hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
侵襲時再生治療に関する研究:血管内細胞移植の確立

本研究の目的は、各侵襲モデルに対する血管内細胞移植法の効果を明らかにすること、また血管内細胞移植の生体反応性を制御するメカニズムを検討すること、である。多臓器不全モデルに対して骨髄間質細胞を経静脈的に投与することにより、各臓器障害の軽減や生存率の有意な改善が認められた。また、骨髄間質細胞と血管内皮の共培養系を確立し、骨髄間質細胞の分泌性因子が血管内皮細胞傷害を直接的に抑制する経路があることを明らかにした。さらに、クラッシュ症候群モデルに対する骨髄由来単核球細胞移植が、抗炎症効果を発揮し、生存率を改善することを明らかにした。本研究では、侵襲時再生応答からみた新たな治療戦略として、血管内皮修復・再生効果をもつ細胞移植法を解明するために、以下の3点に目標を絞り実施する。1.重症外傷、熱傷、敗血症、出血性ショックの異なる侵襲モデルにおいて、血管内皮傷害と骨髄機能を含めた血管内皮再生応答を経時的に評価する。2.各侵襲モデルにおいて、血管内皮修復・再生治療として血管内皮前駆細胞、骨髄間質細胞、骨髄由来単核球細胞の血管内移植を行い、各細胞移植法の有効性(生存率など)を比較検討する。3.特に、血管内皮における再生応答遺伝子の発現と各血管内細胞移植による変化をマイクロアレー法を用いて明らかにする。平成22年度は、重症外傷、熱傷、敗血症、出血性ショックの各侵襲モデルにおける再生応答に関する研究を進め、各侵襲モデルにおいて有効性が期待できる経血管内細胞移植による各種再生治療が血管内皮の修復・再生を促進して臓器障害を軽減するか、生存率を改善するか、比較検討を進めた。敗血症モデルにおける骨髄間質細胞の血管内細胞移植が、生存率を有意に改善することが明らかとなり、現在メカニズムを詳細に検討中である。平成23年度は、各侵襲モデルにおける各細胞移植法の有効性(生存率など)を比較検討する予定である。また、多臓器障害発症時の再生応答遺伝子の発現に関する研究を進め、血管内皮前駆細胞、骨髄間質細胞、および骨髄由来単核球細胞の血管内移植群において、血管内皮および各臓器で発現の増強または低下する遺伝子をマイクロアレー法で同定、解析する予定である。(1)重症外傷、熱傷、敗血症、出血性ショックの異なる侵襲モデルにおいて、血管内皮傷害と骨髄機能を含めた血管内皮再生応答を経時的に評価する。(2)各侵襲モデルにおいて、血管内皮修復・再生治療として血管内皮前駆細胞、骨髄間質細胞、骨髄由来単核球細胞の血管内移植を行い、各細胞移植法の有効性(生存率など)を比較検討する。(3)特に、血管内皮における再生応答遺伝子の発現と各血管内細胞移植による変化をマイクロアレー法を用いて明らかにする。平成23年度は、重症外傷、熱傷、敗血症、出血性ショックの各侵襲モデルにおける再生応答に関する研究を進め、各侵襲モデルにおいて有効性が期待できる経血管内細胞移植による各種再生治療が血管内皮の修復・再生を促進して臓器障害を軽減するか、生存率を改善するか、比較検討を進めた。敗血症モデルにおける骨髄間質細胞の血管内細胞移植が、生存率を有意に改善することが明らかとなり、メカニズムを詳細に検討した。特に、内皮細胞培養系における骨髄間質細胞移植の効果に注目し、現在評価中である。また、開発を進めた外傷モデル(クラッシュ症候群)において抗HMGB1抗体の有効性を証明し、論文を作成した。平成24年度は、引き続き敗血症モデルにおける骨髄間質細胞の血管内細胞移植の効果発現メカニズムを解明するとともに、各侵襲モデルにおける各細胞移植法の有効性(生存率など)を比較検討する予定である。また、多臓器障害発症時の再生応答遺伝子の発現に関する研究を進め、骨髄間質細胞の血管内移植群において、血管内皮および各臓器で発現の増強または低下する遺伝子をマイクロアレー法で同定、解析する予定である。本研究では、侵襲時再生応答からみた新たな治療戦略として、血管内皮修復・再生効果をもつ細胞移植法を解明するために、以下の3点に目標を絞り実施した。1重症外傷、熱傷、敗血症、出血性ショックの異なる侵襲モデルにおいて、血管内皮傷害と骨髄機能を含めた血管内皮再生応答を経時的に評価する。2各侵襲モデルにおいて、血管内皮修復・再生治療として血管内皮前駆細胞、骨髄間質細胞、骨髄由来単核球細胞の血管内移植を行い、各細胞移植法の有効性(生存率など)を比較検討する。3特に、血管内皮における再生応答遺伝子の発現と各血管内細胞移植による変化をマイクロアレー法を用いて明らかにする。

重症外傷、熱傷、敗血症、出血性ショックの各侵襲モデルにおける再生応答に関する研究を進め、各侵襲モデルにおいて有効性が期待できる経血管内細胞移植による各種再生治療が血管内皮の修復・再生を促進して臓器障害を軽減するか、生存率を改善するか、比較検討を進めた。その中で、敗血症に伴う多臓器障害モデルにおいて、骨髄間質細胞の血管内細胞移植が生存率を有意に改善することが明らかとなり、そのメカニズムを詳細に検討した。移植した骨髄間質細胞が、肺、肝臓、腎臓など各臓器に集積することを確認した。特に、骨髄間質細胞の劇的な抗炎症効果、臓器保護効果がどのように発揮されるのか、内皮細胞培養系における骨髄間質細胞移植の効果に注目し、共培養系を使った新しい評価を行った。その結果、骨髄間質細胞の細胞移植が血管内皮の活性化、障害マーカーの発現を抑制し、有意な血管皮保護作用を発揮することが判明した。また、多臓器障害発症時の再生応答遺伝子の発現に関する研究を進め、骨髄間質細胞の血管内移植群において、血管内皮および各臓器で発現の増強または低下する分子の解析を試みた。敗血症モデルにおける骨髄間質細胞移植の有用性が明らかとなり、そのメカニズムの解明を詳細に進めているため。当初の計画にはなかった内皮細胞培養系における骨髄間質細胞移植の効果を現在評価中であり、解析にある程度の時間を要する。24年度が最終年度であるため、記入しない。敗血症モデルにおける骨髄間質細胞移植の有用性が明らかとなり、今後の臨床応用も視野に入れ、そのメカニズムの解朋に焦点を当てて進める。他のモデルにおける細胞移植の有用性の評価も並行して進める。
人工ゼオライト(ゼオライト化した石炭灰)の有効利用に関する研究

