hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ピペラジン誘導体によるCO2分離高分子膜のCO2透過促進メカニズムの解明

CO2回収貯留技術(CCS)は、温暖化および気候変動問題の有効な解決策として研究されているが、その実用化のためには効率的な省エネルギーCO2分離回収法の確立が必須である。膜分離法は、分離膜を境界に供給側と透過側ガスの化学ポテンシャル差(分圧差)が駆動力となり分離が進行するため、加熱などの追加エネルギーが不要であり、次世代のCO2分離回収法として着目されている。これまで種々のCO2分離膜が開発されており、アミンを分離膜に添加することによって、CO2選択性を著しく向上させることがわかっている。しかしながら、その実用化にはCO2透過性の向上が必須である。申請者は、アミン含有高分子膜のCO2分離メカニズムの解明を行ってきた。特に水蒸気存在下では、CO2は主にHCO3-となり透過することを明らかにした。ここで、分離膜の膜厚が5ミクロン以下では、HCO3-生成がCO2透過の律速段階(溶解律速)となっているため、HCO3-生成効率の向上がCO2透過性のさらなる向上に繋がる。これまでの予備検討において、ピペラジン誘導体の添加によって高分子膜のCO2透過性向上が確認されており、これはピペラジン誘導体がHCO3-生成を触媒したためであると考えられる。本研究は、(1) CO2透過促進因子としてピペラジン誘導体のHCO3-生成触媒メカニズムを解明し、促進因子の構造と触媒機能の相関を明らかにし、(2)高CO2透過性分離膜材料の創成を目的としている。本研究によりCO2透過性の飛躍的向上が達成できれば、高CO2透過性高分子膜の開発が可能となり、大規模CO2発生源である石炭火力発電所などからのCO2分離を目的とした高性能CO2分離膜の研究開発にも重要な情報を与えると期待できる。その結果、CCSの実用化が可能となり、温暖化および気候変動を抑制することができる。これまで、2-(2-aminoethylamino)ethanol (AEAE)をCO2キャリアとしてpoly(vinyl alcohol) (PVA)に物理固定した高分子膜が良好なCO2分離性能を発揮し、さら1分子中に水酸基を2つ有するピペラジン誘導体3-(piperazin-1-yl)propane-1,2-diol (DHPP)を添加することにより分離性能が向上することを明らかにしてきた。AEAE比でDHPPを2-10 wt%と触媒量添加した際、CO2/CH4混合ガスからのCO2分離では、それぞれCO2透過流束と選択性は、37 GPUおよび184、そして45 GPUおよび125となった。AEAEのみ(選択性62)と比較して分離性能が著しく高くなることがわかった。CO2がDHPPと相互作用した際に、DHPPの水酸基とCO2が水素結合した7員環構造を形成することが13C NMRから明らかとなった。これにより、CO2との相互作用が容易となり、形成されるカルバミン酸が加水分解してHCO3-を生成し易くなったためと考えられる。これまでは膜厚が8-11ミクロン程度の自立膜を調製してCO2分離性能の検討を行ってきたが、目標の100 GPUを達成するために薄膜化を検討する必要がある。そこで、循環塗布法により、中空糸膜モジュールの中空糸膜内表面に本膜材料の薄層を形成する検討を行っている。現時点で、膜厚は未測定であるが、CO2透過流束と選択性62 GPUおよび54を達成している。また、アミン含有高分子膜の構造解析も検討した。PVAは結晶性高分子であるが、DHPPなどのアミンと相溶性が高く、アミンと含有することによって非晶状態となることがX線回折の結果から明らかになった。また、ミクロ相分離などの相分離構造を形成していないことが示差走査熱量測定や小角X線散乱測定からわかった。これまでの研究成果より、アミン含有高分子膜に触媒量のピペラジン誘導体DHPPを添加することによってCO2分離性能が向上することがわかった。得られた分離膜のCO2選択性は非常に高く、目標値であるCO2透過流束100 GPUを達成するために、高分子膜のサブミクロンオーダーの薄膜化の検討を引き続き行う。具体的には、高分子膜材料は水溶性であるため、膜材料の水溶液を市販の水処理用中空糸膜モジュールの中空糸膜内を循環させ、膜内表面にCO2分離機能層として膜材料の薄層形成を検討する。予備検討結果から、すでに平膜よりも高い62 GPUを示すCO2分離膜モジュールが得られている。この循環塗布において、水溶液の粘度(濃度)、循環時間、および循環速度はCO2分離機能層の膜厚を決定する因子であり、これらの条件検討から循環条件の最適化を行う。また、加湿条件下でのCO2分離実験において、N2、H2、およびCH4との混合ガスからのCO2分離を検討した結果、CO2透過流束はこれら分離対象ガスに関係なく非常に高いことがわかった。これらのガスの透過とは異なる機構で分離膜を透過していることを示唆している。よって、軽炭化水素の改質によるH2製造のカーボンフリー化以外にも、バイオガス中のCH4濃縮にも有用であると期待できる。よって、最終年度では、CO2分離膜モジュールの実用化を検討するにあたり、耐久性評価と用途先についても探索を行う。

膜分離法は、分離膜を境界に供給側と透過側ガスの化学ポテンシャル差(分圧差)が駆動力となり分離が進行するため、加熱などの追加エネルギーが不要であり、次世代のCO2分離回収法として着目されている。これまで種々のCO2分離膜が開発されており、アミンを分離膜に添加することによって、CO2選択性を著しく向上させることがわかっている。しかしながら、その実用化にはCO2透過性の向上が必須である。申請者は、アミン含有高分子膜のCO2分離メカニズムの解明を行ってきた。特に水蒸気存在下では、CO2は主にHCO3-となり透過することを明らかにした。ここで、分離膜の膜厚が5ミクロン以下では、HCO3-生成がCO2透過の律速段階(溶解律速)となっているため、HCO3-生成効率の向上がCO2透過性のさらなる向上に繋がる。これまでの予備検討において、ピペラジン誘導体の添加によって高分子膜のCO2透過性向上が確認されており、これはピペラジン誘導体がHCO3-生成を触媒したためであると考えられる。本研究は、(1) CO2透過促進因子としてピペラジン誘導体のHCO3-生成触媒メカニズムを解明し、促進因子の構造と触媒機能の相関を明らかにし、(2)高CO2透過性分離膜材料の創成を目的としている。本研究によりCO2透過性の飛躍的向上が達成できれば、高CO2透過性高分子膜の開発が可能となり、大規模CO2発生源である石炭火力発電所などからのCO2分離を目的とした高性能CO2分離膜の研究開発にも重要な情報を与えると期待できる。その結果、CCSの実用化が可能となり、温暖化および気候変動を抑制することができる。これまで数種のピペラジン誘導体を、種々のアミンと高分子マトリクスであるポリビニルアルコール水溶液に所定量混合し、シャーレなどにキャストして溶媒である水を蒸発させることによりアミン含有高分子膜を作成した。得られた分離膜のCO2分離性能をCO2/H2およびCO2/CH4混合ガスを用いて測定した結果、分子中に水酸基を2つ有する3-(piperazin-1-yl)propane-1,2-diol (DHPP)を2-(2-aminoethylamino)ethanol (AEAE)と混合した際に、最もCO2分離性能が高くなることがわかった。また、CO2分離性能評価時に相対湿度が分離性能を決定する重要な因子であり、このことからピペラジン誘導体添加時にもCO2は高分子膜中でHCO3-として透過していることがわかった。そして、より詳細かつ定量的にCO2透過促進メカニズムを解明するために、逆ゲート13C NMRや2次元NMRによる高分子膜中CO2の形態の特定と定量化を行った。その結果、CO2はDHPPの2級アミンと相互作用するが、3級アミンとは相互作用していないことがわかった。また、4割の2級アミンがCO2とカルバミン酸を形成しており、高分子膜に溶解した47 %のCO2がHCO3-として存在していることが分かった。当初予定していた全反射赤外吸収測定は、申請者が所属する研究所の共通機器である赤外吸収スペクトル測定装置の不具合と移設によって検討を行っていないが、高いCO2分離性能を示すピペラジン誘導体の選定と、そのHCO3-生成に関する定量的な知見が得られた。CO2回収貯留技術(CCS)は、温暖化および気候変動問題の有効な解決策として研究されているが、その実用化のためには効率的な省エネルギーCO2分離回収法の確立が必須である。
野生マウスの遺伝資源から発掘したユニークな成長・肥満QTLの候補遺伝子の同定

