hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
子宮頚癌の発癌過程におけるヒトパピローマウイルス感染と宿主および環境因子の関与

1.子宮頚癌へ進行する危険因子としての地理、年齢、異形成の程度、HPV異形成症例の多変量解析により、癌に進行する危険因子としては異形成が高度であることと、HPV感染の存在が独立した危険因子であった。なお、子宮頚癌の発生率が高いエクアドルと日本の比較で、HPV感染に差はなく環境因子、食生活などの違いを検討する必要が示唆された。2.子宮頚部異形成発生におけるレチノイドの関与に関するケースコントロール研究異形成症例のケースコントロール研究により、ケース群ではコントロール群に比較して血液中のレチノイド群が低いことが判明した。これにより、異形成にレチノイドが抑制的に関与し、レチノイドによるchemopreventionの可能性が示唆された。3.子宮頚部扁平上皮癌の発癌過程におけるp53の関与子宮頚部扁平上皮癌を対象としたp53の遺伝子解析の結果、4%の点突然変異しかみられず、子宮頚癌の発癌過程におけるp53の関与は遺伝子変異によるものではなく、HPVのE6遺伝子産物によるp53蛋白の不活化が主たるものであることが示唆された。4.子宮頚癌および前癌病変におけるHPVの存在、p53、サイクリンD1、Ki-67、Bcl-2の発現およびアポトーシス子宮頚部浸潤癌、上皮内癌異形成において細胞周期の促進因子であるサイクリンD1および癌制御遺伝子p53の発現蛋白はともに各病変で差が見られなかった。TUNEL法によるアポトーシスの検出では病変が進行するにともない減少していた。一方、アポトーシス抑制遺伝子であるbcl-2遺伝子の蛋白発現および細胞増殖因子Ki-67は病変進行にともない増加しており、アポトーシスと逆相関の関係にあった。以上の結果から、HPV感染により異形成が生じて細胞増殖が亢進することと、アポトーシスが抑制されることにより、異型細胞が排除されずに増殖が持続することが癌化を促進させる機序の一つであると思われた。以上、平成8-9年度の年度の研究によって子宮頚癌の癌化過程にはHPV感染に加えて、アポトーシスおよび関連遺伝子が深く関与していること、さらにレチノイドによるchemopreventionの可能性が明らかとなった。1,子宮頚癌へ進行する危険因子としての地理、年齢、異形成の程度、HPV異形成症例の経過追跡調査と多変量解析により、癌に進行する危険因子としては初回生検標本で異形成が高度であることと、HPV感染の存在が独立した危険因子であることが明らかとなった。なお、子宮頚癌の発生率が高いエクアドルと日本の比較において、HPV感染率に差はなく環境因子、食生活などの違いを検討する必要が示唆された。2,子宮頚部扁平上皮癌の発癌過程におけるp53の関与子宮頚部扁平上皮癌を対象とした癌抑制遺伝子p53の遺伝子解析の結果、4%の点突然変異しかみられなかった。したがって、子宮頚癌の発癌過程におけるp53の関与は遺伝子変異によるものではなく、HPVのE6遺伝子産物によるp53蛋白の不活性が主たるものであることが示唆された。3,子宮頚癌および前癌病変におけるHPVの存在、p53、サイクリンD1、Ki-67、Bc1-2の発現およびアポトーシス子宮頚部浸潤癌、上皮内癌、異形成において癌の進展に関与する生物学的パラメーターの違いを解析した。細胞周期の促進因子であるサイクリンD1および癌抑制遺伝子p53の発現蛋白はともに各病変で差が見られなかったTUNEL法によるアポトーシスの検出では病変が進行するにともない減少していた。一方、アポトーシス抑制遺伝子であるbc1-2遺伝子の蛋白発現および細胞増殖因子Ki-67は病変進行にともない増加しており、アポトーシスと逆相関の関係にあった。以上の結果から、HPV感染により異形成が生じて細胞増殖が亢進する。さらに、アポトーシスが抑制されることにより、異型細胞が排除されずに増殖が持続することが癌化を促進させる機序の一つであると思われた。以上、本年度の研究によって子宮頚癌の癌化過程にはHPV感染に加えて、アポトーシスおよび関連遺伝子が深く関与していることが明らかとなった。

TUNEL法によるアポトーシスの検出では病変が進行するにともない減少していた。一方、アポトーシス抑制遺伝子であるbcl-2遺伝子の蛋白発現および細胞増殖因子Ki-67は病変進行にともない増加しており、アポトーシスと逆相関の関係にあった。以上の結果から、HPV感染により異形成が生じて細胞増殖が亢進することと、アポトーシスが抑制されることにより、異型細胞が排除されずに増殖が持続することが癌化を促進させる機序の一つであると思われた。以上、平成8-9年度の年度の研究によって子宮頚癌の癌化過程にはHPV感染に加えて、アポトーシスおよび関連遺伝子が深く関与していること、さらにレチノイドによるchemopreventionの可能性が明らかとなった。1.子宮頚癌へ進行する危険因子としての地理、年齢、異形成の程度、HPV異形成症例の多変動解析により、癌に進行する危険因子としては異形成が高度であることと、HPV感染の存在が独立した危険因子であった。なお、子宮頚癌の発生率が高いエクアドルと日本の比較で、HPV感染率に差はなく環境因子、食生活などの違いを検討する必要が示唆された。2.子宮頚部異形成発生におけるレチノイドの関与に関するケースコントロール研究異形成症例のケースコントロール研究により、ケース群ではコントロール群に比較して血液中のレチノイド群が低いことが判明した。これにより、異形成発生にレチノイドが抑制的に関与し、レチノイドによるchemopreventionの可能性が示唆された。3.子宮頚部扁平上皮癌の発癌過程におけるp53の関与子宮頚部扁平上皮癌を対象としたp53の遺伝子解析の結果、4%の点突然変異しかみられず、子宮頚癌の発癌過程におけるp53の関与は遺伝子変異によるものではなく、HPVのE6遺伝子産物によるp53蛋白の不活化が主たるものであることが示唆された。4.子宮頚癌および前癌病変におけるHPVの存在、p53、サイクリンD1、Ki-67、Bc1-2の発現およびアポトーシス子宮頚部浸潤癌、上皮内癌異形成において細胞周期の促進因子であるサイクリンD1および癌抑制遺伝子p53の発現蛋白はともに各病変で差が見られなかった。一方、アポトーシス抑制遺伝子であるbc 1-2遺伝子の蛋白発現および細胞増殖因子Ki-67は病変進行にともない増加しており、アポトーシスと逆相関の関係にあった。
高等学校新課程における課題解決のための新しい化学実験の開発に関する研究

