hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血液・血管系幹細胞の未分化性維持機構の解析

1.血球分化能を持つ血管内皮細胞、中胚葉及び血管内皮から発生した造血前駆細胞をそれぞれ特異的なマーカーを利用して同定できることを明らかにした。2.マウス胚体内組織AGM領域の血管内皮は造血幹細胞の発生起源の一つとされているが、AGM領域の血管内皮細胞はリンパ球産生に強くバイアスがかかった血液分化能しか持たないことを明らかにした。3.転写因子c-Mybを誘導的に強制発現するES細胞を作製し、血管内皮細胞が持つ血液細胞発生プログラムにc-Mybが関与し得ることを、試験管内分化実験系により明らかにした。4.転写因子c-Mybを欠損するES細胞に外来のc-Myb遺伝子を誘導的に発現させる実験系を構築し、血液細胞の分化過程においてc-Mybの発現が量的にも時間的にも厳密に制御されなければならないことを明らかにした。5.ES細胞から分化誘導した血管内皮細胞において細胞接着装置の動態を解析したところ、血管内皮細胞は細胞同士の接着を維持しながら高い運動1生を保持し、細胞接着装置が動的にリモデリングされることを明らかにした。6.転写因子Foxo1の生理的な機能に関して遺伝子を標的破壊したES細胞及びマウスを用いて解析し、血管内皮細胞がVEGFに対して適切に応答し正常な形態変化と血管新生を行うためにFoxo1が必要であることを明らかにした。7.心筋梗塞後に、新生血管に動員される細胞及び骨髄中の血液細胞の一部において、血管内皮に特異的なVE-カドヘリン遺伝子プロモーターが活性化することを、トランスジェニックマウスを用いた解析より明らかにした。本研究は、複数の分化プログラムを構成するコンポーネントが混在している状態が多能性を支配する本質であると捉え、以下の2つの項目に関してその機構を解明することを目的としている。1.血液と血管系の起源となる中胚葉細胞の多能性が成立する機構転写因子Gata-2の遺伝子座にGFP遺伝子を相同組換えにより挿入したES細胞を試験管内で分化させ、中胚葉細胞におけるgata-2遺伝子の発現とそれに伴う分化能力の変化を解析した。その結果、中胚葉の段階でgata-2遺伝子を発現していない細胞には、血管内皮細胞と心筋細胞への両分化能を持つ前駆細胞が含まれることが見出された。さらに、gata-2遺伝子の発現に伴って中胚葉細胞は胚型赤血球への分化能力を持つようになり、心筋細胞への分化能力を失うことが明らかにされた。以上の結果から、中胚葉におけるgata-2遺伝子の発現は心筋細胞の分化プログラムと排他的であり、胚型赤血球への分化プログラムと相関することが示唆された。2.血液幹細胞の個体発生の過程でその多能性が成立する機構血管内皮細胞から成体型血液細胞系列が発生する過程で転写因子c-Mybが持つ機能を解析するために、c-myb遺伝子を欠損するES細胞の分化過程において、血管内皮細胞特異的なVE-cadherin遺伝子プロモーターの制御下にc-Mybの発現をレスキューした。その結果、血管内皮細胞の段階でc-Mybが発現するだけでは血液前駆細胞の発生には不十分であることが明らかにされた。今後、ES細胞から血液前駆細胞に至る発生過程においてc-Mybが真に必要とされる分化段階を特定する一方で、血管内皮細胞の中で成体型血液細胞系列への分化を規定する分子の同定を引き続き進める必要がある。1.血液と血管系の起源となる中胚葉細胞の多能性が成立する機構マウスES細胞の試験管内分化系において、Nkx2.5遺伝子の発現を指標に心筋細胞の分化を特異的に検出する実験系を開発したが、心筋の前駆細胞を同定するには至っていない。一方、ES細胞から分化した中胚葉の中に血管平滑筋細胞と血管内皮細胞、あるいは心筋細胞と血管内皮細胞の二分化能を持つ前駆細胞を見出し、これらが共通の前駆細胞に由来する可能性が示唆された。中胚葉は血液細胞の起源でもあるが、中胚葉の段階で転写因子Tallを発現することが胚型赤血球および成体型血液細胞の発生に必要であることを明らかにした。中胚葉における血液分化能は転写因子Gata-2を発現する細胞に限局しているが、Tallを強制発現させることによりGata-2を発現しない細胞にも血液分化能を賦与できることを見出した。2.血液幹細胞の個体発生の過程でその多能性が成立する機構胎生期の血管内皮細胞が血液細胞に分化することを、in vivoにおける細胞移植実験および細胞標識実験で証明した。成体型血液細胞系列の起源について詳細に検討した結果、CD41(+)VE-カドヘリン(+/-)前駆細胞およびCD41(-)VE-カドヘリン(+)血管内皮細胞の2つの起源があり、発生時期と場所により多能性に差があることを明らかにした。血管内皮細胞は一過性に血液分化プログラムを内包すると考えられるが、転写因子c-Mybが血管内皮細胞の血液分化能に対して促進的に機能し得ることをES細胞を用いた誘導的強制発現により見出した。一方血管内皮・血液細胞特異的プロモーターによるc-myb発現はc-myb欠損ES細胞の血液分化能を回復させなかったため、テトラサイクリンによる誘導的発現系をc-myb欠損ES細胞に組み込み、その形質の解析を進めている。

