hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゼブラフィッシュ突然変異体を用いた中枢神経の背腹軸形成機構の解析

脊椎動物の中枢神経系には明確な背腹軸が認められる。本研究では神経管の最も腹側にあるフロアプレート(FP)細胞の誘導機構や終脳の背腹軸形成におけるFGFの役割を、突然変異の利用と胚操作が容易な小型魚類ゼブラフィシュを用いて解析した。1.ゼブラフィシュ突然変異体one-eyedpinhead(oep)(-/-)胚では神経管腹側構造がFPを含め体軸全体にわたって欠損している。本研究では、野生型及びoep(-/-)のオーガナイザー(胚盾)の移植によって二次軸を誘導し、二次軸におけるFPの有無と移植されたドナー細胞の分布を観察することで、FP形成過程の素仮定をとらえることを試みた。その結果、oep遺伝子は、誘導シグナルを受けてFPに分化する細胞において必要であることや、神経管細胞がFP前駆細胞に対しFPへの分化を抑制する新しい相互作用が見つかった。2.近年マウスなどでは、神経領域最前部で発現するFGFが終脳としての領域特異性の成立に重要であることが示された。我々は、ゼブラフィシュ胚においてFgfシグナルの伝達に必須なRas/MAPKカスケードが前脳最先端部で活性化されていることを燐酸化ERKに対する抗体染色を用いて明らかにした。この領域は将来の終脳腹側を形成する領域であり、fgf3とFgf8を発現している。次に、ドミナントネガティブ型に改変されたRasの過剰発現を行った結果、前脳腹側のマーカー、dlxの発現が抑制された。この表現型は、FGF受容体の特異的阻害剤(SU5402)の局所的投与によっても得られた。以上の結果は、Rasを介したFgfシグナルが終脳の腹側領域の形成に関与していることが示された。神経管の最も腹側の組織であるフロアプレート(FP)はオーガナイザー由来の中軸中胚葉からのSonic hedgehog(Shh)により神経管腹側で誘導されることが示されている。しかし、胚発生においていつ、どこで誘導が起きているのかは明確になっていない。近年行われたゼブラフィッシュの大規模なスクリーニングにより、EGF-CFCモチーフを持つ新規の膜タンパク質をコードするone-eyedpinhead(oep)の突然変異体が単離された。oep(-/-)胚は前方中軸中胚葉を欠き、内胚葉にも異常が見られる。また、神経管腹側構造がFPを含め体軸全体にわたって欠損しており、眼が腹側で融合し一つ眼となっている。しかし脊索は存在し、そこでのshhの発現が認められる。本研究では、野生型及びoep(-/-)のオーガナイザー(胚盾)の移植によって二次軸を誘導し、二次軸におけるFPの有無と移植されたドナー細胞の分布とを観察することで、oep(-/-)胚においてFP形成のどの過程に問題があるのかを解明し、FP形成過程の素過程をとらえることを試みた。oep(-/-)の胚盾を野生型胚に移植した場合には野生型細胞がFPに分化したのに対し、野生型の胚盾を移植してもoep細胞はFPに分化しなかった。従ってoep遺伝子は、誘導シグナルを受けてFPに分化する細胞において必要であることが明らかとなった。さらに、oep(-/-)胚の胚盾由来の細胞は決してFP領域に分布することがなかったことから、胚盾で既にFP(前駆)細胞の選別が行われており、FP前駆細胞だけが選択的に神経管腹側に取り込まれることが示唆された。また、実験の過程で神経(前駆)細胞がFP前駆細胞に対しFPへの分化を抑制する新しい相互作用が見つかった。

頭部腹側でも発現するoep遺伝子産物の役割を調べるために、oep変異体に野生型由来の中軸中胚葉を移植して頭部を含む2次胚を誘導することを試みた。しかし、oep胚で移植により終脳まで含む頭部が誘導される頻度が非常に低く、従ってその背腹軸を調べることが現在までできていない。一方、終脳の背腹軸形成の研究過程で、前脳腹が領域の形成にFgf signalが関与していることが判明し研究を推進した。近年マウスなどでは、神経領域最前部で発現するFGFが終脳としての領域特異性の成立に重要であることが示された。ゼブラフィッシュにおいてもfgf8が神経領域最前部で発現しているが、その突然変異体であるacerebellar (ace)では終脳での異常はほとんど認められない。この為、ゼブラフィッシュにではFgfシグナル伝達の終脳形成における機能は不明であった。我々は、ゼブラフィッシュ胚においてFgfシグナルの伝達に必須なRas/MAPKカスケードが前脳最先端部で活性化されていることを燐酸化ERKに対する抗体染色で明らかになった。この領域は将来の前脳腹側を形成する領域であり、Fgf3とFgf8をともに発現している。次に、ドミナントネガティブ型に改変されたRas(Ras^<N17>)の過剰発現を行った結果、前脳腹側のマーカー、dlxの発現が抑制された。この表現型は、FGF受容体の特異的阻害剤(SU5402)の局所的投与によっても得られた。これらの結果は、Rasを介したFgfシグナルが終脳の腹側領域の確立に関与していることが示された。
中国産トキ個体群の遺伝的多様性に関する研究

本研究の目的は、中国に生息するトキ(Nipponia nippon)の遺伝的多様性の現状を明らかにして、近交弱勢を回避する交配システムを確立することである。初年度は、日中の研究者間で共同研究の協定書を締結して、中国側研究者による現地調査をおこなった。中国科学院北京動物学研究所において、死亡個体から採取した組織からの遺伝子サンプルの採取をおこなった。2年目以降は、同サンプルについて、集団内の遺伝的変異(多型)を検出するための分析をおこなった。まず、中国科学院においてミトコンドリア遺伝子の部分配列を決定して近縁種との系統関係を明らかにした(論文発表済)。次に、ミトコンドリア遺伝子全体をlongPCR法により増幅して、全ミトコンドリア遺伝子に相当する約16,700塩基長のDNA断片を作製した。ついで、EcoRIなどの制限酵素で切断して、断片について制限酵素断片長多型(RFLP)の有無を検討した。しかし、分析に供した個体間での多型は全くみられなかった。また、ミトコンドリアDNAのコントロール領域やrRNA遺伝子の塩基配列を決定したが、SNP等の多型はみられなかった。以上から、ミトコンドリアDNAでは多型が検出できないレベルまで、中国産トキの遺伝的多様性は低下していることが四さされた。別な試みとして、最終年度には、正の選択(ヘテロシス)が起こりうる免疫関連遺伝子の個体変異を検出するための新たなプライマーを設計して遺伝子増幅を行った。その結果、免疫関連遺伝子領域と思われるDNA断片が数種類、得られた。さらに、中立的な核遺伝子の多型を検出する目的で、マイクロサテライト遺伝子の分離同定をおこなった。現在までに、ACを繰り返し単位とする反復配列をふくむゲノム断片が数種類得られている。以上の結果は、中国産トキの遺伝的多様性が極端に低下していることを明確に示しており、血縁に配慮した繁殖プログラムの策定に際しては、より詳細なゲノム情報が必要であると考えられる。目的:本研究では、中国に生息するトキの遺伝的多様性の現状を明らかにして、近交弱勢を回避する交配システムを確立することを日標とした。平成13年度は、まずサンプル採集とトキで適用可能な遺伝子マーカーの検討をおこなった。結果と考察:トキは中国政府が最も重視する絶滅危惧種であり、その研究は国家的統制のもとに行われている。そのため、本研究の開始にあたって先ず。日本と中国の研究者間で、共同研究に関する協定書を締結した(平成13年6月)。次いで、中国側の共同研究者(李、魏、丁)が、陜西省洋県のトキ保護区での現地調査と血液サンプルの採取をおこなった。また、北京動物園の飼育個体からも採血をおこない、両地区で合わせて42個体からの遺伝子試料を採取した。中国科学院北京動物学研究所においてDNA抽出と遺伝子増幅をおこなった。その結果、ミトコンドリアのコントロール領域では、鳥類の共通プライマーを用いることで遺伝子増幅産物がえられることが確認された。しかし、そのほかの遺伝子領域については、既存のプライマーでは、遺伝子増幅が困難であった。2個体についてコントロール領域の全塩基配列を決定して他種との系統関係を調査したところ、データベースにある配列中では、ブロンズトキに最も近いことが明らかになった。ミトコンドリア遺伝子以外のマーカーとしてAFLPを用いた分析も試みたが、DNAを多く必要とする短所のために、必ずしも有効ではないことが明らかになった。したがって、今年度は、主にミトコンドリアDNAについて、集団内の変異を検出するための遺伝子解析を継続した。

