hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト培養胎盤細胞を用いた血管新生に関する研究

私達はヒト胎盤を酵素的に処理して培養し、その上清中あるいは細胞抽出物中のヒト血管内皮成長因子(human vascular endothelial growthfactor : hVEGF)を測定した。その結果、胎盤由来間葉系細胞(human placenta-derived mesenchymal cells : hPDMC)が多量のhVEGFを産生することを見い出している。胎盤は、これまで医療廃棄物として処理されてきた。しかし胎盤は有効利用可能な臓器であり、再生医療や血管新生療法のための細胞資源として極めて有用であると考えられるが、このような発想は文献や学会報告を見る限りなされていない。本研究の目的は、(1)hPDMCから産生されるhVEGFの生物活性をヒト臍帯静脈血管内皮細胞(human umbilical vein endothelial cell: hUVEC)の増殖で検討してこれを証明する、(2)hPDMCからhVEGF以外の増殖因子が産生されていないかを検討する、(3)虚血動物モデルを用い、hPDMCの細胞移植が血流を改善するか否かを検討する、の3つである。移植されたhPDMCは局所でhVEGFを産生した後、最終的には拒絶されると考えられるが、幹細胞の性質を有していれば血管内皮細胞に分化する可能性もある。これについても免疫組織化学で検討する予定である。hPDMCの細胞移植は虚血部位での局所作用性、安全性、低侵襲性の全て点から、これまで報告されているいずれの治療法よりもすぐれている。また胎盤からは大量に細胞が調整できるので、本研究の成果は、ヒトに対する副作用がなく有効で、かつ医療経済的効率の良い血管新生治療を確立させることにつながると期待される。昨年度に研究目的の(1)と(3)を中心に研究を行ったが、本年度は研究目的の(2)を中心に検討を行った。その結果、胎盤細胞の培養上清はhVEGFは、ELISAで測定したhVEGFよりも高い活性を示した。このことは胎盤細胞が産生するhVEGFが生理活性を有すことだけでなく、hUVECを増殖させる他の因子も産生していることを示唆した。他の血管新生因子をELISAやRT-PCRで検討したところbFGFやangiopoietinなども産生していることが判明した。これらの結果から、hVEGFの細胞溶解液を親水軟膏に混ぜ、マウス皮膚創傷モデルに投与したところ、創傷治癒が促進されることが明らかとなった。これらの結果より、培養胎盤細胞の用途として皮膚外用剤の可能性が示唆された。私達はヒト胎盤を酵素的に処理して培養し、その上清中あるいは細胞抽出物中のヒト血管内皮成長因子(human vascular endothelial growth factor: hVEGF)を測定した。その結果、胎盤由来間葉系細胞(human placenta-derived mesenchymal cells: hPDMC)が多量のhVEGFを産生することを見い出している。本年度は研究目的の(1)、及び(3)を中心に検討を行った。その結果、胎盤細胞の培養上清はhVEGFの生物学的活性を有し、ELISAで測定したhVEGFよりも高い活性を示した。このことは胎盤細胞が産生するhVEGFが生理活性を有すことだけでなく、hUVECを増殖させる他の因子も産生していることを示唆する。さらにin vivoで虚血マウスに対する細胞移植療法を行った。麻酔下でNOD/Shi-scidマウスの大腿動静脈を結紮し、片側下肢虚血モデル動物を作製した。レーザードップラーイメージングシステム(Moor LDIシステム)により手術後の血流を測定した。胎盤由来細胞1x10e6個をPBS 0.1mlに懸濁し虚血部位数箇所に分けて筋注し、対照群と比較した。その結果胎盤由来細胞移植群で有意に虚血が改善した。下肢の筋組織を固定して免疫組織化学により新生血管の数を調べたところ、これも胎盤細胞移植群で増加していた。これらの結果より、培養胎盤細胞の移植が、ヒトの虚血性疾患の新しい治療法になりうることが示唆された。

私達はヒト胎盤を酵素的に処理して培養し、その上清中あるいは細胞抽出物中のヒト血管内皮成長因子(human vascular endothelial growth factor : hVEGF)を測定した。その結果、胎盤由来間葉系細胞(human placenta-derived mesenchymal cells : hPDMC)が多量のhVEGFを産生することを見い出している。胎盤は、これまで医療廃棄物として処理されてきた。しかし胎盤は有効利用可能な臓器であり、再生医療や血管新生療法のための細胞資源として極めて有用であると考えられるが、このような発想は文献や学会報告を見る限りなされていない。本研究の目的は、(1)hPDMCから産生されるhVEGFの生物活性をヒト臍帯静脈血管内皮細胞(human umbilical vein endothelial cell: hUVEC)の増殖で検討してこれを証明する、(2)hPDMCからhVEGF以外の増殖因子が産生されていないかを検討する、(3)虚血動物モデルを用い、hPDMCの細胞移植が血流を改善するか否かを検討する、の3つである。移植されたhPDMCは局所でhVEGFを産生した後、最終的には拒絶されると考えられるが、幹細胞の性質を有していれば血管内皮細胞に分化する可能性もある。これについても免疫組織化学で検討する予定である。hPDMCの細胞移植は虚血部位での局所作用性、安全性、低侵襲性の全て点から、これまで報告されているいずれの治療法よりもすぐれている。また胎盤からは大量に細胞が調整できるので、本研究の成果は、ヒトに対する副作用がなく有効で、かつ医療経済的効率の良い血管新生治療を確立させることにつながると期待される。昨年度に研究目的の(1)と(3)を中心に研究を行ったが、本年度は研究目的の(2)を中心に検討を行った。その結果、胎盤細胞の培養上清はhVEGFは、ELISAで測定したhVEGFよりも高い活性を示した。このことは胎盤細胞が産生するhVEGFが生理活性を有すことだけでなく、hUVECを増殖させる他の因子も産生していることを示唆した。他の血管新生因子をELISAやRT-PCRで検討したところbFGFやangiopoietinなども産生していることが判明した。これらの結果から、hVEGFの細胞溶解液を親水軟膏に混ぜ、マウス皮膚創傷モデルに投与したところ、創傷治癒が促進されることが明らかとなった。これらの結果より、培養胎盤細胞の用途として皮膚外用剤の可能性が示唆された。
非天然二核金属中心を有する人工生体触媒の創製

