hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高圧下および高圧処理後の筋肉内デコリン分子構造変化の解析

我々は、これまでの研究から、高圧処理による筋肉内結合組織の脆弱化には主要成分であるコラーゲン繊維を接着・強化している筋肉内デコリンのコラーゲンからの遊離が関与することを予想した。このことから、まずは筋肉内結合組織を単離してそこに含まれる筋肉内デコリンを抽出・単離・精製し、高圧処理に伴うデコリン分子構造変化を詳細に検討することを試みた。平成2829年度において、筋肉内結合組織から単離・精製されたデコリンが1本のデルマタン硫酸鎖と約50 kDaのコアタンパク質を有するデコリンであることを確認した上で、デコリンコアタンパク質を調製し、蛍光光度計を用いて高圧処理後ならびに高圧下でのデコリンコアタンパク質の三次構造を検討したところ、(1) 700 MPaまでの高圧処理ではデコリンコアタンパク質は分解されないこと、(2)デコリンコアタンパク質の三次構造は100 MPa以上の圧力で変化し始め、400 MPaまでは除圧後も元の値に戻らず、従って400 MPaまでの高圧処理はデコリンコアタンパク質の不可逆的な立体構造変化を引き起こすこと、が示された。平成30年度ではさらに詳細を検討すべく、高圧下での表面疎水性ならびに二次構造変化を調査した。8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid (ANS)を用いて高圧下で観察したところ、ANS由来蛍光強度は100 MPaから400 MPaにかけて徐々に低下し、デコリンコアタンパク質内のトリプトファンおよびフェニルアラニン残基は高圧処理に伴って溶媒側に露出した後にタンパク質間で疎水性相互作用を引き起こしていることが示唆された。一方、円偏光二色性測定装置を用いた二次構造解析では、デコリンコアタンパク質の高圧処理に伴う変化は認められなかった。我々は、これまでの研究から、高圧処理による筋肉内コラーゲン線維/結合組織の脆弱化には、コラーゲン線維を接着している筋肉内デコリンのコラーゲンからの解離が関与することを予想し、まずは、高圧処理に伴うデコリン分子構造の変化を詳細に検討することを目的とした。以上の目的から、平成28年度では以下の実験を実施した。科研費基盤C(H24H26年度)研究で確立した手法(Hosonoら,2014)を用い、年間を通じて常時ウシ筋肉内デコリンを抽出・単離・精製した。各種電位泳動を用い、精製したデコリンは1本のデルマタン硫酸鎖(約50 kDa)と約50 kDaのコアタンパク質を有するスモールプロテオグリカンであることを確認した。精製デコリンに対してコンドロイチナーゼABC処理を行った後にイオン交換クロマトを行い、筋肉内デコリンコアタンパク質を調製した。トリプトファン残基(295 nm)およびチロシン残基(280 nm)を内部プローブとして測定した700 MPa高圧処理を行った筋肉内デコリンコアタンパク質の蛍光スペクトルはわずかに低下し、高圧処理に伴ってデコリン分子の3次構造が不可逆的に変化した。また、高圧下・同条件での蛍光スペクトル解析ならびにANSを用いた実験により、400 MPaまでの高圧力下でデコリン分子の3次構造が不可逆的に変化すること、特にコラーゲン分子と相互作用する領域と予測されるデコリンコアタンパク質末端領域における構造変化が大きく、高圧処理に伴う筋肉内コラーゲン線維構造の脆弱化との関連性が推測された。筋肉内デコリンの単離・精製については、収量も精製度も高く、極めて順調に進展した。一方で、平成28年度に、DSCを用いたデコリン分子の熱力学的挙動ならびにCDを用いたデコリン分子の2次構造解析を行う予定であったが、DSC装置の最適化が不調であり、したがって、平成29/30年度に行うべき実験の一部(高圧処理に伴うおよび高圧下でのデコリン立体構造の解析実験を平成28年度に行い、全体としては(辻褄が合った状態で)順調に推移した。なお、平成28年度に予定していた実験に関しては、平成29年度に行うべく、現在、DSC解析条件の最適化を行っているところである。我々は、これまでの研究から、高圧処理による筋肉内結合組織の脆弱化には、筋肉内結合組織の主要構成成分であるコラーゲン線維を接着・強化しているデコリンのコラーゲンからの解離が関与することを予想し、高圧処理に伴うデコリン分子構造の変化を詳細に検討することを目的とした。以上の目的から、初年度の平成28年度では、まずウシ骨格筋から筋肉内デコリンを抽出・単離・精製を行った。精製されたデコリンが1本のデルマタン硫酸鎖と約50 kDaのコアタンパク質を有することを確認したのちに精製デコリンからコアタンパク質を調製し、デコリン分子の三次構造を解析したところ、400 MPaまでの高圧処理でデコリン分子の三次構造が不可逆的に変化することを見出した。平成29年度では、上記の結果をさらに確立するため、トリプトファン残基及びチロシン残基を内部プローブとして高圧下でのデコリン分子の蛍光スペクトルを測定し、並びに、ANS試薬を添加して高圧下でデコリン分子表面の疎水性の変化を測定した。さらに、SDS-PAGEにより、高圧処理に伴うデコリン分子の分解を解析した。以上の実験から、デコリン分子は高圧処理により分解されることはないが、処理圧力の上昇に伴って疎水性アミノ酸残基が徐々に分子表面に露出する方向でデコリン分子の立体構造が変化してゆき、400 MPaの高圧処理を行うと、圧力解放後もデコリン分子の立体構造は元に戻らないことが示された。

