hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
浸透性吸水防止材の基本性能の把握に関する研究

本研究においては,特に表面改質材の種類や塗布施工の方法がコンクリートの塩分浸透性に及ぼす影響を検討することを目的とし,電気泳動法を用いて統一した条件下での比較により最適な施工方法について考察した。その結果,以下のことが明らかになった。(1)表面改質材をコンクリート表面に塗布することで,コンクリート中の塩分浸透性が大きく改善される。現在様々な表面改質材が市販されているが,本研究範囲内では表面改質材の種類による有意な差は認められなかった。(2)表面改質材の塗布回数を1,2,3層としたところ,複数層塗布した場合にはコンクリート中での撥水層厚が大きくなった。さらに,電気泳動試験による塩分浸透性の結果も複数層塗布した場合において実効拡散係数が小さくなった。これらのことから,表面改質材の多量塗布はコンクリートの塩分浸透抑制に効果的であると考えられる。(3)表面改質材を塗布するべースであるコンクリート表面の含水率を0,50,100%と変化させたところ,含水率0%,50%での撥水層厚が大きく,含水率100%での撥水層厚が小さかった。撥水層厚によりコンクリートの塩分浸透性が左右されることを鑑みると,表面改質材の塗布は,コンクリート表面が乾燥している状態で行うことが望ましいと考えられる。(4)表面改質材中のシラン含有率を45%,62.5%,80%と変化させ,モルタル中の撥水層厚を測定したところ,シラン含有率が大きいほど撥水層厚も厚くなった。撥水層厚が大きいほど塩分浸透性が抑制されることから,シラン含有率が大きい方が効率的であると考えられる。浸透性吸水防止材は,施工が容易でコンクリートの外観を変化させることなく,吸水防止性と通気性を両立させることによりコンクリートの耐久性を改善するものである。しかしながら,その効果については一様でなく,材料の種類や成分,施工方法,施工箇所,施工時期,コンクリートの状態等により効果が不安定であることが報告されている。これらのことから本研究においては,浸透性吸水防止材の基本性能を把握することを目的とし,(1)浸透性吸水防止材の種類がコンクリートの実効拡散係数に及ぼす影響,(2)浸透性吸水防止材中のシラン含有率が塗布コンクリートの実効拡散係数に及ぼす影響,(3)浸透性吸水防止材の塗布によるコンクリート中の擾水層厚が実効拡散係数に及ぼす影響について,電気泳動法により実験的検討を行った。その結果,浸透性吸水防止材をコンクリート表面に塗布することでコンクリート中への塩分浸透性が大きく改善されるが,市販されている浸透吸水防止材の種類の違いによる有意な差は認められなかった。ただし,メーカーにより標準塗布量が設けられており,その量によりコンクリート中での機水層厚が異なる傾向を示すため,その影響により実効拡散係数が左右される結果となった。また,浸透性吸水防止材の主成分であるシラン含有率を増加することにより実効拡散係数は小さくなる傾向を示したが,これはシラン含有率によりコンクリート中の擾水層厚が変化することが原因であると考えられた。以上のことから,コンクリートの実効拡散係数は,浸透性吸水防止材の塗布により作成された擾水層厚に影響され,擾水層厚が大きいほど実効拡散係数は小さくなることが本研究においては,特に表面改質材の種類や塗布施工の方法がコンクリートの塩分浸透性に及ぼす影響を検討することを目的とし,電気泳動法を用いて統一した条件下での比較により最適な施工方法について考察した。

現在様々な表面改質材が市販されているが,本研究範囲内では表面改質材の種類による有意な差は認められなかった。(2)表面改質材の塗布回数を1,2,3層としたところ,複数層塗布した場合にはコンクリート中での撥水層厚が大きくなった。さらに,電気泳動試験による塩分浸透性の結果も複数層塗布した場合において実効拡散係数が小さくなった。これらのことから,表面改質材の多量塗布はコンクリートの塩分浸透抑制に効果的であると考えられる。(3)表面改質材を塗布するベースであるコンクリート表面の含水率を0,50,100%と変化させたところ,含水率0%,50%での撥水層厚が大きく,含水率100%での撥水層厚が小さかった。撥水層厚によりコンクリートの塩分浸透性が左右されることを鑑みると,表面改質材の塗布は,コンクリート表面が乾燥している状態で行うことが望ましいと考えられる。(4)表面改質材中のシラン含有率を45%,62.5%,80%と変化させ,モルタル中の撥水層厚を測定したところ,シラン含有率が大きいほど撥水層厚も厚くなった。撥水層厚が大きいほど塩分浸透性が抑制されることから,シラン含有率が大きい方が効果的であると考えられる。
音楽の作曲・演奏・信号の数理モデルを融合する音楽音響情報処理の研究

