hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管内皮細胞が白質梗塞を劇的に回復する機構の解析

脳微小血管内皮細胞を白質梗塞巣に移植するといったん脱髄した軸索の再髄鞘化が劇的に促進されること、脳微小血管内皮細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞と共培養すると、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖が促進されることを明らかにした。脳微小血管内皮細胞の馴らし培地でも、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進効果が認められたので、脳微小血管内皮細胞が合成・分泌する液性因子がオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進することが強く示唆された。申請者は様々な白質障害疾患に対応すべく、新たな治療法の開発を目的として、細胞移植により白質障害の機能を改善させる治療法の開発を目指してきた。その過程で、脳微小血管内皮細胞を梗塞巣に移植するといったん脱髄した軸索の再髄鞘化が劇的に促進されることを見出したが、その分子基盤は未だ全く明らかでは無い。平成23年度は血管内皮細胞が働きかける標的が神経軸索か、オリゴデンドロサイト前駆細胞かを決定するための実験を行い、脳微小血管内皮細胞移植時に軸索再髄鞘化が促進されるのは、神経軸索が対照群に比して正常に近く保たれるためではなく、オリゴデンドロサイト前駆細胞の生存・増殖の促進、髄鞘化オリゴデンドロサイトへの最終分化の促進など、オリゴデンドロサイト前駆細胞を介して起こるものであることを示唆する結果を得た。そこで平成24年度は、血管内皮細胞が、オリゴデンドロサイト前駆細胞を介して軸索の再髄鞘化を促進する機構を明らかにする目的で、幼弱ラット大脳よりオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製、これとラット大脳より調製した脳微小血管内皮細胞を無血清培地中で共培養し、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖に及ぼす効果を検討した。その結果、脳微小血管内皮細胞と共培養すると、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖が促進されることが明らかになった。脳微小血管内皮細胞のconditioned medium(馴らし培地)でも、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進効果が認められたので、脳微小血管内皮細胞が合成・分泌する液性因子がオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進することが強く示唆された。今後はこの分子を同定し、この分子がin vivoで脱髄軸索の再髄鞘化を促進することを確認したいと考えている。本年度は血管内皮細胞が働きかける標的が神経軸索か、オリゴデンドロサイト前駆細胞かを決定するために、以下の実験を行った。成体ラットの内包に定位的にエンドセリンー1(ET-1)を注射、微小血管攣縮を介して内包に白質梗塞を生じさせ、一週間後、成体EGFPトランスジェニックラット脳より単離・培養した微小血管内皮細胞(MVECs)を定位的に梗塞部位に移植、さらに一週間後、動物を屠殺し、大脳を摘出、その切片を作成し、LFB染色で髄鞘染色を行い、再髄鞘化を評価した。対照としては成体EGFPトランスジェニックラットから調製・培養した髄膜細胞(MCs)を用いた。その結果、MVECs移植群では対照のMCs移植群に比べて有意に脱随軸索の再髄鞘化が促進されることが確認された。次に、MVECs移植時に再髄鞘化が促進されるのが、血管内皮細胞により(1)神経軸索が対照群に比して正常に近く保たれるためなのか、(2)神経軸索の変性は対照群と同様に起こるが、オリゴデンドロサイト前駆細胞の生存・増殖の促進、髄鞘化オリゴデンドロサイトへの最終分化の促進など、オリゴデンドロサイト前駆細胞を介して起こるものなのか、を検討する目的で、この白質梗塞モデルにおいて、神経軸索の変化を抗タウ抗体、抗ニューロフィラメント抗体を用いて組織学的に解析、MVECs移植時に神経軸索がMCs移植時に比べて正常に保たれるか否かを検討したところ、両群で大きな差違は認められなかった。このことから上記(1)の可能性は否定され、上記(2)の可能性が高いことが明らかになった。血管内皮細胞が軸索の再髄鞘化を促進する機構が、神経軸索の維持によるものでは無いことを明らかにしたので、おおむね順調に進展している。血管内皮細胞が、オリゴデンドロサイト前駆細胞を介して軸索の再髄鞘化を促進する機構を明らかにする。

具体的には幼弱ラット大脳よりオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製、これとラット大脳より調製した脳微小血管内皮細胞を共培養し、オリゴデンドロサイト前駆細胞の生存・増殖・最終分化に及ぼす効果を検討する。上記の研究を推進するために大部分を消耗品の購入に充て、一部は旅費、謝金に充てる。
有機高スピン分子スピニクスの化学-直接的スピン同定分光の開発

(A)へテロ環共役系高スピン分子の合成と微細構造ESRスぺクトルの完全解析法の確立/普及開殻系π共役電子ネットワークにへテロ核原子を導入する場合、多価荷電高スピン分子では、へテロ核サイトの荷電化によってスピン状態は極端な変調をうけ、高スピン状態と低スピン状態の反転さえ予想できる。引き続き6員環に窒素核を導入した5重項メタフェニレンプロトタイプ(1)、ビフェニルプロトタイプ(2)、1,3,5ーべンゼンプロトタイプ(3)のへテロ共役高スピン分子の前駆体であるポリアジド化合物(4)大きな非局在能をもつπトポロジー系を合成した。プロトタイプ(1)と(3)については、窒素核サイトの直接カチオン化による基底スピン状態の変化を解明する。今年度は複雑な微細構造スぺクトルの完全解析法(固有共鳴磁場)の確立と普及をはかった。(B)任意高スピン系および複雑・スピン混合系のスピン状態の直接同定を可能にする新磁気共鳴分光法/Xバンド2次元電子スピンニューテーション法(2D-ESTN)の開発と確立/新しい適用A02班で新たに合成されることが予想される特異な非局在開殻電子系のスピン構造の同定に寄与するためのものであり、引き続き以下に示す(1)、(2)の他10ケースのケテゴリーの下に、直接スピン同定を目的とした2D-ESTNの開発を行った;(1)群論的に高い対称性をもつ分子構造やクラスター構造をもち、強いスピン間相互作用が高対称場にある高スピン系、(2)低対称場だがスピン量子数Sが著しく大きな擬超高スピン系。平成11年度は、最終的にはS=12をもつπ系の直接同定を試み、分子スピン多重度の記録を更新するために目下実験を継続中である。一方、C_<60>フラーレン多価アニオン系について、初めて3価アニオン系の基底4重項状態を検出しただけでなく、高スピン状態と低スピン状態間の転換過程を見いだし、その過程の物理的な起源を解明した。その結果、これまでの多くの論争と矛盾した解釈に決着をつけた。
予測を生み出す推論装置―文学・数学・美術史・科学哲学史・認知科学からの展望

近年の認知神経科学では、脳内の内的モデルが刺激の到来に先んじて、予測という仕方で知覚や感情を能動的に構成するという仮説が提唱されている。本研究は、予測とは何か、予測を生み出す推論の原理とは何かという問いを軸とし、また予測を裏切る要因として「偶有性」「揺らぎ」「遅れ(潜伏)」に注目することで、認知神経科学のモデルが広く人間存在の理解のために有しうる説明力を検討する。
エピジェネティクス機構をターゲットとした唾液腺癌に対する新規分子標的治療の開発

