hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
合成マトリゲルの創製

異なる受容体の相互作用によって細胞接着活性が低下する現象に関しての報告は少なく、本研究の結果から混合ペプチド-高分子多糖マトリックスが細胞の生物活性をコントロールする手法として利用可能なことが示された。2つ目のアプローチである2ペプチド-高分子多糖マトリックスの幹細胞接着活性の解明、に関しては十種類以上のペプチドを用いて検討を行った。この結果、特定の二種類の異なるインテグリン結合活性を持つ合成ペプチドを混合すると、有意に幹細胞接着活性が上昇することがわかった。現在、詳細を検討中である。また、ラミニン由来ペプチド-キトサンマトリックスの生物活性とその応用に関して、これまでの検証で得られた結果を総説としてまとめ発表・開示した(Polymers, 2015, Hozumiら)。細胞生物学ラミニン由来の活性ペプチドを用いて、人工マトリゲルの作製を目指した。ラミニンはその分子内に多数の活性部位を持つために、RGDなど、1つの活性部位を固定化した機能性材料では、その機能を模倣するのは難しいことが予想される。そこで、ラミニン由来の異なる活性を持つペプチドをキトサンマトリックスに結合させることで、ラミニンの機能を模倣することを試みた。ラミニンα1鎖由来のシンデカン結合ペプチドを、他のラミニン由来インテグリン結合ペプチドと混合固定化すると、混合することによって有意に細胞接着活性と細胞進展活性が促進されることがわかった。また、高分子多糖マトリックスのin vivoへの応用を目指し、生体にも存在する高分子多糖であるヒアルロン酸を用いて混合ペプチドマトリックスを作製したところ、神経細胞への分化を誘導し、増殖は抑えることがわかってきた。今後の研究でさらなる検証を進めていく。以上の結果を鑑みると、いずれの成果も研究目的に対して、おおむね順調に伸展していると考えている。ラミニン-111の機能を模倣した材料を開発することで人工マトリゲルの作製を目指した。ラミニンはその分子内に多数の活性部位を持つために、ラミニン由来の5種類の異なる活性を持つペプチドをキトサンマトリックスに結合させることで、ラミニンの機能を模倣することを試みた。その結果、5種類を混合することでペプチドキトサンマトリックスの生物活性が約2倍にまで上昇することが判った。次いで、ペプチドの混合比の最適化を目指して、様々な混合比で検証したところ、インテグリンαvβ3結合ペプチドの比率が混合ペプチドキトサンマトリックスの生物活性に大きく関与していることが判った。また、高分子多糖マトリックスのバリエーションを増やすためにアルギン酸、ヒアルロン酸を用いて混合ペプチドマトリックスを作製したところ、キトサンマトリックスと同様に生物活性の上昇が見られた。しかし、その生物活性の傾向が、高分子多糖マトリックス依存性である可能性が示唆されたため、今後の研究でさらなる検証を進めていく。合成マトリゲルの作成にあたり、次年度は以下の2つをターゲットとして研究を推進していく。1,幹細胞特異的なペプチド混合比の最適化;
細胞レベルにおける条件反応関連部位の同定

体重約250grの雄のウィスター系のラットを用いて有害条件づけを行った後、〔【^3H】〕2-Deoxyglucose(〔【^3H】〕2-DG)1mCiを与えて条件刺激のみに反応させ、その途中でこの動物を殺して脳を摘出し、ミクロオートラジオグラフを作製するという方法で、大脳皮質の歯状回および第24野における細胞レベルでの2-DGのとり込み場所を検討した。オートラジオグラフの作製にはthaw mount法を用いた。露出は3週間であった。検討した部位を上記の2箇所にしたのは、今までの〔【^(14)C】〕2-DGを用いたマクロオートラジオグラフィーの結果に基づいたものである。顕微鏡観察の結果は、両部位でほぼ同様であった。第24野において〔【^3H】〕2-DGの顕著な標識が見られたのは分子層の外側部であった。また第2層の外顆粒層では標識がやゝ疎と思われた。第3層では第2層よりも標識がやゝ密と思われたが第1層の分子層外側部ほどではなかった。第4層以下は明瞭に区別出来なかった。一般に細胞体の密集しているところは〔【^3H】〕2-DGの分布が疎に見えた。歯状回においても第24野と似た標識状態が見られた。すなわち分子層での標識はやゝ密に思われ、細胞体の集まっている顆粒層での標識はやゝ疎と思われた。Hilus of fascia dentataと呼ばれる層での標識はやゝ密と思われた。このような所見から条件反応時の2-DGの取り込みのより多い場所は、神経細胞の細胞体よりも突起の部分ではないかと思われた。Sokoloffらによって〔【^(14)C】〕2-DG法が脳内の局所グルコース代謝を見る方法として発表されて以来、多くの実験がされてきたが、この方法は解像力が悪いという欠点を持っていた。今回我々はβ線の飛距離の矩い【^3H】をつけた2-DGを用いる方法で大まかな細胞レベルでの条件反応時のグルコースの取り込み部位を検索した。しかしながら実験はまだ始まったばかりである。正確な結果を得るためにはなお実験の繰り返しが必要である。
荷重解析に基づくインプラント支持型可撤性部分床義歯の最適設計の探索

