hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超弦理論を援用した、4次元超対称ゲージ理論の非摂動的側面の研究

本年度も、昨年に引き続き超対称ゲージ理論の研究を超弦理論の観点を援用しつつ行った。特に、その中でも、超対称性に加えてスケール変換のもとでの不変性をもつ、超共形ゲージ理論について研究を行った。これらは、強結合であるため安直な摂動的な解析が適用できないが、ここに超弦理論の効能があらわれる。すなわち、超弦理論によれば、通常の4次元の超共形場理論は、1次元高い5次元の超重力理論をアンチドジッター空間上で考えたものと等価であることがわかる。この際、片側が強結合であればもう片側が弱結合になるため、解析が可能になるのである。具体的には、10次元のIIB型超弦理論を、5次元のアンチドジッター空間と5次元の佐々木アインシュタイン空間の積の上で考えたものを解析すれば良い。さて、そのような立場からの研究として、最大の超対称性をもつ理論に関してはこの10年に非常に沢山の研究があるが、最小の超対称性をもつものに関してはここ数年研究が深化した興味深い分野であり、今年度の私の力点はそこにあった。最小の超対称性をもつ超共形場理論の解析のために基本的なデータは、その理論の大域対称性三つの間の三角量子異常である。以上の議論から、その三角量子異常は、重力理論側のデータであらわせるはずである。超共形場理論の種別に対応するのは5次元の佐々木アインシュタイン空間の種別であるから、それら空間の幾何学であらわせるはずである。以上のような考察のもとから、S. BenvenutiとL. A. Pando Zayasの協力のもと、佐々木アインシュタイン空間の幾何学と超共形場理論の三角量子異常の関連について精密に明らかにしたものが今年度の発表論文である。これは超共形場理論の解析において今後基本的な方法となると思われる。立川は、局所化によるインスタントンの数え上げの手法の拡張を研究して、4次元N=2ゲージ理論のベクトル多重項を支配する低エネルギーラグランジアンを再帰的に決定する所謂「接触項方程式」が、例外群を含む一般のゲージ群とハイパー多重項の表現を持つ場合にも成立することを示した(2005年3月の春の学会で報告。論文は準備中)。これは、インスタントンの数え上げを通常の4次元空間で行ったものと、そのブローアップ上で行ったものとを比較することによって行われる。また、立川は受入教官の江口と共同で、超弦理論のカラビヤウへのフラックス付きコンパクト化による4次元N=1超対称理論がどれぐらいありうるかという問題を研究した。現実の素粒子理論は、あと数年で実験にかかりうるところにN=1超対称性があると非常につよく示唆されているので、この研究は実験物理にも大きな意味を持ちうる。その結果、プランクスケールより階層的に低いスケールでゲージ理論があらわれるような真空は比較的沢山あるということがわかった(2004年9月の秋の学会で報告)。しかし、この場合のゲージ理論はパリティ不変性を保つようなものであって、素粒子の標準模型はそれを破っているので、そのようなモデルを探すことが次の問題となってくる。また、立川は、東京工業大の坂井、新田、大橋、衛藤、五十棲、および理化学研究所の太田とともに、N=2超対称可換ゲージ理論のドメインウォール解で、超対称性を半分保つものについて調べ、解のパラーメタのなす空間の構造を解明した(投稿中)。パラメタ空間は、数個の多様体をその中の因子にそって張合わせたような構造をしていることがわかった。また、その張合わせの近傍ではドメインウォール間に興味深い力学が存在することを見いだした。本年度は,昨年に引き続き超対称ゲージ理論の研究を行った。まずひとつには、4次元の非自明超対称超共形ゲージ理論に重点をおいて研究した。超共形ゲージ理論は、その高い対称性のため、摂動論が適用できないような強結合領域に於いても、励起の質量次元などを調べることが出来る。ここ数年新たな例が超弦理論を通じて沢山発見されており、それを調べる手段としては、大きく分けて二つ、一昨年開発されたa-最大化原理というものと、また、AdS/CFT対応とよばれる4次元のゲージ理論の量子的強結合力学を5次元の重力理論の弱結合領域に写像して扱う方法がある。代表者の得て出版したひとつ結果は、この二つの方法を結びつけるというものである。すなわち、a-最大化原理を5次元の重力理論に読み替えると、まさに5次元のドメインウォールを支配するattractor機構になるということを見いだした。また、もうひとつの結果として、Pouliot型とよばれる、SOゲージ群とSUゲージ群の間の右手左手を入れ替える対称性の無い理論と有る理論が、低エネルギーでは一致するという双対性についてa-最大化原理をもちいてより詳しく調べたというものがある。超対称ゲージ理論の別の側面として、超弦理論から4次元の超対称性を導くには内部空間にどのように電場磁場を入れるかに応じて莫大な方法がある。特に、内部空間が特異性を生じる場合に、場合の数が爆発的に増えるが、これまでは特異性が最も簡単な場合にしかその増大ぐあいが調べられていなかった。そこで、その他のより複雑な特異性のもとで増大度がどうなるかを調べた。具体的には、特異性によって生じるソリトンの入れ替えのタイプが与えられれば、増大性を決定できるということを一般に示し、それをArgyres-Douglas特異性とよばれる電子とモノポールが同時に質量ゼロになるような特異点に対して具体的に解析を行った。

本年度も、昨年に引き続き超対称ゲージ理論の研究を超弦理論の観点を援用しつつ行った。特に、その中でも、超対称性に加えてスケール変換のもとでの不変性をもつ、超共形ゲージ理論について研究を行った。これらは、強結合であるため安直な摂動的な解析が適用できないが、ここに超弦理論の効能があらわれる。すなわち、超弦理論によれば、通常の4次元の超共形場理論は、1次元高い5次元の超重力理論をアンチドジッター空間上で考えたものと等価であることがわかる。この際、片側が強結合であればもう片側が弱結合になるため、解析が可能になるのである。具体的には、10次元のIIB型超弦理論を、5次元のアンチドジッター空間と5次元の佐々木アインシュタイン空間の積の上で考えたものを解析すれば良い。さて、そのような立場からの研究として、最大の超対称性をもつ理論に関してはこの10年に非常に沢山の研究があるが、最小の超対称性をもつものに関してはここ数年研究が深化した興味深い分野であり、今年度の私の力点はそこにあった。最小の超対称性をもつ超共形場理論の解析のために基本的なデータは、その理論の大域対称性三つの間の三角量子異常である。以上の議論から、その三角量子異常は、重力理論側のデータであらわせるはずである。超共形場理論の種別に対応するのは5次元の佐々木アインシュタイン空間の種別であるから、それら空間の幾何学であらわせるはずである。以上のような考察のもとから、S. BenvenutiとL. A. Pando Zayasの協力のもと、佐々木アインシュタイン空間の幾何学と超共形場理論の三角量子異常の関連について精密に明らかにしたものが今年度の発表論文である。これは超共形場理論の解析において今後基本的な方法となると思われる。
肥満・糖尿病と発癌を結びつけるグルタミン代謝ネットワークの基盤的研究

