hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
代謝遺伝子サイレンシングライブラリ72の構築

大腸菌の解糖系、TCA回路、呼吸鎖は総計60反応ステップからなり、72遺伝子産物が関与している。これらの反応ステップを一括して解析するために、72遺伝子に対するアンチセンスRNAの発現ベクターを全て作成した。さらに、アンチセンスRNAによって各遺伝子をサイレンシングし、どのような表現型が現れるかを解析した。このアンチセンスRNA発現ベクター群に、代謝遺伝子サイレンシングライブラリ72と名づけた。さらに、アンチセンスRNAによって各遺伝子をサイレンシングし、どのような表現型が現れるかも解析した。まず、全72標的遺伝子に対するアンチセンスRNA発現ベクターの構築を行った。次いで、サイレンシング効率の評価を行ったが、具体的には、サイレンシングによって、特異的な表現型が観察されるか、タンパク質、mRNAレベルで最低60%以上の抑制効率が達成できるかどうか調査した。効率の悪かったものについては、アンチセンス配列を変更することによる再構築を1度から数度行い、その結果、71遺伝子で満足できるレベルのサイレンシング効率を達成できた。残りの1個については中央代謝への寄与が少ないことが文献上で明らかになったので、研究から除外した。さらにそれらベクターを用いて各遺伝子を個別にサイレンシングした時に、糖資化性(グルコース、ピルビン酸、コハク酸、酢酸)がどのように変化するかを調査した。その結果、過去文献で発表されている遺伝子破壊株での結果と一致するものもあれば、そうでないものもあった。さらに、サイレンシング前後で、グルコースを唯一の炭素源とした時の中間代謝産物がどう変化するかをを高速液体クロマトグラフィーを用いて解析した。その結果、ピルビン酸、フマル酸などに顕著な蓄積量の変化が見られた。特に、aceE遺伝子をサイレンシングすると多量のピルビン酸が蓄積することがわかった。ピルビン酸は工業上有用な物質であるので、この結果を用いて、ピルビン酸の生産性をさらに上げる研究にも取り組んだ。これらの反応ステップを一括して解析するために、72遺伝子に対するアンチセンスRNAの発現ベクターを全て作成することを目的とする。さらに、アンチセンスRNAによって各遺伝子をサイレンシングし、どのような表現型が現れるかも解析する。本年度は、全72標的遺伝子に対するアンチセンスRNA発現ベクターの構築を行った。次いで、ベクターの評価を行ったが、49個については満足できるサイレンシング効率で機能していることを確認した。残りの23個のベクターのうち22個について、アンチセンス配列を変更することによる再構築を1度から数度行い、すべて満足できるレベルのサイレンシング効率を達成できた。具体的には、サイレンシングによって、特異的な表現型が観察されるか、タンパク質、mRNAレベルで最低60%以上の抑制効率が達成できた。さらに、それらベクターのうち、52個について、グルコース、酢酸、ピルビン酸、コハク酸を唯一の炭素源とした時の表現型を観察した。予想通りの表現型を示したものもあれば、予想しなかった表現型が現れたものもあった。さらに、生育に必須であることが分かっているものが5個あるが、これらについては、IPTGを含む完全培地(LB培地)での生育の可否も調べた。予想よりもベクターの再構築をする頻度が高く、そこにやや時間を要したが、他の研究との時間を調整しながら、実験計画書に記載通りのスケジュールで研究を消化した。まず、グルコース、酢酸、ピルビン酸、コハク酸を唯一の炭素源とした時の表現型について、観察を終える。ついで、予定通り、同形質転換体71個を用いて、サイレンシング前後の有機酸、アルコール、糖などの中間代謝産物を高速液体クロマトグラフィーを用いて調査する。なおこれには、最小培地+グルコースを用い、培養開始から6、12、24時間後の培養上清について調査する。菌の生育が遅い場合は適宜時間を調整する必要がある。予定よりも、合成オリゴヌクレオチドの価格が安くかったこと、及び人件費分を使用しなかったことで、次年度使用額が出た。次年度は、高速液体クロマトグラフィーの消耗品に予定よりも多く予算が必要になりそうであるので、その分に回したい。また、論文掲載費用も、当初予定よりも多くかかる可能性があるので、そちらにも利用したい。
中央ヨーロッパにおける地域構造と生活様式の変化―ポーランド,チェコ,スロヴァキア,ハンガリーの事例―

1989年に始まる「東欧革命」に伴う急激な市場経済化の進行、旧西ヨーロッパ諸国からの大量のヒト、モノ、サービス、情報の流入は、中央ヨーロッパ諸国の地域構造を大きく変化させた。また、生活様式の急激な変化をもたらした。本研究では、中央ヨーロッパ諸国、なかでも市場経済化の進展の著しいポーランド、チェコ、スロヴァキア、ハンガリーの4ヵ国を研究対象地域にして、つぎの4点を明らかにした。1)地域構造の変化、2)生活様式の変化、3)地域構造と生活様式の変化との関連、4)1)3)の解明を通して、これらの国々の直面している地域問題を明らかにし、その解決の方向性をさぐること。本研究で明らかになったことは、おもにつぎのようにまとめることができるだろう。1)東欧革命以降、研究対象地域では、人口、民族、産業、インフラ、交通、環境、生活様式や生活行動など、あらゆる面にわたって大きく変化している。2)サービス業などの第3次産業部門の発展が著しく、第1・2次産業部門の発展が遅れており、いわゆる社会階層の分化が進行している。3)大都市、主要な観光地域、旧西ヨーロッパ諸国の隣接した国境地域で発展が顕著であり、農業地域や工業地域で問題が顕在化している。こうした成果は、平成14年(2002年)9月に金沢大学ならびに岐阜県世界分布図センターで開催されるシンポジウムで発表されることになっている。また、同年9月には、本の出版『中央ヨーロッパの変化と展望(仮題)』を予定している1989年に始まる「東欧革命」に伴う急激な市場経済化の進行、旧西ヨーロッパ諸国からの大量のヒト、モノ、サービス、情報の流入は、中央ヨーロッパ諸国の地域構造を大きく変化させた。また、同年9月には、本の出版『中央ヨーロッパの変化と展望(仮題)』を予定している本年度は、研究対象地域の地域構造と生活様式の概要を把握することが主な目的だった。この目的を達成するために、ドイツ、地誌・空間秩序連邦研究所やオーストリア東・南東ヨーロッパ研究所をはじめ、ポーランドのミツケヴィッチ大学、チェコのカレル大学、スロヴァキアのコメニウス大学などの図書館で資料収集をおこなった。また、ポーランドのワルシャワ、ポーランド南部の農村地域、チェコ南部の農村地域、ドイツとチェコの国境地域など、いくつかの地域でサンプル調査を実施した。これらの調査は、外国人共同研究者の多大な援助や支援を受けたこともあり、大きな成果が得られた。研究対象地域では、産業構造の変化が急激に進むなかで、地域的差異が拡大していること、生活様式も大きく変化していることが明らかになった。次年度においては、これらの諸点を実態調査によってさらに詳細に把握・考察するつもりである。旧東ヨーロッパの地域的特色のひとつは、本研究の対象地域である中央ヨーロッパ諸国を中心とした地域と南東ヨーロッパ地域(バルカン諸国)との格差が拡大していることである。本研究地域の地域的特色を明確にするためには、南東ヨーロッパ地域の概要を知っておくことが不可欠である。こうした観点から、われわれは、約1週間にわたってルーマニア各地を訪れ、地域観察や地域調査を実施した。ルーマニアでの調査研究は、今後の研究に大いにプラスになるものと思う。本年度の調査研究は、3年計画の2年目であった。昨年度の調査研究を踏まえて、本年度は、各研究者がそれぞれの研究目的に基づいて調査を集中的におこなった。おもな調査目的と調査地域は、つぎのとおりである。1)ポーランド北西部、スロヴァキア西部、チェコ北部の農業地域の変化に関する調査、)2)ハンガリー南部の農業の構造的変化に関する調査、3)ポーランドの水文環境に関する調査、4)ハンガリーのドイツ系少数集団のアイデンテイテーに関する調査、5)中央ヨーロッパの都市間結合に関する調査、6)チェコにおける観光地域の変化ならびに観光流動に関する調査。それぞれの調査は、外国人共同研究者の援助を受けて順調に進んだ。大きな成果が得られたと思う。今後、これらの研究をさらに深化させるとともに、これらの調査研究地域が中央ヨーロッパのなかでどのように位置づけられるかを明確にしていくつもりである。旧東ヨーロッパ諸国の特色のひとつは、本研究対象地域と南東ヨーロッパ地域(バルカン諸国)との格差が拡大していることである。本研究地域の地域構造と生活様式の特色を明確にするためには、南東ヨーロッパ地域の状況を把握しておくことが必要である。

