hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者における血圧日内変動と歯科治療中の変動

(目的)歯科処置時の身体的,精神的な刺激は,患者の血圧や心拍数などの循環変動に様々な影響を及ぼす。一方,これら血圧や心拍数などの循環系のパラメーターは1日24時間のスパンの中で絶えず変化し,リズムを形成している。そこで,本研究は歯科処置時における循環系のパラメーターの変化は,患者の日内変動幅の中でどうような位置を占めるか,また,その患者の日内リズムとどのような関係があるかを知る目的で行った。(方法)対象者はすべて歯科処置が予定されているものとした。歯科処置予定前日の歯科処置予定時間より26時間以上前に来院させ,A&D社製24時間携帯型自動血圧計TM2425を装着し,家庭内または職場にて24時間のの血圧値,心拍数の測定を行った。測定間隔は昼間,夜間ともに30分間隔とした。また,歯科処置予定当日は自動血圧計を装着させたまま来院させ,歯科処置中の血圧値心拍数の測定を行った。歯科処置は、すべての症例において局所麻酔下における抜歯処置とした。(結果)1.24時間血圧平均値より外来血圧値の方が有意に高かった。2.Non-Dipper(24時間血圧における夜間血圧低下率が10%未満)を示す者に歯科処置時の血圧上昇がみられた。3.早朝における血圧上昇が大きい者に歯科処置時の血圧上昇がみられた。
精子鞭毛運動調節機構の解明

サケ科魚類精子の運動能獲得機構に関しては、これ迄intactの精子について調べてきたが、本年度はTriton xー100を用いて細胞膜を除去した精子について調べ、精子運動装置である軸糸においても運動能獲得現象があることを明らかにした。この軸糸の運動能獲得はintact精子における獲得より早期に起る。従ってサケ科魚類精子運動能獲得は軸糸と細胞膜で別々に起り、双方の完成によって十分に運動能を備えた精子となると考えられる。サケ科魚類の精子動運能開始については.まずcAMP依存性プロテインキナ-ゼ、チロシンキナ-ゼ、チロシンキナ-ゼ抗体の精子運動性に与える彰響とタンパク質のリン酸化に与える影響について検討し、精子運動開始のカスケ-ド機構においては、まずcAMPがAキナ-ゼをリン酸化し活性化し、活性型Aキナ-ゼがチロシンキナ-ゼをリン酸化し活性化し、活性化チロシンキナ-ゼが15Kタンパク質のチロシン残基をリン酸化することが明らかとなった。又この反応以後の機構についてはトリプシンがcAMP依存性のタンパク質のリン酸化とは別の経路で精子運動を開始させることが明らかになり、プロテア-ゼがタンパク質のリン酸化以後に働いて運動開始の最終的な引き金をひくことが示唆された。今年度に入って15Kタンパク質の抗体が完成したので、更なる精子運動開始機構の解明が進むものと期待される。精子運動活性化.走化性については、これ迄進められてきたニシン精子活性化物質の精製が完了した。更にユウレイボヤで卵由来の精子活性化物質の存在が精子運動測定装置Cell Softによる画像解析法によって確認され、精子活性化、走化性の解析が行なわれた。この物質は濾胞細胞やテスト細胞にはなく.卵本体の植物極側から放出させ、この場所へ精子を誘引することが明らかとなった。現在カラムクロマトグラフィ-法、高速液体クロマトグラフィ-法等を用いて、精子誘引物質の単離精製を試みている。サケ科魚類精子の運動開始機構に関して、従来の^<45>Ca取込みによる測定法に加え、guin2、fura2など蛍光指示薬を用い、精子運動開始時にCa^<2+>の流入の起る事を確認した。又NMR法、9amino acridineによる蛍光法で精子運動開始時に細胞内pHが激しく低下する事が明らかとなった。更に精子運動開始に伴いK^+の流出が起り、それによって膜電位が浅くなる、即ち過分極が起る事がTPP電極法によって明らかとなった。膜電位はCa^<2+>の存在下では、Ca^<2+>が流入するため若干脱分極側へ向く事も合わせて明らかとなった。カルモジュリン拮抗試薬によって、精子運動開始時にカルモジュリンが重要な役割を荷っていると考えられていたが、今回、電気泳動法により、又フォスフ.オジエステラーゼ活性の測定から、ニジマス精子には実際にカルモジュリンが存在する事を確かめた。CAMP-プロテインキナーゼ-15Kタンパク質の過程がCa^<2+>以後の精子運動開始の引き金を引く事が明らかになっているが、それ以後の過程については全く未解明である。最近、トリプシンがCAMPの有無にかかわりなく精子の運動開始を引き起す事が明らかとなった。トリプシン以外にもキモトリプシン、パパインが有効であり、エラステース、キモパパインは無効であった。更にプロテアーゼインヒビターであるダイズ豆トリプシンインヒビター、ロイペプチン、キモスタチン、ペプスタチンAは精子運動開始を阻害し、アンチパイン、E-64は阻害しないなどの結果から、ロイシンの様な無極性のアミノ酸を認識するプロテアーゼが精子運動開始に関与している可能性が強い。海産無脊椎動物、ホヤ、ウニ、ヒトデの精子運動開始に関しては、ホヤでK^+チャンネル、Ca^<2+>チャンネル阻害剤が精子運動を阻害する事から、サケ科魚類の場合と同様にイオンチャンネルの関与が考えられる。又、ウニにも精子運動開始の引き金タンパク質と考えられる15Kタンパク質が存在する事が確かめられた。低張の浸透圧が精子運動開始の最初の引き金をひくことが知られている両生類精子で、Ca^<2+>イオノフォア処理によって運動が停止し、Ca^<2+>を添加すると運動が再び開始すること、界面活性剤によって細胞膜を除去した、除膜モデル精子がCa^<2+>の存在下でのみ運動を開始することが明らかとなり、Ca^<2+>が両生類精子の運動開始の要因であることが示唆された。一方、両生類除膜精子ではcAMP.cGMP等のサイクリックヌクレオチドによっては運動開始が起こらないことも明らかとなり、昨年度の研究で明らかとなったサケ科魚類の精子運動開始機構であるK^+-cAMP系とは異なる機構、即ち浸透圧-Ca^<2+>系が両生類精子運動開始の引き金をひくことが明らかとなった。一方海産魚では高張の浸透圧が精子運動開始の引き金をひくことが、クサフグ精子を用いて明らかにされているが、今年度はヒガンフグ、カレイ系統の異なるヌタウナギ・深海性魚類ヨコエソなど様々な海産魚について調べ、高張の浸透圧が海産魚に共通の精子運動開始要因であることが明らかとなった。更にクサフグ、カレイ等の精子を用い、Ca^<2+>イオノフォア、除膜モデルの運動性に対するCa^<2+>の影響について調べられた。

