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シロアリの交雑がもたらす共生微生物群集の置換の過程と宿主に及ぼす影響の解析

2種のシロアリの交雑に伴う原生生物群集の変化過程を観察するため、2018年3月に山口県下関市でカンモンシロアリReticulitermes kanmonensis、5月に茨城県水戸市でヤマトシロアリR. speratusの有翅虫を採集してこれを交雑させた。交雑から80日後、120日後、280日後に原生生物の種と種別個体数を計数した。その結果、交雑コロニーでは80日で腸内の原生生物の種はヤマトシロアリとほぼ同じ組成になるが、この時点では各種の個体数比は特異的であり、これが時間経過とともに通常のヤマトシロアリのコロニーに特徴的な比率に近づいていくことが明らかになった。この変化は複数の交雑実験コロニー間で共通しており、種間の選択過程が混合後に成立する群集構造を強く決定すると考えられた。また、日本列島の石垣島、西表島、沖永良部島、与論島、沖縄本島、宝島、中之島においてヤマトシロアリ属のコロニーを採集し、共生原生生物組成を調査した。石垣島・西表島ではすでに確認されているヤエヤマシロアリR. yaeyamanusと同じ原生生物が確認された。また、与論島と沖永良部島ではそれぞれオキナワシロアリR. okinawanus(沖縄本島)・アマミシロアリR. amamianus(奄美大島・徳之島)と同じ原生生物種組成が確認された。また、宝島ではアマミシロアリに近い組成、中之島ではアマミシロアリとヤマトシロアリに類似した組成のコロニーが確認された。トカラ列島は北方型・南方型原生生物群集の移行域として多様な群集組成が見られると考えられる。またこの地域で原生生物の種間水平感染が2種間で生じたことが推定された。採集したシロアリと腸内容物からDNA抽出を行い、遺伝的解析の準備を進めた。さらに、原生生物群集の移植実験を行うため、酸素による原生生物除去の条件検討を進めた。昨年度までに、ヤマトシロアリ属の共生原生生物組成の野外調査と試料の採取を、琉球列島を中心とする13の島嶼で実施した。その結果、これまで詳細が不明であったヤマトシロアリ属の共生原生生物組成とその変異をかなり細かく解明することができた。特に、トカラ列島が北方系と南方系の組成の移行帯として比較的大きな変異をもつことが明らかになった。またトカラ列島では、シロアリでは初めて、過去に生じた宿主の交雑と共生原生生物1種の水平感染が具体的な2種の宿主間で推定されたことは新規な成果である。同時に、異種シロアリ間の交雑にともなう原生生物組成の調査では、異種の宿主が交雑した後の共生微生物各種の個体数変化の詳細な調査を共生微生物群集で初めて行った。その結果、交雑後に共生微生物種の種組成の変化が収束した後も、共生微生物各種の個体数構成はさらに時間をかけて変化していくこと、この変化の特性はどの実験コロニーでも共通していることなど、共生微生物群集についての新しい知見が得られている。一方、網羅的遺伝子配列の取得実験の実施は当初予定より少し実施を遅らせ、最終年度に行う事とした。また、原生生物の異種間での再感染に関する実験も、昨年度実験時間が十分にとれなかったこともあり、本実験は最終年度に行うこととした。今年度は以下の様な方針で研究を進める。(1)トカラ列島の口之島・悪石島・諏訪之瀬島についてヤマトシロアリ属の採集を行い、原生生物の標本作製、組成調査、宿主腸内容物からのDNA抽出、宿主のDNA抽出を進める。これまで採集した琉球列島を中心とする日本列島の島嶼のヤマトシロアリ属の試料(与那国島、石垣島、西表島、多良間島、宮古諸島、久米島、沖縄本島、沖永良部島、与論島、奄美大島、徳之島、宝島、中之島、屋久島、九州、本州)を用い、MIG-seq法による配列取得と系統推定を行う。同時に腸内容物DNAから増幅したSSUrRNA遺伝子の部分配列の網羅的読み取りを行い、両者を突き合わせる。(2) 3種のシロアリを用いて3通りの2種間交雑を行い、原生生物組成の変化を比較する実験を行う。材料にはヤマトシロアリR.speratus・カンモンシロアリR. kanmonnensis・オキナワシロアリR. oknawanusを用いる。すでに3種のシロアリの有翅虫を採集ずみであり、交雑コロニーを現在作成中である。今後、血球計算盤を用いて一定期間おきに計数して原生生物の組成変化を確認する。同時に一部の個体については腸内容物のDNAを抽出する。(3)酸素により原生生物群集を除去したシロアリ個体を用い、別種の群集の再感染実験を行う。材料としてヤマトシロアリとオキナワシロアリを用い、セルラーゼ活性の測定とコロニー間の敵対性実験を行う。セルラーゼ活性の測定について現在条件検討を行っている。(4)実験結果を総合し、日本列島におけるヤマトシロアリ属の原生生物群集の進化と異種間での置換の過程と、置換が宿主に与える影響とを考察する。同時に研究結果の論文化を進める。日本列島のヤマトシロアリ属について、原生生物組成調査を行った。鹿児島県奄美大島と徳之島でアマミシロアリ、沖縄県の沖縄島、久米島、北部宮古列島(宮古島・伊良部島・下地島・池間島)でオキナワシロアリ、与那国島でキアシシロアリR. flaviceps、多良間島と石垣島でヤエヤマシロアリR. yaeyamanusを採集し、宿主の腸内容物の鍍銀染色標本を作成した。

