hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
展葉の不均一性に着目した季節性熱帯常緑林における乾季蒸散量の時系列推定

乾季と雨季が明瞭に分かれる季節性熱帯気候に生育するカンボジア低地常緑林で、新葉を開く「展葉現象」と葉から水蒸気を放出する「蒸散」の関係を研究した。カンボジア低地常緑林では、乾季に出た新葉が豊富な地下水を使い、乾季中にもさかんに蒸散していた。フタバガキ科大径木は新葉を乾季の始めに出すので、乾季中期に多くの水蒸気を地面から空中へ送り出す役割を果たす。フタバガキ科大径木が失われると森林を巡る水の動きが変わると考えられる。本研究では、カンボジアの季節性熱帯常緑林における展葉現象の実態および展葉と蒸散速度の関係を解明し、カンボジアの季節性熱帯常緑林における乾季蒸散量を広域的かつ時系列的に推定することを目標としている。当該年度は林冠を構成する常緑樹種について展葉フェノロジーを調査し、乾季蒸散量測定樹種を選定した。先ず衛星NOAAによって取得されたNDVIの時系列変化の解析によって、展葉パターンを広域的に推定して類型化した。次に異なるパターンを示した地域を現地踏査し、優占する常緑樹種を判別した。乾季の前半に落葉する傾向を示したシェムリアップ州(カンボジア北西部)の環境省バイオマス調査林ではDipterocarpus alatusが優占していた。乾季の前半に落葉する傾向と乾季の前後半に2回落葉する傾向が混合していたモンドルキリ州(カンボジア南東部)の環境省保全林ではD. dyeriが優占していた。乾季の前半と後半に2回落葉する傾向が卓越していたコンポントム州(カンボジア中央部)ではAnisopteracostataおよびD. costatusが優占していた。既往の調査においてA.costataは乾季の前半に落葉し、D. costatusは乾季の前後半に2回落葉する傾向が認められている。以上の結果を踏まえて、乾季蒸散量測定樹種をD. alatus, D. dyeri, A. costataおよびD. costatusに定め、落葉展葉フェノロジー調査および個葉蒸散量測定用の足場建設を委託した。委託調査の結果は乾季が終了する来年度4月以降に回収する。本研究では、カンボジアの季節性熱帯常緑林における展葉現象の実態および展葉と蒸散速度の関係を解明し、乾季蒸散量を広域的かつ時系列的に推定することを目標としている。当年度はフタバガキ科林冠構成種について乾季蒸散量を経時的に測定し、展葉状態との連関を明らかにすることを目的とした。カンボジア中央部・コンポントム州の季節性常緑林において、林冠構成樹種であるフタバガキ科常緑樹Dipterocarpus costatusの個葉蒸散量を12月-2月の乾季期間に測定した。先ず、個葉蒸散量測定に用いた簡易蒸散量測定装置(DECAGON SC-1)の精度検定を行った。検定は乾季始め(2009年11月)の現地にて多樹種の切り枝を用いた光合成測定装置の標準機種(LI-COR,LI-6400)測定結果(田中らunpublished)との比較によって行った。両者の相関係数は高くない(R^2=0.35)ものの、蒸散活性の高低を示唆しうると判断した。経時測定はD.costatusの壮齢個体(DBH=48cm)および若齢個体(DBH=43cm)上の個葉140枚を対象にのべ7184回行った。展開した新葉の蒸散活性は展葉後10-40日目で高かった。30-40日目に最大となった後、60日目以降は最大活性の40-50%程度で推移した。問歇的な展葉現象を反映して、林冠には葉齢の異なる個葉が混在していた。枝単位の蒸散活性が最も高かったのは1月上旬であった。2月末日の測定終了時には展葉間近の葉芽が樹冠上に認められ、3.月下旬から4月上旬に掛けて、樹冠の蒸散活性が再び高くなることが予想された。なお、サテライト観測プロット候補としたクラティエ州スノウル野生生物保護区においては大規模な違法伐採と森林火災が発生し、調査機材・試料が焼失する等の被害が生じた。研究の履行は困難と判断し、当該地における蒸散量測定を中止した。本研究では季節性熱帯域に生育するカンボジア低地常緑林における展葉現象と蒸散速度の関係を解明し、乾季蒸散量を広域的かつ時系列的に推定することを目標としている。最終年度である当年度は成果の時空間的なスケールアップを目指した。個葉蒸散活性の時間変化と林分葉群動態を統合した乾季蒸散量変化モデルを構築し、衛星情報を用いた外挿手法を検討した。カンボジア低地常緑林は大量の地下水が貯留・供給される厚い土層上に成立するため、乾季中でも水分条件に著しい制約が掛からない。

個葉蒸散量は気象条件(飽差)と個葉蒸散活性(気孔コンダクタンスで指標)に依存すると考えられる。個葉蒸散活性は展葉後の成熟に伴って急速に高まったのち漸減した。林分蒸散量は個葉蒸散量に加え、個葉存在量にも依存する。乾季中の個体葉量(直接観測)と林分葉量(葉面積指数を非破壊的光学手法で推定)は一定であった。個体蒸散量は個体内の葉齢構成を反映し、林分蒸散量は林分の葉齢構成を反映すると考えられる。林分の葉齢構成の時系列変化を明らかにするため、落葉フェノロジーをリタートラップ法で推定した。フタバガキ科大径木が卓越する林分では展葉は乾季前半と後半に起こるが、フタバガキ科大径木を欠く林分では展葉は乾季後半に集中する。前者では乾季前半と後半に蒸散量が増加するが、後者では前半の増加を欠くと推測される。衛星NOAA画像解析(2001-2002年)では調査地であるカンボジア中央部にフタバガキ科大径木が広範に存在しており、乾季の前後半における蒸散増加が示唆された。近年進行中のフタバガキ科大径木の消失による森林劣化が常緑林地域の乾季蒸散量に与える影響を推定するため、高解像度衛星ALOS解析(環境省環境総合B-072)で検出された大径木伐採エリアにおいて、伐採(2006-2007年乾季)前後の変化を高頻度・中解像度衛星MODIS画像を用い、時系列モデル化処理で得られるスペクトルの季節変化区分を利用して解析した。
小児の咬合力変化と身体組成変化の関連

