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超高精度数値解法を用いた波動場逆問題に対する数値的再構成法の研究

本研究では,波動方程式の順問題に対する超高精度数値解法と密度型位相最適化問題に対する高精度数値的再構成法を開発した.波動方程式の順問題に対しては,空間方向を任意多点差分法,時間方向をGauss-Lobatto選点によるスペクトル選点法により離散化することで直接的解法を導出し,数値実験により高精度性と問題点を明らかにした.また,システム誤差を考慮しなくてよい非適切問題である位相最適化問題に対して,任意多点差分法とH1勾配法による高精度数値的再構成法を導出し,数値実験によりその有効性を明らかにした.今年度は,スカラー波動方程式の順問題に対する超高精度数値計算法において重要な非対称疎係数行列を持つ連立一次方程式の反復解法における前処理および高精度演算利用の研究を実施した.本研究では,疎な非対称行列の解法として有用なBiCGSTAB法を採用している.昨年度の研究により,高精度近似解を実用時間で得るためには収束性改善が必須であることが判明したため,前処理および高精度演算使用による効果を検証した.前処理としては,多倍長計算に伴う使用メモリ量抑制実現のため,行列の疎構造を維持する対角スケーリングとフィルイン無し不完全LU分解を採用した.それらの前処理について多倍長計算環境下における数値実験を実施し,どちらの手法についても大きな改善が見られず,反復回抑制に対して前処理より計算桁数を大きく取る方が効果的であることを明らかにした.また,内部内積演算を荻田・大石らにより提案された高精度演算法に置き換えた高精度演算BiCGSTAB法を考案し,数値実験によりその効果を検証した.その結果,高精度演算を用いた場合においても,収束性に改善は見られなかった.以上の結果より,計算桁数を大きく取ることが,収束性にとって最も効果的であることが明らかとなった.しかし,計算桁数を大きく取ることは計算時間の増大を意味するため,今後は疎行列用直接解法の検討が必要であることを確認した.これらの成果について,国内学会において口頭発表を実施した.今年度は,波動方程式の逆問題に対する高精度再構成手法開発の基礎研究として,トポロジー最適化による最適設計問題に対する高精度反復型解法の開発を行った.最適設計問題とは,弾性場などにおいてエネルギーなどを意味する汎関数を制約条件下で最小化する領域形状を求める問題であり,その性質は非適切である.しかし,使用するデータはこちらで規定できるため測定誤差は存在しない問題であり,多倍長計算と高精度解法を用いた再構成手法の有効性が期待できる問題である.トポロジー最適化とは,領域形状を偏微分方程式の係数関数を同定することで最適形状を求める手法であり,波動方程式の係数同定問題への適用を考察するための基礎研究として有効である.本研究では,まずポアソン方程式に対する最適設計問題を対象とし,最急降下法およびH1勾配法による反復型数値的再構成手法を開発した.偏微分方程式の計算手法としては任意多点差分法を用い,手法において必要な数値積分法として指数関数補間を利用した方法を用いた.それら手法を有効に動作させるため,多倍長計算環境とMPIによる並列計算高精度プログラムを開発し,その有効性を数値実験により検証した.その結果,最急降下法による結果は数ステップで計算が破たんするのに対し,アルゴリズム全体の数学的枠組みを保証しているH1勾配法は,収束性は遅いものの工学的妥当性のある結果へ収束していくことを確認した.一方,計算時間を予想以上に要したため,プログラム内部の更なる並列化と探索幅の決定手法改良が,波動方程式への適用を考察する上での検討課題である.これらの成果について,国内学会において口頭発表を実施した.今年度は,スカラー波動方程式の順問題に対する超高精度数値計算アルゴリズムの開発と計算機への実装を実施した.時間方向近似にはチェビシェフ多項式とGauss-Lobatto選点によるスペクトル選点法を,空間方向近似には求積点配置の自由度が高い任意多点差分法を採用することで,任意形状の空間領域におけるスカラー波動方程式の順問題に対する高精度解法の実現を試みた.開発数値解法において必要になる連立一次方程式の近似計算プログラムとして,多倍長計算環境exflibの利用を想定した外積形式ガウス消去アルゴリズムによる並列ソルバを開発し,それを用いて計算機への開発手法実装を実施した.さらに購入ワークステーションを用いて数値実験を行うことにより,一定数の選点・求積点数を用いて行った実験においては開発手法の高精度性を示唆する結果を得ることはできた.しかし,超高精度性を確認するためには,より多い選点・求積点,そして振動数の大きい例題に対する数値実験結果が必要となり,多倍長環境を利用したことによる使用メモリ量の関係から,係数行列の疎性を考慮した連立一次方程式の数値解法開発の必要性が明らかとなった.本研究では,疎な非対称行列の解法として有用なBiCGSTAB法の使用を試みたものの,計算桁数が連立一次方程式の近似解の収束性に大きな影響を持つことが判明し,使用メモリ量抑制の観点からも内積などの内部演算の高精度化が今後の課題であることを確認した.これらの成果について,国内学会において口頭発表を実施した.今年度は,波動方程式の逆問題に対する高精度再構成手法開発の基礎研究として,密度型トポロジー最適化問題に対して昨年度開発した高精度数値的再構成法について,採用した各種勾配法の特性の検討と従来法との比較検討を行った.まず,Poisson方程式を支配方程式とするトポロジー最適化問題に対して,高精度計算環境下で更なる数値実験を行い,計算桁数増加および離散化精度向上をしたにも関わらず最急降下法の計算が破たんすることを確認した.

