hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
不斉パイアリルパラジウム錯体を経由する動的速度論的光学分割反応の開発と応用

偶然に見出した反応により合成した基質で,報告例が少ないパイアリルPd錯体を経由し炭素ー炭素結合を含む動的光学分割が進行することを見出した.そこで,反応条件最適化と生物活性化合物の不斉全合成への応用を主な目的として研究を開始した.検討の結果,原料合成経路の確立,高光学純度を得るための基質構造を明らかにした.また,溶媒と反応温度の最適化,キラルPd(0)錯体を反応系内で発生させる方法も確立できた.芳香環上の置換基の電子的効果により,化学収率と光学純度が変動することを明らかにできたが,機構解明に関しては今後の検討課題である.また,生成物からベンジル位不斉第四級炭素の立体選択的構築にも成功した.平成25年度は,既に見出すことに成功している炭素ー炭素結合形成を伴う動的光学分割反応を生物活性アルカロイド全合成に適用できるような実用的レベルまで到達させる事を第一の目的として,反応条件を精査した.平成24年度に実施した研究では原料合成経路の最適化に成功した.しかし,メタセシス反応を用いる従来の方法では,スチレンを用いた場合には中程度の収率で目的化合物を得ることが出来ていたが,官能基を有するスチレンでは著しい収率の低下と分離困難な副生成物が生成することが明らかとなった.そこで,フェニルアセチレンおよびその誘導体を用いる経路に変更することにした.その結果,工程数は従来法よりも一段階増えたが,安定した収率で反応機構を解析するために必須である様々な官能基を有する基質の合成にも適用可能な経路を確立することが出来た.次に,動的光学分割反応の最適条件探索を行った.平成24年度は,マロン酸ジエチルのナトリウム塩を還元剤として用い,Pd(II)錯体を反応系内でPd(0)に還元してから基質を加えて反応させる手法の開発に成功した.しかし,不斉配位子とアリルパラジウム(II)クロリド二量体から調製した不斉パラジウム(II)錯体は,作成から日時が経ったものを使用すると反応の収率が低下する傾向が見られた.このことは実際に不斉全合成に適用する際には問題となると考え,同一フラスコで錯体を調製して反応を行う手法を検討した.本法は,収率に未だに問題を残しており,引き続き平成26年度も改良を行う予定である.一方,生物活性アルカロイドの不斉合成研究に関しても検討を行った.これまでに成功していたケトンのα位へのアリル基の立体選択的な導入は,後の官能基変換で問題になることが分かった.そこで,β位置換基を先に修飾してからアリル基の導入を行うことにした.平成26年度も継続して検討を続ける予定である.偶然に見出した反応により合成した基質で,報告例が少ないパイアリルPd錯体を経由し炭素ー炭素結合を含む動的光学分割が進行することを見出した.そこで,反応条件最適化と生物活性化合物の不斉全合成への応用を主な目的として研究を開始した.検討の結果,原料合成経路の確立,高光学純度を得るための基質構造を明らかにした.また,溶媒と反応温度の最適化,キラルPd(0)錯体を反応系内で発生させる方法も確立できた.芳香環上の置換基の電子的効果により,化学収率と光学純度が変動することを明らかにできたが,機構解明に関しては今後の検討課題である.また,生成物からベンジル位不斉第四級炭素の立体選択的構築にも成功した.本研究の基礎となる炭素ー炭素結合形成を伴う動的光学分割反応は既に見出しているが,収率に関する再現性が乏しく,安定した結果が得られる反応条件はまだ確立できていない.平成24年度は,反応条件の最適化と生物活性アルカドイドの全合成を推進するために,まず大量かつ容易に原料を合成するルートの再検討を行うことにした.これまでの合成経路では,大量の原料を用いた反応では,収率の著しい低下や副生成物の生成が観察された箇所が複数認められた.そこで,10 g以上の化合物を用いても再現性良く生成物を得ることができる合成経路の確立を目指して検討を行った.検討した経路によっては,揮発性化合物を経由するものや,副生成物との分離が困難であり,それ以上の検討を断念した経路も有ったが,最終的に容易な実験操作,安定した中間体,かつ大量に動的光学分割反応の条件検討を行える基質を合成できる合成経路を確立できた.次に,動的光学分割反応の最適条件探索を行った. Pd(0)-不斉配位子錯体を用いた反応では,高い光学純度をもつ生成物を得ることができたものの,収率の再現性に問題を残した.そこで, Pd(II)錯体を反応系内でPd(0)に還元してから基質を加えて反応させる手法を試みた.検討の結果,マロン酸ジエチルのナトリウム塩を還元剤として用いる反応条件では,グローブボックスのような特殊な実験装置を必要とせずに動的光学分割反応を実施可能であることを明らかにできた.しかし,収率には未だに改善する余地を残しており,さらなる反応条件の最適化を目指す予定である.一方,生物活性アルカロイドの不斉合成研究に関しては,ラセミ体の原料を用いて検討を行った.その結果,パラジウム錯体を触媒としてシクロペンタノン誘導体のベータ位の立体化学を利用してベンジル位にアリル基を立体選択的に導入する手法を確立できた.

