hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
巨大誘電率をもつ有機半導体の光散乱法を用いた研究

ある種の有機半導体において、中性ーイオン性転移と呼ばれる分子の価数変化を伴う相転移をおこすことが知られている。この種の物質は、分子の価数不安定性が原因となり、電場に対して極めて特異な応答を示す。その例が巨大な誘電応答と電流スイッチング現象である。特に後者は分子素子実現へ向けての礎となる現象であり、十年来非常に注目を集めている。本研究では、これらの現象が1次元分子積層鎖上の積層欠陥(ソリトン)の運動ときわめて密接に関連していることを明らかにした。有機半導体の伝導特性と光物性の研究が、伝導体のそれに比べて著しく立ち遅れている現状の中で、半導性錯体の新機能発現の可能性を示しその基礎的知見の集積を行ななった点でこの研究の意義があっと考えられる。以下、特に電流スイッチング現象について得られた知見をしるす。(1)多種類の電荷移動錯体において非線形伝導が観測されたが、強い微分負性低抗おそれに伴う電流スイッチング効果は、分子が二量体を組んだ低温相(スピン・パイエルス相と呼んでもよい)において顕著に観測される。(2)線形な伝導度は低温相に入ると急激に減少するが、スイッチング現象はあたかもその減少分を回復するかのように発現する。(3)スイッチングのオン状態の微視的な情報を得るため、ラマン散乱、赤外分光、光院導などの光プロ-ブを用いて実験を行なった。研究費は主に、ラマン散乱測定用装置の購入に使用された。この結果、低温相のスイッチオン状態では、スピンパイエルス秩序が一部こわれていることが明らかになった。以上の知見から錯体のスイッチング状態は多量のソリトンが流れている状態であり、ここではあたかもスピンパイエルス秩序が一部破壊されているように見えることがわかった。
骨髄異形成症候群の血球機能不全に対する治療標的機構の解明

FOSは、細胞ストレスに伴う翻訳停止時に速やかに発現増加する早期反応遺伝子である。骨髄異形成症候群(MDS)患者の好中球における翻訳停止時のFOS mRNA増加率は、健常好中球の約半分にとどまり、FOS誘導過程の異常が示唆された。このFOS mRNA誘導不全は、FOS mRNAの合成能低下ではなく、FOS mRNAの不十分な安定化(=分解の抑制)によるものだった。一部の患者ではFOS mRNAを安定化するHuR蛋白が減少し、2/3の症例でFOS mRNAに結合する二つのmicroRNAの増加が検出された。HuR及びmicroRNAの異常発現がFOS mRNA安定化不全の一因と考えられた。平成23年度に、[1]骨髄異形成症候群(MDS)患者好中球を翻訳阻害ストレスに暴露した場合、FOSのmRNA誘導不全を呈すること、[2]好中球における翻訳阻害時のFOS誘導には、MAPK p38経路を介するFOS転写の増加と、Human antigen R (HuR)のFOS mRNA 3'UTRへの結合を介するFOS mRNAの安定化(分解抑制)が関与すること、[3]翻訳阻害によるFOS転写の増加はMDSと健常血球で同等であることを明かにした。平成24年度は、MDS好中球におけるFOS mRNA誘導不全の原因を更に追究した。翻訳阻害ストレス下では健常血球においては顕著なFOS mRNA安定化が認められたのに対し、MDS血球では有意にmRNA安定化が抑制されていた。しかし非ストレス下では、MDS血球におけるFOS mRNA減衰が健常血球に比して速い傾向があったものの、有意差は認められなかった(PLOS ONE, in press)。これらの結果より、MDS血球ではストレス時に特異的に作用するHuRによる安定化効果が不十分であると予測したが、MDS患者のFOS mRNA 3'UTRに変異はなく、HuR蛋白発現量は80%以上の患者で健常人と同等のであった。そのため、HuR以外のFOS mRNA安定性制御因子の発現量をMDSと健常血球で比較したところ、miR-34aとmiR-155の過剰発現と、FOS mRNA coding regionに結合してmRNA安定性を制御するupstream of N-ras (UNR)の減少を検出した。UNRの単独減少の場合と、miR-34a・miR-155両者の過剰発現の場合に、翻訳阻害時のFOS mRNA安定化不全が起こることを確認した。真核細胞は、DNA障害性のストレスに暴露されるとcap-dependentな翻訳を停止する。FOSは、翻訳停止時に迅速にその発現が増加する早期反応遺伝子である。骨髄異形成症候群(MDS)患者から分離した末梢血好中球において、翻訳阻害時のFOS mRNAの増加率が健常好中球における増加率の半分にとどまることを見出した。FOS mRNAのbasallevelは健常人と同等であることから、MDS患者血球ではFOS mRNAの誘導過程に何等かの異常があると考えられた。そこでまず、好中球において翻訳阻害時のFOS誘導には、FOS転写の増加とmRNA分解抑制(=mRNA安定化)が関与する事を確認し、MDS血球ではFOS転写活性は健常血球と同等であるがFOS mRNAの安定化が不十分であるためにFOS誘導不全が起こることを突き止めた(Feng et al, PLoSONE; 8(4):e61107, 2013)。更に我々は、好中球において、FOS mRNAの安定性は3'UTRに結合するmicroRNA、AU-rich element (ARE)に結合を介するmRNA安定化蛋白HuRによって制御されことを確認した。MDS好中球のFOS mRNAには、coding regionにも3'UTRにも変異は検出されず、HuRの発現低下が認められたのは患者の2割未満だった。そこで、FOS mRNAに結合し得るmicroRNAをdatabaseから抽出し、その発現を解析したところ、健常血球に比べてMDS血球で有意に増加している二つのmicroRNAを同定した。現在は、これらのmiRNAの過剰発現が好中球機能異常と造血細胞のアポトーシス促進性のサイトカイン産生に関わることを示唆する結果を得、そのメカニズムの詳細を検討中である。このメカニズムが明らかになり、患者血球で検証できれば、本研究で見出したFOS発現制御異常という新な観点からMDSの血球異常成立を説明することが可能となると期待する。骨髄異形成症候群(MDS)患者の好中球におけるFOS mRNA誘導不全が、不十分なmRNAの安定化によることを特定し、論文として報告できた(平成25年度PLOS ONEに掲載)。

