hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ジベレリンメタボローム解析による低温要求性木本花卉ラベンダーの開花促進技術の開発

ラベンダー(Lavandula×interm edia)の開花特性に関して、以下のことを明らかにした。1.典型的な長日植物で緑植物春化型植物の性質を有すること。2.活性型ジベレリンであるGA_1を経由する早期13位水酸化経路のジベレリンメタボロームマップを有すること。3.花芽分化にはジベレリンが必須であるが低温の代替は出来ないこと。4.花芽分化に先立ち活性型の内生GA_1量が増加すること。5. GA_3処理により低温享受量が不十分な植物体の開花促進が可能であること。以上から、低温要求量に応じたGA_3処理でラベンダーの開花誘導が可能である。平成21年度の研究目標は、ラベンダーの花芽分化に対する低温要求性の解析(平成2122年度)およびジベレリン(GA)類の同定とメタボロームマップの作成(平成2122年度)である。開花特性が明らかではないが、園芸分野で利用されるLavandula×intermediaを研究材料として用いた。生育ステージを調整した挿し木苗を5°Cで12週間まで低温処理した場合、10週間処理のものは低温後の温暖条件で100%が花芽分化したが、6週間処理では花芽分化しなかった。花芽分化は低温処理期間中には起こらず、低温後の温暖条件に移行した1週間後から始まった。以上から、L.×intermediaは花芽分化に低温を必要とする緑植物春化型植物の特性を有することが明らかになった。低温処理温度が上昇するにつれて、花芽分化率と開花率が減少する傾向が認められた。十分な低温量を受けた後の植物では日長が伸びるに従い花芽分化率と開花率が増加したことより、L.×intermediaは本質的には量的長日植物であると推定された。6週間以上の低温処理を施した植物ではGA3処理により花芽分化が促進したが、6週間未満の植物ではGA3処理の影響は見られなかった。このことから、GA3処理は開花を促進するが低温を代替する作用はないことが明らかになった。L.×intermediaの内生GAとして、GA1、GA19、GA20、GA53をGC/MSにより同定したが、同時に抽出・精製過程においてラベンダーの主成分である精油成分が分析の障害となっていることが明らかになった。同定したGA類から早期13位水酸化経路(GA12→GA53→GA44→GA19→GA20→GA1→GA8)がL.×intermediaの主たるジベレリンメタボロームマップであることが推定された。平成22年度の研究目標は、低温要求性に対するジベレリン感受性の解明および生育および花芽分化に関与するジベレリンメタボロームステップの特定である。低温要求性については、低温処理期間の増加に伴い出蕾枝率が増加し、出蕾所要日数は減少したことから、低温は出蕾の重要な要因である事が再度確認された。またGA無施用区ではGA生合成阻害剤であるUCZ施用に伴い出蕾枝率が減少し、出蕾所要日数が増加したことから、出蕾には内生GAが関与していることが確認された。低温0週ではGAを施用しても出蕾は見られず、低温8週に比べ12週の方がGA施用による出蕾枝率の増加が著しかったことから、低温によりGA感受性が増すことが示唆された。しかし、GAを施用する低温8週の区ではUCZの施用濃度の増加により出蕾枝率が低下し、出蕾所要日数が増加したのに対し、GAを施用する低温12週の区では出蕾枝率と出蕾所要日数に対するUCZ施用の影響は無かった。以上から、低温処理期間が短く開花のための低温充足度が不十分であれば開花はGAの内生量に依存し、低温処理期間が長く低温充足度が十分であれば開花はGAの内生量には依存しないことが示唆された。一方、ジベレリンメタボロームにおけるGA内生量は、GA_<53>は低温処理終了時から低下し、GA_<19>、GA_<20>は低温処理終了7日後から高くなった。またGA_1も低温処理終了7日後から高くなり、低温処理終了14日後に最大になった。このことから低温処理終了後からGA_<53>がGA_<19>、GA_<20>、GA_1と代謝され、低温処理終了7日以降に見られた活性型GAであるGA_1の蓄積が低温処理終了21日以降に見られた出蕾に直接関与したと考えられる。このように、低温処理終了後の20位酸化酵素と3位酸化酵素遺伝子の強い発現がジベレリンメタボロームの推進力として働き開花を引き起こすと推定された。

平成23年度の研究目標は、開花の促進に直接的に関わるジベレリン誘導体あるいは酵素活性阻害剤を用いて、花芽分化の誘導に必要な低温代替期間や、開花促進を誘導するジベレリン誘導体類を明らかにすることである。その結果、ジベレリン生合成阻害剤処理により開花が抑制されるがジベレリン処理により開花の抑制が回復することから、花芽分化と花芽発達にはジベレリンが必須であることが明らかになった。一方、ジベレリン生合成阻害剤処理による開花の抑制は、低温処理期間が長くなるにつれて回復することが明らかになった。ジベレリン処理では、早期13位水酸化経路上で生合成されると考えられる活性型GA1、GA3、GA5の効果は、発蕾促進においてはGA5>GA3>GA1で優れること、GA5ではGA3に比べて小花数の増加と発蕾促進が認めらること、早期13位水酸化経路上で生合成される活性型ジベレリン類は、その作用性に強弱はあるもののいずれも同様の作用性を示すこと、内生ではないGA3であっても、内生のGA1と同様の作用が推定されることなどが明らかになった。一方、ストックで著しい開花促進効果を示したdimethyl-GA4は、GA3に比べて小花数の増加と発蕾促進を示したものの、開花株率、開花枝率では効果は劣った。05週間の低温処理では、温度に係わらずジベレリン処理による開花誘導は認められず、ジベレリン処理は低温処理に取って代わることは出来ないことが明らかになった。6週間以上の低温処理では、ジベレリン処理による開花株率増加と発蕾促進が認められることから、ジベレリンは低温処理の不足を補完するものであると考えられる。また、十分な低温処理量があれば、外からジベレリンを処理しても、内生ジベレリンの働きを加速しないことから、低温量により、ジベレリン感受性に変化があることが推測された。以上から、低温要求量に応じたジベレリン処理でラベンダーの開花誘導が可能であることが明らかになった。なお、ここで用いたジベレリン誘導体の処理濃度は、全て100ppmとした。
自由貿易下における韓国農産物の対日本輸出機構と日本農業に与える影響

