hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非学習形質であるフクロウ類の鳴き声の地理的分布は遺伝構造を反映するか？

南西諸島のリュウキュウコノハズクはケラマ海裂を挟み、分岐から約150万年を経過した北系統と南系統に区分されることを明らかにした。沖縄島の西側の小島嶼はケラマ海裂の北側に位置するが、個体の形態と声紋は南系統の特徴を示し、遺伝的にも支持された。沖縄島では北系統が優占していたが、少数の南系統も生息し、異系統間のつがいが確認され、浸透交雑が起っていることがわかった。ケラマ海裂は地史的時間経過でリュウキュウコノハズクの祖先種を分断し、種レベルの変異を蓄積させ異所性の二系統を作った。その後、沖縄周辺の小島嶼には生態学的時間スケールで移入が生じ、二系統が二次的に同所棲になり、交雑が生じ始めたと推察された。琉球列島のケラマ海裂とトカラ構造海峡で挟まれた島々は中琉球と呼ばれる。更新世前期にはすでに隔離されていたと推察され、非飛翔性の陸生脊椎動物の約80%がこの地域の固有種である。鳥類にもヤンバルクイナなどの固有種が認められ、ケラマ海裂は鳥類の分布境界、蜂須賀線として注目された。しかし在来種に占める固有種の割合は約10%に過ぎず、固有の10亜種も産するが、南・北琉球とそれぞれ約10亜種が共通しており遺伝的交流が推察される。本年度も、2012年と同様にリュウキュウコノハズクOtus elegansの繁殖期である5-7月に野外調査によりサンプリングを行った。形態計測値、鳴き声、遺伝解析により移動分散の障壁としてのケラマ海裂の持つ意義について検討した。北琉球(中之島)、中琉球(奄美大島、徳之島、伊平屋島、伊是名島、沖縄島、座間味島、久米島)、南琉球(宮古島、石垣島、西表島、与那国島、波照間島)、および南大東島で、捕獲計測・採血、鳴き声の録音を行なった。外部形態、声紋、mtDNA-CO1領域の解析で北・中琉球は区分できなかった。南大東島個体群は完全に独立した。中琉球の大島嶼である奄美大島、徳之島、沖縄島と南琉球の島々の比較では、沖縄島に比較的大きな変異を認めたが、明瞭に区分された。北中と南琉球の遺伝距離は種レベルの違いといえる3%を示した。沖縄島の西側の伊平屋島、伊是名島、座間味島、久米島の個体群の形態と声紋は、中琉球に位置するにも関わらず南琉球の特徴を持っていた。これらの小島嶼の個体群は南琉球のハプロタイプを持っており、その矛盾は遺伝的に裏付けられた。ケラマ海裂は地史的時間スケールでリュウキュウコノハズクの祖先種を分断し、種レベルの変異を蓄積させた。中琉球の小島嶼には生態学的時間スケールで移入が生じていると推察された。学習により獲得される鳴禽類のさえずりは、方言とみなされる文化的形質である。さえずり方言の地理変異の研究は多いものの、さえずりは学習形質であるが故、方言の括りと遺伝構造が一致しない。一方、学習によらない亜鳴禽類、非スズメ目などの鳴き声は、生得的な形質のため遺伝構造との対応が示唆されてきた。しかし実証例がない。本研究ではフクロウ類の鳴き声と遺伝構造に対応関係があるのかどうか、個体群、および個体レベルで確認することを目的としている。リュウキュウコノハズクの繁殖期にあたる4月下旬ー7月に、慶良間諸島(座間味島、阿嘉島)、沖縄諸島(伊平屋島、伊是名島、沖縄島、久米島)、南大東島、奄美群島(徳之島)宮古列島(宮古島)において、リュウキュウコノハズクを合計57捕獲した。島嶼では、リュウキュウコノハズクの生息個体数が少なく、データセット数が少なくなると予想されたが、最少でも5個体を捕獲することができた。捕獲個体については、金属足輪を装着することで永続的な個体識別を可能にし、捕獲せずに個体識別を可能にするように金属足輪の上に反射テープ巻き付けた。捕獲個体については、外部形態計測値を計測し、採血を行った。標的個体は、捕獲前後に同種他個体の鳴き声をスピーカーから再生し(プレイバック法)、反応して近くに飛来した個体の足輪を確認した上で録音した。各個体群の外部形態の比較解析を行なった。鳴き声の解析には莫大な時間を要するが声紋分析は順調に進んでいる。採取した血液からDNA抽出、ミトコンドリア、核、マイクロサテライトの各DNA解析は、山階鳥類研究所において実施された。

マイクロサテライト遺伝子座は現在のところ13座位以上と数が多いため、同様に時間を要するが順調に解析されている。本年度の成果ではまだ結論を見いだすに至っていない。陸生の小型脊椎動物、特に両生類、爬虫類の分布は地理障壁にかなり厳格に規定される。鳥類の分布もある程度は地理障壁に制限されるが、飛翔が可能なため隔離の制約は緩い。しかし、近接した島々や隣接する地域など、移動が十分可能と推察される場所でも、起源を同一にする近縁種や亜種が分布する例が知られている。東南アジア・オセアニアに生息するモズヒタキ科には側所的分布が多く、キバラモズヒタキは世界で最も複雑な分布と地理変異を持つ種とされ70亜種に区分される。このような分布は生態的種分化、もしくは変異順序種分化によるものと推察される。それぞれの標徴形質は、生態的要因や配偶者選択により維持され、移入個体との交雑は適応度を下げ、隔離が強化されるプロセスが働くのだろう。私たちは、南西諸島に分布するリュウキュウコノハズクが、ケラマ海裂を挟み、外部形態形質と鳴き声に差異を蓄積し、分子系統解析により分岐から約150万年を経過していることを明らかにした(北系統と南系統と呼ぶ)。しかし矛盾する分布例が見つかった。沖縄島の西側の伊平屋島、伊是名島、久米島はケラマ海裂の北側に位置するにも関わらず、それぞれの個体群を形成する個体の形態と声紋は南系統の特徴を示し、遺伝的にも支持された。沖縄島では北系統が優占していたが、少数の南系統も生息し、異系統間のつがいが確認された。つまり、ケラマ海裂は地史的時間経過でリュウキュウコノハズクの祖先種を分断し、種レベルの変異を蓄積させ異所性の二系統を作った。その後、沖縄周辺の小島嶼には生態学的時間スケールで移入が生じ、二系統が二次的に同所棲になったと推察される。動物生態学予定したデータ収集がほぼ終了した。形態計測値の解析、鳴き声の解析も終了した。遺伝解析については種レベルの差異を検出するmtDNA-COI領域は完了したが、個体群間の移動の程度を確認するには至っていない。平成24年度はサンプリングを行なう年度と位置づけていたため、十分に目的を達成できている。想定外の結果となった地域がある。5-7月に野外調査を実施し、サンプルを補充することが必要である。野外調査は、沖縄島と座間味島で行なう。また解析遺伝子に多様性を持たせる必要がある。7月までのサンプルを含め、10月を目処に遺伝解析他の解析を終了させる。年度内に論文を執筆投稿する。平成25年度もリュウキュウコノハズクの繁殖期にあたる5月下旬ー7月に野外調査を行う。南西諸島全体におけるリュウキュウコノハズクの遺伝的構造を把握するために、前年に野外調査をした以外の島々で捕獲調査を行う。吐噶喇列島(中之島、悪石島)、奄美群島(奄美大島)、宮古列島(多良間島)、八重山列島(石垣島、西表島、波照間島、与那国島)が調査地である。捕獲後の処置については、前年度と同様である。小島嶼(上述下線の島)では、5-10個体の捕獲を目指し、そのほかでは20-30個体を捕獲する。この年度は合計約100個体分のデータセットが得られると予測している。春から夏の野外調査が終了後、形態、音声、遺伝解析を行なう。当該年度末に予定していた野外調査が中止になったため。野外調査の旅費と学会発表のために使用する予定である。申請者については、野外調査のための旅費が70%程度以上を占め、分担者については遺伝解析のための試薬の購入、機器のランニングコストに使用される。
電磁力を利用した走行連続柔軟媒体の非接触波動制御に関する研究