真核細胞では、様々な細胞ストレス下で翻訳が停止すること、サイトカイン等好中球活性化刺激によるFOS誘導はMDSで保たれておりFOS誘導不全は翻訳停止刺激に特異的であることから、翻訳停止させたMDS血球におけるFOS mRNA安定化不全はストレス反応異常を反映している可能性が濃厚であり、MDSの病態解明にとって興味深い結果を得た。しかしFOS mRNA安定化不全の原因候補が予想に反して複数検出されたため、平成24年度以降のマウスの実験は変更せざるを得ない点で、「計画以上に進展している」とは言えない。健常人とMDS患者血球におけるGM-CSF、LPS、翻訳阻害の三種類の刺激によるIEG発現誘導の比較、ビオチン化RNAを用いたmRNA結合タンパク複合体の解析についてはほぼ計画通りに行った。しかし誘導不全IEGの網羅的検索は、DNAマイクロアレイに必要な量のRNAを好中球から得ることができず、未遂である。増殖力旺盛な細胞株と分化して増殖力を失った好中球では、抽出できるRNA量に差があると考えられる。十分量のRNAを得るためには輸血を要する患者から、計画大量の採血をしなければならないことが判明した。そのため、この部分については計画を変更する必要が生じた。FOS mRNA誘導因子が一つに絞られる場合にはマウスを用いて検証実験をする予定だったが、候補因子が複数であることと、FOS mRNA誘導不全の血球異常との関連について更に検討する必要があることから、マウスを用いた検証実験に変えて以下のように研究を進める。近年LPS刺激を受けた細胞で、c-fosがTNFalphaの転写を抑制していることが示された。TNFalphaは、MDS患者で増加しており、アポトーシスを引き起こして血球減少をもたらしているものとして注目されて久しい。そこでまず、[1]翻訳阻害ストレス下で蓄積したFOS mRNAが訳阻害解除時に一気に翻訳される可能性、[2]ストレス暴露後のTNFalpha産生増加に対してFOSが抑制的に作用する可能性、c-fosとTNFalpha産生機構の相互作用を検証する。それを踏まえて、(1)miR-34aとmiR-155の過剰発現と(2)UNRの減少が細胞ストレス下のFOS誘導不全を介してTNFalpha産生に与える影響を検討し、(1)(2)とMDSの病態との関連を明らかにする。DNAマイクロアレイを用いる網羅的解析は、real-time RT-PCRによる個々のIEG発現解析に変更する。この場合、解析可能なIEG数が限定されるが、解析対象は、FOS mRNA分解を担う制御因子を同定し、これとHuRの共通の標的分子を優先的に解析する。FOS mRNA 3'UTRを用いたpulldown assay及びMAPK p38のmRNA安定化への関与の検討の結果、主なARE結合mRNA不安定化蛋白(AUF1、TTP、KSRP)の関与は否定的で、alternativeに考えられる制御因子としてmiRNAが考えられる。このため、今後は好中球でFOS mRNA分解を制御し、HuRと拮抗するmiRNAの同定も試みる。FOS mRNA分解因子が同定できた段階で、平成24年度に計画していた標的分子の検証実験を開始する。その後24年度に計画していた実験に移行する。マウスの購入+飼育のための費用を、miRNA購入、PLOS ONEに受理された論文の掲載料、TNFalpha抗体及びElisa kit
口腔扁平上皮癌のリンパ節転移におけるポドプラニンの生物学的意義

これまでに樹立した内因性podoplanin発現陽性の口腔扁平上皮癌細胞株SCC-TFにanti-sense-podoplaninを導入したTF-asPおよび対照株TF-contを用いてin vitroにおける増殖活性および遊走活性を比較検討した。その結果、増殖活性には有意差を認めなかったが、遊走活性はTF-asPがTF-contと比較して有意に低下していた。これまでに肺扁平上皮癌細胞株におけるpodoplanin発現依存性のVEGF-C発現抑制効果を報告してきた。そこでin vitroにおけるVEGF-C mRNAの発現をreal time RT-PCR法を用いて検討すると、肺扁平上皮癌と同様にTF-asPのVEGF-C発現が有意に低下していた。次に、同樹立細胞株を用いたマウス腫瘍移植モデルの増殖活性を検討したところ、TF-asP群において有意に増殖活性が高い結果となった。細胞株接種後21日目の腫瘍組織において、LYVE-1抗体およびvon Willebrand factor抗体を用い、免疫組織化学的に腫瘍リンパ管および血管新生を管腔数密度、平均管腔面積および周辺長に関して比較検討したが、いずれも有意差はみられなかった。最後に、移植腫瘍組織の腫瘍細胞株由来ヒトVEGF-C mRNAをヒト特異的なプライマーを用いてreal time RT-PCR法を用いて確認した結果、有意差を認めなかった。これらの結果は、生体では様々な環境因子に影響され、in vitroの現象が反映されない場合があると考えられ、増殖活性の結果の相違もこのことによるものと推察される。臨床病理学的に口腔扁平上皮癌細胞のpodoplanin発現は予後不良因子として報告されているものの、発生臓器やその周囲の環境においてその機能に相違があるとされており、今後は多種類の細胞株を用いた検討が必要であると考えられる。
剛直な環骨格を有する直線状ケイ素配列による新規共役系の構築とその物性

