hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
前立腺組織内アンドロゲン環境の変化に適応したアンドロゲン受容体活性化機構の解明

低アンドロゲン環境下に適応した前立腺癌アンドロゲン受容体活性化機構の解明を目的とした。5α還元酵素阻害剤、デュタステリドの投与群、非投与群の前立腺癌組織内ステロイド濃度を測定し、21炭素ステロイドである20β-OHDHPに着目した。20β-OHDHPは野生型および変異型前立腺癌細胞株のアンドロゲン受容体を活性化し、細胞増殖を促進することが明らかとなった。20β-OHDHPの合成経路は去勢抵抗性前立腺癌の治療標的となりうることが示唆された。<方法>前立腺肥大症に対する5α還元酵素阻害剤(デュタステリド)の投与下に前立腺癌と診断された症例(投与群)とデュタステリドの投与なく前立腺癌と診断された症例(未投与群)の前立腺組織を採取し、組織内のアンドロゲンとプロゲスターゲンをLC/MSを用いて測定した。<結果>未投与群の前立腺組織内テストステロン濃度は組織内アンドロステンジオン,プロゲステロンと相関関係にあり、組織内アンドロステンジオン濃度もプロゲステロンとの相関関係を認めた。投与群のGleason scoreは全例で高悪性度前立腺癌であった。投与群の前立腺組織内ジヒドロテストステロン濃度は未投与群と比較し有意に低下しており、また投与群の組織内テストステロン濃度は有意差はないが未投与群よりも高かった。アンドロステンジオンから5α-A-dioneへの合成は5α還元酵素によるが、投与群において5α-A-dioneは有意に低下し、アンドロステンジオンは有意差はないが高値であった。デュタステリド投与後の組織内プロゲスターゲン濃度は未投与群と比較して高い傾向にあった。デュタステリドにより前立腺癌組織内のジヒドロテストステロンと5α-A-dioneはほぼ完全に抑制されていたが、前立腺癌組織内においてプロゲスターゲンからテストステロンへの合成が行われていることが明らかとなった。デュタステリド投与下ではそのdelta-4 pathwayによるテストステロン合成が促進され、前立腺癌増殖に関与していることが示唆された。5α還元酵素阻害剤を投与された前立腺肥大症患者あるいは診断前に投与された前立腺癌組織は採取され、組織内アンドロゲン、エストロゲン、プロゲスターゲンへの影響についての解析は予定通り進んでいるが、同一症例による経時的な組織採取については臨床的な治療経過がよいため遅れている。<方法>5α還元酵素阻害剤(デュタステリド)投与群・非投与群の前立腺肥大症患者の組織およびデュタステリド投与下に前立腺癌と診断された症例(投与群)とデュタステリドの投与なく前立腺癌と診断された症例(未投与群)の前立腺組織を採取し、組織内のアンドロゲンとプロゲスターゲンをLC/MSを用いて測定した。<結果>前立腺組織内でAllopregnanoloneと同じ分子量をもちデュタステリドで合成が阻害される物質が同定され、20α-OHDHPまたは20β-OHDHPと考えられた。前立腺癌培養細胞(LNCaP cells, VCaP cells)を用いてアンドロゲン受容体(AR)活性化作用、細胞増殖能を測定し、20β-OHDHPがよりAR活性化作用を持ち、かつmutant ARだけでなくwild ARに対する刺激作用を持つことが分かった。Pregnanoloneの添加で20β-OHDHPが前立腺細胞内で合成されることが確認され、かつ同条件下ではARの活性化に十分なアンドロゲンの合成は認められなかった。さらに前立腺細胞内でのPregnanoloneからのアンドロゲン合成を遮断するためCYP17A1阻害剤であるアビラテロンを添加した場合でも20β-OHDHPの細胞増殖作用は阻害されず、またARを持たないDU145 cellsを用いた検討では、グルココルチコイド受容体に対する刺激作用を併せ持っていないことが分かった。<結論>20β-OHDHPは前立腺組織内で合成され、ARに対する直接刺激作用を持つことが解明された。内分泌療法に抵抗性を持つ去勢抵抗性前立腺癌に対して、20β-OHDHPを標的とした治療が有用となりうることが示唆された。ヒト前立腺肥大症および前立腺癌組織から得られた結果をもとに、前立腺癌培養細胞を用いた実験に移行していく。アンドロゲン環境を変えた培養条件や、前立腺組織内アンドロゲン合成酵素阻害剤を添加し、細胞内アンドロゲン環境の変化に応じた共役因子、アンドロゲン合成酵素、リガンド非依存性シグナル因子の発現変化と細胞増殖の作用機序を解明を行っていく。前立腺癌ヒト前立腺癌組織の採取について、症例の蓄積と解析に時間を要し、当該年度での細胞実験への移行が遅れたため臨床検体の解析結果をもとに行う前立腺癌細胞培養実験に使用する予定
腫瘍マーカー倍加時間・増殖細胞核抗原およびKi67抗原を用いた前立腺癌の増殖能

内分泌療法(去勢術あるいはLH-RHアナログ)による治療後、再燃し前立腺特異抗原もしくは前立腺性酸性フォスファターゼ倍加時間を算定しえたのは42例である。この中で前立腺原発巣の再発部位を生検した7例のホルマリン固定標本を用いてArgyrophilic nucleolar organizer regions(AgNOR)および増殖細胞核抗原(PCNA)染色を行った。同じく増殖能の指標とされるKi-67は新鮮材料を必要とし、今回は標本が無く検討できなかった。AgNOR染色は既に報告してある方法にておこなった(Prostate20:1-13,1992)。クラスターを形成しているものは焦点を変えることにより個々の小体を数えた。PCNA染色は、一次抗体としてDako社の抗PCNAモノクローナル抗体、二次抗体としてVector Lab.社のビオチン化抗マウスIgGを用いたABC法にておこなった。全腫瘍細胞に対する陽性細胞の割合よりPCNA陽性率(%)を算出した。腫瘍マーカー倍加時間の算定は、腫瘍マーカーの対数値をY軸、日時をX軸として、上昇直前より治療変更前までの値より、その回帰直線Y=aX+bを求め、log2/aより得た。AgNOR染色による小体数、PCNA陽性率(%)および腫瘍マーカー倍加時間はそれぞれ、4.0-4.9(4.4±0.3)、5-60%(29.4±24.4)、40.2-151日(76.9±44.8)であった。PCNA陽性率と腫瘍マーカー倍加時間とは、強い逆相関を示したが、AgNOR染色による小体数は他の2つとは相関がなかった。以上の結果より、腫瘍マーカー倍加時間で示される前立腺癌の内分泌療法再燃後の増殖は、PCNAでみた細胞増殖能と強く関連することが示唆された。
単球と血小板の相互作用を介する新しい炎症抑制経路の同定

