hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グラフ理論の総合的研究

グラフ理論そのものと、グラフ理論の応用を含めた関連分野を総合的に研究した。グラフ理論の研究では、次のような研究を行なった。(1)マッチングの一般化である(1,f)-奇次数部分グラフに関するもの;(2)平面上へに与えられた点集合をグラフの点集合として、グラフを平面上に直線埋め込みする問題;(3)グラフの3ページ本型埋め込みにおいて辺と本の背の交差を許すと、交差数をどの程度まで少なくできるかと言う問題;(4)グラフに長い閉路が存在するための条件、(5)3角形を含まない単純有向グラフにおける4サイクルの数え上げ;(6)位数がg(k)以上で最小次数2k以上のグラフには、同じ長さのk個の互いに点素な閉路が存在することの証明;(7)クラインのk上の3角形分割がハミルトン閉路を持つための条件、対角変形による3角形分割の同値性の研究;(8)グラフの次数条件とある種のサイクルの存在についての研究;(9)グラフのbandwidthは行列との関係でも重要であるが、木のbandwidthについて新しい上界を得た;この他、代数的グラフ理論、組合せ理論、離散幾何、アルゴリズム論、画像処理に関する研究、発見科学の提唱に関連する研究などを行なった。たとえば、代数的グラフ理論では、スピンモデルの研究とかm_1=3である原始的対称アソシエーションスキームの分類などをおこなった、また画像処理に関連する研究では、ハーフトーニングの問題を数学的に定式化し、グラフアルゴリスムをもちいた効率的なアルゴリズムの提案した。研究の進展および新しい分野の開拓には、研究者相互の情報交換が非常に大切である。この観点から7月24日-26日の3日間この研究分担者を含む研究集会を慶應大学において開催してもらった。また12月19日から21日には龍谷大学瀬田キャンパスにおいて応用数学合同研究集会を開催し、多数の分担者の参加を得た。この他にも各種研究集会、東京理科大学で開催されているような定期的なセミナーや不定期のセミナーで分担者を含めた研究打ち合わせや情報交換が行われた。研究実績としては、次のページのような専門誌での研究発表も含め多くの成果があった。次に、ごく最近の研究で、まだ専門誌等での研究発表にはいたっていないが、研究会での発表がなされたもののいくつかを述べる。これらからも研究が順調に進展していることがうかがえる。グラフの2-連結[κ,κ+1]-因子グラフの奇次数部分グラフグラフのB-distanceと直径グラフのbook embeddingにおける交差数グラフの連結小部分グラフへの分解問題K_2とサイクルを成分とするグラフの成分因子グラフ理論そのものと、グラフ理論の応用を含めた関連分野を総合的に研究した。(1)マッチングの一般化である(1,f)-奇次数部分グラフに関するもの;(2)平面上へに与えられた点集合をグラフの点集合として、グラフを平面上に直線埋め込みする問題;(3)グラフの3ページ本型埋め込みにおいて辺と本の背の交差を許すと、交差数をどの程度まで少なくできるかと言う問題;(4)グラフに長い閉路が存在するための条件、(5)3角形を含まない単純有向グラフにおける4サイクルの数え上げ;(6)位数がg(k)以上で最小次数2k以上のグラフには、同じ長さのk個の互いに点素な閉路が存在することの証明;(7)クラインの壷上の3角形分割がハミルトン閉路を持つための条件、対角変形による3角形分割の同値性の研究;(8)グラフの次数条件とある種のサイクルの存在についての研究;(9)グラフのbandwidthは行列との関係でも重要であるが、木のbandwidthについて新しい上界を得た;この他、代数的グラフ理論、組合せ理論、離散幾何、アルゴリズム論、画像処理に関する研究、発見科学の提唱に関連する研究などを行なった。

たとえば、代数的グラフ理論では、スピンモデルの研究とかm_1=3である原始的対称アソシエーションスキームの分類などをおこなった、また画像処理に関する研究では、ハーフト-ニングの問題を数学的に定式化し、グラフアルゴリズムをもちいた効率的なアルゴリズムの提案した。
直接接触法のよる流動性氷の生成機構と流動特性

水と不溶性の冷媒液を水中に注入し、直接接触熱伝達により生成される円盤状の氷は流動性に優れ、氷水スラリーによる冷熱貯蔵・輸送技術に有望であるが、その生成機構や流動特性はほとんど解っていない。これは氷晶の初生や成長過程の挙動の観察が困難であるためである。本研究では、流動しながら成長する氷晶の観察手段を確立し、その観察手段を用いて、実験パラメータによる氷晶の初生条件や成長過程の観察を行い、その生成機構を検討する。また、生成された氷晶の流動特性と融解伝熱特性を明らかにする。そのために氷晶の初生および成長過程の顕微鏡観察が可能な氷蓄熱実験装置を設計・製作し、冷媒フロリナ-トの温度と流量を主要パラメータとして、蓄熱漕の冷却特性と温度分布の測定、円盤状氷の成長過程の顕微鏡観察・解析を行った。次に、液液直接接触製氷過程の能動的制御法を探求する目的で、氷の凍結過程に及ぼす超音波振動の影響を調べた。得られた新たな知見は以下の通りである。(1)蓄熱漕の温度分布は冷媒による攪拌効果で比較的均一な状態で直線的に温度降下し、氷点以下になると0.1K0.5K程度過冷却した後、氷晶が生成されると過冷却は急速に解除されほぼ0°Cの一定値となる。(2)氷晶はきわめて薄い円盤状で、直径と厚さの比がほぼ一定の状態で、時間の経過とともに直径の増加割合を減少しながら直径3mm程度まで成長を続ける。(3)氷晶が複数個団塊となると、個々の氷晶の形態は円盤状から樹枝状へと変化しながら成長する。これは団塊になることにより氷晶の運動と水の流動が制限され、過冷却の程度が局所的に変化するためと考えられる。(4)水を吸水した濾紙を流動中のフロリナ-ト冷却液に浸積し、凍結挙動を調べたモデル実験において、超音波振動の印可により凍結温度が約5°C上昇し、過冷却解除に有効であることが判明した。流動特性の検討は今後の課題として残った。本年度は、氷晶の初生および成長過程の顕微鏡観察が可能な実験装置を設計・製作し、冷媒フロリナ-トの温度と流量を主要パラメータとして、蓄熱漕の冷却特性と温度分布の測定、円盤状氷の成長過程の顕微鏡観察・解析を行った。(1)蓄熱漕の温度分布は冷媒による撹拌効果で比較的均一な状態で直線的に温度降下し、氷点以下になると0.1K0.5K程度過冷却した後、氷晶が生成されると過冷却は急速に解除されほぼ0°Cの一定値となる。