今年は、研究の最終年でもあるために、これまでの検討を踏まえて野菜部門を中心に研究を進めてきた。今年度は韓国からの輸入が最も盛んなパプリカの状況について考察を行ってきた。大きな理由としては、韓国の対日輸出の中でも一番の比重を占めており、日本のパプリカ需要においても7割を占めるなど、両国において大変重要な品目であることにその背景がある。しかし極めて重要な品目であるパプリカにも関わらず、輸出.入の両側面から分析はあまりない。したがって今後の需要の増加も予想される中、日本国内のパプリカ生産の状況を含め詳しく分析した。その成果は「パプリカ生産における国内・外の生産・流通の変化」野菜の情報、農畜産業振興機構、2006年6月号を参照されたい。パプリカを取り巻く状況は、他野菜部門とは全く違う様相を見せており、輸入野菜に圧されて、国内生産が縮小する中で、むしろ国内産地の躍進が目立つ。それはパプリカそのものの需要を外国産が作り出し、さらに出来上がった流通に国産のパプリカ生産が後になって展開した経緯がその背景にあるが、どちらにしても非常に参考になる形態でもある。近年、農産物の安全性が心配される中、国産野菜が改めて注目されるようになった。輸入の増加による悪い影響もあろうとは思うが、また新しい道も同時に開ける可能性も含んでいると思われる。その意味で今年度に実施したパプリカ調査は極めて大きな端緒を提供している。2年間の韓国の対日輸出の現況についてまとめたが、相互に利益をもたらす可能性についても確認することが出来た。たとえば豚肉がそれに該当する。好む部位が正反対のために、韓国も無理せず輸出することが出来、また日本からの輸出の可能性もないわけではない。またはパプリカのように日本国内に全く供給能力がない場合も同じである。しかし供給の安定性を考えれば長期的に外国産に頼ることは極めてリスキーな行動である。出来れば国内生産も維持し、輸入先と相互効果を高めるような生産体系の確立が望まれる。その意味で日本にも野菜輸出の可能性を含め、北東アジア全体で食料需給の可能性を探る必要性く強く感じる.'平前年度に引き続き、韓国における対日輸出品目のうち、日本に多大な影響を及ぼす品目を絞り、その検討を行った。今年も主に韓国の現地調査を行い、統計資料等から把握しきれない韓国国内の動向について明らかにした。平成17年度は野菜生産を重点的に検討し、対日輸出の主要品目である果菜生産の成長要因について焦点を合わせた。韓国の場合、ここ10年の間に、果菜生産に大きな力を注いでおり、結果的に、対日輸出の主要品目として成長しているが、その成長要因については日本国内はみならず韓国においても明らかにされていなかった。そこで、果菜生産の大きな成長要因として、韓国国内で行われている育苗の供給システムに着目し、育苗産業の全体な動向及び果菜生産との関連を明らかにした。加えて育苗生産の分業化によって韓国の果菜生産の成長が促進されたことや、育苗そのものが、対日輸出の主要品目として成長していることを確認した。また同時に、韓国の全般的な農業政策の動向についても整理し、最近の韓国の農業政策とりわけ環境農業についての分析を行った。これらの研究成果は平成17年度に、雑誌や学術論文などに投稿し掲載された。さらに韓国と日本の農業政策の違いだけではなく、先進フランスの農業政策についての国際比較研究を行い、農林水産政策研究所主催の日・中・韓の国際シンポジウムにおいて、日本農業の実践的な取り組みについて、先進諸国の相違点を踏まえ「住民(農業生産者)参加型農村開発」というタイトルで報告を行った。その成果の一部は、平成18年に、農林水産政策研究所レビューNo.19に「生産者が運営資金を拠出して創った地域農業システム」というタイトルで掲載される予定である(確定済み)。他の成果については下記の研究発表欄を参照されたい。

たとえば豚肉がそれに該当する。好む部位が正反対のために、韓国も無理せず輸出することが出来、また日本からの輸出の可能性もないわけではない。またはパプリカのように日本国内に全く供給能力がない場合も同じである。しかし供給の安定性を考えれば長期的に外国産に頼ることは極めてリスキーな行動である。出来れば国内生産も維持し、輸入先と相互効果を高めるような生産体系の確立が望まれる。その意味で日本にも野菜輸出の可能性を含め、北東アジア全体で食料需給の可能性を探る必要性く強く感じる.'平
大気圧プラズマの利用技術が体験できる実践的教育システム

1.研究目的大学生を対象とした科学技術教育の手法の一つとして、講義による知識の教授に加えて、講義の内容に即した演示実験を組み込むことが必要と考える。本研究では知識の教授から演示実験の結果に対する考察能力が養成できる効果が期待できる実践的な教育システムの開発を目的とする。2.研究の方法(1)雰囲気ガス圧を1000hPa100hPaまでの制御とプラズマの可視化を目的として、真空チャンバーをアクリルパイプとし、誘電体チューブにヘリウムガスが流せ、電極に低周波高電圧を加えると触れても熱くないプラズマが発生する装置を製作する。なお、製作する装置は学生自身が演示実験を体験できる構造にする。(2)空気の影響を調べるために雰囲気ガス圧を1000hPaと100hPaで実験する。この時に発生したプラズマをプラスチックフィルムに照射することによりフィルム表面の親水性が向上するか実験する。結果は接触角の測定で確認する。(3)(2)と同様の条件で発生させたプラズマを溶液濃度が4ppmwの食品着色液に照射したときに溶液が分解するかを実験し、溶液の分解過程はデジタルカメラで記録する。3.研究成果(1)本装置は雰囲気ガス圧の制御とプラズマの可視化や学生自身が演示実験を体験できる構造にした。(2)プラスチックフィルム表面の接触角測定及び溶液の分解過程から大気圧プラズマ(1000hPa)を用いて簡便にフィルム表面の親水性向上及び溶液分解が可能であることがわかった。雰囲気ガス圧を100hPaにした時、OHラジカルの減少により1000hPaほど親水性の向上は無かった。また溶液の分解は視覚では充分な違いは無かった。ヘリウムプラズマが溶液に到達しやすくなり溶液の分解効果が得られたと考える。ヘリウムは不活性ガスにも関わらず親水性の向上や溶液分解が起こり、しかも触れても熱くなかった。開発した装置は講義による知識の教授と学生が演示実験に参加でき、研究成果が考察できる実践的な教育システムであると考える。
ゼータ関数のq類似およびそれを基点とした特殊関数のq類似の研究

