hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔内X線写真像の画像解析技術による補正に関する研究

本研究の目的は、(1)前年度の研究予算で作成したエックス線規格撮影装置の効用を確立すること、(2)通常に撮影された口内レントゲン写真を、コンピュータグラフィツクス技術を用いて規格撮影に近い効果を得るように補正して、歯周炎罹患歯が一定期間後にどの程度進行するかを客観的に測定できるシステムを作ることである。同一部位2枚のレントゲン写真から、歯周炎による骨吸収度の差や病変の進行速度を判定できれば、歯の予後の予測に役立てることができる。また、規格化されていない偏心撮影されたレントゲン写真であっても、正放線撮影写真となるように画像処理を施して補正することで、同一部位の写真の比較が可能となる。これは、患者への説明、患者の動機づけ、治療計画の立案の上で有効な手段となる。本年度は、まず、すでにわれわれが開発したエックス線規格撮影装置の改善を行い、高い再現性を確認した。また、実際の患者では、歯周治療から6週間後に骨の変化がディジタルサブトラクション法により認められることを確認した。さらに、乾燥頭蓋骨における任意の点の座標を3次元ディジタイザにて測定し、エックス線写真をフィルムスキャナーによってコンピュータに取り込むこむことによって、レントゲンの線源、被写体とフイルムの位置関係を行列式を用いることによって逆算した。この結果、この方法は極めて容易に非規格撮影レントゲン写真の骨レベルを算定できることが確認された。
環境教育カリキュラムにおける風土の関係論的な学習のポートフォリオ評価研究

本研究の目的は、環境についての客観的知識を提供する環境諸科学を総合するのみならず、環境倫理、風景、アメニティなどの環境についての主体的な意味を総合する、風土を中心概念とする環境教育力リキュラムにおいて、子どもの学習評価はいかにあるべきかを明らかにすることであった。客観的な知識および論理的な思考だけでなく、主体的で個性的な意味づけの多様性の評価方法として、ポートフォリオ評価法を手がかりとした。研究方法として、具体的な風土教材を開発した。これまで、琵琶湖を対象にした教材を引き続き研究するとともに、あらたに、中国内モンゴル自治区の草原の砂漠化をテーマとした環境教材の開発を行った。砂漠化の原因としては、過放牧、過開墾、乱伐という三つが原因とされるが、それらが清代、清末から中華民国、中華人民共和国における人民公社による大規模のうち開発、そして生産請負制の導入という歴史的な経緯の中でどのように関連しながら砂漠化の要因を形成してきたかを分析する教材を作成した。さらにそうした歴史をふまえて、今日的な環境政策である生態移民をどのように受け止めるのかをロールプレイを通して主体的に学ぶ生態移民ロールプレイの開発を行った。さらに、風土概念を社会科カリキュラムとその教育評価にどのように位置づけるのかを検討するために、アイルランドの公民政治カリキュラムにおけるスチュワードシップの概念とその教材と評価方法に注目した。今年の研究成果の概要は次の点である。第一に、草原の風土に焦点化した教材を開発するために、中国内モンゴル自治区において草原の砂漠化の現地調査、および現地小中学校における環境教育の現状についての観察と聞き取り調査を行った。調査地は、シラムレン草原、ダルカンモーメアンレンゴウ旗バイリンミョウチンの蒙古族学校(小・中学校)、伊克昭盟達拉特旗烏蘭郷恩格貝および周辺のクブチ砂漠、展旦召(ザンダンザオ)蘇木(ソム)の緑化基地、包頭市包鋼附属第11小学校であった。また、社会科の教科書、環境教育に関する教師用の参考書などの文献収集も行った。さらに、内モンゴルの子どもたちや住民の環境意識、草原をどのように意味づけているかを調査するアンケート項目の作成を行い、来年度の調査の準備を行った。第二に、中学校地理分野において地図を中心としたパフォーマンス課題とその評価のためのループリックの開発を行ない、京都市の私立中学校において、夏休みと冬休みの課題として、実践的に検証した。第三に、ポーとフォーリオ評価の試行的な実践として、中学校歴史分野において日中理解をめざした日中戦争学習のプロジェクト学習プランを開発し、滋賀県の公立中学校において実践的に検証した。中国内モンゴル自治区における砂漠化と生態移民に関する教材を開発した。この教材の特徴は次の点である。第一に、砂漠化の原因を歴史的に捉え、中国の社会政策と関連付けてとらえている点である。砂漠化の原因は一般的には過放牧、過耕作、乱伐の3つが並列的にあげられることが多い。しかし、本教材ではこれを次のような歴史と政策の流れの中でとらえている。すなわち、清末の社会的混乱の中での移民による人口増大とそれに伴う過耕作、乱伐、中華民国による開発、人民公社による大規模開発による過耕作、生産責任制の導入に伴う過放牧。第二に、現在進められている生態移民政策における貧困対策・経済成長、環境保護、遊牧文化の維持という目標間のジレンマをロールプレイとして教材化した点である。生態移民政策に関する現実を教材化した点自体にも独自性があるが、さらにそこにおけるジレンマの構造をロールプレイという参加型の学習によって追及できるようにした点に意義がある。第三の特徴は、ダルカン旗の実態調査と聞き取りに基づき、その地域の蒙古族学校の中学校地理教材としてものと、日本の高校でも活用できるものと複数のヴァージョンを開発したことにある。実践的な検証は今後の課題であるが、この教材はダルカンの中学生には身近な地域の問題を学習する地域教材として、日本の高校生には国際協力やより広い世界と自分の生活を結びつける教材としてそれぞれ意味があると共に、比較研究の共通教材という意義がある。また、諸外国の環境教育カリキュラムの研究としてアイルランド共和国の「公民・社会・政治」という中学校の公民教育の科目を検討した。この科目は7つの基本概念の一つにスチュワードシップを位置づけている点で注目された。

さらに、ポートフォリオの研究を中学校の教師との共同研究によって進めた。本研究の目的は、環境についての客観的知識を提供する環境諸科学を総合するのみならず、環境倫理、風景、アメニティなどの環境についての主体的な意味を総合する、風土を中心概念とする環境教育カリキュラムにおいて、子どもの学習評価はいかにあるべきかを明らかにすることであった。客観的な知識および論理的な思考だけでなく、主体的で個性的な意味づけの多様性の評価方法として、ポートフォリオ評価法を手がかりとした。研究方法として、具体的な風土教材を開発した。これまで、琵琶湖を対象にした教材を引き続き研究するとともに、あらたに、中国内モンゴル自治区の草原の砂漠化をテーマとした環境教材の開発を行った。砂漠化の原因としては、過放牧、過開墾、乱伐という三つが原因とされるが、それらが清代、清末から中華民国、中華人民共和国における人民公社による大規模のうち開発、そして生産請負制の導入という歴史的な経緯の中でどのように関連しながら砂漠化の要因を形成してきたかを分析する教材を作成した。さらにそうした歴史をふまえて、今日的な環境政策である生態移民をどのように受け止めるのかをロールプレイを通して主体的に学ぶ生態移民ロールプレイの開発を行った。さらに、風土概念を社会科カリキュラムとその教育評価にどのように位置づけるのかを検討するために、アイルランドの公民政治カリキュラムにおけるスチュワードシップの概念とその教材と評価方法に注目した。
ドナー特異的輸血による移植肝由来細胞のホスト内動態と免疫寛容機構の組織学的解析

