hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
促進試験における促進時間の実際の暴露時間への換算に関する萌芽的研究

本研究では,カルシウム溶脱の実験的予測手法を構築した.そして,本手法を用い,コンクリートおよび改良地盤からのカルシウム溶脱に及ぼす要因に関して検討した.その結果,以下の知見が得られた.・カルシウム溶脱促進手法に電気化学的促進試験を用い,かつ,これと拡散試験を組合わせることで,促進期間を実時間に換算できるカルシウム溶脱に関する実験的予測手法を構築した.本手法は,「ある促進期間で促進溶脱させたカルシウム量は,実際の現象においては促進期間前後の拡散試験で得られた拡散カルシウム溶脱速度の平均速度で溶脱する」と仮定し,促進期間を実期間に換算するものである.・構築された実験的予測手法を用い,100年に渡るコンクリートからのカルシウム溶脱の予測を行った.さらに,予測結果を約100年間水分に接していたコンクリート部材の調査結果と比較した.その結果,本実験的予測手法の妥当性を確認できた.・水セメント比が異なるコンクリート供試体に対し,実験的予測手法と数値解析的予測手法を適用し,約40年後のカルシウム溶脱の予測を行った.その結果,両者の予測はほぼ一致した.実験的予測手法と数値解析的予測手法を用い,水セメント比がカルシウム溶脱に及ぼす影響について予測した.その結果,低W/Cほどカルシウム溶脱深さは小さく,暴露面近傍での物性変化の割合は低W/Cほど顕著になると予測された。・電気化学的手法と拡散試験を組合わせた手法により,改良地盤からのCa溶脱に関する長期予測手法を構築した.・上記の手法を用い,配合および粘土種類がCa溶脱に及ぼす影響を把握した.・本手法と数値解析手法を組合わせることにより1000年を越える超長期耐久性を予測する手法を構築した.本手法の妥当性は実構造物における調査と比較することにより行った.本年度の検討の結果,以下の知見が得られた.1カルシウム溶脱促進手法に電気化学的促進試験を用い,かつ,これと拡散試験を組合わせることで,促進期間を実時間に換算できるカルシウム溶脱に対する実験的予測手法を構築した.本手法は,「ある促進期間で促進溶脱させたカルシウム量は,実際の現象においては促進期間前後の拡散試験で得られた拡散カルシウム溶脱速度の平均速度で溶脱すると仮定し,促進期間を実期間に換算するものである.また,本方法を用いることにより以下の知見が得られた.〓上記の方法を用いることにより,カルシウム溶脱に対する抵抗性を向上させる方法として,(1)エーライトを多く含むセメントを用いること,(2)混和材を用いること,(3)養生期間を十分に設けることが有効であることが確認された.〓セメント種類や混和材種類によらず,Ca溶脱後のビッカース硬さとCa/Siモル比は直線関係にあることが確認された.2コンクリート供試体中での塩害および中性化による鉄筋の腐食速度の温度依存性に関して評価した結果,本論文の範囲内(周辺温度20°C40°C,湿度55%)では,温度の上昇に伴い,鉄筋の腐食速度が速くなることが確認された.また,鉄筋の腐食速度と温度の関係は見かけ上アレニウスの式に従うことが確認された.その結果,コンクリート中鉄筋の腐食に対する見掛けの活性化エネルギーを算出することができた.3温度の上昇に伴い,塩化物イオンの浸透,中性化の進行および酸素の透過量は速くなることが確認された.また,上記は見かけ上アレニウス式に従うことが確認された.本研究では,カルシウム溶脱の実験的予測手法を構築した.そして,本手法を用い,コンクリートおよび改良地盤からのカルシウム溶脱に及ぼす要因に関して検討した.その結果,以下の知見が得られた.・カルシウム溶脱促進手法に電気化学的促進試験を用い,かつ,これと拡散試験を組合わせることで,促進期間を実時間に換算できるカルシウム溶脱に関する実験的予測手法を構築した.本手法は,「ある促進期間で促進溶脱させたカルシウム量は,実際の現象においては促進期間前後の拡散試験で得られた拡散カルシウム溶脱速度の平均速度で溶脱する」と仮定し,促進期間を実期間に換算するものである.・構築された実験的予測手法を用い,100年に渡るコンクリートからのカルシウム溶脱の予測を行った.さらに,予測結果を約100年間水分に接していたコンクリート部材の調査結果と比較した.その結果,本実験的予測手法の妥当性を確認できた.・水セメント比が異なるコンクリート供試体に対し,実験的予測手法と数値解析的予測手法を適用し,約40年後のカルシウム溶脱の予測を行った.その結果,両者の予測はほぼ一致した.実験的予測手法と数値解析的予測手法を用い,水セメント比がカルシウム溶脱に及ぼす影響について予測した.その結果,低W/Cほどカルシウム溶脱深さは小さく,暴露面近傍での物性変化の割合は低W/Cほど顕著になると予測された。・電気化学的手法と拡散試験を組合わせた手法により,改良地盤からのCa溶脱に関する長期予測手法を構築した.・上記の手法を用い,配合および粘土種類がCa溶脱に及ぼす影響を把握した.・本手法と数値解析手法を組合わせることにより1000年を越える超長期耐久性を予測する手法を構築した.本手法の妥当性は実構造物における調査と比較することにより行った.
小脳皮質構築過程における血管・ニューロン・グリア間相互作用機構の追究