音楽の作曲・演奏・信号の複数階層の数理モデルの開拓と融合を進めた。A:信号階層では、音楽信号の多重音解析、楽譜整合、信号の変換・加工・分離、音源方向推定、音楽の電子透かしなど、B:演奏階層では、演奏解析、リズム推定、自動演奏、自動伴奏、運指決定、自動ジャズセッションなど、C:楽譜階層では音楽作曲理論の数理的定式化を軸にした和声認識、楽曲構造解析、歌詞からの自動作曲、自動作詞、自動編曲、画像からの自動作曲など、D:共通基盤ではこれらを支える数理モデル化や機械学習・最適化、多階層ニューラルネットなどを階層間に渡る問題に重点をおいて、研究・開発を行った。本研究は、音楽の作曲・演奏・信号の3階層間の融合処理を目指すもので、以下のような多彩な成果を得た。ユーザーによる誤りや任意の弾き直し・弾き飛ばしを含む演奏に追従できる自動伴奏技術の研究・開発を行い、遷移確率行列がベクトルの外積で表されるHMM(隠れマルコフモデル)を考案して計算量を大幅に低減するアルゴリズムを導出し、楽譜追跡の精度が向上することも確認した。緩く同期した多声部の演奏を記述する出力合流HMMを考案し、楽譜追跡、ピアノ運指の自動決定とリズム採譜の精度向上を検証・確認した。ステレオ音楽音響信号に対し、時間周波数領域の位相差に情報を埋め込む頑健な音響電子透かしの手法を開発し、国際会議IIHMSPで優秀論文賞を受賞した。HMMによるギターのための自動編曲では自動的に最適な移調を決定する方法を提案した。ギター演奏者の左手と右手を独立にモデリングすることにより、ギターに特徴的な演奏法を利用する自動編曲が可能となることを示した。伴奏システムにおいて、人間の演奏リハーサルによりテンポ変化プランを推定し、テンポ変化の大きな楽曲に対し、追従性能を向上した。名演奏の合奏の録音データを詳細解析し、間同士の合奏で互いに聴き合いテンポ制御するモデルを実現し、録音された合奏データでの評価実験で予測精度の向上を確認した。ギターを計算機への入力手段として活用するために、ギター演奏をMIDI化する技術の開発に取り組んだ。メロディをより抽象度の高い表現に変換し、専門知識なしにメロディの操作・加工を実現する方法を検討した。ジェスチャ認識による自動譜めくり、MIDIファイルからのタテ線譜の生成、画像の印象にマッチした楽曲の半自動生成、ARによる古墳の遺物と発掘調査状況の表示と雰囲気にあった楽曲生成、既存の楽曲のダンス調への変換、自動伴奏の表現力向上のためのMIDI演奏表情付けの基礎検討を行った。おおむね順調と言ってよいであろう。研究成果も順調に生み出せているし、分担者同士の交流や協力関係もうまく行っている。予期しなかったことは、年度途中で研究員が辞職したことであるが、直ちに後任の募集を行って決定した。本研究は、統計的信号処理、音楽理論の確率モデル化、演奏の数理を中心に据えて音楽信号及び情報の解析・認識・加工・生成に関する広汎な技術を開発するもので、申請者らとともに研究員や十数名の大学院生・学部生が取り組んだ。課題は3つのレベルの解析と生成(かなり跨る)と共通基盤であり、A)信号階層:楽音を扱うレベルで、【解析】多チャネル音楽信号分離、多重音解析、音響リズム認識、信号加工(修復)・分離・認識、自動採譜、信号の楽譜追跡/【生成】歌声合成など、B)演奏階層:【解析】演奏解析、演奏リズム解析/【生成】自動演奏、自動伴奏など、C)楽譜階層:【解析】構造解析、和声解析/【生成】自動作曲、自動編曲、四声体生成など、D)共通基盤:ニューラルネット(MLPとボルツマンマシン)学習の高速化、DNN(Deep ural Network)の上記問題への適用、補助関数法による学習、新しいモデル型(合流型HMMなど)など階層に渡って研究を行った。中でも、高精度な楽譜追跡と自動伴奏システム実現に関して、今までもテンポ変動・弾き間違い・曲中のジャンプなどをHMMでモデル化し、Viterbi尤度最大基準で楽譜を追跡する研究を行ってきたが、さらに装飾音符の演奏や簡単なアレンジを含む演奏にも追従可能な楽譜追跡を実現した。また、隠れマルコフモデルによってピアノ曲をギターに自動編曲する理論を創始し、隠れマルコフモデルの復号問題として、異楽器間の自動編曲のアルゴリズムを開発した。ギター演奏において、良い音色で演奏する運指を自動決定する研究では、開放弦を用いない運指、あるいは弦間の移動が少ない運指などを自動決定するアルゴリズムを開発した。自動採譜に関しては、2次元文脈自由文法に基づいて、人が演奏したMIDIデータから楽譜を推定する理論を打ち立て、それを実現する2次元のLRパーサを開発した。多岐に渡る研究項目を、代表者と分担研究者6名と連携研究者3名で実施している。申請時の計画予算額に対して、実際に交付された予算額は約7割であったために、いくつかの計画項目は取りやめたり変更をしているが、全体としては順調に成果が生まれている。課題は3つのレベルの解析と生成(かなり跨る)と共通基盤であり、A)信号階層:楽音を扱うレベルで、【解析】多チャネル音楽信号分離、多重音解析、音響リズム認識、信号加工(修復)・分離・認識、自動採譜、信号の楽譜追跡/【生成】歌声合成など、B)演奏階層:

【解析】演奏解析、演奏リズム解析/【生成】自動演奏、自動伴奏など、C)楽譜階層:【解析】構造解析、和声解析/【生成】自動作曲、自動編曲、四声体生成など、D)共通基盤:ニューラルネット(MLPとボルツマンマシン)学習の高速化、DNN(Deep ural Network)の上記問題への適用、補助関数法による学習、新しいモデル型(合流型HMMなど)など階層に渡って研究を行った。中でも、自動伴奏の研究進展が著しく、ジャズセッションを観測空間内の複数のベクトル軌跡の絡み合いとして数理モデル化し、統計学習可能なシステムを実現し、オフラインではあるものの、ピアノ演奏からベースとドラムスのパートを自動生成するシステムを実現した。また、隠れマルコフモデルに基づくギターの自動運指決定においてminimax規準によるViterbiアルゴリズムを発案し、最も難しい箇所が最も易しくなるような運指を自動導出することができた。歌声合成においては、従来の音声合成フィルタに換えて、パワースペクトルを生成し位相復元を行うことにより波形に変換する方法を発案して、従来より高い音声品質を得た。自動作曲においては、ユーザが与えた数個のキーワードから歌詞を自動生成する技術を開発した。また、歌詞から最適に近い自動作曲条件を自動セ選ぶ手法を開発した。音楽の作曲・演奏・信号の複数階層の数理モデルの開拓と融合を進めた。A:信号階層では、音楽信号の多重音解析、楽譜整合、信号の変換・加工・分離、音源方向推定、音楽の電子透かしなど、B:演奏階層では、演奏解析、リズム推定、自動演奏、自動伴奏、運指決定、自動ジャズセッションなど、C:楽譜階層では音楽作曲理論の数理的定式化を軸にした和声認識、楽曲構造解析、歌詞からの自動作曲、自動作詞、自動編曲、画像からの自動作曲など、D:共通基盤ではこれらを支える数理モデル化や機械学習・最適化、多階層ニューラルネットなどを階層間に渡る問題に重点をおいて、研究・開発を行った。後任の研究員については、特性に合わせて研究テーマを少し別方向から開始し、やがて計画通りの路線に繋げる方針を取った。また、それに伴って、予算の一部を翌年度に繰り越した。今後も計画内容を、研究の進展に合わせて柔軟に実施して行く。28年度が最終年度であるため、記入しない。音楽信号情報処理自動作曲システムOrpheusのwebページである。「自動作曲」検索の第一位、また「オルフェウス」検索の第一位に現れる。アクセス回数は数百万ビューに及んだ。自動作曲システムOrpheusのwebページである。「自動作曲」あるいは「オルフェウス」で検索すると、1位に表示される。数十万曲の作曲、数百万ビューの閲覧があった。
哺乳動物前後軸形成の分子機構