(2)氷晶はきわめて円盤状で、直径と厚さの比がほぼ一定の状態で、時間の経過とともに直径の増加割合を減少しながら直径3mm程度まで成長を続ける。(3)成長した氷晶が複数個団塊となり流動が制限されると、個々の氷晶の形態は円盤状から樹枝状へと変化しながら成長する。これは団塊になることにより氷晶の運動と水の流動が制限され、過冷却の程度が局所的に変化するためと考えられる。氷晶の成長過程のモデル解析と、氷水スラリーの流動特性と融解特性の実験・解析は、以上の実験結果をふまえて、次年度に行う予定である。水と不溶性の冷媒液を水中に注入し、直接接触熱伝達により生成される円盤状の氷は流動性に優れ、氷水スラリーによる冷熱貯蔵・輸送技術に有望であるが、その生成機構や流動特性はほとんど解っていない。これは氷晶の初生や成長過程の挙動の観察が困難であるためである。本研究では、流動しながら成長する氷晶の観察手段を確立し、その観察手段を用いて、実験パラメータによる氷晶の初生条件や成長過程の観察を行い、その生成機構を検討する。また、生成された氷晶の流動特性と融解伝熱特性を明らかにする。そのために氷晶の初生およぴ成長過程の顕微鏡観察が可能な氷蓄熱実験装置を設計・製作し、冷媒フロリナ-トの温度と流量を主要パラメータとして、蓄熱漕の冷却特性と温度分布の測定、円盤状氷の成長過程の顕微鏡観察・解析を行った。次に、液液直接接触製氷過程の能動的制御法を探求する目的で、水の凍結過程に及ぼす超音波振動の影響を調べた。得られた新たな知見は以下の通りである。(1)蓄熱漕の温度分布は冷媒による攪拌効果で比較的均一な状態で直線的に温度降下し、氷点以下になると0.1K0.5K程度過冷却した後、氷晶が生成されると過冷却は急速に解除されほぼ0°Cの一定値となる。(2)氷晶はきわめて薄い円盤状で、直径と厚さの比がほぼ一定の状態で、時問の経過とともに直径の増加割合を減少しながら直径3mm程度まで成長を続ける。(3)氷晶が複数個団塊となると、個々の氷晶の形態は円盤状から樹枝状へと変化しながら成長する。(4)水を吸水した濾紙を流動中のフロリナ-ト冷却液に浸積し、凍結挙動を調べたモデル実験において、超音波振動の印可により凍結温度が約5°C上昇し、過冷却解除に有効であることが判明した。流動特性の検討は今後の課題として残った。
ノックアウトマウスを用いたホメオテック遺伝子の標的遺伝子の同定

私たちがこれまでに作成したホメオテイック遺伝子Msx1、Msx2、Hoxa10のノックアウトマウスを用いて、これらの遺伝子の標的遺伝子ないし下流遺伝子の同定を試みた。胎生12.5日から生直後のMsx1欠損マウスの臼歯の形成過程について、増殖因子Bmp4の発現をin situ hyridizationにより経時的に調べたところ、歯上皮のBmp4の発現は、野生型と同じように胎生12.5日頃より認められたが、直下の歯間葉での発現は全経過を通して全く認められなかった。一方、野生型の歯間葉でのBmp4の発現は、Msx1の発現が認められるようになる胎生13.0頃より認められた。また、最近報告された転写因子Lef1のノックアウトマウスの歯の発生異常が、Msx1欠損マウスの異常と全く同じであったことより、Msx1欠損マウスにおけるLef1の発現を調べたところ、野生型とは異なり、歯間葉での発現は全経過を通して全く認められなかった。Lef1欠損マウスの歯間葉でのMsx1の発現は、正常であった。in vitroでMsx1欠損マウスの歯間葉を培養し、ビーズにBMP4を付けて植え込むとLef1の発現を誘導できた。以上の実験結果より、歯の発生においては、最初に歯上皮からBMP4が放出され、このシグナルにより直下の歯間葉において、Msx1の発現が誘導され、このMsx1が、直接あるいは間接的にBmp4の発現を誘導し、産生されたBMP4がLef1の発現を誘導する、すなわち、歯上皮Bmp4→歯間葉Msx1→Bmp4→Lef1というシグナル経路が存在し、この経路により歯が形成されることが明らかにされた。毛嚢、乳腺の形成においても、上皮Bmp4→間葉Msx1およびMsx2→Bmp4→Lef1という、ほぼ、歯と同じシグナル経路が重要な役割を果たしていることが明らかにされた。さらに、肢芽においても、上皮(頂堤)Bmp4→間葉(進行帯)Msx1およびMsx2→Bmp4という共通の経路の存在が発見された。Msx1およびMsx2は、この他に、心内膜床、妊娠子宮、下垂体などの上皮-間葉相互作用が認められる組織で発現しており、上述したシグナル経路と共通の経路が、各器官形成に際して機能していることが推測される。in situ hybridizationによるMsx1およびMsx2の下流遺伝子の探索では、この他に、体節Msx→MyoD、歯間葉Msx1→Syndecanの経路が明らかにされた(Cell投稿準備中)。Msx1、Msx2、Hoxa10のsubtractionあるいはPCR differential displayによる標的遺伝子ないし下流遺伝子の同定の試みについては、いくつかのクローンを単離した段階であり、現在、欠損マウスのRNAを用いたRNAse protection assayなどにより、確認の実験を行っているところである。今後、陽性クローンについて塩基配列の決定を行い、研究を進めていく予定である。

in situ hybridizationによるMsx1およびMsx2の下流遺伝子の探索では、この他に、体節Msx→MyoD、歯間葉Msx1→Syndecanの経路が明らかにされた(Cell投稿準備中)。Msx1、Msx2、Hoxa10のsubtractionあるいはPCR differential displayによる標的遺伝子ないし下流遺伝子の同定の試みについては、いくつかのクローンを単離した段階であり、現在、欠損マウスのRNAを用いたRNAse protection assayなどにより、確認の実験を行っているところである。今後、陽性クローンについて塩基配列の決定を行い、研究を進めていく予定である。
原田病の分子免疫学的研究(抗原の決定とクロ-ニングを中心として)

