hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
英語における方向を表す副詞的表現の共時的・通時的研究

本研究の主たる成果は、様々な歴史的言語資料から収集した用例に基づき、英語における方向を表す副詞が文法化の事例として認定可能なものから認定不可能なものまで多様な歴史的発達を遂げていることを実証し、これらの歴史的発達を用法基盤モデルの観点から解明した点にある。これにより、用法基盤モデルが、文法化現象のみならず、様々な言語変化を説明する理論として利用可能であることを示すことができた。本研究の目的は、主にOEDその他の電子化された(歴史的)言語資料に基づいて英語における方向を表す副詞の歴的発達を調査し、用法基盤モデルの観点から説明を試みることである。今年度は特にforthの歴史的発達とその理論上の位置付けに焦点を絞って研究を行った。まず、OEDその他の資料からforthの歴史的発達を調査した結果、forthは「方向」という語彙的意味から相的意味を獲得したというBrinton and Traugott(2005)における「文法化」の事例ではなく、Haspelmath(2004)における「撤回」の事例に相当することを示し、さらに、この「撤回」の事例は、「文法化」の事例と同様、使用頻度と生産性を言語変化の説明基盤とする用法基盤モデルにおいて適正に捉えることができることを示した。上記の研究成果については、第80回日本英文学会全国大会において口頭発表し、その内容を加筆・修正したものが近代英語協会学会誌『近代英語研究』第25号に掲載される予定である。以上のように、forthの歴史的発達については用法基盤モデルが説明理論として有効に機能するが、このモデルにおいても、言語使用における頻度の増減が何によって駆動されるのかに対する動機付けが弱いこと、および多様な意味変化や文法化に伴う変化の漸進性を捉えることが困難であること、の2点において問題があることを、日本英文学会中部支部学会誌『中部英文学』第28号に掲載された書評論文の中で指摘した。文法化理論と用法基盤モデルの理論的統合の可能性については、一部、Takikawa他編『IVY Never Sere』の中で、特に「語彙化」現象の扱いとの関連で指摘したが、今後はこの観察の妥当性を検証すること、およびforth以外の方向を表す副詞の発達について、当該の言語表現の頻度や生産性の増減に大きな影響を与える類義語との意味的・統語的競合の実態を明らかにすることが必要となる。本研究の目的は、OEDその他の電子化された(歴史的)言語資料に基づいて英語における方向を表す副詞の歴史的発達過程を調査し、Brinton and Traugott(2005)(以下B&T)の文法化理論とLangacker(2000)やBybee(2007)らによる用法基盤モデル(以下UBM)と統合した理論的見地から説明を試みることである。前年度はforthの歴史的発達の考察に絞り、その発達が「文法化」ではなく「撤回」の事例であり、UBMにおいて説明可能であると結論付け、この内容が今年度発行された近代英語協会誌『近代英語研究』第25号に掲載された。本年度はさらに、awayとoutの歴史的発達に関する調査を行い、これらの副詞がその歴史的発達から文法化の事例とみなすことができるものの、outと比べてawayのタイプ頻度および生産性の漸進的増加がみられないことなどから、両者の文法化の進展に程度差があることを実証した。これら一連の研究の帰結として、英語の方向を表す副詞は、歴史的には語彙的意味から相的な意味を獲得した文法化の事例であるB&Tの主張は、本研究で調査したawayとoutに当てはまるものの、forthには当てはまらないことになる。この内容は国際ワークショップ(Current Trends in Grammaticalization Research、於オランダ)で口頭発表された。