その点は、旧東ヨーロッパの特性ならびに今後の展望を考えるうえでも重要である。こうした理由から、本年度は昨年のルーマニアに続いて、ブルガリアを訪れ、各地で地域調査や資料収集をおこなった。ブルガリアでの地域調査や資料収集は、きわめて有意義だった。本年度の調査研究は、3年計画の最終年度であった。本年度は、昨年までの成果を踏まえて、つぎの2点についての調査研究をおこなった。1)中央ヨーロッパおよびバルト三国に関する研究代表者ならびに研究分担者の調査(補足調査を含む)、2)中央ヨーロッパの地域的特色および地域的問題・課題の解明。1)に関しては、研究代表者および研究分担者7人が、平成13年7月から平成14年1月にかけてそれぞれ独自に調査を行なった。なお、バルト三国における調査を実施したのは、中央ヨーロッパの地域特性を浮き彫りにするためである。われわれの調査は、海外共同研究者6人の助力・援助により、順調に進んだ。また、2)に関しては、東欧革命後の人口、民族、海外投資、産業(農業、工業、観光業等)、インフラ、環境、人々の生活様式や生活行動等の大きなかつ多様な変化が、同時に、地域的格差・差異が顕著になっていることが具体的に明らかになった。われわれは、これらの研究成果を700ページを越える研究成果報告書にまとめた。さらに、われわれの成果は、平成14年(2002年)9月26日27日、金沢大学で開催される日本地理学会のシンポジウムならびに9月30日に岐阜県世界分布図センターで開催される研究集会で発表されることになっている。われわれは、それらのシンポジウム、研究集会に6人の海外共同研究者を招聘することを予定している。今回の科研費による調査研究では、中央ヨーロッパの生活様式についての調査は必ずしも十分とはいえなかった。この点については、今後の課題にしたいと思う。
基底膜結合型インテグリンを介するシグナル伝達と活性制御の分子機構

ラミニン結合性インテグリンにに、膜4回貫通蛋白質テトラスパニン(特にCD151)が結合して、複合体を形成している。本研究では、この複合体形成の生理的意義を究明し、以下の成果を得た。(1)ヒト胎盤からラミニン結合性インテグリンα3β1を精製する際、分子量30 kDaの蛋白質が共精製されることを見出し、これがテトラスパニンCD151であることを明らかにした。また、CD151に対する単クローン抗体を作製し、この抗体(8C3)がインテグリンα3β1-CD151複合体を解離させることを見出した。さらに8C3抗体カラムを用いてCD151を除去することにより、インテグリンα3β1のラミニン結合活性が有意に低下すること、またCD151との再結合によりラミニン結合活性が回復することを明らかにした。これらの結果は、CD151との複合体形成がα3β1のラミニン結合活性を制御していることを示している。(2)インテグリンを介する基底膜からのシグナル伝達において、CD151との複合体形成がどのような役割を果たしているかを明らかにするため、CD151の発現をsiRNAを用いて抑制し、その影響を解析した。その結果、CD151発現抑制細胞では、ラミニンへの接着活性が有意に低下し、細胞の形態も扇型から紡錘体型に変化していた。この原因を探るため、シグナル伝達に関わる因子の動態を解析した結果、CD151発現抑制細胞ではc-srcの活性が有意に増加していることが判明した。また、部位特異的リン酸化チロシン抗体を用いた解析により、csk依存的なY529のリン酸化がCD151発現抑制細胞では有意に低下していることがわかった。これらの結果は、CD151との複合体形成がラミニン結合性インテグリンを介するシグナル伝達の制御に密接に関与していることを示している。1)"CD151がインテグリンの活性化状態を制御している"という作業仮説の検証を行った。具体的には、インテグリンα3β1-CD151複合体からCD151を解離させる条件を検討し、我々が以前作製したCD151抗体の一つがCD151をα3β1との複合体から解離させることを見いだした。この知見をもとに、CD151を含まないインテグリンα3β1を調製する方法を確立し、そのリガンド結合活性を測定したところ、有意にリガンド結合活性が低下していることが判明した。また、このCD151を含まないインテグリンα3β1にCD151を再結合させると、リガンド結合活性はもとにレベルに回復した。これらの結果は、我々の作業仮説を強く支持するものである。2)基質に固相化したCD151抗体を用いて細胞表面のCD151を捕捉すると、細胞内蛋白質(特にsrc family kinase)のチロシンリン酸化が強く誘導されることを見いだした。この結果は、CD151が細胞内へのシグナル伝達受容体として機能していることを強く示唆している。3)CD151を介するシグナル伝達にインテグリンとの安定な複合体形成が必要かどうかを検証するため、β1インテグリンを欠失したマウス細胞(GE11細胞)にヒトCD151を強制発現させ、これをCD151抗体を固相化した基質上に播種して、CD151からのシグナル伝達がどのように影響されるかを検討した。その結果、β1インテグリンとの複合体形成なしでも、filopodia形成を指標とする限り、シグナル伝達に大きな影響は見られないことが判明した。

