hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳腫瘍細胞における細胞極性制御異常の解明

代表的脳腫瘍である神経膠腫(グリオーマ)の形質を細胞極性制御の観点から解析するために、細胞極性を制御する分子であるLAP蛋白質(ヒトERBINおよびScribble)について解析した。ヒトScribbleと結合する蛋白質を酵母two-hybrid法を用いてスクリーニングし、いくつかの新規結合候補蛋白質を同定した。Scribbleは、p0071およびMRP4とそのPDZドメインを介して相互作用し、細胞のbasolateral membraneで共局在し、そして、これらの蛋白質の機能を制御している可能性を見出した。細胞極性を制御する分子であるLAP蛋白質について、その細胞運動制御機能や分化と増殖の統御における機能を解析することを目的として、ヒトScribbleと結合する蛋白質を酵母two-hybrid法を用いて探索した。全長Scribbleをbaitとして行ったtwo-hybrid screeningで、p0071、delta-catenin、tetratricopeptide repeat, ankyrinrepeat and coiled-coil containing 2(TANC2)、latrophilin 3(LPHN3)を含むいくつかの新規結合候補蛋白質を同定した。また、N末端のロイシン・リッチリピートの部分をbaitとしたtwo-hybrid screeningも行ったが、それでは良い候補蛋白質を得ることはできなかった。一方、ヒトScribbleのパルミトイル化の可能性についても検討した。ScribbleのN末端に存在する3個のシステイン(システイン4,システイン10,システイン22)の変異体を作製し、細胞に強制発現させてそれらの局在を観察したところ、システイン4およびシステイン10が、Scribbleの形質膜局在に重要であることが判明した。また、システイン4およびシステイン10の変異体は、野生型のものに比べて可溶性が高くなっていた。これらのことから、Scribbleのシステイン4およびシステイン10がパルミトイル化されている可能性が示唆された。全長Scribbleをbaitとして行ったtwo-hybrid screeningで同定したScribble結合候補蛋白質の中で、p0071について解析を進めた。p0071(別名plakophilin4)は、p120カテニンと相同性を有する蛋白質で、カドヘリンの関与する細胞間接着に関与する分子であると考えられている。p0071はそのC末端にPDZドメイン結合モチーフをもつが、酵母two-hybrid法で、このPDZ結合モチーフを介してScribbleのPDZドメインと結合することが確認された。細胞に強制発現したScribbleを免疫沈降すると、内在性のp0071が共沈した。さらに、MDCK細胞における細胞免疫染色で、Scribbleとp0071の共局在が認められた。興味深いことに、Scribbleの発現をRNA干渉法にてノックダウンすると、p0071の発現量が増加した。また、同様に、Scribbleの発現をRNA干渉法にてノックダウンし、免疫染色を行うと、p120カテニンと相互作用が報告されている転写因子の一種であるKaisoが、細胞内より核内に移行する傾向が認められた。一方、ERBINのLeucine rich repeatsドメインをbaitとして行ったtwo-hybrid screeningでERBIN結合候補蛋白質として同定したOdinについて解析を行った。最終的に、Odinに対する抗体を作製し、内在性のERBINとOdinが結合するかを検討したが、結合は認められなかった。また、作製した抗体を用いて行った細胞免疫染色でOdinは、細胞免疫染色でERBINの存在する細胞間接着部位には存在せず、一部は、細胞-基質間接着部位に存在した。Leucine-rich repeats(LRRs)ドメイン及びPDZドメインをもつScribble、ERBINなどのLAP蛋白質ファミリーは細胞極性形成に関与することが報告されているが、その細胞運動制御機能や分化と増殖の統御における機能を解析することを目的として、ヒトScribbleと結合する蛋白質を酵母two-hybrid法を用いて探索した。全長Scribbleをbaitとして行ったtwo-hybrid screeningで同定したScribble結合候補蛋白質の中で、Multidrug resistance protein 4(MRP4、別名ABCC4)について解析を行つた。MRP4は、ATP-binding cassette(ABC)transporter superfamilyのsubfamily Cに属する蛋白質で、形質膜に存在して、ロイコトリエンB4、cAMP、PGE1、GSHなどの内在性基質やMTX、topotecanなどの抗がん剤の細胞外への輸送を行う蛋白質であることが報告されている。また、MRP4は前立腺を含む幅広い組織で発現が認められているが、細胞によって、apical membraneに局在する場合と、basolateral membraneに局在する場合があるとされている。

MRP4はそのC末端にETALというPDZドメイン結合モチーフをもつが、酵母two-hybrid法で、このPDZ結合モチーフを介してScribbleのPDZドメインと結合することが確認された。細胞に強制発現したScribbleを免疫沈降すると、内在性のMRP4が共沈した。さらに、内在性のScribbleを抗Scribble抗体で免疫沈降したところ、その免疫沈降物中にMRP4が含まれており、ScribbleとMRP4は、in vivoで結合していることが確認された。Caco-2細胞における細胞免疫染色で、ScribbleとMRP4は、basolateral membrane上で共局在していた。また、Caco-2細胞でScribbleの発現をRNA干渉法にてノックダウンし、免疫染色を行うと、MRP4がbasolateralmembraneより消失した。これらのことより、Scribbleは憾P4と相互作用し、その機能を制御している可能性が示された。
非強制型国家規制の拡大とその憲法的統制

