hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス蝸牛microRNA発現解析による老人性難聴発症機構の解明

microRNA(miRNA)は約22塩基対より成る二重鎖非翻訳性RNAである。ターゲットとなるmRNAの翻訳や安定性を制御し、種々の疾患や老人性変化に関与する。本研究では、老人性難聴モデルマウスの蝸牛におけるmiRNAの経時的な発現を解析し、老人性難聴病態を明らかにすることを目的とする。C57BL/6を老人性難聴モデルマウスとして用いた。聴性脳幹反応(ABR)と歪成分耳音響放射(DPOAE)により聴覚機能を評価した。周波数8、16、32kHzの短音刺激に対するABR検出閾値は、10カ月の時点で急速に悪化し、16カ月に反応が認められなくなった。DPレベルは徐々に低下し、12カ月までにノイズレベルに達した。1カ月齢18匹36耳、10カ月齢18匹36耳、16カ月齢15匹30耳をmiRNA発現解析に用いた。RNAlater内で、迷路骨包から膜迷路を摘出した。smallRNAを含む全RNAを各月齢グループごとに抽出し、Agilent2100バイオアナライザーにて品質チェックを行った。miRNA発現解析にはmiRCURYLNAmicroRNAArrayを用いた。非階層クラスター分析により、計42の老人性難聴に関連しうる候補miRNAを同定した。microRNA(miRNA)はRISCとの複合体を形成し、複数の特異的なmRNAの翻訳抑制、分解により、発生、分化、増殖、アポトーシスなどを調節するとされている。本研究では、老人性難聴モデルマウスC57BL/6を用い、蝸牛における経時的なmiRNA発現解析を行った。miRNA発現解析に先立ち、聴性脳幹反応(ABR)と歪成分耳音響放射(DPOAE)を用いてC57BL/6の経時的な聴覚評価を行った。ABRは、8、16、32kHzの短音を音刺激とした。DPOAEは、L1=65dB、L2=55dB、f2/f1=1.2、f2=4-20kHzとし、DPグラムを作成した。ABR検出閾値は、10から12ヵ月の間に急速に上昇し、16ヵ月の時点で完全に反応が認められなくなった。DPレベルは、3ヵ月の時点で軽度の低下を示し、12ヵ月でノイズレベルとなった。これらの結果から、miRNA発現解析を1、10、16ヵ月に施行することとした。マウスを安楽死させた直後に側頭骨を摘出し、RNAlater内で解剖した。実体顕微鏡下で外側の骨迷路を丁寧に除去し、蝸牛外側壁とコルチ器を含む膜迷路のみとした。左右の蝸牛膜迷路をRNAlaterで満たされたマイクロチューブ内に収集し、-20°Cで冷凍保存した。1ヵ月齢18匹36耳、10ヵ月齢18匹36耳、16ヵ月齢15匹30耳から、miRNAを含む全RNAを抽出し、Agikent2100バイオアナライザーにて品質チェックを行った。発現解析にはmiRCURY LNA microRNA Arrayを用い、各月齢におけるmiRNAの発現を比較した。各月齢間で、数種類のmiRNAにおいて発現変化が認められた。今後、C57BL/6の加齢に伴う聴覚変化に特異的なmiRNAとターゲットとなるmRNAの同定を検討することで、老人性難聴の発症機構を明らかにする予定である。ターゲットとなるmRNAの翻訳抑制、分解を担う重要な遺伝子調節因子であり、種々の疾患や加齢性変化に関与する。本研究では、老人性難聴モデルマウスC57BL/6を用い、老人性難聴に関連する特異的なmiRNAを同定し、今日の高齢化社会における重要な課題である老人性難聴の予防と治療を目的とする。1カ月齢18匹36耳、10カ月齢18匹36耳、16カ月齢15匹30耳からmiRNAを含む全RNAを抽出し、Agilent2100バイオアナライザーにて品質チェックを行った。発現解析にはmiRCURY LNA microRNA Arrayを用い、各月齢3つのmiRNAプロファイルを作成した。

これらのmiRNAプロファイルに対する非階層クラスター分析(どれか1つの比較でRatio≧1.5あるいは≦0.66)により6つのクラスターに分類され、12遺伝子(クラスター1)、3遺伝子(クラスター2)、15遺伝子(クラスター3)、5遺伝子(クラスター4)、2遺伝子(クラスター5)、5遺伝子(クラスター6)、計42の候補となる加齢性難聴関連miRNAを同定した。同定されたmiRNAには常染色体優性遺伝性難聴DFNA5と難聴マウスdiminuendoの原因遺伝子miR-96、内耳有毛細胞やラセン神経節に発現し有毛細胞の分化、成熟に関連すると考えられるmiR-183およびmiR-182、アポトーシスに関連するmiR-29が含まれていた。1、10、16カ月齢の全RNAに対するmRNA発現プロファイルの作成も終了しており、現在解析が進められている。今後は、miRNAとmRNAデータの統合解析を行うことで、ターゲットとなる遺伝子群の同定が可能になると考えられる。microRNA(miRNA)は約22塩基対より成る二重鎖非翻訳性RNAである。ターゲットとなるmRNAの翻訳抑制、分解を担う重要な遺伝子調節因子であり、種々の疾患や加齢性変化に関与する。本研究では、老人性難聴モデルマウスC57BL/6を用い、老人性難聴に関連する特異的なmiRNAを同定し、今日の高齢化社会における重要な課題である老人性難聴の予防と治療を目的としている。1カ月齢18匹36耳、10カ月齢18匹36耳、16カ月齢15匹30耳からmiRNAを含む全RNAを抽出し、Agilent2100バイオアナライザーにて品質チェックを行った。発現解析にはmiRCURY LNA microRNA Arrayを用い、各月齢3つのmiRNAプロファイルを作成した。同定されたmiRNAには常染色体優性遺伝性難聴DFNA5と難聴マウスdiminuendoの原因遺伝子miR-96、内耳有毛細胞やラセン神経節に発現し有毛細胞の分化、成熟に関連すると考えられるmiR-183およびmiR182、アポトーシスに関連するmiR-29が含まれていた。1、10、16カ月齢の全RNAに対するmRNA発現プロファイルとの統合解析にて、候補となる老人性難聴関連タンパクを同定した。3つの月齢に対する非階層クラスター分析が終了し、加齢性難聴に関連するmiRNAを同定することができた。また、mRNAにおいても発現プロファイルの作成が今年度に終了し、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。非階層クラスター分析により得られた42の加齢性難聴関連miRNAの中でEMBL-EBIからターゲット遺伝子を検索できるmiRNAに対して、mRNA発現プロファイルとの間で統合解析を行い、加齢性難聴に関連する遺伝子群を同定する。
Smad2の歯肉上皮ダウングロース抑制による歯周組織再生療法の改善に関する研究

