hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トマトモザイクウイルスRNA複製複合体の分子解剖

トマトモザイクウイルス(ToMV)は宿主細胞内のオルガネラ膜上にRNA複製複合体を形成する.複製複合体はToMV複製タンパク質とToMV RNAに加え,宿主側の因子により構成されると考えられるが,宿主因子に関する情報は限られている.申請者は昨年度までに,ToMV感染細胞より膜結合の複製タンパク質およびToMV RNA合成活性を可溶化し,精製する方法を確立した(Nishikiori et al.,2006).本年度はToMV RNA複製複合体を構成する宿主側の因子を明らかにするため,ToMV複製タンパク質と共精製された宿主タンパク質を質量分析法により同定した.その結果,ToMVの増殖に関与することが遺伝学的に示された宿主膜貫通タンパク質のTOM1およびそのホモログと,TOM2Aが同定された.また,低分子GTPaseのひとつで機能未知のタンパク質ADPリボシル化因子様タンパク質(ARL)が同定された.当該ARLおよびホモログ遺伝子はタバコおよびシロイヌナズナに少なくとも4つ存在した.ARLが植物体内でのToMV増殖に必要であるか調べるため,シロイヌナズナarl T-DNA挿入変異株を入手した.シロイヌナズナの各arl遺伝子単独変異はToMV増殖に影響を与えなかったが,いくつかのarl二重変異株および三重変異株では,ToMV増殖が強く抑制されることが判明した.また,非感染BY-2細胞抽出液における試験管内ToMV RNA翻訳・複製系を用いた解析から,ARL添加はToMV関連タンパク質の翻訳には影響を及ぼさないが,RNA複製を亢進することが判明した.以上,本研究により,ToMV RNA複製に関与する新規の宿主タンパク質を同定した.上記の研究成果は特許出願済みであり,また,平成19年度日本植物病理学会において発表予定である.トマトモザイクウイルスをはじめとするプラス鎖RNAウイルスは、宿主細胞のオルガネラ膜上で子孫RNAを合成する。本年度はトマトモザイクウイルス(ToMV)RNA合成酵素を精製し、ウイルスRNAの複製に関与する宿主側のタンパク質を同定することを目的に研究を行った。申請者は、ToMVに感染した細胞より調製した膜にリソフォスファチジルコリンという界面活性剤を作用させることにより、ToMVのコードする複製に関与するタンパク質(複製タンパク質)およびRNA合成活性を可溶化することに成功した。このRNA合成酵素を精製したところ、宿主がコードするTOM1、TOM2Aタンパク質に加え数種の宿主タンパク質が共精製された。TOM1、TOM2Aタンパク質は遺伝学的手法により同定されたToMVの複製に関与する宿主膜タンパク質であり、本研究により細胞内においてToMV複製タンパク質と相互作用する可能性が示唆された。共精製された他の宿主タンパク質に関しては、現在同定を試みている。申請者は、細胞粗抽出液より複製活性を精製する実験を通して、複製タンパク質の大部分は可溶性画分に存在しRNA合成活性を示さないこと、一部の複製タンパク質のみが膜に結合してRNA合成活性を示すことを明らかにした。可溶性と膜結合の複製タンパク質の間では界面活性剤処理後の挙動や、共精製される宿主タンパク質の種類や量に違いがみられ、局在により性状が大きく異なることが示唆された。以上の結果より、複製タンパク質は可溶性タンパク質として宿主細胞内で合成され、膜および宿主タンパク質との相互作用を通して、一部の分子が膜に結合しRNA合成活性を獲得する可能性が示唆された。上記の研究成果の一部は平成17年度日本分子生物学会年会において発表し、現在論文投稿準備中である。トマトモザイクウイルス(ToMV)は宿主細胞内のオルガネラ膜上にRNA複製複合体を形成する.複製複合体はToMV複製タンパク質とToMV RNAに加え,宿主側の因子により構成されると考えられるが,宿主因子に関する情報は限られている.申請者は昨年度までに,ToMV感染細胞より膜結合の複製タンパク質およびToMV RNA合成活性を可溶化し,精製する方法を確立した(Nishikiori et al.,2006).本年度はToMV RNA複製複合体を構成する宿主側の因子を明らかにするため,ToMV複製タンパク質と共精製された宿主タンパク質を質量分析法により同定した.その結果,ToMVの増殖に関与することが遺伝学的に示された宿主膜貫通タンパク質のTOM1およびそのホモログと,TOM2Aが同定された.また,低分子GTPaseのひとつで機能未知のタンパク質ADPリボシル化因子様タンパク質(ARL)が同定された.当該ARLおよびホモログ遺伝子はタバコおよびシロイヌナズナに少なくとも4つ存在した.ARLが植物体内でのToMV増殖に必要であるか調べるため,シロイヌナズナarl T-DNA挿入変異株を入手した.シロイヌナズナの各arl遺伝子単独変異はToMV増殖に影響を与えなかったが,いくつかのarl二重変異株および三重変異株では,ToMV増殖が強く抑制されることが判明した.また,非感染BY-2細胞抽出液における試験管内ToMV RNA翻訳・複製系を用いた解析から,ARL添加はToMV関連タンパク質の翻訳には影響を及ぼさないが,RNA複製を亢進することが判明した.以上,本研究により,ToMV RNA複製に関与する新規の宿主タンパク質を同定した.上記の研究成果は特許出願済みであり,また,平成19年度日本植物病理学会において発表予定である.
核酸とのコンジュゲーションによる色素会合体調製法の確立

