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ブレイクの複合芸術における「自己愛」の表象

この研究の目的は、イギリスロマン派詩人・画家ウィリアム・ブレイクの複合芸術作品において、「自己愛」の概念がどのように描き出されているかを、18世紀当時の自己愛論のコンテクストを考慮しながら、解明することであった。従来のブレイク研究は「自己愛」の重要性を認識しながらも、その考察を詩ばかりに限定してきた。ブレイク作品は詩+絵という両メディアが合体した複合芸術であり、ヴィジュアルな面を無視することはできない。本研究では、ブレイクの「詩」と「絵」をべつべつに研究する旧来の方法から抜け出し、ブレイクの作品をふたつのメディアが組み合わされた本来の姿で考察する一方法を示せたと思う。具体的にいえば、ブレイク詩が語る自己愛が、どのように視覚化されて絵となったかを分析したのである。ブレイクの絵にはデフォルメされた肉体がたびたび出現するが、その肉体が、詩で言及される「自己愛」と密接な関係にあることを明らかにした。ブレイク作品のなかで自己愛を具現化するのは、「スペクター」とよばれる登場人物であるが、その人物の肉体がデフォルメされる傾向にあることも、説明がつく。ブレイクの絵を分析するさい、彼の作品をデジタル処理してコンピュータに取り込んだうえで、緻密な検証を行った。こうして、「自己愛」を軸にして、ブレイクの詩と絵の関係が解明できたと思う。この研究の目的は、イギリスロマン派詩人・画家ウィリアム・ブレイクがその複合芸術作品において「自己愛」の概念をどのように描き出していったかを、十八世紀に展開されていた自己愛をめぐるディスコースに照らし合わせながら解明することである。2年計画の初年度にあたる平成13年度には、十八世紀イギリスにおいて「自己愛」をめぐってどのようなディスコースが展開されていたかを探究した。とくに、「肉体」をキーワードにしながら「自己愛」概念に関する資料を収集した。「肉体」は十八世紀における「自己愛」の定義の中核におかれ、ドルバック卿やメアリ・ウルストンクラフトによると「肉体を保護しようとする自然の第一法則が自己愛」と認識されていたのである。また、ブレイクの複合芸術作品における「自己愛」の表象の分析に取りかかる準備をすすめ、分析すべきブレイクの作品のページ数を特定して、それらのページをコンピュータに取り込む作業をほぼ終えた。これらのデジタル処理された作品を、収集した「自己愛」の概念の資料とつき合わせながら、ブレイクにおける「自己愛」の表象のありかたを考察することが、次年度(最終年度)に残された課題である。この研究の目的は、イギリスロマン派詩人・画家ウィリアム・ブレイクの複合芸術作品において、「自己愛」の概念がどのように描き出されているかを、当時の自己愛論のコンテクストにおいて解明することであった。ブレイク詩が語る自己愛が、どのように視覚化されて絵となったかを分析した。すでに前年度に、ブレイクの複合芸術作品における「自己愛」が表象されている作品のページ数を特定して、それらのページをコンピュータに取り込む作業を終えていたので、これらのデジタル処理された作品の緻密な検証を行うことによって、詩が語る自己愛がどのように視覚化されているかを解明した。こうして、「自己愛」を軸にしてブレイクの詩と絵の関係が解明できた。
テロメラーゼ・テロメア維持が細胞の不死化に果たす役割

ヒト正常体細胞は有限分裂寿命であるが、癌組織では90%以上でテロメラーゼが検出され、不死化した細胞だけが臨床的な癌にまで成長できるものと理解されている。テロメラーゼ・テロメア維持が細胞の不死化に果たす役割を解析するため、様々なヒト体細胞にhTERTを導入した結果、テロメラーゼ活性発現、テロメア延長、分裂寿命延長、不死化の関係は単純ではないことが分かった。これらのプロセスにおける細胞内シグナル伝達系については理解が進んでおらず、解析を進めた。繊維芽細胞や血管内皮細胞では多くの場合hTERT導入だけで不死化した。分裂寿命で増殖停止する直接の原因はp21の発現上昇によるが、テロメア短縮が最上流シグナルにあることを種々の方法で確認し、テロメア短縮によるp21発現上昇はp53非依存的であることを確認した。このプロセスでp21の発現は、p38MAPKによって正に、HDAC2によって負に制御されていることが示された。hTERT導入繊維芽細胞によっては、通常の培養条件である20%酸素気相で活性酸素・DNA損傷・ATM-p53-p21の経路で増殖停止し、3%酸素気相では不死化した。乳腺上皮細胞、アストロサイト、肝実質細胞は、カルチャーショックのため20回程度しか分裂できない。強力な増殖誘導作用を持っSV40T抗原遺伝子の導入でショックを乗り越え、さらにhTERTを導入すると不死化した。意外なことにhTERTにはT抗原と似た増殖誘導作用があり、hTERT導入のみによってこれらの細胞のカルチャーショックを乗り越えさせ、さらに不死化させた。骨芽細胞はp16によって増殖停止し、hTERTによって延命も不死化もしなかった。hTERT導入細胞は基本的に正常細胞の表現型を維持しているが、hTERT導入によって発現が変化する遺伝子群、テロメア長に依存して現変化する遺伝子群などを、プロテオーム、DNAチップで解析中である。また、hTERT導入がゲノムの正常性を維持する可能性、外来DNA導入に対する防御への関与および細胞トランスフォーメーションに対する抵抗性への関与についても解析を進めている。以上、多くの予想外の結果を含めて、テロメラーゼ活性発現、テロメア延長、分裂寿命延長、不死化、トランスフォーメーションの関係は単純ではなく、癌化に果たすテロメラーゼ・テロメア維持の役割の解析は未だ不十分で、継続的な研究が必要ある。ヒト体細胞が有限分裂寿命を持つのは、細胞複製毎に起きるテロメア短縮のためであり、無限分裂寿命を持つ(不死化)細胞はテロメアを延長するテロメラーゼ活性を持つ。しかしながら、テロメラーゼ遺伝子(hTERT)の強制発現によるテロメア延長だけでは、細胞の種類によってかなり挙動が異なり、必ずしも不死化するわけではない。たとえば、胎児血管内皮細胞、乳腺上皮細胞はhTERT導入で不死化するが、繊維芽細胞はhTERT導入によってテロメアも分裂寿命も延長するが不死化しない事などがわかっている。本研究では、1.遺伝的早老症であるウエルナー症候群の線維芽細胞は、培養系で20-30代しか分裂できず、T抗原を導入してもではほとんど延命しなかった。2.これにhTERTを導入すると不死化細胞が得られた。

