hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
言語独立・ハッシュ値・行粒度の追跡子による，ソフトウェア追跡性の高精度な確保

・電子画像データに埋め込む追跡子RIC (robust index code):昨年度,提案実装した電子画像データ中に埋め込む追跡子としてRIC (robust index code)の超流通システム(super distribution system)としての有用性を議論し,RICを利用した画像超流通システムは,ラッパが削除可能であるが,追跡子に紐付けたコンテンツは複製不可能であること,AmazonやNetflixなどのコンテンツ・プラットフォーム方式に比較してアクセス容易性や著作権者の利益の点で優れることなどを明らかにした.・プログラム開発中のコード断片を,編集中のプログラマの表情や独り言に紐付ける追跡技術CodeCAM:既存のツールやIDEへの変更が不要で,かつ言語独立に実装するために,キーロガーを用い,その入力列とコード断片中を紐付ける新しい方式を提案実装した.予備実験では,殆どの時間は無表情だが,起こした表情の中では「幸せ」と「驚き」が主であり,表情とアクションに相関があるという結果を得た.・パターンマッチングのためのデータフローグラフ抽出器の実装FGyama:ソースコードの静的解析においても,追跡性は重要であり,制御やデータの依存関係をいかに辿るか,それをどう表現すべきかは自明ではない.この研究では,各変数を個別に扱い,データ間の依存関係を重視した新しいデータフローグラフを提案・実装した.予備実験としてクローン検出への適用結果を示した.昨年までで提案実装したTCCシステムの知見の応用として,(1)電子画像データに埋め込む追跡子RIC,(2)プログラム開発中のコード断片を,編集中のプログラマの表情や独り言に紐付ける追跡技術CodeCAM,(3)パターンマッチングのためのデータフローグラフ抽出器の実装FGyamaの研究成果をあげたため.本年度は追跡性に関する応用技術あるいは関連技術として,主に以下の研究を行った.・電子画像データに埋め込む追跡子RIC (robust index code)に対して,昨年までに提案実装した電子画像データ中に埋め込む追跡子としてRIC (robust index code)をさらに改良し,画像劣化が大きい場合の補助手段として,画像のヒストグラムを用いる手法を提案し,実験的にその有用性を示した.・追跡性が確保されていない場合の補完技術として,プログラムコード中のコメントを解析する技術を提案実装し有用性を評価した.具体的には,コメントを11種類に分け,決定木ベースの分類器を実装した.予備実験では説明的なコメントを60%の適合率,80%の再現率で抽出できた.・マルチスレッドプログラムのデータ競合バグを効率よく並列に検知する手法を提案した.具体的には各検査スレッドのメモリアクセスを追跡することで,オフラインでアクセス数を平滑化し,予備実験でParallel FastTrackに比べて37%オーバーヘッドが減ることを示した.・近年大きな問題となっている脆弱性であるUse-After-Freeを動的に高速かつ正確に検証する方法を提案実装した.
鏡映面配置のトポロジーとその平坦構造との関係

実線形空間に有限鏡映群(コクセター群)が作用しているとする.鏡映面の補集合の複素化の基本群はアルティン群とよばれ,組みひも群の一般化を与える.本研究では,コクセター群Wとの放物型部分群W'に対して,WとW'それぞれの鏡映面の集合の間の関係を解析的に記述した.そのための手法として,斎藤恭司によって構成された原始ベクトル場の理論を本質的に用いた.原始ベクトル場の生成するフローと判別式の零点で表される集合の位置関係を考察して,このフローに関するシフトを援用して,W'の作用する空間からWの作用する空間への実半解析的な埋め込み写像で,W,W'の作用と同変であるものを構成した.これは,原始ベクトル場という手法を用いて,鏡映面の補集合の幾何学に新たな知見をもたらしたものである.この埋め込みは,それぞれのサルベッティ複体などの位相幾何学的対象の間の埋め込み写像を自然に引き起こす.したがって,W,W'それぞれに対応するアルティン群のコホモロジーの間の写像が誘導され,これは,アルティン群とその放物型部分群のコホモロジーのとの間の関係を考察する手法に発展することが期待される.昨年に引き続き超平面配置の補空間のトポロジーについて,特に鏡映群によって定められる超平面配置のトポロジーと平坦構造の関係,そしてそれらも含まれるより一般的な,フリーと呼ばれる超平面配置のクラスについてのトポロジーについて研究している.現在行っている研究の内容は具体的には2つである.1つ目はある既約な鏡映群の超平面配置の補空間へその双曲的部分群に対応する超平面配置の半解析的かつ滑らかな埋め込み写像についての研究である.今まで得られた結果では余次元1に対応するものが得られている.この場合は鏡映面配置の平坦構造において本質的である原始的ベクトル場と,ディスクリミナントから定義される代数型関数を用いて構成されるが余次元が2以上のものについてはさらにディスクリミナントの分岐集合について細かい考察が必要になってくる.現在はその部分についての研究を行っている.もう1つは対数的ベクトル場を用いた超平面配置の補空間の変形についての研究である.つまり対数的ベクトル場のフローにそった変形により補空間をなるべく次元の低い空間に変形することを考えている.特に超平面配置が自由の場合について興味を持っている.今のところ実2次元の線形な場合にのみその構成ができている.高次元への拡張はできていないが,現在は特に帰納的にフリーである超平面配置のクラスについて興味を持っている.このクラスではある超平面に制限して定義される超平面配置が再びフリーで,かつそれぞれの対数的ベクトル場には相互関係が具体的に構成されている.この性質を用いてこの構成が拡張できるかどうかを研究している.実線形空間に有限鏡映群(コクセター群)が作用しているとする.鏡映面の補集合の複素化の基本群はアルティン群とよばれ,組みひも群の一般化を与える.本研究では,コクセター群Wとの放物型部分群W'に対して,WとW'それぞれの鏡映面の集合の間の関係を解析的に記述した.そのための手法として,斎藤恭司によって構成された原始ベクトル場の理論を本質的に用いた.原始ベクトル場の生成するフローと判別式の零点で表される集合の位置関係を考察して,このフローに関するシフトを援用して,W'の作用する空間からWの作用する空間への実半解析的な埋め込み写像で,W,W'の作用と同変であるものを構成した.これは,原始ベクトル場という手法を用いて,鏡映面の補集合の幾何学に新たな知見をもたらしたものである.この埋め込みは,それぞれのサルベッティ複体などの位相幾何学的対象の間の埋め込み写像を自然に引き起こす.したがって,W,W'それぞれに対応するアルティン群のコホモロジーの間の写像が誘導され,これは,アルティン群とその放物型部分群のコホモロジーのとの間の関係を考察する手法に発展することが期待される.
GPCRの三次元構造解明を目指した活性型及び不活性型GPCR固定化抗体の作製