生体の器官の組織の構築と機能維持には、ライフラインとしてその栄養にあたる血管系の発生が密接に関連する。中枢神経系においても、発生過程に応じて脈管形成、血管新生や、血管ネットワークの走行パターンが巧妙に制御されていることが考えられ、マウスの小脳をモデルシステムとする解析を進めた。小脳の組織構築においては、皮質の層構築とともに、前後方向、内外側方向での区域化が特徴的である。内外側方向の区域化として、縦縞状の小脳皮質傍矢状帯域が可視化されるトランスジェニックマウスを解析したところ、傍矢状帯域帯域の境界部によく一致して分子層を貫く血管が走行しており、出生直後からのおよそ5日間では、Pax6免疫陽性の顆粒細胞がこの部で移動する所見が認められたことから、血管構造がニューロンの細胞移動に関与している可能性が考えられた。小脳皮質構築における顆粒細胞移動の早期過程に注目して、Pax6、GFAP、PE-CAMに対する多重免疫染色法によって、ニューロン、グリア、血管の関連について追究した。また、出生3日後からのマウス小脳スライス培養系において、血管構造に注目して、血管が成長・維持されつつ顆粒細胞の移動が追跡できる条件を検討した。さらに、Eph-Ephrin系のメンバーについて、in situ hybridization法と免疫組織化学法の多重染色によって発現細胞の同定を試み、小脳皮質の分子層において、回路網形成期に応じて、層構造を貫く血管から層内での横方向への分岐が制御的に生じることが示唆された。生体の器官の組織構築と機能維持には、ライフラインとしてその栄養にあたる血管系の発生が密接に関連する。中枢神経系の発生過程においても、脈管形成、血管新生や動静脈分化のステップとともに、血管ネットワークの走行パターンが巧妙に制御されていると考えられる。小脳においては皮質層構築とともに矢状方向、内外側方向に区域化されることが機能発揮に不可欠な神経解剖学的基盤である。縦縞状の小脳皮質傍矢状帯域を可視化できるトランスジェニックマウスの組織形態学的解析から、出生後の帯域の境界部に移動中の顆粒細胞を検出し、この部位に高頻度に血管が走行する所見を得たことから、グリア細胞に加えて血管構造の細胞移動への関与の可能性が考えられた。今年度は、小脳皮質構築過程における血管、プルキンエ細胞や顆粒細胞、バーグマングリアの位置関係を記述し、これら細胞間の相互作用の可能性を検証することで協調的な血管・神経発生の可能性を追究する第一歩とした。傍矢状帯域を最初に検出できる胎生15日以降の小脳を栄養する血管ネットワークの構築について、特に脳軟膜脈管叢から皮質へと内向きに進入するポイントと傍矢状帯域パターンの関連に注目して蛍光抗体染色法で解析した。さらに、whole-mount in situ hybridization法を行ってマウス胎生後期小脳で縦縞状の遺伝子発現パターンを見いだした遺伝子群のうち、血管新生の制御機能が報告されているeph-ephrin系について、in situ hybridization法と免疫組織化学法の多重染色で発現細胞の同定を試みた。
３次元多様体の幾何構造と組合せ構造

(1)Ian Agolがアナウウンスした「3次元双曲空間上の2つの放物的変換が生成する自由でない離散群は,2橋結び目群Heckoid群に限る」という分類定理に完全な証明を与えることを目指した秋吉宏尚,大鹿健一,John Parkerとの共同プロジェクトにおいて,双曲的軌道体のある無限族がAgolのリストに加わるという可能性が残る,という問題を除いては,証明をつけることができた.次年度はこの無限族を排除できることの証明を目指す.これまでの研究を通して,2橋結び目群,Heckoid群,2つの放物的変換が生成するクライン群の解明が進み,また研究成果も論文として着実に発表している.(1)Ian Agolがアナウウンスした2つの放物的変換が生成するクライン群の分類定理の証明において,残りの双曲軌道体の無限族が排除できることを証明する.(1)双曲的2橋絡み目群およびHekoid groupの放物的生成対は,上方あるいは下方メリディアン対に限ることを,Adams-Boileauの観察およびアレクサンダー不変量を用いる事により証明した。これは,昨年度にDonghi Leeとの共同研究により得ていたツイスト結び目に関する結果を完全に一般化し,Ian Agolがアナウンスしていた結果に別証明を与えるものである。応用として,2橋絡み目群の間の全射準同型が,メリディアン保存であり,従ってOhtsuki-Riley-Sakuma構成により得られるものに限ることを証明した。(相見俊介,Donghi Leeとの共同研究:論文準備中)(2)上述のAgolのアナウンスで示唆しているアイデアを解明して一つの解釈を与えた。(3)双曲的交代絡み目補空有間のThurston-Yokota分解の辺のホモトピー類は非自明であることを証明した。これより,この分解が定める貼り合わせ方程式の解で,離散忠実表現を導くものが存在する事が示された。(横田佳之との共同研究:論文準備中)2橋絡み目群およびHeckoid groupの放物的生成対の分類はAgolによりアナウンスされていたが,論文は発表されていなかった。この状況で,Agolのアナウンスの誤りを修正し,きちんとした別証明をつけたのは,意義ある研究であると考える。また,いままでよく理解できなかったAgolのアイデアの解明が進んだことも順調な進展と捉える事ができる。(4)任意の強可逆結び目は,付随する可逆対合で不変なザイフェルト曲面を持つことを,アルゴリズムを与えることにより証明した.また,強可逆結び目の不変ザイフェルト種数(不変ザイフェルト曲面の最小種数)と通常の種数の間のギャップはいくらでも大きくなることを証明した.これは日浦涼太氏との共同研究である.これまでの研究を通して,2橋結び目群,Heckoid群の性質,交代結び目の性質,写像類群の測地rayへの作用,の解明が順調に進んでいる.また,研究成果も論文を通して着実に発表している.(1)Ian Agolがアナウウンスした「3次元双曲空間上の2つの放物的変換が生成する自由でない離散群は,2橋結び目群とHeckoid群に限る」という分類定理において.2つのケースの内,一方のケースについては完全な理解が得られた.これは秋吉宏尚,大鹿健一,John Parkerとの共同プロジェクトである.来年度は残りのケースの解明を目指す.(2)過去の研究で,2以上の自由周期を持つ双曲結び目,およびは3以上の自由周期を持つ素結び目はキラルであることを証明し,また素という条件を外すと,任意の自然数nに対して,自由周期nをもつキラル結び目を構成していた.そこで自由周期2を持つ素結び目でアキラルなものは存在するかという問題が未解決問題として残っていた.この問題に対して肯定的解答を与えた.より正確には,(a)各符号ε=+,-に対して,自由周期2を持ちεアキラルであるが-εアキラルでない素結び目が無限に存在すること,(b)自由周期2を持ち+アキラルかつ-アキラルな素結び目が無限に存在することを証明した.さらにそのような結び目の外部空間のJSJ分解のルートに関する詳細な情報を得た.これはLuisa Paoluzzi氏との共同研究である.これまでの研究を通して,2橋結び目群,Heckoid群,2つの放物的変換が生成するクライン群,そして結び目の対称性の解明が進み,また研究成果も論文として着実に発表している.(1)Ian Agolがアナウウンスした「3次元双曲空間上の2つの放物的変換が生成する自由でない離散群は,2橋結び目群Heckoid群に限る」という分類定理に完全な証明を与えることを目指した秋吉宏尚,大鹿健一,John Parkerとの共同プロジェクトにおいて,双曲的軌道体のある無限族がAgolのリストに加わるという可能性が残る,という問題を除いては,証明をつけることができた.次年度はこの無限族を排除できることの証明を目指す.これまでの研究を通して,2橋結び目群,Heckoid群,2つの放物的変換が生成するクライン群の解明が進み,また研究成果も論文として着実に発表している.(1)Agolのアナウンスを完全に解明し,2つの放物変換で生成されるクライン群が2橋絡み目群とHeckoid groupに限ることを証明する。(2)John Parker, Gaven Martin,秋吉宏尚,山下靖と協力して,2つの放物変換で生成されるクライン群全体が作る空間を,力学系的観点から研究し,その「網目構造」を解明する。