本研究ではDNA二重鎖を"場"として利用し、色素を予め決められた数・配向・配列で整列させた色素超分子を調製することを目指した。D-スレオニノールを介して色素(メチルレッド)を二重鎖の対応する位置に導入したところ、極めて強い励起子相互作用を示した。また、NMRによる構造解析の結果、色素がらせん軸に対して垂直にスタッキングしていることがわかった。また、二重鎖の融解温度は色素数の増加と共に大幅に上昇したことから、導入した色素が"塩基対"として機能することが分かった。DNAは相補鎖と自発的に二重鎖を形成するという超分子として非常に魅力的な性質を有している。本研究ではその超分子性を利用し、数・配向・配列の制御された色素会合体の調製を目指す。色素は会合することで非線形光学効果などの顕著な物性を発現することが知られているが、その会合形態の制御が非常に困難であった。DNAの内部に色素を共有結合を介して導入すれば、数・配向の制御された色素会合体を調製することができる。本年度は色素(メチルレッド)を連続的に導入したDNA同士を二重鎖形成させることで"くし型"会合体の調製を行った。吸収スペクトル測定及びNMR構造解析の結果、"くし型"会合体では色素がらせん軸方向にスタックしたH会合体を形成していることがわかった。一本鎖の状態では色素が平行にスタックすることから、"くし型"会合を利用することで平行型と逆平行型色素会合体を二重鎖形成によって可逆的に制御できることを明らかにした。また、その際色素が分子間スタッキングすることで二重鎖が大きく安定化した。この会合体は従来のスペーサー(1,3-propanediol)を導入した会合体と比べて、CDスペクトルの強度が小さいことから色素がほぼ平行にスタックしていることが分かった。このように、強い励起子相互作用及び大きな二重鎖の安定化を示す色素会合体を調製することができた。更に、異なる色素(メチルレッド及びナフチルレッド)を導入したDNA同士を二重鎖形成させることで複数種の色素によるヘテロ会合体の調製にも成功した。本研究では、DNAに色素を導入し二重鎖を形成させることによって、数・配向が厳密に制御された色素超分子の調製を目指した。非天然リンカーであるD-スレオニノールを介して色素(メチルレッド)を二重鎖の対応する位置に導入したところ、色素が強く励起子相互作用したH会合体を形成することがわかった。また、その際導入した色素が分子間スタッキングにより二重鎖を大きく安定化することを見出した。この結果はD-スレオニノールを介して導入した二つの色素がいわば"塩基対"として機能することを意味している。また、複数種の色素をDNAに導入することにより、ヘテロ会合体の調製も行った。DNAを用いることで、複数種の色素を決められた順序に整列させることが出来る。実際、メチルレッド及びナフチルレッドによるヘテロ会合体を調製したところ、強く励起子相互作用することが分かった。更に、様々な色素を導入したヘテロ会合体を調製し、異種色素間の励起子相互作用の大きさが二つの色素の極大吸収波長の差に依存することを見出した。また、このヘテロ会合体の設計を蛍光色素によるクラスター調製に応用した。蛍光色素及びクエンチャーをそれぞれ二重鎖の対応する位置に導入したところ、二重鎖形成によって蛍光発光のON/OFFを制御することが出来た。このように、本研究では非天然リンカーを介して対応する位置に色素を導入することで、色素間の相互作用を二重鎖形成によって制御することに成功した。この設計を用いれば二重鎖形成により色素間の相互作用を自在に制御できるため、新たなナノ材料やDNAプローブの開発が期待できる。
モデルマウスを用いた、疾患発症における極性輸送関連分子の役割の解明

細胞極性は組織の形成やその機能に必須の役割を果たしている。しかし細胞極性に関与する遺伝子の組織や個体での機能はまだよくわかっていない。さらに細胞極性に関与する遺伝子はまだ数多く残されていると考えられる。そこで我々は細胞極性のメカニズムの解明のため、1細胞極性、特にその中の極性輸送に関与する遺伝子の欠損マウスの作製、解析及び、2細胞極性に関与する新規遺伝子のスクリーニングを線虫を用いて同定し、その遺伝子の欠損マウスの作成を行った。1については、Rab8a,bの二重欠損マウス、syntaxin3の小腸特異的欠損マウス、SNAP23神経、膵臓特異的欠損マウスの解析を行った。Rab8a,bの二重欠損マウスについては、生後死亡し、その時期がRab8a単独の欠損マウスより早まるため、Rab8aとRab8bの機能的な重複が示唆された。またRab8が線毛形成に重要であるというこれまでの知見から、Rab8a,b二重欠損マウスでは線毛形成の異常が生じることが予想されたが、予想に反してそのような表現型は見いだされなかったため、その理由の解明を現在行っており、他のRabの重要性が示唆される所見を得ている。またsyntaxin3小腸特異的欠損マウスで微絨毛の短小化やapical markerの細胞内蓄積が見られたため、その原因の解析を行っている。SNAP23の膵臓内外分泌腺特異的欠損マウスを作製解析したところ、SNAP23は膵内分泌と外分泌で異なる作用を持つことを発見し、現在その結果をまとめているところである。PKD1,2の欠損マウスでは今の所大きな異常が見られないが二重欠損マウスは胎生致死であるため、その原因の解明を行っている。また2の、線虫でスクリーニングした新規遺伝子のいくつかについて現在マウスを作製しているところであり、あるものについては既にマウスが完成しているためその解析を行っている。24年度が最終年度であるため、記入しない。そこで我々は細胞極性のメカニズムの解明のため、(1)細胞極性、特にその中の極性輸送に関与する遺伝子の欠損マウスの作製、解析及び、(2)細胞極性に関与する新規遺伝子のスクリーニングを線虫を用いて同定し、その遺伝子の欠損マウスの作成を行った。(1)については、Rab8a,bの二重欠損マウス、syntaxin3の小腸特異的欠損マウス、SNAP23神経特異的マウス、SNAP23膵臓特異的欠損マウスの解析を行った。またRab8が線毛形成に重要であるというこれまでの知見から、Rab8a,b二重欠損マウスでは線毛形成の異常が生じることが予想されたが、予想に反してそのような表現型は見いだされなかったため、その理由の解明が待たれる。また、SNAP23の膵臓内分泌腺と外分泌腺特異的欠損マウスを作製解析したところ、SNAP23は膵内分泌と外分泌で異なる作用を持つことを発見し、現在その結果をまとめているところである。また(2)の、線虫でスクリーニングした新規遺伝子のいくつかについて現在マウスを作製しているところであり、あるものについては既にマウスが完成しているためその解析を行っている。

またsyntaxin3小腸特異的欠損マウスで微絨毛の短小化やapical markerの細胞内蓄積が見られたため、その原因の解析を行っている。SNAP23の膵臓内外分泌腺特異的欠損マウスを作製解析したところ、SNAP23は膵内分泌と外分泌で異なる作用を持つことを発見し、現在その結果をまとめているところである。PKD1,2の欠損マウスでは今の所大きな異常が見られないが二重欠損マウスは胎生致死であるため、その原因の解明を行っている。また2の、線虫でスクリーニングした新規遺伝子のいくつかについて現在マウスを作製しているところであり、あるものについては既にマウスが完成しているためその解析を行っている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度でRab8a,bの二重欠損マウス、SNAP23欠損マウス、PKD1欠損マウス、PKD2欠損マウスについては解析が殆ど終了した。Syntaxin3欠損マウスについても解析の方向にメドが立ったため。これまで順調に進んでいるため、来年度に予定通りRab8a,b二重欠損マウス、SNAP23欠損マウス,PKD1,2欠損マウスについては論文の投稿が可能である。また、syntaxin3,FAPP1,2等他の欠損マウスについても解析は順調に準んでいるため、方針に特に大きな変化はない。
液中化学反応に及ぼす乱流混合の影響に関する研究

