hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
器具の時系列的使用解析に基づく給水・給湯負荷算定法の開発

本研究は,建築物における給水・給湯負荷算定法として,瞬時・時間・日といった一連の時系列的負荷を統一的に算定する手法を開発することを目的に,3カ年計画で進めた。以下に得られた成果を示す。まず,各種建築物用途における使用水量・湯量,器具利用に関する既往研究,調査結果を整理し,単身・独身寮,集合住宅,駅舎トイレにおける器具利用に基づく水・湯使用実態を明らかにした。また,算定モデルに供する新たな基礎データを蓄積するため,大学食堂,複合商業施設内飲食店舗,事務所ビルなどの建築物用途を対象として,詳細な使用水量・湯量,器具利用に関する調査を実施した。特に,これまで基礎データが少なかった飲食店舗では,使用水量の時系列データのほかに,来客者数などの貴重なデータが得られ,詳細な水使用実態を明らかにすることができた。既往研究や実測調査結果をもとに,各建築物で器具利用に着目した負荷算定モデルを設定し,モンテカルロ・シミュレーション手法を適用した負荷算定プログラムを作成した。負荷算定モデルは,住宅や事務所トイレなどの各水使用器具の特性をモデル化した用途別モデルと,大学食堂,飲食店舗などの厨房を有する建築物用途への応用として,複数の水使用器具を集合として捉えるユニットモデルを提案した。各種建築物用途における負荷算定モデルをもとに,モンテカルロ・シミュレーション手法を用いて時系列的な負荷の算定を行った。算定結果について実測結果と比較検討し,本算定法の広範な有用性を示した。本算定法のユニットモデルの考え方は,そのほかの様々な建築物用途今の広範な適用が期待できる。また,瞬時・時間・日といった時系列的な負荷の予測は,給水・給湯設備の管径設計や機器容量決定などに広く応用できるものと考えている。平成13年度に実施した事項と得られた知見を以下に示す。1.既往研究のデータ整理と再分析研究代表者らがこれまで収集してきた,住宅,事務所,駅舎など各種建築物の使用水量湯量データについて改めて解析し,新たな負荷算定法導出のための基礎的資料を整理するともに,最近測定した使用湯量データに基づき,単身・独身寮における負荷算定モデルを作成し,シミュレーションによって給湯負荷予測を行い,モデルの妥当性を検討した。2.業務用厨房を対象とした使用水量の測定と準備これまで明らかにされていない業務用厨房に関する使用水量,湯量のデータ収集を進めた。測定対象として,(1)比較的限定されたメニューが大量に出食される学生食堂(広島大学内の3棟),(2)単一メニューで調理と洗浄が時間的に完全に分離する学校給食施設(東広島市内,豊松町内で各1棟),さらに,(3)複合商業施設内にある一般的な食堂・レストラン(広島市内の1棟で店舗数は20以上)とした。このうち,(1),(2)については,既設給水,給湯配管に電子式水道メータを設置し,水量と対応する発振パルスをロガーで記録する連続測定を,秋季と冬季について実施し,測定期間中の来客数や出食数等のデータを併せて収集した。(3)については,平成14年度春季から(1),(2)と同様な測定ができるよう,メータ設置等の準備作業を行った。3.事務所ビルを対象とした使用水量の測定事務所ビルにおけるより精密な負荷算定手法を構築するため,広島市内の事務所ビル1棟の男子・女子便所の一部を対象として,2.と同様な使用水量測定,並びに,人感センサを用いた各種器具の同時使用状況調査を冬季から開始した。本年度は初年度に引き続き,各種用途の建物における使用水量・湯量の把握・解析と負荷算定法の基本事項の検討をした。

計測は,初年度と同様に電子式水道メータを既存配管に設置し,単位流量ごとに発信されるパルス信号を,また,使用量と対応させる各器具の使用実態については,器具周りに設置した各種の人感センサーからの信号をそれぞれロガーに記録している。具体的には以下のとおりである。1)食堂・レストランなどの業務用厨房を対象に使用水量・湯量の測定を初年度より継続して進めた。比較的限定されたメニューが大量に出食される大学学生食堂3棟および単一メニューで調理と洗浄が時間的に完全に分離する学校給食施設2棟は,年間各期の解析を目的に,初年度から継続して測定し当初予定のデータ収集を完了して,来客者数や出食数等と併せて解析作業を進めた。複合商業施設内にある一般的な食堂・レストラン(店舗数21)については,使用水量の測定と顧客の動向を含めた使用実態調査を4月より1年間にわたり実施し,使用水量と来客者数の関連分析,および業態による水使用発生負荷のパターン化を試みた。2)事務所ビルにおいては,初年度末より測定を開始している1棟を含め,使用水量・湯量について広島市内の3棟を対象に測定を進めた。大・小便,手洗い等の器具使用実態は人感センサーを用いて分単位でデータの蓄積をしている。また,ビル内の社員食堂2店舗の使用水量・湯量の測定も同様に行っている。なお,前年度からの1棟は今年度で完了し,他の2棟は次年度まで継続する予定である。3)集合住宅については,既存蓄積データのもとに,給水温度の差異による水と湯使用の関連分析と併せて,負荷算定法に関わる要因の検討をシミュレーションにより進めた。4)算定法の基本条件検討のため,データ蓄積のある駅舎トイレを対象に,確率的手法と乱数シミュレーションによって秒単位の負荷量の算定結果を比較した。3年間に渡る最終年度として,瞬時・時間・日といった一連の時系列負荷を統一的に算定することを目的に,モンテカルロ・シミュレーション手法を用いた負荷算定モデルを開発し,以下に示す各建物用途に適用して,その有用性を検証した。1.集合住宅における給水・給湯負荷の算定単身・独身寮,集合住宅における使用水量・湯量の測定・解析結果をもとに,住宅における給水・給湯負荷算定モデルとして,水・湯使用器具ごとに負荷予測を行う用途別モデルと,1住戸を単位とした住戸ユニットモデルを作成し,モデルの妥当性を検討した。2.事務所ビルにおける使用水量・湯量と器具利用に関する解析および給水負荷の算定広島市内の事務所ビル2棟の男子・女子便所,湯沸し室,社員食堂を対象に,量水器や人感センサーを用いた使用水量・湯量,トイレ利用頻度の測定と,調査員の目視による在階人数調査を行った。衛生器具の使われ方について解析を行い,事務所ビル内トイレにおける給水負荷算定モデルを作成し,本算定法の適用性を示した。3.駅舎トイレにおける給水負荷の算定乗降者数,トイレ利用者数,器具使用者数の関連を明らかにし,事務所ビルと同様に給水負荷算定モデルを作成し,給水負荷の予測を行った。特に,駅舎トイレでは器具の集中利用現象が発生するため,利用者の待ち状況と負荷の関連についても検討を加えた。4.飲食店舗における使用水量・湯量に関する解析および給水負荷の算定大学食堂,レストラン等における使用水量実測データをもとに,店舗属性,来客者数の関連分析,水使用パターンの類型化を行った。飲食店舗の厨房ユニットモデルを作成し,本算定法の広範な有用性を示した。
アウストラロピテクス類 歯牙化石,上顎大臼歯の形態学的研究