3.健常人のアストログリアや骨芽細胞も培養系で20-30代しか分裂できず、テロメア短縮のための増殖停止ではない。4.アストログリアや骨芽細胞では、hTERT導入によってテロメラーゼ活性を強制発現させても分裂寿命の延長はおきず、SV40T抗原を導入すると分裂寿命が著しく延長するが不死化はしない。5.T抗原を導入しておいた細胞にhTERT遺伝子を導入すると、不死化細胞が得られた。6.hTERT導入だけで不死化した血管内皮細胞は、インビトロでの血管形成能を持つ等の正常血管内皮細胞としての性質を持っていた。7.不死化した血管内皮細胞は正常血管内皮細胞の増殖を促す因子を分泌していることが分かった。不死化血管内皮細胞が正常内皮細胞の増殖を促進する因子を出していることは興味あることである。T抗原とhTERTの強制発現で不死化したアストログリアや骨芽細胞でも同様に正常細胞の増殖を促進する因子を出していれば、その因子の添加によって正常細胞を増殖させ、hTERT導入のみによる不死化が期待できる。癌のほとんどにテロメラーゼ活性が見られる。テロメラーゼはテロメア延長作用を持ち、癌細胞の成立に必須な細胞不死化への役割が強く認識されてきた。しかし、テロメラーゼの果たす役割はそれだけではなく、増殖促進や細胞遺伝子発現に直接間接に影響することを示唆するデータが、本研究を通じて蓄積しつつある。多くのヒト体細胞は、培養系で10-20代しか増殖できず(いわゆるカルチャーショック)、これはテロメア短縮の限界による増殖停止とは異なるが、テロメラーゼ遺伝子(hTERT)導入によって増殖回数が著しく延長することがわかった。例えば、ヒトアストロサイトは通常10-20回しか分裂できないが、hTERTの導入により60回を超えて今なお増殖中である。肝実質細胞は通常は数回程度しか分裂できないが、hTERTの導入により15回を超えて今なお増殖中である。強い増殖誘導活性を持つSV40T抗原遺伝子を導入すると増殖回数が著しく延長することと似ているが、hTERT導入細胞はいずれも正常機能を保持しており増殖速度も速くならないところが異なる。遺伝子発現やタンパク質発現のパターンはhTERT導入によって大きくは異ならないが、いくつか異なるものもあり、注目される。特に興味あるのは、hTERTを導入したアストロサイトを培養した培地には、導入していない細胞の培地には見られなかったタンパク質スポットが二次元電気泳動から見い出されたことである。このタンパク質の発現がhTERT導入で誘導されるものか、増殖継続に役割を果たしているものかが注目され、同定を急いでいる。これらのことは、テロメラーゼ活性を有する癌細胞の持つ性質を理解する上で、新たな視点として注目に値する。ヒトアストロサイトは培養系での分裂寿命が約20代と短く、テロメアはほとんど短縮しない。ウイルスベクターによってhTERTを導入すると、90代をこえて現在もまだ増殖中である。核型は正常であった。
数μLの血液中の脂肪酸を存在状態別に迅速定量するマルチステップ反応熱分解法の開発

本年度は、血液を含浸させたろ紙試料をミクロ反応炉内に導入した後、血中脂肪酸のメチル化と気化を、遊離型とエステル結合型の順番で連続して行える二段階反応系を構築することを試みた。反応試薬としては、ステップ1では、遊離脂肪酸のメチル化のみを引き起こす酢酸テトラメチルアンモニウム(TMAAc)を、また、ステップ2ではエステル結合の加水分解とそれに引き続くメチル化反応の双方を有機できる水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)を選択した。装置構成としてはミクロ反応炉を備えたガスクロマトグラフ/質量分析計(熱分解GC/MS)を使用した。測定手順としては、まず、TMAAc存在下で試料成分を一旦反応熱分解GC測定し、試料中の遊離脂肪酸成分を一旦分析し(以上がステップ1)、次いで、試料カップ中にTMAHを添加した後、再度反応熱分解GC測定し、今度はエステル結合型の脂肪酸成分の検出を行う(以上がステップ2)方策を採用した。各ステップにおける反応条件(反応温度および反応時間)を最適化した結果、ステップ1では300°Cにおいて30秒間、ステップ2では400°C下での反応を通じて脂肪酸成分が最も高効率に対応するメチル化体に変換されることを見出した。これらの条件下で脂質試料を2段階方式で反応熱分解GC/MS測定して得られたクロマトグラム上には、それぞれ遊離型およびエステル型の脂肪酸成分が選択的かつ高感度に観測された。以上のように、本年度の検討を通じて、遊離型およびエステル型の2種類の脂肪酸成分を区別しながら定量できる、二段階反応系を構築することができた。初年度には、もともと1)反応性の異なる試薬を段階的に活用した多段階反応と2)酵素反応を採用した新規反応場の構築の2つを検討項目としていた。それらのうち、前者についてはほぼ検討が終了したが、後者についてはその基礎検討しか行うことができなかった。その一方で、当初、2年目に予定していた高速ガスクロマトグラフィーシステムとの連結や、マルチステップ反応熱分解GCシステムの性能評価の一部を前倒しのかたちで実施することができた。以上のことから、上記(2)の自己評価を行った。今年度開発した、2段階式の反応熱分解系に対して、新たに酵素分解プロセスを加味した多段階反応を構築する。ここではリン脂質に結合した脂肪酸に特異的に作用する分解酵素と、反応性の異なるメチル化試薬類を段階的に組み合わせて用いる。これにより、リン脂質と中性脂質に結合した脂肪酸を区別してメチル化と気化が行える。以上の反応系で用いる試薬種や反応温度等の条件の制御を通じて、1遊離型、2リン脂質結合型、および3中性脂質結合型の3種類の状態で存在する脂肪酸類を連続してメチル化体へと変換できるマルチステップ反応熱分解システムを今年度中に完成させる。さらに、この方法を実際の人血中の脂肪酸分析に応用して、当該成分の存在状態ごとの高感度定量を実現する。

以上の反応系で用いる試薬種や反応温度等の条件の制御を通じて、1遊離型、2リン脂質結合型、および3中性脂質結合型の3種類の状態で存在する脂肪酸類を連続してメチル化体へと変換できるマルチステップ反応熱分解システムを今年度中に完成させる。さらに、この方法を実際の人血中の脂肪酸分析に応用して、当該成分の存在状態ごとの高感度定量を実現する。平成30年度の実験が効率よく進んだ結果、消耗品の支出が予定より少額となり、その一部を繰り越すこととなった。なお、残額は反応試薬等の消耗品に充てる予定である。
高機能化人工材料を用いた新規骨移植療法の確立

