hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3次元レーザー微細加工法を用いた光周波数領域での左手系メタマテリアルの開発

2光子重合反応を利用したマイクロ/ナノ加工法において,マイクロレンズアレイを用いたマルチレーザービームスポット生成法を開発し,それを用いて複数の3次元構造物を並列に一度に作成する手法を開発した.実験では,直径300ミクロンのマイクロレンズがガラス基板上にアレイ状に形成されたレンズアレイを用いて,約1000個程度のレーザービームスポットを同時に生成させた.そしてこのビームスポットを紫外線硬化樹脂中で3次元的に走査することにより,3次元的なアレイ状の樹脂構造物を同時に製造することに成功した.さらにこのポリマー構造物に対して,無電解メッキ法をベースにサイト選択的な金属コーティング行う手法を開発した.具体的には光重合樹脂中にメタクリルアミドを添加することにより金属の付着性を高めた樹脂を開発した.そしてこの改質した樹脂と元の樹脂の両方を個別に用いて3次元構造物をつくり,改質した樹脂部にのみ選択的に銀,金,銅などの金属をコートできることを確認した.そして100nmの空間分解能で局所的に金属コートされた3次元マイクロ構造物の加工が可能であることを確認した,またコートされた金属層の抵抗率は,バルク金属の抵抗率と比べて高々数倍程度であり,極めて電気伝導度の高い3次元金属構造体が作成できることを確認した.これらの実験結果から,我々が開発した加工技術は,複雑な3次元形状と樹脂などによって保持された金属構造体を必要とするメタマテリアルなどの加工法に極めて有効であることが実証できた.光硬化性樹脂を用いた2光子吸収光造形は、サブミクロンの分解能で自由な3次元ポリマー微細構造を作成できる手法の1つである。我々のグループは、さらにマイクロレンズアレイを用いて作製したマルチレーザースポットを利用して、複数の3次元造形物を広い領域にわたり同時に作製する方法について研究を進めてきた。本年度は、この手法をベースとして作成した3次元構造の金属化をめざし、2光子吸収光造形と無電解銀めっきを組み合わせる方法について検討した。2光子吸収光造形で作成したポリマー構造物は,ガラス基板上に作成されるが,この試料に無電界めっきで金属をコートすると,金属はポリマー表面よりもガラス基板表面に出し易いという性質があり,目的のようにポリマー表面のみを選択的に金属化することはできない。そこで本研究では、光硬化性樹脂に芳香族誘導体を添加し,さらにめっき前にポリマー表面にSnCl_2処理を行うことで、銀の核形成を促して密着性を増強させた。加えてガラス基盤表面には,銀の析出を抑制するために疎水性処理を施した。その結果,ポリマー構造表面のみに選択的に金属コーティングができることを確認した。また、この銀コートの抵抗率を測定して導電性を調べた。線幅1μmのポリマー線を作成し,この表面に銀をコートした。そして,その線の両端に銀電極を作り、電極間の抵抗値を測定することでその抵抗率を求めた。実験の結果、抵抗率は7.4×10^<-8>Ωmであった。この値はバルクの銀の抵抗率(1.6×10^<-8>Ωm)と比較して高々4.6倍であることがわかった.以上の研究結果から、3次元金属微細構造作製の1つの手法として2光子造形法と無電解金属めっき法の組み合わせの有効性を確認した。2光子重合反応を利用したマイクロ/ナノ加工法において,マイクロレンズアレイを用いたマルチレーザービームスポット生成法を開発し,それを用いて複数の3次元構造物を並列に一度に作成する手法を開発した.実験では,直径300ミクロンのマイクロレンズがガラス基板上にアレイ状に形成されたレンズアレイを用いて,約1000個程度のレーザービームスポットを同時に生成させた.そしてこのビームスポットを紫外線硬化樹脂中で3次元的に走査することにより,3次元的なアレイ状の樹脂構造物を同時に製造することに成功した.さらにこのポリマー構造物に対して,無電解メッキ法をベースにサイト選択的な金属コーティング行う手法を開発した.具体的には光重合樹脂中にメタクリルアミドを添加することにより金属の付着性を高めた樹脂を開発した.そしてこの改質した樹脂と元の樹脂の両方を個別に用いて3次元構造物をつくり,改質した樹脂部にのみ選択的に銀,金,銅などの金属をコートできることを確認した.そして100nmの空間分解能で局所的に金属コートされた3次元マイクロ構造物の加工が可能であることを確認した,またコートされた金属層の抵抗率は,バルク金属の抵抗率と比べて高々数倍程度であり,極めて電気伝導度の高い3次元金属構造体が作成できることを確認した.これらの実験結果から,我々が開発した加工技術は,複雑な3次元形状と樹脂などによって保持された金属構造体を必要とするメタマテリアルなどの加工法に極めて有効であることが実証できた.
ルワンダのガチャチャ裁判による和解醸成効果に関する研究