1.マウスの前後軸回転がWnt/β-cateninシグナルにより制御されていることを示した。Otx2変異マウスで見られる軸回転異常はβ-cateninシグナルの抑制不全に起因していることをβ-cateninの活性を観察すること等で明らかにした。更に、Otx2標的遺伝子であるDkk1の発現を詳細に解析することから、このWnt拮抗因子が臓側内胚葉の前方移動の誘因分子となっていることが示唆された。2.硬骨魚類において哺乳動物の前方臓側内胚葉がどの組織に対応するのかを解明するため、フグOtx2遺伝子の前方臓側内胚葉特異的なエンハンサーがゼブラフィシュにおいてどのような発現活性を持つか解析した。結果、この制御領域は硬骨魚においては前方中内胚葉の発現を支配していた。3.Otx2遺伝子の前方臓側内胚葉における発現調節領域を解析した結果、Fork headファミリーの転写因子の結合部位が発現に必須であることが明らかになった。4.内在性のWntシグナル経路が実際に終脳の領域化に関わるかについて検討を行った。結果、Wntシグナル伝達に関わる因子のうち、シグナルを負に制御する因子、あるいは変異分子の強制発現実験によって、内在性のWntシグナルが終脳の初期の領域化に重要であるとの結果を得た。さらに、内在WntとしてWnt8b、Wnt1を候補因子と考え、siRNAによるノックダウン実験を行うための材料、実験条件等の準備を行った。5.Ssdep1変異マウスを用いて脊索前板と頭部の形成機構を解析した。Ssdp1は頭部形成においてLim1、Ldb1と遺伝的相互作用を示し、Lim1-Ldb1-Ssdp1複合体が脊索前板を形成することが示唆された。Ssdp1変異胚では前頭部マーカーの消失以前に、頭部欠失を説明しうる細胞死・増殖の変化は見られず、脊索前板の主たる機能は、前頭部の遺伝子発現の維持と考えられた。1,neo薬剤耐性遺伝子をOtx2遺伝子の第一イントロンに挿入することで、mRNA量が野生型に比べ顕著に低下したhypomorphic遺伝子座を作成した。実際、Otx2のhypomorph遺伝子座とnull遺伝子座とをもつ変異マウスでは顕著な前脳形成不全を示した。分子マーカーを用いた解析から、前方神経上皮の構造は一時的には発生するが、その後の前脳への特異化が正常に進行しないことが示された。さらに、実験発生学的手法である共培養実験を用いて解析した結果、Otx2遺伝子が前方神経上皮において前方神経稜からの誘導シグナルに反応するのに必須な遺伝子であることが明らかになった。2,Otx2ヘテロ変異マウスはC57BL/6の遺伝的な背景でotocephalyと呼ばれる顔面頭蓋奇形を発症する。そこでどの量的遺伝子座(Quantitative trait locus)がOtx2と相互作用して顔面頭蓋奇形を発症させるのか、遺伝学的な手法を用いて解析した。多型マーカーを用いて染色体全体を検索した結果、第2番、10番、18番染色体上に5つの修飾遺伝子座が局在していることを明らかにした。これらの遺伝子座はヒトでの同様な疾患(単脳胞症や無顎症など)の原因遺伝子の候補となっていることが強く示唆される。3,神経上皮は、誘導シグナル(Fgf8など)に対し、前後軸に沿って異なる応答性を持つことが知られている。今回、ニワトリ胚の過剰発現系を用いて、Six3及びIrx3が神経上皮の応答性にどのような役割を果たしているかを解析した。結果、Six3は終脳領域の応答性をIrx3は中脳領域の応答性を規定していることが明らかになった。さらに、Six3とIrx3は相互に抑制的に働くことでZona Limitansの境界形成に関与していることが示唆された。1)頭部形成過程においてOtx2遺伝子と遺伝的に相互作用する遺伝子座の同定に成功した。0tx2ヘテロ変異マウスはB6マウスの遺伝的背景で顔面頭蓋奇形を発症するが、CBAマウスの遺伝的背景では発症しない。この種間の表現型の違いを利用し、顔面頭蓋奇形を発症させる修飾遺伝子座を検索した結果、2番と18番染色体上に修飾遺伝子座が存在していた。2)マウスの前後軸回転がWntシグナルにより制御されていることを示した。軸回転異常を示すOtx2変異マウスなどでWntブロッカーである、mdkk-1遺伝子の発現が失われていた。そこで、Otx2遺伝子座にmddk-1をノックインしたマウスを作成したところ、Otx2変異胚で見られた軸回転の異常が回復していることを見いだした。3)前方臓側内胚葉形成の分子機構を解明するため、マウス以外の、ヒト、ニワトリ、フグのOtx2遺伝子の前方臓側内胚葉特異的な発現調節領域を特定をした。これらの制御領域を比較し、欠失変異体や塩基置換変異体を持つtransgenic miceを作製することで、特異的な発現に必要なコアな塩基配列を決定した。4)ニワトリ胚の過剰発現系を用いることで、Six3とWntシグナルは相互に抑制的に働くことを明らかにした。つまり、分泌性因子によるWntシグナルの遮断によって予定頭部領域にSix3が発現し、その後、Six3がWntシグナルを抑制し、2重にWntシグナルが遮断されことで、頭部前方が形成される。

5)視床神経核の特異性を規定する転写因子Sox14、Gbx2の発現制御機構を解析した。Gli1は高濃度Shhリガンド存在下でSox14を誘導し、Gli2はShhの高濃度、低濃度にかかわらずGbx2を誘導した。従って、Gli1、Gli2の発現パターンにShhの濃度勾配が重なることで、視床原基内の特定の位置にSox14、Gbx2を発現する神経細胞が産み出された。1,脊椎動物の中で最もゲノムサイズの小さいフグのゲノム領域を用いてOtx2遺伝子の発現調節機構を明らかにした。頭部形成過程においてフグOtx2遺伝子座70kbに渡ってエンハンサーを7カ所、非翻訳領域に同定した。また、同じ硬骨魚であるゼブラフィッシュにおいても保存されて機能することを見いだした。2、マウスの前後軸回転がWntシグナルにより制御されていることを示した。Otx2変異マウスで見られる軸回転異常は,Wntブロッカーである、mdkk-1遺伝子を導入することで回復した。また、Otx2遺伝子はmddk-1の遺伝子発現に直接正に関与していることをトランスジェニックマウスを作製することで明らかにした。3、昨年度までにトランスジェニックマウスにおいて、フグOtx2遺伝子の前方臓側内胚葉特異的な発現を支配しているエンハンサーを同定していた。この制御領域を用いて、硬骨魚類において哺乳動物の前方臓側内胚葉がどのような組織に対応しているのかを明らかにするために、トランスジェニックゼブラフィシュを作成した。4、Wntシグナル経路が終脳の領域化に果たす役割について、ニワトリ胚の強制発現実験系で検討を行った。その結果、Wntシグナルが終脳背側部を規定し、腹側部を抑制することが明らかとなり、またこの作用は、従来終脳の部域化を制御するとされたソニックヘジホッグの作用に先立って終脳原基をパターン化していると考えられた。5、前頭部を欠失する突然変異マウスheadshrinkerはSsdp1の発現低下が原因であることを見出した。またSsdp1はLim1-Ldb1-Ssdp1複合体の転写活性化能をつかさどるコアクチベーターとして、頭部オーガナイザーの1つである脊索前板の形成を制御し、前頭部の維持に関わっていることが示唆された。1.マウスの前後軸回転がWnt/β-cateninシグナルにより制御されていることを示した。Otx2変異マウスで見られる軸回転異常はβ-cateninシグナルの抑制不全に起因していることをβ-cateninの活性を観察すること等で明らかにした。更に、Otx2標的遺伝子であるDkk1の発現を詳細に解析することから、このWnt拮抗因子が臓側内胚葉の前方移動の誘因分子となっていることが示唆された。2.硬骨魚類において哺乳動物の前方臓側内胚葉がどの組織に対応するのかを解明するため、フグOtx2遺伝子の前方臓側内胚葉特異的なエンハンサーがゼブラフィシュにおいてどのような発現活性を持つか解析した。結果、この制御領域は硬骨魚においては前方中内胚葉の発現を支配していた。3.Otx2遺伝子の前方臓側内胚葉における発現調節領域を解析した結果、Fork headファミリーの転写因子の結合部位が発現に必須であることが明らかになった。4.内在性のWntシグナル経路が実際に終脳の領域化に関わるかについて検討を行った。結果、Wntシグナル伝達に関わる因子のうち、シグナルを負に制御する因子、あるいは変異分子の強制発現実験によって、内在性のWntシグナルが終脳の初期の領域化に重要であるとの結果を得た。
分子クラスターの運動制御・分光・画像観測による分子間相互作用ダイナミクスの研究

