hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗体触媒及びリパーゼの高度機能改変と物質生産への応用

本研究は、エステル加水分解という共通の機能を持った2種の特異な触媒性タンパク質、「リパーゼ」と「抗体触媒」について、その触媒メカニズムを明らかにし高度機能改変を行なうことを目的として行なった研究である。まず、Pseudomonas属由来のリパーゼをコードする遺伝子を単離し、高発現プロモーターに接続することによって、大腸菌でリパーゼを大量に発現させる系を確立した。しかし、生産されたリパーゼはペプチド鎖が正しく折り畳まれず、不活性な封入体を形成した。一方、リパーゼ遺伝子のすぐ下流にある未知のタンパク質をコードする遺伝子を見い出し、同じく大腸菌で大量発現させ、その遺伝子産物を単離することに成功した。この遺伝子産物は、in vitroで先ほどの不活性なリパーゼを正しく巻戻し、活性型のリパーゼに変えるシャペロン様の働きがあることを明らかにした。一方、エステル加水分解の遷移状態アナログとなるリン酸エステルを抗原としてモノクローナル抗体を誘導し、アルキルエステルを加水分解する抗体触媒を得た。この抗体は、効率よくしかも非常に高い立体選択性でエステルを加水分解する活性を有していたが、著しい生成物阻害を受け、反応は数回のターンオーバーののちほぼ停止してしまった。この抗体の触媒機構を明らかにするために、抗体タンパ質の化学修飾を試みたところ、1個のアルギニン残基が反応に必須であることがわかった。そこで、抗体の結合部位をコードしている遺伝子をクローニングし、アミノ酸配列を明らかにしたところ、重鎖の第3超可変領域(CDR3)にアルギニン残基が1つ存在していることが判明した。このアルギニン残基は、また、生成物との静電的相互作用により強力な生成物阻害を引き起こす原因ともなっていることを、炭酸エステルを基質として用いることによって証明した。すなわち、反応後、脱炭酸により中性の生成物を生じる炭酸エステルでは、予想通り、生成物阻害はほとんど見られず、100回以上のターンオーバーが観測された。以上のように、エステル加水分解という共通の機能を持った2つの触媒性タンパク質、リパーゼと抗体触媒について、分子シャペロン様活性化、活性残基と反応機構という観点から詳細な反応機構論を展開することができた。平成5年度は以下の2点について研究を行なった。1.エステル加水分解を触媒する抗体の触媒機構と生成物阻害の軽減、および触媒性残基の導入エステルを加水分解する活性のあるモノクローナル抗体を、遷移状態アナログをハプテンとして誘導し、その諸性質を明らかにした。化学修飾の結果、抗体の結合部位にあるアルギニン残基1個が活性に必須であるばかりでなく、その活性アルギニン残基と生成物カルボン酸との静電的相互作用が生成物阻害の原因であることをつきとめた。そこで、反応と同時に脱炭酸し、生成物の負電荷が自動的に消失するような基質である炭酸エステルを用いて反応を行なったところ、予想通り抗体の結合部位あたり100回以上のターンオーバーが観測され、触媒的に反応が進行することが確かめられた。また、抗体の結合部位に、一般塩基触媒として作用するカルボキシル基を導入し、抗体の触媒活性とターンオーバーの両方を向上させる試みとして、リン酸エステルのα位にアミノ基を持ったハプテンを合成し、これを用いてモノクローナル抗体を誘導した。このハプテンに対し特異的に結合する抗体が多数得られたが、エステル加水分解活性を持った抗体はまだ得られていない。

さらにマウスの免疫とスクリーニングを繰り返す予定である。2.Pseudomonas属リパーゼの大量発現と、巻戻しタンパク質によるリパーゼの活性化Pseudomonas属リパーゼをコードする遺伝子を高発現プロモーターに接続し、大陽菌で大量発現させる系を確立した。しかし生産されたリパーゼはペプチド鎖が正しく折りたたまれず、不活性な封入体を形成した。いっぽう、リパーゼ遺伝子のすぐ下流にある、未知のタンパク質をコードする遺伝子を同じく大陽菌で大量発現させ遺伝子産物を単離することに成功した。この遺伝子産物はin vitroで先ほどの不活性なリパーゼを正しく巻戻し、活性型のリパーゼに変える働きがあることがわかった。リパーゼの巻戻しには等モルの巻戻しタンパク質を必要とし、ATPを必要としないなどの点で、従来から知られているシャペロンとは異なるタンパク質であることが示唆された。平成6年度は、エステルを高い立体選択性で加水分解するモノクローナル抗体について、その触媒機構および生成物阻害のメカニズムを明らかにすることを目的に、主として反応機構論的観点から研究を進めた。得られた抗体の触媒機構を探るために化学修飾を試みたところ、抗体1分子あたり2個のアルギニン残基が反応に必須であること、そしてその活性アルギニン残基はハプテンとの結合にも必須であることがわかった。そこで、この抗体の結合部位をコードしている遺伝子をクローニングし、抗体結合部位のアミノ酸配列を明らかにしたところ、重鎖(heavy chain)の3番目の超可変領域(CDR3)に、アルギニン残基が1つ存在することがわかった。さらに、得られた1次配列をもとに、抗体結合部位の分子モデリングを行なった結果、このアルギニン残基は抗原結合部位のほぼ中央に位置するばかりでなく、溶媒と自由に接触する位置にあることが示され、このアルギニンが反応を触媒する活性残基であることはほぼ間違いないと結論した。そして、結合部位にある活性アルギニン残基が、負電荷を帯びた反応遷移状態を電荷的に安定化することによって反応を触媒しているという反応機構を提出するに至った。また、この抗体触媒は著しい生成物阻害を受け、数回のターンオーバーののち反応が事実上停止してしまうが、そうした生成物阻害の起こるメカニズムについてもこの活性アルギニン残基と関係づけて議論した。すなわち、エステルが加水分解されると負電荷を持ったカルボン酸が生成し、これが活性中心のアルギニンと強く電荷的相互作用するために著しい生成物阻害が生じると推定した。そこで、この仮説を証明するために、加水分解後、脱炭酸により負電荷を帯びた生成物が生じないよう工夫した炭酸エステルを基質にして反応を行なったところ、予想通り生成物阻害はほとんど見られず、100回以上のターンオーバーが観測された。以上のように、活性アルギニン残基が関与する触媒機構とともに、生成物阻害のメカニズムを含めて、抗体触媒の詳細な反応機構論を展開することができた。
消化管における糖鎖関連酵素群の発現調節の検討とその代謝疾患への応用