我々はこれまでにラット肝移植拒絶モデルの系に、ドナー特異的輸血(DST)を前処置として施すと移植片が生着することを見出した。本研究はこのDST効果の本態の解明である。昨年度に、DST前処置+肝移植群(寛容群)では肝移植群(拒絶群)とは異なり、樹状細胞を含む移植肝由来ドナー細胞(passenger leukocyte)のホストリンパ組織への遊走と拒絶反応の中心的役割を担うCD8+T細胞の活性化が全く抑制されていることを見出した。これはDST単独で誘導される細胞障害性のドナー特異的抗体が移植直後に遊走細胞を消失させるために、ホストリンパ組織内で免疫応答が起こらないためであると考えられた。最終年度である本年はまず、両群の移植臓器内における免疫担当細胞の経時的な動態変化を解析した。ホスト細胞の肝臓内浸潤は移植最初期(2d)までは寛容群が多いものの、中期(5d)では拒絶群がそれを上回り、拒絶期(10d)頃にはほぼ全域を占拠していた。CD8+T細胞は拒絶群では中期にかけて浸潤数が増大し、非常に強く活性化していた。一方寛容群ではCD8+T細胞の浸潤絶対数およびその活性型の割合ともに強く抑制されていた。中期拒絶期ではエフェクター細胞がCD8T+細胞からマクロファージに移行するが、寛容群ではこれらにも一貫した抑制効果が示した。そこで他の免疫調節因子を検索したところ制御性T細胞(Treg)が、寛容群選択的に、この時期に同調してホストリンパ組織、肝門脈域において細胞数の増加し、活性化することが認められた。これらDST抗体の認識抗原はドナーMHC-1であり、したがってMHCの異なる系統で輸血を行うと同様にアロ抗体が誘導された。以上よりDST効果の主要素はアロ抗体によるpassenger leukocyteの遊走とホスト内免疫応答の抑制であること、それ以外にTreg等の免疫調節因子が作用してドナー特異的に免疫寛容を維持していると考えられた。現在、研究成果を投稿準備中である。ヒト臓器移植においてドナー特異的免疫抑制方法の開発が望まれて久しい。我々はラット同種(アロ)肝移植拒絶モデルを確立し(Hepatplogy 47 (4) : 1352, 2008)、この系にドナー特異的輸血(DST)を前処置として施すと移植片が生着することを見いだした。そこで本研究を深めてDSTの本態を明らかにすることを着想するに至った。2年計画の初年度としてまず、DST+肝移植(寛容群)とDST(-)+肝移植(拒絶群)におけるレシピエントリンパ組織における免疫担当細胞の動態を経時的に比較した。その結果、拒絶群のリンパ組織で起こる、移植肝由来ドナー樹状細胞の遊走とレシピエントCD8陽性T細胞増殖性応答が寛容群では全く認められなかった。そこでDSTのみで何が起こるのかを調べた結果、レシピエント血中にドナー特異的IgM抗体が産生され、このアロ抗体は補体依存性にドナー細胞特異的な細胞障害活性を有していることを見いだした。他の細胞遊走関連分子の発現変動を解析すべく、移植早期(6h)における肝臓、脾臓でcDNAマイクロアレイを行ったが、両群で顕著な差は認められなかった。従って寛容群では移植後にドナー細胞がレシピエントリンパ組織に遊走できないために、エフェクターCD8陽性T細胞産生が誘導されないと考えられた。実際、DST前処置後7日目のラット血清をナイーブラットに養子免疫し、肝移植を行う(養子免疫群)と平均生存日数を有意に延長させることに成功した。しかしながら、養子免疫群の免疫寛容は不十分であったことから、DSTによる免疫寛容成立には他の免疫調節因子が関与する可能性が示唆された。そこでFoxP3分子を指標に、調節性T細胞(Treg)の動態を解析したところ、寛容群のレシピエント脾臓ではFoxP3陽性細胞が移植後7日後頃より増加していた。以上、本年度の成果としてDST前処置がレシピエントにもたらす免疫寛容の2大要素としてアロ抗体産生とTreg産生を明らかにしだ。特に拒絶反応を誘導する主細胞(ドナー肝樹状細胞)の遊走を阻害するというコンセプトは特異的免疫抑制法を模索していく上で非常に独創的である。現在、さらなる解析と臨床応用を目指した本法の検討を行っている。

一方寛容群ではCD8+T細胞の浸潤絶対数およびその活性型の割合ともに強く抑制されていた。中期拒絶期ではエフェクター細胞がCD8T+細胞からマクロファージに移行するが、寛容群ではこれらにも一貫した抑制効果が示した。そこで他の免疫調節因子を検索したところ制御性T細胞(Treg)が、寛容群選択的に、この時期に同調してホストリンパ組織、肝門脈域において細胞数の増加し、活性化することが認められた。これらDST抗体の認識抗原はドナーMHC-1であり、したがってMHCの異なる系統で輸血を行うと同様にアロ抗体が誘導された。以上よりDST効果の主要素はアロ抗体によるpassenger leukocyteの遊走とホスト内免疫応答の抑制であること、それ以外にTreg等の免疫調節因子が作用してドナー特異的に免疫寛容を維持していると考えられた。現在、研究成果を投稿準備中である。
メカニカルストレスによる脂肪細胞の代謝内分泌機能制御の分子機構

