hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小胞体タンパク質センサーの機能的多様性と生体制御

申請者が同定に成功している細胞種特異的小胞体ストレスセンサーOASISおよびBBF2H7の機能をそれぞれのノックアウトマウスを用いて解析することで生体機能調節におけるタンパク質の品質管理の制御を明らかにするとともに、両ストレスセンサーが機能せず生じる小胞体タンパク質品質管理の破綻メカニズムの解明を目指した。その結果、以下の成果を得た。1.小胞体ストレスセンサー欠損マウスの解析:膜貫通型転写因子であり、小胞体ストレスセンサーでもあるOASISおよびBBF2H7の生体内機能を調べるためそれぞれの遺伝子欠損マウスを作成した。OASIS欠損マウスでは骨形成異常が、BBF2H7欠損マウスでは軟骨形成異常が認められた。それら病変形成の分子機構を明らかにするため、主要な転写ターゲットをスクリーニングした結果、OASISは骨組織の主成分である1型コラーゲンを、BBF2H7は小胞体-ゴルジ間輸送に必須のSec23aを転写誘導することが明らかになった。以上の成果は、骨軟骨組織では小胞体ストレス下でOASISあるいはBBF2H7が基質タンパク質の合成あるいは分泌を促進させることで分化成長に寄与していることを示唆している。2.小胞体ストレスセンサーOASISの脳内機能:OASISは脳損傷時にアストロサイトに発現する。アストロサイトにおけるOASISの機能を探るためにOASIS欠損マウスにカイニン酸を投与し神経細胞に損傷を起こさせた後の神経細胞やアストロサイトの反応について検討した。野生型マウスに比べOASIS欠損マウスでは海馬領域において反応性アストロサイトの増殖が悪く、海馬領域の神経細胞の脱落が顕著に認められた。このことは、OASISは神経細胞傷害時に活性化してアストロサイトを増殖させるとともに、神経細胞を傷害から保護する重要な因子などの放出に関わる可能性を示唆している。小胞体タンパク質品質管理機構に密接にかかわる小胞体ストレスセンサーの生体内における機能を明らかにし、新しいタンパク質社会学の概念構築を目指している。本年度得られた成果は以下のとおりである。1)小胞体ストレスセンサーのターゲット遺伝子同定; OASISおよびBBF2H7のターゲットをマイクロアレイ法で探索した結果、OASISの場合は1型コラーゲンを、BBF2H7の場合はSec23aを転写誘導することが明らかなった。またプロモーター解析、ゲルシフトアッセイ、ChIPアッセイなどにより、各遺伝子上流に存在するCRE-like配列に作用して小胞体ストレスセンサーが転写誘導することも明らかにした。2)小胞体ストレスセンサー欠損マウスの解析;各小胞体ストレスセンサーの遺伝子欠損マウスでは骨(OASIS)および軟骨(BBF2H7)形成異常が生じる。いずれのマウスとも障害される細胞では小胞体が異常に拡張し、内部に分泌物を大量に貯め込んでいた。BBF2H7欠損軟骨細胞の場合は、ターゲットであるSec23aを強制発現させることで小胞体の異常拡張は救済され、軟骨基質の分泌が改善した。従ってターゲット遺伝子の転写レベル低下がマウスの表現型形成に大きく寄与していることが明らかになった。3)OASIS類似小胞体ストレスセンサーの発現解析; AIbZIPおよびCREBHの組織分布を検討し、それらの発現が組織・細胞種特異性を有することを明らかにした。
心臓冠状動脈主幹部のステレオタイプなパターンを決定するメカニズムの解明

心臓に酸素や栄養を供給する冠状動脈は左冠状動脈と右冠状動脈から構成されます。成人では動脈硬化による冠状動脈の狭窄や閉塞によって心筋梗塞が起こります。一方、冠状動脈が正しく形成されないと小児期に心不全や突然死が起こります。胎生期に冠状動脈が形成されるメカニズムを明らかにすることは心筋や冠状血管の再生医療の開発に寄与することができます。また先天性異所性冠状動脈起始症等の原因を明らかにすることができます。申請者はこれまでに冠状血管の起源やその発生過程を明らかにしてきました。本研究では冠状動脈の主幹部(大動脈から起始する血管)が正しく形成されるメカニズムについて研究します。
F. メンデルスゾーンと近代的演奏会 : その成立と変遷の総合的実証研究

市民社会の台頭とともにあらわれた「近代的演奏会」の成立と変遷を検証することで、「創造的」と言われる作曲家の創作活動が音楽マーケットと不可分の関係にあることを実証することが本研究の目的であるが、個別の音楽作品に関しては、交響曲全盛期にあって、交響曲よりずっと規模の小さい「演奏会用序曲」をメンデルスゾーンが数多く作曲したことに注目し、それらの作品の内容・成立・受容をさぐること、また、その「演奏会用序曲」がオーケストラ作品としてだけではなく、家庭用ピアノ作品に編曲されて受容されたことから、当時のピアノ作品の出版状況を調査するにあたって、メンデルスゾーンの未出版ピアノ作品に注目することで当時のピアノ作品受容状況、また、メンデルスゾーンの作品構想をさぐることに注力した。その結果彼は、当時の中心的ジャンルである「ソナタ作品」ではなく、二部分によって構成される作品を多く手がけ、その作品形態を完成させようとしていたことを発見した。これは、7月に出版された「F.メンデルスゾーンの初期未出版ピアノ作品:182025年の習作群を考察する」(『阪大音楽学報』所収)をもとに研究を発展させた研究であり、日本音楽学会全国大会にて「F.メンデルスゾーンの二部分形式作品:初期ピアノ作品におけるスタイル習得の過程」と題して発表した(2011年11月5日)。「演奏会用序曲」に関しては、メンデルスゾーンの演奏会用序曲第二番「ヘブリディーズ諸島」Op.26の成立過程を調べる中で、各段階の稿に大きな相違点があることがわかり、イギリス・オックスフォード大学ボートリアン図書館、ロンドンの大英図書館等に残されている自筆譜や筆写譜を丹念に閲覧した。その結果、自筆譜に使われた紙質やインクの種類には検討すべき余地が多くあること、成立の空白期について調査する必要があることがわかり、次年度ひきつづいて解読・調査する。メンデルスゾーンの演奏活動を軸に近代的な演奏会の成立の過程と変遷を当時の社会状況を視野に入れて総合的に実証することを目的としている本研究において、本年度は8月に、ドイッ・ライプッィヒで開催された国際メンデルスゾーン会議にて、これまでの研究成果のうち、当時の聴衆の受容に合わせて作曲された演奏会用序曲について発表した。10月に開催された日本音楽学会全国大会では、「メンデルスゾーンとイタリア:ドイツ人音楽家のイタリア旅行体験を多角的に検証する」と題するシンポジウムを主宰し、国家内で語られることの多いこれまでの音楽学研究の枠組みを異文化間へと問題提起した。学術論文としては、19世紀初頭に大きく変容した音楽社会の動きの中で楽譜出版がもたらした意味を探るため、ライプッィヒで19世紀前半50年間にわたって刊行された総合音楽新聞AMZの書評欄を手がかりに、楽譜の価格、新刊の宣伝文句を調査・検討し、考察した研究を発表した。また本研究は演奏会という制度に注目することで、聴衆としての市民の存在をクローズアップし、公論の形成の萌芽を扱い、より大きな枠組みへと問題提起していくことをも目的としているが、19世紀初頭の公共演奏会の在り方を現代社会の視点で考察するものとして、滋賀県栗東市の栗東芸術文化会館の創造的育成事業に注目し、「まちづくり、ひとづくりへの挑戦:さきらジュニアオーケストラ・アカデミー(栗東芸術文化会館)」と題する論文を執筆した。市民社会の台頭とともにあらわれた「近代的演奏会(=入場料収入を前提とし演奏会専用ホールで開催)」の成立と変遷を検証することで、「創造的」と言われる作曲家の創作活動が音楽マーケットと不可分の関係にあることを実証することが研究の目的である。この研究は音楽社会史研究という歴史学的手法を用いつつ、作品研究(分析)も同時におこなう画期的な研究モデルであり、今年度は、6月から1月にかけてドイツ・ライプツィヒ及びベルリンにて、主に以下の3つの点から調査を行った。1.ライプツィヒ・ゲヴァントハウス管弦楽団の演奏会プログラムの変遷(18世紀末から20世紀初頭)を調査し、その変容を検討する2.メンデルスゾーンが創出した新しい作品ジャンル「演奏会用序曲」に注目し、作品と音楽マーケットの関係および音楽史に与えた影響をさぐる3.メンデルスゾーンの未出版ピアノ作品を調査することで当時の出版状況と創作活動の相互連関を裏付けるその成果としては、1.について、ライプツィヒ市歴史博物館付属図書館に保存されているプログラムを全てデジタル画像として収集した。2.では、作曲過程で残された各段階の稿を比較検討し、先行研究で整理未完だった各稿の差異・変遷を解明した。3.は、ベルリン国立図書館及びライプツィヒ大学付属図書館に保存されている自筆譜を分析する作業で、その結果出版をめざす過程で、内容は同じであるのにタイトルを変更する例が多々あることが明らかとなり、また、そのタイトル変更に淀の法則があることもわかった。これは今後のジャンル研究に重要な意味を持つことになると思われる。