唾液腺癌は再発、転移を頻発するため予後不良であることが知られており、より効果的な新規治療法の開発が望まれている。そこでHDAC阻害剤バルプロ酸(VPA)を用いてエピジェネティックス機構をターゲットとした新規治療法の開発を行った。VPAは唾液腺癌細胞株に対してp27、p21の発現増強を介したG1 arrestを誘導し、その結果、腫瘍増殖を抑制した。またVPAは唾液腺癌細胞を移植したマウスに対しても著明な腫瘍増殖抑制効果を発現した。VPAが唾液腺癌に対するより効果的な治療薬である可能性が示唆された。・唾液腺癌細胞株の癌抑制遺伝子の発現に対するDNAメチル化阻害薬とHDAC阻害薬の影響・ヌードマウスへ移植した唾液腺癌細胞株の造腫瘍性の検討上記について検討を行った。また、HSY細胞(5x10*6cells/50μl)をヌードマウス背部皮下に移植したところ、約10日目に腫瘍の生着を認め、HSY細胞に造腫瘍性があることを確認した。唾液腺癌細胞株の細胞増殖に対するHDAC阻害薬の影響当教室が有する唾液腺癌細胞株HSG、HSY、TYS、ACC-2、ACC-Mに対して、バルプロ酸1mM、2mM、5mM、10mMの濃度でMTT assayを行った。各唾液腺癌細胞は濃度依存的に細胞増殖が抑制された。唾液腺癌細胞株の細胞周期に対するHDAC阻害薬の影響平成25年度に行う動物実験の全実験として、唾液腺癌細胞株がヌードマウスに生着することを確認した。唾液腺癌は放射線や抗癌剤に対する感受性が低く、しばしば局所再発や遠隔転移し、一般に予後は不良とされている。そのため新規治療法の開発が待たれている。一方、バルプロ酸は、てんかんや躁うつ病などの治療薬として広く用いられている薬物であるが、最近、ヒストン脱アセチル化酵素(histon deacetylase; HDAC)の阻害薬として機能することが報告され、乳癌や前立腺癌に対する抗腫瘍効果が報告されている。その背景として、最近、塩基配列の変異を伴わないエピジェネティックな変化が癌の発生や進展に重要な役割を果たすことが次第に明らかとなってきたことが挙げられる。そこで、本研究では、唾液腺癌に対してもバルプロ酸を含めた種々のHDAC阻害薬やDNAメチル化阻害薬が抗腫瘍効果を示すのではないかと考え、エピジェネティック機構をターゲットとした唾液腺癌に対する新規治療の可能性について検討した。唾液腺癌細胞株の細胞増殖に対するHDAC阻害薬の影響、唾液腺癌細胞株の細胞周期に対するHDAC阻害薬の影響を検討したところ、HDAC阻害剤の濃度依存的に細胞増殖は抑制され、G1arrestを認めた。また、ヌードマウスに移植した唾液腺癌細胞株の腫瘍増殖に対するHDAC阻害薬の影響をけんとうしたところ、HDAC阻害剤投与群において、腫瘍増殖は抑制された。口腔外科・唾液腺癌細胞株の癌抑制遺伝子の発現に対するDNAメチル化阻害薬とHDAC阻害薬の影響・ヌードマウスへ移植した唾液腺癌細胞株の造腫瘍性の検討上記を平成25年度の研究実施計画に掲げており、ほぼデータがそろいつつある。唾液腺癌細胞株のヒストンアセチル化の検出唾液腺癌細胞株の細胞増殖に対するHDAC阻害薬の影響唾液腺癌細胞株の細胞周期に対するHDAC阻害薬の影響上記を平成24年度の研究実施計画に掲げており、ほぼデータがそろいつつある。・ヌードマウスに移植した唾液腺癌細胞株の腫瘍増殖に対するHDAC阻害薬の影響・ヌードマウスに移植した唾液腺癌細胞株の腫瘍増殖に対するDNAメチル化阻害薬の影響上記の実験を行う予定である。唾液腺癌細胞株の癌抑制遺伝子の発現に対するDNAメチル化阻害薬とHDAC阻害薬の影響ヌードマウスへ移植した唾液腺癌細胞株の造腫瘍性の検討ヌードマウスに移植した唾液腺癌細胞株の腫瘍増殖に対するHDAC阻害薬の影響ヌードマウスに移植した唾液腺癌細胞株の腫瘍増殖に対するDNAメチル化阻害薬の影響上記移植実験の摘出腫瘍おける癌抑制遺伝子の発現について検討する。初年度からの繰越金があったため、次年度使用額が予定より多くなった。実験動物の購入費、飼育費およびHDC阻害剤、DNAメチル化阻害剤の購入費、摘出腫瘍における癌抑制遺伝子の発現を免疫染色にて確認するための費用、細胞培養に必要な試薬等の購入費、また、資料収集のための旅費等に充てる。前年度に引き続き、in vitroでの唾液腺癌のエピジェネティクスな特性とHDAC阻害薬あるいはDNAメチル化阻害薬が唾液腺癌細胞に与える影響を検討する。したがって、細胞培養試薬(メディウム等230千円)、細胞培養器材(プラスティックデッシュ、ピペット等100千円)が必要となる。また、各種試薬(HDAC阻害薬、DNAメチル化阻害薬、抗体、リアルタイムPCR用プローブ等)として600千円が必要である。

前実験として、唾液腺癌細胞株がヌードマウスに対して造腫瘍性を有することを確認する。その実験動物、飼料の費用として100千円必要である。次に、モデルマウスを用いたin vivoでの解析を実施する。まず、唾液腺癌細胞の培養のため細胞培養器材・試薬として100千円必要である。モデルマウス(3千円/匹)を1群6匹で3群使用するので計18匹使用予定であり、その費用として(54千円)、マウスの飼育飼料(146千円)、担癌マウスの治療にHDAC阻害薬あるいはDNAメチル化阻害薬(200千円)が必要である。さらに効果判定、組織切片の作成や免疫組織染色のための各種試薬(280千円)の購入が必要である。これら研究で得られた成果を国内外の学会で発表するため、旅費として400千円、論文発表のために外国語論文の校閲費として50千円、論文投稿費、印刷費として200千円を予定している。次年度への繰越金は動物実験、細胞培養等に使用する予定である。
実験脊髄損傷における電気生理学的検討ならびに早期薬剤投与の効果に関する研究

