hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バナジウムによるp53活性化機構とその毒性学的意義

A549ヒト肺胞上皮細胞において、5価バナジウムであるメタバナジン酸ナトリウム(NaVO3)の曝露濃度(10-200μM)および時間(8-48hr)に依存して、リン酸化型p53セリン15および総p53蛋白量の増加を認めた。NaVO3曝露(100μM、48hr)細胞抽出液よりp53蛋白を免疫沈降後、各セリン残基のリン酸化を検討した結果、セリン15部位のリン酸化が最も顕著であった。オルトバナジン酸ナトリウム(Na3VO4)およびメタバナジン酸アンモニウム(NH4VO3)曝露でもp53セリンリン酸化および総p53蛋白量の増加が認められた。NaVO3曝露によりextracellular signal-regulated protein kinase(ERK)のリン酸化が認められたが、ERK経路阻害剤UO126処理では、p53セリン15のリン酸化は抑制されなかった。一方、phosphatidylinositol 3-kinase related kinases(PIKKs)阻害剤wortmanninあるいはcaffeine処理、およびRNA干渉によるataxia telangiectasiamutated(ATM)ノックダウンでは、NaVO_3曝露によるp53セリン15リン酸化が抑制された。過酸化水素消去剤catalaseおよび抗酸化剤N-acetylcystein処理では、p53セリン15リン酸化抑制は認められなかった。S15A変異型p53導入A549細胞では野生型導入細胞に比し、NaVO_3曝露によるp53-DNA結合活性上昇とDNA断片化は軽度に低下したことから、バナジウム曝露によるこれらの細胞応答にはp53セリン15部位リン酸化以外の関与もある。以上、A549細胞における5価バナジウム曝露は、PIKKファミリーに属するATMに依存したp53セリン15のリン酸化を生じる。さらに、アクリルアミドを曝露したSH-SY5Y細胞および亜鉛を曝露したA549細胞においても、バナジウム曝露と同様なp53蛋白セリン15のリン酸化を認めた。また、カドミウムを曝露した近位尿細管細胞において、転写制御因子STATのセリン727部位リン酸化も認めた。1メタバナジン酸ナトリウム(100μM)を48時間暴露したA549ヒト肺胞上皮細胞の抽出液から、p53蛋白を免疫沈降し、各セリン残基(セリン6、9、15、20、37、46、392)のリン酸化を特異的リン酸化認識抗体を用いたウェスタンブロット法にて検出した結果、セリン15部位のリン酸化が最も顕著であった。2 A549細胞におけるメタバナジン酸ナトリウム暴露によるセリン15残基リン酸化型p53蛋白の蓄積は、濃度(10-200μM)および暴露時間(8-48時間)依存性に認められた。3 DNA-PKおよびATMの阻害剤であるwortmanninの処置により、メタバナジン酸ナトリウム暴露によるp53蛋白セリン15残基のリン酸化が抑制された。一方、PI3K阻害剤のLY294002、MAPキナーゼ経路阻害剤であるU0126およびSB203580の処置では、p53蛋白のリン酸化抑制は認められなかった。p53蛋白セリン15残基リン酸化に至るシグナル伝達経路として、DNA-PKおよびATMの関与が考えられた。4オルトバナジン酸ナトリウムおよびメタバナジン酸アンモニウムの暴露(100μM、48時間)でも、A549細胞においてセリン

15残基リン酸化型p53蛋白の蓄積を認めた。5代表的な神経毒性物質であるアクリルアミド暴露により、SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫において、A549細胞におけるバナジウム暴露と同様なp53蛋白セリン15残基のリン酸化を認めた。今後、A549細胞において、wortmanninの処置、およびp53蛋白セリン15残基のセリン→アラニン置換を行い、バナジウムによるセリン15残基リン酸化とp53転写活性化との関連性をレポータージーンアッセイを用いて検討する。また、バナジウム暴露によるp53蛋白リン酸化に及ぼす活性酸素の影響を検討する。1 5価バナジウムであるメタバナジン酸ナトリウム(NaVO3)を曝露したA549ヒト肺胞上皮細胞において、濃度(10-200pM)および曝露時間(8-48時間)依存性のp53蛋白セリン15部位リン酸化を認めた。また、wort-manninおよびcaffeine処理実験により、p53蛋白セリン15部位リン酸化に至るシグナル伝達経路として、ATM(ataxia telangiectasia mutated)の関与が考えられた。2ヒトATM遺伝子に対するsiRNAを用いたATMノックダウンにより、A549細胞におけるメタバナジン酸ナトリウム曝露(100pM、48時間)によるセリン15部位リン酸化型p53蛋白レベル上昇は69%、総p53蛋白レベルは39%低下した。従って、阻害剤および本ノックダウン実験により、バナジウム曝露ではATM経路依存性のp53蛋白セリン15部位リン酸化が生じることを明らかにした。3 p53蛋白セリン15残基をアラニンに置換した遺伝子をA549細胞に導入し、メタバナジン酸ナトリウムを曝露(100μM、48時間)したところ、バナジウムによるp53転写活性およびヌクレオゾームレベルの上昇は、野性型p53遺伝子導入細胞に比し、各々17%、15%抑制された。4過酸化水素消去剤catalaseおよび抗酸化剤N-acetylcysteine(NAC)の処理では、メタバナジン酸ナトリウム曝露(100μM、48時間)によるセリン15部位リン酸化型p53蛋白レベル上昇は、明らかには抑制されなかった。次年度、バナジウム曝露によるp53蛋白セリン15部位リン酸化がもたらす毒性学的意義、特にp53転写活性、標的遺伝子発現、アポトーシス、についての検討を行う。また、バナジウム曝露によるp53蛋白セリン部位リン酸化に及ぼす活性酸素の影響についても追加実験を行う。1ヒトp53蛋白セリン15残基をアラニンに置換した遺伝子(S15A)および野生型p53遺伝子をA549細胞に導入し、メタバナジン酸ナトリウム(NaVO_3)曝露後のp53-DNA結合活性とDNA断片化(細胞質ヌクレオゾーム)を測定した。その結果、S15A変異型p53導入細胞では、野生型導入細胞に比し、NaVO_3曝露によるp53-DNA結合活性上昇とDNA断片化は、各々、17%と15%の低下であり、バナジウム曝露によるp53蛋白セリン15リン酸化は、p53転写活性化およびDNA断片化において部分的な関与をしていると考えられた。2 NaVO_3曝露A549
規則構造の格子欠陥制御に基づく環境フレンドリー熱電変換材料の高性能化

