hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
親和標識法によるATPaseの反応機構の解明

アデノシンポリホスホピリドキサールを大腸菌F1-ATPaseに作用させたところ,試薬は酵素のα, β両サブユニットに結合して,酵素活性を消失させた.NaBH_4で処理した失活酵素を還元カルボキシメチル化後,リジエンドペプチダーゼで消化して生じるペプチドをゲル濾過によって分〓した.ピリドキシルリジンに由来するけい光をもつ物質は4つのピークに分離された.ピークIは未消化物であり,ピークIIIは少量であったので,以後の実験には用いなかった.ピークIIから得られた標識ペプチドの構造決定を行ったところ,標識残基はβサブユニットのLys-155であると同定された.一方,ピークIVから得られた標識ペプチドを解析した結果からは,標識残基はαサブユニットのLys-201であることが判明した.これら2つの残基は,標識剤の構造から考えて, ATPのγ位リン酸基の近傍に位置するものであろう.一方,化学修飾による結果は,この標識剤が触媒部位に結合していることを示唆している. F_1-ATPaseの触媒部位はαとβとの境界面に存在するものと考えられる.両サブユニットの一次構造には高い相同性があるが,標識された2つのリジン残基は対応しない.このことは, ATPのγ位リン酸基の近傍に存在する残基が両サブユニットにおいて異ることを示唆する. αのLys-201とβのLys-155は共に種々のATPaseで極めて良く保存されている.後者はグリシンリッチな領域に存在していたが,前者はその領域から離れていた.ATPaseのαサブユニット上でATP結合部位に位置する残基が同定されたのはこの研究が初めてである.アデノシンポリホスホピリドキサールを大腸菌F1-ATPaseに作用させたところ,試薬は酵素のα, β両サブユニットに結合して,酵素活性を消失させた.NaBH_4で処理した失活酵素を還元カルボキシメチル化後,リジエンドペプチダーゼで消化して生じるペプチドをゲル濾過によって分〓した.ピリドキシルリジンに由来するけい光をもつ物質は4つのピークに分離された.ピークIは未消化物であり,ピークIIIは少量であったので,以後の実験には用いなかった.ピークIIから得られた標識ペプチドの構造決定を行ったところ,標識残基はβサブユニットのLys-155であると同定された.一方,ピークIVから得られた標識ペプチドを解析した結果からは,標識残基はαサブユニットのLys-201であることが判明した.これら2つの残基は,標識剤の構造から考えて, ATPのγ位リン酸基の近傍に位置するものであろう.一方,化学修飾による結果は,この標識剤が触媒部位に結合していることを示唆している. F_1-ATPaseの触媒部位はαとβとの境界面に存在するものと考えられる.両サブユニットの一次構造には高い相同性があるが,標識された2つのリジン残基は対応しない.このことは, ATPのγ位リン酸基の近傍に存在する残基が両サブユニットにおいて異ることを示唆する. αのLys-201とβのLys-155は共に種々のATPaseで極めて良く保存されている.後者はグリシンリッチな領域に存在していたが,前者はその領域から離れていた.ATPaseのαサブユニット上でATP結合部位に位置する残基が同定されたのはこの研究が初めてである.
近世大阪における幕府機構の研究

研究成果は、おもに次の3点からなる。第1に、大坂の幕政機構は武士によって担われていたために、武士の存在の究明がまず必要である。それを知るための史料として大坂に独自な武鑑があるが、「大坂武鑑」と総称されるものの種類、さらにその全国的調査をして、所在目録(ただし未定稿)を作成した。第2に「大坂武鑑」を分析することを通じて、大坂の武士人口およびその種類、また大坂の町人や周辺の農民が、武士たちと公式・非公式にどのような関係を作っていたか、武士をどのように見ていたか、解明した。これまで町人の町としか大坂を見なかった点からいえば、画期的な成果であろう。第3に、大坂武士の典型と思われる町奉行所与力のうち、史料の恵まれている内山彦次郎について、その経歴を中心に明らかにして、大坂武士の生きた姿を描きだした。これも大塩平八郎に偏った武士像の修正に役立つだろう。なお町奉行日記の収集にも努め、一部解読、利用したが、その全面的な活用は、今後の課題である。初年度は当初、計画通り、大坂町奉行日記と「大坂御役録」の調査、収集を行なった。大坂町奉行の日記では、文政12年(1829年)着任の新見伊賀守正路の日記の収集を東北大学図書館狩野文庫で行ない、撮影の後、現在、解読作業を続けている。また大坂代官竹垣直道日記(天保嘉永期)の存在を東京大学史料編纂所で知り、これも関連する史料として収集のうえ、解読を進めている。しかし日記の解読には時間がかかり、今年度で完了する見込みはたっていない。なお大坂代官竹垣直道は、天保14年の上知令発令時の現地代官であるが、それに関連して史料集『天保「上知令」騒動記』を出版した。同史料集は上知対象となった村落の史料を主に、これまでの調査をもとに編んだものだが、本研究のひつようせいと重要性を筆者に知らしめたものである。つぎに東北大学および東京大学で、大坂で発行された武鑑ともいうべき「大坂御役録」の所在確認作業を行なった。その結果、これまで大坂で行なってきた所在確認調査にあらたにデーターを加えることができ、明和年間(1760年代)から慶応3年(1867)までの110年の間の所在を確認した。次年度も、近世大阪資料のコレクションで知られる九州大学法学部や慶応大学図書館にて、この作業を続行するつもりである。なお「大坂御役録」の所蔵館として知られる大阪市立中央図書館の要請で、「大坂武鑑と河内往来」という演題で報告をした。これは後日、出版の予定で、現在、初校を済ませたが、ページ数は確定していないために、次項「研究発表」には載せていない。本研究では、おもに2つの柱をたてて研究期間に入った。1つは、大坂の幕政機構を形づくる大坂城代以下の役職者の人事記録の収集・検討である。これについては「大坂武鑑」と総称される人事記録が、大坂の書肆を版元に享保年間以降出版されたが、それには冊子の体裁を取る「大坂武鑑」・「大坂袖鑑」という系列とならんで、もう1つの系列として1枚両面刷りの「浪華御役録」があることを明らかにした。とくに「御役録」は江戸の武鑑などにない特異なタイプで、大坂の武士に向けられた大坂町民の視線を示していて実に興味深いものがある。それぞれについて、全国の主だった所蔵機関に出かけ、所在調査と収集を行ない、所在目録という形で成果を得ることができた。2つには現実に幕政機構を担った人物の記録の収集・検討で、これについては大坂町奉行新見正路・久須美祐明、町奉行公用人(のち家老)野々村治平、及び与力内山彦次郎の関係史料を収集し、それぞれ解読・検討を進めた。雑誌論文として収めた2編は、いずれもこれらの成果である。なお大坂の市政を担う町奉行の日記は、これまでの大坂研究でもまったく考慮に入れられていず、大きな盲点となっていただけに、その公刊は大きな意義を与えるだろうが、今回の研究期間内には図書として公刊することができず、今後の課題とした。
π拡張型らせん状芳香族分子の合成とキラル分子機能の開拓