1、ゼータ関数のq類似の研究報告者は以前、Kaneko-Kurokawa-Wakayama(以下[KKW]と書く)によって導入されたqリーマンゼータ関数をバーンズ型に多重化し、その解析的性質について研究した。このq多重ゼータ関数から多重カンマ関数のq類似を構成すると、梯子関係式がウェイトに関して対称ではないなど、それが本来持つべき性質がうまく反映されない。そこで本年度は、この問題を解消すべく、上記q多重ゼータ関数を拡張(変形)し、それについての詳細な研究を行った。一方で、[KKW]のqゼータ関数をオイラー・ザギエ型に多重化し、二重の場合にメリン・バーンズ積分を用いてその有理型接続を与えた。これはMatsumotoによって得られた結果の類似である。しかしこの表示では古典極限がうまく計算できないなどの問題点も残り、上記有理型接続には更なる改良が必要であると考えられる。2、対称関数を用いた(q)多重ゼータ値・L値の研究昨年度に引き続き、"対称関数の特殊化"という観点から(q)多重ゼータ値・L値について研究した。まず上記オイラー・ザギエ型の(q)多重ゼータ値・L値については、インデックスがすべて等しい場合の値を組合せ論(分割)の言葉を用いて明示的に表した。この表示とこれまでに得られている結果とを合わせれば、ベルヌーイ数・オイラー数の間の非自明な関係式が得られる。これらの結果は論文にまとめて現在投稿中である。また、琉球大学の木本一史氏との共同研究では、非可換調和振動子に付随するスペクトルゼータ関数の特殊値を記述するある種の数列を"交代的多重ゼータ値の有限部分和"とみなし、その極限を上記手法を用いて明示的に計算した。この結果をまとめた論文はProceedings of the American Mathematical Societyから出版予定である。1、ゼータ関数のq類似の研究Kaneko-Kurokawa-Wakayamaによって導入されたqフルビッツゼータ関数(sとtの複素二変数関数)の変形で、すべてのsとtに対してその古典極限が元のゼータ関数に一致するものを構成した。すなわちそれは、全平面で有効なqフルビッツゼータ関数の1パラメータ族を与えており、実際そのような例として知られているUeno-Nishizawa、Tsumura、Kawagoe-Wakayama-Yamasakiによって研究されたq類似たちは、それぞれその特殊化として得られる。さらに、上記の例を含む特別な場合については、その解析的性質(極やそこでの留数および特殊値)を研究した。2、対称関数を用いた多重L値の研究Arakawa-Kanekoによって導入された多重ディリクレL値のインデックスおよび指標が全て等しい場合の評価式を、対称関数を用いて二通りに導いた。それらはそれぞれ分割にわたる和、多項係数と1の冪根を用いた多重和で表される。この手法は非正の整数点での特殊値を計算する場合にも有効である。また、同様の議論により、非可換調和振動子のスペクトルゼータ関数の特殊値を記述する数列(の極限)をリーマンゼータ値で表す公式を得た。それに付随して、二重L値に対するオイラーの関係式の類似を導いた(琉球大学・木本一史氏との共同研究)。3、ラプラシアンの行列式とそれに付随するゼータ関数の研究Milnorによる多重ガンマ関数の研究の類似として、ラプラシアンの"深さrの行列式"(スペクトルゼータ関数の1-rでの微分を用いて定義)を導入し、コンパクトリーマン面および高次元球面の場合にそれぞれ明示的表示を得た。それらはバーンズの多重ガンマ関数および、前者の場合は加えてミルナー・セルバーグゼータ関数と呼ぶべき新しい関数(セルバーグゼータ関数のある一般化)を用いて記述され、r=1の場合にそれぞれVoros、Kumagaiの結果を含む(東京工業大学・黒川信重氏、九州大学・若山正人氏との共同研究)。

また、琉球大学の木本一史氏との共同研究では、非可換調和振動子に付随するスペクトルゼータ関数の特殊値を記述するある種の数列を"交代的多重ゼータ値の有限部分和"とみなし、その極限を上記手法を用いて明示的に計算した。この結果をまとめた論文はProceedings of the American Mathematical Societyから出版予定である。
菱形角柱群流路におけるフリップ・フロップ流れの発現メカニズム

本研究では,菱形角柱群流路内におけるフリップ・フロップ流れの発現メカニズムを定量的に明らかにするために,二次元粒子画像流速測定法(PIV)と二次元レーザ・ドップラー流速計(LDV)による可視化計測や浮子追跡法などによる流れの可視化実験を行った.それらの実験では,流れ方向の菱形角柱の列数を一列から最大六列まで変化させ,それぞれの管路の最終列での中央部に位置する菱形角柱に挟まれた分流領域での流速及びその変動の計測を行った.特に今年度は,流路の上流側からの乱れのフリップ・フロップ流れへの影響についてLDVを用いて流速変動を計測し,そのスペクトル特性も調べた.以下に主要な結論を箇条書きにして示す.(1)PIVを用いて分流領域内に発現する三次元的な縦渦及び渦の連結振動を流速ベクトルの変化によって示すことができた.(2)LDVを用いて第四列目のLeading edge付近において,フリップ・フロップ流れやカルマン渦列のそれぞれの振動と交差流れのせん断層の振動などが相互干渉を起こす形で重なり合う節目の点である「干渉節目点」が存在していることを明らかにすることができた.また流路断面の違いや上流側からの乱れの供給の変化に対して,菱形角柱群流路におけるフリップ・フロップ流れの振動特性を定量的に明らかにすることができた.(3)干渉節目点がエッジトーン現象の発現点となり,フリップ・フロップ流れの発現の引き金的な役割を果たすことも説明することができた.またフリップ・フロップ流れの発現メカニズムも説明することができ,交差角が30°の菱形角柱群流路内のフリップ・フロップ流れについては,カルマン渦列振動の周波数とは大きく異なるが,規則正しく,しかも安定した自励振動が発現することも明らかにすることができた.本研究では,菱形角柱群流路内におけるフリップ・フロップ流れの発現メカニズムを定量的に明らかにするために,二次元粒子画像流速測定法(PIV)と二次元レーザ・ドップラー流速計(LDV)による可視化計測や浮子追跡法などによる流れの可視化実験を行った.それらの実験では,流れ方向の菱形角柱の列数を一列から最大六列まで変化させ,それぞれの管路の最終列での中央部に位置する菱形角柱に挟まれた分流領域での流速及びその変動の計測を行った.特に今年度は,流路の上流側からの乱れのフリップ・フロップ流れへの影響についてLDVを用いて流速変動を計測し,そのスペクトル特性も調べた.以下に主要な結論を箇条書きにして示す.(1)PIVを用いて分流領域内に発現する三次元的な縦渦及び渦の連結振動を流速ベクトルの変化によって示すことができた.(2)LDVを用いて第四列目のLeading edge付近において,フリップ・フロップ流れやカルマン渦列のそれぞれの振動と交差流れのせん断層の振動などが相互干渉を起こす形で重なり合う節目の点である「干渉節目点」が存在していることを明らかにすることができた.また流路断面の違いや上流側からの乱れの供給の変化に対して,菱形角柱群流路におけるフリップ・フロップ流れの振動特性を定量的に明らかにすることができた.(3)干渉節目点がエッジトーン現象の発現点となり,フリップ・フロップ流れの発現の引き金的な役割を果たすことも説明することができた.またフリップ・フロップ流れの発現メカニズムも説明することができ,交差角が30°の菱形角柱群流路内のフリップ・フロップ流れについては,カルマン渦列振動の周波数とは大きく異なるが,規則正しく,しかも安定した自励振動が発現することも明らかにすることができた.本研究では,菱形角柱群流路内におけるフリップ・フロップ流れの発現メカニズムを定量的に明らかにするために,二次元粒子画像流速測定法(PIV)と二次元レーザ・ドップラー流速計(LDV)を用いて流路内の分流領域の流れの可視化計測実験を行った.その実験では,流れ方向の菱形角柱の列数を一列から最大六列まで変化させ,それぞれの管路の最終列の中央部に位置する菱形角柱に挟まれた分流領域での流速及びその変動の計測を行った.PIVを用いた可視化計測では,分流領域の平面及び鉛直断面における流速分布を求め,LDVでは分流領域の種々の点において流速変動を計測し,パワースペクトルを求めた.一列や二列型の菱形角柱群管路では,.流路内の分流領域での流速分布に片寄りが生じフリップ・フロップ流れは発現しなかったそれらに対して三列以上の菱形角柱群管路では,フリップ・フロップ流れが発現し,六列型の菱形角柱群流路内の分流領域では次のような結論を得ることができた.(1)フリップ・フロップ流れの分流領域における流速分布を三次的に表示することができ,主流の剥離に伴う二次流に縦渦が発現していることを明らかにすることができた.(2)菱形角柱群流路内の分流領域では,第一列目から最終列目まで同じ卓越周波数をもつパワースペクトル分布を示し,その流れの振動が管路全体に波及していることを明らかにすることができた.この場合の第三列目の分流領域でのエネルギー供給点付近でのパワースペクトルの値は最大になり,その下流側の分岐点付近にはフリップ・フロップ流れを逆に弱めるような形で他の振動との相互干渉を起す特異な点が存在することも明らかにすることができた.その点を菱形角柱群流路内での「干渉節目点」と名づけた.