未利用の熱を用いた温度差で発電できる熱電発電システムは温室効果ガス排出量削減と省エネルギー化に大きく貢献できる。実用化に十分な高性能、経済性、環境親和性を兼ね備えた熱電材料の創出を本研究の目的としてハーフホイスラー化合物に着目し、規則的な原子配列(規則構造)の乱れである種々の格子欠陥を積極的に制御して熱電性能を向上させる方法を考案した。その結果、電気特性と熱特性をバランスよく両立させることにより性能向上を達成できた。再生可能エネルギーとして自然界に存在する熱源、産業活動から排出される未利用の廃熱など、様々な形態と規模の熱が至る所に広く分散して存在している。これら熱エネルギーを電気エネルギーに直接変換できるクリーンな「熱電変換発電」システムを社会に広く普及させることができれば、温室効果ガスの排出量削減とエネルギー環境問題の解決に貢献できる。本研究では高温用の熱電変換材料としてハーフホイスラー型化合物を選択して、格子欠陥制御により飛躍的な熱電特性の向上させるための低環境負荷元素に基づく材料設計基盤を構築することを目指す。本研究課題は追加採択されたという事情により、初年度の研究期間は実質4ヶ月に限られた。そこで事前調査の研究として進めていたTi-Ni-Sn三元系状態図の構築に取り組んだ。熱電材料としてのハーフホイスラー化合物の中では、低環境負荷および元素戦略の面からTiNiSnベース合金の実用化が最も望ましい。実際にはTiNiSn合金の作製プロセスは他のハーフホイスラー合金に比べて難しい。TiNiSn合金設計を作製プロセスと共に開発するためにはTi-Ni-Sn三元系状態図を構築することが不可欠である。800°Cおよび1000°Cの等温度断面ならびに反応経路図の考察を進めた。TiNiSnの相平衡に影響を及ぼす相として、アーク溶解のas-cast組織にTi_2Ni_2Snが確認された。1373K以上で加熱保持すると体積率が減少して消失することからTi_2Ni_2Snは準安定相であると考え、今後の課題として検討する。さらに当初の計画を若干変更して、ハーフホイスラー相と平衡して共存するホイスラー相との結晶学的な関係ならびに異相界面の特徴を理解するために、Ti-Ni-SnおよびZr-Ni-Co-Sn系合金の透過電子顕微鏡を用いた組織観察を行った。ハーフホイスラー母相に析出するホイスラー相の形態から、ハーフホイスラー相は比較的大きな弾性異方性を有する可能性が示唆された。温度差により発電するクリーンな熱電発電システムを社会に普及できれば、産業活動や一般生活で排出される廃熱、自然界の熱など、地球に分散している様々な規模の熱を電気に直接変換でき、環境問題の解決に貢献できる。本研究では700°Cの高温で使用できる熱電材料としてハーフホイスラー型化合物に着目し、低環境負荷元素から成るTiNiSnをベースとする合金系を選択して、相平衡に基づく格子欠陥制御と作製プロセスを利用した相界面の組織制御により性能を飛躍的に向上させる熱電材料設計基盤を構築することを目的とした。ハーフホイスラー規則構造では格子点の1/4に及ぶ空孔が特徴である。溶解凝固でTiNiSn合金を作製すると必ず組成が若干Ni-richとなり、過剰Ni原子はほとんど空孔には固溶されず、ホイスラー相として析出する。TiNi固相とSn液相の界面に生成するTiNiSnは化学量論組成に限りなく近く、原子レベルではNiと空孔の一部がランダムに位置交換した格子欠陥が安定に存在することを透過電子顕微鏡による組織観察と化学分析により明らかにした。ホイスラー相が共存してゼーベック係数が低い前者に比べ、後者の格子欠陥は熱伝導率の低減に有効であるために優れた熱電特性が期待される。TiNiSnとZrNiSnはハーフホイスラー同士で相分離する。一方向凝固で合金を作製すると、ZrNiSnが初晶として成長し、液相へのTi濃化が進んで最終凝固部分はTiNiSnとなる。TiとZrがランダムに固溶する温度域で長時間熱処理を行うとTiの偏析は解消されて均一な分布に近づくが、Zrは完全には均一な分布にならない。相分離の温度域で時効処理を行って熱電特性を測定したところ、優れた電気出力因子を維持したままで熱伝導率を低減でき、実用化の目安とされる無次元性能指数ZT=1を越える性能向上が実現できた。地球温暖化の抑止策としてだけでなく、震災後に再考が進む発電の在り方の議論においても、再生可能エネルギーを利用した発電技術の確立が望まれている。太陽熱など自然界の熱源、産業活動や一般生活で排出される廃熱など、地球上に広く分散して存在する様々な規模の熱エネルギーを電気エネルギーに直接変換できるクリーンな熱電発電システムを社会に広く普及させてエネルギー環境問題の解決に貢献する。本研究では1000K程度の高温で使用できる熱電変換材料としてハーフホイスラー型化合物を選択し、相平衡に基づく格子欠陥制御と作製プロセスを利用した組織制御により性能を飛躍的に向上させる熱電材料設計の基盤を構築することを目的とする。

相平衡の観点からハーフホイスラーMNiSn相(M=Ti,Zr,Hf)はホイスラーMNi2Sn相の共存を避けることが困難である。ホイスラーは熱電特性を損なう原因となる金属相であるため、その析出過程が熱電特性に及ぼす影響を明らかにした。一方向凝固により単相合金を作製できるZrNiSnを選択し、Ni-rich組成においてNiを過飽和に固溶させた単相合金を作製し、室温から1073Kでゼーベック係数、電気抵抗率、熱伝導率を測定した。およそ773Kでハーフホイスラー母相中にホイスラー相の析出が開始することに起因してゼーベック係数の絶対値が急激に小さくなることを透過型電子顕微鏡(TEMおよびSTEM)による組織観察で明らかにした。析出初期はナノサイズのクラスタリングのような状態であり、773Kで3h保持すると体積率5%程度、結晶学的な方向性を持った数十nm程度の板状粒子に成長する。電気抵抗率と熱伝導率の温度依存性には顕著な変化が認められず、ゼーベック係数に及ぼす影響が大きいと考えられる。1273Kで熱処理することで析出したホイスラー相の一部が再溶解し、ゼーベック係数の値も再び大きくなる。本研究課題は11月後半に追加採択されたという事情により、初年度は実質4ヶ月の研究期間に限られ、研究分担者1名が学内本務の都合により参加を辞退した。しかし採択の可否に関わらず運営費交付金を土台として進めていた事前調査研究に基づいて速やかに本研究課題を開始できるように努力した。その結果として若干の計画変更を加えながらも、熱電材料設計の基盤となるTi-Ni-Sn三元系状態図の構築、および格子欠陥制御としてのハーフホイスラー・ホイスラー異相界面の観察に基づく考察を行うことができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題は追加採択されたという事情により初年度は実質4ヶ月の研究期間に限られ、計画変更を加えながら研究推進の努力を行ってきた。熱電材料設計の基盤となるTi-Ni-Sn三元系状態図の構築に初年度から取り組んでいるが、Sn液相の多い組成域では凝固組織からの判別が難しい。相平衡の観点から避けることが難しい不純物相としてのホイスラー相の析出が熱電特性に及ぼす影響を明らかにしたが、これは第2年度計画には含まれていなかった。当初の計画から遅れる一つの要因となったが、組織因子が熱電特性の及ぼす直接の効果を定量的に理解する重要な知見を得ることができたため、研究全体を進める上では有意義であった。化学量論組成に近いZrNiSnやTiNiSnで観察してきたナノクラスターの存在との類似性が認められ、今後の展開にも期待できる。初年度が実質4ヶ月の研究期間に限られたことを受け、研究計画の見直しを行って今後の方策を検討した。ただし当初の研究目的を目指すことに問題はない。熱電材料設計の基盤となるTi-Ni-Sn三元系状態図の構築に関して、初年度に見いだした課題に取り組みながら完成度を上げ、規則構造の格子欠陥制御に直結させるためCoを加えた4元系への拡張を試みる。透過電子顕微鏡によるハーフホイスラー・ホイスラー異相界面の詳細な観察と解析をM-Ni-Co-Sn系(M=Ti,Zr)に対して行い、格子欠陥としての相界面ならびに空孔サイト固溶元素が熱電特性に及ぼす影響の理解を目指す。
光学活性セレノキシドのプラメラ-型炭素鎖伸長反応を用いる大環状化合物の合成研究