このことは,最急降下法がトポロジー最適化問題のような係数同定問題に対して本質的に不安定なことを意味している.さらに,高精度計算環境下での数値実験および従来計算環境との比較検討を通して,H1勾配法の安定性と問題点を明らかにした.具体的には,有限要素法と倍精度環境を用いた結果と高精度計算環境で得られた結果が大きく異ならないことを示すことにより,H1勾配法が計算環境・方法によらない本質的な安定化手法であることを数値的に示した.一方,手法の基礎となっているKKT条件は,解析的な状況に近い高精度計算環境下においても数値的に満たされなかった.このことは,得られた近似再構成係数関数は最適関数と近似的にも保証できないことを意味しており,今後の応用に際して改良しなければならない問題点である.なお密度型トポロジー最適化問題は,ある種の条件下で最適な領域形状を求めるものであり,偏微分方程式の係数同定問題として数理モデル化されている.そのため,今年度の研究で得られた成果は,波動方程式の係数同定逆問題への応用が期待できる.今年度の研究成果については,関連学会で発表するとともに論文誌へ投稿し,現在審査中である.今年度は,昨年度までに開発した密度型位相最適化問題に対する高精度数値再構成手法を基礎として,波動方程式の係数同定逆問題の実用例である「鉄とコンクリートの合成梁の接合部欠陥同定問題」に対する数値同定法の開発を行った.密度型位相最適化問題の数理モデルは,[0,1]を値域とし,対象領域の空間次元に対応したユークリッド空間を定義域とする適当に滑らかな関数(シグモイド関数)を用いて定義したものを係数関数とする偏微分方程式を導入し,その係数関数を同定する逆問題として表されている.ここでの係数関数は,シグモイド関数とその値を制御する設計変数の合成関数で構成されることが多い.設計変数は,対象としている構造物を含む領域を定義域とし,シグモイド関数の定義域であるユークリッド空間を値域とする関数であり,元の問題に付加条件がない限り,滑らかさのみが仮定される.その係数同定逆問題モデルを変分法的定式化により汎関数の最大または最小化問題へと帰着し,反復型解法により最適形状を得るのが一般的な方法である.本研究では,合成梁接合部のずり剛性係数および軸剛性係数をシグモイド型関数に置き換えた密度型連立波動方程式を導入し,それぞれのシグモイド関数を制御する設計変数関数を同定する密度型接合部欠陥同定問題を導出した.この密度型係数同定問題を解く方法として,H1勾配法を基礎とした抽象勾配法を採用した.探索方向を求めるための強圧的かつ有界な対称双一次形式として,ずり剛性に関わる設計変数に対してはH2ノルム,軸剛性に関わる設計変数関数に対してはH1ノルムを基礎としたものを導入し,それらを用いた反復型数値的再構成法を開発した.
作業記憶に関与する前頭連合野のニューロン回路網の研究

本研究は、ニューロン間の情報伝達の様式や方向を明らかにすることにより、作業記憶に関与する前頭連合野肉の神経回路網を明らかにすることを目的に実施した。手のリーチング運動を使った2種類の遅延反応(遅延リーチング課題、遅延連続リーチング課題)を学習した2頭のアカゲザルを使用した。ニューロン間の相互作用を検討するためには、このような課題で観察される前頭連合野のニューロン活動の分類とその機能的意味の検討が必要である。2頭のサルの前頭連合野から記録した243個のニューロン活動に関連のうち、課題した活動の見られた138個のニューロンについて解析をおこなった。このうち85個は目標位置として呈示した視覚刺激に応答し、72個は遅延期間中に持続的な活動を、108個はリーチング運動の遂行時に活動を示した。なかでも遅延期間中に生じる活動は、作業記憶の構成要素である情報の能動的な保持機構を反映すると考えられるので、これに注目して詳しく解析した。その結果、目標位置として呈示される視覚刺激がある位置に呈示されると遅延期間活動を生じるニューロン(位置依存性)、視覚刺激がある位置の組み合わせで呈示されると遅延期間活動を生じるニューロン(組み合わせ依存性)、呈示される位置には無関係に遅延期間活動を生じるニューロン(無選択性)などが見出された。また、位置依存性、組合わせ依存性を示すニューロンの多くが、刺激の呈示順序にも依存した活動を示した。このように前頭連合野の個々のニューロンには、比較的単純な情報を保持するものから、いくつかの情報が組み合わされた複雑な情報を保持するものまで、様々なものの存在が明らかになった。このうち、位置依存的で呈示順序にも依存する活動は、位値選択性のある遅延期間活動をもつニューロン間の相互抑制的な結合により形成されることが示唆された。今後、保持されている複雑な情報は単純な情報の組み合わせにより形成されるという仮説のもとに、観察されたこれらの活動パターンがニューロン間のどのような相互作用により可能なのかを、単純なモデルと相互相関解析を用いて検討する計画である。2頭のアカゲザルに、手のリーチング運動を使った2種類の遅延反応(遅延リーチング課題と遅延連続リーチング課題)を訓練した。遅延リーチング課題では、2ヶ所に視覚刺激が0.5秒づつ順次呈示された後3-5秒の遅延期間に入り、遅延の終了後刺激の呈示順序と同じ順序で反応キーを押すと報酬が得られる。遅延リーチング課題では、1ヶ所に刺激が呈示され、遅延終了後その位置の反応キーを押すと報酬が得られる。サルが両課題を充分に学習した後、単一ニューロン活動の記録を行った。現在までに230個の単一ニューロン活動を前頭連合野の主溝とその周辺部から記録した。記録したニューロン活動のうち遅延期間中に生じる活動は、作業記憶の重要な要素である情報の能動的な保持機構を反映すると考えられる。そこで、このような遅延期間活動に注目し、複数位置の同時作業記録メカニズムと位置の呈示順序が作業記録に及ぼす影響を詳しく解析した。その結果、手がかりとして呈示される視覚刺激が視野内のある位置に呈示されると遅延期間活動を生じるニューロン(位置依存性ニューロン)、視覚刺激がある位置の組み合わせで呈示されると遅延期間活動を生じるニューロン(組み合わせ依存性ニューロン)、呈示される2つの視覚刺激の相対的な位置関係に応じて遅延期間活動を生じるニューロン(相対位置依存性ニューロン)などが見いだされた。

また、位置依存性ニューロンや組み合わせ依存性ニューロンでは、多くが刺激の呈示順序にも依存した活動を示した。このように、前頭連合野の個々のニューロンには、比較的単純な情報を保持するものから、いくつかの情報が組み合わされた複雑な情報を保持するものまで、様々なものが存在することが明らかになった。今後、このようなニューロン活動の組み合わせにより、どのようにして複数の刺激位置とその順序が保持され、正しい反応が生じるのかを考察する計画である。本研究は、ニューロン間の情報伝達の様式や方向を明らかにすることにより、作業記憶に関与する前頭連合野内の神経回路網を明らかにすることを目的に実施した。手のリーチング運動を使った2種類の遅延反応(遅延リーチング課題、遅延連続リーチング課題)を学習した2頭のアカゲザルを使用した。ニューロン間の相互作用を検討するためには、このような課題で観察される前頭連合野のニユーロン活動の分類とその機能的意味の検討が必要である。2頭のサルの前頭連合野から記録した243個のニューロン活動のうち、課題に関連した活動の見られた138個のニューロンについて解析をおこなった。このうち、85個は目標位置として呈示した視覚刺激に応答し、72個は遅延期間中に持続的な活動を、108個はリーチング運動の遂行時に活動を示した。なかでも遅延期間中に生じる活動は、作業記憶の構成要素である情報の能動的な保持機構を反映すると考えられるので、これに注目して詳しく解析した。その結果、目標位置として呈示される視覚刺激がある位置に呈示されると遅延期間活動を生じるニューロン(位置依存性)、視覚刺激がある位置の組み合わせで呈示されると遅延期間活動を生じるニューロン(組み合わせ依存性)、呈示される位置には無関係に遅延期間活動を生じるニューロン(無選択性)などが見出された。また、位置依存性、組み合わせ依存性を示すニューロンの多くが、刺激の呈示順序にも依存した活動を示した。このように、前頭連合野の個々のニューロンには、比較的単純な情報を保持するものから、いくつかの情報が組み合わされた複雑な情報を保持するものまで、様々なものの存在が明らかになった。このうち、位置依存的で呈示順序にも依存する活動は、位置選択性のある遅延期間活動をもつニューロン間の相互抑制的な結合により形成されることが示唆された。今後、保持されている複雑な情報は単純な情報の組み合わせにより形成されるという仮説のもとに、観察されたこれらの活動パターンがニューロン間のどのような相互作用により可能なのかを、単純なモデルと相互相関解析を用いて検討する計画である。
地域社会における温暖化防止施策とコラボレーション