以上の高圧下でのデコリン分子の立体構造変化がコラーゲン線維との相互作用に関係することが推測された。筋肉内デコリンの単離精製並びにデコリン分子立体構造変化解析実験等は順調に進展したが、平成29年度に予定していたもう一つの実験(デコリン分子の二次構造解析)にまでは至らず、進捗としてはやや遅れていると判断した。デコリン分子の二次構造解析にためには単離精製デコリン試料が大量に必要となるため、平成29年度後半でデコリン単離精製の負担が大きくなったためである。デコリン分子の二次構造解析は、平成30年度前半にさらに大量のデコリンを単離精製してから平成30年度後半に実施する。我々は、これまでの研究から、高圧処理による筋肉内結合組織の脆弱化には主要成分であるコラーゲン繊維を接着・強化している筋肉内デコリンのコラーゲンからの遊離が関与することを予想した。このことから、まずは筋肉内結合組織を単離してそこに含まれる筋肉内デコリンを抽出・単離・精製し、高圧処理に伴うデコリン分子構造変化を詳細に検討することを試みた。平成2829年度において、筋肉内結合組織から単離・精製されたデコリンが1本のデルマタン硫酸鎖と約50 kDaのコアタンパク質を有するデコリンであることを確認した上で、デコリンコアタンパク質を調製し、蛍光光度計を用いて高圧処理後ならびに高圧下でのデコリンコアタンパク質の三次構造を検討したところ、(1) 700 MPaまでの高圧処理ではデコリンコアタンパク質は分解されないこと、(2)デコリンコアタンパク質の三次構造は100 MPa以上の圧力で変化し始め、400 MPaまでは除圧後も元の値に戻らず、従って400 MPaまでの高圧処理はデコリンコアタンパク質の不可逆的な立体構造変化を引き起こすこと、が示された。平成30年度ではさらに詳細を検討すべく、高圧下での表面疎水性ならびに二次構造変化を調査した。8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid (ANS)を用いて高圧下で観察したところ、ANS由来蛍光強度は100 MPaから400 MPaにかけて徐々に低下し、デコリンコアタンパク質内のトリプトファンおよびフェニルアラニン残基は高圧処理に伴って溶媒側に露出した後にタンパク質間で疎水性相互作用を引き起こしていることが示唆された。一方、円偏光二色性測定装置を用いた二次構造解析では、デコリンコアタンパク質の高圧処理に伴う変化は認められなかった。平成29年度は、(1) DSC分析やCD解析を行うためには大量の精製デコリンが必要なため、引き続き、年間を通じて常時ウシ筋肉内デコリンを抽出・単離・精製する。(2) DSC分析/解析条件の最適化を行った上で、高圧処理したデコリンの熱変性挙動を明らかにし、高圧処理に伴うデコリン分子構造の変性状態や安定性を解析する。(3)高圧下ならびに高圧処理後のデコリンコアタンパク質のCD解析を行い、デコリン分子2次構造の変化およびその可逆性を検討する。平成30年度は、(1)平成30年度に予定している解析実験には大量の精製デコリンが必要となるため、引き続き年間を通して(特に年度前半に)ウシ筋肉内デコリンを抽出・単離・精製する。(2)高圧下並びに高圧処理後のデコリンコアタンパク質のCD解析を行い、デコリン分子の二次構造変化及びその可逆・不可逆性を検討する。(3)高圧下でのデコリン分子の遊離SH基量を測定し、デコリン分子の三次構造変化との関連性を検討する。
合成ペプチドによる塩基性線維芽細胞増殖因子の受容体結合阻害と血管新生の抑制

血小板第4因子(PF-4)には、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の受容体結合阻害活性と、血管新生のin vitroにおける抑制作用があり、その活性中心は、ヘパリン結合部位であるC末端の10個のアミノ酸フラグメントに存在する。そこで本年度では、bFGFの受容体結合阻害活性を持つ最小アミノ酸単位を決定すべく、C末端の10個のアミノ酸フラグメントC-10(KKIIKKLLES)のうち、特にヘパリン結合性に関与していると考えられる6個のアミノ酸フラグメントC-6(KKIIKK)を作成し、その活性をC-10と比較した。その結果、C-6には活性は認められず、このことは、アミノ酸の荷電のみならず、アミノ酸フラグメントの三次元構造も重要であることを示唆している。さらに次に、C-10の血管新生抑制活性をin vivoの系で検討した。dorsalair sac法により観察されるマウス背側皮下での血管新生を、C-10が抑制しうるか否かを検討したが、C-10の静脈投与では血管新生を抑制することはできなかった。この結果から、C-10の投与量の問題とともに、in vivoの血管新生にはbFGF以外のファクターが同時に関与していることが考えられた。血小板α顆粒に含有される血小板第4因子(PF4)には血管新生抑制作用の有ることが報告されているが、申請者はこのPF4の血管新生抑制作用が、血管新生因子である塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の受容体への結合を阻害することによっていることを報告した。そこで本研究では、PF4分子中のbFGF受容体結合阻害の活性部位を同定すると共に、その部位の合成フラグメントを用いて血管新生のコントロ-ルが可能かどうかを検討した。bFGFの受容体への結合はヘパリンあるいはヘパラン硫酸に依存していることが報告されているが、PF4にはそのC末端部位にヘパリン結合ドメインが存在しヘパリンの作用を中和することが知られている。そこでC末端のヘパリン結合ドメインを合成して、まず^<125>IーbFGFの受容体結合に及ぼす効果を検討したところ、合成ペプチドはPF4と同様に^<125>IーbFGFの受容体への結合を阻害した。次に血管新生において必須の現象である血管内皮細胞のプラスミノ-ゲンアクチベ-タ-(PA)産生に及ぼす影響を検討した。PAの産生はそのmRNAをNorthern blot法で検出し今回購入したデンシトメタ-で定量した。また細胞遊走に及ぼす影響についても検討した。その結果合成ペプチドはPF4と同様にいずれの現象をも阻止した。そこで最終に血管内皮細胞のコラ-ゲンゲル内での管状構造の形成(血管新生のin vitro model)に及ぼす影響を検討したところ、PF4と同様に管状構造の形成を阻害した。すなはちPF4の血管新生抑制作用の活性はC末端のヘパリン結合ドメインにあることが明かとなり、同部位の合成ペプチドを用いても血管新生が阻止される可能性が示された。これまでの研究から、血小板第4因子(PF-4)には塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の受容体結合阻害活性と血管新生抑制作用があること、PF-4のbFGFの受容体結合阻害活性は、C末端のヘパリン結合部位にあることが明らかとしている。そこで本年度は、PF-4のC末端合成ペプチドの血管新生に及ぼす影響について検討した。PF-4のC末端から10、11、12、13、個のアミノ酸から成る4種類の合成ペプチドは、いずれもbFGFの受容体結合阻害についてはほぼ同等の阻害活性を示す。そこでこれら合成ペプチドの血管新生に及ぼす影響を評価するために、血管内皮細胞の遊走能、プラスミノーゲンアクチベーター産生能とコラーゲンゲル内での管腔形成能に対する作用を検討したところ、いずれの合成ペプチドにも同等の阻害活性を認めた。次に種々の腫瘍細胞と血管内皮細胞との混合培養における血管内皮細胞の管腔形成についても検討したが、一定の傾向は得られなかった。このことは、腫瘍による血管新生にはbFGFだけでなくさまざまな因子が複雑に関与していることを示しているものと考えられる。さらにin vivoの血管新生に及ぼす効果についても検討する予定であったが、定量性に問題があるため本年度では実施できず、次年度へ持ち越した。
日周リズムの変調による生活習慣病の発症機構