精子運動活性化物質については、シロサケでは雌体膣液の物質がアルカリ性であり、精子内pHを上昇させ精子の活性化を促すことが示唆された。また、ニシン卵由来の精子活性化物質の精製がセファデックスカラムクロマトグラフィ-、等電点電気泳動法/を用いて進められ、まだ単一物質には至っていないものの相当精製された標品が得られてきた。サケ科魚類ではチロシンキナ-ゼによる15Kタンパク質のリン酸化が精子運動開始の最終段階であるが、今年度は大量に購入することの可能なシロサケ精子から、15Kタンパク質、チロシンキナ-ゼ、cAMP依存性プロテインキナ-ゼの精製が可能になり、今後のサケ科魚類精子運動開始機構の生化学的研究の展望を開いた。サケ科魚類精子の運動能獲得機構に関しては、これ迄intactの精子について調べてきたが、本年度はTriton xー100を用いて細胞膜を除去した精子について調べ、精子運動装置である軸糸においても運動能獲得現象があることを明らかにした。この軸糸の運動能獲得はintact精子における獲得より早期に起る。従ってサケ科魚類精子運動能獲得は軸糸と細胞膜で別々に起り、双方の完成によって十分に運動能を備えた精子となると考えられる。サケ科魚類の精子動運能開始については.まずcAMP依存性プロテインキナ-ゼ、チロシンキナ-ゼ、チロシンキナ-ゼ抗体の精子運動性に与える彰響とタンパク質のリン酸化に与える影響について検討し、精子運動開始のカスケ-ド機構においては、まずcAMPがAキナ-ゼをリン酸化し活性化し、活性型Aキナ-ゼがチロシンキナ-ゼをリン酸化し活性化し、活性化チロシンキナ-ゼが15Kタンパク質のチロシン残基をリン酸化することが明らかとなった。又この反応以後の機構についてはトリプシンがcAMP依存性のタンパク質のリン酸化とは別の経路で精子運動を開始させることが明らかになり、プロテア-ゼがタンパク質のリン酸化以後に働いて運動開始の最終的な引き金をひくことが示唆された。今年度に入って15Kタンパク質の抗体が完成したので、更なる精子運動開始機構の解明が進むものと期待される。精子運動活性化.走化性については、これ迄進められてきたニシン精子活性化物質の精製が完了した。更にユウレイボヤで卵由来の精子活性化物質の存在が精子運動測定装置Cell Softによる画像解析法によって確認され、精子活性化、走化性の解析が行なわれた。この物質は濾胞細胞やテスト細胞にはなく.卵本体の植物極側から放出させ、この場所へ精子を誘引することが明らかとなった。現在カラムクロマトグラフィ-法、高速液体クロマトグラフィ-法等を用いて、精子誘引物質の単離精製を試みている。
六角形モジュラーマルチレベルコンバータ構成の新しい三相交流電力変換システムの研究

本研究では,電力系統接続向けの三相/三相電力変換システムとして,六角形型MMC(H-MMC)による新しい回路構成とその制御方式について提案し,有効性の検証を行った。H-MMC回路と制御方式について理論解析を行い,電力管理とコンデンサ電圧の制御を含めたH-MMC制御手法および蓄電装置を付加したシステムの制御手法を提案した。提案方式について,回路解析ソフト(PSIM)によるシミュレーションによりその有効性を示した。さらに,ミニモデル作製及び制御プログラム開発(DSP,FPGA)を行い実験検証を進めた。実験により提案システムが定常,過渡状態において安定かつ適正に動作することを明らかにした。太陽発電システム等の分散型電源の普及やこれらを接続したスマートグリッドシステムの実用化を想定した場合に電力系統の電圧変動抑制や電力流量の制御が重要となる。このような電力系統の中継点に接続して,電力流量を制御するための三相/三相電力変換システムが重要となってくる。モジュラーマルチレベルコンバータ(MMC)は,変圧器を利用せず小型・軽量,マルチレベル出力による電圧の低歪み化および高電圧出力化などの利点があり,電力系統接続用の電力変換器に適している。本研究では,電力系統接続向けの三相/三相電力変換システムとして,六角形型MMC(H-MMC)による新しい回路構成とその制御方式について提案し,その有効性の検証を行う。H-MMCは単相変換器(セル)を直列に多段接続してモジュール化し,これらを環状接続した回路構成である。環状接続を6分割して六角形としたときの3端子を三相入力側,他の3端子を三相出力側として接続して三相/三相電力変換器として利用する。すべてのセルにはキャパシタが接続されており,この電圧を一定に保ちながら入力側と出力側との電力の授受を中継するように動作させる。これにより,入力側(電力系統上位側)と出力(電力系統上位側)の相互の電力変動を抑制・吸収しながら,電力流量を制御することができる。最初に本システムの回路と電力系統接続時のモデル化及び理論解析を行い,電力流量に関する基本動作を明らかにした。この動作原理に基づいて電力流量制御の制御方式を提案し,その動作解析を回路シミュレーションにより検証した。検証により,提案する方式が適正に動作することを明らかにした。次に動作検証のための実験システムの構築を行った。システムはH-MMCの主回路及びディジタル制御装置(DSP,FPGA)で構成し,主回路の作製および制御プログラムの作成を行い,目的とする基本動作が可能であることを確認した。前年度はモジュールのセル数を1アームあたり1つの計6つとした構成の実験装置を作製し動作が理論通りとなることを確認していたので,さらにセル数を増加したセル数12の回路を作製し,より実用的な構成で動作の検証を行った。実験装置はセル数12に対応した制御プログラムをディジタル制御装置(DSP,FPGA)用に作成した。このモデルの動作確認として,出力に負荷を接続した回路で三相/三相交流の電力変換動作について検証をし,必要なセルの電圧を一定に制御しながら目的の任意交流出力が可能であること,負荷の変動にも安定して動作可能であることを確認し,提案する方式がシミュレーションと同様に適正に動作することを明らかにした。今後はさらに出力側へ系統連系した際の動作検証,過渡応答の検証を進める。また,電力授受の調整を行うための蓄電装置を用いた回路と制御についても理論解析・シミュレーションを行い,理論通りに目的の動作が可能であることを確認した。このシステムを現実験システムに組み込むための回路を作製したので,今後これを利用した系統連系時の電力授受のバランスをとるための制御の実験検証を進める。研究計画に従って,提案するH-MMCの動作確認のための実験装置作製を行い,H-MMCの制御方式の動作検証を行った。提案する制御は,セルの電圧制御,入力側有効・無効電力制御,出力側有効・無効電力制御及び環状回路を循環させる電力の制御を統合して制御する方式で,この方式の基本動作を実験により検証した。制御に必要なプログラムは,DSP,FPGA用の制御プログラム(C言語プログラム,VHDLプログラム)を作成した。負荷は線形なリアクトル,抵抗負荷を接続して任意交流出力が可能であること,負荷の変動にも安定して動作可能であることを確認できたことから,実験検証により実用的なシステム動作の有効性を明らかにした。また,このシステムに組み込む蓄電システムを利用した回路の制御についても理論解析・シミュレーションにより検証した結果,目的とする動作が確認できたのでこれを現システムと組み合わせた実験を行うことができる。ここまでの実験システムで基本動作を確認できたことにより,今後,提案する制御の有効性を検証するための系統連系試験,系統・負荷変動などの過渡応答試験などに進めることができる。以上のことから,本研究は計画に沿って,おおむね順調に進展しているといえる。