化学反応の多くは液体中で生じ、特に生物工学では化学反応はほとんどが液中で生ずる。また、このような化学反応は流動混合、拡散の影響を強く受ける拡散律速反応であるが、このような液中反応乱流の現象の研究は非常に少ない。本研究はこの反応乱流の基礎研究である。まず、基礎研究に適した反応として、1ナフトールとジアゾベンゼンスルフォン酸のアゾ結合の特性を調べた(購入分光光度計利用)。次に空間の一点での反応成分の濃度を測定するため直径10μmの光ファイバープローブを開発した。また改善された光ファイバー式多色濃度計を製作した。反応流路として150mmの正方形断面、長さ840mmのアクリル製の装置を製作して速度分布、変動速度分布を測定した(購入光ファイバーLDV利用)。この装置で上記の反応を調べ、中心軸上の反応生成物の濃度変化、生成物の変動濃度変化、2成分の濃度相関分布を明らかにした。多成分物質の管内混合の研究としては内径100mm、全長2000mmの管路を製作し管壁よりの点源拡散を測定した。その結果、管軸断面の平均濃度、変動濃度のrms値分布が自己保存分布をなすと云う著しい特徴を見出した。また管断面内の平均濃度、変動濃度の等値線を求めプルームの広がりを明らかにした。シミュレーションについてはランダムフーリエモードとランダムフライトモデルを複合させたモデルで円柱周りの拡散を調ベた。また、pdf法により分子混合モデルを調べた。これらの結果を実験と比較するため、一様乱流場の点源拡散と、これが球によって乱された場合の実験的研究を行った。そして球に近づく乱流拡散場の濃度pdfの変化が収支方程式によって説明できること、pdfの歪み度の変化が球に近いところで急であることを見出した。またフラクタル解析を行い、流れ場の変形が濃度フラクタルに影響しないことが明かとなった。さらに同軸2色噴流の混合過程を測定し混合の進行を調ベた。本研究の目的は、液体中で生じる物質の化学反応に及ぼす乱流混合の効果を実験及び数値シミュレ-ションによって解明することである。本年度遂行された研究内容及び現在の進行状況は以下の通りである。(1)まず,第一の目標は最も単純な化学反応過程であるA+B→C型の反応を示す化学物質の選択であった。現在のところ,lーナフト-ルとジアゾスルファニ-ル酸のアゾ結合反応あるいは直接染料(Congo Red)の酸性液中での呈色反応(青色に変色)が有力候補であるが,未だ決定するに至っていない。今後も調査を継続する予定である。(2)実験については,既存の水路を利用して,まず反応のない場合の2成分同軸噴流の混合過程をレ-ザ-流速計と分光濃度計により調べた。用いた物質は直接染料のダイレクトファストオレンジ(物質A,中心噴流)とレオナルブル-(物質B,環状噴流)である。極めて信頼性の高い効果がいくつか得られたが,特に中心軸上における2成分濃度相関係数C_<AB>=<γ_Aγ_B>^^^ー/{√<γ^2_A^^ー>・√<γ^2_B^^ー>}の下流方向変化(-1から1への単調増加)は,今後の化学反応過程の調査に貴重な資料を提供するものである。実験については,上記の2成分噴流の他に,現在液中化学反応用管路の設計,製作が進行中である。

測定系については光ファイバ型多成分濃度計と光ファイバ型2次元レ-ザ-流速計が本年度購入され,現在テスト中である。(3)シミュレ-ションに関しては,第一段階として,格子乱流中の連続点源拡散についての変動濃度場の計算と,発達した管内流における物質のパフ拡散,連続点源拡散の計算が確率過程モデルによって行われ,過去のデ-タとよい一致が得られた。今後A+B→O型やA+B→C型の反応過程への応用を考えている。また,ランダムフ-リエモ-ド法による物体まわりの流体粒子の挙動の計算や速度・散逸pdfモデルによる一様等方性乱流中の均一勾配スカラ-場の発達の計算も現在進行中である。同軸噴流の拡散実験のための水洞を完成、調整した。この装置は管内径100mm、管路長200mm、上流、下流にタンクを備え、通水系は回流型と通水型の二種に切り換え可能である。下流タンクにはニ-ドル弁を置き微妙な流量調査が可能である。流量はオリフィスによって測定する。上流側にはノズル、整流装置がある。拡散物質は染料水溶液でロ-ラポンプによりヘッドタンクに供給される、乱れの促進のため管入口にはトリップワイヤが設けられ、流速は後方散乱型LDVで、濃度は光ファイバ-型吸光濃度計で測定する。これらを全て整備し流速分布を測定したところ十分に発達した乱流速度分布が得られた。第1段階として管壁の点源の場合の実験を行った。特に著しいことは平均濃度分布が乱流境界層の場合と同じ形の自己相似分布を示すことである。また、変動濃度の強度も相似な分布となった。このような濃度分布特性の理解のため球周りの拡散場の特性を測定し特に前方淀み点近傍の変動濃度の変化について縞み度の概念を用いて説明し,また濃度分布のフラクタル特性を明らかにした。さらに球周りの濃度分布の確率密度関数の分布を調べ、剥離域ではこれが対数正規分布になることを見出した。シミュレ-ションについてはランダムフ-リエモ-ドとランダムフライトモデル複合させ、フ-リエモ-ドでは渦による拡散を、フライトモデルでは分子拡散の効果を代表させて流体粒子の乱流移動を追跡し球周りの拡散の様子を明らかにした。また、等方性乱流中の2粒子拡散問題に対し、連続の条件を満たし、分子拡散の効果をとりいれた新しいモデルを構成しシミュレ-ション形算を行って点源拡散のデ-タと比較してよい一致を得た。液中化学反応は無数にあるので、乱流混合との関係を調べるには適切な反応を選択することが重要である。このため、特に分光的に測定するのに適し、反応定数がよく調べられている1ナフトールとジアゾベンゼンスルフォン酸のアゾ結合を利用することとして、そのスペクトル特性を詳細に調ベ、これまでに開発した光ファイバー多色変動濃度計で測定できることを確認した。反応流実験として、150mmの正方形断面、長さ、840mmのオーバーフロー付の1ナフトールのアルカリ緩衝液流中にノズルよりジアゾベンゼンスルフォン酸水溶液を噴出する反応器を製作した。各液はヘッドタンクより供給され、反応生成物はオーバーフローにより回収される。反応のない場合の噴流の速度分布、濃度分布特性をLDV、濃度計で確認したのち、初期濃度比を10、20と変えて測定した、その結果、従来、測定された例のないこの反応の濃度変動が開発した多色濃度計で正確に測定できることが確かめられた。
神経疾患のフリーラジカルの関与とその治療薬における抗過酸化作用の検討