ヒト血小板に結合したIgGが末梢血単球上のFcγRIIAを刺激することで,本来は細胞内シグナルに対して活性化型のレセプターであるFcγRIIAが「抗炎症経路」に変換されることが示された。本研究は自己免疫疾患などの原因となる慢性的な炎症において破綻している生理的な抗炎症経路の存在を示唆し,またこれまで基本的な機序の不明であったイムノグロブリン製剤IVIgについて,今まで見過ごされて来たFcγRIIAを介する中心的な機序を示した。26年度は血小板と単球の相互作用から抗炎症につながる分子経路をマウスモデル系およびヒト末梢血由来単球および単球系株細胞を用いて同定することを進めた。A)モデル系としてのマウス単球・マクロファージ上の抗炎症シグナル惹起分子の同定とシグナル解析:これまで,『ヒト血小板+抗血小板IgG+末梢血単球』の極めて単純なin vitro系において,IgGの有無によりLPS刺激で誘導されるIL-6産生抑制,IL-10亢進が見られることを観察しており,さらにヒト単球の代わりにマウス骨髄単球や骨髄誘導培養マクロファージを用いることで同様の抗炎症性サイトカインIL-10の産生亢進が起こることも確認した。マウスのモデル系においてこれが単球上のどのような分子により起動しているのかを同定したところ,活性化型Fcレセプターの共通シグナルサブユニットであるFcRγが欠損するとこのIL-10産生亢進が消失する知見を得た。またFcγRIIBやFcγRIII欠損マウス由来の細胞を用いることで,FcγRIIIがこの経路を仲介することを同定した。さらにIgGのフラグメント化によりFc部分が必要であることから,本経路には活性化型FcγRIIIが起点となることを証明した。B)ヒト単球表面上の標的Fcレセプター分子の同定を試み,Inflammatory単球およびResidential単球いずれにも発現するFcレセプターであるFcγRIIAが貢献していることを,それぞれのブロック抗体IV.3を用いて実証した。これらの結果をまとめ,BMC Immunol誌に論文を発表した(謝辞記入あり)。C)27年度はヒト自然抗体のプールであるγグロブリン製剤の有効性がこの新しいIL-10産生経路に貢献するか否か,および血小板上に発現する単球との相互作用に寄与する分子の同定について検討する計画である。末梢血単球からのサイトカイン産生を抗炎症型にスイッチさせる単クローン抗体の作用機序を解析していたところ,意外なことにこれが血小板と単球との結合を仲介していることを発見した。さらに本IgGが活性化型シグナルを導入するとされているFcγレセプターであるFcγRIIAである可能性が阻害抗体実験等で示された。即ち,血小板に結合したIgGが単球FcγRIIAを刺激することで,本来は細胞内シグナルに対して活性化型のレセプターであるFcγRIIAが「抗炎症経路」に変換されることが示された。本研究では血小板上の分子の特異性,単球サブセットであるInflammatoryとResidentのいずれが応答するのかを明確にしたうえ,極めてポリクローナルな自然抗体IgGのプールであるγグロブリン製剤(Intravenous Ig; IVIg)がこの抗炎症経路を刺激するか否かを検証した。本研究はこれまで重要な生理機能を担う半面,炎症の局面では悪者の扱いを余儀なくされていた血小板と単球に焦点を当て,これらの組み合わせとIgGで生理的な炎症抑制機構が成立していることを証明した。本研究は自己免疫疾患などの原因となる慢性的な炎症において破綻している生理的な抗炎症経路の存在を示唆し,またこれまで基本的な機序の不明であったIVIgについて,今まで見過ごされて来たFcγRIIAを介する中心的な機序を示すことができ,治療の面でも関連分野に大きな貢献ができた。またこの新規な抗炎症経路の我々の発見を起点にして,それぞれ2つのサブセットから成るとされている単球や樹状細胞などが有する,隠されていた免疫制御機構の発見につながる可能性があり,関連分野を学術的に大いに刺激し,創薬にもつながる成果が得られた。モデル系としてのマウス単球・マクロファージ上の抗炎症シグナル惹起分子の同定とシグナル解析においてこれが単球上のどのような分子により起動しているのかを検討し,活性化型Fcレセプターの共通シグナルサブユニットであるFcRγであることを示した。またFcγRIIIがこの経路を仲介することを同定した。ヒト単球においてはFcγRIIAがこれに相当する機能を果たすことを実証した。これらの結果をまとめ,BMC Immunol誌にすでに論文を発表した(謝辞記入あり)。

以上のように,計画した研究項目については計画よりも速やかな進捗を得て国際的免疫学雑誌に論文発表を既に行っており,まだ着手していないγグロブリン製剤の有効性の検討,および血小板上,単球上の補助因子の探索についても平成27年度に順調に進める計画であるため期待どおりの成果を得たと判断した。医歯薬学(免疫学)27年度はヒト自然抗体のプールであるγグロブリン製剤の有効性がこの新しいIL-10産生経路に貢献するか否か,および血小板上に発現する単球との相互作用に寄与する分子の同定について検討する計画である。本研究を通じて製薬企業と協働するなど,疾患治療への道筋も探索する。
合成プローブを活用したテトロドトキシンの食物連鎖機構および生合成経路の解明

