hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カルシウムセンサーDOC2ｂのリン酸化を介する小胞膜融合調節機構

今回、DOC2b-/-マウスで検討した結果、インスリン抵抗性、耐糖能異常を認め、筋肉でのインスリン依存性糖取り込みが低下していた。またDOC2bはatypical PKC(aPKC)と結合し、その結合がDOC2bの細胞膜への移動に重要であることがわかった。DOC2bはaPKCと結合して細胞膜へ移動し、GLUT4小胞の細胞膜融合を促進して、個体の糖恒常性を維持している。1.DOC2bリン酸化シグナルを解明する。培養細胞の検討からDOC2bが細胞膜でカルシウムセンサー蛋白として働くためには、DOC2bのN端にあるMID domainがリン酸化を受ける必要があると考えられる。我々はインスリンシグナルの下流に存在するDOC2bリン酸化シグナルについて解明する試みを行った。次にDOC2b MID domainのリン酸化モチーフより上流因子としてセリン・スレオニンキナーゼを想定し、候補となったPKCファミリーとDOC2bの免疫沈降実験を行った。その結果、PKCの一つが、DOC2bとインスリン存在下で特異的に結合した。よってインスリン存在下でPKCがDOC2bをリン酸化することがわかった。これらの結果から目的としていたインスリンによるDOC2bリン酸化シグナルの重要な部分は解明できたと考えている。「B.DOC2bリン酸化シグナルの上流因子を同定」次にDOC2b MID domainのリン酸化モチーフより上流因子としてセリン・スレオニンキナーゼを想定し、候補となったPKCファミリーとDOC2bの免疫沈降実験を行った。「B.DOC2bリン酸化シグナルの上流因子を同定」次にDOC2b MID domainのリン酸化モチーフより上流因子としてセリン・スレオニンキナーゼを想定し、候補となっていたPKCファミリーとDOC2bの免疫沈降実験を行った。平成25年度の実験計画である1.DOC2bのリン酸化部位を同定する。2.DOC2bのリン酸化シグナルの上流因子を同定する。については上流因子であるPKCがDOC2bのMID domainを特異的にリン酸化することを確認し、目的は概ね達成された。糖尿病計画書で設定した平成25年度の実験計画の(1)DOC2bのリン酸化部位を同定する。についてはDOC2b MID domainのデータベースを基に候補となるセリン残基に変異を加えた変異体を作製し、DOC2bリン酸化抗体で認識するかを検討し、特異的なセリン残基がリン酸化されることを確認できた。(2)DOC2bリン酸化シグナルの上流因子を同定する。についてもPKCとDOC2bの免疫沈降実験で結合を確認できたので、DOC2bリン酸化シグナルを解明するという目的は概ね果たせたと考える。今回平成25年度に計画していた実験が順調に進展したことから、当初予定していた実験試薬や消耗品等を低額に抑えることができたため次年度使用額が生じた。次年度、培養細胞の継代やウイルス作成、動物飼育費と併せて使用する。
極微量しかコエンザイムQをもたない分裂酵母が示す表現型とCoQの存在意義

コエンザイムQ10(CoQ10)は、ミトコンドリアにおける電子伝達機能の他に、近年、脂質の過酸化防止機能を有する脂溶性抗酸化物質としての働きや、硫化物の代謝、ピリミジン合成などの新たな機能の発見に注目が集まっている物質である。CoQが欠損すると、植物では胚性致死を示し、動物では胎生致死を示すことが報告されていることから、CoQは非常に重要な成分である。Schizosaccharomyces属の分裂酵母のうち、S. pombeはモデル生物として広く基礎研究で使われており、私たちの研究室ではS. pombeのCoQ欠損株が、最少培地での生育遅延、酸化ストレス感受性、毒性の高い硫化水素の発生など、特徴的な表現型を示すことを明らかにしてきた。分裂酵母の中でもS. japonicusはCoQが検出されないと報告されているため、実際にS. japonicusからCoQ抽出を行ったところ、極微量ではあるがCoQ10が検出された。そこで、本年度は、S. pombeのCoQ欠損株とCoQ量が極微量であるS. japonicusの表現型を詳細に解析した。その結果、S. japonicusはグリセロールを炭素源とする非発酵性培地では生育せず、酸素消費量もごくわずかでS. pombeのCoQ欠損株と同様の性質を示した。一方、過酸化水素やパラコートなどの酸化ストレス条件では、S. pombeのCoQ欠損株よりも強い酸化ストレス感受性を示し、ほとんど硫化水素も発生していないことが分かった。また、嫌気条件下では栄養豊富な培地でも特にS. pombeのCoQ欠損株は生育が悪くなるのに比べて、S. japonicusはその生育が好気条件とほとんど変わらなかった。以上の結果から、S. japonicusはCoQ量が極微量であるが、S. pombeのCoQ欠損株とは異なる表現型を示すことが示唆された。コエンザイムQ10(CoQ10)は、ミトコンドリアにおける電子伝達機能の他に、脂溶性抗酸化物質としての働きや、硫化物の代謝、ピリミジン合成などの新たな機能の発見に注目が集まっている物質である。モデル生物として広く使われているS. pombeに比べて、研究例の少ないS. japonicusの最大の特徴はCoQが検出されないと報告されていることであるが、実際にS. japonicusからCoQ抽出を行ったところ、極微量ではあるがCoQ10が検出された。そこで、本研究では、CoQ量が大きく異なる2種類の分裂酵母S. pombeのCoQ欠損株とCoQ量が極微量であるS. japonicusの表現型を詳細に解析し、S. japonicusは非発酵性培地では生育せず、酸素消費量もごくわずかでS. pombeのCoQ欠損株と同様の性質を示すことを明らかにした。一方、酸化ストレス条件では、S. japonicusは強い酸化ストレス感受性を示し、ほとんど硫化水素も発生していなかった。また、嫌気条件下では栄養豊富な培地でもS. japonicusはその生育が好気条件とほとんど変わらず生育することなど、新しい知見を見出した。また、S. japonicusは形質転換効率が非常に悪いが、CoQ合成酵素遺伝子を破壊することによってCoQを欠損したS. japonicus株を作製した。本年度の研究で、CoQ量が極微量のS. japonicusの表現型を詳細に解析し、S. pombeのCoQ欠損株とは異なる表現型を示すことが明らかになった。また、CoQ合成酵素遺伝子を破壊することによってCoQを欠損したS. japonicus株を作製することができた。そこで、次年度はS. japonicusのCoQ欠損株を用いて様々な表現型を解析し、極微量ながら存在するCoQによって表現型にどのような影響があるかを解析していく。また、S. pombeのCoQ欠損株で影響を受けるCysの量やグルタチオンの量など、代謝系における影響や、抗酸化系における影響についての検討も行っていく。