培養細胞レベルでは、周期的ストレッチ刺激により脂肪細胞の分化が抑制されるとともに、成熟脂肪細胞では幾つかのサイトカインの発現が一過的に誘導される。更に個体レベルの実験として、マウス腹部への局所バイブレーションの効果を調べた。高脂肪食を負荷したddY系雄性マウスを、無麻酔での30分間の物理的拘束に馴化したのち、片側の精巣周囲脂肪の真上の腹部に、皮膚の上から100Hz、30分間の振動刺激を1日2回与えた(n=16)。経過期間の体重と摂餌量の推移、16日後に摘出した各種脂肪組織重量/体重比、血中グルコース濃度には差が見られなかったが、バイブレーション負荷群では血漿中トリグリセリド(TG)濃度は僅かに低下する傾向があり、血漿中遊離脂肪酸(NEFA)濃度は有意に低値を示した。更に、振動刺激直下の精巣周囲脂肪組織では、刺激と反対側の脂肪組織に比べてTG/タンパク質比、ならびにPPAR-γ_2やSREBP-IcのmRNAレベルが有意に低下していた。同組織ではレプチンの発現も低下し、これに伴い血漿中レプチン濃度も低下傾向を示した。これらのことから、中・長期にわたる局所バイブレーション刺激を受けることにより、幾つかの遺伝子発現が抑制され、脂質代謝や一部のアディポサイトカインの発現分泌低下にまでつながる脂肪細胞の機能変化が生じることが示唆された。この際、刺激側の脂肪組織では、IL-6やIL-1βのmRNAレベルが増大する傾向にあり、軽度の前炎症性変化が生じていると考えられた。本研究から、局所バイブレーション刺激は体重減少につながる脂肪組織の減少効果はもたらさないが、刺激部位直下の脂肪組織の中・長期的な遺伝子発現および代謝内分泌機能の変化を介して、肥満に付随する高レプチン血症などが改善される可能性が示唆された。前炎症性反応の意義や功罪については今後の課題として更に検討を進める。3T3-L1由来の成熟脂肪細胞(L1-adipo)、あるいは正常マウス(ddY系)の精巣周囲脂肪細胞(ddY-epi)および遺伝的肥満マウス(db/db)の皮下脂肪細胞(db/db-sc)に対して、周期的伸展刺激(ストレッチ)を与え、各種遺伝子の発現変動を解析した。調べた20種類の遺伝子のうち、摂食抑制作用を惹起するレプチンとインシュリン抵抗性を惹起するTNFαの発現が上昇することを見いだした(L1-adipo,adY epi)。このほかにもアポトーシス関連酵素(caspase-3)の増加(L1-adipo,db/db)、脂肪代謝関連酵素(lipoprotein lipase)の増加(L1-adipoのみ)、解糖系酵素(GAPDH)の減少(L1-adipoのみ)が有意な変化として検出された。インビボ脂肪組織への力学刺激の効果は、マウス腹部への局所バイブレーション刺激を負荷することにより調べた。1525週齢の成体マウス(ddY)を無麻酔条件下で保定し、精巣周囲脂肪組織を標的にして、腹部から1日2回の振動刺激(100Hz,30分間)を16日間与えた。この間、バイブレーション負荷群は刺激開始47日後に、対照となる保定のみの群に比べて、体重減少が一過的に進んだが、その差は、統計学的に有意であったとはいえ、軽微なものであった。摂食量には差が無かった。振動部位直下の精巣周囲脂肪組織においては差が見られなかった。一方、腸間膜脂肪組織においては、脂肪組織重量ならびに中性脂肪含量の低下傾向が見られた(p=0.10,n=46)。更に、血漿中の中性脂肪含量には差が見られなかったが、遊離脂肪酸(NEFA)量は、バイブレーション負荷群において低値を示した(p<0.01)。グルコース、レプチン、アディポネクチン等には差が見られなかった。次年度はより詳細な分子機構の解明を目指す。

本研究から、局所バイブレーション刺激は体重減少につながる脂肪組織の減少効果はもたらさないが、刺激部位直下の脂肪組織の中・長期的な遺伝子発現および代謝内分泌機能の変化を介して、肥満に付随する高レプチン血症などが改善される可能性が示唆された。前炎症性反応の意義や功罪については今後の課題として更に検討を進める。
混晶系薄膜材料における量子効果のピコ秒分光による評価とその面内制御に関する研究

量子井戸中の励起子に、電場磁場を印加すると、その波動関数への外場効果により励起子のダイナミクスが変化する事が予想される。特にバルクにおいては励起子が存在できない程強い電場中でも、二次元励起子は安定に存在でき、大きな電界効果が期待され又、磁場中では励起子の低次元化によるサイズ効果が期待される。本研究ではMOVPE法によるGaAS系量子井戸の作製、二次元励起子の電界、磁界の外部場効果によるダイナミクス変化について行った。1.量子井戸作製-我々のMOVPE装置で、先ず典型的なアンドープGaAsを製作し、そのPLスペクトルをHe温度で調べた。(D°,X)(A°,X)等の鋭い束縛励起子の発光線が見られ、又、自由励起子の発光もあり、高純度GaAsが成長出来ている事が確認された。又、GaAs/【Al_(0.6)】【Ga_(0.4)】As単一量子井戸(SQW)を製作し、そのPLスペクトルを調べた。SQWの発光ピークより、井戸幅を計算すると約14mmであり、SQWが製作出来ているものと思われる。2.電場中での二次元励起子-MBE法で作られたGaAs/【Al_(0.4)】【Ga_(0.6)】As多重量子井戸にショットキー電極を用い多直に外部より電界を印加した。電界印加時に発光量の減少、発光ピークの低エネルギーへのシフトが観測された。又、電界と共に発光寿命が長くなる事が解った。これは外部電場により、実空間で励起子の分離が生じ、電子正孔の波動関数の重なりが小さくなり、遷移確率が減少した為と考えられる。3.磁場中での二次元励起子-量子井戸に多直に磁場を印加すると、二次元励起子の局在化が進み、ゼロ次元に近づくと考えられる。又、磁場によりランダウ準位が生じ、エネルギーの緩和過程にも、ランダウ準位と量子化準位との競合等といった問題が表われてくる。本実験では磁場の増加と共に、発光が高エネルギーシフトし、又、発光量も増加する事が解った。又、発光の立ち上り時間をピコ秒分光した結晶高磁場下においては、立ち上り時間は長くなる事が分った。
PMLのSUMO E3リガーゼ同定によるPML NB形成機構解明