原因病はメラノサイドに対する自己免疫疾患であり、細胞性免疫がその主体をなすと考えられている。本研究では最初に各種melanocyte,牛ぶどう膜粗抽出液をmitogenとして、原田病患者から採取した抹消血リンパ球、及び脳脊髄液中のリンパ球を用い、^3Hthymidineの取り込みによるLymphocyte prolife ration assayを行った。melanocyteはGー361、WN115、Bowes、WN9、HMV1の粗抽出液可溶性成分を用いた。いづれの抗原に対しても、抹消血リンパ球、脳脊髄液ともに有意の反応を示すものはなかった。次に、これら抗原を分子量別に分画し、それぞれの分画を濃縮後、同様の方法にてassayした。この方法では分子量約7万の分画にproliferationを示す蛋白質の存在が示された。更にこの蛋白を単一の蛋白として精製分離するため二次元電気泳動を行った。等電点電気泳動ではPH約6.8の部分に増殖を示す部分があり、この部分を分子量別に二次元に展開した。展開したそれぞれのペプタイドは分子量約7万を示すものを採取し、lymphocyte proliferation assayを行った。これにより患者リンパ球が増殖を示すペプタイドが同定された。なお、コントロ-ル(negative)としては正常ヒト抹消血リンパ球を用いた。このペプタイドは現在アミノ酸分析中である。アミノ酸分析の結果に従い、これに対応するoli gonucleotideを合成し、すでに作製済みのcDNA libraryからこのペプタイドのcDNAをクロ-ニングする予定である。
泣きと涙の定量化と心身の健康に関する基礎的研究

本研究は、泣くことや涙に対する一般的な認識を捉えた上で、泣きと涙の定量化を試み、涙を流すことによる心身状態の変動を明らかにするものである。研究の結果、感動映画に対する泣きの程度に、内容の知識や以前に視聴した経験は大きく影響しなかった。また、他者の涙を見た際、笑顔や他の表情とは異なる感情反応が示された。綿糸、濾紙、綿球を使うことによって涙液量測定の可能性が得られた。さらに、泣くことに伴う唾液中コルチゾール値や心拍、瞬目といった生理的反応の変化が明らかになった。本研究の目的は、泣きと涙液の分泌の定量的分析および身体的・心理的健康に与える影響について、生理指標、生化学的指標、行動指標、主観的指標を用いて実験的・多面的に検討することである。泣くことや涙に対する一般的な認識を捉えた上で、泣きと涙の定量化を試み、涙を流すことによる心身状態の変動を明らかにしようとするものである。初年度は、予備的研究として、泣きと涙に対する一般的な認識についての調査を行った。日常的に涙を流す頻度やその原因、涙を誘う書物や映画などを問う調査項目に対する回答結果より、来年度以降の実験的研究で用いる悲しみや感動を喚起させる刺激映像を選定する。涙を流すにいたる刺激映像は人によって様々であること、内容を知っていたり以前に視聴した経験があることは、感情の喚起に大きく影響しないことが明らかとなった。さらに、男性においても涙をよく流す人が多くはないが見出され、被験者のプールの目安を立てることが可能となった。また、泣くことおよび涙を流すことによる心理的・身体的変化を検討するため、悲しみの表情のフィードバック効果を実験的に調べた。さらに、他者の涙を見ることによる感情の変化を捉えることを目的に実験を行ったところ、笑顔や怒りの表情に対する反応とは異なる結果が得られた。なお、涙が出るような感情操作に適切な実験状況を設定する際の参考にするため、他者存在および対人不安特性について、多くの知見がすでに示されている笑い表情の表出における影響に関する実験を実施し,学会発表を行った。研究期間3年中2年めの22年度は、泣きと涙の量的測定を試みた。通常の眼球表面における涙量測定に用いられる綿糸法やシルメル試験紙を利用し、眼裂より流れる涙の測定に対応できるよう改良を実施した。さらに、綿球などで採取した涙液の分離にも取り組み、涙の重量および体積の測定と含有物分析の可能性を見出した。これらにより、最終年度に、涙液自体の量的指標、涙液以外の生理的および生化学的指標、自身の泣きに対する主観的評定の関係性を実験的に調べる見当をつけることができた。また、泣くことおよび涙を流すことの心理的・身体的影響を検討する研究の一環として、他者の涙を見ることによる感情の変化を捉えることを目的に実験を行ったところ、笑顔や怒りの表情に対する反応とは異なる結果が得られた。さらに、涙が出るような感情操作に適切な実験状況と課題を設定する際の参考にするため、評価的他者による観察下における心的負荷に関する実験を実施し、泣きに伴って変動する瞬目や心拍を測定した。これらは、いずれも学会発表によって報告を行った。研究期間3年における最終年度の23年度は、昨年に実施可能性の見当をつけた涙の測定方法を用いて、実験的に泣きと涙の量的な検討を行った。約2時間にわたる涙を誘う映画視聴中の涙液を、長時間記録するために改良した綿糸およびシルメル試験紙、綿球の3種類の方法で採取し、同時に唾液中アミラーゼ活性値と瞬目を記録した。その結果、測定方法による被験者に対する負担の違いがあるものの、涙の量と感情および気分の関係が明らかになった。また、感動映像視聴前後の唾液中コルチゾールの変化を、泣いた人と泣かなかった人に分けて比較したところ、泣いた人に見られたコルチゾール値の大きな変動が、気分の爽快感と関係していることが示された。これについては、論文にまとめて学術雑誌に投稿した。

さらに、泣くことおよび涙を流すことによるストレスの軽減について検討する研究の一環として、音楽によるリラクセーションと生理反応の変化について、喚起される感情に対する教示の影響を捉えることを目的に実験を実施し、学会発表によって報告を行った。
半導性セラミックス一粒界と気体との相互作用と特異機能発現機構の解明

