hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
急性膵炎における膵腺房細胞アポトーシスと重症化機序の解析

膵腺房細胞アポトーシスにおけるステロイドの関与について明らかにするための基礎実験として、マウス膵腺房細胞へSV40large T antigenを導入することにより作成された培養細胞株で、アミラーゼの分泌能を保持した266-6細胞を用い検討した。実験方法としては266-6細胞を1×10^5/mlの濃度でplatingした後、RU486を1μM、10μM、100μM添加し、細胞数の変化をcell counterで24時間まで経時的に測定した。一方、RU486を1μM、10μM、25μM、50μM添加した際のアポトーシスの発現を、propidium iodide(PI)染色を用い、9、14、18時間後フローサイトメトリー(FACS法)で検出した。RU486添加後24時間後、1μMおよび10μM添加群では有意な変化は認められなかったが、100μM添加した群においてコントロール群に比し細胞数は40%以下と有意な減少を示した。一方FACS方による検討では、RU486を50μM添加した群において、9時間後からアポトーシス細胞の有意な増加を認めた。In vitroマウス膵腺房由来培養細胞株である266-6細胞を用いた実験系において、グルココルチコイド受容体拮抗薬RU486はアポトーシスを介した細胞数の減少をきたすことが判明した。このことから、膵腺房細胞の形態保持には内因性グルココルチコイドが生理的に重要な役割を持っていることが示唆された。今後は、マウス膵菅結紮モデルでのRU486もしくはメチルプレドニゾロン投与の検討をし、in vivoでの膵腺房細胞アポトーシスにおけるステロイドの関与について、さらなる評価が必要である。膵腺房細胞アポトーシスの誘導機構を解明するために、腺房細胞のアポトーシスにより膵萎縮に至るマウス膵管結紮モデルを用い、この過程におけるFas receptor(FasR)およびFas ligand(FasL)の関与について検討した。実験方法としては、C57BL/6系雄性マウス(6週齢)を用い、膵管結紮群、コントロール群(単開腹群および無処置群)の3群で検討した。結紮後、1あるいは3日で、膵の脾臓葉を摘出した。摘出した膵を二分割し、一方からAGPC法によりRNAを抽出し、FasRおよびFasL mRNAの発現をRT-PCR法により検出した。他方は膵の組織学的検討に供し、HE、ヘキスト33342(H-342)、TUNEL染色を行った。さらに免疫組織化学的検討によりFasRおよびFasLの局在についても調べた。腺房細胞アポトーシスは、結紮1日後で0%(H-342法),0.1%(TUNEL法)、3日後で2.7%(H-342法),1.8%(TUNEL法)認められた。FasR mRNAは無処置群を含め全ての群で発現が認められ、この発現は群間で明らかな差がなかった。FasL mRNAは、コントロール群に比し、膵管結紮群でその発現が増強されていた。免疫組織化学的検討では、FasLは結紮3日後で陽染した腺房細胞が散見されたが、FasRの発現は全ての群で検出されなかった。腺房細胞アポトーシスの出現する結紮3日後に同期して、腺房細胞にFasLの発現が認められたことより、膵管結紮後の腺房細胞アポトーシスにおけるFasR-FasLsystemの関与が示唆された。

膵腺房細胞アポトーシスにおけるステロイドの関与について明らかにするための基礎的実験として、マウス膵腺房細胞へのSV40 large T antigenを導入することにより作成された培養細胞株で、アミラーゼの分泌能を保持した266-6細胞を用い検討した。実験方法としては、266-6細胞を1×10^5/mlの濃度でplatingした後、RU486を1μM、10μM、100μM添加し、細胞数の変化をcell counterで24時間後まで経時的に測定した。一方、RU486を1μM、10μM、25μM、50μM添加した際のアポトーシスの発現を、propidium iodide(PI)染色を用い、9、14、18時間後フローサイトメトリー(FACS法)で検出した。RU486添加後24時間後、1μMおよび10μM添加群では有意な変化は認められなかったが、100μM添加した群においてコントロール群に比し細胞数は40%以下と有意な減少を示した。一方、FACS法による検討では、RU486を50μM添加した群において、9時間後からアポトーシス細胞の有意な増加を認めた。In vitroマウス膵腺房由来培養細胞株である266-6細胞を用いた実験系において、グルココルチコイド受容体拮抗薬RU486はアポトーシスを介した細胞数の減少をきたすことが判明した。このことから、膵腺房細胞の形態保持には内因性グルココルチコイドが生理的に重要な役割を持っていることが示唆された。今後は、マウス膵管結紮モデルでのRU486もしくはメチルプレドニゾロン投与の検討をし、in vivoでの膵腺房細胞アポトーシスにおけるステロイドの関与について、さらなる評価が必要である。
第三世代重力波望遠鏡用大口径低温鏡の低温吸着汚染の解明と解消法の開発

重力波を精度良く観測するために、日本の重力波望遠鏡KAGRAでは、約-250°Cまで冷却されたサファイア鏡を用いて鏡自身の熱的な揺らぎを抑える試みをしています。鏡は真空容器内に設置されますが、それでも内部には多くの分子が残っています。このような分子が低温の鏡に吸着されてしまうことにより、重力波を捉えるために最適化されていた鏡の反射率などを変更させるような効果を生じてしまいます。本研究では、この分子の影響を正確に理解し、重力波望遠鏡が長期間、高感度に安定運転できるようなシステムの開発を行います。
第3次中国産ショウジョウバエの系統分類学・進化遺伝学的研究

