hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
航空機複合材構造のバードストライクに関する損傷モデリング

本研究ではバードストライクを受ける航空機複合材構造の信頼性評価技術の確立を目指し,柔軟体衝突によるCFRP積層板の損傷を予測する解析技術を構築した。特に,粒子法(SPH)において,粒子を計算空間に写像することによって粒子の不均一な配置を可能とし,計算効率を改善する新たな手法を開発した。本手法に,き裂進展に伴うエネルギー吸収を表す材料軟化モデルを導入して,積層板の層間はく離の進展を予測した。本手法を用いてバードストライク損傷を予測し,実験結果をよく再現できることを示した。実験面,解析面ともに,CFRP積層板のバードストライクによる損傷をモデリングするための基礎を確立することを平成25年度の目的とした。まず,CFRP積層板に対する柔軟体の高速衝撃試験を実施した。複数の衝撃速度で試験を行ったが,超音波CスキャンやX線探傷装置で観察しても無損傷または固定端での曲げによる破断という結果になった。これは積層板の板厚が小さすぎたためであり,柔軟体衝撃損傷を把握するためには,試験片の寸法や固定の方法を変更する必要があることがわかった。次に,Smoothed Particle Hydrodynamics (SPH)による粒子法シミュレーションの計算効率の改善を行った。計算点である粒子を物理座標系において不均一に初期配置し,これを等間隔とする一般化座標系へ座標変換して解析する手法を確立した。本手法を用いて等方性板の静的曲げや円孔近傍の応力集中問題を解析し,理論解と一致することを確認した。また,写像を利用した解析手順に加え,写像後の計算空間への状態方程式の適用や,SPHで高速衝撃問題に必要な人口粘性の式を開発し,改善手法に組み込むことで,高速衝撃シミュレーションを構築した。本手法を用いて鋼球のアルミニウム板への高速衝撃問題を解析した。解析結果は,写像のスケールに依存せず実験結果とほぼ一致し,本手法の妥当性を示した。さらに,本手法により少ない粒子数で大モデルの高速衝撃問題を解析可能となり,粒子数の1.224乗で計算効率の改善を達成した。さらに,改善したSPHにおいて,報告されている柔軟体構成則を飛翔体に適用し,柔軟体の剛体壁への高速衝突解析を実施した。解析で得られた最大圧力は,報告されている実験結果と概ね一致した。また,圧力の時間応答は写像のスケールに依存せず一致し,解析手法の妥当性を実証した。まず,平成25年度に提案した,一般化座標系への写像によって計算効率を改善したSmoothed Particle Hydrodynamics (SPH)を,高速衝撃に伴う大変形を表現できるよう定式化し,プログラムに実装した。アルミニウム板への鋼球の高速衝撃の実験結果(平成25年度に実施)に対して解析を行い,応力波の伝搬やクレーター形状の比較によって,解析の妥当性と解析コストの削減効果を実証した。次に,上記SPHに直交異方性構成則を適用し,CFRPクロスプライ積層板への柔軟体の高速衝撃を実験と同じスケールのフルモデルで解析した。予測されたCFRP積層板の変形状態は,ハイスピードカメラによるCFRP試験片の変形の観察結果とおおむね一致した。ここで用いた構成則はひずみ速度依存性のない一般化フックの法則であるが,ひずみ速度依存性は,マクロな視点では大きくないことがわかった。また,従来のSPHによるフルモデルの解析は計算コストが大きすぎて大型計算機を使用しないと実施できないが,提案しているSPHを用いれば汎用ワークステーションで解析を実施可能であり,提案手法の有用性を実証した。提案SPHによるCFRP積層板の高速衝撃解析において,応力基準による損傷発生の判定と,損傷した粒子の剛性低下を組み込んだ。予測された損傷の形態は高速衝撃試験後の試験片に観察された損傷と異なり,損傷の取り扱いには改善が必要であることがわかった。また,高速衝撃試験機を試作した。これは,飛翔体を収めたサボをフライホイールで加速する装置である。速度計測機の調整を残しているものの,実際に飛翔体を発射できることを確認した。平成26年度に開発した,大変形を解析するための一般化座標系におけるSmoothed Particle Hydrodynamics (SPH)では,即時破壊モデルによって損傷判定を行ったため,CFRP積層板への柔軟体の高速衝撃において実験結果と異なる過剰な層間はく離が予測された。そこで,平成27年度には,脆性的な損傷進展挙動を改善するべく,応力ーひずみ関係における軟化挙動と粒子のエネルギー吸収を表現するSmeared crack modelを提案SPHに実装した。単軸引張荷重を受ける棒の中央面で損傷判定を行い,解析手法の妥当性を検証した。得られた応力ーひずみ関係は理論的に予測される双線形型の軟化挙動を示した。また,CFRP一方向積層板のモードI層間破壊靱性試験(DCB試験)に対応する解析を行った。得られたき裂長さー開口変位関係は,き裂進展の初期段階を除いて実験結果とおおむね一致した。き裂進展の初期段階で観察されたき裂長さと合わなかったことは,解析モデルの初期条件が実験と異なることが原因である。以上より,提案SPHに導入したSmeared crack modelの妥当性を実証し,破壊靱性を考慮した損傷解析を可能とした。本解析手法を用い,CFRPクロスプライ積層板に対する柔軟体高速衝撃解析を実施し,文献に報告されている実験結果と比較した。板厚方向にのみ粒子を多く配置することで試験片全体をモデル化し,繊維破断(即時破壊)と層間はく離(Smeared crack model)を判定した。

