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ディーゼル排気微粒子(DEP)による生殖器・循環器作用の生理学的要因に関する研究

ディーゼル排気(DE)は、国内外で深刻な社会問題となっている大気汚染発生源の一つである。呼吸気道に侵入したディーゼル排気微粒子(DEP)は上部気道を容易に通過して細気管支や肺胞領域に達しそれらの部位に沈着するとともに、体内に吸収された成分が肺や循環器系をはじめとして全身の臓器に重篤な影響を及ぼす可能性が示唆されている。本研究ではDEPが生体に及ぼす影響として重要視されている循環器系および生殖器系機能に対する作用に関して、生体への曝露実験から摘出臓器および細胞にいたるまでDEPの影響に対して多面的に検討を加えた。DE曝露実験、DEP溶液の静脈内投与実験、および血管や心筋の摘出標本を用いた実験などの生理学的実験から、DEPには血管や心筋に作用する化学物質が含まれ、それらが生体に対して血圧の上昇あるいは低下、異常心電図の発現の原因となることが明らかとなった。さらに、DEPは心筋培養細胞に対して細胞傷害性作用を有することが明らかとなり、その傷害性にはO_2^-、H_2O_2やOHなどの活性酸素種が関与し、心筋細胞由来のNOは細胞傷害性に関与する可能性の低いことが明らかとなった。この様に心筋細胞を用いて得られた結果は、DEを吸入曝露した際の心血管系における反応に関して、その機序の一端を説明できるものと考えられた。一方、DEPは雌マウスの生殖機能やその子の生後発達に対して、DEP中のフタル酸エステル類などの作用を介して有害な作用をもたらすことが明らかとなった。したがって、DEPは生殖器系に関して毒性学的および内分泌かく乱作用としても多大な影響を有する可能性が示唆された。DEPの循環器系や生殖器系を含めた生態に及ぼす影響に関してはさらに詳細な検討が必要であると考えられるが、本報告がこの分野の研究における今後の発展にとって多少なりとも有用な情報源として貢献できれば幸いである。(1)DEPによる繁殖機能障害に関する研究C57BL/6N雌マウスに対してディーゼル排気ガス中の粒子濃度が0.3、1.0および3.0mg/m^3の3群と対照群(清浄空気のみ)を設け,約4ヶ月間にわたって吸入暴露させた。その結果、母マウスの流産や娩出不全等の繁殖異常は曝露群と対照群との間に有意差は認められなかった。しかし、雌雄ともに高濃度曝露群で有意に減少した。雄子マウスでは生殖突起肛門間距離(AGD)の有意な短縮、雌子マウスの頭臀長の有意な短縮が示された。一方、雌子マウスの膣開口時期は、0.3および1.0mg/DEP/m^3群で有意に早まった。ついで、ディーゼル排気微粒子(DEP)を直接妊娠マウスに皮下投与した結果、0.006、0.06、0.6、6.0、60mg/mouseの全投与濃度で有意な流産率の増加が認められた。流産率は高用量投与群よりも低用量投与群に高い傾向がみられた。DEPE皮下投与群では出生子の体重減少および雌マウスの膣開口時期に対する影響がみられた。つぎに、DEまたはDEPEに1ヶ月間または4ヶ月間曝露し,オキシトシン(OT)に対する子宮収縮反応を調べた。その結果、3.0mgDEP/m^3を含むDEの4ヶ月間曝露群ではOTに対する子宮収縮反応が有意に増大した。さらに、卵巣除去マウスにDEPEを直接皮下投与した実験において、有意な収縮増強が示された。(2)DEPによる血管平滑筋および心筋に対する作用機序に関する研究血管と心筋の両方に作用を有し、反応が明瞭なbenzene分画のNaOH可溶分画に注目し、それを第115分画に分け、それぞれについて血管、心筋標本作用を観察した。

心筋の強縮反応が得られた第3分画では、fraction15のすべての分画に血管の弛緩反応が、そしてfraction1にのみ心筋の強縮反応が観察された。可溶分画の第3分画中に含まれる物質は、紫外分光法による解析によってフェノール性化合物であることが判明した。1)DEPEおよび抽出分画がラットの摘出心筋、血管平滑筋収縮に及ぼす影響ラット摘出心室筋標本の単収縮(刺激頻度1Hz、刺激電圧5V)に対するDEPE(0.1mg/ml、1.0mg/ml、10mg/ml)の作用効果を調べた。その結果、0.1mg/mlの濃度では心筋の収縮性に変化が認められなかったが、1.0mg/mlでは収縮振幅の明瞭な減少が生じ、10mg/mlでは作用直後に振幅が一過性に増加したのち持続的な減少が激しく生じ、20分後にはDEPE作用前の約8%にまで減少した。また、この際心筋は持続的な拘縮を生じていた。なお、これとは別の実験で、一次培養心筋細胞に対するDEPEの作用を調べた結果、細胞内カルシウム濃度の恒久的な上昇が観察された。一方、ラット胸大動脈の摘出血管標本に上記のDEPEを作用させたところ、0.1mg/mlでは軽微な収縮、10mg/mlでは明瞭な弛緩反応が認められた。2)DEPE(PM2.5)の気管内投与が心不全ラットの心電図、血圧に及ぼす影響正常ラットおよびドキソルビシン投与(6mg/kg2回腹腔内投与)によって作出された心不全モデルラットにDEPまたはPM2.5の気管内投与による心電図、血圧の変化を観察した。全体的には有意な変化は認められなかったが、一部の個体ではPM2.5の気管内投与でQT間隔の延長やQRS群の異常が観察された。3)DEの吸入暴露によるマウスの心電図、血圧に及ぼす影響正常マウスおよびドキソルビシン心不全モデルマウスにDE(ディーゼル排気)(0.03mg/m^3、0.3mg/m^3、3mg/m^3)を吸入暴露し、暴露開始前目、暴露開始の翌日および3日後に無麻酔下で心電図および血圧を測定した。その結果、低濃度ドキソルビシン投与マウスおよび無処置マウスではDEの吸入暴露によりQRS群の延長およびQT間隔の延長などの心電図変化が観察された。3mg/m^3に暴露した一部のマウスでは血圧については、ドキソルビシン投与マウスおよび非投与マウスで低下が認められた。本研究はDEPが心筋細胞に与える影響について、活性酸素種との関連性を明らかにすることを目的として行った。Wistarラット新生仔の心室をコラゲナーゼ処理して得られた単一分離心筋細胞を培養し、実験に用いた。DEPE曝露による細胞傷害性はMTT assayによる生細胞数測定、培養液中に漏出したLDH活性と酸化ストレスの指標となるTBARSを測定することにより行った。また、O_2-、H_2O_2、OH、それぞれのスカベンジャーであるSOD、catalase、MPGの存在下でDEP曝露を行うことにより、これらの活性酸素種が細胞傷害性へ及ぼす影響を調べた。DEPEは曝露時間、濃度依存的に生細胞数を減少させた。また、細胞傷害性には曝露初期の影響が大きいことが示唆された。TBARSの測定結果より、DEPE曝露後、通常の培養液で培養している間に過酸化脂質の上昇がみられ、DEPE曝露後に開始した連鎖的脂質過酸化反応がDEPE除去後も進行していることが示唆された。
食品中抗酸化成分の新規機能の探索