1989年度には、戸田正憲・渡辺英昭・北川修が、吉林省、新彊ウイグル自治区、広東省でショウジョウバエ相の調査を行うと共に、木村正人が北京大学で中国産カオジロショウジョウバエ種群の光周期反応を調査し、以下のことが明らかとなった。1.中国産ショウジョウバエの総種数459種、うち既知種267種、未同定種192種であった。2.中国の緯度の異なる地域から採集したカオジロショウジョウバエ4種の光周期反応については、卵巣休眠の程度について日本産の同種群と同様の結果を得た。3.広東省鼎湖山でクロショウジョウバエの純粋な野生集団を発見した。本種は人家性種といわれていたので、世界で初めての記録である。4.クロショウジョウバエのミトコンドリアDNA変異を調査し、日本産同種分子レベルでの比較を行った。1990年度は、吉林省長春市の東北師範大学生物系、新彊ウイグル自治区ウルムチ市の新彊大学生物系と共同でショウジョウバエの採集並びに分類・同定を行った。また、上海市の〓旦大学遺伝学研究所の陣華中氏を日本に招へいし、中国産ショウジョウバエの分類・同定を行った。1.中国東北地方のショウジョウバエ相に関する研究:1990年78月の約1カ月間、戸田正憲が東北師範大学生物系の孫暉と共同で、北朝鮮との国境に近い長白山自然保護区及び長春市東方の左家自然保護区でショウジョバエ相に関する調査を行った(1)1989年までに、吉林省からは25種の記録しかなかったが、今年度の調査により新たに60種の記録を加え、総計85種となった。このうち既知種は61種、残の24種は新種を含んだ未同定種である。なお、既知種61種のうち約半数の31種は中国新記録である。(2)吉林省産ショウジョウバエ種構成の特徴は、北日本、特に北海道のそれと非常に近く、北海道のショウジョウバエ相成立の歴史として、北回り経路(ユ-ラシア大陸極東北部→サハリン→北海道)を強く示唆するものである。2.新彊ウイグル自治区のショウジョウバエ相に関する研究:1990年7月下旬より約1カ月半、渡部英昭・戸田正憲・北川修(戸田・北川は途中から参加)が新彊大学生物系の李国強らと共同で以下のような調査を行った。(1)ウルムチ近郊、天池、南山、(2)伊梨地区の伊寧市内、サイラム湖周辺、(3)北部のモンゴル国境に近いアルタイ地方のシャオトング、ブルチン、白樺公園でショョウジョウバエ相の調査を行い、分類学及び生態学的に多くの新知見を得た。昨年度までに同自治区からは、8種のみ記録されいてたが、今年度24種の新記録を加え、総種数は32種となった。そのうち既知種22種、未同定種10種である。なお、既知種22種のうち10種が中国記録である。3.華東地域のショウジョウバエ相に関する研究:日本に招へいした上海〓旦大学遺伝学研究の陣華中が、主として華東地域(浙江省、福建省、安徽省、湖南省、貴州省)で採集した総数17644個体の標本を日本で共同で同定した。その結果、中国新記録4既知種を確認し、さらに1新種について記載に必要な詳しい分類学的研究を行っいてる。4.中国大陸産ショウジョウバエの総種数について:1990年度に行った上記の研究により、中国産ショウジョウバエの総種数は528種に達した。それらは、既知種294種(この中には1983年に始まった本研究班によって記載された68の新種を含む)、投稿中の新種19種、投稿準備中の新種22種である。

1.中国東北地方のショウジョウバエ相に関する研究:1990年78月の約1カ月間、戸田正憲が東北師範大学生物系の孫暉と共同で、北朝鮮との国境に近い長白山自然保護区及び長春市東方の左家自然保護区でショウジョバエ相に関する調査を行った(1)1989年までに、吉林省からは25種の記録しかなかったが、今年度の調査により新たに60種の記録を加え、総計85種となった。このうち既知種は61種、残の24種は新種を含んだ未同定種である。なお、既知種61種のうち約半数の31種は中国新記録である。(2)吉林省産ショウジョウバエ種構成の特徴は、北日本、特に北海道のそれと非常に近く、北海道のショウジョウバエ相成立の歴史として、北回り経路(ユ-ラシア大陸極東北部→サハリン→北海道)を強く示唆するものである。2.新彊ウイグル自治区のショウジョウバエ相に関する研究:1990年7月下旬より約1カ月半、渡部英昭・戸田正憲・北川修(戸田・北川は途中から参加)が新彊大学生物系の李国強らと共同で以下のような調査を行った。(1)ウルムチ近郊、天池、南山、(2)伊梨地区の伊寧市内、サイラム湖周辺、(3)北部のモンゴル国境に近いアルタイ地方のシャオトング、ブルチン、白樺公園でショョウジョウバエ相の調査を行い、分類学及び生態学的に多くの新知見を得た。昨年度までに同自治区からは、8種のみ記録されいてたが、今年度24種の新記録を加え、総種数は32種となった。そのうち既知種22種、未同定種10種である。なお、既知種22種のうち10種が中国記録である。3.華東地域のショウジョウバエ相に関する研究:日本に招へいした上海〓旦大学遺伝学研究の陣華中が、主として華東地域(浙江省、福建省、安徽省、湖南省、貴州省)で採集した総数17644個体の標本を日本で共同で同定した。その結果、中国新記録4既知種を確認し、さらに1新種について記載に必要な詳しい分類学的研究を行っいてる。4.中国大陸産ショウジョウバエの総種数について:1990年度に行った上記の研究により、中国産ショウジョウバエの総種数は528種に達した。それらは、既知種294種(この中には1983年に始まった本研究班によって記載された68の新種を含む)、投稿中の新種19種、投稿準備中の新種22種である。
アミド挿入反応の新展開とカルベノイドの金属特性の解明

安価な金属触媒を用いるアミド挿入反応の開発に向けて、申請者は銅触媒を網羅的に検討し、Cu(tfacac)2触媒が有効であることを明らかにした。申請者は金属カルベノイドと金属ナイトレノイドの反応性の相違について検討を行った。アミド基に対する反応をモデルとして検討した結果、カルベノイドはアミド挿入反応を起こすのに対し、ナイトレノイドはCーH結合挿入反応を起こすことを明らかにした。金属カルベノイドと芳香環の分子内反応をモデルとして、検討を行った。汎用されるロジウムカルベノイドを用いた場合、C-H挿入反応が進行するのに対し、銀カルベノイドを作用させると化学選択的に脱芳香化反応が進行することを見出した。金属カルベノイドの挿入反応は、結合開裂を伴いながら炭素原子が結合間に割り込む特徴的な分子変換法である。近年でもC-H結合や炭素-炭素多重結合への挿入反応は、不活性結合の官能基化法として研究が行われている。以前、申請者は世界で初めて金属カルベノイドのアミド結合に対する挿入反応の開発に成功した。今回、申請者はアミド挿入反応を生物活性物質の合成に応用することで、本反応の有用性を実証すると共に創薬化学展開ができると考えた。しかし本反応は高価なロジウム触媒を要する点に、改善の余地を残す。そこで安価な金属触媒への代替研究およびカルベノイド化学における金属特性の解明を目的として研究に着手した。安価な金属触媒を用いるアミド挿入反応の開発に向けて、銅触媒を網羅的に検討し、Cu(tfacac)2触媒が有効であることを明らかにした。さらに触媒量の低減を検討した所、0.05 mol %の触媒量でも反応を完結させることができた。これは報告されている銅カルベノイドの挿入反応の中で最も少ない触媒量である。本反応により窒素渡環システムを一挙に構築することができたので、アミド挿入反応を鍵工程とする天然アルカロイドの全合成を検討した。五環式構造を有するモノテルペノイドインドールアルカロイド、ベロシミンの既知中間体へと誘導することに成功し、その形式全合成を達成した。また金属カルベノイドと金属ナイトレノイドは類似した反応性を持つことが知られている。しかしながら、それらの類似性・相違性の発現理由を明らかにした報告はなかった。申請者はアミド基に対する反応をモデルとして検討した結果、カルベノイドはアミド挿入反応を起こすのに対し、ナイトレノイドはCーH結合挿入反応を起こすことがわかった。反応機構の解析に向けてDFT計算を行った所、金属種に配位している原子の求電子性が選択性の発現に大きく寄与していることが示唆された。当初、計画した通りアミド挿入反応における金属触媒の代替えに成功した。またアミド挿入反応を鍵工程とする天然アルカロイドの形式全合成を達成した。さらに金属カルベノイドと金属ナイトレノイドの反応性を比較して、化学選択性の発現理由を突き止めた。従って、本研究はおおむね順調に進展していると言うことができる。以前、申請者は世界で初めてロジウムカルベノイドのアミド結合に対する挿入反応の開発に成功した。カルベノイド種は配位している金属種によって大きく異なる反応性を示すが、その金属特性は解明されておらず、その反応性の差異を活用した合成化学的な応用例は殆ど報告されていなかった。申請者は同化学種の新規な反応性の開拓および金属特性を活用した反応制御を目的に研究を行った。芳香環に対する反応をモデルとして、汎用されるロジウムカルベノイドを用いた場合、ブフナー環拡大反応やC-H挿入反応が進行するのに対し、銀カルベノイドを作用させると化学選択的に脱芳香化反応が進行することを見出した。1)カルベノイドは配位している金属種によって反応性が異なる事が知られているが、その原因の体系的理解は不十分である。申請者も既に、使用する金属触媒に応じて、異なる骨格を有する化合物が生成する新たな反応系を見出しているが、現在のカルベノイド化学では、その原因を説明できない。申請者は金属触媒の網羅的な検討とDFT計算を行い、カルベノイドの金属特性の解明と有機合成化学への応用を検討する。

