hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放線菌の致死性プラスミドの機能を抑制する因子とその作用機構

PockプラスミドpSA1.1を保有するStreptomyces azureus PK100a株の胞子形成率はpSAプラスミド非保有株PKCやpSA非保有株PK100Cの10^<-5>以下であった。この抑制を回復させる物質を広く検索したところ、50μg/ml前後の濃度で平板培養上の胞子の色が確認できる10^<-3>以上の比率に上昇させる物質としてL-Cys、D-Cys、Bacitracin(BC)、Glutathione(GL)を検出した。これらの物質は野生型株PKO、PKC、PK100C株の胞子形成、気菌糸生育を促進した。また、BCは液内培養菌体の生育を促進した。特に、BCのPKO株とPK100a株由来の胞子形成回復株PK100asに対する気菌糸伸長効果が最も顕著であり、無添加対照の3倍以上になった。BC対するPKO株とPK100as株が類似挙動を示したので、両菌株の性質を比較したところ、PK100as株はPKO株と同様pSA組込み配列を保有するようになり、PKO株と同じように欠損ファージSAt2産生を伴う自然誘発性のpockを形成するなど、PKO化の傾向を示した。この結果はまたpSAプラスミドが染色体組込み配列から生じ、再び染色体に組込まれ、またプラスミド化することを示している。L-CysとD-Cysにはチオストレプトン増産傾果があり、この増産効果は、チオストレプトンの構成成分にCysが含まれ、また構成成分の4個のthioazole環残基がCysに由来することによると考えられた。以上の結果を総合して、L-Cys、D-Cys、BC、GLは、細胞を活性化して、細胞分裂、形態分化および抗生物質産生能を高めることで、pSA1.1の致死作用を陵駕し、胞子形成やチオストレプトンの産生を促進すると推測した。L-Cys、D-Cys、BC、GLと類似の効果が認められる物質を産生するStreptomyces cyaneus等の放線菌を数株検出したが、物質の同定には至っていない。しかし、本研究で使用した方法は細胞分化及び抗生物質の産生を促進する物質の優れた検索法になると確信した。抗生物質チオストレプトン生産菌streptomyces azureusのpock形成プラスミドpSA1.1は宿主細胞の胞子形成とチオストレプトン(TS)産生を著しく低下させる.本研究では, pSA1.1の宿主細胞に及ぼすこれらの抑制作用を解除し,胞子形成とTS産生を回復させる物質を検索し,それらの作用を検討し,以下の結果を得た.なお本研究にはpSA1.1を約30コピー有するPK100a株を主として用い, pSA1を約1コピー有する野生型株及び全くプラスミドを持たないPK100c株を比較に使用した.1).L-, D-システイン(Cys),シスチン,グルタチオン,バチトラシンにPK100a株の胞子形成を回復させる作用があることを見いだした.

特にL-, D-Cysが最も有効で, PK100a株の胞子形成率は野生型株の10^<-5>以下であるのに対し, 50-200μg/mlの添加で10^<-3>以上に増加した.一方,野生型株とPK100c株では顕著な効果は認められなかった.2).L-, D-Cys及びシスチンにTS増産作用を認めた.本作用にはL-Cysが特に有効であった.即ち, PK100株は寒天培地上で野生型株の約65%量のTSを産生するが, 50-200μg/mlのL-Cys添加で80-95%量に増加した.またPK100a株の液内培養ではTS産生は検出不可能であったが, 50-200μg/mlのCys添加によって野生型株の10-30%量のTSを検出した.一方,野生株とPK100c株でも50-100μg/mlのCys添加でTS産生が約50%増加した.3).L-, D-Cys及びバチトラシンは用いた全菌株で気菌糸(或は胞子着性菌糸)の伸長増大作用を示した.即ち, Cysは気菌糸を50μg/mlの濃度で無添加の約1.5倍,バチトラシンは10-40μg/mlの濃度で1.5-4倍増大させた.特にバチトラシンの野生型株に対する効果が最も顕著であった.これらの物質の作用機構については現在検討中である.1.L-、D-Cysには顕著なTSP増産効果があり、この増産効果は、TSPの構成成分にCysが含まれ、また構成成分の4個のthioazole環残基がCysに由来することによると考えられた。BCには液内培養菌体の生育促進効果が認められた。2.BCに対して著しい気菌糸伸長を示した野生株PKO株とpSA1.1を有するPK100a株由来の胞子形成回復株PK100asの性質を比較したところ、PK100as株はPKO株と同様pSA組込み配列を保有するようになり、PKO株と同じように欠損ファージSAt2産生を伴う自然誘発性のpockを形成するなど、PKO化の傾向を示した。PK100as株の親株PK100aがTSPを殆ど産生しないのに対し、PK100as株では明瞭なTSP産生の回復が認められた。またpSAプラスミドは染色体組込み配列から生じ、再び染色体に組込まれ、またプラスミド化する性質のあることが明らかになった。3.以上を総合して、L-Cys、D-Cys、BC、GLは、細胞を活性化して、細胞分裂、細胞分化及び二次代謝産生能を高めることで、pSA1.1の致死作用を陵駕し、胞子形成やTSPの産生を促進すると推測した。4.さらに、類似の効果の認められる物質を産生するStreptomyces cyaneus等の放射菌を数株検出したが、物質の同定には至っていない。しかし、本研究で使用した方法は細胞分化及び抗生物質産生を促進する物質の検索に優れた方法であることを示した。
注意と意図の重畳を進化的に考える　－鳥類網膜の遠心性制御の機能的意義の解明－