ひとつは、非強制型国家規制という論点を提示した論者たちが、特定の国家像や民主政像を有していたことが明らかになり、それに関する先行研究を調査することができた。彼らの構想はいわゆる「リベラル・デモクラシー」と呼ばれる思想に基本的には立脚するものである。彼らは、それに立脚するからこそ非強制型国家規制を利用すべきだとの主張も展開している。つまり、そのような規制態様には、強制のない形で私人の行動をコントロールする害悪性の可能性だけでなく、リベラル・デモクラシーの前提となる社会実践を維持する有用性をも有していると主張しているのである。そして、その有用性を活かしつつも、害悪性を抑制する憲法理論の構築を目指していたのである。また、その憲法理論の構築に際し、「法の表示」と呼ばれる概念が有用であることをも主張していた。この点については、しかし、先行研究の渉猟と分析に想像以上に時間を取られ、論文の公表に至らなかった。彼らの議論を詳細に紹介し、それが現在の憲法理論に与える影響について考察する論文を早急に公表したいと考えている。もうひとつは、現代的問題と本研究との繋がりを示す2つの成果を発表したことである。当該年度においては、(1)非強制的な国家規制と近年その社会的存在感を増す人工知能(AI)の法的統制との関連を指摘する論攷と、(2)ナッジと呼ばれる非強制的な私人行動統制メカニズムを積極的に支持する論者の近著への書評を著した。これらにおいて、現代の技術や社会問題に関しても、本研究が示唆を有することが明らかになったと思われる。本年度は、本課題で取り扱う研究内容を論文等の形で公表することが叶わなかった。これは、非強制的国家規制に関する先行研究が、研究計画提出時の想定よりも質・量ともに膨大で、その収集及び分析に多くの時間を割く必要に迫られたからである。それ故に、それらを取りまとめ、法学理論上の意義や現実の法的実践に対する示唆を伴う形で論文化することができなかった。この意味で、研究計画に遅れが生じているとの指摘に対しては甘受せざるをえないと考えている。ただ、先行研究の収集と分析には時間を掛けることができ、一定の成果も経ている。次年度については、これらの成果を論文等の形で積極的に公表していく予定である。また、この収集・分析によって、2年目の研究計画に影響を与える主張を発見することもできた。これらも当初の計画通り2年目の成果として、論文等での発表を進めていく。研究成果の第1に掲げた研究については、論者の議論を詳細に紹介し、それが現在の憲法理論に与える影響について考察する論文を早急に公表したいと考えている。論文を2019年度前半に投稿し、2019年中に刊行されるようなスケジュールを念頭に、執筆を進める。その後は、2年目の研究計画に基本的に基づく形で、1年目の成果との接続を意識しつつ、非強制型国家規制の憲法統制論の確立に努める。

研究成果の第1に掲げた研究については、論者の議論を詳細に紹介し、それが現在の憲法理論に与える影響について考察する論文を早急に公表したいと考えている。論文を2019年度前半に投稿し、2019年中に刊行されるようなスケジュールを念頭に、執筆を進める。その後は、2年目の研究計画に基本的に基づく形で、1年目の成果との接続を意識しつつ、非強制型国家規制の憲法統制論の確立に努める。
コンクリート構造物の総合的なマネジメントシステムの構築

本研究は、国や県といった多数の構造物を管理する機関において有用となるよう、全体構造物の耐久性能評価を可能とし、それらに基づいて適正な維持管理を行うシステム、総合的マネジメントシステムを提案した。総合的マネジメントシステムの構成は確率的な劣化シミュレーションシステムと補修管理計画の最適化システムから成る。劣化シミュレーションは、各劣化モデル(例えば、塩害劣化ならば塩分の浸透、腐食の進行等)に対しばらつきを加味した構造物情報を与えることで、全構造物が各劣化状況に至る確率を算出する。その結果、将来のある時点における全構造物の性能確率分布が得られる。予測される劣化状況が異なれば適当な補修方法も異なるため補修計画の仮定を行い、これより維持管理コストの試算が可能となる。補修方法の提示とコスト試算を繰り返すことにより、より有効な維持管理計画が行われることになる。本研究では、全体システムの枠組を構築したもののその精度は十分ではない。特に劣化モデルに対する精度はまだまだ検討の余地が多く、また入力データとそのばらつきについても追加調査が必要である。これら精度を向上させるためには、現段階に対する検証が必要であり、その手段の一つとして実構造物の劣化状況との比較検証が有効である。今後、実構造物の劣化状況調査を進めると同時にシステム全体の精度向上を図る意向である。H15年の研究は、まず1.塩害による劣化過程の個々の構造物に対する定式化とその検証2.全構造物の劣化度を算定するプログラムの作成と検証の二点の達成が必須であった。1の「塩害劣化過程の定式化と検証」では、塩害においては特に表面塩化物イオン濃度が重要と考え詳細研究を行った。この結果、風速と海岸距離から飛来塩分量のモデル化を行い、この飛来塩分量に気象とコンクリート表面状態を考慮した表面塩化物イオン濃度モデルを構築した。このモデルを実構造物と比較検証することにより、その精度を一定のものとした。2の「全構造物の劣化度を算定するプログラムの作成と検証」については、構造物の諸元を与えれば、その入力データの誤差(ばらつき)を考慮して経過年における劣化度を算定するプログラムを製作した。また、過去の点検調査結果等を用いて入力データの誤差の提案を行うとともに、作成プログラムの評価を行った。以上の劣化予測に対し、維持管理過程における補修補強が劣化過程に与える影響を考察し、経年変化と必要コスト比較を行った。この塩害の研究結果を参考に、疲労、中性化、アルカリ骨材反応に対する同様の研究に現在とりかかっている。H15年度末の研究進捗状況としては予定の90%程度である。
ヒトセメント芽細胞に特異的に発現する遺伝子の同定

