hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イノシトールリン脂質による心筋遅延整流性K^+チャネルの調節機構の解析

モルモット心臓から酵素処理により得られた単離心房筋細胞に全細胞型パッチクランプ法(whole-cell patch-clamp mode)を適用して,イノシトールリン脂質による緩徐活性型遅延整流性K^+チャネル電流(I_<Ks>)の調節機構の解析を行った.I_<Ks>は保持電位-50mVから種々の膜電位に脱分極パルスを与えて活性化し,活性化の程度は-50mVに再分極したときに発生する末尾電流(tail current)の大きさで評価した.本研究課題により得られた研究成果は以下の通りである.1.高濃度(【greater than or equal】10μM)のwortmanninはPI4-キナーゼをブロックすることにより細胞膜のホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸(PtdIns(4,5)P_2)量を減少させることが知られている.Wortmannin(50μM)をパッチ電極を介して細胞内に負荷するとI_<Ks>の大きさは208.5±14.6%(n=9)に増大した.2.PtdIns(4,5)P_2(100μM)を細胞内に負荷するとI_<Ks>の大きさは44.8±8.2%(n=4)に減少した.3.抗PtdIns(4,5)P_2抗体を細胞内に負荷するとI_<Ks>の大きさは198.4±19.9%(n=5)に増大した.4.細胞膜PtdIns(4,5)P_2のもつ負電荷を中和するneomycin(50μM)やAl^<3+>(50μM)を細胞内に投与するとI_<Ks>の大きさはそれぞれ161.0±13.5%(n=4)ならびに150.0±8.2%(n=4)に増大した.これらの実験結果により,モルモット心房筋細胞のI_<Ks>は細胞膜PtdIns(4,5)P_2により抑制性の調節を受けており,それにはPtdIns(4,5)P_2のもつ負電荷が関わっている可能性が示唆された.さらに,5.細胞外ATP(50μM)によるP2Y受容体刺激はGq-ホスホリパーゼC(PLC)の活性化を介してI_<Ks>を増大させるが,パッチ電極を介して細胞内にPtdIns(4,5)P_2(100μM)を負荷すると細胞外ATP(50μM)によるI_<Ks>の増大作用は著明に減少した.よって,P2Y受容体刺激によるI_<Ks>の増大反応には細胞膜PtdIns(4,5)P_2の消費・減少が第一義的に関わっていると考えられた.このように,細胞膜PtdIns(4,5)P_2によるI_<Ks>の抑制作用はGq-PLC連関受容体刺激に伴うI_<Ks>の増大反応に密接に関わっている可能性が示唆された.モルモット心臓から酵素処理により得られた単離心房筋細胞に全細胞型パッチクランプ法(whole-cell patch-clamp mode)を適用して,イノシトールリン脂質による緩徐活性型遅延整流性K^+チャネル電流(I_<Ks>)の調節機構の解析を行った.I_<Ks>は保持電位-50mVから種々の膜電位に脱分極パルスを与えて活性化し,活性化の程度は-50mVに再分極したときに発生する末尾電流(tail current)の大きさで評価した.本研究課題により得られた研究成果は以下の通りである.1.高濃度(【greater than or equal】10μM)のwortmanninはPI4-キナーゼをブロックすることにより細胞膜のホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸(PtdIns(4,5)P_2)量を減少させることが知られている.Wortmannin(50μM)をパッチ電極を介して細胞内に負荷するとI_<Ks>の大きさは208.5±14.6%(n=9)に増大した.2.PtdIns(4,5)P_2(100μM)を細胞内に負荷するとI_<Ks>の大きさは44.8±8.2%(n=4)に減少した.3.抗PtdIns(4,5)P_2抗体を細胞内に負荷するとI_<Ks>の大きさは198.4±19.9%(n=5)に増大した.4.細胞膜PtdIns(4,5)P_2のもつ負電荷を中和するneomycin(50μM)やAl^<3+>(50μM)を細胞内に投与するとI_<Ks>の大きさはそれぞれ161.0±13.5%(n=4)ならびに150.0±8.2%(n=4)に増大した.これらの実験結果により,モルモット心房筋細胞のI_<Ks>は細胞膜PtdIns(4,5)P_2により抑制性の調節を受けており,それにはPtdIns(4,5)P_2のもつ負電荷が関わっている可能性が示唆された.

さらに,5.細胞外ATP(50μM)によるP2Y受容体刺激はGq-ホスホリパーゼC(PLC)の活性化を介してI_<Ks>を増大させるが,パッチ電極を介して細胞内にPtdIns(4,5)P_2(100μM)を負荷すると細胞外ATP(50μM)によるI_<Ks>の増大作用は著明に減少した.よって,P2Y受容体刺激によるI_<Ks>の増大反応には細胞膜PtdIns(4,5)P_2の消費・減少が第一義的に関わっていると考えられた.このように,細胞膜PtdIns(4,5)P_2によるI_<Ks>の抑制作用はGq-PLC連関受容体刺激に伴うI_<Ks>の増大反応に密接に関わっている可能性が示唆された.モルモット心臓から酵素処理により得られた単離心房筋細胞に全細胞型パッチクランプ法(whole-cellpatch-clamp mode)を適用して,イノシトールリン脂質による緩徐活性型遅延整流性K^+チャネル電流(l_<Ks>)の調節機構の解析を行った.細胞灌流液には急速活性型遅延整流性K^+チャネル電流(l_<Ks>)の阻害剤であるE-4031(5μM)を加えて実験を行った.l_<Ks>は保持電位-50mVから種々の膜電位に脱分極パルスを与えて活性化し,活性化の程度は-50mVに再分極したときに発生する末尾電流(tail current)の大きさで評価した.今年度の研究により得られた実験結果は以下の通りである.1.高濃度のwortmanninはPI4-キナーゼをブロックすることにより細胞膜のホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸(PIP_2)量を減少させることが知られている.Wortmannin(50μM)をパッチ電極を介して細胞内に負荷するとl_<Ks>の大きさは約2倍に増大した.2.PIP_2(100μM)を細胞内に負荷するとl_<Ks>の大きさは約1/3に減少した.3.抗PIP_2抗体(30nM)を細胞内に負荷するとl_<Ks>の大きさは約2倍に増大した.4.細胞膜PIP_2のもつ負電荷を中和するAl^<3+>(50μM)やneomycin(50μM)を細胞内に投与するとl_<Ks>の大きさは約2倍に増大した.これらの実験結果により,モルモット心房筋細胞のl_<Ks>は細胞膜PIP_2により抑制性の調節を受けており,それにはPIP_2のもつ負電荷が関わっている可能性が示唆された.現在,PIP_2によるヒトのl_<Ks>の調節に関わる構造基盤を明らかにする目的で,KCNQl遺伝子+KCNEl遺伝子,もしくはKCNQl遺伝子を導入した培養細胞(COS7,CHO)にパッチクランプ法を適用して,上記の1.4.の項目について検討を行っている.平成13年度の本研究課題において,単離モルモット心筋細胞の緩徐活性型遅延整流性K^+チャネル(I_<Ks>)は細胞膜構成リン脂質であるホスファチジルイノシトール4,5-ニリン酸(PIP_2)により抑制性の調節を受けていることを明らかにした.本年度(平成14年度)はこの細胞膜PIP_2によるI_<Ks>の抑制性調節機構の生理的意義を明らかにする目的で,単離モルモット心房筋細胞に全細胞型パッチクランプ法(whole-cell patchclamp mode)を適用して実験・検討を行った.今年度の研究により得られた結果は以下の通りである.1.細胞外ATP(50μM)によるP2Y受容体刺激はI_<Ks>に対して増大作用をおよぼすが,パッチ電極を介して細胞内にPIP_2(100μM)を負荷すると細胞外ATP(50μM)によるI_<Ks>の増大作用は著明に減少した.2.一方,PI-4 kinaseを抑制し細胞膜PIP_2含量を減少させる目的で細胞内に高濃度(50μM)のwortmamminを投与するとI_<Ks>が増大するが(平成13年度結果),この増大反応の後に細胞外ATP(50μM)を投与しても,I_<Ks>の増加は有意に減少した.これらの実験結果により,P2Y受容体刺激によるI_<Ks>の増大反応にはP2Y受容体-Gq-ホスホリパーゼC(PLC)の活性化による細胞膜PIP_2の消費・減少が第一義的に関わっていると考えられる.3.細胞内に3価の陽電荷をもつスペルミジンや4価の陽電荷をもつスペルミンを投与すると,I_<Ks>が徐々に増大していった.
円形フェ-ズロックアレイ導波形炭酸ガスレ-ザ

