hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オートファジーに依存しない新規ミトコンドリア分解経路の実体解明

前年度、Atg27が液胞膜からエンドソームに逆行輸送されること、この逆行輸送はSnx4複合体により媒介されることを見出したため、今年度はその分子機構に注目して解析を行った。その結果、Snx4複合体は液胞膜上のリン脂質PI3Pを介してリクルートされること、Snx4複合体はAtg27の細胞質領域に位置するR224を介してAtg27を認識していること、Snx4複合体は自身のBARドメインを介して、液胞膜を変形させ、Atg27を含む輸送小胞形成を媒介することを明らかにした。これらの解析結果は、申請者を筆頭著者としてJournal of Cell Biology誌に発表した(Suzuki and Emr., JCB 2018)。上記の結果から、酵母細胞におけるリサイクル経路は2つのタンパク質複合体、Retromer複合体、Snx4複合体により媒介されることが明らかになった。次に、これらのタンパク質複合体非依存的にリサイクルされる膜タンパク質を探索した。その結果、エンドソームに局在する膜タンパク質Obr1がRetromer/Snx4複合体非依存的に、エンドソームからゴルジ体へとリサイクルされることを見出した。このリサイクル媒介する因子を探索し、新規タンパク質複合体Vps77複合体を同定した。これにより、酵母細胞における、膜タンパク質のリサイクルはRetromer複合体, Snx4複合体, Vps77複合体の3者により担われていることが明らかとなった。興味深いことに、この3者を欠損させると、エンドソーム形成が見られなくなる。すなわち、これら3つの複合体が協調的に機能することにより、エンドソームのアイデンティティが保たれていることが明らかとなった。新規リサイクル分子複合体を同定したことから、本年度の研究は順調に進んだものと考えている。29年度が最終年度であるため、記入しない。出芽酵母では、基質を取り囲んだ液胞膜が直接内腔へと陥入することで基質の分解を行うミクロオートファジーという現象が知られる。本研究では、ミトコンドリアを基質としたミクロオートファジー、ミクロマイトファジーに注目し、解析を行った。本年度はミクロマイトファジーが誘導される条件を探索した。酵母細胞を長期間窒素源飢餓にさらすと、電子顕微鏡においてミクロマイトファジーの誘導が観察された。しかし、ウェスタンブロットにより、ミトコンドリアの分解を評価したところ、検出限界以下であった。このことから、ミクロマイトファジーによるミトコンドリア分解は非常に寄与が小さいことが分かった。そこで、ミクロオートファジーにより分解を受けるミトコンドリア以外のオルガネラや膜タンパク質を探索した。その結果、オートファゴソームの外膜に局在する膜タンパク質がミクロオートファジーにより分解されることを見出した。興味深いことにこの分解はESCRT複合体を必要とした。これらの結果より、ミクロオートファジーの新たな基質として膜タンパク質であるAtg9を見出し、この分解にESCRT複合体が必要であること見出した。ミクロオートファジーの新たな基質として膜タンパク質であるAtg9を見出し、この分解にESCRT複合体が必要であること見出したことから、計画は順調に進展していると考える。前年度、ミクロオートファジーによる分解基質を探索した結果、オートファゴソーム外膜に局在するAtg9がESCRT複合体を介したミクロオートファジーにより分解することを明らかにした。本年度はさらなるこの分解基質を探索した。まず、Atg9同様にオートファゴソーム外膜に局在すると考えられる膜タンパク質Atg27に着目した。Atg27はAP-3経路により、ゴルジ体から液胞膜へと直接、運ばれ、主に液胞膜に局在する。富栄養条件下では、Atg27は液胞膜に局在するが、栄養源飢餓条件では、Atg27は液胞内腔へと運ばれた。この液胞内腔への輸送もESCRT複合体を必要とした。以上より、Atg27もESCRT複合体を介したミクロオートファジーにより分解を受ける可能性が示唆された。この分子機構を探索するため、Atg27との相互作用が報告されている因子の欠損株におけるAtg27の局在を観察した。すると、エンドソームからゴルジ体への逆行輸送に必須なレトロマーを欠損させた際、Atg27がエンドソームに局在することを見出した。Atg27がどうやってエンドソームに蓄積するのか、調べた結果、Atg27は液胞膜からエンドソームへ運ばれることを見出した。さらに、この液胞膜からエンドソームへの逆行輸送に必要なタンパク質を探索し、Snx4/41/42複合体を同定した。Snx4/41/42複合体はPI3P依存的に液胞膜上に集積し、Atg27の液胞膜からエンドソームへの逆行輸送に機能していた。これらの結果より、Atg27はAP-3経路により、ゴルジ体から液胞膜へ運ばれた後、Snx4/41/42複合体を介して、液胞膜からエンドソームへと逆行輸送されることを明らかにした。これまで液胞膜からエンドソームに逆行輸送される経路は同定されておらず、Atg27は液胞膜からエンドソームへと運ばれるはじめての膜タンパク質である。本年度は昨年度に引き続き、ミクロオートファジーの研究を行い、Atg9だけでなくAtg27がESCRT複合体を介したミクロオートファジーにより分解されることを見出した。

また、その研究過程でAtg27という膜タンパク質が液胞膜からエンドソームへ逆行輸送されることを見出した。この研究結果は液胞膜上に膜タンパク質の量的制御を行う監視システムが存在することを示唆する。不必要になった膜タンパク質はユビキチン化を受けることで分解を介した下方制御を受ける。一方、これらの監視システムを通過した膜タンパク質はSnx4/41/42複合体を介して、リサイクルされる。このように細胞は極めて効率的に膜タンパク質を“選別"そして"リサイクル"していることが明らかとなった。この知見はこの知見はこれまでただの“ごみ箱"と考えられていた液胞が“"タンパク質の仕分け“という新たな機能を持つことを提唱するものである。そのため、本年度は極めて良好に研究が進んだと考えている。前年度、Atg27が液胞膜からエンドソームに逆行輸送されること、この逆行輸送はSnx4複合体により媒介されることを見出したため、今年度はその分子機構に注目して解析を行った。その結果、Snx4複合体は液胞膜上のリン脂質PI3Pを介してリクルートされること、Snx4複合体はAtg27の細胞質領域に位置するR224を介してAtg27を認識していること、Snx4複合体は自身のBARドメインを介して、液胞膜を変形させ、Atg27を含む輸送小胞形成を媒介することを明らかにした。これらの解析結果は、申請者を筆頭著者としてJournal of Cell Biology誌に発表した(Suzuki and Emr., JCB 2018)。上記の結果から、酵母細胞におけるリサイクル経路は2つのタンパク質複合体、Retromer複合体、Snx4複合体により媒介されることが明らかになった。次に、これらのタンパク質複合体非依存的にリサイクルされる膜タンパク質を探索した。その結果、エンドソームに局在する膜タンパク質Obr1がRetromer/Snx4複合体非依存的に、エンドソームからゴルジ体へとリサイクルされることを見出した。このリサイクル媒介する因子を探索し、新規タンパク質複合体Vps77複合体を同定した。これにより、酵母細胞における、膜タンパク質のリサイクルはRetromer複合体, Snx4複合体, Vps77複合体の3者により担われていることが明らかとなった。興味深いことに、この3者を欠損させると、エンドソーム形成が見られなくなる。すなわち、これら3つの複合体が協調的に機能することにより、エンドソームのアイデンティティが保たれていることが明らかとなった。新規リサイクル分子複合体を同定したことから、本年度の研究は順調に進んだものと考えている。今後はESCRTタンパク質がどのようにAtg9の分解に機能するのか、その分子機構を解析していく予定である。ESCRT複合体はエンドソームにおける陥入構造の形成に寄与することが示されているが、ごく最近、ESCRTタンパク質が液胞膜に局在し、液胞膜タンパク質の分解に機能することが示されており、Atg9の分解にもESCRTタンパク質が直接機能していることが予想される。まず、ESCRT複合体がAtg9の分解に直接関与するのか、明らかにするため、ESCRT複合体とAtg9の相互作用があるか、解析を行う。
塩害農地のファイトレメディエーションに対する土壌物理学的展開に関する研究

