hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪肝による肝移植への挑戦－虚血再還流障害から移植を炎症と凝固を礎として

生体肝移植での虚血再還流障害を炎症と凝固・抗凝固因子に着目して1ラットを用いた虚血再還流モデル2生体肝移植後の臨床検体での凝固・抗凝固因子の解析を行った。1抗凝固因子のトロンボモジュリン(TM)は抗凝固作用と抗炎症作用を有するため、肝保護効果が期待される。移植肝の虚血再還流障害に対する、組み換えヒト可溶性TM(rhsTM)の肝保護効果について検討した。Wistarラットにて70%肝切除後残に血行遮断を20分間行い、再還流した。手術30分前にrhsTMを1mg/kgにて静注し、対照群は生食投与とした。rhsTM群にて、肝逸脱酵素値は、術後6・12・24時間のいずれも対照群に比較して有意に低値であった。術後6時間目のED-1免疫染色では、ED-1陽性細胞はrhsTM群で有意に少なかった。24時間後のTUNEL assayではrhsTM群にてTUNEL陽性細胞は有意に少なかった。12時間後のPCNA免疫染色ではrhsTM群でPCNA陽性肝細胞数を多く認めた。以上より、rhsTMは虚血再還流障害においてrhhTMは肝細胞保護作用、抗炎症作用を有し、肝再生を促す可能性が示唆された。2生体肝移植の術後14日目の血小板値、VWFとその特異的切断酵素のADAMTS13に注目した。移植後14日目の血小板値が10万以上(HP群)と10万未満(LP群)に分類し血漿中ADAMTS13活性とVWFも測定した。術後半年後生存率はLP群で61%とHP群の93%に比較して有意に不良であった。ADAMTS13活性はHP群にて低値であった。VWF/ADAMTS13の比はLP群が有意に高値であった。術後14日目の血小板値が術後14日目のADAMSTS13の独立因子となった。以上より生体肝移植後に血小板低値が継続することは、類洞内皮細胞障害によるADAMTS13の減少が関与することが示唆された。研究成果報告は1動物実験におけるフルクトース脂肪肝モデルラットの作製、トロンボモジュリン(TM)の投与結果2臨床試験における生体肝移植患者における抗凝固因子の測定である。1一項目目としての脂肪肝ラットの作成は、薬剤誘導性より実際に臨床上問題となっているファーストフードによるフルクトース誘導性脂肪肝を作成した。病理学的に脂肪沈着を確認し、軽度であるも血中中性脂肪は差を認めた。フルクトース誘導性脂肪肝ラットにおける虚血再還流障害の凝固障害・炎症反応の解析において、肝機能は上昇するもTM投与群における血栓形成抑制作用は、軽度の免疫染色による類洞内フィブリン沈着、血清FDP濃度は差を認めるも有意差を認めるまで至らなかった。抗炎症効果もTNFαおよびIL-6の肝全体における発現を比較するも有意差がなく、TMの投与量やタイミングを再考中である。2二項目目は生体肝移植周術期の血液臨床検体における炎症および凝固因子の測定と合併症の発生率を検討した。生体肝移植周術期の術前,術後1,7,14,28日目に採血し,血小板数,ADAMTS13,VWF,VWF propeptideの術前術後の動態を分析し、肝移植術後の合併症である肝類洞内の血栓性微小血管障害症(Thrombotic microangiopathy ;TMA)との関係を探索した。結果として肝移植後の死亡例におけるADAMTS13の低下とVWFpp,VWFpp/ADAMTS13比の上昇は重篤な肝類洞内皮障害を反映していることが示唆され,特にVWFpp/ADAMTS13の測定は,血小板凝集による消費に左右されることなく,肝移植後の予後規定因子であるTMA発症を早期に予測できる可能性があると考えられた。
東南アジアモンスーン域大河川流域における大洪水発生可能性の予測

本研究では、当該研究者らが開発してきたマクロ水文モデルを中国淮河流域(140,000km2)に適用し、多地点での河川流量を算定してモデルの実用性を検証することを目的とした。入力データセットとして、田中(京大防災研)によって作成されたEEWB data set (version 1.0)、およびGAME再解析データversion 1を用いて、淮河流域の流出シミュレーションを実行した。また、流出シミュレーション結果をもとに、大河川流域で必要となるフォーシングデータの分解能と対象流域の面積との関連を分析した。シミュレーション期間は1998年5月1日から1998年8月31日の4ヶ月間である。得られた成果の概要を以下に示す。1)EEWBデータセットを用いて流量シミュレーションを行った結果、対象流域下端のBengbu(130,000km2)での流量流量シミュレーション結果が特に7月以降で観測値を下回ることが明らかとなった。この原因としては、特に入力データとして用いたEEWBデータの遮断蒸発量が過大評価していることが考えられた。これをもとに、田中らによってEEWBデータの修正がなされた。新たなEEWBデータでは蒸発散量の値が改良されており、これを用いた流量シミュレーションは来年度の課題となった。2)GAME再解析データを入力データとして流量シミュレーションを行った結果、1.25度空間分解能データを用いた場合には、良好な河川流量の再現結果が得られた。これは、ある程度以上の面積を持つ流域ならばグローバルなスケールでの気象モデルを用いて十分河川流量が再現・予測できることを示している。3)河川流量の再現を図る場合、入力データ(降水量・蒸発散量)として、どの程度の時間・空間分解能が要求されるかを対象とする流域面積との関係で調査した。その結果、少なくとも流域面積の1/10程度の空間分解能が、入力データセットとして要求されることがわかった。本研究では、当該研究者らが開発してきたマクロ水文モデルを中国淮河流域(140,000km2)に適用し、多地点での河川流量を算定してモデルの実用性を検証することを目的としている。本年度は入力データセットとして、田中(京大防災研)によって作成されたEEWB data set(version 1.0)、およびGAME再解析データversion1を用いて、淮河流域の流出シミュレーションを実行した。
全固体ナトリウム二次電池用ナノ複合体電極の創製

