hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
緑膿菌クオラムセンシング機構の総体的理解に向けたAHLレセプターの機能解析

そこで、N末端を数残基分切り縮めた形でのタンパク質発現を試みた結果、RhlRを可溶性画分に著量に発現させることに成功した。次に、既知のRhlR認識配列を含むDNA断片をプローブとして、大腸菌で発現させたRhlRのDNA結合活性の検出を試みた。しかし、大腸菌の無細胞抽出液を直接使用したゲルシフトアッセイでは、AHLの添加の有無に関わらず、完全長のRhlRとN末端側を切り縮めたRhlRのいずれにおいても、DNA結合活性は検出されなかった。一方、大腸菌による発現実験と並行して、由来の異なる8株の緑膿菌を対象として、その無細胞抽出液からのRhlR活性の直接の検出を試みたが、いずれの株の抽出液にも目的の活性を検出することはできなかった。AHLレセプターを含め、細菌の転写調節タンパク質は、通常、細胞内での発現量が少なく、その調製にあたっては、大腸菌発現系などを用いて高発現させる必要がある。しかしながら、一部のタンパク質は可溶性画分への発現が難しく、実験に難航する場合が多い。RhlRもその例にもれず、可溶性画分への発現は容易ではなかったが、低温で発現誘導することにより完全長のRhlRを一部可溶性画分に発現させることに成功した。更に、N末端を切り縮めたRhlRを著量に発現させることに成功した。これらの成果は、これまで誰も成し得なかったRhlRの精製を実現に大きく近づけたという点において、評価に値すると考える。一方、RhlRのDNA結合活性は、今回アッセイに用いたいずれの無細胞抽出液試料中にも検出できなかった。その原因として、何らかの因子による活性阻害や、RhlR機能に不可欠な因子の不足・欠如など、様々なものが考えられるが、その解明は、RhlRの生理機能に関する新たな発見に直結する可能性もあり、今後の最重要課題の一つと考える。緑膿菌は、自身の病原性をクオラムセンシング(QS)と名付けられた細胞間情報伝達機構により制御している。本菌のQSには、転写制御因子として3種のアシルホモセリンラクトン(AHL)レセプター(LasR, RhlR, QscR)が関与することが明らかとなっているが、RhlRとQscRの解析はLasRに比べて大きく遅れており、その性質や機能には不明な点が多い。本研究では、RhlRの発現・精製と分子機能解析、および、QscRの普遍性と感染症における役割の検証を行うことを主目的としている。一昨年度の取り組みにより、N末端を数残基分切り縮めたRhlRは、大腸菌細胞内において高い可溶性/安定性を示すことが明らかとなった。そこで、昨年度は、大腸菌無細胞抽出液からのN末端短縮型RhlRの単離・精製に取り組んだ。結果、硫安沈殿による分画と複数のカラムクロマトグラフィーを組み合わせることにより、本タンパク質を高純度に精製することに成功した。次に、本精製標品を用いて、ゲルシフトアッセイによるDNA結合活性の検出を試みた。しかし、反応液へのAHLの添加の有無に関わらず、精製標品に目的の活性は検出されなかった。上記実験と並行して、RhlRの発現プラスミドと、RhlRが制御するプロモーター配列の下流にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を配置したプラスミドを保持する大腸菌レポーター株を作出し、レポーターアッセイによる完全長RhlRとN末端短縮型RhlRの転写促進活性の比較・検討を行った。結果、完全長RhlRは、AHLの添加量に応じて顕著な活性を示したのに対し、N末端短縮型RhlRは全く活性を示さなかった。
細胞老化の発癌制御に関する2面性とその調節に関する研究

哺乳動物の正常な体細胞に癌遺伝子の活性化など発癌の危険を伴う異常が生じると発癌防御機構の1つとして知られる「細胞老化」が誘導され、異常細胞の増殖が不可逆的に停止することが知られている。しかし、最近、我々は細胞老化を起こすと、活性酸素種(ROS)の著しい上昇とそれに伴う多核・多倍体化が促進され、良性腫瘍から悪性腫瘍への形質転換を促進している可能性があることを見出した。そこで、本研究では、細胞老化におけるROSの産生とその染色体分配機構に及ぼす影響を明らかにすることにより、これまで殆ど注目されてこなかった細胞老化のもう一つの側面(発癌促進作用)の実体を解明することを目的として研究を行った。条件的に不死化したヒト線維芽細胞株を用いて細胞老化を誘導後に細胞増殖を再開した細胞クローンを単離した。それらの細胞クローンのうち約10%の細胞クローンが足場非依存的増殖能や染色体数の増加など元の細胞が持っていなかった悪性腫瘍形質を獲得していた。そこで、それらの細胞クローンで共通して起こっている遺伝子発現変化をマイクロアレイを用いて解析した結果、発現レベルが著しく上昇している遺伝子の中に染色体分配への関与が示唆される遺伝子が複数含まれていることが分かった。そこで、様々な悪性腫瘍細胞においてそれらの遺伝子の発現をRNA干渉法(RNAi)により阻害したところ、細胞が瞬時にアポトーシスを起こした。また、細胞老化を誘導する際にROSの産生を抑えておくと、これら遺伝子の発現変動が起こらず、悪性形質を獲得した細胞が出現しなくなった。これらのことからROSにより染色体分配に関与する遺伝子の発現が変化することが細胞老化に伴う染色体異常と、悪性腫瘍細胞への形質転換に深く関与していることが示唆された。哺乳動物の正常な体細胞に癌遺伝子の活性化など発癌の危険を伴う様々な異常が生じると発癌防御機構の一つとして知られる「細胞老化」が誘導され、異常細胞の増殖が阻止されることが知られている。しかし、最近、我々は細胞老化の誘導は活性酸素種(ROS)の著しい上昇とそれに伴う多核・多倍体化を促進し、良性腫瘍から悪性腫瘍への転換を促進している可能性があることを見出した。そこで、条件的に不死化したヒト線維芽細胞株を用い、細胞老化を誘導後、細胞増殖を再開した細胞クローンを単離した。それらの細胞クローンのうち足場非依存的増殖性など、もとの細胞(条件的に不死化したヒト線維芽細胞株)が持っていなかった悪性腫瘍細胞としての形質を獲得している細胞クローンを選び、それらの細胞クローンで共通して起こっている遺伝子発現変化をマイクロアレイを用いて探索した。その結果、発現レベルが著しく上昇しているものと低下している遺伝子群が存在することを見出した。興味深いことにそれらの遺伝子の中には染色体分配に関与しているものが複数含まれていた。更に興味深いことに、悪性腫瘍細胞としての形質を獲得している細胞クローンでは染色体の数がほぼ倍化しており、染色体の分配異常が発癌と密接に関与していることが強く示唆された。今後は同定した染色体分配に関与する遺伝子の発現異常が細胞老化の形質維持や悪性腫瘍化への転換にどのように関与しているかについて解析を行う。
ヒト臓器構成プロセスのシームレスなライブ観察