本研究は、小形で比較的大きな出力が得られる導波形炭酸ガスレ-ザに着目すると共に、導波形炭酸ガスレ-ザの出射面を円形アレイ状に配列し、隣接する導波路間の壁に隙間を設け,それにより光波を結合させ、円形フェ-ズロックアレイ導波形炭酸ガスレ-ザを構成しょうとするものである。円形フェ-ズロックアレイ導波形炭酸ガスレ-ザの試作内径20mm,外径24mm、長さ210mmの銅パイプを外側に,内径8mm、外径10mm,長さ210mm銅パイプを内側に用いて円形同軸形中空導波路を構成した.外側の銅パイプには,長さ方向に対して幅3mm、長さ200mmのスロットを並列に6本開けられ、それぞれのスロットに,導波路の隔壁として,幅3.5mm,高さ6mm,長さ100mmの三角柱を2本ずつ,計12本埋め込まれている.外側及び内側の銅パイプには水冷が行われている。導波路の両側には,反射率99.7%の完全反射ミラ-と反射率95%の部分透過ミラ-が取り付けられ,それぞれのミラ-でレ-ザ共振器が構成されている。動作実験動作実験では,1)各導波路で一様な放電,2)各導波路で同時発振3)各導波路のレ-ザ間においてフェ-ザロック発振動作の3点について動作確認を行った.1)については,ガス圧力50Torrにおいて入力電力230Wまで一様な放電が得られている.それ以上入力電力については,まだ実験を行っていない.2)3)については,ガス圧力50Torr,入力電力50Wで同時発振およびフェ-ズロック動作を確認した(スペクトルアナライザ-を用いた各レ-ザ光間のビ-ト周波数の観測による).これらの結果より,フェ-ズロックアレイ導波形炭酸ガスレ-ザによる導波形炭酸ガスレ-ザの高出力化の見通しが得られた.本研究は、小形で比較的大きな出力が得られる導波形炭酸ガスレ-ザに着目すると共に、導波形炭酸ガスレ-ザの出射面を円形アレイ状に配列し、隣接する導波路間の壁に隙間を設け,それにより光波を結合させ、円形フェ-ズロックアレイ導波形炭酸ガスレ-ザを構成しょうとするものである。動作実験動作実験では,1)各導波路で一様な放電,2)各導波路で同時発振3)各導波路のレ-ザ間においてフェ-ザロック発振動作の3点について動作確認を行った.1)については,ガス圧力50Torrにおいて入力電力230Wまで一様な放電が得られている.それ以上入力電力については,まだ実験を行っていない.2)3)については,ガス圧力50Torr,入力電力50Wで同時発振およびフェ-ズロック動作を確認した(スペクトルアナライザ-を用いた各レ-ザ光間のビ-ト周波数の観測による).これらの結果より,フェ-ズロックアレイ導波形炭酸ガスレ-ザによる導波形炭酸ガスレ-ザの高出力化の見通しが得られた.
ライム病ボレリアスフィンゴ糖脂質結合蛋白質の病原学的機能解析とワクチン開発

Borrelia burgdorferi297株gapdh遺伝子の翻訳可能領域1020bpをクローニングし、発現ベクターpMAL-c2を用いて大腸菌中でGbp37をマルトース結合蛋白質(MBP)との融合蛋白質(rfGbp37)として発現させた。精製rfGbp37を電気泳動したのち膜にブロットし、rfGbp37に対するスフィンゴ糖脂質ガラクトシルセラミド(GalCer)の結合性、及びTLCに展開したGalCerに対するrfGbp37の結合性を検討し、得られた組換え蛋白質がGalCerに対して特異的な結合活性を維持していることを確認した。さらに、すでにスフィンゴ糖脂質をレセプターとしてボレリアが接着することを確認しているCHO-K1細胞に対するrfGbp37の結合性をELISA法により検討し、200μg/mL程度で飽和に達する濃度依存的な結合を確認した。またボレリアのCHO-K1細胞接着に対し、rfGbp37は200μg/mLの濃度で約35%の競合阻害活性を示すことを明らかにした。ボレリア菌体上のGbp37の分布状態を調べるため、抗rfGbp37抗体を一次抗体とし、金コロイド標識プロテインAを標識抗体とした菌体の免疫電子顕微鏡解析をい、菌体表層に付着した金コロイド粒子が観察され、さらに菌体の界面活性剤前処理による表層膜の傷害により粒子の付着数が減少したことから、Gbp37がボレリアの菌体表層に存在することを明らかにした。またrfGbp37免疫マウスを用いたボレリアのfood padへの感染実験の結果、対照のMBP免疫マウスに比較して有意なfood pad腫脹の抑制がみられたことから、rfGbp37が感染防御能を有することを明らかにした。さらに様々なライム病ボレリア種を抗原とするELISAにおいても抗rfGbp37抗体は高い反応性を示し、Gbp37の抗原性は異なるライム病ボレリア種間でも保存されていることを明らかにした。Borrelia burgdorferi 297株のグリセルアルデヒド-3-リン酸-デヒドロゲナーゼ(GAPDH)の配列に基づき特異的プライマーを設計した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により特異的増幅産物を得、これをpGEM-Tベクターに連結し、大腸菌JM109に形質転換した。形質転換体より再度GAPDH遺伝子を切り出し、マルトース結合蛋白質発現ベクターpMAL下流に連結し、融合タンパク質として発現させた。予想通り約80kDaの蛋白の発現確認した。この発現蛋白質は膜ブロット法により、ビオチン化ガラクトシルセラミドと反応した。また、TLC上でのガラクトシルセラミドとボレリア菌体より抽出して得た37kDaガラクトシルセラミド結合蛋白質(Gbp37)との結合を特異的に阻害し、遺伝子組換え融合タンパク質の作製に成功した。現在、この融合タンパク質の精製と免疫抗血清の作製を進めている。今後、本蛋白質をマウスに免役し、実験的ボレリア感染に対する防御活性、さらにはボレリア菌体上における本蛋白質の分布を免疫電子顕微鏡法を用いて検討する予定である。また、本蛋白質とガラクトシルセラミドをはじめとするスフィンゴ糖脂質との結合をsurface plasmon resonance(SPR)assayにより検討したい。Borrelia burgdorferi 297株gapdh遺伝子の翻訳可能領域1020