2)アミド挿入反応の特徴は、様々な窒素渡環システムの構築が可能な点である。その特徴を活かし、異なる環構造を有する医薬候補分子の合成研究を行う。3)本研究の展開として、金属ナイトレノイドを用いた直截的CーH結合官能基化反応の開発に取り組む。化学系薬学
中途覚醒型不眠の代謝性バイオマーカー―脂肪酸代謝変化とレム睡眠発現異常の関与

中途覚醒型不眠の生物学的背景は未解明であるが、レム睡眠発現異常との関連が想定される。過眠症多数例での横断的検討から、入眠時レム睡眠期の生じやすさが中途覚醒頻度と強く関連し(p=.002)、覚醒とレム睡眠の易移行性が高いことが中途覚醒の基盤として想定された。過眠症ではCPT1活性低下が中途覚醒回数と関連した。予備的検討で、過眠症症例の中に脂肪酸代謝促進が、レム睡眠持続性および中途覚醒減少をもたらす症例が存在したことから、脂肪酸代謝異常は、過眠症にみられる中途覚醒頻度およびレム睡眠発現異常の双方の病態基盤(因果関連を持つ)となっている可能性が示された。中途覚醒型不眠の代表例としてうつ病とナルコレプシーがある。ともに背景としてレム睡眠発現異常の関与が想定される。ナルコレプシーではレム睡眠と覚醒の頻回の相移行が睡眠維持障害をきたすと考えられる。本年度、多数のナルコレプシー症例について横断的解析をすすめ、頻回の中途覚醒が脂肪酸β酸化異常、特にCPT1機能低下と関連することを確認した。対照群および近縁過眠症群ではこの関連は見いだされなかった。またナルコレプシー群ではCPT1Bの機能変化をひきおこすSNP rs5770917と、CPT1機能低下が関連することを見出したが、このSNPの多型が、中途覚醒回数と独立して関連する因子とは確認できなかった。主観的な中途覚醒報告に基づく解析では、微細な変化の検出が難しい可能性があることと考えられたため、睡眠脳波の解析により、レム睡眠と覚醒の相移行を検出する方法の検討を行った。通常の睡眠ポリグラフ検査では本人が自覚しないものを含め脳波上の覚醒反応数をarousalとしてカウントするが、これは中途覚醒型不眠とは必ずしも一致しない。そこで主観的睡眠感と関連し、睡眠相の安定化の指標として、慢性疲労症候群の睡眠異常の検出に有用と報告されている「睡眠ステージ遷移確率」を用いて、ナルコレプシー3例の睡眠脳波を測定し同時に採血を行って脂肪酸代謝指標の測定を行った結果を、現在解析中である。中途覚醒型不眠の生物学的背景は未解明であるが、レム睡眠発現異常が基盤として想定される。本研究では過眠症群352例(ナルコレプシー229例、近縁過眠症123例)と対照群312例の主観的および睡眠脳波上の中途覚醒回数と関連する指標について横断的な探索と解析を行った(過眠症群の156例と116例はPSGとMSLT検査結果が利用可能だった)。予備検討に基づき中途覚醒頻度に関連する代謝指標として、脂肪酸代謝関連遺伝子型と長鎖脂肪酸β酸化の律速酵素CPT1の活性指標(C0/(t[C16]+t[C18]))に注目して解析した。中途覚醒と関連する臨床症状として、年齢および睡眠薬服用で増加、過眠症群ではレム睡眠抑制作用をもつ三環系抗うつ薬(TCA)服用および夢・寝言や夜間摂食の頻度と関連した。MSLTでの入眠時レム睡眠期の発現回数は中途覚醒頻度と強い関連を示し(p=.002)、レム睡眠潜時は中途覚醒頻回群で5.5分→2.7分と顕著に短縮した。遺伝因に関しては、対照群では中途覚醒回数とCPT1B多型(p=.043)とHLA(p=.010)が関連し、ナルコレプシーと同じHLA遺伝子型をもつ健常者では睡眠持続性が低下傾向にあることが確認された(年齢性別と睡眠薬服用を調整)。またCPT1B遺伝子型(活性低下)が、特に肥満傾向の健常者で中途覚醒に関わる可能性が示された。過眠症群では、中途覚醒頻度とHLA遺伝子型は関連したが、予想に反して脂質代謝関連遺伝子の多型とは関連がみられなかった。脂肪酸代謝活性については、CPT1活性が過眠症特異的な低下を示し、過眠症のリスクを1.4-1.6倍高めることが判明した。また過眠症群における中途覚醒回数はCPT1活性指標と強い関連を示し、年齢性別BMIとTCA服用を調整した後も、関連が確認された(p=.074)。一方対照群では中途覚醒頻度が元来低くCPT1活性との関連はなかった。脂肪酸代謝異常は、過眠症において中途覚醒頻度およびレム睡眠発現異常の双方の病態基盤として存在しうることが示された。精神神経科学横断的な研究と解析により当初の仮説についての検証は計画以上に進行し、血中脂肪酸代謝指標が対照群では年齢およびBMIによって変化することを見出した。しかし当初の作業仮説のうち、中途覚醒数と脂肪酸代謝異常との関連はナルコレプシー群のみでの確認となった。

