hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗炎症剤を音響感受性物質として用いた超音波の抗腫瘍効果について

1.In vitro study:Sarcoma 180浮遊液と薬剤液(0.2mMのピロキシカムとHp-diacetate)を混じ,共振周波数2MHz,2.0Wの強度で30秒間照射し,腫瘍細胞の生存率を算出した.また活性酸素種のスカベンジャーであるL-HistidineとD-Mannitolを添加し同様に超音波照射を行った.その結果,薬剤添加により有意に腫瘍生存率が低下した.またL-Histidineの添加で抗腫瘍作用は抑制されたが,D-Mannitolでは抑制されなかった.以上からピロキシカムは一重項酸素を介し超音波抗腫瘍効果を増強させる,と結論した.2.In vivo study:調整したSarcoma 180浮遊液(1.5x10^7個)とピロキシカム溶液(0.2,0.1,0.01mM)をエーテル麻酔下でマウスの背部air pouch内へ同時に注入し,蒸留水を入れたガラス管中にpouch部のみ水没させ,共振周波数2MHz,3,6,10Wの強度で120秒間照射した.その結果,濃度10W,0.2mMの群では,照射直後の生存腫瘍細胞数は有意に低値で,照射後1週での残存する腫瘍面積も他群よりも有意に低値で,周囲筋の構造も保たれていた.また,生存率も約60%で他の群より良好であった.しかし抗腫瘍効果は3Wや6Wでは認められなかった.マウスair pouch modelにおいて10W以上の超音波照射下では,ピロキシカムは濃度依存性に超音波抗腫瘍効果を増強させる,と結論した.1.In vitro study:Sarcoma 180浮遊液と薬剤液(0.2mMのピロキシカムとHp-diacetate)を混じ,共振周波数2MHz,2.0Wの強度で30秒間照射し,腫瘍細胞の生存率を算出した.また活性酸素種のスカベンジャーであるL-HistidineとD-Mannitolを添加し同様に超音波照射を行った.その結果,薬剤添加により有意に腫瘍生存率が低下した.またL-Histidineの添加で抗腫瘍作用は抑制されたが,D-Mannitolでは抑制されなかった.以上からピロキシカムは一重項酸素を介し超音波抗腫瘍効果を増強させる,と結論した.2.In vivo study:調整したSarcoma 180浮遊液(1.5x10^7個)とピロキシカム溶液(0.2,0.1,0.01mM)をエーテル麻酔下でマウスの背部air pouch内へ同時に注入し,蒸留水を入れたガラス管中にpouch部のみ水没させ,共振周波数2MHz,3,6,10Wの強度で120秒間照射した.その結果,濃度10W,0.2mMの群では,照射直後の生存腫瘍細胞数は有意に低値で,照射後1週での残存する腫瘍面積も他群よりも有意に低値で,周囲筋の構造も保たれていた.また,生存率も約60%で他の群より良好であった.しかし抗腫瘍効果は3Wや6Wでは認められなかった.マウスair pouch modelにおいて10W以上の超音波照射下では,ピロキシカムは濃度依存性に超音波抗腫瘍効果を増強させる,と結論した.【方法】細胞数が6.7x10^5となるよう調整したSarcoma180浮遊液1.0mlと,0.3%のDMFを溶解剤として濃度を調節したピロキシカム溶液1mlをマウスの背部air pouch内へ注入し,その後蒸留水を満たした径30mm,高さ15mmのガラス管中にair pouch部のみ水没させ,共振周波数2MHz,10Wの照射強度で120秒間照射した.マウスはピロキシカムの濃度により0.2mM,0.02mM,0.002mMの群に分け,対照としては0.3%DMF溶液を用いた.超音波照射後1週でのair pouch部の組織像と,マウスの生存率をKaplan-Meier法により各群で比較した.【結果】組織学的にはピロキシカム濃度0.2mMの群で,残存する腫瘍の面積が他の群よりも有意に低値で(ANOVA,p=0.003),air pouch内腔面の構造や周囲筋肉の構造も保たれていた.一方,ピロキシカム濃度が0.02mM,0.002mMの群と対照では旺盛な腫瘍の増殖を認めた.生存率は0.2mMの群で約60%,0.02mMの群で約20%であった.一方他の群ではマウスはすべて約40日で死亡した(log rank,p=0.005).【結論】In vivoでピロキシカムは音響感受性物質として有用であり,その抗腫瘍効果は濃度依存性であると考えられた.【文献】ピロキシカムによる超音波の抗腫瘍作用の増強.日整会誌73:S1659,1999.1.In vitro study : Sarcoma 180浮遊液と薬剤液(0.2mMのピロキシカムとHp-diacetate)を混じ,共振周波数2MHz,2.0wの強度で30秒間照射し,腫瘍細胞の生存率を算出した.また活性酸素種のスカベンジャーであるL-HistidineとD-Mannitolを添加し同様に超音波照射を行った.

その結果,薬剤添加により有意に腫瘍生存率が低下した.またL-Histidineの添加で抗腫瘍作用は抑制されたが,D-Mannitolでは抑制されなかった.以上からピロキシカムは一重項酸素を介し超音波抗腫瘍効果を増強させる,と結論した.2.In vivo study:調整したSarcoma 180浮遊液(1.5×107個)とピロキシカム溶液(0.2,0.1,0.01mM)をエーテル麻酔下でマウスの背部air pouch内へ同時に注入し,蒸留水を入れたガラス管中にpouch部のみ水没させ,共振周波数2MHz,3,6,10Wの強度で120秒間照射した.その結果,濃度10W,0.2mMの群では,照射直後の生存腫瘍細胞数は有意に低値で,照射後1週での残存する腫瘍面積も他群よりも有意に低値で,周囲筋の構造も保たれていた.また,生存率も約60%で他の群より良好であった.しかし抗腫瘍効果は3Wや6Wでは認められなかった.マウスair pouch modelにおいて10W以上の超音波照射下では,ピロキシカムは濃度依存性に超音波抗腫瘍効果を増強させる,と結論した.
眼稀少疾患の遺伝子解析システムの構築

