hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境応答における植物二次代謝発現制御の分子機構解明

1.アントシアニン分子の修飾ならびに輸送に関与するタンパク質の同定MYB様転写因子PAP1の過剰発現により発現上昇するアシル転移酵素、カルコン異性化酵素ならびにグルタチオンS-転移酵素(GST)について組換えタンパク質を用いた機能解析とT-DNA挿入ノックアウトラインのフラボノイド分析を行い、蓄積される代謝物変動から機能を解析した。2.カンプトテシン生産と自己耐性獲得機構について強力なDNAトポイソメラーゼI阻害剤カンプトテシンを生産する植物の自己耐性機構を調べた。その結果、カンプトテシンを生産する植物では、トポイソメラーゼIに特異的なアミノ酸変異が起こることで、耐性能を獲得していることが明らかになった。また、カンプトテシンを生産しない近縁植物リュウキュウイナモリのDNAトポイソメラーゼIについても調べた結果、生産植物の変異による自己耐性能の獲得はカンプトテシンの生産能の獲得と共進化していることが明らかになった。3.キノリチジンアルカロイド生合成の細胞内局在と生物学的意義についてLupinus angusutifoliusにおいてアルカロイド生産するビター品種特異的遺伝子のうち、オルニチン脱炭酸酵素ホモログ(LaDC)、アミン酸化酵素ホモログ(LaAO)、アシル転移酵素ホモログ(LaAT)に関する機能解析と細胞内局在解析を行った。LaDCはリジン脱炭酸活性を有することが明らかになった。さらにキノリチジンアルカロイドを生産する他のマメ科植物も同型の酵素を有することが明らかとなり、本酵素の存在がキノリチジンアルカロイド生産能の分化と関係があることが示唆された。環境応答により発現変動する植物二次代謝について、生合成経路を構成する触媒酵素遺伝子、転写制御遺伝子の探索と機能解析を行った。ルピナスにおけるキノリチジンアルカロイド生合成について、アルカロイドを生産するビター品種と非生産のスイート品種を用いてビター品種特異的な遺伝子をプロファイリングし、アルカロイド生産に関与するリジン脱炭酸酵素遺伝子を単離した。組換え酵素の反応特性を解析し、リジンを優先的に脱炭酸し、ポリアミンのカダベリンを生産する酵素であることを明らかにした。このタンパク質に特有なアミノ酸変異は、キノリチジンアルカロイド生産植物に特異的であることが示された。また、抗ガン剤原料カンプトテシンを生産するアカネ科チャボイナモリ毛状根に特異的に発現するCYPならびにERF転写因子についてRNAi法による遺伝子抑制を行い、代謝物蓄積への影響を調べることにより、これらが関与する生合成ステップを推定した。さらにトポイソメラーゼを強力に阻害して細胞毒性を示すカンプトテシンを生産する植物の自己耐性機構について解明した。その結果、生産植物の進化において、カンプトテシンの標的タンパクの変異とともに代謝の進化が起こったことが推測された。このように代謝進化とタンパク質の分子進化の関係を明らかにした。
骨髄における巨核球造血/脂肪細胞へのスイッチ制御機構の解明

巨核球と脂肪細胞の両方への分化能を有する細胞、そしてそれらどちらにも分化しない繊維芽細胞を用いた遺伝子発現解析において差異の認められたいくつかの因子の遺伝子導入細胞を種々のアプローチにより検討した結果、p45NF-E2/Maf G/Maf Kが巨核球分化決定因子であり、脂肪分化決定因子CEBPalphaの共発現の条件下では巨核球分化が抑制される事を認めた。したがって、p45NF-E2/Maf G/Maf KとCEBPalphaが巨核球と脂肪の分化スイッチ機構において重要な役割を有する事を見いだした。骨髄が脂肪変性におちいった時、造血機能が著明に低下することはよく知られている事実であるが、その病態の分子機構は不明である。申請者らは最近、新規開発の分化誘導法にて、脂肪組織から巨核球分化・血小板産生が起こる事、脂肪前駆細胞株からも血小板が効率良く産生され得ることを見出し、その機序に脂肪分化関連因子が関与する事を明らかにした。本研究ではこれらの研究を発展させ巨核球と脂肪細胞両方への分化能を有する細胞を用いて、その分化スイッチ機構を制御する因子の同定を行い、骨髄脂肪変性と巨核球造血への運命決定機構を解明することにより、造血機能不全、特に血小板減少症の病態の分子機構の理解に基づく新たな治療法の開発を目指す。本年度は、巨核球・脂肪細胞の両方へ分化能を有することを申請者が明らかにした数種の細胞株や胚性幹細胞、あるいはどちらへの分化能も有さない細胞株から巨核球や脂肪細胞にin vitroにて分化誘導する際、その細胞分化決定のスイッチに関与すると考えられる候補因子の遺伝子導入を行い、巨核球や脂肪細胞への分化能への影響を検討した。種々のアプローチによる検討の結果、巨核球造血への運命決定因子として転写因子p45NF-E2/Mafを同定するに至った。p45NF-E2/Mafは巨核球からの血小板産生に重要であることはよく知られているが、本研究において、マウス繊維芽細胞、ヒト成人繊維芽細胞がp45NF-E2/Maf遺伝子導入により巨核球に分化することを認めた。巨核球造血への運命決定因子はこれまで不明であり、本知見が初めてである。次年度は脂肪分化決定因子として既に報告されている転写因子のPPARγやCEBPαとp45NF-E2/Mafの相互作用に着目した研究を行い、巨核球造血/脂肪細胞への分化スイッチ制御機構の解明に迫りたい。本研究は、巨核球・脂肪細胞の両方へ分化能を有することを申請者らが明らかにした数種の細胞株や初代培養細胞、あるいはどちらへの分化能も有さない細胞株を用いて、その分化スイッチ機構を制御する因子の同定を行い、骨髄脂肪変性と巨核球造血への運命決定機構の解明を目的とした。具体的には、それら細胞から巨核球や脂肪細胞にin vitroにて分化誘導を行う際、その細胞分化決定のスイッチに関与すると考えられる候補因子の遺伝子導入を行い、巨核球や脂肪細胞への分化能への影響を検討した。種々のアプローチによる検討の結果、巨核球造血への運命決定因子としてp45NF-E2/Maf G/Maf Kを同定した。マウス繊維芽細胞株やヒト成人皮膚繊維芽細胞にこれら転写因子の組み合わせを遺伝子導入し、巨核球分化誘導培地にて培養を行うと巨核球分化・血小板産生が認められた。巨核球造血への運命決定因子はこれまで不明であり、本知見が初めてであった。次に脂肪分化への決定因子として既に報告されている転写因子PPAR gammaやCEBP alphaと前述のp45NF-E2/Maf G/Maf Kを単独あるいは種々の組み合わせでマウス繊維芽細胞株とヒト成人皮膚繊維芽細胞に遺伝子導入を行い、巨核球や脂肪細胞にin vitro分化誘導を行った。種々の詳細な検討の結果、マウス繊維芽細胞株やヒト成人皮膚繊維芽細胞にp45NF-E2とCEBP alphaを遺伝子導入し、巨核球分化誘導培地にて培養を行うと巨核球分化・血小板産生の抑制が認められた。転写因子データベースを用いたコンピューター予測ではp45NF-E2のプロモーター領域にCEBP alphaの結合部位が存在する事を認めた。本研究において、p45NF-E2とCEBP alphaが巨核球と脂肪の分化スイッチ機構において重要な役割を有することを見いだした。
植物由来成分の歯周病予防薬としての役割に関する研究