本年度は、11歳児児童の半年間の身体組成変化と咬合機能の変化を主に検討した。対象と方法:対象者の、形態測定(身長・体重・体脂肪率)、握力測定、歯科検診、Dental Prescale(富士フィルム)による咬合機能測定を行った。同時に、生活習慣調査も行った。Dental Prescaleによる咬合機能測定法は、全顎の咬合力と咬合接触面積が同時に測定される。初回の測定6ヶ月後の同様の測定を行い、その変化を観察した。検討は測定開始時、及び6ヶ月後に未処置齲歯がない正常咬合者、男子4名、女子4名を対象とした。結果:6ヶ月後の男子の全歯列に加わる咬合力は除脂肪体重、体脂肪率と、女子の咬合力は握力と、正で相関する傾向が認められた。6ヶ月間で、男女全ての対象で咬合力が有意に増加し、上下歯列の接触部位の面積を示す咬合接触面積は増加傾向が認められた。一方、単位咬合接触面積あたりの咬合力を示す平均咬合圧は、男女とも6ヶ月間で有意の増加を示さなかった。6ヶ月間の咬合力の変化量は、男子では握力の変化量と、女子では体脂肪率の変化量と正の相関が認められた。6ヶ月間の咬合力変化割合((6ヶ月の変化量)/初回測定値)は、体脂肪率、脂肪体重、握力の変化割合と正で相関する傾向が認められたが、除脂肪体重とは関連が認められなかった。生活習慣との関係においては、例数が少ないため有意な差は認められなかったが、男子の咬合力変化割合が、1週間の学外スポーツ活動時間と、女子の咬合力の変化量が、食事摂取の規則性と正で相関する傾向が認められた。考察:11歳児では6ヶ月間で咬合機能の有意な発達が認められた。また、その発達割合は身体組成の変化、特に脂肪量の増加と関連していることが示された。生活習慣との関係では、身体活動性、規則正しい食生活が咬合機能の発達に寄与する可能性が示唆された。本研究の目的は、縦断研究による咬合力、身体組成の変化・関連を検討することにある。本年度においては、横断研究により咬合接触状態と身体組成、生活習慣の関連を検討した。概要:10歳から14歳の小児86人を対象に、Dental Prescaleを用いた咬合力を含めた咬合接触状態、身体形態の各測定を行い、合わせて自言試アンケートにより身体活動性、食物咀嚼能等について調査を行った。検討は、対象者を暦年齢ではなく、Hellmanの咬合発育段階(歯牙年齢)によりIIIBIV Aに評価分類し、各群間で測定値を比較した。なお、各歯牙年齢間で男女の割合に有意差がなく、咬合接触状態各値も男女で有意差がなかったので、検討は男女を分けずに行った。結果、身長・体重・脂肪体重・除脂肪体重・握力は歯牙年齢の上昇に従い高値を示したが、体脂肪率には差が認められなかった。咬合接触状態では、歯牙年齢が高いほど咬合モーメント値が大きく、平均咬合圧は歯牙年齢IIICで高かったが、咬合接触面積、咬合力に有意な差は認められなかった。また、身体活動性は歯牙年齢が高いほど低かった。さらに、歯牙年齢IV Aで上下顎の正中線が一致している者の割合が多く、顎関節異常を訴える者は少なかった。食物咀嚼能に各群間で有意な差は認められなかったが、歯牙年齢IIIBで、咀嚼筋活動量が高い食物を噛めない者の割合が多い傾向が認められた。このように、小児は歯牙年齢が高くなるほど、身体的成長とともに、咬合接触状態が良好になる傾向が認められ、咀嚼能が向上していることが示された。特に歯牙年齢IIICからIVAにおいては、口腔学的機能が変化する時期であることが示唆された。小児の口腔健康指導においては、暦年齢とともに、歯牙年齢を考慮した指導が望まれる。また、咀嚼能力の評価におけるDental Prescaleの有用性が考慮される。6ヶ月間の咬合力変化割合

((6ヶ月の変化量)/初回測定値)は、体脂肪率、脂肪体重、握力の変化割合と正で相関する傾向が認められたが、除脂肪体重とは関連が認められなかった。生活習慣との関係においては、例数が少ないため有意な差は認められなかったが、男子の咬合力変化割合が、1週間の学外スポーツ活動時間と、女子の咬合力の変化量が、食事摂取の規則性と正で相関する傾向が認められた。考察:11歳児では6ヶ月間で咬合機能の有意な発達が認められた。また、その発達割合は身体組成の変化、特に脂肪量の増加と関連していることが示された。生活習慣との関係では、身体活動性、規則正しい食生活が咬合機能の発達に寄与する可能性が示唆された。
西欧十三世紀の哲学的倫理学

十三世紀後半にオックスフォード大学学芸学部で書かれたとみられる、アリストテレスの『ニコマコス倫理学』第一巻についての、二つの注解書を校訂した。そのうちの一つ、逸名氏の『ウスター倫理学注解問題集』(ms. Worcester Cathedral Library Q.13)とその解説を欧文雑誌で公表した。もう一つの、ヨハネス・ディンスデールの『倫理学注解問題集』第一巻を、現存する三つの写本に基づいて校訂し、解説を加えて報告書冊子を作成し、関係研究者に配布した。(1)十三世紀から十四世紀初頭に書かれた『ニコマコス倫理学』の注解書のなかで、主に公刊されているものの関連箇所を読み、内容を分析した。並行して関連論文を収集して読んだ。(3)オックスフォード大学の学芸学部教師であったヨハネス・ティティンザールの『倫理学注解』の現存する三つの写本を比較検討し、もっとも信頼性の高い写本を決定した。その後、写本の書写・校定の作業に本格的に入った。ヨハネス・ティティンザールの『倫理学注解』は三つの写本に残っている。三つの写本を部分的に書写して比較検討し、もっとも信頼性が高い写本をベースに、他の写本も参照しながら、書写・校定の作業を行った。一連の作業のやり方について、海外(デンマーク・コペンハーゲン)滞在中にSten Ebbesen教授の指導・助言を受けた。また、ケンブリッジで開かれた学会参加の折りに、ケンブリッジ大学図書館所蔵の写本を閲覧した。1.前年度にフランスで発行されている欧文専門誌に投稿・受理された、オックスフォード大学で書かれた作品と推定される『ウスター倫理学注解』の校定版及び作品解説の論文の校正(初校及び再校)を行った。2.未公刊の写本資料であるヨハネス・ティティンザールの『倫理学注解』の序文及び第一巻の注解の書写を終えて、写本間の相関関係を明らかにする作業を進めた。ヨハネス・ティティンザールの『倫理学注解』は、現存する唯一の、十三世紀のオックスフォード大学で書かれたことが確定される倫理学注解であって、校訂版の作成は十三世紀のイングランドの倫理思想を知る上で必須の作業である。校訂版作成上の疑問点を解消するために、コペンハーゲンに滞在し、これまで数々の校訂版作成に関わってきたコペンハーゲン大学教授のSten Ebbesen教授に助言を受けた。3.イギリスのダラムに5日間滞在して、現存する三つのヨハネス・ティティンザールの『倫理学注解』の写本のうち、ダラム司教座聖堂図書館所蔵の写本を閲覧し、第一巻の書写の不明点を解消するとともに、写本全体の状態を確認した。4.『ウスター倫理学注解』やヨハネス・ティティンザールの『倫理学注解』と類似性をもつ、十三世紀のパリ大学で書かれた倫理学注解を読解し、当時のパリ・オックスフォード大学学芸学部教師が、哲学と幸福の関係をどのように考えていたのかをまとめ、国内学会のシンポジウムで発表した。『ウスター倫理学注解』が掲載されるはずの欧文専門誌の発刊が、出版社の都合(当該号が大部になったため)翌年に持ち越され、この校訂版を郵送する際に連絡をとろうと考えていた、十三世紀西欧の倫理学注解を研究している海外の研究者とのコンタクトが遅れた。1.フランスで発行されている欧文専門誌に、オックスフォード大学で書かれた作品と推定される『ウスター倫理学注解』の校訂版及び作品解説の論文が掲載された。2.未公刊の諸本資料であるヨハネス・ティティンザールの『倫理学註解』の序文及び第一巻の校訂版テキストの作成を終えた。当該作品の写本間の関係を明らかにし、校訂版の注に記載した。また、当該作品が依拠している資料(アリストテレス、キケロ、ボエティウス、アヴェロエスなど)を明らかにし、校訂版の注に記載した。校訂版作成上の疑問点を解消するために、コペンハーゲンを訪問し、これまで数々の校訂版作成に携わってきたコペンハーゲン大学教授のSten Ebbesen教授に助言を受けた。3.イギリスのケンブリッジ大学及びオックスフォード大学を訪問し、ヨハネス・ティティンザールの二つの写本の第一巻の書写の不明点を解消するとともに、写本全体の状態を確認した。4.ヨハネス・ティティンザールの『倫理学注解』の写本の状況、著者や著作年代の確定、第一巻に見られる哲学的倫理学と幸福論の主要な理論的特色をまとめた論文を英語で執筆し、ウェブ上で公開した。写本作成の年代と理論的特色から、『ウスター倫理学注解』は、ヨハネス・ティティンザールの『倫理学註解』の影響を受けて書かれた作品の可能性が高いとの結論を出した。また、ヨハネス・ティティンザールの『倫理学註解』は、同時代のパリ大学で書かれた註解、トマス・アクィナスの『神学大全』と『倫理学注解』及びアルベルトゥス・マグヌスの『倫理学注解』の影響を受けて書かれた作品であることを明らかにした。

