hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小児白血病の発症に係わるキメラ遺伝子の機能を阻害するRNAiに関する研究

私たちは今回、t(15;17)(q13;q11)転座を有する急性骨髄性白血病細胞、およびt(2;2)(q21;q35)転座を有する滑膜肉腫細胞を対象として、RNAiによる治療法を開発することを検討している。いずれの転座も今までに報告されていないものであるため、これらの転座よって生じたキメラ遺伝子を同定する必要がある。t(15;17)(q13;q11)転座細胞に関しては、急性前骨髄性白血病でみられる15;17転座とは、転座切断点が異なっているため、現在cDNAライブラリーを作成し、キメラ遺伝子をスクリーニング中である。t(2;2)(q21;q35)転座に関しては、一方の転座切断点が胞巣型横紋筋肉腫に特有の2;13転座でみられるPAX3/FKHRキメラ遺伝子のPAX3の切断点と同一のものであるため、3'RACE法によってクローニングを行いキメラ遺伝子のスクリーニングを行った。キメラ遺伝子の有力な候補が得られた。
ニューロサーキット異常をきたす新規てんかんの原因遺伝子の解析とその病態解明

イハラてんかんラット(IER; Ihara Epileptic Rat)」は生後35ヶ月からてんかん症状を呈し約一年で死に至る原因不明の自然発症ラット突然変異体であり、「精神遅滞症状が先行し、その後てんかんが生じるヒト疾患」の良いモデル動物になる。IERのてんかん発作前の脳についてさらに詳細な解析を行った。ゴルジ染色によって、大脳皮質のV層神経細胞で、樹状突起の側方への進展が障害されているということが認められた。さらに、海馬初代培養では、神経突起の進展と分岐が障害されていた。また、扁桃体における抑制性神経細胞の分布に異常があるということ、そしてその神経突起が異常な形態をしているということがわかった。つまりこのラットでは、扁桃体における抑制性神経細胞がその神経抑制機能が果たせないということや、さらに個々の神経細胞の突起形成の障害によるニューロサーキット異常のためにてんかん準備状態となり、その後てんかんを発症するのではないかと考えられた。原因遺伝子Epi-IERが神経突起の伸長と分岐に関わることを、初代培養細胞への遺伝子導入によって明らかにした。IERでは、Epi-IER遺伝子ゲノム上に一塩基置換があり、それがスプライシング異常を引き起こして遺伝子機能を失うことも明らかにした。また、ヒト疾患の探索のためのスクリーニングを開始した。神経センターにあるてんかん症例リサーチリソースの症例のリンパ芽球の中から、Epi-IER遺伝子の発現が低い群のスクリーニングを行い、極端にその発現が低下している症例群を見つけた。今後、ゲノム解析を行い、Epi-IERの異常によって引き起こされるヒトてんかんの同定に努める。24年度が最終年度であるため、記入しない。IERの原因遺伝子を確定できたこと。Epi-IERのゲノム上における一塩基置換が原因となってスプライシング異常を引き起こしていることが、IERの原因であることを明らかにしたこと。ヒト疾患の探索のために、精神遅滞リサーチリソースの症例のスクリーニングを開始したこと。以上から、初年度としては予定通りである。IERの電気生理学的解析を行い、脳神経系にどのような機能異常があるのかを調べ、精神遅滞やてんかん様症状がいかにしれ招来されるのかを明らかにする。国立精神神経医療研究センターの400家系600症例におよぶ「精神遅滞リサーチリソース」をスクリーニングし、Epi-IER遺伝子の異常によるヒト精神遅滞やてんかんの症例の同定に努める。
極限環境下にある深海微生物の生存戦略イメージング

研究代表者はこれまでから高圧力環境にある生物試料を実時間で観察できる高圧力顕微鏡の開発を行ってきた。この装置を利用すると、地球上で最も深い領域であるマリアナ海溝最深部(約11,000m)の静水圧を超える圧力環境を研究室で作り出すことができる。平成27年度は、海洋研究開発機構(JAMSTEC)が有人潜水調査船「しんかい6500(最大潜航深度6,500m)により深海底から採取してきた海洋細菌の運動マシナリーを調べる研究を行った。Shewanella violaceaDSS12は琉球海溝深度5,000mから採取された代表的な海洋細菌である。8 °C, 30 MPaを生育至適とし、70MPa程度の高圧環境にまで良好に生育できることから好圧菌のモデル生物とされている。また、これまでの研究によりゲノム解析も達成されている(4.8 Mb)。低温(8°C)、大気圧環境下でこの菌体を対数増殖期まで培養し、高圧力環境下で遊泳速度の圧力依存性を調べた。8°C, 0.1MPa条件下では、約半分の菌体が遊泳運動を行っており、その速度は約16 μm/sであった。圧力の増加に伴い、泳ぐ菌体の割合と速度は単調に減少し、100 MPaで共に約半分になった。大気圧環境下で生育する大腸菌は23°C, 80MPaでは完全に遊泳運動を停止したことから、圧力変化に対するDSS12株の遊泳運動能の変化は緩やかであり、高圧力環境への適応が示唆された。今回実験に利用したDSS12株は大気圧環境でも培養可能であり、その生育能力は圧力に対しても緩やかに変化する事が知られている。この知見は、本研究から得られた運動能の圧力依存性ともよく似ており、海洋細菌の運動マシナリーが高圧力環境に適応していることを示唆するものとなっている。また、このDSS12株の運動マシナリーを駆動するエネルギー源の特定は重要な課題であるが、予備実験からはNa濃度駆動型であることが示唆されており、おおむね、研究は良好に進んでいると判断できる。これまでの実験ではDSS12株を大気圧環境で培養してきたのだが、遊泳運動を示す菌体の割合が約半分と少ない状況にある。今後は、培地組成、ならびに、培養時の温度や圧力を変えることで、海洋細菌の運動マシナリーの研究に適した培養条件を検討したい。
子宮平滑筋肉腫における新規分子標的RSF-1の機能解析