近年、肥満や糖尿病は癌の発症、進展、生存に深く関わることが多くの研究から明らかとされている。私はグルタミン代謝の鍵分子GLS2が、ミトコンドリアに存在しαケトグルタル酸を介してTCAサイクルを促進すると共に、グルタチオンを介して抗酸化作用を発揮することを明らかとしてきた。本研究ではGls2ノックアウトマウスを用いて生体内におけるGLS2の生活習慣病と癌における役割を検討した。その結果、Gls2ノックアウトマウスは高脂肪食を負荷すると肥満・高中性脂肪血症・糖尿病といったメタボリック症候群を呈し生存曲線が有意に低下した。更にGls2ノックアウトマウスでは肝癌の進行が有意に増悪することが示された。私はグルタミン代謝の鍵となるGLS2を癌抑制遺伝子p53が制御しエネルギー産生や抗酸化作用を発揮していることを見出し報告してきた。本研究ではこれまでの研究を推し進めIn vivoにおけるGLS2の癌と生活習慣病における役割を明らかとするため以下の実験を行った。1. GLS2の癌と生活習慣病における役割-高脂肪食負荷における肥満モデルマウスおよびNASH-HCCモデルマウスにおけるGLS2の発現解析-高脂肪食負荷モデルマウス、更には生活習慣病と癌の接点で知られるNASH-肝癌の発症過程における経時的なGLS2の発現を検討した。その結果、高脂肪食負荷マウスの肝臓や脂肪においてGLS2発現は有意に増加していた。更にNASH肝でもGLS2の発現は増加するが、肝癌を合併してくると癌部は非癌部に比較してGLS2の発現は低下することが明らかとなった。このことはGLS2が癌と生活習慣病において何らかの役割を果たしていることを示している。2. GLS2ノックアウトマウスの作成とそのフェノタイプの解析そこでGLS2ノックアウトマウスを作製し肝臓と脂肪に焦点を当てGLS2の役割を検討した。遺伝子ターゲテイングストラテジーは、イントロン1にgene trap vectorが挿入されており、exon2以降が翻訳されないようになっている。GLS2ノックアウトマウスはに妊孕性に問題なく、メンデルの法則に従って生まれることが確認された。GLS2ノックアウトマウスは高脂肪食負荷にすると、WTに比較して10週齢から有意に体重増加を示した。両群では摂餌量は同程度であった。更にGLS2ノックアウトマウスでは高中性脂肪血症、糖尿病を呈していた。更に興味深いことにGLS2ノックアウトマウスの肝臓はOil Red O染色で、肝細胞内の脂肪滴が著明、シリウスレッド染色で明らかに繊維化が増加しており、更にMallory小体も認められNASHを来していると考えられた。1. GLS2ノックアウトマウスの作成:GLS2ノックアウトマウスの遺伝子ターゲテイングストラテジーは、イントロン1にgene trap vectorが挿入されており、exon2以降が翻訳されないようになっている。GLS2ノックアウトマウスは妊孕性に問題なく、メンデルの法則に従って生まれることが確認された。2. GLSノックアウトマウスの生活習慣病との関連:6週齢から高脂肪食負荷したGLS2ノックアウトマウスは有意に死亡率が増加した。高脂肪食負荷GLS2ノックアウトマウスは10週齢から有意に体重増加を示し、高インスリン血症、高中性脂肪血症、更にOGTTで耐糖能障害を示し、いわゆるメタボリック症候群を呈していた。更にITTでインスリン抵抗性、ピルビン酸負荷試験で肝臓における糖新生が増加していた。更に肉眼所見でGLS2をノックアウトした肝臓は顕著な脂肪肝を呈しており、各種免疫染色にて肝細胞のballoning,繊維化, mallory小体が認められNASHを来していた。GLS2ノックアウトマウスではDNAの酸化損傷のマーカーである8OHdGが増加しており、NASH肝を呈した背景には、酸化ストレスの増加が関与していると考えられた。3. GLS2ノックアウトマウスにおける癌発症:GLS2が癌の初期発症に関与しているのか検討するためストレプトゾドシンと高脂肪食負荷を組み合わせNASH-HCCモデルであるSTAMマウスを作成した。STAMマウスでは7週齢でNASH, 20週齢でほぼ全例に肝癌を発症することを確認した。更にGLS2ノックアウトマウスではWTに比較して明らかに早期に肝癌を発症することが示された。GLS2ノックアウトマウスの作成に世界に先駆けて作成することに成功した。更に計画していたGLS2の生活習慣病と癌における役割を解明することが出来た。そして、GLS2ノックアウトマウスが、高脂肪食を負荷すると肥満、高中性脂肪血症、糖尿病といったいわゆるメタボリック症候群を呈するといった非常に興味深い結果を得ることができた。詳細な検討によりグルタミン代謝が障害されることで糖新生へとシフトし、更に肥満や酸化ストレスの増加に伴うインスリン抵抗性から糖尿病を発症したと考えられた。更に酸化ストレスの増加が脂肪肝からNASH、更には肝癌への進展に寄与するといった興味深い結果を得ることが出来た。近年、細胞内代謝変化それ自体が老化やインスリン抵抗性などの病態を引き起こすだけでなく癌の発症・進展に関与することが明らかとなり、エネルギー代謝カスケードをターゲットとした抗癌剤の開発競争が世界的に行われている。

私はゲノムの守護神p53が解糖系と並ぶ重要なエネルギー源であるグルタミン代謝のマスターレギュレーターGlutaminase2 (GLS2)を活性化することを見出し、GLS2が好気的エネルギー産生を促進するとともに産生される活性酸素に対しても拮抗的に作用するミトコンドリア制御分子であることを明らかとしてきた。そこで本研究ではGls2ノックアウトマウスを作成し、GLS2を介したグルタミン代謝の破綻が生体内においてどのような疾患と関連するのか検討を行った。その結果、Gls2ノックアウトマウスはメンデルの法則に従って産まれたが、フェノタイプ解析から、高脂肪食を負荷すると肥満・高中性脂肪血症・糖尿病といったメタボリック症候群を呈し、有意に生存曲線が低下することが明らかとなった。一般に、グルタミン代謝は癌細胞の主要なエネルギー源であるため、癌の増悪・進展に作用すると考えられているが、生活習慣病を背景に肝癌を発症するNASH-肝癌マウスモデルSTAMを用いた検討でGls2ノックアウトマウスは有意に肝癌を増悪することが示され、GLS2を介したグルタミン代謝の癌におけるパラドックス作用が証明された。近年、肥満や糖尿病は癌の発症、進展、生存に深く関わることが多くの研究から明らかとされている。私はグルタミン代謝の鍵分子GLS2が、ミトコンドリアに存在しαケトグルタル酸を介してTCAサイクルを促進すると共に、グルタチオンを介して抗酸化作用を発揮することを明らかとしてきた。本研究ではGls2ノックアウトマウスを用いて生体内におけるGLS2の生活習慣病と癌における役割を検討した。その結果、Gls2ノックアウトマウスは高脂肪食を負荷すると肥満・高中性脂肪血症・糖尿病といったメタボリック症候群を呈し生存曲線が有意に低下した。更にGls2ノックアウトマウスでは肝癌の進行が有意に増悪することが示された。GLS2ノックアウトマウスの作成に世界に先駆けて作成することに成功した。更に計画していたGLS2の生活習慣病における役割を解明することが出来た。そして、GLS2ノックアウトマウスが、高脂肪食を負荷すると肥満、高中性脂肪血症、糖尿病といったいわゆるメタボリック症候群を呈するといった非常に興味深い結果を得ることができた。詳細な検討によりグルタミン代謝が障害されることで糖新生へとシフトし、更に肥満や酸化ストレスの増加に伴うインスリン抵抗性から糖尿病を発症したと考えられた。更に酸化ストレスの増加が脂肪肝からNASHへの進展に寄与した可能性が示唆されている。ただ今回の検討ではNASHから肝癌への進行までは検討することが出来ていないため次年度にすすめていく。GLS2遺伝子はヒトおよびマウスにおいて高い蛋白相同性を示し、共に肝臓、脳、膵臓において高発現していた。今後は細胞内代謝に重要や役割を果たしている肝臓、膵臓において臓器特異的にGLS2をノックアウトし臓器特異的な機能を解析することを計画している。内分泌代謝、癌とエネルギー
人工プラークに被われたヒトエナメル質に対するフッ素の脱灰抑制効果