初期人類の化石歯牙標本、上顎大臼歯について二次元計測、特に、咬合面に投影した歯冠および各主咬頭の面積計測を行った。使用したサンプルはAustralopithecus afarensis(dm1:n=5,dm2:n=5,M1:n=10,M2:n=8,M3:n=9),A.africanus(dm1:n=4,dm2:n=5,M1:n=23,M2:n=31,M3:n=20),A.robustus(dm1:n=1,dm2:n=5,M1:n=27,M2:n=27,M3:n=25),A.boisei(dm2:n=3,M1:n=6,M2:n=5,M3:n=3),early Homo(dm1:n=1,dm2:n=6,M1:n=21,M2:n=18,M3:n=14),分類群帰属未判定標本:n=44,および若干の類人猿標本である。これらについて、実体顕微鏡と描画装置を用いて咬合面への投影図を作成し、各咬頭の面積などの形態特徴をデジタイザーにより数値化し、得られたデータの統計解析を進めた。予備的な結果としては以下のことが上げられる。歯冠面積ではA.afarensis/Homoに対しA.africanusは著しく大きく、A.robustusの状態に匹敵する。この傾向はM1ではやや弱いものの、ここでも明確にA.afarensis/Homoよりは大きく、下顎臼歯のパターンと微妙にことなる。咬頭面積ではロブスト型猿人(A.robustus/A.boisei)では歯種によっては頬側咬頭が大きい傾向が示された。また、ホモ属標本ではM2とM3の遠心咬頭が小さいのが目立つ。特に、M3ではどの分類群も多少なりとも遠心咬頭が相対的に小さいが、その中でも、ホモ属では特にhypoconeの縮小が目立ち、他の分類群のでパターンとことなる。また、こうした枠組みのなかで、コンソ遺跡群出土の未公表のearly HomoのM3の形態解析を進めた。
新規酸素ストレス病態モデル動物の作製とその応用

ビタミンE(α-トコフェロール)は脂溶性ビタミンのひとつであり、生体内では抗酸化作用を示し、生体成分特に膜成分の酸化を防ぐ働きを持つ。ビタミンEは血液中をリポ蛋白質に結合して輸送される。α-トコフェロール輸送蛋白質(αTTP)は、肝臓内の可溶性蛋白質であり、血中ビタミンEのリサイクリングに非常に重要な役割を果たしている。また、家族性ビタミンE欠乏症の患者ではαTTP遺伝子に変異を持つ。本研究において、ラット肝癌細胞を用いて確かにαTTPが細胞内のビタミンEの放出を促進する機能を持つことを証明した。さらにこの系を用いて、αTTPを介する肝細胞からのビタミンEの放出は通常のリボ蛋白質の放出経路を利用していないことを明らかにした。さらに、ビタミンEの放出はコレステロール代謝を調節する25-hydroxycholesterolによって阻害されることを見い出した。このことは、ビタミンEの放出が肝細胞内のコレステロール輸送系を利用していることを示唆している。現在、αTTPをtoolとして肝細胞内のコレステロール輸送系を解明しようとするプロジェクトが進行中である。我々はまた、αTTPがビタミンEのどの構造を認識しているか、様々なビタミンEアナログはαTTPにどのくらいのアフィニティーを持つか検討した。その結果、ビタミンEのクロマン骨格および側鎖の構造ともに結合に重要であることが分かった。興味深いことに、様々なビタミンEアナログのαTTPに対するアフィニティーと生物活性の間にはきれいな比例関係があった。すなわち、αTTPに対するアフィニティーはビタミンEアナログの生物活性を決定する重要な因子であることが明らかになった。αTTPは肝臓に最も多く発現しているが、わずかな量は脳、脾臓、肺、腎臓などにも発現していることがわかった。そこで、特に脳におけるαTTPの局在をin situ hybridizationの方法を用いて調べた。その結果、脳のなかでも小脳のブルキンエ層にあるバーグマングリア細胞に多く発現していることが明らかになった。家族性ビタミンE欠乏症の患者の剖検によると小脳のブルキンエ細胞の欠落が見られる.最近我々は、αTTPのノックアウトマウスを作製することに成功した。ホモマウスでは血中ビタミンE濃度は検出限界以下であり、ヘテロではちょうど正常マウスの半分になっていることがわかった。天然にはクロマン環の構造の異なる様々なトコフェロール異性体が存在し、また各異性体間で生物活性が大きく異なることが報告されている。ところで、我々はこれまでに、生体内でビタミンE(α-トコフェロール)と特異的に結合し、その膜間輸送を促進するタンパク質(αTTP)をラット肝臓中に見い出し、その精製および性状解析を行ってきた。その結果、本タンパク質はα-トコフェロールの循環量、引いては生物活性に大きな影響を及ぼしていることが明らかになっている。そこで今回は本タンパク質の各異性体に対するアフィニティーと、その生物活性を比較検討した。まず、本タンパク質の輸送活性はリポソームから膜画分への放射標識したRRR-α-トコフェロールの移行によって測定した。基質特異性はこのリポソームに放射標識していない異性体を過剰量加え、競合阻害の程度を調べることにより検討した。

この実験結果より各異性体のαTTPに対するアフィニティー比を算出したところ、代表的な異性体であるα、β、γ、∂-トコフェロールにおいては、それぞれ100、40、10、5となった。この値と各異性体の生物活性との相関関係を調べたところほぼ正比例の関係にあることがわかった。このことより、肝臓における本タンパク質による選別が、各異性体の循環量に影響を及ぼし、それが引いては生物活性に大きな影響を及ぼしていることが示唆された。ビタミンEは抗酸化作用を持つ脂溶性ビタミンであるビタミンEをどんなに摂取しても体内ビタミンEレベルを維持できないために起こる「先天性ビタミンE欠乏症」という疾患がある。この患者は、感覚神経節後根の壊死および小脳プルキンエ層の壊死による運動障害を呈し、また網膜変性を起こすなど特定の神経組織に傷害を受ける。我々の研究室では、哺乳動物の肝臓内にビタミンEと特異的に結合する蛋白質(αTTP,α-tocopherol transfer protein)を見出し、その精製・クローニングに成功してきた。さらに、先天性ビタミンE欠乏症の原因がαTTPの欠損によることを世界ではじめて明らかにした。今年度は、ビタミンE輸送蛋白質が哺乳動物の脳内にも少量ではあるが存在するこおを見出した。特に小脳に発現がみられたので、小脳内での局在を詳細に検討した結果。プルキンエ細胞を取り囲むバーグマングリア細胞に特異的に発現していることを見出した。ここに存在する輸送蛋白質により小脳プルキンエ層にビタミンEが供給されているものと考えられた。α-トコフェロール輸送蛋白質(αTTP)は体内ビタミンEレベルの調節因子であり、先天性ビタミンE欠乏症の原因遺伝子産物である。ビタミンEは脂溶性の抗酸化物質であり、生体膜成分をはじめとした脂質を酸素ストレスから防御する役割を果たしている。我々は新規酸素ストレスモデル動物の創成を目的とし、αTTPを遺伝的に欠損させたマウス(αTTPノックアウトマウス)の作製に着手した。その結果、本年度ついにαTTPノックアウトマウスの作製に成功した。αTTPノックアウトマウスは通常の食餌を与えていても生後3週間(離乳期)の時点ですでに血中ビタミンE値が検出できないレベルにまで低下していた。また、ヘテロ欠損体におけるαTTPの発現量は正常個体のちょうど半分であり、血中ビタミンE値もこれに応じて半分に低下していることが明らかになり、マウスにおいてもαTTPが体内ビタミンEレベルの調節因子であることが証明された。現在これらのノックアウトマウスのフェノタイプの変化を注意深く観察すると同時に、各種酸素ストレスに対する防御能についての検討、他の抗酸素ストレス作用をもつ酵素の誘導がおこっていないかどうか、また酸素ストレスが関係する可能性のある他の疾患モデルマウスとの掛け合わせ実験等を予定している。
生涯学習時代の成人の学習-教育方法に関する研究-大学における成人教育を中心に-