金属酵素は高い触媒活性と選択性を達成する極めて魅力的な金属反応中心をもつ。例えば、メタンの水酸化や窒素固定をはじめとする合成化学的に難易度の高い反応を常温常圧の温和な条件下で触媒することが可能である。本研究では、タンパク質マトリクスを活用し、非天然二核金属中心を有する生体触媒の構築を行った。第一配位圏の合理的な二核金属配位環境の再構築と、第二配位圏の設計を組み合わせた生体触媒を作製し、その構造および機能解析を行った。本研究では、タンパク質マトリクスを活用し、非天然二核金属中心を有する生体触媒の構築を目的とし、第一配位圏の合理的な配位環境の再構築によって、二核鉄中心を有する酸化反応触媒の創製を実施した。金属タンパク質触媒は、水中の温和な条件下でも高活性な次世代型触媒の候補であり、生物無機化学、触媒化学、タンパク質科学の研究者が近年勢力的に参入してきている。これまでの研究は、天然酵素の単核金属中心を機能改変する、あるいは、単核金属錯体をタンパク質内に包接した系がほとんどである。一方、生体ではメタンの酸化を行うメタンモノオキゲナーゼや水素分子の酸化還元するヒドロゲナーゼのように、タンパク質二核金属中心が、物質循環の鍵となる反応を触媒している。その重要性にも拘わらず、二核中心を含めた多核コアの人工生体触媒の人工機能化の研究は黎明期である。本研究では、シンプルかつ強固な4本へリックス構造のタンパク質マトリックス内に非天然の二核金属中心の構築し、触媒反応への適用を目的としており研究を実施した。具体的には、オキソ/ヒドロキソ架橋された二つの鉄イオンに5つのヒスチジンが配位し、アスパラギン酸とグルタミン酸のカルボキシル基が架橋したヘムエリスリンと同様の二核鉄の配位アミノ酸及び近傍のアミノ酸変異体を調製し、その発現と機能解析を行った。その結果、酸素等の外部配位子との結合挙動が異なるI119E , I119H変異体を見いだした。この変異体が過酸化水素を酸化剤、グアイアコールを基質とした酸化反応において、野生型にはない反応性を有する事を見出すとともに、その構造解析と詳細な機能解析を行い、鉄二核中心の機能改変に関する重要な知見を得た。本研究では、タンパク質マトリクスを活用し、非天然二核金属中心を有する生体触媒の構築を目的とする。第一配位圏の合理的な配位環境の再構築によって、二核鉄中心を有する酸化反応触媒を創製する。本年度は、シンプルかつ強固な4本へリックス構造のタンパク質マトリックス内に非天然の二核金属中心の構築し、触媒反応への適用を目的としており研究を実施した。その結果、酸素等の外部配位子との結合挙動が異なるI119E変異体を見いだした。この変異体が過酸化水素を酸化剤、グアイアコールを基質とした酸化反応において、野生型にはない反応性を有する事を見出した。本年度は、第一配位圏の再構築によって、二核鉄中心を有する酸化反応触媒を創製に着手した。具体的には、メタンの水酸化反応を触媒するメタンモノオキシゲナーゼが持つ、タンパク質中の4本ヘリックスに囲まれた鉄二核が活性部位と、基質を導くチャネルに着目し、酸素運搬体ヘムエリスリン(Hr)に類似したDcrH-Hrタンパク質の鉄二核中心の反応性を調節し、酸化活性をもつ酵素への変換を目指した。そこで、オキソ/ヒドロキソ架橋された二つの鉄イオンに5つのヒスチジンが配位し、アスパラギン酸とグルタミン酸のカルボキシル基が架橋したHrと同様の二核鉄の配位アミノ酸及び近傍のアミノ酸変異体を調製し、その発現と機能解析を行った。

ヒスチジン118番をアスパラギン酸に置換した変異体、非配位性のイソロイシン119番を配位性アミノ酸残基であるヒスチジン、グルタミン酸へと置換した変異体等の改変タンパク質を作製した。その結果、酸素等の外部配位子との結合挙動が異なるI119E変異体を見いだした。この変異体のアジドやフェノールとの結合モードを紫外可視吸収とラマン分光測定により調べたところ、I119E変異体において導入したグルタミン酸のカルボキシラートが二核鉄に直接配位しているか、または二核鉄の配位水分子に水素結合している可能性が示唆された。さらにこの変異体は、過酸化水素を酸化剤、グアイアコールを基質とした酸化反応において、野生型にはない反応性を有する事を見出しており、当初計画以上に進展している。目的とするタンパク質の変異体における機能改変において、当初計画以上の成果が得られており、引き続き変異体の調製に加えて、その構造解析と機能解析を進める予定である。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
1分子観測によるGタンパク質共役型受容体の二状態モデルの検討

昨年度の研究により、Alexa594でラベルしたロドプシンからメタIとメタIIの平衡状態を生成させ、この試料について1分子蛍光観測をすると蛍光強度がステップ状の増減を繰り返すことがわかった。この実験結果と可視吸収スペクトル法での結果を詳細に解析した結果、メタIとメタIIの状態がそれぞれGタンパク質を活性化する構造としない構造の2状態になっていることを発見した。また、7員環レチナールを加えて光反応を起こらなくしたロドプシンやタンパク質部分のみ(オプシン)の1分子蛍光観測をした結果、増減の頻度は低いがこれらも2状態になることがわかった。さらに、各状態のGタンパク質活性化効率を測定したところ、蛍光増減の起こる頻度と相関を示すことを見いだした。また、2状態間の蛍光強度の葦はロドプシンおよびオプシンのほうが大きい可能性が示唆された。これらの結果を現在論文としてまとめている。また、リガンドが結合しなくてもGタンパク質活性化能を示す変異体(構成的活性変異体)について、上記と同様の実験を行うことを試みた。培養細胞で発現させた野生型ロドプシンでは、外節膜中のロドプシンに比べてラベル化効率が非常に低かった。そこで、ラベル化条件を最適化したところ、ROS中のロドプシンと同様に、蛍光強度によって活性構造をとらえることができた。構成的活性変異体も同じ条件で蛍光ラベルされることが確認できたので、今後は、1分子蛍光観測を行う予定である。一方、Gタンパク質のC末端ペプチド(11残基)とメタIIとの結合を利用して複合体での1分子FRET観測も試みた。しかし、ドナーの消光、あるいはアクセプターの発光で両者の結合を観測することは現在成功していない。これは、1分子観測では非常に低濃度の試料牽用いているためにペプチドとメタIIの結合効率が低いことも一因であると考えられるので、より高濃度での観測を行っている。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は細胞外からの刺激物質(アゴニスト)を受容して細胞内シグナル伝達系を駆動するが、その活性状態への変換メカニズムは、構造アンサンブルの中にGタンパク質を活性化する構造(活性構造)が含まれるという二状態モデルや、アゴニストの結合によってGPCRの構造が変化し、活性構造を獲得するというInduced-Fitモデルで説明されている。本研究では、ロドプシンを実験材料とした1分子観測法を利用して、これらのモデルについて検討した。これまでの研究から、ロドプシンに結合したAlexa594の蛍光強度を1分子観測すると、各分子の蛍光強度はステップ状の増減を繰り返することがわかっている。このステップ状の増減が、メタロドプシンIとメタロドプシンIIの熱平衡を表していると考えられるが、測定ノイズのために蛍光強度の変化点を決定するのが困難であった。そこで、ベイズ推定を応用して蛍光強度の変化点を自動的に検出するプログラムを作成し、蛍光強度の変化量と滞留時間のヒストグラムを作成した。そのpH依存性を調べたところ、バルク測定から予想される結果とよく一致したので、1分子計測で観測された蛍光強度の高い状態が活性構造であると結論づけた。次に、活性構造への構造変化に対するリガンドの役割を検討するため、ロドプシンのアポタンパク質であるオプシンをAlexa594で標識し、同様の1分子測定と解析を行った。その結果、オプシンでもステップ状の蛍光強度の増減が観測された。このことから、アゴニストとインバースアゴニストのいずれも結合していない状態では活性構造と不活性構造の平衡になっており、アゴニストの結合によって両者の平衡が活性構造側にシフトすると考えられた。
BTLAによる免疫抑制機構の解明と免疫療法の開発