子宮平滑筋肉腫、子宮体癌に対し、がん遺伝子RSF-1が分子標的治療の標的候補となるか検討した。子宮悪性腫瘍におけるRSF-1タンパク質発現と臨床病理学的因子との関連、予後について検討したところ、RSF-1過剰発現は無増悪生存率また全生存率の間に相関を認めなかった。しかし、機能解析からRSF-1ノックダウン細胞株はコントロールと比較し、有意に増殖能、浸潤能が減少することがわかった。以上の結果から、RSF-1は腫瘍の増殖能、浸潤能を有意に増加し腫瘍増殖、転移に関連すると考えられた。これより、治療標的となる可能性があると考えられた。子宮平滑筋肉腫(Leiomyosarcoma:LMS以下LMS)は子宮悪性腫瘍の中では比較的稀な疾患である反面、早期発見が難しい上、LMS全進行期の5年生存率は27.1%であり、極めて予後不良である。しかしその分子生物学的特徴はほとんど解明されておらず、今後、治療成績を向上させるためには、分子生物学的特徴を解明し、その特徴にターゲットを絞った創薬が必要と考えられる。申請者らの研究グループは、新規癌遺伝子RSF-1はこれまでの予備実験で肉腫組織でのタンパク質発現が上昇していること発見した。本研究ではRSF-1がLMSの分子標的治療の標的候補となりうるかについて、RSF-1タンパク質発現と臨床病理学的因子との関連の検討を行い、さらに機能解析を進める予定であった。当初、LMSにおけるRSF-1に焦点を絞り,タンパク質発現、臨床病理学的因子との関連,予後,抗癌剤感受性について検討を進めたが,症例数が少ないため十分な検討を行うことが出来なかった。そこでLMSだけでなくその他の子宮悪性腫瘍(子宮体癌Endometrial cancer ; EC、子宮癌肉腫; Endometrial caricnosarcoma)に着目し研究を進めた。これまで子宮体癌もRSF-1タンパク質発現の頻度は高いことが報告されているが、予後も含めた臨床病理学的検討はこれまでない。これがLMS, ECの予後不良に関与するか調べるため臨床病理学的因子との相関について検討し,その後細胞株を用い機能解析を行った。子宮体癌ではRSF-1タンパク質発現は90%(54/60)に見られた。RSF-1タンパク質発現と臨床病理学的因子の検討では様々な因子(進行期、筋層浸潤、リンパ節転移の有無など)で有意差は認めなかった。またRSF-1タンパク質発現陽性群で、予後に差は認めなかった。LMSにおいて研究を進める予定だったが、症例数が少なく解析できなかったため、そのたの子宮悪性腫瘍全般について検討することとした。子宮体癌におけるRSF-1タンパク質発現の頻度、臨床病理学的因子との関連、予後、抗癌剤感受性について検討したところ、RSF-1タンパク質発現消失は無増悪生存率、また全生存率の間に有意な相関は認めなかった。癌遺伝子RSF-1の発現は子宮体癌の早期再発、抗癌剤耐性に関連し、有力なバイオマーカーとなり得ると考えられた。子宮平滑筋肉腫(Leiomyosarcoma:LMS以下LMS)は子宮悪性腫瘍の中では比較的稀な疾患であるが、早期発見は難しく、極めて予後不良である。また子宮体癌(Endometrial cancer ; EC以下EC)は近年、食生活の変化、また未婚・未産婦の増加から罹患率は上昇傾向にある。これらの子宮悪性腫瘍の治療成績向上のためには、従来の手術療法、化学療法に加え、分子生物学的特徴の解明を行い分子標的治療の確立が急務である。申請者らの研究グループは、これまでLMS組織、またEC組織において新規癌遺伝子RSF-1のタンパク質発現が上昇していること発見しており、本研究でRSF-1が分子標的治療の標的候補となりうるかについて、RSF-1タンパク質発現と臨床病理学的因子との関連の検討を行い、さらに機能解析を進めた。EC細胞株(Ishikawa, HHUA, HEC1B, HEC50B)を用い、RSF-1が過剰発現するEC細胞株においてshRNAを用いてRSF-1遺伝子ノックアウト細胞の樹立を試みたが、ノックアウト細胞の樹立は非常に困難であった。現在は方針変更し、siRNAでノックダウン細胞を作成し、予定していた増殖能、浸潤能、転移能といった機能解析を進めている。これと並行し、これまで卵巣癌で報告のあった、RSF-1発現細胞におけるパクリタキセル耐性についても、EC細胞株を用い検討を進めている。当初、RSF-1が過剰発現するEC細胞株においてshRNAを用いてRSF-1遺伝子ノックアウト細胞の樹立を試みたが、困難であったため、現在siRNAを用いて実験を進めている。比較的安定したノックダウン細胞が樹立で来たところで、コントロールの導入細胞と比較し、Growth assay、Colony Formation assay、Soft agar assayを用いて増殖能について検討中である。さらにWound healing assay、Invasion assayを用いて浸潤能、転移のうについても検討中である。

申請者らの研究グループは、本研究でRSF-1が分子標的治療の標的候補となりうるかについて、RSF-1タンパク質発現と臨床病理学的因子との関連の検討を行い、さらにH29年度は機能解析を進めた。1子宮悪性腫瘍におけるRSF-1タンパク質発現の頻度、臨床病理学的因子との関連、予後ついて検討したところ、RSF-1タンパク質過剰発現は無増悪生存率、また全生存率の間に有意な相関は認めなかった。2癌遺伝子RSF-1は腫瘍の増殖能、浸潤能を有意に増加させ、腫瘍増殖、転移に関連すると考えられた。これより、RSF-1は治療標的となる可能性があると考えられた。子宮平滑筋肉腫、子宮体癌に対し、がん遺伝子RSF-1が分子標的治療の標的候補となるか検討した。子宮悪性腫瘍におけるRSF-1タンパク質発現と臨床病理学的因子との関連、予後について検討したところ、RSF-1過剰発現は無増悪生存率また全生存率の間に相関を認めなかった。しかし、機能解析からRSF-1ノックダウン細胞株はコントロールと比較し、有意に増殖能、浸潤能が減少することがわかった。以上の結果から、RSF-1は腫瘍の増殖能、浸潤能を有意に増加し腫瘍増殖、転移に関連すると考えられた。これより、治療標的となる可能性があると考えられた。子宮腫瘍における新規癌遺伝子RSF-1の機能解析および、その臨床応用へと展開していくため、本研究では以下の研究項目を予定している。1. RSF-1遺伝子導入における抗癌剤感受性の検討2. RSF-1遺伝子ノックアウトにおける抗癌剤感受性の検討3. RSF-1の制御する遺伝子群、パスウェイの解析1. RSF-1遺伝子導入における抗癌剤感受性の検討:RSF-1が遺伝子変異している卵巣明細胞腺癌株にWild typeのRSF-1をレンチウイルスを用いて遺伝子導入し安定遺伝子導入細胞を樹立する。その後、コントロールベクター導入細胞と比較し、抗がん剤に対する感受性が上昇するか検討する。2. RSF-1遺伝子ノックアウトにおける抗癌剤感受性の検討:逆にRSF-1がWild typeの卵巣明細胞腺癌株においてAdeno-associated virus vector(AAV)を用いてホモロガスリコンビネーションを生じさせ、RSF-1の遺伝子ノックアウト細胞を樹立する。コントロールのAAV導入細胞と比較し、抗癌剤感受性(抗癌剤耐性誘導)が変化するか検討する。siRNA、shRNAで遺伝子ノックダウンした場合はRSF-1の完全な機能喪失には至らないため、本研究では遺伝子ノックアウト法を用いることにした。子宮悪性腫瘍における新規癌遺伝子RSF-1の機能解析、抗癌剤耐性の検討1EC細胞株におけるパクリタキセル感受性の検討、2RSF-1遺伝子ノックダウンにおけるパクリタキセル感受性の検討、3RSF-1遺伝子導入における増殖能、浸潤能、転移能についての検討、4RSF-1遺伝子導入におけるパクリタキセル感受性の検討1EC細胞株においてRSF-1発現の有無によるパクリタキセル感受性の違いについて検討する。2RSF-1過剰発現細胞株において、RSF-1遺伝子ノックダウンし、パクリタキセルの感受性が変化するか検討する。
造血幹細胞におけるTecチロシンキナーゼの解析

