hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｃａｄｍ１マーカーを利用したホモ接合生殖幹細胞の作製法の確立

精祖細胞)を(GDNF, LIF, FGF, EGFを含む)培地で培養することで生殖幹細胞を作製可能である。精祖細胞や卵母細胞をヒトから分離することは倫理的に問題があることから、半数体の精子細胞を分離し、ヘテロ生殖幹細胞を作製することを目的とした。精祖細胞に局在するCadm1のプロモーターに蛍光蛋白を発現させてTgマウスから精子細胞を分離し、融合させ、精粗細胞培地にて培養した。蛍光陽性細胞は得られたが、持続培養可能な細胞株として分離できなかった。分離の間にインテグリンの生存シグナル、RA70/Scap2,が減少した結果によると思われる。今後は精子細胞の細胞死を抑制させることが不可欠である。Spermatogonia(精祖細胞)を培地(GDNF, LIF, FGF, EGFを含む培地)で培養することが可能であり、多分化能をもつ生殖幹細胞を作製することが可能である。しかし精祖細胞や卵母細胞をヒトから分離することは倫理的に問題や組織適合性の拘束がさけられないことから、本研究では半数体の精子細胞を分離し、ヘテロ生殖幹細胞を作製することを目的とした。2.しかし、半数体の精子細胞を分離するには十分でないことから、精子細胞細胞のマーカーを探索したところ、申請者が発見したRA70/Scap2がそのマーカーとして使えることが明らかにとなった(投稿準備中)。しかし、RA70/Scap2欠損マウスを作製したところ、欠損マウスは致死であった。解析したところ、RA70/Scap2遺伝子はレチノイン酸に誘導され、RA70/Scap2はインテグリンの生存シグナルとして組織形成に関与していることが明らかにとなった。ES細胞、iPS細胞、生殖幹細胞などさまざまな幹細胞が報告されているが、iPS細胞は拒絶反応を回避することが可能であるが、遺伝性疾患の治療には応用できない。移植にマッチするHLAは1/10000であることから、幹細胞治療が広く社会的に利用されるためには、幹細胞バンクの設立が必要である。幹細胞バンクの問題点は、HLAのマッチングする膨大な幹細胞の維持管理にある。減数分裂後の2次精母(卵母)細胞を融合し、ホモ接合した生殖細胞(Spermatogonia)の作製とホモ(接合)生殖幹細胞の作製法の確立を目的とする。Cadm1は申請者が発見したシナプス接着蛋白(RA175/SynCAM1)であるが、精巣では精祖細胞と一次精母細胞に局在し(Fujita et al., 2006)、欠損マウスは精子形成不全をもたらす(Fujita et al., 2008)。Cadm1を精粗細胞のマーカーとして、Cadm1プロモーターの下流に蛍光タンパクGFPをつなげたBac-Cadm1-GFP-Tgセミノックインマウスを作製し、またJackson Labから、Oct4-GFP-Tgマウスを購入した。作製したBac-Cadm1-GFP-Tgセミノックインマウスは脳と精巣がGFP陽性であった。しかし、GFPはパラホルムアルデヒド固定で、蛍光を消失するばかりか、脳から神経細胞、精巣組織から生殖細胞を単離培養しても、GFPの蛍光が消失し、解析に耐えられなかった。今後、Cadm1を精粗細胞のマーカーとして、実験計画を遂行するためには、GFPの消失しない条件を確立するか、GFPをRFPに変換する必要がある。今年度、精巣細胞にSrc結合蛋白であるRA70/SKAP2が発現することが明らかになった(投稿準備中)ことから、RA70/SKAP2蛋白をマーカーとすることも考える必要がある。1。その第一ステップとして精祖細胞のセルソーターを用いて分離のためには、マーカーが必須であり、申請者が発見したシナプス接着蛋白Cadm1(RA175/SynCAM1)が、精巣では精祖細胞と一次精母細胞や精子細胞に局在して(Fujita et al., 2006)することから、Cadm1プロモーターに蛍光蛋白を発現させてTgマウスを作製した。2.しかし、半数体の精子細胞を分離するには十分でないことから、精子細胞細胞のマーカーを探索したところ、申請者が発見したRA70/Scap2がそのマーカーとして使えることが明らかにとなった。3.減数分裂後の2次精母(卵母)細胞をホモ接合し、安定したホモ接合精祖細胞を効率よく分離維持できれば、ホモ接合生殖幹細胞の作製が可能である。しかし、2次精母(卵母)細胞のマーカーが必要であり、特異的なマーカーを用いてセルソーターにより分離することが必要である。

探索したところ、申請者が発見したRA70/Scap2がそのマーカーとして使えることが明らかにとなり、特異抗体を作成し、解析をおこなったSpermatogonia(精祖細胞)を培地(GDNF, LIF, FGF, EGFを含む培地)で培養することが可能であり、多分化能をもつ生殖幹細胞を作製することが可能である。本研究では精祖細胞や卵母細胞をヒトから分離することは倫理的に問題があることから、半数体の精子細胞を分離し、ヘテロ生殖幹細胞を作製することを目的とした。申請者が発見したシナプス接着蛋白Cadm1(RA175/SynCAM1)が、精巣では精祖細胞と一次精母細胞や精子細胞に局在することから、Cadm1プロモーターに蛍光蛋白を発現させてTgマウスを作製した。しかし、半数体の精子細胞を分離するには十分でないことから、精子細胞のマーカーを探索したところ、申請者が発見したRA70/Scap2がそのマーカーとして使えることが明らかにとなった。これらのマーカを用いて、精子細胞を分離し、電気パルスを用いて精子細胞を融合させ、精祖細胞培地にて培養し、GFPが弱いながら陽性の細胞を得ることができたが、培養可能な細胞株として分離することができなかった。また、RA70/Scap2欠損マウスを作製したところ、欠損マウスは致死であった。RA70/Scap2遺伝子はレチノイン酸に誘導され、RA70/Scap2はインテグリンの生存シグナルとして組織形成に関与していることから、精子細胞を分離している間に、生存シグナルが減少したために、生存が難しかったと考えられる。今後は精子細胞の生存シグナルを増強させるか細胞死を抑制させる条件を確立することが不可欠である。精祖細胞)を(GDNF, LIF, FGF, EGFを含む)培地で培養することで生殖幹細胞を作製可能である。精祖細胞や卵母細胞をヒトから分離することは倫理的に問題があることから、半数体の精子細胞を分離し、ヘテロ生殖幹細胞を作製することを目的とした。精祖細胞に局在するCadm1のプロモーターに蛍光蛋白を発現させてTgマウスから精子細胞を分離し、融合させ、精粗細胞培地にて培養した。蛍光陽性細胞は得られたが、持続培養可能な細胞株として分離できなかった。分離の間にインテグリンの生存シグナル、RA70/Scap2,が減少した結果によると思われる。今後は精子細胞の細胞死を抑制させることが不可欠である。胎児E8.5-12.5では神経管(Tanabe et al., Neuroscience Letter 2014)に、また生後は精巣の精子細胞に特異的な染色像がみられた。RA70/Scap2がそのマーカーとして使えることが明らかにとなったことから、セルソータを用いて、減数分裂後の2次精母(卵母)細胞を分離し、安定したホモ接合精祖細胞を融合によって作成する必要があり、その条件検討をおこなった。精粗細胞の作製はCadm1-mcherry(赤)を指標とし、精粗細胞からの生殖幹細胞の作製の試みは、Oct4-GFPを指標としておこなった。1.セルソータの故障もあり、条件設定が遅れている。2.また、STAP細胞の作製が報告されたことから、容易に生殖幹細胞が作製できると考え、生殖細胞からのSTAP細胞の作製を試みた結果、再現性が十分えられず、また結果としてSTAP細胞の論文が削除され、時間を浪費することになった。細胞分子生物学セルソータの修理を迅速におこない、融合細胞から安定したホモ接合精巣細胞の分離を可能にする条件を確立したい。またRA70/SCAP2、RA70/SCAP
市民との対話から探求する学童を育てている家族の食に関する多彩な家族保健機能

