hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラージGタンパク質シグナル系の遺伝子異常と発癌機構

【目的】in vitroにおけるGNG7の機能を明らかにする。in vivoにてestablishされた腫瘍に対してGNG7遺伝子を導入し、その生物学的効果を明らかにする。【方法と結果】(1)GNG7発現低下の意義1)mRNA発現レベルと臨床病理学的因子との相関の検討real time PCRで37/55(67%)で50%以上のmRNAレベルの低下、4/55(7%)で発現増強が認められた。の深達度との有意な相関(p<0.05)が認められ、予後との有意な(p<0.05)相関もあった。(2)GNG7の役割の検討1)細胞増殖と細胞周期GNG7遺伝子導入株は有意(p<0.05)に細胞増殖が抑制されていた。GNG7遺伝子導入株はp27蛋白の発現が増強していた。その原因としてskp2、cks1によるp27のユビキチン化の抑制が考えられたがmRNAおよびタンパク質レベルでの両遺伝子の発現低下は認められなかった。2)浸潤能の検討親株、mockと比較してGNG7遺伝子導入株は有意に浸潤能の低下を認めた。マイクロアレイでGNG7遺伝子導入株で発現していたMMP2との相関が示唆された。(3)GNG7発現低下機序の解明GNG7の両側のLOHマーカーにおいて食道癌でのみ一部LOHを認めた。その他胃癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌では限られた症例数ながらLOHは認められなかった。DAC処理前後でGNG7の発現変化をreal time PCRで検討したところ、食道癌では9/15、胃癌で1/1、大腸癌で3/7の細胞株でDAC処理による脱メチル化によりGNG7発現の増強をみとめた。【考察】protein gamma7遺伝子導入株はp27が高発現しておりそのため細胞増殖が抑制されていると考えられた。P27の高発現の機序はとして転写の亢進、p27蛋白の分解抑制など考えられた。(2)癌におけるGNG7の発現減弱機序としてmethylationが最も可能性がある。今後はプロモーター領域を同定し、MSPを行う予定。
高精細マルチスペクトル画像計測による不純物ペレットの溶発雲形成機構の研究

本研究により,複眼光学系を用いたマルチスペクトル画像計測システムの最適化が進んだ。これにより,不純物ペレットの溶発雲中の電子温度の2次元分布を世界で初めて実験的に得ることに成功した。これを受けて,不純物ペレットの溶発雲中の電子密度の2次元分布計測を開始し,実験データの取得に成功した。今後,得られた実験データの解析が進展することで,不純物ペレットの溶発雲形成機構の研究の進展が期待される。本研究の目的は、複眼光学系を用いたマルチスペクトル画像計測システムの最適化をさらに推し進め、不純物ペレットの溶発雲中の電子密度及び温度の二次元分布を計測し、得られた実験データから不純物ペレットの溶発雲の形成機構について、より深い理解を得ることである。ペレット溶発雲中の温度は、溶発雲から発せられるHα線と連続光成分との強度比及びHβ線と連続光成分との強度比からおおよそ評価される。これまでに得られている実験データを解析した所、溶発雲中の温度は、1020eVと予想(数eV程度)より高く評価された。これは、連続光成分に何らかの線スペクトルが影響している可能性が高いことを示唆している。連続光成分の観測用として中心波長536.6nm、半値幅5.0nmの干渉フィルターを使用していたが、ここにCI(538.0nm)が混入している可能性がある。そこで、連続光成分計測に使用している干渉フィルターの透過特性を中心波長630.0nm、半値幅5.0nmに変更して実験を行った。実験データの取得には成功しており、現在、解析を進めている。今年度の実験では、計測システムの計測トリガー信号取得に頻繁に問題が発生した。調査した結果、ペレット入射装置より送られてくるトリガー信号のレベルが以前より若干低く、またノイズが大きくなっていることが判明した。またこれは、ペレット入射装置内のトリガー信号取得系において発生していることも分かった。この問題に対する対応策として、ペレット入射装置より送られてくるトリガー信号のレベルを以前より大きくする、具体的にはペレット入射装置内のトリガー信号取得系内の光学系を大幅に変更することし、現在作業を進めている。平成20年度は,まず昨年度明らかになった問題点の改善を進めた。例えば,上記計測システム向け計測トリガー信号の抜本的改善をもたらす計測トリガー信号取得系を新たに製作し,完成させた。ただ残念なことに,実験装置である大型ヘリカル装置の実験スケジュールの都合上,本実験用の不純物ペレット入射装置内(真空中)に取り付けることができなかった。テストベンチでは信号レベルが約10倍になっているのを確認できているので,今後の実験では計測トリガー信号の取得に問題が生じることはないと考えている。また,昨年度得られた実験データの解析を進めた結果,ペレット溶発雲中の電子温度は, 57eV程度と評価された。この時,ペレット溶発雲内では完全局所熱平衡プラズマが生成されていると仮定している。この温度は,これまでの実験やモデルから予想される温度として妥当なものである。したがって,昨年度連続光成分観測部分に対して行った調整は成功したと言える。この結果を踏まえて,平成20年度からペレット溶発雲中の電子密度の2次元分布計測を開始し,実験データの取得に成功した。初期的な解析結果は,本来最も電子密度が高いと予想される溶発雲中心部の電子密度がその周囲と比較して若干低くなっていることを示している。これが計測の不具合によるものか,実際のものかは今のところ不明であり,現在解析を進めているところである。本研究の最終目標である不純物ペレットの溶発雲形成機構の研究は今後の課題となってしまったが、本研究で得られた実験データの解析が進むことで,その進展が期待される。
アメリカンオプションの最適行使境界に対するシステム内挿近似

