hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
前近代における禅宗社会の展開と環シナ海地域交流

本年度も前年度に引き続き、前近代の日朝関係史を考察する上で最も重要な外交文書に関する研究を進めるために、現在日本に残されている外交文書原本を可能な限り実見し詳細なデーターをとった。また、中世的禅宗の展開を考察するために、代表的な地方禅院の踏査を行った。その際、遺構の残存状況・禅寺の立地状況・歴史的景観に注目し、デジタル画像写真による資料の収集と保存を行った。なお、本年度は最終年度であるため、前年度までの史料調査で見落とした箇所を補填するために、奈良国立博物館・東京大学史料編纂所、独立行政法人国立公文書館、京都大学総合博物館、京都府立総合資料館・山口県文書館・名古屋大学等の諸機関へ赴き、史料調査も行った。本年度の研究成果としては、以下の4点がある。(1)中世後期の外交使節が宿泊する寺院を網羅的に明らかにした。(2)日本に現存する外交文書様式・書契を総合的に分析した。(3)九州大学目本史学研究室所蔵の「宗義達吹嘘」を分析・紹介した。(4)中世九州の禅宗勢力の展開を詳細に考察した、上田純一著『九州中世禅宗史の研究』(文献出版2000年)の書評を行った。以上の研究成果と前年度までの研究成果とを併せることによって、研究課題「前近代における禅宗社会の展開と環シナ海地域交流」の研究目的を達成したといえる。
イオン液体ゲルの実用に向けた新規機械的評価法の確立と３Ｄプリンタによる自由造形

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞内シグナルに応答する革新的遺伝子発現制御システムの創製

本年度は前年度に確立した、本システムと肝細胞特異的ナノカプセル(BNC)の複合化を利用し、本システムのin vivoへの応用を試みた。具体的にはPKCα応答性の新規ポリマー(NPEG)/DNA(ルシフェラーゼをコードする遺伝子)/BNC複合体を、HuH-7移植Xenograftマウスの腫瘍へ直接投与し、そのPKCα活性特異的遺伝子発現をin vivoイメージングにより観測した。その結果、PKCαによりリン酸化を受けるポリマーでのみ遺伝子発現が観測された。一方でリン酸化部位をAlaに置換したポリマーや、正常部位での遺伝子発現が見られなかったことからも、本システムによりPKCα活性化細胞特異的、つまり腫瘍特異的に遺伝子発現を制御できることが強く示唆された。この研究成果に関しては、Nano lettersへ投稿準備中である。さらに前年度、研究過程より新規開発した金ナノ粒子によるリン酸化検出法について、詳細な検討を行った。その結果、本手法が疾病に密接に関与するキナーゼ活性を、極めて簡便に測定できる画期的手法であること、また様々なキナーゼに対する一般性があることを実証した。本手法は考えられる限り迅速な、キナーゼ活性の測定手法であり、今後、阻害剤スクリーニングなどへ応用できる可能性が極めて高いと考えられる。以上の研究成果に関しては、特許申請済みであり、学術論文としてはChemBioChem,8,875-879(2007)、およびAnalytical Biochemistry,373,161-163(2008)に公表済みである。本年度はポリマー基本骨格の確立を行った。具体的には主鎖を従来のアクリルアミドからよりコンパクトな複合体を形成するため、Nイソプロピルアクリルアミド(NIPAM)へと変更し、また分散安定性を高めるためにPEG鎖の修飾を行った。この新規ポリマー(NPAK-PEG)はDNAと50nm程度の粒子を形成し、生理条件下で安定性が従来のPAKと比較し飛躍的に向上することがDLSによる粒子径経時測定により明らかとなった。これによりin vivoにおける本システムの応用性が向上したと考えられる。また並行して、複合体の細胞内移行を向上させるためにリガンドとしてRGDペプチドを修飾した新規ポリマーの設計・合成した。主鎖をNIPAM、側鎖に基質ペプチドとRGDペプチドをグラフトしたNPAK-RGDを用い、インテグリンが発現しているHeLa細胞内にて細胞内のPKA活性に応答した遺伝子発現の制御に成功した。一方、従来評価してきたPAK-DNAの細胞内遺伝子発現制御の詳細を検討するために、リン酸化部位のSerをAlaに置換したPAK_Aを合成し細胞内に導入したところ遺伝子発現の有意な回復が見られなかったことから本ポリマーが細胞内PKA活性に応答し遺伝子発現の制御を行うことが強く示唆された。以上の結果は本年度、J.Control.Releaseにて論文発表した。一方PKA以外のシグナルに着目しメラノーマなどで異常亢進が認められているプロテインキナーゼC-α(PKC-α)に応答するポリマーも同様の手法により設計・合成しゲル電気泳動実験によりPKC活性化に応答しDNAがリリースされることを実証した。本年度は当初の研究予定通り、本システムのin vivoへの適用を志向した、複合体の肝細胞特異的送達を試みた。手法としては、シグナル応答性ポリマー/DNA複合体を肝細胞特異性のバイオナノカプセル内へ封入し、肝細胞かつキナーゼ活性特異的な遺伝子発現の制御を試みた。まず我々は、従来のPKAシグナル応答型システムをバイオナノカプセルに適用した。前年度最適化した分子設計を基に、主鎖をNIPAM,側鎖に基質ペプチドPEGを有するポリマーを用いHepG2へトランスフェクションを行った。その後PKA活性化薬剤であるフォルスコリンを細胞に添加したところ、PKA活性化細胞でのみ遺伝子発現の向上が確認された。また同様の実験を大腸がん細胞WiDrで行ったところ遺伝子発現が確認できなかったことから、肝細胞およびキナーゼ活性特異的な遺伝子発現制御に成功したと考えられる。これは高い遺伝子送達能を有するナノカプセルと病変シグナルに応答し遺伝子発現を制御するシステムの融合に成功したことを示唆しており、我々のシステムの実用性が飛躍的に向上したと言える。この研究成果に関しては高分子討論会にて口頭発表を行い、特許申請済みである。また、前年度報告したPKC応答型ポリマーを用いたin vivo遺伝子デリバリーを、来年度の研究計画を前倒しすることで順調に進めている。一方、前年度、結果を報告したRGDペプチド導入型新規ポリマー(NPAK-RGD)に関しても、細胞毒性評価などの追加試験を行い、その研究成果をBioorg.Med.Chem.Lett.16,5740-5743(2006)に報告した。

この研究成果に関しては、Nano lettersへ投稿準備中である。さらに前年度、研究過程より新規開発した金ナノ粒子によるリン酸化検出法について、詳細な検討を行った。その結果、本手法が疾病に密接に関与するキナーゼ活性を、極めて簡便に測定できる画期的手法であること、また様々なキナーゼに対する一般性があることを実証した。本手法は考えられる限り迅速な、キナーゼ活性の測定手法であり、今後、阻害剤スクリーニングなどへ応用できる可能性が極めて高いと考えられる。以上の研究成果に関しては、特許申請済みであり、学術論文としてはChemBioChem,8,875-879(2007)、およびAnalytical Biochemistry,373,161-163(2008)に公表済みである。
走査型プローブ顕微鏡によるセラミックスのき裂進展素過程のその場観察