自動車用鋼板等に代表される冷延鋼板(連続柔軟媒体)は,多数のローラによって支持されて、圧延,メッキ,塗布,乾燥などの工程を経ながら搬送され,最終的にロール状に巻き取られて製品化される.このような連続柔軟媒体搬送システムにおいては,エネルギーロスの削減,塗布むら,傷発生などを極力抑えた製品歩留まりの向上,生産性の向上を目的として長大な連続ラインを構成するのが一般的である.その際,媒体と駆動用ローラ間における周辺空気の巻き込み現象にともなうトラクションの低下とそれに起因するスリップ・蛇行運動の発生,搬送方向の変換時における媒体とロールの接触,媒体とローラ間の摩擦など,解決すべき重要課題が数多く存在する.しかしながら,これらの課題は従来個々の生産現場において蓄積されてきた経験的技術によって処理されてきており,学理に基づいた系統的なアプローチによる取り組みは産業界からの強い要望にもかかわらず,ほとんどなされていないのが現状である.実際の製鉄所の鋼板連続熱処理工程を考えた場合,特にローラ支持間の長い乾燥工程などでは,ローラ部から発生する外乱が波動を生成し,これが媒体中を伝播することによって弾性振動と複雑に組み合わさる問題が考えられる.さらに,媒体そのものが高速走行していることからも,力学的に大変興味ある現象を発生することが予想される.このような,走行する連続柔軟媒体における波動・振動が同時に発生するシステムへの非接触制御系設計技術,それを支援する媒体挙動シミュレーション技術の確立は学術的にも工業的にも重要である.そこで,本研究期間では以下の問題の解決を行った.1.高速走行状態における連続媒体の力学的挙動を把握するために,鉄鋼プロセスを模擬した実験装置を製作し構築した理論モデルの妥当性を確認した.2.本システムに最適な制御系を設計し,計算機シミュレーションによって設計手法の妥当性を明らかにした.3.デジタル制御を実施し,理論と実験の比較によって構築した制御系の有効性を明らかにした.自動車用鋼板等に代表される冷延鋼板(連続柔軟媒体)は,多数のローラによって支持されて圧延,メッキ,塗布,乾燥などの工程を経ながら搬送され,最終的にロール状に巻き取られて製品化される.このような連続柔軟媒体搬送システムにおいては,エネルギーロスの削減,塗布むら,傷発生などを極力抑えた製品歩留まりの向上,生産性の向上を目的として長大な連続ラインを構成するのが一般的である.その際,媒体と駆動用ローラ間における周辺空気の巻き込み現象にともなうトラクションの低下とそれに起因するスリップ・蛇行運動の発生,搬送方向の変換時における媒体とロールの接触,媒体とローラ間の摩擦など,解決すべき重要課題が数多く存在する.しかしながら,これらの課題は従来個々の生産現場において蓄積されてきた経験的技術によって処理されてきており,学理に基づいた系統的なアプローチによる取り組みは産業界からの強い要望にもかかわらず,ほとんどなされていないのが現状である.そこで申請者は,特に鋼板表面品質の改善を目的として,電磁力技術の応用によるこれらの問題解決策を提案している.これまでに,電磁石や永久磁石を利用した柔軟磁性媒体の非接触支持・搬送技術の研究を行い,その実現性や問題点について報告をしている.現在は,鉄鋼プロセスにおける切り板の非接触支持の基礎研究を行い,その成果を発表している.しかし,実際の製鉄所の鋼板連続熱処理工程を考えた場合,特にローラ支持間の長い乾燥工程などでは,ローラ部から発生する外乱が波動を生成し,これが媒体中を伝播することによって弾性振動と複雑に組み合わさる問題が考えられる.さらに,媒体そのものが高速走行していることからも,力学的に大変興味ある現象を発生することが予想される.このような,走行する連続柔軟媒体における波動・振動が同時に発生するシステムヘの制御系設計技術,それを支援する媒体挙動シミュレーション技術の確立が急務である.本年度は,(1)走行する連続柔軟媒体に関する理論モデルを構築し,波動・振動発生メカニズムを理論的に解明した.(2)高速走行状態における連続媒体の力学的挙動を把握するために,鉄鋼プロセスを模擬した実験装置を製作し,上記(1)で構築した理論モデルの妥当性を確認した.自動車用鋼板等に代表される冷延鋼板(連続柔軟媒体)は,多数のローラによって支持されて、圧延,メッキ,塗布,乾燥などの工程を経ながら搬送され,最終的にロール状に巻き取られて製品化される.このような連続柔軟媒体搬送システムにおいては,エネルギーロスの削減,塗布むら,傷発生などを極力抑えた製品歩留まりの向上,生産性の向上を目的として長大な連続ラインを構成するのが一般的である.その際,媒体と駆動用ローラ間における周辺空気の巻き込み現象にともなうトラクションの低下とそれに起因するスリップ・蛇行運動の発生,搬送方向の変換時における媒体とロールの接触,媒体とローラ間の摩擦など,解決すべき重要課題が数多く存在する.しかしながら,これらの課題は従来個々の生産現場において蓄積されてきた経験的技術によって処理されてきており,学理に基づいた系統的なアプローチによる取り組みは産業界からの強い要望にもかかわらず,ほとんどなされていないのが現状である.実際の製鉄所の鋼板連続熱処理工程を考えた場合,特にローラ支持間の長い乾燥工程などでは,ローラ部から発生する外乱が波動を生成し,これが媒体中を伝播することによって弾性振動と複雑に組み合わさる問題が考えられる.さらに,媒体そのものが高速走行していることからも,力学的に大変興味ある現象を発生することが予想される.このような,走行する連続柔軟媒体における波動・振動が同時に発生するシステムへの非接触制御系設計技術,それを支援する媒体挙動シミュレーション技術の確立は学術的にも工業的にも重要である.

