hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
概日リズムが確立する時期についての研究

概日リズム中枢の視交叉上核(SCN)で、リズムの発振がいつ確立し、外界の刺激で変化するかを、培養SCN神経細胞の分裂で観察する。細胞周期のG1期を橙色で、S-M期を緑蛍光で標識できるFucciTgマウスと、概日リズムを時計遺伝子Per1発現を蛍発光で可視化したper1 : lucマウスで観察した。SCN神経細胞は、DM部は、VL部に比べて分化が早く、生後1日目のSCNは、リズムは弱い。母マウスをほかの雄と飼育すると、生後1日目のVLでは、S-M期の細胞が多く、リズム確立には妊娠母への異常な刺激を避けることの重要性を示唆した。平成21年度の計画である、細胞周期のS-G2-M期のタイミングを橙色蛍光で観察できるTgマウスと、概日リズムの進行を可視化できるper1 : lucやper1 : GFPTgマウスとかけあわせたdouble TgのSCNスライス培養を観察した。これより、生まれる直前の胎児マウスのSCNの神経細胞の分裂はさかんに進行中であるが、時計遺伝子Period1の発現振動はほとんど見られない。これに対し、生後1週間の乳児では、細胞分裂はほぼ停止しており、Per1の発現振動が出てくるようである。生まれる直前から生後1週間、10日後までの間に、環境変化などの外界の刺激で、胎児や乳児の概日リズムの確立する時期や位相変化の機能が、どのような影響を受けるかを調べる研究に移ってゆく準備が整った。本研究の目的は、哺乳類概日リズムの中枢であるSCNにおいて、約24時間の自律的な周期リズムの発振が発生段階のいつ確立するかを、SCNスライス培養のimagingで、神経細胞の分裂する様子を同時にみながら、明らかにすることである。概日リズムは、生体のホメオスタシスの維持や、生理活動の効率化に重要である。この研究により、生後1週間、10日後までの外部刺激が、乳児・胎児の概日リズムに、どのような異変をきたすかわかることは、その時期の不安定な概日リズムを正常に維持し、個体を健全な状態に保つための多くの知見を示すという大きな意義を持つ。本研究の目的は、哺乳類概日リズムの中枢であるSCNにおいて、約24時間の自律的な概日リズムの発振が発生段階のいつ確立するかを、SCNスライス培養のimagingで、神経細胞の分裂する様子を同時にみながら、明らかにすることである。平成22年度の計画である、細胞周期を橙色と緑蛍光で観察できるFucciTgマウスと、概日リズムの進行を可視化できるperl:lucマウスとかけあわせたマウスは、ヘテロ同士の掛け合わせなので、double Tgを得るのは困難であった。そこで、それぞれのTgマウスの同じ発生段階のSCNスライス培養を観察した。これより、生まれる直前の胎児マウスのSCNの神経細胞の分裂はさかんに進行中であるが、時計遺伝子Period1の発現は振動ほとんど見られずリズムは確立していない。生後1週間、10日後までの間に、発現振動の振幅が徐々に高まり、リズムが確立する。胎児の時の母への影響が、この発現振動の振幅の確立に影響するかを、母マウスの飼育環境を変えて子マウスのリズムを比較するという実験を行なっている。この研究により、胎児の時の母マウスへの影響が、その後、概日リズム確立に、どのような異変をきたすかわかることは、早い発生段階で概日リズムを正常に維持し、個体を健全な状態に保つための多くの知見を示すという大きな意義を持つ。また、概日リズムと細胞分裂周期の相関性についても考察する。本研究の目的は、哺乳類概日リズムの中枢である視交叉上核(SCN)において、約24時間の自律的な周期リズムの発振が発生段階のいつ確立するかを、SCNスライスを顕微鏡下で培養しながらimagingにより、神経細胞の分化する様子も観察する。また、環境変化などの外界の刺激で、胎児や乳児の概日リズムの確立する時期や位相変化の機能が、どのような影響を受けるかを調べる。具体的内容は、細胞周期、G1期の細胞を榿色蛍光蛋白で、S-G2-M期の細胞を緑蛋白蛍光で標識し、2色シグナル比率変化で観察できるFucciTgマウスと、概日リズムの進行を時計遺伝子Per1の発現振動のリポーターである蛍の発光シグナルで可視化できるper1:1ucマウスのSCNスライス培養を用いて、SCNの発生・分化と概日リズムを異なる発生ステージで観察した。また、母への影響が、子供のSCNの発生・分化に影響するかを、妊娠中の母マウスをmatingペアと異なる雄とともに飼育し、個別飼育の母マウスの子供マウスと発生を比較する実験を行なった。

SCN神経細胞は、生後1,3,8日後、成体と、発生が進行につれ、S-G2-M期細胞に対してG1、G0期細胞の割合が増える。Dorso Medial (DM)はリズムペースメーカーで、Ventrol ateral (VL)は外界の刺激に対して位相をリセットする機構を担うと考えられているが、DMのほうがVLに比べて分化が早い。また、per1:1uc TgマウスのSCNの細胞が分化進行中である生後1日後では、成体のリズムと比べでDM,VLともに振幅が小さく、強いリズムは確立していない。さらに、母マウスをmatingしたほかの雄マウスと飼育すると、その子供mouseの生後1日目のVLでは、わずかであるがS-G2-M期の細胞の割合が多く影響を受けていた。SCNの細胞分化や概日リズム確立には、早い発生段階で異常な刺激をうけると、SCNのVLの発達に影響を及ぼす可能性が示唆された。本研究は、発生初期の個体のリズムを健全な状態に保つために、妊娠中の母への異常な刺激を避けることの重要性を示唆したという点で、意義を持つ。
思春期心身症におけるセロトニントランスポーター遺伝子発現機構に関する研究--5-HTTLPRの解析--

