hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゲノム不安性とメチル化異常から見た若年胃癌の特異的発癌経路と予後関連因子の解明

若年胃癌は、非若年胃癌に比して女性の割合、肉眼型で5型が多く、低分化型腺癌が有意に多いという結果が得られた。背景粘膜では、萎縮や腸上皮化生が乏しく、好中球浸潤を主体とする高度の炎症細胞浸潤やL-type amino acid transporter(LAT1)の発現があることが分かり、背景粘膜に特徴があることが示唆された。ゲノム不安定性やメチル化異常の差異については確認できなかったが、若年胃癌では、非若年胃癌症例に比して、hMLH-1の発現の消失や減少が低頻度な傾向があることより、DNAミスマッチ修復遺伝子の異常が関与している可能性が低いことが推測される。また若年胃癌は非若年胃癌に比して予後が良好であることが分かったが、予後に関連する因子を同定することは出来なかった。若年胃癌数は2314例中116例で、当施設では全体の5,0%の割合を占めていた。臨床病学的特徴は、男女比は1(58):1(58)で、非若年胃癌に比して有意に女性の発症頻度が高かった。早期癌は54例,進行癌は62例であった。組織型は非若年胃癌に比して低分化型腺癌が有意に多く(92例,79.3%)。肉眼形態はBorr5型が有意に多いという結果が得られた(P<0.05)。腫瘍長径は5.1cmであった。予後については現在検索中である。116例から40例の若年胃癌を抽出し、背景粘膜の炎症をSydney分類にて比較したところ、若年胃癌は非若年胃癌に比して有意に好中球浸潤が見られ、粘膜萎縮や腸上皮化生の頻度が低いことを確認した(P<0.001)。また、若年胃癌と非若年胃癌におけるMSI(Microsatellite instability).LOH(Loss of heterozygosity)を検索・比較するために、Laser Captured microdissection法により組織ブロックから腫瘍成分、背景粘膜、コントロールとしてリンパ節組織をそれぞれ分離採取してDNAを抽出した。腫瘍成分は、腫瘍細胞と周囲間質をそれぞれ別に分離採取した。抽出したDNAを用いて、主にNCI推奨マーカー(D2S123,BAT25,D5S346,BAT26,D17S250)・17番染色体マーカーにおけるMSIおよびLOHをMultiplex PCR-Gene Scan法で検索中である。今後も引き続き、MSIとLOHの検索を行う予定である。ミスマッチ修復蛋白であるhMLH1・hMSH2の発現を検討した所、現時点では非若年胃癌におけるhMLH1の発現の減少・消失頻度が若干高い傾向があった(25%,33%)。また低分化型癌は分化型癌に比してhMLH1の発現の減少・消失症例が有意に多かった。hMSH2の発現の減少・消失は低頻度であった(12%)。背景粘膜では、若年胃癌・非若年胃癌共にHelicobacter Pylori感染が免疫組織化学染色にて高頻度で確認されたが(共に感染頻度は80%以上で有意差は見られなかった)、腫瘍型アミノ酸トランスポーターと考えられているL-type amino acid transporterl (LAT1)の発現は、若年胃癌では有意に低発現を示していることが分かった。予後を中心に今回抽出した若年進行胃癌の臨床病理学的特徴を検索した所、若年胃癌は非若年胃癌に比して有意に予後がよかった(log-ranktest、P<0.05)。
新規マイクロＲＮＡ阻害薬の開発

我々はRNA/DNA二本鎖核酸構造を有し、核酸医薬を相補RNA鎖に組込こんだ2本鎖ヘテロキメラ核酸医薬を開発した。本研究ではまずマイクロRNA122阻害薬を組み込み、二本鎖構造の鎖長変化による影響をin vivoで検討した。その結果、二本鎖塩基長が7-17塩基長の範囲内では、抑制効果上昇に影響を与えないことが明らかとなった。続いてスプライシング制御を行う核酸医薬を組み込み、その有効性をin vitroで検討した。その結果、従来の1本鎖構造と比較して優れたスプライシング制御効果を有することを明らかにした。RNA/DNA2本鎖ヘテロ核酸の鎖長の最適化:本研究ではDNA鎖とcRNA鎖の2本鎖構造を用いていることが特徴であり、cRNA鎖側にマイクロRNA122(miR122)阻害薬を組み込んだRNA/DNA2本鎖ヘテロ核酸を合成し検討を行った。現在用いているDNA鎖は両末端をLNA、中央をDNAとして、核酸間を全てホスホロチオエート結合(PS)とした12-13merのLNA-DNA gapmer構造を用いており、gapmer構造の最適化として、鎖長による効果の違いを検討した。同配列の7-17塩基長のgapmer鎖を有するRNA/DNA2本鎖ヘテロ核酸を合成し、ICRマウス4週齢に0.05mg/kgで静脈投与し3日後の肝臓を採取し、定量PCRにてmiR122発現量を測定した。その結果、gapmer鎖の鎖長によるmiR抑制効果への影響効果について明らかな法則性は見出せなかった。神経内科
牛乳中脂肪酸の食味に及ぼす影響について