本研究では,塩害農地の除塩として有効な手段であるファイトレメディエーションに対して,ヒマワリとビートについて,中国甘粛省の乾燥地塩害圃場において,栽培実験を実施し,気象観測および土壌内水分・塩分の自動モニタリングを行うことによって,まず,作土層に形成される根分布の実測より,根の吸水量を考慮した水分移動解析を行った。その際,各根分布に対し,異なる水分保持特性の土層をそれぞれ設定することにより,実測値をうまく再現することができた。また,灌漑水,肥料,地下水のイオン組成を分析し,土壌水分・ECの計測値から土壌溶液の当量濃度を推定することで,ファイトレメディエーションの効果について検討した。本研究では,塩害農地の除塩として有効な手段であるファイトレメディエーション(植物修復)に対して,この現象を,植生のある土壌内における水分・塩分の同時移動としてとらえ,土壌物理学的にその効果に対するシミュレーションを行い,将来予測に結びつけることを目的としている。具体的には,除塩用植物として可能性が指摘されている幾つかの植物について温室内ライシメータにおける栽培実験を行い,土壌物理的に各植物の塩分吸収特性を解明するために,蒸散の解析に必要なFeddesモデルの根の吸収パラメータや根群の成長関数の決定を行うと共に,実際の塩害地である,中国甘粛省の乾燥地塩害圃場において,各植物の栽培実験を実施し,気象観測および土壌内水分・塩分の自動モニタリングを行うことによって,各植物の修復効果に対する検証を行い,シミュレーションの精度を明らかにし,将来予測を試みることである。今年度は,まず、温室内ライシメータにおける塩水を用いた栽培実験を,ビートとトウモロコシについて実施し,溶質の各イオン成分に関する,両作物の植物体への吸収特性を解析した。その結果,特にNaとCaについてビートにおける吸収が卓越していることが明らかになった。両者における土壌水分の空間分布については差が無かったが,電気伝導度に関しては顕著な違いがあり,イオンの選択吸収性の違いも含めて,非常に興味深い結果が得られた。次に,中国現地実験圃場においても,ビートとトウモロコシの両栽培区について土壌及び作物体の各イオン成分について解析を行った結果,作物体への吸収量については,室内実験と同じ傾向が見られた。土壌内空間分布については,トウモロコシにおいて,土壌表層に多くの集積が観測され,土壌面蒸発量の違いの影響によるものと推測された。今年度は、解析および分析に時間がかかると推定された中国現地栽培実験について、集中的に実験を実施し、結果の集積を行った。その結果、以下のことが明らかになった。トウモロコシ,ビート,コムギ,ヒマワリ各栽培区の深さ0.2mにおけるNa+の経時変化としては,4月のNa+値は全ての栽培区において,顕著に高い値を示した。これは,作物栽培が終了する10月から翌年3月まで地表面が裸地状態になること,その間降水量が著しく減少することから,地表面にNa+が集積したためだと考えられた。5月にNa+値が大きく低下するのは,播種後の灌漑により,リーチングが生じた結果だと推測された。5月以降はNa+値が7月に上昇し,9月に低下する傾向がトウモロコシを除く3つの栽培区で確認された。作物栽培終了時の9月に着目すると,地表面のNa+値の差違は小さいが,深さ0.1,0.2mではトウモロコシ,ビート,コムギ,ヒマワリの順で集積量が大きかった。地表面に近づくにつれNa+値が上昇していく点は各栽培区で共通した。7月に採取した植物体1個体のNa+集積量では,ビートへの集積量が,他の作物と比較して顕著に高い値を示した。コムギは最も低かったが,単位面積当たりの集積量で計算すると,ヒマワリと同程度の値になった。コムギとヒマワリはビートの植物体集積量が高いことに対し,9月の土壌への集積がコムギやヒマワリに比べ高い結果を示した。これはヒマワリやコムギがビートより30日ほど早く栽培が終了した結果だと考えられる。地表面の裸地化により,蒸散項が無くなり,作土層の乾燥が緩和され地表面への水分移動が減少したこと,灌漑・降水によるリーチングの効果によるものと推測された実験圃場は,中国の甘粛省平堡郷(N36°25.5′,E104°25.4′,1461ASL)に設置した。黄土が厚さおよそ100 cmにわたって均質に堆積しており,その下には砂質土層が存在する。圃場内にヒマワリ栽培区とビート栽培区を設定し,栽培区内の観測点でTDTセンサーを利用した土壌水分・EC計測を行った。圃場内のウェザーステーションにおいて,温湿度,降水量,風速,純放射などの気象要素や地下水位を測定した。根域は地表面を上端とし,下端を別途実施した栽培試験の結果から決定した。ヒマワリは深さ15 cmまで,ビートは深さ50 cmまでの領域で根の相対乾物重の80 %以上が分布した。そこでこの深度を境界とし,黄土層のみの土層を根域層と黄土層の2つの層にわけた。水分移動解析は,HYDRUS-1Dを利用し,鉛直一次元で行った。水分特性モデルはVan Genuchtenモデルを適用した。ヒマワリの根域層を考慮しない場合の土中水分移動の解析結果と実測値を比較すると,深さ5 cmにおける解析値は実測値に対し過大評価していた。

