hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食酢醸造用酢酸菌二属の発酵特性に関する包括的研究

本研究は、食酢醸造に用いられる主要二属、即ち静置発酵に用いられるAcetobacter属および深部通気発酵に用いられるKomagataeibacter属(旧Gluconacetobacter属)の酢酸菌について、属ごとの酢酸発酵特性の発現メカニズムについて解析を行うことを目的とした。1.既に取得済みのAcetobacter属酢酸菌19種、Komagataeibacter属酢酸菌11種(および現Gluconacetobacter属5種)のドラフトゲノム情報より、両属全株全遺伝子の対照表を作成した。このデータを基にして、両属のゲノム上、特徴的に存在する遺伝子について比較検討を行なうことを試み、いくつかの興味深い知見を得た。2.各属の代表株としてAcetobacter pasteurianus NBRC3283およびKomagataeibacter medellinensis (旧Gluconacetobacter xylinus)NMRC3288を選定した。それぞれについて、実際の醸造時と近似する培養条件で酢酸発酵を行なわせた。その際、食酢醸造時に存在する主要三種類の炭素源について「エタノールのみ」「エタノール+グルコース」「エタノール+グルコース+酢酸」の三パターンの条件を用い検討を行なった。3.上記「2.」の各条件において、酢酸発酵期における両株の菌体を、ごく初期より経時的に34点サンプリングし、各菌体中に発現しているmRNAをRNA-seq解析に供した。4.上記「3.」により得られた結果をバイオインフォマティクス的な手法で解析し、酢酸発酵の進行に伴い発現量に変化があった遺伝子、或いは発現量が特徴的に高い遺伝子の抽出を試みた。これにより、それぞれの菌株において、酢酸発酵生理の特徴を形成すると考えられるネットワーク的な遺伝子発現挙動に関して、いくつかの知見を得た。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、食酢醸造に用いられる主要酢酸菌二属(Acetobacter属およびGluconacetobacter属)の酢酸発酵特性について、その発現のメカニズムを解明することを目的とする。本課題については、平成25年5月末に当該外国人特別研究員が来日した時点より開始した。現時点では下記のような進捗状況である。1.食酢醸造において静置発酵に用いられるAcetobacter属の酢酸菌18種、深部通気発酵に用いられるGiuconacetobacter属の酢酸菌16種について次世代シーケンサーを用いてゲノム解析を行い、ドラフトゲノム配列を取得した。これを基にして、解析した両属全株について全遺伝子の対照表を作成した。現在、このデータを基にして、両属に共通する遺伝子群および各属に特徴的な遺伝子群を抽出中である。2.各属より代表株として、Acetobacter pasteurianus NBRC3283株およびGluconacetobacter xylinus NBRC3288株を選定し、酢酸菌の代謝を知る上で重要な種々の炭素源(エタノール/グルコース/酢酸)単独或いは複数存在下での生育挙動および酸生成挙動について検討を行った。これにより、両株の酢酸発酵における表現性状の特徴を把握した。3.上記2に基づき、各株について菌体内mRNA発現の網羅的解析を行うための培養条件および生育段階中のサンプリングポイントの検討を行った。両株とも、培養条件により多様な挙動を示したため、本課題の目的に即した解析条件としては、それぞれの実際の食酢醸造条件に準じた条件に絞ることが望ましいと判断した。4.上記3に基づき、両株において、食酢醸造中の遺伝子発現挙動の特徴が解析できる条件でサンプリングした菌体についてtotal RNAを抽出し、現在RNA-seq解析を行っている。ゲノム解析および保有遺伝子菌株別対照表の作成が終了し、両属の保有する遺伝子の違いを抽出する準備が完了した。

また、各属代表株一種について、遺伝子の発現解析に供する培養/サンプリング条件が決定し、既にRNA-seq解析を開始できているため。当該外国人特別研究員は、来日前より偏頭痛等の持病もあり、体調不良で研究室を休みがちであったが、その中でよく頑張ったと考えている。現時点では、成果については解析途中の部分もあり、未だ論文化されていないが、帰国後も連絡を取り合って論文化することを考えている。今後は、両属の保有遺伝子の違いの抽出と遺伝子発現挙動解析を併せて行い、酢酸発酵生理の特徴を遺伝子レベルで解明する予定である。当初予定していたプロテオーム解析は不要と考えられるため、計画から削除する。現在までに他のプロジェクトで得られている結果とタイアップした考察等も加えて、酢酸菌の酢酸発酵生理についての知見を得る。
実験動物の心・血管系に及ぼす環境温度の影響

実験動物の心・血管系に及ぼす環境温度の影響を明らかにすることを目的とし,テレメトリ-自動計測システムを用い,高温(33°C)及び低温(15°C)環境下におけるハムスター,モルモット及びウサギの血圧・心拍数・体温を測定した。さらに,各々の環境下における各動物種の血漿心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)濃度をラジオイムノアッセイにて測定し,心房筋細胞内のANP分泌顆粒を免疫組織化学的並びに電子顕微鏡学的に検索した。【結果及び考察】(1)血圧・心拍数・体温:何れの動物種共に低温暴露による変化は認められなかったが,高温暴露群ではモルモットのみ,血圧は正常値に比べ有意に下降した。何れの動物種共に,高温暴露後の心拍数に変化はみられなかったが,体温は有意に上昇した。(2)血漿ANP濃度:高温暴露24時間後のモルモットの血漿ANP濃度は,対照群に比べ有意に低値であったが,ハムスター及びウサギでは変化はなかった。何れの動物種共に,低温暴露による有意な変化は認められなかった。(3)免疫組織科学的及び電顕所見:高温暴露24時間後,モルモットの心房筋細胞は対照群に比べANP抗体に弱く反応し,電顕的にもANP顆粒数は対照群に比べ減少していたが,ハムスター及びウサギではANP顆粒に変化は認められなかった。低温暴露群において何れの動物種共に,心房筋細胞内のANP顆粒は対照群と差はなかった。以上の結果より,高温環境が心房筋細胞内のANP合成・分泌機序に与える影響には動物種差が存在し,モルモットでは高温暴露により血圧が下降するためANP合成・分泌が抑制されることが示唆された。実験動物の心・血管系に及ぼす環境温度の影響を明らかにすることを目的とし,本年度(平成10年度)は以下の研究を実施した。ハムスター,モルモット及びウサギを用い,高温暴露群として通常環境下(飼育温度;22°C)から高温環境下(33°C)にて24時間飼育後、通常環境下に戻し24時間観察した。同様に低温暴露群として通常環境下から低温環境下(15°C)にて24時間飼育後,通常環境下に戻し24時間観察し,各群における血圧・心拍数・体温の変化をテレメトリー自動計測システムにて測定した。尚,通常環境下にて飼育した各動物種での血圧・心拍数・体温を正常値とした。(1)血圧;ハムスター及びウサギでは,高温・低温暴露による変化は認められながったが,モルモットでは高温暴露23時間後,正常値に比べ有意に下降し,高温暴露24時間後まで有意に低い値のままであった。その後,通常環境下に戻すと速やかに正常値に戻った。尚,低温暴露による変化は認められなかった。(2)心拍数;何れの動物種共,高温・低温暴露による有意な変化は認められなかったが,ウサギでは高温暴露により正常値に比べ,幾分減少する傾向にあった。(3)体温:何れの動物種共に,高温暴露23時間後,正常値に比べ有意に上昇し,高温暴露24時間後まで有意に高い値のままであった。何れの動物種共,低温暴露による有意な変化は認められなかった。以上の結果より,ハムスター及びウサギの血圧・心拍数に及ぼす高温・低温暴露による影響はなく,モルモットの血圧は高温暴露により影響され,何れの動物種共に体温は,高温暴露の影響を受けることが明らかとなった。本年度の研究より,何れの動物種共,血圧・心拍数・体温は低温暴露の影響を受けないことがら,平成11年度は,各動物種の高温暴露後の心・血管系に関与する内分泌学的変化を検索する予定である。