そこで研究方法を再検討し、主観的な睡眠評価と関連する「睡眠ステージ遷移確率」を指標とした解析方法を導入し、さらに実際に睡眠脳波検査を行うと同時に採血するPilot studyを行った。その結果は現在解析中である。終了したばかりのナルコレプシーを対象とするPilot studyについて、睡眠脳波検査と平行して採取した血中脂肪酸代謝指標についての関連解析を進め、中途覚醒と脂肪酸代謝との関連について検討を行う。Pilot studyのような症例の入院を伴う睡眠脳波検査は、施設人員の確保や被験者をふくむ日程調整に困難があるため、症例数を増やすため、在宅での簡易型の睡眠脳波検査と同日の血液採取を行う臨床研究について、倫理審査委員会の承認が得られ次第、開始する予定である。当初の研究仮説と異なる解析結果が得られたため、より詳細な検討が可能な睡眠脳波を含むpilot studyを行うこと、また通常の睡眠変数以外の睡眠脳波解析方法を採用するといった点で、当初計画より若干の研究の遅れが生じているため。ナルコレプシー3例の睡眠脳波測定と同時に採取した血液サンプルについて脂肪酸代謝指標の測定の解析を行い、その結果と「睡眠ステージ遷移確率」で評価された夜間睡眠安定化指標との関連解析を進める。また別途企画される簡易型脳波計を用いた多数例の臨床研究の際に、睡眠検査時点での採血を行い、血中脂肪酸代謝指標の算出を進めつつ、得られた睡眠脳波の解析を行って夜間睡眠(特にレム睡眠)の安定性と脂肪酸代謝指標の関連検討を行って、結論を得る。
臨床応用をめざしたdiscordant異種心臓移植の研究-超急性拒絶反応抑制後に発生する拒絶反応の予防/治療法の確立-

1)ヒヒの免疫学的評価法の確立我々が小動物や人の免疫学に用いてきた手法を用いて、1)抗ブタ抗体の検出をELISA法と滴定法で検出できること、2)ブタに対するヒヒのMLCは自己と比較して低いこと、3)CD3,CD19を除くヒヒのリンパ球分画の多くはヒトのリンパ球に用いる抗体を用いてFACSできることが判明した。2)ブタからヒヒへの異所性異種心臓移植実験ブタからヒヒへの異種移植間では、ヒヒのブタに対する抗体が超急性拒絶反応の重要な働きをしていることが報告されている。今回我々は、ブタの心臓を用いてヒヒ血清中の抗ブタ抗体を減少させることにより、最後に移植したブタ心臓の生着延長を試みる実験を施行した。【対象と方法】4頭のヒヒに2週間免疫抑制剤(FK506 12mg/Kg/day、CAM 30mg/Kg/day)を経口投与した後、異所性にブタの心臓を34つ連続で移植した。移植時の虚血時間を短くするために、13つめまでの心臓は人工血管とコネクターで連結して再潅流させた。その際、ドナーの腕頭動脈から持続的にFUT175を2mg/Kg/hで投与し、補体の抑制を試みた。移植後、ソルメドロール125mgを3日間、FK506 12mg/Kg/day、CAM 30mg/Kg/dayを拒絶されて心拍動停止するまで投与した。【結果】1つめの心臓は全て血流再開後心拍動を開始し、30分以内に超急性拒絶反応により心停止した。23つめの心臓は1時間以上拍動していたが、1時間半で摘出し、最後の心臓を移植した。3頭のうち2頭は、技術的な問題でレシピエントのヒヒが術直後に死亡した。1頭は、術翌日移植心の停止、出血に伴い死亡した。残りの1頭では移植後6日間心臓は拍動していた。12つめの移植心は出血壊死像(超急性拒絶反応の像に一致)、34つめの移植心は遅発性の拒絶反応の像を呈していた。血清中のブタ赤血球に対するヒヒの抗体を測定したところ、心臓を移植するに応じて、その抗体価は低下し、4つめの心臓を移植する直前には検出不能のレベルにまで低下していた。【結語】23つのブタの心臓を用いて予めヒヒの血液を潅流することにより、ヒヒ血清中の抗ブタ抗体は検出レベル以下に低下し、最後に移植したブタ心臓は移植後6日間生着した。今後さらに免疫抑制剤の改良が必要であるが、このモデルは、Discordant異種移植における拒絶反応のメカニズムならびに予防法を研究する上で有用なモデルであると考えられた。

大阪大学動物実験施設における霊長類を用いた実験に関するガイドラインの作成近年、霊長類を用いた実験の規制が厳しくなり、どの動物実験施設でも霊長類を用いた実験に関するガイドラインを作成する必要性が言われるようになった。大阪大学でも本年度からガイドラインを作成することに着手した。霊長類の保有する特殊なウイルス感染症(Bウイルス、エボラウイルスなど)が近年問題となっており、霊長類の使用に関して十分なガイドラインを作成することは重要であると考え、我々は本年度に予定していた移植実験を中止し、本年度しガイドラインの準備に従事した。その結果、本年7月にガイドラインを作成し、9月に大阪大学動物実験委員会においても認可されたので、今後はこのガイドラインに従って実験が進むものと期待される。免疫抑制剤CAMの血中濃度測定血液中でメフェナム酸となる免疫抑制剤にCAMとRS61443が知られており、各薬剤をヒヒ2頭に30mg/kgと50mg/kgを経口投与し、その血中濃度を測定した。2等ともどちらの投与量でも、メフェナム酸の血中濃度はCAMの方がRS61443に比較して高値で、長く維持されることがわかった。これらの薬剤による副作用は認められなかった。ブタの心臓を用いてヒヒ血清中の抗ブタ抗体を減少させることにより、最後に移植したブタ心臓の生着延長を試みる実験を施行した。【対象と方法】3頭のヒヒに2週間免疫抑制剤(FK506 12mg/Kg/day、CAM 30mg/Kg/day)を経口投与した後、異所性にブタの心臓を4つ連続で移植した。移植時の虚血時間を短くするために、13つめまでの心臓は人工血管とコネクターで連結して再潅流させた。その際、ドナーの腕頭動脈から持続的にFUT175を2mg/Kg/hで投与し、補体の抑制を試みた。【結果】1つめの心臓は全て血流再開後心拍動を開始し、30分以内に超急性拒絶反応により心停止した。23つめの心臓は1時間以上拍動していたが、1時間半で摘出し、最後の心臓を移植した。3頭のうち2頭は、技術的な問題でレシピエントのヒヒが死亡した。残りの1頭では移植後6日間心臓は拍動していた。12つめの移植心は出血壊死像(超急性拒絶反応の像に一致)、4つめの移植心は遅発性の拒絶反応の像を呈していた。血清中のブタ赤血球に対するヒヒの抗体を測定したところ、心臓を移植するに応じて、その抗体価は低下し、4つめの心臓を移植する直前には検出不能のレベルにまで低下していた。【結語】3つのブタの心臓を用いて予めヒヒの血液を潅流することにより、ヒヒ血清中の抗ブタ抗体は検出レベル以下に低下し、最後に移植したブタ心臓は移植後6日間拍動していた。今後さらに免疫抑制剤の改良が必要であるが、このモデルは、Discordant異種移植における拒絶反応のメカニズムならびに予防法を研究する上で有用なモデルであると考えられた。
2.3A分解能でのウシ心筋bc_1複合体の立体構造の解明

