hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
単クローン抗体を用いた糖転移酵素活性測定法の開発と血清診断への応用

細胞の癌化に伴って糖タンパクや糖脂質の糖鎖構造に変化が生ずる。本研究では糖脂質糖鎖構造に対する単クローン抗体を作製し、これを用いて糖転移酵素活性を測定し、癌細胞の検出および血清診断に応用する目的で実験を進めた。糖転移酵素活性の測定方法として次の3つの方法を検討した。1.固相化した糖脂質あるいは糖タンパクを酵素およびヌクレオチド糖と共に反応させ、生じた生成物をELISAによって測定する。2.液相で糖転移酵素反応を行った後、生成物をマイクロプレートに固相化し、生成物をELISAによって測定する3.液相で酵素反応を行った後、単クローン抗体を結合させたビーズに生成物を結合させ^<125>I-単クローン抗体を用いRIAによって酵素反応生成物の量を測定する。酵素としては牛のミルクのβ-ガラクトース転移酵素、単クローン抗体としてGalβ1-4GlcNACβ-を認識するH-11を用いた。H-11を用いたELISA法およびRIA法によってGalβ1-4GlcNACβを有する分子は0.730pmolの間で測定できることが明らかとなった。上記した2および3の方法で糖タンパクおよび糖脂質をアクセプターとして測定できることが明らかとなった。またこの測定の為の条件を明らかにすることができた。1の方法については他の2つの方法に比較し酵素活性が低く測定された。このことは基質を固相化した為、酵素との反応性が低下している為と思われる。以上の結果はこれまで複雑であった糖転移酵素活性の測定法を容易にすると共に一度に多くのサンプルを処理できる利点をもっている。今後、血清や腹水のサンプルについて測定し癌との相関を明らかにしてゆく予定である。
バクテリア氷核タンパク質と昆虫不凍タンパク質の類似性および相違性の計算科学研究

本研究では、バクテリアが持つ氷核タンパク質と昆虫不凍タンパク質の類似点および相違点を計算科学シミュレーション手法と結晶成長実験により調べた。その結果、類似点として、氷核タンパク質は不凍タンパク質と同様に氷結晶成長速度の異方性を劇的に変化させる性質があることがわかった。相違点として、氷核タンパク質は氷のベーサル面にのみ吸着するが、不凍タンパク質はベーサル面とプリズム面の両方に吸着する。結論として、どちらのタンパク質も氷結合性を持つが、それらの構造は互いに異なると思われる。平成21年度は、氷核バクテリア水溶液からの氷の結晶成長実験研究を実施し、氷の成長形観察および成長速度測定を行った。バクテリア濃度1mg/mlおよび2mg/mlの水溶液を実験に用いた。温度は過冷却度0.051.0°Cの範囲で行った。氷ベーサル面成長速度の測定には、マッハツェンダー干渉計を用いた。本実験研究の結果、氷核バクテリアは氷ベーサル面の成長を強く抑制し、それ以外の面の成長を著しく促進した。すなわち、氷核バクテリアは氷の成長形を極めて薄い円盤もしくは六角樹枝へと変えていく添加物であることがわかった。本研究で発見された氷核バクテリアの氷結晶成長へ及ぼす効果は、氷核タンパク質が氷ベーサル面へ吸着したことを反映したものと考察される。これより、氷核タンパク質は氷ベーサル面の格子構造とマッチする原子配列構造を持つものと考察される。また、昆虫不凍タンパク質の氷表面吸着エネルギー計算研究を実施した。吸着エネルギー計算は、6サイト水分子モデル及びCHARMM力場パラメータを用い、氷ベーサル面に対して実施した。その結果、昆虫ターンパク質のスレオニン残基整列面が氷ベーサル面に吸着した状態が、エネルギー的に最も安定になることがわかった。本研究結果は、昆虫不凍タンパク質が氷ベーサル面に吸着するという実験結果と一致する。また、氷核タンパク質も氷ベーサル面に吸着すると考えられるため、氷核タンパク質と昆虫不凍タンパク質が類似した三次元構造を持つ可能性を示唆している。しかし、氷核バクテリアの実験では昆虫不凍タンパク質の場合のような氷の成長抑制は観察されなかった。以上より、タンパク質構造や氷との相互作用特性は両タンパク質で異なる部分があると考えられる。平成22年度は、昨年度に引き続き氷核バクテリア水溶液からの氷の結晶成長実験を行うことにより、氷核タンパク質(INP)が吸着する結晶面指数および氷成長形態への作用機構の研究を実施した。本研究の結果、INPは氷{0001}ベーサル面へ選択的に吸着する可能性が極めて高く、そのためにベーサル面に垂直な方向の成長が著しく抑制されることがわかった。一方、INPはベーサル面に平行な方向の成長は著しく促進するが、その原因はベーサル面の成長抑制にともなう結晶化熱発生量の減少およびINPによる水分子配列秩序構造化の促進のどちらか(あるいは両方)であることがわかってきた。本研究結果のフェーズフィールドモデル計算による検証も行い、INPの氷結晶成長への影響の理解は深まってきている。また、昨年度実施した昆虫不凍タンパク質(AFP)の氷表面吸着エネルギー計算に引き続き、本年度はAFPが吸着した氷成長界面の分子動力学(MD)シミュレーション研究を実施した。氷{10-10}プリズム面-水界面に対してシミュレーションを実施した結果、AFPのスレオニン配列面が界面の氷側に接触した吸着構造は周辺に氷が成長しても安定なままであることがわかった。以上の研究を実施したことより、氷成長界面へのAFP吸着構造およびそのINPの場合との違いが判明しつつある。さらに、高圧力下での氷の成長形態を調べるMDシミュレーション研究を実施した。その結果、実験と同様にプリズム面を平坦ファセット面として持つ六角板成長形態が自発的に現れた。AFP存在下における氷成長形も同様な六角板形態である。したがって、今回実施したMDシミュレーションの方法は、AFP存在下での成長形態および分子レベル成長制御機構の異方性の解析にも利用できるものと思われる。平成23年度は、氷核タンパク質(INP)の構造上の特徴およびその不凍タンパク質(AFP)との違いを明らかにするための氷結晶成長実験研究及び分子動力学シミュレーション計算研究を実施し、昨年度までに実施した研究の結果も交えて、INPとAFPの構造上の類似性と相違性の総合的な比較・検討を行った。まず、INPを持つ氷核バクテリアXanthomonas CampestrisとType-3 AFP共存下での氷の結晶成長実験研究を実施した。氷核バクテリアのみの場合、ベーサル面のみがファセット化した薄い円盤結晶が現れる。AFPのみの場合、ピラミッド面に囲まれた多面体結晶が現れる。本研究の実験の結果、両方のタンパク質が共存する場合、ベーサル面ファセットとピラミッド面ファセットの両方に囲まれた六角板状の氷結晶成長形が現れることがわかった。