本研究の目的であるオプション保有者の最適権利行使境界に対する閉じた近似公式の導出に向けて,今年度は以下の研究成果を得た.1.連続クーポン支払のある転換社債の価格評価へのラプラス・カーソン変換アプローチ:転換社債は,予め定められた期間内に予め定められた価格で発行企業の株式に転換する権利が付与された社債で,その価格評価にあたっては,この権利に相当するオプションプレミアムを算定する必要がある.デフォルトの可能性のある企業が発行する転換社債の価格および転換境界に対する閉じた公式を導出し,数値的ラプラス逆変換により取引期間全体にわたる定量的な評価を行った.この成果は内挿近似においても有用な結果となる.研究成果は2018年7月にスペイン・バレンシアで開催された国際会議EURO2018において発表された.2.アメリカンオプションの最適権利行使境界に対する新たな近似公式の開発:平方根指数形の重み関数を導入することで内挿近似を具現化し,正確な漸近的性質を持つ新たな近似公式を導出した.これまで未解決であった重み関数に残された未知パラメータを除去するために,ラプラス・カーソン変換アプローチによって得られた最適権利行使境界が満たす関数方程式を用いた点にこの研究の新規性がある.この研究成果の一部は,2018年11月に京都大学数理解析研究所で開催された「ファイナンスの数理解析とその応用」研究集会および大阪大学数理・データ科学教育研究センター主催のワークショップで招待講演として発表された.3.テキストの監修:オプション価格評価に対する本研究の副産物として,『証券投資理論』(ミネルヴァ書房,2018年5月刊)および『エネルギー・リスクマネジメントの数理モデル』(朝倉書店,2018年11月刊)を監修を行った.研究目的であった最適権利行使境界に対するシステム内挿近似公式を導出することができたが,2018年9月に発症した突発性難聴により「症状再燃の可能性があるため,H30年12月31日までは航空機での移動は不可と考える.」(診断書原文)と診断されたため,研究成果を発表する予定であった国際会議参加をすべて取り消し,同年9月以降の研究計画に大幅な遅延を生じてしまった.このため,2019年1月18日に事業期間延長承認申請書を貴会宛てに提出し,同3月20日付で1年間の延長が承認されている.1年間の事業期間延長のご承認をいただいたので,2018年度の研究成果2について,2019年12月にオーストラリア・シドニーで開催予定の国際会議QMF2019等での研究発表および2019年9月に京都大学数理解析研究所で開催予定の「ファイナンスの数理解析とその応用」研究集会等での研究発表に加え,定数近似などの既存近似との数値比較を含む定量的評価を完結させ,今年度内に論文にまとめて欧米の学術雑誌に投稿する予定である.本研究の目的であるオプション保有者の最適権利行使境界に対する閉じた近似公式の導出に向けて,今年度は以下の研究成果を得た.1.転換社債の価格評価への改良ラプラス・カーソン変換アプローチ:満期前に株式への転換を許容するアメリカンオプションを内包する転換社債の価格および転換境界に対する閉じた公式を導出し,転換境界の漸近的性質を解析的に明らかにすると同時に,数値的ラプラス逆変換により取引期間全体にわたる定量的な評価を行った.この成果は内挿近似においても有用な結果となる.この研究成果の一部は,2016年11月に京都大学数理解析研究所で開催された「ファイナンスの数理解析とその応用」研究集会で発表され,2017年6月に刊行される日本オペレーションズ・リサーチ学会論文誌に掲載予定である.2.有限満期アメリカン交換オプションの価格評価:2つの資産を交換するアメリカンオプションに対しては,無限満期に対する解析解は求められているものの,有限満期の問題については閉じた解はこれまで得られていない.本研究の第2の成果として,上記のラプラス・カーソン変換アプローチを用いて,有限満期に対するオプション価格と最適交換境界に対する閉じた変換公式を導出した.また,最適交換境界の漸近的性質を解析的に求めると同時に,数値的ラプラス逆変換によって定量的な評価も行った.この研究成果は,World Scientific社から2017年に刊行予定の単行本「Stochastic Operations Research in Business and Industry」に掲載予定である.アメリカンオプションを内包する転換社債と投資に関する意思決定問題に対して,査読付き論文2編としてまとめることができたため.本研究の目的であるオプション保有者の最適権利行使境界に対する閉じた近似公式の導出に向けて,今年度は以下の研究成果を得た.1.ストックオプション価格評価のためのバリアオプションモデルの開発:ストック・オプションとは,企業がその取締役や従業員に対して,あらかじめ定められた価額で自社の株式を取得できる権利を付与する新株予約権の一種である.内生的に定められる近似境界をもつバリアオプションモデルを用いることで,ストック・オプション公正価値と権利行使時刻分布に対する明示的で閉じた評価式を導出した.この成果は最適権利行使境界を定数とする場合に相当し,内挿近似においても有用な結果となる.この研究成果は,2017年7月にカナダ・ケベックで開催された国際会議IFORS2017で発表され,2018年1月刊行の日本オペレーションズ・リサーチ学会論文誌に掲載された.2.クーポン付き転換社債の価格評価へのラプラス・カーソン変換

アプローチ:2016年度に行ったゼロクーポン転換社債に対する研究結果を、社債にクーポンが連続的に支払われる場合に拡張し,転換社債の価格および転換境界に対する閉じた公式を導出した.転換境界の漸近的性質を解析的に明らかにすると同時に,数値的ラプラス逆変換により取引期間全体にわたる定量的な評価を行った.この成果は内挿近似においても有用な結果となる.研究成果の一部は,2017年11月に京都大学数理解析研究所で開催された「ファイナンスの数理解析とその応用」研究集会で発表され,より詳細な結果は2018年7月にスペイン・バレンシアで開催される国際会議EURO2018において発表予定である.アメリカンオプションを内包する転換社債と投資に関する意思決定問題に関連して査読付き論文1編を刊行し,さらにもう1編の論文についても国際会議での発表および投稿を予定しているため.本研究の目的であるオプション保有者の最適権利行使境界に対する閉じた近似公式の導出に向けて,今年度は以下の研究成果を得た.1.連続クーポン支払のある転換社債の価格評価へのラプラス・カーソン変換アプローチ:転換社債は,予め定められた期間内に予め定められた価格で発行企業の株式に転換する権利が付与された社債で,その価格評価にあたっては,この権利に相当するオプションプレミアムを算定する必要がある.デフォルトの可能性のある企業が発行する転換社債の価格および転換境界に対する閉じた公式を導出し,数値的ラプラス逆変換により取引期間全体にわたる定量的な評価を行った.この成果は内挿近似においても有用な結果となる.研究成果は2018年7月にスペイン・バレンシアで開催された国際会議EURO2018において発表された.2.アメリカンオプションの最適権利行使境界に対する新たな近似公式の開発:平方根指数形の重み関数を導入することで内挿近似を具現化し,正確な漸近的性質を持つ新たな近似公式を導出した.これまで未解決であった重み関数に残された未知パラメータを除去するために,ラプラス・カーソン変換アプローチによって得られた最適権利行使境界が満たす関数方程式を用いた点にこの研究の新規性がある.この研究成果の一部は,2018年11月に京都大学数理解析研究所で開催された「ファイナンスの数理解析とその応用」研究集会および大阪大学数理・データ科学教育研究センター主催のワークショップで招待講演として発表された.3.テキストの監修:オプション価格評価に対する本研究の副産物として,『証券投資理論』(ミネルヴァ書房,2018年5月刊)および『エネルギー・リスクマネジメントの数理モデル』(朝倉書店,2018年11月刊)を監修を行った.研究目的であった最適権利行使境界に対するシステム内挿近似公式を導出することができたが,2018年9月に発症した突発性難聴により「症状再燃の可能性があるため,H30年12月31日までは航空機での移動は不可と考える.」(診断書原文)と診断されたため,研究成果を発表する予定であった国際会議参加をすべて取り消し,同年9月以降の研究計画に大幅な遅延を生じてしまった.このため,2019年1月18日に事業期間延長承認申請書を貴会宛てに提出し,同3月20日付で1年間の延長が承認されている.
角膜、結膜疾患における障害度の定量的システムの開発