1.血液と血管系の起源となる中胚葉細胞の多能性が成立する機構マウスES細胞から試験管内で分化させた中胚葉細胞による血管内皮細胞、血管平滑筋細胞および心筋細胞への分化をクローンレベルで同時に検出する実験系を構築した。その結果、中胚葉細胞集団中に血管内皮細胞、血管平滑筋細胞および心筋細胞への三分化能を持つ前駆細胞を見いだした。この細胞を純化するためのマーカーの検索が今後の課題である。また、心筋細胞への分化能は血管内皮細胞もしくは血管平滑筋細胞への分化能と共存し、心筋細胞への単能性を示す前駆細胞の頻度が非常に低いことから、多能性中胚葉細胞から単能性の前駆細胞に順次分化する過程で心筋細胞への分化能が比較的後期まで保存されることが明らかとなった。2.血液幹細胞の個体発生の過程でその多能性が成立する機構転写因子c-Mybが血管内皮細胞の血液分化能に対して促進的に機能することから、c-Mybは血管内皮細胞が内包する血液分化プログラムの一部であると考えられるが、テトラサイクリンによるc-Mybの誘導的発現系をc-Myb遺伝子欠損ES細胞に組み込んで血液分化能のレスキュー実験を行ったところ、血管内皮細胞におけるc-Mybの発現は少なくとも赤血球及び骨髄球系細胞の発生には必須でないことが明らかにされた。造血幹細胞は胚体内の血管内皮細胞から発生するという仮説が提唱され支持されているが、胚体内の血管内皮細胞は赤血球や骨髄球系の前駆細胞へ分化することはなく、リンパ球系への分化能しか持たないことを見いだした。造血幹細胞の細胞系譜的起源は未だ確定しておらず、これを明らかにすることが今後の重要な課題である。造血システムの発生において造血幹細胞のStemnessが成立する機構を理解するためには、造血幹細胞に分化する直接の前駆細胞を明らかにする必要がある。マウスの造血幹細胞は胎生10.5日の胎仔下位体幹AGM領域で発生することが受け入れられている。造血幹細胞は背側大動脈の内皮細胞に由来することが提唱されてきたが、背側大動脈よりさらに腹側に局在するCD41陽性細胞が造血幹細胞を含むことが示されるなど、造血幹細胞の細胞系譜的起源についてはなお議論の余地がある。本研究では、これらの細胞集団をマウス卵黄嚢と胎仔下位体幹からそれぞれ分離しその血液分化能を評価した。CD41陽性細胞は、胎生9.511.5日の卵黄嚢および胎仔体幹部のいずれから分離した場合にも赤血球、骨髄球およびBリンパ球への分化能を示した。一方、内皮細胞は胎生9.510.5日の組織から分離した場合にのみ血液分化能を示した。卵黄嚢から分離された内皮細胞は赤血球、骨髄球およびBリンパ球への分化能を示したが、胎仔体幹から分離された内皮細胞からはBリンパ球に極度に偏向した培養しか得られなかった。Dll1を発現するOP9細胞を用いた解析により、胎生10.5日の組織から分離されたいずれの細胞集団においてもTリンパ球への分化能を検出することができた。しかし、致死量放射線を照射されたマウスへの移植においては、いずれの細胞集団についても骨髄再構築能を認めることができなかった。以上の結果から、AGM領域を含む胎仔体幹の内皮細胞はリンパ球系列に偏向した血液分化能しか持たず、AGM領域の造血幹細胞はその場で内皮細胞から分化したものではないことが示唆される。現在、内皮細胞およびCD41陽性細胞に由来する全ての細胞系列を追跡するためのTGマウスを作成中であり、今後これらを用いて骨髄造血幹細胞の細胞系譜的起源を明らかにする予定である。
ミトコンドリアが関与する寿命決定の分子メカニズム

モデル生物であるショウジョウバエは,老化研究においてもまた有用である。本研究では,老化に関するモデル実験系としてのショウジョウバエの普遍性を検証すること,および加齢にともなうさまざまな現象を基礎として,寿命決定にミトコンドリアが関わる機構を考察することを目的とした。平成15年度,16年度の2年間にわたって研究を行い,以下の点を明らかにした。(1)加齢にともなって欠失をもつmtDNAが蓄積することが,PCRとサザンハイブリダイゼーションによって示された。欠失の生じる部位には,ダイレクトリピートが頻繁に存在していた。また,DNAの酸化マーカーである80H-dG量は,核DNAよりもmtDNAに多く,羽化後1日よりも55日で有意に増加していた。これらの結果より,ショウジョウバエにおいても,老化にともなってmtDNAが損傷を受けることが確認された。(2)成虫の胸部筋肉のミトコンドリアでは,電子顕微鏡による観察から,加齢した個体でミトコンドリアの顕著な肥大が見られた。この変化は,死亡率の増加する以前の35日齢頃には現れていることが分かった。一方,呼吸鎖複合体の活性を,複合体IおよびIIが関わる経路について調べたところ,いずれの場合も,活性は羽化後から徐々に低下することが示された。(3)核ゲノムが同一でmtDNAが異なるD.melanogasterのいくつかの系統の寿命を28°Cで測定したところ,異種に由来するmtDNAをもつ系統では,mtDNAが置換していない系統と比較して,寿命が有意に短くなっていた。本研究の成果より,加齢にともなうミトコンドリアの変化の詳細が,ショウジョウバエにおいて把握できた。いずれもミトコンドリアとmtDNAが老化と寿命に大きく関わっていることを示唆するものであり,ショウジョウバエがモデル系として有用であることが確認された。さらに核ゲノム側からの検討もあわせて,寿命と直接的に関連する過程を同定していくことは,今後の老化研究に大きく貢献するものと考えられる。ミトコンドリア内で生成される活性酸素によるタンパク質やDNAの損傷が老化の要因であるとする考えは,ヒトをはじめ,いくつかのモデル生物によって検討されてきた。本研究では,ショウジョウバエを用いてミトコンドリアDNA(mtDNA)の塩基配列によって有意に異なる寿命の決定機構を検討することを目的としているが,そのために本年度は,D.melanogasterを用いて,加齢にともなって生じるmtDNAの構造変化,およびミトコンドリアの形態や呼吸鎖複合体の活性の加齢にともなう変化の解析を行った。その結果,以下の点が明らかとなった。(1)mtDNAのほぼ全域を4つに分割し,PCRによって欠失の有無を調べたところ,5565日齢の個体では欠失を含むと思われる小さなDNA断片の増幅が見られた。このようなDNA断片の塩基配列を多数決定し,欠失が含まれていること,また,欠失の生じる部位にはダイレクトリピートが頻繁にみられることを確認した。このことより,欠失の生成には,ダイレクトリピートが関与する機構がふくまれていることが示唆される。(2)さまざまな日齢の成虫個体の胸部筋肉を用いて,電子顕微鏡によってミトコンドリアの形態の観察を行った。加齢した個体ではミトコンドリアの断面積の増加が見られたが,35日齢頃からこの変化が現れることが明らかとなった。