(1)成人教育方法論の検討アメリカ合衆国の成人教育学者M・S・ノールズが発展させたアンドラゴジーを確認した上で、アンドラゴジーに対する批判や問題提起を、(1)到達目標としての自己決定型学習、(2)ニーズの根拠のとらえ直しをめざす意識変容の学習という2点においておさえることができた。また、日本ではまだあまり検討されていない「学習契約」に注目し、学習者個人のニーズを重視することの意義を確認した。それにより、ノールズ批判の一面性を克服し、一定のアンドラゴジー再評価を行なうことができた。ヨーロッパ、とくにドイツ連邦共和国の成人教育方法論に注目し、「参加者志向」「解釈のパターン論」などの概念を抽出し、アンドラゴジーを超える考え方として位置づけることができた。(2)実践の検討理論的検討のほか、実践(成人教育の実践)にも注目し、アンドラゴジーや参加者志向、解釈のパターン論を取り入れた研修制度とその内容を、ドイツの事例(ドイツの市民大学連盟や成人教育研究所における研修制度の内容と方法の事例)を中心に検討することができた。(3)今後の見とおし翻訳作業中である、M・S・ノールズ『成人教育の現代的実践:ペダゴジーからアンドラゴジーヘ』の訳の完成をめざすと同時に、日本の大学における事業実践分析を進めたい。今年度は、ドイツ連邦共和国における成人学習者の学習方法や教育方法に関する理論動向を理解することに重点を置いた。具体的には、ドイツ連邦共和国を代表する成人教育機関である市民大学(Volkshochschule)において、講座担当者の研修用テキストとして利用されているテキスト『市民大学で講座を担当すること』(原題:Kuvsleitung an Volkshochschulen:K.Meisel u.a.1997)の訳出と出版につとめた。講座担当者のプログラム準備、実施、評価についての解説、参加者志向、解釈のパターンなどの基本概念を折り込んでいるテキストを『おとなの学びを支援する-講座の準備・実施・評価』というタイトルにして、2000年4月に発行の予定である(鳳書房)。他方で、やはりドイツ連邦共和国における、「日常意識志向」の成人教育方法論についても研究をすすめ、論文にまとめた。また、北米の成人教育方法論(自己決定型学習など)についても論文にまとめた。(3)今後の見とおし翻訳作業中である、M・S・ノールズ『成人教育の現代的実践:ペダゴジーからアンドラゴジーへ』の訳の完成をめざすと同時に、日本の大学における事業実践分析を進めたい。
中低層鋼構造建築物の統合型信頼性設計システムの開発

本研究は,中低層鋼構造建築物の構造設計において,地震荷重のような常温環境の荷重に対する設計と火災に対する設計とが全く別に行われている現状から,これらを統合しかつ信頼性理論に基づく設計システムを開発することを目的としている。研究の第2年度としては,前年度に収集・整理したデータをもとに火災に対する鋼構造骨組みの信頼性解析の定式化を行い,これに基づく解析プログラムを作成した。また,火災時の骨組み信頼度には,火災荷重(面積当たりの換算可燃物量)および耐火被覆の種類・量(厚さ)が大きく影響することともに,柱軸力比,梁上の荷重量が関係することを数値解析をもとに示した。そのため,柱軸力比,梁上荷重に関する統計的な資料を調査した。後者については日本建築学会荷重指針・同解説にある統計資料をベースに,部屋用途を考慮して設定するのが妥当であると判断した。これとは別に,現行の構造設計による建築物の性能水準を調査し,積載荷重,地震荷重,風荷重,積雪荷重に対して,使用限界状態,終局限界状態に対応した信頼性指標値が2.05.0の範囲にあることを明らかにした。火災荷重は,終局限界状態のみを考慮すればよく,対比して検討すべきと考えられる地震荷重,風荷重については50年間の信頼性指標値が2.03.0である。鋼構造建築物として具体的な骨組みを想定し,部屋の用途の異なるケーススタディを実施した。部屋用途としては,一般事務所系,技術事務所系,図書・倉庫系について検討した。検討結果は耐火被覆厚と信頼性指標値の関係曲線図として表現した。この図を用いれば,例えば信頼性指標値を2.0として設計するならば,火災荷重の小さい場合には,耐火被覆を施す必要がない可能性も出てくること等の部分的な知見を得た。研究の初年度としては,これらの設計に必要なデータを収集し整理すること,および信頼性解析のためのソフトウェア開発にあたってのフレームワーク作成を行った。こられの研究を実施する過程で,信頼性設計のためには目標設計信頼度を定める必要があるが,建物内居住者の安全性の観点から,地震に対する信頼度と火災に対する信頼度を同一の値に設定すべきか,地震時には構造躯体の挙動のみならず非構造部材や家具等の挙動も重要ではないか等の問題点が明らかになった。したがって,前述の作業と並行して,目標設計信頼度の設定値に関して総費用最小化の観点から考察を進めるとともに,建築物に関連したリスクに対して居住者である一般大衆がどのような選択行動を採るかに関して調査する枠組を作った。この枠組とは,インターネットのホームページを使ってアンケートを実施するというものである。また,地震時において非構造部材・家具等の構造躯体以外のものが人命に与える影響を,実際に建つ中層鋼構造建築物の緒元を用いた弾塑性応答解析により定量的に把握した。今後収集した種々の資料を分析整理するとともに,当初の予定にはなかったものの今年度着手した新たな展開をも踏まえて,次年度には先ず中低層鋼構造建築物の統合的信頼設計に向けて各部材・要素の設計についてケーススタディを重ね,これらの成果を構造物全体の設計に展開する。
自然災害時における信用市場へのアクセス及び貧困削減プログラムが家計へ与える効果

目的1:マイクロファイナンスのパフォーマンスの評価目的2:相互扶助コミュニティメンバーの形成第二の研究実績として、研究員は東京大学経済学研究科の澤田康幸教授およびJICAと共同で、スリランカ南部におけるコミュニティの役割の研究を開始した。具体的には、JICAによって大規模な灌漑整備が行われた地域を対象として、インフラ整備とコミュニティメンバー同士の信頼関係や協力関係との因果関係を研究する。本研究の重要性の一つは、人々の信頼や協力の度合いを測るために、2009年3月にField Experimentと呼ばれる手法を用いて家計レベルデータを収集した点である。このような新しいアプローチを用いた試みは、世界的にもあまり行われていない。
遺伝子発現量のゆらぎとストレス環境下における細胞の生存の関係

