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九州大学における学徒出陣・学徒動員

いわゆる学徒出陣・動員に関しては、それが国策であったことから、最初は制度史・政策史研究として始まった。しかし、近年では個別の大学の事例に拠った研究もなされるようになってきた。しかし、多くの大学の場合、基本資料の整備・作成は未だ不十分なところも少なくない。本研究の目的は、このような状況を踏まえて、(1)九州大学内外における資料調査と、(2)研究にあったが、このうち(1)については、初年度に基本資料となる応召者の名前や人数等の確認作業を行った。その結果、多くの学徒の確認をすることができた。次に次年度は、前年度の成果に基づき、より細かな調査を行うことにした。先ず、資料の収集では、九大出身の「学徒出陣」経験者の聞き取り調査を行った。生々しい「証言」はそのもの自体が貴重な資料であり、本年度刊行の『成果報告書』に収録している。また、『同書』には、「九州帝国大学新聞」の学徒出陣・学徒動員関係記事と、「西日本新聞」の関係記事も収録した。次に(2)の研究活動では、初年度に藤岡健太郎「学徒勤労動員除外と科学研究動員-九州帝国大学の事例を中心に-」(A論文)を、次年度には折田悦郎「九州帝国大学における学徒出陣について」(『成果報告書』所収。以下同)、藤岡健太郎「学校報国隊の編成と活動-政策決定過程と九州帝国大学の事例に関する研究-」(B論文)、佐喜本愛「帝国大学における軍事教練-九州帝国大学を事例として-」を発表した。折田論文は収集データをもとにした表やグラフも使用して「学徒出陣」について論じたもの、藤岡A・B論文はともに従来不十分であった科学研究動員と学校報国隊について、実証的な考察を加えたものである。また、佐喜本論文は、学徒出陣の前史として学生と軍事を結び付けていた教練に着目し、九州帝大での軍事教練について明らかにした。これらの論文は、従来殆ど指摘されてこなかった論点に焦点を当てた専論である。いわゆる学徒出陣・動員に関しては、それがまさしく国策であったことから、最初は制度史・政策史研究として始まった。しかし、近年ではより個別の大学の事例に沿った研究もなされるようになってきた。『東京大学の学徒動員・学徒出陣』(東京大学出版会、1998年)をはじめ、明治、大谷、拓殖、立教、京都大学等から各個別の研究が出されている。この事実は、これらの大学における大学アーカイヴズの活動とも無関係ではないが、ただ多くの大学の場合、基本資料である動員・応召者等の調査は、まだまだ不十分なところも少なくない。本年度の目的は、このような状況を踏まえて、九州大学内外における資料調査(含予備調査)を行うことにあったが、このうち先ず基本となる応召者の確認作業では、九州大学大学文書館・本部事務局所蔵資料や、各部局「同窓会名簿」等の調査を行った。この結果、昭和18年12月のいわゆる「学徒出陣」だけではなく、それ以前に遡って千数百人の応召を確認することができた。次年度はこれらのデータをもとにして新たな分析を行いたい。なお本年度は、以上の調査のほかに、研究協力者の藤岡健太郎「学徒勤労動員除外と科学研究動員-九州帝国大学の事例を中心に-」の発表も行った。同論文はその題名が示すように「科学研究動員」について考察したもので、従来ほとんど論じられて来なかった分野の専論である。

昨年度(平成18年)は、九州大学内外における資料調査を行い、先ず基本となる応召者の名前や人数等の確認作業を行った。その結果、九州大学大学文書館等の調査を通じて、多くの学徒の確認をすることができた。本年度(平成19年)は、これらの成果にもとづき、より細かな調査と研究を行ったが、先ず、資料の収集においては、九州大学出身者で「学徒出陣」を経験された方々の聞き取り調査を行うことができた。平均年齢80余歳の人々の生々しい「証言」は、今となってはそのもの自体が大変貴重な資料であり、本年度刊行の『成果報告書』に収録した。また、同じく『成果報告書』には、「九州帝国大学新聞」の学徒出陣・学徒動員関係記事と、「西日本新聞」の関係記事をまとめたものも収録した。次に研究活動では、研究代表者の折田悦郎「九州帝国大学における学徒出陣について」(本報告書所収。以下同)が、収集データをもとにした表やグラフも使用して九州帝国大学時代の「学徒出陣」について論じ、研究協力者の藤岡健太郎「学校報国隊の編成と活動-政策決定過程と九州帝国大学の事例に関する研究-」は、従来十分な検討がなされていなかった「学校報国隊」について、九州帝国大学の事例に即して実証的な考察を加えた。また、佐木本愛「帝国大学における軍事教練-九州帝国大学を事例として-」は、学徒出陣の前史として学生と軍事とを直接結び付けていた教練に着目し、九州帝国大学での軍事教練について明らかにした。これらの論文は従来殆ど指摘されてこなかった論点に焦点を当てた専論である。
c-Jun発現に着目した卵巣がん化学療法耐性克服への取り組み