最近、我々はリンパ球上に発現する新規の抑制性副刺激分子B and T lymphocyte attenuator(BTLA)を同定した。本研究では自己免疫疾患モデルマウスであるMRL/lprマウスの病態にBTLAが抑制的に作用していることを明らかにした。さらに、BTLAが樹状細胞に発現し、樹状細胞の活性化抑制機能を有し、免疫寛容維持に関与していることを示した。この研究成果は、BTLAが自己免疫疾患治療の標的となり得ることを示しており、BTLAを利用した免疫療法開発に向けた基盤を構築したと言える。研究代表者らは、DNAアレイ法を用いてTh1細胞に発現する遺伝子を網羅的に解析し、新規の抑制性副刺激分子BTLAを同定した。最近、BTLAがリンパ球以外の自然免疫系の細胞にも発現することから、獲得免疫系と自然免疫系をリンクする「免疫抑制遺伝子」である可能性が浮上しており、多様なステップを介して発病するヒトの自己免疫疾患の有力な治療標的となりうることが指摘されている。しかし自然免疫系細胞におけるBTLAの役割は依然不明である。そこで本研究では、まずNKT細胞および樹状細胞活性化制御におけるBTLAの機能を解明し、自己免疫反応の諸相におけるBTLAの役割を明らかにすることを試みた。その結果、1)NKT細胞はT細胞に匹敵するレベルのBTLAを発現していること、2)BTLAは抗原刺激によるNKT細胞活性化を抑制すること、3)BTLA欠損マウスではNKT細胞依存性自己免疫疾患モデルであるconcanavalin A誘導肝炎(conA肝炎)の感受性が野生型マウスに比べ著しく上昇していること、4)BTLA/NKT細胞ダブル欠損マウスではconA肝炎の発症が完全に抑制されること、5)細胞移入実験により、NKT細胞上のBTLAがconA肝炎の抑制に必須であることを明らかにした。すなわち、BTLAは、NKT細胞の活性化抑制に関与し、肝における自己免疫応答を抑制していることが判明した。研究代表者らはマウス樹状細胞がBTLAを発現していることも見出しており、樹状細胞の関与する自己免疫応答にBTLAが重要な役割を果たしていることが示唆されている。今後は樹状細胞におけるBTLAの機能解析を進める予定である。これらの研究によりBTLAを利用して自己免疫疾患を治療する際の標的細胞を同定し、BTLA-HVEM(BTLA ligand)系を応用した新規免疫療法開発の基盤を構築する。そこで今年度の研究では、樹状細胞活性化制御におけるBTLAの機能を解明し、自己免疫反応の諸相におけるBTLAの役割を明らかにすることを試みた。その結果、1)樹状細胞はいずれのサブセット(骨髄球系樹状細胞、リンパ球系樹状細胞、形質細胞様樹状細胞)もBTLAを発現していること、2)BTLAは骨髄由来樹状細胞(BMDC)の活性化やサイトカイン産生を抑制すること、3)BTLA欠損マウスでは樹状細胞依存性疾患モデルであるDSS誘導腸炎の感受性が野生型マウスに比べ著しく上昇していることを明らかにした。すなわち、BTLAは樹状細胞の活性化抑制にも関与し、樹状細胞を介した免疫応答を制御していることが判明した。今後は樹状細胞におけるBTLAのシグナル伝達経路を解明する予定である。そこで本研究では、まず樹状細胞活性化制御におけるBTLAの機能を解明し、自己免疫反応の諸相におけるBTLAの役割を明らかにすることを試みた。

さらにSLE/RA型自己免疫疾患自然発症マウスであるMRL/1prマウスを用いてBTLAの免疫抑制機能を解析した。その結果、1)BTLA欠損MRL/1prマウスは野生型に比べ生存期間が短縮すること、2)著明なリンパ増殖性変化を来し、炎症細胞浸潤を伴った多臓器障害を発症すること、3)高γグロブリン血症が出現、血清中にRFや抗DNA抗体などの自己抗体が著明に上昇することなどを明らかにした。これらの結果はBTLAの関与する多様な病態やその責任細胞を明らかにしたことを意味し、新規免疫療法開発の基盤を構築できたと考える。
サイボーグ思想の「原型」―１９２０年代のイギリス科学思想界の分析

