hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水銀耐性鉄酸化細菌とその遺伝子導入株による汚染土壌からの水銀除去回収技術の開発

自然界より単離された鉄酸化細菌約150株の中から6μMのHg^<2+>を含む二価鉄添加培地で増殖可能なAcidithiobacillus ferrooxidans SUG 2-2株を選抜した。SUG 2-2株並びに水銀耐性株が,二価鉄依存性の新規な水銀気化酵素を持っていることを明らかにした。更に,SUG 2-2株から精製したCytochrome c oxidaseが二価鉄の電子を用いて水銀を気化できることを示した。本株は水銀耐性で塩化水銀を含む水銀土壌,水銀廃液から水銀を選択的に気化回収することが可能で実用的にも応用可能なことを世界に先駆けて明らかにした。これらの環境浄化あるいはリーチングにおいて鉄酸化細菌を用いることは,重金属類を溶出しやすい酸性条件下で生育するために効率がよいこと,従属栄養細菌と異なり有機物の栄養源は必要としないことが揚げられる。中性条件における環境浄化等を考慮して,増殖が早い遺伝子導入株による検討については,様々な研究を重ねているが,報告の段階には至っていなく,今後の一つの課題とした。本研究の目的以外の大きな成果として,SUG 2-2株を調製してA.ferrooxidans MON-1株を得た。MON-1株は20μMのHg^<2+>を含む二価鉄添加培地で増殖可能で,SUG 2-2株に比べ二価鉄依存性の水銀気化活性が強化されていること。さらに有機水銀を分解するOrganomercurial lyase活性の存在を強く示唆し,今後の新たな応用技術としての展開が可能となった。鉄酸化細菌Acidithiobacillus ferrooxidans SUG2-2株は塩化第水銀(HgCl_2)に対して強い耐性を持っており,酸性条件下,二価水銀イオン(Hg^<2+>)を還元し金属水銀(Hg^o)を気化できる。SUG2-2株は,水銀の気化に関与する2種類の酵素活性,即ちNADPH-依存性の水銀還元酵素活性及びFe^<2+>-依存性の水銀気化活性を持っていることを再確認するとともに土壌処理の基礎研究を行った。SUG2-2株の酸性条件下における水銀気化能を実験水銀廃液からの水銀回収に利用するために,水銀廃液に存在していると思われる各種化合物のA.ferroxidans SUG2-2株の水銀気化活性に及ぼす影響を検討した。検討した化学物質のうち,AgNO_3(0.05mM),K_2CrO_7(1.OmM),システィン(1.OmM),トリクロロェチレン(1.0μM),界面活性剤(0.05%)等が,SUG2-2株の休止菌体(lmgタンパク質)と塩化水銀(0.7μM)を含む酸性水(pH2.5)からの水銀の気化活性を強く阻害した。一方,本株で処理する前に,トリクロロエチレンや洗剤等をフェントン法で前処理して分解しておくと水銀気化に対する阻害は無くなった。岡山大学の実験水銀廃液Aからの水銀の気化回収について検討した。二価鉄を添加した酸性水(pH2.5)20m1中に,水銀濃度として17.5nmolになるように実験水銀廃液び本株の休止菌体(タンパク質量0.05mg)を添加し,30°Cで10日間振とうした。その結果,全水銀の47%が気化回収された。同廃液をフェントン法で前処理すると全水銀の約100%を気化回収させることが可能であった。また,界面活性剤と有機水銀p-chloromercuribenzoic acid(PCMB)を含む実験水銀廃液Bもフェントン法で前処理することで全水銀の約100%を気化回収させることが可能であった。さらに高濃度水銀耐性株を調整し諸性質の検討を行っている。

自然界より単利した水銀耐性株Acidithiobacillus ferrooxidans SUG2-2株は塩化水銀濃度が6μMまで増殖が認められた。本株を順次水銀濃度を上昇させた二価鉄無機塩培地に植え継ぎ,単離することによって20μMの塩化水銀存在下でも増殖可能な高度水銀耐性株MON-1株を得た。両株による水銀廃液,水銀汚染土壌からの水銀気化回収システムおよび遺伝子導入株の検討を進めている。本報告では水銀気化能の解析結果を紹介する。1mgの洗浄細胞を140nmolの水銀を含むpH2.5の酸性水20mlに懸濁し,30°Cで3時間インキュベートした。水銀気化量はSUG2-2株が4.7nmol,MON-1株が27nmolであった。MON-1株は反応時に100μmolの二価鉄を添加することによって気化量が約2.6倍(71nmol)に増大したが,SUG2-2株では気化量が5.8nmolで大きな増加が認められなかった。またMON-1株の洗浄細胞による水銀気化にKCNは強く阻害したが,ロテノン,HQNOは阻害がなかった。さらに無細胞抽出液によるNADPH依存性のmercuric reductase活性に関しては両株に大きな差異はなかった。以上の結果から,MON-1株の二価鉄依存性の水銀還元システムの強化はCytochrome coxidaseが強く関与しているといえる。A.ferrooxidansにorganomercurial lyase活性の存在は報告されていない。今回MON-1株の中に本活性が存在するか否かを検討した。A.ferrooxidans12株について,0.1μMのp-chloromercuribenzene(PCMB)を含む二価鉄培地で増殖を調べた結果,MON-1株が最も強い耐性を示した。更に0.1μMのPCMB,酢酸フェニル水銀,メチル水銀を含む酸性水に洗浄細胞を添加した場合の水銀気化速度は,MON-1株が最も速く5日で100%気化した。MON-1株洗浄細胞の105,000g上清画分には,NADPH存在下でこれらの有機水銀からの水銀気化活性が認められ,MON-1株に本活性が存在していることを強く示唆した。自然界より単離した水銀耐性株Acidithiobacillus ferrooxidans SUG 2-2株を調製して得られた高度水銀耐性株MON-1株は,20μMの塩化水銀存在下でも安定に増殖可能であった。MON-1株の菌体をポリビニルアルコール製の坦体に固定化させ,バイオリアクター(2.5リットル)を用いて,塩化水銀を含んだモデル廃水による実験を継続して行った結果,水銀濃度40μMの場合に10日で100%の水銀をHg^0として気化回収できること,また本固定化坦体は連続使用が可能なことを確かめた。水銀汚染土壌をスラリー状にした系で,この担体を用いて水銀を気化回収することが可能なことを確認した。ATCC株を含む11種類のA.ferrooxidansについて,0.1μM p-Chloromercuribenzoic acid (PCMB)を含む二価鉄培地を用いて増殖を調べた結果,MON-1株が最も強い耐性を示し,0.2μMPCMBを含む二価鉄培地でも増殖可能であった。さらに培地のPCMB濃度を段階的に上げることにより誘導した場合0.5-Mあるいはそれ以上のPCMB濃度まで増殖可能であることを確かめた。0.1μMのPCMB,酢酸フェニル水銀,メチル水銀を含む酸性水20mlに洗浄細胞1mgを添加した場合の水銀気化速度は,MON-1株が最も速く5日間で100%気化した。また誘導したMON-1株の洗浄細胞による有機水銀からの水銀気化活性は上昇した。
ゲノム情報を基盤とした次世代アレルギー治療法の開発

