hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
うつ病に関連する遺伝子およびそのメチル化と養育期環境の交互作用の解析

以上の結果の一部を国際学会(ASHG 2016)で報告した。さらに今後は、うつ状態に関係するメチル化変化について得られた結果を国際誌へ投稿予定としている。本研究では、うつ症状に関連する遺伝・環境要因の同定を行い、環境ストレスと関係する遺伝子のメチル化とうつ症状の関連を調べるものである。これまでに収集した関東近郊に在住の約800名の成人サンプルを対象に、うつ症状につながる環境・遺伝交互作用について、全ゲノムレベルでの解析を行い、候補部位を見出した。また、うつ症状に関係するメチル化部位についても全ゲノムレベルで有意な部位は見られなかったが、候補となるメチル化領域が見出された。うつ病の全ゲノム対象の関連解析を行い、遺伝・環境相互作用解析を行ったところ、関連する遺伝子を見出し、別のサンプル集団においても相互作用に有意な結果を得た。上記の結果をもとに、次年度の環境ストレスとメチル化変化量の関連解析につなげることができるため、当初予定していた研究目的を達成したといえる。本年度で得た全ゲノムメチル化解析の結果を用いて、今後はうつ状態群と健常群のこれまでの親の養育態度との関連を調べ、さらに有意な関連遺伝子部位が見出されるか調べる予定である。また遺伝子解析自体は予定通り進行しているが、結果の解釈や追加データ解析に遅れが生じており、今後はそうした結果をまとめて学会発表や国際誌への投稿を継続して進めていくこととしている。精神科遺伝学遺伝・環境相互作用については、生涯変化のない遺伝配列上の個人差(多型)と環境ストレスとの相互作用だけではなく、遺伝配列に変化はないが、環境ストレスによってDNAやその構造を変化させ、遺伝子の働きを就職するエピジェネティックス(メチル化)との関連が報告されている。そこで、うつ病と関連する遺伝子候補部位について一部サンプル(n=50)を用いて遺伝子メチル化変化量を調べ、ストレスやうつ病に関連する遺伝部位の解析を進めていく。当初の研究計画の変更はない。当初予定していたうつ病の候補遺伝子の多型解析と全ゲノム対象の関連解析を行い、関連する遺伝子を見出しており、当初の予定通り進んでいる。現在投稿中の論文が査読中であり、オープンアクセスジャーナルであるため、当初の予定では予算を組んでいたが、査読期間が延びているため。概ね予定通りの予算使用となっているが、当初予定していた研究結果報告の論文投稿準備中であり、英文雑誌掲載料を前倒し支払い請求を行ったが、今年度での論文受理とならなかったため。上記により、投稿論文受理後の掲載費用として次年度への使用予算として計上した。さらに、今後の研究結果の国際学会での参加発表および他の国際雑誌への投稿発表費用としての使用を計画している。2013年度に行った研究成果をもとに、全ゲノム関連解析で見出した関連部位について、別の集団を用いた確認実験を行う。さらに、うつ病の候補遺伝子の多型部位について遺伝子タイピングを行い、本研究で用いたサンプル集団で再現可能かどうかを確認する。すでに新たに別集団のサンプル収集は終了しており、解析に取り組める段階となっている。
地方圏における出生力の地域差とその要因に関する研究

近年地方圏においても少子化が進み、農家の次男、三男などの「潜在的他出者」は大きく減少し、人口流出は人口減少の主たる要因ではなくなりつつある。地方圏においても今後は、出生力低下と。「多産少死」世代の加齢に伴う死亡数増加がもたらす自然減が、人口減少の主たる要因となる。以上の問題関心から本研究では、地方圏を対象に、市町村あるいはそれよりも小地域のスケールで、出生力の地域差を把握し、その地域差をもたらす諸要因について解明することを目的とする。具体的には、市町村別の既存統計や調査データの分析を行い、それに加えて、とくに子ども数の多い地域では聞き取り調査等の現地調査を行う。主たる研究対象地域としては、47都道府県中最も合計特殊出生率が大きい沖縄県を選定した。データ分析から、沖縄県の中でも本島南部地域および離島地域においてとくに出生率が大きい傾向がみられたため、研究初年度である平成17年度においては、本島南部地域を対象として実態調査を行った。また平成18年度においては19982002年において合計特殊出生率が全国で最も大きかった多良間村において実態調査を行った。具体的には、役場の次世代育成支援政策担当者からヒアリングを行い、また保育所・幼稚園において職員や児童の父母に対してインタビュー調査を行った。その結果、伝統的な男児選好が近年においてもなお出生率を押し上げる要因となっているものの、徐々に弱まりをみせつつあること、高齢者も含めて自宅外就業者が増えていること等に伴う育児資源の脆弱化が沖縄においても進行していること、等の知見を得るに至った。ただ、多良間村においてはこれらの変化がまだあまり進行していないため、出生率が未だに高水準にあると考えられる。地方圏においても今後は、出生力低下と、「多産少死」世代の加齢に伴う死亡数増加がもたらす自然減が、人口減少の主たる要因となる。研究初年度である平成17年度においては、47都道府県中最も合計特殊出生率が大きい沖縄県を対象に、データ分析及び実態調査を行うこととした。データ分析から、沖縄県の中でもとくに南部地域において比較的出生率が大きい傾向がみられたため、これらの地域を対象として実態調査を行うこととした。具体的には、市役所・町役場の次世代育成支援政策担当者からヒアリングを行い、また保育所において職員や児童の父母に対してインタビュー調査を行った。その結果、1)伝統的な男児選好が近年においてもなお出生率を押し上げる要因となっているものの、徐々に弱まりをみせつつあること、2)高齢者も含めて自宅外就業者が増えていること等に伴う育児資源の脆弱化が沖縄においても進行していること、等の知見を得るに至った。次年度においてもこれらの結果の分析をさらに継続するとともに、他県においても同様のデータ分析及び実態調査を行うこととする。
人格傾向と遺伝子の関連についての分子遺伝学的研究

