hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
被災地の小児がん患者と家族が経験する重層的なトランジションを支える看護のあり方

「トランジション」「看護学」をキーワードに、4領域の研究を実施し成果を得た。1.東日本大震災を経験した地域に暮らす小児がん患者と家族から半年ごとに継続的にお話を伺い、家族のトラウマからの回復のトランジションを明らかにした。2.臨床のスタッフとともに、小児慢性疾患経験者の成人移行期支援プログラム等、発達のトランジションに関わる3本のプログラム開発を行い、評価研究を実施中である。3.一般児童生徒への小児がん啓発プログラムを開発・実施し、評価を行った。(復学のトランジションを支える体制)4.JCCGとの共同研究とともに、小児がん患者や乳がん患者の家族のQOLを明らかにした。(治療期のトランジション)1) 2014年5月、面接調査事前研修として、上別府による「小児がん患者・家族の心理」の講義およびロールプレイを東北地方の1医療施設にて実施した。その後、同院にて調査を開始。同月、東北地方2施設目にて「研究実施プロセスに関する会議」を東大の研究者を含めて12名により実施し、リクルート手順を確認し今後の実施予定等を審議した。家族面接は4家族に対して計8回、計画通り実施された。面接後、参加者に不安等の有害事象は見られていない。2)東京大学医学部附属病院との協働で、小児がん患者の復学支援、造血幹細胞移植患者の長期フォローアップ、先天性心疾患患者の成人診療科への移行に関する研究を実施している。小児がん患者の復学支援に関しては、小児専門看護師や院内学級教員と共に、医療者と院内学級教員向けの各復学支援マニュアルを検討した。造血幹細胞移植患者の長期フォローアップと先天性心疾患患者の成人診療科への移行に関する研究では、小児専門看護師や医師と共に、専門外来の開設準備や人員の確保を行い、研究を実施する体制を整備した。3)がんの子どもを守る会のソーシャルワーカーと協力し、「教育支援に関するガイドライン」の見直しを行った。4)日本小児白血病リンパ腫研究グループとの協働で、B前駆細胞性急性リンパ性白血病(ALL-B12)、T細胞性急性リンパ性白血病(ALL-T11)、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病(ALL-Ph13)の臨床試験におけるQuality of Life(QOL)評価を目的とした質問紙調査を実施している。今後、新たに実施するQOL調査に対応するため、新たにQOL調査の経験を有する人員1名を補充した。また2015年3月に、医療者や研究者、学生等を対象としたQOL研究セミナー「患者家族の生活の質QOLを高めるための研究と実践」を行い、QOLの普及・啓発を行った。(1)TTCCP研究:東京大学、東北大学、宮城県立こども病院の協働による小児がん経験者と家族への面接調査を実施。7月に宮城県立こども病院にて中間ミーティングを行い、各施設の責任者および面接担当者が現状報告、レクチャーと面接の研修を実施した。9月には新たに参加する面接者の研修を実施した。(2)東大病院との連携研究:東京大学医学部付属病院と共同し、小児慢性疾患患者の成人移行期支援外来設立に向けた小児科医師76名、全看護師1253名を対象に意識調査を実施。また、同施設の造血幹細胞移植後フォローアップ外来で使用する外来問診票の作成・評価・改訂、更に、入院患児に対する復学支援チェックリストの作成も行った。(3)児童生徒への小児がん教育研究:小児がんの啓発を目的とした授業を小学校1校で行い、授業前後で、小児がんやその患者・経験者の知識の増加、および小児がん患者・経験者との交流に対する意欲の向上が見られ、授業は小児がん啓発における十分な効果があった。また保護者を対象に小児がん啓発に関する授業のニーズを収集した。(4)QOLセンターでの研究:前年度から継続し、日本小児白血病リンパ腫研究グループ(JPLSG)との共同研究4件(ALL-B12、ALL-T11、ALL-Ph13、IntReALL)を実施。寛解導入療法時のQOLに対する自己評価と保護者評価の相違と、親の付き添いとの関連を明らかにした。新たに臨床試験下における子どもの心身の状態やQOLに関する研究を2件(ALB-NHL13、STKI14)開始した。(5)その他:1造血幹細胞移植を受ける子どもの両親を対象に、移植前後における心理的苦痛に関する縦断的調査を、3施設にて実施中。2乳がんの手術を受けた女性の親に対する支援構築を目的とし、手術を受けた乳がん患者とその親を対象に心理的問題に関する横断調査を、平成27年度9月より4施設にて実施中。(3)について研究者側の予期できなかった事態により、授業の実施時期が遅れたものの、その後は順調に進展している。今年度、新たに研究協力者を募って、継続し、分析、成果をまとめていく予定である。(5)については、12とも、着手は早かったものの、研究施設の倫理委員会の承認に時間が予想以上にかかったり、対象適格者のリクルートが予想以上に進まなかったりしたため、調査期間を延長して継続中である。(1)(2)(4)は順調に進捗している。研究目的14に対応して研究を遂行した。【目的1】東北大学病院および宮城県立こども病院において面接を継続し、7例にのべ12回の面接を実施した。1例目の家族へは予定していた全6回の面接を完了した。全例の1回目面接を質的に分析し、二度の外傷体験を経験した家族において、一度目の体験の際に家族の凝集性を増した場合には、それが二度目の体験における奮闘の糧となっていることを明らかにした。【目的2】

