hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
線維芽細胞増殖因子は遊離筋肉移植における筋芽細胞の再生を促進する

遊離筋肉移植の術後回復過程における、線維芽細胞増殖因子の関与を検討する目的で実験を計画した。Wister系雄ラットを用いて、膝窩動静脈を血管柄、坐骨神経を運動神経とする腓腹筋を剥離、挙上し筋肉移植モデルとした。筋肉の血行を、血管クリップにて一時的に遮断し、切離した坐骨神経を縫合した後、腓腹筋をorthotopicに移植した。術後4、6、8週で、ネンブタール麻酔下に、手術後および健側の腓腹筋を採取し、エタノール処理を行った後-80°Cにて凍結保存した。保存した検体について、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)のmRNA発現を、RT-PCR法を用いて解析した。各検体からtotalRNAを抽出し、bFGFmRNAの発現の経時的変化について検討した。その結果、筋肉移植後4週の時点では筋組織内にbFGFの発現が認められるものの、6週以後は消失していた。また、健側の腓腹筋にはbFGFmRNAの発現は認められなかった。すなわち、bFGFは筋肉移植術後、比較的早期に筋組織内に発現し、その時期が筋肉内の神経再生時期と一致していることから、筋芽細胞の再生など脱神経変化に陥った筋組織の回復過程に関与している可能性が示唆された。本研究の今後の展望としては、術後早期のモデルも作成し、より早期からのbFGF発現の変化についてのさらに詳細な解析を行い、bFGFの筋芽細胞の再生への関与について検討する必要がある。遊離筋肉移植の術後経過における成長因子、特に塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の関与を検討することを目的として実験を計画した。実験動物にはWister系雄ラットを使用し、筋肉移植のモデルには下腿三頭筋を用いた。まず予備実験として、下腿三頭筋の血管、神経を含めた局所解剖を行い、筋肉移植としての妥当性について検討した。その結果、膝窩動静脈を血管茎として下腿三頭筋を挙上することが可能であり、坐骨神経を運動神経とする遊離筋肉移植モデルとして使用できることが判明した。すなわち坐骨神経は大腿中央で切離し、また血管はクリップで一時的に血行を遮断した。神経の切離は神経外膜の一部を残して行い、直ちに10-0ナイロン糸にて縫合した。また虚血時間は1時間で設定し、その後血管クリップを解除した。モデルは術後早期のものから、12週の長期のものまでを作成予定であるが、現在までに中長期モデルとして10匹を作成した。実験部位の感染や術後死亡したラットはなく、安定したモデルが作成できることを確認した。遺伝子発現の解析についてはそのための試薬や市販のキットを準備し、安定して確実な解析ができるように手技について習熟中である。今後は、経時的な筋肉移植モデルを引き続き作成するとともに、実際の検体についての遺伝子解析を行う予定である。前年度に確立したWister系雄ラットを用いた、筋肉移植モデルを、平成11年度にかけて引き続き作成した。すなわち、膝窩動静脈を血管柄、坐骨神経を運動神経とする腓腹筋を剥離、挙上して筋肉移植モデルとした。筋肉の血行を、血管クリップにて一時的に遮断した後に腓腹筋をorthotopicに移植した。術後4、6、8週で、ネンブタール麻酔下に、手術側および健側の腓腹筋を採取し、エタノール処理を行った後-80°Cにて凍結保存した。保存した検体について,塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)のmRNA発現を、RT-PCR法を用いて解析した。その結果、筋肉移植モデル内のbFGFmRNAの発現は、術後経時的に変化していることが判明した。すなわち術後4週の時点では筋肉内にbFGFの発現が認められるものの、6週以後は急速に消失していた。

従って、bFGFは筋肉移植術後比較的早期に発現し、筋肉内の神経再生の時期と一致していることから、筋芽細胞の再生など脱神経変化に陥った筋組織の回復過程に関与している可能性が示唆された。今後の展望として、術後早期のモデルも作成し、より早期からのbFGF発現の変化についてさらに詳細な解析を行い、筋芽細胞の再生への関与について検討する必要がある。
医学書抄物の目録完成とその国語学的研究

本研究は,実用性の故に伝存する本の数が多く,そのため発掘・整備が遅れている医学書抄物を対象として,その目録を完成し,日本語研究資料としての有効性を解明しようとしたものである。1.調査・整備(1)既調査の本を含めて総計約650本を扱うことができた。これで,伝存する本の大部分を把握し得たものと思われる。(2)これらの資料を,第1類特定の原典に対する注釈書,第2類特定の原典をもたないゾ体で書かれたもの,第3類語句を列挙し解説したもの,の3類に大別した。類ごとに,伝存する本の種類と数を示すと,次の通りである。第1類43種約180本第2類48種約430本第3類18種約40本(3)次に,各種の中を抄者別に類別整理した。2.日本語研究資料としての有効性(1)3類ともに語詞・語彙研究資料として有効であることを確認した。また,「アカブラ」などの身体名,「陳皮」などの本草名が,狂言などの中世文学の解釈にも役立つことを確認した。要語索引の作成がいそがれる。(2)中世呉音研究資料としても活用し得ることを確認した。(3)第2,3類には『医書難字集』『薬性能毒伊路波付』など辞書の形をとるものがあり,辞書史研究上注目される。これらの資料を,所収語彙・配列順・形態などから類別した。(4)近世随筆文学との連続性ということについては,医学書以外の特定の原典をもたない抄物ほど密接でないことが判明した。
細胞の形態制御を司る低分子量Ｇ蛋白質シグナルの包括的理解－上流から下流まで－

