hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
写真法で客観測定した食事時刻・栄養摂取とサーカディアンリズムに関する疫学研究

近年、時計遺伝子の発見など時間生物学の発展により、糖・脂質代謝のサーカディアンリズムの存在が明らかになり、同じ量の栄養摂取でも摂取する時刻や摂取パターンによって肥満や脂質異常症の発症リスクが異なることが動物実験で示されている。しかしヒトでは食事摂取のパターンの違いが及ぼす長期健康的な影響は不明な点が多い。生体リズム異常と健康の関連は、動物実験やコントロール下でのヒトの生理学実験が多数報告され、メカニズムの解明が進んできているが、日常生活下における食事状況と生体リズム異常、疾病発症など長期的な健康影響についての研究は乏しい。申請者らはこれまで実生活化で曝露する温度や光曝露を実測するコホート研究を確立し、血圧日内変動、身体活動量、メラトニン分泌量といった生体リズム指標や肥満、睡眠障害、うつ症状との関連を報告してきた。本研究の目的は、写真法によって正確に把握した食事時刻や絶食時間の実態を明らかにし、メラトニン分泌量などの生体リズム指標、肥満、糖尿病、脂質異常症、うつ、不眠症の有病割合との関連を明らかにすることである。平成30年度は、40歳以上の一般住民500名を対象に、写真法を用いた食事調査(食事時刻、夜間絶食時間)に加えて、生体リズム指標(尿中メラトニン、アクチグラフで測定した身体活動量リズム、手首皮膚温リズム)、生体リズム関連疾患(糖尿病、脂質異常症、肥満症、うつ症状の有病割合、主観的・客観的睡眠の質)について測定を実施できた。平成30年度は、市町村や県、地域のスポーツクラブと連携して対象者の募集を行った。応募者には参加説明会を開催し、生活習慣病予防の重要性に関する情報提供に加えて、本研究の主旨について説明を行い、書面での説明と同意を得て実施した。本研究は、奈良県立医科大学医の倫理審査委員会の承認を得て実施している。毎週約30人ずつ日程調整を行い当初計画よりやや多く、500名に対する測定を完了できたことから、おおむね順調な進捗と考える。次年度以降は食事写真、生体リズム指標、肥満、睡眠、うつ症状などの測定を進めることと合わせて、すでに入手した食事写真から食事摂取時刻や絶食時間の分析を開始する。分析を行うために、統計解析ソフトを購入する予定である。令和3年度には、合計700名のデータを基に、夜間絶食時間の連続値や四分位群と、生体リズム指標、肥満、睡眠障害、うつ症状との関連についての単変量に加えて、性・年齢・飲酒・喫煙・服薬・糖尿病や高血圧・慢性腎臓病といった慢性疾患の有病などの交絡因子の影響を調整した変量モデルによる分析の結果を学会・論文発表を行う予定である。平成31年度から開始する分析にあたり、統計解析ソフトを購入するために、平成30年度予算を繰り越すこととした。
ヒト組み換えタンパク質の発現系を応用した新規歯周組織再生補填剤の開発

本研究は、セメント芽細胞が分泌する細胞外マトリックスの組み換え蛋白質を作製し、従来困難であった結合組織性再付着を人為的に獲得できる補填剤の開発を試みることである。そこで我々はセメント質に存在する代表的な細胞接着因子である骨シアロタンパク質を実験モデルとしてヒトセメント質マトリックスの発現系を確立し、セメント質形成をin vitroおよびin vivoにおいて誘導するかを解析することを主眼とした。ヒト歯胚よりヒト骨シアロプロテインのcDNAをクローニングし大腸菌およびバキュロウイルスを用いた2種類の発現システムでヒト組み換え骨シアロプロテイン(rhBSP)の作製を試みた。その結果、rhBSPは大腸菌ではその発現が認められないものの、バキュロウイルスで感染させたSf9細胞内で65kDaおよび60kDaの2種類の分子量サイズでrhBSPの発現が認められた。rhBSP発現細胞を溶解し陰イオン交換樹脂とcobalt affinityカラムchromatographyを行った結果、rhBSPは65kDaおよび60kDaのタンパク質として精製された。次にrhBSPの生理活性を調べる目的で、半田らが樹立したウシ歯小嚢細胞に対し細胞接着活性を調べたところ、期待通り活性を有することが確認された。この歯小嚢細胞はセメント質形成能を有する特性があることから、rhBSPが細胞接着を介してセメント質形成に関与する創薬として開発可能なことを示した。現在は昆虫細胞用改良型高発現ベクターを用いてstable transfectionを行い、rhBSPを発現するcell lineを作製し、大量精製システムを開発中である。以上の結果から、rhBSPはバキュロウイルス発現系を用いて作製できる事が示された。また歯小嚢細胞に細胞接着活性を有することから歯周病治療用再生補填剤として開発可能である結果が得られた。我々は新たな歯周病再生治療の開発のため、ヒトセメント質構成成分である骨シアロタンパク質(BSP)の組み換え蛋白質を作製し、新規補填材として開発可能か否かを検討する実験計画を立案した。今回我々は翻訳後修飾された組み換え蛋白質の大量発現が可能なバキュロウイルス発現系を用いてヒト組み換えBSPの発現を試みた。第一段階として神奈川歯科大学付属病院に来院した患者より採取した発生期永久智歯歯胚からRNAを抽出し、ヒトBSPcDNAをPCR法でクローニングした。増幅されたPCR産物をTAベクターにサブクローニングを行ない、DNA配列を解析し得られたヒトBSPcDNAのDNA配列が既知のと同一であるか否かを確認した。次にヒトBSPcDNAを基にバキュロウイルスベクターを作製し、昆虫細胞であるsf-9に遺伝子導入を行ないヒトBSPの発現を試みた。その結果ヒトBSPは分子量55kDaおよび60kDaの蛋白質として発現されることが確認された。得られたヒトBSP組み換え蛋白質の生理活性を調べるため、遺伝子導入した昆虫細胞より蛋白質を精製しウシ歯小嚢細胞に対する細胞接着活性試験を行うと、ヒトBSP組み換え蛋白質は有意に高い細胞接着活性を示した。これらの結果よりバキュロウイルス発現系はヒトBSP組み換え蛋白質の作製に適したシステムであることが確認された。平成13年度は大量発現および細胞接着活性をコントロールするアミノ酸配列に対する変異体を作製し、BSPのセメント質形成へのさらなる関わり合いをin vitroおよびin vivoの実験系で解析し、歯周病補填材への開発への可能性を検討していく予定である。昨年度までの研究で、我々は組み換えヒト骨シアロタンパク質(rhBSP)の作製をバキュロウイルス発現システムで行い、Sf9細胞内で65kDaおよび60kDaの分子量サイズで発現することに成功した。またcobalt affinity chromatographyを用いて精製したrhBSPは、ウシ歯小嚢細胞に対し細胞接着活性を有することも確認し、rhBSPが創薬として開発可能なことを示した。