昨年度、研究代表者らはヒトiPS細胞の肝細胞への分化誘導研究において、従来の「細胞の分化誘導」という開発概念から脱却し、異なった細胞系譜の時空間的な相互作用を活用した、「臓器の再構成に基づく分化誘導」を実現化した革新的な三次元培養技術を新たに開発した。(Nature,499 (7459), 481-484、PCT/JP2012/074840:組織及び臓器の作製方法)。本年度においては、まず、研究代表者が世界で初めて確立したiPS細胞からヒト肝臓原基を試験管内で誘導するプロセスをin vitroからin vivoに至るまでライブ観察するための技術を最適化し、その詳細な手技を検討することにより最適な観察手法を確立した。本ライブ観察系を用いることで、血液の流入に要する時間、臓器特異性の高いヒト血管網の構築過程、蛍光iPS細胞の分化段階などを3次元的に解析することが可能となった。以上の結果は、Nature Protocols誌, Organogenesis誌に発表した。さらに、本年度は積極的に領域内の共同研究を推進した。A02班の埼玉大学との共同研究を開始し、肝臓原基作製に必要となる三種の細胞を用いた自己組織化のメカニズム解析を行った。内容は、再生医療学会シンポジウムにて、口頭発表を行った。また同グループと研究を実施した、軟骨再生研究に関する成果は、Stem Cells誌に発表することが出来た。さらに、A03班東北大グループとは、酸素透過膜を用いた培養法に基づく高品質な肝臓原基作製方法を検討し、A02班横国大グループとは血管構造を空間的に配置した立体組織を構築するための技術検討を開始した。今後、共同研究を加速することによりヒトiPS細胞から高い治療効果を発揮可能なヒト肝臓の再生医療技術を確立することが期待される。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究代表者らは、ヒトiPS細胞の肝細胞への分化誘導研究において、従来の「細胞の分化誘導」という開発概念から脱却し、異なった細胞系譜の時空間的な相互作用を活用した、「臓器の再構成に基づく分化誘導」を実現化した革新的な三次元培養技術を新たに開発し、ヒト臓器創出を可能とする細胞操作技術を確立した。本研究では、われわれが開発した方法を用いて、ヒトiPS細胞由来内胚葉細胞集団に対し、血管内皮細胞、及び間葉系細胞との協調的相互作用を試験管内において再現化することで、三次元的なヒト肝臓の原基への自己組織化を誘導するとともに、そのプロセスを共焦点顕微鏡によるタイムラプス観察により可視化した。得られた三次元組織は、マウス肝原基との類似性を組織学解析や遺伝子発現解析により検討した。さらに、形成された三次元組織の成熟過程を、最新のin vivoライブイメージング法と、臓器の機能発現の定量評価系を組み合わせることで、誘導された原基が移植により血管構造を有するヒト臓器へと成熟していく組織化過程を可視化することに成功した。また、膵島誘導の基礎知見を得ることを目的として、同様の手法により膵β細胞株から立体組織の形成が可能であるか否か検証を行った。ヒトiPS細胞由来内胚葉細胞を起点とした組織再構築過程を三次元的に捉え、ヒト臓器の機能成熟化と血管等との協調的相互作用の全体像解明することができれば、得られた基盤的知見を元に臓器形成に必須となる動的環境場の特徴を精密に再現化するシステムを再設計することで、ヒトiPS細胞から高い治療効果を発揮可能なヒト肝・膵組織の再生医療技術を確立することが期待される。

形成された三次元的なヒト器官原基の治療的効果を検討するために、ジフテリア毒素受容体を肝細胞および膵β細胞のみに強制発現させたトランスジェニックマウス(Alb-TRECK/scidおよびIns-TRECK/scidマウス)を用いて移植実験を実施する。本マウスをレシピエントとすることにより、肝細胞・膵β細胞特異的に任意のタイミングで強い障害を引き起こすことが可能となる。ヒトiPS細胞由来三次元肝・膵原基の治療効果を、各種臓器障害マーカーおよび生存率等の変動を計測することにより評価する。機能成熟化の最適条件を決定するために、移植部位(皮下、腎被膜下、腸間膜上など)の検討を行う。また、領域内連携により新たに生まれた埼玉大学・産総研グループとの連携も強化し、新たな研究成果の創出を図る。25年度が最終年度であるため、記入しない。
身体動作に着目したドライバ状態の推定と安全運転支援への応用

本研究では,運転中のドライバの注意力や覚醒度の低下を早期に,精度よく検知することを目的とし,従来の心拍などの生理指標に加えて,ドライバの身体の動きに着目したドライバ状態の推定手法を提案する.このうち,本研究課題ではその基礎検証として,ドライバの注意力低下が生理指標および四肢の動きに及ぼす影響を調査し,またその変化を検出するための基本アルゴリズムを検討する.このことによって,ドライバの注意力低下を早期に,精度よく検知するための定量指標の確立をめざす.本研究では,運転中のドライバの注意力や覚醒度の低下を早期に,精度よく検知することを目的とし,従来の心拍などの生理指標に加えて,ドライバの身体の動きに着目したドライバ状態の推定手法を提案する.このうち,本研究課題ではその基礎検証として,ドライバの注意力低下が生理指標および四肢の動きに及ぼす影響を調査し,またその変化を検出するための基本アルゴリズムを検討する.このことによって,ドライバの注意力低下を早期に,精度よく検知するための定量指標の確立をめざす.
胎児期におけるヒト顔面骨格の3次元成長発達の解明

顔面骨格の正常発達過程は、顔面先天異常疾患の病態解明に必要不可欠であるが、その全容はわかっていない。CTやMRIなど撮像機器の発達により、ヒト胎児標本を多数利用した正確な形態解析が可能となってきた。それらの画像データと3次元解析手法Geometric morphometrics (GM)を組み合わせることにより、胎児顔面の時間軸に沿った標準成長モデル(4次元モデル)を作成する。更に、それに対する脳や咀嚼筋など隣接臓器の影響を明確にする。これにより形態変化を明示するだけでなく、そのメカニズムにも迫ることになり、先天異常疾患の病態生理やその発症時期の解明への貢献が期待できる。
リフトオフによる機能性酸化物の微細加工と新奇物性探索