(1)各種神経筋疾患生検筋におけるSODの分布:ミトコンドリア脳筋症生検筋(MELAS 3例,CPEO 4例)にて抗Mn-SOD,Cu/Zn-SOD抗体を用いて免疫組織化学的に検索した.ミトコンドリア脳筋症ではMn-SOD強陽性線維が散在性に存在し,抗Cu/Zn-SOD抗体ではMn-SOD強陽性線維に一致して軽微な染色性を有するのみであった.多発筋炎ではMn-SOD,Cu/Zn-SODともに軽微に染色される線維が散在した.筋ジストロフィー症,軽微変化例では,Mn-SOD,Cu/Zn-SODともにほとんど染色されなかった.ミトコンドリア脳筋症のMn-SOD強陽性線維の分布は,ragged-red fiberにほぼ一致しており,cytochromec oxidase染色との関連では欠損線維,陽性線維どちらにも分布していた.以上より,ミトコンドリア脳筋症のMn-SOD強陽性線維は,ミトコンドリアの多い筋線維にMn-SODが染色される.しかし,ミトコンドリアが多い細胞では酸素消費量も多く,superoxideを生じやすいところと考えられ,その処理によりMn-SODが多量に誘導され,細胞障害を保護している可能性もある.(2)各種筋疾患での生検筋の過酸化脂質の検討:生検筋のthiobarbituric acid-reactive substance(TBA-RS)はミトコンドリア脳筋症(3例)21.9nmol/g wet tissue,多発筋炎・皮膚筋炎(9例)25.2,筋緊張性ジストロフィー(4例)28.2,横紋筋融解症回復後(2例)21.1,正常対照例(9例)24.8と各疾患群とも明らかな差はなく,生検筋で筋崩壊と活性酸素の関連はこの方法ではあきらかにできなかった.(3)神経疾患剖検脳における過酸化脂質量の測定では,まずコントロールとして正常例において凍結脳における各皮質(前,後,側,頭頂葉)のホモジュネートにおけるTBA-RS量を分光法を用いて測定した。その結果,各皮質とも0.15-0.40nmol/脳mgで後時間やホモジュネートの条件などによりバラツキが多く,今後症例数をふやして検討する.(1)各種神経筋疾患生検筋におけるSODの分布:ミトコンドリア脳筋症生検筋(MELAS 3例,CPEO 4例)にて抗Mn-SOD,Cu/Zn-SOD抗体を用いて免疫組織化学的に検索した.ミトコンドリア脳筋症ではMn-SOD強陽性線維が散在性に存在し,抗Cu/Zn-SOD抗体ではMn-SOD強陽性線維に一致して軽微な染色性を有するのみであった.多発筋炎ではMn-SOD,Cu/Zn-SODともに軽微に染色される線維が散在した.筋ジストロフィー症,軽微変化例では,Mn-SOD,Cu/Zn-SODともにほとんど染色されなかった.ミトコンドリア脳筋症のMn-SOD強陽性線維の分布は,ragged-red fiberにほぼ一致しており,cytochromec oxidase染色との関連では欠損線維,陽性線維どちらにも分布していた.以上より,ミトコンドリア脳筋症のMn-SOD強陽性線維は,ミトコンドリアの多い筋線維にMn-SODが染色される.しかし,ミトコンドリアが多い細胞では酸素消費量も多く,superoxideを生じやすいところと考えられ,その処理によりMn-SODが多量に誘導され,細胞障害を保護している可能性もある.(2)各種筋疾患での生検筋の過酸化脂質の検討:生検筋のthiobarbituric acid-reactive substance(TBA-RS)はミトコンドリア脳筋症(3例)21.9nmol/g wet tissue,多発筋炎・皮膚筋炎(9例)25.2,筋緊張性ジストロフィー(4例)28.2,横紋筋融解症回復後(2例)21.1,正常対照例(9例)24.8と各疾患群とも明らかな差はなく,生検筋で筋崩壊と活性酸素の関連はこの方法ではあきらかにできなかった.(3)神経疾患剖検脳における過酸化脂質量の測定では,まずコントロールとして正常例において凍結脳における各皮質(前,後,側,頭頂葉)のホモジュネートにおけるTBA-RS量を分光法を用いて測定した。その結果,各皮質とも0.15-0.40nmol/脳mgで後時間やホモジュネートの条件などによりバラツキが多く,今後症例数をふやして検討する.
WSNにおける映像センシングでの被覆阻害問題への対策

本研究では,カメラ付きのセンサノードの絶対座標をGPSよりも高精度に特定する方法を考案した.この方法では,センサノードがLEDライトを搭載するアンカノードの光信号をカメラで検出し,アンカノードの方角を計測することで,幾何学的計算により自ノードの存在位置を精密に推定する.評価実験を行ったところ,アンカノード近傍に配置されるノードに関して,位置推定誤差をGPSの1割程度に抑えることが出来た.さらに,できるだけ正確に被覆範囲を自動で特定することを試みたところ,障害物の位置を特定する部分において新しく大きな課題が見つかり,新たな研究テーマを設定して解決を試みることとした.平成27年度は研究の方向性を検討し,可視光を用いた障害物の位置推定の方法を考案した.その方法をもとに室内での簡易な実験を行い,情報処理学会DPSワークショップ2015でポスター発表を行った.従来,障害物の位置推定はレーザレンジスキャナ等を用いれば可能であったが,本研究ではこれらの高価な機器を使わずに,もともとセンサノードに装着されているカメラとLEDライトを利用するだけで安価に位置推定を行うことができる点が新しい.しかし推定精度が落ちることが予想されるため,実験を行うことで推定精度を測る必要がある.そこで,平成27年度では,正式な実験の前段階として簡易な予備実験をいくつか行ってきた.カメラ付きセンサノードを用いることが前提であったため,まずは可視光をカメラで認識できるかどうかの簡易な実験を行った.その結果,市販のLEDライトを使用して,点滅パターンをあらかじめ決定しておけば数メートル離れていてもはっきりと認知可能であることが分かった.光を捉えた映像から点滅パターンを抽出し,自動的にライトが認識できたかどうかを判別させることも可能であることが確認できた.また,約40平方メートルの室内に8個のセンサを設置し,障害物の検出を行った.設置するセンサの個数が増えれば増えるほど推定精度は上昇することが確認できた.センサの個数(設置コスト)と推定精度はトレードオフの関係にあるため,適切な値になるよう調整することを今後の課題として検討していく必要があると認識できた.DPSワークショップ2015では,位置推定の方法とこれらの簡易実験をまとめた成果を発表した.本研究の最終的な目標はカメラノードによるフィールド上の被覆範囲の推定と,追加すべきノードの位置の決定である.当初の研究計画では,人間が歩いてカメラの被覆範囲を調べる予定であったが,障害物の位置を自動的に推定する手法を考案することで被覆範囲の推定も自動化できることに着目し,今年度は障害物の位置推定の手法の考案を行った.現段階では障害物の位置推定手法の考案,LEDライトの認識距離測定実験,室内オブジェクトの位置推定の簡易実験を行うことができている.マルチメディアセンサネットワークは害獣検知などへの応用が期待されているが,撮影できている範囲を特定するためにはカメラの位置と向きを正確に把握できてなければいけない.現状,GPSやRSSIを用いた位置推定は誤差が大きいため,監視したい領域をくまなく撮影できているかどうかは,位置推定の誤差度合によって大きく左右されてしまう.誤差が大きい場合,結局はカメラで撮影された映像を人間が見て判断するしかなくなり,労力が大きい.自動的に取得された各センサの位置情報から監視している領域をできるだけ正確に求めるためには,位置推定の誤差を軽減するための方式が必要となる.本研究では今年度の成果として,各センサノードがカメラをもつマルチメディアセンサネットワークにおいて,カメラを利用して他のセンサの発する光を捉えることで,そのセンサがどの方角に位置するかを特定し,位置推定の精度向上に利用する方式を提案した.また,その方式を評価するための実機実験を行い,RSSIを用いた位置推定の精度を高められることを確認した.現段階では,本研究は陸上のノードの位置推定を対象としているが,GPSが使用できない海中のノードの位置推定においては,カメラや指向性エコーなどによって他のノードの存在する方角を特定するメカニズムはより重要になってくることが予想される.今年度の研究成果をまとめ,情報処理学会DPS研究会が主催するDPSWS2016,IEEE CCWC2017において発表を行った.RSSIとカメラを併用した位置推定方式の提案,および模擬的なセンサノードを製作して実機実験を行うことができた.また,情報処理学会DPSWS2016やIEEE CCWC2017で発表し,今後の研究の方向性も明らかとなった.山林などの自然環境で映像をセンシングするマルチメディアセンサネットワーク(WMSN: Wireless Multimedia Sensor Networks)において,センサによる被覆範囲を特定するためには,ノードの位置を高い精度で特定することが求められている.ノードの位置を正確に求めて効率よい配置を行っても,植物などの障害物により実際には期待通りの被覆範囲にならない場合がある.本研究では,まずノードの絶対座標を高精度に特定する方法を考案した.ノードの絶対座標の取得にはGPS受信機を利用することが多いが,様々な要因でGPS受信機が取得する位置情報には絶えずノイズが混入する.そこで,WMSNのノードに装着されているカメラと撮影用ライトを利用する位置推定法を提案した.センサノードがLEDライトを搭載するアンカノードの光信号をカメラで検出し,アンカノードの方角を計測する.複数のアンカノードの方角を計測することで,幾何学的計算により自ノードの存在位置を精密に推定する.実際に模擬WMSNを構築し評価実験を行ったところ,ノード間距離が数メートル程度の小規模なWMSNでアンカノード近傍に配置される位置推定ノードに関して,位置推定誤差をGPSの1割程度に抑えることが出来た.