本研究は、メチルプレドニゾロン(MP)の大量療法が、脊髄損傷後の脊髄虚血に対して保護効果があるかどうかを確認するために行なった。〔方法〕Wistarラット20匹に対してT7-8椎弓切除を行い、140g圧3秒間のクリップ硬膜外圧迫により脊髄損傷を作製した。損傷30分後に生理食塩水、30mg/kg、または60mg/kg MPの静脈内投与を行なった(各投与群n=4)。損傷2時間後に、オートラジオグラフィー法を用いて、損傷部およびその近接部(5mm頭側・尾側)の脊髄血流を測定した。生理食塩水、30mg/kg MP投与群(各n=4)では、損傷6時間後においても同様に脊髄血球を測定した。脊髄血流の正常値測定のため5匹を使用した。また、脊髄損傷の程度を確認するため4匹を使用し、損傷作製後6週間、下肢運動機能を傾斜板法により観察した。〔結果〕損傷2時間後において、灰白質の脊髄血流は損傷部に近づくにつれて減少し、損傷部では著明な低下がみられたが、各治療群で差はなかった。白質血流も、損傷部では著明に低下し、各治療群で差はなかった。しかし、近接部の白質血流は、MP投与群において有意な低下がみられたが、生理食塩水群での低下はなく、さらに3-5mm尾側では血流はかえって増加していた。損傷6時間後では、損傷部の灰白質・白質の脊髄血流は、さらに低下がみられ、生理食塩水・30mg/kg MP群間で、脊髄血流の値に差はなかった。〔結論〕脊髄損傷後、脊髄の血流は、損傷部および近接部において、少なくとも6時間後まで、進行性に低下していた。MP大量投与は、脊髄損傷による脊髄の血流低下を防ぐことはできなかった。ハロセン麻酔下でT7/8硬膜外クリップ法(クリップ圧140g、クリップ時間3秒)によるラット脊髄損傷モデルを作製し、運動機能、脊髄血流量、病理所見、MRI所見について検討を行った。運動機能は、傾斜面で転倒せずに自分の体を支えていられる角度を経時的に評価したところ、損傷前73.8±2.2^°であったものが損傷後1週間では36.2±9.6^°と最も低かったがその後徐々に回復し、損傷後3週間で55^°(回復率50%)となりその後6週間までの評価はほぼ同値で推移した。脊髄血流の測定は、14Cーindoーantipyrineによるオ-トラジオラフィ-を用いている。T7,8椎弓切除のみの正常灰白質の血流は96.0±3.3ml/100g/minであり、白質は22.9±4.1ml/100g/minであったが、損傷後2時間の時点では損傷部より5mm離れた部位で正常の63%に低下しており、損傷部に近づくにつれて減少し、損傷部では正常の19%にまでは低下していた。ステロイド大量療法では60mg/kg投与群に比べて30mg/kg投与群の方がやや血流の増加を認めているが有意の差は得られなかった。病理学的には急性期では灰白質を中心に出血、壊死巣が広汎に認められ、白質では浮腫像を認めた。損傷後6週間の慢性期では損傷部は広汎な壊死巣を呈しており、その頭・尾側においては損傷部に近づくにつれて白質の空飽化が目立ち、また灰白質では神経細胞の脱落が著明となっていた。MRIについては1.5T超伝導MRIシステムを使用している。

脊髄損傷部位はT1強調画像で低信号,T2強調画像で高信号であり,空洞形もしくは脊髄軟化巣と思われる像を認め、病理所見を裏付ける所見を得ることができた。T7/8硬膜外クリップ法によって作製したラット脊髄損傷モデルの脊髄血流及び病理組織所見の経時的変化について検討した。平成3年度までの結果では灰白質では損傷部に強い血流低下を認め、損傷部から頭尾側へ離れるに従って血流低下は軽度であり、コントロール群とステロイド大量投与群間に有意差は認めなかった。白質においても損傷部ではコントロール群、ステロイド群ともに血流低下が認められ、両群に有意差はなかった。しかしながら損傷部から頭側及び尾側に離れた部位の白質では、コントロール群において血流が維持もしくは増加傾向にあったのに対し、ステロイド群では血流の低下傾向がみられた。本年度はさらに6時間後の脊髄血流変化について検討した。その結果、灰白質においては損傷部及びその頭尾側ともに進行性に血流低下がみられ、これはコントロール群、ステロイド群とも同様であった。しかしながら白質においてはコントロール群において損傷部及びその周辺部位ともに進行性の血流低下が認められたのに対して、ステロイド群では損傷部周辺での血流低下の抑制傾向がみられた。病理組織学的にも損傷部はコントロール群、ステロイド群ともに挫滅、出血性壊死が著明であったが、損傷部より5mm離れた部位ではコントロール群において後索を中心とした出血性壊死を認めたものの、ステロイド群では明らかな異常所見を認めなかった。脊髄損傷急性期にステロイド大量投与療法を行なうことにより、損傷部周辺の白質の血流低下が抑制され、また後索を中心とした出血性壊死の伸展が抑制されていることが判明した。硬膜外クリップ圧迫法により、T7/8レベルに作製したラット脊髄損傷モデルを使用し、脊髄血流の変化の頭尾側方向での分布、病理組織変化、およびステロイド静脈内大量投与に対する反応を検討した。平成4年度までの検討からは、次のような結果が得られた。1)損傷後2時間において低下していた損傷部脊髄血流は、損傷後6時間において、さらに低下する傾向がみられた。2)損傷部より5mmはなれた部位にも後索路を中心とする出血・壊死がみられた。3)ステロイドの大量投与では、損傷部での血流の増加はみられなかった。本年度は、特に、ステロイド投与が脊髄血流に及ぼす影響の空間的分布に関して検討をおこなった。損傷後30分に、生理的食塩水(コントロール)または、methylprednisolone(MP)30mg/kgを静注し(各グループn=4)、6時間後での灰白質・白質の血流を、損傷部および頭尾側方向へ1mmずつ、5mm遠位まで、autoradiography法により測定した。コントロール群では、灰白質の血流は、損傷中心部において最も低下しており、頭側・尾側へ向かうとともに増加傾向がみられた。しかし、5mm遠位部においても、なお、正常値にくらべて低下していた。白質の血流も同様の結果が得られた。MP治療群では、損傷部の血流は、コントロールと同様であったが、尾側2-5mmにおいて、コントロールに比較し、血流の低下は有意に軽度であった。以上より、ステロイド投与は、脊髄損傷レベルに近接した脊髄の循環を保つ効果があることが示唆された。これらの結果は、Journal of Neurosurgeryに投稿中である。
建物-地盤系の微動波形に基づく都市建物の震災危険度評価に関する研究