平成26年度は,既に見出すことに成功している炭素ー炭素結合形成を伴う動的光学分割反応を実用的レベルまで到達させること,および動的光学分割が進行する機構解明のための様々な基質を用いた反応について検討を行った.平成25年度までに実施した研究により,フェニルアセチレンを用いる経路により原料合成経路の最適化に成功した.しかし,動的光学分割反応の基質合成の最終段階である塩基性条件での環化反応の再現性,特に大量の原料での反応の再収率が大幅に低下することを改善する必要があることが明らかになった.反応機構を考慮すると,触媒量の塩基の存在下で充分に進行することが予想できた.このことを考慮して反応条件の再検討を行った結果,原料のテトラヒドロフラン溶液に低温でできるだけ少量のカリウムtert-ブトキシドを加える反応条件が,再現性良く環化反応をもたらすことが明らかになった.次に,動的光学分割反応の最適条件探索を行った.これまでの研究では,マロン酸ジエチルのナトリウム塩を還元剤として用い,反応系内でPd(II)錯体をPd(0)錯体に還元してから基質を加える手法が良好な結果を与えていた.しかし,Pd(II)錯体の還元にも再現性に問題が有ったため,より簡便な方法による不斉Pd(0)錯体生成法の再検討を行った.その結果,基質とマロン酸ジエチルのベンゼン溶液にカリウムtert-ブトキシドのテトラヒドロフラン溶液を加えた後,直ちに不斉Pd(II)錯体のベンゼン溶液を加えて反応させる条件が,最良の結果を与えることが明らかとなった.また,置換基を有する基質に対しても本反応を適用した.一方,生物活性アルカロイドの不斉合成研究の検討も行った.ケトンのα位へのアリル基の立体選択的な導入は,後の官能基変換で問題が発生することが分かった.そこで,β位置換基を先に修飾してからアリル基の導入を行うことにした.有機合成化学平成24年度に確立したメタセシス反応を用いる経路が,官能基を有する基質合成には適用し難いことが明らかになったため,予定より多少進行が遅れ気味であることは否めない.しかし,「現在での達成度」の欄にも記載したように,(1)原料合成に関しては,工程数は増えたが,収率良く様々な基質合成に適用できる手法を確立することができていること,(2)動的光学分割反応は,不斉パラジウム(II)錯体を触媒前駆体として用い,系内で0価に還元して反応に用いる方法が好結果を与える,という二点を明らかにしているため,平成26年度内にこれまでの遅れは取り戻せると考えている.また,生物活性アルカロイド合成に関しても,ラセミ体での合成経路確立後は,光学活性体での合成を検討する予定である.当初予想していなかった動的光学分割反応のための基質合成の再検討に多くの時間を要したため,予定より多少進行が遅れ気味であることは否めない.しかし,「現在での達成度」の欄にも記載したように,(1)原料合成に関しては効率的な手法を確立することができていること,(2)動的光学分割反応は,安定なPd(II)-不斉配位子錯体を系内で0価に還元してから反応に用いる方法が好結果を与える,という二点を明らかにしているため,平成25年度内に平成24年度の遅れは取り戻せると考えている.動的光学分割反応は,Pd(II)-不斉配位子錯体を用いて,系内で還元して反応に用いる方法が好結果を与えることを既に明らかにしている.
血島を構成する未分化中胚葉細胞からの血管内皮・血球細胞の発生機構

1)血島を構成する中胚葉細胞群の細胞系譜の解明マウス胚の血島を構成する中胚葉細胞群は血球と血管内皮細胞に分化すると示唆されているものの未だ明確な証明はなされていない。血島を構成する細胞群の分化能を、遺伝子改変マウス由来のマウス胎児を用いた移植実験系により解析する。現在までめ所、GATA-1プロモーター下にGFPを発現し、全身の細胞でlacZを発現するマウスを樹立してきており、今後移植実験により、血島を構成する細胞の分化能を検討していく。2)血球分化、血管内皮分化におけるFlk1およびGATA-1遺伝子の機能解析血球前駆細胞におけるFlk1遺伝子の発現消失が血球への分化に必要であるかどうか検討するために、GATA-1プロモーター(血島および血球細胞で発現)下にFlk1を発現させるトランスジェニックマウスを2ライン作製した。マウス8日胚の血球前駆細胞を血球コロニーアッセイ法により定量し、その効果を検討したが、その数に変化は認められなかった。一方、血管内皮前駆細胞におけるGATA-1遺伝子の発現消失が血管内皮細胞への分化に必要であるか検討するため、全身においてGATA-1を発現させるマウスを作製した。今後、血管内皮の分化が正常に起こっているか、異所的な造血が認められるかどうか検討していく。3)血島において特異的に発現する新規遺伝子の単離血島において特異的に発現する新規の遺伝子を単離するため、マイクロアレイ法などにより、新規の遺伝子群を単離していく。現在、マイクロアレイの結果を解析中である。
DNA-糖鎖コンジュゲートの合成と細胞標的性をもつ新規アンチセンス分子への応用

近年、さまざまな先天性・後天性疾患の治療や症状の緩和のために、遺伝子レベルで治療を行うアンチセンス療法などの遺伝子治療が注目を集めている。一方・T偶数系のファージは、グルコースを側鎖にもつシチジンを含むDNAを持っており、これは宿主に感染したときに制限酵素などにより切断されるのを抑制していると考えられている。本研究では、この天然に稀に存在する核酸塩基が糖で修飾されたDNAを模倣し、アンチセンス分子と標的遺伝子導入試薬の二つの役割を同一分子内にあわせもつ安定な分子として、DNA-糖鎖コンジュゲートを開発することを目的としている。まず、連鎖移動剤存在下でのラジカル重合を利用して、末端にアミノン基を持つ糖質高分子を合成した。これをヨードアセチル化し、5′-末端チオール化されたオリゴDNAとカップリングすることで目的のコンジュゲートを合成した。またこの手法は、Cysを含むペプチド核酸(PNA)にも適用可能であることがわかった。また、5-ヨードデオキシウリジンを出発原料として、Heck反応により糖で塩基修飾されたデオキシウリジンを合成した。これを用いて、アミダイト法により固相合成し、任意の位置が糖で修飾されたオリゴDNAを合成した。これらのオリゴDNA-糖コンジュゲートのらせん構造や融解挙動は、未修飾のものと比べ、あまり変わらないことがわかった。蛍光法により、コンジュゲートのレクチン認識能を調べたところ、Galを持つブロック型コンジュゲートが、FITC-RCA120に対し、3.7×10^5M^<-1>という結合定数で認識されることがわかった。また、Galを1つしか持たないコンジュゲートでは、その半分ずらした相補鎖とハイブリダイゼーションさせ、自己組織化させることで糖を一定の空間配置でクラスター化させることで、協同的にRCAに結合することがわかった。
人工的なレールの上を走る生物分子モーターを創る

本研究計画は、生物分子モーターとレールを人間が使いやすい形にカスタマイズすることで、分子モーターを使った多様な研究開発の端緒を開くことを目的とし、制御しやすい人工的なDNAフィラメントの上を動くリニア型の新しい分子モーターを創り出すことを目指すものである。まず、新しい分子モーターを作製するために、ヒト転写因子のDNA結合部位をダイニンの微小管結合部位の代わりに融合した新規分子モーターを構築し、ヒト培養細胞で発現させ、これを単離・精製した。次に、レールとなるフィラメント状の構造体として、DNAタイルの重合に依って作られる中空状のDNA構造体(DNAナノチューブ)を作成し、この表面にDNA結合部位の認識配列を組み込んだ。作製した新規分子モーターが機能するかどうかをテストするために、新規分子モーターをガラス上にランダムに結合させ、DNAナノチューブとエネルギー源であるATPを入れて顕微鏡で観察した。その結果、DNAナノチューブは、新規分子モーターによって平均12 nm/sでスムースな滑り運動を起こした。このことは、人為的に設計した初めてのDNAレール上を動くモーターが作られたことを意味している。当初の目標の一つである、新規分子モーターによるDNAナノチューブの運動の観察に成功したため。今後は、DNAナノチューブの滑り運動の観察に加えて、その逆の系、つまり、DNAレールに沿って、カーゴに結合した分子モーターが輸送を行う系を構築する。さらに、認識配列が異なる2種類以上のモーターによる輸送を実現するため、異なる多くの種類のDNA結合タンパク質を探索し、効率的なスクリーニングによって新しい分子モーターのライブラリを得る。
三次元集積化システムオンチップのテスト手法に関する研究