1.人格のおよそ50%は親からの遺伝によると考えられている。その遺伝的背景にせまるため遺伝子多型と人格傾向との関連を検討した。健康成人100名と双極性障害患者90名について、セロトニントランスポーター遺伝子転写調節領域、ドーパミントランスポーター遺伝子3'非翻訳領域、ドーパミンD4/D3受容体遺伝子、レニン・アンギオテンシン変換酵素の遺伝子多型についてPCR法にて頻度を検討した。セロトニントランスポーター転写調節領域(5-HTT gene-linked polymorphic region:5-HTTLPR)の多型に関しては双極性患者群で短い塩基配列を持つ対立遺伝子(s allele)の頻度が有意に高いことがわかった。この遺伝子多型には人種差があり、日本人は白人よりs alleleが高頻度にみられた。2.気分障害患者にはいくつかの特徴的な病前性格が知られているが、人格の5因子次元モデル(big five)に基づくNEO質問紙を用いて、気分障害の患者における人格傾向の特徴を病型別に比較した。健康成人200名と寛解状態の気分障害患者215名(双極性障害91例、大うつ病性障害124例)について、NEO質問紙と両親の養育態度をみるPBI質問紙を用いて評価を行った。その結果、NEOの「外向性」スコアの得点は大うつ病患者群で低く、「開放性」のスコアにおいては双極性障害患者は大うつ病患者より高いことがわかった。3.双極性障害発症の要因のひとつとして脳内セロトニン神経系およびドーパミン神経系の機能障害が想定されている。そこで我々はセロトニントランスポーター(5-HTT)遺伝子の多型、ドーパミンD4レセプター(D4DR)およびドーパミントランスポーター(DAT)遺伝子の繰り返し配列多型に関して遺伝子型の分布と対立遺伝子の頻度を、双極性障害患者群と対照群との間で比較検討した。その結果、双極性障害患者と5-HTT遺伝子のプロモーター領域多型との間に有意な関連が認められた。人格のおよそ50%は親からの遺伝によると考えられている。その遺伝的背景にせまるため人格傾向に関連する遺伝子の候補を探し、遺伝子多型と人格傾向との関連を検討する。また、気分障害患者にはいくつかの特徴的な病前性格が知られているが、遺伝学的手法を用いて解析することにより、気分障害の発症予測因子あるいは発症準備因子をある程度明らかにすることも可能と思われる。本年度は特に倫理面に配慮しながらサンプル数を増やすことを優先し、研究を遂行した。1.健康成人100名と寛解状態の気分障害患者82名(双極性障害28例、大うつ病性障害54例)について、人格の次元診断のためのNEO質問紙と両親の養育態度を評価するためのPBI質問紙に記入させ、採血10ccを行った。2.セロトニントランスポーター遺伝子転写調節領域、ドーパミントランスポーター遺伝子の3'非翻訳領域、ドーパミンD4受容体、レニン・アンギオテンシン変換酵素の遺伝子多型についてPCR法を用いて判定し、患者群での頻度を検討した。3. NEOによる5つの気質(big five)により、患者群と健康成人の気質傾向を比較した。結果比較的少数例ではあるが、セロトニントランスポーターについては患者群で短い塩基配列を持つ対立遺伝子(s allele)の頻度が高いことがわかった。この遺伝子多型には人種差があり、日本人は白人に比べてs alleleが多く認められた。1.気分障害患者にはいくつかの特徴的な病前性格が知られているが、人格の5因子次元モデル(big five)に基づくNEO質問紙を用いて、気分障害の患者における人格傾向の特徴を病型別に比較した。

健康成人200名と寛解状態の気分障害患者215名(双極性障害91例、大うつ病性障害124例)について、NEO質問紙と両親の養育態度をみるPBI質問紙を用いて評価を行った。その結果、NEOの「外向性」スコアの得点は大うつ病患者群で低く、「開放性」のスコアにおいては双極性障害患者は大うつ病患者より高いことがわかった。2.人格のおよそ50%は親からの遺伝によると考えられている。その遺伝的背景にせまるため遺伝子多型と人格傾向との関連を検討した。健康成人100名と双極性障害患者90名について、セロトニントランスポーター遺伝子転写調節領域、ドーパミントランスポーター遺伝子3'非翻訳領域、ドーパミンD4/D3受容体遺伝子、レニン・アンギオテンシン変換酵素の遺伝子多型についてPCR法にて頻度を検討した。セロトニントランスポーター転写調節領域の多型に関しては双極性患者群で短い塩基配列を持つ対立遺伝子(s allele)の頻度が有意に高いことがわかった。また、この遺伝子多型には人種差があり、日本人は白人に比べてs alleleが高頻度にみられた。1.人格のおよそ50%は親からの遺伝によると考えられている。セロトニントランスポーター転写調節領域(5-HTT gene-linked polymorphic region:5-HTTLPR)の多型に関しては双極性患者群で短い塩基配列を持つ対立遺伝子(s allele)の頻度が有意に高いことがわかった。この遺伝子多型には人種差があり、日本人は白人よりs alleleが高頻度にみられた。2.気分障害患者にはいくつかの特徴的な病前性格が知られているが、人格の5因子次元モデル(big five)に基づくNEO質問紙を用いて、気分障害の患者における人格傾向の特徴を病型別に比較した。3.双極性障害発症の要因のひとつとして脳内セロトニン神経系およびドーパミン神経系の機能障害が想定されている。そこで我々はセロトニントランスポーター(5-HTT)遺伝子の多型、ドーパミンD4レセプター(D4DR)およびドーパミントランスポーター(DAT)遺伝子の繰り返し配列多型に関して遺伝子型の分布と対立遺伝子の頻度を、双極性障害患者群と対照群との間で比較検討した。
SUMO化による細胞周期制御機構の解析