(3)横田佳之と協力して,交代結び目補空有間のThurston-Yokota分解が幾何的であるという予想の証明に挑戦する。(4)Brian Bowditchと協力して,穴あき曲面のgeodesic rayの空間への写像類群の作用の非遊走集合のハウスドルフ次元が1よりも真に小さいことを証明する。Ian Agolによりアナウンスされたが論文は発表されていない,2つの放物変換で生成されるクライン群の分類定理の証明がようやく復元できるかもしれないと思えるようになってきた.まずはこのAgolのアナウンスにきちんとした証明を与えることが大切であると考えている.その上で,2つの放物変換が生成するクライン群全体の空間が作る「網目構造」の解明に向かいたい.(1)Ian Agolがアナウウンスした2つの放物的変換が生成するクライン群の分類定理の証明において,もう一方の残りのケースの解明を目指す.(3)結び目群のシンメトリー群の実現問題に取り組む.(1)Ian Agolがアナウウンスした2つの放物的変換が生成するクライン群の分類定理の証明において,残りの双曲軌道体の無限族が排除できることを証明する.
グリコカリックスの敗血症重症化における基礎的検討

血管内皮グリコカリックスについては、損傷により血管透過性が亢進することが示されている。また損傷することでin-vitroモデルでLPSを投与した際の炎症増悪が報告されている(ISRN Nephrol. 2014)。しかし敗血症性ショックモデルでヒアルロン酸投与と生存率の関係を検討した報告は現在までになされていない。このため、本研究は敗血症性ショックと血管内皮グリコカリックス保護・ヒアルロン酸投与の関連について初めて明らかにする有用な検証となる。
非アルコール性脂肪性肝炎を自然発症する新規モデル動物を利用した診断マーカーの探索

非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は、飲酒歴がないにもかかわらず中性脂肪を主とする脂肪の蓄積が肝細胞に起こり、炎症・線維化等のアルコール性肝障害と同様の所見を認める予後不良な疾患である。本研究は独自に開発したNASHを自然発症するマウスを用いて、NASHの診断に有用な非侵襲的な診断マーカーを探索することを目的とした。その結果、apolipoprotein A-Vなどの6種のタンパク質が新規NASHマーカー候補として有用である可能性を見出した。本年度はDKOマウスがNASHを発症する32週齢,およびより病態の進行した62週齢のマウスの血清を用いて以下のように解析した.等電点電気泳動サンプルをImmobiline DryStrip gel (pH 3-10 non-linear, 13cm, GEヘルスケア)にアプライし,5時間ゲルの膨潤を行った.膨潤後のゲルをフォーカシングトレイにセットし,PROTEAN IEF Cell (Bio-Rad)にて等電点電気泳動を行った.等電点電気泳動後のストリップゲルを平衡化バッファー(6 M urea, 20% glycerol, 2% DTT, 2% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH8.8)に完全に浸し,45分間振とうして平衡化した.平衡化したゲルを10-18%ポリアクリルアミドグラジエントゲル(16 cm×16 cm,バイオクラフト)にセットし,25 mA/枚Constant Currentにて電気泳動を行った.泳動先端がゲル下端に到達した時点で電気泳動を終了した.電気泳動後のゲルは固定液(10%メタノール,7%酢酸溶液)で30分間振とう後,SYPRO Ruby (Molecular Probe)にて遮光下で一晩染色した.染色後のゲルは10%メタノール,7%酢酸溶液で十分洗浄した.電気泳動画像はMolecular Imager FX(Bio- Rad)を用いて取得した.二次元電気泳動の画像解析はPDQuest ver.7.30 (Bio-Rad)を用いて行った.野生型マウスとパターンの比較をして再現性を持って(n=3)増減するスポットを抽出した.その結果,有意にDKOマウスで発現の増加するものとして15スポット,減少するものとして10スポットが抽出された.昨年度は、野生型、DKOマウスそれぞれ32、62週齢時の血液サンプルを二次元電気泳動による発現比較解析を行い、有意にDKOマウスだけで発現が増加するものとして15スポット、減少するものとして10スポットを抽出した。今年度は、それらのうち、スポットクオリティーの高いものを9つ選び、MS/MSイオンサーチによるタンパク質同定を実施した。その結果、DKO32週齢において野生型と比べ3倍以上の発現が検出されたタンパク質として、apolipoprotein A-V、1/3に低下したタンパク質としてC4 complement proteinが、62週例の比較ではimmunoglubulin gammma kappa chain variablr、serum amyroid P-component precurdor、Ig kappa chain VregionがDKOのみに3倍上の発現が見られ、pregnancy zone proteinが1/3以下に低下していた。これらのタンパク質は何もNASHの進展マーカとしての報告はなく、新規のものとして有用であることが示唆された。再現性良くNASHマーカーになりうるDKOマウスのみで増減するタンパク質が25個得られた.口腔外科学25個のタンパク質について質量分析を行い,タンパク質の同定を同定する,ELISAアッセイ系を構築し,診断マーカーとしての妥当性を検証する.
葉の炭素・酸素安定同位体比を用いた乾燥地緑化植物の耐塩性診断

