hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シロイヌナズナにおけるHis-Aspリン酸リレー情報伝達の分子機構

申請者らは、シロイヌナズナのHis-Aspリン酸リレー情報伝達系を構成する各種因子の検索と網羅的クローン化を完了している。その結果、現在までに3種類のセンサキナーゼ(AHK2-4)、5種類のHPt(AHP1-5)、14種類のレスポンスレギュレーター(ARR3-16)の存在を明らかにすることに成功した。各遺伝子に関して、cDNAをクローン化し一次構造を明らかにするとともに、各器官での遺伝子の発現様式を明らかにした。さらにAHPがHPt因子として、ARRがレスポンスレギュレーターとして機能する遺伝子であることを遺伝学的手法及び生化学的手法を用いて確定した。興味深いことに、AHK4がサイトカイニン受容センサーであることを示唆する結果も最近得られた。これらこれまでに得られた知見を元に、本研究では申請者は特にAHK, AHP遺伝子群に焦点を絞り細胞内情報伝達ネットワーク全体像の中でのAHK, AHP遺伝子群の位置付け、植物個体レベルでの器官間コミュニケーションを介した個体高次機能統御における役割という2つの視点から、シロイヌナズナにおけるHis-Aspリン酸リレー情報伝達系の解析を進める。本年度は以下の研究を実施することによってAHKsとAHPsまたはAHPsとARRsといった因子間の相互関係と各因子を網羅的に解析することで各因子の特異性を明らかにした。AHKsに関して1)大腸菌システムを利用してAHK2/3/4全ての恒常的活性型変異やドミナントネガティブ変異を作成し、それらを植物体に導入した。その結果、幾つかのラインでサイトカイニン情報伝達系が活性化したと思われるような表現型を示した。2)AHKs遺伝子の発現部位をGUS発現系を利用することでより詳細にし、各因子の発現部位の特異性を明らかにした。AHPsに関して1)酵母Two-Hybrid法を用いてAHP1-5の網羅的な相互作用解析を行った。その結果、新規相互作用因子を取得することに成功した。2)全てのAHPsに関して各器官におけるRNAレベルの発現、GUS発現系を利用した組織レベルでの発現を明らかにした。3)T-DNA挿入変異を検索することで機能欠損変異を取得した。今後これら欠損変異植物体を利用することでAHPのより詳細な生理機能を明らかにしたいと考えている。
象牙芽細胞の痛覚受容器としての可能性に関する研究(イオンチャネルレベルでの検索)

前年度、ラットの切歯を細切することにより取り出した象牙芽細胞をパッチクランプ法にて膜電位の変化およびイオンチャンネルを調べ、象牙芽細胞の痛覚受容器としての可能性を調べてきた.また、継代培養された歯髄細胞においてパッチクランプ法を用い、すでに3種類の細胞応答パターンを得ている.今回、これら両者の結果を考慮し、培養歯髄細胞の象牙芽細胞または前象牙芽細胞への分化と痛覚受容器としての可能性との関連を形態学的、電気生理学的手法によって検討した.実験には、生後23週間のWistar系ラットの切歯を用いた.抜歯後歯牙より歯髄を取り出し、細胞培養を行った.実験には初代歯髄培養細胞を用いた.次に細胞のアルカリフォスファターゼ活性を調べた.細胞は強い染色性と弱い染色性を持つ2種類が得られた.形態的には、紡錘形とアメーパー状の2種類の細胞が得られた.これらにパッチクランプ法を行い形態およびアルカリフォスファターゼ活性とイオンチャンネルとの関係について調べた.パッチ電極で細胞をホールセル状態にした後、細胞表面にK^+チャネル阻害剤であるBa溶液(10mM)で灌流し細胞を刺激したとき、3種類の細胞パターンが得られた.第1はBa^<2+>によって漏洩電流が増強されるタイプ、第2は外向き電流がBa^<2+>によって抑制されるタイプ、第3は0mV付近にピークを持つ内向き電流が発生するタイプの3種類であった.これらの結果は、歯髄から26代継代した培養細胞の結果と類似していた.形態的またはアルカリフォスファターゼ活性とこれら細胞応答パターンの間には明確な差異は見られなかった.今回の所見は、用いた細胞が初代培養細胞であったことから他の細胞の混入や細胞周期のステージなどによる影響が考えられた.歯の痛みのメカニズムは、各種刺激が象牙細管内の組織液を移動させ、それが象牙細管の歯髄側にある歯髄神経繊維の自由終末に伝わることによって生じるという動水力学説が有力である。一方、象牙芽細胞自身が象牙質に与えられた機械的刺激に応答する感覚受容細胞であるとする説もある。本研究の目的は、象牙芽細胞の各種刺激に対する膜電位の変化およびイオンチャネルの特性を調べ、象牙芽細胞が痛覚受容器としての可能性を検討することである。実験には、生後23週目のWister系ラットを用いた。腹腔内麻酔の後、ラットの切歯を下顎骨ごと取り出し、歯芽の中央付近より歯根側をダイヤモンドディスクにて幅0.30.5mmの厚さにカットし、スライス標本を作製した。標本はEDTAで処理した後、プロテアーゼとコラゲナーゼで37°C、30分間、酵素処理を行った。歯髄細胞の一部は歯芽の内面に付着し、残りは歯髄体として分離された。象牙芽細胞は、形態学的に他の歯髄細胞と区別した。象牙芽細胞は、長さが1525μmで細胞に突起を有し、歯髄体表面または歯髄側の象牙質表面に突起とともに細胞体が付着していた。パッチクランプ法を用い、パッチ電極にてホールセル状態にした後、-100mV+80mVまで20mV間隔で増加する電圧パルスを与えたところ、電圧の増加によって電位依存性の外向き整流性の電流が記録された。また、-120mV+60mVまで連続した電圧変化では、-90mV-20mVまでは電流変化はなく、+20mV+60mVの電圧の増加に従って外向きの電流が記録された。また、-120mV-90mVでは逆に内向きの電流が記録された。その後、これらの細胞の表面を10mM Ba溶液で灌流したところ、外向きの電流が抑制された。Ba^<2+>による外向き電流の抑制よりK^+チャネルの存在の可能性が示唆された。前年度、ラットの切歯を細切することにより取り出した象牙芽細胞をパッチクランプ法にて膜電位の変化およびイオンチャンネルを調べ、象牙芽細胞の痛覚受容器としての可能性を調べてきた.また、継代培養された歯髄細胞においてパッチクランプ法を用い、すでに3種類の細胞応答パターンを得ている.今回、これら両者の結果を考慮し、培養歯髄細胞の象牙芽細胞または前象牙芽細胞への分化と痛覚受容器としての可能性との関連を形態学的、電気生理学的手法によって検討した.実験には、生後23週間のWistar系ラットの切歯を用いた.抜歯後歯牙より歯髄を取り出し、細胞培養を行った.実験には初代歯髄培養細胞を用いた.次に細胞のアルカリフォスファターゼ活性を調べた.細胞は強い染色性と弱い染色性を持つ2種類が得られた.形態的には、紡錘形とアメーパー状の2種類の細胞が得られた.これらにパッチクランプ法を行い形態およびアルカリフォスファターゼ活性とイオンチャンネルとの関係について調べた.パッチ電極で細胞をホールセル状態にした後、細胞表面にK^+チャネル阻害剤であるBa溶液(10mM)で灌流し細胞を刺激したとき、3種類の細胞パターンが得られた.第1はBa^<2+>によって漏洩電流が増強されるタイプ、第2は外向き電流がBa^<2+>によって抑制されるタイプ、第3は0mV付近にピークを持つ内向き電流が発生するタイプの3種類であった.これらの結果は、歯髄から26代継代した培養細胞の結果と類似していた.