本研究では細胞周期制御因子に対するSUMO化修飾の有無を検討するための実験系の構築・改良を行った。既報のin vitroSUMOアッセイシステムでは複数の必須酵素が大腸菌体内で効率よく発現せずハイスループットな実験を行うことができなかった。そこでベクターの変更や発現条件の検討を行い効率よく発現できるシステムを構築した。また、この系を用いてHPY2に対するSUMO化の検証を行い正常に機能することを確認した。本研究では、細胞周期制御因子に対するSUMO修飾の有無とその意義を問うものである。本年度はin vitroSUMOylationアッセイを遂行するにあたり必須となるE1酵素と基質候補となる細胞周期関連因子群を、大腸菌による組換えタンパク質発現システムを用いて発現、精製するための実験系の条件検討を主に行った。これは、既存のE1酵素群の発現系が非常に貧弱であり、一度の発現、精製によって実験数回分のタンパクしか生成できなかったため、改良を要したことによる。本研究以前に報告されているE1発現系では、スモールサブユニットSAE1bとラージサブユニットSAE2とを共発現させていたが、これは大腸菌に対して毒性を持つ可能性が高く十分な発現量が得られていなかった。そこで、数種類の発現ベクターを用いて各遺伝子を個別にクローニングしてさらに菌株や誘導条件の検討を行った。その結果、既存のベクターを用いた場合に比べて100倍強の効率で酵素群を得ることに成功した。さらに、この新規ベクターを用いて発現、精製した酵素を用いたin vitro SUMO化アッセイを行い、SUMO E3 ligaseであるHPY2の自己SUMO化がおこなわれることを確認した。また、細胞周期関連因子群をGatewayテクノロジーによって多数クローニングしたベクターコレクションを作成し、これらを大腸菌発現用のベクターに導入して各種細胞周期関連因子群のGST融合型発現ベクターコレクションを作成した。次年度にはこれらの材料を用いてSUMO化される因子の探索とそれに続く機能解析を行う予定である。本研究の意義は、細胞周期制御因子に対するSUMO修飾の有無を検証するための実験システムを構築しスクリーニングを行うことで基質タンパクとしての可能性を明らかにするとともにさらなる実験に供する材料を得るものである。本年度は大腸菌による組換えタンパク質発現システムを用いたSUMO化の検証法を実行するに当たりその有効性の検証を行った。その結果、タンパク質の発現、精製に用いるタグにSUMOが結合し擬陽性を生じるケースが多々あることを確認した。そこで、新たに発現タグと消化のためのプロテアーゼの組み合わせや検出条件の検討を行った。その結果、GSTやMBPなどの擬陽性を生じる可能性を持つタグを除くとともに、蛍光染色剤やHAタグなどのリジン残基を持たないタグを用いたウェスタンブロットなどの方法で確実にSUMO化を検出することに成功した。これにより追加の実験などの確認を待たずにin vitroの実験のみでSUMO化の有無を確定し効率的にスクリーニングを行うことが可能となった。この新システムを用いてSUMO E3 ligaseであるHPY2の自己SUMO化がおこなわれることを確認した。MBPタグ、GSTタグとも有効にHPY2が発現するとともに、SUMO化による分子量の増大を検出することができた。また、プロテアーゼ処理によりタグを除いた際にもHPY2に結合したSUMOは残存したためHPY2自身が大腸菌によるSUMO経路再構築系でSUMO化されうることを示した。さらに、新システムに対応した発現ベクターに細胞周期関連因子群のライブラリーをクローニングしスクリーニングシステムの構築完了とした。本システムを用いて細胞周期制御に対するSUMO制御の意義を探る研究が大きく展開することが期待される。
固定子に永久磁石を配置した可変リラクタンスジェネレータに関する研究

近年,分散型電源に適用される中容量から小容量の発電機の高性能化が望まれている。本研究は,小型高性能発電機の開発を目的として,筆者の着想による永久磁石を併用したリラクタンスジェネレータ(以下PMRG)の開発を行ったものである。平成17年度は,単相PMRGの動作機構を解明するとともに,小型の単相PMRGを製作して所期の動作を確認した。さらに,有限要素法を利用して三相PMRGの基本設計を行った。これらの研究成果に立脚し,平成18年度は以下の事項について検討を行った。1.三相PMRGの試作と特性評価:前年度の検討結果に基づいて,出力が500W程度の三相PMRGを試作した。極数は,三相機では最も基本的な固定子6極-回転子4極とし,磁石にはNd-Fe-Bを用いた。次いで,試作したリ三相PMRGの回転子をサーボモータで駆動して,無負荷時ならびに負荷時の出力電圧ならびに電流,トルク,回転数を詳細に測定した。その結果,試作機の効率は約92%と良好であること,単相PMRGで問題になったコギングトルクも実用上問題が無いほど低減されることが明らかになった。これは,無負荷時に固定子と回転の極間で生じるコギングトルクが,三相構造にすると互いにキャンセルされるためである。これらの実測値と有限要素法による計算値は良好に一致し,PMRGの諸特性が有限要素法によって精度良く推定可能であることが明らかになった。2.多極PMRGの検討:有限要素法によってPMRGの多極化について検討を行った。すなわち,固定子と回転子の極数が12極-8極,16極-12極,18極-12極について特性算定を行った。その結果,多極化によって,出力密度や効率が向上すること,極数には最適な組み合わせがあることなどが明らかになった。3.アウターロータ型PMRGの検討:用途によっては,固定子が内側,回転子が外側のアウターロータ構造が有利な場合もある。ここでは有限要素法に基づいてアウターロータ型PMRGについて検討を行い,その基本構造を明らかにした。4.PMRGの磁気回路モデルの構築:筆者が提唱している「磁気回路法による回転機の解析手法」に基づいて,PMRGの磁気回路モデルを作成した。これは,有限要素法では困難な,PMRGの動特性や過渡特性の定量解析ができるもので,PMRGを風力発電機や小水力発電機として応用する場合に有用なものである。以上より,PMRGの基礎特性が明らかになるとともに,多極化による高性能化の見通しが得られた。さらに,分散型電源システムの開発に有用なPMRGの磁気回路モデルを構築することができ,本研究の目的はある程度達成されたものと考えられる。これらの成果は電気学会全国大会,日本応用磁気学会学術講演会,およびパワーエレクトロニクスと電気機器の国際会議(EPE-PMRCおよびICEM)において発表した。近年,省エネルギーならびに地球温暖化対策のため,風力発電,小水力発電,マイクロガスタービンなどの分散型電源への期待が高まるとともに,これらの分散型電源に適用される中容量から小容量の発電機の高性能化が望まれている。本研究は,筆者の着想による,磁気抵抗(リラクタンス)の変化を利用した新しい発電機の開発を目的として,2ヵ年の予定で行うものである。以下,平成17年度に得られた成果を記述する。1.単相可変リラクタンスジェネレータの設計:先ず,有限要素法に基づいて,単相の可変リラクタンスジェネレータの動作特性について検討を行った。回転数に対する出力電圧,電流,電力,およびトルクを計算し,可変リラクタンスジェネレータ製作するうえで必要な事項を明らかにした。2.プロトタイプ機の製作:単相可変リラクタンス発電機の製作を行った。回転子ならびに固定子は無方向性ケイ素鋼板を打ち抜き加工したものを使用し,永久磁石はNd-Fe-Bを使った。固定子極に巻線を巻いて直列結線して出力巻線とした。3.特性試験:製作したリ単相可変ラクランスジェネレータの回転子をサーボモータで駆動して特性試験を行った。特に,無負荷時ならびに負荷時の出力電圧ならびに電流、トルク、回転数などを詳細に測定した。これらの実測値と計算値は良好に一致し,試作機が所期の特性を有することが明らかになった。試作機の効率は約83%と良好であったが,装置体積に対して出力が小さく,コギングトルクも大きいなどの問題点も明らかになった。4.三相可変リラクタンスジェネレータの開発:上記の問題点の解明を目的に,三次元有限要素法による詳細な磁場解析を行った。その結果,永久磁石からの磁束が回転子を通過せず空間を通る,いわゆる漏れ磁束が大きいため出力が減少することが明らかになった。これを改善するため,本研究では三相可変リラクタンスジェネレータの木曾特性についても検討を行った。すなわち,三次元有限要素法に基づいて,固定子6極,回転子4極の三相リラクタンスジェネレータの特性算定を行った。その結果,出力密度の向上,コギングトルクの低減,効率向上などの成功改善が期待できることが明らかになった。以上より,可変リラクタンスジェネレータの基礎特性が明らかになるとともに,高性能化に見通しが得られ,今年度の目標は達成されたものと考えられる。これらの成果は電気学会全国大会,日本応用磁気学会学術講演会等で発表するとともに,日本応用磁気学会誌に掲載されている。