中央アジアや紅海沿岸の塩生植物において葉の酸素・炭素安定同位体比と枝中の水の酸素安定同位体比を測定し、それらと生育場所の土壌塩分濃度との関係を調べた。その結果、葉の炭素安定同位体比を用いて水利用効率向上による塩への耐性を、枝中水の酸素安定同位体比を用いて地下水など塩分濃度の低い水の利用による塩の回避を評価することができた。また、葉の酸素安定同位体比から蒸散抑制による塩の回避を評価できる可能性が示唆されたが、国内で育てた苗木の塩ストレス実験では再現できなかった。以上より、乾燥地植物の耐塩メカニズムのいくつかは葉の酸素・炭素安定同位体比と水の酸素安定同位体比を指標として評価できることが示された。本研究の目的は安定同位体比を用いた塩生植物の耐塩性指標を開発することである。そのための対象植物として当初予定していた中央アジア・ウズベキスタンに生育するタマリスクではなく、エジプト紅海沿岸に生育するヒルギダマシのサンプルをたくさん入手できたので、それらの炭素・酸素安定同位体比を測定した。長期平均的な水利用効率を反映する葉の炭素安定同位体比は、同一林分内の低塩分区に生育する高木個体では平均値が低く、ばらつきが大きかったのに対し、高塩分区に生育する矮小個体では平均値が高く、ばらつきが小さかった。また、長期平均的な気孔コンダクタンスを反映する葉の酸素安定同位体比は高い位置にある葉ほど低い値であった。これらの結果から明らかになった葉の生理特性を枝の形態とあわせて考察すると、高塩分区の矮小個体よりも長短様々な長さの枝を伸ばしている低塩分区の高木個体の場合、枝の長さが長くなるほど根から吸水した水の輸送経路長が長くなり、通水コンダクタンスが低くなるので葉の水利用効率を上昇させて対応していると考えられた。また、葉の炭素・酸素安定同位体比は個体内分布が大きいことから、個体どうしの耐塩性の比較に利用する際は注意を要することがわかった。さらに、現地観測での結果を検証するため、ガラス室内でヒルギダマシの苗木に0、1、2、3%NaCl溶液を与えて育てる実験を行った。その結果、成長量は2%個体で最大となるなど差が出たが、葉の炭素・酸素安定同位体比には処理間で差がなかった。前年の予備実験では差が出たことや、枯死個体が多く繰り返し数が十分確保できなかったこと、葉数が少なく塩水を付加する前と後の葉を区別して分析できなかったことから実験は失敗であったと考えている。本研究課題では、安定同位体比に基づく乾燥地植物の耐塩性の評価指標の開発に取り組んだ。植物の耐塩メカニズムを「塩の回避」、「塩の排出」、「塩への耐性」の3つに分類し、そのうちの多くが水の酸素安定同位体比、葉の酸素・炭素安定同位体比、葉の化学組成を指標として評価できることを中央アジアなどでの野外観測や国内での苗木実験によって示した。例えば、中央アジアの塩生植物において、根を伸ばして塩分濃度の低い地下水や深層土壌水を利用する、あるいは土壌表層の塩分濃度の低下する雨季のみ成長するなどの「塩の回避」を茎中の水の酸素安定同位体比から評価した。さらに、中央アジアの塩生植物およびスーダン紅海沿岸の塩生植物(ヒルギダマシ)において、土壌塩分濃度の上昇に対して水利用効率を上昇させる「塩への耐性」を葉の炭素安定同位体比から評価するなどした。また、中央アジアの塩生植物のひとつタマリスクにおいて、土壌塩分濃度の上昇にともない葉の酸素安定同位体比と枝内の水の酸素安定同位体比の差が増加したことから塩ストレスの増加に対して気孔を閉鎖して蒸散量を減らし、塩吸収量を抑えていたことが評価できた。これに対し、国内で育てたタマリスクやヒルギダマシの苗木では塩分濃度の上昇にともなって気孔コンダクタンスが低下し、蒸散量も低下していたのにもかかわらず、葉の酸素安定同位体比は理論どおりの反応を示さないことがわかった。なぜこのような相反する結果が得られたのか、その解明が新たな課題として残された。葉の長期的な水利用効率と蒸散量をそれぞれ反映するとされる葉の炭素・酸素安定同位体比を用いた塩生植物の耐塩性の評価を目的とし、ビニールハウスで育てた塩生植物(タマリスク、ヒルギダマシ、ヤエヤマヒルギ)の苗木を用いた塩水付加実験を行い、長期的な塩分ストレスに対する葉の炭素・酸素安定同位体比の応答を調べた。

その結果、高塩分条件下で育てた苗木ほど高い塩分濃度に起因する吸水阻害に対し、気孔を閉じて蒸散抑制していたこと、その結果として水利用効率が上昇し、葉の安定同位体比が上昇したことが示された。したがって、葉の炭素安定同位体比が塩分ストレスによる吸水阻害の評価に利用可能であることが確認できた。一方、ポロメータを用いて測定した蒸発散量は高濃度区の苗木で低下していたが、長期平均的な蒸散量を反映するとされる葉の酸素安定同位体比には濃度間で差がなかった。この不一致の原因として、塩分ストレスによる葉の細胞構造の変化の影響と塩腺からの塩分泌の影響の2つの可能性について検討した。ヒルギダマシとヤエヤマヒルギの実験結果については現在解析中である。また、研究協力者から得た中国新疆ウイグル自治区の塩類集積地において採取された塩生植物サンプルの分析を行った結果、葉の炭素安定同位体比と土壌表層のNaイオン濃度や葉組織中のNaイオン濃度の間には関係がないことがわかった.根や葉の形状、植物体内のイオン濃度や比率、葉組織中のベタイン濃度などの観測結果から、土壌深くまで根を伸ばして塩分低濃度の土壌深層水を利用する、根でイオン選択する、多肉葉に適合溶質を蓄積して浸透圧を高めることで塩分高濃度の水を吸収するなどの方法で塩分高濃度の土壌表層水に起因する吸水阻害を緩和していたため、葉の炭素安定同位体比が土壌表層の塩分濃度に対して応答していなかったと考えられた。現地観測では計画どおり順調に成果が出てきている。一方、ヒルギダマシの苗木を用いた塩水付加実験は失敗してしまったため、現地観測で得られた結果の実験検証はできなかった。ヒルギダマシの水耕栽培は技術的に難しいとされ、過去の成功例が少ないのは承知していたが、他の樹種で成功された方の協力と助言を得て挑戦したのだがうまくいかなかった。この点がやや遅れていると判断した理由である。本研究課題の目的は乾燥地植物の耐塩性の評価を野外で行うための手法を確立することにあるため、中央アジア・ウズべキスタンのキジルクム砂漠の塩類集積地において現地観測を行う予定であった。しかし、2か月間と短い乾燥地植物の活性の高い時期までに準備が間に合わなかったため、中止・延期することになってしまった。そこで、当初より代替案として挙げていた塩生植物の苗木を用いた塩水付加実験を行った。野外では調査プロット間で土壌塩分濃度の他にも水分・温度などに違いがあるため、安定同位体比に影響を及ぼす可能性がある。それに対し、実験では塩分以外の環境を同一に揃えることができ、塩分濃度の違いに対する葉の安定同位体比の応答のみを抽出することができ、よりクリアな解析を行うことができた。ただし、苗木を用いた室内実験の結果を野外にそのままあてはめることはできないため、野外の成木を対象とした解析が不可能である。これに関しては研究協力者や申請者の属する他プロジェクトから新疆ウイグル自治区・アイディン塩湖近辺の塩生植物数種のサンプルとエジプトおよびスーダンのヒルギダマシのサンプルを入手することができ、解析を行うことができた。このように観測方法に関して変更があったものの研究は予定どおり進行させることができた。フィールドでは塩分条件だけでなく水分や養分の条件も変化することから、塩分の影響だけを抽出するのは難しいと考え、コントロール実験を試みたがうまくいかなかった。そこで、フィールドで観測した温度や湿度の空間分布などの微環境条件と葉の酸素安定同位体比の関係をCraig-Gordonモデルなどを用いてより詳細に解析することで、葉の酸素安定同位体比から気孔コンダクタンスを評価する手法を確立する。また、現地で光合成速度と気孔コンダクタンスの瞬間値の測定を行い、葉の安定同位体比を用いた評価結果の支持データを集める。本研究課題では乾燥地植物の耐塩性としてA)塩分回避、B)塩分排出、C)
立体構造にもとづくシグナル伝達分子系でのスイッチ機構の実時間計測

