hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CLIP-RNAi法の開発と応用

最近,筆者ら培養プレート上の動物細胞に対して光照射領域特異的にRNAi(RNA配列特異的な遺伝子発現抑制)を誘導する技術(CLIP-RNAi法)を開発した。本課題では, CLIP-RNAi法で用いるキャリア蛋白質の改良により本技術を改良し、多様な波長の光に対応するように本技術を拡張した。また、CLIP-RNAi法を光照射領域特異的な細胞の分化誘導や、In vivoでのRNAiなどに応用することに取り組んだ。近年,siRNAやshRNAにより配列依存に遺伝子発現抑制が起こる現象(RNAi)が注目され,遺伝子機能研究や創薬研究に幅広く利用されている.研究代表者らは最近,培養プレート上の動物細胞に対して光照射領域特異的にRNAiを誘導する技術を開発した.光で切り取る(=clip)ように遺伝子発現を抑える方法なので,この方法をCLIP-RNAi法と呼ぶことにした.本課題では,CLIP-RNAi法を最適化すると共に応用展開することを目的として、以下に取り組んだ.1) CLIP-RNAi法で用いるRNAキャリアの最適化を目指し,本研究では元となるキャリア蛋白質(TatU1A)の改良を行った。キャリア蛋白質のN末やC末のアミノ酸配列を工夫した結果、C末に分解タグを融合させたときなどに、RNAi効果が高まることが分かってきた.2)本方法の汎用性を高めるため,様々な波長の光照射でRNAiを可能にする必要がある.そこで,Photosensitizer (PS)としてAlexa-Fluor 546以外にも,Alexa-FluorシリーズおよびCy-dyeシリーズで標識したTatU1Aを用い,350-680nm付近の光照射を行うことでRNAiの誘導が可能であるかを調べた.結果として、Alexa-Fluor 633やCy3などの蛍光色素をPSとしてCLIP-RNAi法に使えることがわかった.3) CLIP-RNAi実験について,レーザー光を使うと,さらに精密に照射位置を限定できるはずである.共焦点レーザー顕微鏡のレーザー光を用いて,5x5200x200μm程度の領域におけるCLIP-RNAiや,単一細胞(1020μm)を狙ったCLIP-RNAiを試し、実際にこれらの微細領域におけるRNAiを引き起こせることを確認した.1)多様な光増感剤の適用本方法の汎用性を高めるため,様々な波長の光照射でRNAiを可能にする必要がある。本年度は,700nmから800nmの波長の光で励起できる蛍光色素を光増感剤として使えるかどうかを試した。この波長域の6種類の蛍光色素を用いてみたところ、1種類は光増感剤として使えることが分かった。すなわち、この波長域でCLIP-RNAi法を利用することが可能になった。2)光照射領域特異的な細胞の分化誘導マウス筋芽細胞株を入手し、筋細胞への分化促進を誘導すると報告されているshRNA[anti-TRB]および、筋細胞への分化マーカー発現を誘導すると報告されているmiR-133bをCLIP-RNAi用のキャリア分子と結合する形で設計した。現在、培養シャーレ上で光照射領域特異的にRNAの細胞質内導入を行うことで、領域特異的な細胞の分化誘導を試みているところである。1)cLIP-RNAi法における時間軸の検討:CLIP-RNAi法をより効果的に利用するために、RNA/キャリア複合体で細胞を処理する時間、および、その後に光照射を行うまでの時間を検討した。また、これらの各段階におけるRNAおよびキャリアの細胞内外での安定性を調べた。結果として、各段階において、効果的にRNAiを起こすうえで最適な時間範囲を決めることができた。2)In vivoでのRNAi効果の検証:治療薬としての応用展開を目指し,生体内においてCLIP-RNAi法による局所的なRNAi効果が見られるかどうかを調べた。ここでは,ヌードマウスの背中皮下にLuciferase発現細胞を植え付け,その細胞に対してCLIP-RNAiを行った。まだ再現性の確認が必要ではあるが、この実験において照射部位のみでRNAi効果が見られるという結果を得た。
光捕集電子輸送系の逐次合成

本研究では、高効率光電変換系の界面ボトムアップ法による構築を研究目的とする。高効率光電変換系を実現するために必要な要素として、一つに速やかに電子を電極に移動することが可能であること、もう一つには光電子を発生できる多くの光応答性部位が存在することが挙げられる。電子輸送部分として、申請者の所属する研究室で用いられてきたテルピリジンを逐次的に錯形成させて作製される金属錯体分子鎖を用い、光応答性部位には高い光増感作用を持つルテニウム錯体に注目した。本年度においては、電極と光電変換部位とをつなぐ分子電線部分の性能評価および改良を行った。まず長距離電子移動に関して、従来報告されていた最も遠くまで電子移動速度を落とさずに電子を輸送できる分子電線に匹敵する長距離電子輸送能を持つことが明らかとなり、高効率な電線としての機能を持つことが明らかとなった。さらにその分子電線にポテンシャル勾配を持たせることで逆電子移動を防ぎつつ、速やかに電極へと電子を移動させる高機能化を目指した研究も行った。その方法としては、テルピリジン部分を修飾した架橋配位子を用いて分子電線を作製し、その置換基の電子求引性、電子供与性によって錯体部位のポテンシャルが変化することを利用し、電極に近づくにつれて錯体部位のポテンシャルが上がる、あるいは下がるように配列させることを試みた。また構造的なアプローチとして枝分かれを持つ架橋配位子を用いた樹状型錯体に関してもその長距離電子輸送特性を評価した。これまでのところ、樹状型錯体を用いた場合に電極から錯体ワイヤーへ電子を流しやすく、逆の方向に電子を流しにくいという結果を得ている。この特性を利用することで末端に固定されたルテニウム錯体に光を照射することで優れた光電変換特性が発現する可能性が示された。電子輸送部分として、申請者の所属する研究室で用いられてきたテルピリジンを逐次的に錯形成させて作製される金属錯体分子鎖を用い、光応答性部位には高い光増感作用を持つルテニウムトリスビピリジン錯体に注目した。その方法としては、異なった架橋部位を持つ架橋配位子を用いて分子電線を作製し、その架橋部位の電子求引性、電子供与性によって錯体部位のポテンシャルが変化することを利用し、電極に近づくにつれて錯体部位のポテンシャルが上がる、あるいは下がるように配列させることを試みた。これまでのところ同じ架橋配位子の組み合わせを用いても、その順番を変えることにより末端に固定したフェロセンの電子移動速度が変わることが明らかとなっており、適した架橋配位子の種類と順序を探索することによって詳細なポテンシャル制御が可能になり、光電変換系にとって理想的なポテンシャル勾配、すなわち階段状ポテンシャルが実現できる可能性がある。
超高圧力場を反応場とした軽元素共有結合ネットワークの構築と機能設計