多様な物性を示す物質が発見されている中、それらを実際にデバイスとして利用するには薄膜化と微細加工が必須である。本研究では、興味深い物性を示すにも関わらず、従来の方法では微細化が難しかった物質に利用できる汎用なプロセスの開発を行った。溶液で容易に除去できる高融点物質を用いて、基板上にあらかじめテンプレート層を作製し、その上に目的の物質を堆積した。その後、テンプレート層を溶液によって除去することで、目的の物質を劣化することなく微細加工することができた。今後様々な物質群に適用することで、新たな機能を持ったデバイス作製が可能になると期待される。本研究の目的は、エッチング加工による劣化を伴わずに、ナノスケールまで微細加工できる新しい手法と要素技術を開発し、酸化物等の機能性物質の特性を最大限活用したナノデバイスにおいて新たな物理現象を探索することである。ナノ構造でのみ発現する特性を引き出すには、微細加工技術が欠かせない。しかし、エッチングを用いる従来の微細加工技術では、ナノスケールの素子端面における劣化が不可避で、劣化に強い物質を選択して研究が行われている。本申請では発想を転換し、多様な物質系に適用可能なリフトオフ法を元とする新たな微細加工技術を開発することを目標に研究を進めた。この目標を達成するために着目したのは、無機材料を犠牲層として用いたリフトオフプロセスである。本申請では、高温耐性のある無機犠牲層を利用して、酸化物機能性物質のリフトオフを行う。数10 nmの線幅と、シャープな端面を得るために、温和な条件でリフトオフ可能な、無機犠牲層の2層構造を開発する。さらに、様々な条件でリフトオフできる2層構造の組み合わせを見つけることで、汎用なプロセスを実現する。従来の有機物レジストを元とするリフトオフプロセスを脱却することで、これまで微細化の難しかった機能性酸化物のエレクトロニクスへの応用を促す。汎用な微細加工プロセスを基盤技術として確立することができれば、基礎研究のみならず、産業界にも貢献しうると期待している。機能性酸化物の微細加工に適用可能な、無機材料の2層構造(無機2重層)を用いたプロセス開発を行っている。これまでに、無機2重層を用いてリフトオフすることにより、イオンミリングをすることなくμmスケールでの微細構造の作製に成功した。さらに、異なるエッチング溶液で除去可能な無機2重層を複数開発した。それらを機能性酸化物をはじめとする様々な物質系へと適用し、汎用性のテストを行った。初年度の目標であった、微細加工プロセスの開発は、当初の目標通り順調に遂行することができた。様々な物質の薄膜化研究が進展している中、特徴的な物性を示す薄膜をさらにデバイス構造へと微細化することにより、1既存のエレクトロニクスへの新たな制御性の付加、2新物質を舞台としたメゾスコピック現象の探索といった展開が期待される。しかし、新物質の持つ化学的性質により、加熱やプラズマ処理を用いる従来のプロセスでは微細化の困難な場合が多い。本研究では、幅広い物質系に適用可能なプロセスの確立を目的として、溶液で容易に除去できる「リフトオフ層」と、熱的・化学的に安定な「キャップ層」を組み合わせた2層型犠牲層を開発した。特に、水溶性の無機犠牲層を用いることで、機能性物質へのダメージを最小限に抑えながら微細加工できることを見出した。2層型犠牲層を用いた新しい手法による微細加工のデモンストレーションとして、ペロブスカイト型酸化物および遷移金属カルコゲナイドの微細加工を行った。フォトリソグラフィーで加工した犠牲層をテンプレート層として用い、その上にパルスレーザー堆積法で、ペロブスカイト型酸化物および遷移金属カルコゲナイドの線幅5-100ミクロンの細線を作製し、その電気伝導特性を評価した。得られた構造において、チャネル物質本来の特性である磁性や超伝導特性が維持されていることが分かった。また、電気伝導度は線幅に比例しており、機能性物質の特性を損なうことなく望みの構造に加工することに成功した。確立した微細加工手法を用いて、これまで微細加工が難しかった機能性物質を用いたデバイス作製を行った。今後は、電子線リソグラフィーを用いてナノスケールの微細構造の作製に取り組み、開発した新しい手法でナノサイズの構造を作製できることを実証する。また、これまでに確立した微細加工技術を利用して、輸送特性や磁気特性の観点から興味深い物質群を微細化し、機能性物質を用いたメゾスコピック素子の開発を行う。微細構造での新物性探索を行い、基礎、応用の両面から研究を進めていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。応用物理学28年度が最終年度であるため、記入しない。
隕石中の固体微粒子の形成・集積機構に着目した新しい岩石微惑星形成モデルの探求

本研究の目標は、惑星の前駆天体である「微惑星」が原始惑星系円盤中でどのように形成されたのかを理論計算によって明らかにすることである。本年度は、以下の3つの問題に取り組んだ。1.充填率1%から56%までの様々な塵集合体に対して熱伝導率の計算を行った。その結果、静的圧縮を経験した塵集合体の熱伝導率は充填率と平均配位数の冪関数で非常によくフィッティングできることがわかった。さらに、数値計算から得られた関係式によって、これまで様々な条件下で行われてきた室内実験の結果を統一的に説明できることを確認した。2.複合コンドリュールの起源に関する研究も行った。我々は以前に出版した論文において、複合コンドリュールの形成は結晶化したコンドリュールと過冷却状態の前駆体が衝突・付着によって説明できることを示している。しかし、過冷却状態が長時間にわたり維持される機構は不明であった。本年度は、この過冷却状態が維持されるコンドリュール形成場はどのようなものか検討した。結論として、光学的に薄い衝撃波中では、高温のガス分子がコンドリュールに衝突することによる加熱と衝撃波加熱領域の外部への輻射冷却が釣り合い、コンドリュールが長時間過冷却状態を保持し、複合コンドリュールが形成されうることが明らかになった。3.岩石微惑星及び氷微惑星がいつ形成されたのかという情報は、微惑星の集積機構としてどの理論モデルが妥当かを判断する際に鍵となる。巨大衝突の数値計算及び潮汐進化の準解析的な計算から、大型の太陽系外縁天体の衛星が溶融した1000 kmサイズの天体同士の巨大衝突によって形成されたとすると、衛星のサイズや軌道の特徴、それらの分布を説明できることが明らかになった。この結果は、半径100 kmより大きな太陽系外縁天体が太陽系初期の数百万年以内に形成されたことを強く示唆している。当初の研究計画通り、コンドリュールの形成環境に関する研究を行い、光学的に薄い衝撃波がコンドリュール形成場として適当であることを示した。この結果は国際査読誌に投稿中である。この成果は、初期太陽系の内側領域に存在したダスト粒子の多くは、光学的に薄い衝撃波による瞬間的加熱および短時間での冷却を経験していることを示唆するものである。また、昨年度実施した塵集合体の熱伝導率に関する研究をさらに発展させ、複数の実験的研究の結果を再現できる経験式を得た。この成果を国際査読誌Icarusにおいて発表することができた。加えて、太陽系外縁天体の衛星形成およびその後の潮汐進化に関する研究を行い、太陽系外縁において100 kmサイズの微惑星が数百万年という短時間で形成されたことが明らかになった。1.塵集合体の熱伝導率の理論モデルを用いて、彗星の構成粒子の粒径、組成などを制約する。また、得られた結果をコンドライト隕石の構成粒子と比較することで、コンドリュールと固体微粒子の熱史を議論する。2.低密度な塵集合体について、熱伝導率と充填率の関係をフラクタルな塵集合体の幾何学から導出する。本年度は、以下の2つの問題に取り組んだ。1.近年の理論研究によって、原始惑星系円盤中においてμmサイズの固体微粒子からなる塵集合体が衝突・合体成長する過程で内部密度が桁で下がり得ることが示されてきた。そこで本研究では、低密度な塵集合体の内部に含まれるmmサイズの大きな粒子が、塵集合体同士が衝突したときにどのように振る舞うのかを力学的に考察した。その結果、非常に内部密度の低い塵集合体を考えると、cmサイズに成長した塵集合体同士が高速で衝突するときに内部に含まれているmmサイズの大きな粒子は塵集合体から飛び出してしまい、塵集合体内部からほぼ全て失われてしまうことが明らかになった。一方、現実の隕石中にはコンドリュールと呼ばれるmmサイズの粒子が含まれており、これはコンドリュールが保持されたまま塵集合体が微惑星へと集積したことを示唆している。つまり、本研究の結果は、微惑星形成段階における塵集合体の密度進化について新たな制約条件が存在することを示している。この成果はThe Astrophysical Journal誌において出版された。2.隕石中の固体粒子の集積年代は、隕石母天体の熱進化から逆算して求められるため、塵集合体の熱伝導率を理解することが重要である。本研究では、低密度な塵集合体の熱伝導率を数値計算によって調べた。その結果、低密度の塵集合体の熱伝導率は内部密度のほぼ2乗に比例することが明らかになった。微惑星の熱進化は熱伝導率、天体サイズ、熱源となる放射性核種の存在量などに依存するが、本研究の成果によって低密度な微惑星の熱進化を定量的に議論することが可能になった。この成果はAstronomy & Astrophysics誌において出版された。当初の研究計画通り、μmサイズの固体微粒子とmmサイズの大きな粒子の2成分からなる塵集合体について、原始惑星系円盤内での合体成長に伴う密度進化の計算を行った。その結果、研究計画時には予期していなかった、塵集合体の成長過程における新たな障壁の存在が明らかになった。また、結果を原著論文として国際査読誌に発表することができた。さらに、当初の計画に加えて低密度の塵集合体の熱伝導率に関する研究も行った。