本研究は新規な9員環骨格を有するXeniaジテルペノイドを生合成類似の経路で位置・立体選択的な合成することを目的とするが、その実現のためには炭素鎖のC-2位への選択的なカチオン種の形成と引き続く末端二重結合との間での求電子的環化が不可欠である。本研究ではセレノキシドのプンメラ-反応により生成するセレノニウムイオンの求電子性に着目し、セレノキシドとアリルシラン類からのプンメラ-型α-アリル化反応を環化のモデル反応と位置づけて種々の検討を行った(1)光学活性アルコール(lーメントール)より得られる2-フェニルセレネニル酢酸l-メチルのmCPBA酸化により相当するセレノキシドがほぼ単一の結晶として単離された。従ってlーメンチル基等による立体保護が隣接するセレノキシドの安定化に有効であることが明らかとなった。(2)(1)で得られるセレノキシドに対しジクロロメタン中0°Cで求電子試薬(三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体または無水トリフルオロ酢酸)とアリルトリメチルシランを作用させ、中程度の収率で相当するα-アリル化生成物(2-フェニルセレネニル-4-ペンテン酸lーメンチル)を約1:1のジアステレオマ-混合物として得た。(3)上記のセレノキシドと2-トリメチルシリルメタクリル酸エチル、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体を用いて同様の反応を行った場合には加熱をすることにより相当するα-アリル化生成物が収率良く得られた。一方、γ-位に置換基を有するアリルシラン類を用いた場合には目的とする反応は進行せず、複雑な混合物を与えた。またアリルトブチルスズを用いた反応において同様のα-アリル化生成物は得られたが、有機スズ化合物の混入のためにその精製は困難であった。(4)上記のα-アリル化生成物はmCPBAによりセレノキシドのayn離脱を経由して容易にオレフィン化を起こし、ほぼ定量的にα,β,γ,δ-不飽和エステル((2E)-2,4-ペンタジエン酸lーメンチル)を与えた。従って、本アリル化反応が新規な酸素鎖伸長反応として有機合成的に有効であることが明らかとなった。本研究はXenicinに代表されるXeniaジテルペノイドを生合成類似の経路で位置・立体選択的に合成することを目的とする。この目的達成のための第一段階として、本年度は9員環骨格形成のキ-ステップとなる光学活性セレノキシドとアリルシランからのプンメラ-型分子内アリル化反応のモデル反応を種々検討した。その結果明らかとなった点を以下に述べる。(1)光学活性アルコール(lーメントール)より2段階の化学変換でα-フェニルセレノ酢酸エステルを合成し、次いでこの化合物の酸化を行ったところ、相当するセレノキシドが安定な結晶として単離された。セレノキシドはこれまでは不安定な化学種とされ、その単離例は極めて少ない。従って本反応の結果はlーメンチル基等による立体保護がセレノキシドを安定化する上で有効であることを示している。

(2)(1)で得られるセレノキシドに対しジクロロメタン中-78°Cでルイス酸(三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体)また無水トリフルオロ酢酸とアリルトリメチルシランを作用させたところ、α-フェニルセレノ酢酸エステルのα-メチレン部へのアリル化反応が50%ほどの収率で進行した。また、この反応の副生成物はセレノキシドからの脱酸素により生成するセレニドであった。一方、上記のセレノキシドと2-トリメチルシリルメタクリル酸エチルを用いて同様の反応を行った場合には12時間の加熱還流をすることにより相当するα-アリル化生成物を中程度の収率で得ることができた。これらの反応はセレノキシドからのプンメラ-型反応により生成するセレノニウムカチオンへのアリルシラン類の求核攻撃により進行すると考えられる。以上の結果によりXenicinの9員環骨格を構築するためのモデル反応の条件がほぼ明らかとなった。(3)現在ゲラニオールを出発原料とする分子内アリル化反応の基質の合成を検討中である。以上の成果を踏まえ、来年度はゲラニオールを出発原料とする分子内アリル化反応の基質の合成とそれを用いる分子内環化反応の検討を行う予定である。本研究はXenicinに代表されるXeniaジテルペノイドを生合成類似の経路で位置・立体選択的に合成することを目的とする。この環化のモデル反応として昨年度に引き続き本年度も光学活性セレノキシドからのプンメラ-反応により生成するセレノニウムイオンとアリルシラン類の反応によるα-アリル化反応を種々検討した。その結果明らかとなった点を以下に述べる。(1)光学活性アルコール(lーメントール)より2段階の化学変換により得られる2-フェニルセレネニル酢酸エステルのmCPBA酸化を行ったところ、相当するセレノキシド(2-フェニルセレニニル酢酸lーメンチル)がほぼ単一の安定な結晶として単離された。本反応の結果はlーメンチル基等による立体保護がセレノキシドを安定化する上で有効であることを示している。(2)(1)で得られるセレノキシドに対しジクロロメタン中0°Cで三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体または無水トリフルオロ酢酸とアリルトリメチルシランを作用させたところ、α-アリル化生成物(2-フェニルセレネニル-4-ペンテン酸lーメンチル)が中程度の収率で約1:1のジアステレオマ-混合物として得られた。また、本反応の副生成物はセレノキシドからの脱酸素により生成するセレニドであった。(3)上記のセレノキシドと2-トリメチルシリルメタクリル酸エチルを用いて同様の反応を行った場合には12時間の加熱還流をすることにより相当するα-アリル化生成物が中程度の収率で得られた。一方、γ-位にフェニル基やイソプロピル基などの置換基を有するアリルシラン類を用いた反応では目的とする反応は進行せず、複雑な生成物が得られるのみであった。(4)上記のα-アリル化生成物に対し1当量のmCPBAを作用させたところセレノキシドのsyn脱離を経由するオレフィン化が進行し、ほぼ定量的にα,β,γ,δ-不飽和エステル((2E)-2,4-ペンタジエン酸lーメンチル)が得られた。従って、本アリル化反応が新規な炭素鎖伸長反応として有機合成的に有用であることが明らかとなった。
熱化学的水素製造プロセスにおける平衡物性の測定

