hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
テロメア遺伝子年齢を加齢個体差の客観的指標として用いたネオ・ジェロントロジー研究

慢性腎疾患CKDでの前向き研究で、Gテール長の短縮が、血管イベントのリスクファクターになることを見いだした(CJASN 9, 2117-2122 ,2014)。当初計画した目標をほぼ達成している。平成28年度は、27年度に実施した【健常人の末梢血のテロメア長の測定による遺伝子年齢「テロメア年齢」研究】における遺伝子年齢算出精度をあげるための健常人におけるテロメア長をよびGテール長の測定を実施し、データベース充実を図り、遺伝子年齢算出の尺度の標準化をめざす。【「テロメア年齢」と他の個人差ファクターとの相関調査研究】は、遺伝子年齢が高い群と低い群とで臨床データとの相関を引き続き検討する。ストレス改善におけるテロメアGテール長に及ぼす影響については、【食生活改善によるテロメア長およびテロメアGテール長測定】を昨年度に続いて実施して、データの調査を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。テロメア、エクソソーム、がん、マイクロRNA成27年度は、26年度に実施した【健常人の末梢血のテロメア長の測定による遺伝子年齢「テロメア年齢」研究】における遺伝子年齢算出精度をあげるための健常人におけるテロメア長をよびGテール長の測定を実施し、データベース充実を図り、遺伝子年齢算出の尺度の標準化をめざす。【「テロメア年齢」と他の個人差ファクターとの相関調査研究】は、遺伝子年齢が高い群と低い群とで臨床データとの相関を検討する。【「テロメア年齢」算出に対する疾患のリスク・予防に対する意識調査研究】は、27年度後半において、アンケートなどを実施し意識調査を実施する。ストレス改善におけるテロメアGテール長に及ぼす影響については、【食生活改善によるテロメア長およびテロメアGテール長測定】を実施して、メンタルおよび食生活の詳細についてデータの調査を行う。さらに、ビタミン点滴、レスベラトロールなどなどによる染色体ストレス改善効果について、テロメア長およびテロメアGテール長との相関を調べる。マルチラベルリーダーEnVision保守契約ベーシックプランの契約を行うため28年度が最終年度であるため、記入しない。テロメアHPAプローブの合成が供給会社(海外)の事情により、当初の予想より時間がかかり当初予定していたサンプル全てを測定できなかった。マルチラベルリーダーEnVision保守契約ベーシックプランの支払いを行う28年度が最終年度であるため、記入しない。テロメアHPAプローブは準備できたので、テロメア長およびGテール長の測定に用いる。
シンクロトロン放射光励起によるアモルファス薄膜形成とその評価

真空紫外光は物質との相互作用が大きく、将来の光化学反応には有望と考えられる。最近、新しい光源としてシンクロトロン放射(SR)やマイクロ波起放電管が注目されている。SR光は強力で、指向性に優れているため、将来の超微細加工技術にも適合する光源と考えられる。本研究では、SR光および放電管による真空紫外光励起により薄膜を形成することを試み、形成膜の評価および成膜機構について検討を行った。さらに、将来の超微細加工として放射光が用いられた場合に重要な問題と考えられる半導体基板およびデバイスへの照射による特性劣化の解明を行い、次のような結果を得た。第一に、C_4H_<10>ガスを原料としたSR光励起薄膜形成においては、光照射部分のみに水素化アモルファスカーボン膜を形成することに成功した。成膜中に基板表面付近に電界を印加する実験から、ガスがイオン化していること、成膜に中性の活性種だけでなく正電荷を持つイオンが大きく寄与することが明らかにされた。また、この成膜機構では、40ev以上の高エネルギーフォトンが有効であると推定された。第二に、SiH_4ガスを原料としてSR光励起により、水素化アモルファスシリコン膜が形成できた。C_4H10温の場合と異なり、基板への光照射の有無にかかわらず成膜されたが、光照射が膜の粗密さに影響を与えることがわかった。第三に、Si_2H_6ガスを原料としてマイクロ波励起窓なし水素放電管による真空紫外光励起により、高品質な水素化アモルファスシリコン膜が形成できた。基板温度250°Cで形成した膜において、光感度は10^7に達した。第四に、シリコンMOSデバイス、アモルファスシリコン膜およびそのデバイスにSR光照射を行ったところ、それらの電気的特性に急速な劣化を生じる。しかし、150250°C程度のアニールにより、ほぼ照射前の特性に回復することがわかり、SR光による損傷が深刻な問題ではないことが明らかになった。本研究においては,物質との相互作用の大きい真空紫外光から軟X線の波長範囲の強力な光源であるシンクロトロン放射光を用いた新しい薄膜形成技術,超微細加工技術の確立をめざしている.今年度においては,放射光導入のためのファルタ機構を有する特殊設計された反応容器の製作を行った.さらに,この反応容器にC_4H_<10>ガスを導入しながらSi基板に対し垂直に放射光を照射する実験を行った.その結果,光照射部分のみに選択的にカーボン膜を室温で形成することに成功し,成膜に必要な実験条件を見い出せた.形成膜は,赤外吸収特性の測定や反射高速電子線回折の観察より水素を含むアモルファスカーボンであることが明らかになった.放射光には高エネルギーフォトンが含まれるため,ガスが光電離を起こすことが予測される.今回,基板と光源との間に格子状電極を挿入し,基板表面近傍に垂直な電界を印加しながら薄膜形成する実験も行った.その時,電極と基板間に,光照射した場合のみに電流が流れ,ガスがイオン化していることが確認された.成膜速度においては,電極に正電圧を加えた時のみに増大し,平均電界が+170V/cmの場合,電界非印加時に対し10倍以上に達した.

