hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規糖脂質MPIaseを利用した機能的膜タンパク質の可溶化剤の開発

MPIaseはタンパク質膜挿入に必須の糖脂質である。MPIaseは糖鎖部分と脂質部分がピロリン酸を介して連結されている。ピロリン酸の中央で切断した糖鎖部分(PP-MPIase)は、膜タンパク質と可溶性の複合体を形成するため、この糖鎖は膜タンパク質可溶化剤として有用である。MPIase誘導体を検討したところ、酢酸処理した糖鎖(AcOH-MPIase)はPP-MPIaseからリン酸が除去された構造をもつ。AcOH-MPIaseは膜タンパク質と相互作用しなくなった。これらの結果から、MPIaseの糖鎖と膜タンパク質との相互作用には、多くのアセチル基だけでなくリン酸基も必須であることが判明した。MPIase(Membrane Protein Integrase)は申請者が発見した、タンパク質膜挿入反応に必須の糖脂質酵素である。一連の膜タンパク質はMPIaseにのみ依存して膜挿入する。この膜挿入機構を解析したところ、膜タンパク質はその生合成直後にMPIaseと相互作用し、その後MPIaseの作用で膜挿入することが判明した。そのため、MPIaseは膜タンパク質に特化した分子シャペロンであると考えられる。MPIaseをピロリン酸フォスファターゼで消化すると可溶性の糖鎖(PP-MPIase)が得られる。PP-MPIaseはMPIaseよりも高い膜挿入活性を持ち、膜タンパク質と可溶性の複合体を形成することができる。このことは、PP-MPIaseは膜タンパク質の可溶化剤として利用できる可能性が高いと考えられる。そのため、MPIaseを化学修飾し、より膜タンパク質と安定に相互作用できるMPIase誘導体が形成できると考えられた。まず、MPIaseを酢酸で処理するとPP-MPIaseからリン酸が除かれたMPIase(AcOH-MPIase)が得られた。しかし、AcOH-MPIaseは全く膜挿入活性がなく、しかも膜タンパク質との相互作用が観察されなくなった。このことはMPIaseのリン酸基は膜タンパク質との相互作用に必須であることを示している。現在、PP-MPIaseを出発材料としてアセチル基の導入をはじめとする化学修飾を行っている。MPIaseは糖脂質でありながら膜タンパク質の膜挿入を触媒する、「糖脂質酵素(Glycolipozyme)」と呼ぶべき機能をもっている。膜挿入機構の解析の結果、MPIaseの糖鎖部分は膜タンパク質の膜貫通領域と直接相互作用し、膜挿入中間体を形成することを明らかにした。このことは、MPIaseの糖鎖部分が膜タンパク質一般に適用できる可溶化剤として利用できることが強く示唆されていた。MPIaseを酢酸処理するとMPIaseの糖鎖部分が未修飾のまま回収できることが判明したが、この糖鎖は膜挿入活性、膜タンパク質との相互作用能のどちらも喪失していた。そのため、MPIaseをピロリン酸フォスファターゼで消化し、脂質部分を除去したPP-MPIaseを調製したところ、膜挿入活性、膜タンパク質との相互作用能のどちらも保持されていた。これまでの研究では、放射能標識した微量の膜タンパク質を基質として用いていた。そのため、PP-MPIaseが化学量の基質膜タンパク質に対応できるかどうか不明であった。そこで、従来から使用してきた膜タンパク質(3L-Pf3 coatタンパク質)を過剰生産し、均一にまで精製した。この精製3L-Pf3 coatとPP-MPIaseは可溶性複合体を形成することが明らかとなった。さらに、この3L-Pf3 coatは効率よく膜挿入することも明らかとなった。さらにPP-MPIaseの改良が必要であるものの、PP-MPIaseはmg/ml程度の濃度の膜タンパク質を可溶化できることが明らかとなり、膜タンパク質可溶化剤として有効であることが判明した。生化学当初、MPIaseのリン酸基は膜タンパク質との相互作用や膜挿入活性にはあまり重要ではないことを示唆する結果が得られていたため酢酸処理したAcOH-MPIaseを出発材料として研究を進めたが、AcOH-MPIaseは全く活性がなく、また膜タンパク質との相互作用が観察されなくなることが判明した。リン酸基が相互作用や活性に重要であるという知見は非常に重要な発見ではあるが、膜タンパク質可溶化剤の開発という観点からは一歩後退であるため「おおむね順調に進展している」という評価とした。MPIaseのリン酸基を欠くAcOH-MPIaseは調製が容易ではあるが膜タンパク質との相互作用が観察されなくなるため、酵素処理により得られたPP-MPIaseを材料としてMPIaseの化学修飾を進める予定である。また、MPIase生合成に係わる因子もいくつか同定できたので、これらの枯渇株も用いて変異型MPIaseを調製し、膜タンパク質可溶化剤として用いられるかどうか検討する。研究補助員の雇用開始が遅れ、8月になってしまったため。変異型MPIaseの条件検討数を増加させるための材料費に充てる。
有理型函数論の応用による複素函数方程式の研究