はじめに,豊田市の小中学校校舎の中から構造形式がほぼ等しいと見做される4階建校舎21棟を選定し,建物-地盤系の微動計測を実施した。建物周辺地盤の振動特性は,表層地層図や地形分類図に,市内62箇所で実施した地盤の微動計測結果を関連させて算定した。その結果,21棟の建物周辺地盤の卓越周期は0.13.0秒と幅広く分布し,それらは表層地盤の地質や堆積地盤の深さと良い相関があることが確認された。次に,建物の固有周期を地盤上との伝達関数やコヒーレンスから算定した結果,学校校舎の固有周期は長辺方向(0.20.25秒)が短辺方向(0.10.2秒)に比べてかなり長いことと,地盤の固有周期が長くなるほど建物周期も長くなる傾向があることが判明した。さらに,21棟の建物の長辺方向と短辺方向の固有周期(Tb)と表層地盤の卓越周期(Tg)の大小関係に応じて建物-地盤系の増幅特性を算定した結果,ほぼ同じ建物の建物-地盤系の増幅特性は共振する場合(Tb=Tg)と表層地盤の卓越周期が長い場合(Tg=2.03.0秒)に増大することが判明した。最後に,1995年1月17日に起きた兵庫県南部地震でのRC造建物の被害状況を,阪神地区合同微動観測の結果から推定した建物周辺地盤の卓越周期(Tg)と,福岡市や仙台市での微動計測結果から推定した建物の固有周期(Tb)との大小関係から分析した結果,震度7の地域については両者が共振する場合(Tb=Tg)に被害率が最大となることが分かった。したがって,都市建物の耐震診断や震災危険度を評価する場合には,表層地盤の振動特性と建物各方向の振動特性とを合わせて考えることが必要であり,特に両者の固有周期が近い場合には十分な補強を行うことで建物強度を増すとともに建物周期も短くして共振させないことが重要であると考えられる。
我が国の養殖海水魚類における外部寄生性原虫のサーベイおよびその病原性に関する検索

平成5年度にはまず、ここ数年発生が比較的顕著にみられるトラフグの鰓に寄生するトリコジナについての検討を行った。検討した試料は静岡県田子の養殖場より得たホルマリン固定材料である。鍍銀法ならびに走査電子顕微鏡観察により形態学的観察を行った結果、得られた所見を従来報告されているフグ類寄生の3既知種と比較したところ、それぞれの種とは明瞭な相違点が存在したことから新種であると考えられた。この結果より、我が国の海産魚には当初の予測通り固有種が存在することが明らかとなった。これに引き続き、平成6年度には養殖ブリに認められた寄生原虫についての検討を行った。材料は大分県水産試験場より提供を受けた畜養中のブリ稚魚である。通常の光学顕微鏡的観察に加え、鍍銀法ならびに走査電子顕微鏡により観察を行った結果、2種のTrichodina属繊毛虫と、1種のScyphidia属繊毛虫の寄生が認められた。検出された2種のTrichodinaのうち1種は、新種であると考えられ、ブリにも固有種が存在することが明らかとなった。Scyphidia属繊毛虫については体長50-70μmで、後方の付着器末端が幅広いことが特徴であった。繊毛虫が付着した鰓の病理組織切片を作成し、その病原性について検討した結果、Scyphidia属繊毛虫の付着部位では内毛細血管に出血が見られ、鰓薄板の癒合が認められたことから、本繊毛虫の鰓への寄生は宿主に比較的大きな影響を与えていることが窺われた。最終年度には、トラフグに寄生の見られた新種Trichodinaの病原性に関する検討を行った結果、走査電子顕微鏡像では、鰓薄板の表面のトリコジナ付着跡には深い組織の陥没が見られ、また病理組織標本においては、本繊毛虫の寄生部位に鰓弁構造の崩壊および粘液の異常分泌が認められたことから、本繊毛虫のトラフグに対する病原性はかなり強いものと判断された。本年度はここ数年発生が比較的顕著にみられるトラフグの鰓に寄生するトリコジナについての検討を行った。鍍銀法ならびに走査電子顕微鏡観察により形態学的観察を行った結果、得られた虫体はドーム状の外形を有する1種で、体の直径平均57.8mum、直径39-54mumの付着盤をもち、その中に29-35個(平均31.6)の棘歯を有していた。付着盤の中央は不透明な暗色を呈し、棘歯の外側突起は特徴的な棒状であった。これらの所見を従来報告されているフグ類寄生の3既知種と比較したところ、それぞれの種とは明瞭な相違点が存在したことから新種であると考えられた。走査電顕による観察では、体後部に存在する下部繊毛装置の周囲繊毛環における繊毛が長く、疎に派生していることが本種の特徴として認識された。現在までにトラフグより得られているのはこの1種のみであり、このことが全国の養殖トラフグに共通なものであるか否かについてはなお今後の調査に待つところが多いが、入手経路については現在折衝中である。同定に引き続いて宿主の病理学的検索を実施している。

また、現在他の魚種に寄生の見られたトリコジナの材料についても入手しており、本年度と同様、まず種の同定を行った後病理学的検索を行う予定である。本年度は昨年度に行ったトラフグに寄生する外部寄生性原虫のサーベイに引き続き、養殖ブリに認められた寄生原虫についての検討を行った。材料は大分県水産試験場より提供を受けた蓄養中のブリ稚魚である。通常の光学顕微鏡的観察に加え、鍍銀法ならびに走査電子顕微鏡により観察を行った結果、2種のTrichodina属繊毛虫と、1種のScyphidia属繊毛虫の寄生が認められた。検出された2種のTrichodinaのうち1種は、平均体径、denticleの数、radial pins/denticleの数などの虫体の各種計測値、および各部の形態がT.jadranica Heider,1964の記載とよく一致した。これに対して、他の1種は文献的に該当する種が見当たらず、新種であると考えられた。昨年度トラフグから得られた新種のTrichodinaに続き、ブリにも固有種が存在することが明らかとなった。Scyphidia属繊毛虫については体調50-70μmで、後方の付着器末端が幅広いことが特徴であった。種の同定については現在検討中である。また、これらの繊毛虫が付着した鰓の病理組織切片を作成し、その病原性について検討した結果、Trichodina属繊毛虫の付着部位での鰓の障害程度は比較的軽微であったが、Scyphidia属繊毛虫の付着部位では内毛細血管に出血が見られ、鰓薄板の癒合が認められたことから、本繊毛虫の鰓への寄生は宿主に比較的大きな影響を与えていることが窺われた。本年度はまず、平成5年度に行ったトラフグに寄生の見られた新種Trichodinaと、平成6年度に行った養殖ブリ稚魚に寄生に見られたScyphidia属繊毛虫に関するさらに詳細な形態学的検討を行った。前者については、走査電子顕微鏡および病理組織標本による本原虫の病原性に関する検討を行った結果、走査電子顕微鏡像では、鰓薄板の表面のトリコジナ付着跡には深い組織の陥没が見られ、また病理組織標本においては、本繊毛虫の寄生部位に鰓弁構造の崩壊および粘液の異常分泌が認められたことから、本繊毛虫のトラフグに対する病原性はかなり強いものと判断された。一方、本繊毛虫と同種と思われるものが、他の養殖場のトラフグより確認され、本繊毛虫はわが国の養殖トラフグに比較的広く分布しているものと考えられる。Scyhidia属繊毛虫については、走査電子顕微鏡観察の結果、口部に見られる構造がトリコジナの付着盤に見られる構造と極めて類似していることが判明した。これらの構造の機能および、トリコジナ、スキフィディアの間の系統的関連性等については現在のところ不明で、今後の検討課題である。なお、本年度末に養殖ヒラメの材料を入手し、現在検討を行っているが、現在のところ2種のトリコジナが認められ、うち少なくとも1種は新種であろうと考えられる。
希薄気体流れの数値解析におけるメゾスケール分子衝突モデルの構築