ところで、方向を表す副詞は特定の動詞と共起して句動詞を構成し、個々の構成素の総和から予測困難な意味を描写することも多い。このイディオム化という現象について、B&Tの枠組みでは、文法化に導かれたものと語彙化に導かれたものの2種類に分類可能であり、forthは前者の、awayとoutは後者の事例であることを実証した。この内容は、日本英文学会中部支部大会シンポジウムで口頭発表された。従来の研究では文法化理論におけるイディオム化現象の位置付けが明確でなく、本研究の妥当性を高めるためにはさらに詳細なデータを収集する必要があるが、これについては今後の課題としたい。
可搬型衛星通信装置を用いた大規模災害時のデータ通信システム

停電、電話回線の途絶といった条件下の災害地にある医療機関から、被害情報を発信するための手段として、可搬型衛星通信装置とパーソナルコンピュータを用いた通信がどの程度有用であるかを検討した。方法:可搬型衛星通信装置(MTT DoCoMo)とパーソナルコンピュータを用いて、データ通信を行った。愛媛大学医学部のネットワークが災害により停止するという想定で、nifty-serve 2800bpsの接続ポイントに接続した。なお電源については、ポータブル電源およびDC-ACコンバータを用いて、停電下の情報通信を再現した。結果:送信したデータ内容は以下の通りである。1)愛媛大学医学部附属病院の入院患者約600人の模擬安否情報を、慶応大学村井らによるWIDEプロジェクト、IAA(I Am Alive)計画に送信した。送信方法はコンマ区切りテキスト文(CSV)とし、患者1人当たりのデータ項目は、氏名、年齢、性別、所在(入院病棟、外泊先)、安否(被災状況、重症度)等とした。送信データはWIDEプロジェクトのデータベースに記録され、インターネット、電話、FAX等を通じて、全国から検索が可能となった。2)愛媛大学医学部付属病院入院患者の模擬安否情報と当施設の仮想的な被災状況を、報告フォームに沿って、数時間ごとにデータ通信によりPittsburgh大学の研究協力者へ送り、Pittsburgh大学のウェブ情報として、仮想被災状況を発信した。結論:可搬型衛星通信装置とパソコンによって災害時データ通信が可能である。停電、電話回線の途絶といった条件下の災害地にある医療機関から、被害の状況を写した画像などを含むインターネット情報を発信するための手段として、可搬型衛星通信装置とパーソナルコンピュータを用いた通信がどの程度有用であるかを検討した。方法:可搬型衛星通信装置(NTT DoCoMo)とパーソナルコンピュータ(東芝リブレット50)を用いて、データ通信を行った。愛媛大学医学部のネットワークは災害により停止するという想定で、nifty-serve 2800bpsの接続ポイントに接続した。1.愛媛大学医学部附属病院入院患者(約600人)の模擬安否情報を、慶応大学村井らによるWIDEプロジェクト、IAA(I Am Alive)計画に送信した。送信方法はコンマ区切りテキスト文(CSV)とし、患者1人あたりのデータ項目は、氏名、年齢、性別、所在(入院病棟、外泊先)、安否(被災状況、重症度)等とした。送信データはWIDEプロジェクトのデータベースに収載され、インターネット、電話、FAX等を通じて、全国から検索が可能となった。2.愛媛大学医学部附属病院入院患者の模擬安否情報と当施設の仮想的な被災状況を、報告フォームに沿って、数時間ごとにデータ通信により、Pittsburgh大学の研究協力者へ送り、Pittsburgh大学のweb情報として、仮想被災状況を発信した。方法:可搬型衛星通信装置(NTT DoCoMo)とパーソナルコンピュータを用いて、データ通信を行った。1)愛媛大学医学部付属病院の入院患者約600人の模擬安否情報を、慶応大学村井らによるWIDEプロジェクト、IAA(I Am Alive)計画に送信した。2)愛媛大学医学部付属病院

