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台湾ニューシネマとそれ以降の台湾映画における「日本時代」表象研究

さらに、台湾では、論文「現在台灣電影中「日本時代」的敘述ー以《賽德克.巴莱》、《大稻テイ》及《KANO》為中心」が、『戰後台灣的日本記憶:重返再現戰後的時空』(允晨文化、2017年3月)に所収された。(2)資料・書籍の購入と分析:本年度は、去年度に引き続き、台湾映画における「日本時代」表象に関わる資料や研究書及びDVDを購入した。現在これらの資料や先行研究の分析を順次進めている。(3)資料の調査・収集:8月に台北の国家電影中心や、国家図書館で、関係資料の調査・収集を行なった。二年目である本年度に、成果の一部を口頭発表および学術誌への論文掲載などいくつかの形で公表できた。また、今後の研究を進める上で必要な資料の収集も順調に進んでいる。来年度も継続した成果の公表が望める状況にある。本年度の研究課題「台湾ニューシネマとそれ以降の台湾映画における「日本時代」表象研究」の研究成果は以下の通りである。(1)研究成果の公表:6月に講演「1960年代的台灣電影中的日本表象」を國立清華大學(台湾)で、10月に講演「1990年代を描いた台湾青春映画における日本表象」を文藻外語大學(台湾)で行った。また、國立清華大學で行われた第三屆台灣竹塹學國際學術研討會において、「重現90年代青春電影中的日本表象ー以《九降風》為中心」と題する発表を行った。3月には、日本台湾学会第80回台北定例研究会において、「90年代を描く台湾映画で懐古されるジェンダー保守日本」について報告した。さらに「日本時代」表象について文学の視点から書いたエッセイ二本「多元化台湾現地リポート(4)ー二〇一七年の現代台湾における日本時代ー『花開時節』の「今日的戦略」」(『東方』444号)および「Places to Encounter Taiwan Literature」(エバー航空機内誌『enVoyage』2017年11月号)を雑誌に掲載した。(3)資料の調査・収集:台北の国家電影中心や、国家図書館、国立台湾図書館、国立台湾大学図書館で、関係資料の調査・収集を行なった。三年目である平成29年度は、成果の一部を学会発表、講演など台湾においていくつかの形で公表できた。今後も継続した成果の公表が望める状況にある。平成30年度の研究課題「台湾ニューシネマとそれ以降の台湾映画における「日本時代」表象研究」の研究成果は以下の通りである。(1)研究成果の公表:『大妻比較文化』第20号に論文「台湾学園映画が回顧する1990年代と日本大衆文化」を発表した。また、2019年5月2日に國立臺灣師範大學において、「重現1990年代台灣之校園青春電影中的性別保守日本ー以《藍色大門》、《九降風》、《那些年,我們一起追的女孩》及《我的少女時代》為例」と題する講演を行った。『第三屆竹塹學國際學術研討會論文集』(國立清華大學)に論文「重現1990年代台灣之校園青春電影中的性別保守日本ー以《藍色大門》、《九降風》、《那些年,我們一起追的女孩》及《我的少女時代》為例」を掲載予定である。また、日本における文学や映画の研究を総括する報告を日本と台湾において、以下の通り三回行った。「日本の台湾文学研究、この10年(2008-2017)」(日本台湾学会20周年記念シンポジウム「新たな世代の台湾研究」、2018年5月26日、横浜市立大学)、「Retrospect and Prospect of the Taiwan Studies in Japan in the Recent
固体塩基を用いる環境調和型新規電解反応システムの開発およびその応用展開

プロトン性溶媒や基質であるカルボン酸と固体塩基の酸塩基反応に基づく共役酸塩基対を支持塩とする、見掛け上支持塩を必要としない環境調和型新規電解反応システムの開発に成功した。さらに、固体塩基を用いる本電解反応システムを電解フローセルやパラレル電解合成へと応用展開することに成功した。また、一連の研究課程において固体塩基が陽極で酸化を受けないことを見出し、固体に固定化された試薬や触媒は電解反応を受けないという"有機電解合成における活性点分離の概念"を提唱した。反応基質であるカルボン酸と固体塩基の酸塩基反応に基づくイオン種を支持塩とする、見かけ上支持塩を必要としない新規非コルベ反応システムの開発に成功した。この非コルベ反応システムに基づき、プロリンやアラニン誘導体の非コルベ反応を高収率で行うとともに、通常煩雑な操作を必要とする非コルベ生成物(メトキシ化体)の精製を、固体塩基のろ過およびそれに続くろ液の濃縮という極めて簡便な操作で達成した。また、一般に塩基は陽極で容易に酸化を受けるが、固体塩基は陽極で酸化を受けず非コルベ反応において再利用可能であることも明らかにした。本研究成果は、廃棄物を排出しない有機電解合成システムとしてグリーンケミストリーに大きく貢献するものと期待される。一方、固体塩基が陽極で酸化を受けないことから、「固体に固定化された試薬は電極で酸化および還元を受けない」という有機電解合成における活性点分離の概念を提唱した。さらに、有機電解合成における活性点分離の概念に基づき、固体に固定化された試薬が用いる有機電解反応における後続化学反応の促進効果について検討を行った。その結果、α位に電子求引基を有するスルフィドやp-メトキシベンジルアルコールの電解酸化反応における脱プロトン化過程を、固体塩基を用いることにより促進することに成功した。本研究成果は、固体塩基による脱プロトン化過程の促進効果のみならず、多くの有機電解反応において後続化学反応を固体に固定化された試薬により促進可能であることを示唆するものであり、その学術的意義は非常に大きいものと考えられる。反応基質であるカルボン酸と固体塩基の酸塩基反応に基づく共役酸塩基対を支持塩とする、見かけ上支持塩を必要としない新規コルベ電解反応システムの開発を行った。本コルベ電解反応システムに基づき、長鎖アルカン類や1, n-ジエステル類を高収率で合成することに成功した。また、通常煩雑な操作を必要とする電解終了後の生成物の分離・精製を、固体塩基のろ過およびそれに続くろ液の濃縮という極めて簡便な操作で達成した。また、固体塩基の易分離性に着目し、メタノールと固体塩基の酸塩基反応に基づく電解メトキシ化反応システムをパラレル電解合成へと展開した。すなわち、メタノールと固体塩基の酸塩基反応に基づき、電解セルを直列に接続することで5種類のカルバメート類のパラレル電解メトキシ化を行うとともに、電解終了後には固体塩基をろ過により分離した後にろ液を濃縮することで、対応するメトキシ化体をそれぞれ高収率で得ることに成功した。一方、ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)と固体塩基の酸塩基反応に基づく共役酸塩基対を支持塩とする、見かけ上支持塩を必要としない新規電解アルコキシ化反応システムの開発を行った。HFIPは分子内に強い電子求引基であるトリフルオロメチル基を2個有するため耐酸化性の溶媒として働き、ラクタム類のような高い酸化電位を有する化合物の電解アルコキシ化を比較的高い電流効率で行うことに成功した。さらに、得られたアルコキシ化体をトリフルオロ酢酸存在下、炭素求核剤と作用させることで、炭素-炭素結合形成反応を高収率で行うことに成功した。前年度に開発したヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)と固体塩基の酸塩基反応に基づく電解アルコキシ化反応システムを利用することで、種々のラクタム類の電解アルコキシ化を高収率で行うことに成功した。さらに、トリフルオロ酢酸存在下、得られたアルコキシ化体を様々な炭素求核剤と反応させることで炭素-炭素結合形成反応を行うことに成功した。一方、酢酸やトリフルオロ酢酸と固体塩基の酸塩基反応に基づく共役酸塩基対を支持塩とする、見かけ上支持塩を必要としない新規電解アシルオキシ化反応システムの開発を行った。トリフルオロ酢酸は分子内に強い電子求引基であるトリフルオロメチル基を有するため耐酸化性の溶媒として働き、ベンゼンやシクロアルカン類のような高い酸化電位を有する有機化合物の電解アシルオキシ化を比較的高い電流効率で行うことに成功した。さらに、「陽極と固体塩基間の活性点分離」を「陽極と炭素求核剤間の活性点分離」へと応用展開し、陽極で生成する基質由来の炭素カチオンと陽極で酸化を受けない炭素求核剤を直接反応させることで、従来法では実現不可能であった新たな炭素-炭素結合形成反応を行うことに成功した。