本研究は,インプラント支持型可撤性部分床義歯(ISRPD: implant-supported removable partial denture)の設計指針の確立に資するため,義歯床下インプラントの位置,アタッチメントの種類が異なるISRPD装着者において,口腔内での機能時にISRPDの支持要素(支台歯・インプラント・粘膜)に加わる荷重を実測し,インプラント位置,アタッチメントの種類が各支持要素への荷重分散に及ぼす影響,ならびに口腔機能(咬合力,咀嚼能率,主機能部位)に及ぼす影響を明らかにすることを目的とする.今年度は前年度の測定結果の解析を行なった.解析の結果,実験用ISRPDではマグネットアタッチメント,ボールアタッチメント,ロケーターアタッチメント,ヒーリングアバットメントの違いにより,支台歯・インプラントの3次元荷重と義歯床下粘膜に加わる荷重がそれぞれ異なることが判明した.小型水晶圧センサでの解析の結果では,支台インプラントの位置により,支台歯に加わる荷重ベクトルが異なること,アタッチメントの種類によっても荷重ベクトルが変化することが判明した.さらに,タクタイルセンサでの解析の結果,支台インプラントの位置,アタッチメントの違いにより,荷重中心の移動方向がそれぞれ異なることが判明した.生体内測定を行い,実験用模型でのシミュレーション結果の比較を行うため,また,口腔機能(咬合力,咀嚼能率,主機能部位)に及ぼす影響を明らかにするために,被験者のリクルート行なった.支台歯,支台インプラント,義歯床下粘膜部の荷重測定結果の解析を行なった.生体内測定,口腔機能に関する被験者のリクルートが困難な状況であり,今後の進捗に影響を与える可能性がある.解析したデータを元に,実験計画の修正を図る.支台インプラントの位置,アタッチメントの種類,設置方法の検討し,機能時に各指示要素に加わる荷重を測定する.また,3次元小型水晶圧電式センサによる荷重測定,I-Scanタクタイルセンサによる荷重動態に関する解析方法を再度検討し,より詳細な荷重方向,荷重量,荷重中心の変化,床部分の圧分布の変化を検証する.さらに,被験者のリクルートを行い,生体内測定,口腔機能に関し実験を行なっていく.インプラント支持型可撤性部分床義歯(ISRPD: implant-supported removable partial denture)では義歯とインプラントを繋ぐアタッチメントの破損,義歯の破折などの機械的な合併症や,インプラント周囲の骨吸収等の生物学的合併症が報告されている.これら合併症の主因として力学的要因が考えられるが,ISRPDの支持要素は,歯,インプラント,顎堤粘膜と被圧変位量が各組織でそれぞれ異なり,機能時の各支持要素への荷重分散や義歯の挙動に関しては解明されていない.本研究は,ISRPDの各支持要素に加わる荷重を生体内にて測定することで,支台インプラントの位置および各種アタッチメントが各支持要素への荷重分散に及ぼす影響を解析する.今年度は,ISRPD装着患者の口腔内にて荷重測定を行うため,各種アタッチメント(マグネット、ボール、ロケーター、ヒーリングアバットメント)と3次元小型水晶圧電式センサ,また直接支台歯と3次元小型水晶圧電式センサを適合させるための装置を設計し、精密加工により各種製作を行い、模型実験により検証を行った。片側臼歯部欠損下顎模型(Nissin社製)にて,欠損顎堤部に人工粘膜を設置し,支台インプラントを埋入し実験用模型とした.埋入位置は欠損臼歯部(4ー7)内の2カ所とし(近心部(4),遠心部(7)),2種類の模型を用意した.実験用ISRPDは2種類の模型に対し,それぞれ3個ずつ製作した.実験条件として,実験用ISRPD6番相当部に静的荷重を付与した.支台歯・インプラントに加わる3次元荷重,および義歯床下粘膜に加わる荷重測定を行った.このことより,各種アタッチメント,また支台インプラント位置が異なることで荷重時の各支持要素に加わる力学的な挙動が異なることがわかった.今年度は実験用アタッチメント,ならびに模型実験用の装置を製作し荷重測定を行った.生体内測定に関しては,本実験に適合した被験者のリクルートが困難な状況であり,今後の進捗に影響を与える可能性がある.

本研究は,インプラント支持型可撤性部分床義歯(ISRPD: implant-supported removable partial denture)の設計指針の確立に資するため,義歯床下インプラントの位置,アタッチメントの種類が異なるISRPD装着者において,口腔内での機能時にISRPDの支持要素(支台歯・インプラント・粘膜)に加わる荷重を実測し,インプラント位置,アタッチメントの種類が各支持要素への荷重分散に及ぼす影響,ならびに口腔機能(咬合力,咀嚼能率,主機能部位)に及ぼす影響を明らかにすることを目的とする.今年度は前年度の測定結果の解析を行なった.解析の結果,実験用ISRPDではマグネットアタッチメント,ボールアタッチメント,ロケーターアタッチメント,ヒーリングアバットメントの違いにより,支台歯・インプラントの3次元荷重と義歯床下粘膜に加わる荷重がそれぞれ異なることが判明した.小型水晶圧センサでの解析の結果では,支台インプラントの位置により,支台歯に加わる荷重ベクトルが異なること,アタッチメントの種類によっても荷重ベクトルが変化することが判明した.さらに,タクタイルセンサでの解析の結果,支台インプラントの位置,アタッチメントの違いにより,荷重中心の移動方向がそれぞれ異なることが判明した.生体内測定を行い,実験用模型でのシミュレーション結果の比較を行うため,また,口腔機能(咬合力,咀嚼能率,主機能部位)に及ぼす影響を明らかにするために,被験者のリクルート行なった.支台歯,支台インプラント,義歯床下粘膜部の荷重測定結果の解析を行なった.生体内測定,口腔機能に関する被験者のリクルートが困難な状況であり,今後の進捗に影響を与える可能性がある.今年度得られた測定結果を解析する.また,生体内測定を行うために本研究の目的に合致する被験者の増加を図り,被験者のISRPDの支台インプラント位置により2群(近心支台・遠心支台)に分け,アタッチメントを変化させ,機能時に各支持要素に加わる荷重を測定する.さらに支台インプラント位置やアタッチメントと口腔機能(咬合力,咀嚼能率,主機能部位)との関連を調査する.解析したデータを元に,実験計画の修正を図る.支台インプラントの位置,アタッチメントの種類,設置方法の検討し,機能時に各指示要素に加わる荷重を測定する.また,3次元小型水晶圧電式センサによる荷重測定,I-Scanタクタイルセンサによる荷重動態に関する解析方法を再度検討し,より詳細な荷重方向,荷重量,荷重中心の変化,床部分の圧分布の変化を検証する.さらに,被験者のリクルートを行い,生体内測定,口腔機能に関し実験を行なっていく.次年度使用額が生じた理由は,本研究に適した症例となる生体内測定を行うための被験者数の確保が予定より進捗していないこと,またそれに伴い生体内測定実験に用いる物品の購入数が予定より少なかったことが挙げられる.生体内測定,また,口腔機能に関する測定に適した被験者の確保が予定より進捗していないこと,それに合わせて測定実験に用いる物品の購入数が予定より少ないことが原因である.
新規マウスWAPモチーフ蛋白ELM1,ELM2の機能解析とヒト相同遺伝子の単離