そこで,本研究期間では以下の問題の解決を行った.1.高速走行状態における連続媒体の力学的挙動を把握するために,鉄鋼プロセスを模擬した実験装置を製作し構築した理論モデルの妥当性を確認した.2.本システムに最適な制御系を設計し,計算機シミュレーションによって設計手法の妥当性を明らかにした.3.デジタル制御を実施し,理論と実験の比較によって構築した制御系の有効性を明らかにした.
共役系高分子のナノレベル配列制御システムの構築

本研究は共役系高分子をナノレベルで配列制御できるシステムの構築を目指す。これまで様々ま配列手法が報告されているが、材料への応用に重要とされる高分子の主鎖間の距離をナノレベルで制御できたコンセプトは皆無である。そこで申請者は共役系高分子のナノレベル配列制御の新たな手法として共役系高分子と複数の相互作用部位を有する架橋分子(Aligner)を用いることを提案した。実際にAlinerが共役系高分子を認識部位間隔に配列制御することに功した。そして次なる展開としてジアミン部位を有するポリフェニレンエチニレン(CP1)の三次元配列制御を目的とし、側鎖に亜鉛ポルフィリンを有する共役系高分子(poly-Aligner)を設計し、ホモカップリングにより合成を行いGPCにより分離精製を行った。poly-AlignerとCP1の集合体に関する知見を得るためにAFM、SEM、TEM測定を行った結果、厚みのある規則的な周期構造を有するモルフォロジーが多数観察された。またより定量的な評価を行うために認識部位を一つ有するdimerと二つ有するtrimerを用いて架橋による効果を検討したところ、dimer・CP1複合体はアモルファスであったが、trimer・CP1複合体は周期構造を有するシートが観測された。この結果はpoly-AlignerがCP1を規則的に配列できることを支持するものである。以上の結果より、poly-AlignerはCP1を三次元配列制御できることが示された。さらに本コンセプトを拡張し、配列と次元を制御できるシステムの構築へと展開することを試みた。Poly-Alignerはアミノ基を二つ有する低分子ゲストと錯化すると一次元集合体を、自己集合すると二次元集合体を、そして前述のように高分子ゲストと錯化すると三次元集合体を形成すると期待され、AFMおよびTEM測定によりモルフォロジー観察を行ったところ、低分子ゲストでは単分子レベルのファイバーが、poly-Aligner自身がゲストの場合は結晶性の高い二次元シートが、そして高分子ゲストの場合は厚みのある三次元集合体がそれぞれ確認された。これまで高分子を規則的に配列させる研究は単分子膜を形成させて表面圧をかける方法や共役系高分子に液晶系の側鎖を導入する方法が報告されている。しかしながら材料への応用に重要とされる高分子の主鎖間の距離をナノレベルで制御できたコンセプトは皆無である。そこで申請者は共役系高分子のナノレベル配列制御の新たなコンセプトとして共役系高分子と複数の相互作用部位を有する架橋分子(Aligner)を用いることを提案した。実際にこのコンセプトにより共役系高分子を認識部位間隔に配列制御することに成功した。そして次なる展開としてジアミン部位を有するポリフェニレンエチニレン(CP1)の三次元配列制御を目的とし、側鎖に亜鉛ポルフィリンを有するporphyrin polymerを設計した。Porphyrin polymerの合成をホモカップリングにて行い、GPC(JAIGEL 2.5H + JAIGEL 3H)により20量体以上の成分を分取した。吸収スペクトル測定を行ったところ、亜鉛ポルフィリンとアミンとの軸配位に由来する長波長シフトが観測された。蛍光スペクトル測定では、CP1の周囲にポルフィリンが存在することを示唆する蛍光の消光が観測された。またAFM測定を行ったところ、porphyrin polymerとCP1を混合させた時に厚みのある会合体が観測された。TEM測定では、コントラストの強いシート積層状会合体が観測され、単結晶材料に見られる電子回折パターンおよび数nm間隔のラメラが観測された。さらに厚みのある会合体について暗視野像を観測したところ、全体が明るく光ったため、このモルフォロジーは規則的な三次元集合体であることが示唆された。以上の実験結果により今回設計したporphyrin polymerはCP1を三次元的に配列制御することができると考えられ、申請者が提案した配列制御システムのコンセプトを拡張することに成功した。実際にAlignerが共役系高分子を認識部位間隔に配列制御することに成功した。さらに、本コンセプトを拡張し、配列と次元を制御できるシステムの構築へと展開することを試みた。

Poly-Alignerはアミノ基を二つ有する低分子ゲストと錯化すると一次元集合体を、自己集合すると二次元集合体を、そして前述のように高分子ゲストと錯化すると三次元集合体を形成すると期待され、AFMおよびTEM測定によりモルフォロジー観察を行ったところ、低分子ゲストでは単分子レベルのファイバーが、poly-Aligner自身がゲストの場合は結晶性の高い二次元シートが、そして高分子ゲストの場合は厚みのある三次元集合体がそれぞれ確認された。本研究は共役系高分子をナノレベルで配列制御できるシステムの構築を目指す。これまで様々ま配列手法が報告されているが、材料への応用に重要とされる高分子の主鎖間の距離をナノレベルで制御できたコンセプトは皆無である。そこで申請者は共役系高分子のナノレベル配列制御の新たな手法として共役系高分子と複数の相互作用部位を有する架橋分子(Aligner)を用いることを提案した。実際にAlinerが共役系高分子を認識部位間隔に配列制御することに功した。そして次なる展開としてジアミン部位を有するポリフェニレンエチニレン(CP1)の三次元配列制御を目的とし、側鎖に亜鉛ポルフィリンを有する共役系高分子(poly-Aligner)を設計し、ホモカップリングにより合成を行いGPCにより分離精製を行った。poly-AlignerとCP1の集合体に関する知見を得るためにAFM、SEM、TEM測定を行った結果、厚みのある規則的な周期構造を有するモルフォロジーが多数観察された。またより定量的な評価を行うために認識部位を一つ有するdimerと二つ有するtrimerを用いて架橋による効果を検討したところ、dimer・CP1複合体はアモルファスであったが、trimer・CP1複合体は周期構造を有するシートが観測された。この結果はpoly-AlignerがCP1を規則的に配列できることを支持するものである。以上の結果より、poly-AlignerはCP1を三次元配列制御できることが示された。さらに本コンセプトを拡張し、配列と次元を制御できるシステムの構築へと展開することを試みた。
アクトミオシン再構成系を用いた麻酔薬による筋収縮抑制の分子機構解明に関する研究

