hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超高圧振動付加マイクロチューブハイドロフォーミングプロセスの開発

(2)剛体金型を用いたマイクロハイドロ基礎実験とFEM解析(従来剛体金型による十字及びT成形):昨年度の研究成果を踏まえ、本年度は直径0.5mmのマイクロチューブを用いた十字成形とT成形に関して、潤滑条件、材料および成形形状の影響について実験的ならびに数値的に検討した。これまでのりん脱酸銅以外に、高強度のステンレス鋼管のSUS304を取り上げ、そのT成形実験にも成功した。SUS304では張出し部と向かい合う底部の座屈現象が発生しにくい等、材料特性によるマイクロ成形特性の違いを実験的に明らかにすることができた。Tと十字成形結果からマイクロ成形性に及ぼす成形形状の影響、成形高さおよびプロセスウインドウなどの成形特性に及ぼす成形形状の影響、さらに、各種成形不良に及ぼす加工条件の影響について整理・分類した。あわせてTと十字成形プロセスの特徴を明らかにした。研究室の場所変更さらなる想定外の追加変更による諸設備等の移動に大幅な期間を要した。また本研究での主題でもある、金型弾性変形許容のマイクロハイドロ金型変形連成FEM解析による金型設計では膨大な解析時間と試行錯誤によるモデル適正化に想定以上の時間を要したため、その大規模解析が滞り、新金型の設計製作と検証実験が未達となったため。本年度は、主題の型開き・型閉じの金型弾性変形を許容するマイクロハイドロ成形解析を行い、型開きしない従来の剛体金型を用いた場合との比較を行い、本研究の革新性に富む新たなマイクロ成形加工法の効果を明らかにすることができた。金型変形連成FEM解析によるマイクロ十字(クロス)成形は、摩擦効果が顕著に現れる長尺マイクロ管を対象にした。従来の解析実績のあるマイクロ管の3.1倍の長い長尺マイクロ管とした。解析には従来の巨視的動的陽解法有限要素法を用いたが、金型も含めた三次元ソリッドモデリングのため、膨大に時間を要したが型開きを許容するマイクロハイドロ成形の効果を示すことができた。成形中の型開きを許容することによって、マイクロ長尺管でも枝管部のキャビティ内への材料流動が促進され、従来の剛体金型と比べ大きく材料が張出し変形することを明らかにした。さらに長尺のマイクロ管に対する張出し成形加工の可能性を示すことができた。金型との摩擦係数が異なる成形条件におけるマイクロ成形性を検討した結果、成形性の改善効果が期待できることも示すことができた。型開きを許容することによって、材料流動性が改善され、その結果、マイクロ管の肉厚分布も一様化できる。剛体金型の場合には管端部での局所的増肉が生じ、過度の軸押込みで管内部が閉じてしまう状況も予測された。型開きの後、型閉じまで含めた成形プロセスでは、型閉じに枝管部への材料流動も生じることが判明した。これらの型開きと型閉じの逐次繰り返し成形によって更なる成形性の向上が期待できることがわかった。その研究成果は国内学会で発表をすることになった。今冬の国際会議での発表を申込んでいる。逐次繰り返し成形加工における型開きの最適条件に関してはまだ解明するには至らなかった。この最適化によって更なるマイクロ成形性の向上や異なる形状への応用も大いに期待できる。今後の課題である。(1)型開き(弾性変形)を許容する金型構造解析:本解析結果も得られる状況になりつつあるので、次年度には早急に解析を終えて、実際に型開きを許容する金型を有する装置を設計・試作し、実験的な検討に移れるようにする計画である。
筋グリコーゲン備蓄の充足度と運動に伴う筋たんぱく質分解の動態

筋活動によって、筋たんぱく質の分解が亢進するか否かは明らかでない。しかし不適切な栄養摂取に加え、激しいトレーニングによる糖質、脂肪等エネルギー源の枯渇は体たんぱく質の動員を招くことが予測される。筋たんぱく質分解後、遊離した構成アミノ酸の3-メチルヒスチジン(3-MH)は、分解も再利用されることもなく尿中に排泄され、また尿中に排出されるクレアチニン量は筋活動の如何を問わず筋量に比例して一定である。従って、3-MH/クレアチニン比は筋たんぱく質代謝回転率を表わす有力な指標となる。本研究の目的は、筋グリコーゲンの備蓄度が、筋活動による体たんぱく質の分解にどのように影響するかを明らかにし、競技力の向上に寄与することである。実験は飼育用飼料を摂取させた対照群と高炭水化物飼料を摂取させた両ラット群を、本研究のため考案した強制遊泳装置により30分、30分×2回及び遊泳限界に至るまでの負荷を与えた後採尿し、その後下腿三頭筋及び肝を摘出し、冷水抽出法により筋グリコーゲン量を測定した。3-MH及びクレアチニンは、TSKgelODS-80TMを担体とするHPLCて分離・定量した。筋グリコーゲン量は、筋量が少ないこともあって運動負荷後は殆ど測定できず現在酵素法による測定を検討している。高炭水化物摂取群に比べ、対照群の遊泳限界後のたんぱく質代謝回転率が高いことから、エネルギー源の枯渇に伴い筋たんぱく質の分解が亢進し、エネルギー源として動員されたことを示したが、確認のために尿素排泄量測定の必要があった。また遊泳限界後も、肝グリコーゲンが完全に枯渇していないことから、エネルギー源の多少のみでなく乳酸蓄積等による疲労も考えられ、血中乳酸値の測定も必要であると思われた。更に、競技者の生活実体調査結果から、先ず健全なライフスタイルの確立が急務であると思われた。筋たんぱく質分解後、遊離した筋たんぱく質構成アミノ酸の3-メチルヒスチジン(3-MH)は分解を受けず、また再利用されることもなくそのまま尿中に排泄される。従つて、尿中3-MHの排泄量は筋たんぱく質分解の指標となる。一方、筋中にはアンセリンの前駆体として1-メチルヒスチジン(1-MH)も多量に存在することから、運動に伴う筋たんぱく質の分解とは無関係に尿中に排泄されることも考えられ、尿中の3-MH,1-MH及びヒスチジンを分離・定量する必要があった。また、筋量に比例して尿中に排泄されるクレアチニンは、筋量に対するたんぱく質分解率の指標ともなる。以上のことから、尿中3-MH,1-MH、ヒスチジン3者の分離・定量及びクレアチニン排泄量の定量をHPLCを用いて行なった。担体としては、オクタデシル(C_<18>)基をシリカゲルに結合させたTSKgelODS-80TM(4.6mmID×25)による逆相分配クロマトグラフィーが、3-,1-MH及びヒスチジンの分離に最適であり、同担体で移動相を交換するだけでクレアチニンにも適用出来た。前処理後、HPLCによる3種のヒスチジン分離のため、溶離液として酢酸Na buffer(A)とメタノール(B)或いはアセトニトリル(B)など種々な条件でグラデイエントを試みたが、結局は40%メタノールにより目的の3-MHと、1-MH他全てのアミノ酸を一試料25分で完全に分離・定量出来た。3-MHのみで作成した標準曲線と尿付加のそれとは一致し、前処理後5時間の室温放置で50%弱は分解した。

