hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高次染色体構造を基質とした生化学及び微細構造解析法の開発

本研究では、細胞内から特定の領域のクロマチンファイバーを精製し、可視化解析および生化学的解析に供する手法の確立を目的とする。研究期間内に、制限酵素により断片化した染色体クロマチンファイバー、酵母細胞内に導入した環状DNAに形成されたクロマチンファイバーなどの精製を行い、そこに結合している複製開始制御因子などの構造を原子間力顕微鏡(AFM)による可視化解析により検出した。また、その構造を比較検討する対象として、試験管内でpre-RCなどのDNA複製開始制御因子や複製ヘリカーゼとDNAとの複合体を形成し、その可視化解析を行った。本研究は、細胞内から種々の染色体タンパク質を含んだ高次クロマチンを、その構造を維持したまま精製し、AFMによる可視化解析および生化学的解析に供する技術を確立することを目的とする。26年度は、標的とする染色体領域として、複製開始領域および複製フォークを含むクロマチンを選択し、その精製方法の条件検討を行った。まず、複製開始プロセスの解明をめざし、“複製開始領域を含むクロマチンの精製"を実施した。LacO配列と複製開始領域特異的な塩基配列を含むプラスミドを出芽酵母細胞に導入し、このプラスミド上に形成されたクロマチンを、LacI-FLAG融合タンパク質とともに抗FLAG抗体で免疫沈降した。この際、細胞の破砕方法を、細胞壁を融解させる酵素を用いる方法や、グラスビーズを用いた物理的破砕方法などを試した。また、安定にクロマチン構造を維持したままの精製を達成するため、種々の架橋固定剤の効果も試験した。その結果、クロマチンを高い再現性でAFMにより可視化できる手法を確立した。また、複製フォークが進行を停止する配列を繰り返し含むrDNA領域にLacO配列を導入した出芽酵母を材料としてrDNA領域を精製し、AFM観察に供する実験も実施した。本実験は染色体DNA上の当該領域付近を切断し可溶化する必要があるため、細胞粗抽出液を制限酵素処理した後に免疫沈降処理を行った。しかし、制限酵素処理時の溶液条件によりクロマチン画分が不溶性となり、精製効率が低下したため、グラスビーズ破砕によりクロマチンを細断するなどの検討も行った。その結果、回収効率が未だ低く複製フォークの精製には至っていないものの、クロマチンファイバーの回収はAFM観察により確認できた。以上のように、高次クロマチン複合体の回収が可能となりつつあることは、次のステップである、「高次構造と生化学的性質の相関の実験的証明」をおこなう実験材料を調製可能とした点において、大きな進展であると考える。本研究は、細胞内から種々の染色体タンパク質を含んだ高次クロマチンをその構造を維持したまま精製し、AFMによる可視化解析および生化学的解析に供する技術を確立することを目的とする。26年度までに、出芽酵母に導入した環状DNAを、そこに結合するヌクレオソームや複製開始因子を含む複合体として精製・可視化することに成功したが、27年度は、染色体の部分領域を精製することを目指し、局所的に染色体上にビオチン化修飾を導入する実験をおこなった。具体的には、複製開始因子であるSld3などのタンパク質にビオチン化ライゲースを融合させ、出芽酵母内で発現させる実験を行った。これにより、Sld3と空間的に近くに配置されているタンパク質がビオチン化されることが期待される。これまでに、融合タンパク質が細胞内で発現していることや、ストレプトアビジン固定ビーズによる精製で多くのタンパク質が共精製されていることが確認されている。今後、標的としている複製開始領域クロマチンが選択的に精製できているか等を精査し、また、Sld3以外のタンパク質をビオチン化ライゲースと融合させる実験も行うことで、本手法を様々な染色体領域を精製する手法として確立されることが期待される。また、前年度までに精製法を確立した環状DNAについては、S期に同調させた酵母細胞から精製した標品の観察像では、巨大なタンパク質複合体がDNA上に観察されたものの、その複合体に含まれるタンパク質の同定には至っていない。そこで、比較対象として、再構成クロマチン上にS期に形成される複製ヘリカーゼであるCMG複合体を結合させた標品のAFM観察を行った。この画像と、前述のS期細胞から精製した環状DNA上のクロマチンの像とを比較することで、クロマチン上で複製因子が機能する分子メカニズムを解析できる系となる。以上の結果のように、クロマチン上での反応を可視化および生化学的に追跡する技術基盤の確立を行った。当初の予定通り、クロマチンの切り出し方法や回収方法の条件検討と、回収されたクロマチンのAFMによる評価を、26年度中に実施することができた。環状DNAを細胞に導入しその上に形成されたクロマチンを単離・精製するのに対し、ゲノム上のクロマチンを切り出して回収するアプローチには実験上の制約が多く、精製効率が低いことが判明したが、27年度に引き続き精製方法の改善を図ることにより、当初の計画通りに研究が遂行できるものと考える。

染色体動態当初の予定通り、27年度は、前年度までに確立した手法により精製したクロマチンを基質として用いた生化学実験を開始する。具体的には、複製開始因子を含む精製プラスミドに、複製の開始までに機能するタンパク質を混合するなどし、その結合親和性や、複製開始までの反応(2本鎖DNAの開裂や、相補鎖の合成といった反応)の有無、その際のクロマチン構造変化を試験する。また、26年度までに高効率での精製を達成できなかったゲノムからのクロマチンの切り出しの条件の改善を引き続き行う。当初から使用を検討していた“yeast site-specific recombination R/RS system"を用いるなどして、効率の良いクロマチンの切断・可溶化を目指す。今期は、予備的な実験を種々行った。進展はほぼ予定通りではあったが、より経費の必要な本実験までは至らなかったため。次年度は、今期に確立した手法により本実験を行うため、主として物品費として全額使用予定である。
発がんにおける酸素ラジカルの関与