そこで,根域層を考慮して解析を行った結果,深さ5 cmにおける実測値と解析値はよく一致した。実測値と解析値のRMSEは,根域の考慮の有無により,0.068 cm3cm-3と0.036 cm3cm-3となり,根域層を考慮した場合により良い一致が見られた。同様に,根域層を考慮してビートの解析を行った結果,RMSEは0.043 cm3cm-3と良好な結果を示した。本研究では,塩害農地の除塩として有効な手段であるファイトレメディエーションに対して,ヒマワリとビートについて,中国甘粛省の乾燥地塩害圃場において,栽培実験を実施し,気象観測および土壌内水分・塩分の自動モニタリングを行うことによって,まず,作土層に形成される根分布の実測より,根の吸水量を考慮した水分移動解析を行った。その際,各根分布に対し,異なる水分保持特性の土層をそれぞれ設定することにより,実測値をうまく再現することができた。また,灌漑水,肥料,地下水のイオン組成を分析し,土壌水分・ECの計測値から土壌溶液の当量濃度を推定することで,ファイトレメディエーションの効果について検討した。本研究は室内ライシメータ試験と中国現地観測圃場において耐塩性作物の栽培を行い、サンプリングによる土壌内および作物吸収体のイオンの分析、自動モニタリングによるTDTを用いた、土壌水分、ECの鉛直分布の経時変化の計測といった内容のデータの集積に基づいて解析を行っていくものであり、特に、中国海外現地圃場における栽培実験は、年間を通して4月9月における1度の栽培であり、データ採取に非常に大きな労力と時間を費やさざるを得ない研究である。その意味で、2013年度に引き続き、2014年度も栽培実験をほぼ成功させることができたのは、大きな研究成果であると考えられる。サンプリングも順調に進めることができた。同時に進めている解析においても、非常に興味深い数値解析結果が出ており、それに関しては、2015年度の学会発表にエントリーすることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。土壌物理学今年度の科研の経費を最も有効に利用できるのは、渡航費用のかかる中国における栽培実験であり、1年に1回のサンプリングしかできないので、プロジェクトを通したサンプリング数を増やすためにも、今年度も栽培実験を継続して行う。ビートに関しては、除塩効果を確認できたので、今後、他の作物との比較を栽培実験を通して行っていく必要がある。今年度も年間23回の渡航を行い、現地圃場でのサンプリングと自動モニタリングによる気象関連データ、TDR、TDTによる精度の高い空間的な土壌水分・塩分の経時的変動等の観測を行う。本プロジェクト期間中に得られたデータを用いて、順次シミュレーションによる実測値の効果的な再現法に関して検討を行い、最終的な提言に結びつけていく。本研究は,室内ライシメータ試験と中国現地観測圃場において,同時に耐塩性作物の栽培と土壌内および作物吸収体のサンプリングによるイオンの分析,自動モニタリングによるTDRを用いた計測を行っており,非常に多くの労力と時間を要するものであった。特に海外において,塩害地農家に農地を借用し,固定した観測サイトを設置して,実際の栽培実験を行うといった作業を年間を通して行っており,国内圃場実験とは比較にならない困難さを伴っていることを考慮すれば,基本的にデータが取得できたことに関しては,完全ではないにしろ一応の評価はできると考える。
ナノ超微粒子の摩擦焼結による独創的トライボ膜の創製

摩擦面にナノ粒子を供給して摩擦試験を行うと、供給したナノ粒子が摩擦面で固着・焼結されて表面に膜(トライボ膜)を生成する。このトライボ膜は、金属同士の凝着を抑制するという保護膜の役割を果たすため、たとえ摩擦面に粒子が無くても摩擦や摩耗を低減すると期待される。本研究では,供給する粒子の種類や粒径、トライボ膜生成時の荷重や雰囲気など、トライボ膜の生成条件がトライボ膜の生成状況や摩擦摩耗特性に及ぼす影響について明らかにし、最も優れたトライボ膜を生成するための条件を見出すことを目的として行った。その結果、以下のことが明らかになった。(1)供給した粒子(Bi_2O_3、CuO、Fe_20_3、SnO_2、CoO、Cu)の種類の影響では、Bi_2O_3粒子を供給して生成したトライボ膜が、マイルド摩耗領域が続いた摩擦距離が長く、最も耐摩耗性が優れ、トライボ膜の無い旋盤加工のみの試験片と比べて大幅に摩耗を低減できた。(2)Bi_2O_3粒子によるトライボ膜は、比較的厚く、SEM観察によりその厚さは5.6μmと推測された。一方、Fe_2O_3粒子、SnO_2粒子、CoO粒子によるトライボ膜は薄く、マイルド摩耗領域が続いた摩擦距離は短かった。(3)トライボ膜生成雰囲気(真空中、大気中)の影響では、Bi_2O_3粒子、CuO粒子とも真空中で生成したトライボ膜の方が表面凹凸は細かく、緻密で微細な形態を有しており、耐摩耗性に優れていた。(4)トライボ膜生成荷重(9.8N、19.6N、39.2N)の影響では、Bi_2O_3粒子(ピン、ディスク)、Cu粒子(ディスク)いずれにおいても、荷重19.6Nで生成したトライボ膜が最も耐摩耗性が優れていた。これは、低荷重(9.8N)ではピンがディスクに十分に押し付けられず摩擦面の一部分にしかトライボ膜は生成されず、反対に高荷重(39.2N)では、生成したトライボ膜が摩耗により削り取られやすく均一なトライボ膜が生成されにくいためと考えられた。以上をまとめると、真空中、荷重19.6NでBi_2O_3粒子を供給して生成したトライボ膜が最も優れた耐摩耗性を示すことが分かった。繰り返しを伴う金属のすべり摩耗において、ナノ超微粒子粉末を金属の摩擦面に供給すると、その粒子は固体接触間の摩擦面で固着・焼結されてトライボ膜を生成し、これが金属同士の凝着を防ぎ低摩擦・低摩耗を出現できる。表面エネルギーの大きいナノメーターサイズの超微粒子粉末は、繰り返しを伴う摩擦面の真実接触点での瞬間的高温高面圧下では焼結やMA (Mechanical Alloying、機械的合金化)の現象が生じ、これによって生成された摩擦面のトライボ膜(摩擦摩耗により摩擦面に生じた膜、または摩擦により物性や化学組成が変化した表面部分)は、微細構造を有し耐凝着性・耐摩耗性に優れた表面膜になりうる。