フグ毒テトロドトキシン(TTX)の食物連鎖機構と生合成研究に必要不可欠な安定同位体で標識されたTTX類縁体を合成することが目的である。TTXの生合成前駆体として最も可能性が高い5-deoxyTTXと5,6,11-trideoxyTTXを効率よくかつ確実に合成するために、以下のように研究を進めた。初年度、5-deoxyTTXと5,6,11-trideoxyTTXの合成に必要な11位水酸基の導入された「新共通中間体」の100gスケールでの大量合成に成功した。次年度、5-deoxyTTXを目指して、重要中間体であるラクトンを合成した。すなわちトリクロロアセトアミドの隣接基関与を活用して8位水酸基を導入し、酸化還元によってTTX合成に必要な立体配置に反転させた。ついで、環内オレフィンの立体選択的なエポキシ化、末端オレフィンのオゾン酸化によってアルデヒドに変換した。アルデヒドへのカルボン酸等価体としてアセチレンの導入は、リチウムアセチリドを使うと立体選択的に進行し、保護基の変換後、ルテニウム酸化によってアセチレンを切断しカルボン酸を発生させると、分子内のエポキシドを位置選択的に開環しラクトン中間体が効率よく得られた。5-deoxyTTXを合成するためには、このラクトン中間体へのグアニジン導入を残すのみとなった。今後、5-deoxyTTXと5,6,11-trideoxyTTXの合成ルートの完成させ、安定同位体(15N,13C)で標識されたTTX類縁体を合成する予定である。テトロドトキシンの生合成研究に必要不可欠な同位体標識されたテトロドトキシン類縁体を合成することが目的である。テトロドトキシンの生合成前駆体として最も可能性が高い5-deoxyテトロドトキシンと5,6,11-trideoxyテトロドトキシンを効率よくかつ確実に合成するために、以下の2方法による11-位水酸基の導入法を検討した。従来当研究室で使われてきたトリクロロアセトアミドを持ったエノン中間体のエノラートとmCPBAによる11位の水酸基導入は収率が悪く実用的でなかった。一方、このエノンをDMF中炭酸カリウムと加熱するとビシクロ型のγ-ラクトンが得られることを見出した。このエノンの場合は、同様の方法による11位への水酸基導入が高収率で進行し、ラクタムの加水分解、脱炭酸等を経てアミノ基をBocで保護した中間体の合成に成功した。この方法の通算収率はよいが、11位へ水酸基を導入するためだけに6工程かかっており、更に効率のよい方法が望まれた。そこで、Diels-Alder反応によって共通中間体のシクロヘキサン構造を構築する際に、あらかじめ11位水酸基が導入されたジエンを使う方針に切り替えた。親ジエンである3-bromolevoglucosenoneと水酸基が、11位へ導入されたイソプレノール誘導体を使ってDiels-Alder反応を検討した。この反応は室温でも進行するが、位置選択性を制御するためにLewis酸の添加が必要であった。続いて、Overman転位反応によって、11位に水酸基をもった重要中間体を合成した。なお、文献既知のイソプレノールの合成法は大量合成に適しなかったが、詳細な条件検討の結果、100gのスケールでの合成が可能になった。以上の方法によって懸案だった11位水酸基を導入した中間体を数十グラム合成することができた。この中間体は、TTXのあらゆる類縁体の合成に利用できる「新共通中間体」と位置づけられる。今後は、この中間体から出発して当研究室で開発されたルートを利用して5-deoxyテトロドトキシンと5,6,11-trideoxyテトロドトキシンの標識体合成を行う予定である。

フグ毒テトロドトキシンの食物連鎖機構と生合成研究に必要不可欠な安定同位体で標識されたテトロドトキシン類縁体を合成することが目的である。テトロドトキシンの生合成前駆体として最も可能性が高い5-deoxyテトロドトキシンと5,6,11-trideoxyテトロドトキシンを効率よくかつ確実に合成するために、以下のように研究を進めた。前年度までに、5-deoxyテトロドトキシンと5,6,11-trideoxyテトロドトキシンの合成に必要な11位水酸基の導入された「新共通中間体」の100gスケールでの大量合成に成功している。そこで、5-deoxyテトロドトキシンを目指して、重要中間体であるラクトンを合成した。トリクロロアセトアミドの隣接基関与を活用して8位水酸基を導入し、酸化還元によって立体配置をテトロドトキシン合成に必要な立体配置に反転させた。ついで、環内オレフィンの立体選択的なエポキシ化、末端オレフィンのオゾン酸化によってアルデヒドに変換した。アルデヒドへのカルボン酸等価体としてアセチレンの導入は、リチウムアセチリドを使うと立体選択的に進行し、保護基の変換後、ルテニウム酸化によってアセチレンを切断しカルボン酸を発生させると、分子内のエポキシドを位置選択的に開環しラクトン中間体が効率よく得られた。5-deoxyテトロドトキシンを合成するためには、このラクトン中間体へのグアニジン導入を残すのみとなった。今後、5-deoxyテトロドトキシンと5,6,11-trideoxyテトロドトキシンの合成ルートの完成後、安定同位体^<15>N,^<13>Cによる標識体合成を行う予定である。
最速モーター車軸藻ミオシンのユニークなアクチン結合様式の研究

車軸藻ミオシンはすべてのモータータンパク質のなかで最速の運動速度をもつ。分子生物学的手法による変異実験により,車軸藻ミオシンはアクチンとの結合様式が独特であるということ,この独特の結合様式が最速運動をうみだす主要な要因ということを明らかにした。また,電子顕微鏡観察により車軸藻ミオシンはアクチンと結合するとヌクレオチドポケットが大きく開くことがわかった。これらのことから車軸藻ミオシンは独特の様式でアクチンと結合することにより,ヌクレオチド結合ポケットが大きく開き, ADPの解離が促進されることにより最速運動を引きおこしていると考えられる。淡水産の藻類である車軸藻ミオシンは50μm/sで動く最速の分子モーター蛋白質で,この桁違いのこの速さのため注目されてきた。それは,どのような機構でこの速い速度を生み出しているかを解き明かすことは,ミオシンの化学-力学エネルギー変換機構の解明においても大きな知見となると期待されているからである。申請者は車軸藻ミオシンはアクチンとloop2ではほとんどイオン結合せず,loop3で結合することを示唆するデーターを得ていたが,これが最速ミオシン運動を引き出す機構に関与している可能性が示唆される。そこで,本補助金による研究により,結合様式の検証をおこなった。その方法として,loop2,およびloop3の正電荷をつぶすことにより,アクチン活性化ATP分解活性のKmがどのように変わるかを検証した。Loop3にはloop3には塩基性アミノ酸が5つあるが,これらの塩基性アミノ酸のいくつか,もしくはすべてをアラニンに置換した。その結果,塩基性アミノ酸をアラニンに置換した数が増えるにしたがって,すなわちloop3の正の電荷が少なくなるにしたがって,Kmの値が上昇する,すなわちアクチンとの親和性が減少していった。またloop3の正電荷をすべてアラニンに置換したものはKmが測定できないほどアクチンとの親和性が減少した。このことは,車軸藻ミオシンは他のミオシンと異なり,loop3でのイオン結合でアクチンとの結合に重要であることを示唆している。引き続き平成20年度は,このユニークな結合が速度におよぼす影響を検証していく。研究代表者の伊藤は車軸藻ミオシンのループ2およびループ3に変異を与えた種々の変異車軸藻ミオシンを作製し,それらのアクチン活性化ATP加水分解活性およびアクチン滑り運動活性を調べた。その結果,ループ3の正電荷はアクチン活性化ATP加水分解活性のVmaxを大きくするのに必要であることがわかった。また親和性を大きくするのにも必要であることがわかった。一方,ループ2の正電荷を大きくするとアクチンとの親和性を増大させることができたが,一方,アクチン滑り運動速度が減少した。これはループ2の正電荷の増大にともないアクトミオシンからのADPの解離が遅くなることがわかった。つまり,車軸藻ミオシンはループ2の電荷がほとんどなく,ループ3の電荷が大きいが,これはループ2の電荷を上げることなく,ループ3の電荷を上げることによりアクチンとの親和性を維持したまま,高速運動を可能にするためということが分かった。分担者である安永は、車軸藻ミオシンの構造について、アクチンとの結合状態、及び、単独のものについて、ATPの有無に応じて、電子顕微鏡を用いた構造解析を行い、それぞれの三次元構造を2-3ナノメータの分解能で得ることに成功した。その結果、ミオシン単独のものに比べ、アクチンと結合した際に、ATP結合クレフトが大きく開いた構造をとっていた。このことは、車軸藻ミオシンのもつ、高速のADP解離、ATP結合等の生化学的データの構造学的裏付けを示唆している。
膵β細胞の11βHSDタイプ2とインスリン分泌不全の関連