複素平面上で有理型函数を解に持つ函数方程式の研究を行った。差分Riccati方程式と線形2階同次差分方程式との関係を明確にし,差分方程式の有理型函数解の存在定理,解の増大度などを調べた。また,函数方程式を取り扱う道具として,位数の小さい有理型函数の性質を調べた。Valiron-Mokhon'koの定理を超越整函数への拡張し,Schroder方程式に応用した。線形q-差分方程式の解の存在を判定するために,テーラー展開の係数と対数位数の関係について考察した。複素平面上で有理型函数を解に持つ函数方程式の研究を行いました。取り扱う数学的道具としては,Nevanlinna理論に代表される有理型函数論を用いました。今年度,進展のありました研究内容は,Riccati差分方程式とSchroeder函数方程式についてです。それぞれを以下に述べることにします。複素平面上での常微分方程式の研究は,既にかなりの研究成果がありますが,非線形で代数的なものはRiccati微分方程式に集約され,線形微分方程式は2階線形方程式に集約されます。差分方程式に関しては,Painlev'e方程式の類似など発展的なものはありますが,基礎的なものは整理されていない状態でした。本研究では,Riccati差分方程式と線形2階差分方程式に対象を絞り,微分方程式の結果と対比させながら両者の関係を明らかにしていきました。複素力学系で登場するSchroeder函数方程式の研究を本研究の中でも引き続き行いました。Schroeder函数方程式の定義方程式が位数の小さい超越整函数の場合の増大度や取り扱う道具としてのValiron-Mokhonk'oの定理の拡張などの成果をまとめることができました。特に,増大についての評価は,除外区間を含まない形で表現することができましたので増大の正規性についても研究する動機付けになります。22年度に引き続いて,複素平面上で有理型函数を解に持つ函数方程式の研究を行いました。複素微分方程式論で成立する線形方程式とRiccati方程式の関係について,更なる研究を進めました。また,線形q-差分方程式の解の存在を示すための道具として,位数の低い有理型函数の増大度とテーラー展開の係数との関係について調べました。2階同次線形差分方程式の一般解を求める方法に,差分Riccati方程式の解を利用する方法があります。微分Riccati方程式の場合は,1つの有理型解がわかったとしても他の解を有理型の範囲で記述できるとは限りません。しかしながら,差分Riccati方程式の場合には,1つの有理型解を利用して,周期函数を係数とする属を構成することができます。22年度では,係数として有理関数を主に取り扱いましたが,今年度は,超越的有理型函数の場合も含め取り扱いました。線形q差分方程式の超越的有理型解は,増大の位数が零であることが知られています。古典的な結果として,増大の位数が正の場合については,整函数のテーラー展開の係数で記述される極限値と位数との関係式があることが知られています。今年度の成果として,位数が零の整函数に対しても,対数位数とテーラー展開の係数で記述される極限値との間に関係式があることを示しました。審査中の論文の中では,線形q差分方程式の超越的有理型解の取り扱いを一つの例に挙げてとりまとめをしました。また,位数零の整函数の型(type)についても,対数型とテーラー展開の係数との間に関係式があること示しました。平成22年度, 23年度に引き続いて,函数方程式を複素平面上で取り扱いました。差分Riccati方程式と線形2階同次差分方程式との関係についての研究を更に進めました。この関係は複素微分方程式におけるRiccati方程式と線形2階同次微分方程式との関係に対応するもので,複素平面上での有理型函数解の存在定理,解の増大度などを調べるために重要なものです。今年度は,特に2階同次差分方程式の解を構成し,上述の関係を用いて差分Riccati方程式の超越的有理型函数解の構成をしましたので以下に報告します。差分方程式の場合は,ある有理型函数解が見つかると,微分方程式の積分定数の対応する周期函数を利用して,増大の位数が任意に大きな有理型函数解を構成することが可能です。そこで研究の対象は,増大の位数が小さな超越的有理型函数解の存在に絞られます。Γー函数の応用から差分Riccati方程式において,増大の位数が1の超越的有理型函数解の存在は知られていましたが,増大の位数が1未満の超越的有理型函数解の存在については取り扱われていませんでした。

冒頭に述べた性質と線形同次差分方程式の整函数解と係数の次数の関係から,差分Riccati方程式において増大の位数が1未満の超越的有理型函数解が存在するとすれば増大の位数は1/2であることが予測されます。今年度の研究において,線形2階同次差分方程式に柳原の方法を適用することで,整函数解を構成し,差分Riccati方程式において増大の位数が1/2の超越的有理型函数解が存在することは可能であることを示しました。平成24年度は最終年度でもあり,これらの成果を,函数論シンポジュウムや国際集会において報告いたしました。複素微分方程式論において成立する性質の差分作用素の対応部分についての研究と,位数の小さい超越的整函数の値分布論的性質の研究に関して,併せて3本の学術論文にまとめるなどの作業が完了しています。値分布理論で現れる除外区間についての評価と複素力学系への応用の部分に課題が残されています。24年度が最終年度であるため、記入しない。位数の小さい超越整函数の評価式における除外区間の扱いと,複素力学系への応用については,国内外の研究協力者に助言をいただくなどの措置をとる予定であります。また,Gamma函数などの函数方程式(差分方程式)を満たす特殊函数の複素力学系的性質については,Mathematicaなどの数式演算ソフトによって,力学系の振る舞いを可視化するなどの考察を行いたいと考えています。
ヒトＡＢＣＣ１１発現マウスを用いた腋臭症の病態生理学的要因の解明と創薬アプローチ

本研究は、「人類のアポクリン腺関連形質決定因子: ABCC11のin vivoにおける生理的機能解析を軸に、アポクリン腺分泌機構の制御を担う分子システムを統合的に解明することを目的とし、アポクリン腺関連形質疾患:腋臭症の治療薬探索に応用することを目指す研究」である。平成26年度は、主に以下の項目に取り組んだ。●ABCC11発現マウスの解析:平成25年度までの研究で得られたABCC11発現マウスの解析を進めた。ABCC11タンパク質の組織内局在を検証するために、ABCC11発現マウスから摘出した各種組織の凍結切片を用いて、免疫組織化学法による検討を行った。その結果、特に乳腺、凝固線の管腔側頂端膜においてABCC11の発現が確認された。これまでの結果と合わせて考えると、ABCC11がapical側に局在することが確かめられた。野生型マウスとABCC11発現マウスとにおけるメタボローム差異解析の結果、両者の間で変動があるピークを見出すことができた。ただし、構造同定には至らなかった。候補物質の標品入手について、有機合成を視野に入れながら、今後も検討を続けていく予定である。●ABCC11阻害剤の探索: ABCC11発現膜ベシクルを用いて、[3H]dehydroepiandrosterone-sulfate(DHEAS)を基質とする輸送活性測定系を構築した。反応時間を10分間に定め、試験化合物(最終濃度10 μM)の存在がABCC11によるDHEAS輸送に与える影響を評価することで、試験化合物による阻害率を求めた。現在、輸送活性を低下させる物質を探索している。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、「人類のアポクリン腺関連形質決定因子:ABcc11のin vivoにおける生理的機能解析を軸に、アポクリン腺分泌機構の制御を担う分子システムを統合的に解明することを目的とし、アポクリン腺関連形質疾患:腋臭症(わきが)の治療薬探索に応用することを目指す研究」である。生体内におけるABCC11の生理的機能を解析するために、ヒトABCC11を全身で発現するトランスジェニックマウスの作出を行った。まず、ヒトABCC11 cDNAを過剰発現用CAGプロモーター下流に組込み、発現用ベクターとした。構築した発現ベクターを用いて、マイクロインジェクション法によるABCC11発現マウス(C57BL/6系統)の作出を行い、合計6匹のFOマウスを得た。ジャームライントランスミッションの成否を確認するために、各FOマウスを野生型マウスと交配し、得られたF1マウスより抽出したゲノムを鋳型としたPCRを行うことで遺伝子型を判定した。その結果、ABCC11発現F1マウスを3系統得ることに成功した。現在、解析に必要な個体数を確保するため、各F1マウスの飼育および繁殖を進めているところである。ABCC11発現マウスが得られたことから、以後の研究計画が順調に進展すると期待される。なお、天然のABCC11欠損動物であるマウスにおいて、成熟した糖タンパク質としてABCC11が発現することは、アデノウイルスを介した一過性トランスジェニックマウスを作出することで、事前に確認した。詳細は次のとおりである。まず、ABCC11過剰発現用アデノウイルスを作製し、当該アデノウイルスを感染させたマウス肝臓癌由来Hepa1.6細胞において成熟型ABCC11タンパク質が発現することを確認した。次いで、このアデノウイルスをC57BL/6マウスに投与し、投与3日後に回収した肝臓の破砕液を用いてウエスタンブロッティングを行った。その結果、成熟型ABCC11タンパク質の発現を確認することに成功した。本研究は、「人類のアポクリン腺関連形質決定因子: ABCC11のin vivoにおける生理的機能解析を軸に、アポクリン腺分泌機構の制御を担う分子システムを統合的に解明することを目的とし、アポクリン関連形質疾患:腋臭症(わきが)の治療薬探索に応用することを目指す研究」である。平成24年度までの研究で得られたABCC11発現マウスの解析を進め、検討したほぼ全ての組織においてABCC11タンパク質を発現することを確認した。免疫組織化学法により組織内局在を検証したところ、肝臓において胆管側膜に局在することが示された。ABCC11の生理的基質を探索する目的で、ABCC11発現マウスならびに野生型マウスの血清成分を対象としたメタボローム差異解析を行ったところ、複数の変動因子を見出すことに成功した。特に、ABCC11発現マウス群にて有意に変動する物質X(MZ 268.1041)に着目し、その構造同定に取り組んでいる。ABCC11のin vitro機能評価系としては、ABCC11発現用アデノウイルスを感染させた哺乳類細胞より調製した形質膜ベシクルを用いることで、放射ラベル体([3H] E1S)の取り込みを指標とする輸送能評価系を構築することに成功した。これらを応用することで、ABCC11の生理的機能解析ならびに機能阻害剤の探索が進展し、本研究目的の達成に貢献するものと期待される。また臨床検体を用いて、ヒト腋窩アポクリン腺組織におけるABCC11タンパク質の発現を検証したところ、野生型アレル(538G)を有する患者由来の試料にて成熟型ABCC11タンパク質の発現が確認された。