マイクロアレイを用いて、LCAを含むARRP105例における遺伝子変異の概要を示した。マイクロアレイは従来の直接塩基配列決定法と比較し、LCAを含むARRPの遺伝子診断に有用である可能性が示唆された。また、FEVRにおいて直接塩基配列決定法は遺伝子診断に有用な手法であるが、今回のNorrie病症例の場合、変異の同定が困難な症例も存在する。そのような症例においてMLPA法は有用であった。ARRP・LCAについては現在までに105例中13例に病因となり得る変異を検出した。NMNAT1遺伝子の2家系においてヘミ接合の新規変異である可能性が示唆された。LCAの1家系にRPGRIP1遺伝子のエクソン17欠損新規変異を認め、論文査読作業中。Norrie病の1家系2名にNDPエクソン2を含む欠失を認め、論文査読作業中。FEVRの1家系2名にFZD4の変異を認め、論文発表準備中。論文発表:村上晶第117回日本眼科学会総会評議員会指名講演III眼疾患と遺伝子眼科遺伝子診療をめざした遺伝情報解析日本眼科学会雑誌日眼会誌118:283-298 2014その他報告:藤巻拓郎、宮崎愛、藤木慶子、新井英介、近藤峰生、岩田文乃、村上晶Leber先天盲を含む常染色体劣性網膜色素変性のマイクロアレイを用いた遺伝子解析厚生労働省難治性疾患克服研究事業網膜脈絡膜・視神経萎縮症調査研究班平成24年度総括・分担研究報告書17-9 2013マイクロアレイを用いて、LCAを含むARRP105例における遺伝子変異の概要を示した。我々は眼科稀少疾患患者の迅速正確な遺伝子解析システムの構築により、原因究明と治療可能な患者を見出すことを目指している。我々は眼科稀少疾患患者の迅速正確な遺伝子解析システムの構築により、原因究明と治療可能な患者を見出すことを目指してきた。重症型の常染色体劣性網膜色素変性(autosomal recessive retinitis pigmentosa: ARRP)および、Leber先天盲(Leber congenital amaurosis: LCA)の計105例についてGeneChipを用い33種類遺伝子についてマイクロアレイによる解析を終了した。現在までに105例中14例に病因となり得る変異を検出した。このうちRPE65が原因となる家系は認められなかったが、RPGRIP1、NMNAT1遺伝子が原因となりうる3家系を同定し、論文発表と学会発表で報告した。上記の他、臨床所見から家族性滲出性硝子体網膜症(Familial exudative vitreoretinopathy : FEVR)が疑われた9家系22名と、Norrie病が疑われた1家系3名に対しFZD4、NDP、LRP5、TSAPN12、SOX17、ZNF408の遺伝子解析を行った。直接塩基配列決定法にて解析後、変異の確認できなかった家系についてMultiplex ligation-dependent probe amplification法(MLPA法)も施行した。結果FEVRの1家系2名にFZD4の変異、Norrie病の1家系2名にNDPエクソン2を含む欠失を認め、論文発表と学会発表で報告した。・新たな患者にも説明と同意のもと36名の協力が得られ(平成13年11月時点)順次塩基配列決定を進めている。・研究成果は日本眼科学会、Association for Research in Vision and Ophthalmology: ARVO, U.S.A.(視覚と眼科学研究協会会議)、厚生労働省難治性疾患克服研究事業網膜脈絡膜・視神経萎縮症に関する研究班会議、などにおいて発表した。論文発表は日本眼科学会雑誌、厚生労働省難治性疾患克服研究事業網膜脈絡膜・視神経萎縮症に関する研究班報告書にて発表し、現在jjo the japanese journal of ophthalmology誌へ論文2報の投稿が終わり、査読作業を進めている。当初の平成24年度の計画および、その達成度(括弧内)を各項目毎に示す・遺伝子配列の抽出作業により、標準配列データを作成(完了)。・1988年からの網膜色素変性患者で、劣性遺伝型式、早期発症、孤発例の試料を解析する(新たなアレイを作成したため劣性遺伝型式と早期発症は160%完了。孤発例は未解析)。・網膜色素変性についてはGeneChipアレイにて未解析の試料の塩基配列決定を完結させる(新たなアレイを作成したため160%完了)・未解析データをコンピュータ上で標準配列との差を検索(100%完了)・変異が検出されない場合はMLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)法、Array CGH(Comparative Genomic Hybridization)法、等を用いてコピー数解析を行なう(家族性滲出性硝子体網膜症は100%完了。網膜色素変性は未施行)。・上記で変異が検出されない場合は、イルミナTruSeqエクソームにてマルチプレックスPCRを施行。PCR産物を、新たにHiSeq2000にてエクソーム塩基配列決定しデータ化(新たに開発されたIon AmpliSeq Inherited Disease Panelにて4名のみ施行。

コスト面から残る89例に施行するかは検討中。1例についてはエクソーム塩基配列決定を検討中)。・コンピュータ上で標準配列との差を検索(100%解析済み)。・順天堂大学眼科遺伝診療部門検討会にて進行状況、解析結果を討議(2ヶ月に一度開催されている)。眼科稀少疾患患者の迅速正確な遺伝子解析システムを構築し、ARRP、LCA、FEVR、Norrie病において、新規変異を見出す事が出来た。しかし、本システムを用いても、未だに原因を特定できない症例も存在した。眼科稀少疾患、とりわけ網膜変性疾患関連遺伝子数は現時点でも増加しており、既存のマイクロアレイでは全て対応されていない場合が多い。近年実用化されている次世代シーケンサを用いた全エキソーム解析などの方法を用いて、残る症例の原因究明と、治療可能な患者を見出すことを更に目指して、今後の研究の推進方策を計画中である。網膜変性疾患関連遺伝子数は4月時点で204種が知られており、その99%が既存の全エキソーム解析に含まれていることが分かった。全エキソーム解析に際しては、意図しない「予想外の発見」を避けるため、データ解析前に目的外の遺伝子を除外する作業を加えることを考えている。当大学の老人性疾患病態・治療研究センターにおいて次世代シーケンサの運用が開始され、原因を特定できない症例の解析を少数例から行なう事が可能な状況となった。具体的な運用方法につき他科とも連携し協議が進められている。将来の眼科稀少疾患の治療を目指すに当たり、重篤で頻度の高い遺伝子変異を持つ症例から重点的に研究開発を推進するためにも、本研究による結果を踏まえ病態解明を推進する必要があると考えられる。劣性遺伝型式、早期発症に関してはGeneChipアレイ2種類33種の遺伝子解析は研究期間内に完了可能である。しかし、変異が検出できなかった症例について、更にその他の遺伝子解析を進めることは、交付額の範囲を超えるため、本研究終了後に新たな申請が必要。【平成25年度以降の計画】・新たな患者にも説明と同意の下、協力が得られれば解析を行なう。・新規の塩基配列決定法があれば、利用できるか検討する。・順天堂大学眼科遺伝診療部門検討会にて進行状況、解析結果を討議。・予期しない遺伝子変異が多数検出されてくる場合は共同研究機関に依頼し追試を依頼。・順天堂大学眼科遺伝診療部門検討会にて討議の上、必要に応じて患者や家族に結果の開示と、必要な場合はカウンセリングを行なう。・研究成果を学会ならびに論文にて公表する。
重要文抽出と文簡約を併用する圧縮度の高い新聞記事自動要約