水の熱化学分解法による水素製造を目的として提案された幾多のプロセスのうち, "UT-3"は運転の連続化が容易であることから,工業的に重要なプロセスとして注目されており,その実用化に向けて基礎研究が盛んに進められている.しかし, UT-3プロセスにおけるサイクル流体としてのBr_2HBrH_2O3成分混合物の成分分離・濃縮操作ならびに熱回収操作に必須の平衡物性(気液平衡関係)に関しては,研究が立後れている.本研究はこのような実情に鑑み,上記サイクル流体の気液平衡関係を,実用プラントで予想される操作範囲(圧力:常圧20気圧,温度:常温250°C)で実測・相関することを目的として着手されたものである.このため本年度は金属腐食性に富む対象混合物を加圧,加温下で安全に取り扱うことのできる気液平衡測定措装置の開発ならびに測定システムの確立をめざして研究を行なった.装置の開発にあたっては対象物質の特殊性から従来の金属製耐圧装置の適用が不可能である点を考慮して,新たにガラスとテフロンを主体とする気液平衡測定機構を考案した.すなわち,耐圧ガラス製シリンダー状の平衡セルを金属製オートクレーブ内に設置し,シリンダ内の測定試料部をテフロン製のピストンで封じ,シリンダ内外の圧力をバランスさせて,加圧下でもガラスへの負荷が軽減される仕組みを採用した.この方式は平衡試料を採取する際,ピストンの移動(圧力差0.5気圧)によって試料部の圧力が一定に保持される点をも考慮したものである.またサンプリングシステムはテフロンを主体として配管した.平衡セルの耐圧ならびに昇温のテストを行ない,圧力についてはサンプリング配管も含めて20気圧まで,また温度については約170°Cまで使用可能であることを確認した.現在本測定装置を用いてBr_2, HBr, H_2O各純物質の蒸気圧ならびにBr_2H_2O, HBrH_2Oの各2成分混合物の気液平衡を測定している.水の熱化学分解法による水素製造を目的として提案された幾多のプロセスのうち, "UT-3"は運転の連続化が容易であることから,工業的に重要なプロセスとして注目されており,その実用化に向けて基礎研究が盛んに進められている.しかし, UT-3プロセスにおけるサイクル流体としてのBr_2HBrH_2O3成分混合物の成分分離・濃縮操作ならびに熱回収操作に必須の平衡物性(気液平衡関係)に関しては,研究が立後れている.本研究はこのような実情に鑑み,上記サイクル流体の気液平衡関係を,実用プラントで予想される操作範囲(圧力:常圧20気圧,温度:常温250°C)で実測・相関することを目的として着手されたものである.このため本年度は金属腐食性に富む対象混合物を加圧,加温下で安全に取り扱うことのできる気液平衡測定措装置の開発ならびに測定システムの確立をめざして研究を行なった.装置の開発にあたっては対象物質の特殊性から従来の金属製耐圧装置の適用が不可能である点を考慮して,新たにガラスとテフロンを主体とする気液平衡測定機構を考案した.すなわち,耐圧ガラス製シリンダー状の平衡セルを金属製オートクレーブ内に設置し,シリンダ内の測定試料部をテフロン製のピストンで封じ,シリンダ内外の圧力をバランスさせて,加圧下でもガラスへの負荷が軽減される仕組みを採用した.この方式は平衡試料を採取する際,ピストンの移動(圧力差0.5気圧)によって試料部の圧力が一定に保持される点をも考慮したものである.またサンプリングシステムはテフロンを主体として配管した.平衡セルの耐圧ならびに昇温のテストを行ない,圧力についてはサンプリング配管も含めて20気圧まで,また温度については約170°Cまで使用可能であることを確認した.現在本測定装置を用いてBr_2, HBr, H_2O各純物質の蒸気圧ならびにBr_2H_2O, HBrH_2Oの各2成分混合物の気液平衡を測定している.
気道上皮細胞の一酸化窒素合成酵素遺伝子の誘導によるClチャネル機能の調節

1.ヒト気管支培養上皮細胞のパッチクランプおよびNO産生:単離したヒト気管支上皮細胞にパッチクランプを行い,高CA^<2+>溶液とブラディキニン,あるいはNOドナーであるS-nitroacetyl-N-penicillaine(SNAP)やニトロプルシドの添加により単一CIイオンチャネル電流およびCIチャネルの開確率の増加が観察された。また同時に測定したNO選択性の拡散電流も増加し,免疫蛍光抗体法ではcNOSの活性化が認められたことから,cNOS由来のNOが上皮細胞のCIチャネルを開口させたものと考えられた。2.CIイオンチャネルに対するiNOS誘導の効果:次に上皮細胞にiNOSを誘導するため,エンドトキシン(E.coli由来),ILー1β,TNFα,インターフェロンγの存在下で培養を行い,これらの培養細胞におけるCIコンダクタンス,CIチャネルの開確率を測定した。その結果,これらの刺激はNOの産生を増加させることがわかり、Northern blot解析よりiNOSmRNAの発現のupregulationが認められた。また,以上の効果は,ステロイドあるいはマクロライド処置により抑制されたことより,気道分泌亢進に対するこれらの薬剤の有用性が示唆された。1.ヒト気管支培養上皮細胞のパッチクランプ:単離したヒト上皮細胞にパッチクランプ法(whole cell clamp,inside-out patch)を適用し,Clチャネルの開確率を測定した.その結果,NO産生刺激薬である高Ca^<2+>溶液とブラディキニン,あるいはNOドナーであるs-nitroacetyl-peniillaine(SNAP)やニトロプルシドを細胞内液に添加すると,単一Clイオンチャネル電流の発生がみられ,Clチャネル開確率は増加した.また,その効果はL-NAME,アミノグアニジン,クロルプロマジンの存在下で抑制されたことより,iNOSの関与が示唆された.2.気道上皮由来のNOの測定:NO選択電極と比較電極を培養気道上皮細胞の灌流液に浸漬し,上記薬剤の投与によって発生する拡散電流をNOメーターにてモニターし,ポーラログラフィーの手法を適用しNO産生を直接測定した.ブラディキニン,ニトロプルシドは,いずれも用量依存的にNO産生を増加させ,以上の反応はL-NAMEおよびアミノグアニジンによりほぼ完全に消失した.3. NOSサブタイプの決定:あらかじめ気管支摘出組織標本に対しNADPH diaphorase活性の組織化学を施行し,気道上皮細胞におけるNOSの局在が確認された.次いで,コンフルエントとなった培養上皮細胞を用い,cNOS,iNOS各々のモノクローナル抗体にて免疫蛍光抗体法を行った結果,ブラディキニンとニトロプルシドはiNOS蛋白の発現を誘導することが明らかとなった.1.Clイオンチャネルに対するiNOS誘導の効果:単離したヒト気道上皮細胞にパッチクランプ法(whole cell clamp,inside-out patch)を適用し,単-Clイオンチャネル電流およびClチャネルの開確率を測定した.上皮細胞にiNOSを誘導するため,エンドトキシン(E.coli由来),IL-1β,TNFα,インターフェロンγの存在下で培養を行ったところ,Clコンダクタンス,Clチャネルの開確率の増加が観察された.また,その効果はヂキサメサゾンやマクロライドの添加により著明に抑制された.同時に行ったポーラログラフィーによるNO産生の評価では,上記サイトカインの刺激によりNOが遊離されることが確認された.2.iNOS遺伝子発現の調節:ヒト気管支培養上皮細胞のmRNAを抽出し,RT-PCR法およびプリキャストゲル電気泳動を用いたノーザンブロット法にてcNOS,iNOS各々のmRNAの発現を評価した.その結果,エンドトキシン,IL-1β,TNFα,インターフェロンγで刺激すると,iNOSmRNAの発現が選択的に誘導され,またその効果はステロイドあるいはマクロライドの存在下で明らかな抑制を受けた.
アレルギー疾患の発症と予防に関する研究