1.ペルオキシゾーム増生剤であり、且つ発がん物質であるcisProfibrateをラットに投与し、発がん標的臓器である肝DNAの8-ヒドロキシデオキシグアニン(8-OH-dG)を定量したところ、少量長期間投与で8-OH-dGに顕著な増加がみられた。この結果は発がん過程で細胞内DNA中に実際に酸化的DNA損傷がおこっていることを示している。又かみタバコと口腔粘膜細胞DNA中の8-OH-dGの関連について、100例を分析したところ、数例の前がん病変をもつ人で高い値が得られた。高危険グループのスクリーニングに応用できる可能性がある。2.カテコール、その異性体と誘導体を、少量のMNAN、MNNGで発がんイニシェーションさせたラットにあたえたところ、明らかに胃がん発生を増加させた。このことは、酸素ラジカルのプロモーター作用を示すものである。3.腸内細菌によるコール酸分解物、4-(deca hydro-6-methyl-3-oxocyclopenta〔f〕-quinoline-7-β-yl)valeric acidにペルオキシゾーム増生作用があることがわかった。4.肝発癌性のある真菌生産物、leteoskyrinでBalb3T3細胞を処理することにより、この物質が形質転換能を持つと共に、細胞内DNAに8-OH-dGを増大させることを明らかにした。この結果leteoskyrinの発がん性が酸素ラジカル発生に起因する可能性を示している。5.酸素ラジカルの作用を評価するのに、酸素ラジカルの第一次酸化物である脂質ヒドロペルオキシドの高感度測定法を開発し、この方法を用いて、ヒト血漿中にコレステロールエステルヒドロペルオキシドを検出することができた。6.ヒト正常型C-Ha-rasp21をコードする化学合成遺伝子のコドン12番目のGGTのGを8-OH-dGに置換えしたDNAを合成し、NIH3T3細胞のトランスフェクションに用いたところ、トランスフォーミング活性が得られた。この実験はin vivoでも8-OH-dGは変異に関与していることを示唆している。
機能的組織構築を目指した培養基板力学特性の空間分布操作による細胞挙動制御

培養基板の力学特性の空間分布を操作することで細胞の機能や配向をどこまで制御できるか,その可能性を追求するため,表面の薄層のみ力学特性が異なる基板を用いた細胞の基板力学特性検知機構の解明,弾性率が場所により異なる基板を用いた細胞分離,力学的異方性を有する基板を用いた細胞配向制御を進めることを目的として2年間の研究を進めた.研究後半の本年度は,まず,面内で弾性率が変化する基板の作製を行ない,その上での細胞挙動を調べた.既報(Wong et al.Langmuir,2003)を参考にアクリルアミド溶液に光重合開始剤を加え,適当なマスクを当てつつ紫外線照射してゲル化させることで,弾性率が徐々に変化する基板を作製した.弾性率の範囲は既報(Engler et al.Cell,2006)を参考に幹細胞が筋細胞から骨芽細胞に分化する基盤弾性率の範囲である10-50kPaとした.また,基盤弾性率が20kPa違うと別の細胞に分化すると言う報告から,細胞は5kPa程度の弾性率の差を感知できると予想し,細胞長を100μmとした時にその両端で5kPaの弾性率差が生じるように,50kPa/mmの弾性率勾配を持たせることとした.レーザプリンタを用いて適当なグレーレベルのマスクを作製することで,弾性率範囲2075kPa,弾性率勾配50kPa/mmのゲルの作製ができるようになった.次に作製した基板上で腫瘍由来の血管内皮細胞UV♀2を培養し,その挙動を観察した.その結果,細胞は50kPa付近を境として,より硬い側あるいは柔らかい側に移動する傾向があること,また,硬い領域では細胞が弾性率勾配と直交する方向に動く傾向のあることが観察された.しかし,減光マスクのグレーレベルに応じた微細なパターンがゲル弾性率にそのまま転写され,これが細胞挙動に影響している可能性も否定できず,この点の確認が課題として残された.培養基板の力学特性の空間分布を操作することで細胞の機能や配向をどこまで制御できるか,その可能性を追求するために,表面の薄層のみ力学特性が異なる基板を用いた細胞の基板力学特性検知機構の解明,弾性率が場所により異なる基板を用いた細胞分離,力学的異方性を有する基板を用いた細胞配向制御を進めることを目的として2年間の研究を進めている.研究初年度の本年は,まず,表層の厚みを変化させた2層基板の作製とこの上での細胞挙動観察を行った.すなわち,表層だけが柔らかい基板を作製するために,ガラス基板上に厚さ数100μmのポリアクリルアミド・ゲルの薄膜を成形する方法を確立した.作製した表層厚みの異なる基板上で種々の細胞を培養し,どの厚みから細胞の形態等に変化が見られるか調べた.その結果,柔らかい厚い基板の上で培養された細胞は丸くなるが,ゲル厚みが10μm程度になると広がり始めることが判った.これより,細胞は自身の寸法(100μm)より遙かに小さい10μm程度の深さの基板硬さまでしか察知できないことが判った.この結果は細胞が底面全体を変形させて基板の力学特性を計測しているのではなく,個々の焦点接着斑を独立に運動させて力学特性を計測している可能性を示唆する結果と言える.この点を定量的に調べるために,焦点接着斑に加わる力とそれにより生じる焦点接着斑の変位に対する基板厚みの影響の有限要素解析を行った.この結果,細胞が基板弾性率を焦点接着斑の動きの大きさで察知していることを示唆する結果が得られた.培養基板の力学特性の空間分布を操作することで細胞の機能や配向をどこまで制御できるか,その可能性を追求するため,表面の薄層のみ力学特性が異なる基板を用いた細胞の基板力学特性検知機構の解明,弾性率が場所により異なる基板を用いた細胞分離,力学的異方性を有する基板を用いた細胞配向制御を進めることを目的として2年間の研究を進めた.研究後半の本年度は,まず,面内で弾性率が変化する基板の作製を行ない,その上での細胞挙動を調べた.既報(Wong et al.Langmuir,2003)を参考にアクリルアミド溶液に光重合開始剤を加え,適当なマスクを当てつつ紫外線照射してゲル化させることで,弾性率が徐々に変化する基板を作製した.弾性率の範囲は既報(Engler et al.Cell,2006)を参考に幹細胞が筋細胞から骨芽細胞に分化する基盤弾性率の範囲である10-50kPaとした.また,基盤弾性率が20kPa違うと別の細胞に分化すると言う報告から,細胞は5kPa程度の弾性率の差を感知できると予想し,細胞長を100μmとした時にその両端で5kPaの弾性率差が生じるように,50kPa/mmの弾性率勾配を持たせることとした.レーザプリンタを用いて適当なグレーレベルのマスクを作製することで,弾性率範囲2075kPa,弾性率勾配50kPa/mmのゲルの作製ができるようになった.次に作製した基板上で腫瘍由来の血管内皮細胞UV♀2を培養し,その挙動を観察した.その結果,細胞は50kPa付近を境として,より硬い側あるいは柔らかい側に移動する傾向があること,また,硬い領域では細胞が弾性率勾配と直交する方向に動く傾向のあることが観察された.しかし,減光マスクのグレーレベルに応じた微細なパターンがゲル弾性率にそのまま転写され,これが細胞挙動に影響している可能性も否定できず,この点の確認が課題として残された.
tRNAとaaRSの複合体形成の初期過程としてアンチコドンの識別機構の重要性

これまでアミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)が、対応するtRNAを識別しアミノアシル化の反応を促進する過程において、aaRSの構造は変わらないという仮定で解析が行われてきた。Thermus themophilus由来MetRS(T-MetRS)においても種の異なるE.coli由来MetRS(E-MetRS)と骨格が同じであると仮定し、E-MetRSをサーチモデルとして分子置換法を試みたが失敗に終わった。このことはN末端ヌクレオチド結合ドメインとC末端アンチコドン識別ドメイン間の相対的配向が異なることを示唆すると考え解析を行なった。その結果、T-MetRSの二量体形成ドメインを除去した503のアミノ酸残基より成る酵素単量体の分子全体の配置を求めることが出来た。反射強度は、高エネルギー物理学研究所の放射光測定系を用い収集した。母結晶は、2.0Åの分解能で独立の反射33347個(Rmerge=7.0%)を得た。多重同型置換法によりPHASESプログラムで解析を進め、3.5Å分解能の反射で重原子位置の精密化を行い、6595個の反射に対しfigure of meritは0.478であった。solvent flattenigの位相から得た電子密度図は分子の明確な境界を示した。3次元グラフィックス上でOプログラムを用いてC末端ドメインのαヘリックスを構築し、E-MetRSをそれに合わせ、ミニマップ上でN末端ドメインの配向のずれを考慮し骨格を同定した。予想通り30残基削除のある126から222のループの周囲は電子密度が低くE-MetRSと大きな構造の違いを示す。この部分を除くほぼ全てにおいてミニマップでトレースすることができた。C末端ドメインと二量体形成ドメインを結ぶ505から551のC末端は、E-MetRSではN末端ドメインに戻る。しかし、対応する468から503のT-MetRSのC末端は、C末端ドメインの末端に付いている。E-MetRSでは、N末端ドメインに戻ることよりN末端とC末端ドメインが固定されるが、T-MetRSでは、相互に動きやすいことを示す。
共培養モデルにおける肺線維症の病態解明とプラズマローゲンによる治療可能性の検討

IPFの病態形成に血管網の異常が関与し線維化が形成されていることが報告されている。これまでの研究で血管内皮細胞と線維芽細胞を共培養し、培養条件において血管網を構築させ、これらの細胞の相互作用を評価しうるモデルを作成した。また、iPS細胞における血管内皮細胞分化誘導実験において、プラズマローゲンが重要なリン脂質であることを明らかにした。本脂質は抗酸化作用を持ち、酸化ストレスのかかる種々の疾患において減少することが報告されており、プラズマローゲンはIPFの治療候補になる可能性がある。共培養モデルにおけるIPFの病態解明とプラズマローゲン投与の影響を評価し、新規治療薬としての可能性を検討する。
高温多成分系における新奇な低エネルギーフェルミオンモードの探求

交付申請書の「研究の目的」にあるように、研究員は有限温度Tにおけるクォーク・グルーオンプラズマ(QGP)中のフェルミオン的な集団運動の解明を目指している。しかしg2T(g:結合定数)程度のエネルギー領域を解析する場合、衝突などの粒子同士の相互作用の効果が無視できない事を反映して、単純なループ展開は適用できない。申請者はその領域を解析できるように改善された摂動展開を、カダノフ・ベーム方程式に勾配展開を適用する事で系統的に導出する事を目指す。その結果として、その摂動展開と等価な運動学的方程式が得られると期待される。そのために2012年4月下旬から5ヶ月間、その手法の経験があるJean-Paul Blaizot氏をホストとしてフランスの理論物理学研究所に滞在し、研究を行った。その結果、期待された結果が得られた。この結果を論文にまとめ、Physical Review D誌において出版した。さらに、Blaizot氏と以下のような共同研究を行った。研究員は以前クォーク・グルーオンプラズマ中におけるクォーク的な低エネルギー集団運動の研究を先に述べた改善された摂動展開を用いて行い、その存在および分散関係、崩壊幅、強度などの性質を明らかにしていた。しかしながら、その解析は化学ポテンシャルが0の場合に限られていた。今回の研究においては、化学ポテンシャルが有限の場合について解析を行った。その結果、温度が0で化学ポテンシャルが有限の場合では粒子・反粒子対称性が破れる事により低エネルギー集団運動は存在しなくなる事を明らかにした。また、低エネルギー励起が存在する化学ポテンシャルの最大値は、温度と同程度の大きさである事を示した。現在これらの結果をまとめた論文を執筆中である。これらの研究結果は、4つの学会(国際)および1つの学会(国内)においてポスターおよび口頭で発表された。
ニューロステロイド系を介したGABA_A受容体機能制御と新規中枢作用薬への応用

ニューロステロイド(NS)系を介したGABA_A受容体(GABA_A-R)機能制御系の重要性を明らかにし,この制御系を標的とする新規中枢作用薬の開発基盤を確立するための研究を行った。実験では長期隔離飼育(IS群)またはコミュニケーション箱(CB)法でマウスに心理的ストレスを負荷し,対照群には群居飼育マウス(GR群)を用いた。IS群ではストレス負荷期間依存性にGABA_A-R機能促進性NS(アロプレグナノロン:ALLO)量が低下し,それと伴にペントバルビタール(PB)睡眠が短縮した。フルオキセチンはIS群の脳内ALLO量及びPB睡眠を正常化させた。ALLO生合成阻害はPB及びムシモール誘発睡眠を短縮し,皮質神経細胞のGABA_A-R電流応答を低下させた。中枢性(CBR)及びミトコンドリア性ベンゾジアゼピン受容体(MBR)の内因性物質DBIはGR群のPB睡眠のみを短縮し,この作用はCBR拮抗薬で抑制された。一方,IS群はGR群よりも視床下部DBI遺伝子発現が低下していた。MBR作動薬はIS群のPB睡眠を正常化し,その効果はGABA_A拮抗性のプレグネノロン硫酸(PS)で抑制された。CB法による心理的ストレスは神経性一酸化窒素合成酵素を活性化して脳細胞膜損傷を惹起した。Majonoside-R2(MR2)はこの損傷を抑制し,その効果はPSで拮抗された。以上の結果,正常動物では脳内ALLOがGABA_A-R機能を賦活していることが明らかとなった。また心理的ストレスによる脳内ALLO量減少はGABA_A-R機能を障害し,ALLO量の正常化はストレス病態を改善することが示唆された。更に心理的ストレスによるDBI活性の上昇がPB睡眠短縮に一部関与し,視床下部のDBI遺伝子発現には負帰還制御系が存在する可能性が考えられた。MR2はNS系を介して心理的ストレス誘発の脳細胞膜損傷を抑制することが示唆された。ニューロステロイド(NS)系を介したGABA_A受容体(GABA_A-R)機能制御系の重要性を明らかにし,この制御系を標的とする新規中枢作用薬の開発基盤を確立するための薬理学的,神経化学的研究を行った。薬理実験:心理的ストレス負荷動物には隔離飼育マウス(IS)を,対照群には群居飼育マウス(GR)を用いた。ペントバルビタール(PB:50mg/kg,i,p,)投与後,正向反射消失時間を睡眠時間として測定した。試験薬は脳室内または腹腔内投与した。神経化学実験:大脳皮質よりNSを分離精製し,ガスクロマト質量分析法で定量した。中枢性ベンゾジアゼピン(BZD)受容体(CBR)とNS産生に関与するミトコンドリア性BZD受容体(MBR)に働く内因性ペプチドdiazepam bindinginhibitor(DBI)の遺伝子発現に及ぼす心理的ストレスの影響を調べた。1.IS群ではGABA_A-R機能促進性NS(allopregnanolone:ALLO)量が低下し,それに伴ってPB睡眠時間が短縮した。抗うつ薬fluoxetineはIS群の脳内ALLO量及びPB睡眠時間を正常化させた。2.脳室内投与したDBIはGR群のPB睡眠のみを短縮し,この作用はCBR拮抗薬flumazenilで抑制された。