1復学支援チームで作成した入院早期から退院後の経時的な「復学スケジュール」用紙を用い、復学支援を実施した。「復学スケジュール」導入前に復学した家族4例に面接調査を行いスケジュール内容を評価した。2造血幹細胞移植後フォローアップ外来を継続し、外来運営プロセスの分析から、評価指標やパンフレットの改訂を行った。また問診票の分析から、慢性GVHDが影響するQOLの側面を明らかにした。3医師・看護師の意識調査は投稿中である。小児科外来において小児慢性疾患を有する思春期患者を対象に成人移行期外来を開設、受診した15名の症例を通し移行期支援の有効性を評価した。【目的3】小児がんの啓発を目的とした授業を茨城県の高校生412名、群馬県の小学生37名に実施した。児童生徒における小児がんに関する知識は授業後概ね向上したが、学習の遅れに関する知識は向上しなかった。また、児童生徒における小児がん患者との交流への関心は授業後高まったが、授業後1ヶ月まで維持できなかった。このため、学習の遅れに関する内容の工夫、小児がん患者への関心を長期的に向上する授業形式の検討が必要である。【目的4】日本小児がん研究グループ(JCCG)臨床試験におけるQOL研究を継続した。新たに慢性骨髄性白血病への臨床試験におけるQOL研究を計画した。造血幹細胞移植を受ける両親の不安や抑うつを予測する移植前の要因は、父母間で異なることが明らかとなった。「トランジション」「看護学」をキーワードに、4領域の研究を実施し成果を得た。1.東日本大震災を経験した地域に暮らす小児がん患者と家族から半年ごとに継続的にお話を伺い、家族のトラウマからの回復のトランジションを明らかにした。2.臨床のスタッフとともに、小児慢性疾患経験者の成人移行期支援プログラム等、発達のトランジションに関わる3本のプログラム開発を行い、評価研究を実施中である。3.一般児童生徒への小児がん啓発プログラムを開発・実施し、評価を行った。(復学のトランジションを支える体制)4.JCCGとの共同研究とともに、小児がん患者や乳がん患者の家族のQOLを明らかにした。(治療期のトランジション)おおむね順調であるが、東北地方2施設目における調査開始が遅れている。(1)TTCCP研究:平成27年度に引き続き、宮城県立こども病院および東北大学にて、現地の面接者と東京大学の面接者の協働による面接調査を継続する。小児がんと東日本大震災を経験されたご家族のさまざまな体験を明らかにしてその変化の軌跡を追い、新たな知見を見出し今後の支援に役立てるよう研究を進める。(2)東大病院との連携研究:小児慢性疾患患者の成人移行期支援外来を設立し、支援プログラムの評価と医療者への研修プログラム開発・評価を行う。また、造血幹細胞移植後フォローアップ外来設立後1年間の受診経過・指導内容のまとめ・評価を行う。小児がん患児の復学支援チェックリストに関しては、医療者と利用者双方の視点から評価・改訂を行う。(3)学校児童生徒への小児がん教育研究:平成28年度は、昨年度の授業の結果や保護者のニーズを踏まえた上で、授業を修正し、小・中・高等学校の各1校で小児がんの啓発に関する授業を引き続き行う。
Barrett上皮の癌化における硫酸化糖鎖の意義とこれを応用した血清診断の開発

Barrett(B)上皮をその長さによりshort,middle,long-segmentに分類し大腸型ムチン,小腸型ムチン,胃型ムチン,p53,マトリライシンの発現を調べ,これをB腺癌8例と比較した.なお大腸型ムチンは硫酸化糖鎖SO3-Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcを,小腸型ムチンはシアル酸化糖鎖NANA-GalNAcを,胃型ムチンはMUC5ACならびにMUC6を指標とした.1.胃萎縮および逆流性食道炎の重症度上部消化管内視鏡検査でshort Bは12.6%,middle Bは2.5%long Bは0.6%に見られ,これらの症例は有意に胃の萎縮が軽度で裂孔ヘルニアの合併ならびに逆流性食道炎の合併頻度が高かった.2.B上皮のムチンコア蛋白ならびに糖鎖の発現:short Bでは胃型は93.3%に発現していたが大腸型ムチンならびに小腸型ムチンは18.8%,25.0%と低くかった.long Bでは逆に胃型は33.3%で大腸型ムチンならびに小腸型ムチンは91.7%,66.7%と高頻度に発現が見られた.middle Bは両者の中間的な発現を示した.3.B癌におけるムチンコア蛋白,ムチン糖鎖,p53ならびにマトリライシンの発現:B癌での大腸型,小腸型,胃型の発現はそれぞれ100%,50%,25%であった.p53はB癌全例でover expressionを示し,マトリライシンはB癌の60%に検出され,特にその浸潤先進部に陽性であった.新鮮切除標本の得られた1例での検討ではカゼインザイモグラプィーによりMatrilysinの移動度から活性型matrilysinの占める割合が多かった.B癌に隣接するB上皮は全て大腸型ムチンを強発現した.4.B癌とB上皮に特異的な大腸型ムチンのcore peptideを検出すべく免疫組織染色,Enzymeimmunoassay法を行った。小腸型ムチンシアル酸化糖鎖NANA-GalNAcとMUC2抗体の染色は一致し,Sialomucin分画には抗MUC2抗体が結合した。大腸型ムチン硫酸化糖鎖SO3-Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcならびにsulfomucin分画にはMUC1,MUC2,MUC3,MUC5AC,MUC6ならびにA3D4に対する抗体では反応性は認められなかった.以上よりB上皮はshort→middle→longと長さの伸長に伴いムチンコア蛋白おょびムチン糖鎖のintestinalizationがおき,B癌ではこの傾向が一層顕著となることが認められた.またmicrosatellite instabilityを合わせて検討したがMSHは認められず,P53陽性頻度から考えるとB癌はintestinal typeの癌ではあるがDNA repairの異常による発癌経路とは異なるmecha-nismで発癌すると考えられた.内視鏡的な検討からは胃の萎縮性変化が軽度であり裂孔ヘルニアや逆流性食道炎の合併率の高さから胃酸の逆流が関連していると思われ,middleないしshort Bの頻度も決して無視できるものではなく,この部分のintestinalizationを内視鏡でgastric phenotype Bから鑑別し狙撃生検をすることはmetaplasiaさらにはdysplasiaを早期に発見しうる点で有用と思われ,今後は拡大内視鏡によるB上皮のphenotype分類を行う必要があろう.また酸逆流の抑制がB上皮のphenotypeの変化をもたらすのか否かもB癌のchemopreventionの面から興味深い。Barrett(B)上皮をその長さによりshort,middle,long-segmentに分類し大腸型ムチン,小腸型ムチン,胃型ムチン,p53,マトリライシンの発現を調べ,これをB腺癌8例と比較した.なお大腸型ムチンは硫酸化糖鎖SO3-Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcを,小腸型ムチンはシアル酸化糖鎖NANA-GalNAcを,胃型ムチンはMUC5ACならびにMUC6を指標とした.1.胃萎縮および逆流性食道炎の重症度上部消化管内視鏡検査でshort Bは12.6%,middle Bは2.5%long Bは0.6%に見られ,これらの症例は有意に胃の萎縮が軽度で裂孔ヘルニアの合併ならびに逆流性食道炎の合併頻度が高かった.2.B上皮のムチンコア蛋白ならびに糖鎖の発現:short Bでは胃型は93.3%に発現していたが大腸型ムチンならびに小腸型ムチンは18.8%,25.0%と低くかった.long Bでは逆に胃型は33.3%で大腸型ムチンならびに小腸型ムチンは91.7%,66.7%と高頻度に発現が見られた.middle Bは両者の中間的な発現を示した.3.B癌におけるムチンコア蛋白,ムチン糖鎖,p53ならびにマトリライシンの発現:B癌での大腸型,小腸型,胃型の発現はそれぞれ100%,50%,25%であった.p53はB癌全例でover expressionを示し,マトリライシンはB癌の60%に検出され,特にその浸潤先進部に陽性であった.新鮮切除標本の得られた1例での検討ではカゼインザイモグラプィーによりMatrilysinの移動度から活性型matrilysinの占める割合が多かった.B癌に隣接するB上皮は全て大腸型ムチンを強発現した.4.B