イギリスの科学者ジョン・D・バナールは、身体器官の機械的代替による機能「拡張:extension」を提唱し、今日のサイボーグ論の「原型」をつくった。バナール以来、サイボーグは「拡張」の枠内で議論されてきた。この状況を打開したのが、アンディ・クラークである。彼は、「拡張」とは別系統の、身体の空間的「延長:extension」に基づくサイボーグ論を唱えたが、バナールとは別系統の「extension」でサイボーグを論じていることに無自覚であるため、新しいサイボーグ論の価値を伝え切れていない。本研究では、二つの「extension」から議論を整理し、新しいサイボーグ論の射程を明らかにした。本研究の特長は、サイボーグ思想の「原型」を1920年代のイギリスに求め、「原型」からの変異として今日のサイボーグ論を考察するところにある。平成25年度の成果は、「原型」の形成過程の最重要人物と目されるJ・B・ホールデンの科学、および技術思想の特質と思想的展開の軌跡を確認できたところにある。後にロンドン大学の遺伝学教授に就任するホールデンは、当初、同世代の中で突出した優秀さを発揮したものの、伝統的な生理学を専攻する一学徒に過ぎなかった。イギリス思想界の俊英を執筆陣に迎えて科学、道徳、女性などのテーマ毎にその未来を予測するTo-Day and To-morrowシリーズが1920年代初頭に企画されたとき、編集者は、同シリーズの最初期の一冊の執筆をホールデンに依頼した。ホールデンが著したDaedalus(1923)は、生殖質への働きかけによる人間進化の可能性を論じたものとして知られているが、同書を精査すると、G・K・チェスタートンを名指しで批判する反保守主義、H・G・ウェルズの未来予測への好評価とともに、幾何学から数理物理学を経て生理学に至る科学史観、そして、材料開発の中心が物理化学から生化学に移行するとの独自の技術史観が読み取れる。アカデミズムの枠に捉われなかった同シリーズはホールデンに自由な発言の場を与え、そこでホールデンは、単なる生理学から化学的知見の応用を前提にした生化学への展望を開示したのである。この意味で、同書は、ホールデン自身のその後のキャリアを暗示するとともに、身体を材料、あるいは加工の対象と見做す発想に「科学的」根拠を与えるものとして、同シリーズを先導する地位にあったと言える。平成26年度内の目標は、To-Day and To-Morrowシリーズを当時の科学技術の関係に注目して読解するところにあった。人為的な身体加工の可能性に科学的根拠を与えたのは、同シリーズの最も早い時期(1923年)の執筆者であり、当時のイギリスにおいて最も「先鋭的な」未来予測者だったJ・B・S・ホールデンの遺伝生物学だったことは疑いえないが、身体加工に進化の時間軸を与えたのは、同シリーズに最も遅く(1929年)加わったJ・D・バナールだった。両者は、同シリーズにあって科学的知見に拠りつつ中長期的な未来予測を行った点で執筆陣の中で突出するが、身体加工による人間の進化を宇宙的な時間の中で考察した点で、バナールを後続のサイボーグ論の「原型」と認めるべきである。バナールが依拠した熱力学第二法則、所謂エントロピーの法則のアイディアは、約10年間の内にN・ウィーナーとB・フラーに継承され、21世紀のM・モアらのエクストロピア二ズムに続くアメリカにおける系譜を形成するに至った。今日のサイボーグ論は、K・ケリーのテクニウムでの議論のように、より大規模な技術論の一部に配置され、議論の焦点も、身体加工による人間の変容という現象を包摂する法則の発見に移行している。21世紀のサイボーグ論の基調は、ポストヒューマンの登場に対する悲観的反応を超えて、法則の発見と実現に寄与することへの肯定的、かつ楽観的な態度に彩られている。技術革新や科学的発見等の外的要因から、こうした「楽観論」への転換期を特定し、中長期的視点に人間の実存に関わる短期的視点を組入れる可能性を考察すべきである。本研究の目的は、サイボーグ思想の「原型」を1920年代のイギリスに求め、「原型」からの変異として今日のサイボーグ論を検証し、サイボーグ技術、および新しいサイボーグ論を展望するところにある。平成27年度は、今日のサイボーグ論の「原型」となったJ・D・バナールの思想における科学説が、後続の議論にどのように継承されているかを解明する作業に注力した。その結果、バナールが、熱力学第二法則から逸脱し、エネルギーを集約する能力を備えた知的主体として人間を捉えていた事実、コンピューターの技術革新が進み、サイボーグ論における人間の知的特権が剥奪されていく過程、そして、この過程にあって人間の特権を信奉し続ける一派としてM・モアらの楽観的なエクストロピア二ズムが位置付けられることが明らかになった。サイボーグ論の「原型」の特定から、オーソドクスな議論の問題系を解明する作業はほぼ完成し、この論点に係る成果についてもまとめたが、まとめの過程で、従来の議論とは別系統のサイボーグ論の存在が確認できたため、その評価を含めて本研究を完了することを決定し、一年間の延長を選択した。1920年代後半のジョン・D・バナールによる未来予測は、身体器官の機械的代替による機能の「拡張」を謳い、今日のサイボーグ論の源流となった。

バナールが機械に対する人間の知的優位を確信していたのに対し、バナールを参照した者たちは、1960年代のコンピューターの普及、クラウドとつながったAIの登場の中で、人間の優位が崩壊し、機械にその地位を取って変わられる通過点としてサイボーグ化を論ずるようになった。「拡張」の系統がこのような人間と機械の相剋の構図から抜けられないのに対し、別系統の「延長」からサイボーグを論じたのがアンディ・クラークである。とはいえ、「extension」という概念への着目を出発点にする本研究は、二つ以上の系統からのサイボーグが論じられている事実を指摘することを目的とするものではない。ほとんど全てのサイボーグ論は自らの系統に自覚的でなく、クラークもその例外ではない。この事実の指摘とともに各系統の価値を明確にし、夫々の議論の可能性を最大限に引き出す作業の端緒を開いたことが、本研究の意義と言えよう。加えて、本研究では、相剋に代わる「共生」の構図で人間と機械の分業を考える作業にも緒が付いた。AIには人間の知性とは質的に異なる「知性」がある。このことは、人間同士の協同で不可能だっただけでなく、人間には思考さえできなかった知的営みが、機械との協同で可能になることを意味する。サイボーグ化を完全な機械化への過渡的通過点と見做すのではなく、人間と機械による相補的かつ最も創造的な「共生」体と見ることで、新しい、建設的なサイボーグ論が始まるものと考える。イギリスの科学者ジョン・D・バナールは、身体器官の機械的代替による機能「拡張:extension」を提唱し、今日のサイボーグ論の「原型」をつくった。バナール以来、サイボーグは「拡張」の枠内で議論されてきた。この状況を打開したのが、アンディ・クラークである。彼は、「拡張」とは別系統の、身体の空間的「延長:extension」に基づくサイボーグ論を唱えたが、バナールとは別系統の「extension」でサイボーグを論じていることに無自覚であるため、新しいサイボーグ論の価値を伝え切れていない。本研究では、二つの「extension」から議論を整理し、新しいサイボーグ論の射程を明らかにした。読解を終え、発表に至るまとめの作業に少々遅れがある以外、おおむね計画通りに進展している。今日のサイボーグ論の主流は、技術による人間機能の「拡張」の概念に依拠するバナールの思想を「原型」とする。これに対し、A・クラークは、Natural-born cyborgs(2003)で、「拡張」とは別系統の身体論に基づいてサイボーグ技術を考察している。A・クラークの議論を精査し、本年度中に、新しいサイボーグ論の射程を明らかにする。技術思想史サイボーグ思想の「原型」を形成したTo-Day and To-Morrowシリーズにおける執筆者間の布置を視覚化する作業に着手し、1920年代から今日に至る系譜の概要を提示する。あわせて、短期的視点と長期的視点、人間の実存と法則の発見の間で、今日の議論が後者に大きく振れている点を指摘し、中長期的視点に人間の実存に関わる短期的視点を組入れる可能性を考察する。上記のように、同シリーズの後続の執筆者たちが参照した科学、技術に対する発想が特定できたのは成果の一つと言えよう。実際、ホールデンの発想が数名の著者の記述に取り入れられていることも確認でき、ホールデンを中心にした見取り図の概要は見えてきたとも言える。
オリゴデンドロサイトのコネキシン蛋白に注目したALSの病態解明と新規治療薬の開発

