hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトの骨転移病態を再現する遺伝子改変マウスモデルの樹立

がんは高率に骨に転移し、患者のQOLを低下させる。効果的な骨転移治療法の開発には、骨転移を再現する前臨床動物モデルの開発が望まれる。ヒトで見られる骨転移を再現する遺伝子改変モデルマウスを樹立するために、MMTV遺伝子プロモーター下に骨転移に重要なカドヘリン11(Cdh11)遺伝子と、改良型GFP/ルシフェラーゼ融合遺伝子ffLucを2A配列を介して組み込んだTgベクター(MMTV-Cdh11-2A-ffLuc)を構築し、FVB系マウスの受精卵にインジェクションした。MMTV-Cdh11-2A-ffLucマウスをライン化した後、MMTV-neuマウスと交配し、骨転移モデルマウスを樹立する。平成26年度はTgマウス作製のためのトランスジェニックベクターの構築を行った。プロモーターはマウスの乳腺組織への遺伝子導入が可能なマウス乳がんウイルスのMMTV (mouse mammary tumor virus)遺伝子プロモーターを入手した。MMTV遺伝子プロモーターの下流に、まずSV40改良型のイントロン配列と骨転移遺伝子としてCadherin-11を組み込んだ。骨転移がん細胞の確認と定量的計測のために改変型GFP遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子を融合させたffLuc遺伝子を入手し、2A配列とともにCadherin11の3'領域にサブクローニングした。Cadherin11遺伝子とffLuc遺伝子を同じMMTVプロモーター化制御下で同時発現を可能にする2Aペプチド配列を挿入している。トランスジェニックベクター構築の前に、CMVプロモーターに組み込んだCadherin11-2A-ffLuc遺伝子を乳がん細胞にトランスフェクションし、Cadherin11およびffLucのたんぱく質が正常に発現することを確認した。トランスジェニックベクターの構築後は、シークエンス解析により遺伝子配列に変異がないこと、また方向性が正しいことを確認した。トランスジェニックベクターを含むプラスミドをエンドトキシンフリーの環境下で生成した後、Spe1およびSal1で直鎖化した。現在、直鎖化したトランスジェニックベクターの受精卵へのマイクロインジェクションし仮親マウスへ移植するための準備を進めているところである。本研究では骨転移の分子メカニズム解明を可能にする、発癌から骨転移までを再現する骨転移モデルマウスの作製を試みた。まず、乳癌ウイルスのMMTV遺伝子プロモーターに発がん遺伝子であるHER2を組み込んだ自然発生型乳癌モデルマウスを入手しマウス個体の飼育および維持を行った。そして、申請者らが同定した骨転移に重要な遺伝子であるCadherin-11と、改変型GFP遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子を融合させることにより蛍光タンパク質と発光タンパク質の利点を併せ持つffLuc遺伝子を2A配列で挟み、MMTV遺伝子プロモーター下に組み込んだ。このトランスジェニックベクター(MMTV-Cadhh11-2A-ffLuc)をエンドトキシンフリーのプラスミド精製キットを用いて精製し、直鎖化を行った。過排卵処理したFVB/NJc1の雌マウスと雄マウスとを自然交配させ、マウスから121個の受精卵を回収しインジェクションを行い、翌日状態の良かった98個の胚を偽妊娠マウスに移植した。得られた産仔の尻尾よりゲノムDNAを精製し、PCR法にてトランスジーンの確認を行ったがトランスジェニックマウスを得ることができなかった。その後、雌マウスの数を増やし体外受精で得られた卵にDNAをインジェクションし2細胞期胚までIn Vitroで培養した後移植を行ったが、トランスジェニックマウスを得ることができなかった。250個以上の移植を行ったがFVB系統でのトランスジェニックマウスが得られなかったので、FVB系統よりも産仔数が多いBDF1マウスの受精卵にインジェクションを行った。平成26年度では、Cadherin11遺伝子、MMTV遺伝子プロモーターおよびffLuc遺伝子の入手と2A配列を組み込んだトランスジェニックベクターの構築を終えることができた。また、DNA塩基配列の確認およびたんぱく質発現の行い、問題なく機能することを確認していることから、トランスジェニックベクターの構築は順調に進んでいると判断してよい。しかし、受精卵へのマイクロインジェクションを進めてはいるが、当初の予定であった、仮親マウスへの移植と産仔の獲得を終えていないためやや遅れていると評価した。平成27年度は早い段階でマイクロインジェクションを行う予定であり、今後は研究が順調に進展していく予定である。生化学平成27年度はトランスジェニックマウスの選別と維持をまず行う。受精卵に直鎖化したトランスジェニックベクターをマイクロインジェクションし仮親マウスへ移植する。その後、産仔からゲノムDNAを精製し、ffLuc遺伝子を認識するプライマーを用いてゲノムPCRを行い、ファウンダーマウスを選別する。野生型マウスとの交配を行いTgマウスラインを確立する。

次のステップとして、本研究により作出されたトランスジェニックマウスと、自然発症乳がんモデルマウスを交配することによりダブルトランスジェニックマウスを作製する。本研究で確立する乳がん自然発症モデルマウスとしてはMMTV-neuマウスを用いる予定である。得られたマウスの骨転移を蛍光実態顕微鏡および発光イメージングシステムにより観察する。骨転移モデルマウスが樹立された後はマウスが示す骨転移の生物学的特性の解析を行う。臨床的には骨転移は骨吸収が亢進する溶骨型、骨形成が促進する骨形成型、そして骨吸収と骨形成が混在する混合型が報告されている。そこで、バイオイメージングによる解析に加えて骨転移が確認された部位の病理組織切片を作製し、骨転移の様式を解析する。さらにTRAP染色により破骨細胞の検出を行う。乳がんは肺、副腎および脳へも転移することから、骨組織以外の臓器に関しても転移の有無を検討する予定である。
蛋白質セラピー法による疾患治療の試み

蛋白質セラピー法は11個のアルギニン(11R)からなるペプチドを目的の蛋白質やペプチドに融合する事により、すべての組織へin vivo導入できる方法である。この方法を利用し、ゲノム解析や構造解析で得られた遺伝子情報をもとに、疾患遺伝子に11R融合させ、組み換えタンパク質を精製し、そのタンパク質を静脈より点滴注入することにより疾患遺伝子を補うことができ、遺伝的背景のある疾患を予防、治療する新しい薬剤の創出が可能となる。研究代表者である松下正之は、上記の蛋白質セラピー法を用いて以下の結果を得た。1)アンチセンス核酸(PNA)を塩基性アミノ酸と結合し転写を抑制することに成功した。この方法により、PNAと核内移行シグナルを化学的に結合しPNAの機能を阻害しないで細胞内に導入可能になった。2)癌抑制遺伝子であるp53を癌細胞に導入し、細胞分裂を阻害しアポトーシスを誘導した。3)脳神経細胞に高発現し神経細胞死に重要な役割を果たす、L脱リン酸化酵素calcineurinの阻害ペプチドにより、神経細胞死を抑制した。4)転写因子を恒常的活性型にし、11Rと融合タンパク質をE.coliより精製し、転写制御による,細胞機能制御法を開発した。以上の結果より、蛋白質セラピー法によりタンパク質やペプチドを用いた高分子薬剤の開発が可能であり、様々な疾患に応用できることが確認された。今後、新規に開発したこれら高分子薬剤が生体で機能するかを検討することが大切である。
安定同位体プローブ法と次世代シークエンスの融合で拓くレアバイオスフィアの生理生態