一方、AG50W-X12による前処理後、クレアチニンの溶出液として10%メタノール加酢酸Na buffer(PH 4.7)により一試料12分で定量的に溶出し、これにより標準曲線を作成した。これらの測定法によって作成した両標準線は、再現性に優れていた。ラットに飼育用飼料(CE-2)を投与して対照群とし,CE-2の脂肪を炭水化物にかえて調整した高炭水化物飼料を別群に投与,両群に運動負荷を与えて負荷前後の筋グリコーゲン量及び,運動に伴う体たんぱく質分解の指標として代謝ケージにより採集した尿中の3-メチルヒスチジン(3-MH)とクレアチニン(Cr)排泄量をHPLCにより測定した。運動負荷は,水温を30±2°Cに調整できるように考案したプラスチック製水槽の一方より水道水を直接送り込み強制遊泳させる方法で行なった。筋グリコーゲンの冷水抽出法による測定は,大腿筋に多くの脂肪蓄積がみられたため採取し易い下腿三頭筋を用いたが,筋量が少ないこともあって運動負荷前のグリコーゲン量でもばらつきが大きく,しかも30分の強制遊泳以降は殆ど測定するにいたらず,現在酵素法による測定を試みている。対照,高炭水化物摂取の両群とも,運動負荷前のCr排出量及びたんぱく質代謝回転率に差はみられなかったが,高炭水化物摂取群のCr群排出量が運動負荷量に関係なく一定しているのに対し対照群のそれにはかなりの変動がみられたことから,運動時間帯を含めた一日の経時的Cr排出量測定の必要性をうかがわせた。また,対照群において遊泳限界後のたんぱく質回転率が非常に高いことから,エネルギー源の枯渇による筋たんぱく質の分解が亢進し,エネルギー源として動員されたことを示した。これを確認するためには尿素排泄量の測定も必要と思われた。遊泳限界後も肝グリコーゲンが完全に枯渇していないことから,遊泳限界の原因がエネルギー源の多少だけでなく,乳酸蓄積等による疲労も関係しているであろうことが予測されることから,血中乳酸値も合わせて測定する必要があると思われた。一方本学学生の生活実体調査で,朝食の欠食者が多い(60%70%)このことから,先ずこのライフスタイルの改善が競技力向上に不可欠と思われた。
ボロンドープした半導体ナノダイヤモンドの開発とグルコースセンサーへの応用

本研究は導電性ナノダイヤモンドの形成に最適なボロンドープ量を決定し,グルコースオキシターゼを広範囲に固定するための導電性ナノダイヤモンドの化学修飾する方法を開発したものである.また,グルコースオキシダーゼを固定した導電性ナノダイヤモンド薄膜を用い,グルコースセンサーへの応用を試みた.その結果,導電性ナノダイヤモンド成膜時のボロン導入量が多いほど微量のグルコースを検出でき,再現性が高いことを明らかにした本研究は導電性ナノダイヤモンドの形成に最適なボロンドープ量を決定し,グルコースオキシターゼを広範囲に固定するための導電性ナノダイヤモンドの化学修飾する方法を開発したものである.また,グルコースオキシダーゼを固定した導電性ナノダイヤモンド薄膜を用い,グルコースセンサーへの応用を試みた.その結果,導電性ナノダイヤモンド成膜時のボロン導入量が多いほど微量のグルコースを検出でき,再現性が高いことを明らかにした本年度はバイオセンサーの基板となるナノダイヤモンド薄膜にボロンドープするときの最適なボロンドープ条件を結晶構造、ボロン含有量、電気抵抗率および電気化学特性から検討した。また、より大量のグルコースが安定的に固定できるナノダイヤモンドの開発とその表面に効率よく酵素を固定化する方法を確立した。以下にその概要を示す。1)ラマン分光法による評価の結果,導入ボロン濃度の増加に伴いボロンドープダイヤモンド(BDD)薄膜のダイヤモンドピーク(1332cm^<-1>近傍)減少すること、ナノダイヤモンド(NCD)に関連するピークが増加することがわかった。また、SEM観察の結果からも同様の傾向が観察され、導入ボロン濃度5000ppmでは極めて微細なナノ結晶からなる膜が形成していた。したがって、BDD結晶は導入ボロン濃度の増加に伴い微細化することがわかった。2)BDD薄膜の電気抵抗率は、導入ボロン濃度の増加に伴い減少することがわかった。3)BDD薄膜表面の水素結合量は、導入ボロン濃度5000ppmの場合が最大になると考えられる。4)導入ボロン濃度を変化させることにより、BDD薄膜表面の化学結合状態に相違が生じることがわかった。特に、導入ボロン濃度5000ppmで作製したBDD薄膜は、薄膜表面の化学反応性が高かったことから、化学修飾に適していると考えられる。5)今回の化学処理方法では、十分な量のカルボキシル基への置換が達成できなかったため、化学修飾の成否をFT-IRで正確に評価することができなかった。今後、異なる有機官能基への置換、新たな化学処理方法の確立について検討していく必要がある。本年度は,半導体ナノダイヤモンドの形成に適した成膜条件を検討することを目的とし,ボロンドープ量および成膜時の圧力がダイヤモンド結晶の大きさ,導電性に与える影響を検討した.また,ダイヤモンド表面のカルボキシル化に適した条件を検討することを目的とし,液適法による表面自由エネルギから化学修飾量の評価を行った.以下に得られた結果の概要を示す.1) XRDおよびラマン分光の結果から,今回成膜したすべての薄膜は,グラファイトを含まないナノダイヤモンド結晶で構成されていることがわかった.2) SEM, AFMを用いた薄膜表面の観察結果から,成膜時の圧力および導入ボロン濃度が高いほど,ダイヤモンドの結晶粒径が大きくなる傾向が見られた.3)ダイヤモンド薄膜の電気伝導率は導入ボロン濃度の増加と共に向上した.電気伝導率に与える導入ボロン濃度の影響は低圧力で成膜した時の方が大きいことがわかった.4)異なる条件で成膜したダイヤモンド薄膜を同条件でカルボキシル化化学修飾処理を施した.昨年度の結果から,FT-IR分析は化学修飾したダイヤモンドの表面状態の評価に不向きであることがわかっている.そこで,本年度は化学修飾に伴うダイヤモンドの表面自由エネルギの変化に着目し,静的液滴法を用いて化学修飾量の評価を行った.その結果,化学修飾を行うことで表面自由エネルギの極性成分が顕著に増加し,液適法によって化学修飾量を評価できることがわかった.5)液適法による化学修飾状態の評価の結果,低圧力で成膜した導電性ダイヤモンド表面の修飾量は導入ボロン濃度に依存するのに対し,高圧力で成膜したダイヤモンド表面の修飾量は導入ボロン濃度にほとんど依存しないことがわかった.6)導電性および化学修飾のしやすさの観点から,センサー用基板適したダイヤモンド薄膜は,高圧力および高導入ボロン濃度で成膜する必要があることが明らかになった.本研究は導電性ナノダイヤモンドの形成に最適なボロンドープ量を決定し,グルコースオキシターゼを広範囲に固定するための導電性ナノダイヤモンドの化学修飾する方法を開発したものである.また,グルコースオキシダーゼを固定した導電性ナノダイヤモンド薄膜を用い,グルコースセンサーへの応用を試みた.検討に際しては各ボロン濃度別に成膜したボロンドープダイヤモンドにグルコースオキシターゼを結合させ,ポテンションスタッドを用いて電気的に測定を酵素活性を測定した.センサーとして作用したのは1000ppm,2000ppm,5000ppm,10000ppmであったが,安定してグルコースの検出ができたのはそのうち5000ppmと10000ppmのものであった.これは,導入ボロン濃度が小さいと表面にグラファイトが存在し水素終端となっている面積が少ないため,化学修飾を行ってもグルコースオキシターゼが十分な量だけ結合されなかっただと考えられる.ラマンピーク強度比率から,グラファイトが少なくボロン濃度が高いものほど電流値のぶれ幅が少ない.

