hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
FoF_1-ATP合成酵素の高次構造の解析

本研究では、FoF_1-ATP合成酵素の立体構造を明らかにするため、FoF_1および、Foの精製、2次元結晶化条件の検索を行った。また、脂質二重膜に再構成した精製酵素をAFM(原子間力顕微鏡)で表面観察した。これによって、膜内在性であるFoのサブユニットの配置に関する情報を得ることができた。FoF_1-ATP合成酵素は、我々が既に報告している大量発現系を用いて、密度勾配遠心により精製した。また、Foは精製FoF_1を尿素で処理した。この処理でF_1部分のサブユニットを解離させ、その後Fo部分を遠心操作により沈殿させた。これにより、精製度90%以上のFoを得ることができた。このようにして調製したFo及びFoF_1を脂質二重膜に再構成し、AFMによる観察、二次元結晶化の条件の検索に用いた。Foは膜内在性で、H^+の輸送部位を形成している。したがって、H^+輸送の機構を理解するためにはFoの構造を明らかにすることが必要である。これまでにa,b,cの3種のサブユニットから構成されていること、これらのサブユニットが1:2:10-12の量比で存在していることが報告されている。しかし、これらのサブユニットの配置がどうなっているかはまだ明らかでなかった。本研究ではAFMを用いて、Foの表面構造を観察することにより、Foの各サブユニットの配置を推定した。その結果、cサブユニットによる、リング状の構造物とa,bサブユニットからなると思われる膨らみを見いだした。これは、cサブユニットが形成するリングの外側にaとbサブユニットが配置していることを示している。
地殻－マントル境界における蛇紋岩化作用の反応メカニズムと物質移動

本年度は,昨年度行ったかんらん石ー斜長石ー水系における水熱実験(230度, 2.8Mpa)の実験結果のさらなる解析を試みた.水熱実験において,かんらん石と斜長石の境界付近においては磁鉄鉱が生成しなかった.磁鉄鉱の生成について,Perple X (Conolly, 2009)を用いたシュードセクションによる解析を行った.シュードセクションの作成にあたって,通常の熱力学データベースには含まれていない3価鉄を含む蛇紋石の熱力データを作成し,3価鉄の挙動を考慮した.結果,磁鉄鉱の生成はシリカ活動度と酸素フガシティーよって支配されていることが明らかになった.斜長石から高いシリカ活動度を持つ流体が拡散するため,磁鉄鉱が境界付近で生成しなかったのだと解釈される.かんらん石をバルク組成とした場合の3価鉄の蛇紋石の量は最大で3vol%程度で,シリカ活動度が高いほど少なくなる傾向がある.反応の過程で,2価鉄が3価鉄へ変化すると水素が発生する.このことは,海洋底における水素のフラックスを決定する重要な知見である.また,実験で観察されてアルミニウムの量の反応帯について,流体と固相感の局所平衡を仮定した反応ー輸送モデリングを行った.結果,実験で観察されたAlの量のプロファイルを概ね再現することに成功した.これらの成果はJournal of Petrologyに受理された(Oyanagi et al., 2018).29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。地殻とマントルの境界における蛇紋岩化反応における物質移動との関連性を明らかにするため,かんらん石ー斜長石ー水系における水熱実験(230度, 2.8Mpa)を行った.反応物の空間分布を明らかにするために,メインのオートクレーブ内に片側だけが空いた反応チューブを設置し,斜長石とかんらん石の粉末を設置した.実験時間は最大7980時間(約332日)であり,実験後は,X線回折,熱重量測定を行うとともに,実験試料の走査型電子顕微鏡における観察・画像解析から各鉱物量の測定を行った.かんらん石と斜長石の境界から離れた箇所では蛇紋石+ブルース石+磁鉄鉱が生成する一方で,境界から約1.5mm内において,SiやAlの交代作用の進行とともに特徴的な組成累帯構造をもったAlに富む蛇紋石(Al蛇紋石)の集合体を生成させることを見いだした.Al蛇紋石のAl量は,コアからリムへかけて一旦減少し再び上昇する傾向をとる.Alの量が低い累帯構造の中心付近では,明瞭な輪郭が観察される.この明瞭な輪郭は元のかんらん石の外形を示し,反応フロントが元のかんらん石の内側と外側に進行していると解釈される.かんらん石内部への内側への反応は, Mg, Fe及びSiが除かれる蛇紋石化反応であり,そのMg, Fe及びSiが空隙まで輸送されて外部から供給されたSiと反応して外側の蛇紋石部分が成長することを見出した.実験物と類似した組織が天然試料からも観察されることから,このようなプロセスが広く起きており,Alのゾーニングから反応経路を推定すること可能であることを示唆する.予定されていた水熱実験の実行・解析が修了し,論文執筆にとりかかっている.また,天然岩石の解析も順調に勧められている.これらは当該年度、国内学会発表と国際誌への掲載という形で、研究成果となっている。本年度は,昨年度行ったかんらん石ー斜長石ー水系における水熱実験(230度, 2.8Mpa)の実験結果のさらなる解析を試みた.水熱実験において,かんらん石と斜長石の境界付近においては磁鉄鉱が生成しなかった.磁鉄鉱の生成について,Perple X (Conolly, 2009)を用いたシュードセクションによる解析を行った.シュードセクションの作成にあたって,通常の熱力学データベースには含まれていない3価鉄を含む蛇紋石の熱力データを作成し,3価鉄の挙動を考慮した.結果,磁鉄鉱の生成はシリカ活動度と酸素フガシティーよって支配されていることが明らかになった.斜長石から高いシリカ活動度を持つ流体が拡散するため,磁鉄鉱が境界付近で生成しなかったのだと解釈される.かんらん石をバルク組成とした場合の3価鉄の蛇紋石の量は最大で3vol%程度で,シリカ活動度が高いほど少なくなる傾向がある.反応の過程で,2価鉄が3価鉄へ変化すると水素が発生する.このことは,海洋底における水素のフラックスを決定する重要な知見である.また,実験で観察されてアルミニウムの量の反応帯について,流体と固相感の局所平衡を仮定した反応ー輸送モデリングを行った.結果,実験で観察されたAlの量のプロファイルを概ね再現することに成功した.これらの成果はJournal of Petrologyに受理された(Oyanagi et al., 2018).今後は天然岩石の解析をすすめ,水熱実験との比較を行う.三波川変成帯の,蛇紋岩と泥質片岩の境界に観察される滑石やトレモライトの反応帯の形成メカニズムを,実験との比較を含めて議論する.これらの研究成果を国内外の学会での発表及び国際誌への投稿を行う。また、現在投稿準備中及び査読中となっている研究成果を雑誌論文としてまとめる。
野外における森林・林業教育のあり方と教育手法に関する研究