抗菌蛋白は,自然免疫の重要な構成要素の一つである.ElafinとSLPIは,抗菌活性とプロテアーゼ阻害活性の両方を有するWAPモチーフ蛋白で,それらの自然免疫における役割は,積極的に検討されている.我々は,マウスの新たなWAPモチーフ蛋白SWAM1,SWAM2をクローニングした.SWAM1とSWAM2は,シグナル配列と一つのWAPモチーフからなる蛋白で,elafinおよびSLPIと高い相同性を有していた.SWAM1は腎,上皮小体で定常的に発現しており,肺炎肺では発現が誘導された.SWAM2は舌で定常的に発現していた.SWAM1とSWAM2は大腸菌,Staphylococcus aureusの増殖を10μMのIC90で阻害した.ヒトの相同遺伝子はLOC149709およびhuWAP2と考えられ,これらは他のWAP蛋白(WAP1,elafin, SLPI, HE4,eppin, C20orf170,LOC164237,WFDC3)と染色体20番上にクラスターをなして存在していた.これらの遺伝子は,共通の先祖遺伝子が重複して発生したと想像される.我々の研究は,WAPモチーフが抗菌蛋白形成の重要な骨格であることを示しており,他のWAPモチーフ蛋白も抗菌活性があるかどうか検索する必要があることを示している.抗菌蛋白は,自然免疫の重要な構成要素の一つである.ElafinとSLPIは,抗菌活性とプロテアーゼ阻害活性の両方を有するWAPモチーフ蛋白で,それらの自然免疫における役割は,積極的に検討されている.我々は,マウスの新たなWAPモチーフ蛋白SWAM1,SWAM2をクローニングした.SWAM1とSWAM2は,シグナル配列と一つのWAPモチーフからなる蛋白で,elafinおよびSLPIと高い相同性を有していた.SWAM1は腎,上皮小体で定常的に発現しており,肺炎肺では発現が誘導された.SWAM2は舌で定常的に発現していた.SWAM1とSWAM2は大腸菌,Staphylococcus aureusの増殖を10μMのIC90で阻害した.ヒトの相同遺伝子はLOC149709およびhuWAP2と考えられ,これらは他のWAP蛋白(WAP1,elafin, SLPI, HE4,eppin, C20orf170,LOC164237,WFDC3)と染色体20番上にクラスターをなして存在していた.これらの遺伝子は,共通の先祖遺伝子が重複して発生したと想像される.我々の研究は,WAPモチーフが抗菌蛋白形成の重要な骨格であることを示しており,他のWAPモチーフ蛋白も抗菌活性があるかどうか検索する必要があることを示している.抗菌蛋白は自然免疫の重要な一員である。ElafinとSLPIはwhey acidicprotein (WAP)モチーフを有する抗菌蛋白であり、同時に抗プロテアーゼでもある。これらの蛋白の自然免疫における役割は、現在盛んに研究されている。我々は、2種類のWAPモチーフ蛋白をマウスよりクローニングし、(SWAM1,SWAM2 (ELM1,ELM2から改名)と命名した。SWAM1,SWAM2ともただ一つのWAPモチーフからなっている蛋白で、ヒトElafin、SLPIと高い類似性を有していた。SWAM1は腎臓、子宮、卵巣で発現しており、SWAM2は精巣上体で発現している。SWAM1,SWAM2とも大腸菌、黄色ブドウ球菌の発育を阻害し、そのIC90は10μMであつた。類似性検索の結果、SWAM2のヒト相同遺伝子と思われるものは、ヒト遺伝子dJ211D12.4であり、染色体20番に存在している。抗菌蛋白は,自然免疫の重要な構成要素の一つである.ElafinとSLPIは,抗菌活性とプロテアーゼ阻害活性の両方を有するWAPモチーフ蛋白で,それらの自然免疫における役割は,積極的に検討されている.我々は,マウスの新たなWAPモチーフ蛋白SWAM1,SWAM2をクローニングした.SWAM1とSWAM2は,シグナル配列と一つのWAPモチーフからなる蛋白で,elafinおよびSLPIと高い相同性を有していた.SWAM1は腎,上皮小体で定常的に発現しており,肺炎肺では発現が誘導された.SWAM2は舌で定常的に発現していた.SWAM1とSWAM2は大腸菌Staphylococcus aureusの増殖を10μMのIC90で阻害した.ヒトの相同遺伝子はLOC149709およびhuWAP2と考えられ,これらは他のWAP蛋白(WAP1,elafin, SLPI, HE4,eppin, C20orf170,LOC164237,WFDC3)と染色体20番上にクラスターをなして存在していた.これらの遺伝子は,共通の先祖遺伝子が重複して発生したと想像される.我々の研究は,WAPモチーフが抗菌蛋白形成の重要な骨格であることを示しており,他のWAPモチーフ蛋白も抗菌活性があるかどうか検索する必要があることを示している.
活動依存的カルシウム流入による競合的シナプス回路発達の共通原理の解明

生まれたばかりの個体のシナプス回路は、過剰で重複の多い混線回路である。生後早期の発達過程において、環境刺激や経験・訓練・学習に伴うシナプスの使用状況や神経活動の強弱に応じて、競合的なシナプス回路の強化と除去が起こる。その結果、未熟なシナプス回路は機能的で正確な投射関係を備えたシナプス回路へとリファインされ、正常な脳機能の発現基盤が完成する。この発達過程を経ることにより、ヒトでは臨界期と呼ばれる年少期において、ほとんどの高次神経機能ー認知、言語、楽器演奏、スポーツ、知能、思考、性格、社会性などーが飛躍的に発達する。現在、シナプスに発現するグルタミン酸受容体の活性化とそれによるシナプス後側ニューロンへのカルシウム流入が、この活動依存的シナプス選別過程を制御していることがわかっている。しかし、カルシウム濃度上昇が、一体どのような分子細胞メカニズムを通してシナプス回路の強化と除去を制御しているかについては、ほとんど不明であった。本研究では、カルシウム依存的な活動依存機構とこれに対抗する機構とが拮抗してシナプス回路発達を制御するという作業仮説を立て、これを神経解剖学・神経生理学・発生工学などの手法を用いて個体レベルで検証することを目的とした。本研究の推進により、小脳ではP/Q型カルシウムチャネルが登上線維によるプルキンエ細胞支配の形成・維持を制御し、大脳ではNMDA型グルタミン酸受容体やその制御調節に関わるグルタミン酸トランスポーターが体性感覚系シナプス回路発達を制御することを明らかにした。また、平行線維によるプルキンエ細胞支配をGluD2-Cbln1-ニューレキシンによる分子間相互作用が媒介し、これがカルシウム依存的な形成・維持機構により促進される登上線維支配と拮抗していることも判明した。生後早期の発達過程において、経験・訓練・学習に伴うシナプスの使用状況に応じてシナプス回路の強化と除去が起こる。その結果、未熟なシナプス回路は機能的で正確な投射関係を備えたシナプス回路へとリファインされ、認知・言語・技能・知能などの神経機能が飛躍的に発達する。現在、シナプスおけるグルタミン酸受容体(GluR)の活性化とそれによる細胞内Ca^<2+>濃度や伝達効率の変化が、この活動依存的なシナプス回路発達を促進することがわかってきている。本研究では、GluRおよびその下流で細胞機能制御に関わる分子群に着目し、競合的なシナプス回路の発達・維持の分子細胞機構を、神経解剖学・神経生理学・発生学・行動学の観点から解析することにより、その共通原理を解明する。1) CNB1のfloxマウスの作成と細胞特異的Creマウスとの交配カルシニューリンはカルシウム依存性の脱リン酸化酵素で、触媒サブユニットCNAと制御サブユニットCNBからなるヘテロダイマーとして機能する。脳ではCNAαCNAβCNB1のみが発現しているため、CNB1の遺伝子欠失により脳におけるカルシニューリン活性をほぼ完全に消失させることができる。しかし、null型欠損CNB1マウスは致死的であり、神経回路の発達や機能解析には条件的CNB1欠損マウスが不可欠である。平成19年度の研究では、分担者である新潟大学の崎村教授と共同して、カルシウム結合に必須なEFハンドをコードするCNB1遺伝子の第3エクソンと第4エクソンをloxP配列で挟んだfloxマウスを作成した。さらに、崎村教授と神戸大学の饗場教授と共同して、プルキンエ細胞特異的Creマウスと大脳皮質特異的Creマウスと交配することにより、細胞特異的ノックアウトマウスの作製に成功した。今後、このノックアウトマウスを使って、小脳と大脳皮質におけるシナプス回路における分子機能を追求する。2) CaMKIIα,CaMKIIβ,CNB1の特異抗体作成CaMKIIおよびカルシニューリンの脳内分布解析に必要なポリクローナル抗体作成を行った。