1994年のルワンダにおけるジェノサイド犯罪を裁くべく、ガチャチャ法廷が国家主導で推進された。本研究では、ジェノサイドの元・加害者とサバイバー(生存者)が、ガチャチャを経て、和解をするにいたったのかを現地での聞き取り調査によって明らかにしようと試みた。その結果としては、サバイバーの大半が、元・加害者との交流について消極的な姿勢であることが明らかとなった。一方で元・加害者の半数強がガチャチャの場以外でも謝罪を行っていたことが分かった。ガチャチャ制度は国家による強制的な和解の推進とも言えるが、双方ともに相手方と対面をする機会を持てたことについては肯定的にとらえていた。平成25年11月、ルワンダにおける現地調査を実施。1994年に発生したジェノサイド(大量虐殺)の加害者および被害者40名への聞き取り調査を行った。聞き取り調査の目的は、「隣人が隣人を殺した」と言われる暴力を経験した農村社会において、ガチャチャ裁判が、加害者と被害者の人間関係の変化にどう作用したかを聞き取ることであった。被害者たちはおおむね、殺害された家族の最後について知ることができ、加害者の自白に基づいて見つけ出すことができた遺体を埋葬することができていた。その点については満足しているようであった。そして人間関係の修復について、被害者と加害者との日常の交流をたずねると、大半が相互に往来をしているとのことであった(一方が遠隔地にいるなどの場合もあった)。食糧や調味料の貸し借り、結婚式の際の手伝いや食器を貸し借りするといったものがあった。加害者、被害者の双方とも、このような往来は、ガチャチャの前にはあり得なかったと言う。双方が相手側を恐れていたとのことである。実際にルワンダでは、サバイバーによる加害者やその遺族への報復や、収監された加害者の家族によるサバイバーへの報復が行われてきた。ガチャチャという機会を経て、このような疑心暗鬼の関係に変化が生じたことが見うけられる。今年度は、過去の調査結果の取りまとめを行いつつ、最新研究資料の収集に努めた。しかしながらフィールド調査を行うまとまった時間を確保できず、次年度にゆだねることとなった。本研究は、1994年にアフリカ中央部ルワンダ共和国において発生したジェノサイドに関するものである。ジェノサイド後のルワンダにおいては過去の人権侵害をさばき、民族間の和解を進めることを目的に、対話型かつコミュニティベースの法廷「ガチャチャ」が各村に開設された。本研究は、このガチャチャ裁判を経たのちのコミュニティにおける加害者と被害者の関係性の変容についてインタビューを行、ガチャチャ制度の評価を行うことを主眼に置いている。平成26年度は、4月、11月、27年2月に現地調査を行い、ジェノサイドの生存者とジェノサイドに加担した者との双方に対するインタビュー調査を実施することができた。調査協力者たちは、おおむね双方ともガチャチャのポジティブな側面について語ってくれた。具体的には政府の監督下で安全に対話ができたこと(双方とも報復の恐れを抱いてきた)や、生存者は亡くなった家族の遺体の場所を知ることができて埋葬できたこと、また加害者についても謝罪の機会を得られたことなどを肯定的に語るものが多かった。一方でジェノサイド後に転居したり、加害者が逃亡してしまったために、そもそも和解する相手が存在しなかったりする例もあった。このようにガチャチャに参加した人々はかなり率直に自己の経験とガチャチャへの前向きな評価を語ってくれた。一方でガチャチャの場で自らの罪を認めず、収監されたままの加害者も存在している。そのような立場の人々にとってのガチャチャの評価と言うものも今後は調査していく必要性を強く感じ、次年度以降の課題としたいと考える。国際関係論当初は現地でのフィールドワークを行う上での協力者との調整に困難をきたしていたが、調査地でインフォーマントとの間を取り持つ協力者を得ることができ、順調に調査を進めている。今年度は、新規の学生引率プログラムの企画立案、そして引率に忙殺され、ルワンダでまとまった調査をする時間を確保できなかった。現地調査によれば、加害者側も、恐れを感じたり、良心の呵責にさいなまれたりする者が少なくない。彼らはみな、ガチャチャ裁判のおかげで被害者との関係が再開できたことを前向きにとらえている。他にもジェノサイド加害の容疑で長年にわたって収監されていた者が、ガチャチャでの住民の証言によって冤罪を晴らすことができたというケースもあった。それではルワンダは着実に和解に向かって進んでいるかというと、疑問もはさまざるを得ない部分はある。話を聞いたサバイバーすべてが、ガチャチャの場で謝罪をした加害者をゆるしたと言った。

しかし「なぜゆるせたのか?」という問いかけに対しては、ほぼすべてのサバイバーが「それが政府の政策だから」という返答をした。ガチャチャの場で謝罪されたら受け入れて、ゆるさねばならず、それは国の命令だと認識されているのである。03年に実施した調査時は、多くの被害者が「キリスト教の教えに基づいてゆるす」と答えていたが、今年度の調査で、同じように答える人は、わずかにとどまった。この変化は、近年の強権的な政権運営とも軌を一にしている印象がある。政府が「ゆるせ」という方針を立てたら、人々はそれに従わなければならないという社会状況の一片が垣間見える。しかしながらおおむね、加害者も被害者にもガチャチャ裁判の評価は好印象であった。今後の研究は、ガチャチャに参加しなかった人間への聞き取り調査を実施したい。そのような者たちは、ガチャチャに否定的な人間といえる。彼らが否定する理由を聞き取り、現地の人が考えるガチャチャの否定的な側面を検証していきたい。10月、2月にルワンダで現地調査を行い、インタビュー調査を行い、ガチャチャ裁判を経て、共同体の内部でどのように虐殺被害者と加害者の関係が変容していったかを分析する。現地調査を踏まえ、さらなる経年変化を追跡する必要が生じたため。現地調査の継続。旅費、現地交通費、現地通訳謝金、。
ラット胚における耳胞形成と聴神経節の発生

1.Slc:SDラット(以下ラット)の耳胞は、胎生10.5日(体節数9-12期)から11.5日(体節数21-25期)の間に形成される。菱脳域の表皮(外胚葉)が肥厚し、耳プラコードが形成され、0.5日で耳ピットになり、さらに0.5日で耳胞が形成される。胎仔の大きさ約3.5mmに対し、耳胞の大きさは、頭尾方向に約280μm、背腹方向に約270μm、左右方向に165μmである。2.細胞数は、耳プラコード約700、耳ピット約2800、耳胞約6000である。細胞数の増加、特に、耳ピット期以降の増加は、耳胞形成に本質的な役割を果たしてはいないと考えられる。3.耳胞形成初期過程とマイクロフィラメントの関連はみられない。しかし、耳胞(耳ピット)からの予定聴神経節細胞の遊走、および、正常な耳胞形態の維持には、マイクロフィラメントが役割を果たしている。4.ラット聴神経節は、神経冠由来細胞・神経管(神経板を含む)のlateral域由来細胞・耳クレスト(otic crest)由来細胞・耳胞(耳プラコード・耳ピットを含む)由来細胞が混合し形成される。神経管のlateral域は、将来の第4脳室前庭神経角に対応していると思われる。5.神経冠由来細胞・神経管(神経板を含む)のlateral域由来細胞・耳クレスト(otic crest)由来細胞・耳胞(耳プラコード・耳ピットを含む)由来細胞の移動には、マイクロフィラメントが関連している。6.生体内では、耳胞の体表側lateral域から細胞が遊走し、前聴神経節が耳胞のvental側に形成されるが、コラーゲン条件下でも、その特異性は維持されると思われる。聴神経節からのアクソンの伸長は、生体内では特定の方向に限定されているが、コラーゲン条件下では、その特異性が消失すると考えられる。1.正常発生(in vivo)におけるラット耳胞形成を経時的に観察した。ラット胚耳プラコード(菱脳域の側面外表皮の肥厚)は胎生10日に見られ、体節数10(胎生約10.5日)で200x160x40μm(頭尾軸x左右軸x背腹軸)のくぼみが形成され、体節数13で220x200x75μm、体節数16で220x140x100μm、体節数18で220x180x120μmとなり、体節数21(胎生約11.25日)で閉鎖し、220x180x200μmの耳胞が形成された。最初、プラコードの背部は神経管側面に接近し(体節数10)、その背端が外側方に突出した(体節数16)。ついで、腹端が背端方向に盛り上がり(体節数18)、両端が癒合し表皮から離脱した(体節数21)。この時、プラコードの屈曲に対応した細胞核のapicalあるいはbasal域での局在が観察された。昨年、筆者らは、コンピューターによる画像解析でショウジョウバエ原溝陥入過程を解析し、陥入域の細胞のapicalあるいはbasal面の伸長(細胞核の局在とマイクロフィラメントの消長を伴う)により陥入が起こることを明らかにした。ラット耳プラコードの陥入にも同様の機構が働いている可能性が考えられる。2.ラット全胚培養法を用いて耳胞形成不全胚を作成した。0.01μg/mlサイトカラシンDを添加したラット血清中で、胎生9.5日ラット胚を48時間培養し、頭部神経管形成不全胚を得た。これらの胚の耳胞は150x200x230μmの頭尾方向に短く、左右方向に長い形態異常を示していた。対照胚のそれは220x160x300μmであった。3.耳胞形成過程での細胞の増殖・移動・形態変化を定量的に解析中である。現在、2.で得られた胚をもちいて、抗アクチン抗体染色、および、画像解析を行っている。