さらに1コロニーあたり5個体の宿主腸内容物の観察から原生生物の種組成と宿主個体間の変異を調査した結果、基本的に種特異的な組成となっていることを確認した。また、オキナワシロアリの5コロニーについて、雌雄間で組成の差を検討し、無作為化検定によって個体数の雌雄差を検討したが、有意な差はみられなかった。さらにコロニーにの一部については、SSUrRNA遺伝子の網羅的配列解析のためのDNA抽出を行った。また、ヤマトシロアリ属5種について、Teranympha属の共生原生生物の細胞からSSUrRNA遺伝子の配列を取得して系統解析を行った。また、Trichonympha属について全ゲノム増幅の条件を検討し、同様の系統解析を行うための予備的実験を行った。さらに、シロアリの交雑に伴う原生生物の組成変化のモニタリング実験を行うため、山口県でカンモンシロアリ、茨城県でヤマトシロアリの有翅虫を採集し、異種の雌雄ペアを多数作成したが、非常に死亡率が高かったため、交雑実験は次年度に再度やり直すこととした。また、腸内の共生微生物が宿主シロアリに与える影響を探るため、高圧酸素による原生生物の除去の条件検討を行った。当初の計画で予定していた、シロアリの交雑実験と腸内原生生物組成の経時変化のモニタリングを、今年度は初期コロニーの死亡率が予想以上に高かったために実施できなかった。ただし、琉球列島の原生生物組成の調査に実施計画の重点を移して一部計画の前倒しも行い、交雑実験は次年度以降に行う事としたため、研究計画全体としては概ね予定の通り進めることができていると判断した。2種のシロアリの交雑に伴う原生生物群集の変化過程を観察するため、2018年3月に山口県下関市でカンモンシロアリReticulitermes kanmonensis、5月に茨城県水戸市でヤマトシロアリR. speratusの有翅虫を採集してこれを交雑させた。交雑から80日後、120日後、280日後に原生生物の種と種別個体数を計数した。その結果、交雑コロニーでは80日で腸内の原生生物の種はヤマトシロアリとほぼ同じ組成になるが、この時点では各種の個体数比は特異的であり、これが時間経過とともに通常のヤマトシロアリのコロニーに特徴的な比率に近づいていくことが明らかになった。この変化は複数の交雑実験コロニー間で共通しており、種間の選択過程が混合後に成立する群集構造を強く決定すると考えられた。また、日本列島の石垣島、西表島、沖永良部島、与論島、沖縄本島、宝島、中之島においてヤマトシロアリ属のコロニーを採集し、共生原生生物組成を調査した。石垣島・西表島ではすでに確認されているヤエヤマシロアリR. yaeyamanusと同じ原生生物が確認された。また、与論島と沖永良部島ではそれぞれオキナワシロアリR. okinawanus(沖縄本島)・アマミシロアリR. amamianus(奄美大島・徳之島)と同じ原生生物種組成が確認された。また、宝島ではアマミシロアリに近い組成、中之島ではアマミシロアリとヤマトシロアリに類似した組成のコロニーが確認された。トカラ列島は北方型・南方型原生生物群集の移行域として多様な群集組成が見られると考えられる。またこの地域で原生生物の種間水平感染が2種間で生じたことが推定された。採集したシロアリと腸内容物からDNA抽出を行い、遺伝的解析の準備を進めた。さらに、原生生物群集の移植実験を行うため、酸素による原生生物除去の条件検討を進めた。
淡明細胞型腎癌患者におけるコピー数多型の解析

淡明細胞型腎癌患者において、MTHFRおよびRASSF1A遺伝子型およびハプロタイプは、予後予測因子として有用である可能性が示唆された。さらに、これらの所見は淡明細胞型腎癌進展のメカニズムを解明する手がかりとなる可能性が考えられた。また、淡明細胞型腎癌発生リスクに関与している可能性のあるコピー数多型を同定した。淡明細胞型腎癌患者240例について、methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)遺伝子の2つの遺伝子多型(C677T,A1298C)の遺伝子型およびハプロタイプと、腎癌の臨床病理学的性質および予後との関連を解析した。MTHFR A1298C遺伝子多型には、いくつかの進行腎癌の性質と有意な関連が認められた。この関連は男性患者においてより強く認められた。一方女性患者では、MTHFR C677T遺伝子多型に、いくつかの進行腎癌の性質との間に有意な関連が認められた。さらに女性患者では、MTHFR C677T遺伝子多型とMTHFR 677T-1298Aハプロタイプと、低い生存率との間に有意な関連が認められた。これらの結果より、MTHFR遺伝子型およびハプロタイプは、とくに女性において、淡明細胞型腎癌患者の予後を予測する因子として有用であり、これにより治療の個人化を実現させる可能性のあることが示唆された。これらの結果の原因として、MTHFR遺伝子多型が葉酸代謝を改変し、これによりDNA合成またはDNAメチル化に異常が起こり、これが淡明細胞型腎癌の進展に影響を与えたことが考えられた。以上のことは淡明細胞型腎癌の進展のメカニズムを解明する助けとなる可能性があることが示唆された。淡明細胞型腎癌患者179例について、RASSF1A遺伝子のプロモーター領域のメチル化の程度と、腎癌の臨床病理学的性質および予後との関連を解析した。RASSF1A高メチル化は、高グレード・高ステージの腎癌と有意な関連が認められた。また、RASSF1A高メチル化は、不良な生存率と有意な関連が認められた。RASSF1A遺伝子のプロモーター領域のメチル化の程度は、淡明細胞型腎癌患者の予後を予測する因子として有用であり、これにより治療の個人化を実現させる可能性のあることが示唆された。淡明細胞型腎癌患者240例について、methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)遺伝子の2つの遺伝子多型(C677T,A1298C)の遺伝子型およびハプロタイプと、腎癌の臨床病理学的性質および予後との関連を解析した。MTHFRA1298C遺伝子多型には、いくつかの進行腎癌の性質と有意な関連が認められた。淡明細胞型腎癌患者179例について,RASSF1A遺伝子のプロモーター領域のメチル化の程度と、腎癌の臨床病理学的性質および予後との関連を解析した。これらの結果を2つの論文にまとめ、査読付英文医学誌に投稿・発表した。コピー数多型の解析実験を実際に開始し、現在施行中である。淡明細胞型腎癌患者224例について、Ras association domain family 1A(RASSF1A)遺伝子の3つの遺伝子多型(133Ala/Ser, -710C/T, -392C/T)の遺伝子型およびハプロタイプと、腎癌の臨床病理学的性質および予後との関連を解析した。RASSF1A -710CTT遺伝子型は、高ステージの腎癌と有意な関連が認められた。また、RASSF1A 133Ala-710T-392Tハプロタイプと-710CTT遺伝子型は、不良な無再発生存率と有意な関連が認められた。

これらの結果より、RASSF1A遺伝子型およびハプロタイプは、淡明細胞型腎癌患者の予後を予測する因子として有用であると考えられた。これらの結果を査読付英文医学誌に投稿・発表した。淡明細胞型腎癌患者240例について、methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)遺伝子の2つの遺伝子多型(C677T, A1298C)の遺伝子型およびハプロタイプと、腎癌の臨床病理学的性質および予後との関連を解析した。MTHFR A1298C遺伝子多型には、いくつかの進行腎癌の性質と有意な関連が認められた。この関連は男性患者においてより強く認められた。一方女性患者では、MTHFR C677T遺伝子多型に、いくつかの進行腎癌の性質との間に有意な関連が認められた。さらに女性患者では、MTHFR C677T遺伝子多型とMTHFR 677T-1298Aハプロタイプと、低い生存率との間に有意な関連が認められた。これらの結果より、MTHFR遺伝子型およびハプロタイプは、とくに女性において、淡明細胞型腎癌患者の予後を予測する因子として有用であり、これにより治療の個人化を実現させる可能性のあることが示唆された。これらの結果の原因として、MTHFR遺伝子多型が葉酸代謝を改変し、これによりDNA合成またはDNAメチル化に異常が起こり、これが淡明細胞型腎癌の進展に影響を与えたことが考えられた。以上のことは淡明細胞型腎癌の進展のメカニズムを解明する助けとなる可能性があることが示唆された。これらの結果を国際医学会にて発表した。淡明細胞型腎癌患者20例および健常男女合計約40人においてコピー数多型を解析し、腎癌発症リスクに関与している可能性のあるコピー数多型を同定した。
シナプス後肥厚部(PSD)特異的蛋白質の検索と機能解析