本研究では、活性型および不活性型GPCRのX線結晶構造解析を目指している。そのために、活性型あるいは不活性型GPCRを安定に固定化するモノクローナル抗体を作製し、平衡状態をどちらか一方に傾けることによって抗体の結合した活性型あるいは不活性型GPCRを共結晶化する。その結果、アデノシンA2a受容体を不活性型に固定化する抗体を作製し、アデノシンA2a受容体の不活性型構造を分解能3. 1Åで解くことに成功した(Nature 2012)。現在は、アデノシンA2a受容体を活性型に固定化する抗体を作製することに成功し、結晶化を試みている。申請者らは、酵母及び昆虫細胞を用いて膜蛋白質の高発現株をスクリーニングした結果、未発表のものを含め10種類以上の膜蛋白質について、発現・精製方法を確立した。これらの膜蛋白質を精製し、脂質二重膜中に埋め込ませたプロテオリポソームを抗原とすることで膜蛋白質の機能的構造を保持したままマウスに免疫することが可能となっている。さらにリボソームELISA陽性で変性ドットプロット陰性のクローンをスクリーニングすることで立体構造を認識する抗体を選択することが可能となった。本手法によって得られたアデノシン受容体抗体を用いて受容体/抗体複合体の結晶化を試みた結果、分解能2.7Åで構造を決定することに成功した(論文投稿中)。本抗体はアデノシン受容体の細胞内の窪んだ領域に突き刺さるような結合様式を呈している。本抗体は、不活性化型受容体固定化抗体であることが明らかとなっている(アンタゴニストは結合するがアゴニストは結合しない)。GPCRは全体構造が類似しているが、本抗体は、アデノシン受容体特異的であり、アドレナリン受容体、ムスカリン受容体、苦味受容体にはクロスしない。現在、可変領域のペプチド鎖がシグナル伝達を阻害するか否か細胞レベルで検証中である。小林らは、酵母及び昆虫細胞を用いて膜蛋白質の高発現株をスクリーニングした結果、未発表のものを含め10種類以上の膜蛋白質について、発現・精製方法を確立した。これらの膜蛋白質を精製し、「脂質二重膜中に埋め込ませたプロテオリポソームを抗原とすることで膜蛋白質の機能的構造を保持したままマウスに免疫することが可能となっている。弓さらにリポソームELISA陽性で変性ドットブロット陰性のクローンをスクリーニングすることで立体構造を認識する抗体を選択することが可能となった。本手法によって得られたアデノシン受容体抗体を用いて受容体/抗体複合体の結晶化を試みた結果、分解能2.7Åで構造を決定し論文にまとめた(Nature 2012)。本抗体はアデノシン受容体の細胞内の窪んだ領域に突き刺さるような結合様式を呈しており、ヘリックスの2,3,6,8番と幅広く受容体と相互作用していた。GPCRは全体構造が類似しているが、本抗体は、アデノシン受容体特異的であり、アドレナリン受容体、ムスカリン受容体、苦味受容体にはクロスしなかった。可変領域のペプチド鎖を合成し、受容体とG蛋白質の共役を阻害するか否かについて検討したが、細胞レベルでシグナル伝達を阻害することはできなかった。抗体は広く受容体と相互作用しており、単にペプチド鎖による(二次元的な)作用では受容体との親和性が低下する可能性が示唆された。また、GPCRを活性型に固定化する抗体も作製することができ、アデノシンA2a受容体と抗体の複合体結晶も確認している。現在、構造解析中である。
異種異材継手作製のための低入熱LFW(線形摩擦圧接)装置の開発とLFW現象の解明

今世紀の「ものづくり」を持続させ,それを次世代へと繋げるためには,現在よりも一層の省エネルギ化,低コスト化を実現させながら生産活動を実施することが強く望まれている.その中の一つに,構造物などを溶接・接合する技術がある.その中で,摩擦熱を利用して固相状態で部材同士を接合する摩擦圧接法は,主として回転運動を利用して部材同士の接合を行うことから円形断面形状部材の接合に適しているが,非円形断面形状部材の接合には適していないという問題点がある.本課題は,研究代表者がこれまでに提案してきた回転式摩擦圧接における低入熱摩擦圧接法や接合自己完了型摩擦圧接法を提案するために制作してきた接合実験装置に組み込んできた様々な工夫やノウハウを生かし,非円形断面形状部材の接合も容易な往復直線運動を利用した低入熱線形摩擦圧接(LFW)装置を開発し,これまで明らかにされていないLFW現象の解明を行うとともに低入熱状態で接合できる異種異材継手が容易に作製できる接合手法の提案を行うものである.その中で本年度は,将来の異種材の組み合わせに対してLFWを適用するための基礎データを得るための様々な検討を行った.まず,実際にLFWが容易に実施できる装置メカニズムの提案を行い,その装置を用いて高分子材料や金属材料が接合可能であることを示した.これにより,LFW現象を詳細に観察できる目処を付けた.また,昨年度と同じく純CuとAl合金,Al合金とステンレス鋼の組み合わせ,さらにはAl合金と鉄鋼材料との組み合わせについても取り組み,そして,これらの組み合わせを通じて異種材料のLFW現象の解明につながる回転式摩擦圧接の接合メカニズムに関する各種データの取得を行った.これらを通じ,LFW現象を解明するためのある程度の基礎データの集約を行った.今世紀の「ものづくり」を持続させ,それを次世代へと繋げるためには,現在よりも一層の省エネルギー化,低コスト化を実現させながら生産活動を実施することが強く望まれている.その中の一つに,構造物などを溶接・接合する技術がある.摩擦熱を利用して固相状態で部材同士を接合する摩擦圧接法は,回転運動を利用して部材同士の接合を行うことから円形の断面形状を有する部材の接合には適しているが,非円形の断面形状を有する部材の接合には適していない.そのため,非円形の断面形状を有す部材の接合にはほとんど利用されていないのが実状となっている.本研究課題は,研究代表者がこれまでに提案してきた回転摩擦圧接における低入熱摩擦圧接法や接合自己完了型摩擦圧接法などを提案するために製作してきた接合実験装置に組み込んできた様々な工夫やノウハウを活用し,非円形の断面形状を有す部材の接合も容易にできる往復直線運動を利用した低入熱線形摩擦圧接(LFW)装置を新たに開発し,これまで明らかにされていないLFW現象の解明を行うとともに低入熱状態で接合できる異種材継手が容易に作製できる接合手法の提案を行うものである.その中で本年度は,将来の異種材の組み合わせに対してLFW接合を行うための基礎データを得るために,純Cuとステンレス鋼の組み合わせに対して回転式の摩擦圧接実験を行った.そして,実際に接合面のどの部分から接合され始め,どの時点で接合を完了すれば接合部から破断しない健全な継手が得られるかなどを把握し,純Cuとステンレス鋼との接合メカニズムの解明に向けた各種データの取得を実施した.また,実際のLFW装置を作製するための性能を決定するための第一弾として,同種材料を対象としたLFWでの接合部の温度のシミュレーションも試みた.そして,接合部の焼付きを考慮した接合部の温度をシミュレートすることができる可能性を得た.本研究課題は,交付申請書において以下の2項目を実施することとして申請を行っている.1)低入熱異種材継手の圧接条件の確立2)低入熱LFW装置の製作このうち,1)に関しては,申請者が所有している回転運動を用いた摩擦圧接装置を用い,将来の異種材のLFW接合に関連するデータを得るために,純Cuとステンレス鋼の組み合わせについて接合実験を行っており,それに関する知見をいくつか得ている.一方,2)に関しては,申請後の研究により,申請時の偏心カムとギアの組み合わせによる直線運動機構では接合に耐えることは難しいことが判明した.しかしながら,偏心カムを増やし,かつギアの組み合わせを変えることにより新たな直線運動機構を提案し,それを基にしたCAD/CAM解析を実施した.その結果,新たに提案した直線運動機構により,接合に耐えうることができるLFW装置を提案することができた.そして,その結果を踏まえ,樹脂材料などが接合できる簡易なLFW装置を作製し,その動作確認を行い,作製した簡易なLFW装置で樹脂材料を接合できることも分かった.さらに,同種材料の場合におけるLFW現象の把握と健全な継手が得られる接合条件の確立を目指すためには,接合面温度のシミュレーションが必要であるとの考えより,同種材料では接合面で焼付きを生じて接合されることから,それを模擬したLFWの接合面のシミュレーションを新たに行うことができた.以上のように,当初の計画とは異なり低入熱LFW装置の完全製作には至っていないものの,それに近い内容に研究が進捗していることから,2のおおむね順調に進展しているとして判断した.今世紀の「ものづくり」を持続させ,それを次世代へと繋げるためには,現在よりも一層の省エネルギ化,低コスト化を実現させながら生産活動を実施することが望まれている.

