hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工内耳成績改善と適応拡大のためのトランスレーショナルリサーチ

1.Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)が蝸牛有毛細胞障害に対して、有毛細胞のプログラム細胞死の減少と支持細胞の増殖を起こして、予防・回復効果をもたらすことを見出した。その下流分子としてGap43とNetrin1を同定し、Netrin1にもIGF-1と同様の効果があることを確認した。2.細胞骨格を構成するタンパク質Septin7の内耳におけるコンディショナルノックアウトマウスの解析を行い、このマウスの内耳に奇形があるが、有毛細胞などの感覚上皮は形成されていることが判明した。また、聴神経は形成されている感覚上皮に向けて分布していることも明らかにした。本研究の目標は、人工内耳成績不良症例の成績改善と人工内耳の適応拡大をはかるため、予後不良因子の解明と手術時の残存蝸牛有毛細胞の保護手法を含む解決手段を開発することである。そのために1.蝸牛神経と蝸牛有毛細胞の保護および再生2.奇形における聴神経解剖および遺伝子変異の解明を行うことを予定していた。本年度は1.については、昨年度発見したInsulin like growth factor 1 (IGF-1)の蝸牛有毛細胞障害に対する予防・回復効果において関係する下流分子の同定を試みた。網羅的遺伝子発現解析の結果、Gap43とNetrin1のそれぞれのmRNAがIGF-1で処置された障害蝸牛では発現亢進していることが判明し、定量的RT-PCRにて確認された。これらの成果はNeurosciende letters誌に掲載された。2.については、まず細胞骨格を構成するタンパク質として様々な臓器に発現しているSeptin7の内耳におけるコンディショナルノックアウトマウスの解析を引き続き行い、このマウスの内耳は奇形はあるが、有毛細胞などの感覚上皮は形成されていることが判明した。また、聴神経は形成されている感覚上皮に向けて分布していることも明らかになった。また、内耳奇形の家系の網羅的な遺伝子解析のため血液サンプルの収集を進め、現在10家族の血液サンプルを入手した。今後はこれらのサンプルから調整したDNAの網羅的な遺伝子解析を行う予定である。そのために蝸牛神経と蝸牛有毛細胞の保護および再生奇形における聴神経解剖および遺伝子変異の解明を行うことを予定していた。本年度は1.については、Insulin like growth factor 1 (IGF-1)が、薬剤による蝸牛の有毛細胞障害を予防するあるいは回復させる作用があることを示し、そのメカニズムが有毛細胞のプログラム細胞死の減少と支持細胞の増殖であることを証明した。また、これらのメカニズム駆動のため、IGF-1受容体が複数のシグナル経路を活性化することを解明した。これらの成果はMolecular and Cellular Neuroscience誌に掲載された。2.については、まず細胞骨格を構成するタンパク質として様々な臓器に発現しているSeptin7の内耳におけるコンディショナルノックアウトマウスの解析を行い、このマウスの内耳が内耳奇形の一つであるCommon cavity型の内耳と同様の形態であることを見出した。今後は、このマウスにおいて聴神経がどのように発生分布するかを検討する予定である。また、内耳奇形の家系の網羅的な遺伝子解析のため血液サンプルの収集を進め、現在8家族の血液サンプルを入手した。本年度は1.については、昨年度同定したInsulin like growth factor 1 (IGF-1)の蝸牛有毛細胞障害に対する予防・回復効果において関係する下流分子のうち、分泌分子であるNetrin1にIGF-1と同様の効果がないかを検討した。その結果、IGF-1と同様の効果があり、その効果はプログラム細胞死を介していることが確認できた。現在、IGF-1によって発現を促されるNetrin1が、蝸牛内のどの細胞から分泌されるのかをin situ hybridizationを用いて検討中である。

2.については、昨年度、細胞骨格を構成するタンパク質Septin7の内耳におけるコンディショナルノックアウトマウスの内耳に奇形が生じるが、聴神経は形成されていることを解明したが、本年度は解析を引き続き行い、奇形が生じるメカニズムとして、細胞増殖の制御には異常はないが、細胞死のコントロールに異常が生じることを明らかにした。これらの成果を現在論文にまとめ、発表の準備を行っている。さらに、細胞の運命決定に関わるbasic helix loop helix転写因子であるOligファミリーの内耳発生における発現パターンにつき解析し、Oligファミリーが内耳の発生に重要であることをGene Expression Patterns誌に発表した。また、内耳奇形の家系の網羅的な遺伝子解析のため血液サンプルの収集を進め、現在11家族の血液サンプルを入手した。今後はこれらのサンプルから調整したDNAの網羅的な遺伝子解析を行う予定である。耳科学有毛細胞の保護因子としてのIGF-1の下流でどのような分子が作用しているかを明らかにできたことで、IGF-1よりも特異的に作用する可能性のある、人工内耳手術時聴力温存のための薬剤の候補を得ることができた。特にNetrin1は分泌蛋白でありかつ腎臓などでも障害に対する保護効果があるため、IGF-1に続いて本研究の目的である人工内耳適応の拡大のためのツールの候補を一つを同定できたと考える。また、Septin7の内耳におけるコンディショナルノックアウトマウスの内耳を解析することにより、内耳奇形では感覚上皮が残っていれば聴神経がその部位に到達することが判明した。さらに、内耳奇形の患者および家族の血液採取も想定よりも順調に進んでおり、現在10家族の血液がそろっていて、関連した遺伝子変異を解析する準備も整いつつある状態である。以上から、当初予定よりも計画は進行していると考える。有毛細胞の保護因子としてのIGF-1を同定し、かつその作用機序を明らかにできたことで、IGF-1を人工内耳手術時に聴力温存のために使用する薬剤の一つを得ることができた。早くも本研究の目的である人工内耳適応の拡大のためのツールの一つを同定できた。また、Septin7の内耳におけるコンディショナルノックアウトマウスという内耳奇形のモデルも確立できた。これにより、内耳奇形における聴神経の形態の検討を行えるものと考える。さらに、内耳奇形の患者および家族の血液採取も想定よりも順調に進んでおり、現在8家族の血液がそろっていて、関連した遺伝子変異を解析する準備も整いつつある状態である。IGF-1の下流で作用している分子としてGap43とNetrin1を同定したので、これら内耳有毛細胞を障害からいかに保護しているのかのメカニズムを同定する予定である。それにより、IGF-1よりもさらに効率のよい有毛細胞保護法を開発できるものと思われる。Septin7の内耳におけるコンディショナルノックアウトマウスに関しては内耳奇形のおこる原因の精査、また、異なった時期でのコンディショナるノックアウトを行い、Septin7が内耳の形態形成にかかわる時期を明らかにしたい。また、血液サンプルのDNA抽出、Deep sequencingも施行していく予定である。
樹状突起の脳内での発達機構解明―光遺伝学とイメージングによる新しいアプローチ