(3)さまざまな日齢の成虫から調整したミトコンドリアを用いて,呼吸鎖複合体の活性を複合体IおよびIIから電子が流れる経路について調べたところ,いずれの場合も,35日齢より前から活性の減少があることが示された。これらの結果は,いずれも死亡率が増加する以前の35日齢頃からミトコンドリアの構造や機能に変化が現れはじめることを示し,呼吸鎖の変化によって活性酸素が増加することがDNAの損傷にもつながる可能性を示唆している。現在,mtDNAの点変異についての解析も進めており,これらの結果を総合して,ショウジョウバエの加齢にともなうミトコンドリアの変化の全体像をまとめたい。モデル生物であるショウジョウバエは、老化研究においてもまた有用である。本研究では、ミトコンドリア内で生成される活性酸素による生体分子の損傷が老化の要因とする説を、ショウジョウバエにおいて検証すること、および加齢にともなうさまざまな現象を基に寿命決定にミトコンドリアが関わる機構を考察することを目的としている。本年度は、加齢にともなうミトコンドリアDNA(mtDNA)の変化をさらに調査するとともに、mtDNAの塩基配列と寿命の関係について解析を進めた。(1)D.melanogasterの標準的な野生型の系統を用い、加齢にともなってmtDNAに欠失が蓄積することを以前に示したが、さらに点突然変異、DNAの酸化マーカーである8OH-dGについて調べた。その結果、点突然変異は羽化後1日と55、65日で有意な差は見られなかった。この理由については現在検討中である。それに対し、8OH-dG量は、核DNAよりもmtDNAに多く、いずれも羽化後1日よりも55日で有意に増加していた。(2)核ゲノムが同一でmtDNAが異なるD.melanogasterのいくつかの系統を用い、ストレスが高いと思われる28°Cにおいて寿命を測定したところ、異種に由来するmtDNAをもつ系統では、寿命が短くなる傾向が再確認された。これらのmtDNAの塩基配列の確定を現在進めている。さらに、これらの系統のひとつとそのコントロール系統について、一生の行動量を測定することを試みたところ、mtDNAの塩基配列によって行動量やリズムに差異のある傾向が示された。これらの結果は、mtDNAが寿命と大きく関わっていることが示唆するものであるが、その詳細な機構についてはさらに検討が必要である。ことに、行動に変化が現れる機構は老化との関連においても興味深く、今後も解析を進める予定である。
血漿交換による内皮依存性血管拡張反応の改善

高脂血症において動脈硬化発症前より内皮機能異常が存在することが知られており、内皮機能異常が動脈硬化発症に大きく関与することが示唆されてきた。高脂血症患者においては、急速な動脈硬化の進展のため早期より心血管系合併症を高率に発症し予後が著しく不良であることから、その治療が急務となっている。現在、血中脂質を低下させる治療法として、食餌・運動などの生活習慣改善のほか、HMG-CoA還元酵素阻害薬をはじめとした脂質降下剤による薬物療法と血中のLDLを選択的に吸着するLDLアフェレ-シス療法がある。脂質降下剤の長期投与により動脈硬化の退縮をきたし血管内皮機能が改善することが知られており、同様の効果はLDLアフェレ-シスを繰り返す事によっても得られている。しかしながら、LDLアフェレ-シスは一回のセッションで血中のLDLを70%前後も急速かつ効果的に除去しうる治療法であり、LDLアフェレ-シスよる虚血症状の改善は脂質降下剤の効果よりしばしば急速かつ劇的であることから、その内皮気機能改善効果は必ずしも動脈硬化病変の退縮によらない可能性が考えられる。LDL及び酸化LDLは内皮依存性血管拡張反応を強力に抑制し、同時にLDL-アフェレ-シスNo産生刺激物質であるブラジキニン血中濃度を増加させることから、単回のLDL-アフェレ-シスによっても内皮依存性血管拡張反応が改善する可能性がある。そこで、我々はLDL-アフェレ-シスを施行している高脂血症患者において、前腕動脈に内皮依存性血管拡張物質であるアセチルコリンと内皮非依存性血管拡張物質であるニトロプルシッドナトリウムを注入することにより、単回のLDLアフェレ-シス前後の血管拡張反応を検討した。単回のLDL-アフェレ-シスは血漿中LDLとともに血漿中酸化LDL濃度を著減させた。LDL-アフェレ-シスはニトロプルシッドナトリウムによる内皮非依存性血管拡張反応に影響を与えなかった。しかし、アセチルコリンによる内皮依存性血管拡張反応はLDLアフェレ-シスによって急速に脂質を低下させることにより血管構築が変化しないような短時間内に血管内皮機能は改善することを示す。今回の我々の結果は、LDL-アフェレ-シスの臨床的意義を裏打ちすることであり、同時にヒトにおいて循環血中のLDL又は酸化LDLが直接内皮機能異常をもたらすという新しい概念を提唱するものである。この結果は第50回米国心臓学会高血圧評価委員会において口頭発表されその後full manuscriptとてCirculationにoriginalityを讃えるEditorial Comment付きで掲載された。
ヒト生殖領域における過酸化脂質分解産物の視点からの酸化ストレスの解析

初年度に女性因子不妊における妊孕能低下との関連を報告したサイトカインFractalkine(FRK)の生理学的状態を検討する目的で、子宮頸管粘液中FRK濃度を解析した結果、高濃度の蛋白レベルでFRKが存在することを確認した。その産生源としては、子宮頸管腺上皮と考えられた。次に、女性因子不妊における酸化ストレスと妊孕能の関連を解析する目的にて、腹水中のFRK濃度や酸化ストレスマーカーを、子宮内膜症症例群とコントロール群で比較した結果、FRK濃度は子宮内膜症症例で有意に低下していた。酸化ストレスマーカーの一つである8-OHdG(8-Hydroxy-2-Deoxyguanosine)濃度は、子宮内膜症症例で有意に高く、その他の酸化ストレスマーカーも有意差はないものの高い傾向を認めた。我々は、FRKは精子運動能と遊走能を有すること(Hum Reprod 2004)、8-OHdGや過酸化脂質の酸化ストレスが不妊症症例精漿中に有意に高く存在し妊孕能と関連することもすでに報告している(Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2002)。FRK濃度の低下や、酸化ストレスの増加が女性因子不妊、子宮内膜症症例における妊孕能低下にも関与していることが示唆された。さらに、抗酸化作用、過酸化脂質分解産物抑制作用の妊孕能改善効果を検討し、不妊治療への応用の可能性をさぐることを目的として、抗酸化物質NAC(N-acetyl-cystein)の与える影響について検討した。過酸化脂質分解産物4-HNE(4-Hydroxy-2Nonenal)は酸化ストレスマーカーとしてのみならず、シグナルとしての働き、COX2の発現やProstaglanginの産生は抗酸化物質NAC(N-acetyl-cystein)で抑制されることも確認した。我々はまず、婦人科良性疾患手術時に腹水、末梢血の他、腹膜組織、子宮内膜等の組織を採取した。症例を子宮内膜症症例、不妊症例、月経各周期(増殖期、排卵期、分泌期中期、分泌期後期、月経期)に分類し保存した。腹水中Fractalkine(FRK)濃度を解析した結果、腹腔内におけるFRKの産生源として腹水細胞や腹膜が考えられ、腹腔内のFRK濃度は子宮内膜症症例において有意に低下していることを報告した(Int J Gynecol Obstet 91:36-41,2005)。末梢血中のFRK濃度と子宮内膜症との関連は見出せなかった。FRKが精子運動能と遊走能を有することを我々はすでに報告しており(Hum Reprod 2004)、FRKが子宮内膜症症例における妊孕能低下に関与していることが示唆された。次に、子宮内膜におけるFRKの解析を行なった結果、FRKは内膜上皮細胞と腺細胞に局在を認め、FRKのレセプターであるCX3CR1は腺細胞に存在していた。月経各周期別に解析したところ、FRKの転写レベル蛋白レベルでの発現産生は、増殖期と比べて分泌期で有意に高かった。(Int J Gynecol Obstet in press:2006)FRKは子宮内膜における受精着床に関与する可能性があると考えられる。これらの知見は現在有効な治療方法のない原因不明の妊孕能低下症例、受精着床環境不良症例の病態解明につながるが、さらに、酸化ストレスが及ぼす影響について検討予定である。
視細胞株を用いた視細胞変性に対する薬剤の検討

