hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核エネルギーの「平和利用」協力と日米同盟　1958-1968

本研究成果は、以下に要約される。第1にそれは、1958年の日米原子力協定、1963年の日米IAEA原子力保障措置移管協定、1968年の新日米原子協定に関する外交史料の収集に成功したことである(ただし、1963年協定に関しては一部のみ)。第2に、本研究ではとくに1958年協定を重点的に、日米英の3カ国の外交史料の収集・分析に基づいて、その過程と意義を明らかにした点である。第3に、研究者同士が利用できる外交史料のデータベースの原型を作製したことである。本研究は、現在の日本の安全保障の根幹を成している日米同盟、そしてその中心的要素といえる米国の核兵器による拡大抑止、いわゆる「核の傘」の形成と発展が、同じく日米間の核エネルギーの「平和利用」協力といかなる関係にあったのかについての解明を目指すものである。そこで本研究は、1958年の「日米原子力一般協定」、1963年の「日米IAEA保障措置移管協定」、1968年の「新日米原子力一般協定」という、1950年代半ばから60年代にかけて日米間で締結された3つの核エネルギーの「平和利用」協力関連の協定に着目し、主として米国政府内部の政策決定過程から分析を行っていくことにした。そこで昨年2014年度においては、1958年の協定の考察から開始した。実は1958年の「日米原子力一般協定」と同日に、日本は英国とも同様の協定を締結していた。ゆえに昨年度は、こうした2つの日米ならびに日英の原子力一般協定関連の史料の調査と収集を研究の中心に置いた。まず日本側の史料状況については東京の麻布台にある外務省外交史料館において調査・収集を行い、多くの史料を収集することができた。米国側の史料については、カンザス州アビリーンにあるアイゼンハワー大統領図書館と、メリーランド州カレッジパークにある米国国立公文書館において調査・収集を行った。そして、「日英原子力協定」に関する史料についても、ロンドン郊外のキューガーデンにある英国国立公文書館において調査・収集を行った。以上の3国に渡る史料調査・収集によって、1958年協定の解明に不可欠な史料を収集することができた。さらに昨年度は、こうした1958年の協定の史料収集・調査と並行して、1963年締結の「日米IAEA保障措置移管協定」に関する史料についてもマサチューセッツ州ボストンにあるケネディ大統領図書館において調査・収集を行うことができた。平成27年度は研究助成の最終年度であることから、各地において史料調査・収集を行うと共に、研究の取り纏め、成果の公表に努めた。具体的には、平成27年8月から9月にかけて、米国メリーランド州カレッジパークに所在する国立公文書館、テキサス州オースティンに所在するリンドン・B・ジョンソン大統領図書館にて史料収集を行った。前者では1958年から68年にかけての米国の対日核エネルギー政策に関する史料を、後者では1963年から68年にかけての対日核エネルギー政策に関する史料を部分的ながら収集した。さらに日本では平成28年3月に、東京都港区麻布台に所在する外務省外交史料館、東京都千代田区永田町に所在する国立国会図書館憲政資料室において日米ならびに日英原子力協力協定に関する史料を中心に調査・収集を行った。そして前年度の史料収集の成果をも使用して、平成27年5月には大阪大学大学院国際公共政策研究科と防衛省防衛研究所との合同シンポジウムにて「日米核エネルギー協力体制の構築と形成1952-1958」と題した発表を行った。また、同年11月には関西アメリカ史研究会において「日米原子力協定1955-1958:アイゼンハワー政権の冷戦戦略と対日政策の視点から」と題した発表を行った。さらに、『同志社アメリカ研究』において、査読付き論文「「日米原子力研究協定」への道程-米国における核兵器使用の記憶と冷戦戦略」を公表するに至った。このように平成27年度は、1955年および1958年の原子力協力協定を中心に、その形成過程を解明した。これは現時点において同様の研究が殆ど存在しないこと、また、日米原子力協定の改定が迫っている現在において、極めて有益な示唆をもたらすものであろう。今後は、予算不足ゆえに不十分に終わった1963年および1968年の協定交渉についての史料収集を行い、その分析と成果の公表に努める。やや遅れているとしたのは、以下の理由による。まず、当初の申請額よりも50%近く予算が削減されたために、十分な渡航期間を確保できなかったことである。また、アメリカでの史料調査・収集中、大雪に見舞われ大統領図書館および公文書館が断続的に閉鎖された。それにより史料の調査・収集に大きな遅延が引き起こされた。さらに、日米英における史料調査・収集の結果、とくに米国側において予想以上に非公開史料が多いことが判明したことも、研究全体の進捗を妨げる要因となっている。27年度が最終年度であるため、記入しない。

外交史今年度の研究の方策としては、昨年度に収集した史料を大至急精査していくことが最優先事項となる。さらに可能な限り早期に再度渡米し、テキサス州オースティンにあるジョンソン大統領図書館とメリーランド州の国立公文書館において1968年の日米原子力協定改定交渉の史料を中心に、残りの史料を収集する予定である。それら史料を急ぎ分析し、米国の歴代政権が日本との核の平和利用協力をいかに外交政策上位置付けていたのかを明らかにしていく予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。
ミクロンの表面凹凸の違いを指先で感じ取る「匠の技」の脳科学的解明

