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宋～明代日用類書の基礎的研究

3大澤は2016年11月13日に中国杭州・浙江大学で開催されたConfucian Entrepreneur Discourse 2016 (「儒商論域2016」)に宣読論文「客商たちの告訴状」を提出した。主催者からの連絡では論文集などは発行しないとのことであったので、本年度中に日本語版の論文を公表する予定である(『上智史学』に掲載予定)。4「明代日用類書所在目録」(国内版)を作成中であったが、間もなく完成する見通しが立った。近いうちに東洋文庫ホームページ上に公開できる予定である。5「明代日用類書関連著作目録」を作成中であるが、近年の中国における急激な研究増加により著作類の収集が追いつかない状況である。完成までにはさらに時間を要すると思われる。毎月研究会を開催できたことによって、ほぼねらい通りの成果を得られている。進行が遅れているのは著作目録の作成であるが、その理由は以下の3点である。1近年中国で史料集が発行され、研究材料が手に入りやすくなったこと。2いわゆる業績主義がいっそう進んであり、若手研究者の業績が急激に増加したこと。3これまでほとんど手をつけられていなかった分野であること。1、明代日用類書のうち『三台万用正宗』の訳注をおこない、律例門、商旅門、算法門について一応の完成を見た。そのうちの律例門は前年度までに前・後二部に分けて公開したが、後半部分について、2017年度末に改訂版Ver.1を(公財)東洋文庫のホームページに公開した。2、研究代表者は律例門を題材にして商人たちの告訴活動の現状について研究し、研究論文を公表した。そのなかで、告訴状の作成を必要としていた商人たちとは遠隔地貿易をおこなう客商であり、告訴状の内容分析から彼らが直面していた商業活動上の諸問題を解明することができた。同時に、従来不明確とされてきた日用類書の読者のうち、重要な部分がこうした客商によって占められていたことが解明された。3、日用類書の目録編纂作業については、明刊本の国内所蔵機関目録をほぼ完成し、上記1、と同じく目録稿としてホームページに公開した。4、前年に引き続き研究文献リストの作成作業を進めてきたが、分量の多さという問題に直面しており、いまだ公開するまでには至っていない。5、研究交流については、日用類書を題材として研究を進めている、他分野の研究者と交流をおこなうことができた。具体的には、明代文学の研究者として著名な小川陽一氏をお招きしてお話をうかがい、貴重なアドバイスをいただいた。このときのご指摘をもとに、2017年度に公開した律例門訳注の大幅な見直しをおこなっているところである。その経過報告的な成果が上記1、の改訂版Ver.1である。研究の進展を支えているのは、ほぼ毎月1回開催される研究会であり、そこでの研究報告や訳注の検討である。このなかで研究代表者・分担者の研究交流をおこなうとともに、進捗状況を確認しあっている。また若手研究者をアルバイトで雇うことによって、日用類書目録作成のような、ネット検索を主体とする作業をおこなっている。1、前年度に引き続き『三台万用正宗』の解読作業をおこない、さらにそれらの総括をおこなった。具体的には、卷8律例門(下層)訳注の最終確認および同(上層)「招擬指南」訳注稿の補足と完成、同卷21商旅門・卷22算法門訳注の最終確認である。また、これら訳注の東洋文庫レポジトリへの公開をおこなった。巻8は本年3月までにすべて公開済みであり、巻21・巻22は最終確認作業中につき2019年度前半をめどに公開予定である。なお卷26医学門、卷39僧道門についての訳注作業も開始している。2、『明代日用類書研究論文著作目録』の編集作業を終え、東洋文庫レポジトリへ公開した。
原核細胞における蛋白質分泌の分子機構

水島グループ:(1)SecAがシグナルペプチドの疎水領域を認識しうること、この認識には酸性リン脂質が関与することを明らかにした。そしてこの成果をもとに蛋白質分泌におけるSecAの役割に関して新しいモデルを提示した。(2)SecAのATP機能部位を構成していると推定されている133番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変えたところ、SecAの多くの機能が失われた。この結果をもとにATP機能部位の膜透過における役割を考察した。(3)変異proOmpAを用いてタンパク質の膜透過が20-30アミノ酸残基毎にstepwiseに進行することを示す結果をさらに蓄積した。徳田グループ:大腸菌の膜透過機構を再構成実験系を用いて解析し以下の成果を得た。(1)再構成活性を上昇させる分子量約12,000の膜内在性因子SecGを見い出した。(2)SecGの遺伝子をクローニングし塩基配列を決定した。SecG遺伝子破壊株を構築し、SecGは低温での蛋白質膜透過に重要であることを明らかにした。(3)SecAの受容体となるもはSecYよよびSecEであり、SecGは受容体活性に影響しないが、膜透過に共役したSecAのATPase活性を顕著に上昇させることを明らかにした。伊藤グループ:単独SecYの速やかな分解に、膜ATPase FtsHの機能が必須であること、その他に少なくとも2種類の遺伝子産物が関与することを明らかにした。FisHがN末端で相互作用しているオリゴマーを形成していることを明らかにし、さらに,ATPaseドメインを変異体の作製により解析した。FtsHは膜蛋白質を認識して、状況に応じてアセンブリーあるいは分解へと導く一種のシャペロンであるとの仮説を提唱した。種々のsecY変異株の膜小胞の解析から、遺伝子学的解析推定されたSceYの「活性部位(C5,C6ドメイン)」の多くの変異体はin vitroでSecAのATPase促進活性が著しく低いことを見いだした。また、Syd(Ydr)蛋白質は、SecY24変異蛋白質の特異的阻害剤としてはたらくことをin vitroで示した。山根グループ:枯草菌における蛋白質分泌装置構成因子の一つと考えられるシグナル認識粒子を精製し、本粒子が8-9Sの大きさであること、scRNAとFfh以外に少なくとも2種類の蛋白質成分を含んでいることを明らかにした。secRNAがFfh蛋白質と結合するためにはFfhのMドメインに存在する2つのα-ヘリックス構造が必要であった。また枯草菌SecAのアミノ末端234残基からなるペプチドは大腸菌secA52変異を非許容温度で相補できるが、相補の際には枯草菌SecA234ペプチド・大腸菌SecA52蛋白質・ATP-dependent Protease Laの3者が大腸菌内で複合体を形成していることを明らかにした。

また枯草菌SecAのアミノ末端234残基からなるペプチドは大腸菌secA52変異を非許容温度で相補できるが、相補の際には枯草菌SecA234ペプチド・大腸菌SecA52蛋白質・ATP-dependent Protease Laの3者が大腸菌内で複合体を形成していることを明らかにした。
ニューラルネットを用いた仮名漢字変換の研究