3.IS群の視床下部DBI遺伝子の発現量はGR群と比べて著明に低下していた。以上の結果,(1)脳内ALLO量の減少がGABA_A-R機能を低下させ,ストレス病態を発現させること,(2)脳内ALLO量の正常化によりストレス病態が改善される可能性が高いことが示唆された。更に(3)心理的ストレスによるDBI活性の上昇が一部,PB唾眠時間の短縮に関与することが示唆されたが,DBImRNA発現量は逆に低下したことからDBI遺伝子発現系におけるフィードバック制御系の存在,やDBI以外の内因性物質の存在の可能性も推察された。ニューロステロイド(NS)系を介したGABA^A受容体(GABA_A-R)機能制御系の重要性を明らかにし,この制御系を標的とする新規中枢作用薬の開発基盤を確立するための研究を行った。薬理実験:長期隔離飼育またはコミュニケーションボックス(CB)法でマウスに心理的ストレスを負荷した。対照群には群居飼育マウス(GR)を用いた。ペントバルビタール(PB)またはムシモール(MS)投与後,正向反射消失時間を睡眠時間として測定した。神経化学実験:脳組織中のNSを精製し,ガスクロマト質量分析法で定量した。またCB法で心理的ストレスを負荷した動物の脳内脂質過酸化反応をチオバルビツール酸反応物質の産生量を指標に測定した。GR群では皮質中アロプレグナノロン(ALLO)生合成速度は24pmol/g/hで,神経伝達物質の値に匹敵した。また脳内ALLO含量の低下はPB及びMS睡眠短縮を起こすほか,皮質神経細胞のGABA受容体電流応答性を有意に低下させた。IS群のPB睡眠はプレグネノロン及び末梢性ベンゾジアゼピン受容体(PBR)作動薬投与によってGR群レベルまで回復した。GABA拮抗性NS(プレグネノロン硫酸:PS)は両薬物の効果を抑制した。CB法による心理的ストレス負荷は脳内脂質過酸化反応を有意に促進し,この促進は神経性一酸化窒素合成酵素活性に起因した。Majonoside-R2(MR2)は心理的ストレスによる脳内脂質過酸化反応の促進を抑制したが,その効果はPSで拮抗された。1)正常動物では脳内ALLOは緊張性にGABA_A-R機能を亢進しさせており,心理的ストレス等によるALLO含量の減少がGABA_A-R機能低下を惹起することが明らかとなった。2)またこのALLO含量低下におけるPBRの関与が示唆された。3)MR2はNS系を介して心理的ストレスによる脳細胞膜損傷を抑制することが推察された。
MEMS・レーザアレイによる高速動的光再構成型ゲートアレイの研究開発

近年、日本の半導体産業は熾烈な国際競争の中で、日本固有の技術的優位を保てずに苦戦している。また、VLSIプロセスの微細化が難しくなり、ムーアの法則に従って急激に進歩してきたVLSI技術の先行きが不透明になってきている。それらの理由から申請者らは既存の微細化に頼る半導体の進歩の流れとは一線を画する光電子融合半導体の研究を進めてきた。本研究ではMEMS・レーザアレイ・ハイブリッド構造による高速動的光再構成型ゲートアレイを開発した。10億ものコンテキストを数ナノ秒周期でゲートアレイに実装し続けることが可能で、これまでに無い超高速動的再構成技術を実現した。本研究では、ホログラムメモリ、MEMS(ミラー・アレイ・デバイス)、レーザアレイ、光書き込み型ゲートアレイVLSIから構成され、超高速動的再構成可能な光再構成型ゲートアレイを開発する。この開発の中で、本年度はMEMSデバイスの立ち上げ・評価を実施した。TEXAS INSTRUMENTSのDLPデバイスを導入し、DLPを制御するために必要なソフトウエア類、支援基板類の開発を行った。そして、そのDLPと支援システムを使用して静的なホログラムメモリの実装を行い、その光再構成試験に成功した。現在のところ、1つのコンテキストの実装に成功したのみであるが、次年度にはマルチコンテキスト化に向けて研究を進める予定である。また、大容量の記録を可能にする体積ホログラムメモリとして、液晶と高分子からなる有機複合材料を用いた高分子分散型液晶ホログラムメモリ技術を導入し、その高合子分散型液晶ホログラムメモリ専用の記録光学系を開発した。光再構成に使用するコンテキストパターンをマスクで生成し、高分子分散型液晶ホログラムメモリへの書き込み試験を行った。結果、寸法、コントラスト共に問題のないコンテキストの生成に成功し、光再構成型ゲートアレイに対する光再構成試験に成功した。動的再構成・論理合成ツール・配置配線ツールの開発においては、カリフォルニア大学バークレー校で開発された論理合成ツールSISとトロント大学で開発されたFPGA用配置配線ツールVPRをベースにして、光再構成型ゲートアレイ専用のツールの動的再構成に必須となるコンテキスト間の最適化について研究開発を進めた。本研究ではホログラムメモリ、MEMS(ミラー・アレイ・デバイス)、レーザアレイ、光書き込み型ゲートアレイVLSIから構成され、超高速動的再構成可能な光再構成型ゲートアレイの開発を進めている。昨年度はMEMSデバイス、TEXAS INSTRUMENTSのDLPデバイスを導入し、DLPを制御するために必要なソフトウエア類、支援基板類の開発を行った。そして、そのDLPと支援システムを使用して静的なホログラムメモリの実装を行い、1つのコンテキストの光再構成試験に成功した。本年度は、それらの開発成果を受けて、マルチコンテキスト化の研究に取り組み、4つのコンテキストの実装まで研究を進めた。次年度には、ミラーの角度制御を用いたホログラムメモリの読み出し試験に着手する予定である。一方、大容量の記録を可能にする体積ホログラムメモリとして、液晶と高分子からなる有機複合材料を用いた高分子分散型液晶ホログラムメモリ技術の研究を進めている。今年は偏光依存性を活用した高密度記録に関する研究を進め、その書き込み、読み出し試験に成功した。回折効率に、まだ改善しなければならない課題が残るが、その点については次年度に取り組む。動的再構成・論理合成ツール・配置配線ツールの開発においては、論理合成ツールSISとFPGA用配置配線ツールVPRをベースにして光再構成型ゲートアレイ専用ツールの開発を進めた。特に、動的再構成時に必須となる、コンテキスト資源と、ゲートアレイ上の物理実装資源との間の対応関係の最適化について新提案を行い、その有効性を実証した。この手法を用いると将来的にゲートアレイ実装に必要な論理合成とシミュレーションの所要時間の大幅な短縮が可能になる。次年度は、この最適化についてさらに研究を進め、実際の実装も含めた評価試験に取り組む予定。本研究ではホログラムメモリ、MEMS(Micro Electro Mechanical Systems)、レーザアレイ、光書き込み型ゲートアレイVLSIから構成され、超高速動的再構成可能な光再構成型ゲートアレイの開発を進めた。これまでの光再構成型ゲートアレイはホログラムメモリをアドレッシングするためにレーザアレイを使用してきた。VCSEL(Vertical Cavity Surface Emitting LASER)を使用すれば、多数のレーザがアレイ状に実装できるので、その目的を達成することができるが、将来的に必要とされるコンテキスト数(回路情報数)は100万枚以上であり、仮に1000x1000のVCSELが実現できたとしても、コスト面で採算が取れるのかどうかが問題視されてきた。そこで、本研究では少ないレーザにより多数のコンテキストのアドレッシングが可能になるように、MEMSの1種であるマイクロミラーアレイとレーザアレイとを組み合わせたレーザ・MEMS・ハイブリッドモジュールを試作した。

