hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境化学物質の毒性に関わる選択的スプライシングの解析

本研究では、化学物質や酸化ストレスにより選択的スプライシングが惹起されるのではないか考え検討を行った。ヒ素メチル基転移酵素(AS3MT)mRNAについて検討したところ、過酸化水素曝露により、新しいAS3MTのスプライスフォームを検出した。その後、スプライシング調節因子SRp40の発現減少の関与が示唆され、また、検出されたAS3MT選択的スプライシングフォームにはヒ素に対するメチル化反応が欠損していることを見出した。網羅的解析により、環境化学物質の亜ヒ酸や農薬のパラコートに曝露された細胞において選択的スプライシングが惹起されることを見出した。現在、詳細について検討している。本研究では、化学物質の毒性発現機序においてmRNAの品質機構が損傷をうけているのではないかと考え、mRNAの品質機構のなかでも選択的スプライシングが化学物質により惹起されるのではないかと仮説を立て研究を進めている。まず、最初に環境化学物質に曝された細胞において酸化ストレスが亢進することから、過酸化水素にヒト肝ガン細胞を曝露し、選択的スプライシングが惹起されるかについて検討した。その結果、当研究室で選択的スプライシングを受けることが明らかとなっているヒ素メチル基転移酵素(AS3MT)mRNAについて検討を進めたところ、AS3MT mRNAの3番目から9番目エキソンがスキップされたΔ3-9 mRNAが検出された。データベースを用い解析したところ、エキソン認識に必要なSRp40がAS3MT mRNAのスプライシングに重要であることが考えられた。そこで、過酸化水素曝露によるSRp40発現を検出したところ、過酸化水素により顕著にSRp40発現レベルが減少していることが明らかとなった。現在、その機序について検討を進めている。一方、ヒ素曝露により惹起される選択的スプライシングを網羅的に解析するために、亜ヒ酸にヒト皮膚角化HaCaT細胞を2週間曝露し、totaRNAを採取後transcriptome arrayを実施した。その結果、Matrix metallo-proteinase 1および3において亜ヒ酸曝露による選択的スプライシングが明らかとなった。現在、Real-time-PCR法によって詳細に検討を進めている。また、ビピリジニウム系除草剤であるパラコートをヒト神経芽細胞であるSH-SY5Y細胞に曝露したところ、すでに報告のあったApaf-1の選択的スプライシングを確認することができた。現在、Apaf1の選択的スプライシングの機序、ならびにApaf1以外のmRNAにおける選択的スプライシングについて検討をすすめている。本年度は、前年度に明らかとなった過酸化水素曝露によるスプライシング因子SRp40の発現抑制作用について検討を進めた。過酸化水素によりユビキチンープロテアソーム系が活性化されること、さらにデータベースで検索したところSRp40にユビキチン化されるリジン残基の可能性が予測されたことから、過酸化水素曝露によるSRp40の発現抑制にユビキチンープロテアソーム系が関与していると考えた。ユビキチンープロテアソーム系の阻害剤であるMG-132で処理した細胞では過酸化水素によるSRp40の発現抑制が見られなかったことから、過酸化水素曝露によるSRp40の発現抑制にユビキチンープロテアソーム系の関与が示唆された。さらに、SRp40高発現細胞を使用して過酸化水素曝露によるSRp40のユビキチン化を検討したが、現在のところ結果は得られていない。前年までの検討により、亜ヒ酸にHaCaT細胞を曝露したことにより、MMP1 mRNAのスプライシングに異常を来していることを明らかにしたが、さらに検討を進めたところMMP3 mRNAについてもexonの3番目が亜ヒ酸により欠損している可能性が明らかとなった。現在、その詳細について検討を進めている。環境化学物質として、ビピリジニウム系農薬であるパラコート(PQ)をヒト神経芽SH-SY5Y細胞に曝露して特異なスプライシングが起こるかについて検討した。total RNAを回収しTranscriptome arrayで網羅的に検討したところ、PQによってドーパ脱炭酸酵素(DDC)の発現減少、ならびにスプライシングの異常が明らかとなった。DDCはドパミンを産生する重要な酵素であることから、PQによるパーキンソニズムの原因の一因としてDDCのスプライシング異常が関与しているのではないかと推測し、現在検討を進めている。過酸化水素曝露によるAS3MT mRNAの選択的スプライシングの同定ならびにその機序の一端としてSRp40タンパク質の減少を見出している。亜ヒ酸を用いた実験においては、新規選択的スプライシングを見出している。パラコートを用いた実験においては、すでに明らかとなっている選択的スプライシングを検出する方法を確立しており、新規選択的スプライシングの検出にそれほど時間を要することがないと考えられる。以上の研究結果から、本申請事項はおおむね順調に進行していると考える。環境分子毒性学本年度は過酸化水素曝露によるSPp40の発現減少に関する機序の解析を行う。

具体的には過酸化水素によるユビキチン/プロテアソーム系の活性化を考えている。ユビキチン/プロテアソーム系の阻害剤を用いた先行実験によると、過酸化水素によるSRp40の減少が抑制されてることから本システム活性化およびSRp40発現の人為的制御による選択的スプライシングの発生について検討する。亜ヒ酸曝露による実験については、同定された新規選択的スプライシングについて、亜ヒ酸の曝露濃度および時間依存性について詳細に検討を進めていく。また、選択的スプライシングにより得られたタンパク質の機能解析も合わせて行う。パラコートを用いた実験においては、パラコートを曝露した細胞からtotaRNAを採取後、transcriptome arrayを実施することで、パラコート曝露により惹起される新規選択的スプライシングの検出を試みる。
強磁場による材料の結晶配向の機構解明

