hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス消化器がんモデルを用いた悪性化・転移機構の探索

消化器がんの死亡原因となる悪性化、転移のメカニズムを解析するために、マウスの腫瘍形成モデルを用いた新しい実験系の構築を試みた。その結果、胃腫瘍、腸腫瘍を発生する遺伝子改変マウス、化学発がんモデルマウスよりの腫瘍細胞の単離、経代培養を行った。また、これらの細胞への遺伝子導入、発現も可能となり、悪性化・転移を示す形質の変化を誘導する新たな因子の同定につながる結果を得た。本年度は、マウス腫瘍モデルの悪性化、転移を検討する実験系を新たに構築するために、胃の腫瘍モデルであるGanマウス、腸の腫瘍モデルであるApc^<Δ716>ノックアウトマウスの腫瘍組織からその上皮細胞を単離し、in vitroでの培養を試みた。これまでに報告されている培養条件をもとにした検討の結果、これらの腫瘍細胞の3次元培養系における長期にわたる経代、並びに凍結保存が可能となった。次にこれらの細胞への遺伝子導入法をGFPを発現するベクターを用いて検討した。その結果、レンチウィルスベクターによりGFPを発現する細胞を得ることができた。この方法で導入したい電子は染色体上に挿入されるので、GFPの発現を標識として細胞を選別し、経代していくことが可能である。一方、AOM/DSSによる化学発がんマウスの浸潤が見られるような腫瘍から単離した上皮細胞の3次元培養においては、Apc^<Δ716>マウスの腫瘍とは異なる形態のコロニー形成が見られた。このことは、3次元培養における形態が腫瘍の悪性化と関連していることを示唆している。これらの結果から、マウスのモデル由来の細胞を用いて、遺伝子導入によりその因子の影響を上皮細胞の形質を見ることによって可能な実験系が確立できた。腫瘍細胞の悪性化、転移を誘導する内在的な機構として、本研究においては上皮問葉移行(EMT)を取り上げる。そのため、EMTを誘導する分子のcDNAをGFPと共に発現するレンチウィルスベクターを作成している。これらの得られた材料を用いて来年度は、EMTを誘導した際の腫瘍上皮細胞の形質と遺伝子発現の変化を調べ、新たなマウスモデルを作出する候補遺伝子を決定する予定である。本年度は、前年度で確立した胃の腫瘍モデルであるGanマウス、腸の腫瘍モデルであるAp^<Δ716>ノックアウトマウスの主要組織からの上皮細胞の単離、培養、遺伝子の導入法を、遺伝子の腫瘍形成、悪性化における機能解析に使用することを行った。腫瘍細胞の悪性化、転移を誘導する内在的な機構として、上皮間葉移行(EMT)に着目した。EMTを誘導することがこれまでに示されている遺伝子をGFPと共に発現するベクターを構築し、胃、及び腸腫瘍より培養した上皮細胞に導入したが、TGF-betaを導入した時に細胞の成長が抑制されたほか、顕著なEMTを示すような形質変化は見られなかった。そこで、胃腫瘍形成に関わる因子を新たに探索することを試みた。GanマウスはWntシグナルの亢進と、PGE_2経路の活性化により炎症を伴う胃がんを発生する。このときの遺伝子発現をマイクロアレイにより解析した結果から、炎症依存的に発現が亢進する遺伝子が得られた。これらの中から胃幹細胞で発現が高い遺伝子を選び、siRNAを用いてノックダウンした際の腫瘍原性への影響をヒト胃がん細胞のソフトアガーコロニー形成を用いて調べ、新たな腫瘍形成に関与した遺伝子群を明らかにした。これらの遺伝子を培養下の上皮細胞に導入しその形質変化を調べる実験は現在進行中である。また、腫瘍細胞より単離、培養し遺伝子を導入した細胞を再びマウスの腫瘍、あるいは正常の組織に移植しその形態変化を調べる実験も現在行っているところである。
内分泌因子によるユビキチン化経路解明に基づく増殖性前立腺疾患治療分子標的の同定

本研究では男性ホルモンであるアンドロゲンを中心とした内分泌因子によるシグナル伝達経路を網羅的に同定することで、前立腺疾患発症へと結びつくKey regulatorの同定を試みた。本解析によりOct1、ARFGAPA3、TACC2、miR-148aといった新規アンドロゲン応答遺伝子ならびにマイクロRNAをゲノム上から包括的に同定し、その新規機能と前立腺癌における臨床的意義を明らかにした。今後、これらシグナル伝達経路を標的とした臨床応用が期待される。前立腺肥大ならびに前立腺癌は高齢者のQOLに大きな影響をおよぼす増殖性疾患である。本研究では性ホルモンなどの内分泌因子によるシグナル伝達からユビキチン化を介した下流シグナルを同定することで、前立腺疾患発症へと結びつくKey regulatorを同定し、新たな診断マーカーならびに治療標的の同定を試みる。申請者らは今までに性ホルモン応答遺伝子であるEfp/TRIM25がユビキチン化を介して癌細胞増殖やサイトカイン産生を制御することを見出した(Nature 2002 ; 417 : 871-875, Nature 2007 ; 446 : 916-920)。今回、申請者らはEfpの阻害因子としてA型インフルエンザウイルスの構成タンパクであるNS1を同定した。NS1はEfpと直接結合することで、その基質タンパクであるRIG-Iとの結合、ユビキチン化を阻害することで自然免疫機構を抑制し、インフルエンザウイルスの増殖を誘導する分子機構を解明した(Cell Host Microbe 2009 ; 5 : 439-449)。またEfpと同じTRIMファミリー蛋白の一つであるTerf/TRIM17が自己ユビキチン化を誘導すること、ならびにTRIM44と結合することで、自己ユビキチン化が抑制され、TRIM17蛋白が安定化することを明らかにした(Biochem Biophys Res Commun 2009 ; 383 : 263-268)。さらには内分泌ホルモンとして知られるグルココルチコイド応答遺伝子をマイクロアレイ法により探索し、その結果TRIMファミリー蛋白であるTRIM63を同定した。同時にTRIM63は骨肉腫細胞株において分化ならびに増殖制御を行っていることを見出した(Endocr J in press)。今後、TRIMファミリー蛋白のシグナル伝達ネットワークと疾患発症との関連を解明することで、新たな前立腺疾患治療標的の同定が期待される。今回、申請者らは前立腺癌の発症や進展において重要な役割をはたす性ホルモンであるアンドロゲンから、その受容体であるアンドロゲン受容体(AR)を介したシグナルに焦点を当てて研究を行った。その中で申請者らはCAGE法ならびにChIP-chip法といった最新の方法により前立腺癌細胞におけるヒトゲノム上でのアンドロゲン-ARシグナルに応答する遺伝子を網羅的に同定した(Oncogene 2011;30:619-630)。さらに前立腺癌においてアンドロゲン応答するmicroRNAとしてmiR-148aを新たに同定した(Prostate Cancer Prostatic Dis 2010;13:356-361)。申請者らはmiR-148aがCAND1というユビキチン分解酵素(SCF複合体蛋白質)を負に制御する遺伝子の発現制御を行うことで、前立腺癌細胞の増殖を制御する分子機構を見出した。さらに転写因子であるOct1がARと協調的に作用し前立腺癌細胞の増殖を制御している分子機構を臨床サンプルならびに細胞実験により明らかにした(Int J Cancer in press)。今後、アンドロゲンからmiR148aならびにCAND1発現制御を介したユビキチン化制御システムのような、性ホルモンを介したユビキチン化蛋白分解シグナルやその他のシグナル伝達ネットワークと疾患発症との関連を解明することで、新たな前立腺疾患治療標的の同定が期待される。本研究では性ホルモンなどの内分泌因子によるシグナル伝達からユビキチン化を介した下流シグナルを探索することで、前立腺疾患発症へと結びつくKey regulatorを同定し、新たな診断マーカーならびに治療標的の同定を試みる。その中で申請者らはCAGE法ならびにChIP-chip法といった最新の方法により前立腺癌細胞におけるヒトゲノム上でのアンドロゲン-ARシグナルに応答する遺伝子を網羅的に同定した。その中から各遺伝子の機能検索を行い、前立腺癌の発症、進展に関与するアンドロゲン応答遺伝子を同定した。本検討により申請者らはARFGAP3がPaxillinと協調して、前立腺癌細胞の増殖と遊走を制御する分子機構を見出した(Int J Cancer130,2240-2248,2012)。