まず、筋原繊維を用いた実験において、局所麻酔薬リドカインおよびテトラカインが可逆的および濃度依存的に張力発生を制御することを示した。そして、アクトミオシン系モーター蛋白質の運動再構成モデルを用いた単一アクチンフィラメイトの滑走速度をガラス基盤上で蛍光顕微鏡下に観察し、滑走速度に及ぼす局所麻酔薬の作用をpH6.5,7.0,7.8および8.5において測定した。リドカインおよびテトラカインも共に単一アクチンフィラメントの滑走速度を濃度依存的に抑制した。pH7.0におけるED_<50>値はリドカインおよびテトラカインでそれぞれ18.6mMおよび2.8mMであった。pHを変えて滑走速度に及ぼす影響を調べた解析結果から、局所麻酔薬の荷電型と非荷電型では非荷電型が抑制作用を示すことが明らかになった。これはさらに、永久荷電型リドカイン誘導体QX314がアクトミオシンの滑走速度に全く影響を与えなかったことにより確かめられた。また、非荷電型局所麻酔薬の滑走速度抑制作用は酸性条件下で増大することが明らかになった。さらに、ミオシンATPase(actin-activated ATPase)活性に対する局所麻酔薬リドカインおよびテトラカインの影響をマラカイトグリーン無機リン酸定量法の改良法を用いて行った。ATP加水分解反応に対しては、運動機能に対する制御作用に比べて、局所麻酔薬は著明な効果を示さなかった。以上の結果から、局所麻酔薬はアクトミオシン蛋白分子間の静電相互作用にほとんど影響せず、疎水性部位に作用して化学-力学エネルギー変換過程の脱共役を惹起して運動機能を抑制することが示唆された。アクトミオシン系モーター蛋白質の運動再構成モデルを用いた単一アクチンフィラメントの滑走速度に及ぼす局所麻酔薬の作用をpH7.0において測定した。そのED_<50>値はリドカインおよびテトラカインでそれぞれ18.6mMおよび2.8mMであった。この単一アクチンフィラメントの滑走速度に関する研究については、平成8年度においてもpHを変えた実験などを行って詳細な解析を行う予定である。リドカインは0-25mMの範囲で濃度依存的にミオシンATPase活性を抑制した。一方、テトラカインは0-2.5mMの濃度範囲内でミオシンATPase活性に対して濃度依存的な促進効果を示し、リドカインとは異なる作用を示した。まず、筋原繊維を用いた実験において、局所麻酔薬リドカインおよびテトラカインが可逆的および濃度依存的に張力発生を抑制することを示した。そして、アクトミオシン系モーター蛋白質の運動再構成モデルを用いた単一アクチンフィラメントの滑走速度をガラス基盤上で蛍光顕微鏡下に観察し、滑走速度に及ぼす局所麻酔薬の作用をpH6.5,7.0,7.8および8.5において測定した。

ATP加水分解反応に対しては、運動機能に対する抑制作用に比べて、局所麻酔薬は著名な効果を示さなかった。以上の結果から、局所麻酔薬はアクトミオシン蛋白分子間の静電相互作用にほとんど影響せず、疎水性部位に作用して化学-力学エネルギー変換過程の脱共役を惹起して運動機能を抑制することが示唆された。
関節リウマチ患者におけるサルコペニアのリスク要因の検討と生化学評価法の確立

サルコペニアは、加齢のみならず、関節リウマチなどの炎症性疾患が原因で生じ、予後に多大なる影響を及ぼすことから対策が急務とされている。本研究の目的は、関節リウマチ患者におけるサルコペニアのリスク要因を明らかにし、サルコペニアがフレイルやロコモティブシンドローム、カヘキシアなどに及ぼす影響を検証することと関節リウマチ患者におけるサルコペニアの生化学評価法を確立することである。
情動的摂食の自己制御に関する研究

お腹がすいたときだけではなく、イライラした時などストレスを解消するために食べることがある。ストレスを解消するために食べることは、心の安定を取りもどすために、時には良いことかもしれない。しかしストレス社会の現代では、ストレス解消のための食行動がコントロールできなくなり、健康を害することもある。本研究では、自己効力感、動機付け、ハーディネス、幼少時からの規則的な食生活が食行動のコントロールに有効な要因であることを検討した。オーストリアと日本の大学生の食行動、ボディ・イメージ・ストレス、BMIなどについて、比較検討し、次のような結果および考察が得られた。1.BMI:平均BMI値は、オーストリアの男子学生22.5、女子学生20.8、日本の男子学生21.0、女子大学生20.5であった。2.ボディ・イメージ:日本の学生は、オーストリアの学生に比較して、ネガティブなボディ・イメージを持っていた。また女子学生は男子学生に比較して、ネガティブなボディ・イメージを持っていた。日本の男子学生は、オーストリアの男子学生に比較して、大きくなりたいという欲求が強かった。日本とオーストリアの女子大学生のBMI値には有意な差がみられなかったが、日本の女子大学生はネガティブなボディ・イメージを強く持っていた。3.食行動:抑制的摂食、情動的摂食、外発的摂食について検討したところ、日本の学生は、オーストリアの学生に比較して、抑制的摂食、外発的摂食の程度が強かった。しかし情動的摂食については、文化差はみられなかった。そして男子大学生に比較して、女子大学生は、抑制的摂食、情動的摂食、外発的摂食のすべてにおいてその程度が強かった。4.ストレス:ストレスをもっとも強く感じているのは、日本の女子大学生であった。つまり日本の女子大学生のストレス対処方略について検討する必要性が最も高いと考えられる。日本の女子大学生が、高頻度に選択するストレス対処方略のひとつとして、食べること、つまり情動的摂食がある。本研究の結果から、日本の女子大学生の食行動に注目することが情動的摂食の自己制御に関する研究を進める上で、ひとつの有効な方向性であることがみいだされた。5.食行動の質的な側面にアプローチするために、ストレスを癒す働きのある甘味に対する態度について比較検討した。その結果、日本の女子大学生は、甘味に対するメリット感、接近動因が強かった。情動的摂食を制御する要因として、ハーディネスについて検討するため、質問紙を作成し、その信頼性と妥当性について確認した。次に女性を対象としてハーディネスと情動的摂食との関連について検討したところ、ハーディネスは、情動的摂食を制御する性格特性として位置付けることができることが示唆された。また日本とオーストリアで行われているI型糖尿病の子どものためのキャンプの特徴について、比較検討した。その結果、食事量の調整とインシュリン注射について、基本的な指導方法に相違がみられた。日本では、常に食事量を制御しながら、血糖値を調節する視点が、重要視されているが、欧米では、インシュリン注射の量を調節することによって、血糖値を調節する視点が重視されていた。つまり欧米では、食欲を尊重する方法で、指導が行われている。一方、情動的摂食の実態について聞き取り調査をしたところ、欧米の子どもでは、情動的摂取が生じやすく過剰摂取を制御することに難しさを感じているが、日本では、情動的摂食よりも摂食しないことによる低血糖を深刻にとらえていることが明らかとなった。つまり、食事量を日常的に制御する食生活を身に付けることによって、情動的な摂食も一定範囲内に抑えることができる可能性が示唆された。先行研究では、摂食抑制は、かえって情動的摂食による過食を生じさせる要因となるとの先行研究があるが、必ずしもそうではないことが示唆された。食生活に対するコントロール感などを身に付けることによりハーディネスが高まり、情動的摂食をうまく調節できるのではないかと考えられる。
受精時の花粉管ライブイメージングを実現する有機蛍光プローブ群の創製