bpをクローニングし、発現ベクターpMAL-c2を用いて大腸菌中でGbp37をマルトース結合蛋白質(MBP)との融合蛋白質(rfGbp37)として発現させた。精製rfGbp37を電気泳動したのち膜にブロットし、rfGbp37に対するスフィンゴ糖脂質ガラクトシルセラミド(GalCer)の結合性、及びTLCに展開したGalCerに対するrfGbp37の結合性を検討し、得られた組換え蛋白質がGalCerに対して特異的な結合活性を維持していることを確認した。さらに、すでにスフィンゴ糖脂質をレセプターとしてボレリアが接着することを確認しているCHO-K1細胞に対するrfGbp37の結合性をELISA法により検討し、200μg/mL程度で飽和に達する濃度依存的な結合を確認した。またボレリアのCHO-K1細胞接着に対し、rfGbp37は200μg/mLの濃度で約35%の競合阻害活性を示すことを明らかにした。ボレリア菌体上のGbp37の分布状態を調べるため、抗rfGbp37抗体を一次抗体とし、金コロイド標識プロテインAを標識抗体とした菌体の免疫電子顕微鏡解析をい、菌体表層に付着した金コロイド粒子が観察され、さらに菌体の界面活性剤前処理による表層膜の傷害により粒子の付着数が減少したことから、Gbp37がボレリアの菌体表層に存在することを明らかにした。またrfGbp37免疫マウスを用いたボレリアのfoodpadへの感染実験の結果、対照のMBP免疫マウスに比較して有意なfoodpad腫脹の抑制がみられたことから、rfGbp37が感染防御能を有することを明らかにした。さらに様々なライム病ボレリア種を抗原とするELISAにおいても抗rfGbp37抗体は高い反応性を示し、Gbp37の抗原性は異なるライム病ボレリア種間でも保存されていることを明らかにした。
STINGを介した腫瘍内への細胞集積とその抗腫瘍免疫応答に関わるメカニズムの解明

cGAMPの腫瘍内活性化によるマクロファージの腫瘍内浸潤にはSTING/IRF3/IRF7経路を介してI型IFNsが誘導されることが重要であることが示唆された。次に、骨髄キメラマウスを用いた解析によって、腫瘍内の骨髄球形細胞以外にも血管内皮細胞や間質細胞によって産生されるI型IFNが重要であることが示唆された。以上のことから、cGAMPによってSTINGを介して腫瘍内を活性化することによってI型IFNsが誘導され活性化マクロファージが大量に腫瘍内浸潤し、抗腫瘍免疫応答が活性化されることが明らかになった。STINGリガンド(cGAMP)の腫瘍内投与によって腫瘍内に集積してくるマクロファージをディフクイック染色によって形態学的に解析したところ、マクロファージによく見られる食胞が認められた。また、セルソーターによって単離したマクロファージからRNAを抽出し、抗腫瘍免疫応答に関与する分子の遺伝子発現を解析した結果、IFNb1、Nos2、Cxcl10などの遺伝子が腫瘍関連マクロファージに比べて高発現していることが確認されたことから、こう腫瘍免疫応答に対してプラスに働いていることが示唆された。また、細胞内染色法によってSTINGリガンドによって集積してきたマクロファージの産生サイトカインを解析した結果、TNF-alphaを産生していることを確認した。マクロファージが腫瘍内に集積するメカニズムを明らかにするために、集積したマクロファージに発現されているケモカインレセプターを調べた結果、CCR2及びCCR20を発現していることを確認した。また、cGAMP投与によってそれぞれのケモカイン遺伝子の発現上昇が認められた。しかし、CCL2及びCCL20に対する中和抗体ではマクロファージの腫瘍内浸潤を抑制することができなかったことから、これらのケモカインは関与していないことが明らかになった。そこで、腫瘍内集積マクロファージ内で活性化しているシグナル経路を探るために、網羅的遺伝子解析をした結果、コントロールの腫瘍内マクロファージと比較してTLR4/IRF5のシグナル経路が強く活性化されていることが示唆された。実際にTLR4に対するアンタゴニストをcGAMPと同時に投与することによって、マクロファージの腫瘍内集積が抑制されたことから、STING刺激によって産生される何らかのTLR4リガンドがマクロファージの腫瘍内集積に関与していることが示唆された。平成28年度に実施する予定であった解析のほとんどが既に終了し、平成29年度に実施予定である解析に進んでいる。STINGリガンド(cGAMP)の腫瘍内投与によってマクロファージが腫瘍内に集積してくるメカニズムを解析した。STINGの活性化経路に関与する転写因子、IRF3、IRF7、もしくはSTAT6を欠損した遺伝子改変マウスを用いてcGAMPによるマクロファージの腫瘍内浸潤に影響を及ぼすか検討した。その結果、いずれの遺伝子改変マウスにおいてもcGAMPの腫瘍内投与によって、マクロファージの浸潤が認められた。そこで、I型インターフェロン(IFN)の産生を完全に抑制するためにIRF3およびIRF7のダブル欠損マウスを用いた結果、マクロファージの浸潤が抑制された。さらにI型IFNの依存性を確認するためにI型IFNの受容体に対する抗体を用いた結果、同様にしてマクロファージの浸潤が抑制された。このことから、cGAMPによるマクロファージの腫瘍内浸潤はSTING/IRF3/IRF7経路を介してI型IFNsが誘導されることが重要であることが示唆された。次に、腫瘍内におけるI型IFNsの産生細胞を明らかにするために、STING欠損マウスを用いて骨髄キメラマウスを作成して検討した。放射線照射した野生型マウスにSTING欠損マウス由来の骨髄細胞を移植し、免疫系を再構築した後に、腫瘍細胞を皮内移植しcGAMPを腫瘍内投与した結果、マクロファージの腫瘍内集積が認められた。このことから、血球系ではなく血管内皮細胞や間質細胞によるI型IFNが重要であることが示唆された。同様に、STING欠損マウスに野生型マウス由来の骨髄細胞を移植した場合においても、cGAMPによってマクロファージの腫瘍内集積が認められた。このことから、腫瘍微小環境に既に浸潤している骨髄球系細胞によるI型IFNによってもマクロファージの腫瘍内集積を誘導することが示唆された。cGAMPによるマクロファージの腫瘍内集積にTLR4が関与していることが明らかになったことから、マクロファージの表面上のTLR4が重要なのかを明らかにするためにTLR4KOマウス由来の骨髄を用いてキメラマウスを作成し、cGAMP投与後の腫瘍内にTLR4KO-マクロファージが集積するか確認する。また、様々なTLR4リガンドが知られているが、マクロファージの腫瘍内集積に関与するTLR4リガンドを明らかにするために、in vitroにおけるマクロファージの遊走実験モデルを構築し、siRNAで各TLR4