2018年11月から年度末にかけて国内外の食行動と形成期家族に関する文献、アウトリーチの手法を用いている文献を広く収集した。また大阪大学21世紀懐徳堂(公開講座・シンポジュウムなど様々なかたちの社会連携活動を通じて研究力を広く公開していくアウトリーチ活動展開の部署)や共創機構社学共創本部の担当者と打ち合わせを行い、ラボカフェスタイルで市民と研究者の対話からのデータ収集の可能性を討議した。本研究は、データ収集方法が従来のものとは異なるため今年度はその検討と調整に十分な時間をかけた。2020年2月には、M市内の全小学校5ー6年生と(主に食に関する世話をしている)養育者をペアで質問肢調査を実施予定である。また質的データの収集の準備のため、2019年夏にラボカフェスタイルの市民に向けたミニ公開講座も実施予定である。初年度に実施予定であった親子ペアの質問肢調査が次年度になったため
副腎髄質で産生される生理活性ペプチドの系統的探索

我々は1993年にヒト褐色細胞種組織より、アドレノメデュリンを強力な降圧作用を有する新規生理活性ペプチドとして発見した。我々はアドレノメデュリンの発見以降も、アドレノメデュリンの研究を推進すると同時に、さらなる新たな循環調節因子の探索を粘り強くすすめている。アドレノメデュリンはラット血小板中のcAMPの増加活性を指標に発見できた。副腎髄質には未知の生理活性ペプチドが存在し、その多くのものが副腎髄質に作用している可能性がある。我々は副腎髄質由来の培養細胞のcAMP増加を指標にしたアッセイ法を確立し、新規生理活性ペプチドの探索をすすめ、すでにいくつかのペプチドを精製し、構造解析を決定した。その結果、これらのペプチドはVIP、PHM、CGRP、PACAPであることが判明した。これらのペプチドはすべて降圧作用を有する生理活性ペプチドであった。一方生理活性ペプチドの特徴の一つに、C末のアミド構造があげられる。我々は、ペプチドのC末がアミド化されていることを指標に、ペプチドの検索を行い、ブタ心房からamidicinを単離・構造決定した。amidicinは心臓、腎臓等の循環器組織の高濃度存在し、新たな循環調節因子としての可能性が示された。さらに、ヒトの褐色細胞腫にもamidicinが高濃度存在しちることを明らかにし、その精製と構造を決定した。さらに、ヒトamidicinのラジオイムノアッセイを確立し、血中にも循環していることを明らかにし、循環器疾患や腎不全患者では血中濃度が増加していることを明らかにした。その後の研究により、アドレノメデュリン血管拡張作用、利尿作用をもつペプチドであり、血中を循環するホルモンあるいは心血管組織における局所調節因子として、血圧や体液量の調節に関与する極めて重要な循環調節因子であることが明らかになった。アドレノメデュリンの発見およびその後の研究の展開に示されるように、新たな循環調節因子を発見し、その物質についての研究を推進することは極めて独創性が高い研究となる。我々は副腎髄質由来の培養細胞のcAMP増加を指標にしたアッセイ法を確立し、新規生理活性ペプチドの探索をすすめおり、すでにいくつかのペプチドを精製し、構造解析を決定した。また、我々は副腎に高濃度発現しているオーファン受容体を独自に見いだしており、現在この受容体の安定発現型を確立するための研究を推進している。さらに、ヒトの褐色細胞腫にもamidicinが高濃度存在しちることを明らかにし、その精製をと構造解析をおこなった。さらに、ヒトamidicinのラジオイムノアッセイを確立し、血中にも循環していることを明らかにした。我々は1993年にヒト褐色細胞種組織より、アドレノメデュリンを強力な降圧作用を有する新規生理活性ペプチドとして発見し、アドレノメデュリンの生体内での役割を明らかにすることで、アドレノメデュリンが血圧や体液量の調節に関与する極めて重要な循環調節因子であることが明らかになった。副腎髄質には未知の生理活性ペプチドが存在し、その多くのものが産生される部位である副腎髄質に作用している可能性がある。我々は副腎髄質由来の培養細胞のcAMP増加を指標にしたアッセイ法を確立し、新規生理活性ペプチドの探索をすすめ、5種のペプチドを精製し、構造解析を行った。また、我々は副腎に高濃度発現しているオーファン受容体を独自に見いだしており、この受容体の安定発現型を確立することに成功した。今後はこの安定発現型の培養細胞を利用して細胞内のcAMPやカルシウムイオンを指標に生理活性ペプチドの研究を推進する。我々は、ペプチドのC末がアミド化されていることを指標に、ペプチドの検索を行い、ブタ心房からamidicinを単離・同定した。さらに、ヒトの褐色細胞腫にもamidicinが高濃度存在してることを明らかにし、その単離・同定をおこなった。さらに、アンジオテンシンのN末を認識する測定系を確立することで、アンジオテンシン関連の生理活性ペプチドの系統的検索を行い、proangiotensin-12を内在性の昇圧ペプチドとして発見した。

我々は1993年にヒト褐色細胞種組織より、アドレノメデュリンを強力な降圧作用を有する新規生理活性ペプチドとして発見した。我々はアドレノメデュリンの発見以降も、アドレノメデュリンの研究を推進すると同時に、さらなる新たな循環調節因子の探索を粘り強くすすめている。アドレノメデュリンはラット血小板中のcAMPの増加活性を指標に発見できた。副腎髄質には未知の生理活性ペプチドが存在し、その多くのものが副腎髄質に作用している可能性がある。我々は副腎髄質由来の培養細胞のcAMP増加を指標にしたアッセイ法を確立し、新規生理活性ペプチドの探索をすすめ、すでにいくつかのペプチドを精製し、構造解析を決定した。その結果、これらのペプチドはVIP、PHM、CGRP、PACAPであることが判明した。これらのペプチドはすべて降圧作用を有する生理活性ペプチドであった。一方生理活性ペプチドの特徴の一つに、C末のアミド構造があげられる。我々は、ペプチドのC末がアミド化されていることを指標に、ペプチドの検索を行い、ブタ心房からamidicinを単離・構造決定した。amidicinは心臓、腎臓等の循環器組織の高濃度存在し、新たな循環調節因子としての可能性が示された。さらに、ヒトの褐色細胞腫にもamidicinが高濃度存在しちることを明らかにし、その精製と構造を決定した。さらに、ヒトamidicinのラジオイムノアッセイを確立し、血中にも循環していることを明らかにし、循環器疾患や腎不全患者では血中濃度が増加していることを明らかにした。
核酸医薬品へのパラダイムシフトを加速する経口核酸送達システムの開発研究