本研究は,野外における森林教育・林業教育のあり方について,その理念と今後の課題,森林教育の現状,森林教育効果の把握手法に関して,多面的に検討したものである。また,ドイツ(フライブルク)とイギリス(ロンドン,他)で,森林教育関連事項の予備的なインタビュー調査を実施し,それぞれの国民の森林観,とくに林業観について日本人と比較・検討した。森林教育の理念と今後の課題については,これまでの実践の中で得られた野外活動の意義上可能性,また活動上の留意点について具体的に明らかにするとともに,森林教育研究の意義と課題についても整理した。森林教育の現状については,岩手県,秋田県,福島県の事例をとりあげて調査・検討した。主として林業家が主体的に教育活動を実践している事例分析からは,林業関係団体などが市民,行政と協力しつつ林業家を後押しするシステムを構築することで,市民の動きと連動した森林教育実践が可能になること,また行政による森林インストラクターの養成活動は,インストラクターが活躍できる場を確保しつつ,活動の場となるソフトの運営などはフレキシブルな対応が可能なNPO等の民間団体に依拠して進めることが有効なことを明らかにした。森林教育効果の把握は,質問紙法,ビデオカメラを用いた児童の行動分析,森林活動家のライフヒストリーの分析等を試み,それぞれの手法の有効性を明らかにした。海外調査では,とくにドイツ人と日本人において自国の林業に対する認識や評価のあり方が大きく異なっていることを明らかにした。学会セッシヨン「森林教育の課題と展望」では,森林教育の目標は多様であり得るが,実践においては目標の明確化が重要であり,また教育を実施する側が楽しく実践できる取り組みを創造していくことが重要であることが浮き彫りにされた。平成11年度は,11月にドイツ連望共和国のフライブルク市を訪問し,小学校の教科書等の森林および林業に関する記述部分の資料収集,散歩などで森を訪れる市民へのインタビュー調査等を実施した。得られた資料から,小学校においては,混交林と単純林(モノカルチャー)との違い等が早い時期から教科書に盛り込まれており,またわが国では大学のみで講義されている森林の取り扱いの種類等についても,ギムナジウムの教科書等に詳しく紹介されていることが分かった。また,市民への聞き取り調査では,近郊のシュバルツバルトの森と人との歴史や林業の姿についての知識が,全体として豊かであることが分かった。つぎに本年度は,森林や林業に関して,すでに何らかの行動を起こしている東北地方の森林ボランティアリーダーをはじめとした「森林活動家」のライフヒストリー(生活史)調査も実施した。その結果,森林活動家には中学生時代までに薪集め等の生活に深く関わった形での森林体験を有している人が多く,これら子どもの頃の経験が後のボランティア活動に踏み出す条件を作り出していると考えられた。このほか本年度は,岩手県盛岡市内のU小学校および北上市内のK中学校において,森林教育を実践し,児童・生徒の授業時の反応や森林に対する認識の変化を観察法やアンケート調査法によって検討した。U小学校(5年生)では林間学校の前に小学校近郊の森林でフィールド活動と事前授業を実施し,林間学校での森林学習を単発で終わらないように系統だった森林教育を実施した。また,K中学(2年生)では学校林を利用した森林調査活動,樹木マップづくり等の取り組みを行った。これらの取り組みで得られたデータは,次年度のデータと合わせて分析する予定である。平成12年度は,9月に英国のロンドン周辺および英国南部地域の森林公園を訪問し、森林局のスタッフ等から聞き取りを行うとともに、一部、公園来訪者へのインタビュー調査も実施した。調査の結果、英国でも日本と同様に、林業についての市民の認識には否定的な傾向があり、森林局スタッフからは、子どものころから林業教育の取り組みが弱いという問題点の指摘が聞かれた。

また、現地の公園インストラクターからは、来訪者が「なぜ森の木をきるのか」と聞かれた時には林業の伐採→植栽→伐採のサイクルの話をして説得する等の、市民への教育的対応の状況を知ることができた。つぎに本年度は,小学校(5年生)の森林学習のための遠足に同行し、6名の被験者児童を選び、小型ビデオカメラを児童の頭部にとりつけて森林散策してもらう方法で、野外活動時の児童の行動について把握する取り組みを行った。その結果、ビデオ情報からは、事後の感想文等からは得られない児童の自然に対するリアルな感動の様子や活動の終盤では集合時間を気にしながら行動する等のいくつかの行動の特徴がうかがえた。サンプル数が少ないため明確な結論を得ることはできなかったが、(1)自然認識を深めるための森林散策活動では、ゆとりをもたせた自由行動の時間が必要なこと、(2)自由行動をベースとした活動のなかに作業的な要素の強い課題を含めることには問題があるかもしれないこと等、ビデオと事後の感想文等をあわせることで今後の野外活動の改善につながる貴重な情報が得られた。このほか本年度は,盛岡市内および北上市内の中学校で同一の森林に関する授業を実践し,事前・事後にアンケート調査を行うことで生徒の授業の受けとめ方等について分析した。また、北上市内の中学校では、学校林の利用の仕方をテーマにワークショップ形式の授業を実践し、生徒の反応について検討した。平成13年度は,小学校(5学年)で試行された一連の「森林野外活動」を対象に,児童の意識変化を捉える目的で自由連想法アンケートや児童の学習記録(ポートフォリオ)等を分析した。自由連想アンケートでは、1回目から2回目、さらに3回目と森林学習の回が重なるのに伴い全ての刺激語に対する平均解答語数が著しく増加し、一連の野外活動によって森林に対する児童の知見、イメージが広がる様子が捉えられた。またこれまでほとんど自然と触れ合ったことのない児童は,身近な自然に触れることで感動した様子がみられたが,普段から身近な自然に接している児童は,遠方の林間学校エリアの森林において,より多くの刺激を受けた様子が確認された。以上の検討の結果、過去の自然体験レベル等に個人差がある集団においては、発表会等などの児童相互の意識を共有する取り組みや、複数の異なるフィールドで活動を行うことが森林教育活動では有効であることがわかった。また,森林等をフィールドとした野外学習活動におけるポートフォリオ評価のあり方については,指導する教諭によって児童のポートフォリオの量と質に相当の違いが確認されたことから,評価の前提となる指導のあり方を検討する必要性があると考えられた。この他,本年度は研究のまとめの意味を含めて,学会セッションで「森林教育の課題と展望」を企画し,現場の先生方と研究者が集って森林教育の概念,実践課題等について意見交換する場を設定した。セッションの議論では,森林教育の目標は多様であり得るが,実践においては目標の明確化が重要であり,また教育を実施する側が楽しく実践できる取り組みを創造していくことが重要であることが浮き彫りにされた。
レチノイドによるアンドロゲン依存性増殖因子の転写制御