一方、過酸化水素やパラコートなどの酸化ストレス条件では、S. pombeのCoQ欠損株よりも強い酸化ストレス感受性を示し、ほとんど硫化水素も発生していないことが分かった。また、嫌気条件下では栄養豊富な培地でも特にS. pombeのCoQ欠損株は生育が悪くなるのに比べて、S. japonicusはその生育が好気条件とほとんど変わらなかった。以上の結果から、S. japonicusはCoQ量が極微量であるが、S. pombeのCoQ欠損株とは異なる表現型を示すことが示唆された。コエンザイムQ10(CoQ10)は、ミトコンドリアにおける電子伝達機能の他に、脂溶性抗酸化物質としての働きや、硫化物の代謝、ピリミジン合成などの新たな機能の発見に注目が集まっている物質である。モデル生物として広く使われているS. pombeに比べて、研究例の少ないS. japonicusの最大の特徴はCoQが検出されないと報告されていることであるが、実際にS. japonicusからCoQ抽出を行ったところ、極微量ではあるがCoQ10が検出された。そこで、本研究では、CoQ量が大きく異なる2種類の分裂酵母S. pombeのCoQ欠損株とCoQ量が極微量であるS. japonicusの表現型を詳細に解析し、S. japonicusは非発酵性培地では生育せず、酸素消費量もごくわずかでS. pombeのCoQ欠損株と同様の性質を示すことを明らかにした。一方、酸化ストレス条件では、S. japonicusは強い酸化ストレス感受性を示し、ほとんど硫化水素も発生していなかった。また、嫌気条件下では栄養豊富な培地でもS. japonicusはその生育が好気条件とほとんど変わらず生育することなど、新しい知見を見出した。また、S. japonicusは形質転換効率が非常に悪いが、CoQ合成酵素遺伝子を破壊することによってCoQを欠損したS. japonicus株を作製した。本年度の研究で、CoQ量が極微量のS. japonicusの表現型を詳細に解析し、S. pombeのCoQ欠損株とは異なる表現型を示すことが明らかになった。また、CoQ合成酵素遺伝子を破壊することによってCoQを欠損したS. japonicus株を作製することができた。そこで、次年度はS. japonicusのCoQ欠損株を用いて様々な表現型を解析し、極微量ながら存在するCoQによって表現型にどのような影響があるかを解析していく。また、S. pombeのCoQ欠損株で影響を受けるCysの量やグルタチオンの量など、代謝系における影響や、抗酸化系における影響についての検討も行っていく。当該年度の経費は順調に使用しているが、若干の残額が発生している。無理に使用することなく、次年度の消耗品の購入に充てる予定である。
膵発癌における分化異常とmiRNA制御不安定性の関連解析

申請者は膵発がん時の分化異常(胃上皮分化)に着目し、胃上皮細胞接着分子CLDN18と転写因子EVI1の高発現、EVI1-miRNA96-KRAS axisを同定し、膵発がん過程の解明をこれまで進めてきた。これに基づき本研究では、膵発がんのbiologicalな背景の解明をEVI1を軸に行い、発がん促進サイクルの一つとしてEVI1-miRNA96-Glypican-1 axisを同定した。また、膵がん細胞と膵前がん細胞のmiRNA発現の比較により、発がん時に包括的変動を示すmiRNA群の解析を進める基盤を作った。本研究の成果は、未解明な部分の多い膵発がん過程を明らかにする重要な結果である。本研究課題は膵発癌の解明を目的とし、発がん早期の分化異常(胃上皮化生など)と多段階発癌過程におけるmicroRNA(以下miRNA)の包括的動態、およびmiRNA発現制御の主要分子群とEVI1の役割を中心的に解析している。申請者はこれまで膵発がん早期に発現上昇の見られる転写因子EVI1がmiRNA-96を介してKRASを制御することで発がんを促進させることを解明してきた。今年度はさらに、EVI1によるmiRNA発現変動を介した発がん促進過程の一環として、膵発がん早期に血清エクソソーム内に多く見られると報告されたGlypican-1(以下GPC1)の発現がEVI1-miRNA axisを介して行われており、GPC1発現上昇自体が発がん促進作用を有することについてもin vitroで実証した。さらに浸潤性膵管癌、前がん病変、および浸潤性膵管がん以外の膵病変などから成るヒト組織検体を用いてEVI1, GPC1の組織発現ならびに臨床病理学事項との関連を検討した。<2>miRNA発現制御と膵癌ヒト検体を用いて、浸潤性膵管癌ならびに前がん病変におけるmiRNA発現制御分子の発現を検討し、臨床病理学的事項との関連を検討した。また、細胞株を用いて、miRNA発現制御分子の下流探索を行っている。膵発がん早期に重要であるEVI1の下流機構としてKRAS以外の発がん経路を同定することに成功した。また、同分子は膵癌患者の血清エクソソーム内に多くenrichされることが報告されているが、組織検体での発現検討を行うことで、バイオマーカーとしての意義を検証するための重要な結果をもたらした。本研究課題は膵発がん機構の解明を目的とし、発がん早期の形態変化と分子異常(胃上皮化生など)と多段階発がん過程における、microRNAの包括的動態、およびmicroRNA発現制御の主要分子群とEVI1の役割を軸に据えて研究を進めている。申請者はこれまで膵発がん早期に発現上昇のみられる転写因子EVI1が、microRNA-96を介してKRASを正に制御することで、膵発がんを促進させることを解明した。膵発がん早期のマーカーとして、ヒト血清エクソソーム内にenrichするGlypican-1(以下GPC1)が近年報告された(Nature 2015)。申請者は、ヒト組織検体を用い、GPC1が前がん段階から浸潤がんに至るまで強発現することを見出し、またin vitro assayから、GPC1が膵前がん細胞および膵がん細胞において発がん促進的に作用することを明らかにした。そのうえで、膵発がん早期から発現するGPC1と、前述の、やはり膵発がん早期から発現するEVI1の関係性に注目し、EVI1がmicroRNAを介してGPC1発現を制御し、その発がん促進的作用をmodulateすることを見出した(現在投稿中)。この成果は、膵発がん過程において、発がんを正に押し進めていくEVI1-miRNAを中心としたnetwork機構の解明の一端であり、膵発がんのbiologyを解明するうえで非常に有用な結果である。<2>miRNA発現制御と膵発がんmiRNAの発現制御が膵多段階発がんに果たす機能について、ヒト組織検体ならびにin vitro assayを用いて検証を行っている。家族のケアのために一時的に休業を取得したため。本研究課題は膵発がん機構の解明を目的とし、発がん早期の形態変化と分子異常(胃上皮化生など)と多段階発がん過程における、microRNAの包括的動態、およびmicroRNA発現制御の主要分子群とEVI1の役割を軸に据えて研究を進めてきた。膵発がん早期のマーカーとして、ヒト血清エクソソームにenrichするGlypican-1(以下GPC1)が近年報告された(Nature 2015)。そのうえで、膵発がん早期から発現するGPC1と、前述の、やはり膵発がん早期から発現するEVI1の関係性に注目し、EVI1がmicroRNAを介してGPC1発現を制御し、その発がん促進的作用をmodulateすることを見出した(Oncotarget2017)。<2>