卵巣がんは抗がん剤に対して抵抗を持つものがあり、治療に難渋することが多い。我々は分子標的薬であるJNK阻害薬が卵巣がんの抗がん剤に対する抵抗性を弱める可能性を見出した。特に卵巣がん細胞を用いた実験では、JNK阻害薬を抗がん剤使用前に投与することで、より抗がん剤の効果を増強させることが明らかになった。また子宮内膜症治療薬として臨床試験が行われているJNK阻害薬AS602801は、卵巣がんの再発などの原因となる卵巣がん幹細胞に対しても効果を示すことが分かった。比較的シスプラチンおよびパクリタキセルに対して耐性を持つヒト卵巣がん細胞株を用いて検討を行った。これらの細胞においてc-Junが薬剤耐性に関与するか検討を行った。まずはじめにc-Junの機能を抑制した際に化学療法耐性を減弱させるか検討を行った。c-Junの機能を抑制する方法としてc-Junに対するsiRNAを細胞に導入しc-Junの発現を抑制することにした。c-Junの発現を部分的に抑制した状態でシスプラチンを処理したところ、予想に反してc-Junの発現を抑制した細胞でPARPの切断量が減少した。つまり卵巣がん細胞においてc-Junの発現を抑制した状態ではシスプラチンによる細胞死を抑制される可能性を示唆するものであった。この結果は我々の仮説を支持しない結果であり、今回のc-Jun抑制ではシスプラチンに対する耐性を減弱しなかった。そこでc-Junをリン酸化するc-Jun NH2-terminal kinase (JNK)に着目した。予備実験ではJNK阻害薬であるSP600125(以下SP)を用いてJNK活性を抑制するとc-Junの発現量が低下することが分かっている。そこでSPを用いて卵巣がん細胞のc-Jun発現を抑制することにした。我々の仮説通り、卵巣がん細胞株にSPとシスプラチンを同時に用いることでシスプラチンの抗腫瘍効果を増強させた。一方、SPとパクリタキセルを同時に用いると逆に抗腫瘍効果を減弱させたが、JNK阻害薬を前処理した後にパクリタキセル処理(逐次処理)を行うとパクリタキセルの抗腫瘍効果を増強することを見出した。同様の逐次処理をSPおよびシスプラチンで行ったところパクリタキセルと同様にシスプラチンの抗腫瘍効果を増強させた。このことからJNK活性は卵巣がんの化学療法抵抗性に必要であることが示唆されたが、シスプラチンおよびパクリタキセルにより誘導されるストレス応答性JNK活性化とは異なった役割を担っている可能性も考えられた。以上の結果を国際誌であるOncology Reportsに投稿・受理された。申請時点で得ていた予備実験結果を踏まえて研究した結果、仮説を支持する結果がin vitroで得られ論文投稿に至っている点から、当初の計画以上に進展していると判断した。昨年度においてin vitroの研究結果からJNK特異的阻害薬であるSP600125とパクリタキセルないしシスプラチンの逐次処理でパクリタキセルおよびシスプラチンの殺細胞効果を高めることを明らかにし、国際誌であるOncology Reportsに投稿し掲載された。その後、同様の現象がin vivoで確認されるか検証するために、卵巣がん担癌マウスモデルを用いて、Control、SP600125単剤、パクリタキセル単剤、SP600125+パクリタキセル(同時投与)、SP600125+パクリタキセル(逐次投与)の5群で比較を試みつつあるが、まだ卵巣がん動物モデル作成や薬剤投与の条件を検討している段階であり、本研究実施期間中には有効性の実証にまでは至っていない。上記とは別に申請者および所属する研究室では卵巣がんをはじめとするがん幹細胞の幹細胞性維持にJNKシグナルが必要であることを報告してきたが、これまでに使用してきた多くの論文に使用されているSP600125はヒトに対して安全性が報告されているわけではなかった。近年、子宮内膜症治療薬AS602801はJNKを標的とする分子標的薬がphase2試験をクリアし、ヒトに対して使用可能となったことから、申請者が樹立した卵巣がん幹細胞に対しその有用性に対する研究を行った。すると、AS602801はがん幹細胞に対して、弱いながらも殺細胞性の効果があり、それとともに生存した細胞に対してはがん幹細胞性を喪失させた。さらに腫瘍創始能も顕著に抑制し、目立った副作用も見られなかったことから、これまでに報告してきたJNK阻害薬と同様の効果があることがわかり、がん幹細胞標的治療薬としての可能性を強く示唆することとなった。この成果を国際誌であるOncotargetに投稿し、掲載されるに至った。今後は卵巣がん治療モデルマウスを作製するため、卵巣がん移植モデルマウスを用いて、JNK阻害薬とシスプラチンないしパクリタキセルの同時投与で抗腫瘍効果を増強させるか検討を行う予定である。婦人科腫瘍昨年度はin vitroでの実験を行っており、本年度はin vitroの実験と並行して動物実験を予定している。

試薬購入費および動物購入とそれらの経過観察が長期に渡ることが予想されるため、その飼育費などが主な理由である。上記にも記載した通り、試薬購入および動物購入、動物飼育費として主に使用する。また、本年度に得られた結果をさらに発展させるための試薬購入などに使用する予定である。
ヒトサイトメガロウイルスを中和するヒトモノクローナル抗体の機能解析

1.中和抗原への結合力(反応速度論的解析)単離クローンは、VHのアミノ酸配列により14種(H0lH14)に分類でき、14種はすべて中和抗原gBの膜外領域組換えタンパクgB654に対して結合活性を示した(ELISA法)。そのうち7種(H02,H03,H04,H05,H08,H09,H14)について、SPR(表面プラズモン共鳴)法を利用した反応速度論的解析を行ない、いずれもgB654に対して強い結合力(K_D=9.2-0.53(nM))を示した。2.エピトープ解析結合力が明らかとなった7種のクローンが認識するgB654分子上のエピトープを簡便に分類するため、SPR法で任意の2抗体の競合実験を行なった。その結果、H05とH09,H05とH14の組み合わせでは互いの結合が他の結合を阻害せず、それぞれ異なるエピトープを認識していることが示唆された。全ての組み合わせによる実験の結果、7種の抗体は3グループ(a:H05,b:H09,H14,c:H02,H03.H04,H08)に分類された。3.中和活性解析14種のクローンはFabl価の抗体では、いずれも中和活性を示さなかった。そこで、7種のうちの3種(H05,H08,H14)について、遺伝子組換えによりIgG型抗体を作製したところ、50μg/mlで50%プラーク抑制を示す程度の中和活性を示した。現在、さらに4種(H02,H03,H04,H09)のIgG抗体を作製しており、それらの中和活性についても評価する予定である。
大脳皮質局所回路ニューロンの役割

大脳皮質は多様なニューロンからできているが、これらの間にどのようなシナプス結合選択性があるかはよくわかっていない。先ず、皮質GABA作働性非錐体細胞の軸索、樹状突起上でシナプスがどのように作られていくのかをみるために、シナプスブトン、スパイン形成の確率分布をサブタイプごとに調べた。シナプスブトン・スパインの間隔分布どれも指数関数で近似できるが、サブタイプごとにそれらの平均値は異なっていた。シナプスブトン・スパイン間隔が指数分布していることから、シナプスが突起上にランダムに配置されていると考えられる。実際、軸索上のシナプスブトン密度は細胞体からの距離に依存していなかった。突起の屈曲とシナプス形成の関係をみるために、軸索・樹状突起分枝ごとの曲がりくねりと分枝上のブトン・スパイン密度を計測した。ブトン・スパイン分枝密度の平均値はサブタイプごとに異なるが、ほぼ同じ変動係数(CV)のガウス分布に従い、分枝長とは相関していなかった。非錐体細胞はサブタイプごとに異なる頻度でシナプスを作るが、どのタイプでも突起上に一様に、局所的にはランダムにシナプス配置していることがわかった。非錐体細胞の中には、その出力先の部位が非常に選択的なものから、FSバスケット細胞のように細胞体から樹状突起のシャフト・スパインまで多様な後シナプス構造につくものまである。そこで、上記のようなシナプス配置の神経回路におけるシナプス結合の特異性をみるために、FSバスケット細胞軸索の、単一錐体細胞の樹状突起でのコンタクト部位の分布を調べた。また、FSバスケット細胞の軸索が結合のある錐体細胞の樹状突起に接近する点を求め、実際のコンタクトとの割合を調べた。その結果、FSバスケット細胞による錐体細胞表面における支配領域の組み合わせはペアーごとに多様であるが、各後シナプス細胞にとって選択的であると考えられた。大脳皮質の神経細胞が、どのような基本的な規則によって結合しているのかはまだよくわかっていない。皮質内の配線は、皮質細胞の軸索の伸長・分枝の仕方や、それに沿ってのシナプス結合の作り方で決まる。皮質の介在ニューロンである非錐体細胞は、かなり多様であり、その各サブタイプは、固有のルールで軸索分枝やシナプス形成している可能性がある。先ず、軸索ブトンがシナプス結合を作っているのを確認し、生理的に同定した非錐体細胞の細胞体・樹状突起・軸索の形態的パラメーターから、定量的にサブタイプを決めた。その後、各サブタイプについて、軸索分枝・シナプスブトン形成の局所的な性質を定量化して、比較した。その結果、次のようなことがわかった。(1)各サブタイプは、(i)軸索ブトンの細胞体にシナプスする割合、(ii)軸索の分枝する頻度、(iii)細胞体より白質側にあるブトンの割合などで同定できる。(2)軸索分岐点(ノード)での分枝間角度や軸索の曲がりくねりには、サブタイプ間で差がみられない。(3)ノードの間の距離は指数分布し、その平均(標準偏差に等しい)は細胞ごとに異なる。(4)シナプスブトン間距離も指数分布し、その平均は細胞ごとに異なる。(5)ノード間距離とブトン間距離は、独立に決まっていて、各サブタイプはそれらの値の固有の組み合わせをとる。非錐体細胞のサブタイプは、軸索に沿っての分枝・ブトン形成は同じ分布型をとるが、その間隔の組み合わせは、タイプごとに異なり、それぞれ、局所的なシナプス結合の強さ、後シナプス構造の選択に関連していると考えられる。
フェムト秒パルスラジオリシスによる極限ナノビームプロセスの創生