本研究は角膜,結膜上皮障害病巣部を描出し定量的に測定できる検査法および画像解析装置の開発を目的とし,その研究内容として1)定量的解析に適したフルオ角膜染色法の検討,2)フルオ角膜染色像の撮影法の研究,3)撮影後の画像解析法の開発,4)臨床応用可能な装置の開発を課題とした。前年度までに行った1)-3)をもとに更に画像処理プログラム,所見(点状表層角膜症と一定範囲以上の病巣を有する角膜障害)による撮影法の再検討を行った。さらに実際の症例を対象に薬効の評価を行った。解析プログラムは測定範囲をマニュアルで範囲指定を行った後,一定輝度を有するピクセル数を測定する方法とし,測定対象の選択は4カ所まで可能とすることでノイズ除去を容易とし,測定の迅速化,精度の向上をはかることができた。点状表層角膜症は非圧縮画像で,それ以外は1/4圧縮画像での撮影により画像解析をおこないうることが判明した。薬効評価における本システムの有用性について角膜治療薬〔マトリックスメタロプロテアーゼ阻害薬(MMPI)点眼薬,Epidermalgrowthfactor:EGF点眼薬〕の臨床治験症例を対象にフルオレセイン角膜撮影像(印画紙)を反転し本装置でフルオ染色部の測定をおこなった。フルオの染色条件,点眼後の撮影時期については統一されていなかったこと,撮影装置が従来の細隙灯顕微鏡撮影装置であったことなどから測定結果がすべての症例で均質とはならないとの問題があったが,同一症例では病巣の範囲を定量的に検討することができ,従来の定性的解析法に比較し解析結果,評価の数量的解析が可能となることが判明した。1.フォトスリットランプの開発、試作(1)照明装置撮影面の輝度の均一化を目的として水平二方向からのストロボ照明装置を開発した。また角膜反射を小さくするために発光源はピンポイントとした。(2)フィルターの開発フルオレセイン染色された角膜、結膜病巣部の面積を測定するために、ストロボ照明系に励起フィルター(490nm)を入れ、撮影系にバンドパスフィルター(ピーク波長520nm)を入れた。(3)撮影装置画像処理の容易化かつ精度向上を目的としてディジタルスチルカメラを使用し、ディジタルカメラとフォトスリット装置との接続に装置と接眼鏡との間に光路延長筒を開発した。2.画像解析装置、プログラムの開発(1)ディジタルカメラのメモリーカード(15MB)から画像をパソコンを介して光ディスク(MO)にストアし、その画像を既存ソフトでの画像処理の検討をおこなった。3.角膜、結膜フルオレセイン染色検査法の検討表層の点状病巣と深層かつ広い範囲の病巣とではフルオレセイン色素点眼後の色素の動態が異なることが判明した。前者は瞬目と共に病巣部にのみフルオレセインが残留するのに比し、後者では角膜実質内に色素が拡散してゆくため病巣部の輪郭が不鮮明になるため、より厳密な検査法の確立が必要であることがわかった。研究対象は角膜・結膜上皮障害であるが、角膜・結膜は撮影対象としての性質が大きく異なるため、まず角膜を主たる対象として研究、開発をおこなうことと今年度の研究内容としては1)定量的解析に適したフルオ角膜染色法の検討、2)フルオ角膜染色像の撮影法の研究、3)撮影像の画像解析法の開発を行った。1)定量的解析に適したフルオ角膜染色法の研究(1)家兎角膜を対象に機械的に角膜びらん、点状表層角膜症を作成し、種々のフルオ濃度、用量、測定時間の検討、(2)角膜疾患症例を対象にフルオ染色像の検討をおこなった。

その結果、1%フルオレセン5μl点眼後、5分での測定が最適であるとの結果が得られた。2)フルオ角膜染色像の撮影法の研究a.照明系の検討:従来のフォトスリットランプは撮影背景輝度が均一でない他に、ストロボ光源の角膜反射が大きい。このためストロボ光源の発光部を小径とし、撮影背景輝度の均一化には左、右一対の光軸系としフォトスリットランプに同期する機構を組み込んだ。b.撮影条件の検討:画像解析での二値化処理に対応して、フルオエキサイタ-およびバリアフィルターの検討および装置への組み込みをおこなった。c.撮影媒体の開発:臨床ではリアルタイム処理が望まれる。撮影媒体として画像のコンピュータへの取り込み、処理に適しているディジタルスチルカメラの装置への組み込みをおこなった。3)画像解析法の開発点状のフルオ染色病巣をも検出、測定できるようにピクセル単位での測定を行うプログラムを開発し、種々の臨床例でその有効性の評価をおこなった。本研究は角膜、結膜上皮障害病巣部を描出し定量的に測定できる検査法および画像解析装置の開発を目的とし、その研究内容として1)定量的解析に適したフルオ角膜染色法の検討、2)フルオ角膜染色像の撮影法の研究、3)撮影像の画像解析法の開発、4)臨床応用可能な装置の開発を課題とした。前年度までに行った1)-3)をもとに更に画像処理プログラム、所見(点状表層角膜症と一定範囲以上の病巣を有する角膜障害)による撮影法の再検討を行った。さらに実際の症例を対象に薬効の評価を行った。解析プログラムは測定対象をマニュアルで範囲指定を行った後、一定輝度を有するピクセル数を測定する方式とし、測定対象の選択は4ヶ所まで可能とすることでノイズ除去を容易とし、測定の迅速化、精度の向上をはかることができた。点状表層角膜症は非圧縮画像で、それ以外は1/4圧縮画像での撮影により画像解析をおこないうることが判明した。薬効評価における本システムの有用性について角膜潰瘍治療薬(マトリックスメタロプロテアーゼ阻害薬(MMPI))の臨床治験症例を対象にフルオレセイン角膜撮影像(印画紙)を反転し本装置でフルオ染色部の測定をおこなった。フルオの染色条件、点眼後の撮影時期については統一されていなかったため測定結果がすべての症例で均質とはならないとの問題があったが、同一症例では病巣の範囲を定量的に検討することができ、従来の定性的解析法に比較し解析結果、評価の数量的解析が可能となることが判明した。
腎線維症発症におけるコラーゲン結合インテグリン(IG)レセプターの役割解明