平成14年3月に北京において研究会議を開催して、平成13年度の研究総括と、次年度以降の研究計画の再検討をおこなった。目的:本研究では、中国に生息するトキの遺伝的多様性の現状を明らかにして、近交弱勢を回避する交配システムを確立することを目標とした。平成14年度はサンプル採集とミトコンドリアマーカーを用いた集団内の遺伝的変異の検出をおこなった。結果と考察:前年度の取り決めにもとづいて、中国側研究者によりトキ保護区での現地調査とサンブル採集が行われた。次に中国科学院北京動物学研究所においてDNA抽出と遺伝子増幅をおこなった。更に、中国側研究者が来日して、遺伝子分析作業を共同で実施した。前年度はミトコンドリアDNAの全体を増幅することができなかったが、今回は新たなブライマーを設計して、Long PCR法による遺伝子増幅を試みたところ、ほぼ全体にわたる約16000塩基長の増幅産物がえられた。また、ミトコンドリアDNAを4つの部分にわけてPCRをおこない、それぞれの領域から遺伝子産物を得た。えられたPCR産物はプラスミドベクターを用いて、クローニングした。えられたPCR産物を制限酵素で切断して、個体ごとの制限酵素断片長多型(RFLP)の有無を検討した.その結果、数種類の6塩基認識制限酵素を用いた場合に、RFLPが検出された。また、Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)を適用したところ、EcoRl断片での個体特異的バンドが検出された。以上から、洋県保護区におけるトキ集団では、ミトコンドリア遺伝子と核遺伝子のいずれにおいても、集団内変異が未だに維持されていることが示唆された。本研究の目的は、中国に生息するトキ(Nipponia nippon)の遺伝的多様性の現状を明らかにして、近交弱勢を回避する交配システムを確立することである。そのため、今年度は、昨年度までの現地調査で採取したDNAサンプルについて、集団内の遺伝的変異(多型)を検出するための分析をおこなった。まず、中国科学院においてミトコンドリア遺伝子の全体をlongPCR法により増幅して、全ミトコンドリア遺伝子に相当する約16,700塩基長のDNA断片を作製した。次に、EcoRI、HindIIIなどの制限酵素で切断して、断片について制限酵素断片長多型(RFLP)の有無を検討した。しかし、分析に供した個体間での多型は全くみられなかった。また、ミトコンドリアDNAのコントロール領域やrRNA遺伝子の塩基配列を決定したが、SNP等の多型はみられなかった。以上から、ミトコンドリアDNAでは多型が検出できないレベルまで、中国産トキの遺伝的多様性は低下していることが四さされた。別な試みとして、正の選択(ヘテロシス)が起こりうる、すなわち多型性が期待できる、免疫関連遺伝子の個体変異を検出するための新たなプライマーを設計して遺伝子増幅を行った。その結果、免疫関連遺伝子領域と思われるDNA断片が数種類、得られた。
アバタ表情解釈の文化間比較に関する研究