1.本研究では,学習データとして原文と人手による簡約文が対になった新聞記事データベースを使用している.このデータベースを用いると,人が行なう簡約の傾向に関する情報を得ることができ,自動簡約に役立っ.このような情報抽出を有効に行なうためには,原文と簡約文の間の文節対応付けを行なう必要がある.そのため,概念距離と係り受けを利用した対応付けアルゴリズムを開発した.2.当該研究期間以前は,原文の集合から係り受け距離の分布を求め,それに基づいて係り受け整合度を定めていた.しかし,この方法では原文とそれに対応する簡約文の関係が反映されていない。この問題を解決するため,まず,原文と簡約文の間の文節対応付けを行なった.そして,原文においてある係り受け経路長を持つ文節対が簡約文において係り受け距離1で現れる相対頻度を求め,それに基づいて係り受け整合度を定めた.これを用いて簡約文を生成し,主観評価実験を行なったところ,重要情報の保持,構文的自然性,総合評価のいずれにおいても改善が認められた.3.本研究で採用している文節抽出型文簡約においては,原文中で係り受け関係になかった文節対が簡約文では係り受け関係を持っようになり,文の自然性が損なわれることがある.その場合でも係り文節の末尾を修正することにより,自然性を向上させることができる.ここでは,ルールベースと統計ベースの2つの方法により文節末を修正する方法を提案し,主観評価実験によりその有効性を確かめた.4.文節重要度と係り受け整合度はヒューリスティックな方法で定めていたが,それを確率論的な枠組みで定式化し直して簡約文生成を行なった.主観評価実験の結果,この方法とヒューリスティックな方法はほぼ同等な性能を持つことが明らかになった.1.本研究では,学習データとして原文と人手による簡約文が対になった新聞記事データベースを使用している.このデータベースを用いると,人が行なう簡約の傾向に関する情報を得ることができ,自動簡約に役立っ.このような情報抽出を有効に行なうためには,原文と簡約文の間の文節対応付けを行なう必要がある.そのため,概念距離と係り受けを利用した対応付けアルゴリズムを開発した.2.当該研究期間以前は,原文の集合から係り受け距離の分布を求め,それに基づいて係り受け整合度を定めていた.しかし,この方法では原文とそれに対応する簡約文の関係が反映されていない。この問題を解決するため,まず,原文と簡約文の間の文節対応付けを行なった.そして,原文においてある係り受け経路長を持つ文節対が簡約文において係り受け距離1で現れる相対頻度を求め,それに基づいて係り受け整合度を定めた.これを用いて簡約文を生成し,主観評価実験を行なったところ,重要情報の保持,構文的自然性,総合評価のいずれにおいても改善が認められた.3.本研究で採用している文節抽出型文簡約においては,原文中で係り受け関係になかった文節対が簡約文では係り受け関係を持っようになり,文の自然性が損なわれることがある.その場合でも係り文節の末尾を修正することにより,自然性を向上させることができる.ここでは,ルールベースと統計ベースの2つの方法により文節末を修正する方法を提案し,主観評価実験によりその有効性を確かめた.4.文節重要度と係り受け整合度はヒューリスティックな方法で定めていたが,それを確率論的な枠組みで定式化し直して簡約文生成を行なった.主観評価実験の結果,この方法とヒューリスティックな方法はほぼ同等な性能を持つことが明らかになった.本研究課題では,文簡約,すなわち原文が持つ情報をできるだけ保ちながら,より短い文に書き換えることが重要な位置を占めている.そこで,まず,新聞記事とその人手による簡約文を組にしたデータベースを用いて,原文の構造と簡約文の構造の関係や,簡約文の中に残る文節の種類を調べることにした.そのためには,原文中の文節と簡約文中の文節の対応付けを行なう必要がある.そのような対応付けを自動的に行なうため,本研究では対応付けの良さを測る評価関数を定義し,それを最大化する対応付けを探索によって見出すことを考えた.評価関数は,2つの関数の加重和である.それらの一つは原文中の文節と簡約文中の文節の概念距離を用いて定義される.他の一つは,原文中の係り受け構造が要約文中で保たれている度合いを測るもので,簡約文中で1ステップの係り受け関係にある2文節に対して,それぞれのに対応する原文の文節が何ステップの係り受け関係にあるかを基にして定義される.実験には,「毎日新聞全文記事および54文字データベース(2002年度版)」中の200文を用いた,対応付けの正解データは人手で作成した.また,概念辞書としては,EDR概念体系辞書を用いた.探索は幅優先で行い,計算量や記憶容量を削減するために局所的な評価値の増分に基づいて枝刈を行なっている.実験の結果,再現率90.4%,適合率82.4%という結果が得られた.これは,従来の手法による結果と比較して良好であり,文節間の概念的な距離と係り受け構造の保持度を利用した効果があったと考えられる.本研究課題では,文簡約,すなわち原文が持つ情報をできるだけ保持しながら,より短い文に自動書き換えを行なう処理が重要な位置を占めている.本年度は文簡約に関して次の研究を行なった.1.文簡約においては,簡約された文における原文情報の保持と,構文的自然性が重要である.

本研究では,構文的自然性を確保するために,文節間の係り受け整合度を利用している.これまでは,係り受け整合度を原文とは関係なく大規模なコーパスから統計的に推定していた.本年度は,原文とその人手による簡約文が対になったコーパスを用いて,原文の構造を考慮に入れながらこれを推定することを試みた.まず,原文を係り受け解析し,構文木を作る.そして,原文において係り受け経路を持つ文節対が,対応する簡約文において直接の係り受け関係を持って残存している割合を数え,これを基にして係り受け整合度の推定を行った.この情報を用いて実際に簡約文を生成し主観評価を行なったところ,原文情報の保持,構文的自然性,総合評価のいずれにおいても従来法より良好な結果が得られ,有効性が確認された.2.本研究では,原文からいくつかの文節を選び出す文節抽出型の文簡約法を採用している。このような方法においては,原文で直接的な係り受け関係を持たない文節対が簡約文では係り受け関係を持つようになることもあり,そのままでは自然性を損なう原因となる場合がある.そこで,このようなことが起こったときには,係り文節の末尾を修正して読みやすさを向上させることを試みた.修正はまず人手により作成したルールを用いて行い,その結果をコーパスに照らして自然性の評価を行なう.自然性が低いと判定された場合は,統計的に作成したルールを用いてさらに修正を行なう.この方法で修正された簡約文の主観評価を行なったところ,修正前より読みやすさが向上するという結果が得られ,この方法の有効性が確認された.本研究課題は,文簡約,すなわち原文が持つ情報をできるだけ保持しながら,それをより短い文に自動的に書き換える処理に重点を置いている.本年度は次の研究を行なった.1.本研究では,情報の保持度を定義するため文節重要度を用い,また,構文的自然性の程度を定義するため文節間の係り受け整合度を用いている.文節重要度は,文節残存率,すなわち,原文に存在する文節が簡約文に採用される相対頻度に基づいて求め,また,係り受け整合度は,原文においてある係り受け距離を持つ文節対が簡約文において係り受け距離1で現れる割合に基づいて求めて来た.今年度は,このようなヒューリスティクな方法を確率論的な枠組みで再定式化することを試みた.原文が与えられたとき,ある係り受け構造を持った簡約文が得られる確率を計算すると,その式の中に文節重要度や係り受け整合度に相当する項が現れる.それらの項を原文と簡約文が対になったデータベースを用いて推定し,それを用いて簡約文を生成した.主観評価実験を行なった結果,この方法による簡約文は,情報の保持度,構文的自然性,総合評価のいずれにおいても,ヒューリスティクスを用いた場合とほぼ同等の品質を持つことが明らかになった.2.これまで,文節重要度は各文節の残存率に基づいて求めていた.しかし,この方法では,例えば,原文中の「開催した」が簡約文中で「開いた」となっていた場合,それらの文節は一致したとみなされず,「開催した」は残存したことにならない.この問題を解決するため,原文と簡約文の間の文節対応付けをした上で残存率の計算を行なった.また,文節は,それを受ける文節によって重要度が変化する可能性がある.そこで,係り先の文節の素性も考慮に入れて残存率を計算した.生成された簡約文を観察したところ,ある程度の改善が見られたが,厳密な評価は今後の課題である.
小胞体関連分解の破綻によるタンパク質フォールディング異常病の解析