神経細胞の多様な樹状突起形態は、神経回路の形成と機能発揮に重要であると考えられる。本研究ではマウスの小脳プルキンエ細胞が、特徴的な樹状突起形態を完成させる分子機構の解明を目指した。まず、生後の脳の発達の初期過程において転写因子RORαが樹状突起形成と維持に幅広く必須の役割を果たすことを解明した。さらに、生きたまま脳内の樹状突起形態をin vivo2光子イメージング法で観察し、樹状突起が1本に剪定される際に、活発な退縮・伸長を繰り返すことを見出し、さらにこの過程が神経活動およびカルシウムシグナリングを介して制御されることを明らかにした。脳神経回路形成機構の理解に貢献する成果と考えている。マウス小脳プルキンエ細胞へ、子宮内電気穿孔法を用いてEGFP蛋白質を発現させ、樹状突起形態をin vivo2光子イメージング法によって観察した。その結果、生後8日目から、12日間の間に、複数の樹状突起が形態を変化させながら退縮し1本化する過程を明らかにすることができた。一方、プルキンエ細胞における神経活動を、内向き整流性カリウムチャネルの過剰発現によって抑制した場合においては、このようなダイナミックな形態変化が観察されず、樹状突起が1本化しないことが、in vivoイメージングによって明らかとなった。さらに、神経活動を抑制したプルキンエ細胞においては、生後6日目の時点で樹状突起の伸長方向に異常が見られることを見出した。すなわち、生後6日目以前から神経活動が樹状突起形態を制御していることが示唆された。プルキンエ細胞へ蛋白質性カルシウム指示薬GCaMP6を発現させ、in vivoカルシウムイメージングを行ったところ、生後8日目のプルキンエ細胞において一過性のカルシウム濃度上昇が観察された。このカルシウム上昇は、樹状突起全体で一様に起きていることが示唆された。さらに、神経活動依存的なカルシウム濃度上昇が樹状突起形成に関与しているかを検討するため、P/Q型電位依存性カルシウムチャネルをプルキンエ細胞においてノックダウンしたところ、樹状突起の1本化が阻害されることがわかった。すなわち、神経活動によるカルシウムシグナリングが樹状突起形成を制御する可能性が示された。さらに、プルキンエ細胞へ投射するシナプス形成に異常をきたす各種遺伝子改変マウスにおいて、プルキンエ細胞樹状突起の形態を検討し、プルキンエ細胞へ投射する特定の種類のシナプス入力が、樹状突起1本化を制御する可能性を見出した。プルキンエ細胞樹状突起形態形成にかかわる神経活動依存的な分子メカニズムを解明するため、簡便で効率的なゲノム編集ツールとして近年注目されているCRISPR/Cas9システムを導入し、子宮内電気穿孔法と組み合わせることで、プルキンエ細胞における各種標的遺伝子のノックアウトする手法を確立した(J Neurosci, 2015)。本手法を用いて、カルシウム/カルモジュリン依存的プロテインキナーゼCaMK2aが、樹状突起形態に必要であることを見出した。すなわち、神経活動依存的なカルシウム流入とCaMK2a活性化が、樹状突起形態を制御することが示唆された。また、プルキンエ細胞が樹状突起を大きく形態変化させる生後8日目前後において、カルシウム動態を、in vivo2光子イメージング法によって観察し、樹状突起ごとのカルシウム動態の変化を計測するとともに、それぞれの突起のその後の成長あるいは退縮過程を明らかにした。また、プルキンエ細胞において樹状突起の形態形成にシナプス入力がどのような役割を果たすかを、シナプス形成に異常をきたす各種ノックアウトマウスを利用して検討した。その結果、平行線維シナプスの形成が減弱するマウスにおいて、プルキンエ細胞樹状突起形成に異常が見られることが分かった。すなわち、平行線維のシナプス入力が、樹状突起形態を制御する可能性が見出された。カルシウムイメージングおよび、細胞内カルシウムの役割についての検討は、研究計画に沿って順調に進展していると評価できる。また、プルキンエ細胞へシナプスを入力する各種細胞への遺伝子導入法は、確立しつつある。一方当初の計画では、確立した遺伝子導入法を用いて、プルキンエ細胞へのシナプス形成をイメージングすることで、樹状突起形成メカニズムを明らかにしようと計画していた。しかし、実際に研究を遂行するに当たり、どのようなシナプス入力が樹状突起形成を制御するのかを、あらかじめ検討してから、そのシナプス形成についてイメージングを行うべきとの結論に至った。そのための予備的実験を新たに追加したため、当初計画していたイメージングは次年度に行うこととした。ただし、追加した実験によって得られた知見を活用することで、研究計画を有利に進めることができると考えられるため、研究全体の進展に遅れはないと考えている。したがって、おおむね順調に進展していると評価できる。神経科学当該年度の研究成果はおおむね順調であり、今後の研究計画を大きく変更する必要はないものと考えられる。

したがってこれまでに得られた知見を踏まえ、引き続き研究計画に沿って樹状突起1本化の分子機構を解明していく。すなわち、プルキンエ細胞へのシナプス形成過程とその樹状突起形態制御機構を明らかにする。また、DREADD法を用いてin vivoで神経活動の必要性および十分性を評価する。さらに、細胞貪食機構が樹状突起退縮に関与するかどうかを明らかにする。研究助成金の効率的な調達の結果として、当初の予定より使用額が圧縮でき、未使用額が生じた。上の理由により生じた次年度使用額を、次年度の備品および消耗品の購入に使用することで、研究のさらなる効率化を図る。
分泌タンパク質MFG-E8を介した細胞外分泌膜小胞の生成機構および機能解析