細胞は細胞外からの刺激を受け、多様な細胞内シグナル伝達経路を介して細胞骨格系の再構築を行い、その形態を厳密に制御しており、低分子量G蛋白質RasファミリーやRhoファミリーが重要な役割を担っている。R-Rasは神経細胞の軸索に局在し、活性型が下流エフェクター分子を介して軸索の形態制御に関与していることがわかっているものの、R-Rasの活性を制御する上流シグナルについては不明な点が多い。そこで本研究ではR-Rasの活性制御に関わる細胞外分子の同定とその制御機構を分子レベルで解明することを目指している。これまで、BDNF(脳由来神経栄養因子)によるR-Ras活性化に関与するグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)としてRasGRF1に着目してきた。神経細胞にRasGRF1を単独過剰発現すると、軸索の成長が大きく促進されることがわかった。また、BDNF刺激による軸索の成長促進作用はRasGRF1を過剰発現した神経細胞でも見られる傾向にあった。さらにBDNF刺激によって、RasGRF1のマウスの配列で916番目のセリン残基(ラットでは898番目)のリン酸化が大きく促進することがわかった。BDNF刺激によるRasGRF1のリン酸化は、TrkB受容体を介してPKA(protein kinase A)によって引き起こされることが薬理学的な阻害剤を用いた実験により明らかになり、BDNF刺激によって細胞内でのcAMP濃度が上昇する傾向にあることもわかった。以上の結果から軸索の形態調節の分子メカニズムの一端として、BDNF-TrkBシグナルが細胞内での局所的なcAMP濃度の上昇とこれに続くPKAの活性化を介してRasGRF1をリン酸化し、R-Rasを最大限に活性化することで軸索の形態調節を制御していることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。細胞は、細胞外からの様々な刺激を受け、多様な細胞内シグナル伝達経路を介して細胞骨格系の再構築を行い、その形態を厳密に制御しており、低分子量G蛋白質のRasファミリーやRhoファミリーが重要な役割を担っている。Rasファミリーの一つR-Rasは神経細胞の軸索に局在し、活性型が様々な下流エフェクター分子を介して軸索の形態制御に関与していることがわかってきている。しかし、R-Rasの活性を制御する上流シグナルについては不明な点が多く、本研究ではR-Rasの活性制御に関わる細胞外分子の同定とその制御機構を分子レベルで解明することを目指している。まずR-Rasの上流因子同定を目指して、候補となる細胞外分子を初代培養ラット神経細胞へ添加し、R-Rasの活性を測定した。その結果、脳内の栄養因子の一つであるBDNF(脳由来神経栄養因子)がR-Rasの活性化を引き起こすことを見出した。また、BDNFを神経細胞へ添加すると、軸索の成長(伸長と分枝形成)が促進されること、R-Rasの発現抑制を行った神経細胞では、BDNF添加による軸索の成長促進が見られないことがわかった。この結果から、BDNFはR-Rasを介して軸索の形態制御を行っていることが示唆された。次にBDNF添加により細胞内でR-Rasの活性化を引き起こす、グアニンヌクレオチド交換因子(GEF)の同定を試み、候補分子としてRasGRF1に着目した。そして、内在性のRasGRF1の発現を抑制した神経細胞では、BDNFによる軸索の成長促進がみられないことがわかった。以上の結果から、BDNF添加によるR-Ras活性化と軸索の形態制御はRasGRF1を介していることが示唆された。当初の計画通り、R-Rasの活性制御に関わる細胞外分子の同定とそのシグナル伝達経路の一部分を解明することができたため。

以上の結果から軸索の形態調節の分子メカニズムの一端として、BDNF-TrkBシグナルが細胞内での局所的なcAMP濃度の上昇とこれに続くPKAの活性化を介してRasGRF1をリン酸化し、R-Rasを最大限に活性化することで軸索の形態調節を制御していることが示唆された。今後は、BDNF添加によりR-Ras活性化を引き起こすシグナルのより詳細な伝達経路の解明を目指す。具体的にはBDNF添加によるRasGRF1のリン酸化状態の変化や、そのリン酸化を引き起こす分子メカニズムの解明に取り組む予定である。また、見出したR-Ras活性制御機構とRhoファミリーとの関係の解明にも取り組み、細胞の形態制御を司る低分子量G蛋白質の機能間での協奏的なクロストーク機構の解明を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
テラヘルツセンサの線形性自己校正技術の開発

現在、広く用いられているテラヘルツ波分光装置はテラヘルツ波センサの線形性を基準として、サンプルの透過率や反射率を測定している。このようなテラヘルツ波の応用を支えるため、本研究ではテラヘルツ波センサの線形性自己校正システムを開発した。本システムは重ね合わせ法に基づき、テラヘルツ波信号の単純な和算に対するセンサの応答の線形性を検証する。本研究では、独自の工夫により複数のワイヤグリッド偏光子を組み合わせることで、自己校正システムを構築した。このシステムによってテラヘルツ波パワーメータを校正し、概ね1 %以下の非線形性を得た。本結果は、テラヘルツ波の応用を支える基盤としての役割を果たす。テラヘルツ波を用いた物性研究、イメージング、分析等を実現する上で、被測定物の反射率や透過率の測定は重要な役割りを果たす。反射率や透過率は、入射波に対する反射波および透過波の強度の比によって求められるため、テラヘルツ波を検出するセンサの線形性に大きく依存する。本研究は、テラヘルツ波センサの線形性を自己校正可能なシステムの開発に関するものである。テラヘルツ波センサの線形性自己校正システムは、重ね合わせ法(もしくは重畳法)に基づいて開発される。これは同一強度の信号を2つ入射したとき、重ね合わされた信号は個々の信号の2倍となるかを検証するものである。従って、テラヘルツ波信号を2つに分け、それぞれ同一強度となるように調整した後再び結合し、テラヘルツ波センサに入射させる。このとき、個々の信号を別々に検出した場合と、2つ同時に検出した場合のセンサの応答を比較する。上記原理に基づき、申請者はテラヘルツ波の線形性自己校正システムの構築を行った。当初、研究実施計画に基づき、光伝導アンテナ(PCA)を用いた送受信系を開発したが、信号強度やパルス波形に課題があることが判明した。そこで、より高精度化が期待できる単一周波数信号源であるガンダイオードを利用した線形性自己校正システムを開発した。また、当初、テラヘルツ波を分岐し、強度調整した後、結合する機構に検討が必要であったが、本研究において、偏光子を利用した分岐・強度調整・結合を一纏めに行う機構を開発し、導入した。本機構は分岐したそれぞれの信号が互いに直交する偏波を持つため結合時の干渉を抑制するという利点もある。開発した自己校正システムを用いて、テラヘルツパワーメータおよび熱型検出器の非線形測定を実現した。本成果は、テラヘルツ帯において初となる重ね合わせ法を利用した線形性自己校正の例と言える。テラヘルツ波センサの線形性自己校正システムの信号分岐・結合系の開発において、当初の想定を越えて機能的な機構を開発することができた。本機構は、ワイヤグリッド偏光子を組み合わせることで、信号の分岐、強度調整、信号の結合を一纏めに行うことができ、さらに分岐信号が互いに直交する偏波を持つため、結合波の干渉による強度変化がセンサの非線形性として観測されてしまうという問題も避けることができる。また、当初の計画より高精度化が期待できる単一周波数信号源を用いた自己校正システムを構築した。本システムではPCA以外にも様々な形式のテラヘルツ波検出器の線形性が校正できる。実際に、現在までにパワーメータや熱型検出器など複数のセンサの非線形性測定を実現した。テラヘルツ波技術を世の中で広く共有するためには、テラヘルツ波に関する計量標準が必要である。とりわけ、テラヘルツ波センサの線形性の精密計測は、透過率、反射率、吸収率測定の基礎となるため、スペクトル解析の要素技術として重要である。本研究ではテラヘルツ波帯では初めて、重ね合わせ法によってテラヘルツ波センサの線形性を自己校正するシステムを開発した。重ね合わせ法とは、テラヘルツ波を、それぞれ等しい強度となる様に二分し、個々の波を独立に測定した場合と二波同時に測定した場合を比べ、「1+1=2」という単純な和算が成り立つかどうかを検証するものである。上記の原理に基づく線形性自己校正システムを実現するためのポイントは、分けられた二波の強度が等しくなる様に調整可能にすること、および二波同時に測定する際に波同士の干渉を避けることである。これらの課題は複数のワイヤグリッド偏光子を用いて独自に工夫した光学系によって実現された。本光学系では、ワイヤグリッドの角度によって分岐比が調節可能であり、さらに分岐された二波は互いに直交しているため、再結合して二波同時に測定する際にも干渉はしない。本研究では、開発した線形性自己校正システムを用いて、テラヘルツパワーメータや焦電センサなど複数のセンサに対して線形性の定量評価を行った。この結果、20 500 μWのレンジにおいて、概ね1 %前後の線形性を定めることができた。テラヘルツ波センサの線形性を重ね合わせ法に基づく自己校正によって定量評価できたのは本結果が初である。