今年度は研究最終年度であるため、当初の研究計画に基付き各研究分担者相互に連携を保ちながら、それぞれの分担課題毎に本格的な試験研究を推進し、この間2回の研究会を実施し研究内容及びその成果について検討を行った。今年度中に実施した研究内容は概ね次の通りである。1.人工ゼオライトの有効利用に関する研究分担者に対して、陽イオン交換容量CEC=180me/100gの実験用ゼオライトを必要に応じて供給した。(逸見,櫻井)。2.石炭火力発電所の廃棄物であるフライアッシュをゼオライト化する製法と精製純度に関する基礎実験を前年度に引続き実施した(逸見)。3.石炭灰を簡易な方法でより大量に人工ゼオライト化するための精製装置の研究開発を行い、転炉加圧型ゼオライト化装置を試作して、精製純度に関する実験を行い良好な結果を得た。本装置は試作段階のもので、容量は701/回であるが、実用段階では23m^3/回程度に大型化することも容易である(福島,櫻井,逸見)。4.人工ゼオライトの有効利用に関する研究では、各研究分担者が本格的な実験研究を実施し、次のようなテ-マで研究成果を得たので、研究報告書(別冊)を作成することとした。(1)人工ゼオライト添加と用土の種類がカブ及びホウレン草の初期生育に及ぼす影響(上堂)。(2)湖沼における藻類の異常増殖防止のための底質安定剤(香川)。(3)石炭灰を原料とする人工ゼオライトの合成と性状(逸見)。(4)人工ゼオライトの青果物鮮度保持に及ぼす効果(鶴崎)。農地土壌・土層の物理性改良への利用(櫻井)。(5)有用微生物の根圏定着のための利用(岩本)。(6)青果物鮮度保持への利用(垣生)。(7)人工ゼオライトのエチレン吸収特性(水谷)。(8)養液栽培における安定培地剤(福山)。(9)植物,微生物など細胞生産培地への利用(阿部)。(10)家畜排泄物処理剤としての利用(村上)。(逸見,櫻井)。今年度は研究初年度であるため、当初の研究計画に基付き各研究分担者相互の研究課題について検討確認して、本格的な共同研究態勢を整えることに主力を注いだ。本年度に実施した研究内容は次の通りである。1.石炭火力発電所の廃棄物である石炭灰を人工ゼオライト化する製法に関する基礎実験として、オ-トクレ-ブを用いて精製を行ない、陽イオン交換容量(CEC)を精製純度として比較試験を行った(逸見)。2.人工ゼオライトの有効利用に関する研究分担者に対して、上記の精製法により、CEC=180me/100gの実験用ゼオライトを30kg供給することが出来た(逸見,櫻井)。3.石炭灰をより簡易な方法でより大量に精製するための人工ゼオライト化装置の研究開発を行い、転炉加圧型ゼオライト化装置を試作して、精製純度の比較実験を行った。本装置は試作段階のものであり、容量は70l/回であるが、実用段階では23m^3/回程度に大型化することも容易である(福島,櫻井,逸見)。

4.人工ゼオライトの有効利用に関する研究では本年度は比較的小量の実験材料を使用した基礎的実験研究に力を注ぎ、次年度の本格的な試験研究に向けてその態勢を整えた。本年度に実施した実験研究項目は次の通りである。(1)ダム湖等における赤潮防止のための底質安定剤としての利用(香川)。(2)ポット・プランタ-栽培培土への利用(上堂)。(3)青果物貯蔵庫の脱臭剤としての利用(鶴崎)。(4)養液栽培における安定培地剤(福山)。(5)エチレンガスなどの吸着による果実保存剤(水谷)。(6)農産物鮮度保持への利用(垣生)。(7)根圏における有用微生物の定着化への利用(岩本)。(8)植物、微生物など細胞生産培地への利用(阿部)。(9)土壌・土層の物理的改良剤への利用(櫻井)。(10)家畜排泄物および畜舎の脱臭・乾燥への利用(村上)。今年度は研究最終年度であるため、当初の研究計画に基付き各研究分担者相互に連携を保ちながら、それぞれの分担課題毎に本格的な試験研究を推進し、この間2回の研究会を実施し研究内容及びその成果について検討を行った。今年度中に実施した研究内容は概ね次の通りである。1.人工ゼオライトの有効利用に関する研究分担者に対して、陽イオン交換容量CEC=180me/100gの実験用ゼオライトを必要に応じて供給した。(逸見,櫻井)。2.石炭火力発電所の廃棄物であるフライアッシュをゼオライト化する製法と精製純度に関する基礎実験を前年度に引続き実施した(逸見)。3.石炭灰を簡易な方法でより大量に人工ゼオライト化するための精製装置の研究開発を行い、転炉加圧型ゼオライト化装置を試作して、精製純度に関する実験を行い良好な結果を得た。本装置は試作段階のもので、容量は701/回であるが、実用段階では23m^3/回程度に大型化することも容易である(福島,櫻井,逸見)。4.人工ゼオライトの有効利用に関する研究では、各研究分担者が本格的な実験研究を実施し、次のようなテ-マで研究成果を得たので、研究報告書(別冊)を作成することとした。(1)人工ゼオライト添加と用土の種類がカブ及びホウレン草の初期生育に及ぼす影響(上堂)。(2)湖沼における藻類の異常増殖防止のための底質安定剤(香川)。(3)石炭灰を原料とする人工ゼオライトの合成と性状(逸見)。(4)人工ゼオライトの青果物鮮度保持に及ぼす効果(鶴崎)。農地土壌・土層の物理性改良への利用(櫻井)。(5)有用微生物の根圏定着のための利用(岩本)。(6)青果物鮮度保持への利用(垣生)。(7)人工ゼオライトのエチレン吸収特性(水谷)。(8)養液栽培における安定培地剤(福山)。(9)植物,微生物など細胞生産培地への利用(阿部)。(10)家畜排泄物処理剤としての利用(村上)。
近世朝鮮儒者の民族アイデンテティーをめぐる言説-東アジア諸地域との対比から