実験動物の心・血管系に及ぼす環境温度の影響を明らかにすることを目的とし、本年度(平成11年度)は以下の研究を実施した。【材料及び方法】生後3ヵ月齢のゴールデンハムスター、ハートレイ系モルモット及びニュージーランドホワイト種ウサギの各々20例を用い、高温(33°C)及び低温(15°C)飼育群として各々暴露24時間後に血漿・心臓を採取した。なお対照群として22°C飼育群を用い、各群の血漿心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)濃度をラジオイムノアッセイにて測定し、心房筋細胞内のANP分泌顆粒を免疫組織化学的並びに電子顕微鏡学的に検索した。【結果及び考察】高温暴露後のモルモットの血漿ANP濃度は対照群に比べ有意に低値であった。また、免疫組織化学的に高温暴露後のモルモットの心房筋細胞は、対照群に比べANP抗体に弱く反応し、電顕的にもANP顆粒数は対照群に比べ減少していた。高温暴露後のハムスター及びウサギの血漿ANP濃度は対照群と差はなく、免疫組織化学的並びに電顕的にもANP顆粒に変化は認められなかった。低温暴露群においては何れの動物種共に、血漿ANP濃度及び心房筋細胞内のANP顆粒は対照群と差はなかった。以上の結果より、高温環境が心房筋細胞内のANP合成・分泌機序に与える影響には動物種差が存在し、モルモットでは高温暴露により血圧が低下するためANP合成・分泌が抑制されることが示唆され、何れの動物種共、低温暴露によりANP合成・分泌機序は変化しないことが明らかとなった。
遺伝性多飲マウスの飲水調節機構の分子・生理学的研究

遺伝性多飲マウスは多飲(20-60ml/日)・多尿を特徴として1950年代に発見された。本研究ではこの遺伝性多飲マウスを用いて,体液の中枢性調節および飲水行動発現機構の解明を目的した。以下の点について2年間にわたり国際的な共同研究を展開した。(1)組織学的検索(山下,河田,小泉,Kadekaro)(a)免疫組織化学染色法を用いて,脳内(特に視床下部内)の神経ペプチドの存在様式について検討した。その結果,遺伝性多飲マウスでは正常マウスに比べて下垂体後葉ホルモン含有ニューロン(バゾプレッシン(AVP)・オキシトシン(OXT))の細胞数が視床下部室傍核(PVN)および視索上核(SON)で有意に多かった。また,室傍核の前腹側部に下垂後葉ホルモンを含む細胞が多数存在していた。視交叉上核(SCN)では逆に少なかった。遺伝性多飲マウスで無ナトリウム食によりOXTの染色性は著明に減少した。SCNに豊富に存在するVIPの存在様式に差はなかった。GABAの存在様式にも差はなかった。(b)神経細胞の活動の指標としてimmediate-early geneの代表的なc-fos遺伝子産物であるFOS蚕白の発現様式を正常状態および脱水時(24時間および48時間)で比較したところ遺伝性多飲マウスでは正常マウスに比べて脳室周囲器官(終板器官(OVLT,AV3V),脳弓下器官(SFO)および視束前野)で著明に増加した。PVN,SONでの発現パターンは正常マウスと類似していた。(c)In situ hybridization法によりAVPmRNAの発現の様子とその局在を調べたところ,AVPの局在と一致しており,多飲マウスでは正常マウスに比べて強いシグナルが検出された。また,Northern blot法により,視床下部のTotel RNAからAVPmRNAを比較したところ遺伝性多飲マウスでは正常マウスと比べて約4倍の量があった。分子量は変わらなかった。OXTmRNAは類似してた。(d)2-デオキシグルコース(2DG)法を用いて,遺伝性多飲マウスの脳内グルコース代謝を調べたところ,下垂体後葉のグルコース利用率が著明に増加,SFO,SCNおよび外側視束前野では減少していた。(2)飲水行動の解析(山下,河南,小泉)(a)収縮期血圧(102±8mmHg),心拍数及び体温は正常マウスと変わらなかった。(b)多飲マウスではアンギオテンシンIIの桔抗薬であるカプトプリルの皮下投与により20-30%飲水量が減少(投与後6時間以内)したが,正常マウスでは影響なかった。また,サララシン(AII inhibitor)の脳室内投与でも上記と同様に飲水量が減少した。ところが正常マウスで飲水を惹起するAIIの脳室内投与では飲水量に変化なかった。血中のレニン活性および脳内AIIレベルは差はなかった。(c)オピオイド桔抗薬のNaltrexone皮下および脳室内投与により暗期初期の多飲が減弱した(70%)。κ-agonistであるnor-BNIの脳室内投与により摂食に影響なく飲水を抑制した(70%)。(d)遺伝性多飲マウスの側脳室内にAVPの抗血清(Iμl)を微量注入すると注入前日の飲水量37.9±1.5ml(平均±材準誤差)が20.9±4.6mlになり,有意に減少した。生理食塩水を投与した場合は変化なかった。次にAVP桔抗薬である[Pmpl,Tyr(Me)2]-Arg8-Vasopressin(3-300ng)を同様に投与すると用量によらず,投与後24時間で10-14mlと生理食塩水投与群(34.2±5.9ml)に比べて有意に減少し,正常マウスでは10日すぎにわずかに減少したのみで,摂食量はかわらなかった。(3)スライス標本を用いた解析(山下,稲永,小泉,Dreifuss)(a)脳スライス標本を作製してSFO,第3脳室前腹壁部(AV3V)及びおよびAV3VニューロンのAIIに対し感受性は変わらなかったが,反応するニューロンの数の比率が少なかった。AV3VとPVNのピオイドに対する反応性は,正常マウスに比べてμ-,κ-agonistの反応性が低下していた。AV3VニューロンでNaイオンに対する反応性を調べたが正常マウスとは差がなかった。(b)室傍核および視索上核を含む脳スライス標本の灌流液中のAVPを測定したところ,遺伝性多飲マウスの場合は基礎レベルの量(30pg/ml vs 3pg/ml)が非常に高かった。以上の結果より,遺伝性多飲マウスでは脳内AVP,OXTの過剰,アンギオテンシン系,オピオイド系(特にκ-)およびNaに対する反応性の異常が示唆された。(1)組織学的検索(山下,河田,小泉,Kadekaro)(a)免疫組織

