hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ロジウムなど9族遷移金属触媒に固有のクロスカップリング化学の創立

炭素-炭素結合の構築法として最も有用な反応の一つであるクロスカップリングについて,従来のパラジウムやニッケルのような10族遷移金属触媒にかわり, 9族触媒を用いることにより,クロスカップリング化学の新しい展開を図る研究をおこなった。実験的検討を種々加えた結果,アルキル求電子剤を反応成分とするクロスカップリングをロジウム触媒により進行させる二つの新しい方法論を開発した。また,不飽和分子として一酸化炭素およびアルケンの挿入を伴う新規クロスカップリングを可能にする反応系の開発に成功した。遷移金属錯体で触媒される有機金属化合物と炭素求電子剤とのクロスカップリングは炭素-炭素結合の構築法として最も有用な反応の一つである。しかし,その触媒はパラジウム及びニッケルに限られ,これら以外の遷移金属錯体が触媒活性を示す例はほとんど報告されていない。ここで,9族遷移金属は10族遷移金属と異なり安定錯体がアニオン配位子をもちトランスメタル化から出発する触媒サイクルが可能である。また,酸化状態の変化,言い換えれば硬さ,軟らかさの変化と連動して配位数が変化する。このため,9族と10族の遷移金属錯体では,クロスカップリングの触媒作用と関わる特性に大きな違いがあり,配位子あるいは反応系を適切に選択することにより9族遷移金属触媒で初めて可能になるクロスカップリングの進行が期待される。そこで本研究では,ロジウム触媒を用いるアルキル求電子剤とアリール金属化合物,特にアリール亜鉛化合物との反応,すなわち,アルキルーアリールクロスカップリングを検討した。このロジウム触媒反応では,アリール亜鉛化合物のトランスメタル化に続いてアルキル求電子剤の酸化的付加がおこり,その後,直ちに還元的脱離が進行すれば,10族遷移金属では問題になるベータ水素脱離が抑制されると予想したが,ロジウム触媒でも副反応が優先することが明らかになった。この結果は,1)三価ロジウムからの還元的脱離の進行が遅い,2)酸化的付加体で出現する空の配位座がベータ水素脱離に利用され易いことを示しているように思われる。そこで次に,アルキル求電子剤に配位力のある置換基を導入し,その配位で空の配位座を満たすとともに,その置換基の電子受容性を利用して還元的脱離を加速することを考えた。また,その官能基の存在が,生成物の有用性を高めることができればさらに望ましい。この観点から,合成的な有用性をもつ配位性官能基としてホスホリル基を選び,ロジウム触媒アルキルーアリールクロスカップリングを検討した結果,ホスホリル置換アルキルアレーン類の新規合成を実現することに成功した。遷移金属錯体で触媒される有機金属化合物と炭素求電子剤とのクロスカップリングは炭素-炭素結合の構築法として有用である。しかし,その触媒はパラジウム及びニッケルなど10族遷移金属に限られ,これら以外の遷移金属錯体についての検討は立ち遅れている。ここで,9族遷移金属は10族と異なり安定錯体がアニオン配位子をもちトランスメタル化から出発する触媒サイクルが可能である。このため,従来の10族触媒では副反応であるベータ水素脱離が優先し,選択的に進行させることが不可能なアルキル求電子剤のクロスカップリングを9族触媒により達成できる可能性がある。そこで,ロジウム触媒を用いるアルキル求電子剤とアリール金属化合物,特にアリール亜鉛化合物との反応,アルキルーアリールクロスカップリングを検討したが,ロジウム触媒でもベータ水素脱離の副反応が優先し,反応設計に際し,酸化状態の変化と連動する空配位座の出現を重視する必要が示唆された。本年度は,前年度の研究で見いだされた知見(空配位座を占有できるカルボニル基やホスホリル基などの官能基を反応中心の近傍に有する反応成分を用いることにより選択的なアルキル-アリールクロスカップリングをロジウム触媒で実現できる)を踏まえ,配位性官能基を配位子に導入することにより,反応成分に関して構造的制約がないアルキル-アリールクロスカップリングの実現を目指す研究を行なった。その結果,1,3-ビス(ジフェニルボスフィノ)プロパンの二位炭素にアセトキシメチル側鎖を導入した新規な三脚型配位子が有効であり,この配位子を有するロジウム触媒により電子寡少なアリール亜鉛求核剤と一般的なアルキル求電子剤のクロスカップリングを選択的に進行させることに成功した。パラジウムなど10族の遷移金属錯体で触媒される有機金属求核剤と炭素求電子剤とのクロスカップリングは炭素-炭素結合の構築法として最も有用な反応の一つである。その一方,他族元素の錯体が有効な触媒活性を示す例はほとんど報告されていない。しかし,9族元素の場合,トランスメタル化から出発する触媒サイクルが可能であるなど触媒作用に影響する金属の特性が10族元素と大きく異なる。この違いに着目し,反応系を適切に設計することにより,9族元素に固有の新規な触媒反応の進行が期待される。この観点から,本年度,不飽和分子の挿入を伴う新規カップリング反応の開発を目指した研究を行なった。

一酸化炭素は不飽和分子として有効に作用し,その挿入を伴う触媒的クロスカップリングがパラジウムにより進行することが知られている。しかし,目的ケトンが対称構造であるとき,クロスカップリング成分の一方のみを原料とし,酸化あるいは還元条件下でのホモカップリングがより有用な合成経路になる。この形式の新反応がアリール亜鉛求核剤の酸化的カルボニル化についてロジウム触媒により円滑に進行することを明らかにした。炭素-炭素不飽和分子としてアルケンの挿入を伴うクロスカップリングは一般に困難である。10族元素に代わりロジウム触媒を用いるとき,新規なアルケン挿入反応が進行することを見いだした。また,アリール亜鉛求核剤を用いるクロスカップリングについて,一般的なアルケンの挿入を可能にする触媒反応系の開発に初めて成功した。
ネズミ糞線虫幼虫の化学走行・誘因・ケモレセプター・ラット体内移行の研究

