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種々の超低温保存が家畜および実験動物の未受精卵の染色体に与える影響について

本研究は、家畜および実験動物の未受精卵子の超低温保存が染色体に与える影響について明らかにすべく計画された。平成6年度においては、マウス未受精卵子を用いて研究を行った。この際、当研究室で飼養している転座染色体をホモに有するマウスを精子提供用マウスとして用い、受精時の第1分割期において卵子由来の染色体グループと精子由来の染色体グループを明確に識別し、超低温保存が未受精卵子の染色体に与える影響について詳細に検討した。その結果、耐凍剤のDMSO(Dimethylsulphoxide)は、卵子染色体の構造的異常を引き起こす可能性が高いこと、Propylene glycolは耐凍剤としての効果は低いが、染色体の構造的異常を引き起こす可能性が低いこと、また、凍結融解操作という物理的な障害によっても卵子染色体の構造的異常が引き起こされることが明らかとなった。平成7年度では、牛未受精卵子の超低温保存を種々の方法を用いて検討したところ、DMSOとPropylene glycolの混合使用がDMSOやPropylene glycolの単一使用より適していることが明らかになった。次に、超低温保存後に融解した牛未受精卵子を通常の体外受精に用いている精液によって体外受精させたところ、受精率(2細胞への分割率:1632%)および胚盤胞への発生率(05%)は、凍結融解を行わない新鮮卵子に比べて有意に低いものであった。さらに、体外受精後、第1分割期の染色体を観察し、超低温保存の卵子染色体への影響について追求すべく実験を行ったところ、多倍体の発生率は、顕著な差ではないものの凍結融解卵子において高いという結果であった。また、DMSOとPropylene glycolの混合使用により凍結融解した卵子において、構造的異常の染色体が観察されたが統計的に有意ではなかった。最近、哺乳動物における未受精卵子の超低温保存の研究が緒に付いているが、その細胞遺伝学的安全性に関しての検討は十分ではない。卵子を超低温保存した際の卵細胞質および核質への物理的、構造的影響、特に、遺伝子の担体である染色体への影響として、染色体の不分離による数的異常や構造的異常の発生が懸念される。これらは体外受精およびその後の胚の発生に多大な影響を与えるものであり、詳細な検討が必須と考えられるが、研究報告は数少なく、国内では殆ど皆無であった。本研究においては、転座染色体を有する雄マウス、雄牛の精子を用いて卵子由来および精子由来の染色体グループを明確に識別し、超低温保存が未受精卵子の染色体に与える影響について詳細に検討することによって、マウスおよび牛未受精卵の超低温保存法を細胞遺伝学的見地から検討し、配偶子および胚の凍結法の実用化に貢献しうるものと考えた。本年度は、マウス未受精卵子を凍結融解後、転座染色体をホモに有する雄の精子を用いて体外受精させ、第1分割期において卵子由来および精子由来の染色体グループを明確に識別し、超低温保存が未受精卵子の染色体に与える影響について詳細に検討した。その結果、凍結融解後の体外受精によって、未受精であった卵子の染色体に構造的異常が観察された。しかし、受精率がまだ低く例数も少ないことから、統計的検討を行うまでは至らず、さらに例数の蓄積が必要と考え、現在研究を進行中である。また、家畜卵子への応用として同様の実験を牛未受精卵子を用いて行うために、まず、牛体外受精卵における第1分割期染色体の検出について検討し、方法の確立を行うことができた。

来年度は、牛においてマウスの場合と同様に転座染色体を有する雄牛の凍結精液を用いて体外受精後、第1分割期の染色体を観察し、超低温保存が卵子染色体へ与える影響について追究する予定である。平成7年度においては、平成6年度のマウスでの実験結果を踏まえ、牛未受精卵子の染色体における超低温保存の影響を明らかにすべく、以下の実験を行った。1.牛未受精卵子の超低温保存法の技術的検討平成6年度のマウス未受精卵子と同様、牛未受精卵子を種々の方法によって超低温保存し、融解後の正常性について検討したところ、牛未受精卵子の超低温保存の技術としては、DMSOとPropylene glycolの混合使用がDMSOやPropylene glycolの単一使用より適していることが明らかになったが、現在融解後の卵子の正常性および受精率の更なる向上を目指して、Propylene glycolと他の耐凍剤の2段階使用の方法を検討している。2.超低温保存後に融解した牛未受精卵子の体外受精成績超低温保存後に融解した牛未受精卵子を通常の体外受精に用いている精液によって体外受精させたところ、受精率が1632%と低く、また胚盤胞への発生率も05%と低いものであった。3.牛未受精卵子の体外受精後の第1分割期胚の染色体標本作製第1分割期の染色体検出については、高い分析率を得ることのできる方法を確立し得たが、受精率が極めて低いため十分な分析数が得られていない。なお、卵子由来染色体グループと精子由来染色体グループを識別するために、転座染色体を有する雄牛の凍結精液を利用するつもりであったが、現在のところ凍結融解した未受精卵子の受精率があまりに低いため、転座染色体を有した雄牛の精子では、より受精率が低下することが明らかなことから、この転座染色体を有する精子の利用を控えている。受精率がもう少し向上した時点でこの精子を用いて、卵子の染色体異常について詳細に検討する予定である。
幹細胞含有細片化脂肪組織を用いた新規再生治療と製造デバイスの開発

脂肪由来幹細胞(ASC)は再生医療の細胞ツールとして、期待されている。しかし、ASCの細胞移植は酵素処理や培養が必要であり、法規制や安全性の問題があるため、まだ実用化は広がっていない。本研究では、ヒト脂肪組織由来の微小細片化組織(Micronized cellular adipose matrix; MCAM)、すなわちASC細胞を含有する細片化脂肪組織の製造技術を最適化して、その製造デバイスを開発するとともに、MCAMの治療ツールとしての有用性、安全性について、動物疾患モデルで検証する。
バクテリオファージの構造形成と感染機構