15世紀の朝鮮は新たな王朝がはじまり、様々な国家制度が整備された。しかし、そこには様座な試行錯誤が存在したのであり、その「揺らぎ」こそ朝鮮社会の可能性を示すものである。本研究は、士大夫の随筆集を手がかりに、政治・経済・文学・思想・宗教・風俗に至る近世朝鮮社会の形成過程を考察。それを通じ、新たな政権樹立にともに、民族アイデンテティーが確立していくさまを実証的に追及した15世紀の朝鮮は新たな王朝がはじまり、様々な国家制度が整備された。それを通じ、新たな政権樹立にともに、民族アイデンテティーが確立していくさまを実証的に追及した研究代表者の野崎は、まず近世朝鮮儒者の随筆類を主なテクストに、そこに表れた様々な人物像を考察した論考を執筆。また、説話文学会主催のシンポジウムの講演において、朝鮮人物説話の機能について発表した。また、実在の人物をモデルとした朝鮮古典小説の訳注を刊行。これらと平行して、韓国や台湾における資料収集やフィールド調査も行い、今後の研究の基礎固めを果たした。研究協力者の高坂史朗は、植民地朝鮮と台湾に設立された帝国大学で哲学講座を担当した安倍能成と務台理作を中心に植民地教育が日本知識人にどのような影響を与えたかを論じた論考を執筆。また近世儒者が自らのアイデンテティの確立のため、キリスト教と西洋知識との葛藤を論じた李光来著『西洋思想受容史』を翻訳出版し、その解題で東アジア(中国・朝鮮・日本)の西洋思想受容の特色を比較する考察をなした。研究課題「近世朝鮮儒者の民族アイデンテティーをめぐる言説-東アジア諸地域との対比から」を遂行するため、次のような研究会、および調査活動を行った。7月9日金子祐樹「『東国三綱行実』における「忠」概念に対する考察」をめぐり、高坂史朗らと研究会を開催し、討議した(大阪市大アジア都市文化学)。10月2629日韓国ソウルを訪れ、沈慶昊(高麗大教授)と朝鮮近世儒者の文芸思想に関して討議。また、高麗大学図書館において文献調査・収集を行った。12月1318日「東北アジアの歴史地図から見る」と題し、客員研究員として金裕哲(延世大学教授)尹炳男(西江大学教授)を韓国から招聘し、古代から近代に到る東アジアの歴史地図編纂事業に見られるイデオロギーについて討論した。また、岐阜県立図書館において「外邦地図」の収集を行った。12月2127日中国北京を訪れ、琴知雅(北京大副教授)と前近代韓中関係について討議。また苗千梅(北京外大副教授)と中国における朝鮮時代文学研究の動向について討議。および、研究資料を収集した。3月26日30日韓国ソウルを訪れ、朴煕秉(ソウル大教授)と朝鮮時代漢文学、および古典文学史の方法論・華夷思想について討議。また、奎章閣などにおいて資料を収集した。この他、野崎は研究報告書として、15世紀の著名な士大夫である成俔の随筆集『慵斎叢話』を中心に、近世朝鮮士大夫社会の精神世界を描いた著作を準備しており、予定原稿300枚のうち200枚近くまで書き上げ、次年度中には完成の予定であいる。研究課題「近世朝鮮儒者の民族アイデンテティーをめぐる言説ー東アジア諸地域との対比から」を遂行するため、次のような研究会、および調査活動を行った。平成23年5月4日南通大学(中国浙江省)主催の東アジアセンター開設記念シンポジウムにおいて、中国・韓国・日本・ベトナムの研究者らとともに、今日の東アジア研究の課題と展望について討議した。平成23年7月24日台湾中央研究院(台北)主催の国際学術研究会「近代東亜城市社会群体与社会網」に参加、「15世紀朝鮮における宗教文化」を発表した。9月2428日韓国ソウルを訪れ、朴煕秉(ソウル大教授)と朝鮮士大夫の諸相について討議。また奎章閣などにおいて文献調査・収集を行った。11月30日全南大学(韓国)主催の国際シンポジウム「白湖林悌の生と文学」において、「仲井健治先生の研究活動の再照明ー白湖林悌を中心に」を発表した。12月2428日台湾南部の台南・高雄を中心に民俗宗教調査を訪れ、および研究資料を収集した。3月21日24日韓国ソウルを訪れ、沈慶昊(高麗大教授)と朝鮮時代漢文学、および古典文学史の方法論ついて討議。また、大学図書館などにおいて資料を収集した。この他、野崎は研究報告書として、15世紀の著名な士大夫である成俔の随筆集『慵斎叢話』を中心に、近世朝鮮士大夫社会の精神世界を描いた著作、および詳細な註釈を施した訳注を準備しており、前者に関しては予定原稿300枚のうち200枚近くまで書き上げ、後者に関しては基礎的な作業を完了。引き続きb完成をめざし鋭意、作業中である。

当初は研究課題の扱うべき対象が拡大しすぎる傾向があったが、成俔の『慵斎叢話』を主軸に考察を展開するよう努めた結果、多様な問題意識を一定の秩序のもとに整理・発展させうる手がかりを得、研究課題の達成に確かな見通しを立てることができた。また、韓国や中国の研究者からも有益な知見を得ており、おおむね順調な進展と評価できよう。24年度が最終年度であるため、記入しない。近世朝鮮儒者の精神世界を中心にしており、当時の政治・文化的な状況から関わりの深い朝鮮と中国との二国間の比較考察に重きを置かざるを得ないが、可能な限り、日本との比較も試みたい。最終年度に鑑み、研究成果をシンポジウムや研究会などで発表し、そこでの成果を研究成果報告に取り込み、15世紀朝鮮の著名な士大夫である成俔の『慵斎叢話』を中心に、思想・文学・文化論の視点から民族アイデンテティーに対する考察をまとめていく。
魚肉の肉質の死後変化に関する研究

これまで貯蔵中における魚肉の歯ごたえの変化は、魚体の硬直・軟化と対応した現象と考えられてきた。しかし、冷蔵中における筋肉の破断強度は、ハマチ、マダイ、ヒラメ、ニジマスなど多くの魚類において即殺直後がもっとも高く、魚体が最大硬直を示す死後1224時間後に急速に低下した。これは筋肉の歯ごたえの強さと魚体の硬直とはまったく独立した現象であることを示している。さらにこの結果が実際の食感を反映しているかどうかを知るため、このような筋肉の物性測定と同時に官能検査を平行して行なった。その結果、官能評価と破断強度とはよく相関し、破断強度測定によって歯ごたえの変化を定量化できることが明らかとなった。さらに、冷蔵中における筋肉の軟化機構を明らかにするため、透過型電子顕微鏡観察を行なったところ、筋線維間に存在する結合組織の主成分であるコラーゲン線維の崩壊が認められ、冷蔵中における軟化の主な原因は、結合組織中のコラーゲンの脆弱化によるものであることが強く示唆された。貯蔵中における魚肉の呈味の変化を調べるために呈味成分である遊離アミノ酸とヌクレオチドの含量を測定した。その結果、遊離アミノ酸には目立った変化は認められなかったが、貯蔵初期(約10時間目まで)にATPが急減し、IMPが急増することがわかった。これらの事実から、結合組織中のコラーゲンの脆弱化によって即殺後魚肉の歯ごたえは急速に低下するものの、呈味成分であるIMPが増加することによって刺身は風味を増すものと推測された。更に、加熱肉については、ハマチ筋肉を3週間にわたって氷蔵したにもかかわらず、加熱後に調製した抽出液の風味には大きな変化が見いだされなかったことから、成分の一部(たとえばATP)が加熱によって呈味成分(IMP)へと変化するものと考えられた。代表的な養殖魚であり刺身や寿司だねとして供されることの多いハマチを材料として実験を行なった。すなわち、フィレ-を4°Cで貯蔵し、官能テストによって呈味性(うま味、こく、および臭い)の変化を調べたところ、うま味は即殺直後はほとんど検知できず、その後6ー9時間から強度が増加した。こくは、これよりも更に遅れて(24時間以降)発現することがわかったが、臭いの変化は96時間までほとんど検知できなかった。これらの事実は、即殺直後の魚肉がいく分貯蔵したものより風味が劣ることを示している。さらに、官能評価によって肉の歯応えを調べたところ、即殺直後のものや10時間程度貯蔵したものは24ー72時間貯蔵したものよりも、強度は高いことが明かとなった。次いで、同一の試料について、パンクチャ-テストにより破断強度として求めた肉の歯応えは、即殺後12ー24時間にかけて著しく低下した。しかし、硬直指数から求めた魚体の硬直は、6ー12時間にかけて最も進行が著しく、軟化が進行する12ー24時間にかけては魚体は最大硬直状態のままであった。同様の実験をマダイおよびティラピアでおこなったところ、軟化のパタ-ンには多少の魚種特異性がみられたものの、いずれの魚種においても魚体の硬直にさきがけて、筋肉の軟化が始まり最大硬直中にも軟化は進行することが明かとなった。これまで肉の軟化は魚体の硬直が解けることによるとされていたが、今回の実験結果はこれを否定するものである。これらの事実を総合的に検討した結果、即殺直後の魚肉(たとえば活け造り)は風味の点で劣るものの、歯応えが優れているという結論を導くことが可能であった。

