hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
温度・圧力依存性に基づく蛋白質異常凝集体およびオリゴマー中間体の熱力学的解析

また、そのオリゴマー形成には、キーとなる疎水領域が、分子内だけでなく分子間の相互作用にも働いていることが分かった。今後は、β2mにおいても、モノマー、オリゴマー、線維の三者平衡の圧力依存性を正確に測定することを考えている。研究実績の概要で述べた通り、本計画は蛋白質の天然構造と同様に、アミロイド線維が変性状態との理想的な可逆的に状態転移をすることを想定していたが、そのモデルでは解析できないデータが初めから得られた。具体的には、αSynの線維構造は可逆的な圧力変性を示さない、線維の安定性はその形成履歴に依存して安定性が変化する、2状態転移と思われる条件下でもオリゴマー状態が存在すると思われる挙動を示す、などがある。これらの観察結果を満足するモデルを構築するためには、どのような実験を補うべきか苦慮している。当初の想定から大きく異なった経過を経ているため、当初の計画と比較することは難しいが、研究の進行は少し遅れているという判断である。しかし、これまでの研究から、アミロイド線維には多型があることは報告されている。改めて考えると今回我々が得た結果はもっともらしいものであり、さらに圧力温度摂動を用いることで、さらにそれらの多型の違いを構造レベルで同定できる可能性がある。当初の想定とは異なるものの、新しい知見を提案できるように様々なモデルを検討し、それを支持する実験結果の収集に方向修正したい。αSynの実験状況が上のように想定外のことがあったため、β2mに関してはモノマー/オリゴマー平衡の系の測定に留まっており、アミロイド線維の圧力依存性測定はまだ着手できていない。測定方法自体はαSynのものを踏襲すればよいので、H29年度初めに着手する予定である。また別の問題として、蛋白質精製装置の故障などもあり、実験に用いる蛋白質試料の供給が測定実験の進行に対して遅れていたという点も挙げられる。より効率的な試料供給法についても検討したい。圧力蛍光装置を用いアミロイド線維の構造状態の圧力-温度相図を作成し、オリゴマー中間体やアミロイド線維の構造と熱力学的性質の関連性を議論することを計画した。主な研究対象はαシヌクレイン(αSyn)とβ2ミクログロブリン(β2m)とした。初めにαSynにおいて、チオフラビンT蛍光によるアミロイド線維の圧力変性の可逆性を検証したが、理想的な可逆変性ではないという観察結果を得て、当初想定していたモデルとは異なる解釈が必要であると判断された。また、線維の圧力変性中に生じると思われる線維形成中間状態の検出をNMRで試みたが、有意なデータを得るには至らなかった。そこで、αSynの線維形成能や線維形態がpHに依存するという報告をもとに、αSynの構造変化をNMRで測定し得られた化学シフトデータを主成分解析したところ、pH依存的な構造変化の様子をとらえることができ、また酸性pHでモノマー間会合を示すデータも得た。これが、報告された線維形成能のpH依存性を説明する知見となると考えられる。β2mに関しても、主にモノマー構造変化について解析した。β2mは酸性pHでは常圧、中程度の塩の存在下で線維化するため、β2m構造の圧力、塩濃度依存性をNMRで測定し、得られた化学シフトデータを主成分解析した。その結果、β2mは本来の性質として疎水性クラスター残余構造を形成しており、そこに塩の効果による特有の構造変化が加わることで、線維形成能が上昇しているという知見が得られた。
高齢者の健康寿命を規定する日中間の文化及び環境の因果構造

目的:日中両国の高齢者における社会経済地位が健康(健康状況と生存時間)に影響するメカニズムを解析して,社会経済や福祉制度の成熟及び高齢化の進めに伴い,社会経済地位の作用を比較する。方法:藩陽市で2,766名を9年間,多摩市で8,162名を7年間追跡して,共分散構造モデルを用いて,死亡者の社会経済地位,文化的余暇活動,健康状況及び生存時間に関する構造を解析した。結果:両市共に,健康状況に対する社会経済地位は,直接的影響と文化的余暇活動を経る間接的な影響がある。藩陽市が多摩市より直接的影響が強い一方,多摩市が藩陽市より間接的影響が強い。また,藩陽市が多摩市より健康状況から生存時間に対する影響が強い。結論:社会経済地位が健康に影響するメカニズムとしては,直接にまた文化的余暇活動を経由して影響したことであり,社会経済地位の作用は,社会経済や福祉制度の成熟及び人口高齢化の進めに伴い,物質環境の改善から生活様式の改善に変化し,または生存時間と健康状況との関係は弱くなるため,健康状況が悪化しても生命は維持されることが明らかになった。研究成果に示したように、当初の目的を達成し、主要原著論文が掲載された。他の原著の学会誌掲載時期は、2014年7月が確定された。同様な研究デザインに基づく追跡調査を国内外で実施し、その妥当性を検証していくことは、今後の研究課題である。これまでに艾斌氏が進めてきた中国瀋陽市における2001年に実施した調査を基盤として、その後2009年までの生存分析を実施してきた。そのために、現地、瀋陽市を訪問し、生存データを入手し、IDに基づいて、質問紙調査とその後の生存有無に関するデータ統合に成功した。また、以下に示した当初の仮説を分析してきた。・健康寿命延伸とQOL向上のためのこころと想いの意義を追跡研究によって明確にする。・要介護状況予防の背景要因を追跡調査により、因果構造として明らかにする。・健康寿命を規定する因果構造について、共分散構造分析を用いて明確にする。以上について、半年間で着実に実施してきた。同時に、我が国における先行してきた同様調査との比較検討をしてきた。本研究は、艾斌氏および申請者による共同研究であるが、同時に、東京都老人総合研究所、首都大学東京、中央民族大学の関係者の協力を得て組織的な協同の下で展開している。個々人の生存状況調査と、データとのリンケージに手間取っていたが、ほぼ終了し、現在は、当初の仮説通りの分析を進めている。我が国での1.3万人六年間追跡調査では、基本的な原著論文が完成し、学会に報告している。当初に計画した、研究プロセスに基づいて、推進している。
三次元脳電位画像解析ソフトウェアの実用化