高感度高速蛍光測定装置の開発ロドプシンのような光感受性分子を含む試料で、高い時間分解能で蛍光測定できる装置を開発した。蛍光励起光のロドプシンに及ぼす影響が無視できるくらいの微弱光で、ミリ秒レベルの時間分解能で蛍光測定が可能になった。この装置を用いて、C末部のシステイン残基(Cys345)を特異的に蛍光標識したタコロドプシンの、光活性化後のサブミリ秒領域におけるラベル分子による蛍光変化を測定した。その結果、約1ミリ秒の時定数でC末部に構造変化が起こることが分かった。一方、レチナール近傍の蛋白質構造を反映する可視吸収変化はマイクロ秒の時間領域で完了する。このC末部の構造変化がG蛋白質との相互作用に関与していると思われる。蛍光性GTPアナログを用いたG蛋白質の活性化の実時間測定従来から、G蛋白質の内在性蛍光によるG蛋白質の活性化の実時間測定法は知られていた。しかし、レセプタ等の複数の蛋白質の共存下ではそれらによる蛍光により、G蛋白質の活性化に伴う蛍光変化を捉えるのは非常に難しかった。本研究では、蛍光標識したGTPアナログ(mantGTP,mantGTPγS)を用いて蛍光エネルギー移動法により、G蛋白質に結合したGTPの蛍光だけを捉えことに成功した。mantGTPを用いると、ウシロドプシンの光活性化に伴いG蛋白質(Gt)のmantGTPの結合による蛍光の増加と、G蛋白質自身によるGTP水解反応により生じたmantGDPの解離による蛍光の減少を観測することが出来た。一方、非水解性mantGTPγSを用いことによって、GTPの結合反応のみを反映した蛍光変化が見られた。従って、両蛍光性GTPアナログ(mantGTP,mantGTPγS)を用いることで、GTPの結合反応及びGTP水解反応の速度論的解析が出来ると期待される。申請書に記載した研究実施計画に沿って研究を行った。その結果を以下に記す。【測定装置の調整】ユニバーサルホトンカウンティングシステムによる、ロドプシンの光活性化に伴う蛍光変化を計測できる系を確立した。その結果、蛍光励起光による影響が無視できるくらいの微弱光でミリ秒レベルの時間分解能での測定が可能になった。【種々の蛍光色素のスクリーニング】種々の蛍光試薬を用いて、タコロドプシン、タコG蛋白質(Gqp)の蛍光標識を試みた。どちらの蛋白質においてもほぼ1対1で標識出来る条件を確立した。ロドプシンはラベルよる影響を殆ど受けなかったが、Gqpは、現在のところ、活性を維持したままのラベルは難しい。しかし、そのGqpはGTP交換反応能を失ったものの、ロドプシンと結合することがGqpにラベルした蛍光色素からロドプシンのレチナ-ルへの蛍光エネルギー移動の測定により分かった。そして、Gqp蛋白質は光活性化状態になったロドプシンを認識して結合するのではなく、光活性化以前からロドプシンと結合していることが明らかになった。【mant-GTP】蛍光標識されたGTP(mantGTP)を用いて、G蛋白質の活性化の実時間計測を試みた。まず、ウシ視細胞から精製したG蛋白質(Gt)を用いてその有用性を検討した。その結果、ウシロドプシンの光活性化に伴うGtのmantGTPの結合を実時間で測定することに成功した。Gt自身の加水分解能による生じたmantGDPは、Gtとの親和性が低く、すぐに解離する事が分かった。

それにより蛍光強度の減少が生じ、GTPの加水分解速度も測定できること分かった。最近GTPの加水分解速度を著しく促進させる蛋白質(RGS)が、シグナル伝達機構のオフに関与しているとして注目を浴びている。この系を用いることによりその機能を詳しく調べることが出来るものと期待される。蛍光性GTPアナログを用いた、G蛋白質の活性化の実時間測定昨年度の研究結果、蛍光標識されたGTP(mantGTP)を用いて、G蛋白質の活性化(GTPの結合)を実時間で測定できるようになった。しかしG蛋白質は水解反応より生じたmantGDPと極めて親和性が低く、観測される蛍光変化は、GTPの結合による蛍光増加と、その後のGDPの解離による蛍光減少とが重なったものになる。それ故、この測定ではロドプシンによるG蛋白質のGTP交換反応を速度論的に解析することは難しい。そこで、非水解性mantGTPγSの合成することにした。平塚らの論文を参考にして、当研究室において合成精製する系を確立した。合成したmantGTPγSを用いて、光刺激後ウシロドプシンによるトランスジューシンの活性化を測定した。その結果mantGTPの場合と異なり、GTP結合反応のみを反映した蛍光変化が得られた。両蛍光性GTPアナログ(mantGTP,mantGTPγS)を用いることで、GTPの結合反応及びGTP水解反応の速度論的解析が出来ると期待される。ミリ秒領域でのタコロドブシンのC末部の構造変化タコ口ドプシンは、マイクロ秒の時間帯で可視部の吸収変化が完了するため、その変化が光化学反応の最終過程と考えられていた。幾つかの実験的証拠から可視吸収変化終了後ミリ秒の時間帯で蛋白質部に構造変化が生じていることが示唆されてきたが、実際にどの部位で構造変化が生じているか分からなかった。タコロドプシンのC末部のシステイン残基(Cys345)を特異的に蛍光標識したロドプシン用いて、昨年度開発した高感度高速蛍光測定装置でミリ秒領域の時間帯でのロドプシンのC末部の構造変化について調べた。その結果、約1ミリ秒の時定数でC末部位の構造変化が起きていることが分かった。このC末部の構造変化がG蛋白質との相互作用に関与していると思われる。
脂質が制御するTRPチャネルによる温度感知システムの解明

