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生細胞における1分子操作・1分子観察技術の開発と情報伝達機構の解明

【緒言】生細胞の代表的な生理的機能である増殖と分化を分子レベルで理解するためには分子レベルで分子の操作・観察を行う必要がある。そこで本研究では1分子レベルでの計測・観察を可能とする装置及び検出プローブの開発を遂行してきた。半導体微粒子は従来の蛍光分子で起こる退色などの問題も無く、入射光による発光波長(色)がそのサイズに依存し、単一の材料で幅広い波長の光を発光させることが可能であるため、新しいプローブとしての応用が期待されている。そこで本年度は主に半導体微粒子による生体高分子の修飾および配列制御について研究を行い異種類のタンパク質及び遺伝子の標識および検出プローブの開発を中心に行ってきた。【実験】半導体微粒子の配列制御を行うために、本研究ではDNAの相補性と自己組織化を利用した。鋳型DNAの合成は100塩基のDNAを酵素反応により連結させることで行った。出発物質として用いたこのDNAは2箇所において18塩基程度の特異的な配列を有しており、それぞれの相補鎖を異なるQ-dot(発光波長655nmと585nm)で標識し、鋳型DNAとハイブリダイゼーションさせることで異種のQ-dotによる規則的な配列の作製を行った。【結果】このようにして調整したQ-dot配列について原子間力顕微鏡(AFM)観察及び蛍光顕微鏡観察を行い評価した。得られたAFM像において調整したDNA-(Q-dot)複合体は基板上で伸張しており、直径1012nmのQ-dotが周期的にDNA上に配列できていることが確認された。そこで次に蛍光顕微鏡観察を行ったところ、作製したDNA-(Q-dot)複合体においてそれぞれのQ-dotからの蛍光が観察され、合成した鋳型DNA上に2種類のQ-dotが配列できていることが確認された。生細胞の代表的な生理的機能である増殖と分化を分子レベルで理解するためには分子レベルでの分子の操作・観察を行う必要がある。本年度は主に金属微粒子による検出プローブの開発を中心に行ってきた。金属微粒子は入射光による発光波長(色)がそのサイズに依存するため、単一の材料で幅広い波長の光を発光させることが可能である。また従来の蛍光分子で起こる退色などの問題も無いため、新しいプローブとしての応用が期待されている。そこで金微粒子を新しいプローブとして応用するために、金微粒子による生体高分子の修飾および配列制御について研究を行った。金微粒子の配列制御を行うために、本研究ではDNAの相補性と自己組織化を利用した。鋳型となるDNAの合成は100塩基のDNAを酵素反応により連結させることで行った。出発物質として用いたこの100塩基のDNAは金微粒子で標識した短鎖DNA(18塩基)と特異的にハイブリダイゼーションできるように、2箇所において相補的な配列を有している。反応後、得られたDNAは100から1000塩基の間で様々な長さを有しているため、長さをそろえるために電気泳動及び電界溶出によりDNAの分離・精製を行った。一方、金微粒子によるDNAの修飾はビオチン-アビジン反応を利用することで行った。ビオチン分子は特異的にアビジンと強い結合を形成するため、アビジンで修飾した金微粒子(1nm、5nm)をビオチンで修飾した短鎖DNAと生理食塩水中で反応させることにより金微粒子-DNAを調整した。最後に合成した鋳型DNAと金微粒子-DNAを先ほどとは別の生理食塩水中で混合し、アニール処理を行うことで金微粒子の配列を行った。金微粒子の配列については原子間力顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用いて確認した。半導体微粒子の配列制御を行うために、本研究ではDNAの相補性と自己組織化を利用した。出発物質として用いたこの100塩基のDNAは2箇所において18塩基程度の特異的な配列を有しており、それぞれの相補鎖を異なる半導体微粒子で標識することによって2種類の半導体微粒子による規則的な配列を作製することが可能である。一方、2種類の半導体微粒子によるDNAの修飾はそれぞれビオチン-アビジン反応とアミノ基-カルボキシル基間の反応を利用することで行った。最後に合成した鋳型DNAと半導体微粒子-DNAを生理食塩水中で混合し、アニール処理を行うことで半導体微粒子の配列を行った。このようにして調整した試料について原子間力顕微鏡及び走査型チップエンハンスト蛍光顕微鏡を用いて構造観察及び発光スペクトルの測定を行ったところ、観察された半導体微粒子-DNA複合体からそれぞれの半導体微粒子の発光スペクトルが得られたことから異種類の半導体微粒子配列の形成と特定の塩基配列の標識が確認できた。【緒言】

生細胞の代表的な生理的機能である増殖と分化を分子レベルで理解するためには分子レベルで分子の操作・観察を行う必要がある。そこで本研究では1分子レベルでの計測・観察を可能とする装置及び検出プローブの開発を遂行してきた。半導体微粒子は従来の蛍光分子で起こる退色などの問題も無く、入射光による発光波長(色)がそのサイズに依存し、単一の材料で幅広い波長の光を発光させることが可能であるため、新しいプローブとしての応用が期待されている。そこで本年度は主に半導体微粒子による生体高分子の修飾および配列制御について研究を行い異種類のタンパク質及び遺伝子の標識および検出プローブの開発を中心に行ってきた。【実験】半導体微粒子の配列制御を行うために、本研究ではDNAの相補性と自己組織化を利用した。鋳型DNAの合成は100塩基のDNAを酵素反応により連結させることで行った。出発物質として用いたこのDNAは2箇所において18塩基程度の特異的な配列を有しており、それぞれの相補鎖を異なるQ-dot(発光波長655nmと585nm)で標識し、鋳型DNAとハイブリダイゼーションさせることで異種のQ-dotによる規則的な配列の作製を行った。【結果】このようにして調整したQ-dot配列について原子間力顕微鏡(AFM)観察及び蛍光顕微鏡観察を行い評価した。得られたAFM像において調整したDNA-(Q-dot)複合体は基板上で伸張しており、直径1012nmのQ-dotが周期的にDNA上に配列できていることが確認された。そこで次に蛍光顕微鏡観察を行ったところ、作製したDNA-(Q-dot)複合体においてそれぞれのQ-dotからの蛍光が観察され、合成した鋳型DNA上に2種類のQ-dotが配列できていることが確認された。
光化学異性化反応の量子制御