向網膜系の機能的意義を解明するため多角的な研究を行い,いくつかの知見を得た.特に重要と思われる点は以下の2点である.1)一側の向網膜神経核内の向網膜ニューロンをGABA-A受容体作動薬であるムシモールの微量注入によって不活性化すると,注入対側に呈示された標的刺激の識別能が低下するだけでなく,注入対側に呈示された刺激の検出能も低下することが明らかとなった.このように向網膜系が網膜に送る向網膜信号は,標的識別能だけではなく刺激検出能の改善に寄与していることが分かった.さらにこれら向網膜信号による標的検出能の改善は,標的への正しく素早い定位行動に寄与していることも明らかとなった.2)向網膜神経核への電気刺激やグルタミン酸の微量注入によって向網膜ニューロンを活性化すると,プロテインキナーゼC (PKC)免疫陽性の双極細胞(PKC-BC)において,転写因子であるCREBのリン酸化が見られることを見出した.このことは,向網膜系の3次ニューロンであるIO標的細胞の制御対象がPKC-BCであることを強く示唆する.1)で示された向網膜信号による標的検出能の改善は,IO標的細胞によるPKC-BCと網膜神経節細胞(RGC)間のシナプス伝達のシナプス前促通によっている可能性が高まった.本研究は,脳から網膜への遠心性投射系である向網膜系の機能的意義を解明することを目的とする.多面的なアプローチを行っているが,初年度は主に,1)向網膜信号遮断の標的への到達運動への影響,2)向網膜系刺激によって活性化する網膜固有細胞,の2つのテーマで進展があった.1)向網膜系の2次ニューロンであるIOニューロンをGABA-A受容体アゴニストであるムシモールの局所注入によって可逆的に不活性化することで向網膜系が網膜へ送る向網膜信号を遮断して,広域視野に呈示される標的刺激への到達運動を学習した動物のパフォーマンスへの影響を調べた.その結果,向網膜信号遮断によって前方視野での妨害刺激の誤選択率が上昇することを観察した.さらに,向網膜信号遮断によって側方視野に呈示された単独標的への到達運動の成功率が低下することを観察した.向網膜信号が標的検出力を向上させているとすると,以下のように解釈できる.向網膜信号遮断によって側方視野の標的に対する神経活動が到達運動の解発閾値に達せず,単独標的であっても到達運動が起こらない.向網膜信号遮断によって前方視野の標的に対する選択的促通が起こらないと,到達運動の対象としての標的の優位性が失われ,妨害刺激の誤選択率が上昇する.2)向網膜信号の制御対象である網膜固有細胞を明らかにするために,遮光ゴーグルによって光遮断した動物のIOニューロンの電気刺激によって活性化する細胞を,最初期遺伝子の発現やCREB遺伝子のリン酸化を指標として調べた.IO標的細胞でリン酸化したCREB (pCREB)が観察された.また内顆粒層の中央層に細胞体を持つ細胞でもpCREBが観察された.別途行った免疫二重染色によってPKC陽性双極細胞(PKC-BC)がIO標的細胞の制御対象であることが示唆されているが,内顆粒層の中央層のpCREB陽性像は,PKC-BCである可能性がある.前項で記載の通り,ほぼ当初の計画通りの進捗状況といえる.「注意と意図の重畳を進化的に考える」という主題で,鳥類網膜の遠心性制御の機能的意義の解明を目指して研究を行っている.昨年度は,以下の3つのサブテーマで進展が見られた.1.向網膜神経核の薬理学的不活性化による探索障害の定量的計測2.転写因子CREBのリン酸化による向網膜系の制御対象の同定3.大脳高外套尖頂部からのトップダウン入力の影響特に,1では3面のタッチパネルを組み合わせて自作した広域視野刺激提示装置を用いて,向網膜信号遮断の視覚探索に対する影響を定量的に計測した.これまで向網膜信号遮断の影響は前方視野でのみ計測されていたが,この装置によって側方視野での計測が可能となった.これによって,向網膜信号遮断が側方視野に呈示された単一標的への定位の脱落を引き起こすことを初めて見出した.このように,向網膜信号遮断は標的への正しい定位のための視覚運動統合機能を障害することが明らかとなった.3年計画の2年間で重要な知見を得ることが出来ており,概ね順調に進んでいると考える.向網膜系の機能的意義を解明するため多角的な研究を行い,いくつかの知見を得た.特に重要と思われる点は以下の2点である.1)一側の向網膜神経核内の向網膜ニューロンをGABA-A受容体作動薬であるムシモールの微量注入によって不活性化すると,注入対側に呈示された標的刺激の識別能が低下するだけでなく,注入対側に呈示された刺激の検出能も低下することが明らかとなった.このように向網膜系が網膜に送る向網膜信号は,標的識別能だけではなく刺激検出能の改善に寄与していることが分かった.さらにこれら向網膜信号による標的検出能の改善は,標的への正しく素早い定位行動に寄与していることも明らかとなった.2)向網膜神経核への電気刺激やグルタミン酸の微量注入によって向網膜ニューロンを活性化すると,プロテインキナーゼC (PKC)免疫陽性の双極細胞(PKC-BC)において,転写因子であるCREBのリン酸化が見られることを見出した.

このことは,向網膜系の3次ニューロンであるIO標的細胞の制御対象がPKC-BCであることを強く示唆する.1)で示された向網膜信号による標的検出能の改善は,IO標的細胞によるPKC-BCと網膜神経節細胞(RGC)間のシナプス伝達のシナプス前促通によっている可能性が高まった.1)到達運動への向網膜信号遮断の影響に関しては,動画像解析を加えてより詳細な分析を行う.2)向網膜系電気刺激によるCREBのリン酸化が見られる細胞に対して,PKC免疫染色を行い,PKC陽性双極細胞が本当に向網膜系の制御対象であるかを明らかにする.3つのサブテーマの内,以下の2テーマについて,特に注力する.2.転写因子CREBのリン酸化による向網膜系の制御対象の同定3.大脳高外套尖頂部からのトップダウン入力の影響それぞれ,現在まで興味深い知見が得られており,それぞれ詳細を明らかにするために,周到に実験を進める.消耗品の消費が想定よりも低く抑えることができたこと,計測実験用装置のためのPCやグラフィックボードが想定よりも低価格であったことなどで,次年度使用額が生じた.計測装置作成を次年度に持ち越したため.次年度は最終年度でもあり,計測装置作成も含めて着実な使用計画を立案し,実施する.2年目は抗体など比較的高価な試薬等の消耗品を多く必要とするフェーズに入るため,丁度よい執行状況となると思われる.
腸管免疫末梢教育機構の破綻による炎症遷延化の解明

マスト細胞やマクロファージなどの免疫細胞は、組織・臓器の微小環境に応じて、生体にとって有益に働くように制御されている。申請者の独自の研究から、間葉系細胞と呼ばれる細胞集団が免疫細胞に対して、末梢組織で組織特異性を誘導していることがわかっており、これを「免疫末梢教育機構」と呼んでいる。一方で、線維化をはじめとした慢性炎症では「免疫末梢教育機構」が破綻しており、不適切な免疫細胞の恒常的活性化が起きている。本研究では、間葉系細胞の機能破綻が導く免疫末梢教育の攪乱による組織破壊並びに腸管線維化についての解析を行う。
空間認識能力育成ソフトの開発および高専数学における空間認識能力評価指標の構築