本年度は、主に2種類のπ拡張型キラル化合物の合成を行い、キラルな分子構造に特徴的な分子機能の調査を行った。ヘキサベンゾコロネンをらせん状に展開した構造を持つπ拡張型[7]ヘリセン(ヘキサペリヘキサベンゾ[7]ヘリセン)は、トルエン溶液中において約800 nmに吸収端を示した。分子構造全体を均一にπ拡張する分子設計が長波長応答性を付与する上で有効であるという知見が得られた。また、π拡張型[7]ヘリセンのらせん構造に由来する光学異性体はキラルHPLCを用いて分離が可能であった。円偏光吸収の非対称因子は|gCD| = 1.6 ×10ー2であり、π拡張型[7]ヘリセンが優れたキラル光学特性を示すことを明らかにした。フェムト秒過渡吸収分光測定によって測定した励起状態寿命は約1.2 psであり、無置換の[7]ヘリセンと比較して10の4乗倍におよぶ超高速の励起状態ダイナミクスを示すことを明らかにした。ベンゼン環が正六角形状に縮環したケクレンをらせん状に展開したπ伸長型ヘリセン誘導体については、鈴木-宮浦カップリング反応とGrubbs第二世代触媒を用いて効率的に合成できることを明らかにした。合成したπ伸長型ヘリセンのらせん直径は約10.2 Åであり、無置換の[7]ヘリセン(約5.2 Å)と比較して顕著に大きならせん径を持つ化合物である。分子ばね伸長に対応する力の定数を理論化学計算によって調査した所、π伸長型ヘリセンの分子ばね定数は[7]ヘリセンと比較して約10分の1であり、大きならせん径に由来して「非常に柔らかい分子ばね」として振る舞うことを明らかにした。以上のように、均一にπ共役系を拡張したらせん型芳香族分子が「世界最高レベルの優れたキラル分子機能」や「高い柔軟性を持つ分子ばね材料」を実現する上で有用であることを示した。本年度は当初の研究計画で設計したπ拡張型ヘリセンの内、2種類の化合物について合成、単結晶X線構造解析、円偏光物性の測定に成功し、学術論文として発表することができた。それぞれの化合物の物性測定を通じて、(1)π拡張型[7]ヘリセンが1.2 psの寿命を持つ超高速励起状態ダイナミクスを示すことや、(2)π伸長型ヘリセンが非常にフレキシブルな分子ばね特性を示すことなど、当初の想定以上の知見が得られたことから、当初の研究計画以上に進展していると言える。今後は、走査型プローブ顕微鏡などを用いた単一分子測定に向けて、らせん構造の末端に適切な置換基を導入する手法の確立を目指す。また、らせん状分子の水平方向への更なるπ拡張やらせん軸方向へのらせん長の伸長が、らせん状多環芳香族炭化水素(HPAHs)の分子物性に及ぼす影響について、実測と理論計算を組み合わせたアプローチを用いて検討を進める予定である。それぞれの化合物の物性測定を通じて、(1)π拡張型[7]

ヘリセンが1.2 psの寿命を持つ超高速励起状態ダイナミクスを示すことや、(2)π伸長型ヘリセンが非常にフレキシブルな分子ばね特性を示すことなど、当初の想定以上の知見が得られたことから、当初の研究計画以上に進展していると言える。今後は、走査型プローブ顕微鏡などを用いた単一分子測定に向けて、らせん構造の末端に適切な置換基を導入する手法の確立を目指す。また、らせん状分子の水平方向への更なるπ拡張やらせん軸方向へのらせん長の伸長が、らせん状多環芳香族炭化水素(HPAHs)の分子物性に及ぼす影響について、実測と理論計算を組み合わせたアプローチを用いて検討を進める予定である。
熱塩循環にに関する実験的研究

本年度は、(1)回転流体中の斜面を下る重い密度流の挙動、および(2)2層流体における熱塩拡散を調べる実験を行った。(1)においては、実験水槽を回転テーブルの上に乗せ、冷却によって2次的に線状に結誘起された重い密度流の構造を流れの可視化の方法で調べた。その結果、密度流流体と環境流体との密度差とテイラー数がある限られた範囲の値をとるとき、密度流は傾圧的不安定のために波状構造を呈するようになることが分かった。また、回転密度流のレジーム・ダイアグラムを私実験的に得て、ハドレー的な2次元流から多数の渦を伴う乱流に至るまでの流れの構造を明らかにした。さらに、密度流中の温度分布の同時多点計測を行った結果、規則的な波状不安定構造に対応するような温度プロファイルが得られた。(2)においては、今年度は昨年製作した水平可動板付の熱塩拡散水槽を回転テーブルの上に乗せて、ソルトフィンガー形成に対する系の回転の効果を調べた。その結果、上層が高温・高塩分、下層が低温・淡水の2層界面におけるソルトフィンガーの形成は回転によって著しく抑制されることが分った。ある限られたパラメータを与えたときにのみ界面付近に局在したフィンガーが過渡的に形成されるが、大部分の場合、規則的なフィンガーの形成は見られなかった。以上のように、本年度は主として2つの項目について調べたが、これらの散逸過程とそこで現れる形態は深海底層流のとりうる構造の解明に寄与すると考えられる。回転密度流の規則的な不安定構造は、例えば、極地方において重い深層水が形成されるとき、あるいは形成された深層水が海底斜面を流化するとき、単に平面的な層流として流れるのではなく、不安定構造をとってある場所では強く、またある場所では弱く流れることを強く示唆するからである。
都市成長管理における容積率等規制の有効性と不動産市場に与える影響