本研究では,菱形角柱群流路内におけるフリップ・フロップ流れの発現メカニズムを定量的に明らかにするために,二次元粒子画像流速測定法(PIV)と二次元レーザ・ドップラー流速計(LDV)による可視化計測や浮子追跡法などによる流れの可視化実験を行った.それらの実験では,流れ方向の菱形角柱の列数を一列から最大六列まで変化させ,それぞれの管路の最終列での中央部に位置する菱形角柱に挟まれた分流領域での流速及びその変動の計測を行った.特に今年度は,流路の上流側からの乱れのフリップ・フロップ流れへの影響についてLDVを用いて流速変動を計測し,そのスペクトル特性も調べた.以下に主要な結論を箇条書きにして示す.(1)PIVを用いて分流領域内に発現する三次元的な縦渦及び渦の連結振動を流速ベクトルの変化によって示すことができた.(2)LDVを用いて第四列目のLeading edge付近において,フリップ・フロップ流れやカルマン渦列のそれぞれの振動と交差流れのせん断層の振動などが相互干渉を起こす形で重なり合う節目の点である「干渉節目点」が存在していることを明らかにすることができた.また流路断面の違いや上流側からの乱れの供給の変化に対して,菱形角柱群流路におけるフリップ・フロップ流れの振動特性を定量的に明らかにすることができた.(3)干渉節目点がエッジトーン現象の発現点となり,フリップ・フロップ流れの発現の引き金的な役割を果たすことも説明することができた.またフリップ・フロップ流れの発現メカニズムも説明することができ,交差角が30°の菱形角柱群流路内のフリップ・フロップ流れについては,カルマン渦列振動の周波数とは大きく異なるが,規則正しく,しかも安定した自励振動が発現することも明らかにすることができた.
細胞イメージングによる歯周病と認知症の関連におけるオートファジー機構解明

肥満ー歯周病ー認知症で相互作用があるのか、その際オートファジー機能とはどのような関連があるのかを解析するため、神経細胞株に、歯周病原細菌由来LPS刺激および各種アディポカインやサイトカインを高血糖培地で培養し、レプチン、レプチン受容体やオートファジー関連因子の発現に違いを調べた。イメージングサイトメーターを使用し、各種サイトカイン、アディポカイン誘導時の細胞にてオートファジー関連因子の発現と細胞形態に関連があるのか、細胞内の転写因子局在などについて解析している。各種シグナル伝達抑制剤およびレプチン、レプチン受容体のsiRNAを作成し、神経細胞株に遺伝子導入後の変化について確認する予定である。1Aa菌を培養し、培養した細菌を超音波粉砕後、超遠心とプロテアーゼで処理し、凍結乾燥したのち使用する。神経細胞および歯肉線維芽細胞の培養を開始する。21)各種細胞に各種LPSを添加し、経時的に培養上清を回収し、MTT Assay、LDH Assayにより細胞の生存率および増殖率の違いを検証する。3)各種LPSによる刺激後、経時的に回収した培養上清中各種サイトカイン、アディポカインの産生量をELISA法で定量し、各種細胞における濃度依存的および経時的な産生の違いについて解析している。各種細胞に各種LPSを添加し、経時的に培養上清を回収し、MTT Assay、LDH Assayにより細胞の生存率および増殖率の違いを検証できている。各種LPS添加後、経時的に回収した細胞からRNAを抽出し、cDNAを合成する。Real-time PCRでTNF-α、IL-6、IL-1等サイトカイン、Adiponectin, resistin, leptin等アディポカインのmRNA量を定量し比較することができており、おおむね順調に進んでいる。各種神経細胞に歯周病原菌であるPorphyromonas gingivalis由来LPSおよび大腸菌由来LPSを添加し、経時的に培養上清を回収し、MTT Assay、LDH Assayにより細胞の生存率および増殖率に違いがあるかどうかを検証した。LPSの種により生存率や増殖率に有意な差は認めなかった。各種LPS添加後、経時的に回収した細胞からRNAを抽出し、cDNAを合成した。Real-time RT-PCR法でTNF-α、IL-6、IL-1等サイトカイン、アディポネクチン,レジスチン,レプチン等アディポカインのmRNA量を定量し比較したところ、炎症に関係するTNF-αの発現が有意に高くなっていることを確認した。アディポカインの産生量については、培養条件により各回ごとに結果が一定しないため、再度研究方法を含めて検討中である。各種LPSによる刺激後、経時的に回収した培養上清中各種サイトカイン、アディポカインの産生量をELISA法で定量し、各種細胞における濃度依存的および経時的な産生の違いについて解析した。歯周病菌由来LPSでは、大腸菌と同じ濃度では、有意な結果が得られないことが多く、作用として弱いことが示唆された。各種LPS添加後、経時的に回収した細胞をアディポネクチン,レジスチン,レプチン等アディポカインおよびATG5, ATG7, BECN1などのオートファジー関連因子の抗体を用いたWestern blotting法により発現の違いを解析した。高血糖培地での培養後の細胞とも比較した。アディポカインについては、培養条件により結果が一定しないため、再度方法を含めて検討中である。慢性炎症は、糖尿病の原因・結果双方の病態に深く関わっているが、その詳細な機序については、不明な点も多い。肥満により脂肪細胞が肥大化することで、マクロファージやリンパ球などの免疫細胞が増殖し、炎症性サイトカインやアディポカインと呼称される生理物質が産生される。我々はこれまで、歯周病と肥満とが相乗作用で、全身健康状態の悪化に関連するのではないかという仮説に基づき、肝細胞やヒト由来好中球、単球で歯周病由来因子刺激により各種サイトカインおよびアディポカイン産生が上昇する結果を得てきた。歯周病と認知症は、どちらも老化に伴い症状が進行していく疾患であるが、関連があるのか、肥満ー歯周病ー認知症で相互作用があるのかなどの報告は全くなされていない。認知症は、糖尿病との関連やアディポカインの1つであるレプチンとの関連が数多く報告されている。また、オートファジーは、不要な蛋白のターンオーバーと障害を受けた細胞内小器官の除去を行うため、加齢にとって非常に重要な役割を果たしている。加齢は、オートファジーの低下(ATG5, ATG7, BECN1発現の低下)でもあり、認知症の進行に深く関わることが報告されている。ヒト由来神経細胞株に、歯周病原細菌由来LPS刺激およびレプチンや高グルコースを加え、オートファジー関連因子の発現に違いがあるのかどうか、またイメージングサイトメーターにより、オートファジー関連因子の発現と細胞形態に関連があるのかについて解析する。肥満ー歯周病ー