我々は、今までに、野生マウスの遺伝子プールから成長・肥満に関わる新規量的形質遺伝子座(QTL)を第2染色体上に発見し、野生マウス由来のQTL対立遺伝子を保有するコンジェニック系統を樹立した。本研究では、導入した野生マウス由来ゲノム領域をさらに断片化したサブコンジェニック系統を複数樹立して表現型の解析を行い、また、導入領域内に存在する遺伝子の発現解析を行った結果、肥満QTLに関わる4つの有力な候補遺伝子を発見した。申請者は、今までに、野生マウスの遺伝資源から生後の体重成長と肥満に関与する新奇量的形質遺伝子座(QTL)を第2染色体上に位置づけ、このQTLをC57BL/6J近交系マウスに導入したコンジェニック系統B6.Cg-Pbwg1を樹立し、野生マウス由来の対立遺伝子が1-3週齢増体量を増加させ、白色脂肪組織重量を減少させることを明らかにした。本研究の目的は、コンジェニック領域をいくつかに断片化したサブコンジェニック系統を樹立して表現型評価を行い、染色体の位置情報に基づく候補遺伝子の探索と発現解析等を実施することにより、このQTLの最有力な候補遺伝子の同定を試みることである。本年度は以下のことを行った。(1)サブコンジェニック系統の樹立と表現型評価:以前に樹立した系統も含めて合計14のサブコンジェニック系統について、選抜交配を行い、着目したマイクロサテライトマーカーの遺伝子型のホモ化に成功した。そのうちの5つのサブコンジェニック系統の導入領域について、さらにマーカーの数を増やして詳細に導入領域を決定した。これら5つのサブコンジェニック系統、B6.Cg-Pbwg1並びにコントロールのC57BL/6Jに通常食または高脂肪食を与え、体重、体長、白色脂肪組織等の臓器重量を比較検討した。その結果、少なくとも2個の白色脂肪組織重量に関与するQTLsを確認し、そのうちの1つのQTLの染色体導入領域を約2Mbに狭めることに成功した。(2)候補遺伝子解析:上記約2Mb内にある候補遺伝子をデータベースにより探索し、6個の機能遺伝子について、リアルタイムPCRシステムを用いて遺伝子発現解析を行った。その結果、調査個体数は少ないがC57BL/6Jと着目したサブコンジェニック系統との間で遺伝子発現量が異なる遺伝子を発見することに成功した。(1)サブコンジェニック系統の樹立と表現型評価最終的に成長・肥満に関わるQTLが存在すると考えられる野生マウス由来染色体領域を導入した14種類以上のサブコンジェニック系統を完成させた。これらの中から5種類のサブコンジェニック系統に着目し、各サブコンジェニック系統の体重、臓器重量等の成長関連形質を雌雄それぞれ19-45個体計測し、C57BL/6Jのそれらと比較した。その結果、ある一つのサブコンジェニック系統の体重および白色脂肪重量が顕著に軽いことが明らかとなった。このことが事実であるか否かを確認するために、各サブコンジェニック系統をそれぞれC57BL/6Jと交配し、F1世代を得、F1同士を交配し、F2分離集団を大部分作出した。現在、得られたF2個体群のマイクロサテライトマーカー遺伝子型を決定するとともに、体重、臓器重量等を計測し、特徴解析を行っている。最終結果は次年度にまとまる予定である。(2)候補遺伝子解析今年度は、上記で作出したサブコンジェニック系統とC57BL/6J系統間F2分離集団の表現型評価に時間を費やしたために、リアルタイム定量PCR解析による遺伝子発現調査は実施できなかった。申請者は、今までに、野生マウスの遺伝資源から生後の体重成長と肥満に関与する新奇量的形質遺伝子座(QTL)を第2染色体上に位置づけ、このQTLをC57BL/6J(B6)近交系マウスに導入したコンジェニック系統B6.Cg-Pbwg1を樹立し、野生マウス由来の対立遺伝子が1-3週齢増体量を増加させ、白色脂肪組織重量を減少させることを明らかにした。本研究の目的は、コンジェニック領域をいくつかに断片化したサブコンジェニック系統を樹立して表現型の評価を行い、染色体の位置情報に基づく候補遺伝子の探索と発現解析等を実施し、このQTLの最有力な候補遺伝子の同定を試みることである。(1)サブコンジェニック系統の表現型評価

昨年度までに、成長・肥満に関わるQTLが存在すると考えられる野生マウス由来染色体領域を導入した5種類のサブコンジェニック系統において、体重、臓器重量等の成長関連形質を雌雄それぞれ19-45個体計測し、B6のそれらと比較した結果、ある一つのサブコンジェニック系統の体重および白色脂肪重量が顕著に軽いことが明らかとなっている。そこで、このことが事実であるか否かを確認するために、そのサブコンジェニック系統とB6を交配し、F1並びにF2世代を作出した。得られたF2分離個体群においてマイクロサテライトマーカーの遺伝子型を決定し、長関連形質を解析した結果、野生マウス由来のQTL対立遺伝子をヘテロまたはホモ型にもつ個体はB6対立遺伝子をホモ型にもつ個体より有意に白色組織重量が軽いことが明らかとなった。(2)候補遺伝子の解析着目したコンジェニック領域内に存在する全ての機能遺伝子29個についてリアルタイムPCR解析を行った。その結果、明確な遺伝子発現量の差異を示した候補遺伝子を4個発見することができた。
脂質ラフト形成を制御する機能蛋白質の探索