そのため,ボロン濃度の高いボロンドープダイヤモンドが,低濃度のそれに比べてより正確にグルコースを分解した際に発生する電位を測定できるのではないかと考えられる.以上の結果から,導電性ナノダイヤモンド成膜時のボロン導入量が多いほど微量のグルコースを検出でき,再現性が高いことを明らかにした.
遺伝子破壊メダカとニワトリBリンパ球細胞を使用した化学物質の複合影響評価

化学物質の変異原性を検出するためDNA障害をDSBの検出を免疫染色によるGammaH2axfociを機械により自動カウントする系と生存曲線評価によるバイオアッセイを確立した。今回、モノクロロ酢酸(MCA)のアッセイを行い、MCAが変異原性を有し、アポトーシス阻害剤であることを明らかにした。このような変異原性とアポトーシス阻害の両方の性質を有する化学物質は報告されておらず今後の水質基準等の策定に役立つものと考えられる。産業界に導入における化学物質の変異原性を検出するためにバイオアッセイを行うが、変異原性を検出するこれまでのバイオアッセイには様々な問題点がある。申請者らは、変異原性、つまり薬剤のDNA損傷誘発能力を、より感度特異度ともに高く検出する為に、野生型細胞とミュータントの細胞分裂速度を「比較する」ことにより、変異原生を調べた。このバイオアッセイでは野生型を陰性対象と置くことで、アッセイがうみうる疑陽性をモニターしている為、変異原性の検出感度を上げることができた。今回申請者らは、米国国家毒性プログラム、米国国立衛生研究所化学ゲノムセンターと共同で、1408種の毒性評価済みの化学物質と、7種のDNA修復経路欠損株を用い、スクリーニングロボット(一日に数千種の物質、20種類以上の濃度でのcell based assayを行うことが可能)によるhigh-throughputな解析とその新規スクリーニングの妥当性の検証実験を行った。細胞増殖率測定アッセイで、1408種類の内42種類の化学物質にて、野生型細胞に比しいずれかのミュータントにて細胞増殖の遅れを検出した。その内、代表的10種類の薬剤では、コントロール群を除いて、野生型細胞と各々対応したミュータント間で染色体断裂数の有意差を認めた。化学物質の変異原性のアッセイにおいて遺伝子破壊DT40を用いたアッセイは非常に有効であると考えられた。今後、条件をさらに検討し、日本における特定化学物質の変異原性の再評価を行ってゆく予定である。また、新規化学物質(特化則)のスクリーニングを行い、その危険性を検討し報告してゆく。遺伝子破壊メダカによるアッセイは、遺伝子破壊があるメダカ個体を選別するための方法がコストの上で最も実用化に障害となると考えられた。そのため、HRMの条件等により効率的な遺伝子破壊スクリーニング方法を考慮している。ニワトリBリンパ球(DT40)によるバイオアッセイは順調に進んでいる。大阪医大で高性能ルミノメーターが使用可能となったことも相まって現在、様々な化学物質をスクリーニングしている。現在、ATPによる細胞増殖曲線とカスパーゼ活性によるアポトーシス誘導によるスクリーニングを行っている。また、SLX4の遺伝子破壊DT40細胞を作成し、その表現型を見た。現在はカドミウムによるDNA障害について、様々な遺伝子修復欠損細胞を用いてその機序を解明しようとしている。カドミウムはそして、Preliminary Dataであるが、モノクロロ酢酸(MCA)は水道水の塩素添加の副産物であるが、DNA障害をきたすことが明らかになった、しかしそれだけでなくMCAはアポトーシス阻害剤としての作用を有する可能性が示唆された。通常、DNA障害をうけ修復不可能になった細胞はアポトーシスを起こすが、アポトーシスが起きないということはDNA障害、つまり変異を持った細胞が生き残ると考えられる。我々の仮説としては強く癌化に寄与すると考えられる。こういったDNA障害とアポトーシス阻害を同時にきたす化学物質は今まで知られておらず、通常飲用する水道水に含まれていることもあり公衆衛生学的に重要であり、さらなる研究が必要である。ニワトリBリンパ球(DT40)によるバイオアッセイに加え、DNA障害スクリーニングの精度を向上させるためにGammaH2axの免疫染色を用いたFociの自動カウントシステムを立ち上げDNA障害をきたす化学物質のスクリーニング精度を向上させた。DT40を用いたスクリーニングにおいて、カーボンナノチューブ(CNT)のような固体の毒性評価は細胞内へCNTを取りこむ機構をDT40は持たないために毒性評価ができないという欠点があった、そこでDT40にmacrophage receptor with collagenous structure (MARCO)を発現させ、それによりDT40にCNTを取り込ませ毒性評価を行えることを確認した。CNTは酸化ストレス障害をきたし、多くの遺伝子修復蛋白欠損DT40細胞に感受性を示すことを見出した。この手法は他の不溶性物質にももちいることができるため、画期的な方法である。モノクロロ酢酸は解糖系酵素GAPDH阻害剤であるが水道水において規制の対象となっているがそのDNA障害については明らかでなかった。DT40を用いてスクリーニングを行ったところDNA障害をきたし、UBC13欠損株において感受性を示すことを明らかにした。また、GAPDHはアポトーシスに重要な機能を果たすことからMCAによるカスパーゼ活性の変化を見たがカスパーゼ3/7の活性低下を認め、アポトーシスを阻害することを明らかにした。ニワトリBリンパ球を用いたアッセイは当初の計画以上に進展している。