チトクロムbc_1複合体はミトコンドリア呼吸鎖においてユビキノールからチトクロムcへの電子伝達を行うとともにプロトンの能動輸送を行う異なる11種類のサブユニットからなる巨大膜たんぱく質複合体である。本酵素の原子レベルでの反応機構を解明するには、高分解能でのX線結晶構造が必須である。それとともに本酵素の組成性質を正確に把握しておく必要がある。本研究では、酵素を安定化し結晶化に最も適した界面活性剤の種類の検索をまず詳細に行った。疎水部の末端に環状構造をもつシクロヘキシルヘキシルマルトシド(Cymal6)とシクロヘキシルブチルマルトシド(Cymal4)を混合した標品から得られた六方晶系結晶は不凍剤(グリセロール)へのソーキングに対して強かった。凍結条件でX線回折データの収集を行ったところ、c軸方向で2.4A、ab軸方向で2,7A分解能でのデータをSPring-8において収集することができた。また、呼吸阻害剤であるミキソチアゾール、スティクマテリン、アンチマイシンAを結合させた酵素から得られた結晶についてもX線回折データの収集を行った。結晶標品を用いて質量分析を行い各サブユニットの分子量を測定誤差0.1%以下で正確に決定するとともに含有脂質およびQ_<10>量についても分析を行った。チトクロムbc_1複合体はミトコンドリア呼吸鎖においてユビキノールがらチトクロムcへの電子伝達を行うとともにプロトンの能動輸送を行う異なる11種類のサブユニットからなる巨大膜たんぱく質複合体である。本酵素の反応機構を明らかにするために結晶化が試みられ、近ごろ、2.9Å分解能でのX線結晶構造が報告された。しかし、原子レベルで反応機構を論じるには不十分である。膜たんぱく質の結晶化において、たんぱく質をどのような構造の界面活性剤で安定化し結晶に用いるかということが最も重要である。シュクロースモノカプレートを用いた標品から得られた六方晶系結晶は2.8Å分解能の反射を示したが物理的衝撃やソーキング等に対して弱かった。これに対し疎水部の末端に環状構造をもつシクロへキシルマルトシド(Cymal6)を用いると、ソーキング等に耐える質のものとなったが分解能は上がらなかった。Cymal6と同じ構造をもつが疎水部の炭素数が短いCyma15のみでは結晶は得られながったがCymal6にCymal4を混合して用いた標品からは六方晶系結晶が得られ、この結晶もソーキング等に対して強いものであった。その混合比を詳細に検討したところ0.3%Cymal6に対し0.1%Cymal4を混合した場合が最もよくc軸方向で2.4Å、a,b軸方向で2.7Å分解能を示す結晶が得られた。これらの混合比を変えて得られた結晶の格子定数はシュクロースモノカプレート、Cymal6のみを用いたものと変わらなかった。このことは、Cymal4の添加は結晶中での分子のパッキングに対しては影響を与えず酵素分子の安定性の向上に寄与していることを示唆している。現在までにSPring-8においてnative型結晶のデータの収集を終了した。チトクロムbc_1複合体はミトコンドリア呼吸鎖においてユビキノールからチトクロムcへの電子伝達を行うとともにプロトンの能動輸送を行う異なる11種類のサブユニットからなる巨大膜たんばく質複合体である。膜たんぱく質の結晶化において、たんぱく質をどのような構造の界面活性剤で安定化し結晶化に用いるかということが最も重要である。これに対し、疎水部の末端に環状構造をもつシクロヘキシルマルトシド(Cymal6)を用いると、ソーキング等に耐える質のものとなったが分解能は上がらなかった。

Cymal6と同じ構造をもつが疎水部の炭素数が短いCymal5のみでは結晶は得られなかったが、Cymal6にCymal4を混合して用いた標品からは六方晶系結晶が得られ、この結晶もソーキング等に対して強いものであった。その混合比を詳細に検討したところ0.3%Cymal6に対し、0.1%Cymal4を混合した場合が最もよくc軸方向で2.4Å、a,b軸方向で2.7Å分解能を示す結晶が得られた。これらの混合比を変えて得られた結晶の格子定数はシュクロースモノカプレート、Cymal6のみを用いたものと変わらなかった。このことは、Cymal4の添加は結晶中での分子パッキングに対しては影響を与えず、酵素分子の安定性の向上に寄与していることを示唆している。現在までにSPring-8においてnative型結晶のデータの収集を終了した。
流体関連振動問題と渦構造の解明と三次元渦法の開発に関する研究

本研究では、工学的に多く経験され、その解明が重要とされる流体関連振動問題の基礎研究の一環として、一様流中で流れ方向に強制的に振動する円柱まわりに発生する渦構造の特性を数値シミュレーションならびに実験により検討した。また、流体中の渦度をラグランジュ的に追従し、計算格子を必要としない三次元渦法の開発を行い、球まわりの流れの解析に適用した。本研究により得られた成果は、以下のとおりである。(1)レイノルズ数Re=100、振動振幅比a/d=0.14、無次元振動周波数Stb=00.48.について、流れ方向に強制振動する円柱まわりの流れの三次元解析を行った。後流に形成される渦横造はStb=00.25で三次元性が存在すること、円柱の振動数の上昇に伴い、Lock-inが生じる直前の遷移領域で一時的に流れの三次元性は強まるがその後は弱くなり、Lock-in後はほとんど二次元的な流れとなること、Stb=0.48で、円柱から放出される渦の形態が交互渦から双子渦へと変化すること等が明らかになった。また、Stb【similar or equal】0.46付近では、交互渦放出と双子渦放出の二つの形態が交互に発生する遷移領域が存在し、そこでは、流れの三次元性が存在することも明らかになった。これらは、可視化実験によっても核確認することが出来た。以上よりLock-inが生じたり、放出形態が交互渦から双子渦へと変化する等の流れの状態が変化する際に、遷移領域が存在し、その領域では渦構造の三次元性が強まることが明らかになった。(2)三次元渦法の開発を行い、球まわりの流れの解析に適用した。レイノルズ数Re=100,1000について計算を行った結果、後流がヘアピン状の渦構造となる(Re=100)ことやスパイラル状の構造となる(Re=1000)等の流れの特徴を、非常に良く再現することができた。また、球に働く流体力の特徴も実験結果を良く再現することも確認された。以上のことから、本研究により開発された三次元渦法は、複雑な三次元渦構造の解析に大変有効な一手法となることが確認された。流体関連振動問題の解明と三次元渦法の開発を目的とし、本年度は以下の研究を行った。1.移動境界を含む流れ場に関し渦法に対する圧力の解析技法を確立した。その技法を一様流中で流れ方向に強制的に振動する円柱まわりの流れの二次元解析に適用した。計算条件は、レイノルズ数Re=1000、円柱の直径に対する振動の振幅a/D=0.14、無次元振動数fD/U=00.48(静止円柱から放出されるカルマン渦列の周波数の02倍)とした。その結果、円柱の振動数がカルマン渦の周波数の1倍から2倍程度で後流がカルマン渦列タイプの渦構造となるLock-in現象が生じ、2倍以上で、双子渦タイプのLock-in現象が生じた。これらは既存の実験結果をほぼ再現していることを確認した。また差分法による解析も合わせて行い、フローパターン、流体力等を比較し、本解析技法の性能を評価した。