なぜなら、隕石中の固体粒子の集積年代を知るためには、まず塵集合体の熱伝導率を理解することが必要だからである。我々はいくつかの塵集合体のスナップショットから熱伝導率を数値的に計算し、低密度の塵集合体について熱伝導率の経験式を得ることができた。また、こちらの結果も原著論文として国際査読誌に発表することができた。本研究の目標は、惑星の前駆天体である「微惑星」が原始惑星系円盤中でどのように形成されたのかを理論計算によって明らかにすることである。本年度は、以下の3つの問題に取り組んだ。1.充填率1%から56%までの様々な塵集合体に対して熱伝導率の計算を行った。その結果、静的圧縮を経験した塵集合体の熱伝導率は充填率と平均配位数の冪関数で非常によくフィッティングできることがわかった。さらに、数値計算から得られた関係式によって、これまで様々な条件下で行われてきた室内実験の結果を統一的に説明できることを確認した。2.複合コンドリュールの起源に関する研究も行った。我々は以前に出版した論文において、複合コンドリュールの形成は結晶化したコンドリュールと過冷却状態の前駆体が衝突・付着によって説明できることを示している。しかし、過冷却状態が長時間にわたり維持される機構は不明であった。本年度は、この過冷却状態が維持されるコンドリュール形成場はどのようなものか検討した。結論として、光学的に薄い衝撃波中では、高温のガス分子がコンドリュールに衝突することによる加熱と衝撃波加熱領域の外部への輻射冷却が釣り合い、コンドリュールが長時間過冷却状態を保持し、複合コンドリュールが形成されうることが明らかになった。3.岩石微惑星及び氷微惑星がいつ形成されたのかという情報は、微惑星の集積機構としてどの理論モデルが妥当かを判断する際に鍵となる。巨大衝突の数値計算及び潮汐進化の準解析的な計算から、大型の太陽系外縁天体の衛星が溶融した1000 kmサイズの天体同士の巨大衝突によって形成されたとすると、衛星のサイズや軌道の特徴、それらの分布を説明できることが明らかになった。この結果は、半径100 kmより大きな太陽系外縁天体が太陽系初期の数百万年以内に形成されたことを強く示唆している。当初の研究計画通り、コンドリュールの形成環境に関する研究を行い、光学的に薄い衝撃波がコンドリュール形成場として適当であることを示した。この結果は国際査読誌に投稿中である。この成果は、初期太陽系の内側領域に存在したダスト粒子の多くは、光学的に薄い衝撃波による瞬間的加熱および短時間での冷却を経験していることを示唆するものである。また、昨年度実施した塵集合体の熱伝導率に関する研究をさらに発展させ、複数の実験的研究の結果を再現できる経験式を得た。この成果を国際査読誌Icarusにおいて発表することができた。加えて、太陽系外縁天体の衛星形成およびその後の潮汐進化に関する研究を行い、太陽系外縁において100 kmサイズの微惑星が数百万年という短時間で形成されたことが明らかになった。1.塵集合体の熱伝導率について、より高密度な塵集合体についても数値計算を行い、熱伝導率の密度依存性をより詳細に調査する。
企業従業員に対する報酬とそのインセンティブ効果の基礎研究

日本企業は、高い成長経済の下でシェア拡大に注力し、スケールメリットを活かした規格化と大量生産方式によって、強い国際競争力を持つに至った。しかし、バブル崩壊とその後に続く昨今の日本経済の低迷は、日本企業の雇用制度の根本的見直しを要請している。日本的雇用システムは、企業特殊的な人的資源の確保、企業内でのノウハウ・技術の移転、集団としての生産性、企業と従業員の間のリスク分担、従業員の勤労意欲・忠誠心へのインセンティブなどの点で合理性をもつといわれている一方、その最大の欠点は、労務費の固定費化という点にある。そこで、本研究ではそのための代替的な報酬制度の分析を行った。まず、年俸制の導入や能力給制度の導入などであるが、これらは結果重視で年俸を査定する以上、企業内の個人に責任と権限を与えた上での「目標管理評価制度」でないとうまく機能しないであろう。すなわち、日本企業における集団主義は温存したまま、個人の実力主義を評価する年俸制を名目的に導入したのでは、結局は日本的雇用システムがもっていた良さまで失うことになると考えられる。そこで、従業員の企業に対する忠誠心および企業業績に対する関心といった、日本企業の強みを失うことなく報酬制度改革を行うには、短期指向の年俸制や能力給と同時に長期指向のストック・オプション制度の導入が吟味されるべきである。ストック・オプションは企業に負担なく、しかも業績とリンクした報酬を与えることができるので、日本企業の抱える上記の問題点を解決するための一つの手段と考えられる。しかしながら勿論、企業が継続的発展を行うためには、単なるストック・オプションの導入ではなく、十分長期にわたり、しかも従業員に対して継続的なモティベーションを与えられるような報酬制度となるような工夫をおこなうことも重要である。なお、研究成果は論文の形で近々公表する予定である。
光合成の光環境適応におけるレドックスシグナル伝達機構の解明