軽元素の共有結合ネットワークからなる結晶構造内のオングストロームサイズの空洞を「機能設計の場」と捉え、ゲスト種の導入によって電子・スピン・フォノンを独立に操り、ハイブリッド機能を発現し、モノリシック材料の多機能化を実現することを目的として、ホウ素と酸素、イオウからなる配位多面体を骨格とした新規物質を高圧合成法により探索した。ホウ素化合物の多くは、常圧下ではホウ素の平面3配位構造となるが、高圧力下ではsp^3配置によるBO_4やBS_4四面体の形成が促進され、これら四面体のネットワークから成る高圧相の形成が認められた。Ag-B-O系では、7GPa程度の圧力下で、新規化合物がアモルファス試料中に混在して生成し、そのIRスペクトルからBO_4四面体の形成が示唆された。温度、圧力をパラメーターとして結晶生成条件を詳細に調べることにより、褐色透明の単結晶を単離することに成功した。単結晶X線構造解析の結果、この新規物質はAg_<13>B_<11>O_<23>の化学組成で表される化合物で、BO_4四面体の頂点共有から成る結晶構造内の大きなケージに、Agイオンが統計的に分布した構造を有することがわかった。ケージ内ではAgイオンが大きな熱振動パラメーターを示すことから、ケージをチャンネルとしたイオン伝導性発現が期待できる。メタロイド共有結合性化合物の物質探索では、新たにMnGe_4型新規物質群を見出し、その結晶構造を明らかにし、Mn-Mn距離に応じて強磁性が発現することを確認した。軽元素の共有結合ネットワークからなる結晶構造内のオングストロームサイズの空洞を「機能設計の場」と捉え、ゲスト種の導入によって電子・スピン・フォノンを独立に操り、ハイブリッド機能を発現し、モノリシック材料の多機能化を実現することを目的として、B-S二元系化合物から出発し、超高圧力下でのmacrotetrahedron骨格構造への原子挿入反応を検討した。B-S二元系高圧相としてBS、B_2S_3の2相の存在を確認し、P-Tダイアグラム上での生成領域を確定した。BSは二次元層状構造を有しており、層間には広い空隙を有することから、原子挿入反応のホスト構造として適していることを知見した。B_2S_3高圧相はBS_4四面体の多段連結からなるマクロテトラヘドラル構造を有しており、Ca-B-S三元系に展開することによって、空隙内にCa原子が配置した構造を形成することを知見した。同様の共有結合ネットワークを構築する可能性を見出すため、一価金属イオンを含むCu-B-O、Ag-B-O三元系酸化物の高圧合成を行い、四面体配位のホウ素を有する結晶構造形成を調べた。B-O酸化物系では、B-S系とは異なり、マクロテトラヘドラル化合物の形成は認められず、アモルファス相が形成されやすいことが判明した。メタロイド共有結合性化合物の物質探索を行う過程で、2相の新規強磁性化合物MnGa_2Sb_2、CrGa_2Sb_2を発見し、規則配列したGa-Sb共有結合ネットワーク内に遷移金属原子が直鎖を形成して配置することによって強磁性を発現することを見出した。
光超音波－磁気共鳴デュアルイメージングプローブの創製

ゼラチンあるいは糖誘導体を用いる表面修飾により、生体適合性に優れ、水中で高分散し、長時間安定な新しい“常磁性金属酸化物ナノ粒子"(Gd2O3およびMnO)の合成に成功した。また、これらのナノ粒子が、光超音波イメージング(PAI)と磁気共鳴イメージング(MRI)の双方に有効な分子プローブ型造影剤であることを明らかにした。さらに、これらのナノ粒子造影剤について、EPR効果の発現に適した粒径制御(Gd2O3、MnO)、あるいは表面修飾剤であるゼラチンのアミノ基と人工抗体との複合化により(Gd2O3)、腫瘍への高い集積性を示す新規ナノ粒子造影剤の開発に成功した。現在、臨床現場で広く利用されている磁気共鳴イメージング(Magnetic Resonance Imaging, MRI)は、生体深部の撮像が可能であるが、感度が低く、多量の造影剤の投与、あるいは繰り返し投与が必要であるという問題点を有している。一方、近年注目されている光音響イメージング(Photoacoustic Imaging, PAI)は、撮像範囲が表層2 3 cmの範囲に限られるものの、高感度かつ高解像度でのイメージングが可能である。そこで研究代表者は、癌の早期発見と診断確度の向上を目指し、MRIとPAIの双方のイメージング法に有効なMR-PAデュアルイメージングプローブの開発に取り組んでいる。平成27年度は、常磁性金属の中で2価のマンガン(Mn2+)に注目し、まず、水分散可能な2種類のマンガン酸化物(Mn3O4およびMnO、XRDで構造確認)ナノ粒子の合成を行い、特に、MnOナノ粒子がPAーMRデュアルイメージングプローブとして極めて有効であることを明らかにした。次に、このMnOナノ粒子について、高い生体適合性と親水性を有する糖誘導体を表面修飾剤として用いた結果、D-glucosamineが最も適切な表面修飾剤であることが明らかとなり、D-glucosamine修飾MnOナノ粒子プローブを用いるddYマウスのin vivoでのMRおよびPAイメージングに成功した。本研究では、高い生体適合性と親水性を有する糖誘導体を表面修飾剤とする粒径約100 nmの水分散可能な9種類のMnOナノ粒子を合成した。その中で、特に、D-glucosamine修飾MnOナノ粒子が、現在、臨床現場で使用されている造影剤Magnevistの約4倍の高いT1短縮能r1を示すとともに、近赤外パルスレーザー光の照射により、最も強いPA信号を発生することを明らかにした。以上の様に、本研究の当初の目的であったPAーMRデュアルイメージングプローブとして、D-glucosamine修飾MnOナノ粒子プローブが最適であることを明らかにし、基礎的研究についてはほぼ完了した。次年度以降は計画を前倒しして、動物実験によるD-glucosamine修飾MnOナノ粒子プローブの血中滞留性、体内動態(臓器蓄積性)、および腫瘍集積性の評価を行うとともに、MRIおよびPAIのいずれの画像化においてもさらなる感度の向上を目指す。我々は、生体適合性に優れ、粒径を自在に制御可能なゼラチン被覆Gd2O3ナノ粒子の合成に成功し報告している。本ナノ粒子はMRI造影剤として有効であるが、特異的な腫瘍標的能は有しておらず、ナノ粒子の大きさに依存するEPR(Enhanced Permeability and Retention)効果、すなわち受動的標的能により、長時間(48時間)かけて腫瘍組織に集積する。一方、本ナノ粒子に抗HER2抗体を導入できれば、HER2蛋白を高発現している腫瘍への特異的標的能が付与され、ナノ粒子造影剤が短時間で腫瘍に高集積し、結果としてナノ粒子造影剤の投与量の著しい低減が期待される。そこで本年度は、ゼラチン被覆Gd2O3ナノ粒子造影剤にHER2完全長抗体を導入した能動的標的能を有する新しい磁気共鳴イメージング用(Magnetic Resonance Imaging, MRI)造影剤の開発を行い、その有効性と機能を明らかにした。HER2完全長抗体を導入したゼラチン被覆Gd2O3ナノ粒子プローブは、高い縦緩和能r1を示し、HER2陽性細胞表面への高い結合能を示したことから、腫瘍特異的標的能を有する分子プローブ型MRI造影剤であることが明らかになった。本手法は、HER2抗体に限らず、種々の疾患に発現する抗原に対する抗体に応用可能である。従って、ゼラチン被覆Gd2O3ナノ粒子は、MRIによる抗体医薬の薬効・治療効果の評価に有効な新しいプラットフォームとして期待される。本研究では、我々が独自の方法で開発した「ゼラチン被覆Gd2O3ナノ粒子」が、光超音波(PA)ー磁気共鳴(MR)デュアルイメージプローブとして有効であることを利用し、昨年度までにD-glucosamine被覆MnOナノ粒子が、ゼラチン被覆Gd2O3よりナノ粒子より造影能の高いPAーMRイメージングプローブであること、本年度は、これらのプローブのドラッグデリバリーシステム(DDS)について検討し、HER2完全長抗体を用いることにより、これまでのEPR効果より,はるかに短時間で腫瘍に高集積する造影剤の開発に成功した。以上の結果は、ゼラチン被覆Gd2O3ナノ粒子は、PAIおよびMRIによる抗体医薬の薬効・治療効果の評価にも有効な新しいプラットフォームであることを示している。従って、本研究は、当初の計画以上に進展しており、PAーMRデュアルイメージングプローブの更なる高機能化と新しい展開が期待される。