INPとAFPの氷成長形への作用が相殺されることなく両方とも現れることが示されたため、INPの吸着結晶面はAFPの吸着結晶面は互いに異なると考えられる。AFPはピラミッド面のみに選択的に吸着することがわかっている。したがって、INPはベーサル面のみに選択的に吸着したものと考察される。AFPが氷結晶面へ安定吸着する場合、その氷への接触部分は吸着面構造とよくマッチしている。したがって、同様にしてINPの氷接触部分は氷ベーサル面格子とよくマッチする構造を持っていると考察される。次に、INPと類似したアミノ酸配列構造を持つ昆虫Spruce BudwormAFPの氷界面への安定吸着構造を分子動力学(MD)シミュレーション研究により調べた。その結果、昆虫AFPはベーサル面界面だけではなくプリズム面界面にも安定に吸着することが分子レベルで示された。昆虫AFPの氷接触部分はベーサル面にもプリズム面にも比較的マッチするような構造を持っている。したがって、ベーサル面にのみ選択的に吸着するINPは、たとえアミノ酸配列が類似しているとしても、構造は昆虫AFPとは全く同じではないというのが本研究の結論である。
X線光子相関分光法による１次元・２次元臨界現象の研究

X線光子相関分光により高分子薄膜の表面ダイナミクスを計測し、低次元系である薄膜特有の物性と表面揺らぎの相関について議論した。特に臨界現象と関わりの深い現象であるdewetting挙動との関連を調べるために、dewetting抑制効果があるケイ素を含んだ高分子薄膜の表面ダイナミクスの計測に取り組んだ。表面の揺らぎが大きく抑制されていることを見出し、ケイ素の深さ方向分布データと合わせて議論することで、薄膜の表面物性が大きく変化していることを見出した。本研究は高分子混合系の薄膜のダイナミクスをX線光子相関分光法により測定することで、低次元系での臨界現象の動的ゆらぎの観測を目指すものである。開始当初はダイナミクス測定を容易にするためにマーカー粒子として金微粒子を分散させた薄膜を用いることを試みたが、実際に高分子中に金微粒子を分散させて薄膜化し熱処理したところ、基板への偏析や凝集の傾向が観測されたため、本研究ではマーカー粒子として適さないと判断した。そこで、マーカーにもなり得る試料として、電子密度の比較的高いケイ素を含むかご型構造のシルセスキオキサンにより片末端が修飾されたポリスチレン(PS-POSS)を使用し、その薄膜の挙動を調べることを開始した。X線光子相関分光法によるPS-POSS薄膜に対するダイナミクス測定開始直後から、X線の入射角を全反射臨界角よりも小さい0.14°程度に調整することで、薄膜表面近傍での熱ゆらぎに対応する緩和を観測することに成功していた。しかし、微小角入射型のX線光子相関分光測定では試料由来の散漫散乱が基板からの寄生散乱の影響を受け易いことから、緩和の起源が明らかではなかった。そこで、注目すべき散乱領域および試料条件の最適化を進めることで、緩和速度の定量的な評価を進め、さらに薄膜試料の厚みを70-300 nmの幅広い範囲で変化させることにより、ダイナミクスの厚み依存性を調べた。その結果、緩和速度の厚み依存性および散乱ベクトル依存性を詳細に検証することが可能となり、観測された緩和が薄膜の表面張力波に由来することが明らかとなった。特に、ダイナミクスの厚み依存性は系の次元性とも関わる本研究の重要な要素であり、幅広い厚み範囲で定量的な議論が可能になったことは大きな意義を持つ。本研究は、高分子薄膜における表面揺らぎをX線光子相関分光法により測定し、低次元系での揺らぎから高分子薄膜の相挙動ダイナミクスについて議論するものである。過去の研究において、高分子混合系の相挙動によってdewetingが誘起されることが知られており、dewetting現象の理解は、低次元臨界現象の理解においても重要である。本研究では、高分子中への分散によってdewetting抑制効果が報告されている、ケイ素を高密度に含むかご型構造のシルセスキオキサン(POSS)が片末端が修飾されたポリスチレン(PS-POSS)を材料として、表面揺らぎとdewettingの関係を調べた。様々な分子量・厚みのPS薄膜およびPS-POSS薄膜表面の揺らぎをX線光子相関分光法により測定し、比較を行った。分子量の高い系では単体PS薄膜とPS-POSS薄膜の間で差は観測されなかった。これは、高分子量ではPOSSの元素比率が低く、表面揺らぎに与える影響が小さく有意な変化が観測されなかったためと考えられる。一方、POSSの比率が高くなる低分子量では、PS-POSS薄膜表面の揺らぎは単体PS薄膜よりも10倍以上遅い緩和を示した。すなわち、POSS修飾効果によって、表面の揺らぎが抑制されていることが見出された。POSSの表面への偏析によって表面に高粘度層の形成および、表面張力の低下によって表面揺らぎが抑えられていると考えられる。PS-POSS薄膜の他に、低次元臨界現象を高分子鎖の一端が基板に固定化された高分子薄膜系の臨界現象を扱うことで低次元の臨界現象の研究に取り組んでおり、本研究で築いた基盤をもとに低次元臨界現象の研究を発展させる計画である。ソフトマター物理平成25年度は電子密度の比較的高いケイ素を含むかご型構造のシルセスキオキサンにより片末端が修飾されたポリスチレン(PS-POSS)を本研究の材料として採用し、薄膜表面に生じる熱揺らぎを観測し、定量的に議論することに成功した。さらに、本課題のテーマである次元性を議論する上で重要なパラメータであるダイナミクスの薄膜厚み依存性についても、70-300nmの広い範囲で合理的なデータが得られており、今後、系統的に選択されアt試料に対して25年度に進めてきた実験手法を適用することで本研究課題の目的が達成できると考える。以上の理由から、本研究が順調に進展していると判断する。実験手法については、25年度に進めてきた手法を継続することで低次元系のダイナミクス測定は可能である。

本年度は、試料の最適化を進めることで臨界現象に関する議論を深める計画である。本研究のテーマである臨界ダイナミクスを観測し、議論を進めるためには、薄膜系において臨界現象の発現が明らかな系を対象として進めることが有力な解決手段であると考える。そこで26年度は、既に薄膜系での臨界現象の発現が明らかとなっている有機溶媒中の高分子ブラシ薄膜の相分離系を扱うことを検討する。試料周辺のセルを新たに作製し、溶媒中での様々な温度条件下で測定を行うことで、低次元系の臨界現象について議論を深め、研究をまとめる。研究開始当初、金粒子の購入のために相当額の物品費が必要と考えていたが、金粒子の使用は予備実験でしようしたのみで、本測定では試料としてPS-POSSを使用したことで、その差額が生じたこと、また真空恒温槽等の設備備品についても既存の装置で対応したことで、当初予算よりも少ない支出で研究が進んだために、差額が発生した。次年度は、試料を系統的に変化させての測定が中心となるため、種々の試薬の購入が必要であり、物品費の大半を占める予定である。旅費については、成果発表のための2回程度の国内学会、1回程度の国際学会参加を予定している。
自己組織化膜表面での電子伝達蛋白質の挙動の直接測定