本研究は,小型高性能発電機の開発を目的として,筆者の着想による永久磁石を併用したリラクタンスジェネレータ(以下PMRG)の開発を行ったものである。平成17年度は,単相PMRGの動作機構を解明するとともに,小型の単相PMRGを製作して所期の動作を確認した。さらに,有限要素法を利用して三相PMRGの基本設計を行った。これらの研究成果に立脚し,平成18年度は以下の事項について検討を行った。1.三相PMRGの試作と特性評価:前年度の検討結果に基づいて,出力が500W程度の三相PMRGを試作した。極数は,三相機では最も基本的な固定子6極-回転子4極とし,磁石にはNd-Fe-Bを用いた。次いで,試作したリ三相PMRGの回転子をサーボモータで駆動して,無負荷時ならびに負荷時の出力電圧ならびに電流,トルク,回転数を詳細に測定した。その結果,試作機の効率は約92%と良好であること,単相PMRGで問題になったコギングトルクも実用上問題が無いほど低減されることが明らかになった。これは,無負荷時に固定子と回転の極間で生じるコギングトルクが,三相構造にすると互いにキャンセルされるためである。これらの実測値と有限要素法による計算値は良好に一致し,PMRGの諸特性が有限要素法によって精度良く推定可能であることが明らかになった。2.多極PMRGの検討:有限要素法によってPMRGの多極化について検討を行った。すなわち,固定子と回転子の極数が12極-8極,16極-12極,18極-12極について特性算定を行った。その結果,多極化によって,出力密度や効率が向上すること,極数には最適な組み合わせがあることなどが明らかになった。3.アウターロータ型PMRGの検討:用途によっては,固定子が内側,回転子が外側のアウターロータ構造が有利な場合もある。ここでは有限要素法に基づいてアウターロータ型PMRGについて検討を行い,その基本構造を明らかにした。4.PMRGの磁気回路モデルの構築:筆者が提唱している「磁気回路法による回転機の解析手法」に基づいて,PMRGの磁気回路モデルを作成した。これは,有限要素法では困難な,PMRGの動特性や過渡特性の定量解析ができるもので,PMRGを風力発電機や小水力発電機として応用する場合に有用なものである。以上より,PMRGの基礎特性が明らかになるとともに,多極化による高性能化の見通しが得られた。さらに,分散型電源システムの開発に有用なPMRGの磁気回路モデルを構築することができ,本研究の目的はある程度達成されたものと考えられる。これらの成果は電気学会全国大会,日本応用磁気学会学術講演会,およびパワーエレクトロニクスと電気機器の国際会議(EPE-PMRCおよびICEM)において発表した。
場の理論から得られる可積分系の研究と応用

無分散型と呼ばれる可積分な偏微分方程式系の解の構成方法として、本質的な独立変数の個数を制限する「簡約」という操作について、種々の無分散系(特に多成分系)を対象に研究した。また、統計力学や確率論の方面からも注目されいているStochastic Loewner Evolution(SLE)を、高い対称性(アフィン・リー代数の対称性)を持つ場合に拡張する事を試みた。本年度は無分散可積分系を中心に研究した。・近年、共形場理論とstochastic Loewner方程式(単葉関数論においてBieberbach予想などと関連して導入された方程式をstochasticにしたもの)の関係が注目を集めているが、その関連を可積分系の立場から考察しようという目標に向けて研究中である。ただ、現時点ではstochasticにする前のdeterminisitcなLoewner方程式との関係しか分かっていない。本年度はLoewner方程式から無分散系の解を構成する方法(Gibbons, Tsarev, Martinez-Alonso, Manasらの結果)の証明を無分散広田方程式を用いて簡易化した(Teo氏、Zabrodin氏との共同研究)。・多成分KP方程式系の無分散極限をdifferential Fay方程式の極限として構成した(高崎氏との共同研究)。本年度はstochastic Loewner方程式(以下SLEと略記)についての文献調査を行った。現在までの所SLEと共形場理論の関係は、主にminimal modelとの関係が研究されているが、さらに対称性の高いWZW模型についての関係はまだあまり調べられていない。この関係について、これまでに使った経験のある表現論的な手法を用いて解明できないか、という問題提起を行った。この問題についてシカゴ大学のWiegmann氏が興味を持ち、議論を行いつつある。・(高崎氏との共同研究)多成分KP方程式系の無分散極限をdifferential Fay方程式の極限として構成した。また、高種数のスペクトル曲線を持つ無分散可積分系を無分散広田方程式から考察中である。・SLEについては、シカゴ大学のP. Wiegmann氏を訪問しaffine Lie代数の対称性を持つSLEを構成できるかどうかについて突っ込んだ研究連絡を行った。その結果、highest weight表現のlevel 2(highest weightからweightが2下がった所)の所にsingular vector(特異ベクトル)があるか、という表現論的な問題にSLEの構成が帰着できる事が分かった。実際にそのような特異ベクトルを持つ表現が存在するかどうかという点については分からず、後にモスクワのB. Feigin氏や東京大学の土屋と研究連絡を行ったが、少なくとも「知られていない」という事以上の情報は得られなかった。また、Triesteの国際理論物理センターにおけるworkshopに参加してSLEの基本的な事項について習得した。・無分散可積分系については京大の高崎金久氏との共同研究を継続した。多成分KP hierarchyの無分散化によりuniversal Whitham hierarchyが得られることは分かっているが、今年度はその無分散広田方程式を求め、それによって1変数あるいは多変数簡約を構成した。1成分無分散KP hierarchyからLoewner方程式が現れるが、不思議な事にuniversal Whitham hierarchyの簡約からも同じ形のLoewner方程式が現れる。つまり、Loewner方程式が非常に普遍的に「簡約」というプロセスをコントロールしている事が分かった。
エバネッセント光を利用した分子間力3次元測定可能な光学顕微鏡の試作