入院患者の模擬安否情報と当施設の仮想的な被災状況を、報告フォームに沿って、数時間ごとにデータ通信によりPittsburgh大学の研究協力者へ送り、Pittsburgh大学のウェブ情報として、仮想被災状況を発信した。結論:可搬型衛星通信装置とパソコンによって災害時データ通信が可能である。
染色体高次構造の形成におけるコヒーシンの制御メカニズムの解明

染色体高次構造は種々の染色体機能において重要な役割を果たすことが知られており、このような構造の形成に関わる因子としてコヒーシン複合体が着目されているが、高次構造形成におけるコヒーシンの制御や、コヒーシンによる転写制御についての詳細は不明な点が多い。そこで、本研究ではコヒーシン欠損時の遺伝子の転写活性の変化について解析するため、Precision nuclear run-on sequencing (PRO-seq)の手法確立を試みた。転写阻害剤処理有りと無しの細胞で実験を行ったところ、両者の間で明らかな差が確認できたことから、実験系を確立することができた。今後はさらに実験条件を最適化した後、コヒーシン欠損の条件下などでPRO-seqを行う。また、コヒーシンとともに染色体高次構造を制御する因子を探索するため、転写開始前複合体のサブユニット、TBP、TAF1、TAF6、さらにメディエーター複合体のサブユニット、MED1、MED12、MED23、MED26を欠損した細胞でHi-C解析を行った。メディエーター複合体サブユニットの欠損では、コヒーシンと同等にエンハンサー/プロモーター相互作用の減少がみられた一方で、転写開始前複合体サブユニットの欠損ではエンハンサー/プロモーター相互作用は増加していた。今後は、これらの因子を欠損したときのコヒーシンのクロマチン局在の変化や物理的な相互作用、相互作用部位について解析を行う。さらに、細胞内のコヒーシン複合体の構成因子及び、in vitroでのコヒーシンのATPase活性などについて、これらの因子の有無で変化がみられるかについて解析を行う。染色体高次構造は種々の染色体機能において重要な役割を果たすことが知られており、このような構造の形成に関わる因子としてコヒーシン複合体が着目されている。実際に、コヒーシンがトポロジカルドメインやエンハンサー/プロモーター相互作用といった構造の形成に必須であることがこれまでに示されている。一方で、高次構造形成におけるコヒーシンの制御や、コヒーシンによる転写制御についての詳細は未だ不明のままである。そこで、まずコヒーシン欠損時の遺伝子の転写活性の変化について解析するため、Precision nuclear run-on sequencing(PRO-seq)の手法確立を試みた。これまで報告されている方法を基に、転写阻害剤処理有りと無しの細胞で実験を行ったところ、両者の間で明らかな差が確認できた。そこで今後はさらに実験条件を最適化した後、コヒーシン欠損の条件下などでPRO-seqを行う。また、コヒーシンとともに染色体高次構造を制御する因子を探索するため、既知の転写制御因子の欠損下でHi-C解析を行った。具体的には、転写開始前複合体のサブユニット、TBP、TAF1、TAF6、さらにメディエーター複合体のサブユニット、MED1、MED12、MED23、MED26について、RNA干渉を用いてノックダウンした細胞を使って実験を行った。その結果、メディエーター複合体サブユニットの欠損では、コヒーシンと同等にエンハンサー/プロモーター相互作用の減少がみられた。反対に、転写開始前複合体サブユニットの欠損ではエンハンサー/プロモーター相互作用は増加していた。今後は、これらの因子とコヒーシンとの関わりを詳細に調べていく。今後は以下の点について明らかにしていく。1)コヒーシン欠損時の遺伝子の転写活性の変化を明らかにするため、PRO-seqを行う。そのために、まずPRO-seqの条件を最適化する。