本研究は、異なる飼養条件および加工処理条件の牛乳において、官能評価および脂肪酸を中心とした成分への影響およびその関係性を明らかにすることを目的とした。分析型官能評価および嗜好型官能評価ともに、飼養条件の違いは判別されているが、嗜好性に対しては影響を及ぼさなかった。また、牛乳中の各種脂肪酸組成によって、飼養条件が予測できる可能性が示唆された。殺菌温度および均質化(ホモジナイズ)の有無については、嗜好性に大きな影響を及ぼし、特に放牧飼養による牛乳では、ホモジナイズを行う方が高評価を得た。脂肪酸組成と嗜好性との関係性だけでは明確にならなかったため、今後、これを含めた脂質クラスでの検討が必要である。本年度は初年度であることから、(1)分析型パネリストの選抜試験、(2)分析型パネリストによる飼養形態の異なる官能評価試験および(3)官能評価に用いた牛乳中の脂肪酸分析について実施した。(1)分析型パネリストについては、一般社団法人日本乳業協会が示す『実践官能評価法』に準じて実施した五味識別試験および濃度差識別試験の両方に合格した19名を分析型パネリストとした。(2)官能評価は、放牧飼養乳3種(濃厚飼料無給与放牧農家:A、濃厚飼料併給放牧農家:B,C※放牧依存度B>C)と非放牧飼養乳1種(舎飼い飼養農家:D)をHTST殺菌(72°C15秒間)した牛乳を用い、分析型パネリストによる順位法および3点識別法を用いて嗜好性や識別に関する評価を行った。本研究成果から、放牧草摂取量の異なる飼養形態で生産される牛乳の評価としては、その摂取割合が必ずしも嗜好性に悪影響を及ぼすことはないことが示唆された。また、3点識別法の結果から4種類の牛乳が、分析型パネリストによりそれぞれ識別できる違いがあることも併せて示唆された。すなわち、飼養形態(エサ)が異なる牛乳の識別はされているが、好みに影響するものではないという結果が得られた。(3)官能評価に用いた牛乳について、一般成分、脂肪酸、香気成分、味センサ値など計125成分をそれぞれの方法で測定し、この測定結果が飼養条件(今回は放牧草摂取割合を独率変数とした)にどのように影響しているか各種成分を説明変数としてOPLS回帰分析を行った。その結果、とくに脂肪酸組成による回帰は、全ての成分(125成分)を説明変数とするよりもあてはまりが良いことが明らかになり、放牧草摂取との関係性が考えられる新たな脂肪酸が存在する可能性も明らかになった。今後は官能評価の設計を修正し例数を増やすことで、官能評価と新たな脂肪酸を中心とした化学分析値の関係について検討する。当初の予定通り、五味識別試験および濃度差識別試験による分析型パネリストの選抜を行い、19名が合格し、本年度の牛乳の官能評価試験を行った。牛乳の比較および例数を増やすことが難しいため、次年度は官能評価試験についてパネリストの負担を軽減するような修正行う必要はあるが、OPLS回帰分析により飼養条件(放牧草摂取割合)と乳中脂肪酸と関係性の高い牛乳を用いることが出来ており、基本的には本年度の成績を活用して、例数を増やすことと官能評価と脂肪酸を中心とした乳成分の関係性を明らかにするための試験設計が焦点となる。また、官能評価で用いた放牧草摂取割合の異なる牛乳の脂肪酸分析を同時に行ったところ、特徴的な脂肪酸が牛乳に出現することが明らかとなり、この脂肪酸についても分析を進めていきたいと考えている。本年度は、前年の分析型パネリストの結果から、嗜好型パネリストでの官能評価試験を実施すると共に、放牧草摂取依存的な変化を示す脂肪酸についても同試験で用いた牛乳サンプルについて測定を行った。同時期にサンプリングした放牧飼養乳3種(濃厚飼料無給与放牧:A、濃厚飼料併給放牧:B,C※放牧依存度A>B>C)と非放牧飼養乳1種(D)を高温殺菌処理(HTST,72°C15秒)および均質化と超高温殺菌処理(UHT,120°C2秒)した牛乳を用い、嗜好型パネリストにより順位法で官能評価試験を行った。得られた嗜好性順位を正規スコアに変換し、分散分析および多重検定を行った。また、これら牛乳中の脂肪酸についても分析を行った。UHT処理乳に関しては保存期間が長くなることから、保存期間の影響についても検討した。HTST処理乳については、7月と9月に実施したが、2つの時期における官能評価試験の結果は、放牧依存度の高さが必ずしも嗜好性に影響しないという昨年度の成果が嗜好性パネリストにおいても確認された。一方、7月と9月で順位付けが異なる結果となっており、季節における評価の変化が見られた。UHT処理乳については、UHT処理後5日経過した牛乳の官能評価では、放牧依存度の低いC乳および非放牧飼養であるD乳が有意に高い評価を得た。これに対してUHT処理後12日目における官能評価では、C乳が引き続き有意に高い評価を得たが、D乳は大きくスコアを下げ、放牧依存度の高いAおよびB乳はスコアを上げる結果となり、保存期間の経過により嗜好性スコアの差が縮まった。これらの原料乳について脂肪酸濃度の分析を行ったところ、サンプル数は少ないが、放牧草摂取依存的な変化を示した新たな脂肪酸の増加が昨年同様見られ、また従来より報告されている共役リノール酸などについても増加していた。当初の予定通り、昨年度は分析型パネリスト、本年度は嗜好型パネリストを用いて評価することで研究成果を一般化する予定であり、いずれの試験についても50名以上の被験者を集めて実施できた。

一方、例年になく台風などの影響から飼料構成について7月と9月で異なっており、想定していた以上に乳牛の放牧草摂取量と牛乳に対する評価が一定にならない傾向が見られた。また官能評価データに関しては順調に増えているが、これと結び付けるための牛乳サンプルは官能評価1回につき1サンプルとなるため、サンプル数が少ない。最終年次はは、化学分析値を増やすための嗜好型官能評価試験を実施するなどして、足りないデータを補完する予定である。研究計画最終年度となるため、申請者がこれまでに行ってきた牛乳における官能評価試験データを用い、牛乳の加工処理と官能評価特性とくに嗜好性についての関係について、新たな統計手法(一般化プロクラステス分析およびプリファレンスマッピング)による検討を行った。またこのときの牛乳中の各種脂肪酸濃度と嗜好性との関係についても併せて検討を行った。飼養条件の異なる4農場の生乳(A,B,Cは放牧、Dは舎飼)を原料とし、ホモジナイズおよび殺菌処理(超高温殺菌ホモジナイズ、高温殺菌ホモジナイズ、高温殺菌ノンホモジナイズ)を3処理区設け、計12種の牛乳を用いて、3回の官能評価試験(計154名)を行った。官能評価試験は、市販牛乳(UHTホモジナイズ)を基準(0)とし、色、香りの強弱、香りの良悪、コク、甘味、後味の強弱および総合評価(おいしさ)の7項目を基準に対する各項目±5段階で評価した。総合評価を除く官能評価6項目に対して一般化プロクラステス分析を行い、スケール効果を低減した合意コンフィグを得た後、これによる主成分分析を行った。その結果、飼養条件の違い(放牧と非放牧)および3つの加工処理方法の違いが、官能評価6項目のデータにより類型化されていることが明らかとなった。さらに、これらの主成分分析結果を基に、各パネリストの各サンプルに対する嗜好性データからベクトルモデルを用いたプリファレンスマップを作成した。その結果、放牧草を摂取して生産された3農場A,B,Cの牛乳において、脂質の均質化すなわちホモジナイズ処理を行った方が消費者の嗜好性は高まる可能性が示唆された。一方、このときの各牛乳中脂肪酸濃度と嗜好度との関係については主要な脂肪酸においては明確にはならなかった。牛乳中脂質の95%以上はトリグリセライドの形で存在するため、今後、遊離脂肪酸など微量だが変化しやすい脂質の嗜好性への関与を検討する必要がある。本研究は、異なる飼養条件および加工処理条件の牛乳において、官能評価および脂肪酸を中心とした成分への影響およびその関係性を明らかにすることを目的とした。分析型官能評価および嗜好型官能評価ともに、飼養条件の違いは判別されているが、嗜好性に対しては影響を及ぼさなかった。また、牛乳中の各種脂肪酸組成によって、飼養条件が予測できる可能性が示唆された。殺菌温度および均質化(ホモジナイズ)の有無については、嗜好性に大きな影響を及ぼし、特に放牧飼養による牛乳では、ホモジナイズを行う方が高評価を得た。脂肪酸組成と嗜好性との関係性だけでは明確にならなかったため、今後、これを含めた脂質クラスでの検討が必要である。官能評価については、測定する乳中脂肪酸を主として、評価との結びつきが可能な試験設計に修正する必要がある。
ニューロセルピン遺伝子変異による家族性神経変性疾患モデルマウスの分子病態解析