イムノブロットで検討した結果、CaMKIIβ、CNB1、CNAαCNAβ.に対する特異抗体を得ることができた。今後、これを用いて小脳と大脳皮質でのカルシニューリンの分布を検討する。カルシニューリンはカルシウム依存性の脱リン酸化酵素で、触媒サブユニットCNAと制御サブユニットCNBからなるヘテロダイマーとして機能する。脳ではCNAα, CNAβ, CNB1のみが発現しているため、CNB1の遺伝子欠失により脳におけるカルシニューリン活性をほぼ完全に消失させることができるが、そのnull型欠損CNB1マウスは致死的である。本年度は、大脳皮質特異的Creマウスとの交配により、終脳選択的CNB1ノックアウトマウスを作成した。現在、その解析を行っており、バレル形成・発達において形状やサイズが異なる表現型を見いだした段階である。来年度において、この表現型が一体どのようなシナプス回路の発達異常によるものかの確定を行う予定である。昨年度、CaMKIIα, CaMKIIβ, CNB1に対するポリクローナル抗体作成に着手し、後二者に対する特異抗体の作成に成功した。これらの抗体を用いて、小脳と大脳における分子局在を共焦点レーザー顕微鏡による多重染色と包埋前/包埋後免疫電顕法を解析した。その結果、これらのカルシウム依存性リン酸化酵素および脱リン酸化酵素はニューロンやシナプスの各部に広く分布し、特にシナプス可塑性が起こりやすい大脳錐体細胞の興奮性シナプスや、小脳の平行線維・プルキンエ細胞シナプスに豊富である事が判明した。さらに、CNB1の免疫反応が特異的であることは、上記終脳選択的CNB1ノックアウトマウスを用いる事で証明できた。今後、これらの分子の小脳シナプス回路形成発達における機能的役割を、遺伝子欠損マウスを用いて解析を行う予定である。NMDA受容体のGluN2BとGluN2Dは発達段階に発現する2つのサブユニットである。本研究では、この2つのサブユニットの機能的差異について、GluN2BヘテロマウスとGluN2Dホモ欠損マウスの体性感覚系の回路発達を比較した。同腹のコントロールマウスでは、三叉神経核脊髄路核のバレレットは出生日(PO)に、視床のバレロイドはP2-P3、体性感覚野のバレルはP4-P5に出現した。これに比べ、GluN2Bヘテロマウスではそれぞれ1日遅れて出現し、GluN2Dホモ欠損マウスでは1日早まった。片側眼窩下神経切断による臨界期終了時期を検討したところ、GluN2Bヘテロマウスでは1日遅れて終了し、GluN2Dホモ欠損マウスでは1日早まった。したがって、体性感覚路全般に渡って、GluN2Bはシナプス回路の形成と改築を促進し、対照的にGluN2Dはこれを遅延させていることが判明した。転写レベルでは、GluN2Bは前脳にGluN2Dは脳幹に豊富に発現することが判っている。特異抗体を作成してそのニューロン発現とシナプス局在を検討したところ、成体期の三叉神経核・視床・体性感覚野のいずれにおいても、GluN2Bは主にprincipal neuronに発現し、その非対称性シナプスのシナプス後部に局在した。
芳香性花卉の非メバロン酸経路を介する香り発散特性の分子機構

花卉の香り育種に有用な知見を得るため,バラを用いて以下の実験を行った.芳香性品種の花弁からは,モノテルペノイド,セスキテルペノイド,芳香族アルコール,酢酸エステル,ジメトキシトルエンが検出された.また,これらのバラ切り花の香りには鎮静効果と精神的疲労低減効果が認められた.モノテルペノイド合成酵素遺伝子として2遺伝子がクローニングされた.このうちRhMTS2は被子植物の非環式モノテルペノイド合成酵素遺伝子群に分類され,芳香性品種のかたい蕾で高発現していた.ゲラニル二リン酸合成酵素としては,RhGPPS-LSU1,RhGPPS1が単離でき,前者は芳香性品種すべてと非芳香性の1品種で高発現していた.花卉の香り育種に有用な知見を得るため,バラを用いて以下の実験を行った.芳香性品種の花弁からは,モノテルペノイド,セスキテルペノイド,芳香族アルコール,酢酸エステル,ジメトキシトルエンが検出された.また,これらのバラ切り花の香りには鎮静効果と精神的疲労低減効果が認められた.モノテルペノイド合成酵素遺伝子として2遺伝子がクローニングされた.このうちRhMTS2は被子植物の非環式モノテルペノイド合成酵素遺伝子群に分類され,芳香性品種のかたい蕾で高発現していた.ゲラニル二リン酸合成酵素としては,RhGPPS-LSU1,RhGPPS1が単離でき,前者は芳香性品種すべてと非芳香性の1品種で高発現していた.実験材料であるバラをロックウール栽培により常時供給できる体制を構築した.また,香気成分をTenax TAに捕集するため,3反復の捕集が同時にできるトラップシステムを組み立て,加熱導入(設備備品で装置購入)によるガスクロマトグラフィーの分析条件を検討した.その上で,開花花蕾を用いて,15品種の香気の組成および発散特性を分析した.香気成分の定性には,GC-MSを用いた.これらの分析結果から,香気の発散は主として花弁で起こること,芳香性品種では,ゲラニオール,シトロネロール,ネロール等のモノテルペノイドの他,セスキテルペノイド,各種酢酸エステル,アルコール類が検出され,特に非芳香性品種と比較するとモノテルペノイドの発散量が多いことを明らかにした.モノテルペノイドの発散特性から判断し,芳香性品種として3品種,非芳香性品種として3品種を選定し,ゲラニルニリン酸から非環式モノテルペノイドの合成に関わるモノテルペノイド合成酵素遺伝子を探索することとした.まず,公開されているバラのESTデータベースから,既知のモノテルペノイド合成酵素遺伝子と相同性の高い2つの候補配列を得た.また,ディジェネレートプライマーによる探索で,EST候補配列を含む2つの候補遺伝子断片を得ることができ,全長配列の決定へと研究を進めた.一方,香りの心理的効果の検討については,バラの育種家で生産者でもある今井清氏の協力を得た.香りの疲労回復効果について明らかにするため,負荷のかけ方やばら切り花の提示方法等について手法の検討を行い,POMSによる評価を実施した.フリージアについては,小球しか確保できなかったため当初予定していた促成栽培を断念し,34月に開花させる普通栽培によって交配を行いF1を採種した.同時に供試品種の香気組成を明らかにした.まず,前年度開花が遅れていたフリージアについては,ヘッドスペース吸着・ガスクロマトグラフィー(HA-GC)法により香気成分を分析し,'エレガンス','アラジン','オベロン'における香り特性のちがいがリナロールと他のモノテルペノイドとの発散比率の違いに起因していることを明らかにした.また,品種間の交配によりF1種子を得て,発芽させることに成功した.バラについては,芳香性品種の'チェラブカップ'を用いてペンタン抽出による内生量の分析を行ったところ,モノテルペノイドはいずれも花弁で多量に検出され,がく片および葉では検出されなかった.さらに,がくが開き始めた堅い蕾から花弁がゆるんだ花蕾の段階にかけて外側から内側の花弁に向かってモノテルペノイドが合成・蓄積されていくことが明らかとなった.香りの官能検査とヒトの心理的・生理的反応については,バラ切り花を用い,前年度の方法を改善してPOMSや脳波の計測等を実施した.バラの香りを嗅がせた際の疲労回復効果には個人差が大きく,有効に作用する場合とそうでない場合があった.バラのモノテルペノイド合成酵素遺伝子の探索では,既知のモノテルペノイド合成酵素遺伝子と相同性の高い2つのmRNAの部分配列が'イブカノン'から得られた.全長配列を決定し,これらをRaMTS1, RsMTS2として系統樹を作成した.RhMS1は被子植物のモノテルペノイド合成酵素遺伝子群であるTpsbグループに,RhMS2は被子植物の非環式構造のモノテルペノイド合成酵素遺伝子群であるTps gグループに分類された.また,rea1-timePCRによる発現解析の結果,両遺伝子の発現はがく片が開きはじめた堅い蕾の花弁において最も高く,開花とともに低下した.さらに,両遺伝子ともに非芳香性品種と比較して芳香性品種で発現量が高かった.今後RhMTS2を中心に機能解析を進めることとした.固相マイクロ抽出法によりバラ花弁向軸側および背軸側表面からピペットチップ内に発散される香気成分を捕集した.非芳香性品種においては,香気成分がほとんど検出されなかった.