本研究は、年々増加している小児期、思春期の心身症患者について、その病態の一端を明らかにし医学的対応の手掛かりを得るために、身体症状の病態を分子遺伝学的な側面から検討することを目的に行う研究である。遺伝子分析に当たっては当大学医学部倫理委員会の承認を得た後、ヒト末梢血白血球よりgenomic DNA抽出し、Serotonin Transporter (5-HTT)遺伝子の発現を調節するPromoter領域のPolymorphism (5-HTT-linked polymorphic region;5-HTTLPR)について解析を開始した。現在までに49検体を集積し、29検体を解析した。5-HTTLPRのPCR解析では.繰り返し配列の多いL型と、それの少ないS型が認められるが、これまでの解析では慢性疲労症候群19検体については、対照集団と異なりL型の頻度が有意に高かった。すなわち慢性疲労症候群のGenotypeではL/L型、L/S型の頻度が多い傾向にあり、AlleleではL型の頻度が有意に高かった(x^2検定;p=0.05)。これらとうつスコア(SDS)との関係をみると、L型を有する患者群(L/L型およびL/S型)ではS/S型の患者群より有意に(P<0.05)SDSスコアが高かった。またPerformanceStatusとは有意な関係はみられなかった。また、摂食障害については、これまでのところ遺伝子多型は対照群と有意差はなく、多型の頻度は対照群と同様な傾向にあると考えられるが、まだ症例数が少ないため検体をさらに集積する予定である。5-HTTLPRはプロモーター部位にあるため、その多型の差により5-HTTの発現量が異なることが報告されている。これらの差はプロモーター活性の差を引き起こし、感情の多型にかかわっている可能性が示唆される。これまでに解析した慢性疲労症候群でみられた対照集団との差が、うつ傾向や睡眠障害などとの関連についてさらに検討を加えていく予定である。現在、摂食障害や睡眠障害、不安、うつ症状などを訴えて受診する患者についてインフォームド・コンセントを得た上で検体の提供を依頼し、上記の遺伝子的解析を行っており、対象者を集積中である。また同時に、5-HTTLPRと身体症状や自律神経機能との関連を解析するために、対象者の生体リズム、自律神経機能についても解析を行っている。さらにストレス時の糖代謝の異常とも関連が考えられるため、経口ブドウ糖負荷試験も実施中である。
癌化及び脱癌化に伴うゲルゾリンファミリ-の発現と消長

本研究は当初計画よりいくつか進歩があった為,以下3つに分けて書く1)ゲルゾリンファミリ-精製法の進歩主としてプラズマゲルゾリンについて24時間内で精製出来る方法を開発した。試料を3050%飽和硫安分画後,透折,45mMNaCl,25mMトリスーHCl(pH8,0),1mMEGTAで平衡化したDEAE52カラムにかけ同液で良く洗う。次いで30mMNaCl,O,1mMEGTAに変え,次いでCaCl_22mMにかえると,ほゞ単一バンドでゲルゾリンが得られる。2)74KDアイソマ-の精製と存在様式ゲルゾリンアイソマ-に74KDのものがあることが牛の副腎髄質でわかり,これを精製し,抗体をつくり,組織別に存在を確かめたところ,中枢神経系,一部の内分泌器官,幹細胞由来の一部に存在することがわかった。これらはいずれも開口分泌を行う組織である。さらに酵素分解して,N端分画,C端分画に分けることが出来た。ゲルゾリンファミリ-のもつ,アクチンのCa存在下での切断,PIP_2によるアクチン結合からの解離の性質はN端側にあることがわかった。3)癌化及び脱癌化3T3/NIH細胞で,cHaーras癌遺伝子の導入による癌化細胞とその脱癌化細胞の二次元電気泳動像でのゲルゾリンファミリ-の存在様式を調べた。抗体染色を転写膜上で行うと正常及び癌化細胞ではアイソマ-は2個であったが,脱癌化細胞では3個になっていた。量的にはほとんど変化はなかった。74KDの新らしいゲルゾリンファミリ-が発見されたので,癌化,脱癌化細胞でも検討していきたい。
蛋白質を会合させる人工分子の開発とそれを用いた細胞応答の制御

アポトーシスを含む生体反応に関わる細胞内シグナル伝達においては、蛋白質が複合体を形成する段階がキーステップになっている。TNF receptor suprefamilyに属する受容体蛋白質Fas、CD40などを介するアポトーシス制御のシグナル伝達は、それらの3量体形成が引き金となって起こる。このような蛋白質を特異的に会合させることができれば、細胞内シグナル伝達を誘導、抑制することが可能になると考えられる。ノボビオシンの一部であるノベナミンやクママイシンをはじめとするクマリン誘導体はDNAジャイレースのBサブユニット(GyrB)と特異的に結合することが知られている。クマリン-GyrB相互作用を基盤とした蛋白質会合試薬を開発することを目的として本研究を行なった。GyrBを認識する化合物としてノベナミンを採用することとし、比較的安価に入手可能なノボビオシンを選択的分解に処することによりノベナミンを得た。ノベナミンを2量化させるためのリンカーとして、ClCO-(CH2)4-COCl、ClCO-(CH2)5-COCl、ClCO-(CH2)6-COCl、ClCO-(C6H4)-COCl(メタ、パラ)を用い、これらとノベナミンを反応させることにより、ノベナミンの2量体5種類を合成した。これらの化合物を用いることにより、GyrBと融合させた蛋白質を会合させ、細胞内でシグナルを発生させることが可能と期待される。
ワインに含まれる高分子色素重合体に関する基盤的研究