従って,正電界増加時以外では,おもに電気的中性なガス分子やラジカルが成膜に寄与するが,正電界印加時は,正に荷電したイオンがそれらに加わり,成膜すると考えられる.以上より,放射光励起により選択的に薄膜形成が可能なことが示され,将来の薄膜形成技術への指針を得ることができた.また,放射光に含まれる高エネルギーフォトンにより,原料ガスが光電離を起こすこと,そのプロセスが成膜速度に大きな影響を及ぼすことなど,成膜機構に関する知見を得ることができた.真空紫外光は物質との相互作用が大きく、将来の光化学反応には有望と考えられるが、適当な光源がなかった。最近、新しい光源としてシンクロトロン放射(SR)やマイクロ波励起放電管が注目されている。特にSR光は安定かつ強力であり、清浄性や指向性に優れているため、将来の超微細加工技術にも適合する光源と考えられる。本研究では、SR光および放電管による真空紫外光を用いて原料ガスを励起し、薄膜を形成することを試み、形成膜の評価および成膜機構について検討を行った。前年度においてはブタンガスを原料としてアモルファスカーボン膜の形成を行ったが、本年度においては、シラン系ガスを原料としてシリコン膜の形成を試み、以下のような結果を得た。第一に、モノシランを原料としてSR光励起により、水素化アモルファスシリコン膜が形成できた。昨年度のカーボン膜形成の場合と異なり、基板への光照射の有無にかかわらず成膜され、気相中における原料ガスの分解反応が主成膜機構であると考えられた。しかし、光照射により膜の密度が増加することが見いだされた。また、成膜時に基板表面付近へ電界を印加すると、形成膜の密度が減少してしまい、電界が膜質に悪影響を与えることがわかった。第二に、ジシランを原料としてマイクロ波励起窓なし水素放電管による真空紫外光励起により、水素化アモルファスシリコン膜が形成できた。光学窓を用いない場合は励起水素による原料ガスの分解促進が考えられるが、光学窓を用いた実験との比較から、本実験条件では光分解が主な成膜機構であった。形成膜質は成膜温度に大きく依存し、温度が高いほど結合水素が減少し、光学バンドギャップが減少すること、SiーH結合密度のSiーH_2結合密度に対する比が大きくなることがわかった。基板温度が250°Cの場合に光伝導度が最も大きな膜が得られ、光感度は10^7に達し、従来のプラズマ成長膜に比べて高品質な膜が得られた。
液体を用いたねじり動吸振器

二つの剛円板とそれをつなぐ細い軸からなる,空気タービンで駆動される実験装置を用い,ねじり振動の測定を行った.一方の円板に取り付けられている動吸振器は複数の半径方向羽根によって仕切られた中空円筒容器(動吸振器)からなっている.この容器に液体を部分的に満たし,液体の運動によってねじり振動を吸振する.系に加わる加振トルクは回転速度の1倍と整数倍の成分を持つ.昨年度までは主として,周方向に2,3,4,6,8分割された動吸振器について,表面波の運動をストロボスコープとカメラによる写真撮影によって観察した.各分割数の動吸振器について液体量にかんする同調条件を実験的に調べ,さらに,制振状態における波動を観察した.本年度の研究では,加振振動数が回転速度の2倍成分について主として検討した.その結果,液体量を変えることで,ねじり振動が吸振出来ること,吸振状態において吸振器内の波動は後進波的であり,また,いずれの吸振条件においても,一つのセクタ内に含まれる半波の奇数であることが確認された.コリオリ力も含めた理論解析を行い表面波の運動が進行波的であるという特徴的な現象は液体の運動に作用するコリオリ力の影響であることを解析的に明らかにした.また,同調条件について理論解析と実験値が良く一致することを確認した.最後に,動吸振器の分割数と同調条件についてまとめを行った.二つの剛円板とそれをつなぐ細い軸からなる,空気タービンで駆動される実験装置を用い,ねじり振動の測定を行った.一方の円板に取り付けられている動吸振器は複数の半径方向羽根によって仕切られた中空円筒容器(動吸振器)からなっている.この容器に液体を部分的に満たし,液体の運動によってねじり振動を吸振する.系に加わる加振トルクは回転速度の1倍と整数倍の成分を持つ.昨年度までは主として,周方向に2,3,4,6,8分割された動吸振器について,表面波の運動をストロボスコープとカメラによる写真撮影によって観察した.各分割数の動吸振器について液体量にかんする同調条件を実験的に調べ,さらに,制振状態における波動を観察した.本年度の研究では,加振振動数が回転速度の2倍成分について主として検討した.その結果,液体量を変えることで,ねじり振動が吸振出来ること,吸振状態において吸振器内の波動は後進波的であり,また,いずれの吸振条件においても,一つのセクタ内に含まれる半波の奇数であることが確認された.コリオリ力も含めた理論解析を行い表面波の運動が進行波的であるという特徴的な現象は液体の運動に作用するコリオリ力の影響であることを解析的に明らかにした.また,同調条件について理論解析と実験値が良く一致することを確認した.最後に,動吸振器の分割数と同調条件についてまとめを行った.二つの剛円板とそれをつなぐ細い軸からなる,空気タービンで駆動される実験装置を用い,ねじり振動の測定を行った.一方の円板に取り付けられている動吸振器は複数の半径方向羽根によって仕切られた中空円筒容器(動吸振器)からなっている.この容器に液体を部分的に満たし,液体の運動によってねじり振動を吸振する.系に加わる加振トルクは回転速度の1倍と整数倍の成分を持つ.本年度は周方向に2,3,4,6,8分割された動吸振器について,表面波の運動をストロボスコープとカメラによる写真撮影によって観察した.各分割数の動吸振器について液体量にかんする同調条件を実験的に調べ,さらに,制振状態における波動を観察した.本年度の研究では,加振振動数が回転速度の2倍成分について主として検討した.その結果,液体量を変えることで,ねじり振動が吸振出来ること,吸振状態において吸振器内の波動は後進波的であり,また,いずれの吸振条件においても,一つのセクタ内に含まれる半波の数は奇数であることが確認された.表面波の運動が進行波的であるという特徴的な現象は液体の運動に作用するコリオリ力の影響と考えられる.このため,コリオリ力を考えないときの同調条件とかなり相違があるものと考えられる.この場合の理論解析は現在のところ十分ではなく,実験との比較は今後の課題である.二つの剛円板とそれをつなぐ細い軸からなる,空気タービンで駆動される実験装置を用い,ねじり振動の測定を行った.一方の円板に取り付けられている動吸振器は複数の半径方向羽根によって仕切られた中空円筒容器(動吸振器)からなっている.この容器に液体を部分的に満たし,液体の運動によってねじり振動を吸振する.系に加わる加振トルクは回転速度の1倍と整数倍の成分を持つ.昨年度までは主として,周方向に2,3,4,6,8分割された動吸振器について,表面波の運動をストロボスコープとカメラによる写真撮影によって観察した.各分割数の動吸振器について液体量にかんする同調条件を実験的に調べ,さらに,制振状態における波動を観察した.本年度の研究では,加振振動数が回転速度の2倍成分について主として検討した.その結果,液体量を変えることで,ねじり振動が吸振出来ること,吸振状態において吸振器内の波動は後進波的であり,また,いずれの吸振条件においても,一つのセクタ内に含まれる半波の数は奇数であることが確認された.コリオリ力も含めた理論解析を行い表面波の運動が進行波的であるという特徴的な現象は液体の運動に作用するコリオリ力の影響であることを解析的に明らかにした.
転写終結因子Rhoの終結シグナル識別機構