アレルギー性疾患の発症機序を知るために、免疫担当細胞であるリンパ球の増殖因子であるインターロイキン2(IL2)に対する反応性を指標に、アレルギーの病因抗原に対するリンパ球の反応性、及びこれらの細胞のアレルギー反応誘導作用について解析を進めた。即ち、先づPropidiumiodide(PI)蛍光色素を用いたヒト末梢血T細胞の抗原特異的IL2反応性の測定法を開発した。病因抗原で刺激後5日間培養した患者リンパ球の生細胞数と、測定した蛍光色素量とは直線的な正の相関を示し、そのbackground色素量は全体の5%以下であった。培養細胞に添加して3日間二次培養したIL2の量に比例して蛍光色素量が測定され、0.1units/200μlのIL2量(細胞数26×10^5)で平衡に達した。アトピー患者リンパ球を病因抗原である卵白アルブミン(OVA)、α-カゼイン(α-casein),スギ抗原(JC)あるいはダニ抗原(Df)のいずれかのアレルゲンで刺激すると、症状が誘発される抗原に対してIL2反応性が特異的に誘導された。また誘導されたIL2反応性は従来のトリパンブルー法で測定したものと同程度であった。健康人ではこのような反応は認められなかった。抗原特異的IL2反応性の測定方法としてPI蛍光色素を用いる方法は簡略かつ迅速でありアレルギー性疾患における病因抗原の検索や病勢を把握する上で臨床上有用と考えられた。次に、アレルゲンで誘導された活性化T細胞のIL2に対する反応性を指標に、生体内においてアレルギー状態を作り出すT細胞の特徴について、鶏卵を病因抗原とするアトピー性皮膚炎患者を検討した。卵白アルブミン(OVA)特異的IL2反応性細胞はCD3^+2^+4^+8^-45RA^+、T細胞であり、遅延型アレルギー反応やIgE産生糸のヘルパー細胞として働いていると考えられた。この反応の誘導にはT細胞上のCD4を介してOVA抗原を提示する細胞上のHLA-DQとHLA-DPが重要な働きをしていた。これらのT細胞の活性化に関わるIL2の受容体のうちOVAに特異的に表出される受容体はβ鎖であった。
化学シナプスの情報単位の一つである神経分泌顆粒形成とその制御メカニズムの解明

我々は以前、哺乳類のホスファチジルイノシトール(PI)移送蛋白質(PI-TP)が、トランスゴルジネットワーク(TGN)からの神経分泌顆粒形成を促進する細胞質因子であることを見いだし、さらに、TGNからの神経分泌顆粒形成におけるPI-TPと共同して働く脂質膜上因子としてのPIの本質的な関与と、細胞質側因子としてのアクチン系の潜在的な関与を示唆した。今年度は第一に、このPI系の機能発動における一連のカスケードに作用する可能性のある細胞質側因子として、神経分泌顆粒形成を制御することが知られている三量体型Gタンパク質の関与を以前に確立したPC12細胞に由来する無細胞アッセイ系を用いて検討した。細菌由来のmonoPI特異的ホスホリパーゼC(PI-PLC)と、三量体型Gタンパク質に作用することでこの系を制御することの知られているguanosine5'-3-0-(thio)triphosphate(GTPγS)は、相乗作用的に神経分泌顆粒形成を阻害した。しかし、PI-PLCがアクチン骨格系とTGNの相互作用を亢進するのに対し、GTPγSによる阻害の場合にはこの相互作用の亢進が見られなかった。これらの結果よりGTPγSによる阻害的な制御点はPIの関与する制御点と同じ一連の過程上にあるが、明らかに異なった点であることが示された。第二に、分泌小胞形成における被覆誘導や脂質誘導の実態を明らかにするため、脂質因子群や、クラスリン被覆を誘導する活性を持つマンノース6リン酸受容体に注目した。この受容体の細胞内分布に異常のある培養細胞株を得るため、我々が単離しつつあるTGN-エンドソーム-リソゾーム系に異常を持つ可能性のある変異細胞群を検索した。その結果、2クラスの変異細胞株を得ることができた。これらの細胞株は、TGNからの小胞形成を解析うるために有用なツールとなることが期待できる。我々は以前、哺乳類のホスファチジルイノシトール(PI)移送蛋白質(PI-TP)が、トランスゴルジネットワーク(TGN)からの神経分泌顆粒形成を促進する細胞質因子であることを見いだした。そこで、神経分泌顆粒形成においてPI-TPと共同して働く他の因子の関与を、以前に確立したPC12細胞に由来する無細胞アッセイ系を用いて検討した。まず脂肪因子であるPIの本質的な関与の有無を調べるため、細菌由来のmonoPI特異的ホスホリパーゼC(PI-PLC)の効果をみた。PI-PLCは神経分泌顆粒形成を用量依存的に強力に阻害した。一方、改変した密度勾配を用いた速度遠心法により、2つの異なるTGN(lightとdense)を分離する事に成功した。これを用いて解析した結果、PI-PLCが、小胞形成を阻害すると同時に、PI-TPのdense TGNとの結合を促進する事が明らかになった。この効果に加え、PI-PLCは、TGNで硫酸化を受けたマーカータンパク質の分布を、light TGNからdense TGNにシフトさせた。2つのTGNのうち、dense TGNのみがアクチンの免疫反応を示した。すなわち、このシフトは、TGNとアクチン系の相互作用であると考えられた。このTGNのシフトは特異的で、リソゾームのマーカーや、あらかじめ形成されていた分泌小胞の分布に影響を与えなかった。これらの結果は、TGNからの神経分泌顆粒形成におけるPI-TPと共同して働く脂質膜上因子としてのPIの本質的な関与と、細胞質側因子としてのアクチン系の潜在的な関与を示唆した。
インターネット上における行動計量支援システムの開発に関する研究