温暖化防止活動推進員に対する郵送調査によって、推進員は、高学歴者の割合が高く、定年後あるいは定年を目前にした男性と活動的な専業主婦が主力であり、男性では、これまでの経験を活かし社会的に有意義な活動に貢献したいという意欲が高く、女性では婦人会役員などが行政の勧誘によって推進員になっている場合が多いことなど、男女別の相違点が明らかになった。3年間の各都道府県代表の全国大会応募申請書をもとにデータベース化を行い、関係主体間の連携と環境学習を重視し、地域資源を活用したすぐれた実践が多いことが明らかになった。平成19年9月から調査対象県の選定を行い、郵送による質問紙調査や聴取調査の実施を予定していたが、平成19年5月から「ストップ温暖化一村一品大作戦」という47都道府県で地域レベルでの温暖化対策を募集するコンテストが開始され、当初予想を大きく上回る1074件の応募が全国から寄せられた。コンテストの全国大会が平成20年2月910日に開催され、その結果をも参考に、質問紙調査の対象県として、宮城県・山形県・長野県・京都府・兵庫県・広島県・山口県・沖縄県の8府県を選定した。平成20年度は、京都議定書の定める第1約束期間に入ったこと、7月に北海道の洞爺湖サミットが開催されたことにともなって、マスメディアでも、温暖化問題に関する報道が顕著に目立つようになり、それらもふまえて「地域レベルでの温暖化対策の概要調査」の調査項目を大幅に拡充した。国際的に、地域社会・自治体レベルでの温暖化防止活動について研究関心が急速に高まりつつある。国際学会での本研究報告に対して得られたコメントや反響からも、本研究は日本の温暖化対策の制度的な特質と構造をふまえた、このような世的な研究動向の最先端をいく実証的な研究であるといえる。初年度の調査結果をふまえて、本年度は全国45都道府県の「地球温暖化防止活動推進センター」の中から、活動実績や地域性などをふまえ8府県のセンターを選び、予備的な聴取調査を行ったうえで、約1500人の温暖化防止活動推進員を対象とした質問紙調査を行い、約900人の推進員から回答を得た。どのような社会的条件が推進員としての活動を動機づけ、積極的な活動を促進してきたのかを解明することを目的に、聴取調査と質問紙調査は、彼らが推進員に応募した動機、主な職業経歴、価値観や信条、ライフスタイル、NGOなどとのこれまでの関わりを主要な項目とした。現在詳細な分析をすすめているが、どのような社会的条件とコラボレーションのもとで、どのような温暖化対策が地域レベルで効果をあげうるのか、推進センターおよび推進員の積極的な関与を規定している要因と、消極化させている要因とを抽出し、活動を活発化させるためにはどのような条件の整備が必要か、国や都道府県の政策的・財政的な支援はどのようにあるべきか、さらに、地域社会における温暖化防止対策の政策評価を行ううえで貴重なデータが得られた。初年度・2年度の調査結果をふまえて、昨年度に実施した8府県の「地球温暖化防止活動推進センター」の約1500人の温暖化防止活動推進員を対象とした、郵送法による質問紙調査(約900人の推進員から回収)結果について分析をすすめた。回収率は6080%とどの府県でもきわめて高かった。大卒以上の高学歴者の割合が高く、定年後あるいは定年を目前にした男性と活動的な専業主婦が推進員の主力であり、男性の場合には、職業経験や活動経験などから得た社会的に有意義な活動に貢献したいという意欲が高く、女性の場合には婦人会役員などが行政の勧誘によって推進員になっている場合が多いことが明らかになった。節電などの温暖化防止活動の実行度は女性が高く、男性は情報提供などの実行度が高い。国の温暖化対策への評価は全体的に低いが、地元の府県に対する評価が、とくに京都府などで高く、環境省に対する評価も相対的に高いこと、メディアの温暖化問題に関する報道への評価は高いことなどが明らかになった。国や都道府県の政策的・財政的な支援はどのようにあるべきか、さらに、地域社会における温暖化防止対策の政策評価を行ううえで、全国ではじめての貴重なデータが得られた。このデータを国および都道府県、市町村の温暖化対策の推進のために活用していきたい。研究代表者が初年度から実行委員長として参与観察してきた、これら推進センターが関与する「ストップ温暖化一村一品大作戦」全国大会は、3年間で3596件の応募を得、47都道府県代表によってコンクールを行ってきた。3年間の各都道府県代表の応募申請書をもとにデータベース化を行い、関係主体間の連携と環境学習を重視し、地域資源を活用したすぐれた実践が多いことを明らかにした。この取り組みの意義について、12月にデンマークで開催されたCOP15のサイドイベントで報告し、大きな国際的反響を得た。
線維化アルファシヌクレイン受容体を標的としたシヌクレイノパチー疾患修飾療法の開発