十三世紀におこった変化を理解するために、十二世紀の倫理学のあり方についての理解を二次文献と原典をもとに深める予定であったが、十二世紀に関しては公刊されている資料が少ないことから、十三世紀の公刊されている資料の読解に力点をおいた。その他の点については、研究及び研究の公表がおおむね予定通りに進んでいる。ヨハネス・ティティンザールの『倫理学注解』が引用しているテキスト(locus fontium)を確定する。同『倫理学注解』の二つの写本(ケンブリッジ大学所蔵のものとオックスフォード大学所蔵のもの)を閲覧し、書写の不明な点を解消する。以上の作業を踏まえて第一巻の校訂版を完成させ、公表する。ヨハネス・ティティンザールの『ニコマコス倫理学』第一巻について暫定的校訂版がもとにした写本及び展開されている学説についての解説西洋中世哲学史おおむね当初の研究計画通り、研究と研究の公表を進める予定である。今年度中に『ウスター倫理学注解』の校定版を出版し、次年度中にヨハネス・ティティンザールの『倫理学注解』の第一巻の部分の校定版を作成し、ウェブで公表する。そのために、ヨハネス・ティティンザールの『倫理学注解』の残り二つの写本の調査を行う。今年度中にダラムで、次年度中にオックスフォードで写本の閲覧をする予定である。
熱環境応答型スマートメタマテリアルの提唱と熱スペクトル制御の実証研究

メタマテリアルは金属サブ波長構造を単位素子とした人工光学材料であり、形状によりスペクトル特性を調整可能である。本研究は「スマートメタマテリアル」を新たに提唱し、試作デバイスを用いてスペクトル制御の実証を行うことを目的とする。1)デバイス概要及び光学設計、2)機械構造の設計、3)プロセスの条件出し、4)デバイス製作、5)特性評価の順に研究を進め、最後に研究総括を行う。
気候変動に伴う河川生態系のリスク評価：統計モデルとメソコスム実験の融合

昨今、温暖化の生物多様性への深刻な影響が懸念されている。しかし、信頼度および汎用性の高い水温予測手法は確立されておらず、他の系に比べ淡水生態系での温暖化影響の検証・予測は遅れている。また、既存研究の多くは温暖化の生物への影響を種レベルの観点からしか評価しておらず、種分布や環境の組み合わせが変化する将来において、群集構造や生態系機能がどう変化していくか未知の部分が多い。本研究では、水温モデリング、種分布モデリング、および野外操作実験を統合し、種・群集・生態系と多様なレベルでの温暖化の河川生態系への影響を予測する手法の開発、また本手法を用いた全国スケールで河川生態系の温暖化リスク評価を実施する。
土壁と木材の非破壊現地調査技術の文化財数寄屋建築への展開と保存設計技術の構築

本研究では,文化財数寄屋建築を対象に現場診断結果を用いた耐震性能評価技術を開発する.本研究の目的は,合理的で信頼性の高い評価情報を得るべく,数寄屋建築を損傷させずに土壁と構造木材の材料特性を推定できる要素技術を提供することである.現地調査において,壁土と木材の材料特性が評価できれば,建物の性能評価に直接有益な情報とすることができる.さらに,薄い壁厚の土壁を有する架構の性能評価実験を通して,数寄屋建築のシミュレーション技術を構築する.数寄屋建築の地震時挙動のシミュレーションにより,効果的な耐震補強法を提案する.これらの要素技術を組み合わせて文化財数寄屋建築の保存設計に直接活用できる基盤を整える.本研究では,文化財数寄屋建築を対象に現場診断結果を用いた耐震性能評価技術を開発する.本研究の目的は,合理的で信頼性の高い評価情報を得るべく,数寄屋建築を損傷させずに土壁と構造木材の材料特性を推定できる要素技術を提供することである.現地調査において,壁土と木材の材料特性が評価できれば,建物の性能評価に直接有益な情報とすることができる.さらに,薄い壁厚の土壁を有する架構の性能評価実験を通して,数寄屋建築のシミュレーション技術を構築する.数寄屋建築の地震時挙動のシミュレーションにより,効果的な耐震補強法を提案する.これらの要素技術を組み合わせて文化財数寄屋建築の保存設計に直接活用できる基盤を整える.
k次近隣距離分布を用いた施設配置の頑健性評価