1目的:近年、IGTに対するα-グルコシダーゼ阻害剤を用いた介入試験において、糖尿病への移行を有意に抑制するとの報告があり、このことからα-グルコシダーゼが糖尿病の発症、および進展に関与していることが示唆される。そこで、我々はα-グルコシダーゼの一つであるスクラーゼ・イソマルターゼ(SI)遺伝子の発現調節に重要な働きをするHNF-1とSIの発現、活性の関連をヒト結腸癌由来のCaco2細胞を用いて検討した。2方法:(1)SI上流-1244bp部位からエクソン1の+46bp部位を含むルシフェラーゼ発現プラスミドを作成した。HNF-1aおよびHNF-1bの翻訳領域全長をpCMV6bベクターに組み込んだ発現プラスミドを作成した。インターナルコントロールのP-act-beta-galおよび、上記の各1ugを同時にCaco-2細胞にリポフェクション法を用いて、ルシフェラーゼアッセイおよび、ベータギャルアッセイを行いSI遺伝子転写活性を測定した。(2)コンフルエント後14日のCaco-2細胞を、異なったグルコース濃度(10,100,400mg/dl)で培養し、膜タンパク分画および、total RNAを調整した。これより、SIの消化活性およびリアルタイムPCRを用いてSI、HNF-1aおよびHNF-1b mRNA発現を定量した。3結果:(1)HNF-1aおよびHNF-1bは各々、SI遺伝子転写活性を約10倍、4倍に増加させた。(2)SI消化活性は、低グルコース(10mg/dl)培養時に100、400mg/dlと比較し、約2倍に有意に増加した。このとき、SIおよびHNF-1b mRNAは有意な変化を示さなかった。4考察:HNF-1aおよびHNF-1bは、ともにα-グルコシダーゼのひとつであるSI遺伝子の発現を増加させた。また、Caco-2細胞では、グルコース濃度に依存的にSIの消化活性が調節されており、HNF-1aのグルコース依存性の発現寮の変化がSI遺伝子発現を調節し、その結果として消化活性を調節している可能性が示された。目的α-グルコシダーゼ阻害剤であるボグリボースは、食後過血糖是正のため臨床において汎用されている。この薬剤の小腸における直接的作用を検討するため、2型糖尿病モデルラットのGoto-Kakizaki (GK)ラットに長期投与を行った。方法(1)8週齢雄性GKラットを2群に分け、ボグリボース含有飼料(n=5)および非含有飼料(n=5)を6ヶ月間与えた。また8週齢雄性ウィスターラットに非含有飼料を与えコントロールとした(n=5)。投与1日、1週間、1ヶ月、3ヵ月、6ヵ月の各時点で以下の検討を行った。(2)食後血糖、血中インスリン値を測定した後、小腸を摘出して3等分し、マルターゼ、スクラーゼ、イソマルターゼ、トレハラーゼ、ラクターゼの活性を測定した。さらにスクラーゼ-イソマルターゼ複合体のmRNAおよびタンパク発現量、アルカリフォスファターゼ活性を測定した。(3)6ヶ月間ボグリボースを投与したGKラットに対し1ヶ月間投与を中止し、その後一日だけ再投与を行った。これに対し(2)と同様の検討を行い、休薬を続けた群および非投与GK群と比較した。

結果(1)投与6ヵ月後における食後血糖値は、非投与群に比し有意に低値を示した。(2)マルターゼ、スクラーゼ、イソマルターゼの活性は投与開始後6ヶ月に渡り有意に抑制された。(3)スクラーゼ-イソマルターゼ複合体のmRNAおよびタンパク発現量は、投与群において有意に高値を示した。(4)休薬後、マルターゼ、スクラーゼ、イソマルターゼ活性に対する抑制が見られなくなったが、再投与によって再び有意に抑制された。(5)同様にスクラーゼ-イソマルターゼ複合体のmRNAおよびタンパク発現量は、休薬によって高値を示さなくなった。考察ボグリボースは長期にわたって小腸におけるα-グルコシダーゼ活性を有意に抑制し、その結果有効な食後過血糖是正を得られる薬剤であることが明らかになった。またこの薬剤の抑制効果は可逆的なものであり、その安全性が確認された。1目的:α・グルコシダーゼ阻害剤であるボグリボースは、食後過血糖是正のため臨床において汎用されている。この薬剤の小腸における直接的作用を検討するため、2型糖尿病モデルラットのGoto・Kakizaki(GK)ラットに長期投与を行った。2方法:(1)8週齢雄性GKラットを2群に分け、ボグリボース含有飼料(n=5)および非含有飼料(n=5)を6ヶ月間与えた。また8週齢雄性ウィスターラットに非含有飼料を与えコントロールした(n=5)。投与1日、1週間、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月の各時点で以下の検討を行った。(2)食後血糖、血中インスリン値を測定した後、小腸を摘出して3等分し、マルターゼ、スクラーゼ、イソマルターゼ、トレハラーゼ、ラクターゼの活性を測定Lた。さらにスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のmRNAおよびタンパク発現量、アルカリフォスファターゼ活性を測定した。(3)6ヶ月間ボグリボースを投与したGKラットに対し1ヶ月間投与を中止し、その後一日だけ再投与を行った。これに対し(2)と同様の検討を行い、休薬を続けた群および非投薬GK群と比較した。3結果:(1)投与6ヶ月後における食後血糖値は、非投薬群に比し有意に低値を示した。(3)スクラーゼ・イソマルターゼ複合体のmRNAおよびタンパク発現量は、投与群において有意に高値を示した。(5)同様にスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のmRNAおよびタンパク発現量は、休薬によって高値を示さなくなった。4考察:ボグリボースは長期にわたって小腸におけるα・グルコシダーゼ活性を有意に抑制し、その結果有効な食後過血糖是正を得られる薬剤であることが明らかになった。近年、食後血糖が血管合併症のリスクであるという研究結果が注目されている。ボグリボースは単独あるいはインスリンなどと併用し、食後血糖の改善に有効である。現在、血糖だけでなく体重や脂質に対しての影響を検討している。予備研究では、非使用時に比し体重増加が抑制される傾向を認めている。
唾液分泌を抑制する薬物に関する研究(唾液腺細胞内情報伝達系に対する作用)