ヒトは,わずか数ミクロンの凹凸でも指先で触れるだけで凹凸判断ができる能力を備えている。多くの自動車メーカーの工場では,熟練の技術者が経験で磨いた「匠の技」を利用して,車体表面を撫でることで数ミクロンの突起を検出し,品質検査を行っている。しかし,車体表面は塗料でコーティングされているため,この「匠の技」を既存の光学系計測システムに置き換えることができないのが現状である。一方,このような熟練の技術者は,「どのようにしてミクロンオーダーの凹凸を指先で検知しているのか?」,「脳内でどのような情報処理して接触面の違いを判断できるのか?」の疑問の未解明が,「匠の技」を工学的技術に置き換えることができない主な要因である。本研究は,上記の疑問に対する解答を得て,「匠の技」を工学的技術に置き換える方策を提案することを目的である。今年度は,前年度で試作した2次元レーザ測定ユニットを用いた指紋微振動直接観察システムの原案を見直し,新たにシステムの研究開発に取り込んできた。具体的に,前年度で試作した2次元レーザ測定ユニットを用いた場合は,静止の指紋三次元構成の計測ができるが,微小振動の検出時にノイズが多かったため,測定不能の問題点があった。今年度は,まず高速度カメラによる計測方式へ変更し,システム全体構成を改良した。次に,触覚凹凸縞模様パターンの凹凸幅を変化させて(0.1mm, 0.2mm, 0.5mm, 0.7mmと1.0mmの5種類),システムの評価実験を行った。その結果,新システムの撮像ノイズ低減が顕著であり,5種類の刺激中0.5mm以上の3種類において,刺激時の指紋微小振動の計測に成功した。さらに,課題である凹凸幅0.1mmと0.2mmの縞模様を用いた場合の指紋微小振動の計測は,解決策案も出来ている。今年度において,新たな計測手法を取り入れ,指紋微振動直接観察システムの開発に取り込んできた。本研究を企画した当初に,2次元レーザ測定ユニットを用いて,指紋微振動直接観察システムを構築すると考えた。しかし,レーザ光がカバーできる撮像範囲が狭く,指紋の振動によって発生したノイズが大きく,振動そのものの検出正確性に大きく影響が与えている。そのため,代表者らは,高速度カメラを用いる新しいシステムを考案し,製作に取り込んだ。その結果,新システムは,触覚凹凸縞模様パターンの凹凸幅0.2mm以下の場合においてさらなる改善が必要であるが,おおよそ予定している成果が得られたため,本研究課題は概ね順調に進展していると評価した。今年度は,本研究計画の最終年度であり,以下の3項目を実施する予定である。1.指紋微振動直接観察システムの改良。システムの改良において,主に前述通りの凹凸幅0.2mm以下の場合指紋微振動の観察と,撮像・ノイズ除去・指紋特定・振動周波数分析等の一連作業の自動化プログラムの作成である。2.凹凸刺激に対する指紋微小振動と表面手触り感の相互関係の解明。前述のように,表面のミクロン単位の空間構成情報は撫でる動作によって時間的変化が現れて検知するが,これを確たる証拠を示すには,指紋振動を観察するだけでなく,その心理的評価との関係を明らかにする必要がある。改良したシステムを用いて,指が対象表面を撫でる時のつるつる感・粗さ感と指紋微小振動の関係を実験的に解析する。3.ミクロンの表面凹凸の違いを指先で感じ取る脳機能の検討。fMRI実験を実施することにより,指が対象表面を撫でる時脳活動を観察し,つるつる感・粗さ感に関与する脳活動部位のネットワークを検討する。視覚とは異なり,手触り感は必ず指先の皮膚と対象を接触して得る感覚である。ミクロンの表面凹凸感は,皮膚の変形を引き起こすエネルギーがないため,撫でる動作によって生じる振動(以降,指紋微小振動と呼ぶ)が主な要因と考えられるが,撫でる際の摩擦や力加減により得られる感覚も異なり,単なる機械受容器の振動特性だけでは説明できない。そのため,この謎を解明する鍵は,指が対象面を撫でる際に指紋微小振動の直接観察にあると考えられるが,その技術がないのが現状である。そのため,初年度は,指紋微視的な変化の直接観察システムを開発することが目標である。本年度は,指紋微視的な変化の直接観察システムの開発を目指して,当初の計画に基づいて,触覚試験片の設計・制作,高精度2次元レーザ測定ユニットの構築とデータ記録・解析システムの三項目に取り込んできた。

触覚試験片は,アクリル樹脂の土台の上にレーザ加工により,5ミクロンから100ミクロンまで間に数種類のパラメータを決めてミクロンオーダーの凹凸表面(つるつるやざらざら感を再現)の作成に成功した。一方で,高精度2次元レーザ測定ユニットを試作したが,指紋微小振動の記録には至らなかった。その理由として,レーザのみによる静止の指紋三次元構成の計測ができるが,微小振動の検出時に予想よりノイズが多かったためである。現在計測手法の改良を行いながら指紋微小振動計測に最適なシステム構成を検討しているため,システムの開発は当初より遅れている。そのため,次年度に予定している心理物理学実験とfMRI実験の一部は前倒して実施し,今後の研究に必要不可欠な基礎データが取得した。以上のような状況を総合的に検討した上で,本研究課題は概ね順調に進展していると評価した。ヒトは,わずか数ミクロンの凹凸でも指先で触れるだけで凹凸判断ができる能力を備えている。多くの自動車メーカーの工場では,熟練の技術者が経験で磨いた「匠の技」を利用して,車体表面を撫でることで数ミクロンの突起を検出し,品質検査を行っている。しかし,車体表面は塗料でコーティングされているため,この「匠の技」を既存の光学系計測システムに置き換えることができないのが現状である。一方,このような熟練の技術者は,「どのようにしてミクロンオーダーの凹凸を指先で検知しているのか?」,「脳内でどのような情報処理して接触面の違いを判断できるのか?」の疑問の未解明が,「匠の技」を工学的技術に置き換えることができない主な要因である。本研究は,上記の疑問に対する解答を得て,「匠の技」を工学的技術に置き換える方策を提案することを目的である。今年度は,前年度で試作した2次元レーザ測定ユニットを用いた指紋微振動直接観察システムの原案を見直し,新たにシステムの研究開発に取り込んできた。具体的に,前年度で試作した2次元レーザ測定ユニットを用いた場合は,静止の指紋三次元構成の計測ができるが,微小振動の検出時にノイズが多かったため,測定不能の問題点があった。今年度は,まず高速度カメラによる計測方式へ変更し,システム全体構成を改良した。次に,触覚凹凸縞模様パターンの凹凸幅を変化させて(0.1mm, 0.2mm, 0.5mm, 0.7mmと1.0mmの5種類),システムの評価実験を行った。その結果,新システムの撮像ノイズ低減が顕著であり,5種類の刺激中0.5mm以上の3種類において,刺激時の指紋微小振動の計測に成功した。さらに,課題である凹凸幅0.1mmと0.2mmの縞模様を用いた場合の指紋微小振動の計測は,解決策案も出来ている。今年度において,新たな計測手法を取り入れ,指紋微振動直接観察システムの開発に取り込んできた。本研究を企画した当初に,2次元レーザ測定ユニットを用いて,指紋微振動直接観察システムを構築すると考えた。しかし,レーザ光がカバーできる撮像範囲が狭く,指紋の振動によって発生したノイズが大きく,振動そのものの検出正確性に大きく影響が与えている。そのため,代表者らは,高速度カメラを用いる新しいシステムを考案し,製作に取り込んだ。その結果,新システムは,触覚凹凸縞模様パターンの凹凸幅0.2mm以下の場合においてさらなる改善が必要であるが,おおよそ予定している成果が得られたため,本研究課題は概ね順調に進展していると評価した。前述のように,今年度は,前年度に引き続き指紋微視的な変化の直接観察システムの開発を行う。
発生学的考察に基づいた、低出生体重児の循環器リスクを明らかにする基盤技術の創出

