hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
潜在看護師復職教育プログラムの構築

本研究の目的は潜在看護師の復職教育プログラムを構築することである。調査(1)(3)の結果から、復職研修は潜在看護師同士の交流を持てるようなプログラムとし、救命救急処置や安全の技術、観察とアセスメント能力を養えるような内容を扱うことが必要であると考えられた。構築した復職研修を評価するために、潜在看護師を対象として一般的な研修受講群(コントロール群)と教育プログラム受講群(実験群)の2群に分け、復職の意欲や自信、不安について比較検討を行ったところ、構築したプログラムの有効性が示唆された。本研究の目的は、潜在看護師が医療現場に復職するための実際的で有効な復職教育プログラムを構築することである。平成22年度は、復職教育プログラム案を作成するための基礎的な資料を得ることを目的として、以下の3つの調査を行った。1.看護師個人を対象とした質問紙郵送調査看護師免許を取得後、就業経験のある看護師(潜在看護師・就業看護師)に対して、属性、就業・潜在・復職の状況、復職教育に関する意見等のデータを収集した。復職教育プログラムの内容にあたる臨床実践能力については「看護基礎教育の充実に関する検討会報告書,看護師教育の技術項目と卒業時の到達度(平成19年)』を参考に、各技術項目に対しての自己評価と潜在看護師に求められるレベル評価それぞれ3段階での評価を得て、潜在期間による群間比較等を行った。潜在期間が長期になると直接生命に関わる技術や安全にかかわる技術項目での自己評価が低下していた。2.病院看護部を対象とした質問紙郵送調査看護管理の立場にある対象者に、潜在看護師受け入れ状況や研修の状況、復職教育に対しての意見等のデータを収集した。臨床実践能力については、看護師個人を対象とした調査と同じ項目を用いて、潜在看護師に求められる技術項目とそのレベルを3段階での評価を得た。また、潜在看護師の復職と新人看護師の入職で異なる点がどこにあるのか、新人看護師に求められる技術項目とそのレベルや、研修日数等についても比較するためにデータ収集を行った。調査結果は現在分析中である。3.復職教育についてのグループインタビュー研究に協力が得られた就業経験のある看護師を、潜在・復職経験の有無を考慮してグルーピングし、復職教育についての意見を聴取し、その内容を分析した。復職研修の内容についてのみならず、潜在看護師・臨床双方から、復職教育プログラムに期待する意見も数多く出された。今まで行ってきた(1)復職教育についてのグループインタビュー調査,(2)看護師個人を対象とした質問紙郵送調査,(3)病院看護部を対象とした質問紙郵送調査の3つの調査から得られた結果をもとに、平成23年度は潜在看護師復職研修の現状と課題について分析を加えた。その結果、(1)看護師は、潜在期間が長期になると直接生命に関わる技術や安全に関わる技術項目で自己評価が低下している。(2)看護管理者が潜在看護師・新人看護師それぞれに求める技術レベルをみると、電子カルテに伴う技術以外の全ての項目で、潜在看護師に求める技術レベルは有意に高く、復職すれば即戦力として現場から期待されていることが伺えた。また潜在看護師の復職研修はほぼ全ての病院看護部が必要と回答していたが、実際に行っていないところもある上、研修日数は最多が1日間と短期間で、扱われる内容も新人看護職員研修に比較して乏しいものであった。(3)グループインタビューでは、復職研修は潜在看護師同士の情報共有など、復職へ向けての知識や技術の再確認だけではない、ピア・エンパワメント機能があることも抽出され、復職研修を受講することで自己効力を高めることが復職につながることが示唆された。これらの3つの調査結果から、病院看護部で現在一般的に実施されている復職研修の課題を明らかにし、専門家複数名の意見を聴取した上で、潜在看護師の復職教育プログラム案を立案した。潜在看護師が復職するための実際的で有効な復職教育プログラムを構築することを目的とし、調査(1.看護師個人を対象とした質問紙郵送調査、2.病院看護部を対象とした質問紙郵送調査、3.復職教育についてのグループインタビュー)の結果から、復職準備教育プログラム(実験群研修)を作成し、一般的な研修受講との比較検討を行った。【研修について】実験群研修は、医療安全・フィジカルアセスメント(救急処置を含む)をテーマとして、受講者同士のピア・グループセッションを取り入れた。コントロール群研修は、一般的な内容である医療安全・感染対策について講義中心の研修とした。【方法】潜在看護師29名を実験群(15名)、コントロール群(14名)の2群に分け、それぞれの研修を実施し、研修前後の質問紙調査、受講後のインタビュー調査を行った。調査内容は、看護実践力の自信や医療事故の不安、復職に向けた意欲、自己効力である。

研修受講前後で実験群とコントロール群のこれらの項目の変化を分析した。インタビュー内容は質的に分析した。【結果】2群で年齢や就業期間、潜在期間、研修前の復職の不安や自信等の全ての項目で差はなかった。それぞれの研修後で不安や自信等では2群間の差はなかったが、意欲の変化量は実験群に高い傾向がみられた。また、研修前後の個人間の変化についてみると、実験群では不安(p<0.05)、意欲(p<0.05)、自信(p<0.01)で差があったが、コントロール群では、自信(p<0.05)だけで差があった。研修の時間や学習の内容と理解、受講メンバーとの交流や研修の楽しさ、今後の研修受講の希望について全て肯定的な評価が得られた。研修1週間後のインタビューでは、復職へ向けて復職先を探す、学習への取り組みを始めたなど行動の変化を生じた人がおり、復職への力を得た、看護が好きだと実感できたなども語られた。当初計画通り、平成22年9月に看護師・潜在看護師へのグループインタビュー、平成22年7月12月に看護師個人を対象とした質問調査、平成22年11月平成23年4月に病院看護部を対象とした質問紙調査を計画通り実施した。平成23年度にはこれらの3つの調査結果からの分析から、現在復職教育プログラム案の立案に至っており、おおむね順調に進展していると考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。作成した復職教育プログラムを潜在看護師に実施し、評価を行う。具体的には、現在行われている内容で復職研修を受講者(コントロール群)と今回立案した教育プログラム受講者(介入群)で、研修受講前後の調査を行い、比較検討する。
大気圧放電によるVOC分解メカニズムの解明