本研究の目的は、蛋白質分子の超微操作と一分子観察を行うための顕微鏡システムを構築することにあった。この背景には光ピンセット法により蛋白質一分子の操作が可能となり、一方でエバネッセント光励起によって低バックグラウンド光の元で蛍光一分子を観察することができるようになったことである。本研究では倒立型落射蛍光顕微鏡において光ピンセットとエバネッセント光励起のための光学系を組み合わせることを試みた。具体的にはサンプルをのせたカバーガラス内を全反射を繰り返させてYAGレーザー光或いはアルゴンイオンレーザー光を導き、顕微鏡視野内にエバネッセント場を発生させるというものである。これによって光ピンセットとの組み合わせが容易になると考えられた。光ピンセット法については基本的方法ならびにその応用をアクトミオシンモーターの力発生素過程計測およびアクチン-αアクチニン結合寿命測定という形で確立できた。また、全反射でレーザー光を導波してエバネッセント場を発生させ蛍光一分子を観察することも可能となった。ただ、両方法を組み合わせる段階で当初予想しなかった困難にぶつかった。それは、新しい方補を取った場合、対物レンズの赤外光に対する収差が予測しなかったほど強く現れ、その結果光ピンセットによる超微操作がほとんど不可能になったということである。この困難に対処すべくいくつかの方法を試みたが、赤外光まで収差を取り除いた対物レンズの設計が問題の根本的解決につながるということを結論として得た。赤外光を蛍光顕微鏡光源として使いたい「需要」は実は増加しつつあり、本研究で得られた結論の方向と一致していると考えられるので、今後光学顕微鏡メーカーと緊密な協力関係を樹立し対物レンズの新しい設計をすることが重要になると考えている。本研究の目的:エバネッセント光は光が固体-液体界面で全反射したとき界面付近の液体中に発生する波長程度の厚みの空間に局在する光である。エバネッセント光を蛍光顕微鏡の励起光源として用いれば界面にある蛍光分子のみを励起するのでバルクの蛍光分子由来の背景蛍光を大幅に抑えられる。一方界面付近にある小物体にエバネッセント光があたれば一部が散乱される。散乱強度も界面と物体との距離に強く依存するのでその測定から物体のz方向位置が分かる。我々が作ろうとしている装置の特色は、エバネッセント光で得られる情報に蛍光と散乱光の両方が含まれていることに着目、光学顕微鏡でこれら二つを結合し、更に光ピンセット法をも組み合わせて3次元微小力測定装置とするところにある。なお、エバネッセント光発生法を工夫し、それが顕微鏡本来のイメージング法(微分干渉法や位相差法)のじゃまにならないようにするのも特色である。研究経過と結果:(1)イメージング:新しいエバネッセント励起法(エバネッセント光発生用プリズムを光路からずらしカバーガラス内を導波させる方法)によってアクチン重合のイメージングを実現できた。今のところイメージの質は従来型と変わらないが、従来型では不可能だった位相差像観察が可能になった。また、ミオシンフィラメントに蛍光性ATPを低濃度で与えたところ、ミオシンと相互作用するATPの蛍光像と散乱光によるミオシンフィラメント像の特徴が一致したので両者の同時観察が可能になったと判断した(2)力測定システム:立ち上げが遅れているが、光ピンセットはずでに使用実績もあり原理的に困難はない。また、上に述べたように新しいエバネッセント光発生法は既にできているのでできるだけ早い機会に両者を組み合わせて実験を開始する。本研究の目的はエバネッセント光のイメージングにおける特質を光ピンセット法のもつ超微操作と組み合わせて新しいタイプの顕微鏡を開発することである。エバネッセント光は光がガラス-水界面で全反射したときに界面付近に局在して生じる光である。

エバネッセント光はその性質上ガラスに吸着したものや界面から数百メートル以内にあるものしか照らさない。たとえばこれを蛍光顕微鏡の光源として用いればバルクにある蛍光分子を励起することなく界面付近のものだけを見ることができる。しかしながら、光ピンセット法と組み合わせるためには従来のエバネッセント光発生法と異なり対物レンズに接触する厚さ0.2ミリメートルのカバーガラス内を全反射によって光を伝搬させカバーガラス上にエバネッセント光を発生させる工夫が必要だった。現在新しいエバネッセント光発生方法についてはめどがついた。即ち、カバーガラス内を伝搬する光が作るエバネッセント光を光源として、界面付近で蛍光ラベルした蛋白質(アクチンモノマー)が重合しフィラメントを作っていく過程の映像化に成功した。光ピンセットについては既存の光学顕微鏡に組み込むためのインターフェースの設計・製作が必要であった。とくに対物レンズ瞳の外部への投影位置決定に関して、結像系のパラメータを求めるのがかなり困難な作業だった(パラメータは顕微鏡会社の企業秘密であり実験的に求め、計算と推測を交えて決定せねばならなかった)。しかしパラメータの決定によって最終的に設計が可能となり、現在製作段階にある。カバーガラス上にくっついた細胞が動き回る時の細胞各部分での弾性測定を行うため、光ピンセットで保持した弾性測定用プローブの位置変化をエバネッセント照明で測定する実験準備を進めつつある。
ポリサルファ代謝系を介する新しい抗酸化ストレス制御機構の解明

