hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組織工学を応用したバイオコラーゲンバイパス人工食道の開発と臨床応用

今回の研究において,われわれが考案中であるCollagen coated polypropylene meshのスパイラルコイル付きバイパス人工食道に関して,吻合部を中心とした生体適合性と創傷治癒および人工食道内の円滑な食物の通過に関して,基本的構造と素材の検討を行った.雑種成犬の頸部食道内腔粘膜面に吻合部の素材として考えているCollagen coated polypropylene meshを縫着した組織学的検索を行ったところ,mesh周囲からの上皮化はやや乏しく,mesh辺縁の食道粘膜の炎症性変化を認めた.したがって,軽度の異物感染反応は否定できないが,Collagen coatingの量および方法を検討し,より異物感染反応が少ない素材を検討した.異物感染反応を完全に押さえることはできなかったが,Collagen coated polypropylene meshのスパイラルコイル付きバイパス人工食道の試作品を作成し,雑種成犬の頸部食道でのGraftingを行った.しかし,予想以上に吻合部の異物感染反応が強く,縫合不全のコントロールに難渋している.今後は術後に食道透視および内視鏡を行い,その後に吻合部を含めてGraftを摘出し,組織適合性,創傷治癒の程度および上皮化の有無を組織学的に検討する予定である.バイパス人工食道の基本的構造と素材に関する研究と試作品作製今回の研究において,われわれが考案中であるCollagen coated polypropylene meshのスパイラルコイル付きバイパス人工食道に関して,吻合部を中心とした生体適合性と創傷治癒および人工食道内の円滑な食物の通過に関して,基本的構造と素材の検討を行った.バイパス人工食道の問題点としては,食物輸送に伴う消化管内腔での感染,嚥下運動および蠕動運動によって生じる内圧上昇からの縫合不全,生体組織と人工食道の縫合部創傷治癒遅延による縫合不全,吻合部狭窄,異種材料による組織反応などが考えられる.したがって,バイパス人工食道の重要なコンセブトは,吻合部を中心とした良好な生体適合性と創傷治癒および人工食道内の円滑な食物の通過である.以上のことから吻合部に使用される素材は,良好な上皮化を誘導する素材が望まれる.したがって,本研究ではcollagen coated polypropylene mesh素材を選択した.全身麻酔下の雑種成犬の左側頸部を切開し,頸部食道を遊離露出する.同部で食道壁を切開し,内腔粘膜面に吻合部の素材として考えているCollagen coated polypropylene meshを縫着する.食道および創部を閉鎖する.2週間後に同部を再切開し,縫着部の食道壁を摘出する.組織学的検索を行い、組織適合性,創傷治癒の程度および上皮化の有無を評価した.Collagen coated polypropylene mesh逢着の食道粘膜側から上皮細胞の浸潤が見られたが,mesh周囲からの上皮化はやや乏しく,mesh辺縁の食道粘膜の炎症性変化を認めた.したがって,軽度の異物感染反応は否定できないが,Collagen coatingの量および方法を検討し,より異物感染反応が少ない素材を検討中である.今回の研究において,われわれが考案中であるCollagen coated polypropylene meshのスパイラルコイル付きバイパス人工食道に関して,吻合部を中心とした生体適合性と創傷治癒および人工食道内の円滑な食物の通過に関して,基本的構造と素材の検討を行った.雑種成犬の頸部食道内腔粘膜面に吻合部の素材として考えているCollagen coated polypropylene meshを縫着した組織学的検索を行ったところ,mesh周囲からの上皮化はやや乏しく,mesh辺縁の食道粘膜の炎症性変化を認めた.したがって,軽度の異物感染反応は否定できないが,Collagen coatingの量および方法を検討し,より異物感染反応が少ない素材を検討した.異物感染反応を完全に押さえることはできなかったが,Collagen coated polypropylene meshのスパイラルコイル付きバイパス人工食道の試作品を作成し,雑種成犬の頸部食道でのGraftingを行った.しかし,予想以上に吻合部の異物感染反応が強く,縫合不全のコントロールに難渋している.今後は術後に食道透視および内視鏡を行い,その後に吻合部を含めてGraftを摘出し,組織適合性,創傷治癒の程度および上皮化の有無を組織学的に検討する予定である.
極低温磁場中原子間力顕微鏡法による鉄酸化膜の表面ナノ磁性に関する研究

本研究の目的は、原子間力顕微鏡法(AFM)を用いて磁性材料表面(FeO(111)表面)の構造を原子レベルで明らかにし、そこに発現する磁性と構造との関係を明らかにすることである。昨年度までFeO(111)表面の基板となるFe(110)清浄表面を作成し、AFMによる観察を行い、原子レベルで平坦なFe(110)表面を作成することができた。今年度は超高真空下でFe(110)面を酸化し、その条件の最適化行った。さらにAFMによりFeO(111)表面構造の観察を行い、磁性発現機構の解明を試みた。1.FeO(111)表面の作成酸化条件(基板温度300-500度、蒸着量1000-10000L)を変えて最適化を行った。その結果、基板温度300度、蒸着量3600Lで低速電子回折(LEED)のFeO(111)バルク構造を示す1x1スポットやその表面超構造と考えられている2x2スポットが観察された。また、オージェ電子分光(AES)から推定される酸素被服率も過去の文献と一致した。これにより、従来LEEDやAES観察により研究されたFeO(111)薄膜表面と同等の表面が作成できたと考えられる。FeO(111)表面のAFM観察では平坦な表面は得られなかった。画像には数nmオーダーの起伏が多く、FeO(111)薄膜表面は比較的不安定な面であることが分かった。従来のLEED、AESによるFeO(111)表面の研究では強磁性が発現していたため、これはFeO薄膜の数nmオーダーの起伏が作る他の面の露出が原因である可能性もあることがわかった。今後FeO(111)表面の更なる清浄化方法を検討し、磁場あるなしでAFM観察を行い、表面構造と磁性との関係について研究していく。本研究の目的は、原子間力顕微鏡法(AFM)を用いて磁性材料表面の構造を原子レベルで明らかにし、そこに発現する磁性と構造との関係を解明することにある。今年度はAFM装置の高感度化とFe(110)試料表面の清浄化法を探る実験を行ってきた。まず、磁性材料(FeO(111))表面に働く微弱な交換相互作用力を検知し、その相互作用力マッピングを原子スケールで行うために力検出に使用する光検出回路(光干渉計)の高性能化を図った。これにより標準試料(Si(111)表面)のAFM観察像の分解能を向上させることに成功し、表面第一層原子(AFM探針との相互作用力が大きい)のみならず第二層原子(相互作用力が小さい)の同時観察が可能なほどの高感度化を実現した。次にFe(110)清浄表面の作成条件を最適化するために低速電子線回折装置(LEED)とオージェ電子分光(AES)装置をAFM真空チャンバーに導入した。これによって質の良いFe(110)表面を作成することができるようになり、現在走査型トンネル顕微鏡(STM)やAFMを用いて極低温環境下での試料表面の原子レベルでの観察を行っている。また、FeO(111)酸化膜を作成するための酸素ガスボンベ等の装置への設置はすでに終了しており、酸化膜作成条件の最適化を行いつつ、FeO(111)酸化膜表面を磁場のあるときとないときでAFM観察を行い、データの比較検討を行っている。
細菌毒素に対する免疫応答遺伝子の解析