本研究は、(1)カメラで数式を読み取り3次元グラフを表示するソフトの開発、(2)空間図形認識能力を評価するような指標の構築、(3)3次元グラフに関連する授業コンテンツの開発と社会への発信、という3つの内容からなる。3次元グラフの板書は難しく、導入時の授業で図形をイメージすることができずに、苦手意識のまま克服できない学生が多い。本研究は、(1)(3)によって、空間図形に対する学生の苦手意識を減らし、能動的学修を推進する教育コンテンツの研究開発を目的とするものである。(1)について、平成30年度は、学生が所有する色々な端末に対応する為、Android版のソフト開発を行った。Android版では、カメラで撮った画像からの数式抽出が難しかった為,手書き入力機能の開発を進めた。取得した数式が表すグラフのAR(拡張現実感)技術による特定マーカーへの表示、タップやドラッグでグラフをいろいろ変化させる機能などについては、Windows版と同等の機能を実現した。(2)について、平成30年度は、構築した空間図形認識指標に基づくCBT(Computer-Based Testing)の実施結果を分析し、指標の改良を進めた。また、(1)のソフトを用いた群と用いない群の比較により空間図形認識指標の改良作業を行う計画であったが、Android版ソフトの開発に遅れが生じ、比較による改良作業を行うことができなかった。(3)について、平成30年度は、全国算数・数学教育研究大会や高専シンポジウムにおいて(1)のソフトのデモを行い、実際に使ってもらって好評を得た。(1)のソフトを用いた授業設計シートの作成およびe-learningなどの自主学習の為に利用できるコンテンツ開発ができなかった為、延長申請しこれを行う予定である。関数入力が容易な3次元グラフソフトは、学生の所有する色々な端末に対応する為、Windows版とAndroid版を開発している。Windows版は実用化まで進んだが、Android版では入出力部分に異なる仕組みが必要となり、その解決に時間を要した。ソフトの実用化後に、これを用いた群と用いない群の比較により、空間図形認識指標の改良作業を行う計画であったが、ソフト開発の遅れにより取り掛かれなかった。また、ソフト開発の遅れにより、3次元グラフに関連する授業コンテンツの開発にも取り掛かれなかった。本研究は、(1)カメラで数式を読み取って3次元グラフを表示するソフトの開発、(2)空間図形認識能力を評価するような指標の構築、(3)3次元グラフに関連する授業コンテンツの開発と社会への発信、という3つの内容からなる。(1)については、Android版の手書き入力機能を強化する。また、実際に学生に使用してもらい、操作機能を改良する。(2)については、ソフトを用いた群と用いない群の比較により、空間図形認識指標の改良作業を行う。(3)については、(1)のソフトおよび(2)の指標を基に、授業コンテンツの開発を行う。3次元グラフ表示のソフトはいろいろあるが、それぞれ数式の入力方法が異なり、授業などに導入する際には、使い方の説明に多くの時間を取られる。(1)について、平成28年度は、WindowsをOSとする端末でのソフト開発を行なった。カメラで撮った画像からの数式抽出、取得した数式が表すグラフのAR(拡張現実感)技術による特定のマーカ上への表示、タップやドラッグでグラフをいろいろと変化させる機能などについて実現に至った。平成29年度は、このソフトを教育コンテンツとして導入するため、学生の所有する様々な端末で動作するよう、さらに開発を進めていく。(2)について、平成28年度は、秋田と鶴岡の両高専で行われている数学教育を分析し、評価指標の構築作業を進めた。平成29年度は、この評価指標に基づく数学試験を実施し、その結果をふまえて評価指標の改良作業を行なう予定である。(3)については、平成29年度以降に行なう計画であり、(1)のソフトを用いた授業設計シートの作成を予定している。e-learningなど、自主学習のために利用できるコンテンツ開発もまた、念頭に置いている。ソフトの開発はおおむね順調に進んでおり、基本的な機能は実現できていて、様々な種類の端末で動作するように開発を進めているところである。評価指標の構築もおおむね順調に進んでおり、これを基にした数学試験の実施準備に入っている。授業コンテンツの開発は、当初の計画通り、平成29年度後半から開始できる見込みである。3次元グラフ表示ソフトはいろいろあるが、それぞれ数式の入力方法が異なり、授業などに導入する際には、使い方の説明に多くの時間が取られる。

本研究は、(1)(3)によって、空間図形に対する学生の苦手意識を減らし、能動的学修を推進する教育コンテンツの研究開発を目的とするものである。(1)について、平成29年度は、前年度に引き続きWindowsをOSとする端末でのソフト開発を進めた。カメラで撮った画像からの数式抽出、取得した数式が表すグラフのAR(拡張現実感)技術による特定のマーカーへの表示、タップやドラッグでグラフをいろいろと変化させる機能などについて、改良作業を行なった。また、カメラで読取ができない場合に対応し、手書き入力機能の開発を行ない、十分な精度で手書き入力ができるようになった。(2)について、平成29年度は、前年度に構築した評価指標に基づくCBT(Computer-Based Testing)を作成し、(1)のソフトを未利用の学生に対してこのCBTを実施し、指標の再検討を行った。(3)について、平成29年度は、高専シンポジウムにおいて(1)のソフトのデモを行い、実際に使ってもらって好評を得た。最終年度には、(1)のソフトを用いた授業設計シートの作成およびe-learningなどの自主学習のために利用できるコンテンツの開発を予定している。ソフト開発においては、基本的な機能は実現できているが、様々な種類の端末での動作について簡単ではないことが分かり、平成29年度はWindows端末での動作に絞って開発を進めた。また、計画を変更し、手書き入力機能の開発を先に行なうこととした。これはWindows端末やAndroid端末では様々な種類のカメラがあるため、学生の所有する端末でカメラ機能を利用できない可能性を考えたためである。本研究は、(1)カメラで数式を読み取り3次元グラフを表示するソフトの開発、(2)空間図形認識能力を評価するような指標の構築、(3)3次元グラフに関連する授業コンテンツの開発と社会への発信、という3つの内容からなる。3次元グラフの板書は難しく、導入時の授業で図形をイメージすることができずに、苦手意識のまま克服できない学生が多い。(1)について、平成30年度は、学生が所有する色々な端末に対応する為、Android版のソフト開発を行った。Android版では、カメラで撮った画像からの数式抽出が難しかった為,手書き入力機能の開発を進めた。取得した数式が表すグラフのAR(拡張現実感)技術による特定マーカーへの表示、タップやドラッグでグラフをいろいろ変化させる機能などについては、Windows版と同等の機能を実現した。(2)について、平成30年度は、構築した空間図形認識指標に基づくCBT(Computer-Based Testing)の実施結果を分析し、指標の改良を進めた。また、(1)のソフトを用いた群と用いない群の比較により空間図形認識指標の改良作業を行う計画であったが、Android版ソフトの開発に遅れが生じ、比較による改良作業を行うことができなかった。
骨・軟骨性腫瘍における型別コラ-ゲンの分布特性