JavaScriptは主要インターネットブラウザに自動搭載されている、Webページ構築用の簡易言語であり、入手が容易である上に、プログラミング技法も簡単で、かってのBasicよりも簡単にプログラミングできる。さらに、それに加えて、数学関数も強力に用意されており、それらを用いれば、統計計算をも容易に行うことができる。多くの統計計算は、コンピュータの普及により統計ソフトを多用して処理されているが、計算の中身はブラックボックス化され、ユーザーには見えず、こうした状況は統計学の学習に際しては適切ではない。本システムは、統計学の学習に平行して、必要な計算は直ちに、自らプログラミングして、処理することが出来るよう開発されているので、それらを組み合わせて使用することにより、教育効果が発揮される。また、高度の関数群を組み合わせることにより、中程度までのデータ解析を行うこともできる。主な内容は以下のごとくである。統計学電子化教科書:一例として、データの整理(平均、分散、相関計数)の章を例示統計学ユーザー関数:記述統計学、確率分布、標本分布、推定、統計的検定、多変量解析の基礎的手法、統計シミュレーション行動計量ユーザー関数:尺度構成、精神物理学的方法など心理学に固有な統計的方法他サイトへのリンク(オンライン統計学書、統計処理ソフト、主要統計学研究室)など。[1]ハードウエアの構築:ネットワーク対応情報処理システムであるので、まず、それを可能とするハードウエア・システムの構築が必要である。パソコンiMacを用いてネットワーク・システムの端末とし、それを学内LAN(ODINS,大阪大学学術情報ネットワーク・システム)を経由して、講座(行動工学)のサーバーに接続する作業を行った。現在のところ、アクセス可能なのは講座内からのみであるが、将来はパーミッションを外し、講座外からのアクセス可能な公開システムとする予定である。[2]ソフトウエアの構築(プログラミング):各種行動計量データの統計処理に関して、統計学全般にわたる処理法をプログラミングし、JsStat(JavaScriptによる統計学)として作成した。データの統計処理が基本であるが、新たなテーマについてプログラミングを行った。内容は心理学的測定法、精神物理学的測定法、尺度構成法などに関するものであり、従来作成のものに加えて、それらを総合化する作業を行った。今後はさらに幅広く作成する必要があるが、初年度は基礎的なテーマについてである。[3]オンライン・システムの構築:現在のところオフ・ラインであるが、コンピュータによる実験制御システムの構築、知覚・学習・情動等の領域における心理学的実験、および社会・人格等の領域における社会調査の実施など、行動計量に適したテーマについて、オンライン・システムとする方法を試行錯誤的に模索した。システムの完成を待って、オンライン接続とする予定である。前年度に引き続き、今年度は次のシステムの構築を試みた。[1]統計学システム:各種行動計量データの統計処理に関して、統計学全般にわたる基本的処理法をプログラミングし、JsStat(JavaScriptによる統計学)として作成した。データの統計処理が基本であり、平均・分散・標準偏差・相関係数から、標本分布・統計的推定・検定に至る一連の基本的統計処理過程を解説し、データ処理を行うシステムである。機種フリーであるので、マッキントッシュ、ウィンドウズ機で稼動する。[2]計量心理学システム:各種行動計量データの統計処理を取り上げ、プログラミングを行った。内容は、例えば心理学的測定法、精神物理学的測定法、尺度構成法などに関するものであり、従来作成のものに追加して精緻化した。しかし、今後さらに幅広く作成する必要がある。また、そのシステムを用いて、日本・アメリカ・ドイツ・スウェーデン大学生の環境問題意識に関する国際比較データを処理し、国際心理学会、日本心理学会において報告した。[3]オンライン・計量心理学学習システム:現在のところオフ・ラインであるが、コンピュータに計量心理学に関する各種専門用語・処理法(一部)についての解説を電子情報化して保存した。入力は僅かではあるが、適切な人工的および現実データも用意し、処理の便に供した。更に広範囲の電子化を試みなければならないが、システムの完成を待って、オンライン接続とする予定である。前年度に引き続き、次のシステムの構築を試みた。

データの統計処理が基本であり、平均・分散・標準偏差・相関係数から、標本分布・統計的推定・検定に至る一連の基本的統計処理過程について、データ処理を行うシステムとした。さらに、応用統計学の一例として、主成分分析、重回帰分析等の多変量解析法についてもプログラミングを行った。機種フリーであるので、マッキントッシュ、ウィンドウズ機で稼動する。[2]計量心理学システム:各種行動計量データの統計処理を取り上げ、プログラミングを行った。内容は、例えば心理学的測定法、精神物理学的測定法、尺度構成法などに関するものであり、評定尺度法、一対比較法などを精緻化して追加した。[3]オンライン統計学・計量心理学学習システム:コンピュータに統計学・計量心理学に関する各種専門用語・処理法についての解説を電子情報化して保存した。また内外の統計学・心理学研究室サイトへのリンクを試みた。インターネットを頂点とする、コンピュータ・ネットワーキングの発展と普及は目覚ましいものがあり、本研究は、統計学・計量心理学(行動計量学)の分野を中心とする研究・教育を支援するシステムをコンピュータ上に開発・構築するものである。本年度は最終年度であるので、データの統計処理に関しては、これまでに、統計学全般にわたって各種の処理法をプログラミングし、JsStat (JavaScriptによる統計学)として作成して来たものに加え、新たな手法についてプログラミングを行い、システムとして追加、整備した。心理学的測定法、精神物理学的測定法、尺度構成法など行動計量に関する部分をさらに補い、総合化の作業を行った。すなわち、知覚・学習・情動、および社会・人格等の領域における社会調査の中から、行動計量に適したテーマを選定し、たとえば一対比較法、評定尺度法等、尺度構成等におけるデータの質の吟味を行う方法を試作した。さらにデータ全般に関して、信頼性、妥当性のチェックを行うプロセスを加えた。また、数学的処理、統計学的処理に関するものをプログラミングして、ユーザー関数として保存した。データあるいは処理結果を視覚的に見て理解することも重要であり、ヒストグラム、散布図の描画などの関数を作成して参照できるようにし、システムの強化を図った。
子どもの強迫性障害に対する認知行動療法の心理教育教材の開発と効果の検討