転写終結因子ρ蛋白の機能的特色は転写産物RNAを相互作用の標的とすること,およびそれにATPase反応が共役していることにある.本研究ではこうした反応の分子的基盤を解明するために,先に分離した変異ρ因子を利用して以下の解析を行った.1.変異部位の同定とその機能的効果-数種の変異ρ遺伝子のDNA塩基配例を決定し,それに基き蛋白一次構造を解読したところ,構成アミノ酸419個中,計4箇所の残基に変異が見出された.さらに各残基は次のようにそれぞれ異る機能に関連することが示された-残基3,長鎖RNA結合能;残基156, ATPase反応と転写終結の共役;残基304および323,短鎖RNA相互作用.2.転写終結シグナルの同定-上記変異ρ因子中, 323番残基の置換したものは同時に転写終結部位特異性が変化していた.そこで,正常部位と異常部位の周辺のRNA塩基配列を詳細に比較したところ, 3′末端数残基に系統的な差があり,野生型ρはアデニンに富む配列を選り好みするのに対し,変異型ρは逆にそれを忌避することが判明した.従ってρはRNA鎖の3′最末端部の配列を終結シグナルとして識別している可能性が新たに示唆された.3.ρ蛋白の機能ドメイン編成-ρ蛋白の一次・二次構造を既知のATPaseのそれと比較したところρ蛋白の中央約200残基に共通性が認められ,この領域がATPase活性を担う機能ドメインを構成するものと推定された.これより上述の変異箇所中, 156, 304, 323番残基は直接または間接にATPaseドメインに関連すること,対して3番残基は別のドメインに属することが判った.以上の結果から, ρ因子とRNA間の相互作用の様式とρ蛋白の機能ドメイン構成について重要な手掛りが得られた.これらの知見を基に, ρ因子の分子作用機構を更に掘下げて行きたい.転写終結因子ρ蛋白の機能的特色は転写産物RNAを相互作用の標的とすること,およびそれにATPase反応が共役していることにある.本研究ではこうした反応の分子的基盤を解明するために,先に分離した変異ρ因子を利用して以下の解析を行った.1.変異部位の同定とその機能的効果-数種の変異ρ遺伝子のDNA塩基配例を決定し,それに基き蛋白一次構造を解読したところ,構成アミノ酸419個中,計4箇所の残基に変異が見出された.さらに各残基は次のようにそれぞれ異る機能に関連することが示された-残基3,長鎖RNA結合能;残基156, ATPase反応と転写終結の共役;残基304および323,短鎖RNA相互作用.2.転写終結シグナルの同定-上記変異ρ因子中, 323番残基の置換したものは同時に転写終結部位特異性が変化していた.そこで,正常部位と異常部位の周辺のRNA塩基配列を詳細に比較したところ, 3′末端数残基に系統的な差があり,野生型ρはアデニンに富む配列を選り好みするのに対し,変異型ρは逆にそれを忌避することが判明した.従ってρはRNA鎖の3′最末端部の配列を終結シグナルとして識別している可能性が新たに示唆された.3.ρ蛋白の機能ドメイン編成-ρ蛋白の一次・二次構造を既知のATPaseのそれと比較したところρ蛋白の中央約200残基に共通性が認められ,この領域がATPase活性を担う機能ドメインを構成するものと推定された.これより上述の変異箇所中, 156, 304, 323番残基は直接または間接にATPaseドメインに関連すること,対して3番残基は別のドメインに属することが判った.以上の結果から, ρ因子とRNA間の相互作用の様式とρ蛋白の機能ドメイン構成について重要な手掛りが得られた.これらの知見を基に, ρ因子の分子作用機構を更に掘下げて行きたい.
ドイツ《概念法学》形成過程における法と言語の関係の史的分析

《概念法学》の創始者とも目されるF.C.サヴィニの法学は、リュケァトの重要な研究の登場以来、とりわけカント以降の観念論哲学との関係での研究が、まさにサヴィニの言語使用の分析を通して進められてきた。しかしサヴィニの法学の典型である古典ローマ法学について、サヴィニがローマ共和政からの、国制史的断絶を超えた有機的発展の成果であることを強調するとき、この構想の背後に、市民的人文主義以来の問題構成が鮮やかにあらわれる。こうした大きな見通しを史料的に補強するために、サヴィニの重要な作品『使命』の厳密な翻訳を行うとともに、サヴィニのタキトゥスおよびF.ベイコンとの関係を明らかにする仕事を執筆しえた。今年度も研究は迷走を続けたが、そのために思いがけない発見があった。Savignyの言語と法学の関係の分析の一環として、彼の著名な作品Vom Beruf unsrer Zeit für Gesetzgebung und Rechtswissenschaftの翻訳を行っているが、その第一章は公刊され、第二章は校正中である。最近のSavigny研究が凡そ言語の問題に鈍感であるため、最近のSavignyに係るモノグラフィを徹底的に批判する書評を、いわゆるサヴィニー雑誌の依頼に応じてドイツ語で執筆し、マヌスクリプトを手渡した。Savigny研究の途上で、Savignyの法学理解にTacitus的な視角、Bacon的な視角が大きく影響していることに気づき、この点から現在論文を執筆中である。その過程で、Dirksenを指導した古代史学者Süvernとの関係を詰める必要が生じ、全体の研究に脈絡がついてきたと同時に、大きな歴史的パースペクティヴが得られたことは喜ばしい。しかし、Adversariaの編集作業がー大阪市大の組織的激動と相まってー決定的に遅延しており、この点で、研究条件の劇的な改善が望まれてならない。研究実績としては、サヴィニーの『使命』翻訳が最も重要である。全12章のうち、7章までをほぼ訳出し終えたが、とりわけ7章については訳註作成になお難航が見込まれる。今年度中に第2章を公表することができた。これに緊密に関連して、論文「『使命』における、サヴィニの慣習法論について」を法学雑誌60巻(2014)に公刊し得た。これは18世紀後半の慣習法論とサヴィニの慣習法論との関連性を重視し、サヴィニの慣習法論を観念論哲学との関係でのみ捉えることに適切な限度で警戒すべきことを指摘したものである。サヴィニの慣習法論の論点では、2013年初夏にスウェーデンのストックホルム大学で行われたシンポジウムにおけるドイツ語による招聘講演において、サヴィニとイギリス近世の経験論哲学者F・ベイコンとの意外且つ重要な知的近縁性を指摘し、併せて、サヴィニにおけるタキトゥス主義および市民的人文主義の伝統の継続をも指摘した。かくて、サヴィニの法学に多角的に光を当てる試みは成功したが、他方、Dirksenとの関係を詰める作業は、サヴィニのテクストの複雑性を目の当たりにしたつけで、遅々として進まない。ただし、ストックホルム講演の準備過程で、Dirksenに大きな影響を与え、またプロイセンの教育制度改革にも大きな役割を持つことでサヴィニと接点を持つ、Suevernという古典学者がTacitusを評価した論文に接しえたことは大きい。ストックホルム講演のドイツ語原稿は2014年1月にストックホルムに送付した。なお、法史学研究で最も権威のある(ことになっている)サヴィニ雑誌に、最近の若手によるサヴィニ研究書の書評を依頼により執筆、公表した。Adversariaの作業は遅々として進まない。研究実績は、失敗と成功との奇妙な混淆となってしまった。失敗の記録から報告する。研究計画の第一に掲げた、サヴィニーの手稿Adversaria Iの編集作業は困難を極めている。手稿に携わる者は、公刊業績を熟知していなければならない。何度も、サヴィニーの、公刊されたローマ法史研究を読み直す必要に迫られた。編集は遅々として進まない。ディルクセン研究については、必ずしも失敗ではない。法制史の世界的に代表的な雑誌『サヴィニー雑誌』にドイツ語論文を公刊することができた。そのほか、続けてこの忘れられたサヴィニー批判者のテクストを丹念に読み、ノートを作成している。ディルクセンが強く意識するフランス人文主義法学者BrissoniusのDe Formulis etsolennibusを購入し得たのは有難かった。前述の失敗は、但し、思わぬ成果を齎した。サヴィニー没後150年に当たる2011年10月24・25日に、フランクフルト大学に於て、マックス=プランク=ヨーロッパ法史研究所主催のシンポジウム