日本理化学協会の全国調査結果において,「化学基礎」(2単位)を実施している教員の多くが「十分時間がない」という理由で授業において生徒実験を少なくしたり,断念したりしている状況が浮き彫りになった。本研究は,学習指導要領の目的を確実に達成するために,これまで高校化学の分野の中で,生徒実験として扱われて来た内容の見直しをはかり,生徒自らが進んで化学的なものの見方考え方を身につけようとする意欲を醸成させるように新たに改善し構築した実験カリキュラムを提案し実践を広めることを狙った。特に今回は,「化学基礎」に焦点を当て,新たに一つ一つの実験授業を約30分で完結させる内容に改善する事を目指し,残りの約20分は講義用の時間に活用できるような実験講義までを総括的に実施できる構成を提唱した。改善のポイントとして,作業効率の適正化,作業のルーチン化,作業の普遍化などを掲げ,経験の少ない化学の教員でも負担無く実践できるように工夫を試みた。改善したもののうちの一つの例として,「化学基礎」の高分子の学習にあたる,「ナイロン6」の合成実験を含む実験授業を新たに構築して実践して得た成果について,平成26年度全国理科教育大会にて口頭発表し,多くの高校の現場で実際に指導に当たっている教員の方々から好評を得ることができた。今後は,本研究をさらに広く展開し,「化学基礎」に留まらず標準4単位の「化学」の内容についても新たに改善していくことを考えている。
バングラデシュ北東部の湿地におけるスナドリネコと人との関係

本研究は、バングラデシュ北東部の内陸湿地の住民とスナドリネコの関係を多面的にとらえ、軋轢だけでない側面を明らかにすることで、住民によるスナドリネコの捕殺を減少させることを最終目的とする。特に地域住民の食料確保に着目し、スナドリネコが及ぼす「損失」と「利益」の両側面を明らかにする。つまり、淡水魚や家禽を捕食し、「損失」を与える一方、農業・漁業に害を与える他の動物の捕食者・競合者として間接的に「利益」をもたらすのではないかと仮定し、研究を進める。一年目となる本年度は主に以下について取り組んだ。1.スナドリネコと他の食肉目のフンの識別:試験的に採取したフンから、スナドリネコのフンと同所的に生息する他の食肉目のフンとの識別方法を検討した。スナドリネコの毛と他の食肉目の毛を比較した結果、太さ、硬さ、毛色、毛髄、毛小皮のいずれあるいはいくつかが異なり、毛づくろい行動により混入する個体自身の毛をフンから取り出すことで種の識別が可能であると考えられた。2.スナドリネコに関する聞き取り調査:パイロット調査に基づき、乾季にあたる2018年11月2019年3月にかけて約300世帯に家禽損失のリスク認識などに関する聞き取り調査を行った。他の食肉目と比較すると、スナドリネコによる家禽の損失の頻度・深刻度は少ないとの認識であった。一方、スナドリネコを捕殺しようとする意図は強く、経済的損失や家禽に関するリスク認識のみでは住民の捕殺行動を説明できないことが明らかになった。地域の食料確保におけるスナドリネコがもたらす「損失」と「利益」を明らかにする点については、おおむね順調に進んでいる。実際の家禽の捕食の有無や、農業害獣とされているネズミの重要性を議論する根拠となる食性分析の準備は整い、乾季のフィールド調査にてサンプルも取得できた。少数であるため、今乾季もサンプル収集は必要であるものの、残りの2年間で達成できる見込みである。また、聞き取り調査により、経済的な損失やリスク認識が必ずしも捕殺に結びついていないことなどが明らかになり、経済的な認識以外の部分へ研究対象を拡大することとしたが、大きな変更は生じない。一方、英国・スターリング大学で研究が進められている生物多様性の保全と食料保障の軋轢モデルを応用し、保全政策を検討する点については、バングラデシュのスナドリネコの事例の場合、現行のモデルをそのまま応用することは困難であり、より先進的なモデルを設計していく必要があった。そこで、まず、サブモデルの一つである資源利用ユーザーの行動パターン予測について、研究を進めているところである。本研究の目的は地域住民の食料確保におけるスナドリネコの「損失」と「利益」の両側面を明らかにすることである。しかし、今年度の聞き取りにより、人々の意図形成には、経済的な損失に加え、社会的規範やスナドリネコへの恐れの感情が関わっていることが示唆された。そこで、次年度は、スナドリネコが捕食する魚・家禽・ネズミの割合をフン分析から明らかにするとともに、経済的な側面だけでないスナドリネコと地域住民の関りについて調査を行う。また、保全政策の検討に向け、法的規制に関するシナリオに対し、地域住民がどのように反応するかを調べる。

一方、英国・スターリング大学で研究が進められている生物多様性の保全と食料保障の軋轢モデルを応用し、保全政策を検討する点については、バングラデシュのスナドリネコの事例の場合、現行のモデルをそのまま応用することは困難であり、より先進的なモデルを設計していく必要があった。そこで、まず、サブモデルの一つである資源利用ユーザーの行動パターン予測について、研究を進めているところである。本研究の目的は地域住民の食料確保におけるスナドリネコの「損失」と「利益」の両側面を明らかにすることである。しかし、今年度の聞き取りにより、人々の意図形成には、経済的な損失に加え、社会的規範やスナドリネコへの恐れの感情が関わっていることが示唆された。そこで、次年度は、スナドリネコが捕食する魚・家禽・ネズミの割合をフン分析から明らかにするとともに、経済的な側面だけでないスナドリネコと地域住民の関りについて調査を行う。また、保全政策の検討に向け、法的規制に関するシナリオに対し、地域住民がどのように反応するかを調べる。
ケイ素遊離基の安定化因子の解明と新規還元剤の開発