歯肉上皮のダウングロース抑制を実現するために,機械的な方法でマウスの歯槽骨に欠損を行った。当初より臨床に近い状況を考え,最終的には歯周病原細菌の感染による骨欠損を作製するように変更して,明らかな骨欠損をCT画像で確認できた。また,TGでは,WTと比較して結合組織の治癒を促進することを示唆した。歯周治療後の歯肉上皮ダウングロースのメカニズム解明には,歯周炎による骨欠損を有するマウスの歯周外科治療後の創傷治癒モデルを確立することが必須である。本年度申請者は,当初の機械的削合によるマウス骨欠損モデルから,歯周病原細菌Porphyromonus gingivalisを用いたマウス歯周炎モデルを作製する計画に変更し,より歯周病態を反映した実験系の確立に成功した。(2)CTでは,大臼歯の歯根の2分の1以上に及ぶ根分岐部病変を伴う歯槽骨吸収が存在した。また,HE染色では,歯槽骨欠損部に炎症性の細胞浸潤を確認した。(3)現時点でのマウス歯周炎モデルの作製には,煩雑な操作が必要であり,その作製期間も長期に渡るため,より簡便に短期間で作製する方法を検討中である。今後は,マウス歯周炎モデルにおける歯周外科治療後の歯槽骨欠損部への上皮のダウングロースをWTとTGとで組織学的に経時的に比較をする。さらに,ダウングロースが開始してから終了するまでの上皮組織を採取して.研究実施計画に従い,遺伝子マイクロアレイ解析およびリアルタイムPCR解析を行うことによって,創傷治癒において変化する増殖,遊走,および接着に関与する遺伝子を同定する。歯周組織再生療法おいて,歯根膜,歯槽骨,セメント質といった間葉系組織の再生を促進することは重要である。さらに,これらの組織再生の場を確保するために,歯肉上皮の歯根面に沿ったダウングロースを抑制することは,治療を成功させるうえで大変重要である。しかし,近年の歯周組織再生療法の研究は,間葉系細胞の増殖を目的としたサイトカイン療法が主であり,歯肉上皮の増殖制御を目的とした研究報告は殆ど無い。我々の研究ではSmad2遺伝子を上皮細胞特異的に強制発現する遺伝子改変マウス(K14-Smad2 transgenic mice:TG)の口蓋歯肉から分離・培養した上皮細胞において,増殖能および遊走能を調べ,TGの上皮細胞の増殖能および遊走能は,野生型マウス(WT)の上皮細胞と比較して,有意に低下していることを報告した。今回,WTおよびTGの歯槽骨に骨欠損を作製し,HE染色を行った組織切片を用いて経時的な歯槽骨内への歯肉上皮のダウングロースを比較することが第一の目的であった。そこで,交付申請書には歯の周囲の歯槽骨をラウンドバーを使用して切削して,機械的に骨欠損を作製する方法を記載した。しかし,その方法は感染による歯周組織への影響が無いために,今後の実験結果に大きく影響を与えると考え,Porphyromonus gingivalis(Pg)を感染させた歯周炎マウスモデルを作成することに変更をした。その結果,Pgを感染させたマウスとコントロール用のマウスの歯槽骨をCTで確認をしたところ,Pgを感染させたマウスにおいて著明な歯槽骨吸収があった。また,WTとTGともに歯周炎マウスモデルの作成に成功した。しかし,歯周炎マウスモデルの作成に多くの時間を費やしたたこと,またTGの出産数が激減したことで期間内に予定していた実験ができず,現在進行中である。マウスの歯周炎モデルを作製することに研究計画を変更したため,研究の進行はやや遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究の進行状況はやや遅れているが,約1ヵ月後にはマウスの歯周炎モデルのプロトコルが確立する。その後の実験手法は,申請者の所属する研究室において数多く行っているため,滞りなく進行すると考える。また,平成24年度は,平成23年度の研究計画が予定通りに進まない可能性を考慮して計画を立案したため,若干の余裕はある。
ExosomesとマイクロRNAを用いた、安全性の高いオーダーメイド治療の開発

我々は、以前よりmicroRNA (miRNA)についての研究を進めてきた。miRNAは20塩基程度のsmall RNAに分類されるが、エピジェネティクスの代表であり、遺伝子発現のファインチューナーとして、mRNAの発現を調整している。過去に乳がん細胞由来のExosomesは、Exosomes内にmiRNAの成熟に必要なDicer, TRBPといった機構を内包しており、細胞なしでもmiRNAを生成できる事を報告した。これはmiRNAが細胞非依存的にExosomes内で生成される事を意味し、ExosomesがmiRNAの運び手としてさらに注目されるに至った。miRNA研究は病態解明、バイオマーカー、治療と、大きく3つの分野に別れるが、バイオマーカーとしても大きな注目を集めている。腎メサンギウム細胞由来のExosomesは、細胞表面上にメサンギウム細胞のマーカータンパクを保持しており、そのマーカーを利用して、腎臓由来Exosomesを選択的に回収し、RNAを抽出。そこに含まれるmiRNAを測定することで、腎疾患診断の精度を高める技術に関して、特許を取得し、現在解析を進めている。(P2017-67706A)また治療物質としてのmiRNAは、siRNAといった人工的な核酸と異なり、本来生体内にそなわったRNA干渉機構として、安全性などを含め、次世代の核酸医薬として、期待されている。今回我々は、極めて致死率の高い敗血症に対して、TLRを負に抑制すると言われるmiR-Xに注目をし、従来治療法が確立していない敗血症性AKIに対し、核酸医薬を用いた全く新しいアプローチで、新規治療法の開拓に取り組んでいる。敗血症による死亡率は極めて高く、世界中で2ー3秒に1人が亡くなっていると言われている。敗血症は、関連する臓器障害によって予後が規定されると言われており、我々は敗血症性の急性腎障害(AKI)に着目した。現在に至るまで、敗血症性AKIに対しての治療としては補液や血液透析など、支持的治療法しか選択の余地がなく、著しい生存率の改善は見られていない。今回我々は、敗血症性AKIに対し、Toll like receptor(TLR)シグナルの制御を中心に添えた、全く新しいアプローチで治療する試みに取り組んでいる。実施計画として、まずはin vitroの系において、TLRの下流シグナルを抑制するmicroRNA (miRNA)を選定することからはじめる。単核球系の細胞株を用い、LPS刺激を行い、候補となるmiRNAを投与した際の上清へのIL-6, TNF-αなどNFkBの下流蛋白分泌量を測定し、最も分泌を抑制し得たmiRNAを選び出す。その後有効なプロモータを用いた、miRNA発現ベクターを作成する。次に適切なドラッグデリバリーシステムを用いて、そのmiRNA発現ベクターをマウスに投与し、実験的敗血症を盲腸結紮穿孔モデル(CLPモデル)にて作成する。動物実験の評価として、死亡率とともに、各種臓器障害を病理組織学的な解析、生化学的マーカー、炎症性サイトカイン血中濃度を測定し、治療効果を検討する。最後に、miRNAがどこで、どんな細胞に対して効果を及ぼし、結果に寄与したかを検討する。TLRシグナル下流のエフェクター分子に対して抑制効果を持つとされるmiRNA候補を、in silicoにて選定。リポフェクション法にてそのmature miRNAを、予めLPS刺激したRAW cellへ投与。上清へのIL-6, TNF-αの発現量をELISA法にて測定した。その結果、miR-Xが最も効果的であると判断。以降EF-1プロモータを利用したmiR-X発現ベクターを、in vitroにてRAW cellに遺伝子導入し、miR-Xの過剰発現を確認した。次に動物実験として、PEIをドラッグデリバリーシステムとして、マウスへmiR-X発現ベクターを投与。1週間後に確認した所、脾臓、肺、肝臓に多く発現ベクターが取り込まれていることがわかった。その後CLPモデルを作成し、敗血症を惹起した。miR-X発現ベクターを投与した群は、Emptyベクターを投与した群と比較し、有意差を持って生存率が改善していた。また、臓器障害の指標として、AST, ALT, BUN, Crが低値であり、腎臓への単核球浸潤、接着分子E-selectinの発現、及び腎障害のマーカーとして知られるKIM1の局所発現が抑制されていた。通常敗血症においては、脾臓においてアポトーシスが誘導されることが知られているが、miR-Xベクター治療群は、そのアポトーシスが抑制されていた。またさらに血中の炎症性サイトカインも抑制されていることがわかった。