その結果彼は、当時の中心的ジャンルである「ソナタ作品」ではなく、二部分によって構成される作品を多く手がけ、その作品形態を完成させようとしていたことを発見した。これは、7月に出版された「F.メンデルスゾーンの初期未出版ピアノ作品:182025年の習作群を考察する」(『阪大音楽学報』所収)をもとに研究を発展させた研究であり、日本音楽学会全国大会にて「F.メンデルスゾーンの二部分形式作品:初期ピアノ作品におけるスタイル習得の過程」と題して発表した(2011年11月5日)。「演奏会用序曲」に関しては、メンデルスゾーンの演奏会用序曲第二番「ヘブリディーズ諸島」Op.26の成立過程を調べる中で、各段階の稿に大きな相違点があることがわかり、イギリス・オックスフォード大学ボートリアン図書館、ロンドンの大英図書館等に残されている自筆譜や筆写譜を丹念に閲覧した。その結果、自筆譜に使われた紙質やインクの種類には検討すべき余地が多くあること、成立の空白期について調査する必要があることがわかり、次年度ひきつづいて解読・調査する。
波動歯車の原理を利用した大出力超音波モータに関する基礎的研究

本研究は、小型、軽量、大容量のアクチュエータの開発を目的に、従来の超音波モータとは動作原理の異なる、積層形圧電素子または円管状圧電素子を駆動源として、波動歯車の機構と屈曲を利用した機械的共振により進行波を発生し機械的摩擦力によりロータを回転させる機構の超音波モータに関するものである。本研究で得られた成果は以下の通りである。1.剛性の高い大出力の円環状の圧電素子を使い、波動歯車装置の原理を利用して機械的共振体の剛性を高めた共振型圧電モータ(超音波モータ)を設計、試作した。また、従来の積層形圧電素子を用いたモータについても、機械的剛性を高める改良を行い、特性の改善を図ると共に、本モーターの問題点解明のための基礎データを得た。2.方形波電流出力およびフィルタ付き方形波電圧出力の方形波FETインバータの主回路および制御回路を改良し、出力周波数の精度、操作性を改善した。3.モータの改良により、回転速度の増加が見込めるため、回転速度-トルク特性の測定装置を改良した。4.円環状圧電素子を使用したモーターについて、素子を円環状のまま使用したモータと素子を6個に等分割したモータを試作し比較した。この結果、トルク-回転速度特性に対する素子の分割による影響はあまりなく、ステ-タの機械的特性が大きく影響しているものと思われる。5.円環状圧電素子に電極を取り付ける際の接着状態が、モータの特性に大きく影響することが明らかになった。特に、素子を分割した場合、接着層の厚みのばらつきが悪影響し、接着層をできる限り薄くする工夫が必要である。6.円環状圧電素子を使用する場合、素子に大きな変位を要求する従来の方式では、出力パワーを大きくするために駆動電圧を高くすると、素子の損失のために発熱することが分かった。ステ-タの構造を改造し、素子の変位を大きくしなくても(素子の大きな応力を利用)ステ-タ表面(ロータとの接触点)の円周方向の速度を大きくする必要がある。7.積層形圧電素子を用いたモータの機械的剛性を高め、圧電素子の振動を有効にステ-タに伝えるための工夫として、固定板に対して面対称な構造のモータを試作した。この結果、回転速度、トルク共にかなりの改善がなされた。本研究は、小型、軽量、大容量のアクチュエータの開発を目的に、従来の超音波モータとは動作原理の異なる、積層形圧電素子または円管状圧電素子を駆動源として、波動歯車の機構を利用した機械的共振により進行波を発生し機械的摩擦力によりロータを回転させる機構の超音波モータに関するものである。2.方形波電流出力およびフィルタ付き方形波電圧出力の方形波FETインバータを設計し製作した。インバータの試験の結果、周波数150kHz以上、電流電圧波高値5A以上、200V以上の出力が得られた。3.試作モータをインバータで駆動し共振体の振動を観察した。その結果、超音波領域の周波数(100kHz程度)でモータは共振状態になった。