国土交通省の土地総合情報システムから実際の取引のデータを整理しているが、2015年までのデータだけで、Microsoft Accessのファイルで700MB程度となった。当該ソフトウェアでのファイルサイズの上限に達しつつある。2016年以降のデータを合わせて整理するために、データそのものはMySQLもしくはPostgresqlへ格納し、操作のみAccessで行うことを考えている。そのために、環境整備を進めている現状である。当初の計画からすると、「やや遅れている」と判断される。国土交通省の土地総合情報システムのデータの追加に伴い、様々な研究の可能性が生まれつつある。例えば、ある地下鉄駅の周辺の物件に限定したヘドニック分析の場合、環境変化の影響を排除して、不動産評価を行うことができる。まずは、データの整備を完了させ、当初計画のアイディアを含めて、様々な角度から分析したい。近年、不動産価格の実証分析において、時系列的なデータの充実により、長期間にわたる不動産価格の時間的な変化が注目を集めている。例えば、対象期間の不動産市場の傾向を知るために価格指数の研究である。期間が長期間にわたる場合、価格関数において切片以外が変化する可能性等の問題点があるが、そのような構造変化を考慮した研究も進められている。一方、不動産市場における競争や除外変数に起因する空間自己相関は不動産価格関数の推定にバイアス等をもたらすが、多くの研究では考慮されていない。日本においては、勤務先の指示による転勤が多いが、特に年度末(1月から3月)にそのような転勤は集中し、世帯全体が入居しうる不動産の価格決定は、それ以外の期間(4月から12月)と大きく異なることが予測される。そこで本研究では、不動産価格関数全体が季節間で同一かを空間自己相関を考慮した実証研究により検討する。ここでは、従来の研究で行われているような時間ダミーによる切片の変化で充分かが焦点となる。データとしては国土交通省土地総合情報システムからの不動産取引価格データにおける中古マンションの情報を用いる。中古マンションを対象とする理由は、転勤を繰り返す世帯の需要が強いと思われるので、建て替えの問題を考慮する必要がないためである。今回の研究では、不動産市場における競争や除外変数に起因する空間自己相関を考慮してバイアスのより小さい不動産価格関数の推定を行った。推定結果の検討により、四半期毎の構造変化を確認した。今年度中に導入予定であったワークステーションについて適切な機種の販売が遅れ、導入を延期したため。市町村間の容積率規制の相互依存関係を考慮した財政モデルによる実証研究を行う。また、時空間モデリングやマルチレベルモデル等のより進んだ理論・実証研究を行う。さらには、地価の波及効果のより精緻な理論モデル化を進める。計量経済学モデルとしては、空間自己相関モデルによる道府県内の不動産の相互依存関係とともにマルチレベルモデルによる都道府県間の不動産の相互依存関係を推定したい。
クロマトグラフ法によるアクチナイド元素の化学種分離に関する研究

トリウム、ウラン、ネプツニウム等のアクチナイド元素の水溶液中での化学種や化学的挙動は、未だ十分に判明しているとは言いがたい現状である。そこで、我々がすでに開発・システム化に成功し、核分裂生成物や短寿命核種の分離・研究に適用している高圧濾紙電気泳動装置及び放射能イオンクロマトグラフ装置によりこれらアクチナイド元素の化学的挙動の検討をおこなった。1.高圧濾紙電気泳動法によるアクチナイド元素の化学的挙動の検討水溶液中に存在するアクチナイド元素の陽イオン種及び陰イオン種の同時分析が可能な方法としてニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸を支持電解質として用いる高圧濾紙電気泳動法を開発した。電気泳動分離後、アルセナゾIIIを発色剤とする位置決定法によりアクチナイド元素の泳動位置は青色の錯体として検出され、その位置関係の決定からアクチナイド元素の相互分離法への適用の可能性が判明した。2.放射能イオンクロマトグラフ法によるアクチナイド元素の化学的挙動の検討水溶液中に存在するアクチナイド元素を、複数の検出器(紫外可視分光光度計、電気伝導度計、放射能測定器)を備えた放射能イオンクロマトグラフ装置を使用し、ニトリロ三酢酸またはクエン酸を溶離剤とし、アルセナゾIIIを発色剤とするポストカラム発色法により、620nmの紫外可視分光光度計可視領域の吸収を利用した溶離イオン種の検出法を確立した。その結果、アクチナイド元素の化学的分離挙動は、希土類元素のネオジム、サマリウム等と類似の挙動を示した。
腎臓のクロライド輸送におけるクロライドチャネルの役割に関する研究

研究実績の概要まずはじめに、単離したクロライドチャネル3種類の生体内での存在部位を確定するために、クロライドチャネルCIC-K1,-K2,-3に対する抗体を、ペプチド抗原を用いて、兎を免疫して作製した。CIC-K1、CIC-K2、に対する抗体は特異的なものが得られ、これをもとにして腎臓内での存在部位を免疫組織化学にて確定した。これによりCIC-K1は細いヘレンの上行脚の管腔膜側、基底膜側に存在することが判明した。一方、CIC-K2は接合尿細管の管腔側膜に存在した。このことは、これらクロライドチャネルの生理的役割を推定する上で重要な情報となった。CIC-3には今のところ、良い抗体は得られていない。次に、これらクロライドチャネルの構造機能相関を研究した。CIC-K1は細胞外第一ループの陽電荷アミノ酸を置換するとクロライド電流が増加し、この部位の重要性が示唆された。CIC-3はCHO細胞に強制発現細胞を確立し、カルシウム感受性クロライドチャネルであることが判明した。現在、キメラ分子の検討によりさらに詳しい情報が得られつつある。これらのクロライドチャネルの病態への関与を検討するために、ヒトのこれらのクロライドチャネルのcDNAをまず単離した。さらにヒト遺伝子の解析のために、エクソンイントロン構造を含めて、ヒトクロライドチャネルの遺伝子構造を決定した。これにより、全エクソンをPCRにて増幅し、塩基配列を直接シークエンス法にて迅速に決定する方法を確立した。一方、単離したクロライドチャネル遺伝子を用いて、ヒトの遺伝子座をFISH法にて決定した。1)クロライドチャネルの生体内での存在部位の確定.合成ペプチドを抗原としてウサギを免疫して抗血清を採取した.抗体の特異性をウエスタンブロット,ELISAにて判定し,免疫組織化学にて存在部位を特定した.CIC-K1は腎臓の乳頭部における細いヘンレの上行脚にのみ存在し,電顕にて細胞膜上に存在することが確認された.しかも,apical,basolateral側,両側に存在し,この部位での高いクロライドイオン透過性をになっているクロライドチャネルであると思われた.CIC-K2はCIC-K1と非常に相同性の高いチャネルであるが,免疫組織化学によって,CIC-K1とは異なる部位,すなわち皮質集合尿細管,ヘンレの太い上行脚に存在することが判明した.CIC-K1と異なり,細胞膜だけでなく,細胞質にも染色性が強く,細胞内膜系にも存在する可能性が示唆された.CIC-3は集合管,血管に染色されたが,その後,CIC-3と相同性の高いクロライドチャネルCIC-4,-5が単離され,現在その抗体のCIC-3に対する特異性を検討中である.これらの結果は,腎臓でのクロライドチャネルの役割の理解に重要な貢献をしたと考えられる.2)クロライドチャネルの構造と機能について.CIC-K1は細胞外pHの影響を受けることを明らかにした.このことから,このpH感受性部分の同定を行うことにより,CIC-K1クロライドチャネルのイオン透過に重要な部位を特定できると考えた.よって,細胞外と思われる荷電を帯びたアミノ酸に変異を入れ,pH感受性がどう変化するかを検討中である.3)ヒト尿細管機能異常におけるCIC-K1,-K2クロライドチャネルの関与について.ラットCIC-K1,-K2をプローブとして,ヒトCIC-K1,-K2を単離した.これにより,現在ヒトCIC-K1,-K2遺伝子の構造を解析中であり,次年度,この情報を元にして,ヒト尿細管機能異常症でのこれらの遺伝子の関与を検討する.研究実績の概要まずはじめに、単離したクロライドチャネル3種類の生体内での存在部位を確定するために、クロライドチャネルCIC-K1,-K2,-3に対する抗体を、ペプチド抗原を用いて、兎を免疫して作製した。