グルココルチコイドを不活化する11β水酸化ステロイド脱水素酵素タイプ2(11βHSD2)はミネラロコルチコイド受容体の防御機構として高血圧症における役割が確立されたが、膵β細胞にも存在し、糖尿病等を含めた生活習慣病をリンクする新たな経路として注目される。日本人では、11βHSD2遺伝子のコード領域に多型は検出されなかったが、第1イントロン内にはCAリピート多型が存在し、CAリピートが長いと発現が低下する。正常者388例・2型糖尿病212例の検討では、リピートの長いアリルの頻度が2型糖尿病に多く、疾患感受性遺伝子の一つである可能性が判明した。また正常者346例の検討では、リピート数と空腹時インスリン値・HOMA-R・HOMA-βが逆相関すること、すなわち正常者では11βHSD2発現が低下するとインスリン分泌も低下する可能性が示され、膵β細胞局所の11βHSD2発現低下が日本人2型糖尿病の特徴であるインスリン分泌不全を生じる可能性が示唆された。一方、糖尿病モデルGKラットの単離ラ氏島では対照に比し11βHSD2発現は増加していた。またマウス膵β細胞由来MIN6細胞の11βHSD2発現は、高濃度ブドウ糖反応性インスリン分泌株(m9)に比べ非反応性株(m14)で約2倍に増加していた。MIN6両細胞株に11βHSD2を一過性に過剰発現させると、m14ではPPARγとインスリンのmRNA発現量が約20%低下したが、m9ではGLUT2、glucokinase、HNF1α、HNF1β、IPF、Beta2を含め有意な発現変動を認めなかった。MIN6 m14細胞株で11βHSD2をノックダウン(siRNA)すると、高濃度ブドウ糖に対するインスリン分泌反応が有意に減弱したが、インスリンのmRNA発現はむしろ増加した。免疫組織化学では、OLETFラットのラ氏島に11βHSD2免疫活性を認めた。膵β細胞に局在する11βHSDタイプ2は、インスリン分泌に対し防御的に働くことが示唆された。また正常者346例の検討では、リピート数と空腹時インスリン値・HOMA-R・HOMA-βが逆相関すること、すなわち正常者では11βHSD2発現が低下するとインスリン分泌も低下する可能性が示され、膵β細胞局所の11βHSD2発現低下が日本人2型糖尿病の特徴であるインスリン分泌不全を生じる可能性も示唆される。

MIN6両細胞株に11βHSD2を一過性に過剰発現させると、m14ではPPARγとインスリンのmRNA発現量が約20%低下したが、m9ではGLUT2、glucokinase、HNF1α、HNF1β、IPF、Beta2を含め有意な発現変動を認めなかった。現在両細胞株において、siRNAを用いた11βHsD2ノックダウンの影響について検討中であり、インスリン産生・分泌における役割を明らかにしたい。糖尿病の新たな治療薬として、膵β細胞をターゲットとした組織特異的な11βHSDタイプ2発現調節剤の検索も課題である。グルココルチコイドを不活化する11β水酸化ステロイド脱水素酵素タイプ2(11βHSD2)はミネラロコルチコイド受容体の防御機構として高血圧症における役割が確立されたが、膵β細胞にも存在し、糖尿病等を含めた生活習慣病をリンクする新たな経路として注目される。日本人では、11βHSD2遺伝子のコード領域に多型は検出されなかったが、第1イントロン内にはCAリピート多型が存在し、CAリピートが長いと発現が低下する。正常者388例・2型糖尿病212例の検討では、リピートの長いアリルの頻度が2型糖尿病に多く、疾患感受性遺伝子の一つである可能性が判明した。また正常者346例の検討では、リピート数と空腹時インスリン値・HOMA-R・HOMA-βが逆相関すること、すなわち正常者では11βHSD2発現が低下するとインスリン分泌も低下する可能性が示され、膵β細胞局所の11βHSD2発現低下が日本人2型糖尿病の特徴であるインスリン分泌不全を生じる可能性が示唆された。一方、糖尿病モデルGKラットの単離ラ氏島では対照に比し11βHSD2発現は増加していた。またマウス膵β細胞由来MIN6細胞の11βHSD2発現は、高濃度ブドウ糖反応性インスリン分泌株(m9)に比べ非反応性株(m14)で約2倍に増加していた。MIN6m14細胞株で11βHSD2をノックダウン(siRNA)すると、高濃度ブドウ糖に対するインスリン分泌反応が有意に減弱したが、インスリンのmRNA発現はむしろ増加した。免疫組織化学では、OLETFラットのラ氏島に11βHSD2免疫活性を認めた。膵β細胞に局在する11βHSDタイプ2は、インスリン分泌に対し防御的に働くことが示唆された。
頸動脈プラーク不安定機構に関わるプロテオグリカンの意義とその制御