抗腫瘍蛋白PMLはSUMO化されてPML NBを形成する事で機能を発揮する。PAX5-PMLは急性リンパ性白血病で見つかった新たなPML関連融合遺伝子である。今回の研究でPAX5-PMLが、PMLのSUMO化を阻害することによりPML NBの形成を阻害し、細胞にアポトーシス抵抗性をもたらす事が発見された。一方、亜ヒ酸はPMLのSUMO化の増強、破壊されたPML NBの再構成を誘導し、PAX5-PMLによりもたらされたアポトーシス抵抗性を克服し、PAX5-PML発現細胞に効率的にアポトーシスをもたらす事が明らかにされた。これら研究により白血病におけるPML NBの破壊機構の一端が解明されるとともに、亜ヒ酸がPML及びPML関連融合蛋白のPML部分を標的として作用する事が示された。本研究の目的はPML機能の発現に重要であるPML NB形成機構の解明にある。本年度はPML NB形成におけるPMLアセチル化の重要性について検討した。具体的にはPMLがヒストンアセチル化酵素であるp300によりアセチル化される事を証明しそのアセチル化部位を同定した。また細胞内でのPMLアセチル化はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンA (TSA)の刺激により増強される事も見いだした。更に検討を進めた結果、PMLアセチル化はPML NB形成に必須の翻訳後修飾であるPML SUMO化を増強する事でPML NB形成に重要な役割を果たしており、TSAのアポトーシス誘導機序としてPMLアセチル化→PML SUMO化→PML NB形成増強→アポトーシスというメカニズムが考えられる事を示した。これはPMLの機能調節に対する理解を深めると供に、有用な抗がん剤候補と考えられながらその作用機序の多くが不明であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の作用機序の一部を解明する事に繋がるものである。これらの結果を論文にまとめThe Journal of Biological Chemistry誌に発表した。更にPML SUMO化によって形成されるPML NBは他の蛋白のSUMO化の場としても重要であるという仮説のもとsiRNAによりPMLをノックダウンと抗体アレイを組み合わせた手法でPML依存性にSUMO化される蛋白の網羅的検索を行った。PML依存性にSUMO化される蛋白は検出されなかったが、PMLノックダウンによりSUMO化が増強する、すなわちPMLによりSUMO化を抑制されている蛋白の候補としてGATA-2、NCoRが見いだされた。両者ともにPML NBの構成因子である事が知られており、今後これらのPML依存性SUMO化抑制とその意義について検証していく予定である。本年度はPMLが関連する融合遺伝子であるPAX5-PMLによるPML NBの破壊機構について調べた。PML関連融合遺伝子としてはPML-RARaが知られており、これはPML NBを破壊する事でPMLの機能を阻害し抗アポトーシス活性をもたらす事で急性前骨髄性白血病の発症に関与しているといわれているが、PML NB破壊のメカニズムに関しては不明な点が多い。PAX5-PMLはPML-RARa以外に始めて発見されたPML関連融合遺伝子で、急性リンパ芽球性白血病で発見された。今回の研究で、PAX5-PMLはリンパ球分化を司る転写因子であるPAX5のドミナントネガティブ体としてその機能を阻害するとともに、PML NB形成に必須の翻訳後修飾であるPMLのSUMO化を阻害し、PML NBの形成を阻害する事が発見された。更にPML-RARaにより破壊されたPML NBを再構成する事で知られる急性全骨髄急性白血病の治療薬である亜ヒ酸は、PAX5-PMLにより破壊されたPML NBの再構成も誘導し、PAX5-PMLによりもたらされたアポトーシス抵抗性を克服し、PAX5-PML発現細胞に効率的にアポトーシスをもたらす事が明らかにされた。この研究により白血病におけるPML NBの破壊機構の一端が解明されるとともに、一部の急性リンパ芽球性白血病に亜ヒ酸が有効である可能性が示唆された。これらの成果を国内、国外の学会で発表するとともに、論文にまとめ海外雑誌に投稿中である。本研究の目的はPML機能の発現に重要であるPMLNB形成機構の解明にある。

本年度はPMLが関連する融合遺伝子であるPAX5-PMLによるPML NBの破壊機構について調べた・PML関連融合遺伝子としてはPML-RARaが知られており、これはPML NBを破壊する事でPMLめ機能を阻害し抗アポトーシス活性をもたらす事で急性前骨髄球性白血病(APL)の発症に関与しているといわれているが、PML NB破壊のメカニズムに関しては不明な点が多い。PAX5-PMLはPML-RARa以外に始めて発見されたPML関連融合遺伝子であり、今回の研究でPML NB形成に必須の翻訳後修飾であるPMLのSUMO化を阻害し、PMLNBの形成を阻害する事が発見された。更にPML-RARaにより破壊されたPML NBを再構成する事で知られる急性全骨髄急性白血病の治療薬である亜ヒ酸は、PAX5-PMLにより破壊されたPML NBの再構成も誘導し、PAX5-PMLによりもたらされたアポトーシス抵抗性を克服し、PAX5-PML発現細胞に効率的にアポトーシスをもたらす事が明らかにされた。更に亜ヒ酸抵抗性となったAPL患者から得られてPML-RARα遺伝子のPML部分に変異が有る事、その変異によりPML-RARαの細胞内局在、SUMO化に変化が生じ、亜ヒ酸への反応性が失われる事を発見した。これら研究により白血病におけるPML NBの破壊機構の一端が解明されるとともに、亜ヒ酸がPML及びPML関連融合遺伝子を標的として用する事が示された。これらの成果を国内、国外の学会で発表するとともに、PAX5-PM上のデータはOncogene誌に発表し、変異PML-RARαのデータは海外雑誌投稿中である。
横紋筋肉腫におけるインプリンティング異常の血清診断

Melting Curve Analysis法は,簡便かつ特異性が高く,標的遺伝子のmethylationの分析に有用であった。横紋筋肉腫細胞株、腫瘍組織の両者でimprinting centerの異常メチレーション、すなわちIGF2/H19のimprinting異常を検出できた。腫瘍組織において、imprinting異常はIGF2 mRNA発現に関与している事が示唆された。さらに、血清からも腫瘍のimprinting異常を検出することができた。横紋筋肉腫では11番染色体短腕のLOHが報告され、11p1、5領域に癌抑制遺伝子の存在が示唆されてきた。またこのLOHの多くは母由来であり、横紋筋肉腫の癌抑制遺伝子の候補として親由来により発現に差のある遺伝子、imprinting geneが考えられてきた。一方、IGFファミリーは多くの悪性腫瘍で高発現が報告されており、腫瘍細胞め増殖に深く関与していると考えられている。最近、11p1、5領域にimprinting gene、IGF2、H19が見つかり、その制御にはimprinting centerのメチル化が関与している事がわかってきた。いままでメチル化の判定には、バイスルファイト後のDNAを用いたメチレーションスペシフィックPCRや制限酵素を用いたコブラ法、ダイレクトシークエンス、サブクローニングが用いられてきた。今回我々は、さらに簡便に判定できるmelting curve analysis法に注目し、新たなメチル化判定法であるMelting curveanalysis法を用いたIGF2/H19imprinting異常の検出方法を確立すること、次に、この方法を用いて腫瘍組織におけるIGF2/H19imprinting異常の意義の検討すること、さらに血清遊離DNAを用い同様の異常が検出できるか検討した。結果; Melting Curve Analysis法は,簡便かつ特異性が高く,標的遺伝子のmethylationの分析に有用であった。腫瘍組織において、imprinting異常はIGF2mRNA発現に関与している事が示唆された、さらに、血清からも腫瘍のimprinting異常を検出することができた。今後、検体数を増やし、がんの新たな予後因子の発見や微少残存病変の検出に臨床応用可能か検討していく予定である。横紋筋肉腫では11番染色体短腕のLOHが報告され、11pl、5領域に癌抑制遺伝子の存在が示唆されてきた。一方、IGFファミリーは多くの悪性腫瘍で高発現が報告されており、腫瘍細胞の増殖に深く関与していると考えられている。最近、11pl、5領域にimprinting gene、IGF2、H19が見つかり、その制御にはimprinting centerのメチル化が関与している事がわかってきた。今回我々は、さらに簡便に判定できるmelting curve analysis法に注目し、新たなメチル化判定法であるMelting curve analysis法を用いたIGF2/H19imprinting異常の検出方法を確立すること、次に、この方法を用いて腫瘍組織におけるIGF2/H19imprinting異常の意義の検討すること、さらに血清遊離DNAを用い同様の異常が検出できるか検討した。結果;Melting Curve Analysis法は,簡便かつ特異性が高く,標的遺伝子のmethylationの分析に有用であった。
オルソゴナル自己集合系ソフトマターの構築