小胞体関連分解(ERAD)は、小胞体内のミスフォールドタンパク質を分子シャペロンが識別し、トランスロコンを介して細胞質に逆輸送され、ユビキチン化された後、プロテアソームによって認識され分解するという細胞機構である。小胞体は品質管理(quality control)機構を幾重にも備えており、異常(ミスフォールド)タンパク質は、小胞体膜および分泌経路から特異的に除外された後、細胞内で分解される。また近年、アルツハイマー病、プリオン病、ポリグルタミン病などタンパク質のフォールディング異常とクリアランス遅延によってタンパク凝集体が形成され、重篤な病態を示す例が数多く報告されている。小胞体関連分解システムの破綻として、さまざまなフォールディング異常病が明らかになりつつある。ここでは、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)、α1アンチトリプシンのフォールディング異常およびCdc42-interacting protein(CIP4)の凝集体形成機構を解析した。1細胞表面膜に局在する膜蛋白質であるDPPIVの活性部位変異体は、プロテアソームで分解を受ける。DPPIV変異体の膜結合型と可溶化型(分泌型)を作製し、プロテアソームタンパク質分解系に至る過程の違いを調べた。さまざまな糖鎖合成およびトリミングの阻害剤存在下で細胞培養を行い、DPPIV変異体の分子種の変化ならびにプロテアソーム分解に対する影響をしらべた。その結果、特にER-マンノシダーゼの阻害剤存在下、顕著な違いが見られた。DPPIV変異体(可溶化型)はERマンノシダーゼの阻害剤によりその分解が抑制されるので、マンノースを認識するレクチン様蛋白質EDEMの関与が考えられる。しかしながら膜結合型DPPIVでは阻害剤の影響を受けないことから、EDEMを介さずに分解系に入る可能性が示唆された。2異常タンパク質の蓄積及び凝集体形成機構の違い:培養細胞をプロテアソーム阻害剤で処理すると、細胞内にアグリソームとよばれる変性タンパク質の塊が生じる場合ある。このアグレゾームの形成は異常タンパク質の種類により異なる凝集形態をとることが知られている。CIP4の選択的スプライシング変異体であるCIP4Vの過剰発現は、細胞接着の低下を引き起こすと同時に、β-カテニンを含んだアグリソームを形成した。これらはPerkinなどで見られる典型的なアグリソームの形態をしめした。しかしDPPIV変異体の場合、COS-1細胞に発現させた後、プロテアソーム阻害剤(エポキシミシン)で処理すると、アグリソームの形態は見られず、核の周囲に小胞体の網目構造が凝集された。さらに時間の経過とともに、非常に大きい空胞が核の周囲から細胞質全体にわたって形成された。さらに膜画分にユビキチン化されたタンパク質が蓄積されることから、膨らんでいる空胞は、小胞体であると考えられる。これら小胞体の異常蛋白質の凝集は、細胞内移行の差によって、異なる部位で形成されるのではないかと考えている。小胞体関連分解(ERAD)の経路は一見確立されたかのように思われる。しかし、タンパク質フォールディング異常病と呼ばれる疾患が数多く見つかるにつれ、一つの分解経路だけでは説明がつかなくなってきた。膜結合型と可溶化(分泌)型分子の分解に至る経路の違いや糖タンパク質と糖鎖をもたないタンパク質とのシャペロン認識の違いなど、まだよくわかっていない。また凝集体を形成してアグリソームとして核近傍に蓄積する機構とプロテオソーム分解機構との使い分けも、まぜ解明されていない。そこで、タンパク質分解過程にはいくつかの経路があり、異なるシャペロン群により制御されているという新しい視点からの解析を導入することで、実験計画を実行した。1:細胞表面膜に局在する膜蛋白質であるジペプチジルペプチダーゼIV (DPPIV)の活性部位変異体は、生合成直後、タンパク質のフォールディングが正常に行なわれず、多量体を形成してトランスロコン(Sec61)を介して細胞質中に逆輸送され、ユビキチン化ののちプロテオゾームで分解を受ける。DPPIV変異体の膜結合型と可溶化型(分泌型)を作製し、プロテオソームタンパク質分解系に至る過程の違いを検討する為、さまざまな糖鎖合成およびトリミングの阻害剤存在下で細胞培養を行い、DPPIV変異体の分子種の変化ならびにプロテオゾーム分解に対する影響をしらべた。DPPIV変異体(可溶化型)はERマンノシダーゼの阻害剤によりその分解が抑制されるので、マンノースを認識するレクチン様蛋白質(Edem)の関与が考えられる。しかしながら膜結合型DPPIVでは阻害剤の影響を受けないことから、Edemを介さずに分解系に入る可能性が示唆された。2:異常タンパク質の蓄積及び凝集体形成機構の違い:培養細胞をプロテオソーム阻害剤で処理すると、細胞内にアグレゾームとよばれる変性タンパク質の塊が生じる場合ある。DPPIV変異体の場合、COS-1細胞に発現させた後、プロテオソーム阻害剤(エポキシミシン)で処理すると、アグレゾームの形態は見られず、核の周囲に小胞体の網目構造が凝集された。