その中の一つに,構造物などを溶接・接合する技術がある.摩擦熱を利用して固相状態で部材同士を接合する摩擦圧接法は,主として回転運動を利用して部材同士の接合を行うことから円形断面形状部材の接合に適しているが,非円形断面形状部材の接合には適していない.本課題は,研究代表者がこれまでに提案してきた回転式摩擦圧接における低入熱摩擦圧接法や接合自己完了型摩擦圧接法を提案するために制作してきた接合実験装置に組み込んできた様々な工夫やノウハウを生かし,非円形断面形状部材の接合も容易な往復直線運動を利用した低入熱線形摩擦圧接(LFW)装置を開発し,これまで明らかにされていないLFW現象の解明を行うとともに低入熱状態で接合できる異種異材継手が容易に作製できる接合手法の提案を行うものである.その中で本年度は,将来の異種材の組み合わせに対してLFWするための基礎データを得るために,昨年度と同じく純Cuとステンレス鋼の組み合わせ以外に純CuとAl合金,Al合金とステンレス鋼の組み合わせについても取り組み,そして,これらの組み合わせを通じて異種材料の摩擦圧接メカニズム解明に向けた各種データの取得を行った.また,LFW装置を作製の際に必要な性能決定のために,同種材料を対象としたLFW継手の温度シミュレーションを実施し,接合条件により接合部の温度分布を推定できる可能性を得ることができた.なお,現在,市場状況により装置に必要な市販部品の入手が本課題の研究期間内で入手することが困難であることが判明しているため,それらが入手できなくても本研究課題が実施できるように装置の設計変更などを実施しているところである.本研究課題は,交付申請書および平成29年度に報告した平成28年度の実施状況報告書(研究実施状況報告書)において以下の3項目の実施を予定していた.1)低入熱異種材継手の圧接条件の確立(続き)2)低入熱LFW装置による接合実験の実施3)LFW現象の把握と健全な継手が得られる接合条件の確立(同種材料の場合)このうち,1)に関しては,研究代表者が所有している回転式の摩擦圧接装置を用い,純Cuとステンレス鋼,純CuとAl合金,Al合金とステンレス鋼といった将来の異種材のLFWに繋がる各種データの蓄積を行った.一方,2)に関しては,様々な金属材料を接合することができるようなLFW装置を制作する場合,装置剛性なども必要不可欠となることから大変大がかりとなり,本課題の研究期間ではそれを完遂することが難しくなる.そこで,負荷荷重は小さいものの,樹脂材料が容易に接合できる簡易なLFW装置の制作を昨年度(平成28年度)は実施している.そこで,その装置により定性的かつ定量的なデータを得るために,装置の計装化を実施した.そして,この簡易LFW装置でAlに代表されるような軟質金属材料の接合を実施するために,多少の改造・改良を試みた.しかし,市場状況により装置に必要不可欠であるベアリング等の市販部品の入手が本課題の研究期間内(平成31年末)ですら入手困難であることが判明した.よって,そのような部品を入手しなくとも接合することが可能な装置へと変更しなければならない状況にあり,現在,その装置構造の変更を実施している状態にある.
3次元多様体の組合せ的位相不変量と関連諸問題の研究