しかし、メダカは遺伝子破壊スクリーニングを安価で行う方法を見つけないと誰もができる実験でなく、実用性に欠き、現在検索中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。メダカは遺伝子破壊スクリーニングを安価で行う方法を見つけないと誰もができる実験でなく、実用性に欠き、現在検索中である。High resolution melting (BRM)による条件設定はPCRの条件よりも、そのメダカ検体の処理、DNA量、純度、量、ロボットによる会注を簡単にする等の工夫が必要である。DT40によるバイオアッセイは順調に進んでいるが、さらに簡便なバイオアッセイをハイスループットに解析できる系を立ち上げてゆく。
生殖腺細胞の発生・分化におけるシグナル伝達機構

卵巣顆粒膜細胞は、卵母細胞の発育に伴い、脳下垂体ホルモンの影響を受け、FSHやLHに対する受容体の発現,ステロイドホルモン産生能などの諸性質を獲得しつつ、増殖,分化を繰り返している。すなわち、この細胞は卵の成熟に必要な卵胞内の環境を整えると云う重要な役割を担っている。我々はこれまでに、アクチビンがラット顆粒膜細胞の分化を顕著に促進することを見いだしたのを機に、顆粒膜細胞上のアクチビン受容体の同定,アクチビン結合タンパク質の単離に成功してきた。本課題では、アクチビンの多様な作用を理解するために、そのシグナル伝達調節機構に焦点を当てて研究の展開を図り次のような成果を得た。(1)アクチビン結合タンパク質(ABP)はアクチビンと化学量論的に結合し不活性複合体を形成することにより、アクチビンの様々な作用を抑制した。(2)ABPは、顆粒膜細胞上のプロテオグリカンのヘパラン硫酸残基に特異的に接着した。(3)ブタ卵巣から精製取得したABP標品は少なくとも6種類のアイソホ-ムの混合物であり、それぞれの違いは、糖鎖の有無,C末端領域の欠落の有無にあることを明らかにした。各分子種のアクチビン結合能には殆んど差は認められなかったが、C末端欠落分子種はより高い細胞接着性を示した。(4)卵胞液中では、ABPは3種類のアクチビン(A,AB,B)と複合体を形成して存在していた。ABPーアクチビン複合体を逆相HPLCで精製することにより,アクチビンーBを初めて単離した。(6)アクチビンーBは、いろいろなアッセイ系において、他のアクチビンに比べ極めて弱い活性しか示さなかったが、カエル初期胚での中胚葉誘導活性は他のアクチビン同様、極めて強かった。(7)大量に培養したマウスEC細胞から、初めて、アクチビン受容体タンパク質を単離した。以上,ABPが,アクチビンのシグナル伝達を細胞表面で調節している可能性を示す知見を得た。アクチビンは、脳下垂体からのFSHの分泌促進因子として哺乳動物の卵巣から得られたが、その後、様々に細胞に対する分化誘導能が見いだされて、広く注目されるようになった。我々は先に、ラット卵巣からアクチビン結合蛋白質(ABP)を単離することに成功した。本課題では、ABPのアクチビン作用調節機構を検討した。1.ABPの大量精製法の確立ABPが硫酸多糖に高い親和性を有することを利用は,精製の初期工程にデキストラン硫酸カラムクロマトを導入することにより、効率の良いABP精製法を設定した。本法により,ウシ脳下垂体,ブタ卵巣からABPを精製することに成功した。2.ABPとアクチビンとの不活性複合体の形成ABPは,アクチビンの種々の作用(FSH分泌促進作用,卵巣顆粒膜細胞分化促進作用,赤芽球系細胞分化誘導作用,カエル中胚葉誘導作用など)を化学量論的に抑制した。その際の両者の対応関係はモル比で1:1であった。試験管内で作製した両者の複合体にはアクチビンの作用は全く認められなかった。3.ABPの分子多様性と細胞接着能上記精製法により得た標品は少なくとも5種類のABPの混合物であった。各々の違いは、糖鎮の有無,C末端領域の欠落の有無にあることを知った。

各分子種のアクチビン結合能には違いは認められなかったが,C末端領域欠落分子はより高い細胞接着能を示すことを明らかにした。4.ABPペプチド抗体の作成と組織内分布ABPペプチド抗体を作成しラット組織内分布を検討した結果,卵巣や精巣以外に,卵管,脳下垂体,肝臓,腎臓,脾臓など極めて広範にABPが分布していることを知った。本年度は、アクチビン結合タンパク質の生理的役割の解明とアクチビン受容体の構造解析を重点的に推進して、次のような成果を挙げ得た。(1)アクチビンーBの単離とその性質の検討:アクチビンはサブユニットの組み合わせにより,A,AB及びBの3種類の異性体が存在し得るが、これまで前二者のみが単離され,アクチビンーBは未だ自然界から得られていない。我々は,ブタ卵胞液中では,アクチビンとその結合タンパク質であるホリスタチンとがほぼ等モルづつ結合して複合体を形成して存在していることを見いだした。精製した複合体をさらに逆相HPLCにより分析した結果,複合体は各成分,ホリスタチン及びアクチビンーA,ーABーBに解離してカラムから溶出した。こうして初めて単離されたアクチビンーBの種々の生物活性を測定したところ,FSH分泌促進作用,前赤芽球系細エ分化誘導能,卵巣顆粒膜細胞分化促進能いずれもアクチビンーA及びーABの10ー20%程度の活性しか検出されなかった。しかし,カエル初期胚での中胚葉誘導能は非常に強く、他のアクチビンと同程度であった。これらの結果は、アクチビンーBは初期胚のようなある特定の時期あるいは特定の場所でのみ機能し得ることを示唆している。(2)アクチビン受容体の単離とその性質の検討:これまでに,白血病細胞株からのアクチビン受容体の単離に成功しているが,本年度はさらに高受容体発現株マウスEC細胞Pー19株からの精製を試みた。大量(130l)の培養細胞からアフィニティ-クロマトグラフィ-により約20pmolの受容体タンパクを単離した。本タンパクのN末配列分析の結果,発現ベクタ-を用いるクロ-ニング法により,最近明らかにされたマウス3T3細胞のアクチビン受容体のそれと同一であることが判明した。精製受容体は,アクチビンーA,ーAB,ーBに対して同じ親和性を示したが、構造類縁体のインヒビンやTGFーβとは殆んど反応性を示さなかった。
血中イソフラボン濃度の前立腺癌発症・増殖に与える影響に関する予防疫学的研究