《国際的なサヴィニー?》において、日本におけるサヴィニー研究について明治期から1945年に至るまでを分析し、自らのサヴィニー像の批判的相対化を試みる報告を行った。このシンポジウムの成果は論文集として公刊される予定で、わたくしの原稿は2012年1月末に、すでに編集部に引き渡してある。また、法と言語の関係を日本法との関係で考察する場合に鍵を握る人物だと感じていた、徹底的な《概念法学》批判者来栖三郎について、戦中の業績を立ち入って分析した。民法学者としての自意識に強烈に規定された来栖の思考に、サヴィニーとの並行性がかなり明瞭に見てとれることは思わぬ成果であった。大阪市大で2012年3月2325日に開催された日独法学シンポジウムで日独双方の言語で報告した。これも公刊予定である。Adversariaの編集作業が遅延を重ねているため、一面から見れば、やや研究の進展が遅れていると言わざるを得ない。まとまった研究時間がほしいが、現在の大阪市立大学大学院法学研究科教員には、それがきわめて困難なのである。歯を食いしばって研究する以外にない。ただ、Savigny研究そのものとの関係では、思わぬ方角から、人文主義と近代との結節点が鮮やかに浮かび上がってきたという感触を得た。これまでにはドイツ語やそのほかの言語による研究でも明らかでなかった近世・近代のヨーロッパ思想史との脈絡がつかめてきた。その意味では、思いがけぬ研究の進展が見られたと思う。評価には悩んだ。この期間、法と言語の関係について、ずっと考え続け、また書き続けてきたのは確かである。論文も執筆し、国際シンポジウムにおける報告も行った。重要な図書も購入できた。「遅れている」とは言いたくない。しかし、研究を真剣に行えば、蛇行せざるを得ないという凡庸な真実と向き合わねばならなかったのも事実である。「おおむね順調」という言葉に内心忸怩たるものを感ずるのである。Adversariaの編集作業は、困難を極めている。ただし、「研究の難しさ」といった修辞に甘んじたくはないのである。まずは、2013年5月末にストックホルムで開催されるシンポジウム「観念論哲学と法律家」での招聘講演のために、SavignyとBaconの深い関係を指摘する研究を進めたい。DirksenとSavignyとの関係の洞察も、この研究をてことして質的に深化させたい。同時に、可能な限り、Adversariaの編纂を行いたい。全体は、19世紀ドイツの新人文主義研究としての性格を強く持つようになってきた。それは当然の帰結ではあるが、この方向を、Civic Humanismとの関係に留意しつつ深めていきたい。Adversaria Iの編集作業を、可能な限り進めたい。これとの関係で、サヴィニーの公刊された業績の精読も、続けねばならない。またDirksenの論文の学説史的理解も深めていきたい。そのために、サヴィニーやディルクセンの作品で引用されてある文献の理解にもつとめたい。2011年度の作業に於て、言語と法の問題を考える場合に、日本語と日本法学史の問題にあらためて直面することともなった。当り前ではある。来栖三郎を手掛かりとして、この側面の問題も避けることができなくなった。
生体分子の動力学計算に対する階層的データマイニングの開拓と薬理の動的機構への応用

化学反応における揺らぎの重要性は、実験技術の進展によって、集団平均ではなく1分子レベルの計測が可能になることで注目されている。1分子レベルの反応過程では、分子内に非平衡性が存在する場合、エネルギー・情報の流れを伴った動力学的な効果が予想される。しかし、そのような可能性は未開拓な研究分野である。本研究はこのような動力学的効果を抽出するデータマイニングの開拓と応用を目指す。生体分子のように時空間に階層性が存在する場合、複数の階層に渡るエネルギー・情報の移動が生じる。それらを解明する階層的データマイニングを発展させ、それを応用して新たな動力学的薬理の可能性を明らかにすることが、本研究の使命である。
哺乳類神経細胞におけるmRNA・新生ペプチド鎖の品質管理とその生理的意義