三次元集積化システムオンチップに対して高品質・低コストなテストを実現するためのテスト生成技術・テスト容易化設計技術に関する研究を行った。テスト実行時の温度とテストデータ量の多さに着目し、テスト時の温度ばらつきによる遅延テスト品質の低下を抑えるテスト生成手法、および少ないテストデータ量で高品質な遅延テストを実現可能なテストコスト最適化手法を確立した。平成21年度は、三次元集積化システムオンチップに対する高品質かつ高速テストを実現するための要素技術として「複数の階層の同時テストに起因する問題」を明確化するために、(a)各階層における熱の消失量の違い、(b)三次元集積化システムオンチップ内の各コアのテストデータ量、テスト時間、消費電力および発熱の関係、に関する解析を行った。その結果、三次元集積化システムオンチップでは、電力密度が高く熱の消失が困難であるため、テスト時の温度が従来の二次元集積化システムオンチップに比べ高温になるという知見が得られた。また、高温になるだけでなく、チップ内の階層やコアといった空間的な配置位置の違い、およびテスト時間の経過による温度差が大きいという知見が得られた。回路遅延は温度に依存するため、チップ内の温度ばらつきは遅延値のばらつきを意味し、遅延テストの品質低下を招く。そこで21年度は、三次元集積化システムオンチップに対する高品質遅延テストを実現するために、テスト時の最高温度および温度ばらつきの低減を目的とした温度均一化手法を提案した。この成果は、2010年電子情報通信学会主催のディペンダブルコンピューティング研究会で発表を行った。また、VLSIテストに関する国際会議である「IEEE VLSI Test Symposium」にて2010年4月に発表予定である。また、三次元集積化システムオンチップに対するテストデータ量は膨大となり、それによってもテスト時間の増加、さらには発熱量の増加を招く。そこで、21年度は、少ないテストデータ量で高品質テストを実現するための、テストパターン選択法に関する研究も行った。この成果は、VLSIテストに関するワークショップである「Reliability Aware System Design and Test」で発表を行った。平成22年度は、テスト実行時の温度上昇および温度ばらつきに起因した遅延テスト品質の低下を防ぐ技術として、三次元集積化システムオンチップに埋め込まれたコアを対象とし、発熱を考慮したテスト手法を提案した。具体的には、各階層内の単一のコアを対象とした発熱量および発熱ばらつきが少ないテストパターン生成法(テストパターン内の不定値割当法およびパターン印加順序決定法)を提案した。さらに、複数の階層間の発熱を考慮した三次元集積化システムオンチップのテストスケジューリング手法を開発した。これらの成果は、VLSIテストに関する国際会議である「IEEE VLSI Test Symposium」、「IEEE Asia Pacific Conference on Circuits and Systems」、「IEEE International Workshop on Reliability Aware System Design and Test」および国内研究会である「電子情報通信学会ディペンダブルコンピューティング研究会」で発表を行った。また、三次元集積化システムオンチップにおける膨大なテストデータ量の問題を解決するために、少ないテストデータ量で高品質テストを実現するためのテストパターン生成法およびテストパターン選択法に関する研究も行った。この成果は、VLSIテストに関するワークショップである「IEEE VLSI Test Symposium」、「IEEE Asian Test Symposium」および国内研究会である「電子情報通信学会ディペンダブルコンピューティング研究会」で発表を行った。さらに、階層間のデータ転送に利用される貫通電極(Through Silicon Via,以下TSV)に着目した故障モデル、テストアーキテクチャおよび既存手法に関する調査も行った。平成23年度は,三次元集積化システムオンチップにおける貫通電極(Through Silicon Via,以下TSV)に対し,高品質テストを実現するテスト手法およびテストアーキテクチャに関する調査および研究を行った.TSVに対するテストアーキテクチャおよびテスト手法に関しては,従来の2次元システムオンチップのテストに関する標準化であるIEEE Standard 1500を拡張した標準化作業が進んでおり,新しい手法の提案には至らなかった.しかし,このテーマに関してマレーシアのUniversiti Teknologi PetronasのHussin講師と共同研究を開始しており,次年度以降も継続してテストアーキテクチャ,テスト容易化設計およびテストスケジューリングに関する議論・研究を行う予定である.一方,平成22年度から継続した研究テーマとして,三次元集積化システムオンチップのテスト実行時の時間的・空間的温度ばらつきを低減し,高品質遅延テストを実現するテストパターン生成法を提案した.この成果は,VLSIテストに関する国際会議である「IEEE European Test Symposium 2011」にて発表を行った.さらに,三次元集積化システムオンチップに対し,近年問題となっている微小遅延欠陥検出に関する研究を行った.三次元集積化システムオンチップでは膨大なテストデータ量が問題となるため,少ないテストデータ量で微小遅延欠陥に対して高品質テストを実現するためのテストパターン生成法を提案した.この成果は,VLSIテストに関する最高峰の国際会議であるIEEE International Test Conference 2011」にて発表を行った.
プラナリアにおける有性化因子に関する研究

