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歯周組織の振動刺激応答機構の解明　ー分子基盤の解析とその臨床応用ー

振動刺激により歯周組織が賦活化されることが明らかとなってきているが、歯周組織再生機構における応答機構には不明な点が多い。本研究は、第一に、振動刺激によって歯周組織に発現誘導される分子群とそのシグナリング機構を解明し、歯周組織改造/再生に関わる分子基盤を確立し、第二に、歯周組織リモデリング機構制御法を確立することを目的とする。本年度は、以下のような知見が得られた。(1)我々がこれまでに開発した新しいin vitro振動刺激装置を用いて、培養面積が広く細胞が十分に回収できる底面をもつタイプIコラーゲンコートした培養ディッシュ上にMC3T3-E1骨芽細胞様細胞を播種し、振動刺激を負荷した。培養期間中に振動刺激を加えるタイミングを変化させ、骨芽細胞の分化段階による細胞応答性の変化について検討した。さらに石灰化亢進を検討するために、骨形成誘導培地を用いてアリザリンレッド陽性の石灰化ノジュールの形成に対する振動刺激の影響を調べた。その結果、骨芽細胞が振動刺激に対してより反応する分化段階を選択することにより、骨形成を促進できる可能性があることがわかった。(2)生体内における振動刺激による影響を調べるために、マイクロCT解析定量方法について、イソフルラン麻酔科で生きたままの状態で経時的変化をラットの顎骨を用いて検討を行った。計測によるばらつきを解消すべく、さらに安定した正確な経時的な計測方法を検討中である。(3)既に掲載された論文に加えて、得られた成果についての学会発表と論文投稿を行なった。iPS細胞単独培養系では多数のコロニーが観察され、振動刺激によりNanog遺伝子発現は減少した。一方、骨芽細胞分化に必須な転写因子Runx2、Osterixの遺伝子発現は増加した。今後は、これらの細胞応答を引き起こすシグナル伝達系、および振動刺激の負荷様式について検討して行く予定である。振動刺激が歯周組織を賦活化することが明らかになってきているが、歯周組織再生における応答機構には不明な点が多い。本研究は、(1)振動刺激による歯周組織に発現誘導される分子群とそのシグナリング機構を解明し、歯周組織改造/再生に関わる分子基盤を解明することと、(2)臨床応用を想定し、歯周組織改造/再生モデルとして、矯正学的歯の移動モデル動物を用い、振動刺激に対する応答機構を解析し、副作用がない、速やかな歯周組織リモデリング機構制御法を確立することを目的とする。本年度は、昨年度に明らかとなったマウス骨芽細胞様細胞MC3T3-E1細胞を用いたin vitro振動刺激負荷実験による細胞応答に関する検討と、in vivoにて、マイクロCTを用いたラット骨組織の解析方法の確立を行った。その結果、(1)骨芽細胞の遺伝子発現は、骨芽細胞特異的転写因子Runx2とOsterixが上昇し、さらにType I collagen、Alkaline phosphatase、Osteocalcinの発現上昇も確認された。(2)骨芽細胞における振動刺激の効果は、加速度の影響を受け、アクチンストレスファイバー発達を増強するが、伸展刺激や流れ刺激で見られるような配向性は見られないことが明らかとなった。骨芽細胞に対する振動刺激のシグナルは、伸展刺激や流れ刺激とは異なる経路を介している可能性があると考えられ、さらなる研究を進める必要がある。(3)ラット骨組織(上顎骨、大腿骨、脛骨など)をマイクロCTを用いて、骨密度や機械的強度の定量などの解析方法を確立した。振動刺激に対する細胞応答について、重要な知見が得られた。本研究は、第一に、振動刺激による歯周組織に発現誘導される分子群とそのシグナリング機構を解明し、歯周組織改造/再生に関わる分子基盤を解明することと、第二に、臨床応用を想定し、歯周組織改造/再生モデルとして、矯正学的歯の移動モデル動物を用い、振動刺激に対する応答機構を解析し、副作用がない、速やかな歯周組織リモデリング機構制御法を確立することを目的とする。本年度は、これまで用いてきたタイプIコラーゲンでコートしたシリコン膜製の細胞培養ウェルよりも、培養面積が広くタンパクが十分に回収でき、さらに薄く顕微鏡観察が容易で比較的均一なひずみ分布を示すことが報告されている細胞培養ウェルを用いて、細胞応答とシグナル伝達経路を解析した。培養表面に生じたひずみをシングルストレインゲージを用いたひずみゲージ法により測定し、ひずみの分布を確認した。骨芽細胞様細胞MC3T3-E1細胞に振動刺激を負荷し、F-アクチンの形態的変化とビンキュリンの局在を免疫染色にて共焦点顕微鏡を用いて評価し、さらに、ERK1/2(Extracellular signal-regulated kinase 1/2)のリン酸化をウェスタンブロッティング法にて解析した。その結果、振動刺激負荷15分後から一過性のERK1/2(Extracellular signal-regulated kinase 1/2)のリン酸化が起こり、そのリン酸化はMEK1/2(Mitogen-activated protein kinase kinase 1/2)阻害剤により抑制された。論文の投稿、公開まで進めることができた。また、振動刺激に対する骨芽細胞のシグナル伝達系について、重要な知見が得られた。

振動刺激により歯周組織が賦活化されることが明らかになっているが、歯周組織再生における応答機構には不明な点が多い。本研究は、第一に、振動刺激により歯周組織に発現誘導される分子群とそのシグナリング機構を解明し、歯周組織改造/再生に関わる分子基盤を解明することと、第二に、臨床応用を想定し、歯周組織改造/再生をモデルとして、歯科矯正学的歯の移動のモデル動物を用い、振動刺激に対する応答機構を解析し、副作用が無い、速やかな歯周組織リモデリング機構制御法を確立することを目的とする。本年度は、我々がこれまでに開発した新しいin vitro振動刺激装置を用いて、培養面積が広く細胞が十分に回収できる底面をもつタイプIコラーゲンコートした培養ディッシュ上にMC3T3-E1骨芽細胞様細胞を播種し、振動刺激を負荷した。刺激条件は、刺激時間、刺激間隔、周波数、加速度、細胞分化状態(播種からの日数)、細胞密度を変化させ、細胞応答性の違いを検討し、それぞれのパラメータによって生じる骨芽細胞の応答性の特徴に関する知見を得た。生体内における振動刺激による影響を調べるために、マイクロCT解析と生体内血流変化の定量方法について、マウスの切歯と臼歯、ラットの顎骨と脛骨を用いて検討を行った。計測によるばらつきを解消すべく、さらに安定した正確な経時的な計測方法を検討中である。今後は、既に掲載された論文に加えて、得られた成果についても、学会発表と論文作成および投稿を進める予定である。論文の投稿、公開まで進めることができた。また、振動刺激に対する細胞応答の重要な知見が得られた。振動刺激により歯周組織が賦活化されることが明らかとなってきているが、歯周組織再生機構における応答機構には不明な点が多い。本研究は、第一に、振動刺激によって歯周組織に発現誘導される分子群とそのシグナリング機構を解明し、歯周組織改造/再生に関わる分子基盤を確立し、第二に、歯周組織リモデリング機構制御法を確立することを目的とする。本年度は、以下のような知見が得られた。(1)我々がこれまでに開発した新しいin vitro振動刺激装置を用いて、培養面積が広く細胞が十分に回収できる底面をもつタイプIコラーゲンコートした培養ディッシュ上にMC3T3-E1骨芽細胞様細胞を播種し、振動刺激を負荷した。培養期間中に振動刺激を加えるタイミングを変化させ、骨芽細胞の分化段階による細胞応答性の変化について検討した。さらに石灰化亢進を検討するために、骨形成誘導培地を用いてアリザリンレッド陽性の石灰化ノジュールの形成に対する振動刺激の影響を調べた。その結果、骨芽細胞が振動刺激に対してより反応する分化段階を選択することにより、骨形成を促進できる可能性があることがわかった。(2)生体内における振動刺激による影響を調べるために、マイクロCT解析定量方法について、イソフルラン麻酔科で生きたままの状態で経時的変化をラットの顎骨を用いて検討を行った。
光エネルギー利用ガス→ガス変換植物の創成と環境修復への活用の研究