本研究は、人工材料と自家骨の併用移植療法についての新しい方法を提案するものである。セラミックス材料と手術時に摘出される自家骨に電気分極法を適用することで、それぞれの骨再生能の向上が期待できる。これらを相乗的に利用することで、併用移植療法が飛躍的な骨再生効率の向上が期待される。生体骨(ウシ大腿骨)での分極処理による電荷蓄積についても調査を行った。生体骨中の無機成分による電荷の蓄積を確認することができた。また、人工合成したハイドロキシアパタイトを用いて電気分極法によって材料表面に誘起される電荷の測定を行った。分極処理によって形成された分極による表面誘起電荷を確認できた。本研究は、人工材料と自家骨の併用移植療法についての新しい方法論を提案するものである。市販のセラミックス材料と手術時に摘出される自家骨に電気分極法を適用することで、それぞれの骨再生能を向上することを目指す。自家骨とセラミックス材料の骨再生機能を相乗的に利用することで、併用移植療法が飛躍的な骨再生効率の向上が期待される。さらに、細胞生物学的、分子生物学的解析も行うことで、骨再生機能向上機構を明らかにすることを目指す。これらの高機能化を実現するためには、1骨再生効果が最も高い分極条件の最適化、2動物実験による骨再生能向上の証明、が必要である。初年度である本年度は、骨再生効果を最も効率よく発現させるために、自家骨とセラミックス人工材料について電気分極条件の最適化を行った。セラミックス材料には骨補填材として臨床応用されているハイドロキシアパタイト(HAp)とベータ・リン酸三カルシウム(β-TCP)顆粒を利用し分極処理を行った。分極処理において主要なパラメータは三つ(温度、電圧、処理時間)ある。先行研究に成果をふまえ、分極時の温度は300 °Cと固定し、電圧(電場強度)を数V/cmから数百V/cmの間で変化させ、処理時間1時間にて分極処理を行った。それぞれの条件について、熱刺激脱分極電流測定により蓄積電荷量を求めた。蓄積電荷量は印加電圧の増加に伴い漸増し、今回行った実験の範囲では極値は見られなかった。より高い電圧で分極処理することが望ましいことが分かった。同時に材料学的解析を行うことによって物性変化の有無について確認した。分極処理を行ったHApとβTCP顆粒について、XRDによる結晶相の同定、フーリエ赤外分光分析による含有イオンの同定、走査型電子顕微鏡による表面形状の観察を行った。これらの解析結果では分極処理前後で差異は確認されなかった。骨再生効果を最も効率よく発現させるために、自家骨とセラミックス人工材料(ハイドロキシアパタイト(HAp)とベータ・リン酸三カルシウム(β-TCP))について電気分極条件の最適化を行った。特にハイドロキシアパタイトでは、その構造内に存在する水酸化物イオンが重要な役割をもつことが分かった。すなわち、分極形成には水由来の水酸化物イオンの存在が不可欠である。分極は、水酸化物イオンに由来する配向分極とそのプロトン伝導との複合的な要因によって形成される。また、分極アパタイト上における細胞内タンパク質カスケードの発現機序について着目し、分極面ではFAKをトリガーとする細胞増殖シグナルが活性化されることを見出した。さらに、生体骨での分極処理による電荷蓄積についても調査を行った。研究実施の概要に記載したとおり、年度当初に予定していた研究をほぼ遂行することができた。生体材料学次年度は骨再生能の検証を行うために骨欠損埋植試験を行う予定である。組織学的解析により新生骨形成能および細胞の同定と局在性についての比較検討を行う。遺伝子発現解析により骨再生バイオマーカーの検討を行い、骨再生機能向上機構を明らかにする。材料学解析、生物学解析にはそれぞれの専門家である研究分担者から研究組織を作り、密に連絡をとりながら研究を進め、臨床家との連携を保ちながら、臨床応用を目指す。2014年8月31日から9月3日イギリス・リバプールで開催された26th Annual Conference of the European Society for Biomaterialsで研究成果発表のための旅費として計上した。

旅行者が2014年9月から2015年3月まで、フィンランドオウル大学において長期研修に従事していたため、クレジットカード明細を含む精算資料一式の提出が遅延したため、本年度決済が行われず、次年度決済となった。
戦後復興期日本の経済政策と企業経営－経営史的視角による再検討－

本年度は、立案した年度計画の通り、戦後復興期に関する統計データの収集・整理、三井鉱山、三菱鉱業など各種企業資料の収集・整理・閲覧、および同時期経済史研究のサーベイを行った。資料類については、前年度以前に準備したものも多数存在するが、今年度においても、九州大学附属図書館記録資料館や、財団法人三井文庫において、先行研究で用いられていない資料を収集することができた。そうしたなかから、研究代表者は、北澤満「炭鉱における『合理化』の再検討」という論題で学会報告を行った(政治経済学・経済史学会九州部会、2018年11月17日、於九州大学西新プラザ)。本報告は、炭鉱における「合理化」について、先行研究のサーベイを行いつつ、その問題点を指摘し、今後の石炭産業史研究の方向性を示したものである。とりわけ、研究のかなり初期の時点より炭鉱の「機械化」が過大評価されてきた点を明示したが、この点は急速に生産量が伸張する戦後復興期においても重要な意味を持つ。研究協力者からは、木庭俊彦「戦後復興期における三井鉱山の再建整備」(『三井文庫論叢』第52号)という業績を得た。この論文は、今回新たに公開された三井本社資料のなかの、三井鉱山株式会社の経理関係内部資料を用い、戦後復興期、三井鉱山にとっては、企業再建整備期における同社の財務内容を詳細に分析し、通説とは異なる側面を明らかにしている。新資料を用いた分析なので、資料的価値が高いことはもちろんであるが、本論文の意義はそれのみにとどまらず、従来の研究が傍証などによる推測に留まっていた部分について、一次資料によって確認、更新した点が大きな貢献である。予定していた資料の収集については、順調に進んでいる。また、論文・口頭報告など具体的な成果を、初年度より提示することができたことも、上記判断につながっている。さらに欲を言えば、口頭報告を論文とすることができればベストであったが、記述に万全を期すため、見送った。この点で上記の評価とした。研究が進展するにしたがい、さらに必要な資料が増えてきたため、今年度も、昨年度と同様、かなりの部分を資料の収集・購入、閲覧、分析に費やすこととなる。具体的には、特に三井田川鉱業所の分析が進展しているため、今年度はこの部分について、口頭報告、および論文の刊行を進めていくことを目指したい。研究計画に、大きな変更はない。
大脳運動皮質、及び体性感覚野における神経細胞の活動の可塑性

今年度は、大学施設移転のため、当初予定していた動物実験は、実質できず、申請した実験の設備設定と計測用プログラムの作成を行った。また、作成したプログラムを使い、計画した実験と同様の方法で、かねてより行っていた実験の結果を解析し、現在、論文にまとめている。大脳皮質運動野における神経細胞のDischargeの可塑性に対応する、Hippocampus Dentate Gyrusにおける神経細胞のDischargeの可塑性について、その実験結果の解析に作成したプログラムを適用した。結果として、Perforant PathwayのConditioning(high frequencyあるいはlow frequency electrical stimulation)により、Field PotentialのLTP、Depotentiationとともに、Dentate Gyrusの神経細胞のSpontaneous Dischargeが増加、または、減少することを認め、Synaptic efficacyの可塑性とともに神経細胞のDischarge Patternが変化しうることが示された。計測システムと、Single-unitの分離、およびAutocorreelation funcitonの解析等を含むプログラムが実際に稼働することが確認されたので、次年度、申請した実験(大脳運動皮質、体性感覚野における神経細胞のDischargeの可塑性)にこれらを適用する予定である。大脳皮質運動野でIPSPを細胞内記録し、その入力ソースのConditioningによる変化について調べる実験は、設備が整ったのでDischargeの可塑性についての実験とともに開始する。
大脳皮質における運動野形成機構の解析