形態的またはアルカリフォスファターゼ活性とこれら細胞応答パターンの間には明確な差異は見られなかった.今回の所見は、用いた細胞が初代培養細胞であったことから他の細胞の混入や細胞周期のステージなどによる影響が考えられた.
Lewy小体病（パーキンソン病）の病理学的アプローチによるバイオマーカーの確立

パーキンソン病罹患患者に対する早期の段階での治療介入が期待される中、バイオマーカー、サロゲートマーカーの確立が急務である。病理学的なバイオマーカーとして生検が検討されている。生検部位としては、皮膚、直腸、顎下腺が挙げられている。顎下腺が有用であるかについては、当センターの剖検例を用いて検討を行った。得られた検体は、それぞれHE標本を作製し、免疫染色(抗リン酸化αシヌクレイン抗体、抗αシヌクレイン抗体、抗ニューロフィラメント抗体、抗リン酸化タウ抗体、抗βアミロイド抗体等)を実施してLewy小体関連病理の発現を評価した。その結果、剖検例での検討では、顎下腺への抗リン酸化αシヌクレイン抗体陽性構造物出現は、臨床的にパーキンソン症状が出現してきた症例でないと出現しないことが判明した。上記情報と臨床からの情報(具体的には、パーキンソン病の臨床評価スケール(The Unified Parkinsons Disease Rating Scale:UPDRS)、脳脊髄液の採取(5HIAAやHVAの値を測定する)、頭部MRI、ドパミントランスポーターSPECT、MIBG心筋シンチグラフィーでのH/M比)を照らし合わせて得られる知見の確認を行っている。さらに、高齢発症の症例の中には上記検査後に数年の経過で亡くなり病理解剖される症例も存在する。この1年でpure autonomic failureの病理解剖を経験した。生検で行う前に病理解剖例を用いた検討を行っている。解剖例数の減少に伴い、検討が遅れている。パーキンソン病のバイオマーカーの確立を世界的に検討が進められている。しかしながら、いまだ有用なバイオマーカーの確立には至っていない。本研究は、あくまでも解剖症例で得られた知見を元に、しっかりした説明同意の上で生検箇所を検討していく。パーキンソン病診断への病理学的なアプローチとして各部位の生検を実施する。それぞれHE標本を作製し、免疫染色(抗リン酸化αシヌクレイン抗体、αシヌクレイン抗体、抗ニューロフィラメント抗体等)を実施してLewy小体関連病理の発現率を部位間で比較検討する。比較検討部位として皮膚、直腸、顎下腺を挙げている。その中で一番の候補となる皮膚に対しては、すでに数例の検討がされており皮膚単独でのLewy小体関連発現率は83.3%と高値であることが示された。他の候補部位として直腸生検、顎下腺生検を検討している。直腸に関しては、解剖症例を使用しての検討を行っている。その結果により直腸生検を実施するにあたってどの部位がより生検箇所として適しているかを把握する。その上で、直腸生検を行い他の部位の生検結果と比較検討する。顎下腺に関しても同様に解剖症例を使用して検討を行った上で、生検部位や手技について耳鼻科医と整備を行っていく予定である。また、上記の病理学的なアプローチ以外のバイオマーカーとして、脳脊髄液の採取、ドパミントランスポーターSPECT、MIBG心筋シンチグラフィーを実施しており、得られた結果と生検結果とを比較検討し、バイオマーカーとして何が有意であるのかを確立する。さらに、上記検査を実施した症例が解剖される場合もあり、その際には、末梢神経系検討箇所として、顎下腺、食道胃接合部、直腸、心筋、副腎、皮膚を検索する。顎下腺と直腸生検を実施するにあたっての適正部位の検討が少し遅れている。生検は侵襲的な行為になるため実施するまでの整備に時間を要している。パーキンソン病罹患患者数は世界規模で増加している。早期の段階での治療介入が期待される中、バイオマーカー、サロゲートマーカーの確立が急務である。病理学的なバイオマーカー確立のアプローチの比較検討部位として皮膚、直腸、顎下腺が挙げられている。海外では顎下腺の生検が有用であるとの報告がされているものの、実臨床において顎下腺を生検するのにはいまだ高いハードルが存在する。直腸に関しては、生検においてはいまだ有用性が確立されていない。そこで我々は、解剖症例を使用して直腸のどの部位がより生検箇所として適しているかの検討を進めている。顎下腺に関しても同様に解剖症例を使用して生検部位や手技について耳鼻科医と整備を行っている。各部位から得られた検体は、それぞれHE標本を作製し、免疫染色(抗リン酸化αシヌクレイン抗体、αシヌクレイン抗体、抗ニューロフィラメント抗体等)を実施してLewy小体関連病理の発現率を部位間で比較検討する。また、上記結果をサポートする検査として脳脊髄液の採取(5HIAAやHVAの値を測定する)、さらにドパミントランスポーターSPECT、MIBG心筋シンチグラフィーを実施することで得られた結果と上記病理所見とを比較検討し、バイオマーカーの確立を図る。さらに、高齢発症の症例の中には上記検査後に数年の経過で亡くなり病理解剖される症例もあり、その際には全身を検索する。この1年で生前に皮膚生検(発汗障害があり実施)も含めてパーキンソン病と診断した患者さんの病理解剖を経験した。病理解剖例での検討を行っている。解剖例数が年々減少していることもあり、時間を要している。