小児の慢性、進行性腎疾患に共通する細胞生物学的特徴は、糸球体メサンギウム細胞(MC)や腎間質線維芽細胞(Fib)によるコラーゲン(COL)基質を中心とした細胞外基質(ECM)の異常リモデリングであり、最終的には糸球体硬化、間質線維化からなる腎線維症を呈する。この腎線維症発症に関わる異常なCOL基質リモデリングの分子生化学的機序を、ラット腎炎モデルや培養MC、Fibを用いて、COL結合インテグリン(IG)から発生するシグナル伝達経路を分析することにより検討した。1)組織線維化現象(COLリモデリング)のin vitroモデル、COLゲルコントラクションアッセイを用いたIG機能の検討:エンドセリンは、培養MCのα1β1IGを介する遊走能を刺激することによりCOLリモデリングを亢進させた。一方、腎間質線維化促進因子であるTGF-βは、培養Fibのα1β1,α2β1IG発現を刺激することによりCOLリモデリングを亢進させた。この作用に加えてをTGF-βはFibのα-SM actinの発現も亢進させることが判明した。これらFibのCOLリモデリング能力は抗α1,α2IG機能阻害抗体により阻害され、電顕的観察でも太いCOL繊維の形成が抑制されており、IGの組織線維化現象における重要性が明かとなった。2)COLリモデリングにおけるα1β1IGシグナルの役割検討:シグナル伝達阻害薬やドミナントネガテイブDNA vectorを用いて検討したところ、COLリモデリングの過程でα1β1IGシグナルより発生するシグナルとしてERK-AP-1シグナルが重要であった。このシグナル経路を阻害すると異常なCOLリモデリングを制御できる可能性がある。3)片腎抗Thy-1腎炎は進行性腎炎に見られるECMの異常リモデリング像を呈する腎炎モデルである。この腎炎を用いてIGシグナルの分析を試みた。異常ECMリモデリング像がピークになる時期に、ERKシグナルやIG結合カイネース(ILK)が増強することが判明した。今後は、IG関連細胞内シグナル分子の活性化を阻害する薬剤を発見し、小児腎疾患の進展を抑制する研究を行う必要がある。この腎線維症発症に関わる異常なコラーゲン(COL)基質リモデリングの分子生化学的機序をラット腎疾患モデルや培養糸球体メサンギウム細胞(MC)、腎間質線維芽細胞(Fib)を用いて分析した。1)組織線維化現象(COLリモデリング)のin vitroモデル、COLゲルコントラクションアッセイを用いたIG機能の検討:腎炎促進因子であるエンドセリンは、培養MCのα1β1IGを介する遊走能を刺激することによりCOLリモデリングを冗進させた。この作用に加えてエンドセリンはMCのMMP-2の分泌も亢進させることが判明した。一方、もう一つの腎炎促進因子、TGF-βは培養Fibのα1β1IG発現やα-SMアクチン発現を増加させることによりCOLリモデリングを刺激することが推測された。これら二つの細胞のCOLリモデリング能力は抗α1IG機能阻害抗体により抑制された。2)ラット抗Thy-

1腎炎を用いたα1β1IGの役割検討:抗Thy-1腎炎は進行性腎炎に見られるECMの異常リモデリング像を呈する腎炎モデルである。この腎炎を用いてα1β1IGの機能阻害を試みた。α1β1IG機能阻害抗体を左腎動脈より投与したところ、腎炎に見られる細胞増殖や異常ECMリモデリングがコントロールIgG投与に比べて抑制されたことよりα1β1IGがCOLリモデリングを制御する重要なIGレセプターであることが判明した。今後さらにIGより発生する細胞内シグナル伝達機構(Ras/Rhoシグナル)を分析し小児腎疾患の進展機序を分子生化学的に解明する。小児の慢性、進行性腎疾患に共通する細胞生物学的特徴は、糸球体メサンギウム細胞(MC)や腎間質線維芽細胞(Fib)によるコラーゲン(COL)基質を中心とした細胞外基質(ECM)の異常リモデリングであり、最終的には糸球体硬化、間質線維化からなる腎線維症を呈する。本研究では、腎線維症発症に関わる異常なCOL基質リモデリングの分子生化学的機序を、COL結合インテグリン(IG)を介したシグナル伝達の観点から分析した。1)組織線維化現象(COLリモデリング)のin vitroモデル、COLゲルコントラクションアッセイを用いたIG機能の検討:腎間質線維化促進因子であるTGF-βは、培養Fibのα1β1,α2β1IG発現を刺激することによりCOLリモデリングを亢進させた。この作用に加えてをTGF-βはFibのα-SM actinの発現も亢進させることが判明した。これらFibのCOLリモデリング能力は抗α1,α2IG機能阻害抗体により阻害され、電顕的観察でも太いCOL繊維の形成が抑制されており、IGの組織線維化現象における重要性が明かとなった。2)COLリモデリングにおけるα1β1IGシグナルの役割検討:シグナル伝達阻害薬やドミナントネガテイブDNA vectorを用いて検討したところ、COLリモデリングの過程でα1β1IGシグナルより発生するシグナルとしてERK-AP-1シグナルが重要であった。このシグナル経路を阻害すると異常なCOLリモデリングを制御できる可能性がある。3)片腎抗Thy-1腎炎は進行性腎炎に見られるECMの異常リモデリング像を呈する腎炎モデルである。この腎炎を用いてIGシグナルの分析を試みた。異常ECMリモデリング像がピークになる時期に、ERKシグナルやIG結合カイネース(ILK)が増強することが判明した。今後は、IG関連細胞内シグナル分子の活性化を阻害する薬剤を発見し、小児腎疾患め進展を抑制する研究を行う必要がある。
可変摩擦ダンパーとMRダンパーによる複合型セミアクティブ制振に関する研究