低出生体重児は、循環器疾患を含めた成人後の循環器リスクを上昇させることが知られているが、メカニズムは明らかでない。本研究では原因を明らかにするためのモデルマウスの作成を行なった。妊娠したICRマウスに対して、カロリー制限と帝王切開を施すことで、2種類の低出生体重マウスを作出することを可能とした。一部の群では成長と共に重量差が消失しており、なんらかの代償機構が働いていることが示唆された。本年はカロリー制限による出生時低体重モデルマウスの作出に取り組んだ。ICR系統のマウスに対して胎性中期から後期にかけてカロリー制限を施し、出生児の体重が有意に軽いマウスを作出することに成功した(出生時体重カロリー制限群:1.34±0.10g、対照群:1.82±0.12g)。同様の手法でB6系統でも作出を試みたが、産仔数が少なく再現性の高いモデルを作出することが困難であったため、B6系統の受精卵をICR系統の仮親に移植し、B6系統でも出生児低体重モデルマウスを作出することに成功した(出生時体重カロリー制限群:1.27±0.16g、対照群:1.51±0.14g)。これらの実験により得られたマウスを飼育して、体重差・心室重量の変化を検討したが、母マウス1匹あたりの養育胎仔数や母マウスのカロリー制限の有無により生育状況に差が生じることが明らかとなったため、ICRの里親を別に準備して出生後は里親に同数の胎仔を飼育させることとした。その結果、出生児に認めた体重差は4週齢の時点では消失し、同様に心臓重量についても出生児に認める重量差が生体ではなくなることが明らかとなった。また、他の手法でも出生時低体重モデルを作出するため、出産予定より1日早い耐性18.5日の時点で帝王切開により胎仔を娩出し里親に養育させるモデルも作出した。帝王切開後の保温・呼吸中枢の刺激に努めることで、高い生存率で里親に養育させることに成功した。当初の計画通り、異なる系統のマウスにおいて出生児低体重モデルマウスを作出することに成功し、表現型の解析に向けた準備も順調に進んでいる。初年度に作成した出生時低体重マウスを用いて新生仔期の心臓表現型を比較した。心臓重量と体重は、出生直後から新生仔期にかけては低体重群で有意に低下していたが、生育後は重量差が消失していた。本所見はICRマウスで確認されたが、B6系統マウスの場合は体重差が生育後も遷延しており、プロトコルや系統により成長の過程に差が生じることが明らかとなった。続いて、細胞レベルでの差を評価するために、採取した心臓を単細胞に分離後、磁気吸着ビーズを用いて心筋細胞と非心筋細胞に分離して細胞数を計測した。生後3日の時点で、心筋細胞数に有意な差は認められなかったが、非心筋細胞に関しては低体重モデルマウス群で減少している傾向を認めた。また、免疫組織染色後に心筋断面積を比較した結果、低体重モデルマウスで有意に断面積が拡大していることが明らかとなった。以上の結果から、妊娠飢餓ストレスが加わることにより、心臓内での心筋とそれ以外の細胞の構成率に変化が生じることが明らかとなった。特に、非心筋細胞が低体重群で減少している傾向にあるため、環境負荷に対して心筋細胞数を一定に保つ何らかの代償機構が関与している可能性が示唆された。本研究により、マウスモデルを用いて出生児低体重に伴う成人後循環器リスク上昇のメカニズムを明らかにするための、基本となる実験系を創出することができた。今後は本実験系を用いて、原因因子を明らかにするとともに、循環器疾患との関連を明らかにする予定である。二年目においては心臓の重量差が消失する原因として、心筋細胞の増殖・肥大がどのようにん関与しているかについて検討を行う方針である。また、今回の実験で介入する胎性中期から新生仔期にかけては、冠循環の成熟や心筋の緻密化といった現象が心臓では生じているため、それらの過程になんらかの変化があるか否かを検討する予定である。循環器内科学当初の計画で初年度後半から次年度に着手する予定であった病態モデルでの検討が準備段階に留まったため、当該助成金が生じた。当該助成金を用いて病態モデルでの検討を進めるとともに、二年目の計画も並行して進めていく方針である。
東南アジアの伝統発酵麺に関する微生物とその役割について

東南アジアにおける発酵米麺について、ラオス・ミャンマー・タイの調査を行った。タイには、カノンチーンという発酵麺が存在しており製造方法は、米を浸漬して磨砕しその後布袋で水切りを行っていた。そのしとぎ塊をゆでた後混捏し、ろ過した後に押し出し機で沸騰湯よく中に押し出し、次いで水の中で冷却し、ざるにあげて麺(カノンチーン)としていた。またこの製造工程中の生菌数には、浸漬で好気性菌、大腸菌が多く存在していたが、水きり後の"しとぎ塊"では、乳酸菌が多く存在していた。また、風味成分は、製造工程中の粗蛋白や脂質の減少が認められた。"しとぎ塊"では、有機酸中の乳酸の増加が著しく、他の発酵米麺と同様の傾向を示した。ミャンマーのモヒンガーの製造工程中には、Bacillus属、Lactobacillus属、Streptococcus属,yeast, moldが普遍的に存在していた。発酵米麺の一般成分は原料米と比較して、水分、タンパク質、脂肪、灰分、すべてにおいて低い値であった。また有機酸は、原料米でみられたクエン酸、フマル酸が減少し、新たに乳酸が生成された。また、発酵米麺からタンパクを抽出し、電気泳動でタンパク質泳動パターンを観察したところ、原料米のときに見られた20KD以上のタンパク質が消失していた、さらに14.3kD付近のバンドが薄くなり、6.5KD以下の低分子のバンドが増加していた。このことから発酵による米蛋白質の低分子化が明らかとなった。浸漬米から分離した微生物はBacillus subtilisであった。また、この微生物の至適pHは5.75で至適温度は40°Cであった。タイプカルチャーBacillus subtilis JCM1465に比較すると至適pH、至適温度、熱耐性ともに高い傾向にあった。本年度は、東南アジアのラオス・ベトナムにおける伝統的発酵米麺の調査を行った。その結果、ラオスにおいてはカオプンという発酵米麺の存在が明らかとなった。その製造方法は、他のミャンマーやタイの地域の発酵米麺の製造と同じであった。調査地は、北ラオスを中心に行った。原料の米は、都市部はタイ米や中国米を使用していたが他の地域はラオス米を使っていた。製造方法は、米を洗米し、浸漬後に磨砕して水切りし、しとぎにする。その後茄での操作を行い混ねつし、熱湯中に押し出す方法をとっていた。今回の調査地域では、粥の添加は認められなかったが、南の地域は粥の添加も行なわれ、以前の予備調査地域と同じであった。また、浸漬操作、水切り操作中のpHは、3.5 4.0を示していた。生菌数の測定を行った結果、浸漬米、しとぎとも乳酸菌の生成が多く認められ、その結果pHが低下したものと考えられた。しとぎと麺は常温で乾燥し、米を含めて粉砕後80メッシュのフルイをかけて試料を調製した。一般成分として水分、蛋白質、粗脂肪、灰分を測定した。また、乳酸の生成が考えられたので有機酸の測定も行った。その結果、製造工程が米から麺になるにつれて蛋白質や粗脂肪は減少していたが、有機酸含量としては、しとぎ中の乳酸含有量が多いことが認められた。次年度は、採取した微生物の米に対する影響や抽出蛋白質の変化および、米アレルギーに関しても行いたいと考えている。