本研究は、次世代シークエンスによる16S rRNA遺伝子の大規模解析からその存在が明らかになったものの実体の分かっていない「レアバイオスフィア(稀少微生物)」、とりわけ未踏の微生物分類グループ「微生物暗黒画分」の生態生理を解明するため、申請者自身が近年開発した未培養微生物群の機能同定法「超高感度安定同位体プローブ法(Stable Isotope Probing[SIP])を自然環境中で見られる微生物群集の異なる栄養段階(好気代謝[易分解・難分解化合物の分解]、嫌気呼吸[酸化還元カップリング])へ適用する。これにより、これまで我々の理解が及ぶことの無かったレアバイオスフィアの全貌をあぶり出すことを目指す。2018年度は、好気代謝(難分解化合物の分解)を対象として、超高感度SIPの適用により石油化学工業廃水の生物処理槽内に棲息する未知の1,4-ジオキサン分解菌を複数種同定することに成功した。さらに生物処理槽における分解菌の動態が、1,4-ジオキサンの除去率の変化と密接に関係していることを見出した。さらに1,4-ジオキサン分解菌のいくつかは、実環境中で1,4-ジオキサンだけでなく、易分解化合物(エチレングリコール等)を共代謝的に分解していることが強く示唆された。これらの成果を、超高感度SIPの環境試料への第一適用例として、微生物生態学分野のリーディングジャーナルであるISME Journalで発表した。これを基に、プレス発表、解説邦文の執筆、招待講演の実施を行った。好気代謝微生物として、活性汚泥中の系統学的に新規な1,4ジオキサン分解菌が石油化学工業廃水の安定処理に重要であることを見出した点、さらにそれらの知見を論文発表した点は着実な進捗として評価できる。その他、嫌気代謝微生物として、活性汚泥から放出される地球温暖化ガスN2Oを還元する新規細菌を既に同定しており、現在、成果発表準備中である。以上から、研究が概ね順調に進展していると判断できる。これまでに同定してきた好気代謝および嫌気代謝に関与するレアバイオスフィア(パルミチン酸分解菌やN2O還元菌)について、論文発表を行うための追加実験・解析を行い、論文執筆作業を急ぐ。ここで、次世代シークエンスを用いるが、その試料調整、機器運転・管理、解析に関わるツールが最適化されているため、迅速なデータ取得・解析が可能である。本研究は、次世代シークエンスによる16S rRNA遺伝子の大規模解析からその存在が明らかになったものの実体の分かっていない「レアバイオスフィア(稀少微生物)」、とりわけ未踏の微生物分類グループ「微生物暗黒画分」の生態生理を解明するため、申請者自身が近年開発した未培養微生物群の機能同定法「超高感度安定同位体プローブ法(Stable Isotope Probing[SIP])を自然環境中で見られる微生物群集の異なる栄養段階(好気代謝[易分解・難分解化合物の分解]、嫌気呼吸[酸化還元カップリング]へ適用する。2016年度は、特に好気代謝に焦点を当て、活性汚泥微生物群集がもつ高い好気的有機物分解能を明らかにした。具体的には、易分解化合物であるパルミチン酸などの長鎖脂肪酸が含まれるオリーブオイルを添加した活性汚泥リアクターを立ち上げ、その安定運転を実現した。その後、得られた活性汚泥微生物群集を接種源とした13C-パルミチン酸(1,2,3,4位標識)による培養試験において、13C-パルミチン酸が短時間で生物分解されることを見出した。さらに安定同位体された微生物RNAを次世代シークエンサーによって大規模に同定したところ、系統学的に極めて新規な微生物群が13C-パルミチン酸を取り込むことが明らかになった。さらに難分解化合物を好気的に分解する活性汚泥微生物群を同定するための事前検討を行い、活性汚泥リアクターにて標的とする難分解化合物が安定に分解されること、さらに当該リアクター内で微生物群集が劇的に変遷していること確認した。易分解化合物のパルミチン酸などが含まれるオリーブオイルを添加した活性汚泥リアクターを立ち上げ、その安定運転を実現し、さらにパルミチン酸を分解する系統学的に新規な微生物群を多数同定したことは、大きな進展として評価できる。さらに難分解化合物の安定な分解が観察される活性汚泥微生物群を見出した点も特筆すべき点である。これらの活性汚泥微生物群を対象として、超高感度SIP法による機能解明試験に着手している。

