hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん増殖・転移の分子機構に基づく創薬研究

以上のことから、epoxyquinol Bは、VEGF受容体だけでなく、EGFやFGFなどの受容体に直接作用することで、その酵素活性を阻害し、血管内皮細胞の遊走能亢進をin vitroおよびin vivoで阻害したことが考えられた。また、その作用点はおそらく、各受容体のシステイン残基であることが予想された。放線菌(サイトトリエニン生産菌、リベロマイシン生産菌)において、"非天然型"天然化合物の創製をおこなうために遺伝子シャッフリング手法を用い、二次代謝産物に関与する生合成遺伝子の人工的改変をおこなった。得られた化合物群の生物活性については、in vitroの酵素アッセイや培養ヒト細胞の増殖に与える影響などを指標に評価した。また、HeLa細胞において、既存の薬剤を処理したときのタンパク質の挙動を2D-DIGEで解析し、データベースを構築した。そして、標的分子が同定されていない化合物を評価するためのシステムも構築した。さらに、本申請課題において見出した抗がん剤のリード化合物の標的タンパク質を、「官能基非依存的」にビーズ化した化合物を用い探索・同定した。具体的には、破骨細胞の分化を阻害するメチルゲルフェリンの標的分子を同定するために、メチルゲルフェリン・アガロースビーズを作製して標的分子をglyoxalase I(9LO1)と決定した。実際にメチルゲルフェリンはGLO1の酵素活性をin vitroにおいて阻害した。また、メチルゲルフェリンとGLO1の共結晶の取得に成功し、詳細な相互作用解析を行った。一方、分子生物学的手法および生化学的手法を用い、得られた生理活性物質の標的分子遺伝子のクローニング、過剰発現細胞の樹立さらにはin vitro酵素活性評価系の構築などをおこない、がん増殖・転移の分子機構を解析した。本申請課題の目的は、微生物化学と有機合成化学を基盤として抗がん剤のリード化合物を探索・創製することである。今年度に得られた主な研究成果を下記する。1、遺伝子改変微生物を用いた生理活性物質生産:BCRP(Breast Cancer Resistance Protein)阻害剤フミトレモルジンの生産菌解析では、その生合成経路の全容を解明し、人工的経路改変によってさまざまなフミトレモルジン類縁化合物を創製した。フミトレモルジンC及びデメトキシフミトレモルジンCに強いBCRP阻害活性を見出した。また、ホスファターゼ阻害剤ボスラクトマイシンの生合成前駆体であるデアミノヒドロキシボスラクトマイシンに、ヒト白血病細胞株HL・60細胞の分化を誘導する活性があることを見出した。2、薬剤の作用標的研究:2D-DIGEを用いた薬剤プロテオームシステムについて、新たに10種類のスタンダード化合物を解析し、プロテオームデータベースを拡張させた。また、本システムのさらなる精度向上を目的に、リン酸化タンパク質の発現変動に絞ったプロテオーム解析を導入した。作用機序の異なる複数のトポイソメラーゼII阻害剤の解析から、本システムは、標的分子が同一であつても作用機序が異なる場合、それら阻害剤を明確に区別できることがわかった。11種類の作用
スキーヤーの脚部の屈曲と伸展動作に着目した能動型・受動型ターンモデルの開発

本研究の目的は、スキーヤーの脚部の屈曲と伸展動作に着目したスキーターンモデルを開発することであった。スキーヤーのターン動作と歩行動作には共通性が多いことから、歩行動作と同様に、スキーヤーの動作を、能動的(アクティブ)モデル「力の入れどころ」と、エネルギー効率の良い受動型(パッシブ)モデル「力の抜きどころ」として捉えた。そこで本研究では、1アクチュエーター(モーター)を用いた能動型(アクティブ)スキーのターンモデルの開発と、2アクチュエータを用いない受動型(パッシブ)スキーのターンモデルの開発を行った。1アクチュエーター(モーター)を用いた能動型(アクティブ)スキーのターンモデルを開発した。このターンモデルは、1個のアクチュエーターにより膝関節と股関節の屈曲・伸展が行えるように、4つのピンジョイントを介し、向かい合う節が等しい4節回転機構のリンクによる両てこ機構を用いた。さらに左右の脚部が独立して動作できるように、アクチュエーターを2個用い、左右の脚部が独立して屈曲・伸展ができるようにした。その結果、脚部の屈曲側にターンモデルは傾いて内傾姿勢になり、傾いた側の両スキーに角付けが生じた。また、姿勢上の特徴は、傾いた側の内スキーが外スキーよりも前に出て、スキーに前後差が生じ、ターンモデルの上体はスキーに正対して連続パラレルターンが可能となった。2受動型(パッシブ)スキーターンモデルを開発した。基本構造的は、能動型ターンモデルと同様に、脚部の屈曲・伸展動作により、アクチュエーターなどを用いなくても斜面上を連続パラレルターンした。受動的な膝関節と股関節の屈曲と伸展により、連続パラレルターンが可能であった。ターン姿勢の特徴としては、内傾姿勢と内(山)スキーが外(谷)スキーよりも前に出た正対姿勢であった。
中枢神経系への放射線照射によって生じる高次機能障害の評価及び予防法