本研究は,合理的な建物の地震応答制御として,制震デバイスであるダンパーと建物の架構を繋ぐダンパー支持部材の負担軽減と,建物高さ方向の応答分布の均一化を図ることを目標とした。本研究を通して試作した可変ダンパーの基本的な特性把握と,目標を達成する制御則ならびにこれを実現する比較的簡便な制御システムの構築を行うことができた。本研究は,粘性系可変減衰ダンパーと履歴系可変摩擦ダンパーを組み合わせた複合型セミアクティブ振動制御システムの提案を行うものである。平成18年度においては,まず粘性系可変減衰ダンパーとしてバイパス式MRダンパーについて検討を行った。2kN級のMRダンパー試験体について動的加力試験と,3層の鉄骨造フレーム試験体の各層にMRダンパーを設置して地震波加振を行うセミアクティブ振動制御実験を実施した。これらの結果,多層での制御実験システムが構築でき,意図通りの制御が可能であることを確認した。またMRダンパーについては理想的な可変減衰ダンパーとはならず,粘性要素と摩擦要素を含むビンガム特性1を示し,粘性要素については速度のべき乗に比例する傾向を示し,ダンパー励磁により,この摩擦力と減衰係数が制御できることを確認した。また各ダンパーの設置形式の検討を行うため,粘性系可変減衰ダンパーとしては動的加力実験結果から得られた数値モデルを,履歴系可変摩擦ダンパーとしては完全弾塑性の履歴特性を有し,摩擦力(降伏力)を可変に制御できる理想化モデルを用いて数値計算による検討を行った。ダンパーの設置形式について,2つのダンパーを直列または並列に複合させる場合,この複合デバイスの建物フレームへの設置形式はシアリンク結合が考えられ,デバイスとフレームを繋ぐ支持部材剛性が無視できないため,まずは支持部材剛性がセミアクティブ制御に及ぼす影響について検討した。この結果,制御則によっては支持部材変形によりデバイスに有効にフレーム層間変形が伝わらなくなり,有効な応答低減ができなくなることが確認できた。前年度までの成果を踏まえ,既往技術より合理的な建物の地震応答制御として,制震デバイスであるダンパーと建物の架構を繋ぐダンパー支持部材の負担軽減と,建物高さ方向の応答分布の均一化を図ることを制御の目標とした。平成19年度は,ダンパー部分の減衰力とダンパー支持部材変形の関係を整理するため,制御による減衰力の履歴形状から等価線形化法を用いて制御システムの性能曲線を算出した。この結果,パッシブダンパーやエネルギー応答量に比例したセミアクティブ制御の場合,ダンパーの減衰力(制御力)が支持部材の剛性に対して過度に大きくした場合に,最大応答の増大を招くことを確認した。一方,これまで検討を行ってきた制御則に履歴形状制御を加えた制御則(本研究ではEFH制御と呼ぶ)では,制御力を増大させても応答の増大がほとんど見られない結果となった。このことについてさらに詳細な検討として,模擬波,観測波を用いた時刻歴応答解析,鉄骨造1層フレーム模型を用いた振動台実験を行った結果,EFH制御では,ダンパー部分の減衰力により生じる支持部材の負担力を適宜除荷していることにより,常にダンパー部分で大きなエネルギー消費を行わせることが可能であることが分かった。しかし,これを可変粘性ダンパーのみで実現するよりも,ここに本研究で提案する可変摩擦ダンパーを導入し,支持部材の負担力を緩和させる制御を行う方が合理的な振動制御に有用であることが分かった。平成20年度は,前年度に検討した等価線形化法を用いた制御システムの性能曲線の実験的な検証を行い,その妥当性を確認した。さらにこの結果を踏まえ,本制御則を用いたセミアクティブ制振建物の簡便な設計手法の提案を行った。本研究で検討するセミアクティブ制御則の場合は,地震時の建物のエネルギー応答量に乗ずる制御係数が制御効果に大きく影響することが前年度までの検討で分かった。この制御係数の簡便な設計方法としては,まず1質点系に対しては,制御システムの性能曲線を用いることで,最適な制御係数を設計することが可能であることを実験的・解析的に確認した。さらに, 1質点系で得られた制御量を多質点系に拡張するため,一般にパッシブ振動制御で用いられる考え方を本セミアクティブ制御則に適用することを試みた。ひとつは主架構の層剛性に比例して各質点の制御係数を設定する方法,もうひとつは建物に作用すると想定される層せん断力に比例させる方法である。鉄骨造10層の建物を想定して解析的な検討を行った結果,どちらの手法も各層の応答が設計クライテリアを満足し,かつ過度な制御量とならないような合理的な制御係数の設定ができた。さらにこの2つ方法を発展させ,各層のエネルギー応答量に比例された設計方法についても検討を行ったが,こちらも同様の結果であった。これら3つ設計方法にあまり差が見られなかったのは,今回想定した建物が比較的層剛性が均一であるためと考えられ,例えば特定の層が変形しやすいといった不均等な剛性分布をもつ場合の検討等が今後の課題である。
口腔がんにおけるリンパ管新生因子VEGF-C遺伝子発現調節機構の解明

本年度はその目的と実施計画に従い、研究を逐行した。1.リンパ管内皮細胞の培養は安定して行い得た。市販培養細胞ではなく、ヒト皮膚微小血管内費細胞からの分離培養が安定して行い得た。2.リンパ管内皮細胞3次元培養による腫瘍リンパ管新生能の検定。リンパ管新生能を検定するためこの方法を選択したが、結果が不安定なため、リンパ管内皮細胞の増殖能を直接検定する方法に変更した。3.発現調節領域の構造と機能の解析(1)プロモーター解析を完了した。前年度より継続してルシフェラーゼアッセイにより発現を確認し、遺伝子導入細胞株により活性の差を確認した。(2)エンハンサー領域の同定を行った。最小領域の同定のためプロモーター単独での解析を行い、繰り返し配列も作成し、遺伝子導入の後活性の差をルシフェラーゼアッセイにて検定した。4.転写制御は既知の遺伝子によるものであり、解析は不要であった。5.リンパ管内皮細胞と口腔がん細胞株の共培養により、細胞株の違いによる増殖活性の違いを確認した。また、その活性の違いとマウス移植での転移能を検討し、その相関が判明した。6.VEGF-Cの過剰発現を生じる細胞株作成を行った。その結果得られた細胞株をマウスに移植するよう試みたが、過剰発現細胞株は-過性発現のものにおいては再現性のある結果が得られず、向上発現を行う細胞株の作成には至らなかった。以上の解析を行い、成果を次年度以降刊行される雑誌に投稿する。本年度は、その目的と実施計画に従い、以下の段階まで研究を遂行した。1.リンパ管内皮細胞の培養ヒト皮膚微小血管内皮細胞(HMVEC)の中に血管内皮細胞(BEC)とリンパ管内皮細胞(LEC)が混在している。リンパ管アーカーであるpodoplaninの抗体を用い、LECを分離し、培養を行った。また、申請段階には発売されていなかった市販培養細胞を購入し、より効率的な培養を行った。2.リンパ管内皮細胞三次元培養による腫瘍リンパ管新生能の検定分離培養したヒトリンパ管内皮細胞をわれわれが行っている血管内皮細胞三次元培養法を応用し、三次培養を行い、口腔がん細胞培養株におけるリンパ管新生能を定量評価を試みたが、三次元培養は血管新生能の検定に用いたものの転用で、リンパ管新生能の検定にはやや難があり、安定した結果を得るまで次年度に継続が必要になっている。3.発現調節領域の構造と機能を、分子生物学的・細胞生物学的手法で明らかにする。(1)プロモーター解析発現調節領域の同定を行う。クローニングした上流配列が確かにプロモーター活性を示すかどうかをレポーター遺伝子発現アッセイによって調べた。(1)-Aレポーター遺伝子発現アッセイルシフェラーゼアッセイ2)リン酸カルシウム法を用いて転移能力の異なる数種類の口腔癌細胞に導入した。3)それぞれの細胞により活性の差を検討したただし、口腔がん細胞への遺伝子導入操作が不安定で、次年度はさらに効率のよい方法を検討する必要がある。プロモーター解析の一部が終了し、欠失変異体の作成段階にある。
電気化学発光セルを用いた有機スピントロニクスの創製