花粉症、喘息、アトピー性皮膚炎などのアレルギーは、Th2と呼ばれる特殊なT細胞サブセットから主に産生されるサイトカインによって制御されている。これらサイトカイン遺伝子の多くは、同一染色体上にクラスターとして存在し、そのゲノム構造は哺乳動物間で高度に保存されることにより、遺伝情報を共有している。本研究は、タンパク質として翻訳される以外のゲノム領域にある遺伝情報に焦点を当て、その情報を明らかにすることにより、次世代に向けたアレルギー治療法の開発を目指すものである。我々はIL-4遺伝子内でTh2分化に伴いクロマチンレベルで構造変化が見られる領域を指標として、転写制御領域を欠失させた遺伝子改変マウスを作製した。これまでの我々が構築したGFPレポータートランスジェニックを用いた研究過程から、本研究では2つの哺乳類間でよく保存されている領域、IL-4遺伝子3'下流に位置するDNasaI高感受性領域-4(HS-4)とConserved Non-cording Sequence(CNS-2)に着目した。CNS-2エンハンサーは、Notchシグナルを介して、メモリー型CD4T細胞やNKT細胞等のユニークなT細胞サブセットにおける抗原初期刺激におけるTh2サイトカインの産生を制御する領域である。CNS-2を欠失したマウスでは、アラムをアジュバンドとして使った免疫原に対する反応においてIgEの産生が全く起こらなかった。しかしながら、IL-4の存在下では、CNS-2を欠失したT細胞でも正常にTh2細胞へと分化できる。この事から、Notchシグナルの標的配列を欠くこのマウスでは、抗原初期刺激におけるIL-4の供給が絶たれるため、I型アレルギー反応を起こせなくなってしまっている。一方、HS-4領域は転写因子Runxに対する認識配列を保有し、Runx3を介してTh1特異的に働くサイレンサーとして働くと考えられている。我々が今回構築したHS-4を欠失したマウスの解析から、抗原初期刺激におけるIL-4産生に限局的に働くサイレンサーであり、Th1分化の際に働くサイレンサー領域は別に存在することが明らかにされた。本研究では2つの哺乳類間でよく保存されている領域、IL-4遺伝子3'下流に位置するDNasaI高感受性領域-4(HS-4)とConserved Non-cording Sequence (CNS-2)に着目した。CNS-2を欠失したマウスでは、Alumをアジュバンドとして使ったOVAに対する反応においてIgEの産生が全く起こらなかった。IL-4の存在下では、CNS-2を欠失したT細胞でも正常にTh2細胞へと分化するが、これらTh2細胞をRAG欠損マウスに移入してもIgEの産生は回復しない。この事から、CNS-2はエフェクターとしての機能維持に関わる重要な制御領域であることが明らかにされた。一方、HS-4領域は転写因子Runxに対する認識配列を保有し、Runx3を介してTh1特異的に働くサイレンサーとして働くと考えられていた。しかしながら、HS-4欠失マウスとRunx欠損マウスの解析から、HS-4にはサイレンサー活性があるが、その活性は非常に弱く、これに対しRunxが持つレプレッサー活性は非常に強いことから、HS-4以外の領域の関与が存在することが明らかにされた。また、RunxはT細胞がヘルパーT細胞としての機能を獲得する上で、必須の転写因子であることが明らかとなった。
抗細胞間接着分子抗体使用による虚血-再潅流肝細胞障害機構の解明と臓器移植への応用

ラット肝虚血モデル、ラット肝移植モデル及びマウスエンドトキシンショックモデルを作成し、抗細胞間接着分子抗体及びKupffer cell blockadeの効果について検討した。肝虚血を90分行うとラットは全例死亡し、抗ICAM-1抗体+抗LFA-1抗体投与は生存率を57%まで増加させた。又、虚血肝への白血球の集積を抑制し過酸化脂質生成を抑制し、肝エネルギー代謝を改善させた。マウスエンドトキシンショックモデルに対しても抗接着分子モノクローナル抗体をエンドトキシンと同時に投与すると投与効果が認められた。しかし、抗LECUM-1モノクロナール抗体をエンドトキシンショックが起こった後に投与してもその効果は弱く、新しいモノクローナル抗体を開発中である。ラット肝移植実験では、肝臓をUW液で24時間保存しプロテアーゼ・インヒビターを添加したリンス液を用いて、ラットの肝移植実験を行ったところ、単独ではその効果を認めなかったが、ドナー肝のKupffer cellの機能を抑制する目的で塩化ガドリニウムを併用したところ、生存率の著明な改善を認めた。現在、肝移植実験でのモノクローナル抗体投与実験をおこなっている。以上の結果、虚血及び保存後の肝再潅流障害にKupffer cellの活性化と、それに引き続いておこる白血球が関与することが明らかとなった。ラット肝虚血モデル、ラット肝移植モデル及びマウスエンドトキシンショックモデルを作成し、抗細胞間接着分子抗体投与およびKupffer cell blockadeの効果について検討した。肝虚血を90分行うとラットは全例死亡し、抗ICAM-1抗体+抗LFA-1抗体投与は生存率を57%まで増加させ、かつ虚血肝の白血球の集積を抑制し、過酸化脂質生成を抑制し、肝エネルギー代謝を改善させた。同様な結果はマウスエンドトキシンショックモデルも認められた。ラット肝移植実験では、プロテアーゼ・インヒビターを添加したリンス液を用いて、ラットの移植実験を行ったところ、単独ではその効果を認めなかったが、Kupffer cellの活性化を抑制する目的で塩化ガドリニウムを併用したところ、生存率の著明な改善を認めた。以上の結果、虚血および保存後の肝再灌流障害にKupffer cellの活性化とそれに引き続いておこる白血球が関与することが明らかとなった。しかし、抗LECUM-1モノクローナル抗体をエンドトキシンショックが起こった後に投与してもその効果は弱く、新しいモノクローナル抗体を開発中である。ラット肝移植実験では、肝臓をUW液で24時間保存しプロテアーゼ.インヒビターを添加したリンス液を用いて、ラットの肝移植実験を行ったところ、単独ではその効果を認めなかったが、ドナー肝のKupffer cellの機能を抑制する目的で塩化ガドリニウムを併用したところ、生存率の著明な改善を認めた。以上の結果、虚血及び保存後の肝再灌流障害にKupffer cellの活性化と、それに引き続いておこる白血球が関与することが明らかとなった。
幼児の表現に影響を与える描画指導法の検討－自分なりの表現を楽しむために－