本年度は平成18年度に同定したセメント芽細胞に特異的に発現する遺伝子F-spondinの歯周靭帯細胞の分化および接着能に対する影響を明らかにし、セメント芽細胞での機能や歯周組織再生への応用の可能性を検討する事を目的に以下の通り実施した。(1)平成18年度にF-spondinを歯周靭帯細胞に遺伝子導入すると、石灰化関連蛋白の遺伝子発現を増強させた結果より、平成19年度ではF-spndi1ペプチドを用いて、歯周靭帯細胞の分化に対る影響を検討したところ、細胞のアルカリフォスファターゼ活性を上昇させる傾向が認められた。しかしながら、石灰化関連蛋白の分化後期のマーカーとされるオステオカルシンやボーンシアロプロテインについては変化がみられなかった。また、細胞接着能について検討するためにcell adhesion assayを行ったところ、接着能に明らかな有意差は認められなかった。よって、F-spondinペプチドはセメント芽胞の初期の分化を促進するものの細胞の硬組織形成能および接着能に影響を及ぼさない事が示された。(2)In vivoでの硬組織形成能に与える影響を検討するために、F-spondin遺伝子導入した歯周靭帯細胞をヌードマウスの皮下にハイドロキシアパタイトとともに移植したところ、少量の硬組織形成は認められるもの、明らかな有意差は認められなかった。よって、in vivoでの硬組織形成において、F-spndin単独では硬組織形成促進は難しいことが示された。以上の結果から、F-spondinは歯周組織においてセメント芽細胞に特異的に発現するセメント芽細胞のマーカーとしては注目すべき遺伝子であるが、F-psndin単独ではセメント芽細胞の初期の分化が促進されるのみで、セメント芽細胞の最終分化促進や歯周組織再生への応用のためには他の因子と組み合わせるなど更なる検討が必要と考える。本年度はヒトセメント芽細胞に特異的に発現する遺伝子の同定の研究を行う目的で以下のとおり実施した。(1)セメント芽細胞に特異的に発現する遺伝子の検索をヒトセメント芽細胞(HCEM)とヒト歯周靭帯線維芽細胞(HPL)の遣伝子発現をマイクロアレイ(human focus array,8500既知遺伝子)にて解析し、HCEMにのみ発現する遺伝子について、RT-PCRにより発現の確認を行った。これらの解析により4つの遣伝子候補が挙ったが、それぞれの遺伝子についてヒト骨芽細胞での発現を検討したところ、発現がみられなかったのはF-spondin遺伝子のみであったことから、この遺伝子に注目した。歯周組織においてF-spondinはセメント芽細胞に特異的である可能性が示唆された。(2)F-spondinの抗体を用いてヒト歯周組織の免疫組織化学的染色を行ったところ、セメント質表層にF-spondinの発現が認められ、セメント芽細胞に発現することが確認できた。(1)および(2)の結果から、F-spondinがセメント芽細胞特異的に発現することが明らかとなった。(3)HPLへのF-spondin遣伝子導入は、HPLのアルカリフォスファターゼ(ALP)活性を上昇させ、石灰化関連蛋白であるALP、オステオカルシン、ボーンシアロプロテインのmRNAの発現を増強させたことから、F-spondinがセメント芽細胞の分化に関係していることが示唆された。このようなデータの結果を踏まえ最終年度となる来年度はF-spondinのセメント芽細胞での機能の詳細を明らかにするとともに、その他のセメント芽細胞特異的遣伝子についても検討を進めたい。
気候温暖化がシダ植物の種多様性に与える影響の予測と検出

温暖化が日本のシダ植物の分布へ与える影響を定量的に予測し、検出することを目的とし、おもに次の4つのテーマについて研究を行った。(1)シダ植物7種の分布を気候条件から予測する統計モデルを構築し、将来の気候における生育可能な地域や生育に適する地域を予測した。(2)分布予測における不確実性を把握するために、20個のGCMの気候データを利用して、気候値のばらつきの評価を行った。(3)温暖化の影響検出のため、温暖化に対して感受性の高いと推定される筑波山において谷と尾根の異なる標高と方位で62個の植生調査区を設定した。(4)感受性が高いと推定される北海道ニセコ山系において、30個の植生調査区を設定した。本研究は、温暖化が日本のシダ植物の種多様性へ与える影響を定量的に予測し、検出することを目的とする。正確な将来予測のためには、現在の分布を高い精度で予測する分布予測モデルを構築することが必要である。日本では過去100年間に1.06°C上昇した(気象庁2005)。近年の温暖化影響を検出するために、温暖化に伴い生育地が大きく移動する感受性の高い種と地域を選んで、現地調査を実施し分布の変化を検出する。本年は、分布データの整備と、シダ植物7種について影響予測を行った。シダ植物の分布図(倉田・中池1979-2005)の電子化を行った。植物社会学ルルベデータベース(PRDB)には、地域間で調査地点の密度に差があるので、現地調査と文献によりデータの追加を行った。異なる分布域をもつシダ植物7種の分布を気候条件から予測する分布予測モデル(分類樹)を構築し、将来の気候における潜在生育域(生育可能な地域)や適域(生育に適する地域)を予測した。シダ植物分布図の種の在不在データをモデルの説明変数に使用した。一方、PRDBから抽出した在不在データをモデルの精度検証に使用した。対象地域は日本全域で、空間解像度は約10 km×10 kmとした。現在気候にはメッシュ気候値2000(気象庁2002)を、将来の気候には20812100年のRCM20(気象庁2004)とMIROC(K-lmodel developers 2004)を使用した。シダ植物7種の分類樹モデルから予測された現在の適域と2つの将来の気候における適域を比較すると、増加する種と減少する種に分けられた。亜熱帯や暖温帯に分布するイシカグマ、コシダ、ベニシダの適域は温暖化後に増加し、中間温帯から寒温帯の間に分布する4種の適域は縮小すると予測された。解析結果から判定される温暖化に対して感受性の高い種と地域が、検出の対象地候補となる。将来の気候条件に基づく生育可能な場所(潜在生育域)と現在の分布を比較することによって、現在の分布がどのように変化するかを予想して現地調査を実施することにより温暖化影響の検出を目標とする。将来の正確な潜在生育域の予測のためには、現在の分布を高い精度で予測する分布予測モデルの構築が必要である。本年は、分布予測モデルの精度を向上させるために、土地的普通種3種と土地的依存種3種を対象として、気候変数のみを用いたモデル(気候変数モデル)と、非気候変数(地形と地質)を追加したモデル(気候ー非気候変数モデル)を構築し、植物の分布予測の精度を比較した。その結果、気候ー非気候変数モデルの方がすべての種でより高精度で分布域を予測できることが明らかとなった。とくに、土地的依存種の予測精度の向上が顕著であった。日本では過去100年間に平均気温が1.06°C上昇した(気象庁2005)。近年の温暖化影響を検出するためには、温暖化に伴い潜在生育地が大きく移動する感受性の高い種と地域を選んで、現地調査を実施し分布の変化を検出することが必要である。本年は、筑波山のシダ植物の空間的時間的変化を把握するモニタリングシステムを構築するため、初回の植生調査を実施した。標高(850、800、750、650、550、450m)、地形(尾根と谷)、斜面方向の異なる62地点に永久植生調査区を設定した。調査の結果、谷系列にシダ植物が多く出現し、尾根系列ではスズタケが多いため草本植物は貧弱であることがわかった。低標高域に出現した暖温帯性のベニシダ、イノデなどは、気候変化に対して敏感に移動する可能性があり温暖化の指標種候補と考えられる。