頚動脈脈内膜剥離術の至適な施行時期を解析するため、発症後一週以内の急性期とそれ以後の慢性期に手術により摘出したプラークを免疫組織学的に安定性/不安定性プラークに分類した。さらにプラーク中の酸化LDLおよびマトリックスメタロプロテナーゼ-9(MMP-9)の含有量や活性を測定し、免疫組織学的にこれらの局在を調べた。頚動脈狭窄症例の発症早期に酸化LDL含量やMMP一9の活性が、慢性期に摘出したプラークに較べて上昇していることを明らかにした。さらに酸化LDLのマクロファージへの取り込みに関与するプロテオグリカンであるDecolinやBiglicanの発現量およびその局在を評値し、これらのプロテオグリカンが不安定なプラークに多く発現していることを認めている。またこれらの発現は酸化LDLの増加と相関していた。従来、頚動脈脈内膜剥離術は症状の安定を待って1ヶ月以後に手術が施行されていた。しかし頚動脈狭窄症例では発症早期により強い酸化ストレスや炎症性変化があることを示した本研究結果から、発症早期に手術を行うことが妥当であることを示唆した。この研究から得た知見についてはJournal of Vascular Surgeryに投稿し、受理された頚動脈脈内膜剥離術の至適な施行時期を解析するため、発症後一週以内の急性期とそれ以後の慢性期に手術により摘出したプラークを免疫組織学的に安定性/不安定性プラークに分類した。この研究から得た知見についてはJournal of Vascular Surgeryに投稿し、受理された頚動脈プラークの安定性/不安定性に分類して、急性期(4週間以内)と慢性期(4週間以上)の手術時期での検討を行った。その結果、急性期症例では不安定プラークの率が慢性期に比較して有意に多く見られた。また、急性期、慢性期症例のうち、不安定フラークでは血中及びプラーク中の酸化LDLが安定プラークより有意に高かった。また不安定プラークではMMP濃度が安定プラークより有意に上昇していた。この研究により、頚動脈狭窄症症例では発症早期に酸化ストレスが上昇しており、早期手術の妥当性を酸化ストレスの面から示した。現在decorin、biglycanの発現や構造変化および機能の関連性についてCEA症例のplaqueを用いて解析し、さらに症候性/無症候性との関連性について検討し、解析している。またPlaque中のdecorin biglycanの発現や構造変化とHCII活性を解析し、血中HC IIにどのように反映されるかについて探求している。また術前にスタチンをと投与した例と投与していない症例を比較して、酸化LDL、decorin、biglycanおよびHC II活性とstatinの関係について解析し、動脈硬化発症および進展のmechanismを考察する予定である。19年度に引き続き、さらにスタチン投与によりプラークが安定化するかどうかを酸化LDL, MMP-9活性およびプロテオグリカン蛋白発現量の変化を解析している。CEA適応が決定した症例にCEA前日まで少なくとも1週間から1ケ月スタチンを投与している。不安定性プラークでは酸化LDLとβ2glycoprotein1との複合物(OxLDL/β2GP1)やプロテオグリカンのビグリカンおよびデコリンが上昇しており、MMP-9活性の上昇と相関がみられている。またスタチン投与例ではOxLDL/β2GP1およびMMP-9活性低下が観察されており、プロテオグリカンおよびビグリカンの発現を免疫組織学的およびwestern blot解析によりOxLDL/β2GP1およびMMP-9活性との関係を解析するためスタチン投与症例を追加しており、その解析を継続している。
生体構造に適した、実空間に表示可能な四次元画像表示装置の開発とその臨床応用

本年度前半で四次元表示装置の完成をめざし、前年度に作製した円柱上のミスト(霧)の流れを発生させる装置、小型プロジェクタ群の照射アセンブリ機構、画像処理システムを結合させ、装置の1号機を完成させる作業を行なった。また空間に結像させた画像に対する時空間分解能の計測法を開発するために幾何学モデルを使った実験法を考案した。これによりモニターに表示された画像の分解能を評価するために、空間上に表示された立体像の分解能を評価するための手法構築も行った。このために何種類かのテストパターンを作製して検討を行った。そしてこの手法をもってドライファントムを用いた撮像と表示の実験を進め、開発装置の表示能力の検討を続けた。この結果、臨床医側の研究者と協議しながら表示画像の更なる解像度の向上の必要性に迫られた。本年度中盤でミスト発生装置、小型プロジェクタ群の照射アセンブリ機構、画像処理システムのどの部分を改良すると、最終的な空間解像度がどのように向上するかを技術要素ごとに検討した。これに基づき本年度後半で1号機の再構築し、新たな構造を持つミスト発生装置の搭載を行った。また、小型プロジェクタ群の数を変更するとともに、各プロジェクタの空間的配置を変えることによる最終画像の変化を調べた。これらの各技術要素の並列的な改良作業とともに、研究所内のCT装置と動物実験施設を用いてブタの臓器を使用した実験により、臓器内構造、血管走行これらの動的変化の認識率を検証していった。また研究所内の模擬手術室での照射実験を行い、診療各科の専門医による評価実験を行った。そして同時にナビゲーション手術使用時の画像を空間表示して、術前シミュレーションや手術計画にどのように利用できるかの検討も行った。前年度に作製したミスト装置、小型プロジェクタ群の照射アセンブリ機構、画像処理システムを結合させ、装置の1号機を完成させたが思った通りの空間解像度を持つ表示画像が得られなかった。しかし装置のどの部分を改良すると最終的な空間解像度がどのように向上するかを技術要素ごとに検討してこれを克服できた。これには今まで確かな手法のなかった、空間上に表示された立体像の分解能を評価するための手法の構築を行ったことが問題の洗いだしを明確化したと考える。このために製作した何種類かのテストパターンも適確に役立った。検討の結果、来年度の予算を繰り越して1号機の改良作業を行うことができ、結果的にほぼ順調な研究の進行状況を取り戻すことが出来たと考える次第である。本装置は単に研究室内で完成するだけでは無意味であり、臨床の現場で診断、治療に新たな知見、新たな可能性を生み出さなければ意味は無いものと思う。この観点から臨床の他分野の専門医と協力し、それぞれの専門分野の中で表示すべき体内の4次元情報を的確に表示しうるかを評価していく姿勢を研究開発の最終段階まで保ち続けるつもりでいる。さらに生体の解剖学的構造とその動態を空間に表示して利用することは、これまでの医学では行なわれていない事象であるゆえ、この表示法がどの様に医学を変えていくことができるのか、どこまでも新しい診断法、新しい手術を含む治療法につなげられるかを留意しつつ研究を進めていくつもりである。心臓の拍動、四肢の運動など人体の動的変化、すなわち4次元現象を定量的に捉え、解析することはこれからの医学に大きな貢献となるはずである。しかしながら現実には4次元データを真に4次元的に表示することのできる表示装置は、まだこの世の中に存在していない。最近の生体画像技術の発展により、ようやく生体の4次元データを取得することができるようになりながら、これらを従来のモニターという2次元平面的に投影して暫定的に使用するという、理不尽な手法が日常臨床でも行われている。人体の構造と動態を充分表示可能な高い時空間分解能を持つ4次元画像表示装置の開発とその臨床応用が本研究の目的である。われわれが実現化させようとしている4次元表示装置は、画像表示空間の周囲に同心円上に配置したプロジェクタ群から対象物のプロジェクションデータを投影し、実空間上で複数のプロジェクションデータを光学的に合成して立体像を結像させるものである。さらにこの立体像を時間軸に沿って表示することにより、立体構築物の時間的変化を表示することが可能となる。透明な空気中での4次元像の結像は不可能であるため、本手法では結像に最適の条件を満たす空間的濃度分布を持つ円柱上のミスト(霧)の流れの中に立体像を結像させる方式をとるものとした。下記の進捗状況に示すごとく、本年度は4次元表示装置の原理追求を行うとともに要素技術となる照射アセンブリ機構機構の開発とミスト発生装置の開発を実施して来年度の第1号本装置組み上げ、いくつかの知見を得ることができた。まず本年度内に4次元表示装置の表示原理の追求と照射アセンブリ機構機構の開発とミスト発生装置の開発を実施した。われわれが実現しようとしている4次元画像の表示装置は、コンピュータ内の仮想空間における演算による立体構造の構築ではなく、光学的な結像による実空間での立体像の構築ができる機能を持たせることが必須である。このためには最適の条件を満たす空間的濃度分布を持つ円柱上のミスト(霧)の流れの周囲に同心円上に配置したプロジェクタ群から対象物のプロジェクションデータを投影し、複数のプロジェクションデータを光学的に空間合成して立体像を実空間上に結像させるものである。要素技術開発としては、まず空間上に結像させるための鍵でもある円柱上のミスト(霧)の流れを発生装置構造の開発に務めた。