Fe-Cu合金が凝固する際の固液共存状態でのCuの移動速度を浮力,重力などを考慮した解析により最適な実験条件を算出し,それに基付き12Tの強磁場下で15%Cu-Fe合金の融解-凝固実験を行った.得られた試料の縦断面を光学顕微鏡によりCuの分布状態を観察した.磁化力差による,顕著な磁気分離効果を見出すことはできなかったが,強磁場印加によって,晶出Cuは結晶粒内にほぼ眞球に近い状態で晶出することを見出した.磁場を印加しない場合には,Cuは結晶粒界に晶出し,機械的性質を極端に悪化させると云われているが,本研究結果のように,結晶粒内にCuが分布すれば機械的性質の向上が期待できる.さらに,分布状態を微細かつ均一に分布させることが出きれば,介在物の共存を可能にしたオキサイドメタラジーの如く,Cuを含有したままでの鋼のリサクルの可能性が高まった.本年度の研究では,前年度の研究背一を踏まえ,Cuを結晶粒内へ均一微細分散をさせる条件を把握するために,一方向凝固装置の設計と作製を行い,強磁場下で一方向凝固実験を行ってその事実を明らかにした.さらに,機械的性質の測定を行いCu粒子の結晶粒内分散が機械的性質を向上させることを明らかにした.なお,今後は,Cuを結晶内に分散させた試料の圧延行程での機械的な性質を調べる必要性を認めた.得られた成果を以下の会で報告した.日本鉄鋼協会高温プロセス部会高度電磁力利用マテリアル・プロセッシング研究会:資料No.13電磁2-2平成13年10月24日日本学術振興会製鋼第19委員会凝固プロセス研究会:19委-11960凝固プロセスIII-19平成14年1月31日Fe-Cu合金が凝固する際の固液共存状態でのCuの移動速度を浮力,重力などを考慮した解析により最適な実験条件を算出し,それに基付き12Tの強磁場下で15%Cu-Fe合金の融解-凝固実験を行った.得られた試料の縦断面を光学顕微鏡によりCuの分布状態を観察した.磁化力差による,顕著な磁気分離効果を見出すことはできなかったが,強磁場印加によって,晶出Cuは結晶粒内にほぼ眞球に近い状態で晶出することを見出した.磁場を印加しない場合には,Cuは結晶粒界に晶出し,機械的性質を極端に悪化させると云われているが,本研究結果のように,結晶粒内にCuが分布すれば機械的性質の向上が期待できる.さらに,分布状態を微細かつ均一に分布させることが出きれば,介在物の共存を可能にしたオキサイドメタラジーの如く,Cuを含有したままでの鋼のリサクルの可能性が高まった.よって,今後の研究課題として,機械的性質の測定とCuを結晶粒内へ均一微細分散をさせる条件を把握する必要がある.Fe-Cu合金の磁化率の測定においてマトリックスと晶出物との磁化率の差が大きくないので磁力による分離効果を上げるには磁場と磁場勾配の積を大きくすると共に凝固速度の制を必要とすることが分かった.それには,一方向凝固との組み合わせによって,磁気分離効果を顕在化させ得ることが予想できるので一方向凝固装置の設計と作製を行い,強磁場下で一方向凝固実験を行ってその事実を明らかにする必要がある.Fe-Cu合金が凝固する際の固液共存状態でのCuの移動速度を浮力,重力などを考慮した解析により最適な実験条件を算出し,それに基付き12Tの強磁場下で15%Cu-Fe合金の融解-凝固実験を行った.得られた試料の縦断面を光学顕微鏡によりCuの分布状態を観察した.磁化力差による,顕著な磁気分離効果を見出すことはできなかったが,強磁場印加によって,晶出Cuは結晶粒内にほぼ眞球に近い状態で晶出することを見出した.磁場を印加しない場合には,Cuは結晶粒界に晶出し,機械的性質を極端に悪化させると云われているが,本研究結果のように,結晶粒内にCuが分布すれば機械的性質の向上が期待できる.さらに,分布状態を微細かつ均一に分布させることが出きれば,介在物の共存を可能にしたオキサイドメタラジーの如く,Cuを含有したままでの鋼のリサクルの可能性が高まった.本年度の研究では,前年度の研究背一を踏まえ,Cuを結晶粒内へ均一微細分散をさせる条件を把握するために,一方向凝固装置の設計と作製を行い,強磁場下で一方向凝固実験を行ってその事実を明らかにした.さらに,機械的性質の測定を行いCu粒子の結晶粒内分散が機械的性質を向上させることを明らかにした.なお,今後は,Cuを結晶内に分散させた試料の圧延行程での機械的な性質を調べる必要性を認めた.得られた成果を以下の会で報告した.日本鉄鋼協会高温プロセス部会高度電磁力利用マテリアル・プロセッシング研究会:資料No.13電磁2-2平成13年10月24日日本学術振興会製鋼第19委員会凝固プロセス研究会:19委-11960凝固プロセスIII-19平成14年1月31日
HIV中和抗体を用いたgp120V3領域とケモカインレセプターの相互作用の研究

HIVのエンベロープV3領域はケモカインレセプターとHIVの相互作用に関与しHIVの感染に重要な役割を果たしている。我々は昨年までにV3に反応する中和モノクローナル抗体(ヒト型化抗体、Cβ1,Rμ5.5,RC25)を家兎に免疫し、その血清中に抗イディオタイプ抗体を誘導した。ビオチン化した中和抗体の抗原エピトープを含むペプチドに対する結合反応の抑制という測定系で抗イディオタイプ抗体活性を測定した。免疫に用いた抗体に対する抗イディオタイプ抗体が最も結合抑制活性は高いが高濃度の抗血清を用いるとある程度の交叉反応性が認められた。抗イディオタイプ抗体を精製し、同じ力価にてマウスを免疫したところ、anti-RC25イディオタイプを免疫したマウスでは他の2種の抗イディオタイプ(anti-0.5β,anti-Rμ5.5)に比較して有意に強い力価の中和抗体が誘導された。一方、これらの中和抗体はHIVがケモカインレセプターと相互作用するV3ループ部分に反応することから、^<125>Iでラベルしたケモカインがそのレセプターに結合する活性への影響を調べた。しかし、抗イディオタイプ抗体にも中和モノクローナル抗体にもケモカインとケモカインレセプターの反応に対する阻害効果は認められなかった。これらのことから、さらにRC25に対する抗イディオタイプ単クローン抗体を10種類作成し、中和抗体の誘導能やケモカインとケモカインレセプターの反応に対する影響を検討した。しかし残念ながらこれまでのところポリクローナルの抗イディオタイプ血清抗体に匹敵する活性を持つモノクローナル抗体は分離できていない。免疫療法やワクチンとして動物レベルでの有用性を調べるためには有効性の高い抗イディオタイプ単クローン抗体がぜひ必要であり今後とも努力を続けるつもりである。我々はこれまでHIV-1,HIV-2、SIVに対する中和モノクローナル抗体を作製してきた。これらの中和抗体はHIVのエンベロープV3領域に対する抗体であり、中和のメカニズムについては不明であった。一方、最近の研究から、V3領域はHIVのコレセプターであるケモカインレセプタと相互作用することが判明した。本研究の目的はV3に対する中和抗体の中和メカニズムを調べるとともにその抗イディオタイプタイプ抗体がヒトのケモカインケモカインレセプターシステムの中で、自己抗体となりうるかどうかを検索し、抗イディオタイプワクチンの可能性を検討する点にある。本年度は開発した単クローン抗体のケモカインシステムへの交叉反応性を調べたが、現在までのところ、交差反応は認められていない。また、3種類の中和モノクローナル抗体について抗イディオタイプ抗体を作製した。アフィニティクロマトグラフィーを用いて約90%の精製度を得た。これらについても直接のケモカインレセプターへの交叉反応性は認められなかったが、これらを再び免疫すると、オリジナルの単クローン抗体とは反応性の異なる抗体が誘導されてきた。誘導された抗・抗イディオタイプ抗体について中和能や交叉反応性の検討を推し進めるとともにさらに免疫を続け、ワクチン開発の可能性を検討している。我々は昨年までに3種類のHIVに対する中和モノクローナル抗体(ヒト型化抗体、Cβ1、Rμ5、RC25)を家兎に免疫し、その血清中に抗イディオタイプ抗体を誘導した。