これまでに開発したジシラトリプチセンの合成経路においては、その前駆体を合成する上で、オルト位に臭素原子を有するアリールリチウム中間体を調製する必要があった。一般的に、ハロゲンなどの脱離基をオルト位に有するアリール金属種は、ベンザインが生成しやすく調製が困難であり、特に含リチウム化合物は非常に反応活性であるため、極低温を用いなければならず、実用的とは言い難かった。そこで、より穏和な反応性を持っ有機亜鉛試薬を用いれば、上記の問題が解決できると考え検討を行った。予備的検討として、多ハロゲン置換芳香族化合物に対する塩化リチウム存在下の亜鉛挿入反応を精査したところ、活性化置換基(DG)を用いることで、対応する亜鉛試薬を高収率、高位置選択的に調製できることが分かった。本手法はDGとして、エステル、ケトン、アセトナート、スルポナート、トリアゼンなど広汎な官能基が使えるだけでなく、多ハロゲン化複素環化合物にも適用可能な汎用性の高い方法である。これまで位置選択的な有機典型金属試薬の調製法として、有機リチウムおよびマグネシウム試薬を用いた脱プロトン化、およびハロゲン-金属交換反応等が知られる一方、炭素-ハロゲン結合への位置選択的な典型金属挿入反応はほとんど例がなかった。その原因は、金属挿入反応には過酷な反応条件が必要なため反応制御が困難であり、位置選択性が出現しにくいためである。今回開発した手法では、塩化リチウムが炭素-ハロゲン結合への亜鉛挿入反応を劇的に加速することが鍵となり、これまで困難であった選択的挿入反応が実現したと考えられる。なお、調製した有機亜鉛試薬は、様々な求電子試剤との反応、およびパラジウム触媒存在下でのクロスカップリングにより炭素-炭素結合生成に用いることができるほか、未反応のハロゲン部位も様々な方法で修飾が可能であり、特に有機合成分野において大変有用となりうる。本研究の目的は、剛直なジシラトリプチセン骨格を活用してケイ素一次元配列を構築し、その分子ワイヤーとしての機能を評価することである。標的化合物は、ジシラトリプチセンを橋頭位ケイ素で直接連結したオリゴマーとした。その合成にあたり、十分な溶解度を得るべく、アルコキシ基をベンゼン環上に導入したジシラトリプチセンユニットを設計し用いた。標的化合物は以下のように合成した。すなわち、橋頭位に臭素原子を有するジブロモジシラトリプチセンを、リチウムナフタレニドで還元的カップリングした後、クロロトリメチルシランで処理することで、両末端にトリメチルシリル基を有するオリゴマーを単量体から五量体まで合成・単離した。これらは、それぞれケイ素原子4、6,8,10,12個からなる一次元配列に相当する。二量体については、X線構造解析より6つのケイ素原子がほぼ直線状に並んでいることを明らかにした。これらオリゴマーについて光物性を検討した。磁気円二色性スペクトルでは、240nm付近の遷移で長波長シフトが見られ、電子が非局在化していることが示唆された。電子状態の詳細を明らかにするべく、理論計算により分子軌道を解析したところ、π^*_<Si-Si>軌道を含む空軌道は分子全体に広がりを持ち、ユニット数の増加に伴い軌道エネルギーが低下するのに対し、HOMOはベンゼン環に局在化しており、軌道エネルギーはユニット数によらずほぼ一定であった。すなわち、今回のケイ素一次元配列では、π^*_<Si-Si>軌道が関与した電子の非局在化による励起状態(Frank-Condon状態)の安定化が、遷移エネルギーの低下に寄与していることが分かった。さらに、発光スペクトルでも、ユニット数増加に従い発光波長が長波長シフトしており、発光状態でもπ^*_<Si-Si>軌道が関与した非局在化が起きていることが示唆される。本研究の目的、剛直なジシラトリプチセン同士を直接連結することで、ケイ素原子が直線上に並んだ一次元配列を構築し、その新規共役系としての性質を明らかにすることである。本年度は、次の二つの課題について研究を行った。すなわち、1)ホスフィンスルフィド部位を有するホスファトリプチセンでジシラトリプチセンオリゴマーの両末端をキャップした分子を合成し、ケイ素-次元配列の単分子における電気伝導度の測定を目的とした研究、および2)ホスファトリプチセンの配位子としての性質の評価、である。以下にそれらの実績概要について述べる。1)まず、橋頭位にケイ素-塩素結合を有するホスファトリプチセンの合成を行った。すなわち、ジシラトリプチセン合成で確立した方法と同様に、o-トリプロモホスフィンをt-ブチルリチウムでトリリチオ化した後、四塩化ケイ素を作用させることにより合成した。次に、両末端にハロゲンを有するジシラトリプチセンの合成について種々検討したが、化合物を得るのが困難であった。そこで、合成計画を変更し、ジブロモジシラトリプチセンとケイ素-塩素結合を有するホスファトリプチセンを、リチウムナフタレニドにより還元的にカップリングさせ、つづく硫化反応を行った。この方法により、目的化合物の二量体から四量体までを中程度の収率で得ることに成功した。合成したオリゴマーについて、自己組織化膜の生成について検討を行ったが(大阪大学・夛田教授との共同研究)、現在のところ膜の生成には成功していない。今後、さらなる検討を行う予定である。2)ケイ素上に様々な置換基を有するホスファトリプチセンを合成し、それらを用いて遷移金属に対する配位子としての性質の評価を行った。

その結果、ケイ素上の置換基およびトリプチセンを構成するベンゼン環上の置換基とともに、配位子の電子状態に影響を与えることを明らかとなった。これまでに開発したジシラトリプチセンの合成経路においては、その前駆体を合成する上で、オルト位に臭素原子を有するアリールリチウム中間体を調製する必要があった。一般的に、ハロゲンなどの脱離基をオルト位に有するアリール金属種は、ベンザインが生成しやすく調製が困難であり、特に含リチウム化合物は非常に反応活性であるため、極低温を用いなければならず、実用的とは言い難かった。そこで、より穏和な反応性を持っ有機亜鉛試薬を用いれば、上記の問題が解決できると考え検討を行った。予備的検討として、多ハロゲン置換芳香族化合物に対する塩化リチウム存在下の亜鉛挿入反応を精査したところ、活性化置換基(DG)を用いることで、対応する亜鉛試薬を高収率、高位置選択的に調製できることが分かった。本手法はDGとして、エステル、ケトン、アセトナート、スルポナート、トリアゼンなど広汎な官能基が使えるだけでなく、多ハロゲン化複素環化合物にも適用可能な汎用性の高い方法である。これまで位置選択的な有機典型金属試薬の調製法として、有機リチウムおよびマグネシウム試薬を用いた脱プロトン化、およびハロゲン-金属交換反応等が知られる一方、炭素-ハロゲン結合への位置選択的な典型金属挿入反応はほとんど例がなかった。その原因は、金属挿入反応には過酷な反応条件が必要なため反応制御が困難であり、位置選択性が出現しにくいためである。今回開発した手法では、塩化リチウムが炭素-ハロゲン結合への亜鉛挿入反応を劇的に加速することが鍵となり、これまで困難であった選択的挿入反応が実現したと考えられる。なお、調製した有機亜鉛試薬は、様々な求電子試剤との反応、およびパラジウム触媒存在下でのクロスカップリングにより炭素-炭素結合生成に用いることができるほか、未反応のハロゲン部位も様々な方法で修飾が可能であり、特に有機合成分野において大変有用となりうる。
細胞小器官および種々の分化細胞に対する高圧力パルスの影響

高圧力パルスの生体への影響を微視的に捉えるために、衝撃波が細胞とその機能成分に及ぼす力学的、生理的影響を調べることを目的としている。先ず、幾つかの存在条件の異なるマウスの腫瘍細胞および正常細胞を衝撃波への耐性に関して以下の結果を得た。1.細胞によって3-4MPaのピーク圧力から破壊され始めるものと8MPaまでの圧力では破壊されないものに分かれる。2.この耐性の違いが細胞の接着性に関係し、非接着性浮遊細胞に比べて接着性細胞の方が耐性が高い。3.この耐性の違いが細胞の正常度と悪性度に関係しない。4.この耐性の違いは、細胞の大きさや内部構造密度の違いによるものではなく、細胞膜の構造の違いによる可能性がある。次に、この細胞の耐性の違いの原因を解明するため、生体組織中での細胞の存在状態、細胞分化、あるいは細胞変異と衝撃波への耐性の関係、および同一細胞集団内での細胞ごとの耐性の有無について調べ、次の結果を得た。1.衝撃波への耐性は、細胞の大きさや細胞質の密度・細胞小器官の分布密度と関係しない。2.衝撃波への耐性は、浮遊状態で増殖する細胞やリンパ系の細胞で弱く、接着状態で増殖する細胞や結合組織の細胞で強い。3.正常の繊維芽細胞で調べた限り、衝撃波への耐性と細胞老化(分裂齢)との間には関係がない。4.8MPaまでの圧力の衝撃波によって破壊される細胞でも、破壊細胞の割合が衝撃波の照射回数に伴って増加しないので、同一の細胞集団のなかでも細胞によって衝撃波への耐性に違いがあると推定できる。5.この意味で、同一の細胞集団であっても衝撃波への耐性に関しては不均一であり、一部の感受性の細胞は数回の衝撃波照射によって破壊されるが、残りの耐性の細胞は照射回数を増してもピーク圧を上げない限り破壊されないと考えられる。6.このような同一細胞集団内での耐性の違いは、個々の細胞の細胞周期と関係するかもしれない。生体が高い圧力パルスに曝される機会は頻繁ではないが、衝撃波を利用した結石破砕治療において、あるいは自然または人為的な高圧力発生による生体への影響に関心が持たれてきている。本研究は、高圧力パルスの生体への影響を微視的に捉えるために動物培養細胞についてその力学的影響を調べることを目的にしており、過去数年継続して行っている研究の一段階でもある。これまでに、マウスの腫瘍細胞の衝撃波に対する耐性の研究において、Tリンパ球の腫瘍であるEL-4細胞では、約3MPaのピーク圧力から一部の細胞が破壊され始め、圧力の増加に伴い破壊される細胞の割合が指数関数的に増加すること、マウスのメラノーマB16C2細胞では、8MPaまでのピーク圧力では破壊されないこと、および同じマウスでもこれら2種類の細胞によって衝撃波への耐性が異なるため、さらにいくつかの培養細胞の耐性を比較し、比較的低いピーク圧力から破壊され始めるものと、8MPaのピーク圧力でも破壊されないものに分かれることを示した。本年度はこの細胞の耐性の違いが何によるかについて、さらにいくつかの存在条件の異なる正常および腫瘍細胞について調べ、次の結果を得た。1.衝撃波に対する耐性度は、非接着性浮遊細胞に較べて接着性細胞の方が高い。2.この耐性の違いは、細胞の大きさや内部構造密度の違いによるものではなく、細胞膜の構造の違いによるものと推定できる。これまでの細胞障害の評価はトリパンブルー染色法によるが、さらに他の評価法として、ラクトース脱水酵素(LDH)法を試みた。