しかし、円環状圧電素子の固定部分に部分的に弱い所が存在すると、圧電素子にストレスが加わり、素子が破壊される場合があることが分かった。そこで圧電素子の固定方法を改良した結果、素子の破壊は起こらず進行波の発生が観察された。4.試作モータをインバータで駆動し、超音波領域の周波数(100kHz程度)で60100rpmの回転が得られた。しかし、発生トルクは小さく、素子の固定方法に依然問題があることが推察された。5.円環状圧電素子本体のみをインバータで駆動し、素子の振動を観察した。その結果、圧電素子本体のみで100kHz以上の周波数で共振し、進行波の形成が観測された。しかし、圧電素子上の進行波の波数が機械共振体上の波数と一致していなかった(同じ周波数)。この結果、圧電素子と機械共振体の間に隙間が発生し、圧電素子の変位と応力が十分活かされていないことが分かった。6.圧電素子のみを駆動した状態で素子表面に回転子を接触すると、回転子が回転するのが観察された。これは、小形、高速、大トルクの超音波モータ実現の可能性を示唆していると考えられる。本研究は、小型、軽量、大容量のアクチュエータの開発を目的に、従来の超音波モータとは動作原理の異なる、積層形圧電素子または円管状圧電素子を駆動源として、波動歯車の機構と屈曲を利用した機械的共振により進行波を発生し機械的摩擦力によりロータを回転させる機構の超音波モータに関するものである。本研究で得られた成果は以下の通りである。1.剛性の高い大出力の円環状の圧電素子を使い、波動歯車装置の原理を利用して機械的共振体の剛性を高めた共振型圧電モータ(超音波モータ)を再設計、改良試作した。また、従来の積層形圧電素子を用いたモータについても、機械的剛性を高める改良を行い、特性の改善を図ると共に、本モーターの問題点解明のための基礎データを得た。2.方形波電流出力およびフィルタ付き方形波電圧出力の方形波FETインバータの主回路および制御回路を改良し、出力周波数の精度、操作性を改善した。3.モータの改良により、回転速度の増加が見込めるため、回転速度-トルク特性の測定装置を改良した。4.円環状圧電素子を使用したモーターについて、素子を円環状のまま使用したモータと素子を6個に等分割したモータを試作し比較した。この結果、トルク-回転速度特性に対する素子の分割による影響はあまりなく、ステ-タの機械的特性が大きく影響しているものと思われる。5.円環状圧電素子に電極を取り付ける際の接着状態が、モータの特性に大きく影響することが明らかになった。特に、素子を分割した場合、接着層の厚みのばらつきが悪影響し、接着層をできる限り薄くする工夫が必要である.6.円環状圧電素子を使用する場合、素子に大きな変位を要求する従来の方式では、出力パワーを大きくするために駆動電圧を高くすると、素子の損失のためにに発熱することが分かった。ステ-タの構造を改善し、素子の変位を大きくしなくても(素子の大きな応力を利用)ステ-タ表面(ロータとの接触点)の円周方向の速度を大きくする必要がある。7.積層形圧電素子を用いたモータの機械的剛性を高め、圧電素子の振動を有効にステ-タに伝えるための工夫として、固定板に対して面対称な構造のモータを試作した。この結果、回転速度、トルク共にかなりの改善がなされた。
がん選択的なRNA干渉治療薬の開発に向けた核酸デリバリーシステムに関する研究

合成致死性に基づくRNA干渉療法の開発を目的とし、合成致死遺伝子としてPTENおよびPARP1遺伝子に着目した。PTEN欠損がん細胞を用い、PARP1に対するsiRNA(siPARP1)の抗がん効果を評価した。我々が開発したベクターを用いてsiPARP1を細胞に導入したところ、正常細胞およびPTEN陽性がん細胞と比較し、PTEN欠損がん細胞においてDNA損傷とアポトーシス細胞の有意な増加が認められた。siPARP1は、PTEN欠損がん細胞に対して選択的な殺細胞効果を示し、その効果は低分子阻害剤Olaparibと比較して有意に高かった。本研究成果は選択的ながん治療法の開発に繋がると期待される。本研究課題では、小分子RNAのがん医療への応用展開に寄与することを目的とし、画期的な核酸デリバリーシステムを利用したSynthetic lethality(合成致死)誘導による選択的抗腫瘍効果について研究を行う。今回、合成致死遺伝子の組合せとしては、共にDNA修復に関与するとされるPTENとPARP1に着目した。本年度は、PTEN欠損がん細胞を用いて、PARP1を標的としたsiRNA(siPARP1)の合成致死誘導能について検討を行った。siRNAベクターとして申請者らが開発したDCP-TEPA liposomesを用い、PTEN欠損のMDA-MB-468ヒト乳がん細胞、対照としてPTEN陽性のMDA-MB-231ヒト乳がん細胞においてPARP1遺伝子をノックダウンした。siPARP1導入による遺伝子サイレンシングは、リアルタイムRT-PCR法及びWestern blotting法によって確認した。次に、PARP1ノックダウンのDNA損傷に与える影響をComet assayにより、またアポトーシス誘導能をフローサイトメトリー解析により評価した。その結果、PTEN陽性のMDA-MB-231細胞と比較して、PTEN欠損のMDA-MB-468細胞では、顕著な断片化DNAの増加とアポトーシス細胞の増加が観察された。さらに、WST-8 assayによって抗がん効果を試験したところ、MDA-MB-468細胞においてのみPARP1ノックダウンによる殺細胞効果が認められた。以上の結果より、PARP1ノックダウンはPTEN欠損細胞においてDNA修復機構の破綻を介した合成致死を引き起こすことが示唆された。本年度は、培養がん細胞を用いた合成致死性に関する検討に加えて、インビボへの応用に向けた検討を行った。マウスLewis肺がん細胞株にshort hairpin RNAを導入してPTEN遺伝子をノックダウンした細胞株を樹立した。PTEN欠損Lewis肺がん細胞にPARP1を標的としたsiRNA(siPARP1)を導入し、リアルタイムRT-PCR法及びWestern blotting法によって遺伝子サイレンシングを確認した。WST-8 assayによって抗がん効果を試験したところ、PARP1ノックダウンにより、PTEN欠損Lewis肺がん細胞の増殖が抑制された。一方で、インビボへの応用に向けてsiRNAベクターの開発を実施した。これまでsiRNAベクターの主成分として用いてきたdicetyl phosphate-tetraethylenepentamineの構造類似体を複数種合成し、これまでに開発した脂質ナノ粒子の導入効率をはるかに凌ぐ新規ベクターの開発を試みた。GFPを恒常的に発現するヒト繊維肉腫細胞への導入効率と細胞毒性を指標にして脂質ナノ粒子の処方スクリーニングを実施した。その結果、dioleoylphosphate-diethylenetriamineを主成分として含む脂質ナノ粒子を用いることにより、これまでに開発した脂質ナノ粒子と比較し、十倍以上高い導入効率が得られた。今後、独自に開発したベクターを用いてsiPARP1デリバリーを行い、合成致死性に基づく選択的抗がん効果について検討を進める計画である。本研究では、合成致死性に基づくsiRNA医薬品の開発を目的とし、合成致死遺伝子としてphosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10(PTEN)とpoly [ADP-ribose] polymerase 1(PARP1)の組み合わせに着目した。両者はともにDNA修復に関与するとされ、PTENは約半数のがんで欠損が認められている。そこで、PTEN欠損がん細胞を用い、PARP1を標的としたsiRNA(siPARP1)の合成致死誘導能を検討した。siRNAのベクターには、我々が開発したdicetyl phosphate-tetraethylenepentamine-based polycation liposomes(TEPA-PCL)を用いた。各種培養細胞に対しsiPARP1を導入したところ、正常細胞およびPTEN陽性がん細胞と比較し、PTEN欠損がん細胞においてDNA損傷とアポトーシス細胞の有意な増加が認められた。siPARP1は、PTEN欠損がん細胞に対して選択的な抗がん効果を示し、その効果はPARP1の低分子阻害剤であるOlaparibと比較して有意に高かった。さらに、PTEN陽性がん細胞のPTENとPARP1の双方をノックダウンしたところ、PARP1単独ノックダウン時には認められなかった増殖抑制効果が観察された。以上より、PTEN欠損がん細胞にsiPARP1を導入することにより、DNA修復機構の破綻に起因する合成致死を効果的に誘導できることが示唆された。