本研究の目的は,閉鎖に対する施設配置の頑健性を評価することにある.まず,住民からk番目に近い施設までの距離の分布(k次近隣距離分布)を規則的配置とランダム配置に対して導いた.これを用いて,施設閉鎖によって利用可能な施設までの距離がどの程度増加するのかを分析した.また,実際の公共施設配置を用いて,道路距離の下でのk次近隣距離分布を計測し,連続平面上の直線距離や直交距離に基づくモデルが,ある程度現実に適用可能であることを確認した本研究の目的は,閉鎖に対する施設配置の頑健性を評価することにある.まず,住民からk番目に近い施設までの距離の分布(k次近隣距離分布)を規則的配置とランダム配置に対して導いた.これを用いて,施設閉鎖によって利用可能な施設までの距離がどの程度増加するのかを分析した.また,実際の公共施設配置を用いて,道路距離の下でのk次近隣距離分布を計測し,連続平面上の直線距離や直交距離に基づくモデルが,ある程度現実に適用可能であることを確認した平成20年度は,施設配置の頑健性を評価するための基礎モデルを提供することを目的に,閉鎖を考慮した施設配置モデルを構築した.そして,施設が閉鎖された場合に,住民から利用可能な施設までの距離がどの程度増加するのかを分析した.また,施設までの平均距離を比較することで,閉鎖に対して頑健な配置を明らかにした.具体的な研究実績は以下の通りである:1.規則的配置とランダム配置を対象として,住民からk番目に近い施設までの距離の分布(k次近隣距離分布)を導いた.距離の計測には,代表的な距離である直線距離と直交距離を用いた.規則的配置に関しては,高次の距離を解析的に表現することが困難なので,距離分布の代わりに上限値・下限値を求めた.この上限値・下限値は既存研究で得られているものに比べて良いことが確認できた.2.求めたk次近隣距離分布を用いて,閉鎖を伴う施設配置モデルを構築した.施設が独立に閉鎖され,住民は最寄りの開いている施設を利用するという仮定の下で,利用可能な施設までの平均距離を求めた.これにより,施設密度や閉鎖率が平均距離に及ぼす影響を理論的に把握することができた.3.施設までの平均距離を比較することによって,頑健な配置を明らかにした.直線距離の場合, 68%以上の施設が閉鎖されずに残るからば,三角格子状配置が望ましい配置であることが分かった.直交距離の場合には, 73%以上の施設が残るならば,ダイヤ格子状配置が望ましい配置となることが分かった.本年度は,前年度に構築したモデルを用いて実際の公共施設配置の頑健性を評価するとともに,モデルの拡張として,施設閉鎖情報の提供効果を計測するためのモデルを構築した.具体的な研究成果は以下の通りである.1.公共施設の位置データ,道路ネットワークデータを用いて,道路距離の下でのk次近隣距離分布を計測した.そして,施設が閉鎖された場合に,住民から利用可能な施設までの距離がどの程度増加するのかを分析した.この結果をモデル分析から得られた結果と比較することにより,直線距離や直交距離に基づくモデルがある程度,現実に適用可能であることを確認した.2.災害時のように施設閉鎖情報が得られない状況を記述するモデルを新たに構築した.そして,閉鎖情報が得られる場合と得られない場合とを比較することで,情報の提供効果を計測した.その結果,閉鎖情報を提供することで住民の移動距離を大きく減らすことができること,および,閉鎖情報が得られるかどうかで最適な施設配置パターンが異なることが明らかになった.以上の研究成果は,不確実性に強い都市を設計するための基礎となる.構築したモデルを用いれば,施設閉鎖による損失の大きさを移動距離の増分として見積もることができる.また,施設の補強や増設,情報提供など様々な政策の効果を定量的に把握することができ,政策の優先順位を決定するための有用な資料となる.今後取り組むべき研究課題としては,施設だけでなくアクセスとしての道路も含めた頑健性評価が挙げられる.
血管新生過程におけるカルシウム動態の時空間パターンの意義の解明

血管新生プロセスでは血管内皮細胞内のカルシウム動態が重要な意義を有していると考えられているが、血管内皮細胞へのカルシウム動員機構については不明な点が多い。本研究では、免疫細胞等でストア作動性カルシウム流入(SCOCE)に重要であると提唱されているStim1とOrai1が、血管内皮細胞においてもSCOCの制御に重要であることを明らかにした。また、VEGF刺激時に血管内皮細胞からのvon willebrand factorの放出がSOCE活性依存的に制御されていることを明らかにした。血管新生のプロセスで血管内皮細胞が遊走、増殖し、最終的に血管のネットワークを完成させる過程においては血管内皮細胞内でのカルシウムシグナルが重要な役割を担っていると考えられる。そこで、細胞外からのカルシウム流入に寄与することが明らかになりつつあるSTIM1とOrai1のチューブ形成における機能を明らかにすることを目指した。STIM1とOrai1を標的とするsiRNA発現コンストラクトを作製し、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)内のSTIM1とOrai1遺伝子のノックダウンを行い、これらの細胞での容量性カルシウム流入(SOCE)をカルシウムイメージング法で評価した。その結果、いずれの細胞でもSOCEはほぼ完全に抑制されていることが明らかになり、細胞内カルシウム動態の寄与する血管内皮細胞の機能の抑制が期待された。さらに、長時間の生理条件下でのチューブの形成過程の観察やカルシウムイメージングに最適な方法の構築を行った。ゲル及び培地成分の選定、ゲル厚、細胞密度の最適化や、タンパク質ベースの蛍光カルシウムプローブの選定を行い、CCDカメラを用いた高精細なカルシウムイメージング法の確立を行った。また、形成されたチューブの画像解析を行うためのXYステージを備えた自動顕微鏡システムの構築を行った。今後は、今年度に確立した技術を組み合わせ、チューブ形成の際のカルシウムの時空間的変動へのカルシウム関連分子の寄与を明らかにしていく予定である。血管内皮細胞は血管内皮細胞増殖因子(VEGF)等の栄養因子によって活性化され血管新生過程が開始される。VEGFが惹起する細胞内のカルシウム動態の変化は血管新生のシグナルカスケードにおいて重要な役割を果たしていると考えられるが、その実態は明らかになっていない。本年度はVEGFによって惹起されるストア作動性カルシウム流入(SOCE)に着目して研究を行った。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)でshRNAを用いてSOCEの分子実態として近年注目を集めているStim-1遺伝子とOrai-1遺伝子のノックダウンを行い、VEGF依存的なSOCE活性に与える変化をカルシウムイメージング法によって解析を行った。その結果、VEGFを負荷することによって惹起されるSOCEはStim-1やOrai-1のノックダウンによって著明に減弱した。また、この効果はStim-1やOrai-1のレスキューによって回復した。以上の結果はVEGFによって生じるSOCEにはStim-1とOrai-1の両方の分子が必要であることを示している。また、Stim-1やOrai-1のノックダウン細胞ではVEGF依存的なvon willebrand factor(vWF)の放出が著しく抑制されている事が観察された。この結果は、VEGFがStim-1やOrai-1を介したSOCEを通して、血管内皮細胞からの血小板の凝集を制御することで血液凝固システムにも強く関与している事を示しているものである。以上の新しい知見についての投稿論文を準備中である。
問題意識の発生・変化・消失に注目した観察・実験プロセスの分析