以上をまとめると、プロトン性溶媒と固体塩基の酸塩基反応に基づく新規電解反応システムを開発するばかりではなく「陽極と固体塩基間の活性点分離」を見出すとともに、活性点分離を基軸とする新たな酸化的炭素-炭素結合形成反応へと展開することに成功した。
末梢神経組織の脱髄機序とその対策

1)ラット坐骨神経挫滅後のPLA2の発現・経時的推移:成熟Long-Evansラットの坐骨神経を機械的に挫滅後1,3,5,7,14,21日目に取り出し、OCT compoundを用いて凍結固定した。クリオスタットで8um切片を作成し、(1)OX-42(ラットMac-1、マクロファージを認識)、(2)PLA2に対するポリクローナル・モノクローナル抗体を用いて、Vectastain ABC-Elite kitにより免疫染色を行なった。その結果、マクロファージと思われる細胞の一部がPLA2が陽性であった。この結果は既に昨年度報告したがさらに今年度も確認した.シュワン細胞と考えられる細胞は陽性でなかった.2)培養シュワン細胞・マクロファージによるPLA2の産生・分泌:シュワン細胞は生後2日目のLong-EvansラットからでAra-C処理(Brocksらの方法)によって95%以上の純度で10%FBS加DMEMで培養された。マクロファージは非処理あるいは3%thioglycollateを腹腔内投与後に腹腔内から採取し、10%FBS加DMEMで培養された。培養シュワン細胞に対してこれまでの他の細胞でPLA2酵素を誘導することが知られている、種々サイトカイン(IL1,tumor necrosis factor(TNF)など)を投与して、PLA2の発現、産生・分泌を調べた結果、forskolin+TNF刺激で細胞内PLA2の発現が促進される傾向がみられた。今回もサイトカインの種類を増やして確認したが同様の結果であった.3)ラット坐骨神経挫滅後のPLA2遺伝子の発現:in situ hybridizationを用いて凍結切片上でPLA2遺伝子の発現と消退を調べる目的で,予備的実験を行っている。2)培養シュワン細胞・マクロファージによるPLA2の産生・分泌:シュワン細胞は生後2日目のLong-EvansラットからでAra-C処理(Brocksらの方法)によって95%以上の純度で10%FBS加DMEMで培養された。培養シュワン細胞に対してこれまで他の細胞でPLA2酵素を誘導することが知られている、種々サイトカイン(IL 1,tumor necrosis factor(TNF)など)を投与して、PLA2の発現、産生・分泌を調べた結果、forskolin+TNF刺激で細胞内PLA2の発現が促進される傾向がみられた。
ヒト及びマウスリンパ管腫モデル動物の生物学的特性解析及び病態発生機序の解明

重症・難治性のリンパ管腫(リンパ奇形)は有効な治療法がなく、患者QOL改善のため世界中で新たな治療法開発が待たれている。我々はリンパ管腫切除組織より確立したリンパ管腫由来リンパ管内皮細胞株をマウスへ移植することによりヒトリンパ管腫モデル動物を得たが、これを元に既存のマウスde novoリンパ管腫モデルの生物学的特性を検討し、ヒトリンパ管腫発生の機序の解明及び新規治療への応用を模索する。既にヒトリンパ管腫由来細胞株の遺伝子発現プロファイル解析にて発見された遺伝子異常につき、両モデル動物を用いてその意義を検討する。現時点までに以下の成果を得ている。(1)リンパ管腫患者由来リンパ管内皮細胞株(Human lymphangioma-derived lymphatic endothelial cells, HL-LECs)の収集:手術による切除検体から新たに6株の初代培養細胞株を得た。(2)ヒトリンパ管腫モデル動物の確立:HostとしてNOGマウス、NOD/SCIDマウスを検討し、NOGマウスが適当であることを確認した。(3)3D in vitroリンパ管腫モデルの検討:ゼラチンを用いたin vitroの3Dリンパ管(リンパ管腫)モデルの最適化を検討し、いくつかの薬剤の効果を確認した。(4)治療に用いられているOK-432のリンパ管内皮細胞への直接的な影響を検討し、内皮細胞による取り込み、遺伝子発現プロファイルを検討した。これらは完全にまとめて論文化は済んでいないが、論文化とともに順次終了していく見込みである。先行研究で得られた疾患特異的材料の応用研究であり確実に展開する。その他、マウスde novo病変形成についてはまだ着手していないが概ね順調に進んでいる。今後マウスモデルを用いた応用研究に力を入れていく。概ね当初の研究計画通りに進捗している。主な成果は以下の通りである。(2)蛍光標識不死化HL-LECの確立。hTERTとHPV E6/E7遺伝子の導入により不死化細胞を確立し(im-HL-LEC)、さらに発光(Luciferase)及び発光(GFP)を導入。その中でD2-40(+)の不死化リンパ管腫由来内皮細胞を樹立した(ffLuc-im-HL-LEC)。(3)マウスへの移植によるリンパ管腫モデルの作成。(2)の細胞をNOGマウス、及びNOD/SKIDマウスに移植すると嚢胞性病変を形成し、また病変はIVISにより体外よりルシフェリン発光を定量化出来ることが確認された。病変の長期の動向についてさらに検討中である。(4)遺伝子発現解析結果による各異常発現遺伝子の疾患への関与の検討。疾患発症との関連が強く疑われた3つの遺伝子についてはHL-LECs及び市販の正常LECsを用いて遺伝子抑制、過剰発現モデルの作成が開始された。その他、マウスde novo病変形成実験についてはまだ着手していないが概ね順調に進んでいる。年度途中で研究代表者の所属異動があったため、研究計画に若干遅れが生じた。また培養細胞の大規模の感染があり、一時培養を完全停止せざるを得なかった。最終年度までに取り戻せるよう計画を進めていく予定である。しかしながら大きな流れの変更はなく、今年度までのの主な成果は以下である。(1)リンパ管腫患者