1.二原子分子衝突モデルの構築とその検証これまで松本らが開発してきた二原子分子衝突モデルを,ポテンシャル関数の精度向上,データベースの拡張,衝突断面積の決定方法の見直しなどにより信頼性を向上させた.これにより本モデルを用いた衝撃波の数値解析結果は実験結果と様々なマッハ数で一致するようになった.また,窒素の輸送物性(粘性係数,熱伝導率,拡散係数)が実験値と一致した.さらに,蛍光スペクトル法を用いた自由噴流場の実験を行い,本モデルを用いた数値解析結果と定性的な一致がみられた.さらに気体分子内の振動運動を含むモデル構築の前段階として,量子波束法を取り入れた量子分子動力学シミュレーションシステムの開発に成功した.2.壁面反射モデルの構築とその検証気体分子がキセノン,壁面がプラチナの場合の分子動力学シミュレーションを行い,単原子気体分子の壁面反射モデルの構築に成功した.本モデルは気体分子の衝突過程を多段階に分割しており,それぞれにおいて気体分子の衝突によるエネルギ変化,散乱方向,吸着判定を行っている.さらに二原子気体分子の壁面反射モデルも構築し,モデルをクエット流れの数値解析に適用したところ,壁面におけるスリップ速度は理論値と一致した.また,超高真空下における分子線散乱実験を窒素分子-グラファイト系において行い,散乱した気体分子の三次元的な散乱構造の測定に成功した.気体分子がキセノンや塩素の場合においての知見も得た.赤外分光分析法による凝縮相近傍でのクラスタ過程の測定も行い,凝縮相近傍でのクラスタの存在,および分布状態の知見を得た.1.二原子分子衝突モデルの構築とその検証これまで松本らが開発してきた二原子分子衝突モデルを,ポテンシャル関数の精度向上,データベースの拡張,衝突断面積の決定方法の見直しなどにより信頼性を向上させた.これにより本モデルを用いた衝撃波の数値解析結果は実験結果と様々なマッハ数で一致するようになった.また,窒素の輸送物性(粘性係数,熱伝導率,拡散係数)が実験値と一致した.さらに,蛍光スペクトル法を用いた自由噴流場の実験を行い,本モデルを用いた数値解析結果と定性的な一致がみられた.さらに気体分子内の振動運動を含むモデル構築の前段階として,量子波束法を取り入れた量子分子動力学シミュレーションシステムの開発に成功した.2.壁面反射モデルの構築とその検証気体分子がキセノン,壁面がプラチナの場合の分子動力学シミュレーションを行い,単原子気体分子の壁面反射モデルの構築に成功した.本モデルは気体分子の衝突過程を多段階に分割しており,それぞれにおいて気体分子の衝突によるエネルギ変化,散乱方向,吸着判定を行っている.さらに二原子気体分子の壁面反射モデルも構築し,モデルをクエット流れの数値解析に適用したところ,壁面におけるスリップ速度は理論値と一致した.また,超高真空下における分子線散乱実験を窒素分子-グラファイト系において行い,散乱した気体分子の三次元的な散乱構造の測定に成功した.気体分子がキセノンや塩素の場合においての知見も得た.赤外分光分析法による凝縮相近傍でのクラスタ過程の測定も行い,凝縮相近傍でのクラスタの存在,および分布状態の知見を得た.メゾスケール分子衝突モデルの開発のため,以下の項目に関して研究を行った.(1)分子動力学シミュレーションの改善計算速度,計算精度向上にため超並列計算機対応スキームの開発,時間積分法の改善を行った.また分子の振動状態を一次元調和振動子と仮定し,分子動力学法における回転エネルギ決定法の改善を行うことにより,気体分子の振動運動を量子力学的に考慮した量子分子動力学シミュレーション・スキームを開発することに成功した.(2)大規模なデータベースの構築改善されたスキームを用い,付着分子が固体表面に存在している場合,気体分子に内部自由度が存在する場合などさらに広範囲のパラメータについて数値計算を行った.また,これと平行して窒素分子の自由噴流および窒素/グラファイト系の分子線散乱に関する真空実験を行い,自由噴流場における回転温度や散乱された分子線の速度分布,反射角度分布などを測定した.これらの結果より申請者らはより実用的なメゾスケール分子衝突モデルの開発に必要な知見を得た.(3)メゾスケール分子衝突モデルの改良・開発上記で得られた知見から,既存のモデルより大幅に進歩したメゾスケール分子衝突モデルの開発に成功した.気体分子間衝突モデルに関しては従来型のモデルで使用していたMDデータベースの関数化を行うことによりモデルの汎用性を大幅に向上させ,さらに衝撃波内部のエネルギの非平衡状態を的確に表現することに成功した.また壁面反射モデルに関しては,気体分子の回転運動を考慮したものを開発し,回転エネルギ移動の散乱方向に与える影響などを的確に表現することに成功した.1.二原子分子衝突モデルの構築とその検証これまで松本らが開発してきた二原子分子衝突モデルを,ポテンシャル関数の精度向上,データベースの拡張,衝突断面積の決定方法の見直しなどにより信頼性を向上させた.これにより本モデルを用いた衝撃波の数値解析結果は実験結果と様々なマッハ数で一致するようになった.また,窒素の輸送物性(粘性係数,熱伝導率,拡散係数)が実験値と一致した.さらに,蛍光スペクトル法を用いた自由噴流場の実験を行い,本モデルを用いた数値解析結果と定性的な一致がみられた.さらに気体分子内の振動運動を含むモデル構築の前段階として,量子波束法を取り入れた量子分子動力学シミュレーションシステムの開発に成功した.2.壁面反射モデルの構築とその検証

気体分子がキセノン,壁面がプラチナの場合の分子動力学シミュレーションを行い,単原子気体分子の壁面反射モデルの構築に成功した.本モデルは気体分子の衝突過程を多段階に分割しており,それぞれにおいて気体分子の衝突によるエネルギ変化,散乱方向,吸着判定を行っている.さらに二原子気体分子の壁面反射モデルも構築し,モデルをクエット流れの数値解析に適用したところ,壁面におけるスリップ速度は理論値と一致した.また,超高真空下における分子線散乱実験を窒素分子-グラファイト系において行い,散乱した気体分子の三次元的な散乱構造の測定に成功した.気体分子がキセノンや塩素の場合においての知見も得た.赤外分光分析法による凝縮相近傍でのクラスタ過程の測定も行い,凝縮相近傍でのクラスタの存在,および分布状態の知見を得た.
非小細胞肺癌の発生、進行におけるERβとGPER1/GPR30の働きの解明