学習者の問題意識の発生・変化・消失に注目して観察・実験のプロセスや単元全体の学習を分析した。まず、小学校6年生「大地のでき方」の学習を対象として、そこで取り上げられている教材について児童が抱く疑問や問題意識を「不思議」というキーワードから調査し、次に各授業において児童が抱いた不思議を抽出し、その内容や学習活動(観察・実験を含む)との関係を分析した。事前調査では、アンケート用紙に「不思議なこと」を記述した児童の割合は、「火山」:97%、「化石」:81%、「石」:96%、「地層」:85%であった(n=74)。児童の不思議は、教材によって多様化する場合(火山や化石)と、同じような観点に集中する場合(地層)があった。また、岩石標本を観察させた石に関する不思議では、色、形、手触りなど五感を通して得た情報について「なぜ○○なのか」と表現したものが多く、その記述内容だけでは素朴な疑問なのか、気づきを疑問の形式で表現しただけなのかを判断することは困難であった。授業後の不思議の記述については、授業内容ごとに記述できた児童の割合が異なった。不思議なことを記述できた児童の割合が高かったのは、学校の地面の下のボーリング資料を用いた授業の最後の時間(3時間目)で、授業の内容の高まりや話し合いによる児童の相互作用が不思議の記述を誘発したのではないかと推察された。火山に関する不思議の内容について、事前調査と火山の授業後の調査の結果を比較したところ、関連性が認められる児童は15%で、記述内容がまったく異なっていた児童は44%であった(n=72)。これは児童の視点が授業内容によって焦点化されたためではないかと考えられる。単元の最後に各授業において不思議の振り返りを行ったところ、児童自身の判断では、約50%の不思議が未解決のまま残されていることがわかった。以上の結果を生かして、児童が地域の自然から多様な気づきや疑問を引き出すような「大地のつくり」の単元構想や教材開発を行い、教育現場の教師と連携して実践した。本年度は、研究の初年度であり、基本的に本調査のための資料収集や予備的調査を実施した。研究内容とその成果は次の通りである。まず、小学校5事例、中学校4事例の理科授業を観察し、その学習指導案の分析を通して、授業構想段階における問題解決のモデルを抽出した。また、過去3、4年間に実施された理科の研究授業等の学習指導案を収集し、同様の分析を行い、観察・実験の内容と学習プロセスの関係や授業における観察・実験の位置づけなども分析した。問題解決学習の構想については、小学校理科6年「大地のつくり」の単元において、小学校の教師と連携して単元計画を構想した。単元計画では、問題意識を自己評価する段階を毎時間設け、さらに単元の半ばと最後に児童個人の問題意識を振り返る時間を設定した。それから、中学校・高等学校において生徒の問題意識を調べるための実験として、盲斑や、反射など自分の体について調べる実験を新たに開発し、高等学校において実践した。この成果については、日本理科教育学会第51回全国大会と日本生物教育学会第72回全国本会で発表した。観察・実験プロセスの調査・分析では、問題意識の発生する原因を調べるために、中学校理科のグループ実験における学習者の相互作用をVTR記録を用いて分析した。その結果、グループ外の生徒との相互作用がグループ内の生徒間の相互作用や探究プロセスに影響したことなどがわかった。また、小学校理科「大地のつくり」では、単元レベルでの問題意識の変化を調査したが、授業が3学期に実施されたものであるため、データの分析は現在実施中である。

以上の結果を生かして、児童が地域の自然から多様な気づきや疑問を引き出すような「大地のつくり」の単元構想や教材開発を行い、教育現場の教師と連携して実践した。
滑り運動系の微細構造

まずアクチン分子に関しては、沼田らによりテトラヒメナから単離されたアクチンのcDNAを酵母で発現させる系が初めて確立された。次にミオシン分子に関しては、山本の架橋実験により、アクチンフィラメントとの結合ドメイン(Kーsite)の解析が、盛田らの合成ポリペプチドを用いた方法により、Sーsiteと呼ばれるアクチン結合領域の解析がなされた。また岡本により、光アフィニティ-ラベル法を用いたミオシン分子のATPase活性中心の解析も精力的に行われた。滑り運動の構造的基盤を理解するには、上述したような、タンパク質分子そのものの詳しい構造を解析する一方で、滑り運動中の動的な構造を解析していく必要がある。そのための手法としては、電子顕微鏡法とX線回折法が現在のところ有用であると思われるが、そこで問題となるのはそれぞれの時間分解能である。まず、電子顕微鏡の時間分解能をさらに高めるために、caged化合物を用いた急速凍結法が月田らにより開発が試みられ、本年度中にほぼ完成した。このシステムを用いることにより、来年度から滑り運動系の動的微細構造に関してきわめて重要な情報が得られるものと期待される。次に、X線回折法は、より高い時間分解能と空間分解能を求めて、筑波高エネルギ-物理学研究所のシンクロトロン放射光を用いて詳細な実験が行われた。若林らは、イメ-ジングプレ-トをこの分野に初めて応用し、等尺性収縮中のミオシン分子とアクチン分子の動態についてきわめて明瞭な情報を得つつある。さらに八木らは、同様の方法により、短縮中の骨格筋のX線回折像を得ることに挑戦した。赤道反射に関してかなりの情報が集まった。今後、これら分担者が有機的につながり、共同研究を進めることで、当初の研究目的を充分達成できるものと考えている。
コヒーシンリングによる姉妹染色体接着形成メカニズムの解明

コヒーシンは進化的に保存されたリング構造のタンパク質複合体で、リング中空に通す形でトポロジカルにDNAと相互作用する。このユニークなDNA結合を介して、コヒーシンは姉妹染色分体間接着をはじめとする染色体高次構造形成を担い、染色体分配、DNA修復、遺伝子発現制御等の制御に関与する。本研究は、精製タンパク質を用いた試験管内再構成系により、コヒーシンのトポロジカルなDNA結合の反応機構を明らかにすることによって、接着形成の分子機構を解明することを目指した。今年度は以下の2つの進展があった。1)これまでに高速AFMによる解析で、コヒーシンはフレキシブルな構造変化を起こす様子を捉えていた。今年度はさらにAFMによる解析を進め、コヒーシンがSmcサブユニットの中央部で折れ曲り、可塑的な構造変化を起こすことがわかった。また、予備的ではあるが、DNAと結合したコヒーシンについて解析し、コヒーシンがDNA上をランダムに移動する様子が捉えられた。2)共同研究で得られた結晶構造を元に、ローダーの種間保存部位の変異タンパク質を作製して解析したところ、DNA結合活性が大幅に減弱していることがわかった。また、同じ変異を酵母に導入したところコヒーシンのクロマチンローディングが減弱したことから、ローダーのDNA結合活性はコヒーシンのDNA結合反応の促進に機能することが示唆された。今後は、コヒーシン活性化におけるローダーのDNA結合活性の分子機構について精力的に解析を進める予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。コヒーシンは、最も重要な染色体構造形成タンパク質のひとつで、姉妹染色体接着を形成し、正確な染色体分配に必須である。SMCサブユニットを中核とする巨大なリング状構造のATPase複合体であるコヒーシンは、そのトポロジーを利用して、リングの内側に通すかたちでDNAと結合し、2本以上のDNAを束ねることによって、姉妹染色体接着をはじめとした、染色体高次構造の形成を行うと考えられている。本研究は、我々が構築した精製タンパク質を用いたコヒーシンの機能的なDNA結合反応の試験管内再構成実験を元に、姉妹染色体接着の形成機構について明らかにすることを目指す。本年度は、コヒーシンのDNA結合反応について詳細に解析し、この複合体が一度に2本のDNAと結合し、つなぎとめる活性があることを見出した。これは、姉妹染色体接着を形成するのにまさに必要なDNA-タンパク質構造体であると考えられる。コヒーシンとローダーの相互作用解析から、コヒーシンは大規模な構造変化を起こしてトポロジカルにDNAと結合すると予想されている。高速AFMを用いた一分子観察により、コヒーシンが想像以上にフレキシブルであり、容易に構造を変化させる性質があることがわかった。これらに加え、姉妹染色体接着形成に必須なコヒーシンのPsm3 (Smc3)サブユニットのアセチル化を行うアセチル化転移酵素のEso1を組み換えタンパク質として精製した。コヒーシンによる姉妹染色体接着の形成はDNA複製を共役しておこることが知られている。そのため、コヒーシン単体では姉妹染色体接着の形成に必要な2本のDNAと同時に結合する反応は行えないと考えられていた。それゆえ、本年度確認されたコヒーシンによるDNAつなぎとめ活性は、これまでの姉妹染色体形成モデルを変えうる大変革新的な発見である。また、コンデンシンやSMC5/6複合体の分子作用機構を考察する上でも重要な知見であると考える。現在、この研究については論文を準備中である。さらに、本年度は、高速AFMによる一分子解析、コヒーシンアセチル化酵素Eso1の精製を行い、解析の方向性を多様化することができた。SMCサブユニットを中核とする巨大なリング状構造のATPase複合体であるコヒーシンは、そのトポロジーを利用して、リングの内側に通すかたちでDNAと結合し(トポロジカルなDNA結合)、2本以上のDNAを束ねることによって、姉妹染色体接着をはじめとした、染色体高次構造の形成を行うと考えられている。2017本年度は、コヒーシンの新規のDNA結合活性について重点的に解析し、大きな成果があった。つまり、1)コヒーシンはトポロジカルにDNA結合に結合した状態で、もう一本のDNAと結合し、DNAとDNAのつなぎとめを行うこと、2) 2本目のDNA結合は1本目の結合と同様にローダー複合体とATPに依存すること、3) 2本目のDNA結合は単鎖DNAと不安定な結合からスタートし、DNA合成によって安定な2本鎖と2本鎖DNAのつなぎとめに変換されることを示した。このコヒーシンの素活性は、姉妹染色体間接着の形成機構を原理的に説明しうるものである。また、出芽酵母を使った遺伝学的解析から、単鎖DNA領域が姉妹染色体接着の形成にはたらくことを示唆する結果を得た。以上の得られた知見を纏め、論文として発表した。姉妹染色体間接着は、通常の細胞周期ではDNA複製に共役して形成されるが、一方で、DNA2本鎖切断等のDNA損傷に応答し形成される機構も存在する。