アンドロゲン依存性マウス乳癌細胞(SC-3)はアンドロゲン依存性に著明な細胞増殖促進を引き起こすのみならず、レチノイドであるレチノイン酸にても軽度ながら増殖促進が認められる。さらにレチノイン酸はweak androgen agonist(WAA)の細胞増殖作用を相乗的に促進した。本研究はこれらの分子機構の解明を目的に行った。SC-3細胞はアンドロゲンによりFGFファミリーであるandrogen-inducedgrowthfactor(AIGF)が誘導されることが判明しているため、AIGFのantisense oligonucleotides(AS)を用いて上記の現象を解析した。AIGF ASはアンドロゲン依存性増殖を完全に抑制したことによりAIGFがアンドロゲンによる唯一の自己増殖因子であることが判明した。しかしAIGF ASはレチノイン酸のDNA合成促進には影響を与えなかった。一方レチノイン酸のAWWとの相乗的なDNA合成促進に対してAIGF ASはほぼ完全に抑制した。この結果はレチノイン酸がWAAのAIGF合成促進のステップのレベルで相乗的に作用していることが示唆された。このことはNorhtern blotによるAIGF mRNAの解析にても同様の結果を得た。最近我々はSC-3細胞においてアンドロゲン刺激によりc-myc mRNAが誘導されることを見いだした。さらにc-myc ASによりアンドロゲンおよびAIGFによるDNA合成促進が完全に抑制された結果よりAIGFのsignal pathwayにc-mycが必須の因子であることが判明した。c-myc ASはレチノイン酸によるDNA合成促進に対して影響を与えず、レチノイン酸とAWWのDNA合成促進に対しては抑制した。以上の結果よりレチノイン酸は単独でAIGF以外の増殖因子を介して細胞増殖を促進する機構と、AWWによるAIGFの誘導作用を増強する機構の2つのpathwayが存在することが明らかになった。
多原子系のための結合の組替えを許す新しい分子動力学法の開発

1.分子動力学計算用の、多原子系のための結合の組替えを許す新しい原子間ポテンシャル関数である、ダイナミックボンドポテシシャルを開発した。結合手の数が、1本、2本、4本と異なるH,0,Siを含む系用のポテンシャルのパラメータを決定した。そのポテンシャルを搭載した、分子動力学計算プログラム(能勢-Hoover形式の温度制御アルゴリズム、Parrinello-Rahmanの圧力制御アルゴリズム、を使用可能)を完成させた。本手法により、結合手の数が3本のNを含む系も扱うことが可能であり、現在ポテンシャルパラメータを決定している。従って、当初予定した酸窒化膜/Si界面構造のモデリングを行うには至らなかったが、既存のSi_2O系のポテンシャルを使用し酸化膜/Si界面構造のモデリングを行い、以下の成果を得た。2.昨年度に、SiO_2/Si(001)界面構造の大規模なモデリングを行い、熱成長SiO_2膜は完全には非晶質ではなく、元の結晶Siの残余秩序を保持していることを明らかにした。本結論は、これまで非晶質と考えられてきた熱成長SiO_2膜の描像を変える革新的な知見である。本年度は、この研究に関する袖強計算を行い、その結果も含めて、成果を学術論文にまとめた。(Phys.Rev.Bに掲載)3.成膜温度と成膜後の熱処理によって熱成長SiO_2膜の構造が如何に変化するかを、大規模な構造モデリングとX線回折実験の両方で調べた。熱酸化膜からの回折ピークの位置と強度は、熱酸化膜の構造を非破壊且つ定量的に評価する新しい指標になり得ることを指摘した。熱成長SiO_2膜の熱履歴依存性を元の結晶Siの秩序の消失過程というこれまでにない視点から議論した。(JJAPに掲載)4.SiO_2/Si(111)界面構造のモデリングを行い、SiO_2/Si(001)界面構造のモデリングの結果と比較した。Si(001)上とSi(111)上の熱成長SiO_2膜の残余秩序は、方向と周期において全く異なることを示し、熱成長SiO_2膜の基板面方位依存性について明確な理解を与えた。(JJAPに掲載)5.上記の実績を踏まえて、最近注目を集めたSiO_2/Si(113)界面構造のモデリングを行い、X線回折特性やその他の構造特性を理論的に予測した。X線回折に関する理論予測の結果の一部を実験的に確認した。6.熱成長SiO_2膜中の酸素分子と酸素原子の拡散過程の詳細を、第一原理分子軌道計算によって明らかにした。(JJAPに掲載)本年度は、多原子系のための結合の組替を許すポテンシャルの関数形を定めた。また、大規模分子動力学計算技術の応用として、当研究室で既に開発済みのSi, O、2原子系のポテンシャル関数を使ってシリコン熱酸化膜の大規模モデリングを行った。(1)ダイナミックボンドポテンシャルの完成結合相手を決定する要素を、sp3混成分子軌道の関数形をもつ指向性のある関数で表現し、それ自体を運動させる。結合の有無は、各々の原子の結合手関数の重なり積分によって判断される。現在のところ、O_2分子の取り扱いを可能にした。極座標系とデカルト座標系が混在する複雑な式となったが、運動方程式・内部ストレステンソルを正確に求め、この系の分子動力学計算を実現した。温度制御、圧力制御法を併用した場合でもハミルトニアンが保存することを確認した。今後は、Si, H, O, Nに関して各パラメータを詳細に決定する必要がある。(2)シリコン熱酸化膜からのX線回折パターンの再現酸化膜厚10nm(12000原子)という巨大酸化膜模型を、初期構造としての結晶シリコンに表面から酸素原子を一個ずつ導入していく過程を経て、作成した。これにより、熱酸化膜からのX線回折パターンの再現に世界で初めて成功した。バルクシリコンの111Bragg反射から伸びるCTR上に、ラウエ関数型の強度分布をもつピークが再現された。酸化膜は単なるアモルファスではなく、元のSi結晶に由来する秩序を残していることが本研究で明らかとなった。本成果は、2002年秋季学術講演会(新潟大学・五十嵐キャンパス)で発表され、"第13回応用物理学会「講演奨励賞」"を受賞した。

本年度は、この研究に関する袖強計算を行い、その結果も含めて、成果を学術論文にまとめた。(Phys.Rev.Bに掲載)3.成膜温度と成膜後の熱処理によって熱成長SiO_2膜の構造が如何に変化するかを、大規模な構造モデリングとX線回折実験の両方で調べた。熱酸化膜からの回折ピークの位置と強度は、熱酸化膜の構造を非破壊且つ定量的に評価する新しい指標になり得ることを指摘した。熱成長SiO_2膜の熱履歴依存性を元の結晶Siの秩序の消失過程というこれまでにない視点から議論した。(JJAPに掲載)4.SiO_2/Si(111)界面構造のモデリングを行い、SiO_2/Si(001)界面構造のモデリングの結果と比較した。Si(001)上とSi(111)上の熱成長SiO_2膜の残余秩序は、方向と周期において全く異なることを示し、熱成長SiO_2膜の基板面方位依存性について明確な理解を与えた。(JJAPに掲載)5.上記の実績を踏まえて、最近注目を集めたSiO_2/Si(113)界面構造のモデリングを行い、X線回折特性やその他の構造特性を理論的に予測した。X線回折に関する理論予測の結果の一部を実験的に確認した。6.熱成長SiO_2膜中の酸素分子と酸素原子の拡散過程の詳細を、第一原理分子軌道計算によって明らかにした。(JJAPに掲載)
日本とイタリアにおける芸術交流―１４世紀フランシスコ修道会の布教活動を中心に―