近年のネットワークコミュニケーションでは感情表現のためにアバタがよく利用されるが,これらのアバタの顔や表情の意味は,特に断らなくても任意の利用者間で普遍的に共有されるものという暗黙的な前提の下で使用されている.しかし,研究代表者の先行研究では,日本人がデザインしたアバタの表情解釈には文化差が存在し,人間の表情解釈の文化差に関する知見(イングループ・アドバンテージ)がアバタ解釈にも当てはまることが示唆された.本研究では,日本人以外のデザイナによるアバタデザインの解釈実験を行い,アバタ表情解釈の文化差のさらなる実証的検証を目的としている.平成18年度は欧米4カ国のアバタデザインの準備や実験用サーバなどの実験設備を整えた.平成19年度は,国内外の実験協力者を訪問して被験者を募集し,実験用アプリケーションを開発し,2007年9月から12月(第1次),2008年2月から3月(第2次)に渡ってWeb上で実験を行った.第1次実験において927名,第2次において469名の被験者を得ることができた,その結果,欧米デザイナによるアバタ表情解釈では日本人の解釈一致率が他国の被験者より低い傾向にあることが観察された.特に解釈のばらつきの大きな表情では日本人の解釈一致率が最も低い傾向にあるととがわかった.しかし,イングループ・アドバンテージを示す明確かつ有意な解釈差を得ることはできなかった.平成19年4月に平成18年度のアバタ解釈の研究成果を雑誌論文として発表し,平成20年1月に国際ワークショップにて欧米デザイナによるアバタ解釈の文化差実験の結果を発表した.今後も上記のWeb実験を続行し,より多くの被験者の回答を収集して文化差分析を続けていく予定である.また,本研究を遂行するに当たって,アジア5カ国および欧米5カ国の研究協力者と,擬人化エージェントの見かけや振舞いの文化的妥当性に関する研究ネットワークを構築することができた.今後も文化差研究を共同実施していくとともに,当該分野で国際ワークショップを共同開催するなど,研究活動を広げていく予定である.近年のネットワークコミュニケーションでは感情表現のためにアバタがよく利用されるが,これらのアバタの顔や表情の意味は,特に断らなくても任意の利用者間で普遍的に共有されるものという暗黙的な前提の下で使用されている.当研究ではアバタの見かけ(顔つきや表情)の文化的妥当性を実証的に検証することを目的とする.研究代表者の先行研究では,アバタの表情解釈には文化差が存在することが検証された.先行研究の結果をさらに検証するために,先行研究で使用した日本人デザイナによるアバタだけでなく,他の国のデザイナによるアバタデザインの評価を行いアバタ表情解釈の文化差の実証的検証を目的としている.平成18年度は下記を中心に研究を実施した.1.実験環境の整備実験の実施にあたり,実験用PC (Dell XPS710)を購入した.2.日本人以外によるアバタデザインの発注と入手日本人以外のデザイナによるアバタデザインとして,イギリス,アメリカ,フランスのデザイナーにアバタ表情デザインを発注し入手した.3.実験協力先の発掘と依頼アバタの表情解釈実験には,世界各国の研究者の協力を得て被験者を集める必要がある.擬人化キャラクタ研究に取り組むドイツとオランダの研究者を訪問し,実験への協力を依頼した。実験協力先の研究機関および研究代表者は以下のとおりである.Prof.Dr.Elisabeth Andre(アウグルブルク大学,ドイツ).Prof.Dr.Christoph Bartneck(アイントホーフェン工科大学,オランダ)4.情報収集HAI2006シンポジウムに参加し,擬人化キャラクタ研究に関する情報交換およびアバタ解釈の文化比較に関する貴重な意見交換を行なった.実験の実施と評価は平成19年度以降に行う予定である.近年のネットワークコミュニケーションでは感情表現のためにアバタがよく利用されるが,これらのアバタの顔や表情の意味は,特に断らなくても任意の利用者間で普遍的に共有されるものという暗黙的な前提の下で使用されている.しかし,研究代表者の先行研究では,日本人がデザインしたアバタの表情解釈には文化差が存在し,人間の表情解釈の文化差に関する知見(イングループ・アドバンテージ)がアバタ解釈にも当てはまることが示唆された.本研究では,日本人以外のデザイナによるアバタデザインの解釈実験を行い,アバタ表情解釈の文化差のさらなる実証的検証を目的としている.平成18年度は欧米4カ国のアバタデザインの準備や実験用サーバなどの実験設備を整えた.平成19年度は,国内外の実験協力者を訪問して被験者を募集し,実験用アプリケーションを開発し,2007年9月から12月(第1次),2008年2月から3月(第2次)に渡ってWeb上で実験を行った.第1次実験において927名,第2次において469名の被験者を得ることができた,その結果,欧米デザイナによるアバタ表情解釈では日本人の解釈一致率が他国の被験者より低い傾向にあることが観察された.特に解釈のばらつきの大きな表情では日本人の解釈一致率が最も低い傾向にあるととがわかった.しかし,イングループ・アドバンテージを示す明確かつ有意な解釈差を得ることはできなかった.平成19年4月に平成18年度のアバタ解釈の研究成果を雑誌論文として発表し,平成20年1月に国際ワークショップにて欧米デザイナによるアバタ解釈の文化差実験の結果を発表した.

今後も上記のWeb実験を続行し,より多くの被験者の回答を収集して文化差分析を続けていく予定である.また,本研究を遂行するに当たって,アジア5カ国および欧米5カ国の研究協力者と,擬人化エージェントの見かけや振舞いの文化的妥当性に関する研究ネットワークを構築することができた.今後も文化差研究を共同実施していくとともに,当該分野で国際ワークショップを共同開催するなど,研究活動を広げていく予定である.
カドミウム汚染地域住民の骨代謝異常発症の危険因子に関するコホート研究

富山県神通川流域カドミウム(Cd)汚染地域24集落に居住し,大正3(1914)年から昭和4(1929)年の間に出生した女性住民を対象とした。1985年に尿細管機能と骨代謝に関する詳細な検索を実施した50例について,2000年12月2001年12月の間に同様の検査を実施し,尿細管機能異常に伴う骨代謝異常の病態ならびに発症の危険因子を検討した。現在までに解析の完了した22例(7380歳)について,尿細管機能と骨代謝機能に関する1985年と2001年の成績を比較した結果,以下の知見を得た。体重,身長は有意に低下した。尿中総タンパク,β_2-ミクログロブリン(β_2-M),グルコース排泄は有意に増加しており,また,糸球体濾過値は62ml/minから53ml/minへと有意に減少し,尿細管障害の進行・悪化が認められた。尿中に排泄されるCaの割合は低下していたが,糸球体濾過量の低下による尿排泄量の減少と考えられた。さらに,血清カルシウム,無機リン値の有意な上昇がみられたが,同様に糸球体濾過量の低下によるものと考えられた。中手骨Digital Image Processing(DIP)法による骨量評価では,BMC値が2.01mmAlから1.69mmAlへと低下し,骨量の有意な減少がみられた。4例において,骨レントゲン検査所見において骨改変層様の変化を認め,骨軟化症が疑われた。カドミウム腎症22例の16年にわたる長期観察の結果,イタイイタイ病と考えられる4例を見い出した。4例中3例は糸球体濾過値の低下が顕著であり,また尿細管リン最大再吸収値(TmP/GFR)も著しく低下しており,腎機能の低下,血清無機リン濃度の減少が骨軟化症発症の主要な病態と考えられた。`富山県神通川流域カドミウム(Cd)汚染地域24集落に居住し,大正3(1914)年から昭和4(1929)年の間に出生した女性住民を対象とした。`富山県神通川流域カドミウム汚染地域の女性住民に多発したイタイイタイ病は,多発性近位尿細管機能異常症と骨軟化症を特徴とするきわめて慢性に経過する疾患である。その病理発生機序はカドミウムによる近位尿細管機能異常症(カドミウム腎症)による骨軟化症,すなわち尿細管性骨軟化症と考えられている。本研究の目的は,尿細管障害例の尿細管機能異常ならびに骨代謝の経過および相互の関連を検討し,骨代謝異常発症の危険因子を明らかにすることである。神通川流域カドミウム汚染地域11集落に居住する大正7(1918)年から昭和2(1927)年生まれの女性住民全員137名を対象に,早朝尿中β_2-ミクログロブリン(β_2-M)ほかを測定した。参加者数103名(参加率75%)であった。103名中尿β_2-M値1mg/g creatinineを超えた57例を対象に,尿細管機能と骨代謝に関する詳細な検索を行った。57例中,1985年に検索し得た例は26名であった。現在までに諸測定が終了した10名(7380歳)について解析し,以下の知見を得た。10例中2例(Case4,Case8)に骨レントゲン検査において骨改変層様の所見を認め,骨軟化症の発症が考えられた。本2例は,他の8例に比較し1985年におけるクレアチニンクリアランス(Ccr)値が低く,15年後にさらにCcr値の顕著な低下をみた。