抗ヒトIgG活性を吸着後に抗原として用いた抗体を結合させたアフィニティカラムにて、抗イディオタイプ抗体を精製し、同じ力価にてマウスを免役したところ、anti-RC25イディオタイプを免疫したマウスでは他の2種の抗イディオタイプ(anti-0.5β、anti-Rμ5)に比較して有意に強い力価の中和抗体が誘導された。一方、これらの中和抗体はHIVがケモカインレセプターと相互作用するV3ループ部分に反応することから、^<125>Iでラベルしたケモンカインがそのレセプターに結合する活性への影響を調べた。しかし、抗イディオタイプ抗体にも中和モノクローナル抗体にもケモカインとケモカインレセプターの反応に対する阻害効果は認められなかった。これらのことから、さらにRC25に対する抗イディオタイプ単クローン抗体を10種類作成し、中和抗体の誘導能やケモカインとケモカインレセプターの反応に対する影響を検討中である。広範囲のHIV株を中和する抗体の誘導法は確立していない。有効なワクチン開発や免疫療法の開発に向けて抗イディオタイプ抗体の中には有効なものが含まれることがわかった。今後は抗イディオタイプ抗体を単クローン抗体として分離し、免疫療法やワクチンとしての動物レベルでの有用性を試みる必要がある。HIVのエンベロープV3領域はケモカインレセプターとHIVの相互作用に関与しHIVの感染に重要な役割を果たしている。我々は昨年までにV3に反応する中和モノクローナル抗体(ヒト型化抗体、Cβ1,Rμ5,RC25)を家兎に免疫し、その血清中に抗イディオタイプ抗体を誘導した。ビオチン化した中和抗体の抗原エピトープを含むペプチドに対する結合反応の抑制という測定系で抗イディオタイプ抗体活性を測定した。免疫に用いた抗体に対する抗イディオタイプ抗体が最も結合抑制活性は高いが高濃度の抗血清を用いるとある程度の交叉反応性が認められた。抗イディオタイプ抗体を精製し、同じ力価にてマウスを免疫したところ、anti-RC25イディオタイプを免疫したマウスでは他の2種の抗イディオタイプ(anti-0.5β,anti-Rμ5)に比較して有意に強い力価の中和抗体が誘導された。一方、これらの中和抗体はHIVがケモカインレセプターと相互作用するV3ループ部分に反応することから、^<125>Iでラベルしたケモカインがそのレセプターに結合する活性への影響を調べた。これらのことから、さらにRC25に対する抗イディオタイプ単クローン抗体を10種類作成し、中和抗体の誘導能やケモカインとケモカインレセプターの反応に対する影響を検討した。しかし残念ながらこれまでのところポリクローナルの抗イディオタイプ血清抗体に匹敵する活性を持つモノクローナル抗体は分離できていない。免疫療法やワクチンとして動物レベルでの有用性を調べるためには有効性の高い抗イディオタイプ単クローン抗体がぜひ必要であり今後とも努力を続けるつもりである。
DNAの曲がりとタンパク質による認識の構造的基盤

◎曲ったDNAと特異的に結合するタンパク質である大腸菌の転写制御因子であるOmpRについて次の事を行った。(1)OmpRタンパク質は2つのドメイン構造から成り、そのN末ドメインは浸透圧のセンサ-タンパク質である。EnvZによりリン酸化され、C末ドメインはDNA結合ドメインである事が判った。(2)OmpRのDNA結合ドメインの大腸菌大量発現条を作成し、大量精製する事に成功した。またそのドメインのNMRの測定により、いくつかのアミノ酸の帰属を行った。(3)OmpRのNMRの測定によりいくつかのメチオニン残基のシグナルの帰属を化学修飾の実験と平行することにより行った。(4)現在OmpRのDNA結合ドメインのみを、大腸菌大量発現条で^<15>Nラベルを行ない、その三次元構造を二次元NMR、三次元NMRで解析するための準備を行っている。◎OmpR以外のDNA結合タンパク質として他2次の2種類を取り上げた。(1)大腸菌のリン酸レギュロンの転写調節タンパク質であるPhoBのDNA結合ドメインの大量精製を行なった。(2)プロトオンコジ-ンであるMybタンパク質のDNA結合ドメインを大量精製し、ケイ光スペクトル、ラマンスペクトルよりMybタンパク質中のトリプトファンの環境を調べた。◎曲ったDNAの高次構造を計算機シミュレ-ションで求めた。(1)ニワトリの性染色体の一つであるW染色体のくり返し単位は、約0.7kbで11/3回転している事が判った。(2)ヒト遺伝子のいくつかについてその超高次構造を計算機により求め染色体のバンド構造と相関について調べた。1.DNAオリゴマー(CCTTAAGG)を合成し,そのラマンスペクトル,NMRスペクトル(DQF・COSY・NOESY)の測定を行い,骨格構造およびプロトン間の距離を求め,それらのデータをもとに,制限付き分子動力学計算を行った。その結果,このDNA二重らせんは,TAのステップで主溝側に曲っている事が判った。2.DNAの曲りとゲル電気泳動の相関の理論的考察から,任意の配列の易動度を計算できる一般的方法を開発した。3.曲ったDNAに結合するタンパク質であるOmpRを大量精製し,そのNMRスペクトルを測定した。OmpRのフラグメント,ミュータントのNMRスペクトルと比較する事および光CIDNP法により,一部His,Tyrの帰属を行った。化学修飾により一部Met,Tyrの帰属を行った。4.OmpRのDNA結合ドメインを同定し大量発現系を作成した。更に,フットプリンティング等から結合機能は保持されている事を確認した。このDNA結合ドメインの二次元NMRスペクトルの測定を行ない,少なくともこのドメインに関する構造決定が可能な一連の実験を現在進行中である。
微小技術を用いた人工染色体の細胞内移送,発現,分配の解析と操作