X線結晶構造解析と電子顕微鏡画像からの三次元像再構成の手法を組み合わせることにより、構造変化前後のT4ファージ尾部基盤におけるすべてのサブユニット蛋白質の局在を明らかにすることが出来た。その結果、感染における基盤の大きな構造変化をサブユニット蛋白質の相対的な位置の変化として理解できるようになった。また、新しい手法を用いた分子集合の研究から、基盤ウェッジの絶対逐次的分子集合はサブユニット蛋白質の誘導適合に基づくものであることが示された。本研究は、T4ファージを対象として、分子集合機構および感染過程における各部品蛋白質の協同的役割、即ち作動原理を分子・原子レベルで明らかにしようとするものである。本年度の成果は下記の通りである:1.T4ファージ基盤ハブ複合体及び各構成成分の単離ハブ(基盤中心部)の形成に関与する6つの蛋白質のうち、gp5,gp27,gp29(ものさし蛋白質)は構造体に組み込まれていることが明らかだが、gp51は触媒的に関与することが知られている。しかし、残りのgp26,gp28の機能は不明である。gp28は膜蛋白質であるという報告があり、大量発現すると膜画分に見いだされるので、可溶化について検討する。申請する多角度光散乱検出器は精製した蛋白質の溶液中でのサブユニット構造についての重要な情報を迅速に得るために用いられる。2.テイルリゾチーム変異体Ser351Leuはプロセッシングを起こさない変異株である。野生株ではプロセッシングの起こるSer351-Ala352近傍の約15残基の電子密度が得られなかったが、本変異体を結晶化してX線結晶構造解析解析を行った結果、すべての残基の電子密度を求めることが出来た。その結果、リゾチームドメインの基質認識部位が隣のサブユニットからのペプチドで占拠されているのはプロセッシングの結果ではないことが分かった4.MuファージgpPの結晶化と構造解析。Muファージの尾部基盤蛋白質gp44(gpP)の結晶化に成功した。既に結晶構造解析の予備的な結果も得られている。驚いたことに、3量体gp44の構造はこの蛋白質とはほとんど相同性のないT4ファージのgp27の構造に酷似した円筒状の構造であることが明らかになった。本年度の成果は下記の通りである:1.T4ファージものさし蛋白質gp29の単離gp29は「ものさし蛋白質」で、尾部の長さの決定に関わる蛋白質である。本蛋白質は発現量が低く、プロテアーゼ感受性と考えられ、若干発現するものの短時間で消失する。この蛋白質のN末端にHis-Tagを付加するとプロテアーゼによる切断を防ぐことができたので、この蛋白質を発現させ、イオン交換、ゲルろ過によって少量の試料が精製できたので、現在超遠心分析による性状解析を進めている。2.T4ファージ基盤ウェッジ蛋白質gp7の単離と性状解析gp7は基盤蛋白質の中でもっとも大きい蛋白質(1,032残基)で、恐らくC末端側に膜貫通ドメインと思われる領域があって、そのため凝集しやすく、精製が困難であったが、1Mアルギニン存在下で精製し、徐々にアルギニン濃度を下げることによって可溶化できることが分かった。現在、結晶化のための精製を進めている。3.gp13及びgp14の精製と性状解析gp13とgp14はネックを構成する蛋白質で頭部形成の最終段階で結合し、尻尾との結合部に存在すると考えられる。両蛋白質は超遠心分析の結果、単独では単量体として存在すること、また両者を混合するとgp13:gp14=1:2の比率で結合することが分かった。ウェッジ(基盤周辺部)を構成する7つの蛋白質のうち、gp10ははじめにgp11またはgp7と結合する。Gp10のプロテアーゼによる限定水解をgp11存在下と非存在下で行ったところ、gp11存在下では保護される切断部位が存在することが分かった。この結果から安定で結晶化に適したヘテロ6量体が作成できる見通しがついた。2.Gp7の精製gp7についてこれを可溶性画分として精製する方法が確立した。この方法を用いてgp7を精製し、結晶化の条件をスクリーニングしたが、まだ結晶は得られていない。同時に、プロテアーゼ限定水解の実験から、切れやすいリンカーと思われる切断箇所を明らかにすることができた。この箇所はドメインのつなぎ目の可能性が高い。3.T4ファージネック蛋白質gp13およびgp14の結晶化ネック蛋白質gp13およびgp14の精製方法が確立し、かなりの収量で両蛋白質を精製する見通しがついた。

両蛋白質とも単独では単量体として存在するが、0.8M硫安存在下で濃度で(gp13)_<10>(gp14)_5複合体を形成することが明らかになった。今後、両蛋白質単独、または複合体の結晶化を試みる。4.gp34Nの大量発現とgp9との複合体の結晶化3種類のC末端欠失蛋白質gp34Nを発現するプラスミドを作成し、このうち、2つの紺ストラクトの発現および精製に成功した。現在、それらの結晶化およびそれぞれのC末端欠失蛋白質とgp9との複合体の結晶化を行っている。1.T4ファージ基盤ウェッジ複合体及び各構成成分の単離:ウェッジ(基盤周辺部)を構成する7つの蛋白質のうち、gp7についてこれを可溶性画分として精製することができた。この方法を用いてgp7を精製し、gp7存在下と非存在下でgp10およびgp10-gp11複合体のプロテアーゼ限定水解を行ったところ、gp7自体はプロテアーゼ感受性であったが、gp7の結合によってgp10は全くプロテアーゼ抵抗性になることが分かった。さらに、gplOに結合してgp10をプロテアーゼ抵抗性にするのはgp7のC末端144残基であることが明らかになった。現在このドメインとgp10との複合体の結晶化を進めている。2.T4ファージネック蛋白質gp13およびgp14の結晶化:ネック蛋白質gp13およびgp14の精製方法が確立し、両蛋白質を高純度で精製することが出来た。両蛋白質は水溶液中で結合しなかったが、0.8M硫安中では16.6Sの均一な複合体を形成し、SDS-PAGEのバンドの強度比から、(gp13)_<10>(gpl4)_5のサブユニット構造を持つことが分かった。また、電子顕微鏡画像から得られたリング状の構造はファージの電子顕微鏡画像からの三次元再構成像の大きさと一致した。3.gp34Nの発現・精製と結晶化:C末端を欠失した二種類の蛋白質gp34^<N325>F and gp34^N459F (FはC末端に融合したフォールドン)の発現および精製に成功した。両蛋白質は5.4Sおよび6.2Sの沈降係数をもち、分子量から三量体を形成していることが確認された。現在、結晶化を進めている。1. T4ファージ基盤ウェッジ複合体及び各構成成分の単離gp6のC末端にHis-Tagを付加した蛋白質にgp10, gp7, gp8をそれぞれ別々に発現させた溶菌液を混ぜて複合体を調製したところ、流体力学的に均一な複合体であることが判明し、超遠心分析、SDS-PAGEの結果、複合体は(gp10)_3(gp7)_1(gp8)_2(gp6)_2であることが判明した。ここに、gp53を添加すると、さらに大きな複合体を生じた。この超分子複合体を電子顕微鏡で観察したところ、6回対称の均一な基盤様構造体であることが判明した。超遠心分析の結果、この巨大複合体は沈降係数43.7S、分子量は約3.4×10^6であり、gp6までの複合体が6個集合して生じた複合体[(gp10)_3(gp7)_1(gp8)_2(gp6)_2]_6と仮定した結果と一致することが分かった。2. T4ファージspackle蛋白質(gp61.3)とテイルリゾチームgp5の単離と結晶化T4ファージの溶菌阻止の機構を明らかにする目的で、この現象に関与することが知られているspacke蛋白質(Sp)の大量発現系を構築した。
上側頭溝内皮質における視覚情報処理

