hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウシ成長ホルモン分泌リズムの形成における光の役割と神経機構の解明

本研究は、ウシの生産性(増体・泌乳)に重要な役割を演じている成長ホルモン(GH)の分泌リズムを光が攪乱する現象の中枢神経系による調節機構について、特にドーパミン(DA)神経の作用を明らかにすることを目的とした。その結果、DAがGHピークの形成において刺激性の作用をもつことが明らかとなったが、光によるGH分泌攪乱現象におけるDAの役割を明らかにすることはできなかった。また、光によるGH分泌攪乱現象の調節機構は複雑で、DA神経系だけでなく他の要因も関与していることが示唆された。【目的】本研究は、光刺激を、正常なウシ成長ホルモン(GH)分泌の撹乱因子ととらえ、ドーパミン(DA)神経系を中心としたその調節機構を明らかにすることで、光環境制御によるウシGH軸の活性化を介した新しい生産性向上技術開発のための基礎的知見を蓄積することを目的としている。【方法】本年度は、ホルスタイン去勢ウシを用いて、(1)第3脳室から得られた脳脊髄液(CSF)中のDA濃度変動とGH分泌リズムとの関係、及び(2)DA前駆物質であるL-DOPAの末梢投与がGH分泌に及ぼす影響について、実験を行った。(1)予め第3脳室に装着したカニューレを介して、24時間にわたり1時間毎にCSFを採取し、CSF中のDA濃度を高速液体クロマトグラフィ(HPLC)により測定した。同時に、頚静脈カテーテルより血液を採取し、血漿中GH濃度をラジオイムノアッセイ(RIA)により測定した。(2)正常なウシGH分泌リズム(Kasuya et al., 2012)のうち、GHが頂値に近い時間あるいは底値に近い時間の双方において、頚静脈よりL-DOPAを投与し、投与前1時間から投与後3時間までの間の血漿中GH濃度をRIAにより測定した。【結果と考察】(1)1時間毎に採取したCSF中のDA濃度と血中のGH濃度の変動には明確な相関関係はみられなかった。(2)GH頂値付近(12:00)でのL-DOPA投与はGH分泌を変化させなかった。一方、GH底値付近(0:00)でのL-DOPA投与は、GH分泌を刺激した。これらのことから、DAは主にウシGH分泌リズムにおける個々のGHピークの形成に関与していることが示唆された。【目的】本研究は、光刺激を、正常な牛ウシ成長ホルモン(GH)分泌の撹乱因子ととらえ、ドーパミン(DA)神経系を中心としたその調節機構を明らかにすることで、光環境制御によるウシGH軸の活性化を介した新しい生産性向上技術開発のための基礎的知見を蓄積することを目的としている。昨年度までに、DA神経系がウシGH分泌を刺激する作用を持つことを明らかにしたが、本年度は、夜間の光刺激によるGH分泌の抑制に及ぼすDA前駆体であるL-DOPAの投与による脳内DA増加の影響を検討した。【方法】ホルスタイン去勢ウシを用いた。12L:12D(6:00-18:00 L)の明暗環境下において、(1)消灯、(2)消灯+L-DOPA投与、(3)点灯(0:00-1:00の1時間)、(4)点灯+LDOPA投与の4処置を施し、23:00-3:00の4時間にわたり頚静脈カテーテルより採血し、血漿中GH濃度をラジオイムノアッセイにより測定した。【結果と考察】夜間の光曝露によりGH分泌のピーク出現が消灯時に比べ約1時間遅延する現象は既報(Kasuya et al., 2008)と一致した。L-DOPA投与は、消灯時・光曝露時ともにGH分泌を刺激したが、光曝露によるGHピークの遅延には影響を及ぼさなかった。本年度の実験結果からは、夜間の光曝露によるGH分泌撹乱現象におけるDA神経系の役割は明らかにならなかった。また本結果は、DA神経系以外の調節機構の存在も示唆するものであった。【目的】本研究は、光刺激を正常なウシ成長ホルモン(GH)分泌の撹乱因子ととらえ、ドーパミン(DA)神経系を中心とした調節機構を明らかにすることで、光環境制御によるウシGH軸の活性化を介した新しい生産性向上技術開発のための基礎的知見を得ることを目的としている。昨年度までに、夜間の光曝露によるGH分泌撹乱現象にはDA神経系以外の調節機構の存在も示唆された。そこで本年度は、DA神経以外の機構のひとつとして、光刺激による驚愕反応のGH分泌への関与を明らかにするため、点灯方法の違い(瞬時:驚愕反応を誘発、緩徐:驚愕反応を誘発しない)が夜間のGH分泌撹乱におよぼす影響を検討した。【方法】ホルスタイン去勢牛を用いた。12L:12D(6:00-18:00 L)の明暗環境下に動物を馴致させ、(1)消灯、(2)瞬時点灯(瞬間的に目的照度(約900lx)に達する)、(3)緩徐点灯(消灯状態から一定の速度で照度を上昇させ、2分後に目的照度に達する)の3処置(点灯は0:00-1:00の1時間あるいは0:00-2:00の2時間)を施し、23:00-3:00の4時間にわたり頚静脈カテーテルより採血し、血漿中GH濃度をラジオイムノアッセイにより測定した。【結果と考察】

夜間の光曝露の際、緩徐点灯によるGH分泌ピークの出現タイミングは瞬時点灯のときとくらべ違いがなかった。点灯方法の違いがGH分泌に影響をおよぼさなかったことから、夜間光曝露によるGH分泌撹乱現象におよぼす驚愕反応の関与の可能性は低いと考えられた。本研究は、ウシの生産性(増体・泌乳)に重要な役割を演じている成長ホルモン(GH)の分泌リズムを光が攪乱する現象の中枢神経系による調節機構について、特にドーパミン(DA)神経の作用を明らかにすることを目的とした。その結果、DAがGHピークの形成において刺激性の作用をもつことが明らかとなったが、光によるGH分泌攪乱現象におけるDAの役割を明らかにすることはできなかった。また、光によるGH分泌攪乱現象の調節機構は複雑で、DA神経系だけでなく他の要因も関与していることが示唆された。光曝露によるGH分泌撹乱現象におけるDA神経系の役割は依然明確でないものの、他調節機構の存在を示唆する結果を得ており、この現象の調節機構の解明に手がかりを見出していることから、達成度はおおむね順調といえる。神経内分泌学光曝露によるGH分泌撹乱現象において、当初ターゲットとしたDA神経系単独の作用は明らかとならなかった。一方、DA系以外の調節機構(例:光に対するストレス反応)の存在が示唆されることから、光曝露に対するGHの反応は非常に複雑なものと考えられる。最終年度は主に光に対するストレス反応がGH分泌に影響を与えているか否かについて検討し、その複雑なメカニズムの一端を明らかにする予定である。初年度に計画していた実験を予定通り行うことができ、得られた結果により次年度以降検討すべき点が明らかになったため。所属機関産の実験牛の不足により購入の必要があることと、牛の価格が高騰していることから、牛の購入費分を上乗せとして次年度使用額が生じた。次年度以降も、当初の計画通り実験を行う。具体的にはDAのウシGH分泌に及ぼす効果について、DAアンタゴニストを用いて検討する。牛の購入及び飼育・手術実験等に必要な消耗品の購入を計画している。次年度に購入予定の試験牛一個体の価格が高騰しているため、外部からの牛の購入費分を上乗せとして次年度使用額が生じた。牛及び牛の飼育・手術・実験等に必要な消耗品の購入を計画している。
実験的骨粗鬆症ラットにおける歯槽骨の動態