miRNA発現制御と膵発がんmiRNAの発現制御分子(特に生合成分子)が膵多段階発がんに果たす機能について、ヒト組織体での免疫組織学的発現およびsiRNAによるノックダウン実験などのin vitro assayを用いて検証を進めている。申請者は膵発がん時の分化異常(胃上皮分化)に着目し、胃上皮細胞接着分子CLDN18と転写因子EVI1の高発現、EVI1-miRNA96-KRAS axisを同定し、膵発がん過程の解明をこれまで進めてきた。これに基づき本研究では、膵発がんのbiologicalな背景の解明をEVI1を軸に行い、発がん促進サイクルの一つとしてEVI1-miRNA96-Glypican-1 axisを同定した。また、膵がん細胞と膵前がん細胞のmiRNA発現の比較により、発がん時に包括的変動を示すmiRNA群の解析を進める基盤を作った。本研究の成果は、未解明な部分の多い膵発がん過程を明らかにする重要な結果である。発がん早期のmiRNAの発現動態解明を目的として、ヒト組織検体でのレーザーマイクロダイセクションから膵発がん過程におけるmiRNAの発現変化を追い、また、Drosha, DicerをはじめとするmiRNA発現制御分子が膵発がんにもたらす機能について、in vitroおよびヒト組織検体から検証を行う。microRNAの発現制御分子およびmicroRNAは臓器多様性があり、oncogenicと報告されているものついても必ずしてもすべての臓器に当てはまらない現状がある。申請者は、膵発がんにおけるmicroRNAの役割を、ヒト組織検体における免疫組織化学染色やmicroRNA発現、分子生物学実験、ならびに網羅的な発現解析などの手法を用い、膵発がんにおいて重要なmicroRNAを同定していく。病理家族のケアのために一時的に休業を取得したため、研究が遅延し、当初申請していた2年以内に予定の研究がすすめられなかったため。膵発がんにおける、microRNAの発現制御分子およびmicroRNAの役割を、ヒト組織検体、分子生物学実験、ならびに網羅的な発現解析などの手法を用いて明らかにしていく。
導通部・絶縁部が共存するガラス／ガラス陽極接合界面の作成方法の開発

29年度以前の研究では、ガラス同士の陽極接合を仲立ちする導体層の接合後の残存量を接合界面上の場所によって変えるために接合面に施す導体層の厚みを部分的に変化させていた。この方法で界面上の導体層が全て酸化された部分と一部が未酸化で残存した部分が共存する継手を作成できたが、導体層の厚さが替わる位置に生じる接合面の段差がその周囲の健全な接合を妨げる可能性があった。そこで、アルミニウム層を仲立ちとするガラス同士の陽極接合において、ガラスと接触させ陽極としてガラスとの間に電圧を加えると陰極側に移動するガラス中の陽イオン元素を置換しながらガラスに侵入する性質をもつ銀の層をアルミニウム/ガラス接合面の一部にはさむことによって接合電圧印加開始後のアルミニウム層とガラスの接合の開始を遅らせ、接合後にその部分に未酸化のアルミニウム層を残存させることを試み、仲立ちのアルミニウム層が銀層を施した部分に残存し、それ以外の部分ではすべて酸化された継手を得た。・高導通性の部分と絶縁性の部分が共存するガラス同士の陽極接合界面の作製29年度の研究で開発した、接合する両方のガラスの接合面に仲立ちの導体層を施して陽極接合を行う手法を応用して、未酸化の導体層が残存し高い導通性を持つ部分と全ての導体層が酸化され絶縁性となった部分が共存するガラス同士の陽極接合界面を作製した。1枚のガラスの接合面に蒸着層のない狭い帯状の部分で区切られた厚いアルミニウム層を施し、もう1枚のガラスの接合面に薄いアルミニウム層を施して、両者を重ね合わせて接合を行った。適切な接合条件下で、2つのアルミニウム層が重なった部分は高い導通性を示し、薄いアルミニウム層のみの部分で仲立ちされた部分は全てのアルミニウム層が酸化されて絶縁性となった接合界面が得られた。29年度に開発した接合する両方のガラスの接合面に仲立ちの導体層を施して陽極接合を行う方法を用いて、研究課題の主要な目的である導通部と絶縁部が共存する接合界面を持つガラス同士の陽極接合継手を実際に作製することができた。また、接合界面に未酸化で残存する導体層の量を制御する新たな方法として、電圧印加によってガラス中の陽イオン元素を置換しながらガラスに侵入する性質(non-blocking anode)を持つ銀をガラスと導体層の接合面の一部に挿入して、その部分でのみ接合中の導体層の酸化を遅らせる方法の可能性を示すことができた。この方法では接合を仲立ちする導体層の厚さは接合面全体で一定であり、また一部に施した銀層は電圧印加中にガラスに吸収されるため接合面に導体層の厚さの違いに起因する段差が生じることがないので、接合面全体をより均一に接合できると考えられる。また、接合界面に適切な量の導体を残存させるためには接合条件、特に接合電圧の印加時間を精密に制御する必要があるが、そのためには特に、導体層とガラスを健全に接合するために必要な最低限の電圧印加時間を知る必要がある。陽極接合では接合の対象であるガラスが脆性的であり、また薄板同士の重ね接合であることから得られた接合界面の強さの評価が難しかった。そこで集束イオンビーム(FIB)加工装置を用いて接合界面を横切る微小試験片を作製し、その曲げ試験も同じ装置中で行う手法を考案し、それを用いることでガラス同士の陽極接合界面の強さの評価を行い、アルミニウム層を仲立ちとしたソーダライムガラス同士の陽極接合では接合電圧の印加開始後に接合界面の密着が生じてから短時間のうちに界面の強さが高い値に達しその後大きく変化しないこと、また界面の強さが十分な値に至るまでに必要なガラス中のイオンの移動量の目安を明らかにすることができた。ガラス同士の陽極接合を、仲立ちする導体層を接合する両方のガラスの接合面に施して行う方法を応用して、導通性のある部分と絶縁性の部分が共存するガラス同士の陽極接合界面を作製できることが実証できたので、今後はこの方法で接合界面上に形成しうる導通部/絶縁部のパターンをどの程度細密化・複雑化しうるかの検証を行う。また、30年度に新たに考案した、電圧印加によってガラスに侵入する材料を接合の仲立ちとする導体とガラスの間にはさんで導体の酸化を部分的に遅らせる方法や、ガラス同士の陽極接合界面に部分的な導通部を作成するための別の方法として当初から提案していた導体層の一部を難酸化性の金属と置き換えてその金属の層を接合界面に残存させる方法についても実験を進める。これらの手法で得られた陽極接合界面の力学的・電気的・光学的性質を、FIB装置中での微小力学試験などの手法を用いて測定し、それぞれの作製手法によって得た接合界面の性質の違いを明らかにする。また、それらの性質を材料学的に説明するため、界面の微細組織を透過型電子顕微鏡(TEM)によって観察する。フォトリソグラフィー等の技術を用いて、継手の健全性を保ちつつ、ガラス同士の陽極接合界面上に接合を仲立ちする導体が残った導通部と完全に酸化された絶縁部の微細化なパターンを作製する。そのようなパターンを形成できたら、導通部と絶縁部の光透過性の違いを利用して、本課題のもう一つの目的である回折格子などの光学素子のガラス同士の陽極接合界面上への作製を試みる。