骨に原発する腫瘍の診断や悪性度の判定はかなり難しい。そこで本研究は腫瘍内の型別コラ-ゲン(IXI型)の局在と分布パタ-ンを型特異的抗体を用いて解析し、病理診断と悪性度の判定に寄与することを試みた。IVI型コラ-ゲンに対する型特異的抗体については既に作成済みであるので、今回はIX型、XI型コラ-ゲンをヒト肋軟骨から抽出し、塩析法とアガロ-スゲルクロマトグラフィ-で単離・精製した。この精製に設備備品(分光光度計)を用いた。次にIX型コラ-ゲン(HーMW)をSDラットに免疫し、型特異的抗体を作成した。XI型コラ-ゲンはきわめて微量で、若干のIX型コラ-ゲンの混入が避けられなかったので、アクリルアミドゲル電気泳動後、XI型コラ-ゲンの泳動バンドを切りとって、これをSCラットの免疫した。抗血清を免疫ブロット法で検定したところIX型コラ-ゲンに反応し、XI型コラ-ゲンには反応しなかった。そこで、SJL/Jマウスを用いてモノクロ-ナル抗体の作成を試みたところ、IgM分画の抗XI型コラ-ゲン抗体(α_3(XI)鎖を認識)を得た。しかし免疫ブロット法ではα_1(II),α_1(V),α_2(V)と交叉し、XI型コラ-ゲンのみと反応するエピト-プをもつクロ-ンは得られなかった。これまで作成された抗コラ-ゲン抗体を用いて骨肉腫(20例)、軟骨腫(10例)、軟骨肉腫(17例)の免疫染色を行った。骨肉腫では悪性度が高くなるにつれて各型コラ-ゲンの沈着が多様化するという分布特性を示した。軟骨腫や異型度1の軟骨肉腫ではII型コラ-ゲンが均等に染め出されるのに対し、IX型コラ-ゲンは不均等に分布した。軟骨肉腫は組織学的異型度の増加とともに本来の軟骨性(II,IX型)コラ-ゲンに代って、間質型(I,III,V型)コラ-ゲンが沈着し、VI型コラ-ゲンがびまん性に染め出された。以上、骨腫瘍では型別コラ-ゲンの分布にそれぞれ特徴があり、とくにこの分布特性は悪性度の補助判定に有用であった。
HTLV-1感染防御機構破綻に伴うATL発症機構の解明

NDRG2は新規PTEN結合蛋白質であり、脱リン酸化による活性調節を行なうストレス応答因子であった。ATLを含む多くのがんでは発現低下し、PTENは高リン酸化・不活化型としてPI3K/AKTの恒常的活性化に関り、NDRG2欠損マウスはTリンパ腫を含み多種の癌を発症した。またNDRG2の発現低下は、canonical及びnoncanonical pathway両者を活性化し、NF-kB活性化に寄与していた。すなわちNDRG2はストレス応答に関わる重要な情報伝達系を負に制御し細胞の恒常性を保つ働きを持っており、NDRG2不活化はストレスによるがんの発症に大きく寄与する可能性を示唆した。まず、(1) NDRG2/PP2A複合体によるPTENphosphatase活性制御機構の解明について、NDRG2はPP2Aと複合体を作り、PTENC-terminal STT (Ser380/Thr382/Thr383)の脱リン酸化を引き起こし、PTEN活性型に変化させ、PI3K/AKT情報伝達を負に制御していることを突き止めた。ATL細胞ではAKTリン酸化が恒常的に活性化されており、その活性化機構はNDRG2転写の低下に伴い、PP2AがPTENに結合できず、リン酸化状態のままPTENは不活化し、AKT情報伝達系が活性化された状態をつづけることに繋がっていた。またこのNDRG2転写低下にはgenome欠失の他にプロモーターメチル化が有り、ATL以外にも多種類のがんでメチルが見られ、かつ(7) NDRG2欠損マウスにおいて多種類のがんが出現したことから、NDRG2は固形癌においてもがん抑制遺伝子として働くことがわかった(Nature Comm 2014)。さらに、(2) NDRG2は、PI3K/AKT情報伝達系のみならず、NF-KB情報伝達系においても負の制御をすることが分かってきた。NDRG2は感染防御などのストレス応答因子であり、あらゆる情報伝達系に関わることが示唆され、その防御機構について検討中である。(3)さらに、NDRG2ばかりで無く、数多くの遺伝子がATL発症に伴いメチル化されており、そのメチル化機構、遺伝子を同定することを目的としてメチル化アレイによる解析を続けている。(4)またそれに加えて、PTENに対する新規キナーゼの同定とその性状を検討するため、PTEN及びNDRG2結合タンパク質を同定し、新規キナーゼの同定を進めている。一方(5)染色体分析から同定したBCL11Bについて、さらに(6)ATLの新規マーカーとして同定したTSLC1の遺伝子発現解析を続けている。TGマウスの作製などの動物実験を含めさらなる検討を行う。HTLV-1TaxはBCL11Bの発現抑制を行っており、発現パターンの以上を伴っていた。そこで異常BCL11Bの異常を確認するために、二種類のTGマウスを作製し、白血病発症機構を検討している(4)HTLV-1感染とATL接着因子TSLC1遺伝子の過剰発現機構:TSLCI高発現機構の解析のため、プロモーターアッセイによりp47 E3 ligase発現低下がNF-kB活性化に繋がっていることが分かってきた。成人T細胞白血病(ATL)はHTLV-1母子感染から長期の感染期を経て、約5%が発症する予後不良の悪性疾患である。我々はこれまで急性型ATLのゲノム解析を通じて、14q11に存在するNDRG2遺伝子がゲノム欠失、メチル化により発現低下し、細胞増殖を負に制御することからがん抑制遺伝子候補とした。NDRG2は新規PTEN結合蛋白質であり、PP2AをリクルートしPTEN-C端脱リン酸化によりPTEN phosphatase活性制御に関わっていた。ATLではPTEN高リン酸化型となりphosphatase活性が不活化されAKT情報伝達系の恒常的活性化につながっていた。NDRG2欠損マウスはTリンパ腫のみならず、肝臓がん、肺がん等を引き起こす多様ながん抑制遺伝子であった(Nature Comm 2014)。さらに、NF-kB情報伝達系においてもcanonical pathwayはAKTより、noncanonical pathwayはNF-kB inducible kinase (NIK)のリン酸化促進にNDRG2発現低下が関与しており、ATLにおけるNF-kB情報伝達系の活性化機構にNDRG2発現低下が重要な役割を有していることがわかった(Scientific reports 2015)。NDRG2発現低下にはHTLV-1感染が重要であり、長期感染はNDRG2のメチル化を促進し、HTLV-1/Taxが其のメチル化に関与していた。以上より、HTLV-1感染リンパ球内での慢性炎症に伴うNDRG2発現低下に伴う生体防御機構の破綻、ストレス応答破綻がATL発症に関わるゲノム・エピゲノム異常蓄積に重要な因子であり、その結果としてPI3K/AKT、NF-KB等複数の情報伝達系異常を引きおこし、ATL発症に繋がることを示唆する結果を得た。