2017年度は、好気代謝として、超高感度SIPで同定したパルミチン分解細菌が系統樹で極めて新しいクラスターを形成することを明らかにした。また、13C標識の難分解化合物を分解する新規微生物を複数種同定し、実プラントでの年間動態を解明した。このうち、13Cで中程度に集積された微生物は、13C標識の難分解化合物だけでなく、共存する非標識易分解化合物を共代謝的に分解していることが強く示唆された。これらの結果を得て、超高感度SIPの環境試料への第一の適用例として、成果発表の準備を行った。さらに嫌気呼吸に焦点を当て、窒素処理微生物群集が有する脱窒能力(N2O還元を担う新規なレアバイオスフィア)を解明した。13C-酢酸は嫌気条件下で熱力学的に安定であり、CO2以外の無機電子受容体が枯渇した条件ではメタン生成菌以外には利用されないため、微生物群集のエネルギー代謝と炭素代謝結びつけて評価する場合によく用いられる。ここでは、超高感度SIPによりN2Oと13C-酢酸を同時添加し、N2Oの存在依存的に13C-酢酸を取り込む微生物、すなわち酢酸酸化型のN2O還元菌を同定することに成功した。好気代謝微生物として、活性汚泥中のパルミチン酸分解菌、難分解化合物分解菌を同定し、それらが系統学的に極めて新しいことを示したこと、さらには13Cの集積度合いから実環境における微生物の生理生態学的な棲み分け機構を見出したことは、大きな進展として評価できる。さらに、好気代謝微生物として、活性汚泥から放出される地球温暖化ガスN2Oを直接還元する新規細菌を複数種同定したことは、学術的に意味があるだけでなく、工学的利用の観点からも重要である。以上から、研究が概ね順調に進展していると判断できる。本研究は、次世代シークエンスによる16S rRNA遺伝子の大規模解析からその存在が明らかになったものの実体の分かっていない「レアバイオスフィア(稀少微生物)」、とりわけ未踏の微生物分類グループ「微生物暗黒画分」の生態生理を解明するため、申請者自身が近年開発した未培養微生物群の機能同定法「超高感度安定同位体プローブ法(Stable Isotope Probing[SIP])を自然環境中で見られる微生物群集の異なる栄養段階(好気代謝[易分解・難分解化合物の分解]、嫌気呼吸[酸化還元カップリング])へ適用する。これにより、これまで我々の理解が及ぶことの無かったレアバイオスフィアの全貌をあぶり出すことを目指す。2018年度は、好気代謝(難分解化合物の分解)を対象として、超高感度SIPの適用により石油化学工業廃水の生物処理槽内に棲息する未知の1,4-ジオキサン分解菌を複数種同定することに成功した。さらに生物処理槽における分解菌の動態が、1,4-ジオキサンの除去率の変化と密接に関係していることを見出した。さらに1,4-ジオキサン分解菌のいくつかは、実環境中で1,4-ジオキサンだけでなく、易分解化合物(エチレングリコール等)を共代謝的に分解していることが強く示唆された。これらの成果を、超高感度SIPの環境試料への第一適用例として、微生物生態学分野のリーディングジャーナルであるISME Journalで発表した。これを基に、プレス発表、解説邦文の執筆、招待講演の実施を行った。
高分散金属微粒子による伝導帯アシスト型可視光応答性光触媒の開発

本研究は、光触媒を用いた環境浄化反応における可視光の効率的利用を実現する新たな概念として、"高分散金属微粒子による伝導帯アシスト型可視光応答性光触媒"を提案し、従来の可視光応答型光触媒の性能を凌駕する次世代型光触媒の開発を目的としている.酸化チタン光触媒は有害物質の光分解を中心に実用化が進んでいるが、紫外光しか吸収できないため、室内空間への応用が困難である.我々は、伝導帯レベルが低く、有機物分解の光触媒として不向きと考えられてきた酸化タングステンに、微量の白金微粒子を高分散に担持させると、可視光照射下における有機物の酸化分解反応が極めて高効率で進行することを見出した.光音響分光法などを用いた反応メカニズムの検討から、酸化タングステンそのものは、光吸収によって生成した電子と空気中の酸素分子との反応が極めて遅いものの、微量の白金の担持によって、電子と酸素の反応速度が著しく向上することを見出した.すなわち、酸化タングステンの伝導帯レベルの低さを、白金微粒子がアシストし、その結果として高効率な反応が進行したといえる.これらの結果は、従来とは異なる可視光応答性光触媒の開発コンセプトを示したものであり、今後の当該研究の進展に大きな影響を与えるものと考えられる.本研究は、光触媒を用いた環境浄化反応における可視光の効率的利用を実現する新たな概念として、"高分散金属微粒子による伝導帯アシスト型可視光応答性光触媒"を提案し、従来の可視光応答型光触媒の性能を凌駕する次世代型光触媒の開発を目的としている.酸化チタン光触媒は有害物質の光分解を中心に実用化が進んでいるが、紫外光しか吸収できないため、室内空間への応用が困難である.我々は、伝導帯レベルが低く、有機物分解の光触媒として不向きと考えられてきた酸化タングステンに、微量の白金微粒子を高分散に担持させると、可視光照射下における有機物の酸化分解反応が極めて高効率で進行することを見出した.光音響分光法などを用いた反応メカニズムの検討から、酸化タングステンそのものは、光吸収によって生成した電子と空気中の酸素分子との反応が極めて遅いものの、微量の白金の担持によって、電子と酸素の反応速度が著しく向上することを見出した.すなわち、酸化タングステンの伝導帯レベルの低さを、白金微粒子がアシストし、その結果として高効率な反応が進行したといえる.これらの結果は、従来とは異なる可視光応答性光触媒の開発コンセプトを示したものであり、今後の当該研究の進展に大きな影響を与えるものと考えられる.
血中IGF1低下による新規サルコペニアモデルの樹立とその治療法の開発

筋力・筋量低下によるサルコペニアは高齢者の運動機能の低下や自立性の低下に直結するため、対策が必要です。アダルトにおいて血中のinsulin like growthfactor 1 (IGF1)の濃度が減少するマウスモデル(IGF1 cKO)の作出に世界に先駆けて成功したので、本研究ではIGF1 cKOを用いて、IGF1による筋力・筋量制御機構の解明と、IGF1低下による筋力・筋量低下に対する対策法の開発を試みます。
H3K9メチル化による転写抑制の実体の解明

