hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Laser scanning cytometryを用いたmatrilysin発現と細胞増殖能との関連

我々は、免疫組織学的手法による癌の生物学的性状を評価した後、新しい研究手技-サイトメトリー(LSC)や分子細胞遺伝子学的解析技術(CGH)などを取り入れて、癌の生物学的性状とゲノムコピー数異常との関係を研究している。以下にそれらの詳細を報告する。1、免疫組織学的手法による癌の生物学的性状の評価我々は癌浸潤性と強く関連するmatrilysin発現が進行性胃がんの予後不良因子となることを証明してきた(論文はJournal of Japanese Cancer Researchに載っている)。さらに、matrilysinが癌浸潤の先端部に位置するがん細胞に強く発現しているが、それらの細胞自身には増殖能が低いことを初めて報告し、研究者から高く評価されている(論文はHuman Pathologyに載っている)。がん細胞におけるmatrilysin発現機構を明らかにするために、我々は"cell array"用スライドに載っている50種類の培養細胞によって、研究した。我々はこの"cell array"用スライドの上に毎個spotの中に一定数の一つ種類の培養細胞をのせて、多種類の抗体で別々に蛍光免疫染色をして、laser scanning cytometry(LSC)でそれぞれの蛋白発現量を測った。Matrilysin蛋白は50種類培養細胞の内に4種類の癌細胞に発現された。Ets-1蛋白は7種類の細胞に発現されたが、その中の4種類ともmatrilysinを発現された細胞である。この結果からEts-1 geneはmatrilysin発現のup-regulate geneであるかもしれないことが推測できる。この関係は臨床標本を使って、さらに証明する必要がある。だから、次に我々は臨床手術的に取った210例の胃がん標本の"tissue array"スライドを作成して、matrilysin、Ets-1とbeta-cateninの免疫染色をした。染色結果は検討中している。2、癌の分子細胞遺伝子学の研究当教室では、癌研究の一つ手法としての分子細胞遺伝子学的解析(LSC and CGH)を種種の癌に対して行っているが、私は大腸がんの生物学的性状とゲノム異常との関係を検討していた。これらの結果成果は二つの論文を投稿している。3、その他癌の生物学的性状がゲノム不安定性と関係しているとの考えから、中心体と細胞核DNA量の異常と関係についての研究をしていた。現時点で、臨床標本についての中心体を検出できる実験手順が完成して、70例ぐらいの症例の実験dataを観測した。癌の最大特徴は浸潤増殖を示すことである。癌細胞の浸潤能はmatrilysinファミリーによって大きく左右されることが指摘されている。我々は癌細胞におけるmatrilysin発現が増殖能との逆相関あることを発表した(論文はHuman Pathologyに載っている)。癌細胞におけるmatrilysin発現機構を明らかにするために、我々は"cell array"用スライドに載っている50種類の培養細胞によって、研究した。"Cell array"用スライドというのは50個のspotsのあるスライドである。我々はこの"cell array"用スライドの上に毎個spotの中に一定数の一つ種類の培養細胞をのせて、多種類の抗体で別々に蛍光免疫染色をして、laser scanning cytometry (LSC)でそれぞれの蛋白発現量を測った。matrilysin蛋白は50種類培養細胞の内に4種類の癌細胞に発現された。この結果からEts-1 geneはmatrilysin発現のup-regulate geneだかもしれないことが推測できる。だから、つぎに我々は臨床手術的に取った240例の胃癌パラフィン材料について、matrilysin、Ets-1とbeta-catenin(他人の研究によってmatrilysinのup-regulate geneだと証明された)免疫染色をする。この240例の胃癌組織の表面と深部の組織を別々に取って、"tissue array"用パラフィンのブロックを作成する。この"tissue array"のスライドを用いて、matrilysin、Ets-1とbeta-cateninの免疫染色する予定です。

Ets-1蛋白は7種類の細胞に発現されたが、その中の4種類ともmatrilysinを発現された細胞である。この結果からEts-1 geneはmatrilysin発現のup-regulate geneであるかもしれないことが推測できる。この関係は臨床標本を使って、さらに証明する必要がある。だから、次に我々は臨床手術的に取った210例の胃がん標本の"tissue array"スライドを作成して、matrilysin、Ets-1とbeta-cateninの免疫染色をした。染色結果は検討中している。2、癌の分子細胞遺伝子学の研究当教室では、癌研究の一つ手法としての分子細胞遺伝子学的解析(LSC and CGH)を種種の癌に対して行っているが、私は大腸がんの生物学的性状とゲノム異常との関係を検討していた。これらの結果成果は二つの論文を投稿している。3、その他癌の生物学的性状がゲノム不安定性と関係しているとの考えから、中心体と細胞核DNA量の異常と関係についての研究をしていた。現時点で、臨床標本についての中心体を検出できる実験手順が完成して、70例ぐらいの症例の実験dataを観測した。
繰返し制御に基づく可変速軌道制御

これまで、目標値が時間の関数で周期一定のものに限られていた繰返し制御を、ロボットの制御などのために、空間軌道を反復し、その上の速度(周期)は一定しない状況に適用できるように拡張した。これは次のような手法で、必要に応じて状態量操作を併用し、補償器切換え時の偏差を減らしている:1.いくつかの離散的な軌道速度について補償器を用意する2.各速度で十分繰返しを行い、補償器内に操作量のパタ-ンを形成する3.動作中は、各瞬間の速度に対応する補償器を選んで切換える4.速度が連続的に変化する場合は、操作量パタ-ンによるフィ-ルドフォワ-ド制御とし、離散速度のパタ-ンから連続速度のそれを内挿する今年度は、昨年までに行ったシミュレ-ションに基づき、次の2点で実際のバリ取りロボットへの応用性を確認することを主に行った:1.アナログ・コンピュ-タを制御対象とし、マイコン・コントロ-ラを用いて、ロボット制御上の問題点、特に、教示点と希望の軌道速度を実現する補間点の関係について検討し、距離をパラメ-タとする方式を開発した(ロジック・アナライザと消耗品を使用)。2.提案した手法を円筒座標型の6自由度ロボットに適用し、ガタ等、理想的でない特性をもつ制御対象でも動作することを確認した。また併せて3.高い精度を得ようとする余り過大な操作を行ってしまい、軌道の角で振動的な動作になる現象を解析した(CPUボ-ドを使用)。これらの結果、次の結論を得ている:1.実際のロボットで5つの補償器を用いた場合、速度が100%60%の範囲で連続的に変化しても、偏差は十分小さく保たれる。2.屈曲点における振動の発生については、さらに検討を要する。
アンジオテンシンII阻害下の慢性心不全における内因性ブラジキニンの心機能維持作用