本研究の最終目的は、寄生線虫が生体内でいかなるメカニズムにより温血動物に感染し、その体内移行を行っているのかを解明するためのものである。今回はその研究の一環としてin vitroでのネズミ糞線虫感染型幼虫(L_3)の化学走性実験を試みた。測定系は初めてin vitroアッセイ系として確立したアガロース寒天平板を用いた。同平板周辺部にアトラクタントを置き、45-60分間室温放置後、中央部にL_3300隻を置き36°C、45分間放置した。その後アトラクタント部に集積したL_3をカウントした。無機化合物はNa^+,K^+,Ca^<++>,Mg^<++>(0.01-0.2M)である。コントロールとして蒸留水(DW)を用いた。その結果、L_3はNa化合物であるNaOH,Na_2CO_3,NaCl,NaHCO_3等に良く集積し、その濃度は0.05Mが最適であると思われた。化学走性の強さはNa_2CO_3>NaHCO_3>NaOH>NaClの順であった。他の金属イオンとOH^-、Cl^-化合物(全て0.05M)であるNaOH,KOH,Mg(OH)_2,Ca(OH)_2:NaCl,MgCl_2,CaCl_2,KCl,DWについて試験した結果、Na化合物にのみ多数のL_3の集積が見られ、他化合物には集積を認めなかった。CO_3-化合物に関しては、Na_2CO_3,K_2CO_3は易水溶性であるが、MgCO_3,CaCO_3は難水溶性であるため、走性は正確には不明であるが、K_2CO_3にはL_3の集積を認めなかった。またあらかじめ寒天内に各濃度のNaClが溶解している平板で、各濃度のNaHCO_3をアトラクタントとした同様のアッセイを実施した結果、L_3のNaHCO_3への走性に著明な阻害が見られた。その他、pH7.0に調整した0.05MのNaHCO_3,NaOHにもL_3が集積することを認めた。有機化合物では各種動物血清、アルブミン、一部のペプチドに走性を示した。以上の結果から、L_3は、Na化合物および血清蛋白に正の走性があることが認められた。Na化合物は生体内に多く存在し、生体内Na^+もL_3が走性(感染)を起こす一つの誘因物質であることが示唆された。(第47回日本寄生虫学会南日本支部大会で一部発表,現在投稿準備中)本研究の最終目的は、寄生線虫が生体内でいかなるメカニズムにより温血動物に感染し、その体内移行を行っているのかを解明するためのものである。(第47回日本寄生虫学会南日本支部大会で一部発表,現在投稿準備中)
タクロリムス代謝物プロファイルに着目した肝移植後の拒絶反応回避に関する研究

生体部分肝移植後の術後管理はカルシニューリン阻害薬タクロリムスを中心とした免疫抑制療法が必須とされている。タクロリムスはヒトでは主にCYP3A4によって代謝されるが、これまでタクロリムスの代謝物に関する研究はほとんど行われてこなかった。しかし申請者らは、全血中及び胆汁中に免疫抑制活性を有するM-II(31-O脱メチル体)が高濃度に存在し、タクロリムス代謝特性が変化している症例を経験した。しかし、肝臓に発現する代謝酵素やトランスポータなど、タクロリムス体内動態に関与する分子の発現量がタクロリムス代謝動態に及ぼす影響は明らかになっていない。そこで本研究では、CYP3Aサブファミリー(CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7)によるタクロリムス代謝の速度論的解析を行った。さらに、術後早期の血液検体中のタクロリムス未変化体並びに代謝物濃度を測定し、術時臓器検体中のCYP3A4、CYP3A5及びMDR1 mRNA発現量との相関解析を行った。CYP3A4及びCYP3A5によるM-I生成は時間依存的に増大したのに対し、CYP3A7よるタクロリムス代謝はみられなかった。また、CYP3A4及びCYP3A5によるM-II生成はM-I生成に比して少量であった。CYP3A4及びCYP3A5によるタクロリムス13-O脱メチル化の固有クリアランスは4.5及び3.3μL/min/pmol P450であり、CYP3A5はCYP3A4と類似のタクロリムス代謝活性を有することが確認された。次に、術後早期の生体肝移植患者の全血検体中タクロリムス代謝物濃度を測定したところ、M-Iのみが検出されM-IIは存在しなかった。また、肝CYP3A4、CYP3A5、MDR1 mRNA発現量と全血中M-I/タクロリムス濃度比との相関を解析したところ、CYP3A5発現量と正の相関を示すのに対し、CYP3A4及びMDR1発現量とは相関を示さなかった。一方、小腸CYP3A4、CYP3A5及びMDR1 mRNA発現量と全血中M-I/タクロリムス濃度比とは相関を示さなかった。以上の結果より、生体部分肝移植患者において術後早期における血中タクロリムス主代謝物はM-Iであり、タクロリムスの代謝は肝CYP3A5発現量の個体差の影響を受けることが示唆された。免疫抑制剤タクロリムスは、小腸や肝臓においてCYP3Aを介した代謝を受け、主に胆汁中に排泄される。タクロリムスの代謝物には、TDMで用いられる抗タクロリムスモノクローナル抗体への交叉性を保持しているものが存在する。そのため、免疫学的測定法では血中に代謝物が存在するとタクロリムス血中濃度は実際より高く算出されることが推察され、血中における代謝物の存在がタクロリムスの薬力学的な個体差の一因となる可能性がある。そこで本研究では、生体部分肝移植症例における全血中代謝物プロファイルを明らかにすることを目的として以下の検討を行った。京都大学医学部附属病院において生体部分肝移植を受けた72例の患者において、全血中のタクロリムス未変化体及びM-I、M-II、M-IIIをLC/MS/MSを用いて定量した。また、移植肝よりゲノムDNAを抽出し、スプライシング異常を引き起こすCYP3A5*3多型についてPCR-RFLP法を用いて解析した。M-I、M-II、M-IIIが検出された患者は72例中それぞれ、56、48、55例であり、代謝物プロファイルに個人差が存在することが明らかとなった。また、M-IIIはM-I及びM-IIに比べて低濃度であった。CYP3A5発現群及び欠損群における代謝物濃度を比較した場合、M-I濃度はCYP3A5欠損群が、M-II濃度はCYP3A5発現群がそれぞれ高値を示すことが明らかとなった。従来、タクロリムスの主代謝物はM-Iであると考えられていた。M-Iは抗タクロリムスモノクローナル抗体との交叉性及び免疫抑制活性をほとんどもたないが、M-IIは抗体との交叉性及び未変化体と同程度の免疫抑制活性を有することが知られている。我々はこれまでに、全血中及び胆汁中M-II濃度が高値を示す症例において、タクロリムス投与量の増量を要することを明らかにした。本研究では多くの患者でM-IIが全血中に高濃度で存在することが示され、M-IIの臨床的意義に関してさらなる解析が必要であると考えられた。以上、タクロリムス代謝物プロファイルに個人差が存在すること、タクロリムスの代謝物プロファイルの差違はCYP3A5遺伝子多型に一部起因することが明らかとなった。