全固体ナトリウム二次電池への応用にむけて、高容量電極活物質として硫黄、三硫化チタン、黒リンを含む電極複合体の作製手法について検討した。活物質の微粒子化および、活物質ー導電剤ー固体電解質間の広い接触面積を得ることを目的として、電極複合体に対してメカニカルミリング処理を行い、電極組成やミリング条件が全固体電池の特性に及ぼす影響について調べた。硫黄電極複合体を用いた全固体Na/S電池は室温で約1200 mAh/gの可逆容量を示した。さらに、ミリング処理において化学反応を進行させるプロセスについても検討し、NiS活物質とNa3PS4電解質から構成される電極複合体の作製に成功した。全固体ナトリウム電池の電極複合体の作製について検討した。電極活物質としてa-TiS3、固体電解質としてNa3PS4ガラスセラミックス、導電剤としてアセチレンブラック(AB)を40:60:6の重量比で混合することによって電極複合体を得た。得られた電極複合体を正極に、Na15Sn4合金を負極に用いることによって作製した全固体セルが室温で二次電池として作動し、従来検討してきたTiS2に比べて大きな約300 mAh/gの容量を数サイクル保持することがわかった。硫黄含量の大きな遷移金属硫化物を活物質に用いることによって、遷移金属のレドックスに加えて硫黄のレドックスも利用できたために、高容量が発現したと考えられる。一方、ABを添加していない電極複合体を用いた全固体セルでは急激なサイクル劣化の生じることがわかった。充放電後においては正極由来の抵抗成分が増加しており、正極層のSEM-EDX分析の結果、活物質と電解質間の接触性の低下が観察された。よって正極層へのABの添加が、充放電時の電極ー電解質界面維持に有効であることが示唆された。また、Na15Sn4とABのボールミリング複合体を負極に適用することによって、負極由来の抵抗成分が減少し、全固体セルのレート特性の向上が見られた。Na3PS4に比べて高い導電率を示す94Na3PS4・6Na4SiS4(mol%)ガラスセラミック電解質の適用も、全固体電池のレート特性向上に効果的であることがわかった。本研究では、全固体ナトリウム電池の特性向上にむけて、遊星型ボールミルを用いた電極複合体の作製手法について検討した。遷移金属硫化物正極活物質として、アモルファスTiS3を含む電極複合体を作製した。これを用いた全固体ナトリウム電池は、室温で約300 mAh/gの容量を数サイクル保持することがわかった。正極および負極(Na15Sn4)に対して導電剤であるアセチレンブラック(AB)を添加することによって、全固体電池のサイクル性とレート特性が向上することを見出した。また従来用いてきたNa3PS4固体電解質に比べて高い導電率を示す94Na3PS4・6Na4SiS4(mol%)電解質の適用が、全固体電池のレート特性向上に効果的であることがわかった。また、高容量負極活物質として黒リンの適用を検討した。ボールミル処理により得られた黒リンーABーNa3PS4複合体を用いた全固体電池は、Na3PS4を乳鉢で混合した場合に比べて初期放電容量が約1.6倍増大し、黒リンの理論容量に近い2195mAh g-1を示した。しかし充放電を繰り返すと容量減少が見られた。リンへナトリウムが挿入されることによる大きな体積変化が一因と考えられ、充放電サイクル特性の改善が今後の課題である。一方、メカノケミカル反応過程において、遷移金属硫化物活物質とNa3PS4電解質を形成させることによって、大きな接触面積を有する複合体の作製を行った。出発原料として、NiとNa2S2を用いてメカノケミカル処理することによって、NiS-Na2S複合体が得られた。そこへP2S5を加えて同様の処理をすることによって、NiS活物質とNa3PS4電解質が共存した複合体の得られたことを、XRDおよびRaman、NMRを用いて明らかにした。この複合体を用いることによって、高容量を示す全固体ナトリウム電池の作製が期待できる。無機材料化学全固体ナトリウム電池の特性向上にむけて、電極複合体の導電剤の有無が、電極層の微細組織や充放電特性に及ぼす影響を明らかにした。体積変化の大きな硫黄系正極活物質や合金系負極活物質を用いる際に、炭素系導電剤が充放電時の界面コンタクトロスの低減に有用であることを見出し、電極複合体の設計指針の一つを示すことができた。活物質のより一層の高容量化を図るためには、電極活物質や固体電解質の微粒子化や、両者のナノレベルでの複合化が重要となる。湿式プロセスや自己形成手法を含めた様々な複合化手法を用いて、全固体ナトリウム電池の特性向上を図る。

電極複合体中における活物質や電解質のサイズやモルフォロジー、界面接合状態について調査するために、TEMやSEM観察を行う。複合体のモルフォロジーと電気的特性の関係について交流インピーダンス法を用いて検討する。また充放電後の電極活物質の構造や電子状態について、X線回折やRaman分光、X線光電子分光を用いて明らかにし、全固体セルの充放電反応機構について調べる。得られた知見を基に、全固体セル構築に適した、電極複合体の構成要素、組成、形態、混合手法について設計指針を示す。研究当初は大学院生に支払う謝金を想定していたが、結果的には必要が無かったため、残金を次年度に繰り越すことにした。次年度の研究の一部を大学院生に担当してもらうことを想定しており、謝金として使用予定である。
フェナレニルを基盤とする新しい安定中性ラジカルの開発

従来から我々が研究対象としてきた奇交互炭化水素フェナレニルの特性は,スピンが分子周辺炭素上に符号を交互に交替して分布し,大きなスピン分極構造をとっている点にある。しかし速度論的不安定性のため安定に単離することはできなかったが,これまでに種々の安定化の検討を行いこれを克服した。以下に本基盤研究Bの研究成果およびこれまでに達成している成果を含め簡単にまとめる。1)立体保護による速度論的安定化:t-ブチル基を導入したフェナレニルを合成し,縮合多環炭化水素中性ラジカルとして初めての単離および結晶構造解析に成功した。2)ヘテロ原子置換による等電子修飾:窒素原子を二つ導入した1,3-ジアザフェナレニル系を合成・単離した。炭化水素フェナレニルとは異なる2量体構造をとることおよび窒素原子によるスピン分布のヘテロ原子効果を明らかにした。3)電子系拡張によるスピン構造変換:二つの酸素原子により電子系を拡張したオキソフェナレノキシルを安定な結晶として単離した。スピン密度分布がフェナレニルとは対照的に反転することを明らかにした。4)二次元電子系拡張:t-ブチル基を導入したトリアンギュレンの検出と基底状態が3重項の高スピン分子であることを証明した。これは非ケクレ型縮合多環芳香族炭化水素系で初めての実験結果であり,60年来の懸案を解決した。5)高度両性多段階レドックス系:フェナレニル骨格を3個導入した中性ラジカルが,高度な両性度を示すこと,しかも6段階のレドックス系として挙動する事を明らかにした。不安定な一過性の化学種と認識されてきたラジカルなどの開穀有機分子は、近年の学際的研究によってその基礎的な反応性や機能・物性などがかなり明らかにされ、新しい機能性材料の源として有望であることが示されてきた。これまで我々は、速度論的不安定性のため室温固体状態で安定に単離することはできなかった中性ラジカルフェナレニルに対してCapto-Dative効果や嵩高い置換基(t-ブチル基)の導入による安定化の検討や、ヘテロ原子の導入による安定化の研究を行ってきた。本研究では、これまでの成果をさらに発展させ、以下のような成果を得た。酸素原子を二つ導入した6-オキソフェナレノキシルラジカルの8位にp-ブロモフェニル基を置換したラジカルのX線結晶構造解析に成功し、この分子が反強磁性的なπ-型のダイマー構造をとっていることを明らかにした。さらに、置換基の違いがラジカル分子の結晶構造および磁気的性質に与える影響を調べる為に、8位のフェニル基上に様々な置換基を導入した誘導体の合成も行った。フェナレニル骨格自体にヘテロ原子として窒素を二つ導入した1,3-ジアザフェナレニル系の設計・合成を行い1,3-ジアザ系においてもフェナレニルに特徴的な強いスピン分極構造を保持していることが明らかとなった。磁化率および固体試料のESR測定から室温以上の温度領域で熱励起三重項種を観測した。これらの結果から結晶中ではパンケーキ型のダイマー構造を形成していることが示唆された。X線結晶構造解析の結果はこの推測を支持していたが、炭化水素系の場合とは異なり分子面は平行ではなく若干「ハの字」型をしており、スピン密度が大きい炭素間で弱いσ結合が形成されていることがわかった。これは極めて興味深い結果であり,現在さらに詳細に検討している。近年の学際的研究によって、ラジカルなどの開穀有機分子の基礎的反応性や機能・物性などが明らかにされ、新しい機能性材料の源として有望であることが示されてきた。