強迫性障害(Obsessive-Compulsive Disorder;OCD)とは、意思とは無関係に繰り返し頭に浮かび不安を生じさせる強迫観念と、強迫観念を振り払うために繰り返し行われる強迫行為からなる疾患である。平均発症年齢は19.5歳であり、近年は自閉スペクトラム症(Autism Spectrum Disorder;ASD)など発達障害との関連も示唆されている。本研究では、若年層や自閉スペクトラム傾向の高い方向けの漫画の心理教育を作成し、漫画による心理教育が疾患の理解とモチベーションに及ぼす効果を検証した。大学生56名を対象に調査研究を実施した。まず強迫性障害の治療について描いた漫画を、子どもの臨床を元に精神科医2名・臨床心理士2名で校正して作成し、実験刺激として使用した。比較する統制刺激としては一般的な大人のOCD治療で心理教育として用いられる飯倉(1999)による「強迫性障害の治療ガイド」から引用し、テキストでの心理教育の例として使用した。二つの心理教育資料は、1.強迫性障害の症状、2.強迫観念と強迫行為の悪循環、3.回避の悪循環、4.不安階層表の作り方、5. ERPのやり方や心構え、6.治療経過の紹介、などが共通項として構成されている。また、自閉スペクトラム傾向を若林(2016)による日本語版自閉症スペクトラム指数(Autism-Spectrum Quotient, AQ)50項目にて測定し、刺激との関連を検討した。刺激の違いとAQ高低による分散分析の結果、AQ高群はテキストよりも漫画の方が心理教育を理解しやすいと示された。また、テキスト群においてAQ高群は低群よりも理解度が落ちる傾向が示された。これらのことから、自閉スペクトラム傾向の高い人にとっては、治療を視覚的にイメージしやすい漫画での心理教育が、治療の理解を向上させる可能性が示唆された。強迫性障害(Obsessive-compulsive disorder; OCD)とは、意志とは無関係に繰り返し頭に浮か、不快感を生じさせる強迫観念と、強迫観念を振り払うために繰り返し行われる強迫行為からなる(APA, 1994)。発症には成人期と児童青年期の2つのピークがあり、30%前後が10歳から15歳に集中するといわれている。子どもの強迫性障害は、大人と比較すると発達障害を併存する症例が多く、不合理感の低さや儀式化したこだわりが多いことから、一般に治療が困難と考えられている。また、その治療の中核は認知行動療法の心理教育にあるが、本邦では、有用性が確認され広く一般に使用される、子ども向けの強迫性障害の心理教育資料が存在しない。そこで本研究は、臨床現場のインタビューをもとに心理教育のポイントをまとめ、特に発達障害を併存する症例の特徴を考慮し、子どもの強迫性障害の心理教育の教材を開発する。本年度は、本研究と並行して実施している子どもの強迫性障害に対する認知行動療法の臨床研究の中で、現行の心理教育資料(原案)について治療者と研究参加者の意見を収集しながら改訂を重ねている。平成27年度は、児童OCD患者14名に対して研究参加のアセスメント面接が実施され。そのうち5名が臨床研究の除外基準に該当し、9名がエントリーされた。9名のうち2名が、DSMにより自閉症スペクトラム(Autism Spectrum Disorder)と診断された。2名が治療から脱落し、平成27年度末時点で7名が治療継続中である。子どもの強迫性障害の臨床研究にエントリー後、併存疾患等の問題で治療に参加できない被験者も多く、インタビュー可能な症例数はやや不足している。治療に参加した被験者はCYBOCS(Child Yale-Brown Obsessive-Compulsive Scale)の得点が治療前後で平均37%改善しており、症状改善後に治療を振り返ることで、心理教育の効果や分かりやすさのポイントをおおむね順調に収集できてはいる。強迫性障害(Obsessive-compulsive disorder;OCD)とは、本人の意志とは無関係に繰り返し頭に浮かび不快感を生じさせる強迫観念と、その強迫観念を振り払うために繰り返し行われる強迫行為からなる(American Psychiatric Association, 1994)。本年度は、現行使用している子どもの強迫性障害の理解のための心理教育資料原案について、臨床心理士・医師を中心とする治療者と治療対象である研究参加者との意見を収集し改定を重ねたものについて、教育資料の作成経験が豊富である出版社に編集を依頼し漫画化した資料を作成した。今後は、作成した心理教育の視覚刺激が強迫性障害の心理教育の理解と治療の動機づけに与える効果を、質問紙調査により検討していく予定でいる。イラストレーターによるネームを治療者側がチェックしながら添削しているため、最終的な質問紙の完成にはやや遅れがみられる。

強迫性障害(Obsessive-compulsive disorder;OCD)とは、本人の意志とは無関係に繰り返し頭に浮かび不快感を生じさせる強迫観念と、その強迫観念を振り払うために繰り返し行われる強迫行為からなる(American Psychiatric Association, 1994)。発症には成人期と児童青年期の2つのピークがあり、30%前後が10歳から15歳に集中するといわれている。子どもの強迫性障害は、大人と比較すると発達障害を併存する症例が多く、不合理感の低さや儀式化したこだわりが多いことから、一般に治療が困難と考えられている。また、子どもでは大人以上に本人や家族の服薬への心理的抵抗が高いことが多く、その治療の中核は認知行動療法の心理教育になるが、本邦では、有用性が確認され広く一般に使用される、子ども向けの強迫性障害の心理教育資料が存在しない。そこで本研究は、臨床現場のインタビューをもとに心理教育のポイントをまとめ、特に発達障害を併存する症例の特徴を考慮し、子ども向けに理解しやすい強迫性障害の心理教育の教材を開発する。これまでは、強迫性障害の臨床研究において使用してきた子どもの強迫性障害の理解のための心理教育資料について教育資料の作成経験が豊富である出版社に編集を依頼し40頁の心理教育を目的とする漫画を作成した。本年度はこれらについて臨床心理士・医師らが臨床で実際に使用しながらクライエントの意見を取り入れ、資料の改定を続行している。今後は、作成した心理教育の視覚刺激が強迫性障害の理解と治療動機に与える効果を、質問紙調査により検討していく予定でいる。研究代表者の2度の体調不良により、最終的な質問紙の完成および研究の実施が遅れている。強迫性障害(Obsessive-Compulsive Disorder;OCD)とは、意思とは無関係に繰り返し頭に浮かび不安を生じさせる強迫観念と、強迫観念を振り払うために繰り返し行われる強迫行為からなる疾患である。平均発症年齢は19.5歳であり、近年は自閉スペクトラム症(Autism Spectrum Disorder;ASD)など発達障害との関連も示唆されている。本研究では、若年層や自閉スペクトラム傾向の高い方向けの漫画の心理教育を作成し、漫画による心理教育が疾患の理解とモチベーションに及ぼす効果を検証した。大学生56名を対象に調査研究を実施した。まず強迫性障害の治療について描いた漫画を、子どもの臨床を元に精神科医2名・臨床心理士2名で校正して作成し、実験刺激として使用した。比較する統制刺激としては一般的な大人のOCD治療で心理教育として用いられる飯倉(1999)による「強迫性障害の治療ガイド」から引用し、テキストでの心理教育の例として使用した。二つの心理教育資料は、1.強迫性障害の症状、2.強迫観念と強迫行為の悪循環、3.回避の悪循環、4.不安階層表の作り方、5. ERPのやり方や心構え、6.治療経過の紹介、などが共通項として構成されている。また、自閉スペクトラム傾向を若林(2016)による日本語版自閉症スペクトラム指数(Autism-Spectrum Quotient, AQ)50項目にて測定し、刺激との関連を検討した。刺激の違いとAQ高低による分散分析の結果、AQ高群はテキストよりも漫画の方が心理教育を理解しやすいと示された。
凍結保存せる膵ランゲルハンス氏島を用いた糖尿病の治療法に関する研究