(1)任意の一本の花粉管を選択的に染色する光ケージド赤色発光色素の開発前年度の研究において,花粉管の染色効率が低いため,十分な蛍光強度が得られないことが問題として見つかった。これを解決するためには,光ケージド蛍光色素の細胞膜透過性を高める分子設計が重要である。そこで本年度は,動物細胞でよく知られている細胞膜透過性ペプチド(CPP)が連結した蛍光色素を用い,花粉管染色能のCPP配列依存性について検討した。CPPを含む培地中で花粉管を発芽させ,4時間培養したあと,蛍光顕微鏡で観察した。その結果,リシンを多く含むCPPは花粉管内部からの強い蛍光シグナルが観察されたのに対し,アルギニンを多く含むCPPの場合は,細胞壁に多く補足されていることがわかった。現在,高い花粉管染色能をもつCPP配列の最適化を行っている。(2)植物深部の細胞壁染色を指向した近赤外蛍光性を有する細胞壁染色剤の開発近赤外蛍光色素PREX 710は712 nmと740 nmにそれぞれ極大吸収波長と極大蛍光波長を有するため,クロロフィル由来の自家蛍光に影響されずに画像を取得することができる。また,ほぼすべての蛍光タンパク質と併用できるため,最大6色までの多重染色ができることを明らかにした。前年度までに,PREX 710にアルギニンのオリゴマー(R8)を連結したものが細胞壁マーカーとして機能することを見出している。細胞壁マーカーとしての有用性を評価するため,花粉管伸長時における動態をライブで追跡した。その結果,花粉管伸長速度が早いときは細胞壁由来の蛍光強度が低下し,伸長が休止しているときは蛍光強度が増大するという反対の相関が得られた。これは,花粉管伸長におけるペクチンの量やカルシウム濃度に依存しているものと考えられ,詳細な解析を進めている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。(1)任意の一本の花粉管を選択的に染色する光ケージド赤色発光色素の開発光ケージド蛍光分子は,光照射した部位のみを蛍光染色できる色素である。赤色発光を示す蛍光分子PFに対して光分解性の官能基を連結させることにより,光ケージド分子NB-PF1を合成し,花粉管染色を試みた。培地にNB-PF1のアセトキシメチル(AM)エステル体を添加し,任意の花粉管に405 nmのレーザー光を照射したが,有意な蛍光シグナル増大は認められなかった。一方,花粉管を臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム(CTAB)で処理した場合は,同様の操作により蛍光染色することができたことから,NB-PF1の細胞膜透過性が低いことが原因として挙げられる。この課題は,植物細胞に対する細胞膜透過ペプチドを探索することにより解決できるものと考えられ,共同研究を実施している段階である。(2)植物深部の細胞壁染色を指向した近赤外蛍光性を有する細胞壁染色剤の開発近赤外蛍光色素PREX 710は712 nmと740 nmにそれぞれ極大吸収波長と極大蛍光波長を有する。したがって,クロロフィルが励起されない波長で,PREX 710のみを選択的に励起できることが励起できることがわかった。次にPREX 710に対してアルギニンのオリゴマー(R8)を連結したものを合成し,ヒメツリガネゴケの原糸体の染色を行った。720/13および785/62の励起,蛍光フィルターを用いたところ,細胞壁のみから蛍光シグナルが観測された。一方,640/30と690/50のフィルターセットを用いた場合ではクロロフィル由来の自家蛍光のみを検出することができた。当初計画していた赤色発光を示す光ケージド化合物の合成に成功し,溶液中では目的の機能を示すことを確認できたが,植物が生きたままの状態で花粉管を染色することはできなかった。動物細胞を用いた場合では光ケージド化合物として機能し,単一細胞の選択的ラベル化が達成されたことから,課題は明白であり,植物細胞に対する細胞膜透過性を高めるような分子設計が必要である。また,もう1つの課題である細胞壁染色に関しては,ほぼ当初の予定通りに進行し,ヒメツリガネゴケの原糸体およびシロイヌナズナの根を用いてその有用性を評価することができた。本研究成果については論文執筆段階にある。

また,ほぼすべての蛍光タンパク質と併用できるため,最大6色までの多重染色ができることを明らかにした。前年度までに,PREX 710にアルギニンのオリゴマー(R8)を連結したものが細胞壁マーカーとして機能することを見出している。細胞壁マーカーとしての有用性を評価するため,花粉管伸長時における動態をライブで追跡した。その結果,花粉管伸長速度が早いときは細胞壁由来の蛍光強度が低下し,伸長が休止しているときは蛍光強度が増大するという反対の相関が得られた。これは,花粉管伸長におけるペクチンの量やカルシウム濃度に依存しているものと考えられ,詳細な解析を進めている。細胞壁染色では,前年度に引き続きPREX 710を用いたイメージングを実施する。まず,二光子顕微鏡を用いて,植物深部の細胞壁イメージングを行い,限界到達深度を決定する。近赤外発光に加え,PREX 710の大きな特徴の一つが高い光安定性である。二光子イメージングと合わせることにより,高い時空間分解能による細胞壁動態の長時間イメージングを実現していく。一方,本手法による細胞壁染色は,細胞壁とアルギニンとの静電相互作用を利用したものであり,任意の細胞のみを特異的に可視化することができない。また,色素の解離によるシグナル喪失も予想される。そこで,光を用いて共有結合可能な新たな細胞壁染色剤を開発する。この場合,光を当てた部分の細胞のみで化学反応が進行し,色素と細胞壁の間で化学結合が形成される。この新たなシステムの開発と実証を進め,植物イメージング研究の基盤技術としての確立を目指す。また,花粉管染色に関しては,現在,植物細胞の細胞膜透過ペプチドを探索中である。ペプチド配列によって,細胞膜透過性の程度や細胞選択性が制御できれば,植物研究における強力なツールとなる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
HM136写本の成立から印刷までの過程