研究計画の最終年度である平成7年度の研究経過は,以下のごとく3点に要約される.すなわち,1)データベースの補充(斉藤健,高倉)データベースを強化し,種々のデータによる分解能,再現性などの処理パフォーマンスの安定性を確認し,システムの完成度を高めた.具体的には,ヒトのVDT作業およびその後引き続く仮眠状態の脳電位12チャンネルを記録し,数量化処理可能なデータに加工した.また,ラットの海馬周辺の脳切片に電気刺激を行い,神経回路における興奮反応を0.6msec間隔で記録したデータを用いて,時系列画像データファイルを作成した.2)データベースの解析処理(神山,江口)プログラムメニューに対応した利便性、操作性を考慮し、高速処理能力を備えたシステム構成を用いて,作成したデータベースについて解析処理を行った.具体的には,ヒトの脳電位記録データベースに本研究の特色である最大エントロピー法によるスペクトル解析を適用し,脳平面の二次元画像を作成した.さらに,これらを時系列データとして三次元化し,脳電位の時間変動を1枚の画像に可視化した.従来型のFFTによるスペクトル解析を適用した成績と比較し,分解脳,安定度が向上したことを確認した.また,ラットの海馬周辺の脳切片から得られた超高速度画像も同様に時系列データとして三次元化し,興奮過程の可視化を行い,各部位における興奮レベルの量的変化について時間変動を把握することが可能となった.なお,これらの成果をカオス解析,相関分析などへ導入する意義は大きく,本システムではデータ構成をこれらの非線形解析が容易に実行可能な形式とした.3)研究成果のまとめ(神山,斉藤和雄)上述の実験成績は,本研究の当初の目的はほぼ達成されたことを示す.そこで,本システムの活用範囲,改良すべき問題点等についても検討を加え研究内容をまとめた.研究計画の最終年度である平成7年度の研究経過は,以下のごとく3点に要約される.すなわち,1)データベースの補充(斉藤健,高倉)データベースを強化し,種々のデータによる分解能,再現性などの処理パフォーマンスの安定性を確認し,システムの完成度を高めた.具体的には,ヒトのVDT作業およびその後引き続く仮眠状態の脳電位12チャンネルを記録し,数量化処理可能なデータに加工した.また,ラットの海馬周辺の脳切片に電気刺激を行い,神経回路における興奮反応を0.6msec間隔で記録したデータを用いて,時系列画像データファイルを作成した.2)データベースの解析処理(神山,江口)プログラムメニューに対応した利便性、操作性を考慮し、高速処理能力を備えたシステム構成を用いて,作成したデータベースについて解析処理を行った.具体的には,ヒトの脳電位記録データベースに本研究の特色である最大エントロピー法によるスペクトル解析を適用し,脳平面の二次元画像を作成した.さらに,これらを時系列データとして三次元化し,脳電位の時間変動を1枚の画像に可視化した.従来型のFFTによるスペクトル解析を適用した成績と比較し,分解脳,安定度が向上したことを確認した.また,ラットの海馬周辺の脳切片から得られた超高速度画像も同様に時系列データとして三次元化し,興奮過程の可視化を行い,各部位における興奮レベルの量的変化について時間変動を把握することが可能となった.なお,これらの成果をカオス解析,相関分析などへ導入する意義は大きく,本システムではデータ構成をこれらの非線形解析が容易に実行可能な形式とした.3)研究成果のまとめ(神山,斉藤和雄)上述の実験成績は,本研究の当初の目的はほぼ達成されたことを示す.そこで,本システムの活用範囲,改良すべき問題点等についても検討を加え研究内容をまとめた.本研究は,脳電位時系列変動のオンライン処理を備え,三次元画像処理により立体的に可視化する[三次元脳電位画像解析ソフトウエア]のシステム化を達成することを目的とする.研究計画の初年度である平成6年度は,脳電位記録データベースの完成(斎藤健,高倉昌之)を目指した.現有設備(二次元光量差分計測装地,生体アンプ,データレコーダ,誘発電位装置,パソコン等)を用いて,ラット等の脳電位活動記録を行いデータベース化を計った.脳電位記録データベースの作成過程において,in vitroもしくはin vivoにおける神経細胞活動の継時的変化を数量的に解析し,時系列変化の特徴を抽出することの意義が次第に明らかになりつつある.一方,ルーチンプログラムには,画像記録時後直ちに解析結果の利用が可能で,三次元画像処理は脳電位変化をより解りやすく立体的に可視化する,カオス解析,相関分析などが容易に組み込めるため非線型解析へ発展性がある,などの特色がある.基礎的なルーチンプログラムの完成(斎藤和雄,神山昭男)に向けて,必要な基本プログラムを搭載した解析装置(脳電位デジタル処理システム)を新規購入し,データ転送,解析項目の基準化,データ処理パラメータの標準化などを計った.その結果,0.6msec毎に測定記録されるデジタル画像情報量は大量で,予想以上に解析時間が長いことが明らかとなった.したがって,今後はデータベースをさらに強化し,種々のデータによる分解能,再現性など,パフォーマンスの安定性を確認し,問題点を抽出しながらプログラムの完成度を高めること,実用化の達成(神山,斎藤和雄)に向けて研究経過をまとめ,具体的な利用方法,基礎および応用両面における利用範囲等について検討していく必要がある.研究計画の最終年度である平成7年度の研究経過は,以下のごとく3点に要約される.すなわち,1)データベースの補充(斎藤健,高倉)データベースを強化し,種々のデータによる分解能,再現性などの処理パフォーマンスの安定性を確認し,システムの完成度を高めた.

具体的には,ヒトのVDT作業およびその後引き続く仮眠状態の脳電位12チャンネルを記録し,数量化処理可能なデータに加工した.また,ラットの海馬周辺の脳切片に電気刺激を行い,神経回路における興奮反応を0.6msec間隔で記録したデータを用いて,時系列画像データファイルを作成した.2)データベースの解析処理(神山,江口)プログラムメニューに対応した利便性,操作性を考慮し,高速処理能力を備えたシステム構成を用いて,作成したデータベースについて解析処理を行った.具体的には,ヒトの脳電位記録データベースに本研究の特色である最大エントロピー法によるスペクトル解析を適用し,脳平面の二次元画像を作成した.さらに,これらを時系列データとして三次元化し,脳電位の時間変動を1枚の画像に可視化した.従来型のFFTによるスペクトル解析を適用した成績と比較し,分解能,安定度が向上したことを確認した.また,ラットの海馬周辺の脳切片から得られた超高速度画像も同様に時系列データとして三次元化し,興奮過程の可視化を行い,各部位における興奮レベルの量的変化について時間変動を把握することが可能となった.なお,これらの成果をカオス解析,相関分析などへ導入する意義は大きく,本システムではデータ構成をこれらの非線型解析が容易に実行可能な形式とした.3)研究成果のまとめ(神山,斎藤和雄)上述の実験成績は,本研究の当初の目的はほぼ達成されたことを示す.そこで,本システムの活用範囲,改良すべき問題点等についても検討を加え研究内容をまとめた.
床及び屋根に立体トラスを用い,任意の増改築を可能にする構法の開発に関する研究