本研究は、温暖化が日本のシダ植物の種多様性へ与える影響を定量的に予測し、検出することを目的とする。将来気候の推定値は、全球気候モデル(GCM)によって異なるため、分布予測モデルを用いた温暖化影響評価には将来気候データ(気候シナリオ)に起因する不確実性が存在する。しかし、将来の気候データに起因する不確実性が生物分布予測結果に及ぼす影響については、国内外ともにほとんど検討されていない。本年は、World Climate Research Programの第3次結合モデル比較実験(CMIP3)で公開されている20個のGCMの気候データを利用して、将来気候データを整備し、SRES A1B排出シナリオにおける気候値の分散の評価を行った。SRESA1B排出シナリオに基づく20個のGCMの結果を利用して、将来気候データを以下の手順で作成した。まず、日平均気温と、日最低気温、日降水量より現在(19611981年)と将来(20812100年)の平年値(月平均気温、月平均最低気温、月降水量)を求めた。気温については将来と現在の差を、降水量はその比を求めた。その後、差比データを1km2解像度まで空間補間(単純線形内挿)し、現在の3次メッシュ気候値(気象庁1996)にオーバーレイした。以上の作業をすべてのGCMについて行い、20個の将来(20812100年)気候データを作成した。主成分分析を行った結果、SRES A1B排出シナリオにおける20812100年の気候データは20個のGCM間で大きく異なることが明らかとなった。気温変数(WI、TMC)に比べて、降水変数(PRS、PRW)の方がGCM間のばらつきが大きかった。このことから、気温変数への依存性が高い種に比べて、降水変数への依存性が高い種は予測結果のばらつきが大きくなると推察される。将来の気候条件に基づく生育可能な場所(潜在生育域)と現在の分布を比較することによって、現在の分布がどのように変化するかを予想して現地調査を実施することにより温暖化影響の検出を目標とする。本年は、ニュージーランドランドケア研究所のアンダーソン博士と共同で温暖化のシダ植物への影響予測に基づくシダ植物多様性の保全のための保護区の設計に関する論文を作成しており、近い将来の論文発表する計画である。シダ類を含む植物の分布変化を把握するモニタリングシステムを北海道ニセコ山系で設定した。この地域は国定公園として保護区に指定されており、生物多様性保全上重要な地域である。標高2001000mの異なる標高と地形部において30か所の植生調査プロットを設定し、植生調査を実施した。その結果、11種のシダ植物が出現した。シラネワラビ、オクヤマシダ、ホソバトウゲシバ、シノブカグマ、ヤマソテツ、オシダは出現頻度が高く、エゾメシダ、ゼンマイ、ヤマドリゼンマイ、シシガシラ、ジュウモンジシダは出現頻度が低かった。出現頻度の高い環境は、標高400m800m、斜面中部から谷部、ササ類密生しない群落などであった。この植生調査プロットを再調査することにより、植物の分布変化を把握する。今回の植生調査の過程で、ブナの北限(黒松内)以北のニセコ山系にブナ個体群を発見した。この個体群は、人里から遠く離れた山中のアクセスの悪い地点に位置し、周辺の植生が老齢自然林であること、ブナ個体が不規則に分布し多様な大きさの個体があることなどから自然に成立した個体群であると推定した。したがって、今回の発見個体群が、新北限となる。
霊長類のMRI脳区分マップに基づくヒトの脳構造の進化・発達過程の統合的理解

本研究では、非ヒト霊長類をモデルとして、MRI脳区分マップを作成し、人類進化に伴う脳構造の経時的変化の定量画像分析を行う。これにより、各脳領域の構造と領域間の構造ネットワークにおけるヒトの特異性を見出し、その発達様式を明らかにすることを目指している。本研究では、これまで、米国のJohns Hopkins University School of Medicineの森・大石研究室の技術的支援のもと、日本モンキーセンターが所有する様々な種類の霊長類の脳固定標本に対して、東京慈恵会医科大学が所有する9.4テスラの高磁場MRIを用いて、様々な種類の霊長類脳標本の脳MRI(拡散強調画像、T2強調画像)を撮像してきた。当初の予定通り、霊長類の脳MRIデータベース・システムの開発・公開を進めることができたから。ビデオ学術論文のJOVE誌から、高磁場MRIを用いた様々な大きさの霊長類脳標本に対応した高精度な脳MRIの撮像方法に関して、論文投稿と取材の依頼があった。現在、この論文の作成に取り組んでいる。2019年度内に、論文の出版と撮像方法の公開することを目指す。これにより、霊長類脳イメージングにおける技術的基盤の発展と普及への貢献が期待できる。本研究では、非ヒト霊長類をモデルとして、脳進化マップ・脳発達マップを構築し、人類進化に伴う各脳領域の経時的変化の定量画像分析を行う。これにより、各脳領域の構造と領域間の構造ネットワークにおけるヒトの特異性を見出し、その発達様式を明らかにすることを目指す。H29年度は、米国のJohns Hopkins University School of Medicineの森・大石研究室の技術的支援のもと、主に次の三つの研究開発を行った。(1)京都大学霊長類研究所のチンパンジーの脳MRIのデータベース・シスムテムの開発に向けて、データ整理を行った。(2)慶應義塾大学の発達期のマーモセットの脳MRIと用いて、脳区分マップの構築のための予備的検討を行った。(3)日本モンキーセンターが所有する霊長類脳標本を脳MRIのデータベース・システムの開発を行った。まずは、霊長類12種(ピグミーマーモセット、ヨザル、シロガオオマキザル、カニクイザル、ニホンザル、ボンネットマカク、トクモンキー、サイクスモンキー、アカオザル、シュミッドグエノン、ブラッザグエノン、テナガザル)の脳MRIを対象に日本モンセンターより公開する予定である。主な研究成果として、2本の学術論文(Sakai et al., Neuroscience Research, 2017; Sakai et al., PLOSONE, 2017)を出版した。また、2017年10月には、アトランタにて、Georgia State UniversityのLanguage Research Center主催するLANA (Learning from Apes and other Nonhuman Animals--or something similar!) conferenceで、"Development and evolution of human brain: insights from comparative anatomical MRI between chimpanzees and humans"という演題で基調講演を行った。現在、(3)の日本モンキーセンターの霊長類脳標本の脳MRIデータベースに関する論文を投稿し、改稿版の作成をしている(Sakai et al.,投稿中)。当初の予定通り、チンパンジーおよびマーモセットの脳MRIデータベース・システムの開発・公開に向けての準備を進めることができたから。脳発達マップ及び脳進化マップの構築を行い、サルからヒトへの進化とともに大きく変容したヒト特異的な脳領域を見出し、その脳領域がどのような発達様式により形成されるのかを検討する。これにより、ヒト特異的な脳領域の構造および領域間の構造ネットワークの進化・発達過程の包括的な理解が進む。本研究では、霊長類研究所のチンパンジーの脳画像を基にMRI脳区分マップを構築する。しかしながら、これらの脳画像は低磁場MRI装置での限られた時間での撮像されており、特に成体チンパンジーの脳画像が、画像解析に十分に対応できない画質である可能性も予測される。その場合、NIHのチンパンジー脳データ提供サイト(NCBR: http://www.chimpanzeebrain.org)から、Yerkes National Primate Research Centerで撮像された成体チンパンジーの脳画像を借用することで、MRI脳区分マップの構築を進める。H29年度は、海外学振特別研究員として、米国の研究機関に所属していたため、国際学会の出張費及び画像解析ソフト資料を必要としなかった。H30年度は帰国し、慶應義塾大学にメインに所属することになったので、上記の費用があらためて請求する予定である。