ブドウ球菌性膿痂疹やRitter病等のブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群は、黄色ブドウ球菌が産生する表皮剥脱素(ET)によって発症するが、その発症様式には、頻回に発症するものから1度の発症で終わるものなど、その発症様式に多様性が認められる。この発症様式の多様性を本毒素に対するブドウ球菌性膿痂疹患者の免疫応答性によって説明出来るかどうかについて追求した。昭和63年度は主に表皮剥脱素の分離・精製および構造解析を中心に行ない、A型表皮剥脱素の遺伝子(1.45kbーeta)をブドウ球菌のDNAより分離し、そのDNAの塩素配列より280のアミノ酸配列を決めた。更に本毒素産生性ブドウ球菌の分離頻度の調査では、皮膚疾患以外の検査材料より分離された黄色ブドウ球菌418株中50株(12%)に本毒素の産生を認めた。また健常成人血清265検体中68検体(26%)に抗毒素の存在を認め、4人に1人の割合で本毒素を産生するブドウ球菌に感染していると思われた。平成元年度は伝染性膿痂疹患者35名より黄色ブドウ球菌を分離すると同時にリンパ球を分離してPHAによる刺激試験を行いT細胞の機能を初感染患児群(23名)と既往患児群(12名)とで比較したところ前者ではPHA刺激試験の結果は1名を除き正常範囲の値を示したが、既往歴患児群では5名が正常値を示したが7名が低値を示すなど感染を繰り返す患児群のT細胞機能の低下が認められた。また、50μgの毒素を用いたantigen induced T cell prolifelation assayでも既往歴患児群のほうが低値を示した。採血量の問題があって患児のHLA classII抗原の解析は行えなかったが、健常人について、antigen induced T cell proliferation assayで高値を示したもの3名、低値を示したもの1名のリンパ球を用いて抗血清法によるHLADR及びDQ抗原、DNA typingによるDP抗原の検索を行なったが、特に高値群と関連のある抗原は見いだし得なかった。昭和63年度は表皮剥脱素(ETA)産生黄色ブドウ球菌よりETAの分離・精製を行って約10mgのETAを得ることができた。伝染性膿痂疹患者18名より黄色ブドウ球菌を分離し、その培養液をneonatal niceの皮下に接種してET産生能を調べたが、すべてET産生株であった。菌の分離と血液が得られたのは7名であり、抗ETA抗体の保有者は1名であった。さらに感作リンパ球が分離できたのは3名であり、100mgのETAと10^5のリンパ球との培養において、高反応群であったものが2名であり、低反応群であったものが1名であった。血中抗体価と感作リンパ球の反応性が必ずしも一致していなかった。症例数が少ないので結論は得られていないが、さらにデータの集積に努力したい。また採血量の問題があってDNA解析までは行えなかった。

反応用抗原として用いているETAの分離・精製は、黄色ブドウ球菌からのものを用いていたが、桜井はETAおよび抗原性の異るB型ET(ETB)の構造遺伝子を黄色ブドウ球菌の染色体DNA(ETA)およびプラスミドDNA(ETB)からクローン化して大腸菌に導入して、大腸菌が発現したそれぞれのETの塩基配列から推定したアミノ酸配列の相同性を比較して、ETAの抗原性は毒素蛋白質の中の中間領域より上流にかけて存在することを想定した。これらの結果を基に抗原決定部位の蛋白のみを用いるなどして、免疫応答遺伝子の解析を行う予定である。平成元年度は伝染性膿痂疹患者35名より黄色ブドウ球菌を分離すると同時に血液を採取することが出来、感作リンパ球を分離後、PHAによる刺激試験及び10^5個のリンパ球と50MgのA型表皮剥脱素(ETA)との培養によりantigen induced T cell proliferation assayを行った。分離菌株のETA産生能は培養液を新産仔マウスの皮下に接種して調べた。患児及びその家族より本疾患の既応歴を聴取し、初めて罹患した患児群(初感染群:23名)と以前に罹患した事のある患児群(既応歴群:12名)に分けて結果を比較した。PHA刺激試験において初感染群は1名を除き正常範囲の値を示したが、既応歴群では5名が正常値を示したが7名が低値を示すなど明らかにT細胞機能の低下の存在が示唆された。一方antigen induced T cell proliferation assayにおいて初感染群は高値(2.5×10^4CPM以上)を示した者5名、中間値(12.5×10^4CPM)の者11名、低値(1×10^4CPM以下)の者7名であったのに対して、既応歴群では中間値を示した者6名、低値を示した者6名であって、平均値でみると既応歴群の方が低い値を示した。また患児よりの採血量の問題があって、患児のHLA classII抗原の解析は行えなかったが、健常人についてantigen induced T cell proliferation assayでスクリ-ニングし、高値を示した者3名、低値を示した者1名のリンパ球を用いて抗血清法によるHLA DR及びDQ抗原の検索では、低値の者はDR2,DR4,DRw53,DQw1,DQw4の各抗原を有していたが、高値の者の中で、これらの抗原と異なっていてしかも共通の抗原は見出し得なかった。一方DP抗原はDPβプロ-ブを用いたDNA typingで調べたが、低値の者がDPw2,DPw3を持っているので、高値の者に共通している抗原型でDPw2とDPw3以外の抗原を検索したが見出し得なかった。ETAに体する免疫応答遺伝子はHLAのclass IIの特定の抗原系とは連関していない可能性が高く、更に検討することが必要であると思われます。
オッセオインテグレーション獲得後における BP 製剤投与に関する先駆的研究