本研究の目的は、我々のこれまでの量子制御研究の成果をふまえて、化学的に興味のある光化学異性化反応系に対して量子制御理論を適用し、新しい処方筆を得ることであった。本報告書の研究発表のところに示されているように、主要な成果の一つは"Quantum control of molecular chirality : Optical isomerization of difluorobenzo[c]phenanthrene"のタイトルで,アメリカ化学会誌J.Am.Chem.Soc.(2002).に掲載されている。2年の当該研究期間中に目的を達成することができたと確信している。その研究成果を要約する。とりあげた系の一つはdifluorobenzo[c]phenanthreneの赤外多光子異性化である。これはM型とP型の分子キラリティー変換をともなうもので、生化学的に興味がもたれている。平面偏光レーザーによってラセミ体から純キラリティー分子を得る新しい方法を確立することができた。もう一つの系はバクテリアロドプシン類似アナログのトランスーシス光異性化である。よく知られているように、これは光合成の初期過程を支配している系である。電子励起状態と基底状態のポテンシャル交差(非断熱相互作用)の大きさに制御パルスがどのように依存するかを明らかにした。非断熱相互作用が小さい場合、制御過程は3種類から成り立っていることがわかった。トランス体基底状態から電子励起状態への核波束のポンプ過程、電子励起ポテンシャル曲面上での核波束運動のブレーキ過程、そして電子励起状態からシス体基底状態への核波束のダンプ過程からなる。本研究の目的は、制御されたレーザー場によって光化学反応の目的物質を得る方法論を確立することであった。2年間の研究期間の初年度である今年度は、光合成の初期過程、バクテリアロドプシン類似アナログのトランスーシス光異性化の量子制御法を1次元モデル内で確立することであった。この制御は配列分子系のエネルギー・電子移動制御(darkstateの制御)と関連においても興味ある電子励起状態と基底状態のポテンシャルクロッシング(非断熱相互作用)の大きさに制御パルスがトランスーシス光異性化反応にどのように依存するかを明らかにした。非断熱相互作用が小さい場合、最適制御パルスは3種類の過程からなることが量子制御法より示すことが出来た。すなわち、トランス体基底状態から電子励起状態への核波束のポンプ過程、電子励起ポテンシャル曲面上での核波束運動のブレーキ過程、そして電子励起状態からシス体基底状態への核波束のダンプ過程からなる。ブレーキ過程は引き続き起こるダンプ過程により核波束がシス体の基底状態の平衡位置に(Franck-Condonの垂直)遷移が可能になるようにさせるために必要な過程である。非断熱相互作用が大きい場合、2っの断熱ポテンシャルが上下に変化する、特に、電子励起状態のポテンシャルを上昇させるように周波数が小さいパルスが新たにダンプパルスの前に発生することを新たに見いだした。以上の新たな結果を現在論文としてまとめている。引き続き、2次元に拡張した取り扱いを行なっている。これは円錐交差とよばれるポテンシャル交差であり、相互作用振動モードがトランスーシス異性化反応モードと異なることが知られており、2次元ポテンシャルの扱いは本質的である。光合成の初期過程、バクテリアロドプシンの制御に重要な役割を果たしている。本研究の目的は、制御されたレーザー場によって光化学反応の目的物質を得る量子制御法を確立することであった。特に、化学的に興味のある光合成の初期過程、バクテリアロドプシン類似アナログのトランスーシス光異性化をとりあげる。ここでは、レチナール分子のトランスーシス光異性化をモデルとした。電子励起状態と基底状態のポテンシャル交叉(非断熱相互作用)とレーザーと分子の双極子相互作用がこの光異性化反応の摂動項である。はじめに、1次元モデル内での最適量子制御理論を展開した。

基底状態と光励起状態との断熱ポテンシャルエネルギー曲面の非断熱相互作用をとりいれ、この光異性化反応を促進するレーザー場の設計をおこなった。分子-レーザー双極子相互作用が非断熱相互作用エネルギーより大きいの場合、および、中間的な場合を取り扱った。これらの場合について、大域的最適制御法を適用し、2つの(基底状態と光励起状態)断熱ポテンシャルエネルギー曲面上を運動する核波束の時間発展と最適制御レーザーの電場を評価した。得られた結果を解析することによって、特に、中間的な場合、新しい制御法を見いだすことが出来た。これは一種のポンプーダンプ型の制御法である。これまでの扱いは、強レーザー場によってポテンシャル曲面をゆがめて反応制御をするものであったが、本研究で得られたとり扱いは、核波束が基底電子状態を断熱的に移動させようとするものである。現在、この成果をもとに、非断熱相互作用モードと反応座標モードを考慮した、2次元ポテンシャルモデルを用いて光励起状態の核波束動力学シミュレーションを行っている。
真核光合成生物のリン酸欠乏ストレスに対する順化機構の分子遺伝学的解明

1.クラミドモナスより,7種類のリン酸トランスポーター遺伝子(CrPTA1,2,3および4,CrPTB1,2および3)および,1種類のリン酸欠乏誘導性のホスファターゼ遺伝子のクローニングに成功した。CrPTAlおよびCrPTA3は、酵母の変異株のリン酸輸送能を部分的に相補した。サザンプロット解析の結果、クラミドモナスに存在するCrPTAホモローグは4つで全てであることが判明した。CrPTA1およびCrPTA3の転写はリン酸欠乏条件下で強く抑制されることが判明した。また、CrPTA2およびCrPTA4の転写量は,リン酸栄養に関わらず極めて低いことが示された。以上の結果から,クラミドモナスにおいては,リン酸欠乏で誘導のかかる高親和型リン酸トランスポーターは、PHO84のホモローグではないと結論された。CrPTB1の欠失変異は、細胞当たりリン含量を増大を引き起こすとともに、ヒ酸耐性の形質を付与した。CrPTB1およびCrPTB3の転写量はCrPTB2の転写量と比較すると遙かに少なかった。リン酸栄養欠乏条件下では、CrPTB2の著しい転写誘導がおこることが判明した。一方、CrPTB1とCrPTB3の転写量はリン酸栄養条件で変化しなかった。2.リン酸欠乏順化能変異株psr1の性質をクラミドモナスの比重がリン酸取り込みによって変化することを利用し、タギング法で作製した、およそ100万の独立な変異株より、リン酸欠乏順化能変異株の網羅的なスクリーニングを行なった。最終的にリン酸欠乏ストレス応答に変異を持つ変異株が16株得られた。得られた変異株のうち、10株でPSR1遺伝子の導入による変異形質の回復が起こらず、これらの変異株ではPSR1遺伝子とは異なる、未知の調節遺伝子に変異があることが推定された。クラミドモナスcDNAライブラリーより、植物の高親和型リン酸トランスポーター(PT)のホモローグを2種類、分泌型アルカリフォスファターゼ(AP)のホモローグを1種類クローニングした。PT遺伝子のホモローグ(CrPT1,CrPT2)は、それぞれ560、545アミノ酸のポリペプチドをコードしており、両者はアミノ酸配列レベルで83%と、極めて高い相同性を示した。また、両者とも6種類あるシロイヌナズナのPT遺伝子いずれとも有意の相同性を示し、アミノ酸配列レベルでの相同性は最大で30%であった。クラミドモナスAP遺伝子(CrAP)は、1321アミノ酸のポリペプチドをコードしており、Volvox carteriのAPと、アミノ酸配列レベルで60%の相同性を示した。CrPT1は、細胞のリン酸飢餓処理3時間以内にその転写が完全に抑制された。このことは、CrPT1遺伝子産物がリン酸飽食状態でのみ特異的に発現するリン酸トランスポーターをコードしている可能性を示唆する。一方、この飢餓処理ではCrPT2の転写量に変化は見られなかった。CrAPは、このリン酸飢餓処理により転写誘導された。CrPT1のリン酸飢餓ストレスによる転写抑制は、リン酸欠乏順化能変異株psr1では有意に低かった(PSR1遺伝子産物はリン酸欠乏ストレスのシグナル伝達に関与するMyb-likeな転写因子である)。このことは、CrPT1の遺伝子の転写の抑制がPSR1遺伝子産物によって制御されていることを示す。1.前年度に引き続き、クラミドモナスより酵母のH+/Pi co-transporter遺伝子(PHO84)のホモログの探索をおこない、第3番目のホモログのクローニングに成功した。