モジュラーマルチレベルコンバータ(MMC)は,変圧器を利用せず小型・軽量,マルチレベル出力による電圧の低歪み化および高電圧出力化などの利点があり,電力系統接続用の電力変換器に適している。本研究では,電力系統接続向けの三相/三相電力変換システムとして,六角形型MMC(H-MMC)による新しい回路構成とその制御方式について提案し,その有効性の検証を行った。H-MMCは単相変換器(セル)を直列に多段接続してモジュール化し,これらを環状接続した回路構成である。環状接続を6分割して六角形としたときの3端子を三相入力側,他の3端子を三相出力側として接続して三相/三相電力変換器として利用する。前年度まではモジュールのセル数を1アームあたり1つの計6つとした構成の実験装置を作製し動作が理論通りとなることを確認し,さらにセル数を増加したセル数12の回路を作製し,より実用的な構成で動作の検証を行った。実験装置はセル数12に対応した制御プログラムをディジタル制御装置(DSP,FPGA)用に作成した。このモデルの動作確認として,出力に負荷を接続した回路で三相/三相交流の電力変換動作について検証をし,必要なセルの電圧を一定に制御しながら目的の任意交流出力が可能であることを確認し,提案する方式がシミュレーションと同様に適正に動作することを示した。さらに系統連系した際の動作検証として過渡応答の検証を進めた。過渡応答の条件として,系統入力側の電圧変動,負荷変動および出力周波数変動を与えた場合のH-MMCの動作検証を行い,いずれの条件でも安定に動作可能であることを確認した。また,電力授受の調整を行うための蓄電装置を用いた回路と制御についても理論解析・シミュレーションを行い,入力側の電力と出力のアンバランスに対して蓄電装置への充電・放電動作が適切に可能であることを確認した。本研究では,電力系統接続向けの三相/三相電力変換システムとして,六角形型MMC(H-MMC)による新しい回路構成とその制御方式について提案し,有効性の検証を行った。H-MMC回路と制御方式について理論解析を行い,電力管理とコンデンサ電圧の制御を含めたH-MMC制御手法および蓄電装置を付加したシステムの制御手法を提案した。提案方式について,回路解析ソフト(PSIM)によるシミュレーションによりその有効性を示した。さらに,ミニモデル作製及び制御プログラム開発(DSP,FPGA)を行い実験検証を進めた。実験により提案システムが定常,過渡状態において安定かつ適正に動作することを明らかにした。研究計画に従って,提案するH-MMCの回路構成と電力系統接続時のモデル化及び理論解析を行い,H-MMCに適した制御方式の提案を行った。提案する制御は,セルの電圧制御,入力側有効・無効電力制御,出力側有効・無効電力制御及び環状回路を循環させる電力の制御を統合して制御する方式で,この方式の動作を回路シミュレーションにより検証した。検証の結果,提案する制御が目的とする動作に有効であることを明らかにした。さらに,実験による動作検証を行うために実験システムの構築を行った。
細胞のバリアを攻略する海洋天然物の探索

生体膜をはじめとする生体バリアを透過できない水溶性生理活性物質は,細胞表面の受容体やイオンチャンネル等への作用,もしくは細胞膜の直接的な破壊などの戦略で活性を発揮する.一方で非常に巧妙な機構で膜を透過し組織や細胞内に侵入することで作用する物質もある.本研究では,生体膜などの生体のバリアを巧みに攻略する化合物に焦点を当て,それらの化合物がいかにして組織や細胞内に移行し標的分子に作用するのかを解明することで,天然物をベースとした薬物送達(ドラッグデリバリー)システムの開発に資する基盤的な知見を得る.さらに送達能の高い分子を天然より探索し,これまでにない薬物送達素子を発掘する.生体膜をはじめとする生体バリアを透過できない水溶性生理活性物質は,細胞表面の受容体やイオンチャンネル等への作用,もしくは細胞膜の直接的な破壊などの戦略で活性を発揮する.一方で非常に巧妙な機構で膜を透過し組織や細胞内に侵入することで作用する物質もある.本研究では,生体膜などの生体のバリアを巧みに攻略する化合物に焦点を当て,それらの化合物がいかにして組織や細胞内に移行し標的分子に作用するのかを解明することで,天然物をベースとした薬物送達(ドラッグデリバリー)システムの開発に資する基盤的な知見を得る.さらに送達能の高い分子を天然より探索し,これまでにない薬物送達素子を発掘する.
プチスポット総合研究-太平洋上部マントル不均質性の実態とマグマ生成過程の解明

本研究では、新種の火山プチスポットから採取された玄武岩について鉱物学的・地球化学的解析を行った。その結果、太平洋全域に及ぶ小規模な上部マントルの不均質性は、過去の大陸プレートを構成していたリサイクル物質に起因し、それらは予想以上に多種に渡ることが明らかになった。また、プチスポット火成活動は、太平洋全域で普遍的な現象であることが証明された。マグマの地球化学的なバリエーションは、起源物質の化学的特徴やマグマ生成から噴火に至る過程が小さな火山毎に異なることを示している。1、かんらん石の化学組成分析今までに得られたプチスポット火山の玄武岩について、Sobolev et al.(2007)で公表されている分析条件等を参照し、かんらん石結晶の特にNi,Mnに対して通常とは異なる高い電子線加速電圧と測定時間による分析ルーチンの確立を試みた。結果、高精度のデータを得るには、標準試料等の更なる検討が必要であることが判明し、目下データの高精度化に取り組んでいる。2、リサイクル物質の特定今までに化学組成が明らかになっているプチスポット火山の玄武岩について、初生マグマの微量元素組成を求め、予想されるリサイクル物質の微量元素組成を仮定した溶融モデリングの結果と比較したところ、沈み込んだ海洋性地殻の溶融では、プチスポットマグマ組成を説明することができないことが明らかとなった。同時に、可能性の高い物質として大陸下部地殻(e.g., Rapp and Watson, 1995)もしくは交代作用を受けたリソスフェアマントル(e.g., Pilet et al., 2008)が挙げられる。3、新たなプチスポット火山から得られた玄武岩の分析研究船かいれいKR07-06次航海で得られたプチスポット火山の玄武岩、およびKR07-07次航海によって新たに発見されたプチスポット火山の玄武岩に対して、鉱物化学分析・全岩主要および微量元素組成分析とSr-Nd同位体組成分析を行った。その結果、後者の化学組成は、これまでに見つかっていたプチスポット火山の玄武岩(前者を含む)とは異なることが判明した。以上の結果は、後者の起源となったリサイクル物質および溶融条件が、前者のものとは異なることを示している。2および3の成果すなわち、ア)海洋地殻の地球深部からのリサイクリングが否定されたこと、イ)異なるリサイクル物質の存在は、太平洋上部マントル不均質性の起源のみならず、全地球規模の物質循環を理解する上で、極めて重大な制約である。上記1の結果や、同位体組成の時間発展モデリングおよび実験岩石学の結果(e.g., Pilet et al., 2008)と併せて、更に詳細に解析する必要がある。かんらん石の化学組成分析については、高い電子線加速電圧と長い測定時間により高精度のデータを得る分析ルーチンを確立した。この分析法により、マグマから晶出したかんらん石は、Niの含有量が高くMnの含有量が低い(低Mn/Fe)ことが判明し、マグマ生成に対するリサイクル物質の寄与程度は、80-90%以上と見積もられた。新たなプチスポット火山の全岩化学組成データを、上記の高精度かんらん石データを踏まえて解析した結果、北西太平洋で活動する多数の火山群は、起源物質の違いで大きく2種類に分類されるものの、火山毎に、ア)起源物質のわずかな組成変化があり、イ)同時に部分溶融度も異なること、が定性的に示された。つまり、小さな火山毎に、起源物質の性質とマグマ生成から噴火に至る過程は独立しており、個性豊かな独自のマグマシステムを形成している。マグマ起源物質については、これまでに、大陸下部地殻もしくは交代作用を受けたリソスフェアマントルである可能性が高いことが判明していたが、火山毎に起源物質の組成や部分溶融度が異なるという上記の結果を踏まえると、出発物質の組成を仮定した溶融モデリングでは、全ての火山に対して統一的かつ定量的な起源物質の特定には至らなかった。ただし見方を変えると、太平洋上部マントルの小規模な不均質性(Machida et al.,2009)が、予想以上に多種のリサイクル物質に起因するという実態が明らかになったと捉えることができ、この事は、全地球の物質循環を理解するうえで重大な制約を与える成果である。以上に加え、チリ海溝沖の太平洋で発見した複数の海丘より得られた玄武岩の全岩化学組成とSr-Nd同位体組成分析を行った。その結果、これらの海丘がいずれもプチスポット火山であることが確認され、北西太平洋で2種類に大別された火山の1つに対応することが判明した。つまり、プチスポット火山活動は、少なくとも太平洋では普遍的な現象であると同時に、小規模マントル不均質が太平洋全域に及ぶことが証明された。
骨・軟骨形成における、一次繊毛関連蛋白ＢＢＳ３の分子機能解析