イヌ高頻拍性慢性心不全モデル(n=35)を用いて、アンジオテンシン変換酵素阻害剤(ACEI)とアンジオテンシン受容体拮抗剤(ARB)の併用療法が、内因性ブラジキニン(BK)の増強作用により、心収縮及び拡張能を改善するかどうかコンダクタンスカテーテルとマイクロチップマノメーターを用いて検討した。ACEI(enalapril)とARB(candesartan)の併用療法群においては、それぞれの単剤投与群に比し、左室の後負荷、前負荷を減少させるだけではなく、左室収縮能を有意に改善した。また、左室拡張能においては、左室弛緩能の著明な改善だけではなく、左室のstiffnessの低下を認めた。血清BK濃度は併用療法群において著明に上昇しており、また左室のBK B2受容体は有意に発現が亢進していた。このように、ACEIとARBの併用療法における心血行動態改善に、内因性BKが重要な役割をしていることが示唆された。さらに、血清アルドステロン濃度が、併用療法において著明に低下していることより、左室の線維化が抑制されているかどうか検討した。併用療法群においては、左室の線維化は有意に抑制され(Picrosirius red染色)、左室のcollagen I&IIIのmRNAは有意に低下(RT-PCR)していた。以上より、非ACEのアンジオテンシンII産生経路(chymase etc.)を持つ慢性心不全犬において、ACEIとARBの併用療法は、それぞれの単剤療法に比し左室機能を改善し、左室の線維化を抑制することが示された。その機序として、内因性BKの作用の増強、アルドステロンの抑制が関与している可能性が示された。慢性心不全(CHF)において、ACE阻害薬(ACEI ; enarapril)とアンジオテンシン(AII)受容体拮抗薬(ARB ; candesartan)の併用療法が、内因性ブラジキニン(BK)の作用を介し、それぞれの単剤療法に比し血行動態を改善させるか、イヌ高頻拍心不全モデルを用いて検討した。CHFにおいて併用療法は、ACEIやARBの単剤療法に比し、左室収縮及び拡張能を維持し、左室リモデリングを抑制し、左室-大動脈整合性を改善した。各CHF群において、BK B2受容体拮抗薬HOE140を投与すると、末梢血管抵抗の増大、左室拡張末期圧の上昇、一回拍出量の低下を認め、心機能維持における内因性BKの関与が示唆された。このようなBK B2受容体拮抗薬に対する反応は、併用療法で最も著明であった。また、併用療法群においては血中BK濃度の上昇、及び左室BKB2受容体の増加を認め、併用療法による心血行動態維持作用に内因性BKが深く関与している可能性が示唆された。今年度は、近年BKが左室繊維化を抑制すると報告されたことから、ACEIとARBの併用療法がAIIを抑制するだけではなく、内因性BKを増加させることにより、左室繊維化を各単剤療法に比し抑制するという仮説を検証する。方法は、ACEI、ARBの各単剤療法、併用療法、及び無投与群において、左室コンプライアンスを含む左室拡張能の測定、左室繊維化の定量、collagen I & IIIなど繊維化マーカーの測定にて、血行動態的に及び組織的に左室繊維化を評価後、BKやeNOSの定量及び免疫染色を施行し、内因性BKの関与を推定する。
HPV-中咽頭癌における癌幹細胞の同定と転移・浸潤に関与するシグナル経路の解明

さらに癌幹細胞群と癌非幹細胞群での増殖能力と化学療法感受性について実験を行なった。MTTアッセイにより細胞増殖を確認した。シスプラチンを両方の細胞群に色々な量(0.3125 microgram/mlから40 microgram/mlからまでのRangeで)で適用したところで定量でも高量でも癌幹細胞群は化学物質に対して統計的に有意な抵抗があった。現在Histon Cluster遺伝子のそれぞれに対してSiRNAをデザインしている。癌幹細胞で過剰発現しているHiston Cluster遺伝子をそれぞれ抑制し、癌幹細胞の特徴がなくなり、化学療法、放射線療法などの抵抗が克服できれは癌治療で大成功が得られる。癌幹細胞の分離は非常に時間がかかり、量もとても少ないです。毎回実験するときにまず癌幹細胞を分離し、組織学的にまたは免疫蛍光染色的に癌幹細胞であることを確認してから次の実験段階に進んでいます。SiRNA実験だけは遅れているですが既にHiston Cluster遺伝子に対してSiRNAをデザイン中である。それに代わりにChemosensitivity Assayは早めにした。Histon Cluster遺伝子に対してSiRNA実験により癌幹細胞の抑制を確認し、癌幹細胞の幹細胞特徴がなくなっていることの実験(Sphere FormationアッセイでSphere消失、ALDH1A染色消失、癌幹特徴遺伝子発現低下など)。Histon Cluster遺伝子抑制で化学療法物質(シスプラチン)に対して感受性の変化があるかどうかの確認実験。Matrigel Invasionアッセイにし癌幹細胞の浸潤能力などの変化があるかどうかの確認実験。本研究ではツルク大学Grenman教授より供与されたHPV(-)中咽頭癌細胞株であるUT-SCC 60Aを使用した。この細胞株は扁桃癌から樹立されたHPVー中咽頭癌細胞を含んでいる。腫瘍細胞株を特異的な無血清培地で培養した。癌幹細胞特異の細胞抗体(抗ALDH1抗体)にて染色し、MACS(Magnetic Beads Sorting)により、癌幹細胞および癌非幹細胞の分離を成功した。アルデヒド脱水素酵素(Aldehyde dehydrogenase:ALDH)は、アルデヒドの代謝に関与しレチノールをレチノイン酸に変換させる働きをもち、ALDHの活性は正常組織における幹細胞のみならず腫瘍幹細胞においてもみられることが報告されている。分離した細胞株から癌幹細胞であることを下の方法で確認した:形態的構造相違:培養した細胞株では癌幹細胞群はSphere形成を示し癌幹細胞であることを考慮した。次に癌幹細胞および癌非幹細胞(分化型細胞)から、それぞれTotalRNAを抽出しcDNA作成をした。分離した癌幹細胞を免疫染色および癌幹細胞マーカー遺伝子発現により確認する。逆転写反応を行ってから癌幹細胞に高発現すると考えられるNanog、Sox2、Oct4の発現量をRT-PCR方法で検討した。癌幹細胞株では癌非幹細胞株に比較してこの三の遺伝子すべて高発現を示した。分離した各細胞株をさらに蛍光が付いている抗ALDH1抗体を利用して癌幹細胞であることを確認した。分離した各細胞株をMicroarray解析(GeneChip Human Gene 2.0 ST Array (Affimetrix) 24,838 genesand 11,086 linc RNA)を行った。Microarray解析結果として癌幹細胞株では癌非幹細胞株に比較してHistonClust蛋白コードする遺伝子の好発現を同定した。研究計画通りに進んでいる。研究計画通り見出した頭頸部癌の癌幹細胞特異的シグナル経路に関連する遺伝子を用い、細胞機能実験において増殖・浸潤・転移・薬剤耐性への関与を検討する。Microarray解析により癌幹細胞と癌非幹細胞を比較し、癌浸潤・癌転移と薬剤耐性に関与している遺伝子の選択をし、癌幹細胞と最も関連がある(癌非幹細胞に比較して)高発現遺伝子と低発現遺伝子を選択し機能解析の対象とする。Loss -of-function実験をする。癌幹細胞にトランスフェクションで高発現している遺伝子を特異的なsiRNAを細胞に導入することによりターゲット遺伝子を抑制する。siRNAは化学修飾された二本鎖の核酸で、内在性のmRNAに特異的に結合し阻害するようにデザインされている。MTTAssay、Chemosensitivity Assay、CellMigrationAssayを行う。