すなわちNDRG2はストレス応答に関わる重要な情報伝達系を負に制御し細胞の恒常性を保つ働きを持っており、NDRG2不活化はストレスによるがんの発症に大きく寄与する可能性を示唆した。これまでの結果をまとめ、NDRG2の機能解析としてNature Commに2014年に発表した。さらに機能解析が進展し、また、HTLV-1感染による防御機構が感染のターゲットとしてNDRG2が存在していたことがわかり論文作成中である。この分子機構が明らかになってきたことで、HTLV-1感染に対する細胞内での防御機構としてのNDRG2の重要な役割と、慢性炎症がどのような影響を細胞内に与えるのか、その分子機構がわかってきたことで、将来的な治療法の開発につなげたい。また、HTLV-1TaxはBCL11Bの発現抑制を行っており、発現パターンの以上を伴っていた。そこで異常BCL11Bの異常を確認するために、二種類のTGマウスを作製し、白血病発症機構を検討している。この発見はBCl11Bの新たな機能の発見に格る、重要な発見であり、さらなる分子機構を明らかにする必要がある。さらにTSLCI高発現機構の解析のため、プロモーターアッセイによりp47 E3 ligase発現低下がNF-kB活性化に繋がっていることが分かってきた。TSLC1はATLのマーカーであり、なぜATL細胞の中で高発現しているのか全くわかっていなかった。それがやはりHTLV-1感染に関係しており、NDRG2の発現低下、NFkB活性がその引き金の一つになっていることから、TSLC1の働きを抑える、発現を抑えることが重要な鍵となっている。27年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学。血液学(1)NDRG2の機能解析NDRG2の新たな機構を検討するため、NDRG2/PTEN結合タンパク質を網羅的に質量分析計で測定し、検討する。これらのタンパク質との結合と、NDRG2の機能を明らかにし、PTEN/NDRG2の情報伝達系を明らかにする。またPTENのキナーゼ候補として、新たにserine/threonine kinaseを同定している。この情報伝達系についても、現在検討中であり、ATLにおける新しい制御機構を明らかにする予定である。2) HTLV-1感染によるNDRG2のメチル化機構の解明:HTLV-1感染は、リンパ球の中で持続感染しており、HTLV-1 Taxからの情報はEZH2等のEPCメチル化を促進し、その一つのターゲットとしてNDRG2が存在していた。HTLV-1感染に対する細胞内での防御機構としてのNDRG2の重要な役割と、慢性炎症がどのような影響を細胞内に与えるのか、その分子機構がわかってきたことで、将来的な治療法の開発につなげたい。(3)T細胞分化・ATL発症に伴うBCL11B異常発現解析:HTLV-1TaxはBCL11Bの発現抑制を行っており、発現パターンの以上を伴っていた。
文脈自由文法の漸次学習方式とその応用

文字列の例から形式文法を自動的に合成する文法推論は機械学習の重要なテーマである.われわれはこれまでの研究によって,上向き構文解析の結果から不足している規則のみを生成する規則合成方式と規則集合探索を組み合わせて,文脈自由文法を漸次学習するシステムSynapseを作成し,これが基本的な文脈自由文法を自動合成できることを示した.この2年間の研究の主な成果は次のように要約できる.・システムに規則生成のための新しい方式(ブリッジ法)を組み込み,これが従来用いていた帰納的CYKアルゴリズムより効率が高いことを示した.ブリッジ法では,正例の文字列の構文解析に失敗したとき,不完全な導出木の欠けた部分を補うような規則が生成される.・これまでの最小規則探索に加えて,直列探索と呼ばれる探索方式を用いることによって,最小ではないが正しい規則集合(文法)をはるかに高速に合成できることを示した.・これまでのSynapseでは合成できる文法の形式が変形Chomsky標準形に制限されていたが,一般のChomsky標準形とその拡張形式の規則も合成できるように拡張された.残された研究課題は,これらの方式を改良・拡大して合成できる文法の範囲をさらに拡張し,機械学習への応用をはかることである.具体的な目標として,より複雑な文法を合成できるように帰納推論方式をさらに解析し改良すること,論理文法の合成および構文的パタン認識への合成への応用などがある.文字列の例から形式文法を自動的に合成する文法推論は機械学習の重要なテーマである.われわれはこれまでの研究によって,上向き構文解析の結果から不足している規則のみを生成する規則合成方式と規則集合探索を組み合わせて,文脈自由文法を漸次学習するシステムSynapseを作成し,これが基本的な文脈自由文法を自動合成できることを示した.この2年間の研究の主な成果は次のように要約できる.・システムに規則生成のための新しい方式(ブリッジ法)を組み込み,これが従来用いていた帰納的CYKアルゴリズムより効率が高いことを示した.ブリッジ法では,正例の文字列の構文解析に失敗したとき,不完全な導出木の欠けた部分を補うような規則が生成される.・これまでの最小規則探索に加えて,直列探索と呼ばれる探索方式を用いることによって,最小ではないが正しい規則集合(文法)をはるかに高速に合成できることを示した.・これまでのSynapseでは合成できる文法の形式が変形Chomsky標準形に制限されていたが,一般のChomsky標準形とその拡張形式の規則も合成できるように拡張された.残された研究課題は,これらの方式を改良・拡大して合成できる文法の範囲をさらに拡張し,機械学習への応用をはかることである.具体的な目標として,より複雑な文法を合成できるように帰納推論方式をさらに解析し改良すること,論理文法の合成および構文的パタン認識への合成への応用などがある.本研究は正負の文字列の例から文脈自由文法を自動合成する方式を確立し,さらにその応用を明らかにすることを目的としている.この文法学習方式は,上向き構文解析にもとづいた(生成)規則合成と規則集合(文法)の探索からなる.本年度の研究の主な内容および結果は次の通りである.1.上向き構文解析のために従来のCYKアルゴリズムに代わって,逆導出法と呼ばれる方式が採用された.この方式では導出木を,ある非終端記号Aから入力文字列の第i文字から第j文字までの部分系列への導出が可能であることを意味する項A(i-1,j)の集合によって表す.これによって,一般の文脈自由文法を確定節文法(DCG)やグラフ文法などへ拡張することが可能となった.2.新しくブリッジ方式と呼ばれる規則生成方式が考案された.これは導出木の欠けた部分を橋渡しするための規則を効率的に生成する働きをもち,従来の帰納的CYKアルゴリズムに代わるものである.3.規則集合を求めるために,従来の最小規則集合探索に加えて,直列探索と呼ばれる探索戦略を採用した.これによって最小ではないが,例を満足する文法をはるかに高速に合成できるようになった.4.以上の新しい方式はProlog言語によってSynapseシステムに実装され,評価が行われた.その結果,新しい規則合成および探索は従来の方式より高速であり,しかも一般の文脈自由文法を拡張した文法にもとづく構文的パタン認識などの応用を可能にすることが明らかになった.文字列の例から形式文法を自動的に合成する文法推論は機械学習の重要なテーマである.われわれはこれまでの研究によって,上向き構文解析の結果から不足している規則のみを生成する規則合成方式と規則集合探索を組み合わせて,文脈自由文法を漸次学習するシステムSynapseを作成し,これが基本的な文脈自由文法を自動合成できることを示した.この2年間の研究の主な成果は次のように要約できる.・システムに規則生成のための新しい方式(ブリッジ法)を組み込み,これが従来用いていた帰納的CYKアルゴリズムより効率が高いことを示した.ブリッジ法では,正例の文字列の構文解析に失敗したとき,不完全な導出木の欠けた部分を補うような規則が生成される.・これまでの最小規則探索に加えて,直列探索と呼ばれる探索方式を用いることによって,最小ではないが正しい規則集合(文法)をはるかに高速に合成できることを示した.