癌とB上皮に特異的な大腸型ムチンのcore peptideを検出すべく免疫組織染色,Enzymeimmunoassay法を行った。小腸型ムチンシアル酸化糖鎖NANA-GalNAcとMUC2抗体の染色は一致し,Sialomucin分画には抗MUC2抗体が結合した。大腸型ムチン硫酸化糖鎖SO3-Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcならびにsulfomucin分画にはMUC1,MUC2,MUC3,MUC5AC,MUC6ならびにA3D4に対する抗体では反応性は認められなかった.以上よりB上皮はshort→middle→longと長さの伸長に伴いムチンコア蛋白おょびムチン糖鎖のintestinalizationがおき,B癌ではこの傾向が一層顕著となることが認められた.またmicrosatellite instabilityを合わせて検討したがMSHは認められず,P53陽性頻度から考えるとB癌はintestinal typeの癌ではあるがDNA repairの異常による発癌経路とは異なるmecha-nismで発癌すると考えられた.内視鏡的な検討からは胃の萎縮性変化が軽度であり裂孔ヘルニアや逆流性食道炎の合併率の高さから胃酸の逆流が関連していると思われ,middleないしshort Bの頻度も決して無視できるものではなく,この部分のintestinalizationを内視鏡でgastric phenotype Bから鑑別し狙撃生検をすることはmetaplasiaさらにはdysplasiaを早期に発見しうる点で有用と思われ,今後は拡大内視鏡によるB上皮のphenotype分類を行う必要があろう.また酸逆流の抑制がB上皮のphenotypeの変化をもたらすのか否かもB癌のchemopreventionの面から興味深い。Barrett上皮をその長さによりshort-,middle-,long-segment Barrettに分類し大腸型ムチン,小腸型ムチン,胃型ムチン,p53,マトリライシンの発現を調べ、これをBarrett腺癌と比較した.なお大腸型ムチンは硫酸化糖鎖SO_3-Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcを,小腸型ムチンはシアル酸化糖鎖NANA-GalNAcを,胃型ムチンはMUC5ACならびにMUC6を指標とした.1.胃萎縮および逆流性食道炎の重症度shortは12.6%,middleは2.5%,long Barrettは0.6%に見られ,これらは有意に胃の萎縮が軽度で裂孔ヘルニアの合併ならびに逆流性食道炎の合併頻度が高かった.2.Barrett上皮のムチンコア蛋白ならびに糖鎖の発現short segment BarrettではMUC5ACならびにMUC6は93.3%,93.8%に発現していたが大腸型ムチンならびに小腸型ムチンは18.8%,25.0%と低くかった.long segment Barrettでは逆にMUC5ACならびにMUC6は33.3%,33.3%で大腸型ムチンならびに小腸型ムチンは91.7%,66.7%と高頻度に発現が見られた.middle segment Barrettは両者の中間的な発現を示した.3.Barrett癌におけるムチンコア蛋白,ムチン糖鎖,p53ならびにマトリライシンの発現Barrett癌での大腸型ムチン,小腸型ムチン,MUC5AC,MUC6の発現はそれぞれ100%,50%,25%,12.5%であった.p53はBarrett癌全例でover expressionを示し,Barrett上皮の中でもdysplasiaに相当する部分でfocalに陽性であった.
統計科学における最適化法の研究

研究成果は以下の通りである。半正定値計画問題に対する主双対内点法について研究した.主双対内点法では,2つの正定対称行列XとSを変数として,元の最適化問題を方程式XS=0の解を求める問題として定式化し,これを解くために,XS=νI(νはパラメータ)として定義される中心曲線を離散的に追跡する.我々は,中心曲線を同値な方程式X^<1/2>SX^<1/2>=νIの解として定式化し,これに対してNewton法を適用する方法を提案し,その多項式性を証明した.この問題は,多変数正規分布の最尤推定などとも関係が深く,統計学への応用が期待されている.線形計画問題min{c^Tx|Ax=b,x【greater than or equal】0}に対する計算複雑度が係数行列Aのみに依存する多項式内点法について研究し,これまで得られている最良のアルゴリズムである,VavasisとYeのアルゴリズムを改良することに成功した.彼らのアルゴリズムは,探索方向を計算する上で,事前にX_Aなる係数行列Aのデータから計算される定数を必要とした.この定数の計算は容易ではなく,これがアルゴリズムを実用化する上で問題となった.我々は,この定数を計算しなくても同様のアルゴリズムが構成可能であることを示した.今回はアルゴリズムを中心に研究を展開したが,今後は応用にも力点をおいて研究を進めたい.研究成果は以下の通りである。半正定値計画問題に対する主双対内点法について研究した.主双対内点法では,2つの正定対称行列XとSを変数として,元の最適化問題を方程式XS=0の解を求める問題として定式化し,これを解くために,XS=νI(νはパラメータ)として定義される中心曲線を離散的に追跡する.我々は,中心曲線を同値な方程式X^<1/2>SX^<1/2>=νIの解として定式化し,これに対してNewton法を適用する方法を提案し,その多項式性を証明した.この問題は,多変数正規分布の最尤推定などとも関係が深く,統計学への応用が期待されている.線形計画問題min{c^Tx|Ax=b,x【greater than or equal】0}に対する計算複雑度が係数行列Aのみに依存する多項式内点法について研究し,これまで得られている最良のアルゴリズムである,VavasisとYeのアルゴリズムを改良することに成功した.彼らのアルゴリズムは,探索方向を計算する上で,事前にX_Aなる係数行列Aのデータから計算される定数を必要とした.この定数の計算は容易ではなく,これがアルゴリズムを実用化する上で問題となった.我々は,この定数を計算しなくても同様のアルゴリズムが構成可能であることを示した.今回はアルゴリズムを中心に研究を展開したが,今後は応用にも力点をおいて研究を進めたい.
ヒト赤血球プロテインホスファターゼ2Aの活性制御に関する研究