チロシンキナーゼは一般に細胞の増殖分化に直接的に関わっていると考えられている。我々が単離した新規チロシンキナーゼTecは血液細胞において高発現しており、特に骨髄球系においては最も豊富な非受容体型チロシンキナーゼである。従って骨髄球系細胞の増殖機構においてTecが重要な役割を担うことが予想される。本研究計画においては我々は、骨髄球系細胞に働くサイトカインの細胞内シグナル伝達機構におけるTecの関与を検討した。(1)Tecのサイトカインによる活性化:マウスIL-3依存性細胞株BaF3にc-Kit,Flt3/Flk2,gp130,G-CSF受容体cDNAをそれぞれ導入し安定導入株を得た。これらの細胞は導入受容体のリガンド依存性に増殖することができた。親株を含めたこれらの細胞をそれぞれIL-3,stem cell factor,Flt3/Flk2 ligand,IL-6+IL-6receptor alpha chainsoluble form,G-CSFで刺激するといずれの系においてもTecは刺激依存性にチロシンリン酸化することが判った。また少なくともc-Kit,Flt3/Flk2,gp130とはTecが細胞内で会合することが示された。しかも正常マウスの骨髄よりc-Kit-positive,lineagemarkers-negativeの単核細胞を分離しIL-6+Flt3/Flk2 ligand存在下で培養する際、Tecに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与しTec発現量を低下させると、造血前駆細胞の増殖は抑えられた。以上よりTecは造血前駆細胞の増殖に必須なキナーゼと考えられ、Tecと相互作用を及ぼす細胞内蛋白質を明らかにすることによって、細胞増殖機構に関する新たな視点からの知見が得られると予想される。
肝の病態生理における肝類洞壁細胞機能の解析と治療への応用

1)肝局所免疫能賦活による原発性肝癌の経類洞性進展及び肝転移の抑制。BRMとくにOK432が肝の局所免疫能を高めることを示唆するdataを得た。即ちOK432は高率に肝とくに肝内マクロファージ(クッパー細胞)に集積し、かつTNFα、IL-1α、IL1-βといった抗腫瘍能を有するモノカインのmRNA発現を増強した。とくに静脈内投与後13時間で強い発現を示した。更には、肝マクロファージのIL_2リセプターの発現をも増強した。これらは、新しい知見である。2)エンドトキシン誘発肝障害発生機序の解明と新しい治療法の開発。本症の発生機序には肝マクロファージの活性化→TNFαを主体とするモノカイン及びトロンボキサンA_2(TXA_2)-TXA_2受容体系の活性化→類洞内皮障害、接着分子発現増強、類洞収縮→類洞内凝固、白血球接着亢進、血小板凝集→類洞微小循環障害→肝実質障害が大きく関与していることを明らかにしている。そして、各段階における合理的な治療法を開発し、実験レベルではあるが、効果を得ている。3)肝冷保存・再潅流障害の発生機序の解析とその対策。今回得られた知見は、(1)冷保存中に肝マクロファージが活性化すること(2)類洞内皮細胞上の接着分子ICAM-1の発現が亢進すること(3)類洞内非常のTXA_2受容体がinternalizeすること(4)Caチェンネルブロッカーが冷保存・再潅流時の類洞圧上昇を抑えること等である。いづれも肝移植に際する肝冷保存にとって有益な知見であり、臨床応用が期待される。
植物ウイルス複製酵素複合体の輸送ハブ機能の解明

Affinity精製と質量分析によって、Red clover necrotic mosaic virus(RCNMV)移行タンパク質(MP)と相互作用する宿主タンパク質として、ベンサミアナ植物のGAPDH-Aタンパク質を同定した。GAPDH-AはRCNMVの複製複合体(VRC)と小胞体膜上で共局在し、MPをVRCへとリクルートする作用を通じてRCNMVの細胞間移行に貢献する宿主因子であることがわかった。また、MPの欠失変異体の解析から、細胞の表層に形成されるMPとVRCを含む小斑点状構造はウイルスゲノムの複製には影響しないが、細胞間移行にとって必須の構造体であることを明らかにした。affinity精製と質量分析によって、Red clover necrotic mosaic virus(RCNMV)移行タンパク質(MP)と相互作用する宿主タンパク質として同定されたNicotiana.benthamiana植物のGAPDH-Aタンパク質は、RCNMVの細胞間移行に関与する宿主因子である。今年度の研究で、GAPDH-AとRCNMVMPが植物細胞内で相互作用することがBiFCアッセイによって確認できた。当初の予想通り、葉緑体局在性のGAPDH-Aは、ウイルス感染によって表層小胞体膜に形成されるウイルス複製酵素複合体(cortical VRC)においてMPと相互作用することが確認できた。さらに大腸菌で発現させて精製したGSTとMPおよびGSTとRCNMV複製酵素タンパク質p27と、GAPDH-Aタンパク質が直接相互作用することがGST pull downアッセイによって確認できた。また、GAPDH-A遺伝子をサイレンシングした植物ではRCNMV MPがcortical VRCに局在できず、そのためMPがウイルスRNAを捕捉出来ず、ウイルスの細胞間移行が抑制されるというモデルを提示し、論文投稿中である。GAPDH-Aの他にMPと相互作用する因子として同定されたGermin-like proteinについて、これをクローニングし、発現抑制植物を作製して調べたところ、RCNMVの細胞間移行に関与する宿主因子であることが明らかとなった。現在MPとの相互作用と細胞内局在について解析を進めている。またRCNMV MPのプラズモデスマータへの輸送経路解明のために、各種阻害剤やドミナントネガティブ型タンパク質発現系を利用した解析を行い、これまでに膜輸送系はMPのPD輸送に関与しないことを明らかにした。Affinity精製と質量分析によって、Red clover necrotic mosaic virus(RCNMV)の移行タンパク質(movement protein; MP)と相互作用する宿主タンパク質として、ベンサミアナタバコのGAPDH-Aタンパク質が同定された。GAPDH-Aは、RCNMVの複製酵素複合体とMPとの間に介在し、効率的なRCNMVの細胞間移行に関与する宿主タンパク質である。昨年度は、GAPDH-Aと葉緑体において相互作用して複合体を形成することが知られているGAPDH-B遺伝子をベンサミアナタバコからクローニングし、その配列を決定した。また、GAPDH-Bに対するペプチド抗体を作製し、GAPDH-B遺伝子の発現をタンパク質レベルで検出出来る系を構築した。さらに同抗体を用いて、免疫染色法によってGAPDH-Bの細胞内局在性を調べたところ、ウイルス感染特異的にGAPDH-BがRCNMV複製複合体と共局在することがわかった。現在、GAPDH-BがGAPDH-Aと同様にRCNMVの増殖に関与するのかどうかについて解析を進めている。同じくaffinity精製と質量分析によって、RCNMV MPと相互作用する宿主タンパク質として同定されたGermin-like proteinについて、その細胞内局在が小胞体膜であることがわかった。しかしRCNMV感染特異的な局在性の変化は見られなかった。RCNMVMPの細胞内輸送経路の解明のため、各種阻害剤やドミナントネガティブ型タンパク質発現系を利用した解析を行ったところ、RCNMVMPはCOP II輸送システムとアクトミオシン系を利用していないことがわかった。現在、アクトミオシン系がRCNMVゲノムの複製に及ぼす影響について解析を進めている。研究期間全体を通じて、Red clover necrotic mosaic virusの移行タンパク質(MP)と相互作用する宿主タンパク質GAPDH-Aを同定し、これがウイルス複製複合体に移行タンパク質をリクルートする機能を通じてウイルスの細胞間移行に関わること明らかにした。また、MPの機能ドメイン解析を通じて、MPが複製複合体の形成に影響を与えており、細胞表層に形成される小斑点状の複製複合体はウイルスゲノムRNA複製ではなく細胞間移行のために機能している構造体であることを明らかにした。昨年度は、GAPDH-Aと複合体を形成することが知られているGAPDH-B遺伝子のRCNMV増殖に及ぼす影響について調べたが、影響は認められなかった。続いてRCNMVが属するトムブスウイルス科のTomato bushy stunt virusのゲノムRNA複製のマイナス鎖合成からプラス鎖合成への切り替え段階に関与することが知られているGAPDH-Cについて、サイレンシングを誘導した植物におけるRCNMV増殖への影響を調べたところ、複製には全く影響が無いにもかかわらず細胞間移行が低下するという現象を見出した。現在この現象について確認実験を行うとともに、細胞間移行のどの段階に関与するのかについて詳細な解析を始めている。また、MP中に存在する5つのαヘリックス構造を欠失させた変異MPを発現する組み換えウイルスの接種実験から、3つのαヘリックス構造が細胞間移行に関与しており、そのうち1つはMPが原形質連絡への輸送にとって重要な役割を果たす領域であり、残る2つはウイルス複製複合体の凝集過程に関与しており、複製複合体の凝集とこれとの共局在が低下することによって細胞間移行が低下することがわかった。現在ウイルス複製複合体の形成過程の解明に向けてさらに詳しく解析を続けている。