我々は歯科医学的に骨粗鬆症に関する研究を実施することを計画し、まず、ウィスター系の8週齢ラットと44週齢ラットに、大腿骨と同様に下顎骨にも低Ca食(4週飼育)によって実験的に骨粗鬆の状態を作り出せるが、その変化は44週齢では8週齢ほで著明でないことおよび44週齢の下顎骨における変化は歯の近接部位よりも離れた部位において明瞭に観察されたことを報告した。今回、科学研究費補助金によって、より高齢なラットでも低Ca食により大腿骨と下顎骨に骨粗鬆の状態が発症し、また、その状態が通常食に変えた後にも持続するのかどうかなどの点を明らかにする目的で、高齢ラット(60週齢)を、与える飼料により、コントロール群(通常食)、低Ca群(低Ca食)、変換群(低Ca食-通常食)の3群に分けて、これまでと同様の実験を行った。基本的にはこれまでに用いた方法を採用し、60週齢のラットの下顎骨と大腿骨を被験部とし、血中および骨中のCa量を測定し、組織標本を作製することとした。今回、血液についてはP量も測定し、組織標本については脱灰標本(H-E染色とAzan染色)だけでなく非脱灰標本(ラベリング剤による標識とVillanueva bonestainの併用)により観察を行うことにした。しかし、Ca量の定量に当たって、ラベリング剤としてのテトラサイクリンが存在することによると考えられた計測時のトラブルのため、従来の方法では定量出来ないことが判明したため、今回は血中および骨中の定量は行わなかった。一方、骨重量は灰化重量を測定した。その結果、60週齢ラットでも低Ca食により骨粗鬆の状態が作り出せるが、その状態は食餌を低Ca食から通常食にすることによって回復していることを窺わせる所見を得ている。本研究は補綴学的観点からの歯槽骨研究における骨粗鬆症に関する実験的研究である。44週齢のウィスタ-系ラットについて、すでに口演発表(平成元年度日本補綴歯科学会九州支部学術講演会)した8週齢ラットと同様の実験(低Ca食による骨粗鬆の状態の発症)を行った。その結果、低Ca食によって大腿骨同様下顎骨にも骨粗鬆の状態を作り出せるが、その状態は44週齢では8週齢程著明でないことが明らかになり、さらに下顎骨では歯の存在が影響することが示唆された。この結果は、日本口腔インプラント学会総会20週年記念講演会において発表した(実験的骨粗鬆症に関する研究第2報成熟ラットの下顎骨ならびに大腿骨に対するCa調整飼料の影響)。組織標本については、脱灰標本(HーE染色とAzan染色)と非脱灰標本(ラベリング剤による標識とVillanueva bone stainの併用)による観察法が考えられるが、実験の性質上、ラベリング剤による骨の形成障害も懸念されたため、これまでは脱灰標本によって観察してきた。しかし、実験成果からやはりラベリング剤による骨標識の必要性が示唆された。また、場合によっては、骨融解の現象が観察される可能性を期待したが、それらしき所見が推察されるものの、骨融解の現象を証明するためには、それに適した実験系が必要である。そこで、現在、次年度の計画である66週齢ラットを用いて、ラベリング法による実験を準備中である。

この実験では、高齢ラットにおける低Ca食による骨粗鬆症発症の可能性ならびに通常食に変えた後における骨粗鬆症の状態の持続性、さらに、これまでに8週齢(幼若群)と44週齢(成熟群)の所見との比較、など検討する予定である。骨粗鬆症患者では顎堤が著明に萎縮して総義歯難症例になることが考えられ、このようなる補綴学的観点から、我々は骨粗鬆症に関する研究を実施することを計画した。まず、ウィスタ-系の幼若ラット(8週齢)と成熟ラット(44週齢:1部平成2年度科研費使用)に、大腿骨と同様に下顎骨にも低Ca食(4週では幼若ラットほで著明でないことおよび成熟ラット下顎骨における変化は歯の近接部位よりも離れた部位において明瞭に観察されたことを報告した(平成元年度日本補綴歯科学会九州支部学術講演会、日本口腔インプラント学会総会20周年記念講演会)。しかし、より高齢なラットでも低Ca食により大腿骨と下顎骨に骨粗鬆の状態が発症し、また、その状態が通常食に変えた後にも持続するのかどうかなど解決すべき課題が残った。そこで、これらの点を明らかにする目的で、平成3年度の予算では、高齢ラット(60週齢)を用いてこれまでと同様の実験を行うことを計画した。基本的にはこれまでに用いた方法を採用し、60週齢のラットの下顎骨と大腿骨を被験部とし、血中および骨中のCa量を測定し、組織標本を作製することとした。今回、血液についてはP量も測定し、組織標本については脱灰標本(HーE染色とAzan染色)だけでなく非脱灰標本(ラベリング剤による標識とVillan ueva bone stainの併用)により観察を行うことにした。現在、試料作製中であり、実験結果を検討するまで至っていないが、一部得られた脱灰組織標本によれば、60週齢ラットでも低Ca食により骨粗鬆の状態が作り出せるが、その状態は食餌を低Ca食から通常食にすることによって回復していることを窺わせる所見を得ている。しかし、現時点では未だ試料不足であり、結論を出すにはもっと詳細な検討が必要である。
人工臓器用血液適合性材料の設計条件に関する基礎的研究