顎下腺が有用であるかについては、当センターの剖検例を用いて検討を行った。得られた検体は、それぞれHE標本を作製し、免疫染色(抗リン酸化αシヌクレイン抗体、抗αシヌクレイン抗体、抗ニューロフィラメント抗体、抗リン酸化タウ抗体、抗βアミロイド抗体等)を実施してLewy小体関連病理の発現を評価した。その結果、剖検例での検討では、顎下腺への抗リン酸化αシヌクレイン抗体陽性構造物出現は、臨床的にパーキンソン症状が出現してきた症例でないと出現しないことが判明した。上記情報と臨床からの情報(具体的には、パーキンソン病の臨床評価スケール(The Unified Parkinsons Disease Rating Scale:UPDRS)、脳脊髄液の採取(5HIAAやHVAの値を測定する)、頭部MRI、ドパミントランスポーターSPECT、MIBG心筋シンチグラフィーでのH/M比)を照らし合わせて得られる知見の確認を行っている。さらに、高齢発症の症例の中には上記検査後に数年の経過で亡くなり病理解剖される症例も存在する。この1年でpure autonomic failureの病理解剖を経験した。生検で行う前に病理解剖例を用いた検討を行っている。解剖例数の減少に伴い、検討が遅れている。皮膚、直腸、顎下腺各部位の生検実施症例を蓄積していく。得られた結果を、画像検査を含めた他のバイオマーカーと比較検討する。海外においてもパーキンソン病のバイオマーカーとして有用な生検部位は確立されていない。論文や学会等で発表される内容をアップデートしながら、あくまでも解剖症例で得られた知見を元に、しっかりした説明同意の上で生検箇所を検討していく。パーキンソン病のバイオマーカーの確立を世界的に検討が進められている。しかしながら、いまだ有用なバイオマーカーの確立には至っていない。本研究は、あくまでも解剖症例で得られた知見を元に、しっかりした説明同意の上で生検箇所を検討していく。初年度においては環境整備に時間がかかり、実際の抗体購入費用等に回せなかったため。(理由)環境整備に時間がまだかかっており、評価として使用する機材等に費用がまだ回せていないため。(使用計画)1)評価に要する機材等の購入。2)学会発表や誌面発表に要する経費剖検数が減少したことに伴い、免疫染色に使用する抗体購入等が繰越になったことがあげられます。次年度に研究成果の学会報告や論文化にむけての諸経費にあてます。1)生検を実施する際に必要となる経費、2)症例蓄積に伴い得られた結果を学会や誌面に発表していく。そのために必要な経費に使用していく。
アリルアルコール類によるパラジウム触媒α-位置選択的アミン-アリル化反応の開発

筆者は、塩化スズ(II)を用いるアリルアルコール類からのπ-アリルパラジウム錯体形成法の開発とその有機合成反応への応用の一環として、アミン類のアリル化を試み、以下の点を明らかにした。(1)2-プロパン-1-オールとジベンジルアミンとの反応をモデルとして、パラジウム触媒、配位子、塩基、溶媒、反応温度など反応条件を種々調べた。Pd (PPh_3)_4を触媒(12mol%)とし、2-プロパン-1-オール(2mmol)、ジベンジルアミン(1mmol)、SnCl_2(2mmol)、およびNEt_3 (2mmol)を無水THF中に加え、50°Cで40時間反応させると、80%以上の単離収率でN, N-ジベンジル2-プロペニルアミンが生成できた。(2)上記の反応条件を2-プロパン-1-オールと種々のアミンの反応に応用した。ほとんどのジアルキルアミンはジベンジルアミンと同様の反応性を示した。アリールアルキルアミンでは反応性が低下し、ジフェニルアミンは反応しなかった。第一級アミンのアルキルアミンではジアリル化体が、アニリンではモノアリル化体が選択的に生成した。(3)1位または3位に置換基を持つアリルアルコールとジベンジルアミンの反応も同様に行い、π-アリルパラジウム錯体の無置換アリル位で選択的に反応したアリルアミン類を生成することができた。アリルアルコールが貴重な場合には、アリルアルコール、SnCl_2、およびNEt_3に対して2倍モルのジベンジルアミンを用いて反応させ、70%以上の単離収率で生成物を得ることができた。(4)アリルアルコールとアリルエステル(酢酸と炭酸)の化学選択性を調べたところ、カルボニル-アリル化反応とは異なり、通常のπ-アリルパラジウム錯体生成能と同じ反応性を示した。
侵襲の軽減に向けた極低出生体重児の気管内吸引の方法に関する研究

1500g未満の極低出生体重児の出生数が年々増加し、新生児集中治療室(NICU)の治療とケアは呼吸障害を中心とする長期的な呼吸循環管理へと移行している。呼吸管理中の極低出生体重児にとって、呼吸理学療法は必須のケアであるが、有用性や危険性についてはほとんど検討されていない。本研究の目的は、極低出生体重児に適した気道クリアランス方法の実態を明らかにすることである。全国調査からは、70%以上の看護師が児の安全を維持しながら複数の手技を構成要素とする呼吸理学療法を実施していた。各手技の有効性の評価は困難であるが、発達的予後を含めた評価指標の必要性が示唆された。呼吸管理中の極低出生体重児にとって、気管内吸引及び体位排痰法を主とする呼吸理学療法は必須のケアであり、これらはNICUの看護師によってルティーンに行われている。しかし、いずれの手技も手を用いて実施される主観的なものであり、したがって、実施者により方法や評価基準が異なっている。呼吸理学療法の合併症として脳障害の危険性や不適切な手技に起因する肋骨骨折の発生が報告されているが、スクイージングやシェイキングなど安全性と有効性が証明されていない体位排痰法が慣例的に実施されている。本研究は、気管内吸引と呼吸理学療法の特徴を、複数の手技を構成要素とし短時間に集中的に実施される複合的刺激ととらえ、その影響を中期的指標により個別に詳細に分析することによって、侵襲が少なく発達に良い影響を与える気管内吸引と呼吸理学療法の方法を明らかにすることを目的としている。本年度は、エビデンスの査定と質問紙原案の作成を目指した。1.まず、極低出生体重児に実施されている気管内吸引と呼吸理学療法の影響を明らかにするために、「chest physiotherapy、respiratory physical therapy、低出生体重児、呼吸管理、気管内吸引」をキーワードに「CINAHL」「PubMed」「医学中央雑誌」データベースを用いて検索を行った。53論文が抽出され、そのうちの30論文について批判的吟味を行った。呼吸理学療法の一時的評価項目は無気肺、脳障害、肺機能等であったが中期的評価項目の適切性を判断する情報は少なかった。2.文献検討から得られた項目を反映させた質問紙原案を作成中である。本年度は、国内の総合周産期母子医療センター、地域周産期母子医療センターNICUにおける極低出生体重児に対する気管内吸引と呼吸理学療法の実態を明らかにすることを目的に質問紙調査を実施した。研究に先立ち、研究倫理審査委員会の承認(慶磨義塾大学看護医療学部)を得た。1.質問紙調査と事例観察、分析国内の周産期医療施設(総合周産期母子医療センター、地域周産期母子医療センター)に勤務する新生児集中ケア認定看護師(または、NICUの経験が5年以上の看護師)に、気管内吸引と呼吸理学療法の方法について、郵送法により質問紙調査を実施した。対象の選定は、周産期医療施設一覧に掲載された275施設のうち140施設を無作為に抽出し、各施設2名の看護師に文書で研究依頼をした。調査期間は、2008年1月3月であった。約80施設から回答(回答率57%)が得られた。呼吸理学療法のプロトコールを作成している施設は少数であり、また、呼吸理学療法の評価については、分泌物の量・性状など短期的指標が多く用いられていた。結果は現在も分析中である。なお、事例観察については、都内周産期センターの臨床試験審査委員会に申請中である。2.文献検討及び調査結果については、Intemational Confederation of Midwives 2008、ならびにWorld Association for Infant Mental Health, World Congress 2008で発表予定である。本年度は、文献検討およびエビデンスの査定と併せて、実態調査から得られた結果を活用し、気管内吸引と呼吸理学療法に関するガイドラインの作成を目的とした。(1)最新の文献にもとづき気管内吸引、極低出生体重児および超低出生体重児のケア、呼吸理学療法に関する検討を継続しエビデンスの査定を行った。(2)極低出生体重児への侵襲を最小にする気管内吸引と呼吸理学療法の手技に関する調査の結果、日常的に実施されている呼吸クリアランス法は、排痰体位(ドレナージポジション)、呼気圧迫法、バイブレーション、気管内洗浄であった。児に適用する呼吸クリアランス法の選択基準は無気肺などの肺の状態であり、実施時期や頻度の決定には心拍数、呼吸数、酸素飽和度及び分泌物の量や粘稠度が用いられていた。効果の判定は、短期的指標として心拍・呼吸・酸素飽和度及び血液ガス、中期的には無気肺、肺炎所見の改善であった。