・これまでのSynapseでは合成できる文法の形式が変形Chomsky標準形に制限されていたが,一般のChomsky標準形とその拡張形式の規則も合成できるように拡張された.残された研究課題は,これらの方式を改良・拡大して合成できる文法の範囲をさらに拡張し,機械学習への応用をはかることである.具体的な目標として,より複雑な文法を合成できるように帰納推論方式をさらに解析し改良すること,確定節文法(DCG)の合成,および関数論理プログラム(functional logic program)の合成への応用などがある.
異種分散型Ｐ２Ｐシステムにおけるエコ・モデルの研究

情報システムは、コンピュータ、センサ等の種々の情報機器を含んだ異種なものとなってきている。こうしたシステムでは、これまでの応答時間、スループット等の性能目標に加えて、新たにシステム全体の消費電力の低減が重要となってきている。本研究では、自律的な対等なプロセスから構成される完全分散型の大規模P2Pシステムを考える。ピア間の自律的な協調動作により、システム全体の消費電力を低減できる分散型システムの新しいモデル、特に消費電力については実際のコンピュータの消費電力の実測に基づいて、消費電力のモデルの構築を行った。このモデルに基づいて、ピア間の分散型の協調動作方式を研究し、評価を行った。本研究では、PC、サーバ、センサ等の種々の情報機器から構成される大規模な完全分散型P2Pシステムにおいて、要求サービス品質(QoS)を保障しながら消費電力を低減するためのモデルと資源配分アルゴリズム、通信プロトコルについて研究を行う。まずP2Pモデルでの、ピア間の協調動作を行うモデルの研究を行った。ここでは、オブジェクトを操作するメソッド、アクセス権といったサービス種類と品質に加えて新たに消費電力を考え、知人ピアの信用可能性の定義と定式化を行った。特に消費電力については、種々の応用プロセスを動作させたときのサーバ等の消費電力を実測し、この実測データを基に、電力消費モデルSPC,MLPC等を構築した。次に、このピア間の信用可能性モデルを基に、各ピアは知人ピアの中から要求に対して信用可能な知人ピアを選択し、サービスを要求する方式についての研究を行った。本研究では、応用をCPU、二次記憶、通信を主に行う3つの型に分類し、各々の型に対する知人ピア選択アルゴリズムを研究した。実際の応用ではこれらの型が混在している。このため、混在型応用について、信用可能な知人ピアを見つけるアルゴリズムを研究した。これらのアルゴリズムを実装し、数百程度のピア数から成る環境でのシミュレーションを行い、要求を満足するピアの発見率、時間、メッセージ数等の通信負荷に加えて、消費電力を測定し、本研究で構築したモデルの妥当性を検証した。2011年9月29日(木)、30日(金)に、山形大学(米沢)で全メンバによる研究会を開催し、議論を行った。研究成果は、IEEE Transaction等の国際学術論文誌、IEEE AINA等の国際会議に積極的に公表するとともに、IEEEAINA,BWCCA,CISIS,NBiS等の国際会議を主催し国際的な評価を得てきている。第3年度では、P2Pモデルの主な特徴である大規模化に対して、以下の研究を行なった。1.方式、アルゴリズムの改良:これまでに研究されてきたP2Pアルゴリズム、通信プロトコルを、大規模化と信頼性の観点で改良を行なった。特に、第2年度で行なったシミュレーションによる評価結果を基にして改良を行う。特に、アプリケーション・プロセスを実行していないピアの待機消費電力が大きいことから、処理に必要なピアのみをグループに含めるような動的な方式について研究を行なった。また、ピアの障害に対しても処理を行なえるように、アプリケーション・プロセスを複数のピアで多重化して実行することを考える。多重化により増加するピアの消費電力を低減する多重化方式として、能動的多重化と受動的多重化方式を研究した。2.大規模化への対応: Internet of Things (IoT)のように情報システムは大規模化している。大規模環境において有効に動作できるように、ピアの信用可能性決定アルゴリズム、ピアの選択アルゴリズムの改良を行なった。特に、対象とするピア情報の保持、ピア間の通信方式を研究する。また、大規模システムでの評価をシミュレーションで行なった。3.実機での実装:研究されたP2Pモデルのピア間信用可能性のアルゴリズム、通信プロトコルを、各種の情報機器、サーバ、PC、センサ・ノードに実装する。これを実際に操作させて、実機による実験を行なった。この実験により、研究してきたピア間の信用可能性モデル、電力消費モデルの妥当性を検証した。4.研究会:研究代表者、研究分担者を中心にして、研究会を2014年3月に福岡工業大学で開催した。また、CISIS-2014(台中、台湾)、NBiS(光州、韓国)、BWCCA(Victoria、カナダ)等の国際会議を主催し、研究成果を発表した。また、IEEE Transactions等の学術論文誌に論文を発表した。第2年度では、ピアでの消費電力低減のための種々の処理方式、アルゴリズム、通信プロトコルについて研究を行なった。まず、ピア間の信用可能性概念の定式化を行なった。さらに、多コアCPU、ファン等の冷却装置等が消費電力に与える影響を考察し、種々のコンピュータを対象として、初年度に構築した電力消費モデルを拡張、改良した電力消費モデルを考案し、より実用的なものとした。ピア間の信用可能性概念とコンピュータの電力消費モデルを基本として、以下の方式の設計と開発を行なった。