哺乳類の新皮質は進化上もっとも新しい部分であり、とくにわれわれ霊長類において著しく発達している。本研究では霊長類の新皮質構造を分子生物学的手法を用いて解析し、さらに種間の比較によりその進化的な特徴を解明することを試みた。本課題開始時点で、サル運動野で多く発現するGDF7を軸にした解析と、新皮質の特徴を可視化する遺伝子マーカーの探索の2点を提案し、後者において興味深い結果を得た。マーカーの探索においては、申請者の研究室で同定した領野特異的遺伝子のファミリー分子や、すでにネズミについて層特異性が示されているが、サルに関する情報がない分子などを対象にin situ hybridizationを行った。その結果マカクザル、ネズミにおいて非常に高い層特異性を示す遺伝子をいくつか同定できた。興味深いのはその発現分布には、領野の違いや種の違いが反映されることだ。たとえば、サルでほぼ第6層に限局しているある遺伝子はマウスにおいては、5,6層の両方に発現していた。サルにおいてもネズミにおいても、この遺伝子を発現しているのは6層の全興奮性ニューロンのうち一部であった。このことは、新皮質の浅層(2,3層)になく、深層(5,6層)にのみ存在する興奮性ニューロンのサブタイプが存在し、しかもその層分布は種間で異なるという可能性を示している。過去の研究から、神経連絡の違いや電気生理的性質、形態の違いを示す多くのニューロンタイプが存在することが分かっている。本研究で見いだした遺伝子マーカーがそれぞれどのような性質を持つニューロンタイプに発現しているかは未解明であり、今後新皮質構造を解明する上で重要な手がかりを与えてくれるものと考えている。霊長類の運動野は新皮質の中でも際だった細胞構築を見せる部域でありながら、その形成機構はよく分かっていない。本研究は霊長類の領野形成機構及びその進化的な特徴を解明することを目標としている。第一のアプローチは運動野に多く発現する分子として同定したGDF7を軸としたもので、その第一歩として発現分布を細胞レベルで調べることを目指していたが、残念ながらこれは未だに成功していない。northern blotting,競合RT-PCRの両方法で非常に低レベルと予測されていることもあり、組織化学的な解析は非常に困難であると言わざるを得ない。しかしその過程でTSA(tyramide signal amplification)法を用いた高感度光二重in situ hybridization法を確立することができた。この手法を用いれば、さまざまな遺伝子群の共発現を鍵として新皮質を構成するニューロン群をより詳細に調べることができる。さらに別の角度からの研究として、領野分化に関与している可能性のあるさまざまな分子の発現解析を行っている。現在までに100種類以上の遺伝子について発現分布を調べ、そのうちのいくつかはマウス、フェレットでの発現分布と比較を行った。特徴的なのは多くの遺伝子が何らかの層特異性を示すことで、中には第6層にほぼ特異的な遺伝子も存在した。また種間の比較についていえば、ほぼ同じ傾向を示す遺伝子もあれば、発現様式が大きく違うものもあった。現在特徴的な発現を示すものについてより詳細な解析を行っている。こういった遺伝子を分子マーカーとして使うことにより、運動野のみならず新皮質全体に対する理解が深まるものと考えている。
RNA鎖中の(CAG)nリピート配列を認識する低分子リガンドの創製に関する研究

代表的なトリプレットリピート病であるポリグルタミン病(ハンチントン病)は、遺伝子翻訳領域にあるCAGトリプレット配列の伸長が原因となることが知られており、転写、翻訳の過程において発症を抑える手法の探索、確立が望まれている。我々はCAGリピートが形成するヘアピンニ次構造にA-Aミスマッチ塩基対が多数生じることに着目し、CAGヘアピンに特異的に結合する分子を世界にさきがけて開発した。(Nature Chemical Biologyの創刊号に掲載)本申請研究では、我々が開発したd(CAG)nリピートに結合する分子を改良することにより、CAGリピートがmRNAに転写された際に生じるRNA(CAG)nリピートに、ヘアピン構造を形成して特異的に結合する分子の開発を目指した。リピートDNAやRNAに結合する分子の合成を行った。ナフチリジンを従来とは違うサイドでに良化した分子、即ち、リンカー中央のアミノ基が核酸と結合した場合にマイナーグルーブ側に位置する分子を設計・合成した。それぞれのユニットは、既に合成が終わっている臭化物とアルデヒド体からそれぞれ数工程で合成した。合成した改良型分子を用いて、d(CGG)n,r(CGG)nへの結合を表面プラズモン共鳴測定により考察した。長さの異なるd(CGG)nにより、表面プラズモン共鳴シグナルの顕著な変化を観測した。また、その下流にGFPをクローニングしたベクターを準備し、in vitro転写翻訳系で改良型分子の添加によるGFP発現量をリピートの長さ、改良型分子の濃度等の要因を十分に勘案した条件により定量的に評価している。我々はCAGリピートが形成するヘアピン二次構造にA-Aミスマッチ塩基対が多数生じることに着目し、CAGヘアピンに特異的に結合する分子を世界にさきがけて開発した。(Nature Chemical Biologyの創刊号に掲載)本申請研究では、我々が開発したd(CAG)nリピートに結合する分子を改良することにより、CAGリピートが測Aに転写された際に生じるRNA (CAG)nリピートに、ヘアピン構造を形成して特異的に結合する分子の開発を目指した。我々の分子NAは、DNA二重鎖に対して主溝側から接近することが、MR構造解析から証明されている。これは、GとAを認識する二つの複素環(ナフチリジン環とアザキノロン環)を繋ぐリンカー部分が、DNA二重鎖に結合した際には主溝側に位置するように設計されているためである。このリンカー部分を副溝側に移すことにより、DNA二重鎖への接近が可能となると考え、NAの改良型(改良型NA)の合成を行った。リンカー中央のアミノ基の隣の炭素で還元的アミノ化により、ナフチリジン環部分とアザキノロン環部分を縮合した。それぞれのユニットは、既に合成が終わっている臭化物とアルデヒド体からそれぞれ数工程で合成出来た。合成後にr(CAG)nとの結合評価を行ったところ、期待に反して十分な結合が得られなかった。
ハイパーH_∞フィルタの最適化メカニズムの解明とその高速アルゴリズムの改良