昨年度までに、温度感受性SV40large T抗原遺伝子導入ラット網膜から単離された視細胞株(clone : tsSV40 p-2)を用いて、視細胞死に対して保護作用を有する因子を検討してきた。in vivo動物実験モデルにおいて現在までに視細胞変性に対して保護効果を有することが報告されている栄養因子(BDNF, CNTF)の保護作用について調べた結果、BDNF, CNTFの培地中への添加によって、血清除去によって誘導される細胞死が顕著に抑制された。また、アデノウイルスベクターを用いてCNTF, BDNF遺伝子をtsSV40 p-2に導入したところ、細胞死が、導入しない群に比較して遅延することが明らかとなってきた。本年度は現在市販されている薬剤の中から網膜神経細胞死に対して保護作用を有する薬剤を見出すため、薬剤のスクリーニングを行った。ベタキソロールは緑内障治療薬として使用されている薬剤である。摘出網膜を用いた研究で、低酸素負荷に対する細胞障害に対して、ベタキソロールは保護作用を有することが明らかとなった。また、ベタキソロールの保護のメカニズムは電位依存性カルシウムチャネルブロッカーとして作用することによるとすでに報告されていたが、この研究で細胞外からのカルシウム流入を抑制するだけではなく、細胞カルシウム濃度を別の機構でコントロールしている可能性が示された。また、ベタキソロールと同様緑内障点眼薬であるニプラジロールの保護効果についても検討した。ニプラジロールは一酸化窒素遊離作用を有することが知られている。軸索切断による網膜神経節細胞死に対して保護作用を持つこと、培養細胞を用いた研究でそのメカニズムはcGMP依存性のカスパーゼ活性抑制とカスパーゼのニトロソ化による直接的な酵素活性抑制が介在していることが明らかとなった。温度感受性SV40large T抗原遺伝子導入ラット網膜から単離された視細胞株(clone : tsSV40 p-2)を用いて、視細胞死に対して保護作用を有する因子を検討した。これまでの研究で、tsSV40 p-2は33°Cの培養条件下では増殖し、37°Cでは増殖能を失い、徐々にアポトーシスにより、死に至ることまた、33°Cの培養条件下においても、血清除去によってアポトーシスによって死に至ることが明らかとなっている。この2つの細胞死に対して、どのような因子が保護効果を有するか検討した。まず最初に、in vivo動物実験モデルにおいて現在までに視細胞変性に対して保護効果を有することが報告されている栄養因子(BDNF,CNTF)の保護作用について調べた結果、BDNF、CNTFの培地中への添加によって、血清除去によって誘導される細胞死が顕著に抑制された。また、アデノウイルスベクターを用いてCNTF、BDNF遺伝子をtsSV40 p-2に導入したところ、細胞死が、導入しない群に比較して遅延することが明らかとなった。網膜色素変性の視細胞変性に対して、ある種のカルシウムチャネルブロッカーが保護作用を有することが報告されている。そこで、高血圧症治療薬として用いられているニバジール(ニルバジピン)の視細胞死に対する保護作用を検討した。その結果、tsSV40 p-2の細胞死に対して有意な保護作用は認められなかった。このことから、カルシウムブロッカーの視細胞変性保護作用は、視細胞に対する直接作用ではなく、間接的な効果であることが推察された。
生死を分ける脳炎発火点の解明

ウイルス性脳炎は原因不明のものを含め散発的に発生するが、重症化し、中枢神経系が損傷した場合の社会復帰は困難である。ヘルペスウイルスは、ヒトに脳炎など多彩な病態を引き起こす医学上重要なウイルスである。人類のほぼ全てがヘルペスウイルスに感染している一方で、実際に脳炎発症に至ることは稀である。すなわち、ヘルペスウイルスが脳炎を引き起こすきっかけが何なのかは不明である。本研究は、生体内において、脳炎発症の引き金を引く細胞(群)を特定し、その性状を明らかにすることを目標とする。本研究により、致死的なウイルス性脳炎の発症機序の理解が進み、その対策に貢献できると考えられる。
骨学的形質を用いた獣脚類の呼吸器系進化の解析～生物進化と環境変動の対応を探る試み