扁形動物プラナリアの一種、リュウキュウナミウズムシ無性個体のクローン集団(OH株)に、有性生殖のみを行うイズミオオウズムシを餌として与えると、雌雄同体性の生殖器官が発達し、有性生殖を始めるようになる。体研究は有性個体に含まれている有性化因子を単離・同定することを目的としている。材料にはイズミオオウズムシおよび、イズミオオウズムシの投餌によって有性化した有性化OH個体を用いた。湿重量約4gの有性個体をPBS中で懸濁し、ユ00Kxgで遠心にかけた。その後、上清画分をSep-Pakカラム(tC18,Waters)に通した。純粋、10%MeOH、30%MeOH、100%MeOHの順に溶出すると、純粋画分と10%MeOH画分の両方に有性化活性が認められた。これら両画分を合わせた画分をM1画分とし、AKTA purifier(Amersham Bioscience)を用いて、逆相クロマトグラフィー(Symmetry^<【○!R】>C18,Waters)を行った。条件検討を重ねて、メタノール勾配による溶出をせずとも純粋を通すことにより、おおよそ20カラムボリューム付近で有性化因子が回収できることが分かった。この画分に対して、ゲル濾過クロマトグラフィー(Superdex^<TM> Peptide 10/300 GL, Amersham Bioscience)を行ったところ、有性化活性を示すピーク(紫外波長:220nm)をひとつに限定することができた。現在はこのピークを含んだ画分を収集中であり、ある程度量が貯まり次第、構造解析の予定である。また、前年度報告では、陰イオン交換樹脂に有性化因子が吸着することが示唆されていたが、今回、M1画分に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー(RESOUCE^<TM> Q, Amersham Bioscience)を行ったところ、NaCl勾配0mM450mMの画分にOH個体を完全に有性化させられる活性が認められた。この結果も含めて、有性化因子は500Da以下の低分子で、若干の疎水性をもつ陰性物質であることがわかった。本研究は有性個体に含まれている有性化因子を単離・同定することを目的としている。材料にはイズミオオウズムシの投餌によって有性化した有性化OH個体を用いている。再生能力が乏しいイズミオオウズムシは研究室では切断・再生による材料供給に問題があるのに対し、有性化OH個体の場合はそれが可能である。今回、一定して約2000匹の有性化OH個体を供給できる環境を整えた。有性化因子の粗精製は以下の通りに行った。湿重量約4g(約300匹)の有性化OH個体をPBS中で懸濁し、100Kxgで遠心にかけた。その後、上清画分をSep-Pakカラム(C18,Waters)に通した。これまでは、純粋、10%MeOH、30%MeOH、100%MeOHの順に溶出すると、純粋画分と10%MeOH画分の両方に同等の有性化活性が認められていたが、今回、カラムの使用条件を検討したところ、10%MeOH画分に著しく有性化因子を回収できるようになった。10%MeOH画分に対してSmartsystem (Pharmacia)を用いて、逆相クロマトグラフ(C18)を行ったところ、10%30%MeOHの勾配で溶出した画に有性化活性が認められ、有性化因子が確かに若干の疎水的性質を持つことを示すことができた。予備実験で、陰イオン交換樹脂に有性化因子が吸着することが示唆されていたので、この10%30%MeOH画分に対して陰イオン交換クロマトグラフ(MonoQ)を行ったところ、素通り画分、NaCl勾配100mM150mM、200mM220mMの3画分にOH個体を完全に有性化させられないものの、卵巣を誘導する活性が認められた。

条件検討を重ねて、メタノール勾配による溶出をせずとも純粋を通すことにより、おおよそ20カラムボリューム付近で有性化因子が回収できることが分かった。この画分に対して、ゲル濾過クロマトグラフィー(Superdex^<TM> Peptide 10/300 GL, Amersham Bioscience)を行ったところ、有性化活性を示すピーク(紫外波長:220nm)をひとつに限定することができた。現在はこのピークを含んだ画分を収集中であり、ある程度量が貯まり次第、構造解析の予定である。また、前年度報告では、陰イオン交換樹脂に有性化因子が吸着することが示唆されていたが、今回、M1画分に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー(RESOUCE^<TM> Q, Amersham Bioscience)を行ったところ、NaCl勾配0mM450mMの画分にOH個体を完全に有性化させられる活性が認められた。この結果も含めて、有性化因子は500Da以下の低分子で、若干の疎水性をもつ陰性物質であることがわかった。
組織マイクロアレイを用いた子宮肉腫における分子標的マーカーの同定

本研究は、子宮体部癌肉腫の多数例を用いた組織マイクロアレイでEGFRおよびHER-2発現についての網羅的検索を行い、子宮体部癌肉腫診療における分子標的マーカーとなり得るかどうか検討した。間葉成分でEGFRの強発現が高頻度に認められ、上皮成分においては悪性度が高くなるほどEGFR発現が増強する可能性が示された。一方、HER-2の発現は本検討ではほとんど認められなかった。以上より、子宮体部癌肉腫においてEGFRが診断や治療の分子マーカーとなる可能性が示唆された。子宮肉腫はさまざまの治療に抵抗し、未だに予後が極めて悪い疾患である。本研究では、多数の子宮肉腫手術症例のデータベースを利用して、パラフィン包埋ブロックから腫瘍の組織マイクロアレイを作製し、免疫組織化学法やFISH法などを用いてがん関連遺伝子産物などの蛋白発現ペターンや遺伝子の増幅を解析する。高頻度に起きている特定のがん関連遺伝子の発現異常や遺伝子の増幅などを見出し、予後などの臨床データとの相関を検討して、子宮肉腫における分子標的マーカーを同定することを目的とした研究である。この研究によって同定された分子マーカーから子宮肉腫の発生の機構が理解され、予後改善に向けた分子標的治療の確立につながることが予想される。現在、子宮肉腫手術症例138例のパラフィン包埋ブロックを選択し、2mm径のコアからなる組織ブロックを打ち抜き、レシピエントブロックに並べて組織マイクロアレイを鋭意作製している。今後、組織アレイを薄切して免疫組織化学法あるいはFISH法によって、KIT, EGFR, HER2をはじめとするがん遺伝子の発現異常や遺伝子コピー数異常を検索する。コントロールとして子宮内膜組織や子宮平滑筋組織の組織も必ず入れておき、実験の信頼性を高める工夫をする。また癌肉腫では癌の成分と肉腫の成分に分けて組織マイクロアレイを作り、どちらの構成成分かで特異的に発現や増幅している分子を見落とさないようにする。組織マイクロアレイによるスクリーニングで高頻度に異常が見つかった分子については、腫瘍全体の組織切片で再度免疫染色を行い、結果の正当性を確認する。その上で、同定されたがん関連遺伝子などの発現状況と子宮肉腫の予後などの臨床病理学的データとの相関について調べる。子宮体部癌肉腫は様々の治療に抵抗性で、予後が極めて悪い疾患である。その発生においては、上皮・間葉成分共に単一の上皮性悪性腫瘍細胞から発生するというsingle cell theoryが主流である。既に我々は、子宮体部癌肉腫においてEGFRやHER-2などの発現パターンが上皮・間葉成分で異なることを示してきた。本研究は、子宮体部癌肉腫の多数例を用いた組織マイクロアレイ(TMA)でEGFRおよびHER-2発現についての網羅的検索を行い、子宮体部癌肉腫診療における分子標的マーカーとなり得るかどうか検討した。研究対象は、19972010年に治療を行った子宮体部癌肉腫症例63例。院内倫理審査委員会の承認を得て、手術切除標本のパラフィン包埋ブロックから上皮成分と間葉成分のコンポーネント別に、2mm径のコアからなる組織ブロックを打ち抜き、レシピエントブロックに並べて組織マイクロアレイを作製。それを薄切して、EGFRとHER-2タンパク発現を免疫組織化学的に検討した。上皮成分のうちEGFRが+2以上の発現を示したのは、類内膜腺癌ではG1で18.2%、G2で33.3%、G3で75.9%であり、グレードの上昇と共に発現が増強する傾向にあった。また、漿液性腺癌では37.5%であった。肉腫成分におけるEGFR陽性例は73.1%(+1が17.9%、+2が25.6%、+3が29.5%)であり、肉腫成分ではEGFRタンパクの過剰発現傾向があることが示唆された。HER-2に関して+2以上の発現を示した部分はなかった。TMAを用いた本検討では、間葉成分でEGFRの強発現が高頻度に認められ、上皮成分においては悪性度が高くなるほどEGFR発現が増強する可能性が示された。
ヘモグロビン遺伝子の診断によるユスリカの同定とその水質評価への応用