ニューラルネットにおける、パーセプトロンの教師つき学習を仮名漢字変換におけるパラメータの学習に応用し、Wnnかな漢字変換システムに対して、クライアントプログラムにこの学習機能を組み込んだシステムを試作した。Wnnかな漢字変換システムでは、文節の評価値として、文節に関する7個のパラメータの重み和を用いている。これらの重みは、変換の正しさに大きな影響を与える。従来は、これらの値は、もっともらしい値を固定的に用いていた。変換を正確にするには、これらの、最適な値を求める必要がある。さらに、その最適な値は、変換に用いる辞書のセット、1文全体変換を行なうか文節ごとに変換を行なうかというユーザの癖、全体的な頻度値の上がり具合、入力文章の種類などによって、ユーザによって、時間の経過によって変化する。そこで、ユーザの変換の修正具合を教師信号とし、パーセプトロンの教師つき学習によってユーザごとに重みを動的に変化させる機構を、クライアントプログラム(egg)に組み込んだシステムを作成した。同一文章を繰り返し変換する限り、変換が正しくなる方向に重みが変化することは、証明可能である。このシステムを暫く使い、安定した時点で、新しい重みの値と共に、電子ニュースに公開して一般の人に使用してもらい、重みの変化と変換の確かさの指標となる値を集めた。結果、多数のデータを集めることが出来た。ユーザにより、最適な重みは大きく異なり、この様な、動的なパラメータの修正機構の必要性は立証できた。変換効率の改善を統計的に立証するには至らなかったが、ユーザからの良い印象は多数得られた。
保険料率における内外価格差の実態調査分析

本調査研究の目的は、(1)日本の保険料率は、本当に低料なのか、(2)各国間で保険料率に差があるのは、どのような要因が影響しているのか、について検討することであった。本調査研究の研究期間は2か年であるが、初年度に当たる平成7年度は、保険料率の内外価格差に関する準備的考察として、基本的な文献および統計資料の収集、実態調査等の国内調査を進めるとともに、ヨーロッパ諸国での保険料率に関する実態調査を行なった。具体的には、次の通りである。1.保険料率は、保険金支払等に充当される純保険料率と、事務経費としての付加保険料率でもって、構成されている。自動車保険と火災保険を例にとって、純保険料率に影響を及ぼす道路交通事情、交通事故、自動車の保有状況、家屋の建築構造・素材、人口密度、都市の過密度等について、ヨーロッパ各国の事情を探った。2.具体的な調査地点として、ドイツではフランクフルトを、イギリスではロンドンを中心にして、上記について実態調査を行なうとともに、各国の政府統計の収集を行なった。3.海外調査および国内での予備的な調査を通じて、表定保険料率の国際比較だけでなく、危険度等の各国間の違いを考慮した、実質的な保険料率の国際比較を行なうための準備を行なった。最終年度に当たる平成8年度は、保険料率の内外価格差に関する実証的考察および、競争や政府規制と保険料率との関連性についての国際比較を進めるとともに、アメリカでの保険料率の実態調査を行なった。1.表定保険料率と危険・事故の発生状況などを考慮した後の実質保険料率との国際比較を行なうために、アメリカ調査を実施した。2.具体的な調査地点として、ニューヨーク、首都ワシントン、サンフランシスコ、サンタバ-バラを中心にして、上記について実態調査を行なうとともに、アメリカの保険業および、保険規制に関する政府統計・資料の収集も行なった。3.アメリカでの調査結果を基礎にしながら、保険料率の国際比較の検討を始めた。4.競争や政府規制と保険料率の関連性についての国際比較を行なった。5.わが国における保険行政について、政府規制のあり方、規制緩和の推進について、政策的インプリケーションを提示する予定である。以上、2年度にわたる調査結果により、保険料率においても内外価格差が存在することが確認された。ただし、それは、通常の意味で使われているような、同一製品・サービスに関して、海外における価格に比べて、国内価格が割高であるという意味での「内外価格差」とは、反対の現象であった。具体的には、生命保険を例して挙げれば、次の数字が要約的なデータである。生命保険の価格:満期保険金(含:配当)1単位当りの保険料日本100.0デンマーク110.5フランス138.5ドイツ112.6ギリシャ118.9イタリア153.8オランダ158.0イギリス135.0 (日本を100.0とした場合)わが国の生命保険の料率は、諸外国の料率水準に比べて、低料であることが分かる。しかし、各国の資金運用における利回りの差や、平均死亡率の差を考慮しなければ、厳密な意味での、保険の「内外価格差」を検討したことにならない。これらの課題については、現在検討中である。

以上、2年度にわたる調査結果により、保険料率においても内外価格差が存在することが確認された。ただし、それは、通常の意味で使われているような、同一製品・サービスに関して、海外における価格に比べて、国内価格が割高であるという意味での「内外価格差」とは、反対の現象であった。具体的には、生命保険を例して挙げれば、次の数字が要約的なデータである。生命保険の価格:満期保険金(含:配当)1単位当りの保険料日本100.0デンマーク110.5フランス138.5ドイツ112.6ギリシャ118.9イタリア153.8オランダ158.0イギリス135.0 (日本を100.0とした場合)わが国の生命保険の料率は、諸外国の料率水準に比べて、低料であることが分かる。しかし、各国の資金運用における利回りの差や、平均死亡率の差を考慮しなければ、厳密な意味での、保険の「内外価格差」を検討したことにならない。これらの課題については、現在検討中である。本調査研究の目的は、(1)日本の保険料率は、本当に低料なのか、(2)各国間で保険料立に差があるのは、どのような要因が影響しているのか、について検討することであった。本調査研究の研究期間は2か年であるが、初年度に当たる本年度は、保険料率の内外価格差に関する準備的考察として、基本的は文献および統計資料の収集、実態調査等の国内調査を進めるとともに、ヨーロッパ諸国での保険料率に関する実態調査を行なった。具体的には、次の通りである。1.保険料率は、保険金支払等に充当される純保険料率と、事務経費としての付加保険料率でもって、構成されている。自動車保険と火災保険を例にとって、純保険料率に影響を及ぼす道路交通事情、交通事故、自動車の保有状況、家屋の建築構造・素材、人口密度、都市の過密度等について、ヨーロッパ各国の事情を探った。2.具体的な調査地点として、ドイツではフランクフルトを、イギリスではロンドンを中心にして、上記について実態調査を行うとともに、各国の政府統計の収集を行った。3.海外調査および国内での予備的な調査を通じて、表定保険料率の国際比較だけでなく、危険度等の各国間の違いを考慮した、実質的な保険料率の国際比較を行うための準備を行なった。本調査研究の目的は、(1)日本の保険料率は、本当に低料なのか、(2)各国間で保険料率に差があるのは、どのような要因が影響しているのか、について検討することであった。本調査研究の研究期間は2か年であるが、その最終年度に当たる本年度は、保険料率の内外価格差に関する実証的考察および、競争や政府規制と保険料率との関連性についての国際比較を進めるとともに、アメリカでの保険料率の実態調査を行った。1.表定保険料率と危険・事故の発生状況などを考慮した後の実質保険料率との国際比較を行うために、アメリカ調査を実施した。2.具体的な調査地点として、ニューヨーク、首都ワシントン、サンフランシスコ、サンタバ-バラを中心にして、上記について実態調査を行うとともに、アメリカの保険業および、保険規制に関する政府統計・資料の収集も行なった。3.アメリカでの調査結果を基礎にしながら、保険料率の国際比較の検討を始めた。
ナノ界面近傍における電子状態の診断