まず、前年度までに集めた中生代獣脚類の胸郭骨格に関するデータをワニや鳥類の胸郭変形運動のX線動画(Leon Claessens博士(College of the Holy Cross, Worcester, MA)のデータ)と比較し、胸郭の動きと関節の関係性について確認を行った。ここで行った議論は、2010年10月にピッツバーグで開催される古脊椎動物学会におけるシンポジウムにおいて、共著(Claessens&Hirasawa)で発表する予定である。7月には、フィールド博物館(Field Museum of Natural History, Chicago)およびシカゴ大学Paul Sereno研究室を訪問し、化石標本の調査を行った。この中で、大型獣脚類の肋骨表面に筋痕を確認することができた。現生主竜類の筋の配置から復元すると、これらの筋痕は肋間筋系に対応する。これにより肋骨に対する筋の向きが分かり、胸郭内での肋骨の傾きを推定することが可能になった。続いて、肋骨と椎骨の関節における回転軸の方向データと肋骨の形態を用いて、胸部肋骨を持たない(肋骨-胸部肋骨関節がない)獣脚類の胸郭変形運動をxyz座標上で表せる計測、計算方法を開発し、実際に計算を行った。これにより関節の形態を基にした定性的な議論に終始していた換気ポンプの性質に、定量的な評価が与えられるようになった。その結果、Tyrannosaurus、Allosaurus、Majungsaurusの胸郭変形運動では胸郭の後方部分は,前方部分に対して大きな容積変化を生み出してはいなかったと復元された.したがって、これらの獣脚類は,胸郭変形運動のみでは、現生鳥類に見られる後方の気嚢に吸気を引き込む換気メカニズムを成立させることはできなかったと推定される。これにより、気嚢の獲得と鳥類型呼吸器の確立の間にはギャップがあり、鳥類型換気メカニズムは胸部肋骨を獲得した後期ジュラ紀以降に成立した可能性が高いと考えられる。これまでに記載された中生代獣脚類について文献調査を展開し、19世紀中頃から現在までの記録の大半を洗い出した。これまで胸郭の骨学的特徴の情報は不足していたが、この調査によって過去に記載された標本を包括的に扱う準備が整った.また、Museumd' Histoire Naturelle(Paris)および、Natural History Museum(London)、林原自然科学博物館(岡山)に滞在し、所蔵されている獣脚類化石について、観察・計測を行った。両博物館コレクションの獣脚類標本の大半について調査を実施したが、今年度調査した標本は、化石の保存状態も良く、また、これまで胸郭の形態について情報が少なかった分類群であるため、ここで得られたデータは今1後の研究にとって重要な鍵となっていくだろうと予想している.今年度は、胸郭の離散的な形質について特に重点的に研究をした.博物館における標本調査および文献調査のいずれにおいても、椎骨や肋骨、胸骨、腹肋等の各骨格要素について、例えば「骨化している(1);骨化していない(0)」のように表すようにし、現在までに107種(標本調査:31種;文献調査:76種)の骨学的形質をコンパイルした.これらの形質は、ソフトウェアMesquiteを用いて最節約法で進化プロセスを復元した.この結果については、大学内の古生物学セミナーで発表し、論文としてまとめる準備を現在行っている.同様に、胸郭の連続的な形質(例えば、肋骨の曲率)についてもデータを取ってあり、こちらについても系統図上で形態進化について、特に機能形態学的な観点からアプローチする予定である.さらに、現生四肢動物の呼吸器系に関与する指標(例えばtidal volume)についてもデータを集めており、機能形態学的な解析手法を開発する準備は整い始めている.平成20年4月から6月にかけて、これまでに自身で集めた獣脚類化石の骨学的形質データについて解析を行った。複数の分岐図から獣脚類全体の系統図を作成し、ソフトウェアMesquiteを用いて、胸部骨格の形質進化を最節約的に復元した。また、各タクサが産出する地層の年代データを集め、系統図に年代を入れることにより、それぞれの形質がいつ変化したのかを明らかにした。これらの形質変化は、胸郭の変形運動の自由度を下げ、換気ポンプとしての機械的効率を上げる効果をもたらすものと考えられる。そこで予察的にBerner(2006:Geochimica et Cosmochimica Acta)にある顕生代の大気中酸素濃度、二酸化炭素濃度のシミュレーション復元と、胸郭構造の進化を比較したところ、大まかに見て、胸部肋骨の骨化や鉤状突起の骨化のような現生鳥類の骨格を特徴づける形質変化は、酸素濃度が低く二酸化炭素濃度が高かった後期ジュラ紀に起こったようである。これは現段階ではもちろん予察的だが、注目すべき点であろう。9月には、日本-モンゴル共同古生物学調査(JMJPE)のメンバーとして、東ゴビ地域の下部白亜系の地層でフィールド調査に参加した。これは、クリーニング済の標本からは得られないような産状などの情報を、専門家の目で見て吟味しようという試みである。今回は、通常の調査では採集されないような肋骨化石も採集され、本研究に用いることができることとなった。また、モンゴル古生物学センターに所蔵されているほぼ全ての獣脚類標本について観察・計測を行った。持ち帰った獣脚類肋骨の標本は、薄片を作成し、骨組織を調べるのに用いた。その結果、肋骨断面では、一部に血管の定向配列が見られることが確認された。

これは、筋の付着部位と対応している可能性があるが、シヤーピー線維の痕跡は不明瞭であったため、断定はできない。まず、前年度までに集めた中生代獣脚類の胸郭骨格に関するデータをワニや鳥類の胸郭変形運動のX線動画(Leon Claessens博士(College of the Holy Cross, Worcester, MA)のデータ)と比較し、胸郭の動きと関節の関係性について確認を行った。ここで行った議論は、2010年10月にピッツバーグで開催される古脊椎動物学会におけるシンポジウムにおいて、共著(Claessens&Hirasawa)で発表する予定である。7月には、フィールド博物館(Field Museum of Natural History, Chicago)およびシカゴ大学Paul Sereno研究室を訪問し、化石標本の調査を行った。この中で、大型獣脚類の肋骨表面に筋痕を確認することができた。現生主竜類の筋の配置から復元すると、これらの筋痕は肋間筋系に対応する。これにより肋骨に対する筋の向きが分かり、胸郭内での肋骨の傾きを推定することが可能になった。続いて、肋骨と椎骨の関節における回転軸の方向データと肋骨の形態を用いて、胸部肋骨を持たない(肋骨-胸部肋骨関節がない)獣脚類の胸郭変形運動をxyz座標上で表せる計測、計算方法を開発し、実際に計算を行った。これにより関節の形態を基にした定性的な議論に終始していた換気ポンプの性質に、定量的な評価が与えられるようになった。その結果、Tyrannosaurus、Allosaurus、Majungsaurusの胸郭変形運動では胸郭の後方部分は,前方部分に対して大きな容積変化を生み出してはいなかったと復元された.したがって、これらの獣脚類は,胸郭変形運動のみでは、現生鳥類に見られる後方の気嚢に吸気を引き込む換気メカニズムを成立させることはできなかったと推定される。これにより、気嚢の獲得と鳥類型呼吸器の確立の間にはギャップがあり、鳥類型換気メカニズムは胸部肋骨を獲得した後期ジュラ紀以降に成立した可能性が高いと考えられる。
屋外実験池における水質環境と一次生産および微生物変動に関する研究