ナノメーターオーダーのパターンの作製過程においては、量子ビームのエネルギー付与過程から、イオン化で生成した電子の熱化過程、熱化直後の電子の反応等のフェムト秒・ピコ秒領域で起こる高速反応がレジスト解像度、感度に密接に関係していることが示されている。そのため、極限プロセス技術を確立するためには、レジストへの量子ビームのエネルギー付与過程から現像過程までの反応機構を詳細に解明することが必要不可欠になっている。ナノテクノロジーという観点から最も注目されるレジストプロセスの解像度は主に露光装置側の問題と材料側の問題に分けることができる。しかし、電子ビームは0.1nm以下に収束させられることが示されており、一般的にも直径2nm以下の電子ビームが利用可能になっている。従って、量子ビームリソグラフィの場合はプロセスの解像度は主に材料側の問題であると考えることができる。平成18年度はこれまで明らかにしたレジスト内に量子ビームによって誘起される反応の詳細から、レジストの物性値と感度、解像度等のレジスト性能の関係を明らかにすると共に、パルスラジオリシス法を用い、極限ナノビームプロセスの創生につながる放射線誘起反応の探索を行った。さらに、照射により生成するプロトンの固体レジスト中での挙動を明らかにした。これらの結果から、高分子のラジカルカチオンの水酸基の脱プロトン反応とイオン化で生成する二次電子と高分子の電子付着乖離反応を酸発生に利用する新規のレジストコンセプトを提案した。平成16年度はレジスト内で量子ビームによって生成される電子、カチオンラジカル、アニオンラジカルの挙動がレジストの空間分解能や感度とどのような関係にあるかをフェムト秒パルスラジオリシス装置と電子線リソグラフィシステムを用いて解析し、ナノビームプロセスのモデル化を行いシミュレーションコードを作成した。作製したコードを用い、現在の主流である化学増幅型レジストの反応機構に起因する解像度のボケを見積もったところ、約6nm程度あることがわかった。そのため、極限プロセス技術を確立するためには、レジストへの量子ビームのエネルギー付与過程かち現像過程までの反応機構を詳細に解明することが必要不可欠になっている。平成17年度はレジスト内で量子ビームによって生成される酸の生成機構の詳細をパルスラジオリシス法により解明し、モデル化を行った。電子ビームの軌道をモンテカルロ法により計算し、ナノ加工材料中に生成する酸のプロトン及びカウンターアニオンのナノ空間分布を明らかにした。その結果、プロトンとカウンターアニオンでは照射直後の初期分布に大きな違いがあり、プロトンよりもアニオンの方が不均一に生成されることが分かった。アニオンの不均一分布は、ナノ加工におけるパターンの表面ラフネスの原因になっていると考えられる。

これらの結果から、高分子のラジカルカチオンの水酸基の脱プロトン反応とイオン化で生成する二次電子と高分子の電子付着乖離反応を酸発生に利用する新規のレジストコンセプトを提案した。
サツマイモの効率的な交配育種のための基盤整備

サツマイモ栽培種(Ipomoea batatas)は交配不和合性を有しており、同一の交配不和合群に属する個体間では交配を行えないため、我が国が有している多種多様なサツマイモ栽培種を用いた効率的な交配育種が妨げられている。この交配不和合性は自家不和合性と同一のシステムにより制御されるが、我々は、サツマイモ栽培種の近縁野生種であるメキシコアサガオ(I.trifida)の自家不和合性遺伝子座の解析を通して、自家不和合性の自他認識に直接的に関与しているタンパク質遺伝子(S遺伝子)の最有力候補、ItAB2とItSEAを同定した。これらを元に、サツマイモ栽培種からIb-AB2とIbSEAを同定し、その交配不和合性を人為的に制御するのが本研究の目的である。研究開始初年度である昨年度は、ItAB2とItSEAをメキシコアサガオに導入し、これらが真のS遺伝子であるか否かの検討を行ったが、着花効率が悪く、また着花したとしても花粉稔性が極めて低かった。これは遺伝子導入から再分化に至るまでに長期間に渡ったことが影響したと思われた。また、サツマイモ栽培種の雄側S遺伝子IbAB2を葯から、雌側S遺伝子IbSEAを柱頭から単離するために、交配不和合群AKに属する品種・系統を栽培し、短日処理により開花促進を行い生殖器官の単離を行い、一部についてmRNAの精製を行った。これらmRNAを鋳型として、S1-, S3-, S10-, S29-,Sc-系統のItAB2およびItSEAを増幅できるプライマーを複数種用意してRT-PCRを行ったが、IbAB2, IbSEAの増幅は確認できなかった。S遺伝子型間の多様性が激しいために、単純な増幅が困難だったことが推定された。メキシコアサガオ(Ipomoea trifida)のS候補遺伝子であるItAB2とItSEAが真のS遺伝子であることを証明するためには、これら遺伝子を導入しgain-of-functionの実験を行う必要がある。研究開始初年度は、S10ホモ型系統にS1-S候補遺伝子を導入した。この場合、S1がS10よりも優性であるために単に表現型を確認することで可能であると思われたが、遺伝子導入したS10ホモ型系統の稔性が低下しており、また、長期にわたる培養により着花が低下した。この点に関しては、昨年度中に、S3Sc個体の自殖種子(Sc(自家和合性変異)はS3よりも優性であるため自殖が可能)を300個程度獲得しており、これらからScホモ型個体を選別して遺伝子導入実験に供する。また、サツマイモ栽培種の雄側S遺伝子IbAB2を葯から、雌側S遺伝子IbSEAを柱頭から単離するために、交配不和合群AKに属する品種・系統を栽培し、短日処理により開花促進を行い生殖器官の単離を行った。得られた生殖器官の一部からmRNAの精製い、これらmRNAを鋳型として、S1-, S3-, S10-, S29-,Sc-系統のItAB2およびItSEAを増幅できるプライマーを複数種用意してRT-PCRを行ったが、IbAB2, IbSEAの増幅は確認できなかった。一方、既に明らかになっているサツマイモ栽培種ゲノムに対し、ItAB2, ItSEAの相同遺伝子の存在を調査したところ、AB2やSEAと相同な遺伝子が存在していることが確認された。このことから、サツマイモ栽培種にIbAB2やIbSEAが存在してはいるもののS遺伝子の多様性によってRT-PCRによる増幅ができなかった可能性が示唆された。当初予定では、初年度中にcDNAライブラリーの構築とスクリーニングを行う予定であったが、2年目に実施することとなった。メキシコアサガオ(Ipomoea trifida)のS候補遺伝子であるItAB2とItSEAが真のS遺伝子であることを証明するため、現在栽培中のS3Sc自殖後代からScホモ型系統を選抜し、無菌化した後にItAB2とItSEAの導入を行い、得られる形質転換体を用いて相互交配および自殖を行う。形質転換体中に存在する自家不和合性に直接関与するS遺伝子は導入する遺伝子以外には存在せず、導入した遺伝子の直接的効果が確認できることが期待される。なお、Sc系統のS遺伝子座の配列解析は既に終了しており、当該遺伝子座上に機能する形のItAB2とItSEAが存在しないことが明らかになっていると共に、Sc系統については自家和合性変異体でありながらS遺伝子間の優劣性を維持していること、Scが如何なるS遺伝子型とのヘテロを形成したとしても自家不和合性/和合性の表現型を示すことから、Sc系統自体は自他認識因子のみの変異であることが推定されている。サツマイモ栽培種(I.batatas)の交配不和合性に直接的に関わるIbAB2, IbSEAを単離すべく、これまでに得られている各種サツマイモ栽培種の生殖器官よりmRNAを単離しcDNAライブラリーを調製してスクリーニングを行う。メキシコアサガオのSヘテロ系統においては劣性側のAB2は転写が抑制されていることから、まずは各サツマイモ栽培種の葯から、各交配不和合群において最優性のAB2の単離を試みる。また同時に次世代シークエンサーを用いてRNAseqを試み、ItAB2およびItSEAの相同遺伝子のスクリーニングも試みる。