遺伝子導入は、細胞と生体分子の機能を解析、制御する上で必須の基盤技術である。エプスタイン・バール・ウイルスのEBNA1遺伝子とoriP配列を用いると、人工染色体様の性質が発揮され、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率と発現を著明に向上することが可能である。本研究では、マルチスケール操作によりEBNA1/oriPシステムの細胞内での局在、相互作用、複製維持等を解析するとともに、遺伝子発現制御と再生医療等への応用を行った。本研究課題では、EBV人工染色体の細胞内での移送,保持,分配のメカニズムを微小レベルで解明するとともに,細胞内での遺伝情報の送達,発現,維持の効率がさらに飛躍的に向上した次世代の遺伝子送達技術を開発し、システム細胞工学に資することを目的とする。平成17年度は、EBV人工染色体の各エレメントを別個に有する種々のベクターを構築し、それらを様々な細胞に共導入することにより、種々のエレメントの機能を計測するとともに、遺伝子導入における制約条件を見出す研究を行った。導入には電気穿孔法、カチオニックポリマー等を用い、解析はフローサイトメトリー等にて行なった。その結果、EBV人工染色体の非常な高効率導入・高発現は、EBNA1がtransに、DSとFRがcisに働ける条件でのみ得られること、DSとFRはその両者が必要であることが示され、さらにDSとFRの間にも未知の機能領域が存在する可能性が示唆された。高効率導入・高発現には人工染色体の核内への移行と転写亢進活性が寄与するが、DNA複製は関与しないことが分かった。さらに、細胞と導入法、アッセイ法の組み合わせによっては、ほぼ100%の細胞が導入遺伝子をきわめて強力に発現した。この実験事実は、非ウイルス的遺伝子導入が、実際には条件さえ整えば細胞外から細胞内へのDNA移送を非常に効率よく達成しており、それが遺伝子発現に結びつかないのは核内移送が制約条件になっていることを意味しているが、これは既存の遺伝子導入技術の常識を超える新しい事実である。したがって、遺伝子導入の効率を決定する最大の要因は、細胞内微小画分におけるDNAの挙動と安定性であるという、研究代表者らの仮説を強く支持する結果であるとともに、従来の遺伝子導入ベクター開発の方法論と計測手法にも一石を投じる知見が得られた。平成18年度は、EBV人工染色体導入細胞内におけるEBNA1たんぱくとoriPの素機能、とくにDNAの核内移動、核内保持、複製の、導入発現効率に対する貢献度を検証するともに、細胞外から細胞内へのDNA輸送効率を検定した。その結果、遺伝子導入・発現における、EBNA1/oriP依存性の核内輸送、核内保持の重要性が示された。その一方で細胞外から細胞内へのDNA輸送効率については、EBVエレメントの有無にかかわらず、電気穿孔法やカチオニックリピッドによる方法において、非常に高い効率が達成されており、細胞内のDNAの挙動が遺伝子発現に主要な影響を与える事実が裏付けられた(Kishida eta1.,J. Biotechnol.投稿中)。一方で、蛍光色素でラベルした人工染色体とカチオニックリビッドを細胞に培養後、細胞内局在を解析する研究を行った。EBNA1は通常、核内に存在するが、実際にはその多くはクロマチンに結合しており、一部は核マトリックスにアソシエートしていることが分かった。ところがすくなくとも一部のEBNA1は、核膜、そして細胞質にも分布していること、実際カチオニックリピッドにて導入した直後のoriP-DNAは、主として細胞質でEBNA1とインタラクト後、核内に輸送されることが示唆された(Asada eta1.,J.Biotechno1.投稿中)。このEBNA1の特異な動態が、EBV人工染色体のさまざまな機能の発現を発揮する鍵を握るものと考え、現在EBNA1と結合するホスト因子の同定によりその分子的基盤の解明を試みている。EBV人工染色体の細胞内移送と安定化の解析については,京大・吉村博士との共同研究で,on substrate cell lysis法と共焦点レーザー顕微鏡を組み合わせた解析を行なった。その結果,EBV人工染色体をHeLaS3細胞に導入した際,oriPとEBNA1が,核内のへテロクロマチン領域に共局在すること,また染色体に対するEBNA1の結合親和力は,oriPの共存によって高まることなどが認められた。この結果は,EBV人工染色体が娘細胞へ確実に分配され,宿主細胞内で安定的に維持される為の重要な機構であると考えられる。また,EBV人工染色体の細胞内移行の効率に,DNAの高次構造が与える影響を検証する目的で,京大・吉川教授との共同研究で,EBV人工染色体の高次構造変換を行い,電気穿孔法による細胞内導入を行った。

その結果,DNAのコンパクションにより,細胞内への移送と遺伝子発現は明らかに増加した。この知見は,さらなる高効率遺伝子送達技術の開発に繋がるものと思われる。一方で,遺伝子の機能解析とその応用に関しては,EBV人工染色体による生体内導入発現技術により,IL-27,IL-28,IL-33等の機能解析を行なった。その結果,たとえばIL-27がNK細胞を活性化する等,新たな作用が多数見出され,これらは,新しい癌の免疫療法の開発に繋がる可能性がある。さらに,A03班・東京農工大・森島教授との共同研究で,骨格筋における遺伝子発現制御を生体組織アクチュエーターに応用する研究を,A01班・東京医科歯科大・秋吉教授との共同研究で,ナノDDSに人工染色体を封入する研究を行なった。これらの結果は,EBV人工染色体のシステム細胞工学への新たな応用の可能性を開くと考えられる。本研究課題では、昨年度にひきつづいて、EBV人工染色体の細胞内移送と安定化の機構をマルチスケール操作を用いて解析するとともに、EBV人工染色体の特性を生かした応用研究として、従来より進めている種々遺伝子の生体内機能解析を継続し、さらにEBV人工染色体を用いた、免疫療法を目的とした生体内遺伝子機能解析と再生医療を目的としたプライマリー細胞の遺伝的改変技術の樹立を試みた。EBV人工染色体の細胞内移送と安定化機構の解明では、on substrate cell lysis法と共焦点レーザー顕微鏡を組み合わせた解析を昨年度までに一過性発現に関して行ったが、(AO1班吉村博士との共同研究)、これを導入後長期間維持、発現に応用して解析する研究を行った。このとき、EBNA1のプロモーターを種々改変を加えることにより、長期間維持、発現においてEBNA1の発現量は極めて微量でも十分に機能しうることを見出したので、このことは、EBV人工染色体の再生医療や遺伝子治療への応用の際にも利点となると考えられる。一方で、EBV人工染色体の種々細胞への導入を、AO3班・東京大学・鷲津教授らとの共同研究でマイクロオリフィスを用いた技術で、またMEMSを応用した手法で行い、とくにヒト正常二倍体線維芽細胞、ケラチノサイト、間葉系幹細胞等のプライマリー細胞への導入について、細胞への毒性が低い遺伝的改変技術の確立につながる結果を得つつある。他方、遺伝子発現制御技術に関しては、生体内siRNA導入をさらに発展させ、とくにある種のサイトカインのin vivo抑制による病態制御を、骨格筋、関節滑膜等を対象臓器として行う研究を行った(AO3班・森島教授との共同研究)。これらの結果は、生体機能の構築・模写、細胞、臓器の自在な遺伝改変技術の確立、生体分子素機能の解析につながり、システム細胞工学に大きく貢献するものと考えられる。本年度は、マルチスケール操作によるEBV人工染色体の複製、維持、細胞内移送との機構をさらに解析を進めるとともに、EBV人工染色体を用いた、免疫療法を目的とした生体内遺伝子機能解析の一環として、IL-27やIL-28の生体内直接遺伝子導入を行った。その結果、これまで見出されていなかったIL-27の新規機能の解明や、IL-28の免疫応答誘導能の解明等の結果を得た。
植物病原性及び過敏感反応の両方を司る遺伝子領域(hrp)の発現機構