植物由来ポリフェノールの歯周病予防効果について検討する目的で、フランス海岸松抽出成分(PYC)の抗菌活性および実験的歯周炎における歯槽骨吸収抑制能について検討した。その結果、PYCには明らかなP. gingivalisに対する抗菌活性が認められ、P. gingivalis感染による誘導されるラット歯槽骨吸収を抑制することが明らかとなった。さらに、本抽出物は共培養系を用いた破骨細胞分化誘導を濃度依存的に阻害するとともに破骨細胞の延命時間を短縮することが判明した。以上の結果から、フランス海岸松抽出物は歯周炎の治療や予防に有用である可能性が示された。本研究は、日常的に摂取する食品やサプリメントによる歯周病予防効果の評価を目的としている。平成24年度はラットを用いた歯周病モデル実験での抑制効果を確認した。当該年度(平成25年度)は、松樹皮由来ポリフェノールおよび鶏血藤について細胞培養実験系を用いて1P. gingivalisのヒト歯肉上皮細胞への付着阻害、2破骨細胞分化誘導抑制効果について検討した。1歯周病原細菌であるP. gingivalisはヒト歯肉上皮細胞へ付着することが知られている。この際、P. gingivalisを松樹皮由来ポリフェノールを用いて前処理を行った結果、濃度依存的に顕著な付着阻害作用が認められた。また、松樹皮由来ポリフェノールには、P. gingivalisの細胞内侵入性に対する阻害効果も認められた。2破骨細胞の分化は、Type I-Pコラーゲンで表面処理した48well plateに5-10週齢のBALB/cマウスの大腿骨から採取した骨髄細胞と破骨細胞の分化支持能を持つ細胞であるMC3T3-G2/PA6を10%FBS、M-CSF、ビタミンD3、デキサメタゾンを含むα-MEM培地で7日間共培養することにより誘導した。この培養系に種々の濃度の松樹皮由来ポリフェノールあるいは鶏血藤を添加した場合、3核以上のTRAP陽性破骨細数が明らかに減少し、破骨細胞分化誘導を抑制することが明らかとなった。さらに、破骨細胞の活性化抑制について、5-10週齢のBALB/cマウスの大腿骨から採取した骨髄細胞をM-CSF、RANKLを含むα-MEM培地で7日間培養し形成した成熟破骨細胞に種々の濃度の松樹皮由来ポリフェノールおよび鶏血藤を添加すると、成熟破骨細胞のアポトーシスが誘導されることが明らかとなった。本研究は、日常的に摂取する食品やサプリメントによって歯周病が予防できないかという点について検討することを目的として行われている。当該年度(平成24年度)は、松樹皮由来ポリフェノールおよび鶏血藤を用いて、1抗菌活性の測定および2実験動物による口腔内感染実験を行った。1抗菌活性については、適当な濃度の松樹皮由来ポリフェノールあるいは鶏血藤を含んだ細菌培養用培地を用いて、歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalisを培養し、発育素材が認められるかについて検討した結果、いずれのポリフェノール類にもP. gingivalisに対する有意な発育阻害効果および殺菌効果が認められた。2実験動物による口腔内感染実験は、松樹皮由来ポリフェノールおよび鶏血藤が歯周炎における歯槽骨吸収を抑制するかという点について、ラットを用いたPorphyromonas gingivalis感染による実験的歯周炎モデル(in vivo)での阻害実験を用いて検討した。すなわち、ラット口腔内へのP. gingivalis ATCC 33277株生菌を感染し、各ポリフェノール類をP. gingivalis生菌を接種する時期と前後して短期的に抗菌活性の認められた濃度を目安にラットに接種することによる歯槽骨の吸収量を、上顎臼歯部のセメントエナメル境から歯槽骨頂までの距離を測定して評価した。その結果、松樹皮由来ポリフェノールおよび鶏血藤には明らかな歯槽骨吸収抑制効果が認められた。本研究は、日常的に摂取する食品やサプリメントによる歯周病予防効果を評価することを目的としている。また、平成25年度は松樹皮由来ポリフェノール(ピクノジェノール)が細胞培養系を用いたP. gingivalisのヒト歯肉上皮細胞への付着・侵入を阻害し、さらに歯槽骨吸収の原因となる破骨細胞の分化を抑制すること、ならびに成熟破骨細胞のRANKL刺激による延命活性をも抑制することを確認した。当該年度(平成26年度)は、松樹皮由来ポリフェノール(ピクノジェノール)をチューイングガムに混合し、日常的なガム摂取による口臭抑制効果、およびガム摂取による口腔常態が改善されるかについて検討した。被験者は糖尿病などの全身疾患を有せず、現在、歯周治療を行っていない者を対象とし、1日6回、ピクノジェノールガムあるいはプラセボガムを4週間噛むことによって評価した。

口臭抑制効果については、実験開始時、開始2週間後、4週間後に口気中の揮発性硫化物量を測定することにより評価した。その結果、ピクノジェノールガムの摂取により、実験開始2週間後から有意な揮発性硫化物量の減少が認められた。微生物学平成24年度はラットを用いた実験的歯周炎において、鶏血藤、松樹皮由来ポリフェノールを投与することにより、歯周炎の特徴である歯槽骨吸収を抑制することが明らかとなった。そこで、当該年度はこれらの植物由来成分が骨吸収の原因となる破骨細胞の分化を抑制するかについて検討した結果、有意な抑制効果が認められた。破骨細胞の分化や活性化の抑制に関しては、茶カテキンなどを用いた研究でも報告されており、本研究でも予想されたものである。平成24年度は、主にラットを用いた実験的歯周炎での鶏血藤、松樹皮由来ポリフェノールの阻害効果について検討を行った。ラット歯周炎モデルは、分担者の浜田が多く報告してきた方法であり、熟練した手法を用いて研究を遂行した結果、P. gingivalisにより誘導される歯槽骨吸収に対して、植物由来成分による十分な抑制効果が認められた。また、これらの植物由来成分には、P. gingivalisに対する抗菌活性が認められており、現在までの研究で歯周炎誘発を抑制する可能性が示された。この結果は、申請時に予想されたものであり、おおむね研究は順調に進展している。平成25年度までの研究結果から、植物由来成分は、P. gingivalisをラットに感染させて惹起させる歯周炎を抑制し、破骨細胞分化・活性化に対する抑制作用を有することが明らかとなった。今後は、効果の認められた植物由来成分を配合したガムまたは飲料水を作製し、日常的に摂取することによる口腔状態の改善について検討する。動物実験において、歯周炎予防に役立つ可能性が示された植物由来ポリフェノールが、単純に歯周病原細菌に対する抗菌活性を持ち合わせているために、細菌の口腔内定着を抑制した結果ではないことを証明する。口腔内への定着抑制については、さらに培養細胞を用いた付着阻害実験、バイオフィルム形成阻害実験で検討を重ねることで評価を行う。次いで、植物由来ポリフェノールが直接的あるいは間接的に骨吸収を引き起こす破骨細胞の分化誘導や活性化を阻害することについて検討を行い、各種ポリフェノール類が単純な抗菌活性によるものではない骨吸収阻害作用を有することを証明する。平成25年度は、in vitroの実験を中心に行う。1.ヒト歯肉上皮細胞への付着性:P. gingivalisによる歯槽骨吸収は口腔内への定着から始まるため、植物由来成分によるヒト歯肉上皮細胞へのP. gingivalisの付着性抑制性について検討する。即ち、P. gingivalis菌を細胞に添加後、37°Cで90分間インキュベートして細菌を付着させ、付着した細菌数をBHI血液平板に塗抹することで計測する。この際、P. gingivalis菌を各種ポリフェノールを用いて前処理を行い、同様に付着させ未処理の場合と比較してポリフェノールによる菌の付着阻害について検討する。
履行不能の法的構造-不能法理の基礎的研究