我国各地の種々の富栄養化段階の水域についてPolypedilum属ユスリカの種構成を調べて富栄養化段階に対応したPolypedilum属出現種スペクトラムを作成するとともに、本属各種に特異的なヘモグロビン遺伝子塩基配列を明らかにすることにより、迅速かつ正確なユスリカの同定に基づく水質判定を試みた。一方、Polypedilum属種特異的Hb遺伝子塩基配列の検索については、それぞれ本属の別群に属するcultellatum,japonicum、nubeculosum及びnubiferの相同成分の遺伝子クローニングを試みたところ、nubiferのmonomeric Hbの一成分(PNf-MV)についてのみ成功した。そのため、PNf-MVの推定されるグロビン鎖アミノ酸配列を既に報告されているヨーロッパ産Chironomus thummi thummi(CTT)のHb12成分のそれと比較したところ、N末端及びC末端に近い部分に比較的長いよく保存された領域があることがわかった。そこで、この2つの領域のアミノ酸配列に対応するdegenerative primersを作成し、各種幼虫から調製したtotal RNAを鋳型としたRT-PCRを行ったところ、目的の86アミノ酸残基に相当する約260bpのDNA断片が増幅された。現在、これらの残基配列を決定し、種の同定に利用できる種特異的配列を検索しているところである。1994年1月8月の間に広島県内の瀬戸内海流入大小10河川の計約70地点にコンクリートブロック、山陰地方湖沼群(神西湖・宍道湖・中海・東郷湖・湖山池・多鯰ヶ池)及び富士五湖・田貫湖・芦の湖の計約60地点にコンクリート板を設置し、1-3ヵ月後にこれに付着するユスリカ幼虫を採集し、実験室内で飼育して得られた雄成虫の同定結果に基き各群集中のPolypedilum属の種組成を調べるとともに、採集地点で採取した検水のPO^<3->_4イオン濃度及び電気伝導度を調べた。その結果、Polypedilum tamaharaki→P.asakawaense→P.nubiferに至る富栄養化の程度に対応したPolypedilum属12種における優占種スペクトラムを作成することができた。一方、夜間自動販売機等の灯火に集まる10種のPolypedilum属雄成虫を得、これにより得られた受精卵塊より孵化した幼虫を飼育して得た成虫をもとにして累代飼育を試みた結果、P.cultellatum,P.kyotoense,P.nubeculosum,P.nubiferの4種について実験室内での受精卵の採取に成功し、累代が可能になった。しかし、P.nubifer以外の種では、何れも孵化直後の幼虫の生残率が低いため、Hbの分析に十分な量の幼虫材料を得るには至っていない。このため、現在、初期餌料・底質・エア-レーション等の飼育条件の改善に努めている。また、Polypedilum属を構成する4群のうちのTripodula群については、まだ一種も累代飼育法が確率していない。現在、これまでに採卵実験を試みたP.japonicum,P.tamahinoense,P.unifascium以外の種についても試みるとともに、採卵装置の照明条件を種々変化させて実験を行い、交尾のために必要な条件を検討している。1995年5月から10月の間に、琵琶湖・余呉湖及び三方五湖の計15地点において、コンクリート板を設置して約2ヵ月後にこれに付着するユスリカ幼虫を採集する作業を2回繰り返し、採集した幼虫を実験室内で飼育して羽化してくる成虫を同定するとともに、採集地点にて採取した検水の電気伝導度、PO_4-P濃度及びクロロフィル濃度を調べた。その結果、6種のPolypedilum属ユスリカが記録され、Polypedilum cultellatum→P.nubeculosum→P.japonicum→P.nubiferにいたる出現種のスペクトラムを作成することができた。