滞留時間及び栄養塩濃度を制御できる屋外実験池を用い,栄養塩負荷量と植物プランクトン現存量との関係,栄養塩の挙動に対する動物プランクトンの役割等に関し実験を行い解析した.藻類量は冬期に実験を開始した場合を除き,開始12週間後に最高値に達し,その後動物プランクトンの摂食の影響を受けて大きく変動した.冬期に実験を開始した場合には動物プランクトンの増殖は4月中旬まで観測されず,藻類量は1月から4月にかけて連続的に増加した.リンの見かけの沈降速度Vpは動物プランクトンの増殖していない場合には,実験池の水量負荷(滞留時間)にほぼ関係なく17.921.2my^<-1>の間にあり,平均値は19.3my^<-1>であった.リンの蓄積率Rpは動物プランクトンが増殖していない場合には,水量負荷qsに依存しており,以下のような関係式が得られた. Rp=19.3/(19.3+qs).またこのような条件下では実験池内の全リン濃度Pjは流入全リン負荷濃度Piと水量負荷qsとで決められていることがわかった.動物プランクトンが増殖していない2月から4月にかけて,流入全リン負荷濃度と池内クロロフィルの濃度の間には明確が関係賀認められなかったが,懸濁態窒素濃度との間には直線的な関係が得られた.またこの関係は月により異っていた.この期間, Chl/pp比は連続的に上昇し, 1.13.9を変化した.動物プランクトンの摂食により植物プランクトン現存量は急激に変化したが,植物プランクトンの減少に見合う無機態栄養塩の回帰はみられず,特にリンに関しては溶存態での回帰はごくわずかであることがわかった.一方,窒素に関しては大部分が溶存有機態で回帰しているものと推測された.動物プランクトンの存在により,リンの見かけの沈降速度Vpは高い値を示し,種組成の違いによって, 19.1104.3my^<-1>の間を変動した.滞留時間及び栄養塩濃度を制御できる屋外実験池を用い,栄養塩負荷量と植物プランクトン現存量との関係,栄養塩の挙動に対する動物プランクトンの役割等に関し実験を行い解析した.藻類量は冬期に実験を開始した場合を除き,開始12週間後に最高値に達し,その後動物プランクトンの摂食の影響を受けて大きく変動した.冬期に実験を開始した場合には動物プランクトンの増殖は4月中旬まで観測されず,藻類量は1月から4月にかけて連続的に増加した.リンの見かけの沈降速度Vpは動物プランクトンの増殖していない場合には,実験池の水量負荷(滞留時間)にほぼ関係なく17.921.2my^<-1>の間にあり,平均値は19.3my^<-1>であった.リンの蓄積率Rpは動物プランクトンが増殖していない場合には,水量負荷qsに依存しており,以下のような関係式が得られた. Rp=19.3/(19.3+qs).またこのような条件下では実験池内の全リン濃度Pjは流入全リン負荷濃度Piと水量負荷qsとで決められていることがわかった.動物プランクトンが増殖していない2月から4月にかけて,流入全リン負荷濃度と池内クロロフィルの濃度の間には明確が関係賀認められなかったが,懸濁態窒素濃度との間には直線的な関係が得られた.またこの関係は月により異っていた.この期間, Chl/pp比は連続的に上昇し, 1.13.9を変化した.動物プランクトンの摂食により植物プランクトン現存量は急激に変化したが,植物プランクトンの減少に見合う無機態栄養塩の回帰はみられず,特にリンに関しては溶存態での回帰はごくわずかであることがわかった.一方,窒素に関しては大部分が溶存有機態で回帰しているものと推測された.動物プランクトンの存在により,リンの見かけの沈降速度Vpは高い値を示し,種組成の違いによって, 19.1104.3my^<-1>の間を変動した.国立公害研究所臨湖実験施設にある実験池6個を用いて実験を行った。それぞれの実験池は一辺が3mの6角型をしており深さは1.8mである。実験条件を統一するために池の内側にはナイロン製の内張シートを張って実験を行った。水の滞溜時間は10,20および40日とし、No1No3の実験池ではリンの表面積当りの負荷量を10mg・【m^(-2)】【d^(-1)】とした。その結果、滞溜時間に応じて負荷濃度は0.230,0.116および0.058mg/Iとなった。一方、No4No6の実験池ではリンの表面積当りの負荷をそれぞれ、20,10および5mg【m^(-2)】【d^(-1)】とした。その結果リン負荷濃度は0.115mg/I程度となった。栄養塩の供給はペリスターポンプを用いて冷蔵庫に保存したタンクから行った。水の滞溜時間は霞ヶ浦の除濁湖水を用いて変化させた。リンの試薬としてはK【H_2】P【O_4】を用いた。窒素の試薬はN【H_4】N【O_3】を用いN/P比が10になるよう調整した。以下に得られた結果を述べる。

1.藻類現存量に対する動物プランクトンの影響は非常に大きなことが明らかになった。動物プランクトンの摂食活動による栄養塩の回帰は少かった。2.低濃度の栄養塩を添加した池ではケイ藻が優占する場合が多かったが、高濃度の場合には緑藻類が優占した。ラン藻類の優占は見られなかった。3.生菌数が急激に変化する時期が存在し、その主要因はなんらかの原因により細菌がフロックを形成する為であろうことが推測できた。4.負荷濃度と実験池中の濃度の比をとると、滞溜時間の違いによりこの比が大きく変化することが明らかとなった。すなわち、滞溜時間が短かい場合にこの比が大きく、長くなるにしたがって低下することがわかった。5.懸濁物中のクロロフィル含量,C,N,P含量は季節により大きく変動しており、クロロフィルa/懸濁態リン比は0.54の範囲で変動することが明らかになった。
ラジカル解離型フォトクロミック系の光誘起表面レリーフ構造の形成メカニズムと機能化