ヒト赤血球可溶画分よりサブユニット構造の異なる4種のオプロテインホスファターゼ2A(PP2A):α_1β_1,α'_1β'_1,α_1β_1γ_1,α_1β_1δ_1を分離精製した。αとα'(34kDa)は触媒サブユニットでβとβ'(63kDa),γ(53kDa),δ(74kDa)は調節サブユニットである。α'_1β'_1はMn^<2+>依存性PP2Aであり,α'とα,β'とβはそれぞれ蛋白化学的に区別出来ない。α_1β_1は2価金属イオンが無くとも活性があり,Mg^<2+>またはMn^<2+>によって活性化を受けるが,α'_1β'_1は完全にMn^<2+>依存性でMg^<2+>のみでほとんど活性がない。この性質の違いはαとα'の違いによる。一方,δをリビ・アジュバンドシステムを用いてマウスの腹腔に投与し,δに特異的な抗体を得た。この抗体と反応する蛋白質のラットにおける組織分布をウエスタンブロット法で検討した。その結果,赤血球,脳,心臓,肺,副腎,精巣の可溶画分に単一の70kDa抗体反応蛋白質を認めた。特に含量の多い脳可溶画分よりこの蛋白質を精製した。この蛋白質は,ヒト赤血球α_1β_1δ_1と類似のサブユニット構造を持つ分子量約16万のPP2Aの調節サブユニットであることが判明した。したがってラットでは74KDaδに相当する70kDa調節サブユニットが赤血球のほかに脳に多く分布することがわかった。他方,すでに決定したδの部分アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを作成し,HeLa細胞より合成したcDNAを鋳型としてPCR法でδをコードする0.5kbのcDNA断片を単離した。この断片をプローブとしてヒト大脳由来のλZAPcDNAライブラリー30万クローンをスクリーニングして6個の陽性クローンを単離した。このうちδの全長をコードすると思われる2.9kbのインサートを有するクローンよりその塩基配列を決定した。これから明らかになったδの一次構造は,他のサブユニットの一次構造との類似性が乏しく,δが独自の機能を有するものと想像された。
神経細胞の移動終了過程の解析

近年、分子の網羅的な探索にはアフィメトリクス社のGeneChipがよく利用されているが、その後のin situ hybridizationによるスクリーニングや機能解析には個々の因子を個別にクローニングする必要があり、多大な労力を必要とする。そこで我々は、独自にPerl Scriptプログラムを作成して、個々のGeneChipクローンを、60,770クローンのマウス全長cDNAライブラリーである理研FANTOMクローンに対し対応付けを行った。その結果、従来アフィメトリクス社で48.3%のクローンに対してしか注釈付けされていなかったGene Symbolを76.9%のクローンに対して注釈付けすることができた。さらに、そのアミノ酸配列の物理化学的な性質に基づき、分泌因子及び膜貫通分子の選別を行い、その選別の精度が既知の論文データとの比較により88.6%と判定された(投稿中)。この系を用いて、大脳皮質脳室帯で発現し、皮質板側で発現していない分泌因子及び細胞表面因子として426クローンが得られ、in situ hybridization法によるさらなる絞り込みの結果、脳室帯特異的な分泌因子及び細胞表面因子として88クローンを同定した。さらに、同定したクローンの1つであるS1P1に着目し、S1P1を発現している脳室帯と、S1P1を発現していない中間帯及び皮質板とにおけるカドヘリン複合体の差異について検討した。その結果、大脳皮質神経細胞は移動を開始する領域である脳室下帯から中間帯にかけて、カドヘリン複合体を形成するα-cateninのタイプがαE-cateninからαN-catenin IIへとスイッチングすることが判明した。S1P1は大脳皮質形成期にαE-cateninの消失を抑制することで、αE-cateninからαN-catenin IIへのスイッチングを制御している可能性を考えている。大脳皮質神経細胞は、脳室に面した脳室帯(神経幹細胞の存在部位)で誕生し、脳表面側へと移動した後、6層からなる多層構造を形成する。この層形成機構の従来の研究は、移動終点部位から分泌されるリーリンによる制御を始め、移動細胞への外部からの制御機構を対象としたものが殆どであった。本研究では、神経細胞の最終配置が、移動細胞自身の脳室帯での誕生時にどの程度、また、どのように制御されるのかを解明することを目標としている。本年度は、まず、発生各時期の大脳皮質脳室帯を実体顕微鏡下で切り出して、RNAを調整し、発現レベルが時期によって大きく変動する遺伝子群を、DNA Chipを用いて検索した。その結果、発生初期に多く、次第に発現量が減少する分子群、発生中期に多く、初期や後期には少ない分子群、発生が進むにつれて発現量が増加する分子群の三種が、各々数十クローン見いだされた。これらのうち、特に胎生14日(細胞移動の制御機構が変化すると考えられている時期)の脳室帯に特異的に発現量が多い分子群に着目し、胎生14日生まれの神経細胞がその後脳表面へと移動開始後にも発現が保たれる分子群を検索することを試みた。予備実験として、胎生14日生まれの細胞がどの時期に中間帯を通過するかをラベル実験によって検討したところ、胎生16日頃であることが明らかになった。そこで、さらに、胎生16日の中間帯を実体顕微鏡下で切り出し、RNAを調整して、同様にDNA Chip解析を行い、胎生14日の脳室帯と、胎生16日の中間帯の両者で発現が多い分子群の検索を行った。これらの配列解析をさらに行い、シグナルペプチド、または、膜貫通領域を有すると推定される候補分子を中心に、cDNAを単離または入手して、in situ hybridizationによってその発現部位と変化を調べた。これまでに解析が終了したクローンのうち、興味深い発現プロファイルを示したものについて、さらに抗体を入手し、タンパク質レベルでの分布を検討中である。昨年度までに、大脳皮質神経細胞は、分散-再凝集培養系において、誕生時期依存的に特異的に凝集する傾向を有することが示唆された。これは、皮質表層側(inside-outでの配列を制御することが知られているリーリン分子の分泌・局在部位)を除く目的で、主に中間帯と脳室帯の細胞を切り出して行った実験であったが、リーリンのわずかな混入があった可能性は否定できなかった。そこで、今年度は、リーリンシグナルの伝達分子であり、移動細胞側で発現している、Dab1分子(欠損によって、リーリン欠損と同様の表現型の個体になる)の欠損マウスであるヨタリマウスを用いて、同様の分散-再凝集培養実験を行ったところ、上記の誕生時期依存的な細胞凝集傾向は同じように認められた。以上より、この性質は、確かに細胞の誕生時すなわち脳室帯内または移動中に既に獲得されている形質であって、脳表面のリーリンによる作用を必要としないと結論することができた。また、移動細胞の細胞間相互作用を担う分子が、カルシウム依存的な細胞接着分子であることが培養実験により示唆されたため、カドヘリンファミリーについて、その分布を検討した。その結果、脳室帯や皮質板に限らず、移動細胞が多く含まれる中間帯においても、N-カドヘリンが細胞膜に沿って局在していることを見いだした。この結果は、大脳皮質神経細胞移動においても、カドヘリンが重要な意義を有する可能性を示唆する。今後、カドヘリンのさらに下流分子の解析や培養における機能阻害を行い、機能的意義を明らかにしていく予定である。