コムギ、タバコを含む17植物タクサの無菌培養植物の^<15>N_2O生成についてGoshimaら(1999)方法により調査した。その結果、N_2O発生はユーカリプタス・ヴィミナリスを除いて全ての植物で認められた。最大値はケナフ(0.45±0.20ng N_2O/g fresh weight)、最小値はユーカリプタス・ヴィミナリス(-0.012±0.12ng N_2O/g fresh weight)であった。従って、N_2O発生は植物に共通した機能であることが本研究によって初めて示された。ユーカリプタス・ヴィミナリスでの結果は、大気中のN_2Oを吸収することをしさしている。また、植物(11種)の二酸化窒素同化能とN_2O生成量との間には、高い負の相関(r=0.72)があることを初めて見出した。すなわち、植物の二酸化窒素同化(主として硝酸同化経路を介する)作用とN_2O生成作用には窒素をめぐった「競争関係」があることになる。脱窒菌Pseudomonasu stutxeri由来のN_2OR遺伝子の発現カセットをシロイヌナズナの根に感染させ、ハイグロマイシン耐性を指標として形質転換株を取得した。PCR法により植物ゲノム内での外来N_2OR遺伝子の存在を確認した。T_1個体からタンパク質を抽出し、ポリクローナルN_2OR抗体を用いてウエスタンブロット解析、脱窒菌由来のN_2OR遺伝子は形質転換シロイヌナズナ細胞内で転写、翻訳、成熟していることを確認した。調査した限り、形質転換体内が生成した外来N_2ORタンパク質は活性をもつことを示す結果は得られなかった。植物ゲノムにおけるnos_Zなど脱窒遺伝子ホモログのバイオインフォーマティックス解析を行い、シロイヌナズナ、イネ等のデータを用いて、植物ゲノムにバクテリア脱窒遺伝子(NOR, N_2OR)のホモログについて調査した。その結果、Fusarium oxysporumおよびCylidrocarpon tonkinense cytochomeのカビ由来のP-450型NO還元酵素(P-450nor)遺伝子は、分子進化学的には、シロイヌナズナおよびイネのチトクロームCオキシダーゼ(COX6B)と近縁関係にあることが分かった。大気中のNOx濃度を減少させることは、地球環境の破壊を食い止め、ヒトを含めた地球上の生態系の維持に必要欠くべからざる問題である。植物がNO_2を吸収・同化することはよく知られている。最近、植物がNOも吸収することが報告(Wildt&Kley,1997)されている。本研究の目的は、NO_2ガスをN_2ガスに光エネルギーを活用して、変換する植物の分子育種である。このためには、脱窒菌のN_2OをN_2に還元する亜酸化窒素還元酵素(N_2OR)遺伝子(nosZ)を導入・発現させた組み換え植物を育成することができれば、NO_2ガスをN_2ガスに変換する「ガス→ガス変換植物」が誕生するはずである。

上に述べたように植物はNOを吸収するがが、脱窒菌では、NOはN_2O生成の中間体であり、「ガス→ガス変換植物」は、NOもN_2に変換することが期待される。そこで本研究では、まずモデル植物シロイヌナズナで種々のnosZ発現ベクターを導入・発現させ解析を進めた。これまでに、いくつかの形質転換体を取得したがいずれも断片化されたnosZが導入されているのみであった。これまで、本代表者らは、多くの形質転換体を作ってきたが、今回のように断片化されたトランスジーンが導入されたのは初めてであり、その原因はまだ分からない。近年、硝酸性窒素による飲料水、河川水、牧草などの汚染が問題となっている。特に、酪農地域での大量の糞尿の放出に伴い大量のアンモニアが環境中に放出され、硝化菌による硝化作用による硝酸の生成が原因である。そこで、本研究では、ガスガス変換の考えをさらに発展させ、硝酸自体のガスへの変換についても来年度から探求する計画である。植物はNO2ガスや硝酸性窒素を亜酸化窒素(N2O)に変換する能力を有している。N2Oガスは地球温暖化ガスであると言われている。そこで、本研究では、遺伝子操作・選抜などにより、高等植物に「N2OガスをN2ガスに還元する能力」を付与し、以てNO2ガスを無害なN2ガスに変換する「ガス→ガス変換植物(脱窒植物)」の分子育種を目的とする。(1)nosZの発現プラスミド導入形質転換植物の解析(高橋)前年度に取得した、嫌気性脱窒細菌由来のnosZキメラ発現ベクターを発現させたシロイヌナズナ形質転換体を用い、ウエスタン・ブロット法でN2ORタンパク質の生成を解析・確認した。さらに、nosZ遺伝子導入シロイヌナズナから粗酵素標品を調製し、N2OR活性をベンジルビオロゲン法による測定について検討中である。(2)植物のN2OまたはN2生成能の解析(森川)昨年度までに、上記のnosZ発現ベクターを導入/選抜システムが確立したので、今後、モデル植物であるシロイヌナズナ以外に、約10種の植物の無菌植物培養体を用いてN2O発生を系統的に調査した。その結果、植物によるN2O発生量は種により著しく異なることが判明した(論文投稿中)。当初実験室内の塵挨の培養室への持ち込み(実験者に付着)を防止する目的で、エアーシャワーの設置を計画したが、その後この問題は無菌植物を用いることにより解決することとし、より有効な品目(重窒素ラベル窒素酸化物および実験補助謝金)に活用した。(3)植物ゲノムにおけるnosZなど脱窒遺伝子ホモログの調査(坂本)全ゲノム配列の決定されたシロイヌナズナ、イネ等のデータを用いて、植物ゲノムにバクテリア脱窒遺伝子(NOR, N2ORなど)のホモログがあるかどうかについて、調査した。これまでのところ、これら遺伝子のホモログの存在を肯定・否定する結果は得られていない。植物はNO_2ガスや硝酸性窒素を亜酸化窒素(N_2O)に変換する能力を有している。N_2Oガスは地球温暖化ガスであると言われている。そこで、本研究では、遺伝子操作・選抜などにより、高等植物に「N_2OガスをN_2ガスに還元する能力」を付与し、以てNO_2ガスを無害なN_2ガスに変換する「ガス→ガス変換植物(脱窒植物)」の分子育種を目的とする。1.noszの発現プラスミド導入形質転換植物の解析(高橋)嫌気性脱窒細菌Pseudomonas stuzeri由来のnosZの発現ベクターを発現させたシロイヌナズナ形質転換体を得た.
骨肉腫細胞における自己分泌型細胞運動刺激因子と骨形成関連分子の相互作用の解析