その結果、クラミドモナスでは、このタイプのリン酸トランスポータ遺伝子(PTAと命名)は、PTA1,PTA2,PTA3の3種類存在することが明らかとなった。これらは相互にアミノ酸配列レベルで80%以上の極めて高い相同性を示した。PTA1およびPTA3は,細胞のP欠乏3時間以内にその転写が完全に抑制された。一方,P欠乏3時間処理ではPTA2の転写量に変化は見られなかった。ジェノミックサザン解析およびノーザン解析の結果,クラミドモナスには,PHO84ホモローグはこれらを含め3または4種類しか存在しないこと,3種の遺伝子の+P状態での転写量は,1>3>2の順であること,さらに,P欠乏処理で誘導のかかるようなPHO84ホモローグは存在しないことが判明した。2.本年度、新たにクラミドモナスより、酵母のNa+/Pi co-transporter(PHO89)のホモログとなる遺伝子を2種類(PTBと命名)クローニングに成功した。PTB1は、クラミドモナスのヒ素耐性変異株の原因遺伝子としてクローニングされPTB2は、PTB1のホモローグとしてクローニングされた。両遺伝子のリン酸欠乏での転写調節を調べた結果、PTB1の転写量はPTB2と比較して遙かに少ないこと、また,PTB2の転写量は-P処理で強く誘導されることが判明した。PTB2以外にはP欠乏で誘導のかかるPTAもしくはPTBホモローグは存在しないことから、クラミドモナスにおいては,PTB2がリン酸欠乏時に誘導のかかる高親和型リン酸トランスポーターをコードしていることが強く示唆された。1.前年度までにクローニングされた5種類のクラミドモナスリン酸トランスポーターホモログ(CrPTA1,2および3,CrPTB1および2)の酵母のリン酸トランスポータ欠失変異株による機能相補実験をおこなった。CrPTA1およびCrPPTA3は、酵母の変異株のリン酸輸送能を部分的に相補した。2.新たに公開されたクラミドモナスゲノムのデータベースを利用し、新たにPTAおよびPTBタイプのリン酸トランスポーターを各一つずつクローニングした(CrPTA4およびCrPTB3と命名)。3.クラミドモナスの比重がリン酸取り込みによって変化することを利用し、THI10遺伝子によるタギングで作製した、およそ100万の独立な変異株より、リン酸欠乏順化能変異株の網羅的なスクリーニングを行なった。その結果、様々なリン酸欠乏ストレス応答に変異を持つ変異株を、これまでに16株得た。4.上記で得られた変異株に対し、以前に得られたリン酸欠R順化調節遺伝子PSR1による機能相補実験をおこなった。その結果、16株のうち12株で相補が起こらず、これらの変異株ではPSR1遺伝子とは異なる、未知の調節遺伝子に変異があることが推定された。5.得られた変異株のジェノミックサザン解析の結果、殆どの変異株でTHI10遺伝子によるタグが入っていることを確認した。6.得られた変異株のうちのいくつかについて、7種類のリン酸トランスポーター遺伝子およびホスファターゼ遺伝子のリン酸欠乏による発現調節がどのように変化しているかをリアルタイムPCR法により調べた。7.PSR1遺伝子以外に変異を持つことが確認された変異株のうち2株(psr3,psr6)について古典遺伝学的解析を行い、これらが核遺伝子に変異を持つことを確認した。
加速器を用いた光子誘起陽電子消滅法による非破壊材料評価法の開発

電子加速器を用いて発生した高エネルギーガンマ線ビームを物質に照射し、光子誘起陽電子消滅法によって金属材料の健全性を実環境で評価する手法の開発に成功した。具体的には、電子加速器を用いたレーザーコンプトン散乱によってMeV領域の超短パルスガンマ線ビームを発生し、これを用いて陽電子パルスの生成、および金属サンプルにおいて光子誘起陽電子の寿命測定を行った。また、水素吸蔵合金の水素吸蔵量を非破壊でその場で観測する手法を開発する事ができた。今年度は、LCS光子ビームの安定発生に関する装置改良と調整を行った。具体的には、電子リニアックのRF真空窓の更新を行い、マイクロ波電力輸送の高効率化を行った。これによって、電子エネルギーを現状の300 MeVから315 MeVとすることに成功し、蓄積リングへの高効率入射を達成した。また、クライストロンシステムを一基増設して更なる電子加速効率の向上を図るために、新規にパルス整形回路(PFN)を設計してPFNユニットを製作した。これらの研究によって、光子誘起陽電子消滅ガンマ線法を用いて、加熱試料を測定するシステムの実現にめどをつけた。温度や応力等の条件を変えた状態で、鉄に水素を注入したサンプル片を製作し、空孔型格子欠陥濃度や転位密度変化が水素脆性に与える影響を非接触、かつ溶液中で評価する手法の実証に関する研究を、光子誘起陽電子消滅法を用いて行った。サンプルを製作し、光子誘起陽電子消滅法によってこれを測定した結果、転位密度と応力の間に相関がみられた。これらの研究によって、水素チャージと空孔型格子欠陥濃度の関係を遠隔、かつ非破壊で検査する手法を実証できた。水素吸蔵合金の吸蔵量と空孔型格子欠陥濃度の関係を明らかにするため、水素加圧時と減圧時の空孔型格子欠陥濃度の変化を光子誘起陽電子消滅法によって測定し、これを可視化することを目標とする研究を行った。今年度は、水素吸蔵合金へ永素が吸蔵される様子を、容器に封入された状態で可視化するため、スペクトル先鋭度(Sパラメータ)を画像として可視化するシステムを構築した。これによってSパラメータの二次元可視化が可能であることを確認した。当年度は、陽電子寿命測定(PALS)を行うシステムを構築し、本手法によって寿命測定を行うことに成功した。産総研の加速器が震災で長期間故障したため、愛知県岡崎市にある分子科学研究所の電子蓄積リングUVSOR-IIを用いて実験を行った。同装置にはパルス幅が数フェムト秒のチタンサファイアレーザーが備えてあり、同レーザーを用いたレーザーコンプトン散乱によってパルス幅5ピコ秒、エネルギーが約6MeVの超短パルスガンマ線を発生できるビームラインがある。同ガンマ線を厚さ5cmの鉛ブロック試料に照射することで試料内部で電子・陽電子対を生成し、生成した陽電子が周囲の電子と再結合して511keVの消滅ガンマ線が発生し、これを試料に隣接して設置したBaF2シンチレータによって検出した。陽電子消滅ガンマ線の信号波形を高速のデジタルオシロスコープによってデジタイズし、チタンサファイアレーザーの繰り返し周波数(1kHz)と電子蓄積リングの高周波信号(90MHz)をオシロスコープのトリガーとして用いることで、十分に時間分解能の良い寿命測定を行った。実験から得られた鉛の陽電子寿命は190ピコ秒であった。なお、震災で故障した産総研の電子加速器は、関係者の協力のもとに鋭意復旧作業を行った結果、最終的に電子蓄積に成功した。昨年度に行った陽電子寿命測定(Photon-induced Positron Annihilation Lifetime Spectroscopy; PiPALS)の実験結果を詳細に解析するとともに、陽電子消滅ガンマ線の輸送に対してモンテカルロシミュレーションを行った。また、シンチレーション検出器内における光子の輸送に対するモンテカルロシミュレーションコードを開発し、検出器内での散乱に起因する時間分解能を見積もったところ約60 psecであった。この値は実験的に得られた時間分解能88 psecのかなりの部分を占めており、検出器素子を小さくすることで、時間分解能を数10%向上できることが分かった。そこで、BaF2よりも高密度で、かつ発光波長がより可視域に近いシンチレータ(Yb添加セラミックシンチレータ)を用いたPiPALSシステムを試作し、寿命測定が可能であることを確認した。これによってシステムの時間分解能を70 psec以下とすることが可能であることが分かり、PiPALSを用いて、金属試料の陽電子消滅寿命測定が可能であることを確認した。以上の研究によって、昨年度に190 psecと見積もった鉛の陽電子消滅寿命は、実際は194±15 psecであることが分かった。東日本大震災によって産総研の電子加速器に大きな被害があり、装置の復旧作業に多大な時間を割いたため、本研究の進捗状況は当初の計画に比してやや遅れている。しかし、分子研の装置を用いて陽電子寿命測定に成功したことなどから、当初予定していた研究目標は最終的に達成できるものと思われる。