本研究の成果として、先ず第一に、これまで包括的に論じられることのなかった「フランシスコ会のアジアへの宣教美術」を研究対象として取り上げ、その14世紀の始まりから1597年長崎での日本二十六聖人殉教という歴史的事件、さらにその後の発展という長い歴史的スパンでとらえ、いくつかの重要な指摘を行なったことにある。従来、アジアにむけての宣教美術はイエズス会が1540年にフランシスコ・ザビエルをインドのゴアへ派遣したことを端緒とし、その後1549年に日本へ、さらに1561年中国への布教にともない流布したと考えられてきた。一方、フランシスコ会に関しては、彼らがどの程度、宣教用のための美術表現に心を砕き、実作品を残したかは、限られた現存作を除いて謎に包まれている。こうした状況のなか、本研究によりフランシスコ会の宣教美術が、イエズス会創設より100年以上も早く、1430年代にはインドのタナにおけるフランシスコ会士の殉教を契機として誕生し、ヨーロッパの人々に享受されていたことが明らかとなった。ただしこの絵画はアジア向けのものではなく、西洋カトリック世界に向けられ、本修道会によるアジア宣教の成果を宣伝し、その社会的地位、信仰の正当性を示すために機能したようである。本研究では、当時の貴重な現存作品として、リヴェッロ、サンタントニオ聖堂「日本二十六聖人」壁画を新たに発見し、極東のキリシタン殉教伝が17世紀前半のイタリアでいち早く聖堂内装飾に取り入れられていたことも明らかにした。これは修道会本部における日本殉教伝画像の受容を示す作例としてきわめて重要な発見である。上記の研究成果について、研究分担者であるシンベーニ氏は2017年5月に台湾の輔仁大学において講演を行い、また同10月には立教大学にてヴェローナ大学教授ティツィアーナ・フランコ氏と共に研究会を実施し、今後のさらなる発展について計画を進めている。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
原子核におけるエキゾチッククラスター構造の研究

複数のエキゾチックなクラスター構造を発見し、その出現機構を明らかにした。12C、16Oのリニアチェイン構造がα凝縮構造を持つことを明らかにした。また、12Cのガス的なホイル状態やリニアチェイン構造の出現やバンド構造や遷移確率にシェルモデル的構造の混合が本質的な役割を果たしていることを明らかにした。9Li、11B、14C、14Nの性質においてもクラスター構造の発達が大きな影響を与えていることを明らかにした。本課題の目的は、「エキゾチックなクラスター構造を発見し、その出現機構を明らかにする」、ということである。この目的の前半部分に対する成果として、2つのエキゾチックな構造を発見した。ひとつは中性子過剰な9Li原子核においてα+tクラスター構造が発達し、そのまわりの分子軌道に余剰中性子がつまる、という構造であった。これは2αクラスター構造が発達し、その回りで分子軌道が構成され、その軌道を余剰中性子が占有する、という構造で理解できるBe同位体と類似していた。この成果は非α粒子を構成要素とするクラスター構造においても、分子軌道が形成され得ることを示唆しており、出現法則確立の上で、手がかりとなる。またこれらの構造が、非弾性散乱の角度分布に影響を与えることも示した。もう一つは、12C、16Oの励起状態において現れると期待されているリニアチェイン構造に対する発見であった。リニアチェイン構造はαクラスターが直線状に並んだ構造を持ち、実験、理論の両面から半世紀程度議論されている重要な研究対象である。この構造は伝統的に局在した構造を持つと考えられてきたが、実はαクラスターが一次元上でα凝縮した構造を持つ、ということを示した。12C、16Oは安定核であるものの、原子核における一次元α凝縮構造は申請者らによって初めて提唱されたものであり、非常に重要な発見と言える。この結果は伝統的に局在していると考えられていた多くのクラスター構造が、実は非局在の描像で理解しなければならない可能性を示唆しており、クラスター物理の新しい局面を開き得る成果である。複数のエキゾチックなクラスター構造の性質を明らかにした。まず、11Bにおける2α+tクラスター構造のガス的性質を議論し、角運動量の制限からくる自明な相関を除くとガス的状態として知られるHoyle状態によく似た構造を持っていることを明らかにした。また、12CにおいてHoyle状態やリニアチェイン状態といったエキゾチックな構造を持った状態が現れるのに、直観的にはクラスター構造とは無関係に思えるクラスターの壊れたシェルモデル的構造の様々な状態への混合が本質的な役割を果たすことを明らかにした。また関連する課題として、放射性炭素年代測定に使われている14Cから14Nへのβ崩壊が起きる確率に基底状態におけるクラスター構造の発達の程度が重要な役割を果たしていることを明らかにした。またクラスター崩壊の崩壊幅を簡単に求める近似的手法を開発し、20Neにおける16O+αチャンネルや8Beにおけるα+αチャンネルの崩壊に適用し有用性を確認した。未完成の課題として、中性子過剰な炭素同位体の13Cや16Cに現れるエキゾチックなクラスター構造の理論的探索を行い、ガス的状態やリニアチェイン状態に類似した状態を発見した。現在、どのような機構で現れたか解析中である。また現実的核力から出発したクラスター構造の研究を行うための模型、テンソル最適反対称化分子動力学法の開発に着手した。これは基底波動関数として相関演算子をかけた反対称化分子動力学波動関数を採用することで効率的にテンソル相関を取り込むという手法である。26年度が最終年度であるため、記入しない。原子核理論26年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していた16Cの構造については大きな進展を得られなかった。これは、余剰中性子が多くなると、余剰中性子の配位の取り扱いが困難になり、今まで用いてきた手法である反対称化分子動力学では、高い励起状態の中に記述できない状態が現れてくるからである。一方で想定外の進展があった。特にリニアチェイン構造が一次元α凝縮した構造を持つ、ということを示した成果は原子核物理においてまったく新しい成果であり、非常に重要な発見をしたといえる。この結果は伝統的に局在していると考えられていたクラスター構造が、実は非局在の描像で理解しなければならない可能性を示唆しており、クラスター物理の新しい局面を開き得る成果である。このような大きな結果をあげられたことと、当初の予定を達成できていないことを合わせて「おおむね順調に進展している」と判定した。今後は16Cの構造について確実な結果を出せるように注力する。反対称化分子動力学を用いて構造計算を行うと16Cでは2つのエキゾチックな構造(ガス的構造とリニアチェイン構造)が現れるが、これらの構造の安定化機構を解析する。これらの構造は反対称化分子動力学を用いた計算では、かなり安定した構造として現れるので、これらの構造に限って研究を進めることにする。