未だその評価法の確立には至っていないが、その問題点などを明らかにすることができた。我々は、高圧力パルスの生体への影響を微視的に捉えるために、衝撃波が細胞とその機能成分に及ぼす力学的、生理的影響を調べる目的で、過去数年継続して研究を行っている。昨年までの研究により、マウスの腫瘍細胞および正常細胞を衝撃波への耐性に関してみると、1)細胞によって3-4MPaのピーク圧力から破壊され始めるものと8MPaまでの圧力では破壊されないものに分かれること、2)この耐性の違いが細胞の接着性に関係し、非接着性浮遊細胞に比べて接着性細胞の方が耐性が高いこと、3)この耐性の違いは細胞の正常度と悪性度に関係ないこと、4)この耐性の違いは、細胞の大きさや内部構造密度の違いによるものではなく、細胞膜の構造の違いによる可能性があること、などを示した。本年度は、この細胞の耐性の違いの原因を解明するため、生体組織中での細胞の存在状態、細胞分化、あるいは細胞変異と衝撃波への耐性の関係、および同一細胞集団内での細胞ごとの耐性の違いの有無について調べ、次の結果を得た。1.衝撃波への耐性は、細胞の大きさや細胞質の密度・細胞小器官の分布密度と関係しない。2.衝撃波への耐性は、浮遊状態で増殖する細胞やリンパ系の細胞で弱く、接着状態で増殖する細胞や結合組織の細胞で強い。3.正常の繊維芽細胞で調べた限り、衝撃波への耐性と細胞老化(分裂齢)との間には関係がない。4.8MPaまでの圧力の衝撃波によって破壊される細胞でも、破壊細胞の割合が衝撃波の照射回数に伴って増加しないので、同一の細胞集団のなかでも細胞によって衝撃波への耐性に違いがあると推定できる。5.この意味で、同一の細胞集団であっても衝撃波への耐性に関しては不均一であり、一部の感受性の細胞は数回の衝撃波照射によって破壊されるが、残りの耐性の細胞は照射回数を増してもピーク圧を上げない限り破壊されないと考えられる。6.このような同一細胞集団内での耐性の違いは、個々の細胞の細胞周期と関係するかもしれない。本年度の研究によって指摘された、いくつかの可能性の真偽を検討することが今後の課題である。
グリア芽細胞の移動メカニズムの解明:二種類の螢光分子で標識された生きた細胞の観察

中枢神経系の発生過程における神経芽細胞・グリア芽細胞の移動メカニズムを知る目的から、これら未分化細胞の移動・運動動態を生きた状態で長時間観察した。新生児ラット前脳のSVZから産出した未分化細胞の一部は、脳梁を通って対側大脳半球に移動することを見出した。その際、このレトロウィルス標識細胞は未分化な形態を保ちつつ、単一の先導突起を線維束に平行に伸しながら移動した。新生児期では、ラジアルファイバーは脳室壁から垂直に脳表に向かって伸びており、脳梁を通って伸びているものは観察されなかった。即ち、脳梁における細胞移動はラジアルファイバーの伸長方向とは直交する(tangentialな)方向を取ることが解った。一方、脳梁は燐酸化ニューロフィラメントで標識され、また電顕的には未だ髄鞘で巻かれていない未熟な軸索からなっていることを確認した。新生児期にレトロウィルスを注入された個体を成熟期に達した時点で固定し、標識細胞の最終分化像とその分布を観察すると、注入を受けた側と半対側に認められた標識細胞の多くは半球内側の白質・皮質に分布し、これは脳梁線維の投射部位におよそ一致していた。対側半球に分布していた標識細胞の数は注入側半球内のそれの1%程度であり、これらは分化したアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトであり、単独あるいは23個のclusterを形成していた。このように、SVZで産出したグリア芽細胞の一部は脳梁を通って対側大脳半球に移動することが示された。このことは、両半球間でクローンの混合が起る可能性を示唆している。このtangentialな移動は、ラジアルファイバーではなく、軸索に沿って起こるものと考えられた。中枢神経系の発生過程における神経芽細胞・グリア芽細胞の移動メカニズムを解明する目的から、これら未分化細胞とラジアルファイバーの移動・運動動態を生きた状態で直接観察する研究を実行中である。本年度末までに、以下の研究を行った。1.シアン色および黄色蛍光のcDNAをコードしたレトロウィルスベクターの作製。pECFP-Mem及びpEYFP-Memベクターから、シアン色及び黄色蛍光のcDNAフラグメントを切り出し、これをレトロウィルスベクター(pQNCX-2及びpLNCX-2)に組み込んだ。これらウィルスベクターをパッケージング細胞株(EcoPack293)にtransfectionし、薬剤耐性及び細胞株の蛍光強度を指標に、導入遺伝子が安定に発現している細胞株を選定した。NIH3T3細胞株を標的細胞としたウィルスの力価検定を行い、最も高力価のクローンを単離した。これらは安定かつ十分な蛍光強度を有し、かつ互いに識別可能な色調を発することを確認した。この結果、目的とする2種類のレトロウィルスベクターの作製に成功した。また、超高速遠心により、感染力価が1x10^6CFU/ml程度のウィルス含有液を作製した。マイクロマニプュレイターを用い、出生当日のラット(P0)の前脳片側SVZ及び脳室内に上記レトロウィルス含有液をstereotacticに微量注入する方法を確立した。即ち、新生児の頭頂部及び対側側頭部からの2方向性アプローチにより、SVZおよび脳室内にそれぞれ1,10μlのウィルス液を注入する条件を見出し、児が術後も安定して生育し得ることを確認した。3.生鮮スライス培養。tissue chopperを用いて250μm厚の生鮮脳冠状断スライスを作製し、スライスごと培養する系を確立した。また、これらスライス内の蛍光シグナルを捕らえるフィルターを備えた倒立顕微鏡のセットアップを終了した。4.上記の予備的実験を終了し、次年度には蛍光分子で標識された細胞・構造物の動きを生きたスライス内で観察し、これら動態とその関連性を明らかにする計画である。

