hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HIVの複製・病原性発現に必須なアクセサリー蛋白質の系統的構造・機能相関解析

本研究では、エイズ発症に必須であると考えられているHIVのVifおよびVpx/Vprの構造と機能に関して系統的に解析し、要約以下の成果を得た。(1)HIV-1 gag-CAとHIV-1の種特異的増殖能について検討した。我々が作製した49種類のHIV-1/SIVmac CAキメラウイルスは全てサル細胞HSC-Fで増殖できなかった。そこで、これに加えてSIVmacのvif遺伝子を挿入したHIV-1を作製したところ、HSC-Fでの増殖性を獲得したクローンが見出された(HIV-1 DT:gag-CAのシクロフィリンA結合ループに対応する領域とvif遺伝子のみがSIVmac由来で、ゲノムの約94%がHIV-1)。この結果により、HIV-1種特異性決定領域はvifおよびgagのごく一部にあることが明らかになった。今後、各種のHIV-1 DTウイルスを用いて、HIV-1の種特異的ウイルス複製の分子基盤の解明や新しいサルモデルシステムの構築に取組んで行く。(2)HIV-1はVprを持つが、HIV-2はVprに加えてアミノ酸配列で相同性があるVpxも持つ。ホモロジーモデリングを行った結果、これらの3つの蛋白質はそれぞれ3つのヘリックスから成る類似した構造を持つことがわかった。さらに、HIV-1 Vpr、HIV-2 VprおよびHIV-2 Vpxの細胞毒性効果の比較を試みた。ルシフェラーゼをマーカーに用いた実験から、HIV-1およびHIV-2のVprが強い細胞毒性を持つことを確認した。程度はやや低いがHIV-2 Vpxにも細胞毒性があった。HeLaTet-Off細胞は、HIV-2 Vpxの発現を誘導した時にのみ、ほとんど増殖しなかった。これにより、HIV-2 Vpxも細胞増殖抑制能を持つことが明らかになった。(1)エイズ長期未発症者と発症者由来のHIV-1 vif遺伝子の感染性付与機能を解析した。その結果、ウイルスを血清中に多く持つ発症者は、感染性付与機能を持っvif遺伝子を多く持つことがわかり、生体内でのウイルス複製とエイズの進行にVifの機能が関わることが示唆された。(2)HIV-1 Vifがプロテアソーム分解を受け、低いVifの発現レベルを保つことでHIVを効率的に複製させていることを見出した。Vifは細胞内で細胞質に存在するものと細胞骨格に結合しているものがあるが、細胞質に存在するVifは20分程の半減期でプロテアソーム分解されるのに対し、細胞骨格に結合しているVifは安定で細胞内に蓄積されることを示した。この分解は細胞非依存的であり、その他のHIV-1アクセサリー蛋白質に比し、特に感受性が高いことも示した。この分解に重要なVif内リジン残基も同定した。Vifの分解はウイルス感染性を至適に保つために必須であった。(3)HIV-1はVprをコードするが、HIV-2はこれに加えてVpxもコードする。ホモロジーモデリングを行った結果、これらの3つの蛋白質はそれぞれ3ないし4個のヘリックスから成る極めて類似した構造を持っことがわかった。機能に関する新知見として、HIV-2 Vpxがマクロファージ中でウイルスゲノム逆転写促進能を持つことや種々の細胞に対する毒性効果を持つことを見出した。
非行少年の個性理解と早期指導に役立つ学級環境尺度の開発

非行少年の学級環境に対する評価に関して、本年度は特に少年の「現実の学級環境」と「選好する(好ましい、望ましいと考える)学級環境」に対する評価の関連に着目した。国外の先行研究では、この現実と選好の環境に対する評価の一致が教育効果を高めるとされている(例えば、Stern,1970;Hunt,1975)。前年度までの成果を踏まえて、独自に構成した学級環境評価尺度を、少年鑑別所収容中学生(87名)、及び首都圏の公立中学生(121名)に実施した。学級環境評価尺度40項目の因子的妥当性を検討するため、全208名に実施したデータを用いて因子分析(主因子法Varimax回転)を行った。因子の固有値及び解釈可能性を基準に5因子構造を妥当として、「教師の支援」、「学級での孤独感」、「授業態度」、「学級の規律・結束」、「学業の負担」を抽出した。学級環境評価尺度の評定値を従属変数として、所属(少年鑑別所・一般中学校)と評価対象(現実・選好)を要因とした2要因分散分析を行った結果、少年鑑別所・一般中学校の生徒ともに、現実の学級環境で得ているよりもさらに多くの「教師の支援」、生徒の肯定的な「授業態度」や「学級の規律・結束」、「学業の負担」の軽減、等を求めていることが示された。また、「教師の支援」、「授業態度」、「学業の負担」では所属による交互作用が認められ、傾向の程度は少年鑑別所群でさらに顕著であることが示された。このことから、非行中学生は、一般中学生以上に学校生活における現実環境と選好環境に対する認知の差異が大きいことが検証された。従来の選好・現実環境に関する調査研究では、主に学業成績が教育成果の指標として取り上げられてきたが、本結果は、選好・現実を対象とした学級環境評価の手法が、非行行動に関わる学校環境要因の解明にも有益であることを示したといえる。平成15年度は本研究成果として、次の2論文を発表した。(1)では少年院在院生、(2)では一般中学生を対象とした調査データを用いて、心理学的手法による教育環境の測定結果を、教育現場に有効にフィードバックするための、心理学者と学校現場の教師との連携について論議した。要約(1)「少年院在院者による施設環境評価-日本語版CIESの検討-」Moos(1974)は、人間の心理・社会的環境を構成する基本3次元『人間関係』『個人発達』『組織の維持と変化』を提唱した。米国では既にこの理論に基づく矯正施設環境評価尺度CIESが標準化されている。本稿では、日本版CIESの作成に向けて、少年院6施設でのデータについて数量化III類によるCIES構成次元の探索を目的とした構造化分析を行った。結果、オリジナルの3次元に対応する3軸「心理的な援助」「実用的な指導」「指導方針の明確さ」が抽出された。分散分析の結果、各施設に有意な差が認められた。これらを踏まえて、環境尺斐が矯正教育現場で活用されるために必要な視点について論議した。心理学的手法による環境尺度では、「現実」だけでなく生活者が「好ましい」と考える環境についても測定が可能である。この手法で測定された知見は、例えば、現実と好ましい環境を一致させることで学習効果を高めるなど、教育環境の具体的な改善に活用できる。本稿では、一般中学生を対象に独自の学級環境尺度を実施した。結果、「現実の学級」では、生徒は教師が考える以上に「コントロール」「孤独感」「課題の難しさ」「規律」を深刻に受け止め、一方「好ましい学級」の状態については教師-生徒間に有意な差はなく、教師も生徒も思い描く学級の理想像は一致していることが示された。平成16年度は本研究成果として、次の1論文を発表した。「学級運営に活用可能な学級環境測定尺度の提案-総合選択制高校の学校風土の記述を通して-」【要約】欧米の教育現場では、環境圧力理論(Murray,1938)を根拠とした学級環境尺度(CES : Classroom Environment)等多数の教育環境測定指標が作成され、学校経営者や教師自身によって学級運営や生徒指導に活用されている。わが国の学校現場においても、教師自身が簡易に実施して必要な情報を入手できるツールの普及は有益であろう。そこで本研究では、教師の学級運営支援に活用可能な学級環境の測定内容について検討することを目的とした。具体的には、Actual/Preferredの2種類のフォームの学級環境評価尺度を、一般高校及び総合選択制高校の生徒を対象に実施した。結果では、高校生が学校生活で抱えるさまざまな負担や総合選択制高校の学校風土の特色が記述された。主目的であった学級運営に有益なフィードバックの測定内容・集計方法の検討については、報告書を試作、その有効性を検討した。また本年度は、上記論文で得られた知見をもとに、非行少年を対象とした教師・スクールカウンセラーの学校臨床実践に役立つ学級環境尺度の作成に向けて、次の調査を実施した。【調査対象】首都圏の「少年鑑別所収容中学生80名」及び「スクールカウンセラー配置校中学生120名」現在分析中の本調査データからは、一般中学生では、学校生活において「悩みは人に頼らず自力で克服すべき」いう信念をもつ子どもが実際に相談相手のない環境におかれた場合に、学級集団での孤立感が最も高いこと等が示唆された。また、非行・一般中学生とも、スクールカウンセラーと教師に対するイメージは類似していること等が示されている。