また血清カルシウム(Ca),無機リン(iP)値の低下を認め,とくに血清iPの低下の程度が顕著であった。本2例の尿細管最大再吸収値(TmP/GFR)は10例中最低値を示していた。したがって,腎機能の低下,血清無機リン濃度の減少が骨軟化症発症の主要な病態と考えられた。昨年度に引き続き,神通川流域カドミウム汚染地域11集落に居住する大正7(1918)年から昭和2(1927)年生まれの女性住民全員147名を対象に,早朝尿中β_2-ミクログロブリン(β_2-M)ほかを測定した。参加者は120名(参加率82%)であった。120名中尿β_2-M値1mg/g creatinineを超えた64例(53%)を対象に,尿細管機能と骨代謝に関する詳細な検索を行った。64例中24例については,1985年にも同様の検索を実施している。昨年度実施した精密検査において,1985年と2000年の両検査を受検した22例(7380歳)について,尿細管リン再吸収率(%TRP),尿細管リン最大再吸収値(TmP/GFR),カルシウム排泄率(FEca)ほかの1985年と2000年の成績を比較し,以下の知見を得た。体重,身長,糸球体濾過値(Ccr)の有意な低下を認めた。尿中に排泄されるCaの割合は減少していた。尿中総タンパク,β_2-M,グルコース排泄および血清Ca, iP値の有意な上昇がみられた。中手骨DIP法による骨量の有意な低下がみられた。4例は骨レントゲン検査所見において骨改変層様の変化を認め,骨軟化症が疑われた。カドミウム腎症22例の15年にわたる長期観察の結果,イタイイタイ病と考えられる4例を見い出した。4例中3例はCcrの低下が顕著であり,またTmP/GFRも著しく低下しており,腎機能の低下,血清無機リンの減少が骨軟化症発症の主要な病態と考えられた。
多階層グラフ構造に着目したソーシャルセンサネットワークの構築

本研究では,ソーシャルネットワーキングサービス(SNS)より観測された情報より,防災情報,交通情報等の地理的に依存する環境情報を推定するソーシャルセンサネットワークについて検討する.ソーシャルセンサネットワークが持つ多階層グラフ構造および社会ネットワークにおけるユーザダイナミクスを考慮することにより,社会的信頼性の高い環境情報を広範囲かつ高解像度に推定する手法を確立する.本研究では,ソーシャルネットワーキングサービス(SNS)より観測された情報より,防災情報,交通情報等の地理的に依存する環境情報を推定するソーシャルセンサネットワークについて検討する.ソーシャルセンサネットワークが持つ多階層グラフ構造および社会ネットワークにおけるユーザダイナミクスを考慮することにより,社会的信頼性の高い環境情報を広範囲かつ高解像度に推定する手法を確立する.
自己免疫性甲状腺疾患においてT細胞が認識するチログロブリンの甲原構造に関する研究

チログロブリン(Tg)は、分子量約66万の大きな糖蛋白であり、その分子表面には多数の抗原決定基が表現されている。しかし、このTgの分子構造,およびTgに対する自己免疫応答にて認識される抗原決定基の部位としてその構造は、判明していない。我々は、今までに、Tgに対する自己抗体の認識する抗原決定基は、Tgの極めて限局された部位に存在し、異なった種属間に共通に存在していること,そしてこの決定基の構造はTgの高次構造よりなることを明らかにしてきた。今回は、橋本病患者T細胞の認識するTg抗原決定基を、Tgに対するT細胞の分裂能を指標として解析した。これより以下の点が明らかとなった。1.T細胞は、種属の異なる動物由来のTgにも高応答性を示すことから、種属間に共通に存在するTg抗原決定基を認識している。2.自己抗体も種属間に共通のTg抗原決定基を認識している。これより同一患者における抗体とT細胞の異種動物Tgへの特異性を比較したところ、抗体とT細胞ではその特異性が異なっていた。すなわち、T細胞とB細胞はTgの異なった部位を認識していると考えられた。3.19sTgをStaphylococcus aureus V8プロテアーゼで処理後、高速液体クロマトグラフィにてTgフラグメントの分画を行なった。その結果、390K,230K,100K,42.5K,25K,14Kの6つのTgフラグメント分画を得た。T細胞は、これらすべての分画に応答性を示した。4.Tgをジチオスレイトール(DTT)にて処理し、Tgのジスルフィド結合を切断することによりTg高次構造を変化させた。このDTT処理Tgに自己抗体は、ほとんど結合できないが、T細胞は自然Tgに対するのと同様にDTT処理Tgに高応答性を示した。以上より、橋本病患者T細胞は種属間に共通に存在する抗原決定基を認識し、自己抗体がTgの高次構造を選択的に認識しているのに対し、T細胞は主にTgの一次構造よりなる抗原決定基に対して応答していると考えられた。
小胞体ストレス蛋白ORP150のパーキンソン病発症における関与の解明

小胞体ストレスが虚血性神経細胞死やパーキンソン病の黒質変性に関与しているかをORP150TgとKOマウス、および種々の強制発現系を用いて組織化学的、生化学的に検討した。Wtに比して、Tg由来の培養神経細胞は低酸素暴露に対して抵抗性を示し、反対にKOのそれは脆弱性を示した。マウス中大脳動脈閉塞後の脳梗塞面積および体積は、WtやKOに比してTgで有意に縮小していた。この神経保護作用は虚血環境下でのBDNFの分泌促進を介していることが明らかとなった(Nat Med,7:317-313,2001)。また、Tg神経細胞は興奮性アミノ酸に対しても抵抗性を示し、反対にKO神経細胞では細胞内Ca++濃度の上昇が遷延していた。さらにadenovirusによるORP150の過剰発現は砂ネズミ一過性前脳虚血による遅発性神経細胞死を抑制した(J Cereb Blood Flow Metab,22:979-87,2002)。これらの結果は、神経細胞死を引き起こす種々の環境ストレスが小胞体を標的としていることを示している。次にMPTP投与(30mg/kg,5日間)によるパーキンソンモデルの黒質神経に小胞体ストレスが起こるか否かを検討した。MPTP投与終了後7日目には黒質tyrosine hydroxylase (TH)陽性細胞は約50%に減少し、これらの細胞ではORP150が強く発現しており、黒質ドパミン神経変性の過程で小胞体ストレスが誘導されていることを強く示唆した。そしてMPTP投与後の黒質神経細胞変性過程をTHによる免疫組織化学と線条体ドパミン濃度測定により検討すると、KOマウスではWtに比して早期に神経変性が誘導されること、反対にTgマウスでは変性過程が遷延することが明らかとなった(論文作成中)。以上のことはMPTPによる神経細胞死はミトコンドリアを起源とする細胞死が主座をなすが、同時に小胞体を介する細胞死も関与することを示している。本研究によりパーキンソン病治療のターゲットとして小胞体ストレス軽減対策が有用であり、今後臨床的に応用される可能性が示唆された。Wtマウスに比して、Tgマウス由来の培養神経細胞は低酸素暴露に対して抵抗性を示し、反対にKOマウスのそれは脆弱性を示した。マウス中大脳動脈閉塞後の脳梗塞面積および体積は、WtやKOマウスに比してTgマウスで有意に縮小していた。この神経保護作用は虚血環境下でのBDNFの分泌促進を介していることが明らかとなった(Nat Med,7:317-323,2001)。また、Tgマウスは興奮性アミノ酸に対しても抵抗性を示し、反対にORP150KO神経細胞では興奮性アミノ酸による細胞内Ca++濃度の上昇が遷延していた(投稿中)。さらに、adenovirus vectorによるORP150の過剰発現は砂ネズミ一過性前脳虚血による遅発性神経細胞死を抑制した(投稿中)。これらの結果は、神経細胞死を引き起こす種々の環境