変異型神経特異的セリンプロテアーゼインヒビタ=(ニューロセルピン)は家族性ニューロセルピン封入体脳症の原因となる。数種の変異型ヒトニューロセルピンが知られているが、今回、人では最も劇症型を起こすと言われるG392Eニューロセルピンをニューロンでのみ発現するトランスジェニックマウスを作製し、変異型ニューロセルピンのニューロン内蓄積機構とその結果起こるニューロンの機能障害の原因を追及した。その結果、変異型ニューロセルピンは発現量、変異部位、加齢に依存してニューロン小胞体とリソゾームに蓄積し、代謝分解量を超える合成量が有れば、加齢と共に病的変化を起こすことを明らかにした。本計画遂行に際して使用するヒトG392Eニューロセルピントランスジェニックマウス(G392E-Tgマウス)は、家族性痴呆症のモデル動物確立を目指して世界に先駆けて作製した貴重なモデル動物であり、2003年に作製した。ちなみに、4種のヒトニューロセルピン変異体がニューロセルピン封入体脳症(FENIB)患者から同定たが、G392E型患者は封入体量が最も多く、神経症状は激烈で発症時期も最も早い劇症型FENIBを起こす。また、抗ヒトニューロセルピン抗体はウエスタンブロット法では、ヒトニューロセルピンだけと反応しマウスのそれと反応しない。これらを鑑み、今年度の研究ではG392E-Tgマウスの病態を免疫化学的または免疫組織化学的に解析した。G392E-Tgマウスは野生種マウスでは検出されない抗ニューロセルピン抗体陽性顆粒状沈着物を生後2ヶ月から中枢神経系全領域の神経細胞胞体に蓄積していた。この沈着物の性質を調べるため、G392E-Tgマウスを交配し、ホモ接合体型Tgマウス(G392E^<homo>-Tgマウス)の作成を試み、神経細胞中の抗体陽性沈着物量やその経時変化をヘテロ接合体型Tg-マウス(G392E^<hetero>-Tgマウス)やホモ及びヘテロ接合体ヒト野生種ニューロセルピンTgマウス(WT^<homo>-及びWT^<hetero>-Tgマウス)のそれらと比べた。G392Eニューロセルピンは遺伝子量に比例し加齢と共に増加したが、野生種ニューロセルピンは殆ど蓄積しなかった。この間、G392EニューロセルピンmRNA量は同一種Tgマウス脳では加齢に依る増加は観察されなかった。以上の観察結果は、我々が作成したG392E^<homo>-Tgマウスは遺伝子量、変異の存在、及び加齢に依存して、ニューロセルピン封入体脳症患者と同様に変異ニューロセルピンを神経細胞に蓄積することを示した。更に、この結果、次年度の研究で、神経学的異常、神経細胞死、及び封入体形成の有無と機構を調べることが可能になった。1、ニューロセルピン封入体脳症(FENIB)のモデルマウスを樹立するため、患者でもっとも激烈な症状を示し発症が早い原因タンパクであるヒトG392Eニューロセルピントランスジェニック(Tg)マウス系統を樹立し、その免疫化学的、形態学的、及び神経学的性質を調べた。2、約1年の飼育期間でこのマウスは中枢神経系の殆どの領域の神経細胞に免疫染色により観察できる多量の変異ニューロセルピンを蓄積していた。しかし、予想に反し、これらのマウスは自発的痙攣発作を起こさず、行動学的にも異常は見られなかった。3、我々が観察できた唯一の神経学的異常は、G392ETgマウスがカイニン酸誘導性の痙攣の潜時の短縮と強度の増加を示したことだけであつた。FENIB患者脳に蓄積する変異ニューロセルピンはPAS染色陽性の蓄積物になるが、我々の研究で使っているマウスはこの性質を表す蓄積物の量が少ないことも特徴だった。4、これらの観察結果は、G392Eニューロセルピンが細胞内で分解速度が高いか特殊な局在性を持ち、そのため、神経細胞の機能障害が現れにくい可能性を示唆する。5、最終年度は、これらの点を詳細に調べるため、変異ニューロセルピンの神経細胞内局在を免疫電顕で調べる。得られる結果を元に、神経学的症状の減弱の理由を明らかにする。ニューロセルピンはSondereggerらによって1997年にクローニングされた分泌性のセリンプロテアーゼインビターである。その後、常染色体優性遺伝する家族性の早期発症型認知症の一つであるFENIB(Familial Encephalopathy with Neuroserpin Inclusion Body)がニューロセルピンの遺伝子変異により起こることが1999年に明らかにされた。我々はヒト変異型ニューロセルピン(G392E変異)遺伝子導入マウスを作製・解析し、本マウスでは免疫組織

化学により大脳皮質・海馬・扁桃体・橋・脊髄等でのニューロセルピンのニューロン内蓄積が起こることを明らかにした。このマウスでは、カイニン酸刺激に対する易痙攣性が認められ、FENIB疾患モデルマウスとして適切であることを明らかにした。てんかん・痴呆症状を呈するFENIB患者の傾向として、その発症年齢が低く症状が重篤であるほど、形成されたニューロセルピン封入体は大きくかつ多数存在することが報告されており、封入体形成がFENIB発症に関わる可能性が強く示唆されてきている。我々は電子顕微鏡レベルで脳のG392E変異遺伝子導入マウスニューロンの小胞体・核・ミトコンドリア等の細胞内微細構造を観察し、小胞体におけるroundな、あるいはirregularな異常構造体形成を見出した。さらに免疫電子顕微鏡観察を行うと変異型ニューロセルピンは小胞体のみならずリソソーム内にも蓄積していた。G392E変異ニューロセルピンがリソソーム内に蓄積する意義は現時点では不明であるが、分子レベル・細胞レベルで盛んに行われている蛋白質の品質管理、特に異常蛋白質の分解経路の研究において、本マウスは個体レベルから新たな知見を提供できるものと考えられる。
三次元データベースと数理解析・モデル構築による分野統合的研究の促進

本領域が対象とする出ユーラシア地域のモニュメント,遺物,民族誌データ、認知的データ、自然人類学的データ等を空間的・時間的位置を基準とするフレームワークに位置づけて相互参照・検索可能な形とする.SfM・三次元スキャナーやLiDAR測量など三次元計測によって取得されたデータともリンクすることで,楕円フーリエ解析などの幾何学的形態測定の手法を用いた定量的な解析・比較を行う.また総括班との密接な連携の下,異分野統合のハブとしての役割を果たし,領域全体の一貫性・統合性を確実なものとする.本領域が対象とする出ユーラシア地域のモニュメント,遺物,民族誌データ、認知的データ、自然人類学的データ等を空間的・時間的位置を基準とするフレームワークに位置づけて相互参照・検索可能な形とする.SfM・三次元スキャナーやLiDAR測量など三次元計測によって取得されたデータともリンクすることで,楕円フーリエ解析などの幾何学的形態測定の手法を用いた定量的な解析・比較を行う.また総括班との密接な連携の下,異分野統合のハブとしての役割を果たし,領域全体の一貫性・統合性を確実なものとする.
有機溶媒酵素反応を利用したオリゴ糖の生産