走査型プローブ顕微鏡に付設可能な小型試験機を開発した。安定破壊を目的として、片側シェブロンノッチ試験片を用いた。Si_3N_4セラミックスでは、き裂は連続的に進展するとは限らず、先端あるいはき裂近傍にマイクロクラックを生成しながら、それらが連結して不連続に進展していくことが観察された。また、磁歪材料であるTerfenol-Dでは、き裂の進展に伴いき裂近傍の磁区構造が変化していく様子が確認された。セラミックスの機械的特性向上のために、破壊挙動の観察は重要である。これまでに、我々は走査型プローブ顕微鏡を用いて、各種セラミックスの破面やビッカースき裂の観察を行い、ナノスケールでの破壊挙動の評価を行ってきた。しかし、材料に荷重が作用したときのき裂の動的な観察は行われていない。そこで本研究では、走査型プローブ顕微鏡に付設可能な超小型材料試験機を開発し、これを用いて典型的な構造用セラミックスであるSi_3N_4セラミックスのき裂進展挙動を走査型プローブ顕微鏡でその場観察を行った。作製したSi_3N_4セラミックスを20×4×1.5mmに加工した後、20×4mmの面を鏡面研磨した。さらに、鏡面研磨した試料に30度の片側シェブロンノッチを導入した。この試料を走査型プローブ顕微鏡に付設できる超小型材料試験機に設置して3点曲げ試験を行った。ポップインによりき裂を導入した後、徐々に負荷しながらき裂を安定的に進展させた。き裂の観察は、走査型プローブ顕微鏡のコンタクトモードで行った。曲げ試験においてSi_3N_4セラミックスは安定破壊し、き裂が徐々に進展していく様子が観察された。Si3N4セラミックス中のき裂は先端が必ずしも連続的に進展せず、き裂後方から新たなき裂が発生・連結しながら不連続にき裂が進展していることが明らかとなった。これは、β-Si_3N_4柱状粒子によるき裂先端での応力集中の低下などに起因していると考えられる。近年、優れた機能を有するセラミックスを実用化するために、その長寿命化と高信頼性化が求められている。このような機械的特性を改善する上で、破壊挙動、すなわち、き裂進展挙動に関する知見は重要である。そこで本研究では、ナノスケールでの破壊挙動の新規評価方法として、走査型プローブ顕微鏡によるセラミックスのき裂進展素過程のその場観察技術の確立を目的とした。本年度は、主に構造材料として多く用いられているSi_3N_4セラミックスを対象として実験を行った。まず、原料であるSi_3N_4粉末に焼結助剤を添加した混合粉末を用いて、一軸及びCIP成形により成形体を得た。これを,1800°C、2時間、0.9MPaN_2雰囲気で焼成した後、20×4×15mmに加工した。さらに、試験片の片面を鏡面研磨すると共に、片側シェブロンノッチを導入した。このノッチ入り試験片を小型試験装置で負荷することにより、き裂を安定的に進展させ、走査型プローブ顕微鏡を用いて観察した。Si_3N_4セラミックスが安定破壊し、き裂が徐々に進展していく様子が確認された。またSi_3N_4セラミックスは、1つのき裂が連続的に進展するのではなく、先端あるいはき裂近傍にマイクロクラックを生成しながら、それらが連結して不連続に進展していくことが観察された。鏡面研磨面に対して、わずかにプラズマエッチングを施して、粒界相を数nm突出させた試験片に対しても、同様にき裂進展のその場観察を行った。その結果、焼結助剤としてY_2O_3とAl_2O_3を用いたSi_3N_4セラミックスでは、き裂は粒界相中ではなく、Si_3N_4粒子と粒界相の界面を進展することも明らかになった。また、予備的検討として、次年度で行う予定の電子セラミックスの破面観察を走査型プローブ顕微鏡を用いて行った。本研究では、ナノスケールでの破壊挙動の新規評価方法として、走査型プローブ顕微鏡によるセラミックスのき裂進展素過程のその場観察技術の確立を目的とした。試験片の片面を鏡面研磨すると共に、片側シェブロンノッチを導入した。

その結果、焼結助剤としてY_2_O_3とAl_2O_3を用いたSi_3N_4セラミックスでは、き裂は粒界相中ではなく、Si_3N_4粒子と粒界相の界面を進展することも明らかになった。これに対して、Lu2O3とAl2O3を焼結助剤として作製したSi3N4セラミックスでは、き裂が粒内に進展する様子も見受けられた。R曲線の測定結果から、これらのき裂進展挙動の差異は、添加した希土類酸化物に由来した粒界の強度あるいは破壊靱性の違いに起因していると考察した。また、磁歪材料であるTerfenol-Dを用いて、磁気力顕微鏡モードにてき裂進展挙動のその場観察を行った。研磨面は等方的な磁区構造を有しているのに対して、破面では不均一で1つの方向に偏った磁区構造を有していた。にき裂進展に伴う磁気力顕微鏡観察の結果、き裂の進展に伴いき裂近傍の磁区構造が変化していく様子が確認された。これは破壊時に作用したき裂先端の局所応力による逆磁歪効果によるものと考えられる。
一流柔道選手のトレーナビリティーを規定する遺伝子多型の同定と引退後への応用