今年度は、3つの研究実績が挙げられる。一つは、幼児・児童の描画や造形作品の収集、及び幼稚園や小学校における造形活動や図画工作に関する情報収集を、国内とチェコ共和国で行ったこと、二つ目は、これまでの調査で明らかとなった幼児の描画の特徴について、論文や学会で発表しやこと、三つ目は保育者の描画指導に関する調査結果の一部について、保育者を対象とした講演会や研修等で報告を行ったこと、である。国内での幼児の描画や造形活動に関わる調査については、特徴的な描画指導や造形活動、評価方法を行っていると考えられる、幼稚園や保育所の公開保育や作品展で、撮影による作品の収集と指導に関する情報収集を行うことができた。チェコ共和国では、公私立幼稚園、小学校での描画等の作品の収集、教員・保育者への質問紙調査及びインタビュー調査を実施した。これまでの幼児の描画調査の結果については、自由画の色彩の特徴について論文にまとめた。そこでは、これまでの先行研究に多く見られる目視やマス目を使った手法ではなく、画像編集ソフトを使って各色を定量化する調査方法を採用した。これまで曖昧にされてきた描画で用いられた各色の使用量について把握することが可能となった。この手法による調査結果では、ピンク、肌色、茶に有意差が認められ、女児特有の使用色であることが確認できた。その他、活動的な女児の描画の特徴には男児の描画の特徴と重なる部分があること等ついての報告や、これらの結果を反映させた保育者養成の授業内容や方法についても提案することができた。保育者等を対象とした講演会や研修会では、これまでの調査や情報収集の経過を踏まえ、幼児の描画表現とその際の保育者や保護者の言葉がけによる影響について報告し、また描画活動を含めた造形活動の際に使用する画材や教材の工夫について提案を行った。国内の一般的な幼稚園や保育所等での、保育者や保護者の意識調査について分析中である。幼児の自由画については、モチーフ、構図に加え、今年度は色彩について画像編集ソフトを用いて定量的に分析することができた。また、特色のある指導を行っている幼稚園や保育所には、公開保育や造形作品展に足を運び、実際の幼児の様子や制作の過程、指導の実際を見学することができた。チェコ共和国での同様の調査についてはやや遅れている。調査対象数が幼児の作品、保育者の質問紙ともに充分ではない。その理由としては、大学を異動したことが影響している。当初予定したスケジュールでの国外での調査を行うことができなかった。大学の異動にともない、校務や学年暦が変わり、さらに学内外の仕事が複数重なったことも、研究計画がやや遅れる要因となっている。したがって、保育者の指導が幼児の描画にどのような影響を及ぼしているのか、総合的に分析、考察することについても充分とはいえず、研究計画の見直しが必要となっている。特にチェコ共和国での調査の実施が遅れていることから、結果の公表を予定していた学会での研究発表の計画にもやや遅れが生じることとなった。一方で、幼稚園や保育所での研修や講演会を行い、調査経過を発表する機会に恵まれた。そこでは2つの点について報告することができた。一つは、保育者や保護者の言葉がけや指導に関する意識について紹介、提案することができた。二つ目は、幼児の描画の見る観点について事例を取り上げ、具体的に報告することができた。その他、チェコ共和国の幼児・児童の描画や造形作品を紹介した。海外の幼稚園等の幼児の作品や指導の在り方については保育者の関心も高く、その後、幼児の造形活動に取り入れた園もみられた。調査については、国内外のコンクールや特色ある就学前施設や小学校等での描画を中心とした作品や指導に関する情報の収集を行う予定である。また、チェコでの調査対象数が不足している描画と保育者への質問紙を継続して実施する。すでに複数の幼稚園、小学校から調査の承諾は得られていることから、学内外の仕事の調整を行い、計画が円滑に遂行できるよう努めたい。国内では、継続的な調査を1年間実施することが決まっている。このことから調査全体を見たとき、縦断的な調査研究と、横断的な調査研究の両方を実施することになる。保育者の指導と幼児の自由画や制作への影響や要因について、地域、学年、性別について把握すること、同時に個人ごと、あるいは学級での一年間の描画表現の変化について把握することが期待できる。また、これまで報告している日本の保育者の描画指導に関する考えや言葉がけとの調査結果と、継続中のチェコの教員・保育者の同様の調査結果の比較検討を行う予定である。そして、自身で収集した保育者の質問紙調査以外にも、国内外の幼児・児童の描画指導に関する情報を文献等で収集したものを整理し、今日の描画や造形表現に関する指導法について検討することを予定している。最終年度ということもあり総合的な考察を行う予定である。幼児の描画や作品の実態(モチーフ、構成、色彩)と、保育者の指導について質問紙等の結果と、両者の関係について検討する。特に一般的と考えられる園環境や保育者の指導と、特色のある園環境や保育者の指導とで、幼児の表現にどのような相違がみられるのか明らかにし、幼児にとってより自由な表現活動や表現につながる指導について考察する。これらの調査結果については、国内外の学会で発表を行うとともに、幼稚園や保育所、研究会等での研修や講演会でも公開していく予定である。