予測した層間はく離などの損傷形態は報告されている実験結果とおおむね一致し,積層板の脆性的な損傷進展挙動は改善された。また,衝突速度を変えて解析を行い,損傷が発生する速度が実験結果と一致することを示した。以上より,新たなSPHによるバードストライク損傷解析の妥当性を実証した。本研究ではバードストライクを受ける航空機複合材構造の信頼性評価技術の確立を目指し,柔軟体衝突によるCFRP積層板の損傷を予測する解析技術を構築した。特に,粒子法(SPH)において,粒子を計算空間に写像することによって粒子の不均一な配置を可能とし,計算効率を改善する新たな手法を開発した。本手法に,き裂進展に伴うエネルギー吸収を表す材料軟化モデルを導入して,積層板の層間はく離の進展を予測した。本手法を用いてバードストライク損傷を予測し,実験結果をよく再現できることを示した。解析において,応力基準による損傷発生の判定と損傷した粒子の剛性低下による損傷の表現では実験結果を再現できず,損傷則または損傷粒子の取り扱いが適切でないことが明らかになったため。27年度が最終年度であるため、記入しない。複合材料工学平成27年度には,計算効率を改善したSPHを用いた複合材料積層板の柔軟体衝撃損傷進展シミュレーションを完成させる。特に(1)CFRP積層板の損傷則の改善,(2)CFRP単層板に対する直交異方性の速度依存性構成則の適用,(3)柔軟体の構成則の改善,という3点に取り組む。CFRP積層板の損傷則と損傷粒子の処理について,特に,柔軟体衝突によって大規模に発生することが予想される層間はく離と判定された粒子の処理を改善する。板厚方向により細かい粒子によるモデルによって解析を行い,従来の損傷粒子の処理における問題点を明確にする。その上で,損傷粒子の処理(剛性低下,応力の除去)を最適化する。また,CFRP積層板の構成則について,現状の線形弾性体から,ひずみ速度依存性をもつ粘塑性構成則の導入を試み,CFRP積層板の動的変形挙動に及ぼすひずみ速度の影響を調査する。さらに,柔軟体の構成則の改善も試みる。現状のユゴニオ状態方程式に基づく構成則では,柔軟体球が衝突時にがつぶれるだけで,実験で観察された飛び散る挙動を再現できない。これは,CFRP積層板の変形挙動や応力の伝搬にも影響を及ぼすため,実験で観察された現象を再現できるように改善する。実験に関しては,平成26年度に試作した高速衝撃試験機の計装化を完成させ,柔軟体衝撃試験を実施する。実験・解析両面からCFRP積層板のの柔軟体衝突損傷メカニズムの解明を試みる。柔軟体衝突損傷を支配する材料パラメータを特定し,材料特性や積層構成に対する耐衝撃性を考察する。柔軟体衝突試験で,平成25年度では無損傷または固定端破壊しか起こらず,CFRP積層板に発生する損傷の形態を把握できなかった。また,粒子法での損傷の表現方法として,従来手法である粒子の剛性を低下させる手法で損傷を表現したが,どの程度正確に柔軟体衝突損傷の形態を予測できるかを検証できていない。
分化誘導と効果増強を指向する他剤併用癌化学療法の研究

本研究は化学療法剤、免疫療法剤に加えて分化誘導能や補血作用などの特性を有する植物成分を併用する他剤併用療法について、抗腫瘍効果の増強、副作用の改善など臨床上有用な合併療法の至適条件を設定し、その背景となる三者の相互作用の機作を調べることを目的として以下の実験成績を得た。癌細胞に対する直接的抑制作用は化学療法剤及び再分化誘導剤などを併用し、制癌効果について細胞増殖抑制や再分化誘導能を指標として試験管内で判定した。又、間接的作用は免疫療法剤を選択しマウス同系腫瘍を用いて担癌宿主の生存日数、局所の増殖及び転移状態を精査すると共に宿主より食細胞やリンパ系細胞等を調製して、がん細胞傷害作用を検査した。これらの直接作用及び間接作用を示す薬剤諸種を組み合わせた後、至適な治療計画を選択するための実験を行った。1)非特異的免疫療法剤(OKー432,lentinan及び冬虫夏草抽出液)及び分化誘導物質(saikosaponin等の植物成分,Na butyrate,papaverrine等)の3剤で、延命、局所腫瘍増殖の抑制、特に転移抑制を効果判定の基準とした結果、化学療法剤、分化誘導剤及び免疫調節剤の順序で治療した場合に最も強い抗腫瘍活性が認められた。2)上記動物実験に対応して、B16細胞株の培養系における細胞動態、すなわち抗癌剤処理細胞の分化誘導剤に対する反応性を検討すると、増殖性を抑制しながらメラニン色素産生能を増加する組み合わせが得られた。3)上記の抗腫瘍実験における担癌動物の宿主機能、特に腹腔及び脾の細胞をプラスチック付着細胞(95%マクロファ-ジ)と非付着性細胞に分離し試験管内で癌細胞と混合培養して癌細胞コロニ-形成能に及ぼす影響を検討した結果、プラスチック付着細胞に抑制活性が検出された。
液相を媒介したセラミックス格子整合界面の研究

本研究では、セラミックス接合を行うための接合装置の組み上げ、立ち上げと、実際にその装置を用いて作成された試料の接合界面構造を高分解電子顕微鏡観察することで、接合条件と界面の構造の関係を明らかにした。さらにセラミックス上の溶融合金の挙動の原子レベル観察、解析を通じて、格子整合界面生成に関する基礎的な知見を積み上げた。接合装置については、固定した台上に、上部より絶縁体を介した電極を試料に直接押しあて通電する装置を組み上げた。本装置により炭化ケイ素セラミックスに30A程度の直流電流を流したところ、わずか1秒以下の通電で2300°C以上の発熱が起こることがわかった。また、この発熱は電流を上げる時間に依存し、時間が短いほど高い到達温度を示した。この装置の特性をうまく利用すると、炭化ケイ素/Ag-Cu-Ti合金の接合の場合、特定条件下で界面において脆い反応相を減少させることができた。これに対して、炭化ケイ素/Al系の接合では、界面が炭化ケイ素の稠密面に平行になっている場合が観察され、その界面には、Al_4C_3の反応相とアモルファス層、Alが存在する場合があることがわかった。特に炭化ケイ素とAlの間には特定の結晶学的方位関係が見られた。また、炭化ケイ素とAg-Cu-Ti溶融合金のぬれの直接観察では、種々の反応相生成機構が観察された。生成した反応相TiCの形態に特定の構造が観察されない場合でも、反応相厚さ1nm程度から、結晶学的方位関係が観察された。これに対してlayer by layer成長の場合、SiC表面の方位に従って、2種類のTiCの成長機構が観察あることがわかった。本年度は(1)セラミックス接合を行うための接合装置の組み上げ、立ち上げ及び実際にその装置を用いた接合体の試作と、(2)これらの作成された試料の接合界面構造解析のための試料作成法の確立を目指した。まず、接合装置については、固定した台上に、上部より加圧し絶縁体を介した電極を試料に直接押しあてる装置を組み上げた。この装置を用いて実際に炭化ケイ素/Ag-Cu-Ti合金、炭化ケイ素/Alの接合を行ったところ、良好な接合体を得ることができた。次にこれらの接合体をTEMで断面組織観察するための薄片化加工を行った。従来の機械研磨及びイオン研磨を併用する方法では、機械研磨の条件によっては接合界面に損傷が導入されたが、最終厚み及び研磨方法を最適化することにより、観察に耐えうる薄片試料が作成できた。この試料を用いたTEM観察から、炭化ケイ素/Ag-Cu-Ti合金界面では、接合条件により反応相厚さを制御することが可能であり、特定条件下では反応相が存在しない界面が生成する事が判明した。また、炭化ケイ素/Al系では界面が炭化ケイ素の稠密面に平行になっている場合が観察され、その界面には、Al_4C_3の反応相とアモルファス層、Alが存在する場合があることがわかった。本年度は昨年度組み上げた装置を用いて実際に接合体を作成し、界面を高分解電子顕微鏡観察することで、接合条件と界面の構造の関係を明らかにした。また、高分解能電子顕微鏡内ぬれの直接その場観察実験の解析を通じて、格子整合界面生成に関する基礎的な知見を積み上げた。まず、炭化ケイ素/Ag-Cu-Ti合金界面では、特定条件下で反応相が存在しない界面が生成する事が判明した。