1.既に得ていたTn5トランスポゾンタッギングによるカンキツかいよう病菌の病原性欠損変異株の解析ならびに、コスミドクローンの解析から、本病原細菌は二つの異なるhrp領域を持つことが明らかになった。即ち、比較的小さな領域(hrp1)と、25kbにも及ぶ複数のhrp遺伝子がクラスターを形成している領域(hrp2)である。2.hrp1は大腸菌のグルコスルトランスフェラーゼと相同性を示し、グルカン合成に関与していると考えられた。興味あることに、カンキツかいよう病菌のグルカンは根頭がんしゅ病菌や根瘤細菌のそれと同様環状グルカンであった。このことは、カンキツかいよう病菌においても、病原性発揮或いは過敏感反応誘導のためにはグルカンによって病原菌が植物細胞に吸着する必要があることを示唆している。3.hrp2はナス科植物青枯病菌のhrpクラスターと相同性を示す領域であった。この領域のサブクローンとして、病原性欠損変異株F8に病原性を回復させるものを得た。4.本領域のコスミドクローンに遺伝子融合用トランスポゾンを用いて挿入を行い、転写誘導条件を調べた結果、通常の培養条件下では誘導が見られず、植物体に侵入後誘導されると考えられた。5.こうした遺伝学的研究から病原菌と植物との極初期の相互反応が重要な意味を持つことが示唆されたので、この際生成されるフリーラジカルを化学発光としてとらえ、物質レベルの研究も行った。その結果、カンキツかいよう病菌が高分子、耐熱性ペプチドであるエリシターを生産すること、さらにこの作用を抑える低分子のサプレッサーを生産することを発見した。カンキツかいよう病菌のコスミドベクターpLAFR5を用いたゲノミックライブラリーを構築し、これより本菌のクラスターを形成するhrp領域とPseudomonas syringaepv.syringaeのhrpM領域と相同性を示すクローンを各々得ることが出来た。これらは、前にトランスポゾンタッギングによて分離した病原性欠損変異株の10株の内F8及びF4とF9が上記の各hrp領域に変異を起こしていることをサザンブロットハイブリダイゼーションによって明らかにした。これらの変異株とタバコ培養細胞との共存培養した際、活性酸素の生産による化学発光の上昇がみられなくなった。このことからも、これらの病原性欠損変異株が過敏感反応誘導能力も欠損していることを確認した。次に、それぞれのクローンの制限酵素切断断片地図を作成した後に、これらのクローンの挿入部にTnphoAを用いてアルカリフォースファターゼ遺伝子との融合体を15株得、これらの挿入位置と方向を決定した。これらの融合体の大腸菌内における誘導条件を検討したが、他のhrp遺伝子群で誘導された条件でも誘導は見られなかった。従って、カンキツかいよう病菌のhrp領域は、本菌が植物体内に侵入した時にのみ誘導されるものと考えられた。hrpMと相同性を示したクローンは、グルカン合成に異常をきたし、植物細胞に吸着能力を失っていることが判明した。これにより、かいよう病菌が宿主植物には病原性、非宿主植物には過敏感反応を誘導するためには、グルカンを介して植物細胞に吸着することが不可欠であることを示すことが出来た。また、上記病原性欠損変異株の内、F5とF7株がグラム陰性細菌の主要外膜タンパク質であるポーリン合成に異常をきたしていることを発見した。この結果は研究計画にはなかったものであるが、植物病原性細菌の病原性解明に重要な示唆を与えるものである。

2.hrp1は大腸菌のグルコスルトランスフェラーゼと相同性を示し、グルカン合成に関与していると考えられた。興味あることに、カンキツかいよう病菌のグルカンは根頭がんしゅ病菌や根瘤細菌のそれと同様環状グルカンであった。このことは、カンキツかいよう病菌においても、病原性発揮或いは過敏感反応誘導のためにはグルカンによって病原菌が植物細胞に吸着する必要があることを示唆している。3.hrp2はナス科植物青枯病菌のhrpクラスターと相同性を示す領域であった。この領域のサブクローンとして、病原性欠損変異株F8に病原性を回復させるものを得た。4.本領域のコスミドクローンに遺伝子融合用トランスポゾンを用いて挿入を行い、転写誘導条件を調べた結果、通常の培養条件下では誘導が見られず、植物体に侵入後誘導されると考えられた。5.こうした遺伝学的研究から病原菌と植物との極初期の相互反応が重要な意味を持つことが示唆されたので、この際生成されるフリーラジカルを化学発光としてとらえ、物質レベルの研究も行った。その結果、カンキツかいよう病菌が高分子、耐熱性ペプチドであるエリシターを生産すること、さらにこの作用を抑える低分子のサプレッサーを生産することを発見した。
汎用溶媒抽出分離条件選択システムの開発と実用化

溶媒抽出に関するファクトデータの収録ならびにこれを検索するためのソフトウエアの制作を行い、これらを一体としてデータベースとしたシステム化の構築を進めた。本データベースには、キレート抽出系やイオン会合系などさまざまな抽出系での抽出データが収録されており、これには分配定数、抽出定数、付加錯体生成定数などの定数、表の形式で数値として報告されている抽出結果、曲線などの図式化して表現されている抽出結果が含まれる。所定の手続きによって検索条件を指定することにより、以下に示すように利用できる。1)指定した元素について、指定の試薬、溶媒条件下での抽出率および分配比などの値を示す。2)指定した、元素、試薬、溶媒の組み合われにおいて、抽出率や分配比が水相の酸濃度(またはpH)あるいは試薬濃度にどのように依存するかを、指定した濃度範囲について、図(曲線)式化して示す。3)上記2)において、元素、試薬、溶媒の条件が異なる場合の結果を比較しやすいように図の中に重ねて示す。4)ある元素について、抽出定数や分配定数が指定の値、あるいは指定の範囲に収まるような試薬と溶媒の組み合わせを知る。5)ある試薬と溶媒の組み合わせで、抽出定数や分配定数、あるいは付加錯体生成定数が抽出定数や分配定数が指定の値、あるいは指定の範囲に収まるような元素を知る。6)今後の期待として、収録されている抽出データの検索と連動したプログラムにより、抽出データがまだ報告されていない条件での結果の予想と、最も適当な抽出条件の推測への発展が考えられる。溶媒抽出についての研究は数多く行われているが、それらの研究成果の多くは同一条件で得られたものではなく、またみかけの抽出挙動で表現されているため、これまでの膨大な研究成果が相互に比較・利用しがたく、まして抽出分離の最適条件の選択の目的に利用するのは困難であった。しかし、既知のデ-タを得られた条件に従って整理し直し、数値デ-タ化して収録することにより、これをコンピュ-タで検索することが可能になり、これまでの研究成果が相互に活用し得るようになるはずである。本研究は、これを実現することを目的として、2年間の予定で研究を進めている。初年度に当たる当該年度においては、以下のように進展がみられた。1.標記システムの中心となるデ-タベ-スの基本的構想について、システムの目指すもの、利用するデ-タの範囲と種類、収録するデ-タの範囲と種類、検索の方法と情報の出力方法等について、研究代表者及び分担者による打ち合わせを行い、基本構想を取りまとめた。2.研究代表者及び分担者は、それぞれに、文献より抽出デ-タの収録を試行し、これらを比較することにより、収録すべきデ-タの種類と形式について検討を行い、当該年度において最重要な課題であった収録デ-タの種類と型式の確定を行うことができた。3.デ-タベ-スからのデ-タの検索と利用に関するソフトウエアの作成については、上記1、2と関連させて、新規作成及び改良を続けており、溶媒抽出の高度な専門家でない者にも利用し易いソフトウエアが作成できる見通しを得た。4.抽出デ-タの収録と、利用ソフトウエアの作成の両画にわたる研究の進展は、大きな障害なく次年度に継続される見込である。
アレルギー性鼻炎の病変局所における特異抗体産生細胞の可視化：「酵素抗原法」の応用