脂質合成を統御する転写調節因子sterol regulatory element-binding protein-1(SREBP-1)遺伝子のマウス肝臓における発現は,通常食では一日の明暗サイクルの暗期(摂食期)初期にピークを示すのに対し,高炭水化物食,高脂肪食,高タンパク質食では明期(絶食期)にピークを示し,日周リズム形成における栄養組成の重要性が示された。また,アンモニア解毒系のオルニチンサイクル酵素遺伝子群の発現は,高タンパク質食では摂食期を中心に,低タンパク質食(高炭水化物食)では絶食期後期から摂食期初期にかけてピークを有する日周リズムを示し,アミノ酸分解に由来するアンモニアを処理する必要性により摂食期,絶食期ともに活性化されるものと考えられた。糖尿病,循環器疾患,がん等の生活習慣病は我が国を初め先進諸国において,死亡原因の上位を占め,その克服が大きな課題である。生命活動の日周リズムは,一日の明暗サイクルを基盤にして,睡眠-覚醒,食事時間等の基本的な生活習慣の影響によって形成される。従って,生活習慣病の発症にあたっても日周リズムが深く関与しているものと予想され,事実,心筋梗塞の多発時間帯の存在,夜勤による乳がん発症リスクの増加等の例が知られている。日周リズムの変調による生活習慣病の発症機構の研究にあたっては動物実験モデルの確立が急務である。本研究は,マウスにおいて,明暗サイクルおよび摂食時間の変調が肥満等に及ぼす影響を明らかにし,生活習慣病発症のモデル系を確立するとともに,発症機構を解明することを目的とする。(1)脂質合成を統御する転写調節因子sterol regulatoryelement binding protein-1c(SREBP-1c)の肝臓における発現の日周リズムの制御機構-SREBP-1は脂質・コレステロール合成系遺伝子群を統御する転写因子であり,第1エクソンの違いによるSREBP-1aとSREBP-1cのアイソフォームが存在する。今回,肝臓におけるSREBP-1遺伝子発現の日周リズムを制御する機構の解析を行なった。夜行性のマウスを12時間:12時間の明暗周期,自由摂食下に飼育し,4時間毎に肝臓よりRNAを抽出した。ノザン法によりSREBP-1(a+c) mRNAレベルを測定すると暗期開始後にピークを有する日周リズムを示した。続いてreal time RT-PCR法により分別的にSREBP-1aおよび-1c mRNAの発現リズムを調べると,SREBP-1aにはリズムが認められず個体差も大きかったが,SREBP-1cでは,ノザン法と同様に明暗周期に同調するリズムが見られた。また、SREBP-1(a+c) mRNAレベルのピークは、6:18および18:6の明暗周期では12:12に比べ,それぞれ,前方および後方に変移することが示された。一方、放出赤外線検出法により単位時間自発運動量を測定すると,12:12、18:6の明暗条件では暗期開始直後に行動量が増加した。6:18では暗期開始後,約2時間から行動量が増加した。以上より,明暗周期は行動リズムとして検出された覚醒・睡眠リズムを通して摂食タイミングを規定することによりSREBP-1c遺伝子の発現の日周リズムを制御すると考えられた。(2)視交叉上核において光刺激に応答して発現が変動する遺伝子の検索-視交叉上核のリズムの光によるリセット機構ならびに光応答性出力機構の解明を目的として,暗期における光照射後2時間および6時間にマウス視交叉上核において発現が変動する遺伝子のマイクロアレイ解析を行ない,多数の候補遺伝子を得た。また,real time RT-PCR法にPer-1およびFos等のマーカー遺伝子のmRNAレベルの上昇を確認した。現在,アレイ解析の結果をreal time RT-PCR法にて確認中である。(1)脂質合成を統御する転写調節因子sterol regulatoryelement binding protein-lc(SREBP-lc)の肝臓における発現の目周リズムの制御機構-SREBP-1は脂質合成系遺伝子群を統御する転写因子であり,第1エクソンの違いによるSREBP-1aとSREBP-1cのアイソフォームが存在する。前年度までのノザン法およびreal time RT-PCR法を用いた解析により,SREBP-1aに比してSREBP-lcのmRNAレベルがマウス肝臓において明瞭な日周リズムを示すことが明らかになった。本年度は,タンパク質レベルでのリズムを調べるため,SREBP-1のエピトープ予想部位の合成ペプチドに対するウサギ抗体を作成した。マウス肝臓抽出液を用いたウェスタン法により,予想される68kDa付近にバンドが検出され,またそれは合成ペプチドにより競合された。今後,同抗体を用いてSREBP-1タンパク質レベルの日内変動を調べる予定である。(2)視交叉上核において光刺激に応答して発現が変動する遺伝子の検索-視

交叉上核のリズムの光によるリセット機構ならびに光応答性出力機構の解明を目的として,マイクロアレイ解析を行った。その結果,暗期における光照射後2時間で1.5倍以上mRNAレベルが有意に増加した遺伝子は80個,減少した遺伝子は12個,6時間で発現が増加した遺伝子は14個,減少した遺伝子は31個であった。タンパク質合成、修飾、分解系,ミトコンドリアエネルギー産生系遺伝子の多くにmRNAレベルの上昇が見られた。Real-time RT-PCRによりmRNAレベルの上昇が確認されたNADHデヒドロゲナーゼサブユニット3およびユビキチンC-末端ヒドロラーゼ3はそれぞれNADH/NAD^+比,時計タンパク質の分解を制御することにより時計遺伝子の転写活性を調節している可能性が考えられた。(1)脂質合成を統御する転写調節因子SREBP-1遺伝子の肝臓における発現の日周リズム-SREBP-1は脂質合成系遺伝子群を統御する転写因子であり,以前,その発現がマウス肝臓において明瞭な日周リズムを示すことを明らかにした。また,その日周リズムの形成,変調においては,明暗サイクルと摂食絶食サイクル(給餌タイミング)の両者の影響を受けること,すなわち,一日(24時間明暗サイクル)の中の"何時"摂食するかが,重要であることを明らかにした。今回,高炭水化物食,高脂肪食,高タンパク質食摂取がSREBP-1mRNAレベルの日周リズムに及ぼす影響を調べたところ,通常食では12時間:12時間明暗サイクルの暗期(摂食期)初期にピークを示すのに対し,他の変異食ではいずれも明期(絶食期)にピークが移動した。すなわち,"何を"摂食するかがSREBP-1遺伝子発現リズムの形成に重要であるかが明らかになった。(2)オルニチンサイクル酵素遺伝子発現の日周リズム-アミノ酸分解により発生する有毒なアンモニアを尿素へと変換することによる解毒は,摂食期のみならず,体タンパク質分解の起こる絶食期にも亢進すると予想される。今回,尿素合成を行うオルニチンサイクルの5種類の酵素遺伝子群についてそのmRNAレベルの日周リズムを調べた。通常食では,多くの酵素遺伝子は明瞭な発現リズムを示さなかった。一方,高タンパク質食では,2,3,4,5番目の酵素mRNAレベルは暗期(摂食期)を中心にピークを有する日周リズムを示した。また,低タンパク質食(高炭水化物食)では,1,3,4番目の酵素mRNAレベルは明期(絶食期)後期から暗期(摂食期)初期にかけてピークを有する日周リズムを示した。従って,同酵素遺伝子群の発現は日周性の制御下にあり,アミノ酸分解に由来するアンモニアを処理する必要性から,摂食期,絶食期ともに活性化されることが示唆された。(1)マウス肝臓におけるオルニチンサイクル酵素遺伝子発現の日周リズムの解析:肝臓において,アミノ酸に由来するアンモニアを解毒するオルニチンサイクルは,摂食期(夜行性生物の暗期)のみならず,体タンパク質分解の起こる絶食期(明期)にも亢進すると予想され,その日周リズムの形成機構は極めて興味深い。
中重核領域における短寿命中性子過剰核の磁気モーメントの測定