マスト細胞を抗原で刺激したときに生じるp44/42 MAP kinaseの活性化には抗原刺激によるMAP kinase kinase kinaseであるRaf-1の脂質ラフトへの移行と脂質ラフト中での活性化が必要である。また脂質ラフト中で種々の機能分子がRaf-1と相互作用しその活性化を制御していると考えられる。ステロイド性抗炎症薬デキサメサゾンで18時間処理すると抗原刺激による脂質ラフト中でのRaf-1の活性化が抑制されることを初年度に明らかにした。そこで、抗原刺激及びステロイド性抗炎症薬により脂質ラフトへの移行が変化する機能分子を探索し、脂質ラフト中でのシグナル伝達の制御機構を解析した。IgEで感作したラットマスト細胞株RBL-2H3細胞を抗原で2分間刺激後、脂質ラフトを回収し、p44/p42MAP kinaseの活性化に関わる機能分子14-3-3,heat shock protein 90(HSP90)、raf kinase inhibitory protein(RKIP)、kinase suppressor of Ras(KSR)、Spred-1について解析した。これらのうち、脂質ラフト中に検出されたものは、HSP90及びSpred-1であった。デキサメサゾンで前処理した後、抗原で刺激した場合、脂質ラフト中のLAT及びRasの量はほとんど変化しなかったが、Spred-1量は増加した。Raf-1抗体で免疫沈降したところ、Raf-1とSpred-1の結合が観察された。Spred-1は増殖因子によるp44/42MAP kinaseの活性化を抑制する、ことが報告されているため、デキサメサゾンによりspred-1の脂質ラフト中の濃度が増大し、その結果としてp44/p42 MAP kinaseの活性化が抑制されることが示唆された。ステロイド性抗炎症薬は様々な細胞機能を抑制するが、その一つの機序として脂質ラフトへの機能蛋白質の集積を制御していることが示唆された。ラットマスト細胞株RBL-2H3細胞をIgEで感作したのち、抗原で刺激すると2分以内にラフトが形成されるが、このラフトに集積する機能蛋白質と、その集積に対するステロイド性抗炎症薬の作用について解析した。脂質ラフト画分を不連続ショ糖密度勾配法により分取し、含まれる機能分子をWestern blot法で解析した。また、抗原で刺激する18時間前にステロイド性抗炎症薬デキサメサゾン(100nM)を添加した。抗原刺激により脂質ラフトに集合する蛋白質が増加し、linker of activated Tcell (LAT)やMAP kinase kinase kinaseであるRaf-1、Raf-1と結合しその活性化に関与するアダプター蛋白質kinase suppressor of ras (KSR)、heat shock protein 90 (HSP90)のラフト中の含量が増大した。一方、IgEを介した抗原刺激によるシグナル伝達の最も初期に関与すると考えられているチロシンキナーゼLynの含量は抗原刺激によって増加しなかった。デキサメサゾンで前処理すると、LATおよびKSRのラフトへの集積が抑制されたが、Raf-1、HSP90の集積は抑制されなかった。またLynの含量にも変化は見られなかった。また、デキサメサゾンにより、抗原刺激によるLynの活性化は抑制されないが、Raf-1のリン酸化、およびRaf-1の下流にあるp44/42 MAP kinaseの活性化が抑制された。したがって、機能分子のラフトへの集積がp44/42MAP kinaseの活性化経路に重要であること、この集積にはLyn以外の分子が関与していることが示唆された。
三次元マイクロチャンネル構造を誘起する錯体超分子を利用した多次元的界面構築

アミノ酸エステル残基を部分構造とするニッケルジチオカーバマート錯体が,カルバモイルプロトン-末端エステルカルボニル間の分子間水素結合により集積化し,特異な超分子構造を形成することを明らかにした。中でも,グリシン誘導体では約0.7nmサイズのマイクロチャンネル構造となり,分子認識の可能性を見いだした。このようなマイクロチャンネル構造は錯体の折れ曲がり構造によって実現したものである。実際に,ジオキサンやビピリジルのようなプロトン受容体とクラスレートを形成することを見いだした。さらに,アミノ酸残基自体から誘導したニッケルジチオカーバマート錯体は,末端カルボキシル館の相補的水素結合により1次元鎖を形成することがわかった。このような,分子間水素結合を利用した分子認識素子の構築のためニッケルジチオカーバマート錯体をシリコン表面に固定することを検討した。その結果,以下に挙げる3ルートで水素終端化シリコン表面から錯体終端化できることを見いだした。1.あらかじめ錯体中にアルケンを官能基として導入し,水素終端化シリコンとの反応を行う。2.シリコン表面をアミノアルキル終端化し,ニッケルイオンおよび二硫化炭素との表面反応によって錯体化する。3.シリコン表面をアミノアルキル終端化したのち,二硫化炭素およびトリエチルアミンとの反応でジチオカーバマート塩とし,さらにジエチルアミン,二硫化炭素およびニッケルイオンとの反応によって錯体化する。これら3ルートの内,どのルートによっても表面を錯体終端化できる。幅広い固体材料表面を修飾するために利用できる錯体超分子構造の最適化を行った。例えば、ニッケル(II)ジチオカーバマート錯体において,ジチオカーバマート配位子中にω-アミノ酸エステル部位を導入することによって,水素結合形成による超分子構造が誘導できることを明らかにした。とくに,α-アミノ酸であるグリシンやプロリンあるいは1-メトキシカルボニルシクロヘキシルアミンなどを部分構造とする場合には,超分子化によって三元マイクロチャンネルを形成することを明らかにした。さらに,これらの錯体が1,4-ジオキサンあるいは4,4'-ビピリジンのような水素アクセプターを水素結合形成によって特異的に包摂できることを明らかとした。以上の結果から,当初の目標である三次元マイクロチャンネル構造を導き出すための錯体の構造要因について,大幅に理解を進めることができた。さらに,錯体の固体構造に関して,C2対称性を保った折れ曲がり構造をとる場合に,分子認識と見ることができる特異的包接現象を発現することを見いだすことができた。これらの錯体を用いて,シリコン単結晶表面の修飾を以下の2通りの方向から検討した。すなわち,1)表面上のキンクなどを利用した結晶成長,および2)Si-C結合を利用した表面への錯体の固定である。これらの内,キンクなどを利用した結晶成長では,特異的な結晶成長を認めることはできなかったため,この方向での検討は断念した。一方,Si-C結合形成による方法に関しては,表面を水素終端化したシリコン単結晶と末端にC=Cを導入したニッケル(II)ジチオカーバマート錯体との反応によって,当該錯体をシリコン表面上に固定できることを明らかとし,次年度以降の検討課題とするに至っている。水素終端化シリコン表面上へ自己組織化可能なジチオカーバマート錯体を固定するために,a)ジチオカーバマート配位子の末端にアルケンを導入し,この錯体と水素終端化シリコンとの反応によりジチオカーバマート錯体を固定する,b)水素終端化シリコンとω-アミノアルケンとの反応によりアミノアルキル終端化シリコンとした後,アミノ基を利用した表面反応により錯体を固定する,検討を行った。まず,アリルアミンからジチオカーバマート錯体を合成し,水素終端化シリコンとの反応を行い,錯体終端化の可能な条件およびその確認のための分析方法を検討した。その結果,電子スペクトルによって錯体特有のd-d遷移を確認できること,また,表面の水接触角を測定することで錯体固定を判断できることを見いだした。ただし,この経路では両末端にアルケンをもつ錯体しか合成できていないためシリコン表面での自己組織化については検討できなかった。