界面活性剤分子集合体と超分子繊維状集合体が共存したオルソゴナル分子集合系について,カチオン性界面活性剤の親水基構造と対イオンの違いがもたらすゲル化能,ゲル構造,粘弾性特性への影響を調べた。カチオン性界面活性剤であるセチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB),同クロリド(CTAC),セチルピリジニウムクロリド(CPC)のそれぞれの水溶液に12-ヒドロキシステアリン酸(12-HOA)を高温で可溶化させたのちに,冷却することでハイドロゲルを調製した。CTAB系では12-HOAが1.0 wt%以上、CTAC系,CPC系では2.0 wt%以上でゲル化に成功した。得られたハイドロゲルの動的粘弾性測定を行ったところ,周波数によらず貯蔵弾性率が損失弾性率を上回る弾性的な特性を示すことがわかり,CTAB系のものが最も高い粘弾性を示すことがわかった。しかし,いずれのハイドロゲルも12-HOAとn-デカンで得られるオルガノゲルと比べてゾル-ゲル転移温度や粘弾性が低下した。12-HOAのオルガノゲル中でのゲルファイバーは積層した二分子膜からなることが知られているが,ハイドロゲル中においても同様の構造を有することが小角広角X線散乱(SWAXS)測定により確認された。また,光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡により,ゲルファイバー形成の観察も行った。ハイドロゲル中におけるミセルの存在確認については小角X線散乱測定によるミセル由来の干渉ピークの観察およびミセル存在時のローダミン6Gが示す可視吸収波長の観察により行った。以上により本研究で得られたハイドロゲルはオルソゴナル集合系であることが確かめられた。本研究においては交付申請時に以下の研究項目について研究を実施する計画を策定した。(1)オルソゴナル自己集合系の形成条件の探索,(2)オルソゴナル自己集合系の構造解析,(3)機能物質の安定保持・放出制御初年度は主に研究項目(1),(2)について検討を行った。研究項目(1)については,カチオン性界面活性剤の分子構造と組成とオルソゴナル自己集合系の形成条件の関係を明らかにした。また,研究項目(2)についてはレオロジー測定,熱分析(DSC),小角X線散乱(SAXS)測定,紫外可視吸収測定によりゲルの力学特性の解明,超分子繊維状集合体のナノ構造解析,ゲル中におけるミセルとゲルファイバーの独立形成を明らかにした。研究項目(1)についてはカチオン性界面活性剤だけでなく,アニオン性と非イオン界面活性剤を用いることを計画している。また,超分子も12-HOA以外のものを検討する必要がある。形成させる界面活性剤集合体については初年度の研究ではミセルのみであったが,これをひも状ミセル,リオトロピック液晶に拡張し,さらにサブミクロンサイズの粒子状に成形した液晶ゲルおよび液晶ナノ粒子ゲル(ゲルボール)の創製を試みる。研究項目(2)については未実施である電子顕微鏡による超分子繊維状集合体の観察を行う。研究項目(3)については親水・疎水性ナノドメインが共存するミセル,リオトロピック液晶の構造を利用した水溶性・油溶性のモデル機能物質を利用した安定保持と放出制御機能を明らかにすることを目的としており,調製したミセルゲル,液晶ゲル,液晶ナノ粒子ゲル,ゲルボールに保持したモデル機能物質(レチノール,L-アスコルビン酸,フルオレセインなど)の酸化安定性と放出速度を調べる予定である。(1)オルソゴナル自己集合系の形成条件の探索,(2)オルソゴナル自己集合系の構造解析,(3)機能物質の安定保持・放出制御初年度は主に研究項目

(1),(2)について検討を行った。研究項目(1)については,カチオン性界面活性剤の分子構造と組成とオルソゴナル自己集合系の形成条件の関係を明らかにした。また,研究項目(2)についてはレオロジー測定,熱分析(DSC),小角X線散乱(SAXS)測定,紫外可視吸収測定によりゲルの力学特性の解明,超分子繊維状集合体のナノ構造解析,ゲル中におけるミセルとゲルファイバーの独立形成を明らかにした。研究項目(1)についてはカチオン性界面活性剤だけでなく,アニオン性と非イオン界面活性剤を用いることを計画している。また,超分子も12-HOA以外のものを検討する必要がある。形成させる界面活性剤集合体については初年度の研究ではミセルのみであったが,これをひも状ミセル,リオトロピック液晶に拡張し,さらにサブミクロンサイズの粒子状に成形した液晶ゲルおよび液晶ナノ粒子ゲル(ゲルボール)の創製を試みる。研究項目(2)については未実施である電子顕微鏡による超分子繊維状集合体の観察を行う。研究項目(3)については親水・疎水性ナノドメインが共存するミセル,リオトロピック液晶の構造を利用した水溶性・油溶性のモデル機能物質を利用した安定保持と放出制御機能を明らかにすることを目的としており,調製したミセルゲル,液晶ゲル,液晶ナノ粒子ゲル,ゲルボールに保持したモデル機能物質(レチノール,L-アスコルビン酸,フルオレセインなど)の酸化安定性と放出速度を調べる予定である。研究を遂行するために必要な支出がなかったためである。次年度使用額は些少であるため,次年度の物品費に加えて使用する予定である。
嫌気性アンモニア酸化（Ａｎａｍｍｏｘ）細菌の無細胞反応系の構築