本研究の目的は、核酸医薬品等バイオ医薬品の経口薬化のプラットフォームとなる革新的な経口核酸送達システムの基礎開発研究を通して、バイオ医薬品の経口薬化を阻む要因である1低粘膜吸収性2腸管内での損失3必要な技術の集積と実用製剤化の課題を克服し、その実用開発への道を切り拓くことにある。初年度は、主に1と2の課題を克服するために、バイオ医薬品を担持させるヤヌス微粒子の基本設計及びその製造法の開発に取り組んだ。薬物保護機能を有する油脂半球と、粘膜付着性を目的とするアミノアルキルメタクリル酸コポリマー半球により構成されるヤヌス微粒子を設計し、薬物をポリマー半球内に担持させるための技術検討を行った。平均分子量約4kDaの蛍光ラベル化デキストラン(FD4)を用いた検討の結果、薬物を多孔性微粒子に含浸させ、油脂とポリマーを溶解した有機溶媒溶液を油相として、w/o/w型エマルションからの液中乾燥法を用いてヤヌス粒子を形成させる方法によって、カチオンポリマー半球にFD4が局在化したヤヌス粒子(包含率38%;平均粒子径31μm)の得られることを見出した。なお、FD4のin vitroにおける溶出率は5日間で約60%であった。また、単層培養したCaco-2腸管上皮細胞層への接着性は、24時間で約42%であり、全てカチオン性ポリマー半球を介して接着することが明らかとなった。本成果を基に、核酸分子としてα-tochopherol結合型siRNA(VE-siRNA)を含有するヤヌス微粒子を調製したところ、VE-siRNAは一方の半球に局在化し、その包含率は75%以上であった。また、VE-siRNAの溶出は一次様の溶出性を示し、その溶出率は24時間で約70%であった。以上、当年度の検討により、核酸分子を内包するヤヌス粒子を基本設計し、これを調製するための基本的な製造技術情報を得ることができた。初年度の計画は、バイオ医薬品の消化管粘膜デリバリーに適したヤヌス粒子の設計、試作、評価を行うことであった。具体的には、核酸の含量、製剤内における局在、製剤からの放出性、製剤の腸管粘膜付着性を調べ、影響を及ぼす製造上の重要パラメーターを明らかにすることである。製造上、製剤特性に影響を及ぼす因子を調べる過程で、薬物に物理的ストレスを与えない方法(多孔性微粒子を用いる方法)を見出した。すなわち、例えば、w/o/w型エマルションからの液中乾燥法による微粒子製造といった従来の方法では、薬物を油相に分散する際に行う高エネルギーの超音波処理といった物理的ストレスが薬物に悪影響を与えるリスクがあるが、内水相ではなく、薬物を含浸させた多孔性微粒子を薬液キャリアとして用いれば、界面活性剤不要で物理的ストレスもなく容易に油相に分散できる。薬物キャリアの種類(内水相または多孔性微粒子)に違いはあるが、薬物含量と放出性は影響を受けないことが分かった。製剤特性に影響を及ぼす因子を調べたが、製造条件を変えても溶出や含量に影響がなく、堅牢性が高いこと分かった。また、ヤヌス微粒子の腸管粘膜上皮付着性についても一定の知見が得られた。そこで、モデル薬物を用いて得られた情報を基に、製造上物理的ストレスが少ない方法により核酸分子を含有するヤヌス粒子を調製してたところ、ほぼ満足できる薬物含量と放出性を示すヤヌス粒子が得られた。これにより、当初計画していた課題は満たしたと考えている。さらに、ナノサイズのヤヌス粒子調製は、次期課題としていたが、早期に着手したことにより、新規のナノ粒子製造法を見出し、特許申請に至ったことは成果であると同時に、次年度の強力な足掛かりとなった。以上のことから総合すると、おおむね当初計画通りの進捗であると評価される。当年度の検討により、ヤヌス微粒子のナノサイズ化が確認できたので、siRNAのナノコンポジット(ヤヌス微粒子、非ヤヌス微粒子)化を行った上で、そのナノコンポジットからのsiRNAの損失を防止するための保護製剤を開発する。また、ヤヌス微粒子を内包する製剤を、錠剤等の実用経口製剤化するための検討を行う。なお、この保護製剤としては、すでにsiRNAを含侵させた検討により有用性を確認しており、また、錠剤などの実製剤に組み入れやすい多孔性マイクロスフェアを予定している。検討の推進においては、いったん、蛍光標識デキストリンを用いて検討を行った上で、良好な特性を有する試作製剤に対してsiRNAを適用する予定である。一方、粘膜付着性に関しては、ヤヌス粒子のサイズ(マイクロvs.ナノサイズ)の違いが腸管粘膜上皮への付着性に及ぼす影響などを明らかにしていく予定である。さらに、経口製剤化のために必要となる腸溶性製剤化あるいは消化管部位特異性の経腸送達システムとしての設計及び試作・評価を行っていく予定である。

薬物保護機能を有する油脂半球と、粘膜付着性を目的とするアミノアルキルメタクリル酸コポリマー半球により構成されるヤヌス微粒子を設計し、薬物をポリマー半球内に担持させるための技術検討を行った。平均分子量約4kDaの蛍光ラベル化デキストラン(FD4)を用いた検討の結果、薬物を多孔性微粒子に含浸させ、油脂とポリマーを溶解した有機溶媒溶液を油相として、w/o/w型エマルションからの液中乾燥法を用いてヤヌス粒子を形成させる方法によって、カチオンポリマー半球にFD4が局在化したヤヌス粒子(包含率38%;平均粒子径31μm)の得られることを見出した。なお、FD4のin vitroにおける溶出率は5日間で約60%であった。また、単層培養したCaco-2腸管上皮細胞層への接着性は、24時間で約42%であり、全てカチオン性ポリマー半球を介して接着することが明らかとなった。本成果を基に、核酸分子としてα-tochopherol結合型siRNA(VE-siRNA)を含有するヤヌス微粒子を調製したところ、VE-siRNAは一方の半球に局在化し、その包含率は75%以上であった。また、VE-siRNAの溶出は一次様の溶出性を示し、その溶出率は24時間で約70%であった。以上、当年度の検討により、核酸分子を内包するヤヌス粒子を基本設計し、これを調製するための基本的な製造技術情報を得ることができた。初年度の計画は、バイオ医薬品の消化管粘膜デリバリーに適したヤヌス粒子の設計、試作、評価を行うことであった。具体的には、核酸の含量、製剤内における局在、製剤からの放出性、製剤の腸管粘膜付着性を調べ、影響を及ぼす製造上の重要パラメーターを明らかにすることである。製造上、製剤特性に影響を及ぼす因子を調べる過程で、薬物に物理的ストレスを与えない方法(多孔性微粒子を用いる方法)を見出した。すなわち、例えば、w/o/w型エマルションからの液中乾燥法による微粒子製造といった従来の方法では、薬物を油相に分散する際に行う高エネルギーの超音波処理といった物理的ストレスが薬物に悪影響を与えるリスクがあるが、内水相ではなく、薬物を含浸させた多孔性微粒子を薬液キャリアとして用いれば、界面活性剤不要で物理的ストレスもなく容易に油相に分散できる。薬物キャリアの種類(内水相または多孔性微粒子)に違いはあるが、薬物含量と放出性は影響を受けないことが分かった。製剤特性に影響を及ぼす因子を調べたが、製造条件を変えても溶出や含量に影響がなく、堅牢性が高いこと分かった。また、ヤヌス微粒子の腸管粘膜上皮付着性についても一定の知見が得られた。そこで、モデル薬物を用いて得られた情報を基に、製造上物理的ストレスが少ない方法により核酸分子を含有するヤヌス粒子を調製してたところ、ほぼ満足できる薬物含量と放出性を示すヤヌス粒子が得られた。これにより、当初計画していた課題は満たしたと考えている。さらに、ナノサイズのヤヌス粒子調製は、次期課題としていたが、早期に着手したことにより、新規のナノ粒子製造法を見出し、特許申請に至ったことは成果であると同時に、次年度の強力な足掛かりとなった。以上のことから総合すると、おおむね当初計画通りの進捗であると評価される。当年度の検討により、ヤヌス微粒子のナノサイズ化が確認できたので、siRNAのナノコンポジット(ヤヌス微粒子、非ヤヌス微粒子)化を行った上で、そのナノコンポジットからのsiRNAの損失を防止するための保護製剤を開発する。また、ヤヌス微粒子を内包する製剤を、錠剤等の実用経口製剤化するための検討を行う。
高齢者に対する歯科医療対策.唾液分泌量減少による口腔内環境および咀嚼能率の変化