PSD(シナプス後肥厚部)のダイナミックにして特徴的形態を形成する物質根拠とそのメカニズムを追究するべく、PSD特異的モノクローナル抗体を用いたPSD構成蛋白質の検索とその機能解析を本研究の目的とした。1)モノクローナル抗体によるPSD構成蛋白質の検索分子量800kD25kDの30種類の蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いてイムノスクリーニングにより検索を進行中で、3種類の新現蛋白質をクローニングし、4種類のPSDに局在する既知蛋白質を同定した。N末側にEVH1ドメイン、C末側に特有のロイシンジッパー・モチーフを有する蛋白質をクローニングし、PSD-Zip45と名づけた。EVH1ドメインはI型代謝性グルタミン酸受容体(mGluR1およびmGluR5)と結合し、ロイシンジッパー・モチーフは強力な自己多量体形成能を示す。そこで、COS7細胞共発現系を用いて、PSD-Zip45によるmGluR1αクラスター形成を証明した。また、シナプスへのPSD-Zip45ターゲッティング機構を解明した。さらにPSD-Zip45の新たな機能を解析する目的で、yeast-two hybrid法によりPSD-Zip45結合蛋白質の検索を用い、新規2蛋白質と既知3蛋白質をクローニングした。C末側にロイシンジッパー・モチーフとコイルドコイル構造を有する新規蛋白質をクローニングし、dendritic spineおよびshaftに局在することを明らかにした。
地域分化のプロセスからみた日本のモチ稲栽培地域編成の条件と地理的環境

1.本研究は、わが国の稲作をウルチとモチに分け、モチ稲栽培の面から稲作地域論を展開する新しい試みの一環として、地図分析とフィールドワークにより過去約100年間におけるモチ稲栽培地域編成の特色を把握し、それを規定した条件と地理的環境との関係について考察したものである2.わが国の稲作におけるウルチとモチとの作付面積は、伝統的にほぼ一定の比率をもって継続してきたが、高度経済成長期以降とりわけ1970年代以降の米の生産調整の過程において、モチ栽培の地位が大きく後退すると共に、ウルチとモチの栽培の地域分化が全国的規模で展開してきたことが明らかになった。3.今日のモチ稲栽培は日本列島の南北に配置される形で発生した大規模な栽培地域、内陸山間部における栽培地域、そして局地的な栽培地域の3類型に要約できる。4.モチ稲栽培は、共通してウルチ米での生産対応が困難で、かつ米生産の経済的比重が高い地域で展開してきたことが判明した。それらを可能にした条件としては、(1)良質モチ品種の開発・導入、(2)農協および行政の対応(作付誘導、流通、経営指導)(3)水田の基盤整備、(4)稲作一貫機械化体系の普及、などの要因を指摘することができる。5.モチ稲栽培の地域における位置づけ方は、それぞれの地理的環境と密接に関連しており、分化したモチ稲栽培の地域的性格は明瞭な差異をともなっている。このことは、地域環境に適応した稲作展開を図ることが稲作地域として持続しうる大きな条件の一つであることを意味する。1.本研究は全国的な統計資料の分析と事例分析(フィールドワーク)により、日本の稲作におけるモチ稲栽培地域の地域分化の特質を、地理学的に解明することを直接の目的としている。3年計画の初年度に当たる本年は、基本的な統計資料の収集・整理と北海道を中心としたフィールドワークをすすめた。その結果は以下の通りである。(1)わが国のモチ稲栽培地域について、明治以降今日にいたる地域的展開状況を把握するための都道府県レベルの試作地図、及び近年の動向をより詳細に分析するための試作地図をそれぞれ作成した。(2)これらの地図は、わが国のモチ稲栽培地域が近年激しく地域分化を遂げ、栽培地域の立地環境にも大きな変化が発生していることを提示するための基本的な成果であるが、同時にこれらより全国的な地域分化の方向と地域的類型を整序することが可能である。(3)北海道におけるフィールドワークでは、新しいモチ稲栽培地域形成の最も典型的な事例(名寄市とその周辺地域)について調査し、地域分化を生み出す社会経済的条件と地理的環境との関係について理解を深めることができた。また予期しなかった冷害及び米の自由化問題にたいする地域の反応と対応についても、有意義な知見が得られた。2.今後は試作地図の完成作業と地域分化の様式のモデル化につとめたい。さらに、残されたフィールドワークに重点を移し、地域分化の要因分析を総合的に行うための調査を進めていく予定である。1.わが国の水稲栽培におけるモチ稲栽培の地位(モチ稲作付率)は、第二次大戦後の高度経済成長期以降急速に衰退し、今日では全国平均で3%台になっているが、衰退以前には明治以降ほぼ一定の割合で推移し、大きな変動はなかった。この点を全国的に詳細に明らかにしうる戦前(S.16)段階の資料を発見し、その整理と分布図作成を進めた。その結果、当時のモチ稲作付率は、郡レベルでみると710%台(郡全体の39%)がもっとも多く、ついで57%台(同24%)、1015%台(同19%)、35%台(同10%)の順であったことを確認した。また、当時はモチ稲栽培が全国の諸地域にかなり均等に分布していたことも明らかとなった。その中にあって、概して郡部に比べ市部においてモチ稲作付率が高い傾向が存在していたことを突き止めることができた。

2,フィールドワークによって、今日モチ稲栽培が進展している地域の一般的な条件と地理的な環境について考察を深めることができた。とくに九州の有明海沿岸から八代海沿岸にかけた稲作地帯においてモチ稲地帯の形成が進展していることが判明した。このことの理由として、水田地帯における冬作物(例えば、い草)の存在、肥沃な干拓地帯の土壌、有力なモチ品種の存在、共同乾燥施設の導入等の諸要因が関連していることについて確認した。なお、一般にモチ稲栽培の急速な衰退地域として特徴づれられる東京大都市圏にあって、利根川中流域では特殊的にモチ稲が発展している事例を収集した。3.モチ稲栽培の地域分化を促す要因として、国土利用の都市化(農地および水田経営の縮小)と農家の兼業化、良質ウルチ稲栽培の展開の可能性と流通条件(農協の対応)に加えて、農業経営レベルにおける水稲の作季と収量、および試験研究機関における品種開発の動向も関係していることが明確となった。1.本研究は、わが国の稲作をウルチとモチ分け、モチ稲栽培の面から稲作地域論を展開する新しい試みの一環として、地図分析とフィールドワークにより過去役100年間におけるモチ稲栽培地域編成の特色を把握し、それを規定した条件と地理的環境との関係について考察したものである。2.わが国の稲作におけるウルチとモチとの作付面積は、伝統的にほぼ一定の比率をもって継続してきたが、高度経済成長期以降とりわけ1970年代以降の米の生産調製の過程において、モチ栽培の地位が大きく後退すると共にウルチとモチの栽培の地域分化が全国的規模で展開してきたことが明らかになった。3.今日のモチ稲栽培は日本列島の南北に配置される形で発生した大規模な栽培地域、内陸山間部における栽培地域、そして局地的な栽培地域の3類型に要約できる。4.モチ稲栽培は、共通してウルチ米での生産対応が困難で、かつ米生産の経済的比重が高い地域で展開してきたことが判明した。それらを可能にした条件としては、(1)良質モチ品種の開発・導入、(2)農協および行政の対応(作付誘導、流通、経営指導)(3)水田の基盤整備、(4)稲作一貫機械化体制の普及、などの要因を指摘することができる。5.モチ稲栽培の地域における位置づけ方は、それぞれの地理的環境と密接に関連しており、分化したモチ稲栽培の地域的性格は明瞭な差異をともなっている。このことは、地域環境に適応した稲作展開を図ることが稲作地域として持続しうる大きな条件の一つであることを意味する。
土壌コロイドの制御による酸性土壌の物理性・耐食性維持に関する研究