COMMA-1D乳腺上皮細胞に加え、HEK293やCaco-2から分泌されるMFG-E8を含む膜小胞は多く、MFG-E8の他にも多くのタンパク質が存在することを高解像度の電気泳動法と銀染色法を組み合わせることにより見出した。膜小胞を大量に調製し、局在するタンパク質を質量分析計を用いて網羅的に解析した結果、これまで他の細胞種から分泌されるexosomeに局在することが報告されているものに加え、それぞれの細胞に特異的なものも含まれていることが判明しつつある。今後はこれらの同定をさらに進めるとともに、その生理的意義の解明に向けてsiRNAを用いたノックダウン実験を試みている。また膜小胞分泌におけるMFG-E8のもつD-domainの機能解析を行うために、D-domain(D1およびD2)をタンデムに並んだ形で単独に発現する発現プラスミド、あるいはMFG-E8の各ドメインを様々なコンビネーションで持つキメラタンパク質発現プラスミドを構築した。これらをCOS7細胞に一過性に導入し、それら変異体の膜小胞への局在を指標に解析したところ、D2ドメインを2つタンデムに持つ変異体は膜小胞への強い局在を示した。またD-domainをシグナル配列を持つ分泌性タンパク質(例えばαLactoalbumin)のC末端側にD1あるいはD2-domainを単独あるいはタンデムに並んだ形で付加した場合は、予想に反して膜小胞への局在が見られなかった。ところがシグナル配列を持たないタンパク質にD-domainを付加すると一部のタンパク質が膜小胞への局在を示すことが明らかとなった。これが何に起因するのか現在解析を進めているところである。膜小胞が培養上清中に分泌される現象を一般化するために、現有の抗MFG-E8抗体を用いたスクリーニングを実施しようと試みたが、ヒトをはじめとする他種由来の分子に対する交差性を示さないことから、急遽ヒトMFG-E8に対する抗体を作成した。ヒトMFG-E8 cDNAをRT-PCRにより増幅し、N末端部分に相当する部分をpETベクターにin-frameでつなぎ、大腸菌内でチオレドキシン融合タンパク質として発現させ、常法により精製した後ウサギに免役し、高力価の抗体を得た。これら抗体を用いてMFG-E8を含む膜小胞の存在の有無を調べた結果、検出されるMFG-E8量には多少の差があるものの、NIH3T3繊維芽細胞、C2C12筋芽細胞、RAWマクロファージ細胞、3T3-L1前駆脂肪細胞(以上マウス由来)、HEK293細胞、Caco-2大腸ガン由来上皮細胞、MCF7乳ガン由来上皮細胞(以上ヒト由来)によりconditionされた培養上清中に膜小胞が分泌されることが明らかとなり、膜小胞分泌は一部の限られた細胞種で見られる現象ではないことが強く示唆された。特にHEK293やCaco-2から分泌される膜小胞は多く、MFG-E8の他にも多くのタンパク質が存在することを高解像度の電気泳動法と銀染色法を組み合わせることにより見出しており、現在質量分析計を用いたこれら分子の同定を試みるための準備をしている。また膜小胞分泌におけるMFG-E8のもつD-domainの機能解析を行うために、D-domain (D1およびD2)をタンデムに並んだ形で単独に発現する発現プラスミド、シグナル配列を持つ分泌性タンパク質(例えばαLactoalbumin)のC末端側にD1あるいはD2-domainを単独あるいはタンデムに並んだ形で付加した発現プラスミドを構築した。現在COS7に導入し解析を実施している。また同時にレトロウィルスを介した導入のためのコンストラクトも構築済みである。COMMA-1D乳腺

上皮細胞に加え、HEK293やCaco-2から分泌されるMFG-E8を含む膜小胞は多く、MFG-E8の他にも多くのタンパク質が存在することを高解像度の電気泳動法と銀染色法を組み合わせることにより見出した。膜小胞を大量に調製し、局在するタンパク質を質量分析計を用いて網羅的に解析した結果、これまで他の細胞種から分泌されるexosomeに局在することが報告されているものに加え、それぞれの細胞に特異的なものも含まれていることが判明しつつある。今後はこれらの同定をさらに進めるとともに、その生理的意義の解明に向けてsiRNAを用いたノックダウン実験を試みている。また膜小胞分泌におけるMFG-E8のもつD-domainの機能解析を行うために、D-domain(D1およびD2)をタンデムに並んだ形で単独に発現する発現プラスミド、あるいはMFG-E8の各ドメインを様々なコンビネーションで持つキメラタンパク質発現プラスミドを構築した。これらをCOS7細胞に一過性に導入し、それら変異体の膜小胞への局在を指標に解析したところ、D2ドメインを2つタンデムに持つ変異体は膜小胞への強い局在を示した。またD-domainをシグナル配列を持つ分泌性タンパク質(例えばαLactoalbumin)のC末端側にD1あるいはD2-domainを単独あるいはタンデムに並んだ形で付加した場合は、予想に反して膜小胞への局在が見られなかった。ところがシグナル配列を持たないタンパク質にD-domainを付加すると一部のタンパク質が膜小胞への局在を示すことが明らかとなった。これが何に起因するのか現在解析を進めているところである。
Ataxin-2を介した神経変性疾患発症メカニズムの解明