温熱刺激により転移を促進する分子であるautocrine motility factor (AMF)の発現が減弱し細胞運動も温熱刺激により著明に減弱した。骨形成能には大きな変化は認められなかったが骨形成因子BMPはサブタイプによって発現が減弱しているものと増強しているものがありこれらが相殺し合っている可能性が考えられた。骨転移病変と原発巣で糖代謝を比較したところ転移病変のほうが優位に高い値を示した。AMFは糖代謝にもかかわる分子であり転移巣のほうが高い糖代謝に寄与していると考えられた。平成20年度は前年度に行った温熱刺激を骨肉腫細胞に与える実験のデータを用いて研究を進めた。自己分泌型細胞運動刺激因子(autocrine motilitv factor以下AMF)は温熱刺激により発現は減弱した。またDNAマイクロアレイにて遺伝子の発現変化を比較し、温熱刺激に特異的と考えられる遺伝子をいくつか検出した。骨形成関連遺伝子の発現が認められ、これらの転写因子とAMFの関連が示唆された。AMFは糖代謝に関わる分子phosphoglucose isomerase(PGI)と相同な蛋白であることが知られている。このためin vivoで細胞や組織の糖代謝を調べられるFDG-PETを用いて様々な骨腫瘍細胞の糖代謝を調べた。糖を細胞内に取り込む分子としてグルコーストランスポーター(GLUT)が知られているがそのアイソザイムの発現を調べ、各腫瘍における糖の取り込みに重要なGLUTアイソザイムをいくつか確認した。また、骨形成関連分子の上昇とFDG-PETによる腫瘍細胞の糖代謝との関連も調べ、これらについてもいくつかの知見を得た。GLUTのうち骨腫瘍細胞の糖取り込みに重要と思われたアイソザイムを培養骨肉腫細胞に導入、あるいは抑制する実験を行いいくつかの知見を得た。また化学療法の前後での手術材料を用いて骨肉腫細胞のAMF発現、FDG-PETで評価された糖代謝などの因子と生命予後の関連の解析を行った。輿味深いことに化学療法後のAMFの発現と糖代謝は生命予後と相関していたものの、化学療法前のデータと生命予後との相関は認められなかった。前年度に引き続き温熱刺激による骨肉腫細胞の反応を調べた。温熱刺激により転移を促進する分子である自己分泌型細胞運動刺激因子(autocrine motility factor以下AMF)の発現が減弱したことから細胞の運動の変化を測定したところ細胞運動は温熱刺激により著明に減弱した。これらのことから骨肉腫細胞においては温熱刺激によりAMFを介した転移能が抑制されることが示唆された。また骨形成能には大きな変化は認められなかったがマイクロアレイの結果をみると骨形成因子BMPの発現に関してサブタイプによって減弱しているものと増強しているものがありこれらが相殺し合っている可能性が考えられた。今年度はAMFの発現がFDG-PETで評価された糖代謝の指標となる値standardized uptake value(SUV)と相関するという知見をもとに転移性骨腫瘍をFDG-PETにて解析した。骨への転移病変のSUVと原発巣のSUVを比較したところ転移病変のほうが優位に高い値を示した。AMFは転移を促進する分子であり転移巣のほうが高い糖代謝を示したことは今までの知見と矛盾しない結果であると考えられた。悪性腫瘍は骨転移する際に破骨細胞を利用して転移巣を形成することが知られている。上述の結果をもとにして破骨細胞においても糖代謝関連分子、AMF発現を確認している。
日本バレエの誕生『東京バレエ団』とその歴史的意義

本研究は、日本バレエ史上最大のメルクマールと位置付けられる「東京バレエ団」(1946年結成、1950年自然消滅)の実像を明らかにするとともに、その歴史的意義を考察することを目的としている。具体的には、(1)これまで明らかになっていなかった東京バレエ団の活動実態および上演作品を、現存資料、聞き取り調査から、その実像を浮かび上がらせること、(2)東京バレエ団の活動とその後「世界有数のバレエ大国」と称されることとなる日本バレエ界の発展との因果関係の考察、(3)東京バレエ団の結成、解散の原因ともいえる日本バレエ界の特殊性を、今日的視点から捉えなおすことである。本研究は、日本バレエの誕生といえる「東京バレエ団」(1946年結成)の実像を明らかにするとともに、その歴史的意義を考察することを目的としている。具体的には、1.これまで明らかになっていなかった東京バレエ団の活動実態、及び上演作品を、バレエ史研究、舞台美術史研究の両面から調査考察し、既に蓄積された膨大な資料からその実像を浮き上がらせること、2.東京バレエ団の活動とその後称されることとなる「バレエ大国日本」との因果関係の考察、3.東京バレエ団に起因する日本バレエ界の特殊性が変容しつつある現在について考察する。2014年度(初年度)は、資料収集、聞き取り調査を中心に、東京バレエ団の実態について研究調査を行った。研究代表者・川島京子は、プログラム、バレエ雑誌といった当時の資料から、東京バレエ団の結成と離合集散について調査し、また上演された全8作品について、基本データおよび、現存する写真資料の収集・検証から、その構成、演出・振付などについて調査考察した。分担者・鈴木晶は、それら上演作品の出自についての調査を進めた。聞き取り調査としては、使用音楽について、戦後から日本で上演された多くのバレエ作品の指揮・編曲に携わったバレエ音楽の第一人者福田一雄氏にインタビューを行った。また、舞台美術については、RA佐野勝也氏ほか研究協力者2名が資料収集を行った。研究代表者・川島京子は、1年目の成果として、上演作品全8作品のうち、日本初演となる3作品について論文として発表した。具体的には、1.これまで明らかになっていなかった東京バレエ団の活動実態、及び上演作品を、既に蓄積された膨大な資料からその実像を浮き上がらせること、2.東京バレエ団の活動とその後称されることとなる「バレエ大国日本」との因果関係の考察、3.東京バレエ団に起因する日本バレエ界の特殊性が変容しつつある現在について考察。最終的に、これら研究成果として、研究発表を含めた関係者によるシンポジウムを開催する予定である。2年目となる2015年度は、1年目に行った基礎的資料の収集と分析から継続し、川島はアメリカでの資料調査を行うとともに、東京バレエ團がその後の日本バレエ界に及ぼした影響について考察。1950年代の日本におけるバレエ・ブーム現象について調査研究し、メディアに現れるバレエの表象と、一般社会へのバレエ認知のされ方、及び、バレエ界内部の実情とを照らし合せ、「世界有数のバレエ大国日本への発展を支える戦後のバレエ・ブーム」を立証することを試みた。また、鈴木は、前年度から継続して、東京バレエ団上演作品の出自について、国内の関係者への聞き取り調査や海外での資料調査を行うとともに、それら作品の上海、日本での受容のされ方とその後の上演形態の変遷について調査を行った。当初予定されていたCGによる舞台美術の復元については、研究協力者の急逝により中止とならざるを得なくなったが、その他の研究計画については予定通り実行されている。本研究は、日本バレエの誕生といえる「東京バレエ團」(1946年結成)の実像を明らかにするとともに、その歴史意義を考察することを目的として行ってきた。最終年度となる2016年度は、東京バレエ團結成70周年にあたることもあり、第一回公演『白鳥の湖』が初演された8月に、本研究の成果発表とともに関係者を交えてのシンポジウムを開催した。場所は、この公演の稽古場となった貝谷バレエ団で行われた。内容は、川島京子によるこれまでの研究調査をもととした成果発表と、7名の登壇者による討議。討議は、山野博大氏(批評家)に司会をお願いし、また当時の音楽についての証言を福田一雄氏(指揮者)にしていただき、そして、東京バレエ団に参加した各団体、各舞踊家の門下にあたる、うらわまこと氏(松尾明美バレエ団)、大竹みか氏(貝谷バレエ団)、森龍朗氏(服部・島田バレエ団)、雑賀淑子氏(小牧バレエ団)、藤田彰彦氏(藤田繁氏長男)に参加いただいた。加えて、このシンポジウムとは別途に、東京バレエ團第2回公演以降すべての公演で主役を務めた関直人氏へのインタビューを行った。これらにより、新たな資料の発見はもとより、上演の経緯、分裂の原因、各作品の実像、振付の詳細、出自などがより明らかとなり、同時に、不明点、疑問点の整理が行われた。これらは、3年間の本研究調査研究成果に加え、東京バレエ団の歴史的意義、そしてその後の日本のバレエ界の特殊性と結び付け、報告書として本年度中に発表する準備をすすめている。