さらに膜面分にユビキチン化されたタンパク質が蓄積されることから、膨らんでいる空胞は、小胞体であると考えられる。これら小胞体の異常蛋白質の凝集は、細胞内移行の差によって、異なる部位で形成されるのではないかと考えている。小胞体関連分解(ERAD)は、小胞体内のミスフォールドタンパク質を分子シャペロンが識別し、トランスロコンを介して細胞質に逆輸送され、ユビキチン化された後、プロテアソームによって認識され分解するという細胞機構である。小胞体は品質管理(quality control)機構を幾重にも備えており、異常(ミスフォールド)タンパク質は、小胞体膜および分泌経路から特異的に除外された後、細胞内で分解される。また近年、アルツハイマー病、プリオン病、ポリグルタミン病などタンパク質のフォールディング異常とクリアランス遅延によってタンパク凝集体が形成され、重篤な病態を示す例が数多く報告されている。小胞体関連分解システムの破綻として、さまざまなフォールディング異常病が明らかになりつつある。ここでは、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)、α1アンチトリプシンのフォールディング異常およびCdc42-interacting protein(CIP4)の凝集体形成機構を解析した。1細胞表面膜に局在する膜蛋白質であるDPPIVの活性部位変異体は、プロテアソームで分解を受ける。DPPIV変異体の膜結合型と可溶化型(分泌型)を作製し、プロテアソームタンパク質分解系に至る過程の違いを調べた。さまざまな糖鎖合成およびトリミングの阻害剤存在下で細胞培養を行い、DPPIV変異体の分子種の変化ならびにプロテアソーム分解に対する影響をしらべた。その結果、特にER-マンノシダーゼの阻害剤存在下、顕著な違いが見られた。DPPIV変異体(可溶化型)はERマンノシダーゼの阻害剤によりその分解が抑制されるので、マンノースを認識するレクチン様蛋白質EDEMの関与が考えられる。しかしながら膜結合型DPPIVでは阻害剤の影響を受けないことから、EDEMを介さずに分解系に入る可能性が示唆された。2異常タンパク質の蓄積及び凝集体形成機構の違い:培養細胞をプロテアソーム阻害剤で処理すると、細胞内にアグリソームとよばれる変性タンパク質の塊が生じる場合ある。このアグレゾームの形成は異常タンパク質の種類により異なる凝集形態をとることが知られている。CIP4の選択的スプライシング変異体であるCIP4Vの過剰発現は、細胞接着の低下を引き起こすと同時に、β-カテニンを含んだアグリソームを形成した。これらはPerkinなどで見られる典型的なアグリソームの形態をしめした。しかしDPPIV変異体の場合、COS-1細胞に発現させた後、プロテアソーム阻害剤(エポキシミシン)で処理すると、アグリソームの形態は見られず、核の周囲に小胞体の網目構造が凝集された。さらに時間の経過とともに、非常に大きい空胞が核の周囲から細胞質全体にわたって形成された。さらに膜画分にユビキチン化されたタンパク質が蓄積されることから、膨らんでいる空胞は、小胞体であると考えられる。
発生工学を応用した神経芽腫自然発生モデルの作成-トランスジェニックマウスに神経芽腫は発生するか-

<実験方法および結果>1)導入遺伝子の作成N-myc遺伝子の発現調節ベクターとして,SRαを用いた。SRαプロモーターの下流にN-myc遺伝子を接合させ,これを導入遺伝子とした。2)遺伝子導入方法BDF1マウスの受精卵350個にマイクロインジェクション法を用いて,1)で作成した遺伝子を導入した。マイクロインジェクション法によって損傷を受けずに生存できたものは80%であった。3)受精卵の卵管移植偽妊娠させたICRマウスの卵管内に各個体あたり2)で作成した受精卵を約30個(左右卵管へ約15ずつ)移植した。4)テイルサザン法によるトランスジェニックマウスの判定卵管移植後21日目に,帝切によりマウス胎児を取り出した。胎児の数は1個体あたり約15-20であった。しかしテイルサザン法によりN-myc遺伝子が確認できた個体はすべて胎児死もしていた。<考察>今回行った方法では,マウス個体への遺伝子導入は成功したが,すベてが胎児死亡し目的としたトランスジェニックマウスの産出ができなかった。これを改善するにはN-myc発現調節ベクターの種類を変更することにより,遺伝子発現の時期および部位を変化させる必要がある。可能性としてはmodified SRαベクターかHonjoベクターを用いた実験系が考えられる。
植物時計の全体像と分子機構

藍色細菌、緑藻(クラミドモナス)、高等植物(シロイヌナズナ)で生物時計の解析を進めた。1.藍色細菌のKaiABC時計タンパク質複合体の相互作用部位を同定した。2.クラミドモナスのROC時計タンパク質の機能解析を行った。また、核の遺伝子発現を連続的に観察するために核レポーター株を作製した。3.開発した圧倒的な処理能力のある生物発光リアルタイムモニタリングシステムを用いて、シロイヌナズナでの大規模突然変異体分離を行った。藍色細菌の生物時計分子装置(基本振動子)はKaiA、KaiB、KaiCの3つの時計タンパク質から構成されており、これらのタンパク質間の相互作用によって時間発振がなされている。kai時計遺伝子はkaiA遺伝子とkaiBCオペロンからなるkaiABC遺伝子クラスターを構成している。kaiBCオペロンはKaiAで促進され、KaiCで抑制される。時計への光入力系の1つを構成する時計関子遺伝子pexは時計の周期を伸ばす働きがあり、遺伝子破壊すると時計の周期が短くなり、kaiAオペロンの発現が促進される。逆に過剰発現すると周期は伸長し、kaiAオペロンの発現が抑制される。本研究では、PexがkaiA遺伝子の上流域に結合してkaiA遺伝子の発現を抑制するリプレッサーであることを証明した。また、X線結晶構造解析によって藍色細菌Anabaena sp. PCC 7120とSynechococcus sp. PCC 7942由来の二つのPexの原子構造を解明した。Pexはwinged-helix構造を持つホモ2量体であった。ゲルシフトアッセイ法によって、Pex結合部位としてkaiA遺伝子の上流域に存在する25-bpの最小塩基配列を同定した。決定したPexの原子構造に基づいて、DNAとの結合に関与すると思われるドメインとアミノ酸残基を推定し(Kurosawa et al., 2009, Genes Cells14:1-16)、kaiA遺伝子の上流域への特異的DNA結合活性に関与すると思われるドメインのアミノ酸残基に一連の一アミノ酸残基置換変異を導入し、それぞれ試験管内でのDNA結合活性とin vivoリズム活性に及ぼす影響を解析し、そのアミノ残基の重要性を確認した。藍色細菌の生物時計分子装置は時計タンパク質KaiA、KaiB、KaiCの3つの時計タンパク質からなり、ATP存在下の試験管内で24時間周期で自律的に時間発振する。KaiCリン酸化レベルやKaiC ATPase活性、Kai時計複合体の会合・解離の振動が知られている。しかし、Kaiの会合・解離の詳細や時間発振機構は不明である。これまで、KaiA-KaiB間相互作用は検出されていなかった。システイン残基(Cys)を持たないKaiBの特定のアミノ酸残基に一アミノ酸残基置換を導入し、Cys残基にスピンラベルを導入し、スピンラベルをプローブに用いて、ESR法でESRスペクトルを測定して解析した。先ず、KaiBの活性部位であるpositively charged cleftの近傍に存在する64番目の残基をCysに置換してスピンラベルを導入した。この標識KaiBをKaiAと反応させるとESRスペクトルに特異的な変化が検出された。しかし、KaiB単独の場合や、KaiCやネガティブコントロールのウシ血清アルブミンを混ぜた場合には、何の変化も検出されなかった。この変化はKaiAの生理的濃度範囲で起こった。また、KaiBと相互作用したのは時間発振機能のあるKaiA C末端ドメインであった。このKaiA-KaiB間相互作用の産物がKaiA-KaiB複合体としてゲル濾過クロマトグラフィーで検出された。複合体の化学量論はKaiAダイマー2分子に対してKaiBテトラマー1分子であった。一方、分子表面に存在する101番目の残基をCysに置換してスピンラベルを導入した場合には、KaiAと反応させてもスペクトル変化は検出されなかった。したがって、KaiAとの相互作用は64番目残基の近傍で起こること、また64番目残基の近傍で構造変化が起こることを示唆している。ヒトや高等植物を含む多くの生物では、その活動や生理活性が細胞内分子機構である生物時計によって24時間周期の振動を示す。ゲノム研究の結果、植物系(高等植物、緑藻、藍色細菌)の生物時計は構成分子が互いに異なっていることが示された。我々はこれまでに、クラミドモナスの葉緑体ゲノムにルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ生物発光レポーター株を作製し、時計遺伝子群をクローニングした。本研究では、これら時計タンパク質の、DNAとの結合の有無や時計タンパク質問の複合体形成に関して解析を進めた。また、核からミトコンドリアや葉緑体への時間情報伝達の機構を解明するため、クラミドモナスの核ゲノムの使用コドンに最適化した赤色ルシフェラーゼ遺伝子(鉄道虫由来)を人工合成し、核ゲノムに組み込んで核のレポーター株を作製した。高等植物の真の生物時計