神経管のlateral域は、将来の第4脳室前庭神経角に対応していると思われる。5.神経冠由来細胞・神経管(神経板を含む)のlateral域由来細胞・耳クレスト(otic crest)由来細胞・耳胞(耳プラコード・耳ピットを含む)由来細胞の移動には、マイクロフィラメントが関連している。6.生体内では、耳胞の体表側lateral域から細胞が遊走し、前聴神経節が耳胞のvental側に形成されるが、コラーゲン条件下でも、その特異性は維持されると思われる。聴神経節からのアクソンの伸長は、生体内では特定の方向に限定されているが、コラーゲン条件下では、その特異性が消失すると考えられる。ラット胚における聴神経節細胞の起源の解析otic placodeの神経管よりの部分からの細胞遊出、otic pitの両端基部からと、脊索よりの部分からの細胞遊出が観察された。otocystになると、その頭頂部に近い脊索よりの部分に聴神経節細胞集団が見られ、対応する部分のotocystから細胞が遊出しており、ラット胚においては、“耳胞"の脊索よりの部分に加え、表皮に面する部分にも予定聴神経節細胞が存在していると考えられた。しかし、抗NF抗体や抗PKC抗体で聴神経節細胞は染色されず、予定聴神経節細胞の同定がまだできていないため、それらの細胞動態を解析する研究は進展していない。2)BrdU処理による耳胞形成不全胚における“耳胞"細胞の増殖・移動・形態変化聴神経節中の予定神経細胞同定のために、BrdU処理によりpost mitotic細胞の検出を試みている中で、耳胞形成不全胚を得た。BrdU処理をすると、胚全体の大きさ・体節数は対照胚と変わらなかったにもかかわらず、“耳胞"中での細胞分裂は低下してきた。BrdU処理の時期・時間を変化させると、種々の段階の耳胞形成不全が観察され、otic placode期での細胞分裂低下が耳胞形成に重大な影響を及ぼすことが明らかになった。3)論文作成の現状サイトカラシンDを用いて行った研究結果については、現在、論文投稿中である。BrdUを用いて行った研究については、現在、論文作成中である。本年度の計画は、3次元コラーゲンゲル中での耳胞の培養である。トリプシン処理で、胚細胞は重大な障害を受け、培養後の状態は悪い。機械的除去では、培養後の状態は良いが、間充織細胞は残る。発生途上の耳胞、前聴神経節、および、菱脳域神経管は単離することが困難で、それらは、組織からの遊走細胞と周囲の間充織細胞を含む複合体としてしか取り扱えないと思われる。10%血清添加の通常の培養液では、上記組織片の培養の状態はきわめて悪い。本研究では、培養液として100%ラット血清を使用しているが、この条件では、培養液からの種々の因子の除去は困難である。耳胞を3次元コラーゲンゲル中で培養すると、培養片の全縁から間充織細胞と思われる細胞が遊走し、楕円状の耳胞の長軸に沿ったlateral側の端に、前聴神経節と思われる細胞塊が観察される。生体内では、耳胞の体表側lateral域から細胞が遊走し、前聴神経節が耳胞のventral側に形成されるが、コラーゲン条件下でも、その特異性は維持されると思われる。聴神経節細胞のマーカーを用いたさらなる研究が必要とされる。3次元コラーゲンゲル中で培養された前聴神経節の全縁に、間充織細胞と思われる遊走細胞とアクソンが観察される。生体内では、聴神経節からのアクソンの伸長は特定の方向に限定されているが、コラーゲン条件下では、その特異性が消失すると考えられる。作成した抗Wnt-1ペプチド抗体で観察する限り、ブロモデオキシウリジン処理胚の神経冠細胞は前聴神経節に合流しない。この前聴神経節を3次元コラーゲンゲル中で培養すると、対照の場合と同様、培養片の全縁からのアクソンが観察される。
膵島移植長期成績改善のためのオートファージ阻害剤による免疫抑制副作用制御法の開発

Mammalian target of rapamycin (mTOR)阻害剤は,膵島移植に用いられる免疫抑制剤の中で中心的役割を果たす薬剤であるが,各種細胞株に対しオートファジーを誘導することが知られている。しかしながら,mTOR阻害剤投与にて膵島にもオートファジーが誘導されるかは報告されていない。今回の研究で,LC-3-GFPマウスを用いて,ラパマイシン投与により実際に膵島にオートファジーが誘導されることがin vitroおよびin vivoで証明された。また,オートファジー阻害作用を有する3-methyladenine(3-MA)を添加することで,分離膵島のオートファジーを抑制し,膵島グラフトに対しても保護的に働くことが確認された。これらの結果より,mTOR阻害剤を含む免疫抑制プロトコールにオートファジー抑制剤を組み合わせるストラテジーが膵島移植の長期成績を改善しうることが示唆された。【研究目的】膵島移植の「長期成績改善」を目指し研究を行った。【研究方法および研究結果】オートファジー様細胞死と移植膵島傷害との関連を解析した。ラパマイシンは、膵島移植後に用いられる中心的免疫抑制剤であり、その薬理効果はmammaliantarget of rapamycin(mTOR)阻害剤である。1ng/mlまたは10ng/mlのラパマイシン濃度でマウス膵島を処理した。その結果、オートファジー誘導のマーカーであるLC3-IIタンパクの膵島細胞内蓄積を確認し、さらに膵島のviabilityも約50%抑制されることをMTS assayで確認した。また、膵島からのインスリン分泌能をグルコース負荷テストで解析した結果、10ng/mlラパマイシン処理ではインスリン分泌はほぼ完全に抑制された。一方、オートファジー阻害剤である3-methladenine(3-MA)で追加処理することによりLC3-IIタンパク膵島細胞内蓄積、膵島viabilityさらに膵島インスリン分泌能を有意に改善させることができた。従って、膵島におけるオートファジー誘導は膵島移植の遠隔成績に強く関与していることが示唆され、移植用膵島におけるオートファジー制御は移植膵島の品質保持、ひいては長期生着に有用であることが示唆された。【まとめ】膵島にオートファジーが起こることを確認でき、膵島のviabilityに負に作用することを明らかにした。さらに、オートファジー阻害剤である3-MAを膵島に投与することで、オートファジーによる膵島傷害性が回避されることを認めた。今後、膵島インスリン分泌など内分泌機能への影響を解析し、さらにin vivoにおいても移植膵島にどのように影響するかを探究する計画である。【研究目的】膵島移植の「長期成績(遠隔期でのインスリン離脱率)の改善」を目指し研究を行った。【研究方法および研究結果】ラパマイシンは膵島移植後に用いられる中心的免疫抑制剤であり、その薬理効果はmammaliantarget of rapamycin (mTOR)阻害剤である。平成20年度の研究報告ではin vitroでの解析により1ng/mlおよび10ng/mlのラパマイシンによりマウス膵島を処理した結果、膵島自身にオートファジー(以下AU)の誘導を確認でき、このオーAU誘導により膵島のviability、インスリン分泌能共に低下することを確認できた。平成21年度の研究では、in vitro実験により確認できたAU誘導がin vivoでのラパマイシン投与によっても生体内の膵島にもAUが誘導されるか解析した。GFP-LC3 transgenic miceに0.2mg/kgのラパマイシンを腹腔内投与し、1週間、2週間、3週間の投与期間でそれぞれマウスを犠牲死さセマウス膵臓を摘出、膵島および膵外分泌組織でのAUの誘導を検証した。GFP-LC3 transgenic miceではAUが誘導された組織ではオートファゴゾームの形成と共にGFP dotの蛍光シグナルを検出することができる利点を持っている。ラパマイシン投与マウスでは、投与1週間の解析では膵島、外分泌共にAU誘導を示唆するGFP dotは検出できなかったが、投与2週間以降の蛍光組織検索では膵島、外分泌組織共にGFP dotの強い発現を確認した。さらに同組織のインスリン染色ではAUを誘導した膵島ではインスリンの染色強度は抑制されていた。マウス血糖の推移では血糖値の上昇などは認められなかった。また、ラパマイシン投与と同時にAU阻害剤である3-methladenine (3-MA)を投与されたマウスでは膵島、外分泌組織共にGFP dotは検出されなかった。【まとめ】in vivoにおいてもラパマイシン投与により膵島にオートファジーが起こることを確認でき、その膵島のインスリン染色の染色強度は抑制された。