このモジュールを複数用いることで超高速動的再構成可能な光再構成型ゲートアレイが実現できる。試作したハイブリッドモジュールとそれを適用した光再構成型ゲートアレイの試験結果からは、1000個のハイブリッドモジュールを光再構成型ゲートアレイに適用すれば、既存の集積回路技術では実現できない10ns間隔で10億以上のアドレッシングさえも可能になることが導き出せ、その有効性を実証できた。この技術は次世代のホログラム・ストレージシステムにも適用可能な技術で波及効果も大きい。
新興リケッチア感染症・日本紅斑熱の重症化機序解明と救命治療法の確立

研究期間内にもRickettsia japonica感染である日本紅斑熱の患者数は増加の一途たどった。さらに、重症例や死亡例の存在も明らかとなった。Orientia tsutsugamushi感染のつつが虫病と比較し、急性期のサイトカインの血中濃度は日本紅斑熱では著明高値を呈し、とくにTNF-αにおいて重症化との関連性が示唆された。日本紅斑熱ではテトラサイクリン系薬に加え、一部のニューキノロン系薬の併用が有効性を示した。実験的にもこの2剤の併用が、単独投与時よりTNF-α産生抑制を増強した。日本紅斑熱の救命のための治療法として、これら2剤の併用が有力な候補となる可能性が示唆された。1.我が国では近年、新興リケッチア感染症・日本紅斑熱の報告数が急増し、発生地域の広がりも認められる。2009年には新型の紅斑熱群リケッチア症としてRickettssia heilongjiangensis感染症の存在も明らかになった。日本紅斑熱の治療としては、テトラサイクリン系薬剤に加えニューキノロン系薬剤併用が有効である例が報告され、つつが虫病との最大の相違点として認識される。2.これまでに臨床所見を確認し得た日本紅斑熱(23例)において、重症度を従来より用いている重症度スコア(Iwasaki et al, J Clin Microbiol, 1997)をもとに比較した。10例(43.5%)が、重症度2以上に相当し、従来調査したつつが虫病より重症度が高いことが示された。また重症度を2以上(重症群)と2未満(軽症群)に分け比較すると、急性期の血中TNF-α濃度は有意に重症群が高く、TNF-αが重症度を示す指標となりうることが示唆された。3.in vitro実験系において、minocycline(MINO)およびdoxycyline(DOXY)が単球系細胞(THP-1)において、サイトカイン(TNF-α,IL-12p40)およびケモカイン(IL-8,IP-10,MCP-1,MIP-1α,MIP-1β)の産生を濃度依存性に抑制することが示された。日本紅斑熱においてもテトラサイクリンの有する、宿主側のサイトカイン産生を制御し、過剰な生体防御反応を抑止することが推測された。しかし、臨床的にはテトラサイクリン単剤の有効性が低いことが指摘され、ニューキノロン系薬剤の併用が必要であることが報告された。この点について、実験系でMINO+ofloxacin(OFLX)によるTNF-α産生に与える影響を検討したが、OFLXによる相乗的な抑制効果は確認できなかったことより、併用効果は抗リケッチア活性の直接的な増強によることが推測された。1.これまで確認された新興リケッチア感染症・日本紅斑熱(Japanese spotted fbver : JSF)の国内死亡例3例の詳細を確認した。全例、播種性血管内凝固(disseminated intravascular coagulation : DIC)を合併し、2例は多臓器不全に陥っていた。1例は生前に確定診断がついていない症例で、2例は5日後および2日後に治療が開始されていた。治療の内容は、1例はminocycline(MINO)単独、1例はMINOとciprofloxacin(CPFX)の併用であった。しかし、抗菌剤併用例のCPFXの追加投与は死亡直前であった。研究代表者が開催した第3回日本リケッチア症臨床研究会(2011年1月15-16日、大津にて)において、リケッチア感染症では、テトラサイクリン系薬剤とニューキノロン系薬剤を併用した場合、重症化する例が少ないことが報告されていることより、これらの薬剤の早期併用によりJSFを含むリケッチア感染症の重症例を救命できる可能性が示唆された。2. Weil-Felix反応においてJSFの診断に用いられるプロテウス(OX-2)由来LPS 100μg/mlにより刺激した、ヒト単球・マクロファージ系のTHP-1細胞から産生されるtumor necrosis factor (TNF)-αは、一部のニューキノロン系薬剤の併用にって、テトラサイクリン系薬剤単独より抑制効果が増強された。リケッチア感染症重症例の背景にはSIRS (systemic inflammatory response syndrome)の存在があり、その発症に関与するTNF-α産生を抑制するためには、抗菌剤の併用(MINOおよびCPFX)が有効であることが示された。1.つつが虫病と、日本紅斑熱の急性期