リガンドの遺伝子をノックダウンした細胞株を用いて検討する。この検討で明らかになったTLR4リガンドについて、がん患者病理組織材料を用いて免疫染色法を用いて、その発現頻度とマクロファージの浸潤頻度及び患者生命予後について解析する。
有界モデル検査による仕様検証手法を利用したソフトウェア開発コストの削減

本研究課題では,動的性質の検証手法であるモデル検査を用いたUML設計群の検証手法について研究開発を行った.本研究では特に,ソフトウェアの各モジュールの動作とモジュール間のメッセージ通信に関する設計の整合性に注目しており,各モジュールが与えられたメッセージ通信仕様を満たすか有界モデル検査により検証するものである.また,UML設計群を一つのモデルに統合することによるモデルの巨大化に伴い,検証コストが指数的に増大することが予想されるため,有界モデル検査の適用とその効率化についても研究を行っている.この目的を達成するため,まず,モジュールの動作並びにモジュール間のメッセージ通信を記述するUML設計群から有界モデル検査のためのモデルを抽出する手法について研究開発を行った.各UML設計で記述された動的振る舞いを論理式表現し,それらを組み合わせることで有界モデル検査による検証を実現する.次に,有界モデル検査をUML設計群の検証に最適化するため,状態空間の探索アルゴリズムの比較実験を行った.また,適用実験の一環として,Webページのナビゲーション構造の検証についても研究開発を行い,UMLの状態マシン図によりモデル化されたナビゲーション構造をモデル検査により検証する手法について研究開発を行った.最後に,提案する検証系を計算機上に実装するため,与えられたUML設計群から論理式表現を自動生成するツールを開発した.その成果として,UML設計群として与えられたモジュールの動作並びにモジュール間のメッセージ通信が互いに矛盾なく記述されているかを有界モデル検査により検証する枠組みを実現するとともに,自動検証ツールについて実装の一部を完了した.また,適用実験として,Webナビゲーション構造の設計に対して提案法による検証を行い,有効性を確認した.本研究課題では,動的性質の検証手法であるモデル検査を用いたUML設計群の検証手法について研究開発を行った.本研究では特に,ソフトウェアの各モジュールの動作とモジュール間のメッセージ通信に関する設計の整合性に注目しており,各モジュールが与えられたメッセージ通信仕様を満たすか有界モデル検査により検証するものである.また,UML設計群を一つのモデルに統合することによるモデルの巨大化に伴い,検証コストが指数的に増大することが予想されるため,有界モデル検査の適用とその効率化についても研究を行っている.この目的を達成するため,まず,モジュールの動作並びにモジュール間のメッセージ通信を記述するUML設計群から有界モデル検査のためのモデルを抽出する手法について研究開発を行った.各UML設計で記述された動的振る舞いを論理式表現し,それらを組み合わせることで有界モデル検査による検証を実現する.次に,有界モデル検査をUML設計群の検証に最適化するため,状態空間の探索アルゴリズムの比較実験を行った.また,適用実験の一環として,Webページのナビゲーション構造の検証についても研究開発を行い,UMLの状態マシン図によりモデル化されたナビゲーション構造をモデル検査により検証する手法について研究開発を行った.最後に,提案する検証系を計算機上に実装するため,与えられたUML設計群から論理式表現を自動生成するツールを開発した.その成果として,UML設計群として与えられたモジュールの動作並びにモジュール間のメッセージ通信が互いに矛盾なく記述されているかを有界モデル検査により検証する枠組みを実現するとともに,自動検証ツールについて実装の一部を完了した.また,適用実験として,Webナビゲーション構造の設計に対して提案法による検証を行い,有効性を確認した.大規模ソフトウェアの開発では,設計における誤りの混入が,開発プロセス全体のコストを増大させてしまう要因となる.従って,開発コストの削減のためには設計段階での誤りを早期に発見することが必要となる.そのために,開発現場ではUMLをはじめとした形式的な仕様記述手法が広く用いられている.しかしながら,システムが設計者の意図した動作を行うか,といったシステムの動的な側面については形式記法では保証することができない.モデル検査はシステムの動的な側面を検証する手法であり,UMLの検証にも応用が進められている.UMLでは9種類の図を用いてシステムの異なった側面を記述するが,従来の研究では単一の図を対象とした検証しかされておらず,それらを組み合わせて実装したときに発生する複雑な誤りは発見できなかった.そこで本研究課題では,上記のような誤りを検出するため,複数のUML図を統合してモデル検査を行うための手法について研究開発を行った.特に,統合によるモデルの巨大化に伴って検証コストが指数的に増大することが予想されるため,有界モデル検査の適用とその効率化について研究を行った.具体的には,有界モデル検査を適用するため,特定のUML図の組合せによって記述されたシステムの仕様記述から,統合されたモデルを求める手法を考案し,例題システムへの適用実験を通して有効性を示した.また適用実験のー環として,UML図によってモデル化されたWebナビゲーションの検証に対しても提案手法を適用した.さらに,有界モデル検査を複数UML図の検証に最適化するため,様々なアルゴリズムを適用して比較実験を行った.その成果として,複数のUML図を統合してモデル化し,有界モデル検査による検証を行う枠組みの開発に成功した.さらに検証を効率化することで,大規模なソフトウェア開発に対して提案手法を適用するための見通しが得られた.大規模なソフトウェアの開発においては,設計段階で混入した誤りや不具合による手戻りが,開発プロセス全体のコストに与える影響が非常に大きくなる.これを防ぐためにUMLを始めとした形式的な仕様記法がソフトウェアの設計に広く用いられている.あらかじめ定め照れた記法に従って設計を行うことにより,設計の曖昧性や開発者間の誤解を避けることができる.しかしながら,ソフトウェアが設計者の意図した通りの動作を行うか,といった動的な側面における正しさについては形式仕様記法では保証できない.