従来のトラス構造物、特に立体トラスのように、弦材にパイプを用いボールジョイントにより構成されるトラス構造物は構造計算の際ジョイント部をピン支点として置き換え計算している。しかしながら、実際の接合部はある大きさをもったボールにボルトを介してパイプと接合されており、弦材またはボールに曲げモーメントが働くと、この力は他の部材に影響を与える。例えば、立体トラスに屋根を架ける場合はボール上に2次部材を渡しその上に屋根材を葺くことになりボールにある程度の曲げモーメントが働いている。このように従来の立体トラス架構は計算上(理論上)では接合点にはモーメントがかからず弦材にかかる応力は軸力のみであるとしてきた。だが、本研究では、そのテーマである床架構として立体トラスを用いることや、柱の取り付け取り外しが自由なシステムという点から弦材やボールに曲げ力をかけることが必要条件となった。それにより、柱を水平支持材で固定しキャンチレバーの柱にする形式や、床や屋根に2次部材を用いず、直接上弦材にパネル等を敷くシステムを開発した。次に、これらのシステムの可能性を実証するために強度実験を行なった。これはボールに曲げモーメントが生じた時に周囲のボルトやパイプにどのような影響を与えるか、また、パイプ=ボルト=ボールが一体となった時のボルトの曲げ強度の測定が目的である。一方、柱をブレース形式とし、屋根-柱-床を一体のトラス架構としたシステムを開発し、実際に事務所・工場・研究所の平面計画を行ない、それらのプランに従い柱を配置し、大型計算機を用いて構造解析を行ない柱の配置計画における指針を得た。以上の過程を踏まえてサブシステムの設計を行ない立体トラスを用いた従来にないフレキシビリティのある構法の開発を行なった。
大脳皮質ニューロンのサブタイプ依存的な軸索投射機構の解明

脳内の多様なニューロンがそのタイプに応じた軸索投射パターンを形成する機構の解明に向けて、まずは神経回路を可視化するため、投射パターンの異なる2つの大脳皮質ニューロン群の遺伝子発現を比較し、それぞれに特異的な遺伝子の候補を得た。これらの遺伝子のプロモータ領域を利用してマウス大脳皮質のニューロンにGFPを発現させ、回路の可視化ができるようになった。その結果、あるプロモータで標識されたニューロンは、同側半球内の別の領野に投射するだけでなく、対側の大脳皮質にも軸索を投射することが明らかになった。一方、ニューロンのタイプを決定する転写因子を発現させてタイプ変換実験による軸索投射パターンの変化も解析した。本研究は大脳皮質に存在する多様なニューロンが、それぞれのサブタイプに応じて特徴的な神経回路を形成する機構を明らかにすることを目的とし、特に同じ領野の同じ層に混在していながら異なる神経回路を形成する連合ニューロンと交連ニューロンの軸索投射機構を解析する。我々は、マウス大脳皮質1次体性感覚野(S1)に存在する連合ニューロン(1次運動野M1に投射する)と交連ニューロン(対側のS1に投射する)の遺伝子発現をDNAマイクロアレイ解析により比較し、連合ニューロンでの発現が優位な候補遺伝子を得ていた。これらの連合ニューロンにおける発現をM1からの逆行性トレーシングとin situハイブリダイゼーション(ISH)との2重標識を行って確認していた。本年度はマイクロアレイ・データの再解析を行い、交連ニューロンに優位に発現する候補遺伝子として10遺伝子程度選び、大脳皮質切片に対するin situハイブリダイゼーションを行った。シグナルが得られたものについて、対側S1からのトレーシングとISHとの2重標識により交連ニューロンでの発現を確認しているところである。ニューロン・サブタイプに特異的なプロモータでCreを発現させ、それぞれの神経回路の構造や接続先のニューロンを可視化するため、pCAG-loxP-stop-loxP-Lyn-GFPおよびpCAG-loxP-stop-loxP-WGAのコンストラクトを作製した。また、whole mountでこれらを観察できるように、脳の透明化と免疫組織染色を組み合わせたiDISCO法の検討を行い、大脳半球の大きさで可視化できる条件を設定した。本研究は、大脳皮質に存在する多様なニューロンが各々のサブタイプに応じて特徴的な神経回路を形成する機構、特に同じ領野の同じ層に混在しながら異なる神経回路を形成する連合ニューロンと交連ニューロンの軸索投射機構を明らかにすることを目的とする。マウス大脳皮質1次体性感覚野(S1)に存在する連合ニューロン(1次運動野M1に投射する)と交連ニューロン(対側のS1に投射する)の遺伝子発現をDNAマイクロアレイ解析により比較し、既に得られていた連合ニューロン特異的プロモータの候補遺伝子に加えて、昨年度は交連ニューロン特異的プロモータのための18の候補遺伝子について大脳皮質切片に対するin situハイブリダイゼーション(ISH)を行った。今年度は、ISHでシグナルが得られたものについて、対側S1からの逆行性トレーシングとISHとの2重標識実験を行ったが、明確に2重陽性となるものは得られなかった。現在もスクリーニングを継続している。また、M1と対側S1の両方に投射するニューロンにCreを発現させ、pCAG-loxP-stop-loxP-Lyn-GFPにより両方の回路を同時に標識する系の構築を並行して行った。これを用いてLyn-GFPと同時にLmo4を強制発現させるニューロンサブタイプの変換実験を行い、軸索投射パターンの変化の有無を検証したが、GFPのみを発現させたコントロールと比べて明瞭な差異は検出できなかった。一方、軸索の正確なトレースにはニューロンを疎らに標識する必要があるが、Cre/loxPによる低頻度標識では細胞間でGFPの発現量がばらつくという課題があった。これを克服するため、すべてのCre陽性細胞でGFPの高発現を得るための独自のシステムを開発した。今後、このシステムにより、スクリーニングで得られる特異的プロモータによる回路の可視化が効率的に行えるようになると期待される。交連ニューロン特異的遺伝子のスクリーニングにやや時間がかかっているが、プロモータ-Creと組み合わせて用いるコンストラクトはほとんど準備できているので、プロモータが得られたらすぐに実験を開始する態勢は整っている。神経科学平成27年度は、できるだけ早い段階で交連線維を標識できるプロモータを同定し、得られ次第、プロモータ-Creのコンストラクトを作製し、上記のコンストラクトと一緒にエレクトロポレーションを行って大脳皮質に導入し、回路構造の可視化(GFP)と接続先ニューロンの同定(WGA)を行う。連合ニューロン

特異的プロモータやM1と対側S1の両方に投射するニューロンのプロモータで同様の実験を行って、それぞれの結果を比較する。さらに、それに引き続き、軸索ガイダンス分子のノックダウン実験や、Lmo4強制発現によるサブタイプ変換実験を行って、その軸索投射様式への影響を解析する。プロモータの同定など、一部の実験が当初想定よりも時間がかかっているため、使用するタイミングが次年度になるものが生じたため。研究計画全体を通じて子宮内電気穿孔法による遺伝子導入を頻繁に行う必要があり、妊娠動物の購入費用および飼育費用を多めに計上している。プロモータ同定のためのコンストラクト作成に必須となるBACクローンの購入に20万円程度を要する。また、日本神経科学会、日本神経化学会と日本解剖学会で発表を行う予定であり、これらに要する旅費を計上した。
選択的スプライシングを制御する核内微小時空間場のバイオプローブを用いた解析