現在、本研究課題に関するビデオ学術論文を作成しており、2019年度も投稿・校正作業が続く。これに伴い、同時期まで霊長類脳標本の脳画像を追加で収集する可能性もある。よって、これらの研究活動に必要な経費として、オープンアクセス料(約350000円)と、脳標本の運搬のための出張経費(約220000円)をあげる。
風洞実験による瓦の飛散・ズレ防止に関する研究

本研究では,従来ほとんど注目されていなかったかわらの飛散の前兆現象である動揺(がたつき,ずれ)に着目し,風洞実験によりそれらのメカニズムを解析した.この結果,以下のことがわかった(1)飛散直前のかわらの振動周波数は,ハンマリング試験で得られた固有振動数とほぼ一致した.(2)風向角の影響については,風向角が増すにつれ,振動や飛散を引き起こし易くなり,飛散に至る風速も低下する傾向が見られた.また,振動や飛散を引き起こし易いかわらは局所的に限定され,屋根下流の右端に集中していることがわかった.(3)屋根の傾斜を変化させた場合,緩やかな勾配では振動や飛散に強く,勾配が急になるにつれて,振動の発生が早まり,その結果,飛散し易いことがわかった.(4)かわらの飛散に影響を及ぼす屋根勾配の影響は,勾配が急になるにつれて,加速度の絶対値および変動の振幅も増加する傾向が新たに判明し,加速度情報を解析することにより屋根勾配の影響を再度確認することが出来た.(5)飛散直前に現われるかわらの波うち現象が観察でき,隣接する2枚のかわらに作用する力が同期したり,位相がずれたりする現象を解析することが出来た.(6)高速度ビデオカメラの映像解析により,飛散現象に最も大きな影響を及ぼす低周波数の振動数を同定することができ,かわらの挙動を支配する主な要因(外部圧力と内部圧力とのバランス)を明らかにすることが出来た.また,かわらに作用する力の発生メカニズムも明らかとなった.本研究では,従来ほとんど注目されていなかったかわらの飛散の前兆現象である動揺(がたつき,ずれ)に着目し,風洞実験によりそれらのメカニズムを解析した.この結果,以下のことがわかった(1)飛散直前のかわらの振動周波数は,ハンマリング試験で得られた固有振動数とほぼ一致した.(2)風向角の影響については,風向角が増すにつれ,振動や飛散を引き起こし易くなり,飛散に至る風速も低下する傾向が見られた.また,振動や飛散を引き起こし易いかわらは局所的に限定され,屋根下流の右端に集中していることがわかった.(3)屋根の傾斜を変化させた場合,緩やかな勾配では振動や飛散に強く,勾配が急になるにつれて,振動の発生が早まり,その結果,飛散し易いことがわかった.(4)かわらの飛散に影響を及ぼす屋根勾配の影響は,勾配が急になるにつれて,加速度の絶対値および変動の振幅も増加する傾向が新たに判明し,加速度情報を解析することにより屋根勾配の影響を再度確認することが出来た.(5)飛散直前に現われるかわらの波うち現象が観察でき,隣接する2枚のかわらに作用する力が同期したり,位相がずれたりする現象を解析することが出来た.(6)高速度ビデオカメラの映像解析により,飛散現象に最も大きな影響を及ぼす低周波数の振動数を同定することができ,かわらの挙動を支配する主な要因(外部圧力と内部圧力とのバランス)を明らかにすることが出来た.また,かわらに作用する力の発生メカニズムも明らかとなった.本研究では,従来ほとんど注目されていなかったかわらの飛散の前兆現象である動揺(がたつき,ずれ)に着目し,風洞実験によりそれらのメカニズムを解析した.この結果,以下のことがわかった.(1)飛散直前のかわらの振動周波数は,ハンマリング試験で得られた固有振動数とほぼ一致した.(2)風向角の影響については,風向角が増すにつれ,振動や飛散を引き起こし易くなり,飛散に至る風速も低下する傾向が見られた.また,振動や飛散を引き起こし易いかわらは局所的に限定され,屋根下流の右端に集中していることがわかった.(3)屋根の傾斜を変化させた場合,緩やかな勾配では振動や飛散に強く,勾配が急になるにつれて,振動の発生が早まり,その結果,飛散し易いことがわかった.本研究では、風速を静的な風圧力に換算した従来の研究に対して、瓦の飛散の前兆現象である動的な振動に着目して行ったものである。すなわち、風洞実験により、瓦の飛散に最も大きな影響を及ぼすと考えられる比較的低周波数の振動発生のメカニズムを明らかにした。具体的には、以下のことがわかった。(1)昨年度の報告で述べた瓦の飛散に影響を及ぼす屋根勾配の影響を、加速度情報を解析することにより確認することが出来た。(2)飛散直前に現れる瓦の波うち現象が観察でき、隣接する2枚の瓦に作用する力が同期したり、位相がずれたりする現象を解析することが出来た。(3)高速度ビデオカメラの映像解析により、飛散現象に最も大きな影響を及ぼす低周波数の振動数を同定することが出来た。また、瓦に作用する力の発生メカニズムも明らかとなった。本研究では、風速を静的な風圧力に換算した従来の研究に対して、瓦の飛散の前兆現象である動的な振動に着目して行ったものである。昨年度に引き続き、風洞実験により、瓦の飛散に最も大きな影響を及ぼすと考えられる比較的低周波数の振動発生のメカニズムを明らかにした。(1)昨年度の報告で述べた瓦の飛散に影響を及ぼす屋根勾配の影響を、加速度情報を解析することにより再確認することが出来た。(3)高速度ビデオカメラの映像解析により、飛散現象に最も大きな影響を及ぼす低周波数の振動数を同定すること述出来た。
聴覚障害児に対する個別適応型の日本語文法学習教材の開発に関する研究

