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数学の観点から行う数学史の研究

関孝和及びその直接の弟子たちの業績は比較的よく知られているが、関西にいた田中由真、井関知辰や仙台にいた戸板保佑たちの仕事はまだまだよく研究されていない。後半年はこの人たちの業績解明に多くの時間を使った。この結果はこの秋に津田塾大学で開かれる第22回数学史シンポジウムで報告する予定である。建部賢弘、賢明兄弟は、師の関孝和が行列式を導入したときに発表した行列式展開の便法である交式・斜乗を、後に大成算経にまとめるときには捨ててしまったが、その理由もかいま見ることができたのではないかと思っている。フーリエは「熱の解析的理論」(1822)の第V章で球体の球対称な熱の伝導を論じている。ここでは時にロバンの名前が与えられている第三種境界条件が現れる。1862年ケルビン卿は、これを簡易化したモデルを用いて地球の年齢を論じ1億年を超えないと結論して進化論者たちを落胆させたが、19世紀末工部大学校の教授であったペリーとヘヴィサイドがこの危機を救ったという話を用意し、研究成果として今後発表をしていく予定である。
「2ドメイン」構造をもつ酵母ヘモグロビンの分子生理学的研究

酵母ヘモグロビンは「酸素結合ドメイン」と「還元酵素ドメイン」とから成っているが、本研究では、まず「分子全体」を発現させるベクター(pMAL-c2/Candida Hb)と「酸素結合ドメイン」のみを発現させるベクター(pMAL-c2/heme domain)とを作製した。次に、それらを大腸菌に導入して大量培養したのち、ゲル濾過とイオン交換クロマトグラフィー法を用いて、whole proteinと酸素結合ドメイン(以下ヘムドメインと記す)とを単離精製することに成功した。そこで、両者の吸収スペクトルを測定してみると、whole proteinではメト型のSoret peakがオキシ型のそれよりも高くなっているのに対し、ヘムドメインではその関係が逆転していた。このことから、whole proteinのメト型ではヘム鉄(III)に水分子が配位している六配位構造を、ヘムドメインでは水分子の配位していない五配位構造をとっているものと考えられた。したがって、「酸素結合ドメイン」の軸配位子構造にも、「還元酵素ドメイン」が大きな影響を与えていることが分かった。次に、ヘム鉄に結合した酸素分子の安定性を調べるため、オキシ型(HbO_2)からメト型(metHb)への自動酸化速度を、25°C、0.1M buffer中で、pH4から9までの広い領域に渡って詳細に測定した。その結果、ヘムドメインのみの場合は、全てのpH領域でwhole proteinよりも自動酸化を受けやすいことが分かった。一方、whole proteinでもヘムドメインでも、その自動酸化速度は酸性側で共に増大するが、pHに対する傾きはせいぜいn=-0.5程度であり、しかもpH4付近になると速度の飽和が見られた。したがって、酵母ヘモグロビンの自動酸化反応には、遠位His残基を介して発現される酸触媒項は全く含まれていないものと結論された。我々は1992年にCandida酵母を大量に培養して、そこからヘモグロビン様タンパク質を単離精製し、その全一次構造を世界に先駆けて決定した。しかしこのタンパク質の発現量は極めて低く、広範な構造論的研究や反応論的研究を展開することは困難であった。そこで、本研究ではまず酵母ヘモグロビンのcDNAを調製し、それを大腸菌にトランスフォームして大量発現系を構築した。形質転換した菌体からwild typeの酵母ヘモグロビンを単離精製し、吸収スペクトルやNADHを添加した場合のヘム鉄(III)の還元反応などを調べ、酵母菌由来のnativeなものと同様な性質を有していることをまず確認した。次に、酵母ヘモグロビンに結合した酸素分子の安定性を調べるため、オキシ型(HbO_2)からメト型(metHb)への自動酸化速度を、25°C、0.1M buffer中で、pH3-9までの広い領域に渡って測定した。その結果、酵母ヘモグロビンのpH-profileは、マッコウクジラの場合とは大きく異なり、酸性領域における傾きはn=-0.5と緩やかであることが明らかとなった。従って、酵母ヘモグロビンの自動酸化反応には、遠位Hisを介して発現される酸触媒項が含まれていないものと結論された。また、wild type酵母ヘモグロビンの円偏光二色性を測定した結果、そのα-helix含量は約44%と見積もられた。現在、酵母ヘモグロビンの酸素結合領域(ヘムドメイン)のみを発現させる系を構築中である。次に、それらを大腸菌に導入して大量培養したのち、ゲル濾過とイオン交換

クロマトグラフィー法を用いて、whole proteinと酸素結合ドメイン(以下ヘムドメインと記す)とを単離精製することに成功した。そこで、両者の吸収スペクトルを測定してみると、whole proteinではメト型のSoret peakがオキシ型のそれよりも高くなっているのに対し、ヘムドメインではその関係が逆転していた。このことから、whole proteinのメト型ではヘム鉄(III)に水分子が配位している六配位構造を、ヘムドメインでは水分子の配位していない五配位構造をとっているものと考えられた。したがって、「酸素結合ドメイン」の軸配位子構造にも、「還元酵素ドメイン」が大きな影響を与えていることが分かった。次に、ヘム鉄に結合した酸素分子の安定性を調べるため、オキシ型(HbO_2)からメト型(metHb)への自動酸化速度を、25°C、0.1M buffer中で、pH4から9までの広い領域に渡って詳細に測定した。その結果、ヘムドメインのみの場合は、全てのpH領域でwhole proteinよりも自動酸化を受けやすいことが分かった。一方、whole proteinでもヘムドメインでも、その自動酸化速度は酸性側で共に増大するが、pHに対する傾きはせいぜいn=-0.5程度であり、しかもpH4付近になると速度の飽和が見られた。したがって、酵母ヘモグロビンの自動酸化反応には、遠位His残基を介して発現される酸触媒項は全く含まれていないものと結論された。
テンスとアスペクトの統語論的研究に基づく普遍文法の解明