ついで,b)の経路による固定について,シリコン表面をC3C9のアミノアルケンを用いて終端化を施した。このようにして得たアミノアルキル終端化シリコンをメタノール中に浸漬し,ニッケル塩,グリシンメチルおよび二硫化炭素を1:1:2のモル比で加え,通常錯体を合成する場合と同様な条件下で反応を行った。a)で明らかになった確認方法を用いて分析を行った結果,炭素数が少ないアミノアルキル終端化シリコンの場合に効率よく反応が進行することを明らかにした。また,自己組織化可能なジチオカーバマート錯体による分子認識能を明らかにする目的で,プロトンドナーあるいはアクセプターとして作用しうる化合物とのクラスレート形成を検討した結果,グリシン誘導体がジオキサンあるいはp-フェニレンジアミンとクラスレート形成することを見いだした。ジチオカーバマート錯体の分子間水素結合形成による超分子形成には,これまで明らかにしてきたアミノ酸エステル残基の中のカルバモイルプロトンと末端エステルカルポニル間の水素結合以外に,本年度には末端カルボキシル期間の水素結合も利用できることを明らかにした。末端カルボキシル館の相補的な水素結合は,錯体たよる1次元高分子鎖形成につながりて,配位子の構造によりマイクロチャンネル形成が可能である。また,このよう,な錯体超分子がビピリジルなどの水素受容体を包摂できることを見いだし,シリコン表面へ固定した場合に分子認識素子として作用する可能性を明らかにした。また,錯体のシリコン表面への固定法に関しては,今年度新たに,水素終端化→アミノアルキル終端化→表面反応によるジチオカルバマート終端化→錯体終端化のルートで可能であることを見いだし,過年度に明らかにしたルートと合わせ3ルートが利用可能となった。しかしながら,第1段階である官能基をもったアルケンを使うアルキル終端化の効率が低い欠点があり,その改善にむけて検討を加えた。その結果,例えばアルケニルアルコールをのヒドロキシル基をエステルとして保護し,その後,アルキル終端化一脱保護することで効率よく官能基をもったアルキル終端化が進行することを見いだした。この技術を応用することで,錯体終端化にとどまらず,重合開始剤のシリコン表面への固定も効率的に行うことができた。このような開始剤を使うことでシリコン表面上に分子量を制御しながらポリスチレン層を形成できることがわかった。
新しい成長ホルモン放出促進ペプチド、グレリンの構造と機能の解析

申請者らがヒトおよびラットの胃から発見したグレリンは、成長ホルモン分泌促進および摂食亢進作用をもつ新しい生理活性ペプチドである。グレリンは3番目のアミノ酸セリンが、脂肪酸であるオクタン酸によって修飾されており、しかもその修飾基の存在が活性発現に必要という、これまでに知られていない構造をしている。申請者らはグレリンに関して本年度中に次のような研究を行った。1,グレリンの脳室内投与によって強力な摂食亢進作用を示すを明らかにした。ラット脳質内ヘグレリンを慢性投与すると、ラットの脂肪組織は増大し、体重が増加した。このグレリンの摂食亢進作用はニューロペプチドYを介しての作用であった。2,血中グレリン投与によって血圧が低下するが、心拍数は変化なかった。心不全でカヘキシアを起こしているモデルラットへのグレリン投与によって、心機能の改善が見られた。3,グレリンが哺乳類だけでなく、両生類にも存在することを明らかにした。Bullfrogのグレリンでは3番目のアミノ酸がスレオニンで、その側鎖は哺乳類グレリンと同じくオクタン酸によって修飾されていた。4,グレリンは胃だけでなく、消化管全体に存在していた。消化管でのグレリンは下部消化管に行くほど、含量は低下した。5,グレリンは膵臓にも存在して、インスリン分泌を刺激することを明らかにした。グレリンは膵臓のランゲルハンス島のA細胞にグルカゴンと共存していた。以上のことから、グレリンが単に成長ホルモン分泌調節をするだけでなく、代謝・エネルギー調節に深く関与するホルモンであることが明らかになった。またグレリンは循環器作用も有しており、グレリンの幅広い臨床応用が期待される。新しい成長ホルモン分泌促進ペプチド、グレリンに関して、本年度中に申請者は次のような研究を行った。1,オーファン受容体GHS-Rの内因性リガンド、グレリンを胃から精製し、構造決定した。グレリンがin vitro,in vivoで成長ホルモン分泌を刺激することを明らかにした。ヒトにおいても、グレリンの静脈内投与によっても強力な成長ホルモン分泌活性をもつこと明らかにした。2,グレリンの第2の内因性formとしてdes-Gln14-ghrelinを精製・構造決定した。des-Gln14-ghrelinはグレリンと同一の遺伝子から選択的スプライシングによって、生成されることを明らかにした。des-Gln14-ghrelinはグレリンと同じく、血中投与によって強力な成長ホルモン分泌作用を示した。3,グレリンの胃・消化管での分布を免疫組織染色で調べた。その結果、30年以上不明であった胃のX/A-like細胞の分泌顆粒の中身が、グレリンであることを明らかにした。4,視床下部の摂食中枢を介して、グレリンが摂食活動を促し、体重増加をもたらすことを明らかにした。5,グレリンが胃において胃酸分泌、胃液分泌亢進作用を示すことを明らかにした。6,グレリンのRIA測定系を確立した。