一方、Hb遺伝子のクローニングについては、Polypedilum属を構成する4群のそれぞれ別の群に属する4種のうち、P.nubiferについてはMonomer第5成分(PNfL-MV)の遺伝子クローニングに成功し、PNfL-MVのグロビン鎖cDNAは755bpからなり、15残基のシグナルペプチドを含む161のアミノ酸をコードしていることがわかった。P.nubeculosumについてはcDNAライブラリーを作成するとともに、PNfL-MVに対応する成分を精製し、N末端22残基を決定した。この2種間の対応する成分のN末端配列の比較では、22positionsのalignmentのうち同一のアミノ酸が見られたのはわずか5positionsのみであり、種特異性が高い遺伝子診断に有効な配列が存在する可能性が示唆された。P.japonicumについても、対応する成分は既に精製されており、現在N末端配列を決定中である。P.cultellatumについては、虫体中のHb量が上述の3種に比べてかなり少ないため、対応する成分の精製には大量の幼虫が必要であり、現在材料を集めているところである。富栄養化段階に対応したpolypedilum属出現種スペクトラムの作成に関しては、本年度は、6年度及び7年度に得られたデータのまとめ及び解析を行った。その結果、河川の早瀬からは24種が出現し、富栄養化が進行するに従ってaviceps, pedestre等→hiroshimaense等→japonicum, surugense等→tamaharaki等→convictum→paraviceps等→okigrandisのような出現種の遷移が起こると推定された。また、河川の淵からは10種が記録され、tamahosohige等→asakawaense等→togaexpansum等→nubeculosum等のような富栄養化段階に対応したスペクトラムが推定された。一方、湖では、masudai等→cultellatum等→nubiferのようなスペクトラムが推定された。一方、Polypedilum属種特異的Hb遺伝子塩基配列の検索については、平成7年度に本属の4群のうちのnubifer群のnubuferのHb(PNf-MV)の遺伝子クローニングに成功していたので、本年度はそれぞれ他の3群に属するcultellatum, japonicum及びnubeculosumのPNf-MVに対応する成分の遺伝子クローニングを試みたが何れも成功には至らなかった。そのため、PNf-MVの推定されるグロビン鎖アミノ酸配列を既に報告されているヨーロッパ産Chironomus thummi thummi (CTT)のHb1 2成分のそれと比較したところ、N末端及びC末端に近い部分に比較的長いよく保存された領域があることがわかった。そこで、この2つの領域のアミノ酸配列に対応するdegenerative primersを作成し、各種幼虫から調製したtotal RNAを鋳型としたRT-PCRを行ったところ、目的の86アミノ酸残基に相当する約260bpのDNA断片が増幅された。現在、これらの塩基配列を決定し、種の同定に利用できる種特異的塩基配列を検索しているところである。
上皮成長因子受容体遺伝子変異による発癌マウス肺からの幹細胞の同定

申請者の研究室で樹立されたEGFR遺伝子変異(マウスEGFRExon19 delE748-A752とヒトEGFRExon21L858R)をそれぞれ導入した遺伝子改変マウス(♂)と野生型C57BL/6マウス(♀)により生まれた胎仔を用い、分担研究者熊本大学伊藤隆明教授の指導で胎仔肺を摘出し器官培養を行った。肺の発生の過程における発癌を直接確認した。今後は胎仔肺の肺癌組織の一部を用いて培養にEGFR-TKIを添加し、EGFRーTKI感受性の変化についてMTTアッセイ法やWestern Blotting法や免疫染色などを用いて検討することを予定している。胎仔肺の器官培養を行った。実験に使用するマウスは,EGFR遺伝子変異導入マウスのオスと野生型C57BL/6マウスのメスを交配させ,妊娠確認後,胎齢14日時点で妊娠マウスを腹腔内麻酔ののち頸椎脱臼にて安楽死させ,帝王切開により胎仔を摘出する。胎仔肺のみを摘出して6穴のディッシュに培地を1.5ml入れその上にフィルターカップを置いて器官培養を開始し,以後胎仔肺の観察を行う。胎仔のgenotypeについては胎仔頭部の組織を用いてDNA抽出を行い,EGFR遺伝子変異を有する個体かどうかをPCRにて確認する。胎仔肺に肺癌組織が認められた場合には,その一部を用いて培地にEGFR-TKIを添加し,腫瘍増殖が抑制できるかどうかを肉眼的に確認する。またEGF, FGF, HGF, PlGF, VEGFなどの増殖因子をそれぞれ培地に添加し,EGFR-TKIの感受性の変化についてMTTアッセイ法やWestern Blotting法や免疫染色などを用いて検討する。細気管支肺胞管結合部に蛍光免染を行いBASCsの存在を確認することも検討している。申請者らはII型肺胞上皮に特異的に遺伝子発現させることが可能なSP-Cプロモーターを利用し,EGFR遺伝子変異(マウスEgfr Exon 19 del E748-A752,ヒトEGFR Exon 19 del E746-A750に相当,ヒトEGFR Exon 21 L858R)を導入した遺伝子改変マウスを樹立・報告している(Cancer Sci 2008,Cancer Res 2009)。この遺伝子改変マウスは肺に自然発癌する腫瘍を形成し,癌死する。腺腫様過形成⇒腺癌の経過を観察でき,EGFR遺伝子変異に起因する発癌モデルとして有用と考えられる。本研究では,このEGFR遺伝子改変マウスから細胞株を樹立し,がん幹細胞を樹立・同定・機能解析することを目指した。今回はEGFR Exon 19 del導入マウスモデルlとEGFR Exon 21 L858R導入マウスモデルを用いる。熊本大学伊藤隆明教授(連携研究者)との共同研究で遺伝子改変マウスの胎仔肺を摘出し器官培養を開始した。実験に使用するマウスは,EGFR遺伝子変異導入マウスのオスと野生型C57BL/6マウスのメスを交配させ,妊娠確認後,胎齢14日時点で妊娠マウスを腹腔内麻酔ののち頸椎脱臼にて安楽死させ,帝王切開により胎仔を摘出した。胎仔肺のみを摘出して6穴のディッシュに培地を1.5ml入れその上にフィルターカップを置いて器官培養を開始し,以後胎仔肺の観察を行った。胎仔のgenotypeについては胎仔頭部の組織を用いてDNA抽出を行い,EGFR遺伝子変異を有する個体かどうかをPCRにて確認した。胎仔肺に肺癌組織が認められた場合には,組織切片を作成し、SP-Cなど免疫組織染色を施行している。胎仔肺の器官培養を繰り返し試みた。即ち,実験に使用するマウスは,マウスEgfr遺伝子改変マウスのオスと野生型C57BL/6マウスのメスを交配させ,妊娠確認後,胎齢14日時点で妊娠マウスを腹腔内麻酔ののち頸椎脱臼にて安楽死させ,帝王切開により胎仔を摘出する。胎仔肺に肺癌組織が認められた場合には,その一部を用いて培地にEGFRチロシンリン酸化酵素阻害薬を添加し,腫瘍増殖が抑制できるかどうかを肉眼的に確認する。またEGF,FGF,HGF,PlGF,VEGFなどの増殖因子をそれぞれ培地に添加し,EGFRチロシンリン酸化酵素阻害薬の感受性の変化についてMTTアッセイ法やWestern Blotting法や免疫染色などを用いて繰り返し検討している。細気管支肺胞管結合部に蛍光免染を行いBASCsの存在を確認中である。平成27年4月1日平成28年3月31日産前産後の休暇または育児休業により研究を中断していた。27年度は研究代表者の2度目の産前休暇、育児休暇があり、研究を行うことができなかった。幹細胞は自己複製能と多分化能をもつ細胞であり,臓器に特異的な組織の幹細胞が必要に応じて自己複製と分化を繰り返すことにより臓器機能が維持されている。癌は正常な制御から逸脱した組織であるが,癌組織においても癌種特異的な幹細胞の存在が明らかにされている。この「癌幹細胞」は組織幹細胞と同様に自己複製能を有して癌細胞を供給し,癌組織を維持する。