初年度は、幼児の描画指導法の実態を探るため、1幼児の描画の分類方法の検討、2造形専門家の指導を受けていない、特別なメソッドによる指導を受けていない、一般的な幼児の描画の分類を開始、3造形専門家の指導やメソッドによる指導がみられる幼児の描画収集の検討、4近年の幼児の描画指導法に関する課題、以上4つの事柄について取り組んだ。1幼児の描画の分類や分析方法については、これまで色彩、モチーフからの視点から調査研究が中心に行われてきた。本研究では多角的な視点から分類、分析を試みるため、色彩、モチーフ、構図、複数の研究者による評定、さらに保護者と保育者に対しての描画活動に関する質問紙調査を加えることにした。2一般幼児の描画の分類は概ね完了し、複数の研究者による評定を実施し、得られた結果の一部について国際大会で口頭発表を行った。3造形専門家や特別なメソッドを取り入れた描画指導を行っている幼稚園や保育所、小学校等については、各教育施設のHPや絵画コンクールの作品から情報を得ることができた。4幼児や児童の描画指導についての先行研究から、描画指導法の課題として、保育者や教育者自身が描画活動や描画表現に苦手意識があることから指導法にも自信がないこと、したがって外部の造形講師の導入やメソッドによる描画活動が行われている実態があり、それについては保育現場や教育現場だけではなく保護者の意見も賛否があることが確認されたが、幼児や児童の考えや思いを把握する情報は得られなかった。描画指導の目的をどこに置くかによって、指導方法が大きく異なることが明らかとなった。1年目の研究はおおむね順調に進展している。単独の研究であっても、研究協力者からの助言や指導、造形教育の研究者の協力、また資料提供等によって調査研究を進めることができた。特に日本色彩研究所の研究員からの助言や具体的な分析方法についての意見交換によって、これまで行われてきた手法とは異なる色彩分析方法を試みることができた。今年度は、特別な指導法や造形専門の指導者のいない、幼稚園や保育所の幼児の自由画の分析を中心に行うことを目標とし、またそれを実行することができた。収集した自由画について、幼児の造形表現を専門とする研究者間で検討を行い、それを描画分析を実施できたことは大きな進展であった。同時に複数の研究協力者に協力を仰ぎ、分析方法について検討することができた。また、メソッドによる指導法や造形専門の指導者による描画活動を行っている幼稚園や造形教室、小学校の描画も収集することができた。次年度に向けて、調査協力を依頼する幼稚園や保育所、小学校等の検討や準備も進行中である。次年度の海外調査についても、これまでの調査協力をお願いしてきた機関に依頼している。研究の成果についても論文掲載、国際学会での口頭発表を行うことができた。特別な描画指導を行っていない幼稚園、保育所に通う幼児の自由画の特徴の実態、家庭でのお絵かきと保護者の関わり、園での造形活動と保育者の関わり、について調査分析を行った。1.描画を構成する色彩、描写力、技法、構成、を技術面、着想、自由さ、を創造性、そして主題という7つの項目について、幼児の造形教育専門家による評定を行った。色彩、描写力、技法、着想、主題については、女児の方が評定の数値が高く、有意差が認められなかった構成と自由さは、性差の特徴が低い項目であることが考えられた。
司法・行政解剖における剖検資料の目的外使用に関する調査研究

法医解剖(司法・行政解剖)において、採取臓器・体液等の使用目的が鑑定嘱託事項の範囲を超える場合の規制は、特に許諾の取得方法の問題から、なかなか具体的で現実的な原案への到達が困難である。本研究では、主として法医解剖に携わる法医学者の立場の意識調査が必要であり、それが規範作成に重要な資料になるという仮説のもとに企画作業を開始した。そして、種々の懸案事項を検討したところ、1)規範の必要性ならびに危急性、2)規範における規制の対象となるカテゴリー、3)規制の根拠に対する認識、4)教育への使用の妥当性、5)許諾確保の具体的方法、6)倫理審査機関の位置づけ、7)執刀者の裁量、などの項目が調査されるのが有用と考えられた。しかし、本来臓器・検体の研究目的の使用については、研究の形態や目的により法医学研究者の中でも見解に開きがあるほか、特に法医解剖に係る遺族の特殊な感情を考慮すると、執刀者側との認識との隔たりは如何ともし難いと予想され、本件の意識調査を実施してもこの溝を埋めることは困難と予想された。本研究ではこれらのことを検討した結果、本件に係る規範作りには、使用目的限定の模索よりも、むしろ規制の対象となる使用目的を、(1)遺伝子解析、(2)第三者への譲渡と商用取引、(3)鑑定と無関係な研究材料提供のように当初は限定し、包括的な許諾方法を得る可能性について議論することの方の利益が大きいと推論した。
摂食障害患者における加速度計を用いた排出行動の客観的評価方法の開発

本年度は、採取したデータの処理および解析を行った。対象は,東京大学医学部附属病院心療内科に通院中の神経性食欲不振症患者9名(制限型5名、むちゃ食い/排出型4名)および健常女性7名であった。方法に関しては,腕時計型のアクチグラフ(加速度計)を1週間携帯することにより、日常生活下での身体活動のデータ採取を行った。食事の時間帯および過食や排出行動を記録するために、生活記録表(行動日誌)の携帯および記録を同時に行った。身体活動の基礎的解析として、1日平均身体活動数を患者群と健常群との間で比較した。また,むちゃ食い/排出型患者のデータを用いて、過食および排出行動前後の身体活動データの観察を行い、仮説生成を試みた。結果は,平均年齢および平均BMI (Body Mass Index)は、患者群で27.0歳(SD 6.9)、14.8kg/m^2 (SD 1.8)、健常群で23.3歳(SD 2.1)、20.1kg/m^2 (SD 1.2)であった。一日平均身体活動量は患者群で163094counts/day (SD 34560)、健常群で180527counts/day (SD 24223)であり、グループ間で統計学的な有意差を認めなかった。むちゃ食い/排出型患者のデータの観察では、過食や排出行動前では、過食や排出行動のない食事前と比べて、身体活動量が小さくなるデータの傾向を認めた。従って,今後さらに洗練された解析手法を開発することによって,過食や排出行動の検知や予測を行い,これらの病的食行動に対する予防的介入の可能性が示唆された。本年度は、解析対象となる基礎データを採取するための準備を中心に行った。[生活記録票の開発]アクチグラフ(加速度計)の解析に際して,食事の時間帯および過食や排出行動と,アクチグラフで得られる身体活動データとの関連を調査するために食事行動の記録が必要となる.そのため,生活記録票として行動日誌を開発した.日誌の開発に際しては,日誌の携帯に関わる利便性の向上を目的として,小型の手帳サイズでの製本を行った.また,まとめ書きを防止するため,出来事ごとに記録することを被験者に通知し,記録の利便性を高めるために,小型のボールペンを用意した.記録内容は,就寝時間および起床時間,アクチグラフを外した時間,再装着の時間,朝食昼食夕食間食の時間,過食と排出行為があればその時間を記録することとした.開発に際して,研究者本人および共同研究者による試用を行い,用紙のサイズやレイアウトの調整を行った.[アクチグラフのセットアップ]本研究では,腕時計型のアクチグラフを使用した.アクチグラフの使用に際して,研究者本人および共同研究者による試用期間を設け,実際の使用感を調査した.結果,日常生活に支障はなく,とくに強い負担感は生じなかった.入浴などで一時的に装置を脱着したのち,再装着を忘れる可能性があると思われた.この点に関しては,検査開始時に被験者への説明を十分行うことである程度防止できると考えられた.[現在のデータ採取状況]現在までに東京大学医学部附属病院心療内科に通院中の神経性食欲不振症患者9名(うち制限型5名,むちゃ食い排出型4名),健常者9名のデータを採取した.うち脱落者はなく,行動日誌の記録コンブライアンスも良好であった.しかし,2名の被検者ではデータ採取が不可能であったことがあり,セットアップの問題もしくはバッテリーの問題に起因したと思われ,今後の課題となった.本年度は、採取したデータの処理および解析を行った。
卵減数分裂に干渉しない精子星状体