タイに、カノンチーンという発酵麺が存在しており、製造方法は、米を浸漬して磨砕しその後布袋で水切りを行っていた。その"しとぎ塊"をゆでた後混捏し、ろ過した後に押し出し機で沸騰湯浴中に押し出し、麺とする。この押し出した麺を水の中で冷却し、ざるにあげて麺(カノンチーン)となる。北タイの製造方法の特徴としては、原料の米から"しとぎ塊"まで一連の工場で製造されている場合が多く、"しとぎ塊"の状態で地方の工場に送られる場合が多い。また、この製造工程中の生菌数では、浸漬中で好気性菌や大腸菌が多く存在していたが、水きり後の"しとぎ塊"では、乳酸菌が多く存在していた。また、風味成分は、製造工程中の粗蛋白や脂質の減少が認められた。"しとぎ塊"では、有機酸中の乳酸の増加が著しく、他の発酵米麺と同様の傾向を示した。ミャンマーのモヒンガーの製造工程中には、Bacillus属、Lactobacillus属、Streptococcus属、yeast、moldが普遍的に存在していた。発酵米麺の一般成分は原料米と比較して、水分、タンパク質、脂肪、灰分、すべてにおいて低い値であった。また有機酸は、原料米でみられたクエン酸、フマル酸が減少し、新たに乳酸が生成された。発酵米麺の遊離アミノ酸は、原料米に比較して増加していた。また、発酵米麺からタンパクを抽出し、電気泳動でタンパク質泳動パターンを観察したところ、原料米のときに見られた20kDa以上のタンパク質が消失していた。さらに14.3kDa付近のバンドが薄くなり、6.5kDa以下の低分子のバンドが増加していた。このことから発酵による米蛋白質の低分子化が明らかとなった。浸漬米から分離した微生物の性質について検討した結果、浸漬米から分離した微生物はBacillus subtilisであった。また、この微生物の至適pHは5.75で至適温度は40°Cであった。タイプカルチャーBacillus subtilis JCM1465に比較すると至適pH、至適温度、熱耐性ともに高い傾向にあった。
光によるナノ炭素材料の界面物性制御技術の高度化

単層カーボンナノチューブ(SWCNT)の特性を最大限発現させることのできるデバイス作製に向けた基盤的技術への貢献を目指し、光刺激で吸脱着できるSWCNTの分散剤の高度化と薄膜加工技術への展開を行った。具体的には、特異な界面特性により凝集しやすく、溶液プロセスでは扱いにくいSWCNTの表面特性を、光反応によって構造変化する分散剤によって制御する方法を用いた。従来型の分散剤(界面活性剤や高分子等)が抱える課題(添加量過多、脱着困難等)を解決し、構造最適化した新規光応答性分散剤の創製を検討した。本研究では、申請者がこれまでに確立した光応答性分散剤による単層カーボンナノチューブ(SWCNT)の分散制御技術を高度化し、新規SWCNT薄膜加工技術として展開してゆくために、まず現行の光応答性分散剤が抱える課題(不可逆反応・多段階反応)を克服する新規光応答性分散剤(可逆で一段階反応)を設計合成し、その物性評価を行うことを目指し、本年度は種々『可逆応答性』分散剤の候補を設計合成し、カーボンナノチューブの分散性評価、薄膜中の光反応性、有機溶媒への対応を視野に入れたイオン交換の検討をし、いくつか有用な分散剤を見出すことができた。これまでの合成ルートを用いて合成することのできる可逆性分散剤を8種類合成し、薄膜中における光反応性を検討した。洗浄した石英基板にキャスト法で製膜したあと、紫外可視吸収スペクトルを測定し、膜中の分子間相互作用について知見を得た。さらに、偏光顕微鏡によって、膜のモルフォロジー観察を行った。いずれの化合物も、置換基の炭素数や枝分かれ等の影響によって、分子間相互作用に多少の違いがみられ、紫外可視吸収スペクトルにおける最大吸収波長のシフトがあった。しかしながら、紫外光を照射すると、いずれも薄膜中で光反応が進行した。凝集状態でも十分に光反応が進行することがわかった。薄膜中で分散剤分子は吸収スペクトルに若干の影響を及ぼす程度に相互作用してはいるが、光反応(比較的大きな体積変化を必要とする)を妨げることはないことが明らかになった。続いて、光反応の可逆性に着目して新たに設計した分散剤を合成し、SWCNTの分散性評価を行った。当初、8種類合成するスキームを計画したが、反応の進行が確認されない、副反応生成物が多量に含まれてしまうなどの結果を招き、4種類のみ新規合成することができた。いずれの4種類とも、SWCNTを分散することができ、また、光照射によりSWCNTを凝集させることも出来た。分散液調製に使用可能な溶媒を『水』以外にも適用できるか検討するために、分散剤をイオン交換したものを合成し、溶解性と分散性評価を行った。イオン種には2種類用いた。水以外の9種類の溶媒への溶解性を調べ、可能性のあった2種類について、SWCNTの分散を試みたが、良好な分散液を得ることができなかった。溶媒の極性、分散剤とナノチューブ表面との親和性等、相互作用のバランスが大切であることがわかった。本研究の目的は、SWCNTの特性を最大限発現させることのできるデバイス作製に向けた基盤的技術への貢献を目指し、光刺激で吸脱着できるSWCNTの分散剤の高度化と薄膜加工技術への展開を目指すことであり、具体的には、特異な界面特性により凝集しやすく、溶液プロセスでは扱いにくいSWCNTの表面特性を、光反応によって構造変化する分散剤によって制御する方法を用いる。本年度は塗布法(バーコーティング)により製膜する手法の確立に向けて、SWCNTの高濃度分散液(SWCNTインク)の調製方法について検討を行った。SWCNTにはその製法により様々な径、長さのものがあり、さらには純度もその製法に依存する。不純物を多く含む汎用のSWCNTを使用する場合、遠心操作等で不純物をふるい分ける必要が生じる。本検討では、高濃度化によりインクの粘度が増すために遠心操作は行えない可能性を考慮し、不純物を殆ど含まず、なおかつ径の制御されたSWCNTを製造する手法e-DIPS法で作製したものを使用することにした。予め分散剤を溶解した水溶液に、秤量したe-DIPS_SWCNTを加え超音波処理を施すことで均質なインクとした。超音波処理は、はじめバス型(35kHz, 80W)で前処理し、つづいてホーン型(19kHz, 75W)で処理した。本検討では、バーコート法による塗布が可能な0.5、0.75、1wt%のSWCNTインクを調製することができた。特に、本研究で使用している我々が開発した光応答性分散剤は、従来の界面活性剤とはSWCNTの可溶化メカニズムが異なり、ミセルなどの会合体を形成することなく、単量体でSWCNT表面に吸着してSWCNTの分散を促すことが特徴である。そして本検討では、分散剤の使用量がSWCNTと等倍でも高濃度化分散が可能(界面活性剤の場合は数十倍の仕込み比が必要)であることがわかった。目的とする濃度の分散液を作製することができた。引き続き得られた分散液の評価を行っていく。本研究は、単層カーボンナノチューブ(SWCNT)の特性を最大限発現させることのできるデバイス作製に向けた基盤的技術への貢献を目指し、光刺激で吸脱着できるSWCNTの分散剤の高度化と薄膜加工技術への展開をすべく、研究をすすめた。