次にTACC2が前立腺癌細胞の細胞周期進行を誘導し、増殖制御を行う分子機構を見出した。また、臨床サンプルならびに動物モデルを用い、TACC2が前立腺癌の予後を規定する重要な診断マーカーであり、治療標的遺伝子としても重要であることを示した(Mol Endocrinol in press)。さらに転写因子であるOct1がARと協調的に作用し前立腺癌細胞の増殖を制御している分子機構を臨床サンプルならびに細胞実験により明らかにした(Int J Cancer130,1021-1028,2012)。以上のように本研究期間において、アンドロゲン応答遺伝子を網羅的に探索する中で、臨床診断マーカーならびに治療標的として重要な因子を複数同定した。今後、これら遺伝子を用いた臨床応用が期待される。
双頭型ボロン酸分子と糖による複合糖鎖の合成とそれらの生体高分子との相互作用の研究

天然多糖の一種であるシゾフィランと核酸との特異的な相互作用を期待し、シゾフィラン側鎖に種々のアミノ酸を導入したアミノ酸修飾シゾフィランの合成を行った。まず、側鎖グルコースを過ヨウ素酸酸化処理し、1,2ジオールの酸化的開裂に伴うアルデヒド体を得た。このアルデヒド体とアミノ酸との還元的アミノ化反応により目的とするアミノ酸修飾シゾフィランを合成することができた。今回、アミノ酸としてアニオン性のセリン(Ser)とカチオン性のリシン(Lys)、アルギニン(Arg)をそれぞれ導入することに成功した。合成したアミノ酸修飾シゾフィランと核酸(poly(C))との相互作用をCDスペクトルで評価した。その結果、カチオン性のアミノ酸であるアルギニンやリシン修飾シゾフィラン-poly(C)複合体において、大きな融解温度の上昇が確認された。また、融解温度はアミノ酸の導入率の増加に伴い、上昇する傾向を示した。一方でアニオン性アミノ酸であるセリン修飾シゾフィランではpoly(C)と複合体は形成するものの、未修飾シゾフィランと比較して融解温度が減少する結果となった。これらの結果はアミノ酸残基と核酸のリン酸残基間での静電相互作用で無理なく説明されると考える。以上の結果から、アミノ酸修飾シゾフィランは核酸と複合体を形成すると同時に、その残基の電荷によって複合体の安定性が制御できることが明らかとなった。言うまでもなくアミノ酸は生体適合性の機能性分子である。よって、今回合成したアミノ酸修飾シゾフィランは潜在的に遺伝子ベクターとしての機能を有していると考えられる。さらにこれらの実験結果を基に、今後シゾフィランに細胞指向性ペプチドを導入することも可能になると期待される。
3Dプリンタを用いた個人トレー一体型オーダーメイド歯ブラシによる菌血症予防の試み

本研究では、動脈硬化、高血圧のリスクであると捉えられはじめた歯原性菌血症の原因となる口腔細菌を3Dプリンタにて作製したオーダーメイド歯ブラシを用いて抑制し、菌血症予防ができるかを検討することを目的とした。各個人から作製した口腔模型からオーダーメイド歯ブラシの設計を行い、3Dプリンタにより出力を行った。オーダーメイド歯ブラシを用いた3DS除菌療法によりStreptococcus mutansの抑制と最高血圧の低下に有効な可能性が示唆された。また、口腔フローラ解析によるVeillonellaとFusobacteriumの割合が揮発性硫黄化合物濃度測定により迅速に予測できる可能性が示唆された。う蝕と歯周病のハイリスク者は、歯原性菌血症を日常的に起こしているため、動脈硬化を惹起し、ゆえに高血圧のリスクであると捉えられはじめた。本研究では、歯原性菌血症の原因となる口腔細菌を3Dプリンタ(CAD/CAM)にて作製したオーダーメイド歯ブラシを用いて抑制し、菌血症予防ができるかどうかを検討することを目的としている。平成26年度は、1)歯原性菌血症診断マーカーの模索、2) 3Dプリンタを応用したオーダーメイド歯ブラシ作製システムの構築、3)3DS除菌療法およびオーダーメイド歯ブラシの動脈硬化予防効果について検討を進めてきた。1)歯原性菌血症診断マーカーの模索は、歯原性菌血症の診断マーカーとして、有望と考えられる唾液中エンドトキシンについて、臨床被験者を募り、インフォームドコンセントを得た上で、データ収集を行ってきた。2) 3Dプリンタを応用したオーダーメイド歯ブラシ作製システムの構築については、通法により印象採得した歯列石膏模型データを3D情報に置き換え、その模型に合せたオーダーメイド歯ブラシをCAD/CAMソフトにて設計し、3Dプリンタ(CAD/CAM)による出力を行った。3) 3DS除菌療法の動脈硬化予防効果の検討については、臨床被験者を鶴見大学歯学部附属病院3DS除菌外来にて募り、インフォームドコンセントを得た上で、3DS除菌療法を実施し、データ収集を行ってきた。その結果、オーダーメイドトレーを用いた3DS除菌により、口腔細菌数の減少、血圧の改善がみられた。う蝕と歯周病患者は、歯原性菌血症を日常的に起こしているため、動脈硬化を惹起し、ゆえに高血圧のリスクであると捉えられはじめた。本研究では、歯原性菌血症の原因となる口腔細菌を3Dプリンタ(CAD/CAM)にて作製したオーダーメイド歯ブラシを用いて抑制し、菌血症予防ができるかどうかを検討することを目的とした。1歯原性菌血症診断マーカーの模索: 3DS除菌療法は口腔細菌の制御が目的であるため、口腔細菌数を即時検査する項目として、口腔細菌代謝産物である揮発性硫黄化合物(VSC)濃度を測定した。その結果、Treponema denticola(T. denticola)数とVSC濃度に正の相関が認められた(p < 0.05)ことから、歯科診療室におけるT. denticola数の迅速検査として、VSC測定が有用な可能性が示唆された。2 3Dプリンタを応用したオーダーメイド歯ブラシ作製システムの構築:各個人から作製した口腔模型を用い、オーダーメイド歯ブラシの設計を行った。口腔模型より3Dデジタル情報を収集(STLファイル化)し、3Dプリンタ(CAD/CAM)により、出力を行った。現在、実用化に向けて、材質の改良を続けている。以上のことから、3DS除菌療法は、オーダーメイド歯ブラシによりS. mutansの抑制と最高血圧の低下に有効な可能性が示唆された。また、3DS療法において重要なターゲットとなるT. denticola数がVSC濃度測定によって迅速に予測できる可能性を示唆した。1)のため、本研究に同意の得られた被験者より微生物学的検査、生化学的検査等を実施してきた。その結果、歯石除去前後に上腕から採取した血液中エンドトキシン量は一般生化学検査による測定法では検出限界(1.0 pg/ml)以下となることがわかった。3)のため、本研究に同意の得られた被験者より微生物学的検査、動脈硬化度検査等を実施してきた。分析の結果、除菌療法後に口腔細菌数と血圧に改善の傾向が認められた。本結果については、第64回日本口腔衛生学会にて発表する予定である。口腔微生物学平成27年度は、1)は、歯原性菌血症診断マーカーの候補を検討するため、臨床データをさらに収集し、データ分析を実施する。