1.組み合わせ幾何的研究成果(石井等)(1)3次元多様体の組み合わせ表示として、「疑似組み紐群」という組み紐群に似た表示をもつ群の要素として3次元多様体を表す方法が与えられた。これは、特異三角形分割のdual cmplexの特殊な族であるflow-spineによる3次元多様体の表示に対応している。(2)上記の疑似組み紐群の表現から3次元多様体の位相不変量が構成されることが示された。turaev-Viroによる量子的不変量はその構造から疑似組み紐群の直積の表現に対応しているものと思われるが、これは今後の研究課題である。2.微分幾何学的研究成果(前田、藤原等)(1)主バンドルの接続全体に作用するゲージ群のオービットに対する体積の概念とそれを曲面として見た場合の平均曲率の概念を一般化し、一般化されたHsiangの定理が前田等によって示された。また、この理論を用いて3次元多様体の位相不変量を構成する試みの研究が進行中である。(2)ポアソン環の変形という立場からの量子群についての説明が、様々な例によって与えられた。(3)辺の長さが任意のグラフ上にラプラシアンが定義され、そのスペクトルの下限とグラフの等周定数の関係が示された。3.その他の研究成果(1)立体内ビリヤードのcomplexityの決定(塩川等)(2)古典対称群上のPoisson核の特徴付け(河添)(3)barotropic圧縮性Navier-Stokes方程式の自由境界問題の平衡状態近くでの大域的可解性の証明(谷等)(4)Painleve方程式の解の挙動(下村)(5)その他(菊池、国松等)1.組み合わせ幾何的研究成果(石井等)(1)3次元多様体の組み合わせ表示として、「疑似組み紐群」という組み紐群に似た表示をもつ群の要素として3次元多様体を表す方法が与えられた。3.その他の研究成果(1)立体内ビリヤードのcomplexityの決定(塩川等)(2)古典対称群上のPoisson核の特徴付け(河添)(3)barotropic圧縮性Navier-Stokes方程式の自由境界問題の平衡状態近くでの大域的可解性の証明(谷等)(4)Painleve方程式の解の挙動(下村)(5)その他(菊池、国松等)
世代間関係から見た鹿児島の変容〜ライフコース・ネットワーク・個人化を軸として

本研究は、日常生活というミクロな場面の様態を通して、鹿児島という社会の変動を捉えようとしたものである。ミクロな場面の様態を捉える上では、近年の社会変動を理解する上で一つのキーワードとして関心を持たれている「個人化」に特に焦点をあて、果たして「個人化」というような変動が実際に生じているのか、また、「個人化」の動向が年齢層によって異なっているかどうかを中心にして調査をおこなった。対象者の選出は2段階抽出法で行った。鹿児島市の選挙人名簿を用いて、鹿児島市内の桜島地域を除く町・丁から50地点を抽出し、各地点でそれぞれ20名を抽出した(男性・女性それぞれ10名づつ、計1000人)。なお、対象者の年齢は、96年12月末日で、25歳以上69歳以下とした。′97年1月中旬に調査票を郵送し、2月の上旬に調査員が回収をおこなった。有効回収率は、本調査の分析に入ったところで73.1%であった。調査票では、社会・イエ・家族・個人のそれぞれの単位へのコミットを検討する質問と、また、「個人化」という視点では特に焦点となる「家族の個人化」という変動を検討する質問を用意した。結果は、全体的には若年層が高齢層に比して「個人化」の傾向が異なった。例えば、人生観においては、若年層が高齢層に比して社会という単位を重視する傾向にあり、年齢が下がるほど個人という単位を重視する傾向にある。ただし、婚姻上の地位でコントロールすると、既婚者が最も家族という単位を重視し、未婚者は個人という単位を重視する傾向にあり、また、若年者ほど未婚者が多いので、今後「個人化」がさらに進行するという結論は簡単には下せない。また、個々の質問が具体的に指し示している材料によっても回答の傾向には相違がある。今後の課題としては、多変量解析を進めるとともに、ライフコース・パターンや生活領域の意味についても注意を払って解釈する必要がある。
中国市場向け国際電子商取引システムの開発-日韓中における貿易手続電子化の実証実験

日中間における商品、物流、金融、保険についての情報の一元化を行い、それぞれを商品スキーマ、物流スキーマ、金融スキーマ、保険スキーマを定義した。これらのスキーマはデータと処理をもつオブジェクトとして扱われる。また、データを永続化するために、これらのオブジェクトを関係データベースに保存するマッピングの実装も行った。これらをWebアプリケーションとデータベースを連携させるシステムを構築した。一元化された貿易情報はINVOICE、Packing List, Shipping Instructionなどの貿易書類としてAdobe社が提供するPDF(Portable Document Format)として関連企業に公開される。さらに、日本の電子商取引ベンチャー企業と共同で、日本の副原料を中国加工工場に輸出する実証実験を実施した。その結果、本研究で提案した貿易情報の一元化により、電子物流決済が実行できた。韓国とは、韓国電子商取引学会と連携して、日韓国際電子商取引の可能性を含む動向調査等を行い、今後の貿易情報システム間接続の問題点を明らかにした。国際的に電子的ビジネスを行うe-businessを実施することが本研究の目的である。そのために、今年度は、貿易金融EDI (Electronic Data Interchange)の標準化について調査研究を行った。貿易金融EDIは国家ごとに進められており、欧米をはじめ、日本のTEDI、韓国のKTNET、台湾のTRADE-VANなどアジア各国もオープンなネットワークのもとですべての貿易書類を電子化しペーパレスな貿易業務手続が行われている。また、本研究の対象国である中国でも、中国電子口岸が登場し、政府主導で貿易金融EDIが推進されている。また、貿易事務手続きの実務的側面から電子化のための要件分析を行うべく、日本と中国の間で電子商取引のサービスを提供しているチャイナ保証ネットワーク(株)の協力を得、貿易手続きのプロトコルの調査研究を行った。最後に、技術的側面から電子データのやりとりを行うためにWebサービスの調査研究を行った。第1にWebアプリケーションを開発するためのモデルであるMVCフレームワークについて調査し、その実装を行った。第2にWebサービスを実装するために、SOAP、WSDL、UDDIなどの通信技術に加えて、通信プロトコルの上にビジネスプロトコルを実装することを目的としたebXMLについても調査研究し、ebXMLのメッセージングの実験をするべく、システムを開発した。今年度の実務的側面と技術的側面の調査研究に基づいて、来年度は貿易手続きEDIの実証実験と評価を行う予定である。日中間において、商品、物流、金融、保険についての情報の標準化を行い、それぞれを商品スキーマ、物流スキーマ、金融スキーマ、保険スキーマなどを定義した。このスキーマはオブジェクトとしてデータと処理をもつ情報として扱われる。またデータを永続化するために、このオブジェクトを関係データベースに保存するマッピングの実装も行った。これらをWebアプリケーションとデータベースを連携させてシステムを構築した。標準化された貿易情報はINVOICE、Packing List, Shipping Instructionなどの貿易書類としてAdobe社が提供するPDF(Portable Document Format)として関連企業に公開される。さらに日本の電子商取引ベンチャー企業と共同で、日本の副原料を中国加工工場に輸出する実証実験を実施した。結果、本研究で提案した貿易情報の標準化により、電子物流決済が実行できた。今後の課題として、本研究で提案した貿易情報と各国の貿易情報システムとの連携が挙げられる。日本のTEDI、韓国のKT-NET、中国の中国電子口岸など、本実証実験で実際に接続したのは、中国電子口岸だけであった。日本のTEDIと接続できなかった理由は、技術的問題ではなく、接続するための費用の捻出が問題であった。今後、TEDIについてはより安価にそして簡単に接続できることを期待する。
マウスモデルを用いた変形性関節症の発症の分子メカニズムの解析