「テンス(時制)」と「アスペクト(相)」はともに時間に関わる言語表現であるが、アスペクトが、主に動詞の語彙的意味と連動して動詞句が表す事象(event)の性質(完了、継続等)を決定するのに対して、テンスは、動詞句が表す事象が時間軸上のどの点で起こるものであるか(過去、非過去等)を決定するという差がある。統語的にも、アスペクトを表す機能範疇(Aspect)は、動詞句を選択し、動詞の目的語の性質と連動するのに対して、テンスを表す機能範疇(Tense)は、その指定部に文の主語を選択し、文の発話内の力(illocutionary force)を決定する機能範疇である補文標識(Comp ; C)によって選択されるので、主語および補文標識の性質と連動するという差がある。テンスとアスペクトの間の、このような差異を踏まえ、「平成18年度の研究成果」に記した論文では、生成文法理論の見地から、日本語の補文内からの長距離A移動の可否を、補文のテンスおよび補文標識の統語的性質に還元する説明を提案した。具体的には、「主語繰り上げ(Subject Raising)構文においては、補文のテンスが主節のテンスと同時の解釈を受けるときのみ、その主語が節境界(CP)を越えて長距離A移動できる」「かき混ぜ(Scrambling)構文においては、補文主語が音形のない名詞句であるときのみ、補文目的語が節境界を越えて長距離A移動できる」という、従来から知られている2つの一般化に対して、「補文のCが主節のVへ編入したとき、補文のTP指定部を占める名詞句が当該のVの指定部へA移動できる」という仮説に基づく統一的説明を与えた。節境界を越えるA移動の可否に関する事実は、従来、テンスがもつ意味素性の観点からフェイズ(phase)としてのCPを2種類にタイプ分けすることで説明されていたが、本研究は、この従来の説明に内在する問題点を解決し、当該の事実に対して、「CPは常にフェイズである」というより単純で理論的に望ましい仮説と、「補文のCが主節のVへ編入する場合がある」という補助仮説のもとで、純粋に統語的な説明を与えたものである。「テンス(時制)」と「アスペクト(相)」はともに時間に関わる言語表現であるが、前者が時間を点として捉え、後者は時間を線として捉えるという違いがあり、この両者が言語表現の時間についての意味を決める上でどのように相互作用するかは、言語ごとに微妙に異なる。また、時制と相を表す形態素は、日本語だけを見ても、基本となる用法の周辺にさまざまの派生的用法をもち、多様な意味や状況を表すことから、時制と相にまつわる広範な現象のうちのどの側面を中核的現象とみなすかによって、さまざまに異なる一般化を導くことができる。したがって、時制と相の研究の現状は、理論的説明を追求することと平行して、記述的一般化の精度を高めることにも力点を置く必要がある。このような現状を踏まえ、「平成17年度の研究成果」に記した論文では、生成文法理論の見地から、特に、日本語の相形態素「(て)い」と時制形態素「る」を取り上げ、「「ている」と同じ意味で「る」が用いられるのは、それが何らかの演算子によって構成素統御されている場合に限られる」という記述的一般化を示し、これを説明する理論的道具立てとして、極性表現の一種としての「時の普遍量化子」を提案した。これは、16年度に刊行された論文「The Simple Present Tense in Japanese and the Phonetically Empty Universal Quantifier」を縮約し改良を加えたものである。いずれの論文も、日本語の時制形態素の特徴に限って論じたものである。この提案を基盤として、来年度は、英語の時制形態素と相形態素、日本語の相形態素についての研究へと拡充し、さらに、日本語と英語の動詞の語彙的意味に共通の特徴と相違点を明らかにするとともに、普遍文法に内在すると考える「時の普遍量化子」の本質的特徴を明確にすることを通して、普遍文法の解明に寄与する論文を仕上げる予定である。具体的には、「主語繰り上げ(Subject Raising)構文においては、補文のテンスが主節のテンスと同時の解釈を受けるときのみ、その主語が節境界(CP)を越えて長距離A移動できる」「かき混ぜ(Scrambling)

構文においては、補文主語が音形のない名詞句であるときのみ、補文目的語が節境界を越えて長距離A移動できる」という、従来から知られている2つの一般化に対して、「補文のCが主節のVへ編入したとき、補文のTP指定部を占める名詞句が当該のVの指定部へA移動できる」という仮説に基づく統一的説明を与えた。節境界を越えるA移動の可否に関する事実は、従来、テンスがもつ意味素性の観点からフェイズ(phase)としてのCPを2種類にタイプ分けすることで説明されていたが、本研究は、この従来の説明に内在する問題点を解決し、当該の事実に対して、「CPは常にフェイズである」というより単純で理論的に望ましい仮説と、「補文のCが主節のVへ編入する場合がある」という補助仮説のもとで、純粋に統語的な説明を与えたものである。
偏性細胞内寄生細菌・リケッチアの飢餓応答機構の解明

リケッチアの媒介節足動物・マダ二の飢餓環境におけるリケッチア生残のための応答機構の解明を目標とし、マダニ細胞での飢餓状態成立をモニターするためのオートファジー関連抗原Atg12抗体を作製した。また、マダニ細胞、ほ乳動物細胞に非病原性紅斑熱群リケッチアを感染させると、リケッチア増殖の抑制がみられ、オートファジーの関与が示唆された。これに病原性株を重感染すると非病原性リケッチアの増殖が惹起され、病原性株がオートファジー抑制因子を産生している可能性が推測された。偏性細胞内寄生細菌・リケッチアはマダニ等の媒介節足動物(ベクター)中で共生的に生存し、経卵伝播する。通常、ベクターは吸血のチャンスを得るまで、飢餓状態で年余にわたり生残するが、リケッチアはベクターの飢餓状態にも対応して生存を続け、哺乳動物への感染源となる。本研究ではこのベクター内の飢餓環境におけるリケッチア生残のための応答機構を、培養細胞レベルで分子生物学的に解明することを目的とし、リケッチア感染昆虫細胞あるいはマダニ細胞に飢餓状態を誘導した場合、リケッチアのどのような遺伝子群が飢餓状態に応答して発現するかを明らかにすることを目指した。昆虫細胞(NIAS-AeAl-2)あるいはマダニ細胞(DALBE3、ISE6)を培養し、アミノ酸枯渇により誘導されるオートファジー関連遺伝子の発現状態で飢餓状態の成立をモニターすることを試みた。しかし、ヒトあるいはラットの抗Atg8抗体、抗LC3抗体はこれらの細胞のオートファジー関連蛋白質との交差反応性が弱く、オートファジー誘導、すなわち飢餓状態成立をモニターできなかった。そこで、DALBE3マダニ(Dermacentor albipictus)由来細胞でのオートファジーをモニターする目的で、D.albipictusのAtg12(DaAtg12)に対する抗体を作製することとした。Hemaphisalis longicornisマダニのAtg12遺伝子を元に、発現ベクターpGEX-6P-3を用いて組換えDaAtg12を作製した。これを抗原として、家兎を免疫して抗体を作製し、これを用いて当初の計画を遂行する予定にしている。通常、ベクターは吸血するまで年余にわたり飢餓状態で生残するが、リケッチアはベクターの飢餓状態にも対応して生存を続ける。本研究では飢餓環境におけるリケッチア生残のための応答機構を、培養細胞レベルで分子生物学的に解明することを目的とし、リケッチア感染昆虫細胞あるいはマダニ細胞に飢餓状態を誘導した場合、リケッチアのどのような遺伝子群が飢餓状態に応答しそ発現するかを明らかにすることを目指した。マダニ細胞(DALBE3、ISE6)を培養し、アミノ酸枯渇により誘導されるオートファジー関連遺伝子の発現状態で飢餓状態の成立をモニターすることを試みたが、ヒトあるいはラットの抗Atg8抗体、抗LC3抗体はマダニ細胞の抗原との交差反応性が弱く、オートファジー誘導をモニターできなかった。そこで、マダニ(Dermacentor albipictus)由来のDALBE3細胞でのオートファジーをモニターする目的で、D.albipictusのAtg12に対する抗体を作製している。これとは別に、マダニ細胞、ほ乳動物細胞(Vero、HeLa)に非病原性の紅斑熱群リケッチアを感染させると、リケッチアの増殖が抑制されており、持続感染が成立した。ウエスタンブロット法、電子顕微鏡観察等によりオートファジーが増殖抑制に関与していることが示唆された。また、この感染細胞に病原性株を重感染すると病原性株同様、非病原性株の増殖も惹起されることが示された。これらから、リケッチアのマダニ細胞内持続感染とオートファジーとの関係の重要性が示唆された。今後、作製した抗体を用いて飢餓状態をモニターし、飢餓応答により発現する遺伝子群とリケッチアの生残との関連を明らかにする。リケッチアは偏性細胞内寄生細菌であり、マダニ、シラミ、ノミ等の媒介節足動物(ベクター)中で共生的に生存し、経卵伝播する。本研究では飢餓環境におけるリケッチア生残のための応答機構を、培養細胞レベルで分子生物学的に解明することを目的とし、リケッチアを感染させた昆虫細胞あるいはマダニ細胞に飢餓状態を誘導した場合に、それに応答してリケッチアのいかなる遺伝子群が発現するかを解明することを目指した。