本年度はヘキサアリールビスイミダゾール(HABI)誘導体のアモルファス薄膜において光誘起表面レリーフ(PSR)形成を確認し,そのPSR形成は物質移動に起因すること,およびパターン露光の際の明部と暗部における物質量変化に起因した化学ポテンシャル勾配により物質移動が起こることを明らかにした。さらに,PSR形成における置換基効果について比較するため,HABI誘導体(p-MeO-HABI,p-EtO-HABI,p-NO_2-HABI,p-CN-HABI)を合成し,各HABI誘導体のTPIRへの光解離度とPSR形成時の凹凸高低差の関係について検討した。HABI誘導体では明部から暗部への物質移動によりPSR形成することが確認され,PSR構造の凹凸高低差は照射光強度および照射時間に依存することが分かった。ESR測定により,各HABI誘導体薄膜中のTPIR生成量(光解離度)は照射光強度に依存することが分かった。同一の照射条件下において,TPIR生成量の多い,すなわち光解離度の大きい誘導体(電子供与基を置換した誘導体)ほどPSR形成時の凹凸が大きいことが分かった。HABI誘導体は光照射により生成するTPIRが高い酸化力をもつ反応活性種であるため,光記録を目指すフォトクロミック材料としては研究の対象外とされてきたが,1分子のHABIから2分子のTPIRを生じることに着目し,物質量の差に起因した化学ポテンシャル勾配がPSR形成の物質移動に起因していることを提案し,物質量変化を制御することでPSR形成効率の向上がみられることを見出した。これらの結果は,PSR形成方法の一つの方針を提起し,PSR形成効率向上を目指した分子設計指針につながると考えられる。光誘起表面レリーフ(PSR)形成はアゾベンゼンなどのフォトクロミック分子において報告されているが、スピン機能を有するフォトクロミック系での報告はなく、その形成メカニズムについては明確になっていない。種々のフォトクロミック分子を用いた薄膜における光誘起表面レリーフ形成および形成機構の解明は,表面レリーフ形成に適した分子構造の解明という観点からも重要な課題である。本研究ではラジカル解離型フォトクロミズムを示すヘキサアリールビスイミダゾール(HABI)誘導体,o-Cl-HABIのアモルファス薄膜のPSR形成について検討し,ラジカル解離型フォトクロミック分子に特徴的なPSR形成機構を見出すことを目的とした。本年度はo-Cl-HABI薄膜にパターン露光を施すと,明部では2分子のo-Cl-TPIRが生成し,暗部ではo-Cl-HABIが残る。化学ポテンシャルは物質量変化に依存するため,明部と暗部の物質量変化により,明部と暗部の間に化学ポテンシャル勾配が誘起される。化学ポテンシャル勾配が生じるとo-Cl-HABI薄膜の明部から暗部,あるいは暗部から明部への物質移動(拡散)が可能となり,結果として明部が凹,暗部が凸となるPSR構造が形成されることを明らかにした。初めて化学ポテンシャル勾配に起因する光物質移動を明らかにしたといえる。
生体光センシング技術への応用を目指した磁気共鳴ラマン分光法の新規研究開発

物質に一定波長の光を照射すると、物質を構成する分子の振動に依存して波長が変化するラマン散乱光が発生する。近年、ラマン散乱光分析は非標識観察技術として生命科学分野で注目され、生体応用の試みが盛んになっている。申請者もラマン分光分析により正常組織と線維化、炎症、脂肪蓄積などの病変組織を判別することに成功したが、生体由来ラマン散乱光は極めて複雑かつ微弱で、病変物質の特定には至っていない。そこで、磁気共鳴技術との融合によって生体由来ラマン散乱光を修飾し、より多くの情報を引き出す「磁気共鳴ラマン分光法」という光センシングの新概念を開き、生体光センシング技術への応用の可能性を検証する。
加齢黄斑変性症における上皮間葉転換のレドックス制御を標的とした創薬への基盤研究

網膜色素上皮細胞の上皮間葉転換(EMT)を検討した。我々は、炎症性サイトカインTumor necrosis factor-αがヒアルロン酸受容体CD44の細胞質内ドメイン結合タンパクであるMerlinの発現低下を誘導し、Merlinの発現低下により、CD44とActin細胞骨格の架橋タンパクであるERMタンパクが活性化すると同時にヒアルロン酸の細胞内取り込みが亢進し、このヒアルロン酸取り込みがp38MAPKの活性化に必要であった。MerlinはTAK1の活性化にも関与し、p38MAPKのリン酸化、細胞増殖を制御することを明らかにした。網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells; RPE)へのストレス負荷による上皮間葉転換(EMT;epithelial mesenchymal transition)を検討するために、より臨床に即した病的状態でのEMTを確認する実験系を作成した。方法は裂孔原性網膜剥離、黄斑前膜、黄斑円孔にて硝子体手術を行った際に採取した硝子体サンプルをヒトRPE細胞株に添加し2D培養を行った。硝子体サンプルの取得については当大学倫理委員会にて受理され、同意を得た患者より術中硝子体サンプルを取得した。サンプルを60分負荷後に機械的ストレスをかけ、細胞誘導能と細胞内シグナル伝達を解析した。また3D培養を行い各病的硝子体負荷にてよる細胞の形態変化も確認した。結果は黄斑上膜、裂孔原性網膜剥離患者より採取した硝子体サンプルを無血清培地へ添加し、シグナルの活性化について検討した。一部の硝子体サンプル刺激によりSmad2, p38MAPKの活性化を認めたが、疾患群における差は認めなかった。NFkappaBのリン酸化はウエスタンブロットでは認めなかったが、免疫染色では一部の細胞に核内移行を認めた。細胞運動能に関しては20%硝子体刺激下にてwound healing assayにて解析を行った。硝子体刺激では細胞運動能の明らかな亢進は認めなかった。機械的刺激によりSmad2のリン酸化の亢進を認めた。さらに、硝子体刺激を行うと、疾患群に関わらず、p38MAPKのリン酸化が亢進することがわかった。3D培養では硝子体負荷にて星状の形態変化が認められた。ヒト網膜色素上皮細胞(ARPE-19)を用いて、EMT誘導因子であるTNF-α刺激を行い、Merlinの発現、局在について検討した所、TNF-α刺激下ではMerlinの発現は減少し、膜貫通型受容体CD44との結合も減少した。次にsiRNAを用いてMerlinの発現を特異的に抑制(siMerlin)した所、siMerlin細胞において、ERMタンパク質のリン酸化が亢進し、ヒアルロン酸の取り込みが有意に亢進した。siMerlin細胞ではTAK1-p38MAPK経路の活性化とBrdU取り込みが亢進し、BrdUの取り込みはTAK1阻害薬で有意に抑制され、TAK1阻害薬はTNF-αによるEMTも抑制した。以上よりMerlinはヒアルロン酸取り込みに伴うTAK1-p38MAPKシグナルの活性化を制御し、EMTの維持だけでなく細胞増殖にも関与していた。この経路は眼内の増殖性線維性疾患の新たな治療標的となると考えられた。RPE細胞のEMTモデルを用いて、EMTと酸化ストレスの相互作用による加齢黄斑変性における脈絡膜血管新生の機序を明らかにすることを目的としているが、MerlinがTAK1-p38MAPKシグナルの活性化を介し、EMTの維持、細胞増殖にも関与していることが判明し、眼内の増殖性線維性疾患の形成機序の一部が解明されたと考える。眼科学マウスでの脈絡膜新生血管モデルを用いてEMT誘導が脈絡膜新生血管に与える影響を検証する。レーザー障害部位において、Merlinの局在の変化を検討し実際の脈絡膜新生血管形成、繊維化の過程においてMerlinの役割を検討する。またsiRNAやTAK1阻害薬を用いてMerlinの発現を抑制することによるin vivoでの新規の脈絡膜新生血管形成阻害薬としての可能性について検討を行う予定である。RPE細胞のEMTモデルを用いて、EMTと酸化ストレスの相互作用による加齢黄斑変性における脈絡膜血管新生機序の関連を明らかにすることを目的としているが、網膜下の線維化だけでなく黄斑上膜などの網膜上の繊維化においてRPE細胞が関与するか検討を行なった。その結果RPE細胞への硝子体刺激のみでEMTの可能性が示唆されるデータが得られた。今後は網膜下疾患への検討を進めていく方針である。マウスでの脈絡膜新生血管モデルを用いてEMT誘導が脈絡膜血管新生に与える影響を検証する。レーザー障害部位においてRPEは障害され、瘢痕治癒することが知られている。