振動法や呼気圧迫法、軽打法の実施に関しては慎重な適用が求められているが、実際には適用事例が多く実施頻度が高いことが明らかになった。(3)(1)の成果は、第28回国際助産師連盟(ICM)3年毎大会(イギリス、グラスゴー)、ならびに第11回世界乳幼児精神保健学会世界大会(横浜)で報告した。
肝細胞におけるビリルビン、胆汁酸その他の有機物質の輸送機序の解明

肝細胞の有機イオン代謝と輸送の機序を明らかとし、臨床医学との関連を追及する目的で、以下の研究を行った。(1)有機アニオンモデルとしてpravastatin(PS)を選び、その肝細胞から毛細胆管への排泄機序を明らかとする目的で、正常ラット及びDubin-Johnson症候群モデルの先天黄疸ラット(Eisai hyperbilirubinuria rat ; EHBR)の毛細胆管側肝細胞膜vesicle(CMV)への標識PS摂取を観察した。PSの輸送は、ATPと上行性pH勾配の両方により促進された。この輸送は、EHBRにおいては認められなかった。従って、この輸送がビリルビンその他の有機アニオン輸送に生理的に作用していると推定出来た。(2)ラットの胆管閉塞において、標識PV及び標識taurocholate(TC)のCMVへのATP依存性摂取の変化を経時的に観察した。胆管閉塞2日目で既にPV,TCの両者の摂取は著明に減少し、病態時のこれら膜輸送変化の意義が明らかとなった。(3)肝細胞小胞体のbilirubin UDP-glucuronosyltransferase(bilirubin UGT ; UGT 1*1)活性が正常の約30%、約10%に減少している、各々Gilbert症候群、Crigler-Najjar症候群II型において、特に前者を中心にUGT 1*1遺伝子の異常を解析した。Gilbert症候群においては、coding regionの主にヘテロの点突然変異とpromoter regionのホモのTA過剰を認めた。従って本症候群では、優性遺伝、劣性遺伝の両方が存在する可能性が高い。(4)Rotor症候群において、肝組織のglutathione S-transferase(GST)の免疫組織染色の欠如を認めた。従って、Rotor症候群は肝細胞上清分画のGSTの欠損が病因である可能性が強い。(5)我々の成績を中心として、bilirubinを含む有機アニオンの肝代謝・輸送について、文献的観察を加えた。^3H-BDG又は^<14>C-PVのベジクルへの摂取を観察した。ATP 5mM存在下で^3H-BDGの摂取の亢進が見られず、BDGの胆汁中排泄はATP非依存性である可能性が強いと結論した。一方、^<14>C-PVの摂取はATP存在下で亢進しATP依存性の輸送であると考えられた。^<14>C-PVの摂取は、ベジクル外側(生理的状態では肝細胞内側に相当)のpHを内側よりも下げると、著明に亢進した。^<14>C-PVの摂取はATP及びPVの濃度依存性があり、かつ飽和がみられた。このpH及びATPの両方に依存する有機陰イオン輸送経路は今まで報告されておらず、今後更に研究を継続する予定である。閉塞性黄疸ラットにおける^3H-taurocholate(^3H-TC)と^<14>C-PVの細胆管側肝細胞膜輸送を比較観察したところ、7日目には^3H-TCの方に著明な低下が存在しており、両者の輸送が病態時に異なる可能性が示唆された。2.ビリルビンの肝細胞内抱合に関する研究:ビリルビンはbilirubin UDP-glucuronosyl transferase(BGT)によりグルクロン酸抱合をうけるが、Gilbert症候群では酵素活性が約1/3と低い。

今回6例のGilbert症候群患者の白血球を用いてBGT遺伝子の解析を行い、4例でBGTアイソザイム固有のエキソン1A上に数種のヘテロのpoint mutationを見いだした。あと2例は、それぞれエキソン1D上と共通エキソン4上のpoint mutationであった。以上から、Gilbert症候群が常染色体性優性遺伝をする事を明らかにした。肝細胞の有機イオン代謝と輸送の機序を明らかとし、臨床医学との関連を追及する目的で、以下の研究を行った。(1)有機アニオンモデルとしてpravastatin(PS)を選び、その肝細胞から毛細胆管への排泄機序を明らかとする目的で、正常ラット及びDubin-Johnson症候群モデルの先天黄疸ラット(Eisai Hyperbilirubinuria rat;EHBR)の毛細胆管側肝細胞膜vesicle(CMV)への標識PS摂取を観察した。PSの輸送は、ATPと上行性pH勾配の両方により促進された。この輸送は、EHBRにおいては認められなかった。従って、この輸送がビリルビンその他の有機アニオン輸送に生理的に作用していると推定出来た。(2)ラットの胆管閉塞において、標識PV及び標識taurocholate(TC)のCMVへのATP依存性摂取の変化を経時的に観察した。胆管閉塞2日目で既にPV,TCの両者の摂取は著明に減少し、病態時のこれら膜輸送変化の意義が明らかとなった。(3)肝細胞小胞体のbilirubin UDP-glucuronosyl transferase (bilirubin UGT; UGT 1*1)活性が正常の約30%、約10%に減少している、各々Gilbert症候群、Grigler-Najjar症候群II型において、特に前者を中心にUGT1*1遺伝子の異常を解析した。Gilbert症候群においては、coding regionの主にヘテロの点突然変異とpromoter regionのホモのTA過剰を認めた。従って本症候群では、優性遺伝、劣性遺伝の両方が存在する可能性が高い。(4)Rotor症候群において、肝組織のglutathione S-transferase(GST)の免疫組織染色の欠如を認めた。従って、Rotor症候群は肝細胞上清分画のGSTの欠損が病因である可能性が強い。(5)我々の成績を中心として、bilirubinを含む有機アニオンの肝代謝・輸送について、文献的考察を加えた。
ビッグデータ時代の多様な検索要求を満たす統一的インデックス基盤の実現