一般人とアスリートどちらにおいても、体力・運動能力や体型に遺伝的な影響があることはすでに多くの報告から明らかにされている。これまで、国内外で横断的にその影響に関する報告は多くなされてきた。しかしながら、縦断的に検討した報告は少ない。特に、大学生アスリートを対象として、その期間の体組成や運動能力の変化に与える遺伝的な影響を検討した報告は少ない。さらに、大学までの競技者の引退後の形態および運動能力の変化について、検討した報告は見受けられない。そこで、本研究では、大学柔道選手の現役期間中と引退後の形態・体力への遺伝的な影響について明らかにすることを目的とした。対象者はT大学男子柔道部に所属経験のある者とした。対象者は、現役期間中、半年に1回の形態・体力測定を実施した。形態測定は、体組成(InBody)と周囲計の計測を行った。また、唾液からDNAの抽出を行い、遺伝子多型の解析を行った。遺伝子多型は、ACTN3、ACE、IGF2、MSTNなど、骨格筋との関連性が報告されている遺伝子について検討を行った。その結果、横断的な測定の結果に与える遺伝的な影響は確認された。縦断的な影響については、現在検討中である。引退後の測定についてはできておらず、対象者への郵送などによる調査を実施した。それらのデータは、現在分析中であり、今後、現役時の階級と変化の関連性などについて検討していく予定である。縦断的な体組成データと遺伝的な影響に関する検討は、今後実施していく計画である。スポーツの競技能力はトレーニングや栄養などの環境要因と遺伝要因によって決定される。大規模な疫学調査では、競技能力の約7割は遺伝要因によって決定されるとの報告もある。しかしながら、この遺伝要因がどのようなメカニズムで競技能力を規定しているのかについては十分に明らかにされていない。競技能力に関連する遺伝子多型は70以上報告されている。しかし、これらの多くの知見は主に欧米人が対象とされており、日本人を含むアジア人を対象とした研究は少ない。柔道は筋力や筋量が必要な競技であるため、競技能力に関連する遺伝子多型は筋量のトレーナービリティにも関係する可能性があると仮説を立てた。そこで本年度は、αアクチニン3(ACTN3)遺伝子、アンジオテンシン変換酵素(ACE)遺伝子、インスリン様成長因子2(IGF2)遺伝子と骨格筋量のトレーナービリティとの関連性を明らかにすることを目的とした。対象者は全日本学生柔道優勝大会で最多の優勝回数を誇るT大学男子柔道部の現役学生とした。遺伝子多型解析は唾液からDNAを抽出し、PCR法またはPCR-RFLP法のどちらかによって、ACTN3、ACE、IGF2遺伝子多型解析を実施し、現在までに一部終了している。さらに、対象者には体組成測定器(Inbody770)を用いて、夏と冬に測定を実施し、2年間追跡を行った。測定は、トイレ後の運動前の朝に実施された。現在、2年目の測定中である。2年分の骨格筋量および部位別骨格筋量の変化量を確認し、遺伝子型別に分析予定である。また、骨格筋量を体重で除した値を骨格筋率とし、同様の分析も実施予定である。研究環境の変化に伴い、遺伝子多型解析の依頼先の再検討を行った。そのため、遺伝子多型解析の実施が遅れている。スポーツの競技能力は、遺伝要因と環境要因の2つによって決定される。我々はこれまでに、柔道における競技力や体力と遺伝要因について明らかにしてきた。具体的には、αアクチニン3(ACTN3)遺伝子、アンジオテンシン変換酵素(ACE)遺伝子、インスリン様成長因子2(IGF2)遺伝子を中心に分析し、柔道選手の筋力やパワーはACTN3遺伝子もしくはIGF2遺伝子多型と関連することが明らかとなった。しかしながら、これまでの検討において、トレーナビリティや脱トレーニングに及ぼす遺伝要因の影響はほとんど示されていない。そこで本研究では、トレーナビリティや脱トレーニングに及ぼす遺伝要因を明らかにするために、柔道選手の体重や体組成(筋肉量や脂肪量)の変化量に着目して検討を行った。遺伝子多型解析は唾液からDNAを抽出し、PCR法またはPCR-RFLP法のどちらかによって、ACTN3、ACE、IGF2遺伝子多型解析を実施し、現在までに大部分を終了している。さらに、対象者には体組成測定器(InBody770)を用いて、夏と冬に測定を実施し、2年間追跡を行った。また、大学で競技を引退した対象者に対して、郵送で現在の体重の調査も実施した。今後は、トレーナビリティは3年間の在籍期間中の変化を指標に、脱トレーニングは引退後の体組成の変化を指標にするため、サンプルサイズを増やして分析していく計画である。また分析する遺伝子多型の候補として、脂肪量と関連する遺伝子多型等も増やして体組成の変化量に及ぼす遺伝的な影響を明らかにしていく計画である。研究初年度の遅れもあり、研究全体としては若干遅れている。本年度は、引退後の選手は全国に分散しており、対象者とのコンタクトは個別に実施したため時間を要した。

さらに、大学までの競技者の引退後の形態および運動能力の変化について、検討した報告は見受けられない。そこで、本研究では、大学柔道選手の現役期間中と引退後の形態・体力への遺伝的な影響について明らかにすることを目的とした。対象者はT大学男子柔道部に所属経験のある者とした。対象者は、現役期間中、半年に1回の形態・体力測定を実施した。形態測定は、体組成(InBody)と周囲計の計測を行った。また、唾液からDNAの抽出を行い、遺伝子多型の解析を行った。遺伝子多型は、ACTN3、ACE、IGF2、MSTNなど、骨格筋との関連性が報告されている遺伝子について検討を行った。その結果、横断的な測定の結果に与える遺伝的な影響は確認された。縦断的な影響については、現在検討中である。引退後の測定についてはできておらず、対象者への郵送などによる調査を実施した。それらのデータは、現在分析中であり、今後、現役時の階級と変化の関連性などについて検討していく予定である。縦断的な体組成データと遺伝的な影響に関する検討は、今後実施していく計画である。実施途中の遺伝子多型解析を終了させ、2年間の骨格筋量の変化率との関連性を検討する。その結果を受けて、それ以外の遺伝子多型を分析するかどうかを決定し、研究を進める。さらに、引退後の検討を行うために引退した選手を対象に、体重や体組成測定を実施する予定である。2年目までに、トレーナビリティと脱トレーニングによる遺伝的な影響を検討するための表現系を中心に測定が概ね終了しつつある。しかしながら、遺伝的解析とその関連性を検討する分析が当初の予定よりも遅れているため、謝金を活用して円滑に実施する予定である。本年度は、遺伝子多型分析の環境変化に伴い、分析を次年度以降に持ち越したため、差額分が発生した。研究実施の進捗状況の変更と分担者の増加に伴い、予算の使用計画について若干変更した。研究実施内容については概ね変更はない。生じた差額分は、本年度実施予定であった遺伝子多型の解析に使用する。
実在論的な知覚の哲学の研究

本年度の研究では、私は素朴実在論(naïve realism)について一貫して研究し、素朴実在論は幻覚の現象的特性を積極的な仕方で特徴づけられないので、幻覚についての消去主義を採用する必要があることを明らかにした。その議論は次のようなものである。知覚経験は現象的特性をもつ。素朴実在論とは、真正な知覚の現象的特性は外界の対象と経験主体の間に成立する知覚的関係によって説明されると考える立場である。だが、幻覚の現象的特性を同様の仕方で説明することはできない。したがって素朴実在論者は、「幻覚においても外界の対象とその性質にみえるものが現れてくる」ということに別の説明を与えねばならない。M. G. F. Martinは、センスデータや表象内容といった存在者に訴えてそれを説明することはできないと論じた。彼の論点は、もしそのような仕方で幻覚の現象的特性を説明すると、知覚のケースにも同様の説明が当てはまってしまうことになり、素朴実在論が維持できなくなってしまうというものである。これに対して、Adam PautzやMatthew Kennedyは、知覚の現象的特性が二重に説明されること自体に問題はないと主張した。私は、彼らに対して次のように反論した。経験の現象的特性を説明するということは、その経験において現れ出てくるものの本性を明らかにすることである。したがって、真正な知覚経験の現象的特性が二重に説明されるということは、その経験において現れ出てくるものが二種類の本性をもつということになるが、それはありえない。以上の議論を踏まえて、私は、素朴実在論者は幻覚には現象的特性は存在しないと考える消去主義を採用すべきだと結論した。また、これに加えて、素朴実在論は知覚経験の現象的特性が〈直示的判断に対して事実的な正当化を与える〉という役割をもつことを認めうるという点についても明らかにした。本研究は、素朴実在論という立場の整合性や認識論的利点について新たな知見を得たという点で、意義深いものであったと言える。(抄録なし)本年度の研究では、私は主に以下の二つのことを論じてきた。(1)幻覚に陥っている主体には何かが現れているようにみえるが、実際には何も(イメージであれ何であれ)現れていない。(2)真正な知覚経験において、意識のなかに現れてくるものは、世界に実在する物理的対象とその性質である。以下では、これらの2点に関する成果を詳述する。(1)幻覚において、経験主体は確かに「私の目の前にリンゴのような何かが現れている」と判断する。しかし、(実在するリンゴではない)リンゴのような何かが主体に現れているということを認めると、その何かがいったいどのような存在者なのかという問いが生じる。とりわけ、そのような存在者は物理主義的な世界観のなかにうまく位置づけられないと考えられる。そこで私は、「そのような判断が実際には偽であり、彼には何も現れていない」立場を整合的な仕方で認められるような哲学的幻覚理論を構築しようと試みた。その結果、私たちが自分自身の心的状態について知るときに用いる内観能力をどう捉えるかが、そのような理論の鍵となることが判明した。内観能力はいまだ認知科学でも探求の進んでいない分野であり、私の研究はより具体的な認知科学的研究に対する概念的基礎研究となる可能性がある。(2)真正な知覚経験において、意識に現れてくる対象が世界に実在する物理的対象であるとする動機は主に2種類ある。(1)直示的指示や直示的思考の可能性を確保できる唯一の理論である。(2)現象的特性と物理的世界のあいだの説明的ギャップを閉じることができる唯一の理論である。私は、(1)を洗練させることによって、また、(2)を「そのギャップをもっとも存在論的に倹約的な仕方で無害化することのできる理論である」と改定することによって、この立場を推進する強い理論的動機があることを明らかにした。