由来リンパ管内皮細胞株(Human lymphangioma-derived lymphatic endothelial cells, HL-LECs)の収集:手術による切除検体から新たに6株の初代培養細胞株を得た。(2)ヒトリンパ管腫モデル動物の確立:HostとしてNOGマウス、NOD/SCIDマウスを検討し、NOGマウスが適当であることを確認した。(3)3D in vitroリンパ管腫モデルの検討:ゼラチンを用いたin vitroの3Dリンパ管(リンパ管腫)モデルの最適化を検討し、いくつかの薬剤の効果を確認した。(4)治療に用いられているOK-432のリンパ管内皮細胞への直接的な影響を検討し、内皮細胞による取り込み、遺伝子発現プロファイルを検討した。年度途中で研究代表者の所属異動の影響を引きずり、研究計画に遅れを生じている。また培養細胞の大規模の感染があり、一時培養を完全停止せざるを得なかった。最終年度までに取り戻せるよう計画を進めていく予定である。しかしながら大きな流れの変更はなく、今年度までのの主な成果は以下である。(2)ヒトリンパ管腫モデル動物の確立(4)OK-432のリンパ管内非細胞への影響の検討重症・難治性のリンパ管腫(リンパ奇形)は有効な治療法がなく、患者QOL改善のため世界中で新たな治療法開発が待たれている。我々はリンパ管腫切除組織より確立したリンパ管腫由来リンパ管内皮細胞株をマウスへ移植することによりヒトリンパ管腫モデル動物を得たが、これを元に既存のマウスde novoリンパ管腫モデルの生物学的特性を検討し、ヒトリンパ管腫発生の機序の解明及び新規治療への応用を模索する。既にヒトリンパ管腫由来細胞株の遺伝子発現プロファイル解析にて発見された遺伝子異常につき、両モデル動物を用いてその意義を検討する。現時点までに以下の成果を得ている。(1)リンパ管腫患者由来リンパ管内皮細胞株(Human lymphangioma-derived lymphatic endothelial cells, HL-LECs)の収集:手術による切除検体から新たに6株の初代培養細胞株を得た。これらは完全にまとめて論文化は済んでいないが、論文化とともに順次終了していく見込みである。今までの成果を踏まえて以下の研究を進める。徐々に臨床へ近づけることを念頭においている。1,「疾患由来不死化
早期非小細胞肺癌に対する放射線治療法の確立に関する臨床的・病理組織学的研究

1.放射線治療を行ったI期末梢型非小細胞肺癌36例を対象として予防的縦隔照射の意義について検討した結果,縦隔照射を行わなかった26例の3年,5年原病生存率は53%,40%で,縦隔照射例10例の生存率64%,39%と同等であった.5年累積局所再発率は28%で,初回再発形式で縦隔リンパ節のみに再発の認められた症例は縦隔照射非施行の1例のみであった.以上から,低肺機能や高齢などで放射線治療の適応となる末梢型早期非小細胞肺癌症例に対する治療法として,肺機能の温存などの観点から所属リンパ節への予防照射は必ずしも必要ないと考えられた.2.胸部X線写真陰性の非小細胞肺癌12例14病巣(扁平上皮癌13,腺癌1)に対する^<192>Irを用いた気管支腔内照射の初期効果と有害事象について検討した.照射法は原則として気管支控内照射を先行し,外照射を併用した.腔内照射の線量は,気管支内径に応じて線源中心から510mmの点で5Gy/回とし,1025Gyの照射を行った.治療後の観察期間は最長30か月で,現在のところ局所再発例も重篤な有害事象発生例もみられていない.以上の結果から本法は肺門部早期肺癌に対する標準治療の一つになりうると考えられた.3.肺癌の放射線治療後に^<18>FDG-PETを施行し,^<18>FDGの集積程度と局所再発の有無について検討した結果,^<18>FDG-PETは治療効果判定に有効で,SUV値3を基準値とすると,再発例(SUV平均値±SE:3.8±0.6)と非再発例(平均値±SE:1.1±0,4)のSUV値の間に有意差が認められた.また,効果判定時期は,治療終了から6か月,12か月後が妥当と考えられた.4.生検病理組織標本についてp53蛋白発現の程度と治療成績について検討した結果,p53蛋白発現陰性例の放射線感受性は陽性例にくらべ有意に高く,p53蛋白発現は放射線感受性の先行指標となりうる可能性が示唆された。1.早期非小細胞肺癌症例に対する放射線治療の実践1)放射線治療法について検討する.肺門部早期癌6例に対して,遠隔操作式後充填式密封小線源装置を用いた腔内照射と外照射との組合せで放射線治療を行い,治療計画でえられた線量分布と腫瘍ならびに正常組織の照射に対する反応との比較検討を行った.その結果,腔内照射先行で照射を行う方が正常粘膜反応は軽度であることがわかった.腔内照射の線量評価点は,線源中心から気管では10mm,主気管支葉気管支では7mm,区域気管支では5mm,亜区域支では3mmとし,外照射との組合せでは,1回線量5Gyで23回の腔内照射に外照射40Gyの併用が適当であると考えられた.また,腔内照射単独の場合には,1回線量5Gyで56回の照射が適当と思われた.2)腫瘍の病理組織学的所見・アポトーシス関連遺伝子蛋白の発現と照射効果との関連性の検討放射線治療を主体に治療を行った非小細胞肺癌36例の生検組織標本を用いてp53蛋白の免疫組織染色を行い,p53蛋白発現の有無と照射効果,生存率との比較を行った.その結果,p53蛋白発現が陰性の症例は陽性例にくらべ有意に照射効果が良好で,生存率も延長する傾向が認められた.2.非小細胞肺癌の至適分割照射法に関する基礎的検討ヌードマウス可移植ヒト肺癌株の放射線誘発アポトーシスとp53などアポトーシス関連遺伝子(蛋白)発現の多寡には相関が認められ,野性型p53の発現と腫瘍増殖抑制効果との間には関連性があることが明らかとなった.1.放射線治療を行ったI期末梢型非小細胞肺癌36例を対象として予防的縦隔照射の意義について検討した結果,縦隔照射を行わなかった26例の3年,5年原病生存率は53%,40%で,縦隔照射例10例の生存率64%,39%と同等であった.5年累積局所再発率は28%で,初回再発形式で縦隔リンパ節のみに再発の認められた症例は縦隔照射非施行の1例のみであった.以上から,低肺機能や高齢などで放射線治療の適応となる末梢型早期非小細胞肺癌症例に対する治療法として,肺機能の温存などの観点から所属リンパ節への予防照射は必ずしも必要ないと考えられた.2.胸部X線写真陰性の非小細胞肺癌12例14病巣(扁平上皮癌13,腺癌1)に対する^<192>Irを用いた気管支腔内照射の初期効果と有害事象について検討した.照射法は原則として気管支控内照射を先行し,外照射を併用した.腔内照射の線量は,気管支内径に応じて線源中心から510mmの点で5Gy/回とし,1025Gyの照射を行った.治療後の観察期間は最長30か月で,現在のところ局所再発例も重篤な有害事象発生例もみられていない.以上の結果から本法は肺門部早期肺癌に対する標準治療の一つになりうると考えられた.3.肺癌の放射線治療後に^<18>FDG-PETを施行し,