唾液分泌は唾液腺細胞内のイノシトールリン脂質(PI)代謝系を介して促進される。ベンゾジアゼピン系(BDZ)薬物は副作用として唾液分泌を抑制する。この研究では、BDZ系薬物による唾液分泌抑制機序を明らかにするために、唾液腺細胞内のPI代謝系に対するBDZ系薬物の影響を調べた。その結果以下の事が明らかとなった。1.ジアゼパム(DZP)はムスカリン受容体刺激によるラット耳下腺細胞内イノシトール1,4,5-三リン酸(IP_3)産生を抑制した。2.DZPはムスカリン受容体、α_1-アドレナリン受容体刺激による耳下腺細胞内カルシウム([Ca^<2+>]_i)の増加を減少させた。この[Ca^<2+>]_i減少は、細胞外液にCa^<2+>(1.27mM)が存在、非存在下のいずれにおいてもみられた。減少率はIP_3産生の減少率(約35%)とほぼ同じであった。Thapsigargin刺激による[Ca^<2+>]_iの増加はDZPによって減少しなかった。3.DZPの急性投与量(5mg/kg,i.p.)ではラット耳下腺、顎下腺・大脳皮質のいずれにおいてもGTP結合蛋白質(Gqタイプ)、ホスホリパーゼC(β_3タイプ:PLC-β_3)量に顕著な変化はみられなかった。4.DZP(0.8mg/kg/day,i.p.)の10日間連続投与により耳下腺、顎下腺、大脳皮質のPLC-β_3量が顕著に減少した。Gq量には顕著な変化はみられなかった。今回の結果からBDZ系薬物が唾液腺細胞内のPI代謝系に影響を及ぼすことが明らかとなった。DZPは唾液腺細胞内のムスカリン、α_1-アドレナリン受容体刺激によるIP_3産生を抑制し、IP_3と連関した[Ca^<2+>]_iの増加を抑制する。さらにIP_3産生酵素量を減少させる。この細胞内のIP_3産生と[Ca^<2+>]_iの減少がBDZ系薬物による唾液分泌抑制と密接に関連していることが認められた。[目的]抗不安薬であるDiazepam (DZP)が、唾液分泌機構において重要な役割を果たしているイノシトールリン脂質代謝系に影響を及ぼし、Inositol 1,4,5-trisphosphate (IP_3)産生を抑制することを以前に明らかにした。この抑制作用がDZPによる唾液分泌抑制と関連していると考えられる。今回はIP_3産生と連関している細胞内カルシウム濃度([Ca^<2+>]i)に対するDZPの影響を調べ、唾液分泌抑制機構をさらに検索した。[方法]体重220g前後のWistar系雄性ラットから耳下腺を摘出し、酵素処理により腺房細胞を調製した。この耳下腺腺房細胞を無蛍光ガラス板上に播種した後、細胞内Ca^<2+>測定用の蛍光指示薬であるFura-2/AMを細胞に負荷し、実験に供した。[Ca^<2+>]iは、ARGUS 50にて測定した。[成績][結論]

DZPは、耳下腺細胞内のおいてm_3-ムスカリン受容体、α-1-アドレナリン受容体刺激によって産生されるIP_3と連関した[Ca^<2+>]iの増加を抑制する。この細胞内のIP_3産生と[Ca^<2+>]iの減少が、DZPによる唾液分泌抑制と密接に関連していることがさらに確認された。[目的]ベンゾジアゼピン(BDZ)系薬物が、唾液腺細胞に存在するBDZ受容体を介して、Cl-の流動に影響を及ぼしたり、ムスカリン受容体刺激によるinositol 1,4,5-trisphosphate(IP_3)産生や、細胞内Ca^<2+>の上昇を抑制することなどを明らかにした。そして、これらの抑制がBDZ系薬物による唾液分泌抑制に関与していることを示した。今年度は、耳下腺細胞内Cl-の動態をさらに解析し、IP_3産生酵素であるphospholipase C(PLC)活性に対するCl-の影響を調べた。[方法]Wistar系雄性ラットから耳下腺を摘出し、酵素処理により腺房細胞を調製した。細胞内Cl-の挙動は、細胞内Cl-測定用蛍光試薬であるMQAEを用い、ARGUS50にて測定した。PLC活性は、[^3H]phosphatidylinositol 4,5-bisphosphateを基質として用い、反応産物である[^3H]IP_3を測定して求めた。[結果]diazepam(DZP)は、耳下腺細胞内へのCl-流入を促進した。この作用は、BDZ受容体遮断薬によって抑制された。DZPはCl-の細胞外への流出を抑制した。この結果は、^<36>Cl-で得られた結果と一致していた。ラット耳下腺から調製した細胞膜と1%コール酸処理膜可溶性画分のPLC活性は、Cl-(0-150mM)濃度に依存して有意に減少した。[考察]以上の結果から、BDZ系薬物は耳下腺細胞膜上の受容体を介してCl-の細胞内流入を促進する。しかし、増加したCl-によりPLC活性が抑制され、IP_3量が減少するために細胞内Ca^<2+>量が減少し、Ca^<2+>依存性Cl-チャネルを介したCl-の細胞外への流出が抑制され、それに伴う水の分泌が抑制されると考えられた。[目的]これまでに我々は向精神薬による唾液分泌抑制機序を検索してきた。in vitro, in vivoの実験結果から唾液分泌機序において重要な役割を果たしている唾液腺細胞内イノシトールリン脂質代謝系の抑制が向精神薬による唾液分泌抑制に関与していることを示した。今年度は、唾液分泌に関与するイノシトールリン脂質代謝系におけるGTP結合蛋白質(Gqタイプ)とホスホリパーゼC(β_3タイプ:PLC-β_3)の蛋白量レベルに対する抗不安薬ジアゼパム(DZP)の影響を調べた。[実験方法](1)生後7-8週齢のWistar系雄性ラットを用いた。(2)DZP投与は急性投与と連続投与で行った。急性投与:DZP(5mg/kg, i.p.)を投与し、2時間後に耳下腺、顎下腺、大脳皮質を摘出した。連続投与:DZP(0.2 or 0.4mg/kg, i.p.)を1日2回、3-10日間連続投与後、各組織を摘出した。(3)摘出した組織から遠心分離操作により細胞膜を調製した。(4)細胞膜蛋白質をSDSゲル電気泳動後、Gq, PLC-β_3に対する抗体を用いてWestern blotを行い各蛋白量を分析した。[結果および考察]DZPの急性投与では耳下腺、顎下腺、大脳皮質のいずれにおいてもGq, PLC-β_3量に顕著な変化は認められなかった。DZP(0.8mg/kg/day, i.p.)の10日間連続投与により耳下腺、顎下腺、大脳皮質のPLC-β_3量に顕著な減少が認められた。しかし、Gq量には顕著な変化は認められなかった。
ナメクジをモデル動物としたにおい情報の末梢での符号化と中枢での解読機構の解析