ラットにおけるインテグレーションモデルの確立を達成し、同モデルにおいて、BP製剤であるゾレドロネートのオッセオインテグレーション獲得後における影響を検討した。その結果、撤去トルク値においては、投与直後ならびに3か月後の評価においてゾレドロネート投与群はその値が高くなり、またNTXは投与直後に低下し、3か月後ではコントロール群よりも高くなることから、オッセオインテグレーション獲得後にもビスフォスフォネート製剤が影響を及ぼしていることが明らかとなった。4週齢Wistar系ラット大腿骨に対し、チタン製のインプラント体(φ2mm×2mm)の埋入を行い、経時的に骨形成マーカーである骨型アルカリフォスファターゼ(BAP)および骨吸収マーカーであるI型コラーゲン架橋Nーテロペプチド(NTX)の測定を行った。その結果、約12週でコントロール群と同等となり、ラットにおけるインテグレーションモデルの確立を達成した。同モデルにおいて、BP製剤であるゾレドロネートを腹腔に投与し、各期間における撤去トルク値および骨吸収マーカーであるNTXの測定を行った。本年度は、4週齢Wistar系ラット大腿骨に対し、チタン製のインプラント体(φ2mm×2mm)の埋入を行う。術後1週から8週にて経時的に尾静脈より採血を行い、骨形成マーカーである骨型アルカリフォスファターゼ(BAP)および骨吸収マーカーであるI型コラーゲン架橋Nーテロペプチド(NTX)の測定を行う。同時に、コントロールとして大腿骨部の切開、剥離のみの擬似手術を施行した群を作製し、BAP、NTXの測定を行った。これらの評価を行うことで、インプラント体埋入後のオッセオインテグレーション獲得過程における骨動態の評価を行うとともに、ベースラインデータとした。また、骨動態の評価と並行し、各タイムポイントでのインプラント体の除去トルクの測定及び組織切片の作製を行い、インプラント体と骨との結合強度を評価する。BAP、NTAの変化と実際の除去トルクの変化やインプラント周囲の骨形成の状態からオッセオインテグレーションが確実に得られるまでの期間を決定した。平成23年度に計画していたBAP、NTAの変化と実際の除去トルクの変化やインプラント周囲の骨形成の状態からオッセオインテグレーションモデルの確立を予定通り達成でき、24年度に行う予定であるBP製剤の投与のオッセオインテグレーションに対する影響分析を行うj九ん日が達成できた。作製したオッセオインテグレーションモデルに対し、BP製剤の投与を行うとともに、BAPおよびNTXの継時的な測定を行う。得られたデータとベースラインデータとの比較を行うことでBP製剤投与による骨動態の変化を明らかとする。また、インプラント除去トルクの測定とともに組織切片の作製を行い、オッセオインテグレーションの強度および周囲骨の変化の解析を行う。BP製剤は、ゾレドロネート(ゾレドロン酸/ZOL (2-(imidazol-1-yl)-1-hydroxyethylidene-1,1-bisphosphonare)とし、コントロールとして、エチドロネート(ETI (disodium(1- hydroxyethylidene))diphosphonate)、リセドロネート(RIS (monosodium 1-hydroxy-2-pyridin -3-ylethylidenediphosphonate hemipentahydrate))とし、投与方法は、ZOLおよびETIの投与は、それぞれ50μgを1000μlのリン酸緩衝整理食塩水(PBS; phosphate bufferd saline)に溶解し、オッセオインテグレーション完了後より、1日1回連日腹腔内投与を行い、ラットを屠殺する前日まで投与を行う。各群のラットは、それぞれ5匹とし、投与期間は1週間、1か月および3か月とする。投与期間中は、合わせてBAP、NTXの計測による骨動態の変化や除去トルク計測によるオッセオインテグレーションの評価を行う。本年度は、オッセオインテグレーションを確立したマウスにインプラントを埋入するための実験用チタンインプラントならびにビスフォスフォネート製剤の購入を予定している。またデータ解析のために解析ソフトの購入を行う。
顕微授精後受精障害症例に対する治療的な人為的卵活性化法の有効性に関する検討

ICSI後受精障害卵に対する卵活性化法併用の有効性が確認された。ICSI後受精障害卵中において、時間経過にともない精子染色体の分離が高頻度に確認され、このことが卵活性化刺激後の受精障害・精子染色体異常率の上昇・胚発生障害の一因であることが示唆された。以上から、卵活性化因子障害症例において、ICSIに卵活性化法を併用する場合、精子染色体への悪影響を避けるために、ICSI直後の卵活性化刺激が必要であると考えられた。また動物実験により、第2極体確認時期のICSI後受精障害卵に対する卵活性化刺激併用では、その後の受精・胚発生が障害されないことが確認された。ヒトPiezo-ICSIにおける卵活性化の早期判定はICSI後4時間で可能であり、同時期に不活性化卵に人為的卵活性化法を併用することで受精障害を回避し、その後の胚発生を補助出来る可能性が示唆された。卵細胞質内精子注入法(Intracytoplasmic sperm injection : ICSI)後の受精障害卵の発生補助の目的において、受精判定時(ヒトICSI後18時間程度)に受精障害と判定されるICSI卵をより早期に判定する方法を検討し、併せて人為的卵活性化法併用のタイミングの違いが受精・胚発生に及ぼす影響を調べ、同法の将来的な臨床応用の可能性についての検討を行っている。1、動物モデル(マウス)^※を用いて、ICSI後受精障害卵中の精子核の状態を経時的に観察し、精子頭部の経時的変化(=精子由来染色体が脱凝縮していく)と、異なる時期に人為的卵活性化刺激を加えた場合の精子染色体に及ぼす影響と、その後の受精・発生過程に及ぼす影響についての知見を得た(=脱凝縮が進んだ後の活性化刺激では、染色体異常率が上昇し、その後の受精・胚発生が障害される)。同検討から、ICSI後、より早期の人為的活性化刺激併用の必要性が示唆された。2、諸家の報告によると、ICSI症例中1%前後に精子中卵活性化因子が障害されていると考えられる症例が存在する。本年度、同症と診断された患者に十分なインフォームドコンセントを文書にて得たのち、治療後の余剰精子を2名分凍結保存した。次年度以降、卵活性化能・染色体異常率・人為的活性化刺激の影響等について検討予定である。前年度研究結果から、卵細胞質内精子注入法(Intracytoplasmic sperm injection : ICSI)後の受精障害卵の発生補助の目的において、人為的卵活性化を併用する場合、より早期の併用が効果的である可能性が示唆され、ヒト卵でのICSI後の受精障害を早期に診断する方法について検討を継続して行っている。1.動物モデル(マウス^※)を用いた動物実験の結果から、第2極体放出判定により、その後の受精を予測し、受精障害と判定された卵子に人為的卵活性化を併用することで胚発生を補助出来る可能性が示唆された。ヒトでは、ICSI後4時間で第2極体放出判定(受精予測)が可能であることが示唆される知見を得ている。診断効率を高めるべく、臨床データの蓄積を行っている。2、ヒトICSI後受精障害症例(精子中の卵活性化因子が障害されていると推定される症例)と診断された患者に十分なインフォームドコンセントを文書にて得たのち、治療後の余剰精子を前年度から合計して5名分凍結保存した。同症例から得た精子を用いて、卵活性化能・染色体異常率・人為的活性化刺激の影響等について検討中である。※Alkirated Iminosugars摂取後の雄マウスは精子形成が障害され、精子頭部奇形、精子運動性障害、卵子透明帯通過時に必須のアクロソーム酵素形成障害をきたし一過性の不妊症となる。また卵活性化因子の障害も示唆されている。これまでの研究結果から、卵細胞質内精子注入法(Intracytoplasmic sperm injection : ICSI)後の受精障害卵の受精・発生補助の目的において、人為的卵活性化を併用する場合、より早期の併用が効果的である可能性が示唆された(1)。また、ヒト卵でのICSI後の受精障害を早期に診断する方法については、piezo-ICSI※1後4時間での第二極体放出の有無による予測が有効である可能性が示唆された(2)。1.動物モデル(マウス※2)を用いた動物実験の結果から、第二極体放出の有無により、受精障害(第二極体なし)と判定された卵子に人為的卵活性化を併用することで受精・胚発生を補助できる可能性が示唆された。