下側頭葉皮質の回部にあたるTE野の細胞の多くは、物体の部分的特徴に対してかなり鋭い選択性を持って反応し、似た図形に応答する細胞は集まってコラムを形成していることを我々は過去に報告した(Fujita et al., Nature, 360,343-346,1992)。ところが、別研究グループによれば、下側頭葉皮質の細胞の60%が、彼らの呈示した5つの図形のいずれかに対して反応を示し、反応の選択性はあるものの非常に低く、個々の細胞の反応は、アスキーコードにおけるビットのようなもので、それだけでは、何らの意味ある情報と成り得ないとしている(Gochin et al., J. Neurophysiol., 71:2325-2337,1994)。この結果の食い違いの原因には、1)記録部位の違い(TE野に記録を限っているか、上側頭溝下壁をも含んでいるか)、2)サルが麻酔下か覚醒下か、3)ナイーブなサルか強い学習負荷をかけたサルかのいずれかがあると考えられる。本研究では、第一の可能性を検討する目的で、40個の図形刺激に対するTE野と上側頭溝下壁の細胞の視覚反応性を比較した。両者の間には、上記の結果の違いを説明するような刺激選択性の差異は見いだされなかった。現在、同時進行中の、麻酔下と覚醒下の比較においても、上記の食い違いを説明する現象は見いだされず、我々は、学習により、下側頭葉皮質の細胞の視覚反応性に大きな変化を及ぼしていることが、2つの研究の結果の差を説明するのだと考えている。
プロジェクトのコストマネジメントシステムの開発

本研究の目的は,管理会計領域においてこれまでほとんど研究がなされてこなかったプロジェクトに着目し,コストマネジメントシステムを開発するための基礎的研究を行うことである。プロジェクトの代表例として,新製品や新システムの開発プロジェクトがあげられ,成否が企業の命運へと繋がることも多いことから,プロジェクトのコストマネジメントシステムの開発に関する基礎的研究を行うことは意義があるものと思われる。この目的を達成するために,第一ステップとしてコストマネジメントシステムの検討,第二ステップとして検討したコストマネジメントシステムの効果検証の二つのステップを踏むことを予定している。
金属との複合化による木質由来炭素の高・多機能化-メソ細孔を有する高結晶炭素の製造

酢酸ニッケルと酢酸カルシウムの所定量を水溶液含浸で添加したカラマツを縦型石英管中で種々の昇温速度、種々のヘリウム気流中で700-900°Cに加熱し、0-2.0時間保持し、これら反応因子が得られた炭化物の炭素の結晶性(T成分の生成)と細孔構造にどのような影響を及ぼすのか、副生する液体、気体生成物の収率や組成、性状がどのように変化するのかを調査した。その結果、カルシウム非共共添加のニッケル2%担持、昇温速度10°Cmin^<-1>、ヘリウム流量11.6-23.2mlSTPcm^<-2>min^<-1>、850-900°Cで1-1.5時間保持の条件で結晶性のメソ孔炭素(高い導電性と液相吸着能を有する二元機能炭素)が効率よく生成することがわかった。また、メソ細孔はBET表面積の減少を伴いT成分の生成と並行して発達することが明らかになった。このメソ細孔、BET表面積、T成分の問の密接な関係は、T成分の生成がミクロ孔のメソ孔への合体を引き起こすことで説明された。また、この二元機能炭素が生成する条件では、副生する液体が軽質化して酢酸生成量が増加し、気体中の可燃分特に水素が著しく増加することから、このニッケル触媒炭化は木材(木質系バイオマス)のエネルギー+マテリアルの同時生産を可能とする画期的な熱化学的転換法であることが確認された。さらに、結晶性メソ孔炭素の実用製品化を想定してリグニン炭素の微粉化-酸洗浄を行ったところ、炭素の結晶性とメソ細孔性は大きく向上した。従って、炭化-微粉化-酸洗浄という一連の工程を経ることでこの二元機能炭素の付加価値は一層高まり、高分子物質の選択的吸着・除去用の高性能炭素電極として用途が呈示された。無処理(UT)及びカルボキシメチル化(CM)したカフマツ木粉に所定量の酢酸ニッケルと酢酸カルシウムを水溶液含浸で添加し、これをステンレス容器に入れて縦型石英反応管に移し,He気流中で室温から900°Cまで10°C/分で加熱した。この間に生成した液体は氷水トラップに,気体ばガスバックに捕集し,液体の性状についてはGC-MS, IR, NMRスペクトル測定を行って分析し,気体についてはGCで組成を調べた。残渣炭化物については,重量を測定した後XRD, SEM-EDX測定を行い,表面積と細孔構造を調べた。その結果,UTへのNi添加は油分(アセトン可溶水不溶)を減少させて可燃ガス成分,特に水素の生成量を著しく増大させた。また,炭化物炭素の結晶子の厚み(Lc)は大きく増大し,表面積の変化は小さかったが,メソ細孔(2-50nm)の割合は増加した。従って,単にニッケルを添加するだけでも,メソ細孔を有する結晶炭素の製造は可能であることがわかった。一方,CMへのNi添加では,UTのそれより油分が減少し,可燃ガス成分,特にCOが増加した。これば油分のガス成分への分解が促進されるためであり,油分中の酢酸生成割合が増加することから,化学改質前処理が油の組成改善につながったことを示している。油組成NiとCaの共添加によってさらに改善され,COとCH4の生成量も増加したが,Ca量の増加は結晶炭素生成とメソ細孔の出現を抑制した。適量のCa共存ではLcの増加とメソ細孔の発達が認められことから,このCM木材のニッケル触媒炭化では機能性木炭の製造と同時高品質の油,ガスの生産が可能となることが示された。