1)"CD151がインテグリンの活性化状態を制御している"という作業仮説の検証を引き続き行った。CD151と複合体を形成したインテグリンα3β1と複合体を形成していない同インテグリンの活性化状態を活性型インテグリンを選択的に認識する抗体(mAbAG89)との反応性により比較検討し、CD151との複合体形成により、インテグリンα3β1の活性化状態が安定化されることを明らかにした。このようなCD151によるインテグリンα3β1の活性化状態の安定化は、細胞から単離したインテグリンだけでなく、細胞表面上のインテグリンでも観察され、生理的な意味を持つ現象であると考えられる。次に、CD151の発現をsiRNAを利用して抑制する実験系を確立し、CD151発現抑制細胞でインテグリンα3β1の活性化状態がどのように変化するかを検討した。予想通り、CD151発現抑制細胞では、mAbAG89との反応性が有意に低下し、インテグリンα3β1の活性化状態が不安定化したことが確かめられた。2)昨年度の研究により、我々が作成した抗CD151抗体8C3は、精製したインテグリン-CD151複合体を解離させることがわかっている。このような8C3抗体によるインテグリン-CDI51複合体の解離が細胞表面でも起こるかどうかを、FRET(fluorescence energy transfer)を利用した測定法を開発して検証した。その結果、我々の8C3抗体は添加後速やかにインテグリン-CDI51複合体を解離させたが、他のCD151抗体(SFA1.2B4、11G5、14A2.H1)では、複合体の解離は観察されなかった。これらの結果は、8C3抗体がインテグリン-CD151複合体を解離させるユニークな抗体であることを示している。ラミニン結合性インテグリンには、膜4回貫通蛋白質テトラスパニン(特にCD151)が結合して、複合体を形成している。インテグリンを介する基底膜からのシグナル伝達において、テトラスパニンがどのような役割を果たしているかを明らかにするため、CD151の発現をsiRNAを用いて抑制し、その影響を解析した。その結果、CD151発現抑制細胞では、ラミニンへの接着活性が有意に低下し、細胞の形態も扇型から紡錘体型に変化していた。また、CD151発現抑制細胞では、著明な突起伸張が観察された。このような基質への接着の変化の原因を探るため、シグナル伝達に関わる因子の動態を解析した結果、CD151発現抑制細胞ではc-srcの活性が有意に増加していることが判明した。また、部位特異的リン酸化チロシン抗体を用いた解析により、csk依存的なY529のリン酸化がCD151発現抑制細胞では有意に低下していることがわかった。また、p130Cas、FAK、paxillinのチロシンリン酸化の有意な亢進がCD151発現抑制細胞では観察された。これらの結果は、ラミニン結合性インテグリンとCD151が複合体を形成することにより、c-srcの活性化が抑制されていることを示唆している。また、CD151発現抑制細胞では、カドヘリンの活性を反映するCDS(calcium-dependent cell adhesion system)活性が低下していた。CD151は基底膜への接着とそれに共役するシグナル伝達を制御する一方、カドヘリンを介する細胞-細胞間接着の制御にも関わる可能性が高く、基底膜による上皮の構築において重要な役割を果たしていることが推定された。
生産スケジューリング技術開発の事例ベースによる支援システムに関する基礎研究

(1)数理モデル作成の前段階である実際問題の整理とその記述を支援するために、汎実体一関連モデル(GERM)なる新しい情報モデルと、これに基づく問題記述法を提案し、かつ、これをデータベース化する方式を確立した。新方式をインプリメントした事例データベースのプロトタイプシステムを開発してその有効性を検証した。また、GERMによる問題記述によれば、最適化問題ばかりでなくシミュレーションの対象となる問題の記述も可能なことを明かにした。(2)教理モデルを純粋に数学的なオブジェクトとして定義し、これと対応する問題定義を「結合条件」と呼ぶ情報によって結びつける、多対多の対応付けを可能にする技術を確立した。これにより数埋モデルの再利用が容易になり、かつ、問題定義に対応する数理モデルの作成を支援する事例データベースの開発が可能になった。これらを検証する事例データベースのプロトタイプシステムを開発した。本方式では、モデル/データ独立が実現している。(3)ユーザが作成する数理モデルである「ユーザ定義モデル」とソルバーが前提とする数埋モデルである「標準モデル」およびソルバーオプションを「結合情報」によって対応づけてソルバーを起動する方式を開発するとともに、問題の数値例を上記のプロトタイプシステムに組み込む方式を開発した。これによってモデル/ソルバー独立が実現され、既存ソルバーの再利用が容易になるので、無駄な開発努力を省くことができる。(4)事例データベースのプロトタイプシステムを開発した経験から、オブジェクト型を記述の基本要素とするGERMは、ユーザにとって、その記述内容を直感的に理解することは必ずしも容易ではないことが分かった。そこで、オブジェクト・インスタンスを記述することでオブジェクト型を定義できるユーザインターフェースを提案し、その実現方法を構成した。数理モデルを元にする意思決定支援では、現実の問題とそれを表現する数理モデルの相互関係の中に、応用上極めて重要な情報が隠されているとする本研究の立場から、我々は既存の諸研究とは異なり、現実問題の構造化した記述(「問題定義」と呼ぶ)とその数理モデルを独立に記述し、両者の関係は「結合条件」として別に記述する方式を提案した。この方式によれば、問題定義と数理モデルの間の多:多の対応関係を無理なく記述することができる。問題定義の記述方法として汎実体-関連モデルを提唱し、その記述形式を集合論的方法を用いて確立した。この記述方式によれば、現実問題を非数理的用語、言い換えれば、ほぼ日常語に近い用語を用いて問題定義を記述することができ、しかも、実体、関連といったオブジェクトを記述の単位として活用する構造化記述を実現することができる。従って、数理的世界に疎い意思決定者にも理解しやすく、しかも、検索・部分変更など再利用に便利な事例ベース・システムの構築が可能になった。このような記述方式を利用する問題定義並びに数理モデルの事例データベース・システムの基本設計を行い、開発に着手した。開発に際して、実体-関連モデルと親和性の高い関係データ構造、および、複雑なデータを一体化して操作することが容易なオブジェクト指向方式を併用する。開発作業は進展しているが、本研究の目標とするレベルまでの完成は来年度の予定である。なお、今年度の成果の一部を平成9年秋のOA学会で報告した。本研究の基本的な狙いは、数理的モデルに基づく生産スケジューリング問題の解法開発に際して、(1)数理モデル作成の前段階である実際問題の整理結果の記述を形式化しデータベース化することによって、実際問題の整理を支援する技術を確立すること、そして、(2)それを数理モデルと結びつけるに際して実際問題と数理モデルの間の多対多の関係を許すような技術を確立して、数理モデル作成の支援を可能にすること、そして、(3)作成された数理モデルが既存のソルバープログラムで解くことが可能な場合にはそれを起動して当面の数値例を解けるようにすることによって、無駄な開発努力を省くこと、などである。(1)に対しては汎実体ー関連モデル(GERM)に基づく問題記述を提案しこれをデータベース化する方式を提案して昨年以来続けているプロトタイプシステムの開発は終了した。