本年度は研究課題であるレドックスシグナル伝達機構の解明に関連して、概日時計からのレドックスシグナル伝達により、細胞の形質がどれほどコントロールされているのかを調べた。これまで私たちのグループでは細胞親和性を有する電子メディエーターを用いて、細胞内レドックス状態の概日リズムを電気化学的に測定する手法を開発してきた。本年度はこの手法によってシアノバクテリア細胞内のROSレベルやROS除去に必要な還元力の変化が反映されることが示唆された。このことは概日時計によるレドックスコントロールが細胞のROSへの耐性に影響を与えることを示唆したため、形質としてROS耐性の概日リズムを測定した。その結果、野生株では主観的時間に依存してROS耐性が異なることを見出した。概日時計欠損株では時間によらずROS耐性は有意に変化しなかったことから、概日時計によって細胞のROS耐性が制御されていることが示された。したがってこれらより、細胞内レドックス状態の概日変動がROS耐性の概日リズムを誘起することが示唆された。これらの結果は論文にまとめ、投稿中である。また、本年はメタン資化菌が細胞外電子伝達能を有するかどうかを電気化学的に調べた。メタン資化菌は銅欠乏状態で外膜シトクロム(OMC)様タンパク質をコードする遺伝子が高発現することが報告されている。OMCは細胞外電子伝達において重要な役割を果たすタンパク質であるため、メタン資化菌に細胞外電子伝達能があることが予想された。メタン資化菌を含む培地に一定電位を印加すると、銅欠乏状態で細菌からのアノード電流が観測された。さらにOMCのヘムに結合し、その機能を阻害するCOガスを加えるとアノード電流の減少が観測された。これらからメタン資化菌のOMCを介した細胞外電子伝達能が実験的に初めて実証された。これらの結果は論文としてまとめ、査読付きの英文学術誌に受理された。本年度はシアノバクテリアにおけるレドックスシグナルネットワークの解明に取り組んだ。その結果、細胞内で概日時計による遺伝子発現制御とROS耐性がレドックス制御を通じてリンクしていることが示唆された。この結果は現在論文にまとめ、投稿中である。また、概日時計タンパク質へのレドックスシグナル伝達機構の分子スケールでの解明に向け、時計タンパク質KaiAおよびKaiCを用いたレドックスシグナル伝達物質のスクリーニングにすでに着手している。以上より、進捗状況はおおむね順調に進展していると判断した。本年度にKaiA, KaiCを用いたシグナル伝達物質のスクリーニング方法が確立された。今後も引き続きこの手法を用いて、細胞抽出液から概日時計タンパク質へのレドックスシグナル伝達分子の探索を行う。さらにスクリーニングの結果からシグナル伝達物質の分子構造の特定および時計タンパク質へのシグナル伝達の全容を明らかにする予定である。
高温超伝導セラミックスの拡散接合

酸化物系超伝導材料のうち臨界温度Tcが90K級のY-Ba-Cu-O系超伝導材料は、最も一般的であり実用化が期待されている。実用化に際しては、材料の成形加工及び接合技術が不可欠であるが、接合技術についてはこれまでほとんど報告されていない。本研究では、まずセラミック高温超伝導体を作製し、得られた超伝導体同士の拡散接合を行った。接合継手に対し、せん断強度試験・組織観察及びX線回折試験等を行った。また示差熱分析により、接合界面に挿入した銀及び酸化銀インサート材の酸素解離現象を把握し、超伝導特性評価結果と比較して、インサート材中からの元素の拡散が超伝導特性に及ぼす影響について検討した。以下に、本研究によって得られた主な結果をまとめて記す。1.示差熱分析装置での熱分析結果によると、超伝導体に添加した酸化銀は、約350°C付近で酸素を解離していた。酸素欠損量の大きいYBCOは350°C付近で重量の増加が見られ、酸化銀から解離した酸素が超伝導体に取り込まれている可能性が高いことが示唆された。2.酸化銀添加超伝導体と銀添加超伝導体の焼結後のペレットの収縮量を測定した結果により、酸化銀中の銀が超伝導体の密度の向上に寄与していることが示された。3.接合界面近傍のX線回折結果から、インサート材として使用した酸化銀が接合時に酸素を供給することにより超伝導組成の維時に寄与していると判断された。従って、接合を考える上での添加剤あるいはインサート材としては銀よりも酸化銀の方が適していると考えられる。4.接合部のX線回折結果によると、接合時における超伝導相の破壊は最大でも接合界面から0.3mmあたり迄であり、インサート材を拡散させることにより、超伝導特性を損なわずにセラミック高温超伝導体の拡散接合が可能である事が示された。酸化物系超伝導材料は液体窒素(沸点77K)中での使用が可能であり、このうち、臨界温度Tcが90K級のYBa_2Cu_3O_7-×系超伝導材料は、最も一般的であり実用化が期待されている。また直流4端子法による超伝導特性評価を行い、接合熱サイクル及びインサート材中からの元素の拡散が超伝導特性に及ぼす影響について検討した。以下に、本研究によってこれまでに得られた主な結果をまとめて記す。1.固相反応法によりY系超伝導体(Y-Ba-Cu-O)を作製した。この際、仮焼結の時点でX線回析を行い、超伝導体の生成を確認することで作成時間を短縮する事ができた。2.接合温度において分解し、拡散を活性化すると共に超伝導特性の改善が期待されるインサート材を用いる事により、超伝導体同士の拡散接合を行い、継手が得られた。また、示差熱分析により超伝導体とインサート材の反応の可能性が示された。3.接合継手について、接合部のせん断試験・組織観察・元素分析・X線回折等を行い、良好な接合部組織が得られている事が示された。