翻訳停滞に起因するmRNA・新生タンパク質品質管理機構Ribosome-associated Quality Control (RQC)に関わる因子の脳神経系における機能解明を目的として、昨年度までにRQC誘導に必須なZNF598のマウス海馬におけるノックダウンモデルが長期記憶の阻害を示す結果が得られていた。本年度は、ZNF598が細胞体だけでなく、シナプスにも存在すること、ZNF598自身の発現がシナプス刺激により減少すること、ZNF598が神経細胞において全タンパク質合成レベルを抑制することを示唆するデータが得られた。これらの結果は神経細胞におけるZNF598による翻訳抑制が長期記憶の形成に必須な役割を果たすことを示唆している。また、RQCにおいて新生ペプチド鎖の分解に必須なE3 Ligase、LTN1の発現抑制が神経突起伸長を阻害する結果が昨年度までに得られていた。RQCにおいては、mRNAから解離後の60Sリボソーム上でCAT tailと呼ばれるAla、Thrからなるペプチドタグが新生ペプチド鎖のC末端に付加される。これによりリボソームトンネル内の新生鎖のリジン残基がリボソーム外へ押し出され、LTN1による効率良いユビキチン化が促進される。この反応は出芽酵母ではRQC2によって行われる。一方、LTN1欠損によりCAT tailが付加された異常新生鎖が蓄積すると凝集体形成を誘導することが出芽酵母において示されている。今回、RQC2の哺乳類ホモログであるNEMFの解析を進め、NEMFが哺乳類細胞においても終止コドンを欠失したnonstop mRNAの翻訳時にCAT tailと考えられる配列を新生鎖に付加すること、nonstop産物が核内凝集体を形成すること、LTN1 KDによる神経突起伸長阻害がNEMFとのダブルKDによりレスキューされることが明らかにされた。当研究室で解析が進められてきた出芽酵母のRQC因子Hel2/RQT1、RQT2、LTN1の哺乳類ホモログであるZNF598、hRQT2、Listerinの解析を行った。GFP及びHis3遺伝子の間に、出芽酵母においてRQCを誘導することが知られている連続したリジン配列(Lys(AAA)24)をin-frameで挿入したレポーターをHEK293T細胞に導入し、上記因子のノックダウンの影響をウェスタンブロットにより解析した。その結果、ZNF598、およびhRQT2のノックダウンは、いずれもLys(AAA)24における翻訳停滞効率の低下、翻訳停滞による短い新生ペプチド鎖の減少が観察され、これらの因子がRQCの誘導に必須な役割を果たすことが示された。一方、ListerinのノックダウンではLys(AAA)24における翻訳停滞産物の蓄積が観察され、出芽酵母LTN1と同様に、Listerinが翻訳停滞産物の分解に関与することが確認された。以上の結果より、基本的なRQCの分子機構は出芽酵母から哺乳類まで保存されていることが示された。RQC因子の個体における機能を明らかにする目的で、本研究では特にマウス海馬におけるZNF598およびhRQT2の機能解析を行っている。これまでに、shRNAを発現するAAVをマウス海馬に導入しノックダウンモデルを作製することに成功しており、これらのマウスを用いた行動解析を開始している。これまでに、ZNF598、hRQT2、Listerinが哺乳類細胞におけるRQC因子として機能することがHEK293T細胞におけるレポーター解析により確認された。また、マウス個体を用いた高次脳機能におけるRQC因子の解析を開始しており、すでにノックダウンモデルの作製を確立し、予備的な行動解析データが蓄積しつつある。また、RQCの内在性標的を同定するために次年度に計画していたリボソームプロファイリングについてもすでに実験を開始しており、これらについては当初の計画以上に進展している。一方で、神経細胞における品質管理因子の発現や局在の確認についてはまだ充分な解析が行うことができていない。ZNF598はHEK293T細胞だけでなく神経細胞にも発現し、神経細胞では主に細胞質に局在し、一部は樹状突起においても検出されることが確認された。一方、RQT2、Listerinについては免疫染色に使用できる抗体が見つかっておらず、ウェスタンブロットによる発現の確認にとどまっている。hRQT2についてはHEK293T細胞における発現は確認されたが、マウス細胞において使用できる抗体が見つかっておらず、マウス個体におけるタンパク質レベルでの発現の確認ができていない。このため、現在、GFPタグを付加した因子の作製を行っており、局在の確認に用いる予定である。翻訳停滞に起因するmRNA・新生タンパク質品質管理機構Ribosome-associated quality control(RQC)に関わる因子の脳機能における機能を明らかにする目的で、昨年度までに確立したRQC誘導に必須なZNF598およびASCC3の海馬におけるノックダウン(KD)モデルマウスを用いて、複数の高次脳機能解析を行った。その結果、ZNF598 KDマウスでは不安の亢進、長期記憶の異常が確認された。一方、ASCC3 KDマウスでは、ZNF598 KDマウスと同様の長期記憶の異常と、不安の抑制・脱抑制という逆の表現型が観察された。また、ASCC3 KDマウスでは短期記憶の異常も確認された。また、ZNF598、ASCC3および、RQCにおいて新生タンパク質分解に必須なE3ユビキチンライゲースLTN1の神経突起伸長における機能を確認する目的で、これらの因子をノックダウンした初代培養神経細胞を用いて、神経突起形態の複雑性を定量するSholl解析を行った。

これまでに、LTN1 KDにより神経突起複雑性の低下が確認され、さらに、LTN1とZNF598あるいはASCC3との二重KDにより神経突起の形態異常がレスキューされることが示され、翻訳停滞産物の蓄積が神経突起伸長を阻害することが示唆された。一方、ZNF598, ASCC3の単独KDでは突起伸長の異常は観察されなかった。以上の結果から、RQCに関わる各因子は神経細胞の異なる発達段階で異なるレベルの重要性を示すことが明らかにされた。神経突起伸長の初期段階では、RQC誘導は必須ではないものの、翻訳停滞産物の除去は重要であり、一方、成熟ニューロンにおいてはRQCの誘導自体が認知機能制御に重要な役割を担うことが示された。これまでに、ZNF598、ASCC3ノックダウンマウスについて、主要な高次脳機能解析を完了しており、長期記憶の障害や不安の異常といった表現型が観察されている。また、初代培養神経細胞を用いた神経突起の複雑性の解析においては、異常な翻訳停滞産物を除去するLTN1のノックダウンが神経突起伸長を阻害することが示された。以上のように、品質管理因子の脳機能制御における役割を例示することに成功しており、本研究の目的の一つであるRQCの脳機能における重要性の解明という点において、研究は順調に進展していると考えられる。一方、神経細胞におけるRQCの分子制御機構についてはまだ解析が十分に進んでおらず、特にリボソームプロファイリング等によるRQC標的の同定や、神経細胞内における因子の局在について、今後更なる解析を進める必要がある。翻訳停滞に起因するmRNA・新生タンパク質品質管理機構Ribosome-associated Quality Control (RQC)に関わる因子の脳神経系における機能解明を目的として、昨年度までにRQC誘導に必須なZNF598のマウス海馬におけるノックダウンモデルが長期記憶の阻害を示す結果が得られていた。本年度は、ZNF598が細胞体だけでなく、シナプスにも存在すること、ZNF598自身の発現がシナプス刺激により減少すること、ZNF598が神経細胞において全タンパク質合成レベルを抑制することを示唆するデータが得られた。これらの結果は神経細胞におけるZNF598による翻訳抑制が長期記憶の形成に必須な役割を果たすことを示唆している。また、RQCにおいて新生ペプチド鎖の分解に必須なE3 Ligase、LTN1の発現抑制が神経突起伸長を阻害する結果が昨年度までに得られていた。RQCにおいては、mRNAから解離後の60Sリボソーム上でCAT tailと呼ばれるAla、Thrからなるペプチドタグが新生ペプチド鎖のC末端に付加される。これによりリボソームトンネル内の新生鎖のリジン残基がリボソーム外へ押し出され、LTN1による効率良いユビキチン化が促進される。この反応は出芽酵母ではRQC2によって行われる。一方、LTN1欠損によりCAT tailが付加された異常新生鎖が蓄積すると凝集体形成を誘導することが出芽酵母において示されている。
HLA領域にマップされる免疫病の原因遺伝子と同定の分子機構の解明