IoTを始めとして多種多様なビッグデータが発生しており、データ集合の特徴抽出や指定条件に合致するデータの取得など、検索技術へのニーズも多様化している。本研究課題では、このような多様な検索要求を満たすことができる統一的なインデックス基盤を確立することを目的とする。この目的を達成するために、以下のように二つの研究課題を推進した。課題1:多様な検索要求を満たす統一的なインデックス構造の構築本課題では、多様な検索要求に対して、それぞれの検索の種類で効率化(探索空間の枝刈り・絞込みなど)に用いることのできる数学的・理論的アイデアを整理もしくは新たに定義する。そして、複数の異なる検索要求において共通して利用できる効率化手段を検討する。本研究課題の初年度は、まずいくつかの初歩的な検索技術に対して、各検索要求の整理を行った。さらに、異なる検索技術のうち、数学的・理論的な手順の一部を共通化できるものが存在するかを検討した。これらの検討結果に基づいて、共通化されたインデックス構造についての構想に着手した。課題2:統一的なインデックス構造上のオンライン検索アルゴリズムの構築初年度は、課題1において共通化されたインデックス構造について構想を練る程度にとどまったため、オンラインアルゴリズムについても簡単な検討を行った。さらに、この内容と並行して、翌年度以降に対象とする高度な検索技術として、いくつかの新たな検索技術の考案・実装を行った。共通化インデックスについて、異なる検査要求に対する理論的・数学的な整理は若干遅れており、具体的なインデックス構造の考案には至らなかった。この点については次年度に向けての最優先課題と考えている。その一方で、高度な検索技術については、いくつかの重要な新技術を考案することに成功し、データベース分野で最も権威のある国際会議に採録されるなど、重要な成果を達成した。この点については、当初の計画以上の進捗である。以上のことから、総合的に判断して、概ね順調に進展していると判断した。次年度は、以下のように研究を推進する予定である。課題1:多様な検索要求を満たす統一的なインデックス構造の構築本研究課題の二年目にあたる2019年度は、初年度をさらに発展させて、いくつかの基礎的な検索技術に対して、各検索要求の整理と定義を行う。そして、それらの異なる検索技術のうち、数学的・理論的な手順の一部を共通化できるものが存在するかを検証し、存在する場合はそれらを共通クラスとして捉え、検索理論・手順を再整理する。その結果に従って、そのクラスに共通化されたインデックス構造について検討を進める。課題2:統一的なインデックス構造上のオンライン検索アルゴリズムの構築初年度に行った、共通化されたインデックス構造およびオンラインアルゴリズムに関する検討をさらに発展させる。また、従来にない新たな高度検索技術を設計・実装し、それらを実行するための共通化インデックスについても検討を開始する。
臨床検体由来肺癌幹細胞樹立とバイオマーカータンパク質同定

我々は肺癌臨床検体を用い、種々の既知幹細胞マーカーの免疫染色を行った。染色結果より、肺癌幹細胞マーカー候補として適切であると考えられたCD166陽性細胞、陰性細胞の各種遺伝子発現レベルを公開データベース解析、肺癌手術検体による発現レベル解析、shRNA導入によるノックアウト実験等を行った。その結果、一つの遺伝子が新規肺癌幹細胞マーカーおよび将来的分子標的候補となり得る可能性を示した。近年認識されてきた癌幹細胞仮説は、癌組織中で大多数を占める非癌幹細胞、あるいは、培養細胞を用いた研究に基づくこれまでの知識を根底から見直す必要性を提起している。乳癌等一部の癌でその存在と重要性は揺るぎないものの、肺癌等では存在そのものに懐疑的な意見も根強い。また、学会レベルでは様々な報告もあるものの、ほとんどが細胞株レベルのものであり、臨床検体の情報に乏しい。本申請では肺癌を研究対象とし、肺癌幹細胞株の樹立と肺癌幹細胞マーカーの同定を目的とした。臨床検体および培養細胞を用いた各種マーカー候補(CD34, CD44, CD117, CD133, EpCAM, CD166)の発現検索、培養細胞を用いたマウス肺転移巣形成効率の測定、公開データベースによる遺伝子発現検索、臨床検体を用いた遺伝子発現検索等を行った。肺癌幹細胞マーカーとして報告のあるCD133は臨床病理検体の免疫染色解析結果多くの肺癌で発現が観察されなかった。また、培養細胞においても同様であったため、マーカーとしての有用性が低いと考えられた。一方、研究期間中に発表のあったCD166はほとんどの肺癌に程度の差こそあれ発現が観察され癌幹細胞マーカーとして適切であると考えられた。最初に、公開データベースより、CD166と発現相関関係が観察された遺伝子につき、定量PCR法により検証を行った。種々の遺伝子を検討した結果、一つの遺伝子につき名古屋大学における臨床検体においてもCD166と発現の正相関が観察された。この遺伝子をshRNAでノックダウンし、マウスに接種したところ、肺転移巣の形成が抑制された。以上の結果より、この遺伝子が将来的に肺癌治療の分子標的候補となり得る可能性が示唆された。また、癌幹細胞に関する報告の多くは既存の培養細胞を用いたin vitro研究であり、個体研究の大部分は未だ課題として残されている。本申請では肺癌を研究対象とし、B, T細胞系に加えてNK細胞機能を欠損した新規免疫不全マウスを用い、臨床検体から肺癌幹細胞株の樹立と肺癌幹細胞マーカーの同定を行う。さらに、樹立した肺癌幹細胞を用いて肺癌幹細胞を標的とした肺癌治療薬のスクリーニングシステムの確立のための予備的検討を行う。平成23年度は約100症例の肺癌手術検体より癌幹細胞株を樹立した。この細胞株は、わずか1000個の細胞接種でマウスに腫瘍を形成する。既知の癌幹細胞表面マーカーを調べたところCD34(-), CD44(+/-), CD117(+), CD133(-)EpCAM(+) CD166(+)であった。興味深いことに得られた細胞を血清存在下で培養するとこのうちCD166が陰性となり、また、マウスでの腫瘍形成能も消失した。こうした表面抗原発現様式、および、マウスでの腫瘍形成能の変化はこれまで調べた限り既存の培養細胞株では観察されない。さらに、マウスで形成された腫瘍においては、原発性と同じく、多様な分化度を持つ組織像が確認されたことより、CD166陽性であるこの細胞株が幹細胞と同等の性質を持つこと、また、培養条件を変えることによって幹細胞性を消失されることが示された。今後この細胞株を用いることで、幹細胞性をコントロールしながら肺癌の発生、転移、治療に関わる研究を行うことが可能となった。平成23年度の達成目標は「細胞株の樹立」と「Rag2, Jak3ノックアウトマウスにおける腫瘍形成能の定量化」「樹立細胞株の分化能の評価」であった。【研究実績の概要】に記したとおり、一年の研究期間中にこの3点とも達成目標に到達した。肺癌幹細胞株が樹立されたことにより、安定的に研究を行う体制が整った。しかし、現時点で実験に用いることのできる細胞株は一つに過ぎないため、株数を増やす必要がある。これらの細胞株をもちいて、幹細胞マーカーおよび肝細胞性を規定する因子についてスクリーニングを行う。そこで得られる結果をもとに、臨床肺癌検体をもちいて肺癌幹細胞マーカーおよび規定因子の検証を開始する。さらに、樹立した肺癌幹細胞株を用いて肺癌幹細胞を標的とした肺癌治療薬のスクリーニングシステムの確立のための予備的検討を行うことが残された課題である。