^<18>FDGの集積程度と局所再発の有無について検討した結果,^<18>FDG-PETは治療効果判定に有効で,SUV値3を基準値とすると,再発例(SUV平均値±SE:3.8±0.6)と非再発例(平均値±SE:1.1±0,4)のSUV値の間に有意差が認められた.また,効果判定時期は,治療終了から6か月,12か月後が妥当と考えられた.4.生検病理組織標本についてp53蛋白発現の程度と治療成績について検討した結果,p53蛋白発現陰性例の放射線感受性は陽性例にくらべ有意に高く,p53蛋白発現は放射線感受性の先行指標となりうる可能性が示唆された。1.放射線治療を行ったI期末梢型非小細胞肺癌36例を対象として予防的縦隔照射の意義について検討した結果,縦隔照射を行わなかった26例の3年,5年原病生存率は53%,40%で,縦隔照射例10例の生存率64%,39%と同等であった.5年累積局所再発率は28%で,初回再発形式で縦隔リンパ節のみに再発の認められた症例は縦隔照射非施行の1例のみであった.以上から,低肺機能や高齢などで放射線治療の適応となる末梢型早期非小細胞肺癌症例に対する治療法として,肺機能の温存などの観点から所属リンパ節への予防照射は必ずしも必要ないと考えられた.2.胸部X線写真陰性の非小細胞肺癌12例14病巣(扁平上皮癌13,腺癌1)に対する^<192>Irを用いた気管支腔内照射の初期効果と有害事象について検討した.照射法は原則として気管支腔内照射を先行し,外照射を併用した.腔内照射の線量は,気管支内径に応じて線源中心から510mmの点で5Gy/回とし,1025Gyの照射を行った.治療後の観察期間は最長30か月で,現在のところ局所再発例も重篤な有害事象発生例も見られていない.以上の結果から本法は肺門部早期肺癌に対する標準治療の一つになりうると考えられた.3.肺癌の放射線治療後に^<18>FDG-PETを施行し,^<18>FDGの集積程度と局所再発の有無について検討した結果,^<18>FDG-PETは治療効果判定に有効で,SUV値3を基準値とすると,再発例(SUV平均値±SE:3.8±0.6)と非再発例(平均値±SE:1.1±0.4)のSUV値の間に有意差が認められた.また,効果判定時期は,治療終了から6か月,12か月後が妥当と考えられた.4.生検病理組織標本についてp53蛋白発現の程度と治療成績について検討した結果,p53蛋白発現陰性例の放射線感受性は陽性例に比べ有意に高く,p53蛋白発現は放射線感受性の先行指標となりうる可能性が示唆された.
非酸素発生型光合成細菌の持つPS I タイプ反応中心の分子基盤と人工系への応用

1.ヘリオバクテリア反応中心の結晶化・構造解析:異なる空間群の結晶(C2とR32)が得られており、米国グループが2017年に報告した高分解能データ(2.2オングストローム)を目指してスクリーニング方法や凍結方法などの改良を試みた。現在、目標であった高分解能にほぼ到達することができ、詳細な解析を進めている。米国グループに存在していなかったキノン分子が、我々の構造中には存在していることが明確になった。構造の相違は、電子移動反応の素過程を反映している可能性がある。またコアタンパクとPshBサブユニット(2[4Fe-4S]型フェレドキシン)との共結晶化を行い、回折実験可能な回折強度データが得られている。2.フーリエ変換赤外分光法(FTIR法)による還元型キノンの検出の試み:Kevinら(米国)は、ヘリオバクテリア膜標品に強いパルスレーザー光を連続的に照射することで、還元型キノンの生成をHPLC解析により確認している。そこでヘリオバクテリア膜標品に光を照射し、FTIR法による還元型キノンの検出を試みた。同じ手法で紅色細菌を用いた膜標品では還元型キノンが検出されているにも関わらず、還元がたキノンは検出できなかった。タイプ2反応中心におけるQH2生成とは異なった反応機構をもつ可能性がある。3.超高速分光による過渡吸収変化の測定:ヘリオバクテリア反応中心のサブピコ秒からナノ秒までのスペクトル変化(400-900nm)の時間展開を丹念に調べなおすことを始めた。まだ予備的段階ではあるが、670nm(8-OH Chl a)励起により時定数2.4 nsの未知の成分が検出された。今後、再現性を確認する必要がある。4.緑色イオウ細菌反応中心の結晶化:コアタンパクにHisタグを付加した反応中心複合体はすでに作成済みである。結晶化に適した安定な複合体標品の調製方法について検討した。ヘリオバクテリア反応中心の構造基盤に関わる解析については、当初の想定以上の結果が得られ、順調に進んでいる。研究実績の概要で述べているが、我々の標品中には長く議論の的となっていた二次電子受容体キノンが見出された。このことはこれまで知られていない未知の電子移動反応・経路が存在している可能性があり、今後さらなる分光学的解析が必要となってきた。そのためにまずはフーリエ変換赤外分光(FTIR)を用いることで、光駆動反応によるキノン還元(キノール生成)を検出する試みを実施した。その理由は、すでに米国のアリゾナグループ(Kevinら)は、ヘリオバクテリアの膜標品に光照射することにより、還元型キノン(キノール)が蓄積することを見出しているからである。しかしながら紅色細菌においてその有効性が十分に確認・報告されているにも関わらず、同様の手法では還元型キノンは検出されなかった。米国グループは還元型キノン検出において強いパルスレーザー光を連続的に照射しているため、副次的反応の可能性も示唆された。今後も生理的条件に近い実験条件で、キノン還元検出を試みていく必要がある。さらに超高速分光による過渡吸収変化の測定では、測定標品の安定性の確認と照射するレーザー光の出力に関しての予備実験が必要であり、実際の測定は次年度に持ち越すことになった。一方、新たに着手した緑色イオウ細菌反応中心の結晶化では、標品調製の改良に時間を費やした。精製途中で複合体が解離しやすいことが問題で、ようやく解決の糸口を見い出すことができ始めている。ホモダイマー型反応中心の構造基盤に関わる解析:我々のヘリオバクテリア反応中心の結晶構造解析は目標であった高分解能を達成することができ、キノンの存在を明らかにした。結合部位環境は光化学系1反応中心のキノンA1の疎水環境とは大きく異なるが、興味深いことにArg残基とπ-π相互作用する強い結合であった。一方において米国のアリゾナグループ(Kevinら)は、ヘリオバクテリアの膜標品に光照射することにより、還元型キノン(キノール)が蓄積することを見出している。我々は反応中心に結合するキノンは二次電子受容体(A1)として機能すると想定していたが、未知の反応機構・経路が存在する可能性も残されている。しかしながら最初の試みとして行ったフーリエ変換赤外分光(FTIR)を用いたキノールの生成の検出はネガティブな結果であった。用いた手法は紅色細菌においてその有効性が十分に確認・報告されている方法と同じであるが、反応特性が異なる可能性もある。膜標品は嫌気的に調製してきているため、ほとんどがすでに還元型キノンである可能性も否定できない。今後は膜標品の調製・処理方法を検討するとともに、可溶化反応中心に酸化型キノンを添加した標品を調製するなどして再度、測定を行う予定である。超高速分光による過渡吸収変化の測定:今後、詳細な測定を実施する。今まで測定されていなかったサブナノ秒レベルのスペクトル変化(400-900nm)の時間展開を丹念に調べていく。緑色イオウ細菌反応中心の結晶化:精製途中で複合体が解離しやすいことが問題であったが、dim-light下(ほぼ暗所下)では安定な複合体標品が調製できることが確認できている。X線結晶構造解析とともにクライオ電子顕微鏡による構造解析に挑戦していく予定である。