以上の議論を踏まえて、私は、素朴実在論者は幻覚には現象的特性は存在しないと考える消去主義を採用すべきだと結論した。また、これに加えて、素朴実在論は知覚経験の現象的特性が〈直示的判断に対して事実的な正当化を与える〉という役割をもつことを認めうるという点についても明らかにした。本研究は、素朴実在論という立場の整合性や認識論的利点について新たな知見を得たという点で、意義深いものであったと言える。本研究はイギリスを拠点として行われており、そこでの英語での議論のやり取りや論文執筆に思った以上に手間取ってしまったことが研究の遅れの主要な原因である。研究の内容は順調に進んでいるので、来年度はより多くの論文投稿や学会発表が期待できる。今後は、より一層学会発表や論文投稿の数を増やしていきたい。なお、英語を母国語としない研究者であるためのデメリットは数多くあるが(学会での意見交換がスムーズにできなかったり、論文執筆にかなりの時間がかかるなど)、ネイティブチェックなどを積極的に使うことによって克服していきたい。研究の進展は当初の予定に追いつきつつある。とりわけ、来年度の前半期は多くの学会発表の予定(ギリシャ・イギリスなど)があるので、多くの成果が期待できる。(抄録なし)
プロトプラスト再生系を利用した感染実験による菌類ウイルスの宿主範囲の検討

果樹の根を腐敗させ枯死にいたらしめる白紋羽病の低環境負荷な防除法を開発するために菌類ウイルスの利用を試み、白紋羽病菌(Rosellinia necatrix)に感染し病原力を低下させるウイルスが探索された。本研究では、そこで見いだされたウイルス2種について、白紋羽病菌以外の菌に対する感染性を検討することにより、これまでほとんど報告のない菌類ウイルスの宿主範囲およびウイルスによる菌の病原性への影響について調査し、ウイルスが見いだされた宿主以外の他の植物病原菌に対する生物防除へ応用する可能性について探ることを目的とした。具体的には、白紋羽病菌(子のう菌類、ソルダリア亜綱、マメザヤタケ目)W8株から見いだされたウイルス粒子W8VP(Partitiviridae)とW370株から見いだされたW370VP(RarV:Reoviridae)を部分純化し、子のう菌類、ソルダリア亜綱、ディアポルテ目に属する果樹類胴枯病菌(Diaporthe G-type)、クリ胴枯病菌(Cryphonectria parasitica)、リンゴふらん病菌(Valsa ceratosperma)に対してプロトプラスト感染系により感染させ、感染菌株を作出した。これら2種の白紋羽病菌から見いだされたウイルスは、白紋羽病菌と目レベルで異なる菌に感染することが明らかとなり、人為的に感染させれば宿主範囲は広いことが推察された。各菌のウイルス感染株と非感染株を用いて、Diaporthe G-typeではナシ枝に、リンゴふらん病菌ではリンゴ枝に、クリ胴枯病菌はリンゴ果実に有傷で含菌寒天を接種した。Diaporthe G-typeにおいてはW8VP感染による病原力低下効果が高く、W370VP感染による病原力低下効果は低かった。リンゴふらん病菌ではW8VP感染による病原力への影響は認められなかったが、W370VP感染によって、大きく病原力が低下した。そして、クリ胴枯病菌では、W8VP,W370VP両ウイルスがそれぞれ感染することにより、病原力が大きく低下した。以上の結果から、ウイルス種と宿主菌の組み合わせにより、ウイルスの影響が異なることが明らかとなった。このことは、菌類ウイルスを本来の宿主と異なる植物病原菌に感染させれば、本来の宿主においては潜在感染していたウイルスでも、対象となる植物病原菌に対して病原力低下効果をもたらす可能性があり、菌類ウイルスを生物防除剤として広く活用出来ると期待される。白紋羽病は果樹の根に寄生して枯死に至らしめるため、果樹栽培において経済的被害が大きい難防除病害である。低環境負荷の本病防除法を開発するため、白紋羽病菌に感染して病原力低下効果をもたらす菌類ウイルスが探索され、いくつかのウイルスが見いだされた。本研究においては、これら白紋羽病菌から見いだされたウイルスの内、異なる科に属する2種について、白紋羽病菌以外の菌に対する感染注を検討することにより、これまでほとんど報告のない菌類ウイルスの宿主範囲について調査し、本来の宿主以外の他の植物病原菌に対する生物防除へ応用する可能性について探ることを目的とした。菌類ウイルスの伝搬は菌糸融合によるとされ、異なる菌種間でのウイルス移行は難しいが、菌の細胞壁を溶かしたプロトプラストの状態ではウイルスの導入が可能であるため、プロトプラスト化した菌に部分純化したウイルス粒子を感染させた。具体的には、白紋羽病菌W8株から見いだされたウイルス粒子であるW8VP(Partitiviridae)とW370株から見いだされたウイルス粒子W370VP(Reoviridae)を部分純化し、子のう菌類・殻菌綱・マメザヤタケ目に属する白紋羽病菌と子のう菌類・殻菌綱・ディアポルテ目に属するValsa ceratosperma,Cryphonectria parasitica,Diaporthe sp.G-typeをプロトプラスト化し、部分純化したW8VPとW370VPをPEG-CaCl_2法で感染させ、再生させた菌糸体中でのウイルス感染および増殖の有無を確認した。その結果、W8VPはディアポルテ目の3種菌に対して、すべて100%の感染率を示し、宿主範囲が広いことが推察された。一方W370VPは、ウイルスが見いだされたマメザヤタケ目の白紋羽病菌に対しては10%の感染率にとどまったが、ディアポルテ目の3種菌に対しては白紋羽病菌よりも高い感染率となった。この結果からW370VPが白紋羽病菌よりも他種菌において感染・増殖が有利である可能性が考えられ、菌類ウイルスの宿主範囲を考える上で興味深いとともに、生物防除資材として利用するための有益な知見となると思われる。具体的には、白紋羽病菌(子のう菌類、ソルダリア亜綱、マメザヤタケ目)