アントシアニンは不安定な化合物であり、他の化合物との誘導体を形成することによって、安定化することが知られている。アルコール発酵開始後はアセトアルデヒドがアントシアニンと誘導体を形成するが、アルコール発酵開始前にこのような誘導体が生成しているか不明である。本年度は発酵開始前のブドウ果汁に多く含まれる酒石酸がフェントン反応によって生成するアルデヒドであるグリオキシル酸によって新たなアントシアニン誘導体化が形成されているのではと考え、その色調変化に寄与しているアントシアニン誘導体を明らかにした。試料はMalvidin-3-O-glucoside(Mv3g)を含む酒石酸水溶液または、Mv3g・Epicatechin (EC)の酒石酸混合水溶液を調整し、そこにEDTA溶液あるいは硫酸鉄(II)を添加し、30°Cの暗所で反応させた。色調変化は色差計で評価し、酒石酸分解物を介して生成したアントシアニン誘導体の構造解析はUPLC-DAD-MS/MSを用いて測定した。二価鉄を添加した試料はキレート剤を添加した試料に比べてMv3gが大きく減少し、反応溶液の色調が赤から紫に変化した。また、ECを含む試料では赤から橙への変化になった。新たに生成した誘導体の構造解析を行った結果、3つの化合物を確認した。化合物1は、酒石酸分解物によって架橋構造を持ったMv3gの2量体で、Mv3gに比べ長波長側に吸収を持っていた。化合物2はMv3gとEC間で同様に架橋構造も持つ構造で、この誘導体の吸収もMv3gと比べ長波長側にシフトしていた。化合物3はMv3gとECの間で環状構造を形成していた。この誘導体は440nm周辺に大きな吸光を持っていた。これらの新規誘導体の吸収は反応溶液の色調変化に寄与しており、アルコール発酵前段階での色調変化への影響が示唆された。赤ワインの渋味(収れん作用)の主成分は、ブドウの種子や果皮由来のプロアントシアニジンである。その化学構造は、カテキン、エピカテキンなどのフラバン-3-オール(カテキン類)が重合した構造を基本骨格とし、様々な修飾や変換を受けて多岐にわたっている。特に、色調の保持としての機能以外に、高分子色素重合体は呈味の深みや複雑さ・良質の渋味を与え、おいしさを構成する重要な役割を担っている。そのプロアントシアニジンは高分子であるため、そのままの状態で化学構造を分析することは難しい。そのため、加水分解により低分子化し、求核剤で誘導体化後、HPLC分析を行う方法がある。現在、求核剤として一般的に用いられているのは、フロログルシノールとベンジルメルカプタンである。これら求核剤を用いた方法(Phloroglucinolysis (Kennedy and Jones, 2001)とThiolysis(Thompson et al., 1972))は、その反応性、再現性の良さから使用されている。この2つの方法には、それぞれ長所、短所がある。ベンジルメルカプタンを用いたチオリシスはフロログルシノリシスと比較し、分解生成物の収量が多い反面、ベンジルメルカプタンは催涙性の強い刺激臭のため、「公害対策基本法」において公害とされ、「悪臭防止法」によりその使用が規制されている。一方、フロログルシノリシスは、無臭で取り扱いが簡便だが、チオリシスと比較すると分解物の収量が少ないことが問題である。以上、上記の2つの方法の長所を併せ持ち、反応性、再現性が良く、環境に負担のない「1-ドデカンチオールを用いたプロアントシアニジン分析方法」を開発した。新しいプロアントシアニンジンの分析方法を開発するにあたり、求核剤として1-ドデカンチオールに注目した。この化合物はベンジルメルカプタンと同様のアルカンチオール系の化合物であり、高い反応性が期待できる。また、1-ドデカンチオールは無臭の化合物で、安価に手に入る。本研究では1-ドデカンチオールを用いた新しいプロアントシアニジン分析方法を開発することを目的とした。まず、1-ドデカンチオールによって生じるカテキン類誘導体について、その化学構造とモル吸光係数は明らかするため、5.00 gのカベルネ・ソービニヨンの種子抽出物と1-ドデカンチオールを用いたチオリシスを行った後、分取HPLCにより3つの誘導体を得た。NMR分析の結果、化合物1((ー)-Epicatechin-4β-dodecanethioether)、化合物2((+)-Catechin-4α-dodecanethioether)、化合物3((ー)-Epicatechin-3-O-gallate-4β-dodecanethioether)と決定し、モル吸光係数を算出した。次に上記で分取した誘導体を用いて、1-ドデカンチオールを用いたチオリシスを行った結果、ブドウ種子由来プロアントシアニジンについて、現在広く使われているフロログルシノリシスと比較し、高い収率が得られた。本研究の結果より、1-ドデカンチオールを用いた方法の利点として、フロログルシノリシスよりも使用する薬品の数が少なく、反応時間も短い点、従来のチオリシスの欠点であった強悪臭を生じず、取り扱いやすい点が挙げられる。以上のようなことから、1-ドデカンチオールを用いた分析方法は新しいプロアントシアニジン分析方法として有効であるが示唆された。赤ワインの熟成期間、アントシアニン類と縮合型タンニンの両方で化学変化を起こし、より安定な高分子色素重合体を形成する。

熟成期間を経るにつれて赤ワイン中の赤色色素成分の中で徐々に高分子色素重合体が占める割合が多くなり、赤ワインの色調に大きく影響を及ぼしている。また縮合型タンニンにおいては、C4-C8とC4-C6との間のフラバン結合を介して連結された高分子のFlavan-3-olsであり、それらの構成単位は主にカテキン・エピカテキン・エピカテキンガレート・エピガロカテキンである。ワインタンニンの渋味は、唾液タンパク質との疎水性相互作用や水素結合、タンパク質との凝集・沈殿によるタンニンとの相互作用によるものであると考えられている。赤ワイン中のタンニンの平均重合度(mDP)は、モノマーごとに異なる。モデル溶液中では、モノマーは渋味よりも苦味があると認識されるが、mDPが増加するにつれて渋味も増す。平均重合度に加えて、タンニンのサブユニット構成比は渋味を決定する重要な変数であると考えられる。しかし、上記のようにプロアントシアニジンに関する報告は見られるが、化学構造が複雑で且つ分子量が大きい赤ワインの高分子色素重合体の研究に関する報告はほとんどない。さらにその呈味の質の評価については未だ不明な点が多い。本研究では、前年度の研究において新たに開発した1-ドデカンチオールを用いたプロアントシアニジン分析方法を用いて、ワインから分離した高分子色素重合体の構造と知覚(渋味)の関わりを調べた。赤ワイン中に存在する高分子色素重合体を分子量ごとに分画し、分画した高分子色素重合体の構造と渋味の調査を行い、高分子色素重合体の構造が赤ワイン中において呈味にどのような影響を与えるか明らかにすることを目的とした。赤ワインをToyopearl HW-40Fに供し、66%アセトン水溶液で高分子色素重合体を溶出し、高分子色素重合体画分を得た。この画分を限外ろ過で分子量ごとに分画し乾燥粉末にし、SEC(サイズ排除クロマトグラフィー)を使用して分子量を求めた。さらに前年度開発した方法を用いて各フラクションのflavan-3-ols組成や糖組成を求めた。さらに官能評価を行った。各フラクションの色調から、色を持つ高分子色素重合体であることを確認した。またSECの分子量分布の測定により、各フラクションが分画できたことが判明した。各フラクションのフェノール性化合物と糖組成より、各フラクションの70から80%がフェノール性化合物で、20から30%が糖類で構成していた。各フラクションとブドウ種子抽出物についてFlavan-3-olsの組成分析を行ったところ、平均重合度(mDP)がFr. 3はFr. 1とFr. 2と比較して小さいことが明らかになった。Prodelphinidin比についてもFr. 3はFr. 1とFr. 2と比較して小さいことが明らかになった。糖組成においては、他のフラクションと比較してFr. 1のみアラビノースが多く含まれ、ラムノースが少ないことが示唆された。また、官能評価について渋味強度に有意な差は見られなかったが、渋味の質に関してはFr. 1は収斂性が弱く・心地よいという渋味品質の評価を得た。Fr. 2は収斂性がある・ざらざら感・心地よいという渋味品質の評価を得た。Fr. 3は収斂性がある・ざらざらしているという評価を得た。アントシアニンは不安定な化合物であり、他の化合物との誘導体を形成することによって、安定化することが知られている。
経膣分娩と閉経が尿禁制機構に与えるリスクを実験形態学的観点から解析する