前年度に引き続き、合成生物学的に構築した大腸菌を用いて、生存関連因子の発現状態のゆらぎがストレス環境下での長期的な生存とどのように関わっているか、に関する研究を行った。(1)抗生物質耐性遺伝子発現株の生存に与える分解タグの影響の評価生存関連因子のゆらぐ速さを変える目的で作製したタンパク質の分解を促進するペプチドタグをC末端に付加して発現するような蛍光標識ストレプトマイシン耐性遺伝子(smR)発現株について、分解タグの有無が集団の生存に与える影響を評価する実験を行った。SmRの分解速度及び合成速度は異なるが、その細胞内濃度の分布が同程度になるような大腸菌株のペアに対して、同じ濃度の抗生物質ストレプトマイシンを投与すると、分解タグが無いものについては生菌数が増えるようなストレプトマイシン濃度であっても、分解タグがある場合は生菌数が減少する、ということが確認され、抗生物質に対する細胞の応答が単に抗生物質耐性を与える酵素の濃度だけで決まっているのではないことが示唆された。(2)細胞系譜解析による遺伝子発現の意義の評価1細胞計測によって得られる細胞系譜から、遺伝子発現レベルといった「表現型」と細胞の増えやすさ、生き残りやすさを表す「適応度」の関係を定量する手法を前年度に開発した。この手法の実験における重要性を評価するため、smR発現株のタイムラプス計測結果に適用した。今年度は対照実験としてsmRを発現しない細胞株について、ストレプトマイシンの有無で表現型と適応度の関係はどのように変化するのかも調べた。蛍光蛋白質の時間平均生成率の適応度地形の比較から、smRを持たせない場合は同じ時間平均生成率であっても適応度の値が落ちたことから、smRを持たせることの役割が蛍光蛋白質の生成率の適応度地形を維持するという形で現れた可能性が示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。合成生物学的に構築した大腸菌を用いて、生存関連因子の発現状態のゆらぎがストレス環境下での長期的な生存とどのように関わっているかを調べるため、(1)ストレプトマイシン耐性遺伝子発現株の検討および改良、(2)遺伝子の発現状態といった「表現型」と細胞の増殖能力や生存能力の指標となる「適応度」の関係を細胞系譜に基づいた1細胞レベルで評価する細胞系譜解析の理論的枠組みの構築、および(1)で作製したストレプトマイシン耐性遺伝子発現株の計測へのこの解析手法の応用を行った。(2)について、我々は、1細胞計測によって得られる細胞系譜から、遺伝子発現レベルといった「表現型」と細胞の増えやすさ、生き残りやすさを表す「適応度」の関係を定量する理論的な枠組の整理を行い、表現型の違いがどの程度適応度差をもたらすのかを定量的に評価する手法を開発することに成功した。この結果はJSMB/SMB2014および第52回日本生物物理学会で発表した。このような細胞系譜解析手法を(1)で作製したストレプトマイシン耐性遺伝子発現株のタイムラプス計測結果に適用した。細胞時系列における耐性遺伝子の発現レベルの指標として、「時間平均蛍光蛋白質濃度」と「時間平均蛍光蛋白質生成率」の2種類を考えた。(2)の解析によると、ストレプトマイシン存在下における細胞集団の平均的な増殖能力は、耐性遺伝子を持たせることによって上がるにもかかわらず、細胞系列間でみられる「ゆらぎ」のレベルでは、発現した蛋白質の濃度はそれほど積極的に適応度差をもたらしていない、という可能性を示唆する興味深い結果を得た。この結果は米国生物物理学会第59回年会で発表した。ストレプトマイシン耐性遺伝子発現株の検討および改良を行ったことで、順調に実験を進めることができている。

また、データ解析を進める上で基礎となる理論的な枠組みの構築に成功したことにより、得られた実験データから、今までにない知見を得ることができた上、今後のデータ解析にも多いに有用と考えられる。この点で、当初の計画以上の進展があると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究で開発した細胞系譜解析方法により、耐性遺伝子発現量のゆらぐ速さと長期間生存する細胞系列の出現頻度の関係を定量的に評価する。次に、ストレス環境とストレスの無い成長環境を交互に切り替えるような実験を、環境を切り替える時間周期を様々に変えて行い、ストレス環境で生き残った細胞が、生き残りやすさの記憶をどのくらい持続することができるのかを、測定する。これらをもとに、遺伝子発現量のゆらぎの時間スケールが、ストレス環境における細胞集団の適応現象において果たす役割について議論する。
計量構造と多様体構造

1.酒井は以前んから,リーマン多様体における種々の計量不変量の間に成り立つ関係,計量不変量と多様体構造の関連をテーマとして研究して来た。上記課題に関する研究費の援助の下で,特に勾配ベクトル場のノルムが一定である様な関数を許容するリーマン多様体の構造について調べた。多様体のリッチ曲率が下から押えられている場合にはその様な関数のラプラシアンの絶対値が上から押えられることを示し,特に等号が成立する場合の多様体構造を定めた。手法は主として測地線,ラプラシアンの幾何における比較定理を用いる。次に上の事実の摂動版を考察した。最近リッチ曲率と多様体構造の関連について,J.チーガー,T.H.コールディング等の新しい手法によって懸案の予想が次々解かれている。彼等の研究の検討を行って,その方法で勾配ベクトル場のノルムが一定である関数についての上の事実の摂動版が取り扱える様で検討している。ただ私の取り扱っているのはかなり強い条件の下である。また著書「Riemannion Geometry」の第2版が出版予定で第1版の改訂を行った。2.次に上記課題に関連して分担者達の行った研究について簡単に触れる。三村はホツプ空間の自分自身への写像のホモトピー類の集合にいつ群構造がはいるかを調べ,コンパクト連結リー群のK理論を考察した。勝田はグラフのラプラシアンと,ノイマン型境界値問題のスペクトル幾何を研究した。高橋は接触構造と数学教育に関してまた吉岡は一般位相空間について研究した。
ヒト化マウスモデルにおけるHIV-1感染病態への粘膜局所自然免疫の関与の解明