放射線の副作用を海馬歯状回の神経新生機能の低下としてとられる視点から細胞,動物モデルによる基盤解析及びヒトを対象に高気圧酸素療法(HBO)を併用することで認知能低下、脳機能保護への影響を捉えることを目的とし研究を実施した。臨床症例の解析からは放射線4Gy-12Gy相当の海馬被爆によりfMRI(GE Health Care 3T MRI Discovery 750) lure taskで解析したパターン分離能によって神経新生能の著しい機能低下が示唆された。HBO併用により白質髄鞘線維の被覆形成が促進された。今後ヒト海馬機能の評価法を確立する事で臨床的な海馬機能モニタリングが可能になると思われる。Oxygenationとneural stem cellの増殖と分化に着目しヒト神経幹細胞放射線の副作用を海馬歯状回の神経新生機能の低下としてとられる視点から細胞,動物モデルによる基盤解析及びヒトを対象に高気圧酸素療法(HBO)を併用することで認知能低下、脳機能保護への影響を捉えることを目的とし研究を実施した。平成24年度は臨床研究を施行した。ヒト全脳照射施行例20例における認知行動機能の解析およびfMRIを用いた海馬機能解析を施行した。その結果照射前には、全般性認知機能(3MS,MMSE,HDS-R)は保たれているものの、前頭葉の実行系機能のうちの柔軟性(TMT)および抑制性(Stroop)機能は、悪性度が高まると障害される傾向を認めた。本年度購入したLC-Model定量解析ソフトウエアを用いて放射線治療患者の神経幹細胞の新生活性を時間軸に沿って追跡解析した。fMRIよりえられた所見に一致し照射中には1.28ppmおよびNAAのピークの減少が認められた。本研究では放射線の副作用を海馬歯状回の神経新生機能の低下としてとられる視点から細胞,動物モデルによる基盤解析及びヒトを対象に高気圧酸素療法(HBO)を併用することで認知能低下、脳機能保護への影響を捉えることを目的とし琉球大学倫理委員会の許諾を得て研究を実施した。その結果、放射線を2Gy 5回全脳照射したマウスおよび動物用チェンバーを用いて高気圧酸素2気圧20分100%酸素を併用(HBO併用)した群との比較解析では放射線はDoublecortin陽性神経前駆細胞の発育・増生を選択的に阻害する事が判明した。さらにHBO併用群では神経前駆細胞の発育が保護されている所見を得た。又両群ともより未分化の神経幹細胞は保持されていた。これら動物モデルによる基盤解析から臨床的に放射線障害により誘発される海馬機能低下を阻止するためには神経幹細胞の増殖と同時に神経前駆細胞への分化を促進する事が治療法の確立につながるものと考えられた。臨床症例の解析からは放射線4Gy-12Gy相当の海馬被爆によりfMRI(GE Health Care 3T MRI Discovery 750) lure taskで解析したパターン分離能によって評価される神経新生能の著しい低下が示唆され今後ヒトにおける海馬機能の評価法を確立する事で臨床的な海馬機能モニタリングが可能になると思われる。脳神経外科Oxygenationとneural stem cellの増殖と分化実験に必要なヒト神経幹細胞実験が計画通リ遂行できた。臨床解析では、高次機能とくに前頭葉の実行系機能の障害が認められ、機能的磁気共鳴画像を用いた海馬機能解析およびLC-Model定量解析ソフトウエアを用いたMRS解析において放射線により海馬の神経新生能の低下が示唆された。この所見は我々の仮説を支持するものである。Oxygenationとradiationの併用による効果を培養系での解析をさらに遂行しまた動物モデルでの実験も併用する。平成25年度は臨床研究を継続しさらに細胞、動物モデルによる解析を行う。1【細胞分裂】海馬歯状回神経幹細胞に対する各群の細胞死、細胞分化に対する影響2【細胞移動性】海馬歯状回神経幹細胞に対する各群の細胞走行性に対する影響3【免疫細胞に与える影響】海馬歯状回神経幹細胞に対する各群の誘発する炎症細胞の位置づけ。次年度で物品を購入するためマウス購入を計画主な使用用途は、培養関連の消耗品や動物実験に必要な消耗品、薬剤の購入に当てる。
フェロトーシスを利用した口腔がん治療

癌細胞は活性酸素の代謝や鉄代謝などのフェロトーシスと関わりが深い細胞シグナル変異を多く認める。特に生体の抗酸化ストレス機構の一因を担うシスチン輸送体xCTの過剰発現が一部の悪性腫瘍において発見されており、その阻害あるいは欠損は様々な臓器の癌細胞にフェロトーシスを誘導する。フェロトーシスは新たに提唱された細胞死概念であり、鉄依存的な活性酸素の発生による酸化ストレスによって引き起こされる新規の細胞死経路である。本研究は口腔癌細胞におけるフェロトーシス誘導メカニズムの解明とxCT発現量解析を行うことで、口腔癌におけるxCT標的治療の妥当性について検討を行う。
中学生の援助要請行動から適応に至る過程の検討と予防的介入法の開発

本研究の目的は中学生の援助要請行動から適応に至る過程を明らかにし,それらの実証的研究にづく不適応の予防的介入法を開発することであった。これまでの研究により,援助要請行動から適応に至るプロセスモデルが提唱され,適応の向上につながる援助要請行動に示唆が得られた。今年度は介入法の作成と3つの研究が行われた。介入法の内容は,(1)援助評価の心理教育,(2)ソーシャルサポート提供スキルの集団社会的スキル訓練,(3)援助要請スキルの集団社会的スキル訓練,(4)まとめとしての心理教育,という4つの部分から構成された。実施は50分×2回のセッションとして計画された。さらにワークブックを作成し,介入対象者に配布した。研究1では臨床心理学・発達臨床心理学を専攻する大学院生18名を対象に介入研究が実施された。その結果,介入直後の援助要請スキルとフォローアップ時(約10日後)の被援助志向性の一部が上昇した。研究2では,定時制高等学校2年生3学級44名に介入研究が実施された。2つのスキル得点の低い生徒のみを抽出して分析したところ,有意傾向ではあるが介入後(約1ヶ月後)に2つのスキルの上昇が確認された。研究3では私立女子中学校3年生2学級86名に介入研究が実施された。分析の結果,全体では介入後(約10日後)のソーシャルサポート提供スキルと被援助志向性の一部に有意傾向ではあるが向上が見られた。2つのスキル得点の低い生徒のみの分析では有意傾向ではあるが2つのスキルの上昇が示された。以上より,適応につながる援助要請行動を促進するための実証に基づく介入法が開発され,一定の効果が得られた。中学生対象の介入法開発の過程で大学院生,高校生にも実施し,介入効果,内容の適切性,難易度も考慮されており,中学生以上を対象とした介入法として学校現場でも利用可能なものが開発されたと考える。本研究の目的は中学生の援助要請行動から適応に至る過程を明らかにし,それらの実証的研究に基づいた不適応の予防的介入法を開発することであった。これまでの研究成果は以下の通りである。第1に,援助要請行動から適応に至る過程として,1.援助要請スキルの実行→2.援助の被授与(実行されたサポート)→3.援助に対する評価(援助評価)→4.学校適応,という4つの概念から構成される過程が先行研究を基に理論的に考察された。第2に,1,2,3の概念を測定する尺度が開発された。第3に,それぞれの概念と既存の適応尺度との関連,ならびに隣接する概念同士の関連が実証的に検討された。第4に,これらの過程とは別に,援助を求めることに関連する個人内変数である被援助志向性を測定する尺度(中学生版)が開発された。これらの研究結果を踏まえ,今年度の研究では,援助要請行動から適応に至るプロセスモデルの全体的な検討を行った。具体的には,中学生に過去1ヵ月以内に悩みを相談したときの状況を想起してもらい,上記の(1)(4)の概念すべてを含めた質問紙調査を実施した。その結果,悩みの経験が多いこととネガティブな援助評価(「対処の混乱」と「他者への依存」)の間には正の関連があること,援助要請スキルの実行と援助の被授与の間には正の関連があること,援助の被授与とポジティブな援助評価(「問題状況の改善」と「他者からの支えの知覚」)には正の関連があること,ポジティブな援助評価は学校適応と正の関連があり,ネガティブな援助評価は学校適応と負の関連があること,が明らかになった。加えて,それぞれの概念間の関連はこれまでの研究によって得られた知見と概ね一致する結果であった。今年度の研究により,先行研究の少ない援助要請行動から適応に至る過程が実証的に検討され,一つのモデルが提案され,適応の向上につながるための援助要請・援助提供の在り方に示唆が得られた。