中重核領域の中性子過剰核を対象に精密核分光研究を行う事を目的として、短寿命な不安定核を迅速・高効率に取り出して質量分離するための装置として、RFイオンガイド法の開発を行っている。本研究では、不安定核イオンの引出し部に六極型イオンガイドを導入することで質量分解能の改善を図り、不安定核イオンの収量向上を目指した。また、SPIGの導入と同時に、加速領域の真空コンダクタンスの改善を行った。これらの改良の後、中重核領域に複数の安定同位体を持つXeを用いて従来のスキマーシステムとの比較を行った。その結果、質量分解能はスキマーシステムの60に対し、SPIGシステムでは310まで向上させることに成功した。短寿命の不安定核を迅速、高効率で取り出して質量分離するための装置としてRFイオンガイド型同位体質量分離装置を開発している。本研究では開発の最終段階として、これまでの研究により有効性を証明できたRFカーペットをガス停止容器全面に配置する。これは、不安定核イオンが壁に付着して失われることを防ぐものである。それと同時に、イオン引出し部直後の差動排気部に、リニアトラップの原理を用いた六極のロッドによるRF線形トラップ(SPIG)を導入する。また、オフラインでこれらの装置のパラメータ探索や性能試験を実施する。以上により現有のイオンガイドの収量を10倍に増加することを目指している。昨年度は、初年度に製作したSPIGの導入を進めた。現有のイオンガイドは30 kPaという高圧力領域から10 Paの真空領域へと移行する差動排気中間領域に、高電圧(1 kV)での引き出し系を用いていることから、イオン引出時に、ガス衝突による速度分散を起こし、結果として引出し効率、質量分解能、輸送効率の劣化を招いている。特に質量分解能は60程度であり、これにより輸送効率が30%程度となっている。そこで、高真空を保ちながら低電圧での高効率引出しを実現するために、ガスセルの出口とスキマー電極の間にSPIGを設置した。SPIGを設置した状態で、ガスセル中へ導入するヘリウムガスにXeガスを少量混合し、質量数130前後のXeイオンを引出して質量分解能を測定した。その結果、質量分解能は300以上となり、SPIG導入前と比較して大幅に改善することに成功した。これにより、質量数が130前後の中重核にたいしても単一アイソバービームとして、ビームライン末端まで輸送することが可能となった。また、震災復旧後のビームコースの試験を兼ねて、オンライン実験も実施した。短寿命の不安定核を迅速、高効率で取り出して質量分離するRFイオンガイド型同位体質量分離装置(RFIGISOL)を開発している。本研究では開発の最終段階として、リニアトラップの原理を応用したRF線形トラップをイオン引出し部直後の差動排気部に導入する。RF線形トラップとして本研究では六極型(SPIG)を採用する。また、加速器からのビームを用いずに行うオフライン実験で、RFIGISOLやSPIGのパラメータ探索や性能試験を実施する。以上により、現有のRFIGISOLから引き出される不安定核の収量を10倍に増加することを目指している。RFIGISOLでは、30 kPaの高圧力領域から10 Paの低圧力領域へと移行する差動排気領域に高電圧での引出系を用いており、イオン引出時にガスとの衝突による速度分散を起こし、引出効率や質量分解能、輸送効率の低下を招いていた。そこで、高真空を保ちながら低電圧での引出しを実現するために、差動排気領域にSPIGを導入した。オフライン実験では、中重核領域での質量分解能を測定するために、緩衝ガスとしてガスセルに導入しているHeガスに少量のXeガスを混合し、主に放電型イオン源を用いてXeをイオン化し、質量分離を行った。その結果、質量分解能はSPIG導入前と比較して、2倍に改善した。さらに質量分解能を上げるために、スキマー電極の撤去と差動排気部のコンダクタンスを改善する改良を実施した。その結果、質量分解能は300となり、SPIG導入前と比較して大幅に改善することに成功した。また、質量分解能が向上した一方で、不純物イオンの増加が見られた。その対策として、RFIGISOL排気系の補助ポンプとして、新たにドライポンプを導入したほか、ベーキングの強化も実施し、不純物イオンの抑制を図っている。短寿命の不安定核を迅速,高効率で取り出して質量分離するための装置としてのRFイオンガイド法を開発している.本研究では最終段階の開発として,これまでの研究により有効性を証明できた不安定核イオンが壁に付着して失われるのを防ぐRFカーペットをガス停止容器全面に配置する.それと同時に引き出し直後の差動排気部にリニアトラップの原理を用いた六極のロッドによるRF線形トラップ(SPIG)の導入する.

また,オフラインでこれらの装置のパラメータ探索や性能試験をするための252Cf核分裂用線源の開発を行う.以上により現有のイオンガイドの10倍の収量増加を目指す.今年度はSPIGの開発に着手した.現有イオンガイドは30 kPaという高圧領域から10 Paの真空領域へと移行する差動排気中間領域に高電圧での引き出し系(DC 1kV)を用いていることから引き出し時のガス衝突による速度分散を起こし,結果として引き出し効率,質量分解能,輸送効率の劣化を招いている.そこで高真空を保ちながら低電圧での高効率引き出しを実現するために引き出し部にSPIGを導入する.研究としてはSPIGの設計と製作を行い,RF印加のための回路も製作した.そして,RFアンプとユニット式受信機用いて単体での特性を調査した.単体ではイオンのトラップに必要な2 MHz近傍における180 VppのRFを印加できることを確認した.東日本大震災により、RFイオンガイド型同位体質量分離装置(RFIGISOL)が設置されている実験室の放射線遮蔽扉が損傷した。また、ビームラインも地震の揺れによりアライメントにずれが生じたため、2012年10月まで復旧工事が行われた。この間、実験装置やビームラインの一時的な移動・撤去や冷却水の停止などがあった。これに伴い、初年度の研究計画に遅れが生じた。そのため、研究計画を変更し、RFIGISOLを使用せずに実施可能な項目を前倒しするなどの工夫を行ったが、震災復旧工事が当初予定の2012年5月から10月へとずれ込んだ影響もあり、全体的に遅れが生じている。今年度はSPIGについては設計と製作を行い,RF印加のための回路も製作した.また,RFアンプとユニット式受信機用いて単体での特性を調査した.一方,開発を行っている東北大学サイクロトロン・ラジオアイソトープセンターの施設が被災したため,冷却水等インフラが全く使用できず,当初予定していた項目のうち改良型RFイオンガイド法の開発およびそれの性能試験のための252Cf核分裂線源の開発を行うことができなかった.昨年度までに、SPIGの導入と、それによる質量分解能の改善に成功している。しかし、Xeガスと比較して、収量の少ない不安定核については、ガスセルからの引出しと、ビームコース末端への輸送を確認できていない。これは、ガスセル中で不安定核イオンが熱化する際に、ガスセル内の不純物との衝突により、中性化や複合分子イオンを形成しているためと考えている。平成25年度には、複合分子イオン形成の原因となっている不純物の除去や、複合分子イオンの積極的な分解などを試験する。不純物の除去としては、真空排気系の改善の他、ガスセル内に設置されたRFカーペットに用いている材質の再検討と改造を行う。それでもなお、複合分子イオンが有意に抑えられない場合も考えられる。これまでの研究から、ガスセル出口とSPIGとの間の電位により、複合分子イオンの分解が可能であることが知られている。そこで、複合分子イオンを分解しつつ、放電せず安定して印加可能な電位を探索する。これらの対策の効果をオフラインで確認した後に、オンライン実験を実施し、不安定核の収量を確認する。そしてさらに、核モーメントの測定へと進めていく。本研究開発にはCYRIC施設の震災からの復旧が不可欠である.
ナイロンオリゴマー分解酵素（ＮｙｌＡＢＣ）の分子設計と物質生産への応用