無添加(None),Ni添加(Ni),Ni+Ca添加(Ni+Ca)木材を昇温速度10°C/minとしてHe気流中700,750,800,850,900°Cで1h炭化し,液体,気体の生成及び炭化物の表面積,細細孔構造,炭素の結晶性を調査した。Ni2%はNoneよりH2とC02発生量が多く(それぞれ1.6,1.2倍),油分(液体生成物中のアセトン可溶分)は900°Cでは多く,油分中の酢酸割合APは温度にかかわらず高かった(Noneは6-7%,Ni2%は8-9%>。また,Ni2%炭はNone炭よりBET表面積SAは小さい(None炭は700-900°Cでほぼ400m2/g,Ni2%炭は700,800,900°Cでそれぞれ400,320,160m2/g)が,メソ細孔割合MPP(直径2-50nmのメソ細孔の占める体積と全細孔容積の比)が高く(None炭は700-900°Cで60-45%,Ni2%炭は850,900°Cで約95%),850と900°Cでは結晶炭素(T成分)が生成した。Ni4%ではNi2%よりH2とC02発生量が僅かに増加し,APは11-12%まで増加したが,SA, MPP, T成分の発達には大差はなかった。一方,Ni2%+Ca1%のH2とC02発生量はNi2%の1.1-1.2倍で,APは16-20%であり,900°CのNi2%+Ca1%炭のT成分の発達は同温度のNi2%より劣るが,SAは大きくMPPは96%であった。Ni4%+Ca2%はNi2%+Ca1%とSA, MPP, T成分の発達はほぼ類似であったが,H2発生量はNi2%+Ca1%の1.2倍で,APは30-44%と非常に高かった。以上の結果から,Ni単独添加でもH2発生量とAPの増加,MPPの増大を伴うT成分の生成が観測されるが,Caの共添加は,熱分解域を800°C以上の高温に移行させることで標記目的のメソ細孔とT成分の同時選択的発達を可能とした。Ni触媒炭化によって結晶性でメソ孔を有する炭素(導電性で液相吸着能の高い二元機能炭素)を選択的に調製するための適正条件を明らかにするため、炭化温度、Ni量、Ca共添加量、He気流量、昇温速度、保持時間等の影響について調べた。その結果、T成分を生成し、メソ孔割合が高い炭化物を与える温度は850-900°Cであり、Ni添加量は2%で十分であった。また、この温度域におけるCa共添加量の増加はT成分とメソ孔の生成を共に抑制した。このことから、T成分の形成とメソ孔の発達は密接な関係を有することが確認された。さらに、メソ孔の発達は、BET表面積を減少させ、BET細孔容積を減少させることから、主としてミクロ孔の合体によることが示唆された。He流量については、T成分とメソ孔の生成割合を最大とする適正量が出現した。このことは炭素表面における発生ガスの拡散挙動が重大な影響を及ぼすことを示している。昇温速度の変化は調査した範囲では重大ではなかったが、保持時間の延長はT成分、メソ孔の生成に有利であった。このことは炭素内部の熱伝導が反応促進に関与し、それだけ炭素の熱伝導の低さを物語っている。即ち、本研究ではセパレーター、キャパシター等への応用が可能な高性能炭素電極用炭素の製造を目指しており、このような高付加価値の二元機能炭素が適正条件のNi触媒炭化によって簡単に製造できることを明らかにしたことは工業的に大きな意義がある。また、T成分の形成とメソ孔の発達との高い相関性は学問的に興味深い新知見であり、今後そのメカニズムを詳しく調査することが炭素機能化の新ルート開拓につながると期待される。
メルケル細胞の細胞生物学的特性の研究-特に毛嚢メルケル細胞の機能について

メルケル細胞は1875年にF.Merkelから発見された。その後、数多くの研究の蓄積にもかかわらずメルケル細胞の機能や発生学的起源、あるいは分化のメカニズムについても未だ不明な部分が多い。毛盤にはメルケル細胞が比較的多数存在するため、メルケル細胞の生物学的研究にとって毛盤に局在するメルケル細胞は有用である。毛周期の活動期・退行期・休止期それぞれへの誘導因子や抑制因子、修飾因子が見つかっているものの、そのメカニズムについては解明されていない。ところがマウスを使用した実験で毛盤のメルケル細胞と毛周期との関連が報告された。そこで今回はラットを使用して、毛盤のメルケル細胞と毛周期との関連を調べた。まずマウスの背部の皮膚を抜毛し、抜毛後0,1,3,5,8,12,17,18日の表皮シートを作成して毛盤のメルケル細胞数の変化を調べたところ、毛周期によるメルケル細胞数の変化を認めた。つまり、depilationにより毛周期の調整が行われたマウスにおいて毛盤のメルケル細胞の増減が観察された。次に、毛盤に存在するメルケル細胞の毛周期に伴う数の変化を、ラット背部の皮膚を材料として表皮シートを作成し、3次元的に観察した。胎生18日から生後100日までのラット背部の皮膚の表皮シートを作成し、毛包の発生段階である第1周期と毛包の再生による第2周期および第3周期における毛盤に存在するメルケル細胞数の変化を調べたところ、胎生期および生後と共に成長期前期から中期にかけて増加し、成長期中期から退行期にかけて減少した。この結果から毛盤に存在するメルケル細胞の分布は、毛周期に連動して増減することが明らかになった。また、メルケル細胞は形態学的にoval cell typeとdendritic cell typeに大別される。oval cell typeは神経終末と接合がよくみられ、dendritic cell typeは神経との接合があまりみられず、分泌機能を営んでいると推測されている。さらに両者の頻度を継時的に観察したところoval cell typeのメルケル細胞数は毛周期に関係なくほぼ一定しており、毛盤1個あたり5.6個であった。一方dendritic cell typeのメルケル細胞数が、毛周期により変化していた。つまり分泌機能を有するとされるdendritic cell typeのメルケル細胞が選択的に毛周期と関連することが推測された。メルケル細胞の機能や発生学的起源、あるいは分化のメカニズムについても未だ不明な部分が多い。毛盤にはメルケル細胞が比較的多数存在するため、メルケル細胞の機能を解析する上で毛盤は重要な研究対象となる。毛盤を構成する要素として多数のメルケル細胞と共に毛嚢は重要である。毛嚢における毛周期の活動期・退行期・休止期のメカニズムについては解明されていない。Moll I. et al.によりマウスの毛盤のメルケル細胞と毛周期との関連が報告された。そこで今回はラットの毛盤のメルケル細胞と毛周期との関連を三次元的手法を用いて調べた。

マウスの背部の皮膚を抜毛し、抜毛後0,1,3,5,8,12,17,18日の表皮シートを作成して毛盤のメルケル細胞数の変化を3次元的に調べた。その結果毛周期に連動してメルケル細胞数の変化を認めた。次に、毛盤に存在するメルケル細胞の数の変化を胎生期から継時的に観察した。ラット背部の皮膚を用い毛盤の形態形成期及びその後の毛周期に伴う毛盤のメルケル細胞の数の変化を3次元的に観察した。胎生18日から生後100日までのラット背部の皮膚の表皮シートを作成し、毛嚢の発生段階である第1周期と毛嚢の再生による第2周期および第3周期における毛盤に存在するメルケル細胞は、胎生期および生後と共に成長期前期から中期にかけて増加し、成長期中期から退行期にかけて減少した。この結果から毛盤に存在するメルケル細胞の分布は、毛周期に連動して増減することが明らかになった。また、メルケル細胞は光顕レベルでoval cell typeとdendritic cell typeの形態学的多様性が報告されているが、両者の頻度を継時的に観察したところoval cell typeのメルケル細胞数は毛周期に大きな影響を受けることなく、毛盤1個あたり5.6個であった。一方dendritic cell typeのメルケル細胞数は毛周期により著明な増減を示した。分泌機能を有するとされるdendritic cell typeのメルケル細胞が選択的に毛周期と関連して何らかの機能を果たしていることが推測された。メルケル細胞は1875年にF.Merkelから発見された。その後、数多くの研究の蓄積にもかかわらずメルケル細胞の機能や発生学的起源、あるいは分化のメカニズムについても未だ不明な部分が多い。毛盤にはメルケル細胞が比較的多数存在するため、メルケル細胞の生物学的研究にとって毛盤に局在するメルケル細胞は有用である。毛周期の活動期・退行期・休止期それぞれへの誘導因子や抑制因子、修飾因子が見つかっているものの、そのメカニズムについては解明されていない。ところがマウスを使用した実験で毛盤のメルケル細胞と毛周期との関連が報告された。そこで今回はラットを使用して、毛盤のメルケル細胞と毛周期との関連を調べた。まずマウスの背部の皮膚を抜毛し、抜毛後0,1,3,5,8,12,17,18日の表皮シートを作成して毛盤のメルケル細胞数の変化を調べたところ、毛周期によるメルケル細胞数の変化を認めた。つまり、depilationにより毛周期の調整が行われたマウスにおいて毛盤のメルケル細胞の増減が観察された。次に、毛盤に存在するメルケル細胞の毛周期に伴う数の変化を、ラット背部の皮膚を材料として表皮シートを作成し、3次元的に観察した。胎生18日から生後100日までのラット背部の皮膚の表皮シートを作成し、毛包の発生段階である第1周期と毛包の再生による第2周期および第3周期における毛盤に存在するメルケル細胞数の変化を調べたところ、胎生期および生後と共に成長期前期から中期にかけて増加し、成長期中期から退行期にかけて減少した。また、メルケル細胞は形態学的にoval cell typeとdendritic cell typeに大別される。
長州戦争の研究