更に、It-S遺伝子の単離と構造解析を進めるべく各種サツマイモ栽培種のゲノムライブラリーの構築に着手することを予定しているが、研究進捗状況の遅れを取り戻すべく、長鎖の解読ができる次世代シークエンサーの利用も考える。サツマイモ栽培種(Ipomoea batatas)は交配不和合性を有しており、同一の交配不和合群に属する個体間では交配を行えないため、我が国が有している多種多様なサツマイモ栽培種を用いた効率的な交配育種が妨げられている。この交配不和合性は自家不和合性と同一のシステムにより制御されるが、我々は、サツマイモ栽培種の近縁野生種であるメキシコアサガオ(I.trifida)の自家不和合性遺伝子座の解析を通して、自家不和合性の自他認識に直接的に関与しているタンパク質遺伝子(S遺伝子)の最有力候補、ItAB2とItSEAを同定した。これらを元に、サツマイモ栽培種からIb-AB2とIbSEAを同定し、その交配不和合性を人為的に制御するのが本研究の目的である。研究開始初年度である昨年度は、ItAB2とItSEAをメキシコアサガオに導入し、これらが真のS遺伝子であるか否かの検討を行ったが、着花効率が悪く、また着花したとしても花粉稔性が極めて低かった。これは遺伝子導入から再分化に至るまでに長期間に渡ったことが影響したと思われた。また、サツマイモ栽培種の雄側S遺伝子IbAB2を葯から、雌側S遺伝子IbSEAを柱頭から単離するために、交配不和合群AKに属する品種・系統を栽培し、短日処理により開花促進を行い生殖器官の単離を行い、一部についてmRNAの精製を行った。これらmRNAを鋳型として、S1-, S3-, S10-, S29-,Sc-系統のItAB2およびItSEAを増幅できるプライマーを複数種用意してRT-PCRを行ったが、IbAB2, IbSEAの増幅は確認できなかった。S遺伝子型間の多様性が激しいために、単純な増幅が困難だったことが推定された。メキシコアサガオ(Ipomoea trifida)のS候補遺伝子であるItAB2とItSEAが真のS遺伝子であることを証明するためには、これら遺伝子を導入しgain-of-functionの実験を行う必要がある。研究開始初年度は、S10ホモ型系統にS1-S候補遺伝子を導入した。この場合、S1がS10よりも優性であるために単に表現型を確認することで可能であると思われたが、遺伝子導入したS10ホモ型系統の稔性が低下しており、また、長期にわたる培養により着花が低下した。この点に関しては、昨年度中に、S3Sc個体の自殖種子(Sc(自家和合性変異)はS3よりも優性であるため自殖が可能)を300個程度獲得しており、これらからScホモ型個体を選別して遺伝子導入実験に供する。また、サツマイモ栽培種の雄側S遺伝子IbAB2を葯から、雌側S遺伝子IbSEAを柱頭から単離するために、交配不和合群AKに属する品種・系統を栽培し、短日処理により開花促進を行い生殖器官の単離を行った。得られた生殖器官の一部からmRNAの精製い、これらmRNAを鋳型として、S1-, S3-, S10-, S29-,Sc-系統のItAB2およびItSEAを増幅できるプライマーを複数種用意してRT-PCRを行ったが、IbAB2, IbSEAの増幅は確認できなかった。一方、既に明らかになっているサツマイモ栽培種ゲノムに対し、ItAB2, ItSEAの相同遺伝子の存在を調査したところ、AB2やSEAと相同な遺伝子が存在していることが確認された。
通時的意思決定モデルの精緻化とアノマリーの解決