発生した霧を安定した層流として空間に放出する装置に装着するハニカム構造の整流管の構造と霧を押し出すポンプを設計して試験装置を製作した。ハニカム構造の内部形状と材質を変化させることにより、中心部の濃度が高く周辺部に向けて濃度の低いガウス分布上の霧の流れを作るための制御機構を構築することに成功した。特にハニカム構造の材質と内面表面の性状がミスト濃度分布の安定性を決定することを発見した。複数方向からのデータのプロジェクション法についてはプロジェクションの方向とプロジェクション数を変更できる試験装置を開発し、これらの条件が変わることにより結像される画像がどのように変化し、観察者の認識が変わってくるかを調べた。特に1対1の実寸で患者患部の位置、臓器表面の深さを実感して計測するための表示条件を絞り込み、結像させている空間に指を入れた際の画像全体への影響なども調査した。結果的に空間結像方式であるが故に複数の観察者による観察も可能であり、4次元像を前にした複数の観察者による討議も可能となることも証明することができた。本年度前半で四次元表示装置の完成をめざし、前年度に作製した円柱上のミスト(霧)の流れを発生させる装置、小型プロジェクタ群の照射アセンブリ機構、画像処理システムを結合させ、装置の1号機を完成させる作業を行なった。また空間に結像させた画像に対する時空間分解能の計測法を開発するために幾何学モデルを使った実験法を考案した。これによりモニターに表示された画像の分解能を評価するために、空間上に表示された立体像の分解能を評価するための手法構築も行った。このために何種類かのテストパターンを作製して検討を行った。そしてこの手法をもってドライファントムを用いた撮像と表示の実験を進め、開発装置の表示能力の検討を続けた。この結果、臨床医側の研究者と協議しながら表示画像の更なる解像度の向上の必要性に迫られた。本年度中盤でミスト発生装置、小型プロジェクタ群の照射アセンブリ機構、画像処理システムのどの部分を改良すると、最終的な空間解像度がどのように向上するかを技術要素ごとに検討した。これに基づき本年度後半で1号機の再構築し、新たな構造を持つミスト発生装置の搭載を行った。また、小型プロジェクタ群の数を変更するとともに、各プロジェクタの空間的配置を変えることによる最終画像の変化を調べた。これらの各技術要素の並列的な改良作業とともに、研究所内のCT装置と動物実験施設を用いてブタの臓器を使用した実験により、臓器内構造、血管走行これらの動的変化の認識率を検証していった。また研究所内の模擬手術室での照射実験を行い、診療各科の専門医による評価実験を行った。そして同時にナビゲーション手術使用時の画像を空間表示して、術前シミュレーションや手術計画にどのように利用できるかの検討も行った。前年度に作製したミスト装置、小型プロジェクタ群の照射アセンブリ機構、画像処理システムを結合させ、装置の1号機を完成させたが思った通りの空間解像度を持つ表示画像が得られなかった。しかし装置のどの部分を改良すると最終的な空間解像度がどのように向上するかを技術要素ごとに検討してこれを克服できた。
肝硬変症からの発癌過程における増殖抑制機構の異常とその制御に関する研究

肝硬変症から高頻度で肝細胞癌が発症することが知られている。肝硬変症では肝細胞の壊死・再生が頻繁に繰り返されており、そのため肝硬変症は肝細胞癌発生の母地になるとされている。正常状態では、肝細胞の増殖はパラクリン機序により分泌されるtransforming growthfactor-β(TGF-β)を中心とした増殖抑制因子により制御されている。しかし、肝の発癌過程において、TGF-βなどに対する反応性を失い、この増殖抑制機構から逸脱することにより、自律的増殖能を獲得すると考えられる。私共は本年度において、ラット肝硬変モデルの肝細胞がTGF-βに対する反応性の低下を示すことを見い出している。すなわち、ラットにチオアセタマイドを飲料水に混入して投与し、肝硬変を作製した。この硬変化した肝よりコラゲナーゼ・カン流法により肝細胞を単離した。この硬変化肝細胞は、DNA合成能の増加を示し、細胞増殖能はむしろ亢進していると考えられた。一方、硬変化肝細胞の初代培養培地にTGF-βを添加しDNA合成への影響をみると、50%阻害するのに要するTGF-β濃度は正常肝細胞の場合と比較して有意に高濃度であった。このことから、硬変化肝細胞は、増殖能は亢進しているが、増殖抑制因子であるTGF-βに対する反応性が低下していると考えられた。一方、私共はすでにヒト肝癌組織において、TGF-βmRNAおよびTGF-β蛋白量の増加を報告している。今回、肝細胞癌患者における血清中TGF-β濃度をbioassay法およびELISA法を用いて測定した。その結果、正常者、慢性肝炎患者、肝硬変症患者のいづれに対してもTGF-β濃度の有意な増加を見い出した。これはヒトの癌組織よりTGF-βが血中に放出されていることを示唆する初めての知見である。
日帰り手術における看護婦のケア・コーディネイト機能に関する研究