ガラス同士の陽極接合界面の光学的性質を制御する手段として提案している、仲立ちの導体層に難酸化性の金属を合金化して接合界面に微細な金属粒子を分散させる手法も、陽極接合継手への逆電圧印加についての過去の知見も活かして検討する。・ガラス同士の陽極接合を仲立ちする導体層の電気抵抗の、導体層の初期厚さ、接合条件による変化の観察チタン、アルミニウムの層をを仲立ちとしたソーダライムガラス同士の陽極接合を行い、接合後に界面に残った導体層の電気抵抗の導体層の初期厚さ、接合条件(接合電圧の印加時間)による変化を観察した。チタン、アルミニウムいずれの導体層でも、小さい初期厚さで長時間の電圧印加を行った場合、ほぼ絶縁状態となるまで電気抵抗が増加するのが観察された。電気抵抗の変化は接合界面の光透過率の変化と良い相関を示した。接合後の界面の微細組織の観察によって、電気抵抗が著しく増加した界面の導体層は接合中にガラス中から接合界面に供給される酸素によってほぼすべて酸化していること、一方大きな初期厚さから始めて接合後も導体層の導通性が残った界面には未酸化の金属が残存しているのが確認された。これらの結果から、仲立ちとする導体層の厚さを部分的に変えることで、場所ごとに導通性の異なるガラス同士の陽極接合界面の作成が可能であることが示された。・ガラス同士の陽極接合を、接合する両方のガラスの接合面に仲立ちとなる導体層を施して行う可能性の検証従来、ガラス同士の陽極接合を仲立ちする導体層は接合するガラスの片方のみに施すものであり、両方のガラスに施した場合、導体層同士の界面の接合が行われないため接合が完了しないと考えられてきた。しかし導体層の厚さを部分的に変化させたい場合、両方の接合面に導体層を施して接合できれば導体層の製膜過程を簡略化することができ、また接合後の界面に形成できる構造に広がりができる。一方のガラスに施す導体層を接合の初期に完全に酸化される程度に薄くしてやることで、残った酸化層ともう一方の導体層が接合されて接合が完了するのではないかと考え、そのような接合の実現性を実験的に検証した。ガラス同士の陽極接合継手において、接合を仲立ちして界面に残存する導体層の導通性を、導体層の初期厚さ、接合条件を適切に設定することで制御できることを実験によって実証し、またそれらの条件の違いで導通性に変化が生じる原因を接合界面の微細組織観察によって明らかにした。これらの成果から、本課題の目標とする導通部と絶縁部が共存するガラス同士の陽極接合界面を、接合を仲立ちする導体層の初期厚さを接合面の場所によって変えてやることで実現できることを示すことができた。導通部と絶縁部が共存するガラス同士の陽極接合界面の実用的応用として、陽極接合を用いてガラスのパッケージ中に封止する電気素子にガラスの間の接合界面を通じて外部から電気回路を接続することを考えているが、そのような構造を容易に作成するためのプロセスの検討を通じて、接合する2枚のガラス板の両面に厚さの異なる導体層を施し、陽極接合中に薄い導体層が完全に酸化されることを利用して接合を完成させる手法を新たに考案し、そのような接合が実際に可能であることを実験的に検証し、実用的な接合プロセスの開発を進展させることができた。これまでガラス同士の接合を仲立ちする導体材料としては主にチタンとアルミニウムを検討してきたが、接合研に施した導体層の厚さを場所によって変えるような場合により密着性の高い接合界面を形成させて得られる継手の気密性を確保する目的で、それらの材料と機械的・熱的性質の大きく異なるスズに着目し、スズを仲立ちとしたガラス同士の陽極接合の実現性を検証する実験を行い、健全な継手が得られる接合条件の範囲を明らかにした。この結果は、本課題の実用的応用である電気素子のガラスパッケージ封止体の作製に有効に利用できると考えられる。
海洋中深層における大規模炭素循環を支配する微生物食物網ネットワークの機構論的解明