具体的には、(1)これまで明らかになっていなかった東京バレエ団の活動実態および上演作品を、現存資料、聞き取り調査から、その実像を浮かび上がらせること、(2)東京バレエ団の活動とその後「世界有数のバレエ大国」と称されることとなる日本バレエ界の発展との因果関係の考察、(3)東京バレエ団の結成、解散の原因ともいえる日本バレエ界の特殊性を、今日的視点から捉えなおすことである。1年目の研究計画は、「東京バレエ団の実態研究」として、資料収集と、東京バレエ団の実態について研究調査するものであった。大きく分けて2点あり、1.東京バレエ団設立の背景と、参加バレエ団離合集散の整理(川島)2.上演作品についての資料収集(2ー1.振り付け及び構成について(川島)、2ー2.舞台美術について(佐野)、2ー3.上演作品の出自について(鈴木))としていたが、これら研究計画は予定通り実施できた。最終年度となる2016年度は、東京バレエ團結成70年にあたることもあり、第一回公演『白鳥の湖』が初演された8月に、本研究の成果発表とともに、関係者たちを迎えてのシンポジウムを開催する。これにより新たな証言も得られると考えられ、3年間の本研究の調査結果に加え、シンポジウム内容も含めて報告書として発表したいと考えている。芸術学、舞踊学、バレエ史2年目は、戦後のバレエ・ブームについての調査研究及び、舞台美術復元プロジェクトへの準備である。これらについては、1.戦後バレエ・ブームにより各メディアに現れたバレエ、一般社会、バレエ界への影響(川島)2.東京バレエ団及び、バレエ・ブーム現象を、世界バレエ史の観点から考察(鈴木)3.CGによる舞台美術復元への準備(佐野)である。このうち3の美術については、CGによるものを予定していたが、RAであった佐野氏の重病により変更せざるを得ず、写真資料の発掘とその考察とする予定である。鈴木による海外調査出張が、2回の予定であったところを1回で実施したため。主に、海外調査出張が時期尚早と判断したこと、舞台美術調査のための謝金40万円を前倒ししたが、RAの重病の為実施しなかったことによる。最終年度2016年度に開催するシンポジウムは、計8名のパネリストを招聘する予定であり、その謝金、会場費、印刷費などに全額を支出する予定。海外調査出張、謝金ともに、次年度に延期して実施する。
在宅福祉NPOの地域社会におけるネットワークと組織基盤形成に関する実証的研究

本年度は前年度明らかになった福祉NPOの課題を引き続き希求することになった。つまり、これら組織の実施するサービスが単なる高齢者福祉サービス供給の多様化に留まらず、ネットワークを形成することでより広範な社会的な課題に対応していることが明らかになった。つまり、高齢者福祉サービスを実施するNPOが、行政機関や一般市民に対する「アドボカシー」を行い始めているのである。本年度は具体的なアドボカシーの状況について、横浜市および兵庫県内のNPOについて調査を行った。NPOがアドボカシーを実施するには、社会的な課題を的確に把握すると共に、それを実現するキャパシティ(capacity)が不可欠である。なお、アドボカシーを実施するに当たっていくつかのスタイルがあることも本研究から明らかになった。例えば、メディアを通して世論を形成し、行政機関に政策変更を要求する。現場の事業を実施し、成果をみせながら政策に取り入れていった。といったパターンである。同時に、緊急時の対応、例えば阪神大震災後の政策形成においては、緊急時の対応とその後の平常時においては様々な諸条件の変化することもわかった。研究代表者が研究開始を実施する仮説の通り、こうした組織基盤は外部から安易に導入できるものではない。日本の一部のNPOは「成熟期」に入っているが、「萌芽期」にどのように組織が形成されたかは極めて重要となる。特に1980年代半ば以降、少なくないNPOは「ネットワーキング」という概念を機軸として、活動を展開してきた。研究代表者の調査した限りでは、現在でもこの概念は有効である。そこで、研究代表者は3年間に渡るNPO研究の延長線上として、NPOの歴史研究に着手することにし、研究を開始した。ネットワーキングという概念を導入するに至るプロセスを今後明らかにするのが、残された課題といえる。本年度は調査計画に基づいて、調査の基本設計と一部NPOに対する予備調査を実施した。研究代表者の過去の研究蓄積(データおよび関係資料)と先行研究について分析を試みつつ、一部NPOに対して調査設計に関わるヒアリング、インタビューを実施し、NPOに関する研究会に参加して議論を深めることで研究の進捗をはかった。予備調査に関して、本研究の特徴である在宅福祉NPOを「単体」として捉えるのではなく、地域社会およびその構成員との関係で捉えるという視点から分析を行い、具体的事例として神奈川県を中心に、千葉県、兵庫県で活動するNPO、それを取り巻く地域社会の構成員(中間支援NPO、購買生協、地方自治体、他地域のNPO、市区町村社会福祉協議会、保健所、地縁組織、商店街、民間企業、等)について調査を行った。その結果、NPOの活動内容が単なるサービス提供に収まらず、サービスの複合化、アドボカシーにまで拡大し、組織基盤を強化するなかで、地域社会により影響を強めている事象を捉えることができた。また、この点について分析する際、地域社会の様々な構成員との「関係性」が鍵となっているという仮説を得ることができた。本年度はこの「関係性」に着目した研究成果として、主に組織論的な観点から「協働」について論じた。次年度以降、「関係性」についてより掘り下げるには、組織論的アプローチだけではなくローカル・ガバナンス論の観点をより組み入れることで、当初の研究目的を果たすことが可能になるといえよう。本年度は研究実施計画に従って、まず本調査の再設計を行った。前年度に明らかになった在宅福祉NPOの地域社会の構成員との「関係性」の構築が、相互作用を孕んでNPOにどのような影響を及ぼすかについて整理したいと考えたからである。そこで地方自治体とNPOとの関係性に着目したが、その際、概念整理のためにローカル・ガバナンス論に着目し、イギリスの行政・NPO間のパートナーシップ施策、社会的排除(Social Exclusion)対策について検討した。本調査では、こうした概念の検討を実施しつつ、在宅福祉NPOに対してヒアリングを実施した。その結果、これら組織の実施するサービスが単なる高齢者福祉サービスの供給の多様化(「複合化」)を越え、より広範な地域社会の課題に対峙する傾向が明らかになった。精神障害者に対する地域支援などもその一例である。また、NPOの事業として、「アドボカシー機能の強化」と「商業化(Commercialization)」が同時進行している事例が存在し、地域の諸アクターとの連携を通して、まちづくり等にも積極的に関与しつつあった。これらの事例研究を通して、NPOの実施する事業に焦点を当てるだけでなく、NPOの「公共」概念の変遷を分析する必要があることが明らかになった。この点は、外部から「目にみえにくい(invisible)」要素となる。そのため、最終年度となる次年度は、この点について再度ヒアリングを実施しながら、組織論アプローチ、政治学的アプローチを用いて、最終報告としてまとめたいと考えている。