一方芳香性品種では向軸側,背軸側ともモノテルペノイドの発散量は多く,`イブピアッチェ'ではゲラニオールが,`ファンシーイブニング'では向軸側のネロールの発散量が多かった.すべてのモノテルペノイド合成の前駆体となるゲラニル二リン酸(GPP)の合成に不可欠と考えられているゲラニル二リン酸合成酵素(GPPS)遺伝子を探索した.GPPSはSSU,LSUおよびGPPSの3つのクレードに分類され,GPPS-SSUは単離できていないが,GPPS-LSUとGPPSについてはクローンが得られ,全長配列を決定した.得られたアミノ酸配列をもとに系統樹を作成した結果,RhGPPS-LSU1は他種のGPPS-LSUの近傍に位置するGGPPSのクラスターに,RhGPPS1は他種のGPPSが位置するクラスターに分類された.芳香性および非芳香性各2品種を用いてRhGPPS-LSU1およびRhGPPS1の器官別発現量を調査したところ,RhGPPS-LSU1は`イブピアッチェ'や`ファンシーイブニング'の中花弁や外花弁で高発現しており,`スイートアバランチェ'の外花弁や葉でも高い発現がみられた.一方,RhGPPS1の発現量には芳香性,非芳香性の品種間で大きな差はみられなかった.`イヴピアッチェ'の生花から水蒸気蒸留によりハイドロゾル,有機溶剤抽出によりアブソリュート,不揮発性溶剤抽出によりアンフルラージュ油脂を得,ヒトへの心理・生理効果を検証した.これら3種の抽出物の呈示により唾液アミラーゼ活性が低下した.生花の呈示では,気分状態が改善され,抽出物より優れた心理効果があった.生花と抽出物によって香気成分組成に違いがみられた.バラにおける香気成分の発散特性をより詳細に明らかにするため,香気成分の発散部位である花弁の向軸側表皮,背軸側表皮の形態を走査型電子顕微鏡により観察した.向軸側の表皮細胞は釣鐘状で先端にクチクラが筋状微細構造をつくっていた.一方,背軸側は平板で全面にクチクラワックスが沈着していた.ただし,芳香性品種,非芳香性品種とも形態は似通っており,香気成分を蓄積するような細胞や構造物は観察されなかった.芳香性の品種である`イブピアッチェ'を供試し,背軸表皮と向軸表皮をそれぞれ取り除いた外花弁から香気成分を抽出して分析した.香気成分はいずれの側からも多量に検出され,向軸側ではネロールが,背軸側ではゲラニオールとネロールの内生量が多かった.前年度までに明らかになった,バラモノテルペノイド合成酵素候補遺伝子のRhMTS1およびRHMTS2について,非芳香性品種および芳香性品種の花弁での発現解析を継続したところ,RhMTS1は`イブピアッチェ'の内花弁において高発現していた.RhMTS2は,`イブピアッチェ',`スイートアバランチェ'ともに内花弁で外花弁と比較して高発現しており,芳香性,非芳香性の品種間に発現量の差は認められなかった.これらの結果は,前年度までの結果と概ね一致し,この2つのモノテルペノイド合成酵素候補遺伝子の発現において,芳香性,非芳香性を説明することはできなかった.芳香性のバラ切り花について,ヒトの心理(POMS)・生理(心拍変動パワースペクトル解析,唾液アミラーゼ量)に及ぼす影響を調査した.生花や生花弁を呈示した直後から,交感神経活動の低減と副交感神経活動の亢進がみられ,バラの香りが鎮静効果を与えていることが示された.また,アミラーゼ量が低下したことから,精神的疲労を低減することが示唆された.
Ｉｎ　ｖｉｖｏ　イメージングシステムを用いた膵癌治療実験