1.降雨実験を鳥取大学乾燥地研究センター(全国共同利用施設)内のアリドドームで行った。変異荷電粘土鉱物を主として含む酸性土壌に対して、硫酸カルシウムの施用が顕著に土壌の分散ならびに侵食を助長することを示し、これに対して陰イオン型,非イオン型のポリアクリルアミドの微量の施用が顕著な分散抑制、侵食防止効果を示すことを実験的に明らかにした。実験の成果は、2002年度の国際土壌保全機構会議(ISCO2002)において発表した。2.室内カラム実験として、4極電気伝導度センサー、テンシオメータなどで構成した土壌カラムを作成し、塩化ナトリウム、硫酸カルシウム流下実験と流下溶液の経時的モニタリングを行い、電気伝導度の変化から変異荷電土壌と酸性土壌改良に用いるCa塩資材の反応・移動について明らかにした。また、排水中の化学物質の濃度、pHを用いてchemical speciationを行い、カラム内で生じている可能性のある反応について検討を進めた。その結果、酸性土壌に関連する水(土壌水、湖沼水)のpH値の形成は、酸性土壌に含まれるAlの量に依存すること。深層酸性土壌の改良に有効とされている硫酸Ca(セッコウ)は、酸性土壌中の粘土鉱物に対して特異吸着を示すことが示唆された。特異吸着の結果、粘土鉱物の荷電特性、分散凝集特性が変化することがカルシウム塩による酸性土壌の分散性助長の一因であることが示唆された。この実験の成果は、国際土壌科学会議(2002年度、タイ国)にて発表を行った。1.本年度は、人工降雨装置が製作中であったため、降雨実験を鳥取大学乾燥地研究センター(全国共同利用施設)内のアリドドームで行った。変異荷電粘土鉱物を主として含む酸性土壌に対して、陰イオン型のポリアクリルアミドが顕著な効果を示すことを明らかにした。実験の成果は、2002年度の国際土壌保全機構会議(ISCO2002)において発表する予定である。2.また、室内実験として、変異荷電土壌と酸性土壌改良に用いるCa塩資材の反応について土壌カラム実験を進めた。その結果、深層酸性土壌の改良に有効とされている硫酸Ca(セッコウ)は、酸性土壌中の粘土鉱物に対して特異吸着を示すことが示唆された。特異吸着の結果、粘土鉱物の荷電特性、分散凝集特性が変化することが予想されている。この実験の成果は、国際土壌科学会議(2002年度、タイ国)にて発表する予定になっている。
頭頸部癌におけるEGFR,IGF-1Rと重粒子線の関係の検討

癌細胞における増殖因子受容体およびその機能抑制と放射線治療との関連が注目されているが、未解明な事項が多い。特に重粒子線においてはさらにその知見は十分でない。申請者はEGFRとIGF-1Rの2つの遺伝子と放射線との関係について研究を行ってきており報告を行ってきている。本研究ではそれら受容体と放射線治療との関係、特に重粒子線(炭素線)について研究を行う。現在、本研究は放射線医学総合研究所(放医研)の共同利用研究「HIMAC」に研究課題として採択され、放医研の炭素線照射装置を利用して行っている。研究は現在のところ、主にヒト頭頸部扁平上皮癌細胞のFaDuを用いてγ線と炭素線による放射線効果の違い及び抗EGFR抗体の照射効果におよぼす影響を検討している。抗EGFR抗体としてはcetuximabを使用している。1)clonogenic survival assayでは炭素線においても放射線増感作用を示している2)ウェスタンブロットを用いてγ線におけるEGFRおよびp-EGFRの発現状況及び変化を検討した。γ線照射によるEGFRの変化は認められなったが、p-EGFRにおいては4Gy照射で発現の上昇がありcetuximabの投与によりそれらが抑制されることが認められた。3)ヒト頭頸部扁平上皮癌細胞を用いた炭素線照射およびcetuximab併用によるPCR arrayを用いたRNAの変化の検討。PCR arrayにて、EGFおよびPDGFシグナリングに関係する遺伝子84種類を炭素線照射およびcetuximabの投与の有無について検討を行った。Cetuximab投与群およびcetuximabと炭素線の併用群において、いくつかの遺伝子の発現変化が認められた。増殖因子とその受容体からのシグナルは,腫瘍の発生・進展に大きな役割を果たしている。近年,癌治療の分子標的としてチロシンキナーゼ活性を有する増殖因子受容体が注目されている。消化器癌などでは,epidermal growth factor receptor (EGFR)などを標的とする分子標的治療薬の開発,臨床試験が進み,一部はすでに臨床応用され放射線治療との併用で高い効果を示している。本邦ではcetuximabが頭頸部癌においても認可され放射線併用で用いられるようになってきた。しかしながら、cetuximabの頭頸部扁平上皮癌に対する重粒子線治療との併用に関しては十分な研究が進んでいないのが現状である。そこでEGFRと抗EGFR抗体の重粒子線治療における働きをγ線と炭素線で検討し、分子標的治療薬と重粒子線の併用によるさらなる腫瘍制御の可能性を検討する。・Cetuximabの放射線増感作用Cetuximabの放射線増感作用を調べるためclonogenic survival assayを行った(図1)。CetuximabはFaDuにおいてγ線の軽度増感作用を示したが、Detroit562はγ線においては増感作用は認められなかったが炭素線では軽度の増感作用が認められた。一方、Faduでは、どちらの線種においても軽度の増感作用が認められた。・EGFRのタンパク発現の変化ウェスタンブロットを用いてγ線、炭素線におけるEGFRおよびp-EGFRの発現状況及び変化を検討した。EGFRにおいては今回の短いタイムポイントではcetuximabはいずれの線種においても変化は認められなかった。一方、p-EGFRにおいては照射後よりすぐに上昇が認められ時間の経過とともに低下していき、その上昇がcetuximabによって抑制されることが認められた。同様の現象は炭素線においても確認された。Cetuximabの比較的感受性があることが過去の報告で分かっているHN5(頭頸部扁平上皮癌細胞)を入手し前年度と同様に解析を行った。また、特にcetuximabに感受性良好なHN5に照準をしぼり炭素線との併用でのDNA repairやapoptosis誘導の評価を行った。研究成果と解析結果この効果の差が細胞本来のEGFRの発現状況と関係があるかをwestern blotで確認したところHN5では高度にEGFRが発現していることが分かった。この差がcetuximabの直接的な感受性の差になっているかは不明であるが、可能性としては考えることができるだろう。以降の実験においてはcetuxima感受性株のHN5を用いて実験を行った。γH2A-X fociによって炭素線によるDNAダメージとcetuximabのDNA repairに対する働きを検討した。その結果ではcetuximabによって放射線増感作用を示したHN5では炭素線によって誘導されたDNA損傷からの回復がcetuximabによって遅延していることが分かった。TUNNEL assayにて炭素線によるapoptosisの誘導とcetuximabによるそれらの増強作用を検討した。その結果ではやはりsurvival assay, γH2A-X fociの結果と同様にFaDuよりもHN5においてよりcetuximabによるapoptosisの誘導の増強作用が認められた。炭素線照射装置の利用時間が限られており、割り当て時間内での使用に限られているため望むスケジュールで実験結果が得られていない。耳鼻咽喉科学達成度はやや遅れているが、引き続き放医研の共同利用研究に課題と申請し炭素線照射を行っていく予定である。本研究申請期間内には一定の成果がでる見込みである。今年度は細胞のコンタミネーションの問題が発生し、予定した実験が消化できなかった。また実験の条件設定(細胞数)の不具合などにより得られた実験結果が少なくなり目標に達しなかったため予定していた実験が行えず使用額に差が生じてしまった。