以上の結果は、ヒト腋窩アポクリン腺における成熟型ABCC11の存在を初めて示したという点で重要であり、これまでの我々の実験データと合致し、ABCC11の機能が腋臭症をもたらすという我々の仮説を支持するものである。本研究は、「人類のアポクリン腺関連形質決定因子: ABCC11のin vivoにおける生理的機能解析を軸に、アポクリン腺分泌機構の制御を担う分子システムを統合的に解明することを目的とし、アポクリン腺関連形質疾患:腋臭症の治療薬探索に応用することを目指す研究」である。平成26年度は、主に以下の項目に取り組んだ。●ABCC11発現マウスの解析:平成25年度までの研究で得られたABCC11発現マウスの解析を進めた。ABCC11タンパク質の組織内局在を検証するために、ABCC11発現マウスから摘出した各種組織の凍結切片を用いて、免疫組織化学法による検討を行った。その結果、特に乳腺、凝固線の管腔側頂端膜においてABCC11の発現が確認された。これまでの結果と合わせて考えると、ABCC11がapical側に局在することが確かめられた。野生型マウスとABCC11発現マウスとにおけるメタボローム差異解析の結果、両者の間で変動があるピークを見出すことができた。ただし、構造同定には至らなかった。候補物質の標品入手について、有機合成を視野に入れながら、今後も検討を続けていく予定である。●ABCC11阻害剤の探索: ABCC11発現膜ベシクルを用いて、[3H]dehydroepiandrosterone-sulfate(DHEAS)を基質とする輸送活性測定系を構築した。反応時間を10分間に定め、試験化合物(最終濃度10 μM)の存在がABCC11によるDHEAS輸送に与える影響を評価することで、試験化合物による阻害率を求めた。現在、輸送活性を低下させる物質を探索している。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究計画を進める上で、最も重要な項目の一つであるABCC11発現マウスの作出が順調に進展している。マイクロインジェクション法の採用により、C57BL/6マウス系統においてトランスジェニックマウスを作出することに成功したため、今後の戻し交配を省略することが可能であり、次年度以降の研究計画が速やかに実行されると期待される。また、in vitroでのABCC11過剰発現に必要なアデノウイルスの作出にも成功しており、ABCC11発現マウスの解析により見出された基質候補化合物のin vitro評価に対する不安はない。本研究計画を進める上で、最も重要であるABCC11発現マウスの作出に成功した。所属研究室が保有するUPLC-MSIMSを用いたメタボローム差異解析の立ち上げにも成功し、生理的基質候補物質が複数見出されてきている。ABCC11は物質の膜輸送を担うトランスポーター分子であるため、ABCC11の生理的機能解析において、その生理的基質の同定が極めて重要である。今年度までの研究において、上述の目的を達成するための基盤を構築することに成功し、かつ臨床検体の解析による裏付けが進んでいる。したがって、現在までの達成度を「おおむね順調に発展している」と判断した。
アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いたオピオイド受容体の脱感作機構の解析

本研究者は既に、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いてクローン化されたオピオイドδ受容体と外来のGTP結合蛋白質(G-蛋白)αサブユニットを同時に発現させた、いわゆる「機能的受容体-G-蛋白再構成モデル」を作成し、NG108-15細胞由来のオピオイドδ受容体(DOR-1)がGi-蛋白(Gilα)と共役してホスホリパーゼC活性化にともなうCa^<2+>依存性Cl-電流(Icl^-(Ca^<2+>))を誘発することを報告した(Miyamae T et al. 1993,FEBS Lett.333,311-314)。本年度はこのモデル系を用いてオピオイドδ受容体応答の脱感受性機構の解析を進めた。その結果、(1)同受容体応答は、高濃度(μMオーダー)のアゴニストの頻回適用によってアゴニスト依存性の脱感受性反応を生じること、(2)この脱感受性反応はcalphostin CなどのプロテインキナーゼC(PKC)阻害薬やPKC阻害ペプチドによって特異的に抑制されること、一方cAMP依存性キナーゼ(PKA)、チロシンキナーゼ、及びカルモジュリン依存性キナーゼ(CaMKII)などに特異的な阻害薬ないし阻害ペプチドは無作用であること、(3)PKC阻害薬或いは阻害ペプチドは、G-蛋白を直接活性化する作用を持つAlF_4-の適用によって惹起されるIcl^-(Ca^<2+>)に対し無作用であること、などの知見が集積された。これらの結果から、オピオイドδ受容体応答のアゴニスト依存性の脱感受性反応は、受容体以後ではなく受容体自身がPKCによってリン酸化されることにより生じることが強く示唆された(Ueda H,Miyamae T et al. 1994,Regulatory Peptides 54,305-306)。従って本年度は、同受容体のシグナル伝達制御機構解明への端緒とも言うべき重要な一知見を得ることができた。
超高圧下超音波測定で切り拓く量子軌道液体状態の低エネルギー励起の解明