本研究はHIV-1感染時に腸管・生殖器の粘膜で最初に感染が成立する細胞および感染直後に活性化・誘導される自然免疫担当細胞を明らかにすることを目的とした。感染後のウイルス動態を明らかにするために、骨髄球系造血機能を増強したヒト化マウスを作製した。重度免疫不全マウスの新生仔マウスにヒト由来造血幹細胞とヒト臍帯由来間質系・間葉系幹細胞を同時移植した。間質系・間葉系幹細胞はimmunosuppressiveに作用したが、間質系・間葉系幹細胞の培養方法を変更することで、間質系・間葉系幹細胞のマウス骨髄内での生着が認められた。末梢血、脾臓内での骨髄球系細胞の再構築に加え、皮膚上皮組織内にヒト由来ランゲルハンス細胞の存在がFACS解析により確認され、骨髄球系細胞の再構築が認められた。この結果は間質系・間葉系幹細胞と造血幹細胞の同時移植に成功した最初のヒト化マウスであり、本研究の結果報告には間に合わなかったが、論文を投稿中である。今後このヒト化マウスを用いた多分野の研究が期待される。上記で確立したヒト化マウスにデュアルレポーターHIV-1ベクターウイルス(ルシフェラーゼとGFPを同時に発現)を感染させた。ウイルス粒子へのルシフェラーゼ取り込み効率が低く、生体イメージングでは発光を検出できなかった。ウイルスを接種して3時間後及び6時間後に生殖器、消化管組織を摘出し、蛍光免疫染色によりウイルス粒子由来のGFP蛍光を検出した。HIV-1粒子は接種3時間後には粘膜組織表面に広く浸潤し、6時間後にはウイルス粒子を取り込んだ、または侵入した細胞が観察された。現在これらの細胞種の同定を行っている。今後、骨髄球分化に必要なヒト由来サイトカイン遺伝子を遺伝子導入した間質系・間葉系幹細胞を用いてより高度に骨髄球系細胞が再構築したヒト化マウスを作製することで、ウイルス接種直後の自然免疫応答を解明する。平成27年度に計画したマウスにおけるヒト免疫の系統的再構築について技術を確立した。具体的には(1)ヒト臍帯血からCD133陽性造血幹細胞を単離し、6種類のサイトカイン存在下で単培養することにより、免疫細胞への分化能を損なうことなくex vivoでの増殖(およそ200倍)が可能になった。これにより、同一臍帯血に由来する造血幹細胞を移植できるマウス数が増加した。(2)間質・間葉系幹細胞については、市販品は同幹細胞の純度が低かったため、臍帯血または臍帯からの分離に変更した。臍帯血からの分離は効率が低く、数種類の方法を検討した結果、より誘導効率および純度が高い臍帯ワルトン膠質から単離する方法を確立した。更に間質系幹細胞のsphere培養を行うことにより、生体内に近い状態を再現する方法を確立した。(3)本研究計画にはなかったが、造血幹細胞を間質系幹細胞シート上で共培養することにより、上記(1)のサイトカイン存在下で単培養する方法よりも、より幹細胞の性質を維持した状態で造血幹細胞を増殖させることが可能となった。(4)新生仔マウスへの幹細胞移植に関して、本研究申請時に計画した心臓内移植では移植後仔マウスの生存率が低く、生存したマウスでもヒト免疫細胞は確認されなかった。そこで侵襲性の低い顔面静脈内移植に変更した結果、移植後生存率が改善するとともに、ヒト由来のT細胞、B細胞が確認された。(5)分化に必要なヒトサイトカイン遺伝子の生体内発現に必要なvectorを構築し、ヒトサイトカインの産生を確認した。ただし特定サイトカインの不必要な過剰発現を回避するため、今後マウスへの移植には上記(3)で増殖した造血幹細胞とともに上記(2)のsphere培養した間質系幹細胞を同時移植する方法に変更する予定である。「研究実績に概要」欄に記載の通り、(1)造血幹細胞のex vivoにおける増殖、(2)間葉系・間質系幹細胞の分離方法の変更、(3)新生仔マウスへの移植方法の変更を余儀なくされたため、計画に多少の遅延が生じたものの、計画通り平成27年度内にNSGマウスのヒト化に成功した。ただNSGマウスの繁殖に遅れが生じたことから、当初の計画よりも実験匹数が少なくなった。このため、本年度(平成28年度)は実験規模を拡大して計画通りウイルス感染を行い、本研究を遂行する。平成28年度には感染実験を実施するのに十分高いヒト免疫細胞の再構築が可能になった。(1)移植する造血幹細胞は可能な限り幹細胞に近い方が、マウス骨髄内でのヒト由来の造血機能に有利になると考えられる。in vitro培養により増殖した造血幹細胞において、本来の幹細胞の比率を高めるため、間葉系幹細胞を3D培養しsphereとして培養し、造血幹細胞を共培養した。免疫蛍光染色を実施した結果、間葉系幹細胞sphere表面に造血幹細胞が相互作用していることが示された。この方法により、間葉系幹細胞sphere表面で造血幹細胞が相互作用し、幹細胞としての性質を保持すると考えられる。また3D培養することにより、間葉系幹細胞そのものも、幹細胞としての性質を保持できると考えられる。(2)NSGマウスへの幹細胞移植方法として、27年度には心臓内移植および顔面静脈内移植方法を実施したが、移植後生存率や移植成功率、ヒト免疫細胞の再構築比率が低かった。

顔面静脈内移植では個体によってはヒト由来の免疫細胞が認められたものの、ヒト由来細胞の比率は低かった。そこで28年度には肝臓内移植を実施し、移植後生存率が高くなると共に、末梢血において2050%のヒト免疫細胞の再構築が可能となった。また、T細胞やB細胞、NK細胞に加えて、骨髄球系の細胞の再構築も認められた。これにより、マウスのヒト化の技術が確立した。(3)感染実験に使用するベクターウイルスとして、HIV-1をベースとし、GFPおよびルシフェラーゼの両方を発現するデュアルレポーターベクターを構築した。培養細胞に感染させた結果、目的通り、両方のレポーター遺伝子を発現することが示された。このウイルスベクターを濃縮し、感染実験に用いられるように調整した。飼育管理しているNSGマウスの繁殖が悪く、研究に若干の遅れが生じていたが、28年度に微生物モニタリングを実施した結果、本学実験動物管理区域内のSPF管理区域にて、区域全体で日和見菌(Staphylococcus属およびHelicobacter hepaticus)の汚染が認められた。同菌は日和見菌のため、通常の微生物モニタリングには検査項目として含まれていなかったが、NSGマウスは重度免疫不全のため、感染の影響が出たものと考えられる。このため、飼育していた全個体を安楽死により処分し、飼育室の部分的なクリーンアップを行い、新しく清浄マウスを購入し、コロニーを構築した。このため、研究実施に遅れが生じている。ヒト正常妊婦から提供を受けた臍帯血から造血幹細胞を、また臍帯から間葉系幹細胞を分離、精製し、培養にて増殖させた。間葉系幹細胞はsphereとして3次元培養し、造血幹細胞と共培養することによって間葉系幹細胞と造血幹細胞を相互作用させた。このsphereまたは造血幹細胞のみをコンディショニングした免疫不全マウスに移植することにより、免疫系をヒト化したマウスの作製が可能になった。間葉系幹細胞は免疫制御の効果が報告されているが、本研究で間葉系幹細胞・造血幹細胞のsphereを移植したマウスは、造血幹細胞のみを移植したマウスと比較して、ヒト由来の免疫系再構築の効率が著しく低下した。この結果から、同時に移植した間葉系幹細胞が造血幹細胞からの免疫担当細胞の分化に何らかの影響を及ぼした可能性が考えられた。ヒト由来免疫系が再構築されたマウスにHIV-1をベースとしたGFP・Luciferase遺伝子をコードするデュアルレポーターレンチウイルスを感染させ、感染実験の条件決めを進めている。メスマウスを経膣感染、オスマウスを経直腸感染させ、感染数時間後に感染臓器を摘出、Luciferin溶液に浸漬し、IVISシステムを用いて化学発光の検出を試みた。IVISシステムの検出感度の問題から現時点でウイルス粒子の発光シグナルは検出できていないが、検出を可能にするべく条件決めを実施している。感染臓器はホルムアルデヒド固定後凍結切片を作製し、蛍光免疫染色を行った。その結果ウイルス粒子と考えられる蛍光シグナルが認められた。現在、感染部位に存在する免疫細胞の同定を進めている。以上の結果から、経粘膜感染後のウイルス動態を解析する小動物実験系が確立し、今後感染直後に感染の標的となる細胞および感染により誘導される免疫細胞を解析できると考えている。動物実験管理区域の汚染もあり、計画の進捗状況はやや遅れていたものの、作製したヒト化マウスにウイルス感染させる段階まで計画を進めることができた。
移転価格税制に関する調査研究