真核細胞の核内は、多数の核内構造体によって高度に区画化された空間である。遺伝子発現は、核スペックルなどの核内構造体によって形成される微小核内空間場を介した制御を受ける。本研究では、放線菌培養上清から分離した核スペックル形成阻害化合物をバイオロジカルプローブに用いて、核内構造体を介して選択的スプライシングやmRNA核外輸送などの転写後遺伝子発現が如何に制御されるか、その時空間的な場による制御機構を解明した真核細胞の核内は、多数の核内構造体によって高度に区画化された空間である。本研究では、放線菌培養上清から分離した核スペックル形成阻害化合物をバイオロジカルプローブに用いて、核内構造体を介して選択的スプライシングやmRNA核外輸送などの転写後遺伝子発現が如何に制御されるか、その時空間的な場による制御機構を解明した真核細胞では、遺伝子の転写やスプライシングなどの反応が、核スペックルやPMLボディなどの核内構造体によって形成される微小核内空間(場)で密接に連携しながら進行する。これらの核内構造体形成に影響を与える、放線菌培養上清から分離した化合物をバイオロジカルプローブに用いて、核スペックルに分布するスプライシング因子の動態制御とスプライシング反応への影響について解析した。まず、核スペックルの肥大化をもたらすことを指標に放線菌培養上清1870-14aから精製したToyocamycinについて解析したところ、スプライシング因子SF2及びSC35が、Toyocamycin処理後30分で核スペックルに強く集積していくことが示された。スプライシング因子の核スペックル集積に伴い、Clk遺伝子のエキソン含有型選択的スプライシングが促進された。アデノウイルスE1A遺伝子の選択的スプライシングにおいては、Toyocamycin処理は遠位5スプライス部位選択の促進を引き起こした。一方、核スペックルからpoly A^+RNAが分散する放線菌培養上清1891-1aから精製したtubercidinは、核スペックルからスプライシング因子SF2及びSC35の遊離分散を引き起こし、Toyocamycinとは逆に、Clk遺伝子のエキソンスキッピング型選択的スプライシングを強く促進した。また、転写と共役したスプライシング反応は阻害しないが転写後スプライシングを行うCol1A1遺伝子exon24のスプライシングは阻害することが示された。これらの結果は、核スペックルがスプライシング因子の核内分布を調節することで選択的スプライシングを制御している可能性、及び核スペックルが転写後スプライシングを行うイントロンのスプライシング完了をチェックするmRNA品質管理装置としても機能している可能性を示唆する。遺伝子の転写やスプライシングなどの反応は、核スペックルやPMLボディなどの核内構造体によって形成される微小核内空間(場)で密接に連携して進行する。本研究は、これらの核内構造体構築に影響を与える、放線菌培養上清から分離した天然阻害化合物をバイオロジカルプローブに用いて、核内構造体を基盤に様々な因子が出入りして形成される微小空間場によって、転写後遺伝子発現が如何に制御されるか、その時空間的な場による制御機構を解明することを目的に行った。核内構造体(核スペックル)を肥大化する化合物として同定したtoyocamycinは、スプライシング因子のリン酸化kinaseを抑制することにより、核スペックルへのスプライシング因子の集積を促進し肥大化をもたらすことが示された。一方、核スペックルを分散化させるtubercidinは、スプライシング因子の核スペックル局在に必須なnon-coding RNA (MALAT1 RNA)に取り込まれその分解を促進することで、核スペックルからのスプライシング因子SF2の分散化を惹起している可能性が明らかとなった。また、これら二種類の阻害化合物処理によって引き起こされる核スペックルの変化(集積と分散化)による選択的スプライシングへの影響を解析し、Clk遺伝子においては、核スペックルへのスプライシング因子の集積(toyocamycin処理)によってexon inclusionが、核スペックルからのスプライシング因子分散(核質濃度上昇、tubercidin処理)によって、exon skippingが引き起こされることが示唆された。さらに、exon array解析を行い、ゲノムワイドにこれら化合物が選択的スプライシングに与える影響を解明することに成功した。遺伝子の転写、スプライシング、mRNA核外輸送などの反応は、核スペックルなどの核内構造体によって形成される微小核内空間で密接に連携して進行する。本研究は、核内構造体構築に影響を与える、放線菌培養上清から分離した天然阻害化合物をバイオロジカルプローブに用いて、核内構造体を基盤に様々な因子が出入りして形成される微小空間場によって、転写後遺伝子発現が如何に制御されるか、その時空間的な場による制御機構を解明することを目的に行った。核スペックルを肥大化する化合物として同定したtoyocamycinは、ATP拮抗剤としてClk kinaseを阻害し、スプライシング因子SF2などのリン酸化を減少させることで核スペックルにSF2を集積させ、選択的スプライシングに影響を及ぼすことが示された。

興味深いことに、toyocamycinは、選択的スプライシング阻害に加えて、成熟mRNAの核外輸送も阻害することが判明した。SF2はスプライシング反応制御に加えて、mRNA核外輸送のアダプター因子としても機能していることから、toyocamycinはSF2のリン酸化阻害により、mRNA核外輸送に影響を与えた可能性が考えられた。RIP assayの結果から、toyocamycinはSF2と核外輸送因子TAPの相互作用に影響を及ぼして核外輸送阻害を引き起こしていることが示唆された。また、exon array解析により、ゲノムワイドにtoyocamycinが選択的スプライシングに影響を与える遺伝子群(エキソン群)を同定した。配列情報の統計的解析から、toyocamycinにより選択的スプライシングが影響を受けるエキソンには、SF2結合配列分布に特徴的な偏りがある可能性が明らかとなった。当初の解明目的とした核スペックルの形成と局在するスプライシング因子の動態変化(集積と分散)が選択的スプライシング反応に及ぼす影響を、核スペックルの形成に関して正反対の効果を示す化合物toyocamycinとtubercidinを用いて、分子レベルで解明できたので区分(2)の自己評価とした。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、核スペックルの形成変化がゲノム全体の選択的スプライシングに及ぼす影響について、exon arrayを用いて解析している。toyocamycinとtubercidinの処理によって、変動する遺伝子群(イントロン群)を抽出できつつあるので、更に解析を進めたい。また、化合物処理によって変動を示すいくつかの代表的遺伝子について、レポーターミニ遺伝子の作成を進め、toyocamycinとtubercidinによって影響を受ける選択的スプライシングに関わるpre-mRNA上のシス塩基配列の同定へと研究を展開する予定である。
複数エージェント間のオントロジー交換プロトコル