近年、分子の網羅的な探索にはアフィメトリクス社のGeneChipがよく利用されているが、その後のin situ hybridizationによるスクリーニングや機能解析には個々の因子を個別にクローニングする必要があり、多大な労力を必要とする。そこで我々は、独自にPerl Scriptプログラムを作成して、個々のGeneChipクローンを、60,770クローンのマウス全長cDNAライブラリーである理研FANTOMクローンに対し対応付けを行った。その結果、従来アフィメトリクス社で48.3%のクローンに対してしか注釈付けされていなかったGene Symbolを76.9%のクローンに対して注釈付けすることができた。さらに、そのアミノ酸配列の物理化学的な性質に基づき、分泌因子及び膜貫通分子の選別を行い、その選別の精度が既知の論文データとの比較により88.6%と判定された(投稿中)。この系を用いて、大脳皮質脳室帯で発現し、皮質板側で発現していない分泌因子及び細胞表面因子として426クローンが得られ、in situ hybridization法によるさらなる絞り込みの結果、脳室帯特異的な分泌因子及び細胞表面因子として88クローンを同定した。さらに、同定したクローンの1つであるS1P1に着目し、S1P1を発現している脳室帯と、S1P1を発現していない中間帯及び皮質板とにおけるカドヘリン複合体の差異について検討した。その結果、大脳皮質神経細胞は移動を開始する領域である脳室下帯から中間帯にかけて、カドヘリン複合体を形成するα-cateninのタイプがαE-cateninからαN-catenin IIへとスイッチングすることが判明した。S1P1は大脳皮質形成期にαE-cateninの消失を抑制することで、αE-cateninからαN-catenin IIへのスイッチングを制御している可能性を考えている。
イネの分裂組織の維持と小穂形成に関する分子遺伝学的研究

胚発生後の植物の形態形成では,地上部はシュート頂,地下部は根端に存在するメリステムに依存した器官形成が行われる.シロイヌナズナではシュート頂,花序,花のメリステムの維持制御にCLAVATA(CLV)シグナル伝達経路が重要な役割を果たすことが知られている.私たちは,これまで,イネのメリステムの維持制御に関わる2つのFLORAL ORGAN NUMBER遺伝子(FON1,FON2)の解析を行ってきた.その結果,FON1はCLV1様のレセプターカイネースをコードしていること,FON2はCLEドメインをもつCLV3様のペプチド性シグナル分子をコードしていることを明らかにし,イネにおいても,CLVシグナル伝達経路が基本的には保存されていることを示してきた.その一方で,研究過程でイネに独自の制御系が存在していることも示唆された.今年度はFON2とFON2に類似したCLEタンパクであるFON2-LIKE CLE PROTE工N1(FCP1)の機能解析を行った.その結果,FON2は主に花メリステムの維持制御に関わるのに対して,FCP1はシュート頂と根端のメリステムの維持制御に関わることが明らかとなった.このように,イネでは異なる遺伝的経路の組み合わせによりメリステムが維持制御されていることが示された.また,FCP1の作用には,FON1は必要ないことも判明し,FCP1は独自のレセプターを必要とすることが示唆された.さらに,FCP1とFON2の作用の違いを決定する重要なアミノ酸を同定することに成功した.さらに,今年度はfon2変異のサプレッサーとして単離したFON2 SPARE(FOS2)遺伝子の機能解析も行った.その結果,FOS2はシュート頂,花,根端のメリステムの維持制御に関わることが明らかとなった.また,遺伝学的,生化学的な解析の結果,インディカのFOS2は機能型であるのに対して,ジャポニカのFOS2は変異型であることが示された.このFOS2の解析によって,栽培イネにおいてもメリステムの維持制御の遺伝的機構は多様化していることが示唆された.植物のシュートの頂端分裂組織や花分裂組織は葉や花などの側生器官の形成に重要である.シロイヌナズナではCLAVATA(CLV)シグナル伝達系によりメリステムの維持制御が行われていることが知られている.本研究は高等植物の分裂組織の制御の共通性・多様性を明らかにすることを大きな目標とし,具体的にはイネの分裂組織の維持の遺伝的制御機構を明らかにすることを目標としている.これまで,イネの2つのFLORAL ORGAN NUMBER遺伝子(FON1,FON2)の解析を行ってきた.その結果,イネにおいても,CLVシグナル伝達系が基本的には保存されているが,その一方で,イネに独自の制御系が存在していることも示唆された.今年度は,イネの分裂組織の維持制御に関わる新たな因子を単離し,その機能解析を行った.FON2遺伝子を単離する過程で,インディカのカサラスゲノムがジャポニカのfon2変異を抑圧する可能性が示唆された.そこでQTL解析を行い,主働遺伝子が座乗している領域から候補となる遺伝子を絞り込み,解析を行った結果,fon2変異の抑圧遺伝子を同定することに成功した.この遺伝子をFON2 SPARE(FOS2)遺伝子と命名した.FOS2はFON2と同様にCLE familyに属するペプチド性のシグナル分子であった.次にin situ hybridizationによる発現パターン解析や構成的遺伝子発現体の表現型解析など,FOS2の詳細な機能解析を行った.その結果,FOS2はイネの栄養成長の分裂組織の制御に関わっていることが明らかとなった.シロイヌナズナでは,CLVの単一なシグナル伝達経路によって地上部のすべての分裂組織が維持制御されている.それに対し,本研究により,イネのシュート頂,花序,花の分裂組織は異なるシグナル伝達経路のコンビネーションにより制御されていることが強く示唆された.胚発生後の植物の形態形成では,地上部はシュート頂,地下部は根端に存在するメリステムに依存した器官形成が行われる.シロイヌナズナではシュート頂,花序,花のメリステムの維持制御にCLAVATA(CLV)シグナル伝達経路が重要な役割を果たすことが知られている.私たちは,これまで,イネのメリステムの維持制御に関わる2つのFLORAL ORGAN NUMBER遺伝子(FON1,FON2)の解析を行ってきた.その結果,FON1はCLV1様のレセプターカイネースをコードしていること,FON2はCLEドメインをもつCLV3様のペプチド性シグナル分子をコードしていることを明らかにし,イネにおいても,CLVシグナル伝達経路が基本的には保存されていることを示してきた.その一方で,研究過程でイネに独自の制御系が存在していることも示唆された.今年度はFON2とFON2に類似したCLEタンパクであるFON2-LIKE CLE PROTE工N1(FCP1)の機能解析を行った.その結果,FON2は主に花メリステムの維持制御に関わるのに対して,FCP1はシュート頂と根端のメリステムの維持制御に関わることが明らかとなった.このように,イネでは異なる遺伝的経路の組み合わせによりメリステムが維持制御されていることが示された.また,FCP1の作用には,FON1は必要ないことも判明し,FCP1は独自のレセプターを必要とすることが示唆された.