24年度が最終年度であるため、記入しない。本手法の特徴は、試料深部における陽電子寿命測定をその場で行うことにあるため、水素吸蔵合金や応力の蓄積等を非破壊で可視化することが目標となる。今後は実用化を目指した研究を行うこととする。また、超短パルスガンマ線を高い繰り返し周波数で発生する装置が、国内では非常に少ないことから、同装置の開発および汎用化・小型化を行い、本手法の普及と関連する研究テーマの拡大を目指す。
意味の曖昧さと多様さを考慮する大規模画像・ビデオの自動表現手法に関する研究

本研究は今までの関連研究で対応しなかった画像・ビデオの意味の曖昧さと人間のそれに対する解釈の多義さがあらかじめに定義したドメイン/カテゴリーに対する連想値で反映され、semantic tolerance relation modelで表現することを検討した。さらに、その構築したsemantic tolerance relation modelをドメイン/カテゴリーに対する連想値の計算に導入し、画像/ビデオの意味に基づく自動注釈に活用した。semantic tolerance relation modelの導入が画像/ビデオの意味による検索性能の改良に役に立ったことが分散ユーザによる検索結果により検証した。1)画像・ビデオの特性である意味のあいまいさと人間のそれに対する解釈の多義さをうまく反映できるデータ構造をdomain/categoryとそれらの間の関連性でシステム的に定義した。本研究はその関連度を計測する方法を検討する上で、各クラス間の関係を表明できるsemantic tolerance relation modelを構築した。2)人間の画像・ビデオに対する解釈の多義さにより、新たにdomainやクラスを追加、削除する要求が生じると考える。そのために、domainやクラスの追加、削除に伴うsemantic tolerance relation modelとそれらのクラスを分類する分離器の再構築手法及びその手法の有効性を究明した。3)画像・ビデオを意味に基づき自動登録するための画像・ビデオの有効表現手法とその実現方法を検討した。具体的には、まず、ビデオをshotに分割し、そして、shotがあるkey-frameに代表された。そして、image/key-frameの意味は定義したdomain/categoryらとの連想値のデータ構造でmetadata表現した。さらに、nature vs. man-made domainに関するcategoryとhuman vs. non-humanに関するcategoryに対する連想値を自動的に獲得するalgorithmを開発した。4)上述データ構造で自動登録した画像・ビデオのmetadataは画像の意味のあいまいさと解釈の多義さをうまく反映できることをcross-domain/queryによる画像・ビデオのranking結果で検証した。5)上述の成果を基づいて、分散環境をベースした大規模画像・ビデオの意味自動登録と検索システム構築の仕組みを検討した。そのために、domainやクラスの追加、削除に伴う分類器の再構築を効率的に実現できる手法を考察し、少量の学習サンプルでクラスを代表するモデルを構築する方法を検討した。5)上述の成果を基づいて、分散ユーザによる分散環境をベースした大規模画像・ビデオの意味自動登録と検索システム構築の仕組みを検討し、そのplatformを開発した。1)本研究は画像・ビデオの意味のあいまいさと人間がそれに対する解釈の多義さをうまく反映できるために、画像・ビデオの意味はあらかじめに設定したdomain/categoryとの連想値によるデータ構造で表現すると提案した。さらに、lexicon's paradigmatic relationを参考する上で、各category間の関係を表明できるsemantic tolerance relation modelを構築し、その相互関係を数値化する方法を考案した。そのために、domainやクラスの追加、削除に伴う分類器の再構築を効率的に実現できる手法を考察し、少量の学習サンプルでクラスを代表するモデルを構築する方法を検討し、有効性を検証した。3)ビデオをshotに分割し、そして、shotを代表するkey-frameを抽出する。その上で、image/key-frameの意味を表現する有効手法として、あらかじめに設定したdomain/categoryとの連想値によりimage/key-frameを自動的に登録する実現方法を検討した。実験結果はsemantic tolerance relation modelの導入がcategoryに対する連想値の計算精度の向上に役に立ったことを示した。4)上述の成果を基づいて、分散ユーザによる分散環境をベースした大規模画像・ビデオの意味自動登録と検索システム構築の仕組みを検討し、そのplatformを開発した。さらに、上述データ構造で得た画像・ビデオの意味metadataは画像の意味のあいまいさと解釈の多義さをうまく反映できることを5人の被験者のcross-domain/category queryによる画像・ビデオの検索結果により検証した。そのうち、5人の被験者のtarget画像における検出率の平均は82%であり、その有効性を示した。
在宅医療における看護婦の裁量権拡大と医療の質の変化に関する研究