分散処理システムの構成要素を自律的なソフトウェア部品であるエージェント(以下、エージェントと略す)を用いて構築するためのフレームワークであるADIPSフレームワークの開発利用経験をもとに、新たなマルチエージェントシステム間のオントロジー交換用プロトコルを開発することを目的として研究を進めた.従来ADIPSフレームワークにおいてエージェントでオントロジーを実現するためには,エージェントプログラミングを行うものが意識的にオントロジーを用いる必要があったが,平成11年度平成12年度に行ったエージェントアーキテクチャの研究によって作成された新たなエージェントアーキテクチャにより,エージェント間オントロジー交換プロトコルを設計・実装することが可能になった.本研究によって得られた新たな知見は以下の通り.1.分散処理システムの構成要素となるエージェントの設計者とは別に,エージェントの振る舞いを決定する(1)エージェント間協調プロトコル設計者,(2)エージェントの推論方式を定める知識処理機構設計者,(3)エージェントの構造を設計するコントローラ設計者の3つのメタエージェント設計が存在し,これを明示することで,従来のADIPSフレームワークにおけるエージェント設計よりもエージェント設計が容易になる.2.エージェントプロトコルの記述方式としAgenTalk(桑原他)が有効に利用できる3.メタエージェント設計を利用することで,特定分散処理システム向けのエージェント記述量が削減できる.4.エージェント設計段階での識別子(エージェント名)と複数の複製されたエージェントとの対応付けを行うアルゴリズムとそのアルゴリズムを実装したエージェント記述言語が新たに要求される.エージェント教育の必要性,新しい分散処理システムの構成法の概念をつかむための教育が必要であり,実システムとしての本研究成果とは別に教育用システム開発を行い,成果は図書として発表した.マルチエージェントシステムを開発するための枠組として,Agent-based Distributed Information Processing System,ADIPSフレームワークを研究開発してきた経験をもとに,新たなマルチエージェントシステムシステム間のオントロジー交換プロトコルを設計することが研究目的である.1999年度は,オントロジー交換プロトコルを処理するマルチエージェントフレームワークの設計,エージェントアーキテクチャの設計を行い,知識表現モデルの検討を行った.この結果,つぎに示すようなエージェントアーキテクチャ,知識表現モデルが本研究目的に適しているという知見を得ることができた.エージェント間通信プロトコルは従来の通信プロトコル記述言語と同様に,メッセージと状態遷移図により表現可能であり,桑原らによるAgenTalkと同様の方式で実現可能である.しかしながら,オントロジー交換の過程で生じるエージェント間プロトコル自体の再定義と利用を実現するためには,不十分であり後述するエージェントアーキテクチャを記述するモデル記述言語の導入の必要性が明らかになった.知識表現モデルとしては,多様な表現形式を受容する必要があり,その処理系は述後論理を元に構築する.形式表現言語としては,XMLを用いることで,エージェントプログラム環境の実現を容易にし,既に存在する多くのXML形式の知識表現を流用可能にする余地を残した.エージェントアーキテクチャは,これまでのADIPSフレームワークと異なり,新しいモデルを定義実行できるモデルが必要であり,かつモデル自身の振る舞いを実行時に動的に変更することで,オントロジー交換に対処する必要がある.このため新たにエージェントのモデル記述言語を設計した.この表現形式も知識処理系と同様に,形式表現としてXMLを採用した.以上,目的とするマルチエージェントシステム間のオントロジー交換プロトコルを実証するための,あたらしいマルチエージェントフレームワークを設計した.分散処理システムの構成要素を自律的なソフトウェア部品であるエージェント(以下、エージェントと略す)を用いて構築するためのフレームワークであるADIPSフレームワークの開発利用経験をもとに、新たなマルチエージェントシステム間のオントロジー交換用プロトコルを開発することを目的として研究を進めた.従来ADIPSフレームワークにおいてエージェントでオントロジーを実現するためには,エージェントプログラミングを行うものが意識的にオントロジーを用いる必要があったが,平成11年度平成12年度に行ったエージェントアーキテクチャの研究によって作成された新たなエージェントアーキテクチャにより,エージェント間オントロジー交換プロトコルを設計・実装することが可能になった.本研究によって得られた新たな知見は以下の通り.1.分散処理システムの構成要素となるエージェントの設計者とは別に,エージェントの振る舞いを決定する(1)エージェント間協調プロトコル設計者,(2)エージェントの推論方式を定める知識処理機構設計者,(3)エージェントの構造を設計するコントローラ設計者の3つのメタエージェント設計が存在し,これを明示することで,従来のADIPSフレームワークにおけるエージェント設計よりもエージェント設計が容易になる.2.エージェントプロトコルの記述方式としAgenTalk(桑原他)が有効に利用できる3.メタエージェント設計を利用することで,特定分散処理システム向けのエージェント記述量が削減できる.4.エージェント設計段階での識別子(エージェント名)と複数の複製されたエージェントとの対応付けを行うアルゴリズムとそのアルゴリズムを実装したエージェント記述言語が新たに要求される.エージェント教育の必要性,新しい分散処理システムの構成法の概念をつかむための教育が必要であり,実システムとしての本研究成果とは別に教育用システム開発を行い,成果は図書として発表した.
熟練者の視線を繰り返し体感できるVR型サーフィン・トレーニングシステムの実現