しかし、肝臓に発現する代謝酵素やトランスポータなど、タクロリムス体内動態に関与する分子の発現量がタクロリムス代謝動態に及ぼす影響は明らかになっていない。そこで本研究では、CYP3Aサブファミリー(CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7)によるタクロリムス代謝の速度論的解析を行った。さらに、術後早期の血液検体中のタクロリムス未変化体並びに代謝物濃度を測定し、術時臓器検体中のCYP3A4、CYP3A5及びMDR1 mRNA発現量との相関解析を行った。CYP3A4及びCYP3A5によるM-I生成は時間依存的に増大したのに対し、CYP3A7よるタクロリムス代謝はみられなかった。また、CYP3A4及びCYP3A5によるM-II生成はM-I生成に比して少量であった。CYP3A4及びCYP3A5によるタクロリムス13-O脱メチル化の固有クリアランスは4.5及び3.3μL/min/pmol P450であり、CYP3A5はCYP3A4と類似のタクロリムス代謝活性を有することが確認された。次に、術後早期の生体肝移植患者の全血検体中タクロリムス代謝物濃度を測定したところ、M-Iのみが検出されM-IIは存在しなかった。また、肝CYP3A4、CYP3A5、MDR1 mRNA発現量と全血中M-I/タクロリムス濃度比との相関を解析したところ、CYP3A5発現量と正の相関を示すのに対し、CYP3A4及びMDR1発現量とは相関を示さなかった。一方、小腸CYP3A4、CYP3A5及びMDR1 mRNA発現量と全血中M-I/タクロリムス濃度比とは相関を示さなかった。以上の結果より、生体部分肝移植患者において術後早期における血中タクロリムス主代謝物はM-Iであり、タクロリムスの代謝は肝CYP3A5発現量の個体差の影響を受けることが示唆された。
鳥類顕微授精胚の発生研究

最近、世界で初めてウィルスによらないトランスジェニックニワトリの生産が遺伝子導入PGCキメラニワトリによって可能となった(Nature、2006Etches group、米国)がその成功率はきわめて低い。したがって本研究では、哺乳類で有効な顕微授精(ICSI)技術をウズラ実験に応用する。「トランスジェニックニワトリの生産」に達するまでには「遺伝子導入、ICSI、受精卵培養発生、受精卵移植、孵卵、孵化」の諸過程を成功させたいが、このうち(1)低いICSI受精率の改善と(2)低いICSI受精卵の発生遅延を改善して健康な胚発生を確立する。人為的にウズラ卵細胞質内に5mMストロンチウム処理あるいはCa_2+を処理することによりICSIによる発生率が20-27%まで倍増した。続いてウズラ卵細胞質内のCa^<2+>濃度を増加させる精子側の因子を同定するためウズラ精巣内精子細胞からphospholipase Czeta (PLCzeta)のcDNAを単離した。PLCzeta cRNA (60ug/ml)をウズラ卵子に3nl顕微注入し3時間体外培養を行なった結果、双方共に約60%で前核が形成された。単一円形精子細胞を単独でICSIしたウズラ卵は、24時間後の発生を指標とした場合に全く発生しなかったが、円形精子細胞とともに60ug/ml PLCzeta cRNAを注入することで46.7%の卵子が発生を示した。また、単一射出精子とともに60ug/ml PLCzeta cRNAをウズラ卵子に注入し、培養時間をこれまでの24時間ではなく72時間に延長したところ、PLC_ cRNAなしでICSIしたウズラ卵子は、15%の発生率を示し、発生ステージもV-VIIであつたものが、PLCzeta cRNAの賦与により、発生率は50%まで増加し、さらに発生ステージも放卵時に相当するステージXを越え、原条形成(ステージ6)まで進行した。鳥類におけるトランスジェニックの作出には非ウィルス法として、種々のほうほうが試みられているが成功率は極めて低い。よって本研究は、これまで鳥類では行われたことのない細胞質内精子顕微注射法(Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI)を用いた遺伝子導入法を試みた。外来遺伝子としてGreen Fluorescent Protein (GFP)を単一射出精子とPLCzeta cRNAと同時に注入し、ウズラ胚にGFPを発現させることを目的とした。ベクター・外来遺伝子は、pCX-EGFPプラスミドを使用し60μg/ml PLCzeta cRNAをインジェクションピペットに吸入した後、同じインジェクションピペットへGFP-射出精子を吸入する。顕微注入した卵子は、Onoらの方法(1994,2001)に従って、DMEM入り20mlプラスチックカップ中で41.5°C、5%CO_2条件のもと、24時間の体外培養を行ない(System Q1a)、更に48時間のニワトリ水溶性卵白で満たしたウズラホスト卵殻を用いた追加体外培養を37.5°Cの条件で行なった。さらにSystem Q2では、30分のインターバル、90度のアングルの条件のもとで転卵した。顕微注入後、計72時間体外培養したウズラ卵子は、蛍光実体顕微鏡(Olympus SZX 12)を用いて観察した。System Q1およびQ2の体外培養72時間後、7個の卵子が胚盤葉発生しそのうち6個が外来遺伝子GFPを胚盤葉で発現していることが観察できた。さらに外来遺伝子がホストウズラ染色体に組み込まれているかを胚盤葉DNAを用いてPCR法で検討した結果、GFP遺伝子は6個の胚盤葉DNAの内3個に増幅が観察された。したがって、PLCzeta cRNA注射と同時に本ICSIによる遺伝子導入法が新しいトランスジェニックトリの作出に道を開くものとして期待される。
階層構造を制御した担持合金ナノクラスタ触媒の創成と選択的分子変換への展開