H30年度は、研究計画書の実験2の一部と実験3を実施した。また下記の課題245について分析を進めた。本研究では全期間を通じて、通時的意思決定にかかわる3種類の実験を行い、主として自己符号化学習型Deep Neural Network(以下DNNと記載する)及び疎性を持つカーネルモデルを用いてデータの分析とモデル化を行った。以下課題ごとに分析結果を要約する。課題1(時間選好に関わる多くの要因の整理)では、時間選好に関わる既知の数多くの要因についてそれらの意思決定予測における有効性を同時に検討した。特に、特定の経験やイメージの容易性について,人々がこれらの意思決定のベンチマークとして使用していることを突き止めた。これらの知見は以降の通時的意思決定のモデル化に活かされた。課題2(選好関係の通時的不安定性に関する検証)では、生体情報のmulti-modalな測定システムを作成し、通時的意思決定における情動的要因の導入について検討した。検証の結果、生体情報は通時的な意思決定予測に予測に大きな影響を持つことが確認された。特に、EEGとfNIRSの組み合わせが優れ、それらにEye-trackerを加えることで飛躍的に予測精度が向上した。課題3(消費の通時的独立性に関する検証)については、消費系列を予測する多変量型のDNNを用いて予測の向上を検討した。課題4(個人差の影響)については、被験者の属性に関するアンケートデータで個人差の影響を吸収しようとしたが、有効な結果は得られなかった。一方で、ディリクレ過程を用いたノンパラメトリックベイズ法により、統計的に個人差を持つグループを分類することは一定の有効性を持った。課題5(アノマリーの解決)については、疎性を持つカーネルモデルが、時間割引率の通時的変化等、意思決定と市場に関する代表的なアノマリーと整合性を持つことを確認した。H28年度は、時間選好に関わる多くの要因の整理を目的として、申請書における実験1を実施した。申請書においては、選好の不安定性や形状、不確実性の存在、経緯や習慣形成の影響、肉体的な状態、情動や衝動性、イメージの容易性に関して、包括的な実験を行い、その後の統計解析によって、それら要因の非線形関係や包含関係などを明らかにする予定であった。今年度の研究では、分析手法については、予定していた階層ベイズ推定による3層パーセプトロンによる分析だけでなく、疎性を持つカーネル法や自己符号化学習型Deep Neural Network(DNN)による分析も併用し、推定手法や前提とする関数系に分析結果が依存しないよう配慮した。また、当初、実験では行動データのみを収集し、生体情報の取得はここでは行わない予定であったが、実験実施コストが比較的少ないEye-trackingデータと反応速度データの取得も行動実験と同時に行った。具体的には、コンピュータベースの実験システムを制作し、被験者のGUI上の視線と刺激定時からの反応速度を計測した。しかしながら、要因の包括的検討については、不確実性の存在、肉体的な状態、情動や衝動性、イメージの容易性のみに留まった。それぞれの分析手法を比較すると、今回の実験データに限って言えば、最小二乗誤差はDNNが最小であるものの、交差検定結果は疎性を持つカーネル法が最も優れていた。またいずれの推定結果においても、要素間の非線形関係性をモデルに導入した方が予測精度は改善した。さらに各要素の重要性に関しては、不確実性の存在が有意に大きな影響を持ち、情動や衝動性とイメージの容易性が複合的で弱い影響を持つことが分かった。肉体的な状態については有意性を確認できなかった。しかしながら、総合的には、これらの結果を確定できるほどに十分なサンプルが得られておらず、追加の実験が必要だと考えている。申請段階においては、選好の不安定性や形状、不確実性の存在、経緯や習慣形成の影響、肉体的な状態、情動や衝動性、イメージの容易性に関して、包括的な実験を行う予定であったが、この要因の包括的検討については、不確実性の存在、肉体的な状態、情動や衝動性、イメージの容易性のみに留まった。実験サンプルも結果を導けるほどに十分ではない。その点で遅れている。しかしその一方において、分析手法については、予定していた階層ベイズ推定による3層パーセプトロンによる分析だけでなく、疎性を持つカーネル法や自己符号化学習型Deep Neural Networkによる分析も準備した。課題1の解決において、最も重要でかつ難しい点は、比較的少ないサンプル数から多くの要因の複雑な関係を解析しなくてはいけないことである。疎性を持つカーネル法は、少ない学習サンプルの下でも比較的良い予測を与えることで知られている。また、当初、実験では行動データのみを収集し、生体情報の取得はここでは行わない予定であったが、実験実施コストが比較的少ないEye-trackingデータと反応速度データの取得も行った。これらの点では予定を先んじている。したがって総合的にはおおむね予定通りといえる。H28年度は,時間選好に関わる多くの要因の整理(課題1)を目的として,申請書の実験1を実施したが,検証できた要因は、不確実性の存在、肉体的な状態、情動や衝動性、イメージの容易性のみとなった。H29年度は実験1の残りの部分と,選好関係の通時的不安定性に関する検証(課題2)を実施するために実験2を行った.まず実験1の残りについては,選好の不安定性や形状、経緯や習慣形成の影響,およびイメージの容易性に,特に注目してデータを収集し分析を行った.

これにより経緯の影響やイメージの容易性については,人々がベンチマークとして使用している質問(あるいは経験)が存在することを突き止め,更にそれをEye-trackingデータや反応速度データも用いて確認した.また本研究では、脳情報をはじめとする生体情報を活用することで、情動的側面が通時的選好関係の変化にどのように影響するのかを特定するために,マルチモーダル計測を行い、意思決定モデルへの生体情報導入の徹底を図るのが一つの目的であるが,この実験において困難な点は、生体情報測定デバイスをmulti-modality化することにより、転送・計算量が飛躍的に増加するという点である。生体情報は、一般に時間解像度が非常に高く、刺激への反応も瞬時に観測する必要がある。この問題に対応するため、0.1ミリ秒単位の高い時間解像度でデータを取得・制御できる実験システムを設計する必要がある.H29年度はこれを完成させ,実験データの収集を始めた.更に,主に実験1の結果を基にした研究結果を専門誌に投稿中である.残念ながら掲載には至っていない.実験2のマルチモーダル計測システムは完成したものの,実験データの収集は始まったばかりである.マルチモーダル測定による実験は,非常に多くの時間を要するのため,30年度を通してコンスタントに実施していく必要がある.また,昨年できなかった課題1に関しては,すべての要因について検証を終え上記のような知見を得ることができた.しかしながら論文の専門誌への掲載に手間取った.今後も引き続き論文をリバイスするとともに,新しく得た結果も公表していく.その一方において,申請書の計画5アノマリーの解決で予定していた,意思決定アノマリーと観測されたデータから予測した意思決定モデルとの関係をシミュレーション分析で明らかにできた.具体的には,実験1のデータから抽出したモデルが、時間割引率の通時的変化、量効果、損益非対称効果、選択範囲効果といった、この分野で良く知られた事実と整合的であることを立証した.これらの点は進んでいる点である.以上の両面を総合的に判断するとやや遅れていると言える.H30年度は、研究計画書の実験2の一部と実験3を実施した。また下記の課題245について分析を進めた。本研究では全期間を通じて、通時的意思決定にかかわる3種類の実験を行い、主として自己符号化学習型Deep Neural Network(以下DNNと記載する)及び疎性を持つカーネルモデルを用いてデータの分析とモデル化を行った。以下課題ごとに分析結果を要約する。課題1(時間選好に関わる多くの要因の整理)では、時間選好に関わる既知の数多くの要因についてそれらの意思決定予測における有効性を同時に検討した。特に、特定の経験やイメージの容易性について,人々がこれらの意思決定のベンチマークとして使用していることを突き止めた。これらの知見は以降の通時的意思決定のモデル化に活かされた。課題2(選好関係の通時的不安定性に関する検証)では、生体情報のmulti-modalな測定システムを作成し、通時的意思決定における情動的要因の導入について検討した。検証の結果、生体情報は通時的な意思決定予測に予測に大きな影響を持つことが確認された。
脳内において樹状突起ガイダンスを制御する細胞外環境