変形性関節症(Osteoarthritis, OA)は、慢性の炎症を伴う関節疾患で、関節軟骨の退行性変性および、骨軟骨の増殖性変化を特徴としている。多因子疾患であるため、発症の機序ならびに増悪のメカニズムの解析は未だ体系化されてるとは言い難い。本研究では、加齢に伴う自然発症のOAを再現できるマウスモデルを確立し、軟骨の退行変性の機序を検討することを主たる目的としている。本研究では、マウスに対して卵巣摘除を行なった後、トレッドミルを用いて強制走行を行い、過度の力学的ストレスを関節軟骨に加えることによって、膝関節に直接的な外傷を加えなくても再現性よくOA様変化を誘導できることを示した。加齢、性差、人種等の遺伝的背景、生活習慣等の複雑な要因が関与する多因子疾患であるため、その発症並びに病態の進行の分子メカニズムの解析には、ヒトの変形性関節症の特徴を再現できるマウスモデルの構築が必須であると考えている。この考えから、私たちは平成23年度から25年度までの基盤研究において、膝組織に対する非侵襲のマウスOAモデルの確立とその再現性の検証を行ってきた。このモデルは、卵巣摘除(OVX)を行ったマウスに対して週5日、速度20m/min、100分のトレッドミルによる強制走行を6週間行うものである。Balb/cマウスを用いた実験では、OVX(OVX+CAGE)並びに強制走行(SHAM+RUN)は、それぞれ単独では、関節軟骨に対して重篤な変化は与えなかったが、OVXと強制走行を組み合わせた群(OVX+RUN)においては、コントロール(SHAM+CAGE)と比較して顕著な軟骨の退行変性が観察された。OVX+RUN群においては、他の群に比較して重篤な滑膜の肥厚並びに滑膜マクロファージ(F4/80)の浸潤が観察された。以上の結果は、OVX、強制走行による過度の力学的負荷は、相乗的に膝関節に対して退行変性を誘導するが、その理由の一つとして関節炎症の重篤化が考えられた。本研究は、その詳細な分子メカニズムの解析を行うことである。当該年度においては、OA発症における遺伝的背景の差異を検討するため、骨量の異なる2種類のマウス系統(C57Bl/6及びC3H/HeJ)において同様の検討を行い、Balb/cの結果との対比を行った。その結果、C57系統においては、OVX+RUN軍においても重篤な軟骨変性と滑膜炎症は観察されず、本実験系が、OA発症における遺伝的背景解析の実験モデルとして有用である可能性が示唆された。変形性関節症は、その分子基盤が十分解明されていない為、疾患の原因に基づいた治療法は未だ確立されていない。変形性関節症に関する基礎研究を困難としている要因の一つとして、変形性関節症の病態を効率よく再現出来る動物モデルが確立されていない点が挙げられる。本研究では、軟骨の退行変性が明らかになる以前に生じる関節(周囲)組織の初期変性の同定および解析を可能とする為の、再現性の高い非侵襲マウス変形性関節症モデルの確立を試み、発症ならびに進行の機序を解明することを目的としている。閉経及び前十字靭帯断裂等に起因する膝関節の不安定化はOAの重要なリスクファクターであると報告されていることから、本研究ではマウスの閉経モデルである卵巣摘除と関節内に外科的な侵襲を加えることのない、トレッドミルを用いた強制走行を組み合わせる方法で関節軟骨の代謝変化の観察を行った。8週齢のメスBalb/cマウスに対して卵巣摘除を施行し、術後1週より、6週間強制走行させた。卵巣摘除の有無、強制走行の有無で、4群(卵巣摘除、卵巣摘除+走行、偽手術、偽手術+走行)に分けて比較検討した。その結果、卵巣摘除+走行の群では、偽手術群と比較して有意に軟骨基質の変性が観察された。またこれらは、滑膜の慢性炎症を伴っていた。系統間の違いによる遺伝的背景の相違が関節軟骨代謝に及ぼす影響を検討するため、同一実験をC57Bl/6マウスおよびC3H/HeJマウスで行ったところ、4群すべてにおいて、著明な軟骨の変性は観察されなかった。本研究では、膝に直接の外科的侵襲を加えること無く軟骨の変性を再現よく誘導出来る系の構築を行った。また、その軟骨変性の過程は、ヒトのOAの初期変化に見られる現象と類似していた。更に、本実験系は、人種等の遺伝的背景の相違が関節軟骨のホメオスタシスに及ぼす影響を解析していく上で強力な実験系となることが期待された。これまでの研究成果に関して、Balb/cマウスの結果を論文にまとめ、投稿を行った。現在Minor Revisionで修正を行っている。マウス系統間の差異を検討する目的で行った、C57Bl/6JおよびC3H/HeJマウスの結果も現在投稿に向けて準備中である。変形性膝関節症は、その分子基盤が十分に解明されていないため、疾患の原因に基づいた治療法は未だ確立されていない。変形性膝関節症に関する基礎研究を困難にしている要因の一つとして、変形性膝関節症の病態を効率よく再現できる動物モデルが確立されていない点が挙げられる。