本研究成果は選択的ながん治療法の開発に繋がると期待される。全体としては申請書に記載した年次計画に沿って研究が進行しているため。薬物送達学当初の計画に沿って研究を推進する予定である。当初の計画に沿って研究を推進する予定である。
タンパク質の糖鎖修飾がユビキチン化のシグナルとなる機構の解明

SCFは、基質認識サブユニットF-boxタンパク質を入れ替えることで様々な基質に対応する複合体型ユビキチンリガーゼである。代表者は3種類のF-boxタンパク質FBXO2, FBXO6, FBXO27がN結合型糖鎖を認識することを見出し、その糖鎖認識機構について明らかにしてきた。N結合型糖鎖は小胞体やゴルジ体などオルガネラ内腔や細胞外に存在する糖タンパク質に付加しているのに対し、これら糖鎖認識F-boxは細胞質に存在するため、小胞体で正常な構造をとれなかった糖タンパク質が細胞質に逆行輸送され、ユビキチン化され分解される小胞体関連分解に関与するのではないかと考えてきた。本研究課題において、オルガネラダメージの局面でFBXO27が機能し、オルガネラの除去に関与することを新たに見出した。FBXO27はN-ミリストイル化により平常時は細胞内のオルガネラ膜上に局在している。しかし、薬剤処理によりリソソームやエンドソームなどに損傷を与えた場合、オルガネラ内の糖タンパク質糖鎖の漏れを素早く感知し非常に短時間に損傷オルガネラに集積する。特にリソソームが損傷を受けた際にはFBXO27によりLAMP2が高度にユビキチン化を受けることを見出した。これまで、損傷リソソームの表層にあるユビキチン鎖が目印となりオートファジーが引き起こされ損傷リソソームが除去されるリソファジーと呼ばれる生体防御機構が報告されていたが、どのようにリソソームの異常が認識されるのかその機構は不明であったが、FBXO27による糖鎖認識がひとつの機構であることを明らかとした。また、FBXO6は高マンノース型糖鎖を認識することから小胞体関連分解に関わるものと考えてきたが、その詳細は不明であった。代表者は、その特異的ユビキチン化基質に関して同定し、細胞内における機能解析を行った。小胞体などの分泌経路のオルガネラや細胞外に存在する糖タンパク質糖鎖が、細胞質に存在する3つのF-boxタンパク質に認識されるか、その新たなメカニズムの解明を目的とし、研究を進めている。今回、ミリストイル化により細胞内膜に結合する糖鎖認識F-boxタンパク質FBXO27が、糖鎖結合能と膜結合能依存的に、損傷を受けたリソソームに素早く移行することを見いだした。FBXO27によりユビキチン化するタンパク質を同定したところ、LAMP1,LAMP2という主要リソソーム構成糖タンパク質であった。FBXO27によるこれらの糖タンパク質のユビキチン化はオートファジーを誘導し、損傷リソソームを回復される「リソファジー」という生体防御機構に関わることも明らかとした。リソソームの損傷は細胞に対し毒性を示し、オートファジーがその修復を担うことは報告されていたが、何がその損傷を認知し、どのようにオートファジーが誘導されるのか詳細なメカニズムは知られていなかった。本研究により、リソソーム内の糖タンパク質の細胞質への露出がシグナルとなりそのユビキチン化がリソファジーの開始に関わることを提唱する。機能未知であった糖鎖認識F-boxタンパク質の解析を行うことで新たな細胞品質管理機構に関わることを明らかとすることができた。F-boxタンパク質はユビキチンリガーゼの基質認識サブユニットであり、SCF型ユビキチンリガーゼとして機能する。ヒトではおよそ70種類あるF-boxタンパク質のうち、3つのF-boxタンパク質FBXO2,FBXO6,FBXO27はN結合型糖鎖を認識する。N結合型糖鎖を持つ糖タンパク質は細胞外もしくは小胞体などの分泌経路のオルガネラの内側に存在するが、糖鎖認識F-boxタンパク質は細胞質に存在するため、両者は膜で隔てられている。糖タンパク質をユビキチン化するためには、糖タンパク質が細胞質へ出てくる必要があり、小胞体で正しい構造が取れなかった異常タンパク質が細胞質へ逆行輸送される小胞体関連分解(ERAD)に関わるユビキチンリガーゼであると考えてきた。今回の研究により、糖鎖認識ユビキチンリガーゼの新たな機能を解明した。FBXO27はミリストイル化により細胞内膜に結合しており、損傷を受けて糖鎖が細胞質へ現れたリソソームやエンドソームに効率良く集積する。特にリソソームが損傷を受けた際に細胞質へ漏れ出した糖タンパク質LAMP1,LAMP2が、FBXO27により認識され、ユビキチン化を受けることを見出した。これまで、損傷リソソームの表層にあるユビキチン鎖が目印となりオートファジーが引き起こされることで損傷リソソームが細胞内から除去されるリソファジーと呼ばれる生体防御機構に関して、どのようにリソソームの損傷が認識されるのかは不明であったが、FBXO27による糖鎖認識がひとつの機構であることが判明した。この成果はProc. Natl. Acad. Sci. USAに掲載された。糖鎖認識F-boxタンパク質の機能解析を行うことで新たな細胞品質管理機構を提唱することができた。