初年度の解析では、経膣分娩モデルとして膣拡張処理を行ったラットを用いて、処理4週後の外尿道括約筋(external urethral sphincter, EUS)における筋繊維タイプ別の影響を予備的に検討した。その結果、メスラットEUS近位部のみに存在するtype 2B線維が選択的に減数・萎縮していたが、EUS近位から遠位まで全層にわたって存在するtype2A線維には大きな変化は認められなかった。よって今年度は、経腟分娩モデルのEUSに生じる筋繊維損傷の変化を処理直後から3週間まで経時的に追跡すると同時に、処理後8週経過した時点で損傷筋が回復しているかどうかについて蛍光多重免疫染色を用いて明らかにすることを目的とした。膣拡張処理3日、1・2・3・8週間後のEUS試料を線維タイプ別のマーカーを用いて多重免疫染色すると、膣拡張処理3日目ですでに括約筋近位部に局在するtype2B繊維は萎縮像を呈し、その状態が13週間後まで継続していることが明らかになった。8週間経過した試料でもtype2B繊維の減少・萎縮像を呈したケースが多く観察された。さらに、再生筋のマーカーであるembryonic myosin heavy chain(eMHC)の抗体を用いて上記試料を免疫染色した結果、処理直後はEUSの近位から遠位部まで全層に渡って陽性筋線維が検出されたが、それらは経時的に減少し、8週間後にはほとんど近位部筋層にしか検出できなかった。これらの結果は、EUSを構成する筋線維のうちtype2B線維が一時的な圧迫・虚血による影響を最も強く受けて不可逆的に変性し、一旦変性するとほとんど再生する可能性がないことを示し、経腟分娩を含む長時間の尿道圧迫がEUSの尿道閉鎖機能不全に繋がるリスクを示唆することができた点で意義深いと考える。詳細に経時的な変化を観察するため、膣拡張処理3日、1・2・3・8週間後での組織採取時期を設定し、それぞれの時期で試料を採取することにしていたが(各67試料)、昨年度7月の豪雨災害に伴う大学内断水などの影響で動物の購入・飼育・実験処置等ができない時期があり、計画通りに材料採取自体ができなかった。よって、年度末の段階で、試料約半数程度で凍結切片作成、多重蛍光免疫染色、標本観察と写真撮影が終了していない。まず、前年度に採取した試料のうち、まだ凍結切片作成・多重蛍光免疫染色が終了していない試料の処理を終了させる。次に膣拡張処理後3日、18週間後すべての試料について、KEYENCE BZ-700を用いて必要な画像取得を行い、画像解析によりEUS矢状断面積全体における筋繊維サブタイプごとの面積比率を出して比較し、統計学的処理を行う。数値解析終了後にすべてのデータをまとめ、論文執筆を行いAnatomical Record(予定)に投稿する。さらに今年度は、閉経モデルとしてリタイヤラットに卵巣除去を行い、8週間経過した尿道周囲組織を対象として、尿道粘膜ヒダの形成・EUSの筋繊維構成・EUSにおける一酸化窒素の発現様態などに的を絞って無処理群と比較検討し、閉経が尿道周囲組織、特に尿道閉鎖に関連する構造物にどのような変化をもたらすかについて、形態解析を行う。得られた結果は2020年3月の解剖学会・全国学術集会で発表し、最終的に論文にまとめる。尿道閉鎖機序のうち、活動的尿道閉鎖に重要な役割を果たす外尿道括約筋(external urethral sphincter, EUS)は、膀胱平滑筋や尿道平滑筋と協働して括約機能を発揮する特殊な横紋筋組織である。実験動物を用いたEUSの組織学的な特徴を明らかにすることは、ヒト尿失禁メカニズムの解明や適切な予防・治療法の開発のための形態学的基盤の確立に貢献する。我々は、EUSの機能的特性に大きく影響する筋線維タイプ構成に着目し、しばしば尿失禁モデル動物の作成に用いられるラットを対象に蛍光多重免疫染色を用いて解析した。その結果、ラットEUSの部位による筋線維タイプ構成割合の差異に加え、それらには明瞭な性差も存在すること、さらに、生殖腺除去を行うとEUSの筋線維タイプ構成割合が変化することも見出して報告した(Tsumori and Tsumiyama, Anat. Rec, 2017)。これらの所見は、性ホルモンの減少や枯渇がEUSの機能に大きく影響する可能性を形態学的観点から明らかにしたものである。次に、経膣分娩モデルとして膣拡張処理を行ったラットを用いて、処理後4週間のEUSの筋繊維タイプ別の影響を検討した。その結果、メスラットEUS近位部のみに存在するtype 2B線維が減少・萎縮し、最も大きな影響を受けることが明らかになった。この所見は、経膣分娩により速筋の中でも特にtype2Bが不可逆的な損傷を受け、その結果EUSの機能不全をきたす可能性を示唆するものとして注目され、現在論文投稿中である。初年度で、ラットEUSの筋線維タイプ構成の特徴を明らかにした上で、去勢の影響についても検討し、論文発表することができた。さらに、経膣分娩後のEUSへの筋損傷の可能性についても、まず処理後4週間という時点での変化を明らかにし、2018年3月26日にHistology and Histopathologyに投稿した(現在査読中)。EUSの筋線維タイプ同定のための三重蛍光免疫染色法も手技的に確立したため染色結果についてはコンスタントなデータが得られており、研究遂行上技術的にも問題は生じていない。

さらに、特にオスラットの場合、EUSは去勢により筋線維が著しく萎縮することからアンドロゲンの影響下にあることが明らかになったため、筋支配ニューロンと筋組織自体両方におけるアンドロゲン受容体の発現についても蛍光免疫染色を行って解析を進めた。その結果、仙髄のEUS支配ニューロン、EUS筋線維ともにアンドロゲン受容体を発現することが明らかになった。本結果については第123回日本解剖学会全国学術集会で発表した(2018年3月29日)。初年度の解析では、経膣分娩モデルとして膣拡張処理を行ったラットを用いて、処理4週後の外尿道括約筋(external urethral sphincter, EUS)における筋繊維タイプ別の影響を予備的に検討した。その結果、メスラットEUS近位部のみに存在するtype 2B線維が選択的に減数・萎縮していたが、EUS近位から遠位まで全層にわたって存在するtype2A線維には大きな変化は認められなかった。よって今年度は、経腟分娩モデルのEUSに生じる筋繊維損傷の変化を処理直後から3週間まで経時的に追跡すると同時に、処理後8週経過した時点で損傷筋が回復しているかどうかについて蛍光多重免疫染色を用いて明らかにすることを目的とした。膣拡張処理3日、1・2・3・8週間後のEUS試料を線維タイプ別のマーカーを用いて多重免疫染色すると、膣拡張処理3日目ですでに括約筋近位部に局在するtype2B繊維は萎縮像を呈し、その状態が13週間後まで継続していることが明らかになった。8週間経過した試料でもtype2B繊維の減少・萎縮像を呈したケースが多く観察された。さらに、再生筋のマーカーであるembryonic myosin heavy chain(eMHC)の抗体を用いて上記試料を免疫染色した結果、処理直後はEUSの近位から遠位部まで全層に渡って陽性筋線維が検出されたが、それらは経時的に減少し、8週間後にはほとんど近位部筋層にしか検出できなかった。これらの結果は、EUSを構成する筋線維のうちtype2B線維が一時的な圧迫・虚血による影響を最も強く受けて不可逆的に変性し、一旦変性するとほとんど再生する可能性がないことを示し、経腟分娩を含む長時間の尿道圧迫がEUSの尿道閉鎖機能不全に繋がるリスクを示唆することができた点で意義深いと考える。詳細に経時的な変化を観察するため、膣拡張処理3日、1・2・3・8週間後での組織採取時期を設定し、それぞれの時期で試料を採取することにしていたが(各67試料)、昨年度7月の豪雨災害に伴う大学内断水などの影響で動物の購入・飼育・実験処置等ができない時期があり、計画通りに材料採取自体ができなかった。よって、年度末の段階で、試料約半数程度で凍結切片作成、多重蛍光免疫染色、標本観察と写真撮影が終了していない。初年度の膣拡張処理ラット(経膣分娩モデル)を使った解析により、処理後4週間の時点でEUSのtype2B線維に著しい萎縮が認められたことから、筋損傷が進行あるいはまた回復する過程を経時的にトレースする必要があると考えられた。よって、今年度は、処理後3日、5日、13週間後の各時点でEUSの組織学的変化を多重蛍光免疫染色を用いて解析する。
ミオシンモーターの細胞内ナノシステムの構築と制御