1.ヘリオバクテリア反応中心の結晶化・構造解析:異なる空間群の結晶(C2とR32)が得られており、米国グループが2017年に報告した高分解能データ(2.2オングストローム)を目指してスクリーニング方法や凍結方法などの改良を試みた。現在、目標であった高分解能にほぼ到達することができ、詳細な解析を進めている。米国グループに存在していなかったキノン分子が、我々の構造中には存在していることが明確になった。構造の相違は、電子移動反応の素過程を反映している可能性がある。またコアタンパクとPshBサブユニット(2[4Fe-4S]型フェレドキシン)との共結晶化を行い、回折実験可能な回折強度データが得られている。2.フーリエ変換赤外分光法(FTIR法)による還元型キノンの検出の試み:Kevinら(米国)は、ヘリオバクテリア膜標品に強いパルスレーザー光を連続的に照射することで、還元型キノンの生成をHPLC解析により確認している。そこでヘリオバクテリア膜標品に光を照射し、FTIR法による還元型キノンの検出を試みた。同じ手法で紅色細菌を用いた膜標品では還元型キノンが検出されているにも関わらず、還元がたキノンは検出できなかった。タイプ2反応中心におけるQH2生成とは異なった反応機構をもつ可能性がある。3.超高速分光による過渡吸収変化の測定:ヘリオバクテリア反応中心のサブピコ秒からナノ秒までのスペクトル変化(400-900nm)の時間展開を丹念に調べなおすことを始めた。まだ予備的段階ではあるが、670nm(8-OH Chl a)励起により時定数2.4 nsの未知の成分が検出された。今後、再現性を確認する必要がある。4.緑色イオウ細菌反応中心の結晶化:コアタンパクにHisタグを付加した反応中心複合体はすでに作成済みである。結晶化に適した安定な複合体標品の調製方法について検討した。ヘリオバクテリア反応中心の構造基盤に関わる解析については、当初の想定以上の結果が得られ、順調に進んでいる。研究実績の概要で述べているが、我々の標品中には長く議論の的となっていた二次電子受容体キノンが見出された。このことはこれまで知られていない未知の電子移動反応・経路が存在している可能性があり、今後さらなる分光学的解析が必要となってきた。そのためにまずはフーリエ変換赤外分光(FTIR)を用いることで、光駆動反応によるキノン還元(キノール生成)を検出する試みを実施した。その理由は、すでに米国のアリゾナグループ(Kevinら)は、ヘリオバクテリアの膜標品に光照射することにより、還元型キノン(キノール)が蓄積することを見出しているからである。しかしながら紅色細菌においてその有効性が十分に確認・報告されているにも関わらず、同様の手法では還元型キノンは検出されなかった。米国グループは還元型キノン検出において強いパルスレーザー光を連続的に照射しているため、副次的反応の可能性も示唆された。今後も生理的条件に近い実験条件で、キノン還元検出を試みていく必要がある。さらに超高速分光による過渡吸収変化の測定では、測定標品の安定性の確認と照射するレーザー光の出力に関しての予備実験が必要であり、実際の測定は次年度に持ち越すことになった。一方、新たに着手した緑色イオウ細菌反応中心の結晶化では、標品調製の改良に時間を費やした。精製途中で複合体が解離しやすいことが問題で、ようやく解決の糸口を見い出すことができ始めている。
オートファジーと上皮細胞極性形成の連関による腸管恒常性維持機構の解明