PRO-seqは修飾塩基を取り込ませることにより新生RNAを標識し、これを精製することで合成された直後のRNAを解析する手法であるが、これまで修飾塩基は1種類で行っていた。そこで、この修飾塩基を2種類や4種類に増やすことにより、より高解像度のデータが得られる可能性がある。よってこの点についてさらに検討を行い、得られた最適な実験条件でコヒーシン欠損時の遺伝子の転写活性を調べる。2)転写開始前複合体のサブユニットとメディエーター複合体のサブユニットの欠損で染色体高次構造に変化がみられたことから、これらの因子とコヒーシンとの関わりを明らかにする。まず、これらの因子を欠損したときのコヒーシンのクロマチン局在の変化をChIP-seqやChIP-定量PCRで調べる。また、これらの因子のコヒーシンとの物理的な相互作用や相互作用部位について、精製タンパク質等を用いて解析を行う。また、これらの因子はいずれも転写制御に関わっていることから、欠損までに比較的時間のかかるRNA干渉を用いた実験では、副次的な影響をみている可能性がある。そこで、これらの因子についてAuxin-Inducible Degron (AID)タグを付加したヒト培養細胞株を樹立する。AIDによって速やかに目的の因子を分解することで、副次的な影響を抑え、よりダイレクトな欠損の効果を観測する。

また、コヒーシンとともに染色体高次構造を制御する因子を探索するため、転写開始前複合体のサブユニット、TBP、TAF1、TAF6、さらにメディエーター複合体のサブユニット、MED1、MED12、MED23、MED26を欠損した細胞でHi-C解析を行った。メディエーター複合体サブユニットの欠損では、コヒーシンと同等にエンハンサー/プロモーター相互作用の減少がみられた一方で、転写開始前複合体サブユニットの欠損ではエンハンサー/プロモーター相互作用は増加していた。今後は、これらの因子を欠損したときのコヒーシンのクロマチン局在の変化や物理的な相互作用、相互作用部位について解析を行う。さらに、細胞内のコヒーシン複合体の構成因子及び、in vitroでのコヒーシンのATPase活性などについて、これらの因子の有無で変化がみられるかについて解析を行う。染色体高次構造は種々の染色体機能において重要な役割を果たすことが知られており、このような構造の形成に関わる因子としてコヒーシン複合体が着目されている。実際に、コヒーシンがトポロジカルドメインやエンハンサー/プロモーター相互作用といった構造の形成に必須であることがこれまでに示されている。一方で、高次構造形成におけるコヒーシンの制御や、コヒーシンによる転写制御についての詳細は未だ不明のままである。そこで、まずコヒーシン欠損時の遺伝子の転写活性の変化について解析するため、Precision nuclear run-on sequencing(PRO-seq)の手法確立を試みた。これまで報告されている方法を基に、転写阻害剤処理有りと無しの細胞で実験を行ったところ、両者の間で明らかな差が確認できた。そこで今後はさらに実験条件を最適化した後、コヒーシン欠損の条件下などでPRO-seqを行う。また、コヒーシンとともに染色体高次構造を制御する因子を探索するため、既知の転写制御因子の欠損下でHi-C解析を行った。具体的には、転写開始前複合体のサブユニット、TBP、TAF1、TAF6、さらにメディエーター複合体のサブユニット、MED1、MED12、MED23、MED26について、RNA干渉を用いてノックダウンした細胞を使って実験を行った。その結果、メディエーター複合体サブユニットの欠損では、コヒーシンと同等にエンハンサー/プロモーター相互作用の減少がみられた。反対に、転写開始前複合体サブユニットの欠損ではエンハンサー/プロモーター相互作用は増加していた。今後は、これらの因子とコヒーシンとの関わりを詳細に調べていく。今後は以下の点について明らかにしていく。1)コヒーシン欠損時の遺伝子の転写活性の変化を明らかにするため、PRO-seqを行う。そのために、まずPRO-seqの条件を最適化する。