CIC-K1、CIC-K2に対する抗体は特異的なものが得られ、これをもとにして腎臓内での存在部位を免疫組織化学にて確定した。これによりCIC-K1は細いヘンレの上行脚の管腔膜側、基底膜側に存在することが判明した。一方、CIC-K2は接合尿細管の管腔側膜に存在した。このことは、これらクロライドチャネルの生理的役割を推定する上で重要な情報となった。CIC-3には今のところ、良い抗体は得られていない。次に、これらクロライドチャネルの構造機能相関を研究した。CIC-K1は細胞外第一ループの陽電荷アミノ酸を置換するとクロライド電流が増加し、この部位の重要性が示唆された。CIC-3はCHO細胞に強制発現細胞を確立し、カルシウム感受性クロライドチャネルであることが判明した。現在、キメラ分子の検討によりさらに詳しい情報が得られつつある。これらのクロライドチャネルの病態への関与を検討するために、ヒトのこれらのクロライドチャネルのcDNAをまず単離した。さらにヒト遺伝子の解析のために、エクソンイントロン構造を含めて、ヒトクロライドチャネルの遺伝子構造を決定した。これにより、全エクソンをPCRにて増幅し、塩基配列を直接シークエンス法にて迅速に決定する方法を確立した。一方、単離したクロライドチャネル遺伝子を用いて、ヒトの遺伝子座をFISH法にて決定した。
ロボットスーツを適用した脊髄損傷早期治療介入と３次元動作解析を軸とした包括的研究

本研究では、3次元動作分析装置を解析に取り入れることで3次元での力学的な解析を行い、ロボットスーツを装着した場合の動作への影響や効果を明らかにするため、関節角度を用いた動作の変化や筋電計を用いた筋活動の変化を調べた。その結果、着用時と非着用時で異なる関節角度の傾向が観察された。今後下肢アシストロボットの評価を行う際には、アシストをいかに行うかと並行して、ロボットを装着すること自体の影響を考慮する必要があると考えられる。筋活性度の結果からは下肢アシストロボットを装着することで筋の負担が減っているとは示されなかった。今後は対象者や対象動作の種類を増やし、さらなる検証を行っていく必要がある。災害や事故,病気などが原因で障害を有する方々に最も適した生活水準の達成を可能にしていくための手段の提供を目指すリハビリテーションにおいては効果的な訓練法の開発は常に重要な課題である。本研究の目的は、自動アシストモードを搭載するロボットスーツを用いた訓練をリハビリテーションに取り入れていくにあたり、動作解析にて評価,分析することで、今後のリハビリテーション医療に繋げていくことである。本研究では、3次元動作分析装置を解析に取り入れることで3次元での力学的な解析を行い、健常人がロボットスーツを装着して訓練した場合の姿勢や運動の状態を解析することで生理的な運動の状況との相違点を検討した。本年度は昨年度実施した健常者を対象にしたロボットスーツ装着の有無という2条件下での、歩行,立ち上がり,バランス,姿勢といった動作において3次元動作分析装置(VICONMX, VICON PEAK社),床反力計(AMTI社・KISTLER社)による計測データをもとに関節モーメント,関節角度,歩行速度,重心動,床反力などを算出し解析を行なった。体格や症状、入院期間などの点から期間中に脊髄損傷患者での訓練にロボットスーツを適用することが困難であったため、健常人の計測を継続して行った。その結果、起立、歩行などといった動作において、ロボットスーツを装着する場合としない場合での違いを明らかにすることができ、ロボットスーツをリハビリテーションへ応用する場合、着用時と非着用時で動作が異なることを考慮しながら訓練を行う必要性があることが分かり、上記結果を国内、国際学会などで報告した。本研究の目的は、自動アシストモードを搭載するロボットスーツを取り入れた訓練をリハビリテーションに取り入れ、3次元動作解析の手法を取り入れて評価,分析することでより一層副作用の少なく効果的な訓練法を提案し、新しい治療戦略に繋げていくことである。本研究では、3次元動作分析装置を解析に取り入れることで3次元での力学的な解析を行い、健常人がロボットスーツを装着して訓練した場合の姿勢や運動の状態を解析することで生理的な運動の状況との相違点を検討する。その結果を元に実際に患者が装着してリハビリテーションを行う場合、より効率的で負担の少ないロボットスーツの調整,訓練の方法を実際のリハビリテーションに取り入れる。本年度は健常者を対象にロボットスーツ装着の有無という2条件下で3次元動作分析装置(VICONMX, VICON PEAK社),床反力計(AMTI社・KISTLER社)による計測を行った。当初ロボットスーツを装着した上での動作解析では赤外線反射マーカーとロボットスーツによる赤外線反射が混在してしまい計測が困難となるなど問題が生じたものの度重なる検討の結果、測定が可能となり、体幹,骨盤,下肢の体表に赤外線反射マーカーを貼付し、3次元動作分析装置と床反力計により、歩行,立ち上がり,バランス,姿勢といった動作においてマーカーの3次元位置を測定した。同時に筋電の計測とビデオカメラによる各動作の全体像の記録も行った。引き続き計測したデータをもとに、関節モーメント,関節角度,歩行速度,重心移動,床反力などを算出解析すると共に、計測も併せて行っている。本年度は3次元動作解析を用い、ロボットスーツを装着した場合の健常者での動作解析を行った。ロボットスーツを装着しない状態での3次元動作解析による評価は順調に達成できている。ロボットスーツを装着した状態での計測に関しては、赤外線反射マーカーの設置場所や手技などでロボットスーツ無しの状態と同様に測定するために検討が必要であり、ほか、設置したマーカーによる通常の赤外線反射以外の反射が非常に多いなどの問題が生じ当初は計測自体が困難であったため、足圧分布測定装置や重心動揺計などといった他の動作解析装置を組み合わせていくことでの解析を行っていくなど別の角度からアプローチすることも考えられたが、検討を重ねていくことで徐々に問題をクリアすることができ、現在ではロボットスーツを装着した状態での3次元動作解析を行うことができている。