動物が外界からの刺激をどのように脳内の神経活動へと表現するかは,脳のはたらきを理解する上で重要な問題である。近年,脳内情報表現およびその処理には,神経細胞集団の同期的かつ周期的な活動の重要性が指摘されている。本研究においては,比較的単純な神経系をもちながらも,高度な嗅覚識別・学習能力をもち,かつ嗅覚神経系に神経集団の同期振動が顕著にみられるナメクジを用いて,嗅覚情報の情報処理について生理学的研究を行った。今年度は,前年度に報告した嗅上皮から記録される2.5HzのElectro-olfactogramについて,その情報処理上の役割を解析した。ナメクジの末梢嗅覚神経系である触角神経節からは,においの非存在下においても常に1-2Hzの局所電場電位が記録されるが,これは多数の神経の周期的同期活動を示している。流速の速い(0.18ml/s)におい刺激によって嗅上皮上に2.5Hzの振動が現れると,この振動は触角神経節の振動を2.5Hzの振動へと引き込んだ。流速のおそい(0.10ml/s)におい刺激では2.5Hzは観測されず,引き込みも起こらなかった。両方の流速において,におい刺激中には嗅覚中枢へと情報をおくる触角神経束からのスパイク活動は増加した。このスパイクの発生するタイミングの自己相関解析により流速の遅い場合では約1.2Hz,速い場合では約2.3Hzでの周期性があることが明らかになった。また,さらに触角神経節における局所電場電位の位相と,におい応答中のスパイク発生のタイミングを解析した結果,多くのスパイクは電場電位のピーク位相に発生し,この振動を引き起こす神経回路はにおい情報を中枢へと伝える神経細胞の発火タイミングを周期的に同期させている可能性が示された。また,嗅上皮の振動活動には一酸化窒素合成酵素の働きが必要であり,セロトニンは同期性を高めることも明らかにした。ナメクジは嗅覚中枢が単純で規則的な構造をもち,他の動物に比べてより抽象的な高次の嗅覚情報処理が研究されている.しかし,嗅覚中枢に入力されるにおい情報がどのように神経活動に符号化されるのかはよく分かっていない.多くの動物の感覚神経系では,神経細胞の同期振動活動がその情報の脳内表現に重要な役割を持つと考えられている.本研究ではナメクジ嗅覚末梢神経系での同期振動活動に注目し生理学的解析を行った.ナメクジの鼻である触角には触角神経節が存在し,これは触角神経束により嗅覚中枢へと連絡している.この神経束の断端から細胞外記録し,色々なにおいを異なる刺激時間,流速,濃度で与えたときの応答を解析した.その結果,においの種類に関わらず広い流速,濃度範囲において刺激前から存在する自発性低周波振動(1-2Hz)の振幅減少,誘引されたより速い振動(9Hz)という2種類の応答が見られた.また,強いにおい刺激ほど自発性低周波振動が大きく減少し,その回復も遅くなった.このにおい応答はγアミノ酪酸またはアセチルコリンのブロッカー存在下で抑えられた.また組織学的解析によりγアミノ酪酸およびアセチルコリンを含有する神経細胞の分布を決定した.以上の結果をJ Neurobiol誌へ投稿中である.また,触角神経節で発生した自発振動が,どのように触角神経束へと伝播するのかγアミノ酪酸などの薬物灌流実験により解析し,1-2Hzの電位振動が触角神経節内で広くコヒーレントになったときに伝播が起こることを明らかにした(J Neurophysiol誌へ投稿中).また,この自発振動を形成する神経回路網を同定するためパッチクランプ法により触角神経節の神経細胞から細胞内記録を行った.電流注入での発火パターン,自発性の活動の違いからいくつかのタイプがあることが分かった.今後,これらの細胞の振動形成への寄与について解析する.動物がどのように感覚情報を多数の神経細胞の活動によって脳内表現しているのかを理解するため,ナメクジ嗅覚系で見られる神経細胞集団の同期活動に注目し,解析を行った。ナメクジの鼻である触角には触角神経節が存在し,におい情報の処理を行っている。触角神経節の構造,神経連絡についてはこれまで不明な点が多いため,特に神経節の左右に一対ある細胞塊(CM, cell mass)について神経トレーサーであるDiIを用いて組織学的な解析を行った。この細胞は,触角神経節の中でも,においを受容する嗅細胞が投射する神経網部位に広く神経突起を伸ばし,また嗅覚中枢である前脳葉へも投射することから,嗅覚のリレーニューロンであることが示唆された。このデータに,以前行ったγアミノ酪酸(GABA)に対する免疫組織学的解析およびアセチルコリンエステレース活性染色のデータを加え論文を発表した。また,触角神経節から前脳用への神経経路である触角神経束から細胞外記録を行い,におい刺激を行った時の変化について生理学的解析を行った。その結果,におい刺激前に常に存在する0.5-3Hzでの周期的な神経電位振動の振幅はにおい刺激により減少し,活動電位の発生頻度は電位振動の振幅と負の相関があることについて論文を発表した。また,GABA,アセチルコリン,グルタミン酸がCMにおける神経細胞への局所投与が触角神経節の神経細胞集団の同期活動に大きな変化を起こすことを明らかにし,CMの神経細胞が同期活動に重要な役割を果たしていることを明らかにし,論文が受理された。

さらに,嗅上皮からElectro-olfactogramを記録し,これが触角神経節から記録される神経電位振動に同期して振動していることを示した。一定以上の流速での空気およびにおい刺激は,においの種類によらず嗅上皮に2.5Hzの振動を引き起こすことを明らかにした。動物が外界からの刺激をどのように脳内の神経活動へと表現するかは,脳のはたらきを理解する上で重要な問題である。近年,脳内情報表現およびその処理には,神経細胞集団の同期的かつ周期的な活動の重要性が指摘されている。本研究においては,比較的単純な神経系をもちながらも,高度な嗅覚識別・学習能力をもち,かつ嗅覚神経系に神経集団の同期振動が顕著にみられるナメクジを用いて,嗅覚情報の情報処理について生理学的研究を行った。今年度は,前年度に報告した嗅上皮から記録される2.5HzのElectro-olfactogramについて,その情報処理上の役割を解析した。ナメクジの末梢嗅覚神経系である触角神経節からは,においの非存在下においても常に1-2Hzの局所電場電位が記録されるが,これは多数の神経の周期的同期活動を示している。流速の速い(0.18ml/s)におい刺激によって嗅上皮上に2.5Hzの振動が現れると,この振動は触角神経節の振動を2.5Hzの振動へと引き込んだ。流速のおそい(0.10ml/s)におい刺激では2.5Hzは観測されず,引き込みも起こらなかった。両方の流速において,におい刺激中には嗅覚中枢へと情報をおくる触角神経束からのスパイク活動は増加した。このスパイクの発生するタイミングの自己相関解析により流速の遅い場合では約1.2Hz,速い場合では約2.3Hzでの周期性があることが明らかになった。また,さらに触角神経節における局所電場電位の位相と,におい応答中のスパイク発生のタイミングを解析した結果,多くのスパイクは電場電位のピーク位相に発生し,この振動を引き起こす神経回路はにおい情報を中枢へと伝える神経細胞の発火タイミングを周期的に同期させている可能性が示された。また,嗅上皮の振動活動には一酸化窒素合成酵素の働きが必要であり,セロトニンは同期性を高めることも明らかにした。
認知症予防に着眼した日本全国を対象とした調査：水道水リチウムの効果