セラミックス粒界と気体との相互作用を調べるためにモデル粒界を作成して界面電気特性の測定と焼結体中から単一粒界だけを取り出しマイクロマニュピレーターを用いて微小な界面の電気特性を測定した.モデル界面を作成するために必要な単結晶をキセノンランプをを熱源とするFZ法により育成した.得られた単結晶はLaを0.2mol%添加した半導性SrTiO_3,Ba_<0.05>Sr_<0.95>TiO_3およびBa_<0.1>Sr_<0.9>TiO_3である.成長方位はそれぞれ(001),(210),(111)である.これらの単結晶を所定の組み合わせで1540,1670°C圧力0.1,1.5,2.6Mpaの条件で加熱接合して試料を作製した.これらの接合試料は作成直後の状態で既に電圧-電流特性に非直線性が認められた.さらにこの試料を還元雰囲気中1185°Cに加熱すると非直線性が消滅し,この非直線性は酸化-還元雰囲気により可逆的に変化することが明らかになった.接合部分の微構造観察から接合界面には1540°C以上の昇温時に一度液相となり,冷却時に再結晶して形成したと考えられる界面層が認められた.この層が単結晶の接合と電気特性に深く関与しているものと考えられる.また単一粒界試料の微小領域電気特性測定においては,試料作成方法が重要であることがわかった.薄片試料作成のための研磨により粒界の電気特性が劣化し,この劣化は数100°Cのアニール処理により回復することが明らかになった.試作したステージを用いて単一粒界試料や強誘電体薄膜試料の粒と粒界の抵抗率,誘電率,緩和特性を複素インピーダンス法,ICTS法,TSC法で測定した.酸化亜鉛,チタン酸ストロンチウムバリスターの単一粒界試料は試料の酸化還元処理により粒界近傍の電気伝導度が可逆的に変化することが明らかとなった.セラミックス粒界と気体との相互作用を調べるためにモデル粒界を作成して界面電気特性の測定と焼結体中から単一粒界だけを取り出しマイクロマニュピレーターを用いて微小な界面の電気特性を測定した.モデル界面を作成するために必要な単結晶をキセノンランプをを熱源とするFZ法により育成した.得られた単結晶はLaを0.2mol%添加した半導性SrTiO_3,Ba_<0.05>Sr_<0.95>TiO_3およびBa_<0.1>Sr_<0.9>TiO_3である.成長方位はそれぞれ(001),(210),(111)である.これらの単結晶を所定の組み合わせで1540,1670°C圧力0.1,1.5,2.6Mpaの条件で加熱接合して試料を作製した.これらの接合試料は作成直後の状態で既に電圧-電流特性に非直線性が認められた.さらにこの試料を還元雰囲気中1185°Cに加熱すると非直線性が消滅し,この非直線性は酸化-還元雰囲気により可逆的に変化することが明らかになった.接合部分の微構造観察から接合界面には1540°C以上の昇温時に一度液相となり,冷却時に再結晶して形成したと考えられる界面層が認められた.この層が単結晶の接合と電気特性に深く関与しているものと考えられる.また単一粒界試料の微小領域電気特性測定においては,試料作成方法が重要であることがわかった.薄片試料作成のための研磨により粒界の電気特性が劣化し,この劣化は数100°Cのアニール処理により回復することが明らかになった.試作したステージを用いて単一粒界試料や強誘電体薄膜試料の粒と粒界の抵抗率,誘電率,緩和特性を複素インピーダンス法,ICTS法,TSC法で測定した.酸化亜鉛,チタン酸ストロンチウムバリスターの単一粒界試料は試料の酸化還元処理により粒界近傍の電気伝導度が可逆的に変化することが明らかとなった.セラミックス粒界と気体との相互作用を調べるためにモデル粒界を作成して界面電気特性の測定と焼結体中から単一粒界だけを取り出しマイクロマニュピレーターを用いて微小な界面の電気特性を測定した.モデル界面を作成するために必要な単結晶をキセノンランプを熱源とするFZ法により育成した.得られた単結晶はLaを0.2mol%添加した半導性SrTiO_3,Ba_<0.05>Sr_<0.95>TiO_3およびBa_<0.1>Sr_<0.9>TiO_3である.成長方位はそれぞれ(001),(210),(111)である.これらの単結晶を所定の組み合わせで1540,1670°C圧力0.1,1.5,2.6Mpaの条件で加熱接合して試料を作製した.これらの接合試料は作成直後の状態で既に電圧-電流特性に非直線性が認められた.さらにこの試料を還元雰囲気中1185°Cに加熱すると非直線性が消滅し,この非直線性は酸化-還元雰囲気により可逆的に変化することが明らかになった.接合部分の微構造観察から接合界面には1540°C以上の昇温時に一度液相となり,冷却時に再結晶して形成したと考えられる界面層が認められた.この層が単結晶の接合と電気特性に深く関与しているものと考えられる.また単一粒界試料の微小領域電気特性測定においては,試料作成方法が重要であることがわかった.

薄片試料作成のための研磨により粒界の電気特性が劣化し,この劣化は数100°Cのアニール処理により回復することが明らかになった.次年度はこれらの粒界部分の電気特性の可逆的な変化と雰囲気ガスおよび粒界層の微構造変化について検討し,粒界部分の特異機能発現機構について検討する予定である.本研究の目的は,様々な電子材料の結晶界面領域(結晶表面や粒界等)での特異な物性を理解することにある.これらの領域においては固体と固体との相互作用だけではなく,固体と雰囲気気体との相互作用も重要なはたらきをしている.特に焼結体の表面や粒界が化学的に腐蝕されやすいこと等から類察しても,粒界と気体との選択的な相互作用は無視出来ないものと考えられる.そこで結晶界面の電気抵抗,誘電率,粒界障壁の高さなどの電気的性質を種々雰囲気あるいは機械的応力下で測定分析することにより,メゾスコピック領域での物性と測定時の雰囲気や温度あるいは機械的応力との関係を明らかにする事である.研究概要1.初年度に作製した微小領域測定装置にX,Y,Z軸を独立に精度よく制御できるステ-を取り付ける改造を行った.このステージに温度コントローラーと加熱装置,さらに簡単な応力を加えながら電気的な接触をとることのできるマニュピレータを自作して目的のステージを試作した.2.微小領域物性の測定試作したステージを用いて単一粒界試料や強誘電体薄膜試料の粒と粒界の抵抗率,誘電率,緩和特性を複素インピーダンス法,ICTS法,TSC法で測定した.酸化亜鉛,チタン酸ストロンチウムバリスターの単一粒界試料は試料の酸化還元処理により粒界近傍の電気伝導度が可逆的に変化することが明らかとなった.また誘電体薄膜は測定時の応力によって誘電特性が影響されることがわかった.
非筋ミオシン活性の可視化と光操作による細胞分裂制御機構の解明

動物細胞における細胞質分裂の過程は、非筋ミオシンII(NMII)およびアクチンフィラメントが協働的に生み出す収縮力や張力といった、力学的制御に基づく形態変化を伴う。しかし、分裂過程の細胞が生み出す力の制御機構の頑強性に関する知見は少なく、細胞質分裂の本質的な理解には至っていない。本研究では、FRETにより分裂過程におけるシグナル伝達因子であるECT2, RhoAや、NMIIの活性を可視化することを試みる。さらに、光遺伝学的に細胞内局所的なNMIIの活性化/不活性化を人為的に誘導する系を構築する。これらにより、普遍的な現象である細胞質分裂の、力学的な制御機構の理解が期待される。
網羅的遺伝子解析から抽出した遺伝子産物を指標とする乳癌細分類の試み