今回の調査では1複数の写本および印刷本における言語的特徴の比較2印刷原稿見積もり用マークの比較を行った。1に関しては、原本にはなかったいわゆる「キャクストン英語」が印刷の過程で洗練され、ある程度一貫性を持った形で印刷本に移行している事実が裏付けられた。また、編集者による付け加えや削除も極めて規則的に行われている部分があることが明らかになった。2はHM136写本とVat.lat.11441写本における印刷見積もり用マークを比較するという、これまで行われたことのなかった比較である。casting-off markのデジタル画像を用いて、両者のパターンの相違と相似を比較検討した。2014年は予定していた海外出張を行うことができなかったため、casting-off markのバチカン図書館での採取・比較、またJohn Lecheという書き込みを特定するために予定していたチェスター市のアーカイヴ課での来歴調査が実現できなかった。この遅れを取り戻すために、2015年度中にイタリアとイギリスのチェスターへの出張を敢行する予定である。一方で、打ち合わせを予定していたDaniel Wakelin博士が来日してくれたため、テキスト派生についての専門的な意見交換は行うことができ、貴重な情報提供も実現した。それによればこの分野の第一人者でもあるLotte Hellinga博士が関心を寄せており、こちらからの更なる情報提供を期待しているとのことである。テキスト派生に関する研究においては、研究計画に記載したDouce323写本との直接の比較ではなく、手元にあるBL Additional 10099のマイクロフィルムとの間でスペリングの対照比較を行うことができた。それによれば、キャクストン版のスペリングはHM136に比べて近代化されており、BL Additional 10099はキャクストン版よりも近代化されている、つまりHM 136<キャクストン版<BL Add 10099という関係が成り立つ。BL Add 10099がキャクストン版の原本と無関係であることは既に研究者が研究成果として発表してきたものであるが、スペリングの見地からもBL Add 10099がHM 136とは遠い関係にあると証明できたことは、傍証としては有益である。(第30回日本中世英語英文学会シンポジウムにて口頭発表済)なお、研究計画時にはなかった新しい情報として、和歌山大学の小栗栖氏が電子校訂に有益なツールを開発していることが分かった。今後のテキスト校訂でこのツールを使用する準備を進めている。本研究「HM136写本の成立から印刷までの過程」を構築するに当たっては、3つのアプローチから成る研究計画を提出した(A.テキスト派生に関する研究、B.castinf-off markの比較研究、C.来歴に関する調査)。2015年にはAに関連する論文を発表し、Bの比較をするにあたりもっとも重要な資料が収集できた。ただしCについては筆者の当初の予想とは異なる見解を示した論文が発表されたこともあり、今のところLeche familyのアーカイヴに行って得られる情報が本研究に役立つかどうかは限定的だと判断している。ゆえにCの計画は軌道修正中である。【A.の実績】2014年のシンポジウムで発表した調査研究に基づき、これまで重要視されていたBL Add 10099写本を仔細に検討、これがCaxtonの印刷本を手稿として書写されているという事実を改めて示した。これはAdd 10099写本の成立が、HM136写本の成立との対照をなすものとして重要だからである。論文では特に接尾辞や表現の「近代化」に着目し、Add 10099写本が写本から派生したとは考えられないことを示した。自己点検をしてみると、過去2年間で残すことができた発表数・論文数があまり多くないことが惜しまれる。また、上述したように、計画のCにあたるLechefamilyの歴史研究がHM136写本の来歴とは関わらないかもしれないという知見を得たために、この部分については今回の調査で結論が出せない可能性も出てきた。以上の反省点はあるものの、2016年に入ってからバチカン図書館での情報収集が非常にうまく行ったため、HM136写本とVat.lat.11441写本上のcasting-off markを比較検討する目処は立ってきている。Vat.lat.11441写本とはラテン語の_Nova Rhetorica_の写本であり、Caxtonのcasting-off markが施されていることがHM136写本以外で知られる唯一の写本だ。このたびそのcasting-of markをデジタル画像で採取することができた。これとHM136写本の画像の比較により、Caxton工房での印刷形態の変遷というマクロな視点から、HM136写本のcasting-off markを研究することが可能になったと考えている。また、関連してHuntington図書館で新たな知見を得た。2015年夏、研究代表者がCaliforniaのHuntington図書館での調査中に、HM136写本のページ割付方法は、ドイツの印刷業者が採用した方法と酷似しているとの仮説がドイツの研究者Randall Herz氏よりもたらされた。これはCaxton印刷工房でHM136写本どのように印刷に使われたのかを示すひとつの有力な仮説である。ちなみにVat.lat.11441写本はHM136写本のやり方を踏襲せずにページの割り付けを行っていることから、Caxton工房では印刷年代や対象言語によって複数のページ割付方法を試みたと推論できそうだ。本研究を行うためにもっとも重要と位置付けていたcasting-off marksの採取をバチカン図書館で行うことができた。

これにより、Vat. lat. 11441とハンティントン図書館のHM136写本の印刷工程の比較をする素地は整った。ところが、見かけ上の共通項は研究者の予測以上に少ないもので、計画していたように、精細な画像での見かけ上の比較により両者の印刷工程に何らかの共通項をあぶり出せるであろうという予想は裏切られる結果となった。しかし両者の校訂順序を細かく比較した結果、見かけ上の違いとは裏腹に、ページ割付の順番は各丁合ごとに行われていたに違いないこと、1ページと16ページ、2ページと15ページ(Vat. lat. 11441の場合は1ページと20ページ、2ページと19ページ・・・)を同時に割り付けるという方法も両者で共通して採用されていたに違いないことは確認できた。ただし、丁合ごとの区切り目もその前のcasting-offの具合を見ながら微妙に調整していたかどうかは未だ不明である。また、両面印刷のために乾かす時間が必要であったため、版組をする順序が前後した可能性があるかどうかもはっきりはしなかった。大量の紙を必要とする印刷において、ページ割付が極めて重要であったという事実はこの調査を通じて得られた最大の収穫である。総じていえば、casting-off markはその写本が印刷本の底本として使われたものである事実を如実に示す証拠として重要ではあるものの、そのものを精査しても出てくる証拠は限定的なものであった。研究者はHM136写本の成立から印刷までの過程をVat. lat. 11441を通じて論じることは極めて厳しいという結論に達したため、今後はHM136写本単独の研究に立ち返り、年代記の集大成をキャクストンが成し遂げたという見地から多角的に論じていく。上記に示したように、casting-off markを中心とした本研究の方向性は大きく転換しなければならないことが明らかとなった。ただこのプロセスを経なければ次に進むべき方向は得られなかったことから、この経験は必要な貴重な糧として引き続き本研究に活かしていきたい。ただしHM136写本が果たして本当にキャクストン版の底本であったかという問題については、研究者が前回の課題で既に概略部分は論文の形にしてあるから、成立から印刷までの過程を論じるにあたって大きな問題はない。論文を書くために必要な資料は既に整っているから、後は確認のために現物に一度当たれば充分である。キャクストン版が印刷された時に使用された二つの印刷用原稿、ハンティントン図書館のHM136写本と、バチカン図書館のVat. lat. 11441写本のcasting-off markを世界で初めて比較することができた。バチカン図書館から入手した解像度の高いデジタル写真により、両者のマークの明らかな違いが浮き彫りになるとともに、マークの付けなおしなどの手法面においては、両者で共通する手法が用いられた可能性を指摘することができた。1478年から1480年はキャクストンの印刷工房で印刷機の新規導入等があった時期であり、活字や組み版の行ぞろえも刷新されたが、手稿でも変更点が確認できた。
高圧凍結技法による胃酸分泌関連蛋白と細胞膜動態に関する超微形態研究