ハムスター膵癌細胞株PGHAM-1にルシフェラーゼ遺伝子を導入したPGHAM-1/Luc細胞を用いて、各種膵癌実験モデルを作成し、その進展・転移経過のIVISsystemによるin vivo imagingを試みた。また、同細胞に対するgemcitabineの効果を、in vitroおよびin vivoで検討した。Gemcitabineの抑制効果はin vitroで見られ、癌の進展・転移はIVISsystemによりin vivo imagingとして捉えられたが、その効果の定量化には至らなかった。今後より安定したin vivo imaging定量化システムの確立およびその応用が期待される。【目的】ルシフェラーゼ遺伝子発現PGHAM-1膵癌細胞を用いたIVIS Systemイメージ実験モデルおよびPGHAM-1膵癌モデルにおいて膵癌の特性解明や効果的な治療法を検討する。【実施計画】1.ハムスターin vivo各種膵癌モデルの確立、2.安定した新たなルシフェラーゼ発現ハムスター膵癌細胞株(PGHAM-1/Luc))の樹立、3. PGHAM-1細胞およびPGHAM-1/Luc細胞に対するGemcitabineやIL-24の抗腫瘍効果の検討、4.複数のヒト膵癌細胞株に対するGemcitabineやIL-24など他の抗腫瘍物質の増殖抑制・アポトーシス誘導効果の検討、および相乗効果の検討。【研究成果】1.本施設で確立されたハムスター膵癌細胞株(PGHAM-1)よりクローニングで3種類の膵癌細胞株を樹立し、本実験に用いた。レンチウイルスにてルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼ発現膵癌細胞株(PGHAM-1/Luc)を樹立した。2.PGHAM-1/Luc細胞の膵脾葉移植実験モデルを作製しIVISにて経時的に観察した。膵脾葉への癌生着率は75%で、移植1週後よりIVISにて確認された。脾内投与では肝転移モデルが、腹膜移植モデルでは腹膜播種モデルが確立された。3.GemcitabineおよびIL-24によるPGHAM-1/Luc細胞への抗腫瘍効果およびアポトーシス誘導効果を検討し、in vitro, in vivoにおける至摘投与濃度が決定された。PGHAM-1に対する抗腫瘍効果については、gemcitabineは3ng/mlで有意に増殖を抑制したが、IL-24の投与では抑制効果はみられなかった。一方、アポトーシス誘導効果については、gemcitabineが3ng/mlで有意に誘導したのに対し、IL-24の投与では誘導がみられなかった。ハムスター膵癌細胞株(PGHAM-1)を用いた同種膵内移植膵癌モデルは、短期間に膵原発巣、肝転移、腹膜播種を発生させ、ヒト膵癌の進展形式を全て兼ね備えた研究モデルとして有用と考えられている。今回、レンチウィルスベクターを用いて、PGHAM-1細胞にルシフェラーゼ遺伝子を導入し新たなルシフェラーゼ発現膵癌細胞株を樹立した(PGHAM-1/Luc)。本細胞を同種膵内移植し、毎週体重測定およびIVISによる生体観察を行うとともに、gemcitabineの治療効果判定における有用性を検討した。PGHAM-1移植ハムスターは3ヶ月以内にすべて癌死したが、IVISにより癌の発育が経時的に生体観察可能であった。癌死した個体でのROIはすべて1X106で、ROIの測定は癌の発育の検討に有用と考えられたが、個体差も認められ、ROIと腫瘍重量との関係を明らかにすることはできなかった。治療実験としては、gemcitabineの投与は腫瘍のアポトーシスを増加させる傾向がみられ、担癌動物の生存を延長する傾向も観察された。動物愛護から多数の動物を使用する実験が困難となっている現在、本実験モデルの有用性は今後益々増加するものと考えられる。【目的】ルシフェラーゼ遺伝子発現PGHAM-1膵癌細胞を用いたIVISSystemイメージ実験モデルにおいて膵癌の特性解明や効果的な治療法を検討する。【実施計画】1.複数のルシフェラーゼ発現ハムスター膵癌細胞株(PGHAM-1/Luc))の樹立、2.ハムスターin vivo膵癌モデルの確立、3.PGHAM-1/Luc細胞に対するGemcitabineや他の抗癌剤の抗腫瘍効果、および相乗効果の検討、4.複数のヒト膵癌細胞株に対するGemcitabineや他の抗癌剤の増殖抑制・アポトーシス誘導効果の検討、および相乗効果の検討。レンチウイルスにてルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼ発現膵癌細胞株(PGHAM-1/Luc)の樹立に成功した。2.PGHAM-1/Luc細胞(4x106個/μl)をハムスター膵脾葉に移植し、膵癌実験モデルを作製しIVISにて経時的に観察した。

移植4週頃より原発巣とともに腹膜播種が20%にみられた。全例が3か月以内に癌死した。以上のように膵内移植膵癌モデルを確立した。脾内投与では肝転移モデルが、腹膜移植モデルでは腹膜播種モデルが確立された。3.4.GemcitabineによるPGHAM-1/Luc細胞への抗腫瘍効果およびアポトーシス誘導効果を検討し、in vitro, in vivoにおける至摘投与濃度が決定された。同時に複数のヒト膵癌細胞株に対するGemcitabineのin vitroにおける至摘投与濃度も決定された。現在、他の抗癌剤の効果や相乗効果につき検討中である。現在、他の抗癌剤における効果を検討中であり、相乗効果については今後施行予定であるが、遺伝子導入した膵癌細胞株の安定性にやや問題があり、より安定した条件を検索している。現在、他の抗癌剤における効果を検討中であり、相乗効果については今後施行予定であるが、概ね順調に進展している。今後、ハムスター膵癌細胞株およびヒト膵癌細胞株に対するGemcitabineと他の抗癌剤の併用でのin vitroにおける増殖抑制・アポトーシス誘導の相乗効果を検討する予定である。さらに、実験膵癌モデル(in vivo)におけるgemcitabineを中心とした多剤併用療法による腫瘍抑制効果、転移抑制効果、そして相乗効果などを検討する。さらに、実験膵癌モデル(in vivo)におけるgemcitabineを中心とした多剤併用療法による腫瘍抑制効果、転移抑制効果、そして相乗効果などを検討し、ルシフェラーゼ発現ヒト膵癌細胞株を樹立後、ヒト膵癌細胞を用いたin vivoの治療実験を施行する予定である。次年度はハムスター膵癌細胞株およびヒト膵癌細胞株に対するGemcitabineと他の抗癌剤の併用でのin vitroにおける増殖抑制・アポトーシス誘導の相乗効果を検討する予定である。さらに、実験膵癌モデルにおけるgemcitabine、S1を中心とした多剤併用療法による腫瘍抑制効果、転移抑制効果、そして相乗効果などを検討し、より効果的なルシフェラーゼ発現ヒト膵癌細胞株を樹立後、ヒト膵癌細胞を用いたin vivoの治療実験を施行する予定である。よって研究費は実験動物、薬剤の購入、および本研究の方法および結果について海外研究者との討論、情報収集のために米国膵臓学会に参加する旅費として使用する予定である。次年度はハムスター膵癌細胞株およびヒト膵癌細胞株に対するGemcitabineと他の抗癌剤(特にフッ化ピリミジン系の薬剤、プラチナ系薬剤)の併用でのin vitroにおける増殖抑制・アポトーシス誘導の相乗効果を検討する予定である。
免疫チェックポイント分子の機能解析とその制御を標的とした新しい治療法の開発