まずリニアチェイン構造であるが、拡張した分子軌道模型を用いて中性子の配位に対する曲がりのモードに対する安定性を調べる。16Cのリニアチェイン構造は12Be+αクラスター構造を持っているが、この12Beについた余剰中性子とαクラスターの中の中性子との反対称化の効果により曲がりのモードが阻害される効果が存在する可能性がある。またガス状態はその状態の正確な記述のためには多数の配位の重ね合わせが必要であるが、現時点の計算ではこれが不十分であることがわかっている。これを達成するためにStochastic法を採用する。この方法は、多数の配位を重ねあわせるときに、確率的手法を用いて、記述しようとしている系に対して重要な配位だけを効率よく取り出す、という手法である。この方法は昨年度の一次元α凝縮構造の研究において、ガス的なクラスター構造の記述に対して有用であることを確認している。これを達成し、昨年度の成果と合わせて、エキゾチックなクラスター構造の出現法則について知見を与える。
超短命アフリカメダカは神経精神疾患モデルとなり得るか？

本研究では超短命の脊椎動物であるアフリカメダカにおいて加齢以外になんら特別な処置なしに、ヒトパーキンソン病に酷似した病変が進んでいくことを見いだしました。すなわちアフリカメダカは加齢依存性に神経変性およびαシヌクレイン陽性の凝集体の進展を示しました。これはまさにヒトパーキンソン病病理に瓜二つと言えます。Nothobranchius furzeriのドパミン神経およびノルアドレナリン神経の解剖図譜を、anti-Tyrosine Hydroxylase抗体を用いて作製することに成功した。その結果、ドパミン神経およびノルアドレナリン神経の分布は、申請者がこれまで解析してきたメダカやゼブラフィッシュと同様であった。老化による神経変性の影響を検討するために、1ヶ月齢および3ヶ月齢においてドパミン神経およびノルアドレナリン神経の細胞数をカウントした。1ヶ月齢の成魚では青斑核に平均22個のノルアドレナリン神経を認めた。驚くべきことに加齢以外に特別な負荷をかけなかったにもかかわらず、3ヶ月齢でノルアドレナリン神経が著明に減少し、5ヶ月齢ではほぼ消失していた。ドパミン神経の変性は時間的に、ノルアドレナリン神経より後期であった。アフリカメダカはアフリカのモザンビーク等に棲息する年魚と言われる種類の小型魚類です。この小型魚類は脊椎動物で最もあるいは2番目に短命だと言われています。35ヶ月で短い一生を終えるサイクルは内因的なものであり、野生のみならず実験室内でも再現されます。さらにわずか12ヶ月で臓器の萎縮、運動能力の低下、癌の発生頻度の上昇など、老化の様々な兆候を示します。もちろん小型魚類一般のモデル動物としての利点は同様に有しており、老化やそれに伴う疾患の新しいモデルとなると期待されます。本研究申請ではアフリカメダカを神経疾患のモデル動物として樹立することを目的としました。研究期間内に申請者らはこの超短命の脊椎動物であるアフリカメダカにおいて加齢以外なんら特別な処置なしに、ヒトパーキンソン病に酷似した病変が進んでいくことを見いだしました。すなわちアフリカメダカは加齢依存性にドパミン・ノルアドレナリン神経の変性を示し、αシヌクレイン陽性の凝集体病変は脳幹脊髄あるいは腸管自律神経から全中枢神経へ連続的に進展を見せました。このような所見は外観の類似した他種の小型魚類であるメダカやゼブラフィッシュでは全く観察されません。これらの結果から老化がパーキンソン病の発症に強く関わっていることが示唆されます。この自然発生のヒト疾患モデルは大変貴重であり、今後さらに詳細な解析を続けていきます。想定通り加齢による神経変性が確認できた点は大きい。また飼育方法を樹立した点も今後につながる。神経内科学このような加齢のみによる著明な神経変性を来すモデル動物は、申請者の知る限り報告はなく、マウスや類似の小型魚類であるゼブラフィッシュ、メダカでも観察されない。初年度は引き続き本解析を継続するとともに、in situ hybridizationを用いてドパミン神経とノルアドレナリン神経の解剖図譜をさらに詳細なものとする。またノルアドレナリンやドパミンの減少を生化学的にも定量する特にノルアドレナリン神経の変性が、ドパミン神経の変性よりも顕著であることは注目に値する。というのは実際のヒトパーキンソン病においても、末梢交感神経などから、青斑核、黒質、大脳と病変が連続的に末梢から進行するというBraak仮説が有力なものとして提唱されており、Nothobranchius furzeriの加齢依存性神経変性もそれと類似するからである。末梢病変の検索を進めながら、かつαシヌクレインおよびユビキチンを免疫染色し、凝集体の存在を検索する。またその凝集体の進展を齢を追って解析し、Braak仮説が脊椎動物一般に受け入れられる説であるかどうかを検証する。薬物負荷や遺伝子操作は、その投与経路や操作方法により、必然病変好発部位が存在し、Braak仮説の検証には適さないことがある。これは特に薬物負荷や遺伝子操作を行っていない、加齢だけが負荷因子の本モデルでは容易な検証である。また、並行してNothobranchius furzeriのより簡易な継代方法を開発する。古典的にはピートに産卵させるが、ピート内の卵は検卵する手間が大変であり、またいくつか休眠状態に入ってしまうため、せっかくの本モデルのスピードを十分に活かすことができない。申請者はすでに、砂へ産卵したものを同日中にシャーレに0.3%食塩水をいれて28°Cで保持すると、休眠に入る個体数が少ない事を見いだした。その飼育方法をさらに最適化し、休眠のない、迅速な老化疾患研究に適したモデル動物へと試行を繰り返す。まとめ買いなどにより、わずかに消耗品費が押さえられた。また中古機器の購入で機器代金も押さえたため。アフリカメダカの飼育費、および切片解析と生化学解析に使用する。
高温処理自家骨移植の同化促進