ストレスが小胞体を標的とすることを示している。次にMPTP投与(30mg/kg,5日間)によるパーキンソンモデルの黒質神経に小胞体ストレス反応が起こるか否かを検討した。MPTP投与終了後7日目には黒質tyrosine hydroxylase(TH)陽性細胞は約50%に減少し、これらの細胞ではORP150が強く発現していた。以上の結果は黒質ドパミン神経変性の過程で小胞体ストレスが誘導されていることを強く示唆する。しかしながら、現在までMPTP投与後の残存黒質TH陽性細胞数はORP150TgマウスとKOマウス間に明らかな差は認められていない。このことはMPTPによる神経細胞死がミトコンドリアを起源とする細胞死であるため、小胞体ストレスによる細胞死を検出しえない可能性が考えられる。今後、神経変性の時間的経過をより詳細に検討していく必要があるが、同時に小胞体とミトコンドリアのクロストークを検討することが重要と考えられた。小胞体ストレスが虚血性神経細胞死やパーキンソン病の黒質変性に関与しているかをORP150TgとKOマウス、および種々の強制発現系を用いて組織化学的、生化学的に検討した。Wtに比して、Tg由来の培養神経細胞は低酸素暴露に対して抵抗性を示し、反対にKOのそれは脆弱性を示した。マウス中大脳動脈閉塞後の脳梗塞面積および体積は、WtやKOに比してTgで有意に縮小していた。この神経保護作用は虚血環境下でのBDNFの分泌促進を介していることが明らかとなった(Nat Med, 7:317-313, 2001)。また、Tg神経細胞は興奮性アミノ酸に対しても抵抗性を示し、反対にKO神経細胞では細胞内Ca++濃度の上昇が遷延していた。さらにadcnovirusによるORP150の過剰発現は砂ネズミー過性前脳虚血による遅発性神経細胞死を抑制した(J Cereb Blood Flow Metab, 22:979-87, 2002)。これらの結果は、神経細胞死を引き起こす種々の環境ストレスが小胞体を標的としていることを示している。次にMPTP投与(30mg/kg,5日間)によるパーキンソンモデルの黒質神経に小胞体ストレスが起こるか否かを検討した。MPTP投与終了後7日目には黒質tyrosine hydroxylase (TH)陽性細胞は約50%に減少し、これらの細胞ではORP150が強く発現しており、黒質ドパミン神経変性の過程で小胞体ストレスが誘導されていることを強く示唆した。そしてMPTP投与後の黒質神経細胞変性過程をTHによる免疫組織化学と線条体ドパミン濃度測定により検討すると、KOマウスではWtに比して早期に神経変性が誘導されること、反対にTgマウスでは変性過程が遷延することが明らかとなった(論文作成中)。以上のことはMPTPによる神経細胞死はミトコンドリアを起源とする細胞死が主座をなすが、同時に小胞体を介する細胞死も関与することを示している。本研究によりパーキンソン病治療のターゲットとして小胞体ストレス軽減対策が有用であり、今後臨床的に応用される可能性が示唆された。
エゾシカの個体数制御を目的とした避妊ワクチン開発―抗原選択とその避妊効果の解明―

昨年度行った飼育下エゾシカへのブタ透明帯糖蛋白質に基づく合成ペプチド投与試験において透明帯糖蛋白質の種特異性が示唆された。そのため本年度は、透明帯糖蛋白質の種特異性をより詳細に検討することを目的として、エゾシカ卵巣サンプルを材料としてエゾシカの透明帯糖蛋白質の遺伝子をクローニングし、その塩基配列の同定を行った。その結果、同定した領域全体において、ブタにおける配列との相同性は塩基配列で93%、アミノ酸配列で84%であった。そのうち昨年度の投与試験に用いた合成ペプチドの基となった領域においては塩基配列で93%、アミノ酸配列では88%であり、投与試験により示された種特異性の原因になっていることが推察された。また、同定された領域内に、アミノ酸配列のブタとの相同性が50%、牛との相同性が60%となる非常に特異性の高い領域が含まれている事が明らかになった。その後、それら2つの領域の種特異性に関して、それらの領域の蛋白質に対して産生された抗体の、標的抗原への結合能や受精阻害能を含めたより精密な検証を行うため、それぞれのアミノ酸配列に基づき合成ペプチドを作成した。作成した合成ペプチドは今後、実験動物にそれぞれ免疫してポリクローナル抗体を作成し、免疫組織化学や体外受精阻害試験を用いて種特性を検証し、高い種特異性が示された合成ペプチドは、飼育下エゾシカを用いた投与試験に用いる。避妊効果の種特異性はエゾシカ避妊ワクチン開発におけるもっとも重要な課題であり、今回示唆された透明帯糖蛋白質の種特異性は今後避妊ワクチン開発を進めていくにあたっての重要な情報である。本年度は、種特異性の高い抗原蛋白質の選定を目的として、合成ペプチドを用いた臨床実験を行った。合成ペプチドは他の研究でオジロジカにおける抗体産生が報告されているブタ透明帯糖蛋白質の一部であるpZP1のB細胞エピトープ領域に基づいて設計し、キャリアー蛋白質としてKLH(Keyhole limpet hemocyanin)を結合させた。ワクチン投与実験には、飼育下のエゾシカ3頭を用い、うち1頭をコントロールとした。投与は2週間間隔で4回行い、一回につき合成ペプチドワクチン500μgとアジュバンド(Titer Max Cold ; Titer Max)400μlを混合したエマルジョンを4等分し、左右下肢および臀部の筋肉内に投与した。投与と同時に採血を行い、ELISAによる抗体価の測定に用いた。最終投与後3日目に大量採血を行い、得られた血清を免疫組織化学的解析に用いた。抗体価測定の結果、投与個体において著しい抗体価の上昇が認められた。免疫組織化学的解析は、ブタ卵巣およびエゾシカ卵巣への抗体結合の確認を目的に行った。その結果、ブタ卵巣への結合は認められたが、エゾシカ卵巣への結合は認められなかった。ここまでで得られた結果を考察するとエゾシカとブタでpZP1のB細胞エピトープのアミノ酸配列が異なるという仮説がたてられる。これは、ZP1のB細胞エピトープの種特異性を示唆するものであるため、今後は、エゾシカにおけるZP1のB細胞エピトープの配列を明らかにすることで、エゾシカ避妊ワクチン開発に向けた種特異的抗原蛋白質の選定を行う。現在はエゾシカ卵巣組織を材料としてRT-PCRを行い、エゾシカZP1のB細胞エピトープの遺伝子を増幅し、その塩基配列を同定する作業を行っている。
アセチルコリン受容体の構造, 機能ならびに遺伝子発現に関する研究