(1)実験システムと実験装置の改良,電極作製コロナ放電の発光を積分する,およびコロナ放電中を通過させるXeランプ光のパスを長くするため,針電極を縦1列に配置させた複数針-平板電極を作製した。(2)分光診断の実施(1)改良した電極で発生させたコロナ放電発生させると、発光が積分され、従来よりもS/N比が向上した発光スペクトルを観測できるようになった。その結果、コロナ放電中の発光種の特定の確度が向上した。(2)TRG-OESによる電子エネルギー算出方法を修得し、水素中の放電に適用した。また、放電チェンバに酸素-窒素ガスと微量の希ガスを封入し,TRG-OESに用いる希ガスの発光スペクトルを測定した。いくつかの発光スペクトルに重複があるため、TRG-OESに使用できる波長の特定を行った。(3)Xeランプ放出光を,光学窓を通して放電チェンバ内を通過させた後,スペクトル強度を測定し、BAS測定を行ったが、S/N比が悪く信号を検出できなかった。次年度の課題としたい。大気圧質量分析(APMS : Atmospheric Pressure Mass Spectrometry)システムを構築するとともに,APMSを用いてVOC分解時の大気圧コロナ放電を診断した。また,その他のプラズマ診断法も併用し,APMS診断の確認を行った。(1) APMSの構築と動作確認φ0.1mmのスキマーとオリフィスを取り付けた2段階差動排気システムを作製し,大気圧下の気体分子を取り込んで質量分析(APMS)を可能とするステムを構築し,動作を確認した。窒素と酸素を80 : 20で混合した模擬空気に微量のアセトンを混合したガスをAPMSで分析した結果,模擬空気に含まれる数百ppm程度のアセトンを検出できることがわかった。(2) APMSによるVOC分解特性の調査放電チェンバに微量のアセトンを模擬空気に混合したガスを封入して大気圧コロナ放電を発生させ,放電中で生成される種を測定した。その結果, H(m/z=1), H2(m/z=2), OH(m/z=17), H2O(m/z=18), CO(m/z=28), O2(m/z=32)およびCO2(m/z=44)の生成の可能性が示された。また,同時に行った赤外吸収分光診断はCO, CO2, O3の生成が確認された。赤外吸収分光測定では分子振動で双極子モーメントが変化しない(赤外不活性)ものは測定できないが, APMSによりアセトンを大気圧コロナ放電で分解したときに, H2, O2が生成させる可能性が示唆された。アルゴン・酸素中に微量のアセトンを混合したガスのコロナ放電分解実験も行い,模擬空気中と同様の分解生成物の質量スペクトルが得られることを明らかにした。
新測定法による地磁気逆転・エクスカーションにおける地球磁場強度変動の研究

今年度は、タヒチ島で採取した合計34枚の溶岩に対する古地磁気方位測定・古地磁気強度測定・Ar-Ar年代測定を完了させるとともに、全データの解釈を行った。古地磁気方位測定の結果を解析した結果、採取した34溶岩は「逆磁極(逆転開始期)→方位反転→正磁極(逆転完了期)」という方位変化を記録していた。方位反転は5回であり、13回の方位反転が見られる他地域のデータよりも詳細に地球磁場変動を記録していると示唆される。34溶岩の中位・上位に位置する3溶岩のAr-Ar年代は、測定誤差の範囲内で重なった。これらの3溶岩の年代値の重み付き平均は769±20ka(2σ)であり、報告されているブルン-松山地磁気逆転の年代と一致する。一方、34溶岩の下位に位置する1溶岩のAr-Ar年代は845±18kaであった。これらの結果から、34溶岩はブルン-松山地磁気逆転の数万年前から逆転全体にわたる地球磁場変動を記録していることが明確になった。新測定法(低温消磁2回加熱ショー法)による地球磁場強度の測定を行った結果、「磁場強度は振動するように大きく変化する(逆転開始期)→大幅に弱まる(方位反転期)→過去5百万年間の平均値なみに回復する(逆転完了期)」というブルン-松山地磁気逆転における磁場強度変動の全体像を復元できた。とくに逆転開始期からは、地球磁場強度と地球磁場方位に特定の相関(逆転ライン)が見出された。これは、新測定法を用いることで精度の良い古地磁気強度を得た結果、初めて判別できた逆転開始期における地球磁場の特性である。以上の研究成果をまとめた論文を現在執筆しており、近日中に国際誌に投稿する予定である。地磁気逆転を記録する試料は地球磁場強度測定が難しいケースが多く、測定には計画を上回る時間を費やした。そのためエクスカーションを記録する溶岩に対する測定は行えなかった。今年度の研究実施計画の中心は、1.地磁気逆転・エクスカーションを記録するタヒチ島火山岩を採取する2.採取した試料を用いて地球磁場方位・地球磁場強度の測定を開始し予察的な測定結果を得るという2点であった。上の2つの計画は完了し、本研究課題の進捗状況はほぼ計画通りである。以下にその詳細をまとめる。1.サンプリングの準備と実施平成18年11月27日12月11日に、南太平洋フレンチポリネシア領タヒチ島にて調査を行い、火山岩試料の採取を行った。産業技術総合研究所主任研究員の小田啓邦氏(古地磁気学;受入研究者)・石塚治氏(火山学・年代学)に協力を依頼し、サンプリングは私を含めた3人で実施した。タヒチ島西部のブナルウ渓谷において,78万年前の地磁気逆転ならび111万年前の地磁気エクスカーションを記録していると推定される48枚の溶岩から448試料を採取できた。2.地球磁場方位測定および地球磁場強度測定の開始採取した火山岩試料のうち,地磁気逆転を記録していると推定される17枚の溶岩に対して,地球磁場方位測定を開始した。現在までに1溶岩につき3試料の方位測定が完了し、予察的な結果を得た。この予察的結果によるならば、これらの17溶岩のうち数枚は地磁気逆転の完了期を記録していると考えられる。このことから、本研究のねらいの一つである地磁気逆転の完了期の地球磁場強度を復元できる可能性を確認できた。そこで、これらの溶岩の試料に対して、新測定法(低温消磁2回加熱ショー法)による地球磁場強度測定を開始した。本報告書作成時点で、12試料の測定が完了した。3.その他火山岩試料の岩石磁気学的測定のための準備を行った。また、2試料に対してAr/Ar年代測定を行ったが、試料の性質の影響から、信頼度の高い年代は得られなかった。このことから今後の測定においては試料の選択に注意する必要があることが認識できた。本年度の研究により、ブルン-松山地磁気逆転を記録する溶岩に対する古地磁気学的な測定はおおかた完了した。岩石磁気学的測定の結果、これらの溶岩は、チタン含有量x=00.7のチタノマグネタイトを磁性鉱物として含むことがわかった。また、これらの磁性鉱物は単磁区から多磁区の磁区構造をとることもわかった。これらの結果をまとめると、34枚の溶岩は初生の熱残留磁化を保持する安定な磁化記録であると考えられる。34枚の溶岩かち得た地球磁場方位測定の結果を総合すると、逆磁極から逆転期に入り最終的に正磁極に至る方位変動を復元できた。この結果は、本研究と同じタヒチ島の溶岩から報告されているデータ(Chauvin, et al.,1990)やその他の地域のデータに比べて、より詳細な方位変動データである。地球磁場強度測定は、地磁気逆転の完了期を中心に15溶岩の36サンプルに対して行った。その結果5サンプルから強度データを得た。地球磁場強度測定を困難にしている原因は、当時の地球磁場強度が弱かったためにサンプルの熱残留磁化強度も弱くなり、相対的にノイズである2次磁化の影響が大きいことにある。また、チタンに富むチタノマグネタイトの室内加熱に伴う熱変質が大きいことも主な原因と考えられる。以上に基づき、2次磁化の影響が少なく、かつ、チタンに富むチタノマグネタイトを含まないサンプルを選択して、追加の地球磁場強度測定を現在行っている。