本研究の目的は、在宅医療における看護婦の裁量権拡大と医療の質との関係を、訪問看護ステーションにおけるミクロデータをもとに、定性的・定量的に明らかにすることである。英国におけるプライマリケアでは、クライアントに対するサービス内容の決定に、訪問看護婦(district nurse)が幅広い裁量権を持ちつつある。この背景には、医療コストの削減問題だけでなく、サービス提供におけるスキルミックスの進展が、クライアントの生活や健康管理をより促進させるという期待がある。われわれは、英国での訪問調査を平成11年に実施した後、日本のミクロデータ収集のための全国調査を、平成12年7月に実施した。英国では、在宅医療の質の向上に看護婦の裁量権拡大が寄与するという先見的期待のもとに、看護婦の裁量権拡大の試行が実施されつつある状況であった。訪問時、そのアウトカム評価に向けたNHSのデータベース開発のためのプロジェクトが進行していた。英国のこのような政策レベルでの動きに対し、日本国内の現場面接調査の結果からは、現場レベルでの動きの方が先行している可能性が示唆された。そこで、訪問看護婦の裁量範囲を示す指標を絞り込み、全国約3000カ所の訪問看護ステーションに対して、医療依存度の高い利用者に対する訪問看護婦の裁量状況について質問紙調査を行った。その結果、約600ステーションから約1000ケースのデータが回収され、訪問看護婦の裁量範囲について、(1)患者の手持ち薬剤の使用(2)ステーションへの置き薬剤の有無とその取り扱い(3)相対的医行為の実施状況(4)薬剤オーダーの主治医への依頼(5)検査オーダーの主治医への依頼という点において、質の高い看護婦が担当する場合には、かなりの裁量を与えていることが示唆された。その成果としては、(1)在宅患者への迅速な対応(2)(迅速な対応があるゆえか)通院回数を減少させる可能性が示唆された。本研究では、在宅医療における看護婦の裁量権拡大と医療の質との関係を、訪問看護ステーションにおけるミクロデータをもとに、定性的・定量的に明らかにすることを目的としている。英国では、在宅医療の質の向上に看護婦の裁量権拡大が寄与するという先見的期待のもとに、看護婦の裁量権拡大の試行が実施されつつあるが、日本では未だその動きはない。この関係性をより鮮明にするために、本研究では英国と日本との比較を試みている。平成11年度は、両者の実態構造をあきらかにするために、日本と英国の全体的な統計資料の収集の他に、訪問調査によって最新の動きに関する情報収集を行った。英国における訪問調査は、ロンドンとエジンバラの2カ所で、それぞれAudit CommisionとISD(Information and Statistic Division)を訪問した。ロンドンのAudit Commisionでは、当該組織が所有する最新の調査結果をもとに、英国の訪問看護サービスの提供構造(スキルミックスの状況と提供サービスの関係)、その評価手法および用いている指標、家庭医・専門医との関係等について、率直な意見交換を行った。スコットランドのISDでは、訪問看護のアウトカム評価の可能性に関する議論を行った。これらの調査を通して、訪問看護というサービス内容は拡大も縮小も可能な不安定状態にあるが、その必要性は経験的に認知されつつあることから、当該サービスを積極的に評価し、公的財源を投入することの妥当性を科学的に証明することが求められていると判断された。すなわち、(1)何が成果なのか、(2)その成果指標として何が使えるのか(3)構造・過程と成果との関係性の証明に関する実証研究が必要であることが認識できた。(1)(2)(3)を英国・日本の2国間で比較することによって、訪問看護婦の裁量権と医療の質との関係がよりわかりやすくなる可能性が示唆された。

本研究の目的は、在宅医療における看護婦の裁量権拡大と医療の質との関係を、訪問看護ステーションにおけるミクロデータをもとに、定性的・定量的に明らかにすることである。英国におけるプライマリケアでは、クライアントに対するサービス内容の決定に、訪問看護婦(district nurse)が幅広い裁量権を持ちつつある。この背景には、医療コストの削減問題だけでなく、サービス提供におけるスキルミックスの進展が、クライアントの生活や健康管理をより促進させるという期待がある。われわれは、英国での訪問調査を平成11年に実施した後、日本のミクロデータ収集のための全国調査を、平成12年7月に実施した。英国では、在宅医療の質の向上に看護婦の裁量権拡大が寄与するという先見的期待のもとに、看護婦の裁量権拡大の試行が実施されつつある状況であった。訪問時、そのアウトカム評価に向けたNHSのデータベース開発のためのプロジェクトが進行していた。英国のこのような政策レベルでの動きに対し、日本国内の現場面接調査の結果からは、現場レベルでの動きの方が先行している可能性が示唆された。そこで、訪問看護婦の裁量範囲を示す指標を絞り込み、全国約3000カ所の訪問看護ステーションに対して、医療依存度の高い利用者に対する訪問看護婦の裁量状況について質問紙調査を行った。その結果、約600ステーションから約1000ケースのデータが回収され、訪問看護婦の裁量範囲について、(1)患者の手持ち薬剤の使用(2)ステーションへの置き薬剤の有無とその取り扱い(3)相対的医行為の実施状況(4)薬剤オーダーの主治医への依頼(5)検査オーダーの主治医への依頼という点において、質の高い看護婦が担当する場合には、かなりの裁量を与えていることが示唆された。その成果としては、(1)在宅患者への迅速な対応(2)(迅速な対応があるゆえか)通院回数を減少させる可能性が示唆された。
トランスジェニック技術を用いた軟体動物貝殻形成遺伝子の機能解析