ナイロン分解酵素NylCはAsn266-Thr267間で分断され、活性型酵素へ変換される。自己分断部位への変異導入で、前駆体として得られる変異体を構築した。その立体構造解析から自己分断の分子機構モデルを提案した。また、同酵素はテトラマー構造をとるが、耐熱性に影響を与える変異の大半が、各モノマー分子の接触界面に位置する。特に122位の置換は耐熱性に大きく影響するため、同部位に着目した変異体を構築した。構造解析の結果、熱安定性の高い変異体では、隣接モノマーとの距離が近接しており、より強い分子間相互作用が働いていることが分かった。さらに、親型酵素から耐熱性が36°C上昇した変異酵素の取得にも成功した。加水分解酵素の逆反応によるアミド合成は、物質生産の観点から重要な検討課題であるが、本来の加水分解機能と比べて、通常、有機溶媒中における合成活性が低いため、十分な収率が得られない。本研究では、種々のナイロンオリゴマー分解変異酵素を用いて、高効率のアミド合成を可能とする触媒中心の形成要件について検討した。これまで、NylB'カルボン酸エステル分解酵素からのナイロンオリゴマー分解活性の高機能化では、G181D→H266Nによる適応歩行(タイプA変異)と、D370Y→R187S→F264Cによる適応歩行(タイプB変異)の2種類が存在することを確認しているが、前者ではアミド分解活性(水溶液中)と合成活性(有機溶媒中)がほぼ同等であった(合成/分解活性比≒1)。一方、後者の変異酵素では、分解活性のみを有し、合成活性は検出されなかった(合成/分解活性比<0.005)。生成物平衡濃度に影響を与える箇所として、触媒クレフト先端部に位置する187位に着目した。タイプA変異酵素のアルギニン(Arg187)を、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異変異により、種々のアミノ酸に置換した。tert-ブチルアルコール中におけるアミド合成機能と加水分解機能の反応速度論解析を行った結果、変異酵素間の合成収率の変化は、主としてK_<cat>効果によるものであり、基質結合能(K_m値)は殆ど影響を受けないことが明らかとなった。さらに、アミド合成の触媒効率(K_<cat>/K_m)は、370位アミノ酸置換によって影響を受け、バリン置換によって最も高い触媒効率を示すことを見いだした。これらの変異酵素の立体構造解析を行った結果、アミド合成を高効率で触媒するため、触媒クレフト周辺の疎水性反応場形成(水排除効果および触媒部位の外部環境への遮蔽)が重要であると結論した。ナイロンの再資源化においては、副産物の原料への変換が重要な検討課題である。ナイロンオリゴマー分解菌Arthrobacter sp.KI72株が生産する6-アミノカプロン酸環状2量体(Acd)加水分解酵素(NylA)は、Acdに極めて特異性が高く、ε-カプロラクタム、6-アミノカプロン酸直鎖状2量体(Ald)には殆ど活性を示さない。これまでの研究により、Ser174,cisSer150,Lys72が触媒残基であることが分かっている。本年度はAcdの2カ所のアミド結合の内、加水分解を受けない側のアミド結合近傍に位置するAsn125,Cys316の変異体を用いて、Ald及び炭素数の異なる環状アミド(ω-ラウロラクタム,ω-オクタラクタム,ε-カプロラクタム)に対する分解機能を検討した。変異型NylA発現株から粗酵素液を調製し、陰イオンクロマトグラフィーで精製後、Aldと各ラクタムの分解活性を測定した。その結果、Ald分解活性は、N125D,C316Dの2酵素では親型NylAに比べて4060倍上昇することを見いだした。また、触媒効率(kcat/km)は6070倍上昇し、125位、316位のAsp置換は新たにNylB機能を付与すると推定した。ε-カプロラクタム、ω-オクタラクタム分解活性は微弱であるものの、316位がPhe,Leu型の変異酵素で活性の付与・強化が示された。一方、ω-ラウロラクタムに対する活性はC316L変異により、親型酵素の3倍に上昇したが、C316F変異により3%まで低下した。酵素・基質複合体の立体構造から、本酵素の基質認識について考察した。Arthrobacter sp.KI72のナイロン加水分解酵素(NylC)は、3量体以上の6-アミノカプロン酸オリゴマーをエンド型で分解する。

同酵素は、αサブユニット(27kDa)とβサブユニット(9kDa)がヘテロ2量体を形成し、さらに、これらが4分子会合した(αβ)4構造を有する。これまで、サブユニット界面に位置する4アミノ酸置換(D122G-H130Y-D36A-E263Q変異)により、親型NylCの熱変性Tm値が、52°Cから88°Cまで上昇することを見いだした。特に、D122G置換が熱安定性に大きく影響することから、耐熱性が異なるVal, Arg, Lys変異酵素についてX線結晶構造解析を行った。その結果、1.051.2Åの高解像度の結晶構造の取得に成功した。得られた結果から、122位と近接するLys159(A鎖)ーGlu115(B鎖)間の距離は、野生型では2.82Åとなっているが、耐熱性の高い酵素ほど、側鎖間の距離が近接するという現象が確認できた。さらに、野生型ではループのゆらぎにより、モノマーAの130位付近の電子密度が観察できないのに対し、耐熱性の高いGly酵素ではモノマーAの130位付近の電子密度が観察することができた。すなわち、122位の置換は、局所的な静電的安定化効果に加え、サブユニット界面において、ループの安定化に影響すると推定した。また、同ループ上に位置する137位においても、Ala, Phe, Trp置換により、耐熱性が大きく低下したことから、側鎖の大きさが構造の安定化に関係していると考えられた。さらに、NylCの自己分断機構を明らかにする為、部位特異的変異導入法により変異酵素を取得し、自己分断に関わるアミノ酸残基の特定と役割の推定を行った。1.ナイロン工場排水などを分離源として、6アミノカプロン酸オリゴマーを加水分解する微生物の取得を行い、酵素精製と特徴付け、遺伝子クローニングと塩基配列解析、高発現化を行った。また、好アルカリ性細菌など、特殊な環境で生育可能な微生物を含めて、約10種類の分解菌を取得した。2.これまで、10量体程度のオリゴマーは、3種の酵素NylA, NylB, NylCによりモノマーまで分解できることが明らかとなっていたが、今回、親型NylC(熱変性のTm値52°C)のサブユニットA/B界面に位置する4変異導入により、Tm値が88°Cまで上昇した変異酵素を構築できた。さらに、同酵素は、6ナイロン、66ナイロン、修飾ナイロン(6ナイロンのアミド窒素の約30%がメトキシメチル基で修飾)など、種々のポリアミドに作用することを見いだした。3.GPC分析では、固体表面の分子量変化の検出が困難であったが、新規表面分析(ガスクラスター2次イオン質量分析)の導入により、ナイロン分解の定量的分析が可能な実験系が整った。4.Ahx直鎖2量体から、モノマーへの変換は、NylBにより行われる。NylBはモノマーから、直鎖2量体を高効率で合成できるが、数アミノ酸置換で、合成・分解の反応方向性、アミド合成収率が大きく変化する。高効率のアミド合成が可能な触媒中心の形成要件を、立体構造・理論化学・速度面から明らかにすることができた。5.N-メチル化アミド結合を特異的に加水分解する酵素は、分子間の水素結合の緩和、特異的な切断・再結合を制御する方法として有用であるが、同機能を有する新規酵素も見いだした。NylAの基質認識部位を構造から同定後、アミノ酸置換を行った。その結果、これまで活性が検出されなかった、6アミノ酸直鎖2量体、εカプロラクタム、ωラウロラクタムなどの新たな基質に対する活性を、計画的に増強することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。
Ost癌遺伝子の構造と機能解析