実際のサーフボードに乗り,ヘッドマウントディスプレイ(HMD)で実際の波のりの360°映像を視聴しながら,サーフィンの繰り返し体験を実現するための基礎検討を進めている。現状、海上での計測が困難であるため、基礎検討として、室内で実験を行った。サーフセットという、ゴムボールの上にサーフボードをおき、波乗りの状態を再現できる装置を利用し、被験者には、実際に波に乗っている状態を想定した動きをしてもらい、筋肉の動きの変化を計測した。具体的には、2種類の計測を行った。一つ目は、両足の脛、ふくらはぎ、大腿の前後、腹筋、背筋の12カ所に筋電センサを取り付け、サーフボードの上に横たわった状態から立ち上がって波に乗っている状態の動作までの一連の動きを再現してもらい、その際の筋電を計測した。2つめは、センサ取り付け位置は同じであるが、実際にサーフィンを行っている360°映像(Youtube映像)を用意し、その映像をヘッドマウントディスプレイ:HMD(Lenovo Mirage Solo)に再生した状態で、先の実験と同様にサーフセットの上で波乗りを擬似的にしている動作を行ってもらった。一回目の実験では、各被験者は自分の想定した動きをしているだけであるが、HMDを装着した場合、被験者全員が同じ波に乗った状態での筋肉の動きを計測することができる。現在、サーフィン経験のある被験者8名、サーフィン経験の無い被験者4名に対して、計測実験を行い、現在データ解析を進めている。熟練者と初級者では、筋肉の動きに大きな違いがあることは確認出来ているため、これらの解析結果を31年度、学会発表を行う予定である。また、31年度は、大きなプールに水をはり、海水と同レベルの塩水にして、サーフボードを実際に水に浮かべた状態で、30年度と同様の実験を行う予定である。サーフィン時の筋電計測の実験が大幅に遅れている。30年度は、大型プールを用意し、水上でのサーフィン時の筋肉の動き計測を行った。しかし、防水対策が不十分であったため、筋電センサが故障してしまったため、修理に時間がかかってしまい、実験開始が大幅に遅れた。そこで、室内での基礎実験を行い、水上での計測に関して、しっかり準備を整えることとしたため、半年程度の遅れが出ている。室内でのサーフィン疑似体験による動き計測を行い、熟練者と初級者の違いを明らかにする。そして、VR視聴時での繰り返し動作の有効性を検証していく予定である。海上での実験は、天候に左右されるため、実験対象期間を十分に確保し、データ計測を行っていく必要がある。サーフィンのVR疑似体験を行うためのデバイスとして、スタンドアロン型が望ましい。このタイプのHMDは発展途上であり、この数年、各社競って新製品を出している。昨年の段階では、実験に耐えうるスペックの装置の購入が難しかったが、31年度発表予定のデバイスであれば有意義が実験が期待できる。そこで、関連機器の購入を繰り越したため、助成金の変更が生じた。

また、被験者による実験が遅れているため、謝金並びに、その成果発表の機会が翌年にずれ込んでいる。以上の理由から助成金の大幅な変更が発生している。31年度は、実験機器の購入並びに、より多くの被験者実験(それに伴う謝礼、旅費)、それら成果の国際会議発表に伴う学会参加費及び海外旅費として使用する予定である。
外洋と相互作用がある内湾の一次生産機構

本研究の目的は、黒潮系の暖水塊が定期的に進入する内湾の一次生産機構を明らかにすることにある。この様な開放的内湾では植物プランクトンの現存量は黒潮の内湾への流入、すなわち急潮を起点とする外洋との相互作用を通して急激に減少し、その直後、短期間で回復する。しかし、なぜ現存量の急激な増加回復が起こるのかは解っていない。そこで、1)湾内への黒潮の進入、2)湾内海水の移動、3)黒潮と内湾海水との混合、4)急潮による底泥付近および間隙水の水質変化、5)急潮による湾内の水質変化、6)植物プランクトンの現存量分布、7)急潮が起きたことを想定した海水のAGP試験、8)急潮による内湾のAGP変化、9)急潮による光合成活性の変化、10)潮流、水質、植物プランクトンの動的連鎖関係の解析を行った。その結果、黒潮の内湾への定期的進入が底層の栄養塩濃度を上昇させ、かつ栄養塩を上層に汲み上げるポンプアップの役割を果たし、この水質変動に連動して、植物プランクトンが増加するという一連の連鎖的変化が起きていることが明らかになった。外洋と急潮を介して相互作用がある内湾の植物プランクトンの増殖機構は、栄養塩の表層への供給のされ方とその頻度が、湖沼や閉鎖性内湾の植物プランクトンのそれらとは著しく異なっており、海水の動きが水質、植物プランクトン現存量を決める重要な要因であることが指摘された。今後の研究課題は急潮の規模と底質と植物プランクトン増殖量の関係を定量的に把握するための最適パラメーターの選定に関する研究と、急潮と急潮との間における植物プランクトンの動態の解明が必要であろう。このような開放的内湾では植物プランクトンの現存量は黒潮の流入を起点とする外洋との相互作用を通して急激に減少し、その直後、短期間で回復する。水温上昇期にこれが繰り返し起こる。そこで1)湾内への黒潮の進入、2)湾内海水の移動、3)黒潮と内湾海水の混合、4)潮流が海底泥に与える化学的影響、5)水質変化、6)植物プランクトンの現存量分布、7)植物プランクトンの増殖と水質との関係を明らかにし、潮流、水質、植物クトンの増殖は一連の連鎖関係を形成していると言う立場に立って、植物プランクトン現存量の振動機構を解明しようとした。研究実績の概要は以下の通りである。1.調査対象となっている湾に進入する黒潮系の暖水塊は表層で27°C水深10mに水温躍層があり、23°Cに低下する。このことから水深10m以浅の海水が密度流となって湾内に進入すると考えられた。2.湾表層に進入した急潮によって湾内水の2/3が底層から湾外に押し出された。急潮後、湾外の低温海水が湾の底層から進入し、再び内湾水の5/6が湾外に押し出された。このように急潮後の湾外と湾内の海水交換が大きいことが判明した。3.急潮後、底層の栄養塩濃度が顕著に増加し、表層で植物プランクトンの現存量が急潮前より多くなり、約9倍に増加した場所もあった。4.急潮により湾内の海水が流動し、これが底層の栄養塩濃度を増加させ、その結果表層の植物プランクトンが増加したと言う一連の変化過程が考えられた。

5.急潮の機能として、栄養塩のポンプアップ機能、水質浄化機能、回分培養機能、植物プランクトン活性化機能が考えられた。本研究の目的は、黒潮系の暖水塊が定期的に進入する内湾の一次生産機構を明らかにすることにある。この様な開放的内湾では植物プランクトンの現存量は黒潮の内湾への流入、すなわち急潮を起点とする外洋との相互作用を通して急激に減少し、その直後、短期間で回復する。しかし、なぜ現存量の急激な増加回復が起こるのかは解っていない。そこで、本年度は1)急潮による底泥付近の水質変化、2)急潮が起きたことを想定した海水のAGP試験、3)急潮による内湾のAGP変化、4)潮流、水質、植物プランクトンの動的連鎖関係の解析、5)湖沼や閉鎖性内湾の植物プランクトンの変動機構とは異なった機構が存在するかどうかに注目した、黒潮が流入する内湾に共通する植物プランクトンの増殖機構のモデルの提示を試みた。研究実績の概要は以下の通りである。1.暖水塊が全層に入り終わり、湾外の海水が底層に回帰する時期に、底泥間隙水中の栄養塩濃度が著しく増加したことから、急潮の進入で有機物分解が著しく促進されたと考えられた。また急潮が進入し、底泥付近の濁度が増加した後、底泥間隙水栄養塩濃度は減少したことから、海水の流動により底泥が撹拌され、栄養塩が間隙水中から拡散したと考えられた。2.急潮を想定した植物プランクトンの現場培養、および急潮前後の現場海水を用いたAGP試験よ、急潮は植物プランクトンを増加させることが解った。3.外洋海水の内湾への定期的進入が底層の栄養塩濃度を上昇させ、かつこれを汲み上げるポンプアップの役割を果たし、この水質変動に連動して、植物プランクトンが増加するという一連の連鎖的変化が起きていることが明らかになった。
HTLV-I関連シェーグレン症候群の発症機序の解明