気相であるプラズマと電極等の固相間の界面は、プラズマプロセスに直接的に関わると考えられるため、これまで様々な研究が行われてきた。本研究では、低圧プロセスプラズマと、液面と接する大気圧プラズマを対象に、プラズマの電子状態診断を行った。大気圧プラズマは、近年では固体ではなく、液体と接した状態に注目が集まっている。これは、大気圧プラズマの医療やバイオ応用を考えた時、液体とプラズマの接触が避けられないからである。しかし、液体とプラズマが接することで、プラズマの基礎物理量(電子密度や電子温度)がどのように影響を受けるかは、まだ明らかになっていない。このような背景のもと、液体と接する大気圧プラズマ中の電子密度・電子温度を、レーザートムソン散乱法を用いて測定した。トムソン散乱法を用いたのは、液体を含まない大気圧プラズマの診断手法として、高い信頼性を有しているからである。一方、大気圧程度に密度の高いガス中に計測用レーザーを入射すると、母ガスを多光子電離してしまい、計測が不正確になる恐れがある。本研究ではそのような擾乱に配慮し、十分にレーザーパワー密度が低い領域で、計測を行った。十分に低いパワー密度では、その反面、得られるトムソン散乱光強度が微弱となり、レーザー1000ショット程度の積算計測が必須となる。そのような計測が実現できるナノ秒パルス放電と、蒸気圧が極めて低い液体材料(イオン液体)を併用することで、安定した放電生成環境の元、液体電極使用による放電状況の変化を定量的に把握した。低圧プロセスプラズマについては、数Torrオーダーのプローブ計測が困難となる圧力のプラズマについて、トムソン散乱法が適用可能な領域を明らかにした。25年度が最終年度であるため、記入しない。プラズマ(気相)と電極などの固相間の界面物理状態はプラズマプロセスに直接的に関わるため、これまで様々な研究が行われてきた。一方、近年では、気相・固相間の作用だけではなく、液面に放電プラズマを照射させるなどの取り組みが盛んに行われている。これらの研究は、液体が介在することになる、プラズマのバイオ応用や医療応用研究の基礎になるものである。プラズマをバイオや医療応用に用いるとき、真空容器が不要で、熱的破壊作用を伴わない大気圧非熱平衡プラズマ(以下、大気圧プラズマ)の利用が望ましいとされているが、大気圧プラズマが液体表面で生成された時、プラズマにどのような変化が生じるかは、まだあまり実測されていない。プラズマとの界面が、従来の固相から液相に変わるとき、プラズマによる液相中の変化を観測することはもちろん重要であるが、気相であるプラズマ中の変化を知ることも、気相・液相間の反応理解を進める上で重要と考えられる。このような背景のもと、本研究では液体と接する大気圧プラズマ中の電子状態診断を試みた。大気中ではプローブ法や発光分光法では、プラズマを乱したり、計測結果の解釈に曖昧さが生じると考え、主体計測手法として、レーザートムソン散乱(LTS)法を据えた。さらに、その計測結果を補完し、信頼性を高める目的で、発光分光計測を行った。プラズマと接する液体としては、蒸気圧が極めて小さいことで知られる、イオン液体を用いた。このイオン液体を電極として、ナノ秒オーダーのパルス電流による熱的に非平衡な放電プラズマを生成し、そのプラズマ中の電子密度や電子温度の時間変化をLTS法で観測した。電極の極性を変えたり、イオン液体部分を同形状の金属電極に変えて、その時の電子密度や電子温度を比較した結果、電子密度や電子温度に有意な差が生じることが確認できた。当初の計画では、液体を含まない低気圧および高気圧のプラズマを研究対象にしていたが、高気圧プラズマの今後の展開を考慮して、当初計画に加えて、液体表面で生成される高気圧プラズマの研究を追加した。

この新たな研究内容を進めるために、多少の遅れが生じている。現在、液体が介在した大気圧非熱平衡プラズマの診断を、主にレーザートムソン散乱法で行なっている。今後は、それを補完し、計測結果の信頼性を高めるために、発光分光法など他の計測をさらに推し進めていきたい。また、本新学術領域研究内では、申請者が計測対象としている、液体が介在する大気圧非熱平衡プラズマが盛んに用いられている。申請者が行なっている診断手法を、他の申請者と連携して用いることで、よりよい研究成果が得られると予想されるので、他の申請者との連携も進めていく予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
手術器具による視野遮蔽領域を補完する”死角なき”小児外科手術ロボットの開発