さらに,FCP1とFON2の作用の違いを決定する重要なアミノ酸を同定することに成功した.さらに,今年度はfon2変異のサプレッサーとして単離したFON2 SPARE(FOS2)遺伝子の機能解析も行った.その結果,FOS2はシュート頂,花,根端のメリステムの維持制御に関わることが明らかとなった.また,遺伝学的,生化学的な解析の結果,インディカのFOS2は機能型であるのに対して,ジャポニカのFOS2は変異型であることが示された.このFOS2の解析によって,栽培イネにおいてもメリステムの維持制御の遺伝的機構は多様化していることが示唆された.
肺高血圧治療薬の併用が血中濃度推移に及ぼす影響ならびに機序の解明

本研究は、エンドセリン受容体拮抗薬とPDE-5阻害薬の相互作用が血中濃度に与える影響を明らかにすることで安全かつ有用性の高い併用療法を目指すことを目的として実施された。当初は単独療法から併用療法への切り替え時の血中濃度推移を中心に測定を行う予定であったが、該当する症例の集積が十分ではなかった。そのため、すでにこれらを併用中の症例や、今後併用療法に移行がする可能性のある症例における血中濃度についても測定対象を広げ検討を行った。その結果、本研究期間中、併用例11例、いずれか単剤の使用例を含めると21例の血中濃度測定を行うことができた。なお、実施を計画していたCYP分子種に関わる検討については、検討対象とすべき分子種の選定に至らなかったため実施していない。これまで併用の前後で血中濃度推移を小児肺高血圧症患者において比較検討した報告はなかったが、本研究によって1症例ではあるがtadalafil単剤からbosentan併用へと移行した際の比較検討を行うことができた。その結果、tadalafilのAUCがbosentan併用前に比べ併用後では低下しており、この症例においては、bosentan併用によるAUCの低下率は成人で報告のある値と同程度であることが示された。BosentanのAUCは成人に比べ小児において低値を示すことがBeghettiらによって報告されており、この症例におけるAUCも、成人におけるAUCより低かった。しかしながらこの症例においてtadalafilのAUCが成人と同程度の比率まで下がったことを考えると、小児肺高血圧症患者のbosentan併用時のtadalafi1血中濃度の推定のためには更なる測定結果の蓄積が必要であり、現段階でtadalafi1の適切な投与量設定を求めるためには、症例ごとに併用前後の血中濃度の確認を行うことが必要であると考えられた。
ランダムポリペプチドによる蛋白質の構造形成能の創出

本研究では、ランダム配列をもつポリペプチド(140アミノ酸残基)から実験室内進化を行った。140アミノ酸残基のポリペプチドには、20^<140>種類の可能な配列がある。この膨大な数のから、機能のあるタンパク質を進化させることは容易ではない。どれくらいの初期配列からスタートすれば、進化が可能であろうか?変異によって、ランダムなアミノ酸配列はその物性を変化するのだろうか?これらの問題に答えるために、任意に選んだたった10種類のランダム配列に対して、エステルの加水分解反応の遷移状態アナログ(CAII)に対して、親和性を調べた。その結果、10種類の中にも親和性や物性に関して十分な多様性があることがわかった。そこで、親和性の最も高い配列に対して変異と選択を繰り返した。この際、各世代の配列の数は10種類に限った。その結果、6世代目まで、親和性に関して十分な親和性の増加が見られた。精製して1、3,6世代目のタンパク質はエステルの加水分解活性をしめした。さらに、選択に用いたCAIIをいれると、進化実験で得られたポリペプチドの触媒活性は阻害された。このことは、何らかの活性部位がすでに形成されていることを示している、CAIIに対する親和性と触媒活性の活性化自由エネルギーの間には直線関係があることがわかった。これは、酵素活性の増加に関して遷移状態仮説が成り立っていることを示している。これらの結果より、たった10種類の任意の配列からでも、触媒機能が進化しうることがわかった。ファージライブラリーからの選択はランダム蛋白質がエステル結合加水分解反応の遷移状態アナログに吸着することで行った。酸素は化学反応の遷移状態を安定化することによって触媒機能を示す。よって、リン酸系の遷移状態アナログに対して高い親和性を持つランダム蛋白質は、エステルの加水分解反応の遷移状態を安定化し、触媒活性を示すことが期待される選択系の性質によって得られる結果が変化するかもしれないので、3つの方法を試してみた。1つはプレートに遷移状態アナログを固定する方法である。これは抗体酵素を取得する際に標準的に用いられている方法である。この際、遷移状態アナログのプレート表面密度が選択の重要な条件となるのでそれを検討した。2つ目の方法では遷移状態アナログを固定したアフィニティーカラムクロマトグラフィーである。この方法ではランダムポリペプチドと遷移状態アナログの結合解離が多段反応になるので、微妙な結合定数の差も検出可能となる。3つ目は磁性粒子を用いる。この場合、ビオチン化した遷移状態アナログとファージライブラリーを接触させ、アビジン結合磁性粒子によって吸着ファージを回収する。この方法は溶液反応なので、上記の2つの個体表面への吸着反応に比べ、親和力と選択性の対応関係がよりハッキリしていた。細かな条件設定は、すでに調製済みの遷移状態アナログに対する抗体酵素のファージディスプレーを用いて行った。多様なランダムポリペプチドを提示しているファージ集団に前年度確立した選択法を行った。そして、得られたファージ集団を大腸菌に感染させ増幅回収し、再び同様に選択を繰り返した。この操作で集団の多様性は失われる。そこで我々が開発したTthポリメラーゼをもちいたランダム変異法を行った。そして、多様性を再増幅した集団で再び選択を行った。変異と選択のサイクルによって、ランダムポリペプチドの遷移状態アナログに対する親和性が徐々に上がってくると考えられる。よって、各段階のファージ集団より全部で10クーロン程度をランダム蛋白質単独発現用のベクターにクローニングした。それらについて、すべて配列を決定した。その結果、変異率は1世代あたり2-3置換程度であることがわかった。さらに各クローンのアナログに対する親和性は世代が進むにつれて増加傾向にあることがわかった。つまり、人工的なタンパク質進化が進み始めたことがわかった。