H3K9メチル化酵素SETDB1により転写抑制されるレトロウイルスにGFP遺伝子を組み込んだウイルスをES細胞に感染させ、GFPの発現が抑制された細胞をレポーター細胞として、Cas9-CRISPRによるノックアウトスクリーニングを行い、レトロウイルスの転写抑制に寄与する因子の網羅的探索を行った。結果、SETDB1を筆頭としてレトロウイルスや内在性のレトロエレメントの転写抑制に寄与することが分かっていた因子が軒並み同定され、さらにいくつもの新規因子の同定にも成功した。新規に同定した因子の中では、SETDB1の上位で機能する因子と下流あるいは並行して機能する因子があることが見えてきた。本課題では、H3K9メチル化による転写抑制の分子機構の実体の明らかにするため、1)H3K9メチル化酵素G9aの標的遺伝子の転写抑制機構を明らかにする、2)H3K9メチル化酵素GESET/Setdb1により抑制されるレトロ転移因子の転写抑制機構を明らかにする、3)G9aとSetdb1の解析から得られた知見を元に“H3K9メチル化による転写抑制シグナルカスケード"の統合的理解を目指す、の研究を計画した。その中で、H26年度は、以下の研究を行った。I)shRNAによるノックダウンあるいはCas9によるノックアウトスクリーニング系の確立shRNAノックダウンスクリーニングにはCelecta社が提供しているマウスshRNAライブラリーを入手した。一方、Cas9によるノックアウトスクリーニングでは、英国サンガー研究所の遊佐宏介博士の作成したCas9/gRNAライブラリー系を用いるため、必要な細胞及びgRNA発現レンチウイルスベクターを遊佐博士より入手した。遊佐博士が確立したCas9を恒常的に発現するES細胞に、GFPレポーター遺伝子を持つレトロウイルス(MSCV-GFP)を感染させ、2週間培養した後、GFP陰性の細胞をセルソーターで分取し、サブクローニングした細胞でSetdb1 gRNAを導入した際にGFPが発現してくるクローンを選択した。これをレポーター細胞として、mouse shRNAあるいはgRNAのLenti virusライブラリーを感染させ、感染5日目にGFP陽性画分をセルソーターで分取し、この細胞からshRNAあるいはgRNAのゲノムDNAを回収、次世代シークエンサーによりシークエンス解析を行った。現在、このスクリーニングで同定された上位ヒットの遺伝子に関して、評価・検証を行っている。ヒストンH3の9番目のリジン残基のジあるいはトリメチル化(H3K9me2,3)は、種を超えて保存された転写抑制のエピジェネティックマークとして存在している。しかし、どのようにしてこのエピゲノム情報が転写を抑制するのか、その機構はまだよく理解されていない。そこで本研究課題では、これまで申請者が精力的に研究を進めてきた2つのH3K9メチル化酵素G9a/GLP、ESETにより誘導されるH3K9me2,3をモデルとし、H3K9メチル化による転写抑制の分子機構の実体の解明を試みることを計画した。H27年度は、以下の研究を行った。1.ESETにより抑制されるレトロウイルスの転写抑制に関与する遺伝子の網羅的スクリーニングH26年度、マウスES細胞でのCas9/gRNAによるノックアウトスクリーニングを可能にするため、humanized Cas9を恒常的に発現するES細胞を樹立、これにGFPレポーター遺伝子を組み込んだレトロウイルスを感染させ、しばらく培養後、GFP陰性の細胞からEsetをノックダウンあるいはノックアウトするとGFPの発現が誘導される細胞株を樹立した。H27年度は、この細胞を使いて、GFPの発現を指標に、gRNAライブラリーを発現するレンチウイルスを用いて、レポーター遺伝子の発現抑制に関与する遺伝子のスクリーニングを行った。その結果、gRNAによるノックアウトスクリーニングにより、これまでレトロウイルスの転写抑制に関わることが知られていた複数の遺伝子だけでなく機能未知な遺伝子を多数同定した。H3K9メチル化による転写抑制の分子機構の実体を明らかにするために、初年度はスクリーニング系を立ち上げ、2年目は主にgRNAを用いたCRISPR-Cas9の系による網羅的ノックアウトスクリーニングを行い、3年目で新規に同定された遺伝子の機能を明らかにする、ことを計画した。研究実績の概要で述べたように、H26年度(初年度)はESETの下流で転写が抑制されているレトロウイルスをレポーターとして組み込んだ細胞を樹立し、H27年度(2年目)はこの細胞を用いCRISPR-Cas9の系による網羅的ノックアウトスクリーニングを行い、すでにレトロウイルスの転写抑制に関わることが知られていた複数の遺伝子だけでなく、機能未知な遺伝子も多数同定した。よって、今のところ研究はおおむね順調に進展していると評価した。目的:ヒストンH3の9番目のリジンのジ、トリメチル化(H3K9me2,3)は、種を超えて保存された転写抑制のエピジェネティックマークとして存在している。そこで本研究では、H3K9メチル化による転写抑制の分子機構の実体の解明を試みた。研究計画:ヒストンH3K9メチル化酵素SETDB1/ESETは、内在性レトロウイルス及び外来性のレトロウイルスの転写抑制に寄与しており、Setdb1をノックアウトしたES細胞ではこれらのレトロエレメントの脱抑制が誘導される(Matui et al Nature 2010)。そこで、マウスES細胞でSETDB1により転写が抑制される外来性レトロウイルスの5'LTRの下流にGFP遺伝子を組み込んだレポーターウイルスをES細胞に感染させ、その後GFPの発現が抑制された細胞をレポーター細胞として使い、Cas9-CRISPRによる遺伝子ノックアウトスクリーニングを行って、レトロウイルスの転写抑制に寄与するエピジェネティック因子の網羅的探索を行い、新規因子が同定をめざす。

そして、同定された新規因子がどのようにしてレポーターウイルスの転写を抑制するのか、又どのような内在性レトロエレメントの転写抑制に寄与するのか、解析を進める。研究成果:スクリーニングした結果、SETDB1を筆頭としてこれまでレトロウイルスや内在性のレトロエレメントの転写抑制に寄与することが分かっていた因子が軒並み同定され、さらにいくつもの新規の因子の同定にも成功した(Fukuda et al. Genome Res. 2018)。新規に同定した因子の中では、SETDB1の上位で機能する分子と下流あるいは並行して機能する分子があることが見えてきた。H3K9メチル化酵素SETDB1により転写抑制されるレトロウイルスにGFP遺伝子を組み込んだウイルスをES細胞に感染させ、GFPの発現が抑制された細胞をレポーター細胞として、Cas9-CRISPRによるノックアウトスクリーニングを行い、レトロウイルスの転写抑制に寄与する因子の網羅的探索を行った。結果、SETDB1を筆頭としてレトロウイルスや内在性のレトロエレメントの転写抑制に寄与することが分かっていた因子が軒並み同定され、さらにいくつもの新規因子の同定にも成功した。新規に同定した因子の中では、SETDB1の上位で機能する因子と下流あるいは並行して機能する因子があることが見えてきた。2つ計画しているスクリーニングのうち1つは実験を開始し、既に複数の新規遺伝子を同定するに至っている。その観点から本研究課題はおおむね順調に進展していると判断している。H28年度は、以下のことを行う1.上述したように、これまで、ESETの下流で転写抑制を受けることが分かっているレトロウイルスのプロモーターの下流にGFPを組み込んだレポーターを導入したES細胞を用いて、gRNAによるノックアウトスクリーニングを行い、その結果、これまでレトロウイルスの転写抑制に関わることが知られていた複数の遺伝子を同定した。同時に、機能未知な遺伝子も多数同定した。そこで、最終年度のH28年度は、まず、スクリーニングにより同定された機能未知の上位24種類の遺伝子をCas9/gRNAによってノックアウトし、RNA-seq解析を行って、これらの遺伝子によってどのような遺伝子の転写が抑制されているか、特に内在性レトロウイルスのどのようなものがノックアウトにより脱抑制されるのか、を明らかにする。2.上記の実験と並行して、同定された上位遺伝子のいくつかの遺伝子に注目し、その機能解析を進める。具体的には、遺伝子がコードしているタンパク質の核内やクロマチン上での局在、複合体として存在しているタンパク質の場合は複合体内の他の因子との機能相関を解析する。
子どもの走運動の指導に資した足の着地に関する研究