1. P2Pシステムのアプリケーションを、CPU、二次記憶装置、通信の資源の各々を主に利用する計算(CP)型、記憶装置(ST)型、通信(CM)型の各アプリケーション型に分類した。各アプリケーション型のプロセスを実行したときの電力消費モデルを用いて、プロセスを実行するためのピアを、QoSを満足し消費電力を低減できるように、P2Pオーバレイ・ネットワーク上で発見する方式を研究した。2.実際のアプリケーションでは、CPU、二次記憶装置、通信の三種の資源が複合的に利用される。このため、CP, ST, CMの応用型が複合した一般的なモデルを考案した。複合型応用に対して、QoSを満足しながら消費電力を低減できるようにプロセスを実行できるピアを発見するアルゴリズムを研究し、消費電力、実行時間について評価した。3.大規模、異種ネットワークでの信頼性があり有効な通信方式を、ネットワーク上で中継を行うピアの信用可能性をもとに研究した。大規模な異種のネットワークで、ピアから送信されたメッセージを各ピアに、信頼性をもって有効に転送する通信プロトコルを設計し、プロトタイプの実装を行なった。中継ピアとしては信用可能性の高くつ消費電力を低減するものを選択するものである。研究代表者、分担者を中心にして、バルセロナで研究会を開催した。本年度は最終年度として、これまでの研究成果に基づきながら、以下についての研究を行なった。1.エコ方式、アルゴリズムの改良:エコな分散システムを実現するために、これまでに研究を行なってきたP2Pアルゴリズム、通信プロトコルの改良を行った。特に、プロセスの多重化により、システムの性能と信頼性、可用性を向上できる。一方で、実行されるサーバ数が増加することから消費電力も増加してしまう問題が生じる。このため、消費電力を増加させない多重化方式として、プロセスの複数のレプリカを実行させるときに、あるレプリカが終了した時点で他のレプリカを停止させる強制停止方式、またレプリカの実行開始時間をずらせる遅延実行方式を研究し、評価を行なった。これにより、システム全体の消費電力を低減できることを示した。2.大規模化:大規模なシステム環境では、各構成要素のピアプロセスが自律的に動作することが必要となる。このために、他のピアをどのように信用できるかを決定することが重要となる。ピアの信用可能性決定アルゴリズム、ピアの選択アルゴリズムの改良を行った。本年度は、ピア間の不正情報流を防ぐために、ロールベースのアクセス制御(RBAC)を用いて制御するためのトランザクションの同期方式を新たに研究した。3.評価:最終年度として、これまでに研究してきた方式の総合評価を行ない、特に電力消費モデルの妥当性と有効性を示した。4.研究会:研究代表者、研究分担者により、研究会を、2014年9月にNBiS-2014がSalerno (Italy)で開催された機会を利用して開催し、研究成果の取りまとめを行った。
行動・運動の学習と発達に関与する大脳基底核の役割

本研究は、黒質線条体ドーパミン系が線条体ニューロンが保有するどのタイプの受容体を介して、行動の学習に伴う活動特性の変容とその維持に関与しているかを明らかにすることを目的として行った。実験には2頭の日本ザルを用いた。45連の多連ガラス微小電極を使って、中心の電極によってサルの線条体ニューロンTANsの活動を記録しながら回りの電極でD1クラスまたはD2クラス受容体拮抗薬を電気泳動的に投与した。調べた40個のTANsのうち19個のTANsはD2クラスの拮抗薬(-)-sulpiride(10mM,pH4.5,<50μA)の投与によって選択的に、3個のTANsはD1クラス受容体拮抗薬によって選択的に反応が消失した。また、他の〓個のTANsはD1クラス、D2クラスの受容体拮抗薬のいずれによっても反応が消失することが解った、ドーパミン受容体拮抗薬を投与することによるTANsの自発放電レベルへの有意な影響はみられなかった。また、コントロール実験として生理食塩水を電気泳動的に(<30nA)または圧注入法によって(<1μl)投与したが、TANsの反応に有意な影響は見られないことが確認された。以上の結果は行動の学習に関与する大脳基底核の神経機序についての次の作業仮説を支持する。すなわち、行動の学習が完成した状態では、黒質線条体ドーパミン系が主としてD2受容体の、一部はD1受容体を介するメカニズムによって線条体のニューロンTANsが行動の学習に伴って獲得した活動を表出することを可能にしていると考えられる。すなわち、学習によって獲得された線条体ニューロンの活動の表出を黒質線条体ドーパミン系が主にドーパミンD2受容体を介して制御していることが強く示唆される。行動や運動の学習と記憶の脳内機序において大脳基底核の黒質線条体ドーパミン系が重要な役割を担うことを示唆する知見を木村らは従来の研究によって得ている。本年度は、黒質線条体ドーパミン系を破壊した動物の大脳基底核線条体のニューロンがどのような活動特性を持つか、運動・行動の学習と記憶能力がどうであるのかを調べる研究を行った。サルの一側の黒質線条体ドーパミン系を神経毒MPTPにより選択的に破壊した。手を使った運動課題の学習に伴って、破壊と対側の線条体のニューロンは行動課題に用いられる感覚手がかりを予測したり、課題が適切に行われた後与えられる報酬を期待するなどの、課題を学習することに選って獲得されたと考えられる活動特性を持つものが多くみられた。これに対して、破壊された側の線条体のニューロンは、感覚手がかりの大きさや強さなどの物理的な性質に関連する活動や手の運動の速度や大きさなどと関連するものが多く、学習を等して形成されたと考えられるものが極めて少ないことが解った。一方、複数の運動を組み立てて一続きの運動として行うことを学習させると、約3数間で破壊と同側に手を用いる場合には予測的で極めてスムースな連続動作が可能になったが、破壊と対側の手を用いる場合には個々の運動は可能であるものの、動作に繋がりがなく、感覚手がかりに頼って離散的な運動を複数回行うことで課題を実行することが判明した。このことは黒質線条体ドーパミン系が学習と記憶の機序に深く関わることを強く支持する。8年度はこの点を更に確実に示すために研究を行う。