すなわち、ナノ超微粒子粉末の摩擦焼結(固体接触問の摩擦による粉末粒子の焼結)により、トライボロジー特性に優れた独創的トライボ膜の創製が可能である。本研究では、(1)ナノメーターサイズの超微粒子粉末を金属のすべり摩耗の摩擦面に供給し、供給する粉末粒子の種類・粒子サイズ・摩擦条件・摩擦雰囲気などが、摩擦焼結によるトライボ膜の組成・厚さ・形状などの生成形態に及ぼす影響を明らかにすること、(2)その生成したトライボ膜のトライボロジー特性を明らかにすること、を目的として実施した。1年目である本年度は、摩擦面に供給するナノ超微粒子には、ビルドアップ法により作成し市販されている金属と金属酸化物のナノ超微粒子を用いて実験を行った。具体的には、ガス中蒸発法粒子によるFeやNiなどの20nmの金属超微粒子や、気相法によるα-Fe_2O_3、Al_2O_3、CuOなどの数10nmの金属酸化物粒子を使用した。摩擦焼結は、現有のピンオンディスク摩擦摩耗試験機を用いて行い、ピン・ディスク試験片材料としてFe・Ni・Cuなどの金属を用いた。なお、摩擦雰囲気の影響を調査する目的で、雰囲気制御摩擦摩耗試験機を製作・購入した。摩擦面の高分解能SEM観察により、ナノ粒子の焼結現象の証拠が得られ、ナノ粒子の摩擦焼結によるトライボ膜の生成を発見した。さらに、このトライボ膜は摩耗を飛躍的に低減することを見出した。2年目である本年度は、雰囲気制御ピンオンディスク摩擦摩耗試験機を用いて、鋼の摩擦面に数10nmの酸化物ナノ超微粒子を供給し、雰囲気を大気中、Arガス中、真空中の3種類に変えて実験を行い、雰囲気と酸化物粒子供給が及ぼす表面膜(トライボ膜)の生成への影響を明らかにした。さらに、大気中または真空中でナノ粒子を供給することにより生成した表面膜(トライボ膜)の摩擦摩耗特性を大気中で調べた。その結果、Bi_2O_3粒子を大気中で供給した場合の摩擦面には、生成面積率は小さいが何層にも重なった厚いトライボ膜が観察された。また、真空中で酸化物ナノ粒子を供給した試験では、大気中で酸化物ナノ粒子を供給した摩擦面よりも、滑らかで緻密なトライボ膜が生成していた。大気中で酸化物ナノ粒子を供給してピンに生成したトライボ膜の摩擦摩耗試験では、CoO→CuO→Fe_2O_3→SnO_2→Bi_2O_3粒子の順に、粒子を供給しなかった場合の試験片に比べて摩耗が低減された。しかし、試験前に生成していたピンのトライボ膜は、摩耗により消滅してしまい、試験途中からシビア摩耗になった。一方、トライボ膜同士を摩擦摩耗させた場合の試験では、どの粒子のトライボ膜もマイルド摩耗になり、CuO→Fe_2O_3→Bi_2O_3の順に摩耗が低減した。これらのことから、Bi_2O_3粒子を供給して生成したトライボ膜がトライボロジー特性に最も優れていることがわかった。さらに、真空中でCu金属粒子を供給して生成したトライボ膜は、大気中において優れた摩擦摩耗特性を示し、トライボ膜がない場合と比べて大幅に摩耗が低減された。とくに、細かい50nmのCu粒子によるトライボ膜は、1,mのCu粒子によるトライボ膜と比べて耐久性・耐摩耗性に優れていた。以上まとめると、ナノ粒子を供給して生成したトライボ膜は、トライボ膜が無い場合と比べて摩擦摩耗特性を飛躍的に向上させることがわかった。今後は最適なトライボ膜生成条件について詳細に調査する予定である。摩擦面にナノ粒子を供給して摩擦試験を行うと、供給したナノ粒子が摩擦面で固着・焼結されて表面に膜(トライボ膜)を生成する。このトライボ膜は、金属同士の凝着を抑制するという保護膜の役割を果たすため、たとえ摩擦面に粒子が無くても摩擦や摩耗を低減すると期待される。
耐塩性シロイヌナズナが有する塩馴化機構の解明

シロイヌナズナのaccessions (ecotype)を用いた研究により、accessions間には耐塩性の大きなバリエーションがあること、また耐塩性には、塩ショックに対する耐性と、生育に影響を与えない程度の塩ストレスを一定期間経ることで、海水程度の塩水(浸透圧)にも耐性を示す、「塩馴化能」があることを明らかにしてきた。特に、高い耐塩性を示すaccessionsは塩馴化能を有しており、高い耐塩性の獲得には塩馴化能が重要であることが示唆された。そこで本研究では、塩馴化機構を遺伝学的に明らかにすることを目的とした。206 accessionsの塩馴化能を評価し、250,000 SNPsデータを用いたGWAS解析を行った(USDA-ARS Hoekenga主任研究員らとの共同研究)。その結果、塩馴化に寄与する可能性のあるSNPsを特定した。塩馴化能と最も高い相関を示したSNPを含む塩馴化型accession由来の遺伝子を非塩馴化型accessionに導入したところ、塩馴化能の相補は認められなかった。そこで原因遺伝子領域に存在する全ての多型を検出することを目的に、塩馴化型accession由来のBACライブラリーを作成し、当該領域のシークエンスを行った。その結果、非塩馴化型accessionと比較した場合、168 SNPsに加え、17 kbpの欠損および周辺領域の組換えが生じていることが明らかとなった。他の塩馴化型accessionsでも欠損・組換えが確認出来たことから、耐性との関連が期待される。24年度が最終年度であるため、記入しない。350種のシロイヌナズナaccessionsを用いた耐塩性評価により、耐塩性に優れるaccessionsは、生育に影響を与えない程度の塩ストレスを一定期間経ることで、海水程度の塩水(浸透圧)にも耐性を示す、「塩馴化能」が優れていること、さらにこの塩馴化能が1遺伝子座により制御されていることを明らかにしてきた。本年度は、この遺伝子座の同定を目的として、genome-wide association study(GWAS)を行った。具体的には、206 accessionsの塩馴化能を評価し、250,000SNPsデータを用いたGWAS解析を行った(USDA.ARS米国農務省植物栄養部門Owen Hoekenga主任研究員との共同研究)。その結果、塩馴化に寄与する可能性のある複数SNPsを特定した。さらに、塩馴化能を有するZu-Oにイオンビームを照射して突然変異を誘導した種子を作成し、40000粒のM2種子(2000粒のM1種子由来)を用いてスクリーニングを行った。その過程で、1つの塩高感受性を単離した。遺伝学的解析の結果、原因遺伝子が耐塩性必須遺伝子、SOS1(Na^+/H^+ antiporter)であることを明らかにした。この変異株の耐塩性は極めて損なわれているものの、塩馴化試験(弱い塩ストレスに一定期間曝した後、高浸透圧ストレスを施す試験)においては、塩馴化能欠損accessionであるCol-0を超えた高い耐性を示すことから、塩馴化能の重要性を遺伝学的に示すことが出来た。これまでに遺伝学的な解析により、塩馴化能を制御する遺伝子座の領域を絞り込んできた。本年度行ったGWASは、この領域から、原因となりうるアミノ酸置換を誘導する候補SNPsを絞り込むための解析であり、非常に明確な結果を得ることが出来た。耐塩性シロイヌナズナが有する塩馴化能の解析については、得られた候補SNPsを有する遺伝子群を、塩馴化能が欠失したaccessionsに導入することで、原因遺伝子の特定が期待される。