有機合成化学における還元反応は、酸化反応と共に、重要な反応である。特に遊離基還元は官能基選択性やその手軽さから多方面で利用されている。この様な反応では、様々な理由からヒドロシランが使用されているが、その反応性はあまり高くない。本研究では、これらの反応性を高める因子、即ち、ケイ素遊離基の安定化因子の解明と新規還元剤の開発を目的に研究を行った。先に我々は、9,10-位にケイ素原子を含むアントラセン誘導体(1)が還元剤として有効であることを報告し、中間に生成するシリルラジカルの安定性が重要であることを提案した。本研究では1の誘導体を含む種々の新規ヒドロシランを創製し、その反応性を試した。我々は、1の反応性の活性化因子は新たな渡環(p-d)π相互作用であると提案したが、別の研究グループから立体障害による安定化や超共役であるとの提案もあった。そこで、種々の置換基を持つ1の合成を行い、それらを用いた光化学的に発生させたシリルラジカルの安定性を異性化を目安として測定した。その結果、立体因子は安定化因子とは考えにくく、渡環(p-d)π相互作用が考えられる最も有力な因子であると推測された。したがって、この考え方に基づいた還元剤設計を行い、新規ヒドロシランの合成を行い、反応性を調べた。また、1に関係する周辺化合物の化学的考察も行った。その結果、(1)現在までに合成した種々のヒドロシランの還元性を確かめたが、アントラセン誘導体を超えるような化合物は得られていない。(2)生成するシリルラジカルの安定性については諸説あるが、光化学的に確かめたアントラセン誘導体のラジカル異性化より、我々が以前より提案している(p-d)π渡環相互作用によると考えるのが最も妥当であろう。(3)今後、この研究を推し進めることにより、ただ単に合成試剤の開発に留まることなく、含ケイ素芳香族化合物の合成や新しい機能を発現するケイ素化合物の探索にも繋がる結果が得られたと思われる。有機合成化学における還元反応は、酸化反応と共に重要な反応であり、特に、遊離基的還元は官能基選択性やその手軽さから多方面で利用されている。一方、スズ化合物の毒性を考慮すると、ヒドロシランを同様な反応条件で還元剤として利用できれば、完全なスズ代替品となるが、ケイ素一水素の結合解離エネルギーは大きく、修飾シランの合成の検討を要する。近年、(Me_3Si)_3SiH(1)や(MeS)_3SiH(2)などが目的に合致する化合物として報告されているが、これらの合成はそれほど容易ではない。先に我々は、9,10-位にケイ素原子を含むアントラセン誘導体(3)が還元剤として有効であることを報告し、中間に生成するシリルラジカルの安定性が重要であることを提案した。本研究では、このシリルラジカルの安定化因子を解明して次なる還元剤の分子設計を行うことを目的とした。化合物1や2が還元剤として有効であるのは、生成するシリルラジカルが超共役により安定化されるからであると言うのが現在の通説である。それに対して我々は、3に於いては9-位に生成するラジカルは10-のケイ素原子のd軌道との(p-d)π渡環相互作用またはベンゼン環との共役により安定化されていると考えた。

そこで、10-位にイオウ原子を導入したアントラセン誘導体を合成し、その還元性を確かめ、期待するような結果を得た。また、ナフタレンの9,10-位にシリル基を導入して(p-d)π隣接基関与を目論んだが、結果はあまり好ましくなかった。これは立体障害による2つの置換基の位置関係が好ましくないことが推測された。現在は、種々の置換基を持つ3の合成とそれらを用いた光化学的に発生させたシリルラジカルの安定化反応を検討しながら安定化因子の解明を行っている。有機合成化学における還元反応は、酸化反応と共に、重要な反応である。特に遊離基還元は官能基選択性やその手軽さから多方面で利用されている。この様な反応では、様々な理由からヒドロシランが使用されているが、その反応性はあまり高くない。昨年に引き続いて、反応性を高める因子、即ち、ケイ素遊離基の安定化因子の解明を目的に研究を行った。昨年度からの継続研究で、種々の新規ヒドロシランを創製し、その反応性を試した。現在までに得られた結果では、9,10-位にケイ素原子を含むアントラセン誘導体(1)が最も良い還元剤であることが示された。我々は、この活性化因子を新たな渡環(p-d)π相互作用であると提案したが、別の研究グループから立体障害による安定化であるとの提案もあった。そこで、本年度は、種々の置換基を持つ1の合成を行い、それらを用いた光化学的に発生させたシリルラジカルの安定性を異性化を目安として測定した。その結果、立体因子は安定化因子とは考えにくく、渡環(p-d)π相互作用が考えられる最も有力な因子であると推測された。現在は、この考え方に基づいた還元剤設計を行い、新規ヒドロシランの合成を行っている。その他、本年度はこの研究に関係する周辺の化学的考察も行った。
自殺遺伝子導入幹細胞による悪性グリオーマの治療研究

治療に難渋する悪性脳腫瘍に対しての骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)/ganciclovir(GCV)を用いた自殺遺伝子療法の研究を行った。ラットC6脳腫瘍細胞に対し、herpes simplex virus-thymidine kinase(HSVtk)を導入したMSC(MSCtk)を用いて治療を試みた。In vitroでは、MSCtk:C6の細胞比率が1:128でも抗腫瘍効果を示し、1:32で完全な腫瘍死滅効果が得られた。培養顕微鏡での観察では、MSCtkが48時間以上生存し、bystander効果が続いていく様子が観察された。In vivoでのラットを用いた研究では、腫瘍縮小効果と、生存曲線の延長が確認された。安全性の確認では、in vitroにおいてneuronおよびgliaの初代培養上にてMSCtk/GCV治療を行ったが、正常脳細胞に対する影響は見られず、in vivoにおいては治療ラットの経時的な組織学的検索を行ったが、正常脳細胞に対する影響は認められなかった。MSCtk/GCV治療は、効果的で安全な治療であると考えられた。悪性神経膠腫の治療として、骨髄幹細胞を用いた遺伝子治療の臨床応用に向けての基礎実験を行うことが本研究の目的である。In vitroにおけるMSCtkの脳腫瘍細胞に対する効果の検討では、MSCtkとC6(ラット脳腫瘍細胞)とを混在培養し、ganciclovir(GCV)を投与し、異なった細胞比率にて、効果がどのように出るか調査した。1:32でも脳腫瘍細胞の死滅効果が得られた。また、より早期のGCV投与にてより効果が得られ、投与期間は3日間以上が望ましいことが分かった。自殺遺伝子療法が正常細胞に及ぼす影響の検討では、neuron primary cultureを行い、その培養中で、C6およびMSCtkを混培養しGCVを投与し、Bystander効果発現時のneuronへ与える影響および抗腫瘍効果を観察した。この実験により、bystander効果が発現されても、正常脳細胞へ与える影響は見られなかった。今回の実験にて、MSCtkを用いた悪性脳腫瘍に対する治療は補助療法として十分効果が期待できた。また、今後の臨床応用へのプロトコール作成に重要な基礎実験を行うことができた。現在、in vivoでの研究を遂行中である。治療困難な悪性神経膠腫の治療の選択肢となり得る研究が進んでいることは、悪性脳腫瘍の治療に難渋している臨床の現場において、希望の光となるものである。臨床実験へと進めば、多大なインパクトを与えるものである。前年度は主にin vitroでの研究を行ったが、今年度はin vivoでの研究が主であった。MSCの移動能の調査では、SDラットC6脳腫瘍モデルを作製し、3日目にGFP-MSCtkを同側脳内に注入した後、経時的に脳を取り出し、蛍光顕微鏡にて観察しMSCtkの腫瘍への集積を観察した。翌日より脳腫瘍へのMSCtk集積が始まり、MSCtk注入2日後までは比較的急峻な増加曲線が得られ、後7日目までは緩やかな増加を見た。MSCtkの経静脈投与では、非常に少ない集積しか得られなかった。ラットでのMSCtkを用いた治療効果の検討では、SDラットC6脳腫瘍モデルを作製し、3日目に同側脳内にMSCtkを注入、翌日よりGCVの腹腔内投与を7日間行った。対象ラットの一部は20日目に脳を取り出し、腫瘍の大きさを検討、一部では生存曲線の調査を行った。治療群では、明らかな腫瘍の縮小と、生存曲線の延長が確認された。一部には治癒と思われる例も認められた。今回の実験にて、MSCtk/GCVを用いた悪性脳腫瘍に対する治療は補助療法として十分効果が期待できた。
広汎性発達障害児のコミュニケーション能力に働きかけるリズム遊びの教材開発