しかし、3-MAの投与によりこれらの現象を回避することができ、膵島移植の遠隔成績の向上に直結する膵島保護プロトコールの樹立に応用できる可能性を示した。これまでの研究成果により、mTOR阻害剤であるラパマイシンは、in vitroでマウス膵島に対しオートファジーを過剰に誘導することを確認した。またラパマイシンは膵ベータ細胞からのインスリン分泌能を低下させ、さらに膵島自身のviabilityも低下させる作用を持っていることを明らかにした。さらに、GFP-LC3トランスジェニックマウスから分離した膵島を用いた研究でも、ラパマイシン投与によりin vivoでも膵島にオートファジーが誘導さることを確認できた。これらの結果からin vitroおよびin vivoにてラパマイシン投与は膵島のオートファジーを亢進することが確認された。今年度は、ラパマイシンにより膵島に誘導されたオートファジーとアポトーシスの関係をTMRE assayを用いて解析した。その結果、ラパマイシンにて処理した膵島ではアポトーシス陽性の膵島が有意に増加しており、7-AADによる染色では死細胞が有意に増加していることが示された。しかし、ラパマイシン処理時に3-methladenine(3-MA)を添加することでアポトーシスおよび死細胞のpopulationが有意に減少した。これらの結果より、ラパマイシンによる膵島傷害作用はオートファジー抑制作用を有する3-MA投与により部分的に改善されることが示され、膵島ではオートファジーはviabilityを低下させnegativeに働くことが示された。また、今回の研究でオートファジー過剰誘導とアポトーシスとの間にcross talkがある可能性が示唆された。これらの結果より、mTOR阻害剤を同種膵島移植の系に免疫抑制剤として使用する場合、オートファジーを抑制するストラテジーが必要となる。
パラインフルエンザ2型ウイルスベクターを用いた重症免疫疾患に対する遺伝子免疫療法

喘息などのアレルギー性疾患に対する新しい遺伝子免疫療法のツールとして、リバースジェネティクスを駆使し、気道粘膜に特異的に感染し病原性の認められないパラインフルエンザ2型ウイルス(PIV2)に、マウスインターロイキン4(mIL-4)ならびにそのアンタゴニスト(mIL-4a)を挿入したリコンビナントウイルス[rPIV2(mIL-4),rPIV2(mIL-4a)]を作製した。これらのウイルスは、in vitro(Vero,BHK,LLC-MK2細胞)においては、親株であるrPIV2とほぼ同じ増殖傾向を示し、その感染細胞の培養上清中のmIL-4発現量は、35(μg/ml)と極めて高い値を示した。一方、in vivo(マウス肺)において、rPIV2(mIL-4)は殆ど増殖を示さなかったが、rPIV2(mIL-4a)では、ピーク時のウイルスレプリケションがrPIV2の3倍程度高かった。また、これらのウイルス間で明らかな炎症性の差はなかった。さらにrPIV2(mIL-4a)からのmIL-4a発現により生体内のIL-4の発現が抑制されるとウイルスのレプリケーションが促進し、逆にrPIV2(mIL-4)からのmIL-4発現により生体内のIL-4の発現が増加するとウイルスのレプリケーションが抑制されることから、IL-4によるPIV2レプリケーション抑制が示唆された。これらの結果をふまえ、OVA誘発喘息モデルマウスを用いて上記のウイルスベクターによる喘息の予防・治療効果について、マウスの肺胞洗浄液中の全細胞数ならびに全蛋白量を指標に検討した。Th1移行性を示すIL-4アンタゴニストを挿入したPIV2ベクターを接種したマウスでは、上記の両指標が他のコントロール群と比較して約50%程度に抑えられており、Th1/Th2バランス是正による新規遺伝子免疫療法としての有用性が示唆された。喘息などのアレルギー性疾患に対する遺伝子免疫療法に用いるために、リバースジェネティクスを駆使し、マウスインターロイキン4(mIL-4)ならびにそのアンタゴニスト(mIL-4a)を挿入したパラインフルエンザ2型ウイルス[rPIV2(mIL-4),rPIV2(mIL4-a)]を作製した。これらのウイルスは、培養細胞において親株であるrPIV2とほぼ同じ増殖傾向を示し、VeroならびにBHK細胞での増殖能が高く[感染(m.o.i.3)後48時間で2x10^7(TCID_<50>/ml)]、それらの感染細胞の培養上清中のmIL-4およびmIL-4aの発現量は、35(μg/ml)と極めて高い値を示した。また、L929細胞では、ウイルス増殖がほとんどないにもかかわらず5070(ng/ml)の発現がみられた。ウイルスベクターの安全性の確認のためmIL-4のウイルス増殖への影響を調べた。乳のみハムスター及びマウスの肺におけるウイルス増殖についてReal-time PCRによるウイルスゲノム数とTCID_<50>による感染性粒子のタイターを比較した。ハムスターにおいては、いずれのウイルスもウイルス接種(1x10^7TCID_<50>)後、2日目から6日目にかけて10^8コピー程度のウイルスゲノムが認められ8日目では著しく減少した。また、感染性ウイルス粒子数も、感染後24日目[1x10^6(TCID_<50>/ml)]をピークとし8日目にはほとんど認められなくなった。