これまで我々は、酸素原子を二つ導入した6-オキソフェナレノキシルラジカルの8位にp-ブロモフェニル基を置換したラジカルのX線結晶構造解析に成功し、この分子が反強磁性的なπ-型のダイマー構造をとっていることを明らかにした。本年度はフェナレニル骨格自体にヘテロ原子として窒素を二つ導入した1,3-ジアザフェナレニル系の設計・合成を行い、1,3-ジアザ系においてもフェナレニルに特徴的な強いスピン分極構造を保持していることを明らかにした。結晶構造解析から結晶中では炭化水素系のフェナレニル場合とは異なり、ダイマー型構造を構成する分子面は平行ではなく若干「ハの字」型をしており、スピン密度が大きい炭素間で弱いσ結合が形成されていることがわかった。一方、有機化合物におけるサーモクロミズムは、結合の開裂、結合のねじれ、互変異性、電荷移動等の要因によって発現し、外部刺激応答物質として期待される。サーモクロミズムを示す中性ラジカルはほとんどなく、結晶状態において発現した例は皆無である。サーモクロミズムの起源となる中性ラジカルの基礎的なπ電子相互作用の解明は重要である。フェナレニルラジカルおよび窒素を導入したジアザフェナレニルが溶液状態においてサーモクロミズムを示すことを明らかにした。さらに、ジアザフェナレニルが中性ラジカルとして初めて結晶状態でも明確なサーモクロミズムを示すことを見出した。緑色のジアザフェナレニルラジカルは、60Kで無色透明に可逆的に色が変化し、中性ラジカルとして初めて結晶状態においてサーモクロミズムを示した。
サツマイモネコブセンチュウ系統のエフェクター多型比較

サツマイモネコブセンチュウは、世界中の作物圃場で大きな問題となっている植物寄生性線虫である。抵抗性品種の育成が進んでいるのは一部の主要作物に限られ、それらの作物においてさえ、抵抗性打破レースの出現がしばしば起こっている。本研究では、国内で単離されたサツマイモネコブセンチュウ50系統を用い、異なる感染形質を示すものを対象として、エフェクター候補遺伝子が有する多型の同定を行う。サツマイモネコブセンチュウは、サツマイモ5品種(農林1号、農林2号、種子島紫7、エレガントサマー、ジェイレッドに対する感染形質によってSPレースと呼ばれるグループに分類されている。本研究と並行して、50系統の表現型解析とSPレース分類が行われた。平成30年度には、PacBio Sequelシステムを用いて日本産線虫系統のロングリード参照配列の構築を試みた。この配列に対して前年度蓄積した50系統のイルミナリードをマッピングすることにより、より多くの多型を検出することに成功した。SPレース検定結果を表現型としてGWAS解析を行った結果、タンパク機能に影響を与えるSNPとの関連が複数得られ、中にはシグナルペプチドを有するなど、今後の機能解析の重要な候補遺伝子を得ることができた。PacBio Sequelシステムのロングリード参照配列の構築により、複雑な構造のサツマイモネコブセンチュウゲノムの精度を上げることができたと考えられる。それにより、多型の検出とGWASに成功し、候補遺伝子を得ることができた。一方で、参照配列には構造が不確定な部分や精度の低い部分が残っているため、再構築の必要がある。より精度の高いロングリード参照配列を再構築し、マッピングとGWASを行う。また、得られた候補遺伝子の機能解析を進める。本研究では、国内で単離されたサツマイモネコブセンチュウ50系統を用い、異なる感染形質を示すものを対象にトランスクリプトームデータを比較し、エフェクター候補遺伝子が有する多型の同定を行う。サツマイモネコブセンチュウは、サツマイモ5品種(農林1号、農林2号、種子島紫7、エレガントサマー、ジェイレッド)に対する感染形質によってSPレースと呼ばれるグループに分類されている。平成29年度には、各系統のゲノムを解読し、一塩基多型から分子系統分類を行った。その結果、系統的に近縁で、感染形質の異なる系統の組み合わせを複数見出した。このようなペアのトランスクリプトームデータを比較することで、目的とする感染形質に関わる遺伝子を効率よく検出することが可能となる。このようなペアのゲノムを比較し、挿入欠失(InDel)部位を探索したところ、SPレース特異的な部位が存在することが分かった。その中には、農林2号に対する感染性の有無と連動するInDel部位があった。今後は、それらの部位に座乗する遺伝子に着目しながらトランスクリプトームデータの比較を行う計画である。平成29年度の計画であった、サツマイモ品種に対して異なる感染形質を示すサツマイモネコブセンチュウ系統のトランスクリプトーム比較について、全ゲノムの多型情報を用いた系統分類と表現型解析を並行して実施し、比較解析の対象とする系統の組み合わせを絞り込むことができた。RNAサンプルの取得方法について予備実験を行い、無菌的に感染させdual RNA-seq (宿主植物と寄生性線虫両者のデータを取る)を実施する方法を具体的に検討することができた。サツマイモ品種に対して異なる感染形質を示すサツマイモネコブセンチュウ系統のトランスクリプトーム比較解析を行い、これまでに明らかになったゲノムのInDel領域との対応関係を調べる。

一連の比較解析によって、感染形質の違いを引き起こすサツマイモネコブセンチュウ遺伝子(エフェクター)を明らかにする。サツマイモ品種への感染表現型について、植物側の反応の詳細については知られていない。植物側の何が抵抗性あるいは感受性に関与しているのかを調べるため、詳細な表現型(感染がどこまで進むのか、細胞死の有無など)を根を透明化するなど観察方法を工夫して明らかにしていく。以上の研究を実施し、これまでに知らせていなかった「感染能力の違い」を生み出す機構について、遺伝子レベルの知見を得たいと考えている。より精度の高いロングリード参照配列を再構築し、マッピングとGWASを行う。また、得られた候補遺伝子の機能解析を進める。人件費として計上していたが、実験遂行上必要とならなかった。翌年度に消耗品として使用する。
次世代シークエンサーを用いた悪性神経膠腫新規バイオマーカーの開発