また、本研究の結果を発表するための論文の執筆を開始した。今年度は、タヒチ島で採取した合計34枚の溶岩に対する古地磁気方位測定・古地磁気強度測定・Ar-Ar年代測定を完了させるとともに、全データの解釈を行った。古地磁気方位測定の結果を解析した結果、採取した34溶岩は「逆磁極(逆転開始期)→方位反転→正磁極(逆転完了期)」という方位変化を記録していた。方位反転は5回であり、13回の方位反転が見られる他地域のデータよりも詳細に地球磁場変動を記録していると示唆される。34溶岩の中位・上位に位置する3溶岩のAr-Ar年代は、測定誤差の範囲内で重なった。これらの3溶岩の年代値の重み付き平均は769±20ka(2σ)であり、報告されているブルン-松山地磁気逆転の年代と一致する。一方、34溶岩の下位に位置する1溶岩のAr-Ar年代は845±18kaであった。これらの結果から、34溶岩はブルン-松山地磁気逆転の数万年前から逆転全体にわたる地球磁場変動を記録していることが明確になった。新測定法(低温消磁2回加熱ショー法)による地球磁場強度の測定を行った結果、「磁場強度は振動するように大きく変化する(逆転開始期)→大幅に弱まる(方位反転期)→過去5百万年間の平均値なみに回復する(逆転完了期)」というブルン-松山地磁気逆転における磁場強度変動の全体像を復元できた。とくに逆転開始期からは、地球磁場強度と地球磁場方位に特定の相関(逆転ライン)が見出された。これは、新測定法を用いることで精度の良い古地磁気強度を得た結果、初めて判別できた逆転開始期における地球磁場の特性である。以上の研究成果をまとめた論文を現在執筆しており、近日中に国際誌に投稿する予定である。地磁気逆転を記録する試料は地球磁場強度測定が難しいケースが多く、測定には計画を上回る時間を費やした。そのためエクスカーションを記録する溶岩に対する測定は行えなかった。
タンパク質工学による神経幹細胞移植用スキャフォールドの設計

中枢神経組織内に移植された神経幹/前駆細胞の生着を助けるためのタンパク質性キャリアー材料の設計に取り組んだ。その結果,コラーゲンやヒアルロン酸のような天然高分子がベース材料として有用であり,また,増殖因子,神経栄養因子,インテグリン結合ドメインなどを,タンパク質工学による分子設計手法を駆使してベース材料内に担持させる方法が,細胞の生存率向上にきわめて有効であることがわかった。このような複合材料の設計法は,中枢神経疾患の再生医療の進歩に大きく寄与するものと考える。神経幹細胞の移植による中枢神経の再生治療を効果的に行うための新規材料の設計を行うための、移植用スキャフォールドの開発を行った。そのさい、スキャフォールドを構成する材料を合理的にデザインするため、遺伝子組み換えによる人工タンパク質の設計手法を採用した。本研究で設計した人工タンパク質は次の2つの要素を備えたものとした。(1)溶液状態にあるタンパク質を移植細胞とともに患部に注入すると速やかにゲルを形成し、細胞の分散を防ぐことのできるような物理化学的性質をもつ。この目的のため、隣接分子のドメイン間で会合体を形成し、それが架橋点となってハイドロゲルが生成するような仕組みをもつ。(2)移植細胞の増殖、分化、移動、シナプス形成などを高度に制御できるポリペプチド鎖を移植細胞に提示するためのドメインをもつ。H19年度は、(1)構造形成ドメインの選択、(2)機能ドメインの選択、(3)合成したキメラタンパク質の神経系細胞の培養系を用いた評価について検討した。(1)に関して、分子間会合によってコイルドーコイル構造を形成する中間径繊維由来のドメイン、あるいは、自己組織化によって微細繊維からなるゲルを形成するコラーゲン、架橋によってゲルを形成するヒアルロン酸について検討し、それらの構造形成要素としての有効性について基礎的知見を得た。一方、(2)に関しては、細胞増殖因子(EGF)、神経栄養因子(CNTF、BDNF)、細胞接着分子(NCAM)、細胞外マトリックス(laminin)について検討した。これらの全長あるいは一部の配列を融合したキメラタンパク質について、(3)では、培養神経幹細胞を用いた評価系を利用して、細胞の増殖、分化、生存等に及ぼす影響を評価した。神経幹細胞の移植による中枢神経の再生治療を効果的に行うための新規材料の設計を行うための移植用スキャフォールドの開発をH19年度に引き続き行った。それまでの検討の結果、移植用材料として有効と考えられたコラーゲンおよびヒアルロン酸をベースとする材料に焦点を絞って研究を進展させた。コラーゲンをベースとする場合には、コラーゲンに特異的に相互作用するドメイン(von Willebrand因子のA3ドメイン)を一成分とするキメラタンパク質を合成した。融合パートナーとしては、上皮細胞増殖因子を組み込んだ。このキメラタンパク質をコラーゲンゲル内に結合ドメインを介して複合化し、その内部における神経幹細胞の増殖および形態変化について調べた。その結果、神経幹細胞の生存・増殖にとって適切なゲルの諸物性に関する知見を得ることができた。これに関して、現在、論文を執筆中である。一方、ヒアルロン酸の場合は、予めキレート反応を利用して導入した金属イオンと、脳由来神経栄養因子(Brain derived neurotrophic factor;BDNF)に導入したヒスチジンタグとの間の錯体形成を利用して、ヒアルロン酸ゲル内部に担持させた。培養細胞を用いた評価ならびにラット脳内移植試験によって、ゲルの最適な組成、細胞の生存維持、機能ドメインの効果などについて知見を得ることができた。このヒアルロン酸ベースの移植用材料に関して、現在、論文を投稿中である。昨年度までの研究の結果、神経幹細胞の生存や増殖性を高めるハイドロゲル状のスキャフォールドには、細胞分裂の促進効果のある上皮増殖因子(EGF)を組み込むことが有効であることがわかった。また、ベース材料としてコラーゲンを用いると、ゲル化を利用した細胞の封入が容易で、かつ、コラーゲン結合性ポリペプチドを用いた制御因子の担持を効果的に行うことのできることがわかった。そこで本年度はさらに、EGF担持ハイドロゲル-神経幹細胞複合体の系について、ゲル内部で増殖した細胞の分化状態について調べた。ゲル内で増殖した細胞を回収し、マーカー遺伝子(ネスチンおよびクラスIIIβチューブリン)の発現をリアルタイムPCR法によって定量した結果、ゲル内部の細胞の多くは神経幹細胞のマーカーであるネスチンを発現していた。一方、封入された神経幹細胞の生存をさらに向上させるには、スキャフォールド内部での細胞の接着状態を改善することが有効であると考えた。コラーゲンは神経幹細胞に対して比較的不活性であり、分散状態におかれた細胞はアポトーシスを起こしやすいと考えたからである。そこで、インテグリンと相互作用することが知られているラミニン由来のG3ドメイン複合体をコラーゲンゲル内部に担持させた。このゲルの内部では、細胞がインテグリンを介して接着することに起因して、細胞の生存率が培養細胞を用いたin vitro試験および健常ラット脳におけるin vivo試験の双方において向上することがわかった。
次世代型統合的ゲノム解析による食道癌の治療効果予測アルゴリズム構築と分子標的探索