しかしこの発現系ではrhBSPの高収量は望めないため、本年度は高発現を目的とした新たな発現システムの開発に取り組んだ。まずrhBSPは細胞を用いた系では発現が低いと考え、大腸菌と小麦胚芽の無細胞抽出分画を用いin vitro translationを試みた。結果は両実験系共に充分な発現は認められなかった。そこで次にrhBSPのDNA配列に発現を抑制する配列があると考え、ラット骨肉腫細胞株で発現が確認されているN末、C末の一部が欠落したBSP fragment 1をヒトcDNA配列に基づき作製し、バキュロウイルス発現システムおよびin vitro translationにてその発現を試みた。しかし今実験でも高発現は得られなかった。一方我々は同じfamilyに属するヒトオステオポンチンをバキュロウイルス発現システムで高発現に成功しているところから、rhBSPのcDNAが発現困難な配列を有していることを予想した。そこで昆虫発現用ベクターでプロモーターにエンハンサーを組み込んだ改良型高発現ベクターを用いてrhBSPの発現を試みた。結果は予想通り従来型ベクターと比較して、transient transfectionの状態で約10倍以上発現が観察された。現在はstable transfectionを行い、rhBSPを発現するcell lineを作製中である。今後は大容量のrhBSPの精製システムを確立し、歯周病実験モデルに応用し、評価する予定である。
臍帯血由来ヒト間質系幹細胞の無血清大量増幅法の開発と臨床応用のための基礎的検討

我々は、臍帯血と同様に、従来廃棄されてきた、胎生期由来の組織である胎盤にも、未分化な幹細胞が含まれているのではないかと着想し、その細胞療法や再生医療への臨床応用の可能性について検討した。母親の同意を得た後、出産時に分娩された胎盤から分離された細胞を、約4週間培養することにより、間質系幹細胞の樹立に成功した。樹立された間質系幹細胞は、フローサイトメトリーでは、従来の報告と同様に、CD45low、CD31-、AC133-CD54+、CD29+、CD44+であった。また、PCRによる検討では、幹細胞マーカーであるOct-4、Rex-1、血液/内皮系細胞マーカーであるHoxB4、GATA-2、CBFβ、TAL-1、CD34、flk-1、flk-1、Tie-2、心筋マーカーであるGATA-4、腎臓マーカーであるrenin、骨格筋マーカーであるmyogeninnestin、神経系マーカーであるGFAP、肝細胞マーカーであるα-1-fetoprotein、膵細胞マーカーであるamylaseを発現していた。さらに、これらの胎盤から樹立された間質系幹細胞は、培養条件をかえることにより、骨細胞や脂肪細胞に分化する能力を有していた。以上の結果は、従来廃棄されてきた胎盤の中には、間質系幹細胞が含まれていることを示しており、胎盤は、種々の細胞療法や再生医療に応用可能な細胞の供給源となり得ると考えられた。
脳卒中再生医療時代の新たな機能低下予防介入を目指して：末梢神経機能評価への着眼

脳卒中は後遺障害を残す可能性が高く、本邦の要介護予防のためには再発予防および発症後の後遺障害の予防が極めて重要である。脳卒中による麻痺の中で下肢麻痺は特に歩行障害を引き起こして患者の日常生活動作(以下、ADL)の低下と要介護状態の主要要因となる。そのため脳卒中患者の歩行障害の予防と改善に関するリハビリテーションが大きな課題の一つとして取り扱われている。脳卒中患者の末梢神経機能を標準化された計測により評価し、機能低下に関連しうる要因を検討することを本研究の目的とした。脳卒中患者の中で「片麻痺の有無」を問う質問に回答し、調査に同意を得られた61名を対象(分析対象肢数は122肢)とした。分析対象者を年代別(60歳以下、61-70歳、71-80歳、81歳以上)に分け、腓腹神経活動電位振幅(96肢)、腓腹神経伝達速度(95肢)との関連を検討した。加齢によって振幅は縮小する傾向が認められた(p=0.001)。速度に関しても高齢になるに伴い速度は低下することが示された(p<0.001)。麻痺側肢・健側肢間において振幅および速度の統計学的に有意な相違は認められなかった。麻痺保有者と非保有者と比較してリハビリの実施割合が高かった(それぞれ64%、36%、p<0.001)。平成28年度から実施する片麻痺を有する脳卒中患者調査のために、平成27年度は末梢神経機能評価に用いる神経伝導検査装置DPNチェックを購入し、分担研究者が測定方法のレクチャーを受けた。また、近畿圏の脳卒中診療病院のうち、協力の得られる医療機関の実務担当者と数回にわたり打合せを行い、調査内容の再検討および調査票の修正、プロトコールの再確認等、円滑な調査の遂行のための準備を行った。併せて、本課題に関する倫理審査を所属機関の倫理委員会に申請し、研究の実施についての承認を得た。当初予定では平成27年度中に患者調査の一部を開始する予定であったが、主任研究者の産休および育児休業のため、調査協力機関との調整や調査員の確保への着手に遅れが生じた。そのため調査の開始が当初予定より遅れて、平成28年度6月以降となった。平成28年度は研究協力医療機関において、外来通院中の脳卒中患者62名(男性44名、女性18名)を対象として左右下肢の末梢神経機能評価および背景因子の質問紙調査を実施した。対象者の年齢は20歳台80歳台であり、計124肢測定中25肢が測定不能、99肢について評価がなされた。測定不能であったのはいずれも50歳以上の対象者の肢であり、その頻度は全体で20%(124肢中25肢)、性別では男性19%(88肢中17肢)、女性22%(36肢中8肢)であり、性差は認めなかった。年齢階級別には、50歳台10%(10肢中1肢)、60歳台26%(50肢中18肢)、70歳台21%(48肢中10肢)、80歳台8%(12肢中1肢)であった。一般集団においても腓腹神経の走行異常が存在するため、測定不能者が一定頻度で出現することは予測される。しかしながら、今回の調査集団での測定不能頻度は高く、また、測定不能者について性差や年齢による一定の傾向があるとは考えにくい。測定不能の考え得る理由としては、測定部位の皮膚の乾燥や筋力・皮下脂肪の減少などがあるが、その影響は現段階では不明瞭である。当初予定では平成27年度に約25名、平成28年度に約50名、計75名程度の調査を実施する予定であったが、調査協力医療機関における外来通院脳卒中患者数による制約のため、62名の調査実施数となった。脳卒中は死亡を免れても後遺障害を残す確率が高く、本邦の要介護予防のためには脳卒中発症予防及び発症後の後遺障害の予防が極めて重要である。一旦病巣が形成された脳卒中患者の多くは麻痺や言語障害などの後遺障害を残し、慢性期に再発を繰り返すなどで日常生活動作(ADL)が低下し、やがて要介護状態、死亡に至る場合が多い。特に下肢麻痺は歩行障害を引き起こしてADL低下と要介護状態の主要因となるため、看護学・理学療法学領域の研究および臨床において、脳卒中リハビリテーション、特に歩行障害の予防と改善に関するリハビリテーションが大きな課題の一つとして取り扱われている。脳卒中治療の発展の可能性として再生医療による中枢神経再生が挙げられるが、再生医療による歩行障害の改善のためには歩行等の機能に関連する末梢神経が健全であることが必要であり、脳卒中患者の下肢末梢神経機能評価が必要と考えた。平成29年度は前年度に引き続き、外来通院中脳卒中患者を対象に標準化された計測方法により脳卒中患者の末梢神経障害の有無を評価した。その結果、麻痺を有さない患者の神経伝導速度は53.4±5.28(R)、52.8±5.58(L)であった。右片麻痺を有する患者では52.8±3.99(R)、50.00±11.97(L)、左片麻痺を有する患者では51.2±5.78(R)、50.3±4.37(L)であった。麻痺側と健側の神経伝達速度に統計学的に有意な相違は認めなかった。データ収集に時間を要したため、解析およびデータ公表に遅れが生じた。