W8株から見いだされたウイルス粒子W8VP(Partitiviridae)とW370株から見いだされたW370VP(RarV:Reoviridae)を部分純化し、子のう菌類、ソルダリア亜綱、ディアポルテ目に属する果樹類胴枯病菌(Diaporthe G-type)、クリ胴枯病菌(Cryphonectria parasitica)、リンゴふらん病菌(Valsa ceratosperma)に対してプロトプラスト感染系により感染させ、感染菌株を作出した。これら2種の白紋羽病菌から見いだされたウイルスは、白紋羽病菌と目レベルで異なる菌に感染することが明らかとなり、人為的に感染させれば宿主範囲は広いことが推察された。各菌のウイルス感染株と非感染株を用いて、Diaporthe G-typeではナシ枝に、リンゴふらん病菌ではリンゴ枝に、クリ胴枯病菌はリンゴ果実に有傷で含菌寒天を接種した。Diaporthe G-typeにおいてはW8VP感染による病原力低下効果が高く、W370VP感染による病原力低下効果は低かった。リンゴふらん病菌ではW8VP感染による病原力への影響は認められなかったが、W370VP感染によって、大きく病原力が低下した。そして、クリ胴枯病菌では、W8VP,W370VP両ウイルスがそれぞれ感染することにより、病原力が大きく低下した。以上の結果から、ウイルス種と宿主菌の組み合わせにより、ウイルスの影響が異なることが明らかとなった。このことは、菌類ウイルスを本来の宿主と異なる植物病原菌に感染させれば、本来の宿主においては潜在感染していたウイルスでも、対象となる植物病原菌に対して病原力低下効果をもたらす可能性があり、菌類ウイルスを生物防除剤として広く活用出来ると期待される。
油脂蓄積珪藻からバイオディーゼル原料を放出させ、省エネルギーに回収する技術の開発

脂質高生産珪藻Fistulifera solari内に蓄積された油滴状の脂質を分解し、遊離脂肪酸として細胞外に放出することを目指し、遺伝子組み換え技術を用いてリパーゼの過剰発現を試みた。その結果、リパーゼ遺伝子高発現による細胞毒性の可能性が示唆された。そこで、加水分解活性部位に変異を加えた変異型リパーゼをGFPと融合して発現させたところ、細胞毒性を抑制でき、標的リパーゼの一部が油滴を包むように局在する様子が観察された。今後、当該リパーゼを細胞毒性示さないレベルで発現させるための発現制御システムを構築することにより、油滴中からの遊離脂肪酸放出に適用できると期待される。脂質高生産珪藻Fistulivera solari内に蓄積された油滴状の脂質を分解し、遊離脂肪酸として細胞外に放出することを目指し、遺伝子組み換え技術を用いてリパーゼの過剰発現を試みた。油滴上に局在すると予想される当該株由来のリパーゼ遺伝子を恒常的に発現するベクターを構築し、マイクロパーティクルボンバードメント法により導入した。その結果、形質転換対は獲得できたものの、そのゲノムに挿入されたリパーゼ遺伝子は触媒部位をコードする領域が欠如していた。そのため、リパーゼを恒常的に発現することにより、細胞毒性が生じる可能性が示唆された。そこで、当初計画した通り、当該株のトランスクリプトーム解析で得られた情報を基に、細胞が定常期に達し、脂質の蓄積が完了した後にのみに発現する遺伝子(硝酸塩代謝関連遺伝子、トランスポーター遺伝子など)のプロモーターを用いた発現制御システムの構築に取り組んだ。上記のプロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝誌を配置した、発現制御ベクターを複数構築するに至っている。それらを当該株に導入し、既に形質転換体の獲得に成功しており、現在、発現挙動解析を実施している。さらに当初、油滴に局在すると予想されるリパーゼとは別に、トランスクリプトーム解析の結果、脂質分解時に強く発現するリパーゼ遺伝子を複数特定した。これらのリパーゼも油滴に局在し、脂質の分解に寄与する可能性が高いと考えられるため、今後の局在解析の対象に加える予定である。脂質高生産珪藻Fistulifera solari内に蓄積された油滴状の脂質を分解し、遊離脂肪酸として細胞外に放出することを目指し、遺伝子組み換え技術を用いてリパーゼの過剰発現を試みたところ、細胞毒性の可能性が示唆された。そこで、当該株のトランスクリプトーム解析で得られた情報を基に、細胞が定常期に達し、脂質の蓄積が完了した後にのみに発現する遺伝子(硝酸塩代謝関連遺伝子、トランスポーター遺伝子など)のプロモーターを用いた発現制御システムの構築に取り組んだ。上記のプロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝誌を配置した、発現制御ベクターを複数構築し、当該株に導入した。その結果、GFP蛍光を示す形質転換体得られたものの、GFP蛍光は常時確認され、脂質の蓄積が完了した後にのみに発現するという、ネイティブな機能を人工的に再現することはできなかった。これは、発現制御システムの構築には、発現制御ベクターに組み込んだプロモーター配列だけでは不十分であり、その他の転写調節因子結合部位の補助を得る必要があるためであると考えられる。現在、微細藻類においてこれらの転写調節因子結合部位の同定は進んでおらず、今後の研究課題であると考えている。一方で、油滴に局在すると予想されるリパーゼの遺伝子に変異を入れ、加水分解能を失わせた変異型リパーゼとGFPの融合タンパク質発現ベクターを構築し、その局在を確認した。加水分解能を失わせることで、細胞毒性を抑制し、局在解析を容易にすることができた。リパーゼの多くは細胞質に局在することが確認されたが、一部、油滴を包むようにGFP蛍光が局在する様子が観察され、標的リパーゼが油滴と相互作用する可能性が示唆された。今後、当該リパーゼを安定的に、細胞毒性を抑えた条件で発現することにより、油滴中のリパーゼから遊離脂肪酸に分解し、細胞外に放出するシステムを構築できると期待される。遺伝子発現制御システムの構築と脂質を分解するリパーゼの細胞内局在解析のための基礎的な解析と形質転換体の作出を完了することができた。これにより来年度は、脂質高生産珪藻の細胞内で毒性を示すリパーゼを、効果的に発現させるためのプラットホーム構築を推進することが可能となった。以上の成果が得られたことより、本研究は概ね順調に進んでいると判断している。生物工学平成26年度中に作出した遺伝子発現制御システムの構築のための形質転換体を培養し、GFPをレポーターとして、発現制御パターンの詳細な解析を進める。