悪性神経膠腫は、集学的治療の進歩にもかかわらず、平均生存期間15ヵ月の非常に予後の悪い腫瘍である。免疫療法は最も期待される治療法のひとつであり、近年、多くのがん種において、有効な成績が報告されている。一方、悪性神経膠腫に対する治療成績は必ずしも良好とはいえない。これは、中枢神経系という特殊な免疫環境が関与しており、従来の抗腫瘍メカニズムが作用しない所以だと考えられている。当施設において治療された神経膠腫30例の腫瘍検体、血清を対象とし、次世代シークエンシング法による網羅的なT細胞受容体(T Cell Receptor : TCR)レパトア解析を行った。グレード4(膠芽腫)15例、グレード3(退形成性星細胞腫、退形成性乏突起膠腫、退形成性乏突起星細胞腫)7例とし、コントロールとしてグレード2(星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫)8例をおいた。増幅しているTCRを定性的、定量的に解析し、アルゴリズムに基づいてClonality, Diversity Indexを算出したところ、悪性神経膠腫においてTCRの多様性が低下していることが明らかとなった。さらに、同一症例の異なった時期、化学療法の前後での検証を行うため、4検体の追加検査を行った。同一症例であっても、治療の有無、再発によって、発現するTCRの種類、Clonalityに変化が生じることが分かった。また、臨床経過の良いものにDiversity Indexが低い傾向が示唆された。TCRレパトア解析でのTCR多様性の低下、特定T細胞の活性化は、複数のがん種で予後との相関を示すとの報告が見られる。本研究での結果は、特殊な免疫環境における脳腫瘍でも、他がん種同様の反応が期待できることを示している。本研究によって、悪性神経膠腫の免疫機構の一端が解明されることにより、ペプチドワクチンをはじめとした免疫療法の改良、開発の足掛かりとなった。悪性神経膠腫の新たな治療法開発のため、我々は免疫療法に着目して研究を開始した。特殊な免疫機構を有する中枢神経系での抗腫瘍メカニズムを明らかにすることで、より効果の期待できる症例の選択、治療効果判定、有効性予測の免疫バイオマーカーの開発を行うことを目的としている。増幅しているTCRを定性的、定量的に解析し、アルゴリズムに基づいてClonality, Diversity Indexを算出した。さらに、これらの結果と、化学療法・放射線療法の有無、初発・再発、腫瘍のグレードによる差異などの臨床所見との関連を検証したところ、PFSの良いものにDiversity Indexが低い傾向が示唆された。そこで、個々の症例をより精密に検討するため、うち4検体に対して、TCRレパトア解析の追加検査を行い、同一症例の異なった時期、化学療法の前後での変化を比較、検討した。現在、腫瘍検体の免疫染色(CD4, CD8, CD3)を行い、上記のTCRレパトア解析の結果および臨床経過との相関を、あわせて解析中である。そのうえで、腫瘍、末梢血で増幅するT細胞プロファイルの比較を行い、簡便な免疫バイオマーカーとなり得る可能性を模索する。TCRレパトア解析において、個々の症例をより精密に検証する必要性を認めたため、追加検査を行った。そのため、連なる研究に若干の遅れを生じたが、同一症例であっても、時期、治療の有無などによって、発現するTCRの種類、Clonalityに変化が生じることが示唆され、つづく研究への足掛かりとなった。TCRレパトア

解析でのTCR多様性の低下、特定T細胞の活性化は、複数のがん種で予後との相関を示すとの報告が見られる。本研究での結果は、特殊な免疫環境における脳腫瘍でも、他がん種同様の反応が期待できることを示している。本研究によって、悪性神経膠腫の免疫機構の一端が解明されることにより、ペプチドワクチンをはじめとした免疫療法の改良、開発の足掛かりとなった。平成29年度で得られた研究実績を踏まえ、さらなる検証を行う。腫瘍検体の免疫染色に、FOXP3、PD-1、PD-L1を追加し、CD4+, CD8+, CD4+CD25+制御性T細胞の割合と臨床経過の相関、当施設で行ってきたペプチドワクチンに対する反応性を検討する。各症例より得られたTCR情報から、増幅しているTCRサブクローン上位10セットを選び、全症例あるいは臨床的に予後良好例に共通して増幅するもののスクリーニングを行う。複数の候補より、免疫バイオマーカーとして有用性の高いものを抽出し、検討を行う。同時に、特異的免疫エピトープとなり得る脳腫瘍neoantigen候補を同定し、評価する。選別した脳腫瘍neoantigenの予測アミノ酸配列から、HLA結合性予測プログラム(BIMAS)およびプロテアソーム切断予測プログラム(PAProC)を用いてHLA-A24およびHLA-A2結合性エピトープペプチドを推測し、結合性の高い候補ペプチドを合成する。上記の研究で得られた新規ペプチドワクチンと免疫チェックポイント阻害剤による複合免疫療法のin vivoでの治療実験を行う。まず、膠芽腫幹細胞マウスモデルを用いて、腫瘍抗原ペプチドワクチンを投与し、一定期間後にCTL解析を行うことで、腫瘍抗原投与法の最適化を行う。次に、新規ペプチドワクチンと免疫チェックポイント阻害剤(抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体など)併用投与後のCTL解析、生存期間より、治療効果を検証する。以上より、得られた結果をとりまとめ、成果の発表を行う。研究の進捗により、本年度で必要とした消耗品費が予定よりも減少し、次年度への持ち越しとした。<使用計画>消耗品費:免疫染色に用いる抗体(FOXP3, PD-1, PD-L1など)の費用として計600,000円、膠芽腫幹細胞の培養に必要な培地、試薬(Neuro Basal Medium, B27,ヒトEGF,ヒトFGF,ヒトLIFなど)の費用として600,000円、スライドグラス、プラスチック・ガラス容器、保管培養に用いるフラスコなどに対して600,000円、動物実験として、C57BL/6マウスの購入、当研究室で飼育のために用いる餌や床として600,000円を使用する。その他の経費:学会旅費・参加費として200,000円、更に最終年度であるため、論文発表経費として300,000円を使用する見込みである。
建築物耐震設計用入力地震動の設定にかかわる広域地域特性の評価に関する研究