生体の温度センサーの分子実体であるTRPチャネルは、サブタイプにより様々な温度閾値がありそのチャネル開口が制御される。一方、TRPチャネルは温度のみならず、脂質を始めとする生体内代謝物により温度の閾値やチャネルの開口が変化することも知られる。我々は膜リン脂質とリゾリン脂質に着目した研究を背景としており、これら脂質がTRPチャネルの活性にどのように影響するかについて、特にGタンパク質型受容体の解析で確立してきたアッセイ手法をTRPチャネルに応用することで、その活性制御機構の解明を試みた。当該年度において、主要研究課題である「TRPチャネルの活性に影響を及ぼす脂質の網羅的探索」に関して、TRPV1、TRPV3、TRPM7、TRPM8、TRPA1に対してリン脂質誘導体と脂質化合物ライブラリーを用いて、そのTRPチャネルの活性化をTGFα切断アッセイにより評価した。さらにこれら脂質によるTRPチャネルの抑制効果をTRPチャネルのアゴニストの競合作用により評価した。その結果、アナンダミドとその類似化合物がマイクロモーラーからサブマイクロモーラーのオーダーの濃度でTRPV1とTRPA1を活性化することを見出した。また、前年度までの研究によりイノシトール含有リゾリン脂質がTRPV1を活性化することを見出していたことから、本年度では細胞膜で内在的に産生・代謝回転されるリゾ脂質がTRPチャネルの活性に与える影響について調べた。質量分析計を用いた脂質解析により、アシルCoAコレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤の1つを培養細胞に添加することでリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼを阻害することで2-アシル型リゾホスファチジルイノシトールが顕著に蓄積することを見出した。TRPV1発現細胞に本化合物を添加すると、高温条件でTRPV1の活性化レベルの上昇が観察された。29年度が最終年度であるため、記入しない。TRPチャネルはさまざまな刺激に柔軟に応答し生体の恒常性の維持に重要な役割を持つ。近年、TRPチャネルの活性化に影響を与える分子として脂質の重要性が指摘されている。このような脂質の多くは炎症などの刺激に応じて局所で生体膜から産生される。刺激依存的に産生されるさまざまな脂質分子がTRPチャネルの活性を制御し、温度感知システムの厳密な調節に寄与するもの想定されるが、脂質によるTRPチャネル制御の全体像はほとんどわかっていない。そこで、本研究において「TRPチャネルの活性に影響を及ぼす脂質の網羅的探索」を主軸に、「リゾリン脂質感受性を示すTRPV1とTRPA1のマスト細胞脱顆粒や肝炎発症への役割解明」を目指す。当該年度において、TRPチャネルの活性化を高精度かつ特異的に検出する検出法としてGタンパク質欠損HEK293細胞を用いたTGFα切断アッセイを構築した。この手法を用い、温度感受性の異なるTRPチャネルに対してリゾリン脂質と脂質化合物ライブラリーに対する応答をスクリーニングし、TRPチャネルを活性化する脂質を複数見出した。また、通常の培養温度である37°Cに加えて、高温(40°C)と低温(25°C)でもTRPチャネルの活性を評価することで、TRPチャネルの下流で活性化が誘導される膜型プロテアーゼ(ADAM10, 17)のうち、ADAM10がTRPチャネルの温度感受性を反映することがわかった。また、リゾホスファチジルセリン(LysoPS)の急性肝炎抑制作用についてTRPチャネルの阻害剤を用いて薬理学的な解析を行ったところ、TRPV1チャネル阻害剤が部分的にLysoPSの効果を抑制することができることを見出した。さらに、LysoPSのマスト細胞脱顆粒促進応答の受容体探索を狙ったラット腹膜マスト細胞の初代培養系に対するRNA干渉(siRNAエレクトロポレーション)の条件を確立した。実施項目「TRPチャネルの活性に影響を及ぼす脂質の網羅的探索」は培養細胞を用いた簡便な検出法を確立し、リゾリン脂質と脂質化合物ライブラリーに対するスクリーニングを実施した。また、この過程でTRPチャネルの下流でADAM10とADAM17が異なる温度感受性によって制御されることを見出した。また、実施項目「リゾリン脂質感受性を示すTRPV1とTRPA1のマスト細胞脱顆粒や肝炎発症への役割解明」においては、マスト細胞脱顆粒応答におけるTRPチャネル阻害剤の検討を行い、脱顆粒に関与するTRPチャネルを絞ることができた。今後、確立したRNA干渉法によりそれぞれのTRPチャネルの寄与を調べることができる。また、マウス急性肝炎モデルの肝炎発症抑制ではTRPA1, TRPV1チャネル阻害剤を用いて、TRPV1チャネルが関与することを見出した。さらに、領域内共同研究として、土居計画班員と概日リズムに関与するGPCRの解析の共同研究を始めるに至った。当該年度において、主要研究課題である「TRPチャネルの活性に影響を及ぼす脂質の網羅的探索」に関して、TRPV1、TRPV3、TRPM7、TRPM8、TRPA

1に対してリン脂質誘導体と脂質化合物ライブラリーを用いて、そのTRPチャネルの活性化をTGFα切断アッセイにより評価した。さらにこれら脂質によるTRPチャネルの抑制効果をTRPチャネルのアゴニストの競合作用により評価した。その結果、アナンダミドとその類似化合物がマイクロモーラーからサブマイクロモーラーのオーダーの濃度でTRPV1とTRPA1を活性化することを見出した。また、前年度までの研究によりイノシトール含有リゾリン脂質がTRPV1を活性化することを見出していたことから、本年度では細胞膜で内在的に産生・代謝回転されるリゾ脂質がTRPチャネルの活性に与える影響について調べた。質量分析計を用いた脂質解析により、アシルCoAコレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤の1つを培養細胞に添加することでリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼを阻害することで2-アシル型リゾホスファチジルイノシトールが顕著に蓄積することを見出した。TRPV1発現細胞に本化合物を添加すると、高温条件でTRPV1の活性化レベルの上昇が観察された。TRPチャネルの温度感受性に影響を及ぼす脂質の探索を引き続き行う。脂質スクリーニングでヒットが得られた場合、この脂質が体温変化により生体内でその量が変動するかどうかをLC-MSを用いて調べる。また、この脂質をマウス個体へ投与した際の体温変化に与える影響を調べる。温度変化による培養細胞の膜組成をLC-MSで評価するとともに、この細胞に発現させたTRPチャネルの活性を調べる。脂肪酸添加で上記の膜組成と同様の変化を起こした際に、TRPチャネルの機能変化が生じるか調べる。リゾホスファチジルセリン(LysoPS)およびリゾホスファチジルスレオニン(LysoPT)のマスト細胞脱顆粒促進作用と肝炎抑制作用へにTRPチャネルの寄与を評価する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
中国近世の商業出版と文人