本研究では、これまで未解明であった、海洋中深層の炭素循環過程を支配する微生物食物網ネットワークの構造と動態に関する理解を深化させるために、研究船による観測とモデリングを連携させた学際的な研究を推進した。その結果、海洋の表層から深層にかけて、深度とともに、微生物食物網の構造が系統的に変化することが明らかになった。また、微生物間相互作用を明示的に組み込んだ、全海洋規模3次元生物地球化学モデルの構築を進め、微生物相互作用が海洋物質循環に及ぼす影響を定量的に評価することに成功した。本研究では、海洋中深層の大規模な炭素循環過程を支配する微生物食物網ネットワークを捕食系と感染系からなる複合的なシステムとしてとらえ、その変動メカニズムを解明することを目的とする。平成24年度には、捕食系と感染系の鉛直分布パターンと有機物動態の関係を解明するための方法論の検討を進めた。具体的には、放射性核酸前駆体をトレーサとして用いた微生物の活性測定と、フローサイトメトリー法によるウィルスの動態の高精度な分析を組み合わせることで、海洋中深層における細菌ーウィルス系の相互作用を解析する手法の検討を進めた。また、学術研究船「白鳳丸」と海洋地球観測船「みらい」の研究航海において、感染系と捕食系の関連パラメータと有機物変数の分布を詳細に調べるための観測を実施した。同時に、培養実験により有機物添加に対する捕食系と感染系の応答特性を明らかにする手法の検討も進めた。さらに、感染系と捕食系を組み込んだ生物地球化学モデルを構築し予備的な数値実験を行った。本年度の研究により、微生物食物網ネットワークの動態を定量的に把握するための方法的な基盤の整備が進んだ。また、予備的に構築したモデルの解析から、中深層の微生物食物網動態に対して海水の移流が影響を及ぼしている可能性が示唆された。これらの成果の一部は、論文として公表するとともに、国際学会等で発表した。本研究では、海洋中深層の大規模な炭素循環過程を支配する微生物食物網ネットワークを捕食系と感染系からなる複合的なシステムとしてとらえ、その変動メカニズムの解析を行うことを目的として推進している。平成25年度は、前年度に引き続き、西部および中部太平洋の観測を実施するとともに、微生物動態のパラメータの検討を進めた。また、学術研究船白鳳丸や調査船みらいの航海で得られた微生物諸量とそれと関連する物理化学パラメータの鉛直分布や季節変動および地理的変動に関するデータを基に、海洋中深層における微生物と有機物の動態を明示的に組み込んだ全海洋規模3次元生物地球化学モデルの予備的モデルの構築を進めた。また、西部北太平洋における微生物(原核生物とウィルス)の全深度分布のデータベースを構築し公開した。このデータベースは、海洋中深層の微生物食物網ネットワーク解析の重要な基礎となるものであり、本研究計画の主要なアウトカムのひとつであると考えている。また、昨年度に検討した微生物動態の解析手法を適用することで、微生物食物網の動態の解析を進めた。これまで情報の乏しかった、海洋中深層におけるウィルスの分布についての解析を進め、海洋大循環によってウィルスが大規模に輸送されている可能性をはじめて指摘した。この成果を国際誌に公表した。さらに、以上の観測とモデリング研究から得られた成果を国際会議の招待講演において公表し、世界的に著名な専門家との議論を進めた。本研究では、海洋中深層の大規模な炭素循環過程を支配する微生物食物網ネットワークを捕食系と感染系からなる複合的なシステムとしてとらえ、その変動メカニズムを解明することを通じて、海洋物質循環についての理解を深化させることを目的とし、観測とモデリングを連携させた学際的な研究を推進した。平成26年度は、本研究で実施した研究船観測(白鳳丸、みらい)によって取得した、海洋における微生物諸量の全深度分布と、それに関連する物理化学パラメータのデータを統合化し、データベースを充実化するとともに、得られたデータの解析を進めることで、海域および季節による捕食系と感染系の変動機構の究明を進めた。また、微生物間相互作用を明示的に組み込んだ、世界初の全海洋規模3次元生物地球化学モデルの構築を進め、微生物相互作用が海洋物質循環に及ぼす影響の検討を行った。本研究で得られた実験データ等を踏まえ、パラメータ設定の検討を詳細に行い、モデルの改良を進めた結果、微生物や栄養塩類の鉛直分布の観測結果が良好に再現できた。このモデルを用いて感度解析を行った結果、溶存有機物と微生物の相互作用系が、海洋一次生産を低下させていることが示された。また海洋における溶存有機物の分布が、捕食系の温度依存性パラメータのわずかな変化に対して敏感に応答するという新たな知見も得られた。さらに、ウィルス(感染系)の海洋における分布が、海洋大循環の影響を受けていることも示唆された。成果を論文としてまとめ、国際誌に公表した。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究は、以下の理由からおおむね順調に進展していると判断する。平成24年度に実施した方法的な検討を踏まえ、太平洋における観測研究を実施するとともに、得られたデータをデータベースとして公開した。

また、これまでのデータをもとに、海洋の微生物食物網ネットワークに関する予備的モデルを構築し、その成果を国際会議等で公表した。海洋生物地球化学本研究によって得られた、海洋中深層の微生物食物網ネットワークに関する総合的な観測データと実験結果を統合化し、全海洋規模の3次元生物地球化学モデルを構築し、本研究の目的である、海洋の物質循環における微生物食物網の役割についての理解の深化を達成する。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、主に、中深層における微生物食物網ネットワークを定量的に把握するための方法論の検討を進めたが、その結果、今後の研究の推進に必要な研究手法の整備が進んだ。これらの分析手法については、次年度以降もさらに改良を加える予定であるが、今年度の目標はおおむね達成できた。また、研究船による観測もおおむね順調に進展し、異なる海洋学的特性をもった外洋域における微生物食物網と有機物パラメータの分布を解析するためのサンプルの収集が進んだ。さらに、予備的な生物地球化学モデルの構築を進め、中深層の微生物食物網動態の統合的な理解にむけての基盤を構築することができた。全深度微生物分布データベースには白鳳丸航海により得られた微生物(原核生物およびウィルス)の生物量および生産速度の全深度分布に関するデータおよび関連情報(CTDおよび栄養塩データ)がまとめられている。全深度微生物分布データベース(FddMAP)には白鳳丸航海により得られた微生物(原核生物およびウィルス)の生物量および生産速度の全深度分布に関するデータおよび関連情報(CTDおよび栄養塩データ)がまとめられている。今年度に検討を進めた手法にさらに改良を加えることで、中深層の微生物食物網ネットワークの諸特性を高精度に分析する手法を開発する。また、これらの手法を適用することで、微生物食物網ネットワークの動態の解析を進める。今年度に引き続き、白鳳丸等の研究船による観測研究を進め、熱帯、亜熱帯、亜寒帯、極域を含む広範な海域において、微生物食物網変数と有機物パラメータのデータを収集する。また、これらの情報をモデルに統合化するための検討を進める予定である。
偶蹄目の家畜および野生動物における環境適応性に関する遺伝子のcSNPs探索