FAM64Aは転写抑制因子TSHZ2による抑制がはずれて、ある種の乳癌で過剰発現しているタンパク質のひとつである。本研究の目的はFAM64A蛋白の細胞内での役割を解析し、FAM64A陽性乳癌の臨床的特徴を解析することにより、乳癌の細分類に利用可能なマーカー、新規分子標的を提示する事である。現在までに愛知医科大学病院で手術された浸潤性乳管癌検体197例に対して免疫染色を行い、FAM64A陽性例の臨床データ、特に年齢、サブタイプ、組織学的グレード、Ki-67 index、リンパ節転移、腫瘍径、ステージ等の臨床病理学的特徴との相関を解析した。その結果FAM64A陽性例は特にTNBCで多く、陰性例に比べると組織学的グレートとKi-67 indexが高い傾向にあった。加えて、ヒト乳癌細胞株を用いた分子生物学的実験を行った。その結果FAM64AにはExon5のalternative splicingによる転写産物アイソフォームが存在すること、TNBC細胞株ではそのうちのisoform1のみを発現していること、またFAM64A発現TNBC株は野生型BRCA1/2を持っていることが示された。さらにFAM64A発現TNBC細胞株は、FAM64A特異的siRNA処理により細胞周期G2/M期で停止しその後細胞死を起こすこと、さらにその際DNA二本鎖切断のマーカーgH2AXが著増することが示された。またLC/MSを用いた解析よりFAM64Aは、複製機構安定化や抗がん剤耐性にかかわる核蛋白SMARCA5・BAZ1B複合体と結合することを見出した。臨床医として日々の臨床診療を行いながら、研究室で基礎研究を行うことは、現実的に実験の為に時間を取ることやスケジュール管理が難しく、予定通りに研究が進まない状況が続いていた。研究室にて行う基礎実験は、初めての事ばかりでもあり、ひとつひとつ時間がかかってしまい、また失敗して結果が出ない事が多くあった。また、妊娠契機に体調不良の時期があった事や産休取得などの私情も重なり、研究を進める事が困難となった。当院乳癌手術検体に対する免疫染色の数をさらに増やし、統計学的な検討を行いFAM64A陽性症例の臨床的特徴を明らかにする。乳癌細胞株においてTSHZ2発現低下により発現亢進する遺伝子として同定された1114個の遺伝子のうち、複数のpublic databaseと比較し、乳癌の特にTNBCの発生・進展に関与する可能性のある遺伝子として、FAM64Aの他に4つの遺伝子を絞り込んだ(FAM83D,FOXM1,DLGAP,DONSON)。今後、これらに対する市販抗体をもちいて、当院の手術検体で免疫染色を行う。さらにFAM64Aと同様の分子生物学的実験を通してこれらの遺伝子の細胞機能を探ることにより、今後これらの遺伝子産物各々を指標とした乳癌サブグループ化を試みる。

今後、これらに対する市販抗体をもちいて、当院の手術検体で免疫染色を行う。さらにFAM64Aと同様の分子生物学的実験を通してこれらの遺伝子の細胞機能を探ることにより、今後これらの遺伝子産物各々を指標とした乳癌サブグループ化を試みる。蛋白に対する抗体など基礎実験に必要な用具や薬剤など。乳癌の分子生物学的知識や実験に関する知識を得るための書籍。データ収集、解析などのために必要なパソコンソフトウェアなど。
植物培養細胞におけるアルカロイドの分泌機能の解析と医薬品生産への応用

アキカラマツ(Thalictrum minus,キンポウゲ科)の培養細胞は生成したベルベリンの大半を培地へ分泌する.本研究ではこの特異な細胞培養系を用いて以下の研究成果を得た.1)ベルベリンの生成・分泌促進条件:100μMNAAと10μM BAを添加し,かつリン酸量を制限したLS液体培地がベルベリンの生成・分泌に好適であった.2)分泌機能と細胞構造:電顕解析の結果,ベルベリン生成時に特異な微小顆粒の形成を認めた.分泌に関するこの顆粒の役割の解明は今後の問題である.3)分泌機構:各種ATPase阻害剤の添加実験から,ベルベリンはATPaseをエネルギー源とする機能輸送で分泌されることが判明した.4)培養株の育成:細胞選抜によりベルベリン高生産株(約830mg/l)を得た.一方, 17固体の野性植物から個別に培養株を育成した結果,ベルベリン生成に関して培養株と親固体の間には相関関係はなかったが,培養株の生成量と分泌量との間には有意な相関があった.5)異種植物培養細胞の生合成能:Thalictrum属由来の培養株の生成能を比較した結果, T.flavumとT.dipterocarpumの培養株がそれぞれ500mg/l, 830mg/lのベルベリンを生成したが,分泌能は認められなかった.6)二段培養によるベルベリンの効率的生産法:1)で確立した生産に好適な培養条件(生産培地)は増殖には不敵であったので, 1μM2.4-Dを含むLS培地を増殖培地とする二段培養を採用する事によって安定した生産システムを確立できた.7)固定化細胞による連続生産法:アルギン酸で固定した結果,遊離細胞に匹敵する生成・分泌能を発揮した.そこで,新たに考案した気液交互供給が可能な二槽式のバイオリアクターを用いて固定化細胞を培養したところ,好適培養条件(室気供給30秒,培地供給2分の周期)では, 60日の長期に渡って,遊離細胞より高いベルベリン生産・分泌能(50mg/l/日)を保持できた.アキカラマツ(Thalictrum minus,キンポウゲ科)の培養細胞は生成したベルベリンの大半を培地へ分泌する.本研究ではこの特異な細胞培養系を用いて以下の研究成果を得た.1)ベルベリンの生成・分泌促進条件:100μMNAAと10μM BAを添加し,かつリン酸量を制限したLS液体培地がベルベリンの生成・分泌に好適であった.2)分泌機能と細胞構造:電顕解析の結果,ベルベリン生成時に特異な微小顆粒の形成を認めた.分泌に関するこの顆粒の役割の解明は今後の問題である.3)分泌機構:各種ATPase阻害剤の添加実験から,ベルベリンはATPaseをエネルギー源とする機能輸送で分泌されることが判明した.4)培養株の育成:細胞選抜によりベルベリン高生産株(約830mg/l)を得た.一方, 17固体の野性植物から個別に培養株を育成した結果,ベルベリン生成に関して培養株と親固体の間には相関関係はなかったが,培養株の生成量と分泌量との間には有意な相関があった.5)異種植物培養細胞の生合成能:Thalictrum属由来の培養株の生成能を比較した結果, T.flavumとT.dipterocarpumの培養株がそれぞれ500mg/l, 830mg/lのベルベリンを生成したが,分泌能は認められなかった.6)二段培養によるベルベリンの効率的生産法:1)で確立した生産に好適な培養条件(生産培地)は増殖には不敵であったので, 1μM2.4-Dを含むLS培地を増殖培地とする二段培養を採用する事によって安定した生産システムを確立できた.7)固定化細胞による連続生産法:アルギン酸で固定した結果,遊離細胞に匹敵する生成・分泌能を発揮した.そこで,新たに考案した気液交互供給が可能な二槽式のバイオリアクターを用いて固定化細胞を培養したところ,好適培養条件(室気供給30秒,培地供給2分の周期)では, 60日の長期に渡って,遊離細胞より高いベルベリン生産・分泌能(50mg/l/日)を保持できた.アキカラマツ(Thalictrum minus)の液内培養細胞は、生成したベルベリンの大半を培地へ分泌するが、この特異な細胞培養系を用いて以下の研究成果を得た。1)ベルベリンの分泌促進条件:培地組成の検討により、二種類の植物ホルモンの組合せ(100μM NAと10μM BA)並びにリン酸量の制限がベルベリンの生産、分泌を促進することを見出した。2)培養株の育成:細胞選抜によりベルベリン高生産株(25-30mg/30ml)を得た。一方、野生の母植物17個体から個別に培養株を育成したところ、ベルベリン生成に関して培養株と親個体の間に相関関係はなかったが、培養株のベルベリン生成量と分泌量との間に有意な相関が認められた。しかし、上述の選抜株を凌駕する株は未だ得られていない。3)異種植物培養細胞の生合成能:アキカラマツ以外のThalietrum属17種由来の培養株のアルカロイド生成能を比較した結果、I.dipterocarpumとI・flavumの培養細胞がそれぞれ25mg,15mg/30mlのアルカロイドを生成した。