本申請課題で目指しているダイヤモンドアンビル(DAC)を用いた超高圧下超音波測定の開発にあたり、業者との打ち合わせ、話し合いを進めていく中で、予想以上に開発設計の時間が要することとなり初年度の物品購入が極めて難しい状況になった。次年度(本年度)引き続き業者との打ち合わせを通じてデザイン、設計を細部まで詰めて、装置を製作予定である。こうした状況から、初年度は業者との装置設計、デザインの話し合いに留まっている。これまで経験したことのない超高圧領域下での超音波測定用圧力セルを製作予定であるため、業者と綿密に話し合い、議論の場をもち、その製作を進めている。細部まで議論を詰めた状態での設計が必要不可欠である。上記理由により、研究の進捗状況は極めて遅延している状態にある。昨年度実施した業者との超高圧セル設計、デザインをもとにして、本年度前半に圧力セルを完成させ、本セルを研究室既存の実験装置に取り付け、実験を遂行する。特にR2T2O7系の幾何学フラストレーションを有するα-パイロクロア化合物を中心にして予備実験を試み、高圧セルの試験運転、さらにはキャリブレーションを実施する予定である。
行政経営のための経営情報及び教育・学習システムの構築－上水道事業を対象として－

まず,公企業である上水道事業の経営に於いて原価管理が重要となることを,受益者負担により料金を支払っている住民の観点から明らかにした.そして,その管理のツールとして原価管理支援システムのプロトタイプを初めて構築した.本システムは,机上の空論ではなく,実際の自冶体を事例としながら実際に行政で使用することを念頭に開発を行った.さらに,より安い水道料金を求める住民感情に応えるため,但単純に原価を計算するだけではなくその結果から,原価を高くしている原因を分析可能としている.そして,その改善方法まで診断できるように工夫されている,この一連の流れを日頃原価管理を行っていない職員でも行えるように工夫している.本研究では、上水道事業を対象としてまずはその業務のコスト削減→合理化→リエンジニアリングまでを支援する経営情報システムを構築することを目的としている。さらに、職員がその一連の流れの中で必要な企業会計知識を学習できるようにe-Learningシステムも合わせて開発することも目的としている。以上の目的の下、当初の計画では,高知県安芸市を事例として既に開発済みであったコスト削減支援システムを拡張する予定であった。しかし、安芸市の協力が引き続き得られない状況になった。そのため、改めて高知県の他の市町村である香美市に協力を依頼することになった。協力自体は快諾を得られたが、研究としては安芸市の成果を基にしながらも改めて香美市を事例としてコスト削減支援システムを構築し直すことになった。そのためには、同じ上水道事業といえども各業務を構成している活動の内容は異なるため、その詳細なインタビュー調査から改めて行う必要があった。さらに、活動毎に生じている労働時間や費用も異なるためそれらの調査も必要となった。以上のような予備調査を終了し、現在は安芸市モデルのシステムの活動等のデータを香美市モデルのデータに置換する準備が整ったことが大きな1つの実績である。さらに、上述のインタビュー調査に於いて上水道事業は典型的な装置業務であることが判明した。よって,これらの装置のリプレイス案を戦略的に立案することが研究計画の次のステップである合理化及びリエンジニアリングに繋がることが明らかになった.この合理化及びリエンジニアリングの位置付けを具体的な事例の中で明確にしたことも本年度の大きな実績の1つである。香美市上水道事業を対象として聞き取り調査及びデータ整理を行い,PC上にその事業モデルを構築できた.その結果,当該事業を構成しており日々実際に行われている任意の活動に関して原価を自在に計算可能となった.しかも,ただ単に原価を計算するだけではなく,事業全体で見た時になぜ原価が高くなっているかその問題となる活動の分析・特定もユーザインターフェイスを工夫しユーザとシステムを協調させることで可能となっている.さらに,その問題となる活動の原価がなぜ高くなっているその原因も費用的に分析可能となっている.分析後は,定量的な検討には止まってはいるがその改善案の検討も可能となっている.つまり,本研究の目的である行政経営の実現に向けて真に必要となる原価計算→業務分析→改善案提言の一連の流れをシステムとして実現できている.しかし,以上は,あくまでも研究室レベルに過ぎない.そこで,実際に当該事業の課長及び担当者にシステムを実行してレビューをして頂いた.その結果,両者より非常に高評価を頂いた.特に,当該事業は今後赤字事業である簡易水道事業との統合を控えている状況にある.そのため,今後はその統合に本システムを積極的に活用していくこととなった.つまり,事業として構造的に改善が期待できない簡易水道事業との統合であるため,上水道事業を積極的に改善していくことが事業経営の要となる.そのため,本システムを統合に向け機能を充実・拡張させることを目指して相互に協力していくこととなった.この統合は,香美市だけではなく他の自冶体でも行われていることからも今後その傾向が強くなることが予測される.よって,本研究の成果のインパクトは大きなものになることが期待できる.昨年度開発した本研究の原価管理支援システムによる分析から,対象事例では施設の維持管理が原価的に最大の問題であることが判明した.そこで,上水道事業の先進事例として全国的にも有名な広島県を調査訪問を行った.その結果,広島県でも同様に施設の維持管理が原価的に大きな問題となっていることが分かった.しかし,その対策としてそのシステム化までは至っていない現状であった.その結果を受け,さらに広く先行研究を調査した.しかし,維持・修理履歴の単なるデータベース化や施設の点検に着目し,複数の施設をどのような順番で回ればその巡回コストを抑えることができるか等の研究のみであった.上水道事業に於ける施設維持管理のシステム化に関する研究は行われていない状況であった.そこで,本研究では,本年度は対象事例に於ける施設維持管理に関する意思決定支機能の開発を目的とした.具体的には,当該事例に於ける過去の故障や修理履歴データを分析し当該機能の概念設計までを行った.それらの成果を対象事例に於いて発表を行ったところ,対処事例に於いてもそのシステム化が重要な課題であるとの認識を持っており,本研究で設計を行った支援機能は日頃の業務に於いてまさに必要としているものであるとの評価を頂いた.よって,本機能のコンピュータ・システムとしての実現に是非とも協力をしたいとのことであった.