以上より,適応につながる援助要請行動を促進するための実証に基づく介入法が開発され,一定の効果が得られた。中学生対象の介入法開発の過程で大学院生,高校生にも実施し,介入効果,内容の適切性,難易度も考慮されており,中学生以上を対象とした介入法として学校現場でも利用可能なものが開発されたと考える。
リモートセンシングによる林地土壌含水率の推定と荒廃森林の抽出

近年,間伐が遅れ,放置された人工林が増加しており,林床の裸地化による水涵養機能の低下や土壌流出等を引き起こす森林の荒廃が問題となっている.しかしながら,どの林分が荒廃しでいるかを広域的に調査することは非常に困難であり,対策をたてる上で大きな障害となっている.一方,リモートセンシング手法は広域性,瞬時性,定期性といった長所から,これらの問題に対して非常に有効な手段と考えられるが,リモートセンシングデータが捉えるのは林床ではなく樹冠であるため,荒廃状態を樹冠の状態から推定する必要がある.そこで,本研究では,荒廃した人工林と健全な人工林の樹冠の特徴を明らかにし,リモートセンシングデータを用いた荒廃人工林の抽出の有効性を評価することを目的とした.まず,現地調査による林内環境の解析を基に,相対照度と下草による被覆率の関係から人工林の荒廃度を評価した.次に,現地での散水実験および土壌含水率の測定によって,人工林が荒廃するにつれて土壌の浸透能,及び含水率が低下することを確認した.さらに,現地およびPOT実験において採集した単葉の含水率を測定した結果,土壌含水率が低下するにつれ,ヒノキの葉の含水率も低下することが分かった.含水率の低下によって分光反射特性も変化し,葉の含水率と葉の水分状態を表す植生指標との間に良好な相関性があることを確認した,特に,可視・近赤外バンドを用いたRatio Water Index (RWI)がヒノキの葉の含水率の推定に対して,最も有意な相関を示した(r=0.86).しかしながら,ASTERデータから算出したRWIを基に,人工林を荒廃度別にグループ化した結果,有意な差が見られなかった.これは,単葉レベルで得られた関係を群落レベルに対して適用することが困難であることを示唆している.荒廃した人工林では,葉の含水率が低下していても;樹冠密度が健全な人工林に比べて高いため,群落としての葉の含水量に違いが表れない可能性がある.一方,葉の水分状態を表す植生指標ではなく,ASTERの熱バンドを利用することによって,有意な差を確認することができた.これは,荒廃した人工林と健全な人工林との樹冠密度の違いによる,林床の影響の有無に起因していると考えられる.これらの結果から、リモートセンシングデータを用いた荒廃人工林の抽出には、可視光・近赤外・短波長赤外バンドより,熱バンドを利用した方が有効である可能性が示唆された。近年,間伐が遅れ,放置された人工林が増加しており,水涵養機能の低下や土壌流出等の問題で,人工林の荒廃が指摘されている.衛星リモートセンシングが捉えるのは樹冠であるため,森林の荒廃状態を,樹冠を通して推定する必要がある.一方,提案された植物の葉の水分状態を推定する指標は日本の多雨地域における荒廃した人工林を抽出できるかを検討する必要がある.そこで,本研究では,人工林の荒廃度と土壌含水率および葉の含水率の関係を明らかにすること,また,リモートセンシングからヒノキの葉の含水率を推定する可能性を検討すること,最後に,衛星データを用いた荒廃人工林の抽出を試み,その有効性を評価することを目的とした.現地調査による林内環境の解析を基に,相対照度と下草による被覆率の関係から人工林の荒廃度を評価した.人工林荒廃度別に土壌含水率を分類化した結果,人工林の荒廃度が増加するにつれて,土壌含水率が低下することが明らかになった.次に,POT実験において,土壌含水率の低下による葉の含水率の変化を観測した結果,土壌含水率が低下するにつれ,ヒノキの葉の含水率が連動して低下することが明らかになった(r=0.80).ヒノキの葉の含水率の低下によって分光反射特性も変化し,葉の含水率と葉の水分状態を推定する植生指標には,良好な相関性がみられた.特に,Ratio Water Index(RWI)がヒノキの葉の含水率の推定に対して,最も有意な相関を示した(r=0.86).RWIを用いて,Aster衛星データから,荒廃した人工林の抽出を試みた.その結果,荒廃した人工林の割合は,大正町では52%,葛篭川流域では43%と判定された.現地調査地点を利用して精度評価を行った結果,この荒廃度マップの分類精度は63%であった.今後,斜面特性や樹冠温度の考慮,現地調査による荒廃度分類の閾値の検討を行うことによって,人工林荒廃状況の評価がより正確に行えるようになると考える.近年,間伐が遅れ,放置された人工林が増加しており,林床の裸地化による水涵養機能の低下や土壌流出等を引き起こす森林の荒廃が問題となっている.しかしながら,どの林分が荒廃しでいるかを広域的に調査することは非常に困難であり,対策をたてる上で大きな障害となっている.一方,リモートセンシング手法は広域性,瞬時性,定期性といった長所から,これらの問題に対して非常に有効な手段と考えられるが,リモートセンシングデータが捉えるのは林床ではなく樹冠であるため,荒廃状態を樹冠の状態から推定する必要がある.そこで,本研究では,荒廃した人工林と健全な人工林の樹冠の特徴を明らかにし,リモートセンシングデータを用いた荒廃人工林の抽出の有効性を評価することを目的とした.

まず,現地調査による林内環境の解析を基に,相対照度と下草による被覆率の関係から人工林の荒廃度を評価した.次に,現地での散水実験および土壌含水率の測定によって,人工林が荒廃するにつれて土壌の浸透能,及び含水率が低下することを確認した.さらに,現地およびPOT実験において採集した単葉の含水率を測定した結果,土壌含水率が低下するにつれ,ヒノキの葉の含水率も低下することが分かった.含水率の低下によって分光反射特性も変化し,葉の含水率と葉の水分状態を表す植生指標との間に良好な相関性があることを確認した,特に,可視・近赤外バンドを用いたRatio Water Index (RWI)がヒノキの葉の含水率の推定に対して,最も有意な相関を示した(r=0.86).しかしながら,ASTERデータから算出したRWIを基に,人工林を荒廃度別にグループ化した結果,有意な差が見られなかった.これは,単葉レベルで得られた関係を群落レベルに対して適用することが困難であることを示唆している.荒廃した人工林では,葉の含水率が低下していても;樹冠密度が健全な人工林に比べて高いため,群落としての葉の含水量に違いが表れない可能性がある.一方,葉の水分状態を表す植生指標ではなく,ASTERの熱バンドを利用することによって,有意な差を確認することができた.これは,荒廃した人工林と健全な人工林との樹冠密度の違いによる,林床の影響の有無に起因していると考えられる.これらの結果から、リモートセンシングデータを用いた荒廃人工林の抽出には、可視光・近赤外・短波長赤外バンドより,熱バンドを利用した方が有効である可能性が示唆された。
TGF-βファミリー特異的阻害分子の開発