一次繊毛は細胞外へ突出したアンテナ様細胞小器官であり、ヘッジホッグシグナルを含む様々なシグナル伝達への関与や、細胞外の力学的・化学的情報を細胞内へと伝えるセンサーとして機能すると考えられている。しかし、骨格発生における一次繊毛の機能は未だ十分に理解されていない。本研究は、Bardet-Biedl Syndromeの原因遺伝子であるBBS3という分子に着目し、そのノックアウトマウス(Bbs3 KOマウス)の骨格発生を検討することを目的とした。我々はこれまでにBbs3 KOマウスには特徴的な頭蓋顔面領域の形態異常が観察されること、また顔面正中部の構造が低形成であることを示した。当該年度においては、胎生発生期の頭蓋顔面領域におけるBBS3の発現パターンを検討した。その結果、BBS3は胎生期12.5日目に頭蓋底正中部に出現する鋳型(外肺葉性間葉細胞の凝集)の背側に強く発現することが明らかとなった。頭蓋底の形成には両側から正中部への細胞遊走が必要であるが、Bbs3をノックダウンした細胞では、細胞遊走能が低下していたことから、BBS3 KOマウスの頭蓋顔面領域における正中部の低形成は、正中部への細胞遊走能の低下が原因であると示唆される。27年度が最終年度であるため、記入しない。骨の細胞において、動的な細胞外マトリックスからの化学的・力学的情報を細胞内へ伝えるメカニズムは、多くの研究から明らかになりつつある。昨今、骨・軟骨形成や代謝における一次繊毛の役割が注目されている。一次繊毛は、骨芽細胞・軟骨細胞を含むほ乳類のほとんどの細胞に存在する細胞小器官であり、Hedgehog (Hh)シグナルやWntシグナルを初めとする様々な細胞内シグナルに関与すると共に、細胞外の力学的負荷を感知するメカノセンサーとして働くことも示唆されている。現在までに、一次繊毛の存在が正常な軟骨内骨化や力学的負荷の骨形成促進作用に必要とされることが報告されているが、一次繊毛を介した細胞内シグナル伝達のメカニズムについては、未だ不明な点が多い。本研究では、一次繊毛関連タンパクBardet-Biedl Syndrome (BBS)に着目し、骨芽細胞・軟骨細胞においてBBSタンパクを介した一次繊毛の働きを明らかにすることを目的としている。平成26年度の研究より、胎生期18.5のBbs3 KOマウスの胸骨上下のズレが観察された。また、頭部のμCT解析より、Bbs3 KOマウスは頭蓋顎顔面領域における変形が観察された。胸骨の上下のズレは、一次繊毛内関連モータータンパクの構成ユニット、Kif3aのコンディショナルノックアウトマウスにおいても観察される(Dev Biol, 2007Sep 15 ; 309 (2) : 273-84)。また、Wntシグナルの阻害因子Gsk 3betaのノックアウトマウスでも胸骨の不完全融合とズレが観察される(Nature, 2007 Mar 1 ; 446 (7131) : 79-82)。これらのことから、Bbs3を介した一次繊毛の機能は、HhシグナルやWntを制御することが考えられる。HhシグナルおよびWntシグナルにおけるBBSタンパクの関与は以前から示唆されているが、そのメカニズムについては未だ明らかになっていない。他のBBSノックアウトマウスでは、骨格形成を検証した報告はないため、Bbs3 KOマウスに観察された胸骨と頭蓋顔面の表現形を明らかにしたのは、本研究が初めてである。一次繊毛は多彩な機能を有し、骨構成細胞において細胞外のシグナルを受容するケモセンサー(化学刺激受容器)やメカノセンサー(機械刺激受容器)として機能することが示唆されるが、その詳細なメカニズムは明らかになっていない。我々は、一次繊毛の機能に関わるBBS3に着目し、BBS3欠損下におけるマウスの骨表現の解析を進めている。Bbs3ノックアウトマウスはメンデルの法則に従って出生するが、生後2-3時間以内にチアノーゼを呈して死亡した。Bbs3ノックアウトマウスの心臓において中隔欠損が観察されたことから、Bbs3ノックアウトマウスの死因は先天性心疾患によるものと考えられる。胎生期18.5マウスの頭部骨格をμCTを用いて解析したところ、Bbs3ノックアウトマウスの頭蓋底正中部では蝶形骨の低形成や上顎骨の異形成が観察された。一方、後頭骨の形態や石灰化に異常は認められなかった。アリザリンレッドおよびアルシアンブルーを用いた骨格標本から、Bbs3ノックアウトマウスの頭蓋底では、蝶形骨間軟骨結合および蝶形骨・後頭骨間軟骨結合が正中部において融合していないことがわかった。また、歯胚の欠損や口蓋裂、胸骨の非対称性融合が高い浸透率で観察された。一方、下顎骨、頭蓋骨、四肢長管骨における骨格形成異常は観察されなかった。組織学的解析から、頭蓋底形成の鋳型となる左右一対の梁軟骨は形成される一方、その正中部は融合せず、繊維芽細胞を含む結合組織で充たされていた。以上の結果から、頭蓋顔面領域の発生過程において、Bbs3は頭蓋底正中部の形成に重要な役割を担うことが明らかにされた。今後、なぜBbs3非存在下では梁軟骨の正中部における融合が進まないか検討をしていく予定である。