本研究は、地盤あるいは「地震基盤」よりも深い、地殻又は上部マントル中に於ける地震波動伝播特性が、地表に建つ構造物への入力地震動特性に如何なる影響をもたらすかについて、関東地方及びその周辺域で発生する地震を対象として検討したものである。そこで本研究に用いた一次資料は、南関東の東松山・小川・館山・銚子・大洗及び伊豆半島修善寺において1978年以来継続している岩盤強震アレー観測によるおよそ4千成分の加速度時刻歴記録であるが、これらの全ての記録について周期特性解析(応答スペクトル解析)を施し、これを基礎資料として前述の広域地域特性の抽出を試みた。具体的には、ここに計算したそれぞれの応答スペクトルによって各地震動の強さを評価し、これに武村らによって近年提案された距離滅衰式を当てはめ、その実験式の係数のブロック毎による相違から、各震源と各観測点との間の地殻・上部マントル中における地震波動伝播特性を抽出し、その結果を既往の地震学的研究成果、特に近年の関東・東海地域に於ける地震予知事業に関連した東京大学や国立防災科学技術センター等による3次元速度構造の諸研究成果と比較対応することによって、その物理的意味と工学的意義を示さんとした。その結果、これ迄に得られた幾つかの知見を列挙すれば、北信地域に発生した極浅発地震による関東地方での地震動特性は、平均よりは振幅がかなり大きくなる傾向が認められるのに対し、逆に福島県沖に発生する浅発地震や茨城県沖・福島県沖で発生するやや浅発地震ではむしろ小さめの振幅になるなど、無視しがたい傾向がみとめられる。これらの傾向は、前記3次元速度構造モデルとおおむね対応するものであり、この地域における深い地下構造の特性を反映したものと考えることができよう。但し、その定量評価及び工学的意義の確定には、更に他の多くの伝播経路に沿う観測データの蓄積が必要である。
相互定理と定性力学を利用した工作機械の熱剛性解析モデルの改良

熱剛性解析モデルの対象として小型NC旋盤の工具インデックス・ユニットを取り上げた。このインデックス・ユニットを熱絶縁して定盤上に固定し、電気ヒ-タ-で加熱しながら温度分布と3点の変位を測定した。一方、有限要素法単独でこのユニットの静剛性解析を行うと共に相反定理と有限要素法を併用して、測定した温度分布と特定点(測定点)における変位からこのユニットの変形パタ-ンを求めた。次いでこれら両パタ-ンの相違点が無くなるように解析モデルを修正する手法を確立した。次に同じ手法をこの旋盤のベッド及び主軸頭にも適用して解析モデルを改良した。最後にこれらの改良された構造要素を計算機上で組み立てた旋盤全体の構造モデルに対して、主軸受けや工具インデックス・ユニット、強電盤などの自己発熱に原因する構造各部の温度上昇と変形量、同じく旋盤の置かれている環境の温度変化に原因する旋盤の温度分布の変化と変形量を計算した。実験値との照合は切削した工作物の寸法精度の変化と対応させるために、旋盤全体の解析モデル上での工具と工作物(主軸)中心線との相対位置の変化を算出して行い、この手法が実用上十分な精度を持っていることを確認した。発熱量の同定や熱変形パタ-ンの十分な精度での測定が困難な為に、従来、熱剛性解析モデルは改良が難しかったので、所望の精度の解析モデルを得ることが困難であったが、容易に高い精度の得られる静剛性のデ-タを用いる本手法の導入によって、解析モデルの精度を飛躍的に高めることができる。また、あわせて開発した工具と工作物間の相対変位を算出するプログラムによって、各温度要因の工作精度への寄与率が明らかになり、より工作精度安定性の高い、合理的に熱剛性の高い設計を得るための指針を得ることができる。
カルボン酸残基を有する光学異性体の高感度分離分析

HPLCによる対掌体の分離分析法のひとつであるキラル誘導体化法の微量分析に対する有用性は良く知られているが,カルボン酸対掌体の分離分析を目的とした場合,誘導体化試薬に反応時間や検出のための発色団等の面で少なからず問題点が残されている。今回,この問題を解消するために,より有用な発色団を有する試薬を使った分析法の確立及び反応時間を飛躍的に短縮できる試薬の開発を試みた。1.従来よりこの問題に取り組んでおり,すでに選択性の高いダンシル基を発色団として有する光学活性アミン,1-(4-dansylaminophaenyl)ethylamine,の合成法と,それを用いた蛍光検出-HPLCによるアリールプロピオン酸類の分離分析法を既に確立している。この時,本試薬は化学発光検出の適用も可能であり,同検出法の適用による,選択性と検出感度のさらなる向上が期待された。そこで化学発光検出器を購入し,検出のための発光反応試薬,試薬溶液及び移動相の流速,反応時間等の最適化を行ない,HPLC条件を確立したところ,蛍光検出に比べ検出限界を20倍程度改善できることを確認した。これと共に,本法による生体試料中の同化合物対掌体の高感度分離分析法を確立した。2.上述の方法において,誘導体化のための反応時間は決して速いとは言いがたい。そこでカルボキシル基との反応性が非常に高いトリフルオロメタンスルホン酸エステル基に着目し,同官能基を有するキラル化合物,(R)-2-(2,3-naphthalimino)-2-(phenyl)ethyl trifuluoromethanesulfonateを合成し,カルボン酸対掌体とのキラル誘導体化を検討した。本試薬とアリールプロピオン酸類対掌体との誘導体化反応は10分程度で終了し,反応時間を飛躍的に改善できることを確認した。また,生成したジアステレオマ-の分離も良好であり,検出限界も蛍光検出を用い,数10fmolと従来法に比較しても劣らない高感度検出が可能であった。
ショウジョウバエを用いた細胞競合機構の遺伝学的解明