しかしながらGWASで用いた250,000SNPsは、実験系統であるCol-0とLerのSNPsを中心に作られたものであり、Col-0と塩馴化能を有する耐塩性accessions間にはさらに多くのSNPsの存在が考えられる。今後は早急に塩馴化能を有する耐塩性accession由来のBACクローンを作成し、もれなく塩馴化能を説明するSNPsを特定する必要がある。
酵母ペルオキシソームの膜透過装置の解析

1)N-またはC-末端にHis-tagを付加したPex13pまたはPex14pを生理的条件に近いPEX14遺伝子のプロモーター支配下で発現させ、これらHis-tag付加体を含む複合体をペルオキシソーム膜面分よりNonidetP-40で可溶化後Niカラムを用いて精製したが、まだかなり共雑するタンパク質を含んでいた。また、Niカラムでの挙動の差異から、主にPex14pを含む複合体にはPex13pが含まれていないことが示唆された。次に、最近開発された二段階のアフィニティークロマトグラフイーを連続的に行うTAP(tandem affinity chromatography)システムを用いて精製を行った。His-tagと同様にTAP-tagをN-またはC-末端に付加したPex14pの発現株を用いて検討したところ、最終溶出画分中にタグ付加Pex14p以外に、約80,63,28kDaのバンドが検出され、Pex14pがこれらのタンパク質と特異的に結合し複合体を形成していることが示唆された。現在、これらのタンパク質の同定を行っている。2)In vitroでのimport assay系の確立のために、PCR法にてH.polymorphaのアルコールオキシダーゼ(AO)およびアミンオキシダーゼ(AMO)遺伝子を単離し、転写用ベクター(pCITE-2)にサブクローニングした。現在、in vitro転写・翻訳系により標識したAOとAMOを用い条件検討を行っている。一方、in vivoのimport assay系については、C末端にPTS1(-SKL)または、N末端にAMOのPTS2を付加したGFP融合遺伝子をΔpex14欠失変異株のアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター領域に組込み、同プロモーター支配下で発現する株を作製した。これらの株に野生型Pex14pをゼオシン耐性をマーカーとするベクターにより発現させたところ、蛍光が斑点状に観察されPTS融合GFPがペルオキシソームに局在していることが示唆された。一方、ベクターのみの場合は蛍光が細胞質全体に分散していた。これらの結果より、今回作製したPTS融合GFPを発現するΔpex14欠失変異株はPex14pの構造機能相関の解析に有用であり、現在種々の変異体Pex14pを発現させて検討しているところである。1)まず、メタノール培地で培養した酵母H. polymorpha(野生株)のペルオキシソームを含む膜画分からPex14pまたはPex13pを含む膜透過装置複合体の分離精製を試みたが、両peroxinの発現レベルが低く成功しなかった。そこで、N-またはC-末端にHis-tagを付加したPex14pを過剰発現するΔpex14欠失変異株、および、同様にHis-tagを付加したPex13pを過剰発現するΔpex13欠失変異株を作製した。これら発現株より得られたペルオキシソーム膜画分を0.2%または0.5%Nonidet P-40で可溶化した後、Niカラムを用いて精製を行った。なお、両者では可溶化に必要な界面活性剤の濃度が異なることがわかった。また、N-末端にHis-tagを付加したPex14pまたはPex13pを用いた場合、SDS-PAGEでこれらのバンドが確認できる位まで部分精製できることがわかった。

また、Pex14pを含む複合体とPex13pを含む複合体が異なることを示唆する結果が得られた。今後は、得られた標品のさらなる精製および部分精製標品に含まれる他のタンパク質成分の同定を行う予定である。2)In vitroでのimport assay系の確立のために、まず、PCR法にてH. polymorphaのアルコールオキシダーゼおよびアミンオキシダーゼ(AMO)遺伝子を単離した。さらに、転写用ベクター(pCITE-2)にサブクローニングし、in vitro転写系でこれらのmRNAを合成することができた。一方、in vivoのimport assay系については、C末端にPTS1(-SKL)、または、N末端にAMOのPTS2(N末端50残基)を付加したGFP融合遺伝子を作製した。これらのレポータータンパク質を野生株に発現させたところ、生菌のままでの蛍光顕微鏡観察により両融合タンパク質がペルオキシソームに局在していることが示唆された。1)N-またはC-末端にHis-tagを付加したPex13PまたはPex14Pを生理的条件に近いPEX14遺伝子のプロモーター支配下で発現させ、これらHis-tag付加体を含む複合体をペルオキシソーム膜より可溶化後Niカラムを用いて精製したが、まだかなり共雑するタンパク質を含んでいた。そこで、最近開発された二段階のアフィニティークロマトグラフィーを連続的に行うTAP(tandem affinity chromatography)システムを用いて精製を行った。His-tagと同様にTAP-tagをN-またはC-末端に付加したPex14Pの発現株を用いて検討したところ、最終溶出画分中にTAPタグ付加Pex14P以外に、約80,63,28kDaのバンドが検出された。以上の結果よりPex14Pがこれらのタンパク質と特異的に結合し複合体を形成していることが示唆された。現在、これらのタンパク質の同定を行っているところである。2)In vitroでのimport assay系については引き続き条件検討を行っている。一方、in vivoのimport assay系については、C末端にPTS1または、N末端にPTS2を付加したGFP融合遺伝子をΔpex14欠失変異株のアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター領域に組込み、同プロモーター支配下で発現する株を作製した。これらの株に野生型Pex14Pをゼオシン耐性をマーカーとするベクターにより発現させたところ、蛍光が斑点状に観察されPTS融合GFPがペルオキシソームに局在していることが示唆された。一方、ベクターのみの場合は蛍光が細胞質全体に分散していた。これらの結果より、今回作製したPTS融合GFPを発現するΔPex14欠失変異株はPex14Pの構造機能相関の解析に有用であり、現在種々の変異体Pex14Pを発現させて検討しているところである。
疎外された人口と国際関係:社会的歪みと秩序への挑戦