平成29年度は、ゼラチンと安定な複合体を形成する抗癌剤ドキソルビシン(DOX)を複合化した新規ゼラチン被覆Gd2O3ナノ粒子(DOX-Gd-NPs)の合成と機能評価を行った。まず、塩基性条件下Gd(NO3)3・6H2Oをジエチレングリコール(DEG)溶媒中で加熱することにより、DEGに分散したGd2O3ナノ粒子を得た。続いて、アセトン加え、遠心沈降により集めた沈澱を洗浄後、超純水に分散させた溶液に、PEG化ゼラチンとDOXとの混合水溶液を加え、室温で12時間撹拌した後、未反応のDOXを限外濾過により除去し、DOX-Gd-NPsを得た。さらに、ヒト子宮頸癌由来のHeLa細胞にDOX-Gd-NPsおよびDOX単体をそれぞれ投与した結果、いずれも高い細胞増殖抑制効果を示した。以上の結果より、新たに合成したDOX-Gd-NPsは、PA/MRデュアルイメージングプローブとして有効であるとともに、DOX由来の顕著な細胞増殖抑制効果を併せ持つ「セラノスティック」プローブであることが明らかになった。ゼラチンあるいは糖誘導体を用いる表面修飾により、生体適合性に優れ、水中で高分散し、長時間安定な新しい“常磁性金属酸化物ナノ粒子"(Gd2O3およびMnO)の合成に成功した。また、これらのナノ粒子が、光超音波イメージング(PAI)と磁気共鳴イメージング(MRI)の双方に有効な分子プローブ型造影剤であることを明らかにした。さらに、これらのナノ粒子造影剤について、EPR効果の発現に適した粒径制御(Gd2O3、MnO)、あるいは表面修飾剤であるゼラチンのアミノ基と人工抗体との複合化により(Gd2O3)、腫瘍への高い集積性を示す新規ナノ粒子造影剤の開発に成功した。平成27年度までの研究で明らかにした「糖修飾MnOナノ粒子プローブ」の紫外可視吸収スペクトルを測定し、研究代表者が既に開発に成功しているゼラチン修飾Gd2O3ナノ粒子のスペクトルと比較する。大きなモル吸光係数と可視光領域(長波長)の吸収が観測されれば、ゼラチン修飾Gd2O3ナノ粒子より、糖修飾MnOナノ粒子の方がPAイメージングに有効と考えられる。一方、MRIについては、糖修飾MnOナノ粒子プローブでは、Mn2+の不対電子の配置から、高い造影能(r1およびr2)を示すことが予想され、陽性および陰性の両性MRI造影剤としての有効性が期待される。さらに、「D-glucosamine修飾MnOナノ粒子プローブ」を健常マウスに尾静脈投与し、血中滞留性と体内動態(臓器蓄積性)を明らかにし、疑陽性が観測されないことを確認する(バックグラウンドとして、内在性のMn2+が観測されるため。)。より詳細には、マウスの排泄物(糞・尿)をMRS、LC/ESI-TOF MSおよびMALDI-TOF MS、原子吸光光度計により分析し、本ナノ粒子の排泄機構を明らかにする。これらの動物実験の結果をフィードバックし、より高機能性の「糖修飾MnOナノ粒子プローブ」を創製する。また、必要であれば、MnOナノ粒子表面のD-glucosamineのアミノ基をトリガーとして、ポリエチレングリコール(PEG)鎖の導入、および腫瘍抗原特異的抗体の導入を行い、血中滞留性の向上を目指すとともに、腫瘍へのターゲティング機能を有する革新的な分子プローブ型「糖修飾MnOナノ粒子プローブ」を開発する。
スラミングを受ける船の最終強度について

1.まず、現在までに開発してきた理想化構造要素を用い、ハルガーダの最終強度を解析した。その際に、従来から開発していた解析プログラムに弧長増分法を導入し構造物の崩壊時における非線形挙動に強いプログラムに改良した。さらに、多自由度従属拘束の手法をプログラムに導入することにより、船体梁の曲げ、剪断等を考慮できるシステムを構築した。作成したプログラムを基に、いくつかの船体縦構造に対して、ホギングとサギングによる崩壊を解析した。2.船体縦曲げ強度解析システムとしてスミス法によるプログラムも作成した。このシステムを最終強度の統計的性質を把握するために用いた。解析にあたってはモンテカルロ・シミュレーションおよび感度解析を行った。また、衰耗の激しい老朽化船における構造信頼性についても検討を行い、安全性を評価した。3.次に、外力の評価法として船体断面に作用する2次元流体力と弾塑性有限要素法を組み合わせた解析システムを構築した。有限要素法には梁要素を用いている。ハルガーダの崩壊挙動は上記強度解析システムから計算される曲げモーメント曲率関係を用いる。この計算プログラムにより、波浪中の船体の折損過程のシミュレーション解析を行い得ることを示した。4.スラミングにより、船体構造が大きく変形する場合の基礎的研究して、流体と構造の連成現象を解明するための数値解析プログラムを開発した。これを用いて簡易な形状について、構造の剛性、流体の形状を変更したパラメータ計算を行い、連成の影響を検討できることを示した。5.今後は、これらを組合せて、スラミングを受ける船体防撓板構造の最終強度解析システムとして統合化できるよう検討を続ける予定である。まず初年度として、本研究では、現在まで開発してきた構造要素を用い、ハルガーダの最終強度を解析した。作成したプログラムをもとに、いくつかの船体縦構造に対して、ホギングによる崩壊とサギングによる崩壊を解析した。また、各パネルが初期撓みや溶接残留応力を有する場合についても解析を行い、縦強度の最終強度を算出した。船体縦曲げ強度の統計的性質を把握するために、本年度はスミス法を用いたモンテカルロシュミレーションを行った。その結果、線隊縦曲げ強度の統計的性質を特定することができ、波力応答と構造強度を総合した構造信頼性問題への適用を行うことができた。また、衰耗のはげしい老朽化船における構造信頼性についても検討を行い、安全性を評価した。構造の動的応答の解析に関しては、横圧をうける二重底構造の動的挙動について解析を行うプログラムを完成させた。この計算を行う際には、構造物の塑性と座屈損傷を考慮に入れ解析を行っている。以上の各プログラムの開発により、「スラミングをうける船の最終強度解析法」の構造部分に関するシステムの構築の骨格が完成した。本研究では、現在まで開発してきた理想化構造要素を用い、ハルガーダの最終強度を解析した。作成したプログラムをもとに、いくつかの船体縦構造に対して、ホギングとサギングによる崩壊を解析した。もう一つの船体縦曲げ強度解析システムとしてスミス法によるプログラムも作成した。解析にあたってはモンテカルロシミュレーションおよび感度解析を行なった。