本研究で発見したコヒーシンの単鎖DNA依存的な2本目のDNAと結合活性は、これら異なる姉妹染色体接着形成経路について、統一的な分子モデルで説明しうる。すなわち、複製フォークにおいては、リーディング鎖の2本鎖DNAとラギング鎖にできる単鎖DNAとの間で、DNA2本鎖切断においては、切断箇所のプロセシングによって形成される単鎖DNAとドナーとなる無傷の姉妹DNAとの間において、コヒーシンが2本目のDNA結合反応によって姉妹DNA間の繋ぎ止めを形成するというものである。実際に、出芽酵母において、単鎖DNA結合タンパク質複合体RPAを過剰発現させると、姉妹染色体接着の形成が抑制され、逆にRPAの変異によって、ctf18変異株の姉妹染色体接着形成の異常が抑圧された。これらの遺伝学的解析は、単鎖DNAが実際に酵母細胞内において姉妹染色体接着の形成に関与することを示唆している。以上から、本研究の発見は、コヒーシンの姉妹染色体接着形成の分子機構について新たなパライダイムを提唱する。コヒーシンは進化的に保存されたリング構造のタンパク質複合体で、リング中空に通す形でトポロジカルにDNAと相互作用する。このユニークなDNA結合を介して、コヒーシンは姉妹染色分体間接着をはじめとする染色体高次構造形成を担い、染色体分配、DNA修復、遺伝子発現制御等の制御に関与する。本研究は、精製タンパク質を用いた試験管内再構成系により、コヒーシンのトポロジカルなDNA結合の反応機構を明らかにすることによって、接着形成の分子機構を解明することを目指した。今年度は以下の2つの進展があった。1)これまでに高速AFMによる解析で、コヒーシンはフレキシブルな構造変化を起こす様子を捉えていた。今年度はさらにAFMによる解析を進め、コヒーシンがSmcサブユニットの中央部で折れ曲り、可塑的な構造変化を起こすことがわかった。また、予備的ではあるが、DNAと結合したコヒーシンについて解析し、コヒーシンがDNA上をランダムに移動する様子が捉えられた。2)共同研究で得られた結晶構造を元に、ローダーの種間保存部位の変異タンパク質を作製して解析したところ、DNA結合活性が大幅に減弱していることがわかった。また、同じ変異を酵母に導入したところコヒーシンのクロマチンローディングが減弱したことから、ローダーのDNA結合活性はコヒーシンのDNA結合反応の促進に機能することが示唆された。今後は、コヒーシン活性化におけるローダーのDNA結合活性の分子機構について精力的に解析を進める予定である。コヒーシンの新規DNA結合活性についてさらに詳細に解析していく。とくに高速AFMの一分子観察と組み合わせ、2つのDNAをつなぎとめる構造の実像について明らかにする。コヒーシンのアセチル化反応を試験管内で再構成し、アセチル化がコヒーシンの活性に与える影響を解析する。特にコヒーシンのDNAからの解離反応における影響について検討する予定である。コヒーシンによるDNAとDNAのつなぎとめ構造は、姉妹染色体間接着の分子実体であると考えられる。2018年度は、この構造を可視化することに注力する。コヒーシンーDNAの複合体を分離精製し、分子間力顕微鏡によって、その構造を明らかにする。
毛様動脈血管平滑筋に対する神経ペプチドの効果についての薬理学的研究