1).成人男子6名を対象に、ライス、ソ-セージ、クッキーを咀嚼試料とし、チューイングスピット法を用いて咀嚼実験を行ない、正常時と唾液分泌量減少時の一口量咀嚼時間、嚥下時食塊水分量を比較した。硫酸アトロピンは一回0.5mgを服用し、約60分後に最低値(約50%減)を示したことから、分泌量減少時の咀嚼実験は服用60分後に行なった。その結果、正常時の一口量、一口量咀嚼時間、および嚥下時食塊水分量は、同一被験者、試料では変動が少なく、ほぼ一定した値が得られた。硫酸アトロピン服用60分後の一口量咀嚼時間は、各咀嚼試料とも服用前に比較して有意な延長が認められた。しかし、嚥下時食塊水分量については、服用前と有意な差は認められなかった。以上、唾液分泌量が減少すると、咀嚼時間は有意に延長するが嚥下時の食塊水分量には有意差がみとめられなかったことから、唾液分泌機能が低下した場合には、咀嚼能率が低下することが推測された。2).歯周組織が臨床的に健康である青年男子10名を被験者とし、無作為にI,IIの2群に分け、48時間ブラッシング停止後のプラーク付着量を測定した。期間中被験者全員には同一の食事、および間食をとらせ、I群には1日3回毎食前に硫酸アトロピン0,5mgを経口投与し、II群には偽薬を投与した。プラーク付着量はVolpeの方法に従った。その結果48時間後のプラーク付着量は全体ではI群がII群に較べて危険率0,1%で有意に高い値を示した。また唇頬側部と舌口蓋部の比較ではI,II群とも唇頬側部が高く、I群のほうがII群より高かった。上下顎別では下顎より上顎が高く、I群がII群より高かった。以上のことから唾液分泌量を抑制すると、プラーク付着量が有意に増加することが示唆された。高齢者に多く見られる口腔乾燥症に対する歯科的な対策として本年度は、硫酸アトロピン服用による実験的唾液分泌量減少下での食物咀嚼能率について検討を行なった。成人男子6名を対象に、ライス、ソーセージ、クッキーを咀嚼試料とし、チューイングスピット法を用いて咀嚼実験を行ない、正常時と唾液分泌量減少時の一口量咀嚼時間、嚥下時食塊水分量を比較した。なお、被験者間および試料間には大きな差が見られた。

硫酸アトロピン服用60分後の一口量咀嚼時間は、各咀嚼試料とも服用前に比較して有意な延長が認められた。しかし、嚥下時食塊水分量については、服用前と有意な差は認められなかった。以上、唾液分泌量が減少すると、咀嚼時間は有意に延長するが嚥下時の食塊水分量には有意差がみとめられなかったことから、食塊を嚥下する時期は、従来から報告されている食物の粉砕程度などに加えて、食塊の水分量にも影響されることが示唆され、唾液分泌機能が低下した場合には、咀嚼能率が低下することが推測された。一方、咀嚼中に分泌される唾液量は、一口量を口に入れてから嚥下するまでの間、規則正しく分泌されるわけではなく、各被験者の一口量咀嚼時間を単純に3等分した場合(初期、中期、後期)、初期に分泌される量が最も多かった。これは味覚の順応、味の希釈などによる分泌量の減少が短時間に起こることは考えられないことから、咀嚼の初期における口腔の粘膜乾燥反射が強く働いていると考えられた。本年度は、硫酸アトロピン服用下唾液分泌量減少時におけるプラーク付着量、及び味覚閾値の変動について検討を行なった。歯周組織が臨床的に健康である青年男子10名を被験者とし、無作為に5名づつI,IIの2群に分け、48時間ブラッシング停止後のプラーク付着量を測定した。期間中被験者全員には同一の食事、および間食をとらせ、I群には1日3回毎食前に硫酸アトロピン0.5mgを経口投与し,II群には偽薬を投与した。プラーク付着量はVolpeの方法に従い、被験歯は上顎右側および下顎左側第一大臼歯、上顎左側および下顎右側中切歯、上顎左側および下顎右側第一小臼歯の6歯とした。2日間約1時間毎に安静時唾液分泌量を計測した結果は、危険率1%でI群が有意に低い値を示した。48時間後のプラーク付着量は6歯の合計を全体、唇頬側部、舌口蓋部、中央部に分けて集計した結果、全体ではI群がII群に較べて危険率0.1%で有意に高い値を示した。また唇頬側部と舌口蓋部の比較ではI II群とも唇頬側が高く、I群の方がII群より高かった。上下顎別では下顎より上顎が高く,I群がII群より高かった。以上のことから唾液分泌量を抑制すると、プラーク付着量が有意に増加することが示唆された。唾液分泌量減少時の味覚感受性については、ろ紙ディスク法を用い、各種濃度のショ糖液(甘味)、食塩液(塩味)、酒石炭酸液(酸味)、塩酸キニ-ネ液(苦味)の基本四味で、舌上の鼓索神経支配領域、舌咽神経支配領域、軟口蓋上の大錐体神経支配領域での味覚感受性について検討を行なった。その結果ショ糖液を除く三液は鼓索神経支配領域、舌咽神経支配領域ともそれぞれ味覚閾値の上昇がみられた。一方、大錐体神経支配領域では何れの味質でも変化はみられなかった。以上のことから、舌上の各神経支配領域では、唾液分泌量が減少すると味覚感受性が減退する傾向にあることが示唆された。
石英ガラス加工における加工設備によるガラスの汚染の低減