本年度は主に次の2点について重点的に実験を行った。(1)水溶液中での修飾電極の観察(2)電極表面に吸着した蛋白質の観察(1)について、有機分子で修飾した金属電極ないしは金属基板の液中観察は非常に例が少ない。この半年程度の間にドイツのグループから数編の論文が発表された程度である。それも、彼らの場合は疎水的な有機分子表面を有機溶媒中で観察している。本研究では蛋白質の吸着を目的としているため、メルカプトピリジンなどの親水的な分子を用い、また水溶液中での観察を試みた。その結果、水溶液中での電極表面の構造は大気中で観察した場合と全く異なることが判明した。これは分子が親水的であることに起因しているのではないかと考えられる。(2)について、ヘモグロビン、チトクロムcの2種類の蛋白質分子を修飾電極表面に吸着させてSPM観察した。ヘモグロビンについては水溶液中での観察に成功した。チトクロムcについては乾燥させた試料を大気中で観察して、吸着した蛋白質分子の分布を貸しかすることができた。また水溶液中で観察したが、ヘモグロビンに比べ分子が小さいため、アーチファクト(不純物や修飾電極そのものの凹凸)ときちんと見分けるためには、なお検討が必要である。
職場のオープン化・流動化が個人と組織に及ぼす影響の研究

職場のオープン化・流動化に伴うワークスタイルの変化が個人・組織にどのような影響をもたらすのかを、シミュレーションによるモデル化と実証研究を一貫して行った。その結果、職場のオープン化・流動化が意図せざるコミュニケーションを活性化する条件、意図せざるコミュニケーションの活性化がイノベーションや問題解決の促進につながる条件が明らかとなった。職場のオープン化・流動化に伴うワークスタイルの変化が個人・組織にどのような影響をもたらすのかが本研究の課題である。一般的に、職場のパーティションをなくし、席も自由席化すると、部門やチームの境界を越えて、多様で異質な人どうしの意図せざるコミュニケーションが自然発生的に起こり、問題解決やイノベーションが促進されると考えられているが、この点について実証分析とシミュレーション分析の両面から経営組織論的に検討するのが本研究の目指すところである。平成22年度は、「職場のオープン化・流動化が果たして意図せざるコミュニケーションを活性化」させるかどうかについて、シミュレーション分析に取り組んだ。Axelrod(1997)の文化変容モデルを拡張させ、Agent-based Simulationによる分析を行った。その結果、職場空間が広い場合、エージェントは同じ文化のもの同士で集まり、グループの垣根を越えたコミュニケーションが無くなってしまった。一方、職場空間が適度な場合、エージェントは自由に移動しながら、異なる文化を持つ者と偶然出会いながらコミュニケーションをとっていた。職場空間が狭い場合、コミュニケーションが逆に発生しにくくなっていた。以上の結果は、研究代表者によるベンチャー企業のオフィス移転のケース分析と整合的なものだった。つまり、職場空間のマネジメントの重要性について、その妥当性・一般化可能性が示された。平成23年度は、「職場のオープン化・流動化が果たして意図せざるコミュニケーションを活性化」させるかどうかについて、平成22年度に構築したシミュレーション・モデルの実証研究に取り組んだ。実証研究にあたり、IT業界におけるグローバル企業2社に主にヒアリングと職場観察を実施した。シミュレーション・モデルの1つはAxelrod(1997)の文化変容モデルの拡張モデルで、職場空間の広さが重要な要因となることが示唆された。この点について、対象企業はオフィス移転とともに広くなった空間を適切にマネジメントすることで、コミュニケーションの活性化を引き出していた。このことはシミュレーション結果を十分に支持するものだった。もう一つのモデルはCohen et al.(1972)のゴミ箱モデルの拡張モデルで、オープンで流動的な職場において、個人の仕事活動が断片化されたり、個人が仕事に対して受動的だったりすると、「やり過ごし」が蔓延するということが示唆された。この点について、対象企業では、ワークスタイルの変革も含めて実施することで、上記のような問題にアプローチしていることが明らかとなった。このことはシミュレーション結果を支持するものだった。
動学的応用一般均衡モデルを用いた高温耐性品種米普及による地域経済への評価分析

本研究の目的は、気候変動適応策としての高温耐性品種米による地域経済への影響を動学的応用一般均衡(DCGE)モデルを用いて評価することである。平成30年度は、『農家経営統計調査』の個票データを用いて日本農業の生産性分布に関する分析を行い、併せてDCGEモデルで使用するパラメータを得た。特に、生産性を計測する際には、内生性の問題に考慮した推定方法を用いて生産関数を推定し、その結果から日本農業の全要素生産性(TFP)を計測した。加えて、営農類型別に分布の形状パラメータとバラエティ間の代替の弾力性を推定した。その結果、日本農業の生産者間の異質性を示すパレート分布の形状パラメータ(パレートのk)は2.31で、バラエティ間の代替の弾力性は1.71であることを明らかにした。また、営農類型ごとのパレートkを比較すると、施設野菜や果樹作といった野菜・果樹で相対的に高く、肥育牛や採卵養鶏、ブロイラー養鶏といった畜産関連の営農類型で相対的に低かった。本研究で対象としている水田作は、他の営農類型と比較して中程度であった。バラエティ間の代替の弾力性は、施設野菜作や施設花卉作などの施設園芸が比較的高い値であった一方で、肥育牛や水田作は相対的に低い値であった。さらに、TFPを4つの農業地域(都市的農業地域、平地農業地域、中間農業地域、山間農業地域)ごとに分けて、それらの生産性分布の形状が異なることを明らかにした。これらの結果を、第32回応用地域学会(ARSC)研究発表大会とWestern Regional Science Association (WRSA) 58th AnnualMeetingの2つの学会(うち1つは国際学会)で報告し、それぞれ分析結果やその解釈の妥当性や改善点を中心に討論者や参加者と議論を行い、有益なコメントを得た。現在、それらのコメントを踏まえて分析の改善に取り組んでいる。DCGEモデル内で外生的に設定する必要がある稲作における生産者間のばらつきとともに財の差別化の程度について、個票データを用いて生産性分布の形状パラメータとバラエティ間の代替の弾力性を定量的に明らかにするとともに、次の地域間分析のために生産性分布の形状の比較などの予備分析を進めているためである。今後の研究予定は次のとおりである。まず、平成30年度に行った生産性分布の分析結果をまとめ、各地域を対象にその要因に関する分析を行う。そのうえで、それらの結果をDCGEモデルに導入する予定である。平成28年度は分析に必要なデータ収集とデータベース作成を行った。主な内容は、(1)全国DCGEモデルで使用する社会会計表の基準年の変更、(2)稲作の研究開発関連のデータベース作成、(3)地域間産業連関表の作成の3点である。まず、(1)全国DCGEモデルの既存の社会会計表の基準年の変更では、Akune et al.(2015)で用いた社会会計表の基準年を「産業連関表」と関連データを用いて2011年に変更した。次に、(2)稲作の研究開発関連のデータベース作成では、農業関連の研究開発データを農林水産省「農林水産関係試験研究要覧」、品種別作付面積を農林水産省「米穀の品種別作付状況」と(公社)米穀機構の公表データ等を収集しデータベースを作成した。さらに、(3)地域間産業連関表の作成では、経済産業省「平成17年地域産業連関表」の9地域の基本分類のデータを用いて、農業と食品製造業を中心とした地域間産業連関表を作成した。これらのデータベースは平成29年度以降のモデル推定や評価分析に用いる。具体的には、全国や各地域を対象に研究開発と新品種普及モデルの推定に(2)のデータベースを使用する。これらのうち全国モデルの結果を(1)の社会会計表を用いたDCGEモデルに導入し、稲作での新品種開発を含めた研究開発の経済効果を評価する予定である。(3)の農業と食品製造業を中心とした地域間産業連関表は、特定の地域の異常気象による農業被害の地域間の影響といった国内の地域間のフードシステムの脆弱性を評価するのに用いる。研究開発と新品種普及モデルの推定が、必要なデータベース作成に想定以上の時間を要したため遅れている。これは、当初、稲作の品種別作付面積のデータ収集で使用を予定していた電子データベースが利用不可になり、紙媒体も含めて収集しなおし、データベース作成を行ったためである。平成29年度は、分析に必要なデータ収集を前年度に引き続き行うとともに、フードシステムを通じた異常気象による食料供給の影響についてシミュレーション分析を行った。データ収集については、農林水産省「農林水産関係試験研究要覧」から農業関連の公的試験場の地理情報を含む研究開発のデータを収集しデータベースを作成した。また、CGEモデルで用いる農業部門の生産性の分布形状を明らかにするために、別途データを入手し生産関数の推定とそこから導き出される生産性分布の推定に着手した。当初の研究内容に追加した地域間のフードシステムの脆弱性の評価分析の成果を公表したこと、さらに、生産性分布の推定に必要な個票データを入手し分析に着手したためである。