本研究では、関節軟骨の変性が明らかになる以前に生じる関節内及びその周囲組織の初期変性の同定及び解析を可能とするために、再現性が高く、非侵襲のマウス変形性膝関節症モデルの確立を試み、発症並びに進行の機序を解明することを目的としている。閉経並びに前十字靭帯損傷等に伴う膝関節の力学的不安定化は、変形性膝関節症の重要なリスクファクターであると報告されていることから、本研究では、マウスの閉経モデルである卵巣摘除と関節内に直接的な外科的侵襲を加えることのない、トレッドミルを用いた強制走行を組み合わせる方法で関節軟骨の代謝の変化の観察を行なった。8週齢のメスBalb/cマウスに対して卵巣摘除を施行し、術後1週より6週間の間強制走行させた(1週あたり10km)。卵巣摘除の有無、強制走行の有無で4群(卵巣摘除のみ、卵巣摘除に強制走行、偽手術のみ、偽手術に強制走行)に分けて比較検討を行なったところ、卵巣摘除に加えて強制走行を行った群において有意な関節軟骨の変性を観察した。また、関節軟骨の変性に伴い、隣接する滑膜組織の炎症の慢性化が観察された。炎症反応が、関節軟骨に対する力学的負荷に伴う退行変性にたいして増悪因子として働くかを検討するため、卵巣摘除を施行していないマウスに対して関節腔内にモノヨード酢酸(MIA)を注射した後に、強制走行を行なったところ、3週間で有意な関節軟骨の退行変性が観察された。以上のことから、変形性膝関節症の初期病変における滑膜炎症と膝関節の力学的負荷、不安定性の重要性が示唆された。変形性関節症(Osteoarthritis, OA)は、慢性の炎症を伴う関節疾患で、関節軟骨の退行性変性および、骨軟骨の増殖性変化を特徴としている。多因子疾患であるため、発症の機序ならびに増悪のメカニズムの解析は未だ体系化されてるとは言い難い。本研究では、加齢に伴う自然発症のOAを再現できるマウスモデルを確立し、軟骨の退行変性の機序を検討することを主たる目的としている。本研究では、マウスに対して卵巣摘除を行なった後、トレッドミルを用いて強制走行を行い、過度の力学的ストレスを関節軟骨に加えることによって、膝関節に直接的な外傷を加えなくても再現性よくOA様変化を誘導できることを示した。本実験系は、6週間に及ぶトレッドミル走行試験を行う必要があるため、実験期間中におけるマウスの脱落を抑止する工夫が必要である。また、実験の開始からデータ取得(組織学的解析の完了)までに長期の期間を必要とすることも考慮して研究計画を実行していくことを常に考えるべきと考えている。当該年度において、2系統のマウスを用いた実験を行い、現在組織学的解析を行っている最中である。次年度中にはこの実験結果の解析を終了できると考えており、計画よりは少々遅れているが、概ね順調に進行していると考えている。Balb/cマウスにおいて確立した、膝に対する非侵襲の変形性関節症モデルを用いて、異なる四肢長官骨量を有するSyngenicマウス(C57Bl/6JおよびC3H/HeJ)における関節軟骨の退行変性の重症度を組織学的に解析する(継続)。これにより、変形性膝関節症の発症に及ぼす遺伝的背景の差異を検討するモデル系の確立を試みる。最終年度に向けて、研究成果の公表(論文発表)を行う。整形外科学Balb/cマウスにおいて確立した非侵襲の変形性関節症マウスモデルを用いて、異なる表現型を有するsyngenicマウス(C57Bl/6、C3H/HeJ、DBA/2)を用いた、関節軟骨の変性を制御する遺伝的背景の検索を継続して行う。本研究項目では、骨量や炎症性反応の程度が異なることが明らかとなっている種々のsyngenic
炭酸リチウムの性成熟期前投与における精巣の発達への影響

炭酸リチウムは、精神科領域で気分安定剤として特に躁うつ病、うつ病に汎用されている。リチウムは生体内で甲状腺や内分泌の機能調節に極めて重要な働きをしており、過剰状態では筋肉攣縮、成長障害、腎障害などを生じることが知られている。最近、性成熟期後の実験動物に炭酸リチウムを長期投与すると精巣機能に異常が起きることが報告された。しかし、性成熟期前の炭酸リチウム投与が精巣の発達や機能に与える影響を調査した報告はない。そこで今回、性成熟期前の雄マウスに炭酸リチウムを投与し、精巣の発達や機能に与える影響を調査する。炭酸リチウム(lithium carbonate)は、予防・治療薬として特に躁うつ病、うつ病に汎用されている。躁うつ病は遺伝要因の関与が高いといわれており、患者の約25%は15歳(思春期)以下で発症し、慢性化することが多く、再発率が高い。したがって、炭酸リチウムを長期にわたり内服することは珍しくない。25年度は性成熟期前の雄マウスに炭酸リチウムを投与し、精巣の発達や機能に与える影響を検討した。24年度に決定されたリチウム濃度をふまえ、3週齡ICRマウスの雄に0.05(3.5mg/day)%、0.01(700ug/day)%炭酸リチウム含水道水およびコントロールとして水道水を3ヶ月与えた(自由摂取:5ml/day)。0.05、0.01%炭酸リチウム群およびコントロール群の3ヶ月後精巣をテクノビット包埋し、ヘマトキシリンエオジン染色で精子形成障害程度を光学顕微鏡下で観察した。また、mRNAを抽出し、サイトカインおよびタイトジャンクション因子の発現をリアルタイムPCRで検討した。結果は0.05および0.01%炭酸リチウム群は精細管内の精細胞の脱落(特に精子細胞や精母細胞)を認めたが、コントロールに比べて有意な差はなかった。また、タイトジャンクション因子にも有意な差はなかった。しかし、精巣内のサイトカインのmRNA発現は炎症性サイトカイン(IFN-gamma、TNF-alpha)の有意な低下を認めた。さらに、マクロファージ数が有意に減少していた。したがって、炭酸リチウムの摂取は精巣内免疫環境に影響を与える事がわかった。24年度は性成熟期前の雄マウスに炭酸リチウムを投与し、精巣の発達や機能に与える影響を調査ために、性成熟期後のマウスを用いて、投与量や精巣毒性の有無などを検討した。本研究科研費で購入した躁うつ病やうつ病の予防・治療薬である炭酸リチウムを性成熟前のマウスに投与する前段階として、炭酸リチウム投与量を検討した。まず、8週齡ICRマウスの雄に1(約70mg/day)、0.1 (7mg/day)、0.05 (3.5mg/day)、0.01 (700ug/day)%炭酸リチウム含水道水およびコントロールとして水道水を3ヶ月与えた(自由摂取:6-7ml/day)。炭酸リチウムは治療域と中毒域の濃度が近い事で知られている。1%炭酸リチウム群は4週間以内に腎障害のためすべて死亡した。残りの0.1、0.05、0.01%炭酸リチウム群およびコントロール群の3ヶ月後精巣をテクノビット包埋(Heraeus Kulzer社)し、ヘマトキシリンエオジン染色で精子形成障害程度を光学顕微鏡下で観察した。0.1、0.05および0.01%炭酸リチウム群は精細管内の精細胞の脱落(特に精子細胞や精母細胞)を認めた。また、マウスの炭酸リチウム摂取に対して濃度依存的に精細胞の脱落像が増悪する傾向にあるものの、低濃度ほどマウスによって毒性感受性に違いがあり、個体差が影響している事が明らかになった。以上、本年度で炭酸リチウムの濃度が決定した。