ICSI後26時間まで活性化刺激のタイミングを遅らせると、時間経過に伴い異常受精の増加・胚発生率低下を認めたことから、ICSI後より早期の診断・人為的活性化併用の重要性が再確認された。2.期間中のヒトICSI症例における後方視的検討により、ICSI後4時間の時点で受精卵の約90%に第二極体が確認可能であったことから、ヒトICSIにおいてICSI後4時間の時点での第2極体放出判定により、その後の受精予測が可能であることが示唆された。受精障害と判定されたヒトICSI卵に対する人為的活性化後の受精率・胚発生率については継続的にデータの蓄積を行っている。※1:ピエゾインパクトマニピュレーターを用いたICSI※2:Alkirated Iminosugars摂取後の雄マウス(一過性の精子形成障害をきたし、精子頭部奇形・アクロソーム酵素形成障害・卵活性化障害が認められる)
in situ hybridizationを用いた結核病巣の結核菌の組織学的検出

結核の病態は,近年複雑化,多様化し,診断のみならず治療にも多くの問題がある。感染初期の未治療肺結核患者に抗結核剤治療を行った場合,排菌は順調に減少または陰性化しているにもかかわらず,治療開始後3ヶ月ごろまでに胸部X線上肺野陰影の拡大,新陰影の出現,胸水貯留,肺門縦隔リンパ節腫大などの初期悪化が約15%にみられる。その機序としては,(1)悪化しつつあった時期に抗結核剤治療が開始されたため効果が遅延した。(2)抗結核剤に対するアレルギー反応,(3)抗結核剤,特にRFPにみられる免疫抑制作用による結核病変の悪化,および(4)強力な抗結核剤治療により死滅した大量の結核菌の菌体に対するアレルギー反応などが考えられるが,その発現機序は解明されないまま今日に及んでいる。その理由の1つに日常検査において,病理組織上の結核結節内の乾酪壊死巣や壊死をとりかこむ肉芽組織中の結核菌を特異的に検出判定する方法がないからである。in situ hybridization法は,組織切片状で非放射性プローブを用いて結核菌群に特異的な塩基配列を迅速かつ高感度に検出でき、同時に免疫組織学的手法を併用することも可能である。そこで本研究は,in situ hybridization法を用いた結核病巣内の結核菌の検出を日常検査として確立することを目的とする。本年度は,in situ hybridization法の検出条件の検討を行うために,まず組織から結核菌群特異的なDNAが検出可能な症例を検索した。病理組織で乾酪壊死巣およびラングハンス巨細胞が認められた組織のパラフィン薄切切片からDNAを抽出し,PCR法を用いて,結核菌群特異的遺伝子の検出をおこなったところ,20/43症例から結核菌群特異的なDNAが検出された。今後この症例を用いてin situ hybridization法の検出条件を行う予定である。
明暗順応における視細胞繊毛でのタンパク質輸送機構の解析

明暗順応における視細胞繊毛の蛋白質輸送機構の解析を行った。ゼブラフィッシュ変異体の解析から繊毛蛋白輸送には複数のキネシンが組織ごとに異なるサブセットを用いて機能していることが示された。また、繊毛キナーゼMakの遺伝子欠損マウスでは、外顆粒層にトランスデューシンの異常な局在が見られ、Makがトランスデューシンの輸送に関与する可能性が示された。平成24年度はゼブラフィッシュ視細胞脱落変異体であるGEP293の表現型解析を行ってきた。これまでの研究で、GEP263は繊毛の逆行性輸送A複合体の構成要素の遺伝子配列に変異が存在することを見出してきた。まず、共同研究によりGEP263の電子顕微鏡による解析を行った。鼻腔上皮の繊毛を電子顕微鏡観察したところ、GEP263変異体では、鼻腔上皮の繊毛の先端が膨らんだ様子が観察された。この結果は、逆行性輸送が阻害されたために、繊毛局在タンパクなどが繊毛の先端に蓄積したことの証明となる。これは、GEP263視細胞の繊毛においてIFT88が蓄積していたことと一致する結果であった。また、電子顕微鏡観察により、GEP263では視細胞外節の構造が未発達であることが観察された。視細胞外節はトランスデューシンなど明暗順応に関係する蛋白質が局在する細胞内小器官であり、興味が持たれる。更に、最近、逆行性輸送との関連が示唆されているTulp蛋白質との関係をモルフォリノノックダウンにより解析を行っている。また、これまでに、Makと相互作用する分子として、プロテオミクス解析を行ってきた。現在、これらの中から明暗順応に関連する因子の探索を行っている。また、Makを含む繊毛キナーゼが繊毛における蛋白質輸送に重要であることを見出している。本研究により得られた結果を含め、現在GEP263の解析結果を論文発表する準備を進めている。平成23年度は、新たに同定したゼブラフィッシュの視細胞脱落変異体であるGEP360の解析を中心に行った。GEP360変異体のマップクロスを行い、ポジショナルクローニング解析により、GEP360の原因遺伝子変異を同定した。GEP360変異体には、新たなセントロソーム関連因子にナンセンス変異が存在することがわかった。現在は、GEP360の詳細な表現型解析を行っている。このGEP360では、視細胞の外節におけるタンパク質の輸送に異常があることが明らかとなり、明暗順応への関与が予想される。また、タフツ大学と共同で行った研究により、ゼブラフィッシュ変異体を用いて、視細胞の外節のタンパク質輸送にKif3Bが重要であることを明らかにした。この研究により、Kifファミリーの分子が組織特異的な機能を果たしていることが明らかとなった。また、視細胞外節のタンパク輸送に関係し、網膜色素変性症の原因となる繊毛キナーゼMakの研究に関して、Makと相互作用する分子の同定をプロテオミクス解析の手法を用いて進めている。これまでに、Affinity Tag purification法とショットガンプロテオミクス解析法を融合した手法を確立し、Makと相互作用する分子の解析を行った。現在、データを収集し、解析を行っている。また、Makのパラログである繊毛キナーゼICKの網膜特異的なノックアウトマウスを作製し、Makとの機能的な比較に焦点を絞って研究を進めている。ゼブラフィッシュ変異体の解析については、原因遺伝子の同定に成功した。GEP360のポジショナルクローニング解析を行い、原因遺伝子の同定に成功した。また、繊毛キナーゼMakのプロテオミクス解析については、これまでの解析手法を確立し、解析を行っている。平成24年度は、GEP360の表現型解析を進める。現在手法を確立した解析法を用いてMakのプロテオミクス解析を進める。Makノックアウトマウスが明暗順応にどのようなメカニズムで関与しているのかを明らかにする予定である。Makのパラログである繊毛キナーゼICKの網膜特異的なノックアウトマウスを作製し、Makとの機能的な比較に焦点を絞って研究を進めている。分子生物学用の一般試薬や消耗品、抗体の作成などに、研究費を使用する予定である。
双生児研究法を用いた高齢双生児の生活機能とライフスタイル要因の検討