脳卒中は後遺障害を残す可能性が高く、本邦の要介護予防のためには再発予防および発症後の後遺障害の予防が極めて重要である。脳卒中による麻痺の中で下肢麻痺は特に歩行障害を引き起こして患者の日常生活動作(以下、ADL)の低下と要介護状態の主要要因となる。そのため脳卒中患者の歩行障害の予防と改善に関するリハビリテーションが大きな課題の一つとして取り扱われている。脳卒中患者の末梢神経機能を標準化された計測により評価し、機能低下に関連しうる要因を検討することを本研究の目的とした。脳卒中患者の中で「片麻痺の有無」を問う質問に回答し、調査に同意を得られた61名を対象(分析対象肢数は122肢)とした。分析対象者を年代別(60歳以下、61-70歳、71-80歳、81歳以上)に分け、腓腹神経活動電位振幅(96肢)、腓腹神経伝達速度(95肢)との関連を検討した。加齢によって振幅は縮小する傾向が認められた(p=0.001)。速度に関しても高齢になるに伴い速度は低下することが示された(p<0.001)。麻痺側肢・健側肢間において振幅および速度の統計学的に有意な相違は認められなかった。麻痺保有者と非保有者と比較してリハビリの実施割合が高かった(それぞれ64%、36%、p<0.001)。先に記したように、平成27年度に予定していた患者調査の開始に遅れが生じた。しかしながら、平成27年度に調査協力機関の内諾を得て調整を行うとともに、今年度中に予定数の調査を実施すべく調査員の確保した。今後はこれらの調査員に対して、脳卒中患者の末梢神経機能評価および新たな介入方略開発のための基礎資料を提供しうる科学的信頼性確保の観点から、測定についての研修を実施する。本研究の遂行に関しては平成27年度中にすでに倫理委員会の承認を得ており、実務面での微調整および測定の標準化が完了次第、調査を開始する予定である。したがって、今年度中には昨年度生じた研究の遅れは回復されると考える。平成29年度は当初予定数に加えて、今年度までの調査で不足している分を加算した約40名の調査を平成28年度とは異なった協力医療機関において実施する予定である。また、神経脱落の程度およびその関連要因に関する分析を実施し、得られた成果を学会等において公表すると共に、調査協力医療機関および調査参加者、一般市民へ公開する。平成30年度は収集されたデータをもとに詳細な解析を実施し、その成果を公表する予定である。当初予定では平成27年度にに患者調査の一部を開始することとなっていたが、調査員の確保等の遅れにより、調査の開始が平成28年度にずれ込んだ。そのため、現地調査に係る費用(入力用端末の購入や交通費、人件費等)の使用がなされなかった。当初予定では平成27年度平成28年度で約75名の調査を実施する予定であったが、調査協力医療機関に外来通院する脳卒中患者数の制約から、62名の実施数となった。そのため、現地調査にかかる費用および調査結果のデータベース化等にかかる費用の一部が使用されなかった。データ収集に時間を要したため、分析および成果公表等にかかる経費を次年度に繰り越す必要が生じた。平成28年度は、平成27年度に実施予定であった患者調査を開始するため、平成27ー28年度計画に挙げていた現地調査に係る費用(入力用端末の購入や交通費、人件費等)、ならびに情報袖手や学会発表などに要する費用が使用される予定である。平成29年度は調査協力医療機関を拡充して調査が実施されるため、平成28年度に計上していた現地調査に係る費用並びに学会発表、成果の社会への還元に要する費用が使用される予定である。
中世にみる女性教育と基礎教養の研究

平成16年度平成18年度研究期間中の研究成果の概要は以下のとおりである。(1)平成1214年度科学研究費の交付を受けた研究課題「女訓書の研究」の成果である『女訓抄』(平成15年・三弥井書店)を手掛かりとして、中世期における女訓書創造の営みがどのような思想的背景のもとになされたかについて考察し、その内容を論文化した。(2)『月庵酔醒記』輪読会において、同書所載の「仮名教訓」の諸本調査およびその内容の検討を行い、女訓に留まらない室町末期の教訓と教養のありかたを明らかにし、論文化した。(3)中古から中世に至る物語に描かれた「世の中」を教育という観点から考え、女訓書を読むことの意味について口頭発表を行った。(4)平成19年4月、「中世の文学」の一冊として『月庵酔醒記(上)』を三弥井書店より刊行。足利晴氏・義氏に仕え、古河公方の重臣であった戦国武将、一色直朝(月庵)が記した雑話集『月庵酔醒記』の注釈作業に関して、担当箇所の校訂本文の作成および、頭注・補注を執筆した。具体的には、『月庵酔醒記』上巻の佐藤嗣信に関する挿話と、節用集的内容である「須弥四州名」から「人歳之名」までの46項目である。なお現在、続く中巻の原稿作成中である。(5)平成21年度刊行予定『伝承文学全注釈叢書女訓抄』(三弥井書店)の注釈作業。平成18年11月より、『大東急記念文庫善本叢刊』所収の寛永16年古活字版を底本とし、穂国文庫本・寛永19年整版本・大阪女子大学写本との校合のもと校訂本文を作成。「本文」「注釈」「補注」からなる全注釈形式にて、「序」「第一四倒八苦」の原稿を執筆し、現在「第二五障三従の事」の原稿を作成中である。本年度の成果は以下の通りである。1,平成12年14年度科学研究費の交付を受けた研究課題「女訓書の研究」の成果である「女訓抄」(2003年・三弥井書店)を手掛かりとして、中世期における女訓書創造という営みがどのような思想的背景のもとになされたのかについて考察し、その内容を論文にまとめた。具体的には、応永28年浄土宗鎮西派の聖聡が『往生要集』「大文第一厭離穢土」「大文第二欣求浄土」の解説を試みた「厭穢欣浄集」との比較を通して、「女訓抄」の作品世界の枠組みを明らかにした。さらに十章という章段数および説話を集成する性格の類似から「十訓抄」を、中世期の教育書という点から『世鏡抄』をそれぞれ取り上げ、『女訓抄』と比較することで、中流の家女に向けての教訓の内実が他の作品といかに関わるのか、前提となる男女観とともにそこに伺われる時代相を論じた。2,『月庵醉醒記』輪読会において、同書所載のいわゆる「仮名教訓」の諸本調査およびその内容の検討を行い、女訓に留まらない室町末期の教訓と教養のありかたについて、その一端を発表した。3,内藤記念くすり