さらに、ロボットスーツ有無両者において3次元動作解析中の同期させた表面筋電といった計測も加えて測定できるようになってきており、全体として概ね順調に計画は進展している。ロボットスーツ装着有無の2条件下での類似点,相違点を検証し、ロボットスーツ装着下においてどのような動きや調整をすることがより人間の運動特性に適した訓練となるかを検討する。その結果を元に実際のリハビリテーションに反映させていく。定期的に評価を行うことで運動機能改善効果を検証していく。表面筋電型による筋収縮出現の有無,立位時の免荷歩行支援装置による免荷量の変化による改善の評価を行うと共に、筋酵素(CK:クレアチンキナーゼ)の変化量を計測することで、ロボットスーツによる過剰な筋損傷などの副作用が生じていないかなども評価していく。これらの評価に当たっては、ロボットスーツを用いない通常のリハビリテーションにて訓練をしている年齢や発症時の障害の程度などを合わせた脊損患者群に対しても同様の評価を行い、ロボットスーツを用いた訓練の有無での治療効果に有意差があるかを検討し、最終的に脊損患者に対してロボットスーツをリハビリテーションに取り入れることでの効果の検証を行っていく。その結果をフィードバックすることで、臨床への応用による効果,動作解析の結果,それらを併せての評価を包括的に検討し、ロボットスーツを実際のリハビリテーションに取り入れていく新たな治療戦略に結びつく手法の開発を目指す。併せて、参加者にかかる疲労度や着脱時の利便性さらに安全性なども評価する。脊損患者における心理的評価:脊損患者の治療においては、心理的サポートは非常に重要である場合が多い。そこで、先進的なイメージのあるロボットスーツを取り入れた訓練を行うことでの心理的要素の変化をSatisfaction With Life Scale (SWLS), Patient Health Questionnaire-9 (PHQ-9)といったスケールを用いての評価も検討していく。ロボットスーツは購入ではなく月々レンタルとして導入している。ロボットスーツを装着した状態での3次元動作解析するためにクリアしないといけない点が生じたことと、全期間ロボットスーツをレンタルする場合、研究費が足りなくなってしまうこともありまずはロボットスーツを装着した状態で安定して3次元動作解析ができる状況まで検討を重ねる必要があった。その結果、計測が可能になった段階でレンタルを開始しており、次年度途中でレンタルができなくなるといったことがなく計測や訓練を継続して行えるよう次年度に使用する予定の研究費が生じている。主にはロボットスーツのレンタルに使用する予定である。
糖鎖シルセスキオキサン型プローブを用いる抗糖鎖抗体スクリーニングシステムの開発

本研究の目的は、糖鎖シルセスキオキサン型プローブを用いるハイスループットな抗糖鎖抗体スクリーニングシステムの構築である。まず、糖鎖シルセスキオキサン型プローブの合成としてシルセスキオキサン(以下POSS)部位へのチオール・エン反応による糖鎖の導入について種々検討したが、副反応が優先して進行してしまい、目的物質を十分な量合成することが非常に困難であることが明らかとなった。そこで、アミド結合による導入を検討するためのPOSS誘導体の合成を検討した結果、1か所のアミノ基のみを保護したPOSS誘導体の合成に成功した。今後、得られたPOSSプローブを利用して目的の遂行を目指す。本プローブは抗原部位の糖鎖と、クラスター化のコア部位となるシルセスキオキサン(以下POSS)、固定化部位のフルオラス基の3つの部位から成る有機・無機ハイブリッド型プローブである。特に抗原部位の糖鎖以外はバイオイナートなシルセスキオキサンとフルオラス基であることから抗原性を有さず、また非特異的な吸着が抑制できる。さらにプローブ中で糖鎖をクラスター化するため十分な強度の結合定数を有するようになるため、ファージディスプレイ法と組み合わせることで選択性の高い抗糖鎖抗体の迅速スクリーニングが可能となる。25年度は1:フルオラスタグ部位、及び糖鎖部位の再設計と合成、2フルオラスタグ含有糖鎖POSSプローブの合成、を行った。まず1については昨年度合成したフルオラスタグ部位と糖鎖部位のPOSSブロックへの導入について検討を行ったが、フルオラスタグ部位の導入が困難であることが分かった。更に糖鎖部位もチオールリンカー導入効率が低く再現性に問題があることが明らかとなった。そこでフルオラスタグ部位と糖鎖部位の分子構造を再検討し、それぞれのリンカー部分の構造を変えた新たなユニットの合成を行った。その結果、新たに合成したフルオラスタグ部位がPOSSブロックへHuisgen反応により効率的に導入できることが明らかとなった。更に糖鎖部位の合成収率も改善された。次に2についてはPOSSブロックに対して、新たに合成した糖鎖部位をチオールのラジカル付加により導入する検討を行った。その結果、糖鎖部位の導入が確認されフルオラスタグ含有糖鎖POSSプローブの合成に成功した。24年度は1:フルオラスタグ含有POSSコアブロックの合成と、2:1で合成したフルオラスタグ含有POSSブロックに導入する糖鎖部位の合成、を行った。まず1についてはPOSSブロックの合成に付いて種々検討を行った結果、当初計画の構造である7つのアルキン基を有するPOSSブロックの合成は非常に困難であることが明らかとなった。そこで糖鎖導入部位用官能基、及びフルオラスタグ導入部位用官能基について様々な官能基を用いてPOSSブロックの合成の検討を行った。その結果、糖鎖部位を導入する官能基としてビニル基を、フルオラスタグ部位を導入する官能基としてアジド基を有するPOSSブロックの合成に成功した。次に2については、POSSブロックに対して糖鎖部位をチオールのラジカル付加により導入することを念頭に、末端にチオール基を、かつスペーサー部位にPEG鎖を有する糖鎖誘導体の合成を行った。糖鎖としては実施計画通りラクトースを選択した。合成法について種々検討を行った結果、末端にチオール基を、かつスペーサー部位にPEG鎖を有するラクトース誘導体の合成に成功した。25年度までにフルオラスタグ部位がPOSSブロックへHuisgen反応により導入できることが明らかとなった。また、糖鎖部位の導入はチオールのラジカル付加により導入できることが明らかとなった。しかしPOSSブロック上の7か所の反応点に対する糖鎖の導入効率は平均34ヶ所であり、7ヶ所すべてに導入できた完全導入体を得ることはできなかった。そこで26年度は糖鎖部位のPOSSブロック上の7ヶ所の反応点への完全導入の検討を行った。