2016/1/1から2016年12月までの114例の非小細胞癌症例においてGPERおよびESR2の発現をrealtime-PCR法で定量した。まず、正常肺と腫瘍部の発現を比較すると、GPERは正常部で有意に発現が高値であった(P<0.001). ESR2も正常肺で高値(P=0.01).腫瘍部、正常部とも発現に男女差はなし。年齢で60歳超の群では有意に正常肺のESR2の発現が高値であった(P<0.001)。喫煙ではBI200以上の群で腫瘍部のGPERの発現が低値(P=0.02)。組織型では腫瘍部のGPERが腺癌群で高値(P=0.004),正常部のESR2が腺癌群で高値(P=0.05)であった。予後は無再発生存期間でGPERのREの閾値を60.8とすると、発現低値群で有意に予後不良であった(P=0.001).ESR2でも閾値を30とすると低値群が有意に予後不良であった(P=0.015)。以上の結果をまとめると以下のようになった。1腫瘍部では正常部よりGPER、ESR2の発現が低下しており、エストロゲンからのシグナルが入りにくくなっている。2このような傾向は喫煙者、非腺癌群で顕著である。3GPER, ESR2の発現低下は非小細胞癌における予後不良因子となっている。現在のところ学会発表や論文執筆には至っていない。今後DATAの集積を加え、論文化を目標とする。現在までの研究結果において、GPER, ESR2は腫瘍部において発現が低下しており、この発現の低下は腫瘍抑制的に働いていることが予測された。今後はこれらの発現抑制がおきている機序についてメチル化や遺伝子変異などを中心に解析していきたい。実験助手の雇用ができなかったので、次年度に雇用し、研究を進行させたい。
副甲状腺ホルモンの骨形成促進作用及びエストロゲンとの相互作用の機序に関する研究

副甲状腺ホルモン(PTH)は間欠投与によりanabolic actionを示すことが知られているが、その機序の詳細は不明であった。今回の研究よりPTHのanabolic actionの機序にIGF-Iと共にIGF結合蛋白-5が関わっていることを示した。またPTHのC端側も一部anabolic actionに関わっていることを示した。さらに内因性PTH過剰を呈する原発性副甲状腺機能亢進症の臨床的検討より、内因性PTHの急激な低下がPTHのanabolic actionの作用発現に極めて重要な役割を担っていることを示した。一方、PTHとエストロゲンの相互作用に関しては、今回の研究においてエストロゲンはPTHにより促進された破骨細胞形成を抑制することを見い出した。そこでこの機序について詳細に検討した結果、stromal cellやwhole bone cellにおいて、PTHは破骨細胞分化抑制因子であるosteoprotegerinの発現を抑制するのに対し、エストロゲンはcAMP依存性プロテインキナーゼ系に作用することによりこのPTH作用を阻害することを見い出した。また破骨細胞前駆細胞にはPTH受容体のみならずE受容体が存在し、EはcAMP依存性プロテインキナーゼ系に作用することによりPTHの破骨細胞形成促進作用を抑制することも見い出した。以上、stromal cellや破骨細胞前駆細胞におけるPTHとエストロゲンのこれらの相互作用がエストロゲン欠乏による破骨細胞新生亢進の機序に重要な役割を担っているものと考えられる。今回の研究結果はPTHの骨形成促進機序、閉経後骨粗鬆症の病態生理そしてPTHとエストロゲンの骨粗鬆症治療薬としての作用機序の解明につながるものと考えられる。私共はPTHのanabolic actionにIGF結合蛋白-5(IGFBP-5)が関与する可能性が想定して研究を行なった。その結果、骨芽細胞株においてPTHは一時刺激(12時間処理後、36時間無刺激)、48時間連続刺激共にIGFBP-5 mRNA発現を促進するが、一時刺激でより強い反応を示すこと、また連続刺激群と異なり一時刺激群では骨形成の指標であるtypel procollagen mRNAの発現を促進することを見い出した。さらにIGFBP-5自身にtypel procollagen mRNA発現促進作用を有していたことより、PTHの骨に対するanabolic actionの機序の一部にIGFBP-5が関わっていることを示した。またヒト骨芽細胞株を用いた検討より、エストロゲン(E_2)はPTH受容体発現を抑制すること等によりPTHの骨芽細胞増殖抑制作用を阻害し、一方E_2はPTHの骨芽細胞機能の調節に促進的に作用し、これには一部IGF-I、IGFBP-5が関わっていることを示した。一方E_2はPTHの骨吸収促進作用を抑制すると考えられているが、その機序の詳細は不明であった。私共はE_2がPTHにより促進された破骨細胞形成を抑制することを見い出した。そしてこの機序を検討した結果、造血幹細胞由来の破骨細胞前駆細胞にはPTH/PTHrP受容体のみならずE_2受容体が存在し、PTHの破骨細胞形成促進作用をcAMP依存性プロテインキナーゼ系に作用することにより抑制することを示した。これによりPTHの骨吸収促進に対するE_2の抑制作用の機序の一端が明らかになった。今年度の研究結果はPTHの骨形成促進機序、閉経後骨粗鬆症の病態生理、そしてPTHとE_2の骨粗鬆症治療薬としての作用機序の解明につながるものと考えられている。

今年度は骨芽細胞、stromal cellそして破骨細胞前駆細胞における副甲状腺ホルモン(PTH)とエストロゲンの相互作用について詳細に検討した。まず骨芽細胞においてはエストロゲンはPTH受容体発現を抑制することなどによりPTHの骨芽細胞増殖抑制作用を阻害し、一方エストロゲンはPTHの骨芽細胞機能の調節に促進的に作用し、これには一部IGF-I及びIGF結合蛋白-5が関わっていることを示した。stromal cellやwhole bonecellにおいて、破骨細胞分化抑制因子であるosteoprotegerin(OPG)の発現をPTHは抑制するのに対し、エストロゲンはこのPTH作用をcAMP依存性プロテインキナーゼ系に作用することにより阻害することを見い出した。従って初年度の研究で示したPTHの破骨細胞分化促進に対するエストロゲンの抑制作用の機序にこのOPG発現におけるPTHとエストロゲンのinteractionが関わっているものと考えられる。一方破骨細胞前駆細胞にはPTH受容体のみならずエストロゲン受容体も存在し、エストロゲンはPTHの破骨細胞形成促進作用をcAMP依存性プロテインキナーゼ系に作用することにより抑制することを示した。以上よりエストロゲン欠乏による破骨細胞新生亢進にはstromal cell及び破骨細胞前駆細胞におけるPTHとエストロゲンの相互作用そしてエストロゲン欠乏における相対的骨形成低下には骨芽細胞におけるPTHとエストロゲンの相互作用が重要な役割を担っていることが明らかとなった。以上、今年度の研究結果は閉経後骨粗髭症の病態生理、そしてPTHとエストロゲンの骨粗鬆症治療薬としての作用機序の解明につながるものと考えられる。
極低温環境用形状記憶アクチュエータの開発