1)日本全国を対象とした疫学研究において、「水道水リチウム濃度と認知症の有病率は有意な負の相関をとる」という仮説を設定し、これを検証する。⇒日本全市の水道水リチウム濃度は計測済みだが市単位での認知症有病率のデータが入手できていないため、再度ナショナルデータベースの関連データを請求している。平行して、介護保険「認知症高齢者の日常生活自立度」IIa以上を認知症者と仮定し、大分県18市町村の認知症有病率を調べている。現時点で12市町村のデータを入手した。2)認知症患者と性や年齢をマッチさせた非認知症患者を対象に、「認知症群は非認知症群と比較して有意に低い血中リチウム濃度を有する」という仮説を設定し、検証する。⇒50歳以上でリチウムを治療薬として投与されていない当院外来・入院患者86名より同意を得て採血し、順天堂大学衛生学講座で血中リチウム濃度を測定した。他の危険因子で補正を加えるため血中アミロイドβ蛋白、脳由来神経栄養因子、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸を、神経心理検査としてMini-Mental State Examination (MMSE)、Clinical Dementia Rating、ピッツバーグ睡眠質問票、ハミルトンうつ病評価尺度(HAM-D)、ヤング躁病評価尺度を行った。現時点での解析として、MMSE評価点を従属変数とし、対数変換した血中リチウム濃度、抗認知症薬の有無、両者の交互作用項、年齢、性別、教育歴、HAM-D得点を独立変数として重回帰分析を行った結果、対数変換した血中リチウム濃度と抗認知症薬の交互作用項はMMSEと有意な正の相関を認めた。これは抗認知症薬が投与されている場合にリチウムがその濃度に伴って認知機能を改善する可能性、あるいは抗認知症薬が投与されていない場合にはリチウムは認知機能を改善しにくい可能性を示唆すると考察される。⇒日本全市の水道水リチウム濃度はすでに計測済みである。問題点は、市単位での認知症有病率のデータが入手困難なことである。そこで現在、再申請している。2)認知症患者と性や年齢をマッチさせた非認知症患者を対象に、「認知症群は非認知症群(対照群)と比較して有意に低い血中リチウム濃度を有する」という仮説を設定し、これを検証する。他の危険因子で補正を加えるため血中アミロイドβ蛋白、脳由来神経栄養因子、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸を、神経心理検査としてMini-Mental State Examination (MMSE)、Clinical Dementia Ratin、ピッツバーグ睡眠質問票日本語版、ハミルトンうつ病評価尺度(HAM-D)、ヤング躁病評価尺度日本語版を行った。サンプリング数は順調に増加している。1)日本全国の認知症有病率に関するデータを入手する。平行して、介護保険「認知症高齢者の日常生活自立度」IIa以上、あるいは認知症有病率を計算できる他のデータを入手し、水道水リチウム濃度と認知症有病率の相関を調べる。2)引き続き採血サンプリングを増やしていく。

これは抗認知症薬が投与されている場合にリチウムがその濃度に伴って認知機能を改善する可能性、あるいは抗認知症薬が投与されていない場合にはリチウムは認知機能を改善しにくい可能性を示唆すると考察される。1)日本全国を対象とした疫学研究において、「水道水リチウム濃度と認知症の有病率は有意な負の相関をとる」という仮説を設定し、これを検証する。⇒日本全市の水道水リチウム濃度はすでに計測済みである。問題点は、市単位での認知症有病率のデータが入手困難なことである。そこで現在、再申請している。平行して、介護保険「認知症高齢者の日常生活自立度」IIa以上を認知症者と仮定し、大分県18市町村の認知症有病率を調べている。現時点で12市町村のデータを入手した。2)認知症患者と性や年齢をマッチさせた非認知症患者を対象に、「認知症群は非認知症群(対照群)と比較して有意に低い血中リチウム濃度を有する」という仮説を設定し、これを検証する。⇒50歳以上でリチウムを治療薬として投与されていない当院外来・入院患者86名より同意を得て採血し、順天堂大学衛生学講座で血中リチウム濃度を測定した。他の危険因子で補正を加えるため血中アミロイドβ蛋白、脳由来神経栄養因子、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸を、神経心理検査としてMini-Mental State Examination (MMSE)、Clinical Dementia Ratin、ピッツバーグ睡眠質問票日本語版、ハミルトンうつ病評価尺度(HAM-D)、ヤング躁病評価尺度日本語版を行った。サンプリング数は順調に増加している。1)日本全国の認知症有病率に関するデータを入手する。平行して、介護保険「認知症高齢者の日常生活自立度」IIa以上、あるいは認知症有病率を計算できる他のデータを入手し、水道水リチウム濃度と認知症有病率の相関を調べる。2)引き続き採血サンプリングを増やしていく。物品購入において予定していた価格より安価に調達でき、旅費において予定していた国際学会への参加をしなかったため。学外分担者とも連携を密に、意見交換のための打ち合わせなど行っていきたい。
繊維シートを外部緊張材に用いたコンクリート部材の補強効果