細胞競合とは、近接する同種の細胞間で適応度のより高い細胞(勝者)が低い細胞(敗者)を排除する現象である。本研究では、ショウジョウバエ上皮細胞競合モデルを用いて、細胞競合の制御に関わる因子群を網羅的に同定し、その役割と分子機序を遺伝学的に明らかにすることを目的とする。本研究において、約9,000系統のショウジョウバエ突然変異系統をスクリーニングし、近接する極性崩壊細胞(細胞競合の敗者)を排除できないelimination-defective (eld)変異系統8系統を単離した。それらの責任遺伝子の解析から、細胞競合の敗者の物理的排除に関わるSlit-Robo2シグナルおよび細胞競合の勝者と敗者の境界上で機能する細胞表面リガンド-受容体Sa-PTP10Dを同定してそれらの分子機構を明らかにするとともに、細胞競合制御因子として自然免疫TollシグナルのリガンドSpzを抑制する分泌タンパク質Serpin5を同定して細胞競合制御におけるTollシグナルの役割とその分子機構を明らかにした。平成30年度は、chico(IRSホモログ分子)遺伝子のヘテロ変異が成虫原基における極性崩壊細胞の細胞競合による排除を抑制するという現象に着目し、その分子機構の解析を進めた。その結果、興味深いことにchicoは成虫原基ではなく遠隔組織である脳のインスリン産生細胞において必要であることがわかった。さらなる遺伝学的解析により、インスリン産生細胞からのDilp2の産生量が成虫原基における細胞競合に重要な役割を果たすことがわかり、その制御メカニズムを明らかにすることができた。一方、極性崩壊細胞の競合初期の集団サイズが最終的な競合の勝敗に重要な役割を果たすことを見いだし、数理解析と並行してそのメカニズム解析を進めた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。細胞競合とは、同種の細胞間で相対的に適応度の高い細胞(勝者)が低い細胞(敗者)を積極的に排除する「適者選択システム」であり、正常発生における動的な組織構築過程や上皮に生じた前がん細胞の排除など、多様な生命現象に関わることが示されつつある。細胞競合研究の萌芽期にある今、細胞競合の全貌解明を目指すには、まずその制御因子と特異的マーカー分子を網羅的に単離・同定し、それらの役割と動作機序を明らかにすることが必須である。そこで本研究では、ショウジョウバエ上皮細胞競合モデルを用いて細胞競合制御因子群を網羅的に同定し、その役割と分子機序を遺伝学的に明らかにする。具体的には、研究代表者が独自に開発したショウジョウバエ上皮細胞競合スクリーニング系(上皮に誘導した極性崩壊細胞(敗者)に近接する正常細胞(勝者)にEMS誘導性突然変異を導入し、両者間の細胞競合機構に異常をきたす突然変異体を探索する)を大規模に展開し、上皮細胞競合の制御因子を網羅的に同定する。平成26年度は、これまでのパイロットスクリーニングに加えて1700系統の突然変異系統を樹立してスクリーニングを行い、近接する極性崩壊細胞を排除することができないelimination-defective (eld)変異系統4系統を単離することに成功した。さらに、これら4つのeld変異系統のうち3系統はパイロットスクリーニングで単離したeld-4と同じcomplementation group(同一の責任遺伝子をもつ)に属することが分かった。eld-4についてはその責任遺伝子として細胞膜リガンドタンパク質を同定し、さらにRNAiスクリーニングによってその受容体候補タンパク質の同定にも成功した。一方、単独のcomplementation groupに属するeld-5の責任遺伝子領域の絞り込みを、一連の染色体欠失系統を用いて行った。細胞競合とは、近接する同種の細胞間で環境適応度のより高い細胞(勝者)が低い細胞(敗者)を積極的に排除する現象であり、正常発生における組織構築過程や上皮に生じた前がん細胞の排除など、多様な生命現象に関わることが示されつつある。細胞競合現象の全貌を明らかにするためには、まずその制御因子や特異的マーカー分子を網羅的に単離・同定し、それらの役割と動作機序を明らかにすることが必須である。そこで本研究では、ショウジョウバエ上皮細胞競合モデルを用いて、細胞競合の制御に関わる因子群を網羅的に同定し、その役割と分子機序を遺伝学的に明らかにすることを目的とする。これまでに、約7500系統のショウジョウバエ突然変異系統を樹立してスクリーニングを行い、近接する極性崩壊細胞(細胞競合の敗者)を排除することができないelimination-defective (eld)変異系統4系統を単離することに成功した。さらに、この中でも強いeld表現型を示すeld-4系統の責任遺伝子として、細胞表面リガンドSasを同定するとともに、in vivo RNAiスクリーニングにより細胞競合過程で機能すると考えられるsas受容体としてPTP10Dを同定した。平成27年度は、SasおよびPTP10Dタンパク質が細胞競合の細胞境界面においてそれぞれ勝者細胞と敗者細胞のラテラル側に蓄積することを見いだすとともに、それによってトランス活性化される敗者細胞内でのPTO10Dシグナル経路を遺伝学的に明らかにした。一方、別のcomplementation groupとして単離されたeld変異体eld-5の責任遺伝子領域を絞り込み、その責任遺伝子としてToll経路を制御するタンパク質をコードする遺伝子を同定することに成功した。本研究は、ショウジョウバエ上皮細胞競合モデルを用いて細胞競合制御因子を網羅的に探索・同定し、その細胞競合における役割と動作機序を明らかにしていくものである。これまでに、細胞競合の敗者として排除されるべき細胞(極性崩壊細胞)を排除できないelimination-

defective (eld)変異系統を8系統単離し、そのうち1つのcomplementation groupの責任遺伝子として細胞表面リガンドSasを同定するとともに、RNAiスクリーニングによりその受容体タンパク質PTP10Dの同定にも成功した。さらに、上皮組織中での細胞競合時におけるSasおよびPTP10Dの局在変化やそれによるシグナル活性変化も明らかにした。今後、Sas-PTP10Dシグナルの細胞競合制御メカニズムの詳細を明らかにしていくことで、極性崩壊により引き起こされる上皮の細胞競合現象の全貌が明らかになっていくと期待される。以上の経過から、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。細胞競合とは、近接する同種の細胞間で適応度のより高い細胞(勝者)が低い細胞(敗者)を積極的に排除する現象である。本研究では、ショウジョウバエ上皮細胞競合モデルを用いて、細胞競合の制御に関わる因子群を網羅的に同定し、その役割と分子機序を遺伝学的に明らかにすることを目的とする。これまでに、約9,000系統のショウジョウバエ突然変異系統を樹立してスクリーニングを行い、近接する極性崩壊細胞(細胞競合の敗者)を排除することができないelimination-defective (eld)変異系統8系統を単離することに成功した。この中でも特に強いeld表現型を示すeld-4系統の責任遺伝子として細胞表面リガンドSasを同定し、またSasの受容体として機能する受容体型チロシンフォスファターゼPTP10Dをin vivo RNAiスクリーニングにより同定した。さらに、SasおよびPTP10Dタンパク質が細胞競合の境界面においてそれぞれ勝者細胞と敗者細胞のラテラル側に蓄積することを見いだした。平成28年度は、このSas-PTP10Dシステムが細胞競合の敗者となる極性崩壊細胞の排除を駆動するメカニズムを明らかにした。すなわち、正常細胞との接触により活性化されたPTP10Dシグナルは極性崩壊細胞内でEGFRシグナルを抑制し、JNKシグナル依存的な細胞死および細胞のextrusionを促進することがわかった。PTP10Dをノックダウンした極性崩壊細胞ではEGFRシグナルが亢進し、これがJNKシグナルと協調することで細胞内F-actinの集積を介してYorkie(Hippo経路の標的因子)が活性化し、その結果極性崩壊細胞は排除を免れるだけでなく過剰に増殖して腫瘍を形成することが明らかとなった。本研究は、ショウジョウバエ上皮細胞競合モデルを用いて細胞競合制御因子を網羅的に探索・同定し、その細胞競合における役割と動作機序を明らかにしていくものである。これまでに、極性崩壊細胞を細胞競合の敗者として排除するのに必要な勝者細胞側の遺伝子として細胞表面リガンドSasを同定するとともに、その受容体タンパク質PTP10Dを明らかにした。
血管肉腫バイスペシフィック抗体標識LAK養子免疫療法の臨床応用研究