臨床においては癌幹細胞がしばしば治療抵抗性を示すため,再発の主たる要因と考えられることであり,癌幹細胞を除去することにより再発のない治癒が期待できると考えられている。申請者らは現在,上皮成長因子受容体(EGFR)遺伝子変異陽性肺癌マウスモデルを樹立し,発癌予防,薬剤感受性,耐性機序の解析を現在も行っている。EGFR遺伝子変異(マウスEgfr Exon 19 delE748-A752とヒトEGFR Exon 21 L858R)をそれぞれ導入した遺伝子改変マウス(♂)と野生型C57BL/6マウス(♀)により生まれた胎仔肺の器官培養、Sphere colony assayを行い、癌幹細胞の樹立を試み、樹立された細胞株を用いて表面抗原の解析、自己複製能、多分化能、腫瘍形成能、薬剤抵抗性などの機能解析を目的に本研究を開始した。今までに遺伝子改変マウスの胎仔肺を摘出し、器官培養を開始し、発癌までのプロセスを観察した。今回は胎仔肺の肺癌組織の一部を用いて培地にEGFR-TKIを添加し、腫瘍増殖が抑制できるかどうかを肉眼的に確認する、また、EGF、FGF,HGF,PIGF,VEGFなどの増殖因子をそれぞれ培地に添加し、EGFR-TKIの感受性の変化についてMTTアッセイ法やWestern Blotting法や免疫染色などを用いて検討することを予定していた。研究代表者が2度の育児休暇を取得したため、研究自体が大幅に遅れているが、今後も研究は続けていく予定である、申請者の研究室で樹立されたEGFR遺伝子変異(マウスEGFRExon19 delE748-A752とヒトEGFRExon21L858R)をそれぞれ導入した遺伝子改変マウス(♂)と野生型C57BL/6マウス(♀)により生まれた胎仔を用い、分担研究者熊本大学伊藤隆明教授の指導で胎仔肺を摘出し器官培養を行った。肺の発生の過程における発癌を直接確認した。今後は胎仔肺の肺癌組織の一部を用いて培養にEGFR-TKIを添加し、EGFRーTKI感受性の変化についてMTTアッセイ法やWestern Blotting法や免疫染色などを用いて検討することを予定している。研究代表者の産後休暇、育児休暇から復帰し、研究を再開したが、動物実験室改装耐震化のための建て替えなどもあり、動物実験の時間が十分に取れなかった。上司の木浦教授、同僚の久保助教に支援を依頼し、大学院生の協力のもと研究の完遂に向けて実験が再開される予定である。28年度は増殖因子によるEGFRチロシンリン酸化酵素阻害剤の感受性の変化についての検討、蛍光免染によるBASCsの存在を確認する予定である。肺癌上司の木浦教授,同僚の久保助教に新たに支援を依頼し,大学院生の協力のもとに研究の完遂に向けてやっと実験が再開している。27年度は増殖因子によるEGFRチロシンリン酸化酵素阻害薬の感受性の変化についての検討、蛍光免染によるBASCsの存在を確認する。研究者自身の産前・産後休暇、育児休暇のため実験がストップした。また研究室の耐震化のための建て替えなどもあり、実験の時間が十分に取れなかった。トランスジェニックマウスの作成に時間を要した。また遺伝子変異を要する胎仔肺自体が少なく、検体の収集に苦慮したため時間を要している。24年度は育児休暇にて研究を行うことができなかったため、1年の延長を申請した。26年6月に研究再開したが動物実験の遅れにより次年度使用額が生じた。
「スターリン・ノート」と冷戦

本研究は、冷戦後に公開された旧東ドイツ国家機密史料(SAPMO-BA所蔵史料:Stiftung Archiv der Parteien und Massenorganisationen der DDR im Bundesarchiv)を用いることで、「スターリン・ノート」をめぐる東ドイツ指導部とソ連指導部との間の相互関係を跡付け、その上で、冷戦への東ドイツ側の主体的関わりについて分析することを目的としていた。1952年3月10日に、ソ連が、西側の大国(米・英・仏)宛てに提案した「スターリン・ノート」は、ドイツに「中立」を条件に統一政府を形成し、講和条約を締結することを呼びかけたソ連のドイツ統一構想であった。しかしソ連外交の真意と西側への影響については欧米の研究者を中心に多くの議論と論争があり、冷戦後の今日においても国際関係史の重要な争点の一つである。そこで本研究は、(1)「スターリン・ノート」に関する欧米の最新の研究成果の紹介、(2)「スターリン・ノート」をめぐる史料分析、(3)冷戦史の再検討に取り組んだ。本研究はドイツ連邦文書館所蔵史料(SAPMO-BA)の閲覧・分析を通じて、研究成果の一部(とくに「スターリン・ノート」と西側との関係)を、ロシア・東欧学会にて報告した(「『スターリン・ノート』と欧州国際政治」、討論者:羽場久美子教授)。また、学会誌『ロシア・東欧研究』には「スターリン・ノート」と東側との関係について発表した(「『スターリン.ノート』と冷戦1950-1952年」(第37号、2009年))。とくに研究成果として明らかになったことは、1.アメリカと西欧との間で作用していた複雑な外交上・国家間の力関係(例えば、「招待された帝国」としてのアメリカ)が、ソ連と東欧との間でも作用していたこと。また、2.冷戦の最前線にあった東西ドイツにおいては政治指導部間の戦後構想をめぐる激しい対立が存在したこと。(例えば、K.アデナウアー対J.カイザー(西独)、「モスクワ派」と「国内派」の路線の相違(東独)。)そして、3.それらの戦後構想との関連から「スターリン・ノート」問題を捉え直さなければならないこと、であった。他方、「スターリン・ノート」の起源(覚書作成過程)、アジアの冷戦とヨーロッパの冷戦との相互関係、ベルリン危機(1958-1963年)までの東ドイツの対外政策の展開、等々、が新たな課題として残された。本研究を進めるにあたり、羽場久美子教授から東欧における冷戦について、重要な視点をいただいた。また下斗米伸夫教授、横手慎二教授から、ソ連外交の展開の諸断面について、伊藤剛教授、川嶋周一講師、山本健講師から、国際政治の見取り図について多くの貴重な指摘をいただいた。
食品由来の骨形成調節因子の単離とその構造解析