本研究は、知的障害教育校の教育課程の一環として行われた集団リズム遊びである5つの教材について、広汎性発達障害児のコミュニケーション能力に働きかける可能性を検証することを目的とした。実践を通して、主体的な対応ができていること、動きが多様に広がるとともに質的変化が見られたことが認められた。また、無意図的な模倣から意図的な模倣に移行している。これらから、リズム遊びは、広汎性発達障害児のコミュニケーション能力の向上に有効であることが実証できた。平成25年度は、研修や文献を通して広汎性発達障害について理解を深めるとともにダンスセラピーやムーブメント教育の動向について先行研究を調査し、データベースの作成および問題点の解析を行うことを主とした。具体的な実績は次のとおりである。1.ダンスセラピーやムーブメント教育に関する国内における先行研究の分析検討及び関連する先行研究の主要授業モデルの分析検討は概ね進んでいる。2.各種ワークショップに参加し(8/3・4,12/21,3/29・30)、広汎性発達障害児のリズム遊びに有効な実践資料の収集を行った。3.本学部附属特別支援学校小学部において指導実践を引き続き行い(12/2・13・19)、これまでのまとめを日本教育大学協会全国保健体育・保健研究部門全国創作舞踊研究発表会で報告した(12/21)。平成26年度は、前年度未着手であった、全国の特別支援学校知的障害教育校を対象に、ダンス領域の実践がどのような目的、内容、頻度で行われ、どのような成果と問題点があるのかを明らかにするとともに、実践を通してリズム遊びの有効性に関する基礎的資料を得ることができた。1.ウエブ検索(全知P連ホームページ中の概要(会員校))により,全国特別支援学校知的障害教育校704校のうち小学部のある565校をデータベース化し,単一障がい学級を分析対象として、教育課程の実態を調査した。分析の観点は,編成,授業時数,ねらい,学習内容(教材,実践事例など)である。検索期間は,平成26年6月9月であった。その成果を第66回舞踊学会(平成26年11月30日、日本女子体育大学、抄録:舞踊學第37号p.68)で発表した。2.本学部附属特別支援学校小学部で指導実践(平成27年1/16,23,2/9)を行い、映像分析と学部指導主事へのインタビューにより成果を検討した。その結果を実践報告として第34回全国創作舞踊研究発表会(平成27年2月8日、筑波大学)で発表した。3.宇都宮大学地域連携活動事業費の助成を受け、栃木県の小中高教員の協力を得て「小中高の連携を意図した表現運動・ダンスの指導」の実践内容を報告書としてまとめた(平成27年3月31日、全92頁)。本書の中に特別支援学校におけるダンス領域指導についても3例掲載し、次年度報告書作成に向けての布石とした。平成27年度は、引き続いて実践による検証を行うとともに、その成果を報告、活用することに努めた。ビデオ収録を動作学的に分析した結果、反応が乏しいと思われていた対象児に、小さいながらも模倣表現が見られ、主体的な動きも確認することができ、成果が検証された。具体的な実績は以下の通りである。1.実践の内容及び動作学的分析によるその成果を、日本体育学会第66回大会(平成27年8月)において口頭発表するとともに、『宇都宮大学教育学部教育実践紀要』創刊号(8月)、『舞踊教育学研究』第17号(10月)にまとめた。また、知的障害教育におけるダンス教材の指導実践と課題について、『宇都宮大学教育学部研究紀要第1部』第66号(平成28年3月)で報告した。2.実践による検証は、引き続いて6歳児から12歳児まで18名を対象として2回各45分間行った(平成28年1/19,25)。計画していた継続的な実践はできなかったが、3年間計8回の実践を通して成果を確認でき、その実践内容の一部は附属特別支援学校教員による指導のもと、公開研究会において成果として報告された。3.実践による成果をもとにして、全国女子体育研究大会(東京大会)特別支援分科会指導助言者(11月)並びに特別支援に関連する研究会講師(9月、平成28年2月)を務めることができ、また、女子体育連盟夏期講座講師(8月)として実践内容の一部を紹介した。これら研究会の研究協議等を通して、現状と課題について検討し、今後の実践へ反映させた。動作分析による成果の検証を対象者数、分析観点の面から見直し、より確実なものとする必要がある。また、附属学校教員の指導成果をもとに、これまで実践し、有効であった内容を「誰でも」指導できる教材として一般化の方策を探ること、そのために、さらに多くの指導者による指導実践を行うことが必要である。平成28年度本研究のまとめとして以下のことを行った。1.研究発表論文(2件)、口頭発表(1件)対象児5名(うち1名はダウン症児)の分析から有効性について検証した。2.シンポジウム開催1)日時:平成29年3月4日(土)13:0016:15 2)内容:基調講演2題「子どもたちの主体的な学びを共創するICFの理念」池本喜代正先生(宇都宮大学)、「障害のある人達と探ったダンスの力ー教えないダンス指導ー」佐分利育代先生(鳥取大学名誉教授)、シンポジウム(実践報告2題「地域連携によるダンス作品の協同制作と上演活動」