化学染色法を用いて,脳内(特に視床下部内)の神経ペプチドの存在様式について検討した。その結果,遺伝性多飲マウスでは正常マウスに比べて下垂体後葉ホルモン含有ニューロン(バゾプレッシン(AVP)・オキシトシン(OXT))の細胞数が視床下部室傍核(PVN)および視索上核(SON)で有意に多かった。また,室傍核の前腹側部に下垂後葉ホルモンを含む細胞が多数存在していた。視交叉上核(SCN)では逆に少なかった。遺伝性多飲マウスで無ナトリウム食によりOXTの染色性は著明に減少した。SCNに豊富に存在するVIPの存在様式に差はなかった。GABAの存在様式にも差はなかった。(b)神経細胞の活動の指標としてimmediate-early geneの代表的なc-fos遺伝子産物であるFOS蚕白の発現様式を正常状態および脱水時(24時間および48時間)で比較したところ遺伝性多飲マウスでは正常マウスに比べて脳室周囲器官(終板器官(OVLT,AV3V),脳弓下器官(SFO)および視束前野)で著明に増加した。PVN,SONでの発現パターンは正常マウスと類似していた。(c)In situ hybridization法によりAVPmRNAの発現の様子とその局在を調べたところ,AVPの局在と一致しており,多飲マウスでは正常マウスに比べて強いシグナルが検出された。また,Northern blot法により,視床下部のTotel RNAからAVPmRNAを比較したところ遺伝性多飲マウスでは正常マウスと比べて約4倍の量があった。分子量は変わらなかった。OXTmRNAは類似してた。(d)2-デオキシグルコース(2DG)法を用いて,遺伝性多飲マウスの脳内グルコース代謝を調べたところ,下垂体後葉のグルコース利用率が著明に増加,SFO,SCNおよび外側視束前野では減少していた。(2)飲水行動の解析(山下,河南,小泉)(a)収縮期血圧(102±8mmHg),心拍数及び体温は正常マウスと変わらなかった。(b)多飲マウスではアンギオテンシンIIの桔抗薬であるカプトプリルの皮下投与により20-30%飲水量が減少(投与後6時間以内)したが,正常マウスでは影響なかった。また,サララシン(AII inhibitor)の脳室内投与でも上記と同様に飲水量が減少した。ところが正常マウスで飲水を惹起するAIIの脳室内投与では飲水量に変化なかった。血中のレニン活性および脳内AIIレベルは差はなかった。(c)オピオイド桔抗薬のNaltrexone皮下および脳室内投与により暗期初期の多飲が減弱した(70%)。κ-agonistであるnor-BNIの脳室内投与により摂食に影響なく飲水を抑制した(70%)。(d)遺伝性多飲マウスの側脳室内にAVPの抗血清(Iμl)を微量注入すると注入前日の飲水量37.9±1.5ml(平均±材準誤差)が20.9±4.6mlになり,有意に減少した。生理食塩水を投与した場合は変化なかった。次にAVP桔抗薬である[Pmpl,Tyr(Me)2]-Arg8-Vasopressin(3-300ng)を同様に投与すると用量によらず,投与後24時間で10-14mlと生理食塩水投与群(34.2±5.9ml)に比べて有意に減少し,正常マウスでは10日すぎにわずかに減少したのみで,摂食量はかわらなかった。(3)スライス標本を用いた解析(山下,稲永,小泉,Dreifuss)
環に関連する諸問題の表現論的考察

環に関連する諸問題の表現論的考察の成果として、1.作用素環分野、2.表現論分野、3.K-理論分野、4.関数環分野の各分野において、次のような結果が得られた。1.作用素環の指数理論においては、両側加群やsector等の概念を用いた表現論的考察の重要性が指摘されている。ここでは、最小指数の乗法性が基本的な役割を果しており、その証明はvon Neumann環に対しては、色々と試みられている。我々は、もっとも一般的な状況において、作用素値ウエイトの指数型微分の概念を活用してその証明を与えたが、更に、そこでのアイディアを転用することにより、単純C^*-環の最小指数の乗法性についても、その簡略な証明を与えた。ただしここでは、加群の基底の概念を活用した綿谷氏によるC^*-環の指数理論の諸結果を用いている。我々のこの結果は、von Neumann因子環に対しても有効であり、かつ、指数理論における表現論的側面の基礎を与える。2.有限体上の古典群の共役類に関する評価式を与え、cuspidal representationの個数が高々1であることの証明の簡略化を試みた。3.例外リー群E_7の表現を考察することにより、その射影群のK環を決定した。4.二つの強擬凸領域D_1,D_2の共通部分の境界上にある多様体が、多元環A^∞(D_1〓D_2)の峯補間集合となる為の条件を求め、更にこれと関連する結果を得た。これは、滑らかな境界をもつ強擬凸領域DでのA^∞(D)の峯補間集合が有限集合であるというNoellの結果に対応するものである。
有機スズ化合物を用いる立体選択的官能基導入

1、スズエノラートの官能基選択性変換スズエノラートに配位性化合物として4級アンモニウムブロミドを等モル量加えると、反応性が大きく変化し、各種ハライドとのカップリング反応が選択的に進行した。エノラートが本来有しているカルボニル基に対する付加反応性はほとんど消失するため、これらの共存する系でも官能基選択性の転換が可能なことを実証し、その結果をすでに公表している。配位子によるエノラートのカルボニル基に対する反応性の消失は、ケトンよりも活性の高いアルデヒドの場合でも抑制され、その効果の高さを確認している。。Bu_4NX(X=Cl,Br,I)のスズエノラートへの配位の状態を、^<119>SnNMRを用いて検討し、官能基選択性の制御には配位の強さだけでなく、配位子の電気陰性度も重要であることが判明した。Bu_4NIの配位力は弱い。Bu_4NClではスズのピークが消失したが、これは相互作用が強すぎブロードニングが起こっているためと推定される。Bu_4NBrは30ppm程度のシフトを示し、効果的な配位をすることが判明した。2、還元におけるスズヒドリドの官能基選択性制御スズヒドリド(Bu_3SnH)は適度な反応性を有することから選択的な還元剤として広く利用されているが、作用機構がイオン的およびラジカル的なものに変化しやすく、各種条件により選択性が大きく異なる欠点を有している。本研究では、条件によらずイオン的に進行し官能基および立体選択性を制御できるスズヒドリドの創製を検討した結果、次のようなスズヒドリドを開発した。(1)Bu_2SnIH;還元されやすいアルデヒドには作用せず、不飽和ケトンの1,4-還元のみを促進。(2)Bu_3SnH-Bu_4NBr錯体;条件によらずイオン的にカルボニル基を還元し、活性も大きく向上。(3)Bu_2SnFH;Fの強い電気陰性度により還元力が大きく向上、また1,2-還元を選択的に生起。。
モラクセラ・カタラーリスのキノロン系抗菌薬耐性に関わる分子機構の解明