PdAu合金クラスターが炭酸水素アンモニウムからの水素生成反応に有効であること、また、重炭酸塩の水素化に対しても有効なことを見出し報告した(ACS Sustainable Chem. Eng. 2019, 7, 6522-6530.).活性は、Pd/Au比に強く依存すること,構造解析の結果、Auに囲まれた電子不足な孤立Pd種が優れた活性を示すことを明らかとした。また、担体である活性炭にNを導入し、電子供与基が活性に与える影響について検討を進めた。速度論的検討を元に詳細な反応機構を提案した。同様にアンモニアボランのメタノリシスによる水素生成について検討を行い。炭酸水素アンモニウムからの水素生成についても活性は、Pd/Au比に強く依存し,Auに囲まれた電子不足な孤立Pd種が優れた活性を示すことを明らかとした。ハロゲン化アリールとヒドロシランのカップリングによるアリールシラン合成について担持PdAu合金触媒が,塩化アリールを用いた場合に対応するアリールシランを選択的に与えることを見出した.さらに,担持PdAu合金触媒を用いることでジインとアレンの付加環化反応が効率的に進行し、置換ベンゼン誘導体が得られることを見出した.さらに,Au触媒の表面を極少量の金属で修飾した階層的な構造を有する触媒を種々調製し、これらを用いて内部アルキンのヒドロシリル化を検討したところ、極少量のNi種で修飾した活性炭担持NiAu触媒が、反応を効率的に進行させることを見出した。Ni単独の触媒は、ほとんど活性を示さなかったことから、AuとNiの複合化が本反応の効率的な進行に有効であることが分かった。担持PdAu合金クラスター触媒が複数の水素キャリア(炭酸水素アンモニウム、ギ酸、アンモニアボラン)からの水素生成に有効であることを見出し報告した(ACS Sustainable Chem. Eng. 2019, 7, 6522-6530.).いずれの場合にもAuに囲まれた電子不足な孤立Pd種が優れた活性を示すことを明らかとした。これは、合金化による局所構造の変化が、特異な触媒機能を実現する上で有効な手段であることを示している。この結果は、これまで検討を進めてきたヒドロシリル化、[2+2+2]付加環化反応に有効な活性サイトと同じ傾向であることは興味深い。一方、新たな反応系としてハロゲン化アリールとヒドロシランのカップリングによるアリールシラン合成について担持PdAu合金触媒が,塩化アリールを用いた場合に対応するアリールシランを選択的に与えることを見出した.さらに,担持PdAu合金触媒を用いることでジインとアレンの付加環化反応が効率的に進行し、置換ベンゼン誘導体が得られることを見出した.さらに,Au触媒の表面を極少量の金属で修飾した階層的な構造を有する触媒を種々調製し、これらを用いて内部アルキンのヒドロシリル化を検討したところ、極少量のNi種で修飾した活性炭担持NiAu触媒が、反応を効率的に進行させることを見出した。これらの系では、隣接する元素が協奏的な機能を発揮していることを反応機構の観点から明らかとした。これらの結果は、局所構造、階層構造の制御が活性を制御する重要な因子であることを示しており、この様な作業仮説のさらなる展開が期待できる。これらのことから概ね順調に進展していると判断した。これまで検討を進めてきたPdAu合金クラスタの合成法をベースに引き続きPd系合金を中心に第二成分金属とその比率を変化させた合金クラスタを合成し,第二成分金属元素のサイズ,電気陰性度を含む物性が合金クラスタの構造・電子状態・触媒機能に与える影響を系統的に検討する.また、引き続きコア構造をAu(あるいはPd)とし,シェル構造をPdAu合金とする,あるいは,遷移金属クラスタをコア構造に導入し,シェル層のみPdAu合金とするなど,階層的構造を有する合金クラスタを合成し,コアの電子状態・構造が合金クラスタの電子状態・構造ならびに物性に与える影響を検討する.また、本年度見出したAu上に修飾したNiの状態と活性の相関についてさらに検討を進める。合わせて、合金触媒を用いて酸化的アセトキシル化など、新たな反応系への展開を図る.合わせて,固体表面の物性(酸塩基性・酸化還元特性)と合金クラスタの協奏的な機能や,両者の界面における電子状態の変化について検討を進め、さらにメタン等低級アルカンの部分酸化および非可食性バイオマス由来の化合物(グリセロール,乳酸,ヒドロキシ酸,単糖類等)を必須化成品に変換する水酸基の選択酸化や水素化(分解)を対象として検討を進める.PdAu合金ナノ粒子の組成比を制御すること、多数の酸化物を担体として効率よく合金ナノ粒子を固定化する方法の開発に成功した。活性炭担持AuPd合金ナノ粒子は,アンモニアボラン(AB: NH3-BH3)のメタノリシスに対して担持Pd, Au触媒よりも高い活性を示した. CO吸着量で規格化したTOF値は, Au/Pd比の増加とともに上昇したことからAuに囲まれた孤立Pdサイトが反応に有効であることが明らかとなった.

速度論的解析からAu, Pdの電子状態と局所構造の変化による活性向上の要因を検討したところ,Auを導入することで、合金中のAu原子上へのアミンの吸着が優先的になることでメタノールのホウ素種への配位による活性化が促進され、水素生成速度が向上したと推測される。活性炭担持AuPd合金触媒は活性炭担持Pd触媒と比較して、炭酸水素アンモニウム水素化、ギ酸アンモニウム脱水素の可逆的反応を利用した水素固定化、生成のサイクルシステムにおいて高い活性を示すことが明らかとなった。AuとPdはランダムに配列した固溶体を形成していることが明らかとなった。速度論的検討より、炭酸水素アンモニウム水素化においてはAuが炭酸水素塩を活性化させることによって、全体のギ酸アンモニウム生成速度が向上したと考えられる。一方、ギ酸アンモニウム脱水素では、Auが炭酸水素塩を活性化させることによって水分子の求核的付加が促進され、全体の水素生成速度が向上したと考えられる。また、活性炭担持AuPd合金触媒は活性炭担持Pd触媒と比較して、炭酸水素アンモニウム水素化、ギ酸アンモニウム脱水素の可逆的反応を利用した水素固定化、生成のサイクルシステムにおいて高い活性を示すことが明らかとなった。この他、複数の反応系(ヒドロシリル化など)にPdAu合金触媒を適用した。PdAu合金ナノ粒子の組成比を制御すること、多数の酸化物を担体として効率よく合金ナノ粒子を固定化する方法の開発に成功した。その結果、再現性良く各種担体に比較的粒径のそろったPdAu合金ナノ粒子を固定化し、その触媒機能と構造の関係を系統的に検討することができた。本年度は、アンモニアボラン(AB: NH3-BH3)のメタノリシス、炭酸水素アンモニウム水素化、ギ酸アンモニウム脱水素の可逆的反応を利用した水素固定化、生成のサイクルシステム、ヒドロシリル化などへ展開し、一定の成果を得た。特に合金ナノ粒子の機能として、従来提案されてきたリガンド効果、アンサンブル効果に加え、複数の構成元素が協奏的に機能する新規な機能を示ことができたことは、今後の合金触媒の裾野を拡げる成果である。その他、PdAu合金以外のPd系合金ナノ粒子の調製に関する基礎的な知見やAu粒子表面へのNi原子の添加による活性の大幅な向上、Ni粒子表面へのPt原子の添加による活性の大幅な向上など興味深い結果を得ており、今後、さらに検討を進めることで合金触媒の調製とその利用に関してより深い知見が得られると考えられる。また、当初予定していたバイオマス変換反応(グリセロール変換反応)についても既に基礎的な検討を行っている。PdAu合金クラスターが炭酸水素アンモニウムからの水素生成反応に有効であること、また、重炭酸塩の水素化に対しても有効なことを見出し報告した(ACS Sustainable Chem. Eng. 2019, 7, 6522-6530.).活性は、Pd/Au比に強く依存すること,構造解析の結果、Auに囲まれた電子不足な孤立Pd種が優れた活性を示すことを明らかとした。また、担体である活性炭にNを導入し、電子供与基が活性に与える影響について検討を進めた。速度論的検討を元に詳細な反応機構を提案した。同様にアンモニアボランのメタノリシスによる水素生成について検討を行い。炭酸水素アンモニウムからの水素生成についても活性は、Pd/Au比に強く依存し,Auに囲まれた電子不足な孤立Pd種が優れた活性を示すことを明らかとした。ハロゲン化アリールとヒドロシランのカップリングによるアリールシラン合成について担持PdAu合金触媒が,塩化アリールを用いた場合に対応するアリールシランを選択的に与えることを見出した.
Ph陽性白血病の低分子量G蛋白質を介したシグナル伝達機構の治療標的としての検討