認知症で相互作用があるのか、その際オートファジー機能とはどのような関連があるのかを解析するため、神経細胞株に、歯周病原細菌由来LPS刺激および各種アディポカインやサイトカインを高血糖培地で培養し、レプチン、レプチン受容体やオートファジー関連因子の発現に違いを調べた。イメージングサイトメーターを使用し、各種サイトカイン、アディポカイン誘導時の細胞にてオートファジー関連因子の発現と細胞形態に関連があるのか、細胞内の転写因子局在などについて解析している。各種シグナル伝達抑制剤およびレプチン、レプチン受容体のsiRNAを作成し、神経細胞株に遺伝子導入後の変化について確認する予定である。ATG5, ATG7, BECN1などのオートファジー関連因子の抗体を用いたWestern blotting法により発現の違いを解析する。その後1イメージングサイトメーターにより、各種サイトカイン、アディポカイン、オートファジー関連因子を発現した細胞と細胞形態に関連があるかどうかを解析する。また、細胞内転写因子局在もあわせて確認する。31)レプチンおよびレプチン受容体siRNAを作成し、神経細胞と歯肉線維芽細胞に遺伝子導入後、MTT Assay、LDH Assayにより細胞の生存率および増殖率の違いを検証する。2)各種LPSで刺激後の各種サイトカイン、アディポカイン産生をELISA法およびWestern blot、Real-time PCRにて比較し、さらに高血糖培養条件でも同様に解析する。レプチンおよびレプチン受容体siRNAを作成し、神経細胞と歯肉線維芽細胞に遺伝子導入後、MTT Assay、LDH Assayにより細胞の生存率および増殖率の違いを検証する。各種LPSで刺激後の各種サイトカイン、アディポカイン産生をELISA法およびWestern blot、Real-time PCRにて比較し、さらに高血糖培地で培養した細胞でも同様に解析する。社会歯科学ATG5, ATG7, BECN1などのオートファジー関連因子の抗体を用いたWestern blotting法による発現の違いを解析するまでは、研究を進めることができず、当初予定していた抗体類が未購入であるため。神経細胞の培養についてはなかなかうまくいかず、細胞増殖を軌道に乗せるまでに予想以上に時間がかかったため、実験自体を進めることができなかった。2糖尿病モデルにおける各種LPS添加時の解析のため、レプチン遺伝子変異マウスob/obマウスおよびレプチン受容体欠損マウスdb/dbに各種LPSを投与し、マウス用CTを用いて海馬の面積などに違いがあるかどうか検証する。神経細胞に各種LPS添加後、経時的に回収した細胞をアディポネクチン,レジスチン,レプチン等アディポカインおよびATG5, ATG7, BECN1などのオートファジー関連因子の抗体を用いたWestern blotting法により発現の違いを解析する。高血糖培地での培養後の細胞とも比較する。
解糖系酵素の遺伝子発現調節機構を利用した有用蛋白質生産のための動物細胞工学