第一に、ドイツ法の履行不能に関する法理及び立法過程についての検討を行った。その結果、ドイツ民法制定時より不能の理解に相違があり、今日における不能学説の混迷の遠因となっている点が明らかになった。第二に、ドイツにおける法改正前後の議論の検討を行った。その結果、原始的不能の効果、統一要件の是非、不能概念の射程、債務者の帰責事由の意義などにつき、一定の知見を得ることができた。2010年度は、ドイツ法における履行不能概念・法理の生成面に主に焦点を当て、沿革的検討を行った。不能概念に関しては、19世紀半ばのサヴィニー・モムゼンよる理論的精緻化の後、ドイツ民法のキューベル部分草案においてほぼ完成を見るに至る。もっとも、その内容を仔細に検討すると、各論者の見解には、その内容的共通性も認められる一方で、看過しえない断絶も存在していることが明らかとなった。具体的には、原始的不能に関する法的効果の導出根拠を、サヴィニーは債務の性質論に、モムゼンは意思理論に、キューベルは目的物の客観的不存在から法的効果に見出している。これら相違は、不能法理を他律的と捉えるか自律的と捉えるか、また、演繹的で固定的なものとするか政策論的で柔軟な運用を認めるかという視角から区分でき、それぞれを不能法理に関する理論モデルとして位置付けうることが判明した。また、後発的不能については、導出根拠よりも、むしろその外延確定に顕著な差異が見られた。これは、不能を規範的概念と見て評価余地を広く残すか、より狭い概念として措定するかという問題と関連するものであり、やはり先の理論モデルの帰結にも影響をもたらす相違である。以上のような検討から、ドイツ民法制定時点において、既に、不能法理の基礎付け・射程につき異なる理解があり、それが今日における不能学説の混迷の端緒となっているという仮説を提示した。これらを踏まえ、上記仮説を論証し、その止揚可能性に向けて、上記理論モデルと今日の議論状況との偏差を検討する作業を継続中である。本研究課題は、日本民法の履行障害法(債務不履行法)体系再編の準備作業として、履行不能「概念」の存在意義と、その法的構造及び効果を解明することを目的としている。2010年度は、ドイツ民法典(BGB)の制定過程を中心に、履行不能概念の体系化・精緻化を巡る議論を分析し、その理論的基盤となりうるいくつかの仮説モデルを提示した。2011年度は、前年度の作業を承けて、BGB制定後、及び、2002年に施行されたドイツ債務法改正(債務法現代化法)の前後に激しく交わされた議論を中心に、仮説モデルの今日的妥当性とその止揚可能性を検討した。これにより明らかとなったのは、凡そ以下の点である。まず、原始的不能において、当事者が契約締結時に何を「予定」していたか(または、「予定」していなかったか)という意思は、それを無効とする旧来的思考の根拠(仮説)いずれにおいても、考慮要素として挙げられている。その限りでは、原始的不能=有効を主張する「契約基底的」な立場との隔たりは少ない。立場の分かれ目は、当事者が通常如何なる内容で契約を締結するかという原則的な意思解釈のスタンスの違いである。しかし、原則的意思を如何に設定するかは、当事者属性や契約目的物、「不能」と評価されるに至った原因等の変数に応じて変わりうるため、一概には決しえず、類型的な考察が必要となる。以上の意味において、原始的不能の契約の有効・無効という議論は、その問題設定自体に問題を孕んでいる可能性がある。次に、原始的不能と後発的不能の峻別について、両者を統一の要件下に置くという立場に対しては、(上とも関連するが)原始的不能では一定事項に対する意思の不存在を考慮する必要があり、錯誤無効と親和的であるのに対し、後発的不能についてはリスク判断完了後の事由のため事情変更の原則と親和的となるといった点で、部分的には重なるもののなお固有の領域があると考えられる。最後に、債務者解放事由としての帰責事由の存否に関しては、とりわけ不能・給付困難峻別論からは、帰責事由は「不能」判断に織り込み済みとも言え、独自に存否を問う必要性は乏しい。総じて、従来の議論の錯綜は、その前提としての「不能」評価の不誘明性に端を発していると解され、この点の解明が必須である。
マウス脳腫瘍モデルを用いた免疫治療の検討