軟体動物の貝殻形成機構を解明するため、巻貝類のモノアラガイ、セイヨウカサガイ、クサイロアオガイ、二枚貝類のアコヤガイ、および頭足類のオウムガイ等を用いたゲノム解析、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析を行うとともに、胚への遺伝子導入技術の開発や各種阻害剤による遺伝子産物の機能解析を行った。その結果、貝殻の初期発生に関連した遺伝子経路と貝殻成長における巻きと捩れを制御するタンパク質を発見したほか、貝殻基質タンパク質を網羅的に同定し、それらの機能や進化プロセスを推定するとともに、軟体動物における遺伝子導入実験系を確立するなどの成果を得た。巻貝類については,これまでの研究から貝殻腺や外套膜における貝殻の成長勾配を生み出し,規則的な螺旋成長への関与が示唆される遺伝子dpp,およびその上流遺伝子や関連因子と推察されるnodal, engrailed,レチノイン酸等について,発現解析と機能解析を行った.また,dpp遺伝子との関連が予想される遺伝子の探索を行なうため,次世代シーケンサーを用いたEST解析を笠型の貝殻を持つセイヨウカサガイ(Patella vulgata)と螺旋状に貝殻が巻くタケノコモノアガイ(Lymnaea stagnalis)について行なった.その結果,セイヨウカサガイにおいて,貝殻形成への関与が期待されるengrailedとその上流と考えられるレチノイン酸経路の関連遺伝子(レチノイン酸合成酵素cyp26,レチノイン酸分解酵素Aldhla2,Hox2,3,4,5)および,その他の初期発生時の形態形成に重要な数多くの遺伝子(soxB,goosecoid,brachury,pitx)の単離を行なうことができた.また,レチノイン酸経路を詳しく調べるために,セイヨウカサガイの胚をレチノイン酸あるいはレチノイン酸合成酵素阻害剤で処理し,代表的な発生ステージ(胞胚期,原腸胚期,トロコフォア期,ベリジャー期)で胚を固定し,in situハイブリダイゼーション法による遺伝子発現解析を行なった.二枚貝類については,アコヤガイのゲノム概要配列のアノテーションを行い,本研究計画で機能解析を行うアスペイン遺伝子の他,数多くの貝殻形成関連遺伝子と初期発生の関連遺伝子を同定した.また,本研究の遺伝子機能解析で用いる各種発現プロモータ配列もアコヤガイゲノムにおいて同定した.さらに,実験室内においてアコヤガイの初期発生を行うための親貝,幼生の飼育系を確立した.アコヤガイにおいてトランスジェニック系統を作出するために、以下の実験を行った。(1)ベータチューブリンおよびベータアクチン遺伝子のプロモーター領域の単離、(2)minosトランスポゾンを含むプラスミドへの上記プロモーターおよびeGFP遺伝子のクローニング、(3)トランスポゼースを含むプラスミドへの上記プロモーターのクローニング、(4)上記プラスミドのアコヤガイ受精卵へのエレクトロポレーションによる導入。これまでに、アコヤガイ受精卵にエレクトロポレーションがベストな状態で行われる条件検討を体系的に行っており、受精卵にプラスミドDNAが取り込まれる電圧、通電時間等を明らかにした。アコヤガイの上述プロモーターが受精卵において働いているかどうか現在確認を行っている。また、アコヤガイに関しては、一昨年出版されたゲノム概要配列に含まれる一連の遺伝子の同定、解析(アノテーション)を行い、Zoological Science誌の特集号として論文集を出版した。これらの成果は、トランスジェニック技術を用いた今後の遺伝子機能解析のための基礎的な情報を提供する。モノアラガイに関しては、マイクロインジェクションによる遺伝子導入を行うための基礎的実験を行った。具体的には、受精卵への色素のマイクロインジェクションと、卵膜を除去し、むき出しにした胚を毛細管内で発生させる飼育実験を行った。今後さらに条件検討を勧め、遺伝子導入を行う。モノアラガイでは、貝殻のらせん成長に関与する遺伝子としてdpp遺伝子の発現解析を進め、dpp遺伝子が発生初期だけでなく、幼生期、成体期においても外套膜において、らせんに巻く貝では左右非対称に、モノアラガイの右巻き系統と左巻き系統では鏡像対象に、傘型の貝では左右対称に、それぞれ発現していることを明らかにした。今年度は、(1)巻貝における貝殻の巻きのメカニズムの研究、(2)二枚貝における貝殻タンパク質の機能解析、(3)アコヤガイゲノムにコードされている遺伝子の研究を行った。(1)に関しては、dpp遺伝子が笠型の貝殻を持つカサガイでは左右両側で発現するのに対し、右巻きのモノアラガイでは外套膜の右側の、左巻き突然変異体のモノアラガイでは左側の特定の部位でのみ発現していることを明らかにした。さらにリン酸化Smadに対する抗体を用いた解析により、dpp遺伝子産物の受容体も同様に、貝殻の左右性に対応した左右非対称(もしくは左右対称)の働き・発現をしていること、すなわちdppが貝殻の後期発生(成長)において左右非対称な成長を調節している可能性が高いことを明らかにした。また、dppの上流で発現していることが示唆されていたレチノイン酸(RA)経路に関する研究を行い、RA経路が無脊椎動物で機能していることを初めて明らかにするとともに、RA分解酵素(Cyp26)の発現が貝殻形成領域のRA濃度の低下を引き起こすことでengrailed遺伝子を発現させ、貝殻形成を制御している可能性が高いことを明らかにした。(2)に関しては、アコヤガイのゲノム配列をもとに、EF-1alpha遺伝子とGAPDH遺伝子の発現プロモータの単離を試みた。今後、これらの発現プロモータを組み込んだトランスポゾンコンストラクトを用いることで、貝殻タンパク質アスペインの遺伝子ノックダウンの実験を行う。

(3)については、アコヤガイゲノムにおいて、初期発生に重要な代表的シグナル分子の4種類のスーパーファミリー(FGF, Hedgehog, Wnt, TGF-beta)と貝殻基質タンパク質をコードする遺伝子の網羅的同定作業を行い、他の動物門のデータと比較することで、これらの遺伝子の進化プロセスを明らかにした。アコヤガイにおいてトランスジェニック系統を作出するために、昨年度に引き続き、アコヤガイあるいはハエのハウスキーピング遺伝子プロモーターとGFPを含むプラスミドのアコヤガイ胚へのエレクトロポレーションの実験を行った。まず、プラスミドなしで、電圧と静電容量の2つのパラメータについて、いくつかの組み合わせを試し、エレクトロポレーションによって胚のおよそ3割が電流によって壊れずに生き残る条件を割り出した。その後、プラスミドを含む溶液中でエレクトロポレーションを行い、プラスミドが胚に導入されたことをPCR法によって確認した。一方で、これらの方法でプラスミドを導入した胚においてGFP遺伝子の発現による蛍光が確認されなかったため、現在別の遺伝子のプロモーターを用いて、実験を行っている。モノアラガイについては、貝殻基質タンパク質のプロテオーム解析と外套膜のトランスクリプトーム解析を行い、127種の貝殻基質タンパク質を同定した。これらのうち、29種はデータベース検索により既知のタンパク質に同定されたが、残りの98種は新規タンパク質であることを明らかにした。頭足類のオウムガイでも同様に貝殻プロテオーム解析と外套膜のトランスクリプトーム解析を組み合わせた解析を行い、新規タンパク質を発見し、他の貝殻タンパク質とも共通するドメインを同定した。また、モノアラガイの発生初期のいくつかの段階で、発生に重要なシグナル伝達因子であるWntの促進剤と阻害剤による機能解析実験を行った。その結果、ベリジャー期におけるWnt促進剤処理区で、貝殻が正常に立体的に巻かず、平巻きに近い巻きを示す変異体が複数観察された。このことから、Wntが、すでに先行研究で貝殻形成に関与することが示されているシグナル伝達因子のDppとともに、貝殻の巻きのメカニズムに深く関与している可能性が示唆された。今年度は、アコヤガイ(二枚貝類)とクサイロアオガイ(巻貝類)を用いて、マイクロインジェクションによる受精卵への遺伝子導入を試みた。その結果、卵サイズの大きいクサイロアオガイにおいて、より確実に遺伝子導入ができることを確認した。そこで、クサイロアオガイの貝殻基質タンパク質のin vivo機能解析を行うためのDNAコンストラクトの作成を行った。また、モノアラガイ(巻貝類)の貝殻基質タンパク質に関しては、貝殻に含まれるタンパク質のうち、貝殻形成のために機能しているものと、たまたま貝殻に取り込まれてしまったものとを区別するため、右巻きの貝殻をつくる成貝3個体の外套膜を左右に分け、それぞれの合計6サンプルについてトランスクリプトーム解析・発現量解析を行った。
メチル化抵抗性ウイルス感染に対する宿主応答