平成26年度の検討では、上腕から採取した血液中エンドトキシン量が一般生化学検査による測定法では検出限界(1.0 pg/ml)以下となることがわかったため、新たに歯原性菌血症診断マーカーとなる候補を選出する必要があると考えられる。2)については、平成26年度に作製した試作オーダーメイド歯ブラシの材質、設計について改良を実施し、臨床応用可能なものにブラッシュアップする。3)ついては、臨床データのさらなる収集およびデータ分析を実施し、3DS除菌療法およびオーダーメイド歯ブラシによる口腔細菌のコントロールを行うことが動脈硬化予防に対し、有益かどうかを検討する。臨床研究被験者が平成26年度の予定数を下回ったため、次年度使用額が生じた。平成26年度に引き続き、本年度も歯原性菌血症診断マーカーの模索、3DS除菌療法の動脈硬化予防効果の検討のため、さらに臨床サンプルの採取を継続する。
シクロデキストリン依存的な口腔細菌の全身伝播機構の解析

シクロデキストリン(CD)は,上皮細胞膜上のコレステロールを包接し,メタロプロテアーゼ依存的な上皮バリア破壊シグナルを誘導する.本研究では,歯周病原性細菌が口腔内に豊富に存在するデンプンやグリコーゲン等のα-グルカンからCDを産生することを明らかにした.これらの結果から,口腔細菌によるCD産生は粘膜上皮透過性を亢進させ,口腔常在細菌の全身伝播に寄与する可能性が示唆された.シクロデキストリン(CD)は,α-グルカンにシクロデキストリンα-グルカノトランスフェラーゼ(CGTase)を作用させて得られる環状オリゴ糖であり,上皮細胞膜上のコレステロールを包接し,メタロプロテアーゼ依存的な上皮バリア破壊シグナルを誘導する.我々は,数種の口腔レンサ球菌が推定CGTaseを有することをデータベース上で確認した.そこで,本研究では,口腔レンサ球菌由来CGTaseによるCDの産生と口腔フローラによる全身疾患発症との関連性について解析し,CDを介した口腔細菌の全身への伝播,および簡易診断マーカーとしてのCDの可能性を検討することを目的として研究を推進した.平成24年度までに,Streptococcus pyogenes,S. sanguinis,S. mitis,S. oralisおよびPorphyromonas gingivalisはα-グルカン分解能を有するが,CD産生能を有する菌種はS. pyogenesとP. gingivalisの2種であることを確認した.最終年度には,各菌種の推定CGTaseのアライメント解析を行い,S. pyogenesおよびP. gingivalisは,推定CGTaseのN末もしくはC末にCBM20ドメインを有することを明らかにした.また,S. pyogenesおよびP. gingivalis由来CGTaseの部分リコンビナントタンパクを用いた解析から,口腔細菌のCGTase活性にはCBM20ドメインが重要であることを証明した.以上の結果から,口腔細菌のCGTaseによるCD産生は,粘膜上皮の透過性を亢進させ,口腔常在細菌の全身伝播に寄与する可能性が示唆された.シクロデキストリン(CD)は,上皮細胞膜上のコレステロールを包接し,メタロプロテアーゼ依存的な上皮バリア破壊シグナルを誘導する.本研究では,歯周病原性細菌が口腔内に豊富に存在するデンプンやグリコーゲン等のα-グルカンからCDを産生することを明らかにした.これらの結果から,口腔細菌によるCD産生は粘膜上皮透過性を亢進させ,口腔常在細菌の全身伝播に寄与する可能性が示唆された.口腔レンサ球菌は,口腔内で豊富に存在するデンプンやグリコーゲン等のα-グルカンを分解し,エネルギー産生に利用する.α-グルカンからシクロデキストリンα-グルカノトランスフェラーゼ(CGTase)の作用により得られるシクロデキストリン(CD)は,上皮細胞膜上のコレステロールを包接し,メタロプロテアーゼ依存的な上皮バリア破壊シグナルを誘導する.我々は,数種の口腔レンサ球菌および歯周病原性細菌が推定CGTaseを有することをデータベース上で確認した.本研究では,口腔細菌由来CGTaseによるCDの産生と口腔フローラによる全身疾患発症との関連性について解析し,CDを介した口腔細菌の全身への伝播,および簡易診断マーカーとしてのCDの可能性を検討することを目的とした.まず,CGTaseを有することが推測されたStreptococcus pyogenes,S. sanguinis,S. mitis,S. oralisおよびPorphyromonas gingivalisのα-グルカン分解能とCD産生量を解析した.その結果,全ての試験菌種がα-グルカン分解能を有することを確認したが,α-グルカンからCDを産生した菌種はS. pyogenesとP. gingivalisの2種であった.そこで,各菌種の推定CGTaseのアライメント解析を行った結果,S. pyogenesおよびP. gingivalisは,推定CGTaseのN末もしくはC末にCBM20ドメインを有することを確認した.以上の結果から,口腔細菌のCGTase活性にはCBM20ドメインが重要であることが明らかになった.平成24年度の研究計画に基づき,CD産生能を有する口腔細菌の選出を行い,CGTase活性に重要なドメインを明らかにした.現在は,S. pyogenesおよびP. gingivalisについて,CGTase欠失株およびリコンビナントCGTaseの作製を進めている.従って,本研究課題は順調に進展していると考えられる.平成24年度に得られた解析結果を基に,口腔粘膜上皮細胞および動物モデルに対するCDの病原性を検討する.さらに,口腔細菌由来CGTaseの感染防御抗原としての可能性およびCDの病原性に対するメタロプロテアーゼ阻害剤の予防薬としての効果を検索する.研究を遂行する上で必要に応じて研究費を執行したため,平成24年度の研究費に未使用額が生じた.しかし,研究計画に変更はなく,今年度は前年度の研究費も含め,当初の予定通りに研究計画を実施する.
マウスを用いTRPA1イオンチャネルに着目した脈絡膜血管新生の新規治療戦略の確立