遺伝子はこれまでクローニングされておらず、我々がシロイヌナズナでクローニングしたpcllが世界初である。我々は圧倒的な処理能力のある生物発光リアルタイムモニタリング・スクリーニングシステムを、JST受託事業で開発し、シロイヌナズナにおける研究への発展的拡張を目指した。
チクングニアウイルス感染関連細胞性因子の同定

ノックアウト細胞ライブラリーを用いて行ったゲノムワイドスクリーニングでGAG鎖合成関連遺伝子以外のチクングニアウイルス(CHIKV)感染関連遺伝子の同定を試みた結果、CHIKV感染への関与が疑われるいくつかの膜蛋白質遺伝子の候補を得ることができた。そのうちの膜蛋白質遺伝子の一つをGAG鎖合成欠損細胞株に導入し、CHIKV感染における効果を検討したところ、当該膜蛋白質遺伝子導入GAG鎖合成欠損細胞株において当研究室のCHIKV#16856Thai strainでの有意な感染の更新が観察された。またこの当該膜蛋白質遺伝子のノックアウト細胞を作製し、CHIKVの感染性を検討したところCHIKV #16856Thai strainではCCID50及びプラック形成等において感染性の低下が観察されたが、CHIKV Ross strainの感染性には影響しなかった。また牛水疱性口内炎ウイルス(VSV)やマウス白血病ウイルス(MuLV)といった別種のウイルスの外皮膜にCHIKV膜蛋白質を発現した組み換えシュードタイプウイルスベクターを用いた感染試験では、CHIKV感受性細胞株と当該細胞性因子のノックアウト細胞との間でこれらシュードタイプウイルスの感染性に差がみられなかった。本研究で作製した増殖欠損型CHIKV発現プラスミドを当該膜蛋白質遺伝子ノックアウト細胞に導入し、CHIKVサブゲノミックプロモーターで発現されるGFPまたはルシフェラーゼの発現量を検討したところこれらの発現量の低下が観察され、当該膜蛋白質がCHIKV感染細胞でのウイルス増殖に関与している可能性も示唆された。CHIKV感染関連細胞性因子として膜蛋白質の1つを新規CHIKV感染関連細胞性因子として同定はできたが、この膜蛋白質がCHIKVの特異的受容体として働いているのかウイルスの細胞内増殖に関わる宿主因子であるのか未だ確証が得られず、この新規細胞性因子がCHIKV感染増殖にどのように関与しているのかを明らかにする必要がある。本研究で同定できた新規CHIKV感染関連細胞性因子がCHIKVの特異的受容体として、宿主細胞への感染の初期段階に関与しているのか、またはウイルス感染成立後のウイルスの細胞内増殖に関与しているのかを、本研究で作製した増殖欠損型CHIKV発現プラスミドと増殖欠損型CHIKVベクター、またこの新規CHIKV感染関連細胞性因子に対する抗体等を用いて検討していく。また当該細胞性因子と結合するウイルス蛋白質の結合領域、及びウイルス膜蛋白質と結合する当該細胞性因子の結合領域について免疫沈降、近接ライゲーションアッセイ等を用いた検討を行う。新規CHIKV感染関連細胞性因子の構造を元にした、合成ペプチド等の作出とその効果の検討を行う。チクングニアウイルスの感染に関連する遺伝子の網羅的同定を目的とし、gRNA-Cas9タンパク質導入ベクターによるCRISPR-Cas9システム(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-Associated Proteins 9)を用いた方法でHEK293ノックアウト変異細胞ライブラリーを作製できた。このノックアウト細胞ライブラリーにチクングニアウイルス、East/Central/South African (ECSA) LineageのAfrican prototype S27株、及びIndian Ocean Epidemic LineageのJapan SL11131株を接種し、生き残ってくる細胞群においてどのような細胞性因子がノックアウトされているのかを導入されているgRNA配列をもとに検討した。その結果、チクングニアウイルスAfrican prototype S27株を接種したHEK293ノックアウト変異細胞ライブラリーで、接種後に細胞死を引き起こさなかった生存細胞を確認できた。一方チクングニアウイルスJapan SL11131株を接種したノックアウト変異細胞ライブラリーでは生存細胞が見いだされなかった。CHIKV-S27株接種後生存HEK293ノックアウト変異細胞群で導入されていたgRNA配列をもとにノックアウトされている細胞性因子の同定を試みたが、有意にノックアウトされている細胞性因子を見出すことができなかった。興味深いことにこれらの接種後生存細胞はチクングニアウイルスに感染していないわけではなく、ウイルス感染が成立し、ウイルス産生量はわずかであるが、ウイルス産生細胞となっていることが見いだされた。またこれらウイルス産生細胞から産生されるインターフェロン等の抗ウイルス因子によって生存細胞が検出されている可能性が考えられた。これらの接種後生存細胞はウイルスの持続感染を考えるうえで有用な材料となる可能性が考えられる。HEK293にgRNA-Cas9タンパク質発現ベクターを導入することでHEK293ノックアウト変異細胞ライブラリーを作製できた。チクングニアウイルスS27株を接種したHEK293ノックアウト変異細胞ライブラリーで、接種後、生存細胞を確認できたが、ウイルス非感染細胞ではなく、ウイルス感染細胞となっていること明らかとなった。これらのウイルス感染(産生)細胞の影響もあり、当初の予定であるノックアウト変異細胞ライブラリー中のgRNA配列の解析による、ノックアウトされている細胞性因子の同定にまで到達できていない。これまでの研究でチクングニアウイルスの標的細胞への感染には細胞表面のへパラン硫酸鎖への結合が重要であることが明らかにされている。へパラン硫酸鎖以外のチクングニアウイルス感染に関与している細胞性因子を同定するため、ノックアウト変異細胞ライブラリー(HAP1/GAG-/knockout cell library)に、チクングニアウイルスE膜蛋白質を有する水疱性口内炎ウイルスのシュードウイルスを接種し生き残ってきた感染に抵抗性の細胞群のうち、未だへパラン硫酸鎖を有している細胞を抗へパラン硫酸抗体を用いて回収し、これに野生型チクングニアウイルスを接種し、チクングニアウイルス感染に抵抗性の生存細胞の回収を試みた。今回、野生型チクングニアウイルス接種後に細胞死を引き起こさずに生き残ってきた細胞クローンを数クローン得られた。