研究背景と研究目的TGFβスーパーファミリーの一員であるMyostatin(MSTN)は、筋形成を負に制御する因子である。このMSTNの作用を制御することが出来れば、骨格筋量を増大させ、筋力を増強させることが可能になり、筋萎縮による運動機能の低下をともなう筋疾患の治療に応用が可能である。我々の研究目的は、MSTNの特異的阻害分子を作製し、筋形成促進効果を臨床へ応用することである。研究方法これまでの研究で作製したMSTN特異的阻害分子過剰発現マウスを用い、分子生物学的、筋組織病理学的解析を行い、マウス生体内におけるMSTN特異的阻害効果を検討した。さらに、筋萎縮を示すモデルマウスと交配実験を行い、改善効果について検討した。また、作製したマウスにおける脂肪組織の解析を行った。研究成果MSTN特異的阻害分子過剰発現マウスを用い、DMD型筋ジストロフィーのマウスと交配実験を行い、改善効果を確認することが出来た。また筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデルマウスとの交配実験も行ったが、MSTN阻害による筋肥大は示すが病状の改善効果は得られなかった。今後は筋原発性の筋萎縮を示すモデルマウスを用い、治療効果を検討していく予定である。さらにMSTN阻害マウスにおいて著しい脂肪組織の減少が確認され、形態学的解析結果から、脂肪細胞が小さくなり、さらに細胞の構造自体に変化が確認された。このマウスでは代謝関連分子の遺伝子発現に違いが見られ、脂肪組織減少のメカニズムも明らかになりつつある。以上の結果より、作製したMSTN特異的阻害分子は先天性の筋疾患治療薬としてのみならず、生活習慣病の新しい予防薬として有効であると考えられる。今後、筋疾患治療への応用、生活習慣病予防への応用を視野に入れ研究を進めていく予定である。研究目的筋肉の増強作用を持つ物質の開発は、筋肉ジストロフィーをはじめとする先天性の筋肉疾患の治療を考える上で非常に重要である。MyostatinはTGFβスーパーファミリーの一員で、生体内において筋肉の量を負に調節する因子と考えられている。Myostatinの作用を制御することで筋力を増強させ、多くの筋疾患の治療に応用することを目的とする。現在Myostatinの阻害物質として明らかになっているのは、Follistatin(FS)、FLRG(follistatin-related gene)、Myostatin propeptideである。このうち、FSに注目し、サイトカインとの結合性を変化させるプロテオミクス創薬の手法を用いて、Myostatin特異的阻害分子を開発し、臨床応用を目的とした基礎的研究を行う。研究方法FSを改変した分子を創製し、Myostatin特異的阻害分子を作製した。次にFS改変分子を骨格筋特異的に過剰発現するマウスを作製し、in vivoでの作用を分子生物学的、筋組織病理学的に解析を行った。さらに、筋ジストロフィーマウスであるmdxマウスとの交配実験を行った。研究成果FS分子の蛋白質ドメイン構造を改変することで、FSが本来持つActivin阻害効果を持たない、Myostatinのみを特異的に阻害するFSキメラ1分子を作製する事に成功した。このFSキメラ1過剰発現マウスにおいては、明らかな筋肥大を示し、加えて、運動機能の増加や、脂肪組織の減少が確認された。非常に興味深いことに、このFSキメラ1過剰発現マウスとmdxマウスの交配実験の結果から、FSキメラ1の発現により筋繊維の崩壊が緩和することが明らかになった。以上の結果より、作製したFSキメラ1分子は先天性の筋疾患治療薬として有効であると考えられる。研究目的筋肉の、再生、補強作用を持つ物質の開発は、筋肉ジストロフィーをはじめとする先天性の筋肉疾患の治療を考える上で非常に重要である。Myostatinの作用を制御することで、骨格筋量を増大させ、筋力を増強させることで多くの筋疾患の治療に応用することを目的とする。研究方法これまでに作製した、FSを改変したMyostatin特異的阻害分子を用いて、遺伝子改変動物を作製した。作製したマウスを、分子生物学的、筋組織病理学的に解析を行った。さらに、様々な筋ジストロフィーモデルマウスと交配実験を行った。また、作製したマウスを用い脂肪組織の研究を行った。研究成果FSキメラ1過剰発現マウスにおいて、病理学的解析から明らかな筋肥大を確認し、加えて、ローターロッド、ワイヤーハング実験を行い運動機能の増加を明らかにした。また、mdxマウスとの交配実験により、FSキメラ1を作用させることで病状の改善効果があることを明らかになった。また現在進行中であるがマイオスタチンを阻害することで発現量の変化する遺伝子が明らかになった。これについては、さらに解析を進め筋肥大の分子的メカニズムの解明を進める。作製したマウスでは著しい脂肪組織の減少が確認された。病理学的解析結果から、脂肪組織中の脂肪細胞の大きさが小さくなっていることが明らかになった。また、このマウスは内臓脂肪の蓄積が抑えられており、肥満になりにくい性質を持つことが分かった。

以上の結果より、作製したFSキメラ1分子は先天性の筋疾患治療薬としてだけではなく、生活習慣病の予防のための新しい予防薬として有効であると考えられる。研究背景と研究目的TGFβスーパーファミリーの一員であるMyostatin(MSTN)は、筋形成を負に制御する因子である。このMSTNの作用を制御することが出来れば、骨格筋量を増大させ、筋力を増強させることが可能になり、筋萎縮による運動機能の低下をともなう筋疾患の治療に応用が可能である。我々の研究目的は、MSTNの特異的阻害分子を作製し、筋形成促進効果を臨床へ応用することである。研究方法これまでの研究で作製したMSTN特異的阻害分子過剰発現マウスを用い、分子生物学的、筋組織病理学的解析を行い、マウス生体内におけるMSTN特異的阻害効果を検討した。さらに、筋萎縮を示すモデルマウスと交配実験を行い、改善効果について検討した。また、作製したマウスにおける脂肪組織の解析を行った。研究成果MSTN特異的阻害分子過剰発現マウスを用い、DMD型筋ジストロフィーのマウスと交配実験を行い、改善効果を確認することが出来た。また筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデルマウスとの交配実験も行ったが、MSTN阻害による筋肥大は示すが病状の改善効果は得られなかった。今後は筋原発性の筋萎縮を示すモデルマウスを用い、治療効果を検討していく予定である。さらにMSTN阻害マウスにおいて著しい脂肪組織の減少が確認され、形態学的解析結果から、脂肪細胞が小さくなり、さらに細胞の構造自体に変化が確認された。このマウスでは代謝関連分子の遺伝子発現に違いが見られ、脂肪組織減少のメカニズムも明らかになりつつある。以上の結果より、作製したMSTN特異的阻害分子は先天性の筋疾患治療薬としてのみならず、生活習慣病の新しい予防薬として有効であると考えられる。今後、筋疾患治療への応用、生活習慣病予防への応用を視野に入れ研究を進めていく予定である。
結び目と3次元多様体の不変量に関連するトポロジー