1)家畜豚品種およびイノシシ数亜種において、β3アドレナリン受容体遺伝子コード領域の完全長配列を決定し、そこに存在する1塩基多型(SNPs)を探索した。その結果、終止コドンの5塩基上流にT(チミン)の1塩基挿入変異を発見した。この変異によりフレームシェフトが生じアミノ酸配列は変異型においてC末側2アミノ酸残基を欠く受容体を生産すると考えられる。この変異型遺伝子の商業用豚品種における分布を調査した結果、ランドレース種および一部の系統豚では、変異型を持つ個体が非常に少ないのに対し、系統造成の過程にあるデュロック種の集団には、高頻度で存在することが明らかになった。また、梅山豚において、新たな変異を発見した。β3アドレナリン受容体は脂肪細胞において、エネルギー収支の調節に重要な役割を担っており、このSNPsによって豚の産業的形質に差異が生じるかどうかさらなる研究の必要がある。2)ウシ属の家畜および野生動物に、加えて河川水牛およぶ沼沢水牛において、βグロビン遺伝子の完全長塩基配列を決定した。その結果、血液中のヘモグロビンの電気泳動的多型に対応するSNPsの存在を明らかにし、タンパク質の電気泳動マーカーをDNAマーカーに置き換えることに成功した。さらに、河川水牛と沼沢水牛間における多型を発見したことから、両者の交雑群における適正な選抜マーカーを提供することが可能となった。3)家畜牛およびガウールの家畜型であるミタンにおいて、セロトニンレセプター1b遺伝子のコード領域の配列を決定し多型を探索した、その結果、北方系牛であるヘレフォード種とトカラ牛の間には多型は存在しなかった。しかし、ミタンにおいては家畜牛との間にアミノ酸置換を伴う変異が存在することを明らかにした。またインド系牛ではこの遺伝子の配列決定にはいたらなかったが、北方系牛との間には遺伝子の上流域において変異があることが示唆された。1)ミトコンドリアDNAの塩基配列の解析から、遺伝的な系統関係が遠いと判断された、家畜ブタ品種およびイノシシ数亜種において、β3アドレナリン受容体遺伝子ORFの完全長配列を決定し、そこに存在する1塩基多型(SNPs)を探索した。この変異によりフレームシェフトが生じアミノ酸配列は変異型においてC末側2アミノ酸残基を欠く。このβ3アドレナリン受容体の多型は中国原産の梅山豚・東南アジア在来豚を主な起源とするクラウンミニブタおよび、東南アジア在来豚より検出され、イギリス原産の中ヨークシャー種には存在しないことが明らかになった。β3アドレナリン受容体は脂肪細胞において、ストレス反応やエネルギー収支の調節に重要な役割を担っており、このSNPsによって豚およびイノシシのストレス反応に違いがあるかどうか今後検討を進める。2)ウシおよびウシ属の野生動物において、βグロビン遺伝子OFRの完全長塩基配列を決定した。その結果、アミノ酸置換を伴う多数の多型を見つけることができた。この多型を比較すると、家畜ウシ集団の中に、野生種と共通の多型が存在する事が明らかになった。このことから、東南アジアの在来牛集団の成立には、ウシとは種を異にする野生種からの遺伝子流入が存在することが証明できた。この結果は、東南アジア在来牛は、ウシにおける遺伝子の多型検出に極めて有効な材料であることを示し、多くの遺伝子における多型の発見が期待できる。
ラットモデルを用いたアルツハイマー病治療薬による緑内障に対する神経保護治療の開発

ラットの上強膜静脈を2本結紮した時の平均眼圧は処置前の13. 2mmHgに対し、1週後20.6mmHg、5週後19. 4mmHgと上昇した。上強膜静脈3本を結紮した時の平均眼圧は処置前の14. 6mmHgに対し、1週後19. 3mmHg、5週後20. 7mmHgと、2本結紮と大差なかった。結紮では結紮が弱いと血流が再疎通する、強いと出血を来たし、眼球癆を起こしやすい、という問題があるため、焼灼を行った。ラットの上強膜静脈3本を焼灼した処置前平均眼圧が10. 3±1. 5mmHgに対して、処置1週後眼圧は10. 0±2. 3mmHgと、有意な眼圧上昇をもたらさなかった。しかし、1眼ずつを見れば、眼圧上昇を来したものもあった。他の眼圧上昇モデルとして、隅角の光凝固モデル、トリアムシノロン硝子体内注入も行ったが、有意な眼圧上昇は得られなかった。まず、上強膜静脈を結紮することによる眼圧上昇を観察した。まず4匹4眼の上強膜静脈を2本結紮し、5週間経過観察した。平均眼圧は処置前の13.2mmHgに対し、1週後20.6mmHg、2週後20.2mmHg、3週後13.8mmHg、4週後18.8mmHg、5週後19.4mmHg(5週後は2匹が死亡したため2眼の平均)と、眼圧上昇傾向を見せたが、効果が弱かったため、次に8匹8眼の上強膜静脈3本を結紮した。8眼のうち、2眼が眼球癆に陥ったため6眼の経過を観察した。平均眼圧は処置前の14.6mmHgに対し、1週後19.3mmHg、2週後17.8mmHg、3週後19.3mmHg4週後20.0mmHg5週後20.7mmHgと、2本結紮と大差なかった。当初上強膜静脈の焼灼を予定していたが、焼灼による炎症の影響を除去するため結紮で行ったが、結紮では1)結紮が弱いと血流が再疎通する、2)逆に強いと出血を来たし、眼球癆を起こしやすい、という問題があるため、今後は焼灼を行う予定とする。また、ドネペジル投与法の至適化のため、既に検討した経口投与法と、硝子体投与、背部浸透圧ポンプ留置法の効果を視神経切断モデルを用いて検討した。視神経切断後1週間で生存網膜神経節細胞数は1135/mm^2となるが(n=6)^1、ドネペジル10μMの硝子体内投与で1251.8/mm^2と生存が促進された(n=5)。これは、すでに報告した1mg/kgの経口投与(1330.3/mm^2)^1より劣るものの、有意な保護効果を示し、研究スタイルによっては使用してよい投与法と考えられる。参考文献ラットの片眼の上強膜静脈2本を結紮したモデルでは、処置眼の術前眼圧が平均10.1±1.1mmHgに対し、術後が9.1±0.2mmHg、対照眼の術前眼圧が11.6±4.2mmHgに対して術後が8.6±1.4mmHgと有意な変化を認めなかった(いずれもn=3)。焼灼モデル以外の薬物スクリーニング手段として、ラット培養網膜神経節細胞に対するpigment epithelium-derived factor(PEDF)の神経保護効果の検討を行った。培養開始3日後の生存細胞数は、PEDFを投与しなかった群(n=18)を1とした生存率で、PEDF1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1μg/mlではそれぞれ1.13±0.53(n=8)1.52±0.54(n=6)2.40±0.52(n=6)3.45±1.08(n=16)4.31±1.34(n=8)であり、濃度依存性に保護効果を有した。