具体的には、特異な界面特性により凝集しやすく、溶液プロセスでは扱いにくいSWCNTの表面特性を、光反応によって構造変化する分散剤によって制御する方法を用いた。従来型の分散剤(界面活性剤や高分子等)が抱える課題(添加量過多、脱着困難等)を解決し、構造最適化した新規光応答性分散剤の創製を検討した。そして、この分散剤を用いて新規SWCNT薄膜加工技術を確立し、SWCNTを利用した電極や薄膜トランジスタ等の応用研究のための基盤的知見を蓄積した。湿式法で均質大面積に塗布膜を形成する方法として、バーコート法があるが、この方法で塗膜するためには一定の濃度でSWCNTを分散させた溶液(以下、SWCNTインクという)を調整しなくてはならない。これまで、SWCNTの分散性評価のために調製した分散液は、SWCNTの濃度が0.03wt%以下であった。そこで、まずは高濃度化を検討した。種々の分散手法を組み合わせ、0.1、0.2、0.5、0.75、1.00wt%の仕込み濃度でSWCNTインクを調製することができた。そして、SWCNTの濃度に依存して液晶性を示すSWCNTインクがあることを見出した。バルクの液晶性について、偏光顕微鏡により詳細に調べ、このSWCNTインクを物理的にシェアをかけながら製膜すると、SWCNT配向膜が得られることを見出し、光学顕微鏡観察、原子間力顕微鏡によるモルフォロジ観察、偏光紫外可視近赤外吸収スペクトルにより、配向状態を詳細に検討した。単層カーボンナノチューブ(SWCNT)の特性を最大限発現させることのできるデバイス作製に向けた基盤的技術への貢献を目指し、光刺激で吸脱着できるSWCNTの分散剤の高度化と薄膜加工技術への展開を行った。これまでに得られた知見をもとに、分散剤の吸着したSWCNTの表面物性の精査、薄膜化、薄膜のモルフォロジー観察等から、薄膜化に影響する緒因子について解析し、優れた膜物性を発揮するナノチューブ薄膜創製に向けて検討をすすめてゆく。本年度得られた分散液の光学物性を調べるとともに、この分散液を用いて塗布法により製膜する手法を確立、得られた膜の物性、モルフォロジを調べてゆく。また、分散剤の光反応性部位を変えた化合物も新たに合成し、その特性(特にSWCNTとの相互作用)について調べる。コロイド界面化学合成や薄膜作製および評価に関して当初の計画ほど経費がかからなかった。また、研究の立ち上げということで、実験補助の必要がなかった。SWCNT分散液調製や分散剤合成に使用している超純水作製装置のフィルターカートリッジ購入に計上していたが、年度内は交換を必要としなかった。薄膜のモルフォロジー観察を精密に行うため、依頼解析を行う予定である。また、実験内容についてルーチンで行える部分について、実験補助員による作業を導入し、研究を加速してゆく。次年度内にフィルターカートリッジは寿命となることが予想されるため、交換費用として使用する予定である。
荷重間隔が廃用性筋萎縮の進行に及ぼす影響に関する組織化学的研究

筆者の先行研究によれば、1日1時間の荷重により廃用性萎縮の進行抑制が一部可能であった。しかし、日内頻度の影響に関する研究結果から、荷重間隔による影響が示唆された。そこで本研究では、総荷重時間を一定とし、荷重間隔を変えてその影響を組織化学的に分析した。まず発育期のWistar系雄ラットを2週間後肢懸垂し、廃用性筋萎縮を惹起した。その間、4・8・12時間間隔で30分荷重を1日2回実施群、24時間間隔で1時間荷重を1日1回実施群、懸垂のみ(荷重しない)群、および対照(通常飼育)群に分類し処置した。分析はヒラメ筋を実験材料とし、HE染色ならびににATPase染色を行い、重量・筋線維タイプ構成比率・断面積を測定し、結果は一元配置の分散分析により統計学的に検定した。その結果、筋湿重量比は荷重による効果を示した。特に24時間間隔では、萎縮を量的に予防できる可能性が示唆された。さらに筋繊維タイプ構成比率では、荷重間隔が12時間以上で荷重効果を認めたこと、またタイプ1線維断面積の平均値では4時間と8時間間隔では差がないことから、総荷重時間を1日1時間に設定した場合は、12時間以上の荷重間隔が、廃用性筋萎縮の進行抑制には効果的と考えられた。本研究条件では、非荷重と再荷重を繰り返すため、筋における病理学的変化も複雑と考えられ、効果的荷重条件に関しては、質的評価を含めさらに検討する必要がある。
閉経後におけるKupffer細胞と肝星細胞の形質変化とNASH・肝癌のリスク増大