1.史料調査長州戦争は,明治維新史研究の重要なテーマであるにもかかわらず,実証的分析はあまり進んでいない。それは戦争にかかわった長州藩,幕府,征長軍に動員された全国諸藩の史料が分散して残存しており,体系的分析が困難であったためである。従って,本研究では関係諸藩の史料はもとより,全国的な民衆の動向にかかわる史料を広く収集し,史料を相互に突き合わせることによって総合的分析を行った。調査を実施した機関および史料は次の如くである。(1)東京大学史料編纂所幕府および全国諸藩の基本的史料(2)京都大学附属図書館尊攘堂関係史料(3)山口県文書館毛利家文庫,県庁旧幕府記録,大村益次郎関係史料ほか県内収集文書(4)山口県立図書館山口県内の市町村史(5)鳥取県立博物館鳥取藩庁文書(6)島根県立図書館松江藩・浜田藩関係史料ほか県内収集文書(7)北九州市立図書館小倉藩関係史料2.総合的分析史料収集した写真判をもとに,パソコンを使用して情報をデーターベース化し,大量観察による史料操作により,諸政治勢力の分析を行った。さらに学術情報センターのISIN(維新)データーベースにアクセスして活用することにより,分析の深化を計った。以上の方法により長州戦争の総合的研究を行った結果,長州藩の勝因として,全国的な民衆の長州藩を支持する動向が大きな規定を与えているという新知見を得た。また長州藩の軍制改革,幕府軍との戦闘状況,幕府軍の内実についても新たな史料を見出だせた。これらを踏まえて総合的な長州戦争の論述をする予定である。
導電性高分子を用いた基礎適合DNAのインプリントと新規センサーとしての応用

筆者は超分子化学を基礎とした生体-人工ナノハイブリッドをいくつか提案してきた。それにより、これまで実現されていなかった新規な特徴を持つ生体材料を用いたナノ材料の開発を行うことに成功した。その結果を以下にまとめる。1.高次構造をもつDNAを鋳型として用い、DNAの高次構造を導電性高分子へ転写することに成功した。さらに、DNAを鋳型として得られた導電性高分子薄膜はゲスト分子を認識することができ、センサーとして有効であることを明らかにした。これらの手法はを用いることによって、選択性の高い基質分子をセンシングする化学センサー構築できると期待される。2.SWNTs-DNAを鋳型として用い、導電性高分子を作製した。さらに、光活性機能について検討したところ、インターカレーターであるEBと導電性高分子であるポリチオフェンが電子移動のドナーとして、またSWNTsがアクセプターとして機能し、多成分系での高効率な電子移動が達成されていることが明らかにした。3.DNAによる機能性分子の認識能を用いて高い光機能を持つ薄膜の作製に成功した。DNAを鋳型として用いることでフラーレンとホルフィリンを適切な位置に配置した電子移動が行えた。これは、我々が開発した導電性高分子の鋳型重合法に適用可能であり、簡便な光電変換電極の作製に成功した。4.一次元のナノ空間を持った天然の高分子であるSPGを用いることにより、その内部に金ナノ粒子の一次元に配列させることに成功した。すなわち、明確な構造を持った金ナノ粒子のナノ組織体を創造する簡便な手法を開発した。これにより、これまで困難であった溶液中の金属配列の制御が可能となった。以上のように、私が提案した方法論は新規なナノ材料として使用できる可能性を示すことができた。人工ナノ材料の技術を使って生体の研究さらに新領域へと進化していくことが期待される。1.緒言最近、我々は導電性高分子モノマーの酸化により生成したカチオン性中間体がアニオン性の鋳型の周りに集積し、鋳型の周りで選択的に導電性高分子を重合できることを明らかにしている。本研究では、この手法を用いて高次構造をもつDNAを鋳型として、導電性高分子への高次構造の転写を検討した。2.実験DNAをアニオン性の鋳型とした導電性高分子の重合は、(1)過硫酸アンモニウムを酸化剤として用いる化学酸化重合と(2)ITO基板上での電解重合を行った。鋳型としてDNAが働いていることを確認するため、得られたpoly(pyrrole)の構造をSEM、TEM、AFMで観察した。また、DNAのインターカレーターであるEB(ethidium bromide)を用い、吸収と蛍光スペクトルにより同定を行った。続いて、CVによるDNA/poly(pyrrole)薄膜のEBに対したセンシシグについて試みた。3.結果と考察特異な形状(すなわち、ロッド、環、スーパーコイル構造体)をもつDNAを鋳型として用い、高次構造の導電性高分子への転写に成功した。また、電解重合によりITO基板上にDNA/poly(pyrrole)複合体薄膜を作製した。鋳型としてDNAが存在することはインターカレーターであるEBの吸収と蛍光スペクトルから確認した。得られたDNA/poly(pyrrole)薄膜はCVにより、EBを検出することが可能であった。本手法により、DNAの分子認識能を活用した新規な電気化学的センサーの開発が期待される。[緒言]最近、我々は導電性高分子モノマーの酸化反応により生成したカチオン性中間体がアニオン性超分子を鋳型として重合し、鋳型の構造を反映した導電性高分子が作製できることを明らかにしている。その中で、我々はDNAの分子認識能を活用してethidium bromideがインターカレートされた多成分系薄膜での高効率な電子移動が達成される導電性高分子フィルムを作製することに成功している。本研究では、DNAを鋳型に用いて光活性種であるカチオン性フラーレンとDNAのインターカレーターであるポルフィリンによる効率的な光機能性電極を作製した。[実験][結果と考察]DNAのリン酸基部位にカチオン性フラーレンが安定に静電相互作用し、DNAにporphyrinがインターカレートしているC[60]・porphyrin・DNA複合体溶液を調整した。C[60]・porphyrin・DNAをアニオン性鋳型としてCVにより導電性高分子の酸化重合を行った。得られた薄膜にporphyrinが担持していることをUV-VIS吸収スペクトルで確認し、porphyrinの吸着量を求めた。一方、C[60]の酸化還元を確認することで得られた薄膜にC[60]が導入されていることを確認し、得られたCVのピークからC[60]の量を求めた。さらに導電性高分子複合体の光機能性の評価を行った結果、光励起されたTMPyPがアクセプターであるC[60]に電子を渡すと思われる。また、TMPyPのカチオンラジカルは電子ドナーであるアスコルビン酸(ASA)から電子を補充しアノード方向の光電流が発生すると考えられる。