本研究は、国家権力から疎外された人口集団が、とりわけ、非平和的な手段を用いて要求を行うに到る現象とその国際関係及び国内社会への影響を分析した。こうした集団が、活性化され、非平和的手段により動員されていく過程においては、国家権力との関係が重要な要因であった。さらに本研究では、誰が、どのような状況下で、市民を狙った暴力行為を行うかという点を分析した。平成21年度は、上記の研究に着手し、主に、いかなる社会状況がテロリストのような社会的に疎外された人々を生成するかという観点から研究を進めていった。国内テロリズムを誘発するような特定の内戦状況の分析、テロリストが市民をターゲットとするような状況の分析、国際赤十字委員会の「人々戦争を語る(People on War Project:以下PoWプロジェクトとする)」による内戦の犠牲者の人口学的な分析、及び戦地の人々の戦争犯罪に関する国際管轄に関する態度の分析をした論文の研究発表を行った。このうち、PoWプロジェクトに関する分析は、欧米の学会においても、他の研究者の研究はほとんど皆無であり、またテロリズムに関する研究は、欧米の学界の成果も含めて従来の研究は、国際テロに偏り、国内テロリズムも含めた包括的な研究は少ないため、従来の研究と比較した際の独自性は出しえる方向に進んでいると考えている。このうち、2つ目の論文は、2009年10月15日から17日にカリフォルニア州モントレーで開催されたISAC/ISSS conferenceで"Terror Groups Targeting Civilians : Their Ideologies and Target Selection"と題して発表する機会を得て、参加者と意見を交換する機会を持った。また他の成果についても、政治学や安全保障の専門家と意見を交換する機会を得た。現時点では、いずれもまだ初稿の段階で、査読論文として発表するにいたってはいないが、今後、査読をさらにうけるなどして、内容の改善に努めていきたいと考えている。またGTDIIに関する研究は、2011年3月31日から4月3日に開催された69th annual national conference of Midwest Political Science Associationで、"Coercive states and terror response."という題名で、ペーパーを発表した。これは、国家機構の市民社会に対する暴力と抑圧がテロの発生と死者数にどのような影響を与えるかという点を分析したものである。最初の1本目の論文は、権力から疎外された人々が戦後の戦争犯罪者処罰に関していかなる意識を持っているかという点を検証した論文である。これに対して、2本目の論文は、どのような属性を持った人が、もしくは、どのような国家政策が、権力から疎外された人々を生む傾向があるかという観点からの研究であった。3本目の論文では特に国家の抑圧機構の暴力が死傷者の大きなテロを誘発する傾向があることを明らかにした。また欧州の地域機構であるOSCEの文書館で調査を行い、本研究の問題関心についての特にバルカンでの具体的な事例の研究も始めた。本研究は、政治権力から疎外された社会集団の研究という、現在までの国際政治学であまり扱われていない対象の研究である。また現代的なテーマであるため実証的な資料が少ないが、今日の国際関係に与える影響の大きさを考えると、一つのテーマとして、可能な限り実証的な研究を行うべき分野であると考えている。平成23年度には2本論文を発表した。1本目は本研究1年目に学会発表した論文を加筆訂正した論文である。2本目は本年4月、シカゴで行われたMidwest political science associationの69回大会で発表した論文を加筆修正したものである。後者の論文はテロリズムという社会暴力が、国家権力からの暴力的手段による排除という要因から生まれる側面が非常に大きいことを議論した。前者の論文はテロリズムの最近の傾向を分析したものである。両研究とも現代の国際関係において、政治権力から疎外された社会集団が存在することになる原因とその結果を分析することを念頭においた統計分析である。またこうした研究は、当然のことながら詳しい個別の事例研究により補強できるものである。そのため、研究者が詳しい現地調査を行うことが現実的に可能であり、国連、EU,OSCEの資料等を通じて、国家及び社会の主だった行為体の反応を文書で検証可能なバルカン半島の事例研究を加えることにした。今年度は特にアルバニア人少数民族の問題と内戦の危機に直面しているマケドニアを調査対象として選んだ。調査はスコピエで行い非常に短い期間であったが、現地の国際機関の公務員関係者、政党関係者等のご協力をいただき、非常に有意義な調査を行うことができたと考えている。今後は、入手可能な実証的な文書で議論を補強し、政治的権力から疎外された人々をどのように国家や社会に再統合していくかという問題意識に研究をつなげていきたいと考えている。本研究は、本件度が最終年度に該当するため以下の点について研究を深めた。まず政治権力から疎外された人口集団の個別の事例について検討してきたが、それを一般化できるパターンを明らかにすることを検討した。

そのため、今年度新たに事例研究を追加して、旧ユーゴスラビア国際刑事裁判所の記録から、市民の殺傷に加わった反乱軍や民兵の特徴的な属性や、彼らが、市民の殺傷行為を行った都市、街、村落の戦前の人口学的な特色を論文にまとめた。また内戦や人民の自決のための戦争で暴力行為の犠牲者となる可能性が高い人々の特徴を調べた論文及び「オフリッド枠組み合意」後のマケドニアに関する国内の政治状況をまとめた論文を公刊した。前者は、内戦下での暴力行為の被害者の属性を、国際赤十字委員会の社会調査People on War Projectで検証したものである。マケドニアの研究は、少数民族が、一旦、武装闘争を行いながら、平和に既存の国家機構に統合されたというきわめて注目に値する事例であった。そのため、今後、政治権力から疎外された集団が非平和的手段で要求を主張してきた時、取るべき政策を検討する際、教訓的な事例であると考えた。これは昨年行った現地調査と一昨年のOSCE公文書館での資料収集の成果を分析したものである。最後に、研究を現状分析に留まらず、将来的には政策的な意味を持たせるため、政治権力から疎外された人口集団を平和に既存の国家制度に統合するには、どのような政策を取るべきかという観点から、恩赦措置について分析したペーパーを提出し学会発表として公表した。なお、学会報告及び公表論文の詳しい内容は、最終報告書に記した。本研究は、最終的には単著としてまとめる予定である。その内容は、理論的枠組み、政治権力から疎外された集団を生み出す原因、結果の計量的研究と事例研究、及びこうした集団を政治過程に再統合する政策を研究することである。この内、実証的研究の部分については、すでに数回にわたり海外で学会報告を行い、2本論文を発表した。また2-3本の論文を近く発表したいと考えている。この予定は当初考えていたものであり、本研究は、おおむね順調に進んでいると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。来年度は、本研究の最後の年となるので、本研究の最終的な目的であった単著を仕上げる予定を固める年としたい。現在までは、政治権力から疎外された人口が存在するようになる原因要因とその効果を主に分析していた。来年度は、こうした集団を国家と社会へ再統合させ、社会的な暴力が発生しないような政策手段を分析したいと考えている。全体として、将来計画している著書は、分析の枠組みと計量的な実証研究の部分と事例研究、最後に政策分析から成るものとすることを考えている。
新生児・乳児の自律神経機能の発達変化は、乳幼児突然死症候群発症に関与するか