我々は高等動物における脳神経機能を分子レベルで解明すべく,組換えDNA技術を用いて神経情報伝達に中心的な役割を担っている神経伝達物質受容体およびイオンチャンネルの構造と機能に関する研究を進めてきた.すなわち, cDNAのクローニングとその塩基配列の決定により,典型的な神経伝達物質依存性イオンチャンネルであるニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)のすべてのサブユニットの全一次構造,代表的な電位依存性イオンチャンネルであるNa^+チャンネルおよびCa^<2+>チャンネルと考えられるCa^<2+>チャンネルブロッカー受容体の全一次構造ならびにGTP結合性制御蛋白(G蛋白)を介して情報を伝達するムスカリン性アセチルコリン受容体(mAChR)の全一次構造を解明し,神経情報伝達を担う膜蛋白はその構造,機能,進化的類似性から上記の三つの基本型に分類できることを示した.またcDNAのクローニングによって, nAChRのサブユニットには従来知られていたα,β,γおよびδサブユニット以外に新しいサブユニット(εサブユニットと命名)が存在すること,脳に一次構造の異なるNa^+チャンネルが少なくとも三種類存在すること,および一次構造の異なるmAChRが少なくとも二種類存在することを発見した.さらにcDNAから機能を有する神経伝達物質受容体およびイオンチャンネルを発現させる系を開発し,発現させた受容体およびチャンネルの性質を電気生理学的,薬理学的ならびに生化学的に解析することにより,神経支配に伴って起こるnAChRの機能変化はγサブユニットからεサブユニットへの切り換えに基づくこと,ならびにmAChRサブタイプは異なる遺伝子産物であることを見い出すとともに,脳のNa^+チャンネルの特性を明らかにした.またcDNAのsite-directed mutagenesisによって, nAChRのイオン透過速度の決定およびアゴニストの結合に関与する機能部位を明らかにした.我々は高等動物における脳神経機能を分子レベルで解明すべく,組換えDNA技術を用いて神経情報伝達に中心的な役割を担っている神経伝達物質受容体およびイオンチャンネルの構造と機能に関する研究を進めてきた.すなわち, cDNAのクローニングとその塩基配列の決定により,典型的な神経伝達物質依存性イオンチャンネルであるニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)のすべてのサブユニットの全一次構造,代表的な電位依存性イオンチャンネルであるNa^+チャンネルおよびCa^<2+>チャンネルと考えられるCa^<2+>チャンネルブロッカー受容体の全一次構造ならびにGTP結合性制御蛋白(G蛋白)を介して情報を伝達するムスカリン性アセチルコリン受容体(mAChR)の全一次構造を解明し,神経情報伝達を担う膜蛋白はその構造,機能,進化的類似性から上記の三つの基本型に分類できることを示した.またcDNAのクローニングによって, nAChRのサブユニットには従来知られていたα,β,γおよびδサブユニット以外に新しいサブユニット(εサブユニットと命名)が存在すること,脳に一次構造の異なるNa^+チャンネルが少なくとも三種類存在すること,および一次構造の異なるmAChRが少なくとも二種類存在することを発見した.さらにcDNAから機能を有する神経伝達物質受容体およびイオンチャンネルを発現させる系を開発し,発現させた受容体およびチャンネルの性質を電気生理学的,薬理学的ならびに生化学的に解析することにより,神経支配に伴って起こるnAChRの機能変化はγサブユニットからεサブユニットへの切り換えに基づくこと,ならびにmAChRサブタイプは異なる遺伝子産物であることを見い出すとともに,脳のNa^+チャンネルの特性を明らかにした.またcDNAのsite-directed mutagenesisによって, nAChRのイオン透過速度の決定およびアゴニストの結合に関与する機能部位を明らかにした.(1)ウシ骨格筋のニコチン性アセチルコリン受容体δサブユニットのcDNAを単離し、その塩基配列を決定することにより、このサブユニットの全一次構造を明らかにした。(2)ウシ骨格筋ニコチン性アセチルコリン受容体の新しいサブユニットをcDNAクローニングにより発見し、εサブユニットと名付け、その全一次構造をcDNAの塩基配列から明らかにした。さらに我々が開発したcDNAの発現系を用いることにより、本サブユニットがシビレエイのアセチルコリン受容体のγサブユニットに代替し機能を有する受容体を形成することを示した。(3)クローン化したアセチルコリン受容体サブユニットcDNAをsite-directed mutagenesisによって改変し、発現させ、生成した変異受容体の機能を調べることにより、シビレエイアセチルコリン受容体αサブユニットの機能部位を明らかにした。(4)シビレエイおよびウシアセチルコリン受容体4つのサブユニットcDNAからそれぞれの受容体を発現させ、その機能をsingle-channel recording法で解析することにより両者の受容体イオンチャンネルの平均開口時間に大きな違いのあることを見いだした。さらに両者の雑種受容体をcDNA発現系によって作成し、それらの機能を調べることによりアセチルコリン受容体イオンチャンネルの開閉にδサブユニットが重要な役割を果していることを見い出した。(5)クローン化した電気ウナギNaチャンネルcDNAをプローブとしラット脳のNaチャンネルcDNAをクローン化することによって、ラット脳には少なくとも3種類のNaチャンネルmRNAが存在することを明らかにするとともに、そのうち2種類のNaチャンネルの全一次構造をcDNAの塩基配列から決定した。1.ラットニコチン性アセチルコリン受容体γおよびεサブユニット遺伝子を単離した。2.ブタ脳ムスカリン性アセチルコリン受容体CDNAを単離し、その塩基配列の決定により、本受容体の全一次構造を解明した。さらにCDNAから機能を有する受容体を発現させることにも成功した。3.ブタ心筋ムスカリン性アセチルコリン受容体CDNAを単離し、その塩基配列の決定により、本受容体の全一次構造を明らかにした。