さらに、DNAを鋳型として得られた導電性高分子薄膜はゲスト分子を認識することができ、センサーとして有効であることを明らかにした。これらの手法はを用いることによって、選択性の高い基質分子をセンシングする化学センサー構築できると期待される。2.SWNTs-DNAを鋳型として用い、導電性高分子を作製した。さらに、光活性機能について検討したところ、インターカレーターであるEBと導電性高分子であるポリチオフェンが電子移動のドナーとして、またSWNTsがアクセプターとして機能し、多成分系での高効率な電子移動が達成されていることが明らかにした。3.DNAによる機能性分子の認識能を用いて高い光機能を持つ薄膜の作製に成功した。DNAを鋳型として用いることでフラーレンとホルフィリンを適切な位置に配置した電子移動が行えた。これは、我々が開発した導電性高分子の鋳型重合法に適用可能であり、簡便な光電変換電極の作製に成功した。4.一次元のナノ空間を持った天然の高分子であるSPGを用いることにより、その内部に金ナノ粒子の一次元に配列させることに成功した。すなわち、明確な構造を持った金ナノ粒子のナノ組織体を創造する簡便な手法を開発した。これにより、これまで困難であった溶液中の金属配列の制御が可能となった。以上のように、私が提案した方法論は新規なナノ材料として使用できる可能性を示すことができた。人工ナノ材料の技術を使って生体の研究さらに新領域へと進化していくことが期待される。
微生物および変性自己細胞の食細胞による貪食機構と意義

食細胞による要除去細胞の貪食は,細胞性自然免疫であり,この貪食機構と意義を明らかにすることが求められていた。本研究では,哺乳動物とショウジョウバエの食細胞について,貪食受容体を介する細胞内情報経路を同定した。また貪食誘導性受容体のリガンドを同定し,微生物と自己変性細胞とでそれぞれ異なる分子を認識するマルチリガンド受容体であると考えられた。さらに,宿主の液性および細胞性免疫応答に作用する,細菌の細胞壁成分を同定し,その働きから,細菌が宿主免疫を回避する抵抗機構の存在がわかった。生体内では,変性自己細胞や微生物が食細胞に選択的に貪食され,生体恒常性が維持される。本研究では,「貪食による精子形成支持や微生物排除の仕組み」と,「細菌が貪食殺菌装置に対抗する生き残り戦略」の解明を目指し,初年度は以下の成果が得られた。I)哺乳類セルトリ細胞による貪食に依存した精子形成支持機構精子形成細胞は分化中に半数以上が死んでセルトリ細胞に貪食され,この反応は精子形成に必須である。セルトリ細胞が貪食依存に精子形成支持因子を産生すると考え,セルトリ細胞のプロテオーム解析よりカルボキシリダクターゼCBR1を見いだした。今年度,この遺伝子をセルトリ細胞で選択的に欠損させたマウスを樹立した。生殖能を調べると,CBR1欠損マウスの雄は対照群と比較して生まれる仔マウス数が少ないことが判明した。II)黄色ブドウ球菌の貪食目印分子及びTLR2依存の活性酸素産生阻害機構黄色ブドウ球菌は,TLR2-JNK活性化を介してマクロファージの活性酸素産生を抑制し,殺菌回避する。黄色ブドウ球菌変異菌株ライブラリーのスクリーニングを行い,この経路に抑制的に働く因子としてdltA遺伝子が見いだされた。III)ショウジョウバエの細菌受容体の同定と感染免疫での貪食の役割食細胞による貪食は,ショウジョウバエでも感染時の微生物排除と宿主生存に必要である。今回,ショウジョウバエのEGFリピート蛋白質Draperが黄色ブドウ球菌貪食への必要性が判明した。Draperは貪食と並行するハエの免疫応答である液性反応には影響しないこともわかった。生体内の変性自己細胞や微生物は食細胞に選択的貪食を受け,生体恒常性が維持される。本研究は,「貪食による精子形成支持や微生物排除の仕組み」と,「細菌が貪食殺菌装置に対抗する生き残り戦略」の解明を目指し,二年目は以下の成果を得た。精巣セルトリ細胞が貪食依存に産生する精子形成支持因子の解析:貪食依存にセルトリ細胞で発現亢進するカルボニルリダクターゼ1(CBR1)のセルトリ細胞コンディショナルノックアウトマウスを作成し,組み換え効率を調べるとほぼ100%近くであり改変動物の樹立と評価した。精子形成過程進行への寄与を,組織化学的解析と精巣上体の精子数で評価したところ,CBR1欠損は少なくとも正常環境下では精子形成に大きな影響を与えないとわかった。黄色ブドウ球菌の哺乳類マクロファージによる細菌の殺菌回避を導く因子の同定黄色ブドウ球菌菌株群の解析より,細胞壁成分の壁タイコ酸がTLR2経路抑制因子候補に挙げられ,今年度の遺伝学的及び生化学的解析によりその機構が判明した。TLR2リガンドである黄色ブドウ球菌リポプロティンのリガンド活性は壁タイコ酸により弱められ,これがマクロファージのTLR2経路を介するJNK経路活性化とこれに制御される活性酸素産生を抑制する。そのために,貪食された食細胞内で細菌が生き残ると考えられた。ショウジョウバエ食細胞による黄色ブドウ球菌の貪食機構の解析ショウジョウバエDraperが黄色ブドウ球菌の貪食受容体と見いだし,今年度は,黄色ブドウ球菌のDraperリガンドを,変異菌株ライブラリーを利用した遺伝学的解析と,細菌細胞壁成分の生化学的解析より見いだした。すなわち,細胞壁のリポタイコ酸がリガンドとしてDraperに直接結合し,食細胞内の低分子量G蛋白質を介して細菌を貪食した。さらに,本反応が細菌感染時にハエが生きるために必要な防御反応であると判明した。黄色ブドウ球菌の哺乳類および昆虫食細胞による殺菌回避を導く因子の同定と感染免疫における役割哺乳類TLR2経路の活性調節因子として黄色ブドウ球菌dltA遺伝子を見いだした。本遺伝子の働きにより,細胞壁タイコ酸がD-アラニン化を受け,これが細胞壁リポプロティンのTLR2リガンド活性を抑制することを見いだした。さらに,タイコ酸がD-アラニン化されることにより,昆虫の自然免疫応答も影響を受けるとわかった。すなわち,自然免疫受容体ペプチドグリカン認識タンパク質による微生物リガンドペプチドグリカンのリガンド活性が,D-アラニン化タイコ酸により低下するとわかった。この結果は,グラム陽性細菌細胞壁成分の修飾が,哺乳類と昆虫とで共通して,細菌の免疫系からの回避因子として機能することを初めて示した。