マダニ細胞(DALBE3、ISE6)を培養し、アミノ酸枯渇により誘導されるオートファジー関連遺伝子の発現状態で飢餓状態の成立をモニターすることを試みたが、市販のヒトあるいはラットのオートファジー関連抗原に対する抗体はマダニ抗原との交差反応性が弱く、オートファジー誘導をモニターできなかった。そこで、マダニ(Dermacentor albipictus)由来のDALBE3細胞でのオートファジーをモニターする目的で、D.albipictusのAtg12に対する抗体を作製し、この抗体を用いてマダニ細胞におけるオートファジーをモニターすることを試みた。これとは別に、マダニ細胞、ほ乳動物細胞(Vero、HeLa)に非病原性の紅斑熱群リケッチアR.montanensis、Rickettsia sp.LONなどを感染させると、リケッチア増殖の抑制がみられ、オートファジーの関与が示唆された。この感染細胞に病原性株を重感染すると非病原性リケッチアの増殖が惹起され、病原性株がオートファジー抑制因子を産生している可能性が推測された。これらから、マダニ細胞内でのリケッチア持続感染とオートファジーとの関係の重要性も示唆された。
カスパーゼ活性阻害による神経細胞障害抑制の臨床応用に向けた戦略的研究

神経細胞死に関与することが明らかにされている蛋白分解酵素であるカスパーゼを抑制することによって神経難病に対する新しい治療を開発することを計画した。しかし、実際にこの研究に着手してみるとなかなか思うような結果を得ることが困難であることが分かってきた。例えば、各カスパーゼの免疫組織化学的方法について残念ながら我々の手では状態のよい染色ができなかったこと、新しいカスパーゼ阻害薬をいくつか合成を試みたけれども、市販の阻害薬以上のものが得られなかったこと、などであり研究の計画を進めることが困難であった。しかし、カスパーゼ活性の測定が可能になったのでまず培養細胞(SHSY5Y)で形態学的変化とカスパーゼ活性の関係を調べたところ、少なくとも明らかにアポトーシスの形態的特徴をもちながらも、1、2、3、6、9のいずれのカスパーゼ活性が正常であることを48時間までの培養条件で確認した。従って、計画の当初に想定したようにアポトーシスによる細胞死とカスパーゼの活性化とは必ずしも平行しないことを確認した。けれども、このことは既に様々な系を用いて証明されていることであり新しい知見ではなかった。さらにその後の世界的な研究の進展により、カスパーゼ活性阻害薬も必ずしもその特異性が厳密でないこと、神経変性疾患における神経細胞死は必ずしもアポトーシス過程によるものではないこと、など我々が主張してきたことを裏付ける報告が数多くなされるようになってきた。そこで、我々は神経変性疾患の神経細胞死を抑制する方法を創出するという本来の目的に立ち返り、CAGリピート病がその遺伝子内に存在するCAGリピートの異常伸長により作られる異常な蛋白の発現によって神経細胞死が起こることが分かっているので、この遺伝子の発現をRNAiのメカニズムによって抑制することによりこの疾患の治療への道を開くことにした。現在鋭意この方向の研究を進めているところであり、本研究費はこの方向への研究に十分生かしている。神経細胞死に関与することが明らかにされている蛋白分解酵素であるカスパーゼを抑制することによって、CAGリピート病やパーキンソン病などの神経難病に対する新しい治療法が開発できないかと考え、いくつかのモデルを用いて検討することにした。その際、カスパーゼの特異性を確認するために他の蛋白分解酵素系についても検討することにした。対象とするモデルは、パーキンソン病モデルとしてラットの被蓋内側に6-ハイドロキシドパミンを注入する方法を用いた。また、ALSモデルとしては同じくラットの髄腔に興奮性アミノ酸類似化合物であるカイニン酸を持続注入する方法を用いた。いずれもモデル動物はほぼコンスタントに作成することができるようになった。一方蛋白分解酵素については、カスパーゼの特異的変化があるか否かを検証することも一つの目的であるので、対照の意味も含めて各種カスパーゼ活性のみならず各種カテプシン活性を測定することにした。具体的には、少量のラット神経組織のホモジェネイトの遠心後の上清をサンプルとしてカスパーゼ1、2、3、6、9のそれぞれ蛍光標識基質と反応させ、生成した産物の蛍光を測定する方法をとることにした。また、カテプシンについても手順はほぼ同様であるがカテプシンB、L、Hの各蛍光基質を用いるところだけが異なる。最近やっとこの方法が確立したところであり、実際の測定を始めたところである。一方、カスパーゼ阻害薬については、共同研究者のところで様々なデザインを行っている段階である。神経変性疾患に認められる共通の病変は、ある種の神経細胞群の選択的な変性・脱落である。例えば、パーキンソン病における黒質メラニン含有細胞、筋萎縮性側索硬化症における脊髄前角細胞の選択的脱落などである。このような神経細胞の早過ぎる死のメカニズムが解明されれば、治療の方法も見いだされるという期待もある。