また、トランスクリプトーム情報から選出した、脂質を分解するリパーゼの細胞内局在解析では、細胞内毒性を低減するために、触媒活性部位に人為的に変異を導入し、発現を容易にする手法を新たに試みる。以上のアプローチにより、本研究に必要な発現制御システムの開発、油滴局在リパーゼの同定を行い、両者を組み合わせることで、珪藻細胞内の脂質の分解を試みる予定である。
1930年代イギリスにおける経済成長理論の生誕：ハロッド成長理論形成過程の再検討

本研究は、近代経済成長理論の創始者としてハロッドを位置づけ、彼の理論形成に直接的に寄与した要因として、ケインズ『貨幣論』、ハイエク『価格と生産』、ミードとの往復書簡、フェビアン協会に着目する。本研究は、フェビアン協会から「経済成長」という着想をハロッドが得たこと、彼の成長理論は『貨幣論』の長期動学化であること、超克すべき『価格と生産』が彼の理論形成において補完的要素となったこと、さらにミードとの議論も補完的要素となったことを論証する。『貨幣論』、『価格と生産』、ミードそしてフェビアン協会を近代経済成長理論生誕の契機として位置づけることは、経済学史研究に新しい視点をもたらすだろう。
^<18>F-標識PETプローブ合成用トータルマイクロリアクターシステムの開発

電気化学的に濃縮された[^<18>F]フッ素イオンをマイクロリアクターによるPET分子プローブ標識合成利用するため、精製まで含めたトータルシステムとするための基礎的な技術開発:第1段の濃縮チップの改良による濃縮度改善、反応段数の増加による溶媒量の増加に対応するための中間濃縮チップの開発、市販固相抽出カラムによる分離精製の検討を行った。濃縮度低下は移送時の拡散が主要因であること、中間濃縮チップによりオンライン的に大幅に溶媒量を減らすことができることなどの実用化に向けた有用な結果が得られた。初年度に掲げた目的は、1)^<18>F-フッ素イオンの濃縮度の向上、2)標識反応用のマイクロチップの開発、3)中間濃縮法の開発、であるが、その成果について以下に示す。1.既存の濃縮チップを用いたチップ内容積である20μLの溶液の拡散を評価したが、大きな拡散は観測されず、実測された80μLを与える要因としては、捕捉された^<18>F-フッ素イオンの吸着と脱着速度が推測された。従って、これ以上の小さい内容積のチップを試作して最適化を図るよりも、現在のチップを使用して高濃縮度を与える条件を検討し、現在その結果を評価している。2.石英ガラス製の反応チップでは、^<18>F-フッ素イオンがチップ流路内で捕捉・反応し、標識効率を低下させていることが判明した。従って、これを防ぐ反応試薬濃度を見出した。また、低吸着が期待されるプラスチック反応チップを試作し評価した。使用可能な溶媒や温度に制限があり、材質に関して今後検討を加える予定である。標識反応に関しては、反応溶媒にアセトニトリルを使用する場合、その沸点以上の反応温度を実現することに成功した。標識反応はどの合成反応においても非常に迅速で1分以内にプラトーに達したが、標識中間体として有用なCH_2Br^<18>Fの合成では、反応収率のピークが0.1分にあった。このことは、迅速な加熱と正確で短い時間制御が可能なマイクロリアクターで初めて実現できた反応であり、その有用性を示す大きな成果である。3.中間濃縮法として、固相抽出による分離精製法の検討を中心に行った。中でもCH_2Br^<18>Fの精製では、気液分離を効率的に行い、次の反応に移送する簡便な方法を完成させた。^<18>F-標識フルオロメチル化反応を進展させる基盤を確立できた。本センターのサイクロトロンが使用できなかったため、該当年度に予定していた目的:(1)新たな^<18>F-フッ素濃縮チップの試作と評価、(2)プラスチック製反応チップの試作と評価、(3)中間濃縮法の開発、を完全に達成することはできなかった。以下に各目標についての進捗状況と成果を記載する。(1)新^<18>F-フッ素濃縮チップ:流路幅を4mmから2mmの半分にしたチップを試作し、その評価を行った。チップ内での流体の線速度が変化するため、これまで最適化した印加電圧とターゲット水の流速に関して新たに最適化を開始したが、継続中であり次年度に完了させる。(2)プラスチック反応チップ:COP(Cyclo Olefin Polymer)樹脂を用いた反応チップをいくつかデザインし、^<18>F-イオンの吸着性と反応性を検討した。石英ガラス製のチップに比べ熱伝導の違いにより、これまでに最適化した反応温度よりかなり高めに加熱する必要があったが、最高使用温度が130°C程度であり、加熱方法やプラスチックスの材質に関し一層の検討が必要であった。(3)中間濃縮法:反応チップから取り出される反応液をオンライン的に蒸発して濃縮できる中間濃縮チップを試作し、流路容積(流路の数、長さなど)、液体の流速、Heの流速および温度のパラメータに関して最適化を行った。アセトニトリル溶媒に関して最適化が進行中であり、次年度はこのチップからの回収法に関しても最適化を進める。一方、マイクロリアクターで合成される低沸点化合物(気体)に対しては、吸脱着による濃縮法の開発を進めた。^<18>F-標識臭化フルオロメタンを濃縮し、20μLのDMSO溶媒中に捕集して^<18>F-標識アミノ酸を合成し、HPLC分析カラムで精製することに成功した。昨年度からの継続である1新たな18F-フッ素濃縮チップの試作と評価、2プラスチック製反応チップの試作と評価、3中間濃縮法の開発、に加え、4小さな使い捨て固相抽出カラムによる精製・濃縮法の開発、5トータルマイクロリアクター合成システムの組上げ、の5つの目標達成を目指して研究を行ったが、東日本大震災の被害からの復旧の遅れのため、5は未達成で最終年度を終えざるを得なかった。以下にこれらの成果の概略を記す。1流路幅2 mmの新18F-フッ素濃縮チップを評価した。

濃縮効率などには大きな変化(収率の低下)は見られなかったが、期待した濃縮度の改善も変化はなく、濃縮チップ自体の容積よりもそれぞれのパーツ間の接続部のデッドスペースや輸送流路での拡散が濃縮された18F-イオンの分布を支配していることが示された。大幅な濃縮度の改善には一つのチップ内で濃縮と反応を行う一体化チップの開発が不可欠と結論された。23プラスチック反応チップ(COP樹脂)を用いた反応チップおよび中間濃縮チップ(蒸発チップ)をいくつかデザインし、18F-イオンの吸着性と反応性および蒸発濃縮効率を検討した。反応チップは130°Cまでの反応温度に耐え、吸着もほとんどなく実用性を示した。中間濃縮チップに関しては流路構造、反応液流速、温度、He流速の各パラメータを変化させて最適化を図った結果、90%以上の効率で溶媒のアセトニトリルをオンライン的に蒸発留去可能であることが判明した。一方、気液分離用蒸発チップも試作し検討したが、液体の表面張力等の要因により、最適化に失敗した。4水溶性の高い化合物であるチロシンと18F-標識O-フルオロメチルチロシンとの分離精製をモデルとして、種々の市販固相抽出カラムを検討した。炭素系の吸着剤であるENVI-Carbが唯一よい分離を与えたが、溶媒組成やpH等のパラメータの最適化が今後必要であった。平成23年3月11日に発生した東日本大震災による被災のため予定していたサイクロトロンがこの1年間使用不能となり、他施設の支援を受けてそこで製造された^<18>F-フッ素イオンを用い研究開発を継続できたが、実験回数に限りがあり、年度初めに掲げた目標を達成することが困難であった。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度であり、研究課題の目標達成に向け努力するが、サイクロトロンの復旧がいつ頃になるかにより、進行状況が違ってくる。年度初めころは昨年度同様外部の支援施設での実験を継続し、データの集積に努める。
次世代経皮カクテルワクチンの開発基礎研究