今年度の研究では、広帯域のパルス光を用いた運動制御法と、先端的分光法、そして独自の画像観測技術を開発・利用することで、分子のさまざまなダイナミクス観測を行った。1.新規光電子・光イオン断層イメージング法の開発分子の光イオン化で生じる光電子やイオンの空間分布を測定する荷電粒子イメージング法はダイナミクス研究の強力な手法の一つである。しかし、既存のイメージング法では、レーザーや検出器の配置が制限され、観測困難な現象の存在が指摘されてきた。本研究では、光電子や光イオンの3次元的空間分布のうち、レーザーの偏光面内のみの断層像を直接撮像する新規イメージング装置を開発、設計し、さらにテストマシンによる試行実験を経て分子や分子クラスターのダイナミクス研究に最適化したものを新規に製作した。開発した装置によって、分子運動を支配する波動関数(の2乗)を直接的に可視化することが可能となり、分子ダイナミクスを量子性・波動性を含めて理解するための新ツールたりえるものになったと考えている。2.新規振動回転イメージング分光法の開発と分子クラスターに対する応用本研究で開発したイメージング装置を用いて、分子クラスターの分子間振動、回転ダイナミクスの実時間追跡を行った。観測された画像の時間変化から、分子間振動に帰属されるピコ秒オーダーの周期と、回転運動に帰属されるナノ秒オーダーの周期が得られた。両者の逆数から、分子クラスターの分子間振動数(相互作用ダイナミクス)や回転定数(分子構造)が求められる。さらに、本手法を多重パルス照射に基づく振動コヒーレント制御と組み合わせることで、複数の分子間振動をモード選択的に観測し、ダイナミクスの詳細に迫ることを可能にした。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、分子システムが分子間振動モードの励起で構造を大きく変えるダイナミクスを、分子レベルかつ実時間で追跡すること、そしてその観測から多次元多極小ポテンシャルにおける分子の動的構造の分子論的描像を築くことを目的としている。研究1年目である今年度の研究では、分子クラスターの構造とダイナミクスを追跡するための新しい時間分解画像観測のアプローチを考案し、そのための装置設計と最適化を行った。具体的な対象として、これまでに構造研究が皆無だった窒素クラスターをとりあげ、フェムト秒インパルシブラマン散乱過程による低振動モードの選択的励起、および誘起した振動ダイナミクスの実時間画像観測をおこなった。通常の飛行時間測定では強い背景信号に埋もれてしまうクラスター由来の微弱な信号を、画像上の空間を選択することで効率的に観測することに成功した。観測した画像の時間変化から、約1030フェムト秒周期の振動構造が得られた。分子間相互作用ダイナミクスを研究する上で、分子間振動数という、最も直接的な情報を初めて抽出することに成功したといえる。現在、励起光やプローブ光の偏光や強度を変えた測定によって、どのような分子間振動であるか帰属することや、多段階に振動を励起することで相互作用組み換えダイナミクスの観測につなげることを目指している。また、振動モード選択的多段階励起のための、偏光状態と遅延時間が任意に制御できる多重パルス光学系を設計、構築した。さらに、光学系の性能評価として、分子回転運動の加減速実験を行った。偏光の精密な制御によって、運動の方向と速さまで含めた高度な分子制御が可能となりつつある。研究初年度は方法論の開発に注力する計画であり、ほぼ計画どおりに光学系の構築および画像観測装置の分子クラスター実験への応用に成功しているため。

研究2年目は初年度に開発した光電子・光イオン画像観測装置を用いることで、ラマン強度の大きな負イオン種への適用や、クーロン爆発過程が複雑化し1年目のアプローチが困難となりうる巨大クラスターおよび巨大分子系(分子量200以上)に関しても議論を可能にする。さらに、新規観測装置の特徴である、励起状態の分子構造が可視化できる利点を活用し、超短パルス紫外光源との組み合わせによる電子励起状態ダイナミクスの観測へと研究を展開する。また、ポテンシャルエネルギー曲面上の運動についての理論的研究を領域内共同研究として計画している。実験と理論の比較によって、特に未帰属だった分子間振動モードなどについて、飛躍的に解析が進むものと期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ゲノム不安定性を示すマウスを利用した癌抑制遺伝子の単離

がんの発症や悪性化の分子機構の解明には、原因遺伝子の効率的な同定と機能解析が重要となる。私達は、レトロウイルス挿入変異を用いて、マウスに発症した血液腫瘍から、発がんに重要な共通挿入部位の遺伝子を網羅的に同定してきた。しかし従来法では、ウイルス挿入で発現が活性化される癌遺伝子が主に単離され、癌抑制遺伝子の候補はほぼ発見できなかった。そこで、分裂組み換えを頻発する変異マウス(ブルーム(Blm)遺伝子変異マウス)を用いて挿入変異を行ない、両アリルへの変異導入効率を高めて、癌抑制遺伝子を優先的に単離する方法の構築を試みた。まず、Blm変異マウスは、挿入変異によって、野生型マウスより早期に血液腫瘍を発症することがわかった。腫瘍細胞ゲノムのウイルス挿入部位の解析から、新たに癌関連遺伝子を多数同定し、特にウイルスが翻訳領域の内部に挿入している遺伝子(癌抑制遺伝子の候補)を十数個単離することに成功した。この中には、RB関連遺伝子、CDK阻害因子、ファンコニ貧血原因遺伝子など既知の有力な候補が含まれており、目的の実験系の樹立が確認された。現在、新しく同定された候補の機能解析を進行しており、これまでにJumonji(JmjC)ドメインという共通構造をもつBCIS1、BCIS2遺伝子産物がDNA修復に関与する可能性を明らかにした。さらに、BCIS1が癌遺伝子産物BCL6の複合体に含まれ、その機能を制御することを示唆する結果も得ている。BCIS1はヒストン脱メチル化酵素の活性を持つことが最近報告されており、DNA修復や転写制御とクロマチン構造変化の関係に注目している。また、マウスの6番と8番染色体にマップされる2つの新規候補遺伝子(BCIS3、BCIS4)については、DNA二重鎖切断修復に関与する可能性を見いだしており、あわせて解析中である。
磁場印加型エマルション検出器を用いたニュートリノ振動実験