これらの結果から薬理学的性質の異なるムスカリン性アセチルコリン受容体のサブタイプは異なる遺伝子の産物であることが示唆された。4.シビレエイおよびウシニコチン性アセチルコリン受容体δサブユニットキメラをそれぞれのCDNAの部分的組換えにより作成し、これらのキメラδサブユニットを含む受容体を発現させ単一チャンネルコンダクタンスを解析した。その結果、ニコチン性アセチルコリン受容体δサブユニットの膜貫通領域の一つと考えられる【M_2】とその近傍がニコチン性アセチルコリン受容体イオンチャンネルのイオン透過速度の決定に重要な役割を果していることを明らかにした。5.ウシニコチン性アセチルコリン受容体の5種類のサブユニットを様々な組合せで発現させ、単一チャンネルの性質をパッチクランプ法で解析し、また各サブユニット、mRNA量を発生の各時期で比較することにより、神経支配に伴って起こるニコチン性アセチルコリン受容体の機能的変化はγサブユニットからεサブユニットへの切り換えに基づくことを明らかにした。6.クローン化したラット脳NaチャンネルCDNAから機能を有するNaチャンネルを発現させ、その機能が脳poly【(A)^+】RNAから発現させたNaチャンネルと本質的に差のないことを示した。この結果よりNaチャンネルの機能が発現にはlarge polypeptideのみで充分であることが明らかになった。
連続パラメタを持つ確率過程に対する質量輸送問題

RをR^d(d【greater than or equal】1)上の確率密度関数とする。Rによって非等方化されたR^d上のグラフのガウス曲率流について、我々は、以下の成果を得た:ガウス曲率流の離散近似確率過程列の構成;ガウス曲率流を記述する偏微分方程式の弱解の存在と一意性:上記偏微分方程式の弱解は粘性解である事の証明。pとRをR^d(d【greater than or equal】1)上の確率密度関数とする。確率密度関数pとRを持つR^d値確率変数X、Yの内で、E[|X-Y|^2]を最小にするものは、ある凸関数φを用いて、Y=Dφ(X)と書けることが、質量輸送問題において知られている。ところで、(Rによって)非等方化されたR^d上のグラフのガウス曲率流について、我々は、以下の成果を得た:ガウス曲率流の離散近似確率過程列の構成、ガウス曲率流を記述する偏微分方程式の弱解の存在と一意性、上記偏微分方程式の弱解は粘性解である事の証明。今後は、ガウス曲率流の離散確率近似の精度の数値計算による研究、及び、質量輸送問題とガウス曲率流を特別な場合として含む理論の構成を行うことが課題である。
全生活環の形質に基づく子のう菌類の科の系統学的再検討

子のう菌類の種多様性の全容を解明するためには、従来の分類基準に加え無性世代の形態学的特徴や分子系統情報を積極的に取り込む必要がある。本研究では全生活環に基づく分類体系の基盤構築から、有性世代に基づく従前の科の概念の妥当性を再検討した。(1)ロフィオストーマ科の事例: Lophiostomabipolare類似菌について複数の領域に基づく分子系統解析と形態観察を行った。結果として、本菌群には11種の隠ぺい種が含まれ、ロフィオストーマ科内で既知の3属と6新属に散在することを明らかにした。(2)メラノンマ科の事例:広義メラノンマ科には無性世代の特徴で明らかに異質なグループが含まれることを明らかにした。結果としてメラノンマ科を再定義した上で1新科2新種1新組み合わせを提唱した。無性世代の形態学的特徴から宿主植物との共進化の関係も明らかにした。(3)ロフィオトレマ科の事例:広義ロフィオトレマ科について複数の領域に基づく分子系統解析と形態観察を行った。結果として、ロフィオトレマ科を再定義した上で3新科7新属8新種2新組み合わせを提唱した。申請者は、有性世代を重視した従前の分類体系の問題点を明らかにし、全生活環に基づき子のう菌類の科概念を再構築した。結果として、無性世代により科概念が補強される事例、無性世代により科が分割されるグループの事例、無性世代のみで構成されるグループの事例を明らかにした。これらのサンプリング調査の過程で付随的に発見した分類学上興味深い属や種については、共同研究の論文で発表した。本研究で用いた標本は弘前大学菌類標本室(HHUF)に寄贈され、菌株は国内のカルチャーコレクションへ保存・寄託され、種同定に使われる配列はDDBJに登録された。今後、本研究の成果物は、微生物資源として利活用されることが期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。動物や植物に並ぶ主要な分類群の一つである菌類は、全体のごくわずかしか種を把握できておらず、生物多様性の把握は不十分である。この問題の原因の一つに、菌類最大のグループである子のう菌類における分類学上の特殊性が存在する。子のう菌類はその生活環に有性世代と無性世代をもつ。子のう菌類は有性世代の形態学的特徴に基づき分類され、分子系統解析による裏付けのもとで門、綱および目レベルの整備がされてきた。一方で、無性世代しか知られていない菌類は、分子系統解析に頼らなければ系統を推定できない状況にある。現行の菌類の分類体系において科は有性世代のごくわずかな形態学的相違点のみで区別されており、科の情報は充実していると考えられない。そこで無性世代の形態形質を科の枠組みに加えることで、従前の科の枠組みが補強・分割される事例や無性世代のみの新しい科が見出される事例を通して、両世代による子のう菌類の科の再構築を試みる。本年度は対象とする各系統群に所属する菌株の補充に重点を置いた。採集調査は陸上植物の枝や葉に寄生もしくは腐生する菌類を対象とした。東北を中心に採集調査を行った。熱帯地方では菌類多様性が高いことから、7月には大阪や徳島を中心に採集調査を行った。調査によって得られたサンプルは研究室で顕微鏡観察に基づき分類学的に興味深いものや重要なものを標本にした。その後、標本から胞子を単離し、菌類を純粋培養することで菌株を得た。当初、この採集調査を通して菌株を130菌株を得ることができた。これらの菌株は培地上で培養し,菌糸からDNAを抽出し、PCRを行い、ダイレクトシーケンスによって複数のDNAバーコーディング領域を決定した。形態の特徴付けでは、光学顕微鏡により子実体や胞子の大きさや色に基づく形態観察により、属や種の同定および特徴付けも行った。研究成果の一つとしてCryptocoryneum属の分類学的再検討を報告した。Cryptocoryneum属菌はスポロドキア状の子実体と手のひら状の分生子によって特徴付けられる不完全菌類であり、主に木本植物などの枯死植物上に生じる。また本属菌のテレオモルフが不明であることや分子系統解析がなされていないことから、本属の分類学的所属も不明のままである。