中枢神経系の発生過程における神経芽細胞・グリア芽細胞の移動メカニズムを知る目的から、これら未分化細胞の移動・運動動態を生きた状態で長時間観察した。新生児ラット前脳のSVZから産出した未分化細胞の一部は、脳梁を通って対側大脳半球に移動することを見出した。その際、このレトロウィルス標識細胞は未分化な形態を保ちつつ、単一の先導突起を線維束に平行に伸しながら移動した。新生児期では、ラジアルファイバーは脳室壁から垂直に脳表に向かって伸びており、脳梁を通って伸びているものは観察されなかった。即ち、脳梁における細胞移動はラジァルファイバーの伸長方向とは直交する(tangentialな)方向を取ることが解った。一方、脳梁は燐酸化ニューロフィラメントで標識され、また電顕的には未だ髄鞘で巻かれていない未熟な軸索からなっていることを確認した。新生児期にレトロウィルスを注入された個体を成熟期に達した時点で固定し、標識細胞の最終分化像とその分布を観察すると、注入を受けた側と半対側に認められた標識細胞の多くは半球内側の白質・皮質に分布し、これは脳梁線維の投射部位におよそ一致していた。対側半球に分布していた標識細胞の数は注入側半球内のそれの1%程度であり、これらは分化したアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトであり、単独あるいは23個のclusterを形成していた。このように、SVZで産出したグリア芽細胞の部は脳梁を通って対側大脳半球に移動することが示された。このことは、両半球間でクローンの混合が起る可能性を示唆している。このtangentialな移動は、ラジアルファイバーではなく、軸索に沿って起こるものと考えられた。
Rh血液型抗原エピトープ群の分子遺伝学的解析とRh遺伝子診断システムの確立

RHDとRHCE両遺伝子の全塩基配列を決定し,遺伝子構造に関する詳細な検討を行った。その結果,両遺伝子内にAlu配列をはじめとする多数の分散型繰り返し配列ならびに様々なSTRの存在を確認することが出来た。また,両遺伝子のアライメント解析により,イントロン1,2などに23kbの範囲で多重組換えを起こしていると考えられる領域が同定された。イントロン2については,塩基置換,gaps数と組換え領域の解析により,c型とD型が2回組換えを起こした後に,1つのAlu-Sx配列が挿入されたC型のイントロン2が生じたことが推測された。Rhポリペプチドとコンプレックスを形成するRh50糖蛋白(RhAG)は,赤血球系細胞に特異的に発現することが示唆された。RHAG遺伝子の発現調節メカニズムを明らかにすることを目的として,赤芽球系細胞株特異的なDNaseI感受性領域の同定とクローニングを行った。その結果,-10kb付近にDNaseI高感受性領域を見出したが,同部位には強いエンハンサー活性が認められた。マウスのrhag遺伝子の上流をクローニングし,コンピューターによるマッチング解析を行った結果,この領域は高度に保存されていることも明らかになった。このエンハンサー配列に結合し,アンカーとなる転写因子はGATA-1であることも判明し,RhAG発現のコントロール機序の一端を明らかにすることが出来た。Rhシステムにかかわる各種variantの分子遺伝学的解析も順調に進展した。Partial Dについては,新たなタイプを同定することが出来た。また,weak Dの解析を進め,質的ならびに量的なRhD抗原の変化によることを証明した。RH遺伝子の全構造解析に取り組み,RHD遺伝子とRHCE遺伝子,さらにこれらをつなぐスペーサー領域の全ての塩基配列を決定した。ここで得られたスペーサー領域の塩基配列データを基に,エンハンサー領域の同定を進め,RHCE遺伝子の上流約7kbのところに同活性を見出した。また同時に,Rhポリペプチドの赤血球膜固定に必要なco-moleculeのRh50糖蛋白をコードするRHAG遺伝子解析も進めてきた。RHAG遺伝子の5'非翻訳領域をクローニングし,そのプロモーター解析を行い,同遺伝子が赤芽球に特異的に発現する機構を明らかにすることが出来た。さらに,RHAG遺伝子のエンハンサー領域のクローニングにも成功した。上記の研究を進めつつ,Rh血液型抗原エピトープ群の解析のために,リコンビナントRhポリペプチド(RhD,RhcE,Rhce,RhCE)発現細胞ならびにCE-D,D-CEキメラ抗原発現細胞を作製し,各種抗Rh抗体との反応性を検討した。さらに,RhDの代表的な変異型であるpartial Dの血清学的,分子遺伝学的解析を行い,3種類の新しい変異型を見出した。これら一連のアプローチにより,各種抗原エピトープに関する重要な情報を得ることが出来た。また,Rhnull例やD--例の遺伝子解析により,新たな変異遺伝子を見出すとともに,Rhnullにおけるregulator型とamorph型の遺伝的歳を明確に示すことが出来た。RHAG

遺伝子の発現調節メカニズムを明らかにすることを目的として,赤芽球系細胞株特異的なDNaseI感受性領域の同定とクローニングを行った。その結果,-10kb付近にDNaseI高感受性領域を見出したが,同部位には強いエンハンサー活性が認められた。マウスのrhag遺伝子の上流をクローニングし,コンピューターによるマッチング解析を行った結果,この領域は高度に保存されていることも明らかになった。このエンハンサー配列に結合し,アンカーとなる転写因子はGATA-1であることも判明し,RhAG発現のコントロール機序の一端を明らかにすることが出来た。Rhシステムにかかわる各種variantの分子遺伝学的解析も順調に進展した。Partial Dについては,新たなタイプを同定することが出来た。また,weak Dの解析を進め,質的ならびに量的なRhD抗原の変化によることを証明した。
ヘテロポリ酸の特殊反応場を用いた触媒反応系の分子反応工学