本研究では、システインのイオウ付加体であるシステインパースルフィドをはじめとする活性ポリスルフィドの生理機能に注目し、メタボローム解析手法(ポリサルファメタボローム)を駆使して、動物および植物における活性イオウ・ポリサルファ系のユニークな抗酸化制御システムの全貌を解明することを目的としている。昨年度までの研究において活性ポリスルフィドを網羅的かつ定量的に測定するメタボローム解析系を確立して、生体内に存在する様々な活性イオウ分子種の検出と動態解析、代謝経路と生理機能解析を行い、システイン-tRNA合成酵素(CARS)によるタンパク質翻訳に共役した新規ポリスルフィド生成系を同定し、ミトコンドリア型のCARS2が生成するパースルフィドがミトコンドリアの酸素消費速度や膜電位形成の制御に深く関わることが示された。本年度は、ポリスルフィド生成の生理学的機能についての詳細な解析を行った。ミトコンドリア型CARS2のノックアウト細胞の解析から、CARS2由来パースルフィドはミトコンドリア形態形成にも関わっており、哺乳類細胞においてミトコンドリアの分裂に中心的な役割を果たすDrp1 (dynamin-related protein 1)の酵素活性がタンパク質ポリスルフィド化によって制御されていることが分かった。また、CARS2によるイオウ代謝プロファイルを詳細に解析した結果、CARS2により生成されるパースルフィドは電子伝達系から電子を授受し、硫化水素(H2S)へと代謝・還元することが示唆された。さらに、イオウ代謝産物であるH2Sの代謝経路としてSQR (sulfide:quinone oxidoreductase)によるプロトン供与を介したミトコンドリア膜電位形成が認められ、ミトコンドリアの電子伝達およびエネルギー産生における活性ポリスルフィドおよびイオウ代謝経路の関与が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、ポリスルフィド系活性イオウ分子種の生体内生成動態の解析と活性イオウ分子種により制御される抗酸化シグナルの分子機構の解析を行った。活性イオウ分子種の動態解析では、まず、アルキル化試薬としてモノブロモビマンおよびヨードアセトアミド誘導体を用いた高感度タンデム質量分析計(LC-MS/MS)による各種ポリスルフィドの検出・同定システムの開発に成功した。この検出システムを用いた精密な定量解析により、ヒト肺がんA549細胞などの培養細胞やヒトやマウスの各種臓器,血液中に多様なポリスルフィド化合物が様々なレベルで存在することを明らかにした。特にグルタチオンパースルフィドは100μMを超える高い細胞内濃度で存在することが分かった。さらに、培養細胞を用いた実験から、生体内ポリスルフィドの生成はシスタチオニンβ-シンターゼ(CBS)およびシスタチオニンγ-リアーゼ(CSE)に依存することが確認された。また、ポリサルファ化合物の抗酸化作用として、グルタチオンパースルフィドなどの活性ポリスルフィドが、過酸化水素を分解・消去する強力な抗酸化活性を有すること、および活性酸素シグナルのセカンドメッセンジャーである8-ニトロ-cGMPと速やかに反応して8-SH-cGMPへと代謝・変換することを明らかにした。8-SH-cGMPの生成は培養細胞や各種組織試料でも確認され、CBSおよびCSEの酵素活性に依存することが示された。昨年度までの研究において、高感度タンデム質量分析計(LC-MS/MS)による各種ポリスルフィドの検出・同定システムの開発に成功し、ヒトおよびマウスの生体内に様々なポリスルフィドが各種レベルで存在し、抗酸化シグナル制御に関わることを明らかにしてきた。本年度は、細胞内ポリスルフィド生成機構の詳細な解析とタンパク質ポリサルファ化(ポリチオール化)の解析を行った。これまでに、細胞内ポリスルフィド生成系としてシスタチオニンβ-シンターゼやシスタチオニンγ-リアーゼの関与を明らかにしてきたが、新規ポリスルフィド検出・同定システムによる詳細な解析の結果、タンパク質翻訳に共役した新規ポリスルフィド生成系の存在を見いだした。この新規ポリスルフィド生成系は大腸菌から哺乳類細胞まで保存されており、これら生物の細胞内における主要なポリスルフィド産生系として機能していることが示された。さらに、この新規ポリスルフィド生成系は、システイニル-tRNAにポリスルフィドを導入することにより、タンパク質翻訳に共役して様々なタンパク質のポリサルファ化に関わることが分かった。これらのことから、翻訳に共役した新規ポリスルフィド生成系が細胞内ポリサルファ動態およびタンパク質ポリサルファ化の制御に重要な役割を果たしていることが示唆された。新規ポリスルフィド生成系の発見があり、その役割の解明のための追加実験を行ったが、そのために本研究の当初目的の一つである生体内活性イオウ・ポリサルファの生成機構の解明に関する知見をさらに深めることができ、研究はおおむね順調に進展していると評価できる。

本研究では、システインのイオウ付加体であるシステインパースルフィドをはじめとする活性ポリスルフィドの生理機能に注目し、メタボローム解析手法(ポリサルファメタボローム)を駆使して、動物および植物における活性イオウ・ポリサルファ系のユニークな抗酸化制御システムの全貌を解明することを目的としている。昨年度までの研究において、高感度タンデム質量分析計(LC-MS/MS)による各種ポリスルフィドの検出・同定システムを開発するとともに、システイン-tRNA合成酵素による翻訳に共役した新規ポリスルフィド生成系を見いだした。本年度は、システイン-tRNA合成酵素の細胞内ポリスルフィド生成およびタンパク質ポリサルファ化に与える影響について解析を行った。哺乳類細胞のシステイン-tRNA合成酵素(CARS2)のノックアウト細胞の作製に成功し、LC-MS/MSを用いたポリサルファメタボロームによる解析を行った結果、野生型細胞に比べCARS2ノックアウト細胞では、細胞内システインポリスルフィドレベルが著明に減少し、CARS2が主要な細胞内ポリスルフィド産生系として機能していることが示された。また、親電子物質とポリスルフィドとの化学反応性を利用した親電子プローブ標識ゲルシフトアッセイを用いてこれらの細胞のタンパク質ポリスルフィド化を解析した結果、CARS2ノックアウト細胞では野生型細胞に比べ、各種タンパク質のポリサルファ化が著明に減弱し、CARS2がタンパク質ポリサルファ化に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、CARS2ノックアウト細胞と野生型細胞の比較解析から、CARS2によるシステインポリスルフィド産生がミトコンドリア機能に関わることが示唆され、今後このようなポリスルフィドの生理機能の解析を進めていく予定である。本年度は当初計画どおりCARS2ノックアウト細胞の作成とその細胞内ポリスルフィド動態の解析、およびタンパク質ポリサルファ化解析系の構築と各種生体試料中のポリサルファ化タンパク質の解析を行い、目的とする研究成果を得ることができた。研究はおおむね順調に進展していると評価できる。昨年度までの研究において活性ポリスルフィドを網羅的かつ定量的に測定するメタボローム解析系を確立し、生体内に存在する様々な活性イオウ分子種の検出と動態解析、代謝経路と生理機能解析を行ってきた。本年度は、システイン-tRNA合成酵素(CARS)による翻訳に共役した新規ポリスルフィド生成系について、ポリスルフィド生成の分子メカニズムおよびその生理学的機能についての解析を行った。細菌および哺乳類の各種CARSの解析から、CARSがシステインを基質としてシステインパースルフィドを産生することが分かった。
細胞内情報伝達関連機能タンパクの修飾による高等植物二次代謝能の制御