動物細胞による蛋白質生産系の大きな問題点の一つは酸素供給である。他の栄養素は一時に過剰に添加することが出来るが、酸素は溶解度が低いため連続的に供給する必要がある。この研究は、これらの問題点を解決するために、低酸素により発現が誘導される遺伝子の特徴を利用したものである。低酸素に応答して発現が誘導される遺伝子は多数発見されており、解糖系の酵素乳酸脱水素酵素A(LDHA)もその一例である。この遺伝子のプロモーターの特徴は、通常の酸素圧下でも強い転写活性を持ち、なお且つその活性が低酸素で誘導されることである。LDHAのプロモーターの下流にEPO遺伝子を接続したプラスミドを作製し、これをチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)細胞に導入し、多数の細胞株を取得した。この細胞株の中には、常酸素圧でもEPOを大量に生産し、しかも低酸素圧では更に生産が強く誘導される細胞株を発見した。なお、プロモーターの低酸素応答部位に変異を導入した場合には、EPOの生産が低酸素で誘導される株は得られず、酸素に応答する遺伝子の特徴が利用されていることを証明することが出来た。さらに、種々の酸素濃度で培養した培養上清よりEPOを単離し、in vtro及びin vivo活性を測定し、糖鎖を解析し、どの酸素条件で培養した場合でも一定の品質を持つEPOが生産せれていることをを示し、本研究で開発した方法が実用的に適していることを証明した。低酸素応咎性領域を含む乳酸脱水素酵素A(LDHA)のプロモーターの下流にエリスロポエチン遺伝子を接続した発現ベクターを構築した。また、コントロールとして低酸素応答性領域に変異を導入し、低酸素応答性がない発現ベクターを構築した。これらの発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣(CHO)胞に導入して、安定形質導入細胞株を得た。期待通り、野生型の低酸素応答性領域を持つ発現ベクターが導入された細胞では、明らかな低酸素誘導性(約10倍以上)のエリスロポエチン産生が見られ、一方変異型の低酸素応答性領域を持つ発現ベクターが導入された株では低酸素誘導性のエリスロポエチン発見は見られなかった。同様に、コバルトによる発現誘導も野生型の低酸素応答性領域を持つ株でのみ輯察された。エリスロポエチンは糖蛋白質で、その糖鎖はin vitroの活性には必要ではないが、in vivoの活性には必須である。低酸素条件下で細胞を培養して生産したエリスロポエチンが通常酸素圧下で培養した場合と同じ活性を持つか、つまり低酸素条件下でも同様な糖鎖の付加が見られるかについて検討した。その結果、SDS-PAGEでどちらの培養条件下でも同じ分子サイズのエリスロポエチンが産生されており、実際エリスロポエチン依存的に生育する細胞株を用いたin vitro活性測定法においても、飢餓ラットを用いたin vivo活性測定法においそも低酸素条件下で培養しても、通常酸素条件下で培養した場合と同程度の比活性を有するエリスロポエチンが産生されていることが確認された。また、今回用いたLDHAプロモーターは通常酸素条件下でも強力なプロモーターであり、さらに低酸素で誘導がかかることから、動物培養細胞による物質生産に有用であることが示唆された。この結果、二つの問題が生じる。(1)動物細胞は撹拌など剪断力をに対して脆弱であり、多くの改良がなされたとはいえ酸素供給は常に細胞損傷を伴う。(2)蛋白質の高生産を目指して活発な代謝を維持するための酸素の大量供給は、ATP生産のためのミトコンドリア機能をフル回転させることとなり、活性酸素が活発に生産され細胞死を招く。

低酸素に応答して発現が誘導される遺伝子は多数発見されており、解糖系の酵素乳酸脱水素酵素A(LDHA)もその一例である。この遺伝子のプロモーターの特徴は、通常の酸素圧下でも強い転写活性を持ち、なお且つその活性が低酸素で誘導されることである。LDHAのプロモーターの下流にEPO遺伝子を接続したプラスミドを作製し、これをチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)細胞に導入し、多数の細胞株を取得した。この細胞株の中には、常酸素圧でもEPOを大量に生産し、しかも低酸素圧では更に生産が強く誘導される細胞株を発見した。なお、プロモーターの低酸素応答部位に変異を導入した場合には、EPOの生産が低酸素で誘導される株は得られず、酸素に応答する遺伝子の特徴が利用されていることを証明することが出来た。動物細胞による蛋白質生産系の大きな問題点の一つは酸素供給である。他の栄養素は一時に過剰に添加することが出来るが、酸素は溶解度が低いため連続的に供給する必要がある。この研究は、これらの問題点を解決するために、低酸素により発現が誘導される遺伝子の特徴を利用したものである。さらに、種々の酸素濃度で培養した培養上清よりEPOを単離し、in vtro及びin vivo活性を測定し、糖鎖を解析し、どの酸素条件で培養した場合でも一定の品質を持つEPOが生産せれていることをを示し、本研究で開発した方法が実用的に適していることを証明した。
磁性強誘電体における電気磁気ドメインの制御

強誘電性と磁性を併せ持つ磁性強誘電体は、ジュール熱によるエネルギーの損失を極力抑えることでき、かつ電気分極及び磁化という複数の秩序変数を利用したデバイスの基本原理として期待されている。特に近年、らせん磁気構造によって誘起される電気分極が発見された事を契機として、新物質の探索や新しい物性制御方法の開拓に観点をおいた研究がなされてきた。強的な秩序を持つ物質では、電気分極や磁化の向きが180°あるいは90°異なるドメイン(分域)が形成される。このようなドメイン間に存在するドメイン壁(分域壁)の性質が抗電場や抗磁場の大きさ、あるいは外場応答の速さを決めるため、物性制御の観点ではドメイン壁の性質を調べることが重要である。このため本研究では、磁場印加により電気分極の方向が90°回転する斜方晶RMnO_3等の磁性居誘電体を対象として、電気分極回転時に現れるドメイン壁の制御方法を開拓することを目的として研究を行った。以下ではTb_<1-x>Dy_xMnO_3を対象とした研究について述べる。初めに単結晶試料を作成し、傾き磁場下での電気分極の回転する向きを調べた。実験結果から、電気分極回転時に現れるドメイン壁の厚さが試料の組成及び印加磁場の強度によって変化する事を見出した。強誘電体ではドメイン壁の運動は低周波の誘電率に寄与する。このため電気分極回転時の誘電率の変化を調べることで、ドメイン壁の易動度を調べることができる。電気分極測定と同じ試料について電気分極回転時の誘電率を調べた結果、磁場印加強度や試料組成に依存して誘電率の大きさが変化する事を見出した。傾き磁場下における電気分極の回転する向きの変化と電気分極回転時の誘電率の大きさの変化は振る舞いの傾向が一致していることから、本研究ではらせん磁性強誘電体における90°ドメイン壁の厚さおよび易動度を観測し、磁場や組成変化によって制御可能であることを明らかにした。
鶏肝臓における新規脂質シグナルの転写調節メカニズム解析-高機能性食肉生産の基盤-