心不全でカヘキシアを起こしているモデルラットへのグレリン投与によって、心機能の改善が見られた。3,グレリンが哺乳類だけでなく、両生類にも存在することを明らかにした。Bullfrogのグレリンでは3番目のアミノ酸がスレオニンで、その側鎖は哺乳類グレリンと同じくオクタン酸によって修飾されていた。4,グレリンは胃だけでなく、消化管全体に存在していた。消化管でのグレリンは下部消化管に行くほど、含量は低下した。5,グレリンは膵臓にも存在して、インスリン分泌を刺激することを明らかにした。グレリンは膵臓のランゲルハンス島のA細胞にグルカゴンと共存していた。以上のことから、グレリンが単に成長ホルモン分泌調節をするだけでなく、代謝・エネルギー調節に深く関与するホルモンであることが明らかになった。またグレリンは循環器作用も有しており、グレリンの幅広い臨床応用が期待される。
エネルギー・水循環情報データアーカイブ

国際共同研究GAMEでは、ユーラシア大陸上の寒帯から熱帯にわたる様々な地域における、大気、水圏、地表面、植生の観測が実施された。この観測によって得られたデータの中には史上これまで得られなかった貴重なデータが多く、このデータを利用して行われる研究の可能性は計り知れないものがある。「エネルギー・水循環情報データアーカイブ」班の目的は、これらの貴重なデータを集約化・アーカイブし、広く世界に公開・配布することである。「エネルギー・水循環情報データアーカイブ」班は国際的にはGAIN(GAME Archive & Information Network)として活動し、その役割は2つ、GAMEで取得されたデータの管理方針の作成、及びGAMEデータを公開・配布するシステムの構築であった。データ管理方針の作成について、本研究は国際的な研究計画であるため、データ管理方針は研究者間の国際協力の基礎となるものであった。このデータ管理指針は、本研究で得られたデータに関するガイドラインであり、データの定義、データ提供の基本方針などが含まれる。このデータ管理指針のうちで、最も重要なものは内外の研究者に対するデータ公開のスケジュールであり、98年の集中観測時のデータ及びそれ以外の観測データがそれぞれのスケジュールに則って公開された。データ公開・配布するシステムについて、第一にインターネットを通じての長期間継続的なデータ提供システムを構築した。このために、利用しやすい様に設計されたユーザインターフェイス、及び10年以上の利用を視野に入れた計算機システム・データベースシステムが整備・構築された。また、オンラインアクセスが未発達の国を考慮し、当該データ内容をCD-ROMとして製作、それらの国の研究者・実務者を中心に配布した。これまでに発行された7本のGAME DATACD-ROMはいずれも本研究の成果物である。本年度は初年度として、他の研究グループ各班からのデータ取得処理状況に関する情報収集を行った。特に大気のゾンデ観測データに関しては、当該データアーカイブグループなどでデータを取りまとめ、4次元同化実験への入力値とできるようインベントリを作成し、データベースとしての取りまとめを行なった。現地現業機関データの収集も予定通り行ない、新たにいくつかの国から地上気象観測データなどを収集してデータベースに付加した。また、次年度以降に控えた国際的なプロジェクト内でのデータ公開に向けたデータポリシーの確認と周知徹底、手順やスケジュール管理をデータアーカイブ班として行った。個々の観測データ等に関しては、今後さらに既存収集データの整理、不足データのリストアップ等を実施し、次年度以降必要な情報を入手する予定である。一方で、現有の情報サーバーの能力不足が顕著となったため、次年度に導入予定であった情報サーバを前倒しで導入した。このセットアップには当初問題はあったものの、現在では順調に運用されている。インターネット経由でのデータ公開は既に部分的に行なわれているが、公開のためのデータベース整備、Webページの構築に予想以上に人的資源がとられ、また、データポリシーの問題もあって完全に公開されているわけではない。これに対する処置として、多様なグローバルデータセットに対してデータ形式、構造の自動認識を行なってWeb上ヘスムーズに配置するシステムの試験的研究を実施した。現時点でも自動的認識手法によっても的中率を90%程度にまで高められることが確認されている。今後、こうした成果も利用しながら所与のデータ公開システム構築へ向けて研究を進める。平成10(1998)年度のGAME集中観測期間(IOP)の終了から2年余りが経過し、ようやく各種観測データや収集データが処理蓄積され始めた。気象水文領域研究の4つの地域ごとに概観すると、熱帯域観測計画(GAME-T)に関しては、分散型データセンターが立ち上がり、公開ポリシーに関して確認をとりつつ順次コンテンツが増えている状況である。亜熱帯前線帯(HUBEX)に関しては日中でシンクロナイズした分散型データセンターが機能している。チベットに関しては、当初の予定通りにGAME内、そして国際研究コミュニティに公開されたデータセンターが確立している。

さらに、これらを横断する形で、現地水文気象観測、あるいはタワーによるフラックス観測データに関してはGAME-AANグループによってやはり分散型データセンターが構築され、利用が可能となっている。集中観測に関してもっとも資源が投入されたラジオゾンデによる大気の3次元構造観測データに関してもアーカイブが公開され、これらに基づいて気象研によってGAME再解析(大気の4次元データ同化)が実施された。GAME再解析データとチベットデータに関してはその集成をデータCD-ROMとして各300ずつ作成し、日本国内21機関、海外16ヶ国50機関に送付済である。さらに、50GB近くにもなる高空間解像度データは研究代表者機関においてオンラインで公開され、30以上の機関からのアクセスがあり利用されている。こうしたネットワーク上に展開している分散型データセンターは気象研に置かれたGAIN-HUBからのリンクによって統合され、全体として順調に機能している。次年度は最終年度として、これらのデータセンターの緻密化と、充実、ユーザインターフェースの擦り合わせとより使いやすいシステムの構築を行なう。本特定研究の最終年度に対応して、アジア各国からのデ-タの最終的な収集、今後数年の使用に耐える計算機システム・データベースシステムの構築、利用しやすいように設計されたユーザインターフェースの構築、GAINデータセット及び、GAME-Tデータセット配布のためのCD-ROM作成などを行った。まず、本特定研究は1998年にアジア各地で行われた水文・気象集中観測を基盤とした研究であるが、アジア各国の現業機関において観測されたデータは、政治・経済的な事情もあり、数年経た後でないと収集不可能なものも多い。本年度は、1998年からは3年ほど経過した後であるが、そのような時期に該当するため、東南アジア・東アジア各国の各現業観測機関を巡り、精力的に交渉及びデータ収集を行った。収集された気象・水文データは速やかに東京大学生産技術研究所と気象研等に設置されているデータベースシステムに容易に再利用が可能な形でデジタル化され収納された。次に、これら観測・収集された水文・気象データは今後数年から可能ならば10年以上にわたり研究において利用されるとともに、インターネットを通じて世界に公開され続ける必要があり、そのため必要なCPUの増強、ストレージおよびバックアップの強化、ミラーリングの増強などを行った。インターネット公開の基盤であるホームページの更新及び増強も行った。
イメージング質量分析を用いた酵素のハイスループットスクリーニング法