本研究は,新しい評価方法を用いて長期の血液適合性の発現機序や破綻の原因を明らかにし,血液適合性材料の設計条件を確立する基礎を築くことを目的とするもので,本年度は以下の研究を行った.1)材料の長期のin-vivaでの抗血栓性の評価とin-ritroでの評価結果の比較10種類のポリウレタン系材料をサック型人工心臓ポンプの内面22箇所に塗布し左心バイパスとしてヤギに装着し,種々の流量下で12週間駆動し,各材料表面の血栓の付着の様子を肉眼および走査電顕で比較した.次に同じ材料のin-ritroの実験を行った.犬の全血を用いて全血凝固時間,補体系の活性化,凝固系の接触相の活性化を調べた. in-vivoの結果では,血栓の生じる程度はポンプの流量によって異り,ポンプの流量が一定値以上では肉眼的には血栓を認めないが,走査電顕的には微小血栓の形式を認めるものがあり,各材料間の抗血栓性の差異が再現性をもって求められることが判った.この結果主鎖にポリジメチルシロキサンを含んだポリウレタン(KP-13)が最も抵血栓性が良いことが判った. in-vitroの結果でもこの材料は最も優れた結果を示したが,他の材料の抗血栓性はin-vitroとin-vivoの結果は必ずしも相関がなく,流れなど他の因子の影響が考えられた.2)KP-13の人工血管としての応用の試みKP-13を用いて直径3mmの小口径人工血管を試作した.小口径人工血管の問題点である縫合部のパヌス形成を防ぐために,人工血管の中央は平滑面に,両端を小孔を有した粗面とし,縫合部の血液適合性は粗面上の偽内膜で中央部は平滑面でそれぞれ確保することを考え試作し動物への植込実験を行った.粗面の孔の密度,偽内膜形成過程,粗面と平滑面の抗血栓性などについて調べた.結論にまでは到っていないが,偽内膜の形成には孔の密度が高い方が有利なこと,粗面の存在が必ずしも有利でないことが判った.本研究は,新しい評価方法を用いて長期の血液適合性の発現機序や破綻の原因を明らかにし,血液適合性材料の設計条件を確立する基礎を築くことを目的とするもので,本年度は以下の研究を行った.1)材料の長期のin-vivaでの抗血栓性の評価とin-ritroでの評価結果の比較10種類のポリウレタン系材料をサック型人工心臓ポンプの内面22箇所に塗布し左心バイパスとしてヤギに装着し,種々の流量下で12週間駆動し,各材料表面の血栓の付着の様子を肉眼および走査電顕で比較した.次に同じ材料のin-ritroの実験を行った.犬の全血を用いて全血凝固時間,補体系の活性化,凝固系の接触相の活性化を調べた. in-vivoの結果では,血栓の生じる程度はポンプの流量によって異り,ポンプの流量が一定値以上では肉眼的には血栓を認めないが,走査電顕的には微小血栓の形式を認めるものがあり,各材料間の抗血栓性の差異が再現性をもって求められることが判った.この結果主鎖にポリジメチルシロキサンを含んだポリウレタン(KP-13)が最も抵血栓性が良いことが判った. in-vitroの結果でもこの材料は最も優れた結果を示したが,他の材料の抗血栓性はin-vitroとin-vivoの結果は必ずしも相関がなく,流れなど他の因子の影響が考えられた.2)KP-13の人工血管としての応用の試みKP-13を用いて直径3mmの小口径人工血管を試作した.小口径人工血管の問題点である縫合部のパヌス形成を防ぐために,人工血管の中央は平滑面に,両端を小孔を有した粗面とし,縫合部の血液適合性は粗面上の偽内膜で中央部は平滑面でそれぞれ確保することを考え試作し動物への植込実験を行った.粗面の孔の密度,偽内膜形成過程,粗面と平滑面の抗血栓性などについて調べた.結論にまでは到っていないが,偽内膜の形成には孔の密度が高い方が有利なこと,粗面の存在が必ずしも有利でないことが判った.
新星の窒素同位体比で探る太陽系起源・銀河系化学進化

非常に遅い進化をする新星(「遅い新星」)においては、可視光極大期に光球面温度が十分に下がり、分子が形成されることがある。我々は、2012年の「へびつかい座新星」V2676 OphにおいてC2およびCN分子を同時に初めて新星において検出し、そのバンド吸収プロファイルから、新星における炭素および窒素の同位体存在比を初めて明らかにした。理論的先行研究から、観測された同位体比を説明するには比較的大きな(1.1太陽質量以上の)白色矮星が必要であるが、可視光光度の変化が非常に遅いという特徴からは白色矮星質量が比較的軽い(0.6太陽質量)ことが示唆され、矛盾が生じている。世界で初めてC2分子の検出に成功した(かつ世界で2例目となるCN分子検出に成功した)2012年のへびつかい座新星V2676Ophに続く分子生成新星の検出を目指しているが、平成27年度は新しく発見された新星の数は少なく、モニタリング観測からは分子生成新星を発見することはできていない。過去のV2676Ophの可視光分光データの再解析を実施し、分子生成のトリガーとなる環境を明らかにするべく、吸収線が卓越したスペクトルの解析を行って、光球面温度の変化について調べた。V2676Ophは分子生成直前にほとんど輝線を示さない吸収スペクトルを示しており、これを超巨星の合成恒星スペクトルと比較した結果、ほぼ6000Kの光球面温度の場合に一致した。また、[Fe/H]については太陽組成よりもHが欠乏しており、新星爆発の熱核暴走反応によって、伴星から白色矮星表面にふりつもったガスの中でHが消費された結果と考えられる。この結果より、色超過E(V-I)と光球面温度の関係を較正し、他の日付において観測されている色指数(V-I)の値から表面温度を見積もった。その結果、V2676Ophは発見直後にすでに表面温度が7000K程度になっており、ほぼ一定の状態を保っていた事が判明した。これは非常に進化の遅い新星であることを意味している。その後、可視光極大を経て光球面温度は更に低下し、5000K程度になったところでC2およびCN分子が検出されていることが分かった。その後、光球面温度は4500K程度にまで下がっていることが、C2分子の吸収プロファイルから分かる。このような状況は光球面付近における紫外線強度の低下を生じ、分子生成を促進していたのではないだろうか。平成27年度には、当初、予想していたほどには新しい新星の発見がされておらず、モニタリング観測に成功した新星の数は,当初より少なくなっているため。分子生成を起こした新星V2676 Ophについて、その光球面温度の変化を推定する新しい手法を確立し、論文として出版した(Kawakita et al. 2016, PASJ, 68, 87)。通常の古典新星は可視光極大期には光球表面有効温度が8000K程度、F型超巨星に似たスペクトルを示すとされてきた。しかし、V2676 Ophでは可視光極大期以降に連続的に光球面温度が減少し、5000K程度となったところでCNおよびC2分子の吸収バンドが観測されるに至ったことが明らかとなった。その温度減少率から、比較的高温度な光球面温度状態のうちからCO分子が生成されており、その放射冷却によって光球面温度が減少した可能性を論文中では指摘している。また、同新星のダスト生成以後に実施した中間赤外線分光観測の結果についても、論文として出版している(Kawakita et al. 2017, AJ, 153, 74)。国立天文台Subaru望遠鏡に取り付けた中間赤外線撮像分光器COMICSによって2014年と2015年に実施した観測の結果から、当該新星の原因となった白色矮星がCOタイプであることを示した。これはV2676 Ophがゆっくりとした減光を示すSlow novaの一種であったことと理論的には整合的であった。しかし、COタイプの白色矮星における新星爆発であったとすると、既に本研究で出版した成果[Kawakita et al. (2015), PASJ, 67, 17]にある炭素および窒素の同位体比については、既存の新星爆発・元素合成モデルでは十分に説明できないことも判明した。更に、新しい分子生成新星の発見を目指して構築した国際観測ネットワーク成果として、インドネシア・バンドン工科大学・ボッシャ天文台における新星観測の成果を出版した。現在のところ新たな分子生成新星の確認はできていない。過去に得られている観測データについては着実にデータの解析が進み、学術論文として出版に至っている。ただし、新しい分子生成新星の発見については、全国的な悪天候に阻まれ、予定通りには進んでいない。本研究では天の川銀河系内で起こる古典新星のうち、極大付近で光球面温度が十分に低くなり、C2およびCN分子が形成されるような新星を新たに発見し、可視光領域に見られる分子吸収バンドのプロファイルから炭素および窒素の同位体存在比を明らかにすることを最終目標とした。今年度は当該研究の最終年度として、これまでのモニタリング観測を継続すると共に、3年間の研究成果の取りまとめを行った。