Moraxellacatarrhalisは呼吸器感染症の主要起炎菌として認識されている。一方でキノロン系抗菌は広域抗菌スペクトルを有し、優れた体内移行性を有する為、臨床現場で使用頻度の高い抗菌薬である。本研究では、M. catarrhalisのキノロン系抗菌薬耐性機構について、未だ不明な点が多いことから、in vitroで作製した耐性株を使用して、キノロン耐性に関わる分子機構の解明を試みた。耐性株はstepwise selectionを用いて作製し、levofloxacinのMIC分布が0.25mg/Lから32mg/Lを示す株を得た(wild type ; 0.032mg/L)。得られた菌株における、キノロン作用標的であるgyrA, gyrB, parCおよびparE遺伝子のオープンリーディングフレーム領域の塩基配列を決定した。高度耐性株では低感受性株(MIC ; 0.25mg/L)と比べ変異の数が多く確認された。作製した変異株では標的遺伝子内に、今までに報告されていない7か所の遺伝子変異または塩基の挿入が起きていることが確認された。それらの変異のうち、低感受性株ではgyrB遺伝子に最初の遺伝子変異が起こっていた。それぞれの変異遺伝子を形質転換実験により、標準菌株に導入した結果、一つの遺伝子変異のみで著しくキノロンMICが上昇する変異は確認されなかった。また、gyrA遺伝子においてのキノロン耐性決定領域から著しく離れた領域へのコドンの挿入が軽微なMIC上昇に関与していることが確認された。今後は遺伝子変異のみで説明出来ないlevofloxacinのMIC上昇について、抗菌薬の膜透過性などを評価する目的で、膜タンパク質プロファイルなどを実施し、更なる解析を実施していく予定である。Moraxella catarrhalisは呼吸器感染症の主要起炎菌として認識されている。
灰分融点制御による石炭の高効率ガス化プロセスに関する基礎研究

本研究は、実際のガス化状態下においてフラックスの添加による灰分の融点降下とガス化炉操業温度の関係を明らかにし、新しいガス化プロセスを開発しようとするもので、本年度は以下の成果が得られた。1.気流層型高温ガス化実験:前年度において試作した気流層型ガス化炉を使用して、粒径別に分けた3種類の太平洋炭(粒径44-53μm、105-149μm、420-590μm)のガス化実験を、ガス化温度:1300°C1650°C、石炭供給量:60500g/hの範囲で行った。出口の石炭転換率は0.50.95となり、ガス化温度や粒径に大きく影響した。また、生成ガスは主にCO、CO_2およびH_2であり、CH_4などの炭化水素ガスはほとんど検出されなかった。SEMによりチャー表面を観察したところ、1400°C以上の温度でガス化したチャーには、チャー表面に溶融して丸くなった灰分が観察され、熱天秤による基礎実験で得られた結果と概ね一致した。2.フラックスを添加した石炭灰分の溶融温度の推定:溶融温度が大きく異なる石炭灰分10種類に、石炭石、鉄鉱石などのフラックスを添加した時の溶融挙動を検討した。フラックスを添加した場合には、灰分中のAl_2O_3が溶融に大きな影響を与えることを明らかにした。また、これまでの実験結果に基づいて、灰分の溶融に及ぼす化学組成の影響を重回帰分析によりる解析し溶融温度の推定式を提出した。3.混炭による融点制御:高融点炭に溶融温度の低い石炭を混合して灰分の溶融温度を調節できれば、フラックスの添加とともに実現性の高い融点制御方式になる。ここでは、基礎的な観点から混炭の溶融温度を測定した。その結果、溶融温度は灰分の含有量に比例してほぼ直線的に低下し、溶融温度の制御は融点の異なる石炭を混合することにより十分可能であること、また混炭の溶融温度を先の推算式で概ね推定できることを明らかにした。
キキョウ新規システインプロテアーゼ遺伝子-「花弁萎れ遺伝子」としての発現特性解析

キキョウシステインプロテアーゼ(CPase)遺伝子として,PgCP1に加え新規にPgCP2を単離した.両遺伝子の花弁自然老化時の発現様式を比較したうえで,プロモーター領域の解析および推定される発現制御要因の検証を行った.開花時花弁の全RNAからPgCP1とは異なるcDNAクローンPgCP2(1,316bp,アクセッション番号AB363729)を単離した.PgCP2の推定アミノ酸配列は他植物由来のaleurain様CPaseと高い相同性を示し,PgCP2がPgCP1とは異なる種類のCPaseであることが明らかになった.2.自然老化時の花弁におけるPgCP1とPgCP2の発現様式の比較開花から自然老化に至る各段階の花弁において両遺伝子の発現様式を比較した.PgCP1が開花直後から老化開始直前まで著しく発現増加する一方,PgCP2は開花前の発現レベルを維持し,両遺伝子の発現様式に大きな差異があることが明らかとなった.3.PgCP1とPgCP2プロモーター領域の解析および発現制御要因の検証PgCP1の5'上流領域には特徴的なcis制御因子としてエチレン応答因子(ERE)が見出された.一方,PgCP2についてはEREは見られなかった.PgCP1は花弁において外生エチレンにより発現増加したがPgCP2はエチレン反応性を示さなかった.PgCP1の5'上流領域には糖応答に関わる因子も複数種類発見された.PgCP2の5'側上流領域には乾燥応答に関わる複数種類の因子が見出された.以上より,花弁においてCPase遺伝子PgCPIとPgCP2が異なる発現動態を示すことが見出され,異なる複数の要因が両遺伝子を別個に発現制御する可能性が示された.キキョウ花弁の老化過程におけるシステインプロテアーゼ(CPase)遺伝子PgCP1の発現動態,およびその発現制御に関わるプロモーター領域の解明に向け,以下の研究成果を得た.1.花弁萎凋過程におけるCPase遺伝子の発現解析PgCP1の全翻訳領域を含むcDNA(1,676bp)をDDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベースに登録した(アクセッション番号,AB252653).人工気象器で栽培した品種`センチメンタルブルー'の花持ち性は510日であった.花の老化進度を形態的特長から8段階に区分した.ステージI(開花直前)VII(萎凋進行)の花弁から得た全RNAについて,PgCP1 cDNAをプローブとしたノーザン分析を行った.その結果,PgCP1は(1)開花前の花弁では低レベルに発現⇒(2)開花直後から萎凋開始時にかけて極めて高レベルに発現→(3)萎凋進行時には再び低レベルに戻る,という発現特性を持つことが明らかになった.現在PgCP1のエチレン応答性についても解析を進めている.2.ゲノムDNAからのPgCP1遺伝子プロモーター領域の単離と解析DNA増幅装置を用いてTAIL-PCRを行った結果,`センチメンタルブルー'のゲノムDNAからPgCP1のプロモーター領域を含むと考えられるサイズ約0.81.5kbの複数の増幅DNA断片が得られた.現在これら増幅DNA断片をクローニングし,塩基配列の解読を行っている.3.複数のCPase遺伝子が花弁老化に関与する可能性の検討PgCP1 cDNAをプローブとしたノーザン分析では,サイズがわずかに異なる2種類の転写物のシグナルが検出された.このことから花弁ではPgCP1に加えPgCP1と塩基配列の類似した他のCPase遺伝子が発現している可能性が判明した.現在,このCPase遺伝子に相当するcDNAクローンの単離を試みている.キキョウシステインプロテアーゼ(CPase)遺伝子PgCP1のプロモーター領域に存在する応答配列(cis制御因子)およびそこから推定されるPgCP1の発現制御要因を検討した.1.PgCP1遺伝子のプロモーター領域に含まれる応答配列の探索ゲノムDNAを鋳型としたTAIL-PCR産物の塩基配列を決定した.3'末端側の配列はPgCP1 cDNAの5'末端側の配列と一致しており,PgCP1のプロモーター領域を含むと判断した.開始コドンの上流領域0.7kbの塩基配列を,植物のcis因子データベースで解析したところ,エチレン応答因子(ERE)様の配列が発見された.現在,さらに上流領域の解読も含め,他の制御因子を探索している.2.PgCP1遺伝子の発現制御要因の検証上記プロモーター領域の解析結果から,エチレンがPgCP1の発現誘導要因の1つである可能性が示唆された.そこで花の自然老化時のエチレン生成パターンを再検討したところ,雄蕊展開時の花で検出されることが判明した.しかしエチレン生成開始前の花弁でもPgCP1は発現していることから,エチレン以外の発現誘導要因も関与する可能性が示唆された.花弁のプロテアーゼ活性は自然老化時に次第に増加し,外生エチレン処理によっても増加した.現在,外生エチレンに対するPgCP1の応答性を解析している.3.複数種のPgCP遺伝子が花弁老化に関与する可能性の検討ノーザン分析ではPgCP1転写物およびサイズがわずかに異なる転写物のシグナルが,開花直後の花弁でより明確に検出された.そこでPgCP1 cDNAの単離に用いたプライマーセットを用い,開花時花弁の全RNAを鋳型に,低アニーリング温度条件でRT-PCRを行った.その結果約0.5kbの増幅断片が得られた.現在この増幅産物のクローニングを行い,PgCP1以外のCPase遺伝子cDNAを探索している.キキョウシステインプロテアーゼ(CPase)遺伝子として,PgCP1に加え新規にPgCP2を単離した.