(P2017-67706A)また治療物質としてのmiRNAは、siRNAといった人工的な核酸と異なり、本来生体内にそなわったRNA干渉機構として、安全性などを含め、次世代の核酸医薬として、期待されている。今回我々は、極めて致死率の高い敗血症に対して、TLRを負に抑制すると言われるmiR-Xに注目をし、従来治療法が確立していない敗血症性AKIに対し、核酸医薬を用いた全く新しいアプローチで、新規治療法の開拓に取り組んでいる。TLRシグナル下流のエフェクター分子に対して抑制効果を持つとされるmiRNA候補を、in silicoにて選定。リポフェクション法にてそのmiRNAを、予めLPS刺激したRAW cellへ投与。上清へのIL-6, TNF-αの発現量をELISA法にて測定した。その結果、miR-Xが最も効果的であると判断。以降EF-1プロモータを利用したmiR-X発現ベクターを、in vitroにてRAW cellに遺伝子導入し、miR-Xの過剰発現を確認した。次に動物実験として、PEIをドラッグデリバリーシステムとして、マウスへmiR-X発現ベクターを投与。1週間後に、in vivo imaging,ベクターに組み込まれたGFPの発現の評価から、脾臓に多く発現ベクターが取り込まれていることがわかった。免疫染色、及び表面マーカーによるソーティングにより、取り込まれた細胞は脾臓マクロファージであることが示唆された。その後CLPモデルを作成し、敗血症を惹起した。miR-X発現ベクターを投与した群は、Emptyベクターを投与した群と比較し、生存率が改善していた。また、臓器障害の指標として、AST, ALT, BUN, Crが低値であり、血中のIL-6, TNF-α, MCP-1といったサイトカインも抑制されていた。腎臓への単核球浸潤、接着分子E-selectinの発現が抑制されていた。更に検討を重ね、PEIによるベクターのデリバリーサイトである脾臓を予め摘出したマウスに、PEI/ベクターを投与、その後CLPモデルを作成した所、ベクターによる生存率の改善効果、臓器障害のマーカー、血中サイトカイン血症に有意差が消失し、コントロール群と同等な障害となった。よって、脾臓こそが本治療法のターゲットとなる臓器であり、脾臓における過剰な免疫応答をコントロールすることで、生存率が改善したと考えている。我々は、以前よりmicroRNA (miRNA)についての研究を進めてきた。miRNAは20塩基程度のsmall RNAに分類されるが、エピジェネティクスの代表であり、遺伝子発現のファインチューナーとして、mRNAの発現を調整している。過去に乳がん細胞由来のExosomesは、Exosomes内にmiRNAの成熟に必要なDicer, TRBPといった機構を内包しており、細胞なしでもmiRNAを生成できる事を報告した。
自己決定権の法構造――保護法益としての自己決定権と古典的権利論のパラダイム転換