本研究の目的は、気候変動適応策としての高温耐性品種米による地域経済への影響を動学的応用一般均衡(DCGE)モデルを用いて評価することである。平成30年度は、『農家経営統計調査』の個票データを用いて日本農業の生産性分布に関する分析を行い、併せてDCGEモデルで使用するパラメータを得た。特に、生産性を計測する際には、内生性の問題に考慮した推定方法を用いて生産関数を推定し、その結果から日本農業の全要素生産性(TFP)を計測した。加えて、営農類型別に分布の形状パラメータとバラエティ間の代替の弾力性を推定した。その結果、日本農業の生産者間の異質性を示すパレート分布の形状パラメータ(パレートのk)は2.31で、バラエティ間の代替の弾力性は1.71であることを明らかにした。また、営農類型ごとのパレートkを比較すると、施設野菜や果樹作といった野菜・果樹で相対的に高く、肥育牛や採卵養鶏、ブロイラー養鶏といった畜産関連の営農類型で相対的に低かった。本研究で対象としている水田作は、他の営農類型と比較して中程度であった。バラエティ間の代替の弾力性は、施設野菜作や施設花卉作などの施設園芸が比較的高い値であった一方で、肥育牛や水田作は相対的に低い値であった。さらに、TFPを4つの農業地域(都市的農業地域、平地農業地域、中間農業地域、山間農業地域)ごとに分けて、それらの生産性分布の形状が異なることを明らかにした。これらの結果を、第32回応用地域学会(ARSC)研究発表大会とWestern Regional Science Association (WRSA) 58th AnnualMeetingの2つの学会(うち1つは国際学会)で報告し、それぞれ分析結果やその解釈の妥当性や改善点を中心に討論者や参加者と議論を行い、有益なコメントを得た。現在、それらのコメントを踏まえて分析の改善に取り組んでいる。DCGEモデル内で外生的に設定する必要がある稲作における生産者間のばらつきとともに財の差別化の程度について、個票データを用いて生産性分布の形状パラメータとバラエティ間の代替の弾力性を定量的に明らかにするとともに、次の地域間分析のために生産性分布の形状の比較などの予備分析を進めているためである。平成29年度以降の研究予定は次のとおりである。まず、研究開発と新品種普及モデルについて全国や各地域を対象に推定を行う。これらのうち全国モデルの結果をDCGEモデルに導入し、稲作での新品種開発を含めた研究開発の経済効果を定量化する予定である。また、特定の地域の異常気象による農業被害の地域間での影響といった現在の国内の地域間のフードシステムの脆弱性を評価する予定である。当初の研究計画との変更点は、現地調査の時期と研究結果の公表の追加である。研究開発と新品種普及モデルの推定のために現地調査を行う予定であったが、データベース作成に予定以上の時間がかかったためモデル推定に遅れが生じている。これに伴い現地調査時期を変更する。また、当初の研究内容に追加した地域間のフードシステムの脆弱性の評価分析の成果の公表を追加する。これらに必要な経費の使用変更申請を平成28年度に行った。今後の研究予定は次のとおりである。まず、農業部門の生産性分布の推定を完了させ、研究開発と新品種普及モデルについて全国や各地域を対象に推定を行う。
近代日本のローカルアーキテクト・更田時蔵の創作活動に関する研究

