hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血清抗体価を指標とする水系感染症のリスク評価手法の開発とその適用

近年カンボジアでは地下水のヒ素汚染が報告され,農村部では微生物とヒ素による地下水の複合汚染が問題となっている。ヒ素が抗体を産生するリンパ球のDNA合成を阻害するという知見が得られていることから,対象地域のように微生物とヒ素による水源の複合汚染が見られる場合には,ヒ素への曝露により抗体陽性率が過小評価されることが懸念される。本年度は,対象地域で採取した住民261人の飲用水(地下水)と毛髪サンプル中の重金属濃度を測定し,住民の重金属への暴露の実態を評価した。また,昨年度明らかにした不衛生な水の利用(飲用水の大腸菌群濃度が1個/mL以上であること)によるヘリコバクター感染症リスクの上昇(オッズ比=5.29)について,重金属への曝露が影響しているかどうかを検証した。対象村落では井戸水が主要な飲用水源で,そのおよそ20%からはWHOのガイドライン値(10μg/L)を超えるヒ素が検出された。さらに, 42%の井戸からはガイドライン値(10μg/L)以上の鉛も検出された。ヒ素への暴露がヘリコバクター感染症罹患率へ与える影響は,住民を毛髪から1μg/g-dry以上のヒ素が検出された集団とされない集団に層化することで,ヒ素の曝露という交絡因子を排除した上で,あらためてオッズ比を計算し評価した。その結果,飲用水の大腸菌群濃度が1個/mL以上であることのオッズ比は5.27(95%CI=1.09-25.4)となり,層化する前のオッズ比とほぼ同じであった。対象村落では,抗ヘリコバクター抗体IgGの産生に対するヒ素曝露の影響は無視できるほど小さかった。本年度はカンボジアの農村を対象として現地調査を行い,得られた血液サンプルからヘリコバクター,カンピロバクター,アデノウイルスに対する抗体を検出することで水系感染症の発生状況を把握した.さらに,飲用水の水質と抗体陽性率との関係を明らかにし,感染リスクを低減できる水利用方法について検討した.ヘリコバクターは一度ヒトに感染すると胃に常在し,生涯に渡って抗体が検出されるため,抗体陽性率は年齢に伴って増加する.全年齢を通しての抗体陽性率,すなわち対象地域のヘリコバクター罹患率は84.5%であった.この結果から最尤法を用いて年間感染確率を推定したところ,8.4%となった.先進国における年間感染確率が0.5%といわれていることから,この農村の年間感染確率は非常に高いといえる.カンピロバクターについては感染後,12年で抗体価が減少することが知られている.よって,抗体陽性であることは過去12年の間にカンピロバクターに感染したことを示している.全年齢を通した抗体陽性率は1.6%であり,現地ではここ12年の間に大きなカンピロバクターのアウトブレイクは発生していないことがわかる.アデノウイルスの抗体陽性率は99.0%であり,住民のほとんどが抗体を保有していた.アデノウイルスもヘリコバクターと同じく,一度感染すると生涯に渡って免疫を持つため,年齢に伴って抗体陽性率は増加する.この農村では,生後23年以内にほぼ全住民がアデノウイルスに感染していた.ヘリコバクターの感染に影響を与える暴露因子を評価するため,オッズ比を用いたひょうかを行った.その結果,飲用水中から大腸菌群が1CFU/mL以上検出された集団は,検出されない集団に比べてヘリコバクターの感染リスクが約5倍も高かった.この結果により,大腸菌群が検出されない水を飲用することで,ヘリコバクター感染のリスクを低減できることが示唆された.近年カンボジアでは地下水のヒ素汚染が報告され,農村部では微生物とヒ素による地下水の複合汚染が問題となっている。
非神経細胞に発現する侵害受容器の炎症病態に対する役割解明

侵害受容器TRPA1チャネルは非神経細胞にも発現するが、その調節メカニズムは明らかとなっていない。本研究では、TRPA1を内因性に発現する肺がん由来細胞A549を用い、炎症性サイトカインであるIL-1αの作用について検討した。IL-1αは濃度および時間依存的にTRPA1の反応性を増加した。この増強反応はextracellular-regulated kinase(Erk)阻害薬で抑制された。IL-1αはTRPA1タンパク質の細胞膜表面への移行を増加した。以上の結果から、A549細胞において、IL-1αはErkの活性化を介してTRPA1の膜移行を誘発し、TRPA1反応を増強することが示唆された。平成27年度は、非神経細胞に発現する侵害受容器の発現調節機構を明らかにした。肺がん由来A549細胞には侵害受容器の1つであるTRPA1チャネルが発現している。本研究では、炎症性サイトカインであるIL-1αをA549細胞に適用するとTRPA1チャネルの発現量が増加し、TRPA1チャネルの作動薬であるallylisothiocyanateに応答する細胞数が増加した。この応答は細胞内シグナル伝達経路の1つであるextracellular-regulated kinaseの活性化を介していた。TRPA1チャネルは起炎性物質や炎症病態組織中に存在する内因性物質によっても作動することが知られ、これらの結果は神経細胞だけでなく、周辺細胞においても炎症時にTRPA1チャネルが亢進・活性化することが示唆された。更には、TRPA1チャネルはカルシウム透過性のイオンチャネルであり、カルシウムシグナルを活性化させる。本研究で使用したA549細胞は炎症性サイトカインを放出することから、炎症応答で惹起されたTRPA1チャネルによって炎症を更に増悪する可能性が考えられた。したがって、阻害薬によるTRPA1チャネルの活性化を制御することは、疼痛だけでなく、炎症の拡大をも緩和する可能性があることが示唆された。今年度は、通常神経細胞に発現し、発痛物質の感知、疼痛刺激の伝達に作用する侵害受容器が神経細胞以外でも機能していることを明らかにした。更には、炎症病態組織中でこれらが発現増加する機構を明らかにし、炎症病態の制御に対する新しいターゲットを示唆するに至った。平成28年度は、平成27年度に引き続き、非神経細胞に発現する侵害受容器の発現調節機構を明らかにした。侵害受容器の1つであるTRPA1チャネルは肺がん由来A549細胞に発現している。A549細胞に炎症性サイトカインであるIL-1αを適用するとextracellular-regulated kinase(Erk)の活性化を介してTRPA1チャネルの感受性が増加した。この現象はIL-1αによってTRPA1チャネルの発現量が増加したと考えられたが、IL-1α処理群と対象群のTRPA1チャネルの発現量に差が見られなかった。TRPA1チャネルはカルシウム透過性のイオンチャネルであり、細胞表面での発現が必要であることが考えられた。そこで、TRPA1チャネルの細胞表面の発現量を比較したところIL-1α処理群のそれは対象群に比して増加していることが明らかとなった。更には、このIL-1αによるTRPA1チャネルの細胞表面の発現量の増加はErk阻害薬によって減弱した。したがって、A549細胞において炎症性サイトカインIL-1αはErkを活性化し、TRPA1チャネルの細胞質から細胞表面への膜移行を促進する働きがあることが考えられた。これらの結果から、肺組織などでは炎症環境下で炎症性の因子に曝されると非神経細胞のTRPA1チャネルの細胞表面の発現と機能が亢進し、これらの細胞の活性化も炎症応答に関与する可能性が示唆された。今年度は、昨年度に引き続き非神経細胞に発現する侵害受容器の発現調節機構を明らかにした。炎症性サイトカインによりこの侵害受容器の細胞表面での発現が亢進することを明らかにした。このことは神経細胞以外の細胞においても痛みのセンサーである侵害受容器が機能することを示唆するものであり、炎症環境下で応答が増大しうることを示している。これらの調節は炎症応答を制御する上で重要であることを明らかにした。平成29年度は、非神経細胞に発現する侵害受容器の反応性について検討した。ペパーミントに含まれるメントールは清涼感をもたらす香気成分であり、冷温感知受容器であるTRPM8チャネルのアゴニストとして知られている。メントールはアロマオイルとして広く用いられており、肺に吸引されるが知覚神経のほか非神経細胞に対する作用は明らかとなっていない。そこで、肺のモデル細胞として肺がん細胞A549を用い、メントールによる応答を解析した。A549細胞は、mRNAおよびタンパク質レベルでTRPM8の発現が見られた。A549細胞にメントールを適用すると細胞内Ca増加反応が生じた。この反応は0.3 mMの濃度では10%程度の反応性であったが、3 mMになるとほぼ全ての細胞で反応が見られた。低濃度側の反応は、TRPM8チャネルの阻害薬では抑制されず、TRPA1の阻害薬で抑制された。メントールはTRPA1チャネルのアゴニストとしても作用することが知られ、メントールはA549細胞に対してTRPA1チャネルに作用することが明らかとなった。しかしながら、高濃度側の反応はTRPA1チャネルの阻害薬でも抑制されなかった。