抗緑内障治療薬の血管拡張作用を薬理学的に検討するために、ウサギ摘出毛様動脈に対するレボブノロールとプロスタグランディン製剤(PG製剤)の効果を検討した。顕微鏡下で白色家兎摘出眼球より毛様動脈を分離し、myographシステムに装着し、当尺性収縮記録法によって、種々の薬物の効果を検討した。同じ薬物の血管細胞内のCa濃度に及ぼす影響をFluorophotometryをもちいて同時に検討した。レボブノロールは高カリウム溶液、1μMヒスタミン、10μMフェニレフリン、100nMエンドセリン1で収縮させた毛様動脈を濃度依存性に弛緩させた。内皮依存性一酸化窒素合成阻害薬や血管内皮除去はこの弛緩に影響を与えなかった。実験の結果レボブノロールの血管弛緩作用は2つの機序によると考えられた。まず、電位依存性Caチャネルとは異なるチャネルを介した細胞外からのCa流入を阻害する機序が考えられた。次に」レボブノロールは血管平滑筋のCaに対する感受性を変えることによって効果があると考えられた。タフルプロストも高カリウム溶液で収縮させた毛様動脈を濃度依存性に弛緩させた。この弛緩はPGE2やPGI2による弛緩効果よりも強いものであった。この弛緩機序の一部は容量性Caチャネルの抑制によると考えられた。多くの抗緑内障がウサギ毛様動脈に対して弛緩効果を持っており、これがin vivoでこらの薬剤が眼循環に効果を持つ説明になると思われた。緑内障のriskfactorの最も重要なものは眼圧であるが、正常眼圧緑内障のような症例には眼循環も重要な要素と思われる。抗緑内用薬の眼循環に対する効果の研究はこの意味から臨床上も重要である。多治見スタディの結果、日本人の緑内障の中で正常眼圧緑内障の占める割合が非常に高いことが報告された。日本人の失明原因のトップを占める緑内障の治療を考える場合に、正常眼圧緑内障の治療方針の決定は益々重要になってきている。緑内障の治療は一般的に眼圧下降療法が行われるが、正常眼圧緑内障の眼圧下降は技術的に困難であることが多い。眼圧下降以外の緑内障治療として癌血流改善が注目されているが、近年眼血流を測定できる様々な機器が開発され、緑内障治療点眼薬の血流に対する効果が検討されている。我々は緑内障治療点眼薬の眼血流に対する作用機序を検討した。今回我々が検討した緑内障治療薬の血管作用は、血管を高カリウム溶液で収縮させた状態でこれらの薬剤を投与した際に、どの程度の弛緩作用を持っているかで評価した。今回は眼循環に作用するとされるβ遮断薬levobunololの血管弛緩機序について薬理学的検討を行った。屠殺した白色家兎から眼球を摘出し、視神経と並行して走る毛様動脈を摘出し、血管を微小血管収縮測定装置Myograph System(J.P.Tranding社.デンマーク)に固定し、薬剤に対する効果を調べた。さらにそのメカニズムを調べるため蛍光Ca指示薬であるFura-2を用い、ヒト培養大動脈血管平滑筋細胞内Ca濃度をAquacosmos systemを用いて測定した。Levobundolは、高K溶液、1μM histamine、10μM phenylephrineあるいは100nM endothelin-1で収縮させた毛様動脈を濃度依存性に兎緩させた。外液のカルシウムを除去した無Ca溶液中で起こるHistamine収縮をLevobunololは抑制したが、無Ca溶液中で起こるHistamineによる細胞内Ca上昇に対しては抑制を示さなかった。

Levobunololは濃度依存性に毛様動脈を弛緩させ、血流改善作用があることが予想された。血管地緩機序としては細胞外Caに依存しない成分とCa感受性に対する作用が示唆された。新しいプロスタグランディン製剤であるタフルプロストの血管弛緩作用も今回初めて見出された。この薬剤の血管弛緩は細胞外のCa流入阻害によると考えられた。正常眼圧緑内障の治療において、既存の緑内障治療薬は眼圧下降という目的からは十分な効果は持っていない。このような薬剤の眼血流に対する効果はこの意味から臨床上重要と思われる。緑内障は失明原因の一位を占める重要な疾患であるが、疫学調査で明らかになったように眼圧が正常範囲内にある正常眼圧緑内障が重要な疾患として注目されている。正常眼圧緑内障の病態に視神経の循環不全が重要な要素の一つと考えられ、眼循環に対する治療も注目を集めている。既存の緑内障治療薬は眼循環に対する効果を持っていると言われており、我々はin vitroでこれらの薬剤が血管平滑筋に対してどのような効果を持つかを検討した。方法としては、ウサギより視神経の循環に重要と考えられる毛様動脈を摘出し、等尺性収縮記録法を用いて血管の性質と薬物の作用をin vitroで検討した。また、細胞内Ca動態に対する影響も同時に検討した。β遮断薬であるBetaxololは比較的高濃度でこの血管を弛緩させたが、その機序として、これらの薬剤の持つCa拮抗薬様作用が考えられた。1evobunololは我々が検討したβ遮断薬の中で最も強い弛緩反応を示したが、これは平滑筋のカルシウム感受性に効果があることがわかった。プロスタグランディン関連薬としてウノプロストンは濃度依存性の弛緩を起こしたが、弛緩は内皮非依存性で、Ca拮抗薬様作用とも異なり、容量性Caチャネルを阻害している可能性が示唆された。今回新たに検討したtafluprostも同じような作用を有していることが明らかとなった。既存の緑内障治療薬のほとんどは血管弛緩作用を持つが、その作用機序は異なっていることが明らかとなった。この結果は臨床的にも非常に有意義である。
ループの協調的スウィングによるミトコンドリアADP/ATP透過担体の輸送機能発現

我々はミトコンドリア内膜に存在するADP/ATP透過担体の機能発現機構に関する研究を行い、これまでにマトリックス側に突出したループが、それぞれゲート、基質結合の主要な部位として機能していることを見いだし、ループの協調的な立体配置の変化により輸送機能が発現するという、Cooperative Swinging Loop Modelを構築した.このモデルに基づき、より詳細な分子レベルでの輸送機能発現機構の解明を目的として、本年度は以下に示す成果を得た.1.部位特異的プロテアーゼによる切断反応の解析リジルエンドペプチダーゼによる切断の様式を解析し、輸送に際してループの大きな立体配置変化が起こっていることをより直接的に証明することができた.2.架橋形成反応の解析界面活性剤で活性を保持したまま膜から可溶化した担体では、銅オルトフェナンスロリンによる分子間架橋形成は起こらず、第1ループのCys56と第3ループのCys256の間で分子内の架橋形成反応が起こることを明らかにした.3.スチルベン誘導体の選択的標識反応この透過担体に対するスチルベン誘導体の反応性を解析し、第1膜貫通セグメント内にあるLys22を選択的に修飾することを初めて明らかにした.4.組み換えウシ心筋型ADP/ATP透過担体の発現系の確立酵母の内在性ADP/ATP透過担体の2種類の遺伝子を破壊したのち、ウシ心筋型同透過担体のcDNAを組み込んだプラスミドを導入し、酵母ミトコンドリアに機能を保持したウシ心筋ADP/ATP透過担体を発現させることに成功した.我々はミトコンドリア内膜に存在するADP/ATP透過担体の機能発現機構に関する研究を行い、これまでにマトリックス側に突出したループが、それぞれゲート、基質結合の主要な部位として機能していることを見いだし、ループの協調的な立体配置の変化により輸送機能が発現するという、Cooperative Swinging Loop Modelを構築した.このモデルに基づき、より詳細な分子レベルでの輸送機能発現機構の解明を目的として、本年度は以下に示す成果を得た.1.部位特異的プロテアーゼによる切断反応の解析リジルエンドペプチダーゼによる切断の様式を解析し、輸送に際してループの大きな立体配置変化が起こっていることをより直接的に証明することができた.2.架橋形成反応の解析界面活性剤で活性を保持したまま膜から可溶化した担体では、銅オルトフェナンスロリンによる分子間架橋形成は起こらず、第1ループのCys56と第3ループのCys256の間で分子内の架橋形成反応が起こることを明らかにした.3.スチルベン誘導体の選択的標識反応この透過担体に対するスチルベン誘導体の反応性を解析し、第1膜貫通セグメント内にあるLys22を選択的に修飾することを初めて明らかにした.4.組み換えウシ心筋型ADP/ATP透過担体の発現系の確立酵母の内在性ADP/ATP透過担体の2種類の遺伝子を破壊したのち、ウシ心筋型同透過担体のcDNAを組み込んだプラスミドを導入し、酵母ミトコンドリアに機能を保持したウシ心筋ADP/ATP透過担体を発現させることに成功した.
形質膜の機能ドメイン構造に関する研究