具体的には、糖水酸基の保護基の種類、光反応の容器の材質の種類、反応光源の種類について、糖の導入率が最大になる条件についての検討を行った。その結果、糖水酸基は無保護の状態、反応容器の材質はPyrexガラス、反応光源は400W高圧水銀ランプの場合に平均6か所の糖の導入に成功した。本研究の目的は、糖鎖シルセスキオキサン型プローブを用いる抗糖鎖抗体スクリーニングシステムの構築である。本プローブは抗原部位の糖鎖と、クラスター化のコア部位となるシルセスキオキサン(以下POSS)、固定化部位のフルオラス基の3つの部位から成る有機・無機ハイブリッド型プローブである。特に抗原部位の糖鎖以外はバイオイナートなシルセスキオキサンとフルオラス基であることから抗原性を有さず、また非特異的な吸着が抑制できる。さらにプローブ中で糖鎖をクラスター化するため十分な強度の結合定数を有するようになるため、ファージディスプレイ法と組み合わせることで選択性の高い抗糖鎖抗体の迅速スクリーニングが可能となる。昨年度までに、シルセスキオキサンへの糖鎖の導入をチオール・エン反応により7か所の反応点に対して、収率は低いが、最大6か所に糖鎖を導入できる結果が得られた。最終年度は糖鎖の導入収率の向上を目指し、種々検討を行ったが、収率の向上は得られず、また副反応が優先して進行してしまい、目的物が得られない場合もあった。このように、チオール・エン反応による糖鎖導入は再現性も低い結果となった。アルキルスペーサーを使用した予備実験ではチオール・エン反応は収率良く進行していたので、本実験の結果からPEGスペーサーを有する糖鎖誘導体がチオール・エン反応には不適当な基質である可能性が示唆された。そこでPOSSへの糖鎖の導入をアミド結合で行う計画に変更し、そのためのPOSS誘導体の合成を行った。種々検討の結果、オクタアミノプロピルシルセスキオキサンの8か所のアミノ基のうち1か所のアミノ基のみBoc化された誘導体が得られた。今後、本化合物の7か所のアミノ基に糖鎖をアミド結合で導入後、保護されたアミノ基を遊離にし、そこにフルオラス基を導入することで目的とする糖鎖シルセスキオキサン型プローブを合成する計画である。本研究の目的は、糖鎖シルセスキオキサン型プローブを用いるハイスループットな抗糖鎖抗体スクリーニングシステムの構築である。まず、糖鎖シルセスキオキサン型プローブの合成としてシルセスキオキサン(以下POSS)部位へのチオール・エン反応による糖鎖の導入について種々検討したが、副反応が優先して進行してしまい、目的物質を十分な量合成することが非常に困難であることが明らかとなった。そこで、アミド結合による導入を検討するためのPOSS誘導体の合成を検討した結果、1か所のアミノ基のみを保護したPOSS誘導体の合成に成功した。今後、得られたPOSSプローブを利用して目的の遂行を目指す。26年度の計画は1フルオラスタグ含有糖鎖POSSプローブ、及び2フルオラス相互作用による糖鎖POSSプローブの固定化である。1では、25年度に糖鎖部位のPOSSプローブへの導入はチオールのラジカル付加により導入できることが明らかとなった。
ゲノム構造異常とエピゲノム異常の包括的解析に基づく新規骨髄腫治療法の開発

今回の検討により多発性骨髄腫において長鎖散在反復配列(LINE-1)は有意に低メチル化していることが示され,かつその前癌病変であるMGUSは正常コントロールと骨髄腫の中間のメチル化レベルを示したことから多発性骨髄腫の進展に伴いメチル化レベルが段階的に低下することが示唆された。さらに,LINE-1メチル化レベルと染色体欠失の程度には有意な逆相関を認め,LINE-1が低メチル化している検体ほど染色体欠失が多いことが示された。また,LINE-1のメチル化レベルと予後の相関を検討した結果,LINE-1の低メチル化は独立した予後不良因子であることが示された。近年では多くの悪性腫瘍においてDNAのメチル化といったエピジェネテッィクな遺伝子異常が腫瘍の発生や進行において重要な役割を果たしていることが報告されてきている.その一例として,LINE-1等のDNA繰り返し配列のグローバルな低メチル化が染色体不安定性を生じるという報告がある.多発性骨髄腫における染色体異常は極めて多様であり、その解析は、骨髄腫の発生・進展機序の解明に有用である。染色体異常は多発性骨髄腫の予後因子としてこれまでにも広く知られるところであることから,我々は多発性骨髄腫におけるDNA繰り返し配列のメチル化レベルの評価を行い,DNAメチル化レベルと染色体異常との関連および予後やその他の臨床情報との関連に関し検討を行うこととしたゲノム上に繰り返し現れる反復配列のDNAメチル化は、ゲノム全体のメチル化レベルを反映すると注目されている。長鎖散在反復配列(long interspersed nuclear element ; LINE)の代表であるLINE-1はゲノムの17%を占めており、興味深いことにレトロトランスポゾンの一種でもある。近年の報告では、がんでみられるゲノムワイドな低メチル化と染色体不安定性との関連が、LINE-1低メチル化に起因すると示唆されている。今回骨髄腫におけるLINE-1のメチル化レベルを解析したところ、正常形質細胞と比較し、MGUS症例、骨髄腫症例へと進展するにつれて、そのメチル化レベルが低下することを見出した。今後骨髄腫症例におけるLINE-1低メチル化が予後に及ぼす影響を検討する予定である。さらに、個々の症例においてアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法を用いて染色体異常を解析し、LINE-1メチル化レベルとの関連も検討する予定である。今回我々は,多発性骨髄腫におけるDNA繰り返し配列のメチル化レベルと染色体異常および予後との関連について検討を行った。これまでにも様々な腫瘍においてその低メチル化が指摘されているが,今回の検討により多発性骨髄腫においてもLINE-1は有意に低メチル化していることが示され,かつその前癌病変であるMGUSは正常コントロールと骨髄腫の中間のメチル化レベルを示したことから多発性骨髄腫の進展に伴いメチル化レベルが段階的に低下する可能性が示された。さらに,LINE-1メチル化レベルと染色体欠失の程度には有意な逆相関を認め,LINE-1が低メチル化している検体ほど染色体欠失が多いことが示された.染色体欠失が生じる場合には染色体欠失領域の両断端が重要と考え,染色体欠失領域の断端と隣接するプローブの間の領域をBreakpointとして抽出し詳細な検討を行った。Breakpointのうち4症例以上で共通して認められるものをCommon break point (CBP)と定義したところ、全ゲノム中に80のCBPが同定された。CBP領域にはその他の領域と比較しLINE-1がより多く存在することが示され,かつbreakpointの数とLINE-1のメチル化レベルには有意な逆相関が認められたことから,LINE-1が高密度であり低メチル化を生じている検体では染色体欠失が生じやすいことが推察された.また,LINE-1のメチル化レベルと予後の相関を検討した結果,LINE-1の低メチル化は独立した予後不良因子であることが示された.多発性骨髄腫においては染色体がnon-hyperdiploidy(染色体の高度な増幅を伴わない)である群が予後不良であることが知られているが,non-hyperdiploidyは染色体欠失に特徴づけられる一群であり,このことは今回の結果と一致すると考えられた.今回の検討により多発性骨髄腫において長鎖散在反復配列(LINE-1)は有意に低メチル化していることが示され,かつその前癌病変であるMGUSは正常コントロールと骨髄腫の中間のメチル化レベルを示したことから多発性骨髄腫の進展に伴いメチル化レベルが段階的に低下することが示唆された。多発性骨髄腫における染色体異常は極めて多様であり、その解析は、骨髄腫の発生・進展機序の解明に有用である。本研究は、アレイCGH法を用いたゲノム構造解析と、次世代シークエンサーを用いた全ゲノム領域のDNA異常メチル化解析とを組み合わせ、ゲノム・エピゲノム異常を包括的に解析し、発がん・病態進展に関連する標的遺伝子を探索することを目的とする。1)多発性骨髄腫の臨床検体の収集:当科で保有する臨床検体から核酸を抽出する。