ラットに摂食刺激を加えた胃酸分泌期と、胃酸分泌抑制剤を投与した胃酸分泌休止期における胃底腺壁細胞の細胞膜動態について、高圧凍結技法により作製した電子顕微鏡観察試料をもとに超微形態学的解析を加えた。特に、細胞膜動態に関わる膜融合蛋白やKCNQ1等のイオンチャネルの胃酸分泌期と休止期における細胞内局在について、電顕レベルに及ぶ詳細な免疫組織化学的解析を行ない、当該研究分野における形態学的基盤となる新たな知見を得た。さらに、胃底腺壁細胞の細胞膜動態に関わるTRIM50の細胞内局在変化を探索し、TRIM50KOマウスにおける機能形態解析について、電子顕微鏡レベルの詳細な解析を行い、論文報告した。胃酸分泌に与る胃底腺壁細胞が生理的条件の変化に応じて示す著明な膜動態と形態変化については近年の研究進展によって新たな重要課題が生まれ、その解明は消化機構の研究基盤提出はもとより、臨床における胃粘膜傷害の予防や治療に繋がるものと期待されている。本研究は独自に開発したラット単離胃粘膜モデルの生理的条件を振り分け、微細形態と生体物質の保持に卓越した能力を示す高圧凍結技法による試料作製を遂行し、胃底腺壁細胞の膜動態やイオンチャネルの細胞内局在を可視化する形態学的アプローチにより追求するもので、プロトンポンプ阻害剤に代わる新たな胃酸分泌抑制薬の創薬ターゲットの探索も視野に入れた研究を目的とする。平成24年度は、ラットに摂食刺激を加えた胃酸分泌期と、胃酸分泌抑制剤を投与した胃酸分泌休止期における胃底腺壁細胞の細胞膜動態について、高圧凍結技法により作製した電子顕微鏡観察試料をもとに超微形態学的解析を前年度に引き続いて推進した。さらに胃底腺壁細胞の細胞膜動態に関わるTRIM50の細胞内局在変化を探索し、TRIM50ノックアウトマウスにおける機能形態解析について、電子顕微鏡レベルの詳細な解析を行い、論文報告した。胃酸分泌に与る胃底腺壁細胞が生理的条件の変化に応じて示す著明な膜動態と形態変化については、近年の研究進展によって新たな重要課題が生まれ、その解明は消化機構の研究基盤提出はもとより、臨床における胃粘膜傷害の予防や治療に繋がるものと期待されている。本研究は独自に開発したラット単離胃粘膜モデルの生理的条件を振り分け、微細形態と生体物質の保持に卓越した能力を示す高圧凍結技法による試料作製を遂行し、胃底腺壁細胞の膜動態やイオンチャネルの細胞内局在を可視化する形態学的アプローチにより追求するもので、プロトンポンプ阻害剤に代わる新たな胃酸分泌抑制薬の創薬ターゲットの探索も視野に入れた研究を目的として遂行された。本研究期間においては、ラットに摂食刺激を加えた「胃酸分泌期」と、胃酸分泌抑制剤を投与した「胃酸分泌休止期」における胃底腺壁細胞の細胞膜動態について、高圧凍結技法により作製した電子顕微鏡観察試料をもとに超微形態学的解析を加えた。さらに細胞膜動態に関わるsynt axin3, VAMP8, Hip1r等の細胞内局在の変化を探索し、本研究の基盤となる形態学的所見を収集するとともに、胃酸分泌への関与が示唆されるKCNQ1などのイオンチャネルの胃酸分泌期と休止期における細胞内局在について、免疫組織化学的手法による電子顕微鏡レベルの詳細な解析を行った。さらに、胃底腺壁細胞の細胞膜動態に関わるオートファジーの関与を探索し、胃小窩壁細胞特有の機能形態解析結果について、学会シンポジウムにて報告した。平成23年度は、ラットに摂食刺激を加えた胃酸分泌期と、胃酸分泌抑制剤を投与した胃酸分泌休止期における胃底腺壁細胞の細胞膜動態について、高圧凍結技法により作製した電子顕微鏡観察試料をもとに超微形態学的解析を加えた。さらに細胞膜動態に関わるsyntaxin3, VAMP8, Hip1r等の細胞内局在の変化を探索し、本研究の基盤となる形態学的所見を収集するとともに、胃酸分泌への関与が示唆されるKCNQ1などのイオンチャネルの胃酸分泌期と休止期における細胞内局在について、免疫組織化学的手法による電子顕微鏡レベルの詳細な解析を行った。

生体ラット胃底腺壁細胞の胃酸分泌期と休止期における細胞膜動態と胃酸分泌関連蛋白の局在解析を進め、特に細胞膜動態に関わるTRIM50の機能解析を果たし、平成24年度当初の目的は概ね達成された。生体ラット胃底腺壁細胞の胃酸分泌期と休止期における細胞膜動態と胃酸分泌関連蛋白の局在解析を進め、本研究の基盤となる形態学的所見の収集にあたる平成23年度当初の目的は概ね達成された。この2年間で収集された所見をもとに、ラット単離胃粘膜モデルの生理的条件を振り分け、胃底腺壁細胞が摂食後の胃酸分泌刺激状態から次の食餌に備えて休止状態に至る全ての生理的条件下における細胞膜動態と胃酸分泌関連蛋白の細胞内局在解析を進める。平成23年に収集された所見をもとに、ラット単離胃粘膜モデルの生理的条件を振り分け、胃底腺壁細胞が摂食後の胃酸分泌刺激状態から次の食餌に備えて休止状態に至る全ての生理的条件下における細胞膜動態と胃酸分泌関連蛋白の細胞内局在解析を進める。高圧凍結実験の遂行に必要な液体窒素や、免疫組織化学的解析で使用する抗体をはじめとする消耗品・実験試薬の購入、ならびに研究打合せと学会発表に要する旅費などに使用する計画である。
末梢血白血球で発現するⅦ型コラーゲンの意義はなにか？