肺がん肝細胞株培養(培地、成長因子、プレート、そのほか試薬)と遺伝子・遺伝子産物発現解析(マイクロアレー、リアルタイムPCR、抗体、シークエンシング等)にかかわる諸経費、病理学的解析(抗体、染色キットなど)にかかわる諸経費等を物品費として計上した。学会参加費'(癌学会)、共同研究打ち合わせ経費(熊本、北海道、東北出張)につき旅費を計上した。論文等及び掲載にかかわる諸費用をそのほかとして計上した。
網膜色素上皮細胞における内向き整流カリウムチャネルの発現と細胞内分布の制御機構

網膜色素上皮細胞(RPE)に発現する内向き整流カリウムチャンネル(Kir)としてこれまでKir4.1が報告されていたが、RPEの電気生理学的性質から他のチャンネルの発現が推測されていた。我々はこの本態としてKir7.1がRPEに発現するか否かを検討し、RT-PCR法を用いてKir7.1mRNAがRPEに発現していることを発見した。次にKir7.1蛋白を用いて家兎からポリクローナル抗体を作成した。この抗体を用いてウエスタンブロットを行い、Kir7.1はRNAのみでなく蛋白レベルでもRPEで発現していることを確認した。次に光学顕微鏡を用いた免疫組織化学を行い、Kir7.1蛋白のRPEにおける局在を検討した。その結果Kir7.1はRPEのApical細胞膜突起の根元あたりに強く発現していた。一方Na+,K+-ATPaseと二重免疫染色を行うと両者の発現部位はほぼ一致し、Kir7.1とNa+,K+-ATPaseは似た細胞内局在を示した。さらにKirは1.1から7.1までのサブタイプに分かれているが、そのうちKir4.1とKir5.1の網膜内局在を免疫組織化学で検討した。Kir5.1は主としてミューラー細胞と網膜神経細胞の一部に陽性であった。Kir5.1はミューラー細胞では細胞体にびまん性に染色されたが、Kir4.1はミューラー細胞の硝子体側のエンドフットまたは血管周囲に巻きつく突起部に強い局在を示した。また、Kir4.1の免疫沈降を行うとKir5.1が含まれているためミューラー細胞の細胞体または遠位側にはKir4.1/Kir5.1の異種4量体が局在し、エンドフット側にはKir4.1の同種4量体が局在していることが示唆された。網膜色素上皮(RPE)に発現する内向き整流カリウムチャネル(Kir)としてこれまでKir4.1が報告されているが、このチャネルの性質はRPEの電気生理学的とは明らかに異なるものであり、他に優位に発現するKirの存在が考えられていた。我々はRPEの電気生理学的性質に近い性質を持つKir7.1がRPEに発現するか否か、そしてその細胞内局在とそれを決定するメカニズムを解明することを目標として本研究を開始した。平成13年度の成果を記載する。1.RPEにおけるKir7.1mRNAの発現:RT-PCR法を用いてKir7.1のRPEにおける発現を検討し、RPEにはKir7.1のmRNAが発現していることが確認できた。2.RPEにおけるKir7.1蛋白の発現:まず、兎をホスト動物としてKir7.1のN末端およびC末端のアミノ酸配列に対するポリクローナル抗体を作成した。これらを検討した結果、N末端のアミノ酸配列に対する抗体が免疫組織化学法およびウエスタンプロット法で使用可能なことが判明した。次にこの抗体を用いてウエスタンプロット法でRPEにKir7.1蛋白の発現の有無を検討した。その結果RPEの膜分画にKir7.1蛋白が発現することが確認された。3.RPEにおけるKir7.1蛋白の局在:免疫組織化学的手法(光学顕微鏡)を用いてKir7.1のRPEにおける発現を検討した。その結果、Kir7.1はRPEのapical細胞膜突起の根元に発現していることが確認された。Kir4.1はapical細胞膜突起の中央先端部に発現していたので、両者の細胞内局在が違うことが判明した。一方、Na^+, K^+-ATPaseとの2重染色での検討では両者の発現部位は一致し、Kir7.1とNa^+, K^+-ATPaseが似たような細胞内局在を示すことが示された。ミューラー細胞と網膜色素上皮紬胞(RPE)は網膜神経細胞のイオン環境

特にK^+イオンの濃度調節を司ると考えられている。ミューラー細胞によるK^+イオンのバッファリングやRPEのapical側に大きなK^+コンダクタンスが存在することが以前から知られており、近年パッチクランプ法によりその実態が内向き整流性K^+チャネル(Kir)であることが示された。KirはKirl1.1からKir7.1までのサブタイプに分かれているおり各々機能分化している。われわれは網膜においてそれらKirサブタイプがどのように局在し機能しているかを解析してきた。ポリクロナル抗体を用いて網膜におけるKir4.1とKir5.1の発現と局在を検討したところKir5.1はミューラー細胞と網膜神経細胞の一部に免疫的に染色された。ミューラー細胞ではKir5.1は細胞体にdiffuseに染色されたが、Kir4.1はミューラーの硝子体側のエンドフットまたは血管周囲にまきつく突起部に強い局在を示した。Kir4.1による免疫沈降ではKir5.1が含まれていることからミューラー細胞の細胞体または遠位側にはKir4.1/Kir5.1の異種4量体が局在し、エンドフット側にはKir4.1同種4量体が局在していることが示唆された。それら異なる4量体チャネルはミューラー細胞におけるK^+イオンのバッファリングに異なる役割を示している可能性がある。またKir5.1が染色された網膜神経細胞はGAD65が発現しておりGABA産生アマクリン細胞と考えられた。Kir5.1は機能が十分に解析されていないため、ミューラー細胞やアマクリン細胞でどのように機能するかは今後の検討課題である。さらに免疫染色によってPREにKir7.1がapical processの基底部に局在してしていることが示され、電気生理学的にも培養細胞発現系でもK^+イオン特性がRPEと似ており、Kir7.1がRPEのK^+イオン特性を決めており、Kir7.1は網膜下腔のK^+イオンの恒常性に関与していると考えられた。ミューラー細胞と網膜色素上皮細胞(RPE)は網膜神経細胞のイオン環境特にK^+イオンの濃度調節を司ると考えられる。ミューラー細胞によるK^+イオンのバッファリングやRPEのapical側に大きなK^+コンダクタンスが存在することが知られており、近年その実態が内向き整流性K^+チャネル(Kir)であることが示された。KirはKir1.1からKir7.1まである。我々は網膜においてKirサブタイプがどのように局在し機能しているかを蛋白レベルで解析した。ミューラー細胞の細胞体または遠位側にはKir4.1/Kir5.1の異種4量体が局在し、エンドフット側にはKir4.1同種4量体が局在している。Kir5.1がGABA産生アマクリン細胞に染色される。またKir7.1がRPEapical processの基底部に局在しRPEのK^+イオン特性を決めて網膜下腔のK^+イオンの恒常性に関与していることを示してきた。今後は生体網膜での電気活動の観察が必要であるが、電位依存性カリウムチャネル(Kv)に対しては特異的阻害薬ペプチドが知られる一方でKirに対してはそのようなペプチドはなく、生体網膜での機能解析は困難であった。最近になり蜂毒のテルチアピンがKirのいくつかを阻害することが報告された。
振動台実験と常時微動観測による尾根地形での地震時地盤応答の究明に関する研究