生活環境要因などの他に、身体的機能や社会性、ストレス対処能力に関する調査を行った。8年間において、調査対象者約1,200名、平均年齢75.3±12.5歳(平成26年度時点)の身体的機能や社会性の変化はほとんどみられなかった。ストレス対処能力は、一卵性双生児間と二卵性双生児間に有意な差はなく、遺伝的な影響はほとんどないことが分かった。主観的健康観との関連は、64歳未満では、「身体に痛みがない」と「治療を要する疾患がない」ことが、65歳以上では、「手段的日常生活動作機能」「外出機会」「ストレス対処能力」と「身体に痛みがない」ことが関連していた。本研究の目的は、「健康」で「長寿」な生活に最も関与しているライフスタイルの直接的な影響を明らかにすることである。そのために、遺伝子要因を統一し、環境要因のみの関連を明らかにできる双生児研究法を用いている。平成25年度は、平成24年度の調査から、高齢双生児の現状を明らかにするために以下を実施した。1.平成24年度の調査結果をまとめ、平成22年度調査に参加を得られた者の調査結果との変化をみた。2.平成24年度までの調査内容を踏まえ、関連機関への報告をおこなった。3.関連機関と連携して、調査対象者のリストの整理をおこなった。4.関連機関と連携して、平成26年度の調査の検討をおこなった。双生児を対象者とし双生児研究法を用いることで、「健康」で「長寿」であるためのライフスタイル要因を明らかにすることを目的に、平成20年度、平成22年度に引き続き、平成24年度に3時点目の調査を行った。3時点目の調査においては、従来調査からの継続調査項目や追加調査項目について、複数の尺度の検討から対象者の特性や日本語版尺度としての信頼性の高いものを選択し、1-2時点目の調査者とスーパーバイザーとの協議の上、決定した。例えば、計画していた調査内容からストレス対処能力を削除した。この尺度指数は、対象者の年齢では安定しているものである。本調査の目的はライフイベント等による短期的な変動を評価するものではなく、長期的な総合評価が影響因子として仮説を立てており、平成22年度に調査済みのため削除した。次に、平成24年5-8月にかけて郵送にて、調査票を郵送および回収をした。調査に関する意見については問い合わせが数件あり、その都度対応した。調査票からデータベースを作成すると同時に、対象者リストを整理した。同時に調査票にて、健康に関する専門的な回答を希望されている対象者には、対象者データーベース管理センターに伝達し、センターから対応していただくように手配を行った。データベースをもとに、現在分析を続けている。生活環境要因などの他に、身体的機能や社会性について継続調査を行い、ストレス対処能力(SOC:sense of coherence)に関する調査を行った。本調査を含め、平成26年度までの4時点8年間において回答を得た調査対象者約1,200名、平均年齢75.3±12.5歳(平成26年度時点)の身体的機能や社会性の変化はほとんどみられなかった。ストレス対処能力(SOC:sense of coherence)得点は、一卵性双生児間の得点における相関係数と二卵性双生児間の得点における相関係数に有意な差はなく、遺伝的な影響はほとんどないことが分かった。主観的健康観との関連をみるために、64歳未満と65歳以上に分けた重回帰分析を行ったところ、64歳未満の年齢層では、「身体に痛みを有していない(.30)」と「治療を必要とする疾患に罹患していない(.23)」ことが関連していた。また、65歳以上の年齢層では、「手段的日常生活動作(IADL)機能(.21)」、「外出機会があること(.20)」、「ストレス対処能力(.16)」と「「身体に痛みを有していない(.16)」ことが関連していた。64歳未満では、身体的な要因が直接主観的健康観に影響することが分かった。また、外出や他人との交流のような社会活動の頻度は高齢者において、遺伝的な影響を受けていることが分かった。このような社会活動の現象とうつ症状との関連には共通する遺伝要因と環境要因が影響していることが分かった。看護学3年間の研究において、平成24年度の調査を終了し、それを踏まえて平成26年度の調査計画を行った。平成26年度調査においては、関連機関と連携し、疫学的情報を踏まえた長期的な調査の基盤となる予定である。平成26年度の調査は隔年比較の予定通り、5-6月として準備している。

調査年度毎の成果報告を予定していたが、縦断的分析を踏まえた報告が本研究目的に適っていると判断し、行っていないため、進捗度としては予定通りだが、報告はやや遅れている。データベースから、単純集計と3時点目の双生児ペア分析を行った。しかし、本研究の目的には、3時点4カ年の縦断的な「健康」で「長寿」な状態とその影響因子(ライフスタイル)を明らかにするため双生児ペア分析が必要であるが、分析結果とそのための手法においてスーパーバイスを受けている状態である。本研究の目的を達成するために、最終年度として以下の方策に基づいて実施する。進行に伴い、スーパーバイザーや関連機関協力者からも専門的な助言を得ることとする。1.平成20年度から調査協力を得られている者の縦断的経過変化を明らかにする。2.平成24年度調査までの報告を国際双生児学会で発表予定である。3.平成26年度調査を実施し、複数の疫学的要因を踏まえた縦断的分析を行う。これにより、「健康」で「長寿」である環境要因を長寿国である我が国で継続調査できるような基礎情報の確立を目指す。現在行っている双生児ペア分析を進め、縦断的な変化と影響因子を明らかにする。それを雑誌へ投稿する。また、調査対象者へ調査結果の報告を行う。後期は、学会で研究発表を行うとともに、平成26年度に予定している4時点目の調査内容を検討する。平成25年度によていしていた物品・人件費は平成24年度に購入したり、実施したため必要がなかった。平成25年度の学会旅費も近郊で行われたため使用しなかった。平成24年度の調査経験から、平成26年度に対象者を増やした調査を行うため、物品費と人件費については繰越分が必要となる概算である。また、平成26年度には国際学会での発表を予定しており、予定通り旅費として使用する予定である。その他、論文作成時の構成などで雑費使用する予定である。1)スーパーバイズを受けるための交通費および学会交通費2)雑誌投稿に関する経費(投稿費、英文構成費)3)調査報告に関する経費(印刷費、郵送費)4)文献費5)発表のための学会参加費
軸素輸送と成長円錐運動におけるコラプシン応答