本研究は,ランニングにおける足の着地方法とパフォーマンスとの関係を明らかにし,初級者を対象に足の着地方法の改善による効果を検証しようとするものである。研究初年度として,一般成人を被験者として「走運動における足の着き方」に関しての成果を得,続いて昨年度に,子どもを対象に「走運動における足の着き方」についての成果を得て,本年度は「走運動における足の着き方」に関しての可変性について検討した。被験者は,小学校5年生の男子1名と女子2名の計3名とした。被験者およびその保護者に本実験の要旨をあらかじめ説明し参加の同意を得て測定実験を行った。被験者には,十分なウォーミングアップの後,平坦な走路上にて,全力疾走での50m走を2回行わせた。また,1回目の測定実験の後,約3か月経過した後に,2回目として再度同様の測定実験を行った。被験者の疾走動作を2台の高速度ビデオカメラを用いて250fpsで撮影した。また,被験者全員が各被験者の足のサイズに合わせた同一の型のシューズを用いるものとし,シューズ内には足底圧力分布測定システムのセンサシートを挿入して試技を行わせた。撮影された映像及び足底圧力分布測定システムによって得られた足底圧値とその時間変化データをもとに分析・考察した。分析の結果,着地タイプの判別にあたっては,使用する測定システムによっては異なるタイプとして判別される場合があり,判別の目的に応じて使用する測定システムを検討する必要があることが分かった。また,1回目の測定と3カ月後の2回目の測定で着地のタイプが異なっていた被験者がおり,一定期間前後で着地タイプが変容する可能性が示された。ごく普通の小学生において,疾走速度の向上を目的として動作の改善を図る場合,接地様式のみを変えようと指導することは適切ではない。身体各部が協調した合理的な動作を理解させ獲得させることが重要であろう。本年度は,一般成人を対象に,ランニングにおける走速度を段階的に変化させ,各走速度において足が地面に接地している間の足底圧がどのように変化するのかを明らかにすることを目的に研究を行った。被験者は成人男子6名とした。被験者には,ジョギングペースから全力疾走まで10段階の主観的努力度を設定し,各設定の努力度での40m走を行わせた.10段階を1セットとして,これを2セット行わせ,合計20本の試技を行わせた。2台の高速度ビデオカメラを用いて被験者の疾走動作を撮影するとともに,被験者には足底圧力分布測定システムのセンサシートを挿入したシューズを用いて試技を行わせ,疾走中の足底圧力分布の時系列データを求めた。その結果,着地の様式は2種類ないしは3種類と明確に分類されるものではなく,個人内において走速度を変化させることによって少しずつ変化するものであると考えられた。また,走速度の増大に伴って足底面内の着地位置はより前方に,より外側へと変化していく傾向があることが明らかとなった。さらに,走速度の増大には身体重心の真下付近に着地して減速力を減らすのではなく,着地直前に股関節をより屈曲させた状態で着地することによって,着地位置をより前方へ移動させ,加速力を増大させることを優位にしていた可能性が推察された。これらのことから,より高い走速度で疾走するには,中足部および前足部付近で着地し,かつ,足関節角度を固定し踵付近で荷重をかけることなく離地に至るように脚を動かすことが望ましいと考えられた。本研究では,ランニングにおける足の着地方法とパフォーマンスとの関係を明らかにし,初級者を対象に足の着地方法の改善による効果を検証しようとするものである。本研究を遂行するにあたっては,本年度に,一般成人を対象に,ランニングにおける走速度を段階的に変化させ,各走速度において足が地面に接地している間の足底圧がどのように変化するのかを明らかにする計画であった。研究実績の概要に示したように,本年度はほぼ当初の計画通りに進めることができており,このままのペースで次年度に研究を進めて行きたい。研究初年度に当たる昨年度に,まずは,一般成人を被験者として「走運動における足の着き方」に関しての成果を得,続いて本年度は,子どもを対象に「走運動における足の着き方」についての成果を得ることを目的に研究を行った。被験者は,小学校6年生男女各2名の計4名とした。被験者には,十分なウォーミングアップの後,平坦な走路上にて,全力疾走で40m走を2回行わせた。また測定試技にあたっては,被験者全員が各被験者の足のサイズに合わせた同一の型のシューズを用いるものとし,シューズ内には足底圧力分布測定システムのセンサシートを挿入して試技を行わせた。撮影された映像及び足底圧力分布測定システムによって得られた足底圧値とその時間変化データから,各試技について,走速度,脚の着地角度・距離,接地時間,及び足底圧中心位置の時間変化を求めた。

分析の結果,接地局面全体における下肢動作は,同一被験者の試技間においても,被験者間においてもほとんど差が無く,すべての試技で同様の動作となっていた。しかし他方で,接地局面前半における足底圧中心位置や足底圧積分値の時間変化は,試技によって明確に異なっていた。接地局面での脚の動かし方が同様であっても着地のタイプが同一タイプであるとは限らず,着地様式が接地局面後半の疾走動作に影響を及ぼすことは無いと考えられた。本研究は,ランニングにおける足の着地方法とパフォーマンスとの関係を明らかにし,初級者を対象に足の着地方法の改善による効果を検証しようとするものである。前年度に本研究全体の計画を一部修正しており,本年度は対象を子どもに絞って「走運動における足の着き方」に関しての研究成果を得ることを目標にしていたため,本年度はその修正された計画どおりに進めることができた。次年度には研究の最終段階として,走運動の指導による「足の着き方」の可変性についての測定実験を予定しており,それに向けて準備を進めているところである。研究初年度として,一般成人を被験者として「走運動における足の着き方」に関しての成果を得,続いて昨年度に,子どもを対象に「走運動における足の着き方」についての成果を得て,本年度は「走運動における足の着き方」に関しての可変性について検討した。被験者は,小学校5年生の男子1名と女子2名の計3名とした。被験者およびその保護者に本実験の要旨をあらかじめ説明し参加の同意を得て測定実験を行った。被験者には,十分なウォーミングアップの後,平坦な走路上にて,全力疾走での50m走を2回行わせた。また,1回目の測定実験の後,約3か月経過した後に,2回目として再度同様の測定実験を行った。被験者の疾走動作を2台の高速度ビデオカメラを用いて250fpsで撮影した。また,被験者全員が各被験者の足のサイズに合わせた同一の型のシューズを用いるものとし,シューズ内には足底圧力分布測定システムのセンサシートを挿入して試技を行わせた。撮影された映像及び足底圧力分布測定システムによって得られた足底圧値とその時間変化データをもとに分析・考察した。分析の結果,着地タイプの判別にあたっては,使用する測定システムによっては異なるタイプとして判別される場合があり,判別の目的に応じて使用する測定システムを検討する必要があることが分かった。また,1回目の測定と3カ月後の2回目の測定で着地のタイプが異なっていた被験者がおり,一定期間前後で着地タイプが変容する可能性が示された。ごく普通の小学生において,疾走速度の向上を目的として動作の改善を図る場合,接地様式のみを変えようと指導することは適切ではない。身体各部が協調した合理的な動作を理解させ獲得させることが重要であろう。当初の計画では,本年度には前年度に行った実験結果をもとに,「ランニング初級者において足の着き方に関する指導の有無がパフォーマンスに及ぼす影響」を検討する予定であり,被験者には,成人として健常な大学生,または,子どもとして小学校高学年の児童を20名程度予定していた。しかし,前年度に大学生を被験者として「走運動における足の着き方」に関しての成果を得ることができたこともあり,このうえさらに,大学生対象の測定実験を計画する必然性が無くなった。
モンスーン影響下での地層形成:短周期の水位変動による地層形成と気候変動の解読