これは接合温度が高温になればなるほど、反応相が厚く生成するが、装置の特性上、高温を得るためには接合時間を短くしなければならず、反応相を得るための熱量が減少する。結果的に特定の昇電流時間で反応相がなくなることになることがわかった。また、炭化ケイ素/Al系の接合では、界面が炭化ケイ素の稠密面に平行になっている場合が観察され、その界面には、Al_4C_3の反応相とアモルファス層、Alが存在する場合があることがわかった。特に炭化ケイ素とAlの間には特定の結晶学的方位関係が見られた。この他、炭化ケイ素/炭化ケイ素の接合も可能であった。しかし界面には炭化ケイ素中に含まれるFeによると考えられるFe-Si系化合物が生成しており、その反応相の厚さは熱量に依存していた。また、SiCと高融点金属のWの接合では、界面には反応相の形成がない直接接合が可能であった。これに対して、炭化ケイ素とAg-Cu-Ti溶融合金のぬれの直接観察では、種々の反応相生成機構が観察された。生成した反応相TiCの形態に特定の構造が観察されない場合でも、反応相厚さ1nm程度から、結晶学的方位関係が観察された。これに対してlayer by layer成長の場合、SiC表面の方位に従って、2種類のTiCの成長機構が観察あることがわかった。
酸化損傷DNA前駆体2-OH-dATPの哺乳動物細胞における変異誘発機構の解明

1.ヒト由来培養細胞を用いて損傷ヌクレオチドによる変異誘発を解析する系を確立した。ヒト胎児腎由来の293T細胞にSV40 ori配列および変異検出用の標的遺伝子supFを含むプラスミドをトランスフェクションし、SV40 LargeTantigen依存的にプラスミドを複製させた。細胞内における複製反応のピークとなる24hr後に損傷ヌクレオチドを含む低浸透圧溶液中に暴露することで細胞内へ損傷ヌクレオチドを導入し、さらに24hr培養を行った後、複製されたプラスミドDNAを回収した。大腸菌を用いてsupF遺伝子上に変異の生じたプラスミドを選択し、supF変異体率を求めた。dGTP由来の酸化損傷ヌクレオチド8-OH-dGTPを293T細胞へ導入することにより、大きな変異体率の上昇が観察された(2×10^<-4>→8×10^<-4>)。この時誘発された変異をシーケンシングにより解析したところ、そのほとんどがA : T→C : Gトランスバージョンであった。したがって8-OH-dGTPは生細胞においても強い変異原性を有することが示された。一方dATP由来の2-OH-dATPを導入しても、コントロールと比較して有意な変異体率の上昇はみられなかった。2.低浸透圧によるヌクレオチドの導入とsiRNAを用いたノックダウンを組み合わせることで、Y-family DNA polymeraseをはじめとする、種々の遺伝子の損傷ヌクレオチドによる変異誘発への関与について調べた。標的遺伝子として2-OH-dATPおよび8-OH-dGTP分解酵素MTH1、ミスマッチ修復関連酵素MSH2、Y-family DNA polymeraseとしてPol eta、Pol iotaおよびRev1、さらにB-family DNA polymeraseであるPol zetaの触媒サブユニットRev3に対するsiRNAを変異検出用のプラスミドと共導入し、24hr後のノックダウンをウエスタンブロッティング法もしくはRT-PCR法により確認した。同条件において24hr後に8-OH-dGTPを導入し、変異体率を求めたところ、Pol etaおよびRev1をノックダウンした場合において、8-OH-dGTPによる変異誘発が有意に抑制された。したがってこれらのY-family DNA polymeraseは、生細胞における8-OH-dGTPの取り込みもしくは修復に関与していると考えられる。一方、損傷ヌクレオチドによる変異誘発を抑制すると考えられるMTH1、MSH2をノックダウンした場合においても2-OH-dATP導入による変異誘発は観察されなかった。ヒト細胞ではGと対合した2-OH-Aを認識するDNAグリコシラーゼであるMUTYHなど様々な修復酵素の存在が示されており、2-OH-dATPによる変異誘発の抑制に関与する遺伝子についても、さらなる解析が必要である。1.損傷ヌクレオチドのCOS-7細胞への導入法および変異のスクリーニングのための標的プラスミドの細胞内での複製および維持、回収について検討を行った。初めにマイクロインジェクション法によるヌクレオチドおよびプラスミドの同時導入を試みたが、インジェクションした細胞で複製が遅延したことから、この方法では複製時まで導入した損傷ヌクレオチドの濃度を保つことが困難であると考えられた。そこで現在は、プラスミドにさらに薬剤耐性遺伝子を組み込むことで細胞内に安定に維持した状態で損傷ヌクレオチドを導入する系を検討中である。2.polηを欠損したXP-V細胞核抽出液を用いて試験管内複製反応を行い、HeLa細胞核抽出液をコントロールとして損傷ヌクレオチドによる変異誘発を比較した。XP-V細胞核抽出液中ではバックグラウンドの変異体率が上昇したため2-OH-dATPによる変異誘発は検出できなかった。一方、8-OH-dGTPによる変異誘発はHeLa細胞核抽出液中と同様に観察され、8-OH-dGTPによる変異誘発にpolηは大きく関与しないことが示唆された。3.Y-familyポリメラーゼと損傷ヌクレオチドによる変異誘発の関連について調べるため、dinB(polIV)およびumuDC(polV)を欠損した大腸菌株に損傷ヌクレオチドを直接導入し、解析を行った。dinB欠損株では2-OH-dATPによる変異誘発が抑制されたことからdinBは2-OH-dATPによる変異誘発を促進することが示された。この促進作用はDinBのポリメラーゼ活性に依存した。逆にumuDC欠損株では2-OH-dATPおよび8-OH-dGTPによる変異誘発が共に促進され、過剰発現株では抑制された。このumuDC遺伝子産物による変異誘発抑制は、ポリメラーゼ活性を消失したUmuC D101N置換体とUmuDの発現によっても観察された。1.損傷ヌクレオチドの哺乳動物細胞における変異誘発を解析する系を確立した。SV40 TAntigenに依存したプラスミドの複製が可能でこの種の実験に頻用されているCOS-7細胞を用い、種々検討の結果、損傷ヌクレオチドを市販のトランスフェクション試薬であるLipofectamineを用いることで、変異検出用のプラスミドと同時に導入することに成功した。8-OH-dGTPをこの方法により導入した場合には、特異的なA:T→C:Gトランスバージョンの誘発が確認された。2-OH-dATPについては現在大量合成中である。このようにLipofectamineを用いることで損傷ヌクレオチドによる変異誘発を検出することに成功したが、今後siRNAによるノックダウン条件での比較を行うことを考えるとさらに導入効率を高める必用がある。