本研究では尾根部の地震時応答を明らかにするため,模型を用いた振動台実験と被害のあった尾根部での常時微動測定を行った.振動台実験の結果,最も揺れが大きくなる周波数(1次ピーク)では稜線にほぼ平行な応答となっていた.また揺れの大きい範囲は尾根稜線の変曲点付近から尾根付け根までの長さの約2/3程度まで,高さ方向には尾根稜線から尾根高さの34割程度であることがわかった.しかし高周波領域では,尾根の応答は稜線に直交するように加振しているにもかかわらず,稜線上にもほとんど揺れない点が現れるなど複雑な応答となることがわかった.常時微動測定の結果,健全な地点の卓越周期は宅地の標高や石積み擁壁の高さによる違いがみられず,ほぼ一定の値となった.地震による被害が見られた宅地では,卓越周期が長周期側の値となっており,宅地が緩んだために長周期側の値となった可能性が示されたが,一部では被害の見られない宅地でも卓越周期が長周期側の値となり,宅地内部が緩んでいる可能性があることが分かった.また長周期側の値となった地点の分布は,振動台実験で1次ピークとなった時の揺れの大きい範囲とほぼ一致し,実験に用いた物性値や相似則などから推定される尾根の卓越周期は,常時微動測定により求まった卓越周期と一致した.現場付近の花崗岩のせん断波速度などを用いた4質点系解析の結果,尾根上部では加速度が約1.82.0倍に増幅されていた可能性があることが分かった.常時微動計を用いたアレー観測の結果,卓越周期時には尾根下部の振幅に比べ,上部では5倍程度の振幅となっていたことがわかった.以上から,地震時に尾根が共振したために尾根上部の揺れが大きくなり,尾根上部に被害が集中した可能性があることが分かった.また本研究から常時微動測定により宅地の緩みを評価できる可能性があることがわかった.芸予地震後の現地調査の結果,呉市では平野部と山地部の境界である丘陵地に被害が集中し,特に尾根上部に集中していたことが明らかとなった.今後のリスクマップ作成や耐震補強が必要な箇所の選定のための基礎的研究として、尾根部での地盤応答特性に及ぼす尾根形状の影響を明らかにすることが必要である。本研究では、小型振動台を用いた模型実験と原位置での常時微動観測を行い、それらと被害記録とを合わせて検討し,尾根部での地震時三次元応答について明らかにすることを目的としている。今年度は両城地区を対象として,模型実験および常時微動観測を行った.まず測量結果を基に,模型を作成し,高さを変化させた模型を作成し、加振周波数を段階的に変化させながら加振を行い、尾根高さと加振周波数が尾根地形の地盤応答特性に与える影響について検討した。その結果頂上付近の揺れが最も大きくなる振動数では,頂上付近の揺れが大きい範囲と石積擁壁に被害が見られた範囲がほぼ一致することが分かった.また常時微動観測では,周辺地域に比べ,尾根部の卓越周期が短く,芸予地震時に花崗岩地盤上で観測された強震記録の卓越周期とほぼ一致していることが明らかとなり,地震時には共振していた可能性が高いことが分かった.また宅地内での卓越周期の違いについて検討したが,石積擁壁の高さ,石積擁壁までの距離,家屋までの距離による違いは小さく,尾根高さ方向に卓越周期に変化がないことも分かった.しかし芸予地震時に被害が見られた宅地では,健全な宅地に比べ卓越周期が長くなっていることが分かった.芸予地震後には尾根部ではこれまで被害が発生しなかったような少雨でも崩壊が引き起こされており,地震により宅地が不安定化されたものと判断される.したがって地震による石積擁壁の地震後の安定性を常時微動観測による評価できる可能性があることを示している.本研究では尾根部の地震時応答を明らかにするため,模型を用いた振動台実験と被害のあった尾根部での常時微動測定を行った.振動台実験の結果,最も揺れが大きくなる周波数(1次ピーク)では稜線にほぼ平行な応答となっていた.また揺れの大きい範囲は尾根稜線の変曲点付近から尾根付け根までの長さの約2/3程度まで,高さ方向には尾根稜線から尾根高さの34割程度であることがわかった.しかし高周波領域では,尾根の応答は稜線に直交するように加振しているにもかかわらず,稜線上にもほとんど揺れない点が現れるなど複雑な応答となることがわかった.常時微動測定の結果,健全な地点の卓越周期は宅地の標高や石積み擁壁の高さによる違いがみられず,ほぼ一定の値となった.地震による被害が見られた宅地では,卓越周期が長周期側の値となっており,宅地が緩んだために長周期側の値となった可能性が示されたが,一部では被害の見られない宅地でも卓越周期が長周期側の値となり,宅地内部が緩んでいる可能性があることが分かった.また長周期側の値となった地点の分布は,振動台実験で1次ピークとなった時の揺れの大きい範囲とほぼ一致し,実験に用いた物性値や相似則などから推定される尾根の卓越周期は,常時微動測定により求まった卓越周期と一致した.現場付近の花崗岩のせん断波速度などを用いた4質点系解析の結果,尾根上部では加速度が約1.82.0倍に増幅されていた可能性があることが分かった.