Chemical systemを用いたフッ素によるエナメル質の脱灰抑制効果については従来より数多くの報告がある。細菌と歯質の界面でのフッ素の効果についての研究は非常に少ない。そこで今回、gel-stabilized biofilm systemを用いてフッ素の脱灰抑制効果を調べることを目的とした。エナメル質表面をFーバーニュシ(ビ-ブランド・メデイコ・デンタル)により37°Cで24時間処理した後、1M KOH 50ml中に24時間浸漬し、CaF_2様物質を除去した。このエナメル質をS.mustans NCTC 10449のkilled cellを含む人工プラークで被い、界面のpHをISFETを用いて連続的に記録しながらpH4.2の乳酸緩衝液中で24時間インキュベーションした。また、この時、乳酸緩衝液のpHもガラス電極を用いて同時に連続的に記録した。Fーバーニッシュ処理しないエナメル質にも同様のインキュベーションを行なった。界面でのpHと乳酸緩衝液のpHとの差および、インキュベーション後の微小硬度変化は、F処理群が未処理群よりも有意に小さく、フッ素によるエナメル質の脱灰抑制が明らかとなった。
効果的で質の良い精神的ケアの提供に向けた看護師の対人反応性指標の作成

臨床対人反応性指標の原案を統計学的に検証することを目的としてオンライン上での無記名自記式質問紙調査を実施した。対象者は、全国の精神科病院、救急救命センター、緩和ケア病棟に所属する看護師とした。調査を依頼する対象施設は、層化抽出法によって抽出し、2018年5月から7月に協力を依頼した。調査内容は、対象者の背景、臨床対人反応性指標の原案、対人反応性指標、セルフ・コンパッション尺度、自由記述であった。質問紙の入力期間は2018年9月から10月末とし、施設を通して対象者に調査を依頼した。2018年11月、回答されたデータを業者から受け取り、SPSS.ver24を用いて、統計学的検証を行った.なお、本研究は実施にあたって発表者が所属する大学の倫理委員会の承認を得た(18-050)。調査の結果は以下の通りとなった。研究への協力を依頼した216施設のうち、49施設から協力が得られた。協力が得られた施設で働く看護師1323名に依頼文書を配布し,57名から回答があった.対象者の平均年齢は43.5歳(標準偏差11.7)であった.項目分析を行った結果、4項目が他の項目と関連が低く、見直しが必要であるという結果になった。探索的因子分析の結果、23項目4因子構造となった。既存の尺度との相関に関して、対人反応性指標、セルフ・コンパッション尺度の下位尺度と臨床対人反応性指標の4つの因子は中程度から弱い相関を示した。相関分析の結果から、特に第2因子は視点取得と関連があると考えられた。オンライン調査の結果、回答数が少なく十分な分析が行えないものの、行う予定であった予定通り分析まで終了している。オンライン調査の結果、回答数が少なく、十分な分析が行えない状況となった。オンライン調査は、予定通り実施し、学会誌にまとめている段階であり、遂行することができていると言える。しかし、尺度を完成させるためには修正された臨床対人反応性指標を再度調査する必要があるため、やや遅れていると評価した。2019年度は、郵送法による無記名自記式質問紙調査を行う予定である。その調査によって臨床対人反応性指標の信頼性と妥当性の十分な統計学的検証を行う予定である。
アデノウイルスベクターを用いたアミロイド蛋白質前駆体の機能と神経毒性に関する解析

本研究では遺伝子導入強制発現するベクターとしてアデノウイルスベクターを用い、アミロイド前駆体蛋白質(APP)のニューロンでの作用を研究した。本研究では、ラット個体脳内ニューロンと、培養系としてヒト胚性ガン細胞NTera2(NT2細胞)由来のニューロンを用いた。完全に分化したNT2ニューロンにAPP発現アデノウイルスベクターを導入した。導入後の形態変化を観察したところ、感染後3日目から突起を縮退させ、細胞体も膨潤するなどの変性が観察され、5日目になると変性ニューロンは細胞死を引き起こしていることが確認された。ラット個体脳内に直接導入した場合も良く似た変性形態を示した。ニューロンの変性がどのような経路でもたらされるのかをさらに検討した。まず変性細胞の核の形態をヘキスト染色により顕微鏡で観察した。その結果、核の凝集、分裂化が観察された。さらにDNAの断片化が起きていることをタネル反応により確認した。以上の結果からAPP強制発現によるニューロン変性はアポトーシスであることが示された。またカスパーゼ3が、変性に先立って顕著に活性化されることが見いだされた。これらの結果からアルツハイマー病におけるニューロン変性の際にAPPの過剰蓄積がカスパーゼ3の活性化、さらにアポトーシスを引き起こしている可能性が示唆された。APP分子内のどの領域がアポトーシス誘導に関与しているのかを変異体APPを用いて検討した。その結果、アミロイドβペプチドを含む領域が重要であることを見いだした。またAPP強制発現により細胞内カルシウム濃度が上昇することが見いだされ、このことがカスパーゼ3活性化にいたる細胞内でのシグナル伝達に関与している可能性が示された本研究では遺伝子導入強制発現するベクターとしてアデノウイルスベクターを用い、アミロイド前駆体蛋白質(APP)のニューロンでの作用を研究した。またAPP強制発現により細胞内カルシウム濃度が上昇することが見いだされ、このことがカスパーゼ3活性化にいたる細胞内でのシグナル伝達に関与している可能性が示された本研究では遺伝子導入強制発現するベクターとしてアデノウイルスベクターを用い、in votro、in vivo条件下のニューロンに効率よく遺伝子導入する方法を確立し、その系を用いてアミロイド前駆体蛋白質(APP)のニューロンでの作用を研究した。研究材料として全長型APP695を普遍的で強力なCAGプロモーターによって発現するアデノウイルスベクターを作製した。培養細胞としてヒト分化ニューロンに極めて近い性質を持つ胚性ガン細胞NTera2(NT2細胞)由来のニューロンを用いた。分化したNT2細胞にAPP発見アデノウイルスベクター感染後の形態変化を観察したところ、感染後2日目まででは変化は見られなかったが3日目から突起を縮退させ、細胞体も膨潤するなどの変性が観察された。さらに5日目になるとAPPを多量に発現して細胞内に蓄積しているニューロンでは突起の縮退、細胞表面の不整化などの変性像が認められた。さらにラット脳内に直接アデノウイルスベクターを注入し高効率にニューロンに遺伝子導入する方法を検討した。その結果1M mannitolを含む緩衝液を用いた場合、等張液を用いた場合に比べニューロンへの導入効率が10倍以上高くなることを見いだした。そこで、この条件下でAPP発現ウイルスを感染させ強制発現実験をした。その結果ウイルス注入5日後にはAPPを多量に発現しているニューロンが変性していることを見いだした。変性ニューロンを電子顕微鏡によって観察したところ、軽度のクロマチン凝縮、自己消化像、変性ニューロン周辺のミクログリアの集結、シナプス終末部の膨大や消失、などの変性像が認められた。NT2細胞の場合もラット脳内ニューロンの場合も細胞内に全長型APPが蓄積していることが確認された。以上の結果から全長型APPの多量発現が神経変性をもたらすことが示された。本研究では遺伝子導入強制発現するベクターとしてアデノウイルスベクターを用い、in vitro、in vivo条件下のニューロンに効率よく遺伝子導入する方法を確立し、その系を用いてアミロイド前駆体蛋白質(APP)のニューロンでの作用を研究した。