我々は以前、ALSモデルマウス脊髄では進行期にオリゴデンドロサイトのコネキシン蛋白(Cx32, Cx47)の発現が障害されていることを報告しており、本研究ではオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)からオリゴデンドロサイトへの分化、およびCxの裏打ち蛋白ZO-1(Zonula occludense-1)に注目した。培養OPCからオリゴデンドロサイトへの分化には、野生型マウスと変異SOD1 Tgマウス間で差を認めなかった。一方変異SOD1 Tgマウスでは発症以前にオリゴデンドロサイトのCx47と共存するZO-1の発現が低下しており、進行期のCx47発現異常の原因となっている可能性が考えられた。Connexin(Cx)32およびCx47はオリゴデンドロサイトに発現し、アストロサイトに発現するCx30およびCx43とともにグリア細胞間でgap junctionを形成する。このgap junctionを通じてグリア細胞間の分子やイオンの交換が活発に行われており、Cxsは中枢神経系の恒常性維持に重要である。当研究室はこれまでに筋萎縮性側索硬化症(ALS, Amyptrophic lateral sclerosis)モデルマウスの脊髄灰白質において、Cx32およびCx47の広汎な発現異常を認めることを明らかにしている。しかしこれらの異常がALSの病態進行にどのように寄与するかはまだ明らかでない。本研究では、オリゴデンドロサイトCx蛋白の発現異常が、ALSの病態にどのように関与しているのか、またALS治療のターゲットとなりうるかどうかを検討することを目的としている。ヒトALSやALSモデルマウスである変異SOD1 Tgマウスでは、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC, Oligodendrocyte precursor cell)から成熟オリゴデンドロサイトへの分化が障害されていることが知られており、オリゴデンドロサイトのCx蛋白発現異常の原因と考えられる。まず平成26年度は培養細胞を用いた実験を中心に行った。変異SOD1トランスジェニック(Tg)マウスの新生仔マウス脳からOPCを単離し、野生型マウスから単離したOPCと、増殖や分化、Cx32/Cx47蛋白の発現を比較した。通常の培養条件下では、野生型マウスからのOPCと変異SOD1 TgマウスからのOPC間で、増殖や分化、Cx32/Cx47蛋白の発現に明らかな差は認めなかった。変異SOD1 TgマウスにおけるOCPの分化異常やCx32/Cx47の発現異常は、ALSの病態進行の過程で神経幹細胞へ何らかのストレスが加わることで生じる現象であると考えられる。当研究室では筋萎縮性側索硬化症モデルマウス(変異SOD1(G93A)Tgマウス)の進行期に、オリゴデンドロサイトが発現するコネキシン(Cx)47および32の発現が障害されていることを報告しており、本年度はその機序を解明するため、Cx蛋白の裏打ち蛋白であるZO-1(Zonula occludens-1)に注目して解析を行った。免疫染色にて、野生型マウスの脊髄前角では主に血管内皮とグリア細胞の細胞膜上にZO-1の発現を認めた。グリア細胞のZO-1はオリゴデンドロサイトのCx47と共存していた。Cx32との共存、およびアストロサイトでのZO-1の発現は認めなかった。発症前の変異SOD1(G93A)Tgマウスでは、Cx47の細胞膜上の発現は保たれているものの、細胞膜上のZO-1の発現が低下していた。進行期の変異SOD1(G93A)マウスでは、オリゴデンドロサイトのCx47は細胞質内に内在化していた。Cx47はアストロサイトのCx43とgap junctionを形成し、このgap junctionを通じて活発なイオンや小分子の交換を行い、運動神経軸索の機能維持に重要な役割を果たしている。変異SOD1(G93A)マウスでは、オリゴデンドロサイトにおいてCx47蛋白を構造上支持するZO-1の発現が早期より低下することにより、進行とともにCx47の細胞膜上での発現が障害され、神経細胞の変性を助長する可能性が示唆された。マウスの交配に時間を要するため、初年度は培養細胞を用いた実験を中心に行った。現在は変異SOD1 Tgマウス、変異TDP-43 Tgマウスを用い、オリゴデンドロサイトのCx蛋白発現異常をきたす機序を解析中である。27年度が最終年度であるため、記入しない。神経内科ALSモデルマウスおよび薬剤誘導型オリゴデンドロサイト特異的Cx32/Cx47コンディショナルノックアウトマウスを用い、Cx32/Cx47の発現異常がALSの病態に及ぼす影響を解析予定である。またALSモデルマウスと培養細胞を用い、OPCの分化異常やCX32/Cx47の発現異常をきたす機序を解析予定である。
超流動ヘリウム中におけるナノ微粒子の光による作製と配列制御