ヒトデ卵を卵核胞崩壊(GVBD)以前に受精させたGV多精卵の多極紡錘体形成率(干渉率)は100%であった。またGVBD以後に多精させたBD多精卵では、卵-精子星状体の距離が数μmであっても干渉率が低く5%程度であった。さらにBD多精卵紡錘体極のサイクリンB量は、干渉していない精子星状体より顕著に高いことが明らかになった。サイクリンBが多く蓄積する星状体が、GV内容物の影響を受けて染色体と相互作用できるようになることが強く示唆された。ほとんどの動物で、受精は卵減数分裂の途中に成立する。では「なぜ、精子星状体は卵減数分裂に干渉しないでいられるのか?」本研究ではヒトデ卵を用い、この問題を解析した。ヒトデ卵母細胞は、卵核胞崩壊(GVBD)後に受精させると(BD受精卵)、多精し難く、精子星状体は卵減数分裂に干渉しない。一方、GVBD以前に受精させると(GV受精卵)、多精になり、精子星状体は卵減数分裂に干渉し、発生が異常になる。この結果から、GV受精卵の精子星状体は、卵星状体と同様に、紡錘体形成能を持つことが確かめられた。しかしBD多精卵の第一分裂中期においては、受精後約20分において、すでに卵中心体から形成された星状体が卵染色体と相互作用しており、そのために第一減数分裂中期では精子星状体が卵減数分裂に干渉できないことが明らかになった。一方、第二減数分裂中期では精子星状体は発達するが、卵ー精子星状体の距離が数μmであっても、干渉率が低く5%程度であった。この結果から、BD受精卵の精子星状体は、卵星状体と質的に異なっていることが分かる。その差を明らかにするために、GV多精卵のGVBD後の動物極または植物極にそれぞれ存在している精子星状体のサイクリンB量を定量したところ、動物極>植物極であることが明かになった。この星状体のサイクリンB量は、GV内容物を細胞質移植すると顕著に増加した。さらにBD多精卵紡錘体極のサイクリンB量は、近傍の干渉していない精子星状体より顕著に高かった。従ってサイクリンBがGV内容物の影響で、GVBD過程においてGV近傍に位置した星状体により多く蓄積し、星状体微小管が染色体と相互作用できるようになることが強く示唆された。正常受精(BD受精)ではGV内容物がGVBD後に拡散・希釈されるために、精子星状体サイクリン量が少なくなり、干渉できなくなると考えられる。ほとんどの動物で、卵減数分裂の途中で受精は成立し、卵減数分裂が完了するまで精子中心体は、卵分裂装置に干渉しない。卵減数分裂が完了すると、精子中心体から伸びる紡錘糸は、精子・卵由来の染色体全てと結合する。では「なぜ、精子星状体は卵減数分裂に干渉しないでいられるのか?」平成23年度は、仮説「卵中心体から伸びる微小管によって、すでに卵染色体の動原体は占有されているために、精子中心体からの微小管が結合できない。」の真偽を明らかにするのが目的となっていた。実験の結果、確かに第一分裂中期においては、51/51の割合で、精子中心体は卵由来の紡錘糸と干渉せず、美しい2極の中期紡錘体が形成された。しかし、今回、正常なタイミングで受精させた多精卵において、第二減数分裂中期について注意深く観察したところ、138/146では正常な中期紡錘体であったが、8/146(約5%)において3極の紡錘体であることが判明した。この成果は、全ての試料について共焦点顕微鏡で観察したことで得られたものである。それでは、5%の干渉は、卵染色体と精子中心体(星状体)が相互作用してしまうほど、近い距離にあったためなのであろうか?この疑問点を解明するために、本研究では、共焦点顕微鏡を用いて、二極間の距離計測を行った。正常な紡錘体を形成している卵で、紡錘体と精子星状体が近い3例を選び、その距離を測定したところ、平均6.7μmであった。一方、第二減数分裂中期における多極紡錘体の3極間の距離を測定したところ11μmであった。したがって、二極間の距離が短いから干渉するわけではないことが示された。しかし、ほとんど(95%)の卵では干渉していなかったことから、卵紡錘体の近傍に精子星状体が存在していても、干渉しにくい機構はあると考えられる。現在、これまでの結果から、GVBD直後にGV周辺で収束するアクチン網の存在が、干渉機構に大きく関与しているのではないかと考えている。