Ataxin-2は、神経難病の発症に深く関連するがその機構は不明である。本研究では、Ataxin-2がRNA代謝に関与するとのこれまでの知見を手がかりに、その生理的・病理的機能を明らかにすることを目的として実施した。その結果、Ataxin-2がmicroRNA機能複合体RISCと相互作用していることを発見した。また、RNA結合タンパク質として直接RNAに結合していることを見出し、その標的がmRNAであることを同定した。また、Ataxin-2は標的mRNAの安定性を促進し、疾患関連変異がこの機能を減弱することを明らかにした。筋萎縮性側索硬化症(ALS)や脊髄小脳変性症(SCA)などの神経難病は、治療法が確立しておらず、病態解明が急務である。SCA2型は、Ataxin-2のポリグルタミン鎖異常伸長が原因であるが、最近になって本リピートの中等度伸長が、ALSの危険因子であることが判明し、Ataxin-2の機能破綻が、両疾患に共通した神経変性機構の根底にあると考えられる。しかしながら、Ataxin-2の生理的機能は依然として不明である。一方、我々は、Ataxin-2がmicroRNAの機能複合体であるRISCの構成因子であることを発見したことから、主にmicroRNAとの相互関係に着目しながら、その生理的機能を特定し、更にポリグルタミン鎖伸長が本機能にどのように影響するのかを明らかにするため、本研究を開始した。これまでに、Ataxin-2がmicroRNAの機能複合体RISCと結合すること、結合に必要不可欠なドメインを決定した。また、RISC複合体を重さによって分画したところ、microRNAをRISCへloadする複合体には含まれず、TNRC6Aなどと共存していた。機能アッセイを行うと、TNRC6Aが翻訳抑制に働く一方で、Ataxin-2はタンパク質発現を促進する機能を持つことが判明した。しかしながら、microRNAによる翻訳抑制自体に与える影響は軽微であったことから、互いに近接しながら、異なる機構によってタンパク質発現を制御していると考えられた。このため、Ataxin-2自体がRNA結合能を保持するのではないかと予測し、結合RNAをPAR-CLIP法で回収し、網羅的にシーケンスを行った。その結果、Ataxin-2は、mRNAの3'UTRに直接結合し、mRNAの安定性を促進していることが分かった。レポーターアッセイでは、microRNAによる翻訳抑制自体に与える影響は軽微であった。一方Ataxin-2は、mRNAの3'UTRに直接結合し、mRNAの安定性を促進していることが分かった。このため、miRNAとAtaxin-2の結合部位が近接している場合に限って、相互作用している可能性が考えられた。これとは別に、脳脊髄におけるAtaxin-2の標的を明らかにするため、現在組織中のAtaxin-2に対するCLIP法の確立を目指して、条件検討中である。SCA2型は、Ataxin-2のポリグルタミン鎖異常伸長が原因であるが、最近になって本リピートの中等度伸長が、ALSの危険因子であることが判明し、Ataxin-2の機能破綻が、両疾患に共通した神経変性機構の根底にあると考えられた。しかしながら、Ataxin-2の生理的機能は依然として不明であった。また、microRNAをRISCへloadする複合体には含まれず、TNRC6Aなどと共存していた。

一方、本年度は、主に脳脊髄におけるAtaxin-2の標的を明らかにするため、組織中のAtaxin-2に対するCLIP法の確立を目指した。4-SUをマウス腹腔に投与すると、高効率に脳に移行し神経細胞に取り込まれることが確認できた。次に、脳組織を摘出後バラバラにし、紫外線を照射して免疫沈降が可能な様々な条件を検討し、最終的に脳組織でのCLIP法が確立できた。今後、この手法を利用して脳に発現するAtaxin-2の標的RNAを決定する。Ataxin-2は、神経難病の発症に深く関連するがその機構は不明である。本研究では、Ataxin-2がRNA代謝に関与するとのこれまでの知見を手がかりに、その生理的・病理的機能を明らかにすることを目的として実施した。その結果、Ataxin-2がmicroRNA機能複合体RISCと相互作用していることを発見した。また、RNA結合タンパク質として直接RNAに結合していることを見出し、その標的がmRNAであることを同定した。また、Ataxin-2は標的mRNAの安定性を促進し、疾患関連変異がこの機能を減弱することを明らかにした。これまでにAtaxin-2をノックダウンした際のmicroRNAの機能を評価するアッセイ、Ataxin-2のmRNA内における結合部位などを同定しており、ほぼ計画通りに進捗しているため。27年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学、RNA生物学今後は、mRNAにおけるAtaxin-2とmiRNAの結合部位の相対的な位置情報をもとに解析を進める。また、マウスの脳脊髄組織を用いたAtaxin-2の標的同定を進める。これまでに、Ataxin-2の結合因子、機能アッセイによる評価、ポリグルタミン鎖伸長による影響などを評価し、これらは計画通りに進捗しているため。今後は、Ataxin-2の持つ生理的機能を、miRNAとの関連に重点を置いて、更に培養細胞レベルで解析を進める予定。
中国語学習を支援するためのデータベースの構築

今年度は主に中国語のデータベースの構築に取り組んでいた。今まで決めてきた中国語の句、節、構文の解析方針を再検討しつつ、アノテーションの一貫性の保持に力を入れた上で、解析済のデータに対して修正を行った。また、新しいデータのアノテーションも進めていた。例えば、中国語版Wikipediaに載せてある“秦始皇(始皇帝)"という条目を解析した。この条目には、707文(24, 505語)あまりの中国語データが含まれており、そのほとんどは平均30語を超えた長文である。ハードルの高い解析を挑戦することによって、本研究で採用されているアノテーション方針がさらに磨かれ、その実用性と信頼性が検証されつつ一層上昇できたと考えられる。なお、その成果の一部を二本の論文にまとめた。その一本は、まだ『中国語学第265号』に投稿中だが、もう一本の「統語・意味情報付きコーパスの開発に関する研究:中国語名詞句の解析について」という論文は、『国立国語研究所論集第17号』での掲載が決まった。また、コーパスの中のデータをより外国語教育という目的を重んじるものに変換するためのプログラムを作成するために、外国語教育の視点から中国語の各構文に関する再考察も行った。その一例として、中国語の存在表現が挙げられる。本研究は、従来中国語の学習者を困らせてきた存在表現をめぐる様々な問題(例えば、“有"と“在"の相違、存在表現における各構成要素の文法成分の決定、場所を示すために方位詞を追加する制限の強弱、など)を、中国語という大きな枠組みの中でシステマティックに考察した。これによって、中国語の存在表現の特徴がより一般的に捉えられただけでなく、それと他の文法事項との関連性や共通性も視野に入れられるようになった。なお、その成果の一部は、中国語教育学会第16回全国大会および言語科学会第20回年次国際大会で発表した。本研究は、これまで中国語の句、節、構文の解析についての研究成果を多く蓄積してきた。これにより、中国語の長文をはじめとする各種のデータを論理的でシステムティックにアノテーションしていくための土台が構築できつつあると考えられる。その下で、今後コーパスのデータの安定的な増加が予測されます。アノテーションしたデータの量が多くなるにつれて、構文解析器の精度も少しずつ向上している。本研究は、構文解析器を経過した初歩的な統語解析の結果を修正するのに大量の時間と労力を投入してきた。今後この傾向に何か根本的な改善をもたらすことができるとは到底予期しないが、パーザーの精度の向上が手修正の手間の軽減につながるということは確実だと考えられる。このプラスの循環がこれからも続いていくと思われる。研究代表者は外国語教育の現場で中国語教育に関する経験を積み重ねている。中国語学習者がいったい何を求めているのかということについての自分なりの認識を深めていると同時に、学習者のニーズに応えられるデータはどのようなものであるべきかという課題についての研究代表者自身の見解も成熟している。これは今構築しているデータベースの実用性の向上につながっていると考えられる。研究代表者は去年の10月から国立国語研究所の共同研究員になった。今後、その機関拠点型共同研究プロジェクト「統語・意味解析コーパスの開発と言語研究」のメンバーからの本格的な協力と支援が期待できる。今後これまでの解析方針をさらに磨き続け、旧データに対する修正と新データに対するアノテーションを行っていく。また、外国語教育という視点からの中国語の各表現に関する再考察も同時に進めていく。データの蓄積がある程度の量に達したら、ユーザーインターフェイスの開発に取り組む予定である。課題としては、研究代表者の現在の身分(GSICSフェロー)では、科学研究費を使ってアノテーターを雇うことが簡単にできないとこの前大学側から伝えられた。データの量を増やしていくことが本研究にとって肝心だが、アノテーション作業を実際に実施しているのが研究代表者一人だけであるという現状を変えない限り、データの量の大幅な増加が期待しにくいと思われる。今後アノテーターの安定的な雇用を実現できるよう積極的に大学側と相談・交渉していくつもりだが、もしやはり無理があるようだったら、許可できる範囲内において研究計画の適度の修正を検討する可能性もある。