マウス脳腫瘍モデルを用いた免疫治療の検討を行うことにより、臨床治験に役立つ基礎的データを集積することが本研究の目的である。マウス脳腫瘍モデル作成後、腫瘍内へ樹上細胞を投与し、翌日に養子免疫療法としてCD8T細胞を静脈投与した。結果として、腫瘍内に樹状細胞を投与することにより、腫瘍抗原をT細胞に抗原提示し、かっ樹状細胞から分泌される様々なサイトカインによりケモカインがより多く分泌され、静脈投与されたT細胞が効率的に遊走、集積し腫瘍細胞を攻撃する結果が得られた。方法としては、まずin vitroでovalbmin(OVA)を発現しているmouse melanomacell line(M05)を培養し腫瘍細胞を準備した。C57BL/6系マウスに定位的に上記で準備したMO5を脳内に注入しマウス脳腫瘍モデルを作成した。一方で養子免疫療法のための腫瘍抗原特異的リンパ球を準備した。培養中に様々なサイトカインを加えてinterferon gammaを分泌するtype I cytotoxic Tcell(Tcl)に3-4日間で誘導し、上記脳腫瘍モデル作成6-7日後に静脈投与した(養子免疫療法)。腫瘍内投与するための樹状細胞(DC)は、C57BL/6(H-2^b)系マウスの骨髄細胞から採取培養を行なった。腫瘍モデル作成後、5日目に腫瘍内へDCを定位的に投与し、翌日に養子免疫療法として、Tclを静脈投与した。結果として、腫瘍内に樹状細胞を投与することにより、腫瘍抗原をリンパ球に抗原提示し、かつ樹状細胞から分泌される様々なサイトカインにより腫瘍内からケモカインがより多く分泌され、静脈投与されたリンパ球がより効率的に遊走・集積し腫瘍細胞を攻撃する結果が得られた。また有意に脳腫瘍モデルマウスの生存期間が延長した。長期生存したマウスに再度腫瘍を脳内へ移植しtumor re-challengeを行ったところ、樹状細胞投与群では、さらに生存期間が延長した。Tclも腫瘍内へ長期にわたり作用していることがわかった。このことから脳腫瘍モデルマウスに対して樹状細胞やリンパ球投与といった免疫治療を行うことは、将来的にも臨床の場で効果的な治療法となる可能性がある。また本研究の成果は、脳腫瘍患者のみならず、他の癌患者にも、応用できるものと考えられる。方法としては、in vitroでovalbminを発現しているマウスmelanomacell lineを培養し腫瘍細胞を準備し、C57BL/6系マウスに定位的に脳内に注入しマウス脳腫瘍モデルを作成した。一方で養子免疫療法として腫瘍抗原特異的リンパ球を準備した。培養中に様々なサイトカインを加えてtype I T細胞(Tc1)に誘導し、上記脳腫瘍モデルに静脈投与した(養子免疫療法)。腫瘍内投与するための樹状細胞は、同系マウスの骨髄から採取培養した。脳腫瘍モデル作成後、5日目に腫瘍内へ樹上細胞を定位的に投与し、翌日に養子免疫療法としてTc1を静脈投与した。結果として、腫瘍内に樹状細胞を投与することにより、腫瘍抗原をT細胞に抗原提示し、かつ樹状細胞から分泌される様々なサイトカインにより腫瘍内から例えばinterferon inducible protein-10(IP10)といったケモカインがより多く分泌され、静脈投与されたT細胞が効率的に遊走、集積し腫瘍細胞を攻撃する結果が得られた。またこれらの免疫治療により有意に脳腫瘍モデルマウスの生存期間が延長した。長期生存したマウスに再度腫瘍細胞を脳内へ投与し腫瘍再チャレンジを行ったところ、樹状細胞投与群では、さらに生存期間が延長した。Tc1も腫瘍内へ長期にわたり作用していることがわかった。このことから脳腫瘍モデルマウスに対して、樹状細胞や腫瘍抗原特異的T細胞投与といった免疫治療を行うことは、将来的にも臨床の場で効果的な治療法となる可能性がある。
土壌菌核が高濃度に含有するキノンの役割解明

本研究では、菌根菌の一種であるCenococcum geophilumが、休眠体中に高濃度で含んでいる4,9-dihydroxyperylene-3,10-quinone(DHPQ)の役割を明らかにすることを目的とし、“構造強化材の機能"、“電子伝達媒体の機能"、および“抗菌材の機能"について検証した。その結果、DHPQには錯形成能や抗菌能が認められなかった。その一方で、DHPQと菌核粒子には共通して強いラジカル活性が認められた。これらのことから、DHPQは電子伝達媒体、あるいはラジカル暴露から生体を防御する役割、を担っているものと考えられた。具体的には、既報(A. Calderbank et al., J. Chem. Soc., 1954: 1285-1289)に従ってDHPQを合成した。1ロット毎に得られる収量が少ないため、合成を複数回行うことにより約3gの粗DHPQを得た。既報では最終段階で昇華精製を行っていたが、この操作により著しくDHPQの収量が減ってしまうこと、および元素分析計による純度評価で80%以上の純度が確認できたため、本申請課題では昇華精製を行わなかった。得られたDHPQを用いて、先ずは抗菌能の評価を最小発育阻止濃度(MIC)により行った。菌種には大腸菌(Escherichia coli)と黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を用い、DHPQと類似構造を持つテトラサイクリン(抗菌剤)、キニザリン、1,4-ジヒドロキシナフトキノンについても行った。その結果、他の類似化合物では抗菌能が認められたものの、DHPQについては有意な抗菌能が認められなかった。また、MICに用いた類似化合物とともにDHPQの水酸基についてpKaを評価した結果、DHPQのpKaが最も高い(10.4)ことが明らかになった。このことから、通常の環境下でのpHにおいてはDHPQの水酸基はほとんど解離していないことが明らかになった。DHPQとアルミニウムイオンとの錯形成能の評価については、平成25年度の終わりより検討を開始した。平成26年度は、4,9-dihydroxyperylene-3,10-quinone (DHPQ)の物理化学的な性質を中心に検証した。具体的には、水溶液および有機溶媒中におけるDHPQとAlイオンとの錯形成能の検討、FT-IRを用いた菌核粒子中のDHPQの状態推定、およびサイクリックボルタメトリーによるDHPQの電子伝達能の評価を行った。水溶液中では、DHPQの3倍量程度のAlイオンを添加しても、錯形成は確認できなかった。このため、有機溶媒(1,4-ジオキサン)中のDHPQに、500倍量程度までAlイオンを共存させて錯形成を確認した。その結果、2倍量程度でも若干のスペクトル変化は認められたものの、100倍量のAlイオンが存在する時とはスペクトルが明らかに異なっていた。同様の化学構造を持つ5,8-dihydroxy-1,4-naphthoquinone (DHNQ), 1,4-dihydroxyanthraquinone (DHAQ),テトラサイクリンについても検討してみたものの、水溶液中および有機溶媒中での結果はほぼ同様であった。これらのことから、DHPQおよび類似化合物はAlイオンと積極的に錯形成をしないものと結論した。また、粉砕した菌核粒子をFT-IRにより測定し、DHPQ、およびAlと錯形成したDHPQ(DHPQ-Al)のスペクトルとを比較した。その結果、DHPQ-Alに特徴的なピーク(1510 cm-1)は観察されなかった。このことから、菌核粒子に含まれているDHPQは錯形成をしておらず、DHPQそのものとして存在しているものと考えられた。DHPQの電子伝達能については、ジメチルスルホキシド中でのサイクリックボルタモグラムを測定した。その結果、DHNQやDHAQとは異なる挙動が観察されたものの、これについては改めて検証する必要があると考えている。具体的には、菌核粒子を樹脂に包埋した後に薄切片を作成し、透過型電子顕微鏡(TEM)とエネルギー分散型X線分析(EDX)により評価した。その結果、菌核粒子の隔壁内部における構成成分のほとんどが炭素(恐らくDHPQ由来)であり、隔壁内部で一様に分布していることがわかった。菌核粒子に含まれる色素を抽出して吸光スペクトルを確認したところ、DHPQに加えてメラニンも存在することが明らかになった。ESRによる評価では、DHPQとメラニンの両者にラジカル活性が認められ、DHPQの方が強い活性を示した。菌核粒子自体にもラジカル活性が認められたものの、DHPQ-AlとDHPQ-Feについては、ラジカル活性が認められなかった。これらのことから、菌核粒子のラジカル活性はDHPQやメラニンに由来するとともに、菌核粒子内ではAl3+及びFe3+と錯形成していないことが示唆された。DHPQやメラニンに抗菌性が認められなかったこれまでの結果を鑑みると、DHPQは菌核粒子中で電子伝達系としての役割、あるいは環境中でのラジカル暴露から生体を防御する役割を果たしているものと考えられた。また、これらの役割を長期にわたって効果的に果たすためには、DHPQとメラニンの共通した水への不溶性と高い耐光性も、重要な性質であるものと考えられた。