今年度の成果は以下の通りである.ネパール,カトマンズについての研究で,1試料の年代測定を行い,さらにこれまでの成果のとりまめを行った.カトマンズ盆地においては気候解読を大きく進めることができ,チベットでの気候変化と同調して気候変化が起きていた可能性が初めて明らかになった.ケニアにおいては,現在,ケニアに見られる地形依存の気候が,1000万年前にはすでに発達していた可能性が示された.このほか,これまでの成果を3編の論文としてまとめた.1編はネパール,カトマンズ盆地の地質調査と年代測定の結果をとりまとめたものである.この論文の作成については,英文の校閲依頼を行い,年度内の比較的早い段階でJournal of Nepal Geological Society誌に投稿をした.また,もう1編の論文は,ネパール,カトマンズ盆地での短周期の湖水準変動の結果,形成された地層の特徴とその形成過程に関する論文である.これについては19年度の中頃に作成を開始し,年度末の段階で原稿がほぼ完成している.これについては,現在,Journal of Sedimentary Research誌またはSedimentology誌への投稿を検討している.これとほぼ平行して,同じく調査対象としたケニア中部の地層について,同じく地層の形成過程に関する論文の作成を行った.これについては19年度末現在で,およそ80%が完成している.これについては今後,継続して論文の作成を進める予定である.今年度はまず,ケニア中央部において,ケニアリフト中央部に分布する中新統の湖成堆積物の調査を行った.その中で特に,厚さ数mmから数cmのサイクルの,雨期・乾期の繰り返しによると思われる地層の記載を行った.堆積物の特徴は,(1)ハンモック状斜交層理やウェーブリップル葉理の発達した砂層とそれに重なる,根痕や乾裂を含んだ泥層のセット,または(2)マッドフレーク層とそれに重なる葉理の発達した薄い極細粒紗と乾裂の発達した泥層という重なりである.(1)の地層の重なりは波浪堆積構造の存在と泥層中の根痕と乾裂の存在から明らかに氾濫原環境の沈水と露出を示す.(2)もマッドフレークと葉理の発達した砂層,薄い泥層も流れとよどんだ水域の存在を示し,乾裂はその後の陸上への露出を示す.こうした(1),(2)の特徴を示す地層がこれまでの年代学的研究から,かなりはやい堆積速度で形成されたとされる地層中に非常に多く認められるたとから,年変動を反映すると推定される.この地層は,とくに堆積盆の下部の地層に認められ,上部ほどはっきりしなくなる.とくに氾濫原の泥層の特徴に変化が見られない事から,気候変化などの外的な要因というよりは,埋積に伴って侵食基準面の面積が広がったことに伴い,氾濫原が沈水しにくくなったことが原因として考えられる.また,今年度,ネパールのカトマンズ盆地,またはシワリク層群の堆積物を対象としたモンスーン影響下での地層の特徴とその形成過程を現地調査によって検討する予定であったが,とくに今年の中盤以降,ネパール南部の情勢が悪くなったために,予定を変更して,すでにシワリク層群の地質データを豊富に保有しているネパール人研究者を島根大学に招聘し,共同で研究を行った.シワリク層群のデータをとりまとめ,再解析を行った結果,モンスーン活動に伴う洪水堆積物の特徴が明らかにされ,モンスーンの活動履歴に関する新しい知見がえられた.今年度は,ケニア中央部ナカリ地域の中新統,バングラディッシュ・シレット地域に露出する中新統シワリク層群相当層,ネパール,カトマンズ盆地の第四系,シワリク層群を対象として,モンスーン影響下でできた地層を記載し,その形成過程を検討した.(1)ケニア・ナカリ地域での中新統の地質調査の結果,この地域の地層は昨年行った地域と比べて,やや大きな堆積盆で堆積し,年代はやや古いことがわかった.ここでは限られた層準で季節変動に伴う,氾濫原の沈水・干上がりの記録を解読できたが,全体的に季節変動はほとんど記録されていないことがわかった.これは,盆地が大きいために湖の水位上昇・低下が抑制されることが原因であると推定される.(2)バングラディッシュの中新統の調査では,従来,河川堆積物とされてきた地層を対象に調査を行った.残念ながら,詳しい調査の結果,地層中に潮汐堆積物の典型的特徴が見いだされたこと,重力流堆積物を含むことから,地層は海底の流路堆積物,およびその周辺の自然堤防堆積物であることが判明した.本来の目的とした調査をすることができなかったが,この地域の地層形成に関して,新たな知見を得ることができた.(3)カトマンズ盆地の調査では,年変動と思われる湖水準変動に伴う地層形成を具体的に示すことができた.とくに,河川は雨期には網状流,乾期にはごく小規模な蛇行流となり,雨期には蛇行流は沈水することが示された.それぞれの形成時の湖水準が26mも異なるため,乾期と雨期で,地層ができる場がはっきり分かれることも明らかになった.また,このデータから過去の降水量の推定を行った.シワリク層群の調査からは,雨期・乾期の水面の変動に起因すると思われる,非常に独特な河川堆積物が見つかった.今年度の成果は以下の通りである.ネパール,カトマンズについての研究で,1試料の年代測定を行い,さらにこれまでの成果のとりまめを行った.