食道扁平上皮癌(ESCC)の「個別化医療」実現のため、体系化されたプロトコールで治療された臨床検体と臨床情報を収集し、これらを対象に次世代シーケンサーとアレイによりオミックス(配列、コピー数、メチル化、発現)情報を抽出、統合することにより、分子マーカーを用いてESCCの悪性度や治療効果を予測するためのアルゴリズムを構築した。さらに統合データを用いて診断や治療の標的遺伝子候補の探索と同定を行い、ESCCのみならず他のがんでも、本アプローチが応用可能で有用であることを示した。食道扁平上皮癌(ESCC)の「個別化医療」実現のため、詳細な臨床情報を付帯した高品位臨床検体を対象に次世代テクノロジーを駆使して抽出するOmics情報から、ESCCの新たな悪性度や治療効果予測アルゴリズムを構築すると共に分子標的治療の標的遺伝子候補探索を目的に研究を推進し、以下の成果を得た。1.ESCC臨床例からの臨床検体と派生するバイオリソース、臨床情報収集Omics解析対象となる体系化されたプロトコールで治療されたESCC臨床例についての凍結組織とパラフィン包埋組織の収集ならびに臨床情報データベース作成は、今年度、(1)術前化学療法または化学療法単独(Docetaxicel+S-1+Cisplatin)145例、(2)術前化学放射線療法または化学放射線療法単独(同)33例、ならびに(3)化学放射線療法(5-FU+Nedaplatin)100例について行った。機能ゲノム解析に用いるため、ERSCC細胞株42種を含む癌細胞株も収集した。2.ESCCのOmics解析次世代シーケンサーによる配列解析、アレイによるゲノムコピー数・DNAメチル化解析、次世代シーケンサー・アレイによる遺伝子発現解析の技術導入と独自の情報解析パイプラインの整備を行い、統合解析が可能なシステムを構築した。これらを基盤に、実際に臨床検体と細胞株について、ゲノム・エピゲノム解析、mRNA/miRNA遺伝子発現解析を進め、デジタルデータの収集を行った。この過程で、ESCCの新規予後予測コピー数異常マーカニを同定した(論文投稿中)。さらに扁平上皮癌として口腔癌、あるいは乳癌や肝癌などESCC以外の腫瘍についても解析プラットフォームが有用であることを確認し、口腔癌におけるエピジェネティックな発現抑制を受ける癌抑制型miRNA(miR-218など)。をはじめ、複数の癌抑制miRNAを報告した。これらの結果から、本課題で構築されたシステムにより1で収集したESCCの解析を継続することで、ESCCの診断・治療標的同定が達成可能であることが示された。食道扁平上皮癌(ESCC)の「個別化医療」実現のため、臨床情報を付帯した高品位臨床検体を対象に次世代テクノロジーを駆使して抽出するオミックス情報から、悪性度や治療効果予測アルゴリズムを構築すると共に分子標的治療の標的遺伝子候補探索を目的に研究を推進し、24年度に引き続き25年度は以下の成果を得た。1. ESCC臨床例からの臨床検体と派生するバイオリソース、臨床情報収集:(1)術前化学療法または化学療法単独、(2)術前化学放射線療法または化学放射線療法単独、(3)化学放射線療法など体系化されたプロトコールで治療されたESCC臨床例の組織ならびに臨床情報の収集・データベース作成を継続した。個々の症例における病態や変異に類似するモデル実験系構築のために癌細胞株も追加収集した。2. ESCCのオミックス解析:次世代シーケンサー・アレイによるゲノム配列、ゲノムコピー数、DNAメチル化、遺伝子発現解析の継続とデータ蓄積を進めた。他のグループとの連携による配列収集の推進を図ると共に、全ゲノム解析の検討も開始し、これらを基に、オミックスデータの統合情報解析法の改良を進めた。これらの各取り組みから候補遺伝子を同定すると共に、腫瘍内の不均一性に基く治療効果の推定の可能性の検討、ゲノム編集によるハイスループット機能解析系構築にも取り組んだ。3. ESCC以外の腫瘍ならびに他疾患について、解析プラットフォームが有用であることを確認し、ゲノム・エピゲノム異常の標的遺伝子同定を進めることができた(Oncogene 2014他)。これらの結果から、本課題で構築されたシステムにより、さらにESCCの診断・治療標的同定達成が期待できることが示された。食道扁平上皮癌(ESCC)の「個別化医療」実現のため、詳細な臨床情報を付帯した高品位臨床検体を対象に次世代テクノロジーを駆使して抽出するOmics情報から、ESCCの新たな悪性度や治療効果予測アルゴリズムを構築すると共に分子標的治療の標的遺伝子候補探索を目的に研究を推進し、23年度に引き続き24度は以下の成果を得た。1. ESCC臨床例からの臨床検体と派生するバイオリソース、臨床情報収集:体系化されたプロトコールで治療されたESCC臨床例についての凍結組織とパラフィン包埋組織の収集ならびに臨床情報データベース作成を、(1)術前化学療法または化学療法単独、(2)術前化学放射線療法または化学放射線療法単独、(3)化学放射線療法の適用例の術前後を対象に行った。