さらに,できるだけ正確に被覆範囲を自動で特定することを試みたところ,障害物の位置を特定する部分において新しく大きな課題が見つかったため,新たな研究テーマを設定して解決を試みることとなった.本研究では,カメラ付きのセンサノードの絶対座標をGPSよりも高精度に特定する方法を考案した.この方法では,センサノードがLEDライトを搭載するアンカノードの光信号をカメラで検出し,アンカノードの方角を計測することで,幾何学的計算により自ノードの存在位置を精密に推定する.評価実験を行ったところ,アンカノード近傍に配置されるノードに関して,位置推定誤差をGPSの1割程度に抑えることが出来た.さらに,できるだけ正確に被覆範囲を自動で特定することを試みたところ,障害物の位置を特定する部分において新しく大きな課題が見つかり,新たな研究テーマを設定して解決を試みることとした.障害物の位置推定のためには,カメラノードの位置が判明している必要がある.しかし,実際の使用場面を考えたとき,自然環境であらかじめ決められた位置にカメラノードを正確に設置するのは難しく,労力がかかる.そのため,ある程度の目測で設置し,自動的にセンサノードの位置を測定するメカニズムが必要であることが分かってきた.従来の位置推定手法では各無線機器の発する電波の強度(RSSI)を用いるものがあったが,カメラが捉えた可視光を利用すると従来よりさらに良い精度でノードの位置推定を行うことができると予想される.そのため,今後はノードの位置推定手法について最優先で取り組んでいく.現状ではRSSIを利用した方式の精度向上のみ行っているが,今後はGPSの精度向上のためにカメラ情報を利用する方式を提案していく.その際には,GPSの位置ずれの特性を調べることが必要である.また,カメラは常に水平に置かれているとは限らないため,加速度センサによって重力の方向を検出し,傾きを自動的に計算し,光源の方角をより正確に推定する機構を導入することが,実用に向けた課題となる.モバイルコンピューティング
ヒドラ再生を制御する遺伝子の解析

昨年度から引き続き再生時特異的に発現する遺伝子の分離を行った。本年度もう一つのアプロ-チとして頭部再生不能系統(regー16)の再生能を回復させる事を試みた。1)再生特異的に発現する遺伝子クロ-ンの分離。前年度に頭・足部を切除後、3時間再生させたヒドラ由来のcDNAライブラリィを作成した。これを用いて弁別選択法で再生特異的に発現する遺伝子のcDNAクロ-ンの分離を継続した。分離したcDNAクロ-ンは更にその再生における時間的、空間的発現パタ-ンをホ-ルマウントを用いたイン・シチュハイブリダイゼイション法またはノ-ザン・ブロットハイブリダイゼイション法で分析して再生特異性を確認した。その結果、前年度と合わせて6クロ-ンが再生特異的と考えられた。現在個々のクロ-ンの詳細な解析を行っている。2)頭部再生不能系統(regー16)の再生力を回復させる試み。regー16の再生不能の要因は内胚葉の消化細胞にある事、他の系でタンパク分解酵素が再生に関与するのとの報告がある事等からregー16の再生端を数種のタンパク分解酵素で処理し再生能回復の有無を調べた。その結果、プロテナ-ゼK(50mg/ml)を再生3時間の間作用させた時が最も有効で再生能を30%近く回復させる事ができた。これらの事は(1)おそらく内在性のタンパク分解酵素が再生に関与している事、(2)再生能が100%回復しなかった事は蛋白分解酵素以外の何らかの因子も関与している事を示唆する。今後、内在性タンパク分解酵素種の特定を行い、また、その阻害物質の正常再生に与える影響を調べる事により蛋白分解酵素の再生への関与を証明する予定である。
日本人英語学習者による英語のリズムパターンの習得-生成と知覚において-