この点については近年、変性疾患における神経細胞死はアポトーシスによるものではないかとする考えがある。事実、TUNEL法による患者組織の検索の結果からその仮説を支持するとされたこともある。また、アポトーシスの際に作動するとされるカスパーゼも、変性疾患の残存する神経細胞で活性上昇を見たとする研究結果もある。さらに、カスパーゼ阻害薬によりある種の神経細胞死が抑制されたとする報告もある。しかし、我々は注意深く実際の患者脳の病理学的検索を行ったところ、残存する神経細胞の中に多くの割合で(例えばパーキンソン病では70%以上)細胞のサイズ、細胞質の染色性、核の形態などの指標から「病的神経細胞」が存在することを見いだした。すなわち、これらの神経変性疾患においては、時間的経過が著しく早いアポトーシスが病初期から生じているのではなく、十数年に渡る長い「病的状態」の末に細胞死が生じるものであることが予想された。そこで、この仮説を検証するために、MPP^+によるSH-SY5Y細胞の細胞変性の過程を形態的および生化学的観察を行った。その結果200μM1mMの範囲でMPP^+濃度および培養時間依存的にヘキスト33342陽性の変性細胞が出現するものの、細胞のカスパーゼ活性には全く変化がなかった。すなわち、細胞の「形態的な病的状態」がそのまま細胞のアポトーシスを意味するものではないことが判明した。
ダイズ根粒菌におけるグルタチオンによる細胞増殖増制御機構の解明

TedR型転写抑制因子であるblr7984遺伝子を破壊したダイズ根粒菌では細胞増殖が速まる。対数増殖期の菌をマイクロアレイ解析に供したところ、近傍のbll7981-3、シトクロームオキシダーゼ、鞭毛形成や糖輸送体の遺伝子発現が上昇しており、細胞増殖との関連が示唆された。破壊株を接種した根粒中バクテロイドでは、bll7981-3のみが野生株由来のバクテロイドよりも上昇しており、これらがblr7984のターゲットであることが分かった。中でもグルタチオントランスフェラーゼであるbll7983は最も上昇しており、このことが増殖を速めた可能性を検証するため、bll7983過剰発現株の作成に着手した。根粒菌は植物に共生すると根粒内でバクテロイドに分化し、細胞増殖が抑制され窒素固定能を獲得する。バクテロイドはペリバクテロイド溶液(PBS)に包まれており、PBSにはバクテロイドへの分化を引き起こす物質が含まれていると考えられている。ダイズ根粒菌Bradyrhizobium japonicum USDA110のblr7984遺伝子は転写産物がTetR型リプレッサーと推定されるが、PBS中で培養することによって発現が減少するため、この遺伝子破壊株が作成され共生関係における遺伝子発現制御への関与を調べることとなった。本研究では、破壊株の網羅的遺伝子発現解析および形質の調査を行なった。blr7984遺伝子破壊株は野生株と比較して単生時の細胞増殖速度の上昇が観察された。cDNAマイクロアレイ解析の結果、破壊した遺伝子に隣接するbll7981、bll7982、bll7983の発現量が大きく増加していることが明らかになった。また単生状態においては98の遺伝子が野生株と比較して発現増加していたが、その中には、呼吸に関与するサイトクロームオキシダーゼや鞭毛形成に関与する遺伝子などが含まれており、これら遺伝子と細胞増殖速度上昇との関係が示唆された。blr7984遺伝子破壊株をダイズに接種すると、栽培3週目の植物体あたりの根粒重の低下およびその栽培5週目での根粒数の増加を示した。マイクロアレイの結果、共生状態では野生株と比較して発現上昇していた遺伝子はbll7981、bll7982、bll7983のみだった。bll7983がコードするグルタチオントランスフェラーゼは細胞分裂、根粒形成および窒素固定とも深い関係があることが報告されているため、この遺伝子が形質の変化をもたらした要因である可能性は高いと考えられた。今後はbll7983の過剰発現株を作成し形質を調査することで、この仮説を検証して行く。研究代表者はダイズ根粒菌B.japonicumUSDA110よりも増殖が速く、またその根粒は老化が遅く窒素固定能力を高く維持できる変異株を保有している。この変異株は、ダイズとの共生時に発現が変化する転写抑制因子の遺伝子blr7984を破壊することによって創出された。blr7984に隣接するグルタチオントランスフェラーゼの発現が上昇していることから、変異株の表現型とグルタチオンとの関係が示唆されるが未だ不明である。変異株における増殖促進機構を調べるために、対数増殖時の細胞の遺伝子発現を次世代シークエンサーによって野生株と比較する手法をとり、菌体サンプリング時期決定のため、各株の増殖速度、吸光度(OD)、および菌数変化の関係を調べた。培養時間に伴う菌数の増加は、破壊株の方が明らかに早かった。また破壊株の菌数は培養84時間目をピークにその後減少するが、吸光度は84時間目以降も上昇しており、破壊株から何らかの菌体外物質が産生されていることが示唆された。破壊株は増殖後期以降に粘性が高いことから、菌体外物質は多糖と推定された。また吸光度と菌数の関係式をそれぞれの株について求め、吸光度を測定することにより簡易的に菌数を推定できるようにした。上記の結果より、菌体サンプリングの時期を、増殖後期でありかつ菌数が1.52.0 x 108の範囲になるよう、破壊株は培養48時間目、野生株は培養84時間目とした。これらの時期の細胞は増殖の程度が同様であるので、野生株と破壊株の間では、増殖の速さを制御する遺伝子の発現に違いがあると予想された。採取した菌体から全RNAを抽出しmRNAを精製した。野生株についてはcDNAライブラリーの合成後クラスター形成を行い、Genome Analyzer IIx(Illumina)を用いたシーケンスまで終了した。470万750万リードという良好な結果が得られた。