電荷とスピンの2つの自由度を利用したスピントロニクスの研究は、無機半導体・金属を中心に基礎物性・応用研究の両面から盛んに行われている。本研究では、環境負荷が少なく、資源戦略的な観点からも将来が有望視されている有機半導体材料を用いた有機スピントロニクスの研究を行った。有機スピントロニクスを実現するために、スピンポンピングを利用して有機半導体中にスピン注入を行う手法、電気化学発光セルを利用してスピン注入を行う2つの手法に挑戦した。本研究の目的は、多様な有機分子材料への電気的スピン注入を自在に制御し、その特性を光学特性で評価する手法の確立し、その背景に眠るサイエンスの理解と応用展開を目指すことである。今年度は、電気化学発光セル(LEC)を用いた有機スピントロニクスデバイス及びスピンポンピングによるスピン注入の実験を試みた。1、LECは、有機発光ポリマーと電解質の混合材料を電極で挟むだけのシンプルな構造の発光デバイスであるが、今回、電極として磁性電極を用いることで有機材料へのスピン注入を目指した。得られた結果として、磁性電極を用いた場合にも、2.5V程度でLECが発光をはじめることを観測した。電極材料の仕事関数と有機発光ポリマーのエネルギー順位が異なるに関わらず、有機発光ポリマーのバンドギャップ程度のエネルギー(2.4eV)でLECが発光することは、LECが電気化学反応により電荷注入が行われるためであると言える。しかし現時点では、得られた発光特性からスピン注入の有無およびスピン伝導の評価を行うことはできなかった。2、有機半導体に対して、微小磁性体の磁化歳差運動に起因したスピンポンピングを利用して、スピン角運動量を有機半導体中にトランスファーし、スピン注入を行った。有機半導体として、最も移動度が高いことが知られているルブレン単結晶を用いた。得られた結果として、強磁性共鳴スペクトルの測定を行い、明瞭な共鳴ピークが観測した。また外部磁場変化によるピークシフトも確認され、有機半導体にスピン注入が行えていることを示唆している。本研究では、有機分子材料への電気的スピン注入を自在に制御し、その特性を評価する手法を確立し、その背景に眠るサイエンスの理解と応用展開を目指すことを目的に研究を行った。今年度は、電気化学発光セル(有機発光ポリマーと電解質の混合材料を電極で挟むだけのシンプルな構造の発光デバイス)を用いて、有機スピントロニクスデバイスの可能性について検討を行った。1)電気化学発光セルの電極に磁性材料を用いたデバイスを作製し、磁性材料からのスピン注入を試みた。磁性材料のスピンの向きを揃えるために、磁場を印加したところ有機発光ポリマー自体が100G程度の小さな磁場で大きな磁気抵抗を持つことが明らかになり、スピンが注入できているのか検証することができなかった。したがって、電気化学発光セルを利用した有機スピントロニクスデバイスが実現できるかは明らかにすることができなかった。2)ただし副産物として、電気化学発光セルの磁気輸送特性の評価を行った結果、発光する前後(自己組織PN接合の形成の前後)の電圧で、磁気輸送特性が、正の磁気抵抗から負の磁気抵抗へ変化する様子を観測した。これは、発光の前後で異なるメカニズムで磁気抵抗が誘起されることを示唆している。この様に、有機スピントロニクスデバイスの可能性は検証することができなかったが、電気化学発光セルの磁気輸送特性の研究や、量子ドットを使った新しい発光デバイスの作製など、多くの副産物があり、今後も研究を進めていく予定である。有機半導体現時点では、電気化学発光セル、及びスピンポンピングによるスピン注入の2つのテーマより有機半導体へのスピン注入の実験を行っている。電気化学発光セルの実験では、磁性電極を利用した場合にも発光を観測し、残すは、磁場中での光学特性の評価を行うだけである。また、スピンポンピングの実験では、デバイスの作製が行える様になり、強磁性共鳴スペクトルが得られるところまで研究は進捗しており、おおむね順調に研究は進展している。昨年度から引き続いて電気化学発光セル及び、スピンポンピングによるスピン注入の2つの研究テーマから有機半導体へのスピン注入の研究を進めていく。まず電気化学発光セルの研究では、磁性電極を用いた発光セルを用いて、磁場中での光学特性の評価を行っていく。光学遷移選択則を利用した光学評価からスピンが注入されていることの確認と、分子内のスピン伝導の評価を行っていく。特に、有機分子材料のスピン拡散長や緩和時間などの特性に注目し、有機半導体材料におけるスピンの伝導機構の原理解明を行う。また磁場により発光強度を自在に操る新規有機スピントロニクスデバイスの作製を行う予定である。またスピンポンピングによるスピン注入の実験では、現時点で強磁性共鳴スペクトルが得られる所まで研究が進捗しており、今後は、デバイス構造を最適化することで、スピン注入の検証、逆スピンホール効果による有機半導体におけるスピン伝導、ゲート電界によるスピン伝導の制御の測定を行っていきたい。電気化学発光セルの作製に不可欠な有機発光ポリマー材料の購入を計画していたが、納期が間に合わないことが判明したため、次年度に繰越を行った。予定通り、2014年度に有機発光ポリマーの購入を行う。
D-アミノ酸への転換反応追跡用次元拡張型振動円二色性分光法の開発

本プロジェクトでは、(1)次元拡張型VCD装置の開発を行い、(2)ペプチドオリゴマー中のD-アミノ酸の検出を目指した研究を行った。(1)に関しては、VCD装置のバージョンアップを行い、ベースラインの長期間安定性を実現し、信号/雑音比をあげて微弱シグナルの測定を可能とした。それと同時に直線偏光の測定も可能とし、固体VCD法の開発をおこなった。(2)(2A)粘土鉱物(モンモリロナイト)表面にキラルな金属錯体ΔーあるいはΛー[Ru(phen)3]2+(phen=1,1-phenanthroline)を吸着させて、モンモリロナイト表面にキラル認識場を作製した。インターカレートした錯体のΔ、Λ体に対応して反転したシグナルを得ることができた。さらに、この試料中にキラル物質として有機分子であるR,-あるいはS-BINOL(1,1'-bi-2-naphthol)を吸着させ、モンモリロナイト面上におけるキラル分子間の相互作用を検討した。モンモリロナイトを含めた3成分系にVCD法を適用した結果、金属錯体との相互作用により柔らか分子の有機分子BINOLがコンフォーメーションを変える証拠を得ることができた。VCD法を層状化合物に初めて適用した例である。(2B)パーフルオロ基をもつ低分子量ゲル化剤とアルキル基をもつ2成分系のキラルゲルに対してVCD法を適用した。ゲル化速度と熱力学的安定性への影響を検討した。特に、ゲル化剤のキラリティの影響(立体化学的効果)の検討をおこなった。VCD吸収がゲル化に伴い増大してく現象を観察した。(2C)ペプチドオリゴマー関連のテーマとしては、抗菌ペプチドボンビニンH2,H4のD体アロイソロイシン残基の役割に関して領域内で共同研究をおこなった。VCDの結果から1残基目の側鎖と2残基目の側鎖の関係がH2ではトランス型、H4ではシス型であることがわかった。29年度が最終年度であるため、記入しない。たんぱく質に代表される生体高分子ではさまざまなコンフォメーションが可能であり、その“柔らかさ"のもとで階層的高次構造(一次から四次)が導かれる。各階層は特有の不斉構造(キラリティ)を有し、それらが機能発現のための不可欠な要素となっている。我々は高感度化を目指した振動円二色性分光法と表面反射とのVCD-RASコンカレント測定装置の開発を行ってきた。その結果VCD-RAS手法が、溶液、膜あるいは固体試料に見られる分子集合体の示す超分子キラリティ解析に対して新しい手段となり得ることを示してきた。本プロジェクトでは、次元拡張型VCD-RAS装置の開発を行い、それを用いたペプチドオリゴマー中のD-アミノ酸の検出を目指した研究を提案した。本年度はその第1歩として、微弱なシグナル追跡のための振動円二色性分光法装置の検出部および光学系のバージョンアップをおこなった。D-アミノ酸追跡用試料としては抗菌作用のあるペプチドをとりあげ、その中に存在することが知られている2つの不斉炭素をもつL-イソロイシンとD-アロイソロイシンの関係に着目した。その結果、固体状態での測定によって2つの不斉炭素に由来するVCD吸収の符号がそれぞれ独立には決まらず、両者のキラリテイに相互依存していることがわかった。ペプチド中のアミノ酸のR体、あるいはS体を同定する上で、着目する分子のVCD吸収の符号に対して隣接したアミノ酸のキラリティが影響を与える可能性があることを明らかにした。本年度は振動円二色性分光法装置の検出部および光学系のバージョンアップを行った。その結果、微弱シグナルが測定可能となり、論文化した結果は、Chem.Lett.のEditor's Choiceに選出された。愛媛大学のホームページにも掲載された。(2C)