すなわち、アクチン網が収縮するために卵染色体は素早く動物極に集められると考えられており(Lenart et. al. 2005)、正常時(MI期)に精子が卵内に侵入してくる時には、卵染色体はアクチン網に絡み取られ、引き続き速やかに卵中心体によって捕まえられる。したがって、その間に卵内に入った精子星状体は、卵の第1減数分裂には干渉できない。第2減数分裂において精子星状体が卵紡錘体に干渉するのは、卵half spindleの時に、散らばっている染色体に、たまたま近くにいた精子星状体が働きかけた結果であると考えられる。通常受精では卵内の精子星状体の数は1つなので、干渉する確率は非常に低い。しかし本研究のように、多くの精子が卵内に入っている多精卵では、half spindleの近くに精子星状体が分布する確率も高くなるために、低い割合ではあるが干渉した。したがって、23年度申請書に記載の仮説A「卵中心体から伸びる微小管によって、すでに卵染色体の動原体は占有されているために、精子中心体からの微小管が結合できない。」はMII期では偽である。さらに、仮説B「精子中心体から伸びる微小管先端構造は、(卵中心体のものとは、何らかの点で構造が異なるために)、卵由来染色体と結合できない」については、MII期において、干渉できるために、偽である。23年度は仮説ABのどちらかが正しい場合について計画を立てていた。しかし、23年度の研究において、MI期において干渉しない理由として、第三の仮説C「正常時(MI期)に精子が卵内に侵入してくる時には、卵染色体はアクチン網に絡み取られ、引き続き速やかに卵中心体によって捕まえられるために、その間に卵内に入った精子星状体は、卵の第1減数分裂には干渉できない。」が考えられた。そこで24年度は仮説Cの真偽を明らかにする。そのためにまずは、経時的に固定した染色卵を作成して、共焦点顕微鏡で観察する。これによって、アクチン網と卵染色体、そして精子星状体がどのような配置となって、干渉されることを免れているのかを明らかにする。さらに、in vivo観察技法も開発して、これを確かめる。以上の研究によって、MI期における干渉防止機構が明らかにできる。MII期においては、5%の割合で干渉することが、23年度の研究から明らかになった。これは当初予測していなかった結果であるが、新たに共焦点顕微鏡を用いた詳細な解析から判明した。この結果からは、精子星状体から伸びる微小管が干渉しない構造になっているのではないことが強く示唆される。しかし、精子星状体のごく近傍に位置する卵染色体でも、全て精子星状体由来の微小管と相互作用するわけではない理由は不明だ。干渉する場合と干渉しない場合に、どのような違いがあるのか?一つの可能性として、MIMII期において卵星状体から離れた卵染色体と精子星状体の位置関係に鍵があるかもしれない。すなわち、精子星状体が動植軸に位置した時に、干渉が起こりやすいかもしれない。この可能性を検討するために、それぞれの位置情報を明らかにできるように、観察法を改良する。共焦点顕微鏡による観察のための消耗品(抗体、ガラス器具等)を使用する。微小管・染色体結合タンパク質発現用試薬一式とマイクロインジェクション用消耗品一式、すなわち染色体に結合するensconsin-3GFPのmRNAを作成し、卵内にマイクロインジェクションする実験と、さらに微小管に結合するタンパク質RanにAlexa-568で蛍光標識したものを卵内にマイクロインジェクションする実験でin vivo,リアルタイムで観測を行う。さらに、実験動物費、論文校正・投稿費、学会発表費を使用する
腱構造を用いた内骨格型力覚提示システムに関する研究

本研究では、人の指の上に腱状の構造を配置し、装着者の骨格をリンク系として直接駆動ことで、従来のリンク機構を用いた装置に比べ、非常にコンパクトな装置の開発を目指している。これを実現するため、(A)手の各関節に力を提示るには、腱をどのように手の表面に配置するか、(B)個人ごとに異なる手のパラメータをどのように同定するか、(C)同定されたパラメータをもとにどのように制御をおこなうかという問題に取り組んでいる。本年度は、(B)の問題に取り組んだ。関節と腱の変位との間の関係を記述するヤコビ行列は、腱(ワイヤ)と関節軸の間の距離(モーメントアーム)によって構成される。モーメントアームを同定するには、装着者の手が動いた際の関節角変化と腱の移動を同時に計測すればよいが、関節角は、装着者の関節軸の位置が不明な状況で推定しなければならない。しかし、従来の方法では正確な関節角を計測するのは困難である。そこで、指の関節上に一定の厚みをもった薄いベルト状の柔軟材料を重ね、指の屈曲にともなう、これらのベルトの上下面での相対的な位置変化を計測することで、正確な関節角度を推定する方法を提案した。装置のプロトタイプを制作するとともに、実験により、提案手法により推定された角度が非常に高い精度で実際の関節角度を推定できることを確かめた。今後は、このプロトタイプをもとに装置の改良をおこなうとともに、上述の(A)に対応する装置の開発を進め、これと合わせることで、力覚を提示する際に必要となる、関節角度と腱の移動距離との間の関係の導出を装着者ごとにおこなう手法を提案する。研究実績の概要に記述した研究実施計画の項目(A)装置の腱配置の決定、(B)関節角度と腱の移動距離との間の関係の計測、(C)制御手法の提案のうち(B)が順調に進み、必要な計測技術を確立したことから、おおむね順調に進展していると言える。本年度に提案、開発した、重ね合わせたベルトを用いて関節角度を推定する装置のプロトタイプををもとに装置の改良をおこない、さらに、研究実績の概要に記述した研究実施計画の項目(A)に対応する装置の開発を進め、これと合わせることで、力覚を提示する際に必要となる、関節角度と腱の移動距離との間の関係の導出を装着者ごとにおこなう手法を提案する。今年度は、最終的に提案する予定の力覚提示装置の構成のうち、力を指に伝える部分の開発はおこなわず、指の角度を精確に計測する部分の開発に専念した。そのため、当初計画していた装置の開発費の一部を次年度に持ち越した。
ルイス酸型レセプターを用いる新しい分子認識化学の開発