本研究では、1.食品調理時における抗酸化物質の動態、及び2.生体内における抗酸化物質の新しい機能の探索の2点を主要課題として研究を進めた。なお、2.では、炎症反応の中心的なサイトカインである腫瘍壊死因子(TNF)により誘導されるアポトーシス抑制作用に着目し、アポトーシスと関わりのある疾病を食物由来の成分により治癒・予防できる可能性を探るものである。1.調理モデルにおけるビタミンCの消失速度に及ぼす他の食品成分の共存の影響スープや煮物を想定した調理モデル系にビタミンC(アスコルビン酸、AA)と調味料を加えて煮沸加熱し、AAの消失速度に影響する要因を調べた。AAの消失反応は1次反応であった。AA溶液に調味料を加えて加熱すると、食塩はAAの減少を抑制したが、醤油やみそ、風味調味料を添加すると、添加濃度依存的にAAが減少した。醤油やみそを添加することによって酸素が速く消費され、その後、嫌気的な条件下で反応が進行することが示唆された。これらの調味料がAAの分解を促進する要因として、アミノ酸と鉄が関与している可能性が考えられた。2.抗酸化物質が持つTNF誘導アポトーシスに対する抑制機構TNFをアポトーシス誘導剤として用い、ヒト白血病細胞株U937でのアポトーシス抑制効果を評価したところ、ビタミンE(VE)のほか、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、N-アセチルシステイン(NAC)、2-メルカプトエタノール(2-ME)でもアポトーシスが40-60%抑制された。そしてグルタチオン(GSH)レベルを指標にして抑制機構を調べた。NACや2-ME添加群ではTNF刺激時のGSHレベルが有意に高く維持されていたが、VEまたはBHT添加群ではGSHレベルの変動は小さく、細胞内GSHレベルの変動で抑制効果のすべてが説明できるわけではないことが示された。食品中には、種々の抗酸化成分が存在し、食品の変性を防ぐと同時に、栄養成分としても体内で様々な役割を果たすとされている。しかし、これらの抗酸化成分は、試験管内では抗酸化作用を持つものの、実際の食品中やその調理時、さらには生体内でどの様な機能を果たしているかは未だ明らかではない点も多い。そこで本研究では、1.食品調理時における抗酸化ビタミンの動態と抗酸化物質の新しい機能の探索、及び2.生体内における抗酸化物質の新しい機能の探索の2点を主要目標として研究を進めた。今年度に得られた結果は以下の通りである。1.加熱調理モデルにおけるビタミンCの消失速度に及ほす調味料の影響スープや煮物を想定した調理モデル系にビタミンCを加えて煮沸加熱し、ビタミンCの残存率を安居らによるポストカラム法で測定したところ、食塩にはビタミンCの減少を抑制する効果がみられた。一方、しょうゆとみそは、ビタミンCの減少を促進した。促進要因については検討中である。2.ビタミンEが持つアポトーシス抑制作用のメカニズムについて炎症反応の主要メディエーターである腫瘍壊死因子(TNF)をアポトーシス誘導剤として用い、白血病細胞株U937に対するアポトーシス抑制効果を評価したところ、ビタミンE、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤にアポトーシス抑制効果が見られた。しかしその抑制効果は、細胞内グルタチオンレベルの上昇によっては説明できないことがわかった。本研究では、1.食品調理時における抗酸化ビタミンの動態と抗酸化物質の新しい機能の探索、及び2.生体内における抗酸化物質の新しい機能の探索の2点を主要目標として研究を進めた。

なお2.の生体内における機能としては、炎症反応の中心的なサイトカインである腫瘍壊死因子(TNF)により誘導されるアポトーシス抑制作用に着目し、アポトーシスと関わりのある疾病を食物由来の成分により治癒・予防できる可能性を探るものである。1.調理モデルにおける抗酸化ビタミンの安定性に及ぼす脂質の影響水と油(ダイズ油またはナタネ油)が混合した調理モデル系でのビタミンC(アスコルビン酸)とビタミンE(トコフェロール)の変化を調べた。油脂中に水溶性成分が存在すると加熱中のトコフェロールの分解を抑制すると考えられた。また、水のみ添加した試料よりもアスコルビン酸を添加した試料でトコフェロール残存率が若干高くなる傾向がみられた。従って、アスコルビン酸はトコフェロールの安定性に何らかの影響を及ぼす可能性が示唆された。2.抗酸化成分が持つTNF誘導アポトーシスに対する抑制機構TNFをアポトーシス誘導剤として用い、白血病細胞株U937に対するアポトーシス抑制効果を評価したところ、ビタミンEのほか、ブチルヒドロキシトルエン、N-アセチルシステイン、2-メルカプトエタノールでもアポトーシスが約50%抑制されていることを昨年度までに明らかにした。そこでこの抑制機構を知るために、これらの抗酸化剤で処理した細胞と未処理の細胞について、細胞内グルタチオンレベルを調べた。その結果、抗酸化剤によるアポトーシスの抑制効果と細胞内グルタチオンレベルとは弱い相関にあるが、すべての抑制効果をグルタチオンレベルの上昇によっては説明できないことがわかった。本研究では、1.食品調理時における抗酸化ビタミンの動態と抗酸化物質の新しい機能の探索、及び2.生体内における抗酸化物質の新しい機能の探索の2点を主要目標として研究を進めた。1.調理モデルにおけるビタミンCの消失速度に及ぼす他の食品成分の共存の影響スープや煮物を想定した調理モデル系にビタミンC(アスコルビン酸、AA)と調味料を加えて煮沸加熱し、ビタミンCの消失速度に影響する要因を調べた。AAの消失反応は1次反応であった。AA溶液に調味料を加えて加熱すると、食塩はAAの減少を抑制したが、酒やみりんはほとんど影響を及ぼさなかった。しかし、醤油やみそ、風味調味料を添加すると、添加濃度依存的にAAが減少した。醤油やみそを添加することによって酸素が速く消費され、その後、嫌気的な条件下で反応が進行することが示唆された。これらの調味料がAAの分解を促進する要因として、アミノ酸と鉄が関与している可能性が考えられた。2.抗酸化物質が持つTNF誘導アポトーシスに対する抑制機構TNFをアポトーシス誘導剤として用い、ヒト白血病細胞株U937に対するアポトーシス抑制効果を評価したところ、ビタミンE(VE)のほか、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、N-アセチルシステイン(NAC)、2-メルカプトエタノール(2-ME)でもアポトーシスが約50%抑制された。この抑制機構を知るために、抗酸化剤で処理をした細胞と未処理の細胞について、細胞内グルタチオン(GSH)レベルがどの様に異なるかを調べた。NACや2-ME添加群ではTNF刺激時のGSHレベルが有意に高く維持されていたが、VEまたはBHT添加群ではGSHレベルの変動は小さく、細胞内GSHレベルの変動で抑制効果のすべてが説明できるわけではないことが示された。
西洋古代における哲学・医学・数学・懐疑主義による仮設法使用の比較研究