Affinity精製と質量分析によって、Red clover necrotic mosaic virus(RCNMV)移行タンパク質(MP)と相互作用する宿主タンパク質として、ベンサミアナ植物のGAPDH-Aタンパク質を同定した。GAPDH-AはRCNMVの複製複合体(VRC)と小胞体膜上で共局在し、MPをVRCへとリクルートする作用を通じてRCNMVの細胞間移行に貢献する宿主因子であることがわかった。また、MPの欠失変異体の解析から、細胞の表層に形成されるMPとVRCを含む小斑点状構造はウイルスゲノムの複製には影響しないが、細胞間移行にとって必須の構造体であることを明らかにした。この1年で、GAPDH-Aと関連が深いと考えられるホモログ遺伝子GAPDH-Bのクローニングが完了し、これに対する抗体を用いて特異的なタンパク質検出を行うことが出来るという目途が立ったことで、GAPDH-BとRCNMV増殖の関連性について調査するための下準備が全て完了した。また、Germin-like proteinの局在性からは目新しい情報は得られなかったが、これをサイレンシングした植物におけるRCNMV MPの局在性に変化が生じるかどうかを検定して、論文投稿へと進める予定である。RCNMVMPの細胞内輸送経路の探索も、既報の輸送経路を使用しないという現象が明らかとなり、複製への影響と複製酵素複合体形成への影響を調べる予定である。唯一、MPと相互作用する宿主因子を新たに質量分析によって明らかにするという計画だけは成功しなかった。これはHisとFLAGの二重タグをC末端に付けたMPを植物細胞に発現させて二段階免疫沈降を行うという計画であり、同様の二重タグの付加による宿主因子の単離は、RCNMVの複製酵素タンパク質p27とp88においては非常に成功した方法であった(Hyodoら、投稿中)が、MPでは、おそらくタンパク質の立体構造の問題などで抗体とタグとのアクセスが不十分であったため、望ましい結果を得られなかった。この結果に対しては、以下の「今後の研究の推進方策」欄で対策を考えている。植物病理学RCNMVMPと相互作用する宿主因子を単離することに成功したが、このときの免疫沈降実験では、二段階精製を行ったことが理由の一つと考えられるのだが、不純物の混入が非常に多かったため、更なる宿主因子の解析を行うには信頼性に乏しいと考えている。そこで、新たに免疫沈降を行う予定である。一つはMPと緑色蛍光タンパク質(GFP)との融合タンパク質をコードする組み換えウイルスを発現させる系で、GFP抗体ビーズを用いて全タンパク質画分を用いて免疫沈降実験を行う予定である。RCNMV
SAT(命題論理の充足可能性)問題を解くアルゴリズムに関する研究

今日ではSATソルバーは、回路の等価性検証、モデル検査など、幅広い分野で探索エンジンとして用いられている。それらの実用性の高い問題に対して用いられるSATソルバーの殆んどはDPLLアルゴリズムをベースにしている。DPLLアルゴリズムには、この10年ほどの間に多種多様なアイデアが付加されている。近年のDPLLベースの探索アルゴリズムでは、仮定に仮定を重ね、探索中に矛盾を導いては、それを回避するための制約条件を積極的に学習することによって探索範囲を狭める仕組みになっている。DPLLでは、ある種の制約条件を学習する際に、今までの探索をすべて放棄して、rootまで戻ることになっている。本年度の研究では、まず実用的にはその状況の際に、いつもrootまで戻るのが良いとは限らないことを明らかにした。学習内容が重要であることは言うまでもないが、それに至る探索過程もそれなりに尊重しても良い、ということである。その上で、rootまで遡るのではなく、ある簡単なヒューリスティックスに従って途中まで探索を戻す手法を提案した。提案手法の有効性の実験的確認として、SATの世界最大規模のコンペティションである、SAT Race 2006の問題に対して適用し、若干ながら提案手法の優位性が認められた。提案手法は、ここで問題としている、ある種の制約条件の学習という状況が発生しなければ、従来法と全く同じ振る舞いになるので、従来法に比べて大きな欠点はない。本年度は初年度なので、サーベイを中心に行った。来年度に本格的な実装を行う予定である。現在のSAT solverには様々な知識が盛り込まれている。知識をルールとしてプログラムに導入するのであるが、ルールをたくさん盛り込めば、当然探索効率が良くなる傾向がある。しかし一方で、ルールの適用にかかるオーバヘッドがかさみ、単位時間辺りの探索速度は低下し、トータルとして見た解答時間は遅くなることがある。これが計算機で実装した時の大きなジレンマである。つまり、どのルールの組み合わせを導入するかによって、solverとしての性能は大きく変化する。また、探索の前に前処理を行うのが一般的であるが、前処理によっても大きく性能が著しく変化する。前処理の方法によっては、その後の探索エンジンの機能を大きく引き出すことができることもある。つまり探索における基本ルールの組み合わせだけでなく、前処理の方法との組み合わせや、前処理と探索エンジンとの間における力の入れ方のバランスが非常に難しい。本年度の試験的に実装では、問題に対する得手不得手が大きく、まだ実用に耐えない。探索の基本ルールの組み合わせや、前処理の方法との組み合わせがうまく噛み合っていない。来年度は現在定評のあるChaffやMiniSATなどのsolverの前処理や、基本ルールを部分的に盛り込みつつ、問題に対する得手不得手の少ない、安定した性能を発揮できるsolverの開発を行う予定である。
ストレスが顎関節痛を増強させる脳神経メカニズム