渦法は、振動する単独物体まわりの流れの解析において差分法とほぼ同等の性能があることが確認された。2.上記の流れ場に差分法を適用して三次元解析を行い、円柱後流に形成される渦構造を検討した。円柱の振動数が、カルマン渦の周波数程度になると、Lock-in現象が生じ、後流に形成される渦の三次元構造が一次増大した。更に円柱の振動数を増大させると、突然渦構造の三次元性は弱まりフローパターン、円柱に作用する流体力特性等が二次元計によるものと一致することがわかった。3.楕円柱まわりの二次元流れを渦法により解析し、導入渦の強さと流れ場の循環との関係を考察した。流れ場に導入する渦は、壁面におけるすべり無し条件と密接に関係している事を明らかにし、三次元渦法における渦導入法を検討した。また、球まわりの流れを解析し特徴的な渦構造を捕らえることが出来、三次元渦法の基礎が確立された。昨年度に引き続き、流体関連振動問題の解明と三次元渦法の開発を目的とし、本年度は以下の研究を行った。A-1.昨年行われた流れ方向に強制的に振動する円柱まわりの流れの3次元解析において、円柱を、Lock-in領域から後流の渦形態が交互放出から双子放出に変化する領域で振動させると、後流の渦構造の三次元性は弱まりフローパターン、円柱に作用する流体力特性等が二次元計算と一致することがわかった。しかし一方で同様の可視化実験により、放出形態が交互状から双子状に変化する際に、交互放出と双子放出が交互に出現し後流に3次元的な渦構造が存在する遷移域があることがわかった。A-2.上記の結果を基に、可視化実験と同様の条件の詳細な3次元解析を行った。円柱の振動数を増加させていくと、Lock-in領域になる直前で、一次的に流れの3次元性が高まる遷移領域が存在することがわかった。渦の放出形態が交互状から双子状に変化する領域においては、可視化実験と同様に、双子渦放出と交互渦が交互に出現すること、極めて弱いが、後流に3次元的な渦構造が存在することがシミュレートできた。以上より、振動円柱において、流れの3次元構造は、Lock-in領域や流れの状態が変化する際に一時的に増大し、遷移領域を形成することがわかった。B.回転振動する円柱の流体力の特性を2次元解析により検討した。円柱に作用する揚力を基に、位相差をつけて円柱を回転させると、位相の与え方によっては抗力および揚力の振幅が減少することがわり、このメカニズムを明らかにした。C.三次元渦法を開発し、球まわりの流れをおよび回転する球まわりの流れ解析に適用した。可視化実験で得られているような、後流に形成される特徴的な渦構造を捕らえることが出来た。
変分法を用いた逐次インバージョンによる地球に不均質異方非弾性モデルの決定

得られた成果は以下の通りである。1.地球の自転,楕円体,非弾性,及び水平方向の不均質構造を考慮に入れた総合的なモデルに対する自由振動の正規モード解の、変分法による厳密解の計算法の開発。2.1.で求めた正規モード解を用いて、自由振動の固有振動数及び理論地震記象に対して偏微分係数を計算し、それを用いた不均質構造のインバージョンのアルゴリズムの定式化、及び開発。これらのうち、1では、現時点で最も大きな試験関数の集合を用い、周期200秒付近の自由振動のモードの不均質構造によるカップリングを調べた。この結果、不均質構造によるモード間のカップリングは、分散曲線上の隣り合うモードで非常に強く、また、捩れ振動と伸び縮み振動とのカップリングも大きいことがわかった。これらのカップリングは、不均質構造の水平方向の波長がモードの波長と比べて充分大きい場合でも顕著となることがわかったが、これは今迄無視されてきた点である。2.では、固有振動数及び固有関数の偏微分係数を計算するための定式化を行い、1.で計算した固有関数を用いて、この偏微分係数が数値的に充分な精度が保証されるかどうかを試験した。その結果、充分な精度をもち、インバージョンに使用するために充分実用となることがわかった。これらとは独立に、水平方向の不均質構造を考慮した一般的な運動方程式を導いた。これは特に、初期応力に関する情報なしでも運動方程式を書き下すことができるようにしたものである。今後は、1.2の結果を用いて、これらを実際の地震記録に適用し、不均質構造のインバージョンを実行し、不均質構造モデルを得る予定である。
多様体の自己同値写像空間のトポロジー

3次元球面S^3の自己同相写像群Top(S^3)に関するHatcherの定理の別証が得られないかを,S^1-同変同相写像群との関係を用いて,研究した。Homeomorphism予想(連結なコンパクトn次元多様体M^nの自己同相写像群Top(M^n)はヒルベルト多様体か)について.n≦2のときにすでに証明されているが,n≧3のとき未解決である。Top_∂(D^n)(n次元球体D^nの同相写像でその境界∂D^n=S^<n-1>上では恆等写像であるもの全体)がANR(距離空間のクラスで)であることを示せば,予想が正しいことがわかっている。さらに,Top_∂(D^n)をTop∂(D^n)の閉包とすれば,Top_∂(D^n)がANRであることを示せば,Top_∂(D^n)がANRであることがわかる。Top_<∂*>(D^n)をD^nの中心*と∂D^nを固定する同相写像全体からなるTop_∂(D^n)の部分群とし,その閉包をTop_<∂*>(D^n)とする。このとき,次の結果が得られる。
糖蛋白糖鎖から見た脳の老化メカニズムの一面