熊谷佳代先生(岐阜大学)、「小学部におけるリズム遊びの実践を通した学びについて」茅野理子(宇都宮大学)を含む)、質疑応答3)参加者:30名特別支援学校教員12名、小学校教員2名、大学教員2名、学生7名、一般7名(退職教員等を含む)であった。参加者からは、音楽の選び方,重度の障がいをもった生徒とのかかわり、教師が笑顔で接する秘訣などが質問として挙がった。3.報告書作成1)「広汎性発達障害児のコミュニケーション能力に働きかけるリズム遊びの教材開発」(平成29年3月31日)全78ページ、80部;内容は、発表論文(一部加筆修正)、シンポジウム内容、参考文献一覧から構成。2)「特別な支援を必要とする子どもたちがともに学びあう集団リズム遊び(実践編)」(平成29年3月31日)全26ページ、900部;内容は、5つの教材例を提示。本研究は、知的障害教育校の教育課程の一環として行われた集団リズム遊びである5つの教材について、広汎性発達障害児のコミュニケーション能力に働きかける可能性を検証することを目的とした。実践を通して、主体的な対応ができていること、動きが多様に広がるとともに質的変化が見られたことが認められた。また、無意図的な模倣から意図的な模倣に移行している。これらから、リズム遊びは、広汎性発達障害児のコミュニケーション能力の向上に有効であることが実証できた。ウエブ検索による調査から、実態と課題を明らかにすることができた今年度3回の実践ではあったが、コミュニケーション能力に働きかけるリズム遊びとしての有効性をビデオ分析や小学部指導主事へのインタビューから確認することができた。これまでの研究の発展として、附属学校教員との共同研究を推進するとともに、公立校における指導実践を依頼し、誰でも指導できる教材としての有効性を検証する。講習会の開催などを通して普及に努める。実践成果並びに教材例をまとめた報告書を作成する。舞踊教育学今年度実施した報告書の作成を基に、附属特別支援学校教員並びに県内の特別支援学校教員の協力を得て、教材開発した実践内容を報告書にまとめる。そのために、1.附属特別支援学校での実践を引き続き行う。2.県内の特別支援学校教員と月1回程度の研究会を持ち、授業モデルを実践、検証する。3.本学部特別支援教育の大学教員から専門的な助言を受ける。平成25年度は、栃木県を中心とした特別支援学校を対象に質問紙調査を行い、ダンス領域の実践がどのような目的、内容、頻度で行われ、どのような成果と問題点があるのかを明らかにすることも研究内容としていたが、それについては、未調査である。またダンスセラピーやムーブメント教育に関する国外における先行研究の分析検討は遅れている。補助事業の目的をより精緻に達成するための研究の実施(追加実践、学会参加、論文投稿など)をするため。教材開発したリズム遊びの一般化をめざし、以下の内容を実施するため。1講習会の開催と栃木県を中心とs他特別支援学校、公立小学校において実践を重ね、その結果を論文に投稿する。2本学教育学部附属特別支援学校並びに栃木県特別支援学校教員と共同研究を推進し、実践を通して有効であった内容を指導書としてまとめる。実態と課題をより鮮明にするための栃木県内の特別支援学校におけるアンケート調査を改めて行うとともに引き続いて国外における文献収集を行うため。昨年度実施できなかった年間を通しての実践に係る交通費等が生じるため。
転写因子群C/EBPファミリーによる関節疾患制御

CCAAT/エンハンサー結合タンパク質(C/EBP)betaは軟骨細胞の分化増殖を制御することが知られているが、今回我々は軟骨細胞における他のC/EBPファミリー分子の作用を解明すべく本研究を実施した。転写活性化ドメインを有するC/EBPファミリー分子ではCebpb、Cebpdの発現が豊富であった。軟骨細胞株による解析により、Cebpa, Cebpb, Cebpdには軟骨同化分子を抑制し、変性関連分子を誘導することが明らかになった。C/EBP共通のドミナントネガティブフォームであるACEBPは、これらと反対に軟骨細胞の同化を促進し、変性を抑制することが分かった。CCAAT/エンハンサー結合タンパク質(C/EBP)は共通のロイシンジッパー構造を持つ6種類のファミリーから成る転写因子群であり、各々が様々な細胞において炎症・増殖・代謝など幅広い機能制御を担っている。申請者らは過去に、軟骨細胞でドミナントに働くC/EBPβの変形性関節症促進作用を報告したが、最近複数のC/EBPファミリー分子が軟骨細胞の炎症やアポトーシスに強く関与することを示唆するデータを得た。本研究では、C/EBPファミリー分子が変形性関節症と炎症性関節疾患の発症、進行をどのように制御するかを総合的に解明するため、疾患サンプルにおける発現解析、機能解析を行う。C/EBPファミリーのうち転写活性化ドメインを有するCebpa, Cebpb, Cebpd, Cebpeの4つの分子のマウス関節軟骨での発現をmRNAレベルで測定したところ、Cebpbの発現が最も豊富であり、Cebpdの発現がその半分程度であったが、他の分子の発現は2桁以上低かった。関節軟骨変性に伴う発現量の変化を解析したが、ともに初期には増加し、末期には減少していた。ヒト患者サンプルでの解析でも同様の結果が得られ、Cebpは変性初期に病態に関与している可能性が考えられた。細胞株に過剰発現させる実験では、Cebpb, Cebpdともに軟骨基質分解酵素を誘導する作用が確認された。各ファミリー分子に比較的類似した作用が見られたことから、全ファミリーに共通したドミナントネガティブフォームを用いた解析も行っていく。発現解析、細胞レベルでの解析は当初の予定通りである。CCAAT/エンハンサー結合タンパク質(C/EBP)は共通のロイシンジッパー構造を持つ6種類のファミリー分子からなる転写因子群であり、各々が様々な細胞において、炎症、増殖、代謝など幅広い機能制御を担っている。申請者らは過去に、軟骨細胞でドミナントに働くC/EBPβの変形性関節症の促進作用について報告したが、その後、他のC/EBPファミリー分子が関節軟骨に発現し、多様な作用を有することが分かったため、その全貌を解明すべく本研究を実施している。C/EBPファミリー分子のうち、転写活性化ドメインを有するCebpa, Cebpb, Cebpd, Cebpeの4つについて発現を調べたところ、マウス関節軟骨ではCebpb、Cebpdの発現が豊富であり、Cebpaは1桁ほど発現量が低く、Cebpeの発現量はほとんどなかった。ヒト関節軟骨細胞でもほぼ同様の傾向であることが分かった。Cebpa, Cebpb, Cebpdを軟骨細胞株に強制発現させたところ、関節軟骨の主成分である2型コラーゲンの分解酵素matrix metallopeptidase 13(MMP13)や、肥大軟骨細胞の特異的マーカーであり、関節軟骨細胞の変性の目安でもある10型コラーゲン(COL10A1)が誘導される一方、2型コラーゲンやアグリカン、転写因子SOX9といった軟骨細胞の本質に関わる分子の発現が低下し、いずれも軟骨細胞にとってネガティブな作用を有することが分かった。またこの3分子の強制発現によって、細胞株の増殖の速度が低下することも分かった。現在はこれらの3分子について、siRNAでの発現抑制、あるいはC/EBP共通のドミナントネガティブフォームを用いた機能抑制実験を行っており、細胞レベル、生体レベルでの検証を進めていく。ほぼ予定通りの経過であるが、マウスを用いた解析の準備が予定よりやや遅れている。次にこれらの機能を解析すべく、Cebpa, Cebpb, Cebpdを軟骨細胞株に強制発現させたところ、軟骨基質2型コラーゲンの分解酵素matrix metallopeptidase 13(MMP13)や、肥大軟骨細胞の特異的マーカー10型コラーゲン(COL10A1)が誘導される一方、2型コラーゲンやアグリカン、転写因子SOX9といった軟骨の維持に必須の分子の発現が低下した。C/EBP共通のドミナントネガティブフォームであるA-