ファスチクリンIVホモログ、コラプシンは神経成長円錐の強い退縮活性を持つ分子量100kDの分泌型蛋白である。コラプシンによる退縮機構の詳細は現在ほとんど不明であるが、同応答はpertussis toxin (PTX)感受性を示す。この性質を利用し、アフリカツメガエル卵母細胞系を用いた発現クローニングによりコラプシン応答に関与する細胞内分子、CRMP-62(collpsin response mediator protein)を同定した。同分子はUNC-33と相同性を示す。UNC-33線虫変異株における表現型は、神経軸索における微小管の異常蓄積と、神経走行の広範な異常である。本研究の目的は、微小管を基本要素とする神経軸索輸送に着目し、コラプシンの軸索輸送に及ぼす効果を成長円錐に対する効果と比較・検討することにある。培養マウス後根神経節の軸索および成長円錐をビデオ増感微分干渉顕微鏡を用い観察した。コラプシン持続適用は濃度依存性に単位時間当たりの順行性、逆向性双方の輸送粒子数を増大した。増大のピーク値はコラプシン投与後、5-8分に認められ、それ以後漸次減少し適用30分後には基礎レベルに戻った。一方粒子の速度には有意な効果を示さなかった。PTX2時間前処理はコラプシン適用34分の時点における成長円錐退縮を完全に阻害したが、輸送粒子数の増大効果に対し無影響であった。Gタンパク質の活性化ペプチドであるマストパランは成長円錐を強力に退縮させるとともに、軸索輸送を抑制した。コラプシンと異なり、マストパランの両作用はいずれもPTXにより阻害された。以上の知見はコラプシンがPTX非感受性の、成長円錐の退縮応答とは異なった経路を介し、特異的に軸索輸送を促進することを示す。これと平行しCRMP分子の発現を特異的に抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの検索を現在続行しつつある.ファスチクリンIVホモログ、コラプシンは神経成長円錐の強い退縮活性を持つ分子量100kDの分泌型蛋白である。これと平行しCRMP分子の発現を特異的に抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの検索を現在続行しつつある.
中国における国営企業と私営企業のコーポレートガバナンスの比較研究

中国は、90年代初め頃より、社会主義市場経済の建設を目指して、近代企業制度(その重点は国有企業改革)の確立を開始した。その中で企業不祥事が頻発し、その対策としてガバナンスが重要課題となった。われわれは(1)上海申貨腔有限公司(2)上海普道財務諮洵有限公司等数社の訪問を通してガバナンスについての聞き取りを行った。中国企業のガバナンスはいわば「制度先行型(systempreceded)」といえるのであるが、そこには幾多の課題がなお存在することが明らかとなった。中国は、1993年頃より、社会主義市場経済の建設を目指して、近代企業制度(その重点は国有企業の株式会社化)の確立を開始した。その中でとりわけ問題であるのは、会社資産の不正流用、粉飾決算、虚偽情報の開示、相場操縦、インサイダー取引などの不祥事であった。本調査においては、そうした中国のガバナンスの現状を把握するとともに、中国企業数社にインタビューした。表面的な制度は作りつつあるものの、中国特有の「関係」に基づく人脈経営などは、把握が困難な側面もあり、実質的なガバナンスは不明なままに残されているように思われる。そうした理由としては、(1)中国においては、社長(総経理ないし董事長)の権限が強いこと。つまり、社長は取締役会によって任命されるが、社長は、取締役会から授権された権限のほか、定款や法定の権限も行使できる。(2)当時の現行法では、社長の業務執行が適切であるかどうかを取締役会が監視・監督する規定がなかったこと。(3)独立取締役の機能の問題。2001年8月に「上場会社における独立取締役制度の確立に関する指導意見」が出され、上場会社においては独立取締役の設置が義務付けられたが、はたしてどこまで機能しているかが不明なこと。なおわれわれは、最近下記の2社を訪問調査を行った。(1)上海申貨腔有限公司(2)上海普道財務諮洵有限公司である。詳細は省くが、下記の点を中心に聞き取りをした。「(1)会社の株主比率(上位10人ほど)(2)総経理に選ばれたプロセス。(3)企業陛営の目的(存在意味)(4)企業利益の分配について(割合)a株式配当b設備投資c従業員(人件費)d役員報酬e研究・技術開発fその他(5)ステークホルダーに対する重要度について(順位)a株主b従業員c取引先d顧客e国会f社会(6)自分の考え(思想)に一番影響を与えたもの(人物・書物等)(7)経済体制について...aアメリカ(アングロサクソン)型の個人主義かつ自由で実力主義の金融型資本主義bヨーロッパ大陸型ないし日本型の共同体的資本主義、のどちらがいいと思うか?(8)監事会の監事選任のプロセス。」ただ、時間や戦法の担当者の都合の関係で、十分なものとなっていないので、さらに今後再調査を行いたいと思っている。中国は、1990年代より、社会主義市場経済の建設を目指して、近代企業制度(その重点は国有企業の改革、すなわちその株式会社化)の確立を開始した。その中でも、近代化に伴う問題として、会社資産の不正流用、粉飾決算、虚偽情報の開示、インサイダー取引などの不祥事が挙げられる。本調査においては、後者の課題、すなわち、ガバナンスの現状を把握し、その課題を明らかにすることである。表面的な制度は作りつつあるものの、中国特有の「関係」に基づく人脈経営などは、把握が困難な側面もあり、実質的なガバナンスは不明なままに残されているように思われた。その理由としては、1中国においては、社長(総経理ないし董事長)の権限が強いこと。2当時の現行法では、社長の業務執行が適切であるかどうかを取締役会が監視・監督する規定がなかったこと。3独立取締役の機能の問題。2001年8月に「上場会社における独立取締役制度の確立に関する指導意見」が出され、上場会社においては独立取締役の設置が義務付けられたが、どこまで機能しているかが不明なこと。なおわれわれは、2010年の2社に続き、下記2社の訪問調査を行った。(1)国民淀粉工(上海)有限公司(2)聚信国租有限公司ある。インタビュー内容は昨年度同様の下記の点である。「1会社の株主比率(上位10人ほど)2総経理に選ばれたプロセス。3企業経営の目的(存在意味)4企業利益の分配について(割合)a株式配当b設備投資c従業員(人件費)d役員報酬e研究・技術開発fその他5ステークホルダーに対する重要度について(順位)a株主b従業員c取引先d顧客e国会f社会6経済体制7監事会の監事選任のプロセス。」ただ、時間や先方の担当者の都合の関係で、十分なものとなっていないので、さらに今後再調査を行いたいと思っている。