本研究の科学研究費補助金の支援により、国際研究集会「Invariants of knots and 3-manifolds」を、平成13年9月17日9月21日の期間、京都大学数理解析研究所において、同研究所の平成13年度プロジェクト研究「21世紀の低次元トポロジー」の一環である同研究所の共同利用計画(短期共同)として、開催した。出席者は96名であり、内26名が国外からの参加であった。また、同じ月の研究集会以外の週は同研究所においてセミナーを開催し、研究討論を行った。歴史的にはこの分野は1980年代にChern-Simons場の理論の相関関数として結び目と3次元多様体の量子不変量という膨大な数の不変量が発見されたことに由来する新しい研究領域である。この分野に関してこの20年間になされたさまざまな研究によりChern-Simons場の理論の相関関数をトポロジーの立場から理解する作業はほぼ完了しつつあり、不変量の研究はその意味で現在転機をむかえているとおもわれる。そのような時期である今、国内外の一線の研究者が本研究集会・セミナーに集まり研究発表・討論できたことは、この分野の研究の今後の展望を考え、参加者で認識をともにする上で、きわめて有意義なことであった。本研究集会のProceedingsはオンラインジャーナルGeometry and Topology Monographsから出版され、本研究集会における具体的な研究成果はここにまとめられた。とくに参加者から提出された数々の未解決問題は、研究集会のproblem sessionにおける討議をへて大槻により編集され、約200ページの未解決問題集としてまとめられた。この未解決問題集もProceedingsの一部として出版される予定である。この分野の今後の動向の指針となることを期待したい。研究集会「結び目と3次元多様体の不変量に関するトポロジー」を,平成13年9月17日9月21日の期間,京都大学数理解析研究所において,同研究所の平成13年度プロジェクト研究「21世紀の低次元トポロジー」の一環である同研究所の共同利用計画(短期共同)として,開催した.出席者は96名であり,内26名が国外からの参加であった.外国人招待講演者に旅費と滞在費を支給し,また日本人招待講演者と研究集会参加者に(とくに若手研究者を中心に)旅費滞在費の援助をおこなった.歴史的にはこの分野は1980年代にChern-Simons場の理論の相関関数として結び目と3次元多様体の量子不変量という膨大な数の不変量が発見されたことに由来する新しい研究領域である.この分野に関してこの20年間になされたさまざまな研究によりChern-Simons場の理論の相関関数をトポロジーの立場から理解する作業はほぼ完了しつつあり,不変量の研究はその意味で現在転機をむかえているとおもわれる.そのような時期である今,国内外の一線の研究者が本研究集会に集まり研究発表・討論できたことは,この分野の研究の今後の展望を考え,参加者で認識をともにする上で,きわめて有意義なことであった.本研究集会のProceedingsはオンラインジャーナルGeometry and Topology Monographsから出版される予定であり,本研究集会における具体的な研究成果はここにまとめられる.とくに参加者から提出された数々の未解決問題は,研究集会のproblem sessionにおける討議をへて大槻により編集され,百数十ぺ一ジにおよぶ未解決問題集としてまとめられつつある.この未解決問題集もProceedingsの一部として出版される予定である.

この分野の今後の動向の指針となることを期待したい.本研究の科学研究費補助金の支援により、国際研究集会「Invariants of knots and 3-manifolds」を、平成13年9月17日9月21日の期間、京都大学数理解析研究所において、同研究所の平成13年度プロジェクト研究「21世紀の低次元トポロジー」の一環である同研究所の共同利用計画(短期共同)として、開催した。出席者は96名であり、内26名が国外からの参加であった。また、同じ月の研究集会以外の週は同研究所においてセミナーを開催し、研究討論を行った。歴史的にはこの分野は1980年代にChern-Simons場の理論の相関関数として結び目と3次元多様体の量子不変量という膨大な数の不変量が発見されたことに由来する新しい研究領域である。この分野に関してこの20年間になされたさまざまな研究によりChern-Simons場の理論の相関関数をトポロジーの立場から理解する作業はほぼ完了しつつあり、不変量の研究はその意味で現在転機をむかえているとおもわれる。そのような時期である今、国内外の一線の研究者が本研究集会・セミナーに集まり研究発表・討論できたことは、この分野の研究の今後の展望を考え、参加者で認識をともにする上で、きわめて有意義なことであった。本研究集会のProceedingsはオンラインジャーナルGeometry and Topology Monographsから出版され、本研究集会における具体的な研究成果はここにまとめられた。とくに参加者から提出された数々の未解決問題は、研究集会のproblem sessionにおける討議をへて大槻により編集され、約200ページの未解決問題集としてまとめられた。この未解決問題集もProceedingsの一部として出版される予定である。この分野の今後の動向の指針となることを期待したい。
日韓安全保障協力の形成メカニズム:非西洋型国際関係理論の理論的・実証的研究

初年度となる平成29年度は、(1)1990年および2000年代における日本と韓国の安全保障政策決定過程を新古典現実主義の視点から分析し、(2)1980年代の日韓関係(中曽根政権下での対韓経済援助)に関して調査を行った。特に、平成29年度は理論研究に集中的に取り組んだ。日韓が安全保障協力を開始した1990年代と比較し、冷戦下での日韓安全保障関係について研究を行った。(1)に関しては、主に自民党第1次安倍政権から民主党政権そして自民党政権への2度に渡る内閣交代という日本の国内政治の過渡期を対象として日韓安全保障政策を分析した論文を発表した。また、本研究課題のベースとなった研究代表者(冨樫)の博士論文を日本語へ翻訳し、本研究課題における冷戦下での日韓安全保障関係について補完した著書「日韓安全保障協力の検証ー冷戦以降の『脅威』をめぐる力学」を平成29年7月に出版した。(2)に関しては、平成29年度では対韓円借款決定の背景を探る過程において、当初の計画に加えて1980年代初頭の中朝関視点が重要となることが分かり、研究を進めている。当初の研究計画では、研究代表者(冨樫)をはじめとして、研究協力者には中朝関係の専門家が含まれていなかったため、平成30年度以降は、国内外の中朝関係専門家もしくは冷戦期の中国専門家などとの意見交換を積極的に行い、包括的な視点から研究課題に取り組んで行きたい。平成30年度以降は、研究実施計画においては本来であれば初年度に行う予定であった資料研究に取り組んで行きたい。当初の計画では、初年度資料研究を行う予定であったが、資料調査がスムーズに行えないなどのトラブルがあった。一方で、本研究の第2段階でもある理論研究は比較的順調に進んでいる。理論研究は資料調査に比べて時間がかかるため、やや遅れていると評価した。今後の計画としては、初年度に滞っていた資料研究を進めていくと同時に、平成30年度に計画されていた理論研究も行う。また、12月ごろには国内外の研究協力者とセミナーを開催し、研究に対する完成度を高めて行く予定である。当初物品費として計上したデスクトップパソコンはノートパソコンへと変更し、プリンターの購入を検討していたため、今年度購入する予定である。その他、資料調査を目的とした出張および、アメリカへの学会報告が次年度へ、および韓国や国内へと変更となったため、初年度の使用率が低かったものを思われる。これらについては、平成30年度中に実施する計画である。
コンドロイチン4硫酸転移酵素の精製とクローニング