なお、今回の実験によって圧搾法による魚肉の保水性の強さを測定したが、72時間以内では、いずれの試料にも有意な差は認められず、今後の検討を必要とすることが判明した。ハマチおよびヒラメ筋肉を氷蔵し、この期間(06月)中における遊離アミノ酸含量の変化を調べたが、目立った変動は認められなかった。一方、呈味性のヌクレオチド(IMP)は徐々に減少した。この傾向はコイ筋肉でもほぼ同じであった。この事実は、これらの魚種ではIMPが肉の風味を決定する要因とも考えられるが、いずれの魚種においても、肉中におけるIMPの閾値1μmole/gを越しているので、IMPは肉の呈味性を左右する因子とはならないと判断した。筋肉の軟化速度に影響を与えるプロテア-ゼ活性を魚種ごとに比べた。すなわち、マサバ、マイワシ、マアジ、トラフグ筋肉のカテプシンD、中性プロテア-ゼ、アルカリ性プロティナ-ゼの活性を測定したところ、これらの酵素活性には著しい魚種間差がみられた。とくにカテプシンD活性は、マサバ、マイワシで高く、またアルカリ性プロテア-ゼ活性はマイワシで高かった。しかし、これらの魚種について死後の物性変化とこれらプロテア-ゼ活性との相関を調べたところ、両者の間に相関は認められなかった。さらに筋原線維の断片化率と物性変化との関係も調べたが、両者の間に相関性は認められなかったことから、筋原線維を構成する乙帯の脆弱化は、筋肉の軟化原因とはなりえないものと推察された。一方、筋肉の軟化過程における微細構造の変化を、アルカリ浸漬処理後走査型電子顕微鏡で観察したところ、軟化速度の速いマイワシでは筋細胞間に存在し、おもにコラ-ゲンからなる結合組織の網状構造がほどけてゆく様子が認められた。さらに透過型電子顕微鏡で詳しく観察すると、コラ-ゲン線維の三次元構造の崩壊が明瞭に示された。これは軟化速度の違いは、筋肉細胞を相互に接着している結合組織の構造的差異に起因することを示唆している。冷蔵中における魚肉の軟化は、筋細胞周辺の脆弱化によるものと考えられるが、その分子機構を明らかにするためには、筋細胞周辺のコラーゲンの分子種を同定することが必要である。そこで、コイ筋肉中の主要コラーゲンであるI型とV型コラーゲンをそれぞれ、DEAE-セルロース、DEAE-トヨパールおよびDEAE-セルロース、SP-フラクトゲルにより精製した。次に、ウサギを用いてこのI型およびII型コラーゲンのポリクロナール抗体を作製した。各血清画分をさらにアフィニティー精製し、特異抗体を作製した。その後、このような方法で作製した特異抗体を用いて、免疫組織学的に筋肉組織における両コラーゲンの分布を検討した。その結果、抗I型コラーゲン抗体は、筋隔膜に強い交叉性を示したが、筋内膜における交叉性は低かった。これに対し、抗V型コオラーゲンでは、筋隔膜における交叉性はI型抗体とくらべてはるかに低かったが、筋内膜に強い反応が認められた。以上の結果より、軟化に対応して構造が崩壊する筋内膜コラーゲン線維は、主としてV型コラーゲンより構成されていることが明らかとなった。ハマチ、マダイ、フグ、ニジマスなどを用いて各鮮度段階(死後72時間まで)における種々の筋肉タンパク質の電気泳動を試みたが、各段階における特異なパターンを検出することはできなかった。また、HPLCによってニジマス筋肉の軟化に伴うコラーゲン分解物の検出を試みたが、成功には至らなかった。
免疫記憶細胞化した遺伝子改変Ｔ細胞を利用する白血病に対する新規細胞免疫療法の開発

白血病細胞を攻撃する様に遺伝子改変したCD8陽性Tリンパ球(人工CTL)がより効果的に機能するには、輸注後患者体内に長期間留まることが重要である。本研究において、本来CTLが持つHLAクラスI拘束性に白血病細胞を認識するT細胞受容体(TCR)遺伝子を導入した特殊な量産型CD4陽性Tリンパ球(人工ヘルパーT細胞)が、治療用人工CTLの「記憶細胞化」を促進して、その寿命を延ばすことを明らかにした。腫瘍抗原特異的T細胞受容体(T-cell receptor: TCR)遺伝子改変T細胞(TCR-T細胞)用いた「がんに対する細胞免疫療法」は、現在、アメリカを中心に臨床試験が行われ、その有効性を示す知見が集積されて来ているが、白血病に対する細胞免疫療法の臨床試験は始まったばかりである。我々は、2013年7月に白血病抗原WT1を、日本人に最も頻度が高いHLA-A24拘束性に認識するTCRを、独自の高効率レトロウイルスベクター(WT1-siTCR vector)に組み込み遺伝子導入したTCR-T細胞を利用して白血病・骨髄異形成症候群を治療する日本初の多施設共同臨床試験を開始した(UMIN 0001159)。並行した基盤的検討として、白血病長期寛解を達成する上で重要な因子である1白血病抑制効果の増強・長期間の維持、2白血病性幹細胞の抑制の2点を達成するために、直接白血病細胞を傷害する遺伝子改変CD8陽性細胞傷害性T細胞(WT1-siTCR-CTL)の記憶細胞化と、白血病性幹細胞の局在部位である骨髄ニッチへのTCR-T細胞の集積性を高めることを目的として、同じWT1-siTCR遺伝子を導入したCD4ヘルパーT細胞(WT1-siTCR-HTL)の有用性に注目して研究を継続して来た。その結果、同時投与されたWT1-siTCR-HTLは、様々な機序を介して、WT1-siTCR-CTLの血病細胞傷害活性を増強し、セントラルメモリー・エフェクターメモリー細胞への分化を促進した。さらに骨髄ニッチへの遺伝子改変T細胞の集積性を高め白血病性幹細胞を標的とする細胞免疫療法の実現が視野に捉えられた。また、異なる視点から、モノクローナル抗体を利用する細胞免疫療法の開発へ向けた新たなエフェクター細胞を開発し論文発表した。加えて、難治性成人T細胞白血病を対象とするTCR-T細胞療法の開発も行い論文発表した。腫瘍抗原特異的T細胞受容体(T-cell receptor: TCR)遺伝子を導入して作った人工的な腫瘍特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)をがん治療に用いる細胞免疫療法は、現在アメリカを中心に臨床試験が行われ、その有効性が証明されつつある。我々は、白血病性幹細胞に高発現していると考えられているがん抗原WT1を、日本人に頻度が多いHLA-A24拘束性に認識するTCR遺伝子を、独自に開発した高効率レトロウイルスベクター(WT1-siTCR vector)を用いて導入した人工CTLを使って、血液がんを治療する日本初の臨床試験の今年度実施を予定している。本治療法開発研究過程で、人工CTLが投与された生体内で長期間生存出来ることが高い治療効果に繋がることを見出した。輸注された人工CTLの長期生存には免疫記憶細胞(メモリー細胞)特に、セントラルメモリー細胞の性格を持つ人工CTLの果たす役割が大きい。輸注する人工CTLの腫瘍応答性を高めて、かつ患者体内に長期間留まることを可能にする方法として、我々はがん細胞を特異的に認識するCD4陽性T細胞を利用する系を開発した。概して腫瘍特異的CD4陽性T細胞を大量に得ることは容易ではない。そこでWT1-siTCR vectorを用いてCD4陽性T細胞のHLAクラスII拘束性に抗原を認識する内因性TCRを抑制すると同時に、導入したWT1特異的TCRを介してHLAクラスI拘束性にがん抗原を認識する新たなヘルパーT細胞を作成した。この人工ヘルパーCD4陽性T細胞と人工CTLを同時に患者に輸注することで、輸注後早期の治療効果を高めるだけでなく、患者体内で人工CTLのセントラルメモリー細胞への分化も誘導できることを見出した。さらにヒト白血病細胞を移植した免疫不全マウスを用いた治療モデルでも、その効果を確認した(投稿準備中)。我々は、2013年7月から白血病抗原WT1を特異的に認識するT細胞受容体(TCR)遺伝子を導入し抗腫瘍効果を付与した患者自身のT細胞(TCR-T細胞)を用いる白血病に対する新たな細胞免疫療法の第I相多施設共同臨床試験(UMIN 0001159)を開始し、症例の蓄積と臨床的解析を進めている。それと並行して、より汎用性が高く、より効果的な白血病に対する細胞免疫療法を樹立する事を目的とした基礎研究を進めている。その成果として、新たにオーロラキナーゼA(AURKA)とテロメラーゼ逆転写酵素を標的とするTCR-T細胞を開発し、後者は移植適応の無い難治性成人T細胞白血病(ATL)に対する新たな治療法となる可能性が示された。