培養細胞としてヒト分化ニューロンに極めて近い性質を持つ胚性ガン細胞NTera2(NT2細胞)由来のニューロンを用いた。分化したNT2細胞にAPP発現アデノウイルスベクター感染後の形態変化を観察したところ、感染後2日目まででは変化は見られなかったが3日目から突起を縮退させ、細胞体も膨潤するなどの変性が観察された。さらに5日目になるとAPPを多量に発現して細胞内に蓄積しているニューロンでは突起の縮退、細胞表面の不整化などの変性像が認められた。ニューロンの変性がどのような経路でもたらされるのかをさらに検討した。まず変性細胞の核の形態をヘキスト染色により顕微鏡下で覗察した。その結果、核の凝集、分裂化が観察された。さらにDNAの断片化が起きていることをタネル反応により確認した。以上の結果からAPP強制発現によるニューロン変性はアポトーシスであることが示された。現在アポトーシス直接関与している因子、カスパーゼの活性化が起きているのかどうかなどアボトーシスをもたらす経路を検討中である。本研究では遺伝子導入強制発現するベクターとしてアデノウイルスベクターを用い、ヒトニューロンに効率よく遺伝子導入する方法を確立した。その系を用いてアミロイド前駆体蛋白質(APP)のヒトニューロンでの作用を研究した。ヒト初代培養ニューロンに代わる培養系としてヒト分化ニューロンに極めて近い性質を持つ胚性ガン細胞NTera2(NT2細胞)由来のニューロンを用いた。完全に分化し、分裂を終了したNT2ニューロンにAPP発現アデノウイルスベクターを導入した。導入後の形態変化を観察したところ、感染後2日目まででは変化は見られなかったが3日目から突起を縮退させ、細胞体も膨潤するなどの変性が観察された。5日目になると変性ニューロンは細胞死を引き起こしていることが確認されたニューロンの変性がどのような経路でもたらされるのかをさらに検討した。まず変性細胞の核の形態をヘキスト染色により顕微鏡下で観察した。そこでアポトーシスを引き起こすプロテアーゼ、カスパーゼ群の活性化が起きているのかどうかを検討した。その結果カスパーゼ3が、変性に先立って顕著に活性化されることが見いだされた。これらの結果からアルツハイマー病におけるニューロン変性の際にAPPの過剰蓄積がカスパーゼ3の活性化、さらにアポトーシスを引き起こしている可能性が示唆された。本研究では遺伝子導入強制発現するベクターとしてアデノウイルスベクターを用い、アミロイド前駆体蛋白質(APP)のヒトニューロンでの作用を研究した。ヒト初代培養ニューロンに代わる培養系としてヒト胚性ガン細胞NTera2(NT2細胞)由来のニューロンを用いた。
γPKC遺伝子変異による脊髄小脳変性疾患-分子機序解明と新たな治療法探索-

昨年度は遺伝性脊髄小脳失調症14型(SCA14)の原因として同定された変異γPKCは(1)細胞内で凝集体を形成すること(2)アポトーシス性細胞死を引き起こすこと(3)凝集体形成によりユビキチン・プロテアソーム系(UPS)の機能低下を引き起こすこと、を明らかにした。本年度は変異γPKCが細胞死を引き起こすメカニズムをより詳細に検討するとともに、SCA14の病変部位である小脳プルキンエ細胞に対する変異γPKC発現の影響を検討し、以下の結果が得られた。(1)変異γPKC凝集体形成は小胞体ストレスを誘発する。変異γPKC-GFP凝集体の見られるCHO細胞では、小胞体ストレスのマーカーであるPERKのリン酸化およびCHOPの核内発現増大が観察された。これは、CHO細胞にプロテアソーム阻害薬であるlactacystinを処置することによっても誘発された。(2)変異γPKCは初代培養小脳プルキンエ細胞においても凝集体を形成する。マウス胎児由来の小脳初代培養細胞を作製し、アデノウイルスベクターによりプルキンエ細胞選択的に変異γPKC-GFPに発現させると、多くの細胞で凝集体形成が観察された。(3)変異γPKCはプルキンエ細胞の樹状突起面積を減少させる。広範囲に分布する樹状突起を持つ小脳プルキンエ細胞に対し、変異γPKC-GFP発現は樹状突起の分布面積を有意に減少させた。この減少は変異γPKC-GFPの凝集体有無に関係なく観察された。以上の結果より、SCA14において発見された変異γPKCの凝集体はUPSの機能低下を引き起こし、小胞体ストレスを誘発することにより、アポトーシス性細胞死を引き起こすことが示唆された。また、小脳プルキンエ細胞においても変異γPKCは凝集体を形成するものの、樹状突起分布面積を減少させる作用は凝集体の有無に関係ないことから、変異γPKCの易凝集性以外の特性の変化がプルキンエ細胞の樹状突起を減少させ、SCA14患者で観察される小脳皮質の萎縮を引き起こすのではないかと示唆される。本年度は遺伝性脊髄小脳失調症14型(SCA14)の原因として同定された変異γPKCがどのようなメカニズムで神経細胞死を引き起こしているかを解明する目的で、変異γPKC-GFPを培養細胞株に発現させ、その分子生物学的特性を検討し、以下の結果が得られた。(1)変異γPKCは細胞質で凝集体を形成しやすい性質を持つ。(2)変異γPKCの発現により細胞死が誘発された。変異γPKC-GFPを発現するCHO細胞では変異γPKC-GFPの発現量依存的に細胞死が引き起こされた。変異γPKCの凝集体が見られる細胞では活性化caspase-3の増大が観察されたことから、この細胞死はアポトーシスであると考えられる。(3)変異γPKC凝集体形成によりユビキチン・プロテアソーム系の機能低下が引き起こされた。変異γPKC-GFPの凝集体はユビキチン陽性であり、プロテアソームの集積も観察された。また、プロテアソーム感受性のGFP誘導体を用いた検討により、変異γPKC凝集体の見られる細胞ではプロテアソーム活性が低下していることが明らかとなった。以上の結果より、SCA14において発見された変異γPKCは細胞内で凝集体を形成し、ユビキチン・プロテアソーム系の機能低下を引き起こすことにより、神経細胞死を引き起こしていることが示唆された。来年度は初代培養小脳神経細胞やトランスジェニックマウスを用いて、神経細胞死を起こすメカニズムをより詳細に検討していく予定である。