一次繊毛は細胞外へ突出したアンテナ様細胞小器官であり、ヘッジホッグシグナルを含む様々なシグナル伝達への関与や、細胞外の力学的・化学的情報を細胞内へと伝えるセンサーとして機能すると考えられている。しかし、骨格発生における一次繊毛の機能は未だ十分に理解されていない。本研究は、Bardet-Biedl Syndromeの原因遺伝子であるBBS3という分子に着目し、そのノックアウトマウス(Bbs3 KOマウス)の骨格発生を検討することを目的とした。我々はこれまでにBbs3 KOマウスには特徴的な頭蓋顔面領域の形態異常が観察されること、また顔面正中部の構造が低形成であることを示した。当該年度においては、胎生発生期の頭蓋顔面領域におけるBBS3の発現パターンを検討した。その結果、BBS3は胎生期12.5日目に頭蓋底正中部に出現する鋳型(外肺葉性間葉細胞の凝集)の背側に強く発現することが明らかとなった。頭蓋底の形成には両側から正中部への細胞遊走が必要であるが、Bbs3をノックダウンした細胞では、細胞遊走能が低下していたことから、BBS3 KOマウスの頭蓋顔面領域における正中部の低形成は、正中部への細胞遊走能の低下が原因であると示唆される。当初の研究計画では、骨代謝におけるBBS3の役割を検討する予定であったが、マウスの遺伝的バックグランウンドをC57BL/6へ統一したことにより、Bbs3ノックアウトマウスが新生児致死を示したことから、当初の予定通りに実験を進めることができなかった。しかしながら、Bbs3ノックアウトマウスの死因を探求するプロセスにおいて、頭蓋顔面領域の骨格形成異常や先天性心疾患、胸骨の非対称性融合など、注目すべき表現形を見いだすことができたことから、研究が大きく進展した。現在は研究の方向性が定まり、おおむね順調に進展していると判断できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、胎生期10.5-14.5における梁軟骨発生および正中部での融合に着目し、組織学的手法により解析を行う。またwhole mount embyroを用いたin situ hybridizationにより、Bbs3ノックアウトマウスの頭蓋底においてどのような遺伝子の発現パターンが変化しているか検証する。in vitroの実験系では、培養軟骨細胞ATDC5細胞においてsiRNAによりBbs3をノックダウンし、細胞の遊走能やソニックヘッジホッグに対する走化性について検証する。当初の予定通り、Bbs3マウスおよびBbs1 floxマウスのバックグラウンドの均一化は完了しており、Bbs3-/-マウスすでに解析を開始している。Bbs1コンディショナルノックアウトマウスは、現在骨解析を始める段階にある。培養細胞を用いた実験では、Bbs3がヘッジホッグシグナルを正に制御することを示す予備的な実験結果を得ている。Bbs3-/-マウスの生後致死が、生後の骨の解析を阻んでいるが、全体的には概ね順調に進展している。今後はBbs3-/-マウスの頭蓋顎顔面領域における表現形を、μCT解析・骨格標本により明らかにしていく。また、Bbs3 KOマウスの出生後致死の解明をすすめると同時に、兄弟の間引きや里親の供給などによりBbs3-/-マウスの出生後生存率を上げ、生後の骨の解析の実現を目標とする。Bbs1コンディショナルノックアウトマウスの骨解析は、8週齢のマウスを用いて行う。
台地・谷地境界域における地下水流動系、湧出形態と硝酸性窒素の自然浄化ゾーン

硝酸性窒素が地下水の環境基準に指定されたが、硝酸性窒素の主要な負荷源が農業活動を中心とした非特定汚染源・面源で、硝酸性窒素の実効的な浄化方法がない。水田や湿地などには自然の浄化機能があるとされており、汚染対策としての役割が期待されている。しかし、湿地などの浄化機能については、必ずしもそのプロセスが明らかになっていない。本研究では、「台地-谷地の地形・地質条件により地下水流動系における浄化ゾーンの位置・範囲が規定され、台地部で汚染された地下水が流出する位置・経路・形態により汚染されたままあるいは浄化されて流出して来るという相違が生じる」という仮説を検証し、その条件・プロセスを明らかにしようとするものである。硝酸性窒素がある程度高濃度で検出され、数多く観測井を設置できる研究対象地域として、つくば市内の台地末端斜面(谷地と谷地間の尾根部)にプロットを設定し、100本余りの観測井・ピエゾメータ(最深12m)を掘削し、地質構造を明らかにし、3次元的な地下水の流動と水質(NO_3^-、Cl^-、SO_4^<2->、HCO_3^-、Na^+、K^+、Ca^<2+>、Mg^<2+>、Fe、Mn、ORP、DO、EC、DOCなど)の変動を観測している。地下水は、台地部から低地部へ流動するが、谷地の谷頭と末端の流出域で上向きの流れが生じている。谷地の谷頭での上向き流は、高濃度の硝酸イオンを表層部へ輸送する役割を果たしているが、末端部の上向き流は清浄で、還元的な地下水を供給し、一般に浄化に寄与している。2地域において硝酸性窒素の浄化ゾーンを特定できた。浄化ゾーンは、末端斜面では砂層とローム層の境界で、谷地では再積成粘土層の直下に谷地に沿って馬蹄形で、薄いシート状に存在していた。主要な浄化プロセスは有機炭素を電子供与体とする脱窒であると考えられ、硫化物を供与体とする反応はほとんどみられないようである。この浄化ゾーンの季節的な伸縮などについては、地下水位の変動に伴う還元域からの有機物を含む水の供給量の多寡によることが判明した。尾根部の上部は酸化的な涵養域であるが、下部は周辺のポテンシャル分布により地下水が尾根部を横断して、汚染物質を輸送することもある。また、比較のためつくばの緩斜面やカナダの例についても比較検討した。湧水のタイプとして、浸み出し型、湧き出し型、パイプ流型が存在し、浸み出し型は自然浄化を受けやすく、パイプ流型は高濃度の場合が多く、湧き出し型は流動経路と浄化ゾーンに依存する。