本研究では海外のプロ及びアマチュアの観測者を含めて観測ネットワークを構築し、新たに発見された新星について、C2およびCN分子吸収バンドが見られるかどうかモニタリング観測を行ってきた。このような分子生成新星のプロトタイプであるV2676 Ophの発見(2012年)以降、残念ながら、これまでの間に新たなサンプルは発見されていない。これには、一昨年、昨年と新たな新星の発見が少なかったことも原因のひとつとして挙げられる。非常に遅い進化をする新星(「遅い新星」)においては、可視光極大期に光球面温度が十分に下がり、分子が形成されることがある。我々は、2012年の「へびつかい座新星」V2676 OphにおいてC2およびCN分子を同時に初めて新星において検出し、そのバンド吸収プロファイルから、新星における炭素および窒素の同位体存在比を初めて明らかにした。理論的先行研究から、観測された同位体比を説明するには比較的大きな(1.1太陽質量以上の)白色矮星が必要であるが、可視光光度の変化が非常に遅いという特徴からは白色矮星質量が比較的軽い(0.6太陽質量)ことが示唆され、矛盾が生じている。平成28年度も新たに発見された新星のモニタリングを継続する一方で、新規にモニタリングの協力研究者を獲得し、観測ポイントを増やすことを進めている。国際的な観測ネットワークの構築は順調であり、引き続き、観測ネットワークを活用した新しい分子生成新星の発見に努めるとともに、過去の同種の新星についての調査を進める。天文学平成27年度に期待していたほどの頻度で新星があたらしく発見されなかったため、その観測データ処理等にかかる経費や観測機器の準備にかかる経費などが未執行となっている。平成28年度には前年度末から出現している新星などのデータがあり、計画に従って執行可能と考えている。具体的には、国立天文台すばる天文台等で観測に成功したデータの処理を進めるための業務委託やデータ処理に必要な計算機・ソフトなどの物品費、研究成果報告のための国際研究会参加などの旅費に充てる予定である。
魚類光受容細胞の生化学的及び免疫組織学的研究

松果体は円口類から爬虫類に至る動物種では光受容器官、鳥類では光受容能と共に生体時計、哺乳類では内分泌器官であることがわかってきたが、共通していることは松果体の機能と光環境が密接に関連していることである。本研究では、魚類の網膜及び松果体にみられる光感受物質とそれらの器官で特異的に合成されるホルモンであるメラトニンとの関連を明らかにすることを目的として、特に網膜と松果体のメラトニンに関する知見が得られたので、ここに報告する。長期飼育、入手の簡便なコイを12L:12D条件下で2週間程度飼育した後、松果体、網膜、血漿のサンプリングを行った。サンプリングは数時間毎に、明期に23ポイント、暗期に34ポイントの時刻について行い、RIA法を用いてメラトニンの含量を求めた。その結果、松果体、網膜、血漿中それぞれのメラトニン含量に明期に低く暗期に高い顕著な日周リズムがみられた。また、12L:12D条件に続く恒暗条件下では、網膜のメラトニン濃度が恒暗条件にした1日目から3日目までの3日間の主観的暗期の時間に主観的明期の時間より高い値を示した。それに対して松果体では明らかな濃度変化は認められず、コイの網膜自体にサーカディアンクロックが存在すると考えられた。次に、網膜と松果体の光受容とメラトニン合成がどのような相互関係を持っているのかを明らかにするために光ファイバーを用いた局所的光照射装置を作製し、網膜のみに局所的に光を当てて、メラトニン含量の変化を調べようとしたが、眼球に照射した光は脳や松果体にまで透過してしまうことがわかった。その時の結果は、松果体より網膜に強い光が照射されているにも係わらず、網膜中のメラトニンに変化はみられず、松果体と血漿中のメラトニンは有意に抑制された。以上の結果よりコイの松果体と網膜はメラトニンの合成とそれに係わる光受容をそれぞれ独立して制御している可能性が示唆された。
アポトーシス抑制遺伝子EATのコンディショナルノックアウト法による生体内機能

申請者らは、独自に、ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)の分化初期に発現が上昇する遺伝子としてEATを単離した。本遺伝子は、bcl-2関連遺伝子に属している。本遺伝子の過剰発現が、培養細胞では抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制すること、トランスジェニック・マウス(EAT-Tg)では、膵ラ氏島の過形成を生じることを明らかにした。本研究では、更に、EATの機能を詳細とするために培養細胞およびマウスにおいてノックアウトすることを目的とする。本研究では、上述したEAT-Tgを100120週令まで飼育することにより、肝癌、悪性リンパ腫、肺腺癌、皮膚付属器腫瘍、皮膚線維肉腫といった腫瘍を発生することが明らかとなった。このことは、本遺伝子と腫瘍発生に深い関連があることを示唆している。また、これらの腫瘍は、発症時期が遅いため、EATが積極的に腫瘍を発生させるというよりもむしろ、アポトーシスの抑制を含めた間接的な関与が想定された。さらに細胞レベルでの機能を詳細にするために、マウスEC細胞であるF9細胞において本遺伝子のコンディショナル・ノックアウトを試みた。EATの重要なドメインが含まれるexon2を除去できるようなターゲッティングベクターを作製し、F9細胞に導入した。現在、450クローンをスクリーニング中である。本遺伝子をノックアウトしたF9細胞は、レチノイン酸などの添加によりアポトーシスによって死滅すると予想される。また、本遺伝子のコンディショナル・ノックアウトマウスを作製するために、胚性幹細胞に上述したターゲッティングベクターを導入し、132クローンをスクリーニングした。12クローンの相同組換体の候補を得たので、マウスを作製する予定である。これらのノックアウト法を用いた解析により、本遺伝子の細胞死、細胞増殖、分化に対する機能が解明されることが期待される。
放射線等価係数による化学物質誘発健康リスクの予見的リスク評価手法の開発