SDラットの長管骨について新鮮骨、70度処理骨(70度15分)、オートクレーブ処理骨(120度10分1.2気圧)それぞれを0.010.5mmに砕片化し、10%牛胎児血性添加RPMI1640を用いた単層培養系で、ラットの血管内皮細胞と共に5%C02条件下で培養した。培養後3日、5日、7日での血管内皮細胞の増殖について、トリプシン処理を行って細胞を単離し、細胞数をカウントしたが、3群ともにコントロール群に比較して増殖能は低下することはなかった。またオートクレーブ処理骨群では新鮮骨や70度処理骨に比較して、血管内皮細胞の増殖が促進される傾向を認めたが、有意差は認めなかった。さらにVCAM-1とカドヘリンの免疫組織染色を行ったが、明らかな染色性の差を認めなかった。血管内皮細胞と各処理骨の接着性について走査型電子顕微鏡による観察を行ったところ、オートクレーブ処理骨への接着性は良好でもっとも細胞数が多く観察でき、ついで70度処理骨、新鮮骨の順に接着している細胞数が減少した。人体における処理骨の同化速度は、新鮮自家骨が最も良好で、70度処理骨、オートクレーブ処理骨の順に遅れることが確認されている。まず破骨細胞が接着し、ついで骨芽細胞が接着し、リモデリングが行われる人体での骨同化過程と、血管構築過程とは逆転することを理解した。この機序を規定しているサイトカインの動きについて、さらに検討することにより、各種処理骨をさらに早く同化させうる条件を解明できるものと考えている。温度処理骨の温度条件によるコラーゲン変性の程度や骨基質内の因子活性の変化が骨芽細胞の分化や増殖にどのような影響を与えるかについて検討する目的で以下の実験を行った。方法:SDラット骨髄細胞を培養し、骨芽細胞様細胞を分離した。SDラットの長管骨を70度15分処理(70度群)したものと、120度10分(120度群)したものを作成した。新鮮自家骨(自家骨群)と合わせて3群の骨について0.010.5mmに粉砕し、同量培養フラスコに散布した後、骨芽細胞様細胞を同数培養し、培養3.5.7日の培養液を採取し、I型コラーゲン量とオステオカルシン量を定量した。また骨を入れないものをコントロール群とした。結果:コントロール群に比し、3群共細胞増殖能は低下する事はなかった。120度群は70度群や自家骨群に比較して、3.5.7日ともI型コラーゲン量P<0.0002,オステオカルシン量P<0.0001と有意差をもって高値を示した。120度群ではオステオカルシン量は徐々に減少する傾向を示したが、I型コラーゲン量は逆に増加する傾向を示した。考察:120度群ではコラーゲン変性が強く非生理的な環境である為、骨芽細胞様細胞はまず細胞分化をし、オステオカルシンを産生すると共に、I型コラーゲンを合成して、自らの環境を整えたと考えられる。一方70度群は自家骨群とオステオカルシン量・I型コラーゲン量共同様であった。これは骨芽細胞様細胞にとって70度処理した骨は自家骨と同じ環境として認識していることと解釈できる。今後細胞増殖能を詳細に検討すると共に、アルカリフォスファターゼ活性を検討し、FGF.PDGF等の活性因子の影響を検討する予定である。骨芽細胞様細胞を砕片化した新鮮自家骨と培養した系(自家骨群)、70処理骨と培養した系(70度群)、オートクレーブ処理骨と培養した系(120度群)について、培養液中のオステオカルシン(OC)濃度、I型コラーゲン濃度(I-coll)濃度を培養3.5.7日に経時的に測定した。新鮮自家骨群は骨を加えず培養したコントロール群と差を認めず、120度群がOC,I-coll共に最も高値を示し、70度群は中間の値を示した。またOCについては、120度群は漸減傾向を示したが、I-collについては、漸増傾向を示した。70度群については、培養後の変化は明らかでは無かった。オートクレーブ処理骨と接した骨芽細胞様細胞は、細胞接着環境を整える目的でまずOC活性を高め、細胞分化を促進し、I-coll産生が徐々に増加したと考えられる。70度群では、120度群に比較してより生理的な条件であるため、自家骨群により近い傾向を示したと解釈できる。さらに細胞増殖能については、70度群は培養5日を経て急速に増加したが、120度群は培養後より急速な増加を示し、5日には平衡状態となった。砕片化した骨に対する骨芽細胞様細胞の接着性の差と骨芽細胞様細胞誘導物質の産生の差が考えられた為、培養早期の走査電顕を行うと共に、骨成熟の目安としてのアルカリフォスファターゼ染色を行っている。また骨外細胞誘導物質については、二漕式培養系において、コンディションドメディウムを用いた検討を行っている。

培養後3日、5日、7日での血管内皮細胞の増殖について、トリプシン処理を行って細胞を単離し、細胞数をカウントしたが、3群ともにコントロール群に比較して増殖能は低下することはなかった。またオートクレーブ処理骨群では新鮮骨や70度処理骨に比較して、血管内皮細胞の増殖が促進される傾向を認めたが、有意差は認めなかった。さらにVCAM-1とカドヘリンの免疫組織染色を行ったが、明らかな染色性の差を認めなかった。血管内皮細胞と各処理骨の接着性について走査型電子顕微鏡による観察を行ったところ、オートクレーブ処理骨への接着性は良好でもっとも細胞数が多く観察でき、ついで70度処理骨、新鮮骨の順に接着している細胞数が減少した。人体における処理骨の同化速度は、新鮮自家骨が最も良好で、70度処理骨、オートクレーブ処理骨の順に遅れることが確認されている。まず破骨細胞が接着し、ついで骨芽細胞が接着し、リモデリングが行われる人体での骨同化過程と、血管構築過程とは逆転することを理解した。この機序を規定しているサイトカインの動きについて、さらに検討することにより、各種処理骨をさらに早く同化させうる条件を解明できるものと考えている。
「前競争的協働」時代の国際水産認証制度とエコラベルの役割変化に関する研究

水産物の持続可能性のための認証制度とエコラベル制度が導入された20年前は、持続可能な漁業とそうでない漁業を認証とエコラベルの仕組みを活用して、区別することが目的であった。しかし現在では、認証制度は「他社との差別化」を目的としたものから、協働のためのツールへと変化しつつある。それは、国際的にビジネスを展開する企業や団体が共同で、乱立する認証制度の質を審査する団体を設立する動きであったり、同じ魚種を養殖する水産養殖会社が、国をまたぐ協力により国際認証の取得を目指す動きなどである。この研究では、大多数が認証を取得すると認証の存在価値はどうなるのかや、より地域レベルでの取組との協働の可能性を探る。
高齢者の口腔看護データベースシステムの開発に関する基礎研究