本研究は多糖類を有機溶媒中で酵素加水分解させ効率的にオリゴ糖を生産する画期的な方法を開発する事を目的として行った。先ず、基質として可溶性澱粉、酵素にはBacillus subtilis由来のαーアミラ-ゼを用いて、一定の割合で酵素水溶液を含むヘキサンあるいはドデカンを溶媒系として反応を行った。その結果、水の有機溶媒に対する体積比が10%のときオリゴ糖生成量が最大となり、水系の約1.7倍であった。このときの澱粉のオリゴ糖への変換率は66%であった。次に、寒天を基質としてオリゴ糖の生成を試みた。寒天分解酵素の市販品はきわめて入手しにくいため、海洋微生物からのスクリ-ニングを行った。その結果硝酸ナトリウムを含む無機栄養培地の寒天プレ-ト上に、寒天分解能力を有する細菌が3株得られた。しかし、いずれの株もヘキサンあるいはドデカンを含む液体培地中では増殖できず、有機溶媒耐性が見られなかったことから、本実験系には不適当であると判断され、以降の実験は行なわなかった。一方、αーアミラ-ゼによる有機溶媒中での澱粉分解において24時間以内に酵素が失活してしまった。そこで、反応系に界面活性剤を添加することにより逆ミセルを形成させ、酵素の安定化を試みた。その結果、Tween60を添加することにより、水系とほぼ同等の安定性が達成され、また、75時間後のオリゴ糖生成量は水系の1.5倍であった。また、アルギン酸カルシウムによって酵素を固定化した場合も有機溶媒中でのαーアミラ-ゼは安定化され、140時間後には水系の4倍以上のオリゴ糖生成量が達成された。酵素の安定化は、逆ミセル、固定化により酵素周辺に親水的な雰囲気が保持されたためと考えられた以上のように、本研究成果はきわめて基礎的ではあるが、今後の食品分野をはじめとするバイオインダストリ-の発展に充分寄与できるものと予想される。
不確実性や政策介入に対する企業の労働調整に関する実証分析

安定的な質の高い雇用機会が確保されているかどうかは国民の生活の豊かさを規定する大切な要因である。しかしながら、現実には金融危機や自然災害の発生などの外生的なショックによって雇用機会は大きな変動にさらされることがある。このようなショックが雇用、賃金、労働時間にどのような影響を与えるかを理解することが適切な政策対応を検討するうえで重要である。また、同時に雇用の在り方を変化させようとする政策介入が所期の目的を達成しているのかどうかの評価を行うことも重要である。本研究ではこれらの課題を政府統計の大規模な個票データを用いて解析する。企業が不確実性や政策介入に対して、雇用量、労働時間、賃金等の側面でどのような調整を行っているかを、為替レートの変動、企業の業績予測、女性活用推進法等の政策介入の3つの観点から計量的に分析し、労働者の技能特性、労働市場の摩擦に関する構造、労働市場における情報の非対称性の程度等の影響と企業の労働調整行動の実態を明らかにする。3つの研究課題に対して具体的な方法が提示されている。複数の官庁ミクロデータを接合したデータベースを新たに構築し、様々な変数を同時に推定することで、従来、検証が困難であった理論仮説を検証しようとする計画は独創的であると共に、研究代表者・分担者の研究実績に照らして実行可能性が高いと評価する。労働経済学領域への学術的新規性および雇用政策等への含意が期待される。
遺伝子制御を伴う選択的シナプス可遡性の分子機構の解明

vesl-1S遺伝子は海馬の長期持続型LTP(L-LTP)に伴い発現が誘導される。遺伝子産物であるVesl-1Sタンパク質はmGluR1/5やIP3受容体と相互作用する足場タンパク質であり、これら受容体のシナプス部位での機能的な配置を調節していると考えられている。Vesl-1Sを特異的に認識する抗体を作成し、シナプス可塑性に伴うVesl-1Sタンパク質の細胞内局在を調べた。海馬歯状回の1つの顆粒細胞はentorhinal cortexからmedial-(MPP)とlateral-(LPP)perforan pathの2つの入力を受けている。顆粒細胞とMPPのシナプスは主にmiddle molecular layer(MML)に、顆粒細胞とLPPのシナプスは主にouter molecular layer(OML)に局在している。無麻酔自由行動下雄ラットの貫通線維にテタヌス刺激を与えLTPを誘導しVesl-1Sタンパク質の局在を観察した。L-LTPを誘導するテタヌス刺激をあたえるとvesl-1S mRNAの発現誘導は顆粒細胞体層で認められたが、シナプス層であるMML/OMLには認められなかった。これに対し、長期持続型テタヌスをMPPに与えた時にはMMLに、LPPに与えた時にはOMLにVesl-1Sタンパク質の選択的な局在が観察された。シナプス前である同側のECには顕著なvesl-1S mRNAの発現誘導やVesl-1Sタンパク質の局在変化は認められながった。免疫電子顕微鏡法による解析の結果、Vesl-1Sタンパク質はシナプス後に存在していた。これらの事より神経細胞の可塑的変化に伴い細胞体で合成されたVesl-1Sタンパク質を、入力を受けたシナプス特異的に輸送する機構が存在することが明らかとなった。現在、より詳細な解析が可能なin vitro系、すなわち海馬初代培養ニューロンでVesl-1Sタンパク質の細胞内挙動をリアルタイムで解析できる系を開発中である。
コーヒー摂取による生活習慣病予防効果の分子基盤の解明