NASHの年齢分布には性差がある.女性は閉経後の50歳以降に高頻度である.女性NASHの年齢分布は一般女性人口の肥満と生活習慣病の年齢分布に類似している.NASH発症と肝発癌には閉経後の女性ホルモンの低下が推測されている.女性ホルモンの低下が誘導するNASH発症と肝発癌を促進する分子メカニズムの解明にあたり,女性NAFLD/NASHの臨床病型を明らかにした.閉経後女性のNAFLD/NASHでは,同年代の男性に比較して,サルコペニア肥満指数であるskeletalmuscle mass to visceral fat area ratio(SV ratio)が低値でありサルコペニア肥満の傾向にあった.また,骨格筋細胞外脂肪の高値,肝弾性度(硬度)の高値,肝線維化マーカーの高値が認められた.閉経後女性におけるNAFLD/NASHには,内臓脂肪増加と耐糖能異常に加えて,下肢筋力低下が重要な病態因子であると考えられた.Sqstm1とNrf2遺伝子の二重欠損(DKO)マウスのNASH病態について,オス,メスにおけるNASH病態を比較した.DKOマウスのNASH病態(肝脂肪沈着,炎症,線維化)は,オスと比べメスで軽度であった.DKOメスの血中エストラジオール濃度は,8週齢でオスと比較し有意に高値であったが,50週齢では低下していた.肥満病態(体重,摂餌量)は,オスマウスでは若齢時から徐々に体重と摂餌量が増加していくのに対し,メスマウスでは30週齢以降に急激に増加した.DKOオス,メスにおいてCTを用いて内臓脂肪量を比較した.DKOオスは若齢時から体重あたりの内臓脂肪量,骨格筋量が徐々に増加した.一方,DKOメスでは30週齢で内臓脂肪量のみが急激に増加したため,体重あたりの骨格筋量は低値となった.これらの背景として,女性ホルモンが過食抑制や炎症抑制に働いていることが考えられる.閉経女性におけるNAFLD/NASHの臨床病型が明らかとなってきた.Sqstm1とNrf2遺伝子の二重欠損(DKO)マウスのNASH病態に関する性差の解析により,ヒト性差に類似した病態を示すDKOマウスは,女性医学の観点からNASH発症機序の解明や治療法の開発をしていく上で有用なモデルであることが示された.Sqstm1とNrf2遺伝子の二重欠損(DKO)マウス♂に高カロリー食として高脂肪/高ショ糖食を24週間摂餌させると,NASH肝病変の進展が加速し,強い肝線維化と50%の頻度で肝癌(通常食の4倍の頻度)が認められることが判明した.そこでヒト臨床病型に類似した本マウスにおける「性差からみたNASHと肝癌」の研究は高い独自性と創造性を有する.こも観点より,本年度は基礎と臨床医学の両面より新しい研究成果を追求する.NASHの年齢分布には性差がある.女性は閉経後の50歳以降に高頻度である.女性NASHの年齢分布は一般女性人口の肥満と生活習慣病の年齢分布に類似している.NASH発症と肝発癌には閉経後の女性ホルモンの低下が推測されている.女性ホルモンの低下が誘導するNASH発症と肝発癌を促進する分子メカニズムの解明にあたり,女性NAFLD/NASHの臨床病型を明らかにした.閉経後女性のNAFLD/NASHでは,同年代の男性に比較して,サルコペニア肥満指数であるskeletalmuscle mass to visceral fat area ratio(SV ratio)が低値でありサルコペニア肥満の傾向にあった.また,骨格筋細胞外脂肪の高値,肝弾性度(硬度)の高値,肝線維化マーカーの高値が認められた.閉経後女性におけるNAFLD/NASHには,内臓脂肪増加と耐糖能異常に加えて,下肢筋力低下が重要な病態因子であると考えられた.Sqstm1とNrf2遺伝子の二重欠損(DKO)マウスのNASH病態について,オス,メスにおけるNASH病態を比較した.DKOマウスのNASH病態(肝脂肪沈着,炎症,線維化)は,オスと比べメスで軽度であった.DKOメスの血中エストラジオール濃度は,8週齢でオスと比較し有意に高値であったが,50週齢では低下していた.肥満病態(体重,摂餌量)は,オスマウスでは若齢時から徐々に体重と摂餌量が増加していくのに対し,メスマウスでは30週齢以降に急激に増加した.DKOオス,メスにおいてCTを用いて内臓脂肪量を比較した.DKOオスは若齢時から体重あたりの内臓脂肪量,骨格筋量が徐々に増加した.一方,DKOメスでは30週齢で内臓脂肪量のみが急激に増加したため,体重あたりの骨格筋量は低値となった.これらの背景として,女性ホルモンが過食抑制や炎症抑制に働いていることが考えられる.閉経女性におけるNAFLD/NASHの臨床病型が明らかとなってきた.Sqstm1とNrf2遺伝子の二重欠損(DKO)マウスのNASH病態に関する性差の解析により,ヒト性差に類似した病態を示すDKOマウスは,女性医学の観点からNASH発症機序の解明や治療法の開発をしていく上で有用なモデルであることが示された.Sqstm1とNrf2遺伝子の二重欠損(DKO)マウス♂に高カロリー食として高脂肪/高ショ糖食を24週間摂餌させると,NASH肝病変の進展が加速し,強い肝線維化と50%の頻度で肝癌(通常食の4倍の頻度)が認められることが判明した.

そこでヒト臨床病型に類似した本マウスにおける「性差からみたNASHと肝癌」の研究は高い独自性と創造性を有する.こも観点より,本年度は基礎と臨床医学の両面より新しい研究成果を追求する.
化学物質の多様性に応じた雄性生殖毒性試験法の開発