土木構造物の補修・補強を目的として、繊維シートを緊張しRC部材に接着する工法について検討を行った。繊維シートとしては炭素繊維およびアラミド繊維シートを用いた。実験はシートとコンクリートの付着試験およびT形RC試験体のウェブ部に緊張・接着したPRC桁の曲げせん断試験を行なった。以下に得られた知見を示す。1.付着試験の結果、シートの引張荷重作用端から定着端方向へ10cm離れた部分は付着応力が生じず、有効付着長は約10cmであった。2.シートの剥離せん断破壊が起こる場合の桁の有効付着面は斜めひぼ割れ面とシート高さの1/2までの横断面で囲まれる直角三角形と見なすことができる。3.シートを緊張・接着することにより部材の曲げ耐力・せん断耐力共に増加した。4.あらかじめひび割れを入れた試験体の耐力はひび割れの無い場合に比べ低下するが、シートを緊張・接着することにより、耐力はひび割れの無いものを補強した場合と同程度まで向上した。5.曲げ耐力は従来のプレストレストコンクリートの計算法を適用して算定できる。6.せん断耐力については従来のトラス理論に準じ、シートとコンクリートの付着強度をコンクリートのせん断強度と仮定することによって算定できる。土木構造物の補修・補強を目的として、繊維シートを緊張材としてRC部材に接着する工法について検討を行った。繊維シートとしてはアラミド繊維シートを用いた。アラミド繊維は、強靱、軽量であり、湿潤時の強度低下が少ない、変形能が大きい、しわがよりにくい、耐衝撃性が高い、などの特長を持っており、接着補強工法に適した材料であると考えられる。実験はT形RC試験体のウェブ部に二方向シートを緊張・接着し、プレストレスを導入した。試験体はスターラップの無いせん断破壊試験体とスターラップを有する曲げ破壊試験体であり、曲げおよびせん断について補強効果を検討した。1.曲げ破壊型試験体にシートによる補強を行った場合、耐力は1724%増加し、ウェブ補強型の二方向シートによる曲げ補強効果が確認された。。2.せん断破壊型試験体にシートによる補強を行った場合、耐力は3637%増加した。3.曲げ耐力は従来のプレストレストコンクリートの計算法を適用できる。4.せん断耐力については従来のトラス理論に準じ、シートとコンクリートの付着強度をコンクリートのせん断強度と仮定することによって算定できるが、接着不良によるシートの剥離が生じることもあり、付着・接着性能の評価方法を確立する必要がある。実験はシートとコンクリートの付着試験およびT形RC試験体のウェブ部に緊張・接着したPRC桁の曲げせん断試験を行った。1.付着試験の結果、シートの引張荷重作用端から定着端方向へ10cm以上離れた部分は付着応力が生じず、有効付着長は約10cmであった。2.シートの剥離せん断破壊が起こる場合の桁の有効付着面は斜めひび割れ面とシートの高さの1/2までの横断面で囲まれる直角三角形と見なすことができる。
魚類の松果体・脳・下垂体における春機発動関連因子の探索

魚類の春機発動(生まれて初めて成熟すること)の生理メカニズムの解明に向けて、脳内で発現するキスペプチン遺伝子の発現、脳下垂体における生殖腺刺激ホルモン遺伝子の解析を行った。また、初回成熟を左右する成長と年齢の関係をハタ科魚類を用いて調べた。その結果、脳内におけるキスペプチン遺伝子の配列が明らかになるとともに、その測定が可能となった。この遺伝子は、卵黄蓄積を行っている個体で高い発現がみられた。また、魚種によって生殖腺刺激ホルモンの発現は性分化前と後で異なることがわかった。さらに、同じハタ科魚類であっても、初回成熟の決定に強く関わる因子は年齢である場合と成長である場合があることがわかった。本研究では、全く解明されていない魚類の春機発動のメカニズムの解明に向けて、松果体・脳・下垂体において発現する春機発動に関わる因子を探索する。魚類の春機発動には、年齢と成長が主要因子として関わると考えられているが、ここでは年齢と関係する成熟因子の解析を進める。本年度は、これまでの研究により初回成熟の開始が年齢に依存する可能性が高いハタ科魚類の成熟可能個体と未成熟個体を用いて、松果体・脳・脳下垂体の生殖関連因子のうち、生殖腺刺激ホルモンとその受容体遺伝子の発現動態を解析するための研究を行った。1)脳における春機発動に関わる因子を探求するため、カンモンハタ、クエ、アカハタを用いて、2種類の生殖腺刺激ホルモン(濾胞刺激ホルモンと黄体形成ホルモン)と生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンのクローニングを進めた。また、脳におけるホルモン分泌と生殖腺の発達との関係を調べるため、生殖腺における生殖腺刺激ホルモン(濾胞刺激ホルモンと黄体形成ホルモン)受容体遺伝子の発現を解析するための準備を開始した。その結果、濾胞刺激ホルモンと黄体形成ホルモンの遺伝子の解析が終了し、遺伝子の発現解析が可能となった、また、濾胞刺激ホルモンと黄体形成ホルモンの両受容体遺伝子の部分配列を明らかにし、測定系構築の準備が整った。2)クエを用いて、2歳から6歳までの年齢の異なる個体の生殖腺発達を調べた。また、年齢ごとの成熟率、血中ステロイド濃度の測定を実施した。その結果、2歳の個体は成熟しなかったが、3歳の個体より成熟個体が出現し、年齢が増すごとに成熟率は増加した。しかし、成熟は成長(体サイズ)とかならずしも連動しないことが分かった。3)ハタの脳内における、ドーパミン等の生体アミン濃度測定のための予備試験を実施し、使用する脳の量、前処理方法等について検討を進め、小型の魚種からも十分な測定が行える測定系を確立した。本研究では、これまでに解明の進んでいない魚類の春機発動のメカニズムを解明するために、松果体・脳・脳下垂体において発現する春機発動関連因子を探索することを目的とする。春機発動は、年齢と成長の両因子が関わると考えられていることから、この両因子に関わる遺伝子の解析を進める。本年度は、脳で発現し生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンの分泌制御に関わる可能性が高いキスペプチンの遺伝子解析をハタ科魚類を用いて行った。1)カンモンハタを対象魚として、脳内からキスペプチンの遺伝子kiss 1とkiss 2の単離解析を行った。その結果、kiss 2遺伝子のクローニングは終了し、その塩基配列が明らかとなった。多くの魚類にはkiss 1およびkiss 2の両遺伝子が見つかっているが、本種ではkiss 1を単離することができなかった。他のハタ科魚類と比較したところ、キジハタ、クエでは両kiss遺伝子が見つかっているが、チャイロマルハタでは本種と同様にkiss 2のみが確認されている。2)kiss 2遺伝子の相同性は、他のハタ科魚類と高い相同性を示した。また、マダイなどとも高い相同性を示した。現在、リアルタイムPCRによる遺伝子測定系の確立を目指しているが、検索プライマーを用いて、生殖腺発達に伴うkiss 2遺伝子の発現変化を簡易的に調べたところ、成熟の中期において高い発現を示すことが分かった。昨年度は春機発動を含む成熟全体を統御する2種の生殖腺刺激ホルモン遺伝子の解析を進め、重要な解析ツールを手に入れた。本年度は、成熟開始スイッチの鍵となるであろうキスペプチン遺伝子解析を行い,kiss 2遺伝子が確認された。しかし、脳内に存在する可能性が高いkiss 1遺伝子を単離することはできなかった。kiss 1がカンモンハタでは欠落している可能性も捨てきれないものの、その証拠をつかむには至っていない。本年度は、両kiss遺伝子の解析を完了されるまでを目標としたが、その目標は達成できなかった。しかし、生殖腺発達の異なる個体を用いて発現解析を行ったところ、生殖腺の発達に伴う遺伝子の発現変化が確認され、kiss遺伝子と生殖腺発達の関係を明らかにする基盤ができた。これは、来年度に行う予定であった研究内容であるが、1年早く成果が得られたことは大きな前進である。また、天然海域から未熟個体を確保できたことも、次年度に向けて大きな前進である。これらを総合的に判断して、研究の進捗状況はおおむね順調であると判断した。本研究は、これまで解明の進んでいない魚類の春機発動メカニズムの解明に向けて、脳において発現する春機発動関連因子を探索することを目的として行われた。春機発動には年齢と成長が関与すると考えらえることから、この両因子に関わる遺伝子の解析を進めた。