パーキンソン病(PD)は線維化aSを主要構成成分とする神経細胞内封入体であるLBの出現と、カテコラミン産生細胞の脱落を特徴とする神経変性疾患である。近年、線維化aSの神経細胞間伝播、いわゆるプリオノイド仮説が注目され、病態研究のメインストリームの一つとなっている。しかし、基本的事項であるaSの細胞間伝播機構のメカニズムに関してはいまだ不明な点が多い。本研究では細胞外aSが神経細胞へ取り込まれる際に受容体として機能する特異タンパクの網羅的探索・同定を通じてaSYN内在化過程をさらに詳細に検討し、神経・グリア細胞表面の線維化aS受容体分子をターゲットとした伝播阻害治療薬の開発を最終目標とする。パーキンソン病においては異常凝集したアルファシヌクレイン(αSYN)が細胞間を伝播して病変が拡大していくとするプリオノイド仮説が提唱されている。しかし、基本的事項であるaSYNの細胞間伝播機構のメカニズムに関しては、いまだ不明な点が多い。近年、神経・グリア細胞表面に局在し、線維化αSYN受容体として機能しえる分子として、lymphocyte activation gene 3、α3-NaK-ATPaseなどが複数報告されるに至り、αSYN伝播に直接関与するαSYN受容体タンパクの網羅的探索・同定が望まれるようになった。本研究では細胞外αSYNが神経細胞へ取り込まれる際、受容体として機能する特異タンパクの網羅的探索・同定を通じてαSYN内在化過程を詳細に検討し、神経・グリア細胞表面の線維化αSYN受容体分子をターゲットとした伝播阻害治療薬の開発を最終目標とする。マウス全脳由来の膜タンパクを人工脂質二重膜へ再配置することでライブラリ化したものを出発点として、リガンドには単量体αSYN・線維化αSYNを用いた。単量体αSYN結合分子と線維化αSYN結合分子の両者を別々にMALDI-TOF質量分析法により解析し、受容体候補タンパクを網羅的に検討した。その結果、細胞外ドメインを有すること、単量体αSYNよりも線維化αSYNに強く結合することなどの受容体候補タンパクとしての各種条件を満たした5つの候補タンパクが同定された。2018年度に予定していたマウス全脳由来の膜タンパクライブラリを出発材料としたMALDI-TOF質量分析法による膜タンパクの網羅的スクリーニングをすでに終えており、現時点では二次スクリーニングを開始している。同定された5つの受容体候補タンパクを個々に発現した培養細胞系を用いて、共免疫沈降法により細胞外aSYN(単量体・線維化物)との実際の分子間会合を確認中である。また併せて、受容体候補タンパクに関して、過剰発現またはサイレンシングにより発現量を変化させ、単量体αSYN、線維化αSYNの細胞内への取り込み量をウェスタンブロット、または免疫組織化学に基づいて定量評価を行っている。質量分析法による1次スクリーニングを経て、培養細胞系を用いた2次スクリーニングに有意差が得られた分子は真の線維化aSYN受容体である可能性が高いと判定する。培養細胞系において、αSYN受容体候補分子に対する特異抗体や結合阻害分子を用いることで、選択的かつ効率的にαSYN取り込みを抑制することが可能となる条件を探索する。最後に、線維化αSYN受容体候補タンパクのノックアウト、あるいは特異抗体の髄腔内投与などの手法を用いて、マウスモデルでのαSYN脳内伝播抑制効果を評価する。

2018年度に予定していたマウス全脳由来の膜タンパクライブラリを出発材料としたMALDI-TOF質量分析法による膜タンパクの網羅的スクリーニングをすでに終えており、現時点では二次スクリーニングを開始している。同定された5つの受容体候補タンパクを個々に発現した培養細胞系を用いて、共免疫沈降法により細胞外aSYN(単量体・線維化物)との実際の分子間会合を確認中である。また併せて、受容体候補タンパクに関して、過剰発現またはサイレンシングにより発現量を変化させ、単量体αSYN、線維化αSYNの細胞内への取り込み量をウェスタンブロット、または免疫組織化学に基づいて定量評価を行っている。質量分析法による1次スクリーニングを経て、培養細胞系を用いた2次スクリーニングに有意差が得られた分子は真の線維化aSYN受容体である可能性が高いと判定する。培養細胞系において、αSYN受容体候補分子に対する特異抗体や結合阻害分子を用いることで、選択的かつ効率的にαSYN取り込みを抑制することが可能となる条件を探索する。最後に、線維化αSYN受容体候補タンパクのノックアウト、あるいは特異抗体の髄腔内投与などの手法を用いて、マウスモデルでのαSYN脳内伝播抑制効果を評価する。
銀ナノ粒子－酸化チタン複合系における多色フォトクロミズムの機構解明と機能改善

銀ナノ粒子一酸化チタン複合系の機構解明と機能改善を目的として、酸化チタン上に析出させた銀ナノ粒子の光電気化学的性質・挙動の観察と、サイズを制御した銀ナノ粒子の析出を行った。酸化チタン基板上の1つの球状銀ナノ粒子からの散乱スペクトルは、約460nmと620nmの2か所にピークを持ち、1つの粒子が2つの局在表面プラズモン共鳴モード(LSPRモード)を示すことが分かった。FDTD法によるシミュレーションから、短波長側のピーク波長では電場が銀ナノ粒子の周囲全体に広がり(Full-surface mode)、長波長側では銀と酸化チタンの界面に電場が局在化(Interface mode)していることが分かった。これは、銀が高い誘電率を持つ酸化チタンと接することで、Interface modeが大きくレッドシフトし、Full-surface modeから分離されるためである。次に、それぞれの共鳴波長の光を照射して各modeを励起したところ、それぞれの励起したmodeに由来する散乱光強度が選択的に減少した。すなわち、光照射前にはFu11-surface modeに由来する緑色の光と、Interface modeに由来する赤色の光が散乱されて橙色に観察されていた散乱光が、Fu11-surface modeを励起(450-500nm照射)後には赤色(Fun-surface modeに由来する緑色の散乱光強度が減少)に、Interface modeを励起(600-700nm照射)後には緑色(Interface modeに由来する赤色の散乱光強度が減少)に変化した。さらに、両モードを同時に励起(450-700nm照射)したところ、全ての波長域の散乱光強度が減少し、散乱光の色は暗色となった。このように光照射波長を変えて2つのLSPR modeを選択的に励起することで、単一銀ナノ粒子の散乱光の色を燈色から赤・緑・暗色と複数の色に変えることに成功した。このように、球状銀ナノ粒子を酸化チタンに担持させることで、Full-surface modeとInterface modeの2つのLSPR modeを分離し、各modeを選択的に励起することでそれぞれ粒子のサイズと形態を変化させ、単一銀ナノ粒子によるマルチカラー変化を達成した。この研究成果は、アメリカ化学会(ACS)の著名な学術雑誌「Nano Lett.」において報告した。銀ナノ粒子-酸化チタン複合系の機構解明と機能改善を目的として、酸化チタン上に析出させた銀ナノ粒子の光電気化学的性質・挙動の観察と、サイズを制御した銀ナノ粒子の析出を行った。酸化チタン微粒子膜上に光触媒析出させた直立銀ナノプレートを、暗視野顕微鏡とAFMによって同時に観察することで、一粒子レベルでの光電気化学的特性や挙動を解析することが可能となった。その結果、プラズモン共鳴波長の光照射による直立プレートの転倒と、それに伴う共鳴波長のレッドシフトが確認され、このことはシミュレーション結果からも支持された。さらに、直立銀ナノプレートに特徴的な偏光特性を確認し、可視偏光あるいは近赤外偏光を照射することで本系の偏光特性を制御することにも成功した。この一粒子レベルでの暗視野顕微鏡-AFMの同時観察は、本研究の目的とする銀ナノ粒子-酸化チタン複合系の機構解明・機能改善に大きく貢献できる手法である。また、ニオブ(Nb)をドープした導電性酸化チタン単結晶上に銀イオンを吸着させ、AFMを利用して特定箇所に電圧を印加することで、任意の場所にのみ銀ナノ粒子を析出させることができた。印加電圧の大きさ、あるいは印加時間を制御することで、析出粒子のサイズをある程度制御することもできた。さらに、粒子間距離や配列を制御した銀ナノ粒子団を析出させることができた。さらに研究を進めていくことで、球状粒子だけでなく、ロッドなどの異方性粒子も析出させることができると期待される。また今後はこれらの光電気化学的性質・挙動を観察・解析していく予定である。これら偏光特性制御は、認証や偽造防止にも利用することができると期待できる。これらの研究成果は、アメリカ化学会(ACS)の学術雑誌「J. Phys. Chem. C」において報告した。さらに、水中で偏光を照射することで、共鳴プレートを配向選択的に転倒させるだけでなく、基板から除去することも可能となった。また、この一粒子レベルでの暗視野顕微鏡-AFMの同時観察は、本研究の目的とする銀ナノ粒子一酸化チタン複合系の機構解明・機能改善に大きく貢献できる手法である。