習慣的なコーヒー摂取が、肥満や炎症に関連して生じる生活習慣病の発症リスクを低下させる可能性が報告されている。我々は、前駆脂肪細胞3T3-L1を用いて、コーヒー豆焙煎成分がインスリンシグナル経路のアダプター分子IRS1の分解を促進することにより、肥満の要因である脂肪細胞の分化を抑制することを見出した。また、コーヒーの抗炎症効果に関して、コーヒー豆焙煎成分がLPS誘発マウスマクロファージ細胞の炎症反応を抑制することを見出し、その効果は、Keap1の不活性化による転写因子Nrf2の活性化によることを見出した。以上の結果は、コーヒーの喫飲による生活習慣病予防効果の分子論的解明につながる。一日35杯のコーヒー喫飲の習慣が、糖尿病やがん、認知症など、様々な生活習慣病のリスクを低減する効果があることが報告されている。本研究では、コーヒーの生活習慣病予防効果を分子レベルで解明することを目指している。コーヒーによる肥満予防の効果を解析するため、前駆脂肪細胞3T3-L1細胞の脂肪細胞への分化に対する効果を調べた。3T3-L1細胞を脂肪細胞に分化誘導する際、コーヒーを加えると分化初期段階におけるG2/M期への移行が抑制される事を見出した。解析を進めた結果、コーヒー成分が、分化誘導に必須のERKによる転写因子C/EBPbのリン酸化を抑制すること、この抑制はインスリンシグナルにおけるIRS1の抑制によることを明らかにした。コーヒー成分によすIRS1の抑制はIRS1特異的に起こり、それはIRS1タンパク質の分解促進によることを見出した。一方、コーヒーによる大腸がん予防効果については、ヒト大腸がん由来Caco-2細胞を用いて解析を進めた。コーヒー添加により、Caco-2細胞の増殖が抑制され、同時に、がん遺伝子K-rasの転写およびKRASタンパク質の発現が抑制された。この時、K-ras遺伝子を標的とするmicroRNAであるmiR30cおよびmiR96の発現がコーヒー用量依存的に誘導されていることを見出した。さらに、この効果はコーヒー豆の焙煎により生成する成分によるものであることが明らかとなった。さらに、コーヒーの抗炎症効果を、マウスマクロファージRAW264.7細胞を用いて調べた。細胞をLPSで刺激すると炎症性マーカー(NO, iNOS)および炎症性サイトカイン(CCL2, CXCL1, IL-6)が誘導されるが、この発現誘導はコーヒー濃度依存的に抑制された。また、この効果はコーヒー豆の焙煎により生成する成分による効果であることが明らかとなった。ほぼ研究計画に沿って研究を遂行できた。具体的には、生活習慣病のリスク要因である肥満に対するコーヒーの抑制効果について、インスリンシグナル伝達への抑制効果を分子レベルで明らかにできたこと、また、大腸がん予防効果の一因として、miRNA誘導を介する発がん遺伝子rasの抑制効果を明らかにできた点が挙げられる。一日35杯のコーヒー喫飲の習慣が、糖尿病やがん、認知症など、様々な生活習慣病のリスクを低減する効果があることが報告されているが、その効果の科学的根拠やメカニズムには不明な点が多い。そこで、本研究では、コーヒーの生活習慣病予防効果を分子レベルで解明することを目指している。28年度では、まず、認知症予防効果について研究を行った。一日35杯の習慣的なコーヒーの喫飲がアルツハイマー病の発症リスクを低減させるという疫学研究や、アルツハイマー病モデルマウスに45週間カフェインを摂取させると海馬のアミロイドタンパク質の蓄積が40%減少したという報告等がなされ、コーヒーの認知症予防効果が注目されている。カフェインがこの抑制効果の本体であるという報告もあるが、カフェイン以外の成分の関与も示唆されており、有効成分や分子メカニズムについて、十分解明されてはいない。アルツハイマー症の発症には、βおよびγセクレターゼによるアミロイド前駆タンパク(APP)の切断によるアミロイドβ(Aβ)タンパク質の分泌・蓄積が関与している。重篤な副作用が予想されるγ-セクレターゼの抑制に比べ、β-セクレターゼ(BACE1)の抑制はより副作用の少ないアルツハイマー病のターゲットと考えられている。我々は、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Yを用いてコーヒーによるBACE1発現への影響を検討した。その結果、コーヒー添加によりBACE1のタンパク質量は用量依存的および経時的に減少することを見出した。この時、BACE1のmRNAに変化はなく、BACE1タンパク質の分解促進が起きていることが示唆された。また、コーヒーによるBACE1タンパク質の分解促進効果は、カフェインなどの主成分ではなく、酢酸エチルに可溶な焙煎成分であることも判った。タンパク質分解の促進効果のメカニズムを解析した結果、コーヒー成分によりプロテアソームによるBACE1分解の促進が起きていることも判明した。28年度はコーヒーの生活習慣病予防効果のうち、認知症および白内障への効果について解析を行い、認知症予防効果については神経細胞におけるAβ産生に関わる酵素活性に対する抑制効果を見出し、そのメカニズムの一端を明らかにできた。さらに、白内障予防効果については、コーヒーの焙煎成分ピロカテコールが、強い抑制効果を示し、水晶体内の抗酸化活性への効果であることを明らかにした。1コーヒーの抗肥満効果の分子機構の解明:多くの疫学調査により、習慣的なコーヒー摂取が、肥満や肥満に関連して生じる生活習慣病の発症リスクを低下させる可能性が報告されている。我々は、コーヒー豆抽出液は、インスリンシグナル経路を阻害することにより、肥満の要因である脂肪細胞の分化を抑制することを報告している。

前駆肥満細胞3T3-L1において、コーヒー豆抽出液が、インスリンシグナルの重要なアダプター分子であるIRS1タンパク質の発現を低下させることを見出した。解析の結果、コーヒーの焙煎成分が、プロテアソームによるIRS1分子の分解を促進していることが明らかとなった。今後は、コーヒー豆抽出液によるIRS1の分解促進の分子機構および成分の同定を進める。2コーヒー成分による敗血症に対する症状改善の分子メカニズムの解明:敗血症では、病原体成分であるLPSにより活性化されたマクロファージにより、炎症性メディエーターが過剰に産生されることが知られている。これまでに、コーヒー豆抽出液が、LPS刺激によるマクロファージからの炎症性メディエーターの産生を抑制することを明らかにした。この抑制効果は、コーヒー焙煎成分による転写因子Nrf2の活性化によることを見出した。この活性化はNrf2の151番のシステインが関与すること、さらに、コーヒーの焙煎成分のうち、カテコール類が関与することを明らかにした。3コーヒー摂取による認知症予防効果の解析:コーヒー成分がヒト神経細胞SH-SY5Yにおけるアミロイドβ(Aβ)産生を抑制することを見出し、それが、Aβ産生の律速酵素β-セクレターゼ(BACE1)の分解促進によることを発見した。さらに、BACE1の分解は、コーヒーの焙煎成分によるプロテアソームサブユニットのセリンのリン酸化による活性化によるものであることを明らかにした。習慣的なコーヒー摂取が、肥満や炎症に関連して生じる生活習慣病の発症リスクを低下させる可能性が報告されている。我々は、前駆脂肪細胞3T3-L1を用いて、コーヒー豆焙煎成分がインスリンシグナル経路のアダプター分子IRS1の分解を促進することにより、肥満の要因である脂肪細胞の分化を抑制することを見出した。また、コーヒーの抗炎症効果に関して、コーヒー豆焙煎成分がLPS誘発マウスマクロファージ細胞の炎症反応を抑制することを見出し、その効果は、Keap1の不活性化による転写因子Nrf2の活性化によることを見出した。以上の結果は、コーヒーの喫飲による生活習慣病予防効果の分子論的解明につながる。昨年度の研究でコーヒーの肥満予防効果のメカニズムとして、インスリンシグナル伝達への抑制効果が明らかとなった。特に、コーヒー成分によるインスリン受容体アダプター因子IRS1の分解促進効果の分子メカニズムを明らかにすることを目指す。プロテアソーム阻害剤MG132によりコーヒーの抑制効果は減弱することから、ユビキチンープロテアソーム分解系が関与している予想され、この分解システムへの効果を中心に解析する。また、関与する成分の同定も進める。コーヒーの大腸がん抑制効果では、コーヒーによる2種のmiRNAの発現誘導が明らかとなったが、このmiRNA発現誘導のメカニズムの解明を進める。具体的には、関与する転写因子の特定とそれに対するコーヒー成分の作用の解明を進める。また、関与するコーヒー成分の同定も行う。
眼部悪性腫瘍における網羅的ゲノム解析と臨床応用への展開