本研究では、飛行時間型二次イオン質量分析計(TOF-SIMS)による質量分析イメージングを利用して酵素のハイスループットスクリーニング法の開発を目的としている。前年度に引き続き、Candida antarctica由来リパーゼB(CALB)をモデル酵素として、マイクロチャンバー上でパラニトロフェニルパルミテートの加水分解反応を行い、その後TOF-SIMSによる検出・イメージングを試みた。CALBをシリカゲルビーズに吸着し、固定化酵素を調製した。表面が平らなシリコンウエーハー上に基質であるパラニトロフェニルパルミテートを含有するアガロースフィルムを作成し、その表面に固定化リパーゼを散布し、37度で放置して酵素反応を行った後、TOF-SIMSを用いて反応生成物であるパラニトロフェノールおよびパルミチン酸の検出を行った。TOF-SIMSの性質上、固定化酵素粒子が存在する部分からは固定化酵素そのものによる物理的な障害によりスパッタリングが起こらず、シグナルが検出できなかった。そこで、固定化酵素を磁性シリカゲルビーズを用いて再度調製し、これを磁石を用いて基質マトリックスの最表層部に包埋させる技術を開発した。この技術を利用して、再度リパーゼの検出を行ったところ、非常にクリアに酵素活性を検出することに成功し、TOF-SIMSによる酵素の検出が可能であることを実証することが出来た。今後は、TOF-SIMS上のイメージと顕微鏡観察におけるイメージの位置を合わせる方法を解決し、TOF-SIMSにより活性が確認されたリパーゼを、顕微鏡下マイクロマニピュレーションにより回収する方法試みる予定である。この方法が完成すれば酵素の分子進化工学におけるスクリーニングのための非常に強力なツールとなることが期待される。今年度はCandida antarctica由来Bリパーゼをモデル酵素として、マイクロチャンバー上でパラニトロフェニルパルミテートの加水分解反応を行い、その後TOF-SIMSによる検出・イメージングを試みた。まず、TOF-SIMS検出用の基材としてガラス、ポリカーボネートよびシリコンウエーハーを比較検討したところ、シリコンウエーハーが検出感度、物理的強度およびコストにおいて優れていた。次にシリコンウエハー上に作成した0.2mm四方の反応室を備えた反応チャンバーを用いて実験を行った。すなわち、チャンバー全体に基質溶液を塗布後、各反応室に顕微鏡下で観察しながら種々の濃度の液体のリパーゼを分注した。その後37度で放置して酵素反応を行った後、TOF-SIMSを用いて反応生成物であるパラニトロフェノールおよびパルミチン酸の検出を行った。その結果、リパーゼの有無およびその量に応じてシグナルを検出することに成功し、リパーゼ活性質量分析イメージングの画像として捉えることができた。パラニトロフェノールの場合は負イオンモードが最適であった。一方、もう一方の生成物であるパルミチン酸に関しては検出する事が困難であった。今後は、球状シリカゲルなどのビーズに吸着固定した固定化リパーゼを用いて同様の反応を行い、TOF-SIMSによる検出が可能であることを実証する予定である。
小劇場演劇の軌跡--状況劇場と演劇センター68/71の移動公演・メディア戦略

本研究は1960年代半ばに隆盛を極めた小劇場演劇のなかでも劇団状況劇場と演劇センター68/71のメディア戦略と移動公演について、ポスターや機関紙の分析を通じてその詳細を明らかにしようとするものである。本研究では両劇団の移動公演の実態調査とポスターや機関紙の分析を合わせて行い、地方調査で得られた証言や収集した一次資料から当時の上演がどのような制作体制に支えられていたのか明らかにするとともに、マニフェストと調査結果の比較を行った。本研究は先行研究では単独で論じられることの多かった1960年代から70年代の小劇場演劇の興業形態、言語活動、身体表象それぞれの特徴を接続させ、小劇場演劇が何を改革すべく芸術運動を起こしたのかを総合的に考察することを目的としている。本年はひろく小劇場演劇に関する一次資料の収集と検証、および本研究の主たる調査対象である演劇センター68/71と状況劇場の地方公演に関する調査を行った。まず資料収集の面ではチラシ、機関紙・誌を収集し、演劇センター68/71の機関誌とポスターについて分析、拙論「『複製』と『所有』のはざまで:演劇センターの機関誌・ポスター分析」としてまとめた。演劇センター68/71は「運動としての演劇」というテーゼを掲げ活動を展開していたが、本論では先行研究ではなされなかった、集団理念について機関誌・ポスター、作品中の身体の表象との関連性からの検証を試みた。また本年は調査初年度ということで両劇団のみを対象とせず、小劇場演劇が俳優の身体性に依拠しながらもなぜ活発な言語活動も並行して行っていたのかを明らかにすべく、劇作家別役実の作品分析も行った。拙論「別役実『正午の伝説』分析:『我慢する身体』の表象をめぐって」では、先行研究では積極的になされてこなかった身体の観点から別役のあらたなドラマツルギーを読み解く作業を通して、別役だけでなく小劇場演劇全体において身体とはなんだったのかを明らかにする糸口とした。地方公演の調査としては、岡山にて当時演劇センター68/71と状況劇場の公演を地方窓口となって受入を担っていた関係者から聞き取り調査を行うことができた。他にも沖縄、北九州にて実際の上演場所の調査と当時を知る関係者からの聞き取り調査を行った。調査は次年度も継続し、全体像が明らかになったところで論文としてまとめる予定である。最終年度にあたる本年は昨年に引き続き調査を行うとともに収集した上演関連資料の考証作業を中心に行った。考証作業にあたってはアメリカ・イリノイ大学を訪問し、同大学所属のデイヴィッド・グッドマン教授に面会した。グッドマン教授は演劇センター68/71の初期メンバーであると同時に、日本現代演劇研究者として唐十郎作品の英訳も手がけている方である。訪問期間中はグッドマン氏から二度の聞き取り調査に御協力いただく他、所蔵資料をご紹介いただき、移動公演というスタイルに対する見解や、劇団の制作体制についての証言を得ることができた。また聞き取り調査はこの他に、大阪の劇団・犯罪友の会主宰の武田一度氏に面会し、関西地方における演劇センター68/71と状況劇場のテント興行について当時地元の協力者をつとめていた者としての立場から語っていただいた。こうした調査を経て得られた研究結果は本年、論文・学会発表に加え、研究計画でも目標としていた演劇博物館における企画展示「広場をつくる・広場を動かす日本の仮設劇場の半世紀展」を通じて発表することができた。本展示では図録も作成したため、より広く成果を発信することを可能にしたとともに、展示に先駆けて、イギリスにて開催された国際学会に参加し、調査の一部(移動公演という上演スタイルについて)を報告。海外の研究者に対しても成果を発信することができた。演劇センター68/71および劇団状況劇場の移動公演については、これまで両劇団がどのような理念の下で上演活動を行っていたのかは知られていたものの、実際の制作現場の状況がどうであったのかは明らかにされてこなかった。本研究ではそうしたこれまで明らかにされてこなかった制作現場の実体を聞き取り調査から明らかにした点に意義が認められ、広く社会に対して研究結果を発信することによって、60年代以降の日本の現代演劇研究の促進に貢献できたと言える。
HOLZ図形を利用した転位等周りの微小歪場可視化法の確立と応用