変異株において細胞増殖速度を促進させる分子メカニズムを解明するために、次世代シークエンサーによるトランスクリプトーム解析に取り掛かることができた。まず野生株と変異株についてそれぞれ厳密に増殖速度を調べ、野生株と変異株について増殖の程度(菌数)が同様となる培養時間を決定し、菌体をサンプリングした。そこから抽出したRNAを用いたトランスクリプトーム解析では、まず野生株について良好な結果が得られた。次世代シークエンサーを用いた実験技術は複雑ではあるが、本年度において習得したので、破壊株についても間もなく結果を得ることができる予定である。野生株についてトランスクリプトーム解析が終了したので、次は変異株について同様のことを行う。そして、野生株の結果と比較することにより、変異株において発現が変化している遺伝子を網羅的に選抜し、個々の遺伝子機能についてデータベースを用いて調べる。それらを機能別にグルーピングしたり、代謝パスウェイマップ上に載せたりすることにより、変異株において細胞増殖を促進する機構を描き出す。またこの変異株で、変異が入ったblr7984に隣接するグルタチオンSトランスフェラーゼの遺伝子発現が40倍に増加していることから、破壊株の表現型とグルタチオンとの関連が示唆されている。これを検証するために、対数増殖期の細胞中グルタチオン量を測定する。変異株は細胞体積が小さいことがすでに分かっているが、その体積を顕微鏡観察によって正確に測定し、体積当たりのグルタチオン量を求める。そしてこのグルタチオン量測定結果と、トランスクリプトーム解析の結果を突き合わせ、グルタチオンが細胞増殖速度に関与しているかどいうかを検討する。菌体を培養する培地作成のための器具や試薬、RNA抽出や精製のためのキット、グルタチオン測定のための試薬やHPLC付属品等を購入する。また得られた結果を、国内学会(植物微生物研究交流会、9月、愛知)および国際学会(国際窒素固定会議、10月、宮崎)で発表するための旅費に使用する。さらに、論文投稿料や英文校閲料金に使用する。
東南アジアにおける社会・経済の発展段階に対応した森林利用様式の定式化に関する研究

昨年公表されたFAO(国連農業食料機構)の「1990年熱帯林資源調査」によれば、全世界で毎年1530万haの熱帯林が失われている。このうち熱帯アメリカで約半数に当たる740万ヘクタールが減少しており、世界規模の環境問題を考えるときに、アマゾンが取り上げられるのはこの面積の大きさによると考えられる。一方、アジア太平洋地域では全熱帯林の4分の1に当たる390万ヘクタールが減少しているに過ぎない。しかしながら森林減少率を森林面積に対する割合で計算すると、全世界では0.8%であるのに対し、東南アジア大陸部では1.8%、島嶼部でも1.4%と非常に速い。現地での環境と、燃料生産を含めて木材生産に大きな問題を起こしつつあることは明白である。これに対し、先進国では森林面積が増大しているのが通例である。もっともこれらの国は以前に森林に覆われていたものが減少し、底を打ち現在の増大に転じているのである。同様に発展途上国にもこうした「底打ち点」を期待するものであるが、現況がどうであり、どのようにしていつ「底打ち点」を迎えることができるか考察することが我々の研究の原点となっている。調査対象地の社会経済発展段階ついて先ず述べよう。フィリピンは、一人当たりの国民所得が1990年に730USドルになり、国連の分類によれば「中位所得」国になる。しかしながら、1965年から1990年までの経済成長率を一人当たり国民所得で計算すると1.3%に過ぎない。1970年代まではそれなりに成長を遂げていたことを考え合わせるなら、高度経済成長を続ける東南アジアに在っては「経済停滞」国と判断せざるを得ない。タイは、一人当たり国民所得は1420USドルで「中位所得」国であるが、4.4%の高い成長率を持つ。インドネシアは一人当たり国民所得は570USドルで「低位所得」国であるが、4.5%の高い成長率を持つ。次に森林利用の態様であるが、まずフィリピンを見ると自然林が殆ど無くなっている。地域毎に経済水準と森林減少の関連を調べたが、ほとんど関係が見られなかった(永田)。こうした状況の中でアグロフォレストリーを技術的根拠とした社会林業政策が政府や民間企業によって行われている(餅田)。要点としては林野所有形態、市場、金融が挙げられる(加藤)。請負再造林政策では農業との労働時間、あるいは土地の競合が問題として挙げられる(葉山)。そのほか地元住民のための様々な開発政策が持続的な開発のために立てられ、森林生態系の回復が図られている(Tomboc)。また、農業開発などにより、タイでも森林面積は急速に減少したが、経済成長に伴い木材需要が増大し、木材価格が上昇してきた。また土地の所有権を農民に与える政策とあいまって、また政府からの補助もあり、樹木植栽が進んできている(熊崎)。こうした背景の中で分収造林も進んできており、長期的な土地なし農民への分収、中長期の金融の必要性が指摘される(Makarabhirom)。インドネシアではまだ森林が残されているが、おそらく1000年以上も環境と共存してきた移動耕作が変質し、森林減少がまさに進行している状況である(井上)。木材以外の林産特産物、たとえばラタン(増田)や黒檀(Wijayanto)などの生産も行われており、森林との共存が図られている。われわれはこうした森林の変化、特にインドネシアに在っては、森林の減少の測定(粟屋)を、タイに在っては樹木植栽面積の測定(露木)を、それぞれランドサットTMデータを用いてリモートセンシングの手法で測定し、現地調査(ランドトゥル-ス)を行った。こうした研究によって、「低位所得国」では森林が残されているものの、正に森林減少が進行している。また「中位所得国」では、森林が「底を打って」いることが確認された。しかしながら、どのように森林増加に結び付くかは、各々の国で異なっている。経済成長国では木材価格の上昇が要点であり、経済停滞国では様々な政策によりそれを実現しようと努力している。また森林が残されている国でも森林資源の充実のための政策が取られている。いづれにせよ現地住民の土地所有権を認めるような林野所有の形態が、森林資源造成に鍵になっていると言えよう。

フィリピンは、一人当たりの国民所得が1990年に730USドルになり、国連の分類によれば「中位所得」国になる。しかしながら、1965年から1990年までの経済成長率を一人当たり国民所得で計算すると1.3%に過ぎない。1970年代まではそれなりに成長を遂げていたことを考え合わせるなら、高度経済成長を続ける東南アジアに在っては「経済停滞」国と判断せざるを得ない。タイは、一人当たり国民所得は1420USドルで「中位所得」国であるが、4.4%の高い成長率を持つ。インドネシアは一人当たり国民所得は570USドルで「低位所得」国であるが、4.5%の高い成長率を持つ。次に森林利用の態様であるが、まずフィリピンを見ると自然林が殆ど無くなっている。地域毎に経済水準と森林減少の関連を調べたが、ほとんど関係が見られなかった(永田)。こうした状況の中でアグロフォレストリーを技術的根拠とした社会林業政策が政府や民間企業によって行われている(餅田)。要点としては林野所有形態、市場、金融が挙げられる(加藤)。請負再造林政策では農業との労働時間、あるいは土地の競合が問題として挙げられる(葉山)。そのほか地元住民のための様々な開発政策が持続的な開発のために立てられ、森林生態系の回復が図られている(Tomboc)。また、農業開発などにより、タイでも森林面積は急速に減少したが、経済成長に伴い木材需要が増大し、木材価格が上昇してきた。また土地の所有権を農民に与える政策とあいまって、また政府からの補助もあり、樹木植栽が進んできている(熊崎)。こうした背景の中で分収造林も進んできており、長期的な土地なし農民への分収、中長期の金融の必要性が指摘される(Makarabhirom)。インドネシアではまだ森林が残されているが、おそらく1000年以上も環境と共存してきた移動耕作が変質し、森林減少がまさに進行している状況である(井上)。木材以外の林産特産物、たとえばラタン(増田)や黒檀(Wijayanto)などの生産も行われており、森林との共存が図られている。われわれはこうした森林の変化、特にインドネシアに在っては、森林の減少の測定(粟屋)を、タイに在っては樹木植栽面積の測定(露木)を、それぞれランドサットTMデータを用いてリモートセンシングの手法で測定し、現地調査(ランドトゥル-ス)を行った。こうした研究によって、「低位所得国」では森林が残されているものの、正に森林減少が進行している。また「中位所得国」では、森林が「底を打って」いることが確認された。しかしながら、どのように森林増加に結び付くかは、各々の国で異なっている。経済成長国では木材価格の上昇が要点であり、経済停滞国では様々な政策によりそれを実現しようと努力している。また森林が残されている国でも森林資源の充実のための政策が取られている。いづれにせよ現地住民の土地所有権を認めるような林野所有の形態が、森林資源造成に鍵になっていると言えよう。フィリピン:今年度は、首都マニラにて林政関係の資料を収集し、セブ島の社会林業プロジェクト、ミンダナオ島ビスリにおける民間会社(PICOP)の事業地、同じくミンダナオ島ディゴスにてBaptist Rural Life Centerが実施している社会林業プロジェクト、等の予備調査を実施した。
コーパス言語学的手法に基づくディケンズの文体研究のためのデータベース構築と応用