マルテンサイト変態による形状変化を利用し熱を直接機械的エネルギーに変換する形状記憶合金は,エネルギー密度が圧電材料の約1000倍高く,形状変化が変態温度で起こるので温度センサーとしての機能も併せ持つ。従ってアクチュエータ素子の大幅な小型化・簡略化・低コスト化が可能であり,特に複雑な機械機構の適用が難しい極低温の様な極限環境下におけるアクチュエータ素子の駆動に適している。しかし,極低温形状記憶合金の特性は未開拓の分野である。本研究では極低温アクチュエータの駆動素子に適用できる形状記憶合金を開発する。本年度はCu-Al-Mn合金について,低温形状記憶合金としての適用の可能性を調べた。Cu-Al-Mn合金の場合,室温で熱力学的に安定なのはL2_1規則構造であるが,規則化温度が比較的低温にあるため,焼き入れ直後は非常に規則度が低い状態にあると考えられる。時効処理によって規則度が変わることで変態温度が変化すると考えられる。Cu-14Al-(10-18)Mn系合金の母合金を高周波溶解で作製し圧延により板材を得た。この板材から各測定用の試料を切り出し,1173K,5分の溶体化処理後水中に焼き入れた。図は溶体化+時効後の各合金についての電気抵抗と温度の関係を示した。1416Mn合金は温度の低下と共に電気抵抗が減少する,非常に金属的な傾向を示している。しかし12Mn合金は冷却時に100K付近で大きく抵抗が上昇し,加熱時は減少するという挙動を示している。この温度でより比抵抗の高いマルテンサイト相が生成するためと考えられる。この曲線から求められた変態温度はM_s=117K,M_f=100 K,A_s=119 K,A_f=131Kである。その結果,Cu-14Al-12Mn合金に置いて液体窒素温度付近での形状記憶効果が期待できることが明らかになった。本年度はTiNi系形状記憶合金を強加工と熱処理により、ナノ結晶化することによる変態温度の低下について調べた。Ti-50.2mol%Ni合金を高圧ねじり加工などで非晶質化し、その後673K以下の温度で1時間熱処理することで、直径数10nmのナノ結晶状態を得た。得られた試料について示差走査型熱量計でマルテンサイト変態温度を測定した。その結果、結晶粒の微細化はR相変態温度を若干上昇させる他、B19'マルテンサイト変態温度(Ms)を大きく低下させるとともに変態温度幅(△M=Ms-Mf)を広げる効果があるが、逆変態温度はそれほど大きく低下させないことが明らかになった。従ってナノ結晶下では形状回復温度を低下させることができないことを示している。
呼吸器系悪性腫瘍発現に及ぼす慢性吸入大気汚染物質の促進効果に関する研究

大気機汚染物質のNO_2が肺腫瘍生成を促進する作用を有するかどうかを明らかにする目的で、発癌剤前投与とNO_2暴露の併用実験を行った。低濃度の発癌剤N-bis(2-hydroxypropyl)nitrosamine(DHPN)あるいは生理食塩水を6週令のWistar系雄ラットの腹空内に1回投与し、翌日からそれらラットを清浄空気、0.04ppm、0.4ppmあるいは4ppmのNO_2に17カ月間連続暴露した。肺では、DHPNを投与した清浄空気暴露群と0.04ppmNO_2暴露群の各40匹中に各々1匹(3%)づつにadenomaが認められた。これに対してDHPNを投与した4ppmNO_2暴露群では40匹中5匹(13%)に肺の腫瘍が認められ、そのうち4匹にadenomaが、1匹にadenocarcinomaが認められた。しかし、この値はDHPNを投与した清浄空気暴露群と比べて有意差はなかった。DHPNを投与したあとNO_2暴露されたラットでは高率に肺胞上皮細胞の過形成が発生していたが、その発生率とNO_2濃度との間に有意な相関は認められなかった。なお、NO_2暴露のみの群では肺胞上皮細胞に過形成は認められなかった。一方、細気管支上皮の過形成DHPNを投与した4ppmNO_2暴露群で顕著で、40匹中17匹(43%)に認めらた。しかし、DHPNを投与した他の暴露群ではその過形成はほとんど認められなかった。また、DHPN無投与の4ppmNO_2暴露群で認められた過形成はDHPN投与群で認められたものより軽度であった。これらの結果は肺の腫瘍形成が4ppm NO_2暴露によって促進されうることを示している。しかし、低濃度のNO_2暴露ではその効果は認めらられなかった。本研究はガス状大気汚染物質の二酸化窒素(NO_2)およびオゾン(O_3)等の単独あるいは複合暴露による呼吸器系腫瘍のプロモーション作用の有無を検討する.本年度はラットに発癌物質のNーbis(2ーhydroxypropyl)nitrosoamine(BHPN)を体重Kg当り0.5g投与(1回)し,その後,0,0.04,0.4および4ppm NO.ナ_<2.ニ>を連続18ヵ月間暴露終了後,一夜採尿してから屠殺し,肺と鼻腔の病理標本を作製した.また別に10ppm NO.ナ_<2.ニ>を連続6週間暴露し,腫瘍のプロモーションマーカーとして肺のOrnithine decarboxylase(ODC)活性とポリアミン量の変化を調べた.肺の肉眼的腫瘍性病変(腫瘍,過形成,増殖を含む)の割合はNO_2暴露群間あるいはBHPH+NO_2暴露群間で全く有意差はなかった.これに対し,病理標本による腫瘍検索ではNO_2単独暴露では腫瘍は全く認められなかったが,BHPN+NO_2群ではNO_2群ではNO_2のOppm群と0.04ppm群で各々40匹中1例の腫瘍があり,0.4ppm群では1例もなかったのに対して,4ppm群では40匹中4例の良性腫瘍と1例の悪性腫瘍が認められた.鼻腔の腫瘍検索では,NO_2単独暴露群では全く腫瘍はなかった.