博物館にある大同薬室文庫にて、室町末期の諸資料を中心に、中世期の基礎教養のありかたを伺わせる資料および女訓に関する新資料の発掘を目指して調査継続中である。本年度の研究成果は以下の通りである。一色直朝が記した中世の雑話集で「戦国の空白期を埋める貴重な資料」(鈴木棠三『古典文庫』解説)と評される『月庵酔醒記』の注釈作業に関わることで、主に次の2点を中心に研究を進めた。1,『月庵酔醒記』に収められた「御文十箇条」という婚家での心得や処世訓を箇条書きにした一通の仮名文を取り上げ、その成立事情と文化的背景を推測した。すなわちその内容は、室町末に成立したとされ以降の女訓書にも大きな影響を与えた『仮名教訓』にほぼ重なるものでありながら、他の類書には見慣れない授受の状況に関する一文を有する。この一文と教訓の内容から、そもそも「御文十箇条」は公家の娘が武家に嫁ぐ際に贈られた教訓であること、その背景には、公家と武家、それぞれの文化的背景の違いが垣間見えることを、同時代に武家の娘向けに書かれた女訓書『幻庵覚書』との比較検討を通して論じた。2,平成18年度刊行予定『中世の文学月庵酔醒記』(三弥井書店)の担当箇所について、本文校訂と頭注・補注の執筆を担当した。具体的には、『月庵酔醒記』上巻の佐藤嗣信に関する挿話と、「須弥四州名」から「人歳之名」までの46項目である。嗣信関連説話については、地方に展開した禅宗僧侶の活動に関わるものとして、また、月の異名、ものの異名については、節用集との関わりから中世後期の基礎教養の内実を窺わせるものとして、次年度さらに調査検討を加えたい。(1)足利晴氏・:義氏に仕え、古河公方の重臣であった戦国武将、一色直朝(月庵)が記した雑話集「月庵酔醒記」の注釈作業に関する研究成果。・2007年刊行『中世の文学月庵酔醒記(上)』(三弥井書店)の担当箇所ついて、校訂本文の作成および、頭注・補注を執筆した。具体的には、『月庵酔醒記』上巻の佐藤嗣信に関する挿話と、節用集的内容である「須弥四州名」から「人歳之名」までの46項目である。その研究成果は、中世後期における<知>の全体像とその蓄積・継承といった教育的営為の解明に寄与するものである。・『月庵酔態記』中巻に収められ「男女のうはさ」と題された六項からなる一群を手掛かりとして、『月庵酔態記』にみる中世末期から近世初期にかけての過渡的性格と世俗性について論じた。具体的には、六項の最初に置かれた「二条殿の御文十箇条」中の妻に向けて夫に対する態度を説いた第四条に注目し、つづく二つの説話、仮称「たヽらのなにがし」の話と「家とうじふたりもたるおとこ」の話を「りんき」の観点から考察し、そこに説かれた室町末期の武家にとっての望ましきありかたを論じた。(2)2009年度刊行予定『伝承文学全注釈叢書(第一期)女訓抄』(三弥井書店)の注釈作業に関する研究成果。・2006年11月より、『大東急記念文庫善本叢刊』所収の寛永16年古活字版を底本とし、穂国文庫本・寛永19年整版本・大阪女子大学写本との校合のもと校訂本文を作成。・「本文」「注釈」「補注」からなる全注釈形式にて、「序」「第一四倒八苦」の原稿を執筆し、現在「第二五障三従の事」の原稿を作成中である。
機能画像を融合した日本人脳回脳溝図譜の臨床応用開発