次に、外力の評価法として、船体断面に作用する二次元流体力と弾塑性有限要素法を組み合わせた解析システムを構築した。有限要素法には梁要素を用いている。ハルガータの崩壊挙動は上記強度解析システムから計算された曲げモーメント曲率関係を用いる。この計算プログラムにより異常海象下における船体の折損過程を明らかにするつもりでいる。今後は、このシステムをスラミングによる衝撃力を考察できるように改良する必要がある。以上の各プログラムの開発により、「スラミングをうける船の最終強度解析法」に関するシステムの構築の骨格はほぼ完成した。研究計画最終年度である平成12年度には、次のような成果を得ている。1.船体縦曲げ強度解析システムとしてスミス法によるプログラムも作成した。このシステムを最終強度の統計的性質を把握するために用いた。解析にあたってはモンテカルロ・シミュレーションおよび感度解析を行った。また、衰耗の激しい老朽化船における構造信頼性についても検討を行い、安全性を評価した。2.次に、外力の評価法として船体断面に作用する2次元流体力と弾塑性有限要素法を組み合わせた解析システムを構築した。ハルガーダの崩壊挙動は上記強度解析システムから計算される曲げモーメント曲率関係を用いる。この計算プログラムにより、波浪中の船体の折損過程のシミュレーション解析を行った。繰り返し曲げ荷重の大きさと曲げモーメント曲率関係の相違により、変形挙動が以下のタイプに分類できることなどを示した。1)シェイクダウンし、塑性変形が停止するタイプ、2)ヒステリシス・ループを描きながら塑性変形を繰り返すタイプ、3)塑性変形が急増し、進行性崩壊するタイプ3.スラミングにより、船体構造が大きく変形する場合の基礎的研究して、流体と構造の連成現象を解明するための数値解析プログラムを開発した。これを用いて簡易な形状について、構造の剛性、流体の形状を変更したパラメータ計算を行い、連成の影響を検討できることを示した。また、別途研究されている実験結果との比較・検討も行っている。今後は、2と3を組合せて、スラミングを受ける船体防撓板構造の最終強度解析システムとして統合できるよう検討予定である。
微小環境因子による炎症反応と癌関連糖鎖合成酵素遺伝子の発現誘導機構及び意義の解明

メラノサイト及びメラノーマ細胞のガングリオシド糖鎖合成酵素遺伝子の発現レベルを解析した結果、GD3合成酵素遺伝子の発現がメラノーマで高く、メラノサイトでは非常に低かった。しかし、メラノサイトではTNFα刺激とcAMP刺激除去によりその遺伝子の発現上昇が認められ、TNFαとcAMPを介したシグナルがGD3合成酵素遺伝子の発現を正反対に制御することが示唆された。一方、これらの処理によりメラノーマ細胞ではGD3合成酵素遺伝子発現の変動はなく、IKK阻害剤によりその発現は著しく低下した。従って、癌関連糖鎖合成酵素遺伝子の発現制御はメラノサイトとメラノーマでは異なることが明らかになった。ヒトメラノーマ細胞株(SK-MEL-28)及び培養ヒトメラノサイトについてスフィンゴ糖脂質の糖鎖合成酵素遺伝子の発現レベルをRT-リアルタイムPCRでにより解析した結果、SK-MEL-28ではメラノサイトと比較して、GD3合成酵素(ST8SIA1)及びGM2/GD2合成酵素(B4GALNT1)遺伝子の発現が高く、GM1/GD1b合成酵素(B3GALT4)遺伝子の発現が顕著に低かった。他のメラノサイト及び各種のメラノーマ細胞株の糖鎖合成酵素遺伝子の発現についても検討し、同様の結果が得られた。メラノサイトおよびメラノーマにUVBを照射した場合、これらの遺伝子発現に著明な変化は認められなかった。一方、メラノサイトをUVB照射ケラチノサイト(HaCaT細胞)の培養上清で培養した場合、GD3合成酵素、GM2/GD2合成酵素遺伝子の発現上昇、及びGM1/GD1b合成酵素遺伝子の発現減少が認められた。UVBを照射したHaCaT細胞では、炎症性サイトカインのTNFα、IL-1β、IL-8やIL-6の産生と培養上清中への分泌が認められた。さらにTNFαあるいはIL-6を含む細胞培養液で細胞を培養した場合、メラノサイトにおいてのみGD3合成酵素遺伝子の発現誘導が認められた。しかし、メラノーマ細胞ではTNFαまたはIL-6含有細胞培養液で培養してもGD3合成酵素遺伝子の発現レベルの変動は認められなかった。また、UVB照射HaCaT細胞で遺伝子発現が上昇する各種サイトカイン、増殖因子等について検討した結果、IL-1α、LIF、GM-CSF、bFGF、NGF、TGF-α、CCL5がUV照射により発現上昇した。更にメラノサイトにおいては、cAMP刺激を除去することによってもGD3合成酵素遺伝子の発現が誘導された。本研究では、定量RT-PCRによりメラノーマ細胞株と培養メラノサイトにおけるガングリオシドの糖鎖合成酵素遺伝子の発現レベルを比較し、皮膚微小環境における遺伝子の発現調節機構を検討した。その結果、メラノサイトと比較して、メラノーマでは、GD3、GM2/GD2合成酵素遺伝子の発現レベルが高く、GM1/GD1b合成酵素遺伝子の発現レベルが低下していることを明らかにした。一方、紫外線(UVB)を照射したケラチノサイト(HaCaT細胞)の培養上清でメラノサイトを培養した結果、GD3、GM2/GD2合成酵素遺伝子の顕著な発現誘導が認められ、GM1/GD1b合成酵素遺伝子は抑制された。培養上清からはTNFαやIL-6が検出され、これらのサイトカインによりGD3合成酵素遺伝子の発現が誘導されることも明らかになった。さらに、メラノサイトにおいてdibutyryl cAMP (dcAMP)とIBMX(ホスホジエステラーゼ阻害剤)の存在下と非存在下で上記3つの糖鎖合成遺伝子の発現レベルに対する影響を検討したところ、dcAMPとIBMX非存在下でGD3合成酵素遺伝子の発現が顕著に増加した。この培養液にcAMPを添加するとGD3合成酵素遺伝子の発現は抑制された。また、メラノサイトの細胞内でcAMPを上昇させるホルモンであるα-MSHによってもGD3合成酵素遺伝子の発現は抑制された。これらの結果より、GD3合成酵素遺伝子の発現がcAMPを介するシグナル伝達経路により抑制されることが示唆された。各種のメラノーマ細胞株についてもTNFα及びdcAMPによるGD3合成酵素遺伝子、GM2/GD2合成酵素遺伝子、GM1/GD1b合成酵素遺伝子の発現レベルの異同を検討したが、これらの遺伝子の発現レベルの変動は認められなかった。メラノサイトにおいて、GD3合成酵素遺伝子の発現がcAMPを介するシグナル伝達経路により抑制されることが明らかになった。一方、メラノーマ細胞株では、TNFα及びdcAMPによるGD3合成酵素遺伝子、GM2/GD2合成酵素遺伝子、GM1/GD1b合成酵素遺伝子の発現レベルの変動は認められなかった。これらの結果から、正常細胞のメラノサイトと癌化したメラノーマでは糖鎖合成酵素遺伝子の発現制御機構が異なると推察された。しかし、各種のシグナル伝達分子阻害剤により、TNFα及びcAMPによるGD3合成酵素遺伝子発現制御のメカニズムを明らかにする予定であったが、現在、条件検討中で結論がでていない。私達はこれまでに、ヒトメラノサイト及びメラノーマ細胞の糖鎖合成酵素遺伝子群の発現レベルを網羅的に解析し、メラノーマでは、酸性スフィンゴ糖脂質のGD3及びGD2の合成酵素遺伝子が発現増強し、GM1合成酵素遺伝子の発現が著しく低下していることを明らかにした。また、腫瘍の発生においては細胞と微小環境との相互作用が重要であるが、UVB照射したケラチノサイトの培養上清中に確認された炎症性サイトカインTNFα, IL-1,およびIL-6によりメラノサイトでGD3合成酵素遺伝子が発現誘導されることを明らかにした。