また、小脳プルキンエ細胞においても変異γPKCは凝集体を形成するものの、樹状突起分布面積を減少させる作用は凝集体の有無に関係ないことから、変異γPKCの易凝集性以外の特性の変化がプルキンエ細胞の樹状突起を減少させ、SCA14患者で観察される小脳皮質の萎縮を引き起こすのではないかと示唆される。
hGM-CSFレセプタートランスジェニックマウスを用いたリンパ球分化の解析

我々は、サイトカインレセプターの発現とT細胞のサイトカイン応答性の関係を調べるため、ヒトGM-CSFレセプターα鎖、β鎖を分化段階にかかわらず強制発現させたトランスジェニックマウス(Tg-m)を用い、GM-CSFによるシグナルが胸腺細胞の増殖、分化に与える影響を調べた。その結果、GM-CSFレセプターを発現した胸腺細胞はGM-CSFに応答した増殖能を獲得したが、特定の分化段階にはレセプターの発現にもかかわらず増殖活性を示さない事を見い出した。またT細胞の分化系である胎児胸腺培養系にGM-CSFを加えたところ、特定の分化段階においてのみ分化抑制が見られた。現在、この分化抑制の分子機構を解析中である。以上の現象がサイトカインレセプターファミリーの一般的現象であるかどうか明らかにするために、in vitroでの分化誘導能が知られるG-CSFレセプターのTg-mを作製した。このTg-mにおいてはG-CSFの添加によって胸腺細胞の増殖は全く観察されず、骨髄細胞のコロニー解析でも巨核球系列の強い誘導が見られるなど、GM-CSFレセプターTg-mとは異なる結果を得た。また、我々のこれまでの細胞株を用いたGM-CSFレセプター変異体およびキメラレセプターの解析結果をもとに、GM-CSFレセプターα鎖、c-fos活性化の役割を検討するために変異体レセプター、キメラレセプターのTg-mの作製を計画した。現在、それぞれ遺伝子の導入されたマウスを数系統得たので発現について検討中である。
熱帯気候の形成・変動機構に関する数値的研究

太平洋の熱帯収束帯(ITCZ)がなぜ北半球に偏在するのかというは気候学の長年の謎である.その謎を解明するため、大気大循環モデルと海洋1.5層モデルから成る大気海洋結合ハイブリッドモデルを作成した。南北対称な基準の海陸設定に、アフリカ大陸のような海洋東岸の北半球5N以北に大陸を付け加えた実験を行った。その結果、平均的に海面水温は北半球で高温、南半球で低温、またITCZは北半球に存在するという現実的な南北非対称分布を示した。一方、海洋の西岸に張り出した大陸を付け加えた実験では海面水温や降水量の平均分布はほぼ南北対称であった。以上から、太平洋ITCZを北半球へ偏在させているのはアメリカ大陸で、ユーラシア大陸ではないということが示唆された。熱帯大西洋は、気候平均場には太平洋とよく似た特徴を持っているにもかかわらず、非常に異なった気候変動を示している。特に、熟帯大西洋では、赤道を挟んで南北半球の海面水温がシーソー振動することが知られている。このような南北シーソー振動がなぜ太平洋に見られないかという問題を、大気海洋モデルを用いて調べた。その結果、熱帯大気海洋結合系にエルニーニョのような南北対称モードと、大西洋シーソーのような南北反対称モードがそれぞれ存在していることが分かった。また、この2種類モードの成長特徴から、東西幅の大きい太平洋では、対称モードが不安定に成長し卓越する、一方、幅の狭い大西洋では、両モードが共存することが示された。熱帯大洋のうち、インド洋は太平洋と大西洋と大きく異なり、強い季節風に支配されている。理想化した海陸分布の下で大気大循環モデルを用いて数値実験を行った結果、夏期モンスーンの時間発展における陸面過程と地球自転効果について新しい知見が得られた。熱帯収束帯(ITCZ)を北半球へ偏在させているのは何なのかというは気候学の長年の謎である.この熱帯気候の南北非対称性を維持する大気海洋間の正のフィードバックは幾つか提示されているが、現実で温かい海としてなぜ南でなく北が選ばれるのか、そのメカニズムは分かっていない。本研究は、熱帯気候の南北非対称性を強制するものとして海陸分布に注目し、その効果を調べることを目的とした。そのために、大気大循環モデル(CCSR/NIES AGCM5.4)と海洋1.5層モデルから成る大気海洋結合ハイブリッドモデルを作成した。理想化した海陸分布をモデルに与え、その非対称性がどのように広域に亘る大気海洋結合系に影響を及ぼすかに注目した。具体的には、南北対称な基準の海陸設定に、アフリカ大陸のような海洋東岸の北半球5N以北に大陸を付け加えた実験を行った。これは北半球の張り出した陸面温度の方が南の海面水温より高く、大気下層で北の陸に向かい赤道上を南風が吹くことによる。この海洋東岸付近の南北非対称擾乱が大気海洋結合不安定波動を励起し、その西進により海洋の中央域にまで広がる東西に幅広い南北非対称気候を形成することがわかった。熱帯大西洋は、気候平均場においては太平洋とよく似た特徴(北半球に偏在するITCZや赤道冷水舌)を持っているにもかかわらず、非常に異なった気候変動を示している。特に、熱帯大西洋では、赤道を挟んで南北半球の海面水温がシーソー振動することが知られている。