HLAクラスl領域に原因遺伝子がマップされる免疫病のうち、HLA-B51と相関するベーチェット病、HLA-Cw6とCw7に相関する尋常性乾癬、HLA-B27と相関する強直性脊椎炎に注目し、それらの原因遺伝子の同定をめざして、まずHLA領域の散在する19個の多型をしめす遺伝マーカーを利用して、原因遺伝子のマッピングを施工した。その結果、ベーチェット病はHLA-BとMICA遺伝子周辺の非HLA遺伝子、尋常性乾癬はHLA-C遺伝子周辺の非HLA遺伝子、強直性脊椎炎はHLA-B27遺伝子それ自身が原因遺伝子と、考えられた。そこで、ベーチェット病のHLA-BとMICA遺伝子周辺の非HLA遺伝子、並びに尋常性乾癬のHLA-C遺伝子周辺の非HLA遺伝子の単離のために、クラスl遺伝子領域についての構造解析を行った。すなわち、MICA-HLA-A-HLA-C遺伝子付近をカバーするコスミドクローン14個の計452kbの塩基配列を決定した。そこで、これらの塩基配列のデータについて、BLASTn、BLASTx、FASTAの各プログラムを用いたホモロジー検索を行い、またコーディングやエキソン領域の予測は、X-GrailとHEXONの各プログラムを用いて行った。ホモロジーの検索やコーディング領域の予測により、遺伝子の存在が予想された領域について、塩基配列データに基づいて設計したプライマーを用いたRT-PCR、ノザンハイブリダイゼーション、cDNAライブラリーのスクリーニングによるcDNAクローンの単離により、新発現遺伝子の同定を行った。その結果、この領域に21個(これらの内、10個は既知の遺伝子で11個が新遺伝子)の遺伝子とESTとヒットする7ケ所の領域をみいだすことができた。また、この領域に、35個のdinucleotide繰り返しが見い出され、今後本領域にマップされる疾患の感受性遺伝子の同定に有効な遺伝マーカーになると考えられた。
相対論効果を考慮したITERスケールプラズマの反射法シミュレーション研究

ITERのような電子温度が10keVを超えるような核燃焼プラズマにおいては,マイクロ波計測における高温電子の相対論効果は無視できない。相対論効果によって電子質量は実効的に重くなり,それによって電子プラズマ周波数ω_<pe>が小さくなるので,これに関係するマイクロ波のカットオフ周波数が大きく変化するからである。相対論効果による電子質量の増加AはA=1+T_e/204で与えられ,これから電子質量の増加割合は電子温度T_e=20keVで約10%, 40keVでは約20%になることが分かる。これは無視することの出来ない大きさである。本研究では,干渉計も含め反射計計測おける電子の相対論効果の影響について超短パルス反射法のFDTDシミュレーションも含めた解析を行った。干渉計計測と反射計計測に関しては,モデル密度分布を仮定して電子の相対論効果の影響に関する理論解析も行った。結果,密度分布を決定するアーベル逆変換の式に電子質量の相対論的補正Aを考慮することによって正しい密度分布が得られることが明らかになった。具体的には,反射計計測の場合アーベル逆変換式の中のω_<pe>をω_<pe>/A^<1/2>で置き換えることによって電子質量の相対論補正が取り入れられる。また干渉計計測では密度分布に対するアーベル逆変換式にAをかけることによって相対論補正が取り入れられる。これらの解析結果は,超短パルス反射法に関するFDTDシミュレーションの結果とも一致している。干渉計計測や反射計計測において,アーベル逆変換式に相対論補正Aを考慮することによって密度分布の正しい再構成が得られることが明らかになったが,実際にこれを実施するには電子温度Teの空間分布を前もって計測しておく必要があり,これはマイクロ波計測における新たな課題となる。
分別解体容易な軸組み工法接合部の開発

解体や部材の回収が容易な接合方法の開発を目的に、一般的な接合具である種々の長さの釘と木ネジの取り付けや取り外しの作業時間を測定した。同時に部材の再利用を困難にする接合具の取り残し量を調べた。その結果、1)釘は木ネジに比べ作業時間が長く、釘長が長くなると作業時間も増加した。2)全220本の内2.4%の木ネジがネジ頭のつぶれにより残留したが、釘の残留した割合は1.2%であった。すなわち木ネジは釘よりも取り外しが容易であるが、取り付け時にネジ山をつぶさないことに注意する必要があり、この点で直径の大きな接合具であるボルトやラグスクリュー,ドリフトピンの方が分別解体には適していることがわかった。これらの結果を踏まえ,本研究では取付け具としてボルトまたはドリフトピンを用いた柱と土台の接合方法を考案した。設計した接合部は、直径16mm、長さ210mmの鉄パイプを柱の軸心に挿入し、3本のボルトまたはドリフトピン(φ12)で止めつけられる。この接合は柱のホゾ加工の必要がなく、木材の加工も電動ドリルを用いて簡単にできることに特徴がある。またドリフトピンには軽量の鉄パイプを用い、端部にネジ加工を施してあるため電動ドライバを用いることで取り外しが容易である。柱-土台接合部の引抜き試験の結果、本接合部の許容耐力は1.5kNあり、実用上問題のないことが確認された。1.接合具の解体作業能率の調査対象は木造で一般的な釘と木ねじの2種類で、それぞれ接合具長の異なる3種類について調べた。部材は105mm正角のスギとベイマツで、ハンマとくぎ抜き(釘)、インパクトドライバ(木ネジ)を用いて、接合具(10本)の取外し(取付け)作業にかかる作業時間、作業前後の作業者の心拍数変化を測定した。予備作業を経験した主として20代の男女6名について調べた結果、釘は木ネジに比べ取外しに時間がかかり、釘長が長いほど負担も大きくなるのが認められた。スギに比べ密度の大きいベイマツは、概して作業時間が長かったが、電動工具を用いた木ネジの場合、ネジ長の違いや樹種による差は小さい。また別途行った木ネジ接合金物の取外し作業では、施工時に十字穴が潰れたものや、取外しの際にネジ頭が破断するものが存在し、これらの取外しは困難を極めた。すなわち木ネジの場合、施工時の取付けの良否や、接合具の強度について再考の余地があることがわかった2.再利用材の材質調査解体作業において予め不良部材の特定ができれば、当該部材について手作業による丁寧な解体の必要がない。本年は雨ざらしで約5年を経た壁長1820×1820(mm)、高さ2730mmの軸組み(材;スギ)について、解体前の簡易な欠陥材識別方法を検討した。具体的には解体前後の部材のたわみ振動法による共振周波数を求め、材質や接合部劣化を示す指標としての可能性を調べた。解体前の接合状態をピンと剛の2通りで評価し、解体前後で計算した部材のヤング係数Eを比較すると、長尺(柱)で劣化の程度が小さい材ほど前後のEに大きな差がなく、Eが小さい方が剛接合の評価に近づいた。Eが大きい材ほど解体前にピンと剛の中間的な値を示し、短尺(桁)で劣化が顕著な材では、ばらつきや解体前後の差がかなり大きいことがわかった。(1)再利用材の材質調査壁長1820×1820(mm)、高さ2730mmの軸組みで、建築後ほぼ雨ざらしのまま約5年が経過した建物を対象に再利用時に問題となる部材の劣化について調べた。部材は全てスギで、劣化が比較的軽微な柱材を対象に、打撃振動法によるヤング係数を求めた。測定は断面の分割数を徐々に上げながら行い、最後は約15×15mm、長さ800mm程度の棒状に分割した。