PECAM-1はCD31とも呼ばれる130kDのimmunoglobulin superfamilyの接着分子で、内皮細胞と造血細胞に広範に発現する。2つのチロシンリン酸化部位ITIM領域を有し、細胞シグナル伝達を御することが報告されている。慢性骨髄性白血病やPh陽性急性リンパ芽球性白血病引き起こす融合型チロシンキナーゼBCR/ABL発現細胞において、BCR/ABLおよびSrcファミリリーキナーゼがPECAM-1のITIM領域をリン酸化することを見いだした。ITIMのチロシンリン酸化によりSHP2結合し脱リン酸化するとともに、Gab2とも複合体を形成し、細胞内シのシグナル伝達の制御に関与することが推察された。BCR/ABLチロシンキナーゼ阻害薬imatinib耐性変異E255KやT315Iはより強くPECAM -1をリン酸化した。BCR/ABL発現細胞にPECAM-1をを過剰発現すにより、Rap1/MEK経路の活性化と細胞接着亢進し、imatinibやBCR/ABLチロシンキナーゼ第二世代阻害薬dasatinibによるmitochondria障害caspaseの活性化を介したアポートーシス誘導を抑制した。これらの結果よりPECAM-1はBCR/ABL性白血病において、薬剤耐性や白血病化の進展に関与していることが推察された。Ph陽性白血病の原因であるBCR/ABLチロシンキナーゼに対する阻害剤は、慢性期の慢性骨髄性白血病に著効を呈するが、多くの例では微少残存病変を認め治癒は困難である。また、BCR/ABLキナーゼ領域の変異で耐性を生じ得ることから、進行例およびPh陽性急性リンパ性白血病例では多くが再発し難治化する。申請者は、BCR/ABLがRap1/B-Raf経路を活性化し増殖誘導とアポトーシス抑制に重要な役割を果たすことを見いだし報告してきた。本研究では内皮細胞と造血細胞に広範に発現するPECAM-1に注目し検討を行った。PECAM-1は2つのITIM領域を有し、この部位のチロシンリン酸化によりSHP2その他のシグナル因子と結合することでシグナル伝達にも関与し、抗アポトーシス機能や、SDF-1依存性の造血幹細胞の骨髄への集積、integrinを介した細胞接着の亢進機能を有し、また、Rasファミリーの低分子量GTPase Rap1を活性化することも報告されている。申請者の検討で、PECAM-1は造血細胞においてサイトカインやケモカイン受容体からのRap1等を介した細胞内シグナル経路活性化を巧妙に制御することにより、細胞の増殖、接着、遊走等の調節機構を統合している結果を認めている。BCR/ABLその他の活性化キナーゼによるこの調節機構の破綻が白血病の発症や進展に関わる可能性も想定され、新規治療の検討のためにも、この機構のさらなる解明をすすめている。PECAM-1はCD31とも呼ばれる130kDのimmunoglobulin superfamilyの接着分子で、内皮細胞と造血細胞に広範に発現し、2つのチロシンリン酸化部位ITIM領域を有し、細胞シグナル伝達を制御することが報告されている。慢性骨髄性白血病やPh陽性急性リンパ芽球白血病を引き起こす融合型チロシンキナーゼBCR/ABLが、直接またはSrcファミリー・キナーゼの活性化を介して、PECAM-1のITIM領域をリン酸化することを見いだした。このリン酸化部位にはチロシンフォスファターゼSHP2が結合し脱リン酸化すると供に、Gab2等とも複合体を形成し、細胞内シグナル伝達の制御にも関与することが推察された。BCRIABLチロシンキナーゼ阻害薬imatinib耐性変異体E255KやT315Iはより強くPECAM-1をリン酸化した。また白血病細胞株K562等でPECAM-1の過剰発現は、Rap1/MEK経路の活性化と細胞接着を亢進し、imatinibや第二世代阻害薬dasatinibによるmitochondria障害とcaspaseの活性化を介したアポトーシス誘導を部分的に抑制した。

これらの結果より、PECAM-1はPh陽性白血病細胞において、BCR/ABLからのRap1/MEK経路等を介した細胞接着やアポトーシス陽性等を制御する細胞内シグナル伝達機構を調整し、imatinib等への治療抵抗性獲得機構にも関与することが示唆された。PECAM-1はCD31とも呼ばれる130kDのimmunoglobulin superfamilyの接着分子で、内皮細胞と造血細胞に広範に発現する。2つのチロシンリン酸化部位ITIM領域を有し、細胞シグナル伝達を制御することが報告されている。慢性骨髄性白血病やPh陽性急性リンパ芽球性白血病を引き起こす融合型チロシンキナーゼBCR/ABL発現細胞において、BCR/ABLおよびSrcファミリーキナーゼがPECAM-1のITIM領域をリン酸化することを見いだした。ITIMのチロシンリン酸化によりSHP2が結合し脱リン酸化するとともに、Gab2とも複合体を形成し、細胞内シグナル伝達の制御に関与することが推察された。BCR/ABLチロシンキナーゼ阻害薬imatinib耐性変異E255KやT315Iはより強くPECAM-1をリン酸化した。BCR/ABL発現細胞にPECAM-1をを過剰発現することにより、Rap1/MEK経路の活性化と細胞接着を亢進し、imatinibやBCR/ABLチロシンキナーゼ第二世代阻害薬dasatinibによるmitochondria障害とcaspaseの活性化を介したアポトーシス誘導を抑制した。これらの結果よりPECAM-1はBCR/ABL陽性白血病において、薬剤耐性や白血病化の進展に関与していることが推察された。研究成果により論文掲載2報を行うことができた。また現在1報投稿中また1報の投稿準備中である。現在までの結果がさらに新たなテーマへの推進となっているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。得られた結果をさらに進め、造血器腫瘍の発症・進展・治療抵抗性獲得機構・新規治療の開発に向けてさらなる研究を行いたい。
特別支援学校における重度・重複障害のある児童生徒への教材・支援アセスメントの開発

●研究目的:障がいの状態が非常に重度な子ども(超重度児)に、光や音、感触など様々な感覚刺激をアセスメントし、授業で活用する教材や支援の幅を広げること、繰り返すことで子どもの成長を客観的に把握することを目的とした。●研究方法:(1)見る・聴く・(手で)感じる・香る・動くの5項目のチェックシートとその素材からなるアセスメントセットの超重度児への試行、(2)振動して音声が出る簡易自作支援スイッチの超重度児への試行、(3)iPadの超重度児へ試行を行った。●研究成果:(1)の方法から、超重度児は初体験する感覚刺激に対して嫌悪の意思を示しやすいこと、注意持続力の課題から1度に23素材しか試行できないこと、普段慣れている声や香りは好意的な意思を示すこと、アセスメントを活用することで教員の視野が広がることなど成果と課題が明らかになった。(2)の方法から、振動し吹き込んだ音声が流れる機器は超重度児にも関心が比較的高いこと、音声の入れ替えが簡単なため教員が授業で活用しやすいこと、保護者が家庭でも活用できることなどが明らかになった。(3)の方法から、押さなくても触れるだけで音や光が変化し、また画面が大きく注目しやすいiPadは超重度児でもかかわりやすいこと、様々な音や光など豊富で安価なアプリがあり超重度児の関心にフィットしやすいこと、超重度児用アプリ集の作成が有効であることなど明らかになった。今後も超重度児の「好き!」の広がりという観点から、課題を踏まえて継続して取り組む必要性を感じている。
常緑性ツツジと落葉性黄花ツツジとの遠縁交配で得られた後代の黄花退色化現象の解明