しかし、アルカロイド分泌能は認められなかった。4)分泌機能と細胞構造との関連性:ベルベリン生成に伴う培養細胞の構造変化を電顕解析した結果、分泌活動期に特異な微小顆粒の形成を認めた。しかし、ベルベリン分泌機能のないオウレン培養細胞にも同様の顆粒が存在するので、本顆粒の役割の解明は今後の課題である。5)二段培養によるベルベリンの効率的生産方法の開発:100μM NAAと10μM BAを添加し、かつリン酸を制限したLS培地はベルベリン生産培地として好適であったが、細胞増殖には不適であるので、2、4-Dを含む培地を増殖培地とする二段培養法を採用した結果、安定した生産(約25mg/30ml)を確保できた。
骨格筋分化における新規ヒストンH3バリアントH3mm7の遺伝子選択機構の解明

骨格筋分化では、ヒストンH3.3が分化前から分化特異的遺伝子を“マーキング"することで分化後の選択的な遺伝子発現をもたらす。H3mm7は、骨格筋で発現が高かいことが明らかとなっているがその機能は不明である。そこで、本研究では、H3mm7の機能解析を行った。培養細胞を用いた解析から、H3mm7が遺伝子に取り込まれると転写規定レベルが変化することが明らかとなった。また、H3mm7を含むヌクレオソームの構造は、H3.3ヌクレオソームに比べ不安定であった。これらのことから、H3mm7はゲノム中に取り込まれることでヌクレオソームを不安定化し、遺伝子発現を促進していることが示唆された。骨格筋分化では、ヒストンH3バリアントの一つであるヒストンH3.3が、分化前から分化特異的遺伝子を“マーキング"することで分化後の選択的な遺伝子発現をもたらす。ゆえに、ヒストンの選択的な取り込み機構は、骨格筋分化において最も初期の遺伝子選択機構であると考えられる。質量分析の結果、H3mm7は骨格筋組織で高く発現していたことから、骨格筋におけるH3mm7の機能解析を行った。骨格筋分化過程におけるH3mm7のRNA発現レベルを評価したところ、骨格筋幹細胞ですでに発現していたことから、分化初期から機能していることが示唆された。そこで、CRISPR-Cas9システムを用いて骨格筋芽細胞C2C12細胞でH3mm7遺伝子座をノックアウト(KO)した細胞株を作成した。mRNA-seqにより骨格筋分化能を評価したところ、H3mm7 KO細胞は野生型に比べ骨格筋分化が遅延していた。一方で、GFPを融合させたH3mm7を強制発現させたH3mm7KO株は、骨格筋分化能が回復した。H3mm7を含むヌクレオソームの結晶構造解析により、H3mm7の特性を調べたところ、H3.3のアミノ酸配列と異なる2つのH3mm7固有のアミノ酸のうちA57が構造不安定性をもたらすことが示唆された。生化学的アプローチによる機能解析により検証した結果、H3mm7を含むヌクレオソームはH3.3ヌクレオソームに比べて不安定であることが示された。次に、H3mm7遺伝子を持たないNIH3T3線維芽細胞にMyoDを強制発現させ骨格筋形質転換を誘導する系を用いて、H3mm7及びS57A変異を持つH3.3を発現させたNIH3T3は、野生型に比べ骨格筋分化が促進されていた。これらのことから、H3mm7は、分化過程で骨格筋遺伝子に優先的に取り込まれることでヌクレオソームを不安定化し、遺伝子発現を促進していることが示唆された。本年度の目的のひとつである、H3mm7の責任残基の同定を生化学と細胞生物学の両面からできたことは、大きな進歩であるといえる。具体的には、H3mm7の遺伝子座が欠損していると考えられるマウス線維芽細胞NIH3T3を用いて、H3.3の32番目のThrをIle、57番目のSerをAlaに置換することでH3mm7様の変異を1つ加えたGFP融合DNAを過剰発現させ株は、MyoDの強制発現による形質転換後の分化誘導により、分化マーカーがH3mm7とH3.3 S57A強制発現株のみが、分化誘導後早期に発現することが明らかとなった。また、共同研究によるリコンビナントヒストンを利用した再構成ヌクレオソームにおける熱安定性実験や結晶構造解析も、A57が責任残基であることが確認された。骨格筋で発現が確認されているH3mm7をノックアウトした骨格筋芽細胞C2C12細胞(H3mm7KO細胞)は骨格筋分化が遅延していたことを前年度明らかとした。本年度は、さらに詳細なmRNA-seq解析から、H3mm7は骨格筋遺伝子に限らず遺伝子の転写レベルの基底状態を上昇させていることが示唆された。H3mm7が形成するクロマチン構造や特異的化学修飾を含む構造が遺伝子の転写制御への関与を評価するために、次世代シークエンサーのデータを数理科学手法によるルール抽出解析法の開発を試みている。本年度は、ヒストンH4のK20のアセチル化が哺乳細胞で存在し遺伝子発現の抑制に関わることを見出した(Kaimori et al, Sci. Rep., 2016)。次に、H3mm7の骨格筋形成における発現時期を特定するために成体骨格筋から骨格筋幹細胞、成熟骨格筋を単離しRNAの発現レベルを評価したところ骨格筋幹細胞で最も発現が高いことが明らかとなった。この際、複数のヒストンH3バリアントの発現パターンも確認され、骨格筋におけるヒストンバリアントの発現の多様性が明らかとなり、論文化を進めている。また、今後の組織レベルでの解析に向けて、微量組織サンプルからのRNA-seq解析を立ち上げた(Yokota et al, Am J Pathol., 2016)。同時に切片上でのエピゲノム解析を行うための準備として、単一細胞レベルでのエピゲノムプロファイリング技術の開発を進めている(特願2016-167967)。