初年度にハロゲン系プロパンや殺虫剤を試験物質としてラットに投与し新規精子試験法WST-8法による精子代謝能測定法、精子尾部形態測定法が従来の雄性生殖毒性試験法である精子運動能や精子数解析では検出できない影響を検出できることを示した。第2年度には、新たに入手した30種類以上のテトラゾリウム塩をラットおよびマウスの精子浮遊液を用いて一斉にスクリーニングし、WST-8以外にWST-3, WST-5等細胞毒性試験では用いられていないテトラゾリウムでも精子では感度よく応答することが示された。また、マウスに重金属や有機溶剤を投与してCASA(従来の精子解析法)の画像を大量に保存した。第3年度は、マウス精子尾部の形態解析のための手法開発を試みた。その結果、CASAによる暗視野画像で尾部形態の解析を試み、未成熟精子、短尾精子の検出に成功した。さらに、マウスの精子浮遊液の一部を固定し遠心後、MASコート付きスライドグラスに塗抹し、ヘマトキシリン・エオシン染色することで、尾部形態だけでなく頭部形態の解析を可能とした。また、精巣毒性を計測する客観的指標として精巣中の精子頭数をCASAで測定することも可能とした。現在、ラットを用いた実験からマウスを用いた実験に移行しつつ、これらの手法を応用している。第4年度は、マウスを用いた実験に移行し、通常明暗と変則的明暗条件により雄マウス飼育しただけ(化学物質は未投与)で、精子数及び精子形態に変化を生ずることを突き止めた。また、ラットでは1,2-ジクロロプロパンを皮下投与した結果、精子数、精子運動能に変化が認められない投与条件でも、精子尾部形態に異常が認められることが示せ、本研究課題で提案している暗視野精子形態解析法の有用性が確認されている。本課題の初年度は年度後半に追加で採択され、その結果、初年度は期間も短く(実質4か月)、ラットにおける実験に終始し、マウスでの検討には至らなかった。第2年度にはマウスでの検討に着手し、尾部形態異常の判断基準の確立に時間がかかり、解析が遅れた。また予定していたテトラゾリウム塩のうち一部入手困難なものがあり、今後もスクリーニングをしなければならなくなった。第3年目にはマウスにおける精子形態解析法を開発し、また精巣毒性の客観的指標の開発に成功したものの、その応用と、精子の運動持続性に影響する化学物質の解析法の開発及びCASAによる精子運動能解析法の欠点の改良法の開発が遅れた。これらの遅れを取り返すべく、努力したが、第4年度に代表者が急遽統括研究員に加え実験動物管理室長(併任)に就任したため、管理室業務に追われ、本研究遂行にあたり若干の遅延をもたらした。また、本研究のキーとなる精子運動解析装置(CASA)が不調となり、点検の必要から、研究計画の見直しが必要になった。また、現在作成中の論文原稿があり公表が次年度となる見込みのため。マウスを中心とした実験により既に開発した精子形態解析方法の有用性を確認するとともに改良を試みる。また、精子の運動持続性に影響する化学物質の解析法の開発及びCASAによる精子運動能解析法の欠点の改良法の開発を試みる。ラットによる実験では、精子数に変化がない化学物質で、精子運動能が低下しているか、あるいは精子形態に異常な化学物質をスクリーニング的に選択し精巣上体への影響がないかを延長最終年度に検討したい。平成27年度は、既に精子への影響の明らかなジブロモクロロプロパン(DBCP: 25 -100 mg/kg)、および精子への影響が不明確な1,2-ジクロロプロパン(DCP: 250-1000mg/kg)をラットに週2回4週間皮下投与して(全8回)開発を試みた。対照群には溶媒を投与した。1週間後、精子を培地中に浮遊させ、精子自動解析装置(CASA:ハミルトン社製IVOS)により精子運動能および精子数の測定を行った。また、テトラゾリウム塩(WST-8)法により精子ミトコンドリア代謝能を測定した。さらにCASAにおける拡大画像を保存し、後日呼び出し、短尾精子、未成熟精子、無頭精子、無尾精子、首折精子を目視計測し最終的に正常精子率を求めた。その結果、DBCPの75および100 mg/kg投与群において有意な精子数減少と運動能の急激な低下を認めた。正常精子率もまた同投与群において減少していた。また、頭部・尾部離断精子が同群で顕著に多く認められた。WST-8法による精子代謝能も同群において有意な低下が認められた。他方、DCPでは精子数および精子運動能にはいかなるパラメータにおいても有意差を見いだせなかった。しかし正常精子率は全ての投与群において減少を認めた。また、未成熟精子および頭部・尾部離断精子が全ての群で有意に増加した。また、WST-8法では500および1000 mg/kg投与群において有意な低下が認められた。以上よりDBCPの影響として精子数の低下、精子運動能の低下は従来から認められていたが、運動能低下の原因は離断精子の増加によることが明らかとなった。DCPの精子への影響は十分に確かめられていなかったが、精子数、精子運動能の影響が認めらないところで代謝能および精子形態には変化が認められた。新規精子試験法(精子代謝能測定法、精子尾部形態測定法)で試験することは生殖毒性試験をする上で有用と考えられる。

本課題は年度後半に追加で採択され、初年度は期間も短く(実質4か月)、しかもテトラゾリウム塩の選択、尾部形態異常の判断基準の確立に時間がかかり、ラットでの検討に終始して、マウスでの検討には至らなかった。また、予定していたテトラゾリウム塩のうち入手困難なものがあり、一部のスクリーニングしか行えなかった。従来の精子数や精子運動能の測定を中心とする精子試験法では化学物質の雄性生殖毒性を評価するには限界があることから、主として精子ミトコンドリア代謝能や精子尾部の形態などに着目した新規の精子試験法を提案し、従来の精子試験法とも比較検討することにより、より簡便な試験法の確立、作用機序に応じた測定法の開発(精子運動持続性等の精子検査法の他、精巣毒性評価法も含む)、既存法の改良を通して、いままでには見いだせなかった化学物質の精子への作用の解明、および従来のガイドラインの変更ないし詳細化を最終目的とする。初年度に1,2-ジクロロプロパン(DCP)を試験物質としてラットに投与し新規精子試験法WST-8法による精子代謝能測定法、精子尾部形態測定法が従来の雄性生殖毒性試験法である精子運動能や精子数解析では検出できない影響を検出できることを示した。第2年度には、1-ブロモプロパン(1BP)および2-ブロモプロパン(2BP)を試験物質として同様の実験を行い新規精子試験法が従来法に劣らないことを示した。さらに新たに入手した30種類以上のテトラゾリウム塩をラットおよびマウスの精子浮遊液を用いて一斉にスクリーニングし、WST-8以外にWST-3, WST-5等細胞毒性試験では用いられていないテトラゾリウムでも精子では感度よく応答することが示された。また、マウスに重金属や有機溶剤を投与してCASA(従来の精子解析法)の画像を大量に保存した。適用外手法としてマウス精子尾部の形態解析を現在行っている。本課題の初年度は年度後半に追加で採択され、その結果、初年度は期間も短く(実質4か月)、マウスでの検討には至らなかった。第2年度にはマウスでの検討に着手し、尾部形態異常の判断基準の確立に時間がかかり、解析が遅れている。また予定していたテトラゾリウム塩のうち一部入手困難なものがあり、今後もスクリーニングをしなければならなくなったため。初年度にハロゲン系プロパンや殺虫剤を試験物質としてラットに投与し新規精子試験法WST-8法による精子代謝能測定法、精子尾部形態測定法が従来の雄性生殖毒性試験法である精子運動能や精子数解析では検出できない影響を検出できることを示した。第2年度には、新たに入手した30種類以上のテトラゾリウム塩をラットおよびマウスの精子浮遊液を用いて一斉にスクリーニングし、WST-8以外にWST-3, WST-5等細胞毒性試験では用いられていないテトラゾリウムでも精子では感度よく応答することが示された。
新しく発見した非NOS依存性NO産生の障害腎における存在とその役割に関する研究