本研究計画はDickensの小説全作品を電子コーパス化し、語彙や構文の出現パターンをコンピュータ解析することによって、Dickensの英語を計量的な視点から記述しようという試みである。計画二年目の平成11年度は、前半では、平成10年度に引き続き言語データの電子化法の理論的検討と実験を相補的な形でとりおこなうことによって研究基盤の確立をはかり、後半では、出来上がった電子コーパスを基に文体統計論的分析を行うことでDickensの英語におけるおける語彙の生起パターンと文体変異の相互関係を考察した。研究実績の主な点は次の通り:1.語彙品詞標識マークアップ(組み込み)法の理論的検討および実践。最近のコーパス言語学の成果、とりわけマークアップに関する研究を比較検討し、文体研究に最適化した形でマークアップを応用する方法を研究した。電子テキストを元に、様々なタイプのテキストマークアップの試行とテキスト分析の実験を繰り返し、英語散文のテキスト処理に有用なマークアップ方法の開発を試みた。その結果、品詞標識に関してはPenn-Treebank方式に準じた形式を採用し、自動品詞標識付与プログラム(UNIXサーバ上で稼動)に学習させることで、自動認識率を96%以上にまで高めることが可能になった。本研究計画で作成したコーパスはいずれもPenn-Treebank準拠の品詞標識が埋め込まれている。2.コーパスデータの文体統計学的分析。編纂したコーパスから得られたデータを基に、さまざまな語彙項目や構文間の相互関係、テキスト間の相互関係、そして語彙や構文とテキストとの相互関係を分析した。その結果、Dickensの小説の言語における語彙の出現パターンは、i)経年的に変化しているということ、ii)言語使用域ごとに一貫したパターンが見受けられるということ、iii)作品の冒頭部における変異が最も大きく、作品の巻・章が進行するにつれて、変異が小さくなると言う傾向が見られた。これらのうち最も興味深い現象としてi)の経年変化を挙げることができる。Dickensの文体は前期の作品において典型的に認められるより文語的、形式的、複雑な構造を持ったものから、後期の作品に特徴的な相対的に口語的、並列的、文脈依存な傾向を深めた文体へと移り変わっていることを本研究は明らかにした。本研究計画はDickensの小識を電子コーパス化し,語彙や構文の出現パターンをコンピュータ解析することによって,Dickensの英語の特質を計量的な視点から記述しようと試みるものである。データの応用・分析に当たっては,コーパス言語学的手法を適用することによって,Dickensの英語における口語脈の発達や言語使用域における文体変異の相を説得力の高い客観的な形で提示することを目指している。計画一年目の平成10年度は研究基盤を確立するために,以下の仕事を遂行した.l.光学式文字読み取り(Optical Character Reader)装置を用いたDickensの作品の入力および校正作業.様々な版のテキストをもとにOCRによる入力を実施した結果,現時点で最高水準のOCR装置を用いても,読み取りの際に約2%の確率で誤認識・欠落等のエラーが生じることが判明した。そのため入力したテキストと原本とを注意深く照合し,入念な校正を行うことが必要となった。2.電子テキストの第一次編集・加工作業。単にテキストを電子化しただけのものでは,精密な解析が困難であるため,行末のハイフネーション修正,引用符の統一化,綴り字の統一化などを行い,コンピュータによるテキスト処理の際に直面しうる問題に予め対処した。3.語彙品詞鵬識マークアップ(組み込み)法の理論的検討および実践。最近のコーパス言語学の成果,とりわけマークアップに関する研究を比較検討し,文体研究に最適化した形でマークアップを応用する方法を研究している。これまでのところ,一作品当たり約2万語のサンプルテキストを元に,様々なタイプのテキストマークアップの試行とテキスト分析の実験を繰り返し,英語散文のテキスト処理に有用なマークアップ方法の開発を試みている(平成11年度も継続して行う予定)。

その結果、Dickensの小説の言語における語彙の出現パターンは、i)経年的に変化しているということ、ii)言語使用域ごとに一貫したパターンが見受けられるということ、iii)作品の冒頭部における変異が最も大きく、作品の巻・章が進行するにつれて、変異が小さくなると言う傾向が見られた。これらのうち最も興味深い現象としてi)の経年変化を挙げることができる。Dickensの文体は前期の作品において典型的に認められるより文語的、形式的、複雑な構造を持ったものから、後期の作品に特徴的な相対的に口語的、並列的、文脈依存な傾向を深めた文体へと移り変わっていることを本研究は明らかにした。
視聴覚コミュニケーションの社会的機能と進化：歌鳥を用いた比較認知アプローチ