我々は発現ベクター(λpCEV27)を用いてラットの骨肉腫細胞株からtransforming活性を有するいくつかのcDNAsを単離してきた。その中で新しい癌遺伝子ostを単離しその構造と機能について検討している。さらに、fibroblast growth factor receptor2(FGFR2)の活性化についても検討した。1.ost癌遺伝子は、構造とその機能においてDbl癌遺伝子と類似点がある。Ost産物はDH(Dbl homology)領域とPH(Pleckstrin homology)領域を有している。Dbl癌遺伝子との類似点がありRhoファミリー低分子量G蛋白質(RhoA、Cdc42とRacl)を制御している。2.ヒトost遺伝子の単離とその構造の解析については、現在進行中である。
配列選択的活性化を利用した新規RNA切断法の開発と遺伝子診断への応用

切断したいRNAと相補的な2本のPNAを用いて、切断したい位置だけを一本鎖にしておくことで、RNAを配列選択的に切断することができることがわかった。高いRNA切断活性をもつランタニドイオンの他、亜鉛(II)イオンなどでも選択的な切断が可能であった。RNAの相補鎖としてDNAを用いる場合には、インターカレーターであるアクリジンを修飾しておくことで、RNAの切断活性を飛躍的に上昇できることが既に明らかになっているが、相補鎖がPNAの場合には、若干挙動が異なることがわかった。ランタニドイオンを切断の触媒として使用した場合にはほとんど切断活性化が見られないのに対し、亜鉛(II)イオンを用いたときには顕著にRNA切断活性が上昇することが明らかになった。アクリジンによるRNA活性化の機構を解明する上で、非常に重要な知見を得ることが出来た。PNAはRNAと非常に安定な複合体をつくり、分解耐性も高いため、複雑な高次構造を形成するrRNAなどの解析に役立つことが期待される。またRNA切断と質量解析を利用した遺伝子診断系への応用を目指してDNAナノ構造体の形成の研究を行った。8本のB型DNA二重らせんを束ねたDNAナノチューブを設計し、その形成をAFMで確認した。これまでそれぞれ120°の角度で6本のDNAを束ねたナノチューブは報告されているものの、8本を束ねたものは非常に難しいと考えられてきた。本研究では、二重らせんを結合する角度を一本ずつ適宜変えることで、この問題を解決することに成功した。・アポEの遺伝子に関して、プラスミドに挿入したゲノムDNAを大腸菌でクローニングし、抽出したプラスミドから転写した長鎖RNAを基質として、MALDI-TOF/MSによるSNPs解析系の構築を行った。転写範囲、および切断位置を最適化した結果、179merのRNAを転写することで、最も効率よくRNA中の二箇所のSNPサイトの遺伝子型を質量解析で明確に判別することが出来ることが明らかとなった。それぞれのSNPサイトを含む10merおよび12merのRNA断片を切り出せるように2分子のアクリジンを導入した2本の修飾DNAを同時に用いることで、179merのRNAの4箇所を同時に切断して質量解析用のRNA小断片を得た。一方、アクリジンをDNAに導入するためのリンカーの構造も様々に変え、RNA活性化に最適なリンカーを設計した。その結果、L-threoninolに4-aminobutanoic acidを結合したリンカーを介してアクリジンを導入した修飾DNAが最も高いRNA活性化能を示すことが明らかとなった。さらに、アクリジン自体の構造とRNA活性化能との関連も検討した。さまざまな置換基を導入したアクリジンのRNA活性化能を比較した結果、ニトロ基の様な強い電子吸引基とかさ高いアルカンエーテルを組み合わせてアクリジンに導入することが、アクリジンのRNA活性化能を高める上で非常に重要であることがわかった。この知見に基づき、9-amino-6-nitro-2-isopropoxyacridineをL-threoninol由来のリンカーでDNAに導入することにより、アクリジン修飾DNAのRNA活性化能を飛躍的に上昇させることに成功した。さらに、これを利用したSNPs解析法の精度、およびスピードを大幅に改善した。
社会性魚類の顔認知や意図的騙しの研究：脊椎動物の社会認知の起源を目指して

研究課題(魚類の社会認知様式)についての予備実験を行った。基質に産み付けた卵を捕食者から隠蔽する魚、マリアシクリッドBujurquina vittataの繁殖方法を確立し、捕食者提示実験を行った。マリアシクリッドは飼育水槽を水換えすることによって産卵が誘発されていた。マリアシクリッドが産卵後、実験水槽に卵捕食者を想定したGeophagus surinamensisを収容、両者の行動を観察した。観察の結果、捕食者が卵が産み付けられた基質のほうを向いているときは、親個体の卵隠蔽行動(卵が付着した基質を裏返す、卵の付着した基質に別の基質を被せる、卵の付着した基質を別の場所に移動する)が観察される可能性は低かったが、捕食者が卵とは別の方向に身体を向けているとき卵隠蔽行動は多く観察された。これらの結果は、マリアシクリッドの両親は捕食者の視線、自身の位置、自身の卵の位置関係を的確に識別・認知し、卵隠蔽行動をおこなったことを示唆しているだろう。また、実際の生体ではなく動作が統一された刺激でマリアシクリッドの卵保護行動を観察するためCGモデルを作成した。4月からこのCGモデルを用いてマリアシクリッドの両親が捕食者の視線を識別出来るか、更に実験を行う予定である。また、コンビクトシクリッドのOther-regarding preference: ORP (他者に利益を好む性質)についての実験を行った。コンビクトシクリッドは『自身と繁殖パートナーであるメス個体に報酬が与えられる選択肢』を『自身のみに報酬が与えられる選択肢』より選ぶことがわかった。この結果は魚類においても他者に利益を与える行動は、『他者の状況などを理解・認知』した上で『他者に利益を与えようとする情動』に基づいて引き起こされている可能性がある。本年度の当初の予定どおり、実験個体の予備観察を行った。また、魚類の社会認知能力に関する他の実験も同時に進行中である。これらのデータを合わせれば、魚類の社会認知能力の様式を明らかにできると考えられる。当課題の一部は、当該ジャンルの国際科学誌の査読下である。また、次年度の実験準備も整っており、引き続き成果が期待できる。上述のように、本年度はCGモデルを用いたモニター実験を行う予定である。魚類に対するPCモニターを用いたモデル提示実験はすでに一定の成果をあげており(e.g., Satoh et al. 2016)、同様の実験方法で成果が期待できるだろう。また、本課題の一部は科学誌に投稿中である。また、ひきつづき本課題の内容は国際雑誌に投稿していく予定である。その調整、執筆も次年度の課題である。
腰椎分離症の先天的（遺伝的）要因の解明