常緑性白花ツツジと落葉性黄花ツツジとの交配で得られたF1実生の花弁内カロテノイド含量が減少する要因について明らかにするため,カロテノイド含量および生合成遺伝子の発現量の啓示的変化を調査した.発現解析を行ったところ,花弁発育に伴い,キレンゲツツジのPSYおよびPDSの発現量が`ミヤマサツキ'に比べ有意に高くなり,F1実生では両親の中間の発現量を示した.CCDに関しては,`ミヤマサツキ'およびF1実生のCCD4の発現量が生育期間を通じてキレンゲツツジよりも高かった.以上よりF1実生における花弁内カロテノイド含量の減少は`ミヤマサツキ'より遺伝したCCD4の発現量の増加によることが強く示唆された.常緑性白花ツツジ(ミヤマサツキ)と落葉性黄花ツツジ(キレンゲツツジ)との亜属間交配で得られたF1個体の黄花色退色化現象の要因を明らかにするために,今年度は花弁発育に伴うカロテノイド色素組成の変化を葉と比較した.その結果,キレンゲツツジにおけるカロテノイド色素の集積は,クロロプラストからクロモプラストへの変化に伴うβ,βカロテノイド類の割合の増加に起因することが示唆された.また,F1実生でも,花弁の発育に伴いβ,βカロテノイド類の割合の増加がみられたことから,カロテノイド色素を集積するためのクロロプラスト→クロモプラストの変換が生じていると思われた.次に,degenerate PCRおよび5',3'-race法を用いてカロテノイド生合成および開裂(分解)に関与する遺伝子の単離を試みた.現在までのところ,F1の開花花弁より,開裂酵素CCD1およびCCD4の全長配列,およびキレンゲツツジ開花花弁よりカロテノイド合成に関与する遺伝子のうちIPI, PSY,PDS,ZDS, LCYB, HYBの全長配列およびGGPS, CRISTO, Lcyeの下流配列を単離した.また,IPI,PSYについては,もう片親のミヤマツツジについても全長配列を単離した.常緑性白花ツツジと落葉性黄花ツツジとの交配で得られたF1実生の花弁内カロテノイド含量が減少する要因について明らかにするため,カロテノイド含量および生合成遺伝子の発現量の啓示的変化を調査した.発現解析を行ったところ,花弁発育に伴い,キレンゲツツジのPSYおよびPDSの発現量が`ミヤマサツキ'に比べ有意に高くなり,F1実生では両親の中間の発現量を示した.CCDに関しては,`ミヤマサツキ'およびF1実生のCCD4の発現量が生育期間を通じてキレンゲツツジよりも高かった.以上よりF1実生における花弁内カロテノイド含量の減少は`ミヤマサツキ'より遺伝したCCD4の発現量の増加によることが強く示唆された.常緑性白花ツツジ(ミヤマサツキ)と落葉性黄花ツツジ(キレンゲツツジ)との亜属間交配で得られたF1個体の黄花色退色化現象の要因を明らかにするために,今年度は花弁発育に伴うカロテノイド含量の変化およびカロテノイド成分の遺伝について調査した.まず,開花前日の花弁には,キレンゲツツジで30μg/gFW,ミヤマサツキで1μg/gFW,F1でその中間の10μg/gFWのカロテノイドが含まれていた.色素組成は,キレンゲツツジでβカロテン,ルテインが主要色素であり,ミヤマサツキではルテインが多かったもののβカロテンはほとんど含まれていなかった.F1は,両親の中間の色素組成を示した.花弁発育に伴い,キレンゲツツジでは色素含量および組成の変化はみられなかったが,ミヤマサツキおよびF1では含量が低下し,開花5日後にはほとんどなくなった.また,F1では発育に伴い,キサントフィル類の割合が増加した.常緑性白花ツツジ(ミヤマサツキ)と落葉性黄花ツツジ(キレンゲツツジ)との亜属間交配で得られたF1個体の黄花色退色化減少の要因を明らかにするために,今年度は8つのカロテノイド生合成遺伝子(IPI,PSY,PDS,CRTISO,ZDS,LCYb,LCYe,HYB)および2つのカロテノイド開列酵素遺伝子(CCD1,CCD4)についてRT-qPCRによる発現解析を行った.キレンゲツツジとミヤマサツキにおけるカロテノイド含量の差は,PSYおよびPDSの発現量の差に基づくことが示唆された.一方,F1実生では,上記2遺伝子について花弁生育中も比較的高い発現量を維持していたことから,F1実生にみられるカロテノイド減少に基づく退色化は他の要因が関与していることが示唆された.そこで,次に2つのクラスのCCD遺伝子について発現量を調査したところ,CCD1では花弁は発育期間を通してキレンゲツツジの方がミヤマサツキおよびF1個体に比べて発現量が高く,CCD4では逆にミヤマサツキおよびF1の方が発現量が高かった.また,これら遺伝子の推定されたアミノ酸配列に基づく局在性解析の結果,CCD1はcytosolに,CCD4はchromoplastに局在していることが推察された.以上の結果より,F1実生は,PSYおよびPDYの発現量が増加することでカロテノイド生合成能は高くなっているが,ミヤマサツキより遺伝したCCD4遺伝子の高い発現によりカロテノイド含量が花弁生育中に減少し,その結果退色化が生じるものと思われた.花卉園芸学カロテノイド色素分析に関しては,当初の計画通り,終了している.

関連遺伝子群のクローニングに関しては,全長配列の解析まで進んでいる遺伝子が11遺伝子中8遺伝子とおおむね進んでいることから,順調であると判断した.本年度は,色素組成の調査および関連遺伝子群のクローニングを計画していたが,色素組成の調査については,計画した通りに進んでいる.関連遺伝子群のクローニングに関しては,部分配列の解析まで進んでいるが,全長配列まで至っていない,これらの点から,やや遅れていると判断した.全長配列のクローニングが終了していない遺伝子については,クローニングを終了させる.さらに得られた,配列をもとにプライマーを設計し,リアルタイムPCRにより,各遺伝子の発現解析を行う.得られた結果をもとに,退色化現象の要因を考察する.まず,これまでに部分配列を明らかにしているカロテノイド生合成遺伝子群について,5'および3'race法を用いて,全長配列を決定する.すでに全長配列を決定しているCCD1については,リアルタイムPCR法を用いて花弁発育ステージごとの遺伝子発現量を解析し,花弁発育に伴うカロテノイド含量の減少との関連性を調査する.さらに,前述のカロテノイド生合成遺伝子群についても,全長配列を明らかにしたのちにリアルタイムPCRを行い,花弁発育に伴うカロテノイド含量の減少との関連性を調査する.5'RACE法用にデザインしたプライマーでの増幅が一部の遺伝子ではうまくいかず,シークエンス解析のためのクローニングが遅れたために,シークエンス解析用の費用が次年度使用額として残った.新しく設計したプライマーにより,増幅はうまくいっているので,クローニング終了後,ただちにシークエンス解析を行う.シークエンス解析用費用として用いる.部分配列のみを明らかにしているカロテノイド生合成遺伝子群について,全長配列を明らかにするためのrace法およびシークエンス解析のために使用する.
高齢者の活動余命を推定する指標としての体力の有用性に関する研究