本研究は、従来中国語の学習者を困らせてきた存在表現をめぐる様々な問題(例えば、“有"と“在"の相違、存在表現における各構成要素の文法成分の決定、場所を示すために方位詞を追加する制限の強弱、など)を、中国語という大きな枠組みの中でシステマティックに考察した。これによって、中国語の存在表現の特徴がより一般的に捉えられただけでなく、それと他の文法事項との関連性や共通性も視野に入れられるようになった。なお、その成果の一部は、中国語教育学会第16回全国大会および言語科学会第20回年次国際大会で発表した。本研究は、これまで中国語の句、節、構文の解析についての研究成果を多く蓄積してきた。これにより、中国語の長文をはじめとする各種のデータを論理的でシステムティックにアノテーションしていくための土台が構築できつつあると考えられる。その下で、今後コーパスのデータの安定的な増加が予測されます。アノテーションしたデータの量が多くなるにつれて、構文解析器の精度も少しずつ向上している。本研究は、構文解析器を経過した初歩的な統語解析の結果を修正するのに大量の時間と労力を投入してきた。今後この傾向に何か根本的な改善をもたらすことができるとは到底予期しないが、パーザーの精度の向上が手修正の手間の軽減につながるということは確実だと考えられる。このプラスの循環がこれからも続いていくと思われる。研究代表者は外国語教育の現場で中国語教育に関する経験を積み重ねている。中国語学習者がいったい何を求めているのかということについての自分なりの認識を深めていると同時に、学習者のニーズに応えられるデータはどのようなものであるべきかという課題についての研究代表者自身の見解も成熟している。これは今構築しているデータベースの実用性の向上につながっていると考えられる。研究代表者は去年の10月から国立国語研究所の共同研究員になった。今後、その機関拠点型共同研究プロジェクト「統語・意味解析コーパスの開発と言語研究」のメンバーからの本格的な協力と支援が期待できる。今後これまでの解析方針をさらに磨き続け、旧データに対する修正と新データに対するアノテーションを行っていく。また、外国語教育という視点からの中国語の各表現に関する再考察も同時に進めていく。データの蓄積がある程度の量に達したら、ユーザーインターフェイスの開発に取り組む予定である。課題としては、研究代表者の現在の身分(GSICSフェロー)では、科学研究費を使ってアノテーターを雇うことが簡単にできないとこの前大学側から伝えられた。データの量を増やしていくことが本研究にとって肝心だが、アノテーション作業を実際に実施しているのが研究代表者一人だけであるという現状を変えない限り、データの量の大幅な増加が期待しにくいと思われる。今後アノテーターの安定的な雇用を実現できるよう積極的に大学側と相談・交渉していくつもりだが、もしやはり無理があるようだったら、許可できる範囲内において研究計画の適度の修正を検討する可能性もある。
人工的顎裂への骨再生材料と骨髄幹細胞との混合移植による骨形成

当研究科で開発した骨再生材料であるoctacalciumphosphate(OCP)と豚皮膚由来のアテロコラーゲンとの複合体は自己修復不可能と言われる骨欠損へのインプラントで骨架橋を形成したが、組織学的所見で、僅かではあるが母床骨と異なっており、形成された骨が歯科矯正的な歯の移動に際し障害を与えることが考えられた。そこで、イヌに人工的な顎裂を形成し、顎裂部へ骨再生材OCP/Collagen埋入後、イヌ自身の骨髄穿刺液を播種した群と播種しない群とで骨形成を比較することを目的とし実験した。その結果、骨再生材料(OCP/Col)へ骨髄穿刺液を播種した群の骨形成がよりよい骨形成が得られた。本科研費による研究の前段階までの実験的研究で、当歯学研究科で開発された骨再生材料であるOCP(Octacalcium phosphate)/Collagen複合体はこれまでのラットおよびビーグル犬を使った実験において、自己修復不可能と言われる骨欠損であっても充分な骨形成あるいは骨架橋の形成が認められた。形成された骨の結晶学的検討を行なったところ、XRD(X線回折)において、母床骨と同様な組成の骨が形成されている。また、フーリエ変換赤外分光光度計(FTIR)による分光光学的検討においても、母床骨と類似したアパタイトが形成されたことが示された。しかし、形成された骨の組織切片を作製し、その組織的所見を観察すると、僅かではあるが母床骨と異なり、微小な、骨とは異なるアパタイトと思われる残留物が認められた。そのため顎裂部に本骨再生材料で骨が形成された場合、歯の移動に障害を起こす可能性が考えられることから、母床骨と同様な骨が形成されることを期待し、骨再生材料のimplant時に骨髄穿刺液を播種することにより、形成される骨の性質の改善を図ることを目的として実験を行ったものである。今回、ビーグル犬に人工的顎裂を形成し骨髄穿刺液を播種した群と播種しなかった群との経過を追ったX線学的な所見によれば、骨髄穿刺液を播種した群に、よりよい骨形成が認められていることが明らかとなっているが、組織学的所見等の詳細な所見は、今後の解析を待つことになる。(本実験にはOCP(Octacalcium phosphate)/Collagen複合体のOCP顆粒径100200μmのものを使用した)
治癒する歯内歯周病変を診断するための細菌学的検査方法の確立