高濃度側の反応は、細胞外Caを除去しても抑制されることがなく、細胞内Caストアの枯渇によって抑制されたことから、細胞内Caストア由来の反応であることが明らかとなった。高濃度のメントールを適用すると1時間程度で細胞死が誘発された。以上の結果から、A549細胞に対して、メントールはTRPA1チャネルに作用し細胞内Ca増加反応を引き起こし、より高濃度になるとTRPA1チャネル非依存的に作用し、細胞毒性に至ることが明らかとなった。侵害受容器TRPA1チャネルは非神経細胞にも発現するが、その調節メカニズムは明らかとなっていない。本研究では、TRPA1を内因性に発現する肺がん由来細胞A549を用い、炎症性サイトカインであるIL-1αの作用について検討した。IL-1αは濃度および時間依存的にTRPA1の反応性を増加した。この増強反応はextracellular-regulated kinase(Erk)阻害薬で抑制された。IL-1αはTRPA1タンパク質の細胞膜表面への移行を増加した。以上の結果から、A549細胞において、IL-1αはErkの活性化を介してTRPA1の膜移行を誘発し、TRPA1反応を増強することが示唆された。今年度の成果を発展させ、肺組織中でのTRPA1チャネルの役割を明らかにするとともに他の組織における侵害受容器の発現とその機能を明らかにする。これまでの成果を更に発展させ、肺組織中での炎症環境下における非神経細胞のTRPA1チャネルの発現調節機構を明らかにするとともに、新たな非神経細胞における侵害受容器の役割を探索する。炎症当該年度に必要とした消耗品の購入は完了した。次年度により高額な消耗品を購入する可能性があるため、次年度の助成金と合せて使用することとした。次年度の消耗品購入に充てる。
オルガネラ膜接触部位を介した脂質輸送機構とその生理学的役割の解明

スフィンゴ脂質の中心的分子であるセラミドは小胞体で合成された後、COPII小胞を介した小胞輸送および介さない非小胞輸送によってゴルジ体へ運ばれる。セラミドの非小胞輸送は、小胞体とゴルジ体の膜同士の接触を必要とすると考えられている。これまでの解析から、私達はTcbタンパク質がセラミドの非小胞輸送に機能している可能性を見出している。Tcbタンパク質は小胞体に局在するタンパク質であるが、ゴルジ体と接している領域に局在している可能性がある。そこで本年度は、Tcb3の局在性について詳細な解析を行った。先ず、Tcb3を過剰発現させてその局在性を調べたところ、小胞体上のドット状の構造に局在することを発見した。さらに、Tcb3のドメイン欠損変異体およびほかのTcbタンパク質の欠損株を用いて解析を行った。その結果、Tcb3のC末端ドメインを欠損させた場合にはドットが形成されないことだけでなく、Tcbタンパク質ファミリーの他の因子であるTcb1およびTcb2を破壊した場合にもドットが減少することを見出した。このことからドットの形成は、Tcb3のC末端ドメイン、および他のTcbタンパク質との機能的相互作用が関与していることが示唆された。次に、Tcb3のドットの局在場所について解析を行ったところ、小胞体膜上におけるCOPII輸送小胞形成の場であるER exit siteとは一致しないことが明らかとなった。そこで、Tcb3のドットがゴルジ体と接した領域である可能性について解析を行ったところ、Tcb3のドットはメディアルゴルジと優先的に共局在することが明らかになった。セラミドからIPCへの変換に必要な酵素Aur1はメディアルゴルジに主に局在していることから、Tcbタンパク質は、小胞体とメディアルゴルジ間の接触部位を介してセラミドを直接輸送させることにより、効率的なIPC合成を促している可能性が考えられる。本年度の成果のなかでも特筆すべきことは、小胞体に局在するTcb3を過剰発現させたときに、Tcb3が小胞体とメディアルゴルジ間の接触部位に局在することが明らかになった点である。この発見によって、Tcb3がセラミド非小胞輸送および接触領域を介した効率的な複合スフィンゴ脂質合成において重要な役割を果たしていることが示唆された。今後は、複合スフィンゴ脂質合成活性と、それにおけるTcb3のドメインの重要性について解析を行う。酵母のSEC遺伝子の温度感受性変異を用いて小胞輸送を停止させた条件下において、ゴルジ体で起こるセラミドのイノシトールリン酸セラミド(IPC)への変換を、脂質代謝ラベリングにより解析を行う。Tcb3および、Tcb3のドメイン欠損変異体を過剰発現させ、その影響を調べる。これらの研究を行うために必要なプラスミドはすでに準備が整っている。
カイコの突然変異体を利用した染色体地図作成