最近、十年余にわたって、アメリカの移転価格税制は改定したり新たな規則を制定して企業の移転価格を制御するための税務当局の権力を強化した来ている。1988年に白書を発行して基本方針を整備してから、1990年にはていあん規則により外国系企業の米国現地法人への課税強化に乗り出した。この傾向はさらに強められて、1933年にはいると、暫定規則で。アームズレングス価格に接近する方法として利益比準法の適用を打ち出してきた。この方式は、現実の法人所得に課税するよりも、企業のみなし利益に課税する危険が多く、わが国を始め、ヨーロッパ主要国政府並びにOECDから強い批判を受けたが、すでにこの適用を行って、税務査察が行われている。この間の事情を背景として、次の2点に的を絞り、今回の研究目的とした。1)移転価格を多国籍企業が実際にどのように設定しているか。2)その設定価格に対して税務当局が如何に抵抗するか。3)事前確認制度に対する企業の対応。これらを中心に、実地調査と文献調査を企てた。移転価格の設定に際して企業はいかなるファクターを重視するか、また子会社が独自に移転価格を設定するとしたらいかなるファクターによるのかということを現実に調査した。現実に、わが国の多国籍企業もその子会社の多くが税務査察を受けており、税額の更正決定を受けた企業が少なからずある。そこでアームズレングス価格接近には国際的に認められている算定法のうちどれが妥当であるかについて実地調査を行った。次いで、米国の移転価格税制に対する日本企業の対応と事前確認制度についても実地に調査した。ファインディングスは以下のようである。1)移転価格の設定は基本としてアームズレングスである。しかし、この回答は信憑性が薄い。価格の設定は極秘事項に属するからである。2)米国の利益批准法適用については、大多数の企業が理論的面と、実際面から反対している。かなり多数の企業は、利益分割法に賛成する。3)事前確認制度については、巨額の費用がかかり、相当の年月が必要なことから、否定的である。大多数の企業は、費用2000万円以下、期間3ヶ月以内を望んでいる。ただし、日、米、豪、加の税務当局がこの方式を推進しているから、今後前向きにこの制度を真剣に検討する意向は十分汲み取れた。今回の研究目的は次の2点である。2)その設定価格に対して税務当局が如何に対抗するか。企業は部門制を布いているときには、部門同士で財及びサービスを移転する場合に、移転価格を設定して企業全体の利潤を最大化する傾向がある。このことは経済分析からも当然とされるが、現実世界で個別企業がどのように移転価格を設定しているかについては、実地調査がほとんどなされていない。そこで多国籍企業の本社が子会社へ移転価格を設定するときにいかなるファクターを重視するか、また子会社が独自に移転価格を設定するとしたらいかなるファクターによるのかということを現実に調査した。移転価格に対してアメリカではこの2、3年税務調査を特に外国企業の在米子会社に対して厳しくしており、国際的問題にまで発展している。同国では移転価格税制を毎年のように改訂して、昨年7月に最終法を設定した。わが国の多国籍企業もその子会社の多くが税務査察を受けており、税額の更正決定を受けた企業が少なからずある。実地調査はアンケートとインタビューの二本立てで行ったが、昨年10月下旬に科学研究費の交付が決まり、研究期間が十分なかったために、詳しい分析については次年度に行う予定である。

次いで、米国の移転価格税制に対する日本企業の対応と事前確認制度についても実地に調査した。ファインディングスは以下のようである。1)移転価格の設定は基本としてアームズレングスである。しかし、この回答は信憑性が薄い。価格の設定は極秘事項に属するからである。2)米国の利益批准法適用については、大多数の企業が理論的面と、実際面から反対している。かなり多数の企業は、利益分割法に賛成する。3)事前確認制度については、巨額の費用がかかり、相当の年月が必要なことから、否定的である。大多数の企業は、費用2000万円以下、期間3ヶ月以内を望んでいる。ただし、日、米、豪、加の税務当局がこの方式を推進しているから、今後前向きにこの制度を真剣に検討する意向は十分汲み取れた。1.1994年度に実施した企業への移転価格アンケート調査の結果を分析して、昨年11月に調査報告書を発行した。2.日本在外企業協会が日系在米企業の移転価格調査のアンケートに、当方の質門事項を無断利用したので禍福移転により親会社と子会社の意識の違いを調べたかったが、先方の調査企業名をディスクローズされなかったので、この比較ができなかった。しかし、一般的次元で移転価格税制に対する親会社と子会社の対応の違いをある程度まで明らかにすることができた。3.文献による研究では、米国の『移転価格最終規則』とOECDの『ガイドライン』及び1968年公刊の『白書』を精細に比較対照した。4.面接調査は先方の都合等で満足できる数での調査ができなかったが、アンケート回答の裏の事情をも説明を受けることができた。5.総じて、多くの企業はアメリカの移転価格税制強化に対して批判的であるが、大企業ほどその対策を講じるように真剣に研究しているようである。6.アームズレングス価格を理論的に追及するとき、限界概念で分析するが、現実の企業での決定には複雑な要因が絡み合っている。7.事前確認制度は秘密事項が多く、資料の提出を受けることができなかった。8.一、二年後に同様のアンケート調査を行い、時系列的に分析する必要を痛感する。
眼内悪性腫瘍における免疫治療抵抗性メカニズム解析と新たな治療法の開発応用

眼内悪性腫瘍に対する治療の多くは最終的に視機能が失われることが少なくありません。そのため、眼内悪性腫瘍における視機能温存療法は社会的に大いに必要とされています。我々はこれまでに、免疫チェックポイント阻害療法の効果を増大させる新たな治療法の可能性を報告してきました。さらに、免疫チェックポイント阻害療法に抵抗性を示すことが多い眼内悪性腫瘍には様々な細胞集団が存在することを見出し、高い評価を受けてきました。本研究では、細胞表面マーカーで2群間に分類した悪性腫瘍細胞を用いて、治療に抵抗性を示す細胞集団を明らかにし、治療抵抗性メカニズムを解明するとともに新たな治療法の開発を試みます。
リポソ-ムシステムの導入による抗腫瘍性サイトカイン細胞障害機序の分子論的解析