そこで本研究課題では,動的性質の検証手法である有界モデル検査を用いたUML設計検証手法について研究開発を行っている.ここで提案する設計検証手法はソフトウェアの各モジュールの動作とモジュール間のメッセージ通信に関する設計に注目しており,各モジュールが与えられたメッセージ通信仕様を満たすか有界モデル検査により検証するものである.まず,モジュールの動作並びにモジュール間のメッセージ通信を記述するUML設計群から有界モデル検査のためのモデルを抽出する手法について研究開発を行った.提案手法では,各UML設計で記述された動的振る舞いを論理式表現し,それらを組み合わせることで有界モデル検査による検証を実現している.さらに,提案する検証系の実装のため,与えられたUML設計群から論理式表現を自動生成するツールを開発した.また本研究課題では適用実験の-環として, Webページのナビゲーション構造の検証についても研究開発を行い, UMLの状態マシン図によりモデル化されたナビゲーション構造をモデル検査により検証する手法について研究開発を行った.本年度の成果として, UML設計群として与えられたモジュールの動作並びにモジュール間のメッセージ通信が互いに矛盾なく記述されているかを有界モデル検査により検証する枠組みを実現するとともに,自動検証ツールについて実装の一部を完了した。また,適用実験として, Webナビゲーション構造の設計に対して提案法による検証を行い,有効性を確認した.
c-mycによる熱ショックタンパク質70(hsp70)遺伝子の発現制御と細胞周期

まず、hsp70プロモーター領域に種種の欠損変異を導入し、そのプロモーター活性を測定した。その結果、MYC-HSP-Bは強いエンハンサー活性を有することが明らかとなった。次にMYC-HSP-B、およびMYC-HSP-Bを含むhsp70遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子に連結したキメラ遺伝子を作成し、マウスBalb3T3細胞でstableに発現する細胞株を作成した。この細胞株を同調し、細胞周期におけるhsp70発現に対するMYC-HSP-Bの効果を検討した。hsp70遺伝子そのものはmiidle G1期に最初の発現ピークを迎え、次にS期中期に2番目のピークを迎える。MYC-HSP-Bキメラ遺伝子のみを導入した細胞株では、この最初のピークのみの発現が見られ、MYC-HSP-Bに変異を導入したものはその発現が観察されなかったことから、MYC-HSP-Bはhsp70遺伝子のmiddle G1での発現を規定するエンハンサーと考えられる。そこで、S期で発現するサイクリンA遺伝子にこのMYC-HSP-Bを連結し、細胞周期における発現を検討したところ、サイクリンA遺伝子本来のS期での発現ピークに加え、新たにmiddle G1に発現ピークが出現した。この結果は、MYC-HSP-Bが細胞周期特異的発現を規定することを示している。次にMYC-HSP-Bに結合するタンパク質cDNAを酵母One hybrid systemによりクローニングした。得られたpositive clonesを更に、C-MYCとの結合を指標としたTwo hybrid systemにより更にスクリーニングし、2種類のcDNAを得た。塩基配列解析の結果、これらのタンパク質はヒストンH1遺伝子の細胞周期特異的発現を規定するエンハンサー結合タンパク質H1TF2Aの新たなファミリータンパク質と考えられた。H1TF2Aがhsp70遺伝子の発現制御を、ましてやC-MYCとの結合などは一切報告されておらず、新たな発見といえる。
現代イギリスの自然葬法に関する宗教学的研究

本研究は、これまで葬送を支えていた家族や地域互助組織、信仰共同体などが崩壊し、そこで共有されていた儀礼や信仰体系が失われた現代社会において、人々がどのように自らの死を意味付けているのかを、新たな葬送形態である「自然葬法」に着目し明らかにすることを目的としている。自然葬法の注目すべき点は、世界的な環境保護意識などを背景に、90年代以降、文化や習俗の異なる様々な国や地域で実施されていることであり、これまで主に日本や日本との文化的類似性の認められる東アジアを対象に行われてきた日本の葬送研究に、グローバル化や後期近代化という側面から迫ることができる。本研究では、日本とは全く異なる社会・宗教的背景を持つイギリスの自然葬法を対象に、その普及を支える社会構造や人々の意識の解明を通じ、現代社会における死生観の空洞化とそれに対する人々の反応を日本との同時代性のなかで描くことを目指している。今年度はイギリスにおける葬送の近代化の過程について主に英語の基礎文献によって明らかにし、また2月には現地調査も行なった。まずイギリスにおける葬送の近代化に関しては、19世紀以降特に都市部を中心に、墓地の横溢化に伴う瘴気問題、公衆衛生概念の発達、公営墓地の普及、火葬の進展などから、伝統宗教である英国国教会が葬送の領域に与える影響力が著しく低下していくことを明らかにした。また現地調査では、現在イギリスで実施されている自然葬法が、この葬送の世俗化とも呼べるような文脈において展開し、反面、近代化の中で合理化された葬送を市民の手に取り戻す動きの中で生起していることも明らかにした。これらの成果については、6月の「宗教と社会」学会、7月の駒沢宗教学研究会、また9月の日本宗教学会にてそれぞれ口頭発表を行った。さらに6月の口頭発表の内容は、2019年3月発行の駒沢宗教学研究会『宗教学論集』に論文として掲載されている。文献調査についてはほぼ予定通りの進捗だが、現地調査については2019年度の「若手研究者海外挑戦プログラム」に採択されたことでより長期での調査が可能となったため、研究計画には以下のような変更を加えることになった。まず調査地については、当初予定していたカーライル市営墓地ではなく、プログラムの受け入れ機関であるバース大学の周辺の自然葬地を調査地に設定し、さらに自然葬地だけではなく教会墓地、公営墓地、火葬場、葬儀社なども調査の対象にし、現代イギリスにおける葬送墓制を総合的に俯瞰し自然葬地の社会的な位置付けを把握することを目指した。このため、今年度の現地調査では、現地の研究者とのネットワーク作りと、調査予定の自然葬地での予備調査、また自然葬地申込者の全体的な属性や動向を探るために自然葬地申込者が記入したフィードバック・フォームの収集を行なった。こうした調査計画の変更はむしろ本研究を大幅に進展させるものであり、当初の計画通りとはいかなかったが順調な進展であると考えている。「現在までの進捗状況」でも述べたように、今年度はプログラムを利用してイギリスでの長期調査を行う予定である。調査においては実際の自然葬地申込者の語りを収集するとともに、イギリス社会における自然葬地の位置付けの把握を目指し、葬送に関わる多様なアクターを視野に入れ調査を実施する。9月にはバース大学で開催されるDeath, Dying and Disposalの国際学会にて、日本とイギリスの自然葬法の比較に関して発表を行う予定である。