1.カイコの連関群地図を染色体と対応させるためには詳細な染色体像の解明が必要である。そこで、体細胞期から減数分裂期に至る染色体形態の変化を空気乾燥法によって追究し、その概要を明瞭な写真像で明らかにした。染色体分類にとっては胚子期の体細胞あるいは第一卵母細胞のデイプロテン期が適していた。2.染色体異常と推察されていたE^<Ds>突然変異体について遺伝学的・細胞学的に解析を行い、同変異体は第7連関群と第6連関群の染色体が相互転座して生じたと結論した。その根拠は次の通りである。(1)第6連関群と第7連関群の標識遺伝子を用いた遺伝分離から本来独立であるべき標識遺伝子間に連関関係が認められた。(2) E^<Ds>ヘテロ個体においては体細胞では染色体数に異常がないものの、第一減数分裂期には染色体対が1本減じると共に4価染色体が形成された。(3)第二減数分裂中期で5種類の数的染色体異常を認めると共に、次世代に一定頻度の致死性を確認した。(4) E^<Ds>と同じ連関群所属のcDNAクローンを用いた蛍光in situハイプリダイゼーションにより、第一減数分裂期に異常形態をとった染色体にシグナルを認めた。3.軟体蚕solの遺伝子分析を行ったところ、本遺伝子が第6連関群の新たな起点になることがわかった。今まで第6連関群の起点とされてきたE遺伝子はsolを起点とする21.0となる。これについてE遺伝子から1.4離れたNc遺伝子をプローブとした蛍光in situハイプリダイゼーションを試みたところ、シグナルは染色体の中程に認められ、solを起点とすることが妥当であることがわかった。カイコの遺伝子位置が交配実験と細胞学的双方からに確認された最初の例である。1.交雑実験から染色体異常が報告されていたT(23:25)Nd、T(6;7)E^<Ds>、T(6;20)E^<Np>の染色体を観察したところ、T(23;25)Ndでは染色体数が一本減じ、巨大な染色体が存在することを確認し、本異常は23、25の連関群染色体がほぼ完全な形で融合していると推定された。また、融合点から両者の染色体長を求め、他の染色体と比較したところ、いずれかの連関群は最も長いグループの染色体であることが判明した。T(6;7)E^<Ds>、T(6;20)E^<Np>においても巨大な染色体が認めれたがT(23;25)Ndで見られたものと比べると小さかった。T(6;7)E^<Ds>、T(6;20)E^<Np>の異常染色体を比較すると第6連関群染色体は28本の染色体中比較的長く、第7は短く、第20は中庸の長さにあることがわかった。2.上記の異常が確認された染色体異常蚕のうち、T(6;7)E^<Ds>、T(6;20)E^<Np>の異常染色体をE遺伝子をプローブとしてin situハイブリダイゼーション法による検出を行った。非特異なスポットが当初は見られたが徐々に改善しつつある。1.カイコ第6連関群のE複対立遺伝子群の中のE^<Ds>については

細胞学的に異常な形態をとる染色体を昨年度認めていた。今年度は、同じ連関群所属のcDNAクローンを用いた蛍光in situ (FISH)ハイブリダイゼーションを試みたところ、異常形態をとる染色体にシグナルが認められた。E^<Ds>ヘテロ個体においては体細胞では染色対数に異常がないこと、次代に致死性が現われる事も確認した。昨年度の遺伝子実験と総合して判断し、E^<Ds>は第6連関群と第7連関群との総合転座によって生じたと結論した。2.カイコの連関群地図を染色体と対応させるには詳細な染色体像の解明が必要である。そこで体細胞期と減数分裂期の連続的な染色体形態の変化を空気乾燥法によって追究した。染色体分類には胚子期の体細胞と第一卵母細胞のディプロテン期が適していることが判明した。3.軟体蚕solの遺伝子分析を行ったところ、本遺伝子が第6連関群の新たな起点になることがわかった。今まで第6連関群の起点とされてきたE遺伝子はsolを起点とすると21.0となる。これについてE遺伝子から1.4離れたNc遺伝子を利用した蛍光in situ (FISH)ハイブリダイゼーションを試みたところ、シグナルは染色体の中程に認められ、solを起点とすることが妥当であることがわかった。カイコの遺伝子が交配実験と細胞学的双方からに確認された最初の例である。
ムチンによる細胞交通と病態の制御

ムチンは細胞がその表面に特定の構造の糖鎖を高密度に多数発現する必要があるときに用いられる分子で、糖含量が高く非常に分子量の大きい糖蛋白質である。ほとんどの糖鎖はいわゆるムチン型のO-linkedのものであり、これらの糖鎖の結合するペプチド部分は細胞外に存在ししばしば繰り返し構造を持つ。最近の研究結果から、細胞どうしの認識とそれによる活性化、さらには体内分布を決める細胞交通を制御する分子がムチンであることが明らかになった。特に、免疫細胞と上皮細胞(特に癌化したもの)などが関与する病態形成において重要性が強く示唆された。本年度は、ムチンのグリコシレーションとこれを認識する分子であるレクチンに関する次のような成果を得た。(1)硫酸化ルイスa糖鎖を含むムチンがマウスの消化管(大腸の遠位)に発現する事を明らかにした。(2)ヒト大腸癌細胞表面の肝臓に発現する接着分子に結合すると考えられるムチン糖鎖の構造を明らかにした。糖鎖の還元末端附近にはコア2構造を持つポリラクトサミンで、フコースは分岐近くのN-アセチルグルコミンサンにひとつ付着していた。(3)MUC2ムチンのタンデムリピートの一部をなすスレオニンが三回繰り返す構造が、異なるペプチドNーアセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(GalNAc-T)によってどのようにN-アセチルガラクトサミンの転移を受けるかを査定した。GalNAc-T1はまずN-末端方向から1番目次いで3番目のスレオニンに、GalNAc-T2は1番目のスレオニンのみに、GalNAc-T3はまず3番目、次いで2番目、次いで1番目の順で全てのスレオニンにGalNAcを転移することが明らかとなった。すなわちムチンの糖鎖のアレンジが異なるGalNAc-Tによって実現することが明かとなった。(4)ヒトMUC1ムチンのcDNAベクターでマウスを免疫することによって、ヒトMUC1ムチンに対する免疫応答が誘導され、MUC1ムチンを発現したメラノーマの実験的な肺転移が抑制されることが明かとなった。本研究の目標は、数多くのO-結合型糖鎖を含む細胞表面分子であるムチンの、ペプチド部分と糖鎖部分各々の生合成制御と、ムチン発現に伴う細胞表面のパターン変化、さらにその結果としての細胞交通の変化を査定することにある。本年度は次のような成果を得た。(1)赤白血病細胞にMUCIムチンcDNAを強制発現させた系で、同一の細胞に異なるムチンコアペプチドを発現させた際、付加する糖鎖の構造がことなることが明らかにされた。さらに、MUCIムチンの発現によって、NK細胞に対する感受性の低下が観察された。(2)ヒト腎癌ではMUCIムチン発現レベルと悪性度とのあいだに正の相関があることを確認した上で、腎癌細胞にMUCIムチンを強制発現させることに成功した。この細胞の交通様式に関して検討中である。(3)ヒトマクロファージレクチンのcDNAクローニングに成功し、発現と特異性の解析によってこれがムチン抗原として知られるTn抗原を認識することを発見した。また、この糖鎖抗源を発煙しているムチンを産生する細胞に、ヒトマクロファージレクチンが結合することを見い出した。(4)ムチンを認識するマクロファージレクチンを強制発現させた細胞のin vivoにおける動態が変化し、腫瘍内に局在しやすくなることを明らかにした。(5)MUCI