レトロウイルスの遺伝子発現は、感染した宿主細胞による不活性化を受ける。レトロウイルスの潜伏感染機構の解明とレトロウイルスベクターの発現低下という欠点の克服を目指し、われわれは、マウス白血病ウイルス(MLV)由来のレトロウイルスベクターから、宿主のメチル転移酵素の基質となるDNA配列「CpG」を塩基置換により可能な限り除去して「メチル化され得ない変異ウイルスベクター」を構築することにした。これにより宿主細胞がゲノムに組み込まれたウイルス遺伝子を不活性化する機構を、DNAのメチル化によるもとそれ以外に区別して明らかにしたい。まず、マウス白血病ウイルス由来のレトロウイルスベクターpBabe puroを出発材料とし、2つの機能部分について、メチル化の標的となるCpGを別の塩基に置換する作業を進めた。(1)puromycin耐性遺伝子は199個のアミノ酸からなる。そこで、コードされるアミノ酸配列を変えないように102個のCpGをすべて他の塩基配列に変更し、長さ30塩基のオリゴヌクレオチド44本にわけて合成した。全長の塩基配列を決定したあと、発現ベクターに挿入して細胞にpuromycin耐性を付与するかを検討した。(2)Long terminal repeat(LTR)は転写調節を担うエンハンサー・プロモータを含む。LTR領域をさらにエンハンサー領域、プロモータ領域、R領域、U5領域に分け、各領域内をCpG-freeにしてLTRの転写活性を測定した。今後、これらの変異の統合などにより、CpG-free LTRや「メチル化され得ない変異ウイルスベクター」の構築を進める。
学校参加の条件となる保護者意識の形成過程に関する研究

保護者の学校参加を展望する際の鍵として、教室の子どもたちに向けられる共通関心が保護者において形成されることに着目した研究を当該年度も継続して行った。前年度には、これまでの研究において対象としてこなかったタイプの保護者に関わる問題を扱うインタビュー調査を実施し、トランスクリプトを作成して分析に着手していたが、当該年度は、まず、この前年度実施調査で得られたインタビュー・データの分析を完成させ、論文にまとめた。ここでの調査の対象としたのは、わが子の特性に困難を抱える保護者である。そうした保護者にあっては、例えば、わが子以外の子どもたちとわが子とを優劣の視点から比較することにより、共通関心の形成がなされ難いと推測される。あるいは、そうした保護者に共通関心が形成されることがあった場合、その共通関心には、わが子に向けられる私的関心との間で独自の連関をなす可能性もある。これらの点を想定しながら調査データを分析した結果、そうした保護者にあっても共通関心の形成がなされうること、その条件が学校や教室の状況、担任教師と保護者との関係や、教師の働きかけといった点にあること、また、そうした保護者の私的関心に質的な変容が生じうることなどが明らかになった。加えて、当該年度には、これまで継続している対象に対する調査を重ねて行った。そのほか、新規の対象を開拓して調査を実施し、データを得たうえで、保護者の学校参加に関わる研究視点を新たに設定しつつ、そのデータの分析にも着手した。研究実施計画に沿うことができたため。また、遂行中に生起した課題にも取り組むことができたため。当該年度に得たデータの分析を進め、成果をまとめる。近年の学校参加論において、保護者の私的関心の排他性の問題が不可避の論点となっている。研究代表者はこれまで、この問題に対して、教師の働きかけによって教室の子どもたちに向ける共通関心が保護者において形成されうることやその条件を明らかにしてきた。本研究はこの成果をさらに発展させるものであり、これまでの研究において対象としてこなかったタイプの保護者に関わる問題をも対象に含め、多様な保護者において学校参加の条件となる意識がいかに形成されうるかを明らかにすることを目的としている。研究初年度は、新規に研究のフィールドを開拓し、当該フィールドにおける研究課題を把握・設定したうえで、調査を進めデータを収集し、分析に着手した。また、これまでの研究のフィールドにおいても、新たな課題を設定して調査を進めデータを収集し、分析に着手した。おおむね当該年度の研究実施計画に沿って各調査が進展し、当初必要だと考えていた研究データが得られたため。得られたデータを分析し成果にまとめる作業を進めつつ、さらに必要な調査を実施する。研究対象に固有の事情により、出張による調査回数が当初予定を下回り、旅費が抑制されたため。次年度の出張による調査によって使用する計画である。研究対象固有の事情により、出張による調査回数が当初予定を下回り、旅費が抑制されたため。次年度の出張による調査で使用する計画である。
複数の人工衛星と地上観測データを用いた太陽風モーメントの電離層への伝播の解析

太陽風の運動量が磁気圏の内部に入り、磁気圏内に電場を励起してプラズマの対流を起こす過程を理解することは、磁気圏内のプラズマの物理を理解する上で重要な課題である。時間的に変動する電場を磁気圏-電離圏間でmappingする場合、様々な問題が生じてくる。今年度は、時間変化の伝播時間および電場の空間的な一様性について解析を行った。1.数時間の長期的な変動をもつ磁気圏内の電場の伝播(WKB近似が成り立たない)について位相速度の考察Alfven速度の変化する空間スケールが波長に比べて短い場合には、Alfven Modeであっても位相速度はAlfven速度よりも遅くなる。波動の方程式をnumericalに解くことによって算出したAlfven伝播時間は、Alfven速度の逆数を磁力線に沿って積分したAlfven伝播時間よりも長くなる。磁気圏の電場強度と電離圏の電場強度の比や位相差は、この2つの伝播時間を用いた場合とでは異なる。磁気圏-電離圏間のAlfven伝播時間よりも長い周期の変動については、前者のほうがAlfven伝播時間は短くなる。それよりも短い周期については、異なり方はランダムとなる。モデルにこの修正をかければ、観測データをよりよく説明できることが期待される。2.磁気圏内の電場の一様性について従来、1つの人工衛星による観測では、空間と時間の分離ができないので、観測された電場がどの程度の空間スケールを持つのか見積もることは困難であると考えられてきた。これに対し、rotE=-dB/dtを使って、磁場の時間変化から統計的に電場の空間変化を見積もる試みを行った。その結果、強度の大きな電場ほどZ方向に大きな空間スケールを持つことが示唆された。lmV/mを超えるような大きな電場は、磁気圏の断面のスケールで起きていると考えられた。本研究の最終目的である、地球磁気圏のプラズマの大規模な対流が引き起こされるメカニズムを明らかにするために、本年度は以下の研究を行った。1.磁気圏内に太陽風起源のプラズマが侵入して長周期MHD波を励起した時の電離圏応答の理論的計算2.GEOTAIL衛星とあけぼの衛星の、同一磁力線上同時の電場データ及び、地上の電気伝導度を用いた解析1.の計算の結果、磁気圏内を伝播するMHD波の電離層における反射が、電離圏において観測される時間的に変動する電場の特性に大きく影響することが明らかになった。即ち、長周期の変動については、振幅は殆ど減衰しないが時間遅れを伴って電離圏高度で観測され、比較的短周期の変動は、振幅が減衰し電離層高度では殆ど観測されない。この結果は、2.の観測結果と大変よく合うことがわかった。2.において計算との比較の対象となった観測時期はごく限られたものであるが、1.の理論的計算は、磁気圏の電場変動に対する電離層の応答特性が電離層の電気伝導度に大きく依存することを示唆し、従って季節依存することを示している。6月に東京で行われた地球惑星科学関連の合同学会において、中間結果の口頭発表を行った。9月にトルコで行われた磁気圏境界面外部の物理に関する国際会議で招待講演を行った。10月には札幌で行われた国際会議(S-RAMP)において口頭発表を行った。また。これまでの結果をshort letterにまとめたものを、国際雑誌に投稿した。
C型肝炎ウイルスの増殖と発がん病原性に関与する宿主リン酸化酵素の解析