当初計画していたPCAを用いた線形性自己校正システムを変更して、より高精度化が見込める単一周波数光源を用いたシステムを構築したが、今後の計画に大きな変更はない。今後、構築した自己校正システムの精度検証や固定減衰器の校正等を行う予定である。計測工学線形性自己校正システムの再設計に伴い、部品(ワイヤグリッド偏光子など)の再選定を行った結果、安価な部品で構築することができた。また見積もり競争等によって可能な限りの節約を行った。以上の結果、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、光学部品やテラヘルツ関連部品の購入などに充てる。
ＭＡＳＣアッセイ法を用いたエネルギー代謝関連遺伝子の機能同定

私達は食事から得られるエネルギーを使うことで運動や体内の機能調節(例えば体温維持)しているので、このエネルギー代謝の制御システムが破綻すると様々な失調を来す。効率の良いエネルギー代謝活性の新規測定法を用いてエネルギー代謝制御に関わる新しい因子を探索した。その因子は飢餓状態になると細胞内で増加することに加えて、エネルギー産生に関わる酵素の活性を高めることが明らかになった。今後はがんや糖尿病のようなエネルギー代謝制御に関与している疾患にこの新規因子がどのように影響しているのかを調べて、これら疾患の予防や治療に対する新たな知見が得られるように研究を進めていく。H25年度はミトコンドリアに局在するタンパク質をコードした遺伝子をノックダウンするライブラリーを作製した。当初は、合成RNAを購入したsiRNAライブラリーを構築する予定であったが、認可された予算の関係からプラスミドベクターによるmiRNAを発現させるプラスミドライブラリーを構築する事に方向を転換させた。145種類の遺伝子に対してそれぞれ2種類ずつの標的配列を決定して、合計290種類のmiRNA発現ベクターを構築した。これを基に、HeLa細胞へトランスフェクションによる遺伝子導入で一過的にmiRNAを発現させてた上で、BlasticidinSという抗生物質による薬剤選択を行った細胞に対してMASCアッセイによるATP合成活性の変化を測定した。その結果、6種類の遺伝子について発現をノックダウンした時に有意なATP合成活性の変化(上昇2種類、減少4種類)が認められた。再現性を得るため、miRNAを安定的に発現する細胞株を作製して、再度、MASCアッセイによるATP合成活性を測定したところ、4種類について再現性が確認された。その内、1種類の遺伝子ノックダウン株ではATP合成酵素自体の量が減少しており、残り3種類の遺伝子ノックダウン株ではATP合成酵素量には変化が認められなかった。今後は、これら遺伝子のエネルギー代謝における役割を分子生物学的・細胞生物学的側面から研究して、新規ミトコンドリア局在遺伝子の機能同定を行っていくことが重要である。MASCアッセイ法は接着細胞を96ウェルプレートに播種し、簡便にミトコンドリアのATP合成活性を測定できる方法である。本課題は、MASCアッセイ法を利用したスクリーニングによりATP合成に関わる新規因子を同定することを目的とした。初めに、ATP合成酵素の主要なサブユニットATP5A1 (αサブユニット)を標的としたmicroRNA (以後、miR)発現ベクターを構築して、MASCアッセイによりATP合成活性への影響を評価した。miRベクターをトランスフェクションして48時間から96時間におけるATP合成活性を測定したが、顕著な変化が得られなかった。これらの主な理由は、ウエスタンブロットなどの実験から、miRベクターによるトランスフェクションのみではFoF1-ATP合成酵素を十分にノックダウンできないためであることがわかった。そこで、miRベクターをトランスフェクションした24時間後に、miRベクターに付随した薬剤耐性遺伝子を利用して薬剤選別を行った。さらに、1回目のトランスフェクションから48時間後に、再びmiRベクターをトランスフェクションし、最終的には初めのトランスフェクションから96時間後にMASCアッセイ法によりATP合成活性を測定した。この改善により、αサブユニットのノックダウンによる十分なFoF1-ATP合成酵素のATP合成活性の減弱が認められた。さらには、FoF1に相互作用するがその機能はわかっていないMLQ蛋白質に対しても同様にmiRベクターでノックダウンしたところ、FoF1によるATP合成活性に必要である事が分かった。以上のことは、分子生物学会・細胞生物学会・EBEC(ドイツ)において発表し、MASCアッセイによるスクリーニングの有用性を示すことができた。機能未同定のミトコンドリア局在性蛋白質についてノックダウン(KD)細胞のATP合成活性を測定して、新規エネルギー代謝関連因子をスクリーニングした結果、6遺伝子についてATP合成活性に影響する事を明らかにした。また、miRNA安定発現株を作製して4種類について1次スクリーニングの再現性が確認された。KD株の中で、FoF1-ATP合成酵素複合体の量を変化させた遺伝子pFJ8061に注目した。これをHeLa細胞で異所的に発現させて、ミトコンドリアに局在していることを確認した。pFJ8061の安定的KD株を用いたところ呼吸鎖複合体へは影響せずFoF1複合体特異的に複合体量が減弱した。発現解析の結果、pFJ8061遺伝子はFoF1-ATP合成酵素を構成する各サブユニットの発現・翻訳へは影響しなかった。一般的にFoF1複合体のアセンブリに必要な因子を欠損させるとサブ複合体が観察される。しかしpFJ8061-KD株はアセンブリ過程で見られるFoやF1-cといったサブ複合体すら認められなかったので、pFJ8061がアセンブリの初期段階に関与している可能性が考えられる。またpFJ8061遺伝子自身の発現制御について調べた。HeLa細胞に対してグルコース枯渇させると、有意にpFJ8061