そこで新たに浸透圧シフトを利用した導入を試みたところ、添加したヌクレオチドの細胞内への取り込みが促進され、Lipofectamineで導入した場合の約10倍の頻度でA:T→C:Gトランスバージョンの誘発が確認された。現在この系の最適化を行っている。2.さらにこの系がヒト細胞にも適用可能かどうか、ヒト胎児腎由来の293T細胞を用いて検討を行った。293T細胞においても8-OH-dGTP導入によりA:T→C:Gトランスバージョンが誘発された。今後は293T細胞に浸透圧シフト法を用いて2-OH-dATPおよび8-OH-dGTPを導入し、hMTH1およびY-family DNA polymeraseのノックダウンによる変異誘発の変化を調べる。1.ヒト由来培養細胞を用いて損傷ヌクレオチドによる変異誘発を解析する系を確立した。ヒト胎児腎由来の293T細胞にSV40 ori配列および変異検出用の標的遺伝子supFを含むプラスミドをトランスフェクションし、SV40 LargeTantigen依存的にプラスミドを複製させた。細胞内における複製反応のピークとなる24hr後に損傷ヌクレオチドを含む低浸透圧溶液中に暴露することで細胞内へ損傷ヌクレオチドを導入し、さらに24hr培養を行った後、複製されたプラスミドDNAを回収した。大腸菌を用いてsupF遺伝子上に変異の生じたプラスミドを選択し、supF変異体率を求めた。dGTP由来の酸化損傷ヌクレオチド8-OH-dGTPを293T細胞へ導入することにより、大きな変異体率の上昇が観察された(2×10^<-4>→8×10^<-4>)。この時誘発された変異をシーケンシングにより解析したところ、そのほとんどがA : T→C : Gトランスバージョンであった。したがって8-OH-dGTPは生細胞においても強い変異原性を有することが示された。一方dATP由来の2-OH-dATPを導入しても、コントロールと比較して有意な変異体率の上昇はみられなかった。2.低浸透圧によるヌクレオチドの導入とsiRNAを用いたノックダウンを組み合わせることで、Y-family DNA polymeraseをはじめとする、種々の遺伝子の損傷ヌクレオチドによる変異誘発への関与について調べた。標的遺伝子として2-OH-dATPおよび8-OH-dGTP分解酵素MTH1、ミスマッチ修復関連酵素MSH2、Y-family DNA polymeraseとしてPol eta、Pol iotaおよびRev1、さらにB-family DNA polymeraseであるPol zetaの触媒サブユニットRev3に対するsiRNAを変異検出用のプラスミドと共導入し、24hr後のノックダウンをウエスタンブロッティング法もしくはRT-PCR法により確認した。同条件において24hr後に8-OH-dGTPを導入し、変異体率を求めたところ、Pol etaおよびRev1をノックダウンした場合において、8-OH-dGTPによる変異誘発が有意に抑制された。
英語多読授業の短期的、長期的効果に関する実証的研究

大学における多読を取り入れた授業が、学生の英語力にどのような効果をもたらすかを調査した。その結果、(a) 1学期間の多読により全般的英語習熟度が上がること、(b)その伸びは読解のみならず聴解や文法にも及ぶこと、(c)さらに1学期間(通年)多読を続ければ、1学期目の伸びが維持されること、(d) 1学期間多読を行ったクラスは行わなかったクラスより英語力の伸びが大きいこと、(e) 1学期間の多読により読みの流暢さが高まること、が示された。これらの結果から、大学レベルにおける英語多読の効果が実証されたと言える。豊富で多様な理解可能なインプットは第二言語習得の成功に不可欠である。しかしながら、日本のような外国語として英語を学ぶ環境において十分なインプットを確保するのはたやすいことではない。近年、学習環境に関わらずたくさんの英語に触れることを可能にする多読(extensive reading)が注目を集めている。稲垣・稲垣(2008)では、大学における1学期間の教室外での英語多読を取り入れた授業により、英語習熟度テストであるミシガンテストの総得点が有意に伸びたことを示した。しかし、稲垣・稲垣(2008)の研究報告では、多読をしないグループが存在しなかったため、観察された効果が教室内の授業活動によるものであった可能性があり、それが多読によるものであったと断定することができないという問題があった。本研究では、大学における多読を取り入れたグループ(実験群)の効果を、多読を行わないグループ(対照群)と比較することにより厳密に検証した。その結果、実験群と対照群のプレテストの得点を比較するためt検定を行ったが、両群の英語習熟度は同等であった。また、グループ(多読ありvs.多読なし)とテスト(プレテストvs.ポストテスト)を独立変数として、繰り返しのある2要因の分散分析を行った結果、グループの主効果は有意ではなかったが(F(1,122)=0.70, n.s.)、テストの主効果は有意であり(F(1,122)=43.58, p<.001)、グループとテストの有意な交互作用も得られた(F(1,122)=5.00,p<.05).この結果は、多読の有無に関わらず、両グループとも1学期間め英語の授業により習熟度が伸び、その伸びは多読を行っだグルーブの方が大きかったことを示している。さらに、多読を導入したグループは、多読を行わなかったグループよりテストスコアの伸びが大きかった。このことから、両グループとも1学期間の英語授業で英語力が伸びたが、実験グループは、多読を行ったこにより対照群よりも大きく伸びたと言える。稲垣・稲垣(2008)では、同様の研究で対照群を設けなかったため、観察された習熟度の伸びが多読の効果であると断定できなかった。しかし、本研究では、通常の授業活動の効果とは別に多読の効果を特定できたため、多読の効果のより確かな証拠が得られたと言える。今後の研究課題として、読んだ量(語数)と得点の伸びの相関を見る必要がある。稲垣・稲垣(2008)では、大学における一学期間の教室外での英語多読を取り入れた授業により、英語習熟度テストであるミシガンテストの総得点に有意な伸びが見られた。さらに、稲垣・稲垣(2009)では、上記のミシガンテストの伸びをさらにセクション別に分析し、多読の効果は読解だけでなく、聴解や文法にも及ぶことを示した。稲垣・稲垣(2010)では、多読を行うクラス(実験群)と多読を行わないクラス(対照群)を比較したところ、実験群により大きな英語習熟度の伸びが見られ、多読の効果が実証された。本研究では、稲垣・稲垣(2008,2009)のフォローアップとして、さらにもう一学期間(計二学期聞)多読授業を継続した場合にどのような効果が表れるかを検証した。多読は、本来、速効性を求めるものではなく、自分のレベルや興味に合ったものを楽しみながら続けられる活動であり、その最大の強みは長期的効果にあると考えられる(稲垣・稲垣2008,2010)。よって、多読の中・長期的な効果を検証することは重要である。本研究では、大学一年生の英語授業一クラスに一年間(二学期間)多読を取り入れた授業を実施し、その効果をミシガンテストの伸びを見ることにより検証した。