中国は、90年代初め頃より、社会主義市場経済の建設を目指して、近代企業制度(その重点は国有企業改革)の確立を開始した。その中で頻発する企業不祥事対策としてのガバナンスが重要課題であった。中国企業のガバナンス制度は表面的には欧米、特にアメリカを基に作られている。しかし、中国特有の「関係」に基づく人脈経営などが大きく影響していると思われる。われわれは(1)上海申貨腔有限公司(2)上海普道財務諮洵有限公司等数社の訪問を通して次の諸点を聞き取りした。「1会社の株主比率(上位10人ほど)2総経理に選ばれたプロセス3企業経営の目的(存在意味)4企業利益の分配について(割合)a株式配当b設備投資c従業員(人件費)d役員報酬e研究・技術開発等5ステークホルダーに対する重要度a株主b従業員c取引先d顧客e国会f社会6自分の考え(思想)に一番影響を与えたもの(人物・書物等)7経済体制についてaアメリカ(アングロサクソン)型の個人主義かつ自由で実力主義の金融型資本主義bヨーロッパ大陸型ないし日本型の共同体的資本主義、の何れを選好するか8監事会の監事選任のプロセス。」これらの調査より、幾つかの特徴を見出した。まず、1中国においては、社長(総経理ないし董事長)の権限が強いこと。2当時の現行法では、社長の業務執行が適切であるかどうかを取締役会が監視・監督する規定がなかったこと。3独立取締役の機能の問題。2001年8月に「上場会社における独立取締役制度の確立に関する指導意見」が出され、上場会社においては独立取締役の設置が義務付けられたが、この機能が不明なこと。中国企業のガバナンスはいわば「制度先行型」といえるのであるが、今後の課題としてまず(1)2005年の改正会社法のその後の影響(2)とりわけ独立取締役の選任プロセス(3)日本企業のガバナンスとの相違点などを更に比較的に検討する必要があろう。おおむね順調に進展している。1中国においては、社長(総経理ないし董事長)の権限が強いこと。2001年8月に「上場会社における独立取締役制度の確立に関する指導意見」が出され、上場会社においては独立取締役の設置が義務付けられたが、どこまで機能しているかが不明なこと。なおわれわれは、2010年の2社に続き、下記2社の訪問調査を行った。(1)国民淀粉工(上海)有限公司(2)聚信国租有限公司ある。インタビュー内容は昨年度同様の下記の点である。「1会社の株主比率(上位10人ほど)2総経理に選ばれたプロセス。3企業経営の目的(存在意味)4企業利益の分配について(割合)a株式配当b設備投資c従業員(人件費)d役員報酬e研究・技術開発fその他5ステークホルダーに対する重要度について(順位)a株主b従業員c取引先d顧客e国会f社会6経済体制7監事会の監事選任のプロセス。」
指標理論のリーマン面の自己同型群への応用

当該年度においてわれわれは次の論文を発表した:この成果の上に,a reformed Eichlen formulaを発見した。これはまたもう1つのmanuscript:当該年度においてわれわれは次の論文を発表した:この成果の上に,a reformed Eichlen formulaを発見した。これはまたもう1つのmanuscript:
新規わい性発現物質A-2α、βの化学構造の解明と園芸への応用

本研究の目的として最初掲げた光成長抑制物質A-2の化学的本体を明らかにするには至らなかったが、これに必要な技術的知見を次のように集積した。1.抽出ProgressNo.9は季節を問わず畑で育成することができる。花芽が着生したものや、わき芽にもA-2は十分含まれて使用可能である。凍結は刈り取り後、直ちに行う必要があり-20°Cの冷蔵保存で安定に保持される。2.本植物の抽出物の中性画分に含まれる成長抑制物質A-1-1(Pisatin)、A-1-2、A-1-3、A-2およびA-3を同定するシリカゲルカラムクロマトを標準分離法として定式化した。3.逆相高速液体クロマト(HPLC)によりA-1-3に2種(α,β)、A-2に3種(α,βおよびγ)、A-3に2種(α,β)が存在することを明らかにした。この他、この研究過程で新たにA-1-3の存在を見出し、HPLCおよびガスクロマト(GC)においてピークを特定することに成功した。GC-MS結果、分子量は250、αとβの2種の幾何異性体が存在し、溶液中で相互変換をするが-80°Cではしないことを明らかにした。またA-1-3は黄白エンドウ芽生えの成長を抑制すること、および赤色光照射により増加することを突きとめ、光成長抑性物質としての資格を有することを明らかにした。30kgのわい性エンドウ種子を約5ア-ルの圃場(神戸大学農学部農場)に9月と10月の2回に亘って播種し,それぞれ約1箇月栽培して総量120kgの植物体地上部を収獲した。植物体は27個のダンボ-ル箱に詰め最寄りの冷凍倉庫会社に預け,ー20度で凍結保存し、随時一箱ずつ取り出して抽出処理に付した。このような大量抽出処理では経済的理由と火災等に対する安全対策から、従来の定量実験用の小規模抽出とは異なる行程をとるので,各行程ごとの収率を調べながら抽出作業を進めている。現在までに確立した抽出法は次の通りである。即ち、凍結植物の目方の4倍量のアセトンを加え、ウォ-リングブレンダ-で30秒間磨砕し、磨砕液を2日間5°Cでかく拌する。これをろ過し、ろ液に1/5量のpH7.0、0.1Mのリン酸カリ緩衝液と1/4量のベンゼンを加えてかく拌し、静置して上層を取る(以下括孤内%は収率,88%)。これを濃縮して得られる中性画分を、約10倍量の目方のシリカゲルを詰めたカラムに加え、8:2のベンゼン/酢酸エチル混合溶媒をカラム容積の倍量で多量の不純物を除く。次いで、2:8のベンゼン/酢酸エチルで溶出しAー1ー2、Aー1ー3、Aー2およびAー3を得る(80%)。このような工程で総収率70%で主な活性物質の粗画分を得るのに成功した。次に使用予定のハイポ-ラスポリマ-(ダイヤイオンHP20、三菱化成)およびオクタデシルシラン処理シリカゲルの使用条件の検討を行った。キャピラリカラムガスクロマトグラフを購入設置した。目下、カラム液相の種類とAー1ー3およびAー3の分析条件の検討を行っている。初年度に検討した大量抽出精製法に従いわい性エンドウ地上先端3節の節間および葉30kgを処理し精製を進めた。抽出、中性画分および第一段階のKieselgelカラムクロマトグラフまでは初年度の成績のとおりの収率で精製が進行した。しかし第2段階のKieselgelカラムクロマト(および/又はその後の濃縮、貯蔵中)においてA-2はほぼ完全に失活した。この原因は今後追及しなければならない。