ムチンのサイトカインによる誘導の際に機能する転写制御を担う、遺伝子上流配列を解明した。さらにこれに結合する核蛋白質を同定し精製を行った。その結果未知の転写因子である可能性が強いことが判明した。(6)蛍光画像解析装置を用いた細胞の分布パターン解析を開始した。ムチン上の糖鎖を改変するために糖転移酵素遺伝子(フコース転移酵素)を強制発現させたヒト大腸癌細胞の肝臓での分布同態について解析している。本研究の目標は、数多くのO-結合型糖鎖を含む細胞表面分子であるムチンの、ペプチド部分と糖鎖部分各々の生合成制御と、ムチン発現に伴う細胞表面のパターン変化、さらにその結果としての細胞交通の変化を走査することにある。本年度はムチンの提示する糖鎖を認識する分子であるレクチンに関する新たな知見を中心に次のような成果を得た。(1)ヒトマクロファージの発現するC型レクチンの組織化学的な検出が、モノクロナル抗体の作製と、in situ hybridization法の確立によって可能になった。(2)これらの方法により、ヒト癌(肺癌、乳癌、及び子宮体癌)の所属リンパ節の、傍皮質領域、髄索、及び胚中心に、マクロファージレクチン発現細胞を検出した。(3)ヒト腎癌細胞にMUC1ムチンcDNAをトランスフェクションして発現させることにより、交通パターンが変化することを証明した。特に肺転移性の上昇が見られた。(4)蛍光画像解析装置を用いたヒト大腸癌細胞の分布パターン解析をおこなった。ムチン上の糖鎖を改変するために糖転移酵素遺伝子(フコース転移酵素)を強制発現させたところ、門脈注後の肝臓での分布が変化した。すなわち肝への集積が5分後から24時間後まで継続的に高かった。(5)19種のヒト大腸癌細胞株における種々のムチンコアペプチド遺伝子の発現を比較検討し、これらが特定の糖鎖抗原の発現と関連しているかどうか査定した。その結果、MUC1、MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6のいずれもが、特定の糖鎖抗原の発現と関連しなかった。しかし、硫酸化ムチンの発現にはMUC5Bの発現とムチンの硫酸化がともに必須であることなど新たな知見が得られた。(6)ムチンに発現するシアリルルイス-X糖鎖のうち、糖鎖伸長型のものに特異性の高いモノクロナル抗体FH6の認識する糖鎖を発現した細胞には、E-セレクチン発現細胞に接着しないものがあるという、シアリルルイス-X糖鎖の機能に関する新たな知見を得た。本研究の目標は、数多くのO-結合型糖鎖を含む細胞表面分子であるムチンの、ペプチド部分と糖鎖部分各々の生合成制御と、ムチン発現に伴う細胞表面のパターン変化、さらにその結果としての細胞交通の変化を査定することにある。本年度はムチンのグリコシレーションとこれを認識する分子であるレクチンに関する次のような成果を得た。(1)マウス卵巣癌細胞のリンパ節転移が、マクロファージの発現するC型レクチンとの相互作用によって制御されることを明らかにした。また、マウス卵巣癌細胞表面のマクロファージC型レクチンのリガンドとなる分子を同定した。(2)ヒトMUC2ムチンのコアペプチドに、N-アセチルガラクトサミンを転移させ、ムチンをひな形とするO-グリコシレーションライブラリーを作成した。
間質性膀胱炎の分子生物学的観点からの病態解明

間質性膀胱炎は原因さえ同定されておらず、そのため根治治療もない疾患で、厚生労働省の指定難病です。この研究は、これまでに研究されてきた方法とは異なり、転写因子という細胞の設計図レベルで活躍するタンパク質に注目し、転写因子の働きから間質性膀胱炎の発症の仕組みや原因を探ることを目的としています。原因が同定できれば、根治治療の確立が期待できます。具体的には、間質性膀胱炎の膀胱組織を用いて、発症に関わっている可能性のある候補転写因子を絞り込みます。そして、動物実験でわざと候補転写因子が働かないような環境を作り、間質性膀胱炎を発症するか確認することで原因を同定します。
多段階高温成長法による半極性AlN仮想基板の低転位化と深紫外発光ダイオードの研究

本研究では、高温成長とアニール処理を併用することで結晶性・平坦性に優れた半極性AlN仮想基板を作製し、低転位化による分極低減効果の発現と深紫外LEDの高効率化を目指す。具体的には(10-10)面サファイア上の(11-22)Al(Ga)Nにおいて、1高温成長とアニール処理を組み合わせて低転位AlN仮想基板を作製する。2この低転位仮想基板上にAlGaN量子井戸構造を作製し、(11-22)面における非発光再結合中心の特定、制御ならびに分極低減効果の検証を行う。3さらに、これらの結果を踏まえ半極性深紫外LEDの作製と高効率化をはかる。
難治性小児急性骨髄性白血病に対するメソセリンを用いた新規細胞免疫療法の開発