ミオシン繊維の動態と繊維化の解析EGFPミオシンを発現させた細胞で、全反射蛍光顕微鏡によって細胞腹側の細胞膜近傍のミオシン繊維の挙動を高感度カメラにより画像取得し、細胞運動に伴う挙動を解析した。ミオシンの繊維化、脱繊維化がどのように起きるのか、また、個々のミオシン繊維がどのように細胞の尾部や分裂面に集まるかを画像化し解析した。ミオシン遺伝子の改変による細胞内構築の解析ミオシンが細胞尾部に集合するのに、ミオシンのモーター活性が必要かどうかを調べるため、ミオシンのモータードメイン内の点突然変異によりモーター活性のないミオシンを形質導入し、細胞尾部に集まるかどうかを調べたところ、モーター活性がなくとも集合できることが分かった。また、ミオシンはリン酸化の制御を受けるので、リン酸化できないようなミオシンで細胞尾部に集まるかどうかを調べた。また、これらの変異ミオシンにGFP標識を行い、細胞内での集合の様子を直接観察したところ、ターンオーバーはリン酸化とモーター活性の両者に依存することが分かった。ミオシン繊維から細胞の力の出力までミオシン繊維から細胞の力の出力までを観察するために、細胞内のミオシン繊維を観察すると同時に、細胞の出す力を計測した。細胞の出す力を計測する方法としては、最近新しく開発したEvanescence-Force Microscopeを用いた。ミオシンの集合時に確かに細胞の力が発生していることが分かった。ミオシンの集合の細胞内シグナルの解明: PTENがミオシンの上位シグナルであることを新たに見いだした。ミオシンは、双極性の繊維として観察できた。それらは、表層に約7秒滞在した後消失した。mRFPアクチンをEGFPミオシンと同時発現した細胞を観察すると、すべての表層のミオシン繊維はアクチン繊維に結合していることがわかった。表層からのミオシン繊維の解離はリン酸化を介したミオシン繊維の脱重合によることがわかった。ミオシン遺伝子の改変による細胞内構築の解析ミオシンが細胞尾部に集合するのに、ミオシンのモーター活性が必要かどうかを調べるため、ミオシンのモータードメイン内の点突然変異によりモーター活性のないミオシンを形質導入した。その結果、ミオシンが細胞尾部に集まるのにはモーター活性は必要ないことがわかった。また、リン酸化できないようなミオシンで細胞尾部に集まるかどうかを調べたところ、尾部に集まるが過剰に集まった。リン酸化そのものは細胞尾部に集まるのに必須ではないが、過剰になったのは、分子の繊維化への平衡の偏りが原因と考えられた。今後、リン酸化酵素とミオシンの反応を細胞内で直接可視化し、リン酸化がどのように細胞内でのミオシンの分布の調節に関わるのか検討していきたい。ミオシン繊維から細胞の力の出力までミオシン繊維から細胞の力の出力までを観察するために、我々が最近開発した全反射蛍光顕微鏡法と同時に力測定する方法(Evanescence-Force Microscope)を用いた。細胞から伸びる突起が収縮する時にミオシン繊維が集合した。モーター活性のないミオシンを用いたところ、集合は見られるが力が発生していないことから集合したミオシンが力を発生させたことが実証できた。
神経細胞の糖鎖認識による髄液糖タンパク質の直接取り込み機構の解析

我々は、ヒト髄液中に2種類のトランスフェリン(TF)・アイソフォームが存在することを見出した。アイソフォームの1つは、ユニークな糖鎖(脳型糖鎖)を持つトランスフェリン(TF-1)であり、髄液産生組織である脈絡叢に由来する。他の1つは血清型の糖鎖を持つトランスフェリン(TF-2)であり、血液に由来する。即ち両者は由来が異なる糖鎖アイソフォームである。興味深いことに、歩行障害を伴う認知症(特発性正常圧水頭症)では、脳型TF-1のみが減少し、血清型TF-2は変化していなかった(NeurobiolAging, 33:1807-15, 2012)。即ち、両アイソフォームの代謝は独立していた。脳型TF-1のin vivoでの代謝を調べる目的で、ラット髄液中への投与を予備実験として行った。TF-1はTF-2に比べ、迅速に小脳プルキンエ細胞に取り込まれた(未発表)。即ち、プルキンエ細胞はTF-1を糖鎖依存的に効率よく取り込んだ。TF-1の速やかな取り込みに必要な糖鎖機能ドメインをマッピングするために以下の4種類の糖鎖アイソフォームを作製した。1血清型(末端シアル酸)糖鎖をもつTF-2、2アシアロTF-2、3アシアロ・アガラクトTF-2、4TF-1(末端糖は3と同じであるが、バイセクトGlcNAcおよびコアFucoseを持つもの)。作製されたアイソフォームのTFレセプターへの結合活性を調べたが、活性の差は認められなかった。以上の糖鎖アイソフォームのin vivoでの取り込みを比較するために、実験条件の至適化を行った。血清型糖鎖を持つTF-2の髄液内への投与では、10分後に神経細胞による急速な取り込みが見られ、20分後に取り込みがmaximumに達した。以上の結果から、投与後10分および20分後に、糖鎖アイソフォーム間の取り込みを分析することが妥当であることが示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。すなわち両者は由来が異なる糖鎖アイソフォームである。すなわち、両アイソフォームの代謝は独立していた。脳型TF-1のin vivoでの代謝を調べる目的で、ラット髄液中への投与実験を行った。すなわち、プルキンエ細胞はTF-1を糖鎖依存的に効率よく取り込んだ。TF-1の速やかな取り込みに必要な糖鎖機能ドメインをマッピングするため、以下の4種類の糖鎖アイソフォームを作製した。1血清型(末端シアル酸)糖鎖をもつTF-2、2アシアロTF-2(TF-2から酵素的に末端シアル酸を除いたアイソフォーム)、3アシアロ・アガラクトTF-2(アシアロTF-2から更に末端ガラクトースを除去したもの)、4TF-1(末端糖は3と同じであるが、バイセクトGlcNAcおよびコアFucoseを持つもの)である。