TRPA1は感覚神経細胞に主に発現するCa2+イオンチャネルである。本研究では、TRPA1欠失マウスでのレーザー誘発実験的脈絡膜血管新生(CNV)の形成を軽減させることが出来るか否かを検討した。TRPA1欠失はレーザー誘発CNVを優位に抑制し、その際、TRPA1陽性細胞は血管内皮細胞と共発現はしないが近接に発現していた。炎症細胞浸潤を評価するため、TRPA1遺伝子欠失がF4/80陽性細胞におけるVEGF、TGFβ1mRNA発現レベルに影響するかを調べたが、これらはTRPA1に影響されなかった。レーザー照射後の脈絡膜組織からRNAを抽出し、TGFβ-1、MPO、VEGF、F4/80などについてRT-PCRを行ったが、TRPA1欠失はTGFβ-1、MPOの抑制は認めたがその他は差を認めなかった。脈絡膜への炎症細胞浸潤は、VEGFおよびTGFβ-1を含む血管新生増殖因子供給源の1つであると考えられる。今後は血管内皮細胞やマクロファージ特異的なコンディショナル欠失マウスを作成し、レーザー誘発CNV実験を予定してる。血管新生反応は、ERK1/2MAPKおよびAktシグナルを介している。培養ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いた検討では、いずれの経路もTRPA1作動薬、拮抗薬に影響されなかった。このため我々は血管内皮細胞に隣接するTRPA1陽性細胞の活性化が血管内皮のVEGFRを活性化しCNV形成を誘導すると仮定し、TRPA1を発現し、かつ血管内皮と近接することから繊維芽細胞に着目し、HUVECと繊維芽細胞の共培養系を用いて検討を行った。結果、TRPA1遮断がHUVECによる新生血管作用を抑制した。TRPA1拮抗薬によるHUVEC管腔形成の阻害は、線維芽細胞層に存在するTRPA1機能の遮断によるものと考えられた。以上から、TRPA1シグナル制御によりCNVを抑制できる可能性がある。野生型マウスへの脈絡膜新生血管誘発アルゴンレーザー照射を施行しているが、照射による脈絡膜血管誘発が一定せず手技体得に時間を要したため、ノックアウトマウスを使用するに至っていない。当該年度では並行して、比較的に手技が容易な角膜新生血管への影響に関して検討を追加した。(1)C57bL/6背景TRPA1-/-マウス(KO、n=18)および野生型(WT)マウス(n=18)の片眼角膜をパクレンRを用いて焼灼し、輪部から角膜実質への血管新生を誘導した。処置後314日後の角膜のPECAM-1に対する免疫組織化学染色を行い新生血管の長さを測定した。(2) KO(n=20)およびWT(n=20)の片眼角膜中央をパクレンRで焼灼し角膜血管新生を誘導した。焼灼後3日後の角膜を摘出、RNAを抽出した。Real-time RT-PCR法を用いて血管内皮成長因子(VEGF)、トランスフォーミング成長因子B-1(TGFB-1)、マクロファージマーカー(F4/80)の発現を比較した。(3)培養血管内皮細胞(HUVEC)と線維芽細胞の共培養を用い、VEGF存在下に培養液中にTRPA1アンタゴニスト(HC-030031:10μM)またはアゴニスト(AITC:10μM)を添加しHUVECによる管空形成(血管新生作用)に対する影響を検討した。【結果】(1)KOはWTに比して314日後輪部からの角膜血管新生が抑制されていた。(2)KO角膜ではWT角膜と比較してVEGF、TGFB1、F4/80の発現が有意に抑制された。(3)HUVECの血管新生形成(長さと分岐数)はアゴニスト添加では変化がみられなかったが、アンタゴニスト添加で抑制された。【結論】TRPA1シグナルの抑制で角膜新生血管が抑制されることが確認された。TRPA1遺伝子欠失は角膜血管新生の過程で組織でのマクロファージの浸潤、VEGFとTGFB-1発現レベルを抑制していた。KOマウス角膜での血管新生の誘導抑制を説明できる変化を考えられたため、次年度は脈絡膜血管新生に関しても検討を追加していく予定である。実験的脈絡膜新生血管誘発のため、全身麻酔下でマウス眼にアルゴンレーザー(Lambda Plus; Coherent Inc., Santa Clara, CA)で、各象限に1スポット照射(150 mW,スポットサイズ80 μm,照射時間100 ms)するが、得られた結果が一定しないため、照射方法の手技の体得に時間を要した。TRPA1ノックアウト(KO)マウスでは角膜電熱凝固の角膜実質の血管新生が抑制され、マクロファージの浸潤、血管内皮成長因子、トランスフォーミング成長因子β1の発現レベルが低下することを報告した。血管内皮細胞へのTRPA1の影響と、マウスでのアルゴンレーザー誘発脈絡膜新生血管モデルのTRPA1欠損の影響を検討した。【方法】(1)HUVECと線維芽細胞の共培養を用い、VEGF存在下に培養液中にTRPA