糖鎖は細胞の表面の大部分を覆っており、細胞間や細胞一基質間相互作用に重要な役割を果たしていると考えられている。われわれは糖蛋白質糖鎖の系統だった解析法をほぼ自動化することに成功し、その機能を解明しようと試みている。ヒト脳の糖鎖解析を行ったところ、脳の各部位においてN-結合型糖鎖発現パターンに個人差はほとんどないことが明らかとなった。本年度は老化と密接に関連したアルツハイマー病患者の脳内糖蛋白質糖鎖の解析を行った。10%ホルマリン固定ヒト病理標本、前頭葉皮質および前頭葉白質をアセトン沈殿し解析に用いた。蛍光標識後にノイラミニダーゼ処理し、シアル酸を除去した後に糖鎖構造解析のための2次元HPLCを行った。その結果、正常人と糖鎖パターンに差のあることが見いだされた。今後、これがどのような糖鎖構造を反映しているのか解析する。糖鎖は細胞の表面の大部分を覆っており、細胞間や細胞一基質問相互作用に重要な役割を果たしていると考えられている。しかし、糖蛋白質糖鎖の機能解明はあまり進んでいない。その、大きな理由の一つとして、細胞表面や組織中で発現している糖蛋白質糖鎖の系統だった解析方法がないことが挙げられる。われわれは糖蛋白質糖鎖の系統だった解析法をほぼ自動化することに成功したので、今回ヒト脳の分析を行った。10%ホルマリン固定ヒト病理標本正常部位(遺伝的に独立した4例、40-45歳、男女各2例で、各々前頭葉中前頭回、前頭葉白質、被角、アンモン角、小脳皮質)20検体をアセトン沈殿し解析に用いた。その結果脳の各部位においてN-結合型糖鎖発現パターンに個人差はほとんどないことが明らかとなった。ピークの高さに違いのあることはあっても、発現しているN-結合型糖鎖の種類は全く同じであり、非常によく一致していることが分かった。しかしながら同一個体でも領域が異なれば発現パターンも少し異なっていた。今後、年齢変化について検討する。
胃癌腹膜播種を規定するmicroRNAの網羅的解析と治療戦略

網羅的microRNA(miRNA)解析を胃癌腫瘍組織、正常組織よりmicroRNAs発現を解析した。結果、上皮間葉移行に関わるmiRNAが胃癌の遠隔転移と相関していた。血清miR-203を同定し、これがステージI-IIIの胃癌患者よりも、ステージIV胃癌患者で有意に低いことを示し、この低発現は胃癌患者の予後不良の独立した予測マーカーであることを明らかにした。胃癌組織におけるMTA-1発現は腹膜播種予測因子として有用であること、さらに胃癌組織ANGPTL2高発現、並びに血清におけるANGPTL2濃度上昇は、腹膜播種と相関し予後不良群の鑑別に有用である可能性を示した。1.網羅的micro RNA解析を胃癌腫瘍組織、正常粘膜よりtotal RNAを抽出し、microRNAarrayにてそれぞれサンプルの網羅的microRNAs発現を解析した。2.胃癌患者の術前血清と術後血清よりtotalRNAを抽出し、microRNAarryにてそれぞれのサンプルの網羅的microRNAs発現を解析した。2の解析の結果、上皮間葉系移行に関わるmicroRNAが胃癌の遠隔転移と相関しており、さらに、200例以上の胃癌患者血清を用いその検証を行っている。2.胃癌患者の術前血清と術後血清よりtotalRNAを抽出し、microRNAarrayにてそれぞれのサンプルの網羅的microRNAs発現を解析した。3.2の解析の結果、上皮間葉移行に関わるmicroRNAが胃癌の遠隔転移と相関しており、さらに、200例以上の胃癌患者血清を用いその検証を行いその結果、血清mir203を同定した。4.検証解析は、血清miR-203は、ステージI-IIIの胃癌患者よりも、ステージIV胃癌患者で有意に低かった。血清中のmiR-203は、より高いTステージ、脈管侵襲、リンパ節転移、腹膜転移、および遠隔転移を有する胃癌患者で有意に低かった。血清miR-203の低発現は無病生存率および全生存率の低さと関連していた。多変量解析では、血清miR-203の低発現が、リンパ節、腹膜、および遠隔転移と関連しており、胃癌患者の予後不良の独立した予測マーカーであることを明らかにした。転移を誘導する上皮間葉移行にかかわるmicro RNA(mir200family、203)を胃癌患者血清を用いてスクリーニングしmir203が遠隔転移に関わる血清マーカーであることが示された。さらに、検証試験でその再現性が確認され、すでに論文を報告している。2.胃癌患者の術前血清と術後血清よりtotal RNAを抽出し、miRNAarrayにてそれぞれのサンプルの網羅的miRNAs発現を解析した。3.2の解析の結果、上皮間葉移行に関わるmiRNAが胃癌の遠隔転移と相関しており、さらに、200例以上の胃癌患者血清を用いその検証を行いその結果、血清miR-203を同定した。4.検証解析は、血清miR-203はステージI-IIIの胃癌患者よりも、ステージIV胃癌患者で有意に低かった。血清中のmiR-203はより高いTステージ、脈管侵襲、リンパ節転移、腹膜転移、及び遠隔転移を有する胃癌患者で有意に低かった。血清miR-203の低発現は無病生存率及び全生存率の低さと関連していた。多変量解析では、血清miR-203の低発現がリンパ節、腹膜、及び遠隔転移と関連しており、胃癌患者の予後不良の独立した予測マーカーであることを明らかにした。胃癌組織ならびに胃癌患者血清の網羅的な解析は終了しており、今後の再現性試験の準備は終了している。さらに複数の新規胃癌診断マーカーならびに再発予後マーカーも同定しており、その検証を行う予定である。消化管外科上皮間葉系移行に関与するmicro RNAを多数の血清sampleで検証することで、腹膜播種を含む胃癌転移形式の同定に有効であるかを検討する予定である。実験計画が計画通りに進み、試薬購入額を予定より安く抑えられたため。予定通り研究は進行したが、試薬の購入費用が予定よりも安く抑えられたため。試薬などの研究助成金に余剰を認めたため、翌年度の必要な試薬の購入費用に充てる。試薬などの研究助成金に余剰を認めたため、翌年度必要な試薬の購入費用に充てる。
非平衡プロセスの動力学開拓による焼結力学の体系化

焼結は成形した粉体を加熱して複雑形状部品を製造する技術である.セラミック部材の物性や強度は,この焼結プロセスで形成される微構造や微小な内部欠陥に大きく影響される.本研究では,焼結現象をマルチスケールの力学の視点から捉え,「焼結力学」として体系化することを目指す.焼結の平衡熱力学を越えて,非平衡プロセスの動力学を確立するため,ミクロな結晶粒子間に作用する焼結の熱力学的駆動力の根源を探求し,巨視的な収縮を記述する連続体力学との関係を解明する.焼結における粉体プロセスの影響,内部欠陥形成の起源を解析,予測することが可能となり,最終的な焼結体の物性,プロセスの改良につながる.焼結は成形した粉体を加熱して複雑形状部品を製造する技術である.セラミック部材の物性や強度は,この焼結プロセスで形成される微構造や微小な内部欠陥に大きく影響される.本研究では,焼結現象をマルチスケールの力学の視点から捉え,「焼結力学」として体系化することを目指す.焼結の平衡熱力学を越えて,非平衡プロセスの動力学を確立するため,ミクロな結晶粒子間に作用する焼結の熱力学的駆動力の根源を探求し,巨視的な収縮を記述する連続体力学との関係を解明する.焼結における粉体プロセスの影響,内部欠陥形成の起源を解析,予測することが可能となり,最終的な焼結体の物性,プロセスの改良につながる.
核内受容体HNF4αとPPARによるNASH発症機序の解明と治療応用への基礎研究