遺伝子の発現が亢進した。このことは細胞内のエネルギー状態を感知してpFJ8061の発現量が制御され、pFJ8061蛋白質はFoF1複合体のアセンブリに重要な役割を担っていると推測された。但し、pFJ8061を異所的に過剰発現してもFoF1複合体の量が増加しなかったことからpFJ8061単独ではFoF1複合体量を増加することができず、FoF1の各サブユニットの発現誘導やミトコンドリア全体の生合成やFoF1アセンブリに関する因子と協調的に働くことが必要と見られる。細胞生物学今回、人工合成によるsiRNAの作製からプラスミドDNAベースのノックダウンライブラリー作製へと大きく方向転換した事から、当初研究計画書に記載した新規ミトコンドリア局在遺伝子の機能の機能同定までしっかりと行う事ができなかった。しかし、計画の中心的な目的である機能未知であるミトコンドリア局在遺伝子の中からATP合成に関連する因子のスクリーニングを行うことに関して言えば、おおむね達成したと言える。4種類の新規遺伝子は、1つがATP合成酵素量事態に変化を与え、その他は変化しないという状況は明らかとなっているが、さらに4種類の因子がどのようにエネルギー代謝に関わっているのかについてはまったく手つかずの状態である。このことから、達成度は80%ていどと考えている。本研究課題は2カ年計画である。平成24年度はその1年目で、当初の計画はMASCアッセイ法を用いたスクリーニング実験系の条件検討であった。初年度の計画はほぼ完了することができたので、及第点はいただけると考えている。しかし残念ながら、決して満点ではなかった。その理由は以下の2点が挙げられる。1)予算組の甘さ:当初の計画では人工合成したsiRNAをトランスフェクションして機能未知遺伝子-ノックダウン細胞のATP合成活性を評価する予定であったが、人工合成RNAを149遺伝子に対して設計・合成するための予算が不足することが判明した。申請書の段階で、要求された満額予算が認められない可能性も踏まえて、標的遺伝子の絞り込みを行う必要があったと思われる。それ故に、siRNAではなくベクターベースのmiR発現系で標的遺伝子をノックダウンする方法に変更せざるを得なくなった。幸いにも、miR発現ベクターをトランスフェクションする方法でもATP合成活性の影響を評価できる系を確立することができたが、認可された時の予算配分がどの程度全体の研究計画に影響を与えるのかを予め考えるべきであり、計画の甘さがあったことを認めざるを得ない。2)前倒し請求による予算執行すべきであった:初年度計画していたスクリーニングの実験系は比較的順調に進み、平成24年度末の数ヶ月前にはほぼ確立されていた。したがって、基金化されている本研究課題であれば前倒し請求して、機能未知遺伝子の幾つかについてはスクリーニングを開始することができた。
有機EL薄膜と無機半導体薄膜の接合による新しい光-光変換素子の開発

本研究は、無機半導体薄膜と有機電界発光(EL)薄膜を接合することによって、新しい原理により「光-光」変換機能素子を開発することを目的としたものである。私達はすでに、n型のアモルファスシリコンカーバイド(a-SiC:H)と有機ELとの組合せにおいて1%の効率で「光-光」変換が可能なことを確認しているが、今回さらに研究を押し進め、以下のような結果を得た。まず、光電流増倍現象が起こることが明らかとなっているa-SiC:H膜の光電変換特性をさらに詳しく検討した。その結果、a-SiC:H膜における赤色光照射下での増倍光電流が、重ねて照射した紫外(UV)光によって効果的に抑制されることを見いだした。さらに、この現象を「光-光」変換素子に応用し、赤色光から緑色光への変換を重ねて照射したUV光によって最大90%まで可逆的に抑制することに初めて成功した。この素子においては、入力光パターンが出力でも保持される。よって今回の結果は、この「光-光」変換素子が将来の光コンピューティングの2次元光演算素子として応用できることを意味している。次に、「光-光」増幅を目指してa-SiC:Hをn型の有機顔料であるペリレン顔料に置き換えた素子についても検討した。その結果、有機材料としては初めて1万倍に達する光電流増倍現象を観測した。さらに、このペリレン顔料薄膜とEL薄膜を積層一体化した全有機「光-光」変換素子を作製し、40%に達する「光-光」変換効率を達成した。これは、これまでに比べて格段に大きな値であり、「光-光」増幅が可能なことを強く示唆する結果といえる。今後、「光-光」増幅の実現、出力光の受光層へのフィードバックを利用した光双安定デバイスへの展開を計画している。
両生類における幼生型から成体型幹細胞への変換機構の解明

両生類の変態では,尾の退縮や四肢の形成などのダイナミックな形態変化が起こる。さらに,血球や小腸では,それまで機能していた幼生型細胞が細胞死によって除去される一方,成体型の機能を持った細胞が増殖・分化することで成体型組織を再構成すると考えられている。しかし,成体型細胞は,どこから出現するのか,その機構は明らかにされていない。そこで本研究では,無尾両生類であるツメガエルの変態過程において出現する成体型幹細胞の起源,および変態過程でスイッチングする幼生型・成体型幹細胞の増殖・分化機構の解明を目的とする。本年度は,両生類の変態では,尾の退縮や四肢の形成などのダイナミックな形態変化が起こる。本年度は,DNAバーコーディング技術を用いて,幼生期の細胞をランダムに標識する方法の確立を試みた。これまでに,ツメガエルの培養細胞において,薬剤(ドキシサイクリン)誘導性のゲノム編集により,標的配列の編集を行った。今後,このシステムをもつトランスジェニックツメガエルを作製することで,幼生期の細胞が,変態後にどのような動態を示していくのか,明らかにすることが期待できる。両生類の変態では,尾の退縮や四肢の形成に加え,血球や小腸の再構成が起こる。再構成時には,それまで機能していた幼生型細胞が細胞死によって除去される一方,成体型の機能を持った細胞が増殖・分化することで成体型組織を形成すると考えられている。そこで本研究では,無尾両生類であるツメガエルの変態過程において出現する成体型幹細胞の起源,および,変態過程でスイッチングする幼生型・成体型幹細胞の増殖・分化機構の解明を目的とする。初年度として,genetic lineage tracing法による細胞の系譜を追跡する個体の作製の準備として,Creリコンビナーゼ遺伝子やEGFP遺伝子あるいはLacZ遺伝子などのレポーター遺伝子を特定遺伝子座へ導入するために,CRISPR/Cas9システムを用いたノックイン法の検討を行った。その方法として,近年開発が進んでいるマイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)を利用して,標的染色体領域へ正確に遺伝子導入をすることが可能なCRIS-PITCh法(Nakade, S. et al 2014),および2種類のオリゴDNAを用いた2ヒット2オリゴ法(Yoshimi, K. et al 2016)を用いてノックインを試みた。この際の条件検討として,Cas9およびFokI-dCas9の導入,およびChen, Bらが開発したgRNAのステムループ構造の改変(Chen, B. et al 2013)などを行い,特定の遺伝子座にEGFPを導入することができた。本年度は, genetic lineage tracing法による細胞の系譜を追跡する個体の作製のため,Creリコンビナーゼ遺伝子を未分化血球で発現するトランスジェニックカエルの作製を行った。gata2遺伝子の発現調節領域を同定するため, VISTA解析により魚類および爬虫類で保存されている配列(conserved noncoding sequence)を単離した。この配列とgata2遺伝子5'上流領域(-2kbp)を有するEGFPレポーター遺伝子を用いて,トランスジェニックカエルを作製した。その結果,内在性gata2と同様の発現パターンを示したことから,今回単離した領域が,未分化血球での発現に重要であることが考えられた。genetic lineage tracing法による細胞の系譜を追跡する個体作製をする上で,未分化細胞特異的に発現するCreトランスジェニックカエルの系統化に至っていない。