ペプチドオリゴマー関連のテーマとしては、抗菌ペプチドボンビニンH2,H4のD体アロイソロイシン残基の役割に関して領域内で共同研究をおこなった。VCDの結果から1残基目の側鎖と2残基目の側鎖の関係がH2ではトランス型、H4ではシス型であることがわかった。本研究で用いるVCD法は、一般にシグナルが小さいことが問題であるために反応系の選択に工夫が必要である。特にアミノ酸の場合、水溶媒での測定が可能かどうかが重要である。次年度ではこの問題のために、D体のみとL体のみのアミノ酸からなるペプチドオリゴマーを用いて、次元拡張型VCD/LD装置での測定を行う。種々のアミノ酸からなるペプチドオリゴマー(ジペプチドなど)を系統的に調べ、各アミノ酸残基によるVCDスペクトルがD体とL体で反転していることを確かめる。このシグナルの解析には第1原理計算を併用し、ペプチドオリゴマーの構造を決定する。次に、L体中に一個のD体(およびD体中に一個のL体)を含むモデルペプチを取り上げる。L体からD体に置換された時に全体の高次構造(βシート構造など)がどのように影響を受けるかを調べる。具体的には、C=O伸縮やアミド基に帰属されるVCDピークの挙動をペプチドの重合度を変えながら追跡する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
古墳時代の馬飼いに関する動物考古学的研究

本研究は、形態学的および安定同位体分析の複合的な検討を要として、「馬飼い」の実像に迫ることを目的としており、2018年度は本研究の2年目となる。今年度の実績は、河内の牧の推定地として有力視される蔀屋北遺跡から出土した馬歯の安定同位体分析の結果が得られた。その結果は、河内の牧におけるウマの繁殖、飼育、管理、移動、食性など、馬飼い集団がどのようにしてウマを飼っていたのかのみならず、ウマの増殖に関する他地域との連携関係などの解明にも視野が広げられる情報が得られた。また、研究協力者の協力によって、馬飼いに関する研究会を開催した。河内の馬飼いに関連する日下遺跡から出土した埋葬馬の年代測定の結果および考古資料の年代観の複合的検討、馬飼い集団の調整の検討を行い、協力者との情報共有ができた。さらに、畿内周辺地域の馬利用について紀伊の馬利用について、畿内の馬飼い、王権、周辺地域における馬利用の実態把握の総合的検討を試みるための基礎情報の共有ができた。当初の研究計画に従い、順調に進展している。研究協力者との連携は滞りなく、安定同位体分析の結果が得られ、次年度(最終年度)には、形態学的特徴と複合的に検討する準備が整った。研究会の開催は、当初企画のテーマとは異なるが、馬飼いに関連する重要な情報交換ができた。また、河内の馬飼いの実像に関する議論を展開することができ、安定同位体分析の結果によってさらに議論が深まることが確認できた。本年度は研究計画に従っており、本研究の要となる遺跡についての調査は終了した。3年計画の最終年度となる次年度には、研究を総括に着手する予定である。また、本年度に結果が得られた安定同位体分析について、研究協力者(分析者)とは、解釈を進めるにあたり相談も済ませており、次年度の形態特徴と安定同位体からみた馬の特徴を複合的に必要な情報等の整理も始めている。本研究は、大阪(河内)の古墳時代の馬飼いの実態を明らかにすることを目的としており、馬歯・馬骨の形態学的特徴、安定同位体分析、馬具や渡来人との関わりについて検討するものである。2017年度は、研究初年度であり、研究協力者との打合せを行った。協力内容について確認を行い、古墳時代の馬に関連する考古学的研究について助言をもらった。分析作業の具体的内容は、古墳時代の河内の馬飼いの拠点集落の一つと考えられる大阪府蔀屋北遺跡から出土した馬歯、馬骨の安定同位体分析のサンプリングを行った。また、同じく河内の馬飼いに関連する日下貝塚から出土した、ほぼ完形の埋葬馬について形態学的特徴の観察および計測を行った。次年度に安定同位体分析の結果が得られ、馬飼い集団が保有する馬の生育地に関する情報が得られることは重要である。さらに、これまで存在は知られていた日下貝塚出土の馬に関する形態学的特徴の詳細は不明であり、本研究において成果が得られたことは古墳時代の馬の姿の復原に重要な資料となる。それらとは別に、群馬県立歴史博物館の協力を得て、同館が開催した古墳時代の馬に関する展示企画にあわせ、「古代の馬研究会」を開催した。本研究の主対象である大阪(河内)と古墳時代の馬の生産地と目される群馬(上野)の状況に関して、専門研究者で情報交換を行い、研究者間で情報共有できた点はこれまでの馬に関する研究を大きく前進させる契機となり意義深いものとなった。当初の研究計画に従い、研究は順調である。研究協力者との連携は滞りなく、次年度の研究にもつながる助言をもらうことができた。分析面では形態学的特徴に関する観察、計測は終了しており、比較資料となる遺跡についても検索を開始し、予備調査も行うことができた。安定同位体分析のサンプリングも終了しており、次年度の結果を待ちつつ、検討内容についても分析依頼をした研究協力者と相談ができている。研究会の開催は、当初企画のテーマとは異なるが、馬飼いに関連する情報交換ができた。