Matrigel Invasionアッセイにし癌幹細胞の浸潤能力などの変化があるかどうかの確認実験。実験材料の購入の調製で次年度に使用する。実験の一部の順番の変更と出張の変更で次年度使用額が生じた。特になし
核医学的手法を用いる細胞増殖因子産生腫瘍の検出と治療法の開発

ある種の腫瘍では増殖因子がオートクラインまたはパラクラインの機序によって腫瘍の増殖に直接関与している。このような腫瘍では増殖因子に対する中和抗体が腫瘍細胞の増殖を抑制しうることが明らかにされており、中和抗体の治療への応用が試みられている。本研究では塩基性線維芽細胞増殖因子(basic-FGF)を認識するマウスモノクローナル抗体3H3を用い、basic-FGF産生腫瘍を核医学的手法により視覚的に診断する方法を開発した。3H3抗体はインビトロ、インビボにおいてヒト膠芽種細胞U87MGの増殖を抑制する。ヨード125(I-125)あるいはインジウム111(In-111)で標識した3H3抗体はインビトロにおいてU87MG細胞と結合し、U87MG細胞表面にはbasic-FGF受容体のみならずbasic-FCF自体も発現していた。U87MG細胞をヌードマウスの皮下に移植し腫瘍を形成させた後、I-125またはIn-111で標識した3H3抗体もしくはアイソタイプを一致させた非特異的対照抗体を腫瘍周囲の皮下に投与したところ、いずれの標識体においても3H3抗体は対照抗体に比較して腫瘍内に高い濃度で長く留まった。In-111標識抗体は脱ヨード化を受けないのでI-125標識抗体より腫瘍内の放射能が高く保たれ、シンチグラム上もIn-111標識3H3抗体により腫瘍が明瞭に描出された。basic-FGFを産生していない移植腫瘍においては標識3H3抗体の滞留は認められなかった。これらの結果は、投与した標識抗増殖因子抗体の分布が、個々の腫瘍において増殖因子が腫瘍増殖に関与しているか、さらに抗増殖因子抗体による治療が可能か、の指標となりうることを示す。現在、皮下投与ではなく静脈内投与により標識抗体を効果的に腫瘍に集積させることを検討している。ベータ線放出核種を用いて抗体を標識すれば抗体の生物学的作用に放射線による内照射を加味した抗腫瘍効果も期待できる。
RGB画像を利用した血管内皮機能イメージング装置の試作研究

本研究課題では、ディジタルカラーCCDカメラにより取得したヒト皮膚のRGB画像から皮膚表在毛細血管の酸化・還元血液濃度を求め、上腕圧迫-開放に対するこれらの時間応答特性から動脈血流入量、静脈容量、最大静脈血流出量、及び反応性充血後の血流減衰曲線の時定数の4つの血管拡張性指標を推定・画像化する方式を新たに考案した。正常およびI型糖尿病ラットを用いた動物実験およびヒト皮膚に対する実験により各指標の空間分布計測が可能であることを確認した。これにより、新しい血管拡張性評価法の可能性が得られた。本研究課題の目的は、ヒト血管内皮機能情報分析のために簡易な拡散反射分光画像計測システムを試作・開発し、血管拡張・収縮性の非侵襲イメージングを実現することである。本年度の研究では、はじめに光源、ライトガイド、RGBカラーCCDカメラ、光学部品固定装置及び画像取り込み用PCから成る画像取得装置を構築した。次に、皮膚のRGB画像から表在動脈及び静脈血管の拡張性指標を独立に求める方式を検討した。RGBの3応答量からXYZ表色系を介して皮膚表在血管の酸化血液量と還元血液量を推定する変換マトリクスを作成し、血流遮断解除直後の酸化・還元血液量の時系列応答曲線から静脈血流出量と動脈血再還流量を算出するアルゴリズムを考案し、RGB画像から血管拡張性指標の2次元可視化を行なう新しい方式を開発した。さらに、開発したアルゴリズムを基に血管拡張性指標の2次元分布を再構成・画像表示を行なうための計測システムを試作した。カメラコントロール、画像取得及び伝送はIEEE1394FireWireケーブルを介してリアルタイムで行い、AVIフォーマットによる動画ファイルをPC内に保存し、1フレーム毎のオフライン処理による解析と結果の表示が可能であることを確認した。また、RGB画像からウイナー推定法に基づき可視域(450-700nm)のマルチスペクトル画像を推定し、重回帰分析に基づき皮膚表在血管の酸化血液量と還元血液量を推定する方式を新規に開発した。本研究課題の目的は、ヒト血管内皮機能情報分析のために簡易な画像計測システムを試作・開発し、血管拡張・収縮性の非侵襲イメージングを実現することである。本年度の研究では、はじめに、皮膚表面の曲面形状による照明ムラを補正するために、RGB値をLab色空間へと変換し、明度L値の空間的な不均一性を補正した上で再びRGB値へと逆変換する新しい独自のアルゴリズムを考案し、画像解析プロセスに実装した。また、メラニン様色素と馬存血を用いた人工皮膚モデルを作成し、酸化・還元血液濃度の定量性を確認した。次に、ラット背部有形皮弁の基底部を550mmHgの圧力で圧迫・解放可能な新規な動物実験モデルを開発し、正常群とSTZ投与I型糖尿病発症群に対して実験を行った。血管拡張性指標である動脈血流入量と静脈容量はI型糖尿病発症群で低下することが明らかになり、提案システムにより糖尿病により減弱した血管内皮機能を経皮的に計測・画像化できる可能性が得られた。さらに、ヒト上腕部圧迫-解放に対する血液量変化を連続的に画像計測し、動脈血流入量、静脈容量、静脈血流出量、反応性充血のリカバリー時定数の画像化を行った。画像内関心領域の画素平均値と平常時の収縮期血圧、拡張期血圧、脈拍数、脈圧を比較した結果、特に動脈血流入量と脈拍数および反応性充血のリカバリー時定数と拡張期血圧との間の相関係数はそれぞれr=-0.47およびr=0.84であり、血管の拡張性が低いほど心拍数が高く、拡張期血圧が高いほど、血管の拡張・収縮性が低く、反応性充血後のリカバリーに時間を要するという結果が得られた。提案法により得られた結果と従来法であるストレンゲージプレチスモグラフから得られた結果は良い相関を示すことを確認した。以上により、RGBカメラを基盤とした血管拡張・収縮性の非侵襲イメージングが実証され、新しい血管内皮機能分析法の可能性が得られた。
酸化的カップリングによる拡張芳香族マテリアルの合成