本研究では、近代日本のローカルアーキテクトである更田時蔵に関する資料をもとに、更田時蔵の創作活動の特徴を解明することで、近代日本における建築家の地域に根ざした創作活動の特徴として以下の点を明らかにした。まず、更田時蔵に関する資料を収集、整理し、268作品の図面資料を中心としたものであることを明らかにした。さらに、更田時蔵の図面資料にみられる設計手法を、同時代の建築家と比較することで、地域の素材を構造材かつ化粧材として積極的に設計に取り込んでいることや地域に根ざした建築形式を基盤として設計していることなどの方法によって、独自の建築表現を展開していたことを明らかにした。本研究では、近代日本のローカルアーキテクト・更田時蔵に関する資料をもとに、更田時蔵の創作活動の特徴を解明することで、近代日本における建築家の地域に根ざした創作活動の一端を明らかにすることを目的としている。この目的を達成するために、まず、更田時蔵に関する資料の概要を把握して(STEP 1)、次に、STEP 1で把握した資料の概要に基づいて更田時蔵の創作活動の特徴を解明し(STEP 2)、最後に、同時代の建築家との比較を通して近代日本のローカルアーキテクトの創作活動の特徴を解明する(STEP 3)といった3つの段階を設定して研究を進めている。平成28年度においては、交付申請書の研究実施計画に記載したように、上述の3つの段階のなかのSTEP 1に重点的に取り組み、以下の2点の成果を挙げた。第一に、更田時蔵に関する資料を収集・整理し、268作品の図面資料、2件の雑誌発表記事資料、1件の機関誌掲載資料、および1件の新聞記事資料があることを明らかにした。なかでも、図面資料に関しては、作品名や用途などの情報をまとめてリストを作成した。さらに、現在入手可能な図面資料、雑誌発表記事資料、機関誌掲載資料、および新聞記事資料については写真撮影を行い、ヴィジュアルデータ化した。第二に、上述の図面資料のリストを基に、更田時蔵の設計活動を検討し、昭和12年18年が、戦時中の厳しい統制下にもかかわらず、栃木県内の広い地域で様々な用途の建築物を数多く設計していた、最も盛んに活動した時期であることを明らかにした。これらの成果の意義や重要性については、文化的価値の高い資料の収集・データベース化を行い、STEP 2における更田時蔵の創作活動の特徴を解明するための基盤を構築した点と、近代日本のローカルアーキテクトを代表する建築家のひとりである更田時蔵の設計活動の概要を学術的に解明した点が挙げられる。研究実績の概要でも述べたように、本研究の目的は、近代日本のローカルアーキテクト・更田時蔵に関する資料をもとに、更田時蔵の創作活動の特徴を解明することで、近代日本における建築家の地域に根ざした創作活動の一端を明らかにすることである。そして、この目的を達成するために、まず、更田時蔵に関する資料の概要を把握して(STEP 1)、次に、STEP 1で把握した資料の概要に基づいて更田時蔵の創作活動の特徴を解明し(STEP 2)、最後に、同時代の建築家との比較を通して近代日本のローカルアーキテクトの創作活動の特徴を解明する(STEP 3)といった3つの段階を設定して研究を進める計画を立てた。平成28年度においては、上述の3つの段階のなかのSTEP 1に重点的に取り組み、次の成果を挙げている。まず、更田時蔵に関する資料を収集・整理し、268作品の図面資料、2件の雑誌発表記事資料、1件の機関誌掲載資料、および1件の新聞記事資料があることを明らかにし、これらのうち現在写真撮影可能な資料はヴィジュアルデータ化して更田時蔵に関する資料のリストを作成した。次に、上述の更田時蔵に関する資料のリストのなかで、図面資料のリストに着目して、それをもとに更田時蔵の設計活動の概要を検討し、昭和12年昭和18年が、戦時中の厳しい統制下にもかかわらず、栃木県内の広い地域で様々な用途の建築物を数多く設計していた、最も盛んに活動した時期であることを明らかにした。このように、平成28年度においては、STEP 2での図面資料を基にした、更田時蔵の設計手法の特徴を解明するための段階に進むための基盤を構築することができた。これは、平成28年度の交付申請書の研究実施計画に記載した通りの進捗であり、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。この目的を達成するために、まず、更田時蔵に関する資料の概要を把握して(STEP 1)、次に、STEP 1で把握した資料の概要に基づいて更田時蔵の創作活動の特徴を解明し(STEP 2)、最後に、同時代の建築家との比較を通して近代日本のローカルアーキテクトの創作活動の特徴を解明する(STEP 3)といった3つの段階を設定して研究を進めてきた。今年度は、まず、STEP2において、STEP1で更田時蔵に関する資料の中心的なものであると位置付けた設計図書を対象として分析し、以下の2つの成果を得た。なお、分析は、更田時蔵が設計に深く関わったと考えられる、設計事務所開設当初の作品の設計図書に限定して実施した。

第一に、設計図書に描画されている図面の種類を意匠図や構造図などに分類し、作品ごとに図面の種類の構成を分析することで、鉄筋コンクリート造の作品において構造図の割合が高く、なかでも部分配筋詳細図の割合が高いことなどを明らかにした。第二に、更田時蔵の設計手法の特徴について、現存する作品の設計図書に特に注目し、現地調査も含めて検討することで、日本や西欧の同時代的な意匠を巧みに取り入れていたこと、機能を根拠とした平面構成と構造の仕組みを一致させて、それを直裁に表現していたことなどを明らかにした。さらに、STEP3において、同時代の建築家の作品との比較から、更田時蔵は、STEP2で明らかにした設計手法を、地域素材を構造材としながら実践する試みをしていたことを明らかにした。こうした成果は、近代日本における建築家の地域に根ざした創作活動の一端を解明した点で重要な意義をもつと考えられる。本研究では、近代日本のローカルアーキテクトである更田時蔵に関する資料をもとに、更田時蔵の創作活動の特徴を解明することで、近代日本における建築家の地域に根ざした創作活動の特徴として以下の点を明らかにした。まず、更田時蔵に関する資料を収集、整理し、268作品の図面資料を中心としたものであることを明らかにした。さらに、更田時蔵の図面資料にみられる設計手法を、同時代の建築家と比較することで、地域の素材を構造材かつ化粧材として積極的に設計に取り込んでいることや地域に根ざした建築形式を基盤として設計していることなどの方法によって、独自の建築表現を展開していたことを明らかにした。研究実績の概要および現在までの進捗状況でも述べたように、本研究では、まず、更田時蔵に関する資料の概要を把握して(STEP 1)、次に、STEP 1で把握した資料の概要に基づいて更田時蔵の創作活動の特徴を解明し(STEP 2)、最後に、同時代の建築家との比較を通して近代日本のローカルアーキテクトの創作活動の特徴を解明する(STEP 3)といった3つの段階を設定して研究を進める計画を立てている。これまでは、STEP 1に重点的に取り組み、成果を挙げてきた。今後はSTEP1で得られた成果をベースにして、STEP2とSTEP3に取り組んでいく予定である。以下に、具体的な推進方策について述べる。これまでに取り組んできたSTEP1において、更田時蔵に関する資料を収集・整理したところ、図面資料が中心であることが分かった。なかでも、設計図書がほとんどであった。そこで、まず、STEP2では、更田時蔵の設計図書を対象に、建築家の創作活動において最も重要なもののひとつである、建築に関する設計手法の特徴を解明することに取り組む予定である。具体的には、更田時蔵の設計図書から、図面の種類の構成、平面計画の特徴、立面の造形的な特徴などを読み取ることを通して、更田時蔵の設計手法の特徴を解明していく。その際には、こうした作業を効率的に進めるために、設計図書のなかから、更田時蔵の設計手法の特徴が良く表れていると考えられる、代表的な作品に限定して分析を行う。そして、STEP3では、STEP2で得られた更田時蔵の創作活動の特徴と、辰野金吾などの同時代に国家形成に携わった代表的な建築家の創作活動を比較することで、近代日本におけるローカルアーキテクトの設計手法の特徴を相対的に明らかにしていく。以上によって、更田時蔵の創作活動の特徴を解明して、近代日本における建築家の地域に根ざした創作活動の一端を明らかにしていく。29年度が最終年度であるため、記入しない。建築史・建築意匠29年度が最終年度であるため、記入しない。
椎間板変性機序の解明に基づく新たな治療戦略の開発研究