その結果、最初の一学期間で英語習熟度(聴解、読解、文法)に伸びが見られ、二学期目にはその英語力が維持されていた。多読は日本のような外国語圏でも継続して多量のインプットに触れる有効な手段であると考えられる。したがって、多読の効果は短期的のみならず、中・長期的にも検証する必要がある。その意味で、本研究は一年間に渡る多読の効果を調査し、その効果が維持されたいたことを示した点で意義があると言える。今後の課題としては、より直接的に多読の効果を検証できる指標(特に読解テスト、語彙テスト)を開発し、それらを使って多読の効果をさらに短・中・長期的に検証してゆきたい。言語習得におけるインプットの重要性は疑問の余地がない。ところが、日本のような外国語圏で英語を習得しようとすると、インプットの不足が大きな障害となる。そこで、外国語圏にいながら楽しんで大量の英語に触れることができる多読(extensive reading)が注目されている。我々はこれまでの研究で、大学における一学期間の多読を取り入れた授業により、英語習熟度テスト(ミシガンテスト)の総得点に有意な伸びが見られ(稲垣・稲垣2008)、セクション別に見るとその効果は読解のみならず、聴解や文法にも及ぶことを示した(稲垣・稲垣2009)。また、さらにもう一学期間多読を続けたクラスは、一学期目に見られた習熟度の伸びを維持していた(稲垣・稲垣2011)。最後に、稲垣・稲垣(2010)では、別の習熟度テスト(Oxford Quick Placement Test)を用い、多読を行ったクラスは行わなかったクラスより習熟度の伸びが大きいことを示した。これらの研究で、多読が英語力全般の向上をもたらすことが実証されたと言えるが、読むスピードの増加や語感の発達など、習熟度テストでは捉えきれない側面に関する効果も検証することが課題として残った(稲垣・稲垣2011)。そこで、本研究では、多読を導入している大学二年生の英語二クラスを対象に、一学期の授業期間中に月に一度の割合で四度TRR(Timed Repeated Readings、授業に読みの流暢さを促す活動)を実施した。その結果、緩やかではあるが読む速度が増し、学期の終わりには学期の始めに比べて読む速度が有意に増加していた。したがって、一学期間の多読により読みの流暢さが向上したと言える。我々の先行研究(稲垣・稲垣2008,2009,2010,2011)では、習熟度テストの成績に基づき多読が英語習熟度全般を向上させることを示したが、今回、別の指標を用いて習熟度テストでは捉えきれなかった読みの流暢さに対する多読の効果を示したことは意義深いと言えよう。
歯科臨床応用を目的とした触覚センサーの口腔内応用に関する基礎的臨床的研究

圧電セラミック素子をセンサー部に利用した硬さ知覚用触覚センサーが開発された。最近小型化が可能になり、先端が0.5mmの半球状のセンサーを試作した。口腔内に応用するに当たって、歯牙硬組織の硬度を測定できるかどうか調べた。このセンサーは固有の振動数で振動しておリ、対象物に接触すると固有振動数が変化し、この変化量で対象物の硬さを測定する。歯牙硬組識に対しては40g程度の荷重をかけて測定することが必要であることが明かとなった。この荷重の下、健全エナメル質から人工エナメル質齲蝕の硬さを触覚センサーと微小硬度計を用いて測定した。この結果、荷重25、50、70gにおいて、触覚センサーによって得られた値は、ヴィッカスー硬度の圧痕の対角線の長さと有意な一次相関をもち、相関係数も0.92と非常に高いことがわかった。また、歯牙硬組識の中でもっとも硬いエナメル質から、もっとも柔らかい軟化象牙質まで測定することが1つのセンサーで可能であることがわかった。この結果は現在投稿準備中である。口腔軟組織に対しても同装置によリ、硬さが測定できないかどうか調べる目的で、ラバー系の印象材を用いてln vitroで硬さを測定した。硬さの異なる三種類の印象材(ハード、レギュラー、インジェクションタイプ)でブロック状の試験片を作製し、荷重を変えて硬さを測定した。同一の試験片を明石社製ゴム硬度測定器ハードマチックHH-300型を用いて測定した。ゴム硬度測定器では硬さの異なる三種類の印象材の硬さを識別できたが、触覚センサーでは識別できなかった。以上の結果は、試作した先端が0.5mmの半球状のセンサーでは、歯牙硬組織の硬さを測定することはできるが、軟組織はできないことを示している。このセンサーは固有の振動数で振動しており、対象物に接触すると固有振動数が変化し、この変化量で対象物の硬さを測定する。一方で、対象物にどれくらいの荷重で接するかが硬さを測定するためには重要な因子であることもわかった。実験の結果、対象物に対して、50gから100gまでの荷重で測定が可能であることがわかった。以上の結果を踏まえて、この装置を用いれば、歯牙硬組織の中でもっとも硬いエナメル質から、もっとも柔らかい軟化象牙質まで測定することが可能であることがわかった。ヌープ硬度計では健全象牙質以下の硬さであると測定不可能であることから、測定範囲がかなり広く、歯牙硬組織全般に渡って1つのセンサーで測定することが可能であることが示された。触覚センサーで測定した結果を、従来の微小硬度計をもちいた硬度測定との相関関係を調べた。。ハイドロキシエチルセルロースを加えた乳酸緩衝液を用いて、脱灰時間を変化させることによってエナメル質を段階的に柔らかくした。この人工脱灰エナメル質を触覚センサーとヴィッカース硬度計とで比較した。