【研究1】高齢者の口腔の実態を調査するための日本版Oral Assessment Guide(OAG)を用いたデータベースのデモ版の試行を実施した.本学の倫理審査委員会の承認を得た後に実施した.対象施設:北海道内の介護保険施設704施設の中から,2施設を機縁法にて選定した.対象と方法:調査期間2018年1月3月に札幌市内の特別養護老人ホーム2施設の入居者43名を対象にOAGによるスクリーニング検査,口腔内診査を実施した.対象者基本情報は,対象者及び施設管理者より使用許諾を得てカルテより収集し,分析した.2018年度の関連学会で発表する予定である.調査実施後,データベースの入力の研究協力者に意見をもらい検討し,データベースの項目と入力方法の修正することとした.【視察】2018年3月に国家で高齢者の口腔ケアシステムを運営しているPublic HealthWalesを訪問した.急性期病院ICUと高齢者施設の口腔ケア実践について,チャンピオンのシステムを視察し,実際に口腔ケアに使用している物品の紹介を受けた.英国ではスポンジブラシの使用による事故があり,シリコンブラシを開発し,使用していた.また,地域にある歯科スペシャルケア提供施設にて歯科医師・歯科衛生士と意見交換した.病院・施設ともに安心と安寧な環境を重視していた.ロンドンでは,セントジョージ大学病院を視察した.そこでは言語聴覚士が口腔システムを管理していた.【研究2】データベースの項目に口腔ケアの物品である歯ブラシやスポンジブラシについての項目を作成中である.【研究4】口腔ケア技術を可視化する研究を開始した.モーションキャプチャによる手技動作計測実験を専門職3名及び看護学生2名で実施し,CG映像制作を行った.専門職と初学者の看護学生との体の動きの違いが明らかになった.しかしながら,細かい手技動作については課題が残った.【研究1】高齢者の口腔の実態を調査するためにOAGを用いてデータベースのデモ版の試行を実施した.対象施設や研究協力者の支援で予定通りに実施できた.2018年度の関連学会で発表する予定である.調査の実施後,データベースの入力協力者に意見をもらい検討し,データベースの項目を修正することとした.2018年度早々に修正を完了し,【研究3】を開始できるように準備する必要があるため,おおむね順調に進んでいるとした.【視察】2018年3月に国家で高齢者の口腔ケアシステムを運営しているPublic HealthWalesを視察した.当初は,Public Health Walesだけの予定であったが,ロンドンのセントジョージ大学病院も視察でき,予想以上の成果であった.【研究2】データベースを作成に当たり,口腔ケアの物品である歯ブラシやスポンジブラシの項目について作成中であるため,おおむね順調に進んでいるとした..【研究4】口腔ケア技術を可視化する研究を開始した.モーションキャプチャによる手技動作計測実験を専門職3名及び看護学生2名で実施し,CG映像制作を行った.専門職と初学者の看護学生との体の動きの違いが明らかになった.今後は臥床している患者のケア提供時の実験をする必要性があるため,おおむね順調に進んでいる.【研究2】データベースを作成に当たり,口腔ケアの物品である歯ブラシやスポンジブラシの項目について作成を継続する.【研究3】横断研究:研究1で作成したデータベースを用いて高齢者の口腔内の実態を明らかにする.対象施設:北海道内の介護保険施設704施設の中から,78施設(1%を無作為抽出にて)選定し,データベースの使用の協力依頼をして実施する.協力施設が集まらない場合は機縁法にて行う.調査対象:400名程度.【視察】「国際的口腔ケアのスクリーニング方法の開発の検討」の会議が米国で予定され,その時にカナダのシステムを視察したいと考えている.【研究5】研究3で集積したデータを用いてOAGのスコアと口腔ケアの方法との関係を分析する.プロトコールの基準と標準的ケアを検討する.【研究4】口腔ケア技術を可視化する研究を開始した.モーションキャプチャによる手技動作計測実験を臥床している患者への口腔ケア提供時を状況設定して専門職3名及び看護学生2名で実施し,CG映像制作を実施する予定である.【研究6】研究3の前向きコホート研究及び肺炎発症とOAGスコアとの関連に関する研究の実施.調査時期:平成30年12月の予定である.【研究1】高齢者の口腔の実態を調査するための日本版Oral Assessment Guide(OAG)を用いたデータベースのデモ版の試行を実施した.本学の倫理審査委員会の承認を得た後に実施した.対象施設:北海道内の介護保険施設704施設の中から,2施設を機縁法にて選定した.対象と方法:調査期間2018年1月3月に札幌市内の特別養護老人ホーム2施設の入居者43名を対象にOAGによるスクリーニング検査,口腔内診査を実施した.対象者基本情報は,対象者及び施設管理者より使用許諾を得てカルテより収集し,分析した.2018年度の関連学会で発表する予定である.調査実施後,データベースの入力の研究協力者に意見をもらい検討し,データベースの項目と入力方法の修正することとした.【視察】2018年3月に国家で高齢者の口腔ケアシステムを運営しているPublic HealthWalesを訪問した.急性期病院ICUと高齢者施設の口腔ケア実践について,チャンピオンのシステムを視察し,実際に口腔ケアに使用している物品の紹介を受けた.英国ではスポンジブラシの使用による事故があり,シリコンブラシを開発し,使用していた.

また,地域にある歯科スペシャルケア提供施設にて歯科医師・歯科衛生士と意見交換した.病院・施設ともに安心と安寧な環境を重視していた.ロンドンでは,セントジョージ大学病院を視察した.そこでは言語聴覚士が口腔システムを管理していた.【研究2】データベースの項目に口腔ケアの物品である歯ブラシやスポンジブラシについての項目を作成中である.【研究4】口腔ケア技術を可視化する研究を開始した.モーションキャプチャによる手技動作計測実験を専門職3名及び看護学生2名で実施し,CG映像制作を行った.専門職と初学者の看護学生との体の動きの違いが明らかになった.しかしながら,細かい手技動作については課題が残った.【研究1】高齢者の口腔の実態を調査するためにOAGを用いてデータベースのデモ版の試行を実施した.対象施設や研究協力者の支援で予定通りに実施できた.2018年度の関連学会で発表する予定である.調査の実施後,データベースの入力協力者に意見をもらい検討し,データベースの項目を修正することとした.2018年度早々に修正を完了し,【研究3】を開始できるように準備する必要があるため,おおむね順調に進んでいるとした.【視察】2018年3月に国家で高齢者の口腔ケアシステムを運営しているPublic HealthWalesを視察した.当初は,Public Health Walesだけの予定であったが,ロンドンのセントジョージ大学病院も視察でき,予想以上の成果であった.【研究2】データベースを作成に当たり,口腔ケアの物品である歯ブラシやスポンジブラシの項目について作成中であるため,おおむね順調に進んでいるとした..【研究4】口腔ケア技術を可視化する研究を開始した.モーションキャプチャによる手技動作計測実験を専門職3名及び看護学生2名で実施し,CG映像制作を行った.専門職と初学者の看護学生との体の動きの違いが明らかになった.今後は臥床している患者のケア提供時の実験をする必要性があるため,おおむね順調に進んでいる.【研究2】データベースを作成に当たり,口腔ケアの物品である歯ブラシやスポンジブラシの項目について作成を継続する.【研究3】横断研究:研究1で作成したデータベースを用いて高齢者の口腔内の実態を明らかにする.対象施設:北海道内の介護保険施設704施設の中から,78施設(1%を無作為抽出にて)選定し,データベースの使用の協力依頼をして実施する.協力施設が集まらない場合は機縁法にて行う.調査対象:400名程度.【視察】「国際的口腔ケアのスクリーニング方法の開発の検討」の会議が米国で予定され,その時にカナダのシステムを視察したいと考えている.【研究5】研究3で集積したデータを用いてOAGのスコアと口腔ケアの方法との関係を分析する.プロトコールの基準と標準的ケアを検討する.【研究4】口腔ケア技術を可視化する研究を開始した.モーションキャプチャによる手技動作計測実験を臥床している患者への口腔ケア提供時を状況設定して専門職3名及び看護学生2名で実施し,CG映像制作を実施する予定である.
タンパク質提示金ナノ粒子の大腸菌細胞質内調製法の開発