研究目的石英ガラス製品の製作にあたり、加工に使用するガスバーナーを加工物と同じ石英ガラスで製作し、道具や治具なども同様に石英ガラスや加工物に悪影響を及ぼさない材料で製作する。さらにガス配管中に新たにガスフィルターを組み込むことで、従来の製作方法で課題であった石英ガラスへの不純物の付着を低減させ、不純物除去のために行うフッ化水素酸による危険度の高い洗浄作業の頻度を減らし、安全で汚染が少ない製品の製作を可能にすることを目的とする。研究方法石英ガラスでガスバーナーを製作し石英板の溶着加工を行い、従来使用している金属製バーナーとの比較を行った。さらにバーナーに繋がるガス配管の末端にステンレス製ガスフィルターを組込み、配管からのダスト侵入を防いだ。溶融した石英ガラスの整形には従来グラファイト使用していたが、昇華によって石英ガラスを汚染するため、代替品としてガラス状カーボンを使用した。研究成果金属製バーナーと石英ガラス製バーナーの両方で石英ガラス板の溶着加工を行い、加工後のガラス表面を比較した結果、どちらも目視できる不純物が付着したが、石英ガラス製バーナーの方が少なかった。また、配管末端にガスフィルターを組込み同様の加工を行ったところ、付着は完全に防げないものの、さらに低減させた。石英ガラス管を溶融し口径を拡げるテストでは、グラファイトとガラス状カーボンを比較した。グラファイトは燃焼によって劣化し、さらに昇華して石英ガラス管に付着したが、ガラス状カーボンはほとんど劣化、昇華が無く、付着は見られなかったので石英ガラス加工における道具や治具の素材として活用が期待できる。
狭流路内における燃え拡がり火炎を利用した微小重力環境火災安全性評価に関する研究

宇宙環境利用の推進にあたり火災安全性の確保は重要な課題である.しかし宇宙環境で使用される多彩な材料の火災安全性を微小重力環境下で評価することは容易ではない.そこで本研究は微小重力場の燃え拡がりを通常重力場で模擬することを検討し,宇宙環境での火災安全性評価を通常重力場で低コストに行える方法について明らかにした.通常重力場で微小重力を模擬するためには火炎により生じる浮力の影響をできるだけ減少させることが必要となる.そこでまず,気流中の酸素濃度を減少させることで火炎への酸素質量流束を減少させ火炎温度を低下させた.また高温酸化剤気流を使用し周囲温度と火炎温度との差つまり密度差を減少させた.更に,流路高さを数ミリメートルとした狭流路を用いて火炎の大きさを制限し,通常の火炎にくらべて火炎体積を減少させた.それら浮力を減少させる工夫を行い対向気流中で熱的に薄いろ紙の燃え拡がり実験を行った.特に,浮力の燃え拡がり現象への影響を明確にするために,水平,45度上方そして45度下方燃え拡がりにっいて詳しく検討し,火炎形状,燃え拡がり速度の測定を行い微小重力場と通常重力場での各値を比較した.その結果,高温・減酸素狭流路内では燃え拡がり方向の影響を大きく受けず火炎形状は微小重力場での火炎形状に近づくことが明らかとなった.さらに,各方向へ燃え拡がる火炎の伝播限界条件での燃え拡がり速度はほぼ一定の値をとり,その値が微小重力場での燃え拡がり速度に定量的に近づくことがわかった.そして浮力の影響を考察するためにRayleigh数を高温・減酸素狭流路内で形成された火炎に対して算出すると,その値は流路高さが減少するほど減少し浮力の影響が低下することがわかった.このように,狭流路・高温・減酸素環境を用いることで通常重力場で微小重力場での火炎の可燃性固体表面上の燃え拡がりを模擬できることを明らかにした.本研究では微小重力環境における火災安全性評価法の確立を目的に,重力の影響を小さくできる高温・低酸素流の流れる狭流路内における可燃性固体表面上の燃え拡がりと消炎機構について実験的に調査する.今年度は高温減酸素気流中における熱的に薄いろ紙表面上の燃え拡がりを調査するため,水平および垂直下方の燃え拡がりについて実験を行った.高温減酸素気流中の水平燃え拡がりでは,常温通常酸素濃度で見られていた下流位置での浮力による火炎の立ち上がりが見られず,浮力の作用が減少しているがわかった.垂直下方燃え拡がりでは,高温通常酸素濃度では火炎が上方に長く伸びていたが,高温減酸素気流中では火炎形状が丸くなり,微小重力環境におけるろ紙表面上の燃え拡がり火炎形状に近くなることがわかった.燃え拡がりに与える浮力の影響を評価するため,実験で得られた火炎長さ,火炎温度を用いてレイリー数を算出したところ,燃え拡がり限界酸素濃度での高温気流中における垂直下方燃え拡がりで,ほぼ臨界レイリー数に近い値となり,浮力の影響が極めて小さくなっていることがわかった.さらに,地上で微小重力を模擬した燃え拡がり火炎との対照データを得るために,落下塔を用いた微小重力環塊での燃え拡がり実験を行った.微小重力下では浮力の影響による下流での上方への火炎の伸びは見られない.酸素濃度を低下させると火炎長さは短くなり,酸素濃度を増加させると火炎長さも長くなる.S.Olsonのチャンバーを用いた静止気流中の実験では微小重力での燃え拡がり限界酸素濃度は21vol.%であったが,本実験では対向気流中での燃え拡がりのため,燃え拡がり限界酸素濃度はさらに低下し17.2vol.%となった.宇宙環境利用の推進にあたり火災安全性の確保は重要な課題である.しかし宇宙環境で使用される多彩な材料の火災安全性を微小重力環境下で評価することは容易ではない.そこで本研究は微小重力場の燃え拡がりを通常重力場で模擬することを検討し,宇宙環境での火災安全性評価を通常重力場で低コストに行える方法について明らかにした.通常重力場で微小重力を模擬するためには火炎により生じる浮力の影響をできるだけ減少させることが必要となる.そこでまず,気流中の酸素濃度を減少させることで火炎への酸素質量流束を減少させ火炎温度を低下させた.また高温酸化剤気流を使用し周囲温度と火炎温度との差つまり密度差を減少させた.更に,流路高さを数ミリメートルとした狭流路を用いて火炎の大きさを制限し,通常の火炎にくらべて火炎体積を減少させた.それら浮力を減少させる工夫を行い対向気流中で熱的に薄いろ紙の燃え拡がり実験を行った.特に,浮力の燃え拡がり現象への影響を明確にするために,水平,45度上方そして45度下方燃え拡がりにっいて詳しく検討し,火炎形状,燃え拡がり速度の測定を行い微小重力場と通常重力場での各値を比較した.その結果,高温・減酸素狭流路内では燃え拡がり方向の影響を大きく受けず火炎形状は微小重力場での火炎形状に近づくことが明らかとなった.