サイトカインの比較再興リケッチア感染症・つつが虫病(Tsutsugamushi disease)32例および、新興リケッチア感染症・日本紅斑熱(Japanese spotted fever)21例の、急性期の血中サイトカイン濃度を比較した。適切な治療により、いずれの症例も軽快した。日本紅斑熱において急性期には炎症性サイトカインCTNF-α,IL-6,IFN-γ)ならびに、ケモカイン(IL-8,IP-10,MCP-1,MIP-1α,MIP-1β)の血中濃度はいずれも有意につつが虫病より高値を呈した。とくに、TNF-αは2.6倍、IFN-γは3.0倍を呈し、IL-8は9.6倍、IL-10は4.0倍に達していた。多くの臨床家により報告されている日本紅斑熱がつつが虫病に比較し、重症化しやすいこととの関連性が示唆された。重症化を回避するためには、高サイトカイン血症を背景とするSIRS(systemic inflammatory response syndrome)を鎮静化する必要があり、そのための治療の工夫が求められ、現場からはテトラサイクリン系薬とニューキノロン系薬の併用の有効性が示唆された。2.サイトカイン産生抑制のための抗菌薬の効果Minocycline (MINO)は抗リケッチア活性を有する抗菌薬である。つつが虫病では特効的作用を示し得るが、日本紅斑熱では有効性を示さないことが多く、ニューキノロン系薬との併用による救命例の報告が増加している。ヒト単球系THP-1細胞を用い、MINOおよび、ciprofloxacine(CPFX)を単独ならびに併用にて各種サイトカイン/ケモカイン産生に与える影響を検討した。P.aeruginosaのLPS刺激による実験系で4時間後には、TNF-α,IL-8,IP-10,MCP-1,MTP-1α-,MIP-1β,RANTESにおいて、各薬剤単独に比較し、併用において相加的な産生抑制効果が認められた。臨床的経験から、テトラサイクリン系薬とニューキノロン系薬の併用が重症化回避のために有用である根拠の一つとして、サイトカイン産生抑制の増強効果があることが推測きれた。
口承の教育に関する実証的研究

本研究の目的は、「口承の教育」の実効性の検証にある。すなわち、カンやコツの獲得を主体とした芸能の伝承内容(教授内容)が「口承の教育」によってどの程度正確に伝えられているのか、正確に伝えられているとすればそれは何故なのかを明らかにすることである。このためには最低限2年間の記録を比較対照する必要があり、平成6年度・7年度にわたって研究を進めた。その成果は平成7年度(平成8年3月)の「研究成果報告書」にまとめている。1芸能の成立に関する検討各地を代表する芸能(下記)の成立に関する歴史的研究。特に兵庫県社町上鴨川神社の神事芸能を中心に考察を進めた。・奈良豆比古神社の翁舞・兵庫県社町上鴨川住吉神社の神事舞・山形県櫛引神社の黒川能・和歌山県那智勝浦町の田楽・静岡県水窪町西浦の田楽・新潟県の佐渡の春駒2各地を代表する芸能の調査及び記録(1)各地の芸能のビデオ収録。(2)動作解析のためのビデオ収録は定点観測、キャリブレーションなど最低46人の撮影者が必要となり、また研究補助者への旅費・謝金も不足したため、上記すべての芸能の動作解析ができなかった。このため、社町上鴨川神社の神事芸能のみが動作解析用のビデオ収録となり、「神事舞」を動作解析した。このためには最低限2年間の記録を比較対照する必要があり、平成6年度は次の2点から研究を進めた。平成7年度に「研究成果報告書」をまとめる予定である。並びに、歴史学・民俗学・芸能研究に関する先行研究の批判的検討を通して、これまで等閑視されてきた「口承の教育」についての教育学的体系の把握。各地を代表する芸能の調査及び記録これまでの研究代表者の事前調査により、6つの芸能を事例として選択したが、以下の諸点については研究遂行上、問題点が生じた。(1)研究代表者が選定した各地の芸能のビデオ収録のうち、沖縄竹富島のタナドウイは旅費、日程の都合上、割愛せざるをえない状況となった。(2)その他のビデオ収録は行ったが、動作解析のためのビデオ収録は定点観測、ギャリブレーションなど最低46人の撮影者が必要となることが分かった。しかし、研究補助者への旅費・謝金も不足したため、社町上鴨川神社の神事芸能のみが動作解析用のビデオ収録となった。このため、社町上鴨川神社の神事芸能のみが動作解析用のビデオ収録となった。
オステオポンチン遺伝子プロモーターの発現制御と産物機能について

1.OP遺伝子の発現機序解析:a).プロモーター領域のCEの解析:-87--80間AAAACCTC配列にユニークな核蛋白が結合する。この配列を含む領域がシス配列として機能することを確認するために種々の領域を含むstable cloneを単球系細胞株SCC-3で作成した。これらのクローンのCAT活性を検討し、transientの系で観察した結果が正しいことを確認した。b).第一エキソン中のCEの解析:第一エキソン中にCAT活性を顕著に高めるCEが存在することを明かにした。第一エキソンは90ヌクレオチドからなるが多数の3'deletion CATクローンを作り検討した結果全長のクローンで最も活性が高く、3'deletionの長さに比例して活性が低下することを確認した。c)第一イントロン第三イントロン間のCEの検討:第一イントロン以下の下流配列のCEの有無を検討するためにこれらの領域を種々の長さで含むCATクローンを作成し、活性を検討した。その結果、第一イントロン配列の5'側配列を僅かに含む(12bp)クローンですでにCAT活性の有意の低下が起こり、さらに伸長すると(+245+630)強い活性低下が見られた。しかし、さらにその下流には+882領域を中心として活性を回復させる強いCEが存在した。2.rOPの分離と細胞接着および移動における意義の解析:a).rOPの分離:大腸菌系ベクターを用いてウサギおよびヒトOPを高レベルで発現させることに成功した。ウサギではさらにcDNAに点変異を導入し、RGD部をRGEに改変したrOPの作成にも成功した。b).rOPによる細胞の接着実験:ヒトおよびウサギrOPはマウスMφ細胞株P388D1およびB16細胞の接着を起こさせる。また、これらの細胞をrOPで処理することによりFNの活性を濃度依存的に抑制する。しかし、RGE改変rOPでは接着およびFNに対する抑制活性は見られなかった。抗インテグリン抗体を用いた阻止実験から接着にαvβ3以外のインテグリンが関与することを確認した。c).rOPのハプトタキシス(HT)に対する効果実験:rOPはFNに比べて弱いがP388D1およびB16細胞のHT活性を示す。rOPは種々の条件で濃度依存的にFNの活性を阻止する。しかし、変異rOPには阻止活性は全く見られなかった。HTではαvβ3の関与が考えられた。d).抗OP抗体の作成と応用:ウサギOPに対する抗体を作成しF(ab')_2がP388D1およびB16細胞のrOP依存性接着を阻止することを明らかにした。抗ヒトOP抗体を用いて検索したグリオーマのすべてでOPの発現を確認した。これらの細胞では主として53と47kdの蛋白と38と31kdのminorな蛋白の発現が見られた。また、三種のスプライスバリアントの存在を確認した。OP mRNAは悪性度の高い腫瘍で強く発現することを観察した。d).