超流動ヘリウムという極低温かつ粘性が小さい特殊な媒質で満たされた環境下で、高強度レーザーを照射するレーザーアブレーションという手法を用いて、その結晶構造が異方的であるか否かによらず、様々な物質の真球形状を有する単結晶を作製することに成功した。また、その真球性に由来する高効率なレーザー発振を観測した。さらに、上記の特殊な環境である超流動ヘリウム中において、レーザーをナノメートルサイズの微粒子に照射し、その際に生じる輻射力を用いて、微粒子のサイズすなわち(物質の色など光学特性を決定する)エネルギー準位を選別しながら輸送する手法、光マニピュレーションが、様々な物質に適用可能であることを明らかとした。本研究では、超流動ヘリウム中で光によって半導体ナノ微粒子を作製し、光による運動制御を駆使して、その選別、配列などを行う新奇技術を確立することを目的としている。また、作製された単一粒子や集合系の新奇な光学応答とその制御法も調べる。今年度はZnOを主たる対象として、ヘリウム中でレーザーアブレーションを行ってナノ微粒子を作製し、結晶性に優れた微粒子を得るための最適条件を調べた。作製された微粒子を透過電子顕微鏡を用いて高い空間分解能で観察したところ、格子縞が観測できるほど品質の高い単結晶微小球を数多く発見し、格子定数がバルク結晶と一致することを見いだした。また、その粒径は数nmから数百nmに渡っており、大き過ぎて透過電子顕微鏡では観測できないマイクロ粒子も単結晶となっていることが推測された。実際、粒径1-2μmのZnO球において、閾値が非常に低いレーザー発振を観測し、結晶性と真球性の高さを物語っている。急冷によるアモルファス成長などが懸念される超流動ヘリウム中での作製であるにも関わらず単結晶が得られていることに加え、結晶構造がウルツ鋼型で六方晶系に属するZnOにおいては異方的なナノワイヤーなどの成長が通常見られているが、単結晶微小球の作製成功はこうした従来の常識を覆すものである。これは超流動ヘリウム中におけるレーザーアブレーションによる微粒子作製が、ZnOに限らず、様々な物質において結晶微小球を作製する有力な方法となり得ることを示している。また、作製された微粒子を粒径に応じた閉じ込め励起子準位に共鳴したレーザーを用いて、サイズ選別を行うことにも成功し、それらの発光スペクトルを初めて観測できた。本研究では、超流動ヘリウム中で光によって半導体ナノ微粒子を作製し、光による運動制御を駆使して、その選別、配列などを行う新奇技術を確立することを目的としてきた。昨年度までは、超流動ヘリウム中でレーザーアブレーションを行い、ナノ粒子を直接作製してきた。今年度は、予め化学合成されたCdSe量子ドットを対象として光マニピュレーション実験を実施した。これにより、品質が揃った量子ドット群から、さらに詳細に特性を選別することを目指した。有機溶媒中に分散されたCdSe量子ドットをガラス基板上に塗布し、その乾燥体をクライオスタット内に設置して液体ヘリウムを充填した後、高強度レーザーを照射することで、量子ドット群が基板から乖離することを確認した。こうして、超流動ヘリウム中に化学合成されたCdSe量子ドットを分散することに成功した。さらに、マニピュレーションレーザーを照射することで、これまでと同様の量子ドットの光による輸送に成功した。この際、共鳴エネルギーの異なる2種類の量子ドットを混合し、一方に共鳴するレーザーを照射することで、エネルギー準位の選別を試みている。一方、超流動ヘリウム中のレーザーアブレーションによるマイクロメートルサイズの真球単結晶作製法に関して、これまでのZnOの他、CdSeなど他の異方性結晶にも適用可能であり、一般的な手法であることを示した。理論面では、液体ヘリウムなどの環境場が与える影響を取り入れるべく、溶媒の流体力学的な側面も考慮して光マニピュレーションのシミュレーションを行う手法を確立した。実験との対比を鋭意進めている。今年度はZnOの他、バンドギャップが可視域にあり、光電変換素子などへの実用可能性も高いCdSeも対象に加えた。この物質は、励起子結合エネルギーがZnOより小さく、電子・正孔個別閉じ込め系であるため、これまで通りの光マニピュレーションが可能であるか自明ではなかった。この材料に対しても、液体ヘリウム中のレーザーアブレーションを行い、ナノ粒子を作製できることを確かめた。これにより、本手法の一般性を確認することができた。

理論面では、これまで共鳴光ピンセットの理論と実験で矛盾していた点を、非線形光学効果を輻射力の計算に取り入れることにより、包括的に矛盾なく説明することに成功し、さらにそれを上手く活用することにより新しい光マニピュレーションが可能であることを示した。この成果は米国物理学会速報誌「Physical Review Letters」に掲載された。また、米国物理学会Web誌PhysicsのFocus欄に、非専門家や学生に向けて、科学記者が論文の内容を解りやすく説明した読み物として紹介された。また、ここで提案した機構を活用することにより、従来よりも高効率な単分子捕捉方法を理論的に提案した。この手法により、これまで困難であった単分子の長時間捕捉が可能になると期待される。この成果は欧州物理学会誌「European Physical Journal B」に掲載された。従来の予想を覆し、超流動ヘリウム中という極低温下のレーザーアブレーションにおいて、単結晶ナノ粒子やマイクロ球の作製に成功し、さらに、それを透過電子顕微鏡観察により明瞭に確認できたため。光マニピュレーションの対象となる微粒子群の品質が非常に高いことは、今後の研究の進展に極めて有利に働くものである。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画に加え、可視域にバンドギャップがあり、太陽光発電等、実用化が期待される半導体CdSeの量子ドット作製、さらに光マニピュレーションにも成功した。理論研究でも、これまで謎であった実験と理論の不一致が、非線形光学効果に起因することを明らかにすることができた。作製された微粒子を粒径に応じた閉じ込め励起子準位に共鳴したレーザーを用いて、サイズ選別を伴うマニピュレーションを行う際、レーザースペクトル幅を狭窄化し、輸送・選別されるナノ粒子のサイズすなわちエネルギー準位の分布幅をより狭くすることを行う。また、輸送先のSi基板上に金属微小構造を作製してナノ粒子の配列を行う予定であるが、石原グループの計算結果によると、nmサイズの構造作製が必要であり、実験の進展を促進するため、ノウハウをもつ研究グループとの共同研究を計画している。これまで量子ドットのエネルギー準位選別を伴う光マニピュレーションとその対象拡大に成功してきたが、それを踏まえて、量子ドットの配列を制御することを試みる。そのための理論グループとの詳細な打ち合わせも進める。
新規インスリンシグナル分子WDR6を介する細胞内情報伝達経路の同定とその機能解析