本研究では、菌根菌の一種であるCenococcum geophilumが、休眠体中に高濃度で含んでいる4,9-dihydroxyperylene-3,10-quinone(DHPQ)の役割を明らかにすることを目的とし、“構造強化材の機能"、“電子伝達媒体の機能"、および“抗菌材の機能"について検証した。その結果、DHPQには錯形成能や抗菌能が認められなかった。その一方で、DHPQと菌核粒子には共通して強いラジカル活性が認められた。これらのことから、DHPQは電子伝達媒体、あるいはラジカル暴露から生体を防御する役割、を担っているものと考えられた。本申請課題のうち、DHPQの物理化学的な性質(錯形成能、電子伝達能)と菌核粒子中の存在状態については、これまでの検討結果からほぼ明らかになりつつある。また、昨年度に実施したDHPQの抗菌性についても既に明らかになっていることから、総合的には概ね順調に推移していると判断した。環境化学DHPQの物理化学的な特性等については計画通りに明らかになっているものの、電子顕微鏡等を使った状態観察等については計画通りに進行していない。このため、平成27年度は電子顕微鏡等を使った状態観察を中心に行うことを予定している。本申請課題の評価対象物質である4,9-dihydroxyperylene-3,10-quinone(DHPQ)を、以降の各種評価で用いるのに十分な量(約3g)を合成することができた。また、DHPQのpKaの評価についても行った。申請時の平成25年度計画にあった電子顕微鏡等による菌核粒子の詳細な状態観察は遂行できなかったものの、当初は平成26年度以降の計画としていたDHPQの抗菌能評価を遂行した。このため、おおむね順調に進展していると評価した。次年度使用額が生じた主な理由は、当初計画していた電子顕微鏡を用いた菌核粒子中におけるDHPQの詳細な状態観察を行わなかったためである。その理由としては、平成26年度はDHPQの物理化学的な性質を明らかにすることに重点を置いたためである。その結果、DHPQの物理化学的な性質についてはほぼ明らかにすることができた。また、効率的に研究を遂行するよう努めたことにより、当初の計画よりも予算の使用額を抑えることができた。一方で、電子顕微鏡等による状態観察に至らなかったため、電子顕微鏡等に施設使用料として計上していた予算を執行できなかった。これらの理由により、次年度使用額が生じた。平成26年度は、引き続き合成したDHPQを用いてアルミニウムイオンとの錯形成能の評価を行うとともに、DHPQの電気伝導能の評価を行うことを計画している。また、菌核粒子のサンプリングを行い、電子顕微鏡等による詳細な状態観察を行うことを計画している。本申請課題の遂行にあたっては、電子顕微鏡等による菌核粒子の詳細な状態観察は必須である。このため、使用用途は当初の計画の通り、電子顕微鏡等による詳細な状態観察に使用する。また、予算の効率的な執行によって生じた繰り越し額については、菌核粒子から抽出された高分子化したDHPQの抗菌性の確認に使用することを計画している。本申請課題において次年度使用額が生じた主な理由は、当初計画していた電子顕微鏡を用いた菌核粒子中における4,9-dihydroxyperylene-3,10-quinone(DHPQ)の詳細な状態観察を行わなかったためである。
トレニアの花における付属弁形成機構の解析

CPPU処理したトレニアの花におけるホメオティック遺伝子の発現パターンを調べた。その結果、CPPU処理は、がく、花弁、雄ずい、心皮の基本的な4つの花器官におけるホメオティック遺伝子の発現パターンには影響を及ぼさなかった。しかし、CPPU処理によって発生する花弁の向軸側に発生する付属弁に関しては、興味深い結果が得られた。すなわち、花芽発達の比較的進んだステージでCPPU処理した場合に発生する細長い糸状の副花冠では、ホメオティック遺伝子の発現パターンがいわゆる雄ずい型になっているのに対して、花芽発達の比較的早いステージで処理した場合に発生する平板状の付属弁では、花弁型の発現パターンになっていた。糸状、平板状の副花冠とも、表面構造や着色で判断する限り花弁と同様の器官であるが、ホメオティック遺伝子の発現パターンから判断すると、糸状の付属弁では雄ずいのアイデンティティーを持っていることが明らかとなった。以上から、付属弁の形の制御に、ホメオティック遺伝子が密接に関わることが示唆された。一方、トレニアから単離されたこれらのホメオティック遺伝子が機能を持つ遺伝子であることを証明するために、RNAiコンストラクトを作成しトレニアに導入した。これらのノックダウン植物では、導入した遺伝子の種類によって花序の形態やがくへの着色、雄ずいの花糸の部分の花弁化など、表現形としては弱いものの、予想された通りの形態変化が現れ、これらの遺伝子がホメオティック遺伝子として機能を持つことが明らかとなった。さらに、CPPU処理により、花芽に少なくとも処理後1週間程度の期間にわたってサイトカイニンが蓄積することが明らかとなった。これにより、花芽分裂組織が著しく肥大し、本来退化するはずの雄ずいの托葉が付属弁に発達することが示唆された。これらの結果については、現在論文化を進めているところである。トレニアの花芽に、合成サイトカイニンCPPUを処理したときの付属弁の発生過程を電子顕微鏡等で観察した結果、平板状の付属弁の原基は、雌雄ずい分化期に花弁原基の両脇に発生した。雄ずいと付属弁の原基の位置関係は、葉の原基と葉基の位置関係とよく似ており、付属弁が、雄ずいの托葉由来であることを示していた。また、糸状の付属弁の原基に関しては、花弁伸長期に発生した。その発生位置は、付属弁の基部が花筒と融合していることを考えれば、平板状の付属弁と同様に雄ずいの両脇であった。また、付属弁の組織は、円錐状の表皮細胞など、花弁に特徴的な構造を持っていた。以上から、CPPU処理によって発生する付属弁は、スイセン等の副花冠と同様、雄ずいの托葉が花弁状に発達したものであることが示唆された。一方で、ペチュニアおよびストックにCPPU処理を行ったところ、トレニアで認められた花弁周縁の鋸歯の発生がペチュニアでも認められ、ストックでは、花弁数の増加が認められた。つまり、トレニアと部分的に共通の形態変化が認められた。また、トレニアの花芽から、ホメオティック遺伝子のホモログとして、1種類のクラスA(TfSQUA)、2種類のクラスB(TfDEF、TfGLO)、4種類のクラスC遺伝子(TfFAR、TfPLE1、TfPLE2、TfMADSC4)のcDNAの全塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。いずれも、近縁種であるキンギョソウのホメオティック遺伝子と高い相同性が認められた。トレニアの付属弁が副花冠であることが示唆されたため、参考のため、キンギョソウの副花冠におけるホメオティック遺伝子の発現パターンも調べた。その結果、葯から花糸、副花冠にかけて、発現が雄ずい型から花弁型に連続的に変化しており、花糸での発現は、雄ずい型と花弁型の中間であった。このような発現パターンが、副花冠が花弁状に発達する原因であると考えられた。平成17年度に単離されたトレニアのホメオティック遺伝子のホモログ(cDNA))の各花器官における発現量を定量PCR法によって調べた。ホルクロルフェニュロン(CPPU)処理による付属弁の発生部位は、CPPUを与える花芽発達ステージのよって異なるため、花芽における発達中の花弁を基部、中央部、先端部に分けて定量したところ、クラスAとおよびBの遺伝子がともに発現するいわゆる花弁型のパターンを示すのは基部と中央部のみであり、先端部は、主にBクラス遺伝子だけが発現していた。また、雄ずいにおいても、基部の花糸と先端部の葯とに分けて定量した結果、クラスBおよびクラスC遺伝子がともに発現するいわゆる雄ずい型のパターンを示したのは花糸だけであり、葯では主にクラスC遺伝子だけが発現していた。これらの結果は、ABCモデルの原則が成り立つのは各器官の基部側のみであり、先端部では異なった発現パターンとなることを示している。この理由については不明であるが、付属弁が平板状あるいは糸状に発達する違いの原因となっている可能性もあり、次年度、付属弁における発現パターンを中心に詳細に解析したい。なお、平成17年度に単離したホメオティック遺伝子のホモログについては、現在、RNAiコンストラクトを作成してトレニアに導入中である。次年度、組換え体の解析を行う予定である。ベンジルアデニン(BA)処理は付属弁の発生を誘導しなかったので、CPPUによる付属弁の誘導は、サイトカイニン酸化酵素の阻害作用によって内生サイトカイニンが蓄積することによるものであると考えられた。