細胞内のタンパク質複合体などを分解するオートファジーの機能不全は、腸内細菌とともに炎症性腸疾患の発症リスクとなるが、そのメカニズムは不明である。本研究ではショウジョウバエをモデル生物に用い、オートファジー不全が起きた腸管上皮細胞ではRef(2)Pタンパク質(哺乳類p62)が蓄積し、それらが腸内常在菌依存的な活性酸素種(ROS)の刺激に応じて多量体を形成することこそが、腸管上皮の恒常性を破綻させる原因であることを明らかにしてきた。今年度は、ROS刺激に応じてRef(2)Pの多量体形成が起こるメカニズムに関する解析を行った。その結果、1ROSの1種であるH2O2をショウジョウバエ個体に経口摂取させた際に、Ref(2)Pの多量体が腸管上皮細胞の3細胞結合部位近傍に局在していることを見出した。また、3細胞結合部位の構成因子の発現を抑制すると、オートファジー不全腸管上皮細胞におけるRef(2)P多量体形成がキャンセルされた。これらの結果から、3細胞結合部位がROS刺激に応じたRef(2)P多量体形成の場であることが示唆された。続いて、2Ref(2)P多量体が3細胞結合部位のような特殊な場に局在するメカニズムに迫るため、前年度より実施していたオートファジー不全個体のH2O2摂取時の生存率低下に関与する遺伝子の網羅的スクリーニングを進めた。スクリーニングの結果、31遺伝子を同定し、そのうちの13遺伝子が、ROS刺激依存的なRef(2)P多量体の形成や局在に影響を与えた。それらの遺伝子には膜貫通タンパク質も含まれており、細胞外から与えられるROS刺激を感知しRef(2)P多量体形成を誘導する因子である可能性が考えられる。今後、同定した遺伝子とオートファジーやRef(2)Pの関係を解析することで、オートファジー不全腸管で炎症が生じる分子メカニズムを明らかにできると期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。細胞内分解系であるオートファジーの機能不全は炎症性腸疾患の発症原因となるが、その分子メカニズムは不明である。我々はこれまでに、腸管上皮細胞特異的なオートファジー不全ショウジョウバエモデルを用い、オートファジーが腸内常在菌によるHippo経路およびJNK経路への微弱な刺激を負に制御することで腸管幹細胞分裂および腸管上皮細胞の細胞極性を制御することを見いだしている。本研究では、1オートファジー不全による常在菌に対するJNK経路やHippo経路の異常応答の分子機構を解明し、オートファジー不全による腸管炎症の根本原因を解くこと、また、2JNK経路を介した腸管上皮細胞における細胞極性形成に関与する因子を探索することを目的とした。本年度は、選択的オートファジーのアダプター因子であるとともに、自己凝集によってシグナル伝達のscaffoldタンパク質としても機能するRef(2)P(ほ乳類p62ホモログ)に着目した解析を行った。その結果、オートファジー不全によって蓄積するRef(2)Pの凝集体こそがHippo経路およびJNK経路の異常応答を起こす原因であることを明らかにした。また、腸管上皮細胞におけるRef(2)P凝集体形成が常在菌の存在によって促進されることを見いだした。したがって、2に関して、常在菌依存的なRef(2)P凝集体形成のメカニズムを解明することこそが、JNK経路の関与する異常な細胞極性形成を理解するために重要であると考えた。そこで、オートファジー不全が起こす常在菌依存的なRef(2)P凝集体形成に関与する遺伝子をゲノム網羅的に探索するスクリーニング系を確立した。以上の成果は、オートファジー不全による腸管炎症の発症機構に新規な知見を提供するとともに、オートファジーがRef(2)Pを介して腸管恒常性を維持する機構の個体レベルでの解明に繋がることが期待できる。本研究の目的1について、ほ乳類p62のショウジョウバエホモログであるRef(2)Pに着目して解析を行った。その結果、オートファジー不全によるJNK経路およびHippo経路の過剰応答はともにref(2)Pを介して生じており、ref(2)Pの過剰発現はオートファジー不全と同様にこれらシグナル経路の過剰応答を起こすことが明らかとなった。また、Ref(2)Pタンパク質の組織学的解析の結果、オートファジー不全によるRef(2)P凝集体形成が腸内常在菌および、腸内細菌に対するROS産生酵素DUOXに依存的であることが明らかとなった。これらの結果から、オートファジー不全下でDUOX依存的に腸管上皮細胞に与えられるROS刺激がRef(2)P凝集体形成を亢進し、JNK経路やHippo経路の過剰応答を起こすことが示唆される。これは、オートファジーがRef(2)Pを介して常在菌に対する不要な炎症応答を制御するという新規の知見であり、獲得免疫系による炎症の増悪を無視できるショウジョウバエの利点を活かすことができたと考えられる。上記の結果を受け、目的2について、オートファジー不全下でのROS刺激に応じたRef(2)P凝集体形成に関与する遺伝子を探索することで、JNK経路を介した細胞極性形成制御を含む、オートファジーによる腸管恒常性維持機構に迫ることとした。探索系を確立するために、DUOXが産生するROSの1種であるH2O2のショウジョウバエ個体への経口摂取を試みた。その結果、オートファジー不全個体ではH2O2摂取によってRef(2)P

凝集体形成および個体死が亢進し、この個体死がref(2)Pに完全に依存していることを明らかにした。したがって、このH2O2摂取による個体死の亢進を指標にすることで、ROS刺激に応じたRef(2)P凝集体形成に関与する遺伝子のゲノム網羅的探索が可能となった。細胞内分解系であるオートファジーの機能不全は、炎症性腸疾患クローン病発症のリスクとなるが、腸管上皮細胞でオートファジーが腸管恒常性を維持するメカニズムは不明である。本研究ではショウジョウバエ個体を用い、オートファジー不全腸管上皮細胞へ腸内常在菌に由来する活性酸素種(ROS)刺激が与えられると、オートファジーのアダプタータンパク質Ref(2)P(哺乳類p62ホモログ)の複合体形成が促進され、増殖抑制シグナルHippo経路が不活性化されることを明らかにしてきた。今年度は、1Ref(2)P複合体がHippo経路を不活性化するメカニズム解析と2ROS刺激に応じてRef(2)P複合体形成が促進される機構に迫るためのゲノム網羅的スクリーニングを実施した。その結果、1について、腸管上皮細胞においてHippo経路抑制因子Dachs (atypical myosin)がRef(2)P複合体と共局在すること、オートファジー不全によるHippo経路不活性化や腸管幹細胞の過剰分裂がdachsを介して起きていることを明らかにした。更に、Dachsがオートファジーによって量的な制御を受けることを見出した。これらの結果から、オートファジーはRef(2)P-Dachs複合体によるHippo経路不活性化を制御することで腸管恒常性を維持するという新規の知見が得られた。2に関しては、前年度に確立したH2O2摂取によるsurvival assay系と、染色体の一定領域をヘテロ接合で欠損しているdeficiency系統libraryを用いて1次スクリーニングを行った。常染色体の98%以上をカバーする計375のdeficiency系統のうち373系統を検討し、54の候補染色体領域を同定した。本解析の進展によって、オートファジーによる腸管恒常性維持の根幹を担うRef(2)P複合体形成制御機構の解明が期待できる。本研究では、腸管上皮細胞におけるオートファジーの機能解析を行い、オートファジーが非病原性の腸内常在菌に対するHippo経路やJNK経路の過剰応答を制御していることを明らかにしていた。前年度には、1オートファジーによるHippo経路とJNK経路の制御機構を解析し、腸内常在菌存在下でオートファジー不全腸管上皮細胞に与えられる微弱なROS刺激によりRef(2)Pの自己会合が促進され、両経路の過剰応答が起きることを明らかにした。これは、オートファジー不全腸管でのRef(2)P複合体形成こそが恒常性破綻の根本原因であることを示しており、複合体形成の分子機構を明らかにすることが重要と考えた。そこで、2ROSの1種であるH2O2を用い、Ref(2)P蓄積に依存したオートファジー不全個体のH2O2感受性を検出できるsurvival assay系を前年度までに確立していた。今年度は、1について腸管上皮細胞でのオートファジーによるHippo経路制御機構を解析し、オートファジーがHippo経路抑制因子
ガングリオシドGD3の機能解明をめざしたGD3合成酵素のcDNAクローニング

本年度はガングリオシドGD3の機能を研究するための第一歩として,エクスプレッションクローニング法によるGD3合成酵素のcDNAクローニングを行った。まず,ヒトメラノーマ細胞よりcDNAを合成し,それをエクスプレッションベクターpCEV18に組み込みcDNAライブラリーを作製した。cDNAライブラリーをCHOP細胞にトランスフェクションし,GD3に対するモノクローナル抗体R24とセルソーターを用いて,目的のcDNAを持つ細胞を濃縮した。そこからcDNAを取り出し,大腸菌で増やしたあと再びCHOP細胞へ導入した。以上の過程を繰り返すことにより,最終的に1つのクローンを単離した。得られたcDNAは全長1.7kbpで,コードされているタンパク質はアミノ酸341残基からなり,膜貫通領域をN末端付近に持つ2型の膜タンパク質であった。このタンパク質がGD3合成酵素本体であることを,本タンパク質を分泌タンパクとして発現させGD3合成活性を測定することより証明した。本酵素はα2,8-シアル酸転移酵素として初めてクローニングされたものであり,アミノ酸配列上にはシアリルモチーフと呼ばれるシアル酸転移酵素に特徴的な配列が存在することから,シアリルモチーフの役割を考える上で重要な知見を与えた。次に,得られたcDNAをCOS細胞を用いて発現させ,酸素学的な解析によって本酵素の基質特異性を調べたところ,本酵素がGD3だけでなくGQ1bの生合成にも関与することがわかった。このことは,ガングリオシドの生合成経路を考える上で非常に興味深い。今後,このcDNAを使い,ジーンターゲッティングや細胞表面の糖鎖の改変を行ってガングリオシドGD3およびGQ1bの生物機能を解明して行く。また,遺伝子解析によって,糖鎖の発現制御なども明らかにしていく予定である。
ストレステンソルエネルギー密度による化学結合様式の新しい分類