1.本研究による成果の一つは、セクストス・エンペイリコス『学者たちへの論駁』第1巻-第6巻翻訳の完成出版である。また翻訳を通して次の点を確認した。セクストスは、「仮設」に相当するギリシア語hypothesisの意味を細かく区別してから、批判にとりかかる。これは懐疑主義者の論法と関係している。古代懐疑主義にとって実生活と密接に関係し、その基盤となるような事柄は懐疑の対象とならず、特別の知を自認する立場が攻撃の対象となるから、言葉の意味においても日常的意味と、特別の哲学的意味を区別する必要があるのである。とくに「証明の原理」の意味でのhypothesisは、まさしく知識の基礎を構成する原理(出発点)の役割をもつため、特別の意味でセクストスによる批判の対象となる。2.また幾何学に関しては、プラトン、アリストテレス、ユークリッドの仮設使用の比較を行なった。しばしば後二者の仮設使用は、プラトンのそれとは異なるかのように解釈されているが、むしろ「仮設」の基本的役割には相違ないことを確認した。3.プラトン『パイドン』の仮設法の実際を明らかにするとともに、『メノン』における想起説と仮設法の関係については次の知見を得た。(1)想起説はメノンのパラドクスに対する答えとして提出されているが、パラドクスは、「探求開始不可能の議論」「探求続行不可能の議論」「探求成功不可能の議論」の三つの議論をすべて含んでいる。(2)想起説が直接の答えになっているのは、「探求続行不可能の議論」と「発見不可能の議論」である。(3)「ラリサへの道」の譬えは、従来、knowledge by acquaintance(直接知)として「知」を理解するプラトンの立場を示すものとみなされてきたが、むしろ、原因(根拠)を求めての探求との関連で理解されるべきである。1今日なお科学および哲学において真理発見のための重要な役割を果たしている仮設・仮説(hypothesis)による探求法について、この語が最初に用いられた古代ギリシアの医学、数学、哲学の現場の状況を文献読解を通して確認する作業を進め、いくつかの発表を行なったのに加え、今後も発表を継続する予定である。2医学においては、ヒッポクラテス『古来の医術について』で、熱・冷・湿・乾などの自分勝手な「仮設」を立て、諸々の病気や死を同一の原理によって説明しようとする人々が、真偽の知りえない空しい仮設を立てる者として批判の対象とされている。こうした経験主義の伝統は、古代懐疑主義が仮設使用を攻撃する立場に受け継がれる。特にその点は、セクストス・エンペイリコス『学者たちへの論駁』第3巻における幾何学者の仮設使用に対する批判において顕著であり、この部分を含む第16巻の翻訳作業を進めた(今年中に出版予定)。3幾何学においては、プラトン、アリストテレス、ユークリッドの仮設使用の比較を行なった。しばしば後二者の仮設使用は、プラトンのそれとは異なるかのように解釈されているが、むしろ「仮設」の基本的役割には相違ないことを、2003年3月北海道大学文学研究科主催、PHILETH共催シンポジウム「アリストテレス哲学の形成と展開」において「プラトン・アリストテレス・幾何学・懐疑主義における仮設使用の比較」として発表した。4その他、プラトン『パイドン』の仮設使用については、仮設法を広くロゴスの中での探求方法の枠組の中で捉え、同箇所のロゴス及び仮設が、「単純命題」の形で考えられていることを、論文「プラトン『パイドン』におけるlogoiのなかでの探求」(11.研究発表を参照)の中で論じた。1今年度の主たる研究成果は、セクストス・エンペイリコス『学者たちへの論駁』第1巻-第6巻

翻訳の完成出版である。同書では、懐疑哲学の立場から、文法術、弁論術、数論、幾何学、星学(占星術)、音楽への批判が行なわれる。翻訳を通して、これまで一般に知られていなかった懐疑主義の重要資料を翻訳の形で世に送ることができた。また研究代表者自身、次の知見を得ることができた。「仮設」「仮説」に相当するギリシア語hypothesisは、(1)「劇の梗概」(2)「弁論術における個別的な諸問題の探求」(3)「証明の原理」の三つの意味をもっており、セクストスはこの三つの意味を区別した上で批判にとりかかる。当初はこのような言葉の区別は非実質的なことと思っていたが、研究を進めていくなかで、むしろ懐疑主義者の論法と関係する重要な点であることに気づいた。すなわち、古代懐疑主義にとって実生活と密接に関係し、その基盤となるような事柄は懐疑の対象とならず、特別の知を自認する立場が攻撃の対象となる。それゆえ、セクストスにとって、言葉の意味を区別し、批判対象を限定することは必須の作業であり、hypothesisの意味の区別もその姿勢の現われである。とくに(3)の意味でのhypothesisは、まさしく知識の基礎を構成する原理(出発点)の役割をもつため、特別の意味でセクストスによる批判の対象となるのである。2 15年度は上記1の作業に集中したため、プラトン『メノン』『パイドン』の仮設法についてはまだ具体的成果を上げるところにまではいたっていない。しかしそのための2次文献読解の基礎作業は進めることができた。プラトン想起説と仮設法の関係を中心に研究を行ない、とくに『メノン』における想起説、仮設法、および同対話篇で示される「ラリサへの道」の譬えの意味について研究を行ない、次に示す新たな知見を得た。1.想起説はメノンのパラドクスに対する答えとして提出されているが、パラドクス理解のためには、これまで解されてきたような「探求不可能の議論」「発見不可能の議論」という二項対立的理解では不十分であり、「探求開始不可能の議論」「探求続行不可能の議論」「発見(=探求成功)不可能の議論」の三方面から検討されるべきである。パラドクスは、いずれか一つの議論を含むものではなく、三つすべての議論を含んでいる。2.想起説が直接の答えになっているのは、「探求続行不可能の議論」と「発見不可能の議論」である。具体的には、仮設法による探求という形で二つの議論に対する答えになっている。仮設法は、原因(根拠)の推理により真なる思いなしを縛りつけるための方法であり、そしてこの縛りつけが、プラトンによって「想起」と呼ばれているのである。3.「ラリサへの道」の譬えは、従来、knowledge by acquaintance(直接知)として「知」を理解するプラトンの立場を示すものとみなされてきたが、むしろ、原因(根拠)を求めての探求との関連で理解されるべきである。以上の知見は、近く「メノンのパラドクス、想起説、仮設法、ラリサへの道-対話を通してメノンを知ること-」(11.研究発表の欄に記した「メノンを知ること-メノンのパラドクスと想起説-」の増補改定論文)として発表する予定である。
骨格筋細胞はアディポネクチンを分泌して糖脂質代謝を亢進するか？