OPERA実験はタウニュートリノ候補を4例検出した。この内、3例はハドロンを含む崩壊で、バックグラウンド(BG)を研究したところ、シミュレーションでよく再現できることが確認でき、BG期待値の見積もりを実験的に裏付けることができた。その結果、ミューニュートリノからタウニュートリノへの振動は4.2σの統計的有意性で確立できた。バネを用いたエマルション検出器を製作し、ビーム照射実験を行った。解析により、適切なバネの強度と取り扱いの課題を得ることができた。新技術としてフィルム変形補正用フォトマスクと大角度飛跡認識装置の開発に成功した。これは磁場印加型エマルション検出器を用いた実験には重要な技術である。1.長基線ニュートリノ振動実験OPERAの解析においてタウ崩壊候補とバックグラウンド(BG)との区別が必要不可欠であり、我々は主なBGの1つ、ハドロン反応に注目している。昨年度のKEK 4GeV/cπ中間子反応に引き続き、今年度はCERN 2GeV/c, 4GeV/c, 10GeV/cπ中間子反応を照射したECCブリックの解析を行い、より系統的な研究を行った。その結果、タウ崩壊候補となりうる運動学的領域に入るバックグラウンド期待値の不定性を従来の50%から30%に低減することができた。また、核破砕片付随確率は運動量依存性を含め10%の精度で測定することに成功した。2.この研究の中で大角度飛跡まで観測可能な独自の広視野自動飛跡読み取り装置を開発した。柔軟な対応が可能なGPUを用いた高速システムで、飛跡ランキング法を用いることで解析対象の飛跡とコンプトン電子飛跡を効率的に分離することができる。次世代の磁場印加型ニュートリノ実験にも対応可能なシステムで、すでに、UTSの数倍の読み取り速度を達成できた。昨年度の核破砕片(高電離損失粒子)の観測に加えて最小電離粒子に対してもtanθ=3.5の領域まで高効率で検出できることを確認し、日本物理学会で発表した。3.スペクトロメーター用エマルション検出器・本体構造の研究では、フィルムとスペーサーをたわみ、歪みやズレなどがない状態で構造体の中にどのように配置させるか、検討した。実際にバネを用いた構造体によるエマルション検出器を製作してCERN研究所のハドロンビームを照射し、検証を行った。その結果、ある程度の圧力をかければ、通常の取り扱いの範囲ではズレなく保てることがわかった。一方で、落下のような衝撃には弱いことがわかった。1.長基線ニュートリノ振動実験OPERAに対しては検出器本体のあるグランサッソ地下研究所でのブリック・ハンドリングを始めとしてインターフェース・フィルムのスキャンと解析、ブリック本体での二次粒子逆追跡、ニュートリノ反応点の確認と短寿命崩壊探索、物理解析、論文執筆、全てに渡って貢献するとともに技術開発を行い、経験を蓄積した。OPERA実験ではハドロン反応がタウ崩壊のバックグラウンドとなる期待値をモンテカルロ・シミュレーション(MC)で見積もっているが、その検証のため、ハドロンビームを照射したECC検出器のフィルムを解析し、反応数、二次粒子多重度、放出角度、運動量、横運動量などの分布を詳細に比較した。その結果、MCはハドロン反応をよく再現できることがわかり、実験全体の信頼度を向上させることができた。2.上記研究の中で、大角度飛跡まで観測可能な広視野自動飛跡読み取り装置を独自に開発した。柔軟な対応が可能なGPUを用いた測定システムで、次世代の磁場印加型ニュートリノ実験でも威力を発揮する。最終年度は高速化を目指し、改良を検討した。高速化により、1フレーム当たりの光量が減少するため、従来のハロゲンランプからより輝度の高い照明光源への変更が必要になる。価格、発生熱量、制御しやすさなどを考慮してLED照明系の導入を決定し、一部製作を行った。3.スペクトロメーター用エマルション検出器・本体構造の研究では、バネを用いた構造体によるエマルション検出器を製作してハドロンビームを照射し、歪みやズレの研究を行った。最終年度には欧州の研究者達と議論し、MCを実施して次実験における電荷符号識別効率や運動量測定可能確率などを評価した。4.エマルション検出器中での低エネルギー電子の振る舞いについて、Geant4によるMCを開発し、実験データと比較した。これは電子ニュートリノ反応検出の基礎研究である。長基線ニュートリノ振動実験OPERAのグランサッソ研究所でのブリックハンドリングなどの処理に貢献すると共に日本でのエマルションフィルムのスキャンと解析にも本格的に参加した。インターフェースフィルム内の飛跡探索スキャンから、標的ブリック(ECC)への飛跡逆追跡、ニュートリノ反応の再構成、崩壊探索までの全工程に貢献した。その結果、興味深い事象が複数検出されたが、タウ崩壊候補とバックグラウンド(BG)との区別が必要不可欠である。

我々は主なBGの1つ、ハドロン反応の研究を行った。4GeV/cπ中間子反応から放出された2次粒子の運動学的分布はモンテカルロ・シミュレーション(MC)とほぼ矛盾がないことを確認し、論文にまとめた。さらに核破砕粒子が付随する割合を測定した。核破砕粒子はタウ崩壊から放出されることはないので観測されればハドロン反応の有力な証拠となる。その割合の入射粒子運動量依存性も観測され、タウ崩壊とBGとの識別に重要なデータを提供できた。この中で大角度飛跡まで観測可能な独自の広視野自動飛跡読み取り装置を開発した。専用ハードウェアを用いた旧装置UTSと比べ、柔軟な対応が可能なGPUを用いた高速システムである。飛跡ランキング法を用いることで解析対象の飛跡とコンプトン電子飛跡を効率的に分離することができる。次世代の磁場印加型エマルション検出器を用いたニュートリノ振動実験には必要不可欠なシステムで、すでにUTSと同等な速度を達成できた。磁場印加型エマルション検出器の研究では電子・陽電子の識別に焦点をあて、MCを整備するとともに以前SPring 8において低エネルギー電子を照射したECCの解析により、検討を行った。ECCに使用する金属板をより薄いものに変更することで、サブGeV程度の低エネルギー電子まで検出対象に含めることができる。薄塗り乾板の塗布テスト、構造体の設計も開始した。OPERA実験に貢献する中で、タウ崩壊のBG、ハドロン反応の研究を推進し、その成果を国際会議や国内の学会で発表した。さらに独自の広視野高速自動飛跡読み取り装置の開発に成功し、その成果を論文として発表した。次世代の磁場印加型エマルション検出器を用いたニュートリノ振動実験にはこのような柔軟なシステムが必要不可欠であり、その実現に向けて一歩近づいたといえる。大角度飛跡の読み取りが可能になるとともに、解析の邪魔になるコンプトン電子の飛跡を効率的に分離できるので旧システムでは必要とされたマニュアル・チェックを大幅に低減できる。並行してエマルション検出器本体の設計とテストを進めている。OPERA実験に貢献する中で、タウ崩壊の主なBGの一つ、ハドロン反応の研究を推進し、その成果を発表した。さらに独自の広視野高速自動飛跡読み取り装置の開発に成功し、実用化することができた。引き続き、OPERA実験の遂行と解析に貢献する。昨年度はタウニュートリノ検出の要であるタウ崩壊のBG、ハドロン反応の研究が喫緊の課題となり、そのECCの解析を優先させることとなった。
脳磁図と機能的ＭＲＩを用いた脳内ネットワーク変容の解析：難治性てんかんの病態解明