また直流4端子法による臨界温度Tc及び臨界電流密度Jcの測定を行った結果、接合による熱サイクル及びインサート材からの成分元素の拡散によって超伝導特性は大きく影響を受ける事が示された。4.上記2.のインサート材を用いることにより、超伝導特性を損なわずにセラミック高温超伝導体の拡散接合が可能である事が示された。酸化物系超伝導材料のうち、臨界温度T_Cが90K級のYBa_2Cu_3O_<7-X>系超伝導材料は、最も一般的であり実用化が期待されている。実用化に際しては、材料の成形加工及び接合技術が不可欠であるが、接合技術についてはこれまでほとんど報告されていない。本研究では、まずセラミック高温超伝導体を作製し、得られた超伝導体同士の拡散接合を行った。接合継手に対しせん断強度試験・組織観察及びX線回折試験等を行った。また示差熱分析により、接合界面に挿入した銀及び酸化銀インサート材の酸素解離現象を把握し、超伝導特性評価結果と比較して、インサート材中からの元素の拡散が超伝導特性に及ぼす影響について検討した。以下に、本研究によって得られた主な結果をまとめて記す。1.示差熱分析装置での熱分析結果によると、超伝導体に添加した酸化銀は、約350°C付近で酸素を解離していた。酸素欠損量の大きいYBCOは350°C付近で重量の増加が見られ、酸化銀から解離した酸素が超伝導体に取り込まれている可能性が高いことが示唆された。2.酸化銀添加超伝導体と銀添加超伝導体の焼結後のペレットの収縮量を測定した結果により、酸化銀中の銀が超伝導体の密度の向上に寄与していることが示された。3.接合界面近傍のX線回折結果から、インサート材として使用した酸化銀が接合時に酸素を供給することにより超伝導組成の維持に寄与していると判断された。従って、接合を考える上では添加剤あるいはインサート材としては銀よりも酸化銀の方が適していると考えられる。4.接合部のX線回折結果によると、接合時における超伝導相の破壊は最大でも接合界面から0.3mmあたりまでであり、インサート材を拡散させることにより、超伝導特性を損なわずにセラミック高温超伝導体の拡散接合が可能である事が示された。
小中学生のいじめ防止に向けた妬み感情とシャーデンフロイデの喚起メカニズムの解明

本研究の目的は、他者の幸福に対するネガティブな感情である妬みと、他者の不幸に対するポジティブな感情であるシャーデンフロイデに焦点を当て、それらの喚起メカニズムの解明を通じて、学校におけるいじめの予防と介入に役立つ成果を得ることにあった。こうした感情といじめに対する態度の関係を明らかにするために、主に小中学生を対象とした質問紙調査を実施した結果、いじめとは直接関係ない場面でシャーデンフロイデを感じやすい者は、いじめを容認しやすいことがわかった。また、過去約1年以内にいじめに加担した経験が多い中学生が感じる妬みには、加担経験の少ない者が抱くそれと比べて、いじめ排斥態度を高める効果があることも示された。本研究の目的は,小中学生における妬み感情及びシャーデンフロイデと,いじめを代表とする攻撃行動に対する意識との関係を解明することによって,いじめの予防と介入に役立つ研究成果を得ることにあった。まず,中学生約300名を対象として,社会的に望ましい反応に敏感に回答する傾向(社会的望ましさ)が混入することを見越した質問紙調査を実施した。質問紙は,いじめに対する態度(いじめを容認あるいは排斥する態度や,過去一年間にいじめに加担した経験)を測定する尺度と,いじめとは関連のない仮想場面における妬み感情とシャーデンフロイデを測定する尺度から構成されていた。社会的望ましさによる影響を取り除いた解析を通じて,いじめに対する態度に直接関連しているのは,妬み感情というよりはむしろシャーデンフロイデであることが示唆された。また,シャーデンフロイデにはいじめを容認する態度を高める効果があることもわかった。同様の傾向は,約200名の小学生を対象に実施された調査でも確認されたが,妬み感情とシャーデンフロイデの組み合わせが排斥態度を低める影響については,学年が上がるにつれて高まることが明らかになった。こうした研究は,小中学生におけるシャーデンフロイデという感情といじめとの関連性を示す貴重なデータであると判断でき,その成果を日本心理学会第72回大会(北海道大学)や日本発達心理学会第20回大会(日本女子大学)などで順次発表した。本研究の目的は,妬み感情及びシャーデンフロイデと,小中学生におけるいじめに対する意識との関係の解明を通じて,いじめの予防と介入に役立つ研究成果を得ることにある。小中学生約500名を対象として,調査対象者の社会的望ましさが混入することを見越した質問紙調査を実施した。質問紙は,いじめに加担した経験やいじめに対する態度を測定する尺度,ならびに仮想場面における妬み感情とシャーデンフロイデを測定する尺度から構成されていた。社会的望ましさによる影響を取り除いた解析を通じて,いじめを容認する態度を促進するのは,妬み感情ではなくシャーデンフロイデであることが示唆された。また,妬み感情といじめに加担した経験の交互作用が有意傾向であり,妬みを自覚できる者はいじめを排斥する意識が強い傾向にあることも明らかになった。さらに本研究では,シャーデンフロイデに関連した特性として復讐心の働きにも着目し,大学生約500名を対象とした質問紙調査も行った。まず,十分な信頼性と妥当性を有する復讐心尺度の日本語版を作成した上で,復讐心がシャーデンフロイデに及ぼす影響を探索的に検討した。その結果男女ともに復讐心がシャーデンフロイデを促進することや,女性にのみ妬み感情を介したシャーデンフロイデの喚起が特徴的にみられることなどが明らかにされた。なお,以上の研究成果は,日本心理学会第73回大会(立命館大学)や日本パーソナリティ心理学会第18回大会(川崎医療福祉大学)などで順次発表されている。今年度は小中学生だけではなく高校生も含めた約3000名を対象とした大規模な質問紙調査を実施した。質問紙は,過去にいじめに加担した経験やいじめを容認する態度,ならびに規範意識を測定する尺度などから構成された。解析の結果,いじめ加担経験は高校1年まで上昇傾向にあること,中学生においては、教師及び仲間と共有された規範意識は相互に影響し合って容認態度を低める働きを有することなどが明らかにされた。これとは別の中学生約400名を対象とした調査では,学校生活満足度の時系列的な変化によって生徒を類型化し,特性妬みの対処方略選択プロセスを検討した。さらに,小中学生のいじめを排斥する態度といじめに加わる傾向との関連を明らかにするための調査では,いじめに加担した経験の有無と,いじめに遭遇した際に喚起される感情のパターンに応じて,規範意識がいじめ加害傾向を抑制する効果に違いがみられた。

加えて,いじめの加害と看過に関する基礎的な知見を得るために,大学生の量刑判断に及ぼす復讐心の働きに着目した調査も実施したところ,復讐心の抱きやすさが量刑の厳罰化を促進する可能性が示唆された。以上の研究成果の一部は,日本心理学会第74回大会(大阪大学)や日本パーソナリティ心理学会第19回大会(慶応義塾大学)などで順次発表された。
新奇な海洋性超好熱細菌からの有用耐熱酵素の開発・利用に関する研究