鳴禽類の中でもカエデチョウ科は,歌・ダンス・装飾的羽装,という複数の性淘汰形質を持っている.本研究では特に歌とダンスに主な焦点をあて,なぜ複数シグナルが進化し機能しているか検討した.カエデチョウ科の鳥達は,複数の要素にまたがるシグナル(ダンス・歌・嘴音)をうまく協調させて同時に求愛ディスプレイ中に表出していることが分かった.のみならず,発達のごく早い時期からダンスの「練習」様の行動がみられるのは,ダンスと歌の協調を発達させるためである可能性がある.しかし,歌とダンスの協調した表出がみられるにもかかわらず,系統進化史的には両行動は独立に進化しており,メカニズムと機能面も独立であることもわかった.鳴禽類の中でもカエデチョウ科は,歌・ダンス・装飾的羽装,という複数の性淘汰形質を持っている.本研究では特に歌とダンスに主な焦点をあて,なぜ複数シグナルが進化し機能しているか検討した.カエデチョウ科の鳥達は,複数の要素にまたがるシグナル(ダンス・歌・嘴音)をうまく協調させて同時に求愛ディスプレイ中に表出していることが分かった.のみならず,発達のごく早い時期からダンスの「練習」様の行動がみられるのは,ダンスと歌の協調を発達させるためである可能性がある.しかし,歌とダンスの協調した表出がみられるにもかかわらず,系統進化史的には両行動は独立に進化しており,メカニズムと機能面も独立であることもわかった.鳥類や霊長類の高度な社会性は,複雑なコミュニケーションによって担われている.特にヒトや歌鳥においては,発声学習能力によって多様な情報が音信号にコードされる一方で,身体の動きや色・形といった視覚信号も情報伝達に大きく寄与している.本研究では,ブンチョウやジュウシマツのような歌鳥をモデルに用い,雌雄間・つがい間・親子間で交わされるコミュニケーション行動の機能と個体発達を包括的に検討することで,社会性がもたらすコミュニケーション行動の意義を明らかにしようとしている.研究初年度である本年度は,特にブンチョウの求愛ディスプレイ行動の発達に間して,視聴覚形質の両面から検討を行った.ブンチョウの近縁種であるジュウシマツやキンカチョウでは,歌学習がよく研究されており,子は父親から発声を学ぶことが分かっている.ブンチョウではこれらの鳥種とほぼ同様に,社会要因が学習先選択の鍵となっていることが明らかになった.また,ジュウシマツやキンカチョウでは歌学習がよく研究されているにも関わらず歌と同期して表出される求愛ダンスの発達はほとんど研究がなされていない.今回ブンチョウに関して明らかになったのは,繁殖年齢に満たない歌学習期の幼鳥が求愛ダンスを表出する,ということである.このことは,発声のみならず身体運動を介したコミュニケーション行動にも発達要因が大きく寄与している可能性を示唆している.以上の知見に関しては,いずれもサンプル数を加えつつ,定量的解析を今後も継続して行い以降の研究につなげる予定である.鳥類や霊長類の高度な社会におけるコミュニケーションは,音声信号にコードされる一方で,身体の動きや色・形といった視覚信号も情報伝達に大きく寄与している,本研究では,歌鳥をモデルに用い,雌雄間・つがい間・親子間で交わされるコミュニケーション行動の機能と個体発達を包括的に検討することで,社会性がもたらすコミュニケーション行動の意義を明らかにしようとしている.昨年度までの知見に基づき,本年度着目したのは,複数の(モダリティにまたがる)信号の相補性および学習性とその機能である.昨年度までの研究により,研究対象のブンチョウは,オスの求愛歌中において発声(さえずり)と非発声音(嘴音)を組み合わせて表出するという珍しい現象に関して,予備的知見を得ていた.そこで本年度は,発声学習由来であるさえずりと嘴音とが,どのように統合され「リズム」を形成しているか,定型的パターンはみられるのか,またさえずり学習で確認されるような父子間での行動の類似性は見られるのかといった見地から検討をおこなった.得られた結果からは,嘴音の表出がさえずりと比べてランダムではあるものの,ある程度のパターンを持って発音されており,さらにこのパターンが学習性である可能性が示唆された.

このことは,歌鳥において重視されがちな声だけでなく,それ以外の身体運動によって表出されるシグナルも,コミュニケーションにおける意味のある不可分な要素を担っていることを意味する.またこのような鳥種別に得られている知見とあわせ,求愛にともなうダンス(ディスプレイ行動)が,なぜ,どのような生態要因下において進化したのか,網羅的な系統種間比較研究にも着手しており,歌・ダンス・羽装の二型という視聴覚にまたがるシグナルがどう関わって,あるいはどう独立に,進化したのかについても,成果を得つつある.ヒトを含む脊椎動物のコミュニケーションは多くの場合,視聴覚シグナルの複合的行動として表出される.本研究で対象とする鳥類(鳴禽類)においては,これまで発声行動がもっぱら着目されてきたものの,音声と身体動作との複合シグナルが雌雄間コミュニケーションに重要な役割を果たしている.このため,複数モダリティを介した情報伝達行動の進化を考える上で,このような視覚シグナルをも含む複雑なコミュニケーション行動に着目することは有用である.本研究では,その中でも求愛ディスプレイ行動の機能と特徴に焦点をあて,性淘汰の見地から社会行動の進化を明らかにすることを目指している.本年度は特に,従来鳴禽類においてよく研究されてきた発声行動だけでなく,声を介さない発音(mechanical sound / non-vocal sound production)にも焦点をあてて研究をおこなった.鳴禽類のような発声学習種は,学習を通じて多様な音を獲得・表出できるため,声を通じたコミュニケーションが顕著に発達しているとされている.他方,亜鳴禽のような発声非学習種は,発声の多様性は限定的であるため,マイコドリのように,羽など他の発音器官を進化させ,求愛ディスプレイ中の発音に用いる例がある.ところが,カエデチョウ科の一部の種では,鳴禽類でありながら,多様な発声に加えて音を出すためにディスプレイ中に特定の身体行動(足・嘴)を交えることが確認できた.そのため,このような発音行動の規則性,発達学習性について,これまでの発声行動の知見と対比して検証を行った.得られた知見はいまだほう芽的であるが,いずれもサンプル数を加えつつ,定量的解析を今後も継続して行い,今後の研究につなげる予定である.近年の新進の研究がマルチモダリティコミュニケーションの重要性を示唆しているように,ヒトや鳥類のコミュニケーション行動は多くの場合,音声のみによるのではなく,身体運動や色・形のような形態形質といった視覚信号と合わさって複合的に機能している.中でも鳴禽類(歌鳥)の歌は,ヒトの発声コミュニケーションのモデルとして,これまで神経科学・行動学の両面から広く研究されてきた.昨年までの研究により,鳴禽類の中でもカエデチョウ科に属する鳥種は,マルチモダリティコミュニケーションを考える上で興味深い特徴を呈することが明らかになった.カエデチョウ科の鳥は,雌雄が相対して求愛する際に,歌をさえずるだけでなく,同期して儀礼的なダンスを呈する.中には,ダンスの身体運動によって音を発する種や,ダンスによって装飾羽装を際立たせる鳥種もある.また,歌・ダンス・羽装いずれの形質も,鳥種によっては雌雄ともに持つことが知られている.古典的な性淘汰の考えによれば,華やかで複雑な求愛行動は,レック種のような強い性淘汰圧下で雄にのみ進化したと予測されるが,一夫一妻のカエデチョウ科の例はこれと対照的である.そこで本年度は,カエデチョウ科鳥類のマルチモダリティにまたがる求愛シグナルがなぜいかに進化したか,系統種間比較によって検討をおこなった.この結果,ダンス・羽装ともに雌雄間で共進化がみられるものの,歌・ダンス・羽装という異なるモダリティにまたがるシグナルは,おそらく独立に進化してきていることが分かった.特に,ダンスと歌が,同期して表出されるにもかかわらず,独立して進化したというの驚くべき結果である.おそらくマルチモダリティを介する複雑なシグナルは,配偶者選択,つがい間でのきずなの形成,つがい外他個体への信号,といったそれぞれ異なる文脈で機能している可能性がある.26年度が最終年度であるため、記入しない。動物行動26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画と実施順序が前後している実験項目はあるものの,全体としてみれば進行状況に問題はない.
酸化LDLを認識する新規GPCRのリガンド同定とその動脈硬化進展における役割