近年、てんかんの病態は複雑なネットワークを形成していることが示唆されているが、てんかん原性領域の広がりやその詳細な機構は明らかでない。我々は、時間的・空間的分解能に優れた脳磁図(MEG)を用いて、これまでの等価電流双極子(ECD)法とは異なる空間フィルター法で解析することで、時間的・空間的な広がりをもった可視化を行った。非侵襲的な脳機能画像、侵襲的な手法によるネットワーク解析法を確立して、空間フィルター解析法の妥当性と臨床的意義を検証し、難治性てんかんの病態解明に知見を還元した。「難治性部分てんかん」にかかわるネットワークの統合的研究として非侵襲的検査で想定されたてんかん原性焦点とその領域間連関に焦点をあてる。また、術前評価のために頭蓋内電極の慢性留置か覚醒下手術中記録が必要と考えられる患者を対象とする。てんかん原性に関連するネットワークを非侵襲的にMEG空間フィルター解析法とrs-fMRIの手法で同定して、慢性電極留置中もしくは覚醒下手術時に侵襲的に同定されたてんかん焦点と脳内ネットワークを各領域間の大脳皮質脳波の相関を指標に評価して、病態にかかわるネットワークの動的変容を明らかにする。MEG空間フィルター解析法とrs-fMRIの妥当性と臨床的意義を、ネットワークの分布とその変容の観点から侵襲記録の結果と比較し検証する。「難治性部分てんかんのネットワーク動態の可視化と評価法の確立」のために、外科的適応のある難治性部分てんかんで、電極埋め込みや覚醒下手術が必要かつ可能な患者で、本研究計画に同意が得られたものを対象とする。術前に、通常の術前評価(頭皮上脳波・MRI・PET・SPECT)に加えて、rs-fMRI、MEGの記録を行なう。非侵襲的計測として、MEG空間フィルター法(sLORETA)による解析とrs-fMRIにより、てんかん焦点検索と脳内ネットワークを同定する。また、侵襲的計測としては、頭蓋内電極を用いた大脳皮質脳波によるてんかん焦点検索と、領域間の皮質脳波の相関を指標に、病態にかかわるネットワークの機能的結合性の変容を解明する。侵襲的計測で同定された脳内ネットワークの分布および動的な変容と照合して、MEG、rs-fMRIによる機能的結合性の妥当性と意義を検証する。本研究では、「難治性部分てんかん」にかかわるネットワークの統合的研究として非侵襲的検査で想定されたてんかん原性焦点とその領域間連関に焦点をあてる。難治性部分てんかん症例において、時間的・空間的分解能に優れた脳磁図(MEG)を用いて、これまでの等価電流双極子法とは異なる空間フィルター法で解析して、発作間欠期てんかん性放電の時間的・空間的な広がりをもった可視化を行った。また、その手法の妥当性と一貫性を検証するために、非侵襲的な脳機能画像、特に正常被験者によるデータベースを基に統計的解析手法で得られたFDG-PETによるてんかん病態の関連領域の画像と比較・検討した。学会発表にて臨床的意義を検証して、学術論文を準備中である。しかし、他のモダリティーであるrs-fMRIによる、各解析法の妥当性と一貫性の評価は、十分な症例と一致した傾向をまとめることが期間内にできず、研究の継続とした。

さらに、侵襲的な手法との比較・検討のために、頭蓋内電極による神経ネットワーク解明の手法として皮質皮質間誘発電位(CCEP)の手法を用いて、言語機能領域間でのネットワーク形成を解剖学的MRIと比較して証明し、臨床応用の可能性を示した(Yamao et al. 2014)。また、留置頭蓋内電極による皮質脳波での脳内ネットワークの分布と治療介入による動的変容に関しては、頭蓋内電極留置に伴うリスク評価を自験例でまとめて、学会発表・学術論文化することができた(Shibata et al. 2015)。これらのことから、非侵襲的・侵襲的な手法によるネットワーク解析と比較して、空間フィルター解析法の妥当性と臨床的意義を検証し、難治性てんかんの病態解明に知見を還元した。機能外科「難治性部分てんかん」にかかわるネットワークの統合的研究を目指す本研究で、その対象となる外科治療適応症例は、相当程度確保できており、実際に非侵襲的に行われた脳磁図の空間フィルター解析法での記録・解析は順調に進み、これと対比するべきmodalityでの解析に注力している。具体的には、FDG-PETを用いることで、脳磁図での結果を検証することに成功して、学会発表を行って論文化中である。侵襲的手法で同定された「てんかん焦点」と脳内ネットワークを各領域間の大脳皮質脳波の相関を見る解析は、その膨大なデータ量に解析に時間を要しているが、鋭意進めている。「難治性部分てんかん」にかかわるネットワークの統合的研究を目指す本研究で、その対象となる外科治療適応症例は、相当程度確保できていると考えている。実際に非侵襲的に行われた脳磁図の空間フィルター解析法での記録・解析は順調に進んでいるが、これと対比するべきmodalityでの解析において、困難さを感じている。具体的には、慢性電極留置中もしくは覚醒下手術時に侵襲的に同定された「てんかん焦点」と脳内ネットワークを各領域間の大脳皮質脳波の相関を見る解析が、膨大なデータ量に比して、解析コンピューターとソフトが不十分であるために遅れている。さらに症例数をふやすべく、正常被検者によるデータベースを新規導入されたPET機器に応じて確立する準備を初めており、引き続き、同解析法での症例の蓄積をおこなう。解析ハード・ソフトの充実を図り、大脳皮質脳波の相関の解析に当たり、rs-fMRIによっても脳内ネットワークを同定する試みをすすめる。代わりのmodalityとして、「難治性部分てんかんのネットワーク動態の可視化と評価法の確立」のために、通常の術前評価で行われた中で、FDG-PETを用いることを既に試している。正常被検者によるデータベースを基準に、空間的な統計解析を行った画像との一致性や相関を見ることで、非侵襲的計測として解析しているMEG空間フィルター法(sLORETA)の妥当性を示すことができている。そのため、引き続き、同解析法での症例の蓄積をおこなうとともに、新規コンピューターの導入を行なって、大脳皮質脳波の相関の解析に当たり、rs-fMRIによってもてんかん焦点検索と脳内ネットワークを同定する試みをすすめる。一部しか論文ができておらず、これに見込んだ人件費・謝金が残っており、論文化が進むであろう次年度に繰り越す。症例数をふやすべく、正常被検者によるデータベースを新規導入されたPET機器に応じて確立する準備を初めており、これに人件費・謝金が必要になる。
冠水抵抗性作物作出へ向けての分子育種学的研究