常時微動計を用いたアレー観測の結果,卓越周期時には尾根下部の振幅に比べ,上部では5倍程度の振幅となっていたことがわかった.以上から,地震時に尾根が共振したために尾根上部の揺れが大きくなり,尾根上部に被害が集中した可能性があることが分かった.また本研究から常時微動測定により宅地の緩みを評価できる可能性があることがわかった.
カハールの介在細胞による回盲部の運動制御機構の解明

本研究によって、モルモット回盲部の筋層にも神経要素に密接した豊富なICCが存在することが明らかとなった。また回盲部では、粘膜下層にもICCが存在し、長い突起によって粘膜下神経叢や粘膜筋板などと密接していることが明らかとなった。この粘膜下層のICCは、微細構造学的にも筋層のICCと類似した特徴を示しており、神経伝達物質の受容体であるneurokinin 1 receptor(NK1-R)陽性のものも存在した。以上の結果から、この粘膜下層のICCも含め、回盲部に密に存在するICCが回盲部の運動制御において重要な役割を担っている可能性が示唆された。カハールの介在細胞(Interstitial cells of Cajal; ICC)は、消化管運動におけるペースメーカーあるいは興奮伝達機構として重要な役割を担うことが知られている。ICCには複数のサブタイプが存在し、各サブタイプは消化管の部位によって異なる分布を示す。本研究では、回盲部の運動制御においてもICCが重要な役割を担っている可能性を考え、ICCの組織学的解析から回盲部の運動制御機構を解明していくことを目的としている。本年度は、モルモット回盲部におけるICCサブタイプの分布様式、形態的特徴ならびに周囲の神経や平滑筋との関係について免疫組織化学的な解析を行った。その結果、回盲部にも豊富なICCが存在し、その分布様式が回盲部の中で細かく変化していることが明らかとなった。神経から平滑筋への興奮伝達に関わるタイプのICCが、回盲弁で密に分布していたことは、ICCが筋の協調した運動の調節、例えば回盲弁の括約機能等に関わっている可能性を示唆している。各サブタイプの形態は、消化管の他の部位で認められる同一サブタイプの形態と類似しており、長く伸ばした突起によって神経に密接していた。なお、回盲弁近傍では粘膜下層においても双極性あるいは多極性のICCマーカー(Kit)陽性細胞が観察された。これらの細胞は、しばしば突起によってマイスナー神経叢と密接していた。また、回盲弁では筋層と粘膜筋板の間で筋束による連結がしばしば認められた。粘膜下層のKit陽性細胞の中には、それらの筋束を包むように突起を伸ばすものや、粘膜筋板と密接して突起を伸ばすものも認められた。粘膜下層のICCについては、これまでほとんど報告されていないので、今回観察されたこのKit陽性細胞がICCであるか否か、そしてICCであった場合、どのような機能を担っているかについては、今後更なる解析が必要であると考えている。消化管の筋層に認められるカハールの介在細胞(Interstitial cells of Cajal ; ICC)は、消化管運動におけるペースメーカーあるいは興奮伝達機構として働く事が知られている。本研究は、ICC関与の可能性を想定し、回盲部の運動制御機構を1CCの組織学的特徴から解明していくことを目的としている。昨年度は、モルモット回盲部におけるICCの分布様式、形態学的特徴ならびに神経や平滑筋との関係について免疫組織化学的な解析を行い、回盲部の筋層にも豊富なICCが存在し、回盲部の中でも、さらに部位ごとに分布様式が変異を示すことを明らかにした。また、Iccの特異的マーカーとして知られるKit陽性の細胞が、回盲部の粘膜下層にも存在する事を明らかにした。粘膜下層のKit陽性細胞は、長い突起を伸ばし粘膜下神経叢や粘膜筋板、あるいは粘膜筋板と輪走筋を結ぶ筋束と密接していた。このKit陽性細胞は、小腸輪走筋の最内層付近に存在するICC-DMPとも密接な関係を示したため、ICC-DMPと類似の性質を持っている可能性が推定された。そこで本年度は、小腸ICC-DMPが特異的に発現しているneurokinin 1 receptor(NK1-R)に注目し、粘膜下層のKit陽性細胞におけるMK1-Rの発現の有無を免疫組織化学的に解析した。その結果、粘膜下層のKit陽性細胞の中にもMK1-R陽性の細胞が認められたが、その陽性率はICC-DMPに比べはるかに低かった。以上の結果から、粘膜下にはMK1-R陽性と陰性の性質の異なるKit陽性細胞が存在する事が明らかとなった。その他の受容体発現の可能性を含め、これらの細胞について更に解析を進める予定である。カハールの介在細胞(Interstitial cells of Cajal ; ICC)は、消化管運動におけるペースメーカーあるいは興奮伝達機構として働く事が知られている。本研究は、回盲部の運動制御機構へのICCの関与を、組織学的特徴から解明していくことを目的としている。昨年度までに、モルモット回盲部におけるICCの分布様式、形態学的特徴ならびに神経や平滑筋との関係について免疫組織化学的な解析を行ってきた。その結果、回盲部の筋層にも豊富なICCが存在し、回盲部の中でも、さらに部位ごとに分布様式が変異を示すことを明らかにした。

また、一般にICCは消化管の筋層に分布すると考えられているが、回盲部のごく限られた領域においては、ICCの特異的マーカーとして知られるKit陽性の細胞が粘膜下層にも存在し、長い突起によって粘膜下神経叢と密接している事を明らかにした。本年度は、ここまでの成果をCell and Tissue Research誌(vol 338 (1) : 29-35)にて報告した。この粘膜下層のKit陽性細胞については、引き続き解析を行い、この細胞の突起が、粘膜筋板あるいは粘膜筋板と輪走筋を結ぶ筋束とも密接していることを明らかにした。また、このKit陽性細胞の機能を解明していくために、神経伝達物質のレセプターであるneurokinin 1 receptor (NK1-R)の発現の有無を免疫組織化学的に解析した。その結果、粘膜下のKit陽性細胞にはNK1-R陽性のものと陰性のものが存在する事が明らかとなった。これらの結果についても順次報告を行っていく予定である。本研究は、消化管運動におけるペースメーカーあるいは興奮伝達機構として重要な役割を担うことが知られているカハールの介在細胞(Interstitial cells of Cajal ; ICC)の、回盲部における分布ならびに特徴について組織学的な解析を試みるものである。昨年度までは、免疫組織化学的解析を中心に行い、モルモット回盲部の筋層にも豊富なICCが存在し、回盲部の狭い領域内においても部位固有の分布様式を示すことを明らかにした。また、粘膜下層にもICCが存在し、長い突起によって粘膜下神経叢や粘膜筋板などと密接していることを明らかにした。この粘膜下層のICCの中には、神経伝達物質の受容体であるneurokinin 1 receptor (NK1-R)陽性のものが存在した。そこで本年度は、これらの要素の関係を更に詳細に検索するため透過型電子顕微鏡を用いて微細構造学的解析を行った。その結果、回盲弁の粘膜筋板は、回腸側では筋細胞が密に並んだ厚いものであるのに対し、盲腸側では45層の筋細胞が疎に並んだ薄いものであるというように、領域によって異なる特徴を示すことが明らかとなった。粘膜下神経叢周辺には、線維芽細胞の他に、ミトコンドリアが豊富で、細胞膜にカベオラを持つ細胞が認められた。これらの特徴は筋層内のICCと類似しており、粘膜下層にICCの存在することを微細構造的にも示すものと考えられた。これらの細胞と神経要素、粘膜筋板平滑筋などとの機能的接点の有無については、さらに一層の微細構造上の観察を必要としているが、回盲部に密に存在するICCが回盲部の運動制御において重要な役割を担っている可能性が示唆された。