本研究では材料中の転位や析出物等の周りに発生する微小歪場を,汎用の透過型電子顕微鏡を用いて測定する新たな手法について研究を行った.具体的には測定の対象とする微小領域で,収束電子線を絨毯爆撃的に入射するとともに高次ラウエゾーン(HOLZ)図形を撮影し,HOLZ図形のズレ方向かち結晶格子面の歪みをベグトルマップで表した.らせん転位線と平行に観察した場合,格子面がらせん状に歪んでいる様子が再現できた、刃状転位線と平行に観祭した場合には,平面歪み条件下であるにもかかわらず,山なりの歪みが生じていることがわかった.これは試料の薄膜化に伴って,転位線に沿った応力成分が歪みとして現れたものと解釈できた.析出物周りの測定では析出物の形状に伴って,母相の歪場形状が著しく変わることが分かうた.1つの析出物周りで表面から山状の歪場が観察された場合,裏面から同一析出物を測定すると,全く正反対の谷状の歪場として測定され,本手法の妥当性が示された。さらに同一形状の析出物でも母相界面が完全整合な場合は,析出物を中心として対称な歪みが形成されているのに対し、ミスフィット転位がある場合には非対称な歪場が形成されていることが再現でき,測定感度の高さが証明された.本手法では格子面の傾斜歪みを0.01°以下で検出でき,測定空間分解能はデータ処理の都合上14nmで行ったが,データ処理の制約を除けば1nmまで可能である.実際の測定において0.2μm×0.2μm領域を約200点分割領域で測定する場合,測定そのものは20分程度で終了するが,その後のデータ処理に膨大な時間と労力を要した.その点を解決するためソフト化について検討したが,可能性は十分あるものの解析精度および予算の都合上断念せざるを得なかった.透過型電子顕微鏡のHOLZ(高次ラウエゾーン)図形を利用して,材料中の微小欠陥周りの歪場を測定した.本手法を用いた歪場の測定では,測定空間分解能は1nm以下.検出最小格子歪みは0.01°以下であった.bcc構造を有するMo単結晶中に存在する転位等周りの歪場解析を行ったところ,大別すると歪場マップには2種類のパターンが現れ,試料中に存在する転位の向きに依存することが分かった.転位線が試料に横たわっている場合には,転位をはさんで格子が折れ曲がっている様子が観察され,立っている転位では,転位を中心として渦巻き状のベクトルマップが得られた.特に切り立ったらせん転位周りでは,格子がらせんを描いて歪んでいる様子が確認された.また,刃状転位とらせん転位を比較した場合,刃状転位周りの方が格子の歪みが大きいことが分かった.同じbcc構造を有するFe-3%Si合金単結晶でも同様な結果が得られたが,材料による大きな違いは分からなかったが,現在検討中である.さらに本手法の応用としてアルミ合金中のホウ酸アルミウィスカー複合材について,ウィスカーが母材から受ける歪場を測定した.ウィスカーの長軸断面と短軸断面とで比較を行った場合,ウィスカーの弾性異方性によって歪み彫態が異なり,複合材の性能に大きな影響,を及ぼすことが明らかになってきた.今後は本手法の妥当性を確立するためCu-Co合金のCo粒子周りの歪場について測定し,過去の計算結果と比較検討を行う予定である.本研究では材料中の転位や析出物等の周りに発生する微小歪場を,汎用の透過型電子顕微鏡を用いて測定する新たな手法について研究を行った.具体的には測定の対象とする微小領域で,収束電子線を絨毯爆撃的に入射するとともに高次ラウエゾーン(HOLZ)図形を撮影し,HOLZ図形のズレ方向かち結晶格子面の歪みをベグトルマップで表した.らせん転位線と平行に観察した場合,格子面がらせん状に歪んでいる様子が再現できた、刃状転位線と平行に観祭した場合には,平面歪み条件下であるにもかかわらず,山なりの歪みが生じていることがわかった.これは試料の薄膜化に伴って,転位線に沿った応力成分が歪みとして現れたものと解釈できた.析出物周りの測定では析出物の形状に伴って,母相の歪場形状が著しく変わることが分かうた.1つの析出物周りで表面から山状の歪場が観察された場合,裏面から同一析出物を測定すると,全く正反対の谷状の歪場として測定され,本手法の妥当性が示された。さらに同一形状の析出物でも母相界面が完全整合な場合は,析出物を中心として対称な歪みが形成されているのに対し、ミスフィット転位がある場合には非対称な歪場が形成されていることが再現でき,測定感度の高さが証明された.本手法では格子面の傾斜歪みを0.01°以下で検出でき,測定空間分解能はデータ処理の都合上14nmで行ったが,データ処理の制約を除けば1nmまで可能である.実際の測定において0.2μm×0.2μm領域を約200点分割領域で測定する場合,測定そのものは20分程度で終了するが,その後のデータ処理に膨大な時間と労力を要した.その点を解決するためソフト化について検討したが,可能性は十分あるものの解析精度および予算の都合上断念せざるを得なかった.
新規平面脂質膜を用いた細胞膜分裂装置ｄｉｖｉｓｏｍｅの形成過程と構造の解明