以上の糖鎖アイソフォームのin vivoでの取り込みを比較するために、実験条件の至適化を行った。血清型糖鎖を持つTF-2の髄液内への投与では、10分後に神経細胞による急速な取り込みが見られ、20分後に取り込みがmaximumに達した。以上の結果から、投与後10分および20分後に、糖鎖アイソフォーム間の取り込みを分析することが妥当であることが示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。タンパク質の多くは糖鎖修飾を受ける。糖鎖修飾は細胞・臓器特異性を示すことから、タンパク質部分が共通で糖鎖部分のみが異なるアイソフォームが存在する(糖鎖アイソフォーム)。糖鎖は結合するタンパク質の立体構造や代謝動態に影響するため、個々の糖鎖アイソフォームに関して機能アッセイを行い、機能に影響する糖鎖ドメインを決定することが重要である。我々は髄液中にトランスフェリンアイソフォームを見出した。また、髄液に特徴的なアイソフォームが認知症のマーカーになることを示した。このメカニズムの一つとして、トランスフェリンのレセプターへの結合および小脳への取り込みを想定した。本年度、我々は一連のトランスフェリン糖鎖アイソフォームの調製に成功した。1血清型(末端シアル酸)糖鎖をもつTF-2、2アシアロTF-2(TF-2から酵素的に末端シアル酸を除いたアイソフォーム)、3アシアロ・アガラクトTF-2(アシアロTF-2から更に末端ガラクトースを除去したもの)、4TF-1(末端糖は3と同じであるが、バイセクトGlcNAcおよびコアFucoseを持つもの)、の4種類である。このアイソフォームを用いて、細胞に高発現されたレセプターへの結合実験を行ったが、レセプターへの結合活性に差は認められなかった。今後、小脳への取り込みの違いを検証するため、ラット髄液中への投与実験を行う予定である。本年度中に4種類の糖鎖アイソフォームの調製に成功した。このアイソフォーム間で機能的な差が検出できれば、糖鎖機能ドメインのマッピングを進めることが可能である。トランスフェリンアイソフォームの機能として、細胞に高発現されたレセプターへの結合を調べたが、差を検出できなかった。今後は、以下の機能アッセイを系統的に行う予定である。(1)トランスフェリンは鉄輸送タンパク質であることから、各糖鎖アイソフォーム間での鉄結合性(親和性)を検討する。(2)糖鎖アイソフォームをラット髄液中に投与し、その小脳における取り込みを検討している。髄液に特徴的なTF-1はTF-2に比べて取り込み速度が速い傾向があることから、定量的なアッセイを確立して検証する予定である。(3)取り込み速度の精密な測定のためには、小脳スライスを用いた取り込み実験が適している。蛍光標識したTF-1およびTF-2の小脳スライスによる取り込みをリアルタイムでモニターし、可視化・定量化を行う予定である。
地震発生時長期予測モデルの研究

別府湾北西部の海底活断層について、音波探査・ボーリング調査を実施した結果、この断層から過去約6000年に地震が3回発生したことが明らかとなった。これらの地震の発生年と地震時垂直変位量とは、それぞれ、5050年前、0.9m;3650年前、1.3m;1350年前、1.7mと推定された。この結果は、地震の繰り返し発生に関するタイムプレディクタブルモデルと調和的で、同モデルが内陸直木型地震にも適用可能であることを示唆する。同モデルによって、最後の二つの地震の発生間隔(3650-1350=2300年)を、それ以前の地震発生間隔と変位量から予測すると、2020年となり、比較的良い精度(誤差12%)で地震発生時が予測できる。音波探査機による地層調査でボーリング地点を設定したが、この調査から、活断層による音響反射面のくい違いが下位のものほど大きく断層変位の累積性が認められること、反射面のなかには変位の等しいものがあり、変位は間欠的であると推定されること、がわかった。断層をはさみ南北にそれぞれ120m離れた地点で、40mの海底に大型台船からボーリングを実施し、シンウォールの水圧ピストンコアラーによって直径8cmの全コア試料を採取し断層両側の地層を対比した。海底堆積物は、主として黄黒灰色の泥岩で、主体は微生物の糞粒である。音響反射面は、貝・ウニなどの化石或いは木の葉・植物片の包含層、及び火山灰層に対比される。音響基盤(比較的コンパクトな泥炭層)の上位の反射面は、アカホヤ火山灰層(群馬大新井房夫氏鑑定)であることが判明した。アカホヤは断層によって3.9m食い違っており、平均変位速度は0.6mm1年と推定される。理論的研究では、断層の強度不均質、摩擦不均質の二つの場合につき数値実験を行ない、断層セグメント間の相互作用が中程度の場合、タイムプレディクタブル的な振舞をすることが見い出された。
東アジアにおける炭素性エアロゾルの動態と直接放射効果