有望な神経保護薬剤と考えられたが、臨床応用のためにはin vivoモデルの確立が必要であるが、in vivoモデルは既報どおりの手技で行っても安定した眼圧上昇を得ることが難しかった。今回はラットの上強膜静脈3本を焼灼した。既報では結膜を切開して上強膜静脈を分離して焼灼すると報告されているが、実際自験例では直接焼灼をすると高率に強膜穿孔を生じた。ブレードを用いて上強膜静脈を強膜から持ち上げて焼灼すると穿孔しないが、両手を用いる手技のため制御糸の設置が必要となり、制御糸設置時に房水の漏出を生じて眼圧が下降すること、静脈単離時に高率に静脈損傷、出血を伴うことが欠点であった。手術用マイクロスコープを用いれば、結膜上から上強膜静脈の視認が可能なため、結膜上から焼灼した。9匹9眼にたいして施行したが、処置前平均眼圧が10.3士1.5mmHgに対して、処置後(1週後)眼圧は10.0±2.3mmHgと、有意な眼圧上昇をもたらさなかった。しかし、1眼ずつを見れば、眼圧上昇を来したものもあった(最も大きいもので処置後の処置眼の眼圧が144mmHgに対して対側の対照眼の眼圧が10.2mmHg)。他の眼圧上昇モデルとして、隅角の光凝固モデルも検討した。処置前平均眼圧が9.7mmHgに対して処置1週後後が12.5mmHg(n=3)であったが、すべての眼で合併症(出血もしくは角膜混濁)を伴っていた。また、ステロイド誘発性の眼圧上昇を検討するため、トリアムシノロン硝子体内注入も行ったが、注入前平均眼圧が8.6mmHgに対して、注入1週後眼圧は9.1mmHg(n=6)と有意な上昇を認めず、各個体のレベルでも十分な眼圧上昇を来した個体はなかった。
関数型言語記述に基づくコード最適化共通フレームワークの研究

1.本研究は,コード移動に基づく最適化一般に対して,データフロー解析の共通な枠組みを,カスタマイズしやすい形で実現する.本研究の目的は次のとおりである.i.オブジェクト指向記述が可能な関数型言語によって,コンポーネントからなる変更が容易なコンパイラを記述する.ii.コンパイラの各コンポーネントを組み合わせて,基本最適化や新しい最適化を実現する.2.平成16年度に得られた成果は次のとおりである.i.コード最適化の解析に用いられるデータフロー解析を要求駆動型で実現する際に,制御フローグラフの深さに相当するランクに基づいて,訪問する必要がないプログラム点を予測し,それらのプログラム点を飛び越すことによって,効率的な解析を実現する手法を開発した.ii.iの手法を発展させて,必要に応じて効率よく部分冗長な式を発見する質問伝播という手法を開発した.iii.コンパイラ共通基盤上で,VLIWアーキテクチャの1種であるItaniumのコード生成器を実現した.木で表現した中間表現上で,各命令に対応する中間表現断片を割り当てていく過程を利用して,幾つかの命令レベル並列性を抽出する.1.本研究は,コード移動に基づく最適化一般に対して,データフロー解析の共通な枠組みを,カスタマイズしやすい形で実現する.本研究の目的は次のとおりである.(1)オブジェクト指向記述が可能な関数型言語によって,コンポーネントからなる変更が容易なコンパイラを記述する.(2)コンパイラの各コンポーネントを組み合わせて,基本最適化や新しい最適化を実現する.(3)VLIWアーキテクチャ用の最適化や並列プログラム用の最適化を実現する.2.平成14年度に得た成果は次のとおりである.(1)既成のコンパイラlccが生成する中間表現を入力とするバックエンドを,関数型言語OCamlを用いて実現した.このバックエンドは,OCamlのクラス表現によって,制御フローグラフクラス,データフロー解析クラス,別名解析クラス,支配木クラス,支配辺境クラス等にモジュール化してあり,メソッドを使って容易に利用し,組み合わせることができる.また,記述を関数型言語によって実現してあるので,記述の付加や変更も容易である.(2)(1)のコンパイラ上に,従来得られなかった別名情報を発見できる最適化手法を実現した(研究発表2).この手法は,コンパイラのデータフロー解析クラスを利用して実現している.(3)同様に,(1)のコンパイラ上に,冗長なロード命令を従来研究以上に除去できる最適化手法を実現した(研究発表1).この手法は,(2)と同様に,データフロー解析クラスを利用して実現している.1.本研究は,コード移動に基づく最適化一般に対して,データフロー解析の共通な枠組みを,カスタマイズしやすい形で実現する.本研究の目的は次のとおりである.i.オブジェクト指向記述が可能な関数型言語によって,コンポーネントからなる変更が容易なコンパイラを記述する.ii.コンパイラの各コンポーネントを組み合わせて,基本最適化や新しい最適化を実現する.2.平成15年度に得られた成果は次のとおりである.i.従来,計算コストが大きかった多重支配節を効率よく計算する手法を開発した.ii.iの手法を発展させて,必要に応じて効率よく冗長な式を発見する質問伝播という手法を開発した.iii.VLIWアーキテクチャの1種であるItanium上で,レジスタローテーションの巻戻しを行うことによって,ソフトウェアパイプライニングにおける投機実行失敗のペナルティを小さくする手法を開発した.1.本研究は,コード移動に基づく最適化一般に対して,データフロー解析の共通な枠組みを,カスタマイズしやすい形で実現する.本研究の目的は次のとおりである.i.オブジェクト指向記述が可能な関数型言語によって,コンポーネントからなる変更が容易なコンパイラを記述する.ii.コンパイラの各コンポーネントを組み合わせて,基本最適化や新しい最適化を実現する.2.平成16年度に得られた成果は次のとおりである.i.コード最適化の解析に用いられるデータフロー解析を要求駆動型で実現する際に,制御フローグラフの深さに相当するランクに基づいて,訪問する必要がないプログラム点を予測し,それらのプログラム点を飛び越すことによって,効率的な解析を実現する手法を開発した.ii.iの手法を発展させて,必要に応じて効率よく部分冗長な式を発見する質問伝播という手法を開発した.iii.コンパイラ共通基盤上で,VLIWアーキテクチャの1種であるItaniumのコード生成器を実現した.木で表現した中間表現上で,各命令に対応する中間表現断片を割り当てていく過程を利用して,幾つかの命令レベル並列性を抽出する.
急性相反応物質としてのFactor XIII-Aの活性化と創傷治癒機構の作動