エンドペリオ病変は、歯周ポケットと根尖病変が交通した疾患である。臨床的には、エンド病変から引き起こされたエンドペリオ病変は治癒しやすく、歯周炎から進展した病変は治癒しにくいといわれている。そこで、歯内病変から波及したエンドペリオ病変では、病変部にエンド由来の菌が多く、歯周病変由来の病変では、病変部にペリオの菌が多いという仮説を立て、少症例で解析したところ、術前に病変部歯周ポケットに歯周病由来の菌が多いエンドペリオ病変は「治癒しづらい」という傾向が得られた。本研究ではサンプル数を増やし、詳細に細菌叢を解析する。本研究の目的は治癒する歯内歯周病変を検査により判別できるようにすることである。
プロテインノックダウン法による活性型Ras を標的とした新規抗腫瘍薬の開発

本研究課題では、プロテインノックダウン法によって、活性型Rasタンパク質を特異的に標的するSNIPERの開発を目的とする。今回、実際に癌細胞の活性化型Rasを標的すると癌細胞の増殖が抑制され、活性化型Rasが癌治療の潜時的標的となることが示された。さらに、SNIPER作成に必須であるRas結合低分子化合物を数種類確認し、ベスタチンとのハイブリッドの合成に取りかかっている。始めに、活性化型Rasの細胞内の量を減らすことにより、癌細胞株の増殖が抑制されることを検証した。活性化型変異K-Rasを発現している培養癌細胞株群の変異K-Rasの発現をRNA干渉法で特異的に減少させることによって、これらの細胞の増殖が阻害されることが確認できた。一方、野生型のK-Rasを発現している細胞のK-Rasを減少させても増殖活性には殆ど影響しなかった。これらのことから、活性化型変異K-Rasを発現している培養癌細胞の増殖はRasに大きく依存しており、逆に正常組織の増殖におけるRas依存性は低いと考えられ、Rasはこれらの癌細胞に対する特異性の高い分子標的であることが確認できた。また、Rasに特異的に結合するリガンドをスクリーニングすることに先立って、Rasタンパク質がプロテインノックダウン法の系にのってユビキチン化され、プロテアソームによる分解に導くかどうかを検証するためのシステムを構築している。具体的には、発現ベクターを用いてタグ付きのRasを培養細胞に異所性に発現させ、そのタグに対するリガンドを用いたプロテインノックダウンシステムによって発現させたRasを分解に導くというものである。これにより、Rasに対するプロテインノックダウンの効果を前もって予測することが可能となる。さらに、現在研究協力先との綿密な打ち合わせを経て、活性化型変異RasのGTP結合部位に特異的に結合する低分子化合物を設計、スクリーニングする準備が整い、現在進行中である。rasは腫瘍全体の約3分の1で活性化変異が認められている最も普遍的な癌遺伝子であり、その産物である低分子量Gタンパク質Rasは抗腫瘍薬開発上、最も有効な分子標的の一つと考えられる。本研究課題では、Specific and No-genetic IAP-dependent Protein eraser(SNIPER)を用いたプロテインノックダウン法によって、癌細胞中の活性型Rasタンパク質を特異的に標的し、分解に導くための基盤技術を開発することを第一の目的とするため、活性型Rasに特異的に結合するリガンドの同定が必須である。これまで、種々の低分子化合物等がRasに結合することが報告されており(PNAS 109, 5299、Bioorg Med Chem Lett. 19, 4217他)、これらをリガンドとして利用できる可能性が示唆された。これらのリガンド候補をビオチン標識し、in vitro pull-down assayを行い実際にRasに結合する活性があるかどうかを検証した。そのうち、phage displayによって同定された特定の配列のペプチド(Chem Bio Chem 11, 517)や、特定の化合物(Biooreg Med Chem 5, 817)が実際にRasと結合することが確認できた。また、独自の手法でRasに強く結合するペプチド性のリガンドも一件同定している。これらのRasに結合する活性を有している化合物についてはSNIPERを作製し(一部はSNIPER化を完了している)、細胞内でRasを分解することが出来るかを検証する予定である。当初の計画よりも、リガンドスクリーニングの系の立ち上げに時間を要している。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究計画通り、リガンドのスクリーニング、リガンドとベスタチンのハイブリッド(SNIPER)の作製、および作製したSNIPERの活性の評価、1分子構造のチューニングを行う。
導電性と透光性を備えた大形の導電性ナノファイバ/樹脂薄膜の移動電界印加による試作