また、GERMによる問題記述によれば、最適化問題ばかりでなくシミュレーションの対象となる問題の記述も可能なことを発見し、経営情報学会にて研究報告した。(2)に関しては、数理モデルを純粋に数学的なオブジェクトとして定義し、これと対応する問題定義を「結合条件」と呼ぶ情報によって結びつける方式を確立し、プロトタイプシステムに組み込んだ。これらの成果はINFORMSの1998年の年次大会(米国シアトル市)にて報告した。(3)に関しては、問題の数値例を上記のプロトタイプシステムに組み込む方式を開発し、また、ソルバープログラムを起動する方式を開発した。現在、そのシステム開発の途上にある。1999年度は、(3)のシステム開発を完成し、システムインターフェースの改善方法を検討し、プロトタイプシステムに組み込む予定である。本研究の基本的な狙いは、数理モデルに基づく生産スケジューリング問題の解法開発に際して、(1)数理モデル作成の前段階である実際問題の整理結果の記述を形式化しデータベース化することによって、実際問題の整理を支援する技術を確立すること、そして、(2)それを数理モデルと結びつけるに際して実際問題と数理モデルの間の多対多の関係を許すような技術を確立して、数理モデル作成の支援を可能にすること、そして、(3)作成された数理モデルが既存のソルバープログラムで解くことが可能な場合にはそれを起動して当面の数値例を解けるようにすることによって、無駄な開発努力を省くこと、である。本年度は、(3)を中心に研究を行い、数理モデルとソルバーを関係づけるには、問題定義に応じて作成される数理モデルであるユーザ定義モデルとソルバー開発者が想定する数理モデルである標準モデルを区別し、両者を結合する情報を「結合情報」としてデータベース化する方法を考案し、この方法によればモデル/ソルバー独立を実現することが可能なことを明らかにするディスカッションペーパーを作成した。また、(1)に関しては、本研究で開発した問題記述方式であるGERMがオブジェクト型を記述することをベースにするため、ユーザが記述内容を直感的に理解するのは容易でないという欠点を改善するために、オブジェクト・インスタンスを記述することによって入力する事が出来るようなユーザインターフェースを考案し、その実現方法を検討した。その成果をIFORS北京会議(1999,8)にて報告した。
環境統計整備のための基礎的問題の研究

環境データを「環境統計」として体系的に整備しまた継続的に維持していくために、これまでに蓄積された環境データに関する経験的、理論的研究に加えて、統計学的な観点からいくつかの基本的な問題点を整理した。1.大気汚染物質濃度の変動特性を把握するための試みの一つとして、東京都及び鹿島地区を対象に濃度測定器による測定を行った。結果は、現在とりまとめ中であるが、この結果を過去の観測ステーションのデータ、およびモデルシミュレーションの結果等と結びつけて、大気質状態を計測・評価する統計的モデルを作成しつつある。2.複数の地点から互いに相関のあるデータが観測されるときに、これらのデータを共通に支配する確率法則を求める問題を考察した。3.大気汚染データの空間時系列による解析を行い、空間構造を考慮に入れた大気汚染濃度予測を行った。また道路週辺での環境を大気、騒音に対して測定し、2ヶ月間のデータ収集を行った。4.環境中には人体影響が問題視される種々の汚染物質が含まれるが、その全てを計測・監視することは不可能である。そこで環境汚染の指標化について、文献ならびに既存資料を基に整理、検討を試みている。最後に大気汚染物質の空間分布構造を明らかにするための実験計画と統計的データ解析法の理論的研究を併行して進めつつある。
次世代シーケンサーを用いたエクソーム解析による急性期DIC患者の遺伝的素因の解明

播種性血管内凝固症候群(disseminated intravascular coagulation; DIC)は外傷や分娩後大量出血、白血病などの悪性腫瘍や敗血症(重症感染症)など種々の原因で発症する。このうち、急性期DICの原因として臨床的に頻度も高く患者の重症度も高い、敗血症性DIC患者の解析を行うこととした。当初の計画通り研究は下記3段階ですすめた。第1段階(サンプル収集):急性期DIC患者群および対照群として非DIC患者の解析を行うため、重症敗血症および敗血症性ショック患者のサンプル収集をすすめている。平成25年度より継続して行っている。第2段階(遺伝子多型解析):収集したサンプルを用い次世代シーケンサーを用いエクソーム解析を行い、急性期DICに関連する遺伝子多型を発見する。第3段階(細胞実験):導出された遺伝子の急性期DICにおける役割を細胞実験により明らかにする。平成26年度は、第1段階および第2段階を遂行した。サンプル収集の検体数は順調に経時的に増加した。第2段階準備のためエクソーム解析にむけて必要な試薬(HiSeq SBS Kit v4-HS, Sure Select XT Human All Exon V5, SureSelect XT Reagents)を購入し、解析計画をたてた段階である。研究成果を国際的学術雑誌への論文発表や国内外の学術集会発表を行う段階ではない。救急集中治療領域の患者のうち播種性血管内凝固症候群(disseminated intravascular coagulation; DIC)を合併すると依然として致命率が高い.DICは発症や重症化の程度の個人差が大きい.重症患者の転帰に遺伝的要因の個人差が影響を与えることが広く知られているが,DIC発症や重症度に影響を与える遺伝的素因は明らかとされていない.本研究は,急性期DIC患者の遺伝的素因を解明することを目的としている.研究は下記3段階で行う計画である.第1段階(サンプル収集):救急集中治療領域における急性期DIC患者および対照群として非DIC患者のサンプル収集を行う.第2段階(遺伝子多型解析):次世代シーケンサーを用い収集したサンプルでエクソーム解析を行い,急性期DIC発症,DICの重症度,生命予後に関連する遺伝子多型を発見する.第3段階(細胞実験):導出された遺伝子の急性期DICにおける役割を細胞実験により明らかにする.平成25年度は,第1段階に該当しており,救急集中治療領域の急性期DIC患者のデータ収集を行っている.平成25年4月から平成26年3月までの1年間で,千葉大学医学部附属病院において,合計99件の患者サンプルを収集した.サンプル収集の検体数は順調に経時的に増加している.サンプル収集の現段階ではまだ研究成果を国際的学術雑誌への論文発表や国内外の学術集会発表を行う段階ではなく当面その予定もない.播種性血管内凝固症候群(disseminated intravascular coagulation; DIC)は外傷や分娩後大量出血、白血病などの悪性腫瘍や敗血症(重症感染症)など種々の原因で発症する。まだ研究段階としては第1段階ではあるが、サンプル収集は順調に進行しているため。まだ、解析を行う段階にはないため引き続きサンプル収集を継続する。千葉大学医学部付属病院ICUには対象候補となる症例は多く、研究協力者(千葉大学大学院医学研究院救急集中治療医学助教,実験助手,リサーチコーディネーター)らと連携の上、引き続き検体蓄積を効率的に行っていく。平成25年度は解析のための機材準備のための機器購入や情報収集を行った.しかしまだ研究の第1段階で検体収集をすすめてきた状態である.検体の解析に多額の費用がかかる,平成25年度はこれを行っていないため,使用額が平成25年度支給額に満たなくなっている.この解析は検体が集まった段階でまとめておこなう方が手順としても費用としても効率である.検体解析作業が開始される次年度以降に使用計画をしている.
サンプル値制御理論の実用化にむけて:CADの開発と実システムへの適用