血液中のFactor XIII (FXIII)は、酵素活性中心を有するAサブユニット2分子とその担体のBサブユニット2分子からなる4量体で構成され、血液凝固のカスケード反応の最終段階で、トロンビンの作用により活性化されることが知られている。一方、組織や細胞中にも、酵素活性を有するAサブユニット2分子のみから成るCellularタイプのFXIII(cFXIII)が広く生体内に分布することが、近年明らかとなってきた。しかし、cFXIIIのAサブユニット(FXIII-A)がどのように活性化されるのかについては、報告例がほとんどない。そこで、cFXIIIが確実に発現するin vivoの実験系として、我々はゼブラフィッシュの視神経損傷モデルを用いた。ゼブラフィッシュの視神経をクラッシュすると、FXIII-Aは損傷直後から網膜と視神経の両方に発現上昇が見られ、視神経の再生・修復に関与する再生関連分子の1つであることがこれまでの実験で確認されている。ゼブラフィッシュ視神経を実験的に損傷後、網膜で発現するFXIII-AのcDNAについてクローニングを行った。その結果、視神経損傷後のサンプルからは5'領域の一部が欠如した短いタイプのcDNAが多数出現するという、独特の変化を示すことが分かった。これらのクローンを詳細に解析すると、通常の血液凝固過程ではFXIII-AのN末端タンパクの一部でトロンビンによって切り放される、「Activation peptides」のコード領域が欠如したショートタイプのcDNAであることがわかった。また、翻訳開始領域の直前には、Heat shock factor(HSF)1の結合領域が2か所確認された。HSFは視神経損傷後、30分で発現上昇する急性相反応物質である。これらの結果より、HSF1誘導によるFXIII-Aの活性化機構が存在が強く示唆された。組織に分布するCellular FXIII(FXIII-A)の活性化機構についてはこれまで不明であったが、トロンビンが関与しない条件下でも活性化が起ることが、ゼブラフィッシュの視神経損傷モデルにより明らかとなった。この活性化には、転写因子であるHeat shock factor(HSF)1の発現が不可欠であり、HSF-1の発現をインヒビターにより阻止するとFXIII-Aの活性化も阻害されることが証明された。この2つの分子に直接的な相互作用があるのかどうかについて、クロマチン免疫沈降反応(Chip assay)を用いて確認したところ、抗HSF-1抗体により、FXIII-AをコードするDNAが沈降することが確認できた。つまり、FXIII-Aの発現に先んじてHSF-1の発現が上昇し、この転写因子の作用により活性化タイプの短いタンパクで構成されるFXIII-Aが発現上昇するということが確認できた。ゼブラフィッシュの視神経損傷モデルを用いて確認された、トロンビンを介さない活性化タイプのFXIII-Aの発現は、Heat shock factor 1などの転写因子が関与している可能性が示された。これらの転写因子およびHeat shock proteinは、視神経損傷というダメージに対して、30分から数時間という非常に短時間で発現上昇が見られる急性相反応物質としての特徴を有する分子であることが確認できた。今後、FXIII-AやHSFとの相互関係における創傷治癒への関与、さらに、この他の急性相反応物質について検索を進めていく予定である。血液凝固因子として知られるFactor XIII (FXIII)は、近年、様々な組織や細胞中にも酵素活性ユニットからなるFXIII-Aが存在することが明らかとなってきており、Cellular FXIIIとも呼ばれる。魚類視神経の損傷実験では、FXIII-Aは視神経の損傷直後から発現上昇し、視神経の再生・修復に関与する再生関連分子の1つであることが以前の研究により判明しているが、その活性化機構については不明な点が多かった。そこで、ゼブラフィッシュ視神経を実験的に損傷後、網膜および視神経よりtotal RNAを経時的に抽出し、発現するFXIII-AのcDNAについて詳細にクローニングを行った。その結果、損傷していないコントロールの視神経由来のサンプルからはFXIII-A cDNAの全長が常に確認されるのに対して、視神経損傷後のサンプルからは5'領域の一部が欠如した短いタイプのものが多く見られるという独特の変化を示すことが分かった。これらのクローン解析からタンパクへの翻訳を行うと、通常の血液凝固の際にはトロンビンによって切り出される部分(Activation peptides)が欠如したタイプであることが判明した。一方、視神経および網膜組織におけるトロンビンのmRNAの発現は確認されなかった。こられの結果から、視神経損傷後の組織では、トロンビンが関与しないFXIII-Aの活性化機構が存在すると考えられた。さらに詳細なクローン解析により、損傷視神経で発現する短いタイプのFXIII-Aは、Heat shock factor(HSF)の結合配列が確認され、HSF誘導による活性化機構が示唆された。組織に分布するFXIII-Aの活性機構についてはこれまで不明であったが、血液凝固反応での活性化機構とは大きく異なり、トロンビンが関与しない活性化機構の存在が示唆される結果が得られた。ゼブラフィッシュ視神経損傷モデルを使ったFXIII-A活性化機構の解析結果より、Heat shock factor(HSF)などの転写因子が関与している可能性が考えられた。HSFの発現について調べたところ、FXIII-Aに連動した発現上昇の動きが確認された。

一方、組織や細胞中にも、酵素活性を有するAサブユニット2分子のみから成るCellularタイプのFXIII(cFXIII)が広く生体内に分布することが、近年明らかとなってきた。しかし、cFXIIIのAサブユニット(FXIII-A)がどのように活性化されるのかについては、報告例がほとんどない。そこで、cFXIIIが確実に発現するin vivoの実験系として、我々はゼブラフィッシュの視神経損傷モデルを用いた。ゼブラフィッシュの視神経をクラッシュすると、FXIII-Aは損傷直後から網膜と視神経の両方に発現上昇が見られ、視神経の再生・修復に関与する再生関連分子の1つであることがこれまでの実験で確認されている。ゼブラフィッシュ視神経を実験的に損傷後、網膜で発現するFXIII-AのcDNAについてクローニングを行った。その結果、視神経損傷後のサンプルからは5'領域の一部が欠如した短いタイプのcDNAが多数出現するという、独特の変化を示すことが分かった。これらのクローンを詳細に解析すると、通常の血液凝固過程ではFXIII-AのN末端タンパクの一部でトロンビンによって切り放される、「Activation peptides」のコード領域が欠如したショートタイプのcDNAであることがわかった。また、翻訳開始領域の直前には、Heat shock factor(HSF)1の結合領域が2か所確認された。HSFは視神経損傷後、30分で発現上昇する急性相反応物質である。これらの結果より、HSF1誘導によるFXIII-Aの活性化機構が存在が強く示唆された。組織に分布するCellular FXIII(FXIII-A)の活性化機構についてはこれまで不明であったが、トロンビンが関与しない条件下でも活性化が起ることが、ゼブラフィッシュの視神経損傷モデルにより明らかとなった。この活性化には、転写因子であるHeat shock factor(HSF)1の発現が不可欠であり、HSF-1の発現をインヒビターにより阻止するとFXIII-Aの活性化も阻害されることが証明された。この2つの分子に直接的な相互作用があるのかどうかについて、クロマチン免疫沈降反応(Chip assay)を用いて確認したところ、抗HSF-1抗体により、FXIII-AをコードするDNAが沈降することが確認できた。つまり、FXIII-Aの発現に先んじてHSF-1の発現が上昇し、この転写因子の作用により活性化タイプの短いタンパクで構成されるFXIII-Aが発現上昇するということが確認できた。視神経損傷後の修復過程で活性化されるFXIII-Aは、Heat shock factor (HSF)などの転写因子が関与している可能性が考えられた。実際の視神経損傷後のFXIII-Aの発現について検索したところ、HSFの発現上昇に連動した動きが確認された。