本研究において、メラノサイトではTNFαの刺激に加えて、メラノサイトの分化や色素形成を促進するcAMPシグナルの除去によってもGD3合成酵素遺伝子の発現が増強することが明らかになった。また、メラノーマではTNFα及びcAMP刺激による糖鎖合成酵素遺伝子の発現は影響されなかったが、TNFαの下流のシグナル分子であるIKKを阻害すると著しくGD3合成酵素遺伝子の発現が抑制された。即ち、メラノーマにおいてはTNFα非存在下で恒常的にIKKが活性化している可能性が示唆された。以上より、正常細胞と癌細胞では糖鎖合成酵素遺伝子の発現制御機構(TNFα受容体ーシグナル伝達ー転写のカスケード)が異なることが明らかになった。今後、メラノサイトとメラノーマにおけるNF-κBシグナル伝達分子の活性の差異に着目し、癌治療の基盤研究へと進展させる。これまでに微小環境において、炎症性サイトカインのTNFαによってメラノサイトでGD3合成酵素遺伝子の発現が誘導されることを明らかにしてきた。本研究により、メラノサイトの分化や色素形成を促進するcAMPシグナルの除去によってもGD3合成酵素遺伝子の発現が増強することが明らかになった。以上より、正常細胞と癌細胞では糖鎖合成酵素遺伝子の発現制御機構(TNFα受容体ーシグナル伝達ー転写のカスケード)が異なることを明らかにすることができた。私達はこれまでに、ヒトメラノサイト及びメラノーマ細胞の糖鎖合成酵素遺伝子群の発現レベルを網羅的に解析し、メラノーマでは、酸性スフィンゴ糖脂質のGD3及びGD2の合成酵素遺伝子が発現増強し、GM1合成酵素遺伝子の発現が顕著に低下していることを明らかにした。また、腫瘍の発生においては細胞と微小環境との相互作用が重要であるが、UVB照射したケラチノサイトの培養上清中に確認された炎症性サイトカインTNFα、IL-1、及びIL-6によりメラノサイトでGD3合成酵素遺伝子が発現誘導されることを明らかにした。本研究においては、メラノサイトではTNFαの刺激、あるいはメラノサイトの分化や色素形成を促進するcAMPシグナルの除去により、GD3合成酵素遺伝子の発現レベルが短時間で上昇することを明らかにした。しかし、GD3高発現メラノーマ細胞ではTNFα刺激及びcAMP刺激によるGD3合成酵素遺伝子の発現レベルの変動は起こらなかった。また、TNFαによりGD3合成酵素遺伝子の発現レベルが上昇したメラノサイトにTNFαの下流のシグナル分子であるIKKの阻害剤を添加するとGD3合成酵素遺伝子の発現は抑制され、更にメラノーマ細胞においてもIKK阻害剤によりGD3合成酵素遺伝子の発現は著しいく抑制された。Western BlottingによりIKKのリン酸化を検討した結果、メラノーマ細胞では無刺激状態でもIKKのリン酸化バンドが検出され、IKK阻害剤によってリン酸化は抑制された。以上より、正常細胞と癌細胞では癌関連糖鎖
干潟の季節性により支えられる浅海域の高次生産

本研究では干潟の生態系機能が水質浄化機能と底性微細藻類を介した隣接海域への有機物供給機能で季節変化するという仮説を検証するため、有明海湾奥部の軟泥干潟において安定同位体を用いて検証した。その結果、干潟表面の底性藻類を食べる生物が活動しなくなる冬期に干潟底性藻類が浅海域のベントス生産への寄与率は夏期よりも高まり、その寄与は沖合域でも平均60%にも達した。しかし夏期でも底性藻類の寄与率は平均44%で高かった。底魚類への寄与率は季節に限らず70%以上であり、有明海の軟泥干潟は水質浄化よりも有機物供給源として主に機能し、これが本海域の高次生産にも反映されていた。干潟にはそこに生息する生物が海域で生産された水柱の有機物を除去することによる水質浄化機能があるとされる。一方、干潟では底性微細藻類が一次生産者として干潟生態系を支えており、その生産物が隣接海域へ流出し、そこでの生産性にも寄与するという、エネルギー供給機能もありうる。しかしこの機能はあまり注目されてこなかった。また、そうした機能が干潟生態系の季節性により変動する可能性があることに着目した研究例も皆無であった。本研究は有明海軟泥干潟とその浅海域をモデルとしてとらえ、安定同位体を用いてこのことを検証することが主要な目的である。今年度は夏期、秋期、冬期の3シーズンで干潟域と浅海域を横断する測線でベントス、底泥、水柱の懸濁物(POM)を採取し、そのうち夏期、秋期のサンプルの同位体分析を行った。結果、夏期のPOMの炭素同位体比は-20.4±0.17‰(mean±SD)であり、底性微細藻類の代表として干潟で採取した表層泥の炭素同位体比は-20.0±0.15‰でPOMと区別できなかった。主要な濾過食ベントスの炭素同位体比は-17-18‰であった。表層泥の炭素同位体比では正確な底性藻類の同位体比を反映していない可能性があったため、秋期には干潟で底性藻類を摂餌していると思われるタマキビ類の同位体比から推定を試みた。秋期のPOMの炭素同位体比は-22.3±0.12‰であり、タマキビ類から推定した底性微細藻類の炭素同位体比は-16.1士0.56‰となった。秋期の濾過食ベントスの同位体比は-16.7-17.8‰であり、底性藻類の寄与がきわめて高いことがわかった。10月時点での干潟上でのグレーザーの活動は以前高く、季節に関係なく、干潟のエネルギー供給機能は高いのかもしれない。今後は冬期、春期の調査、分析も行い、定量的な寄与率の推定を進める予定である。干潟の生態系機能は主に水柱からの有機物除去という水質浄化機能がクローズアップされる。しかし近年は底性微細藻類の流出を介して隣接する浅海域の生産性にも寄与している可能性も指摘されている。本研究では有明海湾奥部に広がる軟泥干潟において、浅海域の生産性に対する有機物の供給機能について安定同位体を用いて評価し、また干潟で底性微細藻類を摂食するグレーザーの活動の季節性から浄化機能と供給機能の季節変化について評価することを主要な目的としている。前年度の研究結果より、表層底泥では底性微細藻類の同位体比を代表できず、引用値でも夏期のPOMの同位体比と値が変わらないことができないことが判明したため、今年度は干潟で実際に微細藻類を摂食しているグレーザーの同位体比から底性微細藻類の同位体比を推定し、その値を用いて他のベントスに対する底性藻類の寄与率の推定とその季節変化の評価を行った。その結果、底性微細藻類の寄与は夏期において堆積物食ベントスでは沖合域でも平均60%、濾過食ベントスでは沖合域で44%であった。冬期では堆積物食者は沖合域でも76%、濾過食者の場合、種による変異がみられたが平均して62%で夏期よりも寄与は高かった。一方魚類は冬期でも夏期でも底性微細藻類の寄与が70%以上であった。以上より生態系機能に季節変化はみられるものの有機物の供給機能と浄化機能が入れ替わるほどのものではなく、どちらかといえば軟泥干潟はどの季節でも有機物の供給源としての機能が卓越していると考えられる。
前立腺増殖機構の安定化を目指した間質分化誘導療法の開発