C型肝炎ウイルスの複製・病原性責任宿主因子であるリン酸化酵素を標的とした、新規抗ウイルス・肝癌戦略開発に従事した。新規in vitro酵素活性測定系を樹立し米国食品医薬品局承認薬ライブラリを用いた探索の結果、最も顕著な抑制効果を示した抗酒剤を解析した。酵素反応速度論・構造化学的検討から予測された阻害様式と、培養細胞系で観察された抗線維化シグナル効果、選択的抗癌作用、抗ウイルス効果を国際誌に報告した。本研究はゲノムワイドスクリーニングによりC型肝炎ウイルス(HCV)複製を支持する宿主因子であることが示唆されたストレス誘導性リン酸化酵素に関して、HCVの複製・病原性促進機序を解明しその分子機構を標的とした新たな抗ウイルス性肝炎戦略の開発を目指している。これまでに本酵素機能欠失変異体の解析より酵素活性がHCV増殖と線維化シグナル促進に寄与し、細胞系での酵素阻害活性が報告されている糖尿病治療薬が抗HCV効果と抗線維化シグナル効果をもたらすことを報告した。続いて上記変異体解析系による探索的調査の結果、本酵素が酵素活性を介して発癌・癌促進機構にも関与していることを見出している。こうした病理作用に基づき特に酵素活性は第一義的な薬剤標的と考えられ、阻害剤探索を目的として条件を検討してきたin vitro酵素活性測定系の最適化が完了した。そこでとりわけ肝炎・肝癌への予防・治療的適用を視野に入れ、FDA承認薬ライブラリを用いたスクリーニングを実施した。その結果複数の候補阻害剤が単離されたが、最も強力な抑制効果を示した薬剤に関して詳細な解析を行った。酵素・構造化学的検討からは抑制様式が予測され、実際に培養細胞系では試験管内の抑制効果に合致した抗線維化シグナル効果と抗癌効果が観察された。この発見は承認薬を利用した実効性を伴いつつ、未解明な部分が多い酵素自身の生化学・細胞生物学的特性の理解につながる新規知見として、現在国際誌にて査読下にある。同時に酵素結合因子や酵素転写発現阻害剤の探索と解析を継続して進めており、基質候補や発癌機構との関連から、肝炎病態改善と肝癌・肝発癌の抑止を目指した、酵素標的リン酸化の生病理、ウイルス増殖機構、肝炎病態進展機構の解明が期待される。当該リン酸化酵素活性in vitro測定系の条件検討を進めた結果、評価に適切である酵素活性レベルとダイナミックレンジの確保に成功し、既知の阻害剤による顕著な酵素活性抑制も観察され、化合物の酵素活性阻害評価系としての最適化が順調に完了した。当初の計画通りFDA承認薬ライブラリを用いて探索を実施した結果、複数の薬剤による酵素活性阻害が認められ、最も強力な効果を示したものについて詳細な解析を行ったところ、濃度依存的抑制が確認され酵素阻害様式が判明した。加えて本酵素の病理学的特性であるTGF-betaシグナル伝達経路と癌細胞増殖の促進効果に対する影響を肝癌細胞株にて検討したところ、同定した薬剤による抑制効果が明らかになった。これらの新規知見は国際誌への投稿を経て現在査読下にある。一方で樹立した本酵素遺伝子プロモータルシフェラーゼレポータ安定発現細胞においても条件検討が進み、本酵素mRNA発現レベルを促進することが報告されているサイトカイン処理を施したところシグナル上昇が確認され、クローン毎の基底活性レベルや応答性を考慮した細胞系最適化が完了した。現在研究計画通りFDA承認薬ライブラリを用いた探索を実施しており活性阻害効果を示した複数の薬剤が単離されている。本研究の目的は、ゲノムワイドスクリーニングによりC型肝炎ウイルス(hepatitis C virus: HCV)の複製を支持する宿主因子であることが示唆されたリン酸化酵素の、HCV複製・病原性促進機序解明とその分子作用を標的とした新規抗ウイルス性肝炎・肝癌戦略開発である。これまでに本酵素機能欠失変異体を用いて、酵素活性がHCV増殖と線維化シグナルを促進し、培養細胞系での酵素阻害活性が報告されている糖尿病治療薬が抗HCV効果と抗線維化シグナル効果をもたらすことを報告した。加えて本酵素が発癌・癌促進機構にも関与していることを見出した。それゆえ本酵素活性が効果的な薬剤標的と考えられるため、阻害剤探索を目的として新規in vitro酵素活性測定系を樹立した。とりわけ肝炎・肝癌の予防・治療応用を視野に入れ、米国食品医薬品局承認薬ライブラリを用いた探索を実施した結果、複数の候補阻害剤が単離されたが、最も顕著な抑制効果を示した抗酒剤について詳細に解析した。酵素・構造化学的検討からは阻害様式が予測され、培養細胞系では試験管内の抑制効果を反映した、抗線維化シグナル効果、選択的抗癌作用、抗HCV効果が観察された。この発見は、安全性の高い承認薬を利用した実用性を有しながら、酵素自身の生化学的特性の理解につながる新規知見として、国際誌に報告した。なお現在、上記単離された他の阻害剤に関する検討と共に、酵素結合因子や酵素の新規標的分子・経路の探索と解析を継続しており、酵素標的リン酸化の生病理や肝病態のさらなる解明が期待される。