我々が樹立に成功したヒト血管肉腫細胞株(ISO-HAS)を免疫原にして、血管肉腫細胞に極めて特異性の高いIgMモノクローナル抗体(HEW-3)を作成した。HEW-3とLAK細胞に反応するCD3抗体とで作製したバイスペシフィック抗体(BSAb)はLAK細胞に標識することで、ISO-HASを濃度依存的に傷害し、傷害活性は反応時間に比例して増強した。傷害活性は反応培養上清中のTNFαと量的相関が見られた。ヒト血管肉腫マウスモデルWB-SCIDを用いたin vivoでの検討ではBSAb+LAKの4回腫瘍内短期投与で著明な血管肉腫抑制が観察された。このin vitroおよびマウスin vivo実験結果により当大学病院倫理委員会から治験申請許可が下りた。3人の頭部血管肉腫症例から同意がえられたので臨床治験が行われた。2例はBSAb 2.5μgをIL-2+自家培養LAK細胞と共に腫瘍内に局注投与を行い、また残り1例は放射線療法および化学動注療法後の頭蓋内浸潤例で、BSAb 15μgをIL-2+自家培養LAK細胞と共に選択的動注投与が行われた。3例ともにヒト抗マウス抗体の上昇が血中でみられたため、BSAb投与は短期間内の数回にとどまった。しかし、局注の2例では腫瘍の縮小ないし消褪を認め、動注例では著明な腫瘍の消褪がMRI所見で確認された。投与経過中、局注例で発熱が1例に、CRP上昇が2例にみられたが、BSAbによると考えられる臓器障害やアレルギー反応はいずれの症例にも観察されなかった。BSAbはLAK療法を増強するために、血管肉腫に有効であることが確認された。今後の課題は継続的投与が可能なヒトBSAb抗体の作製である。我々はヒト血管肉腫から樹立に成功した血管肉腫細胞株(ISO-HAS)を抗原にして血管肉腫特異的抗体作製を試み、その結果、正常血管内皮細胞に反応しない、極めて悪性内皮細胞に特異性の高いモノクローナル抗体(HEW-3)の作製に成功した。このHEW-3をDTNB(5.5'-dithiobis(2-nitro benzoic acid))でFab-s-NBを作製した。一方、LAK細胞に反応するCD3抗体をDTT(dithiothreitol)で還元しFab-SHとした。両者を当量モル数反応させ、ヘテロF(ab')_2のバイスペシフィック(BSA b)抗体を作製した。FACS解析でこのBSAb抗体の反応特異性はISO-HASとLAK細胞の両者に反応することを確認した。In vitroのcytotoxic assayではこのBSAbの存在下でLAK細胞の障害活性は非存在下に比して明らかに増強した。In vivo assayとしてヒト血管肉腫移植SCIDモデル(WB-SCID)の継代移植腫瘍塊5mm^3に対してLAK6x10^7とBSAb 20μgの併用を初回より1日おき4回のみ局注し、腫瘍サイズを経時的に計測した。なお、IL-2は2000Uを1日おき継続局注した。マウス移植腫瘍塊は各種対照群に比してLAK+BSAb併用投与群では82%以上の著明な腫瘍増殖抑制が観察された。この結果より、BSAb併用療法が臨床上血管肉腫に対するLAK免疫療法の抗腫瘍効果を高める確証が得られた。なお、現在当大学病院の倫理委員会でこのBSAb抗体の臨床治験に関しての審議がほぼ終了し、認可を待っている段階である。

我々はヒト血管肉腫から樹立に成功した血管肉腫細胞株(ISO-HAS)を抗原にして作製した極めて悪性内皮細胞に特異性の高いモノクローナル抗体(HEW-3)とLAK紬胞に反応するCD3抗体とのバイスペシフィック抗体(BSAb)の作製に成功した。これを致死性の血管肉腫治療に臨床実施するために当大学病院の倫理委員会に申請した。約1年がかかってほぼ申請どうりの治験の認可が下りた。この間、臨床治験を行うこうとが出来ず、凍結保存されていたBSAbの活性が低下してしまった。認可後、期間が十分残されていなかったことと、血管肉腫の症例数が少なくインフォームド・コンセント取れる適応例に恵まれず、今年度は臨床実施に至らなかった。しかし、いつでも実施が可能であるように、HEW-3、CD3抗体の作製保存を行い、実施前にすぐBSAb作製できる体制を整えた。一方、BSAb標識LAK細胞の血管肉腫細胞障害機序をin vitroで検討した。その結果、腫瘍細胞障害率はBSAb存在下にLAK細胞から産生されるTNFαの濃度にほぼ比例した。また、この障害率は抗TNFα抗体により濃度依存的に抑制された。このことから、BSAb標識LAK養子免疫療法による血管肉腫抑制はTNFα作用による可能性が示唆された。ヒト血管肉腫から樹立に成功した血管肉腫細胞株(ISO-HAS)を抗原にして作製した極めて悪性内皮細胞に特異性の高いモノクローナル抗体(HEW-3)とLAK細胞に反応するCD3抗体とのバイスペシフィック抗体(BSAb)作製に成功し、in vitroおよびマウスモデルを用いたin vivoで検討してきた結果、ヒト血管肉腫を顕著に抑制することが明らかとなった。今年度は臨床応用するためにそれぞれの抗体を十分量作製し、凍結保存した。インフォームドコンセントを慎重に行い同意が得られた頭部血管肉種患者3例に対して、BSAB2.6μg/mlを自家培養LAK細胞と投与直前に混合して投与する臨床治験が行われた。頭皮原発腫瘍に対しての局注投与は69歳と73歳の2例に、また頭蓋内浸潤腫瘍に対して後頭動脈からの選択的動注投与が48歳の1例に行われた。投与は隔日投与とし、血中にヒト抗マウス抗体HAMAが陽性になった時点で中止し、再投与は行わず、病変の経過、HAMAの推移と臓器障害の有無を検討した。いずれの症例においても臨床的に腫瘍抑制効果が確認された。1例に1日のみ発熱がみられたが臓器障害は起こらなかった。この研究成果はpreliminaryであるが、血管肉腫にはBSAbは有用な治療法になりえることを示唆した。平成15年度よりHAMAが産生されないヒト抗体作成の研究を科研に申請中である。
プリオン感染病態の研究