これら生存細胞クローンのゲノムにおいてエクソントラッピングベクターによりノックアウトされている遺伝子の候補を得ることが出来た。現在、チクングニアウイルス高感受性細胞でのこれらの候補遺伝子のノックアウト細胞を作製中である。チクングニアウイルスの複製活性・感染量の正確な定量化を行うために、サブゲノミックプロモーターで発現制御されている構造蛋白質遺伝子領域をGFP遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子に置き換えた増殖欠損型チクングンヤウイルス発現プラスミドを作製した。これを用いて、チクングニアウイルスの複製活性をGFPの発現量またはルシフェラーゼの活性測定により定量化できる。また構造蛋白質遺伝子発現プラスミドと併用することで、2次感染が起こらない増殖欠損型チクングニアウイルスベクターを得ることが出来、GFPの発現細胞数の測定、またはルシフェラーゼ活性の測定により感染量の正確な定量化に用いることができる。ノックアウト変異細胞ライブラリーより、野生型チクングニアウイルス接種後に細胞死を引き起こさずに生き残ってきた細胞クローンを得ることが出来た。チクングニアウイルスの構造蛋白質遺伝子領域をGFP遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子に置き換えた増殖欠損型チクングンヤウイルス発現プラスミドを作製できた。またこれを用いて2次感染が起こらない増殖欠損型チクングニアウイルスベクターを得ることが出来た。ノックアウト細胞ライブラリーを用いて行ったゲノムワイドスクリーニングでGAG鎖合成関連遺伝子以外のチクングニアウイルス(CHIKV)感染関連遺伝子の同定を試みた結果、CHIKV感染への関与が疑われるいくつかの膜蛋白質遺伝子の候補を得ることができた。そのうちの膜蛋白質遺伝子の一つをGAG鎖合成欠損細胞株に導入し、CHIKV感染における効果を検討したところ、当該膜蛋白質遺伝子導入GAG鎖合成欠損細胞株において当研究室のCHIKV#16856Thai strainでの有意な感染の更新が観察された。またこの当該膜蛋白質遺伝子のノックアウト細胞を作製し、CHIKVの感染性を検討したところCHIKV #16856Thai strainではCCID50及びプラック形成等において感染性の低下が観察されたが、CHIKV Ross strainの感染性には影響しなかった。
フランス「福祉国家」におけるホームレス問題-研究と対策の特徴

「福祉国家の危機」が伝えられているが、フランスではその諸原理(完全雇用制の基づく雇用基準、全国民対象の社会保障制度)は見直されておらず「ホームレス」問題は日雇などの不安定労働者の失職・失業から路上生活に通じるわが国の「ホームレス」問題と性格は異なっていることが確認できた(平成12年9月・フランス現地調査での宿泊施設入所者調査と緊急夜間巡回システムでの観察、そして平成13年2月・広島市での路上生活者調査の比較研究)。第二に、フランスにおけるホームレス対策の「厚み」はわが国で検討されているように特別制度ではなく、一般国民を対象とした普遍的な社会政策(住宅、失業・雇用、医療、社会福祉策)で対処されていること、つまり路上に転落するまでの予防策と、路上後の救済・保護策が有機的に連結されていることである。したがって、現在では常時・常態的な路上生活者は僅少であり、多くは宿泊施設入所に至っていることである。第三に、最大課題は一般住宅の確保となっていること。何故ならば、健康の保持または回復、職業生活への復帰も生活基盤である住宅の確保なくては、成功に至らないことが確認されている。これはわが国の対策が専ら就労指導に傾いていることへの反証になる。第四に、現在フランスでは好況を迎えており、問題は次第に外国人問題に傾斜している。しかし、こうした不法入国者に対しては民間支援団体では国籍取得、文化的差異に基づく生活障害に対処すべきノウハウを蓄積しており、それには政府も補助金を支給するなどの体制を整えつつある(平成13年7月民間団体調査)。以上は1998年の包括的貧困対策法である「反排除法」の影響であり、つまりは全国民、外国人を含む全住民を対象とし、どのような状況になっても生活保障を実行するという福祉国家体制が保持されていることが確認できた。1.フランス「福利国家」に関する理論研究としては、R.カステル著"Metamorphose de laQuestion Sociale"の訳出と、著者自身との意見交換(2000年9月)を通じて、「福祉国家」の歴史的発展とその今日的「危機」(住宅および雇用市場の悪化、貧困の拡大)を把握した。2.フランスのホームレスの実態に関しては、公私の調査のデータベースを作成し、特に95年冬季の国立人口問題研究所のパリ調査に注目して訳出した。調査は、アメリカで使用されている調査および統計手法に基づくもので、科学的(客観的な)数値、そしてホームレスの属性(特に25歳未満の青年の増加、性別、家族関係)、支援策の効果などが把握できた。この調査からもフランスのホームレス問題では、路上生活はほぼ解消されており、支援策の課題が住居への(再)入居、公的就労の拡大であることも確認できた。3.フランスのホームレス支援策の特徴は、支援団体へのヒアリングとその活動の見学、そして行政当局へのヒアリング(2000年9月)を通じて、公私の協同体制であり、それぞれの責任領域が明確であることが分かった。訪問団体は、最大の民間支援組織であるカトリック救済会、2箇所のホームレス宿泊施設、全国民間福祉団体連合会(UNIOPSS)、全国家族手当金庫、そして行政担当者としてパリ県労働雇用局、パリ16区福祉事務所の責任者等である。4.広島市のホームレス二次調査の実行(一次調査は1998年2月に実行)フランスとの比較の意味で、2001年2月7日に、調査員89人によって、市全域での悉皆調査を実施した。200人近くの「路上生活者」をつかめたが、現在集計中である。調査の目的は、彼らが路上に至るまでの社会福祉などの社会施策の実行状況(機能不全)を明確にすることであり、フランス「福祉国家」の社会施策との比較をも行なうつもりである。