すなわち、各症例における骨髄穿刺液の単核球成分をFicollを用いて分離し、magnetic activated cell sorting (MACS)法で抗CD138 magneticbeadsを用いて骨髄腫細胞を選択し、核酸抽出を行った。さらに検体収集と臨床情報の解析を進めている。2)ゲノム構造の解析微細なゲノム構造異常のハイスループット解析を可能としたアレイCGH法と、ヒトゲノムの約42%を占め可動遺伝因子の一種であるレトロトランスポゾンのDNA低メチル化に着目し、多発性骨髄腫における染色体不安定性とレトロトランスポゾンのDNAメチル化との関連を検討している。レトロトランスポゾンは,ゲノム上に繰り返し現れる同一の配列である反復配列に分類されており、長鎖散在反復配列(long interspersed nuclear element:LINE)と短鎖散在反復配列(short interspersed nuclear element:SINE)を有するものがある。アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法(Array Comparative Genomic Hybridization:aCGH)を用いて染色体異常を分析し、メチル化との関連を検討している。その結果、正常形質細胞と比べて、MGUS、多発性骨髄腫へと進展するにつれてLINE-1の低メチル化を認めている。多発性骨髄腫における染色体異常は極めて多様であり、その解析は、骨髄腫の発生・進展機序の解明に有用である。本研究は、次世代シークエンサーを用いたゲノム領域のDNA異常メチル化の解析を組み合わせ、ゲノム・エピゲノム異常を包括的に解析しすることが目的のひとつであった。これまでの研究でLINE-1のメチル化が正常の形質細胞、MGUS、多発性骨髄腫と病期が進行するに従い、低メチル化となっていることを確認した。このことは正常の形質細胞、MGUS、多発性骨髄腫と病期が進行するに従い染色体の欠損、転座が生じやすいことを意味しており、予後との関係が注目される。今後、LINE-1の低メチル化と多発性骨髄腫患者の予後との関係を検討する予定である。これまでに正常形質細胞と比べて、MGUS、多発性骨髄腫へと進展するにつれてLINE-1の低メチル化が存在することが判明した。現在染色体異常とメチル化の関連と、予後について検討中である。今後、骨髄腫細胞株や臨床検体におけるDNA異常メチル化を網羅的に解析する目的で、次世代シークエンサーを用いて、メチル化しているゲノム領域を明らかにする。さらに、臨床検体におけるゲノム構造の異常やメチル化異常と、臨床情報における表現型(特に治療抵抗性)との相関を解析する。GeneSpringなどのソフトウェアを用いてクラスター分析を行い、抗癌剤の効果予測に関与するゲノム構造異常とメチル化異常の同定を試みる。遺伝子発現を抑制するメチル化異常に関しては、遺伝子導入やメチル化阻害剤による標的遺伝子の発現回復により、薬剤感受性・細胞死抵抗性の変化に寄与するかどうかを検証する。
嫌気好気式生物学的リン除去活性汚泥におけるアミノ酸の代謝機構の解明

本研究では嫌気好気式活性汚泥による嫌気条件下でのアミノ酸の摂取について基礎的な検討を行った。検討を行ったアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、およびフェニルアラニンである。活性汚泥の馴致に際しても、これらのアミノ酸を含む人工下水を用いた。グルタミン酸の嫌気的摂取において汚泥中のPHA(ポリヒドロキシアルカノエ-ト)の顕著な増加は確認されなかった。また、上澄水中のアンモニア濃度の挙動から、摂取されたグルタミン酸は脱アミノ化されずに汚泥内に蓄積されることが判明した。汚泥中に遊離のグルタミン酸の増加が確認されたものの、その量は嫌気的に摂取されたグルタミン酸の約半分であった。汚泥中の全アミノ酸を加水分解した後、ダブシルクロリドにより誘導体化して逆相液体クロマトグラフィーにより分析した結果、γ-アミノ酪酸と未知のアミノ酸を成分とするポリマーが汚泥中に蓄積されていることが確認された。このポリマーは水酸化ナトリウム溶液(pH13)にも溶解せず、他のタンパク質から分離・精製することができた。一方、アスパラギン酸の嫌気的摂取においては、摂取に伴って定量的に脱アミノ化が行われ、3-ヒドロキシ吉草酸を主体とするPHAとして蓄積されることが明らかになった。また、アラニンは摂取された後、アラニンのままで汚泥内に蓄積されていた。フェニルアラニンはほとんど摂取されなかった。嫌気的に摂取されるアミノ酸の種類は限られ、また、摂取されるアミノ酸はアミノ酸の種類によって摂取のメカニズムが異なることがわかった。
T細胞が認識するヒト原発性肺癌抗原遺伝子の単離とエピトープの同定

本研究は、日本人に多いハプロタイプを持つヒト原発性肺癌(HLA-A^*2402,B^*5201,Cw^*1202/A^*2402,B^*5401,Cw^*0102)に対してHLAがほぼ一致する健常人(HLA-A^*2402,B^*5201,Cw^*0102/A^*02,B^*5901,Cw^*1202)の末梢血単核球から樹立したMHC classI拘束性のCTLラインを用いて、発現クローニングの手法により、CTLが認識する肺癌特異抗原を単離することを目的とした。昨年度までに、CTLの反応性が拘束されている肺癌株上のHLA分子を各種の標的パネルとCTLとの反応性から、HLA-A^*2402またはCw^*0102と推定し、上記肺癌細胞株より作製したcDNAライブラリーとHLA cDNAをトランスフェクトしたCOS7細胞とCTLとの反応性を、培養上清中に分泌されるIFN-γを指標にして検討した。合計約20万クローンのcDNAをスクリーニングしたが、CTLが認識する特異抗原は検出されなかった。本年度においては、CTLライン中に同種抗原(A^*5401)反応性のクローンが混入している可能性を考慮し、CTLクローニングを行い、45クローンを得た。これらのCTLクローンと上記肺癌株およびB^*5401のみを共有する肺癌細胞株との反応性を比較検討したところ、前者を認識するCTLクローンはすべてB^*5401発現株にも反応性を示したことから、同種抗原に反応するCTLクローンが優勢に存在していると推定された。また、CTLラインと各種標的パネルとの反応性において、A^*2402を共有する標的細胞に対する反応性が低下していたことから、CTLライン中のクローンのpopulationに変動があったことが推定された。すなわち、A^*2402拘束性のCTLクローンが継代の間に減少したと推定した。以上より、本CTLを用いた肺癌抗原単離には問題が多いことから、自己肺癌細胞株に対するCTL誘導とそれら樹立されたCTLによる抗原探索を行うことに計画を変更した。現在までに、ヒト原発性肺癌細胞株を一株樹立し、MHC classI拘束性に自己は胃癌細胞株を認識するCTLラインを樹立したが、CTLの増殖性が不良のため抗原探索に十分な数を確保できなかった。現在、初代培養株の作製を継続している。2.肺癌細胞株由来cDNAライブラリーの作製:1で刺激源として用いた肺腺癌株よりpoly(A)RNAを抽出し、ランダムプライマーを用いてcDNAを合成した。次にこのcDNAを発現プラスミドに挿入し、cDNAクローンとして計約20万クローンに相当するcDNAライブラリーを作製した。3.発現クローニング法によるCTL認識肺癌抗原の単離:COS7細胞にHLA-A^*2402もしくはCw^*0102の発現プラスミドベクターと2.で作製したcDNAライブラリーをDEAEデキストラン法でトランスフェクトし、1.で樹立したCTLラインと混合培養した後、培養上清中に分泌されるIFN-γをELISAで測定することにより抗原遺伝子を含むcDNAプールをスクリーニングした。約20万クローン中、CTLと特異的に反応するクローンが一つ単離できたが、これはHLAcDNAに依存せずにCTLと反応することより、COS細胞上のHLAに提示された抗原がCTLのT細胞リセプターと反応する抗原と類似した為に生じた交差反応であると考えられた。すなわち、A^*2402