本データについては、平成17年度も継続して更に詳細な分析を行う。非行少年の学級環境に対する評価に関して、本年度は特に少年の「現実の学級環境」と「選好する(好ましい、望ましいと考える)学級環境」に対する評価の関連に着目した。国外の先行研究では、この現実と選好の環境に対する評価の一致が教育効果を高めるとされている(例えば、Stern,1970;Hunt,1975)。前年度までの成果を踏まえて、独自に構成した学級環境評価尺度を、少年鑑別所収容中学生(87名)、及び首都圏の公立中学生(121名)に実施した。学級環境評価尺度40項目の因子的妥当性を検討するため、全208名に実施したデータを用いて因子分析(主因子法Varimax回転)を行った。因子の固有値及び解釈可能性を基準に5因子構造を妥当として、「教師の支援」、「学級での孤独感」、「授業態度」、「学級の規律・結束」、「学業の負担」を抽出した。学級環境評価尺度の評定値を従属変数として、所属(少年鑑別所・一般中学校)と評価対象(現実・選好)を要因とした2要因分散分析を行った結果、少年鑑別所・一般中学校の生徒ともに、現実の学級環境で得ているよりもさらに多くの「教師の支援」、生徒の肯定的な「授業態度」や「学級の規律・結束」、「学業の負担」の軽減、等を求めていることが示された。また、「教師の支援」、「授業態度」、「学業の負担」では所属による交互作用が認められ、傾向の程度は少年鑑別所群でさらに顕著であることが示された。このことから、非行中学生は、一般中学生以上に学校生活における現実環境と選好環境に対する認知の差異が大きいことが検証された。従来の選好・現実環境に関する調査研究では、主に学業成績が教育成果の指標として取り上げられてきたが、本結果は、選好・現実を対象とした学級環境評価の手法が、非行行動に関わる学校環境要因の解明にも有益であることを示したといえる。
非天然アミノ酸の部位特異的導入技術を用いたタンパク質の揺らぎ解析

本研究では、非天然アミノ酸導入技術を用いることで、天然および非天然アミノ酸への置換の影響を効率的・系統的に調べることのできる手法の開発や、蛍光標識非天然アミノ酸を導入してタンパク質の構造や機能を蛍光変化や蛍光共鳴エネルギー移動を用いて解析できる手法の開発などを行なった。また得られたタンパク質を診断薬などへ応用し、そのための非天然アミノ酸導入タンパク質の大量合成技術の開発も行なった。タンパク質中のアミノ酸変異は、タンパク質の揺らぎ研究において有効な研究手段である。しかし、従来の研究では使用できるアミノ酸は天然の20種類に限られていたために、精密な揺らぎの制御や揺らぎの計測は困難であった。本研究では、非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入技術を用いて、蛍光共鳴エネルギー移動のドナーおよびアクセプターとなる非天然アミノ酸をタンパク質の特定部位へ導入することで、タンパク質の構造揺らぎを計測するとともに、さらに20種類の天然アミノ酸に加えてそれらの類似体となる様々な非天然アミノ酸や修飾アミノ酸を導入することで、揺らぎを制御しつつ計測できる手法を確立することを目的として計画した。本研究では、4塩基コドンを用いた非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入技術を用いて、2種類の蛍光標識アミノ酸をタンパク質の特定部位へ導入することで、タンパク質の構造揺らぎを蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いて計測することを試みる。また、20種類の天然アミノ酸以外に、多種類の非天然アミノ酸のタンパク質への導入系を確立し、揺らぎに対するアミノ酸置換の影響を系統的に制御できるシステムを開発する。そのために、マルトース結合タンパク質、および、カルモジュリンを用いて、N末端領域にFRETドナーとなる蛍光標識アミノ酸を、タンパク質内部部位にFRETのアクセプターとなる蛍光標識アミノ酸、あるいは非蛍光性アミノ酸を導入して、実際に導入部位に依存してFRETが観測できることを確認した。また、光安定性の高い蛍光基を使用することで、一分子蛍光測定によるこれらの二重蛍光標識タンパク質の構造変化に伴うFRET効率の変化、および、蛍光相関分光分析(FCS)の解析を予備的に行なった。さらに、大きな蛍光基をタンパク質内部に導入する際の周辺アミノ酸配列の最適化や、N末端やC末端に蛍光標識アミノ酸を効率的に導入する新規手法の開発など、蛍光標識アミノ酸の導入法の改善も行なった。また、非天然アミノ酸の導入効率を迅速に測定するための手法として、緑色蛍光タンパク質(GFP)に非天然アミノ酸を導入してその発現をリアルタイムに蛍光検出できる方法を確立した。本研究では、4塩基コドンを用いた非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入技術を用いて、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)のドナーとアクセプターとなる2種類の非天然アミノ酸をタンパク質の特定部位へ導入することで、タンパク質の構造揺らぎをFRETを用いて計測することを試みている。また20種類の天然アミノ酸以外に、多種類の非天然アミノ酸のタンパク質への導入系を確立し、非天然アミノ酸置換により揺らぎを制御できるシステムを開発する。そのためにまず、タンパク質のN末端あるいはN末端領域に蛍光標識アミノ酸を効率的に導入する手法を確立した。また、導入可能なアミノ酸の構造や最適なN末端アミノ酸配列についての検討も行ない、N末端領域では多様な構造の非天然アミノ酸の導入が可能であることを明らかにした。さらに、その手法を用いて、実際にマルトース結合タンパク質などのN末端にFRETのドナーとなる蛍光標識アミノ酸を導入しておき、内部の様々な部位に非蛍光性アクセプターとなる非天然アミノ酸を導入した。栄光寿命測定とその解析により、この手法によりタンパク質の特定残基における構造揺らぎを評価できる可能性があることが示された。また、光安定性の高い2種類の蛍光標識アミノ酸を導入することで、二重蛍光標識タンパク質の構造変化に伴うFRET効率の変化を一分子蛍光測定により解析できることも確認された。一方、これらの蛍光測定法と組み合わせることで、揺らぎに対する非天然アミノ酸置換の影響を系統的に評価できるシステム構築に向けて、フェニルアラニンの多種類の類似体や、PEG鎖などを付加した非天然アミノ酸について、新たにタンパク質への導入法を確立した。そのためにまず、タンパク質のN末端あるいはN末端領域に蛍光標識アミノ酸を効率的に導入する手法を確立して、その手法を用いて、N末端にFRETのドナーとなる蛍光標識アミノ酸を、内部の様々な部位に非蛍光性アクセプターとなる非天然アミノ酸を導入した、マルトース結合タンパク質を合成した。蛍光寿命測定とその解析により、N末端と内部部位の2点間距離およびその揺らぎが測定可能であることが示された。さらに、光安定性の高い2種類の蛍光標識アミノ酸を導入したタンパク質を合成して、二重蛍光標識タンパク質の構造変化に伴うFRET効率の変化を、フロー式1分子蛍光測定により測定できることも実証した。