大脳基底核が順序運動の学習や記憶に関与する仕組みを明らかにするために、サルの一側の黒質線条体ドーパミン系を選択的に破壊することによって、順序運動の学習と記憶の能力にどのような影響を及ぼすかを調べた。また、線条体のニューロンの活動をドーパミン系の破壊前後で比較した。順序運動課題として、視覚に誘導されて複数のボタンを押さえる運動を用いた。課題の学習は1個のボタンを1回押さえる課題から始め、最終的に3個のボタンを順番に3回ないし4回押さえる課題を学習させた。神経毒MPTPによるドーパミン枯渇後に学習を行わせた動物では、枯渇と同側の手の学習では第2第3のボタン押し間隔が24日で急激に短縮し、連続動作へと移ったのに対して、枯渇と対側の手ではわずかな短縮が認められただけであり、離散的な運動の繰り返しであった。第一のボタン押し運動の反応時間には左右の手で差はなかった。一方、習得した3回のボタン押し課題を行っているときに、突然課題を2回のボタン押し課題に切り替えて第2のボタン押しで報酬を与えると、枯渇と同側の手の場合は、第3のボタンは点灯していないにも関わらず、一続きの運動として第3のボタンを押してしまうことが100試行ほど続いた。それに対し、対側の手では、課題を切り替えた直後であっても一度も第3のボタンを押すことは見られなかった。このことは、枯渇と同側の手を使った学習では、個々のボタン押しが順序運動として学習されているために、課題を切り替えた後しばらくは、GOシグナルによって3回のボタン押しの運動プログラムが想起されてしまうのに対し、対側の手の場合は個々のボタン押しが離散的であり、ボタンの点灯に反応するように運動していたことを強く示唆する。以上の結果から、黒質線条体ドーパミン系は、順序運動の学習と記憶想起の過程に強く関与することが明らかとなった。本研究は、黒質線条体ドーパミン系が線条体ニューロンが保有するどのタイプの受容体を介して、行動の学習に伴う活動特性の変容とその維持に関与しているかを明らかにすることを目的として行った。実験には2頭の日本ザルを用いた。45連の多連ガラス微小電極を使って、中心の電極によってサルの線条体ニューロンTANsの活動を記録しながら回りの電極でD1クラスまたはD2クラス受容体拮抗薬を電気泳動的に投与した。調べた40個のTANsのうち19個のTANsはD2クラスの拮抗薬(-)-sulpiride(10mM,pH4.5,<50μA)の投与によって選択的に、3個のTANsはD1クラス受容体拮抗薬によって選択的に反応が消失した。また、他の7個のTANsはD1クラス、D2クラスの受容体拮抗薬のいずれによっても反応が消失することが解った。ドーパミン受容体拮抗薬を投与することによるTANsの自発放電レベルへの有意な影響はみられなかった。また、コントロール実験として生理食塩水を電気泳動的に(<30nA)または圧注入法によって(<1μl)投与したが、TANsの反応に有意な影響は見られないことが確認された。以上の結果は行動の学習に関与する大脳基底核の神経機序についての次の作業仮説を支持する。すなわち、行動の学習が完成した状態では、黒質線条体ドーパミン系が主としてD2受容体の、一部はD1受容体を介するメカニズムによって線条体のニューロンTANsが行動の学習に伴って獲得した活動を表出すことを可能にしていると考えられる。すなわち、学習によって獲得された線条体ニューロンの活動の表出を黒質線条体ドーパミン系が主にドーパミンD2受容体を介して制御していることが強く示唆される。
腸炎ビブリオの３型分泌装置１による細胞死誘導機構の解析

食中毒原因菌である腸炎ビブリオは培養細胞への感染時に3型分泌装置1(T3SS1)依存的な細胞毒性を示す。この細胞毒性に重要なT3SS1エフェクターとしてVepAが同定されている。本研究では酵母遺伝子破壊株ライブライリーを用いたスクリーニングにより、VepAの宿主側標的因子としてV-ATPaseのcサブニットを同定した。また、VepAはリソソームに作用し、リソソーム膜透過を誘導することで内容物を漏出させることが明らかになった。以上より、VepAは宿主細胞のリソソームを破壊することで細胞死を引き起こす可能性が示された。食中毒原因菌である腸炎ビブリオは、3型分泌装置1依存的に培養細胞に対して強い細胞毒性を示すが、その作用機序は不明な点が多い。本研究課題ではT3SS1から分泌されるエフェクターであるVepA、VopSについての解析、およびその標的分子の探索を行った。昨年度までにVepAについて単独で細胞毒性エフェクターとして機能することを明らかとした。また、酵母を用いたゲノムワイドスクリーニングによりVepAの毒性に関与する宿主側因子としてV-ATPaseのcサブユニットを同定している。また、VopSについては新規の標的候補分子を同定した。本年度は昨年度に同定したVopSの標的候補分子について、VopSに対する相互作用を検討し、VopSのAMP化活性部位に依存的に相互作用することを見出した。一方で、培養細胞においてこの標的候補分子の発現をノックダウンし、腸炎ビブリオ感染によりVopSの毒性に対する寄与を評価すると、VopSによる細胞形態変化に影響が認められなかったことから、この標的候補分子はVopSの細胞形態変化を誘導する活性には関与しないと考えられた。また、これらVopSに関する解析の過程において、VopSが細胞内で形質膜に局在している可能性を見出した。VopSはRhoファミリーGタンパク質をAMP化する活性を有することから、VopSの膜局在化が標的となる活性型RhoファミリーGタンパク質へのアクセスに有利に働く可能性が考えられた。我が国における主要な食中毒原因菌である腸炎ビブリオは、培養細胞に対して強い細胞毒性を示す。この細胞毒性は本菌の3型分泌装置1(T3SS1)依存的であるが、その作用機序は不明である。本研究では、腸炎ビブリオのT3SS1による細胞毒性に関与する宿主側因子を同定することで、腸炎ビブリオのT3SS1による細胞死誘導機構の解明を目的とした。T3SS1から分泌されるエフェクターとして、これまでにVepA、VopSなどが同定されている。このうち、VepAについては単独で細胞毒性エフェクターとして機能することを明らかとし、VepAの毒性に関与する因子としてV-ATPaseのcサブユニットを同定している。V-ATPase阻害剤などを用いた解析からVepAの細胞毒性にV-ATPaseのプロトン輸送能は必要ないものの、VepAによってリソソームの内容物の漏出が認められ、VepAがV-ATPaseのcサブユニットへの相互作用を介してリソソームの不安定化を誘導していることを明らかとした。また、VepAの宿主細胞に対する作用の一つとしてオートファジーの誘導が報告されているが、オートファジーを阻害してもVepAへの細胞死への影響は見られず、VepAによる細胞死はオートファジー非依存的であることも明らかとなった。以上より、本研究の結果によってVepAが宿主細胞のリソソームを破壊することで細胞死を引き起こす可能性が示された。また、VopSについても毒性に関係する宿主細胞側因子を探索するため、精製したエピトープタグ融合VopSと細胞抽出液を混合し、プルダウンを行うことで、VopSと相互作用する宿主細胞側の候補分子を同定した。V-ATPaseのVepAによる細胞毒性における役割の解析については、V-ATPaseのプロトン輸送機能はVepAによる細胞毒性に必要でないという、当初の予想に反した結果を得た。しかしながら、VepAはV-ATPaseへの相互作用を介してリソソームを不安定化していることを明らかとし、VepAが宿主細胞のリソソームを破壊することで細胞死を引き起こす可能性を示すことで、V-ATPaseのVepAによる細胞毒性における役割を明らかとすることができた。一方、酵母遺伝子破壊株によるスクリーニングはVepA、VopSについて共に、毒性に関与する新規な遺伝子の同定には至っていない。このうち、VopSについては酵母によるスクリーニングを補完するために計画していたプルダウンによる宿主細胞側相互因子の網羅的な解析により、候補分子を同定することができた。