家畜・家禽の脂肪細胞の容量を決定するVLDLの本体であるapolipoprotein Bは、通常、post-transcriptional regulation(apolipoprotein B蛋白質の細胞内分解)によって制御されていることが知られている。本研究では、apolipoprotein Bの遺伝子発現を制御する肝臓の新たな脂質シグナル制御機構を明らかにすることを試みた。本研究では、まず、この応答が生理的なin vivoの状況でも起こっていることを確認した。次に、初代肝細胞を用いて、プロモーターアッセイを行ったところ、apolipoproteinBのプロモーター領域-200bpおよび-1000-2000bpの2カ所に応答領域が存在することが明らかとなり、新たなシグナル経路であることが明らかとなった。家畜・家禽の脂肪細胞の容量を決定するVLDLの本体であるapolipoprotein Bは、通常、post-transcriptional regulation (apolipoprotein B蛋白質の細胞内分解)によって制御されていることが知られている。本研究では、apolipoprotein Bの肝臓における新たな脂質シグナル制御機構を、これまで我々が情報を蓄積してきたオクタン酸・デカン酸をモデルにして明らかにして、「脂質シグナルー転写因子のクロストークー機能性食肉の生産」という新たな畜産の技術基盤を構築することを目指す。研究初年度である本年度は、鶏へのオクタン酸・デカン酸のトリグリセリドを給与した場合の肝apolipoprotein Bの代謝応答を明らかにすることを中心に試験を行った。1.オクタン酸・デカン酸のトリグリセリドを8%含む飼料をブロイラーに給与しても、肝臓apolipoproteinBの合成に大きな影響は認められなかったものの、各トリグリセリドを短期強制給与、あるいは高脂肪飼料にオクタン酸・デカン酸トリグリセリドを添加した飼料の給与では、肝臓のapolipoproteinB mRNA発現が有意に低下し、脂肪酸シグナルによる転写調節が認められた。よって、このシグナルは、脂肪が負荷された場合に発現するものと推定された。2. apolipoproteinB promoter上に推定結合配列が存在するHNF4-αのmRNA発現は、apolipoproteinB mRNA発現が低下する条件で低下していた。また、promoter領域にその結合配列は見出されないものの、脂質代謝を調節する転写因子SREBP-1のmRNA発現もHNF4-α同様低下していた。その他の、転写因子やインスリンなどのホルモン、細胞内のATPレベルに中鎖脂肪酸のシグナルの影響は認められなかった。3.鶏apolipoproteinB promoterの配列をPCRで増幅し、pGL4.10にコンストラクトした。以上より、本脂質シグナルは新たな経路で作用していること、このシグナルはin vivoでも存在することが明らかとなった。本研究では、apolipoprotein Bの肝臓における新たな脂質シグナル制御機構を、これまで我々が情報を蓄積してきたオクタン酸・デカン酸をモデルにして明らかにして、「脂質シグナル-転写因子のクロスドーク-機能性食肉の生産」という新たな畜産の技術基盤を構築することを目指す。本年度はデカン酸の肝細胞apolipoprotein B mRNA抑制作用の機構解析を、apolipoprotein Bプロモーター解析を用いて行った。1.デカン酸による鶏初代肝細胞のapolipoproteinB mRNA抑制機構を明らかにすることを目的として、apolipoproteinBのプロモーター領域(約2000bp)を鶏ゲノムより抽出し、各種のデリーションミュータントを作成し、これをpGL4.10にコンストラクトした。次に、鶏肝細胞に、リポフェクション、あるいはエレクトロポレーションでコンストラクトをpRLとともに導入し、Dual-Luciferase Reporter Assayを行なった。その結果、転写開始点より-200bpに応答領域が同定され、3箇所のHNF4-α結合推定領域が認められた。2.本実験系の細胞のmRNA発現を調べたところ、HNF4-αの遺伝子発現低下が認められたものの、SREBP-1の遺伝子発現には、デカン酸は影響しないことが明らかとなった。3.EMSAとWestern blotによる解析から、デカン酸によるapolipoproteinB mRNA抑制機構にはHNF4-αの核内蛋白量が関与していることが明らかとなった。以上より、本脂質シグナルはHNF-4αを転写レベルで低下させる機構により、VLDL分泌を低下させることが明らかとなり、次年度は、HNF4-αのプロモーター解析を行うことにより、本脂質シグナルの転写調節機構の全様を解明できるものと推定された。

本年度は、鶏初代肝細胞を用いたin vitro実験系で、オクタン酸、デカン酸の脂質シグナルの本質に迫る解析、すなわちHNF-4αのプロモーター解析と鶏個体を用いた試験を行い、生体内でのシグナルの存在を実証するとともに、食肉への機能性脂質の移行を確認した。1.pmmoter解析によるシグナルの確定pGL4.10にコンストラクトした、鶏HNF-4αプロモーター領域(2000, 1500, 1000, 500, 300bp)を鶏初代肝細胞にpGL4.74とともにトランスフェクションし、デカン酸を用いたプロモーター解析を行ったところ、-1,000付近にシグナル応答部位が存在する可能性が示唆された。一方、apolipoproteinBのプロモーターをHNF-4αとともに導入したところ、HNF-4αに依存しない、新たな応答領域が-2,000-1,000bpに存在することが明らかとなった。よって、脂質によるシグナルは、単一の分子や配列で制御されているのではなく、複合的な制御を受けていることをはじめて明らかにした。残念ながら、本研究では、そのすべてを解析することはできなかったが、中鎖脂肪酸による脂質代謝制御シグナルの存在を世界ではじめて確定することができた。2.鶏生体における脂質シグナルの同定と機能性食肉の生産平成20年度に確立したオクタン酸・デカン酸の強制給与実験系を用いて、転写因子であるHNF-4αの蛋白質発現解析を行ったところ、確かにHNF-4αタンパク質が減少していることを立証した。さらに、機能食肉生産の基礎研究として、食肉中の脂肪酸組成を測定し、機能性脂質が食肉に移行していることを確認することができた。しかし、その存在量は少なく、応用にはさらなる飼料給与スケジュールの検討が必要であることが明らかとなった。
白色腐朽菌のリグニン・糖質分解関連遺伝子間転写ネットワークの解明