本研究を進めていくことで、サイズを制御した銀ナノ粒子を析出させるだけでなく、粒子間距離や配列を制御した銀ナノ粒子団を析出させ、これらの光電気化学的性質・挙動を観察することが可能となると期待される。銀ナノ粒子一酸化チタン複合系の機構解明と機能改善を目的として、酸化チタン上に析出させた銀ナノ粒子の光電気化学的性質・挙動の観察と、サイズを制御した銀ナノ粒子の析出を行った。酸化チタン基板上の1つの球状銀ナノ粒子からの散乱スペクトルは、約460nmと620nmの2か所にピークを持ち、1つの粒子が2つの局在表面プラズモン共鳴モード(LSPRモード)を示すことが分かった。FDTD法によるシミュレーションから、短波長側のピーク波長では電場が銀ナノ粒子の周囲全体に広がり(Full-surface mode)、長波長側では銀と酸化チタンの界面に電場が局在化(Interface mode)していることが分かった。これは、銀が高い誘電率を持つ酸化チタンと接することで、Interface modeが大きくレッドシフトし、Full-surface modeから分離されるためである。次に、それぞれの共鳴波長の光を照射して各modeを励起したところ、それぞれの励起したmodeに由来する散乱光強度が選択的に減少した。すなわち、光照射前にはFu11-surface modeに由来する緑色の光と、Interface modeに由来する赤色の光が散乱されて橙色に観察されていた散乱光が、Fu11-surface modeを励起(450-500nm照射)後には赤色(Fun-surface modeに由来する緑色の散乱光強度が減少)に、Interface modeを励起(600-700nm照射)後には緑色(Interface modeに由来する赤色の散乱光強度が減少)に変化した。さらに、両モードを同時に励起(450-700nm照射)したところ、全ての波長域の散乱光強度が減少し、散乱光の色は暗色となった。このように光照射波長を変えて2つのLSPR modeを選択的に励起することで、単一銀ナノ粒子の散乱光の色を燈色から赤・緑・暗色と複数の色に変えることに成功した。このように、球状銀ナノ粒子を酸化チタンに担持させることで、Full-surface modeとInterface modeの2つのLSPR modeを分離し、各modeを選択的に励起することでそれぞれ粒子のサイズと形態を変化させ、単一銀ナノ粒子によるマルチカラー変化を達成した。この研究成果は、アメリカ化学会(ACS)の著名な学術雑誌「Nano Lett.」において報告した。
植物孔辺細胞に局在する電位依存性K^+チャネルの構造と機能

当初の計画のうちKAT1の結晶化およびX線結晶構造解析については、精製したKAT1の安定性が不十分であったこと等から、期間内に結晶化を達成することができなかった。結晶構造解析が困難になったことから、安定性の改良とCD測定法による二次構造解析に取り組むことにした。昆虫細胞/バキュロウィルス発現系から界面活性剤で可溶化したKAT1について、添加リン脂質が安定性に与える影響を検討したところ、大豆由来の精製ボスファチジルコリンの添加がKAT1の凝集や分解を著しく抑制する効果を示した。大豆由来精製ホスファチジルコリンを添加した条件で精製を行った結果、当初1L培養当たり0.2mgであった収量を1L培養当たり約2mgまで増加させることができた。さらに精製で用いる界面活性剤の選択がKAT1の構造に与える影響について円二色性分光法を用いて検討した結果、DDMに置換した場合α構造を保持していることが示唆された。DDMの場合、FOS cholineやBrij-35に比べてKAT1に吸着するリン脂質の量が有意に高くなることから、吸着したリン脂質の保持がホスファチジルコリンによる安定性の維持に関与することが示唆された。精製したKAT1について平面脂質二分子膜を介した2水相間の電位差-電流の関係を調べて、単一チャネル電流の大きさ、持続時間、出現頻度などについて検討を行った。その結果、セシウムイオンによる阻害を確認することができた。シロイヌナズナでは、気孔が開く際に細胞内へのK+の選択的透過を担う電位依存性K+チャネルとしてMT1(分子量78k×4)が知られる。植物イオンチャンネルの立体構造及びその機能相関の解明は、植物の環境適応における膜輸送系の機能分化を理解するための鍵となる。昨年度KAT1の精製法を確立したことから、本年度はその機能解析と結晶化に取り組んだ。電気化学セルを仕切るリン脂質平面二重膜(BLM)上に、リボソーム法を用いて精製したKAT1を再構成し、その単一チャネル電流の測定を行なった。一つのチャネルの開閉に対応すると考えられるステップ一つ分の電流変化は既報のパッチクランプ法により測定された単一チャネル電流の大きさとほぼ一致することが確認された。また、可溶化・精製したKAT1が活性を有することも確認できた。一方、スパースマトリックス法による結晶化スクリーニングを実施したが、精製した標品は凝集しやすく、結晶化溶液中での安定性を改善する方法を検討することが必要となった。膜タンパク質の立体構造の安定化には膜リン脂質との特異的な結合が重要な役割を果たすことが知られている。精製KAT1に結合しているリン脂質を抽出し二次元薄層クロマトグラフィーで同定を行った結果、KAT1に結合しているリン脂質の種類は置換する界面活性剤よって異なることが判明した。現在、安定化に寄与するリン脂質の同定に取り組みながら結晶化のスクリーニングを進めている。
二本鎖RNAがマガキに引き起こす急性生体防御反応の解明