平成30年度は,これまで添加材として使用してきたカーボンナノチューブ(CNT)に替えて,より高い電気伝導率が得られるといわれているグラフェンを使用して,移動電界を印加して未硬化樹脂中で添加材を一方向に配列させた.作製した複合材薄膜は18 mm×18 mm×0.05 mmサイズで,作製した薄膜の電気伝導率と光の透過率を測定した.グラフェンの樹脂中での分散性の向上のために,界面活性剤トリトンXを使用した.グラフェンと紫外線硬化性樹脂の懸濁物を作製し,これを,ハンドスプレーガンを使って,スライドグラス上に均一に広げた.懸濁物をコートしたこのスライドグラスを多重電極の上に置いた.多重電極では,幅0.2 mmの細長い直線状電極24本が1.2 mmの間隔で平行に並んでいる.この多重電極に60°ずつ位相が異なる±300Vの六相矩形波電圧を印加し,懸濁物に移動電界を加えた.実験では,グラフェンの重量含有率0.1 wt%0.5 wt%の範囲で行ったが,どの重量含有率でも一方向にグラフェンが連結して配列した.波長λが400nm800nm,いわゆる可視光の範囲でグラフェン無添加と添加した試験片の各波長λでの光の強さの比を平均して光の透過率の減少率Tを算出した.グラフェンの重量含有率の増加とともに光の透過率の減少率Tは指数関数的に減少するといえた.と連なったグラフェンの束と束の間隔が狭くなり,光が通過できる領域の割合も小さくなることがわかる.グラフェンの重量含有率が増加するにしたがって光の透過率が減少するのは当然であろう.電気抵抗率ρも測定したが電気伝導度を有するとはいえないレベルであった.CNTを添加材とする複合材の作製,および電気的,光学的特性の検討についての結果をまとめ「材料」に投稿し,平成30年度掲載された.また,より大形の導電性ナノファイバ/樹脂薄膜の作製方法についての理論的検討も行い,論文を作成し,「日本機械学会論文集」に投稿した.現在,研究実績の概要にも記したようにグラフェンを未硬化樹脂中で一方向に連結させた複合材を作製することに挑戦中である.現在はグラフェンを樹脂中に分散させるために,界面活性剤を使用している.最初に使用した樹脂の分子量の大きさのために,グラフェンを一方向に配列できても,グラフェン同士の間の分子量の大きな樹脂が入り込みグラフェン間の距離が大きくなって,作製された複合材に電気伝導性が発現しなかったと考えた.しかし,より分子量が小さな樹脂を使用して同様な方法で複合材を作製しても電気伝導性は発現しなかった.界面活性剤の使用が問題であるかもしれない.そこで,グラフェンに替えて還元酸化グラフェンを添加材として使用して,複合材薄膜を作製する計画である.樹脂との親和性は酸化グラフェンがグラフェンに比べて圧倒的に高い.しかし,酸化グラフェンが安定な素材であり,電気伝導性の発現には添加後に樹脂中で還元する必要がある.この還元の実施は現有設備では難しい.そこで酸化グラフェンほどではないが,ある程度の樹脂との親和性を持つ還元酸化グラフェン購入して添加材として使用する.現在までの進捗状況に記した事項を実施し,結果を論文としてまとめることが大きな課題である.また,一方向に連結したグラフェンの状態を画像解析することも計画している.グラフェンの重量含有率を増加させると連結したグラフェンの束は太くなり,また束の数も増加する.この状態を解析し,グラフェンの連結の過程の解明の一助になればと考えている.平成29年度は,(1)申請者がこれまでに作成したCNT/樹脂複合材薄膜でのCNTの分散性は必ずしも良好とはいえないこと,(2)懸濁物をコートしたカバーガラスの面を前面とすれば,移動電界をカバーガラスの背面から印加しており,コートされる物体が厚い場合は従来の手法は適用できないことの二つの問題に対しての解決策を検討した.CNTの分散性の問題については,CNTを界面活性剤で処理することにより,分散性の向上を図った.また,懸濁物上方より移動電界を印加する方法について検討した.実際には,スライドガラス上にCNTと未硬化の紫外線硬化性樹脂の懸濁物をコートし,多重電極をコート面と向かい合わせの位置に配置して,懸濁物に移動電界を印加した.樹脂を硬化させたのちに,複合材薄膜の電気抵抗率を測定するとともに,分光器を用いて複合材薄膜の光の透過率も測定した.得られた主な知見は以下のとおりである.(1)CNTを界面活性剤で処理することにより樹脂中でのCNTの分散性は向上した.このため,重量含有率で0.1 wt%と少量の添加でも電気抵抗率の低下が確認できた.しかし,CNT表面に存在する界面活性剤が障害となるためか,それ以上CNTを添加したときの電気抵抗率の低下の割合は,未処理のCNTを添加し,同一の電界印加形式を使用したときに比べて小さかった.(2)コートされる物体の厚さの制限を外すために,懸濁物上方より移動電界を印加する形式を試した.懸濁物中のCNTは電界の移動方向にある程度配向した.残念ながら,電気抵抗率の低下の割合は,従来型の移動電界印加方式に比べ小さかった.電気抵抗率の低下の割合が小さかった原因の説明と,解決策の提示を行った.

(3)従来型と新方式のそれぞれの移動電界印加方法で作製した複合材の光の比透過率を測定した.CNTの含有率の増加とともに光の透過率の減少率は指数関数的に低下した.CNTを添加材とする複合材の作製,および電気的,光学的特性の検討については,「研究実績の概要」に記したとおりであり,その結果をまとめて「材料」に投稿し,すでに掲載可の通知を受けている.現在,添加材をグラフェンに変更して未硬化樹脂中でCNTを一方向に連結させるのと同様の手法で複合材を作製することに挑戦中である.この方法により,凝集したグラフェンの塊を一方向に長く伸ばした形式にすることが可能であることがわかっている.光学顕微鏡により,複合材中にこのように繊維状に凝集したグラフェンが何本も観察されている.また,透光性に関しては,CNTより少ない量の添加でなければ同等の透光性が得られないこともわかっている.ただし,実験に用いた未硬化樹脂の分子量が大きかったためか電気伝導性の発現には至っていない.今回の実験に使用した樹脂は低粘度に分類されるもので,グラフェンの配列しやすさを狙ってこれを使用している.これはCNTと混合して電気伝導性が発現した樹脂とは異なる.電気伝導性が発現しない問題の解決のために,(1)電気伝導性が発現に実績のある樹脂を使用する,(2)電界印加形式を工夫することにより,グラフェンをより強固に配列させる,の両方にチャレンジする計画である.平成30年度は,これまで添加材として使用してきたカーボンナノチューブ(CNT)に替えて,より高い電気伝導率が得られるといわれているグラフェンを使用して,移動電界を印加して未硬化樹脂中で添加材を一方向に配列させた.作製した複合材薄膜は18 mm×18 mm×0.05 mmサイズで,作製した薄膜の電気伝導率と光の透過率を測定した.グラフェンの樹脂中での分散性の向上のために,界面活性剤トリトンXを使用した.グラフェンと紫外線硬化性樹脂の懸濁物を作製し,これを,ハンドスプレーガンを使って,スライドグラス上に均一に広げた.懸濁物をコートしたこのスライドグラスを多重電極の上に置いた.多重電極では,幅0.2 mmの細長い直線状電極24本が1.2 mmの間隔で平行に並んでいる.この多重電極に60°ずつ位相が異なる±300Vの六相矩形波電圧を印加し,懸濁物に移動電界を加えた.実験では,グラフェンの重量含有率0.1 wt%0.5 wt%の範囲で行ったが,どの重量含有率でも一方向にグラフェンが連結して配列した.波長λが400nm800nm,いわゆる可視光の範囲でグラフェン無添加と添加した試験片の各波長λでの光の強さの比を平均して光の透過率の減少率Tを算出した.グラフェンの重量含有率の増加とともに光の透過率の減少率Tは指数関数的に減少するといえた.と連なったグラフェンの束と束の間隔が狭くなり,光が通過できる領域の割合も小さくなることがわかる.グラフェンの重量含有率が増加するにしたがって光の透過率が減少するのは当然であろう.電気抵抗率ρも測定したが電気伝導度を有するとはいえないレベルであった.CNTを添加材とする複合材の作製,および電気的,光学的特性の検討についての結果をまとめ「材料」に投稿し,平成30年度掲載された.また,より大形の導電性ナノファイバ/樹脂薄膜の作製方法についての理論的検討も行い,論文を作成し,「日本機械学会論文集」に投稿した.現在,研究実績の概要にも記したようにグラフェンを未硬化樹脂中で一方向に連結させた複合材を作製することに挑戦中である.
CKD-MBD治療戦略における新しい腸管リン制御の展開