達成度はやや遅れているが、引き続き放医研の共同利用研究に課題と申請し炭素線照射を行っていく予定である。本研究申請期間内には一定の成果がでる見込みである。予備実験も終了し今後は計画通り実験を行える目途がついている。短期スパンで予算執行状況の確認を行い、計画を立て使用していく。放射線装置の使用頻度が限られており、照射実験の回数が当初より少なかったため。今年度はPCR arrayによる照射増感作用の解析を予定しており、こちらの実験器具は高価なため繰越金を使用して購入する予定です。
鳥類の胚操作と遺伝子破壊鳥類作製のための基礎研究

イギリスのペリーによって開発されたニワトリ受精卵の体外培養システムは、雌の輸卵管より放卵される1日前の濃厚卵白のみついた受精卵をとりだし、生体外で培養孵化するもので1細胞期の卵子への遺伝子導入を可能にした。しかし、この方法では、1羽の雌鳥から1つの受精卵しか得られないために効率が悪い。そこで、鳥類の卵巣中より数個の未成熟な卵をin vitroで成熟させ、体外受精を行いトランスジェニッグチキンの孵化までをin vitroで行うことを目的とした。このためモデル系として、取り扱いが簡単なウズラのメスの腹部を解剖し、様々な大きさの未成熟卵子が存在している卵巣を摘出した。最も大きな直径1.52cmの卵子の周りに存在する卵黄膜を注意深く取り除いた後、BSA(3mg/ml)を含むDMEM培地で培養した。またこれよりも小さな卵子はBSA(3mg/ml)、インシュリン(5μg/ml)、トランスフェリン(5μg/ml)、EGF(1ng/ml)を含むDMEM培地で培養した。未成熟卵子の成熟の度合いを示すものとしてGVB(germlnal vesicle breakdown)を観察した。ウズラの雌から゙採取した直径が最も大きな約1.5cm卵子とその次に大きな卵子は、解剖後の観察で卵子の周りに存在する卵黄膜を取り除くと卵核胞を確認することができた。また1日培養後にGVBを観察することができた。これらの卵子には黄色卵黄も存在し成熟の可能性も考えられるが、成熟の確認を行うため現在人工受精法を検討している。また卵子に分化する始原生殖細胞を分離する技術を開発し、ウズラ受精卵1個あたり数個の始原生殖細胞を分離し、始原生殖細胞をターゲッティングして遺伝子を導入するシステムを開発した。
大脳皮質における触痛覚情報処理機構の再編成

末梢神経の傷害によって痛覚過敏やアロディニアなどの神経因性疼痛が起こるが、これは体性感覚の伝達経路に可塑的変化が生じることにより発生していると考えられており、その可塑的な変化は末梢の感覚神経系だけでなく、中枢神経系でも起きていることが示唆されている。本研究では、2光子励起レーザー顕微鏡を用いて、神経因性疼痛により大脳皮質一次体性感覚野(S1領域)で生じる変化について解析を行った。実験は、大脳皮質錐体細胞がGFPで標識されたマウスを用い、まず頭蓋骨に大脳皮質観察用の窓を作成した。その後、坐骨神経の1/31/2を糸で縛り神経因性疼痛モデルとした。神経因性疼痛の評価はvon Freyによる機械刺激とアセトンドロップによる冷刺激により行った。神経傷害により、機械刺激および冷刺激の感受性が増大し、これは神経傷害から1日後に現れ、36日後に最大となり、その後1ヶ月以上持続した。神経傷害後に、2光子励起レーザー顕微鏡を用いて、大脳皮質一次体性感覚野のインビボイメージングを行ったところ、棘突起のターンオーバーが増加していることがわかった。このターンオーバーの増加は神経傷害初期に起こり、慢性痛の後期には見られなかった。さらに、障害前に存在した棘突起は優位にその数は減少し、障害後に新生したものはその後も優位に残存した。さらに、末梢刺激に対する大脳皮質の電気的応答は増強した。この結果から、以上の結果から、慢性痛によって大脳皮質一次体性感覚野においてシナプス構造レベルの再編成が促進され、痛覚過敏の発症に関与していることが示唆された。この結果は、難治性の慢性疼痛の治療の新たな戦略を示すことが期待出来る。しかし、大脳皮質一次体性感覚野において神経因性疼痛などの慢性痛により起こる変化は全く明らかになっていない。そこで、本研究では、2光子励起レーザー顕微鏡を用いて、神経因性疼痛により大脳皮質一次体性感覚野(S1領域)で生じる変化について解析を行った。実験は、大脳皮質錐体細胞がGFPで標識されたマウスを用い、まず頭蓋骨に大脳皮質観察用の穴を作成した。神経傷害直後に、2光子励起レーザー顕微鏡を用いて、大脳皮質一次体性感覚野のインビボイメージングを行ったところ、観察した3時間の間に、樹状突起および神経軸索は全く動かず非常に安定していた。一方、棘突起(スパイン)はよく動いており、その動きは対照群に比べ神経傷害モデル群で高かった。スパインの樹状突起上の密度には変化はなかった。以上の結果から、慢性痛によって大脳皮質一次体性感覚野においてシナプス構造レベルの再編成が促進されることが示唆された。今後はこのメカニズムおよびその生理・病態生理的意義の解明に全力を注ぎたいと考えている。神経障害直後に傷害を受けた神経の活動を抑制すると、棘突起のターンオーバー増加は抑制されて痛覚過敏の発現も抑制されたが、痛覚過敏が形成された後に神経活動を抑制しても痛覚過敏の症状は抑制されなかった。以上の結果から、慢性痛によって大脳皮質一次体性感覚野においてシナプス構造レベルの再編成が促進され、痛覚過敏の発症に関与していることが示唆された。今後はこのメカニズムおよびその意義について更なる検討を進めたい。末梢神経の傷害によって痛覚過敏やアロディニアなどの神経因