そこで本研究では,無尾両生類であるツメガエルの変態過程において出現する成体型幹細胞の起源,および変態過程でスイッチングする幼生型・成体型幹細胞の増殖・分化機構の解明を目的とする。本年度は,DNAバーコーディング技術を用いて,幼生期の細胞をランダムに標識する方法の確立を試みた。これまでに,ツメガエルの培養細胞において,薬剤(ドキシサイクリン)誘導性のゲノム編集により,標的配列の編集を行った。今後,このシステムをもつトランスジェニックツメガエルを作製することで,幼生期の細胞が,変態後にどのような動態を示していくのか,明らかにすることが期待できる。幹細胞に特異的に発現する遺伝子座へのCreERTのノックイン個体を作製する。ノックインが困難な場合は,特異的遺伝子のプロモーター領域をCre上流にもつ,トランスジェニックカエルの作製を行う。また,セーフハーバー領域へのレポーター遺伝子(EGFPあるいはLacZ)へ導入した個体を作製する。そして,Creおよびレポーター遺伝子導入個体を交配させ,Creによるレポーター遺伝子の発現を制御可能な個体を作製する。これまでに未分化細胞での発現に重要な制御領域を用いて,Cre発現トランスジェニックを作製し,レポーター遺伝子(EGFPあるいはLacZ)をもつ個体との交配を行っていく。
高病原性鳥インフルエンザウイルスに対する陸生野鳥の感受性と伝播に関する研究

本研究では野外において陸生野鳥を介した高病原性鳥インフルエンザウイルスの様々な感染経路を想定した感染実験を実施した。その結果、(1)感染した野生水禽から湖沼の水を介して陸生野鳥にウイルスが伝播する。(2)感染した陸生野鳥が鶏舎内に侵入し、鶏と接触することでウイルスが伝播する。但し、(3)陸生野鳥間では次々と感染が広がることは考えにくい等の可能性が確認された。これらの成績は鶏舎内への陸生野鳥の侵入防止対策が本病防疫上極めて重要であることを支持した。高病原性鳥インフルエンザウイルスの鶏舎内への侵入経路として、野生水禽類(カモやハクチョウ等の渡り鳥)が直接鶏舎内に侵入することは極めて考えにくいことから、(1)感染した水禽類の糞便(又は糞便汚染水)から留鳥が感染し、鶏舎内に持ち込む経路。(2)感染した水禽類の糞便(又は糞便汚染水)から野生動物が感染し、鶏舎内に持ち込む経路。(3)野生動物が感染野鳥を捕食することで感染し、鶏舎内に持ち込む経路。(4)留鳥や野生動物が接触によって機械的にウイルスを鶏舎内に持ち込む経路。(5)陸生の渡り鳥(小鳥類)が直接鶏舎内に侵入し、ウイルスを持ち込む経路などが想定されているが、何れも直接証明はされていない。これらの可能性を評価するために今年度は以下の実験成績を得た。1)本年度冬季にH5N1ウイルスによる高病原性鳥インフルエンザの国内発生が続発し、10種を越える野鳥の死亡個体からもウイルスが分離されたが、それらは水禽類もしくは猛禽類で陸生小鳥類(スズメ、シロハラなどを含む)からウイルスは分離されなかった。2)捕獲が比較的容易で養鶏場近くにも生息する鳥種として、オオジュリン、ヒヨドリ、スズメ、シロハラ、オオヨシキリの5種を選択した。さらにハトおよびカラスも養鶏場敷地内でよく見かける留鳥であることからこれらも感受性試験の対象に加えることとした。3)2)で選択した5種の野鳥については飼育ボックス内での飼養を試みた結果から、何れも感染実験の実施期間である約2週間の飼育が可能であると判断された。4)死亡直後のシロハラ感染個体を鶏のケージ内に入れ、その後鶏へのウイルス伝播が成立するか否かを調べた。しかし、その後の観察において症状の変化や血中抗体の上昇も認められず、伝播は不成立と判断された。野鳥から高感受性宿主である鶏への異種伝播経路の評価には、飲み水を介した伝播や汚染餌からの感染等を想定した実験モデルを用いて更なるデータの蓄積が必要と考えられた。高病原性鳥インフルエンザウイルスの伝播に果たす野鳥や野生生物の役割を言及した基礎データは依然として国内外ともに不足している。大陸から国内への野鳥の飛来を止めることは不可能であり、ウイルスがそれによって運搬される可能性が否定できない以上、どのような経路でウイルスが侵入するのかを予測して、それに備えることが本病の発生を防ぐ重要な方策の一つである。そこで本研究では以下の3項目で各々実験成績を得ることを目的として企画された。1)大陸特に朝鮮半島を経由して我が国に飛来する野鳥あるいは鶏舎内に直接侵入する種を野外調査により特定する。2)候補となる野鳥の高病原性鳥インフルエンザウイルスに対する感受性およびウイルス伝搬者としての可能性を感染実験により評価する。3)ウイルスの鶏舎内侵入経路としての留鳥あるいは野生動物へのウイルス伝播の可能性を感染実験により評価する。これらの目的達成のために、今年度得られた成果は以下の通りである。1)感染アヒルの糞便(1g当たり約10の6乗個のH5N1ウイルスを含む)を飼育ケージ内へ投入し、そこでドバトを10日間飼育したが、感染は成立しなかった。2)感染アヒルの糞便で汚染された飲み水(1ml当たり約10の5乗個のウイルスを含む)をスズメに与えた場合、用いた2羽とも死亡した。3)スズメから鶏への同居感染が成立するか否かについてケージ内に衝立てを設置した飼育ボックスを用いて実験した結果、鶏への感染は成立しなかった。4)スズメに対する感受性に相違のあるクマタカ株とオオハクチョウ株のHA遺伝子を比較した結果、少なく33個のアミノ酸の相違が認められた。その中にはレセプター結合部位近傍のアミノ酸も含まれていた。来年度は引き続き、侵入ルートの実証実験を継続するとともにウイルス株間の感受性の相違に関わるアミノ酸についてもさらに詳細に解析を進める計画である。高病原性鳥インフルエンザウイルスの伝播に果たす野鳥や野生生物の役割を明らかにする目的で、最終年度である今年度はジュウシマツ(スズメの代替え種)を用いて以下の通り、予想される感染経路の実証実験を行った。1)感染野生水禽類の生息する湖の水を介して陸生野鳥が感染する経路を想定して、ウイルスを含む飲水実験を実施したところ、10の5乗および4乗EID50/