我々は、腸管リン代謝に腸型アルカリホスファターゼ(IAP)が関与すると仮定し、その役割を解明するために腸ALPノックアウトマウスの解析を行った。腸ALPノックアウトマウス小腸上部におけるALP活性の低下を確認した。IAPノックアウトマウスは野生型マウスと比較し、腎臓24水酸化酵素の発現が減少し、血中の活性型ビタミンD濃度は上昇していた。更に、腎臓NaPi発現及びリンの取り込みは両マウスで変化は認められなかったが、腸管Npt2bはIAPノックアウトマウスで有意に減少、小腸でのリンの取り込みも低下していた。本研究において、腸ALPが腸管リン代謝に関与することが明らかとなった。慢性腎臓病(Chronic Kidney Disease:CKD)における高リン血症は、血管石灰化に関与することから、CKD患者における生命予後を左右する重大な因子であり、生体内リン管理は特に重要視されている。さらに、近年新しい調節因子の登場により、リン代謝研究は進歩し、新たな概念が登場した。生体内リン代謝調節に大きな関わりをもつ臓器は入り口となる腸管(感知、調節)、最終調節をする腎臓、貯蔵する骨である。それに加えリン利尿因子PTHを分泌する副甲状腺やFGF23を分泌する骨は生体内リン濃度を感知する臓器とも考えられる。腸は体内にリンを取り入れる臓器であるが、真っ先にリンを認識する臓器であるとも考えられる。そこで我々は、腸(消化管)は栄養素であるリンを取り入れる臓器であるだけでなく、食事性のリンを感知する臓器であると提唱する。最終的にはこの場でリンを感知し体内へシグナルを出す第一の感知器官であることを証明するために本研究を進めている。計画、方法の概要;食事タンパク質に含まれる有機リン、ポリリン酸から無機モノリン酸遊離過程における腸管アルカリフォスファターゼ(Akp3, Akp6)の関与と細胞間隙およびNaPi-2bが関わる腸管リン吸収とのクロストークをvivo, ex vivo実験を駆使し証明する。平成26年度の検討;解析は主にAkp3KOの解析を中心に行った。Akp3は、マウス腸管上部に局在する。Akp3KOマウスを解析した結果、腸管リントランスポーターNaPi-2b発現低下と共に、リン輸送の有意な低下が認められた。また、副甲状腺ホルモンおよび活性型ビタミンDの有意な上昇が認められ、Akp3は正常なリン代謝に必要な因子であることが明らかとなった。そこで我々は、腸は栄養素であるリンを取り入れる臓器であるだけでなく、食事性のリンを感知する臓器であると提唱する。平成27年度の検討;Akp3ノックアウト(KO)マウスにおけるアデニン誘発腎不全モデルを作製したところ、野生型と比較して腎機能低下の進行が緩和した。これは、Akp3KOマウスの腸管NaPi-2b低下によるものが関与することが示唆された。野生型マウスと比較してAKP3KOマウス腎不全モデルは腎機能低下の進行が有意に緩やかである。血中クレアチニンおよび血中リン濃度の上昇が野生型腎不全モデルと比較して、AKP3KOマウス腎不全モデルでは、有意に低い。これは、腸管リン吸収抑制が関与していると思われる。平成28年度は、これまでの結果基盤としてAkp3ノックアウトマウスの腸管リン吸収機構について経細胞輸送および細胞間隙輸送メカニズムについて検討を行った。

コントロールマウスと比較してAkp3ノックアウトマウスの経細胞輸送系においてリン輸送の有意な低下が認められたが、細胞間隙輸送を伴う輸送解析では変化は認められなかった。これは、代謝ケージを用いた糞中リン排泄量のデータ、血清リンデータと合致する。NaPi-2b発現低下を伴うAkp3ノックアウトマウスは、腎臓病に対する耐性をもつことから腸管アルカリフォスファターゼは、その有無により腸管のみならず生体内全体のリン代謝に影響を及ぼすことが示唆された。我々は、腸管リン代謝に腸型アルカリホスファターゼ(IAP)が関与すると仮定し、その役割を解明するために腸ALPノックアウトマウスの解析を行った。腸ALPノックアウトマウス小腸上部におけるALP活性の低下を確認した。IAPノックアウトマウスは野生型マウスと比較し、腎臓24水酸化酵素の発現が減少し、血中の活性型ビタミンD濃度は上昇していた。更に、腎臓NaPi発現及びリンの取り込みは両マウスで変化は認められなかったが、腸管Npt2bはIAPノックアウトマウスで有意に減少、小腸でのリンの取り込みも低下していた。本研究において、腸ALPが腸管リン代謝に関与することが明らかとなった。KOマウスの解析等おおむね順調に進展している。今後は、AKP3の欠損によりなぜ腸管リン吸収が低下するかそのメカニズムを追求する。また、27年度に検討した高リン血症を伴う腎不全モデル以外に緩やかに腎機能が低下する他のモデルにおいてもAKP3の無いことで腎機能低下進行抑制効果を示すか検討したい。しかしながら、まず腸管培養細胞であるCaco-2、C2BB、T-84、Int407、HT29等を用いてin vitro研究を行う予定である。上記培養細胞において、AKP3とそのホモログの発現、腸管リントランスポーターの発現している細胞を選択し、AKP3発現抑制によるリントランスポーター抑制のシグナルを探索する。分子腎臓栄養学今後は、更に詳細なメカニズム解明を進める。とくにAkp3が、腸管リン代謝に影響を持つことから、Akp3と腸管リン代謝との関わりを追求する。3月中納品だが、支払い処理が4月の為3月中納品だが、支払い処理が4月の為