昨年に引き続き、十七世紀前半、中国の明代末期に活躍した文人、〓志謨の作品と出版活動について研究した。〓志謨は、その豊富かつ多彩な作品活動にもかかわらず、従来の文学史ではほとんど注目されることのなかった人物であるが、特に出版と文化との関係を考える場合には、きわめて興味深い人物であると言える。本年は特に、彼の作品の中でももっとも特徴のある『花鳥争奇』、『山水争奇』、『風月争奇』、『蔬果争奇』、『梅雪争奇』『童婉争奇』の争奇シリーズの内容を詳しく検討し、あわせてその出版との関係を考察した。争奇シリーズの中でもっとも早く製作された『花鳥争奇』は、ほぼ天啓初年(1620年代前半)に出版されたと考えられるが、その内容が物語の中に書物を出版するという筋を含み、作品自体が作品中で述べられた出版物そのものであるという興味深い構成になっている点に注目して、彼の創作活動が出版と密接な関係にあることを明らかにした。『花鳥争奇』のこのような構成は、その後の他の争奇シリーズ作品にも基本的に継承されており、明代末期の出版と文学創作の関係を考えるうえできわめて示唆的な存在であると言える。またこのような〓志謨の文学創作が、彼のもう一方の重要な仕事であった類書の編纂と表裏一体の関係にある点に着目し、この時代の小説、戯曲の創作方法とその背景にっいてのひとつの見方を示した。成果の一部は、2004年11月に開かれた台湾中央研究院文哲研究所主催の「明清文学国際研討会」において発表した。本研究は、主に明代末期の文人の著作活動と出版の関係を研究するものである。本年は、明代末期に活躍した文人、とう志謨についての研究を行った。その著『童婉争奇』は、同じ作者の『花鳥争奇』、『山水争奇』,『風月争奇』、『蔬果争奇』、『梅雪争奇』などと並ぶ争奇シリーズの中のひとつであり、敦煌出土の唐代写本「茶酒論」「燕子賦」、また日本近世の「酒茶論」、「酒餅論」などのいわゆる異類論争物につらなるものであるが、その内容が男色と女色の比較である点、きわめて特異であり、中国文学史上、他に類例をみない珍しい作品である。現在この『童婉争奇』のテキストとしては、龍谷大学写字台文庫所蔵の明・天啓四年(1624)萃慶堂刊本と、おそらくそれにもとづいて筆写したと思われる内閣文庫所蔵の江戸初期写本のふたつが知られるが、後者には林羅山による寛永十二年(1635)の識語がある。内閣文庫にはまた前記『花鳥争奇』以下の明刊本も所蔵されているが、それらはすべて林羅山もしくは林家の旧蔵本であり、龍谷大学所蔵の『童婉争奇』も、元来は林羅山の蔵書であったと考えられる。本研究は、『童婉争奇』の内容を分析することによって、中国明代末期江南地域における男色、女色文化とその背景について考察するとともに、それが『童婉争奇』を通じて江戸時代の同類の文学に影響をあたえた可能性についても検討を加える。特に十七世紀後半に活動した伊原西鶴の『男色大鑑』(1687)には、「色はふたつの物あらそい」とあり、『童婉争奇』と同じ趣旨である点が注目される。

〓志謨は、その豊富かつ多彩な作品活動にもかかわらず、従来の文学史ではほとんど注目されることのなかった人物であるが、特に出版と文化との関係を考える場合には、きわめて興味深い人物であると言える。本年は特に、彼の作品の中でももっとも特徴のある『花鳥争奇』、『山水争奇』、『風月争奇』、『蔬果争奇』、『梅雪争奇』『童婉争奇』の争奇シリーズの内容を詳しく検討し、あわせてその出版との関係を考察した。争奇シリーズの中でもっとも早く製作された『花鳥争奇』は、ほぼ天啓初年(1620年代前半)に出版されたと考えられるが、その内容が物語の中に書物を出版するという筋を含み、作品自体が作品中で述べられた出版物そのものであるという興味深い構成になっている点に注目して、彼の創作活動が出版と密接な関係にあることを明らかにした。『花鳥争奇』のこのような構成は、その後の他の争奇シリーズ作品にも基本的に継承されており、明代末期の出版と文学創作の関係を考えるうえできわめて示唆的な存在であると言える。またこのような〓志謨の文学創作が、彼のもう一方の重要な仕事であった類書の編纂と表裏一体の関係にある点に着目し、この時代の小説、戯曲の創作方法とその背景についてのひとつの見方を示した。成果の一部は、2004年11月に開かれた台湾中央研究院文哲研究所主催の「明清文学国際研討会」において発表した。
ヘテロ原子化合物のカチオンラジカル種に対するケイ素のβ効果

カチオンラジカルに対するケイ素の効果はヘテロ原子が酸素のときもっとも大きく、ヘテロ原子が窒素、硫黄になると小さくなることが実験、理論の両面からすでに明らかにしている。そこで、ヘテロ原子として酸素をもつ系に焦点をしぼり、ケイ素の効果が最も大きく発現し、カチオンラジカルを生成しやすい物質、つまり良好な電子供与性物質を創り出すにはどのようにすればよいかを検討した。まず、同じ炭素上にケイ素を1つ、2つ、3つと導入した時その電子供与能がどのように変化するかを調べた。ケイ素が同じ炭素上に2個、および3個ついた化合物を合成し、それらの酸化電位を測定したところ、ケイ素1つのものに比べてさらに酸化されやすいことが明らかとなった。とくにケイ素が3個ついた化合物は、酸化をうけやすいとされているスルフィドなど硫黄原子を含む化合物よりも酸化されやすい。つまり、ケイ素を利用することにより、酸素を硫黄よりも優れた電子供与体とすることができたわけである。以上の結果は、理論計算とよく一致しており、計算を用いた分子設計の有効性も示された。そこで理論計算を駆使して分子設計を行ないケイ素や酸素分子を複数個含む様々な分子を合成し、その酸化電位を測定した。これらの結果にもとづいてケイ素と酸素をふくむ電子供与性分子を設計しその合成を開始した。このような電子供与性物質をテトラシアノエチレンなどに代表される電子受容物質と組み合わせれば良好な有機導電性物質などが開発できるものと期待される。
共生窒素固定系の環境適応システムの解明と環境傾度対応型ダイズ栽培技術への応用