正期産児35人を対象としたポリグラフ記録において、第一静睡眠期と第2静睡眠期の持続時間に有意差は認めなかった。RR間隔は第2静睡眠で497.2±59.5msecで、第1静睡眠478.2±49.0secに比し有意に長かった。RR間隔時系列について自己回帰モデルを用いスペクトル解析を行い、低周波成分(LF)、高周波成分(HF),パワー,LF/HF比を求め検討した。LHパワーLH/HFは有意差を認めなかったが、HFは第1静睡眠4-1±0.8msec2,第2静睡眠4.5±1.0msec2で第2静睡眠が有意に大きく、第2静睡眠における副交感神経緊張が不された。29人の正期産児を対象として驚愕反射の出現頻度の検討を行った。静睡眠期におけるミオクローヌスの分布、啼泣の有無によって驚愕反応の強度を3区分した。驚愕反応出現前後1分のRR間隔時系列についてスペクトル解析を行い、驚愕反応出現前後の交感・副交感神経緊張の変動を検討した。平均驚樗反応出現頻度は0.18/分であった。驚愕反応出現に伴いLFパワー、HFパワー、LF/HF比はいずれも増加したが、驚愕反応強度によってパラメーター前後値はいずれも差異を認めず、個人差が大きかった。自律神経機能から乳幼児突然死症候群に関連する事象をとらえられるか検討したが、個人差が大きく、また、乳幼児突然死症候群の症例は無く、正常対象の症例数も多くないので、明らかな結論は得られなかった。今回の検討を基礎データーにして、乳幼児突然死症候群危険因子の有無による違い、体位による違いなどを検討を続ける予定である。在宅終夜記録を行うにあたって、病院脳波室で新生児期ポリグラフ記録を行い、RR間隔変動(HRV)の自己回帰モデルを用いたスペクトル解析法を検討した。次いで、ポリグラフ記録対象者44名のうち、在宅記録についてインフォームドコンセントが得られた7名について、生後1、2,3,4ヶ月の在宅記録を、平成11年9月から12年2月現在まで行った。新生児のHRVスペクトル解析からの自律神経機能について、低周波帯域(LF)、高周波帯域(HF)、LF/HFを用いて交感(SN)、副交感神経(PSN)緊張を評価すると以下の知見が得られた。(1)受胎後週数の増加に伴い静睡眠期において、PSN緊張は増加、SN緊張は減少したが、同一静睡眠においてもパラメータ値は大きく変動した。(2)PSN緊張は哺乳後の第1静睡眠に比し、第2静睡眠が有意に大で、心拍数の低下も認めた。(3)驚愕反射前後で、自律神経機能は大きく変動し、同一睡眠段階における覚醒段階の変化と関連する変化と考えられた。在宅記録においては、携帯型記録装置(バッテリー作動)にて約12時間に及ぶRR間隔変動とアクチグラムによる体動の定量記録を行い、開始、終了時刻の設定を行うことで、検者が介在することなく安定した記録が行われ、全記録でデータグラフ表示が可能であった。タイムラプスビデオによる行動、眼球運動観察も併せて、終夜12時間の睡眠覚醒段階判定と、睡眠段階毎のHRV解析が可能であることも確認された。ただし、ポリグラフ記録と異なりデータ数が膨大であるため、RR間隔データのアーティファクト除外プログラムを利用した、HRV解析は次年度から開始する予定である。なお、乳児突然死症候群ハイリスク群である、喫煙母体児については1名の対象を行った。積極的に検査を希望する喫煙妊婦もいたが、在宅記録では自宅が当施設近郊にあることを条件とするため、対象収集は他施設産科にも協力を仰ぐ必要があると考えられた。

在宅終夜記録を行うにあたって、体動分析は従来の体動記録装置では、詳細な体動分析ができないため、専用の体動記録装置(actiwatch)を併用して記録を行うこととした。眼球運動と体動記録によって動睡眠と静睡眠は判定可能であるが、本法では脳波を記録していないため、静睡眠期の睡眠深度の判定は不可能である。本年は、新生児期ポリグラフ記録にて、RR間隔変動(HRV)の自己回帰モデル(DADiSPデータ解析ソフト)を用いたスペクトル解析法を検討して、静睡眠における自律神経機能の経時的な変化を検討した。健常正期産児35人(在胎週数40.7±1.4)のポリグラフ記録(記録日齢6.1±2.7)を対象とした。心電図をワークステーションに取り込み,区間1分のRR間隔時系列についてスペクトル解析を行い、低周波数(LF)成分(0.0200.2Hz)パワー.高周波数(HF)成分(0.2Hz)パワー(msec^2),LF/HF比を求めた。静睡眠期においては動睡眠期と比較して、副交感神経緊張は増加、交感神経緊張は減少したが、同一静睡眠においてもパラメータ値は大きく変動した。その経時的変化については、静睡眠期の中央で副交感神経緊張が最大になる場合や、動睡眠への移行直前に副交感神経緊張が最大になるパターンなどが観察された。哺乳後の第1静睡眠と第2静睡眠とを比較すると、副交感神経緊張は哺乳後の第1静睡眠に比し、第2静睡眠が有意に大で、心拍数の低下も認めた。成人の静睡眠では、徐波睡眠期に副交感神経緊張が高まることが報告されている。新生児の静睡眠期における自律神経機能の経時的変動と成人の静睡眠の睡眠段階変化を直接結びつけることのできるデータは得られなかったが、第2静睡眠における副交感神経緊張は、哺乳間での短期睡眠、先行する動睡眠など、新生児特有の睡眠リズムに対応した1事象であると考えられた。本研究の成果のまとめを行った。正期産児35人を対象としたポリグラフ記録において、第一静睡眠期と第2静睡眠期の持続時問に有意差は認めなかった。RR間隔は第2静睡眠で497.2±59.5msecで、第1静睡眠478.2±49.0secに比し有意に長かった。RR間隔時系列について自己回帰モデルを用いスペクトル解析を行い、低周波成分(LF)、高周波成分(HF),パワー,LF/HF比を求め検討した。LHパワーLH/HFは有意差を認めなかったが、HFは第1静睡眠4-1±0.8msec2,第2静睡眠4.5±1.0msec2で第2静睡眠が有意に大きく、第2静睡眠における副交感神経緊張が示された。29人の正期産児を対象として驚愕反射の出現頻度の検討を行った。静睡眠期におけるミオクローヌスの分布、啼泣の有無によって驚愕反応の強度を3区分した。驚愕反応出現前後1分のRR間隔時系列についてスペクトル解析を行い、驚愕反応出現前後の交感・副交感神経緊張の変動を検討した。平均驚樗反応出現頻度は0.18/分であった。驚愕反応出現に伴いLFパワー、HFパワー、LF/HF比はいずれも増加したが、驚愕反応強度によってパラメーター前後値はいずれも差異を認めず、個人差が大きかった。自律神経機能から乳幼児突然死症候群に関連する事象をとらえられるか検討したが、個人差が大きく、また、乳幼児突然死症候群の症例は無く、正常対象の症例数も多くないので、明らかな結論は得られなかった。今回の検討を基礎データーにして、乳幼児突然死症候群危険因子の有無による違い、体位による違いなどを検討を続ける予定である。
エストロジェン受容体陽性乳がんにおける栄養ストレス適応分子機序の解明