結膜やぶどう膜組織に発生する悪性黒色腫や眼内および眼付属器に生じる悪性リンパ腫は生命予後を脅かす疾患であるが、稀少な疾患であるため他臓器の悪性腫瘍と比較して研究の立ち遅れは否めない。応募者の施設は眼部悪性腫瘍を診療する機会が非常に多い特徴を生かし、ポストシーケンス時代のゲノム科学環境のもと、まずは眼部悪性腫瘍に対する包括的かつ網羅的なゲノム解析を行うことを目的としている。眼窩悪性リンパ腫6検体、IgG4関連眼疾患12検体、ぶどう膜悪性黒色腫6検体、眼内リンパ腫3検体に対して次世代シークエンサーを用いて遺伝子変異の網羅的検索を行っている。次世代シークエンサーにより検出された高率に変異する遺伝子を同定できた。特にFMN2、GLTSCR1、INF2、TFAP2A、TRIOBP、TTC19、XISTでは末梢血および口唇粘膜をコントロールとしても全例で遺伝子変異をみとめた。また、眼内液および血清中レベルでのタンパク質の同定も並行して行うことによって、遺伝子産物と臨床病理学的所見との関連の検証を計画している。得られた包括的データと各腫瘍の臨床像や予後との関連についても解析することによって、新規診断マーカーとしての可能性や生命予後推定因子としての意義についても検討を予定している。次世代シークエンサーで解析を行っている眼窩悪性リンパ腫、IgG4関連眼疾患、ぶどう膜悪性黒色腫、眼内リンパ腫を中心に症例数を増やしつつ遺伝子変異を調べることによって、発癌メカニズムの詳細な解明、新たなバイオマーカーの探索、臨床経過との相関(生命予後予測や治療効果判定)と、得られた結果を統合し、個別治療の確立につなげるデータとしていきたい。また、RNASeqも行っており、多くの新規遺伝子異常をみつけることができた。眼窩に生じるリンパ増殖性疾患、なかでも悪性リンパ腫(MALTリンパ腫)やIgG4関連眼疾患の病態は不明である。今回、眼窩MALTリンパ腫とIgG4関連眼疾患においてmultiplex PCRを用いて病原微生物の網羅的検索を行ったところ、眼窩MALTリンパ腫では15例中2例でHHV-6が検出されたのみであったのに対し、IgG4関連眼疾患では22例中5例からHHV-6、8例からHHV-7、7例からEBV、1例から16rRNAが検出された。さらに22例中6例でHHV-6とHHV-7、HHV-6とEBV、HHVとEBVが同時に検出された。眼窩DLBCLは7例中2例でEBVが検出された。眼窩RLHでは7例中2例でEBVが、7例中2例でHHV-6が検出された。末梢血単核球から抽出されたDNAでは全例、ウイルスは検出されなかった。これらのウイルスは眼窩に潜伏感染していた可能性も否定はできないが、IgG4関連眼疾患などでは何らかの病態形成に関与している可能性が考えられた(Sci Rep. 2016)。眼内に生じる最も悪性なぶどう膜悪性黒色腫の診断は、検眼鏡的所見に基づく臨床所見や画像検査を総合的に判断しているのが現状であり、しばしば良悪性の鑑別に苦慮することが少なくない。そこで我々は眼内液における液性因子を包括的に測定、解析し、ぶどう膜悪性黒色腫の眼内液中にはAngiogenin、MCP-1、IL-8が良性腫瘍患者と比較して高値であることを明らかにした。ぶどう膜悪性黒色腫の眼内液で検出された液性因子は腫瘍組織から産生、あるいは悪性腫瘍に対する免疫応答により産生されていることが推測され、本疾患の診断マーカーとして応用が可能であると考えられた(Graefe Arch Clin Ophthalmol. 2017)。眼窩に生じるリンパ増殖性疾患、なかでも低悪性度リンパ腫(MALTリンパ腫)、反応性リンパ組織過形成(RLH)、IgG4リンパ関連増殖疾患(IgG4)の診断は、臨床的には画像診断検査を駆使しても鑑別はほぼ不可能であり、生検後の病理組織学的検索においても形態学的な類似性を示すことから診断に苦慮することがある。免疫組織化学染色は鑑別に有用なテクニックであるが、定性的な評価にとどまり、時に評価に難渋することがある。そこで、各疾患の生検組織を用い、免疫学的表現型の発現パターンをフローサイトメトリーで網羅的に検索を行い、病理組織学的に比較検討を行った。結果の要旨は現在、Jpn J Ophthalmolに投稿し、2017年4月に受理された。また、現在は眼窩悪性リンパ腫6検体、IgG4関連眼疾患12検体、ぶどう膜悪性黒色腫6検体、眼内リンパ腫3検体に対して次世代シークエンサーを用いて遺伝子変異の網羅的検索を行っている。次世代シークエンサーにより検出された高率に変異する遺伝子を抽出することができ、眼内液および血清中レベルでのタンパク質の同定も並行して行うことによって、遺伝子産物と臨床病理学的所見との関連の検証を計画している。2016年度は2報の英文誌に成果を報告することができ、次世代シークエンサーによる解析も進行中であることから、おおむね研究は順調に進展していると考えている。

結膜やぶどう膜組織に発生する悪性黒色腫や眼内および眼付属器に生じる悪性リンパ腫は生命予後を脅かす疾患であるが、稀少な疾患であるため他臓器の悪性腫瘍と比較して研究の立ち遅れは否めない。応募者の施設は眼部悪性腫瘍を診療する機会が非常に多い特徴を生かし、ポストシーケンス時代のゲノム科学環境のもと、まずは眼部悪性腫瘍に対する包括的かつ網羅的なゲノム解析を行うことを目的としている。初年度ではIgG4関連眼疾患において病原微生物の網羅的解析を行い,HHV-6、HHV-7、EBVが抗原として病態に関与している可能性(Sci Rep 2016)を報告した。また、ぶどう膜悪性黒色腫における眼内液中のサイトカインを網羅的解析を行った結果、Angiogenin、MCP-1、IL-8が診断マーカーになりえることを報告した(Graefe Arch Clin Ophthalmol. 2017)。平成29年度では、眼窩に生じるリンパ増殖性疾患、なかでも低悪性度リンパ腫(MALTリンパ腫)、反応性リンパ組織過形成(RLH)、IgG4リンパ関連増殖疾患(IgG4)の診断は、臨床的には画像診断検査を駆使しても鑑別はほぼ不可能であり、生検後の病理組織学的検索においても形態学的な類似性を示すことから診断に苦慮することがある。免疫組織化学染色は鑑別に有用なテクニックであるが、定性的な評価にとどまり、時に評価に難渋することがある。そこで、各疾患の生検組織を用い、免疫学的表現型の発現パターンをフローサイトメトリーで網羅的に検索を行い、病理組織学的に比較検討を行った結果、CD23およびCD25がマーカーとして鑑別に有用であることを報告した(Jpn J Ophthalmol. 2017)。現在IgG4関連眼疾患において、TRIOBP、INF2など新規遺伝子変異を同定し論文執筆中である。現在は眼窩悪性リンパ腫6検体、IgG4関連眼疾患12検体、ぶどう膜悪性黒色腫6検体、眼内リンパ腫3検体に対して次世代シークエンサーを用いて遺伝子変異の網羅的検索を行っている。次世代シークエンサーにより検出された高率に変異する遺伝子を同定できた。特にFMN2、GLTSCR1、INF2、TFAP2A、TRIOBP、TTC19、XISTでは末梢血および口唇粘膜をコントロールとしても全例で遺伝子変異をみとめた。また、眼内液および血清中レベルでのタンパク質の同定も並行して行うことによって、遺伝子産物と臨床病理学的所見との関連の検証を計画している。得られた包括的データと各腫瘍の臨床像や予後との関連についても解析することによって、新規診断マーカーとしての可能性や生命予後推定因子としての意義についても検討を予定している。2016年度および2017年度で3報の英文誌に成果を報告することができ、次世代シークエンサーによる解析も進行中であることから、おおむね研究は順調に進展していると考えている。眼窩悪性リンパ腫6検体、IgG4関連眼疾患12検体、ぶどう膜悪性黒色腫6検体、眼内リンパ腫3検体に対して次世代シークエンサーを用いて遺伝子変異の網羅的検索を行っている。
生体イメージングによる炎症細胞の遊走動態の解析とシミュレーション手法の開発