収束性、追従性、および外乱に対するロバスト性に優れたハイパーH_∞フィルタの最適化メカニズムは十分に解明されて来なかった。本研究では、モデル集合と重み集合の中で従来のH_∞フィルタをさらに最適化する一般ハイパーH_∞フィルタリング問題を提案し、その解法からハイパーH_∞フィルタの最適化メカニズムを解明し、適応フィルタに対して新たな統一的な枠組みを提供した。また、その高速アルゴリズムの誤差解析をシステム論的に行い、数値的安定化法を提案した。従来のH∞フィルタリング問題を現実の問題に適用しようとすると次の二つの問題が生じる。1.対象を状態空間モデルで表現する際、状態の動特性を支配するシステムパラメータ{F_k, G_k}を如何に(近似的にも)決定するかは大きな問題である。これは対象の不確定性、あるいは客観的な不確定性である。2.最大エネルギーゲインの重み付きノルムにおける重み行列を決定する必要がある。これは、ユーザー(設計者)が決めるべきパラメータであり、主体的な不確定性である。この二つの不確定性を解消する一つの方策としてハイパーH∞フィルタリング問題を提案した。また、上記問題において、システム雑音の分散σw^2と忘却係数ρの間にσw^2=x(γf)/ρの関係を導入することで、σw^2を微小な値に保ちながらγfの値のみの調整で、収束性、追従性および近端信号に対するロバスト性の3つの特性に対する多目的な最適化が容易となった。これは、γfの値のみの調整によってエコーキャンセラの総合的な性能を考慮した準最適解(ハイパーH∞フィルタ)が得られることを意味する。これより、ハイパーH∞フィルタは、従来のRLSアルゴリズムなどでは得られない近端信号に対するロバスト性と収束性、追従性とのトレードオフを考慮した全く新しい概念に基づく同定アルゴリズムであることが明らかにした。一方、状態誤差依存性雑音に基づく状態方程式について伊藤確率微分方程式を用いて解析も少しずつ進めている。本年度は、主に次の二つの点を明らかにした。1.外乱から推定誤差までの最大エネルギーゲインを、あるモデル集合と重み集合の中でさらに最小化する多目的な最適化問題:「一般ハイパーH∞フィルタリング問題」を提案した。我々が先に導出したハイパーH∞フィルタは、ある特殊なモデル集合と重み集合に対する一般ハイパーH∞フィルタリング問題の解であることを明らかにした。また、σw^2=χ(γf)/ρの関係はγf-σw^2平面での解の探索方法を与えることがわかった。2.ハイパーH∞フィルタをDSPに組み込む際、計算量の面からその高速アルゴリズムである高速H∞フィルタが用いられる。高速H∞フィルタの計算量はO(N)であり、実時間処理に適している。しかし、実用上は単精度(32bit)で計算されるため数値誤差は無視できない。高速H∞フィルタは線形フィルタリング問題の解であるが、そのアルゴリズムは実は非線形システムとなる。そこで、非線形システムの線形化誤差モデルを導出し、誤差の伝搬を解析した。その結果、高速H∞フィルタの後方予測の部分でアルゴリズムが不安定化する可能性があることがわかった。この対策として、二つの異なる方法で求めた入力信号の後方予測誤差の差を用いてアルゴリズムが安定化する方法を考案した。さらに、との数値的安定化法を付加した高速H∞フィルタをDSPに実装し、4目間連続して動作することを確認した。しかし、入力信号が強い非定常性をもつとき改良の余地がまだ残されている。1.我々が先に導出したハイパーH∞フィルタは、ある特殊なモデル集合と重み集合に対する一般ハイパーH∞フィルタリング問題の解であり、σw^2=x(γf)/ρの関係はγf-σw^2平面での解の探索経路を与えることがわかった。今年度は、H∞フィルタの存在条件を用いて、γf-σw^2平面の解領域を明らかにした。解領域のそれぞれの解は異なった収束性、追従性、観測雑音(近端話者信号)に対するロバスト性をもっており、ハイパーH∞フィルタはこれら三つの性質のトレードオフをとった解を与えていることがわかった。さらに、従来のNLMSアルゴリズムやRLSアルゴリズムもハイパーH∞フィルタリング問題の解であるがわかった。すなわち、NLMSアルゴリズムは(γf,σw^2)=(1,0)の解であり、忘却係数付きRLSアルゴリズムは直線γf=∞上の解である。これより、本研究は適応フィルタに新たな統一的枠組みを提供できたと考えている。2.高速H∞フィルタの計算量はO(N)であり、実時間処理に適している。そこで、昨年度は高速H∞フィルタの数値誤差をシステム論的に解析し、その数値的安定化法を提案し、DSP上で評価した。

しかし、浮動小数点DSPを採用したため、高速H∞フィルタを商業用に固定小数点DSPへ組み込む際、どのような影響が生じるか明らかにされていなかった。今年度は、高速H∞フィルタの固定小数点版の開発を外部委託し、その影響を調べた。その結果、32bitあれば高速H∞フィルタは固定小数点演算でも安定に動作し、25bitまでは動作可能であることがわかった。
微小残存白血病(MRD)形成におけるMRD-1/CD9の機能解明

我々はMRP-1/CD9発現と急性白血病患者予後に関する多施設協同研究(関西医科大学第一内科、神戸中央市民病院、田附興風会医学研究所による)を平成9年度および10年度に施行し、急性白血病(AML and ALL)におけるMRP-1/CD9発現と白血病患者予後との相関を検討した。急性白血病52例におけるMRP-1/CD9発現(Flow cytometryによる)は25例において腫瘍細胞の50%以上が陽性であった。FAB分類別にみると、AML-M1の15例中8例、AML-M3の8例中5例、AML-M4,5症例の12例中9例,ALLの3例中3例がMRP-1/CD9陽性であったが、AML-M2では11例中全例が陰性であった。治療との相関をみると、MRP-1/CD9陽性AML-M1症例8例中6例およびMRP-1/CD9陽性AML-M4,5の9例中6例は寛解不成功および再発例であった。また、これらAML-Ml,4,および5症例群では明らかにMRP-1/CD9陽性例において生存期間の短縮が観察された。これまでの結果は白血病においてMRP-1/CD9の発現自体が病気の再発進展に係わる予後不良因子であることを示唆した。今回、我々は平成9年度に急性骨髄性白血病(AML)におけるMRP-1-CD9分子の発現の病態的意義を解明する目的でMRP-1/CD9発現と白血病患者予後との相関を検討した。これまでAML17例におけるMRP-1/CD9発現(Flow cytometryによる)は11例において腫瘍細胞の50%以上が陽性であった。FAB分類別にみると、AML-M1の4例中3例、AML-M3の4例中全例、AML-M6の6例中4例がMRP-1/CD9陽性であったが、AML-M2では3例中全例が陰性であった。臨床予後との相関を見ると、AML-M1およびAML-M3においてはMRP-1/CD9陽性例全例が1年以内に再発をきたしていた。AML-M4においてもMRP-1/CD9陽性例に寛解不成功例および再発が多く観察された。まだ症例数が少なく統計的有意差は検定できないが、これまでの結果は白血病においてMRP-1/CD9の発現自体が病気の再発進展に係わっている可能性を示唆した。従って、我々はMRP-1/CD9発現とAML患者予後に関する多施設協同研究(関西医科大学第一内科、神戸市中央市民病院、田附興風会医学研究所による)を平成10年度より開始した。今後、症例数を増やし、MRP-1/CD9発現とAMLの予後に関してprospectiveおよびretrospectiveに検討を加えるつもりである。また、患者により得られた白血病細胞および剖検例切除標本において、MRP-1の発現をmRNAおよび蛋白レベルで検討し、MRP-1と微小残存白血病の形成との相関を平成10年度に検討する予定である。今回、我々はMRP-1/CD9発現と急性白血病患者予後に関する多施設協同研究(関西医科大学第一内科、神戸中央市民病院、田附興風会医学研究所による)を平成10年度に施行し、急性白血病(AML and ALL)におけるMRP-1/CD9発現と白血病患者予後との相関を検討した。これまで急性白血病52例におけるMRP-1/CD9発現(Flow cytometryによる)は25例において腫瘍細胞の50%以上が陽性であった。FAB分類別にみると、AML一Mlの15例中8例、AML一M3の8例中5例、AML-M4,5症例の12例中9例,ALLの3例中3例がMRP-1/CD9陽性であったが、AML-M2では11例中全例が陰性であった。治療との相関をみると、MRP-1/CD9陽性AML-Ml症例8例中6例およびMRP-1/CD9陽性AML-M4,5の9例中6例は寛解不成功および再発例であった。また、これらAMLl,4,および5症例群では明らかにMRP-1/CD9陽性例において生存期間の短縮が観察された。