近年、二枚貝にも異物を認識して生体防御反応を誘起するメカニズムが備わっていることが明らかになりつつある。本研究により、ウイルスを表現するdsRNAに対してマガキが血液中の血球数を増加させることが分かった。しかし、この反応は他の二枚貝であるアサリでは見られず、二枚貝の種によって認識メカニズムに違いがあると考えられた。また、dsRNAに対して特段の反応を示さないアサリは、dsRNA導入によるRNA干渉(RNAi)を利用した遺伝子ノックダウンに適した生物と考えられ、アサリを用いたRNAi法の標準化と生理学的研究への応用を試みている。本研究課題一年目の今年は、研究対象であるマガキ血球増加現象を引き起こす刺激源の究明に取り組んだ。すなわち、二本差RNA (dsRNA)類似物接種によるマガキ血球数変化の有無を検討した。通常、マガキが保持しない緑色蛍光タンパク質(GFP)の部分配列を接種源として用いているため、このGFP配列をランダムに変更したdsRNA、GFPと同じ配列をもつdsDNA、および脊椎動物のdsRNA受容体リガンドとなるpoly I : Cを接種した。結果として、dsRNAにおいて顕著な血球数増加が認められたが、dsDNAにも若干の増加が観察された。Poly I : Cでは増加が見られなかったため、二本差塩基配列を特異的に認識する何らかの機構が存在することが示唆される。ただし、dsDNAに関しては対象区と比べて統計的に有為な増加ではないため、個体数を増やすなどして確証を得る必要がある。次に、マガキの生理学的変異は個体差が大きいことから、in vitro系の実験系確立を目指した。この試験では、血球を多く含むと考えられる組織片を採取し、刺激源(dsRNA、poly I : C、またはdsDNA)を加えた培地にて培養し、血球の遊走を期待した。顕微鏡下の観察では、dsRNA添加区において組織外へ多くの血球が遊走する像が観察されたものの、定量的なデータを得るには至らなかった。本年度は、夏期にマガキの生殖腺発達により採血等実験に支障を来すことを経験したため、次年度以降、実験実施時期についても検討することが必要となる。また、震災の影響でマガキを入手することが困難となることが想定されるため、マガキ以外の二枚貝類を実験用試料として使用できるかどうかについても検討を行う予定である。研究課題二年目の本年は、東日本大震災の影響により研究遂行に適したマガキ入手が困難となったため、入手可能な二枚貝・アサリを用いてdsRNA接種に対する反応性を検討、マガキの場合と比較を行った。まず、マガキで血球噌加を誘起したGFP配列をもつ短鎖RNAをアサリ閉殻筋に接種し、24時間後及び48時間後の血リンパ中の血球数を計測した。その結果、全ての国おいて統計的に有為な違いは認められず、マガキでみられたような短鎖dsRNAに対する急性血球増加減少は観察されなかった。次に、より長いdsRNAに対する反応性を検討するため、約600塩基よりなる線形動物Cytochrome Oxidase Subunit II配列をもつdsRNAを接種し、血球数の変化を観察した。この場合にも、血球の増加は観察されなかったため、アサリは20塩基600塩基までの長さのdsRNAを認識し防御反応を誘起する、という機構を持たないことが考えられた。従って、二枚貝綱の中でも種による反応性の違いが考えられる。さて、アサリにおいてはdsRNA接種が防御反応を誘起しないという上記の結果を受けて、アサリにおいては生体防御研究にRNAiの導入が可能であると考え、RNAiを試みた。対象とする因子は血球分泌型の抗菌酵素リゾチームとした。手法としてアサリ閉殻筋に約600塩基のリゾチーム配列をもつdsRNAを接種し、1週間後と2週間後に血球及び外套膜のリゾチーム発現量を逆転写PCRにより解析を行った。また、血リンパ中及び外套膜組織中のリゾチーム活性を測定した。しかしながら、顕著なリゾチーム遺伝子発現量の低下は認められず、また、リゾチーム活性にも低下の傾向は認められず、結果としてRNAiの効果は確認できなかった。dsRNAの質や合成領域、投与量について再検討を行う必要があると考えられた。当初はマガキを用いて実施することを予定していた本研究であるが、東日本大震災の影響でマガキの入手が困難であったため、昨年度よりマガキに換えて入手容易なアサリを用いて研究を実施した。しかし、アサリでは二本鎖RNA (dsRNA)注射による生体防御反応が観察されなかったため、一部予定を変更してdsRNA注射によって対象RNAの働きをノックダウンさせるRNA干渉法(RNAi)確立を目指すことを試みた。研究計画最終年である本年は、昨年度の研究でk考えられた課題、すなわちdsRNA投与量が少なかったために効果が現れなかったと考え、注射するdsRNA量を1個体当たり30マイクログラムから150マイクログラムに増加させた。

この際にも標的としたリゾチーム遺伝子の発現量に変動は見られず、また、タンパク質としての活性にも変化は見られなかった。研究計画遂行中、標的因子であるリゾチームはアイソフォームが存在することが分かり、遺伝子発現や酵素活性からの評価が困難であると想定された。そこで、対象遺伝子を血リンパ局在で重要な生体防御因子であるレクチン(MCL-4)に変更することとした。この変更に伴い、まず、精製したMCL-4分子のアミノ酸配列を解析し、得られた情報から遺伝子配列を決定した。次にMCL-4遺伝子発現部位が血球であることを確認することで、RNAiのノックダウン効果判定するには血球の遺伝子発現を調べる必要があることが分かった。また、タンパクレベルでのノックダウン効果を判定するために、MCL-4分子検出用の特異抗体を作成した。現在、抗体の特異性やMCL-4分子の局在について確認し、ノックダウン効果を判定するための基礎的知見を得ることができたため、今後は導入するdsRNA量をさらに増やして実験を繰り返し、dsRNA注射によるRNAi法の確立と、生体防御反応における影響を評価して行く予定である。今年度はマガキを用いた実験が出来なかったため、血球増加反応の解明という目的の達成はやや困難になった。しかしながら、アサリに対してはdsRNAが防御反応を誘起しないことが分かり、二枚貝生体防御反応へのRNA干渉法応用の確立、というもう一つの目的達成にはかなり近づいたと考えられたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の最終目標は、二枚貝の生体防御研究にRNAi法を導入し、これまでに解明が困難とされた各因子の機能解析を試みることである。マガキで見られたdsRNAに対する血球増加反応はこれを阻むものであり、解明が必要ではあるが、アサリではこの点における問題点は無くRNAiを行える見込みがたった。今年度は、アサリ生体防御研究におけるRNAi法確立に向けて研究を遂行する。さらに、マガキとアサリでみられたこの違いについても、受容因子の観点より解明をすすめていく予定である。
レーザースペックル干渉法をモダリティーとした重合収縮制御法