各分割数で縦およびたわみによるヤング係数を調べ、断面内部のヤング係数分布を求めた。また同一部材の一部を、釘と木ねじの引抜き試験に供し、これらの接合性能を調べた。解体部材は、概して内部より外周のヤング係数が大きく、同時にばらつきも大きかった。縦振動とたわみ振動で比較すると、劣化の大きい外周部で比較的大きな差が認められた。(2)接合具の取り残し調査釘と木ねじの2種類を用い、スギとベイマツの健全材を対象に、取外し作業を延べ6名の作業者で行った。接合具は断面105×105(mm)、長さ約1mの正角材に、長さ方向に10本、1列(10cm間隔)に取付けた接合具を取り外し、部材への取り残し量を調べた。作業にはハンマとくぎ抜き(釘)、インパクトドライバ(木ネジ)を用い、数回の予備作業を体験した20代の男女を作業に当てた。接合具で釘と木ねじを比較すると、ネジ頭のつぶれや捩じ切れによって木ねじの方がより多く残留した。これを樹種別に比較すると比重の大きいベイマツはいずれの接合具でも取り残し量が多くなった。1.解体作業に適した接合具木造建築で多用される一般的な釘と木ねじの2種類を対象に、種類や接合具長の違いが解体作業の能率に及ぼす影響を調べた。スギとベイマツを対象に、ハンマとくぎ抜き(釘)、インパクトドライバ(木ネジ)を用いて、接合具(10本)の取外し(取付け)作業にかかる作業時間、作業前後の作業者の心拍数変化を比較した。20代の男女6名について調べた結果、釘は木ネジに比べ取外しに時間がかかり、釘長が長いほど負担も大きかった。スギに比べ密度の大きいベイマツは、概して作業時間が長くなるが、電動工具を用いた場合、ネジ長の違いや樹種による差は小さい。木ネジの取外し作業は、施工時に十字穴が潰れたり、取外しの際にネジ頭の破断が見られ、これらの取外しは困難を極めた。部材への取り残し量を調べたところ、木ネジの方が多く残留する傾向にあり、樹種では比重の大きいベイマツで多くなった。接合具に釘や木ネジを用いた場合、信頼性や施工性の面では優れるが、解体材の再利用を考えるとボルトやドリフトピンの方が有利であることがわかった。2.再利用材の材質雨ざらしの状態で約5年を経た壁長1820×1820(mm)、高さ2730mmの軸組み(部材;スギ)について、部材の材質劣化を調査した。解体直前の部材の健全さを知る手法の確立を目指し、解体前後の部材の振動法による共振周波数を求めたところ、長尺(柱)で目視による劣化の程度が小さい程前後の測定Eに大きな差がなく、短尺(桁)で劣化の顕著な材では、ばらつきや前後の差が大きかった。劣化が比較的軽微であった柱材を対象に、部材断面内部のヤング係数分布を調べたところ、外周のヤング係数が大きく、同時にばらつきも大きかった。縦振動とたわみ振動で比較すると、劣化の大きい外周部で比較的大きな差が認められ、材質判定にはたわみ振動法が適していることがわかった。
使用者に応じた知能化空間実現のための再構成可能な擬人化インタフェースに関する研究

本研究では,家庭の機器やセンサ同士が連携し,ユーザに情報を提示する知能化空間において,使用者の属性に合わせて,擬人化インタフェースを再構成する仕組みを提案する.本研究では,知能化空間で動く機器に対し,擬人化された表現を身の回りの機器に付与させる.その際,対象に付与させる属性として,人間の身体を想起させるような,明示的な擬人化要素だけでなく,対象が擬人化されているようにユーザに想起させる,仕草・ジェスチャ,応答時間,さらには姿勢・高低などの暗示的な擬人化表現も利用し,ユーザに過度の認知的な負荷をかけることなく,情報提示への集中度を向上させ,親近感を与える.本年度は,まずロボットデバイスの開発を行い、対象が直示できる物体だけでなく、対象に直接触れ合えない空間を顕在化し、存在感をインタラクションにおける障壁として使用する情報提示手法について新たに提案を行ない、この内容をヒューマンコミュニケーション基礎研究会へ投稿した。さらに、老人を対象とした擬人化表現の評価実験分析結果より、従来のマニュアルを用いた手法に比べて、擬人化手法は老人の学習に対する感情値を上げること、音声のみを用いた従来の対話手法に比べ、擬人化しジェスチャを介した手法は、位置に依存した機器の機能の記憶量を増加させることが判明した。これらの実験の印象評価から、擬人化表現が文化に関わらず解釈されうることを確認した。これらの結果について、ユビキタスコンピューティングに関する国内研究会UBI27に投稿を行ない、その結果優秀論文賞を受賞した。また、ロボットに関する国際会議IROS,RO-MANへも投稿を行ない、研究結果が採録された。以上の成果より、本研究者が提案した研究課題『使用者に応じた知能化空間実現のための再構成可能な擬人化インタフェースに関する研究』について、採用期間内に十分な成果が達成出来たと考えられる。
初乳に含まれる胃粘膜細胞増殖分化因子の精製と遺伝子のクローニング

初乳中の胃粘膜増殖分化因子の精製をおこなうために、胃表層上皮粘液分泌細胞に分化しうる胃未分化上皮細胞の初代培養系を確立した。ラット胃粘膜より単離した胃粘膜細胞をcounterflow elutriationを用いて分離し、強いc-fos発現とDNA合成のみられる未分化増殖上皮細胞を得た。本細胞を培養すると3日後には、confluentなmonolayerとなり、わずかに粘液を産生したが、胃粘膜の他の上皮細胞への分化を示す遺伝子発現はみとめられなかった。このconfluent monolayerに、初乳の乳清を10%含むmediumを添加すると上皮細胞の急速なDNA合成の増加と粘液産生細胞への分化がみとめられた。さらに、粘液分泌の増加と一致してPGE_2のEP_2受容体の遺伝子発現の亢進がおこることが明らかとなった。そこで、胃粘膜上皮細胞のDNA合成促進、粘液分泌亢進、PGE_2、EP_2受容体遺伝子発現を指標に、乳清に含まれる増殖、分化因子の精製をこころみた。まず、乳清を抗ラットEGF抗体を結合させたアフィニティーカラムに通し、EGFを除いた後に、Mono-Qイオン交換カラム、ヘパリンセファロースアフィニティーカラム、ゲルロ過カラムを用いて分画をおこなった。胃粘膜上皮のDNA合成を促進する物質は、ヘパリン結合性を有する分子量約3万の蛋白質であり、HGF、FGF、KGFとは異なった未知の物質であった。一方、粘液分泌亢進とPGE_2受容体の発現を亢進させる物質は、分離することができず同一の物質であると考えられた。この物質はヘパリン結合性のない分子量約2万の蛋白質で糖鎮を有すると考えられた。現在、この2種の蛋白質のアミノ酸分析をすすめており、ひきつづいてcDNAクローニングをおこなう。
ミトコンドリア内c-Src活性制御に関わる新規相互作用タンパク質の同定と機能解析