1.免疫細胞の動態解明のためのイメージング解析免疫細胞の動きを2光子励起顕微鏡で得られた経時観察画像のイメージング解析により検出する手法を開発した。従来法での動きの検出は、撮像条件や画像の種類に依存して手法を検討する必要があり、汎用的な方法論の開発の要求があった。そこで、追跡する細胞の特徴を深層学習により取得することで、より精度の高い追跡が行える手法を開発した。具体的には、一般物体追跡のデータセットで事前学習した畳み込みニューラルネットワークに対して、2光子励起顕微鏡での免疫細胞の動態を観察したデータに転移学習することで、細胞の追跡が可能であることを示した。さらに、深さ方向に重なっている画像から、最大輝度投影法による投影で得られる物体中の輝点の深さ情報を追加することで、細胞追跡の精度がさらに向上することを示した。2.1細胞トランスクリプトーム解析でのバッチ補正法の開発1細胞トランスクリプトーム解析では、異なるシーケンシング法で得られたトランスクリプトームデータには、それぞれに異なる欠損やノイズにより生じるバッチと呼ばれる系統的なバイアスが存在し、異なるデータを比較・統合したデータ解析の妨げとなっていた。そこで、欠損値やノイズの影響を受けにくい潜在的ディリクレ割当て(LDA)によるトピックモデルを使って、各トランスクリプトームデータからトピックと呼ばれる潜在的因子を検出し、それらをプロクラステス解析により重ね合わせることで、複数のトランスクリプトームデータを比較・統合できる手法を開発した。従来のバッチの補正法では、補正すべきトランスクリプトームデータすべてに対してデータ変換が必要であったが、本手法では新たに付け加えるデータのみの変換で済むため、大規模なトランスクリプトームデータの比較・統合が従来法と比べて容易にできることが示された。免疫細胞のイメージング解析では、2光子励起顕微鏡で得られた経時観察画像の深層学習により学習することで、より精度の高い細胞追跡が行えることが示された。また、1細胞トランスクリプトーム解析では、潜在的ディリクレ割当て(LDA)によるトピックモデルとプロクラステス解析により、異なるトランスクリプトームデータに存在するバッチを補正することで、比較・統合を行えることが示された。以上のことから、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えられる。2018年度に引き続き、2光子励起顕微鏡により経時的に観察された生体組織画像中での免疫細胞の遊走動態を解析する。具体的には、炎症刺激(例えば高脂肪食負荷)についての経過時刻の異なる生体組織中の免疫細胞の動態を比較することで、急性炎症時と慢性炎症時の細胞動態の差異を判別することを目指す。また現在までに開発された深層マッチングによる遊走動態法を拡張し、時間的に隣接する画像フレームだけでなく、空間的に深さ方向で隣接する画像フレームでも深層マッチングを行うことで、遊走細胞の深さ方向も含めた3次元的な動態を解析するとともに、細胞領域の検出(セグメンテーション)にグラフカット法を応用することで検出精度を向上させる。次に、1細胞トランスクリプトーム解析では、炎症刺激の開始からの経過時刻の異なる生体組織中の免疫細胞の1細胞発現プロファイルから、得られた各細胞単位の遺伝子発現量のセットを各細胞の刺激応答の時系列上で占める位置を推定する手法を開発する。特に、細胞の状態変化は複数の系列で進む(同じ刺激に対する複数の応答に相当する)ことがあり、疑似時間を形成する細胞の系列は分岐を含む木構造を取るため、本研究でも分岐を含む経路に沿って疑似時間を推定できる手法の確立を目指す。さらに、解析結果を基に、炎症状態での免疫細胞の遊走動態を、数理モデルを作成して、そのモデルに基づいて遊走シミュレーションを行い。数理モデルの妥当性を判定する。

免疫細胞のイメージング解析では、2光子励起顕微鏡で得られた経時観察画像の深層学習により学習することで、より精度の高い細胞追跡が行えることが示された。また、1細胞トランスクリプトーム解析では、潜在的ディリクレ割当て(LDA)によるトピックモデルとプロクラステス解析により、異なるトランスクリプトームデータに存在するバッチを補正することで、比較・統合を行えることが示された。以上のことから、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えられる。2018年度に引き続き、2光子励起顕微鏡により経時的に観察された生体組織画像中での免疫細胞の遊走動態を解析する。具体的には、炎症刺激(例えば高脂肪食負荷)についての経過時刻の異なる生体組織中の免疫細胞の動態を比較することで、急性炎症時と慢性炎症時の細胞動態の差異を判別することを目指す。また現在までに開発された深層マッチングによる遊走動態法を拡張し、時間的に隣接する画像フレームだけでなく、空間的に深さ方向で隣接する画像フレームでも深層マッチングを行うことで、遊走細胞の深さ方向も含めた3次元的な動態を解析するとともに、細胞領域の検出(セグメンテーション)にグラフカット法を応用することで検出精度を向上させる。次に、1細胞トランスクリプトーム解析では、炎症刺激の開始からの経過時刻の異なる生体組織中の免疫細胞の1細胞発現プロファイルから、得られた各細胞単位の遺伝子発現量のセットを各細胞の刺激応答の時系列上で占める位置を推定する手法を開発する。特に、細胞の状態変化は複数の系列で進む(同じ刺激に対する複数の応答に相当する)ことがあり、疑似時間を形成する細胞の系列は分岐を含む木構造を取るため、本研究でも分岐を含む経路に沿って疑似時間を推定できる手法の確立を目指す。さらに、解析結果を基に、炎症状態での免疫細胞の遊走動態を、数理モデルを作成して、そのモデルに基づいて遊走シミュレーションを行い。数理モデルの妥当性を判定する。
Gsdfから性決定遺伝子へ独立に進化した3種のメダカの性決定遺伝子誕生機構の解明