嫌気性アンモニア酸化(anammox)の無細胞反応系を構築するため、仮定されているモデルを参考に研究を行った。以下の知見を得た。(1)anammox菌KSU-1株から、反応中間体のヒドラジンを合成するには、基質のNOとアンモニア、酵素のヒドラジン合成酵素、および機能未知であったNaxLS(へテロ2量体ヘムタンパク質)が必要なこと(2)中間体のNOの生成には、従来言われて来たヘム型の亜硝酸還元酵素(Nir)ではなく、KSU-1株ではCu型のNirが行っていること(3)マルチへムタンパク質のヒドロキシルアミン酸化還元酵素(HAO)はNOとヒドロキシルアミンの相互変換を行うこと、以上を明らかにした。嫌気性アンモニア酸化(anammox)の無細胞反応系を構築するため、仮定されている反応機構の各素反応に注目し、以下の実験を行った。1. anammox菌から精製したヒドラジン加水分解酵素(HH)(本酵素は180 kDaのヘテロ3量体へム蛋白質)を使い、前年度と同様に試験管内での反応中間体ヒドラジン生成を調べた。どのような基質を用いてもヒドラジンの生成が認められなかった。そこで、HHとは別に多量に発現しているヘテロ2量体へム蛋白質(NaxLS) (その一次構造に他のタンパク質との相同性がなく、しかも負の酸化還元電位を持つなど、従来の電子伝達のc型へムとは性質が全く違っている。)遺伝子を大腸菌で異種発現させ、これをHHとともに反応に添加する実験を行った。その結果、基質にアンモニアとヒドロキシルアミンを使った場合に、ヒドラシジンの生成が起こることを世界で初めて確認した。現在、その最適条件を検討している。2.上記の実験に並行して、HHの基質と考えられるヒドロキシルアミンがどのように生成されるのか調べるため、多量発現しているタンパク質から有力候補としてヒドロキシルアミン酸化還元酵素(HAO)を選抜した。HAOによる、還元剤存在下でのヒドロキシルアミン生成を調べた結果、基質に亜硝酸還元酵素によって生成するNOを使った場合にのみ、HAOによるヒドロキシルアミンの生成が起こることを確認した。3.我々が研究対象にしているanammox菌KSU-1株には、従来報告のあったヘム型の亜硝酸還元酵素(NIR)ではなく、Cu型のNIRが使われていることを明らかにした。このNIRと上記ヘムタンパク質が一体的に触媒する亜硝酸とアンモニアからのヒドラジン合成反応について、その反応条件、反応の特徴などの解明が検討課題として浮上してきた。具体的には、以下の項目の実験をおこない、それぞれ成果を上げた。1.anammox菌KSU-1株から、反応中間体として知られるヒドラジンの仮定された生合成酵素(HHあるいはHZSと(略記)を精製し、同じく基質と仮定されているNOとアンモニアを反応させたが、ヒドラジンは生成しなかった。しかし、以前我々が精製し、性質を報告している別のヘムタンパク質であるNaxLSを添加するとヒドラジンの合成が起こることを発色法および質量分析いずれによっても確認した。2.NaxLSは、一次構造に他のタンパク質との相同性がなかった。ヘテロ2量体を形成し、それぞれのサブユニットには1つのヘムを保持すると分かっていたが、結晶構造解析の結果、両方のヘムとも非常にまれなCys/His配位をしていることが分かった。この配位環境が非常に低いNaxLSの酸化還元電位の原因であると思われた。3.anammoxの反応の最初の中間体であるNOは亜硝酸還元酵素(NIR)により亜硝酸が還元されて生成する。このNIRはヘムタイプのcytochrome cd1が働くと言われてきたが、KSU-1株では銅タイプのCu-NIRが機能していることを初めて明らかにした。4.以前報告しているマルチへムタンパク質のヒドロキシルアミン酸化還元酵素(HAO)の機能解析を最近の知見に基づき再度行った。その結果、HAOはヒドラジンの脱窒を触媒するのではなく、NOのヒドロキシルアミンへの還元も触媒できることを発見した。HAOはNOとヒドロキシルアミンの相互変換を触媒し、anammoxを微調整していることが分かった。以下の知見を得た。嫌気性アンモニア酸化(anammox)の無細胞反応系を構築するため、仮定されている反応機構を参考に、とくに各素反応のなかで、未知で生化学反応としては報告のない、謎とされるヒドラジン合成反応に注目し、それを触媒するヒドラジン加水分解酵素(HH)を中心に研究を行った。具体的には以下の実験を行い、それぞれに有益な結果を得た。1. anammox菌から予想されるHHを精製した。

本酵素は180 kDaのヘテロ3量体へム蛋白質で、反応中間体と予想できるNOとの相互作用は確認できなかったが、同じく反応中間体と予想できるNH2OH, HNOとの相互作用が認められた。しかし、NH2OHあるいはHNOをアンモニアと組み合わせた基質として反応を行ったが、HHによるヒドラジン合成は起こらなかった。2. HHとは別に多量発現しているヘテロ2量体へム蛋白質(NaxLS)は、その一次構造に他のタンパク質との相同性がなく、しかも負の酸化還元電位を持つなど、従来の電子伝達のc型へムとは性質が全く違っている。そこで、上記の実験と並行してNaxLSの結晶構造解析を行った。その結果、両サブユニットは大きな接触面積を持ち、強く結合していた。サブユニットそれぞれにclass Iとclass IIのヘムを保持し、両へムとも、非常にまれな配位環境であるCys/His配位をしていた。これが大きな負の酸化還元電位の原因と判明した。3. HHの触媒反応にNaxLSが影響を与える可能性も考えられるので、HHの活性発現因子の一つとしてNaxLSを添加による、ヒドラシジン生成活性への影響を調べる実験に取りかかった。今後、最適な反応条件を引き続き探索する。平成23年度未達成であった、HHの活性発現因子の一つとしてNaxLSを添加による、ヒドラシジン生成活性を平成24年度に確認し。その反応中間体としてアンモニアとヒドロキシルアミンを同定した。さらに、反応モデル(仮説)にはなかった一酸化窒素からヒドロキシルアミンの生成を触媒する、候補タンパク質としてHAOを見いだした。一酸化窒素を亜硝酸から生成させるCu型NIRも含め、今後、これらの反応最適条件を明らかにすれば、全体の実験計画を達成出来る。平成24年度に計画のほぼ80%は達成できた。当初の計画(平成23年度)のほぼ80%は達成できた。未達成な点は、HHの活性発現因子の一つとしてNaxLSを添加による、ヒドラシジン生成活性への影響を調べる実験で、、最適反応条件をまだ明らかにはできていない。来年度以降の課題として残った。平成25年度に以下の実験を行う。1.HHによるヒドラジン生成の最適条件を検討する。具体的には基質のヒドロキシルアミンをキャリーするタンパク質の可能性のある、低分子量のヘムタンパク質を精製している。このタンパク質を加えた条件でのヒドラジン生成を調べる。2.HAOとNIRを含む、亜硝酸、アンモニアからのヒドラジン生成系を組み立てる。3.すべてを総合した、無細胞anammox反応系について、その全貌を解明する。おもに平成24年度について以下の実験を行う。1. HHにNaxLSを添加して、ヒドラジンの生成反応が起こるか確認する。これには、窒素の安定同位体を用い、質量数15のアンモニアと質量数14のヒドロキシルアミンを基質とし、窒素間の結合をMALDI-TOFMASSによって質量数29のヒドラジンN2H4が生成することにより行う。同時に並行して、反応pH、基質濃度、還元剤の有無等を変化させヒドラジン生成反応の最適条件を決定する。
アクチン細胞骨格調節によるシナプス伝達効率維持機構の解析