高圧凍結技法を用いた細胞剥離と上皮連続性再構築機構を解明する超微細形態研究

本研究は独自に開発した「細胞剥離」実験解析モデルをもとに、細胞剥離とそれに伴う上皮連続性再構築機構の解明を研究目的とした。高圧凍結技法による試料作製を実施し、剥離する壁細胞における細胞内小器官や細胞骨格、細胞膜の経時的形態変化の他、オートファゴソームの超微細構造と、その形成過程に関する詳細を明らかにした。さらに、剥離細胞と隣接する細胞の接着解離、伸長する細胞突起内の細胞骨格動態等を超微細形態レベルで明らかした。また、胃酸分泌抑制剤が胃小窩壁細胞の剥離を顕著に抑制することが確認された。本研究の成果から、ピロリ菌感染による胃粘膜傷害をはじめ重要課題の解決に繋がる端緒が得られるものと期待される。1.剥離する胃小窩壁細胞の経時的形態変化に関する詳細な超微形態解析独自に遂行した従前の研究成果から、ラットに摂食刺激を加えて作製した単離胃粘膜モデルにおいて、胃小窩壁細胞が顕著に剥離する現象を見出している。本研究を遂行する第一段階として、微細構造の保持に優れた高圧凍結技法による試料作製を実施し、詳細な超微形態解析を行い、剥離する壁細胞における細胞内小器官や細胞骨格、細胞膜の経時的形態変化を中心に、基盤となる形態学的所見を収集した。この結果、オートファゴソームの超微細構造と、その形成過程に関する詳細を明らかにすることができ、次年度以降の解析の基盤を確立ことに成功した。2.剥離現象に伴う細胞接着関連蛋白の局在変化に関する免疫組織化学的解析上記1.の解析で得られた超微形態学的所見に基づき、剥離に際して必要となる細胞接着の解離機構を明らかにするため、E-cadherin、βーCatenin, Occludin、Claudin 1、ZO-1などの細胞接着分子の細胞内局在について、金コロイド標識抗体を用いた電子顕微鏡レベルの探索を含む免疫組織化学的解析を開始した。1.剥離細胞に隣接する細胞が呈する上皮細胞連続性再構築に関する形態解析本研究が目指す細胞剥離のメカニズム解明に繋がる特異な胃小窩壁細胞の剥離に際しては、胃底腺上皮細胞の連続性を欠失しないよう、剥離する細胞の基底膜側を裏打ちするように、隣接する表層粘液細胞が基底膜に沿って細胞突起を伸長することが判明している。前年度に解析された剥離細胞自体の形態変化を参考に、剥離細胞と隣接する細胞の接着解離、伸長する細胞突起内の細胞骨格動態、さらには伸長された突起が再接着する詳細を明らかにするため、超微形態及び免疫組織化学的解析を実施した。2.細胞剥離の生理機構解明に繋がる剥離制御因子の分子生物学的探索本研究が対象とする胃小窩壁細胞の剥離は胃酸分泌刺激により著しく亢進することが判明していることから、臨床で用いられるH2-receptor阻害剤やプロトンポンプ阻害剤による胃酸分泌抑制が剥離を抑制する可能性が強く示唆された。そこで、剥離亢進と抑制の対極的な試料作製に続き、細胞接着関連蛋白の発現を中心とした分子生物学的比較解析を加え、剥離制御因子の同定と細胞剥離の背景にある生理機構の解明に着手した。当初の計画通り、剥離細胞に隣接する細胞が呈する上皮細胞連続性再構築に関する形態解析が完了し、細胞剥離の生理機構解明に繋がる剥離制御因子の分子生物学的探索にも着手できているため。本研究は独自に開発したラット単離胃粘膜の応用研究により確立された「細胞剥離」実験解析モデルをもとに、胃酸分泌刺激の加減によって細胞剥離を制御できる特性を活かしながら、生体における細胞剥離とそれに伴う上皮連続性再構築機構の解明を研究目的とする。研究計画の最終年度にあたる平成28年度は、胃底腺峡部細胞増殖帯における分裂亢進と細胞分化に関わる細胞動態解析を行った。胃底腺峡部は幹細胞が位置する細胞増殖帯となっており、胃小窩壁細胞の剥離亢進に付随して細胞分裂と壁細胞への分化が亢進することが予想された。