硝酸性窒素が地下水の環境基準に指定されたが、硝酸性窒素の主要な負荷源が農業活動を中心とした非特定汚染源・面源であるため、また硝酸性窒素の実効的な浄化方法がない。水田や湿地などには自然の浄化機能があるとされており、汚染対策としての役割が期待されている。しかしながら、湿地などの浄化機能については、必ずしもそのプロセスが明らかになっていない。本研究では、「台地-谷地の地形・地質条件により地下水流動系における浄化ゾーンの位置・範囲が規定され、台地部で汚染された地下水が湧出する位置・経路・形態により汚染されたままあるいは浄化されて流出して来るという相違が生じる」という仮説を検証し、その条件・プロセスを明らかにしようとするものである。本年度は硝酸性窒素がある程度高濃度で検出され、数多く観測井を設置できる研究対象地域としてつくば市内の一地区を新たに選定した。基礎となる地下水の流動を3次元的に把握するため、平面的に分布する観測井(ピエゾメータ)とともに深度の異なる観測井を、現在40本ほど設置し、3次元的に地下水ポテンシャル、水質を測定し始めている。多様な地質構造と地下水流動系、台地上の畑地からの硝酸性窒素、浄化帯の存在などが明らかになってきており、次年度以降、詳細な観測と解析により上記の仮説を検証し、その条件・プロセスを解明する予定である。硝酸性窒素が地下水の環境基準に指定されたが、硝酸性窒素の主要な負荷源が農業活動を中心とした非特定汚染源・面源で、硝酸性窒素の実効的な浄化方法がない。しかし、湿地などの浄化機能については、必ずしもそのプロセスが明らかになっていない。本研究では、「台地-谷地の地形・地質条件により地下水流動系における浄化ゾーンの位置・範囲が規定され、台地部で汚染された地下水が流出する位置・経路・形態により汚染されたままあるいは浄化されて流出して来るという相違が生じる」という仮説を検証し、その条件・プロセスを明らかにしようとするものである。硝酸性窒素がある程度高濃度で検出され、数多く観測井を設置できる研究対象地域として、つくば市内に2ヶ所のプロット(台地末端斜面と谷地)を設定し、それぞれ100本余りの観測井・ピエゾメータ(最深12m)を掘削し、地質構造を明らかにし、3次元的な地下水の流動と水質(NO_3^-、Cl^-、SO_4^<2->、HCO_3^-、Na^+、K^+、Ca^<2+>、Mg^<2+>、Fe、Mn、ORP、DO、EC、DOCなど)の変動を観測している。地下水は、台地部から低地部へ流動するが、谷地の谷頭と末端の流出域で上向きの流れが生じている。谷地の谷頭での上向き流は、高濃度の硝酸イオンを表層部へ輸送する役割を果たしているが、末端部の上向き流は清浄で、還元的な地下水を供給し、一般に浄化に寄与している。2地域において硝酸性窒素の浄化ゾーンを特定することができた。浄化ゾーンは、末端斜面では砂層とローム層の境界で、谷地では再積成粘土層の直下に谷地に沿って馬蹄形で、薄いシート状に存在していた。主要な浄化プロセスは有機炭素を電子供与体とする脱窒であると考えられ、硫化物を供与体とする反応はほとんどみられないようである。なお、地下水流動に関連していると考えられる浄化ゾーンの季節的な伸縮などについては、最終年度に解明する予定である。また、比較のためカナダの例についても若干検討した。硝酸性窒素が地下水の環境基準に指定されたが、硝酸性窒素の主要な負荷源が農業活動を中心とした非時定汚染源・面源で、硝酸性窒素の実効的な浄化方法がない。
造血早期運命決定の分子メカニズムと生物学的意義の解明

血球は様々な機能を持つ多様な細胞集団で構成されており、酸素供給・組織恒常性維持・生体防御などに極めて重要な役割がある。樹状細胞は造血幹細胞(全ての血球細胞のもとになる細胞)に由来し、病原体や腫瘍に対する免疫応答に必須の血球細胞である。最近の我々の研究により造血幹細胞に近い上流の多能性前駆細胞集団の中に樹状細胞に特化した分化能(成熟した血球細胞を産生する能力)を示す細胞が存在することがわかった。この結果は樹状細胞への運命決定が造血の早期段階でも起こりうることを示している。本研究ではこのような造血早期における樹状細胞分化制御の仕組みや免疫学的な意義を明らかにすることを目的とする。
生体防御コレクチンCL-K1の3MC症候群の病態への関与とその分子機構の解明

コレクチンは、自然免疫機能を有することが明らかにされているカルシウム要求性のレクチンである。コレクチンの一つであるCL-K1は、従来のコレクチンと同様、自然免疫機能を有することが明らかにされている。近年、CL-K1の遺伝子欠損と3MC症候群の病態との間に関連性が見い出され、CL-K1が自然免疫機能だけでなく、個体発生および成長発育に関与する可能性が示唆された。本研究の目的は、3MC症候群の治療法確立の可能性を模索するため、これまで自然免疫分子として捉えられてきたCL-K1の個体発生や成長発育に関する知見を得ることである。平成30年度は平成29年度に引き続きCL-K1と相互作用する新規分子の探索を行った。CL-K1を含むコレクチンは、分子内に持つコラーゲンドメインおよびジスルフィド結合を介して3、6、9量体のようにホモオリゴマーを形成することが明らかとなっている。CL-K1は別のコレクチンCL-L1と類似した遺伝子構造をとっていることから、CL-K1がCL-L1とヘテロ複合体を形成している可能性を考えた。CL-K1とCL-L1を培養細胞中で共発現し、培養上清中に分泌されたCL-K1を抗CL-K1抗体を用いたプルダウン法によって回収し、この回収したCL-K1画分からCL-L1を検出することができた。一方、別のコレクチンであるMBLを比較対象としてCL-K1と共発現させたが、得られたCL-K1画分からはMBLは検出されなかった。このことから、CL-K1は生体内においてCL-L1とヘテロ複合体を形成していることを本研究で示唆することができた。コレクチンCL-K1は、これまでに報告されている従来のコレクチンと同様、自然免疫機能を有することが明らかにされている。しかし、近年、ホモ接合体マッピング法を用いた常染色体遺伝子病のゲノム解析の結果から、CL-K1の遺伝子欠損と3MC症候群の病態との間に関連性が見い出されており、CL-K1が自然免疫機能だけでなく、個体発生および成長発育に関与している可能性が示唆されている。3MC症候群の治療法確立の可能性を模索するため、これまで自然免疫分子として捉えられてきたCL-K1の新規機能(個体発生および成長発育)に関する知見を得ることが本研究の目的である。申請者は、コレクチンCL-K1の3MC症候群の病態への関与を明らかにするため、CL-K1遺伝子ノックアウトマウス(CL-K1 KOマウス)の表現型解析を中心的に行った。3MC症候群では骨形成に異常が認められているため、平成28年度は、解析用にCL-K1 KOマウスを増やすことを行い、小動物用のX線断層撮影装置を用いてCL-K1 KOマウスと野生型マウスの骨の3次元画像解析を行った。その結果、CL-K1 KOマウスは、野生型マウスでは認められないような、骨形成の異常を示すデータが得られた。また、3MC症候群の病態を分子レベルで理解するため、CL-K1と相互作用する分子の探索に関して検討を進めた。平成28年度は、相互作用分子の探索に必要な精製CL-K1画分を得るため、ヒト血漿からCL-K1を精製する方法を模索した。結果として、当研究室で作製した抗CL-K1抗体を架橋させた抗体カラムを作製することによって、血漿からCL-K1を精製することに成功した。目標としていたCL-K1 KOマウスの表現型解析において、骨格異常を示すデータを得ることが出来た。また、ヒト血漿中のCL-K1の精製法を確立することが出来た。コレクチンCL-K1は、自然免疫機能を有することが明らかにされているカルシウム要求性のレクチンであり、これは、これまでに報告されている従来のコレクチンと同様である。しかし、ホモ接合体マッピング法を用いた常染色体遺伝子病のゲノム解析の結果、CL-K1の遺伝子欠損と3MC症候群の病態との間に関連性が見い出され、CL-K1が自然免疫機能だけでなく、個体発生および成長発育に関与する可能性が示唆されているが、その分子機構は未だ不明である。平成29年度は、3MC症候群の病態とCL-K1欠損との関連性を調べるため、CL-K1欠損マウスの表現型解析として、マウス臓器の組織切片を作製し、形態観察を行った。その結果、CL-K1欠損マウスでは、野生型マウスでは認められないような、臓器形態の異常を示すデータが得られた。また、3MC症候群の発症メカニズムの全貌を明らかにするため、CL-K1と相互作用する新規分子の探索を行った。まず、抗CL-K1抗体を架橋させた抗体カラムを用いて血漿からCL-K1を精製した。次に、この精製CL-K1画分に含まれる共沈タンパク質の同定を試みたが、想定していたよりもCL-K1の精製純度が悪く、回収量も少なかったため、新規CL-K1相互作用分子を同定するには至らなかった。今後はCL-K1の純度、回収量を改善する方法を検討するか、あるいは相互作用分子の探索方法の変更も視野に入れつつ、3MC症候群の発症メカニズムの全貌解明に迫りたい。