慢性ストレス状態における口腔顔面痛の増大をモデルラットを用い脳神経科学的に明らかにした。ストレス処置として繰り返し強制水泳ストレスを3日間行った。4日目、咬筋侵害応答を定量した。応答は神経興奮のマーカーであるFosタンパクの発現を指標とした。咬筋への疼痛刺激はホルマリン刺激にて行なった。繰り返しストレスは1)強制水泳ストレス処置時の非水泳時間を有意に延長させた;2)三叉神経脊髄路核尾側亜核(Vc)でのFos陽性細胞数を増加させた。Vc領域を区分しFos発現を定量した。Vcと頚髄の移行部では浅層、深層のいずれの部位においてもFos陽性細胞数の増加を認めた。これらのストレス効果はホルマリン刺激側だけでなく反対側でも観察された。さらにVcと三叉神経脊髄路核中間亜核の移行部(ViVc)でのFos発現を定量した。ViVc部でもFos陽性細胞数の有意な増加が確認された。ストレスは、Vc領域での侵害応答を増大させ、結果として痛みを増大させることを示唆する。さらに従来、咬筋など顎顔面部の侵害応答は、ViVcを興奮させるが環境の変化の影響を受けにくい。しかしこのストレス状態ではViVc部で興奮性の増大が認められた。つまりViVc部はストレス誘発性の咬筋侵害応答に積極的に関与していると思われる。次に以上の侵害応答の増大の生体基盤を検討した。選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)は抗うつ効果を示す。本実験ではSSRIの繰り返し投与による、うつ行動、増大した咬筋侵害応答の調節に関与するかを検討した。SSRIの繰り返し投与は、うつ様行動の低下を示した。またストレス処置によって増大したVc部の侵害応答の増幅は、SSRI投与によって低下することが明らかになった。以上の結果より、繰り返し強制ストレスは咬筋侵害応答を増大させるが、その機構はセロトニン機構の変調によることが示唆された。繰り返し情動ストレス状態における咬筋の痛みへの影響について検討を開始した。初年度のゴールは咬筋への痛み刺激に対する中枢神経組織(三叉神経脊髄路核尾側亜核)での侵害受容(痛み)応答の変化を検討することである。初年度では以下の結果が得られた。繰り返し情動ストレス処置を行なうと1)三叉神経脊髄路核尾側亜核領域内の各部位(ViVc, mid-Vc, dPa5など)で、疼痛応答の増大が見られた。そして2)繰り返し情動ストレス処置を加えた同側のみならず反対側でも見られた。つまり繰り返し情動ストレスは三叉神経脊髄路核尾側亜核全体の興奮性を増大させていることが明らかになった。我々は本課題研究に並行し、顎関節の持続性炎症性疼痛モデルを用い、咬筋の痛みの応答が両側性に増大することも明らかにした。本モデルでは疼痛関連行動が増大し、三叉神経脊髄路核尾側亜核領域では侵害受容応答のマーカーとされるリン酸化ERKやFosタンパクの発現が有意に増加していた(Exp Brain Res 2017に公表)。これらの結果から三叉神経脊髄路核尾側亜核は、情動ストレスや局所炎症という病的状態における侵害受容応答の増大を支配する重要な部位であることが明らかになった。さらに繰り返し情動ストレスモデルに対し、抗ウツ薬(SSRI)または非ステロイド系消炎鎮痛剤の投与による抗ストレス効果が咬筋の痛みの反応のいかなる影響を与えるかを検討した。結果、SSRIまたはNSAIDSの投与は抗ストレス作用を示しただけでなく、咬筋への痛み刺激によって生じる三叉神経脊髄路核尾側亜核の興奮性を抑制させることが明らかになった。特にNSAIDSによる抗ストレス効果と、その結果としてのストレス誘発性疼痛の制御は今後、臨床的意義は高いものと思われることから、研究の発展が期待される。これらの所見は既に複数の学会などで公表した。繰り返し情動ストレス処置によって、咬筋の侵害受容応答の有意な増大が確認できたこと、抗ウツ薬(SSRI)の投与によるストレス誘発性の侵害受容応答の増大が抑制されたこと、抗ウツ薬による侵害受容応答の抑制効果はストレス処置群でしか見られないこと(非ストレス群ではSSRI効果を認めなかった)などの実験結果は、概ね当初、予想したとおりである。よっておおむね順調に進展していると判断する。研究成果:繰り返しストレス状態がラットの咬筋部の侵害応答に与える影響を検討した。昨年度までに咬筋への痛み刺激(ホルマリンの使用)が三叉神経脊髄路核尾側亜核での興奮性を増大させることを示したが、当該年度では情動ストレス(3日間(10分/日)の強制水泳ストレス処置)が、いわゆるウツ様行動および三叉神経脊髄路核尾側亜核における神経興奮を増大させることを行動学的、形態学的、電気生理学的に明らかにした。さらに臨床で、ウツ治療に用いられるセロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)がストレスによる咬筋侵害応答に与える影響について、三叉神経脊髄路核尾側亜核部の興奮性を指標に検討した。まず繰り返し強制水泳ストレス処置は咬筋の痛みの応答(三叉神経脊髄路核尾側亜核の興奮性の増大)が有意に増大することが明らかになった。加えて興奮性の増大は、咬筋の刺激側のみならず、刺激の反対側でも観察された。本所見は繰り返しストレスは中枢神経系の興奮性を変調させていることを示唆できる。