1.これまでの経緯セシウムなどでイオン交換されたヘテロポリ酸は不溶性の固体酸触媒として、液相反応に利用可能である。これは工学的にも興味ある系であり、反応工学的な検討を行う必要がある。すでに、分子論的なアプローチと反応器設計について新MTBE合成プロセスの提案を行った。本研究では、この触媒の持つ強酸性を生かした反応場の工学的展開を図る目的で、トルエンと無水安息香酸によるフリーデルクラフツ型アシル化反応を検討した。2.触媒の設計とスクリーング不溶性の強酸性触媒を得るため、酸性プロトンを1分子あたり0.5当量残してあとをアルカリイオンで交換したヘテロポリ酸を用いた。中間体の安定化を図るため、種々のアルカリイオンでの交換を試みた。活性を検討した各触媒のうち、強酸性を有するものだけが活性を示した。アルカリ土類金属では酸性が上がらず活性も認められなかった。アルカリイオンのなかでも、セシウムイオン交換体が最も高い活性を示した。3.活性劣化機構上記の触媒を用いても、反応は完全転化には至らなかった。この原因を探るため種々の添加物の効果を検討した。原料の無水安息香酸の再添加により活性は回復した。従って、反応の停止は不可逆的なものではなく、原料の過剰な消費による事が明らかとなった。GC-MSによる副生成物の分析の結果と、モデル反応である無視安息香酸とジエチルケトンの反応の実験結果をうけて、活性化された無水安息香酸中間体と主生成分であるフェニルトリルケトンが反応して副生成物を与えることを明らかにした。提案した反応機構に基づき、反応速度式を提案した。
核融合炉実現に向けた高周波による電流立ち上げプラズマの高密度化

核融合発電を実現するためには、高密度、高温のプラズマが必要であるが、有力な加熱方法の一つである電子サイクロトロン(EC)共鳴加熱は電子密度限界が存在する。電子密度の上限のない静電波を高周波で励起できれば、核融合発電に向け炉のコンパクト化や、ポートの縮小化による燃料増倍率を示すトリチウム増倍率の向上に貢献できる。EC波はモード変換を通して静電波の一種である電子バーンシュタイン(EB)波を励起する。本研究では、高励起効率が期待できる高磁場側からEC波を入射し、EB波による高密度化を可動プローブを用いて観測し、またEB波により駆動するプラズマ電流を磁場を反転させることで確認する。
光合成同化産物蓄積を水溶性多糖として液胞に分配形質転換した新規飼料イネの素材評価

近年、飼料イネが注目され、品種の育成、栽培・利用技術の開発が進められつつある。主な家畜粗飼料である寒地型イネ科牧草では、可溶性糖類の主な成分であるフルクタン含量の増加が、家畜の嗜好性・健康機能保持の向上に関わることが報告されている。イネでは光合成同化産物を主にデンプンとして葉緑体に貯蔵し、フルクタン合成能力はない。イネの炭酸固定能を高め,飼料価値を向上させることを目的に、フルクタン合成酵素遺伝子をイネに導入し、フルクタン・フルクトオリゴ糖を液胞に蓄積させた新規イネについて糖類、飼料イネとしての応用利用を評価した。イネにコムギのフルクタン合成遺伝子1-SST及び6-SFT単独遺伝子導入と1-SSTと6-SFTの2遺伝子連結導入を行い、それぞれフルクタンの蓄積するT_0の異なる5系統以上のホモ形質転換体T_2を得た。得られた形質転換体には形態異常は見られなかった。形質転換体は出穂、開花が遅れる傾向があり、1-SST単独導入及び2遺伝子導入系統では、1週間以上遅れる系統もあった。出穂が遅れる系統では、生育後期の生長量が高く、止葉やその前の葉の長さが原品種より長くなった。1-SST導入個体ではβ(2-1)結合のイヌリンタイプのフルクトオリゴ糖が蓄積し、6-SFT導入個体ではβ(2-6)結合のオリゴ及び多糖が主に蓄積し、ビブルコースにフルクトースがβ(2-1)結合で重合したオリゴ糖蓄積も確認された。両遺伝子が導入された個体では上記の両方の構造を持ったフルクタンが蓄積した。T_3における葉組織のフルクタンの含量は、閉鎖系温室で生重量1gあたり1-SST導入系統で約17-23mg,6-SFT導入系統で約2-7mg、2遺伝子導入では約26-37mgになり、総含量もほぼフルクタン含量分増加した。これらの結果は、フルクタンを蓄積するイネが飼料利用に高負荷価値を与える素材となりうることを示した。1.研究目的近年、飼料イネが注目され、品種の育成、栽培・利用技術の開発が進められつつある。また,イネ科牧草やコムギでは液胞に蓄積されたフルクタンはエネルギー源として栄養生長に利用される。そこで本研究では、イネの炭酸固定能を高め,飼料価値を向上させることを目的に、フルクタン合成酵素遺伝子をイネに導入し、フルクタン・フルクトオリゴ糖を液胞に蓄積させた新規イネについて糖類、細胞壁成分などを分析し、飼料イネとしての応用利用を評価する。2.結果の概要単独遺伝子導入:(1)1-SST及び6-SFT単独遺伝子導入はCaMV35Sプロモーターにエンハンサー等が付加されたプロモーターを用い形質転換体を作成した。それぞれT_0の異なる5系統(1-SST)と3系統(6-SFT)のホモ形質転換体T_2を得た。(2)上記ホモのT_2において導入

遺伝子発現を調べた結果、ノーザンブロット解析で1-SST及び6-SFT遺伝子の発現が検出された。二遺伝子導入:(1)1-SSTにはトウモロコシユビキチンプロモーター、6-SFTはCaMV35Sプロモーターにエンハンサー等が付加されたプロモーターを用い、形質転換体を作成した。(2)後代選抜により、T_0の異なる5系統の二遺伝子ホモ形質転換体T_2を得た。蓄積フルクタンの構造:(1)選抜中のフルクタン分析から、1-SST導入個体ではβ(2-1)結合のイヌリンタイプのフルクトオリゴ糖が蓄積し、6-SFT導入個体ではβ(2-6)結合のオリゴ及び多糖が主に蓄積し、ビフルコースにフルクトースがβ(2-1)結合で重合したオリゴ糖蓄積も確認された。(2)両遺伝子が導入された個体では上記の両方の構造を持ったフルクタンが蓄積した。近年、飼料イネが注目され、品種の育成、栽培・利用技術の開発が進められつつある。主な家畜粗飼料である寒地型イネ科牧草では、可溶性糖類の主な成分であるフルクタン含量の増加が、家畜の嗜好性・健康機能保持の向上に関わることが報告されている。イネでは光合成同化産物を主にデンプンとして葉緑体に貯蔵し、フルクタン合成能力はない。イネの炭酸固定能を高め,飼料価値を向上させることを目的に、フルクタン合成酵素遺伝子をイネに導入し、フルクタン・フルクトオリゴ糖を液胞に蓄積させた新規イネについて糖類、飼料イネとしての応用利用を評価した。イネにコムギのフルクタン合成遺伝子1-SST及び6-SFT単独遺伝子導入と1-SSTと6-SFTの2遺伝子連結導入を行い、それぞれフルクタンの蓄積するT_0の異なる5系統以上のホモ形質転換体T_2を得た。得られた形質転換体には形態異常は見られなかった。形質転換体は出穂、開花が遅れる傾向があり、1-SST単独導入及び2遺伝子導入系統では、1週間以上遅れる系統もあった。出穂が遅れる系統では、生育後期の生長量が高く、止葉やその前の葉の長さが原品種より長くなった。1-SST導入個体ではβ(2-1)結合のイヌリンタイプのフルクトオリゴ糖が蓄積し、6-SFT導入個体ではβ(2-6)結合のオリゴ及び多糖が主に蓄積し、ビフルコースにフルクトースがβ(2-1)結合で重合したオリゴ糖蓄積も確認された。両遺伝子が導入された個体では上記の両方の構造を持ったフルクタンが蓄積した。T_3における葉組織のフルクタンの含量は、閉鎖系温.室で生重量1gあたり1-SST導入系統で約17-23mg,6-SFT導入系統で約2-7mg、2遺伝子導入では約26-37mgになり、総含量もほぼフルクタン含量分増加した。これらの結果は、フルクタンを蓄積するイネが飼料利用に高負荷価値を与える素材となりうることを示した。
チタン合金の床義歯への応用に関する基礎的臨床的研究