高磁場MRIを使用し、脳内白質線維走行の描出(拡散テンソル画像)及び脳機能の描出(機能MRI)を通じ脳表3次元画像における脳溝(sulci)及び脳回(Gyri)の命名を行った。このデータを基に疾患脳(皮質形成異常脳、腫瘍脳など)の解析をすすめ、健常脳との比較検討を行い、脳形成におけるメカニズムの解明に貢献すると共に、脳機能回復を目指した臨床活用に大きく寄与した。白質データの入手に向けての健常人脳データ取得に関して学内倫理委員会での承認を得た(東京女子医科大学倫理委員会承認番号1955号)後に日本人健常脳収集に向けた準備を行った。白質線維のネットワークに関しては、現在東京大学と共同研究を開始し、専用ソフト(FSL及びDTI tool)を入手し従来のDeterministic methodで十分描出できなかった範囲の白質線維描出能力改善できる可能性をもつProbabilistic methodを導入した解析を行っている。現在、テスト用としての正常脳撮影データについて6名分収集し、一般正常人に運用できるようなシミュレーションを開始しており、6軸と30軸の撮影比較検討し最適な軸数の決定とtracking技術の迅速化を図っている。購入した研究用コンピュータに導入され、データ解析が加速している。また、26-27年度で神経線維のTrackingをMedINRIA(Tract解析ソフト)で臨床脳に活用予定であるが、実際の使用前評価を24例のグリオーマ症例のFA解析で試用開始して実際の臨床症状や検査所見と比較し、結果との比較において一定の評価を得た。平成27年度は、臨床応用を本格化させた。運動野、言語野及び視覚野近傍に位置する病変を持つ患者の術前における機能評価画像としてトラクトグラフィについて、脳腫瘍病変について6軸撮影されたDTI解析を55例に、32軸撮影画像は8例を対象とした。運動野については主として下肢線維を、言語野は弓状束・上縦束を、視覚野は視放線の神経白質線維走行を予測し、覚醒下開頭術中に神経症状の確認を行い白質神経の局在と共に機能評価を実施した。また、術前言語課題タスクについてfMRIを用いた機能評価は16例について実施され、覚醒下手術を受けた患者の皮質マッピングに応用されマッピング時間の短縮、言語優位側の推定に有用と考えられDTI画像解析とあわせた評価としての臨床応用が加速した。これらの機能画像は術前MRIを脳溝や脳回の詳細な解析に基づき照らし合わせており、Preoperative MRI-based delineation of the sulcal and gyral anatomy and its usefulness for glioma resectionin neurosurgeryでのProceedingとして国際コンピュータ外科学会で報告がなされた。脳機能マッピング手法を正確に術中画像に反映させる手法や、術前白質機能画像を術中画像に重畳させる手法を組み合わせることにより、術中画像を含めた臨床応用まで高めることができた。疾患脳解析については、共同研究先であるNeurospinを通じてDystoniaの日本人脳解析について解析がまとまり論文化準備が整った。皮質形成異常脳における解析報告に、国際共同研究がDystoniaについても研究実績として加わる結果となった。構造解析、機能解析に必要なMRIデータ収集が軌道にのり、解析が加速したため、昨年度からの進捗の遅れをカバーしているため。論文化については現在投稿段階のものが多いため、当初の計画通りとしてH27年度での研究成果発表の加速化を図ることが更なる目標である。脳神経外科学、MRI画像解析、定位放射線外科収集されたDTI画像の解析を進めると共に、撮像方法の変更による白質線維の詳細化を試み、より臨床結果に近い術前評価につなげることを目指す。正常脳MRI解析についてもDystonia脳解析と十分な比較検討を行うことでより脳モデルの開発に近似した標準データとしてまとめ上げることが必要と考えている。臨床応用を今まで以上に確実にし、実際の手術室での機能確認での実証を加速させる。MRI撮像シークエンス設定についての最適化を行い、正常脳収集をスタートさせている。正常脳の解析必要数は50名以下で行えると判断したため、確実に収集できるボランティアの獲得に努める。50名の収集予定のためのMRI撮像シークエンスの設定の最適化が十分に進んでいないため、迅速なパラメータの設定を早急に行う必要がある。ただし、神経線維描出及び解析に十分な正常脳については50名以下で行える可能性があるため、早急な検討と同時にデータ収集、さらにT1WI画像との融合作業を行うようにする。皮質形成異常患者と共に、Dystonia疾患脳解析を進めることで、病態解明に向けての研究がすすむ可能性が見込まれるため、小児科連携と同時に国際情報交換をさらに加速させる。DTI画像を白質線維描出及び解析の重要な位置づけとして捉え、正常脳MRI解析と疾患脳解析の両方に画像活用し、脳神経外科臨床応用を実現させる。特に臨床応用を確実なものとするため、実際の機能確認をとおしての実証をすすめることが急務と考えている。正常脳のMRI解析から疾患脳MRI解析への橋渡しのための研究を加速させる。

皮質形成異常患者の診断及び治療に難渋している小児科領域と共同研究に向けた取り組みを行い、病態解明と共に診断治療に応用するプロジェクトを立ち上げる予定である。白質線維の描出と術前評価は特にグリオーマ症例について臨床応用としての成果が期待され、実際の臨床症状と合わせた解析を進める。機能構造が形態に影響していることの実証としては海外共同研究者と共に国際情報交換をより活発化させる。具体的には、Dystonia患者解析について研究合意が得られているため今後MRIの解析を進めることが可能である。神経線維の画像活用についても広く脳外科領域に普及させることで、より研究をアピールするようにする。上記の臨床応用についてはそれぞれが、実際の手術や治療手技に応用し反映されると共に実証が可能である。症例数の蓄積により、より確実な手技の提供と共に今後の脳神経外科に対する発展が見込まれるため、継続した取り組みが必要と考えている。臨床用MRI画像収集に時間がかかり、打ち合わせの回数が一回となったこと。また、非常に多くのデータ処理に必要なコンピュータ購入の時期が遅れたため。研究解析に必要な解析機器の購入を前半に行い、打ち合わせを年度後半に1-2回集中させて研究を加速させる。研究協力者へのMRI撮影数が増えると予想されるため、適正な謝金の拠出を行うと同時に、研究手法の中心的な議論をまとめる必要から海外研究協力者へのより綿密な打ち合わせに研究費の使用を予定している。特に解析ソフト開発者との交流にはFranceにあるNeurospinのMangin氏と、機能外科や発達に関する研究デザインの打ち合わせについてはMarseilleのRegis氏と積極的に意見交換を行うようにする。また、データ管理及び解析に関する適正な使用、論文化や成果報告にも前年度と同様、活発に行うようにする。
光触媒作用により自己表面修飾した酸化チタンナノ粒子の吸着・分解機能