この大西洋シーソー振動が北東ブラジル・サハラ砂漠の降水にも重要な影響を及ぼす。このような南北シーソー振動がなぜ太平洋に見られないかという問題を、簡単な大気海洋モデルを用いて調べた。その結果、熱帯大気海洋結合系にエルニーニョのような南北対称モードと、大西洋シーソーのような南北反対称モードがそれぞれ存在していることが分かった。また、この2種類モードの成長特徴から、東西幅の大きい太平洋では、対称モードが不安定に成長し卓越する、一方幅の狭い大西洋では、両モードが共存することが示された。また、エルニーニョが起こりにくい上記のハイブリッドモデルに南北シーソー振動が現れることも確認した。更に、大西洋で観測されているように、モデルのシーソー振動に伴って、ITCZ内の高層雲とその外にある低層雲がそれぞれ異なる変動を示すことも分かった。熱帯大洋のうち、インド洋は太平洋と大西洋と大きく異なり、強い季節風に支配されている。本研究はインド洋の夏期モンスーンのメカニズムについても、理想化した海陸分布の下での大気大循環モデルを用いて調べた。その結果、モンスーンの時間発展における陸面過程と地球自転効果について新しい知見を得ることができた。最後に、本研究は熱帯に留まらず、日本列島に及ぼす冬季季節風変動の影響についても調べ、北半球スケール振動である北極振動と北海道気温変動の関係を明らかにした。
熱環境保証型エネルギーサービスの事業の実現可能性評価

従来の地域熱供給システムと異なり、建物の熱環境を保証することを契約条件として、熱供給事業者が建物内の空調二次側システムの運用管理まで行い、熱源システムを含めた全体システムを最適化することで省エネルギー性能を向上させる新しい熱エネルギービジネスを実施した場合の省エネルギー効果を評価することを目的とし、地域熱供給プラントのエネルギーシミュレーションと、建物の空調二次側システムのエネルギーシミュレーションを連成させた計算を実施した。地域熱供給プラントのエネルギーシミュレーションプログラムについては、都市ガスを主たる熱源としてボイラ・吸収式冷凍機・コージェネレーション設備・ターボ冷凍機から構成されるシステム、電気を主たる熱源としてターボ冷凍機・ヒートポンプ・蓄熱槽から構成されるシステムの2つを検討対象とし、それぞれ既往研究で開発したモデルをベースとして、一般的な両方式の地域熱供給プラントを扱うプログラムに変更した。建物熱負荷計算、建物内空調二次側システムシミュレーションについては、新たに我が国で開発されたThe BEST Programを利用することで,計算制度の向上と高速化に成功した。両者を連成させ、熱媒温度差の確保、全熱交換機の適正運転、外気冷房、外気導入の適正化、空調設定温度厳守などの建物側対策によって地域冷暖房を含めた全体システムの省エネルギー性・経済性に及ぼす影響を定量的に評価した。また、二次側管理契約割合の変化や気温・エネルギー価格の変動が省エネルギー性や経済性に及ぼす影響を評価した。併せて、平成20年度に実施したスウェーデンイエテボリエネルギー公社でのヒアリングを整理し、上記エネルギーシミュレーションの設定条件の参考に資するとともに、同様なエネルギービジネスが日本で成立しうるかどうかについての考察を行った。熱供給事業者が供給先の建物内の二次側設備までの運用を担うとともに、熱供給量ではなく室内環境(室内気温など)を保証する形で契約をおこない、熱供給事業者が省エネルギー運用のインセンティブを持つような、エネルギーサービスの新しい形態である「熱環境保証型熱エネルギーサービス事業」の可能性を探ることを目的とし、建物側と地域冷暖房側双方のエネルギーシミュレーションモデルを構築し、それを連携してシミュレーションすることにより、建物側の冷水温度差確保、室温制御の徹底が地域冷暖房システム全体においてどの程度の省エネルギー効果を生じるかについて、定量的に明らかにした。また、そのコストメリットについても計算を行った。併せて、このようなエネルギーサービスを行う建物が地域冷暖房システム全体に占める割合の変化や、ヒートアイランド等による外気温の上昇がシステム全体のエネルギー効率に与える影響を明らかにした。また、本研究と同様なエネルギーサービス事業(クライメート・アグリーメント)を実施しているスウェーデンのイエテボリエネルギー公社を訪問し、現在のエネルギーサービス事業の進展状況、同サービスにおける技術的課題、省エネルギー性保証のための具体的対策、同サービスを含めた地域暖房事業全般にわたる今後の展望について、ヒアリングおよび現地調査を行い、次年度以降のシミュレーションプログラムの改良・モデルの設定条件調整に向けて多大な知見を得た。
実験的中心性脳橋融髄症の脱髄過程に関する研究

1.実験モデルの作製:雄ラットに3日間、0.5単位/100g体重のvasopressin tannateを皮下注、同時に体重の5%相当量の2.5%glucoseを腹腔内投与し低Na血症とした。第4・5日に1MNaClを2ml/100g体重腹腔内投与し低Na血症を補正し、第6・7日に状態変化を観察した後、第8日に断頭し組織所見を検討した。2.神経症状:第13日の低Na血症期には著明な変化はみられなかった。第4日、1MNaCl投与直後より全身痙攣、毛の粗糊化、体重減少(平均-15%)、音および痛覚刺激に対する過敏性、後肢により強い痙性、失調歩行などを認めた。第8日以前に16%のラットが死亡した。3.組織所見:10%ホルマリン固定の後、髄鞘染色(KluverーBarrera)を行った。線状体、外包、前交連、視床、中脳に強い脱髄を認めた。橋の変化は明らかではなくヒトにおける病変分布と必ずしも一致しなかった。4.血清電解質浸透圧の変化:第1日ではNa142±5.0mEq/l、K4.2±0.5、Cl97.0±7.1、浸透圧292±8mOsm/kgH_2Oであった。第4日には低Na血症(111±11.0mEq/l)、低浸透圧血症(244±18mOsm/kgH_2O)を呈した。第8日にはNa140±9、浸透圧298±14と正常値に回復していた。K、Clは経過を通じて有意の変化を認めなかった。5.脳・筋の水分含量・電解質・浸透圧の変化:正常ラットでは脳Na232±8mEq/kg・dryweight、K416±6、Cl162±8、浸透圧302±16mOsm/kgH_2O、水分含量78.4±15%;筋Na104±16、K457±29、浸透圧366±28、水分含量76.2±1.6%であった。低Na血症ラットでは脳筋ともにNa、浸透圧の低下を認めたが、第8日では有意の変化は示さなかった。6.体性感覚誘発電位(SEP)の変化:左下肢アキレス腱部を刺激し右頭頂領域硬膜上より誘出した。第1日には16.3±1.9msecであったが、低Na血症をきたした第4日には19.3±4.0msecと軽度に、さらに第8日には25.6±6.4msecと著明な延長を示した。現在、組織所見より脱髄の定量化を試み、電解質・浸透圧およびSEP変化との相関の検討を試みている。さらに低Na血症を補正するスピードの検討も必要と考えている。

第1日には16.3±1.9msecであったが、低Na血症をきたした第4日には19.3±4.0msecと軽度に、さらに第8日には25.6±6.4msecと著明な延長を示した。現在、組織所見より脱髄の定量化を試み、電解質・浸透圧およびSEP変化との相関の検討を試みている。さらに低Na血症を補正するスピードの検討も必要と考えている。
ヒト歯髄細胞の三次元的培養に関する基礎的研究