我々は、視床下部特異的遺伝子WD-repeat protein 6 (WDR6)を単離した。WDR6は脱リン酸化を制御するホスファターゼと相同性があり、さらにタンパク質-タンパク質の相互作用に重要なWD-repeatモチーフを持っている。本研究により脳においてWDR6がIRS-4(インスリン受容体基質-4)と物理的に相互作用することを明らかにし、WDR6が脳におけるinsulin/IGF-Iシグナルの制御因子であることが示唆された。今後の研究により、認知症などの発症に関連する神経変性に対する治療薬開発等への応用が期待される。In vitroおよびin vivoにおけるWDR6の構造および機能解析1. WDR6の機能解析を行うため、human WDR6の全長をcDNAライブラリーより単離し、発現ベクターに組み込み、構成的発現細胞株を樹立した。現在IRSおよびLKB1との結合に必要な領域の同定と、これらの分子のリン酸化制御に関与する領域を解析している。2. WDR6遺伝子改変動物の作製のため、cre-loxPシステムをもちいたターゲティングベクターを構築し、ES細胞での標的遺伝子組み換えを行った。サザンブロット、およびPCRによってポジティブクローンを複数個同定し、現在キメラマウスの作製を行っている。AMPKを介したAutophagy活性化とCRによる神経変性疾患抑制との関連の解明1.構成的活性型AMPK、ドミナントネガティブ型AMPKを組み込んだアデノウイルスベクターを作製した。現在AMPKによって制御される遺伝子の発現解析をin vitroおよびin vivoにおいて行っている。1. Gel Shift assayによりHNF-4がDFCR-REに結合する可能性を確認した。DFCR-RE配列をルシフェラーゼの上流に組み込んだレポータープラスミドを作製した。現在このプラスミドをもちいてレポーターアッセイを行うとともに、このレポーターを構成的に発現する細胞株の樹立を行っている。インスリン/インスリン様成長因子-I(insulin/IGF-I)シグナルは、老化および老化関連疾患の発症や発ガンに重要な役割を担っている。我々は、新規のinsulin/IGF-Iシグナル関連分子と示唆される、WD-repeat protein 6(WDR6)を同定し、この分子の機能解析を通じて、老化関連疾患に対する治療法の開発や、個体および細胞の老化機構の解明を目指した研究を行った。WDR6は脱リン酸化を制御するタンパク質、ホスファターゼと相同性があり、さらにタンパク質-タンパク質の相互作用に重要なWD-repeatモチーフをもっているが、その機能は未知であった。免疫沈降法によりWDR6がIRS-4(インスリン受容体基質-4)と物理的に相互作用することを明らかにした。また、視床下部においてWDR6の発現が高く、このことはIRS-4の発現パターンと一致していた。さらに長寿命ラット、すなわち成長ホルモンアンチセンストランスジェニックラット、および食餌カロリーを制限したラットの視床下部弓状核において、WDR6の発現が低下していることが示唆された。一方で視床下部由来の培養細胞にinsulinまたはIGF-Iを添加するとWDR6の発現が上昇した。これらの結果から、WDR6がinsulin/IGF-Iシグナルの制御因子であることが示唆された。さらなるWDR6の機能解明により、神経変性疾患やガン、生活習慣病等に対する新たな治療戦略を創出するとともに、高等生物の老化機構の解明という普遍的な科学的問題に対する重要な発見をもたらすことが期待できる。現在、cre-loxP系システムをもちいた脳特異的WDR6ノックアウトマウスの作製を行っている。今後は、遺伝子改変動物等をもちいてWDR6の分子機能についてさらに詳しく明らかにして行く。
癌間質のnormalizationによる薬剤送達改善と新規膵癌治療への応用

本研究では膵癌細胞の膵星細胞による癌間質形成に及ぼす影響とその癌間質のremodelingによるnormalizationの2つに着目しそれらを制御する薬剤を同定し、既存の抗癌剤を併用することで癌間質がもたらす膵癌治療抵抗性を克服し、新たな膵癌治療戦略を開発することを目的とし膵星細胞と膵癌細胞の細胞外基質を通した癌間質相互作用を中心に検討を進めた。その結果、膵星細胞の作りだす細胞外マトリックスは膵癌細胞の遊走や浸潤に影響を与えることが明らかになった。今後この機序を詳細に解析し、関連分子の同定からこの機序をコントロールする手法を明らかにし、in vivoモデルでの薬剤送達効率の検討を進めていく。癌はここ30年生存率の改善が見られず取り残された癌腫である。予後不良な原因として高い治療抵抗性がある。膵癌にはdesmoplasiaと呼ばれる過剰な癌間質増生がある。膵癌間質は乏血管性でかつ間質成分による薬剤拡散制限が強く、薬剤到達効率を低下させ、膵癌の治療抵抗性を高めている。最近、癌間質増生抑制で膵癌への薬剤到達濃度が上昇し、抗腫瘍効果が増強すると報告された(Science, 2009, K Olive)。また、この癌間質は量的にも質的にも癌特有のmatrix remodelingにより維持されることがわかってきた。本研究では癌間質の正常化いわゆるnormalizationにより膵癌細胞への薬剤効率を高め、この機序に着目した新たな膵癌治療戦略を開発することを目的とする。まず、当研究室で樹立した膵星細胞から三次元細胞外マトリックスを作成し、膵星細胞のphenotypeと細胞外マトリックスの硬度や配列といった質的特性を評価した。また、膵星細胞が細胞外マトリックスの質的特性に与える影響とそのメカニズムを検討し、さらに膵星細胞由来の三次元細胞外マトリックス上で膵癌細胞を培養し、その形態変化や機能変化を検討した。以上の結果をもとに、機能制御を試みた膵星細胞が作り出す細胞外マトリックス上において膵癌細胞の悪性度を評価した。その結果、膵星細胞を介した細胞外マトリックスの質的特性の制御により癌間質のremodelingひいては癌微小環境のnormalizationが可能となり、新規膵癌治療法への応用できる可能性が見いだせた。
アルコール・覚醒剤複合中毒における死後経過時間と薬物濃度の関連