神経ネットワークを形成するそれぞれの神経細胞は、様々な「細胞外環境」を適切に認知することによって最終的に適切な相手(神経細胞や筋肉など)を見つけ出し、そこへ軸索、樹状突起を伸ばす。よって、神経ネットワークの形成機構を理解するためには、神経突起(軸索、及び樹状突起)による「細胞外環境」認識メカニズムの分子機構を解明する必要がある。本研究では、神経突起の、特にこれまで解析が困難であった樹状突起による「細胞外環境」認識メカニズム解明を目的に研究を行う。まず、樹状突起の形態を生体内で1細胞レベルの解像度で可視化・解析するために、ショウジョウバエの嗅覚系2次神経・Projection Neuron(以下PNと省略)をモデル系とし、遺伝学的モザイク法を用いてスクリーニングを行った。昨年に引き続き平成21年度は、このスクリーニングによって得られた樹状突起投射変異体、特にmeigo(medial glomeruli)変異体の原因遺伝子の機能解析を行った。meigo変異体の原因遺伝子は糖核酸トランスポーター様の構造を持つ8回膜貫通型の膜蛋白質で、そのアミノ酸配列からMeigo蛋白質は糖核酸トランスポーター活性を有することが予測される。糖核酸トランスポーターとは、糖核酸を細胞質から小胞体・ゴルジ体へ輸送する蛋白質である。よってmeigo変異体では、膜蛋白質もしくは分泌蛋白質の糖修飾や蛋白質折り畳みが異常になっていると予測できる。meigo変異体で機能が異常になっている膜蛋白質を遺伝学的に探索し、これまで1つの候補膜蛋白質を見いだすことに成功している。今後は、遺伝学的手法に加え生化学的手法を積極的に取り入れ、Meigo蛋白質による樹状突起投射の制御機構を明らかにしていく予定である。本研究では、神経突起の、特にこれまで解析が困難であった樹状突起による「細胞外環境」認識メカ子ズム解明を目的に研究を行う。平成20年度は、このスクリーニングによって得られた樹状突起投射変異体、特にmeigo(medial glomeruli)変異体の原因遺伝子の機能解析を行った。PNをmeigo変異ホモ接合体にすると、すべての樹状突起投射が脳の正中線側にシフトするという興味深い表現型を示す。遺伝学的マッピングにより、meigo変異体の原因遺伝子は糖核酸トランスポーター様の構造を持つ8回膜貫通型の膜蛋白質をコードする事が明らかになっていた。PN樹状突起投射過程におけるMeigo蛋白質の機能を解析する目的で、Meigo蛋白質を生体内で過剰発現するためのトランスジェニックショウジョウバエ(UAS系統: UAS-meigo系統)を作出した。このUAS-meigo系統を用いてmeigoホモ接合PNにだけmeigo遺伝子を強制発現させたところ、PN樹状突起の表現型はほぼ完全に回復した。これは、Meigo蛋白質が、PN樹状突起投射に関して細胞自立的に機能していることを示唆している。更に、抗Meigo抗体を用いることにより、内在性Meigo蛋白質は小胞体、およびゴルジ体に局在していることを明らかにした。今後は、遺伝学的解析に加え生化学的機能を進めることにより、Meigo蛋白質による樹状突起投射の制御機構に迫っていきたいと考えている。
癌細胞のホメオスタシスを破壊する薬剤の開発と分子機構解析

(1)EGF受容体過剰発現細胞はEGF刺激により、通常の細胞をEGF刺激したときには見られない細胞内情報伝達系の活性化が観察され、これらの活性化はEGF受容体過剰発現細胞の新たなホメオスタシス形成に関わっていると考えられる。微生物2次代謝産物から単離したV-ATPase阻害剤であるconcanamycin B,destruxin EはEGF受容体過剰発現細胞に対して単独ではアポトーシスを誘導しない濃度域で、EGF刺激時にのみアポトーシスを誘導した。このような作用はF0/F1-ATPase阻害剤や、E-APTasa阻害剤では観察されなかったことからV-ATPase活性阻害に伴う酸性オルガネラの消失がEGFシグナリングのホメオスタシス形成を破壊した結果と考えられる。(2)アンギノマイシンBは正常細胞やpRBが通常に機能しているがん細胞にはcyclin D1の発現阻害とCdc25Aの活性化阻害によりG1期停止を誘導する一方で、pRB機能を消失した癌細胞にはCdc25Aの活性化阻害を誘導できず、G1期停止を起こすことなくアポトーシスを誘導した。このようにpRBはCdc25Aの活性化を阻害することにより細胞のホメオスタシス形成に機能しており、pRB機能欠損細胞では異なったホメオスタシス形成によって細胞機能を維持していると考えられる。アンギノマイシンBは、pRB機能欠損細胞におけるホメオスタシス破壊によりアポトーシスを誘導したと考えられる。(3)イノスタマイシンによるアポトーシスはdenovo合成系の活性化によるceramide生成、cytoshromecの細胞質への放出、caspase-3の活性化を通じて誘導されていることを明らかにした。また、TPAによるPKCの活性化はceramide生成のステップを阻害することにより、イノスタマイシンによって誘導されるアポトーシスを阻害した。イノスタマイシンはイノシトールリン脂質代謝回転の阻害剤であることから、イノスタマイシン処理した細胞ではジアシルグリセロール生成が阻害され、PKCによるceramideのde novo合成活性化経路の抑制的制御が解除され、アポトーシスが誘導されたと考えられる。このように、PKCが担うホメオスタシスを破壊する薬剤は新しいタイプの制癌剤になりうると考えられる。
無辛味トウガラシ由来カプサイシン類縁体の生理機能の解明と新規機能素材としての応用