小児急性骨髄性白血病に対する新規免疫療法の確立を目的としてメソセリンを標的とした細胞傷害性T細胞の樹立を試みた。末梢血単核球から得た単球をサイトカインの存在下にて1週間培養することで樹状細胞へと分化させた。さらに別のサイトカインカクテルとメソセリンペプチドによるStimulationを行うことで、メソセリン特異的細胞傷害性T細胞の誘導を試みた。本手法では効率的に細胞増殖を得ることは可能であったが、特異性については結果が一定しないことがあった。したがって高い特異性を安定して得るためには更なる工夫が必要と考えられた。小児急性骨髄性白血病に対する新規免疫療法の確立を目的としてメソセリンを標的とした細胞傷害性T細胞の有用性を検証した。現在国外で主流となっている遺伝子改変型T細胞を用いた免疫療法に比べると、やや煩雑な面がある一方で日本国内では実施しやすい手法であると考えられる。今後臨床応用に向けて有効性や安全性について更なる詳細な検証を継続する。1)急性骨髄性白血病におけるメソセリンの発現解析はじめに急性骨髄性白血病cell lineを複数株用いてメソセリンの発現をフローサイトメトリー法にて解析した。対象コントロールはリンパ性白血病の細胞株にて行った。急性骨髄性白血病ではメソセリンの発現が確認された細胞株がある一方でその発現が限定的なものあり評価は一定しなかった。一方、培養液上清や患者血清を用いて急性骨髄性白血病細胞におけるメソセリンの発現を予測しうる別の手法としてElisa法での測定をあわせて行い再現性の確認を行った。2)細胞傷害性T細胞の樹立細胞傷害性T細胞の樹立方法についての検証をすすめた。末梢血単核球からCD14陽性細胞を磁気ビーズにて分離した後、IL-4とGM-CSFの存在下で5日間かけ単球を樹状細胞を分化させ、さらにIL-6, TNFα, PGE2, IL-1βの存在下で十分成熟させリンパ球と反応させることが重要と考えられる。またペプチドは単一種ではなく複数種用いることが可能と考えられ更なる検証を行う。末梢血由来の単核球からCD14陽性細胞を磁気ビーズにてポジティブセレクションを行い単球を選択的に分離した後、サイトカインと1週間混合培養することで樹状細胞へと分化させた。さらに別のサイトカインカクテルとメソセリンペプチドによるStimulationを2回継続することで、メソセリン特異的細胞傷害性T細胞の誘導を試みた。メソセリンに対する特異性はElispotを用いて確認することとした。本手法では初回stimulation後にはほとんど細胞増殖が得られていないにも関わらず、2回目stimulation後にはほぼ全例で効率的に細胞増殖を得ることは可能であった。その一方で特異性の得られ方はまちまちで、同一ドナーにおいても結果が一定しないことがあった。小児急性骨髄性白血病では必ずしもメソセリンが高率に発現しているとは限らないが、あらかじめ免疫染色やフローサイトメトリーを用いて的確な症例が見出せれば将来的には免疫療法の新たな一つの手法となりうる可能性があると考えられた。したがって更なる検証を継続するとともに、将来の臨床応用への可能性についても評価を行う予定である。小児急性骨髄性白血病においてはメソセリンが発現していることが報告されているが、我々の検討では予想より限定的である可能性も示されており十分検証する必要が出てきたため、やや遅れていると判断した。小児血液腫瘍学対象とする白血病細胞においてメソセリンの発現が低発現であった場合には複数のがん抗原を用いた細胞療法が有用と考えられた。現在、低発現例においてメソセリンの発現を誘導できうるか検討中であるとともに今後は実際の臨床サンプルにおいても検証を加える予定である。
カテプシンEの生合成と細胞内輸送および局在化機構の解析

本研究では、ラットミクログリア細胞やマウス白血病フレンド細胞、ラット胸腺細胞やカテプシンE遺伝子を導入したCHO細胞といった異なる細胞種を用いてカテプシンEの細胞内輸送と選別機構およびプロセシング機構を分子細胞生物学的に解析した。各細胞に対し[^<35>S]メチオニンを用いたパルスチェイス実験を行い、経時的に細胞と培養上清を回収し、両者に含まれるカテプシンEを特異的なポリクロナール抗体で免疫沈降し、沈降物をSDS-ゲル電気泳動とフルオログラフィーによって解析した。その結果、(1)ミクログリア細胞においては、カテプシンEはプロ型酵素として合成された後、チェイス4時間後には中間体を経て成熟型分子へと変換することがわかった。この間、糖鎖は高マンノース型から複合型へと修飾された。このプロセシングはプロトンポンプの阻害剤であるバフィロマイシンA1によって強く阻害された。免疫電顕による観察で、本酵素の大部分がエンドソーム様の空胞構造に存在していることが確認されたことから、本酵素は最終的にはエンドソーム様の酸性コンパートメントで成熟型酵素への変換が起こっていることがわかった。(2)胸腺細胞では、カテプシンEは複合型糖鎖をもつ中間型までプロセスされるが、成熟型酵素への変換はチェイス72時間後でも観察されなかった。しかし、デキサメサゾンを投与すると、胸腺の萎縮に伴い成熟型カテプシンEが強く観察された。免疫電顕による観察では、正常な胸腺細胞のカテプシンEはゴルジ体および小胞体に認められるが、デキサメサゾン処理によってかなりの部分がエンドソーム様オルガネラに移行することがわかった。(3)フレンド細胞やカテプシンE遺伝子を導入したCHO細胞では、本酵素は高マンノース型糖鎖をもつプロ型分子として大部分が小胞体に存在していた。これらの結果から、カテプシンEは細胞特異的なプロセシングを受けて、それぞれの最終局在部位に輸送されることがわかった。
拡散集団の食生態と時空分布(同位体による古栄養学、AMS法による年代測定)

初年度は、主に日本列島の出土人骨・動植物の年代測定・食性分析、及びこれらの解析や評価に必要な基礎試料の収集と研究、加速器質量分析による年代測助の試料調製法の規格化・^<14>C測定の自動化を推進した。1.人骨・動物の放射性炭素年代測定と窒素・炭素安定同位体による食性解析......古人骨からの抽出蛋白質コラーゲンと資源生物の約400試料の^<13>C・^<15>Nの分析、及びこれらの古人骨コラーゲンのうち40試料の^<14>C年代測定を行なった。その結果、北海道の縄文人は6,000年BP頃から一貫して海産物を主要食物としていたこと、本州縄文人は居住環境によって地域食資源生態系に適合した海・陸産物の両者を複合利用していたことが判明した。2.食資源の収集とその^<13>C・^<15>N組成......食性解析の基礎資料としての同位体組成を検討する目的で試料の収集と同位体分析用の蛋白質の抽出を行なった。動物試料は、北太平洋と沿海陸地より現生の底魚類・海鳥類・海産哺乳動物・陸上哺乳動物を採集し、35種類150個体の分類と蛋白質の抽出・精製を終了した。植物試料は遺跡出土の3,0004,000年BPのドングリ類10試料とヒヨウタン1試料、現世のドングリ類を日本列島の7地点で約100試料採集し、蛋白質の抽出を終了した。これらの同位体分析は大半終了し、継続中である。3.ナウマンゾウ・マンモスゾウの^<14>C年代測定......日本列島各地より化石牙を18試料収集し、年代測定を行なった。その結果、22,00048,000年BPがえられ、この約25,000年の間は日本列島と大陸の間に陸路による動物(従って人類も)の交流があったことが実証された。4.加速器^<14>C年代測定の能率化......人骨コラーゲンの真空ガラス封管中での加熱炭化法を開発し、迅速試料調製法を実用化した。^<14>C測定に関しては、加速器入射イオン分析系の半自動化を完成し測定効率を向上した。
持久系スポーツにおける“テーパリング”による骨格筋エネルギー生産系の生化学的応答