唾液腺上皮細胞とHCT-5の共培養を行い、この時のHTLV-I関連蛋白/遺伝子発現や培養上清における液性因子、細胞死関連分子発現を検討した。HCT-5との共培養を96時間まで行うと72-96時間の唾液腺上皮細胞上に約7.8%の頻度でHTLV-I陽性細胞が観察、in situ PCR法でも48時間でのHTLV-I感染が認められた。培養上清のCXCLl1、sICAM-1、IL-8、CXCL10/IP-10およびRANTESはELISA法でも増加を呈した。上皮細胞ライセートのアポトーシスアレイではアポトーシスを誘導分子と拮抗分子の経時的増加が観察されたが、。TUNEL陽性像は見られなかった。HTLV-I感染とシェーグレン症候群(SS)発症との関連は疫学的検討では、強い関連が示唆されてきた。また病理学的には、抗HTLV-I抗体陽性SS群において、二次濾胞の頻度が少なくCXCL13などのケモカインの頻度とあわせて、HTLV-I関連SSの病態に深く関与していると思われる。しかし、HTLV-Iウイルスが唾液腺に直接的に感染するのかあるいは、HTLV-Iに感染したリンパ球より分泌されるサイトカイン・ケモカインが間接的に唾液腺上皮細胞に影響を及ぼしているのかが病態解明に重要であると考えられる。これらの影響を検討するため、SS患者より口唇生検にて得られた唾液腺組織から発育した初代培養唾液腺細胞(SGEC)とHTLV-I関連脊髄症:HAM患者髄液から樹立されたHTLV-I感染細胞株HCT-5ととの共培養を行い、培養上清中でのサイトカイン・ケモカインなど発現の変化について抗体アレイおよびアポトーシスアレイを用いて比較した。共培養0-96時間の上清における抗体アレイ解析では、経時的に可溶性intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), interleukin-8, interferon gamma-induced protein 10kDa ; IP-10(別名CXCL10) regulated upon activationおよびnormal T-cell expressed, and secreted (RANTES)などの発現増加がみられた。抗体アレイにて発現亢進がみられた分子についてはELISA法での定量化を進めている。一方、0-96時間共培養したSGECライセートに対する抗体アレイでは、チトクロームC、Fasなどのアポトーシスを誘導する分子と共にBcl-2、HO-2、HSP-27、SMAC/Diabloなど生存因子も発現していた。しかし、TUNEL法による検討では実際のアポトーシス自体は増加がみられなかった。現在これらのアポトーシス誘導および制御因子のSGECでの発現変動についてHTLV-I感染前後での検討を進めている。HTLV-I感染とシェーグレン症候群(SS)との関連は疫学的には関連が示唆されるが、そのメカニズムは不明であった。培養唾液腺上皮細胞にHTLV-Iが感染しうるかについて、HTLV-I感染細胞株HCT-5を用いて、感染実験を行った。この結果in situ PCRでは48時間以降、蛋白レベルでは72時間以降に感染が確認された。また培養上清では継時的に炎症性サイトカインやケモカイン(RANTES, IL-10, ICAM-1)などの発現が上昇し、感染上皮細胞自体にも発現がみられた。ELISA法での定量でもこれらの発現が確認できた。また、アポトーシス関連分子であるFas, Cytochrome C, Bcl-2, HO-2, HSP-27についても共培養後の発現亢進がみられたが、TUNEL法でのアポトーシス自体は観察されなかった。今後は、HTLV-I感染による自己抗体産生抑制機序やin vivoでどのような細胞にHTLV-I発現がみられるか観察を行う。予定以上に研究が進まない点としては、通常診療内でシェーグレン症候群が疑われる患者さんに対して小唾液腺生検を行っているため、生検実施頻度に初代培養の回数が規定されている点である。既存の細胞株を使った実験ではないため、生検依頼数によっては実験の遅れが生じる。また細胞のコラーゲン・コートプレートへの生着の程度にも症例によって差がある。一定の生着状況ではないため、唾液腺組織の初代培養を開始できても目的のSGECが得られないことが多々見られる。このように生検頻度と細胞の生着という2点が複合している理由で、予定通り実験が行えない場合があるため。膠原病学予定以上に研究が進まない点としては、当院倫理委員会で承認が得られた書式に則り、シェーグレン症候群が疑われる患者さんより小唾液腺生検で得られた組織を使用するため、in vitroの実験がが生検頻度に大きく依存している。

また、初代培養であるために、細胞の生着率が悪い場合、HTLV-I感染細胞との共培養に十分耐えきれない場合が見られる。この場合は、次の生検を待って、唾液腺上皮細胞が生育してからの共培養となるため、cell lineを使う研究のような頻度での研究が難しい点が根本にある。しかし、2種類の抗体アレイを用いた検討によりHTLV-I感染前後で動く液性因子や細胞死関連分子の把握ができており概ね予想通りの進展である。培養上清のサイトカイン・ケモカイン測定に使用するキット単価が大きく、複数キット購入を予定した場合、予算を超過してしまうため。アレイ解析により半定量化された液性因子の動態が明らかとなったため、enzyme-linked immunosorbent assay法により、HTLV-I感染後に増加する分子群の定量化を行う。また共培養後の唾液腺上皮細胞ライセートで増加する分子群については、ウエスタンブロット法や免疫染色法によって抗体アレイでの発現増加を確認したい。この確認が終了した後は、未解決であるHTLV-I感染後のCXCL12/CXCL13などの二次濾胞形成にかかわる分子発現についても検討したい。CXCL13については濾胞性樹状細胞が主な産生源とされており、唾液腺上皮細胞での発現検討が十分でない場合は濾胞性樹状細胞上のこれら分子発現検討が必要になってくる。平成27年度の研究予算に次年度使用分を組み入れ、ELISA用キットを複数個購入する予定であり、細胞培養に必要な無血清培養液、培養プレート等および、免疫に必要な一次抗体の購入に使用予定。
コンデンシンを介したDNA超らせん構造の制御機構とその生理作用の解明