文献調査についてはほぼ予定通りの進捗だが、現地調査については2019年度の「若手研究者海外挑戦プログラム」に採択されたことでより長期での調査が可能となったため、研究計画には以下のような変更を加えることになった。まず調査地については、当初予定していたカーライル市営墓地ではなく、プログラムの受け入れ機関であるバース大学の周辺の自然葬地を調査地に設定し、さらに自然葬地だけではなく教会墓地、公営墓地、火葬場、葬儀社なども調査の対象にし、現代イギリスにおける葬送墓制を総合的に俯瞰し自然葬地の社会的な位置付けを把握することを目指した。このため、今年度の現地調査では、現地の研究者とのネットワーク作りと、調査予定の自然葬地での予備調査、また自然葬地申込者の全体的な属性や動向を探るために自然葬地申込者が記入したフィードバック・フォームの収集を行なった。こうした調査計画の変更はむしろ本研究を大幅に進展させるものであり、当初の計画通りとはいかなかったが順調な進展であると考えている。「現在までの進捗状況」でも述べたように、今年度はプログラムを利用してイギリスでの長期調査を行う予定である。調査においては実際の自然葬地申込者の語りを収集するとともに、イギリス社会における自然葬地の位置付けの把握を目指し、葬送に関わる多様なアクターを視野に入れ調査を実施する。9月にはバース大学で開催されるDeath, Dying and Disposalの国際学会にて、日本とイギリスの自然葬法の比較に関して発表を行う予定である。
高分子系のスロー・ダイナミックスに関する計算機シミュレーション

昨年度から行っている、高分子のゲル電気泳動に関する研究に関して、ボンドゆらぎ模型によるシミュレーションの高速化を計るためのプログラムの改良(特に演算のベクトル化)を進めるとともに、ゲル(障害物)間隔αと高分子の慣性半径R_Iとがほぼ等しい領域を中心として、sieving領域(a>>R_I)からreptation領域(a<<R_I)にかけての高分子の振る舞いを解析した。その結果、モノマー数Nの高分子の拡散係数Dが、sieving領域におけるDN^<-1>の依存性からreptation領域におけるDN^<-2>の依存性へのクロスオーバーが見られた。現在、数値精度を上げた検証を進めている。(高分子系)ガラス物質を、ガラス転移温度T_gの高温側からT_g以下のある温度Tに急冷すると、その温度Tの平衡状態に達するまでにきわめて長い時間を要する。エイジング現象とよばれるものであり、ガラス物質にみられる典型的なスロー・ダイナミックスの一つである。本年度、このエイジング現象のシミュレーションを行うプログラムの開発を開始した。その取組と並行して、スピングラスにおけるエイジング現象のモンテカルロ・シミュレーションによる研究を行い、特に、スピングラスSK模型におけるエイジング現象について、種々の物理量の振る舞いを詳しく解析した。その結果、SK模型に関しては多数の準安定状態が存在することが既に知られているが、その位相空間において、系が高いエネルギーの準安定状態から熱活性化過程で順次より低いエネルギーの準安定状態へ、それぞれの時間スケールで位相空間の限られた領域で準平衡を保ちながら緩和していく機構を明らかにし、これを“Growth of Quasi-Equilibrium Domains"のシナリオとして提起するに到った。
第一原理熱力学に基づく異常原子価元素含有化合物の合成

二酸化チタンをモデル物質として異常高原子価元素の発現条件について精査した。大気圧下と超高圧下における合成実験の比較、共添加を行った実験などから、異常高原子価元素発現のためには、母材として添加元素よりも高い価数を持つ物質を選び、価数の低下を招く酸素空孔の形成を妨げることが重要であるとわかった。そのための手段として、封入、超高圧下における合成、母材よりも高い価数の元素の共添加が有用であると結論した。今年度は二酸化チタン中に添加した微量添加元素に関して、異常原子価を持つ可能性に関して実験・理論計算の両面から研究を行った。合成実験では、大気圧開放系における実験に注力し、ルチル型二酸化チタン中へ微量の3d遷移金属を添加した試料の合成を行った。合成条件として添加元素の濃度および焼成温度を変化させて試料の合成を行い、得られた試料に関してX線回折測定から求める格子定数のシフトから、添加した元素がルチル型二酸化チタン中に固溶していることを確認した。分光実験では、銅添加α-PbO2型二酸化チタン中の銅に関して測定を行ったX線吸収端近傍構造(XANES)スペクトルに関して標準物質および理論計算スペクトルとの比較によりその局所状態を決定し、銅がα-PbO2型二酸化チタン中のTiサイトにCu3+として置換固溶しうることを明らかにした。また、その濃度はおおよそ0.5 at%程度までであり、余剰の銅はCu2+として含まれることが分かった。理論計算では、常圧安定相であるルチル型二酸化チタン、高圧相であるα-PbO2型二酸化チタンに関して、Tiサイトを様々な3d遷移金属元素で置換したモデルを構築し、第一原理計算により、その安定構造およびXANESスペクトルの算出を行った。XANESの理論計算スペクトルの形状から、ルチル型二酸化チタンやα-PbO2型二酸化チタン中に固溶した3d遷移金属が、単純酸化物などの標準物質とは明確に区別できることを明らかにした。研究代表者が所属機関を異動したため、研究体制の構築に時間を要し、当初の予定から遅れが見られる。特に、放射光施設利用実験に関しては、今年度に予定していた分析実験は次年度に振り替えた。合成実験に関しては様々な3d遷移金属元素を微量添加した二酸化チタンの合成に成功しており、これらの試料に関しては次年度に放射光施設を用いたX線吸収分光法による局所状態分析を計画している。分光実験によりスペクトルが得られた際には、今年度に算出した理論計算スペクトルと比較を行うことで、直ちにその局所状態を決定できる。二酸化チタン中に添加した微量元素が、通常の単純酸化物では取りえない高原子価(異常高原子価)となることに関して合成と状態分析を行った。昨年度は高圧下で合成した試料を対象としたが、今年度は常圧下において合成した試料においても異常高原子価となるかに関して、試料の合成とX線吸収微細構造(XAFS)による分析を行った。まず、Cuを添加元素として、高圧下と常圧下で合成した試料を比較したところ、高圧下では微量の添加では異常高原子価であるCu3+という状態を示す一方で、常圧下で合成した試料ではCu2+として観測され、異常高原子価は示さなかった。このことから高圧環境が異常高原子価を引き起こす要因の一つであると言える。また、高圧下で合成した試料に関しても、添加元素の濃度が高くなると、通常の価数の元素が混在するような傾向が見られた。常圧下における試料の合成に関しても様々な添加元素で検討を行ったところ、Ti4+よりも高価数(5+)の元素と低価数(3+)の元素を共添加を行った試料では、格子定数や紫外可視吸収スペクトルが濃度に対して線型的ではない振る舞いをすることが見られた。共添加の比率を変えたりすることによっても振る舞いに変化が見られており、このことは、共添加した元素同士が互いに影響を与えていることを示しており、常圧下で合成した試料中においても異常原子価が発現している可能性を示唆している。詳細に関しては次年度に分析を行いたい。常圧下における異常高原子価発現の兆候が見られた点では順調であった。しかしながら、今年度に老朽化した校舎から新校舎への研究室の移転があり、移転の準備や移転作業、移転後の環境再構築に多大な時間を要した。そのため、研究をまとめる最終段階において遅延が生じている。昨年度に発見した複数の異種元素を共添加した二酸化チタンの特徴的な振る舞いに関し、今年度は固相反応法による試料の合成とX線吸収分光による添加元素の状態分析を行った。一例として、Ti4+よりも高価数(5+)の物質として五酸化二ニオブ(Nb2O5)、低価数(3+)の物質として三酸化二鉄(Fe2O3)を出発原料とした結果について記す。大気圧下で1200°Cにて焼成したところ、共添加したものは、Nb2O5、Fe2O3を単独で添加したものとは異なる色を呈した。Tiに対するFe濃度を固定し、そこに加えるNbの濃度を上げていくと、色が赤褐色から橙色を経て黄緑色へと連続的に変化した。Fe濃度を変化させた場合には同じ色を呈するNbの濃度も変化していった。このことから二酸化チタン中に共添加したNbとFeは互いに影響を与えていることが示された。詳細な解析のために、Fe-L2,3端のX線吸収端微細構造(XANES)の測定を行った。