今回の研究は、日本人英語学習者による英語の聞き取りを困難にしている主要な音声要因の一つであるストレスを担わないunstressed syllableの知覚と生成に焦点をあて、それがリズムパターンの習得にどのように影響を与えているかを実験音声学の立場から分析することを目的とした。日本人と米国人を被験者とし、英語の弱形の生成実験を行った。日本人の実験結果から、日本人の知覚パターンの影響を与えている音響要因が示唆された。さらに、これらの音響要因の知覚への影響を詳細に観測するために、英語の弱形の中でも使用頻度の高い冠詞を取り上げ、分析再合成の手法を用い、検討した。日本人の冠詞知覚に影響を与えていると示唆された先行子音の無音区間持続時間と冠詞の母音持続時間の二要素について、無音区間加工聴取実験と冠詞持続時間加工聴取実験を実施し、日本人と英語母語話者の知覚パターンを比較、検討した。実験の結果より、日本人と米国人で、これらの音響要因の冠詞知覚に与える影響の違いが明らかにされ、日本人の場合、時間制御のパターンに過度に頼っていることが示された。さらに、英語母語話者と日本人学習者による無音区間の持続時間と冠詞持続時間の生成パターンがそれぞれの知覚パターンに影響していることが、示唆された。今回の研究は、日本人英語学習者によるストレスを担わないunstressed syllableの生成と知覚に焦点をあて、それがリズムパターンの習得にどのように影響を与えているかを実験音声学の立場から分析することを目的とする。日本人英語学習者による英語を聞き取りを困難にしている主要な音声要因の一つとしてストレスを担わない弱形の存在が挙げられる。弱形の一つである冠詞を取り上げて検討した結果、先行子音の無音区間の持続時間、冠詞の母音持続時間の二要素が日本人英語学習者による冠詞の聞き取りに大きく影響を与えていることが明らかにされた。さらに日本人学習者において観測された上記の音響要因が米国人母語話者による冠詞の聞き取りに関与しているかどうかを比較、検討した。実験1の無音区間加工聴取実験では、無音区間の長さを変化させ、冠詞の反応率を日本人英語学習者と米国人について測定した。実験2の冠詞持続時間加工聴取実験では冠詞の母音時間を伸縮し、冠詞の反応率を観測し、日本人と米国人の結果を比較、検討した。今回の実験においては、先行子音の無音区間の持続時間は日本人学習者と同じように米語母語和者の聞き取りに影響を与えている音響要因であるが、日本人学習者の聞き取りに影響を与えているもう一つの要因である冠詞の母音持続時間については、母語話者の聞き取りに全く関与していないことが明らかにされた。これは、日本人は冠詞の知覚において、時間制御のパターンに過度に頼っているが、母語話者の場合、冠詞の音質的特徴が知覚の重要な要素であるためと考えられる。今回の研究は、日本人英語学習者によるストレスを担わないunstressed syllableの生成と知覚に焦点をあて、それが英語におけるリズムパターンの習得にどのように影響を与えているかを実験音声学の立場から分析することを目的とした。具体的には、英語の弱形のなかでも使用頻度の高い冠詞を取り上げ、英語母語話者と日本人英語学習者による冠詞の知覚パターンの比較がなされ、日本人の聞き取りに大きく影響している音響要因が明らかにされた。今年度は、特に日本人において観測された音響要因の影響が、英語母語話者においては影響が観測されるのかどうか、母語話者との知覚パターンの比較に焦点がおかれた。分析再合成の手法を用い、これらの音響要因の知覚への影響を詳細に観測した。先行子音の無音区間持続時間と冠詞の母音持続時間の2要素が冠詞の聞き取りに関与しているかを無音区間加工聴取実験と冠詞持続時間加工聴取実験により観測、検討した。
古人骨の妊娠痕の分析による縄文時代と弥生時代の出生率の地域的および時代的比較研究

古人類集団の人口構造を推定する際に要となるのが、古人骨の年齢推定である。古人骨において比較的残りやすい部位である腸骨耳状面を用いた年齢の推定方法は、Lovejoy et.al(1985)、五十嵐(1990)らによって掲示されている。今回は、東京慈恵会医科大学所蔵の近代日本人骨格標本のうち、生年月日と死亡年月日の記録があり、年齢の信憑性が極めて高い資料(男性30体、女性8体、年齢は25歳から85歳)を用いて、耳状面の形態による年齢の推定方法を新たに作った。新たな方法による年齢の推定値は、従来の方法による値と完全には一致しないことがわかった。縄文時代には地域によって人口構造が異なっていた可能性が、五十嵐(1990)によって示唆されている。今回は国立科学博物館所蔵の、蝦島貝塚(岩手県)人骨(縄文時代後・晩期、男性16体、女性30体、不明16体)を対象として、この集団の人口構造を推定した。年齢推定には今回新たに設定した方法を用いた。結果は以下の通りである。蝦島集団では、30歳代後半から40歳代前半での死亡率が最も高かった。蝦島集団の死亡率は、10歳代後半から30歳代前半では、他の本州集団(福島県三貫地遺跡、愛知県伊川津遺跡、吉胡遺跡、岡山県津雲遺跡)より高いが北海道集団より低く、30歳代後半以降では他のどの集団よりも高い。妊娠痕が判定できた全ての女性個体に妊娠痕が認められた。妊娠回数が多かったと判定した個体は40歳代後半以上の個体の60%を占める。この割合は、他の本州集団より高いが北海道集団より低い。以上の結果から、蝦島集団は、他の本州集団より多産多死傾向にあったが、北海道集団ほどではなかったという可能性が示唆できる。日本大学松戸歯学部で解剖された女性遺体6体について、骨盤上の妊娠痕の観察を行った。今後遺族へのアンケートによって、生前の妊娠出産に関する情報を収集する予定である。
ヒト豚間の異種移植における遅延型拒絶及び細胞性免疫反応に関する研究

humanized(ヒト化)SCIDマウスを確立し、マウス内でヒト免疫環境を再現する事に成功した。このhu-PBL-SCIDマウスはその血流中にヒト免疫グロブリン、ヒトTリンパ球の存在を認めた。豚腸間膜動脈片のSCIDマウス大動脈への直接バイパス術を施行した。これにより豚血管内皮細胞に対するヒト免疫グロブリン、リンパ球の直接的な変化が観察された。移植血管壁にはヒト免疫グロブリン(自然抗体)のうち、ヒトIgMの沈着が主に認められた。これはin vivoおよびPAEC(豚大動脈血管内皮細胞)におけるin vitro吸着実験と同様であった。この反応を免疫吸着でblockする事により、豚血管内皮細胞へのヒトリンパ球の吸着像を免疫組織法にて認めた。これらの細胞は主に、ヒトCD3 & CD4陽性細胞であった。検体の還流時間と病理所見の解析より各免疫拒絶反応が最も顕著となるOptimal timeを決定し、モデルとして確立することを目標としたが、これらの細胞はある程度の時間経過を追ってもグラフト血管内皮への浸潤像は病理学的に示さなかった。また、これらDXR(遅延型異種移植拒絶反応)および細胞性免疫反応に関わるヒト免疫担当細胞の詳細な解析を試み、移植片を培養にrecoverしたがヒトcell lineの作製は不能であった。共同研究者の佐々木が異種移植において、ヒトNK細胞が同種移植とは異なった様式にてグラフトのHLA-G & E geneの非発現を認識し移植片拒絶に関与する事をin vitroにて証明した(Transplantation 67;31-37,1999)。ヒト化SCIDマウスを用いin vivoでのヒトNK細胞の異種移植拒絶に対する影響を検討したが、豚血管グラフトにヒトHLA-G & Eをtransfectした後に移植しても明らかな異種移植片拒絶反応の抑制効果は認められなかった。これらの結果の一部を泌尿器科紀要に投稿し受理されたが掲載は未定である(別紙)。humanized SCIDマウスを確立し、マウス内でヒト免疫環境を再現する事に成功した。hu-PBL-SCIDマウスはヒト免疫グロブリンを産生し、その血流中にヒトTリンパ球の存在をPCR法にて認め、かつ同種移植片細胞を拒絶することより機能を有することを病理学的に証明した。豚腸間膜動脈片のSCIDマウス大動脈への直接bypass術を施行した。これにより豚血管内皮細胞に対するヒト免疫グロブリン及びリンパ球の直接的な変化が観察された。ヒト免疫グロブリンによる影響を抗体等にてblockする事により、豚血管内皮細胞へのヒトリンパ球の吸着像が免疫組織法にて認められた。これら細胞も主に、ヒトCD3&CD4陽性細胞が主であった。また、共同研究者として加わった佐々木らにより異種移植において、ヒトNK細胞がグラフトのHLA-G&E geneの非発現を認識し移植片拒絶に関与する事が明らかにされた。ヒトNK細胞が同種移植とは異なった様式にて異種移植での拒絶反応に加担している。humanized SCIDマウスを用いin vivoでのヒトNK細胞の異種移植拒絶に対する影響を検討している。hu-PBL-SCID