次に、患者に輸注されたTCR-T細胞の臨床効果を高める手段として、白血病細胞を直接殺傷するCD8-TCR-T細胞の機能を強化する目的で、特殊なHLA class I拘束性ヘルパーCD4-TCR-T細胞を作成して、その有効性を確認した。その機序は、CD4-TCR-T細胞自体の直接的なキラー活性、ヘルパーT細胞としてCD8-TCR-T細胞のキラー活性の増強に加えて、ケモカイン産生を介した白血病細胞へのCD8-TCR-T細胞誘導、さらにセントラルメモリーT細胞誘導、即ち記憶細胞化の促進を介した生体内での生存期間の延長効果を含む「複合的な効果」であることを明らかにした。また、WT1特異的TCR-T細胞の骨髄性白血病幹細胞に対する抑制効果を、急性骨髄性白血病患者骨髄CD34陽性細胞分画を移植したヒト化マウスを用いる治療モデルと生体イメージング法を用いて検討し、再発抑制に重要な意義を持つ白血病幹細胞を抑制する細胞免疫療法の開発を進めた。最終年度には、TCRを介さない細胞傷害活性である、抗体依存性細胞傷害活性を合わせて有効利用できる、新たな細胞免疫療法の開発も開始した。血液内科学、腫瘍免疫、造血幹細胞移植、感染免疫臨床試験に使用している(クリニカル・グレード)WT1-siTCRベクターを用いて遺伝子改変したWT1-siTCR-HTLは白血病細胞を認識して活性化されると、ケモカインCCL4-CCR5の系を介してWT1-siTCR-CTLを、自身が攻撃している白血病細胞へ向かって集積させて、Th1ヘルパー機能を介して抗白血病作用を増強した。同時に、遺伝子改変していないCD4陽性T細胞と比較して、統計的に有意差を以てWT1-siTCR-CTLのメモリー細胞化を促進した。さらに、このWT1-siTCR-HTL自身もCTLとは異なる機序で白血病細胞をある程度傷害出来ること、ケモカインCXCR4-CXCL12系を介して輸注した免疫不全マウス骨髄へ移行することを突き止めた。すなわち、WT1-siTCR-HTLを併用することで白血病性幹細胞をも射程内に出来る可能性が示された。これらは、より高い臨床的抗白血病効果に繋がることを示唆している(論文投稿中)。同時に我々は、現在、WT1-siTCR-T細胞を用いる骨髄性白血病・骨髄異型性症候群に対する細胞免疫療法の臨床試験を実施しており、患者リクルートと実地臨床への導入に向けた様々なデータを集積中である。次の段階は、1臨床試験で得られたデータを基に、試験管内で得られた知見の確認を進めていく。加えて2試験管内では、人工ヘルパーCD4陽性T細胞はTh1に限定されている。しかし、より長期に渡るCTLの機能強化にはTh17細胞の関与や、Programmed death-1等に代表される免疫チェックポイント分子への介入が必要なことが明らかになって来ている。これらの課題に対応し、より観察期間の長い実臨床に近いモデルを作成して、この治療法の最適化に向けた検討を進める。同じ抗原を認識するTCR遺伝子を用いて遺伝子改変した人工ヘルパーCD4陽性T細胞と人工CTLは、標的である白血病細胞上の同じ抗原を認識することから、輸注された体内では、比較的近くに位置する可能性が高まると予想している。これらCD4陽性
カルシウムを中心とした心不全発症の分子機構の解明と治療への応用

Ryanodine receptor (RyR2)は興奮収縮連関を担う代表的な蛋白質で、多くの結合蛋白質によりその機能は制御される。SorcinはRyR2結合蛋白質の一つであり、in vivoではRyR2のチャネル活性を抑制する。In vivoでのsorcinの役割を明らかとするため、sorcin欠損マウス(SOKO)を作成した。SOKOは正常に発育し、その心筋細胞内カルシウム動態には影響を認めなかった。圧負荷心ではsorcinの発現は上昇する。圧負荷心においてSOKOと野生型マウスは心肥大の程度ならびに心機能に有意差を認めなかった。我々は心臓での興奮収縮連関に影響を与えていると考えられているsoricnのノックアウトマウス(SOKO)を作成し、sorcinの生体内での検討を行った。SOKOはメンデルの法則に従い誕生し、正常に発育し、外見上は大きな異常は認めなかった。これらの事より、sorcinのノックダウンは心肥大や心筋の線維化には影響を与えない事が明らかとなった。心臓超音波法を用いた検討では、左室拡張末期径、収縮末期径、左室短縮率、左室壁厚に両群で差を認めなかった。心機能を更に検討を行うため、観血的に左室内の圧を計測した。左室収縮期圧、左室拡張末期圧、収縮能の指標であるdp/dt max、拡張の指標であるdp/dt min、いずれの指標も両群間で差を認めなかった。次に、マウス成獣単離心筋細胞を用い、心筋のカルシウム動態の検討を行った。最大カルシウムトランジェントとカルシウムトランジェントがPeak Caの3/4から1/4に達する時間であるDecay timeに両群で有意差は認めなかった。以上より、sorcinのノックダウンはマウスの定状状態における心機能、カルシウム動態には影響を与えていないことが明らかとなった。SOKOはメンデルの法則に従い誕生し、正常に発育し、外見上は大きな異常は認めず、定常状態では、心臓超音波法やカテーテル法で測定した心機能は野生型マウス(WT)と相違なかった。マウス横行大動脈(TAC)を縮窄した圧負荷心では、心肥大期にsoricinの発現が上昇する。そこでSOKOに対し、TACを施行した。TAC施行後1週間の心エコーでは、WT、SOKO共にsham手術群に比しTAC群は有意な壁厚の増大を認めたが、WT TAC群、SOKO TAC群間でその程度に差を認めなかった。また、WT TAC群、SOKO TAC群共に心拡大や心機能の低下を認めなかった。体重で補正した心重量、左室重量はsham手術群に比し、TAC手術群で増大を認めるものの、WT TAC、SOKO TAC両群で有意差を認めなかった。Hematoxylin-Eosin染色やAzan-Mallory染色を用いた組織学的検討では、SOKO TAC群はWT TAC群に比し有意な線維化の亢進や、心筋細胞肥大は認めなかった。心肥大期の心筋を単離し、心筋のカルシウム動態の検討を行った。以上より、sorcinのノックダウンはマウスの定状状態だけでなく、病的肥大期においても心機能、カルシウム動態には影響を与えていないことが明らかとなった。
コヒーレント電場によるナノ粒子の配列制御