本研究は、骨格筋細胞がアディポネクチンを分泌するか検討すると共に、骨格筋細胞に発現するアディポネクチンの生理学的意義を明らかにすることを目的とした。マウス筋芽細胞由来C2C12細胞を用いて、アディポネクチンあるいはアディポネクチン受容体1(AdipoR1)をそれぞれ単独あるいは同時に発現を抑制することで、筋細胞への分化の様相を観察した。アディポネクチンあるいはAdipoR1の発現を抑制すると、筋分化が部分的に抑制された。したがって、骨格筋細胞に発現するアディポネクチンは、自己分泌あるいは傍分泌様に振る舞い、自己の細胞サイズ(筋肉量)の制御を介して、糖脂質代謝を調節していることが示唆された。本研究は、骨格筋細胞がアディポネクチンを分泌するか検討すると共に、骨格筋細胞に発現するアディポネクチンの生理学的意義を明らかにすることを目的とし、2年計画で研究を実施する。初年度である平成26年度は、骨格筋細胞からのアディポネクチン分泌とその生理作用について検討した。マウス筋芽細胞由来C2C12細胞を用いて、分化誘導25時間前のC2C12筋芽細胞に対してsiRNAをトランスフェクションして、C2C12筋芽細胞に発現するアディポネクチンをRNA干渉法によりノックダウンした。siRNA処理を24時間行った後、C2C12筋芽細胞を筋管細胞へ分化誘導し、分化の様相を経時的に観察した。その結果、本研究で用いたsiRNAによりアディポネクチンの発現がmRNAレベルで約60%抑制された。C2C12筋管細胞の直径ならびに筋タンパク量は、分化誘導開始後徐々に増大したが、アディポネクチンノックダウンにより、両者共にその増大が抑制された。また、分化誘導1日後にmyogenin発現を比較したところ、アディポネクチンノックダウンによりその発現が抑制された。以上の結果より、筋芽細胞に発現するアディポネクチンは、筋管細胞への分化を促進する作用を持つことが明らかとなった。この筋細胞に発現するアディポネクチンの作用は、アディポネクチン受容体を介したものであるか、C2C12筋芽細胞のアディポネクチン受容体1のノックダウンを試みた。同様にアディポネクチン受容体1のノックダウン処理後に分化誘導したところ、アディポネクチンノックダウンと同様に筋管細胞への分化が抑制された。したがって、骨格筋細胞に発現するアディポネクチンは細胞外へ分泌され、オートクリンあるいはパラクリン様に振る舞い、筋細胞の分化を促進することが示唆された。今後、さらに解析を進め、骨格筋細胞由来アディポネクチンの生理作用を明らかにする。本研究は、骨格筋細胞がアディポネクチンを分泌するか検討すると共に、骨格筋細胞に発現するアディポネクチンの生理学的意義を明らかにすることを目的とし、2年計画で研究を実施された。マウス筋芽細胞由来C2C12細胞を用いて、分化誘導前のC2C12筋芽細胞のアディポネクチンあるいはアディポネクチン受容体1(AdipoR1)をそれぞれ単独で、あるいはアディポネクチンおよびAdipoR1を同時にRNA干渉法(siRNA導入)によりノックダウンした。アディポネクチン単独ノックダウンにより、分化に伴う筋管形成ならびに筋タンパク増加が抑制された。AdipoR1単独ノックダウンでも、分化に伴う筋管形成と筋タンパク増加の抑制、およびCK活性の増加が抑制された。さらに、アディポネクチンとAdipoR1の両分子同時ノックダウンを試みたところ、同様に分化の抑制が観察された。以上の結果より、筋芽細胞に発現するアディポネクチンは、筋芽細胞から分泌され自己分泌あるいは傍分泌様に振る舞い、AdipoR1を介して筋管細胞への分化を維持(促進)する作用を持つことが明らかとなった。したがって、これまではアディポネクチンは脂肪細胞で産生され、血液循環を介して標的組織である骨格筋や肝臓に作用すると考えられてきたが、標的組織である骨格筋細胞自身がアディポネクチンを産生・分泌して自己のサイズ(量)を制御することで、糖脂質代謝を調節していることが示唆された。本研究は、骨格筋細胞がアディポネクチンを分泌するか検討すると共に、骨格筋細胞に発現するアディポネクチンの生理学的意義を明らかにすることを目的としているという意味では、これまで実験は順調に推移している。しかし、当初予定していたアディポネクチンによって引き起こされる細胞内シグナル伝達やアディポネクチン以外の分泌分子の解析より先に、当初2年目に実施予定であったアディポネクチン受容体1のノックダウン実験に着手し仮説通りの結果が得られつつあることから、おおむね順調に推移していると判断している。

骨格筋可塑性2か年計画で実施される研究の2年目である平成27年度では、これまでに得られた結果を基にして、骨格筋細胞由来アディポネクチンの生理作用を明らかにする。アディポネクチン受容体1ノックダウンの影響についてより詳細な解析を進めると共に、アディポネクチンとアディポネクチン受容体1の両遺伝子を同時にノックダウンすることで、C2C12筋芽細胞の分化に対する影響を追究する。これにより、骨格筋細胞に発現するアディポネクチンとアディポネクチン受容体の関係性を検討すると共に、骨格筋細胞由来アディポネクチンの生理作用を明らかにする。そして、骨格筋由来アディポネクチンが全身糖脂質代謝に及ぼす影響を追究する。さらに、アディポネクチン以外に骨格筋細胞から分泌される分子とその生理作用を追究し、骨格筋細胞自身によるセルフコントロール機構の存在とその生理学的意義を明らかにする。得られた研究成果は取りまとめ、積極的に学会発表などを通じて公表していく予定である。
高温強靭性セラミックスの開発