本研究の目的は、血中のイソフラボン濃度と前立腺癌発症リスクの関係について検証するために、症例対照研究と前向きコホート研究が計画された。症例対照研究は、検診の継続受診中に発見された前立腺癌症例を症例群とし、症例群の過去の癌を疑わない時点(PSA値が基準値以下)での年齢とPSA基礎値をマッチさせた非癌症例をコントロール群として抽出し、PSA基礎値測定時の検診受診時の血中イソフラボン濃度を保存血清を用いて測定し、血中のイソフラボン濃度とその後の前立腺癌発症との関連性を検証した。初回検診受診時の臨床的特徴は、PSA基礎値と年齢の中央値は癌症例群とコントロール群ともにそれぞれ2.17ng/ml、70歳で、初診時から最終受診時までの平均経過年数は癌症例群は4.6年、コントロール群は4.4年であった。最終受診時のPSA値(中央値)は癌症例群で5.58ng/ml、コントロール群で2.22ng/mlであった。初回検診受診時の血中Genistein、Daidzein、Equol、Glycitein濃度(ng/ml;平均±S.D.)は癌症例群は131.0±108.2、50.9±51.5、17.9±51.2、3.4±3.5で、コントロール群は194.3±258.7、101.8±113.8、20.3±34.6、7.1±7.2であった。Mann-Whitney U検定における両群間の初回受診時のイソフラポン濃度の有意差はGenistein(p=0.3232)、Daidzein(p=0.0447)、Equol(p=0.3260)、Glycitein(p=0.0487)と有意差を持って、癌症例群よりコントロール群におけるDaidzeinとGlycitein濃度が高かった。Japanese PublicHealth Center (JPHC)studyの結果では、血漿中のGenistein濃度、Equol濃度が高いほど、その後の限局性前立腺癌症の発症リスクが有意に低下することを証明したが、人種差や家族例を超える前立腺癌罹患危険因子であるPSA基礎値を症例群とコントロール群の間で適合させていない点が問題であり、またコントロール群についてJPHCstudyでは臨床的に癌の診断がなされていないことを設定基準にしており、臨床癌へと進行する危険性が高い対象が含まれている可能性があり理想的な研究とはいえないが、本研究では膨大な長期間の転帰が判明しているデータベースから理想的な症例抽出をおこない、DaidzeinとGlyciteinの前立腺癌進展抑制効果が示唆されたことの意義は大きい。本研究は、臨床的な前立腺癌を認めない時期における血中イソフラボン濃度が、その後の前立腺癌発症に影響するか否かを調べるために行う症例対照研究である。研究対象は群馬県における前立腺癌検診を複数回受診し、保存血清の研究への利用について同意が得られた症例の中から、症例群として基礎値が4.0ng/ml以下で、その後の検診にてPSAの上昇を契機に前立腺癌が診断された20症例と、症例群の各症例と初回受診時の年齢(±1歳)とPSA値(±0.2ng/ml)を症例数を1:2(症例群:コントロール群)マッチさせた非前立腺癌症例40例(コントロール群)である。症例群(20例)とコントロール群(40例)において、PSA基礎値が測定された時点の凍結保存血清(-70°C保存)を用い、血中イソフラボンは、ゲニステイン(genistein)、ダイゼイン(daidzein)、グリシスティン(glycitein)、エクオール(equol)の4成分を液体クロマトグラフータンデム型質量分析計(LC/MS/MS)を用いてSRL(Tokyo,Japan)による測定をおこなった。4成分測定値をStudent's t-test(危険率5%)で有意差検定を行ったところ、ゲニステイン、ダイゼイン、エクオールには有意差を認めず(P値はそれぞれ、0.30、0.062、0.83)、グリシスティンにのみ有意差を認めた。(p=0.032)症例群、コントロール群のエクオール産生症例数はそれぞれ9例、22例であり、エクオール非産生群のおける前立腺癌発症のオッズ比は1.49(95% CI:0.50-3.49)であった。がん抑制効果が期待されるエクオールは、両群の測定値における有意差は認めないものの、エクオール非産生群の前立腺癌発症リスクは高いことが分かった。グリシスティン濃度が将来の前立腺癌発症に影響するかは今後の検討が必要である。

最終受診時のPSA値(中央値)は癌症例群で5.58ng/ml、コントロール群で2.22ng/mlであった。初回検診受診時の血中Genistein、Daidzein、Equol、Glycitein濃度(ng/ml;平均±S.D.)は癌症例群は131.0±108.2、50.9±51.5、17.9±51.2、3.4±3.5で、コントロール群は194.3±258.7、101.8±113.8、20.3±34.6、7.1±7.2であった。Mann-Whitney U検定における両群間の初回受診時のイソフラポン濃度の有意差はGenistein(p=0.3232)、Daidzein(p=0.0447)、Equol(p=0.3260)、Glycitein(p=0.0487)と有意差を持って、癌症例群よりコントロール群におけるDaidzeinとGlycitein濃度が高かった。Japanese PublicHealth Center (JPHC)studyの結果では、血漿中のGenistein濃度、Equol濃度が高いほど、その後の限局性前立腺癌症の発症リスクが有意に低下することを証明したが、人種差や家族例を超える前立腺癌罹患危険因子であるPSA基礎値を症例群とコントロール群の間で適合させていない点が問題であり、またコントロール群についてJPHCstudyでは臨床的に癌の診断がなされていないことを設定基準にしており、臨床癌へと進行する危険性が高い対象が含まれている可能性があり理想的な研究とはいえないが、本研究では膨大な長期間の転帰が判明しているデータベースから理想的な症例抽出をおこない、DaidzeinとGlyciteinの前立腺癌進展抑制効果が示唆されたことの意義は大きい。
自律型水中ロボットの構造物観測システムに関する研究