酵素抗原法は、組織切片上の特異抗体産生細胞を可視化する組織化学的手法である。コナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ、スギ花粉免疫ラットのリンパ節を対象とした酵素抗原法を行った。抗コナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ抗体産生細胞を可視化できた。しかし、抗スギ花粉抗体産生細胞を可視化できなかった。また、アレルギー性鼻炎の病変組織(鼻腔ポリープ)を対象とした酵素抗原法を行ったが、抗コナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ、スギ花粉抗体産生細胞を可視化できなかった。アレルギー性鼻炎の病変局所に浸潤する形質細胞が産生する抗体の対応抗原やその浸潤意義は明らかでない。本研究は、ビオチン標識した抗原を凍結組織切片に反応させて、組織内に分布する特異抗体産生細胞を可視化する酵素抗原法を用いて、アレルギー性鼻炎の病変局所に浸潤する特異抗体産生細胞の可視化と浸潤意義の解明を目的として実施している。平成25年度は、初めにコナヒョウヒダニ抗原(Der f1, Der f2)、ヤケヒョウヒダニ抗原(Der p1, Der p2)、スギ花粉抗原(Cry j1, Cry j2)のビオチン標識抗原の作製および、コナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ、スギ花粉粗抽出液免疫ラットの作製を行った。その後、酵素抗原法がコナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ、スギ花粉特異抗体産生細胞を可視化できることを確認するため、粗抽出液免疫ラットリンパ節を対象とした酵素抗原法を行った。その結果、酵素抗原法で、コナヒョウヒダニ抗体(Der f1, Der f2)、ヤケヒョウヒダニ抗体(Der p1, Der p2)産生細胞を可視化することができたが、スギ花粉抗体(Cry j1, Cry j2)産生細胞を可視化することはできなかった。酵素抗原法でスギ花粉抗体産生細胞を可視化できなかった原因として、スギ花粉粗抽出液免疫ラットのスギ花粉抗体価が上がっていなかったことが考えられた。抗原抗体反応を簡便かつ高感度に検出するAlphaScreen法を用いて、スギ花粉粗抽出液免疫ラットのリンパ節組織抽出液中のスギ花粉抗体価を測定してみたところ、スギ花粉抗体価は上がっていなかった。このことより、スギ花粉の免疫方法に問題があったことが明らかとなった。また、アレルギー性鼻炎の病変局所を対象とした解析に用いるアレルギー性鼻炎の病変組織と血清を20症例集めた。アレルギー性鼻炎の病変局所に浸潤する形質細胞が産生する抗体の対応抗原やその浸潤意義は、明らかにされていない。本研究は、ビオチン標識した抗原を組織切片に反応させて、組織内に分布する特異抗体産生細胞を可視化する酵素抗原法により、アレルギー性鼻炎の病変局所に浸潤する特異抗体産生細胞の可視化と浸潤意義の解明を目的として実施した。平成25年度は、コナヒョウヒダニ抗原(Der f1, Der f2)、ヤケヒョウヒダニ抗原(Der p1, Der p2)、スギ花粉抗原(Cry j1, Cry j2)のビオチン標識抗原の作製を行った。コナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ、スギ花粉粗抽出液免疫ラットを作製した。そして、免疫ラットのリンパ節組織を対象に酵素抗原法を行い、酵素抗原法で抗コナヒョウヒダニ抗体、抗ヤケヒョウヒダニ抗体、抗スギ花粉抗体産生細胞を可視化できるかどうかを確認した。酵素抗原法により抗コナヒョウヒダニ抗体、抗ヤケヒョウヒダニ抗体産生細胞を可視化できたが、抗スギ花粉抗体産生細胞を可視化することはできなかった。平成26年度は、アレルギー性鼻炎患者の病変組織と血清と収集した。そして、患者血清における抗コナヒョウヒダニ抗体、抗ヤケヒョウヒダニ抗体、抗スギ花粉抗体価を測定した。アレルギー性鼻炎患者の多くは抗コナヒョウヒダニ抗体、抗ヤケヒョウヒダニ抗体、抗スギ花粉抗体価が高値であった。アレルギー性鼻炎患者の病変組織を対象とした酵素抗原法を行ったが、抗コナヒョウヒダニ抗体、抗ヤケヒョウヒダニ抗体、抗スギ花粉抗体産生細胞を可視化することはできなかった。精製スギ花粉抗原またはスギ花粉そのものを免疫投与したスギ花粉免疫ラットを作製して、酵素抗原法で抗スギ花粉抗体産生細胞を可視化できるかどうかの検討を再度試みた。現在、スギ花粉免疫ラットのリンパ節組織を対象とした酵素抗原法を行い評価中である。医歯薬学平成25年度までに、酵素抗原法でコナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ、スギ花粉抗体産生細胞を可視化できることを確認するための動物実験を全て終了する予定であった。

しかし、スギ花粉免疫方法に問題があり、スギ花粉免疫ラットのスギ花粉抗体価を上げることができず、酵素抗原法でスギ花粉抗体産生細胞を可視化できることを確認できなかった。そのため、免疫するスギ花粉抗原の状態(花粉そのもの、粗抽出液、精製抗原液)や、免疫アジュバントを変更するなどして、再度、スギ花粉免疫ラットを作製する必要がある。それゆえ、当初の計画より進展がやや遅れていると考えている。本研究計画の目的は、アレルギー性鼻炎の病変局所に浸潤する特異抗体産生細胞の可視化と浸潤意義の解明である。平成26年度は、平成25年度までに終了できなかった動物実験と、アレルギー性鼻炎の病変組織と血清を用いた解析を行う。抗原抗体反応を簡便かつ高感度に検出するAlphaScreen法を用いて、アレルギー性鼻炎の病変組織抽出液と血清中のコナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ、スギ花粉抗体の存在を調べる。そして、AlphaScreen法でコナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ、スギ花粉抗体の存在を確認した症例の病変組織を対象とした酵素抗原法を行う。さらに、ビオチン標識コナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ、スギ花粉抗原と抗ヒト免疫グロブリン抗体による免疫蛍光二重染色法を行い、抗アレルゲン抗体の免疫グロブリンクラスを同定する。得られたデータを臨床的な特徴(症状、発症季節、罹病期間)と照らし合わせて、臨床病態との関連性を探る。当初の研究計画では、動物実験は平成25年度で全て終了する予定であった。コナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ免疫ラットはうまく作製され、目的とする研究データを得ることができた。しかし、スギ花粉免疫ラットはスギ花粉の免疫方法に問題があり、スギ花粉免疫ラットをうまく作製することができず、目的とする研究データを得ることができなかった。そのため、コナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ、スギ花粉免疫ラットの実験データをまとめた学会発表、論文発表をすることができなかった。また、動物実験が当初の研究計画より長引き、予定通りに終了することができず、次の研究段階であるアレルギー性鼻炎の病変組織の解析に移ることができなかった。平成26年度は、平成25年度にやり終えることができなかったスギ花粉免疫ラットの解析を終えて、コナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ、スギ花粉免疫ラットの研究結果をまとめた学会発表や論文発表を行い、平成25年度に使用しなかった分の助成金を使用する。その後、アレルギー性鼻炎の病変組織を対象として、研究計画書に従った解析(AlphaScreen法、酵素抗原法、免疫蛍光二重染色法など)を行い、平成26年度に計上した助成金を予定通りに使用する。
グルコースとホルモン情報を統合する膵β細胞Kv・TRPチャネルのセンサー機構