本研究においては,腰椎分離症発生に関する背景(疲労骨折以外の要因)に着目し,以下の2点,(1)超音波検査を用いた腰椎の血流評価,(2)腰椎分離症の遺伝子解析,についての研究を開始した.これらの研究の最終目的は、分離症を発生前に捉え,発生予防にも繋げることであり,研究を進めてきた.研究(1)に関しては,昨年度までに,まず腰椎分離症・分離すべり症患者6名,その他の腰椎疾患(腰椎椎間板ヘルニア,腰部脊柱管狭窄症など)患者18名腰椎疾患患者に対して,超音波検査を用いた腰椎血流評価を行い,まず下位腰椎周辺の解剖学的構造に対する超音波検査の可能性について検討し報告した.仰臥位で椎体・椎間板の観察,腹臥位では棘突起・椎弓の観察を行い,変性の少ない症例については経椎間孔的に脊柱管内の観察も行うことができた.腰動脈はカラードップラーを用いることで観察できた.仰臥位・側臥位でそれぞれ腹部大動脈から分岐している様子を観察し,また腹臥位で背部から観察することで,椎間関節の近傍を通過し背筋群へ分布する背側枝を観察することも可能であることが判った.ただし,腰動脈から腰椎後方要素への分岐までを連続して観察し,そのvariationを評価することは,現段階では評価は困難であり,実際にはlimitationが多いことが判明し,なんらかの工夫が必要であることが判明し,本年度は少し視点を変えて研究を進めることとした.そこで,これまでの腰椎分離症患者のMRIを見直し,骨折部の周辺の軟部組織に輝度変化が見られることに気づき,軟部組織における所見であれば超音波検査で同定できる可能性があることを指摘した(2019年4月の第48回日本脊椎脊髄病学会学術集会にて発表).またこの所見の周囲の血流を同定しようと工夫をしている段階である.研究(2)に関しては,解析方法が決まり,テスト研究を開始し始めている.本研究課題は大きく以下の2つに分かれる。1.腹部エコーを用いた分離症罹患椎周囲の血流の解析2.腰椎分離症の遺伝子解析前者に関しては,2017年に第29回日本整形外科超音波学会にて演題名「腰椎疾患への超音波検査の導入について」として発表したが,血管のvariationの描出にlimitationを感じ,視点を変えて新しい解析方法について検討しはじめたところである.後者に関しては,詳細な解析方法の検討を含めた研究方法の見直し,ならびに倫理委員会の申請・承認に時間を要し,スタートが遅れたが,少しずつ前進している.1.腹部エコーを用いた分離症罹患椎周囲の血流の解析について解析方法の視点を変えて研究を進めていく.MRIの所見と併せて解析しはじめている.2.腰椎分離症の遺伝子解析試験的実験は開始しており,研究を進めていく.今後,家族例の分離症患者の遺伝的解析から変異があることが報告されたSLC26A2遺伝子(ProcNatl Acad Sci U S A.2015)について,分離症(分離すべり症を含む)の手術患者を対象として解析を行う予定である.これまでの研究結果から,分離症発生メカニズムに関しては,椎弓への血流支配を含めた骨形成に関わるなんらかの先天的要因(遺伝的要因)に,繰り返すストレス(疲労骨折)が加わり発生するものと考えている.我々は更なる病態解明のため腰椎椎弓への血流支配に注目し,分離症の好発高位である第5腰椎の後方要素(椎弓)への動脈分布が,一般人において主に4つのvariationがみられることを報告した(Tezuka F, et al. Eur Spine J, 2016).またそれらのうち分離症が有意に多くみられる血管分布のパターンも同定した(第41回日本整形外科スポーツ医学会学術集会にて発表).本研究においては,これらの所見が分離症発生前に捉えることができれば,発生予防にも繋がると考え,実際の患者に腹部エコーを用いることにより,脊椎周辺の血流評価の可能性について検討している.現在の実施状況は,腰椎分離症・分離すべり症患者4名,分離症以外の腰椎疾患(腰椎椎間板ヘルニア,腰部脊柱管狭窄症など)患者13名に対して,外来診療時に超音波検査を用いて下位腰椎(第4・5腰椎)周辺の動脈の分布を観察した.仰臥位・側臥位でそれぞれ腹部大動脈から分岐する腰動脈を観察することは可能であった.また伏臥位で背部からコンベックスタイプのプローベをあてカラードップラーを用いることで,椎間関節の近傍を通過し背筋群へ分布する背側枝を観察することも可能であることが判った.分離症・分離すべり症患者において,第4腰動脈は観察されるが,後方要素への分布を連続して観察することはできず,第4腰椎のみに分布するのか,途中で分岐して第5腰椎に分枝を出すかなどのvariationを調査することは現時点では困難であると思われ,現在更なる解析方法を検討中である.本研究課題は大きく以下の2つに分かれる。1.腹部エコーを用いた分離症罹患椎周囲の血流の解析2.腰椎分離症の遺伝子解析前者に関する当該年後の結果については、本年開催される第29回日本整形外科超音波学会にて演題名「腰椎疾患への超音波検査の導入について」としてpreliminary dataを発表予定である。しかしながら,現時点での解析方法では血管のvariationの描出にlimitationを感じており,現在新しい解析方法について検討している.

