペクトラム青年・成人の自己や他者の感情理解の特性について研究を行った。自己の特性については,欧米でASDの診断・評価のための直接観察尺度としてゴールド・スタンダードとされているAutism Diagnostic Observation Schedule-Genetic(以下ADOS-G)を用い,ASD群(19名)とコントロール群(非ASD群19名)を比較することで,その特性を検討した。ADOS-Gの対人コミュニケーションの質問への回答内容について質的分析を行った結果,自分の感情を説明できないところがみられた。また,他者の感情理解については,高次の「心の理論」課題(Motion Picture Mind Reading Task, Wakabayashi 2011)を用いた研究を行った。この研究の結果,誤信念課題のような基本的な「心の理論」課題を通過する高機能の成人においても,他者の皮肉や相手を思った嘘などの複雑な感情理解においては,ASDは特異的に困難があることが示された。こうした特徴を踏まえて,平成23年度に計画している介入研究のための文献研究を行った。Attwoodの著書や論文(2005)をはじめ,いくつかのASDの子どもや少年を対象とした感情(不安)コントロールを目的とした論文があった。これらの研究は,認知行動療法を採用して個人介入及び小集団介入を行っており,一定の効果を見出していた。本研究でも,小集団による認知行動療法を検討しており,研究デザインや研究参加者の選定をしている段階である。本研究の最終目標は,高機能自閉症スペクトラムの青年・成人を対象とした感情コントロール促進プログラムを開発することである。平成22年度の研究で把握された青年期・成人期の高機能自閉症スペクトラムの感情認知の特徴を考慮して,実際の感情コントロール促進プログラム(小集団認知行動療法)を作成した。内容は,独自に開発した自閉症スペクトラム特性の理解プログラムに加え,感情コントロール促進プログラムは,すでに開発され一定の検証がなされたAttwood(2009)のプログラムに修正を加えたものである。1クール8回で,1回100分で実施している。第1回自閉症スペクトラムの特徴,第2回リラクゼーションと嬉しい気持ち,第3回リラクゼーションと安心感,第4回他者との違いと悲しい気持ち,第5回得意なところと不安な気持ち,第6回苦手なところと不安への対処法,第7回怒りの気持ちと対処法,第8回まとめ(自閉症特性と気持ちの伝え方)。プログラムの中で,参加者各自にプリントなどを通してワークをしてもらい,最終的に参加者独自のノートができるようにしてあり,グループ終了後も活用してもらえるようになっている。現在,小集団で実施し効果を測定中である。<効果検証の方法>被験者:16歳以上の青年期・成人期の自閉症スペクトラム者20名。1グループ45名で45グループ実施する。手続き:45名からなる小集団で,感情コントロール促進プログラムを実施し効果を測定する。自己記入式質問紙(WHO-QOL)や専門家評価(GAF)や他者の感情理解の「心の理論」課題等を行い,プログラムの効果を測定しているところである。現在まで2グループが終了しているが,GAFにおいて改善がみられている。本研究の最終目標は,高機能自閉症スペクトラム(Autism Spectrum Disorders:以下ASD)の青年・成人を対象とした感情コントロール促進プログラムを開発することである。平成24年度は,平成23年度に開発したプログラムの効果について検討した。プログラムは小集団認知行動療法であり,内容は独自に開発したASD特性に関する心理教育プログラムと,Attwood(2009)によって開発され一定の検証がなされている自己の感情認知プログラムを修正したものから構成されている。週1回各回100分,1クールで計8セッションの実施とし,1クールのグループ人数は45名である。プログラムの効果検証は,介入群と統制群に割りつけるランダム化比較試験によって行った。

参加者は,18歳以上のASD成人35名(介入群の男女比10:8,平均年齢33歳,平均FIQ103;統制群の男女比12:5,平均年齢31歳,平均FIQ104)であり,全体で介入グループを4つ実施した。参加者は,ASDの診断以外に,Autism Spectrum Observation Schedule(自閉症観察診断検査:ADOS)の得点なども参加条件とした。評価項目は,生活の満足感に関する自己記入式質問紙であるWHO-QOL,生活上の機能についての専門家評価であるGAF,及び他者の感情理解を調べる「高次の心の理論」課題(PCによる客観テスト)である。評価は介入前後1カ月以内に実施した。その結果GAFと「高次の心の理論」課題の成績に介入群のみに有意な改善がみられ,開発した感情コントロール促進プログラムには十分な有効性があると考えられた。計画通りに進行し,先行研究に鑑み自閉症スペクトラム障害の成人を対象とした感情コントロール促進プログラム(小集団認知行動療法プログラム)を作成した。プログラムは,視覚的な教材を用いて感情認知を高めるパートと自閉症特性について学ぶパートからなる。また,現在,グループ実施前後で,WHO-QOL,GAFのスコアを測定しプログラムの有効性を検討している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度前半期まで,効果検証のための成人グループを実施し,その効果をまとめる。また,その効果検証の結果をみて,プログラムの改変を行い,自閉症スペクトラムの青年・成人を対象としたより良い感情コントロール促進プログラム(小集団認知行動療法プログラム)を作成する。