生体分子の構造には、インドール、ベンゾチオフェン、カルバゾールなどのヘテロ芳香環骨格が多く見られる。これらの骨格へ種々の官能基が配置された化合物群には強い生理活性を示す分子が多く存在し、医薬品や農薬として広く利用されている。近年、これらの分子を効率的に合成する手段として、芳香環上の炭素ー水素(C-H)結合を直接官能基化する方法が注目されている。特にC-Hホウ素化は、合成化学的に有用な有機ホウ素化合物を調製する手法として盛んに研究され、これまでにイリジウムやロジウムなどの遷移金属触媒を用いた反応が開発されている。一方、これらの金属は高い活性が見られるものの非常に高価なため、これに代わるコストパフォーマンスに優れた触媒の開発が望まれている。本研究では、安価なニッケル触媒に着目した。近年、ニッケル触媒を用いたC-H官能基化反応が多数報告されているが、C-Hホウ素化反応にニッケルは用いられていない。本年度は、配位子や添加剤を探索することにより、ニッケル触媒を用いたC-Hホウ素化反応を検討した。その結果、ニッケル触媒を用いた芳香族C-Hホウ素化を世界に先駆けて開発することができた。この反応は、ニッケルビスシクロオクタジエン、トリシクロペンチルホスフィン、フッ化セシウム存在下において、ベンゼン誘導体およびインドール誘導体を効率良くホウ素化できる。また、重水素を用いた反応速度解析より、炭素水素結合開裂が律速段階であることが示唆された。本反応は、より詳細な反応機構解明や基質適応範囲の拡大を行うことで、さらに有用な反応への発展が期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。オーキシン(Indole-3-aceticacid, IAA)は、最も古くから知られている植物ホルモンであり、植物のあらゆる生理応答に関わっている。オーキシンのシグナル伝達に重要な受容体タンパク質としてABP1やTIR1などが知られているが、これら以外の受容体の存在が示唆されるなど、オーキシンのシグナル伝達経路には未解明な部分が多く残されている。それぞれの受容体を選択的に、かつ器官特異的に抑制することができれば、各受容体の機能を浮き彫りにすることが可能で、オーキシンの機能解明にむけた飛躍的進展が期待できる。本研究では、C-H活性化型カップリング反応を用いた迅速合成を基盤に、各受容体に選択的に結合する高機能性人工オーキシンの開発をめざした。インドール骨格へ種々の官能基が配置された化合物群の合成法として、予め官能基化した複素化合物の環化反応がこれまで多用されて来た。この方法は、過酷な反応条件を必要とすることが多く、選択性や効率が低いうえ、反応条件に耐えうる官能基が限られるなどの問題点が存在した。これに対し本研究では、C-H活性化型カップリング反応を用いることで、迅速な官能基化を達成した。とくにIAAの2位へは1段階で無保護のまま官能基化できる条件を用いることで、多様な置換基の導入されたオーキシン類縁体ライブラリーの構築を行った。得られた化合物の生理活性は、ABP1やTIR1など既知の受容体に対する刺激応答およびシロイヌナズナの表現系観察により評価した。その結果、オーキシンの受容体選択的なアゴニスト、アンタゴニストを見いだした。これらの分子群は、植物成長の機構解明を加速し、将来的には食料問題の解決への貢献が期待される。当初の計画とは方向性を若干変更したが、結果的に予想以上の進展が見られた。申請当初の計画に加え、より植物生理に踏み込んだ分子設計および合成を推進する。合成化学と植物
味覚閾値の季節変動に着目した冬季の体重増加の要因解明に関する研究

我が国の国民健康・栄養調査において、体格指数BMIは20歳代以上のすべての年代の男性で増加していた一方、国民1人当たりのエネルギー摂取量は一貫して減少傾向にあったと指摘されている。本申請研究では、BMIとエネルギー摂取量の経年的変化の乖離の一因に冬季の特徴的な体重増加があると仮定し、体重増加の要因として冬季の味覚閾値の変動に着目して、その影響因子および寄与度を明らかにすることを目的とした。平成30(2018)年度から、前年度の調査において抽出された味覚閾値の変動要因の候補となる因子を、味覚閾値や体重等と併せて長期的に調査し、季節ごとの相互の関連を詳細に検討するための縦断調査を、順次開始している。縦断調査では、研究対象者に対し、12か月間にわたり季節ごと(春季・夏季・秋季・冬季)に1回の計4回、当該因子の他、味覚閾値、身体組成、食事摂取状況、身体活動量等の測定を実施している。本年度中に縦断調査を開始した対象者数は40名であり、次年度も継続して調査を行う計画である。この縦断調査の成果は、冬季の体重増加に対する具体的な予防策提案の一助となることが期待でき、体重コントロールに関する情報提供を行うさまざまな場面で活用可能であるため、社会的意義があると考える。当初計画では、体重変動のみを測定する群と、他の項目を加えて詳細に調査する群とに分けて縦断調査を進める予定であったが、研究実施環境等を勘案し、詳細な調査を実施する群に専心して調査を進めることとした。本年度中に40名の測定を開始することができ、ひとまず統計解析を行う上で必要な検出力を得られるだけの対象者数を確保したが、次年度にも対象者を追加し、検出力の底上げを図る計画である。当初の計画通り、平成30(2018)年度に開始した縦断調査を平成31(2019)年度も継続して実施する。それに加えて、次年度にも新規対象者の募集および縦断調査の開始を予定している。平成29年度は、味覚閾値の変動に影響することが予想される内的・外的因子計50項目のうち、冬季にもっとも高頻度に出現する項目あるいは冬季に大きく変動する項目を抽出するため、ヒアリング調査を実施した。調査は、関東地方および東海地方の4年制大学に通う大学生を中心に行った。対象者数は569名であり、このうち回答不備等のあった者を除外したところ、有効回答数は556件であった。今回調査した50項目のうち、冬季に相対的に強い関連を示す因子として14項目が抽出された。抽出された項目は、食嗜好に関する項目、身体活動に関する項目、体調に関する項目、気分に関する項目のいずれかであった。当該年度の横断調査により抽出された因子は、次年度以降の縦断調査において味覚閾値および体重と併せて長期的に調査し、季節ごとの相互の関連を詳細に検討する。本申請研究の成果により、冬季の体重増加に対する具体的な予防策の提案が可能となれば、体重コントロールに関する情報提供を行うさまざまな場面で活用でき、社会的意義があると考える。対象者数に関して、当初予定していた数には達しなかったものの、統計解析を行う上で必要な検出力を確保できるだけの有効回答数を得ることができた。このため、当該年度中に予定していた、冬季に強く関連する可能性のある因子の抽出を行うことができ、さらに、この成果を学会にて発表することができた。