さらに強制水泳ストレス処置後、連日、SSRIを投与しておくと、1先行研究同様、ウツ様行動時間の有意な短縮(非水泳時間の短縮)、および2咬筋への痛み刺激による三叉神経脊髄路核尾側亜核の興奮性の低下が観察された。つまり情動ストレスによる咬筋痛みはストレス応答を制御することで、軽減可能であることが明らかになった。今後の研究展開:三叉神経脊髄路核尾側亜核は咬筋からの痛み情報を直接、受け取る最初の中枢神経部位であるが、同時に上位からの下行性入力を受け、興奮性が調節される。そして情動ストレスは多くの脳部位の機能を変調させることが知られる。今後はストレス痛の基盤である三叉神経脊髄路核尾側亜核の役割をより詳細に検討するでけでなく、ストレス痛が上位脳に与える影響と三叉神経脊髄路核尾側亜核への関わりを検討する。当該年度では繰り返しストレスモデルに加え、急性(単回)ストレス処置は咬筋部の痛みの応答に与える影響を追加検討した。急性ストレス処置は繰り返しストレスとは全く逆の結果が得られた。つまり痛みの応答は有意に低下した。本所見はいわゆるストレス誘発性の鎮痛効果であり、咬筋の痛みというコンセプトで、三叉神経脊髄路核尾側亜核レベルでの興奮性を指標に示したデータは他に見られない。すでに複数の学会で成果の一部を報告済みである。さらに国際雑誌に投稿し、現在、Revise中である。慢性ストレス状態における口腔顔面痛の増大をモデルラットを用い脳神経科学的に明らかにした。ストレス処置として繰り返し強制水泳ストレスを3日間行った。4日目、咬筋侵害応答を定量した。応答は神経興奮のマーカーであるFosタンパクの発現を指標とした。咬筋への疼痛刺激はホルマリン刺激にて行なった。繰り返しストレスは1)強制水泳ストレス処置時の非水泳時間を有意に延長させた;2)三叉神経脊髄路核尾側亜核(Vc)でのFos陽性細胞数を増加させた。Vc領域を区分しFos発現を定量した。Vcと頚髄の移行部では浅層、深層のいずれの部位においてもFos陽性細胞数の増加を認めた。これらのストレス効果はホルマリン刺激側だけでなく反対側でも観察された。さらにVcと三叉神経脊髄路核中間亜核の移行部(ViVc)でのFos発現を定量した。ViVc部でもFos陽性細胞数の有意な増加が確認された。ストレスは、Vc領域での侵害応答を増大させ、結果として痛みを増大させることを示唆する。さらに従来、咬筋など顎顔面部の侵害応答は、ViVcを興奮させるが環境の変化の影響を受けにくい。しかしこのストレス状態ではViVc部で興奮性の増大が認められた。つまりViVc部はストレス誘発性の咬筋侵害応答に積極的に関与していると思われる。次に以上の侵害応答の増大の生体基盤を検討した。選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)は抗うつ効果を示す。本実験ではSSRIの繰り返し投与による、うつ行動、増大した咬筋侵害応答の調節に関与するかを検討した。SSRIの繰り返し投与は、うつ様行動の低下を示した。またストレス処置によって増大したVc部の侵害応答の増幅は、SSRI投与によって低下することが明らかになった。
植物ポリケタイド骨格形成酵素群の触媒機能の拡張と分子多様性の創出

化合物の多様性を創出することを目的とし、様々な構造のCoAチオエステルを基質として、キダチアロエ由来のIII型ポリケタイド合成酵素であるオクタケタイド合成酵素(OKS)とアサ由来ポリケタイド閉環酵素、オリベトール酸閉環酵素(OAC)の共反応を行った。その結果、ヘキサノイルCoAとマロニルCoAを基質としてOKSとOACの共反応を行うと新規ナフタレンが生産されることが判明した。さらに、OACアポ型とOAC-オリベトール酸複合体のX線結晶構造を取得し、変異導入実験を行った結果、OACは基質の結合に重要なペンチル結合ポケットを有し、Tyr72とHis78を触媒残基として用いることが明らかになった。アサ由来オリベトール酸閉環酵素(OAC)は、アサのIII型ポリケタイド合成酵素(PKS)がヘキサノイルCoAと3分子のマロニルCoAから生産するテトラケタイド中間体に作用して、カンナビノイドの生合成中間体オリベトール酸へと閉環する全くあたらしいタイプの新規閉環酵素である。本研究では、様々な骨格を有するアシルCoAエステルとマロニルCoAを基質とした触媒タイプの異なるIII型PKSの酵素反応液にOACを加えることにより、新規化合物の生産を目指した。その結果、ヘキサノイルCoAとマロニルCoAを基質としたキダチアロエ由来オクタケタイド合成酵素(OKS)とOACの共反応液中に、OAC共存下においてのみ生成する新規化合物の存在をLC-MS解析によって見いだした。その分子量から、本生成物はヘキサノイルCoAに6分子のマロニルCoAが縮合して生成したビフェニルまたはナフタレン類縁体であると考察される。一方、ヘキサノイルCoAよりも炭素鎖の短いブチリルCoAや炭素鎖の長いオクタノイルCoA、クマロイルCoAやアントラニルCoA等の芳香族CoAをヘキサノイルCoAの代わりに作用させた場合には、いずれにおいても新規化合物の生成を確認することができず、OACの基質特異性はヘキサノイル基に特化していることが強く示唆された。そこで、OACの基質特異性と触媒機構の解明を目指し、OACのX線結晶構造解析を行った結果、1.4オングストロームの分解能でOACアポ型の結晶構造の取得に成功した。今後、これら立体構造情報の活用により、OACの詳細な触媒機構の解明と、OACの機能改変およびそれら機能改変酵素を用いた新規化合物群の創出が期待される。昨年度において、アサ由来オリベトール酸閉環酵素(OAC)のアポ型の結晶構造の取得に成功した。本年度は、OACのさらなる基質特異性と触媒機構の詳細な解析を目的に、その生成物であるオリベトール酸との共結晶化を行った。その結果、1.6 Åの分解能でOACとオリベトール酸との複合体結晶構造の取得に成功した。OACは、その活性中心キャビティーに疎水性に富んだペンチル基結合ポケットを有し、ここにオリベトール酸のペンチル基を結合することが明らかとなった。また、Tyr24、Tyr72、His78が水素結合によるネットワークを形成し、His78がオリベトール酸のカルボキシル基と水素結合を形成すること、及び、His5もオリベトール酸のカルボキシル基と水素結合を形成することが明らかとなった。そこで、これら4つのアミノ酸に変異を導入し、変異が酵素活性に及ぼす影響について精査したところ、Tyr72とHis78に変異を導入すると酵素活性が消失することが判明した。さらにTyr72F変異酵素とHis78S変異酵素のX線結晶構造解析を行った結果、これらの変異の導入により、Tyr72とHis78の水素結合は消失する一方で、他のアミノ酸残基の立体構造は、野生型とほぼ同一に保持されていることが示された。これらのことからOACは、Tyr72とHis78を触媒残基として閉環反応を触媒していることが示唆された。次に、ペンチル結合ポケットを形成するアミノ酸残基を嵩高いアミノ酸に置換した。その結果、酵素活性が減弱することが示された。さらに、これらの変異酵素についてX線結晶構造解析を行った結果、変異の導入によりペンチル基結合ポケットの容積が減少し、基質が結合しにくくなったため、酵素活性を減弱することが示唆された。このことから、ペンチル結合ポケットは、基質のペンチル基の結合に重要であることが示唆された。上記解析結果に基づき、OACの反応メカニズムを提唱することができた。当初の計画通りに、OACの基質特異性と触媒機構に関して明らかにすることができたことから、総合的に概ね計画通りに進展していると考えている。昨年度までの研究過程において、ヘキサノイルCoAとマロニルCoAを基質として、アサ由来オリベトール酸閉環酵素(OAC)とキダチアロエ由来オクタケタイド合成酵素(OKS)の共反応を行うと、ヘキサノイルCoAに6分子のマロニルCoAが縮合して生成したと推察される未知化合物が生産されることを見いだしていた。また、ヘキサノイルCoAよりも炭素鎖の短いブチリルCoAや炭素鎖の長いオクタノイルCoAをヘキサノイルCoAの代わりにOACとOKSに作用させた場合には、OACの関与によって生成したと考えられる化合物が生産されないものの、OKSのみで生産されたと考察できる複数の未知化合物を見いだしていた。本年度は、これらの未知化合物の構造決定を目指し、大スケールで酵素反応を行い、HPLCで精製した本化合物についてNMRによる構造決定を試みた。