神経伝達に直接関与する神経伝達物質受容体のシナプス上の数や局在はアクチン細胞骨格系の変化により調節されていると考えられるので、電子顕微鏡レベルでアクチン細胞骨格を可視化し解析できる実験系の立ち上げを2種類試みた。1つ目は生体内急速凍結技法により準備した凍結サンプルを通常の超薄切片で観察したが、脳内で良好な形態を保持した部位は見つけられなかった。同時に、通常行っている高圧急速凍結法を用いて準備した試料から、ディープエッチ法により細胞内構造を可視化する試みも開始したが、現在方法の最適化を行っている段階で結果判定まで時間を要する。今後はこのディープエッチ法による細胞内構造の可視化技術の向上を図り棘シナプス内アクチン細胞骨格の詳細な局在解析を行って行く。LTP誘導後の経時的なAMPA型グルタミン酸受容体(AMPA受容体)の数・局在変化については、検出感度や定量性に優れたSDS処理凍結割断レプリカ免疫標識法(SDS-FRL法)を脳組織に応用し電子顕微鏡レベルで解析した。その結果、CA1野錐体細胞や歯状回顆粒細胞の樹状突起上には膜内粒子の凝縮を伴う受容体クラスタが高密度に分布し、レプリカ膜上のシナプスの同定には従来用いられてきた膜内粒子の凝集のみでは不十分であり、NMDA受容体標識を必要とすることを明らかにし、このシナプス標識法を用いてLTP誘導後のAMPA受容体局在を解析した結果、誘導後45分の時点ではシナプス内AMPA受容体の密度増加が観察されたが、GluR1サブユニットのシナプスへの輸送はまだ起こっていないことを示唆する結果を得た。神経伝達に直接関与する神経伝達物質受容体のシナプス上の数や局在はアクチン細胞骨格系の変化により調節されていると考えられるので、LTP誘導後の経時的なAMPA型グルタミン酸受容体(AMPA受容体)の数・局在変化を検出感度や定量性に優れたSDS処理凍結割断レプリカ免疫標識法(SDS-FRL法)を脳組織に応用し電子顕微鏡レベルで解析した。本年度は計画していた実験の内、この解析法を応用するための技術基盤の基礎を固める事を重点的に推進した(実験計画2)。その結果、1)歯状回分子層中のAMPA受容体のシナプス外AMPA受容体密度が高いこと(シナプス内外の平均密度比=5:110:1)、顆粒細胞樹状突起の遠位でシナプス外AMPA受容体がより多くの局在していること、シナプスにおける密度には、領域差がないことを明らかにし、また、2)CA1領域のシナプスを対象にサイレントシナプスの有無を検討した結果、全てのシナプスにAMPA受容体が発現しており、サイレントシナプスは各検出法の低感度がもたらしたアーチファクトであることが示唆された。更に、3)LTPを誘導45分後のシナプス内AMPA受容体標識の平均密度は、対側(450±42.2/micron2,Mean±SE,n=25)とLTP側(478±22.8,n=34)とで有意な変化は認められなかったが、AMPA受容体標識の密度分布は有意に異なり(P<0.05,K-S test)、AMPA受容体標識密度が低いシナプス(<300/micron2)がLTP側で少なかったことから、AMPA受容体密度の低いシナプスがLTP誘導により増強されることを示唆する結果を得た。

同時に、通常行っている高圧急速凍結法を用いて準備した試料から、ディープエッチ法により細胞内構造を可視化する試みも開始したが、現在方法の最適化を行っている段階で結果判定まで時間を要する。今後はこのディープエッチ法による細胞内構造の可視化技術の向上を図り棘シナプス内アクチン細胞骨格の詳細な局在解析を行って行く。LTP誘導後の経時的なAMPA型グルタミン酸受容体(AMPA受容体)の数・局在変化については、検出感度や定量性に優れたSDS処理凍結割断レプリカ免疫標識法(SDS-FRL法)を脳組織に応用し電子顕微鏡レベルで解析した。その結果、CA1野錐体細胞や歯状回顆粒細胞の樹状突起上には膜内粒子の凝縮を伴う受容体クラスタが高密度に分布し、レプリカ膜上のシナプスの同定には従来用いられてきた膜内粒子の凝集のみでは不十分であり、NMDA受容体標識を必要とすることを明らかにし、このシナプス標識法を用いてLTP誘導後のAMPA受容体局在を解析した結果、誘導後45分の時点ではシナプス内AMPA受容体の密度増加が観察されたが、GluR1サブユニットのシナプスへの輸送はまだ起こっていないことを示唆する結果を得た。
結晶性キチン分解におけるキチナーゼドメインの機能発現機構

キチナーゼの基質であるキチンは結晶性で強固な不溶性多糖であり、結晶性キチン分解機構の解明はキチナーゼにとってきわめて本質的な課題である。これまではキチナーゼを構成するドメイン上のアミノ酸残基の機能に着目して研究を行ってきたが、本研究ではより高次の構造にも着目してより本質的な理解を目指した。1)オーバーハングループの結晶性キチン分解における重要性。Bacilluscirculans WL-12キチナーゼA1の活性クレフト上部には、覆いかぶさるように突き出たループ構造が存在する。このループの欠失変異体を作成した結果、このループが結晶性キチン分解に重要な役割を果たしていることを明らかにすることができた。詳細な解析のため、ループ欠失変異体の結晶化を目的に大量調製を試みた。しかし、ループ欠失によってタンパク質の性質が変化し、不溶化したため立体構造解析にはいたらなかった。2)結晶性キチンにのみ特異的に吸着するキチン吸着ドメインの吸着機構。キチナーゼA1のキチン吸着ドメインは結晶性キチンに特異的なユニークなキチン吸着ドメインである。部位特異的変異によってキチン吸着に重要な役割を果たす新たなアミノ酸残基を探索した結果、W687に加えて新たにGln679を同定することができた。この残基を種々のアミノ酸残基に置換した結果、側鎖の極性・長さ・向きいずれもが重要であり、さらに他のアミノ酸残基の吸着への関与が示唆された。S.maecscensキチナーゼB表面には活性クレフトに向かって並ぶ4つの芳香族アミノ酸残基(Y240,W252,W479,Y481)の機能解明のために、Y→W, W→Yの変異をおこなった。その結果Y→Wによって吸着活性が上昇、W→Yによって低下したが、いずれの場合も結晶性キチン分解活性は低下し、効率的な分解には酵素の動きやすさと吸着活性のバランスが重要であることが明らかとなった。この機構を解明するために、結晶性キチン分解活性の高いBacillus circulans WL-12のキチナーゼA1を用いて、これまで主にキチナーゼを構成するドメイン上のアミノ酸残基の機能に着目して研究を行ってきた。今回は、結晶性キチン分解機構のより本質的な理解を目指して、より高次の構造に着目して以下のような研究を開始し、既に重要な成果が得られつつある。結晶性キチン分解活性が高いキチナーゼは深い活性クレフトを持つ。そして、キチナーゼA1の活性クレフト上部にはクレフトに覆いかぶさるように突き出たループ構造が存在し、結晶性キチン表面からのキチン鎖の保持やキチン表面との接触に重要な役割を果たしていると予想される。このループ構造の欠失変異体を作成した結果、予想した通り結晶性キチン分解活性が顕著に低下することがわかった。現在、このループ欠失変異キチナーゼのより詳細な解析が進行中である。