24年度の結果を参考に最終年度である25年度は性成熟前の雄に0.1 (7mg/day)、0.05 (3.5mg/day)、0.01 (700ug/day)、0.005(350ug/day)%炭酸リチウム含水道水およびコントロールとして水道水を1ヶ月与える(自由摂取:6-7ml/day)。中毒域濃度が成獣マウスより低いと予想されるため、投与期間を1ヶ月とした。そして、1ヶ月後の精巣をテクノビット包埋(Heraeus Kulzer社)し、ヘマトキシリンエオジン染色で精子形成障害変化を光学顕微鏡下で観察する。24年度の結果を踏まえ、精細胞の脱落が予想されるため、タイトジャンクションに関わる因子や精子の障害程度を遺伝子やタンパク質レベルで調べ、さらにサイトカイン動態や炎症細胞の有無などの精巣内免疫環境の変化を調べる。平成25年度は総額800千円の研究経費を計上した。その積算根拠として、実験動物のためのマウス代(食餌含)300千円を計上した。さらに、消耗品としてスライドグラス100千円、炭酸リチウム15千円、脱落の要因や精巣の免疫環境を調べるための薬品類(タンパク質や遺伝子抽出試薬、リアルタイムPCR用試薬、ウエスタンブロット用試薬他)385千円を計上した。
インフルエンザとエイズ感染の重症化を決定する致死的宿主応答因子の解析と治療法開発

インフルエンザ感染重症化で認められる末梢の血管内皮細胞の障害に基づく血管透過性亢進状態は、ウイルス感染による細胞間の結合破綻に基づく。本研究では、A型インフルエンザウイルスによる血管内皮細胞の透過性亢進についてのメカニズム解析を行った。インフルエンザ感染により、血管内皮細胞間の接着結合に重要なβ-カテニンの減少に伴う血管透過性の亢進が認められた。β-カテニンのN末のリン酸化はプロテアソームによる分解を誘導するため、リン酸酵素であるGSK-3βをRNAiでノックダウンして検討を行ったところ、インフルエンザウイルス感染によるGSK-3βに依存したβ-カテニンの分解と血管透過性の亢進が認められた研究課題の目的は、インフルエンザ感染に伴う肺水腫、多臓器不全や脳症等インフルエンザの重症化について、感染による血管内皮細胞間の透過性亢進に着目しその発症機序を明らかにする事にある。インフルエンザ感染重症化で認められる、末梢の血管内皮細胞障害に基づく異常な血管透過性亢進状態は、ウイルス感染による血管内皮細胞間の結合破綻に基づいている。血管内皮細胞では、接着結合破綻が、血管内皮細胞の透過性亢進に重要となってくる事から、インフルエンザ感染による血管内皮細胞間の接着結合に与える影響について解析を行ってきた。これまでの研究から、1)インフルエンザ(PR8)に感染すると血管内皮細胞内のGSK3 betaが活性化される。2)活性化されたGSK3 betaは、基質の一つであるの裏打ち蛋白質であるbeta-cateninをリン酸化する。3) beta-cateninがリン酸化されるとbeta-cateninのプロテアソームによる分解が誘導される。4) beta-cateninは分解される事でその発現が低下し、接着結合構成蛋白質であるVE-cadherinとの結合性を失う。5)これらの機序によって、インフルエンザに感染した血管内皮細胞間の接着結合が破綻し、血管内皮細胞障害の原因となる可能性が示唆されてきた。今回我々は、これらメカニズムの詳細を明らかにするため、上記プロセスの中の、インフルエンザウイルス感染によるGSK3 betaの活性化並びにbeta-cateninのリン酸化に着目し解析を行った。その結果、ウイルス感染時に認められる、GSK3 betaに依存したbeta-cateninのN末のSer33/37/Thr41のリン酸化が、プロテアソームによる分解を誘導し、血管内皮細胞間の接着結合を崩壊させ血管内皮細胞間の透過性の亢進を引き起こしている事を明らかにした。インフルエンザ感染重症化で認められる末梢の血管内皮細胞の障害に基づく異常な血管透過性亢進状態は、ウイルス感染による血管内皮細胞間の結合破綻に基づいている。血管内皮細胞では、接着結合(アドヘレンスジャンクション)破綻が、血管内皮細胞の透過性亢進に重要となってくる。これまでの我々の研究から、先ず、インフルエンザ(PR8)に感染すると血管内皮細胞内のGSK3 betaが活性化され、基質の一つであるアドヘレンスジャンクションの裏打ち蛋白質であるbeta-cateninをリン酸化する。beta-cateninがリン酸化されるとこのプロテアソームによる分解が誘導される事でその発現が低下し、VE-cadherinとの結合性を失う。これによって血管内皮細胞間の接着結合が破綻し、血管内皮細胞障害がおこる可能性が示唆された。本研究においては、昨年度までに、上記プロセスの中の、インフルエンザ感染によるGSK3 betaの活性化並びにbeta-cateninのリン酸化に着目し解析を行った。その結果、ウイルス感染によるGSK3 betaに依存したbeta-cateninのN末のSer33/37/Thr41のリン酸化が、プロテアソームによる分解を誘導し、血管内皮細胞間のアドヘレンスジャンクションを崩壊させ血管内皮細胞間の透過性の亢進を引き起こしている事が明らかとなった。最終年度では、今後の推進方策に従いこれらin vitroで得られた知見が実際にマウスを用いた実験で認められるかについて動物実験にて検証をおこなった。その結果、インフルエンザ(PR8)感染マウスにおいて、GSK3betaの活性化及びbeta-cateninの分解による発現低下が確認された。これらの結果は、アドヘレンスジャンクションを構成するbeta-cateninの感染によるGSK3beta依存的な分解が、重症インフルエンザ感染における血管内皮細胞間の透過性亢進機構の重要なメカニズムであることを示唆している。β-カテニンのN末のリン酸化はプロテアソームによる分解を誘導するため、リン酸酵素であるGSK-3βをRNAiでノックダウンして検討を行ったところ、インフルエンザウイルス感染によるGSK-3βに依存したβ-カテニンの分解と血管透過性の亢進が認められた我々は以前より、インフルエンザ感染時における血管内皮細胞の透過性亢進機序の一つとして、ウイルス感染による血管内皮細胞間の結合破綻に着目し解析を続けてきた。HUVECを用いた解析でこれまで、インフルエンザウイルスに感染すると、密着結合に重要な裏打ち蛋白質であるZO1の発現低下が引き起こされる事、この原因としてウイルスによるZO1のプロテアソームによる分解が促進される事を明らかにしてきた。