そこで、BrdU、PCNA、Ki67をはじめとする細胞分裂マーカーや、分化した胃小窩壁細胞と選択的に結合するピーナッツ・レクチンを用いることで、細胞剥離に伴う細胞動態の変化を組織化学的に可視化して検討を加えた結果、剥離亢進から120分まで顕著な細胞分裂の増加は認められないことが明らかとなった。また、胃小窩壁細胞の剥離に伴う上皮細胞連続性再構築が破綻した場合、欠損部から強酸性を示す胃酸やペプシンをはじめとする強力な消化酵素が胃粘膜固有層に流入し、胃粘膜傷害をもたらすことが予想された。そこで、剥離現象に基づく胃粘膜傷害発症メカニズムの解明を目指した応用研究として、臨床で汎用されるH2-receptor阻害剤やプロトンポンプ阻害剤などの胃酸分泌抑制剤が、胃小窩壁細胞の剥離を抑制するか否かを検討した結果、いずれの薬剤も剥離を顕著に抑制することが確認された。本研究で得られた成果をもとに、ヘリコバクター・ピロリ菌感染による胃粘膜傷害をはじめとする重要課題の解決に繋がる端緒が得られるものと期待される。

また、胃酸分泌抑制剤が胃小窩壁細胞の剥離を顕著に抑制することが確認された。本研究の成果から、ピロリ菌感染による胃粘膜傷害をはじめ重要課題の解決に繋がる端緒が得られるものと期待される。当初の初年度研究計画に掲げた超微形態所見の収集に成功し、本研究の基盤確立に成功した。研究計画に基づき、順調に遂行されていることから、次年度の計画にそって鋭意、研究を進めていく。解剖学研究計画は順調に遂行されており、次年度の当初計画に従って、鋭意、研究を進めていく。
サグラダファミリア教会の縮尺模型に基づくベル音楽の可聴化

サグラダファミリア教会に対するガウディの音楽的、音響的意図を探るために、彼自身の手によって完成された生誕のファザードを研究対象として本研究を計画、実施する。以下は平成21年度に実施した内容である。これまでの研究で用いてきた鐘楼下部構造(アクリル製)に修理補強を施し、20年度に製作した鐘楼上部構造と連結し、鐘楼全体の1/25縮尺模型を完成させた。この模型の頭部にツイータを設置し、無響室において可聴化実験を行い、データを収録した。音源には、ベルの合成音および教会において実測したベル音(21年7月に英国で収録)を用いた。データ解析の結果、ベル音は水平方向(角度0度)、-45度、-60度の方向に強く放射されること、また高周波の帯域では+15度方向にも放射されることが分かり、ベル音の可聴化において放射指向性を考慮する必要性が判明した。これらの特性は鐘楼の窓にあるルーバー(角度-45度)がもたらす放射特性であることが数値シミュレーションとの比較から了解された。また、実測したベル音を音源に用いた場合には、対雑音比(SN比)が周波数変換・逆変換に影響することが分かり、なるべく高いSN比の音源を用いて可聴化実験を行わなければならないことが判明した。次に、双曲形楕円断面ベルと双曲形円断面ベルを試作し、これらの"two-pitchbell"がもたらすベル音を収録し、周波数分析した。なお、試作したベルの振動・音響設計においては中央大学理工学部戸井研究室との共同研究から得られた成果を用いた。これらの試作ベルに関する聴感実験に基づいてtwo-pitchbellの設計法について検討中である。この試作ベルの音響特性と周波数変換・逆変換から得られたベル音の音響特性とを比較検討し、サグラダファミリア教会鐘楼からのベル音楽の可聴化について考察した。以下は平成20年度に実施した内容である。ガウディがサグラダファミリア教会の鐘楼に残したと伝えられるチューブ状のベルに基づいて復元されたベルが存在するので、そのベル音を無響室で収録し、スペクトル分析を行った。この分析結果から、ベル音を構成する上で不可欠なスペクトル成分を判別し、ベルの合成音を作成した。この合成音の周波数を25倍に変換し、研究費で購入した球形ツイータ(周波数帯域:15-100kHz,指向性:前方±45度)から送出させた。