本年度中に40名の測定を開始することができ、ひとまず統計解析を行う上で必要な検出力を得られるだけの対象者数を確保したが、次年度にも対象者を追加し、検出力の底上げを図る計画である。平成29年度の調査にて統計解析に必要な数のデータは得られたが、さらに統計解析の水準を上げるために、平成30年度の前半に追加のデータ収集を行う。それと並行して、当初予定していた平成30年度の調査を進める予定である。当初の計画通り、平成30(2018)年度に開始した縦断調査を平成31(2019)年度も継続して実施する。それに加えて、次年度にも新規対象者の募集および縦断調査の開始を予定している。平成30年度に開始予定の追跡調査について、平成29年度の調査の進捗状況によって開始時期を調整する可能性があったため、追跡調査に用いる消耗品類の一部を平成29年度の経費として計上していたが、当初計画していたスケジュールに沿って調査を実施したため、次年度使用額が生じた。当該助成金は平成30年度に実施する追跡調査の経費として計画に沿って使用する。本年度は、研究実施環境等を勘案し、調査対象者数や当該年度中の測定実施回数、研究支援者の支援内容、研究実施場所等を変更したため、国内旅費および人件費・謝金として計上していた経費に当初計画との差異が発生し、次年度使用額に変更が生じた。当該助成金は、次年度に継続して実施する縦断調査に必要な経費として、計画に沿って使用する。
高等植物におけるジャスモン酸のシグナル伝達機構の解明

本研究は、高等植物の病害抵抗性発現機構において、エリシターの下流で二次シグナルとして重要な機能を果たしているジャスモン酸(JA)の生合成やシグナル伝達機構を解明するための基礎的知見を得ることを目的とするものである。得られた主要な成果は、以下のとおりである:(1)イネにおいて防御応答への関与が示唆されているJA応答性遺伝子OsOPR1(12-オキソフィトジエン酸還元酵素1)のプロモーター解析を行い、その発現制御にbZIP型転写因子が関与していることを明らかにした。(2)イネゲノムに10種以上存在するOsOPRsのうち、OsOPR7がJA生合成に関与することを明らかにした。OsOPR7をシロイヌナズナのJA欠損AtOPR3変異体で過剰発現させたところ、雄性不稔形質が回復することが示された。(3)イネ培養細胞から単離したジャスモン酸応答性bHLH型転写因子遺伝子RERJ1がイネ植物体において傷害や乾燥などのストレス応答に関与している可能性を示した。(4)早期エリシター/JA応答性のWRKY型転写因子遺伝子OsWRKY53、OsWRKY71の過剰発現株を用いたマイクロアレイや定量的RT-PCR等の詳細な解析により、多数の病害抵抗性遺伝子の発現制御に、両転写因子が関与している可能性を示した。また、OsWRKY53、OsWRKY71はそれぞれ転写活性化因子、転写抑制因子として機能していることも示唆した。OsORKY53過剰発現体イネはいもち病菌抵抗性を示した。本研究は、高等植物において病原菌感染シグナルの伝達物質として機能することが示されているジャスモン酸(JA)のシグナル伝達機構の全貌を解明することを究極的な目的とする。1イネから申請者らが単離したOsOPR1(JA生合成酵素の一つである12-オキソフィトジエン酸還元酵素をコードしている)について、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いた5'-デリーション解析を行い、OsOPR1の翻訳開始点上流800-1000bpの領域に2個のTGACGモチーフが存在し、これらがJA応答性のシスエレメントとして機能していることを明らかにした。これにより、これらのエレメントに結合すると考えられるTGAファミリーの転写因子がOsOPR1の転写制御に関与していることが強く示唆された。2申請者は、すでにイネの主要フィトアレキシングループの一つである(-)-phytocassanesの生合成酵素遺伝子をコードしているent-cassa-12,15-diene合成酵素遺伝子を単離しているが、その研究過程でもう1種の同族体遺伝子OsDTC2の存在も明らかになった。そこで、OsDTC2cDNAの単離・機能解析を行い、OsDTC2がオリザレキシンSの生合成に関与するstemar-13-ene合成酵素をコードしていることを明らかにした。また、ジテルペン炭化水素からフィトアレキシンへの変換を触媒するP-450酵素遺伝子KO4についてもその遺伝子産物の機能解析を酵母を用いて行っている。3申請者らがyeast three-hybrid systemを用いて単離した、ダイズ培養細胞由来JA受容体候補タンパク質遺伝子(prk1と仮称)について、その遺伝子産物であるPRK1の大量発現系を構築した。今後各種JA誘導体に対する結合活性など諸性質を詳細に解析していく予定である。本研究は、高等植物において病原菌感染シグナルの伝達物質としてエリシターの下流で機能するジャスモン酸(JA)のシグナル伝達機構を解明することを究極的な目的とする。