同時に、緊急時の対応、例えば阪神大震災後の政策形成においては、緊急時の対応とその後の平常時においては様々な諸条件の変化することもわかった。研究代表者が研究開始を実施する仮説の通り、こうした組織基盤は外部から安易に導入できるものではない。日本の一部のNPOは「成熟期」に入っているが、「萌芽期」にどのように組織が形成されたかは極めて重要となる。特に1980年代半ば以降、少なくないNPOは「ネットワーキング」という概念を機軸として、活動を展開してきた。研究代表者の調査した限りでは、現在でもこの概念は有効である。そこで、研究代表者は3年間に渡るNPO研究の延長線上として、NPOの歴史研究に着手することにし、研究を開始した。ネットワーキングという概念を導入するに至るプロセスを今後明らかにするのが、残された課題といえる。
殺蚊蛋白質Cry4Aaの受容体認識機構の解明と新規特性を備えた殺虫蛋白質の開発

殺蚊トキシンCry4Aaは他の多くのCryトキシンと極めて類似する構造(3ドメイン構造)を持つにもかかわらず、殺虫活性に関与する機能構造が他のトキシンと異なることがこれまでの研究結果から示唆されている。Cry4Aaの作用機構を解明し、他のCryトキシンとの相違点を明らかにすることは、効率的な害虫防除システムを構築する上でも重要と考えられる。本研究ではこれまでCry4Aaの機能構造解析を中心に研究を進めてきたが、本年度は特に殺虫活性に関連する様々な因子(糖や2価陽イオンなど)についての解析を進め、以下のような成果を得た。糖が殺虫活性に及ぼす効果:タンパク質糖鎖を構成する一般的な糖でCry4Aaを処理した。その結果、Cry4Aaの殺虫活性はGalNAc処理により促進され、Fucose処理によって阻害された。MannoseやGalactose、GlcNAc処理はCry4Aaの殺虫活性に影響しなかった。C1y4AaのドメインIIIには糖が結合できる「くぼみ」が存在し、この構造を介して標的細胞膜上に露出する糖鎖と相互作用する可能性が考えられた。2価陽イオンが殺虫活性に及ぼす効果:アカイエカ幼虫を陽イオンのキレート剤であるEDTAで処理した結果、Cry4Aaに対する感受性が大幅に減少した。Cly4Aa感受性は幼虫をMgCl_2処理すると回復したが、CaCl2処理は影響しなかった。これはCry4Aaの殺虫活性に標的細胞内へのMg^<2+>流入を契機とするシグナル伝達経路が関与する可能性を示唆していた。興味深いことに、GalNAc処理によるCry4Aa殺虫活性の促進は幼虫のEDTA処理とは関係なく観察され、Fucose処理による殺虫活性の阻害効果は幼虫のEDTA処理によって観察できなくなった。これはCry4Aaの殺虫機構が2つ以上の経路で構成されることを示唆していた。一般的にCryトキシンはドメインIIの表面に露出するループ構造を介して受容体結合し、その後にドメインIが標的細胞膜組織に貫入して小孔を形成する(小孔形成モデル)と考えられている。一方、新たな殺虫機構モデルとして、受容体結合後にadenylyl cyclase/protein kinase A経路が活性化されて細胞死を誘導するモデル(情報伝達モデル)も提唱されている。本研究ではCry4Aaの殺虫活性にMg^<2+>が関与する可能性を示唆したが、Mg^<2+>はprotein kinase Aの活性化に関わる因子であり、Cly4Aaの殺虫機構に情報伝達モデルも関与する可能性を示す重要な知見が得られたと考えている。本研究のこれまでの結果からCry4Aaの受容体結合にはドメインII及びIIIの複数の機能構造が関与する、そしてドメインIIIを介した相互作用にはGalNAcもしくはFucoseを含む糖鎖が関与する可能性が示唆された。また殺虫活性にMg^<2+>が大きく影響することから、Cry4Aaの殺虫機構には小孔形成モデルと情報伝達モデルの両方が関与する可能性が示唆されている。今後はこれらの断片的な結果を関連付けて理解するため実験を行う。具体的にはドメインII及びIIIの変異導入解析と、糖及び2価陽イオン処理、場合によってはprotein kinase A阻害剤の処理を組み合わせ、Cry4Aa殺虫活性の変動を解析する。Cry4Aaと受容体の相互作用を解析するため、推定上の受容体結合部位(ドメインH(V^<322>H^<524>及びIII(S^<525>Q^<695>))に相当するポリペプチド(4AaDII及びDIII)の調製を試みた。ポリペプチドのコード領域はCry4Aaの人工遺伝子(Cry4Aa-S1、hayakawa et al.,2008)からPCR法で増幅し、発現ベクター、pΔGST-4AaCter(hayakawa et al.,2010)を用いて発現させた。pΔGST-4AaCterはタンパク質をアルカリ可溶性の凝集体として発現させるベクターである。その結果、4AaDIIIの生産には成功したものの、4AaDIIは強アルカリ条件下でも可溶化しない凝集体を形成した。またドメインIIを3つに分割したポリペプチド、4AaDII-1(P^<311>D^<408>)、DII-2(T^<354>E^<455>)、DII-3(G^<414>H^<524>をデザインしたが、同様な凝集体を形成して状況は改善しなかった。そこでドメインIIについては分子表面に露出するループ構造を一つずつ含む6種類のポリペプチド(4Aaβ1-α8(E^<325>T^<354>、ループα8を含む)、4Aaβ2-β3(T^<361>H^<388>、ループ1を含む)、4Aaβ4-β5(Q^<396>G^<414>)、4Aaβ6-β7(I^<419>I^<447>、ループ2を含む)、4Aaβ8-β9(K^<456>G^<475>)、4Aaβ10-β11(H^<499>H^<524>、ループ3を含む))をデザインして再度発現を試みた。リカーシブPCR法で人工合成した遺伝子をpΔGST-4AaCterを用いて発現させた結果、ポリペプチドを凝集体として大量調製することに成功した。