平成14年3月に分子科学研究所に導入された極低温超高真空STMの立ち上げを行ない、グラファイト、金などの基板表面の原子像が観察できることを確認した。金およびパラジウムのナノ粒子を液相中で合成し、空気中で基板表面にキャスト法で吸着させSTM観測を行なった。電子顕微鏡で観察した結果とほぼ一致するサイズ(粒径約4nm)で、ナノ粒子が観察された。金ナノ粒子は波長530nm付近でプラズモン吸収を起こす。これによって発生する双極子同士の相互作用を利用してナノ粒子を集団的に駆動することを試みた。しかし、ナノ粒子の吸着量の制御に困難があり、クラスターが多層に吸着してしまった。現在サブモノレイヤーでの光照射の効果を確かめるために実験方法を改善中である。多層吸着した金ナノ粒子は、興味深い高次構造を形成することがわかった。金ナノ粒子のマルチレイヤーはステップやテラス構造をもち、最表面のナノ粒子のSTM像は列状につながって観測された。その列の方向はローカルに見ると平行に揃っており数十ナノメートルにわたるドメイン構造が見られた。隣接するドメインでは列の方向が互いに120度異なっていた。さらに、それぞれのドメインにおける列の向きや面積は時間とともに変動した。このようなドメイン構造が形成されるメカニズムについては検討中である。一方、パラジウムナノ粒子を金(111)面に吸着させて、波長575nmのピコ秒レーザーパルスを照射しながら数時間にわたってSTM観察を行なったところ、光の偏光方向に応じ、ナノ粒子による列状構造の形成と崩壊を示すSTM像が見られた。今後、レーザー光の波長および強度依存性、基板の種類への依存性などを調べ、ナノ粒子の配列をより精密に制御する方法を追及する。固体表面上に分散させた金属クラスターにレーザーを照射することによりその配列制御を行うのが本研究の目的である。今年度はサイズの揃った金属クラスターを再現性良く作成することを第一の目標とし、水溶性高分子の存在下で金属イオンを還元する方法で、パラジウムの高分子保護金属ナノクラスターを作成した。透過型電子顕微鏡によって観察を行ったところ、クラスターサイズは3.5±0.5nm程度であることがわかった。また、還元剤の種類によってX線回折のパターンが変化することを見出した。すなわち、還元の方法によってクラスターの結晶構造に違いが生ずることがわかった。クラスター合成と並行して、レーザー光を縦・横偏光成分に分離しそれぞれの強度を調整することで両者の比率を任意にコントロールするシステムの開発を進めた。光強度をモニターしながら透過率可変型のNDフィルターで調整することでこれを実現する。GP-IB経由でのパーソナルコンピューターによる自動制御を目指して現在開発中である。今後は、来年度初めに分子科学研究所に新規に導入予定の外部からの光照射が可能な極低温超高真空STM装置を用いて、固体表面上に分散した金属クラスターの観察を行い、レーザー照射による影響を調べる予定である。具体的には、金属クラスターの種類・保護高分子膜の厚さ・固体表面の種類による配列の変化を調べ、さらにレーザー強度・波長・偏光比率・固体表面温度による効果を確かめる。
真核生物の膜脂質生成にかかわる遺伝子の発現と調節

リン脂質は生体膜の構成成分として構造的な役割を果たしているのみならず、外界からの刺激に細胞が応答する過程にも深くかかわっている。したがって増殖、刺激伝達など細胞の機能を根本的に理解するためには、リン脂質の代謝がどのようにして調節されているかを明らかにすることが必要である。我々は分子生物学的アプローチを用いて、リン脂質代謝の遺伝子、酵素の構造と調節を明らかにしようとしているが、本年度得られた成果は次のように要約される。1.CDPコリン合成経路の初発酵素であるコリンキナーゼの遺伝子CKIのクローニング、構造解析、および大腸菌における発現。酵母コリンキナーゼ欠損株を用いて、遺伝的相補によりコリンキナーゼ遺伝子をクローニングした。遺伝子には582アミノ酸残基、66.3KDの蛋白質をコードしうる領域が含まれていた。1acZのN末部分にCKI遺伝子のコード域を挿入し融合蛋白として大腸菌で発現させたところコリンキナーゼ活性の他にエタノールアミンキナーゼ活性をも有する酵素が生成した。したがってコリンキナーゼとエタノールアミンキナーゼは同一の遺伝子CKIにコードされていることが結論された。2.酵母ホスファチジルイノシトール(PI)合成酵素遺伝子PISの大腸菌細胞における発現。細胞の刺激応答において重要な働きをするPI合成酵素の遺伝子PISをヘテロな系で発現させ細胞への影響を見るために、PI合成酵素を大腸菌内で発現させた。培地にイノシトールを添加すると、イノシトールは細胞内に取り込まれ、全リン脂質の4%にも及ぶかなりの量のPIが大腸菌細胞内に蓄積した。その際、PI+PG、すなわち酸性リン脂質の総和はPI蓄積前のPGの総量と等しく、大腸菌細胞にして既に膜リン脂質の荷電を一定に保つ機構を有することが示された。
炭素循環と環境保全を実現する森林バイオマス・畜産廃棄物発電による地域振興