過去2年間でわれわれが行ってきた単一塩基多型を用いた全ゲノム相関解析ではアレル出現頻度が10%以下の新たな感受性遺伝子や、過去に発見したCILP、COLL11A1、THBS2などの感受性遺伝子の相互作用は明らかと出来なかった。一方で、酸化ストレスシグナルが椎間板変性やヘルニアの発生に影響を与える可能性が示唆された。そこで、椎間板変性過程における酸化ストレスの関与を検証する目的でWistar系ラット尾椎椎間板穿刺による椎間板変性モデルを作成し、活性酸素種(reactive oxygen species,以下ROS)のマーカーであるNitrotyrosineで免疫染色を行ったところ、穿刺群では非穿刺対照群と比較し有意に陽性細胞数が増加していた。また、椎間板変性に対する高気圧酸素環境(hyperbaric oxygen、以下HBO)の影響を検証する目的で、穿刺群および対照群に1日2時間10日間、小動物用チャンバーでHBO(100%酸素、2.5絶対気圧)を負荷したところ、暫定的ながら組織学的検討で椎間板変性の進行が抑制されるという結果が得られた。採取した椎間板組織からmRNAを抽出し、HBOによる遺伝子発現変化を検討したところ、Type IIコラーゲンやアグリカンなどの細胞外マトリクスタンパク質のmRNAの発現が亢進し、TNFα、COX-2など炎症性サイトカインのmRNAの発現が抑制される傾向にあることを見出した。また、これらのin vivoの実験と並行して、椎間板髄核細胞の生物学的特性を有すると考えられているU-CH1-N細胞を利用して、in vitroの実験系の構築を試みた。昨年度は、U-CH1-N細胞へのリポポリサッカライドの添加、マクロファージ様細胞株との共培養などの実験を施行し、遺伝子発現解析を行った。現在までのところ、まだ十分なin vitroモデルは確立できていないが、今後、実験条件の最適化を行い、椎間板変性に対するHBOの効果を、in vitroモデルを利用してより詳細に検討したいと考えている。1次スクリーニングとして患者群は(1)MRIによる椎間板ヘルニアの診断(2)整形外科医による一年間以上の治療(3)三か月以上持続する背部から放散する片側下肢痛を診断基準として集められた374例、対照群は無症候性健常者940例、解析するSNPは遺伝統計学的手技により全ゲノムを網羅する515286 SNPを選択した。これらのうち実験における信憑性の基準をサンプルに対してはcall rate ≧0.98、SNPに対しては(1) Chr.1-22 (2) call rate ≧0.99 (3)HWE-P ≧10×10 -6と設定した。これらを満たす患者群373例、対照群934例、基準を満たしかつMAF10%未満である145,766 SNPを解析した。各SNPの相関はアレル、優性、劣性の3モデルに対しχ2検定を行い、最も有意なものを検討した。統計学的有意水準はBonferroni補正を用い、P<5×10 -8とした。今回解析を行ったSNPの中で椎間板ヘルニアと最も相関が高かった6 SNPのうちrs1112964、rs12385796、rs3846977、rs7040239の4 SNPは遺伝子領域内あるいは遺伝子近傍に存在した。しかし、3つのモデル全てにおいて有意水準を超える相関を示すSNPは存在しなかった。われわれの今までの遺伝子解析研究から椎間板ヘルニアや椎間板変性との相関が明らかとなったCILP、COL11A1、THBS2、MMP9、SKT、CHST3などの疾患感受性遺伝子はいずれもアレル出現頻度minor allele frequency (MAF)>10%と出現頻度が高いものであったが、今回さらなる疾患感受性遺伝子を同定する目的で、平成28年度の計画に従いMAFが10%以下と比較的出現頻度が低い単一塩基多形SNPまでに解析範囲を拡げて全ゲノム解析を実施した。その結果、椎間板ヘルニアと相関の強い6つの新たなSNPが発見された。一方で残念ながらこれらのうち統計学的有意水準に達するSNPは無かった。通常頻度の低いSNPに対する解析はその結果の不安定性から無条件に除外されることが多い。頻度の低いSNPはその性質上多型の中でもより変異に近い。そのため、その中に疾患に関与しているSNPが存在している可能性は高い。有意なSNPの検出は困難である場合が多いが、今後も研究する価値のある領域であると考える。また、平成28年度中に講座研究室の改装・整備が完了する予定であったが、工事の着工が遅れているため未だに研究室が使用できず、分子生物学的、生化学的手法を用いた各種遺伝子や代謝活性因子の機能解析が未だに開始できていない。椎間板変性やヘルニアの発生と相関するさらなる感受性遺伝子を同定する目的でアレル出現頻度minor allele frequency (MAF)10%以下と比較的発現頻度が低い遺伝子にまで検索範囲を拡げ、単一塩基多型SNP用いた全ゲノム解析を実施した。その結果新たに6つのSNPが発見されたが有意水準を超える相関を示すSNPは存在しなかった。また、今までわれわれが同定したCILP、COL11A1などの疾患感受性遺伝子の相互作用をJoint Effect統計量算出などの統計学的手法によって検証したが、有意な相互作用は見られなかった。