本研究においては、高齢者の活動余命を推測する指標としての体力の有用性に関する研究を実施し、下記の結果を得た。1.高齢者の体力と日常生活動作遂行能力の現状に関する研究地域在住の自立した高齢者の脚伸展パワー、脚筋力、握力および開眼片足立ちおよび日常生活動作遂行能力についての現状を把握することができた。2.高齢者の身体的自立に必要な体力レベルに関する研究高齢者の生活機能の自立に必要な体力レベルについて検討した。その結果、脚伸展パワーは、男性では14.1W/体重kg、女性では9.3W/体重kg以上あること、また脚伸展力は、男性で1.0kg/体重kg、女性では0.8kg/体重kg以上あることが望ましいことが示唆された。3.高齢者における両側性機能低下と体力および日常生活動作遂行能力の関係に関する研究高齢者の筋力の左右差による両側性機能低下は高齢者の脚伸展筋力やパワー水準判定のための手段となることが示唆された。4、体力とミネラルとの関係に関する研究マグネシウムと亜鉛の尿中排泄量が多い人では、握力が低く、平衡維持能力も低い傾向にあった。このことから、高齢者の場合、筋力を維持できない場合には、筋中のマグネシウムや亜鉛を細胞内に維持できない機構が想定された。以上の結果から、高齢者の活動余命を推測する指標としての体力の有用性が示唆された。本研究の目的は、活動余命の指標としての体力の有用性を明らかにすることである。そこで、地域在住の60歳以上の高齢者を対象に体力と日常生活動作遂行能力と体力を明らかにするとともに、老化による腎機能の低下の指標としての尿中クレアチニンと体力の関係についても検討した。1.体力と日常生活動作遂行能力との関係今回は、60歳から79歳の女子242名(平均値士標準偏差;67.O±4.3歳)について検討した。その結果、階段昇降や椅子からの起立などの日常生活活動動作を支障なく遂行できる者において、脚伸展パワー、脚伸展力および握力は有意に高い値を示した。しかし、開眼片足立ちにおいては、有意な差はみられなかった。また、脚伸展パワーと日常生活動作遂行能力との間に有意な相関関係が認められた。このことから、下肢筋機能は活動余命の有用な指標になるものと考えられた。2.体力と尿中ミネラルとの関係65歳以上の高齢者(男子303名、女子503名)の体力と随時尿のミネラル(クレアチニン比など)との関係について検討した。その結果、体力とミネラルとの間に有意な相関関係がみられた。その中でも、マグネシウムと亜鉛の尿中排泄量が多い人では、握力や平衡機能は低い傾向にあった。平成11.12年度は対象者数を多くし、高齢者の活動余命の指標としての体力の有用性についてさらに検討する。また、老化の指標としては尿中クレチニンを用いた。昨年度は体力と日常生活動作遂行能力との間に有意な関係を認め、体力の中でも脚伸展パワー、脚伸展力および握力は活動余命の指標として有用であることを明らかにした。そこで本年度は、昨年度と同農漁村地区の60歳以上の高齢者374名(男性135名、女性239名)を対象に、これら対象者の初診時と3年目の体力と日常動作遂行能力を比較し、両者の変化の関係を検討した。さらに、尿中クレチニンと体力および日常生活動作遂行能力との関係についても検討した。1.体力の変化と日常生活動作遂行能力の変化との関係開眼片足立ちの時間は3年間で男女とも低下する傾向が認められ、特に女性(約17%)にその傾向は高かった。しかし、脚伸展パワー、脚伸展力および握力はいずれも有意な変化は認められなかった。なお、日常生活動作遂行能力の変化および他の項目の変化との関係は検討中である。

2.尿中クレチニンの変化と体力および日常生活動作遂行能力の変化との関係尿中クレチニンの変化と脚伸展パワー、脚伸展力、握力および日常生活動作遂行能力の変化との間には有意な差は認められなかった。平成12年度はさらに対象者を多くするとともに、3年間のまとめを行う。本研究の目的は、活動余命を推定する指標としての体力の有用性を明らかにすることである。そこで、地域在住の60歳以上の高齢者を対象に加齢に伴う体力の変化及びそれが日常生活動作遂行能力及ぼす影響について検討した。1.体力の加齢変化について60歳から79歳の男女1021名の体力の追跡調査を実施した。その結果、各年代において脚伸展パワー、脚伸展力、握力、開眼片足立ちは加齢に伴う有意な変化はみられなかった。しかし、追跡前の体力水準の高い者とそうでない者との2群に分け、経年変化を検討したところ、追跡前の体力水準の高い者は加齢に伴い体力の低下傾向がみられた。一方、体力水準が低かった者は加齢に伴う体力の変化には一定の傾向はみられなかった。2.加齢に伴うの脚伸展力における両側性機能低下について60歳から79歳の男女1021名を3群(60-64歳,65-69歳,70歳)に分け、一側の体肢単独および両側の体肢同時に等尺性最大筋力を発揮した結果から、Bilateral Index(BI)を算出した。BIは3群間で有意な差は認められなかった。これらのBIの数値は一般成人のそれと同様であった。さらに、日常生活動作遂行能力との関連性を検討したが、有意な関係は認められなかった。以上の結果から、高齢者の脚伸展力に関する両側性機能低下は加齢や日常生活動作遂行能力に影響されない可能性が示唆された。
デンドリマーを含む高分子複合系の分子設計と構造解析