さらに,各方向へ燃え拡がる火炎の伝播限界条件での燃え拡がり速度はほぼ一定の値をとり,その値が微小重力場での燃え拡がり速度に定量的に近づくことがわかった.そして浮力の影響を考察するためにRayleigh数を高温・減酸素狭流路内で形成された火炎に対して算出すると,その値は流路高さが減少するほど減少し浮力の影響が低下することがわかった.このように,狭流路・高温・減酸素環境を用いることで通常重力場で微小重力場での火炎の可燃性固体表面上の燃え拡がりを模擬できることを明らかにした.
器官培養を用いた歯胚発生に関する研究

歯の形状と空間的位置の関係を明らかにすることを目的に実験を行った。昨年度に引き続き、Wntプローブを作成するためにWnt cDNAライブラリーの作成を試みたが、期間中に作製できなかった。また、歯特異的なエナメル質の形成を担うエナメル芽細胞の分化過程を解明するためにエナメル芽細胞の細胞培養株化を試みたが、細胞培養株は作製できなかった。そこで、生後8日令のICRマウス切歯根端から取り出したエナメル芽細胞をもちい、エナメル質形成に於けるTGF-β1の作用について調べた。TGF-β1は上皮間葉相互作用に関わる分子の一つで、歯間葉由来の象牙芽細胞の分化やエナメル芽細胞の分化に必須の分子であると考えられている。マウス切歯根端から取り出したエナメル芽細胞を取り出し、コンフルエントに達するまで培養した。コンルフレントに達した後、コントロール、TGF-β1、CaCl_2、TGF-β1+CaCl_2をそれぞれ添加した群に分けて、10日から14日間さらに培養した。培養後、それぞれの群に於いて石灰化の程度を調べるためにアリザリン染色を行った。また、それぞれの群に於いてmRNAを抽出し、RT-PCRにて石灰化に必須のアルカリフォスフォターゼの活性を調べた。アリザリン染色の結果、CaCl_2・TGFβ1+CaCl_2を添加した物は強く染色されたが、コントロール、およびTGFβ1を添加した物は、ほとんど染色されなかった。さらに、アルカリフォスフォターゼの発現量に関しても、CaCl_2を添加した物が最も強く発現したのに対し、TGFβ1やCaCl_2+TGFβ1を添加した群ではアルカリフォルフォターゼの発現が抑制された。以上の結果から、TGF-β1はエナメル質形成過程を抑制することが明らかになった。上記内容を第85回生理学会大会(東京)にて発表した。ほ乳類において歯は体内の器官の中でも形状や位置に関する特異性が特に高い器官である。たとえば、げっ歯類切歯ではエナメル質は唇側にしか観察できない。本研究では歯の形状と空間的位置の関係を明らかにすることを目的にラット胎児より背側組織を含む下顎組織を取り出して、器官培養を行なった。さらに、パターン形成分子の1つであるWntの発現パターンが発生段階に応じてどのように変化するかを観察するために、Wntプローブの作成を試みた。胚期9日齢から14日齢までのラット胎児より取り出した下顎組織では、1週間培養可能であったが、胚期16日齢のラット胎児から取り出した下顎組織では、取り出した下顎が大きく4日間ほどしか培養できなかった。Wntプローブを作成するためにラット胎児より抽出したRNAをテンプレートに用いてRT-PCRを行ない、Wnt cDNAライブラリーの作成中である。また、歯特異的なエナメル質の形成を担うエナメル芽細胞の分化過程にもNotchなどのパターン形成分子が発現していることが明らかになったが、エナメル芽細胞分化にWntやNotchなどのパターン形成分子がどのようにかかわっているかは明らかになっていない。パターン分子の作用を調べるためには細胞培養株の樹立が必要不可欠であるが、現在のところエナメル芽細胞の一次培養からの細胞培養株の樹立には至っていない。そこで、エナメル芽細胞にテロメアーゼ遺伝子をトランスフェクションすることによって、エナメル芽細胞の細胞培養株化を試みた。生後7日目のラットから取り出した下顎切歯からエナメル芽細胞を単離し、テロメアーゼ遺伝子を導入した。ネオマイシンによってテロメアーゼ遺伝子が導入された細胞だけを選抜した。現在、選抜した細胞から限界希釈法によりクローンを作成中である。本年度では培養可能であった胚期9日齢、および12日齢、14日齢のラット胎児より取り出した下顎組織を1週間培養し、歯胚の発生を観察した。その結果、いずれの日齢でも帽状期の歯胚が観察されたが、生体内での歯胚発生段階よりも遅延が生じていた。昨年度に引き続き、Wntプローブを作成するためにWnt cDNAライブラリーの作成中である。また、昨年度に引き続き、歯特異的なエナメル質の形成を担うエナメル芽細胞の分化過程を解明するためにエナメル芽細胞の細胞培養株化を試みた。本年度ではラットだけでなくマウスのエナメル芽細胞においてもテロメアーゼ遺伝子導入によるエナメル芽細胞の不死化を試みた。生後7日齢のマウス、およびラットの下顎切歯から単離した初代培養のエナメル芽細胞にコントロールベクターを導入することにより最適な遺伝子導入条件を決定した。決定した導入条件でテロメアーゼ遺伝子を導入し、ネオマイシンによりテロメアーゼ遺伝子が導入された細胞だけを選抜した。並行して、エナメル質に存在するタンパク質の主成分であるアメロゲニンの発現がTGFβ-1によって上昇するかどうかを観察した。その結果、TGFβ-1によってアメロゲニンの発現がわずかながら上昇する傾向が見られたが、安定した結果が得られなかった。この結果は、初代培養のエナメル芽細胞には種々の分化段階の細胞が含まれているためだと考えられた。このため、株化したエナメル芽細胞を用いてTGFβ-1に対する反応がどのように変化するかを来年度では調べる予定である。

また、歯特異的なエナメル質の形成を担うエナメル芽細胞の分化過程を解明するためにエナメル芽細胞の細胞培養株化を試みたが、細胞培養株は作製できなかった。そこで、生後8日令のICRマウス切歯根端から取り出したエナメル芽細胞をもちい、エナメル質形成に於けるTGF-β1の作用について調べた。TGF-β1は上皮間葉相互作用に関わる分子の一つで、歯間葉由来の象牙芽細胞の分化やエナメル芽細胞の分化に必須の分子であると考えられている。マウス切歯根端から取り出したエナメル芽細胞を取り出し、コンフルエントに達するまで培養した。コンルフレントに達した後、コントロール、TGF-β1、CaCl_2、TGF-β1+CaCl_2をそれぞれ添加した群に分けて、10日から14日間さらに培養した。培養後、それぞれの群に於いて石灰化の程度を調べるためにアリザリン染色を行った。また、それぞれの群に於いてmRNAを抽出し、RT-PCRにて石灰化に必須のアルカリフォスフォターゼの活性を調べた。アリザリン染色の結果、CaCl_2・TGFβ1+CaCl_2を添加した物は強く染色されたが、コントロール、およびTGFβ1を添加した物は、ほとんど染色されなかった。さらに、アルカリフォスフォターゼの発現量に関しても、CaCl_2を添加した物が最も強く発現したのに対し、TGFβ1やCaCl_2+TGFβ1を添加した群ではアルカリフォルフォターゼの発現が抑制された。以上の結果から、TGF-β1はエナメル質形成過程を抑制することが明らかになった。上記内容を第85回生理学会大会(東京)にて発表した。
新鶏膵臓ホルモン(グルカゴン様ペプチド)の単離とその生理機能の解明