抽出・精製の過程ではクレステスト(生物検定)によって活性物質の検定、定量を行うが、この他に高速液体クトマトグラフィー(HPLC)の併用により行程所要時間の短縮と定量精度の向上を計るため順相と逆相の2段階のHPLC法の確立を試みたが、試験した順相カラムではすべて活性物質の回収率が悪く成功しなかったので、Merk社のLiChroprep S60をつめたオープンカラムを第一段階としてWaters社の逆相Sep-Pak tC_<18>で前処理して、逆相HPLCカラム(TSKgel ODS-120T)で分析できる見通しを得た。これらの過程でA-2画分に混在していたA-2とは異なる抑制物質A-1-3αおよびβを少量ながら単離し、ガスクロマトグラフ(GC)上のピークを特定することに成功した。またガスクロマト-マススぺクトル(GC-MS)測定の結果、分子量はともに250であるフラグメンテイションパターンからαとβは幾何異性体であり、溶液中で相互変換することを明らかにした。
リズミカルな顎運動を抑制する脳幹領域の機能的役割の解明

大脳皮質咀嚼野刺激により誘発されるリズミカルな顎運動が、脳幹のある特定の部位を電気的に刺激することにより抑制されることが知られている。しかし、その生理的意義は未だ明らかにされていない。まず、脳幹における咀嚼運動の抑制に関与する神経ネットワークを形態学的手法により調べた。浅麻酔下にてウサギの大脳皮質咀嚼野刺激によりリズミカルな顎運動を誘発させているときに、脳幹に連続電気刺激を行い、咀嚼筋筋電図と顎運動を記録して顎運動抑制を確認したところ、抑制部位は中脳中心灰白質周囲網様体の腹外側領域であった。同抑制部位に順行性トレーサーであるBiocytinあるいは、逆行性トレーサーであるFluoro-Goldを注入し、神経連絡を組織学的に検索すると、Biocytinにより標識された神経終末、結節状構造は、橋内側網様体で両側性に認められ、Fluoro-Goldにより標識された神経細胞体も、橋内側網様体で両側性に認められた。本結果から、顎運動抑制部位の投射部位と入力部位が同じ領域であったことから、中脳中心灰白質周囲網様体と橋内側網様体で相反的な神経ネットワークが存在することが明らかとなった。次いで、大脳皮質咀嚼野を電気刺激することにより、誘発されるリズミカルな顎運動の特性を知ることが必要であり、その第一歩として大脳皮質咀嚼野から被殻への神経投射を、ウサギを用いて、電気生理学的手法と解剖学的手法を合わせて調べた。咀嚼運動を誘発することができる大脳皮質咀嚼野への電気刺激による誘発電位を被殻内において記録した。誘発電位が記録された部位は被殻の腹外側に位置していた。また、大脳皮質咀嚼野からの投射部位を順行性の神経標識物質であるバイオサイチンを注入して、被殻内で標識された神経終末の分布を調べた。大脳基底核の入力部である被殻において、腹側部が咀嚼運動の制御に関わっている可能性が示唆された。しかし、その抑制機構の詳細は未だ明らかではない。そこで本研究では、まず、脳幹における咀嚼運動の抑制に関与する神経ネットワークを明らかにすることを目的に、神経標識法を用いて組織学的に検索した。浅麻酔下にてウサギの大脳皮質咀嚼野を電気刺激し、リズミカルな顎運動を誘発した。顎運動を誘発させているときに脳幹に連続電気刺激を行い、咀嚼筋筋電図と顎運動を記録して顎運動抑制を確認し、抑制部位を同定した。同定部位に順行性トレーサーであるBiocytinを圧注入法により、あるいは、逆行性トレーサーであるFluoro-Goldを電気泳動法により注入した。同定と注入には、一方に電気刺激のためのタングステンワイヤーを、もう一方にはトレーサーを封入した二連ガラス管微小電極を用いた。顎運動を抑制させる部位は中脳中心灰白質周囲網様体の腹外側領域であった。

Biocytinにより標識された神経終末、結節状構造は、橋内側網様体で両側性に認められたが、三叉神経運動核内には存在しなかった。また、Fluoro-Goldにより標識された神経細胞体も、橋内側網様体で両側性に認められた。本結果から、顎運動抑制部位の投射部位と入力部位が同じ領域であったことから、中脳中心灰白質周囲網様体と橋内側網様体で相反的な神経ネットワークが存在することが明らかとなった。このことからも咀嚼運動を抑制するメカニズムも複雑な神経ネットワークにより遂行されていることが示唆された。大脳皮質咀嚼野刺激により誘発されるリズミカルな顎運動が、脳幹のある特定の部位を電気的に刺激することにより抑制されることが知られている。しかし、その抑制機構の詳細は未だ明らかではない。そこで本研究では、まず、脳幹における咀嚼運動の抑制に関与する神経ネットワークを明らかにすることを目的とした。浅麻酔下にてウサギの大脳皮質咀嚼野を電気刺激し、リズミカルな顎運動を誘発した。顎運動を誘発させているときに脳幹に連続電気刺激を行い、咀嚼筋筋電図と顎運動を記録して顎運動抑制を確認したところ、抑制部位は中脳中心灰白質周囲網様体の腹外側領域であった。同抑制部位に順行性トレーサーであるBiocytinあるいは、逆行性トレーサーであるFluoro-Goldを注入し、神経連絡を組織学的に検索したところ、Biocytinにより標識された神経終末、結節状構造は、橋内側網様体で両側性に認められ、Fluoro-Goldにより標識された神経細胞体も、橋内側網様体で両側性に認められた。さらに、今年度は抑制部位である中脳中心灰白質周囲網様体の腹外側部のニューロンが咀嚼中にどのような活動変化を示すかを、ウサギを用いて調べた。無麻酔下で抑制効果を示す部位からニューロン活動を記録した。記録には刺激も行えるガラス被覆エルジロイ電極を用い、ニューロン活動記録後、刺激により咀嚼運動を抑制するかどうかを確認した。しかし、今年度はデータ取得に至らなかった。今後、ニューロン活動記録と抑制部位の同定の整合性を持たせるための方法を改良し、データ取得にあたる。