1アンタゴニスト(HC-030031:10μM)またはアゴニスト(AITC:10μM)を添加後14日間培養し、HUVECでの血管新生作用を長さと分岐数で評価した。(2)培養HUVECを用い、VEGF存在下に培養液中に方法(1)と同内容で添加後7日間培養し、vEGFシグナル(ErkとAkt活性化)をWestern blottingで評価した。(3)野生型マウスとTRPA1ノックアウトマウスを用いてマウス網膜にアルゴンレーザー照射でCNVを誘発し、レーザー照射14日後に10%フルオレスセインデキストラン心腔から注入することで血管造影を行い蛍光顕微鏡で撮影し、CNVの大きさを解析した。【結果】(1)HUVECの血管新生作用はTRPA1アゴニスト添加で差はみられなかったが、アンタゴニスト添加で有意かつ著明に抑制された。(2) VEGF暴露によるErkとAktの活性化はTRPA1アゴニストおよびアンタゴニスト添加で影響されなかった。(3)TRPA1ノックアウトマウスにおいて、レーザー誘発CNVは抑制された。当院の動物実験施設が感染症のため一時閉鎖していたため、マウスを用いた検討を行うことができない時期があった。[方法](1)野生型マウス(C57BL/6、n=5)とTRPA1欠失マウス(n=5)を用いた。レーザー照射14日後に血管造影を行いApo Tome.2(ZEISS)蛍光顕微鏡でフラットマウント法を用いて撮影し、CNVの面積をコンピューターソフトウエアWinROOF(三谷)で解析した。(2)野生型マウスを用いて、レーザー照射3,5,7日後におけるTRPA1の発現を免疫組織学的に検討し、PECAM-1(血管内皮細胞マーカー)との共局在の有無を検討した。(3)野生型マウス(n = 20)およびTRPA1欠失マウス(n = 20)を用いた。レーザー照射(25spot)1日後に脈絡膜組織からRNAを抽出し、MCP-1、TGFβ-1、MPO、VEGF、F4 / 80、IL-6およびαSMAについてRT-PCRを行った。(4)培養HUVECを用い、96wellで培養液中にTRPA1アンタゴニスト(HC-030031:10μM)またはアゴニスト(AITC:10μM)を添加後7日間培養し、VEGF-A(10ng/ml)刺激後、アラマーブルーを添加し、30、60、90、120、150、180分時の吸光度を測定し細胞増殖を評価した。[結果](1)野生型マウスに比べTRPA1欠失マウスにおいてCNVは有意に抑制されていた(P<0.05)。(2)野生型マウスにおけるレーザー照射後のTRPA1は、レーザー照射3日後ではCD31と局在は一致しなかった。レーザー照射7日後では一部局在の一致を認めた。(3)野生型マウスに比べTRPA1欠失マウスにおける脈絡膜組織では、TGFβ-1のmRNA発現を有意に抑制した(p<0.05)。(4)アンタゴニスト、アゴニスト投与でHUVECの増殖に影響はなかった。[結論]TRPA1シグナル制御によりCNVを抑制できる可能性がある。動物モデルについては、使用しているTRPA1ノックアウトマウスは、すでに当教室に導入済みで繁殖中であるが、脈絡膜レーザー照射によって白内障化をきたす個体や眼球損傷をきたす個体が一定数あり、採取サンプルが困難になっている。レーザー条件を検討しながら並行して課題を進行している。TRPA
ムラサキヒシャクゴケのアルミニウム結合性糖鎖構造の解析

ムラサキヒシャクゴケ(Scapania undulata)は水棲のコケで、中性から酸性の水域に広く分布する。昨年度の検討の結果、このコケには多量のアルミニウムが蓄積されており、その程度は中性水域で生息するコケで顕著であった。本年度は、アルミニウムの存在部位の確認と存在状態を明らかにすることでその蓄積機構の解明を行った。中性水域から採取したムラサキヒシャクゴケの葉を試料ホルダーに固定し、液体窒素に浸漬し、急速凍結を行った。試料をそのまま、あるいは活断して定真空型の走査電子顕微鏡で観察した。試料の各部位(細胞質、細胞内顆粒、細胞壁)に電子線を当て発生するX線スペクトルを測定した。その結果、細胞壁からかなり強いX線強度が得られ、特に細胞表層よりも細胞と細胞との境界から高強度のX線スペクトルが得られた。ヘマトキシリンによるムラサキヒシャクゴケの染色から細胞壁にアルミニウムの存在が示唆されていたが、ヘマトキシリンは金属に対する選択制が悪く、他の金属でも同様の染色が得られるが、この結果からアルミニウムが細胞壁に局在していることが確認された。中性水域に生息するムラサキヒシャクゴケの葉を1%SDSを含む50mM MES/NaOH緩衝液(pH6.5)中で粉砕し、遠沈後細胞壁画分を得た。pH2.0から3.0の抽出液中に細胞壁画分を加え、37°Cで浸透した。アルミニウムはpH5.0、6.0ではほとんど溶出されないが、pH4.0以下の抽出液では、pHが低いほど多量のアルミニウムが溶出された。鉄、マンガンでもほぼ同様の傾向が見られ、これらの金属は同様の機構によって、細胞壁成分に結合しているものと推察された。アルミニウムのヘマトキシリン染色ではポリアニオンの存在が必要で、これを介した三元錯体の形成が重要と言われている。したがって、このコケの細胞壁にはペクチン様の酸性多糖が存在しているものと考えられた。コケ(Scapania undulata)の葉の細胞分画を以下の手順で行った.試料には,酸性領域(pH3.63.7)で生息するコケと中性領域(pH5.65.7)で生息するコケを用い,これらを水冷下,ガラス乳鉢とガラス乳房でホモジナイズした.抽出バッファには1.5%SDSを含むMES/NaOH緩衝液(pH6.5)を用いた.このホモジネーとを遠心し,沈殿に更に緩衝液を加え,再び遠心した.上清を合わせて,細胞質及び膜画分とし,沈殿を細胞質画分とした.上清両分は0.1mmのディスクフィルターでろ過した後,細胞壁画分は硝酸を用いた湿式灰化の後,ICP発光分析によりAlの定量を行った.酸性水域のコケのAlは,細胞質.膜タンパク質画分で166μg/g,細胞壁画分に266μg/gと細胞壁に全Alの約60%が存在していた.中性領域のコケでは,細胞質.膜タンパク質画分で228μg/g,細胞壁画分に1830μg/gと細胞壁に全Alの約90%が存在しており,Alの増加がほとんど細胞壁のAlによっていることが明らかとなった.得られた細胞壁画分を0.02%NaIO3を含む0.2%ヘマトキシリン溶液に40分浸漬し,Alの染色を行った.染色を行わない試料の光学顕微鏡観察では細胞の内容物がほぼすべて消失していた.ヘマトキシリンによる染色では,中性領域に生息するコケ由来の細胞壁のみが紫色に染色され,Alが細胞壁に存在することが再確認された.ムラサキヒシャクゴケ(Scapania undulata)は水棲のコケで、中性から酸性の水域に広く分布する。
多変量競合危険データのセミパラメトリック分析法とその医学データへの応用