性疼痛が起こるが、これは体性感覚の伝達経路に可塑的変化が生じることにより発生していると考えられており、その可塑的な変化は末梢の感覚神経系だけでなく、中枢神経系でも起きていることが示唆されている。本研究では、2光子励起レーザー顕微鏡を用いて、神経因性疼痛により大脳皮質一次体性感覚野(S1領域)で生じる変化について解析を行った。実験は、大脳皮質錐体細胞がGFPで標識されたマウスを用い、まず頭蓋骨に大脳皮質観察用の窓を作成した。その後、坐骨神経の1/31/2を糸で縛り神経因性疼痛モデルとした。神経因性疼痛の評価はvon Freyによる機械刺激とアセトンドロップによる冷刺激により行った。神経傷害により、機械刺激および冷刺激の感受性が増大し、これは神経傷害から1日後に現れ、36日後に最大となり、その後1ヶ月以上持続した。神経傷害後に、2光子励起レーザー顕微鏡を用いて、大脳皮質一次体性感覚野のインビボイメージングを行ったところ、棘突起のターンオーバーが増加していることがわかった。このターンオーバーの増加は神経傷害初期に起こり、慢性痛の後期には見られなかった。さらに、障害前に存在した棘突起は優位にその数は減少し、障害後に新生したものはその後も優位に残存した。さらに、末梢刺激に対する大脳皮質の電気的応答は増強した。この結果から、以上の結果から、慢性痛によって大脳皮質一次体性感覚野においてシナプス構造レベルの再編成が促進され、痛覚過敏の発症に関与していることが示唆された。この結果は、難治性の慢性疼痛の治療の新たな戦略を示すことが期待出来る。
115化合物の純良単結晶育成と圧力誘起超伝導の研究

URu_2Si_2は重い電子系の超伝導体の1つであり,古くから盛んに研究されている.URu_2Si_2は17.5K以下において「隠れた秩序」相に相転移する.隠れた秩序の秩序変数は20年以上研究されてきたにもかかわらず未だに明らかになっていない.隠れた秩序相に転移すると磁気抵抗・ホール効果測定からキャリアの大部分が消失し,低キャリアでオープン軌道が無く,かつ電子とホールキャリアが補償した半金属的な状態が実現している,URu_2Si_2の磁気相図はよく調べられており,隠れた秩序状態は36Tの高磁場下で閉じる.我々は残留抵抗比が700にも達する超純良単結晶を用いて,0.1K,27Tの低温・共磁場下の磁気抵抗・ホール効果測定を行った.ホール効果は低温においてH_p=16T以上で減少し始め,H^*=23Tにおいて鋭いジャンプを示す.磁気抵抗はH_p以上でH^2の振る舞いからはずれ,H^*以上で再びH^2の振る舞いに戻る.これは隠れた秩序相の内部に新たな相転移が存在することを示す.また我々は比較的広い磁場範囲でドハース振動を観測した.従来のdHvA効果で報告されていたフェルミ面に加えて,H^*付近以上で新たなフェルミ面を観測した.これは隠れた秩序相の内部に相転移が存在し,フェルミ面の再構成が起こっていることを示している.このような相転移は超純良試料で初めて観測されたこと,2K以上は熱揺らぎにより見えなくなることなどから,バンド毎に独立に隠れた秩序が壊れていると考えられる.このことは隠れた秩序は遍歴的な秩序であることを示唆している.この結果は論文(1)に纏められた.また国内会議(1-3),国際会議(1)で発表を行った.Ce原子は4f軌道に電子を1個もちf軌道の大きな軌道角運動量を反映した大きな磁気モーメントをもつ.4f電子には伝導電子との相互作用により,長距離磁気秩序を安定化させるRKKY相互作用と伝導電子が磁気モーメントを遮蔽し,磁気秩序を消失させる近藤効果が同時に働いている.Ce化合物ではRKKY相互作用と近藤効果の競合により磁気秩序状態からフェルミ液体状態まで様々な基底状態をとる.特に基底状態として異方的超伝導を示すCe, U化合物は重い電子系の超伝導体と呼ばれ,盛んに研究が行われている.CeCoIn_5はそのような重い電子系超伝導体の一種であり,Ce系重い電子超伝導体としてはもっとも高い超伝導転移温度T_c=2.3Kを示す.他の重い電子系超伝導体と際立って異なる重要な特徴は2枚の主要フェルミ面が凹凸を持った円柱状フェルミ面であることであり,他の重い電子系超伝導体が3次元的であるのに対し擬2次元的になっていることである.同じ結晶構造をもつCeRhIn_5は常圧で反強磁性体であり,圧力下で超伝導を発現する.CoをRhで置換したCeRh_<1-x>Co_xIn_5はRhからCoへ移り変わるとともに磁気秩序状態が消失し,超伝導が現れる.中間の濃度では磁気秩序と超伝導の共存がおきる.CeRh_<1-x>Co_xIn_5の純良単結晶育成を行い,電気抵抗,比熱,磁化率測定から相図を,御茶ノ水女子大学古川研と共同で中性子回折の実験を行い,磁気構造を決定した.比熱測定からx=0.2では0.6K以上で超伝導転移は確認できないが,x=0.3では突然T_c=1.2Kの超伝導が現れる.このとき磁気構造は,超伝導と共存しない領域ではq=(1/2,1/2,0.297)の非整合反強磁性に,超伝導と共存する領域ではq=(1/2,1/2,1/2)の整合反強磁性になっていることを中性子散乱実験から明らかにした.これらの結果から,1)フェルミ面上の整合反強磁性により消失する領域は超伝導に対してほとんど寄与がないため,整合反強磁性は超伝導と共存できるが,2)フェルミ面上の非整合反強磁性により消失する領域が超伝導に対して重要な寄与を持っており,超伝導は消失すると推察した.この結果は論文にまとめられ,現在投稿中である.CeCoIn_5は重い電子系超伝導体の一種であり,Ce系重い電子超伝導体としてはもっとも高い超伝導転移温度T_c=2.3Kを示す.またその上部臨界磁場H_(c2)は強いパウリ常磁性の効果により,低温強磁場領域で通常の2次転移ではなく1次転移であることが,熱伝導率,磁化,熱膨張,比熱などの測定から指摘されている,より正確に1次転移領城を決定するため,10x10・m^2程度の微小ホール素子を用いた局所磁化測定法の開発・測定を行った.その測定結果はバルク測定の結果を裏付けるものとなった.強相関電子系における超伝導で最も重要な点は超伝導の発現機構とその対称性であることは明らかであろう.しかしながら重い電子系超伝導体では超伝導の対称性が決定されている物質は少ない.一方で高温超電導体においては薄膜試料の作製に成功しており,薄膜試料に微細加工を施して,クーパー対の位相の直接的な決定に成功している.