最終年度であり、これまでの研究活動を踏まえつつ、理論のまとめの作業に力を注いだ。そのための結節点として、民科民事法分科会夏合宿において、「自己決定権の法構造」と題する報告を行った(2009年8月)。自己決定権には、a公序の相対化原理としての自己決定権、b自由権としての自己決定権、c支援措置としての自己決定権という3種類があることは、以前から認識していた。この報告は、これらのうち、bおよびcに焦点を当て、具体的には医療過誤および取引的不法行為に関する裁判例を素材として、自己決定権の法構造を解明しようとしたものである。さらに、実務家との交流も持ちたいと思い、セクシュアル・ハラスメント等の第一人者である水谷英夫、小島妙子両弁護士に札幌まで来ていただいて、同タイトルでの報告を行い、実務的観点からのアドバイスを頂戴した(2010年1月)。これらを通じて、次のような点が明らかになった。(1)支援措置としての自己決定権は、医療過誤と取引的不法行為た両領域で問題となる。具体的には、説明義務違反を正当化する原理として自己決定権が援用される。ここでは、自己決定権には権利としての性格が稀薄であり、加害者の行為義務(説明義務)違反を重視する違法性論と同一の方向を向いている。そのような事態を反映して、この問題領域では、自己決定権ではなく、機会の喪失などが援用されることもある。(2)これに対して、自由権としての自己決定権が問題になる領域もある。典型的には、エホバの証人の輸血拒否事件であり、ここでの自己決定権は、基本的には権利構成に親しみ、絶対権的性格を有する。マインド・コントロールによる宗教への勧誘についても、同様の性格を有する自己決定権が援用される。このように、この間の研究活動を通して、法構造の異なる自己決定権を析出することができた。今後、これを論文の形で公表するとともに、さらに分析を深化させたい。本年度は最初の年度であり、予定通り基礎的資料の収集と端緒的理論活動に重点を置いた。1)基本的研究課題である「仮託的保護法益としての自己決定権」の研究素材として、医療訴訟と取引的不法行為の領域における文献と関連裁判例を網羅的に収集する作業を開始した。とりわけ、医療訴訟の領域での「期待権侵害論」、「延命利益論」、「治療機会喪失論」などの新しい判例の動向の理論的意義について考えた。2)副次的研究課題については、セクシュアル・ハラスメントやいじめ、パワー・ハラスメント関係の文献と裁判例の収集に力を注いだ。関係して、水谷英夫(セクハラ、パラハラを素材とした「関係性としての権利」の考察)、小島妙子(親密圏における暴力・虐待と法)の両弁護士を招聘して、研究会を開催した。小島弁護士とは、これを契機として、ジェンダー法学会内の「ジェンダー概念」研究WGで研究活動を協力して実施することになった。また、人工生殖と自己決定権について、代理出産等に関する近時の判例の理論的意義について検討し、最初のまとめを北大民事法研究会で報告した(2007年12月)。また、近時の家族法改正動向を、自己決定権の視角からまとめる作業も行い、札幌司法書士会主催の講演の形でその中間報告を行った(2008年3月)。3)比較法的検討としては、フランスにおけるセクシュアル・ハラスメント関係の文献の収集と整理、PACS関係立法資料の収集と整理を開始した。他方、自己決定権自体を対象とした文献、あるいは現代の権利論自体を対象とした文献の収集については、作業は難航している。中間年度である来年度は、引き続いて基礎的資料の収集・整理を行うとともに、理論化の活動にも力を注ぎ始める。また、基本的研究課題である「仮託的保護法益としての自己決定権」の検討を重視するつもりである。本年度は2年目の中間年度であり、予定通り、基礎的資料の収集と端緒的理論活動という前年度の作業を継続するとともに、年度後半にはその理論的整理活動にも取り組むようにした。1)基本的研究課題である「仮託的保護法益としての自己決定権」の理論化作業のために、山田八千子、浅野有紀両教授を招いた研究会を開催した(2008年11月)。浅野報告においては、取引的不法行為を素材としつつ、自己決定権論が検討された。そこで提示された《自己決定権論には権利論と秩序論が混在している》という視角は、本研究を深める上で貴重なものであった。2)副次的研究課題については、(1)前年度に続いてセクシュアル・ハラスメントやいじめ、パワー・ハラスメント関係の文献と裁判例の収集作業を行ったほか、自己決定権論の基盤となる《人格》観念の法的な位置づけについての検討を深めた。市場との関連がそこでの中心的問題意識であり、人格概念によって市場の論理を制約するという方向と、市場のもつ人格上の差異の抽象作用が人格的価値実現に寄与する方向という2つのアンビヴァレントな方向を析出した(前者について吉田克己「労働契約と人格的価値」法時80巻12号、後者について吉田克己「私人による差別の撤廃と民法学」国際人権20号掲載予定参照)。(2)また、比較法については、2009年3月にパリでベルサイユ大学ミュリエル・シャニイ教授およびパリ第13大学ムスタファ・メキ教授と面談し、競争法と取引的不法行為および人間の尊厳観念についての情報を得るとともに、意見交換を行った。

最終年度である来年度は、引き続いて基礎的資料の収集・整理を行うとともに、理論化の作業を本格的に行う予定である。その際には、自己決定権をめぐる権利論と秩序論の交錯が基本的問題意識となるであろう。最終年度であり、これまでの研究活動を踏まえつつ、理論のまとめの作業に力を注いだ。そのための結節点として、民科民事法分科会夏合宿において、「自己決定権の法構造」と題する報告を行った(2009年8月)。自己決定権には、a公序の相対化原理としての自己決定権、b自由権としての自己決定権、c支援措置としての自己決定権という3種類があることは、以前から認識していた。この報告は、これらのうち、bおよびcに焦点を当て、具体的には医療過誤および取引的不法行為に関する裁判例を素材として、自己決定権の法構造を解明しようとしたものである。さらに、実務家との交流も持ちたいと思い、セクシュアル・ハラスメント等の第一人者である水谷英夫、小島妙子両弁護士に札幌まで来ていただいて、同タイトルでの報告を行い、実務的観点からのアドバイスを頂戴した(2010年1月)。これらを通じて、次のような点が明らかになった。(1)支援措置としての自己決定権は、医療過誤と取引的不法行為た両領域で問題となる。具体的には、説明義務違反を正当化する原理として自己決定権が援用される。ここでは、自己決定権には権利としての性格が稀薄であり、加害者の行為義務(説明義務)違反を重視する違法性論と同一の方向を向いている。そのような事態を反映して、この問題領域では、自己決定権ではなく、機会の喪失などが援用されることもある。(2)これに対して、自由権としての自己決定権が問題になる領域もある。典型的には、エホバの証人の輸血拒否事件であり、ここでの自己決定権は、基本的には権利構成に親しみ、絶対権的性格を有する。マインド・コントロールによる宗教への勧誘についても、同様の性格を有する自己決定権が援用される。このように、この間の研究活動を通して、法構造の異なる自己決定権を析出することができた。今後、これを論文の形で公表するとともに、さらに分析を深化させたい。
異種移植におけるNK細胞の制御

まず各ドメインの置換体を作製したところα2ドメインが重要であることが判明。一方、α3ドメインや膜貫通領域の置換体はほとんど発現に影響しなかった。次にHLA-Eのα2ドメイン内に点変異を導入した。HLA-E分子の147番目のアミノ酸をセリンからシステインに変換すると発現が大きく増加し、NK細胞依存性細胞傷害を効果的に抑制した。さらに、147番目以外に11、66番目の置換体でもHLA-E分子の高発現を得た。しかし、147にこれらを加えた(11,147),(66,147),(11,66,147)遺伝子を合成し、CHO細胞やブタ血管内皮細胞株を作成し、NK細胞制御効果を検討したが、これらの置換体では147の単独置換体に劣っていた。<FasL>I型でかつ、血清中の酵素切断部位より上方のFasLとHLA-G1のTM部分をつなぐcDNAを合成し、pCXに構築した(PCX-FasL-TM)。CHO細胞およびブタの血管内皮(PEC)に遺伝子導入し発現させたところ、NK細胞にapoptosisを誘導し、NK細胞依存性細胞傷害に対し抑制効果を示した。<糖鎖変換>NK細胞がα-Gaを認識しないとの報告が出たので、これを検証した。ブタの血管内皮より、pig-α1,3GT遺伝子をcloningした。K562細胞にHLA-G1を遺伝子導入し、NK細胞の反応性を落としたK562を作製した。次にこれに、pig-α1,3GT遺伝子を導入した。このK562細胞は、αGalの発現量が高くなるに連れ、NK依存性細胞傷害性も対照群より有意に上昇した。上昇した傷害性はGSIB4や関連糖鎖によって有意に抑制された。これにより、NK細胞上にαGalエピトープを認識するレセプターの存在が示唆された。結果は、HLA-Eのα2ドメインをHLA-G1の相同部位と置換するとHLA-Eの発現がshift値36から733まで増加し、逆にα1ドメインの交換体は発現量をback groundレベルまで低下させた。またα3ドメインや膜貫通領域はほとんど影響しなかった。現在NK細胞に対する細胞傷害抑制効果を検討している。<FasL> FasLをcDNA libraryからPCR法でつりあげ、pCXに入れ、ブタの血管内皮に遺伝子導入し発現させたところ、NK細胞依存性細胞傷害に対し抑制効果を示した。各ハイブリッド分子はSOE(splice over extension method)により作製し、pCAGGSに構築した。その構築遺伝子をCHO-βあるいはPEC-β(それぞれCHO cellあるいはPECのヒトβ2m遺伝子導入株)に導入した。G418選択培地にて培養後、細胞表面の発現をFACSで解析した。さらに、ヒトNK細胞は末梢血から磁気ビーズ法で精製し、NK細胞傷害抑制性を51Crにより検討した。まず各ドメインの置換体を作製したところα2ドメインが重要であることが判明した。さらにHLA-Eのα2ドメイン内に点変異を導入した。HLA-E分子の147番目のアミノ酸をセリンからシステインに変換すると発現が大きく増加し、遺伝子導入株はヒトNK細胞依存性細胞傷害を効果的に抑制することが判明した。その他、11、66番目のアミノ酸変換でも効果を認めた。さらに、この改良遺伝子HLA-Ev(147)は異種移植に有効な遺伝子であることを細胞傷害試験で証明した。2、<FasL>