200°C以上の海底熱水口が発見されて以来、100°C以上で増殖可能な新奇細菌群(超好熱細菌)が分離され新しい遺伝子資源として脚光を浴びているが、高温・高圧といった培養条件の困難さから利用には至っていない。本試験研究では、産業的に利用価値が高いと考えられる80100°Cで増殖可能な海洋性超好熱細菌を分離培養するシステムを確立するとともに、医学、遺伝子工学や食品工業で切望されている超耐熱酵素の検索、精製およびその遺伝子クローニングを行い利用しようとするものである。研究成果の概要は下記の通りである。(1)耐圧耐熱のガラス瓶と特殊ブチルゴム栓を用いて、気相をガス置換(H_280%:CO_220%)し100°Cまで培養可能な嫌気培養システムを確立した。また耐熱性グリースや種々の断熱材を使用して、95°Cまで振盪可能な好気性の振盪回転培養システムを開発した。本試作機を用いることにより、好気および嫌気性超好熱細菌を効率よく分離・培養することが可能となった。16rDNAの塩基配列より、OKD7は原始的な真正細菌で、K1は原始的な古細菌であった。またK1は本遺伝子中に699bpからなるイントロンを有していた。心不全の診断薬として有望視されている炭酸固定酵素phosphoenolpyruvate carboxylaseをOKD7から精製した結果、本酵素はアロステリック酵素で種々のエフェクターを有していたが、メタン細菌のそれはエフェクターを有しないため利用価値が極めて高いと思われる。またK1が生産する菌体外プロテアーゼは、精製の結果未報告の金属プロテアーゼで反応の至適温度は110°Cで、Ca^<2+>存在下で著しく安定化され利用価値が高いと考えられた。TS100株のDNAポリメラーゼは極めて耐熱性が高く、遺伝子クローニングを行った結果PCR反応に有効であることが明らかになった。近年深海探索船により200°C以上の海底熱水口が発見され、沸点以上で増殖可能な新奇細菌群(超好熱細菌)が発見され、新しい遺伝子資源として脚光を浴びているが、高温・高圧といった培養条件の困難さから利用するには至っていない。本試験研究では、産業的に利用価値が高い80120°Cで増殖可能な海洋性超好熱細菌を分離培養するシステムを確立するとともに、医学、遺伝子工学や食品工業で切望されている超耐熱酵素の検索、精製、クローニングを行い利用に結び付けようとするものである。本年度の研究実績の概要は下記の通りである。(1)耐圧耐熱性のガラス瓶と特殊ブテルゴム栓を用いて、気相をガス置換(H_280%:CO_220%)し95°Cまで浸透培養可能な培養システムを確立した。(2)代表的な分離株としては、長崎県橘湾の海底熱水口より好気性超好熱細菌OKD7株、嫌気性超好熱細菌Pyrococcus TS100、メタン細菌Methanococcus TS300等がある。OKD7は赤い色素を有する桿菌で至適増殖温度が80°Cであり、他の2株は球菌でTS100は至適温度が103°C、TS300は88°Cであった。

OKD7は、16SrDNAの塩基配列より新種の原始的な真正細菌であった。(3)心不全の診断薬として有望視されている炭酸固定酵素phosphoenolpyruvate carboxylaseをOKD7から精製した結果、本酵素はアロステリック酵素で種々のエフェクターを有していたが、メタン細菌のそれはエフェクターを有しないため利用価値が極めて高いと思われる。また遺伝子工学に必須のPCR法に使用される耐熱性DNA polymeraseをTS100から部分精製したところ、極めて耐熱性が大きく現在利用に向けてクローニングを行っている段階である。近年200°C以上に海底熱水口の発見とともに、100°C以上で増殖可能な新奇細菌群(超好熱細菌)が分離され、新しい遺伝子資源として脚光を浴びているが、高温・高圧といった培養条件の困難さから利用するには至っていない。本試験研究では、産業的に利用価値が高い80100°Cで増殖可能な海洋性超好熱細菌を分離培養するシステムを確立するとともに、医学、遺伝子工学や食品工業の分野で切望されている超好熱酵素の検索、精製およびその遺伝子クローニングを用い利用しようとするものである。本年度の研究実績の概要は下記の通りである。(1)既存の振盪回転培養機に耐熱性グリース、種々の断熱材や耐熱基盤を使うことにより、好気条件下で95°Cまで振盪培養可能なシステムを確立した。本試作機を用いることにより、従来不可能であった好気性超好熱細菌を効率よく分離・培養することが可能となった。(2)代表的な分離株としては、鹿児島県トカラ列島の子宝島の海岸熱水口より好気性超好熱細菌K1株、長崎県橘湾の海底熱水口より同細菌TB1株および同県小浜温泉より同細菌OH2株等である。いずれも好気性の不定型球菌で運動性を有し、至適増殖温度が9095°Cであり従来の好気性細菌の至適増殖温度より10°C以上高かった。16SrRNA遺伝子の塩基配列より、これら3株は同属に属する近縁種で新種の原始的な古細菌であった。(3)K1株は菌体外プロテアーゼを生産することから、本酵素を精製したところ分子量52kDaの金属プロテアーゼで、反応の至適温度は110°CでCa^<2+>存在下で著しく安定化され110°C4時間の加熱でも全く活性が低下しなかった。また昨年度分離した嫌気性超好熱細菌PyrococcusTS100株のDNAポリメラーゼは、その遺伝子クローニングを行い利用に向けて検討を行った結果PCR反応に有用であることが明らかになった。
非相同的組換えとDNAの二本鎖切断の修復

染色体異常は、癌や遺伝子疾患の原因として重要であるが、その原因である非相同的組換えの機構については殆ど明らかにされていない。我々は、大腸菌と酵母を用いて非相同的組換えの機構を遺伝学的に解析した。(1)我々は、大腸菌のヒストン様蛋白質であるHUの欠損変異株においてDNAジャイレースに依存する非相同的組換えが自然に誘発されることを見いだした。HUは、ジャイレースが正常な働きをするのを助けていると考えられる。(2)紫外線などによるDNAの損傷によって誘導される非相同的組換えの機構を解析し、RecJエキソヌクレアーゼ、RecQヘリカーゼ、除去修復に働くUvrAたんぱく質などが非相同的組換えに関与していることを明らかにした。(3)出芽酵母のKu抗原ホモログ(Hdf1)の非相同的組換えにおける機能を調べるために、two hybrid systemを用いてHdf1と相互作用する因子の同定を行い、サイレンシング因子Sir4がHdf1と相互作用することを明らかにした。さらに、Sir2、Sir3、Sir4がDNAのヘテロクロマチン化をへてDNAのエンドジョイニングに働くことを明らかにした。さらに、DNAのエンドジョイニングを介して組換えと修復に働くことを明らかにした。(4)ブルーム症候群、ウェルナ-症候群原因遺伝子(BLM,WRN)を出芽酵母の中で発現させ、出芽酵母のこれらの原因遺伝子のホモログであり、RecQホモログでもあるSGS1遺伝子の変異を相補できるかどうかを調べたところ、両遺伝子はともにSGS1遺伝子の組換え抑制機能の欠損を相補できることがわかった。このことは、BLMとWRNの組換え機能の欠損が、ヒトのブルーム症候群、ウェルナ-症候群の細胞で見られる染色体の不安定性の原因であることを示唆している。
酵母における生物時計の遺伝学的,分子生物学的解析