一方、こうした疾患感受性遺伝子の機能解析の結果、酸化ストレスシグナルがCILP,THSP2、MMP9などの発現を介して椎間板変性やヘルニアの発生に影響を与える可能性が示唆された。そこで、椎間板変性過程における酸化ストレスの関与を検証する目的でWistar系ラット尾椎椎間板穿刺による椎間板変性モデルを作成し、活性酸素種(reactive oxygen species,以下ROS)のマーカーであるNitrotyrosineで免疫染色を行ったところ、穿刺群では非穿刺対照群と比較し有意に陽性細胞数が増加していた。また、椎間板変性に対する高気圧酸素環境(hyperbaric oxygen、以下HBO)の影響を検証する目的で、穿刺群および対照群に1日2時間10日間、小動物用チャンバーでHBO(100%酸素、2.5絶対気圧)を負荷したところ、暫定的ながら組織学的検討で椎間板変性の進行が抑制されるという結果が得られた。さらにType IIコラーゲンやアグリカンなどの細胞外マトリクス、TNFα、COX-2など炎症性サイトカインのmRNA発現をリアルタイムPCRで定量解析しているが、現時点でHBO群と非介入群の相違を検出するには至っていない。本研究の目的は、腰椎椎間板ヘルニアをはじめとするさまざまな腰痛疾患発症の基盤となる椎間板変性に対する新しい治療戦略の確立に寄与する知見を集積することであり、具体的な戦略は以下の2つに集約される。1)全ゲノム解析により網羅的に疾患感受性遺伝子を探索し、候補遺伝子群の機能解析を進め、椎間板変性過程におけるその役割を解明する。さらに複数の候補遺伝子の椎間板変性に対する相互作用を検討する。2)発見した遺伝子群によって規定されるタンパク(基質分子、サイトカイン、増殖因子、基質分解酵素、ホルモン、細胞内シグナル)あるいはその関連タンパクの椎間板変性における役割を分析し、椎間板変性機序を解明する。現時点で1)に関しては、われわれが今までのゲノム解析で発見したCILP、COL11A1、THSP2、MMP9、ASP14、CHST3など個々の候補遺伝子の機能解析は進み、椎間板変性過程におけるその役割が徐々に解明されつつあり、椎間板変性機序の解明の一助となる知見が集まりつつある一方で、新たな感受性遺伝子の発見や複数遺伝子の相互作用に関しては充分な成果を得るまでに至っていない。その一因として疾患サンプルが国内1500例、海外を合わせても3000例と少ないことが考えられる。一方、2)に関しては動物実験における組織学的検討では椎間板穿刺操作によって髄核の消失を認め、椎間板変性モデルを安定して作成することが可能となった。さらに、椎間板変性群における免疫組織学的検討で酸化ストレスの関与が明らかとなった。また、予備実験段階ではあるが、高気圧酸素(HBO)負荷によって椎間板変性の進行が抑制されるという結果が得られた。過去2年間でわれわれが行ってきた単一塩基多型を用いた全ゲノム相関解析ではアレル出現頻度が10%以下の新たな感受性遺伝子や、過去に発見したCILP、COLL11A1、THBS2などの感受性遺伝子の相互作用は明らかと出来なかった。一方で、酸化ストレスシグナルが椎間板変性やヘルニアの発生に影響を与える可能性が示唆された。
継続支援を必要とする交通事故被害者を早期発見するための急性期指標の検討

本研究は、交通事故で負傷した人を対象として、事故発生直後に人体傷害の状況等の医療データと、その人が体験した交通事故における車両の衝突速度等の客観指標を収集するとともに、その人に対して質問紙による調査を行い、事故後の間もない時期の心理的苦痛や生活の状況を調査する。事故から1年後に、同じ人を対象に、追跡調査を行い、心理的苦痛や生活の状況を調査し、交通事故を体験した人の縦断的なデータを得ようとするものである。死傷者を伴う交通事故は多数発生しているため、支援を行うべき交通事故被害者を、できるだけ早期に発見するために、事故の内容や負傷の状況などを含めた情報に加えて、事故後の間もない時期の心理的苦痛の情報を収集した上で、交通事故被害者を縦断的に調査するデータが必要である。当該年度までに129件の交通事故を対象とし、そのうちの109件について初回の質問紙のデータを得た。また、これまでに、43件から追跡の質問紙のデータを得た。得られた結果を分析し、周トラウマ期の心理的苦痛、社会的サポート、あるいはレジリエンスといった性格特徴が、精神的苦痛に与える影響を分析した。分析した結果を国内の2学会及び海外の1学会において発表した。調査対象者の確保が当初の想定よりも進まなかったことから、調査を実施できた件数が計画以下に留まっている。引き続き、調査実施地区において新たに発生した交通事故を対象に、医療データ及び交通事故データの収集を行うとともに、初回の質問紙調査を実施する。同時に、当該年度に実施した初回調査の回答者に対し、追跡調査を実施する。収集済みのデータを分析し、研究発表を行う。本研究では、交通事故で重傷を負った人(以下、交通事故重傷者)を対象として、傷害の状況等の医療データ及び衝突速度等の交通事故データを事故直後に収集するとともに、事故から13か月後と、事故から1年後の2回に、精神的苦痛や事故後の生活の様子等に関する調査を行い、継続支援を必要とする交通事故被害者を早期発見するためのデータを4年計画で収集するものである。初年度にあたる本年度は、研究分担者及び研究協力者等と協力し、文献調査等による情報収集を行った上で、医療データ・交通事故データに関する調査項目と収集方法の検討、初回調査(事故から1から3ヶ月後の調査)で使用する交通事故重傷者が回答する調査票の作成を行った。平成27年6月に研究代表者が所属する機関の倫理審査委員会による審査を受けた上で、平成27年9月に調査を委託する機関(一般財団法人交通事故総合分析センター)と契約を結び、茨城県つくば地区において、医療データ・交通事故データの収集及び初回調査に着手した。平成28年3月までに10人分の、医療データ・交通事故データの収集及び初回調査を完了した。これらの対象者については、計画した内容のデータを概ね収集できた。一方で、調査の準備に当初の想定よりも時間を要したことと、調査対象者の確保が当初の想定よりも進まなかったことから、調査を実施できた人数が計画以下に留まっている。交通事故の被害者支援の現場では、多数の死傷者を伴う重大事故が毎年発生している中、必要とする交通事故被害者に必ずしも十分な支援が行き届いていない可能性がある。特に、急性期の症状が顕著でない遅発型と呼ばれる人は、症状が一貫して軽微な軽症型と区別がつきにくく、支援の対象から外れる可能性があるため、急性期から継続的に支援を行うべき交通事故被害者を早期に見極める指標を発見する必要がある。本研究では、交通事故で重傷を負った人を対象として、交通事故の発生直後から1年間にわたって調査を行う。事故の発生直後には、人体傷害の状況等の医療データ及び衝突速度等の交通事故データを収集するとともに、事故後の間もない時期(13ヶ月)と、事故から1年後の2回に、精神的苦痛や事故後の生活の様子等に関する質問紙調査を行う。これらの調査で得たデータを分析し、交通事故被害者の精神的苦痛や社会的適応に影響する要因を縦断的に明らかにした上で、支援に重点を置くべき交通事故被害者を早期に発見するための指標を特定する。本研究に必要なデータは、人体傷害の状況や衝突速度等の専門的な解析が必要であることと、事故直後からの継続した追跡が必要であることから、交通事故調査の専門機関(一般財団法人交通事故総合分析センター)に調査を委託し、それぞれの事故についての詳細なデータを4年計画で収集する。4年計画の2年目にあたる当該年度は、前年度に引き続き、茨城県つくば地区において、医療データ及び交通事故データの収集と、質問紙調査を行った。平成29年3月までに50ケースの交通事故を調査の対象とし、うち36件から初回の質問紙調査のデータを、10件から追跡の質問紙調査のデータを得た。一方で、調査の準備に当初の想定よりも時間を要したことと、調査対象者の確保が当初の想定よりも進まなかったことから、調査を実施できた件数が計画以下に留まっている。