H3mm7は、骨格筋で発現が高かいことが明らかとなっているがその機能は不明である。そこで、本研究では、H3mm7の機能解析を行った。培養細胞を用いた解析から、H3mm7が遺伝子に取り込まれると転写規定レベルが変化することが明らかとなった。また、H3mm7を含むヌクレオソームの構造は、H3.3ヌクレオソームに比べ不安定であった。これらのことから、H3mm7はゲノム中に取り込まれることでヌクレオソームを不安定化し、遺伝子発現を促進していることが示唆された。今後は、生化学解析で示唆されたH3mm7から構成されるヌクレオソームの不安定性を、細胞レベルで実証する。具体的には、野生型とH3mm7ノックアウト細胞の比較により、H3mm7の取り込みの有無がゲノムのアクセシビリティーやRNAポリメラーゼIIのリクルートに影響を及ぼすか検証する。また、ヌクレオソームを構成する他のヒストンの取り込みに影響しているのかについても、評価を行う予定である。また、マウス骨格筋細胞を用いてH3mm7結合因子の精製、同定を行う。H3mm7-GFP発現細胞においてH3mm7結合タンパク質の同定を試みる。また、質量分析でH3mm7特異的に同定された分子は、順次、高親和性モノクローナル抗体の作製を行い、ChIP-seqによりゲノム上での局在性を解析する予定である。エピジェネティクス
有機導体および磁性体における電子-分子振動結合

平成4年度においては、正反射および垂直入射透過スペクトルを色収差なしで測定できる反射対物鏡型偏光赤外顕微鏡を購入し、既存のフーリエ変換赤外分光光度計に接続した。平成5年度においては、液体ヘリウム流通型の湿度可変光学測定用クライオスタットを、本補助金を用いて購入し、偏光赤外顕微鏡に接続した。以上の改良により、微小単結晶試料について、偏光赤外反射もしくは透過スペクトルを、700cm^<-1>から7800cm^<-1>の波数範囲において、20Kから300Kの湿度領域で測定できるようにした。分子間強磁性相互作用を示す、ニトロニルニトロキシドの3-キノリル、p-ピリジル、p-ニトロフェニル各誘導体単結晶を育成し、この装置を用いて偏光赤外反射スペクトルを測定した。この測定結果に基づき、電子-分子振動結合の振動スペクトルに対する影響を観測するには、より分子間相互作用の強い有機磁性体が必要であることを示唆した。分子間磁気相互作用のより強い有機磁性体の探索のため、種々のニトロニルニトロキシド誘導体を合成し磁気的性質を調べた。また、分子間磁気相互作用に対する水素結合の影響を調べる目的で、水酸基およびカルボキシル基を含むニトロニルニトロキシド誘導体を新たに合成し、磁気測定を行なった。有機導体については、導電性BEDT-TTF陽イオンラジカル塩の単結晶について、偏光赤外反射スペクトルの測定を行なった。導電性と磁性を兼ね備えた有機化合物を得て、その化合物における電子-分子振動結合を研究する目的で、BEDT-TTFと水酸基およびカルボキシル基を含むニトロニルニトロキシド誘導体のラジカル塩の合成を試みた。平成4年度において,正反射および垂直入射透過スペクトルを色収差なしで測定できる偏光赤外顕微鏡を,本補助金を用いて購入した。この偏光赤外顕微鏡を,既存のフーリエ変換赤外分光光度計に接続し,微小単結晶試料について,偏光赤外反射もしくは透過スペクトルを,700cm^<-1>7800cm^<-1>の波数範囲において,室温で測定できるようにした。組み上げた顕微光学系の性能を検査するために,今回購入した赤外顕微鏡を用いて測定したBEDT-TTF系有機超伝導体の偏光赤外スペクトルを,パーキン・エルマー社製フーリエ変換赤外分光光度計にスペクトラテック社製偏光赤外顕微鏡を組み合わせた別の顕微光学系を用いて以前測定したスペクトルと比較した。両スペクトルは実質的に一致しており大きな問題はなかったが,今回組み立てた光学系は,干渉計の問題によって生じる,本来存在しない幅広いピークが5000cm^<-1>付近に観測されることがあった。この問題は光学系を改善することによって解消したが,問題解決に少し時間を要した。未だ数が極めて限られている有機磁性体における,顕微偏光赤外分光法を用いた,電子ー分子振動結合の研究には,新しい有機磁性体の探索が不可欠である。本研究代表者は,新しい有機磁性体として3-キノリルニトロニルニトロキシドを磁性測定により見いだし,単結晶を育成して結晶構造解析を行なった。また他の研究者によって同時期に報告された新しい有機磁性体のうち,いくつかのニトロニルニトロキシド誘導体の単結晶も育成した。これらの有機磁性体単結晶について,室温における偏光赤外反射スペクトルの測定を開始した。電子ー分子振動結合の解析には,ラマン散乱スペクトルの測定が必要なので,その測定を計画している。有機導体および有機超伝導体についても,室温における単結晶偏光反射スペクトルの測定を行った。平成5年度においては、液体ヘリウム流通型の温度可変光学測定用クライオスタットを、本補助金を用いて購入した。

このクライオスタットを、平成4年度本補助金を用いて購入した偏光赤外顕微鏡に接続し、微小単結晶試料について、偏光赤外反射もしくは透過スペクトルを、700cm^<-1>から7800cm^<-1>の波数範囲において、20Kから300Kの温度領域で測定できるようにした。反射および透過スペクトル測定用光学系を容易に転換出来るようにするため、カセグレン型反射対物レンズを試料の上下に設置したので、クライオスタットの顕微鏡挿入部の寸法が制限され、この部分の設計製作に時間を要した。有機磁性体における電子-分子振動結合の研究には単結晶試料が不可欠である。本研究代表者は、分子間強磁性相互作用を示す。ニトロニルニトロキシドの3-キノリル、p-ピリジル、p-ニトロフェニル各誘導体単結晶を育成し、偏光赤外反射スペクトルを測定した。また、分子間磁気相互作用に対する水素結合の影響を調べる目的で、水酸基およびカルボキシル基を含むニトロニルニトロキシド誘導体を新たに合成し、磁気測定を行なった。今後、一部の化合物について結晶構造解析を行なった後に、単結晶を用いて光学測定を行なう予定である。有機導体については、京大理の斉藤軍治教授との共同研究により、導電性BEDT-TTF陽イオンラジカル塩の単結晶について、偏光赤外反射スペクトルの測定を行なった。導電性と磁性を兼ね備えた有機化合物を得て、その化合物における電子-分子振動結合を研究する目的で、BEDT-TTFと水酸基およびカルボキシド基を含むニトロニルニトロキシド誘導体のラジカル塩の合成を試みた。
糸状菌由来ジオキシゲナーゼの機能拡張による化合物の創出