抗OP抗体の作成と応用:ウサギOPに対する抗体を作成しF(ab')_2がP388D1およびB16細胞のrOP依存性接着を阻止することを明らかにした。抗ヒトOP抗体を用いて検索したグリオーマのすべてでOPの発現を確認した。これらの細胞では主として53と47kdの蛋白と38と31kdのminorな蛋白の発現が見られた。また、三種のスプライスバリアントの存在を確認した。OP mRNAは悪性度の高い腫瘍で強く発現することを観察した。
ショウジョウバエを用いたカイコの形態形成機構の解析

研究代表者はカイコの幼虫の腹肢の形態形成の分子機構の解析を行なっている。腹肢の発生メカニズムについては、研究代表者は幾つかのことをこれまでに明らかにした。腹肢の発生を制御するE complexは3種類のホメオボックス遺伝子(カイコのUltrabithorax.abdominal-AとAbdominal-B遺伝子、以下Ubx,abd-A,Abd-B遺伝子と略す)の集まったものであり、基本的にはショウジョウバエのbithorax complexに相当する遺伝子群である。そのなかでも特にabd-A遺伝子が腹肢の発生制御に関しては重要な役割を演じている。昨年度までの解析で、腹肢の発生に伴って特別な高分子蛋白質(分子量270キロダルトンと260キロダルトンの蛋白質、以下p270/260と略す)が腹肢の部位に発現することを明らかにした。この蛋白質に対する特異抗体を調製して解析した結果、abd-A遺伝子が欠損したE変異のホモ接合体ではp270/260が全く発現されないことから、abd-A遺伝子の産物がp270/260の発現を制御していると考えている。本年度の解析では、p270/260を発現している細胞の解析をおもに行なった。抗体を用いた解析から、p270/260は腹肢の根幹の数十個の特定の細胞群だけに局在することが明らかになった。詳細な解析から、この蛋白質を発現する細胞はアクチンと結合するファロイジンで強く染色されることや、細胞内ではp270/260はアクチンと同じ細胞骨格に局在しているらしいことが明らかになった。このことからp270/260は細胞骨格でアクチンと何らかの相互作用をする蛋白質ではないかと考えている。
運動に伴う筋感覚情報が高齢者認知機能低下に及ぼす影響

本研究の目的は筋などの体性感覚情報が脳の認知機能にいかなる影響を及ぼすか、またそれらの体性感覚情報が脳のどの部位と連結しているかを脳の感覚情報を客観的に測定できる体性感覚誘発電位、認知機能を解析できるP300電位、注意機能を反映するN140電位、認知機能テストなどを用いて明らかにし、高齢者の認知機能低下や軽度認知障害者回復のための運動処方を提示することである。その結果、高齢者や軽度認知障碍者の認知機能向上・回復には有酸素運動ばかりではなく、最大筋力4050%の程度の筋高強度運動とされていると筋力維持の運動処方が是非必要であることが推察された。本年度は一般高齢者を対象に筋などの感覚情報が脳の認知機能にいかなる影響を及ぼすかを脳の感覚情報を客観的に測定できる体性感覚誘発電位,認知機能を解析できるP300電位,注意機能を反映するN140電位,認知機能テストなどを用いて明らかにすることを目的として研究を実施した.参加者と課題内容:参加者は自立した生活をおくる高齢者30名.研究分担者の介護予防教室に参加している者である.運動課題としては30分間の有酸素運動後,数秒間の最大筋力4050%の程度の筋力維持や座った状態で片足を水平に伸ばしてもらいそのまま10cm上げて太ももが痛くなるまで行う.これらの動作課題を数回繰り返す.さらに20分間の有酸素運動後かなり強度なブラッシングを手足に付加し,それを数回繰り返す.参加者はこれらの運動プログラムを週2回,3カ月にわたって行い動作課題を参加者の健康体力状態を考慮し適切に選択する.3カ月間の介入実験の間に参加者の測定結果を考慮し,運動課題の時間,強度を変え適切な運動強度,時間を確認する.その結果,運動群高齢者は運動週間を持たない高齢者よりも筋電図反応時間(運動群高齢者279±10.3msec,運動週間を持たない高齢者332±13.9msec)は有意に速い結果を示した.認知機能を反映すると考えられているP300電位ついては,運動群高齢者が運動週間を持たない高齢者よりも有意に高振幅(運動群高齢者10.11μv,運動週間を持たない高齢者6.54μv)を示した.さらにN140電位はいくつかの感覚情報(を与え運動させた方が運動群高齢者,運動週間を持たない高齢者両群とも振幅が増加した.これらは皮膚,関節などからの感覚情報は中枢内感覚経路に変容をきたしていることを示している.また感覚情報を伴う有酸素運動は高齢者の認知機能維持・向上に有益であることが推察される.本年度は認知機能テストにより軽度認知障害者と判定された被験者を対象に平成26年度の有効と確認された各種動作課題、トレーニングプログラムを適用し、その効果を認知機能テストや脳の感覚情報を客観的に測定できる体性感覚誘発電位、認知機能を解析できるP300電位そして注意機能を評価できるN140電位を測定し、高齢者認知機能低下を緩和するための運動プログラム作成の基礎資料とするとともに、作成した運動プログラムの効果を再度いくつかの脳電位を用いて確認することが本年度の目的であった。その結果、認知機能と強い相関があることが確認されているペグ移動テストとP300電位、筋電図反応時間(EMGーRT)関係を調べてみると、ペグ移動時間が早い被験者群が他の群と比較して筋電図反応時間(EMGーRT)が短縮していた。さらに課題に関わらずP300電位潜時はペグ移動テストの遂行能力の高い被験者群が短縮し、かつP300電位振幅が高い傾向にあった。さらにペグ移動時間は筋電図反応時間(EMGーRT)、P300電位潜時と有意な相関があることが確認された。さらにペグ移動時間が早ければ注意機能を評価できるN140電位の振幅も有意に高いことが確認された。従ってペグ移動時間課題は反応処理系に加えて脳内の刺激評価処理時間を含む認知機能を反映すること動作課題であることが確認された。従ってペグ移動時間課題は軽度認知障害者と判定された群の脳内の認知機能を評価するのに有効であることが示唆された。さらに本実験ではトレイルメイキングペグテスと(TMT)課題に伴うP300電位、注意機能を評価できるN140電位を測定した結果、トレイルメイキングペグテストと(TMT)課題と脳電位は高い相関があることが確認された。従ってTMPテストは軽度認知障害者の認知機能を簡便に評価できるパフォーマンステストとして有用であることが推察された。平成27年度の計画の実験は概ね順調に進んでいる。現在、データの分析はかなり進んでいて、特にペグ移動動作課題を中心とした運動課題と脳機能との関係に顕著な関係を見いだしている。その結果は最終目的である感覚・運動プログラム提示の重要な基礎データとなると確信している。今までの研究で30分間の有酸素運動後,数秒間の最大筋力4050%の程度の筋力維持や座った状態で認知機能を反映すると考えられているP300電位を測定した結果,運動群高齢者が運動習慣を持たない高齢者よりも有意に高振幅を示すことを確認した。さらにN140電位はいくつかの感覚情報を与え運動させた方が運動群高齢者,運動習慣を持たない高齢者両群とも振幅が増加を示し,皮膚,関節などからの感覚情報は中枢内感覚経路に変容をきたしていることを確認した。