分子認識化学においては国内外を問わず非常に多くの研究者が活発な活動を行っており、化学、及び他の分野との境界領域で大きな地位を占めている。このことは、Cram、Lehnらが最近、クラウンエーテル等の人工酵素を用いる分子認識化学でノ-ベル賞を授与されたことからも明らかであろう。しかし、残念ながら、本研究の前段階では、レセプターと期質との水素結合を利用する分子認識化学がほとんどで、ルイス酸型レセプターを用いる配位結合に基づいた例はきわめて少なかった。また分子認識の基礎研究を実際的な合成反応の開発にまで完成させた例は皆無と言える。本研究では従来の水素結合を利用した分子認識システムとは根本的に異なる独自の分子認識システム、すなわち有機金属反応剤のルイス酸としての性質に着目し、基質の官能基と金属との弱い分子間結合力を利用したルイス酸塩基複合体形成に基づく分子認識化学を開発し、広く有機化学に寄与することを目指して行われた。すなわち高度にかさだかい有機アルミニウム、チタン化合物等をルイス酸型人工酵素として用い、各種のカルボニル化合物、エーテル系化合物などをルイス塩基としてルイス酸塩基複合体形成による分子の選択的補足を試みた。これらの研究から得られてくるデータを基に、従来では得られなかった新たな選択性、反応性の獲得と共に、合理的な新規合成反応プロセスを開発することに成功した。高度にかさ高い有機アルミニウム反応剤、メチルアルミニウムビス(2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノキシド)(MAD)をルイス酸型レセプターとして用いて、各種のカルボニル、エーテル、エポキシド系化合物との複合体形成を試みた。その結果、MADは、アミド、アルデヒド、ケトンあるいはエステル、エポキシド、エーテルの順に強く配位することを低温^<13>C NMRを用いて確認した。また、構造的に極めて類似した各種のカルボニル、エーテル、エポキシ系化合物に対しても、立体障害あるいは塩基性のわずかな差異を識別して高選択的に酸塩基複合体を形成することが明らかとなった。例えば、非対称フマル酸エステルの場合、エステル残基の大きさをMADが識別することができ、この知見は非対称フマル酸エステルのディールズ・アルダー反応における先例のない位置および立体選択性の獲得に応用された。ついで、ルイス酸型レセプター、MADの高い識別能を分離手段として利用するため、MADを部分構造とする有機溶媒に難溶な高分子有機アルミニウム化合物をかさ高いトリフェノールから調製し、液体カラムクロマトグラフィーの固定相とする複合体形成クロマトグラフィーを新たに開発した。このものは、構造的に極めて類似した各種エーテル、エポキシ系化合物の分離に優れており、また、反応の後処理や生成物の分離・精製が不要あるいは極めて容易な流通系リアクターとしてエポキシド転位等、有機合成に適用した。当研究室で開発されたアルミニウム反応剤をルイス酸型人工酵素(ルイス酸型レセプター)として用い、各種カルボニル化合物をルイス塩基としてルイス酸塩基複合体形成に基づく分子の捕捉を試みることによって、これらルイス酸型レセプターの分子認識能、およびその合成的応用について検討し、以下の成果を上げた。(1)当研究室で開発されたアルミニウム反応剤、アルミニウムトリス(2,6-ジフェニルフェノキシド)(ATPH)をルイス酸型レセプターとして用い、各種アリルビニルエーテルのクライゼン転位反応における立体選択性について検討したところ、他の既存のアルミニウム反応剤と比べてATPHが極めて有効であることを見出した。ルイス酸を合理的ににデザインすることが選択的有機反応にとって重要であるであることを示す一例であるといえる。また、この知見を利用して、ビナフチル骨格に基づく光学活性な配位子を合理的にデザインし、その合成に成功した。この配位子を用いて、非常に単純な構造を持つアリルビニルエーテルの不斉クライゼン転位反応を行ったところ、高い光学純度(8792%ee)で所望のアルデヒドを得ることが出来た。(2)ATPHがα,β-不飽和カルボニル化合物のカルボニル炭素を求核剤の攻撃から保護するという知見を芳香族カルボニル化合物に適用したところ、求核剤が高選択的に共役付加を起こすことを見出した。

芳香物化合物に対する共役付加反応はニトロベンゼンなどの特殊な化合物に限られていたが、アルミニウム反応剤の合理的なデザインとその反応性の予測、検討、適用の根気ある繰り返しが、従来困難とされてきた合成反応おいて実を結んだといえる。当研究室で開発されたアルミニウム反応剤をルイス酸型人工酵素(ルイス酸型レセプター)として用い、各種カルボニル化合物をルイス塩基としてルイス酸塩基複合体形成に基づく分子の捕捉を試みることによって、これらルイス酸型レセプターの分子認識能、およびその合成的応用について検討し、以下の成果を上げた。(1)当研究室で開発されたアルミニウム反応剤、アルミニウムトリス(2,6-ジフェニルフェノキシド)(ATPH)がα,β-不飽和カルボニル化合物のカルボニル基に配位した場合、求核剤の攻撃からカルボニル基を保護することを当研究室では既に見出している。この知見を今回、α,β-不飽和カルボニル化合物の選択的1,4-還元反応に応用したところ、アート錯体型還元剤が有効であることが分かった。実際に、ATPHとの組み合わせにおいて最も相性の良かったのはn-BuLiとDIBAL-Hのアート錯体型還元剤であった。すなわち、様々なα,β-不飽和ケトンの還元を試みたところ、いずれの系においても、>99%以上の位置選択性と>95%以上の化学収率で1,4-還元体が得られた。α,β-不飽和アルデヒドについても検討したところ、還元剤としてはt-BuLiとDIBAL-Hの組み合わせがより有効であることが分かった。特に光、熱、酸などに不安定なレチナ-ルの高選択的1,6-還元に成功したことは、今後必要となるレチナ-ルの選択的官能基化に先駆けるものとして注目に値する。(2)ATPHをルイス酸型レセプターとして用いた場合、各種アリルビニルエーテルのクライゼン転位反応において高い立体選択性が発現することを既に報告している。そこでより高いルイス酸性を持つアルミニウム反応剤、アルミニウムトリス(4-ブロモ-2,6-ジフェニルフェノキシド)(ATPH-Br)を合理的にデザインし、クライゼン転位における反応性、選択性について検討したところ、ATPHよりも優れた反応剤であることを見出した。この知見を触媒的クライゼン転位に適用したところ、今までにない高い触媒能を示した。
血管平滑筋細胞の可塑的変化における細胞内ネットワークの解明