チタニアの光触媒能を利用してチタニア粒子上でゾルーゲル反応を適度に進行させることにより、シリカおよびシリカアルミナナノ粒子を吸着剤として形成することに成功した。この技術を用いて作製した作用電極(光アノード)により、デンプンを燃料物質とした光燃料電池を完成させ、光電流を発生させ電力を得るための方法を確立した。さらに、電荷分離により生成した正孔の移動およびデンプンの酸化反応を観測し、反応機構および反応効率を向上させるための条件を明らかにした。酸化チタン自身の光触媒機能を利用した表面ゾルーゲル法により、酸化チタンナノ粒子表面のごく一部を、光により活性化し表面反応を促進することで、極性物質の吸着性に優れたシリカまたはシリカアルミナ超微粒子により修飾する新しい技術を開発するための研究に着手した。平成27年度は、超微粒子形成過程と有機物質の分解反応機構の解明をめざし、以下の項目について実験を行った。1.シリカおよびシリカアルミナ修飾酸化チタン光触媒薄膜の作製ガラス基板上に酸化チタン前駆体ゾルをコーティングし、500°Cで焼成することにより酸化チタンナノ結晶薄膜を作製した。Siアルコキシドの溶液に上記のチタニアナノ結晶薄膜を浸漬し、常温で紫外光照射を行い、シリカー酸化チタン複合光触媒薄膜を得た。紫外光照射強度および時間を変えた条件で複合体を合成した。また、シリカアルミナー酸化チタン複合光触媒薄膜も作製した。2.触媒のナノ構造の観測上記薄膜の電子顕微鏡観察、XRD測定、赤外吸収(IR)スペクトル測定を行い、作製条件による酸化チタン表面上のシリカの粒子径、酸化チタン表面への分散性を含むナノ構造を明らかにし、その形成過程を検討した。3.光触媒分解の反応解析合成した複合触媒を用い、酸素溶存溶液中における植物性高分子(デンプン)の光触媒分解実験を行った。溶液中のIRスペクトル分析により、デンプンの分解過程を観測した。<研究成果>作製したシリカおよびシリカアルミナは粒径数nm程度のアモルファス粒子からなることがわかった。強度100 mW程度、時間30分程度の光量の紫外光照射により、はっきりとした超微粒子の生成を確認することができた。酸化チタン薄膜表面に吸着剤となるごく微量のシリカおよびシリカアルミナ超微粒子を形成することにより、デンプン分子の吸着と光触媒分解を促進し、光電流の発生効率を向上させることができた。シリカおよびシリカアルミナ超微粒子の形成過程と有機物質の分解反応機構の解明をめざして研究を行った結果、以下の成果を得た。1適切な光量の紫外光照射により、酸化チタン薄膜表面に、粒径数nm程度のアモルファス構造のはっきりとしたシリカおよびシリカアルミナ超微粒子を作製することができた。2酸化チタン薄膜表面に高性能吸着剤となるごく微量のシリカおよびシリカアルミナ超微粒子を形成することにより、デンプン分子の吸着と光触媒分解を促進することができ、光電流の発生効率を向上させることができた。3デンプンの分解により中間生成物としてギ酸が観測し、分解機構をある程度推定することができた。以上より、予定していたとおりに研究を推進し、一定の成果を得ることができたため、おおむね順調に進展していると判断できる。チタニア薄膜上に、その光触媒作用を利用して、シリコンアルコキシドまたはシリコンーアルミニウム複合アルコキシドの加水分解・重縮合反応を進行させることにより、シリカまたはシリカアルミナナノ粒子での修飾を行った。光触媒反応によるチタニア薄膜上でのシリカまたはシリカアルミナナノ粒子生成を確認し、これを用いた電極の光触媒特性および光燃料電池特性に及ぼすナノ粒子修飾の効果を評価した。電解液としてNaOH水溶液およびデンプン(燃料物質)を添加したNaOH水溶液を用いて光照射下でのデンプンの分解と光電気化学特性を調べた。デンプンを含まない電解液を用いた場合に比べ、電解液にデンプンを添加することで光電流の値は増加し、デンプンの分解が電流発生に寄与していることがわかった。また、チタニア粒子表面のごく一部にナノ粒子が析出することにより、吸着能が向上した。デンプン添加電解液を用いた場合では、デンプン分子の吸着、拡散、分解の過程をスムーズに進行させることができ、光電流値を高めることができた。過去の研究において、粘土鉱物アロフェンのナノ粒子を少量分散させたチタニア電極で同様な結果を得ている。ナノ粒子がチタニア表面の燃料物質濃度を上昇させ、チタニアで生じた正孔を効率的に消費し酸化分解が進行したことが示唆される。アロフェン分散よりも本研究でのナノ粒子生成法のほうが、構造制御の精度において優れていることがわかった。以上の結果より、チタニアナノ粒子上においてナノレベルでの微粒子の構造制御が可能であり、この方法が光燃料電池の電極作製に有効であることが明らかになった。光触媒反応によるチタニア薄膜上でのシリカまたはシリカアルミナナノ粒子生成を確認し、これを用いた電極の光触媒特性および光燃料電池特性に及ぼすナノ粒子修飾の効果を評価することを目的として研究を行い、以下の成果を得た。1シリカまたはシリカアルミナの原料物質の濃度を変えることにより、析出するナノ粒子の量を制御することが可能であることがわかった。2チタニア粒子表面のごく一部にナノ粒子が析出することにより、燃料物質であるデンプン分子の吸着、拡散、分解の過程をスムーズに進行させることができ、光電流値を高めることができた。

3ナノ粒子がチタニア表面の燃料物質濃度を上昇させ、チタニアで生じた正孔を効率的に消費させることが可能であることがわかった。以上は、予定していたとおりの到達内容であり、一定の成果を得ることができたため、おおむね順調に進展していると判断できる。平成29年度は、光燃料電池の作用電極(光アノード)の電子移動機構の解明をめざして、以下の項目のとおり研究を行いその成果を得た。1種々の作製条件において、チタニアの光触媒能を利用してチタニア粒子上にシリカおよびシリカアルミナナノ粒子(超微粒子)を形成することに成功し、その量を制御する技術を確立した。2デンプンを燃料物質として用い、シリカおよびシリカアルミナナノ粒子で修飾したチタニア電極の光触媒分解特性および光電気化学特性を測定し、デンプンの分解反応と光電流の関係を調べることにより、シリカおよびシリカアルミナナノ粒子がデンプンの吸着性能を強化し、電荷分離によって生じた正孔の消費効率を向上させることを明らかにした。チタニア微粒子の表面を単原子層以下のシリカおよびシリカアルミナ層で修飾することにより、正孔の移動度を大きく低下させることなく、表面で正孔を消費することが可能となった。研究期間全体を通して、チタニアの光触媒能を利用してチタニア粒子上でゾルーゲル反応を適度に進行させることにより、シリカおよびシリカアルミナナノ粒子を形成することに成功し、この技術を用いて作製した作用電極(光アノード)により、デンプンを燃料物質とした光燃料電池を完成させ、光電流を発生させ電力を得るための方法を確立した。さらに、電荷分離により生成した正孔の移動およびデンプンの酸化反応を観測し、反応機構および反応効率を向上させるための条件を明らかにした。さらに、水に不溶性のセルロースの分解による光電流発生の目途もつき、今後いっそうの発展が期待される。チタニアの光触媒能を利用してチタニア粒子上でゾルーゲル反応を適度に進行させることにより、シリカおよびシリカアルミナナノ粒子を吸着剤として形成することに成功した。この技術を用いて作製した作用電極(光アノード)により、デンプンを燃料物質とした光燃料電池を完成させ、光電流を発生させ電力を得るための方法を確立した。平成28年度は光燃料電池電極の電子移動機構の解明をめざして、以下の項目についての研究行う。1.シリカまたはシリカアルミナ修飾酸化チタン電極の作製(4月6月)平成27年度と同様に様々な条件で、シリカおよびシリカアルミナ修飾酸化チタン薄膜をITO透明電極ガラス板上に作製し、シリカおよびシリカアルミナー酸化チタン複合光触媒電極を得る。2.電極の電気化学測定および反応解析(項目1へのフィードバックを含む5月3月)作製した複合電極を燃料物質、電解質、溶存酸素を含む溶液に浸漬し、蛍光分光装置を光源として用いて、電気化学測定装置により、光照射下での電流電圧特性および光電流アクションスペクトルを測定する。平成27年度と同様に、燃料物質分解の定量的な反応解析を行う。光電流値と生成物の定量の結果より、電子移動特性・エネルギー変換効率を評価する。平成29年度は、光燃料電池電極の電子移動機能の解明をめざして、以下の項目についての研究を行う。
森林土壌‐渓流系における溶存有機物の動態に関する研究