平成30年度の研究では、従来、聴覚障害児にとって理解が困難とされている特定の文法項目について、特別支援学校(聴覚障害)の小学部児童を対象とした理解課題を実施しデータを収集するとともにその遂行成績の一部について分析した。本年度は複合動詞の理解について統語的複合動詞と語彙的複合動詞の理解の差異を検討し、統語的知識と意味的知識の両方が理解に影響することが検証された。また、外国人向けの初級ならびに中級の標準的な日本語文法指導書を参考に、約1,600の文法項目を抽出し、それぞれの文法項目を用いた典型的な例文を作成した。これらの中から、複数の指導書で重複する項目を整理し約700項目に集約した。次に、特別支援学校(聴覚障害)の小学1年生から専攻科学生までの約800編の作文について、各文法項目の使用の有無と使用の正誤を抽出・確認した。分析にあたっては形態素解析ソフトを利用して各項目の使用を抽出した後、当該項目が正確に抽出されたかどうかを、一つひとつの文について確認する作業を行った。分析の結果、いずれの年齢段階においても使用される文法項目の種類は限定的であり、また使用された際の文体や表現が画一的な傾向が認められた。さらに分析対象とした項目が使用された約150,000文を抽出し、文法項目ごとにデータへのタグ付け作業を行った。さらに理科と社会の小学校用教科書に登場する文について、電子データ化の作業を行った。本年度に実施した研究成果の一部を日本特殊教育学会第56回大会にて発表するとともに、研究論文として公表した。平成30年度は、文法項目の抽出と聴覚障害児の作文をベースにした各項目の難易度の分析を研究目的とした。本研究では大規模のテキストデータを対象としたため、研究の初動における分析枠組みの設定にやや時間を要した。そのため各項目の難易度設定に対してはさらに詳細な検証を行う必要はあるが、現時点では本年度の目的を概ね達成したと判断できる。並行して行う予定であった小学校教科書の分析については、データ入力作業の進捗がやや遅れたが、80%程度の作業は完了しており、次年度に向けて残りのデータ処理ならびに分析を行う予定である。すでに分析の方法等についてはほぼ確立していることから、今後の作業は円滑に進むものと考えている。平成30年度に分析・検証したデータをもとに、本年度は学習教材の対象とする文法項目の選定と配列を行い、データベース化を進める。データベース化の作業については、平成30年度と同様に研究補助員を雇用して行う予定である。作業については、その後の研究活動が円滑に進むように可能な限り時期を限定して集中的に実施する予定である、さらに平成31(令和元)年度は学習教材のベースとなるソフトウェアの作成に着手する。学習用ソフトウェアの作成に関しては、はじめに正誤判断課題と多肢選択課題を取り上げ、コンピュータ上で作動する試作版を作成し、動作確認をしながら改良を行っていく。また特に難易度の低い文法項目を抽出し、その文法項目の学習教材に使用するイラストなどの視覚的教材についても、試作する予定である。視覚教材については、研究補助員の協力を得るとともに外部業者への委託を考えている。なお平成30年度に実施した研究の成果については、日本特殊教育学会第57回大会等で発表するとともに、研究論文誌を通じて公表する予定である。

すでに分析の方法等についてはほぼ確立していることから、今後の作業は円滑に進むものと考えている。平成30年度に分析・検証したデータをもとに、本年度は学習教材の対象とする文法項目の選定と配列を行い、データベース化を進める。データベース化の作業については、平成30年度と同様に研究補助員を雇用して行う予定である。作業については、その後の研究活動が円滑に進むように可能な限り時期を限定して集中的に実施する予定である、さらに平成31(令和元)年度は学習教材のベースとなるソフトウェアの作成に着手する。学習用ソフトウェアの作成に関しては、はじめに正誤判断課題と多肢選択課題を取り上げ、コンピュータ上で作動する試作版を作成し、動作確認をしながら改良を行っていく。また特に難易度の低い文法項目を抽出し、その文法項目の学習教材に使用するイラストなどの視覚的教材についても、試作する予定である。視覚教材については、研究補助員の協力を得るとともに外部業者への委託を考えている。なお平成30年度に実施した研究の成果については、日本特殊教育学会第57回大会等で発表するとともに、研究論文誌を通じて公表する予定である。
レセプト情報・特定健診等情報を用いた横断＋縦断的川崎病診療実態調査