mlのウイルスを含む水を飲水として与えた群は4日目までに全羽死亡したが、10の3乗EID50/mlウイルスを飲水した群は観察期間中全羽生存した。2)陸生野鳥同士の水平伝播を想定して、同居感染実験を実施したところ、10の7乗EID50/mlのウイルスを接種した群は4日目までに7羽中5羽が死亡し、同居群は5日目に6羽中2羽が死亡したが、残りは観察期間中生存した。3)鶏舎内に侵入した陸生野鳥から鶏への直接伝播を想定して、両者の同居感染実験を実施したところ、10の7乗EID50/mlのウイルスを接種したジュウシマツは5日目までに8羽すべて死亡したが、同居させた鶏は4日目までに4羽中2羽が死亡した。すべての実験を通じて、死亡した鳥からはいずれもウイルスが回収された。一方、生存した鳥では2週後の血清中に接種ウイルスに対する抗体価は認められず、感染が成立していないことが確認された。以上の実験成績および昨年度までの成績を総合し、以下の点が明らかとなった。1感染した野生水禽が糞便とともにウイルスを排泄している湖沼の水を介して、スズメ等の陸生野鳥が感染する可能性が考えられる。2感染した陸生野鳥が鶏舎内に侵入し、鶏と接触(エサや水を共有)した場合にウイルスが伝播する可能性が考えられる。しかし、3陸生野鳥の間で次々と感染が広がる可能性は考えにくい。以上、本研究成績は鶏舎内への陸生野鳥の侵入防止対策が本病防疫上極めて重要であることを示している。2010年2011年にかけて、日本国内においてH5N1亜型の高病原性鳥インフルエンザウイルスによる家きん及び野鳥での流行が多発し、特に感染野鳥の診断が優先され、それに申請者が所属する鳥取大学鳥由来人獣共通感染症疫学研究センターのP3実験施設が使われたために、本研究で同施設を使わなければならない感染実験の実施がやや遅れているが、それ以外は概ね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度に引き続き、陸生野鳥(留鳥)を捕獲あるいは代替種(人工飼育類似種)を入手し、感染実験によって、致死率、感染率、症状、ウイルス排泄量、ウイルス排泄期間、各臓器ウイルス価を明らかにする作業を継続する。また、実施がやや遅れている感染実験すなわち想定されるいくつかの鶏舎内ウイルス侵入ルート(野生水禽類の糞便や汚染された環境水や飼料、感染野鳥の死体など)を検証するための実験に関しては、時間的に野鳥を捕獲しての実施が困難な場合は同様の感受性を有することを確認した上で代替種(飼育鳥)を用いて実施するよう計画を変更したい。平成24年度は最終年度であるため、これまでに得られた成績を総括し、留鳥による鶏舎内へのウイルス伝播の可能性を評価することで、今後の高病原性鳥インフルエンザの国内発生予防対策確立のための一助としたい。
溺死の診断のためのLAMP法を用いた簡易迅速スクリーニング検査法の開発

すべての水中死体に対して,時間と労力のかかる従来の珪藻検査を実施することは容易ではない.そこで,補助診断として簡易に行える溺死のスクリーニングテストを行い迅速に判定できれば,さらに効率的に対応できると考えた.本研究の目的は,LAMP法の優れた特性(簡便性・迅速性)を利用した新しい簡易迅速診断法を開発し,法医実務に役立てることである.本研究の結果,淡水溺死の指標としてAeromomas属細菌を属レベルで広く検出可能な簡便かつ迅速な検出システムを開発した.また実際の解剖事例において,本検査を実施した結果,法医実務診断において非常に有用な検査方法であることが示された.溺死の診断において,水由来の微生物(珪藻類)を,肺や血液,腎臓や肝臓などから検出できれば,生前に水を吸引した可能性が高くなる.しかし,すべての水中死体に対して,時間と労力のかかる従来の珪藻検査を行うことは容易ではない.そこで,補助診断として,簡易に行える溺死のスクリーニングテストを実施し迅速に判定できれば,より効率的に対応できると考えた.水中から発見される死体の状態は,現場環境や水温,死後経過時間等によって,大きく異なり,検査試料中に存在する微生物の種類や数も多様である.このため,特異性の高いプライマーセットを設計することが本法にとって特に重要である.そこで,まず特異性を詳細に検討するために,海水及び淡水環境等から,対照としてBacillus属,Halomonas属,Marionomas属,Pantoea属,Pseudoalteromonas属,Psychrobacter属,Serratia属,Lactococcus属,Enterobacter属,Carnobacterrium属,Staphyrococcus属などの多様な細菌のGenomic DNAを得た(16S rRNA遺伝子を指標に同定).次いで,市販の標準菌株からVibrio属,Photobacterium属, Escherichia属,Listonella属,Pseudomonas属,Citrobacter属,Enterococcus属,Proteus属,Shewanella属,Aeromonas属のGenomic DNAを抽出・精製した.続いて,日本DNAデータバンク(DDBJ)から指標とする細菌遺伝子(small subunit rRNA, gyrase subunit B, DNA-dependent RNA polymerase, etc.)の塩基配列情報を収集し,GENETYX-MAC (Ver. 15.0)を用いてアライメント解析を行い,淡水及び海水溺死を識別可能なプライマー配列を検討・設計した.また,同時にPrimer Explorer (Ver.4.0)を用いてプライマー配列を設計した.現在,これまでに設計した様々なプライマーセットの有効性を検討中である.本研究の目的は,簡便かつ迅速な溺死のスクリーニング検査法を開発することである.そのため,指標とする細菌の対象は,種レベルではなく,多数の種を一度に検出可能な属レベルであることが望ましい.そこで,本研究では淡水溺死の指標としてAeromomas属細菌を広く検出可能な検出システムを開発した.平成27年度は,溺死例ないし非溺死例の計34例144試料について,肺組織(右肺下葉内部,左肺上葉辺縁部)及び血液試料(左心血,右心血,大腿静脈血)中のAeromonas属細菌の存在を明らかにするための調査を行った.先ず,溺死ないし溺死の可能性が高い事例として,淡水域10例(48試料),汽水域5例(23試料),海水域10例(47試料),また非溺死例(ないし極少量の水を吸引した可能性がある事例)として,9例26試料について,肺組織は0.2 g,血液試料は1 mLを凍結後,ビーズクラッシャー装置を用いて物理的に細胞を破壊した.次いで,Proteinase K及びSDSを用いてさらに組織を化学的に溶解し,次いでシリカメンブレン法によってゲノムDNAを精製した.得られたDNA試料をテンプレートとして,本研究で開発したLAMP法を試みた結果,優れた有効性が示された.今後,さらに事例を追加し、これらの結果をまとめ,国際誌に投稿する予定である.なお,すべての事例について,従来の強酸(発煙硝酸)を用いた珪藻の検出を行った(左右の肺,腎臓,肝臓).さらに,多くの事例について,選択平板培地を用いて,血液試料(左心血,右心血,大腿静脈血)中の生菌の検出・同定を行った.また,溺死に関する本研究を進めいく上で,珪藻の検査は必要不可欠である.そこで我々は酵素(Papain)を用いて珪藻を安全かつ簡便・迅速に検出可能な方法を開発した.今後,これらの結果もまとめ,国際誌に投稿する予定である.すべての水中死体に対して,時間と労力のかかる従来の珪藻検査を実施することは容易ではない.そこで,補助診断として簡易に行える溺死のスクリーニングテストを行い迅速に判定できれば,さらに効率的に対応できると考えた.本研究の目的は,LAMP法の優れた特性(簡便性・迅速性)を利用した新しい簡易迅速診断法を開発し,法医実務に役立てることである.本研究の結果,淡水溺死の指標としてAeromomas属細菌を属レベルで広く検出可能な簡便かつ迅速な検出システムを開発した.また実際の解剖事例において,本検査を実施した結果,法医実務診断において非常に有用な検査方法であることが示された.