両遺伝子の花弁自然老化時の発現様式を比較したうえで,プロモーター領域の解析および推定される発現制御要因の検証を行った.開花時花弁の全RNAからPgCP1とは異なるcDNAクローンPgCP2(1,316bp,アクセッション番号AB363729)を単離した.PgCP2の推定アミノ酸配列は他植物由来のaleurain様CPaseと高い相同性を示し,PgCP2がPgCP1とは異なる種類のCPaseであることが明らかになった.2.自然老化時の花弁におけるPgCP1とPgCP2の発現様式の比較開花から自然老化に至る各段階の花弁において両遺伝子の発現様式を比較した.PgCP1が開花直後から老化開始直前まで著しく発現増加する一方,PgCP2は開花前の発現レベルを維持し,両遺伝子の発現様式に大きな差異があることが明らかとなった.3.PgCP1とPgCP2プロモーター領域の解析および発現制御要因の検証PgCP1の5'上流領域には特徴的なcis制御因子としてエチレン応答因子(ERE)が見出された.一方,PgCP2についてはEREは見られなかった.PgCP1は花弁において外生エチレンにより発現増加したがPgCP2はエチレン反応性を示さなかった.PgCP1の5'上流領域には糖応答に関わる因子も複数種類発見された.PgCP2の5'側上流領域には乾燥応答に関わる複数種類の因子が見出された.以上より,花弁においてCPase遺伝子PgCPIとPgCP2が異なる発現動態を示すことが見出され,異なる複数の要因が両遺伝子を別個に発現制御する可能性が示された.
降雨セルの発生死減過程の確率モデルと降雨の確率予測に関する研究

河川流域規模の洪水流出現象を考える上で、メソβ、メソγスケールの雨域の時間的空間的変動をどのように把握するかは重要な問題である。本研究では、降雨セル、セルクラスタ、バンドの分離とセルの追跡・統計解析について検討を行なった。レインバンドの変化過程を分析するため、観測範囲の大半が海洋上である沖縄レーダ雨量計のデータを収集した。降雨セルの変化過程を分析するには、数kmの解像度で降雨強度を観測する必要ばあるので、レーダ雨量計データの利用が望ましい。降雨場の階層構造を分析するために、雨域成長曲線と接谷面解析手法を新たに提案した。雨域成長曲線は、降雨強度の極大点に着目し、極大点の降雨強度からの降雨強度差とその降雨強度差における極大点を含む雨域面積の平方根との関係を図示したものである。実際に観測された降雨場にこの手法を適用した結果、降雨場は、レインバンドに降雨セルが乗っている形でモデル化できることがわかった。レインバンドと降雨セルを接谷面解析によって求め、分離されたセルの移動速度、寿命を調査した。台風時のレインバンドは、対数ラセンで表現されることが分っているので、これに対応した座標系を導入して、この座標系の上でレインバンドの移動特性を調査した。この結果、メソβスケールの雨域は、反時計回りに回転しながら、螺線にそって眼から離れる方向に移動することが分った。また、螺線内部では、メソβスケールの雨域は、始点・終点の移動より早く移動し、終点で一定時間で内部雨域が発生し、始点で雨域が消滅していることが分った。メソγスケールの雨域の寿命、大きさの分布は、それぞれ、指数分布型、β分布型であることがわかった。メソγスケールの雨域(Mg)とメソβスケールの雨域(Mb)との相関関係について調査した結果、1)Mb内のMgの個数は、時間が変化してもほぼ一定であり、2)MgのMbからの距離の分布は、指数分布でモデル化でき、3)Mg発生時のMbからの距離の分布は、一様分布でモデル化でき、4)Mg発生時の眼からの距離の分布は、指数分布でモデル化できることがわかった。本研究では、レーダ雨量計によって得られるレーダエコー図から、降雨セル、セルクラスタ、レインバンドなどの降雨場の階属構造を考慮した、降雨セルの発生死滅過程の確率モデルを構成し、その確率モデルを利用して、実時間で利用できる確率的な降雨予測手法を開発しようとしている。本年度は、地形にあまり影響されない場合の、降雨セル、セルクラスタ、バンドの変化過程を分析するため、観測範囲の大半が沖縄レーダ雨量計のデータを収集した。同時に、バンドの動きや、総観場の様子と関連づけてセルの動きを見るために、レーダデータと同じときの天気図を収集した。切谷面解析法を用いて、入手したレーダデータからセル、セルクラスタを分離し、分離したセル、セルクラスタ内の降雨強度の空間的な分布の特徴を調査した。空間的な分布の特徴を分析するために、高度成長曲線を用いた。この結果、セル内の降雨強度の分布はほぼ円錐状であるとしてよいことがわかった。セルとセルクラスタが分離されたので、セルの発生位置、強度、大きさ、移動速度、寿命を調査した。