一方、今回の解析では新たに、インフルエンザウイルスは血管内皮細胞間の接着結合破綻にも強く関与している事が分かってきた。実際、密着結合構成蛋白質であるoccludinやclaudinの発現が少なく密着結合が形成され難い血管内皮細胞では、接着結合(アドヘレンスジャンクション)破綻が、血管内皮細胞の透過性亢進に重要となってくる事から、今回はインフルエンザ感染による血管内皮細胞間の接着結合に与える影響を中心に解析を行った。その結果、1)インフルエンザ(PR8)に感染すると血管内皮細胞内のGSK3 betaが活性化される。2)活性化されたGSK3 betaは、基質の一つであるアドヘレンスジャンクションの裏打ち蛋白質であるbeta-cateninをリン酸化する。3) beta-cateninがリン酸化されるとbeta-cateninのプロテアソームによる分解が誘導される。4) beta-cateninは分解される事でその発現が低下し、アドヘレンスジャンクション構成蛋白質であるVE-cadherinとの結合性を失う。5)これらの機序によって、インフルエンザに感染した血管内皮細胞間の接着結合が破綻し、血管内皮細胞の透過性が亢進する、等の研究成果を得る事ができた。現在、これら研究成果を基に、インフルエンザウイルス感染によって引き起こされる血管内皮細胞間接着障害機構の詳細の解析を行っている。(理由)インフルエンザ感染重症化機構について、ウイルスによる血管内皮細胞間の接着結合障害機構を、血管内皮細胞培養系を用いて分子レベルで明らかにできたことによる。インフルエンザ感染憎悪(重症化)機構について、ウイルスによる血管内皮細胞間のアドヘレンスジャンクション(接着結合)障害機構を、初代血管内皮細胞培養系を用いて分子レベルで明らかにできたことによる。(今後の推進方策)インフルエンザウイルスによる血管内皮細胞間の透過性亢進機構について、さらにその詳細を明らかにして行く。さらに、マウスを用いた動物実験で検証していく予定である。インフルエンザウイルスによる血管内皮細胞間の透過性亢進機構について、培養細胞を用いてさらにその詳細を明らかにしていく。同時に、マウスを用いた動物実験で検証していく予定である。(次年度の研究費の使用計画)本研究は実際の実験を施行するにあたり、培養細胞の継代維持、遺伝子組み換え操作が不可欠である。さらに、実験動物(C57/BL/6CrSlcマウス)、各種試薬、特異抗体、測定用キット等の購入が必要なため研究経費の多く(70%)は消耗品費に使用する。又、本研究で得られた研究成果を社会に発信するため、年2回の国内及び年1回の国際学会での成果発表を行う予定にしておりそのための旅費として使用する。本研究は実際の実験を施行するにあたり、培養細胞の継代維持、遺伝子組み換え操作が不可欠である。さらに、実験動物(C57/BL/6CrSlcマウス)、非ステロイド系抗炎症薬を含む試薬、各種特異抗体、合成や測定用キット等の購入が必要なため研究経費の多く(70%)は消耗品費に使用する。
共生開始シグナル・イソフラボンを感知するダイズ根粒菌NodDの活性化機構

野生ダイズ根粒菌Sinorhizobium frediiUSDA191 NodD1の大腸菌内発現系によって調製したタンパク抽出物を用いてin vitro再構成する技術改善に取り組み、GroELSシャペロンニン・システムを起動させて活性化したNodDのDNA結合を首尾よく検出することに成功した。但し、未だ再現性やデータの明確さに欠けるため論文発表や学会発表にまで至ることができなかった。この点は正に挑戦萌芽研究の宿命である。NodD1の細胞内局在の観察についても、免疫電子顕微鏡による検討を続けているが未だ芳しい結果は得られていない。一方そ代案として、ウェスタンブロッティング法によりNodD1のタンパク質レベル変動を検討した結果、ダイゼイン存在下でのみ可溶性の細胞膜画分に含まれるNodD1が顕著に増加することが示唆された。しかし、ダイゼイン添加によるnodD1の転写量の変化はなかった。これらの結果から、ダイゼイン添加によって細胞膜に含まれるNodD1の増加には、mRNAの翻訳効率の上昇、あるいはNodD1の安定化が関与すると推測された。そこでNodD1活性化の途中でタンパク質の新規合成を停止しNodD1の安定性を比較したところ、ダイズイン存在下ではNodD1の分解抑制が観察された。これらの結果からNodD1活性化の過程でダイゼインが細胞膜に含まれるNodD1を安定化させその存在量を増加させることが示唆され、本年度はこの点さらに明確にすることができた。また、NodD1の多量体化をクロスリンクで検討した。NodD1が活性化した状態で結合する染色上の位置を定め、それによってNodD1の傘下にある遺伝子群を明らかにすべく、ゲルシフト・アッセイを応用したSELEX解析に挑戦した。この際は、USDA191のみならず栽培ダイズ根粒菌を代表するBradyrhizobium japonicum USDA110株についても同様の手法を適応すべく研究を進めてが、実験方法自体の設定が調わず結果を得るには至らなかった。野生ダイズ根粒菌Sinorhizobium frediiUSDA191のNodD1は宿主植物のダイズから分泌される共生開始シグナル物質イソフラボン(ダイゼイン)を感知するマスター転写因子である。NodD1を大腸菌内でHisタグ融合して発現させ精製するシステムを立ち上げ、精製したNodD1に対する特異的抗体の作出した。本年度は、大腸菌内でのNodD1発現系の改良し、NodD機能をレポーターlacZ発現によって検出するシステムの確立にも成功した。しかし、大腸菌から調製したタンパク抽出物を用いて、NodD1のDNA結合をゲルシフト法等によって示すことは非常に困難であり、結合の安定検出についてはさらなる技術的な改善が必要である。一方その代案として、ウェスタンブロッティング法によりNodD1のタンパク質レベル変動を検討した結果、ダイゼイン存在下でのみ可溶性の細胞膜画分に含まれるNodD1が顕著に増加することが示唆された。そこでNodD1活性化の途中でタンパク質の新規合成を停止しNodD1の安定性を比較したところ、ダイゼイン存在下ではNodD1の分解抑制が観察された。これらの結果からNodD1活性化の過程でダイゼインが細胞膜に含まれるNodD1を安定化させその存在量を増加させることが示唆された。本年度のこれらの成果については8th European Nitrogen Fixation Conferenceなどで発表した。

NodD1が活性化した状態で結合する染色上の位置を定め、それによってNodD1の傘下にある遺伝子群を明らかにすべく、ゲルシフト・アッセイを応用したSELEX解析に挑戦した。この際は、USDA191のみならず栽培ダイズ根粒菌を代表するBradyrhizobium japonicum USDA110株についても同様の手法を適応すべく研究を進めてが、実験方法自体の設定が調わず結果を得るには至らなかった。