拘束性のCTLクローンが継代の間に減少したと推定した。以上より、本CTLを用いた肺癌抗原単離には問題が多いことから、自己肺癌細胞株に対するCTL誘導とそれら樹立されたCTLによる抗原探索を行うことに計画を変更した。現在までに、ヒト原発性肺癌細胞株を一株樹立し、MHC classI拘束性に自己は胃癌細胞株を認識するCTLラインを樹立したが、CTLの増殖性が不良のため抗原探索に十分な数を確保できなかった。現在、初代培養株の作製を継続している。
自立型感染防御機構を備えた移植用培養表皮の作製

(1)抗菌ペプチド提示表皮シートの生体への適用抗菌ペプチドであるザーペシンの遺伝子を導入した角化細胞をマウスの皮下に移植後、大腸菌や緑膿菌などを投与する事で生体内での抗菌活性を検討した。また、ザーペシン遺伝子をトロンビン切断モチーフを含むリンカー及びPDGF(血小板成長因子)レセプターと連結することで固定し、細菌感染時のみ放出させるシステムを開発した。同遺伝子をリポソーム法により遺伝子導入し、マーカーであるMycタグに対する蛍光標識抗体を用いて染色したところ、細胞表面に組み換えタンパク質を発現・提示していることが確認された。しかしながら実験より抗菌ペプチド生産量が低い可能性が示唆された。そこで、細胞外で合成した抗菌ペプチドを細胞表面修飾剤(BAM)に結合したBAM-抗菌ペプチドを調製し、抗菌活性を評価した。マウス繊維芽細胞の培養液にBAM-抗菌ペプチドを添加したところ、数分で抗菌ペプチドを細胞表面に提示することができた。この培養細胞に大腸菌培養液を接触させた場合、抗菌ペプチドが徐々に放出され、抗菌活性を示すことが確認された。一方、ヌードマウス表皮に対しても抗菌ペプチドが角質に提示され、同様な抗菌活性を示した。(2)治癒促進型培養表皮シートの調製法の確立表皮の治癒を促進するための細胞シート調製法を確立した。培養工学的に大量培養した細胞をゼラチンに埋包し、トランスグルタミナーゼで架橋した皮膚シートを作成し、接着因子のアミノ酸モチーフを含むペプチドを加えることも有効であることを見出した。また、細胞とペプチドをあらかじめ接触させておくと効率良くゼラチンゲル内で増殖することを見出した。即時移植可能な表皮シートを調製するため、生体内と同様の細胞密度となるよう細胞数を調整したゼラチンゲルシートを作製したところ、30日程度の細胞の生存が認められた。さらに血管網と同様な構造をゲル内に作る方法を見出した。(1)抗菌ペプチド産生上皮シートの生体への適用を行った。抗菌ペプチドであるザーペシンの遺伝子を導入した角化細胞を重層化させ、移植用シートとした。ヌードマウスの皮下に移植後、大腸菌を移植した皮膚の近傍に投与し、マウスの様子を観察した。皮下組織に上皮シートの生着は確認されたが、明らかな抗菌活性は得られず、マウスの生存日数に有意な差は現れなかった。(2)感染時放出型抗菌ペプチド遺伝子の作製細菌感染時に上昇するトロンビン酵素活性に反応し抗菌剤を放出するシステムを開発を行った。ザーペシン遺伝子をトロンビン切断モチーフを含むリンカー及びPDGF(血小板成長因子)レセプターと連結することで固定し、細菌感染時のみ放出させるシステムを開発した。しかしながら(1)の実験より抗菌ペプチド生産量が低い可能性が示唆されたため、外部で同様なタンパク質を生産した後、細胞表面に提示する方法が良いと考えられた。(3)培養上皮シートの調製法の確立細胞を迅速にシート状にする方法を確立した。定法に従い大量培養した繊維芽細胞あるいは角化細胞をトランスグルタミナーゼと共にゼラチンに加え、伸展しシート化した。この際、血清等を加えることにより、細胞が増殖することのできる上皮シートを調製することができた。また、接着因子のアミノ酸モチーフを含むペプチドを加えることも有効であった。

(1)抗菌ペプチド提示表皮シートの生体への適用前年度までに抗菌ペプチドであるザーペシンの遺伝子を導入した角化細胞を重層化させ、移植用シートとし、ヌードマウスの皮下に移植後、大腸菌や緑膿菌などを投与する事で生体内での抗菌活性を検討したが、ザーペシン生産量低さから生体内での有意な抗菌活性は観察されなかった。そこで、細胞外で合成した抗菌ペプチドを細胞表面修飾剤(BAM)に結合したBAM-抗菌ペプチドを調製し、抗菌活性を評価した。マウス繊維芽細胞の培養液にBAM-抗菌ペプチドを添加したところ、数分で抗菌ペプチドを細胞表面に提示することができた。この培養細胞に大腸菌培養液を接触させた場合、抗菌ペプチドが徐々に放出され、抗菌活性を示すことが確認された。一方、ヌードマウス表皮に対しても同様な実験を行ったところ、抗菌ペプチドが角質に提示された。培養細胞と同様に大腸菌培養液と接触させたところ、同様な抗菌活性を示した。(2)治癒促進型培養表皮シートの調製法の確立表皮の治癒を促進するための細胞シート調製法を確立した。培養工学的に大量培養した細胞をゼラチンに埋包し、トランスグルタミナーゼで架橋した皮膚シートを作成し、接着因子のアミノ酸モチーフを含むペプチドを加えることも有効であることを見出した。また、細胞とペプチドをあらかじめ接触させておくと効率良くゼラチンゲル内で増殖することを見出した。即時移植可能な表皮シートを調製するため、生体内と同様の細胞密度となるよう細胞数を調整したゼラチンゲルシートを作製したところ、30日程度の細胞の生存が認められた。さらに血管網と同様な構造をゲル内に作る方法を見出した。