フロアブルレジンの重合収縮制御を目指した新たな照射法の確立を目的として,異なる波長域のLED照射による重合挙動を,微小領域における試片の変位測定が可能であるレーザースペックル干渉法を用いて解析を行った。その結果,供試したフロアブルレジンのスペックルパターンの相関は,いずれの照射条件においても光線照射開始とともに急激に低下して再び上昇したが,その変化は,照射条件間では明らかな違いは認められなかった。光重合型コンポジットレジンの重合収縮は,術後疼痛あるいは微小漏洩などの原因となることが指摘され,重合収縮の低減化を目的として,その組成変更などが試みられている。一方,臨床においては,フロアブルレジンを用いた積層充填あるいは光線照射モードの変更などが行われている。そこで,フロアブルレジンの重合収縮制御法に関する基礎的検討として,LED光源のうち長波長域の有する深部到達性に着目し,異なる波長域の応用が重合収縮挙動に及ぼす影響について,レーザースペックル干渉法を用いて解析するとともに,ディラトメーターを用いた体積重合収縮率の測定,硬化深さ,ヌープ硬さおよび窩壁適合性の観察を行うことによって検討した。供試したフロアブルレジンは試作を含めた5製品とした。実験条件としては,分光波長分布と光強度を組み合わせた条件を設定した。硬化深さの測定は,ISO 4049の測定方法に準じて行った。供試したフロアブルレジンにおいては,硬化深さは1.815.45 mmの値を示した。また,ヌープ硬さの測定は,照射面の中央付近3点を測定した。硬化深さおよびヌープ硬さともに,いずれのフロアブルレジンにおいても光強度が100 mW/cm2の条件と比較して600 mW/cm2では,その測定値に違いは認められたものの,波長域も含めた条件間には有意な差は認められなかった。また,レーザー顕微鏡によるコントラクションギャップの形成の観察においても,供試したフロアブルレジンにおいては,コントロール群と他の条件間には顕著な差は認められなかった。そこで,フロアブルレジンの重合収縮制御法に関する基礎的検討として,LED光源のうち長波長域の有する深部到達性に着目し,異なる波長域の応用が重合収縮挙動に及ぼす影響について,レーザースペックル干渉法を用いて解析するとともに,ディラトメーターを用いた体積重合収縮率の測定を行うことによって検討した。重合収縮挙動を計測する装置としては,スペックライザST-I(東洋精機製作所)を改良したものを用いた。スペックルパターンの測定は,レジンペースト表面から得られたスペックルパターンを照射開始から120秒後まで連続して記録した。体積重合収縮率の測定は,ディラトメーターを用いて,照射開始から180秒後までの体積収縮率を算出した。その結果,スペックルパターンの相関は,いずれの照射条件においても光線照射開始とともに急激に低下して再び上昇したが,その変化は,照射条件間では明らかな違いは認められなかった。また,光強度600 mW/cm2, 470 nm付近の波長照射を行うコントロール群と比較して,他の照射条件では,一致度の回復に時間がかかる傾向が認められた。体積重合収縮率は,いずれのフロアブルレジンにおいても,照射開始から照射終了時まで急激な収縮を示し,それ以降はなだらかな一定の曲線となる傾向を示した。フロアブルレジンの重合収縮制御を目指した新たな照射法の確立を目的として,異なる波長域のLED照射による重合挙動を,非破壊かつ経時的に物質の動的変化の観察が可能なレーザースペックル干渉法を用いて解析を行った。また,体積重合収縮率の測定はディラトメーターを用いて行った。レーザースペックル干渉法を用いた重合収縮挙動は,スペックライザST-I(東洋精機製作所)を改良したものを用いた。その測定は,レジンペースト表面から得られたスペックルパターンを照射開始から120秒後まで連続して記録した。平成23年度の研究計画・方法では,レーザースペックル干渉法を用いた重合収縮挙動の測定,体積重合収縮率の測定,硬化深さおよびヌープ硬さ試験を行うこととなっていたが,硬化深さおよびヌープ硬さ試験については,研究途中および結果の解析中であるために,本年度の研究実績の概要への記載報告を見送った。しかし,研究の進行状態に問題は認められず,概ね順調に進行している。フロアブルレジンの重合収縮制御を目的として,その重合特性を硬化深さおよびヌープ硬さから検討する。さらに,窩洞内でのフロアブルレジンの窩壁適合性を観察するために規格窩洞を形成,充填を行い,形成されるコントラクションギャップの観察を行う。

得られた測定結果から,レーザースペックル干渉法およびディラトメーターを用いて測定された重合挙動および重合特性との関連性について検討し,フロアブルレジンの重合収縮制御を目指した新たな照射法を確立する。1.硬化深さおよびヌープ硬さ試験それぞれの照射条件で硬化させたフロアブルレジンの硬化深さに際しては,ISO 4049に準じて測定する。また,硬化物のヌープ硬さを微小硬さ試験器(MHT-1,松沢,現有)から測定し,得られたヌープ硬さを連ねてヌープ硬さ曲線を得る。2.コントラクションギャップ形成の観察窩洞内でのフロアブルレジンの窩壁適合性を観察するために,規格窩洞を形成,充填を行い,それぞれの照射条件によって形成されるコントラクションギャップの観察を行う。すなわち,ウシ歯の唇側中央部分にダイヤモンドポイントを用いて直径4mm,高さ2 mmの規格窩洞を形成し,レーザースペックル干渉法と同様な照射条件で光線照射を行う。なお,歯質とフロアブルレジンとのコントラクションギャップ観察に際しては,レーザー顕微鏡(VK-9710, Keyence,現有)を用いる。本研究に使用する硬化物のヌープ硬さを測定する微小硬さ試験器(MHT-1,松沢,現有)およびレーザー顕微鏡(VK-9710, Keyence,現有)等の実験機器備品は,すべて研究代表者の所属する機関ならびに研究室で現有しているところから,研究経費の申請はとくに必要としない。また,使用機器・機材の消耗品については,硬化深さ試験,ヌープ硬さ試験およびレーザー顕微鏡観察を行うために必要である。すなわち,ウシ歯を用いてレーザー顕微鏡でコントラクションギャップの観察を行う材料費等として使用する予定である。また,本研究で得られた結果を国内の学会で発表するとともに,研究者間での情報交換は重要と思われる。そのため,国内学会参加のための旅費,研究結果を国内および国際専門誌に投稿するための費用として校閲および投稿料として使用する予定である。
不登校段階に応じて支援可能な多人数参加型の不登校改善支援システムの開発と評価