I型でかつ、血清中の酵素切断部位より上方のFasLとHLA-G1のTM部分をつなぐcDNAを合成し、pCXに構築した(pCX-FasL-TM)。CHO細胞およびブタの血管内皮(PEC)に遺伝子導入し発現させたところ、NK細胞にapoptosisを誘導し、NK細胞依存性細胞傷害に対し抑制効果を示した。さらに、機能ドメインを検索するために、FasL-TMのdelation mutantを6種類用意し、検索中である。3.DAFおよび糖鎖に対するNK細胞レセプターは現在検索中である。HLA-E分子の膜上のHLA-Gとの相違アミノ酸のすべてに、点変異を導入し、147番目以外に11、66番目の置換体でもHLA-E分子の高発現を得たが、147にこれらを加えた(11,147),(66,147),(11,66,147)遺伝子を合成し、安定発現株(CHO細胞、およびブタ血管内皮細胞)を作成し、NK細胞制御効果を検討した。これら3種類の置換体では返って147の単独置換体に劣っていた。また、反対に、HLA-E分子の膜上のHLA-Gとのアミノ置換体で、発現量をさげる部位を検討した。2.<糖鎖変換>NK細胞がα-Gal(Galα1,3Galβ1,4GlcNAc)を認識しないとの報告が出たので、これを検証した。ブタの血管内皮より、pig-α1,3galactosyltransferase(α1,3GT)遺伝子をRT-PCR法にてcloningした。次にClass I欠損によりNK細胞の標的となるK562細胞を用意し、これにclasslbであるHLA-G1を遺伝子導入し、NK細胞の反応性を落としたK562を作製した。次にこれに、pig-α1,3GT遺伝子を導入した。このK562細胞は、αGalエピトープの発現量が高くなるに連れ、NK依存性細胞傷害性も対照群より有意に上昇した。上昇した傷害性はGSIB4レクチンや関連糖鎖によって有意に抑制された。これにより、αGalエピトープとNK細胞依存性細胞傷害との直接関連性が明らかになり、NK細胞上にαGalエピトープを認識するレセプターの存在が示唆された。
集光レーザー摂動による神経細胞ネットワークダイナミクスの解明

本研究では、集光レーザービームの光摂動技術を神経細胞内分子動態の能動操作に応用し、光摂動に伴い変化する神経細胞ネットワークの時空間ダイナミクスについて検証した。蛍光相関分光解析、および一粒子トラッキング解析した結果、レーザー光強度が高く、培養日数の経過とともに量子ドット標識AMPA型グルタミン酸受容体の分子運動が遅くなる傾向を見出し、受容体分子が光捕捉され、集合することを明らかにした。さらに、蛍光カルシウム指示薬を負荷した神経細胞にフェムト秒レーザーを集光すると、細胞内Ca2+濃度が上昇し、近接する細胞へ神経活動の伝搬が誘発されることを明らかにした。本研究では、集光レーザービームの光摂動技術を神経細胞内分子動態の能動操作に応用し、摂動に伴い変化する神経細胞ネットワークの時空間ダイナミクスを明らかにする。レーザー光摂動を用いて神経細胞のシナプス結合部位に局在する機能分子集合体を操作し、神経細胞の脱分極過程を操作する技術を開発することにより、レーザー摂動による神経細胞ネットワークの時空間制御を実証する。本年度は、現有装置に蛍光イメージング用CMOSカメラ、および顕微鏡用XY軸自動ステージを導入し、レーザー光源を組み込んだ顕微蛍光解析システムを構築した。開発したシステムを用いて、光ピンセットによる細胞内分子集合操作、および集光フェムト秒レーザーを用いた単一神経細胞の光刺激手法の評価を進めた。ラット海馬培養神経細胞表面に局在する神経細胞接着分子NCAMを量子ドットにより可視化し、細胞表面に光ピンセット用近赤外レーザーを集光したところ、レーザー集光領域において量子ドット標識NCAMが光捕捉され、集合する過程を蛍光解析により明らかにした。さらに、フェムト秒レーザー光刺激に伴い変化する、神経細胞ネットワークの蛍光カルシウムイメージング測定手法を改良し、240μm×240μm領域の蛍光像を10 ms毎に取得し、広範囲、高時間分解計測を可能とした。単一神経細胞にフェムト秒レーザーを集光すると、レーザーを照射した細胞体において細胞内カルシウムイオン濃度の一過的な上昇が確認されたのに引き続き、近接する細胞においても蛍光強度の増加が確認され、神経活動の伝搬がレーザー照射に伴い誘発されることを見出した。本年度は、神経細胞シナプス領域に局在する情報伝達分子を対象として、蛍光抗体法により蛍光色素や量子ドットを用いて細胞表面分子を可視化する手法について検討した。神経細胞のポストシナプス領域に局在し、神経伝達物質受容体のひとつであるAMPA型グルタミン酸受容体分子に着目した。ラット海馬神経細胞のシナプス領域に局在するAMPA型受容体の量子ドットを用いた免疫蛍光染色を行い、ライブセル蛍光イメージングに成功し、細胞表面に於いて受容体分子の側方拡散運動を確認した。光ピンセット用近赤外レーザーを細胞表面に集光すると、レーザー光強度に依存して集光領域近傍の量子ドット標識AMPA受容体が光捕捉され、集合することを蛍光相関分光解析により明らかにした。さらに、フェムト秒レーザーを用いた単一神経細胞の光刺激システムを改良し、レーザー光源の安定性を向上した結果、神経細胞のフェムト秒レーザー光刺激が効率良く起こる条件を見出した。本年度の研究実施計画に基づいて研究が遂行され、神経細胞シナプス領域に局在する神経伝達物質受容体のライブセル蛍光イメージング実験系を構築し、細胞表面の量子ドット標識AMPA受容体分子の光捕捉過程を捉えることに成功した。また、フェムト秒レーザー光源の安定性が向上し、神経細胞のフェムト秒レーザー光刺激が効率良く起こることを見出した。以上の成果から、本年度は研究計画に沿って順調に研究が進展したと判断した。本年度は昨年度に引き続き、ラット海馬由来培養神経細胞のシナプス領域に局在するAMPA型グルタミン酸受容体分子を対象として、培養日数に依存して初期集合状態が変化するAMPA受容体分子の分子動態と光捕捉との関係について検証した。神経細胞表面に局在する量子ドット標識AMPA受容体分子に光ピンセット用近赤外レーザーを照射すると、レーザー光強度が高くなるにつれて、また培養日数の経過とともに、AMPA受容体の分子数が増加し、分子運動が遅くなることを見出した。この結果は、AMPA受容体分子が光捕捉され、集合することを明示しており、光捕捉過程はAMPA受容体分子の初期状態に依存することを示した。さらに、フェムト秒レーザー照射に伴う細胞内カルシウムイオン濃度のスパイク変動について詳細に解析するため、蛍光カルシウム指示薬をこれまでのfluo-4からOregon Greenへ代え、神経細胞の自発活動に基づいた細胞内Ca2+濃度のスパイク状の変動を確認した。