日帰り手術(以下DS)の先進国でなぜ80%あるいは90%を超えるほど爆発的に拡がったのかその背景と理由を分析するため米国を中心とする文献研究と医療制度を異にするオーストラリアに視察を行った。医療費の高騰と財政の圧迫とから、DRG/PPS(定額医療費支払い制度)が導入され、DSは病院経営の生き残りをかけて徹底した効率性、質の保障、患者・家族満足のために始まり、拡がったことがわかった。徹底した効率性のためにヘルシーペイシェントの選別、各科にわたるセンター化がなされ、質の保障のためにクリテイカルパスウエイが導入された。他職種を調整しDSを効果的に運用するための人材としてケア・コーデイネイターが必要とされ、看護職がその役割・機能を担当している。患者・家族満足度はそれらが効果的に発揮されたときに高い。日本における日帰り手術の実態を把握するために、50施設を対象にアンケート調査と某DSセンターでケア・コーデイネイターの役割の実際、業務分析、患者満足度の共同調査を行い、ケア・コーデイネイター機能の必要な内容として以下の結論を得た。・優れた看護婦と同様な観察力とそれを可能にする幅広い知識と技術。・予測された経過を自分はたどっていると患者が思える面談時の十分なインフォームドコンセント。・時間に追われての対応でも、自分は充分な看護を受け、安心してリカバリーの時を過ごしていると実感させるコミュニケーション技術と対応能力。・平常時を含め、患者を取り巻く多職種の調整能力とりわけ、予期せぬ事態発生時の調整能力。第一段階:研究の全体構想についての討議並びに助言・指導看護婦によるケアコーディネイト機能とは、日帰り手術を目的とする対象患者の(1)初診から退院後の初回受診にいたる全過程の調整機能と(2)看護の質の保障、スタッフの教育、経営管理のいわゆる看護管理学的機能をもつものであると定義した。(1)に関連して以下の実態調査を計画した。(1)初診から術後初回受診迄の医療・看護システムの実態(2)日帰り手術センターの人的構成(3)対象手術領域(4)患者の満足度のアンケート調査(5)患者からのクレームに対する面談調査(2)に関連して以下の実態調査を計画した。(1)医療費算出と現任教育のためのストップウオッチ法によるタイムスタデー(2)面談技術と看護教育のための参加観察による調査(3)同一疾患で合併症のない手術に関して日帰りと一般的な入院との医療費の実態調査第二段階:調査機関として了解の得られた、湘南鎌倉総合病院を中心に(1)の(1)から(4)の実態調査を行った。(2)のタイムスタデイーは2回、(2)の面談の参加観察は3回、8事例の記録をとった。第三段階:収集資料の分析を現在実施している。第四段階:研究過程の評価会議を行い、(1)の(5)クレームに関する面談調査の必要性が検討され、(2)の(3)に関する調査を計画している。

日本における日帰り手術の実態を把握するために、50施設を対象にアンケート調査と某DSセンターでケア・コーデイネイターの役割の実際、業務分析、患者満足度の共同調査を行い、ケア・コーデイネイター機能の必要な内容として以下の結論を得た。・優れた看護婦と同様な観察力とそれを可能にする幅広い知識と技術。・予測された経過を自分はたどっていると患者が思える面談時の十分なインフォームドコンセント。・時間に追われての対応でも、自分は充分な看護を受け、安心してリカバリーの時を過ごしていると実感させるコミュニケーション技術と対応能力。・平常時を含め、患者を取り巻く多職種の調整能力とりわけ、予期せぬ事態発生時の調整能力。
環境要因健康影響のリスクコントロールと市民とのインフォームドコンセント

研究課題「環境要員健康影響のリスクコントロールと市民のインフォームドコンセント」に関して平成6年度には2回の研究集会を開催した。1)わが国の過去の代表的な環境健康影響問題である水俣病、イタイイタイ病を取り上げ、研究者、地元住民、行政の相互のかかわり合いかたについてレビューを行った(斎藤・北畠)。2)上水道の発ガンのリスクは、ある特定の物質に発ガン性があるとの指摘があっても、これが直ちに特定の人間集団の健康問題とはならない。その発ガン物質が誰に侵入するのかが特定されないからである。しかし、特定の水源地からの上水道中のある物質がヒトの発ガンを高めるとすれば問題はまったく別になる。この場合には、その上水道の供給を受ける市民が特定されることになるからである(住友)。3)日本人は上水道水の発ガンリスクはゼロでなければならないと考えているのだろうか、それとも産業保健の場で行われているような許容量、最小作用量のような考え法を容認しているのだろうか。リスクコミュニケーションの観点からの検討が必要(池田)。4)長崎県下ではHTLV-1キャリアーの女性が分娩をしたとき、県下の産婦人科医が十分なインフォード・コンセントのもとに母乳をやめ人工栄養とすること勧告するることして5年経過した。これにより母から子へのウイルス感染がおさえられることが明確となったが、インフォードコンセントがどのようになされたかが報告された(日野)。5)環境関連法案の施行に対する自治体のスタンスを複数の自治体で比較してみると、非常に大きな違い(差)が存在した。その理由についてはなお検討を要する(北村)などの報告がなされ、きわめて刺激的かつ学際的な討論となった。
精製タンパク質を用いた分裂期染色体の試験管内再構成