「ナノ３Ｄペン」による機能的ナノ構造の造形

粒子の凝集のしやすさと粒子同士の特異的な結合の両方を満たす条件を探すべく,DNA配列,Soret効果を増強するためのPEG(ポリエチレングリコール)の濃度および分子長,レーザー強度などの条件をチューニングした.しかし,レーザー強度が弱すぎると粒子を補足できず,一方で,レーザー強度を上げすぎると対流が生じて,やはり,粒子の補足が困難であった.現在まで,満足いくレベルでの最適化ができていない.引き続き研究を続けていく.並行して,パッシブなコロイド粒子ではなく,自ら遊泳するアクティブな粒子であるバクテリアを担体とする構造体形成も試みた.シリコーンゴムで作製した薄いチャンバーにバクテリア(サルモネラ)溶液を流し,赤外レーザーを照射すると,サルモネラが照射部分に強く凝集することが分かった.これは,サルモネラが温かいところに集まる温度走性を持つことを表している.また,レーザーを走査することで,任意の(2次元の)形状にバクテリアを集合できることを発見した.コロイド粒子のSoret効果によるレーザー凝集では,条件の細かいチューニングが必要となるが,バクテリアの場合,1ー2°C程度の温度上昇でも自ら遊泳して凝集体を容易に形成するので,構造形成に向けて有力な系となりうることが分かった.今後の課題として,菌体表面にヘアピンDNAを修飾し,バクテリア同士を特異的に接着させる必要がある.また,粒子複合体に動的な機能を持たせるため,制限酵素を用いた運動機構の導入を試みた.原理の実証として,DNAヘアピンではなく異なる配列のDNAを2種類の粒子表面に修飾し,さらにこれらのDNAの両方に結合する第3の1本鎖を加えた.片方の2本鎖結合部位にはニッキング制限酵素の認識配列を配置することで,酵素を用いて動的に結合を切断・復活できるようにした.現在,この系を用い,粒子複合体に変形機能を持たせることを試みている.本研究課題では,ペンで描くようにナノ構造を自在に造形できる「ナノ3Dペン」を開発することを目指している.従来のリソグラフィ技術では困難な動的で柔らかく機能的な構造を簡単・高速・安価に造形できると期待できる.化学的性質,硬さ,磁性などを局所的に変えることが可能であり,生体分子や細胞をナノ構造により制御する新しい工学分野を切り拓く.本課題では,「高分子溶液中での局所加熱による粒子凝集技術」と「DNAヘアピンを用いた粒子接着技術」を組み合わせてナノ3Dペンを開発し,動的で多様な機能を持つナノ分子ロボットや,生体分子や細胞を任意のパターンで空間配置するプラットフォームを実現することを目指している.平成29年度は,まず,高分子(ポリエチレングリコール)溶液中で,直径500nmの微小粒子を長波長(1440nm)の赤外レーザーで集めて加熱して粒子が凝集することを確認した.その後,ヘアピンDNAで修飾した直径500nmの微小粒子を凝集させることで,赤外レーザーを照射した箇所でのみ粒子の塊が形成させることに成功した.レーザー位置を手動で動かすことで,ガラスキャピラリー上に構造を造ることができた.さらに,ガルバノミラーを導入し,赤外線レーザーをPC制御で走査できる実験系を組んだ.これを利用し,ガラスキャピラリ上で構造を造形することに成功した.特に,単に一方向に走査するのではなく,折り返しを行いながら走査することで,構造を確実に造形できることを発見した.しかし,現状では構造形成に時間がかかり効率が悪い.より最適な溶液条件およびガラス表面の化学修飾法を模索する必要がある.平成29年度は,1DNAの設計およびナノ粒子の凝集実験,および,2PC制御による造形の自動化,さらに,3複数種類の粒子を用いた複雑な構造の造形を目指した.このうち,1および2は終了したが,3には手がつけれらていない.ひとつの問題は,高分子濃度を濃くすれば凝集力が強まるが,一方で,溶液の粘弾性が強くなり構造体形成に支障が出ることである.これを解決するため,溶液条件(高分子の種類および濃度等)のチューニングに時間がかかり,まだ十分に最適化できていない.今後,DNA配列から見直し,凝集のしやすさと粒子同士の特異的な結合の両方を満たす最適な条件を探していく.また,ガラス表面への粒子の特異的結合を実現するため,ガラス表面の化学修飾に取り組んでいる.文献を調査して様々な方法を試した結果,ある程度の特異性は得ることができた.しかし,まだ非特異的なガラス表面への粒子接着が見られる.引き続き最適な方法を探していく.粒子の凝集のしやすさと粒子同士の特異的な結合の両方を満たす条件を探すべく,DNA配列,Soret効果を増強するためのPEG(ポリエチレングリコール)の濃度および分子長,レーザー強度などの条件をチューニングした.しかし,レーザー強度が弱すぎると粒子を補足できず,一方で,レーザー強度を上げすぎると対流が生じて,やはり,粒子の補足が困難であった.現在まで,満足いくレベルでの最適化ができていない.引き続き研究を続けていく.並行して,パッシブなコロイド粒子ではなく,自ら遊泳するアクティブな粒子であるバクテリアを担体とする構造体形成も試みた.シリコーンゴムで作製した薄いチャンバーにバクテリア(サルモネラ)溶液を流し,赤外レーザーを照射すると,サルモネラが照射部分に強く凝集することが分かった.これは,サルモネラが温かいところに集まる温度走性を持つことを表している.また,レーザーを走査することで,任意の(2次元の)形状にバクテリアを集合できることを発見した.