一方、マウスにおいては、感染性ウイルス粒子はほとんど認められないにもかかわらず、感染後2日目から10日目くらいまで10^6-10^7コピー程度のウイルスゲノムおよびmRNAが存在し、マウスにおいては、defective virus vectorとして機能している可能性が示唆された。現在、OVA誘発喘息モデルマウスを用いて、これらのウイルスベクターによる遺伝子免疫療法の検討を行っている。気道粘膜に特異的に感染し、病原性のほとんど認められないパラインフルエンザ2型ウイルス(PIV2)に、Th1/Th2バランスに関与するサイトカインであるマウスインターロイキン4(IL-4)ならびにそのアンタゴニストを挿入したリコンビナントウイルスを作製し、マウスにおけるin vivoでのウイルス増殖ならびに病原性へのIL-4の影響について検討した。さらにそれらのウイルスベクターを用いて、OVA誘発による喘息モデルマウスにおける遺伝子免疫治療効果の検討を行った。生体内のIL-4の発現の抑制によりPIV2のレプリケーションが促進し、一方、生体内のIL-4の発現が増加するとウイルスのレプリケーションが抑制されることから、PIV2のレプリケーションとIL-4の発現量には負の相関関係が成立し、IL-4によるPIV2レプリケーションの抑制が示唆された。また、IL-4アンタゴニストを挿入したPIV2において、生体内のIL-4産生の抑制効果が認められ、さらにウイルスのレプリケーション効率が増大したにもかかわらず、マウスの肺の炎症性には明らかな差がなかったことから、Th2優位のアレルギー性疾患である喘息等への遺伝子免疫治療用ベクターとしての有用性が示唆された。そこで、上記の喘息モデルマウスを用いてその予防・治療効果について、マウスの肺胞洗浄液中の全細胞数ならびに全蛋白量を指標に検討した。Th1移行性を示すIL-4アンタゴニストを挿入したPIV2ベクターを接種したマウスにおいては、コントロールと比較して上記の両指標が約50%程度に抑えられており、このIL-4アンタゴニストを挿入したPIV2を用い、Th1/Th2バランスの是正による新規の遺伝子免疫療法の有用な効果が示唆された。
レバノン国所在壁画地下墓の保存修復研究

レバノン共和国は地中海に面して温暖な気候・自然に恵まれ、紀元前1500年頃にアルファベットを生み出したフェニキア文化が栄えた。レバノンの地は南のエジプト、東のメソポタミアを控え、永い歴史の全時代を通じてさまざまな勢力、文化、民族が交錯し、また新たな文化が築かれた地域でもある。レバノン共和国の首都・ベイルートの南約80kmのティール(スール)には世界文化遺産「フェニキアの中心都市として栄えた港町ティール」がある。フェニキア時代の遺構は未解明であるが、ローマ時代の列柱道路・水道橋・ヒッポドロムス・ネクロポリスなどの遺跡が発掘・修復されていて、レバノンにおけるローマ文化の見事な精華を見ることができる。ティール世界遺産地区の東約2kmの丘陵裾にはローマ時代からビザンチン時代の地下墓が多数発見されているが、その一角、ラマリ地区に所在する壁画地下墓TJ04の保存修復を2004年度より4年間5次にわたって実施した。地下墓TJ04は既に開口し墓室内は損傷著しい状況であったが、この保存修復に伴う考古学・美術・保存科学調査によって、壁面に20基、床に2基の納体室のある地下墓の構造、石灰岩岩盤を掘削し切石で組み上げる築造の技法、壁面を土器砕片を混入した漆喰で平滑に整える壁面調整技法、波形・石柱・灯火台・オリーブ、コンパスを使った花形などを赤・茶・黄・緑・黒の5色を基本とする彩色技法、機器分析による赤はベンガラ、緑は緑土であるなどの顔料同定、鉛棺・陶棺・壷・ランプ・ガラス瓶などの出土遺物などからTJ04は12世紀に築造された地下墓であることを明らかにし、さらに温度・湿度・照度・大気汚染などの環境調査を行い、墓室内環境が極めて安定していることが壁画を良好に保ってきた要因であることも明らかにした。2009年度は新たにラマリ地区の南1kmのブルジュ・アル・シャマリ地区に所在する壁画地下墓T.01の保存・修復に着手した。ブルジュ・アル・シャマリT.01も既に開口して損傷していたが、墓室四壁の孔雀や魚・壷・銘文などの壁画・文字は色彩も鮮やかに残されていた。初年度の調査とし主として墓室内外の清掃や現状記録を行い、床に6基の掘り込み棺のある墓室の構造、石灰岩岩盤を掘削し壁面に土器砕片を混入した漆喰で平滑に整える壁面調整技法、孔雀・魚・鳥・肉・パン・壷・草花・星・オリーブの葉綱・花綱などを赤・茶・黄・緑・黒など行う彩色技法、壷・ランプ・ガラス瓶・人骨などの出土遺物、壁面のギリシャ文字による死者への慰め銘文、さらには床モザイクのギリシャ文字銘文の「BKT」=ティール暦322年=西暦紀元196/197年の記年によってT01は2世紀末に築造された地下墓であることを明らかにした。これと並び温度・湿度・照度・大気汚染などの環境調査を行い、墓室内環境が極めて安定していることが壁画を良好に保ってきた要因であることも明らかにした。ティール市近郊に所在するローマ時代地下墓は、ラマリTJ04のように墓室壁に納体室を設ける形態が一般的であることからすると、墓室壁に納体室を設けないブルジュ・アル・シャマリT.01は特異な存在である。今回修復を手がけている2基の地下墓の築造年代に差はないと思われるにもかかわらず、このような構造的な差異は何を意味するのか、今後も継続して研究を続ける予定である。本研究は、レバノン共和国ティール市郊外に所在するローマ時代に築造された壁画のある地下墓TJ04について、科学分析等の保存科学研究、発掘調査等の考古学研究、描写技法等の美術史学などの学際的研究によって、地下墓の歴史的文化的研究を行い、損傷している地下墓を修復して保存・活用・公開を企図するものである。また、わが国の文化財の調査、研究、修復、保存などの理念と技術を示し、レバノンとの共同研究によって学術交流を図るものである。