N結合型糖鎖は小胞体やゴルジ体などオルガネラ内腔や細胞外に存在する糖タンパク質に付加しているのに対し、これら糖鎖認識F-boxは細胞質に存在するため、小胞体で正常な構造をとれなかった糖タンパク質が細胞質に逆行輸送され、ユビキチン化され分解される小胞体関連分解に関与するのではないかと考えてきた。本研究課題において、オルガネラダメージの局面でFBXO27が機能し、オルガネラの除去に関与することを新たに見出した。FBXO27はN-ミリストイル化により平常時は細胞内のオルガネラ膜上に局在している。しかし、薬剤処理によりリソソームやエンドソームなどに損傷を与えた場合、オルガネラ内の糖タンパク質糖鎖の漏れを素早く感知し非常に短時間に損傷オルガネラに集積する。特にリソソームが損傷を受けた際にはFBXO27によりLAMP2が高度にユビキチン化を受けることを見出した。これまで、損傷リソソームの表層にあるユビキチン鎖が目印となりオートファジーが引き起こされ損傷リソソームが除去されるリソファジーと呼ばれる生体防御機構が報告されていたが、どのようにリソソームの異常が認識されるのかその機構は不明であったが、FBXO27による糖鎖認識がひとつの機構であることを明らかとした。また、FBXO6は高マンノース型糖鎖を認識することから小胞体関連分解に関わるものと考えてきたが、その詳細は不明であった。代表者は、その特異的ユビキチン化基質に関して同定し、細胞内における機能解析を行った。FBXO27の発現は限られた細胞にのみ見られ、また発現臓器も非常に限局されている。特に脳と胎盤に発現が見られるため、そこで行われている機能を解析するためにノックアウトマウスを用いた解析を行う。また、FBXO2とFBXO6の複合体形成機構に関しても研究を進める。FBXO27の細胞レベルの解析から個体レベルへの解析と進めるために、FBXO27のノックアウトマウスを作製し、特に脳にアミロイドが蓄積した際に野生型に比べその伝播などに影響がないかを調べる。また、mRNAレベルでは脳や胎盤に発現が限局されると考えられるが、タンパク質レベルで詳細に発現解析するためにFBXO27-GFPノックインマウスを樹立中である。これらの解析を行うことでマウス個体中でのFBXO27の機能の理解をさらに深めたい。
酸化物高温超伝導体の分光学的研究

1eV以上の高エネルギ-・ラマン散乱により銅を含む酸化物高温超伝導体(La_<2-x>SrxCuO_4,YBa_2Cu_3O_<7-y>,Bi_2Sr_2Ca_<1-x>YxCu_2O_<8+y>,Nd_<2-x>CexCuO_4,Pr_<2-x>CexCuO_4),La_2CuO_4と同じ構造を持つLa_2NiO_4,La_2CoO_4及び銅を含まない酸化物超伝導体(BaPb_<1-x>BixO_3,BaxK_<1-x>BixO_3)のスピン交換相互作用、スピン-キャリア-相互作用、フォノン-電子相互作用を調べた。銅を含む高温超伝導体の反強磁性絶縁体相ではマグノン散乱の異常(Bigスペクトルにおける4J(Jは2-スピン交換相互作用)付近の散乱ピ-クの存在、本来禁止されているAig散乱強度がBig散乱と同程度の大きさを持つこと)から4-スピン交換相互作用が大きいことを示した。この相互作用はハイゼンベルグ・モデルには含まれない相互作用で、銅と酸素の電子レベルが近いために大きくなり、反強磁性スピン秩序にフラストレイションを与える効果を持つ。そこにキャリア-をド-プするとAigスペクトルは高エネルギ-まで平坦な散乱を示し、マ-ジナル・フェルミ液体のようなふるまいを見せる。Bigスペクトルはド-プ量の増加に応じてピ-クが低エネルギ-側に移行し、キャリア-とスピンの相互作用によるものと考えられる。電子ド-プ系のNd_<2-x>CexCuO_4ではCeと酸素還元は異る作用をすることを見つけた。Ba_<1-x>BixO_3やBaxK_<1-x>BiO_3では電子をド-プしていくと超伝導金属から絶縁体に変化する。その時の格子振動の詳細な解析から局在バイポ-ラロンと自由に動ける遍歴ラ-ジ-ポ-ラロンが共在し、その間の相互作用により超伝導転移温度が高められている可能性を示した。両者のソフト・モ-ドのエネルギ-の相違から、BaxK_<1-x>BiO_3ではラ-ジ・ポ-ラロンの波動関数の広がりが大きく、高濃度ド-ピング領域まで金属的であるため高い転換温度を実現している。
大気圧水素プラズマのみによるシリコン薄膜の形成

200Torr760Torrの圧力範囲で大気圧水素プラズマを安定して発生させるための水冷型電極を開発し、それを用いて、約30cm2の面積で、面内一様な大気圧水素プラズマを発生させることに成功した。大気圧水素プラズマからの発光を分光計測した結果、一般的な低圧プラズマで観察される原子状水素からの発光(H_α、H_β、H_γ)は非常に弱く、水素分子の電子遷移に起因する発光が200nm400nmにかけて非常に強く観察された。冷却電極側に原料Siを、基板ヒーター側に基板を設置し、成膜速度の基板温度依存性、プロセス雰囲気圧力依存性、電力依存性を調査した。その結果、原料Siの温度120°C、基板温度400°C、雰囲気圧力400Torrにおいて約300nm/minの成膜速度が得られた。成膜速度の投入電力依存性は、投入電力の増加と共にほぼ線形に成膜速度の増加が観察された。得られたSi膜は、SEM(走査型電子顕微鏡)およびRED(反射電子線回折)による観察の結果、多結晶Siであることが分かった。また得られた多結晶Siのそれぞれの結晶粒は、基板に垂直に柱状成長していることが分かり、膜厚3μmの時、粒径2μmになることが明らかとなった。さらにXRD(X線回折)の結果から、低温ほど(400)配向する傾向が有ることが判明した。最後に、あらかじめB及びSbがドーピングされたシリコン原料を用いて薄膜を形成することにより、薄膜の導電性制御を行った。その結果、本手法によりドーピングガスを用いずとも、Si薄膜の導電性制御が可能であることが明らかとなった。そこで本手法を用いて作製したpn薄膜ダイオードの電流電圧特性を評価したところ、整流作用が得られ、ダイオードの理想因子はn=1.34であった。
キャピラリー放電X線レーザーの安定性と短波長化スケーリングの解明

キャピラリー放電ピンチのダイナミクスを調べるために、1次元円筒座標系の電磁流体コードを作成した。アルゴンを使ったコロラド大学の実験や東京工業大学の放電ピンチの実験に合わせた駆動電流波形をインプットすると、最大ピンチ時間やX線レーザー利得の持続時間などの実験結果を非常に良く再現することができた。また、最初に衝撃波が中心に到達し、その後に電流層がローレンツ力でピンチして行くという詳細も明らかになった。X線レーザーを短波長化するためには、アルゴンより重い元素のプラズマを使う必要があり、クリプトンまでの元素に対するシミュレーションを実行した。元素が重くなるに従いネオン様イオンを生成するための電子温度・電子密度が高くなり、要求される駆動電流も飛躍的に増大した。初期プラズマ半径を小さくすれば必要とされる電流は少なくて済むが、X線レーザーの利得が得られる領域が狭くなり、さらにプラズマの密度勾配が大きくなることから軸方向に伝播するX線レーザーのパスが利得領域から逸れてしまうことが分かった。2次元の電磁流体コードは、新しい数値計算手法(CIP法)を取り入れ、ピンチ・ダイナミクスの不安定性を精度良く解析できるように開発した。2次元コードによる解析では、今まで予想されている電磁流体不安定性(ソ-セージおよびキンク不安定性など)よりも、密度の低い電流層が中心の高密度プラズマを圧縮する際のレーリー・テーラー不安定性の方が成長率が大きく、初期半径を小さくすればする程成長率が大きくなることが明らかになった。レーリー・テーラー不安定性を押さえるには初期プラズマの一様性が重要であり、放電励起X線レーザーにとって予備放電が非常に重要である理由も明らかになった。
レーザマイクロマニピュレーションと光造形法によるレーザ駆動マイクロマシンの製作