抗腫瘍性サイトカインは、腫瘍細胞に対する特異的障害作用を有し、“がん"治療制圧に向けて大きな期待を集めている。しかし、その細胞障害機序の詳細はほとんど不明であり、方法論の検討が必要である。そこで我々は、リポソ-ムシステムの導入を計画、カリフォルニア大学医学部Dr.Papahadjopoulosのグル-プと共同研究を行った。彼らは最近、蛍光プロ-ブ封入リポソ-ムシステムの細胞内導入により物質の細胞内挙動を追跡する方法を開発し、本研究においては、抗腫瘍性サイトカインの細胞内挙動の分子論的解析にこの新手法を導入すると共に、関連する研究事項に関する共同研究を通じて、これらサイトカインの細胞内膜作用機序ひいては細胞障害機序を明らかにすることを目的とした。また、本共同研究の機会を利用して、これまで進めてきた膜融合に関する共同研究をさらに推進させることをも目的とした。研究成果は以下の通りである。1.抗腫瘍性サイトカインの膜損傷作用と細胞障害作用との関連性及びそれに対する膜脂質ホスファチジルセリンの役割に関する研究成果、加えて従来の共同研究課題・蛋白質による膜融合誘起機構に関する研究成果について、同グル-プに討論を仰ぎ、それを参考に論文として公表した。2.顕微蛍光測光法に基づく、リポソ-ムの細胞内導入による物質の細胞内挙動追跡法を、培養腫瘍細胞及びマクロファ-ジに導入、リポソ-ムの細胞内取り込みの判定システム及び速度論的解析システムを確立した。その過程において、蛍光プロ-ブ封入リポソ-ムが細胞内に取り込まれた後の挙動及びその時間的関係、またpH変化過程に関する新たな知見が得られた。3.免疫グロブリン、トランスフェリン等の蛋白質を封入したリポソ-ムの腫瘍細胞及びマクロファ-ジ内取り込み並びに細胞内挙動を、上記判定システム及び速度論的解析システムを用いて予備的に検討し、免疫グロブリンはリソソ-ムに取り込まれた後分解され、トランスフェリンは細胞膜にリサイクリングされることを見い出し、蛋白質の細胞内挙動の追跡に本法が有用であると判断された。4.抗腫瘍性サイトカインを封入したリポソ-ムの腫瘍細胞及びマクロファ-ジ内取り込みを、上記判定システムを用いて判定し、取り込み後エンドソ-ム内で膜作用性を発現する可能性が示唆され、リポソ-ム封入サイトカインによって活性化されたマクロファ-ジの腫瘍細胞障害性とよく相関することを見い出した。5.蛋白質クラスリンによって誘起される膜融合の反応過程における種々の特異的反応、これらの反応の進行過程、クラスリン分子の膜融合活性発現部位等を明らかにし、膜融合の分子論的メカニズムを概ね解明した。6.両親媒性ペプチドを合成し、その膜結合能、ヘリックス形成能、膜融合能の関係を調べ、膜融合活性発現には、両親媒性よりむしろ疎水性が重要な因子であることを見い出した。これらの成果は、(1)リポソ-ムシステムを用いた抗腫瘍性サイトカイン細胞障害機序解析全般及び膜融合に関する共同研究、研究討論及び研究打ち合わせを、カリフォルニア大学において行った結果、(2)抗腫瘍性サイトカインの腫瘍細胞内挙動と腫瘍細胞障害作用測定の画一化のための研究打ち合せ及び実験条件の設定をカリフォルニア大学にて行った結果、(3)蛍光プロ-ブ封入リポソ-ム及びサイトカイン封入リポソ-ム調製法並びに蛍光プロ-ブでラベルした抗腫瘍性サイトカインの調製法の検討及び習得をカリフォルニア大学にて行った結果、(4)顕微蛍光測光法及びリポソ-ムシステムを用いた物質の細胞内挙動解析システムの設定及び測定の指導を目的に、研究分担者Dr.K.Hongを招へいした後、種々の研究を徳島大学において行った結果、得られたものである。今後さらに共同研究を継続し、リポソ-ム封入サイトカインの細胞内挙動と細胞障害作用との関連性を把握、抗腫瘍性サイトカインの細胞障害機序を分子論的に解明してゆきたいと考えている。

3.免疫グロブリン、トランスフェリン等の蛋白質を封入したリポソ-ムの腫瘍細胞及びマクロファ-ジ内取り込み並びに細胞内挙動を、上記判定システム及び速度論的解析システムを用いて予備的に検討し、免疫グロブリンはリソソ-ムに取り込まれた後分解され、トランスフェリンは細胞膜にリサイクリングされることを見い出し、蛋白質の細胞内挙動の追跡に本法が有用であると判断された。4.抗腫瘍性サイトカインを封入したリポソ-ムの腫瘍細胞及びマクロファ-ジ内取り込みを、上記判定システムを用いて判定し、取り込み後エンドソ-ム内で膜作用性を発現する可能性が示唆され、リポソ-ム封入サイトカインによって活性化されたマクロファ-ジの腫瘍細胞障害性とよく相関することを見い出した。5.蛋白質クラスリンによって誘起される膜融合の反応過程における種々の特異的反応、これらの反応の進行過程、クラスリン分子の膜融合活性発現部位等を明らかにし、膜融合の分子論的メカニズムを概ね解明した。6.両親媒性ペプチドを合成し、その膜結合能、ヘリックス形成能、膜融合能の関係を調べ、膜融合活性発現には、両親媒性よりむしろ疎水性が重要な因子であることを見い出した。これらの成果は、(1)リポソ-ムシステムを用いた抗腫瘍性サイトカイン細胞障害機序解析全般及び膜融合に関する共同研究、研究討論及び研究打ち合わせを、カリフォルニア大学において行った結果、(2)抗腫瘍性サイトカインの腫瘍細胞内挙動と腫瘍細胞障害作用測定の画一化のための研究打ち合せ及び実験条件の設定をカリフォルニア大学にて行った結果、(3)蛍光プロ-ブ封入リポソ-ム及びサイトカイン封入リポソ-ム調製法並びに蛍光プロ-ブでラベルした抗腫瘍性サイトカインの調製法の検討及び習得をカリフォルニア大学にて行った結果、(4)顕微蛍光測光法及びリポソ-ムシステムを用いた物質の細胞内挙動解析システムの設定及び測定の指導を目的に、研究分担者Dr.K.Hongを招へいした後、種々の研究を徳島大学において行った結果、得られたものである。今後さらに共同研究を継続し、リポソ-ム封入サイトカインの細胞内挙動と細胞障害作用との関連性を把握、抗腫瘍性サイトカインの細胞障害機序を分子論的に解明してゆきたいと考えている。研究代表者は、抗腫瘍性サイトカインの細胞障害機序の詳細がほとんど不明である現状を踏まえ、その点を明らかにするため、関連する研究事項をも含め、カリフォルニア大学医学部Dr.Papahadjopoulosのグル-プとの共同研究を通じて次の点を明らかにした。まず、抗腫瘍性サイトカインの膜損傷作用と細胞障害作用との関連性及びそれに対する膜脂質ホスファチジルセリンの役割に関する研究成果、加えて従来の共同研究課題・蛋白質による膜融合誘起機構に関する研究成果について、同グル-プに討論を仰ぎ、それを参考に論文として公表した。次に、顕微蛍光法に基づく、リポソ-ムの細胞内導入による物質の細胞内挙動追跡法を、培養腫瘍細胞及びマクロファ-ジに導入、リポソ-ムの細胞内取り込みの判定システム及び速度論的解析システムを確立した。その過程において、蛍光プロ-ブ封入リポソ-ムが細胞内に取り込まれた後の挙動及びその時間的関係、またpH変化過程に関する新たな知見が得られた。さらに、(1)リポソ-ムシステムを用いた抗腫瘍性サイトカイン細胞障害機序解析全般に関する研究打ち合せ及び方針の決定、
胃癌腹膜播種性転移過程に関与する因子の検討