小児外科専用手術支援ロボットの研究開発を行い、内視鏡外科手術だけでなく、小児外科医が行う小切開手術も可能なプロトタイプを作成した。試作機の操作性および動作確認として、ドライ環境で単純な縫合結紮のタスクを行い、基本的な操作に問題のないことを確認した。また先行して開発した鉗子遮蔽領域の可視化技術を今回の手術支援ロボットに搭載し、シミュレータモデル上での画像誘導に関しても有効性を検証した。その後に剥離や運針などの操作が動作可能かどうかの検証を行い、トータルの手術操作が可能であることを確認した。平成25年度は主に視覚補償システムの開発とその臨床的有用性の検証を行った。現在開発を行っている視覚補償システムは,内視鏡下手術において鉗子によって遮蔽される患部の視覚情報を補償するシステムである.通常用いる医師の視点となる内視鏡に加えて補償用の内視鏡を使用することで,鉗子によって遮蔽されている患部の映像を撮影する.補償用の内視鏡で撮影した映像に処理を加え,医師の視点となる画面内の鉗子に重畳することで,疑似的に手術器具が透明になったような拡張現実感を実現する.導入に際して,視覚補償システムの術具抽出は持針器に塗布した青色の認識により実現した。平成25年度に現在開発を行っている視覚補償システムの有用性評価の実験を行った。本実験では,鉗子によって患部が遮蔽されやすい動作として逆針に着目した.逆針を行った際,遮蔽により運針の様子が観察できないため,縫合針の刺出誤差が増加すると予想される.そこで,視覚補償により逆針の刺出誤差が減少することを検証すべく,3条件のタスクを実施した.順針(視覚補償なし),被験者は逆針(視覚補償なし),逆針(視覚補償あり)の3条件において,右側の鉗子(持針器)で把持した縫合針で目標点間の連続運針を行った.対象はすべて小児外科医とした。Noviceでは術具遮蔽領域の提示による逆針の刺出誤差の増減に対して有意な差が認められなかった.Instructorでは術具遮蔽領域の提示による逆針の刺出誤差の減少に対して5%の水準で有意差が認められた.これらの結果から,Instructorにおいては,提案手法による遮蔽領域の提示を行うことで,正確かつ安定した縫合が可能になっていると考えられる.したがって,本来術具によって遮蔽される領域の刺出点の確認に対して有用であることが示唆された.この結果体腔内での剥離操作、運針操作に関して再検討を行う必要性が生じたため関節可動域に関して再設計を行い、再度検証実験をIn Vitoroで行ったところ、運針操作が格段に向上した平成27年度は小切開手術ロボットの非臨床試験を行った。先天性食道閉鎖症・先天性胆道拡張症・水腎症に対する腎盂形成術に対する小切開手術における縫合動作を主なターゲットとした3Dプリンターを用いた、体幹と臓器モデルを製作し、その疾患モデルにおける狭小空間での手術操作、具体的には運針操作まで可能なこと、また運針操作、縫合操作が可能であることを確認した。当該ロボットは吊り下げ型で,左右の術具マニピュレータと視野補完を行うための内視鏡2台を有する形として製作した.術具マニピュレータの屈曲部は患者の体外に存在し,先端の長い鉗子により縫合動作を行うことが可能である。また実験用動物の臓器に対する把持、剥離などが可能なことを確認した。画像技術に関しては、従来の赤外線位置確認装置を用いた重畳表示から画像認識による重畳表示に変更した仕様とした。以下の項目を平成27年度に確認している。1.Stereo matehingやTime of flightなどの形状推定技術により患部の形状データを取得可能であること。2患部の形状データを基に補完用内視鏡で撮影した画像を変形し、視野画像において鉗子で遮蔽されている患部を再現可能であること。3.三次元位置測定器で鉗子の位置・姿勢を計測し、視野画像内に投影される領域を求めることが可能であること4.2で変形した補完用の画像を3で求めた鉗子が投影されている領域に重畳表示が可能であること。術具の透明化による可視化が問題なく可能なことを確認し、前臨床試験を行い複数の外科医に評価をしていただき、臨床的な有用性を確認した。手術ロボットの作成と画像誘導技術がそれぞれ確立され非臨床試験・前臨床試験までこぎつけてきいる。画像誘導技術に関してはすでに知財を取得している。この手術支援ロボットはいわゆるマスタ・スレーブ型で外科医が操作を行うことが可能である。また次の段階として手術デバイス、特に手術支援ロボットの作成にあたってそれを臨床応用するためには評価が必ず必要である。機器の安全性はもちろんであるがその性能評価にて完成度をチェックしてさらに改良を加える必要がある。ロボットの試作機の段階で小児外科疾患の技術評価型シミュレータを製作し、ロボットの動作性能の評価として用いた。現在までに新生児横隔ヘルニア、食道閉鎖、噴門形成術、肝管空腸吻合術のモデルを作成し、そのvalidationを行い、技術評価モデルとして妥当性さあることを確認し、それぞれのモデルを用いて、手術支援ロボットの操作性を確認した。

最終的に小型実験用動物(成獣家兎体重2-3kg;新生児相当,豚体重5-15kg:乳幼児相当)を用いて全身麻酔下に今回の手術支援ロボットの前臨床試験を行った。まずはマスタ・スレーブとしてのFeasibilityを確認し、臓器認識の正確性を検証し、問題の無いことを確認した。その後に剥離や運針などの操作が動作可能かどうかの検証を行い、トータルの手術操作が可能であることを確認した。また先行して開発した鉗子遮蔽領域の可視化技術を今回の手術支援ロボットに搭載し、シミュレータモデル上での画像誘導に関しても有効性を検証した。小児外科専用手術支援ロボットの研究開発を行い、内視鏡外科手術だけでなく、小児外科医が行う小切開手術も可能なプロトタイプを作成した。試作機の操作性および動作確認として、ドライ環境で単純な縫合結紮のタスクを行い、基本的な操作に問題のないことを確認した。ロボットの基本設計の見直しを行ったことで操作性が格段に向上した。さらに画像誘導システムはすでに前臨床試験まで行いその有用性が確認されロボットに実装可能な状態であるため手術ロボットと画像誘導技術の統合による実験と、ブラッシュアップ、また前臨床試験による外部評価が必要である。28年度が最終年度であるため、記入しない。小児外科画像誘導を実装したロボットでの前臨床試験を行う。この場合に小切開手術と内視鏡外科手術(単孔式を含む)の2つの実験環境を設定して行う予定である視覚補償システムの開発とその臨床的有用性の検証は行いすでに基本的なシステムの構成はできている。小切開対応小児外科ロボットに関しては、スレーブの開発を行って現在のところ針をもって運針可能なレベルの操作性が確保されている。マスターの操作性が課題である消耗品を予定よりも安価に購入することが出来た。手術ロボットの設計を再度行い、制作したため。実験用試薬購入に充てることとする。現在の視覚補償システムの開発とその両輪で進めている小児外科用の小切開対応の内視鏡手術ロボットはスレーブ側の開発を進めている段階であり、今後画像誘導技術とのインテグレーションが必要となる。またロボットの操作性にかかわるマスターの開発はCGの段階であり、今後はマスターの開発を重点に勧めていく予定である視覚補償システムの開発とその臨床的有用性の検証のための動物実験を継続する。25-26年度にかけて、視覚補償システムの開発とその臨床的有用性の検証のための動物実験を繰り返し行うため。視覚補償システムの開発とその臨床的有用性の検証のための動物実験を継続する。
地震動を受ける鋼変断面ラーメンの動的崩壊挙動に関する実験的研究