エタノール(EtOH)の一部はグルクロン酸抱合を受けてエチルグルクロナイド(EtG)になる.このEtGはEtOHより長期にわたり検出しえ得るため,飲酒の証明に有効といわれている.一方,覚醒剤は第3次覚醒剤乱用期と言われ、若年層への乱用が問題となっている.その使用法も,アルミホイル上で炙ったり,アルコールに溶かして服用と,従来の方法とは異なってきている.そこで,今回,ラットにEtOH(4g/kg)単独経口投与,メタンフェタミン(MA,5mg/kg)腹腔内単独投与、EtOHとMAを同時投与し、EtOHの代謝への影響を検討した.また,EtOH群,ETOHとMA同時投与群を屠殺後、ビニール袋に入れ,20°Cで一定期間放置し,EtOH, EtC及びMA, MA代謝物を測定し,死後における濃度変化を検討した.EtCHはいずれの群でも24時間後には血清,尿からは検出されなかったが,EtGは24時間後でも検出された.一方,MAはEtOH同時投与により代謝の抑制を受け,水酸化体の生成が抑制された.次に,死後の腐敗による影響であるが,7日後でも,肝臓,腎臓,脳でEtOH, EtGは17日後も1日後と略同量が検出されたが,EtOH同時投与により、水酸化体の減少傾向が認められた.このように,EtGを測定することにより,EtOHが検出されない場合でも飲酒の証明が可能なことが明らかとなった.加えて,EtG濃度はMAの同時投与により影響は受けず,mAの代謝が影響をうけることが明らかとなった.エタノール(EtOH)の一部はグルクロン酸抱合を受けてエチルグルクロナイド(EtG)になる.このEtGはEtOHより長期にわたり検出しえ得るため,飲酒の証明に有効といわれている.一方,覚醒剤は第3次覚醒剤乱用期と言われ、若年層への乱用が問題となっている.その使用法も,アルミホイル上で炙ったり,アルコールに溶かして服用と,従来の方法とは異なってきている.そこで,今回,ラットにEtOH(4g/kg)単独経口投与,メタンフェタミン(MA,5mg/kg)腹腔内単独投与、EtOHとMAを同時投与し、EtOHの代謝への影響を検討した.また,EtOH群,ETOHとMA同時投与群を屠殺後、ビニール袋に入れ,20°Cで一定期間放置し,EtOH, EtC及びMA, MA代謝物を測定し,死後における濃度変化を検討した.EtCHはいずれの群でも24時間後には血清,尿からは検出されなかったが,EtGは24時間後でも検出された.一方,MAはEtOH同時投与により代謝の抑制を受け,水酸化体の生成が抑制された.次に,死後の腐敗による影響であるが,7日後でも,肝臓,腎臓,脳でEtOH, EtGは17日後も1日後と略同量が検出されたが,EtOH同時投与により、水酸化体の減少傾向が認められた.このように,EtGを測定することにより,EtOHが検出されない場合でも飲酒の証明が可能なことが明らかとなった.加えて,EtG濃度はMAの同時投与により影響は受けず,mAの代謝が影響をうけることが明らかとなった.エタノール(EtOH)はアルコール脱水素酵素によりアルデヒド,さらに酢酸へと代謝されるが,一部はグルクロン酸抱合を受けてエチルグルクロナイドになる.エチルグルクロナイドはエタノールより長期にわたり検出し得るといわれている.本年度はこのエチルグルクロナイドを検出する方法を検討した.このグルクロン酸抱合体を測定するためには,直接これを測定する方法と,血液等の試料をグルクロニダーゼ処理し,遊離したエタノールをGCのヘッドスペース法にて測定し,未処理の値を差し引く事により算出する方法がある.そこで,今回はグルクロニダーゼ処理の時間を種々検討した.救命救急センターの試料でエタノールが検出された血液試料にグルクロニダーゼを作用させ,54°Cで時間を追って5時間後までサンプリングを行い,遊離したエタノールをGCのヘッドスペース法で測定し適切な作用時間を検討した.また,メタンフェタミン(MA)も肝臓の薬物代謝酵素によりアンフェタミン(AP),それぞれのパラハイドロキシメタンフェタミン(MAOH),パラハイドロキシアンフェタミン(APOH)に代謝され,これらがグルクロン酸抱合を受ける.そこで救命救急センターの試料で覚醒剤が検出された試料を用いて,同様にグルクロニダーゼを作用させ,濃度が一定になる条件を検討した.MAとその代謝物はメトキシフェナミンを内標(IS)にして,Bond Elut Certifyにて精製後,無水trifluoroacetyl酢酸で60°C20分間誘導体化後,GC/MSにて測定した.カラムはVF-5ms 30m×0.25mm,膜厚0.25μm(Varian製),温度は80°Cで1分保持後20°C/分で300°Cまで昇温した.測定モードはSIM(selected ion monitoring)で行い,MAはm/z154,118,APはm/z 140,118,MAOHはm/z 154,230,APOHはm/z 140,230,ISはm/z 154,148のイオンを用いた.EtOH及びMAいずれもグルクロニダーゼを4時間作用させる事により,良好な成績が得られた.この確立した方法を用いてさらに動物実験を行って行く

.エタノールはアルコール脱水素酵素によりアルデヒド,さらに酢酸へと代謝されるが,一部はグルクロン酸抱合を受けてエチルグルクロナイドになる.エチルグルクロナイドはエタノールより長期にわたり検出し得るといわれている.本年度も引き続きエチルグルクロナイドを検出する方法を検討した.このグルクロン酸抱合体を測定するためには,直接これを測定する方法と,血液等の試料をグルクロニダーゼ処理し,遊離したエタノールをGCのヘッドスペース法にて測定し,トータルエタノールとして算出する方法がある.前回は救命救急センターの試料をグルクロニダーゼ処理することによりエタノールおよびメタンフェタミンの代謝物に対し良好な成績が得られ,グルクロニダーゼ処理による測定条件を確立した.そこで今回は直接測定するため,エチルグルクロナイドを製薬会社に合成させGC/MSによる測定条件を種々検討した.エチルグルクナイドをメタノールに溶解しmg/mlの溶液を作成した.その10μgを取り,窒素気流下で乾燥後,ピリジン+BSTFA(1:1)100μ1,90°C30分でTMS化を行いGC/MSにて測定した.カラムはVF-5ms 30m×0.25mm,膜厚0.25μm(Varian製),温度は80°Cで1分保持後20°C/分で300°Cまで昇温した.測定モードはスキャンで行った.その結果TMS-エチルグルクロナイドは保持時間10.6分に検出され,m/z217をベースピークとするマスクロマトグラムが得られた.次いで,救命救急センターでエタノールが検出された血液,尿試料をメタノールで抽出後,前記と同様の処理を行いGC/MSにて測定した.飲酒例においては標準のエチルグルクロナイドの保持時間と一致したピークから標準品と一致したマスクロマトトグラムが得られた.このように,エチルグルクリナイドを測定することにより飲酒の証明が可能となった.今後この確立した方法を用いて,どの程度まで飲酒を証明できるか,腐敗の影響,覚せい剤との併用の影響等の動物実験を行って行く予定である.エタノール(EtOH)はアルコール脱水素酵素によりアルデヒド,さらに酢酸へと代謝されるが,一部はグルクロン酸抱合を受けてエチルグルクロナイド(EtG)になる.このEtGはEtOHより長期にわたり検出し得るため,飲酒の証明に有効といわれている.前回確立したEtG測定法を用いて,ラットにEtOH(4g/kg)を投与後1,4,8及び24時間後に血清と尿中のEtOHとEtGを測定した.EtOHとメタンフェタミン(MA.5mg/kg)を同時投与し,相互の薬物濃度への影響も併せて検討した.EtOHはいずれの群でも24時間後には血清,尿からは検出されなかったが,EtGは24時間後でも検出された.EtOHとMAの同時投与によりEtGの生成は抑制される傾向を示した.EtOHは投与後1時間後から肝臓,腎臓,脳でMA同時投与により代謝が抑制される傾向を示した.その結果,EtGの生成も減少傾向を示した.一方,MAも同様にEtOH同時投与により代謝の抑制を受け,水酸化体の生成が抑制された.次に,ラットに同量のEtOH及びMAを投与し,1時間後に,頚椎脱臼により屠殺し,死体を20°Cのフラン器に放置した.1日,3日,7日後にそれぞれの化合物を測定した.20°Cでビニール袋に入れ放置するという今回の実験条件では7日後でも肝臓,腎臓,脳でEtOHは検出された.脳は腐敗の影響を最も強く受け,腐敗によるEtOH,n-プロパノールの生成量が大きかった.また,EtGも検出され,MA同時投与により減少傾向を示した.一方,MAも,今回の放置条件では検出され,EtOH同時投与により,水酸化体の減少傾向が認められた.