マウスはヒト免疫グロブリンを産生し、その血流中にヒトTリンパ球の存在をPCR法にて認め、かつ同種移植片細胞を拒絶することより機能を有することを病理学的に証明した。豚腸間膜動脈片のSCIDマウス大動脈への直接bypass術を施行した。これにより豚血管内皮細胞に対するヒト免疫グロブリン及びリンパ球の直接的な変化が観察された。豚血管内皮細胞へのヒトリンパ球の吸着像が免疫組織法にて認められ、これら細胞は主に、ヒトCD3&CD4陽性細胞であった。豚血管内皮細胞を用いたrepeated stimulationではこれらヒト細胞のcloningは不可能であった。また、共同研究者の佐々木等によりヒトNK細胞はグラフトのHLA-G&E geneの非発現を認識し、移植片拒絶を同種移植とは異なった様式にて拒絶していることが明らかにされた。humanized SCIDマウスを用いin vivoでのヒトNK細胞の異種移植拒絶に対する影響を検討している。特に、移植後のhumanized SCIDマウス内でのサイトカイン産生を測定することによりヒトNK細胞の豚血管内皮細胞に対する異種移植拒絶への影響を検討している。humanized SCIDマウスを確立し、マウス内でヒト免疫環境を再現する事に成功した。hu-PBL-SCIDマウスはヒト免疫グロブリンを産生し、その血流中にヒトTリンパ球の存在をPCR法にて認めた。これにより豚血管内皮細胞に対するヒト免疫グロブリンおよびリンパ球の直接的な変化が観察された。移植血管壁にはヒト免疫グロブリン(自然抗体)のうち、hu-IgMの沈着が主に認められた。これはin vivoおよびPAEC(豚大動脈血管内皮細胞)におけるin vitro吸着実験と同様であった。この反応を免疫吸着でblockする事により、豚血管内皮細胞へのヒトリンパ球の吸着像を免疫組織法にて認めた。これらの細胞は主に、ヒトCD3&CD4陽性細胞であった。検体の還流時間と病理所見の解析より各免疫拒絶反応が最も顕著となるoptimal timeを決定し、モデルとして確立することを目標としたが、これらの細胞はある程度の時間経過を追ってもグラフト血管内皮への浸潤像は病理学的に示さなかった。また、これらDXR(遅延型異種移植拒絶反応)および細胞性免疫反応に関わるヒト免疫担当細胞の詳細な解析を試みたが、細胞のrecoverによるcell lineの作製は不能であった。共同研究者の佐々木が異種移植において、ヒトNK細胞が同種移植とは異なった様式にてグラフトのHLA-G & E geneの非発現を認識し移植片拒絶に関与する事をin vitroにて証明した(Transplantation 67;31-37,1999)。humanized SCIDマウスを用いin vivoでのヒト
胚性幹細胞を用いた腎臓発生分化機構の解明と腎臓再生医療への応用に関する基礎的研究

腎発生に重要な遺伝子であるPax2を遺伝子導入したES細胞において、胚様体(EBs)を形成させ、アクチビンAとレチノイン酸を添加し培養を行った。EBsを回収し、RT-PCR法により評価した。integrinα8、aquaporin-1、BMP7、Ret、Pax8、Podcinの発現亢進を認めた。Pax2遺伝子を強制発現させることで、ES細胞から腎細胞への分化が誘導が示唆された。腎発生メカニズムの解明や将来の腎再生医療への応用が期待された。Pax2遺伝子導入ES細胞を培養し、分化させ、尿細管などの腎構成細胞やその幹細胞を誘導できる至適な培養条件、時間を検討し、移植に必要な細胞を準備した。1.遺伝子導入ES細胞の確立と培養マウスより確立されたES細胞の一つであるMGZRTcH2細胞を用いた。培養条件は5%CO2、37°Cで、培養液はGlasgow MEMに10% FCS、10-4M 2-メルカプトエタノール、non-essential aminoacid、1mMsodium pyruvate、1000U/ml LIFを加えたもの使用する。ES細胞を回収し、Pax2遺伝子を組み込んであるプラスミドDNAを用意し、960μF、250mVの条件でelectropolation法を行い、遺伝子を導入した。2.遺伝子導入ES細胞の分化実験Pax2遺伝子導入ES細胞をLIFを除いた培養液中でhanging drop法を用いembryoidbody(胚様体:EB)を形成させ、分化させた。5日後にEBを再度ディッシュに付着させ、分化を進めて、時間の経過とともに細胞を回収し、発現してくる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認した。また細胞の形態変化なども評価した。3. Pax2遺伝子導入ES細胞およびEBの遺伝子発現の確認回収したPax2遺伝子導入ES細胞、細胞塊をまず導入遺伝子自体が発現しているかどうかをRT-PCR法を用い確認した。ディッシュに平面培養したES細胞を回収し、mRNAを抽出し、SuperScript IIIキットにて逆転写反応を行った。得たcDNAでPCR反応を行い、この時、遺伝子未導入ES細胞を対照とし、増幅DNAバンドの有無などで判断した。同様に他の腎発生の各段階で発現してくる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認し、AQP1、Integrin α8の上昇を認めた。末期慢性腎不全に陥った場合、ドナー不足である腎移植治療の現状から主な治療は人工透析であるが、透析治療は国の財政を圧迫し、また患者の生活への負担も大きい。そこで本研究では、非常に複雑な構造と多くの細胞群により構成される腎臓を再生するために、当研究室で確立している腎・尿管発生に重要な働きをしている遺伝子であるPax2を遺伝子導入したES細胞から腎構成細胞を分化させることで新しい腎臓の再生医療の技術を確立することを試みた。前年度までに作成に成功し、確立したPax2遺伝子導入ES細胞において、胚様体(EBs)を形成させ、中胚葉分化因子であるアクチビンAとレチノイン酸(RA)を(1)非添加、(2)添加の条件別にEBsの平面培養を行った。EBsをそれぞれ回収し、腎臓発生に関連する各種遺伝子発現をRT-PCR法により評価した。さらに、糸球体や尿細管など腎構成細胞の有無について免疫染色法を用い検討した。(1)アクチビンA・RA非添加群でPax2遺伝子を発現させたEBsでは、integrin α8遺伝子(間葉細胞に発現する接着因子)とaquaporin-1遺伝子(近位尿細管マーカー)の発現亢進を認めた。免疫染色では、aquaporin-1陽性細胞数の増加を確認することができた。(2)アクチビンA・RA添加群においては、BMP7遺伝子(間葉細胞から尿細管への分化に関連する因子)、Ret遺伝子(GDNFと協調し尿管芽形成する因子)、Pax8遺伝子(Pax2遺伝子と協調し尿細管形成する因子)、Podcin遺伝子(糸球体の足細胞のマーカー)などの発現亢進を認めた。Pax2遺伝子を強制発現させることで、腎構成細胞あるいは前駆細胞の構成比率が増加し、ES細胞から腎細胞への分化が誘導されたと考らされた。さらに中胚葉分化因子との協調により、腎を構成する多様な細胞への分化が可能と考えられ、腎発生メカニズムの解明や将来の腎再生医療への応用が期待された。ES細胞から腎臓への分化誘導系を確立することを最終目的に、Pax2遺伝子をES細胞に遺伝子導入をし、目的の細胞に分化する可能性のある遺伝子導入ES細胞を前年度までに確立した。さらにそのES細胞を用いて腎発生機構を明らかにするために培養条件を検討し、条件の違いにより発現する遺伝子の違いが明らかになった。1.Pax2遺伝子導入ES細胞およびEBの遺伝子発現の確認