溶存有機物の量と蛍光特性に着目し、森林-渓流系さらには河川流域における動態を解析した。溶存有機物の多くを占める腐植物質には、複数の蛍光ピークをもつものが含まれており、その変化によって溶存有機物の量と質の動態を解析出来ることが示された。また、土壌培養実験からは、有機物と窒素栄養塩の動態が密接に関係しており、その結果が渓流水質に反映していることが示唆された。本研究の目的は、森林土壌から渓流に流れ出る溶存有機物の質と量の変動を解析し、森林環境の変化にどのように応答するのかを明らかにすることであり、以下の3項目を実施することとした。(1)土壌浸透・渓流水形成過程における溶存有機物の変質(2)溶存有機物生成・消費に及ぼす窒素栄養塩の影響(3)溶存有機物の錯体形成能平成21年度は、これら3項目の基礎となるデータを取得するため、本研究の主対象地である芦生研究林とそこを源流とする由良川流域での渓流・河川水調査を行った。溶存有機物(溶存有機態炭素)の濃度は、森林を集水域とする渓流で変動が大きく、また、下流に向かって上昇する傾向が見られた。溶存有機物の多くを占めるとされている腐植物質に関しては、三次元蛍光測定を実施した。本補助金にて購入した三次元分光蛍光光度計を用い、PALAFAC分析による蛍光ピークの同定を行ったところ、1つのタンパク質様蛍光ピークと3つの腐植物質様蛍光ピークが検出された。そのうち、腐植物質様蛍光はほぼ同様の空間分布を示したが、下流に向かって短波長側のピークにシフトすることが示され、流下過程における溶存有機物の変質あるいは森林由来とは異なる溶存有機物が中下流域で附加されている可能性が示唆された。溶存鉄の濃度については、1.3μM以下(<70μg1^<-1>)と日本の河川水濃度としては低い部類であることが分かった。この溶存鉄濃度は、溶存有機態炭素濃度および腐植物質様蛍光強度との相関が見られ、錯体を形成している可能性が示唆された。今年度は、三次元蛍光測定の立ち上げ、蛍光強度の標準化・PALAFAC分析プログラムの整備と溶存鉄濃度分析に時間がかかり、土壌水試料の分析や限外ろ過による溶存有機物の分画等を実施することが出来なかった。平成22年度にはこれらの手法を確立し、溶存有機物と溶存鉄の空間分布と相互作用について解析する予定である。溶存有機物の主体である腐植物質には、植物プランクトンにとって重要な生元素である鉄を利用可能な溶存態に留めておく機能(錯体形成)があるとされ、森と川・海のつながりを知る上で重要な物質である。しかしながら、溶存有機物の起源と生態系内における変質に関しては不明な点が多く、流域を通した研究も数少ない現状である。そこで、本研究では、森林流域全体を対象として、森林土壌から渓流・河川を経て海にいたる流路において、溶存有機物の動態を把握し、同時に溶存鉄濃度を測定することによって上記の点を明らかにすることを目的とした。森林土壌から渓流に流れ出る溶存有機物の質と量の変動を解析して河川・河口域での変質を解明するとともに、森林伐採などの環境変化が溶存有機物と溶存鉄の動態にどのように影響するのかを解析する。平成22年度は前年度に引き続き、本研究の主対象地である由良川流域での渓流・河川水調査を行った。その結果、溶存有機物、溶存鉄濃度ともに空間的・季節的変動があるものの、一貫性があり、溶存有機物(溶存有機態炭素)の濃度は、森林を集水域とする渓流で変動が大きく、また、下流に向かって上昇する傾向が見られた。溶存鉄の濃度については、今年度ICP-AES法による分析の精度について検討を重ね、渓流・河川水中の濃度に関して十分な精度で測定できることが確認できた。この溶存鉄が、溶存有機物と錯体を形成している可能性については、限外ろ過法や樹脂カラムによる処理を実施する予定であったが、十分な検討ができていない。一方、河口域における溶存鉄濃度の調査から、出水時に上昇すること、上流で見られた溶存有機炭素濃度と溶存鉄濃度の相関がなくなることなど明らかとなった。平成23年度秋には芦生研究林内の人工林で間伐実験を実施し、伐採が土壌および渓流水中の溶存有機物さらには溶存鉄の挙動にどのような影響を及ぼすかの調査を行う予定である。平成23年度も引き続き、本研究の主対象地である由良川流域での渓流・河川水調査を行い、2年以上の期間にわたる溶存有機物等水質の季節的変化の様相を把握することができた。これにより、溶存有機物、溶存鉄濃度ともに森林域よりも農耕地ないしは市街地からの排水の影響を受けて濃度が上昇することが明らかとなった。

溶存成分のうち、水域における生物生産にとって栄養となる硝酸塩に関して、窒素と酸素の安定同位体組成を解析したところ、集水域の面積に占める森林の割合が95%以上を占める渓流においては、降水由来の硝酸塩の割合が数%10%で変動したが、農耕地や市街地の占める割合が大きくなる中下流では、24%と低いことが分かった。これらのことから、由良川の水質は、森林を主な集水域とする渓流域では、降水の影響と集水域内の水文過程によって大きく左右され、中下流では、人間活動によって、溶存有機物も硝酸塩も増加していることが明らかとなった。溶存有機物の動態を解析するために、土壌の培養実験を行った。用いた土壌は、地上植生(草本類)のバイオマスがシカによる食害の影響を受けている実験区と受けていない実験区で採取したものであるが、地上バイオマスの影響は見られず、土壌から水抽出できる溶存有機物量と硝化活性との間に正の相関が見られた。これは、渓流水で知られている溶存有機物と硝酸塩濃度の相関とは異なっており、土壌から渓流水に流出する水文過程での水質変化が影響している可能性がある。また、土壌中での窒素循環と有機態炭素循環の関係を調べるために、窒素栄養塩添加実験を実施し、現在その試料を分析中である。人工林伐採による土壌水・渓流水中の溶存有機物の動態解析に関しては、伐採実験計画の遅れにより、平成24年度の開始となってしまった。本科学研究費助成事業の最終年度であるが、できるかぎりの調査を行い、森林伐採と溶存有機物動態の関係を明らかにしたい。本研究では、森林生態系の環境変化を示す溶存有機物の指標の創出を目指し、森林土壌ー渓流系における溶存有機物の動態を解明することを目的とした。森林土壌ー渓流系の異なる地点において土壌水、湧水、渓流水などを採取し、そこに含まれる溶存有機物の量と三次元蛍光特性の変化から溶存有機物の起源と変質を明らかとする。また、土壌試料に窒素栄養塩等を添加して培養実験を行うことにより、渓流水に広く見られる溶存有機態炭素濃度と硝酸態窒素濃度の間の逆相関関係が、森林土壌中における炭素循環と窒素循環の相互作用の結果であることの検証も試みた。その結果、溶存有機物の多くを占める腐植物質には、複数の蛍光ピークをもつものが含まれており、その変化によって溶存有機物の量と質の動態を解析出来ることが示された。すなわち、森林由来の腐植物質は、長波長側に蛍光特性を有しているが、河川を流下する過程で質的変化を受けて短波長側に蛍光ピークが移動することが示唆されるとともに、中・下流域の農地や市街地などからの人間活動由来の溶存有機物が混合することが示された。地面の傾斜が、河川水中の溶存有機物の質と量に影響を及ぼしていることが明らかとなったが、森林の多い上流域では、傾斜が緩いほど溶存有機物量が減少するのに対して、農地や市街地が多くなる中・下流域では関係者ほど溶存有機物が増加しており、傾斜と土地利用の双方が溶存有機物の動態に影響を及ぼしていることが示唆された。また、土壌培養実験からは、有機物と窒素栄養塩の動態が密接に関係しており、その結果が渓流水質に反映していることが示唆された。渓流・河川の広域調査とその分析に時間がかかり、溶存有機物の質を探るための分画作業を進めることができなかった。森林土壌の調査については、一定の進捗があったが、他の研究プロジェクトが実施する予定であった芦生研究林での伐採実験が遅れているため、その場所を用いた調査に関しては、事前調査のみ実施した。24年度が最終年度であるため、記入しない。伐採実験が平成24年度に実施されることが決定したので、実験区を用いた溶存有機物動態の調査を進める。研究期間中には、伐採直後の変化しか追跡できないが、期間終了後も継続調査することによって、所期の目的を達成したい。また、限外ろ過装置による溶存有機物の分画も軌道に乗せる目途が立ちつつある。
大腸菌外膜リポ蛋白質の輸送不全によるRcsリン酸リレー系活性化の機構