膵より分離した膵ランゲルハンス島(以下ラ島)を凍結保存し、ラ島のviabilityをin virtoおよびin vivoで検討した。実験動物はwistar系雄ラットを使用した。ラット膵からコラゲナ-ゼ消化法とFicoll濃度勾配遠沈法によりラ島を分離、純化し、単離ラ島とした。ラ島凍結には凍害防止剤としてDimethylsulfoxideを用い、冷却速度0.25°C/minの緩徐凍結と、25°C/minの急速凍結を行った。ともに-40°Cまで冷却し、-196°Cの液体窒素中に保存した。解凍は急速解凍を行い、解凍後24時間の培養を加えた。In vitroのviabilityの評価はラ島灌流法を用い冷却速度などの諸条件がラ島の動態的インスリン分泌反応に及ぼす影響を検討した。さらに凍結保存ラ島の門脈内同種移植を行い、移植4週後に施行した経静脈的負荷試験(以下in GTT)と移植ラ島の組織学的検討によりin vivoでのviabilityを評価した。成績は以下のごとくであった。1)コラゲナ-ゼによる消化後のラ島数は594.3±103.7個/匹であり、Ficollを用いたラ島純化後のラ島数は509.1±79.7個/匹で、回収率は85.5±3.5%であった。2)新鮮分離ラ島はラ島灌流法にて2相性のインスリン分泌反応を示した。3)凍結保存ラ島は、解凍後に培養を加えることにより、新鮮ラ島に比し分泌量は低いもののインスリン分泌反応の改善がみられ、viabilityを良好に保ち得た。4)急速凍結法では緩徐凍結法に比し分泌量は低い傾向にあったが、緩徐凍結方とほぼ同様の分泌反応を示した。5)凍結保存ラ島の同種移植により、糖尿病ラットは正常血糖に復し、in GTTにてK値1.49%/minと良好な値を示し、組織学的検索でも生着が確認された。雑種成犬を用いて,全麻下に膵を剔出し,コラゲナーゼを作用させて膵ランゲルハンス氏島(以下膵ラ氏島)を分離,組織培養後に凍結保存した.各プロセスごとに実体顕微鏡による形態学的観察,ならびに培養液中にglucoseを添加し,インスリン分泌量を測定するviability試験を行い,イヌ膵ラ氏島の分離,凍結前培養,凍結法について,至適條件を検討した.現在までにえられた知見は以下のごとくである.1分離法:膵間質内の強固な線維成分を消化し,しかも膵ラ氏島への障害を可及的軽減するためにコラゲナーゼの濃度,作用温度,作用時間を検討した結果,至適條件は(1)コラゲナーゼの濃度を6mg/ml,(2)作用温度39°C,(3)作用時間24分であった.さらに,コラゲナーゼ作用期間中は振盪を加え,作用時間経過後は急冷し,細切,遠心する方法が有効であった.2凍結前培養法:分離に際して損傷された膵ラ氏島被膜を組織培養によって修復した後,凍結保存したが,至適培養條件はりRPMl1640倍地に10%牛胎児血清を添加, 2)CO_25%,air95%,3)37°C,4)48時間であった.3凍結法:膵ラ氏島浮遊液1mlに対して, DMSO10%,牛胎児血清10%を加えたHanks'buffer salt solution

10mlを加え20分放置,ついでプログラムフリーザーで10°Cまでは2°C/min,以後-5°Cまで1°C/minで冷却,ここで60秒間植永操作を加え,以後-80°Cまで冷却し, -196°Cの液体窒素中に保存した.解凍後,組織培養し, glucose添加によるインスリン分泌能をみた結果は,インスリン分泌能は保持されていた.糖尿病犬に自家移植し,糖負荷に対する血糖の椎移をみたところ糖尿病パターンの改善がみられた.〔方法〕1)イヌより膵を全剔し、膵よりランゲルハンス氏島を分離し、2日間培養後、プログラムフリーザーを用いて凍結し、1週間保存後、解凍して再びイヌに自家移植し、糖負荷時の血糖及びインスリンを測定した。2)ラットより膵を剔出し、これを用いてラ氏島の分離法に改良を加え、比重法を応用した精製法を試みた。3)分離した膵ラ氏島のviabilityをin vitroで確認する目的で、perifusion手技を導入し、ラ氏島を潅流する培養液中の糖濃度を変化させた場合のインスリン分泌量を定量する方法を検討した。〔成績〕1)実験犬13頭中、空腹時血糖値が150mg/dl以下の著効な3頭、150250mg/dlの有効は4頭で、これら2群を合計した有効以上頭数は53.8%であった。glucose負荷試験におけるK値は著効2.01%/min,有効1.21%/minであった。(福島医誌に本多正久発表予定)2)従来の方法を改良し、機械的操作を可及的省略し、温colagenaseの潅流による消化を強化し、比重法による精製手技を加えることによって、ラット1匹あたりの収量を200300個から800個に増加させることができた。3)perifusion法により分離、培養したラ氏島のviabilityを確認した結果、viabilityを有するラ氏島はglucose負荷によってinsulin分泌が増加し、glucose負荷の終了とともに、負荷前値に戻り、再度のglucose負荷により再びinsulin値の上昇を示す、いわゆる二峯性の分泌曲線を示した。viabilityの確認法として極めて優れた方法であると考えられた。(膵移植談話会にて亀田俊夫発表)膵より分離した膵ランゲルハンス島(以下ラ島)を凍結保存し、ラ島のviabilityをin vitroおよびin vivoで検討した。実験動物はwistar系雄ラットを使用した。ラット膵からコラゲナ-ゼ消化法とFicoll濃度勾配遠沈法によりラ島を分離、純化し、単離ラ島とした。ラ島の凍結には凍害防止剤としてDimethylsulfoxideを用い、冷却速度0.25°C/minの緩徐凍結と、25°C/minの急速凍結を行った。ともに-40°Cまで冷却し-196°Cの液体窒素中に保存した。解凍は急速解凍を行い,解凍後24時間の培養を加えた。in vitroのviabilityの評価はラ島灌流法を用い、冷却速度などの諸条件がラ島の動態的インスリン分泌反応に及ぼす影響を検討した。さらに凍結保存ラ島の門脈内同種移植を行い、移植4週後に施行した経静脈的糖負荷試験(以下iVGTT)と移植ラ島の組織学的検討によりin vivoでのviabilityを評価した。成績は以下のごとくであった。1)コラゲラ-ゼによる消化後のラ島数は594.3±103.7個/匹であり、Ficollを用いたラ島純化強のラ島数は509.1±79.7個/匹で、回収率は85.5±3.5%であった。2)新鮮分離ラ島はラ島灌流法にて2相性のインスリン分泌反応を示した。3)凍結保存ラ島は、解凍後に培養を加えることにより、新鮮ラ島に比し