本研究では、染色体凝縮因子コンデンシンが染色体高次構造を制御するメカニズムを解明することを目指している。次世代シークエンサーを用いてゲノムワイドに構造情報を取得できるHi-C法やそのバリエーションを主たる手法として用いている。昨年度に引き続きヒト凝縮染色体のHi-C法による高次構造解析を行った。間期核で見られるTAD構造が消失し、代わりに10 Mbの周期性を持つ構造が染色体全体にわたって現れることが見出された。しかし、同様のデータに基づいた詳細な解析が2018年中に他研究室により発表されてしまった(Science 359:eaao6135)。現在Hi-Cデータからさらなる独自の知見を引き出すことができないか検討中である。近年コンデンシンの生化学的解析が国内国外の複数の研究室で急速に進展し、コンデンシンの分子機能に関する様々なモデルが提示されてきている。モデルの正当性を実際の染色体中で検証するためには、Mbよりも小さなスケールで染色体構造を捉えることが必要となってくる。Hi-C法の変法であるmicro-Cなどを適用し、染色体構造の可視化をより精緻なレベルで達成するための実験・解析を現在進めている。コンデンシンと構造上よく似た複合体であるSmc5/6複合体は染色体上の固有の箇所に局在することが知られる。この結合部位を説明するモデルの作成を行ったところ、Smc5/6は転写によって生じた正の超らせん構造を認識しているという仮説が浮上してきた。この仮説は分子生物学的実験によっても支持された(スウェーデン、カロリンスカ研究所Camilla Bjorkegren博士との共同研究)。Smc5/6複合体が染色体の超らせん状態をモニターするプローブとして利用できる可能性を示すものであり、この知見を生かした研究にも取り組む予定である。コンデンシンの研究は現在世界中で急速に進展し始めており、その動向を見極めて研究方針を柔軟に修正していくことが必要な状況にある。これまでに染色体構造に関する情報を取得する実験手法であるHi-Cやmicro-C、ChIA-dropなどの技法を動かすことができるようになっており、時流を捉えた研究を行う態勢は整っていると言える。研究はおおむね順調に進展していると考えている。生化学的研究からはコンデンシンが(i)ループの導入、(ii)スキャフォールドの形成、(iii)超らせん状態の制御といった分子活性を示す可能性が提示されている。これらの可能性をin vivoで検証する実験に注力する。これまでに確立したHi-Cやmicro-C、ChIA-drop等の手法でデータを取得し、さらに情報学的解析を行うことでこの課題にアプローチする。上述のように、出芽酵母Smc6の分子生物学的・情報学的解析から、Smc5/6複合体が染色体の超らせん状態をモニターするプローブとして利用できる可能性が浮かんできた。この路線の研究にも取り組む。本研究では、染色体凝縮因子コンデンシンが染色体高次構造を制御するメカニズムを明らかにすることを目指している。今年度は、分裂酵母とヒト培養細胞を対象とした定量的なChIP-seq解析により、コンデンシンはChIP-seqプロファイルで強いピークとして見える"ホットスポット"に確かに高頻度で結合しているが、それだけでなく染色体上の他の領域にも非限局的に存在していることを明確にした。また核内のDNA-DNA相互作用を網羅的かつ高解像度に可視化する実験手法Hi-C法を導入し、ヒト培養細胞における核内高次構造の細胞周期における変化を描出することにも成功した。M期においては間期核を特徴付けるTADと呼ばれる構造が消失し、領域ごとの個性が消失した相互作用の様相を示すことが見出された。コンデンシン除去細胞を用いたHi-Cデータの取得も終えており、これらのデータと高解像度コンデンシン結合プロファイルを相互に比較解析することにより、コンデンシンがM期染色体構築において果たしている役割を今後明らかにして行けると期待している。一方で、コンデンシンはM期染色体凝縮以外の役割も果たしており、それは間期核におけるDNA損傷修復と関係すること、染色体上のホットスポット様の結合と関連があることがこれまでの研究から示唆されている。この機能の詳細を理解するため、分裂酵母を用いた遺伝学的アプローチによる解析を開始した。コンデンシン変異を相補するサプレッサー変異を体系的に取得し、その実体を全ゲノムシークシークエンスにより明らかにしようとしているところである。当初優先して導入することを計画していた「インターカレーターを用いた染色体DNAの超らせん密度の計測」は、技術的困難によりまだ導入できていない。しかし、染色体の高次構造を探る別の手法であるHi-C法については導入に成功しており、かつ得られた解像度は世界の最先端レベルと遜色ないものとなっている。今後はHi-C法のデータを活用してコンデンシンの分子機能に迫る研究を進めることができるので、進捗状況は概ね順調であると考えている。

現在Hi-Cデータからさらなる独自の知見を引き出すことができないか検討中である。近年コンデンシンの生化学的解析が国内国外の複数の研究室で急速に進展し、コンデンシンの分子機能に関する様々なモデルが提示されてきている。モデルの正当性を実際の染色体中で検証するためには、Mbよりも小さなスケールで染色体構造を捉えることが必要となってくる。Hi-C法の変法であるmicro-Cなどを適用し、染色体構造の可視化をより精緻なレベルで達成するための実験・解析を現在進めている。コンデンシンと構造上よく似た複合体であるSmc5/6複合体は染色体上の固有の箇所に局在することが知られる。この結合部位を説明するモデルの作成を行ったところ、Smc5/6は転写によって生じた正の超らせん構造を認識しているという仮説が浮上してきた。この仮説は分子生物学的実験によっても支持された(スウェーデン、カロリンスカ研究所Camilla Bjorkegren博士との共同研究)。Smc5/6複合体が染色体の超らせん状態をモニターするプローブとして利用できる可能性を示すものであり、この知見を生かした研究にも取り組む予定である。コンデンシンの研究は現在世界中で急速に進展し始めており、その動向を見極めて研究方針を柔軟に修正していくことが必要な状況にある。これまでに染色体構造に関する情報を取得する実験手法であるHi-Cやmicro-C、ChIA-dropなどの技法を動かすことができるようになっており、時流を捉えた研究を行う態勢は整っていると言える。研究はおおむね順調に進展していると考えている。今回取得できたHi-Cデータ及び定量的ChIP-seqデータを比較解析することで、コンデンシンが染色体高次構造を制御する機構についての研究を進めてゆく。Hi-C法と並行して、よりローカルなDNA構造を探る手法の導入も行う。引き続きインターカレータを用いる手法についての試行を行うとともに、micro-CやssDNA-seqなどの手法も検討する。また、遺伝学的手法によりコンデンシン機能の解明を目指すアプローチ(サプレッサー変異の単離・同定)も今年度に引き続き進めて行く。生化学的研究からはコンデンシンが(i)ループの導入、(ii)スキャフォールドの形成、(iii)超らせん状態の制御といった分子活性を示す可能性が提示されている。これらの可能性をin vivoで検証する実験に注力する。これまでに確立したHi-Cやmicro-C、ChIA-drop等の手法でデータを取得し、さらに情報学的解析を行うことでこの課題にアプローチする。上述のように、出芽酵母Smc6の分子生物学的・情報学的解析から、Smc5/6複合体が染色体の超らせん状態をモニターするプローブとして利用できる可能性が浮かんできた。この路線の研究にも取り組む。