カトマンズ盆地においては気候解読を大きく進めることができ,チベットでの気候変化と同調して気候変化が起きていた可能性が初めて明らかになった.ケニアにおいては,現在,ケニアに見られる地形依存の気候が,1000万年前にはすでに発達していた可能性が示された.このほか,これまでの成果を3編の論文としてまとめた.1編はネパール,カトマンズ盆地の地質調査と年代測定の結果をとりまとめたものである.この論文の作成については,英文の校閲依頼を行い,年度内の比較的早い段階でJournal of Nepal Geological Society誌に投稿をした.また,もう1編の論文は,ネパール,カトマンズ盆地での短周期の湖水準変動の結果,形成された地層の特徴とその形成過程に関する論文である.これについては19年度の中頃に作成を開始し,年度末の段階で原稿がほぼ完成している.これについては,現在,Journal of Sedimentary Research誌またはSedimentology誌への投稿を検討している.これとほぼ平行して,同じく調査対象としたケニア中部の地層について,同じく地層の形成過程に関する論文の作成を行った.これについては19年度末現在で,およそ80%が完成している.これについては今後,継続して論文の作成を進める予定である.
多様な復興シナリオに応じた市街地復興と住宅再建行動の予測

本研究では,想定首都地震後の住宅再取得意向に関する社会シミュレーションの構築を行ない,演算を行なった結果をまとめた.具体的には,まず,災害後の住宅再取得行動に整理した上で,次に,シミュレーションフローの設計や供給データの設定について記した.そして,シミュレーション実施結果について,集計結果や安定性の確認を行い,さらに,供給データを変えながら計算結果の変動を眺め,復興公営住宅供給を中心に考察を加えた.研究を通じて,想定災害後の住宅再取得問題の事前検討を行なう方法論が提示された.また,想定首都地震後の住宅再取得問題において,量的に賃貸住宅が重要な役割を果たすことを指摘した.本研究では,想定首都地震後の住宅再取得意向に関する社会シミュレーションの構築を行ない,演算を行なった結果をまとめた.具体的には,まず,災害後の住宅再取得行動に整理した上で,次に,シミュレーションフローの設計や供給データの設定について記した.そして,シミュレーション実施結果について,集計結果や安定性の確認を行い,さらに,供給データを変えながら計算結果の変動を眺め,復興公営住宅供給を中心に考察を加えた.研究を通じて,想定災害後の住宅再取得問題の事前検討を行なう方法論が提示された.また,想定首都地震後の住宅再取得問題において,量的に賃貸住宅が重要な役割を果たすことを指摘した.本研究の目的は,想定首都直下地震を対象として,市街地復興のシナリオに応じた住宅再建状況の想定を実現することである.研究期間内に,代表的な市街地復興シナリオの抽出と描画,記述した市街地復興状況に応じた住宅再建行動モデルの構築と予測試行を計画している. 2008年度は,東京大学・埼玉県の共同研究(震災を想定した県土事前復興プログラム)や,文科省首都直下地震防災・減災特別プロジェクトに参画し,神戸市役所や兵庫県庁へのヒヤリングや現地視察,関係者との意見交換等を参考にしつつ,既往研究等を整理し,大きく5つの市街地復興シナリオ(神戸型の市街地再開発シナリオ/土地区画整理シナリオ/まちづくりシナリオ/自主再建シナリオ,中越型の集団移転シナリオ)を抽出した.次年度は,想定首都直下地震における5つのシナリオの組合せの設定を検討し,ややマクロに具体的なデータセットの作業を行いたい.住宅再建行動モデルについては, 2008年度に文科省特別教育研究経費(首都圏大震災軽減のための実践的都市地震工学の展開)の研究資金も利用して, 1都3県全域を対象とした「想定首都地震の住宅対応に関する意向調査」を実施し, 4200サンプルを回収した.収集データから非集計行動モデルの推定をしており,概ね完了した.市街地復興と個々人の住宅再建行動の関係性について,実施調査では,現住地での移住率という指標を用いてその関係性を捉えることに試みたが,調査結果への影響は十分に確認されず,仮想的な意識調査から帰納的に求めることの限界性も示唆された.次年度は,市街地復興と個々人の住宅再建行動の関係性について,シミュレーションフローの設計により演繹的に検討しながら,具体的なシナリオやデータも投入し,市街地復興のシナリオに応じた住宅再建状況想定の試行に繋げたい.本研究では,想定首都直下地震を対象として,復興シナリオに応じた住宅再建状況の想定を目的とし,研究期間内に,代表的な市街地復興シナリオの抽出と,復興シナリオに応じた住宅再建行動モデルの構築と予測試行等を計画した.2008年度は,代表的な市街地復興シナリオの抽出と,1都3県全域を対象とした「想定首都地震の住宅対応に関する意向調査」を実施し,4200サンプルを回収した.収集データから非集計行動モデルの推定をした.2009年度は,2008年度に推定した非集計行動モデルを用いて,想定首都地震後の住宅再取得意向に関する社会シミュレーションの構築を行なった.具体的には,まず,災害後の住宅再取得行動に整理した上で,次に,シミュレーションフローの設計や供給データの設定について検討した.そして,構築したシミュレーションを実行し,集計結果や安定性の確認を行い,さらに,供給データを変えながら計算結果の変動を眺め,最後に,復興公営住宅供給を中心に考察を加えた.作業を通じて,想定災害後の住宅再取得問題の事前検討を行なう方法論が提示された.また,想定首都地震後の住宅再取得問題において,量的に賃貸住宅が重要な役割を果たすことを指摘した.不確定要素は大きいものの抽出した市街地復興シナリオに応じた供給データの設定を与えることで,市街地復興のシナリオに対応したシミュレーションを実施できる環境は整備され,当初計画を概ね達成した.
コンテクストへの依存と省略三段論法の許容度についての比較文化的研究

東洋の高コンテクスト文化・西洋の低コンテクスト文化についての理論論文として"Explanations for cultural differences in thinking: Easterners' dialectical thinking and Westerners' linear thinking"を執筆し、現在Journal of Cognitive Psychologyにおいて審査中である。東洋人の弁証法的思考傾向は、矛盾をコンテクストを用いて解消できるという信念によって生じていて、さらに、コンテクストの高低は、ビッグヒストリーアプローチから説明可能と主張している。また、グローバル化と低コンテクスト化についての書籍である『生きにくさ」はどこからくるのかー進化が生んだ二種類の精神システムとグローバル化』を執筆し、2019年6月に出版予定である。グローバル化がもたらした低コンテクスト状況に現代人の「生きにくさ」があることを主張している。このほか、インターネット調査によって、米国人と日本人の推論スタイルの差異を検討する実験を行った。高コンテクスト文化とされる日本人は、米国人よりも、ターゲットとなる推論のコンテクストの影響をより受けやすいと推定される。さらに、射流洪水があったという結果を知ると、写真の川の水の濁りを高く見積もってしまうという、知覚的(視覚的)後知恵バイアスについても実験を行った。後知恵バイアスは東洋人で大きいとされており、論文を執筆中で、学会において発表予定である。インターネット調査による、日本人と米国人の推論スタイルの違いを検証する実験は、2020年度に実施の予定であったが、準備が予想以上にスムーズだった。現在、日本人・米国人を比較した実験の論文を執筆し、ほぼ完成した後知恵バイアスの論文を投稿する。さらに、日本人、韓国人、台湾人、フランス人、英国人の5か国で行っている省略三段論法の実験について、台湾のデータがまだである。このデータの収集を行う。
KDEL受容体の障害による細胞内蛋白凝集の生成機序の検討