VII型コラーゲンを発現する末梢血中の細胞を特定するために末梢血単核細胞を培養したところ、紡錘形の細胞が接着して増殖していた。これらの細胞から得た核酸を用いてRT-PCRを行ったところ、VII型コラーゲンの発現とともにCD45の発現がわずかにみられ、CD105は強い発現がみられた。免疫染色を行い蛍光顕微鏡で観察したところ、紡錘形の細胞ではVII型コラーゲンとCD105の発現が同時にみられた。これらの細胞はCD29+、CD45-、CD34-であり、ヒト間葉系幹細胞の発現パタンと同一であった。従って、末梢血単核細胞中には間葉系幹細胞が存在し、培養系で生着し、VII型コラーゲンを発現していることが示された。VII型コラーゲンは表皮と真皮を結合するアンカリング・フィブリルを構成するタンパク質である。このタンパク質をコードする遺伝子COL7A1遺伝子に異常が生じると、栄養障害型先天性表皮水疱症(DEB)が発症する。従来、皮膚において表皮と真皮の結合に重要なVII型コラーゲンは、表皮角化細胞あるいは真皮線維芽細胞で発現するものとされていたが、我々は最近、末梢血単核球でも発現していることを見出した。末梢血単核球はリンパ球、単球などから構成されているが、ごくわずかであるが骨髄由来の間葉系幹細胞が含まれることが分かっている。ヒトの骨髄由来間葉系幹細胞がVII型コラーゲンを発現していることを我々はすでに確認している。したがって、末梢血単核球のなかで、VII型コラーゲンを発現している細胞は、間葉系幹細胞である可能性が高い。接着分子であるVII型コラーゲンが末梢血中の循環細胞で発現しているとすると、その機能はこれまで知られていない、未知のものである可能性が高い。本研究は、末梢血のどの細胞がVII型コラーゲンを発現しているのかを同定し、これまで知られていないVII型コラーゲンの機能を明らかにし、さらにVII型コラーゲン遺伝子変異が原因である栄養障害型表皮水疱症(DEB)の新規治療法への手がかりとなる知見を得ることが目的である。健常人末梢血より単核球を採取し、初期培養を行ったところ、培養ディッシュ面に接着した細胞がVII型コラーゲンを産生していることを、RT-PCR法で確認した。また、DEB患者のゲノムDNAで同定されたスプライシング異常変異が、メッセンジャーRNAレベルでどのように影響しているかを調べたところ、患者末梢血由来RNAで得られた結果は、患者線維芽細胞から得られた結果と一致していた。優性または劣性遺伝性皮膚疾患である栄養障害型表皮水疱症(DEB)はVII型コラーゲン遺伝子(COL7A1)の病的変異により発症する。通常、遺伝子診断は患者DNAを用いたCOL7A1遺伝子のPCRによる増幅産物を直接シークエンスすることによって検索される。ただし、一部の症例ではCOL7A1の転写産物であるメッセンジャーRNAの一次構造を解析する必要がある。その際、COL7A1メッセンジャーRNA(COL7A1 mRNA)を採取するためには患者から皮膚を採取する必要があるが、生体への侵襲が避けられない。そこで、目的にかなった代替組織を探したところ、末梢血単核球画分がCOL7A1 mRNAを発現していることを見出した。次に、複数種の細胞の集合である末梢血単核球画分のいずれの細胞がCOL7A1 mRNAを発現しているかを同定するために分離培養を試みたが、COL7A1 mRNAは間葉系由来である皮膚線維芽細胞で多く発現していることから、末梢血間葉系幹細胞(PBMSC)で発現していると推測し、これの分離を試みた。培養系の骨髄由来間葉系幹細胞(BMMSC)ではCOL7A1 mRNAが発現していることを確認した。スライドカルチャーで培養した末梢血単核球を免疫蛍光法で観察したところ、CD105(+)、CD29(+)、CD34(ー)、CD45(ー)の細胞が観察され、これらはPBMSCであると考えられたが、これらの細胞においてCOL7A1タンパクの発現が確認された。CD105、CD29は間葉系細胞のマーカーであることかPBMSCを分離しようと試みたが、CD105(+)、CD29(+)の細胞を回収することができなかった。DEB患者から末梢血単核球を分離し、ゲノムDNA、全RNAを抽出し、遺伝子変異検索を行ったところ、ゲノムDNAで同定した遺伝子変異を裏付ける変化がRNAでも確認できたため、患者末梢血中の単核球は遺伝子変異検索に有用であることが確認できた。以上のことから今年度の計画は順調に進んでいる。以前の研究で我々は末梢血単核細胞でVII型コラーゲンが発現していることを確認していた。今回の研究では、末梢血中のいかなる細胞がVII型コラーゲンを発現しているのかを、種々の方法を用いて検討した。これまでの知見により、骨髄由来間葉系幹細胞でVII型コラーゲンが発現していることは他施設および自施設で確認している。また、末梢血中にはわずかに間葉系幹細胞が存在することを示した報告がある。従って、末梢血中のVII型コラーゲン発現細胞の候補として、まず間葉系幹細胞を考え、末梢血中の間葉系幹細胞の分離を試みた。FACSを用いて間葉系幹細胞と考えられるCD45-/CD105+細胞が存在するかどうかを調べたが、同定されなかった。

次に、末梢血単核細胞を培養し、間葉系幹細胞が分離培養できるかどうかを検討した。プラスチックディッシュに末梢血単核細胞を直接培養したところ、紡錘形の細胞が接着して増殖していることが確認された。これらの細胞から得られた核酸を用いてRT-PCRを行ったところ、CD45の発現がわずかにみられ、CD105は強い発現がみられた。さらに、末梢血単核細胞の免疫染色を行い蛍光顕微鏡で観察したところ、紡錘形の細胞ではVII型コラーゲンの発現と同時にCD105の発現がみられた。これら紡錘形の細胞はCD29+、CD45-、CD34-であり、ヒト間葉系幹細胞の発現パタンと同一であった。以上の結果から、末梢血単核細胞中には間葉系幹細胞が存在し、培養系で生着し、VII型コラーゲンを発現していることが示された。VII型コラーゲンを発現する末梢血中の細胞を特定するために末梢血単核細胞を培養したところ、紡錘形の細胞が接着して増殖していた。これらの細胞から得た核酸を用いてRT-PCRを行ったところ、VII型コラーゲンの発現とともにCD45の発現がわずかにみられ、CD105は強い発現がみられた。免疫染色を行い蛍光顕微鏡で観察したところ、紡錘形の細胞ではVII型コラーゲンとCD105の発現が同時にみられた。これらの細胞はCD29+、CD45-、CD34-であり、ヒト間葉系幹細胞の発現パタンと同一であった。従って、末梢血単核細胞中には間葉系幹細胞が存在し、培養系で生着し、VII型コラーゲンを発現していることが示された。末梢血単核球中のVII型コラーゲン産生細胞を同定するために、抗VII型コラーゲン抗体を用いてFACSによるソーティングを行い、得られた分画が間葉系幹細胞であるのかどうかを分析する。このために、骨髄由来間葉系幹細胞を用いた栄養障害型表皮水疱症の移植療法の第一人者である、大阪大学医学部再生医療部、玉井克人教授と連携して研究を進める。今後、培養細胞中に免疫蛍光法で確認した間葉系幹細胞と思われる細胞を分離培養するために、カクテル抗体ビーズを用いた細胞濃縮法と、TGF-betaや線維芽細胞増殖因子などを組み合わせた細胞培養法を行う。皮膚科学
遺伝性腎疾患におけるスプライシング異常症発症機序の解明および新規治療法の開発

1.スプライシング異常をきたしうる変異の同定およびその頻度の解明を行う:保有する遺伝情報の中から、イントロン変異やサイレント変異およびその病原性が不明なミスセンス変異の中でスプライシング異常の可能性がある変異を検出し、スプライシング異常の頻度およびその重症度への影響を明らかにする。2.スプライシング異常発症機序の解明を行う: minigeneや患者腎由来培養細胞を用いた解析系を用いて、スプライシング促進因子の発現調節を行い、その影響を調べることでスプライシング異常発生機序を解明する。3.新規疾患特異的治療法の開発を行う:すべての遺伝性腎疾患を対象とした治療法の開発を行う。