標準物質として、四酸化三鉄(Fe3O4)や三酸化二鉄(Fe2O3)と比較したところ、二酸化チタン中に単独で添加したFeのFe-L2,3 XANESスペクトルは、四酸化三鉄(Fe3O4)とよく似た特徴であった。このことは、二酸化チタン中のFeは単独では二価と三価が混在していることを示している。一方、FeとNbを共添加した試料のFeでは三酸化二鉄(Fe2O3)と特徴が一致した。このことは、Nb添加の影響により、Feの価数が三価のみになったことを意味しており、共添加することで添加元素の価数制御ができることが示された。二酸化チタンをモデル物質として異常高原子価元素の発現条件について精査した。大気圧下と超高圧下における合成実験の比較、共添加を行った実験などから、異常高原子価元素発現のためには、母材として添加元素よりも高い価数を持つ物質を選び、価数の低下を招く酸素空孔の形成を妨げることが重要であるとわかった。そのための手段として、封入、超高圧下における合成、母材よりも高い価数の元素の共添加が有用であると結論した。今年度に作製した試料に関して、放射光施設を利用したX線吸収分光法により添加微量元素の状態分析を行う。得られたスペクトルは標準試料および今年度に算出した理論計算スペクトルと比較を行うことで、その局所環境・価数を決定する。また、合成実験では、大気圧閉鎖系および高圧閉鎖系における微量元素添加二酸化チタンの合成を行い、異常原子価含有の可能性を探る。さらにより高価数の元素で構成される物質として、酸化ニオブや酸化タングステンへの拡張を探る。今年度に発生した研究計画の遅延に関しては、補助事業期間を一年延長することで対応を行う。工学今年度の直接経費は概ね計画的に使用しており、次年度使用額は1万円以下となったが、無為な予算消化を行わなかったためそのまま次年度使用額として計上した。今年度に老朽化した校舎から新校舎への研究室の移転があり、その準備・移転作業・移転後の作業環境構築に多大な時間を要したため、研究が遅延・中断された。そのため、補助事業期間の延長を申請し、今年度の残額を次年度使用額として繰り越すこととした。当初の使用計画と大きな変更はなく、今年度に発生した次年度使用額は消耗品などの物品費として計上し、使用する。次年度における状態分析の実験のための施設使用料、旅費および研究発表(論文投稿料など)として使用する。
制御性免疫受容体を介した結核菌に対する免疫制御機構の解明

自然免疫受容体の一つであるC型レクチン受容体(CLR)には活性型と抑制型があり、それらのリガンド認識に伴う正負のシグナル伝達のバランスによって、自然免疫ならびに獲得免疫応答は適切に制御されている。これまでに我々は一連の活性型CLRが結核菌および損傷自己由来の糖脂質受容体として機能し、それぞれ特徴的な自然免疫及び獲得免疫応答を惹起することを明らかにしてきた。その一方で、生体の恒常性維持に寄与していると考えられている抑制型CLRについてはそのリガンドを含め依然として不明な点が多い。本研究では、抑制型CLRに着目し、病原体および損傷自己由来の新規リガンドの同定し、抑制型CLRがリガンドの認識を介してどのように免疫応答を抑制するのか解明することを目的とした。抑制型CLRの細胞内ドメインにCD3ζ鎖を結合させたキメラ受容体を発現するレポーター細胞の活性を指標として、死細胞由来の脂質活性画分の精製を行い、マススペクトロメトリーならびに核磁気共鳴スペクトルにより、抑制型CLRの新規脂質リガンドの構造を同定した。可溶性の抑制型CLR蛋白質を用いて死細胞に結合することを見出した。さらに活性化リガンド存在下で死細胞を投与すると、野生型に比べて抑制型CLRを欠損したマクロファージにおける炎症性サイトカインの産生上昇を認めた。本研究により、抑制型CLRの死細胞由来の新規脂質リガンドならびにリガンド認識を介した炎症性サイトカインの抑制効果が明らかになり、死細胞が有する炎症抑制機構を説明する新たな分子機序の可能性が示唆された。自然免疫受容体の一つであるC型レクチン受容体(CLR)には活性型と抑制型があり、それらの抗原認識に伴う正負のシグナル伝達のバランスによって、自然免疫ならびに獲得免疫応答は適切に制御されている。その一方で、生体の恒常性維持に寄与していると考えられている抑制型CLRについてはリガンドを含めその機能は依然として不明な点が多い。本研究では、抑制型CLRに着目し、病原体および損傷自己由来の新規リガンドの同定、ならびに、抑制型CLRがリガンドの認識を介してどのように免疫応答を抑制するのか解明することを目的とした。抑制型CLRの新規リガンドを同定するための検出ツールとして、まず、抑制型CLRの細胞内ドメインにCD3ζ鎖を結合させたキメラ受容体を発現するレポーター細胞を作製した。それらのレポーター活性を指標として、結核菌成分および死細胞成分に対する応答性を解析した。その結果、抑制型CLRは死細胞から抽出した脂質成分に対して顕著な応答性を示した。レポーター活性を指標として脂質画分の精製を行い、マススペクトロメトリーならびに核磁気共鳴スペクトルによる脂質リガンドの構造解析を行なった。その結果、抑制型CLRの新規脂質リガンドの構造ならびにその分子種について同定することが出来た。抑制型CLRの損傷自己由来の脂質リガンドについてその構造を同定した。生体内において抑制型CLRが自己由来の脂質リガンドの認識を通じて免疫応答の抑制化に関わるか、抑制型CLRを欠損あるいは高発現した遺伝子改変動物を用いて検証を行う予定である。(理由)当該年度に使用予定であった消耗品は概ね申請書通りであったが、所属機関の異動に伴い使用額に誤差が出た。そのため、次年度購入予定の消耗品購入代として繰り越した。(使用計画)次年度予算は申請額ならびに繰越額の合計額となるが、繰越額は消耗品購入に使用予定であり、全体的には大きな変更はなく申請書に記載された計画通りに使用予定である。
分布等価回路を用いた局所組織インピーダンスのパラメータ推定に関する研究