本研究では、観測およびボックスモデル・三次元化学輸送領域モデルを用いて、放射収支の鍵となる炭素性エアロゾル(ブラックカーボン、BCと有機エアロゾル)の動態とその放射効果について調べた。本研究で開発・改良された数値モデルは、観測されたBCの混合状態の時間変化や輸送効率の高度分布など、重要なパラメータを良く再現できることが確認された。またその放射効果(光学的厚みや単一散乱アルベド)の特徴も観測と整合的な結果が得られ、直接放射効果の推定精度を高めることができた。東アジアにおける人為的なエアロゾル(大気中に浮遊する微粒子)の増大による、気候影響が強く懸念されている。本研究の目的は、三次元化学輸送領域モデルに放射収支の鍵となる炭素性エアロゾル(ブラックカーボンと有機エアロゾル)に関する新たなエアロゾル・放射特性表現を導入し、東アジアにおける各種エアロゾルの濃度とその放射効果(光学的厚みと単一散乱アルベド)の時空間変動を整合的に明らかとすることである。そして計算結果を観測により検証した上で、東アジアにおけるエアロゾルの直接放射効果について新たな評価を与えることである。本研究は新しい数値モデルの研究と、モデル検証のための鍵となる観測研究より成り立つ。本年度は第1に、ブラックカーボンの混合状態を表現したボックスモデルの開発を実施した。これはひとつの粒径に対して異なった混合状態が同時に存在することが表現できる新しいモデルである。このブラックカーボンの混合状態に基づいて、その放射特性(消散係数、単一散乱アルベド、後方散乱比)の計算を実施し、その効果を定量的に評価した。またブラックカーボンの湿性沈着過程(についても、モデルの改良を行なった。本年度は第2に、炭素性エアロゾル濃度とブラックカーボンの光吸収係数の観測を本研究でリファレンスサイトとして位置づけている八方尾根(エアロゾル濃度のみ)および辺戸岬で実施した。これらの観測との比較により、数値モデルで計算される地表面高度における炭素性エアロゾルの濃度などの妥当性の検証を実施した。この結果、ブラックカーボンの湿性沈着過程の改良などにより、高濃度イベントなどをある程度の精度で再現できることが確認された。また航空機による大気境界層および自由対流圏中のブラックカーボンなどの観測を実施した。本年度は第一に、数値計算の検証・改良に必要となる境界層内および自由対流圏中のブラックカーボンなどの炭素性エアロゾル濃度を、航空機観測により測定した。これらの航空機観測と連動して、沖縄の辺戸岬観測所などでも観測を実施した。本年度は第二に、これらの観測結果とモデルの計算結果とを比較検証した。本研究で実施された航空機観測との比較検証においては、境界層内の大気が自由対流圏に輸送される際の降水過程によりブラックカーボンなどのエアロゾルが湿性除去を受けたケースについて、本研究により改良された数値モデルが半定量的に説明可能であることが分ってきた。またエアロゾルの光学的厚みの時間変動の特徴は本研究で改良された数値モデルにより再現できる一方、絶対値についてはまだ不確定性が大きいことが示唆された。またエアロゾルの光吸収係数や単一散乱アルベドなどは、ブラックカーボンと他の散乱性エアロゾルとの混合状態が重要であることを、定量的に示した。これらの研究により、東アジアの炭素性エアロゾルの動態とその放射効果について、三次元化学輸送領域モデルにより解明が進んだ。本年度には第一に、H21年度に実施したブラックカーボンや有機エアロゾルの航空機観測や地上観測と、本研究で開発された新しい数値モデル計算結果との詳細な比較を行った。この結果、境界層内の大気が自由対流圏に輸送される際の降水過程によりブラックカーボンなどのエアロゾルが湿性除去を受けたケースについて、数値モデルにより半定量的に説明可能であることが分った。

またブラックカーボンの輸送効率(除去されなかったものの比率)は、輸送経路に沿った降水量と相関があることや、観測が実施された春季においては、華北からと華南からとでブラックカーボンの輸送プロセスや輸送効率が異なっていたことなどが明らかとなった。このように気象場との関係からブラックカーボンの輸送効率や輸送される高度、輸送量などを初めて体系的に示すことができた。本研究では第二に、炭素性エアロゾルの直接効果・間接効果に影響を与える新粒子生成過程についても数値計算を実施した。この結果、観測された減少の特徴をつかむことができた。最後にこれらの研究に基づき、東アジアの炭素性エアロゾルの動態とその放射効果について評価を実施した。アジアのエアロゾルや前駆気体の排出量を変化させた数値実験によりその効果を定量的に見積もった。
ゲノム情報によるファイトプラズマ・宿主間の遺伝子相互作用の網羅的解析

本研究では、重大な病害を引き起こす植物病原体であるファイトプラズマのゲノム構造の全容を世界に先駆けて解明し、その宿主決定機構に関する基盤的知見を得ることを目的としている。平成15年度は、前年度までに確立された高度に精製されたファイトプラズマゲノムDNAを抽出し、Sau3AI等による改良ファージライブラリーを作製した。スクリーニング等によってゲノミックライブラリーを検定し、高品質のライブテリーが作製されたことを確認できた。そこで、前年度までの情報を元にゲノミックウォーキングに取り組み、またゲノムのギャップ領域をLong PCRによって取得し、塩基配列を決定した。その結果、モデル系統・タマネギ萎黄病ファイトプラズマ(OY)の弱毒株、OY-Mの約860bpの全ゲノム構造を明らかにすることができた。全塩基配列情報より遺伝子領域を推定した後、データベース照合による機能遺伝子の推定を行い、さらに遺伝子構成について調べたところ、同じMollicutes綱細菌であるマイコプラズマよりも少ない代謝系遺伝子しかコードされていないことが判明した。ペントースリン酸回路に関与する遺伝子や、予想外なことにATP合成酵素のサブユニットなど、これまで生命維持に必須と思われていた遺伝子が欠落していた。これは、ファイトプラズマが細胞内という栄養分の豊富な環境下に生息するうちに、退行的なゲノム進化を遂げた結果であると考えられ、生命が生きていくのに必要な「最少遺伝子」を議論する上で重要な知見となる。本研究課題によって絶対細胞内寄生性の植物病原細菌として初の全ゲノム解析に成功し、ゲノムの退行性進化について重要な証拠を明らかにしたことは、国内外において非常に高く評価されている。平成14年度は、まず、ファイトプラズマゲノムの全体像の把握を目指し、一次構造の解明に着手した。16S rRNA塩基配列による系統解析より、最大のグループに属するonion yellowsファイトプラズマ(OY-W)をゲノム決定のためのモデル系統とした。また、植物の篩部組織に特異的に生育することから、宿主植物として維管束系の発達しているシュンギクを用いることとした。これらの材料よりゲノムDNAの精製、ファージライブラリーの構築、ライブラリーの検証を進めるという流れのなかでゲノムの主要な構造を明らかにするための端緒とする計画である。まず、遠心分離によって単離される植物マイコプラズマ濃縮画分より抽出した全DNAを用いてファージライブラリーを作製した。その後、一部クローンを選抜、ライブラリーの評価を行った。その結果、これまでの16S rDNAのようなPCR増幅産物ではない、ゲノム断片のランダムクローニングに成功し、膜輸送系のsecA遺伝子やelongation factor G/Tu遺伝子によるstr operonを含む断片等が得られた。これらの塩基配列からは、植物マイコプラズマが必ずしも動物マイコプラズマと最も近縁ではないという結果が予備的に得られている。さらに、植物マイコプラズマ画分をプロテアーゼ処理することで、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)により約1Mbpの高度精製ゲノムDNA画分の分離に成功した。現在、大量の高度精製ゲノムDNAの抽出を試みている。
入院児の発達段階と性差に則してカスタマイズ可能なプレパレーションツールの開発