解析の結果、本方法で調製した凝集体は昆虫幼虫の消化液と同じpH11付近のアルカリ条件下で可溶化し、アカイエカ幼虫を用いたバイオアッセイにそのまま利用できることが期待された。殺蚊トキシンCry4Aaは3つのドメイン(ドメインIIII)で構成され、他の多くのCryトキシンと非常に類似した構造を持つ。しかし、多くのCryトキシンで分子表面に露出するドメインIIのループ構造が受容体結合に関与するのに対し、Cry4Aaのループ構造は他の配列に置換できる。Cry4Aaの受容体結合にはドメインH以外の構造、もしくは複数のループ構造が相互補完的/協調的に働く可能性が考えられる。水晶発振子マイクロバランス(QCM)デバイスを用いた親和性解析の結果、β1-α8及びβ2-β3、ドメインIIIポリペプチドはCry4Aaに匹敵する高い結合親和性をBBMに示した。β1-α8及びβ2-β3はループα8及びループ1を含み、これらは置換可能な構造であるものの、受容体結合に何らかの役割を持つ可能性が考えられた。またCry4AaのドメインIIIには糖(糖鎖)と結合可能な構造があり、ドメインIIIがBBMに示す高い親和性は、タンパク質糖鎖を介した結合である可能性が考えられた。そこで様々な糖で処理したCry4Aaを用いてバイオアッセイを行った結果、GalNAc処理はCry4Aaの殺虫活性の促進し、Fucose処理は阻害することが示唆された。Cry4Aaにはレクチン様活性があり、それが殺虫活性に関与している可能性が示唆された。殺蚊トキシンCry4Aaは他の多くのCryトキシンと極めて類似する構造(3ドメイン構造)を持つにもかかわらず、殺虫活性に関与する機能構造が他のトキシンと異なることがこれまでの研究結果から示唆されている。Cry4Aaの作用機構を解明し、他のCryトキシンとの相違点を明らかにすることは、効率的な害虫防除システムを構築する上でも重要と考えられる。本研究ではこれまでCry4Aaの機能構造解析を中心に研究を進めてきたが、本年度は特に殺虫活性に関連する様々な因子(糖や2価陽イオンなど)についての解析を進め、以下のような成果を得た。糖が殺虫活性に及ぼす効果:タンパク質糖鎖を構成する一般的な糖でCry4Aaを処理した。その結果、Cry4Aaの殺虫活性はGalNAc処理により促進され、Fucose処理によって阻害された。MannoseやGalactose、GlcNAc処理はCry4Aaの殺虫活性に影響しなかった。C1y4AaのドメインIIIには糖が結合できる「くぼみ」が存在し、この構造を介して標的細胞膜上に露出する糖鎖と相互作用する可能性が考えられた。2価陽イオンが殺虫活性に及ぼす効果:アカイエカ幼虫を陽イオンのキレート剤であるEDTAで処理した結果、Cry4Aaに対する感受性が大幅に減少した。Cly4Aa感受性は幼虫をMgCl_2処理すると回復したが、CaCl2処理は影響しなかった。これはCry4Aaの殺虫活性に標的細胞内へのMg^<2+>流入を契機とするシグナル伝達経路が関与する可能性を示唆していた。興味深いことに、GalNAc処理によるCry4Aa殺虫活性の促進は幼虫のEDTA処理とは関係なく観察され、Fucose処理による殺虫活性の阻害効果は幼虫のEDTA処理によって観察できなくなった。これはCry4Aaの殺虫機構が2つ以上の経路で構成されることを示唆していた。当初の予定通り、Cry4Aaの推定上の受容体結合部位(ドメインII及びIII)に相当するポリペプチドの大量調製が可能となった。ポリペプチドは昆虫幼虫の消化液と同じpH11付近で可溶化するため、そのままバイオアッセイで用いることが可能と考えている。
地震荷重を受ける摩擦杭の鉛直支持力の原位置摩擦試験による推定

地震荷重を受ける摩擦杭の鉛直支持力を推定する際に重要な杭の周面摩擦力に的を絞って、自ら開発した原位置摩擦試験機を用いた実験的研究を行った。1.模型加圧砂地盤と埋め立て砂地盤おいて四成分コ-ンを用いた摩擦試験を実施し、砂地盤における杭の周面摩擦力に大きな影響をおよぼす側方土圧の性質を試験結果にもとづいて検討した。模型加圧砂地盤を用いた実験では、四成分コ-ンの貫入時における地盤内水平土圧の変化の様子を明らかにした。さらに、四成分コ-ンのフリクションスリ-ブに作用する側方土圧と地盤の相対密度との関係を実験結果にもとづいて考察した。埋め立て砂地盤における実験では、間隙水圧の測定位置が試験結果におおきな影響をおよぼしているとの考察に至った。2.軟弱粘土地盤、硬質粘土地盤において四成分コ-ンを用いた摩擦試験を実施した。この結果をもとに、コ-ン貫入試験で求まる周面摩擦力と杭の載荷試験から求まる周面摩擦力の関係について考察をおこなった。軟弱粘土地盤における実験では、フリクションスリ-ブの位置や表面粗さが異なる場合でも、周面摩擦力の測定値に大きな違いが生じないことを示した。硬質粘土地盤における実験では、コ-ン貫入試験の先端抵抗から粘土の非排水強度を推定した場合よりも、フリクションスリ-ブで測定した周面摩擦力の方が実杭の周面摩擦力の値に近いことを示した。3.上記の1、2の実験を行う中で、試験装置および試験方法の問題点を検討し、今後おこなう研究において活かすことができる有益な知見を得た。原位置摩擦試験による摩擦杭の支持力推定を研究目的とし、前年度までに試作した原位置摩擦試験機を用いることによって、研究実施計画に沿った以下のような研究をおこなった。(1)原位置摩擦試験の測定装置その他の整備原位置摩擦試験機の開発段階においては、実験室内で載荷・測定を行ったため、備え付けの載荷装置や測定機器を用いることが出来た。実地盤で摩擦試験を行うに当たり、可搬性・操作性を工夫した測定装置を作製した。この装置を用いて、以下の原位置摩擦試験を実施した。(2)大型砂地盤土槽における原位置摩擦試験実地盤における原位置摩擦試験の準備段階として、容量2tonの貫入装置を用いて、深さ7mの人工砂質地盤における原位置摩擦試験を行った。並行して行った標準貫入試験結果との比較などから、N値が10程度以下の緩い砂地盤において原位置摩擦試験を行える事を確認した。また、地下水位以下での試験においても、各センサ-が正常に作動することを確認した。なお、N値を10をある程度超える砂地盤においても、貫入装置の容量が充分大きければ試験を行えるとの見通しを得た。(3)実地盤における原位置摩擦試験東京湾沿いの軟弱な砂地盤(東扇島・新砂・豊洲・君津の4箇所)において、原位置摩擦試験を行った。実地盤においても人工地盤における場合と同様に原位置摩擦試験が実施できる事を実証した。なお、試験の結果を解釈する上において、間隙水圧の取扱いが特に難しくまた重要であることが明らかになった。地震荷重を受ける摩擦杭の鉛直支持力を推定する際に重要な杭の周面摩擦力に目を絞って、自ら開発した原位置摩擦試験機を用いた実験的研究を行った。さらに、四成分コ-ンのフリクションスリ-