そこで我々はCeCoIn_5の超伝導対称性を直接決定すべく,分子線エピタキシー(MBE)法を用いた薄膜作製を行い,c軸方向に揃った(ただし面内はランダム)c配向膜の作製に成功した.作製した膜は,バルク試料とほぼ同じ超伝導転移温度,シャープな超伝導転移幅,バルク試料とほぼ同じH_(c2)の異方牲など極めて良質である.残念ながらエピタキシャル成長には成功しなかったため,クーパー対の位相を直接決定することは出来なかった.現在はCeCoIn_5の母物質であり,圧力誘起超伝導体であるCeIn_3のエピタキシャル薄膜の作製にMBE法を用いて取り組んでいる.CeIn_3ならびにf電子を持たない参照物質であるLaIn_3のエピタキシャル薄膜の作製に成功しており,更に進んでCeIn_3をn層,LaIn_3をm層,交互に積んだ人工超格子薄膜CeIn_3(n)/LaIn_3(m)の作製に成功しつつある.人工超格子ではCe層の厚みを薄くしてやることによって磁性に関する次元性を3次元から2次元に変化させることが出来る.我々はCeIn_3(n)/LaIn_3(4)(n=8,5,4)を作製し,その電気抵抗率測定から次元性精御によって反強磁性が抑制され,有効質量が増大することを示した.URu_2Si_2は重い電子系の超伝導体の1つであり,古くから盛んに研究されている.URu_2Si_2は17.5K以下において「隠れた秩序」相に相転移する.隠れた秩序の秩序変数は20年以上研究されてきたにもかかわらず未だに明らかになっていない.隠れた秩序相に転移すると磁気抵抗・ホール効果測定からキャリアの大部分が消失し,低キャリアでオープン軌道が無く,かつ電子とホールキャリアが補償した半金属的な状態が実現している,URu_2Si_2の磁気相図はよく調べられており,隠れた秩序状態は36Tの高磁場下で閉じる.我々は残留抵抗比が700にも達する超純良単結晶を用いて,0.1K,27Tの低温・共磁場下の磁気抵抗・ホール効果測定を行った.ホール効果は低温においてH_p=16T以上で減少し始め,H^*=23Tにおいて鋭いジャンプを示す.磁気抵抗はH_p以上でH^2の振る舞いからはずれ,H^*以上で再びH^2の振る舞いに戻る.これは隠れた秩序相の内部に新たな相転移が存在することを示す.また我々は比較的広い磁場範囲でドハース振動を観測した.従来のdHvA効果で報告されていたフェルミ面に加えて,H^*付近以上で新たなフェルミ面を観測した.これは隠れた秩序相の内部に相転移が存在し,フェルミ面の再構成が起こっていることを示している.このような相転移は超純良試料で初めて観測されたこと,2K以上は熱揺らぎにより見えなくなることなどから,バンド毎に独立に隠れた秩序が壊れていると考えられる.このことは隠れた秩序は遍歴的な秩序であることを示唆している.この結果は論文(1)に纏められた.また国内会議(1-3),国際会議(1)で発表を行った.
異常蛋白質が引き起こす空胞形成の分子解析

(1)VCP及びそのコファクター類の組織分布を免疫組織染色により解析した。マウスでは、管腔構造をとる上皮系の細胞や免疫系細胞、乳腺上皮細胞、胃酸分泌細胞などの分泌機能をもつ細胞で、VCPの強い発現が見られた。ヒト組織でも上皮系の細胞に強い発現が見られ、脂肪肝に伴う細胞内油滴およびMallory bodyの形成部位でも顕著な発現が検出された。また、ヒトがん組織では上皮系の形態をとる細胞で強く発現していた。これらの結果から、VCPはタンパク質や酸などの分泌でも重要な役割を果たしていることが示唆された。(2)HeLa細胞のVCPを5%未満に低下させるsiRNAを作成した。この系にsiRNAの標的とはならないようにデザインした変異体を再導入してタンパク質を置換する普遍的手法を確立し、次の2つの系でVCPあるいはその修飾型が重要な役割を果たしていることを見出した。(2)-1 HeLa細胞ではVCPのノックダウンにより紡錘体極の数が不安定になり、M期で細胞周期が停止もしくは細胞死に至った。野生型VCPの導入で細胞の増殖は回復し、特定部位のリン酸化を模倣する変異体の導入では増殖が更に活性化した。抗体による染色から、このリン酸化VCPは紡錘体極やセントロソームでタンパク質の会合と分離に寄与していることが示唆された。(2)-2培養細胞に発現させたルシフェラーゼを熱ショックにより変性させると、VCPのノックダウン細胞では活性の回復が遅れた。野生型の導入では活性は回復したが、D1領域のATPase欠失変異体では回復が見られなかった。変性蛋白質の機能回復におけるD1領域ATPase活性の重要性が明らかとなった。(3)VCPが関与する信号伝達経路を解明するため、VCPの発現に依存して生育する温度感受性株を得た。ゲノムライブラリーのスクリーニングにより、温度感受性を回復させる8つの遺伝子断片を得た。我々は、ポリグルタミン病の原因遺伝子の一つであるMJDタンパク質に酵母Cdc48の哺乳類ホモログであるVCP/p97が結合するという発見を端緒として、変性タンパク質が神経細胞の機能低下や細胞死を引き起こす分子機構を解明し、疾患治療のための分子標的の同定を目指している。VCPの細胞機能に対する影響を評価する目的で、野生型VCPおよび変異型VCP(K524A)を昆虫細胞に発現させ、精製後ATPase活性を測定したところ、変異型ではATPase活性が消失していた。次に、テトラサイクリン除去により野生型VCPあるいは変異型VCPの発現が誘導されるようにしたPC12細胞株を用いてVCPの細胞機能を検討した。変異VCPの発現誘導で細胞には空胞形成が誘導され細胞死に至るが、この空胞はERの異常な膨張であることをER局在シグナルをもつ蛍光蛋白質との共発現で確認した。変異VCPを発現した細胞ではERストレスの指標であるGRP78の発現誘導が見られ、ER画分にはユビキチン化蛋白質が蓄積していた。変異VCPの発現で通常ERADを通じて分解されている遺伝性嚢胞性繊維症の原因遺伝子産物CFTR-deltaF508がERに蓄積していることが認められた。また、神経細胞の初代培養にアデノウィルスを用いて伸長したポリグルタミン鎖(Q79)を発現させると細胞ライセートのプロテアソーム活性が低下し、IRE1やPERKといつたERストレスで発動される蛋白質リン酸化酵素が活性化された。さらにこの経路の下流でIRE1-TRSF2-ASK1経路の活性イヒが起こり細胞死につながっていることを、ASK1 kmockout mouse由来の神経細胞を用いて示した。ポリグルタミン発現によるプロテアソーム活性の低下にVCPが関係しているという直接的な証拠はまだないが、正常細胞においてはVCPはユビキチン化された変性蛋白質の処理を通じてERホメオスタシスの維持に貢献しており、変異VCPの発現や変性蛋白質の存在下ではERADなど、VCPの関係した変性蛋白質の処理機構が損なわれるためERにストレス応答が起きていると推測される。各種の神経変性疾患でVCPが果たす役割を、VCP特異的抗体で患者脳を染色し検討した。VCP陽性となった凝集体はユビキチンに対しても陽性で、これらは痴呆を伴う運動ニューロン疾患やクロイツフェルト・ヤコブ病におけるballooned neuron,アルツハイマー病の老人斑でのdystrophic neurite,およびパーキンソン病のLewy小体(マリネスコ小体)で認められた。一方、アルツハイマー病でgranurovacuolar degenerationを示した細胞中の顆粒や神経原繊維変化は陰性であった。VCPはポリグルタミンに結合するタンパク質として同定されたATPaseである。本研究では、VCPを細胞のおかれた様々な環境因子を、蛋白質の修飾を通じて細胞機能の変化に転換するセンサー兼エフェクター蛋白質としてとらえて研究を展開している。各種の神経変性疾患でVCPと凝集体の関係をVCP特異的抗体で患者脳を染色し検討した。VCP陽性となった凝集体は痴呆を伴う運動ニューロン疾患やクロイツフェルト・ヤコブ病におけるballooned neuron,アルツハイマー病の老人斑でのdystrophic neurite,およびパーキンソン病のLewy小体(マリネスコ小体)で認められた。凝集体がVCPを通じて細胞機能に及ぼす影響している経路として酸化ストレスの生成を疑い、精製VCP蛋白質を酸化剤で処理し、ヤススペクトロメトリーで酸化ストレスにより修飾を受けるアミノ酸残基を同定した。