多変量競合危険データ解析のためのセミパラメトリックモデルを構築し,そのモデルに基づく分析手法を開発した。また,癌の再発時間データや透析患者のカテーテル感染時間データなど,様々な実際の医学データにそれを適用することによって,その医学データへの応用上の有効性や問題点を明らかにした。理論面では,開発ざれたセミパラメトリック手法が既存のノンパラメトリック手法に比ベてどの程度効率的であるかを明らかにした。漸近相対効率を計算することにより,大標本の場合において,セミパラメトリック推定法が非常に効率的であることが示された。また、シミューレーションによる推定誤差評価によって小標本の場合においても,セミパラメトリック推定法の推定誤差がノンパラメトリック推定法に比べて小さいことが示された。また、医学データへの応用面では,セミパラメトリックモデルの妥当性や原因別ハザード関数や変量間の関連性(例えば,癌の1度目の再発時間と2度目の再発時間の再発部位別関連性など)をどのように評価・表示すべきであるかについて統計学と医学の両方の立場から検証した。具体的なモデルとしては,最初に起こる関心イベントまでの時間(例えば,大腸癌の術後競合危険の場合には,大陽癌再発時間と肝臓への転移時間とその他部位への転移時間のミニマム)を固定した条件のもとで,それぞれのイベントの条件付確率に対してのみ,多項ロジスティックモデルなどのパラメトリックモデルを導入することを提案した。臨床試験などで得られる競合危険データに対して,このモデルに基づく分析法を適用した。その結果,競合するいくつかのリスクのもとでの生存時間と,それに影響を与える共変量(例えば,生活習慣など)の関係について,医学的見地からも有用な知見が得られることが示された。本研究は,多変量競合危険データ解析のためのセミパラメトリックモデルを構築し,そのモデルに基づく分析手法を開発することを目的としている。また,癌の再発時間データや透析患者のカテーテル感染時間データなど,様々な実際の医学データにそれを適用することによって,その医学データへの応用上の有効性や問題点を明らかにすることを目的としている。理論面では,開発されたセミパラメトリック手法がノンパラメトリック手法に比べてどの程度効率的であるかを明らかにした。また,医学データへの応用面では,セミパラメトリックモデルの妥当性や原因別ハザード関数や変量間の関連性をどのように評価・表示すべきであるかについて統計学と医学の両方の立場から検証した。特に17年度は,多変量競合危険データに対するセミパラメトリック法の定式化を重点的に行った。また,18年度以降に行う効率評価のシミュレーションと医学データへの応用のための準備を行なった。具体的に以下の項目を遂行した。1.競合危険データの解析法に関する既存の研究成果の整理2.セミパラメトリックモデルと推測法の定式化3.医学における競合危険データに関する専門知識の整理4.数値シミュレーション・実データ解析のための環境整備本研究は,多変量競合危険データ解析のためのセミパラメトリックモデルを構築し,そのモデルに基づく分析手法を開発することを目的としている。理論面では,開発されたセミパラメトリック手法がノンパラメトリック手法に比べてどの程度効率的であるかを明らかにした(漸近相対効率の評価,シミュレーションによる推定誤差評価などによる)。また,医学データへの応用面では,セミパラメトリックモデルの妥当性や原因別ハザード関数や変量間の関連性(例えば,癌の1度目の再発時間と2度目の再発時間の再発部位別関連性など)をどのように評価・表示すべきであるかについて統計学と医学の両方の立場から検証を行った。具体的には、17年度に定式化した分析法の推測効率に関する理論的・数値的検討を行った。また,実際の医学データに適用して応用上の問題点などを明確化し,手法の更なる改良・拡張を行った。効率評価については、セミパラメトリック推定量の効率を理論的(漸近的)に評価した。また,シミュレーション実験によって,推定量の推定誤差などを数値的に評価した。医学的立場からの有効性の検証については、様々な医学データに対して開発手法を適用し,その有効性や問題点を医学的立場から検証した。特に,結果の解釈の仕方やその表示法(原因別ハザード関数の視覚的表示法など)について検討した。

具体的なモデルとしては,最初に起こる関心イベントまでの時間(例えば,大腸癌の術後競合危険の場合には,大陽癌再発時間と肝臓への転移時間とその他部位への転移時間のミニマム)を固定した条件のもとで,それぞれのイベントの条件付確率に対してのみ,多項ロジスティックモデルなどのパラメトリックモデルを導入することを提案した。臨床試験などで得られる競合危険データに対して,このモデルに基づく分析法を適用した。その結果,競合するいくつかのリスクのもとでの生存時間と,それに影響を与える共変量(例えば,生活習慣など)の関係について,医学的見地からも有用な知見が得られることが示された。
作業記憶神経回路におけるドーパミン作動性入力の分布とシナプス形態

ラットの前頭前野におけるドーパミン受容体D5の分布を蛍光多重染色法を用いて明らかにした。その結果、興奮性、抑制性神経細胞ともほとんどの細胞がD5を有していたものの、細胞内の局在分布パターンが大きく異なっていることが明らかとなった。また、ほとんどすべての神経終末はD5を含有していなかった。これらのD5の詳細な局在分布の解析は、前頭前野で行われる高次認知機能のドーパミン作動性修飾システムの解明に貢献するものである。高次脳機能に関わるラット前頭前野におけるドーパミン作動性システムの一端を明らかにするため、特異抗体を用いた免疫染色法によってドーパミン受容体D1-familyに属するD1およびD5受容体の分布を光学および電子顕微鏡で検索した。前頭前野の辺縁前野(PL)のD1-family受容体は、特に記憶との関連が深いとされている。PLでのD1受容体は、I/II層の浅層とVb/VI層の深層に陽性の帯を認めた。これらの陽性構造物はニューロピルが一様に染まったもので陽性細胞は確認できなかった。中間層では、深層に起始する弱陽性の太い頂上樹状突起が観察された。PLのように浅層の陽性帯を示す皮質は少なく、内側辺縁皮質では前帯状回と後部帯状回の膨大後野無顆粒皮質(RSA)に同様の染色性を認めた。膨大後野顆粒皮質(RSG)では全層でD1受容体は極めて少なかった。PLでのD5受容体は、浅層がやや濃く染まるが、ほぼ全層が一様な染色性を示した。薄く染まったニューロピルの中に陽性細胞体が全層に分布していた。特に、III層の陽性細胞からは多くの頂上樹状突起が染め出された。III層でのD5陽性樹状突起はD1のそれと比べて細いがより濃く染まった。I層ではII層とIII層由来の樹状突起が分枝して陽性ニューロピルを形成していた。内側辺縁皮質を除く大脳皮質の多くではV層の錐体細胞とその頂上樹状突起に強陽性を認めたが、PLでは他の層と比べて同程度か逆にやや弱く染まった。内側辺縁皮質でPLと似た陽性パターンを示したのは前帯状回とRSAであった。RSGでは浅層が強陽性でIII層が陰性、IV層より深層は弱陽性を示し、他とは全く異なる陽性パターンを示した。以上の結果は、PLにおいてD1とD5受容体の分布パターンが異なること、さらに、内側辺縁皮質のD1-family受容体システムが少なくとも2つのパターン、即ち、PLと類似するものとそうでないものが存在することを示している。昨年度の実験で多くの細胞に確認されたD5受容体が、どの細胞種にどの位の割合で存在しているのかを調べるために、GAD65/67、D5受容体、核(Hoechst)の3重染色を行い、共焦点顕微鏡で検索した。その結果、非GAD細胞およびGAD細胞双方の95%以上にD5受容体の存在を認めた。ニューロピルでは、錐体細胞樹状突起幹が最も密にD5受容体を有し、これから起こる棘にもD5受容体陽性を確認した。I層では錐体細胞頂上樹状突起に由来すると思われるタフトにも陽性像を認め、興奮性の錐体細胞では細胞体から樹状突起、棘、タフトに至るまでD5受容体が広く分布していることを観察した。抑制性細胞でも上述したように、細胞体のほとんどにD5受容体の存在を認めた。しかし、GAD65/67では樹状突起は染め出せず、抑制性細胞樹状突起における受容体分布は検索できないため、Parvalbumin(PV)を用いて3重染色を行った。この結果、PV陽性細胞のほぼすべてにおいて細胞体にD5受容体の陽性を認めた。細胞体や近位側樹状突起にD5受容体が密に存在する場合でも遠位側ではより疎となっていた。一方、近位側樹状突起でD5受容体が疎であるものが遠位側で密な分布を示すことはなかった。以上の観察結果から、D5受容体は錐体細胞(興奮性ニューロン)では細胞体、樹状突起、棘、I層のタフトに至るまで広く密に分布するのに対し、抑制性ニューロンでは主に細胞体と近位樹状突起に分布し、遠位ほど疎に分布していることが明らかとなった。さらに、非GAD細胞、GAD細胞の双方とも線維や神経終末にD5受容体陽性像は確認されなかった。平成20年度までの研究から、神経終末の多くはD5受容体を含まないことが強く示唆されたが、昨年度はそれを検証するために、SynaptophysinとD5受容体に対する特異抗体を用いた蛍光2重免疫染色を施し、共焦点顕微鏡で観察を行った。Synaptophysinは、シナプス小胞膜に存在する糖タンパク質で、シナプス前終末のマーカーとして広く用いられている。