細胞が分裂する際、ゲノムDNAは種々のタンパク質とともに「分裂期染色体」の中に収納され娘細胞へと伝達される。染色体の基本構造単位はコアヒストンの8量体にDNAが巻きついたヌクレオソームであるが、この構造が染色体構築にどのような貢献をするのか殆どわかっていない。この根源的な疑問を解くために、本研究では、精製タンパク質やカエル卵抽出液を使って試験管内で染色体を作るという独自の方法を考案した。解析を行った結果、ヌクレオソームがなくても染色体の中心となる軸構造が作られるものの、よりコンパクトな染色体が作られるにはヌクレオソームとコンデンシンの協調的作用が不可欠であることが明らかになった。染色体は、分裂期にコンパクトな構造をつくることによって、その後の娘細胞への分配が正確に行われる。ところが、これまでに分裂期染色体構築に不可欠な役割を果たす因子は、II型DNAトポイソメラーゼ(トポII)とコンデンシンIしか知られていない。そのため、どのようにして染色体が構築されるのかという本質的な問題の理解は殆ど進んでいない。この疑問を解くために、申請者は、(1)可能な限り少ない種類のタンパク質を使って試験管内に染色体を再構成すること、(2)SDS-PAGEでの移動度の変化から予想されるトポIIの分裂期特異的翻訳後修飾の役割を明らかにすることを目標に掲げた。今年度は、目標(1)の達成向けて実験を行った。具体的には、カエル卵の抽出液を用いると染色体を再構成することが知られているので、この抽出液を生化学的に分画し、各々の分画を順次精製タンパク質で置き換えたときに染色体を再構成できるかを検定した。その結果、トポIIとコンデンシンI以外に、コアヒストンと3種類のヒストンシャペロン(ヌクレオプラズミン、Nap1、FACT)とATPを混合した溶液で、カエル精子由来クロマチンをインキュベートすれば染色体を再構成できることを見いだした。さらに、この新規再構成系を用いた解析から、染色体構築に必要かつ十分な翻訳後修飾は、サイクリンBーCdk1によるコンデンシンIのリン酸化のみであることが明らかになった。すなわち、トポIIの翻訳後修飾は、計画開始当初予定したほど重要な意味を持たないと考えられ、目標(2)についても明快な解答が得られた。分裂期における染色体構築メカニズムを理解することを目指し、生化学的実験手法を用いて解析を行った。今年度は、染色体構築に必要かつ十分な因子を決定し、わずか6種類の精製タンパク質を使って染色体を試験管内に再構成できるという成果を誌上発表した。この画期的な方法によって、染色体構築の背後で、ヌクレオソームの動的な構造変動、および、分裂期キナーゼによるタンパク質のリン酸化が、どのような役割を果たしているのかを詳細に理解できるようになった。また、従来から用いてきたカエル卵無細胞系を使った実験においては、通常とは異なりマウスの精子クロマチンを基質として用いる新しいプロトコルを確立した。この実験系では、ヒストンやコンデンシンなど卵由来のタンパク質をクロマチンに取り込ませ、試験管内で染色体を作ることができる。興味深いことに、ヒストンシャペロンであるAsf1を卵抽出液から除くと、ヒストンのクロマチンへの取り込みが完全に阻害された。このヒストンを含まないクロマチンは全体として凝縮度が低く不鮮明な形状を示すものの、その内部にはDAPIで強く染色される明瞭な軸が観察された。この特徴的な染色体様構造において、コンデンシンIIはもっぱら軸に局在するのに対し、コンデンシンIは軸だけでなくその周囲のクロマチンループにも検出された。これらの結果から、コンデンシンIIはヒストン非依存的に染色体軸の形成を促進するのに対し、コンデンシンIはヒストンと協調してクロマチンループの組織化に関与することが示唆される。申請した当時の目論み通りではないものの、研究計画全体は概ね順調に進展している。とくに、最小限の精製タンパク質を用いて染色体の再構成に成功したことについては、誌上発表に際して解説記事が掲載されるなど、関連分野の研究者から高い評価を受けたと認識している。また、海外の学会での発表を通じて、将来の研究の進め方について様々な意見に触れられたことも有意義であった。新たに着手した実験においても、いくつかの興味深い研究成果も得られつつあるなど、非常に収穫の多い一年となった。一連の研究活動の中には、外部機関の研究者との試料のやり取り、実験技術や結果の共有などの共同研究も含まれ、クロマチン・染色体の研究分野全体の発展に微かながらも貢献できたと考えている。染色体構築は細胞分裂に伴う遺伝情報の継承に不可欠なプロセスである。本研究の最終的な目標は、分裂期染色体が作られる分子メカニズムを理解することであり、これまでに精製因子を使って染色体を試験管内に再構成するという画期的な研究成果を発表した。この再構成系はカエル精子核とわずか6種類の精製タンパク質(コンデンシンI、トポイソメラーゼII、ヒストンH2A-H2B、3種類のヒストンシャペロン)で構成される。いずれかのタンパク質を欠いたときや変異体に置き換えたときの影響を比較することにより、各々のタンパク質の機能の詳細な解析が可能になった。しかし、カエル精子核にはゲノムDNAだけでなく、ヒストンH3-H4が含まれているため、これらのヒストンの役割はもとより、染色体構築にヌクレオソームが必要であるのかという根源的な疑問を解くことはできなかった。

こうした技術的な制約を取り払い、再構成系を用いた解析をさらに発展させるために、ヒストンをほとんど含まないマウスの精子核を染色体再構成系に導入することを考案した。2016年度は、そのための予備実験に着手した。すなわち、カエル精子核を用いた場合と同様に、マウスの精子核を(精製タンパク質ではなく)カエル卵抽出液と混和し、インキュベートすると分裂期染色体が形成できることを確認した。次に、このプロトコルにおいて、マウスの精子核由来のゲノムDNA上にヌクレオソームを形成させるのに必要なヒストンシャペロンAsf1を除去した卵抽出液を用いて同様の実験を行った。その結果、驚くべきことに、ヌクレオソームを含まなくても、染色体様構造が作られることが明らかになった。さらに、この特徴的な構造の詳細な詳細な解析により、ヌクレオソームとコンデンシンの機能的相互作用が染色体構築に重要であることを見出した。一連の実験から得られた成果を学術誌に投稿した(査読中)。細胞が分裂する際、ゲノムDNAは種々のタンパク質とともに「分裂期染色体」の中に収納され娘細胞へと伝達される。染色体の基本構造単位はコアヒストンの8量体にDNAが巻きついたヌクレオソームであるが、この構造が染色体構築にどのような貢献をするのか殆どわかっていない。この根源的な疑問を解くために、本研究では、精製タンパク質やカエル卵抽出液を使って試験管内で染色体を作るという独自の方法を考案した。解析を行った結果、ヌクレオソームがなくても染色体の中心となる軸構造が作られるものの、よりコンパクトな染色体が作られるにはヌクレオソームとコンデンシンの協調的作用が不可欠であることが明らかになった。染色体再構築に不可欠な未同定因子の探索が順調に進捗できたことによって、当初の目標であった、再構成系の確立まで順調に漕ぎ着けられた。この再構成系は現在考えられうる最少の因子で構成されており、おのおのの因子の機能、複数の因子による協調的効果を極めて詳細に解析できるようになった。また、染色体構築に重要な細胞周期特異的な制御はシンプルであることを明確に示すこともできた。これまでの成果は、国際学会で発表し、関連分野の研究者からきわめて高い評価をもって迎えられた。一見すると複雑に見える細胞内現象を、最少の要素・分子のみに注目して捉え直すことは、今日の細胞生物学における重要な目標でもある。これまでに得られた成果は先駆的研究の一例として、関連分野にも大きなインパクトを与えると考えられる。これまでに引き続き、自らが開発した染色体再構成系、および、新たに改良を加えたカエル卵無細胞系を相互補完的に用いて、ヒストンを基盤としたクロマチンの動的構造が染色体構築を促進するメカニズムの解明を目指す。とくに次の3つの課題に焦点を絞って解析を行いたい。(1)染色体再構成反応の最適化:精製タンパク質を使った染色体再構成系において、クロマチン周辺のイオン強度や分子混雑度が反応に与える影響を理解する。(2)染色体構築におけるヒストンH2Aの機能の解明:染色体再構成系に様々なH2A変異体を添加した時の影響を解析し、H2Aのどの領域が適切な染色体構築に寄与するのかを理解する。