最近小型化が可能になり、先端が0.5mmの半球状のセンサーを試作した。口腔内に応用するに当たって、歯牙硬組織の硬度を測定できるかどうか調べた。このセンサーは固有の振動数で振動しており、対象物に接触すると固有振動数が変化し、この変化量で対象物の硬さを測定する。歯牙硬組織に対しては40g程度の荷重をかけて測定することが必要であることが明らかとなった。この荷重の下、健全エナメル質から人工エナメル質齲触の硬さを触角センサーと微小硬度計を用いて測定した。この結果、荷重25、50、70gにおいて、触角センサーによって得られた値は、ヴィッカスー硬度の圧痕の対角線の長さと有意な一次相関をもち、相関係数も0.92と非常に高いことがわかった。また、歯牙硬組織の中でもっとも硬いエナメル質から、もっとも柔らかい軟化象牙質まで測定することが1つのセンサーで可能であることがわかった。この結果は現在投稿準備中である。口腔軟組織に対しても同装置により、硬さが測定できないかどうか調べる目的で、ラバー系の印象材を用いてIn vitroで硬さを測定した。硬さの異なる三種類の印象材(ハード、レギュラー、インジェクションタイプ)でブロック状の試験片を作製し、荷重を変えて硬さを測定した。同一の試験片を明石社製ゴム硬度測定器ハードマチックHH-300型を用いて測定した。ゴム硬度測定器では硬さの異なる三種類の印象材の硬さを識別できたが、触角センサーでは識別できなかった。以上の結果は、試作した先端が0.5mmの半球状のセンサーでは、歯牙硬組織の硬さを測定することはできるが、軟組織はできないことを示している。
小児の歯周疾患におけるサイトカインの役割について

研究結果:1)小児の歯周疾患におけるサイトカインの影響をみるために小児の歯肉線維芽細胞にIL-1βを0.110ng/mlで作用させ,作用2日後,4日後の細胞増殖能を成人(30代60代)と比較した.その結果,小児においては作用2日後の0.1ng/mlにおいて一番増殖能が認められた.成人30代においては作用2日後の10ng/ml,60代においては,作用4日後の10ng/mlにおいて一番増殖能が認められ,小児と成人においてのIL-1βに対する反応性が異なっていた.2)IL-1β0.110ng/ml作用後の無血清培地の培養上清を用い,その組織修復能における反応性をみるためにPDGF-AB,b-FGF活性を測定した.その結果,PDGF-ABにおいてIL-1β濃度10ng/mlで作用させた小児の歯肉線維芽細胞の培養上清中のPDGF-AB活性が高かった.b-FGF活性においてもPDGF-AB活性と同様の結果であった.これらより,小児の歯周疾患においてはその形成機序が成人性歯周炎と比較し,早期において低濃度のIL-1βに対する反応性が現れ,炎症状態が成人と同じ状態であっても組織修復因子が組織中に放出されることのより歯肉炎から歯周炎に移行していかない原因の一つとして考えられた.また,成人期からの歯周炎への移行を防ぐためにも充分なプラークコントロールを行うことが重要であると思われた.また,成人においては,PDGF-AB,b-FGFの様な組織修復因子の投与が歯周組織の再生を誘導するてがかりとなる可能性が示唆された.研究結果:1)小児の歯周疾患におけるサイトカインの影響をみるために小児の歯肉線維芽細胞にIL-1βを0.110ng/mlで作用させ,作用2日後,4日後の細胞増殖能を成人(30代60代)と比較した.その結果,小児においては作用2日後の0.1ng/mlにおいて一番増殖能が認められた.成人30代においては作用2日後の10ng/ml,60代においては,作用4日後の10ng/mlにおいて一番増殖能が認められ,小児と成人においてのIL-1βに対する反応性が異なっていた.2)IL-1β0.110ng/ml作用後の無血清培地の培養上清を用い,その組織修復能における反応性をみるためにPDGF-AB,b-FGF活性を測定した.その結果,PDGF-ABにおいてIL-1β濃度10ng/mlで作用させた小児の歯肉線維芽細胞の培養上清中のPDGF-AB活性が高かった.b-FGF活性においてもPDGF-AB活性と同様の結果であった.これらより,小児の歯周疾患においてはその形成機序が成人性歯周炎と比較し,早期において低濃度のIL-1βに対する反応性が現れ,炎症状態が成人と同じ状態であっても組織修復因子が組織中に放出されることのより歯肉炎から歯周炎に移行していかない原因の一つとして考えられた.また,成人期からの歯周炎への移行を防ぐためにも充分なプラークコントロールを行うことが重要であると思われた.また,成人においては,PDGF-AB,b-FGFの様な組織修復因子の投与が歯周組織の再生を誘導するてがかりとなる可能性が示唆された.研究目的および方法:愛知学院大学歯学部付属病院小児歯科外来に来院した小児の歯周疾患の臨床評価および細胞学的特性を検討した。調査対象は、本学小児歯科外来に来院した全身的既往歴のない健常小児30名(健常群13名、歯肉炎群17名)を被験者とした。歯肉炎群は、CPITN codeが6以上の者とした。各被験者の臨床評価の被験歯は、上顎右側中側切歯および第一大臼歯、上顎左側第一大臼歯、下顎左側中側切歯および第一大臼歯、下顎右側第一大臼歯とし、CPITN code PIIndex (Periodontal Index)を、上下顎の前歯部においてはPMA Indexを使用した。研究結果:1)健常小児のうち、健常群のCPITNcodeは1.08±0.40(平均SE以下同じ)で歯肉炎群は6.71±0.14であった。健常群のPIは0.37±0.13で歯肉炎群は1.67±0.07であった。健常群のPMA Indexは9.0±2.61で歯肉炎群は21.1±0.41であった。2)(1)健常小児(健常群)2名の歯肉線維芽細胞を用い、一定の密度に調整した細胞にサイトカイン7種類(EGF、FGF、IL-1β、IL-6、PDGF、TGF-β、TNF-α)を10pg10ngの濃度で添加し、細胞増殖能をマイクロプレートリーダーを用いたMTT法により検索した。その結果、EGF、FGFにおいては10ng/mlで最大活性の増殖能を示し、IL-1βは500pg/mlで最大活性を示した。PDGFは5unit/mlで最大活性を示した。TGF-β、TNF-αにおいては10ng/mlで最大活性の増殖能を示した。IL-6は濃度依存性は認められなかった。TGF-β、TNF-αは、10ng/mlで最大活性の増殖能を示した。