[研究目的]本研究の目的は、平成5年度において、まず、酵素的DNA増幅法(Polymerase Chain Reaction法、以下PCR法と略す)に従って鶏GLPをコードするDNAを増幅し、つぎに、この増幅されたDNAを用い酵母を宿主として生理活性を有するGLPを大量に生合成する。そして、生合成されたGLPに対する単クローン抗体を作製する。さらに、平成6年度において、作製された単クローン抗体をアフィニティークロマトグラフィーのリガンドに供することにより、鶏膵臓からのGLPの単離・同定を行う。また、平成5年度生合成されたGLPを用いて、鶏におけるGLPの生理機能についてin vivo並びにin vitro条件下でグルカゴンのそれと比較検討する。[研究成果]1)PCR法を用いた鶏GLPをコードするDNAの合成:鶏グルカゴン前駆体cDNA内のGLPをコードする塩基配列に基づいて化学合成された20merのプローブを用い、PCR法に従ってGLPをコードするDNAを大量に得た。2)酵母による鶏GLPの発現:まず、1)で得たGLPをコードするDNAをシャトルベクターpAM82(大腸菌と酵母の双方で増幅可能で、しかもPHO5プロモーターなどを有することから酵母での強力な蛋白質発現能をもつベクター)に組み込み、大腸菌JM109で増幅した。つぎに、増幅された組み換えベクターを用いて、酵母Saccharomyces cerevisiae AH22株を宿主としてGLPを大量に発現させた。最後に、発現されたGLPを常法に従って分離・精製後、そのアミノ酸配列並びに生理活性を確認した。3)鶏GLPの単クローン抗体の作製:上記2)で得たGLPで免疫したBALB/cマウスの脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞(P3U1)を常法に従って融合し、得られたハイブリドーマよりGLPに特異的な単クローン抗体を作製した。4)鶏膵臓からのGLPの単離・同定:上記3)で得た単クローン抗体をリガントとしCNBr-活性化セファロース4Bを担体としたアフィニティークロマトグラフィー等を利用して、GLPを鶏膵臓から単離し同定した。5)鶏GLPの生理機能の検討:上記2)で得たGLPを用いて、成長中の鶏に関して、静脈内投与によるin vivo実験並びに初代培養肝臓細胞及び遊離脂肪細胞を利用したin vitro実験を行ない、鶏の体内代謝系、即ち、炭水化物代謝系・脂質代謝系および蛋白質代謝系へのGLPの関与をグルカゴンのそれと比較検討した。[研究目的]申請者らは、鶏膵臓cDNAライブラリーからグルカゴンcDNAをスクリーニングする過程で、グルカゴン前駆体cDNA内にグルカゴン様ペプチド(Glucagon Like Peptide、以下GLPと略す)をコードする塩基配列を見出した。既に、哺乳動物や魚類においてGLPの存在が確認されていることから、鶏膵臓からGLPを単離し同定できる可能性は極めて高いと判断される。

そこで、本研究の目的は、平成5年度において、まず、酵素的DNA増幅法(Polymerase Chain Reaction法、以下PCR法と略す)に従って鶏GLPをコードするDNAを増幅し、つぎに、この増幅されたDNAを用い酵母を宿主として生理活性を有するGLPを大量に生合成する。そして、生合成されたGLPに対する単クローン抗体を作製する。さらに、平成6年度において、作製された単クローン抗体をアフィニティークロマトグラフィーのリガンドに供することにより、鶏膵臓からのGLPの単離・同定を行う。また、平成5年度に生合成されたGLPを用いて、鶏におけるGLPの生理機能についてin vivo並びにin vitro条件下でグルカゴンのそれと比較検討する。[本年度の研究成果]1)PCR法を用いた鶏GLPをコードするDNAの合成:鶏グルカゴン前駆体cDNA内のGLPをコードする塩基配列に基づいて化学合成された20merのプローブを用い、PCR法に従ってGLPをコードするDNAを大量に得た。2)酵母による鶏GLPの発現:まず、1)で得たGLPをコードするDNAをシャトルベクターpAM82(大腸菌と酵母の双方で増幅可能で、しかもPHO5プロモーターなどを有することから酵母での強力な蛋白質発現能をもつベクター)に組み込み、大腸菌JM109で増幅した。つぎに、増幅された組み換えベクターを用いて、酵母Saccharomyces cerevisiae AH22株を宿主としてGLPを大量に発現させた。最後に、発現されたGLPを常法に従って分離・精製後、そのアミノ酸配列並びに生理活性を確認した。3)鶏GLPの単クローン抗体の作製:上記2)で得たGLPで免疫したBALB/cマウスの脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞(P3U1)を常法に従って融合し、得られたハイブリドーマよりGLPに特異的な単クローン抗体を作製した。[研究目的]申請者らは、鶏膵臓cDNAライブラリーからグルカゴンcDNAをスクリーニングする過程で、グルカゴン前駆体cDNA内にグルカゴン様ペプチド(Glucagon Like Peptide、以下GLPと略す)をコードする塩基配列を見出した。既に、哺乳動物や魚類においてGLPの存在が確認されていることから、鶏膵臓からGLPを単離し同定できる可能性は極めて高いと判断される。[本年度の研究成果]
新たな突然変異遺伝子の解明による自己免疫性糸球体腎炎の病理発生の解析

我々は,膠原病の発症がポリジーン系遺伝素因の協同作用によるものとする考え方を基盤に,疾患モデル動物の交配実験や遺伝学的手法を用いて,遺伝素因群の解明に努めてきた。その結果,多くの新規膠原病モデルマウスの系統樹立に至っている.また一方で、糸球体病変局所に沈着するモノクローナル抗体の解析から、糸球体局所に抗体が沈着する機序の解明にも努めてきた。本研究では、新規モデルの中でも最も重篤な自己免疫性糸球体腎炎の発症と若年致死を表現型とするEODマウスと、その系統から自然突然変異種として樹立され、糸球体腎炎の軽快とともに寿命の延長を表現するシナモンマウスを研究材料とした。EODマウスは、膠原病モデルマウスMRL/MpJ-lpr/lpr (MRL/lpr)とBXSBを始祖とし,この2系統の子孫の兄妹交配から早期死亡を育種の選択指標として樹立されたリコンビナント近交系マウスである。これは両親系統より短命で,その死因は早期発症の半月体形成性糸球体腎炎による腎不全と診断される。一方のシナモンマウスは、EODマウスの樹立後十年余りを経た最近,野生色から薄茶色への毛色の変化に伴って,顕著に寿命の延長を示す亜系統として分離・樹立されたものである。本研究課題では、シナモンマウスを用いて、次の2点を目的とした研究を行った。1)病理組織学的に糸球体腎炎の半月体形成を抑制した突然変異遺伝子は何であるか?2)突然変異遺伝子の本来の働きとして、どのような機序を辿って半月体形成を誘導し、糸球体腎炎の重篤化・致死性に関与しているのか?目的1)に関しては、野生種マウスであるMSM/Msとの交配から得られる子孫を用いて、ゲノムワイドの遺伝関連解析を行った。その結果、半月体形成抑制の原因となった変異遺伝子は、マウス第5番染色体上に存在する新規タンパク(シナモンと命名)であることを明らかにした。目的2)に関しては、EODマウスとシナモンマウスの免疫病態の詳細な比較解析を行い、その結果、血小板機能が半月体形成に大きな役割を果たしていることを明らかにした。以上の結果は、腎炎成立機序における腎糸球体の半月体形成の病態メカニズムを明らかにしたに留まらず、シナモンタンパクや血小板機能などが、半月体形成性糸球体腎炎に対する分子・細胞ターゲットとして位置づけられ、この難治性・致死性病変の治療の可能性をも導くことになったと言える。EODマウスは、重篤な糸球体腎炎を自然発症し早期死亡(生後100日以内)をきたす系統である。以前我々は、系統維持の過程で、毛色の変化とともに著明に延命する自然変異マウスを見出し、EODミュータント系統を樹立した。本課題の14年度では、EODミュータント系統に起こった突然変異遺伝子の同定を主目標に研究を進め、以下の結果を得た。