(1)我々がイネからが単離したOsOPR1(JA生合成酵素の一つである12-オキソフィトジエン酸還元酵素をコードしている)の同族体がイネゲノムに10種以上存在することを示し、そのうちのOsOPR8のみがペルオキシソームに局在し、JA生合成に関与している可能性を示した。(2)我々が機能解析を行った、オリザレキシンSの生合成に関与するstemar-13-ene合成酵素遺伝子OsDTC2のプロモーター解析を行い、翻訳開始点上流1458-1634bpの領域に6個のTTGAC(T/C)モチーフ(W-box)が存在し、これらがエリシター応答性のシスエレメントとして機能していることを明らかにした。これにより、これらのエレメントに結合すると考えられるWRKYファミリーの転写因子がOsDTC2の転写制御に関与していることが強く示唆された。(3)イネ培養細胞から早期エリシター応答性のWRKY型転写因子遺伝子OsWRKY53、OsWRKY71を単離し、過剰発現形質転換体を用いたマイクロアレイ解析等により、それらが病害抵抗性発現に重要な機能を果たしている可能性を示した。また、我々が機能解析を進めていたJA/エリシター応答性bHLH転写因子遺伝子RERJ1についても、当該遺伝子が病害抵抗性だけでなく、傷害、乾燥を始めとする様々なストレスに対する防御応答に関与している可能性を示した。本研究は、高等植物の病害抵抗性発現機構において、エリシターの下流で二次シグナルとして重要な機能を果たしているジャスモン酸(JA)のシグナル伝達機構を解明することを究極的な目的とするものである。本年度得られた主要成果は以下のとおりである。(1)イネゲノムに10種以上存在する12-オキソフィトジエン酸還元酵素遺伝子(OsOPR)同族体のうち、ジャスモン酸生合成に関与すると推定されるOsOPR8をシロイヌナズナのジャスモン酸欠損AtOPR3変異体で過剰発現させたところ、雄性不稔形質が回復することが示され、上記推定が正しいことが再確認された。(2)イネの主要なファイトアレキシンであるモミラクトンの生合成に関与する9βH-pimara-7,15-diene合成酵素遺伝子(OsKS4)のプロモーター解析を行い、翻訳開始点上流1140-1145bpに存在するTGACGTモチーフがエリシター応答性のシスエレメントとして機能していることを明らかにした。これにより、このエレメントに結合すると考えられるbZIP型の転写因子がOsKS4の転写制御に関与していることが強く示唆された。(3)早期エリシター/ジャスモン酸応答性のWRKY型転写因子OsWRKY53、OsWRKY71の過剰発現株を用いたマイクロアレイや定量的RT-PCR等の詳細な解析により、OsWRKY53がOsWRKY71の上流で機能していること、両転写因子の制御下に多数の病害抵抗性に遺伝子が存在する可能性が示された。また、我々が機能解析を進めていたJA/エリシター応答性bHLH転写因子遺伝子RERJ1についても、過剰発現株を用いたマイクロアレイや定量的RT-PCR等により当該遺伝子が多数の防御応答遺伝子の発現に関与している可能性が示された。
時間分解コヒーレントフォノン制御を用いた表面原子のインプロセスナノ加工・計測

本研究では,時間的に近接させた2つのフェムト秒パルスビーム(ダブルパルスビーム)を照射した時に,第1のパルス照射後に,ターゲット表面に生じるインコヒーレントなプラズマ励起,格子系のコヒーレント振動励起などの瞬間的な励起現象を低照度レーザー加工に応用することを検討している.本課題では,フェムト秒レーザー照射直後から100ps程度の時間が経過するまでの過渡的なプラズマ励起および格子系の励起現象,また,励起表面の加工中に生じるターゲット表面の形態変化について,時間分解観察を行い,低照度ダブルパルスビームによるレーザー加工現象の基礎過程を調べる.フェムト秒レーザの高強度電界は,物質表面に自由電子と格子イオンの位相がそれぞれ揃った振動(コヒーレントフォノン)を励起する.複数のフェムト秒パルスを内包するパルストレインビームを照射する場合は,コヒーレントフォノンが重畳し,その振動中にレーザーを照射し,加工をすることが可能になると考えられる.本研究では,パルストレインの時間波形を操作して,コヒーレントフォノン励起状態にある表面をパルストレインビームを用いて加工する装置を試作し,パルストレインビームによる表面加工現象を詳しく調べるための基礎実験を行った.まず,数値解析実験によって,周波数空間上で,光波に波形整形のための位相分布を付加し,所望の時間波形を有するパルストレインビームが作製できるかについて検討をした.その結果,M-Sequenceとよばれる1,0の配列の組み合わせで表現される位相分布を用いて,複数のフェムトパルスが連続してあらわれるパルストレインビームの整形が可能なこと,また,その第一パルスと第2パルス以降のパルスの強度比を制御可能であることを確認した.次に,フェムト秒レーザの高強度電界は,物質表面に自由電子と格子イオンの位相がそれぞれ揃った振動(コヒーレントフォノン)を励起する.複数のフェムト秒パルスを内包するパルストレインビームを照射する場合は,コヒーレントフォノンが重畳し,その振動中にレーザーを照射し,加工をすることが可能になると考えられる.本研究では,パルストレインの時間波形を操作して,コヒーレントフォノン励起状態にある表面をパルストレインビームを用いて加工する装置を試作し,パルストレインビームによる表面加工現象を詳しく調べるための基礎実験を行った.本研究では,コヒーレントフォノンを励起する過程における格子振動エネルギーの空間的な局在性と,パルストレインビーム入射時の格子振動の振動応答の高速性に着目し,その加工応用を目指す.本計画では,提案するパルストレインビームを用いたコヒーレントフォノン励起加工現象について,フェムトパルストレインビームによるコヒーレントフォノンの励起とその時間応答を可視化するため,レーザー加工面の安置ストークスラマン散乱光を検出するシステムを設計,構築した.また,パルストレインビームによる加工面のコヒーレントフォノンの励起現象を観測するため,遅延時間を変化させながら被加工面の加工と観察を行い,その加工特性を評価した.また,格子振動の評価結果に基づいて,格子温度を定量する技術を確立し,パルストレインビームを用いたコヒーレントフォノン励起面の加工現象について,その加工原理の解明につながる基礎的な実験を遂行している.本研究では,コヒーレントフォノンの励起過程における格子振動エネルギーの空間的な局在性とパルストレインビーム入射時の格子振動の振動応答の高速性に注目し,その加工応用を目指した研究を遂行してきた.本計画では,パルストレインビームを用いたコヒーレントフォノン励起加工現象について,フェムトパルストレインビームによるコヒーレントフォノンの励起とその時間応答を可視化するため,ダブルパルスビームによるレーザー表面加工実験装置を試作,また,ダブルパルスの遅延時間を変化させ,半導体材料として,Ge(使用光源でのコヒーレントフォノン励起可能), Si(使用光源でのコヒーレントフォノン励起困難)の基板を加工し,その実験結果を比較した.上記の加工実験では,Si, Geともに,ダブルパルスビーム照射による加工結果と,シングルパルスビームによる加工結果に基づき,ダブルパルスビーム(加工前の表面励起あり)とシングルパルスビーム(加工前の表面励起なし)の加工閾値を比較したところ,ダブルパルスビームでは,シングルパルスビームの加工と比較して,より低照度のビームによる加工が可能であることが確認されており,2つ以上の時間的に近接したパルスが繰り返されるパルストレインビーム加工における,レーザーの表面励起効果が確認された.しかし,その表面励起効果は,Si,Geに大きな違いはなく,コヒーレントフォノンの励起が,加工現象に大きな影響を及ぼす可能性を示す実験データは得られなかった.本研究計画のなかで遂行した実験結果を分析した結果,パルストレインビームによる加工では,主に,電子系の励起現象(プラズマ生成)によって,表面光吸収率が上昇する効果が主要因となり,低照度ビームによる加工が可能になることが確認された.