地下墓TJ04は既に開口し墓室内は損傷著しい状況であったが、この保存修復に伴う考古学・美術・保存科学調査によって、壁面に20基、床に2基の納体室のある地下墓の構造、石灰岩岩盤を掘削し切石で組み上げる築造の技法、壁面を土器砕片を混入した漆喰で平滑に整える壁面調整技法、波形・石柱・灯火台・オリーブ、コンパスを使った花形などを赤・茶・黄・緑・黒の5色を基本とする彩色技法、機器分析による赤はベンガラ、緑は緑土であるなどの顔料同定、鉛棺・陶棺・壷・ランプ・ガラス瓶などの出土遺物などからTJ04は12世紀に築造された地下墓であることを明らかにし、さらに温度・湿度・照度・大気汚染などの環境調査を行い、墓室内環境が極めて安定していることが壁画を良好に保ってきた要因であることも明らかにした。2009年度は新たにラマリ地区の南1kmのブルジュ・アル・シャマリ地区に所在する壁画地下墓T.01の保存・修復に着手した。ブルジュ・アル・シャマリT.01も既に開口して損傷していたが、墓室四壁の孔雀や魚・壷・銘文などの壁画・文字は色彩も鮮やかに残されていた。初年度の調査とし主として墓室内外の清掃や現状記録を行い、床に6基の掘り込み棺のある墓室の構造、石灰岩岩盤を掘削し壁面に土器砕片を混入した漆喰で平滑に整える壁面調整技法、孔雀・魚・鳥・肉・パン・壷・草花・星・オリーブの葉綱・花綱などを赤・茶・黄・緑・黒など行う彩色技法、壷・ランプ・ガラス瓶・人骨などの出土遺物、壁面のギリシャ文字による死者への慰め銘文、さらには床モザイクのギリシャ文字銘文の「BKT」=ティール暦322年=西暦紀元196/197年の記年によってT01は2世紀末に築造された地下墓であることを明らかにした。これと並び温度・湿度・照度・大気汚染などの環境調査を行い、墓室内環境が極めて安定していることが壁画を良好に保ってきた要因であることも明らかにした。ティール市近郊に所在するローマ時代地下墓は、ラマリTJ04のように墓室壁に納体室を設ける形態が一般的であることからすると、墓室壁に納体室を設けないブルジュ・アル・シャマリT.01は特異な存在である。今回修復を手がけている2基の地下墓の築造年代に差はないと思われるにもかかわらず、このような構造的な差異は何を意味するのか、今後も継続して研究を続ける予定である。本研究は、レバノン共和国ティール市郊外に所在するローマ時代に構築された壁画の描かれている地下墓の保存科学・考古学・美術史学等の学際的研究によって、地下墓の歴史的文化的研究を行い、墓室内部の損傷を修復して保存公開を企図するものである。第2年目の本年は、地下墓TJ04の墓室内外における温度・湿度・照度・紫外線強度・二酸化炭素濃度・大気汚染濃度等の環境測定を行い、地下墓室内の環境は極めて安定していて、これが2000年を経た今日まで壁画を良好に保つことが出来た要因であること、壁画の顔料と現在の顔料の蛍光X線分析装置による材質分析と比較によって、緑色は緑土、赤色は酸化鉄でありレバノンの山岳地帯で原石が採取され精製された顔料である可能性が高いこと、日本・レバノン両国による壁画の美術史的共同研究により、ローマ時代壁画の伝統に則りつつレバノン独自の壁画の発展が見られること等を明らかにした。また、遺構の実測および出土遺物の実測、写真撮影によるドキュメントを完成した。損傷していた地下墓の納体室(納棺室)、墓室入り口の石扉、地上から地下墓室への石階段は墓室内より発見したオリジナル石材とレバノン考古総局提供の石材を使って修復を完了した。修復に使用した石材・道具・技術は可能な限り伝統的なものを取り入れて行い古代技術研究にも迫ることができた。壁画は赤・緑・黄色などの鮮やかな色彩を保つものの、その表面は埃や油煙による汚れで損なわれていたので、イタリアの壁画修復家の指導のもと薬剤によるクリーニングテストを行い、一部の強固な油煙の汚れを除いて壁画を甦らせることが出来る可能性が強くなった。次年度には壁画のクリーニングを完了し、2年間の研究を基礎に、新たな壁画地下墓の修復研究を展開する予定である。
モヤモヤ病(ウィリス動脈輪閉塞症)患者の遺伝子の解析

モヤモヤ病(ウィリス動脈輪閉塞症)は内頸動脈分岐部を中心に内膜の肥厚による血管狭窄をきたし、脳底部を中心とした異常血管網を形成する疾患であるが、その病因に関しては諸説あるにも関らず不明である。我々は当初、モヤモヤ病の発生には遺伝的素因が関与している可能性が高いと考え、RFLPを示すDNAマ-カ-を用いたリンケ-ジ解析を計画した。しかしながら、家系内発症例に対して家系調査を施行したところ、モヤモヤ病の有無の判定が困難で、明らかな遺伝形式を示す家系を得ることができなかった。つづいて、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞に存在すると同時に、これらの細胞に対して増殖を促進する作用が知られている成長因子であるbFGFに着目し、bFGF遺伝子の解析をおこなった。bFGFCDNAを用いたDNAブロット解析ではモヤモヤ病と正常人の間に明らかな差を認めなかった。しかしながら、浅側頭動脈に対するbFGFの免疫組織学的検討をおこなったところ、モヤモヤ病の中膜平滑筋細胞においてbFGFの免疫染色性が増大していることを認めた。我々は、中膜平滑筋細胞の内因性bFGFが増加することにより、細胞の移動能、浸潤能、増殖能が増大し内膜肥厚がおこるのではないかと推論した。そらに、FGFリセプタ-(FLG)の免疫組織学的検討をおこない、中膜平滑筋細胞にはbFGFばからでなくFGFリセプタ-も存在することが明らかとなった。この結果bFGFはオ-トクラインのメカニズムで働いていることが示唆された。以上我々は、モヤモヤ病の原因となる遺伝子の解明に端緒をひらくことはできなかったものの、モヤモヤ病の内膜肥厚にbFGFが深く関与している可能性を明からにした。(緒言)モヤモヤ病は内頸動脈分岐部を中心に内膜の肥厚による血管狭窄をきたし、脳底部を中心とした異常血管網を形成する疾患であるが、その病因に関しては諸説あるにもかかわらず不明である。しかしながら最近になり遺伝的素因が病気の形成に大きく関与していることが示されてきている。そこで我々は、内膜増植因子として知られているaFGFとbFGFの遺伝子構造に変化がないかどうか、DNAブロット解析を用いて検討をおこなった。(方法)正常人およびモヤモヤ病各7例の血液10mlよりDNA100ないし200μgを抽出し、そのうち3μgを制限酵素(EcoRIあるいはHindIII)で切断した。アガロ-スゲル上で電気泳動をおこなった後、ナイロンメンブレン上にブロッティングをおこない、aFGFあるいはbFGFのcDNAプロ-ブを用いハイブリダイゼ-ションをおこなった。その後、抗体を用いた方法によりバンドを検出した。(結果)蛋白翻訳領域を含む1.3kbのaFGFcDNAを用いたブロット解析では、ECORIで14kb、5kbのバンドが、HindIIIで7kb、5.5kbのバンドが検出できたが、正常人とモヤモヤ病の間で明らかな差を認めなかった。同様に蛋白翻訳領域を含む0.4kbのFGFCDNAを用いたブロット解析でも、ECORIで6.5kd、2kbのバンドが検出できたが、両者の間で認めなかった。(考察)FGFは癌遺伝子と関係の深い物質であり、最も良く知られた内膜増殖因子であり、FGF遺伝子の構造変化がモヤモヤ病の内膜肥厚を引き起しているかもしれないという仮定のもと本研究を行なったが、遺伝子に大きな構造上の変化を認めなかった。今後はモヤモヤ病の家系内発症例につきRFLPマ-カ-を用いたリンケ-ジ解析をおこない、原因となる遺伝子の染色体の同定に努める予定である。