トウガラシの辛味成分であるカプサイシンが動物のエネルギー消費を促進することはよく知られており、抗肥満物質として期待されてきたが、強い辛味のために生理的に有効な量が摂取できないという難点があった。本研究は、最近、新しく見い出された無辛味のトウガラシ'CH-19甘'に着目し、'CH-19甘'に含まれるカプサイシン構造類似物質のカプシエイトに、無辛味にも関わらずカプサイシン類似の生理作用があることを明らかにしたものである。健康な男女被験者に'CH-19甘'果実を体重1kgあたり0.1g摂取させることによって、深部体温、顔や首、手首などの体表面温度が顕著に上昇することを見いだした。同じ条件で、呼気ガス解析を行い、被験者の酸素消費量が有意に高くなることを明らかにした。また、心拍間隔パワースペクトル解析によって、'CH-19甘'の摂取が被験者の交感神経活度を上昇させ、これが体温上昇や酸素消費量の増加の原因となっていることを示唆する結果を得た。'CH-19甘'にはカプサイシンはほとんど含まれていないが、カプサイシンの酸アミド結合がエステル結合に変化しただけの構造類似物質が大量に含まれており、その構造が静岡県立大学の渡辺によって決定されカプシエイトと命名された。本研究では、このカプシエイト純品を用いて、マウスの体温、体表温、酸素消費量、および交感神経活度に与える影響を検討し、これまで、'CH-19甘'の投与によって得られた結果が完全に再現されることを明らかにした。また、カプシエイトの生理作用は、カプサイシン受容体の拮抗薬であるカプサゼピンによって抑制された。さらに、カプシエイト投与後のマウスの呼気ガス解析によって、脂肪の燃焼が促進していることを明らかにした。これらのことから、カプシエイトが'CH-19甘'のエネルギー代謝に対する生理作用の有効成分であり、辛味のあるカプサイシンと類似の機構で作用しているものと結論した。辛味のないトウガラシCH19甘から見いだされた、カプサイシン類縁体のカプシエートについて、そのエネルギー代謝に与える影響と脂肪蓄積抑制効果について検討した。カプシエートを化学合成し、2週間および、4週間マウスに投与したところ、カプサイシンとほぼ同様の程度に、体脂肪蓄積を抑制した。脂肪組織以外の臓器には特に顕著な差は見られず、カプシエートは特異的に体脂肪の蓄積を抑制することが示された。カプシエートをマウスに投与して呼気ガスを分析したところ、酸素消費量の増加、脂肪燃焼の増加が観察された。また、4週間カプシエートを投与したマウスでは、1日絶食させても酸素消費量や脂肪燃焼が高進していることから、カプシエートの長期投与は、基礎代謝などを高め、エネルギー消費の増加した代謝状態を形成するものであることが示唆された。また、カプシエートをマウスに投与し2時間後に遊泳させたところ、カプサイシンを投与した過去の実験と同様に、限界までの遊泳時間が有意に延長した。このことは、カプシエートが、カプサイシン同様に動物の脂肪代謝を活性化していることを支持するものである。カプシエートを産生するCH19甘に関して、カプシエート含量の高い品種を育種によって得ている。今後、さらに育種を試み、安定した株を取得する。カプシエートは急性毒性や変異原性が無いことが確認された。現在、安全な食材としての一層の確認を進めている。

トウガラシの辛味成分であるカプサイシンには副腎からのアドレナリン遊離作用、交感神経活度の上昇、産熱、長期間投与による体脂肪蓄積抑制など様々な生理作用が報告されているが、強い辛味のために人間への応用は困難であった。近年、矢澤らは、辛味のないトウガラシ品種を選抜固定し、CH19Sweetと命名した。CH19Sweetにはカプサイシンはほとんど含まれないが、カプサイシンと構造が類似した物質であるカプシエートが大量に含まれていた。本研究では、ヒトおよびマウスを用いて、CH19Sweetおよびカプシエイトがカプサイシンと同様の生理作用を発現することを明らかにした。21-36歳の健康な男女11名を被験者にして、CH19Sweet果実体および対照として無辛味のCalifornia-Wandarを0.1g/kg体重摂取させ1時間にわたって酸素消費量と体温を測定した。被験者の鼓膜温はCH19Sweet投与によってわずかに上昇し、首と顔の表面温が対照に比べ顕著に上昇した。酸素消費量もCH19Sweet投与群で有意に増加した。マウスを用いた実験でも顕著な体温上昇が観察され、バニロイド受容体のアンタゴニストであるカプサゼピンの前投与によって抑制された。5週齢Std ddYマウス雄にカプサイシンおよびカプシエイトをそれぞれ10mg/kg、対照としてvehicleを2週間、毎日胃チューブで投与した。カプサイシンおよびカプシエイトを投与したマウメは、腎周囲脂肪組織および副精巣周囲脂肪組織の重量が有意に低下していた。これらの結果より、辛くないトウガラシより得られたカプシエイトはカプサイシンと同様に熱産生の高進、酸素消費量の増加、体脂肪蓄積の抑制などの生理作用を有することが明らかとなった。
尿路結石形成に係わる転写因子の解明と遺伝子治療への基礎的研究

【目的】オステオポンチン(OPN)はカルシウム含有結石のマトリックス成分のひとつであり,尿路結石形成に重要な役割を担っている。また,イヌ遠位尿細管細胞(MDCK細胞)でOPNのリガンドであるインテグリンαV β3が発現していることも知られている。しかし,OPNの発現機序ならびに結石形成への関与の詳細についてはいまだ解明されていない。今回,MDCK細胞にOPNおよびビトロネクチン(VN)刺激を加えた後,OPN発現を経時的に調べるとともにFocal adhesion kinase(FAK)のリン酸化の程度を免疫沈降反応とリン酸化アッセイを用いて検討した。【方法】1ng/ml1μg/mlの濃度のOPN蛋白またはVN蛋白をcoatingした98穴プレートでMDCK細胞10^7/mlを4時間培養し,MTTアッセイにより接着細胞数を調べた。また,Dish上のMDCK細胞に1ng/m1-1μg/m1の濃度のOPN蛋白またはVN蛋白を加え4,8,16時間後のOPN蛋白発現をWestern blottingを用いて調べた。さらに抽出した蛋白に抗FAK抗体で免疫沈降反応を行い、抗リン酸化抗体でFAKのリン酸化を検討した。【結果】coatingしたOPN蛋白,VN蛋白の濃度に比例して接着したMDCK細胞数は増加した。同時にOPN蛋白の発現量も刺激した蛋白の濃度依存的に増加した。このときMDCK細胞ではFAKのリン酸化が経時的に進んでいることが確認された。【結論】結石形成を考えるうえで,マトリックス蛋白の腎尿細管細胞での発現機序を解明することは重要なことである。今回は,いったん結石原基ができると不可逆的に結石形成が促進される原因についてOPN蛋白のフィードバック機構による自己分泌を推察して実験を行った。その結果,MDCK細胞でのOPN蛋白にはFAKのリン酸化を介した自己分泌機構が関与している可能性が示唆された。オステオポンチン(OPN)はカルシウム含有結石のマトリックス成分のひとつであり,尿路結石形成に重要な役割を担っている。また,イヌ遠位尿細管細胞(MDCK細胞)でOPNのリガンドであるインテグリンαVβ3が発現していることも知られている。今回,MDCK細胞にOPNおよびビトロネクチン(VN)刺激を加えた後,OPN発現を経時的に調べるとともにFocal adhesion kinase (FAK)のリン酸化の程度を免疫沈降反応とリン酸化アッセイを用いて検討した。また,Dish上のMDCK細胞に1ng/ml1μg/mlの濃度のOPN蛋白またはVN蛋白を加え4,8,16時間後のOPN蛋白発現をWestern blottingを用いて調べた。さらに抽出した蛋白に抗FAK抗体で免疫沈降反応を行い,抗リン酸化抗体でFAKのリン酸化を検討した。【結論】