細胞外マトリックスを用いた三次元的細胞培養としてコラーゲン・ゲル包埋培養法を行った。コラーゲン混合溶液の調製は、豚腱由来Type1 collagen(3mg/ml, pH3.0)8容量に10倍濃度のEagle' MEM1容量をよく混合し、ついで再構成用緩衝液(2.2%NaHCO3, 200mM HEPESを含む0.05N NaOH)を1容量加え混ぜた後、カルチャー・ディッシュに分注し、CO2インキュベータ-内でゲル化させてBase Layerとした。ヒト歯髄細胞(DP細胞)は、臨床的に健全な新鮮抜去歯の歯髄組織を培養してout growthしてきた線維芽細胞様細胞を使用した。細胞分散液を調製し、冷却しながらコラーゲン混合溶液中に加えよく混合後、DP細胞・コラーゲン混合溶液をBase layer上に分注し、直ちにゲル化させCell Layerとした。ゲル形成後、培養液(Overlay medium)を重層し、通常の単層培養法と同様に培養を行った。コラーゲン・ゲル内培養におけるDP細胞の形態的変化を位相差顕微鏡により観察した。ゲル内培養開始後、初期の段階まではDP細胞の形態は球形であったが、その大きさは通常の単層培養のそれと比較した場合やや小さめであった。その後、徐々に進展を開始し、通常の単層培養のそれと比較して、長い2極性の形態を示していた。このことから、DP細胞は再構成されたコラーゲン線維と立体構造の中で細胞形態を大きく変化させることが明らかとなった。その理由として、通常の単層培養においては細胞の接着面の底面だけに限定されるのに対して、今回試みたコラーゲン・ゲル包埋培養では三次元的構造をとっていることから、細胞の周囲全体の接着面が与えられたためと考えられる。現在、培養終了後回収したDP細胞からDNAおよびmRNAを抽出し、遺伝子レベルで、単層培養との比較検討を進めている。
カラーカモフラージュの視覚電気生理

市松模様などの規則的な図形を、視野の中に輝度の違いで描き、それを反転させる視覚刺激は、視覚誘発電位の標準的な刺激法である。ところが、刺激に用いる図形が異なる色に塗り分けられていると、輝度の違いが反転をしても、視覚誘発電位は出ない。この現象は容易に再現でき、その程度は、用いる2色の色度の隔たりに依存することがわかった。図形の色分けが鮮明であるほど、反応が抑制される(カモフラージュされる)視覚刺激ということである。また頭皮から誘導する視覚誘発電位だけでなく、網膜電図も色分けによる抑制が認められた。この現象を精査するため、専用の刺激発生システムを開発し、刺激条件の最適化を試みた。等輝度の赤(x=0.293,y=0.601)と緑(x=0.617,y=0.347)で市松模様を構成し、輝度コントラスト10-15%で反転刺激とする。即ち初めは赤を10-15%暗くしておき、赤の輝度を戻すと同時に(トリガ)緑を暗くする。赤と緑を等しく混ぜて作る黄色のみを用いる市松模様による刺激と、皮質誘発電位、網膜電図を比較した。後者では明瞭な皮質誘発電位が、前者の条件では消失していた。多くの正常者で、パターン網膜電図でもこの現象が認めら、この抑制は網膜レベルで存在していることを示した。
IL-6に着目した歯髄炎の病態形成における歯髄細胞と血管内皮細胞のクロストーク

歯周炎をはじめとした歯周組織の炎症ならびに炎症後の組織修復には複雑な免疫反応が関与することで、その根治を目指した治療法の確立を困難なものとしている。炎症誘発から組織修復までの一連の過程を理解するために、本研究では歯髄ならびに歯根膜、歯肉由来線維芽細胞と骨髄由来間葉系幹細胞のサイトカイン・ケモカインネットワークを介した相互作用を解明する。組織破壊を伴う重篤な炎症は、主として局所に浸潤したマクロファージから分泌されるIL-1β、IL-6、TNF-αといった炎症性サイトカインの作用による過剰な炎症反応が要因とされている。一方、炎症治癒後の組織修復には、結合組織構成細胞への分化能を有する間葉系幹細胞が関与する。主として骨髄に存在する間葉系幹細胞は血行性に全身に運ばれてケモカインCXCL12(SDF-1α)やCCL2(MCP-1)の作用によって炎症部位に遊走・集積し、様々な細胞へと分化することで組織修復に働くとされている。本年度は歯根膜由来線維芽細胞におけるケモカインの発現や、間葉系幹細胞における遊走促進効果効果を明らかにしている。即ち、歯根膜由来線維芽細胞を炎症性サイトカインIL-1β、IL-6ならびにTNF-αで処理すると、SDF-1αとMCP-1のmRNA発現が有意に誘導された。発現誘導されたケモカインによる間葉系幹細胞の遊走能を評価したところ、SDF-1αならびにMCP-1の添加によって間葉系幹細胞の遊走能が有意に促進された。一方で興味深いことに、SDF-1αやMCP-1は歯根膜由来線維芽細胞の遊走を促進しなかった。これらの結果から、炎症性サイトカインによって刺激された歯周組織線維芽細胞がケモカインを分泌し、分泌されたケモカインが間葉系幹細胞にパラクリンに作用することで炎症部位への遊走・集積を促進する可能性が示唆された。
福山型先天性筋ジストロフィーの病態機序に基づいた治療法の確立