口腔扁平上皮癌を含め癌細胞株も追加収集した。2. ESCCのOmics解析:次世代シーケンサーによる配列解析、アレイによるゲノムコピー数・DNAメチル化解析、次世代シーケンサー・アレイによる遺伝子発現解析のデータ収集と情報の統合を進め、コピー数解析による予後予測因子を同定した(Cancer Sci 2012)。メチル化ならびにシーケンスデータの統合解析によるドライバー変異同定や治療反応予測因子の解析は継続して行い情報の検証段階まで進めることができた。3.口腔癌、肺癌、乳癌、肝癌などESCC以外の様々な腫瘍についても解析プラットフォームが有用であることを確認し、ゲノム・エピゲノム異常の標的遺伝子同定を進めることができた(Clin Can Res,2012; Oncogene2012他)。これらの結果から、本課題で構築されたシステムにより、引き続き情報解析を進めることでESCCをはじめとする各種癌の診断・治療標的同定達成が期待できることが示された。体系化されたプロトコールで治療されたESCC臨床例の収集は、計画を上回って進行している。また、ゲノム・エピゲノム解析も技術・情報解析プラットフォームの構築が計画通り進み、そのパフォーマンスも確認され、実際に報告可能な成果も得られた。25年度が最終年度であるため、記入しない。体系化されたプロトコールで治療されたESCC臨床例の収集は、計画どおり進行している。ゲノム・エピゲノム解析に関する技術・情報解析プラットフォームの構築と検証についても、次世代シーケンサー系の稼働とデータ取得、マイクロアレイ系の稼働とデータ取得並びに解析による有用性の確認が進んだ。マイクロアレイ解析と次世代シーケンス解析とを併用して研究期間を有効に使ったデータ取得を行えた結果、成果としても、ESCCならびにその他の癌種についての予後予測因子の抽出が行えることを実証でき、一部の成果については学会発表や論文の形で報告できた。今後、申請時に24年度以降に計画した通り、臨床症例リソース収集とOmics解析を継続すると共に、ESCC臨床例のOmics情報と臨床情報との統合情報解析を基盤として、さらに診断・治療標的候補の同定を進め、治療効果アルゴリズムの構築とそのバリデーションならびに治療標的候補癌関連遺伝子の探索を行う。既に次世代シーケンサーによるゲノム配列・発現解析は充分利用可能になっており、アレイによるエピゲノム解析と組み合わせた高感度、高精度の解析系が確立できている。また、申請時に予測される困難点の一つに挙げた臨床症例数の集積不足については、23年度ですでに克服されていることから、より効率的な研究の推進が期待される。一方で、exosomeについては腫瘍や病期特異性や感度が不十分であり、細胞株培養上清を用いた基礎的検討に力を入れる。
心不全における睡眠時無呼吸症と水分シフトの関係性の解明

心不全の予後改善のために対処可能な合併症とされる睡眠時無呼吸症では、就寝時の下肢から上半身への水分シフトが原因の一つとされ、これをさらに証明する検討を行った。急性心不全では、睡眠時無呼吸症の重症度は水分シフト量と関係し、治療経過中に水分シフト量の低下と関連し軽症化することを報告した。また、僧帽弁閉鎖不全でも、睡眠時無呼吸症の重症度と水分シフト量が関係し、外科治療前後で、水分シフト量の変化と重症度の変化の間に関係性を認めることを報告した。急性心不全後の心臓リハビリテーションにより、水分シフト量の低下に関連した睡眠時無呼吸症の軽症化が得られるか否か検討を継続し、いずれも論文化する予定である。心不全患者の予後改善のために対処可能な予後規定因子の同定が重要とされており、その一つとされる睡眠時無呼吸症(Sleep Apnea: SA)の病因として、日中下肢に貯留した水分が就寝時に仰臥位の姿勢をとることで上半身へ再分布する水分シフトがあり、その関連性をさらに証明する目的で、心不全の病態が変化すると水分シフト量も変化し合併するSAの状態も変化するか否か、また、水分シフトを減少させるような介入によって、SAの状態が変化するか否かなどを明らかにすることを目的とした以下の観察研究を行った。1)急性非代償性心不全にて入院した患者において、急性期を乗り越え安定期に入った比較的早期の段階と退院直前に、終夜睡眠ポリグラフ(PSG検査)とその際の水分シフト量の測定、心機能評価、日中活動性の評価を二回行い、通常の心不全治療・心機能の改善に伴い水分シフト量、SAの重症度、タイプの変化が見られる否かと各変化同士の関連性を検討した。これに関しては、18例の患者で安定期に入った比較的早期の段階でのPSG検査と水分シフト量の測定、心機能評価、日中活動性の評価を行った。そのうち4例において二回目のPSG検査と水分シフト量の測定を行い、心不全の病態の変化に伴うSAの状態の変化について検討し、中間解析を行った。この中間解析結果を国内学会(第79回日本循環器学会学術集会)へ応募し発表した。2)僧帽弁閉鎖不全の手術症例において、手術前後での心不全・心機能の改善に伴い水分シフト量の変化、SAの重症度、タイプの変化が見られるか否かと各変化同士の関連性の検討については、2例の僧房弁閉鎖不全症例で術前術後のデータを収集した。心不全に合併する睡眠時無呼吸症(Sleep Apnea: SA)の病因である水分シフトに関連する以下の研究を継続中である。1)急性非代償性心不全にて入院した患者において、急性期を乗り越え安定期に入った比較的早期の段階と退院直前に、終夜睡眠ポリグラフ(PSG検査)とその際の水分シフトの測定、心機能評価、日中活動性の評価を二回行い、通常の心不全治療・新機能の改善に伴い睡眠シフト量、SAの重症度、タイプの変化が見られるか否かと各変化同士の関連性を引き続き検討した。これに関してはこれまでの症例に追加して計30例の患者で安定期に入った比較的早期の段階でのPSG検査と水分シフト量の測定、心機能評価、日中活動性の評価を行った。このうち計8例では二回目のPSG検査と水分シフト量の測定を行い、心不全の病態の変化に伴うSAの状態の変化について再度解析を行っている。この解析結果は、中間解析の結果も含め昨年度に続き、国内学会(第63回日本心臓病学会)で発表し、平成28年4月末に開催予定の国際学会でも発表予定である(CardioSleep Conference 2016)。2)僧帽弁閉鎖不全の手術症例において、手術前後での心不全・心機能の改善に伴い水分シフト量の変化、SAの重症度、タイプの変化が見られるか否かと格変化同士の関連性の検討については、昨年に引き続き症例を集積中であり計5例で術前術後のデータを収集した。3)心臓リハビリテーション(心リハ)による介入研究に関しては、研究計画書を作成中であり、倫理委員会での承認のための準備を行っているが、本年度で臨床研究の指針が改定されたこともあり、当初の予定を大幅に修正する必要性が生じたため予想外の時間を費やしている。前年度の下肢水分量測定のための装置の専用電極の入手に伴う遅れを取り戻せないでいることが主な原因である。また、追加購入を予定していた生体インピーダンス法におる水分量測定装置のバージョンアップの時期と重なり、購入を本年度に持ち越したが、製造会社の合併などに伴い新規の水分量測定装置の発売が大幅に遅れており、旧機種も在庫の関係で購入できない状況であったため、装置の追加ができなかったことも影響している。心リハによる介入研究に関しては臨床研究の指針が改定に伴い、倫理委員会承認のための書類の再作成、モニタリングのための準備などあり、予想外の時間を費やしたことが影響している。心不全患者の予後改善のために対処可能な予後規定因子の同定が重要とされており、その一つとされる睡眠時無呼吸症(Sleep Apnea: SA)の病因として、日中下肢に貯留した水分が就寝時に仰臥位の姿勢をとることで上半身へ再分布する水分シフトがあり、その関連性をさらに証明する目的で、以下の観察研究を行った。1)急性非代償性心不全にて入院した患者において、安定期に入った段階と退院直前に、終夜睡眠ポリグラフ(PSG検査)とその際の水分シフトの測定などを二回行い、通常の心不全治療に伴い水分シフト量、SAの重症度の変化が見られるか否かと各変化同士の関連性を検討した。