これらの励起現象を,レーザー表面加工に応用すれば,低照度ビームによる低ダメージ表面加工が実現すると考えられる.本研究では,時間的に近接させた2つのフェムト秒パルスビーム(ダブルパルスビーム)を照射した時に,第1のパルス照射後に,ターゲット表面に生じるインコヒーレントなプラズマ励起,格子系のコヒーレント振動励起などの瞬間的な励起現象を低照度レーザー加工に応用することを検討している.本課題では,フェムト秒レーザー照射直後から100ps程度の時間が経過するまでの過渡的なプラズマ励起および格子系の励起現象,また,励起表面の加工中に生じるターゲット表面の形態変化について,時間分解観察を行い,低照度ダブルパルスビームによるレーザー加工現象の基礎過程を調べる.本研究では,コヒーレントフォノンの励起過程における格子振動エネルギーの空間的な局在性と,パルストレインビーム入射時の格子振動の振動応答の高速性に着目し,その加工応用を目指す.フェムト秒レーザーパルスを試料に照射すると,その高強度電場により,調和的で位相の揃った格子振動(コヒーレントフォノン)が励起される.本研究では,フェムトパルスと格子振動の相互作用による高速な振動応答を利用して,格子温度を上昇させ,高速かつ高精度な局所レーザー加工を実現する技術を確立することを目指し研究を遂行した.これまでに,提案手法の妥当性を検証するための基礎的なダブルパルスビーム照射光学システムの構築およびパルスの遅延時間を変化させた場合の加工特性の変化に関する基礎実験を遂行しており,研究はおおむね計画通り,順調に進展している.27年度が最終年度であるため、記入しない。光加工,計測加工対象となる基本的な材料(Ge, Si, SiO2等)に,基本のフェムト秒単パルスを照射した際に,励起されるコヒーレントフォノンの振動変位を計測し,一方で,上記と同じ照射条件で,同様のフルエンス,パルス幅,波長分布を持つフェムト秒シングルパルスを用いて励起したコヒーレント振動の振幅を計測する.次に,これらの実験データの比較照合を行い,コヒーレント振動の振幅変位をシングルパルス照射の場合とダブルパルス照射の場合について定量化する.以上のプロセスを経て,コヒーレントフォノン励起時の格子変位量を定量化し,コヒーレントフォノン励起面の格子温度評価を実現することを目指す.さらに,パルストレインビーム照射時のフルエンスを調整し,コヒーレントフォノンが励起される場合と励起されない場合の加工条件を設定して,加工基礎実験を行い,その結果について考察することによって,コヒーレントフォノン励起加工における加工原理を解明することを目指す.平成25年度は,フェムト秒レーザによるコヒーレント振動励起技術の確立のため,レーザ加工用パルストレインビームの時間波形整形技術の確立に取り組んだ.空間光変調器によって,光の周波数(波長)ごとに異なる位相分布を与えると,フェムト秒パルス列がパルス中に内包されるパルストレインビームが出力される.得られた時間波形は,レーザの時間波形をfsオーダーの時間分解能で計測できるフェムト秒レーザ時間波形計測装置によって評価した.本研究を遂行するためには,パルストレインビームによるレーザ加工を実現するため,高強度のパルストレインビームを時間整形する必要があり,フェムト秒レーザの時間波形整形時に光量の減衰を抑制する必要がある.そのため,提案する手法では空間光位相変調器上で,大幅なビームの減衰を伴う光の強度変調を行わず,位相のみを変調して波形整形を行い,光の利用効率を光の強度変調を行う場合に比べて大幅に向上させるパルス波形整形技術の確立した.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度は,コヒーレント振動によるレーザ加工現象の検証のため,コヒーレントフォノンの時間分解計測技術の確立に取り組む.フェムト秒レーザ
Coiled-coilドメイン阻害に伴う17型コラーゲン切断亢進メカニズムの解明

本研究の目的は、自己免疫性水疱症である水疱性類天疱瘡(bullous pemphigoid, BP)の自己抗原である17型コラーゲン(COL17)の最も主要な抗原領域であるNC16Aドメイン内に存在しるCoiled-coilの生理機能を解明することである。本研究により、Coiled-coilは、正しく3量体としてCOL17を構築する上で不可欠な領域であり、3量体の形成がうまくいかなかった場合、プロテアーゼによって速やかにタンパクが分解される認識部位となることが明らかになった。Coiled-coilは、タンパク質同士の結合に重要な、7アミノ酸ごとの繰り返し配列である。17型コラーゲンには、細胞膜近傍のNC16A領域に強力なCoiled-coil領域が存在するが、NC16A領域は、自己免疫性水疱症である水疱性類天疱瘡の主要な抗原エピトープであり、同領域内で細胞外領域が切断を受けるなど重要なドメインである。しかし、17型コラーゲンにおけるCoiled-coilの生理機能は未だ不明であった。本研究の目的は、NC16Aドメイン内のCoiled-coilの生理機能を解明することであり、NC16A領域内のCoiled-coil領域のロイシンジッパー部に位置するロイシンをプロリンへ置換した変異COL17を作製した。変異17型では細胞外領域の切断が著明に亢進したが、これは非生理的な切断部位であるFurin認識部位で生じることが明らかになった。通常、生理的に17型コラーゲンは細胞膜においてADAMファミリーによって切断を受けるが、Coiled-coilを阻害した変異COL17の切断はADAMの阻害剤では抑制されず、セリンプロテアーゼにより抑制された。更に詳細に特異的な酵素阻害剤とタンパク輸送阻害剤等を用い検討したところ、変異17型コラーゲンは、細胞膜へ輸送される前に、Furinによりゴルジで切断を受けることが明らかになった。従って、17型コラーゲンのNC16A領域に存在するCoiled-coilには3本鎖形成に重要な役割を担う機能に加え、正しく17型コラーゲンが構築されたか監視する新たな生理機能が存在することが明らかになった。
初期病変と周囲の血管病変に注目した牛肝蛭症の再検討