地震動を受ける変断面片持ち柱と隅角部域を含むラーメン柱を対象として、その静的・動的弾塑性性状を明らかにするため、(1)繰り返し水平力を受ける柱の弾塑性性状に関する実験、(2)ハイブリッド実験手法の開発、および、(3)柱の弾塑性動的応答解析を行った。本研究から得られた主な成果を以下にまとめる。1.変断面片持ち柱の弾塑性履歴性状に関する実験繰り返し水平力を受ける変断面片持ち柱8体の崩壊実験を行い、この種の弾塑性履歴性状には一種の不安定現象が現れることを確かめた。また、この現象はP△効果が構成断面間の抵抗荷重差を相殺してしまうことにより生じることを明らかにした。2.ハイブリッド実験手法の開発計算機とサーボ・アクチュエーター3基とをオンラインで結んだハイブリッド実験手法を開発した。運動方程式の数値積分には、New-markβ法と中央差分法を用いた。実験装置に現れる摩擦力除去が一つの問題点であったが、予備弾性実験によって把握した摩擦力を計算プログラムの中で考慮すれば、ほぼ正確な復元力を測定できることがわかった。1自由度系振動体にモデル化した柱の弾性実験を通じて、本手法はほぼ満足できる精度を有していることを確かめた。3.変断面柱の動的弾塑性性状に関する数値解析柱の変断面性に着目して、実地震加速度の作用下で片持ち柱の動的弾塑性性状を数値解析によって調べ、地震時に柱の構成断面ごとの塑性変形進展を許すと、等断面柱の場合に比べて塑性変形が分散するため、構成断面ごとの塑性ひずみの累積を小さくできる利点があることがわかった。今後、弾塑性域における応答変位等の周期特性を理論的・実験的に調べ、この点をさらに検討する必要がある。
胆汁酸の代謝を行う新規P450分子種の解明

従来、代謝産物がUV吸収を持たないリトコール酸の代謝活性の測定は、in vitroで^<14>Cラベルした基質を用い、放射比活性より測定を行っていた。今回、蛍光標識試薬のBrMB(3-bromomethyl-7-methoxy-1,4-benzoxazin-2-one)を用いリトコール酸分子中の-COOHと反応させる事により、蛍光活性を持った代謝産物をHPLCで分離、検出した。SD無処置雌雄ラット肝ミクロゾームを用い活性を測定したところ、各々1.40±0.15nmol/mg/min,1.21±0.22nmol/mg/minで両者の活性の間には著しい性差は認められなかった。さらに各種誘導剤の影響について、雄ではクロフィブレート投与により活性はわずかに上昇したがフェノバルビタール投与では、著しい変化は認められなかった。一方雌ラットではクロフィブレート投与により雄と同様にわずかに活性の増加が認められたがフェノバルビタール投与では雄と異なり、活性は著しく増加した(2.19±0.30nmol/mg/min)。生体内基質として知られているテストステロンの6β位水酸化反応にはCYP3Aが触媒しているが、リトコール酸の6β位水酸化反応に対しても同酵素が関与しているか否かについて検討する為に、無処置及び各誘導剤投与ラット肝ミクロゾーム中のCYP3A含量を測定した。クロフィブレート及びフェノバルビタール投与により雌雄ラット共にCYP3A含量には著しい増加が認められたがいずれの場合も雄の方が雌よりも高い値を示した。リトコール酸6β位水酸化活性とCYP3A含量の間には雄ラットで良い相関が認められた。さらにCYP3Aに対する抗血清を用いた阻害実験を行ったところ、雌雄ラットとも抗血清添加量に依存した著しい活性の阻害が認められた。以上の結果からリトコール酸の6β位水酸化反応にはCYP3A分子種の関与しており、さらに活性に性差の認められない事から、此れ迄に既知のCYP3A分子種とは異なる可能性が示唆された。リトコール酸の水酸化反応にはCYP2C6の関与が報告されている事から、CYP2C6に対する抗血清を用いて阻害実験を行ったところ雌雄とも活性に著しい変化は認められなかった事からCYP2C6の関与はCYP3Aに比べて非常に小さいものと示唆された。最近雄ラット肝よりCYP3A分子種のnewform、CYP3A18についての報告も有り、リトコール酸6β位水酸化反応への関与についても期待される。現在いくつかのCYP3A分子種をコードするDNAをCOS-Iに発現させ各々についてリトコール酸6β位水酸化活性測定を行う予定である。
活性型K-ras遺伝子を標的とした遺伝子治療の基礎的検討-膵癌の治療を最終目標として-

1.活性型K-ras遺伝子を有する膵癌細胞株の樹立と遺伝子解析2.アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞増殖に対する影響K-ras遺伝子のコドン12のpoint mutation部位を中心として、15mer,17merのホスホロチオエ-ト型アンチセンスオリゴDNA(AS)を作製し、in vitroにおけるPca-S細胞に対する増殖抑制効果を様々な条件下で検討した。増殖抑制効果はMTT assayにて解析した。コントロールとしてセンスオリゴDNAを用いた。day0,day1に1、5、10、50μMの濃度でASを添加、day4に測定したところ、10μM以下の濃度ではコントロールに比し有意な増殖抑制効果がみられた。しかし、50μMの濃度ではコントロールでも著明な増殖抑制作用があり、非特異的なcytotoxic effectと考えられた。またday0のみASを添加したところ、コントロールとの差は明らかではなかった。さらに7日目にMTT assayを行ったところ、細胞増殖はコントロールより促進されていた。これはK-ras遺伝子発現がASによる抑制効果に抗して、up-regulationされたのと考えられ、その機序につき現在検討中である。以上のことから、K-ras遺伝子を標的としたアンチセンスDNAの細胞増殖効果はある程度認められたものの、in vitroにおいてさえその効果は限定的なものであった。またその効果も持続せず、実際の遺伝子治療では長期に持続的にアンチセンスを発現するようなベクターが必要になると考えられた。1.活性型K-ras遺伝子を有する膵癌細胞株の樹立60才、女性の膵癌患者腹水中より膵癌細胞株Pca-Sを樹立した。この細胞よりDNAを抽出,K-ras遺伝子コドン12、13、61に特異的なプライマーを用いてPCRにて増幅した後、オリゴヌクレオチドプローブを用いて変異の有無を検討した。その結果、K-ras遺伝子コドン12にGGTからGTTへのpoint mutationを認め、GlyからValへのアミノ酸置換があることが判明した。2.アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞増殖に対する影響K-ras遺伝子のコドン12のpoint mutation部位を中心として、15merのホスホロチオエ-ト柄アンチセンスオリゴDNAを数種類作製した。リポフェクチンを用いてPca-S細胞培養液中に10mMの濃度で添加し、細胞増殖に対する影響を検討した。コントロールとしてセンスDNA、野性型K-ras遺伝子に対するアンチセンスオリゴDNAを用いた。point mutationに特異的なアンチセンスオリゴDNAではコントロールに比し、有意に細胞増殖が抑制された。さらにras蛋白であるp21に対する抗体で免疫組織化学的検討を行い、ras蛋白の発現が低下していることが確認された。3.今後の展開in vivoの系で検討する。すなわちヌードマウスにPca-Sを移植し、アンチセンスオリゴの投与によって、腫瘍の増殖が抑制されるか検討する予定である。平成8年度に続きin vitroにおけるPca-S細胞に対するホスホロチオエ-ト型アンチセンスオリゴDNA(AS)の細胞増殖抑制効果を様々な条件下で検討した。K-ras遺伝子のコドン12のGTT(Gly)からGTT(Val)へのpoint mutation部位を中心として、15mer、17merのASを作製し、かかる変異を有するPca-S細胞に対する増殖抑制効果をMTT assayにて解析した。day 0,day 1に1、5、10、50μMの濃度でASを添加、day4に測定したところ、1、5、10μMの濃度ではコントロールに比し有意な増殖抑制効果がみられた。またAS添加をday0のみにしたところ、コントロールとの差は明らかではなかった。これはK-ras遺伝子発現がASによる抑制効果に抗して、up-regulationされたものと考えられ、その機序につき現在検討中である。