3MC症候群の発症メカニズムの全貌を明らかにするため、3MC症候群の病態と関連性が示唆されているコレクチンCL-K1に着目した。平成29年度は、CL-K1相互作用分子の解析を行ったが、CL-K1の回収量が少なく、相互作用分子の探索が難航したため、想定していたよりも研究が遅れた。コレクチンは、自然免疫機能を有することが明らかにされているカルシウム要求性のレクチンである。コレクチンの一つであるCL-K1は、従来のコレクチンと同様、自然免疫機能を有することが明らかにされている。近年、CL-K1の遺伝子欠損と3MC症候群の病態との間に関連性が見い出され、CL-K1が自然免疫機能だけでなく、個体発生および成長発育に関与する可能性が示唆された。本研究の目的は、3MC症候群の治療法確立の可能性を模索するため、これまで自然免疫分子として捉えられてきたCL-K1の個体発生や成長発育に関する知見を得ることである。平成30年度は平成29年度に引き続きCL-K1と相互作用する新規分子の探索を行った。CL-K1を含むコレクチンは、分子内に持つコラーゲンドメインおよびジスルフィド結合を介して3、6、9量体のようにホモオリゴマーを形成することが明らかとなっている。CL-K1は別のコレクチンCL-L1と類似した遺伝子構造をとっていることから、CL-K1がCL-L1とヘテロ複合体を形成している可能性を考えた。CL-K1とCL-L1を培養細胞中で共発現し、培養上清中に分泌されたCL-K1を抗CL-K1抗体を用いたプルダウン法によって回収し、この回収したCL-K1画分からCL-L1を検出することができた。一方、別のコレクチンであるMBLを比較対象としてCL-K1と共発現させたが、得られたCL-K1画分からはMBLは検出されなかった。このことから、CL-K1は生体内においてCL-L1とヘテロ複合体を形成していることを本研究で示唆することができた。骨形成の異常がCL-K1 KOマウスにおいて認められたが、3MC症候群では他にも様々な形態形成異常が認められるため、これらの異常とCL-K1欠損との関連性の有無を明らかにする。また、CL-K1と相互作用する分子の探索を行うことで、3MC症候群発症に関連する因子の全貌解明を目指す。CL-K1の回収量を増やせるよう改善策を考え、CL-K1相互作用分子の同定を目指す。これにより、3MC症候群の病態に関連する分子の全貌を明らかにしていきたい。当初予定していた計画通りに研究を進めたが、CL-K1と相互作用する分子の探索に関して、CL-K1を精製する方法の確立に想定していたよりも時間を要してしまった。そのため、次年度繰越金が発生した。3MC症候群の病態と関連性が示唆されているコレクチンCL-K1に着目し、CL-K1の精製およびCL-K1相互作用分子の探索を計画していたが、想定していたよりもCL-K1の収量が少なく、研究方法の変更を余儀なくされ、想定よりも支出額が少なくなった。次年度の研究費として使用させていただきます。次年度の物品費として使用させていただきます。
BMPアンタゴニストの制御による歯槽骨増成促進方法の開発

本研究はBMPによる骨形成過程で発現するBMPアンタゴニストを同定し,その機能を抑制することにより骨形成を促進させる方法を開発するものである.本研究においてBMPのアンタゴニストの一つであるSOSTの遺伝子発現を抑制することによりヒト骨髄由来間質細胞の骨芽細胞への分化が有意に促進されることを明らかとした本研究はBMPによる骨形成過程で発現するBMPアンタゴニストを同定し,その機能を抑制することにより骨形成を促進させる方法を開発するものである.本研究においてBMPのアンタゴニストの一つであるSOSTの遺伝子発現を抑制することによりヒト骨髄由来間質細胞の骨芽細胞への分化が有意に促進されることを明らかとした本研究は骨形成タンパク(BMP)による骨形成過程で発現するBMPアンタゴニストを同定し,その機能を抑制することによりBMPによる骨形成を促進させる方法を開発するものである.本年度はその手始めとしてヒト骨髄由来間質細胞(hBMSC)に対するBMP-2の作用を検討するとともにhBMSCが骨芽細胞へ分化する過程において発現しているBMPアンタゴニストの同定を行い,以下の知見を得た.hBMSCをBMP-2で刺激すると,Smadタンパクのリン酸化が亢進した.また,アルカリホスファターゼ活性も濃度依存的に上昇した.次に,BMP-2刺激時のBMPアンタゴニストの遺伝子発現をリアルタイムRT-PCRで検討したところ,BMP-2刺激によりChordin, Chordin like-1, Choedin like-2, SOST, NogginなどのBMPアンタゴニストの遺伝子発現が亢進した.さらにBMPシグナルの抑制因子であるSmad6, Smad7の遺伝子発現も亢進した.一方,炎症性サイトカインであるTNF-alphaとの同時刺激によってNogginやSmadの遺伝子発現は著しく抑制された.以上よりBMP-2はhBMSCにも直接作用し,骨芽細胞分化シグナルを亢進させることが明らかとなった.一方で,骨芽細胞分化を抑制するシグナルの増強も認められたことから,hBMSCにおいてはBMP-2刺激による骨芽細胞分化は負のフィードバック機構により抑制されている可能性が示唆された.また,これら負のフィードバック機構の一部はTNF-aphaによって抑制されることから,BMP-2とTNF-alphaを併用することで効果的な骨造成ができる可能性が示唆された.本研究は,BMPによる骨形成過程で発現するBMPアンタゴニストを同定し,その機能を抑制することによりBMPによる骨形成を促進させる方法を開発する目的で実施された.ヒト骨髄由来間質細胞(hBMSC)をBMP-2で刺激すると,BMPアンタゴニストであるSOSTの遺伝子発現が有意に亢進することが明らかとなった.そこで,SOSTの発現をsiRNAで抑制した状態でhBMSCの骨芽細胞分化誘導を行うとアルカリホスファターゼ活性の上昇やアリザリンレッドによる染色性の亢進が認められた.すなわちhBMSCにおいてSOSTの発現を抑制することによりBMP-2による骨芽細胞分化が促進されることが明らかとなった.さらに,前年度にBMPアンタゴニストの抑制因子の一つであると明らかとしたTNF-aとの相互作用についても検討を加えた.hBMSCにTNF-a(40ng/mL)を作用させても細胞増殖は抑制されなかった.また,BMP-2(300ng/mL)によって誘導されるRunx2やOsterix, ALPの遺伝子発現はTNF-aとの同時刺激により強く抑制され,アルカリホスファターゼ活性やアリザリンレッドの染色性も有意に抑制された.以上からhBMSCにおいてはSOSTなどのBMPアンタゴニストの発現を抑制することにより骨芽細胞誘導が促進できること,また,TNF-aはBMPアンタゴニストの遺伝子発現を抑制するもののBMP-2による骨芽細胞分化も有意に抑制することが明らかとなった.今後はBMP-2による骨形成をより確実なものにするためにはTNF-aのシグナルを制御することも有効な手段の一つであることが示唆された.
次世代スマートデバイスに向けた新材料半導体ナノワイヤ発光素子の要素技術開発