本研究の目的は,簡便かつ迅速な溺死のスクリーニング検査法(淡水溺死)を開発することであり,平成26年度までの研究結果からAeromonas属細菌を特異的に検出可能な4つのプライマーセット(F3,18 mer; FIP,40 mer; BIP,41 mer; B3,17 mer)を設計し,計143株の細菌に対して特異性を調査した.その結果,我々の設計した4つのプライマーセットは,Aeromonas属細菌に対して極めて優れた特異性(属特異性)を有することが明らかとなり,淡水溺死を診断する上で優れた検査法と成り得る可能性が示された.また検出感度はNBRC標準菌株(A. hydrophila, A. salmonicida)に対して10 pg/tubeであり,十分な検出感度が得られた.さらに本法は,試薬の準備や調整が非常に簡単であり,反応温度も63°Cの一定温度で行うことができ,反応時間も僅か80 minで終了するため,極めて簡便かつ迅速な検査法であることが示された.最終年度(平成27年度)において実施予定である法医実務の応用に向けて,準備が整った.法医学今後(平成27年度)は,実際の解剖例(溺死例及び非溺死例)計50例程度に対して,それらの肺(右肺下葉内部,左肺上葉辺縁部)及び血液(左心血,右心血,大腿静脈血)を検査試料としてLAMP法を試み,新しい簡易迅速診断法として実務利用が可能か否かを最終的に評価する.また,3月までにこれらの研究結果を論文にまとめ,法医学関連の国際誌に投稿し世界に先駆けてその成果を発信したい.また,国際学会等にも積極的に参加し,広く公表したい.本研究の目的は,解剖室でも実施可能な簡便かつ迅速な溺死のスクリーニング検査法を開発することであり,検査の方法は可能な限りシンプルでなければならない.そこで,指標とする細菌の対象は,種レベルではなく,多数の種を一度に検出可能な属ないし科レベルであることが望ましい.そこでまず淡水指標としてAeromomas属,海水指標としてVibrio属及びPhotobacterium属の2つのタイプを検出可能なプライマーセットを設計することを目標とした.しかし,属ないし科レベルで共通するプライマー配列を設計し,さらに実際に他の細菌種に対して交差性を有しない配列を決定するのは非常に困難であり,解析・設計・検討に予想以上に多くの時間を要した.また,当研究施設において,耐震補強工事のため,25年度は2度にわたり,研究室の移転(仮移転・本移転)が実施され,その準備や移設,セットアップ,トラブル対応に多くの時間を費やした.これらの理由から本年度はやや遅れを生じたが,より信頼性の高い検査法を確立するためには,十分な検討が必要であり,また本年度の遅れは次年度へさほど影響しないと考えている.今後はまずLAMP法のための最適なプライマーセットを完成させるために,特異性や検出感度を引き続き検討していく.淡水溺死の指標としてAeromonas属,海水溺死の指標として,Vibrio属及びPhotobacterium属,さらに進捗状況によって,植物プランクトンを検出するための葉緑素遺伝子を指標としたプライマーセットも検討し決定したい.前記したように,研究の進捗状況に若干の遅れが生じたために,プライマー合成及びLAMP法に必要な試薬等の費用が一部未使用となったため.26年度において,LAMP法のための最適なプライマーセットを決定するために,プライマー合成やLAMP法を繰り返し試みる必要があることから,これらの消耗品に未使用の予算を充てる.
コンクリート部分充填鋼製パイプ断面橋脚の地震時保有水平耐力照査法の開発

本研究では、まず、コンクリートを部分的に充填した鋼製パイプ断面橋脚の終局強度と変位を定める際に、必要となるパイプ断面における破壊基準についての検討を行った。このため、圧縮と曲げを受けるパイプ断面短柱について弾塑性有限変位解析により限界ひずみを求めた。解析より得られた限界ひずみをもとに提案した経験式は径厚比パラメータと軸力比の関数で表したものである。この部分の成果は、平成8年9月の土木学会第51回年次学術講演会講演概要集に公表されている。次に、コンクリートを部分的に充填した鋼製パイプ橋脚の弾塑性有限変位解析を行った。破壊基準においては、鋼断面部分ではパイプ断面の限界ひずみが用いられ、コンクリート充填断面部ではこれまでと同様にコンクリートの限界圧縮ひずみを1.1%とした。コンクリート鋼製パイプ橋脚の径厚比パラメータ、細長比パラメータ、軸力およびコンクリートの充填率を変化させてそれらの終局強度と変形能に及ぼす影響を調べた。このパラメトリック解析より得られた結果として、同一充填率の場合、径厚比と細長比が大きいほど強度と変形能が小さいことが分かった。さらに、ある決められた塑性率以上の変形性能が要求されるとき、径厚比パラメータと細長比パラメータをどの程度に設計するかを定量的に求めた。
アルツハイマー病促進因子「バイセクト糖鎖」により制御される新規輸送メカニズム