計画では3年度目に研究の集大成として実海域試験をおこなう予定であったが,本年度夏に港湾構造物の自動観測に関するフィージビリティスタディのため,実海域試験をおこなう機会を得ることができた.実海域試験には,船舶使用や多くの人材が必要となることから莫大な費用が伴い,実験の機会を得ることも非常に希であるので,実海域での実験データと知見をできるだけ多く得ることを目標に実験をおこなった.場所は岩手県釜石市釜石港で,世界的に見ても巨大な湾口防波堤があり,湾口の深さは60メートルを超える.この湾口防波堤のケーソン表面と,防波堤工事のための作業基地に仮置きされたケーソン表面を,レーザ測距システムを用いて一定距離と姿勢を保ちながら移動し,ケーソンの画像をTV映像として記録するミッションをおこなった.結果として,流れやうねりの緩やかな作業基地のケーソン観測では,良好に自動観測を遂行できたが,湾口防波堤のケーソン観測では,うねりに対して水中ロボットの推力が非力であり,姿勢制御すらもままならない状況に陥った.自動観測をした映像はモザイキングをおこない,現段階では水平1ラインの広範囲合成画像を得ることができた.実海域試験の成果は,既に国内の学会で発表したほか,海外の学会でも発表する予定となっている.実海域実験で明らかになった課題は,太陽光が差し込む浅海でレーザ測距システムの性能が十分に発揮されない点と,テストベッドの推進力不足である.この結果を受けて,本年度予定していた陸上用のレーザ測距システム製作に関して,ピンポイントのレーザビームを用いるのではなく,シート状のレーザビームを用いて,広範囲にわたる凹凸情報を取得する仕様として上記課題に対処する.現在,陸上および水中で両方使用できるように耐圧容器を設計製作し,このシステムの測距アルゴリズムと水中ロボットの制御システムを調整中である.計画では3年度目に研究の集大成として実海域試験をおこなう予定であったが,本年度夏に港湾構造物の自動観測に関するフィージビリティスタディのため,実海域試験をおこなう機会を得ることができた.実海域試験には,船舶使用や多くの人材が必要となることから莫大な費用が伴い,実験の機会を得ることも非常に希であるので,実海域での実験データと知見をできるだけ多く得ることを目標に実験をおこなった.場所は岩手県釜石市釜石港で,世界的に見ても巨大な湾口防波堤があり,湾口の深さは60メートルを超える.この湾口防波堤のケーソン表面と,防波堤工事のための作業基地に仮置きされたケーソン表面を,レーザ測距システムを用いて一定距離と姿勢を保ちながら移動し,ケーソンの画像をTV映像として記録するミッションをおこなった.結果として,流れやうねりの緩やかな作業基地のケーソン観測では,良好に自動観測を遂行できたが,湾口防波堤のケーソン観測では,うねりに対して水中ロボットの推力が非力であり,姿勢制御すらもままならない状況に陥った.自動観測をした映像はモザイキングをおこない,現段階では水平1ラインの広範囲合成画像を得ることができた.実海域試験の成果は,既に国内の学会で発表したほか,海外の学会でも発表する予定となっている.実海域実験で明らかになった課題は,太陽光が差し込む浅海でレーザ測距システムの性能が十分に発揮されない点と,テストベッドの推進力不足である.この結果を受けて,本年度予定していた陸上用のレーザ測距システム製作に関して,ピンポイントのレーザビームを用いるのではなく,シート状のレーザビームを用いて,広範囲にわたる凹凸情報を取得する仕様として上記課題に対処する.現在,陸上および水中で両方使用できるように耐圧容器を設計製作し,このシステムの測距アルゴリズムと水中ロボットの制御システムを調整中である.
日本人科学研究者向け英語学術論文執筆支援用教材システムの開発

本研究では日本人研究者が英語で執筆する科学論文の中で見られる特徴と、英語母語話者の同一使用域内での表現の特徴とを比較対照するための基礎的データ整備を行い分析を加えた。日本人科学者産出の英文特徴の抽出先として、東北大学の中で世界水準の研究成果を発信し続ける部局である金属材料研究所に焦点を当て、その主要研究分野の材料科学の領域での世界的なジャーナル7種類から、合計563編の論文を慎重に選別した。総単語数は2,307,825で、単語種類数は71,224個にのぼる。海外に発信すべきコンテンツを備えた日本人研究者にとっての有益な英語教材を開発し、学習者としての研究者にとって、自らの英語運用レベルや、到達すべきレベルを客観的に把握し、システムユーザーでもある教授者との双方向性を持った情報共有とを通して、より効率的な教材作成を支援するためのシステム開発を推進した。ユーザー自身による英文データの収集や解析全般を実現する機能をシステムに実装し、それを一方向性のみのe-learning教材としてではなく、対面式の講義や授業の中核となる双方向性を伴ったシステムとして位置付け研究開発を行った。収集した一次データを最大限に活用し、ユーザー(学習者・科学論文執筆者)による定義可能な属性付与を実現するデータベーステーブルの基本設計を完成した。これにより、一方のユーザーとしての教授者側からは、強調を置きたい英語表現個所や構文に対する独自の属性付与を柔軟に保証する事が出来ると同時に、もう一方のユーザーである科学論文執筆能力向上を目指す学習者としての日本人研究者自身も、自らの着目点や疑問点等に関する属性をデータに付与する事が容易になり、双方向性の通信を実現するインターフェイスのもと、より効率的な学習支援を支える教材システムのプロトタイプ(CHAPEL: Corpus Handling and Analysis Package for Electronic Learning)の開発に成功し、実証実験を行った。実証実験後のアンケート調査等を数量的に分析し、次年度の研究推進の指針を得るためのフィードバックとしてそれを位置付けた。今年度のプロトタイプは、TOEFL-ITPの英文データを大量に用いたが、次年度では科学技術系の英語ジャーナルからのデータを取り込むことによって、研究目的に則したより具体的な表現や構文の習得と定着を支援するシステムの開発に向かうこととする。日本人研究者の執筆する科学・学術論文の中で見られる特徴と、英語母語話者の同一使用域内での英語表現の特徴とを比較対照するための基礎的としてのデータ整備を完成させた。日本人科学者産出の英文特徴の抽出先として、主に材料科学(materials sciences)の分野での世界的なジャーナルデータ7種類から、合計563編の論文を慎重に選別した。総単語数は2,307,825で、単語種類数は71224個にのぼる。この論文選別の際には研究補助者の援助を得て、個々の論文の著者が、氏名・所属等からほぼ完全に日本人と認定できるもののみを選択している。これと並行する英語母語話者産出の科学技術論文の典拠先としてはPERC Corpus(http://scn.jkn21.com/percinfo/index_j.html)を活用した。研究期間を通して得られた大きな成果は、(1)日本人研究者の特異な英文表現上の構文選択および伝達動詞選択の傾向の把握、(2)特に特定構文や動詞の過度使用を是正するための自律学習用システム、(3)科学技術論文執筆の前提となる論文読解意味把握能力の育成のための、e-learningシステムの開発と性能評価、が挙げられる。特に(3)に関する研究開発成果は国際学会での研究発表及び論文発表を通して公開した。研究代表者と分担者の研究室間でのVPNシステムによるシームレスな通信環境を確立し、コーパス解析の手法に立脚した分析素材となる英文書の分析を自動化した。この分析には読み易さの度合い(readability)、および語彙的密度(lexical density)等が含まれ、特に日本人むけに改良した読み易さの度合い産出システムに関しては、学会研究発表および学会誌論文発表等をとおして広く学術的意見の交換を行えた。この過程で得られた知見は、研究代表者の担当する大学院の講義で活用された。研究期間初年次にあたる今年度は、世界水準で発信すべき学術コンテンツを持つ日本人科学研究者が英語科学論文を正確に量産するために効果的な教材を作成するために必要な汎用的コーパス解析システムの全体像を各方面からの検討を加えることによって慎重に設計した。システムの中核を成すRDBMS(Relational Database Managament System)の基本的な構築を、研究分担者との連携により概ね完成させ、その成果を2011年9月1日-3日に英国Bristol市のUniversitu of West of Englandで開催された第44回英国応用言語学会での研究発表に繋げた。また国内学会では情報処理学会での研究発表を行った。