ラット軟骨肉腫細胞の培養液に分泌される硫酸転移酵素の性質を調べた結果、コンドロイチンのGalNAc残基の4位に硫酸基を転移するコンドロイチン4硫酸転移酵素(C4ST)は分泌されるがGal NAc残基の6位に硫酸基を転移するコンドロイチン6硫酸転移酵素(C6ST)は全く分泌されないことが分かった。そこでラット軟骨肉腫細胞の無血清培養液を原料として、ヘパリンセファロースCL-6B、Matrex gel red A-アガロース、3',5'-ADP-アガロース、2回目ヘパリンセファロースを用いたクロマトグラフィーによりC4STを均一に精製した。精製された酵素は非還元条件のSDS-PAGEでで50と54kDaの幅広いバンドを示し、ジチオスレイトールのようなスルフヒドリル基をもつ化合物により活性化された。精製C4STはコンドロイチン、脱硫酸化デルマタン硫酸に硫酸基を転移したが、イカ軟骨のコンドロイチン硫酸E、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、完全に脱硫酸化後N再硫酸化したヘパリンには転移しなかった。コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸Cには低い効率で硫酸基が転移された。硫酸化されたコンドロイチン、脱硫酸化デルマタン硫酸をコンドロイチナーゼABCで消化すると、ΔDi-4Sのみが得られることから、GalNAc残基の4位のみが硫酸化されることが分かった。脱硫酸化デルマタン硫酸を基質としたときは、GlcA残基に富んだ部分が優先的に硫酸化された。このことからこの酵素はGlcAとIdoAを識別することが考えられる。精製酵素をエンドペチダーゼで消化し、ペプチドを逆相キャピラリーHPLCで分離し、得られたペプチドのアミノ末端のアミノ酸配列を調べた結果、6種類の配列を得ることが出来た。現在このアミノ酸配列に基づいてcDNAのクローニングを行っている。ラットコンドロザルコ-マ由来の細胞株(RCS-LTC)からコンドロイチン4硫酸転移酵素が分泌されるかどうかを調べた。その結果、コンドロイチン6硫酸転移酵素やコンドロイチン4硫酸転移酵素が培養したニワトリ軟骨細胞から分泌されるのと同様に、RCS-LTCからコンドロイチン4硫酸転移酵素が分泌されることがわかった。ニワトリ軟骨細胞との最も大きな相違は、RCS-LTCでは培養液に分泌されるコンドロイチン6硫酸転移酵素が極めて少なく、大部分がコンドロイチン4硫酸転移酵素であることであった。RCS-LTCからのコンドロイチン4硫酸転移酵素の分泌は、無血清培地に交換後急速に減少することがわかったので、最も効率よく分泌されたコンドロイチン4硫酸転移酵素を回収するため、無血清培養液に交換後、2日目と4日目にコンドロイチン4硫酸転移酵素を含む培養液を回収した。回収した培養液14リットルから、Heparin-Sepharose CL-6B、Matrex gel red A、3',5'-ADP-agarose、Second heparin-Sepharose CL-6Bによりコンドロイチン4硫酸転移酵素をほぼ均一に精製した。精製タンパク質は分子量5万の糖タンパク質であった。コンドロイチン4硫酸転移酵素はジチオスレイトールなどのSH化合物により活性化された。精製したコンドロイチン4硫酸転移酵素はコンドロイチンだけでなく、脱硫酸化デルマタン硫酸にも硫酸基を転移した。

放射性硫酸で標識された脱硫酸化デルマタン硫酸をコンドイチナーゼACIIで分解すると、約50%の放射能が△Di-4Sとして回収されることから、コンドロイチン4硫酸転移酵素はGl_CA残基にはさまれたGalNA_C残基の4位を選択的に硫酸化すると考えられる。ラット軟骨肉腫細胞の培養液に分泌される硫酸転移酵素の性質を調べた結果、コンドロイチンのGal NAc残基の4位に硫酸基を転移するコンドロイチン4硫酸転移酵素(C4ST)は分泌されるがGal NAc残基の6位に硫酸基を転移するコンドロイチン6硫酸転移酵素(C6ST)は全く分泌されないことが分かった。そこでラット軟骨肉腫細胞の無血清培養液を原料として、ヘパリンセファロースCL-6B、Matrex gel red A-アガロース、3',5'-ADP-アガロース、2回目ヘバリンセファロースを用いたクロマトグラフィーによりC4STを均一に精製した。精製された酵素は非還元条件のSDS-PAGEでで50と54kDaの幅広いバンドを示し、ジチオスレイトールのようなスルフヒドリル基をもつ化合物により活性化された。精製C4STはコンドロイチン、脱硫酸化デルマタン硫酸に硫酸基を転移したが、イカ軟骨のコンドロイチン硫酸E、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、完全に脱硫酸化後N再硫酸化したヘパリンには転移しなかった。コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸Cには低い効率で硫酸基が転移された。硫酸化されたコンドロイチン、脱硫酸化デルマタン硫酸をコンドロイチナーゼABCで消化すると、ΔDi-48のみが得られることから、Gal NAc残基の4位のみが硫酸化されることが分かった。脱硫酸化デルマタン硫酸を基質としたときは、GlcA残基に富んだ部分が優先的に硫酸化された。このことからこの酵素はGlcAとIdoAを識別することが考えられる。精製酵素をエンドペプチダーゼで消化し、ペプチドを逆相キャピラリーHPLCで分離し、得られたペプチドのアミノ末端のアミノ酸配列を調べた結果、6種類の配列を得ることが出来た。現在このアミノ酸配列に基づいてcDNAのクローニングを行っている。
温熱寒涼食品の温度感受性ＴＲＰ受容体活性化能と体熱産生への影響