本年度の研究で肝蛭の肝臓への侵入,胆管への到達経路,胆管系の病変などについては従来の報告に記載された事実を確認し,血管系にも病変を生じることがあるという事実は確認できた。とくに門脈系においてはそれらの血管の拡張と内膜増生を疑うに足る病変を持つ症例を見出したが,不規則な内膜増生と成熟した結合組織増生のみですでに好酸球をはじめとする細胞反応が痕跡的になっていることが多く,それらを一連の動きのある病変として捉えるには至らなかった。「好酸球性増殖性小葉間静脈炎(仮称)」と虫道や好酸球性膿瘍の共存する例,発達途上の虫体がみられ,虫体に破壊された肝臓組織に隣接して軽度ながら「好酸球性増殖性小葉間静脈炎(仮称)」類似の像が見られる例もあった。様々な程度の光学顕微鏡下でよく分化した平滑筋とみなされる細部の増殖性変化はこのようなごく軽度の血管病変を持つに過ぎない症例にも見出され,興味ある所見と考えた。今年度の材料収集の中でわが国の牛における豚回虫寄生例の存在も明かとなり,牛の肝臓の寄生虫性病変の見直しの必要を痛感した。本研究では,牛肝蛭症の病理の再検討を企図して食肉衛生検査で発見されるものの中から材料を収集してきた。全く予想出来なかったわけではないが,早期病変を有する肝蛭症牛の肝臓の収集は予想以上に困難で,経費の面で困難ではあるが実験的再現,あるいは肝蛭症が十分な対策を講じられること無く流行している国の研究者との共同研究の必要性を感じさせるものであった。
ニホンウナギの回遊遺伝子単離に向けた分子遺伝学的研究

回遊に密接に関わるレプトセファルスからシラスウナギへの変態に着目し、変態の早さに関連する遺伝マーカーの探索のための解析基盤の構築を行った。具体的には、以下の3つの研究を実施した。(1)解析材料となる家系の作出:完全養殖第2世代のウナギの中で変態の早かった家系の姉妹交配により作出された家系を解析家系とした。変態が開始した個体は変態日数を記録し、DNA解析用にエタノール中に保存した。以上から、変態日数解析用個体77個体のサンプリングが完了した。(3)育種研究の基盤ツールである親子鑑定系の確立:雌親魚5個体と雄親魚15個体を自然交配させた集団を解析家系とし、日齢2日の153個体と日齢30日の148個体を解析に供した。ヘテロ接合度と多型情報含有値の高い8つのマイクロサテライトマーカーを選定し、マルチプレックスPCR法により全マーカーを同時に増幅させ、多型解析を実施した。計301個体のうち297個体の親子のペアを判別でき、鑑定率は98.7%と高い精度の親子鑑定法を確立できた。以上の研究を通じて、変態に関する遺伝的解析基盤の構築するとともに、育種に向けた基礎ツールの確立もできた。26年度が最終年度であるため、記入しない。採用初年度は、分子遺伝学的解析のための家系構築とニホンウナギの親子鑑定法の検討を実施した。ウナギの回遊生態において接岸時期に影響を決める形質である仔魚から稚魚への変態日数に着目し、遺伝学的解析用の家系を作出した。いらご研究所にて完全養殖第2世代のウナギの中で変態の早かった家系の姉妹交配により作出された家系を解析家系とした。日齢30日の個体を150個体の全長、また変態が開始した個体は変態日数を記録し、DNA解析用にエタノール中に保存し、解析用個体225個体のサンプリングが完了した。なお、作出した半数の個体はMAS育種への応用のため、引き続き飼育を継続している。遺伝育種を遂行する上で家系管理は必須であり、そのために必要不可欠な親子鑑定系を確立した。親子鑑定のため、既報(Tzeng et al. 2001, Ishikawa et al. 2001, Wirth and Bernatchez 2001)の15個のマイクロサテライトマーカーを選定した。本研究ではマルチプレックスPCR法によりマーカー型を決定し、得られたマーカー型をPARFEXver1.0 (Sekino and Kakehi 2011)を用いて解析し、親子判別を実施した。解析には雌3個体と雄15個体を集団自然交配させて作出した家系を用いた。4種類の蛍光(FAM, NED, VIC, PET)と各増幅産物の大きさの組み合わせにより、1回のPCR反応系で7マーカーを同時に解析することに成功した。解析した子供172個体中145個体で親のペアを識別することが出来た。雌は3個体中2個体が次世代に貢献し、雄は貢献度に差はあるものの集団交配させたほとんどの個体が次世代に貢献していた。採用初年度は研究計画どおりに解析家系F1の作出に成功し、日齢30日における成長速度の記録、変態を完了するまでの日数を記録した個体の採集に成功した。また、育種の重要なツールの親子鑑定法の開発にも着手しある程度の精度の鑑定法を構築出来た点も評価できる。本年度はサンプリングした個体をddRAD seq法によるQTL解析を実施し、初期成長と変態期の早さに関連する遺伝マーカーの探索を行う予定である。現在のところ、ddRAD Seq法のためのライブラリーの構築には至っていないため、早急にライブラリーの作製系を立てる必要がある。また、昨年度開発した親子鑑定法は精度が若干良くなかったため、本年度はさらにマイクロサテライトマーカーを選定しより高精度な解析系の構築を目指す。
DRPLA遺伝子の機能の解析

1.DRPLA遺伝子の発現調節を解析するために、まず5'上流域の塩基配列を決定した。その領域は極めてGC含量に富み、TATAボックスなどは無く、いわゆるハウスキーピング遺伝子の特徴を有していた。またSP-1やAP-2結合要素などの特徴ある繰返し構造などを持っていた。これらの特徴はすでに報告されているHD遺伝子の上流域と極めて類似していた。そこでDRPLAおよびHDの両者について、相同領域のプロモーター活性を測定し、比較したところ、最大活性を与える領域や、薬剤に対する効果などが異なっていた。2.DRPLA遺伝子のポリグルタミン鎖や特徴あるモチーフの機能を解析するために、一連の欠失変遺体を分離し、一部についてはin vitroあるいは大腸菌や培養細胞で発現させた。