結石形成を考えるうえで,マトリックス蛋白の腎尿細管細胞での発現機序を解明することは重要なことである。今回は,いったん結石原基ができると不可逆的に結石形成が促進される原因についてOPN蛋白のフィードバック機構による自己分泌を推察して実験を行った。その結果,MDCK細胞でのOPN蛋白にはFAKのリン酸化を介した自己分泌機構が関与している可能性が示唆された。osteopontin(以下OPN)は尿路結石関連物質であり、結石形成過程に何らか重要な役割を有することが示唆される。これまで我々はOPNがオートクラインに尿細管細胞で分泌されることを明らかにしてきた。今回はOPN欠損マウスを作成し、その腎結晶沈着について検討を行った。実験1:マウスES細胞のOPN遺伝子exon4を組換えるためNeomycin耐性遺伝子targetting vector導入した。OPN欠損株を受精卵にmicroinjectionし、交配によりOPNノックアウトマウスを作成した。実験2:Wild-type(以下WT)およびOPN欠損マウス(以下KO)[C57BL/6,雄8週齢]に、1-5% ethylene glycole(以下EG)を自由飲水で、50-100mg/kg glyoxylate(以下GOx)を腹腔内注射で2週間投与した。投与後、腎OPN発現(定量PCR, insitu hybridization,免役染色)および結晶形成(Pizzolate染色)を評価した。KOマウスは正常な成長・生殖機能を有し、骨・腎構造も正常であった。80mg/kg以上のGOxを投与した場合のみWT, KOとも腎結晶沈着を認めたが、KOはWTと比して結晶沈着を多く認めた。OPN欠損マウスの作成・繁殖に成功した。KOマウスは実験的高シュウ酸尿による腎結晶沈着がより生じやすいと考えられ、結晶形成においてOPNは抑制因子であることが示唆された。
発生におけるミッドカインの細胞内シグナルの解明

本年度はミッドカイン(MK)の細胞内シグナルの解明を目指し、多方面の解析を試みた。ラット胎仔脳細胞の遊走をMKは誘導した。このときコンドロイチン硫酸、コンドロイチナーゼあるいはバナジン酸(チロシンフォスファターゼ阻害剤)の添加で遊走に阻害がかかることから受容体型蛋白チロシンフォスファターゼPTPζの関与が強く示唆された。PTPζはMKとKd=0.58nMという高親和性を示した。MKの細胞遊走能は他の細胞系でも重要で、MKノックアウトマウスでは、血管内皮障害に伴う新生内膜形成(血管中膜平滑筋細胞の内皮直下への移動およびマクロファージ等の炎症細胞の血管壁への浸潤が重要)がほぼ完全に抑えられ、実際MKがこれらの細胞の遊走を誘導することが判明した。さらに申請者らは骨芽系細胞のMKによる遊走を用いて細胞内シグナルを解析した。この系においてもコンドロイチン硫酸鎖を持つ受容体型蛋白チロシンフォスファターゼPTPζの関与が強く示唆された。また、種種の阻害剤を用いた実験から、少なくともPI3キナーゼ、MAPキナーゼ、PKCがこの系には必須であることが判明した。また、MAPキナーゼの上流にPI3キナーゼが存在すること、PKCはPI3キナーゼ、MAPキナーゼと独立かあるいはその下流に位置することが明らかになった。さらにPDGFとMKが相乗的に作用することを見いだした。また、MKファミリーのもう一つのメンバーPTNとMKの胎生期の脊髄、胎盤における発現を解析した。MKが脊髄管周囲全周性に神経幹細胞に発現するのに対し、PTNはその背側半分および前角運動神経細胞に発現した。胎盤では胎仔由来の栄養芽細胞等でMKが発現するのに対し、PTNは母胎側脱落膜層に発現した。MKとPTNは生物活性を共有することが多いがin vivoでは異なった発現制御が働いており、機能発揮の場に違いがあることが示唆された。
タンパク質間相互作用の新規in vivo検出法

Heat shock protein 47(Hsp47)は小胞体に局在し、コラーゲン特異的に働く分子シャペロンであり、コラーゲンの正常な合成と分泌には、小胞体においてプロコラーゲンとHsp47が相互作用することが必須である。コラーゲンの異常蓄積を特徴とする線維化疾患の治療においてHsp47が分子標的として極めて有望であることがこれまで示されてきた。本研究では、線維化疾患治療に向け、タンパク質間相互作用評価法を開発することを目的とした。生きた細胞内でタンパク質相互作用をリアルタイムに観察できる手法であるBRET(Bioluminescence resonance energy transfer)をHsp47-collagenのタンパク質間相互作用の検出に適用した。BRETでは励起光が不要であり、化合物自身が持つ自家蛍光を排除できることが薬剤スクリーニングでメリットとなり、かつ細胞内での結合と解離をリアルに捉えることが可能となる。種々の条件検討の結果、Hsp47-Halotagとmini collagen-Luciferase間でBRETシグナルが得られた。さらに、これまでに得られていたin vitroでHsp47-collagen間の相互作用を阻害する化合物の添加により、BRETシグナルは減少した。一方で、p53-MDM2というサイトゾルのタンパク質間相互作用のコントロールペアのBRETシグナルは変化しなかった。今回構築した系を利用し、Hsp47阻害候補化合物が、小胞体内で確かにHsp47とコラーゲンの相互作用を阻害していることを示すことができた。予定通り、生きた細胞内でHsp47-コラーゲン間の相互作用をモニターする系を構築できた。この系を利用し、Hsp47-コラーゲン間相互作用阻害剤の阻害活性を測定した。(1)BirA-Avitagsystemを用いた高感度相互作用検出法の応用;ビオチンリガーゼ(BirA)はその認識配列(Avitag)にビオチンを付加する。この反応の特異性は高く、かつ反応が早いため、BirAとAvitagの結合解離は瞬時に起こる。既に構築した、BRETの系をBirA-Avitag系に応用し、小胞体内のHsp47-collagen間相互作用率を細胞外のcollagenのビオチン化率として算出する。ビオチン添加依存的に、Avitagへのビオチン付加の有無を観察し、Hsp47-collagen相互作用阻害剤を用いて、細胞外に分泌されたcollagenのビオチン化量が減少する事を確認する。(2)タンパク質間相互作用検出システムのin vivoへの適用;In vivo jet PEI等のポリエチレンイミンと核酸の複合体をマウス尾静脈へ投与すると、組織(主に肺)に遺伝子が導入される。この方法を用いて、今回開発した評価系をマウス固体に導入し、タンパク質間相互作用の検出とその阻害をマウス固体で評価する。

この方法を用いて、今回開発した評価系をマウス固体に導入し、タンパク質間相互作用の検出とその阻害をマウス固体で評価する。予定通り、生きた細胞内でHsp47-コラーゲン間の相互作用をモニターする系を構築し、さらに、この系を利用し、Hsp47-コラーゲン間相互作用阻害剤の阻害活性を測定したが、条件検討に多くの時間を使用したため、多くの阻害候補化合物を購入し、阻害活性を比較するまでには至らなかったため、次年度使用額が生じた。BirA-Avitag systemを用いた高感度相互作用検出法の応用及び、タンパク質間相互作用検出システムのin vivoへの適用に向け、それらを実施するための消耗品の購入に当てる。さらに、多くの阻害候補化合物を購入し、阻害活性を比較する。その際、解析を行うソフトを購入することで、効率よく阻害活性の評価を行っていく。