ショウジョバエの第二の貪食受容体とこれに認識される黄色ブドウ球菌リガンドの同定と本反応の意義平成20-21年度の研究により,ショウジョウバエ食細胞ヘモサイトの膜受容体Draperと,黄色ブドウ球菌細胞壁成分リポタイコ酸とにより,細菌の貪食排除が規定されることがわかった。しかし,本反応の寄与は貪食排除全体の約半分であり,残りを担う貪食反応の存在が予想された。ショウジョウバエおよび細菌の遺伝学的解析より,ヘモサイトの膜タンパク質インテグリンbetanuが細菌貪食を担い,細菌細胞壁のペプチドグリカンが,インテグリンを介する貪食に必要であることがわかった。さらに,インテグリンを介する食食反応は,Draperと相加的に働くことがわかり,両者を合わせると黄色ブドウ球菌貪食のほぼ全活性を担うことが判明した。この結果は,一つのヘモサイトに二種類の貪食経路が存在することを意味し,昆虫も哺乳類同様に,複数の貪食経路により,物理的および機能的に相加的に恒常性維持を行うと考察することが可能である。
熱レンズ信号交換効率の振動モード依存性とその無輻射遷移機構への応用

現在まで、光り熱分光法の研究を行なっているほとんどの研究者が気付いていなかった熱レンズ信号強度の溶質依存性をはじめて実験的に示すことができた。特にアゾベンゼン、スチルベンなどの大振巾振動をもつ分子において信号強度の小さいことがわかった。これらの溶質依存性が溶質を加えたことによる溶液の熱力学パラメーターの変化ではないこと、多光子吸収、光散乱過程のせいでもないことを確認した。よって観測された溶質依存性を説明するには、溶質から溶媒へのエネルギー移動の際に、溶質の振動モードに応じた割合で溶媒の振動、並進エネルギーに分配されているということを考えなくてはならない。この結論は熱レンズ信号強度を測定することで、溶質の無輻射遷移によりどの様な振動モードが励起されているかを明らかにできるという目標に大きく近づく成果であった。また同様な現象が光音響信号にも観測され光熱分光法の無輻射遷移への新しい応用への道を開いたといえる。一元熱レンズ信号を時間分解することにより、種々の無輻射遷移の過程を捕えることに成功した。例えば通常の光学的方法では測定困難な、一重項一三重項間交差の量子収率を溶液中、固相中、2光子励起法などの種々の条件下において求めることができることを初めて示した。またケト-エノール異性体間のエンタルピー差を時間分解熱レンズ法を用いて求められることも示すことができた。これらはこの手法の特徴を生かしたユニークな成果である。次のステップとしてどの様な振動モードを励起した際、どの程度の信号強度が得られるかを調べるためゼノンランプを分光し、セクターで変調をかけて熱レンズスペクトルを測定するための努力を続けている。現在のところ励起光強度が弱く満足な信号は得られていないが、励起光強度を高めることで信号を得ることができると考えている。
脳の神経栄養因子の発現と脳の可塑性を促す早期運動療法に関する研究

本研究の目的は、早期に行われる運動が中枢神経の可塑性に与える影響を明らかにしようとするものである。18年度の研究では、脳梗塞モデルラットを作成して単純な運動(ラット用トレッドミル運動)と複雑な運動(棒渡り運動)を行わせると、複雑な運動を行った方が機能の回復が早いことを示した。19年度の研究では、運動機能の回復と神経栄養因子などの発現との関係を免疫組織学的に検討した。我々のモデルではコントロール群と運動群において、アポトーシスと関連の深いcaspase-3や軸索の伸張と関連のあるGap43の発現に違いは認められなかった。しかし、神経栄養因子の1つであるGDNFは脳梗塞作成後3日目においてコントロール群と比較して運動を行わせたグループの梗塞周囲に多く発現がみられた。脳梗塞作成後3日目は運動機能の回復が最も著しい時期であり、機能回復とGDNFの関連を示唆する結果であった。GDNFに関しては神経保護作用の報告が多いが、今回の結果では神経保護作用というよりはむしろ脳の可塑性に関与している可能性が考えられた。脳の可塑性はリハビリテーションにおいて重要なテーマである。運動と脳の可塑性の関係が明らかになることによって、根拠に基づいたリハビリテーション医療を実現することが可能になると考えられる。今後、運動によって神経栄養因子の発現が誘導されるまでの、シグナリングカスケードを明らかにできるように研究を発展させていきたい。まず我々は,運動の種類を変えることで麻痺の回復にどの様な影響が出るかを,行動学的に分析する目的で実験を行った。実験には7週令のWistar系ラットの雄34匹(231±12g)を使用し,全て脳梗塞モデルラットを作成した。これらを自然回復群(11匹),単純な運動群(ラット用トレッドミルを20分間走らせる)(12匹),複雑な運動群(20分間の棒渡り運動)(11匹)に無作為に振り分け,運動の回復を2週間観察した。運動機能の評価は,2.5cm幅,120cmの棒の上を歩かせ,後肢の動きで判定するFeeneyらのScaleを用いた。麻痺の回復が最も高いStage7になるのに要した時間(14日しても回復しない場合は14日として計算)を各群で比較すると,一元配置分散分析で3群間に有意差が認められた(p<0.01)。多重比較(Tukeyの方法)で単純な運動と複雑な運動は(p<0.05)で,その他は(p<0.01)にて有意差が認められた。この結果から,特に目的とする動作を繰り返して行うことで他の運動よりも早く,動作能力を獲得できることが示された。次に,この動作能力を獲得する一週間の間にみられる運動機能の回復と脳内の栄養因子発現の関係を検証することとする。実験には7週令のWistar系ラットの雄42匹(232±9.5g)を使用し,自然回復群と運動群(20分間の棒渡り運動)に無作為に振り分けた。自然回復群は脳梗塞作成後1・3・5・7日にそれぞれ6匹ずつ,運動群は脳梗塞作成後3・5・7日にそれぞれ6匹ずつ灌流固定を行い、脳組織を採取した。Schabitzらの論文と同様に梗塞巣の体積を求めて比較した。各群の対象が少なかったので,ノンパラメトリックのKruskal-Wallis検定を行った結果,群間に有意差が認められた(p<0.01)。どこに有意差があるか多重比較を行った結果,3日目と5日目の自然回復群と複雑な運動群に有意差が認められた(p<0.05)。しかし,7日目の自然回復群と複雑な運動群には有意差が認められなかった。免疫染色はPAP法で行い、GDNFとその受容体であるGFRα-1、アポトーシスと関連の深いcaspase-3,軸索の伸長と関連のあるGap43などを染色している。現在,染色された試料の光学顕微鏡画像をパソコンに取り込み、半定量的処理を画像処理ソフト(Scion Image)で行っている。