モヤモヤ病(ウィリス動脈輪閉塞症)は内頚動脈を中心に内膜の肥厚による血管狭窄をきたし、脳底部を中心とした異常血管網を形成する疾患であるが、その病因に関しては諸説あるにも関らず不明である。bFGFは血管内皮細胞や平滑筋細胞に対する強い増殖作用を有すると同時に最も強力な血管増生因子であることが知られているが、今回浅側頭動脈と硬膜の手術標本に対してbFGFに関する免疫組織化学的検討をおこなった。血行再建術時に4例のモヤモヤ病より硬膜の一部を採取し、そのうち2例より浅側頭動脈の断端を採取した。対照群として、モヤモヤ病でない手術例3例より硬膜の一部を、そのうち2例より浅側頭動脈の断端を採取した。以上11検体につき抗ヒトbFGFモノクロ-ナル抗体を用いてABC法により同一条件下で免疫染色をおこなった。その結果硬膜、浅側頭動脈ともに対照群では軽度でまばらな染色を認めたのに対し、モヤモヤ病群では全例両者ともに強い染色を認め、モヤモヤ病ではbFGFの発現が高まっていると考えられた。特に、成人のモヤモヤ病の一例では浅側頭動脈の内膜が肥厚し、肥厚部位に散在する遊走平滑筋細胞に強いbFGFの染色を認め、血管内膜肥厚にbFGFが何らかの役割をになっている可能性が示唆された。そこで、モヤモヤ病におけるbFGFの発現の亢進を遺伝子レベルで解明する為にモヤモヤ病におけるbFGF遺伝子の詳細な解析を進行しているが.現在のところbFGFの発現亢進を説明する新たな知見は得られていない。bFGFばかりでなくbFGFリセプタ-のcDNAを用いたDNAブロット解析ではモヤモヤ病と正常者の間でパタ-ンの相違は認めていない。現在bFGF遺伝子のプロモ-タ-領域をPCR法を用いて検討を始めている。bFGFはtransに働く因子により発現が亢進していると予想されるので、今後その因子の同定を試みる予定である。bFGFは血管内皮細胞、血管平滑筋細胞に存在すると同時に、これらの細胞に対して増殖を促進する作用が知られている成長因子であるが、我々は昨年度までの免疫組織学的検討により、モヤモヤ病の浅側頭動脈の中膜平滑筋細胞においてbFGFの免疫染色性が増大していることを認めた。本年度は、bFGFの作用を明らかにする目的でbFGFリセプタ-(FLG)の免疫組織学的検討をおこなった。抗ヒトFLGポリクロ-ナル抗体を用いて4例のモヤモヤ病および5例の通常の脳血管閉塞症患者の浅側頭動脈を検討した。その結果、モヤモヤ病の浅側頭動脈の中膜筋層では、bFGFとbFGFリセプタ-が同時に存在し、autocrineのメカニズムでbFGFが作用していることが示唆された。以上のことより、我々は、中膜平滑筋細胞の内因性bFGFが増加することにより、細胞の移動能、浸潤能、増殖能が増大し内膜肥厚がおこるのではないかと推論した。ところで、モヤモヤ病の外頭動脈撮影の検討の結果では、約20%の症例で外頚動脈系にも狭窄病変が存在することを認め、モヤモヤ病の狭窄病変は全身性のものであると考えられ、従って、内膜の肥厚に関与していると考えられるbFGFの発現の増加は全身性のものである可能性が示唆された。次に、我々はbFGFの発現を亢進させる因子として単純ヘルペスウィルスを検討した。
SOAに基づく電子行政実現のための設計

本研究は、電子自治体構築のためのSOAを検討し、個別に開発が必要となる情報システムを限定させ、個々の自治体が情報システムの開発に投入すべき投資を限定できるような提案を行うことが目的であった。本年度は、海外における電子自治体の現状について、各地で取り上げられている課題や、その解決策の考え方と実際の取り組みを、現地調査を含む調査を実施することによって、明らかにすることに重点を置いた。主として、欧州の一例としての英国での電子自治体に関する会議における議論、米国での電子自治体に関する会議における議論および具体的事例報告の調査を行った。調査の結果、明らかとなったことは次のとおりである。米国においては、地方政府が調達に関する基本ポリシーを定めており、SOAのアーキテクチャが調達仕様として定められている例がある。英国で開催された会議では、電子自治体にとって住民の満足度を上げるサービスが重要である点が共通の認識であった。これらの調査結果から、次の点が成果として挙げられる。電子自治体がどのようなサービスをどのくらいの品質で提供すべきであるのか、利用者の視点にたって検討し、目標を設定すべきである。それに基づいて、アーキテクチャを含む実現方法を検討し、標準技術等に対する考え方が明確となるような仕様を、基本ポリシーの一部として公差すべきである。またそのポリシーを、基本調達仕様とすることが重要である。この調査結果および成果は、平成20年度内に論文執筆する予定である。今後の研究課題として、本成果を踏まえ、日本における電子自治体の実現に関する技術や標準への対応を検討し、より現実的で具体的な提案を行うことが重要となる。本年度は、現状調査・文献調査に重点を置いて実施した。研究実績として以下の2点を挙げる。1地方公共団体における電子自治体構築の実態と情報システムの現状財団法人日本規格協会オープンソースソフトウェアの標準化調査研究委員会との連携等により、中国地方の地方公共団体および全国の先進自治体等を対象にアンケート調査・分析とヒアリング調査を実施した。調査結果の一部は、同委員会の成果報告書にも反映された。公表されている経費調査等の結果なども参考にすると、大規模な地方公共団体では、レガシーシステムにおけるソフトウェア改修や情報システムの更新などに伴う経費面等の問題、小規模な地方公共団体では、市町村合併などの際に生じる、異なるメーカが提供する情報システム統合における経費面、データ移行の困難さの面等で問題が生じていることがわかった。2 SOAに基づく情報システム再構築のためのニーズ先進諸国における動向を文献調査した。欧州諸国においては、異なるハードウェアやソフトウェアで稼動する情報システムの統合を視野に入れ、オープンソースソフトウェアを採用することや、オープンスタンダードに準拠したソフトウェアを採用しデータの相互利用を長期に渡って保証するなどの方針が打ち出されている。また、米国政府や州政府等においては、情報システムのアーキテクチャを最初に設計し、そのアーキテクチャに準拠することを調達の条件とする方針を明らかにしている例が多い。国内においても、北海道庁を中心にHARPと呼ばれる構想に基づき、複数市町村が共同で構築・運用できるシステムの構築・運用が継続されている。これらの状況から、特に国内の地方公共団体が直面している課題を解決するため、ハードウェア機種非依存、ソフトウェア非依存、かつ情報セキュリティ要件を満たしながらデータ交換を容易にする緩い分散処理アーキテクチャが必要とされていることが明確となった。
次世代免疫療法を想定した治療用腫瘍細胞バンクの開発