本年度は、マウス前立腺間質の構造を改善する、すなわち間質分化誘導により前立腺の増殖機構が安定化するか否かを検討することを目的とした。今回、我々は前立腺間質構造を決める生体内因子としてソニック・ヘッジホッグ(Shh)に着目した。これまでに、膀胱や小腸において上皮由来Shhが平滑筋細胞の分化やホメオスタシス維持に重要な役割を担うことが報告されている。そこで、マウス前立腺に対するShhの役割を検証する目的で、マウス前立腺後側葉(dorsolateral prostate: DLP)を実体顕微鏡下にて微小解剖し、ミリセルフィルター上で培養する無血清器官培養実験法を施行した。まず、去勢条件下でマウスDLPを培養すると基底上皮細胞数が有意に増加することを確認した。そこで、去勢条件下でマウスDLPを精製Shh処理したが基底上皮細胞数に変化は認められなかった。次に、去勢条件下でShh modulator(Shhシグナルの活性化剤)として市販されている化合物SAG処理したが基底上皮細胞数に変化は認められなかった。逆に、去勢条件下でShhシグナルの阻害剤cyclopamine処理しても基底上皮細胞数に変化は認められなかった。最後に、去勢条件下で生じる間質リモデリングをテネイシンC (TNC)の発現で評価したところ、精製Shhおよびcyclopamine処理ではTNC発現に変化なかったものの、SAG処理ではTNC発現が顕著に減少した。以上の結果より、去勢条件下でもSAG処理によりShhシグナルを活性化させると間質リモデリングが改善されるものの、基底上皮細胞数を増加させる増殖シグナルの抑制には至らないことが判明した。つまり、間質分化誘導だけでは前立腺の増殖機構が安定することはなく、それだけ前立腺にとって男性ホルモン(アンドロゲン)が重要な役割を担っていることが示された。マウス前立腺後側葉をミリセルフィルター上で培養する無血清器官培養実験法を用いることで、Shh modulator(Shhシグナルの活性化剤)SAGが去勢条件下での間質リモデリングを改善することを見出すことができた。試薬として高価なSAGを去勢マウスへ長期間、投与することは実現不可能であったため、無血清器官培養実験法によりこの問題点を克服できたことは大きな成果である。本年度は、マウスにおける去勢環境をin vitroの無血清器官培養実験法で模するために男性ホルモン(アンドロゲン)非存在下でのShh modulator(Shhシグナルの活性化剤)SAGもしくはShhシグナルの阻害剤cyclopamineの効果を検証した。次年度は、男性ホルモン(アンドロゲン)存在下でのSAGもしくはcyclopamineの効果を検討するなど、前立腺におけるShhシグナルの役割を明らかにしていきたい。本年度は、マウス前立腺におけるShh発現と体内アンドロゲン濃度との関係を検証した。C57BL6/Jマウス(オス、8週齢)を去勢した後、1,3, 7, 14, 21, 28日目にマウスを屠殺し、前立腺後側葉DLPを回収し、mRNA抽出後にTaqMan probeを用いたデジタルPCRを施行した。また、去勢マウスにアンドロゲンを補充した時のShh発現を検討する目的で去勢後、14日目に20 mg DHTペレットを皮下に埋設し、1,3, 7, 14日目にDLPを回収し、デジタルPCRを施行した。なお、体内アンドロゲン濃度と遺伝子発現量の変動に関する指標として、アンドロゲン依存的に遺伝子発現するNkx3-1 mRNAも同時に測定した。その結果、去勢後速やかにNkx3-1 mRNA発現量は低下したものの、Shh mRNA発現量は経時的に増加し、そのピークは去勢後14日目であった。なお、去勢後28日目には偽手術群と同レベルにまで低下した。次に、去勢マウス皮下にDHTペレットを埋設したところ、Nkx3-1 mRNA発現量は速やかに偽手術群と同レベルに回復した。一方、Shh mRNA量もアンドロゲン付加後1日目で偽手術群と同レベルまで低下したものの、アンドロゲン付加後7日目をピークにShh mRNA発現量は増加した。以上の結果より、マウス前立腺においても平滑筋細胞の分化やホメオスタシス維持に重要と考えられた上皮細胞由来Shhは体内アンドロゲン濃度の低下で発現上昇する因子であることが判明し、去勢マウス前立腺で観察される間質リモデリングの誘導には関与していない可能性が示唆された。本年度は、マウス前立腺におけるShh発現と体内アンドロゲン濃度との関係をデジタルPCRを用いて検証することを目標に実験を進め、予定通り、去勢マウス前立腺およびアンドロゲン付加後のShh mRNA発現量を定量解析することができた。