放射線等価係数を用いた新しいリスク評価法をベンゼン誘発白血病に適用した結果、1ppmの大気中ベンゼンに対して3.5×10-4-8.5×10-4、1μg/m3の大気中ベンゼンに対して1.2×10-7-2.8×10-7の白血病リスク推定値を得た。これらの推定値は表6に示した疫学情報に基づく報告値と比べて約30分の1から約20分の1程度の過小評価となった。白血病の標的臓器である骨髄の正常細胞を用いることでリスク推定値が改善されたと言え、エンドポイント毎に適切な細胞を用いるなど用量-反応評価の条件を整えることで、より正確な健康リスク評価が実現できると予想される。本研究の成果により使用細胞等の実験条件を発症機構に即したものへと近づけることで、より正確なリスク評価が実現できる可能性が示された。今後実験条件に更に改良を加えることで、信頼性を保った予見的な新しいリスク評価法の実現が期待できる。本研究は、ヒト細胞を用いる室内実験により把握が可能な染色体異常をマ-カ-に設定し、広島・長崎の原爆被災者を対象にする疫学調査デ-タに依拠して、都市生活環境中に存在しヒトへの日常的曝露が懸念される有害化学物質による健康リスクを評価・ランキングするための、信頼度の大きい実用的な健康リスク評価枠組みを構築することを目的とする。放射線とベンゼンによって特異的に誘発される白血病、ならびに白血病の根源事象とされる染色体の異常に着目し、染色体異常をバイオマーカーとしてベンゼン代謝物の放射線当量、ならびに白血病(致死・発ガン)ユニットリスクを求めた。ベンゼン代謝物のうちカテコール(CAT)、ハイドロキノン(HQ)をヒト抹消血リンパ球細胞に単独または複合曝露することで、その複合的な影響を評価する。CATについては、曝露濃度依存的に染色体異常を有する細胞数が上昇する傾向が見られ、曝露濃度10μMでは無処理の約30倍の染色体異常が誘発されることを確認した。また、HQについては、曝露濃度1,3,6μMでは無処理と比較して、染色体異常を持つ細胞数が36-38%と約20倍程度に上昇しているものの、濃度依存的傾向は見られない。しかしながら、処理濃度10μMの場合には、染色体異常は70%の細胞で観察され、無処理と比較して35倍の染色体異常が誘発された。異常の実験結果から得られた用量反応関係および低線量率長期曝露における用量反応関係とからヒト抹消血リンパ球細胞にベンゼン代謝物HQ、CATの単独、もしくは複合曝露に対応する放射線等量を算定した。これをもとに、染色体異常をバイオマーカーとしたベンゼンの白血病リスク評価を行ったところ、複合曝露の結果からは、1μg/m3における白血病発ガンユニットリスク、白血病致死ユニットリスクはそれぞれ2.8×10^-7,2.8×10^-7と算出された。これは疫学データから推定されたEPAの算定値と比較して約10分の1の過小評価となった。様々なタンパク質の発現ががんと密接な関係を有しており、解析技術の進歩も相まって、近年ではがんにおけるタンパク質発現プロファイルの解析が盛んに進められ、診断や治療に腫瘍マーカーが利用されることも少なくない。加えて、京都大学原子炉実験所の渡邉らの研究グループは、放射線発がんの一次標的はDNAそのものではなくタンパク質である可能性を示唆する研究結果も報告されている。従って、今年度は染色体異常といった遺伝子レベルでの変化ではなく、タンパク質そのものの変化をバイオマーカーとすることを検討した。まず、ヒト正常骨髄由来CD34+細胞を用いて、X線を照射し、二次元電気泳動法により特異的に発現量が変化するタンパク質を探索した。その結果,14個のタンパク質スポットで発現量の変化を確認した。また、ベンゼン代謝物について同様に二次元電気泳動法により特異的に発現量が変化するタンパク質を探索したところ、28個のタンパク質スポットについて特異的な発現量変化を確認した。そのうち2つのスポットはX線とベンゼン代謝物双方で共通したスポットであり、バイオマーカーとしての利用できる可能性が示唆された。現在、これらのタンパク質の同定解析中である。

本研究は、ヒト細胞を用いる室内実験により把握が可能な染色体異常をマーカーに設定し、広島・長崎の原爆被災者を対象にする疫学調査データに依拠して、都市生活環境中に存在しヒトへの日常的曝露が懸念される有害化学物質による健康リスクを評価・ランキングするための、信頼度の大きい実用的な健康リスク評価枠組みを構築することを目的とする。平成20年度には、1.ヒト正常骨髄細胞を用いた染色体異常試験の実施および2.ベンゼンのヒトPBPKモデルの構築、を行い放射線等価係数の決定と白血病リスク評価を行った。その結果、1ug/m3のベンゼンに70年間曝露された場合、白血病リスクは1.2×10^<-7>-2.8×10^<-7>と推定された。EPAはヒトの疫学調査の結果から推定される白血病リスクを、2.2×10^<-6>-7.8×10^<-6>と推定しており、これと比較くすると、約1/10-1/20程度となった。EPAの推定値よりは過少評価ではあるものの、in vitro毒性試験結果を用いた積み上げ型のリスク評価システムとしては良好な推定結果であると考えられる。ベンゼン代謝物のうり白血病発症に強く関連するカテコールとγ線をヒト正常骨髄細胞に曝露し、マイクロアレイその遺伝子発現量の解析を行った。その結果、テコールとγ線双方に共通して発現量の変化する遺伝子として、JUN、GADD45Aなどが検出され、これらの遺伝子は放射線等価係数を設定するに当たり、重要な遺伝子候補であることが示唆されたまた於射線等価係数による健康リスク評価の枠組みにおいて個人差を扱うため、カテコールをAsian, Hispanic, Black, Caucasian由来の正常骨髄細胞に曝露し、その解析結果から白血病発症機構と関連のある遺伝子群の発現量の差異から、個人差を定量的に評価する方法を検討した。本研究で提案した方法によると、カテコールによる毒性に対して最大で3.74倍の個人差が確認された。この個人差を放射線等価係数によるリスク評価の枠組みに適用し、ベンゼンによる白血病発症リスクを推定したところ、疫学調査によるリスク評価結果の約10倍の過少評価となり、昨年度までのリスク推定結果から改善された。
チェアサイドで利用可能な咀嚼能率測定装置の開発