以上のことから、K-ras遺伝子を標的としたアンチセンスDNAの特異的な細胞増殖抑制効果はある程度認められたものの、in vitroにおいてさえその効果は限定的なものであった。またその効果も持続せず、実際の遺伝子治療では長期に持続的にアンチセンスを発現するようなベクターが必要になると考えられた。
小脳遠心路機能の評価と可塑性に関する研究

小脳への経頭蓋磁気刺激直後、下肢筋の運動を調節する脊髄反射が大きく促通される。小脳と対側運動野の機能的連結に障害のある脊髄小脳変性症症例においてもこの促通現象が確認された。また対側小脳半球刺激でも本促通現象が確認された。これらより、この促通現象の起源は小脳皮質刺激ではなく、脊髄運動神経と両側性に機能的連結を持つ小脳深部核刺激、もしくは脳幹部刺激が起源である可能性を示唆する。他方、この反射促通量は、下肢の運動練習後に変調すること、また小脳への非侵襲的脳刺激法適用後に変調することが分かった。このことは、この促通現象は下肢運動関連領域の神経可塑性を反映して変調する可能性を示唆する。本研究の目的は、「小脳磁気刺激を用いた小脳-脊髄路の機能評価方法」(Matsugiら2014)を用いて、リハビリテーションの基盤となる随意運動学習、姿勢制御学習における、小脳-脊髄路機能の可塑的変化、およびコンディショニング刺激による可塑性促進効果を検討すること、さらに同方法を用いて脊髄小脳変性症症例における小脳-脊髄路機能障害と運動失調の程度の関係を検討することである。予備的実験に予想よりも時間がかかったこと、研究協力施設が遠方にあり、実験スケジュール調整に時間がかかったことが主な理由である。片側小脳半球への経頭蓋磁気刺激による同側下肢筋に関連する脊髄反射促通現象(cerebellar spinal facilitation:CSpF)が、1)同側小脳皮質刺激を起源としているのか、2)対側小脳半球刺激でも生じるのか、3)運動学習や4)非侵襲的脳刺激(Non-invasivebrain stimulation:NIBS)の影響を受けて変調するのかを検討した。その結果、1)特に小脳皮質に萎縮をきたすタイプの脊髄小脳変性症と診断を受け、MRIにて小脳皮質に萎縮を認め、かつ小脳と対側運動野の機能的連結に障害のある症例においてもCSpFが出現することが分かった。他方、2)対側小脳半球、小脳中央部刺激によってもCSpFが出現した。これらのことから、CSpFは小脳皮質刺激を介さずに、脊髄運動神経に両側性に投射経路を持つ室頂核や中位核の小脳深部核、前庭神経核や赤核の脳幹部神経核、もしくはそれらを起源にもつ前庭脊髄路、赤核脊髄路、毛様体脊髄路を刺激することによって生じている可能性が考えられた。また、3)足関節運動による視覚標的追従運動を用いた運動学習の後、および4)小脳へのNIBSとして経頭蓋直流電気刺激を適用した後、CSpF量は変調した。運動学習や小脳へのNIBSは小脳皮質興奮性を変調させることから、CSpFは小脳皮質興奮性変調を反映して変調する可能性が示唆された。その一方で、運動学習や小脳へのNIBSは小脳皮質だけではなく、運動野興奮性に可塑的変化をもたらすことから、CSpFの可塑的変化には小脳皮質興奮性変調だけではなく、運動野など、他の脳部位の興奮性変化も反映される可能性があると考えられた。平成27年度に得られた予備実験結果を基に、運動学習による小脳ー脊髄機能の可塑的変化を小脳磁気刺激によるH反射促通現象が反映するかを確かめる。非侵襲的脳刺激法である経頭蓋直流電気刺激による小脳皮質興奮性変化により小脳磁気刺激によるH反射促通量が変調することを確認する。脊髄小脳変性症症例を対象にした実験について、健常者を対象に研究代表者所属施設で予備実験を行ってきたが、H28年6月頃から協力病院内での健常者および脊髄小脳変性症症例を対象にデータ収集を開始する予定である。リハビリテーション予備実験に時間がかかり、実験数が予定より少なくなったため。また、終了した実験が少なく、英文校正の回数が予定より少なかったため。実験被験者謝金と英文校正費用、および論文投稿費用とする。
滑膜細胞を用いた関節破壊に関与するグリオスタチンとテネイシンCの分子相関の解明