申請者が見出した、「福山型先天性筋ジストロフィー(FCMD)がレトロトランスポゾンの挿入変異がもたらすエクソントラッピングと名付けられるスプライシング異常症であること」をもとに、この異常スプライシングを是正する治療法の実現を目的とし、核酸化合物であるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)による治療を開始しFCMDモデルマウスに対するAONのモデル動物への局所及び全身投与、ヒト患者由来細胞系への投与を行い成功し、不治の病の初の治療法の可能性を示した(Taniguchi-Ikeda et. al. Nature 2011)。これまでの研究で、福山型先天性筋ジストロフィー(FCMD)の責任遺伝子fukutinの発現解析より、FCMDはSVA型レトロトランスポゾン由来の挿入配列がもたらすスプライシング異常症であることを発見した。この発症機序に基づく治療法確立のため、スプライシング異常を引き起こす標的配列を同定し、20メチルRNAやモルフォリノ等を用いアンチセンス核酸化合物を設計し、ヒト患者由来培養細胞系及び、SVA挿入型ノックインモデルマウス系を用いて治療実験を行った。その結果、架橋型モルフォリノの培養細胞系(リンパ芽球及び筋芽細胞)及び、モデルマウスへの局所投与、及び全身投与において、異常スプライシングが阻止され、正常フクチンが回復した。これらは免疫沈降反応及びウエスタンブロッティング法により正常フクチン蛋白の回復を確認し、また機能的回復は、αジストログリカンのOマンノース型糖鎖修飾の回復をウエスタンブロッティング法で解析することより確認した。一方、低分子化合物ライブラリー(NINDS2)を用い、mRNAレベルでスプライシング異常が是正される薬剤の探求を行った。FCMD患者由来初代筋芽細胞を用いRT-PCR法を用いドラッグスクリーニングを行ったところ、スプライシング異常が是正される薬剤を十数個同定した。これらの結果は今後FCMDのRNA治療の可能性を大きく示唆するものである。研究内容の要旨としては、申請者が見出した、「FCMDがレトロトランスポゾンの挿入変異がもたらすエクソントラッピングと名付けられるスプライシング異常症であること」をもとに、この異常スプライシングを是正する治療法の実現を目的とし、核酸化合物であるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)による治療を開始しFCMDモデルマウスに対するAONのモデル動物への局所及び全身投与、ヒト患者由来細胞系への投与、薬剤毒性の検討、核酸配列や化合物分子の至適化、ドラッグデリバリーシステムの構築及び低分子化合物からの有効薬剤の探索を行うことであった。この2年間において申請者はモルフォリノオリゴを用い核酸化合物であるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)による異常スプライシングに対する分子標的治療を開始しFCMDモデルマウスへの局所投与および尾静脈を介した全身投与、及び患者由来細胞系において、AONがRNAレベルだけでなく、蛋白レベル、及び疾患の機能的改善を示す糖鎖修飾の回復に対しても有効であることを示し、不治の病の初の治療法の可能性を示した(Taniguchi-Ikeda et.al. Nature 2011)。またFCMDで引き起こされるスプライシング異常は人の疾患の原因になることを初めて示し、同様のレトロトランスポゾンの挿入を認める他の2疾患についても同様のスプライシング異常を発見し、またチンパンジーにはないヒト特異的なSVA挿入を認める新規遺伝子(AB627340)のエクソントラッピング由来の遺伝子産物をヒト脳において同定し、エクソントラッピングの病的意義だけでなく進化、多様性に関する可能性も示した。この発表は国内でも各種新聞やテレビで報道され、患者家族に対しても公表され大きな反響をえた。この結果をもとに是非臨床応用の実現を目指して、核酸化合物の最適化や薬剤の毒性の検討などを行って行きたい。
膜タンパク質会合過程の高速AFMイメージング

1.バクテリオロドプシン(bR)の構造変化の観察:光吸収サイクルが野性型bRよりも遅いD96N変異体を試料として、緑色レーザー光照射時の光吸収に伴う構造変化の観察を行った。細胞質側では光照射に同期してAFMで観察されるモノマーの輝点が約0.7nm変化することがわかった。光励起された分子の寿命を解析した結果、AFMで観察された構造変化は、基底状態からN中間体への遷移時に発生すると考えられている、EFループの移動であることが分かった。一方、このような構造変化は細胞外側では観察されなかった。また、EFループの移動により隣り合ったbRトライマー内のモノマー同士が相互作用した結果、励起分子の寿命が変化することが分かり、従来から分光法により議論されてきた光吸収サイクルの協同性が構造変化に起因することを明らかにした。2.ロドプシンの会合状態の観察:高速AFMでロドプシンの高分解能な動態変化過程や生理過程を捉えるため、AFM観察に適したロドプシン試料の調整としてウシロドプシンの抽出及び天然脂質膜へ再構成を行った。その結果、再構成時の脂質割合や界面活性剤の割合などの条件を変える事で2次元結晶の結晶化度が変化する事が分かった。また、天然の円盤膜中に存在するロドプシンでも、4°Cで長時間インキュベーションを行うと2次元結晶化し、ダイマー構造をとることが確認できた。3. ATPaseの回転観察の試み:リジン基で修飾したF1モーターを用いることで、アミノシランおよびグルタルアルデヒド処理したマイカに比較的容易に固定できることが分かった。F1のYサブユニットに標識としてストレプトアビジンを固定し、ATP加水分解による回転運動を観察することができた。しかしながら、AFM観察によりYサブユニットが容易に引き抜かれてしまうことも判明し、再現性よく回転観察を行うところまでは達しなかった。1.バクテリオロドプシン(bR)の脱・再結晶化過程の観察ヒドロキシルアミン存在下で緑色レーザー光照射による紫膜の脱結晶化のリアルタイム観察を行った結果、3量体の2次元結晶からの脱離が起こり、その3量体欠陥を基点として2次元結晶の崩壊が始まることが分かった。このことからバクテリオロドプシンからレチナールの解離したバクテリオオプシンは3量体構造を維持したままで、タンパク-脂質間の相互作用が弱くなることで脱結晶化が進行していることが分かった。一方、レチナール添加による再結晶化の観察も試みた。細胞外側では、再結晶化がある程度進行した小さな島状紫膜が時間と共に集合していく様子を捉えることができた。しかしながら、細胞膜側の再結晶化と細胞外側でもバクテリオロドプシンが再結晶を行う初期状態を観察することは出来なかった。これは、測定時に探針が試料系を乱しているためであると考えられるため、低振幅振動で試料への影響を出来るだけ小さくして測定を進めていく必要がある。2.ATPaseの回転観察の試み高速AFMによるATPaseの回転運動観察を試みた。形状の非対称性が大きいと思われるV0-V1を試料として用いた。まず第1段階として、試料のマイカ基板への最適な固定方法を検討した。その結果、マイカをアミノシランで処理し、その後グルタルアルデヒドを介してAB-NTAを固定し、Ni処理することで可溶化、再構成試料共にマイカ基板に固定できることが分かった。その後、回転運動の観察を試みたが明瞭な回転を観察することは出来なかった。回転しているがAFMで捉えられない、AFM観察でタンパク質の構造が破壊されている等の原因が考えられる。
胆管側膜上有機アニオン輸送担体および関連蛋白とチャンネル機能の協関

前年度科学研究費のサポートを得て、ラット胆管側膜上に存在し、グルタチオンおよびグルクロン酸抱合体を含む種々有機アニオン系化合物の胆汁排泄に関与するcanalicular multispecific organic anion transporter(cMOAT)のcDNAクローニングを完了し、cMOAT機能を遺伝的に欠損するラットEisaihyperbilirubinemic rat(EHBR)における変異機構を同定してきた。今年度は、クローン化したcDNA産物の機能を決定すると共に、cMOAT関連蛋白のcDNAクローニングに関して検討を加えた。cMOATcDNAを哺乳類発現ベクターpCXN2にsubcloningし、NIH3T3細胞にtransfectした。G418存在下で得られた安定遺伝子導入株に対しNorthern blotによりcMAOT高発現株を採取し、膜ベシクルを調製した。膜ベシクルにおけるcMOAT基質2,4-dinitrophenyl-S-glutathione(DNP-SG)の輸送を測定したところ、ATP依存性が観察されたが、GTP,CTP,UTPもATPの約50%程度の促進効果を有することが示された。更に、ATPにより促進される輸送はK_m=0.175μMの飽和性を示した。一方、vectorのみを遺伝子導入した細胞株より調製した膜ベシクルにおいてもATPにより促進されるDNP-SG輸送活性が観察されたが、Northern blotの結果からNIH3T3細胞におけるマウスcMOATの発現が確認されたことから、この輸送はマウスcMOATに依る可能性が示唆された。本研究結果は、クローン化されたcMOATcDNA産物の機能を定量的に評価した初めての例である。