コロイド粒子のSoret効果によるレーザー凝集では,条件の細かいチューニングが必要となるが,バクテリアの場合,1ー2°C程度の温度上昇でも自ら遊泳して凝集体を容易に形成するので,構造形成に向けて有力な系となりうることが分かった.今後の課題として,菌体表面にヘアピンDNAを修飾し,バクテリア同士を特異的に接着させる必要がある.また,粒子複合体に動的な機能を持たせるため,制限酵素を用いた運動機構の導入を試みた.原理の実証として,DNAヘアピンではなく異なる配列のDNAを2種類の粒子表面に修飾し,さらにこれらのDNAの両方に結合する第3の1本鎖を加えた.片方の2本鎖結合部位にはニッキング制限酵素の認識配列を配置することで,酵素を用いて動的に結合を切断・復活できるようにした.現在,この系を用い,粒子複合体に変形機能を持たせることを試みている.平成30年度前期では,(1)粒子に修飾するヘアピンDNAの配列を設計しなおして,温度の上げ下げ時の接着のヒステリシスをできる限り大きくすることで,粒子同士の接着の特異性を高める.また,ガラス表面の化学修飾法を改良して,粒子とガラスの間の接着の特異性を高める.まだ試していないポリアクリルアミドブラシによる非特異的吸着の抑制が効果的だと考えている.(2)その後,溶液条件(高分子の種類,長さ,濃度等)を網羅的にスクリーニングして粘弾性を定量的に評価し,粒子の凝集と構造体形成に最適な条件を探す.本年度後期には,(3)ガラス表面での自動走査による構造体形成を目指す.さらに,複数種類の粒子の接着を行い,抗体付き粒子を用い,GFP分子のパターニングを目指す.
実験動物施設内の各種実験動物アレルゲンの調査とアレルギー予防対策

我々は今までに実験動物施設内のマウスアレルゲン量を免疫科学方法を用いて定量するとともにマウスアレルギ予防対策を行ってきた。今年度は同一手法を用いて犬飼育施設内の犬アレルゲンの測定を行うとともに犬アレルゲンの発生量や暴露量を少なくする対策を試み,アレルゲン量の減少程度から対策の評価を行った。すなわち,犬20頭以上飼育している実験動物施設内にエア-サンプラーを設置し,空中犬アレルゲンをサンプラー内のフィルターに捕集し,緩衝液でフィルターから犬アレルゲンを抽出後,免疫科学方法で犬アレルゲン量を測定した。測定条件に合致した犬飼育施設が少ないこと,サンプラーのエア-ポンプの故障などが重なり,今だ発表するに十分なデータ量が得られていない。また,飼育方法の改良,飼育室内気流方向の考慮などによる犬アレルギー予防対策についても検討を行っているが十分なデータが得られていない。今後さらに継続してデータを蓄積して成果を発表するつもりである。当研究課題では,実験動物アレルギーを引き起こす実験動物アレルゲン(アレルゲン)の空中濃度をアレルゲンの絶対量(蛋白量)で高感度に測定する方法を開発し,開発した測定方法を用いて実験動物施設内のアレルゲン濃度を調査し,アレルゲンの発生量や暴露量を少なくする対策を検討する。このためには,各種実験動物の主要アレルゲンの精製を行ない,精製した主要アレルゲンに対する抗体を作成する必要があり,現在以下に述べるところまで研究が進んでいる。各種実験動物の主要アレルゲンの精製マウス,ラット,モルモットイヌ,ネコの主要アレルゲンを精製した。抗主要アレルゲン抗体の作成マウス,モルモット,イヌ,ネコの精製主要アレルゲンに対する抗体を作成した。酵素抗体法の確立マウス,モルモット、イヌ,ネコの主要アレルゲン量の酵素抗体法による測定法を確立した。
構造実験情報の最大化と知識ベ-ス化