本研究は、レセプト情報・特定健診等情報データベース(National Database; NDB)を用いて川崎病患者を対象とした横断的研究である。川崎病と診断された患者が地域ごとにどのような初期治療がされているのか、その後にどのような転帰をたどったのか、川崎病合併症の冠動脈瘤を認めた患者では遠隔期の成人ではどのような医療ケアがされているのかについて実態調査を行い、従来の全国アンケート調査と比較し従来の疫学調査の代替手段として有用か検討する。
ヌクレオチド結合によるミオシン分子頭部の形態変化

本研究では、カエル骨格筋の単一脱鞘筋線維を用いて、多くのX線回析実験を行い、さまざまな環境下における収縮蛋白分子の影響を調べた。標本として用いたのは、食用カエル縫工筋の単一筋線維を、界面活性剤であるTriton X-100で処理したものである。この標本は、単一骨格筋筋線維としては100-150μmと太く、強い回析を生じるため、X線回析実験に適している。標本は厚さ6μmのカプトン膜を張ったX線用ウィンドウの間に入れ、適当な人工細胞内溶液を用いて灌流した。温度は4度とした。実験は、高エネルギー物理学実験所の放射光実験施設(Photon Factory)の小角散乱用ビームライン(BL15A)で行った。(1)燐酸類似化合物であるバナジン酸の効果を調べた。バナジン酸を収縮または硬直収縮によって取り込ませると、カルシウムの存在・非存在にかかわらず、ミオシン分子は弛緩状態と同じように太いフィラメントの軸の周囲にらせん上に配列する。このことは、ミオシン・ADP・バナジン酸複合体が、生理的な中間体であるミオシン・ADP燐酸中間体と非常に似た性質と構造を持っていることを示している。(2)ATPの全く存在しない硬直状態のアクチン・ミオシン複合体に対する、ADPの効果を調べた。1mMADPによって、X線回析像では14.5mmに相当する位置にある太いフィラメント由来の子午線反射の強度が約80%増加する。これは、アクチンと結合したミオシン頭部が、アクチンと解離せずにその形を変化することを示唆している。ADPはATPと同様に、ミオシン頭部の中央に位置する谷状の部分に結合すると考えられ、ADPの結合がミオシン頭部の形態変化を生じるということは、谷間に結合したADPがその両側のドメインの間の位置関係を変えている可能性を示す。これは、ミオシン頭部の複数のドメインの位置関係が変わることによって収縮張力が生じるという仮説と一致する。温度は4度とした。
幼若ラット培養海馬ニューロンの可塑的シナプスにおける可視化BDNF分子の動態

我々は、蛍光蛋白質GFPと脳由来神経栄養因子(BDNF)の融合蛋白質(BDNF-GFP)を長期的に安定発現させた培養海馬ニューロンを用いて、BDNF-GFPが神経活動依存的にスパイン近傍から放出される様子を観察することに成功した。この結果、BDNFがシナプス機能を亢進すべくスパイン近傍から放出される可能性を示した。今回我々は、この放出されたBDNFがどの様なシナプス機能に関与するか、その可能性としてラット培養中枢ニューロンにおける興奮性神経伝達物質グルタミン酸の放出および同期的Ca^<2+>オシレーションに対する影響に着目し解析を行った。ラット海馬、大脳皮質および小脳から培養したニューロンを用いて解析を行った結果、BDNFが急速にグルタミン酸を放出させることを見いだした。さらに、このBDNFによるグルタミン酸放出は、PLCγの阻害剤U73122、細胞内Ca^<2+>貯蔵器官のCa^<2+>を枯渇させるthapsigargin、IP_3受容体の阻害剤xestospongin Cにより抑制されることを見いだした。このことは、このグルタミン酸放出がPLCγ/IP_3を介した細胞内Ca^<2+>貯蔵器官からのCa^<2+>放出により引き起こされることを示唆している。また我々は、BDNFによるこの放出がグルタミン酸トランスポーターの阻害剤であるL-trans-2,4-PDCおよびDL-threo-β-benzyloxyaspartateにより抑制されることを見いだした。この結果は、通常のエキソサイトーシスではなくグルタミン酸トランスポーターの逆転輸送がこの放出過程に関与する可能性を示している。また我々は、培養大脳皮質ニューロンにおいて、ニューロンネットワークの成熟に伴い観察される自発的で同期的なCa^<2+>オシレーションにおけるその頻度が、BDNFにより増強されることを見いだした。さらに、このBDNFによるオシレーションの増強作用にもPLCγ/IP_3を介した細胞内Ca^<2+>貯蔵器官からのCa^<2+>放出およびグルタミン酸トランスポーターの逆転輸送が関与していることを見いだした。以上の結果は、BDNFがPLCγ/IP_3/細胞内Ca^<2+>経路の活性化、そしてそれに伴うグルタミン酸トランスポーターを介したグルタミン酸放出により神経伝達機能を増強する可能性を示している。
腎疾患におけるmicroRNAの発現調節機序とバイオマーカーとしての有用性の検討