骨形成は、骨基質成分(ハイドロキシアパタイト)を合成する骨芽細胞と、これを分解する破骨細胞との間の、巧妙なリモデリングによって行われている。本研究では、この骨形成を促進する物質を、食品中に検索する事を目的として行われた。まず、骨基質合成を促進する骨芽細胞について、そのモデルとなりうる細胞株の検討を行った。その結果、マウス由来の骨芽細胞株MC3T3-E1が最もこれに適していること、すなわち既知の有効成分(ビタミンD、骨形成因子BMP)の添加によって、実際の生体内での骨芽細胞の遺伝子発現パターンを再現でき、また長期培養によって骨基質形成することも確認した。骨形成への有効成分の評価は、このような骨芽細胞に試料を添加したのちに、骨基質成分の合成量を直接測定することがこれまで行われていた手法であった。しかし骨基質成分を直接測定することは煩雑で、しかも細胞株に添加後、長期培養が必要となる。本研究の過程で、骨芽細胞中のアルカリホスファターゼ活性の上昇が、骨基質成分の形成に直接関与することを、遺伝子工学的手法(アンチセンス阻害法)を用いて明らかにした。これにより、食品中の新規な有効成分の検索に当たって、骨基質成分の合成の評価には、アルカリホスファターゼの活性上昇を検討することによって、より迅速で確実な評価が行えることが判明した。現在この評価法をもとに、動物、植物由来の食品(蛋白質)を中心に検索を行っている段階である。
磁気アルキメデス浮上とNMRの融合

本研究課題の目的は、原子核に起因する磁性が磁気浮上物体の力の釣り合いに及ぼす影響を検証することにある。磁気アルキメデス浮上している水の中に存在するプロトンによる磁化を、核磁気共鳴(NMR)の技術によって操作するために、試料空間を1MPaまで酸素ガスで加圧可能なNMRプローブを開発した。これを縦型の14テスラ超電導電磁石に挿入することにより、水滴の磁気アルキメデス浮上に成功した。また、浮上物体中のプロトンスピンに対して、磁化の反転操作を行い、物体の運動を観察した。水滴の磁気アルキメデス浮上実験において、従来は考慮されてこなかった浮上条件への原子核スピン由来の磁化の寄与を検証するという目的のために、初年度である平成20年度は磁気アルキメデス浮上実験のための装置開発を行うとともに、予備的実験を行った。水滴等の試料を、高圧の酸素雰囲気下に置くための密閉容器を製作した。その際、試料をCCDカメラで観測するために、透明なアクリル製の窓を導入し、超伝導磁石の内部に挿入しても試料の様子を観察できるようにした。また超電導磁石内に挿入した試料容器内に酸素ガスを送り込み、その圧力を大気圧10気圧までコントロール可能できるようにセットアップをおこなった。当初は水滴の代わりに水分を多く含む果物や木の実を容器内に置き、酸素圧力を上げて磁気的に浮力を増大させて、果物等を浮上させることに成功した。またその後、数気圧の圧力で酸素密閉された容器内に水滴を注入する機構を自作し、水滴を浮上させることにも成功した。そこで次のステップである、浮上水滴のプロトンNMR実験を行うために、さらなる実験装置の改造・セットアップに着手した。また、NMRの技術で浮上水滴内のプロトンスピンを反転させた時に、水滴にどの程度の力が働き、どの程度力の釣り合う位置がシフトするか、理論的考察および数値的オーダーエスティメーションによる理論的考察も行った。本課題の目的は、磁気アルキメデス浮上実験において、従来-は考慮されてこなかった浮上条件への原子核スピン由来の磁性の寄与を検証することにある。20年度までに装置開発を進めて、磁気アルキメデス浮上物体をCCDカメラを用いて観測可能にし、水滴の近似的物体として水分を多く含むデラウエア葡萄・ナンテン等の果実を浮上させる実験を行ってきた。ただし果実においては正確な磁気感受率のもとに定量的な磁気浮上の議論を行うことが難しいため、21年度は高圧酸素容器内に水滴を注入させる機構を組み込むことに取り組み、その結果無容器の水滴の磁気アルキメデス浮上を行うことに成功した。さらに次のステップとして、浮上している水滴中に含まれる水素原子核(プロトン)の磁化を核磁気共鳴(NMR)現象を利用して操作するために、酸素高圧容器中にNMR用のラジオ波送信コイルを制作し、気密性を保ちながらにして高圧容器の外部と電気信号の入出力が出来るように端子を設置した。また高周波コイルはトリマコンデンサを用いてNMRの共鳴周波数(本研究の場合約450メガヘルツ)においてインピーダンスを整合させることが出来るようになっており、浮上水滴中の核スピンに対してラジオ波パルスを照射する準備を整えた。さらに、ラジオ波パルスの送信およびNMR信号の受信のためのNMR分光計の開発も完了した。本課題の目的は、磁気アルキメデス浮上実験において、従来は考慮されてこなかった浮上条件への原子核スピン由来の磁性の寄与を検証することにあった。20年度21年度にかけては実験装置の開発を主に行い、超電導電磁石中の磁気アルキメデス浮上物体をCCDカメラで観察したり、浮上物体に対して核磁気共鳴実験に必要なラジオ波を照射することを可能にしてきた。22年度は、これらの装置を用いて、磁気アルキメデス浮上物体に対して核磁気共鳴実験を適用する試みを行った。まず、浮上物体に適切な周波数のラジオ波を適切な強度で照射するための校正実験を行い、ラジオ波のエネルギーと磁場強度の関係に関するデータを取得した。次に、磁気アルキメデス浮上している物体に対する、力学的共振周波数の見積もりを行った。さらに、浮上物体の上部と下部における磁場強度の違いから、核磁化を反転させるための断熱的なラジオ波周波数の掃引に関する条件を検討した。最後に、浮上物体中のプロトンの核磁化をラジオ波で反転させる実験を行い、浮上物体が上下に揺さぶられる現象を観測したが、核磁化の反転以外に存在しているとみられる、電場やそれに伴う熱的な擾乱の影響を排除できなかったため、核磁化の寄与の実験的な証明をするには至らなかった。