CEBPを作成し、同様に強制発現したところ、これらと反対に軟骨細胞の同化を促進し、変性を抑制することが分かった。現在はCre存在下にA-CEBPを発現するトランスジェニックマウスを作成し、生体レベルでの検証を行っている。CCAAT/エンハンサー結合タンパク質(C/EBP)betaは軟骨細胞の分化増殖を制御することが知られているが、今回我々は軟骨細胞における他のC/EBPファミリー分子の作用を解明すべく本研究を実施した。転写活性化ドメインを有するC/EBPファミリー分子ではCebpb、Cebpdの発現が豊富であった。軟骨細胞株による解析により、Cebpa, Cebpb, Cebpdには軟骨同化分子を抑制し、変性関連分子を誘導することが明らかになった。C/EBP共通のドミナントネガティブフォームであるACEBPは、これらと反対に軟骨細胞の同化を促進し、変性を抑制することが分かった。細胞培養レベルでの解析を進めるとともに、遺伝子改変マウスを用いた実験を進める。ドミナントネガティブフォームの作成、細胞株での動作確認をしつつ、最終年度に向けてトランスジェニックマウスの作成を進めている。整形外科学おおむね研究が順調に進み、当初予定していた経費以下で計画を遂行することができた。マウスを用いた解析の準備がやや遅れたため。細胞培養レベルでの解析を実施するのに必要な試薬、解析費用。遺伝子改変マウスを用いた実験を進めるために必要なマウス、試薬。ドミナントネガティブフォームの作成、トランスジェニックマウスの作成
有機ラジカル結晶の多形と磁性

有機強磁性体の発見において、基本となった物質はガルビノキシルとp-ニトロフェニルニトロニルニトロキシド(p-NPNN)であるが、これらの物質の結晶にはいずれも多形がある。またその後、磁性と結晶構造の関係を調べる過程で、後者の基本骨格となるニトロニルニトロキシド(HNN)も研究したが、これにも二種の多形があり、異なる磁性を示すことが明らかになった。これらは、磁性発現の機構を解明する上でも重要であるが、同時に結晶構造の決定因子を調べる上でも格好な研究材料を提供していると考えられる。ガルビノキシルは、高温相で強磁性相互作用を示すが、85 K以下の低温相では反強磁性相互作用を示すようになる。その原因を探る目的では、低温の結晶構造解析が重要になる。昨年度に続きその努力を進め、10Kでのx線回折パターンは得いるが、冷却する段階で結晶が壊れるために、余計な回折点が含まれるので、その解析には手間取っていて最終的な結論は得られていない。現在も鋭意努力している。一方、この結晶に7kbar程度の圧力を加えると、磁気測定では転移が抑えられ、しかも強磁性相互作用が残ることが判明した。これによって、従来の不純物を混入する方法ではなく、純物質で磁気相互作用を研究する方法が見いだされた。一方、p-NPNNの4つの多形の間の相関に関しては、モデル計算によって、格子振動の中で分子のライブレーションが関係するモードが重要な寄与をしていることが分かってきた。今後熱測定、ラマンスペクトルの温度変化の測定などによって、このモデルの妥当性を検討していく予定である。ガルビノキシルは、高温相で強磁性相互作用を示すが、85K以下の低温相では反強磁性相互作用を示すようになる。今年度はその努力を勧め10Kでのx線回析パターンは得られているが、冷却する段階で結晶が壊れるために、余計な回析点が含まれるので、その解析が大変困難で今年度にはまだ完成していない。一方、この結晶に5-6kbarの圧力を加えて磁性を調べると、相転移が抑制され、低温まで強磁性相互作用が維持されることが判明した。従来は不純物を混入して相転移を抑えて強磁性相互作用の研究をしていたが、この実験によって純ガルビノキシルにおいても研究を進めることができるようになった。HNNのα相では、ac面内にシート構造が発達することが知られているが、これにはC(sp^3)-H・・・O-Nの水素結合で生じた二量体が、C(sp^2)-H・・・O-Nの水素結合を通して繋がるのが、最も重要な因子になっていることが理論的な計算によって明らかになった。このこととβ相の結晶との関係について、現在研究を進めている。p-NPNNについては、今年度は手が回らなかった。有機強磁性体の発現において、基本となった物質はガルビノキシルとp-ニトロフェニルニトロニルニトロキシド(p-NPNN)であるが、これらの物質の結晶にはいずれも多形がある。

またその後、磁性と結晶構造の関係を調べる過程で、後者の基本骨格となるニトロニルニトロキシド(HNN)も研究したが、これにも二種の多形があり、異なる磁性を示すことが明らかになった。これらは、磁性発現の機構を解明する上でも重要であるが、同時に結晶構造の決定因子を調べる上でも格好な研究材料を提供していると考えられる。ガルビノキシルは、高温相で強磁性相互作用を示すが、85 K以下の低温相では反強磁性相互作用を示すようになる。その原因を探る目的では、低温の結晶構造解析が重要になる。昨年度に続きその努力を進め、10Kでのx線回析パターンは得いるが、冷却する段階で結晶が壊れるために、余計な回折点が含まれるので、その解析に手間取っていて最終的な結論は得られていない。現在も鋭意努力している。一方、この結晶に7 kbar程度の圧力を加えると、磁気測定では転移が抑えられ、しかも強磁性相互作用が残ることが判明した。これによって、従来の不純物を混入する方法ではなく、純物質で磁気相互作用を研究する方法が見いだされた。一方、p-NPNNの4つの多形の間の相関に関しては、モデル計算によって、格子振動の中で分子のライブレーションが関係するモードが重要な寄与をしていることが分かってきた。今後熱測定、ラマンスペクトルの温度変化の測定などによって、このモデルの妥当性を検討していく予定である。
看護師のWLB実現に向けた看護師長のコンピテンシー評価尺度の妥当性の検証

病院に勤務する看護師にとってのWLB実現に向け、看護師長の行動特性の分析(質的研究)ならびに全国の看護師長の調査(量的研究)を経て「看護師のWLB実現に向けた看護師長のコンピテンシー評価尺度)」を開発した。本研究では、この「コンピテンシー評価尺度」と「部下となる看護師の実際のWLB実現度(年次有給休暇取得率、職務満足度の高さ等)」の比較による妥当性および尺度活用による有用性を検証し、最終的に同尺度を軸とするコンピテンシーを兼ね備えた看護師長の養成プログラムの枠組み構築を目的とする。
新規シリコン結晶繊維の作製プロセスの開発