また、アミノ酸置換の揺らぎへの影響を系統的に評価する上で有用となる、1種類のアンバーコドン置換遺伝子から20種類のアミノ酸置換タンパク質を効率的に合成できる手法の開発、および、翻訳後修飾に伴うタンパク質の揺らぎ解析に有用となる、蛍光標識された翻訳後修飾タンパク質の合成法の開発も行なった。蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)のドナーおよびアクセプターとなる非天然アミノ酸をタンパク質にそれぞれ導入して、FRET測定によってドナー・アクセプター間の距離およびその分布を調べ、タンパク質の特定部位における構造揺らぎを計測できる手法を確立することを目的として研究を行なった。モデルタンパク質としてマルトース結合タンパク質(MBP)を用いた場合、N末端にFRETのドナーとなる蛍光標識アミノ酸を導入しつつ、様々な内部部位にアクセプターとなる非天然アミノ酸を導入して、蛍光寿命測定からFRET効率とドナー・アクセプター間距離およびその分布の分析を行なった。また、一分子測定に適用可能なFRETアクセプターとなる新たな蛍光標識アミノ酸を設計・合成し、実際にタンパク質の様々な部位に導入できることを見い出した。この新規蛍光標識アミノ酸はMBPの溶液中での一分子測定に使用可能であること、及び、タンパク質の構造揺らぎの測定に応用できることを明らかにした。また、FRETのドナーの代わりにルシフェラーゼを用いることで、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)によって、同様の分析が可能となることも示した。一方、蛍光標識アミノ酸を抗体のN末端部分に導入した場合に、抗原非結合状態では抗体断片内部のトリプトファンによって消光されるが、抗原の結合によって消光が解消されて、抗原を蛍光変化によって検出できることを見い出した。これは、抗体断片の抗原結合部位の揺らぎを利用することで可能になったと考えられる。また、特定部位のアミノ酸を他の天然アミノ酸や様々な非天然アミノ酸に簡便に置換する手法の開発を行ない、タンパク質の構造やその揺らぎに対するアミノ酸置換の影響を効率良く解析できる手法を確立した。本研究では、非天然アミノ酸導入技術を用いることで、天然および非天然アミノ酸への置換の影響を効率的・系統的に調べることのできる手法の開発や、蛍光標識非天然アミノ酸を導入してタンパク質の構造や機能を蛍光変化や蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いて解析できる手法の開発などの研究を行なった。タンパク質への変異導入については、20種類のアミノ酸と種々の非天然アミノ酸で置換されたタンパク質を、1種類の変異遺伝子から迅速に合成することのできる新規手法を開発した。大腸菌由来アンバーサプレッサーtRNAと化学的にアミノアシル化tRNAを組み合わせることで、1つのアンバーコドン置換遺伝子から、20種類のアミノ酸置換タンパク質を迅速に合成できることを実証した。
電気的手法による核燃料内の化学・物理状態分布評価

核燃料を模擬した試料に電気的測定手法を適用することにより、燃料マトリクス相の酸素不定比状態や各相の化学・物理状態と電気的特性の相関を明らかにすることを目的とし、燃料マトリクス相と金属相の相関に着目して電気化学インピーダンス測定等の各種測定を行った結果、両相は結晶構造は異なり相としては独立であるものの何らかの電気的相互作用が生じている可能性が示唆された。電気化学スペクトロメトリー(以下、EIS)と熱電能分布測定を組み合わせて、燃焼した核燃料内におけるメソスケールでの化学・物理状態の分布、ならびに、酸素不定比が粒界相を含む核燃料内の各相へ与える影響を同時に明らかにする手法確立を目的とする研究を実施した。研究は、非放射性で核燃料物質等の代替となるセリア酸化物を用いて行った。より均質な固溶体酸化物(Ce,Nd)O2-xを調製するため、セリア及びネオジム酸化物を酸溶液に溶解させ、溶解液の蒸発乾固またはシュウ酸による共沈により固溶体化合物を生成させる方法について検討した。また、電気的特性評価のために前年度整備した高温電気化学測定(EIS)装置について、標準試料の測定を通じた性能確認とチューニングを継続した。電気化学測定、微小領域の硬さ分布測定及び熱電能測定を効率的・効果的に実施するために、既往関連研究を調査し、電気伝導率やインピーダンス等の電気的特性と組成、温度、酸素不定比等の条件に係る情報を整理した。より均質で高品質な固溶体酸化物(Ce,Nd)O2-xの調製方法として、セリア及びネオジム酸化物を酸溶液に溶解させ、溶解液を蒸発乾固させた後に熱処理して残留酸成分等を除去する方法を確立した。本方法を用いて組成の異なる5種類の(Ce,Nd)O2-x試料を調製した。調製した試料の電気的特性評価を行うための実験準備として、試料調製装置(高密度焼結体作成装置)の調整や高温電気化学測定装置(EIS)の性能確認とチューニングを行った。電気化学測定、微小領域の硬さ分布測定及び熱電能測定を効率的・効果的に実施するために、電気伝導率やインピーダンス等に関する既往関連研究を網羅的に調査し、電気的特性と組成、温度、酸素不定比等の条件に係る相関解析を行った。機構において、セリアおよびセリアにNdをドープした固溶体酸化物(Ce,Nd)O2-xを調製した。セリアに希土類酸化物を加えて混合粉砕した粉末を加圧成型し、1,300°Cー計10時間の熱処理を行った。熱処理した試料は再度粉砕・混合・成型して熱処理を計2回行うことにより固相反応を促進させ、最終的には1500°Cー3時間の熱処理により焼結した。調製した酸化物は、X線回折測定により、単相の蛍石型の結晶構造を有することを確認した。また、希土類の添加量に対する格子定数の関係は線形であることが分かった。酸化物の特性評価のための高温電気化学測定(EIS)のために、EIS用セルの高温化設計を行い、1,000°Cまでの加熱が行える装置を製作した。高温ユニットを既存のEIS装置に組み合わせて標準試料の測定を行い、所定の性能が発揮されることを確認した。阪大においては、連携研究者の黒崎氏の協力の下、機構で調製した試料のレーザー顕微鏡による表面組織観察ならびに微小領域の硬さ分布測定を行った。産総研においては、連携研究者の山本氏の協力の下、機構で調製した試料による熱電能分布測定実施に向けて、主に装置の測定条件最適化ならびに装置のチューニングを行った。所定量のセリウム及びネオジム硝酸塩を出発物質として酸に溶解した後、溶解液を蒸発乾固させて空気中で熱処理を行うことにより、ネオジムの含有率を025%まで変化させた複数のセリウムとネオジムの固溶体酸化物(Ce,Nd)O2-xの調製に成功した。調製した(Ce,Nd)O2-xのX線回折測定により、セリウムとネオジムは原子レベルまで固溶していることを確認した。