最終的に54例の患者で一回目のPSG検査と水分シフト量の測定が行われ、水分シフト量とSAの重症度の間に独立した関係性を見出した。このうち計12例で二回目の評価が行われ、水分シフト量の低下と関連したSAの重症度の軽減を認めた。中間解析の結果も含め国内学会(第79回日本循環器学会学術集会、第63回日本心臓病学会学術集会)で発表し、国際学会でも発表した(CardioSleep Conference 2016)。現在、論文執筆中である。2)僧帽弁閉鎖不全の手術予定症例において、手術前後で水分シフト量の変化、SAの重症度の変化と各変化同士の関連性を検討した。25例で術前のPSG検査と水分シフト量の測定が行われ、両者の間に独立した関係性を認めた。計19例で二回目の評価が行われ、水分シフト量の変化とSAの重症度の変化の間に有意な相関を認めた。中間解析の結果を国内学会(第81回日本循環器学会学術集会)で発表した。最終的に二回目の評価を20症例で行い論文とする予定である3)心臓リハビリテーションによる介入研究に関しての研究計画書は作成したが、1)と2)の研究に注力するために、中断し1)と2)の論文執筆が完了した時点で再開することとしている。心不全の予後改善のために対処可能な合併症とされる睡眠時無呼吸症では、就寝時の下肢から上半身への水分シフトが原因の一つとされ、これをさらに証明する検討を行った。急性心不全では、睡眠時無呼吸症の重症度は水分シフト量と関係し、治療経過中に水分シフト量の低下と関連し軽症化することを報告した。また、僧帽弁閉鎖不全でも、睡眠時無呼吸症の重症度と水分シフト量が関係し、外科治療前後で、水分シフト量の変化と重症度の変化の間に関係性を認めることを報告した。急性心不全後の心臓リハビリテーションにより、水分シフト量の低下に関連した睡眠時無呼吸症の軽症化が得られるか否か検討を継続し、いずれも論文化する予定である。下肢水分量の測定のための装置の専用電極がはがれやすいため予想よりも多く必要となったが、オーストラリアから個人輸入の形で入手しなければならず、その手続きなどで予想外の時間を要したために遅れを生じた。新規の水分量測定装置購入も検討したが、現状保有している装置との互換性に問題があるため断念し、現状保有している装置のみで追加なしで研究を進めることとなった。このため当初の予定をさらに半年ずらして研究を進める。具体的には、急性非代償性心不全にて入院した患者における心不全治療・心機能改善に伴う水分シフト量、SAの重症度、タイプの変化に関する検討について、前後二回の測定ができた症例をあと2例(計10例)得られたところで終了として最終解析を行い論文化する。僧帽弁閉鎖不全の手術症例における術前後での水分シフト量の変化、SAの重症度、タイプの変化に関する検討は1015症例が得られた段階で中間解析を行い本年度内での完遂を目指す。心リハによる介入研究に関しては、当初は予定していなかったモニタリングや保険加入などの費用が発生するため、装置購入のための費用をそちらに回し、本年度中の開始を目指している。循環器内科現在は専用電極を予定された測定回数で使用する数よりも多く入手できたため、今後はこれの入手による遅れは生じないものと考える。当初の予定を半年ずらし、本年度の上半期中に急性非代償性心不全にて入院した患者における通常の心不全治療・心機能の改善に伴う水分シフト量、SAの重症度、タイプの変化に関する検討の予定した30症例のデータを入手し終了させる。
混合原子価鉄単一次元鎖磁石における複合物性化