血管の壁を構成している血管平滑筋細胞は、血管に弾力性を与えることにより血圧調整に関わる。種々の生活習慣病の発症は血管が詰まる動脈硬化症が原因となる場合が多く、このとき血管平滑筋細胞が性質の異なる細胞へと変化する。このような病的な変化をするときに、細胞内でどのような遺伝子が関与しているのかを調べた結果、T-plastinを含むいくつかの遺伝子が重要な関与をしていることがわかった。平成22年度はスクリーニングした遺伝子について以下のような実験をおこなった。(1)スクリーニングした遺伝子を大腸菌で発現するため、plastin-T,およびeukaryotic elongation factor betaをpET21dに挿入した。またrho GTPase 3はpGEX6.1に挿入した。今後これらの発現タンパク質を精製し、アクチン線維との結合実験を行う。さらに発現タンパク質をNHS-agaroseに固定して、これを平滑筋細胞抽出液と混合するpull downアッセイにより、これらの遺伝子産物に対する細胞内のターゲットタンパク質を単離する実験をおこなう。(2)平滑筋細胞の形質変換に影響を及ぼす可能性のあるDIF化合物(DIF-1およびDIF-3)をラット大動脈平滑筋の初代培養系に添加し、形質変換の時間変化について解析する方法について検討した。通常の10%血清にさらにDIF化合物を培養液に添加して培養すると、平滑筋マーカータンパク質であるαアクチンおよびカルポニンの発現量が増加した。培養液からDIF化合物を取り除くとこれらの遺伝子の発現レベルが元に戻り、DIF化合物の作用に可逆性があることが確認された。また細胞の増殖速度および細胞の形態の観察により、DIF化合物が血清存在下での試験管内培養において収縮型→合成型への形質変換を抑制する可能性が示唆された。このことから適切な濃度のDIF化合物存在下では平滑筋細胞が正常な収縮型の状態を維持することが可能になり、種々の実験に適用できることが期待される。一方p53遺伝子ノックアウトマウス大動脈由来のAC01細胞でも同様にDIF化合物の作用を調べたが、より低い濃度で細胞毒性が見られた。本研究はすでにスクリーニングした血管平滑筋の収縮型あるいは合成型細胞特異的な遺伝子を手がかりにして、それらと相互作用する因子を同定することを目標としている。本年度はこれらのうちT-plastin、rho-E、eEFβについて、RT-PCRによって全長のcDNAを得て、大腸菌発現用のプラスミドを構築した。すでに大腸菌で発現タンパク質が得られるようになっている。現在この発現タンパク質を固定したビーズを作成し、pull downアッセイのための準備をしているところである。RNA干渉の予備実験として培養平滑筋細胞内AC01においてT-plastinの挙動についての解析をおこなった。ウェスタンブロット、リアルタイムPCRを用いた解析によると、T-plastinの発現量は無血清状態で培地にPDGFを添加すると時間とともに発現量が低下した。また培地にTGF-βを添加するとT-plastinの発現量が時間とともに増加した。同じ細胞で平滑筋のマーカータンパク質であるα-アクチン、高分子量カルデスモンも同様にPDGFの添加により発現量が増加、一方TGF-βの添加により発現が低下した。このことからT-plastinが平滑筋の分化マーカーとなる可能性が示唆された。間接蛍光抗体法による観察によると、T-plastinは細胞内でαアクチンと共局在することが確認された。T-plastinはアクチン線維を束化するタンパク質であるが、それ以外の生理活性がないかについても検討をはじめている。(1)平成25年度はT-plastinの全長(アミノ酸残基1630)、及びN端のアクチン結合部位(アミノ酸残基1375)、C端のアクチン結合部位(アミノ酸残基376630)をpEGFPへサブクローニングをおこなった。今後これらのプラスミドを培養平滑筋AC01にトランスフェクションし、細胞内でplastinとアクチン線維との結合を観察する予定である。(2)大動脈平滑筋、および砂嚢平滑筋抽出液から直接T-plastinを抽出し種々のクロマトグラフィーで精製をおこなった。この際に前年度に作成した抗T-plastinポリクロナル抗体を使用して、クロマトグラフィーの各画分のウェスタンタンブロットをおこなうことにより、plastinを含む画分を検出した。この組織から直接得られたplastinと大腸菌で発現したplastinとを使ってアクチン線維との結合実験をおこなったところ、アクチン線維との親和性に差が見られなかった。平成24年度はスクリーニングした遺伝子のうちT-plastinについて集中的に実験をおこなった。大腸菌で発現した全長のT-plastinをイオン交換クロマトグラフィーで精製し、トリに免疫しポリクローナル抗体の作成をおこなった。この抗体は非常に特異性が高いことがわかった。この抗体を利用して間接蛍光抗体法によりマウス大動脈由来のAC01細胞において、細胞内分布を調べたところストレスファイバー上にアクチンと共局在することがわかった。

また大腸菌で発現したT-plastinと骨格筋アクチン、砂嚢平滑筋アクチン、大動脈平滑筋アクチンとの結合を解析した。いずれのアクチンアイソフォームにもほぼ同程度の結合を示し、アクチン線維を束ねることが確認された。さらにこのアクチン線維の束形成はカルシウム依存的で、カルシウム10ー7M以下では束が形成されるが、カルシウム濃度が10ー6M以上ではこの束形成がおこらなかった。これは暗視野光学顕微鏡観察、遠心法で上清と沈殿の組成をSDS-PAGEで解析する方法のいずれでも確認できた。しかし発現したT-plastinとアクチンとの結合は、細胞骨格系タンパク質のなかでは親和性が低く、結合実験によって推定した解離定数は5X10ー6Mであった。上記のポリクローナル抗体を用いて、豚大動脈にT-plastinが存在することがわかったので、大動脈からT-plastinを種々の条件で抽出し、ウェスタンタンブロットで種々の画分に含まれるT-plastinを検出することによって、高イオン強度のバッファーでT-plastinを抽出、硫安分画、Phenyl-TP、DEAE-TPというプロセスでT-plastinを精製することができるようになった。アクチンとの結合において、発現したT-plastinと大動脈から得られたT-plastinの機能に差があるかを、今後すぐに調べる予定である。RT-PCRおよび発現用プラスミドの構築にトラブルがあったため時間がかかり、予定していた実験すべてを完了することができなかった。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初ポリクローナル抗体作成は2ヶ月程度を要すると考えていたが、追加免疫をしても抗体価がなかなか上がらず結局この作業に6ヶ月を要してしまった。また大腸菌で発現したT-plastinとアクチン線維との親和性が良くなかったので、その理由を明らかにするため種々の溶液条件を変えてトライしたため、この操作でも6ヶ月を要してしまった。ノルアドレナリン、ヒスタミンなどのアゴニストを血管平滑筋細胞に加えた時の細胞内の反応を調べるために、ミオシンの調節軽鎖のリン酸化をglycerol-PAGEで定量する実験もおこなったが、再現性に乏しく今後実験方法の改良が必要であることがわかった。最近開発されたMn^<2+>-Phos-tagをSDS-PAGEのゲルに添加する方法がリン酸化ポリペプチドの分離に有効ではないかと考えられる。T-plastinの細胞内での発現量が少ないため、T-plastinの細胞内局在を詳細に調べるためにはGFPベクターを作製し、平滑筋細胞に導入する必要がある。またT-plastinの遺伝子をノックアウトし、そのことが血管平滑筋細胞の形質変換におよぼす影響について解析する実験にも着手したい。