一方、照射した核燃料における相状態の模擬として、酸化物相と金属相が共存する化合物における特性を評価するため、セリウム酸化物とモリブデン金属粉末を出発物質として、粉末冶金的方法により、Ce:Mo原子数組成比が異なる試料を調製した。故障していた電気化学測定装置の修理を行い、調製した試料に対して、微細組織観察、電気伝導率測定、微小領域の硬さ測定等を行った。種々の希土類元素を含有するセリウム酸化物の電気的特性を網羅的に調査し、温度、希土類元素種類及び含有率、酸素不定比等を説明変数として本研究における測定値を含めて解析・評価した。核燃料工学前年度まで行っていた固相反応による固溶体酸化物の試料調製について、担当する研究協力者の職務変更等により遅延を生じ、その結果、EIS、局所硬さ及び熱電能の各測定に遅延を生じたため。担当する研究協力者の職務変更等の理由により、前年度に固溶体酸化物の試料調製方法を変更した。このため試料調製条件を一から検討必要が生じ、高密度焼結体作成装置の故障と相俟って、各種特性測定が遅延しているため。当初予定していた項目を概ね達成している。固相反応による試料調製法の代替手法としての溶液を介した方法に目処が立ったことから、今後は本手法により複数の組成を持つ均質な(Ce,Nd)O2-xを調製し、EIS、局所硬さ及び熱電能の各測定を効率的に行う。また、電気的特性と条件に係る情報整理結果を解析し、それらの間の相関を評価して試料調製及び測定に反映させることにより、系統的な相関評価を効率的に実施する。固溶体酸化物の試料調製方法を確立したことから、高密度焼結体作成装置が復旧次第特性測定用試料の調製を行って各種特性測定を完了させる。特性測定においては、今年度実施したデータ解析手法による特性と組成等との相関の解析結果を有効活用して、より効率的にデータ取得ができるような条件での測定を行う。セリアに複数の希土類元素を添加した試料、およびセリアに希土類、金属、アルカリ土類等、実際の核燃料に含まれる元素を添加した模擬燃焼燃料試料を調製し、研究を進める。機構においては、上記試料の調製およびキャラクタリゼーションを行う。平成23年度にセットアップした高温化学セルを付したEISにより、試料のEIS測定を行う。平成23年度および下記する阪大および産総研における測定によって得られた試料の化学・物理状態分布、熱電能分布、ならびに、硬さ等測定結果を合わせて、EIS測定結果との相関を評価する。阪大においては、今年度調製した試料のレーザー顕微鏡による表面組織観察ならびに微小領域の硬さ分布測定を行う。産総研においては、今年度調製した試料の熱電能分布測定を行い、酸素不定比化合物の最適測定条件を評価する。今年度実施に遅延が生じた電気的特性測定に必要な消耗品の購入を次年度に使用する。平成25年度は、セラミックス高密度焼結体試料を調製して電気的特性測定を実施する予定であったが、高密度焼結体作成装置が故障しその復旧に時間を要している。このため、特性測定用試料の調製に着手できていない。その結果、高密度焼結体試料の仕様(微細組織、密度等)が定まらないため、仕様に合わせた電気的特性測定条件が定まらず、電気的特性測定に使用予定であった一部の消耗品や装置設置場所への旅費が未使用となった。高密度焼結体作成装置は4月ごろ復旧する見込みであるため、セラミックス高密度焼結体試料の調製及び仕様の確定を8月までに終了させ、電気的特性測定用消耗品購入(試料ホルダー、プローブ等)及び装置設置場所への旅費に未使用分の経費を使用する。尚、未使用分経費の使用時期は8月11月ごろを予定している。試料調製およびキャラクタリゼーションに必要な消耗品や備品を購入する。
悪性腫瘍に対する光線力学的治療法の開発