ブに作用する側方土圧と地盤の相対密度との関係を実験結果にもとづいて考察した。埋め立て砂地盤における実験では、間隙水圧の測定位置が試験結果におおきな影響をおよぼしているとの考察に至った。2.軟弱粘土地盤、硬質粘土地盤において四成分コ-ンを用いた摩擦試験を実施した。この結果をもとに、コ-ン貫入試験で求まる周面摩擦力と杭の載荷試験から求まる周面摩擦力の関係について考察をおこなった。軟弱粘土地盤における実験では、フリクションスリ-ブの位置や表面粗さが異なる場合でも、周面摩擦力の測定値に大きな違いが生じないことを示した。硬質粘土地盤における実験では、コ-ン貫入試験の先端抵抗から粘土の非排水強度を推定した場合よりも、フリクションスリ-ブで測定した周面摩擦力の方が実杭の周面摩擦力の値に近いことを示した。3.上記の1、2の実験を行う中で、試験装置および試験方法の問題点を検討し、今後おこなう研究において活かすことができる有益な知見を得た。
欧米憲法理論のアジアへの導入とその展開-日本・台湾憲法学の比較憲法的研究

2008年3月,台湾の憲法・行政法研究者10名を迎え、東京(早稲田大学)で「議院内閣制と大統領制」および「実効的人権保障とその問題点」をテーマとして、第3回共同研究シンポジウムを開催した。2009年3月,日本の憲法研究者8名が台湾に赴き、台北(台湾大学)で、「公法典範的継受與轉型」をテーマとして、第4回共同研究シンポジウムを開催した。これまでの成果をまとめた論文集の刊行に向けて,鋭意努力中である。2008年3月26日に、台湾から10名の憲法・行政法学者を迎え、早稲田大学比較法研究所との共催で、第3回日台憲法交流会を開催した。「欧米憲法理論のアジアへの導入とその展開」が本共同研究の一貫したテーマであるが、今回は、「議院内閣制と大統領制」及び「実効的人権保障とその問題点」の2つを具体的な検討テーマとして設定した。「議院内閣制と大統領制」については、蔡宗珍(台湾大学法律学院)「台湾憲政体制の変革とその公法への影響」、石川健治(東京大学法学部)「Strasbourg/Tokyo/Taipei-議院内閣制論をめぐる1つの準線」、「実効的入権保障とその問題点」については、李建良(中央研究院法律学研究所)「憲法上の国家の保護義務と国民の保護請求権の関係」、毛利透(京都大学法科大学院)「日本の基本権保護義務論」、および黄舒芃(中央研究院法律学研究所)「科学的法学の時代?憲法裁判における実証社会科学の役割再考」の報告がなされた。報告者以外の台湾側参加者は、葉俊栄(台湾大学法律学院)、黄昭元(同)、張文貞(同)、顔厥安(同)、林素鳳(中央警察大学)、林超駁(東呉大学)、阿部由里香(台湾大学法律学院博士課程)の各氏、日本側参加者は、園部逸男、樋口陽一、高見勝利、戸波江二、岡田信弘、小山剛、江島晶子、西原博史、松平徳仁、枦山茂樹、今関源成の科研費メンバーである。一般の参加者も多数来場した。執行権の強化、国家による人権保障という今日的な問題について、台湾と日本の公法研究者の有意義な意見交換の場を提供できたのではないかと思う。なお、第4回は2008年12月に台湾で実施する予定である。2008年度末には東京に台湾側の研究者を招き、共同研究会を開催したが、今回は日本側が台湾に赴き、2009年3月28日、国立台湾大学法律学院(台北・台湾)において共同研究会を行った。日本側参加者は今関源成(早稲田大学)、戸波江二(同)、岡田信弘(北海道大学)、小山剛(慶応大学)、石川健治(東京大学)、鈴木秀美(大阪大学)、松平徳仁(一橋大学・通訳)、松井直之(比較法研究所助手)の8名であった。共同研究会のプログラムは、次のとおりである。蔡明誠(台湾大学法律学院院長)挨拶翁岳生(前司法院院長)司法権の継受と発展-台湾と日本の比較小山剛(慶応大学)自由と安全李建良(中央研究院)社会国家原理の実践と基本権の保障-社会立法の違憲審査を中心として林超駿(国立台湾大学)大法官による憲法解釈の機能の限界岡田信弘(北海道大学)政権交代と議会制民主主義葉俊英・張文貞(国立台湾大学)東アジア立憲主義の成立今回の研究会においても、日本と台湾の憲法状況の相違、およびアメリカ、ドイツの影響を受けた理論的準拠枠の共通性などを確認するとともに、台湾、韓国、日本をモデルとしてヨーロッパ出自の「普遍的立憲主義」とは異なる「東アジア立憲主義」が成立するのではないかという刺激的な問題提起もなされ、台湾の憲法研究者と有意義な意見交換ができたと考えている。台湾と日本のあいだには共通の課題が存在しており、比較憲法学的な研究の可能性と必要性について、改めて再確認する機会となった。台湾の研究者からは、台湾の憲法、憲法学の現状について日本の研究者にもっと知ってほしいという希望が表明された。2005年度から日本と台湾において交互に4回の共同研究会を開催してきたが、これらの研究会の報告をまとめ、書籍として刊行する予定である。
父親の過栄養が仔の腎機能に及ぼす影響やその機序について検討