がんペプチドワクチンではフロイント不完全アジュバントが汎用されているが、投与局所への残留性と刺激性・炎症惹起作用が問題となっている。そこで、本研究ではこれらの副作用がなく、かつ強力な免疫誘導能を有する次世代経皮カクテルワクチンの開発をめざした。その結果、経皮吸収アジュバントであるイミキモドとグリチルリチン併用によりワクチンによる免疫誘導が増強されること、他のHMGB1阻害剤にも同様の増強作用があることを見出した。さらに、移植腫瘍治療モデルにおいてペプチドワクチンで誘導される抗腫瘍作用を増強することも示した。本研究成果は今後の経皮ワクチン開発に大きく貢献することが期待される。個々の患者の免疫記憶に対応したペプチドを用いるテーラーメイドペプチドワクチン療法では、従来型のがんペプチドワクチンに比し、各段に高い臨床効果が得られるようになった。しかしながら、個々の患者の多様性に対応するためには多くの種類のワクチン候補ペプチドを事前に用意しなければならず、HLA検査や免疫検査などの特殊検査が必要であり、かつ投与部位への残留や炎症も長期投与患者では大きな負担となるなど、一般医療へ移行するには多くの問題がある。そこで、本研究ではテーラーメイドワクチンと同等以上の臨床効果を有し、事前の特殊検査を必要とせず、かつ投与局所刺激性の強いフロイント不完全アジュバントを用いない患者にやさしい次世代経皮カクテルワクチンの開発を行う。本年度は以下の研究を実施した。1.経皮アジュバントの開発および至適化・作用機序の解明:TLR非依存型プロトタイプアジュバントの免疫増強作用について、B6マウスを用いIFN-ガンマ産生細胞ELISPOT法で解析した結果、免疫増強作用が確認された。OVA由来クラスIペプチド(SIINFEKL)反応性TcRを有するOT-1マウス脾細胞移入B6マウスを用いて、CSFEアッセイで解析した結果、CD8細胞のクローン増殖が増強されていることが判明した。また、イミキモドの効果を増強する低分子化合物についても同様の方法によりスクリーニングを行った。その結果、アジュバント作用を増強する新規の薬物群を発見した。2.経皮免疫法の検討:OT-1細胞移入B6マウスモデルを用いて経皮免疫法の検討を行った。OVA由来クラスIペプチドを界面活性剤および角質浸透促進剤と混合し、イミキモドとともにB6マウスの皮膚に塗布し、CD8細胞の増殖をCSFEアッセイ解析した。その結果、塗布法でも特異免疫を誘導可能であることが示された。3.経皮ワクチンの抗腫瘍効果の検討:OVAを発現するEG-7ーOVA細胞をB6マウス皮下に移植する実験系を確立した。本研究では従来開発してきたテーラーメイドワクチンと同等以上の臨床効果を有し、事前の特殊検査を必要とせず、かつ投与局所刺激性の強いフロイント不完全アジュバントを用いない患者にやさしい次世代経皮カクテルワクチンの開発を行う。1.経皮アジュバントの開発・至適化・作用機序の解明:前年度に発見したアジュバント作用増強薬剤、グリチルリチンはイミキモド等の自然免疫レセプター関連経皮アジュバントと併用することによりその作用を増強すること、他のHMGB1阻害剤でも同様の増強作用が認められること、およびEG.7移植腫瘍治療モデルにおいて腫瘍増殖の抑制作用が増強されることを示した。さらに、免疫増強の作用機序として、免疫抑制作用を有する炎症性サイトカインの遺伝子発現がグリチルリチンにより抑制されること、およびHMGB1により誘導される免疫抑制が抑制されることにより免疫増強作用が起こることが明らかとなった(論文投稿中および特許申請準備中)。2.塗布ワクチンの開発:分子量1000前後のワクチンペプチドを皮膚の抗原提示細胞に到達させるためには、角質バリアーを通過させる必要がある。従来、物理的に角質層を剥離する方法が試みられているが普及していない。そこで、化学的に除去する方法を用いた塗布ワクチンの開発を試みた。その結果、乳酸溶液に界面活性剤及び高分子ポリマー基剤を混合することにより、効果的かつ低侵襲性に角質層の除去が可能であり、OVAペプチドの塗布によりOVA特異的T細胞の増殖を誘導できることを示した(特許申請準備中)。3.経皮アジュバントの臨床研究の基礎解析:これまでに開発した自然免疫レセプター非依存型経皮アジュバントの健常者に対する臨床試験を実施し、安全性を確認した。さらに、がん患者を対象に、ペプチドワクチンと経皮アジュバントとの併用の臨床試験を開始し血液サンプルの保存を行った。26年度に実施終了しなかった研究項目についてはほぼ終了し、論文投稿まで達した。さらに、特許申請の準備にも至った。27年度より開始予定の研究項目については、3項目中2項目を実施することができた。研究項目:塗布ワクチンの開発に関して、最も難題であった抗原塗布による免疫誘導がケミカルピーリングの手法を導入することにより解決した。ケミカルピーリングは美容皮膚科領域では一般的であるが、ワクチンへの応用は初であり、特許申請準備に至った。研究項目:臨床研究の基礎解析については、当初計画では、自然免疫レセプター非依存型経皮アジュバントとペプチドワクチンとの併用試験を患者で実施予定であったが、倫理委員会より、健常人を対象とするアジュバント単剤の試験を先行して実施することが求められた。これにより、ワクチンとの併用試験実施が大幅に遅れたが、27年度中に開始でき、血液検体の保存及び一部検体の基礎解析の開始に至った。