1。咀嚼能率測定装置の改良前年度に開発した咀嚼能率測定装置による検査結果の正確性、再現性をより高めることより、臨床応用により適した装置へと改良を行った。1)グミゼリー水洗機構の開発咀嚼後の検査用グミゼリーから色素を溶出させる前に、グミゼリー表面に付着した唾液や唾液に溶出した色素などを取り除くための、水洗を十分に行うことのできる装置を設計、製作した。これにより。溶出される色素は、グミゼリー表面からのみになるものと考えられ、検査結果の正確性、再現性を高めることができた。2)色素濃度測定機構の改良測定する色素のスペクトル特性に、類似した中心波長を持つ発光ダイオードを用いることにより、前年度の検査装置に比して、検査結果の正確性が向上した。また色素溶出後の溶液安定に要する時間、液面に対する測定位置、溶出容器の形状、材質等の見直しを行い、装置の改良を行うことにより検査結果の正確性、再現性を向上させた。2。検査用グミゼリーの改良1)検査用グミゼリーの硬さの変化の測定前年度に選定した天然由来色素を含有した検査用グミゼリーを製作した。これに加えて、主にゼラチン濃度を変化させることで、色素を含有し.かつ硬さの異なる複数種類の検査用グミゼリーを製作した。それぞれの検査用グミゼリーを、温度、湿度などの異なる保存条件にて保存し、硬さの変化を測定することで、安定した保存条件を検討した。なお、咀嚼能率測定装置開発には、基準となる1種類の硬さのものを利用している。3。咀嚼能率検査の臨床応用有床義歯患者を対象とした咀嚼能率測定装置による咀嚼能率検査を行い、検査結果の妥当性を検討した。得られた結果を、測定精度にフィードバックし、より正確性、再現性の高い測定値を得ることができるよう測定装置の改良を行った。1.咀嚼能率測定装置の開発検査結果の正確性、再現性をより高めるため、グルコース濃度を利用する方法から、より簡便に測定可能な溶出色素の吸光度を利用する方法へ、測定方法を変更して開発を行った。1)色素溶出機構の開発咀嚼後の検査用グミゼリーから溶出される色素濃度に影響を与える、蒸留水の温度、量、および溶出時間を正確に規定できる装置を設計、製作した。2)色素濃度測定機構の開発正確に色素濃度を測定するために、発光ダイオードを用いたセンサを応用し、測定を行った。従来用いてきた血糖値測定器、ならびに吸光度計による測定値を用いて、測定精度について検討を行った。得られた結果から、装置の改良を行い、測定値の正確性と再現性が向上するよう検討を行っている。2.検査用グミゼリーの改良1)硬さの異なる検査用グミゼリーの製作検査用グミゼリーの、主にゼラチン濃度を変化させることで、硬さの異なる複数種類の検査用グミゼリーを製作した。これによって、幼児から高齢者まで様々な年齢層における集団検診や、すべての歯が健全な人から、自分の歯がまったくない全部床義歯装着者、また脳卒中後の顎口腔運動障害者まで、歯や口腔の状態に応じた検査が可能となる。現在は、含有色素選定、咀嚼能率測定装置開発のため、1種類の硬さのみを製作し、研究に利用している。2)検査用グミゼリーの含有色素の選定天然由来色素18種類の中から、咀嚼能率測定を正確に行うことのできる特性を持った色素を選定した。分光光度計を用いて分析したこ各色素の吸光度曲線の特性から、発光ダイオードを用いたセンサの波長と検査用グミゼリーに含有させる色素の種類を決定した。これにより、咀嚼能率測定装置の色素濃度測定機構の開発が可能となった。1。これにより。2。

それぞれの検査用グミゼリーを、温度、湿度などの異なる保存条件にて保存し、硬さの変化を測定することで、安定した保存条件を検討した。なお、咀嚼能率測定装置開発には、基準となる1種類の硬さのものを利用している。3。咀嚼能率検査の臨床応用有床義歯患者を対象とした咀嚼能率測定装置による咀嚼能率検査を行い、検査結果の妥当性を検討した。得られた結果を、測定精度にフィードバックし、より正確性、再現性の高い測定値を得ることができるよう測定装置の改良を行った。
甲殻類の脱皮を制御する神経ペプチドの単離と構造解析

本研究は甲殻類の脱皮を制御する内因性の因子を検索、精製、構造決定することを目的に開始された。第1年目は検索のための生物検定法を確立するために、クルマエビとアメリカザリガニを用いてY器管培養やカルシウムの動態を調べる方法などいくつかの方法を試みたが、主に飼育上の問題のために成功しなかった。そこで2年目からはこれまで唯一ワタリガニで化学構造が明らかになっている脱皮抑制ホルモン(MIH)に類似の構造を有する物質を化学的に検索することにした。このホルモンはCHH族ペプチドと呼ばれるペプチド群の一員であり、この族の特徴として分子量が80009300、分子内に3対のジスルフィド結合を有するという点がある。これを指標にしてクルマエビとアメリカザリガニのMIH様ペプチドを検索した。まず、眼柄全体を材料として熱処理、酸抽出、逆相分配前処理、ゲルろ過、2回の逆相HPLCによって精製し、いくつかの可能性あるペプチドが得られたが、それらの配列はMIHのそれと類似していなかった。そこで抽出材料をサイナス腺のみとした。これを食塩水で抽出し、直接HPLCで分離し、すべてのピークについて質量分析を行ったところ、いずれからもCHH族ペプチドと考えられるペプチドが得られた。これらは還元カルボキサミドメチル化すると分子量が約350増加することから可能性が高くなった。配列分析の結果から、アメリカザリガニからは血糖上昇ホルモン(CHH)、およびMIHか卵黄形成抑制ホルモン(VIH)のどちらかではないかと思われるペプチドが得られた。前者についてMIHの活性を調べたところ、5サイナス腺相当量でY器官の脱皮ホルモン合成を約30%抑制することがわかった。また、クルマエビからは類似の配列を有する5種類のペプチドが得られ、既知CHH族ペプチドとの相同性の比較からこれらはすべてCHHと考えられた。また、これら5種類のペプチドは1個体が全部を合成していることがわかった。平成4年度の研究成果は以下のとおりである。1.実験材料としてクルマエビとアメリカザリガニを検討したが、クルマエビは種々の点で実験室内で飼育することが困難であったので、実験はすべてアメリカザリガニを用いて行った。クルマエビは抽出材料として用いることはあり得ると考えられる。2.脱皮間期のザリガニの眼柄を切除すると、両眼柄を切除した個体は612日後に脱皮したが、片方の眼柄のみを切除した個体は脱皮しなかった。このことは眼柄に脱皮抑制ホルモンが存在するという従来からの推定を支持するものである。3.脱皮間期のザリガニに脱皮ホルモンである2D-ヒドロキシエクジソンを注射してその効果を調べたところ、2日間連続して4μgずつ注射すると約80%のザリガニに脱皮を引きおこすことができた。なお、4μg1回の注射では効果はなかった。4.ザリガニのエクジステロイドの産生器官であるY器官を体外培養し、エフジステロイドの分泌量を調べた。3種類の培地を検討した結果、食塩を添加したTCM199培地が最も好成績であった。なお、エクジステロイドの正確な定量法は現在検討中であるが、予備実験の結果から、培養液をn-ブタノールで抽出し、乾固した後、高速液体クロマトグラフィーで分離定量することが可能と考えられる。同様の方法を用いて血液中のエクジステロイド量も定量できるのではないかと考えている。