後者に関しては当該年度の予算の関係上、試薬などの準備が遅れていること・解析方法の詳細な検討をしていることなどから進捗が遅れている.腰椎分離症の発生メカニズムは,繰り返すストレス(疲労骨折説)が有力であるが,必ずしもスポーツ活動に従事していない個体にも発生していること,患者の近親者にも高い頻度でみられることなどから,骨形成に関わるなんらかの先天的要因(遺伝的要因)がその背景にあると考えられている.我々は以前より分離症が高頻度で見られる第5腰椎の血流支配(動脈分布)が他の腰椎と異なる点に着目し、その動脈分布は一般人において主に4つのvariationがみられることを報告した.本研究においては,腰椎分離症発生に関する背景(疲労骨折以外の要因)に着目し,以下の2点,(1)超音波検査を用いた腰椎の血流評価,(2)腰椎分離症の遺伝子解析,についての研究を進めている.これらの所見が分離症発生前に捉えることができれば,発生予防にも繋がると考えられる.現在までに21名の腰椎疾患患者に対して,超音波検査を用いた腰椎血流評価を行った.腰椎分離症・分離すべり症患者6名,その他の腰椎疾患(腰椎椎間板ヘルニア,腰部脊柱管狭窄症など)患者18名に対して,まず下位腰椎周辺の解剖学的構造に対する超音波検査の可能性について検討した.仰臥位では椎体・椎間板の観察,腹臥位では棘突起・椎弓の観察を行い,変性の少ない症例については経椎間孔的に脊柱管内の観察も行うことができた(第29回日本整形外科超音波学会にて発表).腰動脈はカラードップラーを用いることで観察できた.仰臥位・側臥位でそれぞれ腹部大動脈から分岐している様子を観察し,また腹臥位で背部から観察することで,椎間関節の近傍を通過し背筋群へ分布する背側枝を観察することも可能であることが判った.ただし,腰動脈から腰椎後方要素への分岐までを連続して観察し,そのvariationを評価することは,現段階では評価は困難であり,なんらかの工夫が必要であることが判った.本研究課題は大きく以下の2つに分かれる。1.腹部エコーを用いた分離症罹患椎周囲の血流の解析2.腰椎分離症の遺伝子解析前者に関するpreliminarydataは,2017年に第29回日本整形外科超音波学会にて演題名「腰椎疾患への超音波検査の導入について」として発表した.しかしながら,現時点での解析方法では血管のvariationの描出にlimitationを感じており,現在新しい解析方法について検討している.MRIの所見と併せて解析することも検討している.後者に関しては,詳細な解析方法の検討を含めた研究方法の見直し,ならびに倫理委員会の申請・承認に時間を要したことなどにより進捗が遅れている.本研究においては,腰椎分離症発生に関する背景(疲労骨折以外の要因)に着目し,以下の2点,(1)超音波検査を用いた腰椎の血流評価,(2)腰椎分離症の遺伝子解析,についての研究を開始した.これらの研究の最終目的は、分離症を発生前に捉え,発生予防にも繋げることであり,研究を進めてきた.研究(1)に関しては,昨年度までに,まず腰椎分離症・分離すべり症患者6名,その他の腰椎疾患(腰椎椎間板ヘルニア,腰部脊柱管狭窄症など)患者18名腰椎疾患患者に対して,超音波検査を用いた腰椎血流評価を行い,まず下位腰椎周辺の解剖学的構造に対する超音波検査の可能性について検討し報告した.仰臥位で椎体・椎間板の観察,腹臥位では棘突起・椎弓の観察を行い,変性の少ない症例については経椎間孔的に脊柱管内の観察も行うことができた.腰動脈はカラードップラーを用いることで観察できた.
ビタミンB12関与ラットメチオニン合成酵素の補酵素認識機構

1.組み換え体ラットメチオニン合成酵素(MS)の発現と精製および性質。ラットMS cDNAをバキュロウイルス-昆虫細胞の発現系で発現させた。MSはほとんどがアポ酵素で発現したので,メチルB_<12>でホロ化して安定化した後,カラムクロマトグラフィーにより精製した。最高比活性や基質のK_m値はラット肝臓の精製酵素と良く一致した。精製MSはcob(II)alamin様の吸収スペクトルを示したが,titanium(III)およびS-アデノシルメチオニンの共存で本来の補酵素であるメチルB_<12>様のスペクトルに変化した。また,還元剤の強さに依存した酸化的失活反応の抑制が確認された。B_<12>の下方配位子部の塩基部やホスホジエステル結合領域がアポ酵素への結合やMS活性発現に重要であることや,シアノB_<12>やアクアB_<12>,アデノシルB_<12>がアポ酵素との複合体形成能が非常に低いことなども示された。2.ラット組織中のB_<12>レベルの変動と酵素活性調節機構の解析妊娠・授乳の期間中親ラットをB_<12>欠乏飼料で飼育して生れた雄ラットを,離乳後B_<12>欠乏飼料で飼育し,B_<12>欠乏ラットを得た.対照群には毎日1μgのシアノB_<12>を経口投与した.B_<12>欠乏群には,体重増加量の低下,尿中メチルマロン酸量の顕著な増加,肝臓中のB_<12>量やホロMS活性,全MS活性,MSタンパク質量の顕著な減少が認められた.B_<12>欠乏ラットにメチルB_<12>を投与すると,比較的短時間でのB_<12>欠乏状態からの回復と,MS活性やMSタンパク質量の経時的に増加が認められた.しかしながら,どの群でもMS mRNA量が同程度だったことと,MSのほとんどがB_<12>を結合したホロ酵素であること,アポMSが不安定であることより,B_<12>の欠乏に伴うMS活性の著しい低下はMSが補酵素による安定化を受けられないためであると結論した.1.組み換え体ラットメチオニン合成酵素(MS)の発現と精製および性質。2.ラット組織中のB_<12>レベルの変動と酵素活性調節機構の解析妊娠・授乳の期間中親ラットをB_<12>欠乏飼料で飼育して生れた雄ラットを,離乳後B_<12>欠乏飼料で飼育し,B_<12>欠乏ラットを得た.対照群には毎日1μgのシアノB_<12>を経口投与した.B_<12>欠乏群には,体重増加量の低下,尿中メチルマロン酸量の顕著な増加,肝臓中のB_<12>量やホロMS活性,全MS活性,MSタンパク質量の顕著な減少が認められた.B_<12>欠乏ラットにメチルB_<12>を投与すると,比較的短時間でのB_<12>欠乏状態からの回復と,MS活性やMSタンパク質量の経時的に増加が認められた.しかしながら,どの群でもMS mRNA量が同程度だったことと,MSのほとんどがB_<12>を結合したホロ酵素であること,アポMSが不安定であることより,B_<12>の欠乏に伴うMS活性の著しい低下はMSが補酵素による安定化を受けられないためであると結論した.1.組み換え体ラットメチオニン合成酵素の精製法の確立。ラットメチオニン合成酵素のcDNAをバキュロウイルスベクターに組み込み,昆虫細胞で大量発現させた。昆虫細胞の酵素含量ははラット肝臓の約500倍であり,酵素の大量調製が可能となった。アポ酵素が不安定だったので,酵素をホロ化して精製した。ラット肝臓酵素の精製法を参考にし,DE-52,ヒドロキシアパタイト,DEAE-TOYOPEARL,Mono-Qのカラムクロマトグラフィーを行うことで,71倍に精製し,純粋なホロ酵素を得た。精製酵素の最高比活性や基質のK_m値はラット肝臓の精製酵素と良く一致していた。以上より,まとまった量の酵素を得ることが困難であった動物メチオニン合成酵素の大量調製への途が拓けた。現在,より簡便な精製法の開発および不安定なアポ酵素の精製を目指して,His-タッグの付いた酵素を発現させ,その精製法の検討を進めている。2.ラットメチオニン合成酵素の性質と活性発現におけるB12の構造と機能の解析。