本研究課題は,非侵襲測定により得られるインピーダンス軌跡から等価回路モデルの各パラメータとそのばらつきを推定するアルゴリズムを構築し,組織の空間分布を把握することを目的としている.平成17年度においては研究の第3段階と最終段階として以下の検討を行った.研究の第3段階では,我々の研究グループが提案している分割電極を用いて,組織の断層図を得ることの可能性について検討した.分割電極とは,基本的には4電極法と同じであるが,電流電極,電圧電極は平板電極にスリットを入れて分割している.このとき,電流電極をすべて等電位とすることにより,隣の電極に漏れ電流が流れることなく,電流は電極の真下を流れる.これを実現するために,定電圧回路から構成される電流電極を用いて,簡易インピーダンス測定装置を試作し,その検証は昨年と同様,植物実験により行った結果,非侵襲でインピーダンスを測定できることを確認した.また,研究の最終段階として,実際の測定データに含まれている生体組織の持つ非一様性や測定時に生じる外部雑音が,推定精度に及ぼす影響について検証した.生体組織の持つ非一様性は等価回路モデルの各パラメータ値に乱数を用いてばらつかせ,測定時の外部雑音は測定モデルの各パラメータ値から計算したインピーダンスデータ(複素数)に雑音を加えて生成した.これらに,研究の初期段階で構築したパラメータ推定アルゴリズムを適用した結果,雑音レベルが大きいと組織のばらつきによる影響はほとんど見られないことを確認した.以上の結果より,非侵襲測定により得られるインピーダンス軌跡から組織の空間分布を把握することができた.最後に,本補助金の援助を与えて下さったことに対し謝意を表し,研究成果の報告とする.本研究課題は,非侵襲測定により得られるインピーダンス軌跡から等価回路モデルの各パラメータとそのばらつきを推定するアルゴリズムを構築し,組織の空間分布を把握することを目的としている.平成16年度においては研究の初期段階と第2段階として以下の検討を行った.研究の初期段階としては,我々の研究グループが提案しているガード電極付き分割電極を用いて,組織の断層図を得ることの可能性について検討した.分割電極で測定したインピーダンスデータを周波数依存性のないパラメータを要素とする等価回路で表現し,そのパラメータ推定アルゴリズムを物品費で申請したパーソナルコンピュータを用いて構築した.等価回路モデルとしては,層状構造モデルや,腫瘍がある層状構造モデルなどについて検討した.また,測定時において皮膚と電極との接触部分に生じる接触インピーダンスを考慮したモデルや,層の厚さと境界が未知のものとして層の厚さと境界の同時推定についても検討した.このとき,パラメータの推定方法にはガウス-ニュートン法を用いた.その結果,測定したインピーダンスデータに最小誤差で適合するパラメータ値を推定することができた.また,研究の第2段階として,物品費で申請したデジタル・ストレージ・オシロスコープとノートパソコンを用いた4電極法による簡易インピーダンス測定装置を試作した.本研究では,組織を切除してその断面を見なければならないため,検証は実験の利便性を考慮して植物(今回は大根)実験により行った.その結果,非侵襲でインピーダンスを測定できることを確認できた.本研究課題は,非侵襲測定により得られるインピーダンス軌跡から等価回路モデルの各パラメータとそのばらつきを推定するアルゴリズムを構築し,組織の空間分布を把握することを目的としている.平成17年度においては研究の第3段階と最終段階として以下の検討を行った.研究の第3段階では,我々の研究グループが提案している分割電極を用いて,組織の断層図を得ることの可能性について検討した.分割電極とは,基本的には4電極法と同じであるが,電流電極,電圧電極は平板電極にスリットを入れて分割している.このとき,電流電極をすべて等電位とすることにより,隣の電極に漏れ電流が流れることなく,電流は電極の真下を流れる.これを実現するために,定電圧回路から構成される電流電極を用いて,簡易インピーダンス測定装置を試作し,その検証は昨年と同様,植物実験により行った結果,非侵襲でインピーダンスを測定できることを確認した.また,研究の最終段階として,実際の測定データに含まれている生体組織の持つ非一様性や測定時に生じる外部雑音が,推定精度に及ぼす影響について検証した.生体組織の持つ非一様性は等価回路モデルの各パラメータ値に乱数を用いてばらつかせ,測定時の外部雑音は測定モデルの各パラメータ値から計算したインピーダンスデータ(複素数)に雑音を加えて生成した.これらに,研究の初期段階で構築したパラメータ推定アルゴリズムを適用した結果,雑音レベルが大きいと組織のばらつきによる影響はほとんど見られないことを確認した.以上の結果より,非侵襲測定により得られるインピーダンス軌跡から組織の空間分布を把握することができた.最後に,本補助金の援助を与えて下さったことに対し謝意を表し,研究成果の報告とする.
癌抑制遺伝子RASSF1が脳腫瘍に及ぼす増殖能・遊走能の解明

肺癌の発生に関与するがん抑制遺伝子としてRASSF1Aは、2000年にクローニングされ、promoter領域のCpG islandのメチル化によりその発現が抑制されることが報告された。その後RASSF1Aのメチル化による不活化は他の様々な腫瘍でも報告され、我々は、脳腫瘍、特に神経膠腫において同様の報告をした。その後のRASSF1Aの機能解析が進み、増殖能に関与するばかりでなく、微小管の安定、細胞移動の制御に関与していることが最近明らかとなってきた。浸潤性の進展様式をとる神経膠腫の病態解明において、ARASSF1Aの神経膠腫による増殖能、遊走能に関する機能実験を行うことは重要と考えられる。<本年度の進行状況>脳腫瘍臨床検体の収集、凍結保存、一次培養、DNAの抽出を行った。また、神経膠腫cell lineを用いて、脱メチル化剤として知られる5-Aza-2' deoxycitidineを添加することにより,メチル化より不活化されたRASSF1A遺伝子再発現による遊走能の差異につき調べた。具体的にはConfluentに達した培養細胞面の一部をスクラッチし、5-Aza-2' deoxycitidine付加群と対照群による遊走に関する比較実験を24時間、48時間の時点で解析した。形態学的な変化、および遊走に関する有意な差異は認められなかった。5-Aza-2' deoxycitidineの濃度は、5μM、10μM、20μMの各条件での濃度依存性は認められなかった<来年度の計画>RASSF1A特異的なsiRNAによるノックダウンによる脳腫瘍の浸潤能、増殖能の解析を計画している。また、5-Aza-2' deoxycitidineは、血液系腫瘍の治療薬としてすでに臨床応用されており、脳腫瘍治療における臨床応用の可能性も視野に入れて研究を継続する。