一方、付属弁の発生を誘導するCPPU処理では、処理後にまず花芽の花托部の肥大が起こる。この肥大は、付属弁の発生に先立って起こっていた。ところが、付属弁の発生を誘導しないBA処理は、花托部の肥大も誘導しなかった。CPPU処理では、花托部の肥大によって雄ずいの原基の間隔が開き、その隙間を埋めるように付属弁の原基が発生していた。このことから、CPPU処理は、花芽の花托部を肥大させて雄ずいの原基の間隔を広げることにより、本来発生しない雄ずいの托葉(つまり付属弁)の原基を発生させることが推察された。次年度は、CPPUによる花托部の肥大の原因と考えられる花芽分裂組織の肥大について詳細に解析したい。CPPU処理したトレニアの花におけるホメオティック遺伝子の発現パターンを調べた。その結果、CPPU処理は、がく、花弁、雄ずい、心皮の基本的な4つの花器官におけるホメオティック遺伝子の発現パターンには影響を及ぼさなかった。しかし、CPPU処理によって発生する花弁の向軸側に発生する付属弁に関しては、興味深い結果が得られた。すなわち、花芽発達の比較的進んだステージでCPPU処理した場合に発生する細長い糸状の副花冠では、ホメオティック遺伝子の発現パターンがいわゆる雄ずい型になっているのに対して、花芽発達の比較的早いステージで処理した場合に発生する平板状の付属弁では、花弁型の発現パターンになっていた。糸状、平板状の副花冠とも、表面構造や着色で判断する限り花弁と同様の器官であるが、ホメオティック遺伝子の発現パターンから判断すると、糸状の付属弁では雄ずいのアイデンティティーを持っていることが明らかとなった。以上から、付属弁の形の制御に、ホメオティック遺伝子が密接に関わることが示唆された。一方、トレニアから単離されたこれらのホメオティック遺伝子が機能を持つ遺伝子であることを証明するために、RNAiコンストラクトを作成しトレニアに導入した。これらのノックダウン植物では、導入した遺伝子の種類によって花序の形態やがくへの着色、雄ずいの花糸の部分の花弁化など、表現形としては弱いものの、予想された通りの形態変化が現れ、これらの遺伝子がホメオティック遺伝子として機能を持つことが明らかとなった。さらに、CPPU処理により、花芽に少なくとも処理後1週間程度の期間にわたってサイトカイニンが蓄積することが明らかとなった。これにより、花芽分裂組織が著しく肥大し、本来退化するはずの雄ずいの托葉が付属弁に発達することが示唆された。これらの結果については、現在論文化を進めているところである。
進行性腎障害におけるTLR7を介した免疫担当細胞制御の意義