健診受診者コホートを対象とした研究では、腎関連指標(腎機能低下、高尿酸血症、尿中アルブミンの漏出)が、生命予後、心血管予後の独立した危険因子であることを明らかにした。ヒト腎疾患症例を対象とした研究では、糸球体、尿細管、間質の各細胞に多数のmicroRNAが発現しており、その発現プロファイルが腎疾患ごとに異なること、IgA腎症では特定の尿中microRNA発現量が1年後の腎機能低下と相関することを明らかにした。これらのことから、腎障害や尿バイオマーカーが、生命予後・心血管予後の指標として有用であることが、一般住民・腎疾患患者においても確認された。1.尿中総microRNA濃度と尿蛋白・腎生検組織変化との相関:現時点までに130症例の腎生検症例の尿からmicroRNAを抽出し、ほぼ全例で尿中microRNAが検出可能であった。尿中microRNA濃度は尿蛋白と正相関したが、腎組織変化(糸球体内増殖性変化、硬化病変、間質線維化)との相関は有意ではなかった。さらにIgA腎症88例のみを対象として1年間の腎機能(推定GFR)変化と尿中総microRNA量の関連を検討したところ、尿中microRNA濃度は1年間のeGFR変化との関連は有意ではなかった。2.個々のmicroRNA濃度と腎病変、腎予後との関連と腎組織内局在:予備的検討で腎組織変化と相関を認めた各microRNA(miR-133b, miR-192, miR-200c, miR-30c)/RNU48比と1年間eGFR変化との関連を検討したところ、miR-133b/RNU48が有意な逆相関を認めたが、他のmicroRNAは有意な相関を示さなかった。In situ hybridization法ではmicroRNAは尿細管上皮細胞での発現が強く、糸球体内細胞、血管壁、間質細胞での発現は軽度であった。3.コホート研究での成果:一般住民コホートにおいて、総死亡や心血管死亡との関連は、尿中蛋白濃度よりも、尿中アルブミン濃度の方が強いことを明らかにした(Sato H, et al. Clin Exp Nephrol 2016)。血中尿酸血値が、特に女性において総死亡、心血管死亡の独立した因子であることを明らかにした(Kamei K, et al. Clin Exp Nephrol 2016)。これらのことから、尿中アルブミン排泄、尿酸代謝に関わるmicroRNAが予後指標として検討対象となりうることが示唆された。1.ヒト腎疾患症例における腎組織・尿microRNAと腎病変の関連についての解析:当初計画した腎生検400症例中、現時点で約130例まで解析が進み、腎組織病変(炎症、細胞増殖、硬化)や腎障害指標(蛋白尿、腎機能など)と腎組織・尿microRNAの関連を検討した。(1)腎生検組織中microRNA定量・局在評価:Insitu hybridization法にて腎生検組織における各microRNA発現の局在を検討したところ、主に尿細管上皮、さらに糸球体と間質の一部の細胞でmicroRNA発現を確認した。このことから、一定の発現量があるmicroRNAについては、現在の手法で局在の確認と半定量的評価は可能であることが明らかになった。(2)尿中microRNAの定量評価と分泌細胞の同定:腎疾患患者の新鮮尿からmicroRNA抽出後、microRNAを定量したところ、ほぼ全例で検出・定量が可能であったことから、本手法で研究を遂行することが可能であることが確認された。しかし、現段階では総microRNAについての解析が中心で、個別のmicroRNAについての定量評価はまだ不十分である。(3)microRNAの網羅的解析:ネフロン部位別のサンプル採取ができていないために、microRNAマイクロアレイ解析はまだ行われていない。2.コホートにおける尿microRNAの腎疾患・心血管疾患リスクのバイオマーカーとしての有用性の検討:現時点までに、腎疾患患者約130人(平成2024年採取)の尿検体からmicroRNA抽出後、総microRNA、腎病変との関連が想定される各microRNA(miR-133b, miR-192, miR-200c, miR-30c)を定量し、1年間のeGFR変化との相関を検討した。コホートを用いた解析は3年目に行う予定であったが初年度から繰り上げて開始した。さらにIgA腎症88例のみを対象として1年間の腎機能(推定GFR)変化と尿中総microRNA量の関連を検討したところ、尿中総microRNA濃度は1年間のeGFR変化との関連は有意ではなかった。2.個々のmicroRNA濃度と腎病変、腎予後との関連と腎組織内局在:予備的検討で腎組織変化と相関を認めた各microRNA(miR-133b, miR-192, miR-200c, miR-30c,miR-21)と1年間eGFR変化との関連を検討したところ、尿クレアチニン濃度で補正したmiR-21が有意な逆相関を認めたが、他のmicroRNAは有意な相関を示さなかった。

In situ hybridization法ではmicroRNAは尿細管上皮細胞での発現が強く、糸球体内細胞、血管壁、間質細胞での発現は軽度であった。3.コホート研究での成果:一般住民コホートにおいて、総死亡や心血管死亡との関連は、尿中蛋白濃度よりも、尿中アルブミン濃度の方が強いことを明らかにした(Sato H, et al. Clin Exp Nephrol 2016)。血中尿酸血値が、特に女性において総死亡、心血管死亡の独立した因子であることを明らかにした(Kamei K, et al. Clin Exp Nephrol 2016)。これらのことから、尿中アルブミン排泄、尿酸代謝に関わるmicroRNAが予後指標として検討対象となりうることが示唆された。1.ヒト腎疾患症例における腎組織・尿microRNAと腎病変の関連についての解析:当初計画した腎生検400症例中、現時点で約150例まで解析が進み、腎組織病変(炎症、細胞増殖、硬化)や腎障害指標(蛋白尿、腎機能など)と腎組織・尿microRNAの関連を検討した。1腎生検組織中microRNA定量・局在評価:Insitu hybridization法にて腎生検組織における各microRNA発現の局在を検討したところ、主に尿細管上皮、さらに糸球体と間質の一部の細胞でmicroRNA発現を確認した。このことから、一定の発現量があるmicroRNAについては、現在の手法で局在の確認と半定量的評価は可能であることが明らかになった。2尿中microRNAの定量評価と分泌細胞の同定:腎疾患患者の新鮮尿からmicroRNA抽出後、microRNAを定量したところ、ほぼ全例で検出・定量が可能であったことから、本手法で研究を遂行することが可能であることが確認された。しかし、現段階では総microRNAについての解析が中心で、個別のmicroRNAについての定量評価はまだ不十分である。3microRNAの網羅的解析:ネフロン部位別のサンプル採取ができていないために、microRNAマイクロアレイ解析はまだ行われていない。2.コホートにおける尿microRNAの腎疾患・心血管疾患リスクのバイオマーカーとしての有用性の検討:現時点までに、腎疾患患者約150人(平成2025年採取)の尿検体からmicroRNA抽出後、総microRNA、腎病変との関連が想定される各microRNA(miR-133b, miR-192, miR-200c, miR-30c, miR-21)を定量し、1年間のeGFR変化との相関を検討した。コホートを用いた解析は3年目に行う予定であったが初年度から繰り上げて開始した。本研究は、尿microRNAを中心に、腎疾患の新規バイオマーカーの探索を目的としたものである。コホートを対象とした研究では、地域住民約3000名の尿検体の解析から、尿中蛋白、特にアルブミンの漏出が、生命予後、心血管予後の独立した危険因子であることを明らかにした(Sato et al. Clin Exp Nephrol. 2016;18:711-7)。