一方,BHPN+NO_2群ではNO_2濃度(O,0.04,0.4,4ppm)の違いにかかわりなく,各々97,100,97,100%の腫瘍発生率を示し,また悪性腫瘍発生率も17,38,18および26%となり,NO_2暴露による腫瘍発生を促進するような影響は認められなかった.腫瘍マーカーとしての尿中ポリアミン量はNO_2の暴露に依存して有意な増加を示した.さらに, 10ppm NO.ナ_<2.ニ>暴露により,肺のポリアミン量は暴露時間の経過に伴ない増加した. ODC活性はNO_2暴露3日目に23倍に増加していた.以上の結果より,NO_2は非常に弱いながらも肺の腫瘍を促進する,いわゆるプロモーション作用を持つ可能性が示唆された. NO_2+O_3等の複合暴露条件下での同作用につていも現在検討中である.本研究はガス状大気汚染物質である二酸化窒素(NO_2およびオゾン(O_3)の単独あるいは複合暴露による呼吸器系腫瘍プロモーション作用の有無を検討することを目的としている。今年度は、この病理標本の鏡検の再検討を行った。その結果、DHPNを投与せず、NO_2のみを暴露したラットでは肺にも鼻腔にも全く腫瘍は発生していなかった。一方、DHPNの1回投与ラットでは、Oppm(Control)群、0.04ppm群をよび0.4ppm群の各40匹中に1匹の線腫が認められた。これに対して、4ppmNO_2群では40匹中5匹に線腫があり、その内の1匹には腺がんが認められた。鼻腔の腫瘍検索の再検討では、昨年の検討とほとんど同じ結果を得た。すなわち、NO_2単独暴露群では全く腫瘍は認められなかったが、DHPN+NO_2群ではNO_2濃度(0、0.04、0.4、4ppm)の違いにかかわりなく、各群各々97、100、97および100%の腫瘍発生率を示し、また悪性腫瘍発生率も各々17、38、18および26%となり、NO_2暴露の影響は認められなかった。腫瘍マーカーについても再実験を行った。10ppmNO_2の1カ月暴露実験で肺のオルニチンデカルバキシラーゼ(ODC)活性は暴露3日目で2倍に増加していた。尿中ポリアミン量も3日目以降で有意に増加していた。これらの結果より、NO_2は非常に弱いながらも肺の腫瘍を促進する。いわゆるプロモーション作用を持つ可能性が再確認された。今年度は再に、DHPNを1回投与後、O_3、O_3+NO_2およびNO_2+硫酸エアロゾルを1年間暴露する実験を開始した。主に、硫酸エアロゾル暴露装置の改良とその運転に多くの労力を費いやした。前年度までは、NO_2の呼吸器系腫瘍促進効果を調べる為に、それだけでは肺に腫瘍を生じない最大無作用近似量(0.5g/Kg体重)の発癌物質(Nーbis(2ーhydroxypropyl)nitrosamine、DHPNと略す)をWistar系雄ラットに1回腹腔内投与し、その後3濃度(0.04ppm、0.4ppmおよび4ppm)のNO_2を連続17ヵ月間暴露した実験をした。その結果、DHPNを投与しただけでNO_2を暴露していない対照群とDHPN投与後0.04ppmNO_2を暴露した群で40匹中1匹にadenoma(良性腫瘍)が生じていたが、0.4ppm群には腫瘍は認められなかった。一方、DHPN投与後4ppmNO_2(労働環境規準)を暴露した群では40匹中4匹にadenomaが生じ、1匹にadenocarcinoma(悪性腫瘍)が生じていた。今年度は肺と鼻腔以外の全臓器の腫瘍の検査と腫瘍マ-カ-として、NO_2暴露12ヵ月目と17ヵ月目の尿中ポリアミン量の測定を行った。DHPN投与により、肺以外にも低率ながら腫瘍の発生が認められた。主な腫瘍発生臓器は肝臓、すい臓、脳および脳下垂体であり、その発生率は313%であった。また、NO_2暴露濃度に依存した腫瘍発生は認められなかった。しかし、全体的に見てDHPN+0.04ppmNO_2群の腫瘍発生率が最も高かった。
新たな動物モデルを用いた難治性ウイルス感染症に対する免疫遺伝子治療の開発

慢性活動性EBウイルス感染症やEBウイルス関連血球貪食症候群などの小児の難治性感染症に対して新たな治療法の開発が求められている。我々はEBウイルス特異的ヒトCD4,CD8の樹立を行った。そのEBウイルス特異的ヒトCD4,CD8細胞は自己のLCL株に対し細胞傷害活性を認め、自己のHLAによって提示されたEBウイルス由来の抗原に反応していることを証明した。慢性活動性EBウイルス感染症やEBウイルス関連血球貪食症候群などの小児の難治性感染症に対して新たな治療法の開発が求められており、本研究では動物モデルを用いて新たな発想に基づく難知性ウイルス感染症に対する免疫遺伝子治療の開発を計画した。研究初年度はウイルス特異的ヒト細胞傷害性T細胞(CTL)クローンならびにヘルパーT細胞クローンの樹立とその機能解析を行った。まず、健常人末梢血リンペ球からB細胞を純化し、EBVを感染させて、EBVトランスフォームB細胞株(B-LCL)を作成した。同じドナーから、末梢血単核球を分離し、自己B-LCLで繰り返し刺激し、EBV特異的CD8陽性CTL株ならびにCD4陽性ヘルパーT細胞株を樹立した。このようにして樹立したCTL株は、EBV感染細胞に対してHLAクラス□拘束性に細胞傷害性を示した。また、EBV特異的ヘルパーT細胞は、HLAクラス□拘束性にTh1サイトカインを産生した。今後、これらのEBV特異的T細胞株をクローン化し、T細泡レセプター遺伝子を単離する計画である。他方、EBV特異的CTLに遺伝子導入する目的で、制御性T細胞の免疫抑制性機能を司っていると考えられているFoxP3遺伝子をクローニングした。さらに、FoxP3発現ベクターを、レンチウイルスならびにレトロウイルスベクターを用いて構築した。今後、上記、CTIL株に遺伝子導入して、EBV特異的例御製T細胞を樹立する予定である。本研究では、動物モデルを用いて新たな発想に基づく難知性ウイルス感染症に対する免疫遺伝子治療の開発を計画した。これにより難知性ウイルス感染症に対する免疫遺伝子治療開発ヒト化モデル動物を確立する予定である。本研究は、新たな免疫不全マウスにヒト造血幹細胞を移植しヒト免疫系を再構築しようとすること、このヒト免疫系再構築マウスを用いてこれまで不可能であった難治性ウイルス感染に対する新たな治療開発小動物モデルを確立する。TCR遺伝子導入自己造血幹細胞移植によって難知性ウイルス感染症の治療開発を行うというきわめて斬新な研究計画である。21年度はEBウイルス特異的ヒトCD4,CD8の樹立を行った。健常者から末梢血単核球を分離し、自己から誘導したAuto-LCLを用いてMix lymphcyto reaction(MLR)を行い、リンパ球を増殖させた。さらにMLRからMACS beads法によりCD8陽性分画とCD4陽性分画をそれぞれ分離した。CD8陽性リンパ球とCD4陽性リンパ球に対しAuto-LCLを用いてMLRを行い増殖させ、Auto-LCLに対してCrrelease assayを行った。その結果、EBウイルス特異的ヒトCD4,CD8は自己のLCL株に対し細胞傷害活性を認め、自己のHLAによって提示されたEBウイルス由来の抗原に反応していることが示唆された。混合し培養する1週間後もう一度Auto-LCLを用いてMLRを行う。この時に培養液にIL-2を加える。2回目のMLRから5日後にMACS beads法によりCD8陽性分画とCD4陽性分画をそれぞれ分離する。CD8陽性リンパ球とCD4陽性リンパ球に対しAuto-LCLを用いてMLRを行い増殖させAuto-LCLに対してCr release assayを行った。その結果、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞共に自己のLCL株に対し細胞傷害活性を認め,自己のHLAによって提示されたEBウイルス由来の抗原に反応していることが示唆された。これらの樹立されたEBウイルス蛋白特異的T細胞クローンからTCR遺伝子を単離、この遺伝子を発現するレンチウイルスベクターが作成されれば、患者末梢血よりウイルス特異的なT細胞を大量に誘導することができ、慢性活動性EBウイルス感染症やEBウイルス関連血球貪食症候群などの小児の細胞傷害活性に対して新たな治療法となる。