この障害部位における経時的なEMTの時間・空間的発現変化を検討し、ROSの蓄積、またチオレドキシン活性の有無について検討する。さらにEMT阻害剤投与を行い、創傷治癒と新生血管の相関、また、間葉上皮転換(MET)を誘導することにより、障害部位のRPEが従来の単層上皮細胞を再構築に至るかを検討する。動物実験においては、EMTの段階をstage化し評価するとともに、補体関連因子、酸化ストレスマーカー・血管増殖因子や炎症性サイトカインの定量評価等との相互比較を行うことで、病態と主要補体活性値がstage分類のマーカーとなりうるかを検討し、EMT阻害剤投与などの治療導入時期・効果の判定を行いたい。
受聴環境の変動にロバストな高品質音場再現システム

本研究課題の目的は,音場再現システムにおいて,再生室内の環境が変化した場合でも高品質な再現音を保持する方法を提案することにある.科学研究費交付期間内においては,逆フィルタの観点から上記目的の達成を目指す.本年度はまず,前年度に得られた知見を元に,インパルス応答の温度補正処理の更なる改良と高速化を行った.まず,インパルス応答そのものの伸縮処理において,時間領域信号の分割数と計算量,補正制度の関係を明らかにした.さらにこの高速化の考えを適応的温度補正処理のアルゴリズムにも適用できることを見出し,適応システムに実装した.その結果,伸縮処理に必要なパラメータの導出も高速に推定できることがわかり,音場再現システムにおける温度補正処理を大幅に高速化できることがわかった.次に,室内伝達系の変動に対するロバスト化として,変動に応じて各制御点の制御帯域を切り替える方式を見出し,数値計算により検討を行った.その結果,制御点の配置関係と各周波数における不安定性の関係を適切に見極めることにより,音の再現制度の劣化を相当に抑制することができた.本方式では,適応のための計算量が少なくて済むことから,大規模な音場再現システムの実現に大きく寄与するものと考えられる.さらに,温度補正処理と逆フィルタ緩和処理の統合に関する基礎検討を行った.これまでは各アルゴリズムを直列に処理していたが,今回は観測信号に応じてどちらか一方のみの処理を行うことができるよう,各処理のスイッチングの導入を試みた.その結果,従来の直列処理よりも高品質に音を提示できる見込みがあることがわかった.本研究課題の目的は,音場再現システムにおいて,再生室内の環境が変化した場合でも高品質な再現音を保持する方法を提案することにある.科学研究費交付期間内においては,逆フィルタの観点から上記目的の達成を目指す.そのため,これまでに申請者が提案した2つの手法,すなわち室内温度変動の推定による逆フィルタの再設計法(温度補正処理)と再生室内の変動に応じた逆フィルタのもつ逆特性の緩和法(OA-TSVD)の統合を行う.本年度においては,まず,室内音響伝達関数のインパルス応答を収録した.これは,数値計算によるシミュレーションであってもできる限り実環境データを使うことにより,シミュレーションの精度を高め,現象の考察を容易化するためである.今回は,同一実験室内において室内温度を変化させたもの,障害となる物体を様々な場所に配置したもの,および,これら両者が同時に起こった場合のインパルス応答を収録した.次に,温度補正処理の高速化を図った.従来の温度補正処理では温度変動に応じてインパルス応答を線形伸縮させる処理を用いていたが,インパルス応答の信号長に比例して多くの計算量を要した.そこで,線形伸縮処理の計算量を削減するため,サブバンド処理を導入した.その結果,適当な数に帯域分割することによって,計算量が元の処理のおよそ十分の一程度に削減できることがわかった.さらに,温度補正処理による再現精度向上のため,リファレンス信号に関する調査を行った.その結果,センサとなる制御点への再現信号はゼロ信号やデルタ信号のようにパワーの小さな信号であるほど,リスニング用制御点での再現精度は向上した.これはOA-TSVDにおける制御方法と一致し,温度補正処理とOA-TSVDが統合しうることを示唆している.本研究課題の目的は,音場再現システムにおいて,再生室内の環境が変化した場合でも高品質な再現音を保持する方法を提案することにある.科学研究費交付期間内においては,逆フィルタの観点から上記目的の達成を目指す.本年度はまず,前年度に得られた知見を元に,インパルス応答の温度補正処理の更なる改良と高速化を行った.まず,インパルス応答そのものの伸縮処理において,時間領域信号の分割数と計算量,補正制度の関係を明らかにした.さらにこの高速化の考えを適応的温度補正処理のアルゴリズムにも適用できることを見出し,適応システムに実装した.その結果,伸縮処理に必要なパラメータの導出も高速に推定できることがわかり,音場再現システムにおける温度補正処理を大幅に高速化できることがわかった.次に,室内伝達系の変動に対するロバスト化として,変動に応じて各制御点の制御帯域を切り替える方式を見出し,数値計算により検討を行った.その結果,制御点の配置関係と各周波数における不安定性の関係を適切に見極めることにより,音の再現制度の劣化を相当に抑制することができた.本方式では,適応のための計算量が少なくて済むことから,大規模な音場再現システムの実現に大きく寄与するものと考えられる.さらに,温度補正処理と逆フィルタ緩和処理の統合に関する基礎検討を行った.これまでは各アルゴリズムを直列に処理していたが,今回は観測信号に応じてどちらか一方のみの処理を行うことができるよう,各処理のスイッチングの導入を試みた.その結果,従来の直列処理よりも高品質に音を提示できる見込みがあることがわかった.