本研究の目的は,サンプル値制御理論の普及,すなわちサンプル値制御理論を実システムに対して数多く適用される理論とすることである.具体的には,制御系CADの開発によりユーザが容易に適用可能となる環境を整え,モデルケースとしていくつかの実システムへ適用し,有効性を示すとともにノウハウを構築することである.具体的には以下の成果を得た.サンプル値制御理論の実システムへの適用については,以下の実システムに対して適用し,連続時間補償器を設計して双一次変換により離散化する一般的な手法と比較して,ロバスト性,および性能に関して有効であることが確認された.これら幅広い対象に対する適用は,サンプル値制御理論を適用するにあたり有効なテンプレートとなることが期待される:ハードディスクドライブ,磁気軸受け,ピエゾアクチュエータ,超音波モータ,アクティブノイズキャンセルシステム.さらにディジタル補償器の計算量を考慮した設計法,非線形システムのディジタル制御のための理論の整備およびその平面マニピュレータへの適用などを試みた.本研究の目的は,サンプル値制御理論の普及,すなわちサンプル値制御理論を実システムに対して数多く適用される理論とすることである.具体的には,制御系CADの開発によりユーザが容易に適用可能となる環境を整え,モデルケースとしていくつかの実システムへ適用し,有効性を示すとともにノウハウを構築することである.具体的には以下の成果を得た.サンプル値制御理論の実システムへの適用については,以下の実システムに対して適用し,連続時間補償器を設計して双一次変換により離散化する一般的な手法と比較して,ロバスト性,および性能に関して有効であることが確認された.これら幅広い対象に対する適用は,サンプル値制御理論を適用するにあたり有効なテンプレートとなることが期待される:ハードディスクドライブ,磁気軸受け,ピエゾアクチュエータ,超音波モータ,アクティブノイズキャンセルシステム.さらにディジタル補償器の計算量を考慮した設計法,非線形システムのディジタル制御のための理論の整備およびその平面マニピュレータへの適用などを試みた.本年度は以下の課題の研究を行った:・サンプル値制御系CADの開発(進行中)・ハードディスク装置,超音波モータの実験装置の製作・開発バージョンのCADを用いたサンプル値制御理論にもとづくハードディスク装置,超音波モータ,連続鋳造機モールド湯面レベル制御系の性能評価・最適設計(進行中)・開発バージョンのCADを用いたディジタルフィルタの最適設計・性能評価サンプル値制御系CADの開発においては,制御系CADのプラットフォームとして標準的に用いられているmatlab上で,最新のサンプル値制御理論の成果を反映したサンプル値制御系CADを開発している.開発においては,matlab最新バージョンのオブジェクト指向プログラミング機能を活用している.ハードディスク装置,超音波モータの実験装置の製作は,開発した制御系CADを用いて,サンプル値制御理論が実システムの制御の高性能化・低価格化に有効であることを明らかにするための準備としての実験装置の製作であり,実際の実験は次年度以降行う.開発バージョンのCADを用いて,ハードディスク装置,超音波モータの制御系,連続鋳造機モールド湯面レベル制御系およびディジタルフィルタを設計し,シミュレーション段階ではあるが,従来法と比較して有効性を示している.これらの結果から,実システムの制御におけるサンプル値制御理論の有効性が予想され,次年度以降実装を行うための予備的な結果は十分得たと言える.本年度は以下の課題の研究を行った:・サンプル値制御系CADの開発:サンプル値制御系の周波数応答の新しい上下界およびその計算アルゴリズムを提案した.提案した上下界は,従来知られていた上下界より精度が高く,計算量は同等である.また,開発中のサンプル値制御系CADに周波数応答ゲインの上下界の計算法を実装した.・ハードディスクのシーク制御:終端状態制御によるハードディスクのショートシーク制御手法を提案した.提案する制御則は,入出力値の拘束,入力の周波数成分などの制約のもとで指定したステップ数でトラッキングを達成する入力のうち,入力のエネルギーを最小化するものであり,制御則の設計問題はLMIに帰着される.また,実験により提案手法の有効性を確認した.・超音波モータの速度制御:超音波モータの速度制御において現れる周期外乱除去のためには繰り返し制御が有効であるが,制御系はむだ時間を含む系となり,設計問題は困難であった.このむだ時間系の構造に着目し,ゲインスケジューリング手法を用いて実装可能な補償器の設計法を明らかにするとともに,速度制御実験を行い有効性を確認した.・ロボットアームの関節角トラッキング実験:関節角制御系のディジタル制御による安定性条件を消散性理論に基づき明らかにした.リアルタイムLinuxを用いて実験環境を構築し,実験によりその有効性を確認した.また,ビジュアルサーボ系の実験環境を構築し,予備的な考察および実験を行った.以上の研究を行うとともに,計測自動制御学会第1回制御部門大会(5月,京都)においてオーガナイズドセッションを開催し,研究成果を公表した.本年度は以下の課題の研究を行った:・サンプル値制御系CADの開発(15th IFAC World Congress,第31回制御理論シンポジウムで公表):サンプル値制御系の周波数応答の新しい二分計算アルゴリズムを2種類提案した,提案したアルゴリズムは.従来提案されていたアルゴリズムより.計算量が少なくなる場合がある,また.開発中のサンプル値制御系CADに周波数応答ゲインの計算法を実装した.・超音波モータの速度制御(SICE Annual Conference 2002,ICIT 2002で公表):超音波モータの速度制御において.連続時間制御理論に基づき設計した連続時間補償器をTustin変換した離散時間補償器は,しばしば系を不安定化する.サンプル値制御理論に基づき直接ディジタル補償器を設計し,速度制御実験を行い,良好な結果を得た.・ロボットアームの関節角トラッキング実験(第2回制御部門大会,SICE Annual Conference 2002で公表)