これまでの結果は白血病においてMRP-1/CD9の発現自体が病気の再発進展に係わる予後不良因子であることを示唆した。今後、より症例数を増やし、MRP-1/CD9発現と急性白血病の予後との関係について、多因子解析を含めさらに検討を加える。
エタノールおよびアセトアルデヒドの脳内神経ペプチドY発現に与える影響

これまでに、エタノール(EtOH)および代謝物アセトアルデヒド(AcH)の脳内の神経ペブチドメッセンジャーRNA(mRNA)発現に与える影響について検討してきた。今年度は、まずAcHが視床下部室傍核での早期発現遺伝子c-fos発現に与える影響について検討した。実験は、EtOH(1g/kgおよび3g/kg)単独およびシアナマイド(アルデヒド脱水素酵素阻害剤)を併用投与し、EtOH投与の30分後に採取した脳を用いて定量的in situハイブリダイゼーションを行った。その結果、低用量エタノール投与時のc-fos発現に血中AcH濃度の上昇が大きく影響していることが明らかになった。また近年、EtOHの感受性と脳内の神経ペプチドの関連が指摘されており、昨年度の検討でもプロオピオメラノコルチン(POMC)mRNA発現の重要性が示唆された。そこで今回は、法医学教室で継代飼育しているアルコールし好性の異なるWistar系由来の高アルコール嗜好性ラット(HAP)および低アルコール嗜好性ラット(LAP)を用いての検討も行った。それぞれのラットの脳を採取し、in situハイブリダイゼーションを行い、視床下部弓状核の神経ペプチドY(NPY)およびPOMCのmRNA発現を調べた。NPY mRNA発現は両群で差がみられなかったが、POMCmRNA発現はHAPラットがLAPラットに比べ発現が多くみられた。これらのことから、EtOH感受性にPOMC mRNA発現の差が関与していることが示唆された。今後さらにエンケファリンやダイノルフィンといった他の内因性オピオイドペプチドmRNA発現との関連についても検討を進める予定である。これまでに我々は、神経ペプチドY(NPY)の視床下部弓状核でのmRNA発現がエタノール(EtOH)投与4時間後に有意に低下することを明らかにしている。そこで、まずmRNA発現の経時的変化を観察するためEtOH投与24時間後の試料を採取し、弓状核でのNPYmRNA発現を検討した。EtOH投与24時間後も4時間後と同様に発現の低下が認められ、EtOHのNPYmRNA発現に与える作用が比較的持続することが明らかになった。NPY mRNA発現に対するEtOHおよびアセトアルデヒド(AcH)の影響は、これまで急性投与後の変化しか検討されていない。そこで、EtOHとシアナマイド(CY:アルデヒド脱水素酵素阻害剤)を1日1回、5日連続投与し、最終EtOH投与の1時間後に脳を採取し、視床下部弓状核でのNPYおよびプロオピオメラノコルチン(POMC) mRNA発現をin situハイブリダイゼーションにて検討した。さらに、弓状核のNPY神経細胞の投射先である室傍核での副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRF),アルギニンバゾプレッシン(AVP)のmRNA発現についても検討した。EtOH, CYを単独および併用投与した群とも弓状核でのNPY mRNA発現はコントロールに比較して有意な差がみられなかった。一方、POMC mRNA発現は、EtOH+CY群で有意に減少した。また、室傍核でのCRF mRNA発現はEtOH+CY群でのみ有意に増加し、AVPのmRNA発現はCY単独群のみ有意に減少した。これらのことから、連続投与時にもEtOHの代謝物AcHがNPY mRNAの発現に与える影響は少ないことが示唆された。また、POMC mRNA発現が変化することから、その産物であるベータエンドルフィンの動態変化の可能性が示唆された。今後さらにそれぞれの神経核でのc-fosなど早期発現遺伝子との関連についても検討を進める予定である。
強度近視眼における脈絡膜血管構築

(1)臨床的検討として,東京医科歯科大学医学部眼科強度近視外来受診患者210名にICG赤外蛍光眼底造影を施行して強度近視眼の脈絡膜循環動態を撮影した。その結果,眼軸長の延長に伴い脈絡膜静脈は後部強膜ぶどう腫縁で血流がウッ滞し,ウッ滞が持続すると異常な静脈吻合を介して随時血流方向を変えて流れやすい方向に血管再構築が行われていた。また,眼内の血流は殆ど眼球赤道部の渦静脈から排出されるとされていたが,強度近視眼では逆に高極部において強膜を貫く後極部渦静脈が約1/4の症例に見られた。これらの後極部渦静脈は主として後極部の脈絡膜血流を受けていたが,さらに赤道部の渦静脈とも吻合し,赤道部方向に向かう血流を受けていたが,さらに赤道部の渦静脈とも吻合し,赤道部方向に向から血流方向もあった。また後極部で強膜を貫いた後,他の渦静脈と合流せずに神経周囲に流入し,強度近視特有の静脈血排出ルートであることが分かった。(2)さらに生後1日のヒヨコの片眼を遮蔽し,実験的に近視を作成し,孵化後4週目に頚動脈から鋳型樹脂を注入して血管鋳型標本を作製し,眼軸延長に伴う脈絡膜血管の変化を三次元的に観察した。それによると,ヒヨコの脈絡膜大血管,視神経周囲血管などには眼軸延長に伴い著変は見られなかったが,脈絡毛細管板の血管管腔は眼軸延長に伴いやや狭細化し,一部では脈絡毛細管板の断裂様の所見を呈した。以上から種の違いはあるものの,強度近視眼における脈絡膜血管の変化は毛細管板に初発し,徐々に細静脈から大血管の再構築,後極部ルートの形成という段階を経て常に流れやすい方向に再建築が行われているものと推察され,これらの脈絡膜血管の変化が近視性網膜脈絡萎縮の進行に深く関与していると考えられた。
腸管マスト細胞の機能制御とアレルギー抑制に関わる腸内細菌の同定と食品開発への応用