まず、OACの関与によって生成する化合物について構造解析を行ったところ、本化合物はヘキサノイルCoAに6分子のマロニルCoAが縮合して生成したナフタレン誘導体であることがほぼ確定できた。次に、OKSにイソブチリルCoAとマロニルCoAを基質として作用させた場合に生成する未知化合物について構造解析を行ったところ、このうちの一つは、イソブチリルCoAに7分子のマロニルCoAが縮合して生成したSEK4bアナログであることが判明した。現在、他の未知化合物の構造決定を進めている。一方、昨年度のOACのX線結晶構造解析の課程においてペンチル結合ポケットに変異を導入したOAC変異酵素を用い、ヘキサノイルCoAよりも炭素鎖の短いブチリルCoAやイソブチルCoAとマロニルCoAを基質としてOKSとの共反応を行ったが、あらたな化合物の生成は確認出来なかった。化合物の多様性を創出することを目的とし、様々な構造のCoAチオエステルを基質として、キダチアロエ由来のIII型ポリケタイド合成酵素であるオクタケタイド合成酵素(OKS)とアサ由来ポリケタイド閉環酵素、オリベトール酸閉環酵素(OAC)の共反応を行った。その結果、ヘキサノイルCoAとマロニルCoAを基質としてOKSとOACの共反応を行うと新規ナフタレンが生産されることが判明した。さらに、OACアポ型とOAC-オリベトール酸複合体のX線結晶構造を取得し、変異導入実験を行った結果、OACは基質の結合に重要なペンチル結合ポケットを有し、Tyr72とHis78を触媒残基として用いることが明らかになった。平成26年度の計画においては、様々なタイプのIII型PKSとOACやそのホモログ酵素を組み合わせ、これに様々な骨格のアシルCoAをマロニルCoAとともに作用させ、新規化合物を生産することを達成目標としていた。今年度の課題実施において、構造決定を決定するまでには至っていないものの、新規化合物の生産を確認することができている。また、本年度中に次年度に予定していたOACアポ型の結晶構造の取得まで至っており、総合的に概ね計画通りに進展していると考えている。本年度において得られたOACの触媒機構に関する知見を踏まえ、OACの機能改変およびそれら機能改変酵素を用いた新規化合物群の創出を目指す。また、OACを他のIII型ポリケタイド合成酵素と組み合わせた場合の酵素反応生成物についても精査することで、さらなる新規化合物群の創出を試みる。28年度が最終年度であるため、記入しない。天然物化学本年度において得られた新規化合物の構造決定を早急に進める。同時に、OACと基質アナログや生成物との複合体結晶構造の取得にも取り組み、OACの基質特異性や触媒機構の詳細を明らかにする。この際には、その情報に基づき変異を導入し反応生成物を精査することで立体構造との整合性を図るとともに、多様な構造の基質に対する基質特異性についても検討し、基質特異性等の改変も含めて行うことにより新規化合物群の創出を目指す。本研究課題で使用する結晶化用試薬を発注したが、在庫がなく、現在、その製造待ちであるため。基質の合成で用いる試薬の在庫がなく当該年度中に購入できなかったため、その費用が次年度使用となった。現在、製造・入荷を待っている結晶化用試薬の購入にあてる。次年度使用となった当該助成金はこの試薬の購入に充てる予定である。
増えすぎた栽培漁業種クロダイの広島湾における初期生残戦略の解明

放流事業によって漁獲量が著しく回復した広島湾のクロダイについて、産卵場、卵分布、稚魚の分布、成長、食性などの初期生態を解明した。クロダイの主産卵場は広島湾の湾口部に形成され、産卵は夜間であり、卵は幅広い水深に分布した。卵密度と稚魚の日周輪解析より、産卵ピークは5月下旬から6月中旬であり、着底は7月上旬から中旬にピークを迎えることがわかった。稚魚の主食はヨコエビ類、カイアシ類、であったが、生息環境に応じ柔軟性を示していた。本年度は研究計画に従い、クロダイ卵や仔魚の同定方法を確立し、広島湾における卵や稚魚の分布および生息密度を調べた。1.エタノールに固定しなクロダイ受精卵を抗原として、クロダイ受精卵を認識するモノクローナル抗体を得た。産卵期および卵径が重複するマダイ、イシダイ、ヒラメの受精卵を用いて単抗体によるスクリーニングを行ったところクロダイ卵のみ陽性反応を示した。また、クロダイのミトコンドリアDNA調節流域前半部を標的とした種特異的プライマーを開発した。このPCR反応はクロダイ属のみに有効であり、PCR産物の有無により仔魚や稚魚の同定が可能となった。2.浮遊卵の採集を広島湾に19調査点を設け、NORPACネットを用いて表層水平曳き(約2kt、5分)で行った。調査期間は2007年5月8日7月10日で、計10回の調査を行った。単抗体法を用いて卵同定を行った。クロダイ卵は計62,799個に達した。卵の平均密度は5月22日に最大21.08個/m^3を記録したが、その後減少し、7月10日には0.05個/m^3となった。19調査地点での平均卵密度は大黒神島北部で70.73個/m^3、西能美島西岸で21.88個/m^3、大須瀬戸で18.76個/m^3となり、その他の地点は0.008.87個/m^3であった。3.広島湾とその島嶼部において、二人曳きの小型曳き網による稚魚採集を、2007年6月5日7月31日に計8回、毎回15地点で行った。調査期間中、合計839尾の稚魚を採集した。採集尾数は6月下旬から増加したことから、広島湾沿岸では主に6月下旬から稚魚の着底が始まると考えられた。15地点における稚魚の採集尾数は調査地点間で異なり、期間を通じて稚魚が最も多く採集できたのは厳島(宮島)北西岸の530尾、次いで似島大黄湾の153尾であり、その他の地点では40尾以下であった。本年度は昨年度の研究計画に従い、広島湾におけるクロダイの1.受精卵の分布密度や2.砕波帯における稚魚の生息密度を調査した。さらに、昨年度、実施した同様の調査結果を照らし合わせ、広島湾におけるクロダイの卵密度と砕波帯の稚魚分布について考察を行った。2008年にける卵の採集は5月7月に計4回(5定点)で行った。採集にはNORPACネット(表層水平曳き;約2kt、5分)を用い、卵同定はモノクローナル抗体法で行った。稚魚の採集は6月7月に計5回(5定点)実施し、サーフゾーンネット(約50m、2回)を用いて採集し、一部の標本は日齢査定に供した。その結果、卵密度は昨年に引き続き、大黒神島北部で最大となった。また、2008年の調査で新たに調査定点に加えた宮島北西岸沖の卵密度は、比較的、低くかった。一方、砕波帯の稚魚は、宮島北西岸で分布密度が最も高いことや、産卵後期に生まれた個体が多く資源加入していることが明らかとなった。また、この結果は2007年度の調査結果とほぼ一致した。2007年と2008年における卵の分布密度から、両年とも産卵は海岸から急深となっている海域(水深30m前後)で主に行われていると考えられた。卵密度より推定された産卵ピークには両年で差がみられた。これは春先から産卵までの水温などの影響と思われた。一方、砕波帯の稚魚は、両年とも宮島北西岸で分布密度が最も高いことや、産卵後期に生まれた個体が多く資源加入していることが共通していた。ただし、2008年の単年調査では、稚魚密度の高かった宮島北西岸沖の卵密度は比較的低く、稚魚分布密度と卵分布密度が必ずしも相関していないことが明らかとなった。広島湾表層におけるクロダイの平均卵密度は、2007年が8.46個/m^3、2008年が9.97個/m^3であった。