本研究では、電子のストレステンソル密度を用いた電子状態の記述を元に、新しい化学結合の理論を展開した。この理論では、空間の各点で定義される電子ストレステンソル密度が中心的な役割を果たすが、そこから導かれるテンション密度、エネルギー密度、領域化学ポテンシャルというやはり局所的に定義される量を用いて、化学結合や反応性を新しい方法で表現できる。これは従来の電子密度や軌道を主とする方法とは異なる視点を与えるにとどまらず、実用上にも有利な点がいくつも見出されている。今年度の研究は以下のようなものが含まれる。(1)エネルギー密度を定義したことから、反応において、どの部分が安定化しているかを示すことができる。詳しくは、反応後の分子のエネルギー密度と、反応前の分子のエネルギー密度の差をとることを行い、これを相互作用エネルギー密度と呼ぶ。このことを三塩化ホウ素と水または水酸化鉄(III)との反応において示した。どうようの差分を電子密度についても計算して比較することで、電子密度の増加と安定化が対応している(が、全く同じではない)ことが見出され、安定化を直接エネルギーで見ることができることを例示した。(2)水素分子イオンの厳密解を用いて電子ストレステンソル・テンション・相互作用エネルギーを基底状態と励起状態について計算し、それらの様子を正確に調べた。ストレステンソルの最大固有値が正の部分でかつその固有ベクトルが核間をつないでいる構造(スピンドル構造)の正確な形が見出され、それは核に接していることがわかった。基底状態と励起状態との比較では、基底状態で最大固有値正の部分が見いだされたのに対して、励起状態ではそのような構造はみられず、ストレステンソルは結合をよく表わしていることが示された。本研究では、電子のストレステンソルを用いた電子状態の記述を元に、新しい化学結合の理論を展開した。この理論では、空間の各点で定義されるストレステンソルが中心的な役割を果たすが、そこから導かれるテンションカ、エネルギー密度、局所化学ポテンシャルというやはり局所的に定義される量を用いて、化学結合を新しい方法で表現できる。これは従来の電子密度を主とする方法とは異なる視点を与えるにとどまらず、実用上にも有利な点がいくつも見いだされている。このストレステンソル解析は独自性の高い手法ではあるが、ストレステンソル自体は従来のDFT法などから計算される波動関数から構成され、われわれのグループによって計算パッケージも公開されている。これは更なる理論の展開とともに順次拡張される予定である。本年度ではその応用として、Ptクラスター、A1クラスターへの水素吸着に関する化学結合や化学反応性が解析された。ラスター(Pt数は29)のあらゆる結合について、結合次数と結合長の関係を調べたところ、H-H結合、Pt-H結合、Pt-Pt結合を分類でき、われわれのエネルギー密度を用いた結合次数は、結合長と非常にきれいな線形に近い相関を持つことがわかった。Alが四面体の頂点に位置するにうなクラスターに水素を吸着させた分子の結合次数を計算したところ、やはりAl-HとA1-A1でそれぞれグループに分離され、結合次数は結合長と比例関係にあることがわかった。12個のAlが二十面体の頂点に位置するような4ラスターの中心にsi,A1,Mgまたはその正負イオンのいずれかがあるようなクラスターへの水素吸着させた時の、様々な原子問の結合次数を計算したところ、この場合も異なる結合間でグループ分けがされ、グループ内では結合長に関して結合次数は線形に減少していることがわかった。
高温処理自家骨移植の基礎と臨床応用(骨形成因子から見た骨誘導と靭帯固着)

まず高温処理により骨内の骨形成因子活性に基ずく骨誘導能の変化を検討した結果、70度10分処理が最も望ましい処理条件であると結論した。さらに温度処理骨内に内在する骨形成因子が、靭帯表層の滑膜細胞に作用し、軟骨に誘導することによって、靭帯が温度処理骨により強固に固着する条件を検討した結果、組織学的には70度10分処理骨によって靭帯組織より明らかな軟骨・骨誘導が生じることを確認した。さらに引っ張り強度を検討した結果、70度10分処理骨にさらに表面脱灰処理を加えることにより、靭帯表層の滑膜細胞に作用し、軟骨・骨誘導を通して未熱処理骨と同程度の靭帯固着性を獲得できることを確認した。また70度10分処理骨の免疫原性についてマウス同種移植系を用いそのCTL活性を測定した結果、新鮮超低温保存骨と同程度に免疫原性は抑えられていることを確認した。さらにSwarm軟骨肉腫組織を用いた温度処理実験で、少なくとも50度20分処理でも腫瘍組織は完全に死滅せず、5週間後には腫瘍組織の増大をみることも確認し、腫瘍の再建に用いる為には、少なくとも60度10分以上の温度処理が必要である事も確認した。さらに50度より100度の温度処理条件と15分より10時間までの処理時間を組み合わせた実験系で骨誘導能を、Al-pレベル、Al-p・2型コラーゲン・1型コラーゲンのmRNAレベル、カルシウム含料を目安にして検討した結果、組織学的な骨・軟骨誘導の検討のみならず1型・2型コラーゲン・Al-p等のmRNAレベルにても70度10分処理の優れていることが実証できた。また同種骨移植を念頭において殺ウィルス処理を含めた温度処理では60度10時間処理を選択することにより、骨形成因子活性を温存できることが理解できた。平成3年度実験モデル2(温度処理骨と靭帯固着)に関して、実験方法に記述した如くラット趾屈筋腱を各温度処理骨に縫着し組織学的検討を加える他、各温度処理骨について塩酸処理による表面脱灰の加えた群と加えない群を作製し、表面脱灰の有無による靭帯結合の変化についても検討し、さらに各群について引っ張り試験を追加し、定量的検討とした、移植後4週では非脱灰骨群では未分化問葉系細胞の増生・浸潤は乏しく、腱と骨との間には間隙が存在した。脱灰骨群では未分化間葉系細胞の浸潤が著明であり、置換された繊維組織が移植骨内の表面脱灰骨部に入り込んでいる像も認められた。12週の経過では、非脱灰骨群では未分化間葉系細胞の浸潤は減少し、繊維組織に置換され、移植骨表面に繊維組織の進入が認められた。脱灰骨群では未熟処理骨と70度処理骨において骨軟骨組織の誘導が見られる部分もあり、腱繊維組織の骨内への進入が認められた。さらに引っ張り試験については4週の経過のみでは移植骨の熱処理の違いによる差異は認められなかったが、未熟処理骨では表面脱灰により引っ張り強度は増強した。12週の経過では移植骨の熱処理温度が高い程引っ張り強度は低下した。また表面脱灰操作により未熟処理骨・70度処理骨では引っ張り強度は増すが、125度加温骨では増加しなかった。さらに各温度処理骨の免疫原性や異物反応惹起性を検討する目的にて、マウスの系で組織適合性抗原のMagor mismatch群とMinor mismatch群を用いて各温度処理骨の移植実験を行い始めている。