human TRPM8、TRPV3, TRPV4を安定的に発現する培養細胞系を樹立した。香辛植物の精油や抽出物30種にて、これらの活性化成分ならびに阻害成分のスクリーニングを行い、TRPM8のアゴニストと、TRPV3・TRPV4のアンタゴニストを含む抽出物等数種を見出したが、いずれも単離には至らなかった。新たなTRPV1・TRPA1アゴニストを複数の香辛植物から見出した。また、ボアカンジンの温度感受性TRP受容体への作用を詳細に調べた。マウスでの給餌試験で、TRPM8とTRPA1アゴニストの効果を調べた。また、無麻酔にてマウスの体表面温度を赤外線サーモグラフィーにて測定する実験系を開発した。暖かい温度域で活性化されるhumanTRPV4遺伝子を取得し、pcDNA4/TOベクターに組み込んでリポフェクション法によりT-Rex HEK細胞にトランスフェクトして、抗生物質で選抜してhTRPV4安定発現細胞を取得した。また、冷たい温度域で活性化するTRPM8については、これまでマウスTRPM8の安定発現細胞を用いていたが、今回、human TRPM8遺伝子を取得し、TRPV4の場合と同様の手法により、hTRPM8安定発現細胞の樹立に成功した。昨年度樹立したhTRPV3安定発現細胞と、今年度作製したhTRPM8安定発現細胞を用いて、香辛植物10数種の精油ならびにエタノール抽出物にて活性化成分の探索を実施したが、TRPV3ならびにTRPM8を活性化した精油・抽出物は存在しなかった。新たなTRPV1・TRPA1活性化成分をドリアンから探索し、含硫化合物数種がTRPA1活性を有することを見出した。温度感受性TRP受容体に影響を及ぼす成分としてボアカンジンを見出し、TRPA1活性を有していながら、TRPV1とTRPM8に対して特異な阻害活性を示すことを明らかにした。また、ヒトにおいて体温上昇効果が知られているウインターセーボリー中の活性化成分をTRPV1・TRPA1安定発現細胞を用いて探索し、精油の主成分であるカルバクロールがTRPA1活性を有することによるものであることを明らかにした。さらにin vivoの実験系として、撮影台等を種々検討することにより、無麻酔にて低拘束状態でマウスの表皮温度の変化を2匹同時にモニターできる系を確立した。温度感受性TRP受容体のうち、「暖かい」という温度域で活性化されるhumanTRPV3の遺伝子を取得し、リポフェクション法によりHEK293細胞に遺伝子導入し、抗生物質による選抜を複数回実施して、TRPV3を安定的に発現した細胞を樹立した。また、ヒトTRPV2での実験系として、安定発現細胞ではなく、一過的発現細胞にて活性化物質の検討ができることを確立した。In vivo試験としては、培養細胞にてTRPA1の強い活性化物質であることを見出している1'-Acetoxychavicol acetate(ACA)のマウスにおける混餌投与試験を実施した。投与するためにACA合成し、ラセミ体を得た。天然のACAはS-体であるため、ラセミ体とS体のTRPA1活性を培養細胞で比較検討した。ラセミ体はS体と同等の活性を示したことから、ラセミ体をそのまま、肥満を誘発する高脂肪高ショ糖(HFS)食に0.025と0.050%の濃度で添加し、一ヶ月間マウスに給餌した。摂取カロリーは等しかったが、腎周囲と精巣上体周辺ならびに腸間膜の白色脂肪組織は、ACAの添加により有意に蓄積量が減少した。また、肩胛骨間の褐色脂肪組織中の産熱蛋白質であるUCP1含量がACA群で増大した。これらのことからACAは脂肪蓄積の抑制作用を示すことが明らかとなった。また、TRPM8野活性化成分メントールと、TRPM8特異的活性化成分WS-12を用いて、同様の給餌試験を実施し、TRPM8活性化成分の肥満等への影響を検討した。メントールとWS-12をそれぞれHFS食に添加し、一ヶ月間給餌した。カロリー摂取は等しく、体重にも差は見られなかった。内蔵脂肪組織重量はWS-12の添加で影響を受けなかった。しかし、HFS群で見は血中グルコース値が高値を示したが、メントールならびにWS-12添加群では低下し、高血糖の改善効果が認められた。これまでに樹立したhumanTRPV1・TRPA1・TRPM8・TRPV3・TRPV4安定発現細胞を用いて、30数種の植物抽出物および精油についてアゴニスト活性ならびにアンタゴニスト活性を測定した。

その結果、アゴニストとしては柑橘類から複数の化合物、香辛料1種から比較的高活性なTRPM8アゴニスト活性画分を見だしたが、TRPV3およびTRPV4に関しては活性抽出物および精油はみられなかった。柑橘精油ならびに香辛料1種の精油にhTRPM8阻害、香辛料2種の精油にhTRPV3阻害、香辛料3種精油にhTRPV4に対する比較的強い阻害活性が認められた。これらに含まれる主要成分で活性化および阻害の本体の解明を試みたが、いずれも活性化及び阻害活性は認められたものの、微量成分が活性本体である可能性が示唆された。これらの中でも現在、hTRPM8活性およびhTRPV4阻害活性の本体を生成しているところである。化合物の同定ができたら、昨年度確立した無麻酔でのマウス表皮温測定系にて、in vivoでの影響を検討する予定である。食品化学TRPV3,TRPV4ならびにhuman TRPM8の安定発現細胞の樹立に成功し、植物抽出物等でTRPV3とTRPM8活性化成分の探索を実施した。また、新たなTRPA1活性化成分数種をドリアンとウインターセーボリーから見出した。In vivoではTRPM8活性化成分の効果の検証ができ、また無麻酔にて表面温度に与える影響の実験系を確立でき、おおむね実験は順調に進展している。TRPV3遺伝子の取得は達成できたが、予定していたTRPV4遺伝子は取得できなかった。しかし、H25年度に予定していたTRPV3を安定的に発現した細胞は今年度に樹立することができた。また、TRPM8活性化成分の探索も実施できなかった。しかし、平成25年度以降に予定していた、時間と手間を要する、温度感受性TRP受容体を活性化する成分の動物試験は、昨年度先行して2例実施することができた。これらのことから、研究は概ね順調に進展していると考える。引き続き、TRPV3, TRPV4, TRPM8の安定発現細胞を用いて、アゴニストならびにアンタゴニスト活性を有する食品と、活性化成分の単離・精製・構造決定を行う。温性ならびに寒・涼性食品を中心に探索を実施する。あわせて、in vivoの実験にて、マウスの体温への影響を検証する。これらの結果を踏まえて、食品の五性と温度感受性TRP受容体活性化能との関係を考察する。温度感受性TRP受容体のうち、TRPV4遺伝子を取得し、安定的発現細胞を樹立するか、一過性発現系にて試験できる実験系を確立する。クローニングに成功したら、抗生物質耐性遺伝子を組み込んだベクターを用いてhuman embryonic kidney (HEK) 293細胞や、Chinese hamster ovary (CHO)細胞などに遺伝子導入試薬を用いて形質転換させて一過性の発現細胞としてそのまま用いるか、抗生物質存在下で細胞を培養して、human TRPsを発現している細胞を選択し、安定的にTRPsを発現する細胞を選別していく。また、TRPV3, TRPV4, TRPM8に対するアゴニスト活性を有する食品と活性化化合物の単離・精製・同定を進める。温性および涼性食品を中心にスクリーニングを行う。
DNA 型トランスポゾンによる養殖ノリ分子育種法の開発