光線力学的治療は腫瘍親和性の有る光感受性物質を取り込ませた後,低出力レーザー照射を行なうもので,我々の教室では10年来基礎的,臨床的研究を行なってきている.昨年度合成し得た新しい光感受性物質であるmono-L-aspartyl chlorin ed(Nped)は,従来のヘマトポマフィリン誘導体(HpD)と比べマウス皮下移植腫瘍で腫瘍集積性が高く,またより高い吸収極大値を有することがわかった.励起波長もより長波長例に有り,血色素により減衰することも少なく,現在臨床応用に向けてさらに研究中である.レーザー器械の開発も従来のアルゴン色素レーザーよりも尖端出力の高いパルスレーザーであるエキシマシーザーを開発,導入しすでに臨床応用を行なっている.このエキシマレーザーは波長可変装置により診断,治療が同一器械で可能であり,特に診断では得られた内視鏡像も蛍光,蛍光波長を同一画面上で表示できる画期的なものである.光線力学的治療の基礎的な機序研究も進み,特にヘマトポルフィリン誘導体Npedは,細胞内ミトコンドリアに取り込まれることが明らかになった.さらにビデオ顕微鏡を用いて観察すると,光感受性物質を取り込ませた後光照射を行なうとミトコンドリア固有運動が障害され,停止してしまうことがわかった.つまり光線力学的治療の機序はミトコンドリア障害がその引き金であることが考えられる.昭和62年度では61年度で行なった光線力学的治療に関する基礎的研究,レーザー器械開発,新しい光感受性物質研究等が確立されつつあり,臨床成績も向上しつつ有ることよりさらに本研究を進めてゆく.悪性腫瘍に対するヘマトポルフィリン誘導体(HpD)とアルゴン・ダイ・レーザーによる光線力学的治療法(PDT)の開発を、昭和57年、昭和58年、昭和59年の研究で得られた基礎的成果に基いて臨床症例を対象として行った。治療条件の確立を目的として、HpDを2.55.0mg/kg静注後、HpDが正常組織から大部分排泄されかつ腫瘍組織内で最も高い集積性を示す72時間後に、アルゴン・ダイ・レーザー光(波長・630nm、先端出力:200600mW)を経気管支鏡的にクォーツファイバーで導き病巣に照射した。経過観察中、経時的に経気管支鏡的擦過細胞診を行った。その結果、PDTによる細胞変化は照射20分後にまず細胞質に現れることが示された(細胞質膨化、空胞変性、異染性など)。4日後にはRepair cellが出現し修復課程をたどった。PDT効果は病巣において施行後かなり早期から認められることがわかった。PDT後に手術を施行した症例の組織学的考察から、照射した病巣が変性、壊死に陥ったことを確認した。早期中心型肺癌症例ではPDTのみで根治させる可能性があると考えられた。各症例の治療条件と治療効果の関連を検討した。PDTはあくまでも局所療法であり、リンパ節転移のある進行癌症例での根治性は無いと考えられるが、PDTにより腫瘍性閉塞気管支を開口させ呼吸状態、全身状態の改善がはかれること、更に術前にPDTを施行して腫瘍表層浸潤病巣を退縮させることにより、切除不能と判定されていた症例で肺全摘が可能となること(拡大手術)、肺機能温存を目的とした切除範囲の縮小化が可能となること(縮小手術)が認められた。進行癌に対するPDTの有用性が示唆された。光線力学的治療は腫瘍親和性の有る光感受性物質を取り込ませた後,低出力レーザー照射を行なうもので,我々の教室では10年来基礎的,臨床的研究を行なってきている.昨年度合成し得た新しい光感受性物質であるmono-L-aspartyl chlorin ed(Nped)は,従来のヘマトポマフィリン誘導体(HpD)と比べマウス皮下移植腫瘍で腫瘍集積性が高く,またより高い吸収極大値を有することがわかった.励起波長もより長波長例に有り,血色素により減衰することも少なく,現在臨床応用に向けてさらに研究中である.レーザー器械の開発も従来のアルゴン色素レーザーよりも尖端出力の高いパルスレーザーであるエキシマシーザーを開発,導入しすでに臨床応用を行なっている.このエキシマレーザーは波長可変装置により診断,治療が同一器械で可能であり,特に診断では得られた内視鏡像も蛍光,蛍光波長を同一画面上で表示できる画期的なものである.光線力学的治療の基礎的な機序研究も進み,特にヘマトポルフィリン誘導体Npedは,細胞内ミトコンドリアに取り込まれることが明らかになった.さらにビデオ顕微鏡を用いて観察すると,光感受性物質を取り込ませた後光照射を行なうとミトコンドリア固有運動が障害され,停止してしまうことがわかった.つまり光線力学的治療の機序はミトコンドリア障害がその引き金であることが考えられる.昭和62年度では61年度で行なった光線力学的治療に関する基礎的研究,レーザー器械開発,新しい光感受性物質研究等が確立されつつあり,臨床成績も向上しつつ有ることよりさらに本研究を進めてゆく.悪性腫瘍に対するヘマトポルフィリン誘導体(HpD)とアルゴン・ダイ・レーザーによる光線力学的治療法(PDT)の開発及び自動化を目的とした。昭和57昭和60年までの基礎及び,臨床実験からPDTの早期肺癌への有効性,進行癌ではPDTを併用することによる拡大あるいは縮少手術の可能性を検討してきた(60年度報告)。

以上の結果、レーザー光線の組織透過性の問題,HpDの腫瘍内分布の不均一性等が今後の課題として残された為、今年度は新しい励起光線としてのパルス波の応用及び新しい腫瘍親和性光感受性物質の開発を目的とした基礎実験を行った。1.パルス波の応用。パルス波を応用して組織透過性を改善しさらにPDTの自動化を計る為の基礎実験を行った。すなわち照射フィイバー先端から照射病巣までの距離をパルスレーザーを用いて計測する為の予備実験として、距離の異なる点に対して照射したパルス波をストリークカメラで捕えて時間分解測充し、光速を考慮して2点間の距離を計測した。しかし、今回の実験はファイバーを用いたものでないので、ファイバーを通じてパルス波を照射しうるようなシステムを開発する必要を認めた。2.HpDの組織内分布状態の観察。担癌マウスを使用し、HpDの組織内分布状態を螢光顕微鏡で観察した。静注によりHpDは腫瘍辺縁に生に集積し、一方腫瘍内に直接注入した場合には高濃度に集積するが周囲の正常組織にも集積してしまう結果となった。よりよい腫瘍内均一分布を得る為に投与方法の改善やHpDの代謝,排泄などの課題が残された。3.新しい腫瘍親和性光化学物質の開発。この目的のため、クロリン系物質の一種Mono-L-Aspartylchlorine6(NPe6)を合成した。今後、HpDとの効果の比較や毒性面の解析を通じて有効性を検討したい。
凍結によるマイクロ・ナノ空間制御に基づく計測化学の展開

凍結により生じる液相空間を理解し、制御することにより凍結現象を新たな機能開拓に利用すると共に、現象の本質を理解することを目的としている。今年度は以下の検討を行った。(1)凍結による液相空間のマイクロ/ナノメーター次元制御、(2)凍結水溶液の物性評価、(3)水溶液凍結系の理論的描像、(4)凍結溶媒抽出、(5)凍結電気化学。(1)では、数百マイクロメーター程度の厚さの氷隔壁を用いて、ナノマイクロ粒子の分離を検討し、50 nm以上の大きさでチャンネル径を制御できることを示した。また、マイクロ粒子の表面に不凍タンパク質を導入することで、粒子の物理的なサイズよりも大きなチャンネル幅で粒子の動きが制限されること、この温度から化学的な相互作用を評価できることを示した。(2)では、蛍光相間分光、発光消光反応速度測定を利用して、グリセロールを含む凍結水溶液の粘性率を決定した。いずれの方法でも、温度が低いほど、また容器空間が小さいほど、同じ組成のバルク溶液に比べて粘性率が高くなることを見出した。(3)ではExtended UNIQUACモデルにより塩の水溶液系の理論的描像を得るためのプログラミングを行った。(4)では、凍結水溶液から液液抽出を行うことにより、凍結していないときに比べて数倍以上の効率的な抽出が可能であることを示した。また、電気的に中性の化合物では分配係数が抽出により小さくなる(水側に分配しやすくなる)ことを見出した。これは以前の研究で電気化学的に明らかにした現象と一致する。(5)では、凍結水溶液中における可逆系のサイクリックボルタンメトリーの測定と、有限要素法によるシミュレーションから電極表面での液相成長に関する知見を得た。その結果液相は特定の方向に成長が妨げられていることが明らかになった。空間制御の観点からは数十nmまで液相チャンネルを再現性良く制御できるようになった。また、粒子表面反応を利用することで化学的相互作用を温度から評価できるようになったことは、想定外の成果であった。熱力学モデルの構築も進んでおり、複雑な凍結系を予測できる見通しが立った。空間制御ではさらに1桁小さい次元にまで拡張できればさらに有用であると期待できる。また、現在合成への凍結の積極的利用を開始しており今後具体的な成果に結びつけたいと考えている。
アンドロゲン非依存性前立腺癌の治療標的アクチビン・ヘッジホッグシグナルの機能解析