ニンジン培養細胞の二次代謝活性発現のための細胞内情報伝達機構のうち、二次メッセンジャーレベルの上昇に寄与するGTP結合タンパク質を検出しその生化学的諸性質を明らかにすることを目的とした。オリゴガラクツロナイド処理して二次代謝活性の誘導を行ったニンジン細胞からミクロゾームフラクションを調製し、SDS-PAGEによってタンパクを分離した。これをニトロセルロース膜に転写した後放射標識したGTPとインキュベートし、GTPに親和性を示すタンパクをバイオイメージングアナライザーで解析した。その結果、分子量約38kDaの位置にGTP結合活性を示すタンパクが検出された。次いで、転写タンパクをGTP結合タンパクに対する抗体で処理し、標識した二次抗体の酵素反応によって発色させ親和性を確認した。様々な一次抗体との反応性を検討したところ、二次代謝活性誘導に特異的と思われるGタンパクは抗GαsおよびGαolfに対して親和性を示すものの、GiやGoなど他のクラスの三量体Gαサブユニット抗体とは交差反応しなかった。またRacやRasといった単量体Gタンパク抗体との反応も認められなかった。これらの実験結果から、ニンジン培養細胞に二次代謝活性を誘導するGTP結合タンパク質はα,β,γのサブユニットからなるヘテロトリマー型のものであって、そのαサブユニットの分子量は約38kDaであると推測される。次に、このGαs、Gαolfに類似したGタンパクについて遺伝子レベルでの情報を得るために、現在までに報告されている当該タンパクの構造を参考にしてプライマーを設計しPCR法による遺伝子断片の検出を試みた。様々なプライマーのうち期待した200塩基相当の断片を特異的に増幅する組み合わせが見出された事から、現在、これを放射標識してプローブとしノーザーンブロット法による解析を行い、二次代謝活性誘導に特異的なGタンパクをコードした遺伝子であることの証明を試みている。ニンジン培養細胞を実験材料として、ペクチン部分加水分解物を誘導物質とした際の二次代謝能誘導の初期過程に関わる情報伝達関連タンパクを特定することを試みた。様々な情報伝達修飾試薬で処理した後に細胞を破砕して原形質膜を精製し、それぞれの膜構成タンパクを電気泳動で解析した。次いで、分離されたタンパクについて三量体及び一量体Gタンパクに対する抗体をプローブとしたイムノブロットを行い、変動を示したタンパクの分子種について情報を得た。その結果、二次代謝能を誘導する様々な処理を施した場合、特に低分子領域において、膜構成タンパクの分子種や濃度に明らかな変化が認められた。さらにGタンパク抗体によるイムノブロット解析の結果、二次代謝能誘導プロセスにおける第一相の二次メッセンジャーであるcAMP濃度が上昇する直前にras様タンパクの量が著しく増加することが明らかとなった。この結果はcAMP合成に関わるアデニレートシクラーゼの活性誘導にras様の一量体型Gタンパクが大きな役割を果たしていることを示唆するものと考えられる。一方、二次代謝活性の制御にあたる情報関連タンパクをコードした遺伝子を導入して遺伝的に安定な高生産性を保持した植物個体を確立することを目的として、脱分化した植物培養組織に対して器官再分化能を示す化合物の合成とスクリーニングを行った。その結果、ピリジルフェニル尿素のN-オキシドが強力な種苗形成活性を有し、オーキシン存在下においても様々な植物の培養細胞の器官分化を促すことを見出した。オリゴガラクツロナイドによる刺激に呼応してニンジン培養細胞内に誘導される二次代謝活性の発現にGTP結合タンパク質が寄与する可能性について検討した。Gタンパク活性化剤であるGTP-γ-Sやmastoparanでニンジン細胞を処理した場合は、オリゴウロナイドが存在しない場合においても二次代謝能の発現が見られた。一方、GDP-β-Sやsuramin等のGタンパク阻害剤で細胞を前処理した後にオリゴウロナイド刺激を与えた場合には代謝能の発現が抑制されることが示された。次いで、水系二層分配法によってニンジン培養細胞から原形質膜を精製し、これにオリゴウロナイド刺激を加えた際の膜局在性GTPase活性の変化を[^<33>P]GTPを基質として検討した。その結果、ウロナイド添加した細胞においては無処理のコントロールと比較して加水分解活性の顕著な上昇がみられ、NaF存在下ではこれがほぼ完全に抑制された。これより、ウロナイド刺激によって原形質膜内のGTP特異的な加水分解酵素の活性が上昇していることが示された。更に、様々な条件下でニンジン原形質膜標品と[^<35>S]GTP-γ-Sとをインキュベートし膜局在性のGTP結合能を比較したころ、オリゴウロナイド存在下で著しい結合活性の上昇が認められた。この活性は非放射性のGTP添加でのみ大きく低下し、ATP添加ではほとんど影響を受けなかったことから、GTP特異的な結合能であると推察される。以上の結果を総合すると、オリゴガラクロナイドによるニンジン培養細胞の二次代謝誘導の発現誘導には、その初期過程においてGTP結合タンパク質が大きな役割を果たしているものと考えられる。

これをニトロセルロース膜に転写した後放射標識したGTPとインキュベートし、GTPに親和性を示すタンパクをバイオイメージングアナライザーで解析した。その結果、分子量約38kDaの位置にGTP結合活性を示すタンパクが検出された。次いで、転写タンパクをGTP結合タンパクに対する抗体で処理し、標識した二次抗体の酵素反応によって発色させ親和性を確認した。様々な一次抗体との反応性を検討したところ、二次代謝活性誘導に特異的と思われるGタンパクは抗GαsおよびGαolfに対して親和性を示すものの、GiやGoなど他のクラスの三量体Gαサブユニット抗体とは交差反応しなかった。またRacやRasといった単量体Gタンパク抗体との反応も認められなかった。これらの実験結果から、ニンジン培養細胞に二次代謝活性を誘導するGTP結合タンパク質はα,β,γのサブユニットからなるヘテロトリマー型のものであって、そのαサブユニットの分子量は約38kDaであると推測される。次に、このGαs、Gαolfに類似したGタンパクについて遺伝子レベルでの情報を得るために、現在までに報告されている当該タンパクの構造を参考にしてプライマーを設計しPCR法による遺伝子断片の検出を試みた。様々なプライマーのうち期待した200塩基相当の断片を特異的に増幅する組み合わせが見出された事から、現在、これを放射標識してプローブとしノーザーンブロット法による解析を行い、二次代謝活性誘導に特異的なGタンパクをコードした遺伝子であることの証明を試みている。
リンカーヒストンの新たな機能～核小体形成と機能に対する役割～