本研究では、有用ダイズ根粒菌の優占化に関する環境適応機構の解明と生態的特性の応用について湛水・塩類集積・温度の環境因子に着目して研究を行った。完全脱窒能を示す有用根粒菌の優占化に土壌の還元状態が影響を及ぼし、脱窒に適した環境で有用菌が優占化し、後のダイズ栽培でも有用菌の高い根粒占有率が検出された。塩類化土壌ではSinorhizobium属根粒菌が宿主への高い感染性を示し、Bradyrhizobium属根粒菌は根粒占有率を下げた。一方、有用菌接種により高温でのダイズの生育阻害が緩和された。以上、有用根粒菌の優占化のための環境因子の一部を明らかにし、温度ストレスへの接種の有用性を確認した。ダイズ根粒菌の水田転換畑における生態学的特性を解析するために、土壌を湛水状態で長期間培養し、土壌の酸化還元電位の変化による、ダイズ根粒菌群集構造の遷移に関して研究を行った。試験菌株として、日本に分布するダイズ根粒菌の代表株として、Bradyrhizobium japonicum USDA 6株, 123株,およびB. elkanii USDA 76株を用いた。また、B. japonicum USDA110野生株(WT)もしくはnosZ遺伝子破壊株(ΔnosZ)を使用した。試験土壌に黒ボク土と灰色低地土をオートクレーブ滅菌処理した土壌を用いた。これらの脱窒能が異なる根粒菌株を用いて滅菌土壌と混合し、マイクロコズムを調製し、土性、湛水・非湛水条件および温度が異なる条件で培養を行い各菌株の占有率を変性剤濃度勾配電気泳動法(DGGE法)で求めた。その結果、土性・温度に関わらずB. japonicum USAD110WTは、湛水条件で高い占有率を示した。一方で、USDA110ΔnosZ株はどの条件でも土壌中での占有率に有意な上昇を示さなかった。これらの群集構造の遷移を多次元尺度構成法で解析した結果、両土壌に共通してB. japonicum USDA110WTを用いたマイクロコズムの湛水条件における群集構造の変遷は他の培養条件と異なる方向を示し、B. japonicum USDA110WTの占有率が高くなる方へ遷移することが明らかになった。以上のことから、B. japonicum USAD110が完全脱窒能を有するために湛水条件において生残性が高いことが示唆された。これらの結果より、有用根粒菌が優占している傾向にある水田において田畑輪換によるダイズ栽培がダイズ生産性向上のために必要になると考えられる。本研究課題では、湛水や塩類集積など様々な土壌環境傾度による根粒菌の群集構造形成のメカニズムを明らかにすることを目的にしている。ダイズは強い塩耐性を持たないが、根粒菌はダイズに比べ塩耐性を示すことが分かっている。また根粒菌を接種することでダイズの耐塩性が上昇することも知られており、根粒菌の種によって塩分に対する感受性は異なっている。根粒菌の中でも、Sinorhizobium frediiは、塩類化しやすい乾燥地で優占していることが報告されている。本年度の研究では、塩類集積土壌における根粒菌生態を検証するための研究を行った。はじめに、NaCl濃度とpHを変化させた平板培地上におけるBradyrhizobium japonicum USDA6, USDA123, USDA110, B. elkanii USDA76, S. frediiUSDA205株のコロニーサイズを経時的に測定し、根粒菌の塩耐性を評価した。次に、B. japonicum USDA6, USDA110, B. elkanii USDA31, S. frediiUSDA205の4菌株をダイズに混合接種し、塩ストレス環境下における感染根粒菌の群集構造を16Sー23S rRNAITS領域のPCR-RFLP法を用いて解析した。根粒菌株の塩耐性試験において、菌株の耐性は、微酸性条件でB. elkanii >S. fredii> B.japonicum、塩基性条件でS. fredii>B. elkanii>B. japonicumとなった。ポット栽培試験において、塩ストレスフリーのポットでは、USDA110が優占し、塩ストレス条件では、USDA31が優占した。本栽培条件では、S. fredii USDA205の感染は認められなかった。これらの結果から、USDA205は高塩濃度・塩基性環境下において、高い塩耐性を示すが、宿主ダイズへの感染課程において優位になることはないと考察された。土壌の塩類集積条件におけるダイズ根粒菌群集構造の変化を解析した。代表的なダイズ根粒菌の塩耐性能の評価、根粒菌株を混和したマイクロコズム土壌の調製から、塩類集積条件による長期培養およびDGGEとRFLP解析による群集構造解析まで行った。塩類集積マイクロコズム土壌における根粒菌群集構造解析は本年度から取り組んだテーマであるが、塩類集積環境における根粒菌生態の一定の特性を捉えることが出来た。また、ダイズの塩耐性能と感染根粒菌群集構造の評価も行い、こちらも塩類集積に伴う群集構造の変化を検出することができた。今後の研究を展開する上で極めて重要な結果が得られた。

研究2年目の進捗状況として、おおむね順調に進展しているものと評価している。本研究課題では、土壌の湛水や塩類集積など様々な土壌環境傾度による根粒菌の群集構造形成のメカニズムを明らかにすること目的に研究を進めている。緯度による温度の変化や農業形態による湛水、乾燥による塩類集積など、根粒菌に対し大きなインパクトを示すと考えられる環境因子を中心に根粒菌群集構造に対する影響を検討した。温度に着目した研究において、フィリピンを対象に土着ダイズ根粒菌Bradyrhizobium elkaniiの16S-23S rRNA遺伝子ITS領域-ハウスキーピング遺伝子rpoBの解析を行った。フィリピンのB. elkaniiのタイプはBe76-Be46であり、九州のB. elkaniiはBe76-Be76のタイプが占め、沖縄ではそれらの混合群集構造を示した。次に、湛水環境下における根粒菌群集構造の変遷について、亜酸化窒素(N2O)還元酵素をコードするnosZ遺伝子を有する根粒菌が優占化することが明らかとなり、湛水などの土壌管理による有用根粒菌の優占化の可能性を示した。さらに、乾燥地の塩類集積土壌においては、Sinorhizobium/Ensifer frediiの優占化が報告されている。平板培地上での根粒菌の耐塩性を検討したところ、Bradyrhizobium属根粒菌と比較してS. frediiの耐塩性を確認したが、実際の土壌を用いたマイクコズムでの優占化は認められなかった。ダイズを塩類集積条件下でS. frediiとBradyrhizobium根粒菌の混合接種後栽培し、感染した根粒菌の群集構造を調査しとところ、塩類集積が進むにしたがい、S. frediiの根粒占有率が高まることが明らかとなった。以上の結果から、温度、湛水状態、塩類集積は、根粒菌群集構造の形成に大きな影響を有し、根粒菌群集構造を形成する環境因子として重要な因子であることが明らかとなった。今年度、温度による根粒菌群集構造に関して、フィリピンの土着根粒菌の解析において、新規の知見を得ることが出来た。ITS領域の解析だけでは分類が困難であった熱帯亜熱帯の土着ダイズ根粒菌の分類において有用なターゲット遺伝子を見出すことが出来た。本研究成果は平成29年4月にPlant and Soilに受理された。現在、フィリピン各地の土壌について調査を進めている。土壌の湛水条件は、完全脱窒能を有する有用根粒菌を優占化させ、温室効果ガスの発生を抑制する。本研究に置ける結果は、完全脱窒能を有する根粒菌を土壌中で高い占有率に保つための土壌管理の可能性を示唆するものである。本研究成果は平成29年4月にMicrobes and Environmentsに受理された。塩類集積における根粒菌群集構造は、宿主への感染が大きな影響を与えていることが示唆された。根粒菌が有する生理的差異のみならず宿主への感染を介して優占化していることが示唆された。根粒菌生態を明らかにする上で興味深い結果が得られたものと考えている。これまでのところ、主に温度、湛水、塩類集積の環境因子に関して研究を進めてきた。それぞれの環境因子と根粒菌群集構造に関して成果が得られており、おおねね順調に進展していると判断している。本研究は、共生窒素固定系を応用して、ダイズを始めとしたマメ科作物の気候変動に対応した栽培技術を確立するため、様々な土壌環境における根粒菌の群集構造構築に関するメカニズムを明らかにすることを目的に行った。