30年度は、「マスト細胞の機能変化とアレルギー炎症の関連解明」について、腸内共生菌が存在しない無菌マウスと抗生物質処理により腸内共生菌をコントロールしたマウスを用いて、全身性アナフィラキシーにおよぼす効果を解析した。腸内共生菌が存在する通常マウスに比べて、無菌マウスでは予想に反して、アナフィラキシーによる体温低下が軽減された。そこで、どの腸内共生菌が関与しているのかを絞り込む目的で、抗菌スペクトルの異なる抗生物質で処理したマウスを使用し、同様の解析を行った。その結果、4種類(アンピシリン、ネオマイシン、メトロニダゾール、バンコマイシン)の混合抗生物質で処理したマウスでは、無菌マウスと同様にアナフィラキシーによる体温低下が有意に抑制された。また、グラム陽性菌に対して抗菌スペクトルを示すバンコマイシンのみでも4種類の混合物と同様にアナフィラキシーが抑制された。一方、グラム陰性菌に対して抗菌スペクトルを示すポリミキシンのみの処理では抑制効果は見られなかった。このことから、グラム陰性菌がアナフィラキシー抑制に関わっていることが示された。マスト細胞活性化の指標であるMCPT-1の血中濃度は、いずれの群でもコントロールマウスと同程度であったことから、腸内共生菌はマスト細胞の機能ではなくマスト細胞の活性化以降のイベントに作用し、アナフィラキシーの症状に関わっていることが示唆された。そこで、腸組織におけるヒスタミンレセプター(HR)のmRNA発現量を測定したところ、HRの1つであるH3RのmRNA発現量が抗生物質処理により減少した。以上のことから、腸内共生菌は腸組織におけるHRの発現を調節することによりヒスタミン感受性を制御し、アナフィラキシー症状に影響をおよぼすことが示された。29年度は、「腸管免疫系の恒常性維持におけるマスト細胞の役割」について1IgA産生、2腸管免疫系の恒常性時に重要な制御性T細胞および樹状細胞の割合、3免疫寛容成立におけるマスト細胞の役割をマスト細胞欠損マウスと野生型マウスを比較することにより評価した。1マスト細胞が存在しないマスト細胞欠損マウスではマスト細胞が存在する野生型マウスと比較して糞便中のIgA抗体価が高いことを明らかにした。2マスト細胞欠損マウスおよび野生型マウスより腸間膜リンパ節を採取し、食物アレルギーの抑制にも関わるCD4+CD25+Foxp3+の制御性T細胞T細胞の割合をフローサイトメーターで解析した結果、マスト細胞欠損マウスでは制御性T細胞の割合が有意に低いことが判明した。さらに、腸間膜リンパ節で制御性T細胞の誘導に関わっているCD11c+MHCIIhighCD103+の樹状細胞の割合がマスト細胞欠損マウスで減少していることも明らかになった。32で示したCD4+CD25+Foxp3+の制御性T細胞およびその誘導に関わるCD11c+MHCIIhighCD103+の樹状細胞は食物アレルギー発症抑制に関わる「経口免疫寛容」の誘導に重要であることが報告されている。そこで、それらの割合が減少しているマスト細胞欠損マウスでは経口免疫寛容が成立しにくいのではないかという仮説を立て、解析した。マスト細胞欠損マウスおよび野生型マウスにOVAを経口投与し、その後OVA/水酸化アルミニウムの腹腔投与により免疫した。免疫前後の血中OVA特異的IgE抗体価をELISAで測定した。野生型マウスでは免疫前にOVAを経口投与することにより、免疫後のOVA特異的IgEの上昇が抑制され、経口免疫寛容が成立した。一方、マスト細胞欠損マウスでは、OVAの経口投与によるOVA特異的IgEの上昇が抑制されなかった。腸管免疫系の恒常性維持におけるマスト細胞の関与をマスト細胞欠損マウスと野生型マウスを用いて解析し、感染防御に重要なIgA産生、過剰な免疫応答の制御に働くFoxp3+制御性T細胞およびそれを誘導するCD103+樹状細胞がマスト細胞により制御されていることを見出すことができた。さらに、マスト細胞が経口免疫寛容の誘導にも関与していることを示すことができた。これは、経口免疫寛容成立に重要な細胞群に影響した結果であることを示唆しており、当初計画していた細胞の割合の解析だけでなく、機能解析にも取り組み整合性のとれた結果を得ることができた。29年度に予定していた腸内細菌叢の構成におよぼすマスト細胞の役割については、野生型マウス、マスト細胞欠損マウスおよびマスト細胞欠損マウスにマスト細胞を移入し再構築したマウスより糞便を採取し、次世代シーケンサーを用いて菌叢解析を行い、野生型とマスト細胞欠損マウスでは腸内細菌叢の構成が異なること、また、マスト細胞欠損マウスにマスト細胞を再構築したマウスでは野生型の構成に一部戻る結果を得ているが、データ解析が不十分であるため現時点では明確な結論が出ていない。以上、一部の解析を次年度に持ち越したが、ほぼ計画通りに進んでいるため、おおむね順調に進展していると考えている。

その結果、4種類(アンピシリン、ネオマイシン、メトロニダゾール、バンコマイシン)の混合抗生物質で処理したマウスでは、無菌マウスと同様にアナフィラキシーによる体温低下が有意に抑制された。また、グラム陽性菌に対して抗菌スペクトルを示すバンコマイシンのみでも4種類の混合物と同様にアナフィラキシーが抑制された。一方、グラム陰性菌に対して抗菌スペクトルを示すポリミキシンのみの処理では抑制効果は見られなかった。このことから、グラム陰性菌がアナフィラキシー抑制に関わっていることが示された。マスト細胞活性化の指標であるMCPT-1の血中濃度は、いずれの群でもコントロールマウスと同程度であったことから、腸内共生菌はマスト細胞の機能ではなくマスト細胞の活性化以降のイベントに作用し、アナフィラキシーの症状に関わっていることが示唆された。そこで、腸組織におけるヒスタミンレセプター(HR)のmRNA発現量を測定したところ、HRの1つであるH3RのmRNA発現量が抗生物質処理により減少した。以上のことから、腸内共生菌は腸組織におけるHRの発現を調節することによりヒスタミン感受性を制御し、アナフィラキシー症状に影響をおよぼすことが示された。2年目となる平成30年度は、まず菌叢解析のデータをまとめマスト細胞がどのような腸内細菌をコントロールしているのか明確にする。また、1年目にマスト細胞が関与する現象として見出したIgA産生やFoxp3+制御性T細胞、CD103+樹状細胞は腸内共生菌により制御されていることが報告されていることから、マスト細胞欠損マウスでみられた現象が腸内細菌叢の構成を変化した結果みられたものであるのか総合的に考察する予定である。また、計画書通り腸内共生菌をコントロールすることによりマスト細胞の活性化依存的なアレルギー応答がどのような影響を受けるのか腸内共生菌の存在しない無菌マウスなどを利用して解析する。
陽電子と光子を用いた量子ビーム協奏利用によるディラック電子系ボロフェンの研究