まず、去勢条件下でマウスDLPを培養すると基底上皮細胞数が有意に増加することを確認した。そこで、去勢条件下でマウスDLPを精製Shh処理したが基底上皮細胞数に変化は認められなかった。次に、去勢条件下でShh modulator(Shhシグナルの活性化剤)として市販されている化合物SAG処理したが基底上皮細胞数に変化は認められなかった。逆に、去勢条件下でShhシグナルの阻害剤cyclopamine処理しても基底上皮細胞数に変化は認められなかった。最後に、去勢条件下で生じる間質リモデリングをテネイシンC (TNC)の発現で評価したところ、精製Shhおよびcyclopamine処理ではTNC発現に変化なかったものの、SAG処理ではTNC発現が顕著に減少した。以上の結果より、去勢条件下でもSAG処理によりShhシグナルを活性化させると間質リモデリングが改善されるものの、基底上皮細胞数を増加させる増殖シグナルの抑制には至らないことが判明した。つまり、間質分化誘導だけでは前立腺の増殖機構が安定することはなく、それだけ前立腺にとって男性ホルモン(アンドロゲン)が重要な役割を担っていることが示された。マウス前立腺後側葉をミリセルフィルター上で培養する無血清器官培養実験法を用いることで、Shh modulator(Shhシグナルの活性化剤)SAGが去勢条件下での間質リモデリングを改善することを見出すことができた。試薬として高価なSAGを去勢マウスへ長期間、投与することは実現不可能であったため、無血清器官培養実験法によりこの問題点を克服できたことは大きな成果である。次年度は、無血清組織器官培養法を用いて、マウス前立腺の組織構築に対するShhの影響を検討する予定である。主に病理組織学的解析になると考えている。本年度は、マウスにおける去勢環境をin vitroの無血清器官培養実験法で模するために男性ホルモン(アンドロゲン)非存在下でのShh modulator(Shhシグナルの活性化剤)SAGもしくはShhシグナルの阻害剤cyclopamineの効果を検証した。次年度は、男性ホルモン(アンドロゲン)存在下でのSAGもしくはcyclopamineの効果を検討するなど、前立腺におけるShhシグナルの役割を明らかにしていきたい。
遺伝連鎖群解析法を用いた赤外期マラリア免疫の標的遺伝子の探索と免疫誘導性の検証

赤外期マラリア原虫感染に対する獲得免疫の標的遺伝子を探索するため、今年度は赤外期マラリア感染に対する防御免疫を賦与するための系を構築した。具体的には野生型ネズミマラリア原虫のP. yoeliiyoelii 17X株感染蚊唾液腺より赤外期マラリア原虫を回収し、アトバコン投与下においてマウスの静脈内に接種した。この赤外期マラリア感染に対する防御免疫を賦与出来る系を用いて、接種した株と異なるP. yoelii yoelii AR株のマラリア原虫を免疫群、非免疫群にそれぞれ感染させ、肝臓内における原虫の増殖を測定した。その結果、17X株で免疫したマウスに17X株を感染させると、非免疫群と比べて有意に肝臓内の原虫増殖が抑制された。また、17X株で免疫下マウスに異なるAR株を感染させると、非免疫群と比べて肝臓内の原虫増殖が有意に抑制された。この結果から、17X株で赤外期マラリア感染に対する免疫を賦与すると、17X株とAR株の両方の株の肝臓内増殖を抑制することが明らかになった。今後は17X株で免疫したマウスにAR株を感染させ、肝臓内増殖の後に起こる赤内期マラリア感染の増殖の有無を検討し、免疫の成立を評価する。26年度が最終年度であるため、記入しない。赤外期マラリア原虫感染に対する獲得免疫の標的遺伝子を探索するため、今年度は赤外期マラリア原虫の抗原調製に用いる蚊(Anopheles stephensi)の系を構築した。具体的には蚊を飼育するための独立した部屋を用意し、温度・湿度管理のための空調を設置し、蚊が屋外に出ないための防御策を講じた。また、構築した蚊の系を用いて、野生型のネズミマラリア原虫P. yoeliiyoelii感染させたマウスから蚊に原虫を伝播させ、感染蚊の唾液腺より赤外期マラリア原虫を回収することに成功した。また、赤外期マラリア原虫感染に対する獲得免疫をマウスに賦与するため、抗原として接種する遺伝子組換えマラリア原虫を、Tulane大学のAhmed Aly博士の指導のもと、作出を進めている。来年度以降は遺伝子組換原虫を作出後、作出した遺伝子組換原虫の蚊への伝搬と感染蚊からの抗原回収を行い、マウスへ接種することで赤外期マラリア免疫誘導能の検討を進める予定である。さらに、赤外期マラリア原虫感染に対する獲得免疫をマウスに賦与する方法として、野生型のマラリア原虫スポロゾイトを接種し、メフロキンという薬剤を同時に投与することで免疫を賦与する系も現在進めている。当初の計画通りマラリア原虫の赤外期抗原を調製するための蚊の系は計画通り構築出来た。また当初予定していた遺伝子組換原虫の作出には成功したが、作出した原虫が実験計画に必要なマウス肝臓内で成長が止まる性質を持たないことが明らかになった。当初の研究計画で計画していた遺伝子組換原虫を作出した結果、実験計画遂行に必要なマウス肝臓内で成長が止まらないことが明らかになった。そこで新たな遺伝子組換原虫の作出を進めると共に、遺伝子組換原虫以外の抗原接種により、赤外期マラリア免疫を賦与する方法を検討する。具体的には野生型の赤外期マラリア原虫のスポロゾイトを接種すると同時にメフロキンという薬剤を投与し、赤外期マラリア免疫の賦与を行う予定である。
わが国の男性労働者の職業別の死亡率の推移と背景にある要因の検討

本研究の目的は、わが国の男性の労働者世代における職業別の死亡率に関して、2010年の人口動態職業・産業別統計より示すことであった。2010年においては、専門職の死亡リスクは低下傾向となったが、管理職の死亡リスクは高止まりのままであることが示された。特に管理職における自殺のリスクが高いことが示され、今後優先すべき課題として取り組まれるべきである。また、死亡率に関連するストレスの影響や自覚的健康感については、管理職においては他の職種よりも良好であることがしめされた。しかし、これらのデータは中高年縦断調査によることから、人口動態統計とは少し対象群の特性が異なることが影響した可能性がある。本研究の目的は、1)わが国の男性の労働者世代における職業別の死亡率に関して、2010年の人口動態職業・産業別統計より示すこと、2)死亡率の推移に関連する要因の検討のために1995年以降の職業別の生活習慣や予防行動(がん検診など)の推移の傾向を明らかにすることである。厚生労働省に解析に必要なデータを統計法に基づいた手続きにて入手をした。現在解析を行っているところであり、今年度中には論文発表などを行う予定である。本研究の目的は、1)我が国の男性の労働者世代における職業別の死亡率に関して、2010年の人口動態職業・産業別統計より示すこと、2)死亡率の推移に関連する要因の検討のために1995年以降の職業別の生活習慣や予防行動の推移の健康を明らかにすることである。厚生労働省より解析に必要なデータを統計法に基づいて入手し、結果の解析を行った。自覚的健康感については、製造業とサービス業において2005年から6年間の追跡では、管理職よりもむしろ悪化していることが示された。これは先行研究の死亡率の結果とは相反する結果であった。これはリーマンショック後の円高によって製造業において雇用者数が減り、非正規が導入されたことが関連している可能性がある。心理的ストレス相当についても同様に管理職の方が良く、製造業において悪化している傾向が早いことが示された。さらに、管理職の癌死亡の増加に着目し、職種によって喫煙をやめる行動がどの程度異なるかについて解析を行ったところ、製造業、保安業、運送業において喫煙を管理者よりもやめない傾向が示された。また、仕事よりも個人的な要因によって心理的ストレス相当が大きくなっている可能性も国民生活基礎調査を用いた研究で示された。また、現在、別3本が査読中である。本研究の目的は、1)わが国の男性の労働者世代における職業別の死亡率に関して、2010年の人口動態職業・産業別統計より示すこと、2)死亡率の推移に関連する要因の検討のために1995年以降の職業別の生活習慣や予防行動(がん検診など)の推移の傾向を明らかにすることであった。2010年においては、2000年に増加した専門職の死亡リスクは低下傾向となったが、管理職の死亡リスクは高止まりのままであることが示された。労働者世代の健康は、社会経済的な影響とも関連する。たとえば、不況などにより、企業のリストラや組織改編により大きな影響を受けてきた。近年も、世界的な不況により電機産業などわが国においてこれまで経済を牽引してきた産業において業績悪化やリストラが行われている。また、内需拡大で経済には良い効果があるが本研究でも確認されたようにサービス業の健康リスクの高さよ具体的名施策は今後より議論されるべきである。これらのデータのモニタリングにより、継続してリスクの高い対象を明らかにし、具体的な施策の実施、ならびにその施策の効果評価を行うことができると考えられた。現在4本の論文の掲載が年度末までに予定されている。また学会発表も2件予定されている。順調に進んでいる。公衆衛生残りの期間は査読への対応、学会発表ならびに社会への還元を行う。論文執筆のための英文校正など平成26年度は当所の予定通り以下のとおりである。労働者の職業別の死亡率の算出については、先行研究と同様に、国勢調査によるそれぞれの労働者の人口を分母とし、昭和60年モデル人口を基準集団として直接法にて算出する。また、2000年以降の死亡率の推移とともに2010年のトレンドがどのように変化しているかを線形回帰によって明らかにする。