この条件で集光フェムト秒レーザーを用いた神経細胞の光刺激を行った結果、近接する細胞において細胞内Ca2+スパイクが同期して複数回観測され、フェムト秒レーザー刺激に伴い、近接する細胞へ神経活動の伝搬が誘発されることを実証した。本年度の研究実施計画に基づいて研究が遂行され、神経細胞表面に局在するAMPA型受容体の光捕捉、集合過程を明らかにした。また、集光フェムト秒レーザーを用いた神経細胞の光刺激に伴い、近接する細胞において細胞内Ca2+スパイクが同期して複数回観測され、神経活動の伝搬が誘発されることを実証しており、研究計画に沿って順調に研究が進展していると判断した。本研究では、集光レーザービームの光摂動技術を神経細胞内分子動態の能動操作に応用し、光摂動に伴い変化する神経細胞ネットワークの時空間ダイナミクスを明らかにする。レーザー光摂動を用いて神経細胞のシナプス結合部位に局在する機能分子集合体を操作し、神経細胞の脱分極過程を操作する技術を開発することにより、レーザー摂動による神経細胞ネットワークの時空間制御の実証を目指す。本年度は、昨年度に引き続いて、興奮性神経伝達において主要な受容体であるAMPA型グルタミン酸受容体(AMPA-R)分子を対象とし、蛍光イメージング解析によりレーザー照射前後における分子動態変化について検証した。培養神経細胞のシナプス部位に局在するAMPA-Rに対して、免疫蛍光染色により蛍光性量子ドットを標識し、波長1064 nmの光ピンセット用レーザーを照射した。単一粒子追跡法により細胞膜表面におけるAMPA-R分子の拡散係数を求めた結果、レーザー光強度が高く、培養日数の経過とともに集光領域での分子運動が遅くなる傾向を見出し、AMPA-R分子の光捕捉を確認した。さらに、集光フェムト秒レーザー照射に伴う神経細胞の光刺激手法の開発のため、神経回路網の細胞外電位計測と蛍光Ca2+イメージングとの同時計測により、レーザー照射に伴う神経回路網の誘発応答について検証した。レーザー照射直後において一過性の細胞内Ca2+濃度上昇が見られ、近接する電極上の細胞から高頻度の電位変化が観測され、フェムト秒レーザー光刺激により神経活動の伝搬が誘発されたことを示した。本年度の研究実施計画に基づいて研究が遂行され、神経細胞表面のAMPA受容体分子の光捕捉過程を蛍光イメージング解析により明らかにした。また、神経回路網の細胞外電位計測と蛍光Ca2+イメージングとの同時計測を行い、集光フェムト秒レーザー照射に伴う神経活動の誘発応答を確認しており、研究計画に沿って順調に研究が進展していると判断した。本年度は、昨年度に引き続き興奮性神経伝達において主要な受容体であるAMPA型グルタミン酸受容体分子を対象として、神経細胞シナプス部位に局在する量子ドット標識AMPA
β-D-グルカンを用いた新規誤嚥評価法の開発

高齢者の誤嚥は極めて重要な問題であり、市中および院内肺炎の原因の相当数を占めていると考えられる(日本呼吸器学会:市中肺炎ガイドライン2007年、院内肺炎ガイドライン2002年)。誤嚥の存在に対する診断法には、飲水試験、嚥下誘発試験、ビデオフルオログラフィー、Radioisotope (RI)を用いた睡眠中の誤嚥検査があるが、今回我々は、経口(経食道)的に摂取された1,3-β-D-グルカンは血中にはほとんど移行しないが、経気道的に摂取された場合には移行する可能性をある症例から予測し、この現象を応用した誤嚥評価法の開発を試みた。すなわち、誤嚥後に1,3-β-D-グルカンの血中濃度が正常値(20pg/ml以下)を大きく超えて高値を示した症例を経験したため、その原因の検索のため誤嚥した経口栄養剤そのものの1,3-β-D-グルカンを計測したところ、28,600pb/mLと極めて高い値を示し、大豆が主成分である経口栄養剤の誤嚥がその原因と考えられた。一方、経胃的に経口栄養剤を投与している患者5名の血中の1,3-β-D-グルカンを測定しても12.3pg/ml、18.1pg/ml、6.7pg/ml、21.2pg/ml、18.4pg/mlとほぼ正常範囲であった。これらのデータを受け、昨年度はマウスを用いた実験において、やはりβ-D-グルカンが経口的には吸収されず、経気道的にのみ吸収されることを確認した。この実験では、6週齢雄のddyマウスに1,3-β-D-グルカンであるCM-Curdlanを経口投与および経気道投与を行い翌日血中のβ-D-グルカン濃度を測定したところ、経口投与した群では、21.1±28.9pg/mlを示したが、経気道投与を行った群では13,200±15,300pg/mlと極めて高い値を示したのである。よって、今年度は何人かの被検者に試み、臨床応用することを目標とした。まず、β-D-グルカンを多量に含むシゾフィラム(スエヒロダケより抽出)を、誤嚥が予想される高齢者に投与するプロコールを作成し、本学倫理委員会に提出した。シゾフィラムは既に別の薬理作用を目的として、患者に投与されており、経口投与の安全性が証明されているとして、倫理委員会にてこのプロトコールが承認された。その後、数人の誤嚥性肺炎が疑われる患者に投与し、血中β-D-グルカンの値を測定した。現在それらのデータを解析中である。また、上記は画期的方法と考えられ、「多糖を用いた誤嚥検査」として特許出願中である。高齢者は誤嚥を契機にした肺炎を引き起こしやすい。誤嚥性肺炎のわが国での疫学的調査は明らかでないが、米国における調査では、市中肺炎の515%は誤嚥が原因の肺炎であり、高齢者における肺炎の予防、治療の戦略的介入に対して誤嚥の評価法が不可欠と考えられる。誤嚥の存在に対する診断法には、飲水試験、嚥下誘発試験、ビデオフルオログラフィー、Radioisotope(RI)を用いた睡眠中の誤嚥検査があるが、専門の施設に限られ、一般には普及していない。そのような状況のなかで、我々は、誤嚥後に1,3-β-D-グルカンの血中濃度が正常値(20pg/ml以下)を大きく超えて高値を示した症例を経験した。その原因の検索のため誤嚥した経口栄養剤そのものの1,3-β-D-グルカンを計測したところ、28,600pg/mLと極めて高い値を示し、大豆が主成分である経口栄養剤の誤嚥がその原因と考えられた。それに比較して、経胃的に経口栄養剤を投与している患者5名の血中の1,3-β-D-グルカンを測定しても12.3pg/ml、18.1pg/ml、16.7pg/ml、21.2pg/ml、18.4pg/mlとほぼ正常範囲であった。以上のことから、経口(経食道)的に摂取された1,3-β-D-グルカンは血中にはほとんど移行しないが、経気道的に摂取された場合には移行する可能性が示された。そこで、さらに、誤嚥の簡易診断法の開発を目指して、マウスは6週齢雄のddyマウスに1,3-β-D-グルカンであるCM-Curdlanを経口投与および経気管投与を行い翌日血中のβ-D-グルカン濃度を測定した。経口投与した群では、21.1±28.9pg/mlを示したが、経気道投与を行った群では13,200±15,300pg/mlと極めて高い値を示し、β-D-グルカンが経口的には吸収されず、経気道的にのみ吸収されることが確認された。誤嚥の存在に対する診断