本研究では、加熱温度やナトリウム(Na)の蒸発速度などの作製条件がシリコン(Si)結晶繊維の生成に及ぼす影響について調査した。その結果、NaSiの圧粉体を800°Cで加熱してNaを蒸発させることで、基盤のSi結晶が粒成長し、その表面にSi結晶繊維が生成することが明らかになった。また、低純度なSi結晶を原料に用いたところ、高純度なSi結晶が得られ、本手法は精錬効果があることが確認された。本年度はシリコン(Si)結晶繊維の生成条件の解明を目的として研究を進めた。本手法ではNa-Si溶液から溶媒であるNaを蒸発させてSi結晶を作製するため、Naの蒸発条件が重要となる。そこで、温度勾配を制御できる電気炉を用いて、様々な原料組成および加熱温度条件のもとでSi結晶を作製し、Na-Si溶液が安定に存在する温度条件や、Na-Si溶液からNaが蒸発してSi結晶が生成する条件などを明らかにした。具体的には種々のモル比で作製したNa-Si溶液を温度勾配付きステンレス管内で700900°Cで加熱し、得られた試料の結晶相をX線回折法で同定した。Na-40mol%Siの試料を700°Cで加熱してNaを蒸発させた結果、Siクラスレート化合物が生成した。また同じ試料を800°Cまたは900°Cで加熱したところ、Na-Si溶液からNaが蒸発して、Siの厚膜状結晶や粒状結晶が得られた。本研究より、各原料組成のNa-Si溶液からNaが蒸発する温度条件が明らかになった。また、作製条件によっては繊維状ではなく粒状のSi結晶が得られたことから、作製条件によってSi結晶の形態を制御できることが明らかになった。得られた粒状Si結晶の不純物濃度を測定したところ、原料の結晶に含まれていた不純物が結晶の表面に掃き出され、精錬効果があることが確認された。同様の手法で作製する繊維状Si結晶においても精錬効果が期待される。本研究を進めている中で、第三元素の影響を調査していたところ、Na-Si-Bの三元系において新規化合物Na_8B_<74.5>Si_<17.5>を発見した。新規構造の本化合物は様々な工業分野への応用が期待できる。今後のシリコン(Si)結晶の高機能化や新たな製品開発において、従来にない多様な形態や組織を有するSi結晶が求められている。そこで本年度は、作製条件を制御して様々な形態や組織のSi繊維を作製することを目的として研究を進めた。本手法ではナトリウムシリコン化合物(NaSi)の圧粉体を800°Cで加熱することでNaを蒸発させSi繊維を作製していた。そこで、加熱温度を変えることでSi繊維の組織制御を試みた。700°Cで加熱した場合は、Siクラスレート化合物の粉末が生成し、900°Cの加熱においては、Si結晶が粒成長して粒状結晶になってしまい、800°C以外の温度ではSi繊維を得ることができなかった。NaSi化合物の融点が798°Cであることから、シリコン繊維を作製するには融点以上の温度で加熱する必要があるが、温度が高すぎると結晶が粒成長しすぎて繊維状に成長しないと言える。800°Cの加熱においては、昇温時間がSi繊維の生成に及ぼす影響を調べた。800°C/hで800°Cに昇温した場合ではSi繊維が生成したが、400°C/hで昇温した場合にはSi繊維が得られなかった。これは400°C/hで昇温した場合は、昇温過程でNaが蒸発し始め、結晶が十分に粒成長するのに必要な融液が得られなかったためだと考えられる。以上のことから、Si繊維を得るためにはSi結晶の粒成長がある程度必要であることが明らかになった。Si繊維の組織制御を行うことはできなかったが、Si繊維の生成メカニズムが明らかになってきた。今後はこの知見をもとに、Si繊維の組織制御を試みる。また、原料にGeを添加して太陽電池などに期待されているSiGe繊維を作製することも試みた。その結果、未だSiGeは得られていないものの、原料であるNaSiGeを生成することに成功した。今後はこの試料を原料にしてSiGe繊維の作製も試みる予定である。
自然発症糖尿病ラットにおける実験的歯周炎の病理組織学的研究

【方法】実験は、自然発症糖尿病(GK)ラット50匹と、JCLウイスターラット50匹の計100匹を用いた。動物の上顎右側臼歯の歯間部に糸を挿入し、J-1,2群(JCLラット)、G-1,2(GKラット)の4群(各群25匹)に分けた。J、G-1群にはストレスを与えず、J、G-2群は糸挿入後3週より隔日間隔で金網による拘束ストレスを6時間行った。各群の動物は、経時的にブドウ糖負荷試験、採血処置を行い、ストレス負荷後2、4、6、8、10日で各群5匹ずつ屠殺した。通法に従い臼歯部の組織切片を作製し、組織学的に観察した。さらに、JCLラット、GKラットの生後2日令(各10匹)の頭蓋骨を培養し、LPSおよびグラム陽性菌破砕抗原にて刺激し骨吸収程度を比較した。【結果】ブドウ糖負荷試験では、G群はJ群と比較して有意に高い血糖値を示した。J、G-2群での経時的な変化はみられなかった。しかし、ACTH、カテコールアミンは経時的に低下を示し、J、G-2群がストレス状態にあることが推察された。組織学的には、歯間部歯槽骨の高さに著明な差は認められなかったが、J、G-2群の第2臼歯の根分岐部では歯槽骨吸収が高度になる傾向を示した。また、LPSおよびグラム陽性菌破砕抗原刺激下での頭蓋骨のカルシウムリリースはJ、G群間で著明な差は認められなかった。【考察】GK(糖尿病)ラットにストレスを負荷すると、病理組織学的に歯周組織の根分岐部に破壊が促進される傾向が認められた。さらに今後、詳細に研究していく予定である。
培養系を用いたマウスGSC/ニッチ・システムの解明と分化誘導系の開発