本研究は、脊椎動物にみられる性決定遺伝子の多様性を理解するために、性決定遺伝子が頻繁に交代するメダカ属において、常染色体のGsdfから独立に性決定遺伝子に進化した、性決定遺伝子がGsdfである3種のメダカ(ルソンメダカ、ペクトラリスメダカ、長崎産ミナミメダカ)を用いて、性決定遺伝子誕生の分子機構を特定しその共通性を解明することを主目的とした。本年度の成果の概要は以下の通りである。1)長崎県産ミナミメダカの性決定遺伝子の原因となった塩基配列の探索新規性染色体であるneoY上のGsdf(GsdfneoY)のコーディング領域のノックアウト個体が雌に分化するため、新規性決定遺伝子である。また、neoX上のGsdf(GsdfneX)とGsdfneoYのアミノ酸配列は同じであることから、本性決定遺伝子の原因配列はシス領域にあると推定されている。そこで、GsdfneoYとGsdfneXとミナミメダカのHd-rR系統のGsdfの上流と下流の塩基配列を隣接する遺伝子まで決定し、GsdfneoY特異的な塩基配列の変化を調べたところ、60カ所程度のSNPと上流に5.5kbの挿入を発見した。さらに、5'RACEによってGsdfneoYのmRNAの完全長を決定したところ、通常のGsdfのmRNAの他に、上流の5.5kbの挿入配列の一部を用いた新規のGsdfのmRNAが転写されていることを発見した。これらの結果から、この挿入を性決定遺伝子になったの原因の候補配列とした。2)長崎県産ミナミメダカの性決定遺伝子の原因となった塩基配列の決定GsdfneoYの5.5kbの挿入配列が性決定機能を獲得した原因であることを確かめるために、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集技術を用いて、この挿入配列の欠失個体を作成した。その結果、GsdfneoYの5.5kbの挿入配列の欠失個体が雌へと分化したことから、この配列が原因であることを強く示唆した。性決定遺伝子がGsdfである3種のメダカ(ルソンメダカ、ペクトラリスメダカ、長崎産ミナミメダカ)を用いて、性決定遺伝子誕生の分子機構を特定しその共通性を解明は以下の3種において4つの行程を同時並行して行っている。1)生殖巣の生殖細胞数の二型が見られる時期からの性決定遺伝子の機能時期の推定。2)性決定遺伝子の発現時期と場所の決定。3)性決定遺伝子の下流で働く性決定カスケードの解明。4)性決定遺伝子の原因となった塩基配列の特定。本年度は、本研究の主目的である特長崎産ミナミメダカの4)に進展が見られたことから(2)と判断した。また、本年度も2つ性決定遺伝子を持つ長崎産ミナミメダカ個体群と周辺の個体群を調べたところ、周辺には2つ性決定遺伝子を持つ個体群は存在しないことが明らかになった。今後も2つの性決定遺伝子が共存し変化していく過程を観察するために、引き続き調査を行う予定である。今後の研究計画に変更はなく、性決定遺伝子がGsdfである3種のメダカ(ルソンメダカ、ペクトラリスメダカ、長崎産ミナミメダカ)を用いて、性決定遺伝子誕生の分子機構を特定しその共通性の解明を行う。本年度は特に長崎産ミナミメダカの性決定遺伝子の原因配列が5.5kbの挿入であることが明らかとなったため、今後はこの挿入配列がなぜ性決定機能を獲得させることができたかをゲノム解析などによって解明していく予定である。また、長崎産ミナミメダカのGsdfneoYとペクトラリスメダカのGsdfbYには、新規の転写開始地点を持つこと、常染色体のGsdfにはないユビキタスな発現を持つ共通点がある。GsdfbYの原因配列もGsdfneoYと同様の機構がある可能性があるので、ペクトラリスメダカのゲノム解析も行う予定である。1.ペクトラリスメダカの性決定遺伝子GsdfbY孵化後の生殖巣の観察により、孵化直後に生殖細胞数の二型(XX.>XY)が見られた。この結果から、既に生殖巣の発生パターンが明らかになっているミナミメダカと同様の孵化前後に性決定遺伝子が機能することを明らかにした。そして、重複によって生じたGsdfbYの発現パターンを解析するために、常染色体上のGsdfと区別できる定量PCRの測定系を確立した。この方法によって、常染色体のGsdfが生殖巣特異的な発現パターンを持つのに対し、GsdfbYの発現量が一定のユビキタスな発現パターンを持つことを明らかにした。2.性分化関連遺伝子の定量PCRによる測定系の確立3種の性決定遺伝子機能後に働く、性分化に関連する遺伝子の順序である性決定カスケードの変化と共通性を明らかにするため、ミナミメダカにおいて生殖巣の発生過程で発現量に性差が報告されている10以上の性分化関連遺伝子の定量PCRによる測定系を確立した。

その結果、Dmyを性決定遺伝子に持つミナミメダカの近交系のHd-rR系統において6つの性分化関連遺伝子(Gsdf, Dmrt1, Scp3, Figa, Foxl3, Amhr2)に発現量の性差が存在することを明らかにした。性決定遺伝子がGsdfである3種のメダカ(ルソンメダカ、ペクトラリスメダカ、長崎産ミナミメダカ)を用いて、性決定遺伝子誕生の分子機構を特定しその共通性を解明は以下の3種において4つの行程を同時並行して行っている。1.生殖巣の生殖細胞数の二型が見られる時期からの性決定遺伝子の機能時期の推定。2.性決定遺伝子の発現時期と場所の決定。3.性決定遺伝子の下流で働く性決定カスケードの解明。4.性決定遺伝子の原因となった塩基配列の特定。「研究実績の概要」には示していないが1-4の行程も順調に進んでいることから(2)と判断した。また、2つ性決定遺伝子の実態調査として、長崎産ミナミメダカの現地調査を行った。2つの性決定遺伝子が共存していることの再確認と、周辺のメダカの生息状況も概ね確認できたので引き続き調査を行う予定である。本研究は、脊椎動物にみられる性決定遺伝子の多様性を理解するために、性決定遺伝子が頻繁に交代するメダカ属において、常染色体のGsdfから独立に性決定遺伝子に進化した、性決定遺伝子がGsdfである3種のメダカ(ルソンメダカ、ペクトラリスメダカ、長崎産ミナミメダカ)を用いて、性決定遺伝子誕生の分子機構を特定しその共通性を解明することを主目的とした。本年度の成果の概要は以下の通りである。1)長崎県産ミナミメダカの性決定遺伝子の原因となった塩基配列の探索新規性染色体であるneoY上のGsdf(GsdfneoY)のコーディング領域のノックアウト個体が雌に分化するため、新規性決定遺伝子である。また、neoX上のGsdf(GsdfneX)とGsdfneoYのアミノ酸配列は同じであることから、本性決定遺伝子の原因配列はシス領域にあると推定されている。そこで、GsdfneoYとGsdfneXとミナミメダカのHd-rR系統のGsdfの上流と下流の塩基配列を隣接する遺伝子まで決定し、GsdfneoY特異的な塩基配列の変化を調べたところ、60カ所程度のSNPと上流に5.5kbの挿入を発見した。さらに、5'RACEによってGsdfneoYのmRNAの完全長を決定したところ、通常のGsdfのmRNAの他に、上流の5.5kbの挿入配列の一部を用いた新規のGsdfのmRNAが転写されていることを発見した。これらの結果から、この挿入を性決定遺伝子になったの原因の候補配列とした。2)長崎県産ミナミメダカの性決定遺伝子の原因となった塩基配列の決定GsdfneoYの5.5kbの挿入配列が性決定機能を獲得した原因であることを確かめるために、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集技術を用いて、この挿入配列の欠失個体を作成した。その結果、GsdfneoYの5.5kbの挿入配列の欠失個体が雌へと分化したことから、この配列が原因であることを強く示唆した。1)生殖巣の生殖細胞数の二型が見られる時期からの性決定遺伝子の機能時期の推定。2)性決定遺伝子の発現時期と場所の決定。3)性決定遺伝子の下流で働く性決定カスケードの解明。