また、河内の馬飼いの実像に関する議論を展開することができ、安定同位体分析の結果によってさらに議論が深まることが確認できた。本年度は研究計画に従っており、本研究の要となる遺跡についての調査は一段落している。3年計画の2年目となる次年度には、研究を補強する遺跡から出土した馬の分析に着手する予定であり、分析に関する依頼などは、すでに相談を始めている。また、本年度にサンプリングした安定同位体分析については、研究協力者との検討内容について相談も済ませており、解釈に必要な類例などの探索を開始する予定である。本年度は研究計画に従っており、本研究の要となる遺跡についての調査は終了した。3年計画の最終年度となる次年度には、研究を総括に着手する予定である。また、本年度に結果が得られた安定同位体分析について、研究協力者(分析者)とは、解釈を進めるにあたり相談も済ませており、次年度の形態特徴と安定同位体からみた馬の特徴を複合的に必要な情報等の整理も始めている。本年度は、情報収集および資料調査に重点をおき、購入を予定していた設備備品で、本格的な資料整理や分析作業に必要なパソコンの購入を次年度に遅らせることにした。2018年度の研究補助の人件費を年度末の3月分確保していた。しかし、研究補助者の勤務日数を確保できなかったため、研究補助作業を次年度に延期することにした。したがって、次年度使用額の分は次年度の人件費として使用し、請求した補助金は計画に準じて使用する予定である。
枯草菌細胞分化の遺伝子ネットワークの全体像

枯草菌機能未知遺伝子破壊株バンクを用いて、胞子の耐熱性を指標にしたスクリーニングから得られた遺伝子の機能解析を進めた。昨年度報告したyaaT, ybdAB, yqjE, ykvVのうち、ykvV, ydiHのより詳細な解析を行い、それぞれσ^Kの活性化とコルテックス合成に関与するタンパク質、胞子形成開始期に必要なDNA結合タンパク質をコードすることを明らかにした。また、EUのグループにより作製された約1200株の遺伝子破壊株についても同様に調べ、8個の胞子形成に関与する遺伝子を見出し、特にymcA, ytcFは胞子形成開始期に重要な働きをもつことが示された。さらに、機能が推定されている遺伝子としてdgkA(diacylglycerolkinase)は、細胞膜合成に関わることが推定されるが、胞子形成期においてはコルテックス形成に関与することを明らかにした。LC/MS/MS解析により得られた約150種類のタンパク質のうち、約30種類の遺伝子について、LacZアッセイにより示されていた発現制御因子に対応するプロモーター配列を推定することができた。上記の遺伝子についてGFP融合タンパク質生産株の作製も終了した。蛍光顕微鏡により観察されたGFP融合タンパク質の局在部位は、遺伝子発現制御因子とタンパク質のアミノ酸配列をもとに推定されていた局在部位とほぼ一致することが分かった。また、GFP融合タンパク質の蛍光が確認された場合でも、GFP融合タンパク質が胞子から抽出されず、免疫ブロッティングで検出されない場合があることがわかった。一方、細胞分化の過程を連続的に追うために必要な蛍光顕微鏡によるタイムラプス画像を得る方法を確立した。細胞膜をFM4-64、DNAをSYTO16で染色し、GFP融合タンパク質の局在をシングルセルで動画として捕らえることが可能となった。本研究は、枯草菌の全遺伝子を対象に網羅的に解析し、細胞分化の遺伝子ネットワークの全体像を解明することを目的としている。1.日本の枯草菌研究グループにより作製された、869個の機能未知遺伝子破壊株について胞子形成欠損株のスクリーニングを行い、計16個の新規胞子形成に関与する遺伝子を同定した。さらに、顕微鏡による形態観察により、これらを、胞子形成開始期に停止する株(12株)、中期に停止する株(4株)に分類した。また、一部の遺伝子については機能解析を行い、細胞分化遺伝子ネットワーク上への位置付けも行った。特にyaaT遺伝子に関しては、胞子形成開始期に働く重要な遺伝子であることを明らにした。さらに、バクテリアレベルでのタンパク質の動態情報を時間経過に伴う動画として捕らえる目的で、胞子形成遺伝子産物(GFP融合タンパク質)について、蛍光顕微鏡下での動態観察を行い、既知胞子形成遺伝子spoIIIJ産物、今回見い出されたyaaT産物はいずれも細胞膜側に局在することを明らかにした。2.枯草菌ゲノムプロジェクトにより存在が明らかにされたyabG遺伝子について遺伝子破壊株のつくるスポアを解析し、この遺伝子がスポアコートタンパク質のプロセシングおよび分解に関わることを明らかにした。精製YabGタンパク質を用いた解析からこのタンパク質はスポア形成期特異的プロテアーゼであることを明らかにした。また、yabG変異スポアのタンパク質について2次元電気泳動により解析し、YabGプロテアーゼの基質の一つであるYrbAタンパク質は合成直後には分子量や電荷の異なるいくつかのポリペプチドとして存在することを明らかにした。このような重要な性質を示すにも関わらず、yabG変異スポアの熱、リゾチーム、クロロホルムに対する抵抗性は野生型スポアと同程度であった。枯草菌機能未知遺伝子破壊株からスクリーニングをして得られた、17個の胞子形成遺伝子に関与する遺伝子の解析を進めた。その結果新たに、胞子形成開始期のリン酸リレー系に働く遺伝子として、yaaT, ybdA, ycgM, ydiH, yqjEの機能が明らかとなり、また、ykvVは胞子形成にpro-σKのプロセッシング後に、σ^Kの活性化に関与することを明らかにした。YkvVはS-S結合の再構築に関与するチオレドキシンモチーフを持つため、YkvVを介したσ^Kの活性化機構に興味が示された。また、枯草菌胞子形成期特異的に機能発現する5つのシグマ因子中σ^Fとσ^Kの強制発現系を構築した。マイクロアレーの結果、発現強度の上位には、各シグマ因子で認識される既知の胞子形成遺伝子が多数見られ、結果の信頼性が確認された。さらに、この中には機能未知遺伝子も多く存在していることが確認された。(σ^Kにおいては既知σ^Kレギュロン40中28、また49の機能未知遺伝子の誘導が確認された。)枯草菌野生株のスポアからSDSとメルカプトエタノール存在下でタンパク質サンプルを調製しSDS-PAGEにより分離した。クマシ染色したゲルを64分割し、プロテアーゼ処理の後、LC/MS/MSにより204種類のタンパク質を同定した。それらのうち半数は機能未知タンパク質であった。発現解析から42種類のタンパク質が栄養期から、28種類のタンパク質がスポア形成期から生産されていることを明らかにした。また、スポア特異的プロテアーゼYabGの欠損株からスポアを調製し、そのタンパク質をLC/MS/MSにより解析することでさらに27種類のタンパク質を同定した。