回収したPax2遺伝子導入ES細胞、細胞塊をまず導入遺伝子自体が発現しているかどうかをRT-PCR法を用い確認する。ディッシュに平面培養したES細胞を回収し、mRNAを抽出し、SuperScript IIIキットにて逆転写反応を行った。得たcDNAでPCR反応を行った。この時、遺伝子未導入ES細胞を対照とし、増幅DNAバンドの有無などで判断した。他の腎発生の各段階で発現してくる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認し、尿細管において水輸送に重要な働きをするAQP1と、腎発生で重要な働きをするIntegrin α8の上昇を認めた。2.Pax2遺伝子導入ES細胞およびEBのマウスへの移植上記実験で得たES細胞およびEBを免疫不全マウスであるSCIDマウスの腎被膜下に移植を行った。今回の検討ではteratomaの形成を認めた。HE染色、免疫染色において移植組織内の明らかな腎組織を認めなかった。3.新規培養条件の検討糸球体構成細胞を形成させる培養条件を検討した。ActivinA、レチノイン酸添付により、RT-PCRにおいて足細胞のマーカーであるPodcinの上昇を確認できた。
B型肝炎抗原蛋白の予測高次構造の精密化

B型肝炎の小型球形粒子はHBsAgのinner dimer60分子とouter dimer60分子が正二十面体上にT=1の対称性で詰められることによって生成することが明らかとなった。inner dimerもouter dimerもすべて1分子1本ずつの糖鎖を持つことが明らかとなったので、中心部の空隙はすべて水であり、リピドはHBsAg dimerにつき22分子がβsheetの間にサンドイッチ状に結合するものだけで説明できることになった。ジアシル型フォスファチジルコリンを特異的に結合する理由は、保存されているグルタミンの側鎖の他に4本のβ鎖の端の酸アミドを考慮する必要がある。現在そのような合理的な分子充填モデルを構築中である。Dane粒子については先にHBcAg dimerがSS結合によって形成され、その上にHBsAgのinner dimerとouter dimerが乗ることによって、5回軸と擬6回軸が1:1の比率で存在する対称性T=3の正二十面体を形成することを予測した。Dane粒子の擬6回軸に形成されるpreーS1領域とpreーS2領域の峡谷称構造が肝細胞に存在すると思われる受容体によって特異的に認識される可能性がある。更にその部分がouter dimerが横すべりしてDane粒子の輪郭構造が崩れるのを防いで安定化していることも見出された。アジア型やアフリカ型の亜型によるアミノ酸の変異はすべて表面に現れるが、受容体に認識されることはないような凹みや陰にかくれるようになっている。一方、5回軸の方はHBsAgのsmall woleculeN端やC端がそのまま現れており、やはり峡谷称構造を形成しているが、こちらは肝細胞膜にHBsAgのN端が突入し、内部のDNAが注入されるように思われる。最近になってその部分の予測高次構造を組立てることが出来た。その原子座標を測定、合理的にし、既に組立てあるinneスdimerやouter dimerのDane粒子上の原子座標につないで、全体としても合理的な高次構造として仕上げて、発表する予定である。B型肝炎は東南アジア、アフリカなどに見られる重要な疾患で、ウィルスが関与していることが知られており、慢性感染者は世界全体で約2億2千万人にのぼり、その何割かは年を経て肝癌になるとされている。この疾病の予防の目的でワクチンの開発が進められているが、そのためにはこのウィルスの表面抗原HBsAgの三次元構造を知ることが必要である。アミノ酸配列は既に知られており、226残基から成るS-HBsAgが肝細胞膜の中からジパルミチルフオスファチジルユリンを選択的に抱合して多数のSS結合により強固な2分子会合体を形成し、これが直径22nmのT=1に相当する正二十面体の小型球形粒子を形成することが、実験的に知られている。しかしながらX線結晶解析は誰も試みておらず、殆んど成功の望もないので、三次元構造予測の方法を開発してベルリンの第7回国際蛋白質配列解析学会で発表した。次いで感染性のDane粒子は3200塩基対のDNAとDNAポリメラ-ゼの複合体がユア抗原HBcAgによって覆われており、その表面を上記のS-HBsAgと、それよりも分子量の大きいM-HBsAgとL-HBsAgが多分2;1;1の割合で42nmの直径の粒子を形成している。電子顕微鏡による観察によればユア粒子はT=3の正二十面体対象性を有することが知られている。更にウッドチャックのHBcAgがライノウィルスの表面蛋白質と相同姓が高いことが見出されたので、蛋白質デ-タバンクからライノウィルスの表面蛋白質の原子座標を取出してHBcAgのモデルを組立てた。ライノウィルスと異なり、保存されたシスティン残基の存在と鵞鳥のHBcAgとの比較により、HBsAgに見られたのと同様SS結合による2分子会合体が形成されている。C端側のプロタミン類似部分はHGS分子模型を用いて組立て、原子座標を測定した。その結果を神戸で開かれた第2回国際蛋白工学会で発表した。今後ス-パ-コンピュ-タを用いて原子座標を改善することを計画している。