はじめに、不登校児童生徒を対象にした支援に適したCMSのプロトタイプを作成し、実際の教育現場で不登校支援に関わる教員による評価を行った。その結果、さまざまな追加機能の要望や、また現在の児童生徒の電子メディアに対する実態から、より基礎的な調査や実験を行う必要性が明らかになった。それを踏まえて、これまでの基礎研究で明らかになっていない電子メディアコミュニケーションにおける感情的な側面に関する基礎研究を行い、国内外の学会で広く研究成果を報告した。なお、基礎実験は、倫理面に十分に配慮する理由から、不登校児童生徒を被験者とはせず、大学生・大学院生を被験者として行った。具体的には、4つの感情(悲しみ、喜び、怒り、罪悪)に関する状況におけるテキストベースのコミュニケーションによる感情伝達に関して研究を行った。これらから、相手との親しさによって、自身の感情の表現に違いが生じることなど、不登校児童生徒支援におけるコミュニケーションに対する示唆を得た。平成19年度は、本研究課題である「不登校段階に応じて支援可能な多人数参加型の不登校改善支援システムの開発と評価」に向けて、Contents Management System(CMS)を用いた不登校生徒のための支援システムのプロトタイプを作成した。このプロトタイプのシステムは、多くの教育現場で使用しやすいように、一般的でフリーのCMSであるJoomla!を用いて作成した。また、作成の途中で教育委員会の教員の意見を取り入れた。つまり、実際に教育センターの相談室において不登校支援にICTを導入した際に必要になるであろう相談室内の通常の文書決裁に合うよう、また不登校生徒の実状に合うように、教育センターでの不登校支援に特化したシステムを目指して作成を行った。さらに、大学生を対象にして、インターネットや携帯メールを用いたコミュニケーションにおける感情的な側面を検討するための基礎研究も並行して行った。すなわち、研究代表者や研究協力者がこれまで行ってきた研究を踏まえて、より詳細にメディアと人間(送信者と受信者)に焦点を当て、不登校支援にICTを導入した際に考えられるような、コミュニケーションにおける感情伝達を中心に感情面についてさまざまな観点から分析を行った。作成したシステムの改善および実際の教育現場での評価は、平成20年度に実施する予定である。なお、上述の研究は、結果の得られた時点で逐次、成果を発表した。最近は、CMSやLMSなど、ユーザが手を加えることができる電子メディアが普及している。これらを用いることは、不登校児童生徒に対して、表現方法の選択肢を増やすことになる。本研究では、不登校改善支援において、多人数参加型の電子メディアであるBBSや、メーリングリスト、プログを取り上げた。つまリ、電子メディアを使ったコミュニケーションにおいて、不登校支援の視座から特徴を明らかにすることは意義がある。平成19年度は、不登校児童生徒を対象にした支援に適したCMSのプロトタイプを作成し、実際の教育現場で不登校支援に関わる教員による評価を行った。その結果、さまざまな追加機能の要望や、また現在の児童生徒の電子メディァに対する実態から、より基礎的な調査や実験を行う必要性が明らかになった。平成20年度では、平成19年度に開発した不登校改善支援のためのCMSの機能を踏まえるとともに、教員の評価から、より多くの課題がわかってきたため、これまでの基礎研究で明らかになっていない電子メディアコミュニケーションにおける感情的な側面に関する基礎研究を行い、国内外の学会で広く研究成果を報告した。なお、基礎実験は.倫理面に十分に配慮する理由から、不登校児童生徒を被験者とはせず、大学生・大学院生を被験者として行った。
アルツハイマー病患者の血中タンパク質の変動解析

血中タンパク質の変動を解析するために、本年度は比較的量に余裕があるアルツハイマー病患者と健常者の血漿を用いて、安定同位体の質量数18の酸素を用いたプロテオーム変動解析を試みた。血液の網羅的解析でマーカー候補となるタンパク質の同定率を上げるには、血液中のおよそ9割近いアルブミン等の主要なタンパク質を分離することが必要不可欠であり、これらを前処理で分離することによって、微量タンパク質の同定を試みた。具体的には、アルブミン、トランスフェリン、ハプトグロビン、IgG、IgA、α1-アンチトリプシン、フィブリノゲン、α2-マクログロブリン、α1-酸性糖タンパク質、補体タンパク質C3、IgM、アポリポプロテインAI、アポリポプロテインAII、トランスサイレチンといった主要な14種類のタンパク質の抗体が固定化されたアフィニティーカラムを用いて、液体クロマトグラフィーでこれらの分離を行った。素通り画分と吸着した画分に分けた後、各々の画分はそれぞれ直接トリプシンで消化を行った。健常者の血漿に関しては消化物を乾固した後に質量数18の酸素を持つ水とトリプシンを加えることで、カルボキシル基の二つの質量数16の酸素が質量数18の酸素へと置き換えられ、質量数が4増えることを確認し、アルツハイマー病患者の血漿に関しては通常の水を用いた操作のままで、最終的にこれらを等量混ぜ、質量分析装置で解析し、ペプチドの量比の比較が可能となった。さらに、網羅的解析でマーカー候補となるペプチドの同定率を上げるために、液体クロマトグラフィーでのカラムの選択や流速及びグラジエント等のパラメーターの条件検討を行い、解析方法の最適化を行った。当初安定同位体の質量数18の酸素を持つ水を用いたプロテオーム解析を予定であったが、新たなタンパク質解析ソフトを導入した結果、安定同位体等のラベル化が必要でないLabel-freequantification (LFQ)解析によってタンパク質の定量化が可能となった。そこで、これらの解析方法についても検討するために時間を要した。これまでに構築した解析方法を用いて、まず、バイオバンクから提供して頂いたアルツハイマー病患者20例及び認知機能正常者20例の血漿タンパク質の網羅的プロテオーム変動解析を試みる。検体は男女比、年齢層を出来るだけ合わせた症例を用い、ADの危険因子ApoE4も偏りがない検体で解析を行う予定である。当初計画していた質量分析装置を用いたプロテオーム解析の数が少なかったため、解析に要する消耗品の購入が少なかった。今年度解析出来なかったサンプルは次年度に解析することを予定している。
圧反射に対する中枢性ゆらぎの影響の機序の解明

圧反射に対する高位中枢からのゆらぎの影響を定量化するためには動物実験を行なった。イヌの入手が困難であったことから実験動物をウサギに変更した。ウレタン・alpha-クロラロース麻酔下で、反射ループを開くために頚部において両側の頚動脈洞を他の血管系から分離し、両側の大動脈減圧神経および迷走神経は切断した。両側の頚動脈洞に接続したチューブをリニアポンプに接続し、頚動脈圧と圧コマンドの差でポンプを駆動してサーボコントロールした。これにより頚動脈洞圧をコンピューターの指令により自在に制御できるシステムを作成した。ウサギの胸部を正中で開き左側の心臓交感神経の1本を周囲の組織から剥離切断した。切断した中枢部より神経活動を記録した。神経活動を整流後、平滑化(遮断周波数30Hz)して定量化し、フーリエ解析して交感神経活動のスペクトル分布を求めた。頚動脈洞圧が一定の状態では0.81Hzにピークをもつスペクトルが得られた。一定に保つ圧を低下させるとこのピークは圧の変化にほぼ比例して増加した。しかしピークの周波数自体が圧の低下に応じてやや高い周波数に移動した。これが時間経過に伴う変化である可能性は残るが、圧反射弓への入力が中枢のゆらぎを変化させている可能性も否定できない。頚動脈に1Hzの正弦波を加えると、中枢のゆらぎである0.8Hzと正弦波の周波数(1Hz)およびその和の1.8Hzにピークを認めたが差の0.2Hzのピークは明かではなかった。装置の不完全さ(サーボゲインの低さ)から入力した正弦波が歪んでおり正確な解析を困難にしているため、今後は適応型制御を用いて歪みの少ない正弦波入力が可能であるシステムを開発する予定である。その上で中枢のゆらぎ自体を変化させた場合の変化について、左右の頚動脈に別々の信号を入力したときの変化についても検討する予定である。