まず高温処理により骨内の骨形成因子活性に基ずく骨誘導能の変化を検討した結果、70度10分処理が最も望ましい処理条件であると結論し、さらに自家移植温度処理骨への靭帯の固着性を検討した結果、70度10分の温度処理骨にさらに表面脱灰操作を加えることによってオートクレーブ処理骨に比し格段に優れ、自家未熱処理骨と同等の靭帯固着性を獲得することが可能になることを明らかにした。またこの70度10分処理骨の免疫原性について、マウス同種移植系を用いそのCTL活性を測定した結果、新鮮超低温保存骨と同程度に免疫原性は抑えられており、実際の同種移植において70度10分処理を加えた処理骨には免疫原性は極めて低く抑えられていることも明らかとなった。つまり70度10分処理骨はさらに高温を加えた処理骨に比し、骨誘導能は高く維持され、表面脱灰操作により靭帯固着性も従来の自家骨移植と同程度良好に発揮されることを示した。またSwarmラット軟骨肉腫を用いた実験では50度30分処理でも腫瘍は完全には死滅しないことを確認しており、腫瘍の再建に用いる為には少なくとも60度以上の熱処理が必要であることも重要なポイントとして確認した。またこの温度処理骨をラットに移植した系で、アルカリフォスファターゼ・2型コラーゲン・1型コラーゲンのm-RNAの経時的測定を行い、温度処理骨に由来する骨・軟骨形成の経時的変化をより具体的に把握することによって骨形成因子による骨誘導能には、軟骨を主として誘導するものと、骨を主として誘導するものがありそうであることを見いだしている。さらには60度、70度、80度の各温度について処理時間を10時間と設定し、ウィルスに対する滅菌効果と骨誘導能についても検討中である。この温度処理骨内の骨形成因子活性に基ずく骨誘導能の変化を組織学的検討にとどめず、さらにアルカリフォスファターゼ活性や、Al-p・2型コラーゲン・1型コラーゲンのmRNAレベルの推移を50度より100度までの温度条件に加え、処理時間を殺ウィルス効果をも有するように考えて1時間・10時間にまで延長した組合せを作製して検討した結果、70度以上の温度処理群では1時間・10時間処理では骨誘導能が組織学的レベルにおいても有意に低下し、アルカリフォスファターゼレベルでは80度以上の処理温度で低下を認め、A1-p・1型コラーゲン・2型コラーゲンのmRNAレベルでも、80度以上の処理温度にて有意に低下すると共に、10時間処理では70度の処理温度群においても明らかな骨誘導能の低下を認めた。つまり自家骨を用いた移植条件では、ウィルス感染の危険性を考慮する必要は無いため、70度10分処理が優れていることが、さらに確認できた。また同種骨移植を考慮にいれた場合には、ウィルス感染が顕在化していない個体からの移植であっても、60度10時間処理により、殺ウィルス効果を有しさらに骨形成因子活性よりみた骨誘導能が維持されていることが確認できた。
グリア細胞の遠隔活性化に着目した慢性疼痛発現メカニズムの解明とその治療法の確立

慢性疼痛の中でも神経の損傷に伴う痛みである神経障害性疼痛は、既存の鎮痛薬では緩和することが難しい疼痛の一つである。本研究では神経障害性疼痛モデルを作製し、大脳における神経系機能の亢進について検討を行い、その調節による疼痛緩和の可能性について検討を行った。神経障害性疼痛モデルマウスにみられた痛覚過敏は、神経伝達物質の放出を抑制するガバペンチンにより改善した。このガバペンチンの効果は、神経障害後3日間の処置でみられたが、神経障害による痛覚過敏が出現してからの処置では改善しなかった。このことから、ガバペンチンは大脳へ作用して神経障害による痛覚過敏の形成を抑制することが明らかになった。次に大脳における神経系細胞の機能変化について検討を行った。大脳の帯状回皮質においてミクログリアならびにアストロサイトの活性化が認められた。また、ミクログリアの活性化を調節する薬物であるミノサイクリンを帯状回皮質へ処置すると神経障害による痛覚閾値の低下が抑制された。このことから帯状回皮質におけるミクログリアの活性化は神経障害による痛覚過敏の発現に関与することが明らかになった。また、ミクログリアの抑制は、アストロサイトの活性化も抑えた。さらに、興奮性の神経伝達に関わるグルタミン酸神経の受容体機能の神経障害による亢進も、ミノサイクリンにより改善した。これらのことから、神経障害により帯状回皮質においてミクログリアが活性化し、この脳領域での興奮性神経伝達を亢進させるため、痛覚過敏が生じていることがわかった。慢性疼痛に悩まされる国民は2200万人おり、その治療は満足のいくものになってはいない。疼痛は、不快な感覚情報として、脳において認識される。つまり、感覚情報と情動情報の二つの側面を有しており、いずれかの情報がなくなると、疼痛として感じられなくなると考えられている。これまでに情動性の入力を調節するよ疼痛として感じられた感覚が、どのように変化するのかに関する基礎的検討は行われていなかった。そこで、本研究では神経障害性疼痛モデルを作製し、情動性に関わる脳領域での神経系細胞の機能変化とその調節による疼痛緩和の可能性について検討を行った。神経障害性疼痛モデルマウスでは、大脳の帯状回皮質においてミクログリアならびにアストロサイトの活性化が認められた。次に、ミクログリアの活性化を調節する薬物であるミノサイクリンの効果を検討したところ、帯状回皮質への処置により神経障害による痛覚閾値の低下が抑制された。この結果は、情動を司る脳領域の機能調節により疼痛が緩和されることを示しており、痛覚伝達の直接的な制御では治療が困難である神経障害性疼痛の治療において情動を司る脳領域の興奮性を低下させる治療法が有効である可能性を示唆している。慢性疼痛は、患者にとっても医療者にとっても大変悩ましい問題である。多くの研究が展開されているが、満足の行く治療法は確立されていない。痛みは脳で認識されるが、これまでの慢性疼痛の研究は痛みが伝わる経路である脊髄機能の解析が中心であった。しかし、脳内で痛みが感じやすくなると、脊髄や末梢において痛み伝達亢進の改善を行なっても、その効果は限定的になる。