肝臓特異的HNF4α欠損マウス(Hnf4aΔHマウス)はNASHを発症して生後約8週間で死亡するが、HNF4αと核内受容体PPARαを欠損させたダブル欠損マウスはNASHを改善し、延命することが分かっている。このため、Hnf4aΔHマウスではHNF4α欠損による標的遺伝子の発現低下と、PPARαの活性化によりNASHを発症することが推測される。このうちNASH発症に関与するHNF4αの標的遺伝子を多く同定できているが、PPARαの活性化機能は十分に解析されていないため、Hnf4aΔHマウス肝臓におけるPPARαの活性化機構について解析した。PPARαは内在性脂肪酸をリガンドとして活性化するため、Hnf4aΔHマウス肝臓内の総脂肪酸解析を行った。この結果、数種類の脂肪酸の割合がHnf4aΔHマウスで増減していることが分かった。さらに、脂肪酸伸長および不飽和化酵素をコードするmRNAの発現を網羅的に解析した結果、Hnf4aΔHマウスでのElovl3の顕著な発現低下、Elovl7の顕著な発現増加、Fads3の発現増加が認められた。このうち、PPARα欠損マウスとPPARαの特異的リガンドを用いた解析から、Elovl7はPPARαにより活性化されることが示唆された。現在のところ、脂肪酸組成の変化と、これらの脂肪酸伸長酵素(Elovl3, 7)と不飽和化酵素(Fads3)の発現の相関性がよく分からないため、Hnf4aΔHマウス肝臓内の遊離脂肪酸組成の解析を進行中である。これにより、脂肪酸組成の変化によるPPARαの活性化機構の解明を目指す予定である。肝臓特異的HNF4α欠損マウス(KOマウス)は非アルコール性脂肪肝(NASH)を発症し、HNF4αとPPARαを欠損させたダブル欠損マウスでは顕著に脂肪肝が改善することが明らかになった。このためKOマウスのNASH発症にはPPARαの活性化が寄与していることが示唆される。このため本研究では、KOマウスにおけるPPARαによる脂肪肝形成機構を解明することを目的とした。KOマウス肝臓では脂肪酸の取り込みに関与するFATP1の発現が顕著に上昇していたため、FATP1の発現がPPARα依存的に転写活性化されるのかどうかをプロモーターアッセイにより解析した。その結果、マウスFATP1のプロモーター活性はPPAR応答配列依存的に転写活性化され、転写活性化はPPARαにより特に強く誘導された。さらには、PPARαの存在下ではコアクチベーターのPGC1αや特異的リガンドによりさらなる転写活性化が認められた。一方、PPARβやPPARγによっても特異的リガンドの存在下で転写活性化が認められたが、PPARαよりも弱いことが分かった。また、ChIPアッセイにより、KOマウス肝臓ではPPARαが特異的にFATP1のプロモーター領域に結合していることが分かったが、PPARβやPPARγの結合は認められなかった。このため、KOマウスによるFATP1の発現誘導はPPARαの活性化によるものであることが明らかになった。また、KOマウス肝臓ではPPARαの発現は低下しているが、FATP1により取り込まれた脂肪酸がPPARαのリガンドとなり、PPARαが活性化されていると推測される。目的を達成したため核内受容体HNF4αの肝臓特異的欠損マウス(Hnf4aΔHマウス)は脂肪肝を経てNASHを発症し、さらに核内受容体PPARαを欠損させたダブル欠損マウスがNASH改善を示すことを見出している。このため、Hnf4aΔHマウスでのPPARαの活性化がNASH発症に寄与していることが予測された。今年度はPPARαの活性化によって誘導されるFATP1を発現誘導可能なヒト肝がん細胞株を作製した。その結果、FATP1の発現誘導により脂肪が蓄積することが分かった。従って、予想どおりHnf4aΔHマウスではPPARαの活性化によるFATP1やCideAの発現増加により、脂肪肝が促進されていることが予想される。また、Hnf4aΔHマウスで発現低下するmiRNAとしてmiR-130a-5p、miR-194-5p、miR-193aを同定しているが、今年度はヒト細胞株でmiRNAを強制発現した後、免疫沈降によるその標的遺伝子の同定に関する実験を新たに行い、現在ChIP-seq解析を行っている。これに加えて、Hnf4aΔHマウスで発現低下するmiRNAとしてmiR-455-3pを新たに同定した。ヒト肝癌細胞でHNF4αをsiRNAを用いて発現抑制することにより、miR-455-3pの発現が低下したため、miR-455-3pはHNF4αの新規標的遺伝子であることが示唆された。さらに、miR-455-3pの標的遺伝子として肝臓の線維化に関与する遺伝子をレポーターアッセイにより同定し、Hnf4aΔHマウスでの発現増加も確認できた。このため、HNF4αはmiR-455-3pを介して肝臓の線維化を抑制していることが示唆される。おおむね達成できたため肝臓特異的HNF4α欠損マウス(Hnf4aΔHマウス)はNASHを発症して生後約8週間で死亡するが、HNF4αと核内受容体PPARαを欠損させたダブル欠損マウスはNASHを改善し、延命することが分かっている。このため、Hnf4aΔH

マウスではHNF4α欠損による標的遺伝子の発現低下と、PPARαの活性化によりNASHを発症することが推測される。このうちNASH発症に関与するHNF4αの標的遺伝子を多く同定できているが、PPARαの活性化機能は十分に解析されていないため、Hnf4aΔHマウス肝臓におけるPPARαの活性化機構について解析した。PPARαは内在性脂肪酸をリガンドとして活性化するため、Hnf4aΔHマウス肝臓内の総脂肪酸解析を行った。この結果、数種類の脂肪酸の割合がHnf4aΔHマウスで増減していることが分かった。さらに、脂肪酸伸長および不飽和化酵素をコードするmRNAの発現を網羅的に解析した結果、Hnf4aΔHマウスでのElovl3の顕著な発現低下、Elovl7の顕著な発現増加、Fads3の発現増加が認められた。このうち、PPARα欠損マウスとPPARαの特異的リガンドを用いた解析から、Elovl7はPPARαにより活性化されることが示唆された。現在のところ、脂肪酸組成の変化と、これらの脂肪酸伸長酵素(Elovl3, 7)と不飽和化酵素(Fads3)の発現の相関性がよく分からないため、Hnf4aΔHマウス肝臓内の遊離脂肪酸組成の解析を進行中である。これにより、脂肪酸組成の変化によるPPARαの活性化機構の解明を目指す予定である。KOマウスで発現上昇するFATP1とCideA、発現低下するmiR-130a-5pとmiR-193aの発現誘導や発現抑制により、ヒト肝癌細胞株においても脂肪蓄積が認められるかどうかを解析する。また、同様な実験をKOマウスで行い、脂肪肝/NASHの病態改善効果について評価する。miRNAの標的遺伝子の同定やFATP1、CideAなどのPPARα標的遺伝子のNASH進行への関与を解析し、HNF4α/PPARαカスケードによるNASH進行に果たす役割を解明する。