プレパレーションは、各施設独自で考案されて実施されることが多いが、共通要素を盛り込んだうえでカスタマイズ可能なツールや、子どもの発達段階や性別、精神発達レベルなど個別性に応じてカスタマイズできるツールは、ほとんど見られないことから、これらを可能にしたプレパレーション・ツールの開発が必要であると考えた。そこで、入院児に必要な場面を選択し、子どもの頑張りを視覚的に確認できる12場面のプレパレーション・ツールと白紙のツールを作成した。ツールの有効性を確認するために、看護師および子どもの家族の両視点からの評価に加え、客観的指標を用いて評価したところ、すべてにおいて有効性が確認された。本研究では、入院児が体験する検査、処置といった様々な場面を取り上げ、基本的な説明内容を子どもの発達段階、性差、パーソナリティに則し検討し、提示すべき要素を明らかにすることを目的とし、その要素を現場の看護師が容易にカスタマイズして利用できるツールとして開発し、ネット上で公開し、無料ダウンロード提供できるシステムを構築することを目標としている。平成24年度には、小児看護の専門家会議・文献検討から、プレパレーション・ツールには、勲章的で、頑張りを可視化でき、収集できるデザインとすることを決定した。基本的ツールの対象は、幼児期学童前期とし、どちらの性でも喜ぶキャラクターとすることとした。デザインは、拓殖大学感性デザイン研究室へ依頼し、花びら型ツールを作成した。入院時に必要なプレパレーション場面について、小児専門病院の看護師と共同して検討し、入院案内、採血、点滴、手術、CT検査、MR検査、腎生検、退院の8種類を作成した。花びら型ツールは、CDファイルにファイリングでき、折りたたむとコンパクトな花びらとなるデザインである。子どもは、処置や検査を受ける前にツールを用いて説明された後、子どもがツールを何度も読み返すことによって、検査や処置の内容を理解することができ、不安や恐怖の軽減につながると思われる。また、ツールを収集することによって、自分の頑張りを可視化することができるため、自己効力感を高めると考えられる。平成25年度には、小児専門病院の協力の下、作成したプレパレーション・ツールを用いて、プレパレーションを行い、その有効性について研究を行った。39歳の子ども89名を対象に、プレパレーションを行い、看護師60名および子どもの保護者69名を対象に質問紙によってプレパレーションの有効性を調査した。その結果、ツールは勲章的な役割、理解度の促進、恐怖の軽減に有効であることが確認された。本研究では,入院児が体験する検査,処置といった様々な場面を取り上げ,基本的な説明内容を子どもの発達段階,性差,パーソナリティに則し検討し,提示すべき要素を明らかにすることを目的とし,その要素を現場の看護師が容易にカスタマイズして利用できるツールとして開発し,ネット上で公開し,無料ダウンロード提供できるシステムを構築することを目標としている。これまでに,小児看護の専門家会議および文献検討から,プレパレーション・ツールには,子どもにとって勲章的な意味を含めることの必要性を認識し,シリーズとしてファイル等に収集できるデザインとすることを決定した。基本的ツールの対象は,幼児期学童前期とし,どちらの性でも喜ぶキャラクターとすることとした。デザインは,拓殖大学感性デザイン研究室へ依頼し,作成された5案の中から,健常な子どもに対する聞き取り予備調査を行い,花びら型のツールを作成することとした。小児専門病院の看護師と共同し,入院時に必要なプレパレーション場面について検討し,入院案内,採血,CT,MRI,腎生検,点滴,手術,退院の8種類を選択し,コンテンツ内容を検討した。コンテンツは,検査・処置の説明,日時,食事について,やってはいけない内容,お願いしたい内容等についてである。花びら型ツールは,CDケース等にファイリングでき,折りたたむと星や太陽など子どもが好むデザインが完成するものとなっており,多くの処置や検査を受けることによって,頑張ったご褒美として,ツールが収集できる仕組みになっており,闘病意欲にもつながると考えられる。また,ツールはファイルごと持ち帰ってもらうため,退院後にも頑張ったご褒美として自己効力感を高めることができ,次回入院や治療に対しても前向きに取り組むことができると考えられる。【研究目的】入院から退院までのすべての場面に応じた子どもにとって勲章的な意味を持つシリーズ化したプレパレーション・ツールの開発を目的とした。入院患児に作成したプレパレーション・ツールを用いたプレパレーションを行い、プレパレーションの効果について、保護者および看護師からの評価ならびにサーモグラフィー装置を用いた顔面表面温度測定による客観的評価を用い評価し、効果的なプレパレーション・ツールを完成させ、Web上からダウンロード可能なシステムを構築することとした。【研究方法・計画】1子どもの入院場面に必要な説明内容を検討し、プレパレーションのコンテンツを考案し、ツールの原案を作成する。2入院児に対してツールを使用し、その効果を検証するとともに、看護師からツールの内容に関する評価を得、その結果を基にツールの精度を高め、ツールを作成する。3完成したツールをweb上に公開し、ダウンロードできるシステムを構築する。

【研究結果】入院児に必要なプレパレーションは、「入院案内」「採血」「点滴」「手術」「バイタルサイン測定」「レントゲン検査」「咽頭培養」「CT検査」「MRI検査」「ルンバール検査」「腎生検」「退院」と記入することで使える「自由項目用」の13ツールとなった。内容、表現などを検討し、幼児期学童期の子どもに理解できるものとした。花びら型のパンフレットで、折り紙のように折りたたむとCDファイルに収納でき、ツールを収集することで頑張りを可視化できるシステムとなっている。看護師および保護者のツールの評価は高く、子どもの理解促進や励みにつながった事が明らかになった。また、客観的な評価である顔面温度もプレパレーションや処置後のディストラクションを行うにつれ上昇し、ストレス軽減につながっており、ツールの有効性は確認された。2014年7月からWeb上で公開し、ダウンロードサービスと提供している。小児看護学本研究は、入院児が一般的に体験するプレパレーション・ツールを作成し、その有効性を評価したうえで、発達段階別、性別にカスタマイズしたものを作成し、web上で公開し、無料ダウンロードできるシステムを構築するという研究である。平成24年度には、計画した通り、1プレパレーション・ツールの場面選定、コンテンツの明確化、2プレパレーション・ツールの試作、印刷、評価修正を行った。その結果、入院から退院にいたる8つのプレパレーション・ツールを作成した。平成25年度の計画は、プレパレーション・ツールを用いた、プレパレーションの効果の検証、使用者評価、プレパレーションの完成であった。これまでに作成したプレパレーション・ツールを用い、小児専門病院の入院児を対象にプレパレーションを行い、その有効性について、看護師およびその保護者を対象に調査した。その結果、ツールの目的である、勲章的役割、理解度の促進、恐怖や不安の軽減について、有効性が確認された。また、自由記述の分析より、より効果的なツールとなるよう、ツールの修正を行った。本研究は,入院児が一般的に体験する一連の場面におけるプレパレーション・ツールを発達段階別,性別に作成する。その効果を子どもの心理的変化を評価することで検証し,ツールを完成させる。その後,無料ダウンロードできるシステムを構築するという流れである。平成24年度の計画は,1入院児が体験する場面の中から,説明した方がよい場面を選定し,作成するプレパレーション・ツールの場面選定を行い,2選定した場面それぞれについて,説明内容を検討し,コンテンツを明確にする。3小児看護の専門家会議を開き,原案を検討,修正し,説明内容を決定する,4選定した場面それぞれに対するプレパレーション・ツールの場面構成を行い,各場面の絵のデザインを行い,イラストや吹き出しとして加える文言等を作成し,印刷,試作する,