リンカーヒストンH1はDNAに直接結合し、細胞種や組織特異的にクロマチン構造を制御、安定化する。本研究では、哺乳類において10種類存在するH1バリアント内の一つであるH1TがrDNA領域を標的としその転写制御に寄与すること、核小体の形成に働くことを明らかとした。核小体はrRNA合成の場であることに加え、tRNAを含めたさまざまな非翻訳RNAを転写・加工してタンパク質と結合させRNA-タンパク質複合体を作るなど、いずれの細胞にとっても不可欠な大型装置として存在している。本研究成果によって、核小体の機能制御因子として新たにリンカーヒストンバリアントH1Tを見出すことができた。本研究はリンカーヒストンバリアントの一つであるH1Tの核小体形成および機能に対する役割を明らかにすることを目的としている。本年度では、H1Tの発現プロファイル、細胞内局在を明らかにした。H1Tは精巣特異的なリンカーヒストンとして知られており、本研究でも高い発現を示すことを確認した。しかし、RT-PCR法によりH1T mRNAの発現レベルを解析したところ、精巣に比べ発現が弱いものの解析に用いたすべての癌由来細胞でH1Tの発現が確認された。また、正常細胞においては筋原細胞および胃でH1Tは発現していた。この結果から、未分化性を示す細胞でH1Tが発現していることが考えられた。そこでマウス胚性幹細胞(ES細胞)においてH1Tの発現を調べたところ、発現が確認され、その発現は分化に伴い減少することが分かった。次に本研究において作製したH1T特異抗体を用いてH1Tの細胞内局在を調べた。その結果、H1T発現細胞では細胞種に関わらずH1Tは核小体に局在していた。H1Tは核小体内で機能を有することが期待されたため、まずH1Tの発現レベルと核小体のサイズとの関係について解析した。その結果、これまでの報告通り核小体のサイズは細胞増殖能とは相関していたが、H1Tの発現レベルとの間には相関は認められなかった。核小体内にはpre-rRNAをコードしているrDNA領域が存在し、rRNAの転写と精製の場となっている。そこで、H1Tの強制発現とshRNAによる発現抑制を行い、pre-rRNAの転写量をRT-PCRによって解析した。胃癌細胞株AGSと乳腺癌細胞株MDA-MB-231で解析を行った結果、H1Tはpre-rRNAの発現に対して抑制的に働くことが分かった。以上より、H1Tはこれまで知られていた精巣以外でも発現していること、発現している細胞では核小体に局在し、rRNAの発現を抑制する機能を有することが明らかとなった。本年度ではクロマチン免疫沈降ーシークエンス法(ChIP-seq法)によってH1Tのゲノム標的領域を同定し、rDNAリピート上での機能を明らかとした。昨年度までに取得していた胃癌細胞株AGS細胞および乳癌細胞株MDA-MB231細胞に加え、H1Tが発現していることが明らかとなったマウス胚性幹細胞(ES細胞)においてH1T抗体を用いたChIP-seq法により、H1Tのゲノム標的領域を探索した。その結果、H1Tは遺伝子領域よりもリピート配列によく結合していることが分かった。そこで、リピート配列のデータベースであるRepbase(http://www.girinst.org/repbase/)と照合させたところ特にrRNAをコードしている領域に多く結合していた。これまで報告されている他のH1バリアントのChIP-seqデータと比較解析を行ったがこれはH1Tに特徴的な結果であった。rRNAをコードしているゲノム領域はrDNAと呼ばれrRNAコード領域と非コード領域が数百コピー連続してゲノム上に存在し核小体内に収納されていることが知られている。そこで、rDNA上での局在をより詳細にChIP-qPCR法によって調べところ、癌細胞およびES細胞のいずれの細胞種においても、非コード領域よりもrRNAコード領域により多く結合していた。次に、H1TのrDNAリピート上での機能を明らかにするため、前年度までに作成していたH1T強制発現細胞(AGSとMDA-MB-231の2種類)を用い、DNaseI感受性法およびMNase感受性法によってH1Tのクロマチン構造に対する役割を調べた。その結果、H1Tの強制発現によってrDNA上の特にrRNAコード領域のクロマチンの凝集が起こっていた。前年度までの成果と合わせると、H1Tは核小体に局在し、その中でrDNAリピートに結合することでクロマチンの凝集を促し、rRNAの転写を調節する機能を有することが明らかとなった。研究課題名にも挙げたH1Tの核小体内での機能を本年度までに概ね明らかとし、これまでの成果を学術論文としてまとめ、受理されるまで達成することができた。ただし年度当初に計画していたH1TのChIP-seqデータから、「rDNA vs.遺伝子領域」の比較を行い、ゲノム領域によってH1Tに機能差異があるかを明らかにすることができなかった。そのため、「おおむね順調に進展している」と自己評価した。リンカーヒストンバリアントの一つであるH1Tは雄生殖細胞で高い発現を示す生殖細胞型バリアントとして知られている。昨年度までに、H1Tが雄生殖細胞に比べ発現は低いものの癌細胞や多能性幹細胞でも発現していること、rDNAリピート領域に結合しクロマチン凝縮を促すことでpre-rRNAの発現を抑制する機能を有することを明らかとした。

この解析の中で、H1Tは核小体に特に局在していたものの、核内のその他(核質)にも局在を示していたことからrDNA以外の領域でも機能していることが示唆された。そこで本年度では、核質におけるH1Tのゲノム標的領域およびその機能を明らかにすることを目的とした。初めに昨年度までに得られていたChIP-seqデータを利用し、ヒト癌細胞株(AGS株、MDA-MB-231株)、マウス胚性幹細胞およびマウス精細胞におけるH1Tの標的領域の探索を行った。ゲノム上の分布を調べたところ、核小体内に位置するゲノム領域以外では、遺伝子コード領域またはその近傍に多く結合していた。より詳細に遺伝子領域周辺における局在を調べた結果、いずれの細胞種においても、特に転写開始点付近によく局在しており、またそれらは高い発現を示す遺伝子であった。次にこれら標的領域におけるH1Tの機能を明らかにするため、癌細胞株においてH1T強制発現および発現抑制実験を行ったところ、標的遺伝子群に対してH1Tは発現促進に働くことが分かった。加えて、DNaseI sensitive assayの結果、H1Tは結合領域のクロマチンの弛緩を促していた。以上より本年度では、遺伝子領域においてH1Tは、rDNAリピート上とは逆に、標的領域のクロマチン弛緩を促し発現上昇に働くことが明らかとなった。リンカーヒストンH1はDNAに直接結合し、細胞種や組織特異的にクロマチン構造を制御、安定化する。本研究では、哺乳類において10種類存在するH1バリアント内の一つであるH1TがrDNA領域を標的としその転写制御に寄与すること、核小体の形成に働くことを明らかとした。核小体はrRNA合成の場であることに加え、tRNAを含めたさまざまな非翻訳RNAを転写・加工してタンパク質と結合させRNA-タンパク質複合体を作るなど、いずれの細胞にとっても不可欠な大型装置として存在している。本研究成果によって、核小体の機能制御因子として新たにリンカーヒストンバリアントH1Tを見出すことができた。当初の計画通り研究が遂行できた。H1Tの発現プロファイルを明らかにすることができ、これまで報告されていた精原細胞のみならず、癌細胞、未分化細胞および多能性幹細胞でも発現していること、発現している細胞では細胞種問わずH1Tは核小体に強く局在している、という結論を導き出すことができた。また、H1T強制発現および発現抑制実験の結果からH1TはrRNAの転写に対して抑制的に働く機能があることも見出すことができた。また、H1T特異抗体を用いたクロマチン免疫沈降ーシークエンス(ChIP-seq)解析のデータも胃癌細胞AGSと乳腺癌細胞MDA-MB-231の2種類の細胞種において取得でき、次年度に向けての準備もすることができた。以上から、「当初の計画以上に進展している」と自己評価するに至った。本年度の後半は学術論文の作製を重点的に行ったため、当初計画していたChIP-seqデータを利用してrDNAリピート上と遺伝子領域上の機能差異を明らかにするまで至ることができなかった。本年度の成果から分かっていることとして、H1Tは割合としてリピート領域に多く結合していたものの、ユニーク領域(遺伝子領域)にも結合していた。