観察の結果、I層からVI層までのすべての層でほとんどすべてのSynaptophysin陽性構造物、即ち、シナプス前終末はD5受容体を含んでいないことが判明した。さらに、Synaptophysin陽性終末は、ニューロピルで多数観察されるD5受容体陽性のスパインあるいはタフトとしばしば接触していた。これらの所見は、ラットの内側前頭前野におけるD5受容体を介するドーパミン作動性調節はシナプスの受け手側で働き、シナプス前終末側では行われないことを示唆している。電気生理学的研究では、D1型受容体(D5とD1受容体)は、錐体細胞のスパインにおける長期増強の形成やPV含有細胞の発火とそれによる錐体細胞の抑制を引き起こすことが報告されている。ラット大脳皮質におけるD1受容体はわずかしか存在しないため、これらの作用は主にD5受容体を介していると考えられる。本研究では、D5受容体は後シナプス部位に存在し、錐体細胞ではスパインを含む樹状突起に、PV含有細胞では活動電位の発生場所に近い細胞体周辺に分布していることを明らかにした。このD5受容体の局在分布パターンは、内側前頭前野が機能の座とされる作業記憶などの高次脳機能に関するドーパミン作動性修飾の基盤をなしていることを示している。
下部地殻レオロジーの実験的研究:水の効果と延性破壊による震源核形成について

本研究では、下部地殻の代表的な岩石である斜長岩のレオロジーにおける水の影響や圧力の影響を定量的に調べるために、下部地殻に相当する温度・圧力を出力可能なGriggs型試験機を使い、斜長岩の予察的な変形実験を行った。本年度前期は、東北大学現有のGriggs型試験機を、変形実験が可能なように修繕した。東北大学が所有するGriggs型試験機用に、研究費で購入した温度制御・モーター制御のリレー回路を作成し、下部地殻条件下での実験が可能な変形試験機を作成した。また、出発試料を合成することで、粒径、含水量を制御かつクラックフリーの斜長岩を合成し、実験試料とした。通常の薄片観察に加え、放射光X線CT観察により、試料中のポア分布を調べた。また、FTIRを用いて、焼結した試料の含水量を求めた。真空焼結した試料の予察的な変形実験から、無水下では合成斜長石多結晶体は、著しく強度が高いことが明らかになった。一方、含水下では、試料の表面約1mmほど水軟化し、変形が集中した。この変形した部分は強い格子定向配列を示した。しかし、強度は無水下で変形したものと変わらないことから、今後、含水下でのアニール時間を長くするなどから、斜長石多結晶体を難化させるのに必要な含水量を調べていく。
キョウチクトウスズメガ体内におけるキョウチクトウ葉強心配糖体の動向について

キョウチクトウ(Nerium indicum Mill.)葉には強心配糖体が高濃度に含有されており、葉を食草とするキョウチクトウスズメガ(Daphnis nerii L,以下D.nerii)の幼虫は強心配糖体を摂取し蓄積する可能性があるにもかかわらず、体色は明らかに保護色を呈している。幼虫が強心配糖体をいかに処理しているかを知るために、葉、幼虫、および幼虫の糞(以下frass)について強心配糖体の比較検討を行った。葉、幼虫、frassの抽出エキスのHPLCによる比較を行い、さらに各々のエキスについて通常のカラムクロマトを行って含有強心配糖体の単離、同定を試みた。葉においては主配糖体であるoleandrin gentiobiosideをはじめ、odoroside A,adynerin,D^<16>-adynerinなどがgentiobiose基を結合したtriosideとして得られたが、monosideとしても比較的少量のoleandrin,adynerin,odoroside A,D^<16>-adynerinなどが得られた。葉におけるoleandrinとadynerinの比は明らかにoleandrinが主配糖体であることが確認された。これに対し、幼虫およびfrassでは配糖体はすべてgentiobiose基が加水分解を受けてmonosideに移行している。またoleandrinは16位アセチル基も鹸化されてdeacetyloleandrinに変化していることが、oleandrinの減少、deacetyloleandrinの増加から明らかになった。この結果、幼虫およびfrassエキスでは、主配糖体は非活性のadynerin,次いでdeacetyloleandrinでありoleandrinは少なく、とくに幼虫のエキスではHPLCにおいても非常に低いピークが観察されるのみであった。したがって、虫体内の強心配糖体は質的にも毒性の弱い構成と考えられ、幼虫にとって保護色は必要と推定された。Frassから得られたadynerinの収量は異常に高い値を示し、幼虫におけるadynerinは、キョウチクトウ葉の成分中もっとも高い濃度で虫体から検出されたursolic acidとともに、その虫体における意義についてさらに検討する必要がある。キョウチクトウスズメガ(Daphnis nerii L.)体内にキョウチクトウ葉の成分がどのように移行し、蓄積されるかについて検討を行った。終齢幼虫11匹を含む約30匹の幼虫をエタノールでホモジナイズ後、葉の成分分離の方法に従って分画を行い、体内の成分を植物二次代謝物のレベルの分離を行った。次に幼虫の糞中に排泄された成分についても同様の抽出単離を行った。結果幼虫体内からは、ursolic acid、cholesterolおよびadynerinが得られた。糞中のカルデノライドの中、量的に多いのはadynerinであり、その他、oleaside A、8beta-hydroxyodoroside A、nerigoside等が小量ないし微量得られた。また葉中に大量に得られるフラボノイドrutinは体内からは全く検出されなかった。考察Adynerinは通常のカルデノライドと異なり8,14beta-epoxy-構造を有する強心不活性カルデノライドである。キョウチクトウ葉内ではminor cardenolideとして、その三糖体の形で存在するものである。キュウチクトウ新鮮葉の配糖体は三糖乃至二糖体として存在しているものと考えられる。今回幼虫体内、糞中から得られたカルデノライドがすべて単糖体として存在していたことは、二、三糖体が幼虫体内(乃至は腸管内)において加水分解されることを示している。