本研究に関する昭和61年度の研究実績は以下の通りである。1.【Al_2】【O_3】に【ZrO_2】とSiCウィスカーを分散させることによって、【Al_2】【O_3】の強度を450MPaから1350MPaへ、破壊靭性を3.5から11.5MN/【m^(3/2)】へと、それぞれ3倍以上、また熱衝撃抵抗を約200°C以上も向上させることに成功した。さらに、【Al_2】【O_3】の強度減少が起る温度を800°Cから1200°Cへと約400°Cも改善した。以上の改善された特性はセラミックスエンジン材料として実用化されようとしている【Si_3】【N_4】やSiCを越えるものであり、したがって、本研究によって、製造コストの低い酸化物セラミックスを高温構造材料として実用化する道が拓かれたと考えられる。2、ポリシマザシを出発原料として、非晶質のSi-C-N粉末プレカーサーを合成し、それを焼結させることによって、【Si_3】【N_4】にSiCを均一に分散させた複合体を製造することに成功した。この方法により世界で始めて、SiCを分散させることにより【Si_3】【N_4】の強度と靭性を同時に改善することに成功した。3、CVD法を駆使して、SiCの結晶粉内に積層欠陥を導入することにより、SiCの破壊靭性を3.5から7.5MN/【m^(3/2)】へと2倍以上も向上させることに成功した。これによって1600°Cの高温まで靭性と強度の減少しないSiCを製造する道が拓けた。4、サブミクロンのSiCに、ポリシラスチレンを約10wt%添加して、15001750°Cの低温で焼結させることにより、金属材料と全く同じように機械加工可能な高純度SiCの製造に成功した。このSiCの機械加工性は、ポリシラスチレンから生じた数nmの非晶質のSiCが、サブミクロンのSiC粒間に分散することによって生じることが判明した。なを、このSiCは高純度である為に、高温(1500°C)になっても強度の低下が生じない理想的な材料であることも分った。化学気相(CVD)法によって合成したSiC及び焼結法で製造した【Al_2】【O_3】系複合セラミックスに関して以下に示したような多大の成果が得られた。それらの成果を基にして、特に【Al_2】【O_3】系セラミックスの場合は、株式会社リケン工業で、各種の機械部品として試作を開始している。1.不純物相のない理想的な結晶粒界を持つ【Si_3】【N_4】,SiCの合成に成功した。この材料は約1000°C以上で強度と靭性が増大する。2.SiCの結晶粒内に積層欠陥を導入することによって靭性を改善する新しい高靭化機構を見出した。この方法によって通常のSiCよりも靭性が約3倍も高いSiCの合成に成功した。3.【Al_2】【O_3】に平均粒径2μmのSiCを5vol%分散させることによって【Al_2】【O_3】の靭性と強度を約1.5倍向上させることに成功した。また、これによって【Al_2】【O_3】の熱衝撃破壊抵抗も大巾に改善された。4.【Al_2】【O_3】にSiCを分散させることによって、1200°Cまで強度が減少しないことも明らかになった。5.【Al_2】【O_3】に15vol%のZr【O_2】と15vol%のSiCウィスカーを分散させた複合体の作製に成功した。この材料の破壊靭性と破壊強度は、それぞれ8.5MN/m3/2,1200MPaであった。これらの値は【Al_2】【O_3】単味の値の3.1MN/m3/2,400MPaに比べ約3倍も高い値である。6.このような靭性と強度の改善によって、【Al_2】【O_3】の熱衝撃破壊抵抗は約2倍も向上した。すなわち、水中急冷に耐えうる臨界温度差が250°Cから450°Cへと約2倍も向上した。7.また、このような靭性の改善によって、切断や機械的研摩等による表面損傷抵抗が著しく改善された。条件によっては、機械的研摩によって強度が逆に20%も向上することが判明した。8.【Al_2】【O_3】にSiCを分散させることによって、遅れ破壊の制御が可能であり、それによって寿命が約2倍も延びることがわかった。

以上の改善された特性はセラミックスエンジン材料として実用化されようとしている【Si_3】【N_4】やSiCを越えるものであり、したがって、本研究によって、製造コストの低い酸化物セラミックスを高温構造材料として実用化する道が拓かれたと考えられる。2、ポリシマザシを出発原料として、非晶質のSi-C-N粉末プレカーサーを合成し、それを焼結させることによって、【Si_3】【N_4】にSiCを均一に分散させた複合体を製造することに成功した。この方法により世界で始めて、SiCを分散させることにより【Si_3】【N_4】の強度と靭性を同時に改善することに成功した。3、CVD法を駆使して、SiCの結晶粉内に積層欠陥を導入することにより、SiCの破壊靭性を3.5から7.5MN/【m^(3/2)】へと2倍以上も向上させることに成功した。これによって1600°Cの高温まで靭性と強度の減少しないSiCを製造する道が拓けた。4、サブミクロンのSiCに、ポリシラスチレンを約10wt%添加して、15001750°Cの低温で焼結させることにより、金属材料と全く同じように機械加工可能な高純度SiCの製造に成功した。このSiCの機械加工性は、ポリシラスチレンから生じた数nmの非晶質のSiCが、サブミクロンのSiC粒間に分散することによって生じることが判明した。なを、このSiCは高純度である為に、高温(1500°C)になっても強度の低下が生じない理想的な材料であることも分った。
ヒトEGFレセプターを標的とする人工抗体を用いた生体内遺伝子導入法の開発

当研究室では抗体の細胞特異性およびポリリジンのDNA結合性と保護作用を利用した新しい遺伝子運搬体「抗体/DNA複合体(イムノジーン)」を独自に開発し、固体レベルでの扁平上皮癌の遺伝子治療法を目指している。それを効率よく作製しかつ臨床での有効性・安全性を高めるため、イムノジーンを人工抗体で作製することが本研究の目的である。改良の余地はあるが、この目的はほぼ達成できた。また人工抗体の大量産生・精製法も確立した。方法はまず抗EGFレセプター・モノクローナル抗体B4G7の遺伝子からPCR法を駆使して一本鎖抗体(scBH)遺伝子を作製した。大腸菌で発現させたscBHはB4G7抗体と競合することを確認した。これにポリリジンを化学結合させると、抗原結合能が消失した。そのため抗体自身にDNA結合性を持たせるためC末に8リジンを付加した一本鎖抗体(scHBFL)遺伝子を作製した。これは大腸菌では分泌不可能であったので、メタノール資化性酵母で大量産生させ精製した。電気泳動法によって、scHBFLはDNA結合能を有していることを確認した。つぎに扁平上皮癌細胞A431に対するレポーター遺伝子の導入効率を検討した。scHBFL単独では遺伝子導入は観察されなかったが。ポリリジンを併用した時scHBFL依存的に遺伝子導入が観察された。β-ガラクトシダーゼをレポーター遺伝子にしたときの活性染色を指標にすると最大導入効率は約0.1%であった。これは、当研究室で開発した抗体のFab断片を利用したイムノジーン法の約1/10の効率であるため、現在scHBFLのDNA結合性を高めるなど改良を行っている。さらに、安全性を高めるため人工抗体のヒト型化も並行して行っている。
演劇俳優における感性的熟達とその支援―包括的な熟達理論の構築へ向けて―