本研究は、テーパリングによる骨格筋エネルギー生産系の生化学的適応を明らかとすることを目的とした。動物実験の結果、運動時間を半減させた場合、また運動時間を幾何学的に減少させた場合の両条件において、持久力および骨格筋エネルギー生産系の酵素含量がテーパリングにより維持されることが明らかとなった。さらに持久力の関係要因を検討したところ、骨格筋における電子伝達系のタンパク含量が持久力と正の相関関係を示すことが明らかとなった。この結果は、運動量を一時的に減少するテーパリングが持久力および骨格筋エネルギー生産系に悪影響を及ぼさないことを示唆している。本研究は、持久性アスリートが経験的に実施しているテーパリングが科学的根拠に基づく手法であることを明らかとするために、テーパリングと骨格筋エネルギー生産系との関連性について検証することを目的としている。研究開始初年度である本年は、実験動物を用いてテーパリングが持久力および骨格筋エネルギー生産系に及ぼす影響を検討した。実験にはSprague Dawley系雌ラットを用い、コントロール群、運動継続群およびテーパリング群の3群を設けた。運動継続群には9週間のトレッドミル運動を、テーパリング群には7週間の運動後に運動時間を半減させたトレッドミル運動を2週間負荷した。実験期間終了後、持久力を測定するために疲労困憊運動を実施し、その直後に解剖して各エネルギー生産系酵素の評価を実施した。実験の結果、テーパリング群の運動継続時間はコントロール群と比較して有意に高い値を示した一方で、運動継続群とテーパリング群との間に有意な差は認められなかった。また、ヒラメ筋におけるエネルギー生産系酵素のタンパク質発現量および酵素活性も同様に、テーパリング群はコントロール群と比較して有意に高い値を示し、運動継続群とテーパリング群との間に差は認められなかった。これらの結果から、持久性運動におけるテーパリングは一時的なトレーニング量の減少を伴うにも関わらず、持久力および骨格筋エネルギー生産系酵素の発現量および酵素活性に悪影響を及ぼさないことが明らかとなった。前年度において、運動時間を2週間、半減させたテーパリングによって持久力および骨格筋エネルギー生産系のタンパク含量が維持されることが明らかとなった。しかしながら、先行研究において運動時間は指数関数的に減少させた方が持久力を向上させることが明らかとなっていたことや、比較群が非運動群であったため、脱運動との比較をしていないなどの問題点が存在した。そこで本年度は、8週齢の雄C57BL/6JJclマウス(n=18)に対し、7週間のトレッドミル運動を負荷した後、運動継続群、運動時間を指数関数的に減少させたテーパリング群および脱運動群に群分けを行った(各n=6)。テーパリングの運動時間は、先行研究を参考に運動継続群の50%とした。2週間後、トレッドミルを用いて疲労困憊に至る運動継続時間を測定した後、解剖して腓腹筋におけるエネルギー生産系のタンパク含量をウエスタンブロット法にて解析した。実験の結果、運動継続時間は運動継続群とテーパリング群と比較して、脱運動群において有意に低い値を示した(p>0.05)。また、骨格筋ヘキソキナーゼ含量、シトクロムオキシダーゼIおよびIV含量が運動継続時間と正の相関関係を示した(p>0.05)。これらの結果から、運動時間を指数関数的に減少させた場合においても、テーパリングは脱運動と比較して持久力を維持できることが明らかとなった。また、骨格筋における解糖系および電子伝達系のタンパク含量が持久力と関係することが明らかとなった。運動生化学本年度は、テーパリングによる持久力保持効果のメカニズムとして骨格筋エネルギー生産系のタンパク質および酵素活性が維持されるという重要な知見を得ることができた。しかしながら一方で、ヒトを対象としたテーパリング効果を検討した先行研究においては持久力の向上作用が認められていることから、本年度に用いた実験条件ではテーパリングによる持久力向上作用を全て明らかにできていないと考えらえる。これまでに得られた知見を参考にして、今後、より厳密なテーパリング条件を検討していくことによって、テーパリングに関する更なるエビデンスを構築する必要性があると考えられる。これまでの実験課題においては、テーパリングが骨格筋エネルギー生産系に及ぼす影響を明らかとするために極端な運動条件(運動時間の半減)を用いた検討を行ってきた。今後、運動時間の段階的な減少や、栄養摂取と関連付けるなどより実践的なテーパリング手法が持久力および骨格筋エネルギー生産系へ及ぼす影響を検討することで、テーパリングにおける新たな知見を獲得していく必要性があると考えられる。本年度はテーパリングに関する基礎的な情報を収集するために、比較的安価な方法を用いた解析を実施してきた。

これまでの成果によりテーパリングが骨格筋エネルギー生産系に及ぼす全体像を明らかとすることができたことから、今後、より詳細かつ高度な解析を実施していく必要があると考えられる。次年度は、テーパリングが骨格筋エネルギー生産系に及ぼす影響を網羅的に明らかとするために、これまでと比較してより多くの検討条件ならびに解析項目を設けた実験を実施する。本年度主に検討したテーパリングと糖質の代謝に関わる酵素に関する指標との関連性だけでなく、脂質代謝など他の代謝経路も含めた包括的な検討を行う予定である。
時間依存性挙動を考慮したジョイント要素の開発