:関節角制御系のディジタル制御による安定性条件を消散性理論に基づき明らかにしたリアルタイムLinuxを用いて実験環境を構築し,実験によりその有効性を確認した.本年度は以下の課題の研究を行った:ハードディスクドライブの制御系設計に関して,ハードディスクのシーク制御において,計算量を考慮したマルチレート制御系設計法を提案した(IEEE Conf.on Decision and Controlで公表).アクティブノイズキャンセルに関して,1次元ダクトのアクティブ消音問題に対してサンプル値制御理論に基づく設計を行い,連続時間ベース設計と比較して有効であることを示した(IEEE Conf.onDecisionand Control, MOVICで公表).
雪泥流流下経路の自動推定システムの開発と信頼度評価：富士山を対象として

初年度である2018年度は,富士山の北斜面で主に春期に発生する雪泥流の震動観測を目的とした臨時観測点の設営・維持作業と臨時観測用の機材の導入を主に行った.2018年時点では,富士山頂から半径15km以内で連続稼働中の気象庁および防災科学技術研究所の火山活動監視目的の震動観測点は9点あるが,雪泥流の発生域に近い山頂から北側山腹には富士山頂(気象庁),富士鳴沢塒塚東(気象庁),富士第5(防災科研)の3点しかなく,山頂をのぞく2点も西北西の一角に偏って分布している.そのため,北西方向への雪泥流の流下検知能力は比較的高いと考えられるものの,無数の流路が認められるスバルライン5合目近傍や北東山腹には震動観測点が存在せず,泥流の発生を検出できない(あるいは位置決定精度が低下する)恐れがある.そこで本研究では,既存観測点がない地域や観測点の隙間を埋めるように,富士スバルラインおよび滝沢林道沿いの4-5合目の6箇所に臨時地震観測点を設置した.現地には商用電源がないことに加え,冬期の暴風雪を考慮して太陽電池の導入を諦め,蓄電池のみによる観測形態を選択した.観測点の設置作業は積雪による道路の通行止めが始まる直前の12月中旬に実施し,一部の観測点では東京大学地震研究所所有の空振計(音波観測)を併設した.2018年-2019年の冬期は例年に比べて積雪が少なく,3月中旬までに明瞭に発生が認められた雪泥流は1例に留まっている.この事例については,おおよその発生日時のほか,現地調査により流下経路の確認がなされている.また,既存の連続観測点の震動記録を確認したところ,雪泥流の流下によると思われる震動が認識できた.本研究による臨時観測の目的や概要については,2018年12月に北海道虻田郡ニセコ町で開催された「第2回国際雪・雪崩シンポジウムinニセコ」において,共同研究者の本多から報告した.富士山の火山活動が表面的に静穏であることに加え,富士山中腹以上の高標高域における自然環境が極めて厳しいなどの理由から,本研究グループが知る限り最近20年くらいは富士山の高標高域における連続震動・音波観測は試みられていない.冬期観測の先行事例がない中で臨時観測点の設置場所選定なども手探りで始まった本研究であるが,地元の火山研究者として現地の環境や社会インフラを把握している研究分担者の吉本および本多が観測点候補地の現地事前調査を実施したことで,地図上で検討していた当初計画にほぼ沿った配置や観測点数での臨時観測を始めることができた.具体的な観測点設置場所は,スバルライン沿いの「大沢駐車場」「奥庭駐車場」「青草洞門」「坂下洞門」と,スバルライン5合目より東側の「佐藤小屋」「滝沢林道」である.これらの臨時地震観測の機材については,当初の計画通りに東京大学地震研究所の共同利用物品を借用させていただいた.例年は2月から4月の融雪期に雪泥流の発生が増大することから,2018年-2019年の臨時観測では12月中旬から4月中旬までの100日程度を観測予定期間として電源容量の算定を行った.残念ながら,本研究で購入した気象観測装置については,消費電力や設置場所・データ収録方法について課題が残ったため,今年度の観測については断念せざるを得なかった.その代わりとして,5合目近傍で道路管理用の気象観測を行っている山梨県道路公社に冬期間の気象データの提供を依頼しご了解をいただいた.あいにく2018年-2019年の冬期は富士山一帯での積雪が例年より少なく,雪泥流の発生も多くないようである.現在のところ,2019年3月8日の朝方に雪泥流の発生が報告されており,防災科学技術研究所の火山観測用の地震計で小振幅ながらも信号が記録されていることを確認している.2019年度は,雪解け後に臨時観測点の撤収とデータ回収を行い,気象庁,防災科学技術研究所の火山監視観測目的の連続震動データと結合した上で,雪泥流発生時のデータセットを作成する.本研究で利用する地震学的な解析では,それぞれの震動観測点における振幅情報を用いるので,観測点ごとの地盤増幅特性を事前に評価する必要がある.そのために,2018年-2019年の本研究の観測期間中に富士山周辺で発生した一般の地震(構造性地震)の記録を抽出し,地盤増幅率の評価を行う.これまでの予備的な研究から,富士山の既存の連続震動観測点のデータだけでも,規模の大きな雪泥流(特に北西方向への流下が見られたもの)は,それなりの精度で流下位置が推定できることが示唆されている.2019年度は,本研究での臨時観測データを加味した上で,解析に用いる観測点の組み合わせや数を変化させ,推定結果にどのような差異が出てくるかを検討する.また,山梨県道路公社より提供いただく予定となっている気象データについては,地震波形の時間変化と気象要素の時間変化との対応関係を検討し,雪泥流が発生した時間の気象条件の評価を行う.