我々は,出芽酵母よりショウジョウバエの時計遺伝子perとかなり広い範囲で相同性を示す遺伝子GTS1をクローン化した.そして,遺伝子操作でGTS1遺伝子欠損株、多コピー遺伝子導入株を作成し表現型を調べたところ,出芽時間,および細胞サイズが遺伝子数,および転写産物量(Gts1タンパク質)に依存的に変化することを認めた.さらに最近,(1)これまで酵母,ハエなどで時計遺伝子の表現型として知られている,熱抵抗性,胞子形成,寿命などで,Gts1が関与しているかをしらべたところ,それぞれにおいて,Gts1タンパクの発現量にほぼ比例した効果が見られることがわかった.また,多量発現させた場合,凝集反応が起こることが解った.(2)Gts1タンパク質がリン酸化タンパク質であり,セリン残基にリン酸化されていること,ヒドロキシウレアなどで細胞周期を停止すると脱リン酸化型が消え,すべてリン酸化型に移行するとをみとめた.現在,Gts1タンパクを多量発生させて,精製し,リン酸化サイトの同定をおこなっている.(3)two-hybrid法でGts1タンパクが細胞内でホモダイマーとして機能していることを見い出し,ホモダイマー形成にややカルボキシ末端側の20残基の部位が関与しており,その中のアスパラギン酸が重要であることが解った.(4)Gts1と結合するタンパク質の検索をtwo-hybrid法でおこない,いくつかの候補タンパク質を同定した.また,ホモダイマー形成部位と相同性をもつ多剤抵抗性トランスポーターと結合することが解り,その意義を検討中である.我々は,生物時計を支配する遺伝子,タンパク質,および時計機能の分子機構について研究するため,出芽酵母よりかなり広い範囲でショウジョウバエの時計遺伝子perと相同性を示し、幾つかのリン酸化部位、糖鎖付加部位をもつ遺伝子をクローン化し,GTS1と命名した.そして,遺伝子操作でGTS1遺伝子欠損株、多コピーGTS1遺伝子導入株を作成し、次の様なことを明らかにしてきた.1.酵母はハプロイドあたり1コピーのGTS1遺伝子をもち,その遺伝子の転写産物(GTS1mRNA)は1.8kbpで,遺伝子の塩基配列から推定されたサイズに一致した.2.大腸菌でGTS1タンパク質を大量発現させて作成した抗体を用いてウエスタンブロットをおこなった結果では、GTS1タンパク質は約45キロダルトンの単一のバンドをしめし,翻訳後の糖鎖付加などの修飾も受けていないと推定された.また,多コピー株では,野性株の約20倍のタンパク質をふくみ,欠損株ではGTS1タンパク質は全く認められなかった.3.成長曲線をとって3者を比較したところ,成長速度にはあまり差が無かったが,出芽の開始時間が、欠損株で最も早く,多コピー株で最も遅かった.そこで,細胞周期のパラメーターを測定したところ,出芽のタイミングがGTS1遺伝子数,したがって,転写産物量に依存的に変化することを認めた.これは,Hartwellらがcdc4変異株の研究から予言した、出芽時間を調節する「タイマー」の性質に一致する.4.そこで,cdc4変異株を用いて,GTS1遺伝子の欠損株,多コピー株等を作成し,出芽のタイミングを調べたところ,やはりGTS1遺伝子dosageに依存したズレが見られた.5.細胞サイズが欠損株で最も小さく,多コピー株で最も大きいことから,この遺伝子は,出芽のタイミングを調節することによって,細胞サイズをコントロールしているものと思われる.(以上論文投稿中)我々は,生物時計を支配する遺伝子,タンパク質,および時計機能の分子機構について研究するため,出芽酵母よりかなり広い範囲でショウジョウバエの時計遺伝子perと相同性を示す遺伝子をクローン化し,GTS1と命名した。そして,遺伝子操作でGTS1遺伝子欠損株、多コピーGTS1遺伝子導入株を作成し,1コピーのGTS1遺伝子をもつ野性株と表現型を比較した。その結果,1.成長曲線を3者で比較したところ,成長速度にはあまり差が無かったが,出芽の開始時間が、欠損株で最も早く,多コピー株で最も遅かった。そこで、細胞周期のパラメーターを測定したところ,出芽のタイミングがGTS1遺伝子数,したがって,転写産物量に依存的に変化することを認めた。さらに,cdc4変異株を用いて,GTS1遺伝子の欠損株,多コピー株等を作成し,出芽のタイミングを調べたところ,やはりGTS1遺伝子量に依存したズレが見られた。2.細胞サイズが欠損株で最も小さく,多コピー株で最も大きいことから,この遺伝子は,出芽のタイミングを調節することによって,細胞サイズをコントロールしているものと考えられる。3.GTS1遺伝子産物(GTS1タンパク質)は約45キロダルトンで,種々の糖鎖切断酵素などの実験から糖鎖による修飾は受けていないことがわかった。4.^<32>P標識実験からGTS1タンパク質がリン酸化タンパクで,おもにセリン残基がリン酸化されている事がわかった。このリン酸化はαファクターやDNA合成阻害剤,細胞周期変異株の実験から,G1期に特異的に促進されることがわかった。現在,リン酸化部位の同定とその意義について実験中である。また,抗GTS1抗体を用いた免疫沈降反応で,いくつかのタンパク質と結合している事が認められ,two-hybrid法でそれらの同定を行っている。我々は,出芽酵母よりショウジョウバエの時計遺伝子perとかなり広い範囲で相同性を示す遺伝子GTS1をクローン化した.そして,遺伝子操作でGTS1遺伝子欠損株、多コピー遺伝子導入株を作成し表現型を調べたところ,出芽時間,および細胞サイズが遺伝子数,および転写産物量(Gts1タンパク質)に依存的に変化することを認めた.

さらに最近,(1)これまで酵母,ハエなどで時計遺伝子の表現型として知られている,熱抵抗性,胞子形成,寿命などで,Gts1が関与しているかをしらべたところ,それぞれにおいて,Gts1タンパクの発現量にほぼ比例した効果が見られることがわかった.また,多量発現させた場合,凝集反応が起こることが解った.(2)Gts1タンパク質がリン酸化タンパク質であり,セリン残基にリン酸化されていること,ヒドロキシウレアなどで細胞周期を停止すると脱リン酸化型が消え,すべてリン酸化型に移行するとをみとめた.現在,Gts1タンパクを多量発生させて,精製し,リン酸化サイトの同定をおこなっている.(3)two-hybrid法でGts1タンパクが細胞内でホモダイマーとして機能していることを見い出し,ホモダイマー形成にややカルボキシ末端側の20残基の部位が関与しており,その中のアスパラギン酸が重要であることが解った.(4)Gts1と結合するタンパク質の検索をtwo-hybrid法でおこない,いくつかの候補タンパク質を同定した.また,ホモダイマー形成部位と相同性をもつ多剤抵抗性トランスポーターと結合することが解り,その意義を検討中である.