また強心活性の強い配糖体、例えばoleandrin、odoroside A系の配糖体が体内はもとより、糞中にも極く微量にしか見い出されないことは注目に値するものと考えられる。平成5年度の実験においてキョウチクトウスズメガ(以下スズメガ)体内からadynerinが得られたことを明らかにしたが、このadynerinがスズメガにより選択蓄積されたものである可能性が高いことは、被検幼虫が5齢の蛹化直前であったことから妥当と考えられる。したがって、今後の研究課題として生理的に人体には不活性なカルデノライド配糖体であるadynerinもスズメガでは何らかの役割を担っている可能性について考えねばならない。スズメガのfrassに存在するカルデノライドは葉中とは異なり、1.すべてmonosideある。2.葉中ではoleandrin(gentiobioside)が他に比し、圧倒的に大量であるのに対し、frass中ではadynerinが最大量を示し、oleandrinは2番目である。これらの値は、葉およびfrass中に共に検出されるursolic acidおよびrutinを定量的に得て、それらの量との比較により確認した。Oleandrinの減少は同じアグリコンoleandrigeninとD-diginoseより成るnerigosideが定量的にそれほどの変化を示していないことから、oleandrinを構成する糖、L-oleandrose部分の加水分解ないしは分解による可能性がある。Adynerinの増加は現在のところ全く理由が不明である。平成6年度の幼虫の採集が出来なかったために再確認が出来なかったが、今後の重要な研究課題と考えている。
リーマン多様体とポアソン核・熱核の情報幾何学

ポアソン核を許容するアダマール多様体Xに対してXからXの理想境界∂X上の絶対連続かつ正値密度を有する確率測度のなす空間P(∂X)への写像,すなわちポアソン核写像φ,のリーマン幾何学・情報幾何学的考察を行った。φがフィッシャー情報計量とXの計量に関して比例的かつ極小的であると仮定すると,ポアソン核がビューズマン関数を肩にもつ指数関数表示でき,その結果Xは漸近調和(すなわち,各ビューズマン関数のラプラシアンが共通の一定値をもつ)かつ可視的(すなわち,理想境界∂Xの任意の2点を結ぶ測地線が存在する)である。さらに比例定数の値は各ビューズマン関数の超曲面である各ホロ球の平均曲率に一致することがわかるが,本研究においてこの比例定数がさらにXの体積エントロピー(各測地球の体積の指数関数的増大度を測る指標)に一致することを示すことができた。当該年度では、Poisson核に関するFisher情報幾何学について考察をすすめた。その結果、交付申請書の研究実施計画の研究目標1についてDamek-Ricci空間のPoisson核が他の階数1の対称空間同様、体積エントロピーとBusemann関数によって表示できることを示すことが、連携研究者との共同研究によってできた。Damek-Ricci空間のLie群的構造が幾何的考察に本質的に働いている。また目標2に関連して、Poisson核写像が相似的かつ極小である場合のHadamard空間Xの幾何的考察ができ、Xは漸近調和的、すなわち任意のホロ球の平均曲率が一様に一定となることがわかった。(当初の予想は、Xが単に調和的であること。現時点では調和に非常に近い漸近調和的まで結論づけられた。)さらにこのとき、Poisson核はBusemann関数および平均曲率によって表示されることもわかった。証明の手法は直接写像の極小性をもちいるのではなく、写像が調和写像と仮定して結論を導くことができた。目標2および3に関連した研究については、極小的相似的Poisson核写像をもつ漸近調和的Hadamard空間Xは可視的空間の性質をもち、このときさらに、Xが解析的多様体ならば、Xは階数1となり、さらには測地流がAnosov的となり、Xはある意味で真に負曲率的ということができる。このことから、Damek-Ricci空間は階数1 Hadamard空間でAnosov的測地流をもつことが判明した。今後の課題としては、上記の条件をみたすHadamard空間Xが調和空間であるための考察にすすむ。そのため、まず測地球の体積増加度、ホロ球の主曲率分布についての考察が不可欠である。現在Damek-Ricci空間について考察を実行中である。当該年度では,ポアソン核に関するフィシャー情報幾何学について前年度の考察の継続という形で精力的に研究を進めた.研究目標1についてTokyo J.Math.掲載論文においてダメックーリッチ空間のポアソン核が体積エントロピーとビューズマン関数によって完全に表示できるという結果を著した.これによってアダマール多様体としてのダメックーリッチ空間から理想境界上の確率測度の空間へのポアソン核写像が定義され、その写像がフィジャー情報計量に関して調和かつ相似的であることが具体的に明らかにされた。目標2では,調和かつ相似的ポアソン核写像を許容するアダマール多様体の幾何学的研究結果、すなわちそのようなアダマール多様体は漸近調和的かつ可視的であらねばならないという結果を,Diffrential Geometry and its Applications,2010国際会議(チェコ・ブルノ市開催)にて報告し,参加者と研究討論を行った.報告はDGA2010Proceedingsとして次年度に出版予定中.またギリシャエーゲ海幾何学サマースクールに参加し,目標2の研究に関連した貴重なアドバイスをもらい、研究が進展中で、次年度にまとめたい.モデル空間に関する剛性が大きな意味をもつというアドバイスであった.加えて,当初の研究実施計画に課題としてあげたビューズマン関数のレベル超曲面であるホロ球の幾何学について最近進展があったので,現在結果をまとめている.次年度各方面で報告したい.一つは,ホロ球の主曲率の個数が,3個以上でかつ定数でないダメックーリッチ空間の存在を示すことができたこと,また測地流のアノソフ性に効力を発揮した安定ヤコビテンソルをわれわれの研究に役立てることに成功した.特筆すべき結果をいくつかあげる.定理:ホロ球がすべて全測地的(主曲率一定)であるアダマール多様体は空間形でなければならない.