【縦断研究の実施】初心者に対し、いかに支援すればより早く効率的に熟達者になることができるのかを明らかにしたい時には、ある初心者が熟達者になっていく過程を縦断的に追う必要がある。そこで平成19年度は、18年度からおこなっていたアマチュア俳優に対する縦断的質問紙調査を、さらに被験者数を増やして2回実施した。その結果、経験の浅い俳優は視野が狭く、自分のことばかり考えて演技に臨むのに対し、経験を積むにつれて相手役の事や劇全体のことを考えるなど、視野が広く変化していくことが明らかになった。また、そのように変化するきっかけとして、演出や演技指導などのスタッフの経験を積むことや、多くの演劇を観る経験が重要であることの2つが示唆された。さらに日本大学芸術学部演劇学科で演劇を学ぶ1・2年生に対しても、縦断質問紙調査を開始した。演劇教育を受けないアマチュア俳優の結果と比較することで、演劇に対する態度については、教育の効果がすぐにあらわれやすいことが明らかになった。また、質問紙と併せて縦断的に実験をおこなうことで、演技能力の変化も追うことを開始した。【感性的熟達を明らかにする研究の実施】俳優が目指すべきは、感性的な部分に熟達することであると考えられ、さらに他領域においても感性的熟達は重要なテーマである。平成19年度は、過去の研究において熟達者たちがめいめいの言葉で言い表していた演技の感性的な部分を、さまざまな経験の長さの俳優が理解できるのかどうか、質問紙調査をおこなった。その結果、声や身体の動きなどの演技の表面的な部分についての表現は、演劇未経験者でも演劇経験者と同程度に理解できるのに対し、演技の感性的な部分についての表現は、演劇未経験者は経験者よりも理解できないこと、しかし、演劇経験者であれば、経験の長短にかかわらず、感性的な表現を同程度に理解できることが明らかになった。
マクロファージの一酸化窒素産生抑制作用を指漂とする抗炎症性植物成分の探索研究

活性化マクロファージ(Mφ)が産生する一酸化窒素(NO)は、生体防御因子として作用する一方、炎症時に多量に産生された場合には炎症を悪化させる。そのため、活性化MφのNO産生を増強する物質には抗腫瘍活性や抗微生物活性が、また、抑制する物質には抗炎症作用が期待される。今回、いくつかの植物について、マウス腹腔MφのNO産生におよぼす影響を調べ、以下のような結果を得た。1.我が国で肝障害の予防・治療に使われる民間薬のメグスリノキ(Acer nikoense)に含まれる(+)-rhododendrolおよびepi-rhododendrinが、経口投与でマウス腹腔MφのNO産生を抑制することを明らかにした。2.エジプトで抗炎症や糖尿病の治療に使われる民間薬Cleomedroserifoliaに含まれる2種のフラボノイドがin vitroの系でマウス腹腔MφのNO産生を抑制することを明らかにした。3.各種炎症性疾患、高血圧、糖尿病に対して民間で汎用されているインドネシア産薬用植物Andrographis paniculataのメタノールエキスが経口投与でマウス腹腔MφのNO産生を抑制すること、および、その活性本体がneoandrographolideであることを明らかにした。4.下痢・赤痢、嘔吐等に使われるインドネシア産薬用植物Caesalpinia sappanに含まれるカルコン誘導体がin vitroの系でマウス腹腔MφのNO産生を抑制することを明らかにした。5.中国で古くからマラリアの治療に使われてきたジョウザンアジサイの主活性成分であるfebrifugineが、経口投与でマウス腹腔MφのNO産生を増強し、血中NO量を高めることによって抗マラリア作用を発現することを明らかにした。活性化マクロファージの産生する一酸化窒素(NO)は、生体防御因子として作用する一方、炎症時に多量に産生された場合には炎症を悪化させる。したがって、マクロファージのNO産生量を増加させる物質には抗腫瘍活性や抗微生物活性が期待され、また、NO産生量を抑制する物質には抗炎症薬としての可能性が考えられる。今回、いくつかの植物について、マウス腹腔マクロファージのNO産生におよぼす影響を調べ、以下のような結果を得た。l)メグスリノキ(Acer nikoense)に含まれる(+)-rhododendrolおよびepi-rhododendrinが経口投与でマウス腹腔マクロファージのNO産生を抑制することを明らかにした。(+)-Rhododendrolは四塩化炭素肝障害モデルにおいて肝保護作用があることが知られている化合物である。2)エジプトで抗炎症や糖尿病の治療に使われている民間薬Cleomedroserifoliaに含まれる2種のフラボノイドがin vitroの系でマウス腹腔マクロファージのNO産生を抑制することを明らかにし、それらの構造を決定した。3)各種炎症性疾患、高血圧、糖尿病に対して民間的に汎用されているインドネシア産薬用植物Andrographis paniculataのメタノールエキスが経口投与でマウス腹腔マクロファージのNO産生を抑制し、その活性本体がneoandrographolideであることを明らかにした。4)中国で古くからマラリアの治療に使われてきたジョウザンアジサイの主活性成分であるfebrifugineが経口投与でマウス腹腔マクロファージのNO産生を増強し、血中NO量を高めることによって抗マラリア作用を発現することを明らかにした。

今回、いくつかの植物について、マウス腹腔MφのNO産生におよぼす影響を調べ、以下のような結果を得た。1)エジプトで抗炎症や糖尿病の治療に使われる民間薬Cleomedroserifoliaに含まれる2種のフラボノイドがin vitroの系でマウス腹腔MφのNO産生を抑制することを明らかにした。2)各種炎症性疾患、高血圧、糖尿病に対して民間で汎用されているインドネシア産薬用植物Andrographis paniculataのメタノールエキスが経口投与でマウス腹腔MφのNO産生を抑制すること、および、その活性本体がneoandrographolideであることを明らかにした。3)下痢、赤痢、嘔吐等に使われるインドネシア産薬用植物Caesalpinia sappanに含まれるカルコン誘導体がin vitroの系でマウス腹腔MφのNO産生を抑制することを明らかにした。4)中国で古くからマラリアの治療に使われてきたジョウザンアジサイの主活性成分であるfebrifugineが、経口投与によってマラリア感染マウスの血中NO量を高めることを明らかにするとともに、血中NO量の増加と抗マラリア作用の相関関係を明らかにした。
初期石灰化と脂質に関する組織化学的・微細構造学的研究