平成23年8月7日には、立命館大学田中省作准教授、静岡大学宮崎佳典准教授、京都大学大学院博士課程鈴木大介氏を仙台市泉区の東北学院大学泉キャンパスに招待し、(1)コーパス処理全般に係る著作権処理の問題、(2)日本人ユーザーの入力英文のベクトル解析に準拠した評価と修正候補英文の専用コーパスからの抽出と提示、等に係る研究会を実施した。これにより、既存大規模コーパスの処理とは別に、個々の研究者が独自に開発するコーパス構築に関わる著作権処理の過程を明らかにすることができた。また、日本人ユーザーの入力英文との類似性を算出したうえで、準拠すべき母語話者産出の英文をモデルとして提示するというシステムを、語彙とその連語(collocation)、連辞(colligation)のレベルで精密化できれば、特定英語ジャーナルという限定された言語使用域(register)なり、学術共同体(academic community)に最も受容されやすい表現や文体を伴ったモデル英文を検索して教材として提供するというシステムの目的に合致するということも明らかになった。教材開発支援システムの中核となるデータベースのテーブル設計と、実際のデータの入出力に関する基本的な設計を終えた。その後プロトタイプ開発に成功し、実証実験を1月初旬に実施した。この事から、研究目的の達成に向けて、おおむね順調に研究は進展していると自己評価できる。プロトタイプの実証実験の結果から、双方向性を伴った情報共有によるe-learningシステムの果たす役割が明確に把握された。ただし、今年度に用いた英文の一次データには、著作権・使用許諾の問題から、申請者が責任を持って利用できる範囲と種類の英文資源が利用されており、英語の各種科学技術系ジャーナルからのものは十分に含まれておらず、平成25年度前半には電子ジャーナル等を利用した科学論文典拠のデータ収集を推進しなけらばならない。また、科学論文を執筆する際に、日本人研究者が抱く関心や疑問点を様々なwebサイト等を通して収集し体系化する必要がある。最終年度におけるシステムの公開方法に関しては、著作権等の問題に慎重に対応しなければならず、若干の遅れや規模の縮小が予想される。平成25年度初めには、所属大学図書館で利用できる電子ジャーナルから、大量の一次データの収集を開始する。また、これと並行して科学技術系論文執筆に不可欠な英語語彙能力育成のための教材を開発し、年度後半にはweb上に公開する。平成24年度に完成したプロトタイプであるCHAPELを中心に、ユーザーによるデータ取り込みとその解析、および独自定義の属性付与の階層性や属性そのもののきめ細かさに対する考察を加える。これによって、学術分野別の使用域特性が抽出できれば、英語コーパス研究の分野に対する大きな貢献となるので、分析の結果等を学会等で発表する。日本人科学研究者が個人のWebサイトやblogで公開している、英文論文執筆に関わる情報や、共有のためのヒント集のようなものを数多く閲覧し、英語教員の視線からとともに、理系の研究者たちが英文構造や表現に対して切実に抱く基本的で素朴な疑問や躓きを可能な限り抽出して、教材システムのコンテンツ充実に努める必要がある。
メチルフェニデートはなぜ注意欠陥多動障害に有効か

注意欠陥多動障害(ADHD)の病態にはドーパミン(DA)情報伝達の異常が関与していると考えられており、メチルフェニデート(MPH)などの中枢刺激薬が有効な治療薬である。しかし、ADHD病態改善に対するMPHの作用機序は明らかではない。線条体ニューロンに選択的に発現するDARPP-32(dopamine-and cAMP-regulated phosphoprotein, Mr 32 kDa)はPKAによりThr34残基がリン酸化されるとプロテインフォスファターゼ1(PP-1)活性抑制蛋白として作用し、DAの効率的情報伝達に必須である。本研究では、幼若(14-15生日、21-22生日)および成熟(6-8週齢)マウスより作製した線条体スライスを用いて、MPHなどの中枢刺激薬によるDARPP-32(Thr34残基)リン酸化調節機構を検討した。成熟マウスではMPHは濃度依存性(K_<0.5> 10 μM)にDARPP-32リン酸化を促進した。D1受容体拮抗薬SCH23390はMPHによるDARPP-32リン酸化を抑制した。幼若マウスではMPHによるDARPP-32リン酸化上昇は認めなかった。しかし、D1受容体刺激薬SKF81297は幼若マウスで成熟マウスと同等にDARPP-32リン酸化を促進した。コカインとメタンフェタミンは成熟マウスでDARPP-32リン酸化を促進した。幼若マウスでは、コカインによるリン酸化上昇は認めなかったが、メタンフェタミンは成熟マウスと同等にリン酸化を促進した。以上より、成熟マウスでは、MPHはDA再取り込み抑制によりDA作用を増強し、D1受容体/PKA/DARPP-32/PP-1情報伝達系を活性化することが明らかになった。しかし、幼若マウスではMPHによるDA作用の増強は認められなかった。幼若マウスにおける線条体ニューロンD1受容体情報伝達系、および、メタンフェタミンのDAトランスポーターを介した作用は成熟マウスと同等に機能しており、DA神経終末でのDA放出機構の未熟性が示唆された(現在、投稿準備中である)。線条体では神経細胞(中型有棘神経細胞;medium spiny neuron)の細胞質内において、ドーパミンにより制御される蛋白DARPP-32(dopamine-and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32 kDa)が選択的に発現している。DARPP-32は、cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)によりThr34残基がリン酸化されるとプロテインフォスファターゼ1(PP-1)活性抑制蛋白として、神経型サイクリンキナーゼ(Cdk5)によってThr75残基がリン酸化されるとPKA活性抑制蛋白として作用する。今回、線条体神経細胞に発現するDARPP-32のリン酸化を指標として、MPH作用を解析した。研究方法は、DARPP-32リン酸化調節機構をマウス線条体スライスをウェスタンブロッティング法で標的とする蛋白をECL(Enzyme-linked Chemiluminescence)にて検出し、化学発光をX線フィルム上に記録しデンシトメトリーを用い定量化し解析した。その結果、MPHは、神経終末からのドーパミン再取り込みの抑制によりドーパミン作用を増強させ、ドーパミンD1受容体作用の増強により活動性が上昇することが判明したが、この結果はADHDにおけるMPHの治療効果と逆の作用と考えられた。今後の計画としては、ドーパミン情報伝達系の発達過程である幼若マウスの線条体スライスを用いてMPHによるDARPP-32リン酸化調節を解析し、成熟マウスから得られた知見と比較し発達過程でのドーパミン情報伝達系・MPH作用の特徴を明らかにする。