本研究では、2成分相互侵入高分子網目(IPNs)の合成過程の最中に生成しつつある相分離構造を利用して、デンドリマーを分散し、デンドリマーの連続相を有する高分子分子複合材料をデザインした。そのため、ポリアミドアミンのデンドリマー(PAMAM-G5)を2-hydroxyethyl methacrylate(HEMA)およびpoly(ethyl methacrylate)(PEMA)の混合系に分散させ、PEMA鎖上にラベルしたけい皮酸の光二量化反応と溶媒成分であるHEMAモノマーの光重合・架橋によって、poly(cross-ethyl methacrylate)-inter-poly(cross-2-hydroxy ethyl methacrylate)のIPNsを作製した。PEMAネットワークはけい皮酸の二量化反応、またPHEMAはEthyleneglycol dimethacrylate(EGDMA)の反応によってネットワークが形成される。反応誘起相分離によって、デンドリマー(PAMAM-G5)の連続相の作製を試みた。得られた相分離構造をレーザ共焦点顕微鏡下でin situ計測を行った。また、3成分の構造を識別するために、デンドリマー(PAMAM-G5)成分をイメージングするために蛍光性分子Fluoresceinを包接させた。また、PEMAの成分をイメージングするために、Rhodamine Bを共有結合でPEMA成分と共重合を行った。このようにして、混合系の三つの成分を別々にイメージングすることができた。この3成分混合系を共焦点顕微鏡下で光照射しながら、形成された相分離構造を計測・解析した。結果として、デンドリマー(PAMAM-G5)がPEMA-rich相と親和性がよく、その中で均一分散することがわかった。さらに、照射光強度や光架橋剤濃度、混合分率を変化させながら、PEMA成分の連続相を作製する条件を確保した。このようにデンドリマーと高分子混合系との溶解性および相分離を巧みに利用することにより、高分子中でデンドリマーの連続相を作製できた。今後、その物性について検討する予定。「デンドリマーを含む高分子複合系の分子設計と構造解析」について昨年の11月から研究を開始したが、まだ時間が経たないので、研究は準備の段階にある。本研究は、高分子混合系の相分離によって形成された共連続構造を利用し、その片方の連続相にデンドリマーを混入させ、力学的特性や伝導性の向上を目指している。1)制御可能な共連続構造を有する高分子混合系の設計:蛍光色素FluoresceinをラベルしたPolystyrene(PS)誘導体とRhodamine6GをラベルしたMethyl methacrylate(MMA-Rh)モノマーに溶解させ、均一な溶液を作成し、紫外光を照射することによりPS鎖を架橋してPS網目を作りながら、PMMAネットウォークも同時に成長させる。このようにしてPS誘導体をマトリックス相中にPMMA-rich相が六方細密充填されたことがレーザー共焦点顕微鏡で明らかにされた。現在、これらの六方細密充填構造の最適条件について実験的に検討している。2)上記の実験で得られた高分子のhexagonal phaseをテンプレートにして、種々の官能基を有するデンドリマーを展開した。しかしながら、デンドリマーが均一に分散しなかったため、今後、その官能基を通して、デンドリマーとまわりにある高分子との親和性を向上して、さらに蛍光色素を化学的に修飾することにより、混合系中にデンドリマーの連続相の形成をイメージングする予定である。
光ナノアンテナを備えた蛍光相関分光分析デバイスによるプリオン病の早期診断法の開発

プリオン病の指標となる異常型プリオンタンパク質の高精度・迅速・ハイスループット分析を目的に、金属ナノギャップ型光ナノアンテナの光増強効果を利用した超微小光励起空間を蛍光相関分光法に適用し、高感度FCSセンサーシステムの構築を行った。シード法により合成された金ナノロッドを、分子スペーサーを介して互いに連結することで、効率的にONA構造を形成する事が出来た。一方、FCSとの統合においては、構造の表面処理及び励起光強度の最適化に時間を要するが初期的なデータを得ることが出来た。本研究では医療・食品分野の現場においてプリオン病の指標となる異常型プリオンタンパク質の高精度・迅速・同時多項目分析を実現する新規分析システムの開発を進めている。具体的には、「金属ナノギャップ型光ナノアンテナの光増強効果を利用した超微小光励起空間の形成」と「微小観察領域を出入りする分子の運動を検出することで、その形状・大きさ・濃度を高感度に分析する蛍光相関分光法」の融合によりそれを実現する。26年度は、1金属ナノギャップ型光アンテナ(ONA)の設計・加工・評価を中心に研究を進め、平行して2光学実験系のセットアップを行った。ONAの設計においては、シミュレーションによる電磁界解析から、棒状の金ナノロッドを光で励起した際、その表面近傍や、連結したONAのギャップ部において顕著な電場増強が生じることを確認した。続いて、界面活性剤水溶液中で金ナノ粒子を成長させるシード法により金ナノロッドを合成した。合成された金ナノロッドは、長軸長45 nm、短軸長12 nmの円柱状構造をとり、その極大吸収波長は780 nmであった。また、合成時の硝酸銀濃度を変えることで、600-1100 nmの範囲でそれぞれ異なる吸収極大を持つ金ナノロッドの合成に成功した。これらの光学特性は、シミュレーション結果と良い一致を示した。金属自身の光吸収特性、及び生体の光透過性を考慮にいれ、極大吸収波長650 nmの金ナノロッドを以降のONA構造作製に用いた。ONA構造の作製は、まず、金ナノロッドの結晶構造の異方性を利用し、構造両端部のみを選択的にチオール化DNAで修飾し、DNAハイブリダイゼーションによって構造を連結することで行った。2光学実験系においては、ハロゲンランプを光源とし、励起・蛍光フィルタ及び偏光板を倒立型顕微鏡に取り付け、ONAの光学特性評価に用いた。本研究では医療・食品分野の現場においてプリオン病の指標となる異常型プリオンタンパク質の高精度・迅速・同時多項目分析を目的とする新規分析システムの開発を進めてきた。具体的には、「金属ナノギャップ型光ナノアンテナの光増強効果を利用した超微小光励起空間の形成」と「微小観察領域を出入りする分子の運動を検出することで、その形状・大きさ・濃度を高感度に分析する蛍光相関分光法」の融合によりその実現を試みた。27年度は、より高効率に金属ナノギャップ型光ナノアンテナ(ONA)を得るため、前年度に開発した金基板上で金ナノロッド(NR)鎖を合成する方法から、ポリスチレンビーズを担体として用いる方法に変更した。続いて、光ナノアンテナを利用した蛍光相関分光分析(ONA-FCS)システムの構築を行った。計画当初、共焦点光学系(検出はAPD)とONA構造とを組み合わせて実験を行う予定であったが、ONAを光学顕微鏡下で視認するのが困難であったため、イメージングFCSのシステムを構築した。ここに、アナライザー(偏光板)を回転させる機構及び暗視野観察のシステムを組み込むことで、視野内のONAの位置及び配向を確認出来るようになり、基板上の任意のONAを多点FCSの光源として利用することが可能となった。最後に、蛍光ビーズおよび蛍光タンパク質(GFP)を対象にFCS測定を行った。現状においては、ONAの増強電場により励起された蛍光シグナルは検出されたが、有意な蛍光シグナルの揺らぎは捉えることが出来なかった。原因としては、ONA構造表面への物質の非特異吸着や強い電場勾配による光トラップ効果により、ONA近傍を試料が自由に動くことが出来ないこと、そして時間分解能の低いイメージングFCSのシステムでは分子の揺らぎを十分に検出出来ていない可能性がある。これらの問題に対しては、その表面修飾や光源の最適化により、克服することが可能であると考えられる。26年度の研究計画においては、効率的な金属ナノギャップ型光アンテナ(ONA)の合成を目指し、新規金属ナノロッド鎖固相合成法の確立を計画していた。しかしながら、提案した平面金電極とチオール還元脱離法とを組み合わせた手法では、生成物の回収率が低く、また、一回の合成に要する試薬量(金ナノロッド量)が多いため、条件を変え繰り返し試行することが困難であることが、実験により明らかとなった。