我々は、オーファンGPCRのリガンド同定を進める過程で酸化リン脂質に反応性を示す新規GPCRを同定した。本研究では、このGPCRのリガンド特異性を含めた生化学的な性状を解析するとともに、機能解析、特に、動脈硬化における機能を探索する。酸化LDLは動脈硬化の発症・進展を支配する重要な因子であり、培養細胞レベルで様々の細胞応答を引き起こす。我々は、最近Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の1つ(GPRX)が酸化LDLに応答することを見出した。GPRXは当研究室で独自に確立したGPCRシグナル検出系を用いて約120種類のGPCRのスクリーニングから同定されたものである。本研究では、MRG Zが動脈硬化巣の発症・進展に関与するかを検討するとともに、動脈硬化のバイオマーカーとしてのMRG Zリガンドの同定を目指している。研究初年度にあたる本年度はGPRXのリガンド同定とトランスジェニック(TG)マウスの作成を行った。(1)GPRXリガンドの同定酸化LDLのどの画分に反応成分があるかを液液分配により検討したところ、GPRXは酸化リン脂質画分に強く反応することがわかった。逆相液体クロマトグラフィーによるさらなる反応分画の精製を試みたが、反応成分の同定には至らなかった。そこで、約20種類のリン脂質を酸化させ、GPRXの反応性の変化を検討したところ、ある特殊な脂肪酸鎖を持つリン脂質(Lipid Y)により強く活性化されることがわかった。この酸化混合物を逆相クロマトグラフィーで分画したところ、脂肪酸鎖の酸化が進んだタイプの酸化Lipid Yが反応成分であることがわかった。(2)GPRXのTGマウスの作成Creマウスとの交配により、GPRXを発現するTGマウスを作成した。得られたTGマウスのうち、発現量の異なる3系統について生殖系列へ受け継がれることを確認した。現在、種々のCreマウスと交配を進めている。酸化LDLは動脈硬化の発症・進展を支配する重要な因子である。酸化LDLは細胞遊走促進、泡沫化、細胞障害など様々な細胞応答を引き起こす。これらの作用の一部はスカベンジャー受容体によって担われることが示されている。しかし、酸化LDLの示す作用メカニズムの多くは不明なままである。申請者らは、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)が酸化LDLの生理機能に関与するのではないかと考え、申請者らが独自に確立した新規GPCRシグナル検出系(TGFα切断アッセイ)を用いてスクリーニングを行い、約120種類のオーファンGPCRから酸化LDLにより活性化される6PCRを1種類(GPRXと表記)同定した。本年度はGPRXのリガンド探索およびGPRX発現細胞の機能解析を行った。酸化LDLを分画すると脂質抽出画分、その中でも特に酸性脂質画分にGPRXの反応成分が存在することがわかった。しかし酸化LDLの酸性脂質画分に含まれる活性成分の比活性が弱く、それ以上の精製が困難であったため、合成された脂質を酸化することで反応成分の同定を試みた。その結果、高度不飽和脂肪酸を含有するリン脂質を酸化した場合に、GPRXが強く反応することを見出した。この酸化脂質を逆相クロマトグラフィーで分画したところ、複数の画分でGPRXの活性化が検出できた。このGPRX活性化画分に含まれる化合物をマススペクトロメトリーで解析したところ、脂肪酸が酸化されてカルボン酸やアルデヒトになった酸化リン脂質が含まれることがわかった。また、GPRXを培養細胞に発現させ、酸化リン脂質を添加したところ、顕著な増殖抑制効果を見出した。生体中における上記酸化リン脂質の存在量や病態時の変動、GPRXを発現する細胞の機能等については今後の研究課題であるが、本研究により酸化リン脂質とGPRXが酸化ストレスを感知する新規の機構として着目すべきことがわかった。
ヒトセメント質および象牙質中のTIMP-1について

ヒトの歯のEDTA抽出液中に主たるマトリックス金属酵素でわる間質コラゲナーゼ、72-kDaゼラチナーゼ/IV型コラゲナーゼおよびストロムライシン-1に対する阻害活性が存在すること、そして、それら阻害活性は抗TIMP-1モノクロナル抗体の共存で完全に抑制されることを明らかにした。さらに、この阻害活性がTIMPであることを確認する目的で、ヒトの歯のEDTA抽出液を抗TIMP-1モノクロナル抗体アフィニティーカラムで部分精製し、SDS電気泳動とイムノブロッティングを行った。EDTA抽出液は分子量28kDaの免疫反応陽性単一バンドを示し、ヒトリコンビナントTIMP-1と同一の泳動度を示した。ついで、ヒトセメント質および象牙質中におけるTIMP-1の分布をTIMP-1のワンステップサンドイッチ酵素免疫測定法とabrasive micro-sampling法を併用して明らかにした。その結果はセメント質中にTIMP-1が検出できる症例では、その濃度は表層で最も高く、セメント-象牙境に向って減少する傾向を示した。しかし、他の症例ではセメント質中にはTIMP-1はほとんど検出できなかった。これに対し、象牙質中でのTIMP-1濃度そのものには固体差があるものの、その分布は全症例で一貫しており、セメント-象牙境から象牙前質にかけて終始増加する傾向を示した。このようにして測定した象牙質中でのTIMP-1の平均濃度(54.1±18.5pg/mg±SE)はセメント質中のそれ(9.6±6.0pg/mg±SE)に比べ有意(p<0.05)に高いことが明らかとなった。現在、さらに、ヒトの歯におけるTIMP-1の局在を明らかにする目的で、抗TIMP-1モノクロナル抗体を用いた免疫組織化学的検索を行っている。