本研究では、膵β細胞におけるグルコース代謝情報およびホルモン情報変換装置としてのKvチャネルとTRPチャネルを介した新たなインスリン分泌制御機構を解明し、そのセンサー情報統合メカニズムを明らかにすることを目的とする。ラット膵島におけるKvチャネルの発現を検討した結果、Kv2.1チャネルのmRNA発現を検出し、二重免疫染色の結果、Kv2.1チャネルは膵β細胞に局在していた。Kvチャネル電流はグルコース濃度依存性を示し、Kv2.1チャネルブロッカーはラット分離膵島からのグルコース誘発インスリン分泌を促進し、β細胞のKv電流を抑制しグルコース刺激による[Ca^<2+>]_i上昇を増加させた。自然発症2型糖尿病GKラットは正常Wistarラットと比較して、β細胞Kv2.1の発現が増大していた。K_<ATP>チャネルサブユニットKir6.2および2型糖尿病との相関が報告されている電位依存性K^+チャネルKCNQ1の膵島発現レベルは、GKラットとWistarラットで同程度であった。単離膵β細胞のKvチャネル活性を電気生理学的に比較すると、GKラットではβ細胞Kvチャネル電流が増強していた。Kv2.1チャネルブロッカー存在下ではGKラットβ細胞におけるKvチャネル電流の増強が観察されなかった。TRPM2ノックアウトマウスは、グルコースやGLP-1刺激によるβ細胞[Ca^<2+>]_i上昇とインスリン分泌が低下していた。以上より、膵β細胞ではKv2.1チャネルやTRPM2チャネルがβ細胞インスリン分泌およびそのホルモン制御機構のセンサー分子として機能していると考えられる。また、2型糖尿病ラットβ細胞では、Kv2.1分子の発現増大によりKvチャネル電流が亢進しており、Kv2.1の発現機能亢進が糖尿病態におけるβ細胞インスリン分泌不全に関与することが示唆される。膵β細胞は血中グルコース濃度に応じてインスリンを分泌していることから、グルコースセンサーのモデル細胞と位置付けられる。近年、β細胞における電位依存性K^+チャネル(Kvチャネル)や新規Ca^<2+>透過性チャネル(TRPチャネル)が、インスリン分泌に関与する可能性が報告されているが未解明な部分が多い。本研究では、膵β細胞におけるグルコース代謝情報およびホルモン情報変換装置としてのKvチャネルとTRPチャネルを介した新たなインスリン分泌制御機構を解明し、そのセンサー情報統合メカニズムおよび成長過程における環境適応変化を明らかにすることを目的とする。1.ラット膵島におけるKv2.1チャネルのmRNA発現を確認し、二重免疫染色の結果、Kv2.1チャネルがインスリン産生β細胞に局在していることが明らかになった。2.Kv2.1チャネルブロッカーのStromatoxin(ScTx)やGuangxitoxin-1E(GxTx)は、ラット分離膵島からのグルコース誘発インスリン分泌を促進した。3.ScTxやGxTxは、β細胞のKv電流を抑制しグルコース刺激による[Ca^<2+>]_i上昇を増加させた。4.グレリン(10nM)は、グルコース誘発インスリン分泌を抑制し、β細胞のKv電流を促進しグルコース刺激による[Ca^<2+>]_i上昇を抑制した。Kv2.1チャネルブロッカー存在下では、グレリンによるインスリン分泌抑制作用ならびにKv電流活性化作用、[Ca^<2+>]_i抑制作用が消失した。以上より、膵β細胞ではKv2.1チャネルが活動電位を抑制制御しており、グレリンによるグルコース誘発インスリン分泌抑制機構には、Kv2.1チャネルの活性化が関与すると考えられる。
一細胞遺伝子発現解析のためのチッププラットフォームの構築

単一の細胞やその遺伝子情報の解析・評価を行うため、微細加工技術を用いて微小反応場(33. 750 nL)を有するマイクロチャンバーアレイチップを作製した。熱伝導性に適したシリコン製マイクロチャンバーや細胞観察に適した透明なポリスチレン製マイクロチャンバーアレイを作製した。オンチップPCR諸条件の検討を行い、遺伝子検出が行えることを確認した後、単一細胞を分離・配置し、PCRおよびRT-PCRを試みたところ、DNA増幅による遺伝子検出が行えることを確かめた。単一の細胞や遺伝子情報の解析・評価を可能にするため、微細加工技術を用いて微小反応場を作製し、これに単一細胞を分離・配置し、PCR法などを組み込んだ一細胞・一分子DNAレベルの解析手法を開発・確立させ、単一細胞評価・診断への基盤技術へと発展させることを目的とする。本年度は、微細加工技術に基づいて2種のマイクロチャンバーアレイを作製した。1チャンバーのサイズは、650×650×250μmで、容量は50nLである。PCR酵素量、プライマー濃度、反応時間、温度などオンチップPCR諸条件の検討を行ったところ、従来の酵素量の10倍を添加することで効率よくDNA増幅が行えることがわかった。また、マイクロチャンバーへの一細胞配置を、ナノピンセットを用いたマニピュレーションにより行うことで可能であった。マイクロチャンバーへのPCR溶液の導入は、ナノリッターディスペンサーを用いることで迅速、正確、均一に導入できた。チャンバーチップ上にあらかじめミネラルオイルを積層しておくことで、ディスペンサーから吐出されたPCR溶液が、オイル層を貫通してチャンバー内に導入され、蒸発を防ぐこともできる。胎児由来有核赤血球をマイクロチャンバーに配置し、血液型判定に用いられる遺伝子マーカーのRhD DNAの増幅も可能であった。オンチップRT-PCRへの適用も想定し、条件検討を行った。その結果、逆転写酵素量1倍に対してPCR酵素量を10倍にすることで、RNAからのDNA増幅の計測が行えることがわかった。また、1ステップRT-PCRだけでなく、汎用的な2ステップRT-PCRを行えるよう、2段構造のマイクロチャンバーアレイも設計作製した。網膜色素変性症など視力の回復において、網膜細胞の再生や移植が有効であるが、このとき網膜細胞の分化状態を遺伝子レベルで評価を行うことが望まれる。網膜細胞の色素沈着に伴う成熟度を一細胞ごとに遺伝子発現評価するため、透明なポリスチレン製マイクロチャンバーアレイを作製した。各チャンバーサイズは540×540×210μm(容量33.7nL)で、これを1枚のチップ上に1248(24×52)個配列させている。PCR酵素量、プライマー濃度、反応時間、温度、内在性コントロール遺伝子などオンチップRT-PCR諸条件の検討を行い、遺伝子検出が行えることを確かめた。ガラスニードルを用いて、網膜細胞一細胞をマイクロチャンバー内に配置可能であった。さらに光学顕微鏡観察下において、色素沈着前と沈着後の網膜細胞を判定することも可能であった。色素関連遺伝子であるRPE65領域のプライマーを用いてオンチップRT-PCRを行ったところ、色素沈着後細胞よりも前細胞のほうが遺伝子発現量の多い結果となった。一方、上述に用いた1ステップRT-PCRだけでなく、より汎用的な2ステップRT-PCRを行えるよう、2段構造のマイクロチャンバーアレイも設計作製した。600x600x100μmサイズのチャンバー(1段目)の上に、1200xl200x200μmサイズのチャンバー(2段目)を有する構造となっている。β2イムノグロブリン遺伝子を指標に、1段目チャンバーにB2Mプライマー、total RNAおよび逆転写酵素を導入し、逆転写反応を行った後、続けて2段目チャンバーにPCR溶液を導入し、PCR反応を行った。その結果、オンチップ2ステップRT-PCRが可能であることが確かめられた。
大脳基底核-脳幹-脊髄投射系による姿勢制御メカニズムの解明