この膨大な数の中から、機能のあるタンパク質を進化させることは容易ではない。どれくらいの初期配列からスタートすれば、進化が可能であろうか?変異によって、ランダムなアミノ酸配列はその物性を変化するのだろうか?これらの問題に答えるために、任意に選んだたった10種類のランダム配列に対して、エステルの加水分解反応の遷移状態アナログ(CAII)に対して、親和性を調べた。その結果、10種類の中にも親和性や物性に関して十分な多様性があることがわかった。そこで、親和性の最も高い配列に対して変異と選択を繰り返した。この際、各世代の配列の数は10種類に限った。その結果、6世代目まで、親和性に関して十分な親和性の増加が見られた。精製して1、3,6世代目のタンパク質はエステルの加水分解活性をしめした。さらに、選択に用いたCAIIをいれると、進化実験で得られたポリペプチドの触媒活性は阻害された。このことは、何らかの活性部位がすでに形成されていることを示している。CAIIに対する親和性と触媒活性の活性化自由エネルギーの間には直線関係があることがわかった。これは、酵素活性の増加に関して遷移状態仮説が成り立っていることを示している。これらの結果より、たった10種類の任意の配列からでも、触媒機能が進化しうることがわかった。さらに初期配列の数を1種類まで落として、進化実験を行った。より自然界に近い機能として、ファージの感染能を選んだ。この場合も7世代で240倍の感染能の増加が見られた。進化実験で得られた各世代の配列を決定した。
金属板材の温間プレス成形CAEを実現する応力-ひずみモデルの構築と成形限界予測

アルミニウム合金板5182-O材に引き続き,純アルミニウム板A1100-O材の温間引張試験,二軸引張試験を一部実施した.本材料はアルミニウム合金でみられる析出物による強化機構を無視できるため,母材本来の温間特性を調査することが目的である.試験の結果,A1100材はA5182材と比較してより低温域で顕著な温度とひずみ速度依存性を発現することを確認した.また,A5182材で見られた室温から100°C付近の動的ひずみ時効は発現しなかった.そのため,A5182材では予引張中には室温と100°Cの応力-ひずみ曲線にほとんど差異がないにもかかわらず,室温ではほとんど見られない応力緩和が100°Cで顕著であった.しかし,A1100材でこの傾向は見られず合金材特有の挙動であることを確認した.また,温間二軸引張試験ではA5182材とA1100材に大きな差異は見られなかった.一方SUS304の二軸バルジ試験は試験装置をほぼ完成した.試験の結果,単軸引張圧縮で得られた知見の通り,二軸変形であっても相当応力で加工誘起したマルテンサイト量をほぼ定量的に予測することができた.また,母相であるオーステナイトの等塑性仕事面の表現には,単純なvon MisesやHillの2次式では精度が不十分であり,これらから相当応力を求めてマルテンサイト量との関係を調査すると応力比ごとにばらつきが大きくなった.一方,高精度なYLD2000-2dや6次降伏関数ではオーステナイトの等塑性仕事面を精度良く予測すると共に,計算された相当応力-マルテンサイト量曲線が種々の応力比における試験でほぼ1本の曲線上にプロットできることを確認した.おおむね計画の通り進行している.ただし,アルミニウム合金板(A1100)の200°Cにおける温間引張試験と二軸試験は終了していないが,試験装置は作成済みであり,最も試験が困難と予想される300°Cの実験は既に終了しているため,予定された実験は全て次年度初頭に終了するものと考えている.また,ステンレス材の温間二軸バルジ試験が未実施であり,これは,当初変形中のひずみおよび曲率を画像処理により取得しようとしていたが技術的に困難であることを確認した.現在は接触式の曲率計と伸び計を製作中であり,次年度前期での実験を計画している.2019年度は本研究の最終年度であり,当初の予定の通り,アルミニウム合金の温度・ひずみ速度依存型構成則と,オーステナイト系ステンレス鋼の加工誘起マルテンサイト量を予測できる構成則の構築を目標とする.アルミニウム合金の構成則はすでにプロトタイプのモデルにて計算を実施している.このモデルでは予ひずみと応力緩和の速度依存性を同時に表現できていないため,それを修正することを目標とする.また,オーステナイト系ステンレス鋼では一軸変形のための構成則を既に提案している.本年度の二軸試験結果は,この単軸変形モデルから多軸への拡張が可能であることを示唆しており,温間試験によりオーステナイト担当の特性が得られた後にモデル精度の検証を実施する.また,いずれのモデルも有限要素法に組込むことで簡単な成形解析を実施し,実験による検証と合わせて,塑性加工における提案モデルの有効性(形状精度や残留応力予測)を明らかにする.アルミニウム合金板(A5182-O)の室温から温間での引張試験により温度,ひずみ速度依存性,応力緩和特性を調査した.また,温間で実験可能な二軸引張試験装置を作成し,二軸引張試験を実施した.その結果,アルミニウム合金板は温間で顕著な温度,速度依存性を示すが,等塑性仕事面形状は温度にほとんど依存しないことを確認した.また,本材料は室温付近では動的ひずみ時効が生じ,室温と100°Cの応力-ひずみ曲線がほとんど一致しているにもかかわらず,室温ではほとんど生じなかった応力緩和が100°Cでは顕著にみられた.これにより,本材料の応力緩和は変位保持中に生じる粒内の転位運動が主たる要因でなく,粒界ひずみが原因であることが間接的に示された.さらに,温間二軸張出試験装置を用い,温間成形限界線図を取得した.その結果,温度が上昇するにつれ成形限界が著しく向上することを確認した.また,ひずみ速度の依存性は,本試験条件に限ってはほとんど影響しないことが確認された.また,オーステナイト系ステンレス鋼(SUS304)の引張バルジ試験装置を開発した.本試験では管状の試験片を使用し,2台のカメラで変形中のひずみおよび曲率を測定することができる.本装置により室温の二軸バルジ試験を実施し,また,同時にフェライトスコープによりマルテンサイト量を測定した.