セルが発生しやすい位置、個数や強度、大きさなどのセルの諸量とセルクラスタの広域データとの関係については現在調査中である。河川流域規模の洪水流出現象を考える上で,メソβ,メソγスケールの雨域の時間的空間的変動をどのように把握するかは重要な問題である.特に,最近は,デジタル化された気象レーダによって,メソβスケールの雨域の時間的空間的な挙動が,5分単位,数km単位で,実時間で入手できるようになってきた.こうしたデータを利用すれば,メソβγスケールの雨域の挙動の特性を解明できるだけでなく,実時間で予測することも考えられ,洪水の予測,洪水災害の防御に役にたつものと期待される.本研究では,わが国の他の建設省所管の気象レーダに比べて,地形の影響が小さいと考えられる沖縄のレーダ雨量計のデータを用いて,台風性降雨の時間的空間的降雨分布特性を調査し,それを元に降雨の確率的予測手法の開発を試みた.台風性降雨は,台風の眼を中心に延びた螺旋状のレインバンドによってもたらされる.よって,まず,このレインバンドによって決定されるメソβスケールの空間構造を解析的に表現する方法を検討した.台風性降雨に限らず,一般の前線性降雨にも適用し得るようにするため,レインバンドの形状を螺旋状に限定しない方法を最初に考え,螺旋状のレインバンドはその方法の特殊化として扱えるようにした.具体的に言うと,x,y軸を水平面内にとったとき,dy/dxがx,yの一次有理式で表されるようなx,y平面内の曲線群によって定まる曲線座標系を導入して,レインバンドの特徴をその曲線座標系を用いて整理することにした.対数螺旋はこのような曲線群の特殊な場合である.この結果,台風性降雨のメソβスケールでの雨域形状を抽出することができるようになった.これを利用して,メソγスケールの降雨セルの発生・死滅特性を,メソβスケールの雨域と定量的に関係付けることが可能となった.河川流域規模の洪水流出現象を考える上で,メソβ,メソγスケールの雨域の時間的空間的変動をどのように把握するかは重要な問題である。特に,最近は,デジタル化された気象レーダによって,メソβスケールの雨域の時間的空間的な挙動が,5分単位,数km単位で,実時間で入手できるようになってきた。こうしたデータを利用すれば,メソβγスケールの雨域の挙動の特性を解明できるだけでなく,実時間で予測することも考えられ,洪水の予測,洪水災害の防御に役にたつものと期待される。本研究では,わが国の他の建設省所管の気象レーダに比べて,地形の影響が小さいと考えられる沖縄のレーダ雨量計のデータを用いて,台風性降雨の時間的空間的降雨分布特性を調査し,それを元に降雨の確率的予測手法の開発を試みた。台風性降雨は,台風の眼を中心に延びた螺旋状のレインバンドによってもたらされる。よって,まず,このレインバンドによって決定されるメソβスケールの空間構造を解析的に表現する方法を検討した。台風性降雨に限らず,一般の前線性降雨にも適用し得るようにするため,レインバンドの形状を螺旋状に限定しない方法を最初に考え,螺旋状のレインバンドはその方法の特殊化として扱えるようにした。具体的に言うと,x,y軸を水平面内にとったとき,dy/dxがx,yの一次有理式で表されるようなx,y平面内の曲線群によって定まる曲線座標系を導入して,レインバンドの特徴をその曲線座標系を用いて整理することにした。対数螺旋はこのような曲線群の特殊な場合である。この結果,台風性降雨のメソβスケールでの雨域形状を抽出することができるようになった。
子育て環境が養育者の生きがい感形成プロセスに与える影響に関する実証的研究

本研究の目的は、時間と状況の2次元からみた生きがい形成の価値過程モデル(以下、生きがい形成モデルとする)を構築し、乳幼児の養育者に適用して、乳幼児の養育者が生きがい感を形成する心理プロセスを明らかにすることである。これまでの実証的研究や文献研究を統合し、生きがい形成モデルを構築した。そして、生きがい形成モデルの測定尺度として、生きがいプロセス尺度と生きがい状態尺度を作成し、その信頼性と妥当性を確認した。さらに、子育て環境の相違として共働き家庭と専業主婦家庭の男女について、生きがい形成モデルに関する検討をした。上記の目的を達成するために、平成24年度においては、下記4つの観点から研究を行った。なお、これらの一部について、関西社会心理学研究会(KSP)と老年心理学研究会with臨床死生学・老年行動学研究会での研究発表を行った。(1)生きがい形成モデルの構成要素の測定尺度の作成:生きがい形成の価値過程モデル(熊野『生きがい形成の心理学』風間書房,2012)の構成要素を測定するための測定尺度を作成した。(2)乳幼児の養育者世代における生きがい形成モデルに関する調査研究:乳幼児の養育者世代(30歳代,男性400名,女性400名)を対象として、上記(1)で作成した生きがい形成モデルについてのウェブ調査を行った。データの統計解析を行うことによって、生きがい形成モデルが養育者世代に適用できることを確認した。(3)乳幼児の養育者における子育て環境に関する検討:乳幼児の養育者における子育て環境に関する文献収集や事例収集を行い、文献や事例の解析や評価を行った。その結果、乳幼児の養育者の生きがい感や幸福感に重要と考えられる子育て環境の要因を明らかにした。(4)乳幼児の養育者の子育て環境と生きがい形成モデルに関する調査の準備:上記(2)で検証した乳幼児の養育者世代の生きがい形成モデルと、上記(3)で検討した乳幼児の養育者における重要な子育て環境との関係を調査するための調査項目を作成した。本研究の目的は、生きがい形成モデルを構築し、乳幼児の養育者に適用して、乳幼児の養育者が生きがい感を形成する心理プロセスを明らかにすることである。これまでに行ってきた実証的研究から、生きがい形成において時間と状況の2つの重要な側面があることを見出し、神谷の生きがい論とセリグマンの幸福論について2側面から理論分析を行った(熊野『大阪大谷大学紀要』2012)。これまでの実証的研究や文献研究を統合し、時間と状況の2次元からみた生きがい形成の価値過程モデル(以下、生きがい形成モデル)を提案した(熊野『教育福祉研究』2011)。そして、生きがい形成モデルを構築するに至った心理学理論を説明するために、学術図書を出版した(熊野『生きがい形成の心理学』風間書房,2012)。乳幼児の養育者世代を対象として、生きがい形成モデルについてのウェブ調査を行った。データの統計解析により、生きがい形成モデルの測定尺度として、生きがいプロセス尺度と生きがい状態尺度を作成し、その信頼性と妥当性を明らかにした(熊野『日心発表』2013)。そして生きがいプロセス尺度から生きがい状態尺度へ至る共分散構造分析を行い、生きがい形成モデルを検証した(熊野『教育研究』2013)。さらに、この生きがい形成モデルの測定尺度を用いて、子育て環境の異なる乳幼児の養育者4群(共働き家庭と専業主婦家庭の男女)に対してウェブ調査を行った。そのデータの統計解析を行い、子育て環境の異なる養育者4群での相違についてまとめた。本研究により生きがい形成モデルならびにその測定尺度を確立し、子育て環境の異なる養育者の生きがい感形成プロセスの相違について検討することができた。今後さまざまな対象における生きがい感形成プロセスを明らかにすることが期待される。本研究の目的は、時間と状況の2次元からみた生きがい形成の価値過程モデルを構築し、乳幼児の養育者に適用して、乳幼児の養育者が生きがい感を形成する心理プロセスを明らかにすることである。上記の目的を達成するために、平成23年度においては、下記4つの観点から研究を行った。なお、これらについて関西社会心理学研究会(KSP)での研究発表に向けて準備中である。(1)生きがいの2側面についての理論分析:これまでに、生きがい形成において時間と状況の2つの重要な側面があることを見出し、その2側面から実証的研究をすすめてきた。平成23年度においては、神谷の生きがい論とセリグマンの幸福論について2側面から理論分析を行った(熊野『大阪大谷大学紀要』2012)。