C. subvermisporaが、セルロースを残し、リグニンを選択的に分解する理由として、これまでセルラーゼの活性が低いことやフェントン反応によるセルロースの分解抑制などが報告されている。また主な糖質加水分解酵素としてキシラナーゼを多く発現していることから、ヘミセルロースを主な炭素源としていることも考えられる。本研究ではリグニン分解のメカニズムが炭素源と関連があるのではないかと考え、各糖を唯一の炭素源とした培地、およびブナ単離リグニン(MWL)を添加した条件で培養した菌体外酵素の活性およびタンパク質発現、遺伝子発現について解析を行った。その結果、糖源の違いにより、培養4ー14日目の培養上清のマンガンペルオキシダーゼ(Mnp)、ラッカーゼ(Lac)活性、糖質分解活性、およびPolyR-478の脱色に違いが見られた。異なる糖源による培養で分解に差が見られたことから、培養上清のタンパク質を網羅的に解析するため、iTRAQを用いてプロテオーム解析を行った。その結果、糖質加水分解酵素の他、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、などリグニンの酸化的分解に関わっていると考えられている酵素に差が見られた。また、遺伝子レベルでの発現を解析するため、リアルタイムPCR法でLacとMnpの発現量の変化を調べ、さらに詳細な遺伝子発現を調べるため、RNAシークエンスを行った。この結果は現在解析中である。本研究の結果から、C.subvermisporaの選択的なリグニン分解機構に関わる要素として、糖によるリグニン酸化分解に関与する酵素の発現促進、または、酸化酵素発現の抑制が示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。木材中のリグニンを選択的に分解する白色腐朽菌C. subvermisporaのリグニン分解機構と糖質加水分解機構の関連について明らかにするため、炭素源(糖)の違いによるリグニン分解酵素、および糖質分解酵素の発現を調べた。液体培地および、プレート培地に添加する唯一の炭素源となる糖、グルコース、セロビオース、セルロ一ス(結晶性;アビセル、非結晶性;カルボキシメチルセルロース)、キシロ一ス、キシロビオース、キシロトリオース、キシロオリゴ糖等の濃度を変えて添加し、さらにリグニンモデル化合物であるPolyR-478を添加し、菌体生育とリグニン分解能を調べた。これまでの研究で、糖の種類によってPolyR-478の色素分解様式が異なることを見いだしている、今回、プレ一ト上で培地中の糖の濃度を変えてもPolyR-478の色素分解自体に大きな影響は見られなかったことから、少量の糖の存在でもリグニン分解酵素の発現促進および抑制に寄与する可能性が示唆された。次に、糖培地の違いによる遺伝子の発現量をリアルタイムPCRで調べるため、リグニン分解酵素である、マンガンペルオキシダーゼ(Mnp)とラッカーゼ(Lac)、およびゲノムDNA上の遺伝子のアノテーションを行い見いだした未報告のキシロース代謝系酵素のプライマーを作製した。各種糖培養した菌体よりRNAを抽出し、リアルタイムPCRを用いて遺伝子の発現量を測定するための測定方法を確立した。それを用いて現在、各種糖培地での培養時間を変えて、RNAを抽出し、それぞれの遺伝子の発現量を時間単位で測定している。また、方法が確立されていないAuto-2Dの条件検討を市販酵素の糖質分解酵素を用い行った。様々な条件で泳動を行い、二次元泳動に必要なタンパク質量、酵素タンパク質の精製条件などを確立することができた。さらに得られたスポットからMALDI-TOF-MSによる解析が可能であることも確認された。この成果は第64回日本木材学会大会(2014、愛媛)で報告し、論文を執筆中である。白色腐朽菌C.subvermisporaは、セルロースを残しリグニンを選択的に分解するという特性から、バイオマス利用の観点からもそのメカニズムが注目されている。これまで、セルラーゼ活性が低いことやフェントン反応によるセルロースの分解抑制などが報告されているが、糖とリグニン分解機構に何らかの関係があると考え、遺伝子発現/抑制、酵素の発現・活性から解析を試みた。本年度は,木材中のリグニンを選択的に分解する白色腐朽菌C.subvermisporaのリグニン分解機構と糖質加水分解機構との関連について明らかにするため、主に、炭素源の違いによるリグニン分解酵素や代謝酵素の遺伝子発現をリアルタイムPCR法を用いて解析した。これまでの研究で、プレート培地中のリグニンモデル化合物の分解が、添加する炭素源によって異なることがわかっている。そこでそれら炭素源の違いによる遺伝子発現量の違いをリアルタイムPCR法で比較した。リグニン分解酵素である、マンガンペルオキシダーゼ(Mnp)とラッカーゼ(Lac)、およびゲノムDNA上の遺伝子のアノテーションを行い見いだした代謝系酵素のプライマーを用いて解析を行った。その結果、5時間までの測定でMnp, LacのRNA発現に違いが見られた。発現量の比較としてハウスキーピング遺伝子にはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼとβ-チューブリンを用いた。現在、代謝系遺伝子および糖質加水分解酵素の解析検討を行っている。また、異なる糖源で培養した菌体外のリグニン分解酵素および糖質分解酵素の分析を二次元電気泳動(2DE)で行うため培養条件の検討を行っている。

また主な糖質加水分解酵素としてキシラナーゼを多く発現していることから、ヘミセルロースを主な炭素源としていることも考えられる。本研究ではリグニン分解のメカニズムが炭素源と関連があるのではないかと考え、各糖を唯一の炭素源とした培地、およびブナ単離リグニン(MWL)を添加した条件で培養した菌体外酵素の活性およびタンパク質発現、遺伝子発現について解析を行った。その結果、糖源の違いにより、培養4ー14日目の培養上清のマンガンペルオキシダーゼ(Mnp)、ラッカーゼ(Lac)活性、糖質分解活性、およびPolyR-478の脱色に違いが見られた。異なる糖源による培養で分解に差が見られたことから、培養上清のタンパク質を網羅的に解析するため、iTRAQを用いてプロテオーム解析を行った。その結果、糖質加水分解酵素の他、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、などリグニンの酸化的分解に関わっていると考えられている酵素に差が見られた。また、遺伝子レベルでの発現を解析するため、リアルタイムPCR法でLacとMnpの発現量の変化を調べ、さらに詳細な遺伝子発現を調べるため、RNAシークエンスを行った。この結果は現在解析中である。本研究の結果から、C.subvermisporaの選択的なリグニン分解機構に関わる要素として、糖によるリグニン酸化分解に関与する酵素の発現促進、または、酸化酵素発現の抑制が示唆された。本年度は,リグニン分解酵素や代謝酵素の遺伝子発現をリアルタイムPCR法を用いて解析した。リファレンス遺伝子や添加する糖量、培養時間を比較し、遺伝子発現/抑制のデータを得ることができた。しかし、酵素のタンパク質側からのアプローチなど、条件検討に時間を費やしたため、転写因子の同定には至らなかったが、本年度得られた遺伝子発現量などの結果を踏まえて解析を進めていきたいと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。二次元電気泳動によって各種条件で培養した菌体内、菌体外のタンパク質を分離し、各条件下における発現に違いが見られたスポットをMALDI-TOF-MSで解析する。同時に、リグニン分解酵素および糖質加水分解酵素の活性を測定する。遺伝子発現に差が生じた転写因子に関して、リグニン分解関連酵素と糖質分解酵素の発現制御に関わる転写因子を解明する。当初の計画にあった、糖源によるリグニン分解能の培養条件等を確立することが出来た.また、リアルタイムPCRのプライマー作製や条件検討を行い、実際のサンプルでの解析を始めることができた。また、プロテオーム解析ではAuto-2Dを尊人し、解析に必要なタンパク質量などを詳細に検討できた。リグニン分解酵素と糖質加水分解酵素の転写量の測定糖源の違いにより発現が変動したリグニン分解酵素と糖質分解酵素の転写駄を定最的に測定し、どの糖がどの酵素の発現を促進および抑制するのかを明らかにする。転写因子の同定それぞれの酵素をコードした遺伝子のプロモーター/エンハンサー配列と推定される部分に結合する転写因子タンパク質をゲルシフトアッセイに供し、シフトしたバンドに含まれる、転写に関わるタンパク質を同定する。