(1)変異遺伝子の同定:マイクロサテライトマーカーを用いた遺伝子型・表現型(毛色)の関連解析から、変異遺伝子が存在する範囲を1.2メガベースに絞り込み、位置的候補遺伝子を挙げた。続いて、親系統と変異系統の候補遺伝子のcDNAの塩基配列を比較検討したところ、新規タンパク質(シナモンと命名)をコードする遺伝子エクソン内に一塩基欠損を同定した。(2)シナモンタンパク質の固定:変異遺伝子は、一塩基欠損による翻訳フレームシフトで、異常タンパク質をコードすると考えられた。そこで、野生型シナモンタンパク質に対するウサギ抗血清を作製し、内在性のシナモンタンパク質および変異型タンパク質の同定を行った。ウエスタンプロットの結果、野生型のシナモンタンパク質は、脳、腎、骨髄、血小板に予想分子量(28kD)で存在し、一方、変異型タンパク質は発現していないことが分かった。モデル疾患の同定:EODミュータントマウスでは、毛色の変化とともに、出血時間の著明な延長、血小板の形態異常、行動異常(tilting)が見られることを明らかにした。以上は、ヒト遺伝性疾患ハマンスキ・ピュドラツク症候群の症状に一致し、EODミュータントマウスを当症候群のモデルマウスに位置づけた(論文準備中)。今年度は、突然変異遺伝子のクローニングに焦点をあて、昨年度に絞り込んだ染色体領域D5Mit288(中心体から34.72Mb)とD5Mit230(同35.17Mb)の間の領域の中に存在する遺伝子(仮想のものも含めて)に関して、シナモンマウスと野生型EODマウスの転写産物の塩基配列をRT-PCRからの直接シークエンス法により決めた。その結果、ESTデータベース上のBC019169クローンに相当する遺伝子のコーディングエクソン上に、一塩基の欠失があることが分かった。また、この一塩基欠失は翻訳フレームシフトをきたすものと予想された。この遺伝子の予想翻訳領域の配列からリコンビナントタンパクを作製し、それをウサギに免疫することにより抗血清を得た。シナモンマウスならびに野生型EODマウス由来の胎児性線維芽細胞、脳、腎臓、血小板、骨髄細胞のライゼートを調整し、上述の抗血清を用いてウエスタンブロットを行った結果、野生型EODマウスには、約30kDのタンパク質(シナモンタンパク質と命名)が検出されたが、シナモンマウスでは検出されなかった。すなわち、シナモンマウス変異は、新規シナモンタンパク質の欠損の原因となっていることが分かった。さらに、このタンパクは、血小板の凝集・分泌に必須の機能を果たしていたことから、血小板が糸球体腎炎の半月体形成に大きな役割を果たしていることを明らかにした。
漢方薬の薬効を利用した脳血管性痴呆治療標的分子の探索・同定とその生理機能解析

本研究では釣藤散をはじめとする漢方薬の脳虚血病態動物における学習記憶改善効果を利用して脳虚血処置と漢方薬投与の操作に対して相反性に発現変化する脳内因子の探索同定と、その脳内生理機能の解析により脳血管性痴呆の治療に資する標的分子を開発することを目的とする。この目的で脳血管性認知障害症患者に対して有効性が報告されている漢方薬釣藤散(CTS)を主に用いた。両側総頸動脈を永久結紮した慢性脳虚血(P2VO)モデル動物を用いてP2VO処置後からCTS投与を開始し,P2VO動物に発現する学習記憶障害や脳内遺伝子発現等を指標にCTSの影響を検討した。その結果,以下の知見を見出すことができた。P2VO動物では対照動物と比べて空間的及び非空間的学習記憶に顕著な障害が認められ,CTS及びコリンエステラーゼ阻害薬タクリン投与により改善された。一方,CTSとは適用疾患が全く異なる柴胡桂枝湯は無効であったことから,改善効果はCTSに特徴的作用であることが推測された。学習記憶に重要なコリン神経系のマーカー遺伝子を指標に精査した結果,P2VO動物ではコリン神経系機能が低下しており,それはCTS投与で回復することが判明した。これらからCTSの効果にアセチルコリン合成酵素やムスカリン性受容体の遺伝子発現系が関与する可能性が示された。脳内遺伝子をDNAアレイ解析した結果,P2VOで発現変化する遺伝子の一つとしてマクロファージコロニー刺激因子(MCSF)、を見出した。さらにCTS投与はPKC系を介してMCSF遺伝子発現を上昇させることを明らかにした。MCSFは虚血や外傷による神経損傷に対して抑制的に働き,コリン神経系に対して栄養性効果を持つことが示唆されていることから、脳血管性認知症に対するCTSの臨床的有効性にもこの作用が一部,関与することを示唆した。本研究は、釣藤散をはじめとする漢方薬の脳虚血病態動物における学習記憶改善効果を利用して脳虚血処置と漢方薬投与の操作に対して相反性に発現変化する脳内因子の探索同定と、その脳内生理機能の解析により脳血管性痴呆の治療に資する標的分子を開発することを目的とする。脳内因子を探索する基礎実験では雄性ICRマウスの両側総頸動脈を永久結紮し、慢性脳虚血病態モデル(P2VO)動物を作製した。手術2週間後からP2VO動物に(1)水(対照群)、(2)漢方方剤釣藤散エキス、(3)釣藤散とは臨床的用途の異なる方剤(柴胡桂枝湯)の経口投与を開始し、各群の学習行動を水迷路課題で評価した。また(4)コリンエステラーゼ阻害薬タクリン(TH)を参照薬として用いた。P2VO対照群では偽手術群(Sham)と比較して顕著な空間認知障害が認められた。釣藤散またはTH投与により障害は改善されたが、柴胡桂枝湯は無効であった。釣藤散及びTHの効果はアセチルコリンM1受容体拮抗薬ピレンゼピンの併用でほぼ完全に抑制されたことから、P2VO誘発空間認知障害に対する改善効果は釣藤散およびTHに特徴的な作用であり、これらの効果に中枢コリン神経系の賦活が関与することが示唆された。行動実験終了後、各群の前脳皮質から全RNAを抽出し、IntelliGene III Mouse CHIPを用いてDNAアレイ解析を行った。検討した4445種遺伝子のうちP2VOにより発現が1.5倍以上増加または0.67倍以下に低下したものが98種検出された。また釣藤散投与によって発現変化した遺伝子として19種検出され、そのうちP2VO処置と相反変化したものは11種検出された。