その結果,マルテンサイト量と相当塑性ひずみの関係は変形形態(応力比)により変化し,これまで提唱されているひずみ誘起のマルテンサイト変態モデルでは説明できないことを見出した.さらに相当応力でマルテンサイト量を整理できることを確認し,加工誘起変態が応力誘起であることを明らかにした.当初の計画では平成29年度までに,温間引張試験,温間応力緩和試験,温間二軸引張試験,温間張出試験,SUS304の引張バルジ試験,変形後試験片のEBSD観察を予定していたが,現段階で温間引張バルジ試験とEBSD観察以外はほぼ計画通り進めることができた.ただし,当初は2000系および6000系のアルミニウム合金板を使用する予定であったが,実験方法が確立するまでは材料の経年変化が小さな5182-O材で研究を進めるよう計画を変更している.遅れの生じた温間引張バルジ試験では温度制御で目標の制御を達成できていないが,オイルバスを作成中であり,これにより問題が解決されると考えている.また,試験後試験片のEBSD観察であるが,予想より多くの試験条件で試験を実施したたため,まずは光学顕微鏡により組織変化の大きな変形,温度条件を検討した.その結果,温間張出試験で粒成長,再結晶,回復の度合いに温度や変形形態(ひずみ比)の影響が大きく表れていることを確認済みであり,今後はこれらの試験片を中心にEBSD観察を実施予定である.アルミニウム合金板5182-O材に引き続き,純アルミニウム板A1100-O材の温間引張試験,二軸引張試験を一部実施した.本材料はアルミニウム合金でみられる析出物による強化機構を無視できるため,母材本来の温間特性を調査することが目的である.試験の結果,A1100材はA5182材と比較してより低温域で顕著な温度とひずみ速度依存性を発現することを確認した.また,A5182材で見られた室温から100°C付近の動的ひずみ時効は発現しなかった.そのため,A5182材では予引張中には室温と100°Cの応力-ひずみ曲線にほとんど差異がないにもかかわらず,室温ではほとんど見られない応力緩和が100°Cで顕著であった.しかし,A1100材でこの傾向は見られず合金材特有の挙動であることを確認した.また,温間二軸引張試験ではA5182材とA1100材に大きな差異は見られなかった.一方SUS304の二軸バルジ試験は試験装置をほぼ完成した.試験の結果,単軸引張圧縮で得られた知見の通り,二軸変形であっても相当応力で加工誘起したマルテンサイト量をほぼ定量的に予測することができた.また,母相であるオーステナイトの等塑性仕事面の表現には,単純なvon MisesやHillの2次式では精度が不十分であり,これらから相当応力を求めてマルテンサイト量との関係を調査すると応力比ごとにばらつきが大きくなった.一方,高精度なYLD2000-2dや6次降伏関数ではオーステナイトの等塑性仕事面を精度良く予測すると共に,計算された相当応力-マルテンサイト量曲線が種々の応力比における試験でほぼ1本の曲線上にプロットできることを確認した.おおむね計画の通り進行している.ただし,アルミニウム合金板(A1100)の200°Cにおける温間引張試験と二軸試験は終了していないが,試験装置は作成済みであり,最も試験が困難と予想される300°Cの実験は既に終了しているため,予定された実験は全て次年度初頭に終了するものと考えている.また,ステンレス材の温間二軸バルジ試験が未実施であり,これは,当初変形中のひずみおよび曲率を画像処理により取得しようとしていたが技術的に困難であることを確認した.現在は接触式の曲率計と伸び計を製作中であり,次年度前期での実験を計画している.
中枢神経系に於ける神経-グリア間情報伝達過程の可視化解析

本研究は、脳海馬の記憶・学習に関わる細胞情報伝達過程に対する、神経ステロイドによる制御様式の解明を目指して遂行した。今年度はまず、プレグネノロン(PREG)を硫酸プレグネノロン(PREGS)に代謝する水酸化ステロイド硫酸基転移酵素が、海馬に於いて神経細胞に局在していることを免疫染色法、及びウエスタンブロッティング法によって解明した。私は昨年、海馬神経細胞にチトクロムP450sccを中心とするPREG合成酵素群が局在していることを発見している。それ故本研究によって、海馬神経細胞に於いて、海馬神経細胞自身に存在するNMDA型グルタミン酸受容体を介するCa信号を増強する作用を持つPREGSの合成に必要な酵素群が全て存在することを解明することができた。更に今年度は、これまで全く不明であった神経伝達物質による神経ステロイド合成の制御機構を検討した。その結果、海馬にNMDAを投与するとNMDA型グルタミン酸受容体を介してカルシウムが流入し、ステロイド合成急性調節蛋白質(StAR)のプロセッシングが誘起されてP450sccへのコレステロール供給が促進されることで、PREG及びPREGSの合成が促進されることを発見した。以上の発見により、「グルタミン酸(NMDA)刺激による海馬神経細胞へのカルシウムの流入→StARのプロセッシングと、P450sccへの基質コレステロール供給の増加→PREG産生→水酸化ステロイド硫酸基転移酵素によるPREGSへの代謝→PREGSのNMDA受容体への結合による受容体活性化→細胞内へのCa流入の増加」という信号増幅機構の存在を解明することができた。本年度は、まず神経ステロイドを介した脳細胞間情報伝達機構を解明するために、大脳組織においてチトクロムP450scc等のステロイド合成酵素の分布を免疫染色法で明らかにした。その結果、チトクロムP450sccは神経細胞に局在することを解明した。即ち、これまでダリア細胞が産生していると信じられてきた神経ステロイドは、実は神経細胞が産生して神経細胞自身の情報伝達をオートクライン的に制御していることを解明した。しかし脳のステロイド合成量は極めて少ないため、神経ステロイド合成機構を直接調べるのは非常に困難である。そこでまず、副腎皮質細胞のステロイド合成に於けるCaの役割を解明し、神経ステロイド合成機構解明への導入とすることを試みた。その結果、cAMPの増加を伴わずにステロイドホルモン合成を促進するNPS-ACTH刺激に対する細胞内情報伝達をCaが担っていることを解明した。また、副腎皮質がストレスに応じて産生するステロイドの神経細胞に対する作用を検討した結果、ストレスステロイドはNMDA受容体に直接作用して細胞内Ca濃度を持続的に高く保つことで神経細胞死を引き起こすことを発見した。一方、Ca信号を介したグリア-神経間情報伝達機構の可視化解析では、ダリア細胞からの信号を選択的に捉えてS/N比の高い計測を行うために、ダリア細胞にCa感受性蛍光蛋白質Cameleonの遺伝子をリポソーム法で導入し、細胞質及び小胞体でのCa動態の測定に成功した。現在導入効率を飛躍的に高めるために、高力価レトロウイルスでのCameleon導入を試みている。