本研究の目的は、輸血の安全基準に準じた治療用の腫瘍細胞の保存法を開発し、これら腫瘍細胞を他のヒトの治療用に用いるシステム(治療用腫瘍細胞バンク)を構築することである。成果は、1.治療用腫瘍細胞株樹立法の開発:1)自己血清や胸腹水を種々の濃度で含む96穴マイクロプレートでの初代培養による、治療用腫瘍細胞株樹立法の開発。研究期間中に32例の癌組織から6例の治療用腫瘍細胞株が樹立された。2)摘出腫瘍組織中の腫瘍細胞の生存期間および生存率を高める低重力培養法を開発。2.治療用腫瘍細胞バンクへの登録:1)6名の治療用腫瘍細胞株のうち、5名から腫瘍細胞バンクへの登録の同意を得た。2)腫瘍細胞バンクへの登録を得たが、細胞株樹立に成功しなかった4例は準治療用細胞として凍結保存。3.治療への応用:1)自己腫瘍細胞による樹状細胞ワクチン療法実施中の3症例中2例において自己腫瘍細胞の代わりに治療用腫瘍細胞の使用が可能と判断された(IFN-g ELISPOT法による)。2)自己腫瘍細胞を消費した1例において、治療用腫瘍細胞を用いて治療を続行した。抗腫瘍免疫反応の誘導は維持され、特別の有害事象は認められなかった。4.腫瘍細胞バンクの公開:5.治療用腫瘍細胞由来エキソゾームを利用したcell-freeシステムによる次世代免疫療法の可能性を検討。現在ワクチン療法などに用いられている腫瘍細胞の多くは、自己腫瘍細胞といえども細胞培養の課程で牛胎児血清などの異種血清に接触した可能性が高く、かつ他の人に応用するための文書での同意が得られていないという多くの問題を含んでいる。今後、これらは未知のウイルス感染や個人情報の面からさらに大きな社会問題となると予想される。したがって、「治療に特化した質の高い安全な治療用腫瘍細胞バンク」を創世を目的として、本年度の計画案に沿って研究成果を概説する。1)治療法腫瘍細胞株の樹立法の開発:計画では、治療用腫瘍細胞樹立に対する同意を得た後に腫瘍細胞の樹立を行うこととしていたが、末期進行癌患者さんが対象となり、細胞株樹立の確立が必ずしも高くない現状を考慮し、「腫瘍細胞の樹立」に同意を得た患者さんから、細胞樹立後改めて「他の患者さんに対する治療用腫瘍細胞として利用する」ことに対する文書で同意をする方法に改めた。本年度は、癌性胸腹水患者さん16名からの腫瘍細胞樹立を試み、うち2名から「治療用細胞としての腫瘍バンク」への登録の承諾を得、さらに4例を培養中である。現在、癌性胸腹水から必ずしも細胞株として樹立できない腫瘍細胞も大量に獲得された腫瘍細胞分画を治療用腫瘍細胞の一つとして登録保存するシステムも試験的にスタートした。2)病原体検査システムの構築:患者の同意を文書で得た後、個人が特定できないようにランダムNo表示のサンプルとして共同研究組織の検査部へ送付し、HB,HCV,HIV,EBV,梅毒,マイコプラズマ,一般細菌のないことを確認後、カルテから基本情報を取得し、個人が特定できないように、基本情報、細胞をランダムNo表示に変更し、上記2症例を治療用細胞として凍結保存した。3)治療用腫瘍細胞の凍結保存システムの構築:凍結保存細胞の一部を3ヶ月毎に融解し、再増殖させ増殖細胞の生物学的特性をチェックしているが腫瘍関連抗原蛋白の発現強度やプロファイルに特別な変化を認めていない。4)治療への応用:次年度の予定であったが、治療中の患者自己腫瘍細胞を使い切ったため、患者の要望と、バンク腫瘍細胞が本患者さんに免疫学的に適応可能であると判断されたため、「他家腫瘍細胞による免疫監視機構構築療法(九大倫理委員会平成14年承認)」の一例目を実施中である。本研究の目的は、輸血の安全基準に準じた治療用の腫瘍細胞バンクを作り上げることである。治療用腫瘍細胞の基準は、1)腫瘍提供患者さんが供血者としての基準を満たしている。

2)培養のいかなる過程においても、輸血血液の基準を満たさないヒト血清および異種血清との接触がない。3)樹立された細胞が輸血用細胞の基準を満たしている。という条件を全て満たすことであり、バンク用細胞の条件は、1)他のヒトの治療用に用いることを文書で同意を得ることである。本年度の成果は、(1)6名の癌性胸腹水患者さんから自己治療を目的とした腫瘍細胞株樹立の同意を得た。16症例中3例で腫瘍細胞バンクへの登録の同意を得、細胞株が樹立された。昨年度同様、残りの2例においては、腫瘍細胞分画を準治療用腫瘍細胞として登録、保存した。(2)登録された腫瘍細胞は、HB,、HCV, HIV, EBV、梅毒、マイコプラズマ等の感染のないことが確認され腫瘍細胞バンクへ登録した。(3)昨年度登録された2症例において、凍結保存1年目の腫瘍細胞の増殖性、腫瘍関連分子発現プロファイルをチェックしたが凍結保存による有意な変化は認められなかった。(4)自己腫瘍細胞刺激樹状細胞によるワクチン療法(免疫監視機構構築療法)を実施中の症例においてワクチン療法後の末梢血中の自己腫瘍細胞反応性リンパ球増加をIFN-gELISPOT法にて解析中であるが、自己腫瘍細胞の代わりに腫瘍細胞バンクの他家腫瘍を用いてELISPOTアッセイを実施した結果、検索した3例中、2例が自己腫瘍細胞の代わりにバンク細胞の使用が可能なことが示唆された。(5)腫瘍細胞バンクに登録された腫瘍細胞を用いて行った「他家腫瘍細胞による免疫監視機構構築療法」において抗腫瘍免疫反応は維持可能であり、特別の有害事象は認められなかった。また、本研究テーマには含まれていなかったが、本研究を通して樹立された腫瘍細胞株が分泌するエクソゾーム(直径100nmの微小小胞)がワクチン療法の免疫原として応用可能なデータを得た。現在、エキソゾームを用いたCell-freeシステムによる次世代の免疫療法を開発中であるが、腫瘍細胞バンクはGMPグレードのエキソゾーム供給原として期待しうる。