初年度は、実用化の行われている諸外国(スウェーデンのウプサラ市、ニュージーランド)ならびに国内でのバイオマス発電の実態調査(岡山県勝山町)とともに最適木質燃料の決定を行うためのバイオマス燃料および間伐材の燃焼試験と化学分析を行った。さらに、燃焼炉ならびに発電に関する知識を得るために清掃工場視察(福岡市)を行い、同市におけるゴミ発電と廃木材ならびに剪定枝条の利用についてその現状と問題点を明らかにした。次年度は、初年度の研究成果を受けて、実用化の行われているその他の諸外国(アメリカ西部オレゴン州、西ドイツとスイス)ならびに国内でバイオマス燃料を生産・利活用している場所の実態調査(徳島県、岩手県)を行い、バイオマス燃料の生産から消費までの一連の流れを分析し、木質燃料生産と同利用環境の実体と問題点を明らかにするとともに、同燃料の今後の新たな展開を発見した。初年度および本年度の研究によって、一応の成果が得られたので、研究成果の地域還元を目的に研究成果の中間発表会(日田市)を開催するとともに、中間報告書を作成し関連の団体等に配布した。最終年度は、これまで2年間の研究成果を受け、国内でのバイオマス燃料の利用促進を主眼に、国内の代表的な地方都市を抽出し、それらの都市での利活用の可能性を検証した。主な研究対象地域は、北海道のカラマツ林業で有名な十勝地方の足寄町と、九州のスギ林業で有名な日田市郡とした。その他、宮崎県、鹿児島県および岩手県でも同様の研究を行った。ほとんどの地域の解析結果から、バイオマス燃料の利用が経済的にもほぼ可能であることがわかった。これまでの研究成果を関連のある都市で還元を行うために、北海道足寄郡足寄町で研究成果発表会を町との共催で行った。先に出版した中間報告書とあわせて、最終研究成果報告書を作成した。今年度は、実用化の行われている諸外国ならびに国内でのバイオマス発電の実態調査とともに最適木質燃料の決定を行う予定であったので、それにしたがって研究を行った。まず第一回目の研究会を全員で開催し、これまでの各部門での研究について理解を深め、その上で今後の研究計画を作成した。次に、国内におけるバイオマス発電の現場を視察し、同発電の実態および環境をつぶさに調べた(全員参加;岡山県勝山町銘建工業)。その後、勝山のバイオマス燃料および福岡県の間伐材の燃焼試験と化学分析を行った(古賀、宮武、北村)。さらに、燃焼炉ならびに発電に関する知識を得るために福岡市の環境局が管理する福岡市中央清掃工場と同東部清掃工場の視察を行い、ゴミ発電と廃木材ならびに剪定枝条の利用についてその現状と問題点を明らかにした。海外におけるバイオマス発電実態を調査するために、スウェーデンのストックフォルム市郊外にあるバイオマス発電、給湯システム見学ならびにスウェーデンにおけるバイオマスエネルギー政策について資料収集を行い(寺岡、吉田)、林業の今後の新たな展開を発見した。これ以外にも、西川はニュージーランドを訪問し、同様の調査を行う予定である(3月)。海外における視察とともに、国内の対象地域である熊本県小国町で地域資源に関する基礎調査(吉田)を行うなど、全員が来年度のための基礎資料を収集した。本年度は、昨年度の研究成果を受けて、実用化の行われているその他の諸外国ならびに国内でバイオマス燃料を生産・利活用している場所の実態調査とともにバイオマス燃料の生産から消費ならびにその環境・社会への影響評価の方法を確立する年度であり、海外における実態調査は、北米とヨーロッパで行う予定であったので、それにしたがって研究を行った。まず第一回目の研究会を全員で開催し、前年度行った各人の研究について理解を深め、その上で今後の研究計画を作成した。続いて国内での木質ペレットの生産・利活用の実態を把握するために、徳島県筒井産業(10月17-18日:吉田,松下)と岩手県葛巻林業(1月18-20,24-25日;今田,吉田,國崎,深井,北村,松下)を見学し、木質ペレット生産と同利用環境の実体と問題点を明らかにした。研究を進める一方で、研究成果の中間発表会を研究対象地の日田市で開催(7月14日:全員)するとともに、同市での調査を本格的に開始した。日田市とともに熱利用の環境、森林の状況等が北欧やアメリカの環境と酷似している北海道(十勝地方)での応用を目指した研究を開始した。さらに、海外におけるバイオマス発電実態を調査するために、アメリカ西部のオレゴン州周辺の林業、林産業ならびバイオマス利用の実態調査を行い(9月22-30日;西川、寺岡、國崎、吉田)、それらの有機的な関係をつぶさに視察し、木質バイオマス燃料の今後の新たな展開を発見した。これ以外にも、西ドイツとスイスでも、同様の調査を行った(11月18-24日:今田、寺岡、國崎、吉田)。そして最後に、昨年度の研究成果、日田市で中間発表会および今年度の研究成果を地域に還元することを目的に、中間報告書を作成し(H13年1月)、関連の団体等に配布した。

次年度は、初年度の研究成果を受けて、実用化の行われているその他の諸外国(アメリカ西部オレゴン州、西ドイツとスイス)ならびに国内でバイオマス燃料を生産・利活用している場所の実態調査(徳島県、岩手県)を行い、バイオマス燃料の生産から消費までの一連の流れを分析し、木質燃料生産と同利用環境の実体と問題点を明らかにするとともに、同燃料の今後の新たな展開を発見した。初年度および本年度の研究によって、一応の成果が得られたので、研究成果の地域還元を目的に研究成果の中間発表会(日田市)を開催するとともに、中間報告書を作成し関連の団体等に配布した。最終年度は、これまで2年間の研究成果を受け、国内でのバイオマス燃料の利用促進を主眼に、国内の代表的な地方都市を抽出し、それらの都市での利活用の可能性を検証した。主な研究対象地域は、北海道のカラマツ林業で有名な十勝地方の足寄町と、九州のスギ林業で有名な日田市郡とした。その他、宮崎県、鹿児島県および岩手県でも同様の研究を行った。ほとんどの地域の解析結果から、バイオマス燃料の利用が経済的にもほぼ可能であることがわかった。これまでの研究成果を関連のある都市で還元を行うために、北海道足寄郡足寄町で研究成果発表会を町との共催で行った。先に出版した中間報告書とあわせて、最終研究成果報告書を作成した。最終の本年度は、これまで2年間の研究成果を受け、国内でのバイオマス燃料の利用促進を主眼に、国内の代表的な地方都市を抽出し、それらの都市での利活用の可能性を検証した。これに先だって、日本各地での木質バイオマスの利用を前提に資源量推定を行いバイオマス燃料の賦存量について研究を進めた。まず第一回目の研究会を全員で開催(平成13年7月:福岡で開催)し、前年度行なわれた研究について理解を深め、その上で今年度の研究計画を作成した。九州全体での木質バイオマス燃料の利用に先立って、同管内におけるバイオマス燃料の主原料の整理と詳細な資源調査を行い、最終的には森林計画区別、燃料別に木質バイオマス賦存量を推定した。同様に、宮崎県で詳細なバイオマス賦存量分布図を作成し、鹿児島県についても同様な解析を行うとともに、木質バイオマス利用に関連してLCA的な評価の面からの総合的な研究を行った。さらに、岩手県でも、また北海道足寄町でも同様の研究を行った。特に北海道の足寄町では、年間の熱環境、森林資源の状況ならびに地形条件も含めてすべてがバイオマス燃料の利用が特に進んでいる北欧に似ていることから、日本の中では最も本格的な利用が期待される。よってより具体的な利用方法としてペレットストーブによる燃焼実験を行った。その結果、現行国内で生産されているペレットを利用すれば、現行の灯油ストーブよりもランニングコストが安いことが証明された。そして最後に、これまでの研究成果を関連のある都市で還元を行うために、北海道足寄郡足寄町で研究成果発表会を町との共催で行った(平成14年1月16日開催)。
ポリアミン生合成酵素遺伝子を利用したイネの低温耐性強化法の開発