本研究では次の4項目について検討を行い、以下の成果を得た。1。超塑性チタン合金の曲げたわみ特性:Tiー6Alー4V合金を超塑性成形して得た種々な弯曲をもつ試験片について曲げ特性を測定した結果、ほぼ同じ厚さではチタン合金の方がCoーCr合金鋳造体より曲げ強さは大きかった。上顎無歯顎模型の部分的な形態を付与した試験片では、前歯部では口蓋が深いものがたわみにくく、臼歯部では逆の結果となった。2。超塑性チタン合金義歯床の歪分布:上顎無歯顎模型より5種類の異る条件で超塑性成形床を作り、それにつき荷重したときの歪みを測定した結果、CoーCr合金鋳造床に比べていずれも大きな歪みを示した。しかし、床後縁部や全体に厚さを増すと歪みは減少し、同等以上の歪み特性となった。レジン咬合堤を付与すると主歪み値は約2/3になった。粘膜模型上では歪み量は大きく減少し、また各床の差違は少くなった。3。超塑性成形床の適合性:種々な厚さの超塑性形成形床と、さらにレジン重合して義歯としたものについて、マスタ-モデルに対する適合性を測定。その結果、床の場合の適合性はきわめて優れており、義歯とした場合でもかなり良好であった。4。超塑性チタン合金床義歯の臨床経過観察:19881989年に0.55mm厚さのTiー6Alー4V合金で製作した上顎全部床義歯29例について、リコ-ルにより経過観察した結果、2例で正中部のレジンの破折、7例で床粘膜面のレジンの剥離によるとみられる色素侵入が認められ、床のたわみの影響が推測された。1。2。3。4。現在までに行った研究とそれによる知見は以下のようである。1)チタン合金の超塑性加工に関する検討:Tiー6Alー4V合金を超塑性加工して得られた義歯床の力学的挙動を調べるため,部分床義歯への応用を想定して弯曲の度合いや形態の異なる板状試験片について曲げ特性を測定した。対照としてCoーCr合金,金合金IIIで同様の15×40mmの平板試料を製作した。超塑性試料の製作は厚さ0.55mmのTiー6Alー4V合金板を950°Cアルゴンガス圧8kg/Cm^2,約60分間で加圧成形した。結果は,Tiー6Alー4V合金試料はCoーCr合金試料に比べ小さなたわみでは勾配が同等で,たわみが大きくなると曲げ強さはCoーCr合金を大きく上まわった。種々な形態を付与したTiー6Alー4V合金試料では,表面に微細な凹凸をつけたり,幅方向に樋状の弯曲をつけることにより曲げ強さは大きくなった。2)超塑性加工したチタン合金義歯床の歪特性の検討:厚さ0.55mm,0.75mmのTiー6Alー4V合金を用いて上顎全部床義歯試料を製作し,口蓋部に荷重したときの各部の歪みを口蓋面8個所に貼布した3軸型歪ゲ-ジで測定した。試料は粘膜面が上になるようテフロン板上に置き,口蓋中央部に最大24kgの荷重を加えた。試料はメタルフレ-ムのみの場合に加えて,全顎用咬合堤を加熱重合レジンで作り,これを接着性即時重合レジンで合着した試料,および前歯部,大臼歯部の咬合堤を削除した試料についても歪測定を行った。その結果,咬合堤を付与することで主歪みは約2/3に減少し,特に後縁部両側で著しい減少を見せた。

咬合堤の削除は主歪値にはあまり影響しなかった。さらに,0.55mm厚さの板を2枚重ねて成形したものについても検討を行った結果,主歪みは他に比べ圧倒的に小さくなり,対照としたCoーCr合金試料よりも小さかった。また拡散接合が行われていることも確認された。本年度は次の3項目について検討を行った。1。超塑性チタン合金(Tiー6Alー4V)義歯床の歪み特性:上顎無歯顎模型を用い、5種類の条件で超塑性成形床を製作、各々につき荷重したときの歪みを記録測定した。その結果、(1)金属床自体の歪み特性については、各床とも荷重点に近い部や正中後縁部で大きな歪みが生じた。これは厚さ0.55mmの板を床全体又は口蓋後縁部に幅10mmで、2板重ねて成形することで著しく減少した。(2)レジン咬合堤を付与した義歯床の歪み特性については、咬合提を付与すると補強されると同時に床全体が荷重を均一に負担するため、主歪み値は平均して2/3程度に減少した。(3)咬合堤の位置が歪み特性に及ぼす影響については、あまり著明な差違はみられなかった。これは、床の形態上、常に正中線上に垂直応力が集中しやすいためと考えられた。(4)粘膜模型上での歪み特性については、すべての義歯床は歪み量が大きく減少し、各床の差違も少かった。(5)口蓋部の一部が強く接触する様にした場合の歪み特性については、接触部を中心として義歯床に応力が生じ、とくに床の薄いもので顕著であった。2。超塑性成形床の適合性:板厚0.55mm,0.75mm,0.55mm2枚重ねの3種類のTiー6Aー4V合金床を成形し、さらに義歯としてレジン重合したものについて,マスタ-モデルに対する適合性を測定した。その結果、成形床のマスタ-モデルとの間隙量は平均0.13mm以下で、優れた適合性を示した。義歯床の場合には、最大で0.20mm以下で、やはり良好な適合性であった。3。超塑性チタン合金床義歯の臨床経過観察:19881989年に0.55mm厚さのTiー6Alー4V合金超塑性成形による上顎全部床義歯症例29例について、リコ-ルにより経過観察を行った。その結果、2例に正中部でのレジンの破折、7例で床粘膜面の臼歯部から後縁にかけてレジンの僅かな剥離とみられる色素の侵入があり、床のたわみが関係していると考えられた。
血栓の形成・崩壊・移動および塞栓とその成長による重要臓器梗塞の力学的メカニズム