キチナーゼA1のキチン吸着ドメインは結晶性(あるいは不溶性)のキチンに特異的に結合するユニークなキチン吸着ドメインであり、その立体構造からもキチンの結晶構造を認識する新規の吸着機構を持つことが予想される。この吸着機構を探る目的で、吸着に関与する新たなアミノ酸残基の探索した結果、新たにGln679がキチン吸着に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。3)キチナーゼA1の全体構造。キチナーゼA1を構成する個々のドメインの立体構造は明らかになっているが、それらがどのように立体的に配置して結晶性キチンを分解しているのかは明らかでない。そこで、まずX線小角散乱の手法を用いてキチナーゼA1分子の溶液中の全体構造の解明を試みた。その結果、キチナーゼA1は水溶液中で長く延びたパイプ状の構造をしていることを明らかにすることが出来た。キチナーゼの基質であるキチンは結晶性で強固な不溶性多糖であり、結晶性キチン分解機構の解明はキチナーゼにとってきわめて本質的な課題である。これまではBacillus circulans WL-12キチナーゼA1を構成するドメイン上の、アミノ酸残基の機能に着目して研究を行ってきたが、本研究ではより高次の構造にも着目してより本質的な理解を目指した。1)オーバーハングループの結晶性キチン分解における重要性。キチナーゼA1の活性クレフト上部には、覆いかぶさるように突き出たループ構造が存在する。昨年度、このループ構造の欠失変異体を作成した結果、このループが結晶性キチン分解に重要な役割を果たしていることがわかった。このループの機能のより詳細な解析のため、結晶化を目的に大量調製を試みた。しかし、ループ欠失によってタンパク質の性質が変化し、精製過程で不溶化が起こってしまい、立体構造解析にはいたらなかった。2)結晶性キチンにのみ特異的に吸着するキチン吸着ドメインの吸着機構。キチナーゼA1のキチン吸着ドメインは結晶性キチンに特異的なユニークなキチン吸着ドメインである。昨年度の実験によって、キチン吸着に重要な役割を果たす新たなアミノ酸残基Gln679が同定された。この残基を種々のアミノ酸残基に置換した結果、側鎖の極性・長さ・向きいずれも重要であり、さらに他のアミノ酸残基が吸着へ関与することが示唆された。S.maecscensキチナーゼB表面には活性クレフトに向かって並ぶ4つの芳香族アミノ酸残基(Y240,W252,W479,Y481)がある。これらの残基の機能を解明するために、Y→W, W→Yの変異をおこなった。その結果Y→Wによって吸着活性が上昇し、W→Yによって低下したが、いずれの場合も結晶性キチン分解活性は低下し、効率的な分解には酵素の動きやすさと吸着活性のバランスが重要であることがわかった。また、それぞれの芳香族アミノ酸残基は位置に特異的な機能を持つことがわかった。
カンキツ果実の赤色色素,β－シトラウリンの生合成ならびに抗がん活性に関する研究

ウンシュウミカンのフラベド(果皮部分)には多量のカロテノイドが蓄積する。その中でも、'宮川早生'の枝変り品種である'山下紅早生'のフラベドには、赤色のアポカロテノイドであるβ-シトラウリンが含まれており、鮮やかな紅色を呈する。しかし、これまでβ-シトラウリンの生合成経路は不明であり、その蓄積メカニズムは解明されていない。そこで、本研究では'山下紅早生'に含まれるβ-シトラウリンの生成に関与する酵素遺伝子を単離し、その集積メカニズムを明らかにすることを目的とした。前年度まで、'山下紅早生'におけるβ-シトラウリン含量の季節変動を調査し、さらに、'宮川早生'とカロテノイド含量・組成およびカロテノイド関連遺伝子の発現の季節変化を比較した。その結果、'山下紅早生'では成熟に伴いβ-シトラウリンが急速に増大した。また、リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析を行ったところ、このβ-シトラウリンの増大に伴い、カロテノイド代謝分解に関わる遺伝子の発現が上昇した。この遺伝子の発現上昇は、果実の成熟期間中、'宮川早生'で低いままで推移するのに対して、'山下紅早生'では増大していた。また、本年度は、このカロテノイド代謝分解のプロモーター領域の塩基配列を'山下紅早生'と'宮川早生'で比較したところ、両品種で異なる領域が認められた。また、機能解析として、ゼアキサンチンを生成する大腸菌にこのカロテノイド代謝分解に関わる遺伝子のcDNAを導入したところ、β-シトラウリンを生成した。以上の結果から、'山下紅早生'のβ-シトラウリン生成は、本研究にて単離された新規のカロテノイド代謝分解に関わる酵素遺伝子の発現上昇によることが明らかとなった。今年度は、山下紅早生'のβ-シトラウリン生成に関わるカロテノイド代謝分解酵素遺伝子について、プロモーター領域の塩基配列の解析および機能解析を行った。従って、今年度の研究目的をほぼ達成できたと考える。また、他のカロテノイド合成に関わる遺伝子の機能解析も行い、1編の論文を執筆し、受理されたことから、当初の計画以上に研究が進展していると考える。本研究では、山下紅早生'のβ-シトラウリン生成に関わるカロテノイド代謝分解酵素遺伝子を単離し、遺伝子発現解析、プロモーター領域の塩基配列の解析および機能解析を行った。今後、さらに、このβ-シトラウリン生成に関わるカロテノイド代謝分解酵素の機能を詳細に解析し、どのカロテノイドを基質として、β-シトラウリンを生成するのか調査を行う。また、プロモーター領域の塩基配列から、'山下紅早生'の枝変わりの原因を解明する。以上のような、より詳細な機能解析およびプロモーター解析を行うことにより、カンキツにおけるβ-シトラウリンの生合成経路およびその集積メカニズムを明らかにする。中でも、'宮川早生'の枝変り品種である'山下紅早生'のフラベドには、紅色のアポカロテノイドであるβ-シトラウリンが含まれており、赤みの帯びた鮮やかな紅色を呈する。そこで、本研究では'山下紅早生'に含まれるβ-シトラウリン含量の季節変動を調査し、さらに、'宮川早生'とカロテノイド含量・組成の季節変化を比較した。'山下紅早生'では10月後半から11月後半にかけてβ-シトラウリンが急速に増大した。一方、'宮川早生'では、実験期間中、β-シトラウリンは検出されなかった。ゼアキサンチン含量は、'山下紅早生'において'宮川早生'の約2倍多く含まれていた。9-cis-ビオラキサンチン含量は、12月の前半から'宮川早生'において'山下紅早生'の約1.5倍多く含まれていた。All-trans-ビオラキサンチン含量は、12月後半から'宮川早生'において'山下紅早生'の約2倍多く含まれていた。フィトエン含量は、12月後半から'宮川早生'において'山下紅早生'の約2倍多く含まれていた。β-クリプトキサンチン含量は、両品種間に大きな差は認められなかった。総カロテノイド含量は、10月後半から11月前半にかけて'山下紅早生'において'宮川早生'の約2倍多かった。以上の結果より、β-シトラウリンの蓄積には、β-シトラウリンの前駆物質として考えられるゼアキサンチンからの分解が関与しているかもしれないことが示唆された。そこで、本研究では'山下紅早生'に含まれるβ-