スサビノリESTデータベースに見いだされた6種のDNAトランスポゾン様配列をもとに,それらの構造とストレス応答性を調べた。6種の配列のうちのひとつは細菌の挿入因子と相同性があった。この因子はゲノム中に複数存在し,ストレス応答性を示した。また,この因子は平成25年3月に公開されたスサビノリ全ゲノム配列中にも複数存在していたことから転移能をもつことが予想され,養殖ノリの分子育種や遺伝子解析への利用が期待される。海苔養殖に利用されているスサビノリは大型海藻のモデル植物として注目されており、ゲノムプロジェクトもほぼ終了し現在公開待ちの状況にある。しかし,遺伝子導入法や形質転換体作出法など遺伝子資源を活用するための基礎技術が確立していない。本研究は,スサビノリからDNA型トランスポゾシ遺伝子を分離し,ストレス処理による活性化を用いて効率的な変異体作出法を開発することを目的としている。初年度はかずさDNA研究所に登録されているスサビノリのESTクローンの配列を利用して、ストレスに応答する転移因子の検索を行った。スサビノリの公開ESTクローンは6種のトランスポゼース様コンティグ配列に分類できた。これら6種の配列のうち3種はセンス配列であったが、残りの3種はアンチセンス配列であった。RT-PCRにより発現量を調べたところ、これらのセンス配列およびアンチセンス配列は通常の生育条件でも少量ながら発現していることが明らかになった。なお、アンチセンス配列として登録されていた遺伝子はアンチセンス配列に加えてセンス配列の発現も検出された。次に、各種ストレス処理による転写量の変化を調べたところ16種のトランスポゼやス様配列のうち、細菌め挿入因子および真核生物のSn/Spmのトランスポゼース領域と相同性のある遺伝子は硫酸銅処理により転写が増大することが明らかになった。これらはいずれも、通常状態ではセンス配列が発現している遺伝子であった。また、これらの遺伝子は熱ストレス処理によっても転写が活性化することが示された。次年度はこれらのストレス応答性遺伝子を中心に遺伝子構造や転移能について検討する予定である。本研究は,スサビノリからDNA型トランスポゾン遺伝子を分離し,ストレス処理による活性化を用いて効率的な変異体作出法を開発することを目的としている。H22年度は,かずさDNA研究所に登録されているスサビノリESTデータベースから6種のトランスポゼース様遺伝子を見いだし,それらの部分配列をもとに発現様式を調べた。その結果,4種の遺伝子は通常状態ではアンチセンス配列が転写され,ストレス処理にも応答しなかった。一方,細菌の挿入因子および真核生物のSn/Spmのトランスポゼース領域と相同性のある2種の遺伝子は通常状態でもセンス鎖配列がごく微量発現し,銅ストレス処理により発現がわずかに増大した。細菌型トランスポゾンが真核生物でも活性型因子として存在する例は知られていないが,起源の古い紅藻スサビノリには残存している可能性が考えられた。そこで,H23年度は細菌型トランスポゾンに焦点をあて,他の5種のトランスポゼース様遺伝子と比較しながら,遺伝子構造と発現様式を再検討した。その結果,細菌型トランスポゾンは201アミノ酸のトランスポゼース様配列のみをコードする単純な構造をもち,磁性細菌の挿入因子と相同性があることがわかった。また,ストレス条件を再検討した結果,同因子は銅ストレスにより転写が活性化されることが確認された。海苔養殖に利用されているスサビノリは大型海藻のモデル植物として注目されており、ゲノムプロジェクトもほぼ終了し現在公開待ちの状況にあった。しかし,遺伝子導入法や形質転換体作出法など遺伝子資源を活用するための基礎技術が確立していなかった。本研究は,スサビノリからDNA型トランスポゾン遺伝子を分離し,ストレス処理による活性化を用いて効率的な変異体作出法を開発することを目的としていた。一方,細菌の挿入因子および真核生物のSn/Spmのトランスポゼース領域と相同性のある2種の遺伝子は通常状態でもセンス鎖配列がごく微量発現していた。

その結果,細菌型トランスポゾンは201アミノ酸のトランスポゼース様配列のみをコードする単純な構造をもち,磁性細菌の挿入因子と相同性があることがわかった。また,ストレス条件を再検討した結果,同因子は銅ストレスにより転写が活性化されることが確認された。H24年度は細菌型トランスポゾンのゲノム構造を調べ,欠損遺伝子もあるが,活性型構造をもつものがあることがわかった。H25年3月にスサビノリのゲノム情報が公開され,この細菌型トランスポゾンがゲノム中に複数存在したことから,この細菌型トランスポゾンは活性型をもつことが推定された。平成21年度にはスサビノリゲノムプロジェクトがほぼ終了したことが新聞紙上でプレリリースされたため,平成23年度はこの公開情報をもとに研究を進める予定であったが,公開が遅れて平成24年4月の時点でも非公開である。ゲノム情報の公開との動向を考慮したために研究の進展が若干遅れた。24年度が最終年度であるため、記入しない。H23年度の研究から細菌型挿入因子様遺伝子に焦点を絞ることができた。幸い,同遺伝子は単純な遺伝子構造であり,また細菌型であることから真核型因子よりも機能解析が容易ではないかと期待している。
転写制御因子の多機能性-翻訳調節へのクロストーク

本研究では、Bリンパ球の最終分化段階、すなわち形質細胞が多量の抗体を産生するにあたって起こる翻訳制御の変更が、抑制性転写制御因子であるId2遺伝子の破壊によって、この分化のマスターとされる遺伝子転写には一見無関係に増強されることが見出され、これは翻訳制御が細胞分化の中にプログラムされた過程として起こるものであることを意味すると考えられることから、Id2遺伝子破壊マウスのBリンパ球をモデル実験系として、転写制御因子が未知の機能として翻訳制御、ことに翻訳開始信号の選択制御に関与している可能性を検証した。Id2遺伝子破壊マウスのId2遺伝子破壊マウスのBリンパ球をLPSとIL-4によって刺激で培養し、最終分化マーカーであるシンデカンの発現をモニターしつつ、各種翻訳因子のリン酸化などの修飾状態や分解速度などを正常Bリンパ球と比較した。このときにId2遺伝子を導入して強制的に発現させることで検出された相違点を修復できるか検討した。これらの結果は、転写の制御(抑制)因子と考えられていた、Id2が何らか細胞質内の信号伝達系を制御修飾していることを強く示唆したが、翻訳制御との明確なクロストークに関する確証を得るには至っていない。一方、CpG配列を含むオリゴヌクレオチドが、IgG1とIgEへのクラススイッチ組換えを、非組換え型転写の制御を介して特異的に抑制することを見出し、その分子機構を関与が想定できる転写制御因子の遺伝子破壊マウス由来Bリンパ球を用いて解析した。その結果、この抑制にはそれぞれE2A、STAT6を抑制するId2、Bcl6は関与しておらず、NFkBとIRF4の活性抑制を介していることが見出された。