本研究では,生体力学に基づいた計算機シミュレーションとin vitro実験を駆使して,重要臓器梗塞の原因となる血栓の形成と崩壊,血栓の血流による移動,および塞栓とその成長といった一連のプロセスのマルチスケールな振る舞いを検討した.まず,ストークス動力学法や粒子法を用いた計算力学シミュレーションにより,血流下で生じる血小板凝集について,生物学的な因子と,血流による流体力学的な因子との関連を明らかとした.同時に,赤血球の変形挙動と見かけの血流抵抗との関連を示し,血球同士の相互作用が血流特性を決定付ける因子であることを明らかとした.また,異なる種類の血球間における力学的および生物学的な相互作用が血栓形成過程を決定することを示した.さらに,マイクロPIV装置を用いて,生体外で微小流路内の血流を定量的に計測する手法を確立した.同装置により,ヘマトクリット値に応じた血流速度の時空間的な揺らぎが計測され,血球の力学的な相互作用が微小循環における血流特性を支配することが示された.一方,地球シミュレーターを援用して,赤血球流動の大規模な計算力学シミュレーションモデルを提案し,血球(μm)から大血管(cm)のスケールに至る血流特性を説明する数理モデルを確立した.左心室と大動脈の統合モデルを開発し,血栓形成に大きな影響を与える血流の渦構造やよどみ点を詳細に評価する上で,同モデルを用いたシミュレーションが実用的な手段として有用であることを確認した.本研究では,生体力学に基づいた計算機シミュレーションとin vitro実験を駆使して,重要臓器梗塞の原因となる血栓の形成と崩壊,血栓の血流による移動,および塞栓とその成長といった一連のプロセスのマルチスケールな振る舞いを検討した.まず,ストークス動力学法や粒子法を用いた計算力学シミュレーションにより,血流下で生じる血小板凝集について,生物学的な因子と,血流による流体力学的な因子との関連を明らかとした.同時に,赤血球の変形挙動と見かけの血流抵抗との関連を示し,血球同士の相互作用が血流特性を決定付ける因子であることを明らかとした.また,異なる種類の血球間における力学的および生物学的な相互作用が血栓形成過程を決定することを示した.さらに,マイクロPIV装置を用いて,生体外で微小流路内の血流を定量的に計測する手法を確立した.同装置により,ヘマトクリット値に応じた血流速度の時空間的な揺らぎが計測され,血球の力学的な相互作用が微小循環における血流特性を支配することが示された.一方,地球シミュレーターを援用して,赤血球流動の大規模な計算力学シミュレーションモデルを提案し,血球(μm)から大血管(cm)のスケールに至る血流特性を説明する数理モデルを確立した.左心室と大動脈の統合モデルを開発し,血栓形成に大きな影響を与える血流の渦構造やよどみ点を詳細に評価する上で,同モデルを用いたシミュレーションが実用的な手段として有用であることを確認した.本年度は,血栓の形成から崩壊に至る一連のプロセスを観察するための実験システムと,これらのプロセスをコンピュータシミュレーションで再現して解析するための計算モデルの基盤を構築した.得られた成果は下記のとおりである.1.一次血栓形成の粒子モデルの構築血しょう流れ下での血小板の凝集,変形および崩壊を表す粒子モデルを構築した.血しょうおよび血小板はすべて粒子で表現し,MPS法に基づいて両者の流れを表現した.血小板には,血管壁の損傷部に確率的に接触する力,および血小板同士が吸着する力をバネモデルで与え,これをMPS法に組み込んで血栓の形成および崩壊過程を表すことができるようにした.2.粒子法による一次血栓形成のシミュレーション上記粒子モデルを用いて,2次元平行平板流路において,損傷した血管壁に血小板が付着し,一次血栓が形成されていく様子をコンピュータシミュレーションで再現した.その結果,血しょうの流速が血栓の大きさや崩壊に影響を与えることが示され,血栓形成過程には流体力学的な因子が大きく関わることが明らかとなった.3.血栓形成過程観察のためのマイクロPIV計測システムの構築ディスク式マルチスキャン方式と高速度カメラを組み合わせた共焦点レーザー顕微鏡システムにより,運動する蛍光微粒子のイメージ画像を取得して,微粒子の流速分布を計測するマイクロPIV装置を構築した.さらに,対物レンズをピエゾアクチュエータによりz軸方向に駆動させる装置を組み合わせ,3次元空間における速度分布を計測できるようにした.4.マイクロPIV計測システムの検証矩形流路内の速度分布を構築したマイクロPIVシステムで計測し,十分な精度で速度分布が計測されることを確認した.また,内皮細胞を介して細胞表面上の蛍光微粒子の運動を観察し,その速度分布を計測できることを確認した.本年度は,前年度で構築したin vitro実験系を用いて,ミクロ流路内血流のPIV流速計測を行うとともに,粒子法シミュレーション手法を拡張し,血流中における血小板の生化学的な活性化,赤血球の変形運動,ならびに血小板と赤血球の連成効果について検討した.得られた成果は,以下の通りである.1.ミクロスケールにおける血流動態観察血小板モデルとして微小蛍光粒子を用いて,ミクロ経路内における微小蛍光粒子の運動挙動をMicroPIVシステムにより観察した.さらに,同システムを用いた計測により,赤血球の有無に応じた血流速度の違いを示した.2.血小板の活性度変化を考慮した粒子法シミュレーション粒子法シミュレーションを拡張し,血小板の活性度変化を考慮した二次元シミュレーションを行った.

その結果,本シミュレーションにより,実験的に観察される,活性度変化に応じた血栓形成が定性的に表現された.より定量的なシミュレーションを行うため,三次元シミュレーションへの拡張も行った.3.赤血球の変形運動を考慮した粒子法シミュレーション粒子法シミュレーションを拡張し,赤血球の変形運動が微小血管レベルの血流に与える影響を検討した.その結果,赤血球が周囲の血しょう流れと力学的に相互作用をし,その結果として,赤血球の弾性特性および赤血球の全血中の数密度(ヘマトクリット)が見かけの血流抵抗を決定することを示した.これらの結果は,実験結果と定性的に一致した.さらに,この赤血球が血小板血栓に与える影響を検討するため,血小板と赤血球の力学的相互作用を直接的に表現する粒子法シミュレーション手法の開発も併せて行った.計算力学的アプローチでは,微小循環における流動構造を解析する上で重要となる赤血球の粒子法モデリングを行い,赤血球の変形能の低下およびヘマトクリット値の変化が血液流動に与える影響について検討した.本モデルでは赤血球膜を構成する粒子同士を弾性膜によって結合することで赤血球の変形能を表現している.昨年度までに開発した血小板血栓シミュレータと本モデルを統合することで実際の微小循環の血小板血栓形成解析に応用が可能となり,さらには血小板と赤血球によって形成される二次血栓形成を解析できるシミュレータとなった.Massage Passing Interface(MPI)を用いた並列計算コードへと発展させ,大規模解析へ対応させた.実験的なアプローチでは,昨年度までに構築した共焦点マイクロParticle Image Velocimetry(PIV)システムを用い,マイクロチャネル内において血栓の形成を確認した.Polydimethylsiloxane(PDMS)で作成した分岐,狭窄などの流路形状における流動構造を明らかにするとともに,様々な流路形状に対して3次元的流動構造を観察できるシステムであることを示した.またデキストラン濃度を変化させた実験を行い,赤血球の凝集における血漿タンパクの影響を評価した.さらに血球の変形や血球同士の干渉など血球動態の詳細な検討のため,血球をラベリングして観察する共焦点マイクロPTVシステムを新たに構築した.