死傷者を伴う交通事故は多数発生しているため、支援を行うべき交通事故被害者を、できるだけ早期に発見するために、事故の内容や負傷の状況などを含めた情報に加えて、事故後の間もない時期の心理的苦痛の情報を収集した上で、交通事故被害者を縦断的に調査するデータが必要である。平成30年3月までに82件の交通事故を対象とし、そのうちの60ケースについて医療データと交通事故データの収集するとともに、初回の質問紙の調査を終えた。また、これまでに、32件から追跡の質問紙のデータを得た。得られた結果を分析し、周トラウマ期の心理的苦痛、社会的サポート、あるいはレジリエンスといった性格特徴が、精神的苦痛に与える影響を分析した。調査対象者の確保が当初の想定よりも進まなかったことから、調査を実施できた件数が計画以下に留まっている。本研究は、交通事故で負傷した人を対象として、事故発生直後に人体傷害の状況等の医療データと、その人が体験した交通事故における車両の衝突速度等の客観指標を収集するとともに、その人に対して質問紙による調査を行い、事故後の間もない時期の心理的苦痛や生活の状況を調査する。事故から1年後に、同じ人を対象に、追跡調査を行い、心理的苦痛や生活の状況を調査し、交通事故を体験した人の縦断的なデータを得ようとするものである。当該年度までに129件の交通事故を対象とし、そのうちの109件について初回の質問紙のデータを得た。また、これまでに、43件から追跡の質問紙のデータを得た。分析した結果を国内の2学会及び海外の1学会において発表した。平成28年度においては、引き続き、医療データ・交通事故データの収集及び初回調査を継続する。平成28年度においては、交通事故発生後の約1年後に実施する追跡調査に着手する必要があることから、研究分担者及び研究協力者等と協力し、追跡調査で用いる調査票を作成し、追跡調査に着手する。また、文献調査を継続するとともに、収集済の初回調査のデータに関して予備的な分析を行う。次年度においては、引き続き、新たに発生した交通事故を対象に医療データ及び衝突速度等の交通事故データの収集と、初回の質問紙調査を継続するとともに、平成28年度までに実施した初回調査の回答者に対し追跡調査を行う。また、収集済の調査のデータに関して予備的な分析を行う。引き続き、調査実施地区において新たに発生した交通事故を対象に、医療データ及び交通事故データの収集を行うとともに、初回の質問紙調査を実施する。平成29年度に実施した初回調査の回答者に対し追跡調査を実施する。収集済みのデータを分析し、研究発表を行う。同時に、当該年度に実施した初回調査の回答者に対し、追跡調査を実施する。
核内低分子RNAによる遺伝子発現の多様性獲得機構の解明

哺乳類の細胞核内に存在する機能不明のオーファン(o-)snoRNAの機能を明らかにするために、化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた核内RNAのノックダウン法を至適化し、多数のo-snoRNAの機能破壊に成功した。RNAポリメラーゼIレポーター遺伝子を用いて、o-snoRNAがRNAメチル化能を持ち、上記ノックダウンによってその活性が消失する事を証明した。o-snoRNAのノックダウンによる遺伝子発現変化をRNA-seqによって解析し、変動する標的候補を複数発見した。核内構造体Cajal体を細胞分画によって精製し、そこに含まれるRNA種をRNA-seq解析で同定し、新しいRNA種を発見した。これまでに実用化しつつあった哺乳類培養細胞における化学修飾を施したアンチセンス・キメラオリゴヌクレオチドによる細胞核内RNAノックダウン法の至適化を行った。さらにこの方法を用いたヒトオーファンsnoRNA(boxC/D型、boxH/ACA型)の特異的なノックダウンを試み、新たに20種類のオーファンsnoRNAの効率良いノックダウンに成功した。単一配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドによるアーティファクトの可能性を除外するために、2種類のオリゴヌクレオチドによるノックダウンを行いU97 snoRNAとHBII295 snoRNAについて成功した。オーファンsnoRNAがmRNAを標的とすることが実際に細胞内で可能かどうかを人工的なレポーター遺伝子の3'UTRやイントロンブランチ部位領域にオーファンsnoRNAの標的配列を組み込んだ発現プラスミドを構築し、オーファンsnoRNAがレポーター遺伝子の発現に影響を及ぼすかどうかを検討したが、人工遺伝子の系では発現変動は見られなかった。このことはオーファンsnoRNAがmRNAを標的にするためには、mRNA側にもsnoRNAと会合するための何らかの特殊なメカニズムを利用している可能性がある。その可能性としてRNAの細胞内局在場所が重要な役割を果たしている可能性が浮上した。そこでオーファンsnoRNAを細胞分画とRNA-FISHによって細胞内局在を検討したところ通常のsnoRNAと同様に核小体に特異的に局在していることが明らかになった。このことから標的となるRNA分子も核小体に局在している可能性が高いことが推測され、人工的に構築したレポーター遺伝子では核小体に局在できなかった可能性が高いことが明らかになった。前年度に至適化した哺乳類培養細胞における核内RNAノックダウン法について、20種類以上のオーファンnoRNAを実施し、さらにRNAポリメラーゼIのレポーター遺伝子を用いて、オーファンsnoRNAに部位特異的な2'-0-メチル化活性があることを証明し、ノックダウンによってその活性が失われることを証明した。これによって、この方法がオーファンsnoRNAの機能解析法として有用であることをRNA誌に論文発表した。本方法は、その後国内外の複数の研究室で有効な方法として利用されている。オーファンsnoRNAの中で、複数の配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドでノックダウンできるHBII295とU97を選別して、独立に2種類のノックダウン細胞を調整し、その細胞由来のRNAとコントロール細胞由来のRNAを用いて、次世代シーケンサー(イルミナGA2)によるRNA seqを実施した。産総研CBRCの光山グループとの共同研究によって、各リードをヒトゲノム上にマップし、各オーファンsnoRNAでリード数が増減しているものを選別し、そのリストを作製した。現在その中から実際に発現変動しているものをRT-PCRによって検証している。核内Cajal体を細胞分画によって精製し、そこに局在するRNA種の解析を次世代シーケンサーを用いて行った。その結果、複数のsnoRNAホスト遺伝子の前駆体RNA断片が濃縮していることを見出した。この事はsnoRNA生合成がCajal体に局在して、これまで明らかでなかった前駆体RNAの合成を伴って行われていることを示唆している。ヒトに存在する標的が未同定なオーファンsnoRNAの機能解明を目指して引き続き解析を行った。前年度までに20種類以上のヒトのBoxC/D及びBoxH/ACAオーファンsnoRNAを、実施者が考案したアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)によるノックダウン方法によって機能破壊する実験を行った。その中から、オーファンsnoRNA中の複数の配列を標的としたASOでノックダウンできるHBII295とU97を選別した。HeLa細胞を用いて、新たに2種類のオーファンsnoRNAのノックダウンした細胞を調整した。その細胞由来のトータルRNAとコントロール細胞由来のトータルRNAを用いて、次世代シーケンサーによるRNA-segを実施し、ノックダウン細胞で特異的に発現変化している遺伝子の同定を試みた。産総研CBRCグループとの共同研究によって、各リードをヒトゲノム上にマップし、様々な条件によって絞り込まれた発現変動遺伝子のリストを作製した。次に得られた候補をリアルタイムPCRによって確認する作業を行った。