本研究では,動物実験(ネコ)を用いて「大脳基底核の異常な出力が脳幹-脊髄下行路に作用するため基底核疾患における姿勢と運動の異常を誘発する」という作業仮説の検証を試みた.その結果,大脳基底核の出力核である黒質網様部から脚橋被蓋核へのGABA作動性投射系が姿勢制御と歩行運動の制御に関与すること,また,その制御は網様体脊髄路系・前庭脊髄路系・モノアミン作動性下行路に作用することによって誘発される可能性を示した.これらの成績は,大脳基底核は黒質網様部-脚橋被蓋核投射系を介して姿勢と歩行を制御すること,そしてこのシステムの異常が基底核疾患における姿勢と歩行の障害を誘発する可能性があることを示唆する.姿勢制御の基本的神経機構は脳幹-脊髄に存在し,網様体脊髄路,前庭脊髄路,視蓋脊髄路などの下行性経路が重要な役割を担う.中でも網様体脊髄路は両側の頭頸部体幹上・下肢筋の活動を制御し,姿勢筋緊張の調節や反射姿勢の形成に関与する.筋緊張の調節には抑制性網様体脊髄路と促通性網様体脊髄路が関与する.そこで今年度は,大脳基底核の出力核である黒質網様部(SNr)から脚橋被蓋核(PPN)へのGABA作動性投射が,これらの網様体脊髄路系に及ぼす作用を解析した.実験には除脳ネコ標本を用いた.橋および延髄網様体には,連続微小電気刺激(50Hz,30-40μA)を加えることにより,姿勢筋緊張を増加,あるいは,消失させる領域が存在する.また,各領域に加えた短パルス刺激は,脊髄のα運動細胞に,其々,興奮性シナプス電位(EPSP)と抑制性シナプス電位(IPSP)を誘発したことからEPSPは促通性網様体脊髄路の活動を,IPSPは抑制性網様体脊髄路の活動を反映すると考えられる.そして,SNrへの条件刺激(100Hz, 40-60μA)により,IPSPの振幅は減少し,EPSPの振幅は増加した.この変化は伸筋・屈筋運動細胞に共通していた.次いで,GABAA受容体作動薬であるMuscimolをPPNに微量注入すると,SNr刺激と同様の作用が誘発された.一方,GABAAの拮抗薬であるBicucullineやPicrotoxinをPPNに注入すると,SNr刺激の作用はブロックされた.これらの成績は,SNrからPPNへのGABA作動性投射が促通性網様体脊髄路と抑制性網様体脊髄路の興奮性を相反的に制御して筋緊張レベルを調節していることを示唆する.即ち,基底核からのGABA作動性出力が亢進すると,促通系の活動が優位となり筋緊張は亢進する.一方,基底核出力が低下すると,抑制系の活動が優位となり筋緊張は減少する.25年度は大脳基底核から脚橋被蓋核領域への投射系が網様体脊髄路を介して姿勢筋緊張レベルの調節に関与することをBehaviorレベルで証明した.本年度(26年度)は27年度に実施予定である研究項目を繰り上げ,脳幹網様体に投射する脚橋被蓋核(PPN)ニューロンが大脳基底核の出力核である黒質網様部(SNr)からのGABA作動性(抑制性)投射を受けるか否かを検討した.実験には除脳ネコ標本を用いた.両側の橋網様体(PRF)に刺激電極を刺入し,各領域に加えた微小電気刺激によって姿勢筋緊張が減少・消失する部位を特定した.次いで,各領域への電気刺激によって逆行性応答する神経細胞をPPNを含む中脳-橋被蓋外側部より導出・記録した.記録したPPNニューロン(n=80)の45%(n=36)がPRFに軸索を投射し,75%(n=60)はPRFからの興奮性入力を受けていた.そして,60%のニューロン(n=48)がSNrからの抑制を受けていた.PPNニューロンの80%以上(n=65)が自発発射を有しており,約1/4(n=21)は定常的な発射活動を示すアセチルコリンニューロンであると考えられた.さらに,SNへのMuscimol(GABA-A作動薬)の微量注入ならびにPRFへのCarbachol(長時間作動性コリン作動薬)の微量注入を試み,筋緊張の変化に対応するPPNニューロン活動を解析した.各々の薬物注入によって,SNrから抑制入力を受け,かつ,PRFに出力を送るPPNニューロンの発射頻度が増加し,これに伴い筋緊張レベルが減弱・消失することが明らかとなった.即ち,SNrの出力はPRFに投射するPPNコリンニューロンを介して姿勢筋緊張の調節に関与することを証明することができた.これらの成績は,SNrからPPNを経由してPRFに至る基底核ー脳幹投射系が,筋緊張の調節に関与する神経回路であることを示唆する.本研究では,大脳基底核(BG)から脚橋被蓋核(PPN)への投射系が脳幹から脊髄への下行系の活動をどの様に修飾して姿勢制御に関与するのか?を検討する.平成25-26年度は除脳ネコにおいて,BGの出力がPPNのコリン作動性ニューロンを介して,橋・延髄網様体から下行する筋緊張制御系の活動を修飾することによって姿勢筋緊張を調節することを証明した.