アンドロゲン非依存性進行前立腺癌の治療法確立の観点から、アンドロゲン受容体(AR)とアクチビン、Hedgehogシグナル間クロストークの存在を明らかにした。前立腺癌とアクチビン受容体シグナルプラスミド[EF1 promoter-ActRIB-IRES bGEO]を構築し、アンドロゲン非感受性前立腺癌細胞ALVA41を用いて、恒常的活性型アクチビンIB型受容体の発現強度の異なる複数個の安定発現株(ALVA-ActRIB)を樹立した。ActRIBの発現をwestern blotならびにLacZ染色にて確認し、機能的にもActivin応答性が発現量に比例して増加していることを確認した。これらALVA-ActRIBはin vitroでの細胞増殖に違いは見られなかったが、それぞれの細胞株をヌードマウスに接種したxenograftモデルで形成された腫瘤を検討したところ、ActRIBの発現量依存性に組織学的悪制度が増し、さらに腹腔内リンパ節転移が観察された。DNAマイクロアレイ解析より、E-cadherin, Sonic hedgehog, VEGFの優意な増加がみられた。前立腺癌細胞におけるアクチビン受容体シグナルの活性化により、前立腺癌の臨床的悪性化が示唆された。アンドロゲン受容体(AR)とHedgehogシグナルHedgehogシグナルの活性化が前立腺癌の進展に関与していることが報告されている。我々はHedgehogシグナルの細胞内分子であるGli1とARのクロストークを明らかにした。前立腺癌細胞においてGli1はARの転写活性を容量依存性に抑制し、AR-Gli1は分子間直接相互作用をすることを明らかにした。前立腺癌の進展のTurning Pointはアンドロゲン非依存性能の獲得にあるが、Hedgehogシグナルの活性化、Gli1の発現亢進がその機序の一つである可能性が示唆された。本研究の目的は前立腺癌の増殖・転移の分子基盤を、アクチビンシグナルおよびHedgehogシグナルの機能を中心にジェノグラフトモデルならびにトランスジェニックマウスの解析を通して明らかにすることである。I)アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株ALVA41を用いた研究成果活性型アクチビン受容体強発現株(ALVA-ActRIB)を樹立し、親株であるALVA41と比較検討を行った。In vitroでの増殖速度、形態に変化は見られなかったが、Migration assayを行うとALVA-ActRIB株でメッシュを通過する細胞数が有意に増加していた。そこでこの2種類の細胞株を用いてマイクロアレイを行い、遺伝子発現の変化を比較した。その結果、Sonic hedgehog(Shh)の発現が約3倍に増加していることを明らかにした.Shhは癌の臨床的悪性度(転移浸潤)と相関することが示されており、Migration assayの結果をShhの発現亢進が説明し得る。Iでの結果を受け、In vivoでのアクチビン受容体発現の役割を明らかにするため、ヌードマウスの背部皮下にALVA41とALVA-ActRIBを接種し腫瘍形成を行った。ALVA-ActRIBによるGenograftモデルでは、腫瘍の増殖が著明に抑制され、病理学的にスキルス癌に変化しリンパ節転移も見られた。すなわち生物学的悪性度が増していた。腫瘍組織を用いて1同様にマイクロアレイを行うとShhの発現がやはり3倍上昇していた。III)トランスジェニックマウスを用いた研究経過Cre蛋白発現アデノウイルスを4週令ActRIBトランスジェニックマウス(ActRIBLoxTG)の前立腺に感染させ、前立腺癌の発生に及ぼす影響を検討中である。アンドロゲン非依存性進行前立腺癌でのActivin/TGF・β、Hedgehogシグナル間クロストークの存在を明らかにした。

I.前立腺癌細胞株・Xenograftモデルを用いた研究プラスミド[EF1 promoter-ActRIB-IRESbGEO]を構築し、アンドロゲン非感受性前立腺癌細胞ALVA41を用いて、恒常的活性型アクチビンIB型受容体の発現強度の異なる複数個の安定発現株(ALVA-ActRIB)を樹立した。ActRIBの発現をwestern blotならびにLacZ染色にて確認し、機能的にもActivin応答性が発現量に比例して増加していることを確認した。これらALVA-ActRIBはin vitroでの細胞増殖に違いは見られなかったが、ヌードマウスのxenograftモデルを用いた検討では、ALVA-ActRIB由来腫瘍で組織学的にスキルス変化がみられ、興味あることに著明な腹腔内リンパ節転移が観察された。In vitroのmigration assayでもALVA-ActRIBで細胞の移動が亢進していた。ALVA41とALVA-ActRIB間でのDNAマイクロアレイ解析より、前立腺癌細胞におけるアクチビン受容体シグナルの活性化により、E-cadherin、Sonic hedgehog、VEGFなどの腫瘍の進展、転移に関与する分子群のmRNAの優意な増加がみられた。ActRIBシグナルがShhシグナルを活性化していること、Hedgehogシグナルは前立腺癌の悪性化に重要であることが報告されていることから、ActRIBシグナルが前立腺癌の進展・増悪に関わり、その抑制は一つの治療戦略であることが示唆された。II.コンディショナルトランスジェニックマウスを用いた研究ActRIBを組織特異的に個体レベルで発現させることを目的にプラスミド[CAG promoter-loxp/EGFP/loxp-ActRIB-IRESbGeo]を構築、ES細胞に導入後に胚盤胞インジェクションを行い、キメラマウスを作成、GLTが得られトランスジェニックマウスを作成した。PB-Creが入手困難であったため前立腺での過剰発現を目的にCre蛋白発現アデノウイルスを4週令マウス前立腺に感染させ、4週後に組織学的検討を加えたが腫瘍の形成は見られなかった。ActRIBシグナルは過形成や発癌過程ではなく、癌の進展・転移の過程に重要な働きをしていると考えられる。
真性ひずみを利用した高次ナノ構造体の創製技術の開発