5.抽出材料としてこれまでにザリガニの眼柄を約1000個集め、20mM塩酸を含む1M酢酸溶液で神経ペプチドを抽出した。現在、この抽出物にY器官のエクジステロイド分泌抑制活性が含まれるかどうかを培養系を用いて検討中である。本研究は甲殻類の脱皮を制御する内性因子を検索、精製、構造決定することを目的に開始した。昨年度は生物検定系を確立することを目指したが、成功しなかった。そこで、今年度はこれまで唯一ワタリガニで化学構造が明らかになっている脱皮抑制ホルモン(MIH)に類似の構造を有する物質を化学的に検索することにした。すなわち、このホルモンはCHH族ペプチドの一員であり、この族の化学的特徴として、分子量8500-9300,分子内に3対のジスルフィド結合を有するという2点がある。この2点を指標にして、クルマエビとアメリカザリガニのMIH様ペプチドを検索した。まず、眼柄全体を材料として、熱処理、酸抽出、逆相分配前処理、ゲルろ過、2回の逆相HPLCを行うことによって、いくつかの候補になるペプチドを質量分析で選び出した。しかし、配列分析の結果、いずれも目的物ではないことがわかった。そこで、今度はサイナス腺を抽出材料して精製した。これを食塩水で抽出し、直接HPLCで分離し、すべてのピークについて質量分析を行った。その結果、いずれの動物からもCHH族ペプチドと考えられるペプチドが得られた。これらは還元カルボキサミドメチル化すると、分子量が約350増加したことから一層その可能性が高くなった。配列分析の結果から、アメリカザリガニからは血糖上昇ホルモン(CHH)およびMIHあるいは卵黄形成抑制ホルモン(VIH)のどちらかではないかと考えられるペプチドが得られた。前者についてMIH活性を調べたところ、5サイナス腺相当量でY器官による脱皮ホルモンの合成と分泌を約30%抑制することがわかった。また、クルマエビからは類似の配列を有する5種類のペプチドが得られ、既知CHH族ペプチドとの相同性の比較からこれらはすべてクルマエビのCHHと考えられた。さらに、これら5種類のペプチドは1個体がすべて合成していることがわかった。
ＡＤＡＭＴＳメタロプロテアーゼによる血管・リンパ管新生研究の新展開

ADAMTS1(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs1)はがんの悪液質に関連する遺伝子としてクローニングされた細胞外マトリックス(ECM)分解酵素である。我々は全長ADAMTS1とプロテアーゼドメインを欠失したADAMTS1(delta-ADAMTS1)の二つのコンストラクトを作成した。Tube formationアッセイでは二つのコンストラクト共に有意に血管新生を阻害した。さらに二つのコンストラクトは共にHUVECの増殖を阻害した。一方、平滑筋細胞や線維芽細胞に対しては阻害効果を認めなかった。同様にフローサイトメトリーによる解析でAnnexin-V陽性細胞数はHUVECで有意に増加していたが、他の細胞では認めなかった。担がんマウスを用いた遺伝子導入治療において、二つのADAMTS1はいずれも抗腫瘍増大効果を発揮した。腫瘍内血管数は有意に減少しており、ADAMTS1治療群では腫瘍内の血管に活性型caspaseのシグナルを認めた。以上より、ADAMTS1はプロテアーゼドメイン非依存的に血管内細胞にアポトーシスを起こし、腫瘍の成長を抑制することが明らかとなった。さらに、アデノウイルスに全長ADAMTS1を組み込み、アデノウイルス治療によるリンパ管内皮細胞(HMVEC-dLy)への効果を検討した。VEGFC刺激したHMVEC-dLyはVEGF-R3のリン酸化を起こすが、アデノADAMTS1はリン酸化を抑制した。またアデノウイルスによりADAMTS1を導入したMDA-MB231乳がん細胞株はコントロールと比べてHMVEC-dLyの遊走を抑制した。ADAMTS1は血管新生・リンパ管新生をそれぞれのメカニズムにより阻害することを明らかにした。24年度が最終年度であるため、記入しない。(1)ADAMTS1各コンストラクトの構築およびタンパク発現解析2種類のADAMTS1コンストラクトを作成した。COS細胞にtransient transfectionし、72時間後に培養上清を回収し、タンパク発現をウエスタンブロッティングで確認した。いずれのコンストラクトも細胞に導入した際に、上清中へリコンビナントタンパクが分泌されていた。(2)血管内皮・リンパ管内皮細胞培養系における阻害効果のメカニズム先の実験でタンパク発現を確認できたので、次に培養ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対してタンパク含有上清を通常の内皮細胞用血清と1:1の割合で添加し、細胞増殖へ与える効果をMTSアッセイにて測定した。次にスクラッチアッセイを行い、内皮細胞の遊走能への効果を検討した。いずれの実験系においても、発現タンパク含有上清は、内皮細胞に対して阻害効果を示した。さらに、アポトーシスのマーカーであるAnnexin Vの発現を検討したところ、発現タンパク含有上清を添加した際に、Annexin V陽性細胞が増加することが明らかとなった。(3)マトリジェルでの血管新生への効果当初は担がんマウスを用いての腫瘍血管新生を検討することを予定していたが、まず初年度はマトリジェルを移植した担がんマウスモデルを利用し、リポフェクション法にて遺伝子導入を行い、各コンストラクトの血管新生阻害を検証した。マトリジェルをそれぞれ摘出し、内部の血管新生を検討したところ、二つのコンストラクト共に、血管新生を抑制していた。引き続き担がんマウスモデルで解析を行った。連携協力者として以下の者が参加した。岡山大学・大学院医歯薬学総合研究科三好亨岡山大学・医学部大月孝志岡山大学・大学院医歯薬学総合研究科稲垣純子ADAMTS1(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs1)はがんの悪液質に関連する遺伝子としてクローニングされた細胞外マトリックス(ECM)分解酵素である。ほぼ予定通りの実験を行い、一部は予定を上回る状況である。リンパ管新生への効果を検証するために、VEGF-CおよびVEGFR3への作用を検討する必要がある。
大質量原始星の進化経路の特定及び解明を目指した、周期-光度関係の観測的検証