また,さらに対象事例に於ける来年度経営計画の中核に本原価管理支援システムを据えたいとの評価も頂いた.本研究の特徴は,その目的より現実の事例を対象としている点にある.しかし,その進捗も事例に依存する部分が多々ある.以前報告したように,著者等の先行研究で協力を頂いていた事例に引き続き協力をして頂く計画であったが,協力を頂けなくなった.それに伴い計画を変更し他の事例を対象として研究をスタートした.この点により,まずは遅れが生じた.この遅れを取り返すために本年度は研究を行う学生も2名に増員して臨んだ.上述の研究実績で説明したように,本年度の研究には関連事例の調査が必要不可欠であった.しかし,その事例との日程調整だけに2,3ヶ月要する等不測の事態が起こり遅れの挽回に手間取ったためである.実績の1つとしては,昨年度までに構築した上水道事業を対象とした原価マネジメント支援システムを対象事例として協力頂いている香美市水道課で適用するための準備・整備を行った.具体的には,システムのバグ修正及び上水道設備の維持管理支援機能の追加構築である.その進捗状況は,担当者が早々に鬱病を再発する等により遅れてはいる.そして,もう1つの実績としては,これまでの研究成果を世に問うたことである.その1つとしは,2016年12月3日に「公企業経営と原価マネジメントー香美市上水道事業を事例としてー」と題して九州経済学会にて発表を行った.その際,否定的な質問やコメントはなく研究を評価して頂いた.さらに評価を問うために,論文として纏め本学会に2017年2月に投稿済みである.現在は査読審査中である.また,本研究は「行政組織に情報技術を適用する」というMOT(Management of Technology)の観点も備えている.この観点で捉えた場合,管理システムとして先行する企業組織の例を参考にシステム化にアプローチすることが一般的である.しかし,本研究を通してそのシステム開発プロセスを詳細に追うと,そのようなアプローチが採れないことが明らかになった.その原因は本研究事例個別のものではなく,企業組織と行政組織との特性の違いに起因するものであった.つまり,一般性があるものである.この点は,行政経営を実現するためには,情報システムが不可欠であることから考えると,非常に重要な点である.しかし,従来研究ではこの点には言及しておらず,新たな研究一面であると我々は考えている.よって,この点を論文として整理して現在MOT学会で査読審査を受けている所である.まず,公企業である上水道事業の経営に於いて原価管理が重要となることを,受益者負担により料金を支払っている住民の観点から明らかにした.そして,その管理のツールとして原価管理支援システムのプロトタイプを初めて構築した.本システムは,机上の空論ではなく,実際の自冶体を事例としながら実際に行政で使用することを念頭に開発を行った.さらに,より安い水道料金を求める住民感情に応えるため,但単純に原価を計算するだけではなくその結果から,原価を高くしている原因を分析可能としている.そして,その改善方法まで診断できるように工夫されている,この一連の流れを日頃原価管理を行っていない職員でも行えるように工夫している.本研究は事例に入っていき実務を踏まえて行うことに価値がある.そのため,自冶体の協力が進捗に大きな影響を及ぼす.
医療を必要とする子どもの災害に備える力を高めるための支援ツール開発

本研究は、医療を必要とする子どもが、災害時に自分たちの健康維持・管理ができるための力を高める看護支援ツールを開発することを目的としている。ツールは、子どもに対して看護師が通常実施しているヘルスケアに加え、災害時の体調の維持・管理について子どもの力を高めるためのものである。H30年度は、29年度に開発したツール1支援内容;災害に備え子どもに必要な8つの力を高めるための支援内容を示す、2個別支援シート(支援者用)および3個別支援シート(子ども用);病名や薬・必要なケアなどを含む「体のこと」、移動方法や日常生活での注意点などを含む「生活のこと」、避難場所はいざというときに利用できる施設の連絡先などの「災害のときに大切なこと」について、看護師と子どもで確認しながら作成し、看護師と子ども、さらに保護者も保管しておくもの、4手引書;本ツールのねらい、使用方法、支援内容の具体例などを記したもの、について、医療を必要とする子どもを看護する看護師にツールの内容の妥当性、こどもの看護への適用性と課題について聞き取り調査し、修正のための意見を聴取した。修正について、研究者会議にて検討し、ツールそのものの形態について、より見やすい、活用しやすい構成に変更すること。また、こどもに導入する際の手順のわかりにくさについて、手引書に具体的な導入方法を記載することとした。さらに、医療を必要とする子どもの災害に備える力の評価のための評価表を追加で作成することした。上記の研究成果について、国際関連学会において1演題発表を行った。当初の計画では、H30年度は作成したツールを用いて、介入研究を行う計画であったが、介入前に、作成したツールに対する看護師の聞き取り調査を追加したこと、さらに研究者の所属機関の移動に伴い、研究環境が整うまでに時間を要し、計画が遅れてしまった。そのため、1年間の研究期間延長を申請し、令和元年度に介入研究及びツールの評価・完成をする計画に修正を行った。令和元年度は、ツールに対する看護師の意見聴取に基づいて修正を行ったツールを用いて、医療を必要とする子どもを看護する看護師に本ツールを導入してもらう介入研究を実施し、その効果を看護師への面接調査から検証し、ツールを完成する。介入については、2府県の医療機関にて行い、外来看護師、病棟看護師の両者に介入してもらい、検証を進める。開発したツールについて、国内外の学会にて演題発表を行う予定である。本研究は、医療を必要とする子どもが、災害時に自分たちの健康維持・管理ができるための力を高める看護支援ツールを開発することを目的として実施した。平成28年度は、医療を必要とする子どもが災害に備える力を高めることに関する半構成面接を2府県で実施した。協力者は、看護師13名(外来看護師6名、病棟看護師7名)、保護者5名、本人4名であった。看護師には、子どもが災害に備えるための関わりの実態や必要性、看護師の役割について聞き取りを行い、保護者と子どもには、子どもに関する身体状況の理解、過去の被災の有無と被災状況、現在の災害への備え、こども自身が災害に備える力をつけることに対する認識と方法について聞き取りを実施した。平成28年度は、関連研究・文献調査とツール開発のための面接の実施を計画していた。予定していた文献検索、面接実施について、ほぼ計画通り順調に進行している。H29年度は、昨年度の面接内容を質的に分析し、「災害に備え子どもに必要な力」を8つ抽出した。さらに、全6回の会議を開催し、支援ツールの開発を行った。開発したツールは、1支援内容、2個別支援シート(支援者用)、3個別支援シート(子ども用)、4手引書から構成される。支援内容は、災害に備え子どもに必要な8つの力を高めるための支援内容を示している。個別支援シートは、病名や薬・必要なケアなどを含む「体のこと」、移動方法や日常生活での注意点などを含む「生活のこと」、避難場所はいざというときに利用できる施設の連絡先などの「災害のときに大切なこと」について、看護師と子どもで確認しながら作成し、看護師と子ども、さらに保護者も保管しておけるよう支援者用と子ども用2種類作成した。手引書は、本ツールのねらい、使用方法、支援内容の具体例などを記したものであり、看護師がツールを活用する際のガイドとなるものである。上記の研究成果について、国内の関連学会において1演題発表を行った。当初の計画では、29年度はツールを完成し、30年度にツールを用いた介入研究を実施する計画であったが、29年度の計画に、ツールの完成度を高めるために、ツールに対する看護師の意見聴取を追加したことにより、当初の研究計画よりやや遅れている。29年度3月時点で、協力者との日程調整中であり、意見聴取は4月以降に実施予定である。