本研究では,まずクリープを中心とした岩石の時間依存性に関する過去の研究を調査した.ついで,岩石試料の一軸圧縮応力下でのクリープ実験と応力緩和試験をおこない,岩石試料の時間依存性に関する基礎データを採取した.不連続面の時間依存性を調べる方法として,応力一定(クリープ)と歪一定(応力緩和)の2つの実験方法を検討した.2つの方法は圧縮応力下や引っ張り応力下でしばしば用いられておりともに有力であったが,今回は歪一定の条件下で実験を行うことにした.その結果,不連続面に加えた歪が一定にも関わらず,せん断応力が時間の経過にともない徐々に低下することが判明した.従来の岩石の時間依存性実験結果を合わせて検討し,時間依存性を考慮したジョイント要素を提案した.新しいジョイント要素の開発・提案にあたっては従来のジョイント要素との互換性を重視した.提案したジョイント要素は,従来どおりばねからできているが,ばね常数が時間の経過に伴い順次低下していくものとした.さらに,この時間依存性を再現できるジョイント要素を組み込んだ有限要素法プログラムを開発したので付録として本報告書に添付した.本研究では,まずクリープを中心とした岩石の時間依存性に関する過去の研究を調査した.ついで,岩石試料の一軸圧縮応力下でのクリープ実験と応力緩和試験をおこない,岩石試料の時間依存性に関する基礎データを採取した.不連続面の時間依存性を調べる方法として,応力一定(クリープ)と歪一定(応力緩和)の2つの実験方法を検討した.2つの方法は圧縮応力下や引っ張り応力下でしばしば用いられておりともに有力であったが,今回は歪一定の条件下で実験を行うことにした.その結果,不連続面に加えた歪が一定にも関わらず,せん断応力が時間の経過にともない徐々に低下することが判明した.従来の岩石の時間依存性実験結果を合わせて検討し,時間依存性を考慮したジョイント要素を提案した.新しいジョイント要素の開発・提案にあたっては従来のジョイント要素との互換性を重視した.提案したジョイント要素は,従来どおりばねからできているが,ばね常数が時間の経過に伴い順次低下していくものとした.さらに,この時間依存性を再現できるジョイント要素を組み込んだ有限要素法プログラムを開発したので付録として本報告書に添付した.岩盤中にジョイント(不連続面)が存在すると"やま"が動き易いと考えられている.これは,鉱山のみならず土木構造物についても言え,ジョイントに関する多くの研究がなされてきた.しかしながら,ジョイントの力学的性質を表現するのにしばしば使用されるのは,依然としてC(粘着力)とφ(内部摩擦角)である.すなわち,岩盤中のジョイントは,摩擦滑りをおこすものとして捉えられている.しかしながら,従来の経験によれば,掘削終了後も内空変位が増大し続けることはしばしば観察される.そのような場合には周辺にジョイントの存在することが多い.これから類推すると,ジョイントに係わる変形・変位を時間依存性挙動とみなす方が適切と思われるが,従来このような観点からの研究は殆ど見当たらない.本研究では,まず,田下凝灰岩と来待砂岩を試料岩石として選び実験を開始した.高さ5cmで直径5cmの試験片を用いて一面せん断試験を行い,試験途中の随所で応力緩和試験を実施した.特に注目して行ったのは,一面せん断試験でピーク強度を越えて残留強度領域に入った所での応力緩和試験である.応力緩和試験は,せん断変位を固定し,1時間にわたってせん断応力の低下を観察した.本研究では,まずクリープを中心とした岩石の時間依存性に関する過去の研究を調査した.ついで,岩石試料の一軸圧縮応力下でのクリープ実験と応力緩和試験をおこない,岩石試料の時間依存性に関する基礎データを採取した.不連続面の時間依存性を調べる方法として,応力一定(クリープ)と歪一定(応力緩和)の2つの実験方法を検討した.2つの方法は圧縮応力下や引っ張り応力下でしばしば用いられておりともに有力であったが,今回は歪一定の条件下で実験を行うことにした.その結果,不連続面に加えた歪が一定にも関わらず,せん断応力が時間の経過にともない徐々に低下することが判明した.従来の岩石の時間依存性実験結果を合わせて検討し,時間依存性を考慮したジョイント要素を提案した.新しいジョイント要素の開発・提案にあたっては従来のジョイント要素との互換性を重視した.提案したジョイント要素は,従来通りばねからできているが,ばね常数が時間の経過に伴い順次低下していくものとした.さらに,この時間依存性を再現できるジョンイト要素を組み込んだ有限要素法プログラムを開発したので付録として本報告書に添付した.
CD4Treg 高抑制能サブセットが大腸癌に及ぼす影響に関する研究

CD4 regulatory Tcells (Treg)は免疫寛容を司る抑制性のCD4 T cellの一群であり,がん免疫においては抗腫瘍免疫を抑制し腫瘍の増殖を促すと考えられている.CD4Tregには異なる機能を有するいくつかのサブセットが存在すると考えられているが,そのサブセットを分ける明確なマーカーは未だ確立していない.申請者はこれまで転写因子であるHeliosの発現がCD4Tregの抑制能や活性化に関連するマーカーであることを報告してきた(Davids MS, Hirakawa M etal. N Engl J Med.2016)(Hirakawa M etal. JCIinsight 2016).大腸癌においてCD4Tregの研究は散見されるものの未だ十分とは言えず,本研究では上述の最新のCD4Tregに関する知見を大腸癌に応用し,新規予後予測因子としてや新規治療ターゲットとしての臨床応用への基盤となる研究を行うこととした.昨年度の研究結果より,大腸癌患者においては末梢血中および腫瘍浸潤リンパ球におけるCD4Treg,とくにHelios陽性のサブセットサブセットが健常者と比べ増加している可能性が示唆されたため,本年度は大腸癌患者間でのHelios発現の差の原因につき検討した.また,最終的に大腸癌患者における末梢血中および腫瘍浸潤リンパ球におけるHelios陽性CD4Tregの発現率と予後との関連性につき検討を行った.研究は,概ね順調にすすんでおり,大腸癌患者におけるHelios+CD4Tregの発現や機能解析を進めている.CD4 regulatory Tcells (Treg)は免疫寛容を司る抑制性のCD4 T cellの一群であり,がん免疫においては抗腫瘍免疫を抑制し腫瘍の増殖を促すと考えられている.CD4Tregには異なる機能を有するいくつかのサブセットが存在すると考えられているが,そのサブセットを分ける明確なマーカーは未だ確立していない.申請者はこれまで転写因子であるHeliosの発現がCD4Tregの抑制能や活性化に関連するマーカーであることを報告してきた(Davids MS, Hirakawa M etal. N Engl J Med.2016)(Hirakawa M etal. JCIinsight 2016).大腸癌においてCD4Tregの研究は散見されるものの未だ十分とは言えず,本研究では上述の最新のCD4Tregに関する知見を大腸癌に応用し,新規予後予測因子としてや新規治療ターゲットとしての臨床応用への基盤となる研究を行うこととした.昨年度の研究結果より,大腸癌患者においては末梢血中および腫瘍浸潤リンパ球におけるCD4Treg,とくにHelios陽性のサブセットサブセットが健常者と比べ増加している可能性が示唆されたため,本年度は大腸癌患者間でのHelios発現の差の原因につき検討した.また,最終的に大腸癌患者における末梢血中および腫瘍浸潤リンパ球におけるHelios陽性CD4Tregの発現率と予後との関連性につき検討を行った.本研究課題は,概ね当初の予定通り進捗しており,その計画に変更はない.計画はほぼ予定通り進行しているが、物品購入が年度をまたいでしまったため次年度使用とさせて頂きます。
社会ドミナンス志向と政治的保守主義の関連性の検討

本研究は、社会ドミナンス志向を測定するための尺度を作成するとともに、社会ドミナンス志向が政治的保守主義の様々な側面との間にどのような関連性を示すかについて検討することを目的とした。まず、社会ドミナンス志向尺度の作成に関しては、Sidanius(1989)の原尺度をもとに一部新たな項目を加えて整理した予備尺度を用意し、大学生を対象として質問紙調査を行った。その結果、社会ドミナンス志向尺度は顕著な一次元性を示し、α係数も。885という高い値が得られた。直接oblinin法による斜交回転結果、社会ドミナンス志向は社会的不平等、貧富の格差および自助努力を信奉する態度群から成り立っていることが示唆された。次に政治的保守主義尺度の整備については、Harada(1994)で使用した尺度項目に最近の政治動向を反映した新たな項目を収集したものを加えて大学生172名に質問紙調査を実施した。因子分析の結果得られた政治的保守主義の構造は基本的にはHarada(1994)と同一であり、軍国主義、資本主義、復古主義、新自由主義、政治参加の制限、中央集権、現体制維持などの12の因子から成り立つことが示唆された。さらに社会ドミナンス志向と政治的保守主義の各次元との関連性については、社会ドミナンス志向は政治的保守主義のうちで復古主義、新自由主義、中央集権、現体制維持との間に正の有意な相関を持つことが明らかにされた。また、社会ドミナンス志向の強い者ほど自らの政治的態度が空虚で、不安定であると認知していることも示唆された。今後は、すでに入手済みの米国人大学生のデータとあわせて比較研究を行うとともに、社会ドミナンス志向が政治的保守主義のどの次元を説明するのかについて早急に検討を行う予定である。
視覚野ニューロン活動の刺激文脈依存的調節のネットワークメカニズム