酸化修飾を受けやすい4つのシスティン残基のうち一つの残基をスレオニンに変えるだけでVCPのATPase活性を酸化ストレスに対して耐性とすることが出来た。この変異体の発現でショウジョウバエ複眼はポリグルタミン細胞死に耐性となった。酸化ストレスと細胞死の関係では、酸化ストレスを生成する亜砒酸を活性酸素消去系であるグルタチオン生合成酵素の阻害剤BSOとともに処理することで、亜砒酸の有効濃度を低下させ同時に細胞死誘導効果のガン細胞に対する特異性を高めることに成功した。実際にin vivoのマウス前立腺癌の転移モデルでも、この同時処理は副作用のない濃度で前立腺癌の転移を抑制することが出来た。酸化ストレスを介した癌の増殖・転移抑制にVCPが果たしている役割は興味深い。酸化修飾の他にもVCPはリン酸化を始めとして様々な修飾を受けていることをマススペクトロメトリーによる解析で明らかとした。意外にも、活性部位から離れたC末領域でのアセチル化がVCPのATPase活性に大きく影響を与えると判明し、このメカニズムおよびアセチル化の反映する細胞状態についていくつかの仮説を検証している。(1)VCP及びそのコファクター類の組織分布を免疫組織染色により解析した。マウスでは、管腔構造をとる上皮系の細胞や免疫系細胞、乳腺上皮細胞、胃酸分泌細胞などの分泌機能をもつ細胞で、VCPの強い発現が見られた。ヒト組織でも上皮系の細胞に強い発現が見られ、脂肪肝に伴う細胞内油滴およびMallory bodyの形成部位でも顕著な発現が検出された。また、ヒトがん組織では上皮系の形態をとる細胞で強く発現していた。これらの結果から、VCPはタンパク質や酸などの分泌でも重要な役割を果たしていることが示唆された。(2)HeLa細胞のVCPを5%未満に低下させるsiRNAを作成した。この系にsiRNAの標的とはならないようにデザインした変異体を再導入してタンパク質を置換する普遍的手法を確立し、次の2つの系でVCPあるいはその修飾型が重要な役割を果たしていることを見出した。(2)-1 HeLa細胞ではVCPのノックダウンにより紡錘体極の数が不安定になり、M期で細胞周期が停止もしくは細胞死に至った。野生型VCPの導入で細胞の増殖は回復し、特定部位のリン酸化を模倣する変異体の導入では増殖が更に活性化した。抗体による染色から、このリン酸化VCPは紡錘体極やセントロソームでタンパク質の会合と分離に寄与していることが示唆された。(2)-2培養細胞に発現させたルシフェラーゼを熱ショックにより変性させると、VCPのノックダウン細胞では活性の回復が遅れた。野生型の導入では活性は回復したが、D1領域のATPase欠失変異体では回復が見られなかった。変性蛋白質の機能回復におけるD1領域ATPase活性の重要性が明らかとなった。(3)VCPが関与する信号伝達経路を解明するため、VCPの発現に依存して生育する温度感受性株を得た。ゲノムライブラリーのスクリーニングにより、温度感受性を回復させる8つの遺伝子断片を得た。
アクチノイドの岩石風化生成物に対する収着機構の検討

放射性廃棄物の地層処分の安全性評価等に関連して、アクチノイド等の放射線毒性を長期に有する核種の地層中での挙動を知ることは緊急かつ重要な課題である。鉄やアルミニウム等の含水酸化物は、酸化物やケイ酸塩その他の結晶性鉱物の表面での溶解(風化)や沈殿(堆積)を通じて地層中に広汎に分布し、高い収着容量を有するので、地層中の核種移行現象を支配する重要な因子の一つである。しかし、これら材料の固液界面が長期の風化作用の結果として物理的かつ化学的に複雑な特性を有するので、その収着特性は明白ではなく、基礎的知見の蓄積が必要である。そこで先ず、鉄やアルミニウムの含水酸化物及び酸化物に対するトレーサー濃度の5価ネプツニウムの収着挙動を調べ、試料の結晶構造や表面状態による影響を検討した。鉄とアルミニウムの何れの系に於いても、鉱物や酸化物粉末よりも水溶液から沈殿させて得た含水酸化物(合成試料)の方が収着性が高く、また鉱物の間では風化生成物の収着性が良好であり、Np(V)の収着は含水酸化物や酸化物の結晶構造や内部表面の状態によって著しく影響されることが明らかとなった。次に、合成した非晶質含水酸化物及び天然鉱物のゲ-タイト、ギブサイトへのEu(III)及びCo(II)の収着のpllに対する変化を、広い範囲の金属イオン濃度に於いて検討し、金属イオンによる収着サイト占有の飽和効果を調べた。これらの含水酸化物に対する収着は、金属イオン濃度が低い場合には、唯一つの結合定数のみを仮定する単純なラングミュア式により説明できることが確かめられた。高い金属イオン濃度に於いては、ゲ-タイトとギブサイトへの収着はサイトの飽和を示す明確な極大値へと達するのに対し、非晶質含水酸化物への収着は金属イオン濃度と共に増加し続けることが確認された。このことより、均質な表面状態を有した鉱物への収着は、金属イオンとサイトの間の1:1の相互作用に支配されているのに対し、非晶質含水酸化物への収着は表面での沈殿生成や固溶体生成のような、鉱物に対する収着とは異なる機構で進むと考えられる。本年度は、鉄およびアルミニウムの酸化物鉱物及び実験室で合成した含水酸化物を用いて、トレーサー濃度(10^<-12>-10^<-13>M)のNp (V)の分配をpHの関数として測定し、収着挙動の支配的因子を明らかにした。分配係数の時間変化を調べた結果、Np (V)の収着には速く進行するもの(1時間以内で平衡に到達)と非常に遅く進行するもの(数日でも非平衡)があることが分かったが、実験的室検討では時間的制約があり、比較的速く進行する反応のみに半定量的に注目せざるを得ない。ヘマタイト、マグネタイトやコランダムといった酸化物鉱物には有効な収着がみられないのに対して、オキシ水酸化物や非晶質含水酸化物のような細孔の多い構造を持つ風化生成物ではかなり高い収着がみられた。また、後者での収着はナトリウムイオンがイオン交換で取り込まれるpHよりはるかに低いpHで起こり、Np (V)の収着は固相表面の活性基との配位性の結合によるものと考えられる。