形質膜は均質な構造ではなく,局所的に分化したドメインが存在する.特に脂質の性質に基づいて形成されるラフトとカベオラは近縁の機能ドメインであり,シグナル伝達,コレステロール輸送などに関与すると考えられている.我々はこれらのドメインの性質を明らかにする目的で研究を行った.1)カベオラの主要な構成成分であるカベオリン-1のアイソフォーム(α,β)の分子的性質を明らかにする目的で,免疫電顕法で内在性のカベオラを持つ細胞を検索したところ,深い陥凹におけるα/βの比率が浅い陥凹に比較して有意に大きいことが明らかになった.また既知のカベオリン分子を発現せず,カベオラを持たない培養細胞にカベオリン-1を発現させると,αアイソフォームはβアイソフォームに比較してより高い陥凹形成能を示した.さらにカベオリン-1が単独で発現する場合に比較して,カベオリン-1,2の両方を共発現する細胞では深い陥凹がはるかに効率的に形成された.これらの結果は,カベオラの陥凹度はコーテッドピットとは異なる機序で制御されている可能性を示唆するとともに,これまで意義の明らかでなかったカベオリン-2の機能を明らかにした.2)14番目のチロシン残基が燐酸化されたカベオリン-1を特異的に認識する抗体を作成し,燐酸化カベオリン-1の局在と生化学的特徴を検討した.その結果,v-Srcの発現によってカベオリン-1が分子内の複数の箇所でチロシン燐酸化を受け,その結果,カベオラの平坦化,およびカベオラの小胞化,凝集,融合が起こることが明らかになった。3)カベオリン-1のアイソフォームが,従来報告されていた翻訳開始点の違いによって生じるだけでなく,異なるmRNAに基づいて産生されることを示し,転写レベルで制御が行われる可能性を示唆した.形質膜は均質な構造ではなく,局所的に分化したドメインが存在する.特に脂質の性質に基づいて形成されるラフトとカベオラは近縁の機能ドメインであり,シグナル伝達,コレステロール輸送などに関与すると考えられている.我々はこれらのドメインの性質を明らかにする目的で研究を行った.1)カベオラの主要な構成成分であるカベオリン-1のアイソフォーム(α,β)の分子的性質を明らかにする目的で,免疫電顕法で内在性のカベオラを持つ細胞を検索したところ,深い陥凹におけるα/βの比率が浅い陥凹に比較して有意に大きいことが明らかになった.また既知のカベオリン分子を発現せず,カベオラを持たない培養細胞にカベオリン-1を発現させると,αアイソフォームはβアイソフォームに比較してより高い陥凹形成能を示した.さらにカベオリン-1が単独で発現する場合に比較して,カベオリン-1,2の両方を共発現する細胞では深い陥凹がはるかに効率的に形成された.これらの結果は,カベオラの陥凹度はコーテッドピットとは異なる機序で制御されている可能性を示唆するとともに,これまで意義の明らかでなかったカベオリン-2の機能を明らかにした.2)14番目のチロシン残基が燐酸化されたカベオリン-1を特異的に認識する抗体を作成し,燐酸化カベオリン-1の局在と生化学的特徴を検討した.その結果,v-Srcの発現によってカベオリン-1が分子内の複数の箇所でチロシン燐酸化を受け,その結果,カベオラの平坦化,およびカベオラの小胞化,凝集,融合が起こることが明らかになった。3)カベオリン-1のアイソフォームが,従来報告されていた翻訳開始点の違いによって生じるだけでなく,異なるmRNAに基づいて産生されることを示し,転写レベルで制御が行われる可能性を示唆した.カベオリン-1はカベオラの骨格をなす分子量21-24kDの膜タンパク質であり,翻訳開始点の違いによる2つのアイソフォーム(αとβ)が存在する.カベオリン-1はv-Srcによって顕著にチロシンリン酸化を受けるということが知られているが,その影響については明らかにされていない.今回の実験では,14番目のチロシン(Tyr-14)でリン酸化を受けたカベオリン-1を特異的に認識する抗体(PY14)を作成し,その局在と生化学的特徴を検討した.ウエスタンブロッティングによりv-Src発現細胞ではPY14は22kDのバンドの他に,23-24kDと25kDにもバンドが認められた.この遅い移動度のバンドは脱リン酸処理により消失した.また,チロシン-14を欠如したミュータントカベオリン-1を発現させたv-Src発現細胞でも遅い移動度のバンドは認められた.蛍光抗体法において,正常細胞におけるカベオリン-1は細胞辺縁部にパッチ状に観察された.これに対し,v-Src発現細胞では辺縁部の標識はほとんど見られず,粗大な顆粒状標識として形質膜付近と細胞内部に観察された.免疫電顕法により,この顆粒状標識はカベオラあるいは様々な大きさの小胞の集合体であることが確認された.形質膜における顆粒状標識は,膜内粒子の少ない領域に確認された.

正常細胞をvanadateまたはpervanadateで処理するとウエスタンブロッティングでは主に22kDにPY14陽性のバンドが認められ,蛍光抗体法では粗大な顆粒は標識されなかった.以上の結果は,v-Src発現細胞におけるカベオリン-1のリン酸化が複数の位置で起こり,カベオラもしくはカベオラ由来の小胞の平坦化,集合,融合を引き起こすことを示唆する.カベオリン-1,2はヘテロオリゴマーを形成し,多くの細胞において形質膜ドメインの一つであるカベオラの基盤を形成する膜蛋白質である.本年度の研究により以下の結果を得た.1)カベオリン-1のアイソフォーム(α,β)は,従来,同一のmRNAから翻訳開始点の違いによって生じると考えられていた.我々はESTデータベースを検索することで5'端が異なり,βアイソフォームだけを産生するmRNA(5'バリアント)を見出した.5'バリアントは多くの細胞において,従来から知られていたmRNA(FL)とほぼ同じ程度に発現しており,カベオリン-1のアイソフォームの量比の調節が転写レベルで決定されていることを示唆した.2)カベオリン-1の分子的性質を明らかにする目的で,カベオラを持たない培養細胞にカベオリン-1を発現させると,αアイソフォームはβアイソフォームに比較してより多くの陥凹を形成したが,陥凹形成の効率は低かった.カベオリン-1,2の両方を共発現する細胞ではカベオリン-1が単独で発現する場合に比較して,深い陥凹がはるかに効率的に形成された.この結果は,これまで機能の明らかでなかったカベオリン-2がカベオラの陥凹形成に関与していることを示した.3)カベオリン-1のN末あるいはC末にEGFPを結合させた蛋白質をMDCK細胞に発現させ,タイムラプス観察を行ったところ,有糸分裂終期の細胞質分裂溝に強度に濃縮し,その後,形質膜全域に分散して一様な分布を示した.この結果はカベオリン-1が形質膜上を二次元的に移動し,細胞質分裂にも何らかの役割を果たす可能性を示唆する.