太陽程度の星より1桁以上重たい大質量星の進化、特に若い段階(原始星)における経路の解明、及びそのために重要な原始星表面における質量降着率の観測的導出法の確立を目指す。そこで、理論提唱されている大質量原始星の脈動不安定(周期的に明るさが変動)モデル、及びそのモデルから予言される周期-光度関係に着目する。本研究では、周期-光度関係の観測的な検証と確立を目指し、6.7GHzメタノール分子のメーザー放射が示す周期的な強度変動の系統的探査の完結と、22.2GHz水分子のメーザー放射を用いた周期変動天体に対する年周視差計測による天体距離と光度の高精度な決定を目指す。
新規アロステリックホスト化合物の合成と機能性に関する研究

本研究により平成7年度から平成9年度にわたり得られた成果は次の通りである。1).ピリジン環を母核とし、二本のクラウンエーテル鎖とその先にβ-ジカルボニル部位を有するホスト化合物を合成し、これらホスト化合物と金属イオンとが鎖形成をすることを明らかにした。また、鎖形成によって生成したキャビティに第二金属イオンを包摂させることに成功し、このホストがアルステリックホストとしての機能性を有することを明らかにした。2).アザクラウンエーテル環を積層させたビスジアザクラウンエーテルを合成し、このホスト化合物にα,ω-ジカルボン酸ジカリウム塩を包摂させた。液-液抽出能はなかったが、溶液中で二つのアザクラウン環がカリウムイオンを包摂すると、カルボキシレートイオンとの静電引力によってトランス体からシス体に構造変換し、この結果ジカルボン酸を包摂できるようになる、いわゆる、アロステリックホストとしての機能を有することが、^<13>C-NMRデータによって明らかになった。3).ベンゾスピロピランはホトクロミック材料として知られているが、フェノキシ環の代わりにオキシキノリン環を有するスピロピランを合成し、この化合物が金属イオン水溶液と接触さっせることによって開環し、金属イオンを取り込み、新規なアロステリックホスト化合物としての機能を有することを明らかにした。4).超原子価ヨウ素化合物、フェニルエチニルフェニルヨードニウム塩とアミン類との反応により、従来生成が比較的困難なエチニルアミン化合物を直接、一段階で合成する新規合成法を見出し、これを応用してフェニルエチニル基を持つ大環状ホスト化合物の合成を行った。この環状化合物は新しいアロステリックホスト化合物として期待される。本研究における平成7年度の研究実績は次の通りである。1)ピリジン環を母核とし、二本のクラウンエーテル鎖とその先にβ-ジケトンウイングを有するホスト化合物の合成と、これらホスト化合物と金属イオンとの錯形成によって生成したキャビテイに、第二金属イオンを包接させることに成功し、アロステリックホストとしての機能性を有することが証明された。現在論文投稿準備中である。2)超原子価ヨウ素化合物、フェニルエチニルヨードニウム塩とアミンとの反応により直接エチニルアミン類を合成する新規合成法を開発した。この方法を応用してエチニルアミノ基とクラウン鎖を有する新規ホスト化合物の合成に成功した。本合成法も論文投稿中である。この新規ホスト化合物はアルカリ金属イオンとともにそのカウンターイオン(有機物アニオン)も同時に包接可能なホスト化合物としてデザインされており、現在包接能について調査中である。3)複数のアザクラウンエーテル環を積層させたホスト化合物を新たに合成し、このホスト化合物についてα,ε-ジカルボン酸金属塩を塩のまま包接させる実験が進行中である。4)ピリジン環を母核とし、このポリエーテル鎖とその先にカルボン酸残基を持つホスト化合物を合成した。これにホスト化合物に各種の金属イオンを捕捉させたところ、鉛イオンに対して特異性が示された。そこでさらに各種の置換基を持つジカルボン酸ホストを合成中である。本研究における平成8年度の研究実績は次の通りである。1).1-アザ-18-クラウン-6および1-アザ-15-クラウン-5を一本のアームで結合させ、ビス-アザクラウンエーテルを合成した。アームとしては-(CH_2)_n-(n=4,6)および-(CH_2)_n-C_6H_4-(CH_2)_n-(n=1-3)などである。

これらホスト化合物に対して、ジカルボン酸としてマロン酸、1,1-ジベンジルマロン酸、テレフタル酸、p-ヒドロキノンなどのカリウム塩を包接させたところ、水溶液中およびメタノール/水系においては二つのアザクラウン環の間にこれらジカルボン酸のカリウム塩が包接されていることが、^<13>C-NMRスペクトルにより確認され、アロステリックホスト化合物としての機能を有することが示された。2).これらの包接体は、液-液抽出により有機溶媒に移行するほどの安定性はないことが判明したので、更に1,10-ジアザ-18-クラウン-6に上記アームを反応させ、クリプタンドとし、カリウムイオンと共にそのカウンターアニオンも同時に包接するかどうかについて調査中である。現在までのところ、クリプタンドについてはp-ヒドロキノンのジカリウム塩において液-液抽出が可能であることが判明している。他の金属塩ではナトリウム塩が同様な結果をしめしている。本研究における平成9年度の研究実績は次の通りてある。1)アザ-18-クラウン環を合成し、この分子の窒素原子にジカルボン酸塩化物を反応させ、ジアミドとし、これを還元して二つのアザクラウン環を有するビスアザ-18-クラウン-6を合成した。また、このウイングにベンゼン環を持つビスアザクラウンも同様にして合成した。更にジアザクラウンの二つの窒素原子に二本のウイングをつけ、クリプタンドを合成した。2)ビスアザクラウン、クリプタンドをそれぞれホストとして用い、2,2-ジベンジルマロン酸ジカリウムおよびテレフタル酸ジカリウムをゲストとして、メタノール/塩化メチレン中で包摂実験を行った。液-液抽出はできなかったが、溶液中の^1H-NMRおよび^<13>C-NMRからカリウムイオンがアザクラウン環に包摂され、ジカルボン酸アニオンが二つのアザクラウン環の間に包摂されていることがわかった。この結果、ジアザクラウンはアロステリックホストとしての機能を有することが示された。3)アロステリックホスト化合物の一つとしての金属イオン輸送を試みた。キノリン環を有するスピロピランを合成し、Cu(II)イオンの液-液輸送を明らかにした。またCu(II),Zn(II),Pb(II),Ni(II),Ca(II)イオンを混合させた水溶液を水層(I)とし、スピロピランのジクロロメタン溶液を間にはさんで、他方に酢酸水溶液を接触させ、イオン輸送を行ったところ、Cu(II)イオンのみが選択的に輸送され、他は輸送されない事が判明した。