機能を持ったタンパク質がその表面に固定化された金ナノ粒子(AuNP)は、基礎科学からバイオテクノロジーに至る幅広い分野で利用されているナノ材料である。本研究では、酵素触媒により金ナノ粒子を調製する新たな手法に基づき、機能性タンパク質がその表面に提示されたAuNPを、生体内で一段階合成することを目標とした。具体的には、グリセロールデヒドロゲナーゼ(GLD)に金結合性ペプチドと抗体結合タンパク質(pG)を融合した組換えタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された大腸菌を金イオンとグリセロールの共存下で培養することで、抗体結合能を有するpGが提示されたAuNPを細胞質内に得ることに成功した。本研究では、目的タンパク質が適当な配向を持って提示された金ナノ粒子を細胞質内で一段階で合成する技術を開発することを最終目標として研究を行っている。具体的には、金親和性ペプチドを付加した組換えタンパク質の発現と生体触媒による金ナノ粒子合成とを連動させ、目的タンパク質の金ナノ粒子表面提示と、金ナノ粒子異方成長の促進の新たな可能性を探索する。この目標に向け、本年度は生体外での詳細な評価を先行して実施した。まず、大腸菌由来グリセロールデヒドロゲナーゼが触媒する酸化還元補酵素再生系に、金に親和性を有するタグを付加した機能性タンパク質を導入して、金ナノ粒子の調製と目的タンパク質による表面修飾を一段階で行う新規プロセスの構築を試みた。進化工学的手法により取得された既報の金結合ペプチドをモデルとして選択し、これをプロテインGのB1部位に融合させたモデルタンパク質を調製した。プロテインGは由来の異なる様々なIgG抗体のFcドメイン特異的に結合する性質を有することから、この人工タンパク質が金結合ペプチドを介して金ナノ粒子上に提示されれば、粒子上にIgG抗体を固定化可能な金ナノ粒子として利用できる。そこで実際にモデル融合タンパク質の発現・精製を行い、試験管内で酸化還元酵素が触媒する補酵素再生系と共存させたところ、融合タンパク質提示金ナノ粒子が得られた。得られたナノ粒子について、透過型電子顕微鏡観察および動的光散乱による粒径測定、表面電荷、粒径分布、IgG結合能等の評価結果を実施したところ、プロテインGが活性を保った状態で金ナノ粒子上に提示されていること、また、金親和性ペプチドタグとしてヒスチジンタグが有効であることを明らかとした。これらの成果を学術論文2編ならびに特許出願1件として纏めることができた。金ナノ粒子(以下、AuNP)は、基礎科学からバイオテクノロジー分野まで幅広く利用されているナノ材料である。特に、機能を有するタンパク質がその表面に固定化されたAuNPは、イムノクロマト等で利用可能なナノバイオ素子として広範な応用が検討されている。しかしながら、AuNPの化学合成と、タンパク質生合成の反応場は通常相容れないため、それぞれを個別に調製した上で、試験管内でハイブリッド化する2段階調製法が採用されるのが一般的である。本研究では、申請者らが最近確立した酵素反応を利用して金ナノ粒子を調製する新たな手法の反応場を、試験管の中から、生きた大腸菌の中へと移行することで、目的の機能を有するタンパク質がその表面に配向を持って提示されたAuNPを、細胞質内・一段階で合成する技術の確立を試みた。まず、グリセロールデヒドロゲナーゼ(GLD)が触媒する補酵素の還元反応場に、金結合性ペプチドを融合した抗体結合タンパク質(pG)を共存させることにより、抗体結合能を有するAuNPの調製が可能なことを確認した。次に、細胞質内には目的とするタンパク質以外にも多様な生体高分子が存在することを考慮し、単一タンパク質(酵素)成分で、pG修飾AuNPを調製することを試みた。具体的には、GLDとpGの融合タンパク質(pG-GLD)に金結合性ペプチドを付加することにより、GLD自身が触媒する過程で生じる金ナノ粒子に、pGが自発的に固定化される系を構築することに成功した。最後に、本融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌内に組み込み、金イオンとグリセロールの共存下で培養することで、抗体結合能を有する金ナノ粒子が組換え大腸菌内に生成することを確認し、当初の目標を達成した。生体分子工学初年度に掲げた目標は概ね達成できた。まず、3つの異なる機能(精製用タグとしてヘキサヒスチジンタグ(His-tag)およびグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、抗体結合ドメインとしてプロテインGおよびプロテインA、金結合ペプチドとしてA3ペプチド)を有する機能性タンパク質をデザインした。また、各ドメインが金ナノ粒子の形成や結合に与える影響を評価するために、A3ペプチドを欠損させたタンパク質および精製用タグを欠損させたタンパク質も調製し、総勢6種類の組換えタンパク質を精製し、E. coliグリセロールデヒドロゲナーゼ(GLD)による金ナノ粒子調製に供した。

その結果、汎用的に利用されているヒスチジンタグが、既報の金結合性ペプチドよりも、金ナノ粒子表面に対して高い親和性を有していることを明らかにできたことから、今後の分子設計に重要な知見が得られたと考えている。さらに、次年度の検討に向けて、新たにBacillus stearothermophilius由来GLD (BsGLD)を選択し、プロテインGとの融合タンパク質を調製することで、タンパク質修飾金ナノ粒子合成における、1ポット・1タンパク質成分系の構築に向けた基礎検討を実施した。BsGLDは結晶構造が明らかとなっている点で、大腸菌由来GLDと比べてより合理的な融合タンパク質の設計が可能である。上述の基礎研究で得られたデータを基に、論文投稿2編、特許出願1件を実施できたことから、研究は概ね順調に進展していると判断した。初年度の研究実績を踏まえ、異なる由来のグリセロールデヒドロゲナーゼを利用した1ポット金ナノ粒子合成系を、大腸菌の細胞質内で構築することを試みる。具体的には、BsGLDの高次構造情報を基に、機能性タンパク質と金結合ペプチドの双方を遺伝子工学的手法により融合させた新規キメラタンパク質を調製することで、単一タンパク質成分によるタンパク質修飾金ナノ粒子の一段階合成の深化を図る。さらには、共存イオン種と還元条件を変えることで、金属ナノ粒子の種類に幅を持たせると共に、例えばレアメタル廃液からの金ナノ粒子構築等、産業応用上意義深い系への適用に関する試みも実施する。一方、特異な性質を有するタンパク質が金ナノ粒子異方成長の促進に与える影響ついても検討したい。前者においては、グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素反応速度が金ナノ粒子の成長に与える影響と、細胞質内のタンパク質発現量やタンパク質提示金ナノ粒子の調製に与える影響を総合的に評価し、目的タンパク質が安定且つ確実に金ナノ粒子に提示される新たな方法論を確立する。一方、後者においては、不凍タンパク質等、これまで金属ナノ粒子の調製に用いられた例がないタンパク質を用いて、生体外での詳細評価を先行し、金ナノ粒子の異方成長とタンパク質提示の基礎データを得ることを目標とする。本年度は共同研究企業からの研究費が当初予想よりも多く配分されたため、最低限の必要経費としての消耗品ならびに論文添削費を執行した。当該共同研究は昨年度で終了したため、今年度は全ての経費を有効に執行する。