植物が冠水などの嫌気ストレスに弱い理由の一つとして、毒性の高いアセトアルデヒドの影響が考えられる。アセトアルデヒドは冠水中および冠水解除時に生じ、細胞の膜構造やタンパク質を変性させる。アルデヒド脱水素酵素(ALDH)はアセトアルデヒドを無毒化する酵素であり、イネでは少なくとも4種類の遺伝子が存在し、塩基配列を決定したが、2種類は細胞質型であり、残りはミトコンドリア型であった。イネなど冠水抵抗性の高い植物では、冠水中や冠水解除時にミトコンドリア型のALDH2が発現し、アセトアルデヒドを無毒化している可能性が考えられる。冠水状態におけるALDH2遺伝子の発現応答を調べたところ、ALDH2bのmRNAは冠水処理で急激に減少するが、ALDH2aのmRMは冠水処理で急激に増加し、冠水解除で元のレベルまで減少することが明らかとなった。一方、タンパク量は冠水中は増えず、冠水解除直後にかなり増えていた。冠水解除直後、蓄積されたエタノールから活性酸素により多量のアセトアルデヒドが合成され、植物に甚大な障害を与えることが知られているが、イネではこの障害をALDH2aが防いでいることが明らかになった。ALDH2aの機能を確認するために、冠水抵抗性が低いトウモロコシやオオムギで同様な実験を行った。冠水中や冠水解除直後におけるALDH2aの発現を調べたが、翻訳産物は確認できなかった。イネ科植物で冠水抵抗性のタイヌビエについても調べたが、冠水中や冠水解除直後に十分なALDH2aのタンパクを蓄積していた。これはイネにおける発現パターンと非常によく似ていた。そこで、ALDH2a遺伝子を冠水抵抗性が低いアラビドプシスで過剰発現させた。その形質転換植物を低酸素状態に置き、再び酸素を供給すると野生種に比べて、生存数がかなり多かった。これはALDH2aを過剰発現させることにより、冠水に弱い作物を冠水抵抗性に改変できることを示す初歩的な成果である。アセトアルデヒドは冠水中エタノール発酵の中間産物としても生じるが、主に冠水解除時に急激な酸素供給によるエタノールの酸化によって生じ、細胞の膜構造やタンパク質を変性させる。アルデヒド脱水素酵素(ALDH)はアセトアルデヒドを酢酸に無毒化する酵素であり、イネでは少なくとも4種類の遺伝子が存在し、2種類は細胞質型であり、残りの2種類はミトコンドリア型であることを確認した。すでに解析してあるALDH2aに加え、細胞質型であるALDH1aとミトコンドリア型であるALDH2bの遺伝子を単離し、その塩基配列を決定した。イネなど冠水抵抗性の高い植物では、冠水状態もしくは冠水解除時にミトコンドリア型のALDH2が発現し、アセトアルデヒドを無毒化している可能性が考えられる。イネの各器官における転写レベルの発現を調べると、ALDH2aは暗所で発芽させた芽生えの葉、花器官でのみ発現していたのに対してALDH2bはすべての器官で発現していた。冠水状態におけるALDH2遺伝子の発現応答を調べるため、播種後7日目のイネを冠水処理し、ノーザン〓ションを行った。その結果ALDH2bのmRNAは冠水処理で急激に減少するが、ALDH2aのmRNAは冠水〓し、冠水解除すると元のレベルまで減少することが明らかとなった。冠水抵抗性が高いイネで冠水中のALDH2aのタンパク質レベルでの発現を調ベた。

その結果驚くべきことに、mRNAの蓄積量が多いにもかかわらず、タンパク量は増えていなかった。そして冠水解除直後にタンパク量がかなり増えていた。そこで調べてみると、冠水解除直後、活性酸素により蓄積されたエタノールから多量のアセトアルデヒドが合成され、植物に甚大な障害を与えることが確認された。そしてイネではこの障害をALDH2aが防いでいることが明らかになった。ALDH2aの機能を確認するために、冠水抵抗性が低いイネ科植物であるトウモロコシやオオムギで同様な実験を行った。冠水中や冠水解除直後におけるALDH2aの発現をRNAレベルやタンパク質レペルで調べたが、イネとは異なり発現していなかった。次にALDH2aの発現がイネ特有なのか、冠水抵抗性植物に共通なのかを調べるため、イネ科植物で冠水抵抗性のタイヌビエについて調べた。それによると、ALDH2aは冠水中でmRNAを蓄積し、冠水中や冠水解除直後に十分なタンパク量を蓄積していた。これはイネにおける発現パターンと非常によく似ていた。しかし、タイヌピエとイネが植物分類上非常に近くそのためALDH2aの発現パターンが似ているだけかもしれない。そのため、イネ科植物の分類を調べたところ、タイヌピエはイネよりもむしろトウモロコシに分類上近いことが判った。これらのことからALDH2aは冠水抵抗性に密接に関与していることが示された。そこで、ALDH2a遺伝子を冠水抵抗性が低いアラビドプシスで過剰発現させた。その形質転換植物を低酸素状態に置き、再び酸素を供給すると野生種に比べて、生存数がかなり多かった。これはALDH2aを過剰発現させることにより、冠水に弱い作物を冠水抵抗性に改変できることを示す初歩的な成果と考えられる。
リンパ管システムに関わる分子の網羅的スクリーニング

(目的)リンパ管内皮細胞よりリンパ管の発生、新生に重要な分子を網羅的に単離同定しその後、リンパ管新生の分子基盤を明らかにする。(方法)(1)マウスリンパ管腫モデルを作製し、そのリンパ管内皮細胞をラットの腹腔内に注入し細胞の表面抗原に対する抗体を網羅的に作製する。(2)リンパ管内皮細胞に特異的に発現しているLYVE-1に着目し、マウスLYVE-1に対するモノクローナル抗体を作製しリンパ管内皮細胞を単離・純化し、血管内皮細胞と発現している分子、機能などの点を比較検討する。(結果)(1)マウスリンパ管腫細胞をラットの腹腔内に注入し細胞の表面抗原に対する抗体作成の過程でXXXクローンのハイブリドーマをELISA及び免疫染色でスクリーニングした結果YYクローンのリンパ管腫由来リンパ管内皮細胞を特異的に認識する抗体が得られた。その後、様々な方法でこの抗体の認識する分子を同定する試みをしたが、結果的には不成功に終わった。(2)マウスLYVE-1に対するモノクローナル抗体を3クローン樹立することに成功した。3クローン間に差はなく、免疫組織染色、FACS解析においてリンパ管内皮細胞を認識できる抗体であることを確認した。現在までにリンパ管内皮に特異的と報告されている分子(SLC、Podoplanin、prox1)は、その報告通りであったが、血管内皮細胞で発現が報告されている分子に関しては弱くリンパ管内皮細胞に発現する分子群(CD44、TIE2、Flt1)と同等に発現する分子群(CD31、TIE1、Flk1)に分かれることを見出した。(考察)LYVE-1に対するモノクローナル抗体の樹立に成功し、リンパ管の同定、純化、単離が可能になったことは、これまでの多くのtoolを海外に頼ってきた国内のリンパ管研究者には朗報であると考える。今後、この抗体を用いて網羅的な解析手法を用いて血管内皮細胞と比較しつつリンパ管内皮細胞を明らかにしていきたいと考えている。(目的)リンパ管の分子基盤を明らかにすることはリンパ管に関わる種々の疾患の原因究明・治療法開発に関わると予想され、大きな期待がもたれる。我々は、正常リンパ管内皮細胞及びがんにおけるリンパ管転移に伴うリンパ管新生の際に出現するリンパ管内皮細胞より、リンパ管の発生・新生に重要な分子を網羅的に単離同定し、リンパ管新生の分子基盤を明らかにする。(結果)1.リンパ管内皮細胞を純化・単離する抗体の作製本年度はリンパ管内皮細胞に発現する分子を解析するために、まずリンパ管内皮細胞をより純化し単離することができる抗体の作製を行った。まずリンパ管内皮細胞に、より特徴的に発現するLYVE-1の細胞外ドメインを認識する抗体を作製し、マウスLYVE-1に対するモノクローナル抗体を3クローンの樹立に成功した。この3クローン間に差はなく、免疫組織染色でリンパ管内皮細胞を認識する抗体であることを確認した。また細胞分離装置(FACS)を用いた解析ではリンパ管内皮細胞を純化し単離できることを確認した。これらの収集したリンパ管内皮細胞で既に血管内皮細胞で明らかとなっている分子マーカーの発現を検討し、血管内皮細胞とその発現を共有する分子、リンパ管内皮細胞もしくは血管内皮細胞に特異的な発現をする分子があることを明らかにした。また、それらのパターンも発生期の胎児と成体では異なる分子が存在することが明らかとなった。来年度はこの抗体を用いてリンパ節転移を伴う担がんマウスモデルから新生リンパ管内皮細胞を収集し、正常リンパ管内皮細胞と比較することによりその性格を明らかにする予定である。2.リンパ管腫に発現する新規分子の探索リンパ管腫モデルマウスを作製しその腫瘍細胞を免疫源にラットに抗体を作製させた。その結果、リンパ管腫を特異的に認識する抗体を得た。現在、その抗体が認識する分子の同定を試みているところである。