今後、歯肉炎群の歯肉を採取し、それらのサイトカインの活性度をELISA法にて測定し、臨床評価との比較検討を行っていく予定である。研究目的および方法:愛知学院大学歯学部附属病院小児歯科外来に来院した小児の歯周疾患の臨床評価および細胞学的特性を検討した。調査対象は、本学小児歯科外来に来院した全身的既往歴のない健常小児30名(健常群13名、歯肉炎群17名)を被験者とした。歯肉炎群は、CPITN codeが6以上の者とした。各被験者の臨床評価の被験歯は、上顎右側中側切歯および第一大臼歯、上顎左側第一大臼歯、下顎左側中側切歯および第一大臼歯、下顎右側第一大臼歯とし、CPITN code、PI Index(Periodontal Index)を、上下顎の前歯部においてはPMA Indexを使用した。研究結果:1)健常小児のうち、健常群のCPITNcodeは1.08±0.40(平均±SE以下同じ)で歯肉炎群は6.71±0.14であった。健常群のPIは0.37±0.13で歯肉炎群は1.67±0.07であった。健常群のPMA Indexは9.0±2.61で歯肉炎群は21.1±0.41であった。2)(1)健常小児(健常群)2名の歯肉線維芽細胞を用い、一定の密度に調整した細胞にサイトカイン7種類(EGF、FGF、IL-1β、IL-6、PDGF、TGF-β、TNF-α)を0.1ng10ngの濃度で添加し、細胞増殖能をマイクロプレートリーダーを用いたMTT法により検索した。その結果、EGF、FGFにおいては10ng/mlで最大活性の増殖能を示し、IL-1βは500pg/mlで最大活性を示した。PDGFは5unit/mlで最大活性を示した。TGF-β、TNF-αにおいては10ng/mlで最大活性の増殖能を示した。IL-6は濃度依存性は認められなかった。TGF-β、TNF-αは、10ng/mlで最大活性の増殖能を示した。一番増殖活性の値が高かったサイトカインは、PDGF、IL-1βであった。今後、歯肉線維芽細胞における組織修復能を検索するために、歯肉線維芽細胞にIL-1βを作用させ、その組織修復能をサイトカインを用いて検索する予定である。研究結果:1)小児の歯周疾患におけるサイトカインの影響をみるために小児の歯周線維芽細胞IL-1βを0.110ng/mlで作用させ、作用2日後,4日後の細胞増殖能を成人(30代60代)と比較した.その結果,小児においては作用2日後の0.1ng/mlにおいて一番増殖能が認められた.成人30代においては作用2日後の10ng/ml,60代においては,作用4日後の10ng/mlにおいて一番増殖能が認められ,小児と成人においてのILー1βに対する反応性が異なっていた.2)IL-1β0.110ng/ml作用後の無血清培地の培養上清を用い,その組織修復能における反応性をみるためにPDGF-AB,b-FGF活性を測定した。その結果、PDGF-ABにおいてIL-1β濃度10ng/mlで作用させた小児の歯肉線維芽細胞の培養上清中のPDGF-AB活性が高かった。b-FGF活性においてもPDGF-AB活性と同様の結果であった.これらより,小児の歯周疾患においてはその形成機序が成人性歯周炎と比較し、早期において低濃度のIL-1βに対する反応性が現れ,炎症状態が成人と同じ状態であっても組織修復因子が組織中に放出されることのより歯肉炎から歯周炎に移行していかない原因の一つとして考えられた.また,成人期からの歯周炎への移行を防ぐためにも余分なブラークコントロールを行うことが重要であると思われた.
プロセスプラズマ内の負イオンのカイネティックスに関する研究

RF・SF_6プラズマに対し、レーザー光脱離=マイクロ波空洞共振法による電子密度および負イオン密度の計測を行った。さらにラングミュアプローブによる正イオン密度の測定を行った。この結果、低圧(100mTorr)、低電力(10W)プラズマにおいてはイオン密度/電子密度の比は数百であり、この比は圧力とともに増加して1Torr近辺では数千に達することが分かった。光脱離で検出される負イオンは主にF^-であり、主要な負イオン種と推定されるSF_5^-の光脱離効率は小さいことが示唆された。四重極質量分析計による負イオン種の測定では、F^-、SF^-、SF_6^-、SF_3^-、F_2^-が検出され、F^-の信号強度が最も大きく、次がSF_5^-であった。しかし、異なる負イオン種に対する測定系の相対感度は未知であり、この結果から主要な負イオン種を特定することは困難である。各負イオン種に対するアフタ-グロー中のイオン電流減衰波形は、ラングミュアプローブによる正イオン飽和電流の減衰波形と著しく異なっており、負イオンサンプリング過程の複雑な性格が示された。また、電流減衰波形はサンプリングチップの材質やそこへのバイアス電圧のかけ方にも敏感であった。負イオンによるサンプリングチップのチャージアップの可能性が考えられる。RF・NF_3プラズマに対しもレーザー光脱離=マイクロ波空洞共振測定を行った。NF_3は同圧力のSF_6よりもさらに電子付着能力が大きいことが明らかになった。このため、測定系の時間分解能による制限により、正確な負イオン密度を算出することはできなかった。レーザー光脱離法とマイクロ波共振電子密度測定法を組み合わせた負イオン密度測定系を製作し、平行平板電極系RF(13.56MHz)SF_6プラズマおよびNF_3プラズマについて負イオン密度の測定を行った。また、アフターグローを用いて負イオンの消滅過程を調べた。さらに補助的手段として静電プローブによる正イオン飽和電流の測定も行った。この結果以下のことが分かった。1.RF・SF_6プラズマに対し、負イオン密度の放電条件依存性が初めて実験的に明かになった。30mTorrから700mTorrまで圧力を増加させると電子密度は減少し負イオン密度は増加する。この結果、0.12W/cm^2のRF電力において、電子密度に対する負イオン密度の比は低圧領域で100のオーダー、高圧領域では1000を超えることが分かった。2.SF_6プラズマ中の負イオンはほとんど再結合で消滅し、拡散消滅は無視できる。また、再結合定数が大きいイオン対と小さいイオン対が存在する。3.SF_6プラズマ中の主要な負イオン種はSF_6^-またはSF_5^-でありF^-ではない。またこれら分子負イオンの光脱離による検出効率はF^-のそれよりもずっと小さい。4.NF_3プラズマは負イオン密度に関しSF_6プラズマと類似した特性を示す。現在、SF_6プラズマに関し、質量分析計によるイオン種ごとの計測を進めつつあり、上に述べた光脱離法による計測とあわせて、RFプラズマ中の負イオンのカイネティックスに関するより深い知見が明かになると期待できる。四重極質量分析計を用い、RFプラズマのアフタ-グロー中の負イオン種を時間分解計測する測定系を実現した。低圧(100mTorr)、低電力(10mW)RF・SF_6プラズマに対する測定を行い、プラズマ中にF^-、SF_5^-、SF_6^-、SF_3^-、F_2^-を検出した。さらに質量数123に比較的強い信号を検出したが、これは、プラズマチャンバ壁からエッチングされたSiに由来するSiF_5^-と推察される。