申請者は19菌株のCryptocoryneum属菌について、ITS nrDNA、EF-1α領域に基づく分子系統解析と形態観察を行い、分類学的所属と種数の把握を試みた。結果として本属菌はプレオスポラ目に所属することを明らかにした。本研究の中でC. condensatumに形態的に類似した複数の隠蔽種を報告した。これら類似した形態を有する系統群を区別する形態学的特徴として、1)分生子のアームの本数、2)アームの大きさ、隔壁数が有効であると考えられた。本研究において計7種の新種を記載した子のう菌類の種多様性の全容を解明するためには、従来の分類基準に加え無性世代の形態学的特徴や分子系統情報を積極的に取り込む必要がある。本研究では全生活環に基づく分類体系の基盤構築から、有性世代に基づく従前の科の概念の妥当性を再検討した。(1)ロフィオストーマ科の事例: Lophiostomabipolare類似菌について複数の領域に基づく分子系統解析と形態観察を行った。結果として、本菌群には11種の隠ぺい種が含まれ、ロフィオストーマ科内で既知の3属と6新属に散在することを明らかにした。(2)メラノンマ科の事例:広義メラノンマ科には無性世代の特徴で明らかに異質なグループが含まれることを明らかにした。結果としてメラノンマ科を再定義した上で1新科2新種1新組み合わせを提唱した。無性世代の形態学的特徴から宿主植物との共進化の関係も明らかにした。(3)ロフィオトレマ科の事例:広義ロフィオトレマ科について複数の領域に基づく分子系統解析と形態観察を行った。結果として、ロフィオトレマ科を再定義した上で3新科7新属8新種2新組み合わせを提唱した。申請者は、有性世代を重視した従前の分類体系の問題点を明らかにし、全生活環に基づき子のう菌類の科概念を再構築した。結果として、無性世代により科概念が補強される事例、無性世代により科が分割されるグループの事例、無性世代のみで構成されるグループの事例を明らかにした。これらのサンプリング調査の過程で付随的に発見した分類学上興味深い属や種については、共同研究の論文で発表した。本研究で用いた標本は弘前大学菌類標本室(HHUF)に寄贈され、菌株は国内のカルチャーコレクションへ保存・寄託され、種同定に使われる配列はDDBJに登録された。今後、本研究の成果物は、微生物資源として利活用されることが期待される。前年度の研究結果を基にして、従前の科の枠組みの妥当性について3つの事例を再検討をする。1)無性世代が含まれることで科概念が補強されるグループの事例:有性世代の特徴のみに加えて無性世代の形態学的特徴も含めることで、従前の科概念の情報量が増えることになる。無性世代の情報が加わることで科概念が無性世代からも裏付けることができると考えられる。2)無性世代が含まれることで科が分割されるグループの事例:有性世代の特徴のみを重視していたために、系統上区別すべき分類群を同一のグループとして見誤っている可能性がある。無性世代の特徴を加えることで無性世代の点から本来区別すべき系統群を見いだすことができると考えられる。3)無性世代のみで構成されるグループの事例:現行の分類体系では有性世代の特徴を重視していたために、無性世代のみで見つかる系統群の存在に気づけない場合があると考えられる。有性世代が不明の多くの不完全菌類の系統を明らかにすることで、従前の分類体系にはない新たな系統群を見いだすことができると考えられる。
流行性非A非B型肝炎の研究

本研究の目的は未知の流行性の非A非B型肝炎の起因ウイルスを発見すべく、まず実験モデルを完成し、ウイルスを分離同定しようということであり、このウイルス性肝炎が主として蔓延しているインド、ネパ-ルなどの研究者と共同研究を行ってきた。そして3年の研究期間の間に実験モデルの完成、ウイルスの分離同定、ウイルス核酸のクロ-ニングに成功した。そしてこの流行性の非A非B型肝炎はE型肝炎と呼ばれることになった。次ぎのステップはこの肝炎の診断方法を開発し、血清疫学的に肝炎の分布、流行形式を明かにし、又ワクチンを開発してこの肝炎の撲滅をはかることである。A型肝炎とB型肝炎の診断方法が確立されて、1955年12月から1956年1月にかけてニュ-デリ-で大流行した肝炎がA型ではなく別の肝炎ウイルスによることが明かにされてから、この肝炎の流行がインドのみならずビルマ、ネパ-ル、ソ連の中央アジア、中国のウイグル自治区などヒマラヤ山脈の周辺の国々に多いことが報告された。我々はインドのAllーIndia Institute of Medical Scienceとの共同研究でこの未知のウイルス性肝炎の解明に取り組んだ。そして先ず、1.実験モデルの開発を試みたのである。初めマモセットを使用したが、感染はコンスタントにおこらず、かにくいざるを使用したところ、十分なウイルスを経静脈的に接種すれば100%感染が成立することが明らかになった。又猿の糞便を用いての継代感染実験にも成功し6代までの継代を行った。6代までの継代実験では潜伏期の短縮、病型の変化などはみられなかった。2.経時的に行った肝生検及びトランスアミナ-ゼのピ-ク時に解剖した若干例の肝組織像からこの肝炎でも組織像は基本的には他のウイルス性肝炎と異ならないことを明かにした。つまり肝細胞の巣状壊死と肝小葉内及びグリッソン鞘へのリンパ球を主体にした細胞浸潤がみられ、このウイルス性肝炎の発生も恐らくウイルス自体の細胞障害性はほとんどなく、肝細胞壊死は宿主の免疫反応によることが想定された。3.感染した猿の胆汁中に大量のウイルスが排出されることを見つけ、ウイルスの精製に成功した。ウイルスの排出は初め散在性にみられるが、やがてスポンタ-ンに凝集した見られる。排出の末期にはエンプティなウイルスが増加する。4.又この精製したウイルスのRNAからλgtllによるcDNAライブラリ-を作製し、インムノスクリ-ニング法によってウイルス核酸のクロ-ニングに成功した。現在全塩基配列の決定に努めている。5.この核酸の塩基配列でプライマ-を作製し、PCR法によりウイルス血症の期間を明かにした。即ちウイルス接種後10日目頃よりトランスアミナ-ゼのピ-ク迄ウイルス血症が証明された。6.インムノスクリ-ニング法により得られたウイルス核酸の一部で大腸菌を用いてウイルスペプタイを発現させ、これを抗原として診断の為の抗体のアッセイ系をEIA法で確立した。まだ若干特異性と感度に問題があり現在改良を進めている。しかし急性肝炎の診断には十分に使用できる。ただ流行地域の一般住民で抗体が5%しか証明されず、血清疫学的研究には使いにくい。恐らくこのペプタイドに対する抗体は肝炎が治ると比較的早く消失すると思われ別のレコンビナントペプタイドを抗原として使用することを計画中である。7.またこれら2,3のレコンビナントペプタイドをワクチンとして使用可能かどうか、かにくいざるをしようとして感染防御実験を始める予定である。8.かにくいざるの培養肝細胞他、種々の培養細胞にこのウイルスをアダプトさせる試みを行っている。これはペプタイドワクチンが有効でないときに、死菌ワクチン或は弱毒生ワクチンの開発にそなえるものである。9.抗体のアッセイ系が完成した後、インド初めビルマ、ネパ-ル、中国のウイグル自治区などで血清疫学的調査を行う。10.現在までの予備的な血清疫学的調査で日本には輸入肝炎として若干存在するものの、散発性の非A非B型肝炎のなかにも殆ど存在しないことが明らかになった。本共同研究はE型肝炎の解明に関して、この病気は存在しないが十分な研究能力を持った日本と、この肝炎は存在するが十分な研究能力を持たないインドが共同で研究を行い大きな成果を治めたもので、日本人の海外旅行、駐在にさいしてはこの肝炎に感染する機会があり、日本の人々へもこの成果は還元されるものと考えている。