H30年度は、29年度に開発したツール1支援内容;災害に備え子どもに必要な8つの力を高めるための支援内容を示す、2個別支援シート(支援者用)および3個別支援シート(子ども用);病名や薬・必要なケアなどを含む「体のこと」、移動方法や日常生活での注意点などを含む「生活のこと」、避難場所はいざというときに利用できる施設の連絡先などの「災害のときに大切なこと」について、看護師と子どもで確認しながら作成し、看護師と子ども、さらに保護者も保管しておくもの、4手引書;本ツールのねらい、使用方法、支援内容の具体例などを記したもの、について、医療を必要とする子どもを看護する看護師にツールの内容の妥当性、こどもの看護への適用性と課題について聞き取り調査し、修正のための意見を聴取した。修正について、研究者会議にて検討し、ツールそのものの形態について、より見やすい、活用しやすい構成に変更すること。また、こどもに導入する際の手順のわかりにくさについて、手引書に具体的な導入方法を記載することとした。さらに、医療を必要とする子どもの災害に備える力の評価のための評価表を追加で作成することした。上記の研究成果について、国際関連学会において1演題発表を行った。当初の計画では、H30年度は作成したツールを用いて、介入研究を行う計画であったが、介入前に、作成したツールに対する看護師の聞き取り調査を追加したこと、さらに研究者の所属機関の移動に伴い、研究環境が整うまでに時間を要し、計画が遅れてしまった。そのため、1年間の研究期間延長を申請し、令和元年度に介入研究及びツールの評価・完成をする計画に修正を行った。平成29年度は、平成28年度の面接結果の分析を行い、医療施設における子ども自身への災害への備えの支援状況を知り、災害の視点での医療を必要とする子どもの健康維持・管理に必要な力を抽出。さらにその力を高めるための支援内容を抽出し、支援ツールの開発を行う。平成29年度は、分析のための全体会議を2回実施する予定である。平成30年度は、開発したツールを医療機関で導入し、ツールの評価のために、看護師、医療を必要とする子ども、保護者に面接調査を実施する。また、面接結果、開発したツールを国内外の学会にて発表予定である。H30年度は、ツールに対する看護師の意見聴取を早急に行い、その意見をもとにツールを完成させる。完成したツールを、2府県3医療機関の小児外来及び小児病棟において、看護師に使用してもらい、その効果を調査票及び面接調査にて検証する。介入の開始時期が遅れた場合には、研究期間の1年延長も視野に研究を進め、実用性の高いツールを完成する。開発したツールについて、国内外の学会にて演題発表を行う予定である。令和元年度は、ツールに対する看護師の意見聴取に基づいて修正を行ったツールを用いて、医療を必要とする子どもを看護する看護師に本ツールを導入してもらう介入研究を実施し、その効果を看護師への面接調査から検証し、ツールを完成する。介入については、2府県の医療機関にて行い、外来看護師、病棟看護師の両者に介入してもらい、検証を進める。
相対論プラズマ中での多段階イオン加速による準単色陽子加速の物理とその実証

レーザーイオン加速研究では、粒子線がん治療への応用を念頭に据え、250 MeVのエネルギーを有する準単色陽子線の発生技術開発が1つのマイルストーンとなっている。我々は、マイクロメートルサイズの“球形"固体水素(=マイクロ水素クラスター)を生成させる独自技術を確立し、このマイクロ水素クラスターにレーザー照射して生成する相対論プラズマ中での多段階加速により、約300 MeVの準単色・高指向性の陽子線を発生させる新たな手法を計算機シミュレーションにより発見した。本研究では、多段階加速に関わる物理を実験とシミュレーションにより明らかにし、準単色300 MeV陽子線加速の実証を目指す。固体水素であるマイクロ水素クラスターに高エネルギーレーザーを照射し、それにより相対論的プラズマを生成し、(1)衝撃波駆動の単色イオン加速、(2)長時間継続するクラスターのクーロン爆発電場による加速、の2段階加速により300MeVの高エネルギー準単色陽子線を発生させるための、理論・実験研究提案である。2段階加速の物理メカニズムの解明と実証を目的としている。レーザー照射生成による相対論プラズマ中での多段階イオン加速のメカニズム解明という学術的意義を有している。粒子線がん治療への応用を念頭に据え、250 MeVの準単色陽子線発生技術の開発が1つのマイルストーンとなっているが、本研究による加速機構の解明とともに、技術開発の進捗も期待される。粒子線がん治療の高度化によって、より広い学術、科学技術あるいは社会への波及効果が期待できる。
培養歯髄細胞におけるオピオイドペプチドの産生機序に関する研究

本研究は歯髄細胞におけるエンケファリン(EK)の産生の機序、とくにブラジキニン(BK)によるEK産生促進の機序を細胞レベルあるいは細胞下レベルで薬理生化学的に追求することを目的として実施された。本研究では先ず細胞下レベルでの実験では、(1)ラット切歯歯髄組織のホモジネ-トより得られた細胞下画分のうち、ライソソ-ム画分にEK産生酵素活性が局在すること、(2)マイクロソ-ム画分および上清画分にEK前駆体タンパクが局在することが見い出された。次いで(3)ライソソ-ム画分よりEK産生酵素の単離精製が行われ、本酵素がシステインプロテア-ゼのカテプシンB(分子量23,600)であること、また、(4)マイクロソ-ム画分および上清画分よりEK前駆体タンパクが単離精製され、共通のタンパク質(分子量58,000)が歯髄のEKの主たる前駆体タンパクであることが見いだされた。(5)このカテプシンBは精製した状態ではBKによって活性化されないが、ライソソ-ム構造を保持した状態ではBKによって活性化される。さらに細胞レベルでの検討ではラット切歯歯髄組織より線維芽細胞を容易に培養することができた。(6)本細胞は、免疫細胞化学的に、また免疫化学的にEKおよびEK前駆体タンパクを含有していることが証明された。(7)本細胞にBKおよびそのカルボキシペプチダ-ゼBによる分解産物desーArg^9ーBKならびにArgを作用させるとカテプシンB活性が上昇し、EKが産生されることが証明された。(8)これらの活性化物質の作用は細胞内外のCa^<2+>に依存していた。各種酵素阻害剤を用いた実験により、(9)BKとdesーArg^9ーBKはB_1受容体を介し、Gータンパクとカップリングしてホスフォリパ-ゼCを活性化し、細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させるとともに各種タンパク燐酸化酵素を活性化することによって、また(10)Argは細胞内に入ってキョ-トルフィンとなりその受容体を介し、あるいはNOとなってGーキナ-ゼを介し、最終的にカテプシンBを活性化すると考えられた。本研究の平成元年度における研究目的は、1)エンケファリン(EK)含有歯髄細胞を分離、培養して、その細胞よりEK前駆体タンパクおよびEK産生酵素を部分精製すること、2)部分精製されたEK前駆体タンパクに、部分精製された産生酵素を作用させてEKが産生することを確かめること、3)(2)の系に対するブラジキニン(BK)のEK産生促進作用の有無を検討すること、であった。以下、交付申請書に記載した研究実施計画に沿ってその実績を述べる。本研究補助金により購入した設備備品を用いて順調に歯髄細胞を培養し、観察し得た。培養された細胞は線維芽細胞であることが形態学的特徴から判断された。免疫細胞化学的検討の結果、この細胞はEKならびにその前駆体タンパクを含むことが確かめられた。