発芽7日目の北海道のイネ品種(ゆきひかり)の幼苗に対して、低温、塩、乾燥、浸透圧、冠水などの環境ストレス処理を行い、ポリアミン含量の変化を高速液体クロマトグラフィーを用いて調べた。その結果、環境ストレスの中では、低温ストレスおよび冠水ストレスによって、ポリアミンの一種プトレシンの含量が顕著に増加することを突き止めた。植物のプトレシンの生合成には、アルギニン脱炭酸酵素(ADC)あるいはオルニチン脱炭酸酵素(ODC)が関与することはよく知られている。我々は、ストレスで誘導されるプトレシンの蓄積に関与する遺伝子を特定するため、RT-PCR法によってイネのADCおよびODC遺伝子を単離し、その非翻訳領域を利用して作製した遺伝子特異的プローブを用いてNorthern法による発現解析を行った。その結果、単離されたOsADC1遺伝子は低温ストレスによって特異的にその発現が増大することが判明した。一方、OsODC1遺伝子は冠水ストレス処理に対して応答し、その発現量が増加することが解明された。以上の結果から、イネ幼苗の低温ストレスによるプトレシン含量の増大にはOsADC1遺伝子が、一方、冠水ストレスによるプトレシン含量の増大にはOsODC1遺伝子が、それぞれ中心的な役割を果たすという役割分担の可能性がはじめて明らかになった。また、本研究において単離されたプトレシン生合成のキー酵素のひとつであるアルギニン脱炭酸酵素遺伝子(OsADC1)は、Northem法による発現解析およびGUSレポーター遺伝子によるpromoter解析の結果から、イネの低温ストレス応答に深く関与することが示唆された。イネの遺伝子転換体の作出までには至らなかったが、本研究で得られた研究成果は、OsADC1遺伝子を操作することによって、内生ポリアミン量を制御できるという可能性を示しており、ポリアミンを利用したイネの低温ストレス耐性の改善に関連した技術開発への応用が期待される。平成17年度は、イネの低温耐性の改良に利用可能な有用なポリアミン関連遺伝子を探索する目的で、イネの主要なポリアミンであるプトレシン、スペルミジン、およびスペルミンの生合成に関与する遺伝子の単離を試みた。その結果、スペルミジンやスペルミンの前駆物質であるプトレシンの生合成に直接関与する2種類の酵素遺伝子、すなわちアルギニン脱炭酸酵素遺伝子(OsADC1;GenBank No.AAT37534)、およびオルニチン脱炭酸酵素遺伝子(OsODC1;GenBank No.AAV39553)の全長遺伝子の単離に成功し、遺伝子データベースに登録した。さらに、OsADC1およびOsODC1遺伝子の3'非転写領域の塩基配列をもとに遺伝子特異的プローブを作製し、これらの遺伝子の環境ストレス応答や植物ホルモン応答を調べるため、イネ幼植物を用いた発現解析を行った。その結果、低温(5°C,12°C)、乾燥、塩(0.3M NaCl)、冠水、浸透圧(0.5M mannitol)、高温(40°C)などの環境ストレス、並びにABA(0.01mM)、ethephon(0.01mM)、ジャスモン酸メチル(0.01mM)、およびサリチル酸(0.01mM)による処理では、OsADC1遺伝子が5°Cや12°Cの低温ストレスに対してのみ特異的に応答して発現が顕著に増大することが明らかになった。一方、OsODC1遺伝子は冠水ストレスに弱く応答することが解明された。これらの結果からイネ幼植物の低温処理にともなうプトレシン含量の増大には、特にOsADC1遺伝子が重要な役割を果たすことが示唆された。

平成18年度は、イネの低温耐性の改良を最終目的にして、今回単離された低温応答性のOsADC1遺伝子やその他のポリアミン関連有用遺伝子をイネに導入して大量発現させた形質転換イネの作出を行う。平成17年度の研究では、イネの主要なポリアミンの一つであるプトレシンの生合成に関与するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子(OsADC1)を単離して解析し、OsADC1遺伝子が低温ストレス下で特異的に誘導されることを明らかにした。平成18年度は、この低温誘導性のOsADC1遺伝子をイネに再導入して大量発現させることによって、イネの低温耐性の改善を試みるための形質転換イネの作出を計画したが、OsADC1遺伝子が高GC含量遺伝子である等の理由から通常のPCR法による遺伝子の増幅などが成功せず、形質転換用バイナリーベクターの構築が困難を極めた。そのため代替法として、同様の低温誘導性が報告されている、もう一つの主要ポリアミンであるスペルミジンの生合成に関与するスペルミジン生合成酵素遺伝子(SPDS)に急遽研究対象を変更した。現在SPDS遺伝子の増幅および大量発現用バイナリーベクターへの組み込みに成功し、形質転換用ベクターを構築した段階である。平成19年度は、このSPDS造伝子の詳しい発現解析等を行うとともに、SPDS遺伝子をアグロバクテリウム法でイネに導入して形質転換体を得て、そのT1種子から得られる個体を用いて、SPDS遺伝子を大量発現させたイネにおけるポリアミン含量の変化、並びにその低温耐性やその他のストレス耐性との関連を検討し、イネの低温耐性の向上に役立てる。平成18年度は、低温応答性のアルキニン脱炭酸酵素遺伝子(OsADC1)をイネで大量発現させることによって、低温耐性の向上を目指した形質置換イネの作出を試みた。しかし、OsADC1が高GC含量遺伝子である等の理由から、形質置換用バイナリーベクターの構築に困難をきわめた。そのため低温誘導性が報告されており、もう一つの主要なポリアミンであるスペルミジンの生合成に関与する、スペルミジン生合成酵素遺伝子(SPDS)に研究対象を変更し、SPDS遺伝子をバイナリーベクターに組み込んで形質置換用ベクターを構築した。平成19年度は、このSPDS遺伝子をイネに導入し、得られた形質置換イネT0系統の表現型を調査した。また、T0系統から得られるT1種子を発芽させ、発芽後約2週間後の若い苗を用いて、SPDS遺伝子導入系統のストレス耐性の変化等を調べた。また、SPDS遺伝子を導入して得られるT0系統を登熟期まで栽培し、その形態学的形質を対照系統と比較した。その結果、遺伝子導入した登熟期のT0系統では、茎の枝分かれ(分げつ)が促進され、茎数が対照系統の約2倍に増加するという形態学変化が観察された。今回の実験ではセンス法及びアンチセンス法によるSPDS遺伝子導入を試みたが、センス法で導入したT0系統は得られたものの、アンチセンス法で導入したT0系統は得られなかった。また、SPDS遺伝子導入系統の若い苗では、25mMの食塩水中における地上部の生長が、遺伝子導入を行わなかった対照系統と比較して約20%改善されることがわかった。しかし、導入系統と対照系統間で、17°Cの低温下における生長の有意差は認められなかった。この他、平成17年度に単離した、低温で発現が誘導される