新生分泌蛋白、膜蛋白は小胞体で、高次構造の形成、複合体形成などを受け機能的に成熟し、細胞内の適切な場所に輸送されて機能を発現する。異常蛋白は小胞体において、分子シャペロンによるquality controlを受け分解除去される。異常蛋白が小胞体に集積すると、分子シャペロンの産生増加、蛋白合成抑制、異常蚤白の分解促進などの小胞体ストレス反応が起るが、同時に分泌系に関与する蛋白の遺伝子発現も促進される。可溶牲小胞体分子シャペロンのカルボキシ末端にはKDELアミノ酸配列があり、小胞体から分泌されてもゴルジ体でKDEL受容体によってKDEL配列が認識され小胞体に逆輸送される。そこで、このKDEL受容体による蛋白輸送の小胞体ストレス反応への関与を検討した。小胞体ストレス下に増大した異常蛋白と小胞体分子シャペロンの一部は小胞体のquality controlを逃れて、小胞体から分泌され、KDEL受容体によって再び小胞体へ逆輸送されることが示唆された。また、KDEL受容体の機能が障害された細胞ではquality controlを逃れて、細胞内に凝集するか、ゴルジ体からさらに細胞外へと分泌された。また、この細胞では小胞体ストレスへの感受性が増大していた。従って、KDEL受容体による逆輸送は小胞体ストレス反応に寄与していることが示唆された。今後、KDEL受容体トランスジェニックマウスを作製し、個体レベルでのKDEL受容体の機能を解析して行く予定である。
クレアチン欠乏症治療を目指した変異クレアチントランスポーターの細胞局在機構の解明

本研究は、疾患原因となる変異型ヒトクレアチントランスポーター(hCRT)の細胞内局在異常の分子機構を解明することを目的とした。本邦で見いだされたhCRT変異であるG561RはhCRTの細胞膜から細胞内膜へ細胞内の局在を変化させることを明らかにした。さらに、hCRT(G561R)は付加糖鎖が変化していることを明らかにした。本研究の結果から、hCRT変異(G561R)はhCRTの糖鎖付加の変化を伴う細胞内局在の変化を起こさせることでクレアチン輸送能の低下を引き起こしていることが示唆された。細胞内局在を正常化する化合物が先天性クレアチン欠乏症の治療薬候補化合物となる可能性がある。本研究は、先天性クレアチン欠乏症の治療を目指し、疾患原因となる変異型クレアチントランスポーター(CRT)の細胞内局在異常の分子機構を解明し、その分子機構の知見を基盤とし中枢クレアチン活性を回復する分子戦略を構築することを目的としている。平成26年度は、変異型CRT及び野生型CRTの安定発現細胞株を樹立し、解析を行った。その結果、変異による細胞膜から細胞内への局在の変化を再現し、さらに分画によって定量的に細胞内局在変化を明らかにした。また、Western blotによる分子量変化は糖鎖の変化によることを明らかにした。従って、細胞内局在変化には変異による糖鎖付加の変化が関わっていると考えられる。糖鎖付加部位と変異部位は一次構造ではかなり離れているが、立体構造予測から高次構造上、比較的近くに位置していることが予想される。患者由来繊維芽細胞でのCRT発現は微量であるため細胞膜画分を単離する必要がある。従来は多量の培養を必要とするためプロテオミクス解析が困難であった。そこで、細胞分画キットを改良し、10cm dish 1-2枚から細胞膜画分を単離する技術を構築した。次年度は本技術を用い定量プロテオミクスを実施予定である。また、マルチモードの逆相カラムを用い、クレアチン、クレアチニン、グアニジノ酢酸を10分で高速定量するLC-MS定量系を完成させた。クレアチン欠乏症の治療に向けては細胞内クレアチンの低下による分子機構の変化を理解する必要がある。さらに、近年シクロクレアチンがクレアチン欠乏症の治療薬候補として注目されているがこのような化合物による治療効果を評価するためのマーカーが必要である。そこで、国内で同定された3つの異なる変異を持つ患者由来及び正常繊維芽細胞の細胞膜画分におけるクレアチントランスポーターを含む複数のトランスポーターの絶対発現量を定量的標的プロテオミクスによって解析した。その結果、複数の栄養系トランスポーターの発現変動が認められた。発現が変動したトランスポーターには脳機能維持に重要な機能をになっているトランスポーターが含まれていた。この結果は、クレアチントランスポーターの変異によって他の栄養系輸送活性が変動する可能性を示す興味深い結果である。また、変異による細胞局在異常の原因としてクレアチントランスポーターへの糖鎖付加の異常がかかわっていることを明らかにした。さらに、マルチモード逆相カラムをもちいてシクロクレアチンのLC-MS/MSによる高感度定量系を構築した。当初計画通り順調に進んでいるが、一部、当初予想しない結果が得られたため、計画の修正を行った。特に、変異による他の栄養系輸送への影響は興味深く、シクロクレアチンの輸送の解析とともにクレアチントランスポーター欠損細胞を構築することによって、分子レベルの解析の加速を行っている。クレアチントランスポーター(CRT)は脳関門に発現し血中から脳へクレアチンを供給している。その変異によって脳内のクレアチンが欠乏し、精神遅滞やてんかんの中枢症状を呈するクレアチン欠乏症を生じる。CRT変異によるクレアチン欠乏症は、潜在的小児患者数が多いと考えられているが、その治療法、治療薬は未だ開発されていない。本研究は、先天性クレアチン欠乏症の治療を目指し、疾患原因となる変異型CRTの細胞内局在異常の分子機構を解明し、その分子機構の知見を基盤とし中枢クレアチン活性を回復する分子戦略を構築することを目的とする。H28年度は、CRT欠損による細胞内分子変化を詳細に解明するために、CRTをCRISPR/Cas9によってノックアウトさせたHEK293細胞の構築を行った。その結果、ヘテロKO細胞が樹立できた。ヘテロKO細胞を細胞分画し、それぞれの画分をWT細胞と定量的プロテオミクスによってプロテオームの比較を行った。また、クレアチンと関連するトランスポーター、受容体については定量的標的プロテオミクスによって高精度に定量比較を行った。その結果、エネルギー関連パスウェイに含まれる分子の変動を同定した。また、一部のトランスポーターについて細胞膜における発現変動が検出された。エネルギー系への影響が予想されたため、細胞増殖を計測した結果、WTと比較しヘテロKO細胞において細胞増殖が低下している事が明らかになった。これらのエネルギー変動を補充することが細胞機能の正常化に寄与すると考えられる。