本年度は、脳で発現し生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンの分泌制御に関わる可能性が高いキスペプチンの遺伝子発現をハタ科魚類を用いて行った。また、年齢と成長の何れかが春機発動の主因子となるかを明らかにするため、これらと成熟との関係を明らかにするための実験を行った。1)魚類のキスペプチン遺伝子はkiss 1およびkiss 2が知られている。しかしカンモンハタではkiss 2のみが単離された。本年度は引き続きkiss 1の単離を進めたが、これの確認はできなかった。チャイロマルハタでも同様の結果が報告されていることから、カンモンハタのキスペプチン遺伝子はkiss 2のみであるか、kiss 1の発現が極めて弱いことがわかった。2)キジハタおよびクエではkiss 1およびkiss 2両遺伝子の存在が確認され、カンモンハタと異なる結果となった。この結果は本科魚種間で遺伝子の発現に差異があることを示しており、機能的にも違いがある可能性が高い。3)kiss 2遺伝子の発現は、成熟中期において高い発現を示すことがわかったが、成熟開始直前や初回成熟前の個体では低いことがわかった。4)クエとアカハタの年齢を耳石を用いて調べるとともに体長の測定を行った。また、生殖腺の発達を組織学的に観察し、年齢・成長との関係を調べたところ、クエは成長が良くても3歳に満たない個体は成熟しないことから、年齢が初回成熟に強く影響するのに対して、アカハタは一定の成長を示した個体は年齢に関係なく成熟する傾向を示した。このように魚種により春機発動に関わる主因子は異なる可能性が示された。魚類の春機発動(生まれて初めて成熟すること)の生理メカニズムの解明に向けて、脳内で発現するキスペプチン遺伝子の発現、脳下垂体における生殖腺刺激ホルモン遺伝子の解析を行った。また、初回成熟を左右する成長と年齢の関係をハタ科魚類を用いて調べた。その結果、脳内におけるキスペプチン遺伝子の配列が明らかになるとともに、その測定が可能となった。この遺伝子は、卵黄蓄積を行っている個体で高い発現がみられた。また、魚種によって生殖腺刺激ホルモンの発現は性分化前と後で異なることがわかった。さらに、同じハタ科魚類であっても、初回成熟の決定に強く関わる因子は年齢である場合と成長である場合があることがわかった。本年度は研究初年度であることから、春機発動を理解する上で必要な遺伝子情報を得るための研究を中心に行ったが、実験魚の分与と飼育実験を実施する施設の施設整備工事の都合により、ハタ科魚類の成熟時期(3ー5月)に十分なサンプルを得ることがでず、遺伝子解析に遅れが生じた。特に、成熟に関わるとされる脳内の情報伝達物質として注目されているキスペプチンの解析を行うことができなかった。しかし、2種類の生殖腺刺激ホルモン(濾胞刺激ホルモンと黄体形成ホルモン)の遺伝子解析とそれら受容体遺伝子の解析には成功し、最も必要とされる因子の情報を得ることができた。加えて、年齢の異なるクエを用いた生殖腺発達と成熟率の解析ができたことは、次年度に向けて大きな前進である。また、脳内の生体アミンの測定に関する準備も進んでおり、ハタ科魚類の脳をもちいたこれらの分析が可能となった。これらを総合的に評価して、研究の進捗状況はおおむね順調であると判断した。春機発動は成長と年齢によって決定される。
がん超早期診断・予防のためのがん特異的エクソソーム超高精度解析デバイス