エストロジェン受容体(ER)陽性の乳がんはおよそ70%以上を占める乳がんである。これまでに、ER陽性乳がん細胞ではアミノ酸のロイシンが細胞の増殖等に非常に重要であり、新たな乳がん治療の標的となりうることを見出した。本研究はER陽性乳がん細胞においてロイシンを細胞内へ取り込む装置であるアミノ酸トランスポーターSLC7A5が制御される仕組みを詳細に明らかにしようとするものである。本研究によって、ER陽性乳がん細胞が特異的に必要とする栄養であるアミノ酸のロイシンを標的とした治療法の開発が飛躍的に進行する可能性が示唆される。
インプリント遺伝子に関連する親アリル判別法の信頼性の検討とその発展的応用

1.DMPA(differntially methylated parental allele)検出法が応用可能な新規インプリント遺伝子SNPの検索を、新たに8遺伝子のSNPsについて行ったが、明らかに有用なSNPは確認されなかった.一方、これまでに応用可能が判明しているH19遺伝子について、以前に対象とした3SNPs(ハプロタイプとして3アリル)の近傍には11SNPsの存在が確認され、これらを加えた14SNPsの型判定をするとハプロタイプとして8アリルが検出された.このことは単独遺伝子多型として十分な情報力があると思われる。これらのSNPsの同時検出方法については現在検討中である.2.DMPA検出法が応用可能な5遺伝子のうち4ローカス(H19,SNRPN,PEG3およびMEST)について集団調査を行った.アリル分布が偏っていたMESTを除き、代わりにHYMAIを加えた4ローカスの同時型判定をミニシーケンス法で行った.7SNPsに特異的なプライマーを用いることで型検出が可能であった.なお、4ローカスの多型の同時検出によりいずれか一つでもヘテロ型が観察される確率は93%であった.事前にDNAの酵素処理を行った後のミニシーケンス法によるDMPA判定ももちろん可能であった.3.DMPA検出法の信頼性を高めるために34人のDNAサンプルを用いたクローニングレベルのメチル化状態を解析した.その結果、個人により若干の差異はみられるが、いずれのローカスでもインプリント状態から推測される親アリルの高度あるいは疎メチル化状態が確認された.一方、少数のクローンではメチル化状態の混在も少数ながら観察されたことから、サンプルによっては判定に困難を伴う可能性があると推察された。このメチル化状態の混在が最も顕著だったのはPEG3であった。1.5つのインプリント遺伝子(H19,SNRPN, HYMAI, PEG3およびMEST)において,これまでに親判別可能と推定されたSNPs周囲のメチル化状態を知るために,バイサルファイト処理を行った複数のDNAサンプルについて,それぞれ新しく設定したプライマーを用いてTAクローニングを行った.そのシ-ケンシング結果については現在分析中である.2.上記各SNPのPCR増幅範囲内の新規SNPを検出すべくSSCP法を行ったが,この方法により検出されたものはなかった.そこで(少し離れている)周辺のSNPを検索し,H19遺伝子における新たな34SNPsを同時検出する方法を検討中である.なお,親判定可能な新規の別のインプリント遺伝子の多型は見つかっていない.また,ボランティア由来のDNA(n=156)について,これまでに頻度調査が行われていなかった上記各SNPsのうち,SNRPN(rs220028),PEG3(rs2302376)およびMEST(rs3807138)の該当SNPのアレル分布を調べた.その結果,多型としての有用性の指標となるヘテロ接合率(HE)はそれぞれ,0.49,0.43および0.17であった.これまでに調べてきたH19(HE,0.61)および報告のあるHYMAI(0.36)のデータを併せて考えると,(多型情報量のやや乏しい)MESTを除く4ローカスの同時検出が効率的であると思われた.そこで,プライマー・エクステンション法を応用したところ,SNPの同時判定が可能であり,より良い判定結果が得られるようなプライマー等の条件について現在検討中である.1.5

つのインプリント遺伝子(H19,SNRPN,HYMAI,PEG3およびMEST)の親判別(DMPA検出法)可能な領域のメチル化状態を複数サンプルについてクローニングレベルで解析したところ、いずれも各親アリルの高度メチル化あるいは疎メチル化状態が確認され、本法による親アリル判定の信頼性が確認された。一方、一部のクローンではメチル化状態の混在も少数ながら観察されたことから、本法における親判定の識別自体は問題ないと思われるが、サンプルによっては判定に困難を伴う可能性があると推察された。このメチル化状態の混在が最も顕著だったのはPEG3であった。2.プライマー伸長法による4インプリント遺伝子の親アリル同時検出を行ったが、プライマー配列を検討した範囲においてはすべてのピーク高を均一に揃えることはできなかった。一方、PEG3遺伝子SNPをヘテロでもつサンプルの親判定が不完全(シングルピークとならない)となったことは、この方法が鋭敏であり、前述したメチル化の混在を反映した結果であると推定された。3.DMPA検出法に応用可能な新規のインプリント遺伝子多型は見つからなかった。一方、H19の該当SNP領域周辺には多くのSNPが存在することから、親判別できるより長いハプロタイプの可能性を調べたところ、既報の検査では3SNPsから成る3アリルによる6ハプロタイプが観察されたが、その前後の11SNPsを加えると(計14SNPs)これまでに8アリルが観察されたことから、H19遺伝子単独での多型情報量の増大が期待される。これらの同時検出法に関しては現在検討中である。