(考察)LYVE-1に対するモノクローナル抗体の樹立に成功し、リンパ管の同定、純化、単離が可能になったことは、これまでの多くのtoolを海外に頼ってきた国内のリンパ管研究者には朗報であると考える。今後、この抗体を用いて網羅的な解析手法を用いて血管内皮細胞と比較しつつリンパ管内皮細胞を明らかにしていきたいと考えている。
膵癌の循環血中腫瘍細胞における細胞骨格タンパク質の役割の解明

蛍光標識したヒト膵癌細胞株を同所移植することでその後発生するCTCsをあらかじめ標識しておくことができることを確認した。よってこの実験系は、今後のCTCsの詳細な細胞解析に大きく寄与することが期待できる。nestin、E-cadherin、vimentinといった細胞骨格タンパク質のLC/MSによる高感度検出が可能となった。今後は、培養細胞のクルードタンパク質でも検出できるか検討していく必要がある。LC/MSによる絶対定量法が確立次第、次の目標である膵癌細胞におけるEMT発現タンパク質の発現パターンを評価するために、膵癌以外の癌細胞の発現パターンとも比較していく予定である。前年度に掲げた研究計画の通り循環血中腫瘍細胞(CTCs)評価につながる新たな知見の獲得を目指した。近年、癌細胞の特長の一つとしてとらえられている上皮間葉転換(EMT)において、細胞が間葉様に進むのに応じて細胞骨格タンパク質の発現パターンが変化(E-cadherinの発現減弱、vimentinの発現増強)することが明らかになってきたため、これをLC/MSを用いて評価する方法を検討した。各タンパク質を絶対定量することにより、正確なE-cadherin/vimentin比を算出することでCTCの性質評価につながるのではないかと考えたためである。用いたLC/MSは、Thermo Scientific製のAccela/LTQ Orbitrap Discoveryで、前年度のnestinタンパク質定量法確立と同様に、in silicoならびに各タンパク質のリコンビナントタンパク質のトリプシン消化産物の解析により、特異性の高い(他のタンパク質の一部と相同性の低い)ペプチド配列を決定し、それらのリコンビナントペプチドを作成することにした。しかし両タンパク質の全長が比較的短く(E-cadherin; 882 AAs, vimentin; 466 AAs)、特にvimentinにおいては特異性の高い配列が少なかったため、各1つずつペプチド配列を選定しリコンビナントペプチドを作成した。このペプチドをスタンダードとしフラグメントイオンの中で最も高い強度で安定的に検出されるフラグメントを選定し、MRMプログラムを設定した。リコンビナントタンパク質のトリプシン消化サンプルとともに連続分析を行ったところ、両者が等しい検出パターンを示したため、このMRMプログラムの使用が可能となった。今後は、検量線の有効濃度範囲を検討し、さらに実際の細胞のクルードタンパク質でも検出できるか検討していく必要がある。平成24年度は、「ヒト膵癌培養細胞の同所移植によるマウス転移モデルを用いた循環血中腫瘍細胞(CTCs)の分離採取」の検討を行った。蛍光標識したヒト膵癌細胞株(DsRed (+) PANC-1 cell)を同所移植することでその後発生するCTCsをあらかじめ標識しておくことができる。そのためEpCAMなどの既存マーカーの使用に比べ精度の高いCTCsの分離採取が可能であると考えた。検討の結果、3-4匹分のマウス腹部大静脈血のプールサンプルを溶血処理後にフローサイトメーターに供することで、10の2乗オーダーのDsRed陽性細胞を回収することが可能となった。これまでの報告に比べ、回収細胞数が増加したことによって遺伝子発現解析やプロテオーム解析を行う場合などに有用であると考えられる。また、平成25年度に実施予定の「LC/MSによるCTCsの細胞骨格タンパク質の定性、定量」に向け、LC/MSによるタンパク質定量法を検討した。細胞骨格タンパク質の一つである中間径フィラメントのnestinを標的とし、LC/MSによる絶対定量を試みた。Nestinを構成する1621アミノ酸残基の中から、in silicoによって特定のアミノ酸配列を選択し、定量分析のための標品となるリコンビナントペプチドを合成した。この合成ペプチドのMSによる検出を検討した結果、10 nMから100 uMの範囲での検量線で非常に良好な直線性を得られるMRMプログラムが決定した。このMRMプログラムを用い、あらかじめnestinの発現が高いことが明らかとなっているACBRI513細胞から抽出したタンパク質をMSに供したところ、nestinを検出することができた。今後は、生体組織から抽出したタンパク質からも同様に検出できるか検討していく必要がある。平成26年度は前年度から継続して、LC/MSを用いたタンパク質の絶対定量を検討した。対象としたタンパク質はE-cadherinとvimentinで、いずれも細胞骨格タンパク質である。近年、癌細胞の特長の一つとしてとらえられている上皮間葉転換(EMT)において、細胞が間葉様に変化するのに応じて細胞骨格タンパク質の発現パターンが変化することが明らかになってきたためである(E-cadherinの発現減弱、vimentinの発現増強)。用いたLC/MSは、所属機関変更に伴い前年度から変更されAcquity UPLC / SynaptG2 (Waters)を使用した。まずは前年度に検討したMRMプログラムの移行を完了するため、LC条件およびMS条件の最適化を行った。SynaptG2はQ-