関節リウマチ(RA)に対する新規薬剤(生物学的製剤、ヤヌスキナーゼ阻害剤)が次々上市されているが、未だ関節破壊の制圧は達成されてない。関節機能障害をきたし生活の質の低下をもたらすRA制御のために、さらなる治療ターゲットの探索が必要である。グリオスタチン(GLS)は、多彩な生理活性を有するタンパク質であり、滑膜に対しては起炎症作用とパンヌス形成作用を示す。またテネイシンC (TNC)は、Toll様受容体4を活性化する。申請者はヒト培養線維芽滑膜様細胞においてGLSが炎症を促進し、軟骨破壊を促進するTNCを誘導することを予備実験にて確認した。これまでのGLSに関する研究とTNCの作用機序から、TNCとGLSとの炎症の連鎖が示唆される。本研究では、これらの炎症のシグナル伝達を明らかにすることが目標であり、新規治療ターゲットを提示し、さらに新しいRA治療薬剤開発を目指す。本年度は、ACR/EULAR RA分類新基準にて診断されたRA患者を対象にし、従来型抗リウマチ薬(csDMARD)、生物学的製剤及びヤヌスキナーゼ(JAK)阻害剤使用中の患者の血清を採取し、凍結保存し、症例収集中である。これまで申請者らはcsDMARD治療を行ったRA患者の血清GLS濃度は疾患活動性と相関することを報告した。またRA患者の血清においてTNC濃度も上昇していることが報告されている。そこで本研究においてcsDMARDのみならず生物学的製剤及びJAK阻害剤使用患者におけるTNCとGLSの血清濃度とRAの疾患活動性の指標(DAS28-ESRなど)、治療効果との相関を明らかにする。GLSタンパク質の測定には当教室で開発した酵素免疫測定法を用いる。本法は正確で、低コストでの測定が可能であるため多数のサンプルを測定することが可能である。TNCに関しては市販の測定キットを用いる。血清は予定どおり収集できている。また人工関節置換術時に採取した滑膜細胞を用いた研究において、本年度に得られた検体の多くがすでに生物学的製剤使用下であり、もともとグリオスタチンの産生能の低下した細胞株があり、計画どおりの刺激実験ができない時期があったが、おおむね予定した実験を行うことができた。テネイシンCとグリオスタチンの滑膜組織上においての局在を調べ、作用部位を明らかにする。人工関節置換術時に採取した滑膜組織を抗テネイシンC抗体と抗グリオスタチン抗体を使用し免疫組織二重染色を行う。滑膜組織から分離培養した線維芽細胞様滑膜細胞を用いてグリオスタチン刺激によるテネイシンCの発現をPCRおよびELISAにて測定する。申請者らはRA患者の関節液中のグリオスタチン濃度は平均約300 ng/mlであり、さらにこの濃度で線維芽細胞様滑膜細胞を刺激するとMMPs (matrix metalloproteinases)の発現を促進し軟骨破壊を誘導することを示した。この結果に基づきGLS 300 ng/mlの濃度で線維芽細胞様滑膜細胞を刺激しテネイシンCの発現を検討する。

滑膜組織から分離培養した線維芽細胞様滑膜細胞を用いてグリオスタチン刺激によるテネイシンCの発現をPCRおよびELISAにて測定する。申請者らはRA患者の関節液中のグリオスタチン濃度は平均約300 ng/mlであり、さらにこの濃度で線維芽細胞様滑膜細胞を刺激するとMMPs (matrix metalloproteinases)の発現を促進し軟骨破壊を誘導することを示した。この結果に基づきGLS 300 ng/mlの濃度で線維芽細胞様滑膜細胞を刺激しテネイシンCの発現を検討する。30年度はテネイシンC刺激によるグリオスタチン産生をmRNAとタンパク質レベルでの検討を中心に行なった。そのためテネイシンCのELISA plateの購入をしなかったため上記の次年度使用額が生じた。31年度に購入し、予定どおりの実験を施行する。
化合物ライブラリーを利用した新規肺高血圧症治療薬の開発

我々は、東北大学化合物ライブラリーを利用し肺動脈性肺高血圧症(PAH)に有効な新しい化合物celsatramycin (CEL)を発見した。PAHの原因の一つである肺動脈平滑筋細胞(PASMC)の増殖を抑制するという全く新しい機序による治療薬として更なる検討を行い臨床応用を目指した。具体的には、PAH患者由来のPASMCを用いたin vitroでのCEL刺激実験、CELを投与したin vivoでの肺高血圧モデルマウスの肺検体、血漿検体等を用いた蛋白解析、遺伝子発現解析、組織解析等を行い、作用機序を明らかにした。またCELは既に24種類の誘導体が東北大学の研究室に存在するが、最適化研究としてより有効で副作用の少ない誘導体を選び出した。セラストラマイシンの機序についてさらに、ZFC3H1というzincfinger proteinに直接結合することから、様々なシグナル経路に影響を与えることが示された。肺高血圧モデル動物を用いた実験では、右室収縮気圧だけでなく、肺動脈圧の測定も行い、CELの効果を確認した。最終的には臨床応用を目的としているため、動物レベルでの副作用についても検討を行い、CEL投与ラットでの血液検査から、肝毒性、腎毒性などないことを確認した。さらに、ADMEの検討を行い、毒性、選択性、溶解性、膜透過性、血中での安定性などをAMEDと連携して検討した。これまでの結果を踏まえ、将来的には企業と連携し、高血圧症の新規治療薬としての臨床試験、製品化を目指したい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。東北大学化合物ライブラリーを利用し発見した、肺動脈性肺高血圧症(PAH)に有効な新しい化合物celsatramycin (CEL)について更なる研究を進めた。具体的には、まずPAH患者由来の肺動脈平滑筋細胞(PASMC)を用いたin vitroでのCEL刺激実験において、その細胞増殖抑制効果の機序を明らかにした。その機序には、Nrf2活性亢進、HIF1α、NR-κB発現低下が関わっていることが明らかになった。Nrf2活性亢進についてはkeap1の抑制によるものであり、その抗酸化作用が細胞増殖抑制に関わっていることが明らかとなった。HIF1α発現低下によるミトコンドリア機能改善作用も明らかとなり、PAH患者のPASMCの細胞増殖亢進の原因とされるミトコンドリア機能異常を改善する事が明らかとなった。またセラストラマイシンはNFκBを抑制することが既に知られていたが、Bioplexの実験では多くのサイトカイン、ケモカインの抑制が示され、NF-κB抑制による炎症抑制作用が明らかとなった。さらにCELは既に24種類の誘導体が東北大学の研究室に存在するが、最適化研究としてより有効で副作用の少ない誘導体を検討し、CEL-3が最適と判断した。CELを投与したin vivoでの検討では低酸素誘発性肺高血圧マウス、モノクロタリン誘発性肺高血圧ラット、SU5416/hypoxia誘発性肺高血圧ラットにおいて肺高血圧治療効果を認めた。さらに、心エコーや右室のウエスタンブロッティングなどの検討を進めた結果、CELは肺高血圧改善作用のみならず右心不全にも効果的であることが明らかになった。将来的には企業と提携し製品化を目指す。肺高血圧患者由来肺動脈平滑筋細胞の細胞増殖抑制効果の機序について、HIF1α、NF-κBの発現抑制、Nrf2の発現亢進など、機序に迫ることができた。実際、肺動脈における細胞異常増殖の原因とされる、ミトコンドリア機能異常、炎症、酸化ストレスなどを改善する事が明らかとなり、セラストラマイシンによる細胞増殖抑制のメカニズムが明らかとなった。in vivo試験では、3つの肺高血圧モデル動物での治療効果が認められ、ヒトでの臨床応用が実現する可能性がさらに高まった。去年までに比べかなり研究が進歩したものと思われ、今後はさらに副作用の更なる検討など、臨床応用に向けた準備を進めていきたい。