また平成27年度は,認知機能テストの1つであるペグテスト移動時間は筋電図反応時間(EMGーRT),P300電位潜時と有意な相関があることを確認した。そこで平成28年度は高齢者や軽度認知障害者10名を用い,30分間の有酸素運動後,数秒間の最大筋力4050%の程度の筋力維持し,高強度の筋感覚情報を中枢に与えた状態で手首の正中神経から電気刺激を与え中枢内を経過していく体性感覚反応を体性感覚誘発電位で捉え,注意機能をN140電位で測定し高齢者や軽度認知障害者の認知機能向上には有酸素運動の他に高強度の筋感覚情報の重要性を確認することであった。その結果,最大筋力4050%の程度の筋力を維持した後の体性感覚誘発電位成分のN18-20電位,N30-32電位は著明に増加し,N140電位も著明に増加を示した。体性感覚誘発電位成分のN18-N20電位は脳内の視床から感覚野までの興奮性の変化を示し,N30-32電位は脳内の体性感覚野の変化を示していることが明らかにされているので最大筋力4050%程度の筋力維持,つまり高強度の筋感覚情報は脳内の感覚認知機能を改善することが推察される。従って高齢者や軽度認知障害者の認知機能向上・回復には有酸素運動ばかりではなく,最大筋力4050%程度の高強度と称されている筋力維持の運動処方が是非必要であることが推察される。本研究の目的は筋などの体性感覚情報が脳の認知機能にいかなる影響を及ぼすか、またそれらの体性感覚情報が脳のどの部位と連結しているかを脳の感覚情報を客観的に測定できる体性感覚誘発電位、認知機能を解析できるP300電位、注意機能を反映するN140電位、認知機能テストなどを用いて明らかにし、高齢者の認知機能低下や軽度認知障害者回復のための運動処方を提示することである。その結果、高齢者や軽度認知障碍者の認知機能向上・回復には有酸素運動ばかりではなく、最大筋力4050%の程度の筋高強度運動とされていると筋力維持の運動処方が是非必要であることが推察された。平成26年度計画の実験はほぼ終了し,データ分析も順調に進んでいる.かなり予想通りの結果がでているため分析が終わり次第統計処理を行い結果公表の準備が可能な段階であるため.平成28年度は、平成26年、27年度の実験結果をもとに高齢者や軽度認知障碍者の認知機能回復の為にどの程度の筋感覚強度、種類の感覚情報を与えたならば有効か、また今年度の運動課題の結果と合わせて具体的な感覚・運動プログラム提示する。そしてその結果を順次、学会誌などに公表する予定である。運動生理学平成26年度のデータを統計分析,図表書きを行い学会発表の準備をするとともに学会誌に投稿する準備も行う.またH27年度の計画であるトレーニングプログラムを適用しその効果を認知機能テスト,脳の感覚情報を客観的に測定できる体性感覚誘発電位,認知機能を解析できるP300電位,注意機能を反映するN140電位を測定・確認し運動プログラム作成の資料を収集する準備を行う.購入を予定していた消耗品(皿電極)の購入を見送ったため。アメリカで開催されるAmerican College of Sports Medicineならびに国内学会への参加を予定していたが,日程の都合が合わず参加を見送ったため,旅費について未使用額が生じた.平成27年度に購入を予定していた消耗品(皿電極)の購入に使用する予定である。
全身性強皮症におけるＩＲＦ５の役割についての解析

全身性強皮症(systemic sclerosis ; SSc)は皮膚および内臓諸臓器の血管障害と線維化を主徴とする膠原病で、患者のQOLおよび予後を著しく障害する重大な疾患であるが、未だ病因は解明されていない。線維化の形成には局所に浸潤する炎症細胞によって産生されるサイトカインが重要な役割を果たしていることが知られているものの、その免疫学的異常のメカニズムは明らかではない。近年、SSc患者の末梢血、皮膚の遺伝子発現解析において、1型インターフェロンにより誘導される遺伝子の発現が増えていることが報告されている。そこで、1型インターフェロンのほか、多数の遺伝子を誘導する転写因子であるInterfero Regulatory Factor5 (IRF5)のSScにおける役割について解明する。ブレオマイシン(BLM)を皮下投与して作成するBLM誘発SScモデルマウスは、皮膚および肺の線維化、自己抗体の産生、真皮への炎症細胞浸潤を呈し、SSc患者の病態をよく反映するモデルマウスであると考えられている(Yamamoto Arch Dermatol Res 2006)。BLM投与によって引き起こされる一連の炎症細胞活性化は、ヒトSSc患者においても認められる現象であり、BLM誘発SScモデルマウスにおける皮膚および肺線維化の誘導はSScと類似した免疫学的異常によることが推察される。本年度はIRF5が全身性強皮症の病態における関与を検討するためにIRF5ノックアウトマウスを用いてBLM誘発強皮症モデルマウスを作製した。IRF5ノックアウトマウスでは野生型マウスと比較してBLM投与によって誘発される皮膚・肺の線維化が有意に減弱した。また、詳細に見てみると、IRF5ノックアウトマウスでは同週齢の野生型マウスに比較し、真皮厚、真皮の膠原線維量が減少していた。また、ブレオマイシン投与7日の炎症期においてIRF5ノックアウトマウスでは野生型マウスに比較して、線維化を促進する細胞接着分子の発現の低下、抗線維化に働く細胞接着分子の発現の亢進が見られた。線維芽細胞、血管内皮細胞、免疫細胞においてIRF5の発現低下が抗線維化に働く可能性が示唆されている。IRF5ノックアウトマウスではブレオマイシンによる皮膚・肺の線維化が野生型に比較し減弱することが示された。今後はブレオマイシンによる線維化の減弱の機序につき全身性強皮症において重要な細胞である線維芽細胞、血管内皮細胞、免疫細胞につき検討することとする。IRF5ノックアウトマウスでのブレオマイシンによる皮膚・肺における線維化の減弱における機序について、全身性強皮症の病態に重要な役割を担う線維芽細胞、免疫細胞、血管内皮細胞につきin vitroで検討する。そこで、1型インターフェロンのほか、多数の遺伝子を誘導する転写因子であるInterfero Regulatory Factor5(IRF5)のSScにおける役割について解明する。