光トラップ法と光造形法を用いたマイクロ構造物の製作方法を確立するための基礎的な研究を行い、製作した構造物のレーザ駆動を試みた。研究経過および成果は4段階に分割できる。1.光トラップと光造形を共有する光学系の構築光トラップには2台のYAGレーザ(波長1064nm,500mW)を、光造形にはHe-Cdレーザ(波長325nm,20mW)を用いる光学系を構築した。二本の手のように自由にマイクロ構造物を運搬・固定することができ、また、任意の点で光造形することができる。顕微鏡下で操作し、ディジタルカメラに記録することができる。2.紫外線硬化樹脂液上での光トラップ紫外線硬化樹脂液上に微小球を載せ、光トラップすることにより以下のマイクロ構造物を製作した。(1)スライドグラス上に鉛直に伸びた円柱へ微小球を固定することができた。球レンズのマイクロ光学系の構築に有効である。(2)光ファイバ先端へ微小球を固定することができた。光ファイバへの光の入射効率をあげることに有効である。3.紫外線硬化樹脂の液滴の光トラップ微小な紫外線硬化樹脂の液滴そのものを光トラップすることに成功し、マイクロ構造物の接合にこれを接着剤として使用する手法を検証した。紫外線硬化樹脂を光トラップで固定し、これをポリスチレンラテックス球ではさむように光トラップで運搬・固定した。この状態で紫外線を照射し、ポリスチレンラテックス球同士を接着固定した。同様の手法で次々と連続してポリスチレンラテックス球を数珠玉状につなぐことができることを確認した。4.レーザ駆動連結したポリスチレンラテックス球を光トラップによりレーザ駆動できることを確認した。片持ち梁上に固定されたポリスチレンラテックス球を光熱効果によりレーザ駆動できることを確認した。シングルモード光ファイバ端の片持ち梁は光強度が弱く、駆動できなかった。光トラップが二次元であるために、構造物の製作に制限があった。今後は、三次元トラップができる光学系を構築し、立体的な構造物を構築するシステムを確立したい。光トラップ法により微小物体を固定し、光造形法で組立を行う手法を確立するために以下の項目について基礎的な研究を実施した。1.ヘリウムカドミウムレーザの325.0nmの発振線を用いた光造形装置を構築した。ピンホールを用いた光学系および石英レンズを用いた光学系により、現段階では20um程度の分解能で微小物体を構築できている。2.ヤグレーザの10540mの発振線を用いた光トラップシステムを構築した。盲径20umのポリスチレンラテックス球を液中でトラップすることができている。3.紫外線硬化樹脂中でラテックス球をトラップすることは現段階では実現できなかった。これは樹脂の粘性がかなり強いことによるものと思われる。最適な樹脂を探すことが必要である。4.紫外線硬化樹脂の表面でラテックス球をトラップすることができた。ピンホールを通過したヘリウムカドミウムレーザを樹脂の下方から照射することによって棒の先端に球を固定したマイクロ構造物を製作した。この手法を繰り返すことにより、スライドグラス上に3個のラテックス球を一直線上に固定することができた。この手法はマイクロ光学系の構築に利用することができる。

5.紫外線硬化樹脂中に光ファイバを導入し、その先端にラテックス球を光トラップした。ファイバーにヘリウムカドミウムレーザを導入し、光ファイバの先端にラテックス球を取り付けることができた。先端球光ファイバとして利用できる。来年度はラテックス球を用いた一方向マイクロボール弁など、より複雑なマイクロ構造物の製作のための基礎的な研究を行う予定である。光トラップと光造形法を用いたマイクロ構造物の製作方法を確立するために、本年度は以下のような基礎的な研究を実施した。1.紫外線硬化樹脂上で直径20μmのポリスチレンラテックス球を光トラップした。2.コア径50μmのマルチモード光ファイバの先端の中心に位置決めを行った。3.光ファイバに紫外光を導入し、ファイバの先端にラテックス球を接着した。4.先端球付きマルチモード光ファイバの特性を測定した。5.同様の手法を用いてコア径10μmのシングルモード光ファィバにラテックス球を接着した。6.先端球付きシングルモード光ファイバの特性を測定した。7.マイクロ一方向ボール弁を制作するためには、樹脂中での光トラップを実現する必要がある。紫外線硬化樹脂中での光トラップが報告された例はなく、これに関する基礎的な実験を行った。来年度は樹脂液中での光トラップを利用して一方向弁を製作する予定である。光トラップ法と光造形法を用いたマイクロ構造物の製作方法を確立するために、昨年度は光学システムを製作し、簡単なマイクロ構造物を試作した。本年度はマイクロポンプの製作を視野に入れて、以下のような基礎的な研究を実施した。1.光硬化樹脂液中で石英球やポリスチレンラテックス球の光トラップを試みた。樹脂液の粘性がかなり大きかったことと、両者の屈折率の差があまりないことから、確実にトラップすることはできなかった。樹脂液の種類やトラップする物体との組み合わせを変えてさらに実験を行う必要がある。2.上記の実験の過程で水中に光硬化樹脂を入れると、数ミクロン程度の微粒子に樹脂がわかれた。この光硬化樹脂そのものの光トラップを試みたところ、確実にトラップできるという新たな知見が得られた。3.光硬化樹脂のトラップを利用してマイクロ構造物同士を接着させることを提案し、実際に水中においてマイクロ構造物を接着して組み立てることができた。4.この手法によれば水中の任意の点に光トラップで光硬化樹脂を運搬・固定し、紫外線をその部分に当てることにより、これまで二光子吸収でしか実現できなかったマイクロ光造形法が簡便に実施できる可能性がある。来年度は、この手法を中心にして、接着剤としての組立法に関する研究と、光造形法として立体物の構築に関する研究を並列して行う予定である。光トラップ法と光造形法を用いたマイクロ構造物の製作方法を確立するために、昨年度は紫外線硬化樹脂そのものを光トラップすることに成功し、これを接着剤として使用する手法について基礎的な実験を行った。本年度は接着剤としての組み立て方法に関する研究、光造形法としての立体物の構築に関する基礎的な研究、および構造物のレーザ駆動に関する研究を以下のように行った。
ムチンをターゲットとしたDNAワクチンによる癌転移の治療に関する研究