マウス精子幹細胞(SSC)からin vitroにおいて精子を産生する培養法を開発した。器官培養法を採用し、血清代替物を用いた培養法で、精子形成を完遂させ、精子産生に成功した。また、培養下で増殖させたマウスSSCを宿主マウス精巣の精細管内に注入移植し、その精巣組織片を器官培養することで、培養SSC由来の精子産生と顕微授精による産仔にも成功した。さらに不妊モデルであるSl/Sl^dマウスの精巣組織片を培養し、精子形成を誘導することに成功した。マウスのGSC(精子幹細胞)の培養系を用いて、in vitroニッチの分子機構を解明し、同時に、ヒトを含むほ乳類全般のGSC培養法を開発することが本研究の目的である。あわせてGSCから精子形成を誘導する培養系を開発し、男性不妊症(精子形成障害)の病態解明・治療法開発につなげることを目指している。そのために、以下のような計画で研究を開始した。(1)in vitroニッチの分子機構の解明:in vitroニッチには未知の構成要素の存在が想定される。in vitroニッチの因子(群)を発見し、GSCの維持・増殖に関わる分子機構を明らかにする。(2)GSC培養条件の改良とin vitro精子形成系の開発:培養条件下でのGSCの自発的分化を抑制し、高純度にGSCを維持培養する方法を開発する。さらにGSCを分化誘導し、精子形成系開発する。(3)GSCの機能アッセイ法の開発:ほ乳類全般に応用できるGSCアッセイ法として、(1)免疫不全マウス精細管への異種移植と、(2)新生仔精巣細胞を用いた精細管再構成法による精子形成系を開発する。(4)ヒトを含む多種ほ乳類のGSCの性質の解明と培養法の開発:細胞表面マーカーを用いてヒト、霊長類、ブタ、ウサギのGSCの濃縮を行い、培養法の開発を行う。これら濃縮GSCの遺伝子発現プロファイル解析を行う。(1)in vitroニッチの分子機構の解明:現在確立している精子幹細胞(GSCs)の培養系ではGSCsと分化した精原細胞(Spermatogonia ; SG)は混在して増殖している。これらGSCs/SGとも言える培養細胞をFACSを用いて未分化な細胞群(GFRα1+、c-kit-)と十分に分化し幹細胞能を失った細胞群(GFRα1-、c-kit+)の2群を分取した。これらの2つの細胞群の遺伝子発現パターンの違いを検討する目的で、マイクロアレイ解析を施行した。またGSC培養に必須な成長因子であるGDNFを加えた培地と加えない培地での培養3日後の培養細胞の発現遺伝子解析も同様にマイクロアレイを用いて行なった。これらのデータは現在解析中であり、今後の実験に利用してゆく予定である。(2)GSC培養条件の改良とin vitro精子形成系の開発:現在、DNAメチル化酵素阻害剤、ヒストンメチル化酵素阻害剤を、それぞれ単独で精子幹細胞培養系に添加し、培養を行なっている。今後、表面抗原の変化、精細管移植法を用いた幹細胞活性の変化について追跡予定である。(3)GSCの機能アッセイ法の開発:ドナー動物として、ブタおよびウサギを用い、宿主動物として高度免疫不全のNOGマウスを用いた精細管内移植実験を行なった。これまでのところドナー動物の生殖細胞の定着は確認されていない。(4)ヒトを含む多種ほ乳類のGSCの性質の解明と培養法の開発:ヒト精巣細胞(精巣癌手術例)を用いて、ヒトGSCの培養実験を試みている。現在までのところGSCの初期コロニーは認めているが、それらの増殖には到っていない。(1) in vitroニッチの分子機構の解明:現在のGSC培養系では、in vitroニッチの構成要素として未知の因子の存在が想定された。そこで培養精原細胞の発現マイクロアレイ解析の結果をin silicoで解析し、培養条件改善に効果的と思われる分子を絞り込んだ。この分子の精巣における発現パターンを免疫染色、定量的RT-PCRを用いて確認を行っている。今後、これらの分子のGSC培養系への作用の分子メカニズムを検証してゆく。(2) GSC培養条件の改良とin vitro精子形成系の開発:幹細胞維持に関わるゲノム修飾がどのようになっているか本年度は詳細に解析した。その結果DNAメチル化が精細胞分化過程に必須であることが過剰発現系と遺伝子破壊を用いた実験で明らかになった。今年度これらの結果をもとに具体的培養系改善のためDNAメチル化を制御する低分子化合物を培養系に添加し、その作用を検討する。またマウス精巣組織を器官培養することにより、減数分裂を完了し、半数体の精子細胞が産生できることを確認し、学術誌に発表した。(3) GSCの機能

アッセイ法の開発:GSCの培養において、単一細胞からの増殖は非常に困難であった。この課題に対して、我々はMicrodrop培養法を開発した。この方法により、ごく少数のGSCも増殖できることが確認でき、そこから増殖したGSCには幹細胞機能があることを精細管内への移植にて確認した。GSC培養系においては培養細胞中の真の幹細胞の比率が常に問題になるが、Microdrop培養法で、幹細胞アッセイも可能となり、GSCの培養条件の改良にも応用できるので、今後の発展に期待できる。(4)ヒトを含む多種ほ乳類のGSCの性質の解明と培養法の開発:これまで、ヒト、ブタ、ラットのGSCの培養を試みてきた。現在、ラットのGSCは安定して培養できるようになったが、ヒト、ブタのGSCの培養法は完成していない。引き続き、培養法の改良を試みる。哺乳類一般、特にヒトの精巣から精子幹細胞(GSC)の培養株を樹立するという目的のもとに、我々はマウスGSCの培養条件の改良を行っている。その方法の一つとして、マイクロドロップ培養法によるGSC培養をおこなった。その結果、マイクロドロップ培養法は、培養細胞中の幹細胞検定法としても利用できることが明らかになり、同時に培養条件の詳細な検討もできることがわかった。また別の戦略として、ゲノム修飾などを低分子化合物でコントロール方法論の応用を考え、GSCが持つ特徴あるゲノム修飾とその役割を探索した。その結果GSCにはde novo DNA methyltransferases非発現、H3K9me2修飾欠落が認められ、分化開始によりこれら修飾が一斉に出現することがわかった。哺乳類のin vitro精子形成はこれまでに成功例がなく、長年の課題であった。我々はGSCニッチの研究にはin vitro精子形成系の開発が重要であるとの認識から、その開発に取り組んできた。精子形成には精細管という構造が必須ではないかとの仮説のもとに、精巣組織片をそのまま培養する器官培養法を採用した。様々条件検討の末、血清代替物が器官培養の精子形成において血清よりも有効であることを見出した。実験を繰り返し、血清代替物を用いた培養で、精子形成が完遂し、精子が産生されることを見出した。さらにそれら精子や精子細胞をもちいて顕微授精を行ない、産仔を得た。さらに精巣組織は凍結可能で、解凍後に同様の器官培養で精子が産生できることも証明した。これらの成果は世界初のものであり、今後の発展が期待されている。マイクロドロップ培養法は、培養細胞中の幹細胞検定法としても利用できることから、培養条件の詳細な検討や改良にも有用であることがわかった。またGSCの内在性の制御機構を明らかにする目的で行った、維持メチル化を障害するNp95KOマウスの解析の結果、精子幹細胞は低メチル化で分化のスタートにDNAメチル化が必須であることが明らかとなり、GSC維持には、DNAメチル化阻害剤が有効であることが示唆された。一方、哺乳類のin vitro