糸状菌Aspergillus japonicus MF275が生産するhimeic acidの生合成研究において、推定生合成中間体であるテトラミン酸を4-ピロンに環拡張する反応を触媒すると予想されるジオキシゲナーゼHimGを見出している。本酵素がさまざまなテトラミン酸を環拡張できるように改変(改変HimG)することで、テトラミン酸を作る酵素遺伝子と改変HimGを組み合わせた4-ピロン類縁体の生物合成システムの構築を目指した。初めに、二次代謝産物生合成遺伝子解析ツールである2ndFindより予測されたHimG配列から人工遺伝子を作成し、大腸菌中でHisタグ融合HimGを発現させた。その結果、25°Cで誘導発現することで、可溶性のタンパク質としてHimGを得ることができた。また、大腸菌で発現させた融合HimGに活性がない場合に備えて、出芽酵母でHimGを発現可能なプラスミドを構築した。本実験は概ね計画通りに進行した。次に、HimGの基質となるテトラミン酸中間体の供給法を検討した。4-ピロン類縁体を生産させる宿主の検討を兼ねて、麹菌もしくは酵母にテトラミン酸中間体の生成に関与するhimAとhimHを導入し、中間体を生成するかを調べた。本実験は、長いDNA断片のクローニングを伴うことから、酵母の相同組換え能を利用した遺伝子断片の連結法により発現プラスミドを構築した。その後、構築したプラスミドを用いて、himAとhimHをもつ麹菌もしくは酵母形質転換体を作成した。麹菌形質転換体の培養抽出物をHPLC分析した結果、目的とするテトラミン酸中間体の検出には至らなかった。現在、酵母形質転換体の培養抽出物については解析中である。今年度はHimGの活性検出には至っていないが、テトラミン酸中間体を生成できる宿主は、今後の4-ピロン類縁体の生産に利用できると思われる。大腸菌を用いたHimG誘導タンパクの調製は、概ね計画通りに進行した。一方、HimGの活性検出に必要な基質供給は、現在のところ達成できていない。その理由として、基質となるテトラミン酸中間体はhimeic acid生産菌の培養物中には蓄積せず、非生産菌などに関連する遺伝子を導入し、生産する必要がある。遺伝子導入に必要なプラスミドは、遺伝子長が12kb(himA)と長い場合や、イントロンが複数ある(himA、himH)ことから、酵母を利用したプラスミド構築(GRC)法で行った。しかし、エクソン部分の連結が予定通し進まず、イントロンを一度で取り除くことができなかった。そのため、プラスミド構築に時間を要したが、現在、酵母形質転換体の作成が完了した。今後、作成した酵母形質転換体の培養抽出物を分析し、目的のテトラミン酸中間体の生成を確認する。プラスミド構築が遅れることを想定して、麹菌形質転換体による基質供給を試みたが、目的化合物は検出できなかった。このことは、麹菌中では、発現タンパク質もしくはテトラミン酸中間体が不安定で活性の検出に至らなかったことが考えられる。まずは、作成したhimAとhimHを持つ酵母形質転換体が目的とするテトラミン酸中間体を生成できるかを調べる。テトラミン酸中間体の供給法を確立後、大腸菌もしくは酵母形質転換体より得たHimGが環拡張反応を触媒するかを調べる。活性がでない場合、HimAとhimHに加えて、himGを持つ形質転換体を作成し、代謝物を調べることでHimGが環拡張反応に関与することを実験的に明らかにする。その後、活性が確認されたHimGの結晶化条件の検討を始める。結晶化が進まない場合は、本学に導入されているタンパク質立体構造シミュレーションソフトMOEを活用することで、活性中心付近の空間に影響を与えるアミノ酸残基について特定する。

今年度はHimGの活性検出には至っていないが、テトラミン酸中間体を生成できる宿主は、今後の4-ピロン類縁体の生産に利用できると思われる。大腸菌を用いたHimG誘導タンパクの調製は、概ね計画通りに進行した。一方、HimGの活性検出に必要な基質供給は、現在のところ達成できていない。その理由として、基質となるテトラミン酸中間体はhimeic acid生産菌の培養物中には蓄積せず、非生産菌などに関連する遺伝子を導入し、生産する必要がある。遺伝子導入に必要なプラスミドは、遺伝子長が12kb(himA)と長い場合や、イントロンが複数ある(himA、himH)ことから、酵母を利用したプラスミド構築(GRC)法で行った。しかし、エクソン部分の連結が予定通し進まず、イントロンを一度で取り除くことができなかった。そのため、プラスミド構築に時間を要したが、現在、酵母形質転換体の作成が完了した。今後、作成した酵母形質転換体の培養抽出物を分析し、目的のテトラミン酸中間体の生成を確認する。プラスミド構築が遅れることを想定して、麹菌形質転換体による基質供給を試みたが、目的化合物は検出できなかった。このことは、麹菌中では、発現タンパク質もしくはテトラミン酸中間体が不安定で活性の検出に至らなかったことが考えられる。まずは、作成したhimAとhimHを持つ酵母形質転換体が目的とするテトラミン酸中間体を生成できるかを調べる。テトラミン酸中間体の供給法を確立後、大腸菌もしくは酵母形質転換体より得たHimGが環拡張反応を触媒するかを調べる。活性がでない場合、HimAとhimHに加えて、himGを持つ形質転換体を作成し、代謝物を調べることでHimGが環拡張反応に関与することを実験的に明らかにする。その後、活性が確認されたHimGの結晶化条件の検討を始める。結晶化が進まない場合は、本学に導入されているタンパク質立体構造シミュレーションソフトMOEを活用することで、活性中心付近の空間に影響を与えるアミノ酸残基について特定する。実験の進捗が遅れているため、計画通りに進んだ場合に購入予定であったタンパク質結晶化キットの購入を見合わせた。今年度は、予定している類縁化合物pestalamideの生合成に関与するpst1、pst9、pst8遺伝子のクローニング試薬、遺伝子点変異に必要なPCR試薬を購入するとともに、活性のあるタンパク質が得られた段階でタンパク結晶化キットを購入する。