現在、臨床に導入されている免疫療法の多くは、免疫チェックポイント分子であるPD-1/PD-L1を標的とした阻害剤が用いられている。一方、標的としている免疫チェックポイント分子は限定的であり、新規分子を標的とした免疫療法の登場も期待されている。そこでliquid biopsyとしても注目されている血液検体を用いてPD-L1と新規免疫チェックポイント分子であるHumanendogenous retrovirus-H long terminal repeat-associating protein 2 (HHLA2)の臨床的意義について検討を行った。対象は、当院にて手術や化学療法などの治療を行った胃癌症例であり、治療前の血液検体を使用した。コントロールとして胃癌細胞株や健常者の血液検体も使用し、血中のPD-L1やHHLA2 mRNA発現を定量RT-PCR解析を用いて評価した。PD-L1の解析では、胃癌細胞株でのPD-L1発現が確認され、胃癌症例は健常者と比較して有意に高値であった。さらにPD-L1発現は、深達度や遠隔転移、ステージと有意に正の相関を示した。またPD-L1高発現群は、低発現群に比較して有意に予後不良であり、多変量解析では独立した予後因子のひとつであった。一方、HHLA2の解析では、胃癌症例は健常者と比較して有意にHHLA2発現が低値であり、深達度や遠隔転移、ステージと有意に負の相関を示した。さらにHHLA2高発現群は、低発現群に比較して有意に予後良好であった。今回の検討で血液中のPD-L1とHHLA2は、宿主の免疫機構に対してそれぞれ抑制的と促進的に作用していることが推測され、HHLA2に関しては新たな免疫療法の標的分子となる可能性が示唆された。癌細胞は、免疫チェックポイント分子を発現することで全身性の炎症反応を惹起し、免疫不均衡をもたらすとの報告もあり、本年度は全身性炎症反応の指標とされるNeutrophil-Lymphocyte Ratio (NLR)と血液凝固因子のFibrinogenに着目した。この現象は、特に進行癌において顕著に見られることから切除不能・再発胃癌を対象とし、血清Fibrinogen値とNLRとを同時に評価したF-NLR scoreの臨床的意義について検討することとした。対象は、切除不能・再発胃癌の診断にて化学療法あるいは化学放射線療法を行った68例であり、治療前1週間以内の血液検体を使用した。血清Fibrinogen値とNLRを測定し、Hyperfibrinogenemia (> 400mg/dL)およびHigh NLR (> 3.0)の症例はF-NLR score: 2、どちらか一方のみ満たす症例をF-NLR score: 1、どちらも満たさない症例はF-NLR score: 0と定義して評価した。治療効果判定では、progressive disease (PD) : 27例(39.7%)、non-PD : 41例(60.3%)であった。PD群は、血清FibrinogenおよびNLRともにnon-PD群より有意に高値であった。またF-NLR score: 0, 1, 2は、それぞれ21例(30.9%)、25例(36.8%)、22例(32.3%)であり、PD群はnon-PD群に比較し、有意に高値であった。さらに予後との関係ではF-NLR score高値例ほど有意に予後不良であり、多変量解析では独立した予後不良因子であった。これらの結果より、切除不能・再発胃癌において癌細胞は全身性の炎症反応を誘発し、宿主の免疫応答を抑制することで治療抵抗性をもたらす可能性が示唆された。免疫チェックポイント分子を発現する癌細胞の免疫抑制機構のメカニズムについて全身性炎症反応の観点から、その臨床的意義も含めて解析し、学会発表およびoriginal articleとして論文発表をすることができた。現在、切除不能・再発胃癌に対する免疫療法は、3次療法としてニボルマブ(PD-1抗体)が胃癌治療ガイドラインでも推奨度Aとして記載され、実地診療で用いられている。一方で免疫チェックポイント分子であるPD-1は、B7 ligand familyのひとつであり、これまでにもいくつかの分子が同定されている。Human endogenous retrovirus-H long terminal repeat-associating protein 2 (HHLA2)は、B7-H7とも呼ばれ、B7 ligand familyに属する新規免疫チェックポイント分子であるが、これまでほとんど研究されていないのが現状であった。そこで本年度は、HHLA2に着目し、胃癌末梢血液中での発現の臨床的意義について検討することとした。対象は、当院にて手術や化学療法などの治療を行った胃癌111例であり、治療前の血液検体を使用した。コントロールとして健常者の血液検体20例も使用し、血中HHLA2発現は定量RT-PCR解析を用いて行った。また胃原発巣と血中でのHHLA2発現を比較する目的で原発巣のHHLA2発現を免疫染色にて評価した。胃癌症例でのHHLA2 mRNA発現は、健常者と比較して有意に低値であった(P < 0.0001)。さらにHHLA2発現は、深達度や遠隔転移、ステージと有意に負の相関を示した(P =0.0331, P<0.0001, P=0.0032)。またHHLA2高発現群は、低発現群に比較して有意に予後良好であった(P=0.0001)。さらに胃原発巣と血中でのHHLA

2発現も相関関係を認めた(P=0.0283)。これらの結果より、胃癌においてHHLA2発現は、免疫機構に促進的に働いている可能性が示唆された。現在、臨床に導入されている免疫療法の多くは、免疫チェックポイント分子であるPD-1/PD-L1を標的とした阻害剤が用いられている。一方、標的としている免疫チェックポイント分子は限定的であり、新規分子を標的とした免疫療法の登場も期待されている。そこでliquid biopsyとしても注目されている血液検体を用いてPD-L1と新規免疫チェックポイント分子であるHumanendogenous retrovirus-H long terminal repeat-associating protein 2 (HHLA2)の臨床的意義について検討を行った。対象は、当院にて手術や化学療法などの治療を行った胃癌症例であり、治療前の血液検体を使用した。コントロールとして胃癌細胞株や健常者の血液検体も使用し、血中のPD-L1やHHLA2 mRNA発現を定量RT-PCR解析を用いて評価した。PD-L1の解析では、胃癌細胞株でのPD-L1発現が確認され、胃癌症例は健常者と比較して有意に高値であった。さらにPD-L1発現は、深達度や遠隔転移、ステージと有意に正の相関を示した。またPD-L1高発現群は、低発現群に比較して有意に予後不良であり、多変量解析では独立した予後因子のひとつであった。一方、HHLA2の解析では、胃癌症例は健常者と比較して有意にHHLA2発現が低値であり、深達度や遠隔転移、ステージと有意に負の相関を示した。さらにHHLA2高発現群は、低発現群に比較して有意に予後良好であった。今回の検討で血液中のPD-L1とHHLA2は、宿主の免疫機構に対してそれぞれ抑制的と促進的に作用していることが推測され、HHLA2に関しては新たな免疫療法の標的分子となる可能性が示唆された。今後の研究については、胃癌の臨床検体を用いて免疫チェックポイント分子の発現を免疫染色にて解析し、同時にCD3,やCD4, CD8, Foxp3に対する抗体を用いてT細胞性免疫応答に関わる因子の評価も行い、原発巣での免疫チェックポイント分子から見たT細胞性免疫応答の抑制機構を明らかにする予定である。今後の研究については、胃癌の臨床検体を用いてHHLA2の発現を免疫染色にて解析し、同時にCD4, CD8, Foxp3に対する抗体を用いてT細胞性免疫応答に関わる因子の評価も行い、原発巣でのHHLA2発現から見たT細胞性免疫応答との関係を明らかにする予定である。
マンソン裂頭条虫擬充尾虫の産生する成長ホルモン様物貭についての研究