単一次元鎖磁石(single chain magnet, SCM)について,外場など環境に応じて磁気特性を変化させる外場応答型単一次元鎖磁石の創成を目指し,合成化学的な側面と物性解明の側面より研究を行った。本研究で対象としたSCMはFe(II)イオンの容易面ねじれ配向により鎖全体として容易軸異方性を実現していることから,磁気特性は構造的な摂動に対し極めて敏感に応答する。可逆的な溶媒吸脱着に連動したSCM特性の可逆的変化をナノ磁石に対し初めて実現した。単一元鎖磁石とは鎖状錯体一つ一つが磁石として振る舞う化合物であり,この21世紀になって発見された最も新しい分子磁性体である.その物性発現には,大きな基底スピン多重度と容易軸型の磁気異方性の導入・制御が重要であり,今日まで容易軸型の金属イオンを連結しての合成が当然であった,それに対し報告者は容易面型の金属イオンである高スピンFe(II)イオンを垂直に振れながら配置させることにより系全体としての容易軸の実現に成功し,新たな単一次元鎖磁石の合成に成功している.本研究ではその磁気物性の複合物性化を見据え,その錯体系のヴァリエーションを増やし,本系に見られる特異な磁気異方性発現の一般化を行うことを目標とした.従来の錯体構築に用いられていた有機配位子Hbpcaについてピリジン環の6位に種々の置換基導入を試み,新規に得られたHbpca誘導体を用いた一次元鎖錯体の合成,構造解析と磁気特性の解明を行った.その結果,今回合成したいずれの錯体においても単一次元鎖磁石としての特性が観測され,容易面捩れ配向型構造による容易軸構築が一般的に可能であることが明らかとなった.また,置換基側鎖の導入により鎖間の配置に差異が観測され,そこに取り込まれている溶媒分子の吸脱着挙動にも違いが見られた.これに伴い,溶媒の吸脱着に伴う磁気特性の可逆的,ないし不可逆的変化も観測され,いくつかの錯体においてはマグネティックスポンジとしての挙動も観測された.バルク磁石以外でこのような外場応答性磁石が構築されたのは初めてのことであり,その磁気特性の詳細の解明について引き続き研究を行っていく予定である.単一元鎖磁石とは鎖状錯体一つ一つが磁石として振る舞う化合物であり,21世紀初等に発見された最も新しい分子磁性体である.その合成に当たり,大きな基底スピン多重度と容易軸型の磁気異方性の導入・制御を目指した分子設計が行われてきたが,報告者は容易面型の金属イオンである高スピンFe(II)イオンを垂直に振れながら配置させることにより系全体としての容易軸を実現する方法に成功し,その物性研究を進めてきた.本年度はそのような物性を示す一連の錯体について,磁気特性が外因,特に取り込まれている溶媒分子の吸脱着により変化する現象の詳細の理解について検討を行い,解明を目指した.錯体系のバリエーションとして錯体構築に用いられていた有機配位子Hbpcaについてピリジン環の6位に種々の置換基導入を試み,新規に得られたHbpca誘導体を用いた一次元鎖錯体の合成,構造解析と磁気特性の解明を行った.いずれの錯体においても単一次元鎖磁石としての特性が観測され,容易面振れ配向型構造による容易軸構築が一般的に可能であることまでは明らかとしていたが,結晶溶媒の吸脱着にともなう磁気的振る舞いの変化に大きな差異が見られた.置換基が小さい場合,鎖間に形成される空隙は相対的に小さく,取り込まれている溶媒分子の個数も少ない.このため,結晶溶媒は抜けにくいか,抜けても結晶性を保持していることが粉末X線回折より明らかとなった.溶媒級脱着にともなう構造変化は可逆であり,磁気特性の変化も可逆であった.一方,置換基が嵩高い場合,空隙内に取り込まれる溶媒分子は多く,その脱離にともなう構造変化は大きなものとなった.そのため,結晶相からアモルファス相への不可逆な相変化が観測され,磁気的にも単一次元鎖磁石から常磁性体への変化が観測された.古典的なバルク磁石とは異なり,零次元ないし一次元構造を持つ磁性体は長距離磁気秩序構造を形成しないことからナノ磁石と呼ばれ,その物性解明と磁気特性の向上を目指した合成手法の開発は,現在の金属錯体研究における大きなトピックスである.特に外場に対して応答性を示すナノ磁石の構築は,分子レベルでのメモリ素子など高密度な分子デバイス実現に向けて重要な研究テーマである.一次元構造を持つナノ磁石「単一元鎖磁石」は鎖状錯体一つ一つが磁石として振る舞う化合物であるが,大きな基底スピン多重度と容易軸型の磁気異方性の導入・制御を目指した分子設計が行われてきた,報告者は容易面型の金属イオンである高スピンFe(II)イオンを垂直に捩れながら配置させることにより系全体としての容易軸を実現する方法に成功し,その物性研究を進めてきた.

錯体系のバリエーションとして有機配位子Hbpcaのピリジン環の6位に種々の置換基導入を試み,新規に得られたHbpca誘導体を用いた一次元鎖錯体の合成,構造解析と磁気特性の解明を行った.いずれの錯体においても単一次元鎖磁石としての特性が観測されたが,結晶溶媒の吸脱着にともなう磁気的振る舞いの変化に大きな差異が見られたが,これは,結晶溶媒の抜けにくさ,抜けた後の結晶性を保持するかどうかなどに依存するものであった。溶媒級脱着にともなう可逆的な構造変化を示すものや結晶相からアモルファス相への不可逆な相変化示すものなどについて,磁気挙動の変化を詳細に調べ,Full paperとして報告した
月経関連遺伝子産物の機能解析と子宮内膜症の発症・進展に果たす役割

当研究室においては、月経を模倣したヒト子宮内膜細胞の培養法を用いて、月経に関連して変化する遺伝子、月経関連遺伝子の候補を保持しており、その中でsarcoglycan-deltaの上昇が、microarrayだけでなく、RT-PCR法および組織免疫染色にても確認された。次に、この遺伝子の子宮内膜症発症における影響を調べるために、磁力を用いた新規子宮内膜症モデルマウスの開発を行っており、現在磁力の強化を行っている。In vitro月経モデルでの増殖期、分泌期、月経期相当子宮内膜でのcDNA microarrayの結果に基づき、増殖期、分泌期に対しての月経期での増減により、3群に分類して、それぞれに属する遺伝子の発現をRT-PCRにて順次確認していった。その中で、macrophage scavenger receptor1およびHES2の増減は、月経期との相関は認められなかったが、delta sarcoglycanでは、月経期に優位に増加を認めた。次に、タンパク質レベルでの増減をwestern blotにて確認したところ、RT-PCRと同様の増加を認めた。一方、ヒト子宮検体におけるdelta sarcoglycanの発現パターンは、月経周期に関係なく、子宮平滑筋においても、他の平滑筋と同様発現を認めた。また、子宮内膜では、高温期子宮内膜腺上皮細胞において、発現を認める一方、子宮内膜間質細胞では、in vitroの結果とは異なり、増殖期、分泌期においては発現は認めず、月経期においても、極少数の細胞に発現を認めるのみで、大部分には発現を認めなかった。これらの結果において、高温期子宮内膜腺細胞において、本来筋細胞特異的に発現が認められるdelta sarcoglycanの発現が認められており、今後は子宮内膜癌細胞において、その発現がどう変化しているかを探求していくことで、新たな子宮内膜の癌化の指標となる可能性を有している。また、Umezawaらにより、ヒト月経血より、骨格筋細胞および心筋細胞への誘導・分化に成功したという報告(Mol Biol Cell.18(5) : 1586-1594, 2007、Stem Cells Vol.26No.7July 2008, pp.1695-1704)における、細胞生物学的機序の解明の足掛かりとなる可能性がある。現在検討しているsarcoglycan deltaのin vivoでの発現状況およびその発現量を増減させた際の、正常および異所性子宮内膜組織の構築や脱落膜化への寄与度を調べるために、異所性子宮内膜・内膜症モデルマウスの作成を開始した。既存の報告のものでは、手術の影響や、移植組織が均一でないという問題点があるため、磁性体を用いての細胞移植によるマウス腹腔内への単一病変の作成を試みた。本年度は,初代培養内膜細胞ではなく内膜腺上皮細胞株Ishikawaを,以前我々が用いたレンチウイルス(Masuda,et al.,PNAS,2007)により,発光蛋白と蛍光蛋白の両者で標識した.IshikawaはEP-CAMを発現しているので,抗EP-CAM抗体と磁気ビーズを用いて標識Ishikawa細胞を分取し,重度免疫不全マウスの腹腔内へ移植した.同時に皮膚の外に直径5mmの磁石を24時間貼付した結果、磁石の直下の腹腔内にIshikawaが集積していることを、既報(Masuda,et al.,PNAS,2007)と同様のbioluminescence imagingにより確認した。一方、発光ならびに蛍光蛋白に加えて選別マーカーの3つの蛋白を同時に発現するレンチウイルスの作製に着手し,現在ベクターの構築を完了した.このウイルスベクターは、移植内膜細胞を磁性体で選別するためのマーカー遺伝子を導入するために必要なだけでなく、移植細胞にsarcoglycan deltaなどの月経・子宮内膜症関連遺伝子を恒常的に導入・発現するうえでも有用なベクターになり得る。以上、次年度に向けての実験条件・技術の確立がほぼ終了した。ヒト正常子宮内膜細胞は入手が困難であり、その希少性を考慮して、モデルマウス作成にあたり、初期の条件設定にはヒト子宮内膜細胞癌株であるIshikawa細胞を使用することとした。この細胞に、細胞内ドメインを欠失したCD271(ΔLNGFR)を組み込んだ、CBR luciferase-2A-ΔLNGFR lentivirusを感染させ、ΔLNGFRにて感染細胞をMACS^<[○!R]>システムにてソートできるようにした。MACSシステムは、磁性体付き抗体にて対象細胞をソートできるため、ソート後にそのまま本実験に使用できる。また、同ウィルスにEmGFP遺伝子を組み込み、EmGFPによって感染効率も調べられるようにした。本年度は、これを用いて、Ishikawa細胞を感染後ソートし、NOD/shi-scid, IL-2RγKOマウス(NOGマウス[○!R])腹腔内に投与し、同部位に磁石を留置した。磁石に関しては、市販のネオジム磁石直径5mm×高さ1mm、約250mTの磁力を保持するものを使用した。