イオン電流はF^-が最も大きく、次にSF_5^-が大きかった。しかし測定に用いたマスフィルタ・二次電子増倍管間のイオン加速電圧(500V)では、負イオンによる二次電子放出効率が1よりずっと小さいことが示され、従って、異なるイオン種の検出効率が大きく異なる可能性がある。プラズマ中の主要な負イオン種を特定するためには、イオン加速電圧を二次電子放出効率が1を越えるまで増加させる、二次電子放出効率を測定する、等が必要であるが、何れも直ちには実行できない。各負イオン電流は、放電オフ直後の急激な減衰と、その後の指数関数的なより緩やかな減衰で特徴付けられる時間変化を示した。これはプローブによる正イオン飽和電流の減衰波形(再結合による消滅から予想される減衰波形を示す)と全く異なっており、プラズマからの負イオンのサンプリングが複雑な過程であることを示唆している。負イオン電流の減衰波形はサンプリングチップの材質、サンプリングチップへのバイアス電圧のかけ方にも敏感であり、負イオンが金属表面で直ちに中性化せず、一時的に表面をチャージアップする可能性があると考えられる。負イオンと固体表面の相互作用はほとんど知られておらず、今後の研究課題である。
細胞内Ｃａシグナルのスイッチとなる新発見のコネキシンの生理機能と発現制御機構

私たちは、ゼブラフィッシュおいてコネキシン36.7(Cx36.7)の機能不全が心筋の筋原繊維の配向の乱れを引き起こし、心臓形成と機能不全に至る事を明らかにしてきた。本研究では、コネキシン36.7(Cx36.7)の心筋前駆細胞特異的な発現の調節機構について明らかにする解析を行った。心筋細胞の分化誘導に関与する転写因子の発現パターンについて,心臓形成時のゼブラフィッシュ稚魚を用いてin situ hybridization法により調べ,Cx36.7の発現パターンを比較したところ,発現のタイミングと局在いずれにおいてGata4がCx36.7と一致することが分かった。そこで,Gata4の発現をアンチセンスモルフォリノにより特異的に抑制したところ,Cx36.7遺伝子のプロモーター活性が著しく下がることが分かった。同様な結果は,プロモーター内部のGata型転写因子の結合配列に変異を導入しても認められた。この結合配列がGata4との相互作用部位であることをin vitroのゲルシフト解析で確認した。以上の結果から,Cx36.7遺伝子の心筋細胞特異的な発現はGata4による転写制御によるところが大きいことが分かった。また、Cx36.7の下流のシグナル伝達について解析を行い、候補転写因子を一つ同定することが出きた。現在、この分子の機能解析を行っている。26年度が最終年度であるため、記入しない。新規のコネキシン分子Cx36.7がゼブラフィッシュの心臓形成のごく初期の段階に一過性に発現し正常な心臓形成に重要な役割を果たし,Cx36.7がカルシウムシグナリングの中継分子である可能性を見出していることから,コネキシンとカルシウムシグナリング系の連携という新しい情報伝達の概念が存在することを予想している。この情報伝達のしくみと意義を分子レベルで明らかにする為,平成24年度はゼブラフィッシュCx36.7遺伝子の発現調節機構について解析を行った。まず,心臓特異的な遺伝子発現の調節に関与するGata4転写因子がCx36.7の発現誘導を行っているか調べた。ゲルシフト解析およびプルダウンアッセイにより,Cx36.7遺伝子のプロモーター領域内のGata結合配列にGata4が直接結合することが分かった。また,生体レベルでのGata4のはたらきを調べるために,Cx36.7遺伝子のプロモーター領域の下流にGFP遺伝子を組み込んだトランスジェニック体Tg(Cx36.7:GFP)を用いて,GFPの発現がプロモーター内のGata結合配列の変異により変化するか検討した。その結果,プロモーター領域内の2つのGata結合配列がCx36.7の発現に重要であることが示された。さらに,アンチセンスモルフォリノによるGata4の発現を抑制したところ,Cx36.7の遺伝子発現が著しく抑制されたことを認めた。以上の結果から,Gata4がCx36.7遺伝子のプロモーター内の2ヶ所のGata結合配列に結合して遺伝子発現誘導に関わっていることが示唆された。ゼブラフィッシュの心臓形成のごく初期の段階に一過性に発現するコネキシン分子Cx36.7が正常な心臓形成に必要であり,カルシウムシグナリングの中継分子である可能性を見出していることから,コネキシンとカルシウムシグナリング系の連携という新しい情報伝達の概念が存在することを予想している。この情報伝達のしくみと意義を分子レベルで明らかにする為,平成24年度ではゼブラフィッシュCx36.7遺伝子の発現調節機構について解析を行い心臓特異的な転写因子Gata4が重要であることを明らかにしている。さらに平成25年度では, Cx36.7の伝えるシグナル分子の特定とその作用機構について解析を行った。まず, Cx36.7の機能不全により心臓形成に異常をきたす変異体ゼブラフィッシュftkを,さまざまな環境水中で飼育したところ,カルシウムイオンの存在下でftkの表現型が回復することを見出した。同様の回復は, Cx36.7をアンチセンス法で発現抑制した場合にも認められたことから, Cx36.7が心筋分化初期の段階でカルシウムイオンを選択的に通すヘミチャネルを形成していることが示唆された。さらに,心筋分化に重要な転写因子の発現もカルシウムイオンに特異的に応答して上昇することを示す結果も得た。以上の結果は, Cx36.7がカルシウム流入を促して心筋細胞分化のトリガーとなるという研究当初の我々の予想を支持するものといえる。また,マイクロアレイによる網羅的解析から,カルシウム依存的または応答性のある分子の発現量がftkで変動していることを見出しており, Cx36.7がカルシウムイオンのメディエーターであることが強く示唆された。

この結合配列がGata4との相互作用部位であることをin vitroのゲルシフト解析で確認した。以上の結果から,Cx36.7遺伝子の心筋細胞特異的な発現はGata4による転写制御によるところが大きいことが分かった。また、Cx36.7の下流のシグナル伝達について解析を行い、候補転写因子を一つ同定することが出きた。現在、この分子の機能解析を行っている。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していたCx36.7の遺伝子発現調節に関与する転写因子の同定とその転写誘導の分子機構の一部を明らかにすることができた。問題のコネキシン分子の通すシグナル分子の実体とそれが心筋細胞分化に及ぼす影響の一端を明らかにすることができた。(1)Cx36.7の転写調節機構の解析に関してはGata4以外の転写因子の関与の可能性についても検討する予定である。(2)計画通りCx36.7が関与するカルシウムシグナリング系の情報伝達因子の特定と心臓形成に与える影響について解析を行う。計画通りCx36.7が関与するカルシウムシグナリング系の情報伝達因子の特定と心臓形成に与える影響について解析を行う。特に,今年度で見出した転写因子の活性化機構について重点的に解析を行い,同様のしくみがゼブラフィッシュ以外の動物種(ヒト)でも認められるのか培養細胞などを用いて解析する。