マンソン裂頭条虫擬充尾虫が産生する成長ホルモン(GH)様物貭の生理学的特性とその構造を追求するために充分量の精製標品を得る必要があり、精製法の改良を試みそして生理活性を観察した。従来は虫体抽出液の塩析、疎水及び陰イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過の4段階で精製したが、改良の結果では虫体抽出液をGH受容体結合アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過の2段階で精製され、特異的GH活性は195倍に上昇し、収率も良好であった。この精製されたGH様物貭の分子サイズは、以前に精製した27KDとは異なり、16KDであった。この新たに見出された16KD蛋白は肝細胞増殖活性を持ち、さらに抗ヒトGHモノクロナ-ル抗体と交叉反応する物貭であった。さらにこのGH様物貭はゴ-ルデンハムスタ-の血糖上昇を抑制することが示唆された。一方、アフィニティクロマトグラフィにてGH受容体に弱い結合をする物貭が認められ、これを陰イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過にて精製すると、以前に精製した27KD糖蛋白であった。この27KD糖蛋白も16KD蛋白と同様に肝細胞増殖活性を示し、抗ヒトGHモノクロナ-ル抗体と交叉反応した。そして27KD糖蛋白をリジンエンドペプチダ-ゼにて切断し、エドマン分解法によりApplied Biosystem Protein Sequenatorを用いてアミノ酸配列を決定した。27KD糖蛋白断片の15個のアミノ酸配列はカテプシンLと67%の相同性を持っていたが、GHとの相同性は認められなかった。これらの結果から、GH受容体に強く結合し、抗ヒトGHモノクロナ-ル抗体と交叉反応する16KD蛋白が肝細胞増殖活性を持つことから本虫感染による肝細胞増殖を惹起させる本体であると考えられ、この物貭のcDNAのクロ-ニング、塩基配列の解明が今後の課題として浮上した。マンソン裂頭条虫擬充尾虫が産生する成長ホルモン(GH)様物質の精製品の生理学的活性を研究するためには、充分量の製精品を効率よく得る必要がある。しかし、我々の従来の方法では精製効率が低く、invivo実験を行うのに充分量の精製品を得るのに困難であった。そこで、本物質は家免肝由来のヒトGH受容体に結合することが判明しているのでGH受容体を用いたアフィニティクロマトグラフィ法により精製することを試みた。妊娠家免肝臓よりGH受容体粗抽出液を調製し、GH-アフィニティカラムにより受容体を精製した。得られたGH受容体を用いて受容体-アフィニティカラムを作製した。虫体粗抽出液を受容体-アフィニティゲルと混和後、緩衝液にて洗浄し、そして5M-Macl_2加25mMトリス塩酸緩衝トリトンX100液にて溶出させた。GH活性はGH-Radiorece-ptor Assay.法にて測定した。5M-Mgcl_2溶出分画にGH活性が認められた。それの特異的活性は粗抽出液の活性より約900倍に濃縮された。この5M-Mgcl_2分画をsuperoseHR12カラムにてゲル濾過したところSDS-PAGEにて分子量約16KDの蛋白が得られた。また、Seglenの方法を改変してマウス肝臓実質細胞の初代培養を行ない、5M-Mgcl_2溶出分画の肝細胞DNA合成能に及ぼす影響を観察した。0.62μg蛋白/mlの添加で対照の1.8倍のDNA合成活性の上昇が認められた。これは本虫感染マウスの肝臓DNA合成促進するという実験結果と付合することである。しかし、この物質をゴールデンハムスターに経静脈投実験を行なったが、ゴールデンハムスターの血糖、Glucose-6-Phasphataseなど糖代謝系への影響は観察できなかった。これは、多分、投与量が少量であったこと(63mg/匹)によるかもしれない。今後、投与量を増加して本物質の糖代謝への影響を観察する計画である。

27KD糖蛋白断片の15個のアミノ酸配列はカテプシンLと67%の相同性を持っていたが、GHとの相同性は認められなかった。これらの結果から、GH受容体に強く結合し、抗ヒトGHモノクロナ-ル抗体と交叉反応する16KD蛋白が肝細胞増殖活性を持つことから本虫感染による肝細胞増殖を惹起させる本体であると考えられ、この物貭のcDNAのクロ-ニング、塩基配列の解明が今後の課題として浮上した。マンソン裂頭条虫擬充尾虫の虫体抽出液及び虫体培養液からヒト成長ホルモン(GH)受容体に対してヒトGHと競合置換するGH様物質が分子量27KDの糖蛋白として分離され、さらに初代培養マウス肝細胞の細胞増殖活性を示す16KDの蛋白が分離された。そこで27KDの蛋白の性状を明らかにするために電気泳動にて精製し、アミノ酸配列を分析したところチオ-ルプロテア-ゼに類似する物質であり、本物質が肝細胞増殖に関与している可能性も示唆された。また、虫体培養液をGH受容体ーアフィニティクロマトグラフィにて分画すると5MーMgCl_2溶出分画にヒトGHと同一Rm値を示す22KDの蛋白が存在し、そしてこの蛋白がヒトGHマウスモノクロナ-ル抗体と交叉反応することが判明した。一方虫体抽出液においては、25KDのBandがヒトGHマウスモノクロナ-ル抗体と交叉反応する主なる蛋白であった。だが、これらのBand以外にも交叉反応するBandが多数認められた。これらの試料を取扱う経過においてGH様物質は不安定な物質であるようにみうけられ、精製過程における安定化の方策の検討が必要であるよう思われた。一方、GH様物質の生物学的活性の一指標として糖質代謝に及ぼす影響を検討するためにラット脂肪細胞への^<14>CーGlucoseの取込み実験を試みた。虫体培養液及び虫体抽出液のGH受容体ーアフィニティクロマトグラフィ精製標品は、対照に比較して約1.2倍の^<14>CーGlucoseの取込の増加しか観察されずさらなる検討が必要であった。今後、ヒトGHモノクロナ-ル抗体との交叉反応性を一つの指標として電気泳動でGH様物質を分離し、そのアミノ酸配列を明らかにすることが課題である。マンソン裂頭条虫擬充尾虫が産生する成長ホルモン(GH)様物質の生理学的特性とその構造を追求するために充分量の精製標品を得る必要があり、精製法の改良を試みそして生理活性を観察した。従来は虫体抽出液の塩析、疎水及び陰イオン交換クロマトグラフィ,ゲル濾過の4段階で精製したが、改良の結果では虫体抽出液をGH受容体結合アフィニティクロマトグラフィ,ゲル濾過の2段階で精製され、特異的GH活性は195倍に上昇し、収率も良好であった。この精製されたGH様物質の分子サイズは、以前に精製した27KDとは異なり、16KDであった。この新たに見出された16KD蛋白は肝細胞増殖活性を持ち、さらに抗ヒトGHモノクロナ-ル抗体と交叉反応する物質であった。さらにこのGH様物質はゴ-ルデンハムスタ-の血糖上昇を抑制することが示唆された。一方、アフィニティクロマトグラフィにてGH受容体に弱い結合をする物質が認められ、これを陰イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過にて精製すると、以前に精製した27KD糖蛋白であった。この27KD糖蛋白も16KD蛋白と同様に肝細胞増殖活性を示し、抗ヒトGHモノクロナ-ル抗体と交又反応した。そして27KD糖蛋白をリジンエンドペプチダ-ゼにて切断し、エドマン分解法によりApplied Biosystem Protein Sequenatorを用いてアミノ酸配列を決定した。