慢性腎不全により透析治療を必要とする患者は依然減少しない。腎障害の発症・進展に慢性炎症が関与していることがこれまで示されている。本研究課題では、進行性腎障害における自然免疫の意義を検討した。その結果、自然免疫に深くかかわる、マクロファージの新たな制御因子を見出した。また、ヒト進行性腎障害において、マクロファージより産生されるマクロファージアポトーシス抑制因子(Apoptosis inhibitor of macrophage :AIM)の沈着が蛋白尿増加、eGFR低下と相関することが明らかとなった。進行性腎障害において、慢性炎症の意義を、マクロファージを中心に解明した。進行性腎障害を、免疫担当細胞・腎固有細胞の慢性炎症の視点から検討し、新たな検査・治療標的を創出することが本研究の目的である。慢性腎不全によって慢性透析に導入される患者数は依然減少を見ず、腎不全のみならず、心血管疾患の合併などで生命予後も不良である。腎障害の発症・進展期には炎症促進系細胞が、また障害修復期には免疫抑制性細胞がそれぞれ関与していることが報告されているが、その詳細や、制御機構については不明な点が多い。我々は、炎症促進性細胞と免疫抑制性細胞のバランスが腎疾患の進展/終息に関与していることを明らかにしてきた。本検討ではToll like receptor(TLR)に着目し、免疫担当細胞の機能制御を検討することによって、疾患活動性のマーカーや治療標的としての基盤を創出したいと考えている。昨年度は、自然免疫に関与するマクロファージと腎疾患に着目して検討を行った。論旨の概要は下記に示すが、マクロファージアポトーシス抑制因子(AIM)が、蛋白尿の増悪、腎機能低下と相関することが明らかとなった。これまで種々の炎症関連タンパクが進行性腎障害の病態に関与することが報告されていたが、本検討において、AIMの腎機能障害に対する関与が示唆された。マクロファージの浸潤が、腎障害を増悪させることが知られているが、成熟型マクロファージから分泌されるAIMも腎障害の促進因子である可能性が示され、今後の治療標的となる可能性も考えられる。これらの結果は日本腎臓学会の英文誌に受理され、出版される予定である。昨年度は、Toll like receptorをはじめとする自然免疫にかかわるマクロファージ着目して検討を進めた。マクロファージアポトーシス抑制因子(Apoptosis inhibitor of macrophage :AIM)は、分化成熟したマクロファージが特異的に産生する約50kDaの分泌型タンパク質であり,マクロファージ自身のアポトーシスを抑制する。近年の研究より分泌された大部分のAIMはIgMと共存していることが明らかとなった。一方で、種々の腎障害による糸球体病変で、IgMの沈着が認められるが、AIMとの関係については明らかではない。そこで、本検討では、腎障害におけるAIMとIgMの病態における意義について検討を進めることとした。ヒト腎生検標本43検体でAIMとIgMを免疫染色により同定し、各臨床パラメーターとの相関を評価した。その結果、糸球体においてAIMとIgMが共存して沈着している面積率と、蛋白尿が相関した。またAIMの面積率と年間eGFRの低下が相関することが判明した。これらの結果は、他臨床パラメーターとの単変量解析、多変量解析においても同様であった。これらの結果は、AIMとIgMが共存することで、腎機能障害が進展する可能性を示していると考えられた。これらの結果はClin Exp Nephrol誌に受理され、2016年4月現在Epub ahead of printとしてウェブ上に掲載されている。今年度は、TLR7をはじめとするパターン認識受容体の、リガンド側因子についての検討を行った。パターン認識受容体の代表的なリガンドとして、細菌などの、病原体関連分子パターン(PAMPs)が挙げられるが、そのうち、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に着目して解析を進めた。近年、ダプトマイシン(DAP)感受性が低下したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)株が報告されている。当院でも、同一患者より分離した、DAP治療中に非感受性となったMRSA株、その後、同薬の中止により感受性の戻った株が認められた。そこで、これら2株の網羅的遺伝子解析を行い、関連する遺伝子を検討することを目的とし、検討を進めた。得られた配列を、コントロール151株と比較した。DAP非感受性株で37199箇所、感受性株で37544箇所の遺伝子変異を認めた。DAP非感受性株に特異的な遺伝子変異を4変異認めたが、いずれもアミノ酸変異を伴っていなかった。DAP非感受性株、感受性株に共通して、アミノ酸変異を伴うミスセンス変異を4遺伝子領域に4変異認めた。これらのうちMprF領域のL826Fは、これまでDAP非感受性への関与が報告されている変異であった。MprFの発現調整因子であるGraR, GraSの遺伝子配列は、両株とも同一の配列であった。これまでDAP非感受性の責任遺伝子と報告される変異が、非感受性株、感受性株ともに認められた。一方で、非感受性株では、細胞壁が厚く、感受性株ではコントロール株とほぼ同等に戻っていた。細胞壁形成関連因子と、その調節因子である二成分制御因子のmRNA発現はDAP非感受性株で更新しており、このことが薬剤耐性に関与することが考えられた。この結果は、現在論文投稿中である。前述のように、本年度は、TLR7をはじめとするパターン認識受容体の、リガンド側因子についての検討を行った。

病原体関連分子パターン(PAMPs)として、種々の炎症を惹起するMRSA、特にDAP非感受性MRSAを解析対象として、網羅的遺伝子解析を行った。遺伝子配列解析と、その変異解析も、順調に遂行できた。さらに、遺伝子の発現解析も、その機序解明のため必要であったが、菌体からのmRNA抽出やリアルタイムPCR法による検討も施行し得た。さらに、その細胞壁を観察する目的で、電子顕微鏡写真の撮影も行ったが、問題なく施行し得た。これらの結果は、英文による論文としてまとめ、現在投稿中である。これらのことから、おおむね計画は順調に進んでいると考えられる。慢性腎不全によって慢性透析に導入される患者数は依然減少を見ず、腎不全のみならず、心血管疾患の合併などで生命予後も不良である。腎障害の発症・進展期には炎症促進系細胞が、また障害修復期には免疫抑制性細胞がそれぞれ関与していることが報告されているが、その詳細や、制御機構については不明な点が多い。進行性腎障害を、免疫担当細胞・腎固有細胞の慢性炎症の視点から検討し、新たな検査・治療標的を創出することが本研究の目的である。今年度は慢性腎不全の一番の原因である、糖尿病性腎症の進展機序と、その防御因子について解析を行った。ヒト血管内皮細胞を、高糖刺激すると、炎症性サイトカイン・ケモカインなどの遺伝子発現が亢進した。また、接着因子などの発現も亢進した。これらのことは、高糖が直接血管内皮の炎症を惹起し、白血球の内皮への接着や、組織浸潤を誘導することを示唆していた。われわれは、さらに、これらの防御因子についても検討し、その薬剤効果を確認した。薬剤添加によって、これらの発現が低下し、炎症が低下したことが確認された。また、炎症関連マーカーのみならず、細胞内シグナルも、高糖および薬剤添加により、変化することが確認された。新たな治療薬の可能性となる結果であり、現在、論文投稿中である。また、これらの動物モデルにおける検討も現在行っている。マウス糖尿病モデルでは、ヒト糖尿病性腎症でみられるような組織所見を得ることはむつかしいが、我々は、片腎を摘出したモデルにより、糸球体の拡大や、尿細管障害などの所見を得ることに成功した。これらのモデルを用いて、糖尿病性腎症の進展を防御する可能性をもつ薬剤について検討を続けている。慢性腎不全により透析治療を必要とする患者は依然減少しない。腎障害の発症・進展に慢性炎症が関与していることがこれまで示されている。本研究課題では、進行性腎障害における自然免疫の意義を検討した。その結果、自然免疫に深くかかわる、マクロファージの新たな制御因子を見出した。また、ヒト進行性腎障害において、マクロファージより産生されるマクロファージアポトーシス抑制因子(Apoptosis inhibitor of macrophage :AIM)の沈着が蛋白尿増加、eGFR低下と相関することが明らかとなった。進行性腎障害において、慢性炎症の意義を、マクロファージを中心に解明した。現在、TLR7欠損糖尿病性腎症モデルマウスの検討を進めている。
鶏の卵蛋白合成制御機構に関する栄養生理学的研究