2009年の調査では21.18個/m^3となり、各年とも5月中旬6月上旬に卵密度が最大なった。また、卵分布の傾向としては、湾奥部で低く、湾口部で高くなった。ただし、クロダイ卵の比重(σ_<15>=1.021)を考慮すれば、湾奥部では卵が沈下している可能性がある。そこで、2009年に層別採集を行ったところ、卵はいずれの調査定点においても水深115m層に概ね一様に分布し、垂直分布と水平分布密度の高低は調査定点で一致した。広島湾におけるクロダイの産卵盛期は5月中旬6月上旬主であり、受精卵は産卵水深、塩分躍層、密度躍層など様々な要因によって幅広い層に拡散していると考えられた。特に、卵密度が高かったのは大黒神島北岸沖、西能美島鹿田漁港沖、大須瀬戸で、これらの海域に共通することは、比較的塩分が高く、かつ、海岸から急深である海域で、これらが広島湾のクロダイの主産卵場と考えられた。一方、稚魚の食性を調査したところ、稚魚が豊富な宮島網の浦(Stn.1)ではヨコエビ類が、西能美島鹿田漁港(Stn.4)と似島大黄湾(Stn.5)ではカイアシ類(ハルパクチクス目の複数種)とカイアシ類(Paracalanus属の1種)への依存度が高かった。このことから、広島湾のクロダイ稚魚は特定の餌生物に依存せず、育成場の餌料環境に応じた柔軟性を有していると考えられた。2009年度における、宮島網の浦の稚魚の成長速度は0.49mm/dayとなった。この結果は2007年(0.50mm/day)や2008年(0.66mm/day)の結果と比較すると最小となった。2009年の宮島網の浦では稚魚の採集量も少なく、胃内容物の餌生物の種類、量も低かった。よって、育成場の稚魚の成長には稚魚の加入量のほか、餌料環境が影響している可能性が高い。
オートファジー選択基質Ｎｂｒ１の病態生理

本課題では、オートファジー選択的基質Nbr1に着目し、Nbr1の分子レベルの解析から、オートファジー不能マウスおよびNbr1遺伝子改変マウスを用いた個体レベルの解析までを包括的に遂行した。作製した肝臓特異的Nbr1欠損マウスは特別な異常は認められなかった。また、Atg7欠損マウスとの掛け合わせで得られた肝特異的なAtg7;Nbr1二重欠損マウスの肝臓は、肝肥大と肝障害を発症するもの、その重篤度に関してはAtg7欠損マウスと大きく変わらなかった。現在、Atg7;p62;Nbr1三重欠損マウスを作製し、解析をすすめている。近年、特定のタンパク質や不要なオルガネラを標的とする選択的オートファジーの生理的重要性、および、その破綻がヒトの疾患発症と深く関わることが判明している。p62は、ユビキチン化タンパク質をオートファゴソームへ運ぶアダプターとして機能し、オートファジー不全では、細胞質に蓄積してユビキチン陽性タンパク凝集体を形成する。今回、p62と類似したタンパク質結合ドメインを有するNbr1の機能について、Nbr1欠損マウスを作出し、解析を進めた。Atg7欠損肝臓でみられる肝肥大や肝機能障害などの表現型は、p62の同時欠損で劇的に回復する。本研究で作製した肝特異的Nbr1Atg7二重欠損マウスの肝臓を調査した結果、肝細胞肥大と免疫細胞の浸潤をともなった肝肥大が観察され、血中のAST、ALT、およびALPも高い数値を示していた。つまり、Nbr1とAtg7の同時欠損では、オートファジー欠損肝臓が呈する症状について回復も悪化も認められなかった。さらに、ユビキチン陽性凝集体について解析を行った。Atg7欠損肝細胞で出現する多数のユビキチン陽性タンパク凝集体は、p62を同時欠損することでほぼ完全に消失する。一方、Nbr1を同時に欠損した場合、Atg7欠損と同様にユビキチン陽性凝集体は形成された。そして、その数、大きさ共に顕著な差は見られなかった。つまり、p62のPB1ドメインは自己オリゴマーを形成できるが、Nbr1のPB1ドメイン同士はオリゴマーを形成できないことが知られている。したがって、Nbr1はPB1ドメインを介したp62との相互作用によりユビキチン陽性凝集体に局在することを示している。オートファジーは、栄養飢餓に応答した非選択的なタンパク質分解経路であると考えられてきた。しかし、栄養条件に関わらず低いレベルで起こっている恒常的オートファジーの、そして恒常的オートファジーに選択性が存在するという発見により、恒常的そして選択的オートファジーの生理機能が注目されるようになってきた。オートファジーによるp62の代謝の重要性が明らかになりつつある一方、オートファジー選択的基質Nbr1に関しては、病態生理だけでなく生理機能さえもほとんど解明されていない。そこで、生体内におけるNbr1の過剰蓄積の影響を検討するため、肝臓特異的もしくは脳特異的オートファジー不能マウスとNbr1ノックアウトマウスとを交配させ、二重欠損マウスを作製し、解析を行った。オートファジー不全によって引き起こされる重篤な肝疾患や神経変性疾患はNbr1との同時欠損では回復は見られなかった。p62やNbr1は、アルコール性肝炎やα1アンチトリプシン欠損症などの肝臓病、パーキンソン病や筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患、肝細胞癌や神経芽腫等の癌の病変部において確認されるユビキチン陽性の封入体の主要構成成分として同定されている。既にオートファジー不能肝や脳組織において、p62およびNbr1の過剰蓄積、それに引き続くp62とNbr1陽性の凝集体形成を確認していた。そこで、Nbr1の凝集体形成機構における役割を解析するため、作成した二重欠損マウス組織を抗ユビキチン抗体を用いて組織染色した結果、オートファジー不能マウス組織で観察されるユビキチン陽性凝集体がNbr1の同時欠損によっての巨大化することが観察された。この結果はNbr1が凝集体の大きさを制御していることを示唆している。これらの証拠は、オートファジーによるp62やNbr1の選択的分解機構の破綻がヒト病態組織で検出される封入体形成に関与することを示唆する。本研究では、オートファジー選択的基質Nbr1に着目し、Nbr1の分子レベルの解析から、オートファジー不能マウスおよびNbr1遺伝子改変マウスを用いた個体レベルの解析までを包括的に遂行し、1) Nbr1の選択的分解機構、2)Nbr1代謝の生理的意義、そして3) Nbr1代謝異常による細胞内変動を明らかにすることを目的に研究を遂行してきた。1) Nbr1の選択的分解機構の解明:オートファゴソーム膜上タンパク質LC3およびGABARAPとの結合により選択的に分解されることを既に明らかにしている。