父親の肥満は子供の疾病発症リスクに寄与することが注目されており、父親の過栄養による子孫の腎障害を検討した。高脂肪・高フルクトースを負荷した父SDラットの仔ラットで食欲増進・体重を認め、8週齢よりアルブミン尿が増加、16週令で耐糖能異常および脂質異常、血圧上昇、アディポネクチン低下を認めた。父親の過栄養が仔の将来の耐糖能異常・腎障害を惹起する可能性があり、メカニズム解明のためアディポネクチンに注目し研究をし進めている。今後、免疫染色による局所でのアディポネクチン発現を含め組織学的に糸球体障害を評価し、エピジェネティクス解析を追加する予定である。本年度は、父親の過栄養が仔の腎障害に関与することを証明しそのメカニズムを解明するためのラットモデル作成を主として行った。12週令のSDラット雄にコントロール飼料を投与する群(NF群)、高フルクトース及び高脂肪飼料を投与する群(HFF群)に分け、6週間同じ飼料を継続した。高フルクトース及び高脂肪飼料を投与した群で高体重・高血糖となったが、腎機能に変化を認めないことを確認した。その後、コントロール食ラット雌と交配した。出産後はすべてコントロール食とし、母ラットあたりの仔の個体数や性別に差がないようにわけ管理した。結果:出産後は継時的(出生後、4週令、8週令、12週令、16週令)にsacrificeし検体を収集した。十分な個体数が一度には得られず、NF群・HFF群ともに追加で交配した。現時点では個体数が少なく統計学的有意差は得られていないが、HFF群で食欲増進を認め体重増加傾向および8週齢頃よりアルブミン尿増加傾向しており、16週令で耐糖能異常および血圧上昇傾向を認めた。父親に対する高フルクトース及び高脂肪飼料負荷が仔の将来の耐糖能異常・腎障害を惹起する可能性があるが、個体数をさらに増やした後に、体重・血圧・耐糖能異常、蛋白尿の統計学的解析に加え、生化学検査にて腎機能・糖代謝・脂質代謝・アディポネクチンを測定し評価する予定である。また、可能であれば網羅的にエピジェネティクス解析を行う予定である。結論:父親の過栄養が仔の腎障害を惹起する可能性がある。父親に対する高フルクトース及び高脂肪飼料負荷が仔の将来の耐糖能異常・腎障害を惹起する可能性があり、検体数が不十分ではあるが仮設通りの結果が得られている。今後は十分な検体数が得られた後に各種検査・病理学的検討を行い、統計学的に評価していく予定である。前年度に引き続き、父親の過栄養が仔の腎障害に関与することを証明しそのメカニズムを解明するためのラットモデル作成を継続し、十分な個体数を得た。父ラットに高フルクトース・高脂肪飼料を投与し、高体重・高血糖(腎障害はなし)となった個体をコントロール食のラット雌と交配、出生後は母ラットあたりの仔の個体数や性別に差がないようにわけコントロール食にて16週にわたり管理するため、うまく交配できない個体があったこともあり、十分な個体数の獲得に時間を要した。父ラットに高フルクトース・高脂肪飼料を投与した仔ラットで食欲増進を認め体重増加を認めた。8週齢頃よりアルブミン尿増加し、16週令で耐糖能異常や脂質異常、血圧上昇、アディポネクチン低下を認めた。父親に対する高フルクトース及び高脂肪飼料負荷が仔の将来の耐糖能異常・腎障害を惹起する可能性があり、現在、免疫染色による局所でのアディポネクチン発現を含め、組織学的に糸球体障害、尿細管障害の有無を確認・解析中である。また、メカニズム解明のため、アディポネクチンに注目しエピジェネティクス解析を追加すべく、免疫沈降法による網羅的解析追加を検討している。当研究室にて免疫沈降法による実験の確立を行っている。当研究室にて終末糖化産物(AGEs)やジメチルアルギニン(ADMA)と腎障害についての関連をこれまでに多数報告しており、当モデルでも関連性を検討する予定である。引き続き母ラットから生まれた仔を継時的に評価していくとともに、病理学的にも腎障害を呈することを確認しメカニズム解明のためアディポネクチンを測定予定である。さらに、父親の過栄養が仔の腎障害を呈する機序としてアディポネクチンの関与が考えられれば、遺伝子改変マウスを用いた検討あるいはアディポネクチンを外的に補充し腎障害への影響を検討する予定である。同時に父ラット・仔ラットの腎臓や精子において腎障害マーカーのエピジェネティクス解析を網羅的に行い、エピジェネティクス変化が仔の腎障害に与える影響を観察予定である。腎臓内科学
神経ペプチドPACAPによる中枢神経系と免疫系間のクロストーク

2015.4-2015.12まで申請者はPACAPとその受容体が造血組織、特に骨髄における場の全容を明らかにし、PACAPの骨髄における造血幹前駆細胞の作用様式をを明らかにするため、次の三つの基礎研究を行った。1.骨髄におけるPACAP受容体の解剖学的全容(場)の解明:1.骨髄におけるPACAP特異的レセプター(PAC1R)の遺伝子発現が骨髄に認められることを見出した。マウスの凍結切片を用いた免疫染色及びフローサイトメトリーでによりPAC1Rが骨髄造血細胞に認められ、未熟な骨髄細胞や成熟した細胞では極めて低いことからPACAP- PAC1Rシグナルは造血過程に関与する可能性を見出した。PAC1R陽性細胞はCD34、CD117、Sca-1の陽性細胞をセールソータで分離し、PAC1の遺伝子発現が造血幹前駆細胞マーカーと共存することを見出した。2.PACAPによる造血能の作用様式の解明:マウスの骨髄造血幹前駆細胞の比率をフローサイトメトリーで解析した。その結果、野生型マウスに比べて、PACAP KOマウスでは骨髄造血幹前駆細胞の割合が低かった。これらの結果より、PACAPは交感神経系から骨髄に放出され、造血機構の制御に関与していると示唆される。3.マウスの骨髄造血幹前駆細胞(CD34+及びCD34+/Sca-1+)をセルソーターにより分離、造血幹前駆細胞の増殖及び分化に対するPACAPの役割をフローサイトメトリー及びCFU-assayにより調べた。さらに、PAC1Rのアゴニスト、アンタゴニストを用いて、造血幹前駆細胞に与える影響を確認した。これらの結果より、交感神経系からPACAPが放出され、レセプターPAC1Rを介して、骨髄における造血幹前駆細胞の増殖を制御していると示唆される。2014.4-2015.3まで申請者はPACAPとその受容体の骨髄における場の全容を明らかにし、PACAPの骨髄における造血制御機構を明らかにするため、次の三つの基礎研究を行った。1.骨髄におけるPACAP受容体の解剖学的全容(場)の解明:骨髄におけるPACAP特異的レセプター(PAC1R)の遺伝子発現が骨髄に認められることを見出した。マウスの骨髄塗抹切片を用いた免疫染色によりPAC1Rが骨髄造血細胞に認められ、PAC1R陽性細胞はCD34、CD117、Sca-1の造血幹前駆細胞マーカーと共存することを見出した。PAC1Rの発現は未熟な骨髄細胞や成熟した細胞では極めて低いことからPACAP- PAC1Rシグナルは造血過程に関与する可能性を見出した。2.骨髄におけるPACAPの発現細胞の解明:リガンドであるPACAPの発現は極めて低レベルであるため、PAC1Rの発現が確認されている脛骨骨髄内に逆行性神経トレーサー(Fluorogold)を注入した結果、腰椎神経節の一部が陽性反応であった。これら神経節を組織免疫染色解析したところ、Tyrosine Hydroxylase(交感神経マーカー)及びPACAPの陽性反応が確認された。3. PACAPによる造血能の作用様式の解明:マウスの骨髄造血幹前駆細胞の比率をフローサイトメトリーで解析した。計画通り進展している。PACAP及びその受容体の骨髄における場の全容を明らかにし、PACAPの骨髄における造血機構の関与を示唆した。