申単元素(ホウ素)単原子層「ボロフェン」の構造を精密に決定し,その新奇ディラック物性の起源を明らかにする.さらに新たな量子物性が期待されるボロフェンを合成するとともに,それぞれの原子構造と電子状態を系統的に明らかにする.本研究では陽電子回折法で原子構造を決定し,軟X線光電子分光で詳細に電子状態を調べる.光子(軟X線)と陽電子の2種類の量子ビームの協奏的利用による多種多様なボロフェンの系統研究により「低次元ホウ素材料科学」を新たな学問分野として切り拓くことを目的とする.申単元素(ホウ素)単原子層「ボロフェン」の構造を精密に決定し,その新奇ディラック物性の起源を明らかにする.さらに新たな量子物性が期待されるボロフェンを合成するとともに,それぞれの原子構造と電子状態を系統的に明らかにする.本研究では陽電子回折法で原子構造を決定し,軟X線光電子分光で詳細に電子状態を調べる.光子(軟X線)と陽電子の2種類の量子ビームの協奏的利用による多種多様なボロフェンの系統研究により「低次元ホウ素材料科学」を新たな学問分野として切り拓くことを目的とする.
Cdk9-サイクリンT複合体による発生・分化制御機構の解析

本研究は、ゼブラフィッシュを用いて発生・分化の制御メカニズムをRNAポリメラーゼIIによる転写反応と関連させて分子レベルで解明することを目的としている。これまでに、転写反応を伸長段階で促進する活性で同定されたCdk9-サイクリンT複合体を標的として研究を進め、ゼブラフィッシュCdk9(zCdk9)の機能抑制実験をモルフォリノオリゴヌクレオチド(MO)の微小注入によるアンチセンス法およびCdk9の有するキナーゼ活性を特異的に阻害するフラボピリドールを用いて行った。その結果、いずれの場合もゼブラフィッシュの初期卵割が、受精後3.8時間のドームステージで停止することを見出した。RNAポリメラーゼIIの特異的阻害剤α-アマニチンを受精直後の卵に微小注入した場合、これまでの報告にあるようにドームステージで卵割が停止することを確認した。また、パルスラベル法により受精直後から6時間頃にかけて合成されるRNAを放射性標識し検出した。その結果、ゼブラフィッシュにおいては、受精後2時間から4時間の間に活発にRNA合成が始まることがわかった。さらに、zCdk9に対するMOの注入では、対象と比較してmRNA合成が特異的に阻害されることもわかった。これまでの報告によると、ゼブラフィッシュの中期胞胚遷移(MBT)は、受精後約3時間(10回目の細胞分裂時)に生じる。よって、Cdk9の機能阻害実験で観察される卵割の停止は、MBTで開始されるmRNA合成の阻害と密接に関連することが示唆された。一方、受精直後からMBTにかけてzCdk9のmRNAやタンパク質量を観察したが、それらの劇的な変動は今のところ観察されていない。今後は、MBT前後でのCdk9活性制御メカニズムの検討が必要であると考えられる。本研究は、Cdk9-サイクリンT複合体を標的にして、ゼブラフィッシュを用いた発生・分化における作用メカニズム、およびラット副腎褐色細胞腫由来のPC-12細胞を実験材料として、神経成長因子NGF(nerve growth factor)で誘導される神経突起形成に関する研究を行うことを目的とした。ゼブラフィッシュCdk9(zCdk9)の翻訳開始コドン周辺を標的にしたモルフォリノオリゴ(MO-zCdk9)を作製し、これを受精後1時間以内の卵に微小注入した。コントロールモルフォリノオリゴ(MO-Cont)添加では、正常に卵割が進行し、少なくとも受精後4日目まで胚発生異常は観察されなかった。一方、MO-zCdk9の微小注入では、受精後3.8時間のドームステージで卵割が停止した。また、Cdk9の特異的活性阻害剤フラボピリドールの濃度を変えて受精直後の卵に添加し、濃度1μM以上においてドームステージで胚発生が停止する事を見出した。以上の結果より、ゼブラフィッシュ胚発生において、Cdk9活性が必須であることが示唆された。今後は、卵割が停止した細胞がアポトーシスを起こして死んでいるか、ゲノムDNAを抽出して解析する予定である。zCDK9に対する特異抗体の作製のためオリゴペプチド合成を行い、これをウサギに免疫したが、未だ反応性および特異性の高い抗zCdk9抗体は得られていない。今後は今回用いたオリゴペプチドとは違う領域に対する抗体スクリーニングを検討する予定である。一方、ラットPC-12細胞において、shRNAを利用したCdk9のノックダウンを試みた。ウエスタンブロット法でラットCdk9(rCdk9)がヒトCdk9に対する抗体と反応し、RNAi法でその蛋白質が低下することを確認した。今後は、Cdk9のノックダウンによる細胞増殖への影響や、NGFに対する反応性を検討する予定である。
分子線エピタキシ-法によるAIGaInN共振型紫外線受光素子の研究

本研究では、窒化物半導体を用いた共振型紫外線受光素子を作製するための基礎技術として、RFラジカル窒素源を用いた分子線エピタキシ-(RF-MBE)法による高品質GaNの結晶成長条件を把握し、シャッター制御法によるAlGaN擬似三元混晶のAl組成制御技術を開発した。Ga分子線供給量を変えることにより、V/III族比が1近傍において結晶のグレイン化が抑制されることを見出した。GaN低温バッファ層の成長温度と厚さ、およびV/III族比を最適化することにより、ノンドープ結晶の残留キャリア密度が5×10^<15>5×10^<16>cm^<-3>まで低減され、Siド-ピングによるn型キャリア濃度が2×10^<17>3×10^<18>cm^<-3>の範囲で制御された。一方、MBE法の特徴であるシャッターによる分子線の急峻な制御を用いて、GaN/AlN短周期超格子を、周期や厚さを原子層レベルで変えて成長することにより、任意の組成を有する疑似的なAlGaN三元混晶の成長試みた。この手法により、AlGaN多重量子井戸構造を作製し、X線回折およびホトルミネッセンス法により、設計通りの構造が形成されていることを確認した。また、同手法により、組成の異なる2種類のAlGaNからなる半導体多層膜反射鏡の試作を行った。このシャッター制御法は、ヘテロ構造デバイス成長のための有効な手法として期待される。また、GaNの成長条件を制御することにより、直径55100nm、長さ1μm以上の均一かつ高密度なGaN極微細柱状結晶が自己形成されることを見出した。この技術は量子細線構造による高性能光デバイス(受光素子を含む)やホトニックバンド構造による自然放出光制御などへの応用が期待される。