プリオン感染に関してその感染源を特定できる方法として、トレースバック現象を見いだし報告した。また、このトレースバック現象を利用して、従来感染源が不明であった硬膜移植後CJD with plaques(dCJD/PLと略す)の感染源が孤発性CJDのVV2であることを証明し、またMV2も感染源になりうることを学術論文として報告した。dCJD/PLの感染源を特定したのは世界初である。1.FDCを使った感染実験硬膜移植後のCJDプリオンの感染実験として、dura-CJD with plaquesプリオンをKi-129M/M, Ki-129V/Vマウスの腹腔内に投与し、75日後にプリオン感染の有無をIHCとWestern blotで評価した。Dura-CJD with plaquesの症例は、プリオン蛋白の遺伝子がいずれも129M/Mタイプであるにも関わらず、感染が成立したのはKi-129V/VマウスのFDCであった。つまり、129Vのプリオン蛋白を異常化させやすいことが明らかになった。2.脳内投与による感染実験FDCを用いた感染実験は、本年度ほぼ評価が確定したが、脳内投与による感染実験にはほぼ2年間の観察期間が必要である。本年度は、一部の結果の記載となる。Dura-CJD withplaquesは、129M/Mの遺伝子を持つ症例がほとんどであるが、ヒト化マウスであるKI-129V/Vマウスには、3例感染させてほとんど全てが300日で発病する。一方、Ki-129M/Mマウスに関しては、現在400日を越えて観察期間中でありここでも129M/M遺伝子の方が感受性が低いことを示している。3.コドン129特異的抗体Ki-129M/Mマウスに、ヒト型の129Vプリオン蛋白を、そしてKi-129V/Vマウスに129Mプリオン蛋白を免疫中である。ただ、それぞれのマウスの間ではたった1つのアミノ酸にしか違いがないため、新しくコドン129に加えて、コドン132をSerからPheに置換したマウス、つまり2カ所のアミノ酸が異なるマウスを2種類作製した。すなわち、Ki-129M=132FとKi-129V=132Fマウスである。現在は、Ki-129V=132FマウスはすでにGerm-line化に成功している。本年度は、この研究を始めるにあたって目標としてきた結果が得られた。プリオン感染の一つの性質であるトレースバック現象を証明したのである。元々は、vCJDプリオンの感染実験において、vCJDプリオンの遺伝子型であるヒト129Metのプリオン蛋白よりもウシ型のプリオン蛋白を持つノックインマウスに感染し易いことを証明しトレースバック現象として報告してきたが、硬膜移植後のCJDプリオンがヒト129Metの遺伝子型を持つにも関わらず、この129Metの遺伝子型よりもヒト129Valのノックインマウスに感染しやすい事を証明した。つまり、硬膜移植でアミロイド斑を有する症例は、もともと129ValのCJD患者の硬膜を129Metのレシピエントに投与された可能性が示唆されたのである。さらに、このトレースバック現象を確かめるため、129Val/Valでタイプ2のプリオンを129Met/Metのノックインマウスに感染させ、感染が成立したマウスの脳内に多数のアミロイド斑が生じること、そして硬膜移植の症例と同じように異常プリオン蛋白の分子量がタイプ2よりも少し高くなることを証明した。加えて、この発病した129Met/Metノックインマウスの脳を用いて、129Val/Valのノックインマウスに感染実験を行ったところ、硬膜移植のアミロイド斑を有する感染実験と同様に容易に感染が成立することを証明した。これによって、我々が発見したトレースバック現象が、プリオン感染の原因を追及する方法として利用できることが明かとなった。アミノ酸の異なるプリオン感染が成立した場合、トレースバック現象が原因追及の方法となりうる。硬腰移植後のCJDは2つに分類される。1つは、シナプス型の異常プリオン蛋白沈着をしめし、典型的な孤発性CJDのMM1と同じであるので感染源はMM1プリオンと考えられている。もう1つは、遺伝子は129Met/Metであるにも関わらず脳に多数のアミロイド斑をみとめ,ウエスタンの分子量がタイプ1と2の中間的分子量を示す硬膜CJD(dCJD/PLと略する)であり、孤発性CJDでは全く認められないような新規のCJDである。我々は、vCJDプリオンの感染実験の実験中にvCJDプリオンがヒトのプリオンであるにも関わらずウシ型プリオン蛋白のノックインマウスに容易に感染するというトレースバック現象を見いだしたので、この感染源が不明のdCJD/PLがどのプリオンに由来するかを検討した。感染実験では、dCJD/PLは、Ki-Hu129V/Vマウスで300日の潜伏期間、Ki-Hu129M

/Mでは、520日以上の潜伏期間を示しトレースバック法からはVVのヒトからの感染を示唆した。このトレースバック現象を検証するために、VV2プリオンをKi-Hu129M/Mマウスに感染させ、このマウスのウエスタンブロットの結果がdCJD/PLのプリオンと全く同じ分子量に移動すること、そして組織学的に多くのアミロイド斑が出現することを明らかとした。つまり、VV2プリオンが129Met/Metのヒトに感染した結果dCJD/PLが新しく出現することを示したわけである。更に、この新しいプリオンをKi-Hu129V/Vマウスに感染させたところ306日で発病し、Ki-Hu129M/Mマウスでは684日も潜伏期間が必要であることを明かとし、トレースバック現象がプリオン感染源を同定するのに有効であることを証明した。当初に掲げた研究日標をほぼ完壁に遂行し、その結果を学術論文として報告した。
階層的気候モデリングによる氷期交代メカニズムの研究

約300万年前以来氷床の発生(氷期)と消滅(間氷期)が交代する気候変動は、数多くの研究から地球の軌道要素が究極的要因になっているもののその応答には気候システム内部の非線形性が強く働いたと示唆されている。氷期間氷期の異なる気候状態やその時間変化が生じるには、氷床、大気、海洋、炭素循環など、さまざまな地球環境プロセスが相互に働いたことが考えられるので、さまざまなプロセスを取り込んだモデルを構築して、数値実験することが要因の解明に役立つと考えられるが計算資源の制約等で系統的な再現実験、感度実験の例は少なかった。ここでは異なる階層の3つの気候システムモデルを構築し、軌道要素に対して気候システムモデルがどのように応答するか、どのような条件が整うと現実の氷期間氷期サイクルのような気候の大きな変化がおこるのか、氷期発生や消滅にどのような偶然性や必然性があるのかなどを、数値実験によってある程度整理した。最終年度は階層(1):過65万年間の気候/氷床変動に実験を延長し、氷床と気候の長時間変化を扱うモデルを用い氷期サイクルが10万年周期で交代することや最終氷期などには最大海面水準にして約140メートル低下するなどの振幅を再現、その周期性や振幅の現れるメカニズムを詳しく調べた。階層(2):大気大循環と氷床の相互作用に重点をおいたモデルでは、この2つの作用を非同期周期および同期で結合する方法を開発できた。階層(3):海洋-大気大循環と炭素循環プロセスに重点をおいたモデルでは、大気海洋結合大循環モデル、炭素循環モデルによる約二万年前の最終氷期、間氷期、現在を実験、データや他モデルと比較した。世界だけでなく日本周辺の古海洋データをよく再現するシミュレーション結果が得られ、どのようなプロセスが働いたかを感度実験で明らかにした。以上に関連して15編の論文を出版した。ここでは異なる階層の3つの気候システムモデルを構築し、軌道要素に対して気候システムモデルがどのように応答するか、どのような条件が整うと現実の氷期間氷期サイクルのような気候の大きな変化がおこるのか、氷期発生や消滅にどのような偶然性や必然性があるのかなどを、数値実験によってある程度整理する。今年度は階層(1):氷床と気候の長時間変化を扱うモデルを用い氷期サイクルが10万年周期で交代することや最終氷期などには最大海面水準にして約140メートル低下するなどの振幅など再現するのに成功した。その周期性や振幅の現れるメカニズムを感度実験を通じて調べることができた。階層(2):大気大循環と氷床の相互作用に重点をおいたモデルでは、この2つの作用を非同期周期で結合する方法を開発した。階層(3):海洋-大気大循環と炭素循環プロセスに重点をおいたモデルでは、大気海洋結合大循環モデルによる時間断面再現実験を実行した。軌道要素、温室効果ガス濃度、氷床地形を外力として与えて、約二万年前の最終氷期、間氷期、現在を比較する。国際モデル比較実験(PMIP)に提出し比較検討することができた。