本研究では、将来更なる需要が予測される次世代スマートデバイス用光源創成に向け、半導体ナノワイヤの結晶成長技術を開発するとともに新材料を有するナノ発光デバイスの作製技術の確立とデバイス動作実証を目的とする。具体的には、可視光域で動作するワイドギャップ半導体ナノワイヤ構造の結晶成長技術を確立するとともに、光学・構造評価を通じ物理物性の理解を深める。次に、絶縁膜・電極形成技術等、電流注入型ナノワイヤ光デバイス構造の作製プロセス技術の確立を図り、ナノワイヤ光デバイスの大きな特徴である、極小光モード体積及び出力光の高指向性を最大限に生かした新機能ナノ光デバイス発現に向けた基盤技術を開拓する。
X線構造に基づくクロストリジウム属特異的溶菌酵素の細胞壁認識分解機構の解明

グラム陽性菌は強固な細胞壁を持ち,細胞の形態を保持している。細菌細胞壁は,グリカン鎖をペプチド鎖が架橋した網目構造の高分子ペプチドグリカンを主要骨格とする。オートライシンは細胞壁ペプチドグリカンを部分的に加水分解する酵素で,細胞分裂・成長を調整する。ウェルシュ菌オートライシン触媒ドメインの立体構造をX線結晶構造解析により決定し,細胞壁分解機構について新たな知見を得た。グラム陽性菌の宿主細胞への感染は,細胞表面にある多種類の表面タンパク質が関与しており,Sortaseと呼ばれる酵素により細胞壁に固定化される。ウェルシュ菌Sortase Bの立体構造をX線結晶構造解析により決定した。細菌は,網目構造の高分子ペプチドグリカンからなる強固な細胞壁により細胞の形態を保持している。溶菌酵素は,細胞壁を分解することにより細菌を死滅させる。病原性クロストリジウム属細菌に働く溶菌酵素は,ペプチドグリカン分解ドメイン(触媒ドメイン)と細胞壁結合ドメインを持ち,その溶菌活性は極めて種特異的である。本研究の目的は,クロストリジウム属特異的溶菌酵素について,細胞壁フラグメントとの複合体のX線結晶解析を行い,種特異的な細胞壁認識分解機構を分子レベルで解明することである。食中毒やガス壊疽の原因となるクロストリジウム属のウェルシュ菌が持つオートライシンAcp(Autolysin Clostridium perfringens)は,アミノ酸配列から,N末側にバクテリアSH3ドメイン構造モチーフのドメインが10個つながった細胞壁結合ドメインと,C末側にGH73(グルコサミニダーゼ)に属する触媒ドメインを持つことが予想され,その3次元構造および細胞壁認識機構には大変興味が持たれる。平成27年度においては, Acpの触媒ドメイン(AcpCD)について,X線結晶解析により2.25Å分解能で3次元構造を決定することに成功した。AcpCDの構造は,8本のαへリックスからなる本体のドメイン(αドメイン,203アミノ酸)と,そこからアーム状に突き出たドメイン(アームドメイン,68アミノ酸)からなる。αドメインの構造は,他のGH73に属するタンパク質と相同性が高く,予想される活性部位は,αドメインとアームドメインとの間に位置している。このことから,AcpCDは,基質であるペプチドグリカンを,両方のドメインで挟むように認識して加水分解することが予想される。細菌は,網目構造のペプチドグリカンからなる強固な細胞壁により細胞の形態を保持している。溶菌酵素は,細胞壁を分解し細菌を死滅させたり,部分的に分解することにより細胞分裂を助けたりする。本研究の目的は,クロストリジウム属特異的溶菌酵素についてX線結晶解析を行い,3次元構造情報から種特異的な細胞壁認識分解機構を分子レベルで解明することである。食中毒やガス壊疽の原因となるクロストリジウム属のウェルシュ菌が持つオートライシン(Clostridium perfringens Autolysin, Acp)は,N末側にSH3構造モチーフのサブドメインが10個タンデムにつながっている細胞壁結合ドメインと,C末側にGH73(グルコサミニダーゼ)に属する触媒ドメインを持つ溶菌酵素である。平成28年度は,Acpの触媒ドメイン(AcpCD)の高分解能(1.76 A分解能)X線結晶解析に成功した。AcpCDは,三日月型の構造で,その中心に深い溝を基質結合部位として持つ。この溝の形と幅がグルコサミニダーゼ活性と深く関わっていることがわかった。基質が結合した構造のモデリングから活性残基を予想することができ,それらのアミノ酸変異を行い,AcpCDの基質認識・活性触媒機構について新たな知見を得た。これらの成果は学術誌に報告した(FEBS Lett. (2017) 591, 231-239)。また,細胞壁構造を認識する酵素として,ウェルシュ菌ソーテースB(CpSrtB)の1.90 A分解能のX線結晶解析に成功した。CpSrtBは,細胞表面タンパク質を基質とし,これを細胞壁に結合させる酵素であり,構造解析の結果から基質を認識する部位を予想することができた。AcpCDの3次元構造をX線結晶解析により決定し,クロストリジウム属細菌に働く溶菌酵素の細胞壁認識・分解活性触媒機構について新たな知見を得て,その成果を学術誌に報告することができた(FEBS Lett. (2017) 591, 231-239)。さらに,Acpの細胞壁結合ドメインの3次元構造を決定するため,10個ある細胞壁結合サブドメインのうち,AcpCDに1つ加えたもの(AcpCWBD10),2つ加えたもの(AcpCWBD9),3つ加えたもの(AcpCWBD8),4つ加えたもの(AcpCWBD7)の計4種類のタンパク質について発現・精製・結晶化を行っており,AcpCWBD10について微結晶を得ている。ウェルシュ菌細胞壁の分解・構成機構について研究を推進するため,細胞壁構造を認識する酵素としてウェルシュ菌ソーテースBのX線結晶解析に成功し,学会発表を行うことができた(第89回日本生化学会大会,仙台)。また,他の細胞壁構造を認識する酵素として,ウェルシュ菌ソーテースCについて発現・精製・結晶化に着手している。