セラストラマイシンの機序についてはかなりの程度示されたが、過去の文献では直接のターゲットとされるものは今までのところZFC3H1というzincfinger proteinが知られている。そこで、ZFC3H1を用いた実験を行い、直接的な機序について示していきたい。肺高血圧モデル動物を用いた実験では、右室収縮気圧は測定したものの肺高血圧の最も重要な指標である肺動脈圧の測定が困難であったため、この測定を進めていく。最終的には臨床応用を目的としているため、動物レベルで副作用について詳細な実験を進めていく。具体的には、毒性、選択性、溶解性、膜透過性、血中での安定性などを東北大学薬学部、企業と協力して明らかにしていく。さらに臨床応用へとつなげるためセラストラマイシンの安全性の検証を行う。具体的には、動物レベルでの副作用はないか、毒性試験など行い詳細に検討する。将来的には企業と連携し、高血圧症の新規治療薬としての臨床試験、製品化を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
分光学的手法を用いたヌクレオソーム高次構造変換過程の解析

染色体蛋白質HMGN1(14)、HMGN2(17)は146bpヌクレオソームに特異的に結合する核蛋白質である。これら二つの構造が類似する蛋白質はヌクレオソームにそれぞれ協同的に結合し、その結果、どちらか一方を二分子含む複合体を形成する。ヌクレオソームにHMGN1/N2が結合するとクロマチン超高次構造が解け、転写や複製等のDNA依存型活性が増強される。HMGN1を用いた例でこの現象は、遺伝子発現を抑制するリンカーヒストンH1と、HMGN1の競合的な相互作用によって引き起こされ、HMGN1のC端とヒストンH3のN端の特異的な相互作用によって促進、その結果最終的にヌクレオソームにヒストンアセチル化酵素のような様々な調節因子がアクセスすると考えられている。最近では、HMGN1/N2自身のアセチル化によってヌクレオソームとの相互作用様式が変化すると報告されている。一方、HMGN2-ヌクレオソームはクロマチンファイバー中で幾つかの集中点に寄り集まり、さらに核中全体で組織化される。高く転写が活性化された細胞の中で、HMGN1/N2の集中点の核内分布は転写部位の分布と等しい位置関係にあることがわかっている。ヌクレオソーム構造変化に対するヒストンとHMGN1/N2の翻訳御修飾の影響を研究するために、まず非修飾蛋白質によって構成されたヌクレオソーム、HMG-ヌクレオソーム複合体の特性を観察する必要がある。私たちは、大腸菌によって非修飾ヒストン、HMGを合成させ、TATAAACGCC繰返しヒストン高親和性配列DNAと、塩濃度を下げることにより、ヌクレオソームを再構成した。その結果、Native PAGEによって、この配列を有するヌクレオソームに特徴的なMNase処理による周期的な(10bp毎)の切断断片を観察し、化学的構造的に一系のヌクレオソームが再構成されていることを確認した。HMGとの相互作用による、ヒストンコアをとりまくDNAの構造変化を観察するためにCD測定を行った結果、HMG-ヌクレオソーム複合体形成時のDNAモル楕円率は、ヌクレオソームのものと比較して負の方向に変化した。この結果、HMG-ヌクレオソーム複合体形成時コアDNAの超らせん性は、解けるよりむしろ締まるということを示している。これらの結果をJournal of Biochemistryに投稿した。染色体蛋白質HMG14、HMG17は146bpヌクレオソームに特異的に結合する核蛋白質である。ヌクレオソームにHMG14/17が結合するとクロマチン超高次構造が解け、転写や複製等のDNA依存型活性が増強される。HMG14を用いた例でこの現象は、遺伝子発現を抑制するリンカーヒストンH1と、HMG14の競合的な相互作用によって引き起こされ、HMG14のC端とヒストンH3のN端の特異的な相互作用によって促進、その結果最終的にヌクレオソームにヒストンアセチル化酵素のような様々な調節因子がアクセスすると考えられている。最近では、HMG14/17自身のアセチル化によってヌクレオソームとの相互作用様式が変化すると報告されている。一方、HMG17-ヌクレオソームはクロマチンファイバー中で幾つかの集中点に寄り集まり、さらに核中全体で組織化される。高く転写が活性化された細胞の中で、HMG14/17の集中点の核内分布は転写部位の分布と等しい位置関係にあることがわかっている。ヌクレオソーム構造変化に対するヒストンとHMG14/17の翻訳御修飾の影響を研究するために、まず非修飾蛋白質によって構成されたヌクレオソーム、HMG-ヌクレオソーム複合体の特性を観察する必要がある。これらの結果は、日本生化学会(2001)、分子生物学会(2001)において発表した。HMGN

1を用いた例でこの現象は、遺伝子発現を抑制するリンカーヒストンH1と、HMGN1の競合的な相互作用によって引き起こされ、HMGN1のC端とヒストンH3のN端の特異的な相互作用によって促進、その結果最終的にヌクレオソームにヒストンアセチル化酵素のような様々な調節因子がアクセスすると考えられている。最近では、HMGN1/N2自身のアセチル化によってヌクレオソームとの相互作用様式が変化すると報告されている。一方、HMGN2-ヌクレオソームはクロマチンファイバー中で幾つかの集中点に寄り集まり、さらに核中全体で組織化される。高く転写が活性化された細胞の中で、HMGN1/N2の集中点の核内分布は転写部位の分布と等しい位置関係にあることがわかっている。ヌクレオソーム構造変化に対するヒストンとHMGN1/N2の翻訳御修飾の影響を研究するために、まず非修飾蛋白質によって構成されたヌクレオソーム、HMG-ヌクレオソーム複合体の特性を観察する必要がある。私たちは、大腸菌によって非修飾ヒストン、HMGを合成させ、TATAAACGCC繰返しヒストン高親和性配列DNAと、塩濃度を下げることにより、ヌクレオソームを再構成した。その結果、Native PAGEによって、この配列を有するヌクレオソームに特徴的なMNase処理による周期的な(10bp毎)の切断断片を観察し、化学的構造的に一系のヌクレオソームが再構成されていることを確認した。HMGとの相互作用による、ヒストンコアをとりまくDNAの構造変化を観察するためにCD測定を行った結果、HMG-ヌクレオソーム複合体形成時のDNAモル楕円率は、ヌクレオソームのものと比較して負の方向に変化した。この結果、HMG-ヌクレオソーム複合体形成時コアDNAの超らせん性は、解けるよりむしろ締まるということを示している。これらの結果をJournal of Biochemistryに投稿した。