1)一酸化窒素の測定法についてまず基本的な問題として,NO測定に頻用されるGriess反応によるNOx(NO_2+NO_3)測定と,電極法によるNOが真のNOを反映しない可能性を見出した.すなわちアルギニンのアナログであるカナバニンや,NO合成酵素の阻害剤であるL-NAMEと過酸化水素の反応でNOxは検出されるが,化学発光法でみるとNOの存在は確認できず,NO_2あるいはNO_3が産生される可能性がある.また,電極法ではNOのみならず,過酸化水素やO_2も反応してしまうという欠陥が明らかになった.2)実験腎症における単離糸球体での一酸化窒素産生についてpuromycin aminonucleoside(PAN)投与によって腎症を誘発したラットでは,投与2日目の尿中および血清中のNOxは増加しており,体内のNO産生は増加していると考えられるが,その時期にNO合成酵素を免疫染色しても,増加が見られず,PANによる活性酸素産生増加に引き続く現象である可能性が高いと考えられた.PAN投与後同時期の単離糸球体でもNOxの産生亢進が確認され,尿中のNOx増加は,糸球体由来と考えられた.3)透析患者での一酸化窒素産生における非酵素的反応の関与についてわれわれは透析患者の血中NOxが増加していることをすでに報告した.腎不全患者では血清中のNO合成酵素阻害物質の増加や活性酸素産生の増加が知られている.そこで,われわれの見出した過酸化水素による非酵素的NO産生に注目し,この系に対する透析患者血清の抑制効果を調べた.その結果,透析患者血清は非酵素的NO産生に対する抑制が弱く,これがNO産生増加に関与している可能性が考えられた.電子スピン共鳴法により,従来から困難とされてきた実験腎炎における生体内のredox stateのin vivo評価を試みた.PANでラットに腎症を誘発し,ラジカルプローブ剤である4-hydroxy2,2,6,6-tetramethyl-piperidine-1-oxyl(TEMPOL)を投与し,腎臓表面からシグナルを捕らえ半減期を算出した.その結果,腎臓内で活性酸素の産生亢進により還元物質が消費される時期に一致し,著明にTEMPOLの半減期の延長を認めた.この事実はPAN腎症での還元能の低下をin vivoで証明するとともに,in vivoでのフリーラジカルイメージングの基礎を開くものである.5)内皮型一酸化窒素合成酵素多型と末期腎不全への進行について内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)遺伝子には,いくつかの多型が知られている.そのうちintron4の27塩基対の5 repeatが4 repeatになるmutationについて調べ,透析患者群で有意にこのmutationが高頻度であることを明らかにした.しかし元疾患別に検討すると,糖尿病性腎症による透析患者群では健常コントロールと差がみられなかった.この結果はこの遺伝子異常が糖尿病によらない腎疾患の進行因子になっている可能性を示唆する.しかし,このmutationのeNOS活性に及ぼす影響に関しては,現在相反する報告が出ており,われわれも現在検討を進めている.1)一酸化窒素の測定法についてまず基本的な問題として,NO測定に頻用されるGriess反応によるNOx(NO_2+NO_3)測定と,電極法によるNOが真のNOを反映しない可能性を見出した.すなわちアルギニンのアナログであるカナバニンや,NO合成酵素の阻害剤であるL-NAMEと過酸化水素の反応でNOxは検出されるが,化学発光法でみるとNOの存在は確認できず,NO_2あるいはNO_3が産生される可能性がある.また,電極法ではNOのみならず,過酸化水素やO_2も反応してしまうという欠陥が明らかになった.2)実験腎症における単離糸球体での一酸化窒素産生についてpuromycin aminonucleoside(PAN)投与によって腎症を誘発したラットでは,投与2日目の尿中および血清中のNOxは増加しており,体内のNO産生は増加していると考えられるが,その時期にNO合成酵素を免疫染色しても,増加が見られず,PANによる活性酸素産生増加に引き続く現象である可能性が高いと考えられた.PAN投与後同時期の単離糸球体でもNOxの産生亢進が確認され,尿中のNOx増加は,糸球体由来と考えられた.3)透析患者での一酸化窒素産生における非酵素的反応の関与についてわれわれは透析患者の血中NOxが増加していることをすでに報告した.腎不全患者では血清中のNO合成酵素阻害物質の増加や活性酸素産生の増加が知られている.そこで,われわれの見出した過酸化水素による非酵素的NO産生に注目し,この系に対する透析患者血清の抑制効果を調べた.その結果,透析患者血清は非酵素的NO産生に対する抑制が弱く,これがNO産生増加に関与している可能性が考えられた.電子スピン共鳴法により,従来から困難とされてきた実験腎炎における生体内のredox stateのin vivo評価を試みた.PANでラットに腎症を誘発し,ラジカルプローブ剤である4-hydroxy2,2,6,6-tetramethyl-piperidine-1-oxyl(TEMPOL)を投与し,腎臓表面からシグナルを捕らえ半減期を算出した.その結果,腎臓内で活性酸素の産生亢進により還元物質が消費される時期に一致し,著明にTEMPOLの半減期の延長を認めた.この事実はPAN腎症での還元能の低下をin vivoで証明するとともに,in vivoでのフリーラジカルイメージングの基礎を開くものである.5)内皮型一酸化窒素合成酵素多型と末期腎不全への進行について内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)遺伝子には,いくつかの多型が知られている.

そのうちintron4の27塩基対の5 repeatが4 repeatになるmutationについて調べ,透析患者群で有意にこのmutationが高頻度であることを明らかにした.しかし元疾患別に検討すると,糖尿病性腎症による透析患者群では健常コントロールと差がみられなかった.この結果はこの遺伝子異常が糖尿病によらない腎疾患の進行因子になっている可能性を示唆する.しかし,このmutationのeNOS活性に及ぼす影響に関しては,現在相反する報告が出ており,われわれも現在検討を進めている.本年度は主にGriess法によるNOの測定法と動物実験モデルを確立した.1) NOの測定法NOの測定はその不安定さゆえに,常に測定しているものがNOを直接反映するものか否かが問題となる.直接にNOを検出する方法として電極法と化学発光法があるが,電極法は今回の検討で,NOに特異的な電極を使用しているにもかかわらず,過酸化水素やスーパーオキサイドラジカルが存在すると,それを検出してしまうことが判明した.すなわち活性酸素存在下でのNOを検出する実験には適さないことが明らかとなった.そこでNOを直接は検出できないが,NOが酸化して出来るNO_2やNO_3を安定して測定可能なGriess法を採用し,オートサンプラー,送液ポンプ,カドミウム還元カラム,検出器,レコーダーを組み合わせ,自動分析装置を完成させた.この装置は市販の専用装置より感度の点で約10倍優れ,1検体あたり6分と迅速で,かつ100検体まで自動分析が可能である.この装置の完成によって今後の研究の迅速化が期待できる.2)動物実験モデルの確立これまでの腎炎とNOの関連を示す研究は,すべてマクロファージあるいはメサンギウム細胞が動員される実験腎炎において行なわれてきた.これは,NOS依存性NO産生をターゲットにする以上当然のことではある.我々は非NOS依存性NO産生を対象としているために,マクロファージの動員されないモデルとしてアミノヌクレオシド・ピュロマイシンを用いて腎炎を誘発しNOの動きを検討することにした.腹腔内注射や静脈内注射などの投与法を検討中であり,まだPreliminaryではあるが,蛋白尿の出現に先立ち,NOのピークがみられるようである.今後,条件を固定し,NO産生に影響する薬剤を用いて実験を積み重ねる予定である.1)一酸化窒素の測定法についてまず基本的な問題として,NO測定に頻用されるGriess反応によるNOx(NO_2+NO_3)測定と,電極法によるNOが真のNOを反映しない可能性を見出した.すなわちアルギニンのアナログであるカナバニンや,NO合成酵素の阻害剤であるL-NAMEと過酸化水素の反応でNOxは検出されるが,化学発光法でみるとNOの存在は確認できず,NO_2あるいはNO_3が産生される可能性がある,また,電極法ではNOのみならず,過酸化水素やO_2も反応してしまうという欠陥が明らかになった.