これは後に解析システムへ気象情報を組み入れる際の基準値を考えるための予備評価である.2019年度の積雪期前には,改めて臨時観測データの取得を目指した地震計・空振計などを用いた冬季連続観測点を設ける.今年度の取得データの状況を評価した上で,可能であれば今年度と同一の地点で,必要があれば地点を変えて実施する.また,本研究で購入した気象観測装置の併設も可能な限りめざし,自前での冬期気象要素の取得に努める.初年度である2018年度は,富士山の北斜面で主に春期に発生する雪泥流の震動観測を目的とした臨時観測点の設営・維持作業と臨時観測用の機材の導入を主に行った.2018年時点では,富士山頂から半径15km以内で連続稼働中の気象庁および防災科学技術研究所の火山活動監視目的の震動観測点は9点あるが,雪泥流の発生域に近い山頂から北側山腹には富士山頂(気象庁),富士鳴沢塒塚東(気象庁),富士第5(防災科研)の3点しかなく,山頂をのぞく2点も西北西の一角に偏って分布している.そのため,北西方向への雪泥流の流下検知能力は比較的高いと考えられるものの,無数の流路が認められるスバルライン5合目近傍や北東山腹には震動観測点が存在せず,泥流の発生を検出できない(あるいは位置決定精度が低下する)恐れがある.そこで本研究では,既存観測点がない地域や観測点の隙間を埋めるように,富士スバルラインおよび滝沢林道沿いの4-5合目の6箇所に臨時地震観測点を設置した.現地には商用電源がないことに加え,冬期の暴風雪を考慮して太陽電池の導入を諦め,蓄電池のみによる観測形態を選択した.観測点の設置作業は積雪による道路の通行止めが始まる直前の12月中旬に実施し,一部の観測点では東京大学地震研究所所有の空振計(音波観測)を併設した.2018年-2019年の冬期は例年に比べて積雪が少なく,3月中旬までに明瞭に発生が認められた雪泥流は1例に留まっている.この事例については,おおよその発生日時のほか,現地調査により流下経路の確認がなされている.また,既存の連続観測点の震動記録を確認したところ,雪泥流の流下によると思われる震動が認識できた.本研究による臨時観測の目的や概要については,2018年12月に北海道虻田郡ニセコ町で開催された「第2回国際雪・雪崩シンポジウムinニセコ」において,共同研究者の本多から報告した.富士山の火山活動が表面的に静穏であることに加え,富士山中腹以上の高標高域における自然環境が極めて厳しいなどの理由から,本研究グループが知る限り最近20年くらいは富士山の高標高域における連続震動・音波観測は試みられていない.冬期観測の先行事例がない中で臨時観測点の設置場所選定なども手探りで始まった本研究であるが,地元の火山研究者として現地の環境や社会インフラを把握している研究分担者の吉本および本多が観測点候補地の現地事前調査を実施したことで,地図上で検討していた当初計画にほぼ沿った配置や観測点数での臨時観測を始めることができた.具体的な観測点設置場所は,スバルライン沿いの「大沢駐車場」「奥庭駐車場」「青草洞門」「坂下洞門」と,スバルライン5合目より東側の「佐藤小屋」「滝沢林道」である.これらの臨時地震観測の機材については,当初の計画通りに東京大学地震研究所の共同利用物品を借用させていただいた.例年は2月から4月の融雪期に雪泥流の発生が増大することから,2018年-2019年の臨時観測では12月中旬から4月中旬までの100日程度を観測予定期間として電源容量の算定を行った.残念ながら,本研究で購入した気象観測装置については,消費電力や設置場所・データ収録方法について課題が残ったため,今年度の観測については断念せざるを得なかった.その代わりとして,5合目近傍で道路管理用の気象観測を行っている山梨県道路公社に冬期間の気象データの提供を依頼しご了解をいただいた.あいにく2018年-2019年の冬期は富士山一帯での積雪が例年より少なく,雪泥流の発生も多くないようである.現在のところ,2019年3月8日の朝方に雪泥流の発生が報告されており,防災科学技術研究所の火山観測用の地震計で小振幅ながらも信号が記録されていることを確認している.
ソーシャルワークにおける共通な援助プロセス・モデルの作成に関する研究-援助プロセスの項目とその作業内容の明確化を目指して-

本研究においては、まだ十分ではないが、文献研究をふまえた仮のソーシャルワーク援助プロセス・モデルの(インテ-ク-アセスメントープランニング-介入-評価-終結)を作成してみた。そして、埼玉県と長野県の施設・機関においてヒヤリングと事例を通して、モデルの適切性と有効性の検討を行なった。その結果については、以下のとおりである。1.これまで、日本で一般的に使用されていたインテ-クは、アメリカの文献では見られなくなり、エンゲージメントやエントリ-などが用いられている。しかし、日本で定着しているインテ-クはそのまま生かしたプロセス展開のほうが現状との関係からスムーズと考えられた。2.インテ-クから介入までの局面と方法は、各施設・機関のソーシャルワーカーのヒヤリングや事例から工夫して行なっていることが明らかになったが、評価と終結に関しては意識して行なわれていなかった。そこで、仮の援助プロセス・モデルを用い検討した結果、医療機関のように明確に終結できる場合には、有効に機能したが、特別養護老人ホームのような長期的援助では課題が残った。今回、提示した援助プロセス・モデルは、おおむね各施設・機関の基本的ソーシャルワーク活動内容を含むと考えられる。しかし、モニタリングやフィードバックの具体的展開(誰が、どのように、どの時点で)については、現実状況と照らして考えると、ケース量の多さや援助計画を立てた後は結果が出るまで見直しがない状況から、援助プロセス・モデルとのギャップが明らかになった。
PK-PD理論に基づいたダプトマイシンの投与方法の開発

MRSA感染症治療薬であるダプトマイシン(DAP)は腎排泄型の薬剤である。ヒトにおいてpharmacokinetics-pharmacodynamics(PK-PD)パラメータは明らかになっておらず、さらに、副作用としてクレアチンキナーゼ(CK)上昇および肝障害が報告されており、これら副作用を回避するための投与方法についても未だ不明なままである。そこで、DAPのPK-PD解析に必要な最小発育阻止濃度(MIC)および血中濃度を測定した。さらに、CK上昇および肝機能障害が発現する因子について検討を行った。MICを求めるために、ベクトン・ディッキンソン(BD)社と栄研化学社のEtestを用い、MRSAおよびEnterococcus faecalisの標準株として、それぞれ29213株(DAP MIC=0.25-1μg/mL)と29212株(DAP MIC=+4μg/mL)を使用した。MRSAに対するDAPのMICはBD社で0.25ptg/mL、栄研化学社で0.094μg/mLであり、E. faecalisに対するDAPのMICはBD社で3μg/mL、栄研化学社で1μg/mLであった。DAPの抗菌効果はカルシウム濃度に依存するため、寒天培地のカルシウム濃度が高い栄研化学社のEtestではMICが低くでることが分かり、BD社のEtestが標準株のMIC域を満たしており、今回の研究にはBD社のEtestを用いた。DAPの血中濃度は高速液体クロマトグラフ法を用いて測定した。また、患者の検査値は当院電子カルテシステムより抽出した。本研究は当院臨床研究倫理委員会の承認(24-137)を得ている。DAPは男性6名、女性8名の合計14名に投与され、平均年齢は68。6±14.6歳、平均体重は52.7±8.2kg、平均クレアチニンクリアランス(Ccr)は68.0±32.4mL/min、平均投与量は6.3±1.2mg/kg/dayであった。CK上昇は14名中3名(18.8%)で認めら、3名の投与量はそれぞれ7,1、6.2、5.8mg/kg/day、Ccrは36.9、54,3、36.6mL/minであった。CK上昇が発現していない症例と比較し、Ccr当たりの投与量が多い傾向にあった。肝機能障害も14名中8名(57.1%)で認められ、CK上昇と同様、Ccrあたりの投与量が多い症例で多く認められた。したがって、DAPを投与する際は、腎機能に応じた投与設計が必要であると考えられた。今後、さらに、DAP投与患者の症例数を蓄積し、効果を最大限発揮し、副作用を回避できる血中濃度域の解明、ならびにPK-PD解析を行う予定である。
2光子顕微鏡を用いた自然刺激による覚醒動物のスパイン可塑性の研究