ナノワイヤなどの一次元ナノ材料の表面に異種原子結晶を成長させ,ナノ材料と異種原子の間に発生する不整合ひずみ(真性ひずみ)を利用したナノ材料曲げ加工技術を確立した。そこでは,コア流動法を新たに考案し,曲げ加工効率を飛躍的に向上させた。さらに,分子動力学解析により,当該不整合ひずみの特徴を理論的に把握した。また,ナノ材料の把持・移動配置を可能にする多自由度のナノ把持装置を開発した。これにより,高次ナノ構造体として特に有用なナノコイルの創製を実現した。ナノワイヤなどのナノ材料の表面に異種原子の結晶を成長させ,これにより発生する巨大な真性ひずみを利用したナノ材料曲げ加工技術を確立し,曲面と有する高次ナノ構造体創製を目的とする本研究の平成20年度の成果は以下のとおりである.1.ナノワイヤの光学的散乱像に注目することにより,ナノワイヤの機械的試験(ヤング率計測,強度計測)が光学顕微鏡下で実施可能であることを実証した.また,散乱像の強度分布と実直径の間に相関があることがわかった.これは,ミュー散乱理論により説明ができた.光学顕微鏡下の試験は,機械的性質に及ぼす環境の影響を調べる上で極めて重要である.2.ナノワイヤの散乱像を光学顕微鏡で観察しながら,原子間力顕微鏡(AFM)カンチバーを用いて負荷試験が可能な装置を開発した.3.位置決め精度5nm,最大移動量400μmの変位増幅XYステージを開発した.4.被覆ナノワイヤの分子動力学解析を行った.ナノワイヤが曲げる原因として,表面応力と格子定数の不整合度による固有ひずみがあり,後者が支配的であることがわかった.また,エピタキシー製膜が成立する場合に,大きな曲げが発生することがわかった.その際の,許容される不整合度は, 20%程度に達した.これは,ナノワイヤの曲げによる膜ひずみエネルギーの緩和が原因として考えられた.5.酸化銅ナノワイヤに対してCrをスパッタ製膜し,該ナノワイヤの曲げに及ぼす膜厚の影響を調べた.ナノ材料に表面に異種原子の結晶を成長させ,これにより発生する巨大な真性ひずみを利用したナノ材料の曲げ加工技術を確立し,曲面を有する高次ナノ構造体創製を目的とする本研究の平成21年度の成果は以下のとおりである.1.ナノワイヤの弾性係数と強度を計測できる作製した光散乱像観察に基づく試験装置を開発した.2.各種ナノ材料を合成できる管状反応炉を作製した.3.上記管状反応炉を利用して,Cr被覆CuOナノワイヤをArガス中で600°Cに加熱した結果,効率的にナノコイルが形成できることを見出した.これは,コア部のCuOの融点が被覆金属の融点に比べ低いために,コア部のみにクリープ流動が起こり,真性ひずみ駆動の曲げ変形を阻害していたコア部の変位拘束が解放されたためである.この方法すなわちコア流動法は,真性ひずみを利用した曲げ加工を飛躍的に効率化できる画期的な手法である.4.分子動力学シミュレーションにより,曲げ変形に及ぼす格子不整合度,結合エネルギーの相違,膜厚の影響を調べた.膜厚の増加により曲げは減少した.また,膜とナノワイヤの結合エネルギーの相違の影響は,格子不整合度の影響に比べ極端に小さい.しかしながら,最大の曲率を与える格子不整合度の値は,結合エネルギーの相違に依存することがわかった.5.単一のナノワイヤをマイクロカンチレバーで捕捉し,スパッタ用真空チャンバー内で,ナノワイヤを配置することにより,明確な条件でナノワイヤに製膜できるようになった.6.原子間力超音波顕微鏡技術の応用により,ナノワイヤの直径方向の弾性の計測やナノ領域の加工に関する基礎技術を開発した.ナノ材料の表面に異種原子の結晶を成長させ,これにより発生する巨大な真性ひずみを利用したナノ材料の曲げ加工技術を確立し,曲面を有する高次ナノ構造体創製を目的とする本研究の平成22年度の成果は以下のとおりである.1.二つのシリコンマイクロカンチレバー先端の間隔,相対的角度,当該カンチレバー支持部の3軸平行移動,当該カンチレバー先端部を中心とした回転運動を,可能とした多自由度把持装置すなわちナノチップスティックスを開発した.光学顕微鏡下に本装置を設置し,ナノワイヤの散乱像をもとに,単一のナノワイヤの把持,移動が可能であることを実証した.2.昨年度開発した管状合成炉を用いて,熱昇華法により酸化亜鉛のナノベルト,ナノワイヤ,櫛状体の大量合成に成功した.

ここでは,従来から報告されている触媒(サファイヤ基板)を用いず,アルミナとシリカからなるセラミックス(HB材)を触媒として用いた.HB材は耐熱材として汎用的であり,またサファイヤ基板に比べ安価である.3.被覆膜の真性ひずみ(不整合ひずみ)を駆動力としたナノワイヤの曲げ変形およびナノコイル形成を飛躍的に促進できるコア流動法(昨年度開発)の高精度化を目的に,コイル径に及ぼす被覆膜厚の影響を調べた.膜厚が1nm以下の場合,被覆効果が不完全のために,コイル形状効率が悪くなり,一方,膜厚を増加すると,不整合ひずみが低下して,コイル径を小さくする(曲率を大きくする)ことができない,という結果を得た,すなわち最適な膜厚が存在することがわかった。4.マイクロカンチレバー先端近傍にナノコイルを形成し,さらに,これに通電するための,当該カンチレバーの配線加工方法を考案した5.3次元分子動力学シミュレーションにより,被覆によるナノワイヤの曲げ-ねじれ連成の変形を確認した.また曲げを促進できる被覆材の選択に関する指針を得た
腎臓のエリスロポエチン遺伝子発現制御機構と腎性貧血発症の関係