大腸菌等のグラム陰性細菌の細胞表層には、N末端が脂質により修飾されたリポ蛋白質が存在している。これらのリポ蛋白質の多くは、内膜のペリプラズム側で修飾された後Lolシステムにより外膜内葉に輸送される。私たちは、Lolシステムが正常に機能しない状況下ではRcsリン酸リレーに依存してlolA遺伝子の転写が誘導され、リポ蛋白質輸送能力を回復させる応答が起こることを見いだしている。本研究は、この応答のセンサー蛋白質であるRcsF蛋白質がリポ蛋白質の輸送状況をモニターする機構について解析したものである。私たちは、大腸菌外膜リポタンパク質の選別輸送に関わる分子シャペロンLolAの構造・機能を解析する過程で、その変異体の一つが、Rcsリン酸リレー系に依存してlolA遺伝子自身の転写を活性化することを発見した。この新知見から、「Rcsリン酸リレー系のシグナル入力に関わる外膜リポタンパク質RcsFは、外膜に輸送された後ではなく、輸送途上で内膜上に滞留したものが内膜上RcsCDキナーゼを活性化する」、すなわち、「RcsFはリポタンパク質の外膜への輸送状況をモニターするセンサーとして働いている」のではないかと考えた。この仮説の当否を検証するため、細胞内局在部位を変化させたRcsFタンパク質を作製したところ、ペリプラズムに遊離したもの、内膜に脂質でアンカーしたもの、シグナルペプチドが切断されず内膜にアンカーしたもの、いずれの場合でも、Rcs系の活性化が観察されることから、内膜上のRcsFはRcsCDキナーゼの活性化を行うことが示唆された。実際に、内膜に脂質アンカーしているRcsFタンパク質がRcsCDキナーゼと物理的に相互作用するかどうかをin vivoでの光架橋実験で検証するために、光反応性アミノ酸ベンゾイルフェニルアラニンをRcsFタンパク質の特定の部位に導入するためのrcsF変異体シリーズを作成した。また、光架橋産物を生成するためのタグを付加したものも作成し、野生型と同様に機能することも確認し、これらの変異体を用いて、光架橋の予備的解析を行った。私たちは、大腸菌ペリプラズムに存在し、脂質修飾されたリポタンパク質を内膜から外膜へ輸送する役割を持つLolAタンパク質の構造と機能を解析する過程で、そのドミナントネガティブ型変異体の一つが、Rcsリン酸リレー系に依存してlolA遺伝子自身の転写を活性化することを発見した。このことは、「Rcsリン酸リレー系のシグナル入力に関わる外膜リポタンパク質RcsFは、外膜に輸送された後に機能するのではなく、輸送途上で内膜上に滞留することによりRcsCDキナーゼを活性化する」、すなわち、「RcsFはリポタンパク質の外膜への輸送状況をモニターするセンサー分子として機能する」のではないかと考えた。この仮説の当否を検証するため、昨年度作成したRcsF変異体を用いてin vivo光架橋実験を行った。その結果、RcsFタンパク質のリンカー部分及びC末端領域の一部分と特異的に相互作用するタンパク質が検出された。このRcsFと架橋形成したタンパク質をRcsF側に付加したHisタグを用いて精製し、質量分析したところ、この相手側タンパク質はOmpAタンパク質であることが明らかとなった。Rcs系制御におけるOmpAとRcsF相互作用の役割は今後の検討課題である。また、RcsFタンパク質において、シグナル感知・伝達に重要な領域を同定するために、部位特異的およびランダムに変異導入したRcsFからその機能に欠損を持つものを同定した。その結果、Rcs系活性化に欠陥をもたらす変異は、C末端領域の一部分に集中していた。この部分は、OmpAと相互作用する部分とは異なっていることから、他の因子との相互作用部位である可能性がある。リポ蛋白質の輸送阻害によりRcsF蛋白質依存的にRcsリン酸リレー系が活性化する機構を明らかにすることを目的として実験を行い、以下の結果を得た。1昨年度に引続き、ベンゾイルフェニルアラニンを用いた部位特異的光架橋実験によりOmpAとRcsFの相互作用に関するより詳細な解析を行った。その結果、RcsFのN末端側のリンカー領域(特定の構造を形成せずCー末端側の球状ドメインと膜にアンカーした脂質をつなぐ部分)とCー末端側の球状ドメインの一部分がOmpAと強く相互作用することが明らかになった。RcsFによるリポ蛋白輸送不全状況の感知に於けるOmpAの役割を明らかにするために、ompA遺伝子を欠損する変異体を作成し、その影響をみたところ、Rcs系の活性化は大きく影響されず、おおむね野生型に近い応答をした。Rcs系の制御に於けるOmpA-RcsF相互作用の役割についてはさらに検討を要すると考えている。2RcsF蛋白質は、リポ蛋白質輸送不全状況下で内膜に滞留した状態で、内膜上に存在するRcsCDキナーゼと物理的相互作用することによりその活性を制御していることが遺伝学的解析から示唆されている。この可能性を検討するため、光架橋法によりRcsFがRcsCまたはRcsDと相互作用するかどうか検討したが、これ迄のところこれら因子との特異的架橋産物は検出できていない。3 RcsFからのシグナル伝達に重要と考えられる領域周辺に光架橋性アミノ酸を導入しクロスリンク形成実験を行ったところ、いくつかの特異的な架橋産物が同定できた。これらのクロスリンク相手となる蛋白質は、RcsFからの情報伝達に重要な役割をもつ可能性があり、現在の同定を試みている。