研究項目:キメラマウスによる免疫誘導解析については、キメラマウスの輸入手配及び自家繁殖用スペースの確保ができなかったために本年度は実施しなかった。以上のことより、当初の計画に沿って概ね進展しているものの、やや遅れていると判断した。フロイント不完全アジュバントはがんペプチドワクチンで汎用されている免疫増強剤であるが、投与局所への残留性と刺激性・炎症惹起作用があり問題となっている。そこで、本研究では従来開発してきたテーラーメイドワクチンと同等以上の臨床効果を有し、かつ投与局所刺激性・残留性のない患者にやさしい次世代経皮カクテルワクチンの開発をめざし研究を行った。フロイントアジュバントに代わるアジュバントとして自然免疫レセプター関連アジュバントの実用化が進められている。我々は経皮ワクチンに応用可能な自然免疫レセプター関連アジュバントであるイミキモドの作用を増強する低分子化合物としてグリチルリチンを見出した。グリチルリチンは生薬甘草の成分で肝炎やアレルギーの治療薬として使用されており、ダメージ関連分子パターンHMGB1を阻害することが知られている。他のHMGB1阻害剤でも同様の免疫増強作用が認められることを示し、さらに、EG.7移植腫瘍治療モデルにおいてOVAペプチドワクチンで誘導される抗腫瘍作用を増強することを示した。免疫増強の作用機序として、免疫抑制作用を有する炎症性サイトカインの遺伝子発現がグリチルリチンにより抑制されること、およびHMGB1により誘導される免疫抑制が解除されることが明らかとなった(Cancer Sci,2016)。ワクチンペプチドの分子量は1000前後であり、皮膚の抗原提示細胞に到達させるためには、角質バリアーを通過させる必要がある。そこで、化学的に除去する方法を用いた塗布ワクチンの開発を試み、乳酸溶液に界面活性剤及び高分子ポリマー基剤を混合することにより、効果的かつ低侵襲性に角質層の除去が可能であり、OVAペプチドの塗布によりOVA特異的T細胞の増殖を誘導できることを示した。これらにより、経皮ワクチンの開発が飛躍的に進むことが期待される。がんペプチドワクチンではフロイント不完全アジュバントが汎用されているが、投与局所への残留性と刺激性・炎症惹起作用が問題となっている。そこで、本研究ではこれらの副作用がなく、かつ強力な免疫誘導能を有する次世代経皮カクテルワクチンの開発をめざした。その結果、経皮吸収アジュバントであるイミキモドとグリチルリチン併用によりワクチンによる免疫誘導が増強されること、他のHMGB1阻害剤にも同様の増強作用があることを見出した。さらに、移植腫瘍治療モデルにおいてペプチドワクチンで誘導される抗腫瘍作用を増強することも示した。本研究成果は今後の経皮ワクチン開発に大きく貢献することが期待される。26年度に計画された研究5項目のうち、4項目について実施することができた。
交連軸索の腹側伸長を規定する真のネトリン1の機能の解明

化学走性説は軸索誘導の基本原理であるが、その証明は未だなされていない。本研究では、軸索誘導分子ネトリン1が化学走性説に従い交連軸索を誘導するというモデルの検証を行い、交連軸索の腹側伸長を規定するネトリン1の真の機能を解明することを試みた。研究期間内において、(1)交連軸索の腹側伸長時におけるネトリン1mRNA並びにタンパクの発現分布の解明、(2)交連軸索の腹側伸長に必要十分なネトリン1の発現分布を解明する実験系の確立という2つの成果を得た。平成24年度は、1免疫組織化学染色に適用可能な軸索ガイダンス分子・ネトリン1に対する特異的な抗体の作製、2交連軸索の腹側伸長時におけるネトリン1タンパクの発現分布を免疫組織化学染色により明らかにすること、3交連軸索の腹側伸長に必要十分なネトリン1の発現分布の解明に必要となる研究資料の作製並びにその解析を行うこと、を目的として研究を推進した。得られた成果は以下の通りである。1免疫組織化学染色に適用可能な抗ネトリン1抗体の作製に成功した。2交連軸索の腹側伸長時におけるネトリン1タンパクの発現分布を解明した。3神経管の底板を頂点とした勾配状のネトリン1タンパクの発現分布に必要なタンパク質を同定した。4発生初期から神経管の底板以外の領域でDNA組み換え酵素・Creリコンビナーゼを発現する遺伝子改変マウスを導入し、それらマウスとネトリン1コンデイショナルノックアウトマウスとを交配させることにより、発生初期段階から底板以外の神経管の領域でネトリン1が欠損する遺伝子改変マウスを作製した。また一連の研究により得られた研究資料を用いて、大脳皮質興奮性神経細胞の神経極性形成過程を明らかにし、中脳ドーパミン作動性ニューロンの同側性の軸索投射を維持する分子機構の解明にも成功した。今後は本研究期間内に得られた研究資料並びにその成果を基にして、軸索ガイダンス分子・ネトリン1が果たして本当に化学走性説に従い交連軸索を腹側へと誘導しているのかを検証し、交連軸索の腹側伸長を規定しているネトリン1の真の作用機序を明らかにしていくことを予定している。本研究の目的はネトリン1の化学走性説の再検証を行い、交連軸索の腹側伸長を規定する真のネトリン1の機能を解明することである。平成23年度は(1)交連軸索伸長時におけるネトリン1の発現分布の解析、(2)交連軸索の腹側伸長に必要十分なネトリン1の発現分布を解明する研究に使用する研究試料の作製を目標に研究を行い、交連軸索の腹側伸長時におけるネトリン1 mRNAの発現分布を明らかにし、交連軸索の腹側伸長に必要十分なネトリン1の発現分布を解明する実験系を構築した。具体的な成果を以下に記す。1)交連軸索伸長時においてネトリン1mRNAは交連軸索の中間標的である底板に加え、脳室帯に幅広く発現していた。この結果は中間標的以外に発現するネトリン1の交連軸索の腹側伸長への寄与の可能性を示唆するものである。2)ネトリン1コンデイショナルノックアウトマウス(Netrin-1 cKOマウス)と底板特異的にCreリコンビナーゼを発現する遺伝子改変マウス(shh-cre, foxa2-creマウス)、底板以外の領域でcreを発現するマウス(nestin-creマウス)との交配を行うことで、交連軸索の腹側伸長に底板に発現するネトリン1が必要か、それとも底板以外の領域に発現するネトリン1が必要であるのかを解析できる実験系を確立した。3)ネトリン1ノックアウトマウス(Netrin-1 KOマウス)表現型回復実験による交連軸索の腹側伸長に十分なネトリン1の発現分布を明らかにするため、Netrin-1 KOマウスにFlpリコンビナーゼを強制発現させる実験系を考案した。その後神経管の特定領域でFlpリコンビナーゼを発現するベクターを作製し、交連軸索の腹側伸長に十分なネトリン1の発現分布の解析を可能とする実験系を確立した。平成23年度に計画した2つの研究の内、交連軸索伸長時におけるネトリン1の発現分布の解析の一部を完成させ、交連軸索の腹側伸長に必要十分なネトリン1mRNAの発現分布を解明する研究に使用する研究試料の準備をほぼ完了することができた。よって現時点までにおおむね良好に研究が進展していると判断している。課題としては神経管においてネトリン1タンパクの発現分布を解析する実験系の確立に成功していない点が挙げられる。ネトリン1タンパクの発現分布を解析する実験系として抗ネトリン1抗体を用いた免疫組織化学を想定し、共同研究により作製した抗ネトリン1抗体、市販の抗ネトリン