目的:将来的に臨床の場で利用できるような効果的な免疫療法の新たなプロトコールを作製するために、マウスにおいて、ムチンを抗原としたDNAワクチンにより転移を抑制すること、及び転移抑制に働くエフェクター機構を解析することを本研究の目的とした。背景:ムチンは多くの腺癌で発現上昇が見られ、発現と悪性度とが相関している。一方で、ムチンに対する免疫応答がある場合には予後が良いという報告もあり、免疫応答を誘導できるかどうかが鍵と考えられる。本研究では、安全で強力な免疫原であるDNAをワクチンとして用いた。プラスミドDNAに含まれる多数のCpGモチーフは、それ自体がアジュバント活性を持ち、樹状細胞(DC)などの効果を最大限に引き出すことができると考えた。方法と結果:.MUC1トランスジェニックマウス(ヒト上皮性癌細胞の主要抗原であるMUC1≠ノ対して免疫間寛容)において、MUC1発現メラノーマの肺転移のDNAワクチンによる抑制を試みた。骨髄から生成した樹状細胞を共投与したときのみ効果的な転移抑制効果が見られた。エフェクター細胞は、樹状細胞共投与のない時にはモノクローナル抗体NK1.1によって除去される細胞が主力であったのに比較して、樹状細胞を共投与した際にはTリンパ球の寄与率が高いことが明らかになった。Tリンパ球の関与はいわゆるWinnアッセイによっても証明された。マウスの遺伝子産物を抗原とするワクチンをマウスにおいて試験するためにマウス乳癌抗原として報告のあった分子の遺伝子クローニングに成功した。結果の重要性:前臨床試験として最も重要なポイントとして、免疫寛容が成立していると考えられるヒトムチン抗原トランズジェニックマウスにおいて樹状細胞の利用によって、この抗原を発現した癌細胞の転移抑制を行ったこと、及び自己の分子であるマウスムチンDNAを用いたワクチンの検討を行ったことがあげられる。
高機能ナノデバイスを目指したミクロ相分離巨大単結晶体の創製

現在のナノテクノロジーに要求される構造スケールである101nmオーダーの周期配列体を自己組織的に形成するブロックコポリマーのミクロ相分離構造の制御を行った。側鎖液晶型ブロックコポリマーを用い、液晶性を利用した低分子液晶混合法、温度勾配法、ガイド基板法を用いることにより、膜面内の配列規則性を2桁向上させ、面外方向の構造アスペクト比を3桁まで引き上げることに成功した。更に、ミクロ相分離膜の自立膜化法及び他物質への転写プロセスの開発し、構造膜の機能化への展開を行った。現在、ナノテクノロジーに要求される構造スケールは急速に小さくなり、その中で高分子ブロック共重合体が自己組織的に形成する10^1nmオーダーの周期構造を有するナノ相分離体の応用が提案されている。しかしそれらが実際に実用化に至るのが困難である最大の原因は、その自己組織化構造の制御が完全ではないことである。側鎖液晶型ブロック共重合体が形成する規則配列ナノシリンダー構造の完全規則配向・配列制御を目指し、3次元理想配列シングルグレイン(単結晶)体を作製することを目的とする。シングルグレイン体は更に、超高密度磁気記録媒体、ウィルス・ナノ粒子分離用自立膜、極端紫外光(EUV)フォトニック結晶への応用へ繋がる。本年度では3次元的にミクロ相分離完全配列領域を拡大するために、(1)低分子液晶混合法、(2)グラフォエピタキシー法、(3)温度勾配印加法の開発と評価を行った。(1):低分子液晶80CBをミクロ相分離膜に混合することにより、無欠陥シングルグレイン領域を未ブレンド膜の100倍の100μm^2までに広げることに成功した。液晶化に支配された本ミクロ相分離膜の秩序性を損なわず、欠陥排除に必要な流動性をあげたことによる。(2):種々のガイド形状を有する基板にミクロ相分離膜を作製することにより、シリンダー六方配列構造の方位を揃えることに成功した。(1)の低分子液晶混合法と合わせることにより、mm級のミクロ相分離膜が期待される。(3):膜厚方向に温度勾配を印可することにより、膜垂直方向へのシリンダー長の増大に予備的に成功した。(1)の方法と合わせることにより、膜厚方向へもmm級の完全配列体が期待される。ナノテクノロジーにおける構造の微細化が進み、トップダウン的リソグラフィー技術と相補的にボトムアップ的自己組織化法が注目を集めている。その中で高分子ブロック共重合体が自己組織的に形成する10^1nmオーダーの周期構造を有するミクロ相分離体の応用が提案されている。本年度では、前年度までに開発した(1)低分子液晶混合法と(2)温度勾配印加法の条件最適化を行い、無欠陥シングルグレイン領域を100μm^2以上まで拡大し、更に、貫通シリンダー構造のアスペクト比を10^3まで増大することに成功した。また、ウィルス・ナノ粒子分離膜の応用を目指し、ミクロ相分離膜の自立膜化を行った。基板からの剥離のため、ミクロ相分離膜と基板の間に酢酸セルロース(CA)層を挟み、ミクロ相分離膜を光架橋した後に、CA層を溶解させることで、ミクロ相分離膜を基板から剥離し、自立膜化することに成功した。更に、親水性シリンダーの貫通経路を通して、低分子物質の膜透過が確認された。本研究は自己組織化法のナノテクノロジーへの貢献へ大きく寄与するものだと考える。
ゼーマン遷移を用いたポジトロニウム超微細構造の精密測定