c-Srcは、増殖、分化、生存といった細胞の根源的機能に関与する非受容体型チロシンキナーゼである。本研究では、エネルギー代謝支配因子であるミトコンドリア内c-Srcの活性制御に関与する新規相互作用タンパク質の同定と機能解析を目的とする。血清含有培地に比べ酸素消費能の顕著な減少が観察された血清飢餓培地条件下で培養したT98G細胞からスクロース密度勾配法を用いてミトコンドリアを回収し、以下の解析結果を得た。(1)血清飢餓条件においてミトコンドリアc-Srcキナーゼ活性が減少した。(2)ミトコンドリアc-Src複合体構成が顕著に変化した。(3)プロテオーム解析を行い、相互作用量が減少するタンパク質としてAT P 5 A1を同定した。(4)AT P 5 A1を過剰発現させると、Srcキナーゼ活性および酸素消費能が増加した。これらの結果は、細胞質とは異なるミトコンドリア特有の環境下における新規のc-Src活性制御機構の存在を示すものである。ミトコンドリアのエネルギー産生異常は、脳筋症や肥満症および2型糖尿病をはじめとするエネルギー代謝疾患の原因になりうることから、本成果が新薬開発の現場に新しい戦略を与えると期待される。ミトコンドリア機能制御に関与する非受容体型チロシンキナーゼc-Srcの活性制御機構の解析を行った。増殖因子刺激により、酸素消費能、呼吸鎖複合体IV活性、ミトコンドリアタンパク質チロシンリン酸化、さらには、ミトコンドリア内c-Srcキナーゼ活性の増加が観察された。昨年度の解析からこのキナーゼ活性の増加には、自己リン酸化部位(419番目のチロシン残基:ヒト)のリン酸化は関与せず、複合体構成タンパク質の変化が関与するものと考えられた。そこで、ミトコンドリア内c-Src複合体を免疫沈降法により精製した後、二次元電気泳動法と質量分析装置による解析を行った。c-Src相互作用タンパク質として、22種類のミトコンドリアタンパク質を同定した。その中でも、キナーゼ活性の増加に伴って、相互作用量が増加する呼吸鎖複合体V(ATP合成酵素)のalphaサブユニットであるATP5A1を同定した。次いで、ATP5A1がキナーゼ活性に与える影響を解析する目的で、ヒトATP5A1をクローニングした後、FLAG-tagを融合した発現ベクターを作製した。次いで、このベクターを一過的に細胞に遺伝子導入した後、c-Src複合体を精製し、in vitro kinaseアッセイを行った。この複合体では、ATP5A1の相互作用量が増加しているだけでなく、キナーゼ活性が著明に増加していた。これらの結果は、形質膜下に存在するc-Srcとは異なるミトコンドリア内特有のc-Src活性制御メカニズムが存在することを示すとともに、ATP5A1との相互作用によりキナーゼ活性が制御されることを示唆している。ミトコンドリア内c-Srcは、エネルギーや活性酸素種産生、さらには、細胞死制御に重要な役割を果たすことから、活性制御メカニズムを解明することは、肥満や糖尿病、神経変性疾患等の加齢性疾患の発症や予防に重要な知見を与えると考えられる。申請者は現在までにc-Srcがミトコンドリアにおいて機能的に発現すること、および、このキナーゼ活性が酸化的リン酸化の制御を通して細胞内ATP量を調節することを解明してきた。さらに、細胞質内とは異なる微小環境であるミトコンドリア内特有のc-Src活性制御メカニズムが存在し、このメカニズムにc-Src複合体構成の変化が関与する可能性を見出している。本年度は、ミトコンドリア機能変動およびc-Src活性変動が認められた刺激条件下(過酸化水素、増殖因子、栄養因子)おいて、細胞からミトコンドリア分画を得た。その後、c-Src特異的な抗体を用いて免疫沈降法を行い、ミトコンドリア内c-Src複合体を精製した。その後、このc-Src複合体をトリプシン処理し、質量分析により切断されたペプチドを同定することによって、複合体構成タンパク質を決定した。

次いで、二次元電気泳動法による複合体構成タンパク質の解析からリン酸化、アセチル化、酸化修飾を含めた翻訳後修飾情報を得た。これらの同定タンパク質の多くは、ミトコンドリア特有の新規相互作用タンパク質であり、刺激条件により増減を示した。現在、直接活性制御を担う因子を決定すべく解析を進めている。研究実施計画に従い、研究目的であるミトコンドリア内c-Src複合体解析を行った。二次元電気泳動法および質量分析によるプロテオーム解析により新規c-Src相互作用タンパク質を数十種類同定した。さらに、これらの相互作用タンパク質は、刺激条件によりさまざまに増減することも見出した。また、in vitro kinaseアッセイによる解析から、その中の複数のタンパク質がミトコンドリア内c-Src活性を直接制御する情報も得ている。このため、研究計画の変更等もなく、当初の計画通りに研究実施がなされている。同定された新規ミトコンドリア内c-Src複合体タンパク質によるc-Src活性制御の分子メカニズムを詳細に検討するため、Src分子との結合領域をGSTプルダウンアッセイおよび相互作用タンパク質特異的な抗体を用いた免疫沈降法を用いて決定する。さらに、領域欠損型および一アミノ酸置換によるリン酸化部位欠損型(Y→F、S,T→A)の変異体分子を作製し相互作用メカニズムを明らかとする。また、これらの分子がエネルギー産生、活性酸素種産生やミトコンドリア膜電位に与える影響を解析し、ミトコンドリア機能制御メカニズムの全貌に迫り、エネルギー代謝疾患をはじめとする病態との関連性を考察する。次年度の研究費は、当初の計画通りに、細胞培養培地類およびプラスチック器具(主にシャーレ)の購入に使用する。これは、研究計画においてミトコンドリアを対象に実験を行っていくためである。実験を成立させるためには、多大な細胞数(通常の細胞実験の3-5倍)を用いてミトコンドリアの回収を行う必要がある。さらに、遺伝子導入試薬の使用量も通常の実験よりも増加するため購入額が高めになる。そのほかに、二次元ゲル電気泳動試薬、市販抗体および免疫沈降用ビーズ、ミトコンドリア相互作用タンパク質抗体およびNDUFV2の特異的リン酸化抗体作製、siRNA作製、放射性同位体試薬等の費用に、相当額の消耗品費を充当する必要性がある。また、本研究課題において得られた知見の迅速な公表を目的に、国内学会にて2回、および国際学会にて1回発表する。そのため、研究費を国内および外国旅費に使用する。