(2)時間と状況の2次元からみた生きがい形成モデルの構築:これまでの実証的研究や文献研究を統合し、時間と状況の2次元からみた生きがい形成の価値過程モデル(生きがい形成モデル)の提案を行った(熊野『教育福祉研究』2011)。そして、生きがい形成モデルを構築するに至った心理学理論を説明するために、学術図書の出版を行った(熊野『生きがい形成の心理学』風間書房,2012)。(3)乳幼児の養育者の生きがい形成モデルの構成要素の検討:上記(2)により構築された生きがい形成モデルを乳幼児の養育者に適用するために、養育者の生きがい感・幸福感や子育て環境に関する文献収集や事例収集を行い、文献や事例の解析や評価を行った。(4)東日本大震災後の生きがい感の変化に関する検討)東日本大震災がおこり、日本人の生きがい感・幸福感にも変化がみられると考えられる。そこで、震災後の日本人の価値観・人生観・生きがい感・幸福感などをめぐる変化について文献収集を行い、日本人の生きがい感・幸福感にも変化が生じている可能性があることを報告した(熊野『企業年金』2011)。乳幼児の養育者世代における生きがい形成モデルを検証し、生きがい形成モデルが乳幼児の養育者世代に適用できることを確認した。また、乳幼児の養育者の生きがい感や幸福感に重要と考えられる子育て環境の要因を明らかにした。これらをもとに、乳幼児の養育者の子育て環境と生きがい形成モデルに関する調査を行う準備が整った。計画外の事象として、東日本大震災の発生により、日本人の生きがい感への影響について新たに検討する必要が生じた。そのため、質問紙の作成などで一部遅れがあるものの、全般としては、生きがい形成モデルの構築、文献調査の進展など、計画通りおおむね順調に進展している。乳幼児の養育者の子育て環境と生きがい形成モデルに関するウェブ調査を行う。調査データに対して統計解析を行い、研究発表を行う。上記の通り、東日本大震災の発生により、計画外の新たな検討を行い、全般としてはおおむね順調に進展しているものの、質問紙作成などで一部の遅れがあるため、次年度に使用する予定の研究費が生じた。今年度は、計画に従い、質問紙作成を行い、養育者の子育て環境と生きがい形成モデルに関する調査研究を行う。文献研究、調査研究、学会等の研究集会への参加にかかわる費用が中心となる。使途は文献研究と調査研究にかかわる費用が中心となる。上記の今後の研究の推進方策に従い、本年度繰り越し分も含め、研究費を使用する予定である。
トランスサイレチンの修飾構造の分析、アミロイドーシスの病態解明と臨床検査への応用

我々は、トランスサイレチン(TTR)のN末端から10番目のシステイン(Cys)に亜硫酸が結合した構造、および、このCysがグリシンに変化した構造を見出した。この反応を調べるため、市販の精製TTR及びTTRのシステイン周辺のアミノ酸配列に相当するペプチドSKCPLMVKを弱アルカリ性でインキュベートし、LC/ESI-MSで分析した。その結果、TTR中のCysがSS結合を形成した後、β脱離によって、グリシン、デヒドロアラニン、亜硫酸Cysなどに変化すると考えられる成分を認めた。LC/ESI-MS/MSによる分析を詳細に記載した。インキュベート後の試料を、加水分解し、アミノ酸分析を行ったところ、グリシンの収量は悪かった。質量数が同じ異性体に変化している可能性も否定できない。ランチオニン等の架橋アミノ酸の証明もできなかった。より詳細なアミノ酸分析が必要である。さらに、精製TTR、正常血清TTR、の構造変化を、SDS-PAGE、及びMALDI-TOFMSで調べた。精製TTRは還元変性条件下でSDS-PAGEで解析した結果、モノマーに加え、ダイマー及び60kDa、45kDa、28kDa、20kDaの複数のバンドを検出した。血清TTRでは、これに加え、55kDaにバンドを認めた。還元変性条件下のSDS-PAGEで、ポリマーは、10%以上認められるが、MALDI-TOFMS分析ではモノマーのみ検出された。MALDIの溶媒は強酸性(0.1%トリフルオロ酢酸)であり、SDSは入っていない。TTRはSDS、尿素などの変性条件下で、非共有結合によるポリマーを形成し易いと考える。β脱離によりデヒドロアラニンを含むTTRが生じ易いことと、変性条件化で非共有結合ポリマー形成しやすいことと、アミロイド形成傾向が関連している可能性があり、なお今後の課題である。本研究は、トランスサイレチン(TTR)・アミロイドーシスを対象として、患者血清中およびアミロイド組織中のTTRの、分子内、分子間のデヒドロアラニンによる架橋の存在を証明し、架橋がアミロイドのベータシート形成の引き金となることを実証することを目的とした。これまでに、我々は、精製TTRあるいはヒト血清中TTRが酸化変性して、N末端から10番目のシステインに亜硫酸が結合した翻訳後修飾構造を見つけた。さらに、このシステインがグリシンに変化したもの及びその中間修飾構造のシステインがデヒドロアラニンに変化した形を見出した。変異TTRの多くはアミロイド原性であり、正常構造のTTRも老人性アミロイドーシスを引き起こすことが知られている。16年度、正常のTTRを弱アルカリ性でインキュベートし、システインがグリシン、デヒドロアラニンに変化することを示した。さらにTTRのシステイン周辺のアミノ酸配列に相当するペプチドSKCPLMVKを合成し同様の変化がおこることを示し平成16年度中に発表した。これらの変化は質量分析により質量数差より推定したが、加水分解の後アミノ酸分析を行った。その結果予想どおりのグリシンの増量は認められなかった。質量数が同じ異性体に変化している可能性が示唆された。またランチオニン(デヒドロアラニンとシステインの結合したアミノ酸、チオジアラニン)等の架橋アミノ酸の証明もできなかった。これらは通常アミノ酸ではないので、より詳細なアミノ酸分析が必要である。アミロイド組織から抽出したTTRはSDS-PAGE電気泳動でモノマーからテトラマーまで分布し還元剤でもモノマーにならない成分を認めた。これらのバンドのTOFMS分析は17年度の課題である。アミロイド以外のタンパク質を用いタンパク質の高感度質量分析に関する基礎技術の検討を行い準備が整った。