本年度は、ナノワイヤ上にエクソソームを捕集した後、ナノワイヤへの様々な外部因子導入とエクソソーム脱離の相関解析を行い、エクソソーム脱離を達成した。外部因子としては、1.電圧印加によるナノワイヤ加熱、2.溶媒交換による溶液中のナノワイヤ表面状態変化、3.ナノワイヤ表面修飾と加熱・溶媒交換による修飾分子の脱離の3種類を試した。1の電圧印加によるナノワイヤ加熱では、電極表面にエクソソームが分散している溶媒が接触すると電気分解が生じ、ナノワイヤの加熱が十分でなくなることが明らかとなったために、電極表面が溶媒と接触しないような表面被膜技術の開発を行った。また、効率的なナノワイヤ加熱のために電極材料となる金属種の選定も行った。さらに、効率よくナノワイヤを加熱するために電極パターンの最適化を達成した。2の溶媒交換による溶液中のナノワイヤ表面状態変化では、陽イオン・陰イオンのイオン強度を段階的に変化させることで、脱離量を制御することに成功した。その際、流量も脱離に影響を及ぼすことが確認され、流量とイオン強度の制御により脱離量制御を達成した。3.ナノワイヤ表面修飾と加熱・溶媒交換による修飾分子の脱離では、表面修飾する分子の種類を段階的に変化させることで、どの分子が最も強く相互作用するかを明らかとした。また、pMAIRS計測を行うことで、その分子とナノワイヤとの結合様式を明らかにすることに成功した。明らかになった結合様式を基盤とし、溶媒交換によるエクソソームの効率的な脱離を達成した。これら13の脱離検討を行った後に、前年度までに達成したポアデバイスとナノワイヤデバイスとの集積化を行った。集積化したデバイスを用いて、エクソソーム捕捉→エクソソーム脱離→エクソソーム検出の1連の流れの検討を行った。本年度は当初計画していたナノワイヤを用いたエクソソームの捕捉・脱離を完了すると共に、計画を前倒しにして、集積化デバイス作製まで着手した。エクソソームの捕捉・脱離においては、当初計画していた加熱による脱離のみならず、溶媒交換による脱離や、表面修飾と修飾分子の脱離の2つの脱離方法も検討することを達成した。さらに、脱離検討を行った後に、前年度までに達成したポアデバイスとナノワイヤデバイスとの集積化を行った。これら進捗状況を鑑みると、当初の計画以上に進展していると考えられる。今後は、前年度までに研究開発した要素技術の集積化デバイスの試作を行い、臨床応用への展開を推進している。集積化デバイスを用いて、国立がん研究センター連携研究者や名古屋大学医学部の連携研究者などと協力し臨床応用を開始する。集積化デバイスにおいては、低侵襲性の診断法である「liquid biopsy」を可能にするため、さまざまな体液(血液・尿・唾液・涙)に含まれているエクソソームのサイズ、表面分子、あるいは内包されるmicroRNAの計測を進める。エクソソームの解析において、得られる定量・定性情報により、がんの種類(肺がん、乳がん、膵臓がん等)を同定し、得られる解析情報から、正常細胞由来かがん細胞由来かを判定することが可能となる。最終的には、100億個中のがん特異的エクソソーム解析を従来の数十倍以上の速度で実現し、がんの超早期診断・予防を達成する。本年度は、ナノワイヤを用いたがん特異的エクソソームの捕集デバイスの開発を行い、個々の技術の性能評価を行った。ナノワイヤを用いたがん特異的エクソソームの捕集は、作製したナノワイヤ構造体に蛍光標識化抗体(がん特異的表面分子を認識)を表面修飾することで達成した。この際には、作製したナノワイヤの配向性や直径、面方位などが抗体の表面修飾に及ぼす影響の評価を行った。また、生体分子分離用に既に開発したナノワイヤ構造体(ACS Nano, 2013, 7, 3029(IF=13); Sci. Rep. (Nat. Pub. Group), 2014, 4, 5252(IF=6); Sci. Rep. (Nat. Pub. Group), 2015, 5, 10584(IF=6))上に酸化グラフェンを吸着させることで、酸化グラフェンナノワイヤの作製に成功した。作製した酸化グラフェンナノワイヤの物性評価には、電子顕微鏡(SEM/STEM/TEM)法やX線回折法を用いた。その後、酸化グラフェンナノワイヤに蛍光標識化抗体の物理的修飾を行った。酸化グラフェンの特性(Small, 2012, 8, 977)により、修飾後に蛍光分子の蛍光強度が減少することが確認された。また、蛍光標識化抗体を酸化グラフェンナノワイヤから脱離することによって蛍光分子の蛍光強度が回復することも確認された。これら結果より、蛍光標識化抗体を用いて、蛍光のON/OFFの概念実証を行うことに成功した。さらに、酸化グラフェンナノワイヤに修飾した蛍光標識化抗体によるエクソソームの捕集と、抗体の脱離によるエクソソームの回収にも成功した。本年度は、当初計画していた酸化グラフェンナノワイヤの作製と、そのナノワイヤへの蛍光標識化抗体の物理修飾ならびに、蛍光強度の減少を確認した。また、蛍光標識化抗体を酸化グラフェンナノワイヤより脱離することによって蛍光強度が回復することも確認し、蛍光分子のON/OFFの概念実証に成功している。

さらに、酸化グラフェンナノワイヤに修飾した蛍光標識化抗体によるエクソソームの捕集と、抗体の脱離によるエクソソームの回収にも成功しており、当初の計画以上に進展していると考えた。本年度は、縦型ナノポアと横型ナノポアであるナノポアチャネルによるエクソソームのサイズ解析と同時(蛍光・電流)計測を行った。縦型ナノポアを用いることで、がんによるエクソソームの分布サイズの平均値変化(がん: 58 nm;正常:46 nm)の計測を実証した。透過型電子顕微鏡によって観察したがんによるエクソソームの分布サイズの平均値変化も同時に行い、ナノポア計測と透過型電子顕微鏡計測との相関が確認された。これらの得られた知見を基に、ナノポアチャネル(横型ナノポア)でも同様の計測結果が得られるかの実証を行った。ナノポアチャネルでエクソソームの蛍光計測を行うために十分な流路長を確保すると、長くなった流路長に応じてポア部分の抵抗値が上昇し、ナノ粒子による抵抗値の微小な変化量が読み取ることができなかったため、計測部はブリッジ回路を用いた電流計測系を開発した。ブリッジ回路では、釣り合いのとれた回路間において流れ込む電流値を計測するため、マイクロ流路によってナノ粒子を検出することが可能である。理論的・実験的検討の結果、大きな電圧を印加することによるS/N比の増強が可能であることが確認され、従来のポア感度(ポア体積/サンプル体積<100)を大幅に上昇させること(ポア感度/サンプル体積<10000)に成功した。最後に蛍光・電流計測の同時計測を実証した。従来の縦型ナノポアは蛍光計測と電流計測を同期させることは技術的に困難であったが、今回開発したナノポアチャネル(横型ナノポア)では蛍光・電流計測の同時計測が容易であることが確認され、ナノ粒子の同時計測を実証した。本年度は、当初計画していた縦型ナノポアと横型ナノポアであるナノポアチャネルによるエクソソームのサイズ解析を確認した。また、電流計測を同期させることは技術的に困難であるため、横型ナノポアであるナノポアチャネルによる蛍光・電流計測の同時計測の実証に成功している。さらに、ブリッジ回路では、釣り合いのとれた回路間において流れ込む電流値を計測するため、理論と実験の両面より、大きな電圧を印加することによるS/N比の増強が可能であることを実証しており、当初の計画以上に進展していると考えた。本年度は、ナノワイヤ上にエクソソームを捕集した後、ナノワイヤへの様々な外部因子導入とエクソソーム脱離の相関解析を行い、エクソソーム脱離を達成した。外部因子としては、1.電圧印加によるナノワイヤ加熱、2.溶媒交換による溶液中のナノワイヤ表面状態変化、3.ナノワイヤ表面修飾と加熱・溶媒交換による修飾分子の脱離の3種類を試した。1の電圧印加によるナノワイヤ加熱では、電極表面にエクソソームが分散している溶媒が接触すると電気分解が生じ、ナノワイヤの加熱が十分でなくなることが明らかとなったために、電極表面が溶媒と接触しないような表面被膜技術の開発を行った。また、効率的なナノワイヤ加熱のために電極材料となる金属種の選定も行った。さらに、効率よくナノワイヤを加熱するために電極パターンの最適化を達成した。2の溶媒交換による溶液中のナノワイヤ表面状態変化では、陽イオン・陰イオンのイオン強度を段階的に変化させることで、脱離量を制御することに成功した。