この線維芽細胞のEKはBKのアナログ、des-Arg9-BKあるいはシステインを細胞に作用させることによって、その産生が増大することが免疫生化学的方法によって確かめられた。歯髄細胞の大量培養は技術的に困難であったので、歯髄組織のホモジネ-トを分別遠心分離して細胞下分画を行った。ライソソ-ム画分の可溶性成分をゲルろ過して、各溶出画分のBANA分解活性を検索し、1つのピ-ク画分を得た。これは分子量約23,600に相当した。ライソソ-ム画分の膜および可溶性成分それぞれ単独、あるいはそれらを再構成したもののBANA分解活性を測定した結果、それぞれ単独のものに比べて、再構成したものは著明なBANA分解活性を示した。マイクロソ-ム画分の可溶性成分および上清画分をゲルろ過にかけ、各溶出画分をトリプシンおよびカルボキシペプチダ-ゼBにて連続消化して後、ラジオイムノアッセイした。マイクロソ-ム可溶性画分および上清画分の両者に共通のEK前駆体タンパクピ-ク画分が見いだされた。これは分子量約58,000に相当した。BANA分解活性ピ-ク画分と前駆体ピ-ク画分とをシステイン存在下でインキュベ-トすると著明にEKが産生された。本研究の平成2年度における研究目的は、1)エンケファリンの前駆体タンパクおよびその産生酵素を単離精製し、同定すること、2)エンケファリン産生のプロセス、とくにエンケファリン産生酵素のブラジキニンによる歯髄線維芽細胞レベルでの活性化の機序を確かめることであった。以下、交付申請書に記載した研究実施計画に沿ってその実績を述べる。1)については、エンケファリン前駆体タンパクは分子量58,000の共通の画分が歯髄ホモジネ-ト,マイクロソ-ムおよび上清画分に見出され、これは各種クロマトグラフィ-および電気泳動実験により、1つのタンパク帯として検出された。このタンパクはマイクロソ-ム画分に主として分布していた。エンケファリン産生酵素はライソソ-ム画分中にあり、各種クロマトグラフィ-および電気泳動ならびに阻害実験により、分子量約23,600のカテプシンBであると同定された。2)については、歯髄線維芽細胞にブラジキニン、desーArg^<9ー>ブラジキニンあるいはアルギニンを作用させると、カテプシンBが活性化され、エンケファリンが産生されることが確かめられた。このカテプシンBの活性化は細胞内カルシウムに依存していた。ブラジキニンおよびdesーArg^<9ー>ブラジキニンのカテプシンB活性化作用は、百日咳毒素およびネオマイシンB、Hー7、Wー7、Hー8、MLー7などの阻害剤によって著明に抑制され、それぞれの受容体を介してカテプシンBを活性化するものと考えられた。アルギニンのカテプシンB活性化作用は、百日咳毒素、ネオマイシンBによっては阻害されなかったが、各種プロテインキナ-ゼ阻害剤によって抑制され、その他Dーアルギニンやロイシルアルギニンによって抑制された。これらの結果から、ブラジキニンの上記の作用は、desーArg^<9ー>ブラジキニンおよびアルギニンの作用の総合したものであるが、それぞれ異なった機序によりカテプシンBを活性化するものと考えられた。平成3年度の研究目的はラット切歯歯髄の培養線医芽細胞を用いてブラジキニン(BK)ならびにその酸素分解産物des-Arg^9-BK(B_1)およびアルギニン(Arg)のエンケファリン(EK)産生酵素カテプシンBの活性化の機序を細胞内情報伝達機構との関連において比較検討することであった。(1)先ず、百日咳毒素(IAP)の影響を検討した。
カイコ主要クチグラタンパク質の物理化学的および細胞生物学的解析

昆虫のクチクラは上皮細胞により合成分泌される細胞外層であり、主にキチンとタンパク質から構成される。本研究ではクチクラの分子構築機構解明の一つのアプローチとしてカイコ上皮タンパク質-キチンならびに細胞間の相互作用について解析を行った。1.カイコ5齢幼虫の上皮タンパク質を抽出し、イオン交換クロマトグラフィー、調製用電気泳動の各精製段階を経て、LCP30を均一タンパク質として分離精製した。また、LCP30以外の上皮タンパク質、LCP17、23、27についても同様の方法で精製を行った。2.定性的ならびに定量的タンパク質のキチン結合活性を解析する方法を確立し、各上皮タンパク質のキチン結合活性について解析を行った。LCP30とキチンの結合は、N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルキトビオースにより部分的に阻害された。また、LCP30とキチンの結合はLCP17、23および27により阻害された。以上より各LCPはキチンのN-アセチルグルコサミン残基を認識し、キチンと結合することが推察された。3.カイコ培養細胞を用いた細胞接着実験においてLCP30は顕著な細胞接着活性を示した。この接着活性には分子内のRGD配列が大きく寄与していることが判明した。また、LCP17およびLCP23にも細胞接着活性が存在することを確認した。4.大腸菌内で発現させたβ-ガラクトシダーゼ/LCP30融合タンパク質はカイコLCP30と同様キチン結合活性ならびに細胞接着活性を有することが判明した。昆虫のクチクラは上皮細胞により合成、分泌される細胞外物質層であり、主にキチンとタンパク質から構成される。カイコ幼虫の主要上皮タンパク質LCP30は、分子量約22kの塩基性タンパク質であり、その一次構造中に細胞接着部位として知られるアルギニン-グリシン-アスパラギン酸配列(RGD配列)を持つ。本研究では、クチクラの分子構築解明の一つのアプローチとして、カイコLCP30-キチン間、LCP30-細胞間の相互作用について解析を行った.1)カイコ5齢幼虫の外皮よりLCP30を抽出し、イオン交換クロマトグラフィー、調整用電気泳動法により均一タンパク質として分離精製した。また、新たに3種の上皮タンパク質も同様の方法で部分精製した。このLCP30を用い、まずLCP30とキチンとの結合について解析した。結合の至適pHは6.0で、2価陽イオンの必要性は認められない。両者の結合はN-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルキトビオースにより部分的に阻害された。以上よりLCP30はレクチン活性を持つことが判明した。また他の上皮タンパク質がLCP30とキチンの結合を阻害することも明らかになった。これらの上皮タンパク質はキチンのN-アセチルグルコサミン残基を認識している可能性が高い。2)LCP30は細胞接着活性を有しているが、この活性はRGD配列を含むオリゴペプチドにより阻害された。このことからLCP30の細胞接着活性はRGD配列に由来すると考えられる。さらに接着には2価金属陽イオンが必要であった。3)LCP30-cDNAを大腸菌beta-ガタクトシダーゼ遺伝子に連結し、これを発現ベクターに組み込み、LCP30融合タンパク質を大腸菌内で大量に合成した。この融合タンパク質もキチン結合活性および細胞接着活性を持つことが明らかになった。1.カイコ5齢幼虫の上皮より上皮タンパク質を抽出し、イオン交換クロマトグラフイ-、調製用電気泳動の各精製段階を経て、LCP30を均一タンパク質として分離精製した。