エリスロポエチン(Epo)は赤血球の産生量を調節するホルモンとして分泌され、低酸素環境や貧血状態ではその分泌が亢進することで組織への酸素供給が維持される。成体における主なEpo産生臓器は腎臓であるが、腎内Epo産生細胞(REP細胞)についての解析は進んでいない。本研究では、Epo遺伝子周辺180-kbを含む大腸菌人工染色体(BAC)を用いて、Epo産生細胞特異的にCre組換え酵素を発現するトランスジェニックマウス(Epo-Cre)を作成し、REP細胞における低酸素応答能の分子機構および腎性貧血発症との関連を明らかにすることを目的とした。昨年度までに、Epo-Creマウスを3系統樹立し、組換えが起きた細胞で赤色蛍光タンパク質を発現するROSA26-tdTomatoマウスとの交配により、REP細胞を永久標識することに成功した。本年度は、新規に樹立した慢性重度貧血マウス(ISAM)を組合せた解析により、皮質から髄質外層までの間質領域における、ほぼ全ての線維芽細胞がREP細胞としての性質を持つことを明らかにした。この結果は、従来までのEpo産生能は一部の間質線維芽細胞に限定されるという概念に反し、腎内の間質線維芽細胞全体にEpoを産生する潜在能が備わることを示した。また、蛍光標識されたREP細胞を単離して遺伝子発現解析を行った結果、低酸素誘導性遺伝子群の発現活性化に加えて、神経系の解糖系酵素を発現することを見出した。これは、REP細胞が神経様の性質を持つことを示唆する以前の我々のグループの報告を裏付ける知見を得た。さらに、慢性腎臓病により線維化が進行した際のREP細胞の挙動については解析が進んでいないことから、一側尿管結紮術による線維化モデルを用いてREP細胞の追跡実験を行った。その結果、腎障害に伴いREP細胞は筋線維芽細胞へ急速に形質転換してEpo産生能を消失すること、さらに皮質全体の線維化はREP細胞由来の筋線維芽細胞で形成されることを明らかにした。これらの結果は、腎線維化に伴い腎性貧血が発症する機序を解明しただけでなく、REP細胞の保護が慢性腎臓病の有効な治療標的となることを示唆するものであった。赤血球の産生量はエリスロポエチン(Epo)の分泌を介して調節されており、低酸素環境や貧血状態ではEpoの分泌量が亢進し、組織への酸素供給を維持する。成体における主なEpo産生臓器は腎臓であるが、そのEpo産生細胞(REP細胞)におけるEpo遺伝子の発現制御機構については解析が進んでいない。我々はEpo遺伝子周辺180-kbを含む大腸菌人工染色体(BAC)を用いたトランスジェニックマウスの解析により、この領域に腎臓エンハンサーが含まれることを同定している。本研究では、REP細胞特異的にCreを発現するトランスジェニックマウス(REP-Cre)を作成し、REP細胞特異的にHIFや他の転写因子をノックアウトさせた場合のEpo遺伝子発現に与える影響を調べる。これにより、REP細胞の持つ強力な低酸素応答能の分子機構を明らかにすることを目的とする。また、Epo遺伝子発現制御の異常が、腎性貧血発症にどのように関与するのかについても解析を進める。本年度においては、BACを用いてREP細胞特異的Cre発現マウス(REP-Cre)の樹立を試みた。まず、Epo遺伝子周辺180-kbの領域を含むBACクローンに対して大腸菌内相同組換えを行い、Epo遺伝子座にCreリコンビナーゼ遺伝子を導入した。組換えたBACDNAをシークエンス法などにより確認した後、超遠心法により精製したBACDNAを用いてマイクロインジェクションを行った。その結果、REP-Creトランスジェニックマウスを4匹得た。今後、系統樹立できたREP-CreマウスをROSA26Rマウスと交配し、Creの発現や組換えパターンを解析する予定である。このREP-Creマウスにより、細胞培養などが困難であるREP細胞について個体レベルでの詳細な解析が可能となる。本研究では、Epo遺伝子周辺180-kbを含む大腸菌人工染色体(BAC)を用いて、Epo産生細胞特異的にCre組換え酵素を発現するトランスジェニックマウス(Epo-Cre)を作成し、REP細胞における低酸素応答能の分子機構および腎性貧血発症との関連を明らかにすることを目的とする。昨年度に、BACトランスジェニックマウスの手法によりEpo-Creマウスを3系統樹立した。本年度においては、Creによる組換えが起きた細胞で赤色蛍光タンパク質を発現するマウス(ROSA26-tdTomato)を米国ジャクソン研究所から入手し、Epo-Creマウスと交配し、Creが発現する細胞・組織を解析した。その結果、Epoの産生部位である腎臓と肝臓において組換えによるtdTomato蛍光を認めたが、一方でその他の臓器における組換えも検出された。腎臓における組換えについて詳細な解析を行い、REP細胞マーカーであるCD73を発現する尿細管間質細胞で組換えが起きること、また貧血誘導的により組換え細胞が増加することを2系統において明らかにした。

これらの結果から、Epo-Creマウスを用いることでREP細胞特異的なノックアウトなどの遺伝子操作が可能となることを示した。さらに、Epo-Creマウスを利用することで、通常(非貧血)状態におけるREP細胞の解析や、REP細胞の追跡実験が初めて可能になる。エリスロポエチン(Epo)は赤血球の産生量を調節するホルモンとして分泌され、低酸素環境や貧血状態ではその分泌が亢進することで組織への酸素供給が維持される。成体における主なEpo産生臓器は腎臓であるが、腎内Epo産生細胞(REP細胞)についての解析は進んでいない。本研究では、Epo遺伝子周辺180-kbを含む大腸菌人工染色体(BAC)を用いて、Epo産生細胞特異的にCre組換え酵素を発現するトランスジェニックマウス(Epo-Cre)を作成し、REP細胞における低酸素応答能の分子機構および腎性貧血発症との関連を明らかにすることを目的とした。昨年度までに、Epo-Creマウスを3系統樹立し、組換えが起きた細胞で赤色蛍光タンパク質を発現するROSA26-tdTomatoマウスとの交配により、REP細胞を永久標識することに成功した。本年度は、新規に樹立した慢性重度貧血マウス(ISAM)を組合せた解析により、皮質から髄質外層までの間質領域における、ほぼ全ての線維芽細胞がREP細胞としての性質を持つことを明らかにした。この結果は、従来までのEpo産生能は一部の間質線維芽細胞に限定されるという概念に反し、腎内の間質線維芽細胞全体にEpoを産生する潜在能が備わることを示した。また、蛍光標識されたREP細胞を単離して遺伝子発現解析を行った結果、低酸素誘導性遺伝子群の発現活性化に加えて、神経系の解糖系酵素を発現することを見出した。これは、REP細胞が神経様の性質を持つことを示唆する以前の我々のグループの報告を裏付ける知見を得た。さらに、慢性腎臓病により線維化が進行した際のREP細胞の挙動については解析が進んでいないことから、一側尿管結紮術による線維化モデルを用いてREP細胞の追跡実験を行った。その結果、腎障害に伴いREP細胞は筋線維芽細胞へ急速に形質転換してEpo産生能を消失すること、さらに皮質全体の線維化はREP細胞由来の筋線維芽細胞で形成されることを明らかにした。これらの結果は、腎線維化に伴い腎性貧血が発症する機序を解明しただけでなく、REP細胞の保護が慢性腎臓病の有効な治療標的となることを示唆するものであった。今回作成したEpo産生細胞特異的Cre発現トランスジェニックマウス(Epo-Cre)は、期待通りにREP細胞において組換えを起こすことが明らかとなり、今後の多くの研究に有用であることが期待されるため。今後は、低酸素応答関連因子であるHIF-2αやPHDsの条件付きノックアウトマウスとEpo-Creマウスを交配し、Epo遺伝子発現やREP細胞自身の形質に与える影響を解析する予定である。さらに、Epo-Creマウスを用いたREP細胞の追跡実験を行い、慢性腎臓病における線維化とREP細胞の関係についての解析も進めていきたい。
終末期がん患者・家族による評価を導入した看護サービス改善の検討

本研究では、一般病棟において治療を行いながら療養生活を送る終末期がん患者とその家族へのよりよい終末期がん看護サービスのあり方を、入院中の患者・家族および看護師への面接調査結果を反映させながら検討することを目的としている。本年度は、研究代表者が終末期がん患者・家族へ当該年度以前に行ってきた家族面接調査結果を参考に、一般病棟における終末期看護サービス改善に役立てるための半構成的質問紙(インタビューガイド)を他研究者からの専門的見解も反映させながら作成した。倫理的配慮として、岡山大学大学院医歯薬学総合研究科倫理委員会から研究の承認を得た。その後、施設への研究協力依頼において当初の計画よりも時間を要したため、本年度においては公表できる研究結果が得られていない。現在、本研究への協力が得られた施設において、研究開始にあたり研究対象者の選別や研究資料等について施設側研究協力看護師らとともに綿密な調整を行っている。本研究の成果は、次年度に得られるデータ分析による結果を報告する。なお、施設への研究協力依頼に要した期間中、本研究に関連した家族面接技術向上のためのセミナーや日本緩和医療学会が主催する教育プログラム等に参加し、新たな知見を得たため次年度の研究に反映させていく。