以上は1998年の包括的貧困対策法である「反排除法」の影響であり、つまりは全国民、外国人を含む全住民を対象とし、どのような状況になっても生活保障を実行するという福祉国家体制が保持されていることが確認できた。
延髄中枢化学受容におけるPhox2b陽性ニューロンのCO2感受性のイオン機構

延髄吻側腹外側部のpFRG/Pre-Iニューロンを含むPhox2b陽性細胞は,呼吸調節における中枢化学受容器(特にCO2センサー)として働くと考えられている.本研究では,新生ラット摘出脳幹-脊髄標本を用いて,pFRG/Pre-I (Phox2b陽性)ニューロンの高CO2受容の神経機構を調べた.pFRG/Pre-Iニューロンは,シナプス前膜からの伝達物質放出などのカルシウム依存性機構の関与を遮断した後も高CO2に反応してカリウムチャネルの閉鎖を伴う膜の脱分極を引き起こした.これらのニューロンは脳内の毛細血管に密着して存在していた.また,カリウムチャネルとしてはTASK1,2,3のサブタイプが検討されたが,これらのK+チャネルは高CO2受容において主要なチャネルとしては働いていないことが確認された.本研究により,pFRG/Pre-I(Phox2b陽性)ニューロンは高CO2刺激を直接受容することが明らかになった.延髄吻側腹外側部のpFRG/Pre-Iニューロンを含むPhox2b陽性細胞は,呼吸調節における中枢化学受容器(特にCO2センサー)として働くと考えられている.本研究では,新生ラット摘出脳幹-脊髄標本を用いて,pFRG/Pre-I (Phox2b陽性)ニューロンの高CO2受容の神経機構を調べた.pFRG/Pre-Iニューロンは,シナプス前膜からの伝達物質放出などのカルシウム依存性機構の関与を遮断した後も高CO2に反応してカリウムチャネルの閉鎖を伴う膜の脱分極を引き起こした.これらのニューロンは脳内の毛細血管に密着して存在していた.また,カリウムチャネルとしてはTASK1,2,3のサブタイプが検討されたが,これらのK+チャネルは高CO2受容において主要なチャネルとしては働いていないことが確認された.本研究により,pFRG/Pre-I(Phox2b陽性)ニューロンは高CO2刺激を直接受容することが明らかになった.呼吸調節における中枢化学受容器(特にCO2感受性)の神経機構は神経生理学上の未解決な重要研究課題である.本研究では,新生ラット摘出脳幹-脊髄標本を用いて,延髄吻側腹外側部のPhox2b陽性ニューロンが直接CO2濃度変化を受容するのかどうかを検証し,CO2感受性のイオン機構を電気生理学的,神経薬理学的,免疫組織学的手法を用いて明らかにする.22年度は,CO2感受性がPhox2b陽性細胞に対する直接作用の結果引き起こされるのかどうかについて検証をおこなった.新生ラット摘出脳幹-脊髄標本を用いて,延髄吻側腹外側部-腹側表面近傍のPhox2b陽性ニューロン(主にpFRG Pre-Iニューロン)からホールセルパッチクランプ法により膜電位を記録し,TTX存在下で高CO2(2%CO2→8%CO2)に対する応答を調べ,ニューロンのCO2応答に対する各種伝達物質(とくに関与が大きいと考えられるサブスタンスPとATP)のプロッカーの影響を検討した.サブスタンスP(NK1受容体)のプロッカーであるspantide又はL-703606,あるいはATP受容体プロッカーであるMRS2179又はPPADSを前処理してもTTX存在下におけるpFRG Pre-IニューロンのCO2に対する脱分極応答は引き起こされた.さらに,シナプスからの伝達物質放出そのものを遮断する目的で,TTX+Cd2+溶液あるいは低Ca2+,高Mg2+(TTXおよびCd2+を追加)溶液に置換した後CO2応答を調べた.この場合にも,pFRG Pre-IニューロンのCO2に対する脱分極応答は抑制されなかった.これらの結果から,pFRG Pre-IニューロンのCO2感受性は,前シナプス要素の関与を必要としないこと,つまり直接,シナプス後膜の受容によることが明らかとなった.本研究では,新生ラット摘出脳幹-脊髄標本を用いて,延髄吻側腹外側部のPhox2b陽性ニューロンが直接CO2濃度変化を受容するのかどうかを検証し,CO2感受性のイオン機構を電気生理学的,神経薬理学的,免疫組織学的手法を用いて明らかにする.23年度は,CO2感受性がPhox2b陽性細胞に対する直接作用の結果引き起こされるのかどうかについて検証をおこなった.新生ラット摘出脳幹-脊髄標本を用いて,延髄吻側腹外側部-腹側表面近傍のPhox2b陽性ニューロン(主にpFRG Pre-Iニューロン)からホールセルパッチクランプ法により膜電位を記録し,TTX存在下で高CO2(2%CO2→8%CO2)に対する応答を調べ,ニューロンのCO2応答に対する各種伝達物質(とくに関与が大きいと考えられるサブスタンスPとATP)のブロッカーの影響を検討した.サブスタンスP(NK1受容体)のブロッカーであるspantide又はL-703606,あるいはATP受容体ブロッカーであるMRS2179又はPPADSを前処理してもTTX存在下におけるpFRG Pre-IニューロンのCO2に対する脱分極応答は引き起こされた.さらに,シナプスからの伝達物質放出そのものを遮断する目的で,TTX+Cd2+溶液あるいは低Ca2+,高Mg2+(TTXおよびCd2+を追加)溶液に置換した後CO2応答を調べた.この場合にも,pFRG Pre-IニューロンのCO2に対する脱分極応答は抑制されなかった.これらの結果から,pFRG Pre-IニューロンのCO2感受性は,前シナプス要素の関与を必要としないこと,つまり直接,シナプス後膜の受容によることが明らかとなった.