結果は、磁石留置部位への細胞集積効果が不十分であったため、幅0.5mmのヨークを装着して磁力を増幅した。これにより、この磁石は約0.3T程の磁力を擁するようになった。この磁石を使用して、細胞数1×10^5/μ1まで希釈して投与しても、細胞は生着するものの、他に子宮にも細胞が生着してしまい、単一病変とはならなかった。今後は、子宮からの未知の誘因物質より強力な磁性体および磁石を検討していく予定である。
Wｎｔ５ａ－Ｒｏｒシグナルによる神経幹細胞の運命決定制御機構の解明

昨年度までの解析から、Wnt5a-Rorシグナルは神経幹細胞の細胞周期G1期からS期への移行を促進する働きをもつことを見出した。本年度は、Ror受容体の発現について免疫組織染色法を用いた解析を行い、神経幹細胞におけるRor2の発現がニューロン産生期の初期ほど高く、発生が進むにつれ次第に減少することを明らかにした。神経幹細胞のG1期は発生の初期ほど短いことが知られており、神経幹細胞におけるRor2の発現量がG1期の長さを制御していることが示唆された。次に、神経幹細胞におけるRor2の発現制御機構を明らかにするため、ニューロン産生期初期のマウス大脳新皮質より単離した神経幹細胞を用いて解析を行った。その結果、2日間培養後の細胞では培養前と比較してRor2の発現量が減少するのに対して、培養過程でヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるバルプロ酸(VPA)で処理するとRor2の発現量の減少が抑制されることが分かった。また、神経幹細胞の増殖を促進する働きをもつbFGFで処理することでもRor2の発現量が維持されることが分かった。我々は、bFGFシグナルがヒストンアセチル化を介してRor2の発現を促進する働きをもつと考えている。以上の結果から、ニューロン産生期の神経幹細胞で発生の進行に伴いエピゲノム制御を介してRor2の発現量が次第に減少することが、ニューロン産生期後期での神経幹細胞の細胞周期進行能の低下ならびに神経幹細胞の自己複製能および中間前駆細胞産生能の低下の原因になっていると考えられた。ニューロン産生期におけるこのようなRor2の発現制御を介した神経幹細胞の運命決定制御機構は、最終的に産生されるニューロンの数を決定するうえで重要な役割を担っていると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。発生過程の大脳皮質では、神経幹細胞より多数のニューロンが産生される。ニューロン産生期の神経幹細胞は非対称分裂を介して自己複製と中間前駆細胞の産生を行う。中間前駆細胞は増殖能を維持しており、分裂を経てニューロンへ分化することで産生ニューロン数を増幅する役割を担う。我々は、これまでにWnt5aの受容体として機能するRorファミリー受容体型チロシンキナーゼRor1/Ror2が発生過程の大脳皮質神経幹細胞に高発現しており、Wnt5a-Rorシグナルが神経幹細胞の自己複製能と中間前駆細胞産生能をともに促進することを明らかにしてきた。平成25年度は、Wnt5a-Rorシグナルによる神経幹細胞の自己複製能と中間前駆細胞産生能の制御機構の解明を目的として、細胞周期の進行制御に着目して解析を行った。胎生期マウスの大脳皮質より単離した神経幹細胞におけるRor1とRor2の発現をsiRNAにより抑制することで細胞周期を脱した細胞の割合が増加することが示された。また、増殖中の細胞を対象として、その細胞周期の長さの平均を測定したところ、Ror1とRor2の発現抑制により、細胞周期が長くなり、特にG1期が伸長していることが明らかになった。他方、精製Wnt5aで神経幹細胞を処理した場合には、反対にG1期が短縮することが示された。これらの結果から、Wnt5a-Rorシグナルは神経幹細胞の細胞周期(G1期からS期)の進行を促進する働きを持つことが示唆された。発生過程の大脳皮質では、神経幹細胞のG1期の長さと中間前駆細胞産生能との関連が示されており、Wnt5a-Ror-Dvl2シグナルは神経幹細胞の細胞周期の進行を促進することにより、神経幹細胞の自己複製と中間前駆細胞の産生亢進に寄与するのではないかと考えられた。ニューロン産生期におけるこのようなRor2の発現制御を介した神経幹細胞の運命決定

制御機構は、最終的に産生されるニューロンの数を決定するうえで重要な役割を担っていると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画に準じて解析を行うことにより、Wnt5a-Rorシグナルが細胞周期の長さの調節に関わることを明らかにしており、本研究計画を予定通り進めていくことができると考えられたため。平成25年度の研究結果を踏まえて、Wnt5a-Rorシグナルによる細胞周期の進行制御について、発生過程の大脳皮質においても実際に同様の機能を持つかどうかについてWnt5a、Ror1、Ror2の各種ノックアウトマウスを用いて解析を行う。また、その分子機構を明らかにするために、一次繊毛制御に焦点をあてて解析を行う。また、一次繊毛を介したWnt5a-Rorシグナルの制御機構の解明ならびに一次繊毛の形成を介した非対称分裂制御機構の解明については、上記ノックアウトマウスに加えて、平成25年度において準備したIFT20ノックアウトマウスを用いて解析を行う。