大脳皮質一次視覚野の個々のニューロンが、領野全体の活動状況に応じて、どのようにその出力を最適化しているのかを検討した。麻酔・非動化したネコの17野のニューロン活動を記録し、受容野に呈示した最適パラメータ(線方位、空間周波数、大きさ、コントラスト、動き方向)のグレーティングパッチに対するスパイク応答が、受容野周囲に呈示したグレーティングのパラメータに依存して、どのような修飾を受けるのかを調べた。受容野周囲刺激の効果は多くの場合抑制性であり、抑制の強さは、受容野刺激と周囲刺激の図形パラメータが類似するほど強まり、同一の場合に最大となった。また、この現象のメカニズムを調べるために、皮質内抑制性神経伝達物質GABAの受容体拮抗薬ビククリンを微小イオン泳動投与することにより、抑制性神経伝達を遮断したときの、受容野周囲刺激の効果を観察した。しかし、抑制の遮断は、受容野周囲刺激による抑制性修飾にほとんど影響を与えなかった。これらの結果は、受容野周囲刺激の効果が、刺激特徴選択性を等しくするニューロンドメインのネットワークレベルで生じており、直接のGABA抑制よりも、興奮性ネットワークの活動低下を反映したものであることを示唆する。
蒙古斑決定遺伝子の解明と機能解析

蒙古斑は生下時より認められることや民族によって発生率が大きく異なることから、その形成には遺伝子が大きく関わっていると考えられる。そこで、我々は蒙古斑関連遺伝子を明らかにするために同一家系内に蒙古斑を持つ子供と持ってない子供が存在する蒙古斑形質が分離している4家系(モンゴル3家系、日本1家系)見つけ、その構成員計41人より遺伝子を提供してもらった。そして、得られたgenomic DNAを用いて連鎖解析を行なった。しかしながら、蒙古斑関連遺伝子の染色体上の位置を特定することができなかった。親の蒙古斑に対する記憶があいまいであり、Ascertainment biasの存在があると考える。蒙古斑は、主に乳幼児の臀部にみられる先天的に発生する青色斑であり、病理組織学的にはメラニンを活発に合成する真皮メラノサイトの集簇である。通常58歳頃に自然消退する。民族間で出現頻度に差がみられ、モンゴル人や日本人ではほとんど現れるが、インド・ヨーロッパ語族の幼児で1-10%と言われている。我々の知る限り、これまで蒙古斑の出現に関わる遺伝子については報告がない。そこで、本研究は蒙古斑の形成に関わる遺伝子を明らかにし、その機能解析を行なうことを目的とする。そして、蒙古斑形成に関与する遺伝子を明らかにすることにより、その結果を真皮メラノサイトが関わる疾患研究へ展開する。モンゴル国の西部に位置するウブス県タリアラン村にKhotonと呼ばれる約9,000人の少数民族には同じ家系内でありながら、出生時に蒙古斑を持つ子供と持ってない子供を有する家系(蒙古斑形質分離家系)が存在する。そこで、その家系を見つけ、その唾液をDNA採取キットを用いて採集し、genomic DNAを抽出して連鎖解析法にて関連遺伝子を明らかにする。我々は本年度(平成25年8月)、現地に出向き、蒙古斑形質分離家系2家系の家族の協力を得てDNAを採集した。また日本国内においても分離家系を見つけ、これまでに計4家系のサンプルを採取した。モンゴルにおける蒙古斑形質分離家系の発見や試料サンプリングのコーディネートは、モンゴル医学研究所のProf. Munkhbatの協力を得て行なった。今後は、蒙古斑形質分離家系より得られたgenomic DNAと全ゲノムマイクロアレー(125万マーカー数)を用いて、連鎖解析法にて関連遺伝子の染色体上の場所を特定し、最終的には関連遺伝子を同定する。蒙古斑は主に乳幼児の臀部にみられる青色斑であり、病理組織学的にはメラニンを活発に合成する真皮メラノサイトの集簇である。民族間で出現頻度に差がみられ、モンゴル人や日本人では90%以上の頻度でみられるが、インド・ヨーロッパ語族の幼児で1-10%と言われている。そこで、本研究は蒙古斑の形成に関わる遺伝子を明らかにし、その機能解析を行なうことを本研究の目的とした。モンゴル国の西部にKhotonと呼ばれる少数民族では同じ家系内でありながら、出生時に蒙古斑を持つ子供と持ってない子供が存在する家系(蒙古斑形質分離家系)が存在する。そこで、先ず、蒙古斑形成に関する遺伝子が明らかにする目的で、同地に出向き、蒙古斑形質分離家系を4家系を見つけた。さらにその後、日本でも1家系も見つけ、計5家系を見つけた。そして、計48人より遺伝子を収集した。得られたgenomic DNAと全ゲノムマイクロアレーを用いて、どの後に連鎖解析を行なった。しかしながら、蒙古斑関連遺伝子の染色体上の位置を統計的に有意なレベルで特定することができなかった。その大きな原因の1つに親の蒙古斑に対する記憶のあいまいさが挙げられ、その曖昧さゆえに家系図の正確さを担保できなかったためと思われる。そこで、今後は記憶が比較的確かな日本人分離1家系の試料を用いてエクソーム解析等の方法で各個人の遺伝情報を収集し、関連遺伝子の染色体上の位置を特定する予定である。色素異常症これまでに既に4つの独立した分離家系の試料を収集に成功し、得られたgenomic DNAと全ゲノムマイクロアレー(125万マーカー数)を用いて連鎖解析を行っている。これは、ほぼ計画通りである。連鎖解析法にて関連遺伝子の染色体上の場所を特定し、最終的には関連遺伝子を同定する。そして、蒙古斑における蒙古斑関連遺伝子の発現を免疫組織化学的方法にて確認する。その後、蒙古斑関連遺伝子の機能を明らかにする。真皮メラノサイト(蒙古斑細胞)がその発症に関わっている疾患の病理組織標本を用いて、蒙古斑関連遺伝子の発現を検索する。

つまり、太田母斑、後天性太田母斑様メラノージス、色素血管母斑症、さらに青色母斑、真皮悪性黒色腫、悪性黒色腫の真皮内浸潤等の疾患における蒙古斑関連遺伝子発現や機能を明らかにする。特に、悪性黒色腫における本遺伝子の発現は臨床的に重要と予想されることから、数多くの標本で検討し、悪性黒色腫の真皮浸潤における本遺伝子の機能・役割を詳細に検索する。