スキルス胃癌の腹膜播種性転移において,腹膜中皮細胞はその防御因子の一つと考えられている.したがって,中皮細胞の形態変化や腹膜からの剥離がおこると,胃癌細胞の腹膜播種性転移がきたしやすくなると考えられる.ヒト腹膜播種の腹膜組織像を検討すると,癌細胞のみならず線維芽細胞を中心とする著明な間質増生が見られた.癌細胞浸潤を認めない部位の腹膜にも,線維芽細胞の増生や中皮細胞の剥離が認められた.一方,早期胃癌症例の腹膜は,線維芽細胞の増生は殆ど認められず,単層扁平の正常中皮細胞が表面を覆っていた.D3細胞の腹腔内接種によるによるマウス播種転移巣においても,腹膜は線維芽細胞の増生と中皮細胞の立方化・間隙の開大・剥離脱落が認められた.そこで,このような腹膜播種転移における腹膜の線維芽細胞の増生が,播種性転移にどのように関連しているのかについて,癌細胞の浸潤能や中皮細胞の形態に注目して検討した.Invasion assayを用いて,腹膜線維芽細胞が癌細胞の浸潤能に及ぼす影響を検討したところ,腹膜線維芽細胞により癌細胞の浸潤能は強く促進された.次に,腹膜線維芽細胞が中皮細胞の形態におよぼす影響を検討したところ,培養中皮細胞は,腹膜線維芽細胞培養上清の添加により経時的に円形浮遊性または紡錘形と形態が変化した.この形態変化により,中皮細胞間に間隙が認められ,単層敷石状の中皮細胞の有する防御作用が失われ,中皮下への転移を来たし易い環境が生じたと考えられた.HGF,EGF,TGF-β,Collagenaseは、中皮細胞の形態を変化させる作用を有していた.さらに中和抗体を使った検討により,この中皮細胞の形態変化は,線維芽細胞が産生するHGFが作用していると考えられた.以上,腹膜線維芽細胞増生は,中皮細胞の形態や癌細胞の浸潤能に影響し,スキルス胃癌の腹膜転移に適した状態をもたらしていることが示唆された.スキルス胃癌は高頻度に播種性腹膜転移をきたすため,その転移メカニズム解明には,スキルス胃癌細胞株を用いた播種性腹膜転移モデルが有用である.今回樹立したスキルス胃癌原発巣由来細胞株(OCUM-2M;以下2M)は腹膜播種をほとんど形成しなかったが,2M細胞を胃壁に移植する方法を繰り返すことにより,高率に播種性腹膜転移を形成する細胞株(OCUM-2MD3;以下D3)を樹立した.親株2Mの腹腔内接種では腹膜播種の形成はみられないが,D3は,腹腔内接種により腸間膜,大網,後腹膜等に多数の播種性転移を高率に形成する.いずれも多数の癌細胞を含む血性腹水を伴っており,組織学的にも,癌細胞が腹膜に接着・浸潤した像が認められた.そこで,今回樹立された低転移株2Mと高転移株D3の性状を比較することにより,腹膜播種性転移メカニズムを検討した.胃壁間質は,主として,Type I,Type IIIコラーゲンより構成されている.癌細胞が,胃壁を浸潤して漿膜面から離脱するには,これらのコラーゲンを分解する酵素であるマトリックスメタロプロテナーゼ-1(MMP-1)の産生が必要である.MMP-1の産生能を比較したところ,D3(190ng/ml)の方が2M(6.2ng/ml)に比べ高く産生していた.他のマトリックスメタロプロテナーゼ(MMP-2,3,9)やTIMP1,2には明らかな差はなかった.癌細胞が,胃壁を進展し漿膜面に露出するためには,MMP-1産生亢進が有利にはたらくことが示唆された.さらに,露出した癌細胞が,原発巣から離れ腹腔内に遊離するためには,細胞間接着の低下が重要となってくる.細胞間接着に関与するものとして,接着分子E-Cadherinがある.両細胞株のE-Cadherin発現はD3(59%)が2M(87%)に比べ低下していた.E-Cadherin発現低下は,播種性転移に有利な条件の一つであることが示唆された.スキルス胃癌の腹膜播種性転移において,腹膜中皮細胞はその防御因子の一つと考えられている.したがって,中皮細胞の形態変化や腹膜からの剥離がおこると,胃癌細胞の腹膜播種性転移がきたしやすくなると考えられる.ヒト腹膜播種の腹膜組織像を検討すると,癌細胞のみならず線維芽細胞を中心とする著明な間質増生が見られた.癌細胞浸潤を認めない部位の腹膜にも,線維芽細胞の増生や中皮細胞の剥離が認められた.一方,早期胃癌症例の腹膜は,線維芽細胞の増生は殆ど認められず,単層扁平の正常中皮細胞が表面を覆っていた.D3細胞の腹腔内接種によるによるマウス播種転移巣においても,腹膜は線維芽細胞の増生と中皮細胞の立方化・間隙の開大・剥離脱落が認められた.

そこで,このような腹膜播種転移における腹膜の線維芽細胞の増生が,播種性転移にどのように関連しているのかについて,癌細胞の浸潤能や中皮細胞の形態に注目して検討した.Invasion assayを用いて,腹膜線維芽細胞が癌細胞の浸潤能に及ぼす影響を検討したところ,腹膜線維芽細胞により癌細胞の浸潤能は強く促進された.次に,腹膜線維芽細胞が中皮細胞の形態におよぼす影響を検討したところ,培養中皮細胞は,腹膜線維芽細胞培養上清の添加により経時的に円形浮遊性または紡錘形と形態が変化した.この形態変化により,中皮細胞間に間隙が認められ,単層敷石状の中皮細胞の有する防御作用が失われ,中皮下への転移を来たし易い環境が生じたと考えられた.HGF,EGF,TGF-β,Collagenaseは、中皮細胞の形態を変化させる作用を有していた.さらに中和抗体を使った検討により,この中皮細胞の形態変化は,線維芽細胞が産生するHGFが作用していると考えられた.以上,腹膜線維芽細胞増生は,中皮細胞の形態や癌細胞の浸潤能に影響し,スキルス胃癌の腹膜転移に適した状態をもたらしていることが示唆された.