1.産卵鶏の各組織における蛋白質合成を測定した結果、肝臓と卵管の蛋白質合成率はその他のどの組織より速いことが判明した。これらの組織間の合成率の違いはRNA:蛋白質比の違いによってほぼ説明された。2.産卵鶏において蛋白質合成速度を測定する際、標識アミノ酸としてLー又はDLー[^<15>N]メチオニンを用いた場合の測定誤差について検討し、DL型の場合には約436%もの過小評価となることを明かにした。3.飼料摂取量の季節変動を考慮にいれて、産卵鶏の成長を予測する数学的モデルを作成した。飼料摂取量の予測には環境気温に対して約5ー6週間の遅れを考える必要があることが示された。4.産卵鶏の産卵周期に伴う蛋白質合成の変動を各組織毎に調査した。体全体ではほとんど影響はみられなかった。これに対して卵管では卵が膨大部に存在するとき最も高い合成量を示したが、肝臓を除くその他の組織では逆に最も低い値を示した。肝臓の蛋白質合成に対する産卵周期の影響はほとんど認められなかった。5.ステロイドホルモンの投与は、鶏ヒナの卵管発達を助長し、オボアルブミンの合成を促進することが判明した。その際、エストロジエン単独投与よりもエストロジエンとテストステロンを組み合わせて投与する方が、より効果的であった。6.鶏ヒナに投与したステロイドホルモンに対する卵管の反応性に品種間で違いがあるかどうかについて検討した。卵用種が最も大きな反応を示し、ついて卵用兼用種、肉用種の順に反応性が低下した。これらの遺伝的要因とステロイドホルモンに対する反応の関連性についての詳しい検討は、今後の研究課題である。1.[^<15>N]アミノ酸のプライムド連続注入を3から6時間行い,鶏の体組織の遊離及び蛋白結合標識アミノ酸の同位体濃度の経時的変化から,それぞれの組織におけるin vivoでの蛋白質合成率の測定法を確立した.その際,同位体濃度の測定にはガスクロマトグラフ質量分析計を使用した.2.鶏の体組織のなかでも肝臓と卵管は非常に速い蛋白質合成速度を持った組織であること,各組織間の合成率の差は主としてRNAの蛋白質に対する相対的な濃度によって説明されることが明かとなった.3.卵管の蛋白質合成には卵管膨大部の蛋白質合成が大きな比重を占めること,その膨大部の蛋白質合成は卵黄の通過とともに大きく変動し,卵黄が漏斗部または膨大部にある時が卵管膨大部自身の蛋白質合成が最大となることが示された.4.同様な連続注入・分析法と高速液体クロマトグラフの併用でin vivoでの卵管中のオボルブミン合成量測定法の開発に成功した.この方法を用いればin vivoでの卵管における蛋白質合成の機構解析が飛躍的に進展するものと思われる.5.鶏ヒナを蛋白質含量及び脂肪含量の異なる飼料で6週間飼育し,その間エストロジェンの筋肉中投与ー中止ー再投与を行った.その結果,特に低蛋白質飼料給与群で卵管の発達が悪かった以外には他の飼料給与区間で大きな差は認められなかった.今後は,より反応性の高い投与量,投与方法や品種を用いてさらに検討することが必要であろう.6.産卵に関する数学的シミュレーションモデルを試作したが,システムとしての反応性や妥当性などの点に依然として多くの点で改良の余地があることが判明した.1.[^<15>N]メチオニンを産卵鶏の蛋白質合成のための標識アミノ酸として用いる場合、DL型ではL型に比べ合成量をかなり過小評価することを見出した。その過小評価の程度は組織毎に異り、436%であった。従って、以後DL型標識メチオニンによる測定値は全て、補正すべきであることが判明した。

2.鶏ヒナにエストロジェン又はエストロジェン及びテストステロンを組み合わせて投与することによって、卵管の発達が著しく促進されることを見出した。また、発達の程度はエストロジェンの単独投与より、テストステロンとの組み合わせ投与の方がより効果的であった。これらの卵管蛋白質から高速液体クロマトグラフを用いてオボアルブミンを分離したところ、卵管の発達程度と平行してオボアルブミン合成が誘導されることが判明した。従って、鶏ヒナにステロイドホルモンを投与して産卵に関する実験モデルを確立できるものと考えられた。3.異なる品種の鶏ヒナにステロイドホルモンを注射して、卵管の発達とオボアルブミン合成誘導における品種差を検討した。ステロイドホルモン注射に対する反応性は卵用種が最も高く、次いで卵肉兼用種、肉用種の順に順下した。従って、遺伝的因子がステロイドホルモンに対する反応性を決定する重要な要因であると考えられた。4.産卵鶏の育成期間中の成長予測に関する数学的モデルの開発を試みた。岐阜県種鶏場より提供されたデータをコンピューターシミュレーションによって解析したところ、飼料摂取量にみられる季節変動は、気温変化に対して約35日の遅れを持つことが判明した。しかしながら、このシミュレーションモデルには飼料蛋白質の質に対する考慮や、産卵モデルとの連結などの点で改良が必要であろう。
計算アルゴリスムの開発と基礎理論

重要で基本的な計算アルゴリスムの一つである中国剰余定理については,開発した高速アルゴリスムの数値実験を行ない,その有効性を検証した。また,有限体上の多項式環においても,この高速アルゴリスムが適用可能であることを注意し,従来の方法と比べて優位であることを示した。(長坂・布施)計算アルゴリスムの基礎となる初等関数の特徴付けの問題については正則条件の下で乗法的関数が巾乗関数の定数倍に限ることを示し,論文とした。さらに,差分条件に対する結果が得られていて,現在は投稿中である。(長坂)誤差のない計算法のアルゴリスムについては,有限数体での部分集合として,ファレ-分数の部分集合をとり,有限長の2進小数をうめ込んで行なえばよいことが知られているが,このうめ込み写像を拡張されたユークリッド互除法の代りに,行列の基本(行)変形でできることを示し,応用として連立一次方程式(合同式)の整数解の解法アルゴリスムを構成し,有用性を検討している。(長坂・布施)計算アルゴリスムの基礎理論としては,計算量の問題を取り扱い,まずアルゴリスムの計算量を相対化の立場から論じた。次いで,クリーネの階層における,ベネットの問題に対して,オラクル(神託)の存在の下での解答を与え,さらに複雑さのクラスのレベルを決定した。また,BPPについての結果も得られた。(田中)2項(多項)係数で作られるパスカルの三角形については,様々な美しい性質が知られているが,GCDやLCMの特別な性質を発見し,さらに一般に拡張すると共に必要十分条件等の計算アルゴリスムを与えた(安藤)。また,ゴッパの符号と整数論との関連をまとめ,未解決の問題を提示し,部分的な解答を与えた。(平松)重要で基本的な計算アルゴリスムの一つである中国剰余定理については,開発した高速アルゴリスムの数値実験を行ない,その有効性を検証した。(平松)中国剥余定理の,有理整数環上での高速アルゴリスムは,長坂ーHoーShiveにより開発されたが,この数値的検証をUBASiC(PCー98)および,REDUCE(法政大学計算センタ-)により行なった。また一般のユ-クリッド環においても婚適用可能であることを示し,特に,有限体上の多項式環上においては,上記コンピュ-タにおいて,実例を計算した(長坂・布施).これらの結果は,「有限体,符号理論,および通信と計算の進歩に対する国際会議」(アメリカ・ラスベガス),日本数学会(北大・福岡大)において,中間報告を行なった.これらは,まとめて学術雑誌に投稿予定である.一方,計算アルゴリスムの基礎理論としては,計算量の問題や,初等関数の特徴付けの問題について,本年度は考察した.まず,アルゴリスムの計算量を,相対化の立場から論じた.つまり,標準的ないくつかの計算量のクラスについて,一意化の問題,および,分離化の問題を定式化し,その相対化版に関していくつかの結果を得た.これは,計算量理論の記述集合論の問題として捕えたものであり,その結果の一部は,「集合論とgeneralized recursion theory」シンポジウム(神戸大)において発表され,論文として発行予定(受理済み)である(田中).また,巾乘関数が,適当な正則条件の下での乘法的関数として特徴付けられるかどうかを検討し,従来得られていた結果の拡張に成功した.巾乘関数のような単数な関数を,より少い性質から決定する特徴付けの問題は,計算アルゴリスムの基礎を一層堅固なものとすることが期待される。