法には、飲水試験、嚥下誘発試験、ビデオフルオログラフィー、Radioisotope (RI)を用いた睡眠中の誤嚥検査があるが、今回我々は、経口(経食道)的に摂取された1,3-β-D-グルカンは血中にはほとんど移行しないが、経気道的に摂取された場合には移行する可能性をある症例から予測し、この現象を応用した誤嚥評価法の開発を試みた。すなわち、誤嚥後に1,3-β-D-グルカンの血中濃度が正常値(20pg/ml以下)を大きく超えて高値を示した症例を経験したため、その原因の検索のため誤嚥した経口栄養剤そのものの1,3-β-D-グルカンを計測したところ、28,600pb/mLと極めて高い値を示し、大豆が主成分である経口栄養剤の誤嚥がその原因と考えられた。一方、経胃的に経口栄養剤を投与している患者5名の血中の1,3-β-D-グルカンを測定しても12.3pg/ml、18.1pg/ml、6.7pg/ml、21.2pg/ml、18.4pg/mlとほぼ正常範囲であった。これらのデータを受け、昨年度はマウスを用いた実験において、やはりβ-D-グルカンが経口的には吸収されず、経気道的にのみ吸収されることを確認した。この実験では、6週齢雄のddyマウスに1,3-β-D-グルカンであるCM-Curdlanを経口投与および経気道投与を行い翌日血中のβ-D-グルカン濃度を測定したところ、経口投与した群では、21.1±28.9pg/mlを示したが、経気道投与を行った群では13,200±15,300pg/mlと極めて高い値を示したのである。よって、今年度は何人かの被検者に試み、臨床応用することを目標とした。まず、β-D-グルカンを多量に含むシゾフィラム(スエヒロダケより抽出)を、誤嚥が予想される高齢者に投与するプロコールを作成し、本学倫理委員会に提出した。シゾフィラムは既に別の薬理作用を目的として、患者に投与されており、経口投与の安全性が証明されているとして、倫理委員会にてこのプロトコールが承認された。その後、数人の誤嚥性肺炎が疑われる患者に投与し、血中β-D-グルカンの値を測定した。現在それらのデータを解析中である。また、上記は画期的方法と考えられ、「多糖を用いた誤嚥検査」として特許出願中である。
ヒトT細胞白血病ウイルスのRNA核外輸送機構の解明

HTLV-1のRexはウイルスmRNAの核外輸送を担うウイルスタンパク質である。Rexの機能にはCRM1やRanBP3に代表される細胞性因子との直接または間接的な相互作用が不可欠であり、これらの細胞内での発現制御はウイルス複製に大きく影響すると考えられる。そこで本年度はCRM1を中心にそれらの発現様式を調べた。まず細胞周期に依存的なCRM1発現制御の有無を調べるため、既存の細胞周期調節試薬(ノコダゾール等)を利用した。その結果CRM1はG1,G2,M期といった細胞周期でも一定の発現量(タンパク質レベル)を保っていることが分かった。次に分化に伴うCRM1発現制御について検討した。この際HL60細胞を利用した。この細胞株はPMAの刺激によりマクロファージ様の細胞に分化することが報告されている。PMA刺激後分化を形態観察で追跡し同時に細胞中のCRM1発現量を測定したところ、分化前後において発現量に変化はなかった。この際RNAレベルでもその発現量に変化がないことが確認された。またCRM1以外にRexの機能に必要であるRanBP3やImportin-beta等の発現量もRNAレベルにおいて分化前後で変化しないことが分かった。さらにアポトーシスにおけるCRM1発現制御についても種々のアポトーシス誘導刺激試薬を利用することで検討した。その結果アポトーシス前後においてCRM1発現量の変化は確認されなかった。これらの結果から、CRM1は細胞の多様な生理反応に必須のタンパク質であり、種々の細胞刺激によらず一定量発現していることが細胞にとって必須であることが示唆された。今後はHTLV-1感染による(主にHTLV-1のTaxタンパク質による)様々な細胞へのストレスに対応した細胞性因子の発現制御があるのか調べる予定である。Rexが正しく機能するためにはCRM1やRanBP3に代表される細胞性因子との直接または間接的な相互作用が不可欠であり、これらの細胞内での発現制御はウイルス複製に大きく影響すると考えられる。そこで本年度はウイルス宿主細胞(CD4+T細胞)におけるCRM1の発現様式を調べた。まずヒトPBMCより単離したCD4+T細胞をPMA、ionophore、IL2により刺激したところ、再現性よくCRM1タンパク質量の増加を認めた。またstaurosporineの添加により発現量増加が阻害されたことから、細胞内シグナルとしてPKCの関与が考えられた。同刺激時のCRM1 mRNA量を経時的に追跡したところ刺激時間に伴いmRNA量が増加するのを認めた。さらにpreliminaryな実験結果ではあるが、mRNA量が増加する以前にCRM1タンパク質量が増加することも認めており、これらの結果はCRM1の発現が転写と転写後の2段階で調節を受けている可能性を示唆している。CRM1の発現様式を更に調べるためには上記のCD4+T細胞を使う方法以外にCRM1の発現量が元々低い細胞株を同定し解析していく方法が考えられた。しかしCRM1は細胞の生存に関係する諸現象に広く利用されているタンパク質であるためかこれまで調べた細胞株は全てCRM1高発現細胞であった。しかし最近CRM1発現量が極めて低いヒト細胞株の同定に成功した。今後はCD4+T細胞とこの細胞株を利用しCRM1発現制御をより詳しく解析していく予定である。Rexの多量体化に必要な因子についてRIP法(Ribonucleoprotein免疫沈降法)などを利用し、解析を進めている。諸条件を至適化し因子の同定につなげる予定である。
流動によるコロイド結晶の形状制御と新しい光機能性材料への応用