膜分裂時には、複数の膜タンパク質が巨大な複合体を形成し、分裂を駆動する。しかし現在、複数の膜タンパク質で構成する巨大複合体の構築過程や構造解析を可能とする適当なモデル脂質膜は少ない。本研究は、大腸菌の内膜成分をもとにした平面脂質膜を開発し、巨大膜タンパク質複合体の構造解析を目的とした。その結果、標的膜タンパク質が平面膜に分配されないことがわかり、複雑な膜タンパク質複合体を解析可能なモデル膜開発を行った。その結果、ト培養細胞由来の細胞膜成分を数μmの範囲に基板上に展開出来ることを見いだした。開発したモデル細胞膜は、複雑な膜タンパク質複合体のイメージング解析が期待される。平面脂質膜上に、大腸菌の細胞分裂装置であるdivisomeを再構築し、構造および機能解析を目的として研究を実施している。本年度は主として、蛍光ラベル化FtsZを用いて蛍光顕微鏡による観察条件および脂質膜との相互作用を検証した。また、FtsZと脂質膜を介するZipAの調製を主として実施した。また、平面脂質膜の構造および物性解析も同時に進行させた。Cy3-FtsZを調整後、GTP依存的に繊維構造を形成させたところ、顕微鏡下で繊維構造を観察できる条件を検討した。結果としてFtsZ繊維が束になった状態の繊維を顕微鏡で観察可能となり、本研究の目標達成に重要な条件を決定する事ができた。また、GFPを融合したZipAの大腸菌の過剰発現株の確立を試みた。現時点で、精製後、実験に用いる十分なタンパク質量を得るまでには至らず、今後、宿主および発現ベクター等を変えることで、収量の向上を目指す。膜タンパク質を解析する平面脂質の作製方法についても検討した。これまでは、大腸菌抽出脂質を用いて平面膜を作製してきたが、膜の脂質組成を明確にするために、合成脂質を用いて気-液界面の脂質膜作製条件を検討した。現時点において、少なくともカルジオリピンは平面膜作製に必要がない事が明らかとなった。PE,PGを中心に、平面膜を効率よく形成する脂質膜組成を検討する必要がある事がわかった。また、膜分裂に関与するタンパク質すべてを用いて、再構築する実験へと発展させている。大腸菌の細胞膜成分(タンパク質を含む)から平面膜を作製し、膜分裂装置のイメージング解析を可能とする実験系の構築への手がかりも見いだした。本研究は、バクテリアの内膜成分を含む新しい平面モデル膜を開発し、巨大膜タンパク質複合体の構造解析を目的とし、研究を実施してきた。これまでに、主として、次の2つの実験を検討してきた。1)蛍光ラベルした膜分裂を制御する膜タンパク質の調製2)大腸菌の細胞膜成分を平面状に展開した新しいモデル膜構築これまでに、蛍光タンパク質を融合した膜タンパク質(FtsZ,ZipA,FtsA,FtsK)の大量発現系の構築を行い、蛍光イメージング可能な量のタンパク質の発現条件を構築する事が出来た。一方、細胞膜成分を利用した平面膜の開発に取り組んで来たが、細胞膜の脂質成分は平面膜に分配されるが、膜タンパク質が効率良く平面膜に入らない事がいくつかのGFP融合タンパク質を使った実験で明らかとなった。本研究のポイントは、細胞膜成分をフラットな平面膜として、蛍光顕微鏡やクライオTEMによるイメージング解析に適したモデル膜作製にある。大腸菌の内膜成分を用いた方法では、標的とする膜タンパク質が平面膜に分配されないため、幾つかの生物種由来の細胞膜で、イメージング解析可能な平面モデル膜の調製方法を検討した。その結果、ヒト培養細胞由来の細胞膜成分を数μmの範囲に基板上に展開出来ることを見いだした。研究期間中に新たに開発した平面モデル膜は、膜タンパク質成分を含み、モデル膜として適している事が分かった。作製した平面膜の原子間力顕微鏡による構造観察や脂質の側方拡散定数などの膜構造、物性の情報を得ることができた。研究期間内において、当初の研究目標を全て達成する事が出来なかったが、これら研究により、バクテリアの膜分裂装置だけではなく、ヒトの巨大膜タンパク質複合体の構造/機能解析に繋げる事が期待される成果を得る事ができた。本研究は、大腸菌の膜分裂時の分裂面に集合し、分裂を調節する膜蛋白質複合体(Divisome)を構成する膜蛋白質の相互作用,ダイナミクス,構造を明らかにする事を目的として、初年度の研究を実施した。試験管内に大腸菌の膜成分を平面状に展開し、divisomeの構築過程の蛍光イメージング解析を行う。研究初年度は、divisomeを構成する膜タンパク質の蛍光イメージング解析のための、蛍光蛋白質を融合した発現株の構築と膜蛋白質の調製を行った。

本年度は、divisome形成の初期に複合体を形成するFtsZ, ZipA, FtsKのGFP融合蛋白質の大量発現系を検討し、それぞれのGFP融合蛋白質のIPTG誘導による発現をSDS-PAGEおよび蛍光顕微鏡で確認した。発現確認後、FtsK-GFP融合蛋白質を含む細胞膜画分の調製を行った。本研究費で購入した高圧細胞破砕装置を用いて、大腸菌を破砕後、超遠心により細胞膜成分にFtsK-GFPが含まれる事をSDS-PSGEおよび蛍光顕微鏡観察により確認した。さらに本研究では、それらGFP融合蛋白質を含む大腸菌膜画分から膜小胞を調製し、大腸菌抽出脂質で作製したリポソームとの融合条件を検討した。その結果、高圧細胞膜破砕時に、リポソームを細胞懸濁液に混合することで、膜小胞とリポソームが融合し、数十μm程度の大きさの巨大な多重膜ベシクルの調製に成功した。得られた巨大な多重膜ベシクルは、平面脂質構造体の作製に重要な構造体であり、大腸菌の膜蛋白質すべてを含む平面脂質膜作製のための大きな進歩である。研究目標達成に向けて概ね計画とおり進める事ができた。本研究は、細胞膜がくびれる現象を制御するタンパク質群の相互作用と構造解析を行い、膜分裂がどのように制御されているかを解明する事を目的としている。分裂を駆動する因子(タンパク質)を試験管内に再構築し、蛍光顕微鏡によるイメージング解析および電顕による構造解析を計画してきた。H24年度終了時の2年間の研究において、計画するタンパク質の蛍光ラベルおよびGFP融合タンパク質の調製を実施してきた。また、膜タンパク質を解析するためのモデル膜についても、作製方法および物性解析を実施してきた。まだ、タンパク質間の相互作用をFRETとして観察する段階には入っていないが、分裂の足場となるFtsZの繊維構造解析を中心にすすめており、順次相互作用解析を実施する。脂質平面膜の作製方法についても、イメージング解析が十分可能な量(面積)を得る条件を確立している。膜タンパク質調製および平面脂質膜調製においてもおおむね順調に進展しており、最終年度に計画するイメージング解析および構造解析を展開する。研究計画初年度においては、divisomeを構成する膜蛋白質の発現系構築と膜タンパク質の調製を実施する計画であった。さらに調製した膜蛋白質間の相互作用をFRETとして観察する予定であった。上記、設定した初年度の到達目標に対して、膜蛋白質の調製に成功し、また平面膜構造体の作製のための手がかりを得る事ができ、概ね初年度の研究計画を達成した。しかし、3月の震災に伴う細胞破砕装置の導入が遅れ、膜蛋白質調製が当初の計画より半年ほど遅れた。そのために、蛋白質間相互作用のFRET観察までには至っていない。しかし、実施計画の遅れの程度は大きくなく、残りの2年間の研究期間内で研究目標を達成する事は可能である。全体の研究計画における達成度としては、概ね達成出来ているとの評価に至った。平成25年度は、これまでに作製した蛍光ラベルタンパク質の平面脂質膜上における相互作用をイメージング解析を実施する予定である。FtsZは、GTP依存的に繊維構造を形成するが、細胞内においては分裂面で、ZipA等を介して膜表面に結合し、繊維が束になることが提案されている。