1995年以降の国民生活基礎調査、国民健康・栄養調査、中高年者縦断調査(過去6年間で入手可能な年度すべて)のデータの解析を開始する。特に生活習慣については、運動、喫煙、既往疾患、がん検診受診、自覚的健康度、ストレスなどの職業別の経年の推移を示す。特に、先行研究では、労働者全体の6割を占め、経年的に死亡率が低下していた製造業、事務職、販売職と管理職、専門技術職の推移を示す。管理職と専門技術職の死亡率の増加に大きく寄与していた自殺については、ストレスや自覚的健康度との関連を検討する。研究結果について米国公衆衛生学会などで発表を行う。支出計画はやや遅れているが最終年度において予定と同様になる。昨年度は厚生労働省からの統計法に基づいたデータ入手に時間を要したため、データのコーディング変更への依頼ができなかったため。今年度に入りデータコーディングの依頼をすでに行っており、終了次第昨年度の予定通り支出を行う予定である。
現代の中国に見る「不文律と成文法の架橋」―上海市の事例を中心に

本年度は、昨年度までにおこなってきた、農村からの出稼ぎ者にたいして法律扶助を実施する草の根ネットワークにかんする追加調査の実施、研究論文の作成をおこなった。1、「小小鳥打工互助熱線」の弁護士にたいする追加調査(2011年9月、2012年3月):2008年から継続して調査している出稼ぎ者向け法律扶助ネットワーク「小小鳥打工互助熱線」が、上海にあらたに設置したオフィスを訪問し、中核スタッフである弁護士にたいする聞き取りをおこなった。2、資料収集:本年度までに収集してきた事例を、法律扶助研究のなかに位置づけるため、上海市図書館において、現地の新聞・雑誌記事(『中国律師』、『中国司法』など)の文献収集をおこなった。3、研究論文の作成:昨年度までに作成した調査記録をもとにして、法律扶助およびコーズ・ローヤリングにかんする先行研究を踏まえ、草の根の法律扶助に参加する若手弁護士の参加動機についての研究論文を作成した。具体的には、熾烈な競争と階層化が進行する弁護士では、新人弁護士が草の根の法律扶助にたいして実務経験の蓄積、顧客の獲得といった経済的な活路を見いだしているという側面にくわえ、当事者である出稼ぎ者への深い同情と善意、使命感、仲間意識など、必ずしも市場原理だけに左右されない動機も強くあることを描写し、中国の法律扶助は幅広い動機をもつ多様な弁護士を包含していることを示した。今年度中の投稿にはいたらなかったが、第一稿はすでに完成させた。修正をおこない来年度中の投稿をめざす。中国の法律扶助をめぐっては、従来は、経済格差拡大にともなって生じた法サービスへの需要をいかに満たすかという、数量的な需要拡大という視点からの研究が主たるものであったが、本研究では成文法の担い手たる弁護士の主体性に着目し、成文法がインフォーマルセクターに普及していく実態を捉えることができた。法律扶助の事例研究としても重要な意味をもつと考えている。本年度は、農村からの出稼ぎ者(農民工)が都市部で直面する法律問題について、その問題解決を担う人材・組織の分業・協業体制を明らかにすることを目標に掲げ、次の二つの研究課題を遂行した。(1)労働組合(工会)による法律扶助の現状分析と問題把握(2)草の根レベルで構築されている出稼ぎ者の相互扶助ネットワーク(農民工NGO)が展開している法律扶助についての実態分析(2)については、以下の3つの現地調査を遂行した。調査1)農民工NGOの実務担当者に対するインタビューを実施し、草の根レベルに出稼ぎ者向け法律扶助の知識やノウハウが蓄積されていることを確認した。調査2)農民工NGOで法律扶助を提供する元農民工のソーシャル・ワーカーに対するインタビューをおこなった。調査と並行して先行研究の検討をおこない、「草の根人材が法律サービスを提供する」という中国のモデルを米国のコーズ・ローヤリングと比較し、研究の独自性を高めた。調査3)農民工NGOのボランティア弁護士に対するインタビューをおこない、弁護士の活動状況や動機についての実態を把握した。なお、当初は上海を主たる現地調査のフィールドとする予定であったが、北京に多くの農民工NGOが存在していること、調査者としてそれらへのアクセスが可能であったことから、本年度は北京を主な予備的な調査地に選定した。本年度の研究成果は、学術誌への投稿論文(2009年7月発表)と書評論文(採録決定済)にまとめた。本年度は、農村からの出稼ぎ者(農民工)向けに、沿海大都市において法律支援を実施している草の根ネットワークの事例について、弁護士の参加動機と活動状況を把握するための現地調査を実施した。さらにその調査結果にもとづき、先行研究と関連させながら考察を進めた。具体的におこなった作業と成果は以下のとおりである。1、北京の草の根ネットワーク「小小鳥打工互助熱戦」にボランティア登録している弁護士8名への聞き取り調査の実施:弁護士に対しては主に参加動機と活動状況についてのインタビューをおこない、調査記録を作成した。同調査からは「沿海大都市での弁護士急増にともなう競争の激化に伴い、若手弁護士にとって、ボランティアが実務経験の蓄積や顧客の獲得のための手段となっている」という側面が浮かび上がった。2、中国研究者への聞き取り調査の実施:華南地域の農民工NGOについて、草の根の労働運動という視点から先駆的研究をおこなっている研究者へのインタビューをおこない、先行研究の検討面での示唆を得た。3、先行研究の検討と事例の考察:昨年度は草の根レベルでの社会変革という視点から弁護士の法律扶助を考察したが、今年度はさらにボランティアをめぐる先行研究も踏まえ、調査結果についての考察を試みた。以上の作業を経て研究論文作成を進めた。執筆過程では、学内外の研究者からの貴重な助言や示唆を得て、それらをもとに改稿をおこなった。来年度は研究論文の完成をめざす。