トランスサイレチン(TTR)はアミロイド変性しやすい構造上の特徴を備えていると考えられている。我々は、TTRのN末端から10番目のシステインに亜硫酸が結合した分子、およびシステインがグリシンに変化した分子を始めて報告し、さらに、システインがSS結合によりシスチンを形成し、β脱離によってデヒドロアラニンに変化することを昨年までに明らかにした。今年度は、精製TTR、正常血清TTRの構造変化を、SDSポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)、CBB染色、銀染色、ウエスタンブロット、及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI-TOFMS)により分析した。精製TTRの還元変性条件下でのSDS-PAGE解析で、正常のモノマーに加え、ダイマー及び60kDa、45kDa、28kDa、20kDaの複数のTTRバンドを検出した。血清TTR(ウエスタンブロット)では、これに加え、55kDaにバンドを認めた。還元変性条件下のSDS-PAGEで、ポリマーは、いずれも、10%以上存在するが、MALDI-TOFMS分析ではモノマーのみ検出された。MALDIの溶媒は強酸性(0.1%トリフルオロ酢酸)で、SDSは入っていない。TTRはSDS、尿素などの変性条件下でのみ、非共有結合によるポリマーを形成しやすいのであろう。グアニジン変性下で、各々ポリマーを十分量分離して、その成分について上記の分析を進めようとしているがまだ準備段階である。またTTR以外のタンパク質についても分析したが、ポリマー形成傾向はTTRが最も強かった。TTRに関連するタンパク質として、スーパーオキシドジスムターゼ、ヘモグロビンの構造変化についても質量分析により調べた。多数試料の分析を行ったが、TTRのようなシステインの変化は認められなかった。
口腔レンサ球菌による感染性心内膜炎の予防薬の開発および発症リスク診断法の確立S

感染性心内膜炎は病原体が心臓の内膜に感染する事で、心内膜での疣贅の形成、敗血症、血管塞栓などの症状を起こす病気である。この病気は心疾患をもつ方に起こりやすく、この方が一過性の敗血症を生じる可能性のある出血を伴う手術や処置を受ける際は、抗菌薬投与による予防が必要となる。しかしながら、歯科処置の際の抗菌薬投与による予防は、非常に少数例で予防に成功する可能性があるのみである。そこで、本研究では抗菌薬投与以外の新たな感染性心内膜炎に対する予防処置の確立を目的とした。口腔レンサ球菌の一種であるStreptococcusgordoniiは、口腔内における歯垢の形成や、それに続く歯肉炎の発症に関与しているのみならず、感染性心内膜炎の原因菌としても知られている。S.gordoniiによる感染性心内膜炎の発症には、菌体表層に発現するシアル酸結合性アドヘジン(Hsa)が重要な役割を担っている事が明らかとなっている。そこで、Hsaとシアル酸との結合を阻害する化合物の探索を試みた。赤血球凝集反応法を用い9600個の化合物をスクリーニングした結果、3個の化合物で菌体による赤血球凝集反応の阻害がみられた。また、Hsaのシアル酸結合領域であるNR2領域とGSTとの融合タンパク質GST-HsaNR2を用いたシアル酸結合実験では、先に得られた3個の化合物のうち、1個の化合物でNR2領域とシアル酸との結合の阻害活性がみられた。以上の結果より、9600個の化合物中から1個の候補薬を得る事ができた。1.HsaのNR2領域と結合する薬剤のスクリーニング:HsaのNR2領域を介したシアル酸結合能を阻害する薬剤を探索するため、赤血球凝集反応法を用いてGST-HsaNR2と赤血球との結合を阻害する薬剤のスクリーニングを行った。96000個の薬剤をスクリーニングした結果、410個の薬剤でGST-HsaNR2による赤血球凝集反応の阻害がみられた。2.候補薬によるS.gordoniiと血球細胞との結合阻害活性の確認:1.の方法で得られた薬剤によってS.gordoniiと血球細胞との結合が阻害されるかを赤血球凝集反応法により検討した。その結果、410個の薬剤のうち3個の薬剤でS.gordoniiによる赤血球凝集反応の阻害がみられた。現在、上記の方法で得られた3個の薬剤によってGST-HsaNR2と3'-sjalyllactoseとの結合が阻害されるかを検討している。感染性心内膜炎の発症にはHsaを介した菌と宿主との結合が重要であることが明らかとなっている。そこで本研究では感染性心内膜炎の予防薬の開発を目標として、Streptococcus gordonii DL1に発現するシアル酸結合性アドヘジンHsaのシアル酸結合能を阻害する薬剤の探索を試みた。今年度は、昨年度の研究で得られた候補薬(No.1, No.2, No.3)を用いてHsaのシアル酸結合能の阻害効果を検討した。本薬剤によりGST-HsaNR2 (GSTとHsaのシアル酸結合領域であるNR2領域との融合タンパク質)と3'-sialyllactoseと結合が阻害されるかをドットブロット法で確認した結果、薬剤No.2で顕著な阻害効果が見られた。また、この薬剤がHsaのNR2と結合していることも明らかとなった。さらに、薬剤No.2が他の菌にも有効であるかを検討した。

赤血球凝集反応法を用いて阻害効果を検討した結果、S. gordonii DL1だけでなくS. gordonii 38、S. gordonii SK6、S. gordonii臨床分離株、S. sanguinis 10556による赤血球凝集反応も阻害することが明らかとなった。このことから、S. gordoniiだけでなくHsaのカウンターパートを発現する他の菌においても本薬剤が有効に働く可能性が示された。これまでの研究でHsaのNR2領域がシアル酸との結合に関与していることが明らかとなっているが、シアル酸との結合に必須なアミノ酸残基は明らかとなっていない。そこで、NR2領域のアルギニンに部位特異的変異の入ったGST-HsaNR2R*を作成し、赤血球凝集反応法を行うことでシアル酸との結合に関わるNR2領域内のアミノ酸残基の探索を試みた。その結果、2カ所のアルギニンがシアル酸との結合に関与していることが明らかとなった。実験を行うのに必要な資材が、提供者の都合により遅延したため。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、研究の遅れを取り戻しつつ、研究計画に従ってこれまでの研究で得られたHsa阻害薬が他の感染性心内膜炎原因菌(StreptococcussanguinisやStaphylococcus aureus)にも有効であるかを赤血球凝集反応法で検討する。また、心疾患モデルラットを用いてHsa阻害薬の有効性を確認する予定である。