本研究では、バイセクト糖鎖と呼ばれる神経系の糖鎖に着目し、未だ謎が多いアルツハイマー病(AD)の発症メカニズムの解明を目的とした。本研究により、ADの発症に関わるBACE1と呼ばれる酵素と相互作用する新しい分子Clec4gを同定した。また、AD脳で蓄積した酸化ストレスによってBACE1上のバイセクト糖鎖が増加し、それがAD発症に寄与している可能性が示唆された。これらはADの発症機構を理解する上で重要な知見と考えられる。本研究では、いまだ不明な点が多いアルツハイマー病発症の分子メカニズムをこれまでにない糖鎖の視点から探ることを目的にしている。ごく最近「バイセクト糖鎖」と呼ばれる特徴的な糖鎖がin vivoレベルでアルツハイマー病の発症を促進させることが明らかになったことから、本研究課題ではこの知見を発展させ、バイセクト糖鎖が細胞内でどのように認識され、機能しているのか、その分子機構の解明を目的とする。特に、アルツハイマー病発症において最も重要な分子の一つ、BACE1の細胞内分布がバイセクト糖鎖の欠損によって大きく損なわれることから、BACE1糖タンパク質の細胞内トラフィックに焦点を当て、アルツハイマー病発症に関わる新たな分子メカニズムを明らかにする。平成26年度では、BACE1と結合する分子の中に、バイセクト糖鎖を認識するタンパク質が存在するとの仮説をたて、BACE1と相互作用するタンパク質をマウス脳より生化学的に単離することを試みた。その結果、BACE1の免疫沈降複合体の中に、Clec4gと呼ばれる糖鎖認識タンパク質が含まれていることを質量分析によって同定した。さらに、これら2つの分子が実際に細胞で相互作用していること、Clec4gを細胞に導入することによってBACE1によるアミロイドβの産生量が減少すること、その減少はBACE1の細胞内局在の変化に起因することを見出した。これらの成果を論文としてまとめ、すでに投稿した。現在、revisionの段階に入っている。これらの成果は糖鎖認識タンパク質が、BACE1との相互作用を介してアミロイドβの産生を制御し、ひいてはアルツハイマー病発症に深く関わることを示すものである。最近「バイセクト糖鎖」と呼ばれる特徴的な糖鎖がin vivoレベルでアルツハイマー病の発症を促進させることが明らかになったことから、本研究課題ではこの知見を発展させ、バイセクト糖鎖が細胞内でどのように認識され、機能しているのか、その分子機構の解明を目的とする。これまでに、バイセクト糖鎖によって機能が調節されるアルツハイマー関連糖タンパク質のBACE1に着目し、BACE1と特異的に相互作用する糖鎖結合タンパク質Clec4gを見出した。そしてClec4gはBACE1の細胞内分布を制御することによってアルツハイマー病の原因と言われるアミロイドβペプチドの産生を負に制御していることを明らかにした。これらの成果はFEBS Letters誌に掲載された。さらに、バイセクト糖鎖によるBACE1の細胞内分布とリソソームにおける分解制御には、加齢やアミロイド蓄積に伴う酸化ストレスが関わっていることを明らかにした。これらの成果はBiochemical Journal誌に掲載された。また現在、これらの成果をまとめた総説をMolecular Aspects of Medicine誌とGlycoconjugate Journal誌に寄稿しており、来年度には出版される見通しとなっている。さらに、BACE1以外のバイセクト糖鎖修飾タンパク質でも同様の現象が見られるかどうかを確かめるため、現在バイセクト糖鎖含有糖タンパク質の網羅的な同定を試みている。平成26年度に予想以上に早くBACE1相互作用分子Clec4gが同定できたため、糖鎖を介したこれらの分子の機能解析が予想以上に進展し、FEBS Letters誌とBiochemical Journal誌へ2報の原著論文を掲載するに至った。またBACE1だけにとどまらず、他のバイセクト糖鎖修飾タンパク質でもBACE1と類似の機能を有するかを探索するため、他のバイセクト糖鎖修飾タンパク質の網羅的同定を行っている。これは当初は計画していなかったが、研究が予想以上に早く進展したために実施可能となった。最近「バイセクト糖鎖」と呼ばれる特徴的な糖鎖がin vivoレベルでアルツハイマー病の発症を促進させることが明らかになったことから、本研究課題ではこの地検を発展させ、バイセクト糖鎖が細胞内でどのように認識され、機能しているのか、その分子機構の解明を目的とする。これまでに、バイセクト糖鎖によって機能調節されるアルツハイマー関連糖タンパク質のBACE1に着目し、BACE1と相互作用する糖鎖結合タンパク質Clec4gを見出した。そしてClec4gはBACE1の細胞内分布を制御することによりアルツハイマー病の原因となるアミロイドβペプチドの産生を負に制御していることを明らかにした。この成果はFEBS Letters誌に掲載された。この成果はBiochemical Journal誌に掲載された。また、バイセクト糖鎖の発現機構についてエピゲノム解析を行い、この成果はProteomics誌に掲載された。

さらにバイセクト糖鎖含有糖タンパク質の網羅的な同定にこれまで成功しており、この成果は論文として準備中である。これらの成果の一部は総説として、Trends in Glycoscience and Glycotechnology誌、Molecular Aspects of Medicine誌、Biomoleucles誌等に掲載された。本研究では、バイセクト糖鎖と呼ばれる神経系の糖鎖に着目し、未だ謎が多いアルツハイマー病(AD)の発症メカニズムの解明を目的とした。本研究により、ADの発症に関わるBACE1と呼ばれる酵素と相互作用する新しい分子Clec4gを同定した。また、AD脳で蓄積した酸化ストレスによってBACE1上のバイセクト糖鎖が増加し、それがAD発症に寄与している可能性が示唆された。これらはADの発症機構を理解する上で重要な知見と考えられる。平成26年度は予想以上に早くBACE1と相互作用する糖鎖認識タンパク質Clec4gを同定することができた。これにより、Clec4gを細胞に導入する実験を行うことが出来、Clec4gがBACE1の局在を制御してアミロイドβ産生を負にコントロールすることを示すことができた。現在すでにこれらの結果は論文としてrevisionの段階に入っていることから、本研究課題は順調に進行していると考えられる。今後は、脳からバイセクト糖鎖含有糖タンパク質を網羅的に同定する。得られた糖タンパク質の細胞内局在を野生型マウスとバイセクト糖鎖欠損マウス(GnT-III)の脳で比較し、バイセクト糖鎖が細胞内局在を制御する新しい機能性分子であることを示す。さらにその分子メカニズムを明らかにするため、バイセクト糖鎖と特異的に結合する細胞内タンパク質を生化学的に同定する。また、バイセクト糖鎖修飾タンパク質の一次構造、二次構造から、これまで謎であったバイセクト糖鎖修飾のためのコンセンサスモチーフの探索を試みる。これらの解析によって、バイセクト糖鎖が細胞内で果たす役割を明らかにし、アルツハイマー病を初めとする疾患の新しい治療薬、マーカー開発のための一助となる知見を得る。糖鎖生物学、生化学、分子生物学今後は、同定したClec4gがBACE1とどのように相互作用しているのか、糖鎖を介したものなのか、また糖鎖であるとするならばBACE1上のどの糖鎖構造を認識しているのかを明らかにする予定である。また、本研究の進展によりBACE1の細胞内局在とタンパク質安定性には酸化ストレスが深く関連していることをごく最近見出している。平成27年度以降は、この詳細な分子機序についての解析を行いたい。27年度は、同定したClec4gを介するBACE1の機能解析と、酸化ストレスによるバイセクト糖鎖を介したBACE1の機能制御に関する研究が予想以上に進展し、2報の原著論文の掲載に至った。続いてマウス脳からのバイセクト糖鎖含有糖タンパク質の網羅的同定を試みている。27年度は、2報の論文作成と、計画しているバイセクト糖鎖含有糖タンパク質同定の予備実験にかなりの時間を費やした。その間、予想していたよりも消耗品の使用が抑えられ、18万円程度の残額が生じた。