マイクロ流体技術をコロイド結晶作製に適用することにより、様々な形状をもつコロイド結晶の作製に成功した。具体的には、コロイド結晶をシェルにもつコア-シェル粒子の作製に成功し、センサー機能を有した新しいマイクロカプセルとして応用できることを示した。またコロイド結晶ファイバや10×10cm^2の大面積高品質コロイド結晶フィルムの作製に成功し、コロイド結晶の形状に起因した新しい光学材料への応用展開を示した。本研究では、荷電コロイド結晶をキャピラリー内で流動させることで、様々な形状の高品質コロイド結晶を作製し、その形状を生かした新しい光機能性材料へ応用することを目的としている。本年度は、マイクロフルイディクス技術を発展させ、コロイド結晶をシェルにもつコアーシェル粒子の作製に成功し、センサー機能を有した新しいマイクロカプセルとして利用できることを示した。具体的には、まずガラスキャピラリーを組み合わせてダブルエマルション形成用のマイクロ流体デバイスを作製した。このデバイス内に荷電コロイド結晶とオイルを同時に流動させた。シリンジポンプを用いて流速を制御することで、荷電コロイド結晶をシェルに持つ安定な0/W/0ダブルエマルションを得ることに成功した。次に、荷電コロイド結晶の粒子配列とシェル形状を高分子ゲルで固定化することを試みた。予め荷電コロイド結晶内にゲル化剤を溶解しておき、ダブルエマルション形成後、光照射しゲル化剤を光重合することで、コロイド結晶の粒子配列とシェル形状を高分子ゲルで固定化することに成功した。さらに高分子ゲルとして、温度応答性を有するポリ-N-イソプロピルアクリルアミドゲルを用いることで、温度応答性を有するコロイド結晶ゲルをシェルに持つマイクロカプセルを作製できた。このコロイド結晶ゲルは、温度を上げるとゲルが収縮するため、ゲルに固定化されたコロイド結晶の格子定数が減少する。これによりコロイド結晶のブラッグ反射色を変化させることができた。本材料は、周囲や内包物質の温度変化によりブラッグ反射色や反射波長が変化するセンサー機能を有したマイクロカプセルとしての利用が期待される。本年度は、流動による高品質コロイドフォトニック結晶ファイバの作製と得られた結晶の光学特性評価を行った。まず中空ファイバを作製するための二重円筒状ガラスチューブを作製した。内径8mm、長さ10cmのガラス管内に、外径7.8mm、長さ10cmのガラス棒を入れ、径の中心が一致するように固定し、厚さ0.1mmの筒状の流路を作製した。この筒状のセルにエアーパルス流動システムを接続し、荷電コロイド結晶を流動させた。粒子濃度10%、粒径約200nmの単分散シリカ微粒子またはポリスチレン微粒子の水分散液を脱塩処理して得られる荷電コロイド結晶を用い、様々なパルス圧でセル内を流動させた。流動後の結晶の品質を透過スペクトル測定、反射スペクトル測定、コッセル線解析から評価、検討した。測定の結果、流速の増加とともに結晶の光学特性と粒子配列性が向上することが確認された。そして、ある一定流速以上ではスペクトル的に非常に優れた結晶になることがわかった。次に、中空ファイバ形状のコロイド結晶の粒子配列を、高分子ゲルを用いて固定することを試みた。コロイド結晶に水溶性のゲル化剤(モノマー、架橋剤、光重合開始剤)を溶解し、エアーパルス流動システムを用いて二重円筒状流路内で流動させた。その後、UV光を照射し光重合させることで、中空ファイバ形状にゲル固定した。ゲル化剤の濃度、光照射条件などの作製条件を最適化することにより、流動により得られた高品質な結晶状態をほぼ維持したままファイバ形状にゲル固定できた。得られたゲル固定コロイド結晶ファイバにおいて、溶媒を変えることによりゲルを収縮させることができ、コロイド結晶のブラッグ反射波長をチューニングすることができた。1.コロイド結晶シェルを利用したレーザー発振マイクロフルイディクス技術を用いて、レーザー色素コア-コロイド結晶シェルからなるダブルエマルションの作製に成功した。レーザー色素であるナイルレッドをトルエンに溶解し、ポリスチレン微粒子からなる荷電コロイド結晶とともにマイクロ流体デバイス内で流動させた。連続相、コロイド結晶相内に添加した界面活性剤の種類、濃度を調整することにより、レーザー色素コア-コロイド結晶シェルからなるダブルエマルションの作製に成功した。粒径160 nm、粒子濃度10%のポリスチレン微粒子からなるコロイド結晶を用いることにより、レーザー色素の発光波長とコロイドフォトニック結晶のブラッグ反射波長を一致させることができた。Nd:YAGレーザーを用いてレーザー色素を励起し、色素からの発光をブラッグ反射によりコア内で共振させることで、レーザー発振を試みた。しかしながら発光ピークの増幅はみられたものの、レーザー発振には至らなかった。レーザー色素コアの大きさやコロイド結晶シェルの厚さを大きくすることにより、レーザー発振する可能性が残っている。本研究期間は終了したが、本研究で得られた知見を基に、引き続きコロイド結晶シェルからのレーザー発振を試みる予定である。

2.大面積単結晶コロイド結晶フィルムの作製流動誘起単結晶化法により、10×10 cm2の大面積単結晶コロイド結晶フィルムの作製に成功した。3Dプリンタを用いて流入口、流出口を作製し、これらとガラス板を組み合わせることにより、試料面積が10×10 cm2の大面積セルを自作した。粒子濃度10%のコロイド結晶を流入口に入れ、プランジャーを押すことにより、コロイド結晶を均一にセル内で流動させることができた。流速を増加させることにより、10×10 cm2の大面積領域で高品質な結晶を得ることができた。本年度の研究目的である流動による高品質コロイドフォトニック結晶ファイバの作製に成功しており、おおむね順調に進展しているといえる。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画に沿って本研究課題を推進する。来年度は最終年度であるため、本研究課題が完了するように、できる限り前倒しで研究を進めることを心掛ける。