発育中のマウス頭蓋冠(頭頂骨)の骨芽細胞において、類骨に面する細胞形質膜上、または細胞間で前固定時のpHに依存して、多層膜構造物(MLS)、空胞状構造が出現、前者はイオン化脂肪酸(IFA)、後者を非イオン化脂肪酸(PFA)として両者を鑑別した。以上、細胞外のpH依存性MLSについて、主として組織化学的方法でカルシウムイオンおよび多糖体などの検出を試みた。1.カルシウムイオンの検出:NHA(n-n-naphthaloylhydroxyalamine-Na)のカルシウムイオンとの親和性を利用し、NHA-Caの沈澱形成を試みたが結果は不安定で、さらなる検討が必要と思われた。また、同様目的でグルタールアルデヒド・シュウ酸カリウム-オスミウム・アンチモン酸を用いた時には、アンチモン酸カルシウムの最終沈澱物は類骨に面する骨芽細胞の細胞膜上および空胞上および骨芽細胞内の脂肪滴周囲に反応所見が認められ、EDXによるカルシウム元素分析でもカルシウムが検出された。2.多糖体の検出:細胞外MLSと多糖体との関係を検索するため、通常二重固定後の超薄切片上で、過ヨウ素酸-チオカルボヒドラジド-蛋白銀による組織化学的多糖体の検出を行なった結果、MLS上に多糖体との反応産物である銀粒子の沈着物が観察された。3.コレステロールの検出:遊離コレステロール検出のためジギトニン含有の固定液を使用した。その結果、細胞外MLS上にはコレステロールジギトニン複合体の存在が確認された。4.さらに、骨芽細胞の分泌物の1つとして細胞外にpH依存性MLSの存在を踏まえた上で、微細構造学的にカルシウム結合部位を確認する目的で、イオン化ランタン含有の固定液を使用した結果、ランタン沈着物は骨芽細胞の周囲、細胞間および細胞外MLSの周縁に観察された。また、EELSスペクトルでは周縁に一致して微量ではあるがカルシウムが検出された。以上の結果から、生理的状件である弱アルカリ性条件下では細胞外MLSは類骨中においてカルシウムトラッピングとともに、多糖体、遊離コレステロールなどを含有する複合体であり、生理・化学的および形態学的観点から類骨中においては石灰化との緊密な関係が示唆された。本研究は、in vivoおよびin vitro両系で骨芽細胞関連の脂質、多層膜構造物(MLS)を形態学的に証明するものである。MLSは、ほぼ球形半球状(<1.5mum)の構造物で、オスミウム酸の前にタンニン酸を含むグルタールアルデヒド固定液(pH7.3)で固定したときのみ観察されるものであり、タンニン酸が存在しても酸性条件下の固定、またはタンニン酸を用いない通常の弱アルカリ条件下での固定では、薄い層からなるラメラ構造で周囲を囲まれた脂肪滴(LD)が観察されるのみであった。このことは、骨でみられるMLSがアルカリpHでラメラ構造を形成し、酸性pHでは脂肪滴を形成する、pH変化でいわゆる相変化を示す特徴をもつタイプの脂質であることを示している。さらに、オスミウム酸を前固定液として用いた化学固定法や、オスミウム・アセトンを置換液として用いた急速凍結置換固定法においても、細胞外LDの保存性については決して良好とは言えなかった。

従って、これら構造物の可視化にはタンニン酸を含むグルタールアルデヒド固定と脱水過程における配慮がきわめて重要であることが明らかとなった。アルカリ性条件下で、タンニン酸によって形成されたMLSは成分的にはリン脂質または脂肪酸の可能性があるが、リン脂質および脂肪酸の純品を用いたアルカリ性・酸性両pHにおけるFreeze-Fracture予備実験から、全てではなくともほとんどが脂肪酸としての特徴を持つものであると推察された。以上の結果から、脂肪酸が骨芽細胞により合成・分泌されることを示すものであり、また骨石灰化に脂肪酸がおそらくCa^<2+>トラッピング作用として関与する可能性を示唆するものである。本研究は、in vivoおよびin vitro両系で骨形成関連の脂質として、いわゆる基質小胞以外の脂質成分として、骨芽細胞の細胞外スペースに存在する多層膜構造物(MLS)に注目し、この構造物の細胞生物学的意義を明らかにするため形態学的検索をすすめている。骨芽細胞の類骨側にみられるMLSは、グルタールアルデヒド固定液の中にタンニン酸を加えることで、規則的周期をもつMLSとなり、これは細胞内では油滴構造として、オスミウム酸では染色されない、飽和脂肪酸を含むことが推察された。細胞外MLSは脂肪内の脂肪滴が細胞形質膜に癒合するとともに、細胞外へ放出され、弱塩基性pH環境下で固定されている間に多層膜構造をとったものと解釈された。すなわち、弱塩基性pHで前固定したあとオスミウム酸の前にpH6.0の酸性条件下でインキュベート(25°C、2brs)すると、多層膜構造は無構造の油滴構造に変化することも確認された。以上のことから、in vitroの脂肪酸純品を用いたフリーズフラクチャー法の結果も合わせて、MLSが脂肪酸(FA)を含む構造物であることが証明された。さて、この構造物について過ヨウ素酸-チオカルボヒドラジド-蛋白銀による多糖体染色を超薄切片上で行った。その結果、反応産物は、細胞内油滴上、とくに細胞質との界面には反応陽性を示した。さらに細胞外MLS上にも反応産物がみられた。次に、遊離コレステロール検出のためにジギトニンをグルタールアルデヒド固定液とともに用いたところ、コレステロール・ジギトニン複合産物が細胞外MLSに一致して認められた。これらの所見はMLSが脂肪酸・遊離型コレステロールを持つ複合体で少なくとも緊密な関係にあることを示唆するものである。これらの結果を踏まえて、Caイオン検出を現在検索中である。最終報告前に行いたい。1.前固定時のpHが弱アルカリ性に調整された条件下では、発育中のマウス頭蓋冠(頭頂骨)の骨芽細胞において、類骨に面する細胞形質膜上、または細胞間で多層膜構造物(MLS)が出現、2.一方、酸性条件下(pH6.8)の固定ではMLSは出現せず、周囲を薄い多層膜または限界膜で囲まれた空胞状構造(VS)が出現、3.これらの構造がpH依存性であることを踏まえ、前者はイオン化脂肪酸(IFA)、後者を非イオン化脂肪酸(PFA)として両者を鑑別した。4.特に、後者は電顕用試料作製のための脱水過程で有機溶媒によって溶解傾向が強く、その保存については前固定時にマラカイトグリーン使用することでPFAを観察することができた。以上の生理・化学的特徴を有する細胞外のpH依存性の多層膜構造物(MLS)について、主として組織化学的にカルシウムイオンおよび多糖体検出をこころみた。
ヘム電子論によるヘモグロビンの協同的酸素結合機能の解明