本研究の目的は、鋼構造物の中でも最も重要な構造要素である柱材を例にとって、構造研究者や構造技術者の間で共有されるべき構造実験情報に対して、これを適切に保存・抽出・参照する手順を導くことである。初年度では、構造実験情報として必要な項目と、その分類法を検討した。本研究の最終年度である本年度の成果は以下の通りである。1.柱の耐力に関する情報を過去の実験結果から抽出し、これを関係デ-タベ-スとして保存した。2.柱の変形能力に関する情報を、塑性率という指標を用いて過去の実験から抽出し、これを関係デ-タベ-スとして保存した。3.構造実験情報を適切に保存・抽出することによって可能になる新しい展開の一例として、上記のデ-タベ-スを用い、現行の設計規定の精度を検討した。この結果得られた情報によって、信頼性設計において必要となる柱の耐力や変形能力のばらつきの程度を定量化できることを示した。4.柱の耐力と変形能力に関する感度解析を実施し、材料特性や残留応力などの諸因子が、柱の耐力と変形能力に及ぼす影響の程度を定量化した。またこの結果を、プロダクションル-ルを用いて知識ベ-スとして記述した。5.上記の知識ベ-スと構造実験情報を保存したデ-タベ-スを組み合わせることによって、いろいろな因子が複雑に相関しあって表現されている構造実験情報を効率よく解釈する上で、知識ベ-スが有益な手段となりうることを立証した。具体例として、柱材の耐力と変形能力を左右する諸因子の影響度を簡潔に定量化し、設計規定の精度の向上を図る上で考慮すべき項目の優先順位を同定した。本研究の目的は、鋼構造建築物のなかでも最も重要な構造要素の一つである柱材を例にとって、構造研究者や構造実務家の間で共有されるべき貴重な構造実験情報に対して、それを効率良く保存しまた必要な情報を簡潔・適切に取り出すことを可能にする知識ベ-スのプロトタイプを試作することである。本年度においては、構造実験情報として保存すべき情報がなにであるかを同定し、またその情報が知識ベ-スとして保存されるためにはどのように分類されるべきであるかを明らかにすることを目的として、鉄骨柱材の構造特性を左右する因子の抽出、構造特性を特徴づける指標の抽出、各因子・指標間の相関度と重要度の分析を中心に研究を進めた。主な成果を以下に示す。1.過去20年間に公表された、鉄骨柱材に対する構造実験に関する論文調査を行い、実験の基本変数と、実験結果として得られている鉄骨柱材の特性を蓄積したデ-タベ-スを構築した。2.このデ-タベ-スを用いて一連の相関分析を実施し、柱材の構造特性を左右する因子と構造特性を特徴づける指標を同定した。3.また不足資料を補うために構造実験も実施し、この結果に基づいて、構造特性を左右する因子の相関度と重要度を定量化した。4.鉄骨柱材の挙動を求めるための数値解析プログラムも整備し、一連の数値解析を通じて、柱材の挙動を支配する因子の特に柱材の強度特性に及ぼす感度を分析した。5.24の分析結果に基づいて、柱材のための実験情報を知識ベ-スに組み込むための手順を開発した。

3.構造実験情報を適切に保存・抽出することによって可能になる新しい展開の一例として、上記のデ-タベ-スを用い、現行の設計規定の精度を検討した。この結果得られた情報によって、信頼性設計において必要となる柱の耐力や変形能力のばらつきの程度を定量化できることを示した。4.柱の耐力と変形能力に関する感度解析を実施し、材料特性や残留応力などの諸因子が、柱の耐力と変形能力に及ぼす影響の程度を定量化した。またこの結果を、プロダクションル-ルを用いて知識ベ-スとして記述した。5.上記の知識ベ-スと構造実験情報を保存したデ-タベ-スを組み合わせることによって、いろいろな因子が複雑に相関しあって表現されている構造実験情報を効率よく解釈する上で、知識ベ-スが有益な手段となりうることを立証した。具体例として、柱材の耐力と変形能力を左右する諸因子の影響度を簡潔に定量化し、設計規定の精度の向上を図る上で考慮すべき項目の優先順位を同定した。