ポジトロニウムの基底状態の超微細構造を精密に測定した。過去の測定値と理論値の間のズレ(15ppm)を検証するために、一様で安定な磁場とポジトロニウム生成からの時間情報を用いて新たな手法を用いた。結果は、203.3942+-0.0016(stat.)+-0.0013(sys.)GHzが得られた。この結果は、理論値と1.2標準偏差で無矛盾でありfavorしている。一方、過去の測定値とは2.6標準偏差離れていた。また、精密測定においてポジトロニウムの熱化過程が無視できないことがわかった。電子と陽電子の束縛系であるポジトロニウムの基底状態には、スピン状態に応じてオルソとパラの二つの準位が有り、両者のエネルギー準位の差は超微細構造と呼ばれる。超微細構造の値は理論計算値と過去の精密測定結果との間で有意なズレが有り、この原因を探るために、過去の測定の系統誤差をなくした新しい測定を行っている。当該年度は、予備測定の結果を踏まえて測定器の改良と組み立てを行った。ポジトロニウムをゼーマン分裂させるために必要な印加静磁場の一様性を増すために、NMR測定器で磁場マップを作成し、補償コイルを設計、製作してチェンバーに取り付けた。また、ポジトロニウムの遷移をおこすための印加RFシステムの安定性を上げる事に注力した。具体的には、温度を安定化させるための空調と断熱処理を行った。また、出力パワーを常にモニターしながらフィードバックを行う事で、長期にわたって安定なRFを印加できるようにした。予備測定中に、キャビティの内部からの脱ガスが問題となることが新たに判明したため、ポンプによる排気処理系を増強し、脱ガス源であるアクリルのライトガイドを石英ガラスへと変更した。これらの改良を行った後に全体の測定系を組み上げ、本測定を開始した。測定は安定で、順調にデータが蓄積されている。一方、熱化による系統誤差をなくすために、本測定と並行して2γ/3γ分光を時間の関数として行う測定も重要となる。このために使用する、HPGe検出器を購入し、分光用のセットアップも組み立てた。こちらも長期測定中である。電子と陽電子の束縛系であるポジトロニウムの基底状態には、スピン状態に応じてオルソとパラの二つの準位があり、両者のエネルギー準位の差は超微細構造と呼ばれる。超微細構造の値は理論計算値と過去の測定の間で有意なズレがあり、この原因を探るために、過去の測定の系統誤差を無くした新しい測定を行った。測定は、超伝導磁石とRFキャビティ、ポジトロニウムの生成と崩壊を観測するシンチレータ系から成る。過去の測定では取得していなかったタイミング情報を利用し、ポジトロニウム系の時間発展まで厳密に解析を行うのが当実験の重要なポイントである。本年度は、前年度までに取得したデータを解析し、結果を得た。膨大な統計量のデータをコンピュータによって解析した。モンテカルロシミュレーション起源の系統誤差が極力生じないように注意した。キャビティ中のガス圧と、ポジトロニウム生成からのタイミングウインドウに対応した共鳴カーブをグローバルにフィットすることで、超微細構造の値: 203.3941±0.0016(stat.)±0.0011(sys.)GHzの値が得られた。この値は、理論計算値と1.2標準偏差で無矛盾な結果である。また、時間情報を利用しないで過去の測定と同様の解析を行うと、大きなズレが生じ、熱化を含む系の時間発展が深刻な系統誤差となり得ることも示した。この結果を論文にまとめ、arXiv: 1310.6923として発表した。査読論文雑誌にも投稿し、現在、査読のプロセス中である。超微細構造の値は理論計算値と過去の精密測定結果との間で有意なズレがあり、この原因を探るために、過去の測定の系統誤差をなくした新しい測定を行っている。測定は、超伝導磁石とRFキャビティ、ポジトロニウム観測のシンチレータ系から成るが、前年度までにすべての装置のセットアップが完了していたため、当該年度はほぼ全ての期間、超微細構造の測定を行った。測定は、遷移用のRFを一定に保ったままゼーマン分裂用の静磁場を変化させて、ゼーマン遷移量の変化をスキャンする。およそ一ヶ月かけてスキャンを一回行うが、周囲の物質の超微細構造に対する影響を調べるため、チェンバー内のガス圧を変化させて複数回スキャンを行った。

測定は長期間にわたったが、フィードバック系の構築や温度安定化のおかげで、良質のデータが得られた。最終的には真空中での超微細構造に向けて各ガス圧でのデータ点の外挿を行うが、その際は、ガスのポジトロニウムに対する散乱断面積とポジトロニウムの初期運動エネルギーの情報が重要となる。これらのパラメータは別のセットアップと半導体ゲルマニウム検出器を用いて、2γ/3γ分光を行う事で求めた。当該年度の以上の測定で、熱化の系統誤差を考慮した上での、ポジトロニウム超微細構造を算出する上でのデータがほぼ出そろった。当初計画の通り、測定装置を組み上げて測定を開始した。今のところ安定してデータ取得できており、今後も継続してデータ取得することにより、目的が達成されると考える。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画の通り、長期間の安定測定を行い、必要なデータをほぼすべて取得できた。今後、取得したデータを解析することにより、目的が達成されると考えている。チェンバー内の物質による脱ガスによる影響が新たに系統誤差となりうることがわかったが、それに対する対策として、真空引きの強化とチェンバー内に使用しているアクリルを脱ガスの少ない石英ガラスへの交換により対策が完了した。このため、今後の測定には影響がないものと考えられる。空調の改良による温度安定性の向上等、長期安定化の努力は今後も続ける予定である。当初計画の通り、測定データを得る事が出来た。今後、系統誤差の詳細の見積もりと測定データの解析を行い、結果をまとめる。
神経芽腫のゲノムおよび遺伝子発現変化の網羅的・統合的解析とその臨床への応用

近年のがん治療法の進展にもかかわらず、進行神経芽腫は依然として予後が悪く、また、現在臨床で用いられている神経芽腫の予後マーカーでは予後予測が困難な中間予後群が存在する。このような症例についての早期判別と適切な治療戦略設定を実現するため、本研究では多検体の神経芽腫を用いたゲノム異常の詳細な解析と、網羅的遺伝子発現データとの統合を行い、癌の発症・進展の原因となる関連遺伝子や、予後不良な神経芽腫の素因となる遺伝子の同定を目指した。その結果、以下の成果が得られた。1)遺伝子発現プロファイルデータの取得当研究室で独自に作製した小児癌由来の11,000個の遺伝子のチップを用いて、予後不良群および中間予後群の腫瘍を中心に遺伝子発現解析を行った。また、同一腫瘍組織におけるゲノムコピー数異常のパターンと遺伝子発現パターンの比較を行うため、同チップに搭載された遺伝子について、UCSCのGenome Browserに対するデータベース検索によりチップ上の遺伝子の染色体マッピングを完了し、本研究で用いたUCSF-BACアレイ上の各クローンとの対応付けも行った。2)アレイCGH法によるゲノム異常データと遺伝子発現データの統合的解析アレイCGH解析により得られた神経芽腫268症例のゲノムコピー数異常のパターンの中から、特に欠失、増加の頻度の高い領域を絞り込み、1)で得られた遺伝子発現のパターンとの比較を行った。神経芽腫で高頻度に欠失が見られる11q領域については、最小重複欠失領域を10Mbに絞り込み、そこに位置する約100の遺伝子についての遺伝子発現パターンと比較することにより、予後不良タイプの神経芽腫で特異的に低発現が見られる候補遺伝子を抽出した。そのうちの一つについて、多検体の腫瘍組織を用いた定量的RT-PCR解析、メチル化の有無の検討を進めた。1p36領域の高頻度欠失領域についても同様の解析を進めた。今後は選択した候補遺伝子の詳細な機能解析を行うとともに、上記以外の染色体領域についても同様の解析を進めていく予定である。このような症例についての早期判別と適切な治療戦略設定を実現するため、本研究では多検体の神経芽腫を用いたゲノム異常の詳細な解析と、網羅的遺伝子発現データとの統合を行い、癌の発症・進展の原因となる関連遺伝子や、予後不良な神経芽腫の素因となる遺伝子の同定を目指す。本年度は以下の成果が得られた。1)遺伝子発現プロファイルデータの取得当研究室で独自に作製した神経芽腫由来の5,000個の遺伝子のチップおよび小児癌由来の11,000個の遺伝子のチップを用いて、予後不良群および中間予後群の腫瘍を中心に遺伝子発現解析を行った。また、UCSCのGenome Browserに対するデータベース検索によりチップ上の遺伝子の染色体マッピングを進め、2)で用いたBACアレイ上に搭載された各BACクローンと対応付けを行った。神経芽腫由来の5,000個の遺伝子のチップについては、マッピング情報のBACとの対応付けが終了した。2)アレイCGH法によるゲノム異常データと遺伝子発現データの統合的解析神経芽腫268症例についてアレイCGH解析を行い、得られたゲノム異常のパターンと、1)で得られた136症例の遺伝子発現のパターンの比較を開始した。