本年度はLCP30に加えて、その他の上皮タンパク質、LCP17、23、27を同様の方法で精製した。2.既に確立したタンパク質とキチン間の結合活性を定性的ならびに定量的に解析する方法を用いて、各上皮タンパク質のキチン結合活性について、さらに解析を進めた。LCP30とキチンの結合は、N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルキトビオースにより部分的に阻害された。また、LCP30とキチンの結合はLCP17、23および27により阻害された。以上より各LCPはキチンのN-アセチルグルコサミン残基を認識し、キチンと結合することが推察された。3.カイコ培養細胞を用いた細胞接着実験においてLCP30は顕著な細胞接着活性を示した。この接着活性には分子内のRGD配列が大きく寄与していることが判明した。また、LCP17およびLCP23にも細胞接着活性が存在することを確認した。さらに、予備的な実験ながら、LCP30はカイコの脂肪体細胞のprimary cultureにおいても高い細胞接着能を示した。このことは、今まで困難とされていた分化した昆虫の組織の細胞を、LCP30で培養器をコートすることにより、安定した状態で培養ができるという可能性を示唆するものである。
不活化ウイルス粒子による癌治療臨床研究を基に機能補充した多角的癌遺伝子治療の開発

我々は複製能を欠いた不活化Sendai virus (HVJ envelope ; HVJ-E)が様々な抗腫瘍作用を有することを見出している。これを用いた癌治療の臨床研究も開始された。そこでさらに抗腫瘍効果を増強するため、HVJ-Eに封入する分子を検討したところ、抗腫瘍免疫を増強できる分子としてIL-12, IL-2の有効性が見出された。IL-12遺伝子を封入する代わりに、IL-12蛋白質を表面にもつHVJ-Eはさらに強力な癌治療効果を示した。また抗がん剤(ダカルバジン)の効果を高めるためにRad51siRNAの封入が効果的であった。我々はベクターとして開発した不活性化Sendai virus粒子(HVJ-E)に多彩な抗腫瘍活性があることを見出した。本研究では、HVJ-Eの抗腫瘍効果のさらなる治療効果増強のため、HVJ-Eに搭載すべき治療分子を検討し、様々な腫瘍モデルを用いてその効果を検証して、転移や再発を抑制できる新たな遺伝子治療法の開発をめざしている。HVJ-Eの抗腫瘍活性の1つは多彩な抗腫瘍免疫の活性化であり、それは樹状細胞の成熟化と癌抗原提示によるCTLの惹起、NK細胞の活性化、および制御性T細胞(RegT)の癌組織での抑制である。その中心的な作用をするサイトカインはType I interferon(IFN), CXCL10, IL-6であることが分かった。しかしCTLの活性化作用は活性化NK細胞から分泌されるIFN-γによっており間接的である。そこでHVJ-Eに種々のサイトカイン遺伝子(GM-CSF, IFN-β, IL-2, IL-12)を封入し、さらに抗腫瘍効果を高めるための治療実験をマウス悪性グリオーマの皮内モデルで行った。IL-2, IL-12の遺伝子を封入したHVJ-Eを腫瘍内に3回投与した群では、腫瘍増殖がほぼ完全に抑制されたが、GM-CSF, IFN-β遺伝子封入群はHVJ-E単独群と比べて有意な腫瘍増殖抑制を示さなかった。IL-2, Il-12遺伝子封入群では腫瘍の完全消失率はそれぞれ70%,30%であった。そこで以降は、IL-2遺伝子封入HVJ-Eを用いたマウスグリオーマ治療実験を行った。グリオーマの脳内接種モデルを作成し、腫瘍形成がみられた時点で1回投与を行った。比較としてIL-2封入レトロウイルスベクターを用いた。IL-2遺伝子封入HVJ-Eの方が有意なマウス生存率の延長を認めた。腫瘍組織での免疫細胞浸潤を調べたところ、HVJ-E群ではレトロウイルスベクター群に比較してCD8^+リンパ球の著明な浸潤を認め、これはRT-PCRでも確認された。IL-2遺伝子はRegTの増殖も促すことが免疫遺伝子治療において問題視されてきたが、HVJ-Eに封入して用いると、レトロウイルスベクター投与群のようなRegTの浸潤増強を認めなかった。次に臨床に近いモデルとして脳内腫瘍を形成後、外科的に切除し残存腫瘍にIL-2遺伝子封入HVJ-Eを投与すると60%のマウスが寛解した。メラノーマは、腫瘍増殖能、転移、再発能いずれも極めて強い悪性度の高い皮膚癌であり、新たな有効な治療法の開発が世界中で取り組まれている。我々はベクターとして開発した不活性化Sendaivirus粒子(HVJ-E)に多彩な抗腫瘍活性があることを見出した。それをもとに2009年末より、大阪大学医学部附属病院ではメラノーマ患者を対象としたHVJ-E腫瘍内投与による安全性と有効性の検証の臨床研究が進行している。その中で、やはり抗腫瘍免疫が活性化されることが分かってきた。メラノーマは既存の抗癌剤や放射線療法が奏功しないケースが多い。そこで抗癌剤や放射線療法で誘発されるDNA傷害の修復を癌細胞において助長し、癌細胞死を増強する治療法の開発を行った。メラノーマ治療に用いられる抗癌剤ダカルバジン(DTIC)を癌細胞に投与するとDNA傷害が起こるが、それを修復する経路のうち相同組み換え修復が活性化し、それに関わるRad51の発現増強が起こった。そこでHVJ-EにRad51siRNAを封入し、DTICと併用投与するとマウスメラノーマ細胞のコロニー形成能が単独投与よりも有意に抑制された。そこでマウスメラノーマの腫瘍モデルを作成し、臨床用量相当のDTICは腹腔内投与(5回)、siRNA封入HVJ-Eは腫瘍内投与(3回)を行った。それぞれの単独群やscramble siRNA