また、GDNFとグリア細胞などとの関連を検証するために、2重染色等も行っている。本研究の目的は、早期に行われる運動が中枢神経の可塑性に与える影響を明らかにしようとするものである。昨年度の研究では、脳梗塞モデルラットを作成して単純な運動(ラット用トレッドミル運動)と複雑な運動(棒渡り運動)を行わせると、複雑な運動を行った方が機能の回復が早いことを示した。今年度の研究では、運動機能の回復と神経栄養因子などの発現との関係を免疫組織学的に検討した。我々のモデルではコントロール群と運動群において、アポトーシスと関連の深いcaspase-3や軸索の伸張と関連のあるGap43の発現に違いは認められなかった。しかし、神経栄養因子の1つであるGDNFは脳梗塞作成後3日目においてコントロール群と比較して運動を行わせたグループの梗塞周囲に多く発現がみられた。脳梗塞作成後3日目は運動機能の回復が最も著しい時期であり、機能回復とGDNFの関連を示唆する結果であった。GDNFに関しては神経保護作用の報告が多いが、今回の結果では神経保護作用というよりはむしろ脳の可塑性に関与している可能性が考えられた。脳の可塑性はリハビリテーションにおいて重要なテーマである。運動と脳の可塑性の関係が明らかになることによって、根拠に基づいたリハビリテーション医療を実現することが可能になると考えられる。今後、運動によって神経栄養因子の発現が誘導されるまでの、シグナリングカスケードを明らかにできるように研究を発展させていきたい。
法花粉学的検査の方法論や検査データの科学的解釈法の構築に関する基礎研究

高知市の市街において,都市域における花粉堆積様式と衣服への花粉付着様式に関する基礎研究を行った.都市緑地の土壌表層では丘陵地から飛来する局地外の樹木花粉が多産するものの,その花粉組成は緑地内の植栽樹木・草本の植被割合,土壌pHおよびシルト含量で概ね説明できる,空中花粉は開花期をピークとして衣服に多量に付着するものの,開花期後に二次飛散したものも相当量,付着する,植栽樹花粉の衣服への付着様式は花の構造や花粉形態に影響を受け,付着花粉は手で払っても雨にさらしても完全に除去できないことなどが分かった.本研究は,法花粉学的検査の方法論や検査データの科学的解釈法を構築する上での基礎情報となる.1)都市緑地における表層花粉の堆積様式主に高知公園および高知大学朝倉キャンパスとそれらの周辺の丘陵地にて,植生調査と土壌表層試料の花粉分析を行った.その結果,a)試料採取地点の近隣に丘陵地にも分布する樹木種が植栽されている場合,地点間で林冠のうっ閉度や樹木組成に多少の変化があっても,花粉組成には変化が乏しい,b)試料採取地点のうっ閉度が高く,その近隣にのみ偏在する樹木種がある場合,その花粉が特徴的に出現する,c)うっ閉度が低い場合,花粉量は化学的・生化学的分解を受けて少ないことなどが分かった.b)は犯罪場所の特定に,c)は犯罪場所の環境の推定に寄与する.2)都市域における空中飛来花粉の堆積様式朝倉キャンパスに衣服を着せたトルソーを設置し,2015年6月2016年3月にかけて,2週間おきに空中を飛来し衣服に付着する花粉を調査した.調査期間を通して2050個/100cm2/日の花粉が付着していた.スギ属,シイ属-クリ属などキャンパス外の丘陵地に主な散布源があり,二次飛散したと推定される樹木花粉が大半を占め,キャンパス内の緑化樹の花粉も開花期を中心に付着していた.トルソーの設置場所と建物や緑化樹との位置関係,布地の種類などによって,付着花粉の量や季節的な変動パターンが異なった.3)布地試料に付着させた花粉の残存様式サツキ(ツツジ科)をモデル植物に選び,開花直後の花に布地試料を擦りつけ,それらを手で払う,雨にさらす,洗濯するという処理にかけ,処理後の花粉の残存様式を調べた.サツキ花粉は粘着糸を持ち花粉どうしが絡まるため,数百の花粉が数珠玉状に連なる状態で布地に付着していた(最大1万粒/25cm2/試料).サツキ花粉の場合,手で払っても雨にさらされても布地試料についた花粉を完全に除去することは困難である一方,洗濯すると布地の種類に関係なく除去されると推定された.本研究では,法花粉学的検査の方法論や検査データの科学的解釈法の構築に向けた指針を策定することを目的として,都市域における包括的な花粉堆積モデルの構築と衣服への花粉付着様式の体系化を行う.これらの解明に向けて,前者は1)都市緑地における表層花粉の堆積様式と2)都市域における空中飛来花粉の堆積様式に,後者は3)布地試料に付着させた花粉の残存様式に関する調査・実験に取り組んでいる.1)に関しては,空中写真の判読と現地踏査によって,まず,市街地とその周辺の丘陵地の植生や都市緑地の空間分布などを把握した.本年度は今後の調査設計,調査地の選定,都市域における花粉堆積様式の概要把握などに力点を置き,まずは市街中心部の大規模な都市緑地から調査を開始した.現在までのところ,調査はほぼ順調に進展している.2)に関しては,実験のための環境整備や物品調達に時間を要し,実験開始が少し遅れたものの,その後,現在までデータ収集を定期的に進めている.3)に関しては当初の計画通りに進め,本年度分の実験を無事,完了した.1)都市緑地における表層花粉の堆積様式本年度は主に高知市市街中心部の小中規模の都市緑地にて植生調査と土壌表層試料の採取および花粉分析を行った.その結果,a)基本的には局地外花粉(丘陵地に主な散布源が分布する樹木種の花粉)を主とする花粉組成を示す,b)都市緑地の規模と花粉組成には明瞭な対応関係は認められない,c)試料採取地点のうっ閉度が高く,その近隣にのみ偏在する樹木種があると,その花粉が特徴的に出現することがある,d)花粉の保存状態には主に土壌pHや土性,三相分布,植被率などが影響していると推定されることなどが分かった.2)都市域における空中飛来花粉の堆積様式朝倉キャンパスに衣服を着せたトルソーを設置し,2016年4月2017年3月にかけて,ほぼ2週間おきに空中を飛来し衣服に付着する花粉を調査した.主な樹木の開花期を中心に,衣服には多種類の花粉が多量に付着していた.主な樹木の開花期を過ぎても,二次飛散した樹木花粉が相当量,付着していた.局地外花粉が付着花粉の過半を占めたが,局地花粉も開花期をピークとして付着する場合があった.周囲の建物との位置関係,近隣の植栽樹の空間分布,布地の種類の違いなどが付着花粉の量や組成に影響を及ぼす場合があった.3)布地試料に付着させた花粉の残存様式キンシバイ(オトギリソウ科)をモデル植物に選び,開花直後の花に布地試料を擦りつけ,それらを手で払う,雨にさらす,洗濯するという処理にかけ,処理後の花粉の残存様式を調べた.