以上より、成熟マウスでは、MPHはDA再取り込み抑制によりDA作用を増強し、D1受容体/PKA/DARPP-32/PP-1情報伝達系を活性化することが明らかになった。しかし、幼若マウスではMPHによるDA作用の増強は認められなかった。幼若マウスにおける線条体ニューロンD1受容体情報伝達系、および、メタンフェタミンのDAトランスポーターを介した作用は成熟マウスと同等に機能しており、DA神経終末でのDA放出機構の未熟性が示唆された(現在、投稿準備中である)。
化学計算に基づく新規発がんプロモーターの探索

本研究はフォルボールエステル類,テレオシジン類の同一のレセプターに作用する発癌プロモーターの構造から化学計算の結果を考慮しつつ合成化学的手法をもって,活性発現に必要な共通構造を明らかにし,さらに新規骨格のプロモーター,特異的な細胞内情報伝達系作用物質を見出すことを目的としている。第一に共通構造を見い出す有力な情報を得,合わせて親規骨格の活性物質を見い出すことを目的としてテレオシジン類の骨格変換を行った。テレオシジンは溶液中で2つの立体配座twist型,sofa型で存在している。これが共通構造を見出す上で障害となっていた。そこで,テレオシジンのインドールをベンゼン環に単純化した上で,8,9,10員環と環状ラクタムの大きさを変えることによりアミドのシス-トランスの活性化エネルギーを大きくし,配座の固定を試みた。これらの化合物の合成,立体配座解析により,8員環でtwist,9員環以上でsofa型の立体配座で存在することを明らかにするとともに,疎水性部分を付加した8員環のラクタム(benzolactam-V8-310)でテレオシジンに近い活性,9員環ラクタム(benzolactam-V9-310)で活性が無いことを明らかにすることにより,テレオシジンの活性立体配座がtwist型に近いことを明確にし,合わせて新規骨格の活性物質を得る目的も達成された。第二に,フォルボールエステルの極性官能基をステロイド骨格上に配置した化合物のデザイン,合成を別の骨格の活性物質の発見を目的として試みた。その一つの酸化型コレステロールがフォルボールエステルに特異的に結合するタンパク(CN-TPBP)に強い親和性をもつことを発見した。この結果は酸化型コレステロールの新しい作用発見につながるものと考えている。発癌プロモーターであるテレオシジン類は溶液中で2つの立体配座が安定に存在し,その相互変換は速い。したがって,フォルボールエステル類等,他の同じレセプターに結合するプロモーターとの構造上の共通性を明らかにする上で大きな問題であった。その最後的な解決策として,2つの配座にそれぞれ固定した化合物を合成し,生物活性を評価することを1つの目的とした。テレオシジン類の2つの立体配座はそれぞれ9員環上のアミド結合がシスとトランスに配置されている。このシス-トランスの変換を制限するため,以前の本研究者の構進活性相関の結果も踏まえ,テレオシジンのインドール環をベンゼン環に単純化した8員環9員環,10員環ラクタムを有する類緑体(ベンゾラクタム類)を合成した。立体配座は8員環でシス-プミド結合,9員環でトランスーアミド結合を有するテレオシジンの2つの配座に対応する構造にそれぞれ固定されたことを核磁気共鳴スペクトルにより確認した。活性は8員環を有するベンゾラクタムのみがテレオシジン類に近い強さを示し,テレオシジのTWIST型の立体構造が,活性に寄与していることを証明した。一方,フォルボールエステル類のプローターの置換基をステロイド骨格上に適正に配置することによってデザインした酸化型のコレステロール誘導体は合成が完了し,その生物活性の検討を行った。プロモーターの作用発現の一次的なレセプターとされているプロテインキナーゼCに対する結合は無かったが,TPAタイプのプロモーターが共通に結合するCN-TPBPと呼ばれる蛋白に対する特異的な結合を示すステロイドを発見した。この結果は,内在性のプロモーターの発見あるいは新しい生理活性ステロイドの発見にと続がる一歩となりうる。本研究はフォルボールエステル類、テレオシジン類の同一レセプターに作用する発癌プロモーターの構造から化学計算の結果を考慮しつつ、合成化学的手法をもって、活性発現に必要な共通構造性を明らかにし、さらに新規骨格のプロモーター、特異的な細胞内情報伝達系作用物質を見出すことを目的としている。

第一にテレオシジンの活性立体配座の決定を試みた。テレオシジンは溶液中で、2つの立体配座twist型,sofa型で存在し、これがプロモーターの共通構造を発見するうえで障害となっていた。平成4年度に、テレオシジンのインドール骨格をベンゼン環に単純化した8員環、9員環、10員環のラクタム類を合成、立体配座解析を行ない、8員環ではtwist型、9、10員環ではsofa型で存在していることを明らかにしたが、これらの化合物が疎水性部分を欠損していたために、明確な生物活性の結果が得られなかった。本年度において研究計画調書のとうり、ベンゼン環部に炭素数10の直鎖アルキル基を導入した8員環(benzolactam-V8-310)、9員環ラクタム(benzolactam-V9-310)を合成し、活性試験を行なった。。8員環化合物にテレオシジンに近い活性を見出し、9員環は活性が無かった。この結果から、テレオシジンの活性立体配座はtwist型に近いことが初めて明らかになった。また、benzolactam-V8-310は新しい骨格の活性化合物であり、プロモーターおよび細胞内情報伝達系の研究に役立つものと考えられる。また、フォルボールエステルの極性官能基をステロイド骨格上に配置した化合物のデザイン、合成を行ない、その一つ酸化コレステロールがフォルボールエステルが特異的に結合するタンパク(CN-TPBP)に強い親和性をもつことを明らかにした。この結果は酸化型コレステロールの新しい作用発見に繋がるものと考えている。