血液の赤血球中に酸素運搬体として存在するヘモグロビンが示す高い酸素運搬能は、協同的酸素結合機能によって支えられている。私共は、ヘモグロビンにおいて酸素が結合する部位であるヘムの電子構造に着目し、従来の研究とはまったく異なる新しい観点で研究を行い、ヘム、ヘム鉄、そして軸配位子ヒスチジンの間の電子的な相互作用がヘモグロビンの協同的酸素結合機能の調節に重要であることを実証することに成功した。酸素(O2)運搬タンパク質ヘモグロビン(Hb)の協同的O2結合の分子機構を、補欠分子族ヘムのポルフィリン環と側鎖ビニル基のπ-π相互作用がヘムの電子構造に及ぼす影響に基づいて解明する研究を行った。密度汎関数法により、ヘム鉄原子の電子密度(ρ)は、ビニル基のコンフォメーションに依存すると共に、ヘム側鎖の2つのビニル基のコンフォメーション変化によるρの変化の大きさは最大でヘム側鎖メチル基1つをトリフルオロメチル(CF3)基に置換した場合に匹敵することを明らかにした。私共は、ヘム側鎖メチル基1つをCF3基に置換することによって生じるρの変化により、O2貯蔵タンパク質ミオグロビンのO2親和性は約1/2.7に低下することを実証している。X線結晶構造解析により示されているHbのヘム側鎖ビニル基の酸素化に伴うコンフォメーションでは、酸素化によってHbのO2親和性は約2.7倍上昇すると考えられた。実際に、ヘム側鎖としてCF3基を1つ、そして2つもつ化学修飾ヘムをそれぞれHbのタンパク質部分に組込んだ再構成Hbを調製し、NMRによりこれら化学修飾ヘムはHbのタンパク質部分に正常に組み込まれることを確認した上で、それぞれのO2結合能を計測したところ、CF3基1つの導入に伴ってO2親和性が約1/2.2-1/6.3倍低下することが示された。一方、協同性はこれら3種類の再構成Hbでほぼ同様であり、天然Hbの約半分であった。このように、HbのO2親和性の調節に関しては、ヘム電子論に基づいて説明できる実験結果を得ることに成功した。協同的O2結合機能については、Hbの4つのサブユニットのヘム側鎖ビニル基のコンフォメーションが酸素化に伴って変化するタイミングを種々のシミュレーションで最適化し、それぞれのサブユニットのO2親和性の変化を検討することにより、ヘム電子構造が果たす役割を解明できると考えている。本研究では、酸素運搬ヘムタンパク質ヘモグロビン(Hb)の協同的酸素結合の分子機構を、ヘムのポルフィリン環π電子と側鎖ビニル基π電子のπ-π相互作用がヘムの電子構造に及ぼす影響に基づいて解明する。本研究は、酸素貯蔵ヘムタンパク質ミオグロビンの酸素親和性と外部配位子の識別はいずれも補欠分子族ヘムの電子構造によって調節されることを実証した私共の研究成果(Shibata et al., JACS (2010))に基づいて実施されている。まず、密度汎関数法(計算法と基底関数:rB3LYP/6-31G(d))により、ヘムのポルフィリン環に対する側鎖ビニル基のコンフォメーションとヘム鉄原子の電子密度の関係を解析した。モデル分子のビニル基のコンフォメーションを系統的に変化させた構造について、ヘム鉄原子の電子密度の指標となるマリケン電荷を計算した結果、予想通り、ヘム鉄原子の電子密度は、ビニル基がポルフィリン環に対して直交する場合に最大、そして、ポルフィリン環と同一平面の場合に最小であることが明らかになった。さらに、ビニル基のコンフォメーションに依存するヘム鉄原子の電子密度の変化は、トリフルオロメチル(CF3)基1つを導入した程度であることも明らかとなった。したがって、私共の研究成果を考慮すると、Hbの酸素親和性は、ヘムと側鎖ビニル基のπ-π相互作用を通して、約3倍変化することが明らかとなった。予備的な実験結果では、CF3基を側鎖にもつ化学修飾ヘムをHbに組み込んだタンパク質の酸素親和性は、予想通り低下することが示された。さらに、ビニル基を除去したヘムをHbに組み込んだ場合には、酸素結合反応における協同性が低下することも示された。このように、本研究により、Hbの生物学的機能を化学的相互作用に基づいて理解するための重要な成果が得られている。研究実績の概要に記載されている通り、ヘム電子論によるヘモグロビン(Hb)の協同的酸素結合機能の解明に役立つ成果が得られている。ヘム側鎖のビニル基のコンフォメーションの影響に依存するヘム鉄原子の電子密度の変化は最大トリフルオロメチル(CF3)基1つを導入した程度の大きさであることが明らかになり、本研究の遂行に極めて重要な知見が得られた。また、CF3基を導入しヘムのπ電子密度を系統的に変えたヘムおよびそれらヘムのCF3基のみがメチル(CH3)基に置換されたヘムを組み込んだHbの調製に成功すると共に、酸素親和性や酸素結合の際の協同性を計測することにも成功した。

試料調製の成功により、CF3基、CH3基の有無で、それぞれ対応する一組のヘムに関して、CF3基からCH3基への置換(または、その逆の置換)が、Hbの機能と構造に及ぼす影響を詳細に解析する準備ができたと言える。さらに、機能計測の結果として、当初の予想通り、ヘムの側鎖ビニル基の除去により、酸素親和性および協同性も共に低下する結果が得られた。また、Hb四量体におけるα、βの各サブユニットの機能を区別して計測する手法も確立した(Sato et al. Bull. Chem. Soc. Jpn. (2012))。これらのことから、本研究はおおむね順調に進展していると判断する。今後の研究により、Hbの機能を化学的相互作用に基づいて解明する予定である。昨年度と同様の手法により、ポルフィリン環π電子と側鎖ビニル基π電子のπ-π相互作用がヘムの電子構造が及ぼす影響を、ヘム近傍の極性環境を考慮して見積もる予定である。これにより、タンパク質分子内部でのヘム側鎖ビニル基のコンフォメーションの変化がヘムの電子構造に与える影響をより一層詳細に評価できると考えている。次に、調製済みのトリフルオロメチル(CF3)基を導入しヘムのπ電子密度を系統的に変えたヘムおよびそれらヘムのCF3のみがメチル(CH3)基に置換されたヘムを組み込んだヘモグロビン(Hb)におけるヘム鉄原子の電子密度を酸化型Hbにおける酸塩基平衡の平衡定数を指標として評価し、それらHbのヘム鉄原子の電子密度と機能との相関関係を明らかにする予定である。また、種々の化学修飾ヘムを組み込んだHbおよびミオグロビンの立体構造をX線とNMRにより解析し、ヘム側鎖の置換が立体化学的要因により、タンパク質内部でのヘムとタンパク質との相互作用に与える影響を明らかにする。さらに、得られた知見に基づいて、Hbの協同的酸素結合に大幅な影響を与えそうな化学修飾ヘムを設計してHbに導入し、同様な実験を行うことにより、Hb機能の電子論的解明に有用な知見の獲得につなげる。そして、Hbのα、βサブユニットにおけるヘムとタンパク質との相互作用およびヘム鉄原子の電子密度とHbの機能との関係を解析し、ヘム電子構造とヘムタンパク質の機能との関係の解明に役立つ成果を得ると共に、ヘム電子論によるHbの協同的酸素結合機能の解明を目指す。トリフルオロメチル(CF3)基を側鎖として導入したヘムなど一連の化学修飾ヘムを組み込んだヘモグロビン(Hb)におけるヘムとタンパク質の相互作用やヘムの電子構造をNMRにより解析するため、当初、NMR分光器使用料として850千円(850時間)を計上していたが、NMR測定用微量試料セルの使用、NMR測定法の最適化などにより、NMR分光器使用料時間を大幅に短縮させることができたと共に、調製するHb試料の量も大幅に減少させることができたことから、約577千円の次年度使用助成金が生じた。当該研究課題申請時点での次年度研究経費総額は1,400千円であったので、次年度使用助成金約577千円と次年度交付予定助成金800千円の合計金額に相当するため、計画通りの研究が実施できると考えている。一方、次年度にも今年度同様にNMR分光器使用料時間を短縮させることができる可能性があると考えられることから、余剰金が生じることが見込まれる場合には、Hbのヘムの電子構造をより高感度かつ高精度で解析するためのNMR測定を実施するか、新規なヘムをHbに組み込む試料調製実験を追加するなどして、当該研究の目的を最大限かつ確実に遂行する予定である。