本研究の目的は2光子顕微鏡を用いて覚醒動物の自然刺激による大脳のシナプス形態可塑性をリアルタイムに観察し、認知学習過程におけるシナプスの形態変化すなわちシナプスの「運動」を可視化しその性質および生理的基盤を解明することである。報告者は現在までに数多くの覚醒動物において長期間シナプスのイメージングを実行し、それらがどのような運動を示すのかについてデータを蓄積しており、スパインの運動には複数の種類が存在するが主なものとして3種類enlarge,shrinkage,twitchingが挙げられることを見出し、それらの空間的な分布および時間的変化を調べた。さらに麻酔状態と覚醒状態においてスパインの運動には有意に差があることを見出しており、これらのスパインの運動の違いには神経細胞集団の活動が大きな役割を果たしていると推測している。昨年度までに2光子顕微鏡下においてマウスが頭部固定状態で遂行できるオペラント条件付けの訓練系を開発し、件付け・行動中にシナプスレベルのイメージングを行うことで、学習および認知活動に伴うシナプスの変化を観察している。この時に、観察している細胞に対する適刺激が存在しなければ、覚醒状態かつ認知活動中といえどもスパインの運動が生じないことを発見した。これから覚醒状態における神経細胞への個々の入力パターンがスパイン運動に重要な役割を果たしていることが推測される。現在は国立精神神経センター武田先生・岡田先生の監督下に作成したアデノ随伴ウイルスを用いてカルシウム指示タンパク(Yellow Cameleon 2.60)を神経細胞に導入し、細胞の活動およびスパインのカルシウムシグナルを取得し、神経細胞への入力パターンを調べているところである。現在までに数多くの覚醒動物において長期間シナプスのイメージングを実行し、それらがどのような運動を示すのかについてデータを蓄積している。さらに覚醒動物の脳活動はその内部状態が存在し変化することが知られていることから、単純な覚醒状態におけるイメージングだけでは不十分と考え、2光子顕微鏡下において頭部固定状態で遂行できるオペラント条件付けの訓練系を開発した。この系を用いて条件付け・行動中にシナプスイメージングを行うことで、学習および認知活動に伴うシナプスの変化を観察することを試みている。さらに同一個体において長期間(数か月)、頻回(毎日)のイメージングも可能としており前頭葉課題学習中におけるシナプスの変化の追跡も可能となっている。このような細胞スケール未満の微小スケールの覚醒動物におけるイメージングは世界にほとんど報告がなく、さらに行動中における微小スケールのイメージングは全く報告されていない。報告者は世界に先駆けてこれらの訓練系および生体内イメージング技術を完成させた。加えて精神神経センター武田先生・岡田先生の指導のもとアデノ随伴ウイルスを作成し、これを用いて神経細胞にカルシウム指示タンパクを導入して神経活動のカルシウムイメージングを立ち上げた。カルシウムイメージングにより、シナプスにおけるカルシウム変化すなわちシナプスの活動シナプスの運動を関連させることで、認知学習過程における神経細胞の活動、スパインの活動とその運動についての関係性を追求している。単純な覚醒状態だけではなく2光子顕微鏡下において頭部固定状態で遂行できるオペラント条件付けの訓練系を開発し認知行動過程におけるシナプス形態変化を可視化しており、加えて同一個体の数カ月以上の長期間にわたる観察さらにカルシウムイメージングを可能にしていることからおおむね順調に進展していると考える。現在立ち上がったアデノ随伴ウイルスを用いたカルシウムイメージングのデータを蓄積し、シナプスの形態変化と神経細胞およびシナプスの活動の関連性を追求する。また、カルシウムイメージングおよびECoG(皮質電図)を用いて脳の状態を調べることで脳内部の状態がシナプスの形態変化および認知学習過程にどのような影響を与えるかを調べていき、認知学習過程の神経・生理学的基盤を調べる予定である。
ハロバクテリアのセンサーロドプシンIIの3次元構造

以下の項目の研究を行い、以下の結果を得た。これまでに確立したSR IIの大量発現系をもとに、Htr IIのハロバクテリアにおける機能的な大量発現系の確立を行なった。ハロバクテリアの野生株ゲノム遺伝子より、Htr IIをコードする遺伝子htr IIをflanking領域を含めてクローニングし、発現ベクターに導入した。このプラスミドを用いて、4種のロドプシンを完全に欠損した変異体を宿主としHtr IIの大量発現系を構築した。具体的にはプロモーターとしてBRのプロモーターである、bopプロモーターを用い、その下流にhtr IIをつなぐことで過剰発現できた。Htr IIの大量発現系では、2種の発現ベクターを作成した。即ち、Htr IIをBRのleader sequenceと融合させたものとleader sequenceと融合させていないものである。これらの形質転換体を単離後、発現量の差異について検討した。組み換え蛋白質の精製を簡略化するために、同蛋白質のカルボキシル基末端には6つのヒスチジンオリゴマーを融合させた。大量発現されたHtr IIは可溶化後、Ni-NTA Agaroseを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した。また、SR IIとHtr IIを同時に過剰発現させる系をハロバクテリア中で構築した。大量発現した蛋白質はHtr IIの場合と同様に精製・単離した。現在、得られたタンパク質を用いてSR II及びHtr IIの3次元結晶を作成中である。具体的にはプロモーターとしてBRのプロモーターである、boPプロモーターを用い、その下流にhtr IIをつなぐことで過剰発現できた。すなわち、HTR IIをBRのleader sequenceと融合させたものとleadersequenceと融合させていないものである。大量発現されたHtr IIは可溶化後、Ni-NTA Agaroseを用いたアフィニィークロマトグラフィーで精製する予定である。また、SR IIとHtr IIを同時に過剰発現させる系をハロバクテリア中で構築する予定である。大量発現した蛋白質はHtr IIの場合と同様に精製・単離する予定である。