この放射音をマイクで収音し、周波数逆変換を行って、可聴化した。次に、生誕のファザードの左半分(表から見て)に当たるバルナバルの塔とシモンの塔の上部構造に関する1/25縮尺模型を製作するため、実測図に基づいて、製作図面を作成し、アクリルで製作した。1/25の縮尺では、鐘楼の壁は65mmになるが、この厚さをアクリルで実現するのは非常に高価で、予算オーバーになると見積もられたので、厚さは50mmに抑えざるを得なかった。しかし、その他の重要な部分(例えば、ルーバー付きの窓など)は1/25の縮尺である。なお、この縮尺模型の頭部はスピーカ(ツイータ)を吊るすためにカットした。この模型を以前の研究で用いてきた鐘楼下部模型(アクリル製)に連結させ、鐘楼頭部からスピーカを吊るして、ベル音を放射させることができた。なお、下部模型は鐘楼の厚さを考慮していないため、構造的に弱いことが判明した。そのため、21年度予算で補強した上で、上部構造と連結する必要が生じた。

この試作ベルの音響特性と周波数変換・逆変換から得られたベル音の音響特性とを比較検討し、サグラダファミリア教会鐘楼からのベル音楽の可聴化について考察した。
慢性腎臓病患者におけるフレイル・サルコペニアと予後についての観察研究

本研究は、慢性腎臓病(CKD)患者におけるフレイル・サルコペニアの頻度とその危険因子・予後を検討することを目的とする。1.東京医科歯科大学腎臓内科外来患者におけるCKD患者の解析2016年に登録した367名の透析未導入の保存期CKD患者を追跡フォローしている。ベースラインのデータを用いてサルコペニアの危険因子として男性、糖尿病、利尿薬の使用があげられることを示し、以前PLOS ONE誌に報告している。特にループ利尿薬がサルコペニアと強い相関を持ち、CKD患者はループ利尿薬を頻用されることから、CKD患者への安易な利尿薬使用へ警鐘をならす意義があった。また、登録時の血清ミオスタチン値と腎機能、筋肉量、ループ利尿薬の関係を検討し、2018年の米国腎臓学会にて発表した。即ち、ミオスタチン値は筋肉量と正の相関を持つが、ループ利尿薬使用、腎機能(推算糸球体濾過量)、CRPとは負の相関関係であった。また、ループ利尿薬使用下では、ミオスタチン値と筋肉量の比例関係がより顕著になることを示した。ループ利尿薬使用者は、浮腫、心不全、尿毒症、肝硬変等を伴なっていることが多く、それらの病態が筋肉量とミオスタチン値の関係を修飾していると考えられた。2.地域基幹病院における透析導入患者のフレイル・サルコペニアの実態とその予後についての検討末期腎不全により透析導入に至った患者を対象とする前向きコホートを立ち上げ、透析導入時のフレイルとサルコペニアの実態を評価し、その危険因子を同定し、合併症(心血管疾患、感染症、悪性腫瘍)の発症、生命予後に影響を与えるかを前向きに調査することを目標としている。現在、研究計画書を作成中である。1.東京医科歯科大学腎臓内科外来患者におけるCKD患者の解析現在、登録後2-3年目のデータ収集を行っており、収集完了後に統計解析を行う予定である。2.地域基幹病院における透析導入患者のフレイル・サルコペニアの実態とその予後についての検討多施設研究の研究計画の作成、各施設における倫理委員会での承認がまだできておらず、症例の登録ができていない状態である。1.東京医科歯科大学腎臓内科外来患者におけるCKD患者の解析登録後2-3年目のデータ収集を行い、収集完了後に統計解析を行う予定である。ベースラインの各種パラメータ(年齢、性別、腎機能、ミオスタチン値、サルコペニアの有無等)を独立変数、心血管疾患、透析導入、クレアチニン値の2倍化、死亡を従属変数としてCox回帰分析にて検討する。2.地域基幹病院における透析導入患者のフレイル・サルコペニアの実態とその予後についての検討多施設共同研究の研究計画書の作成と各施設での倫理委員会での承認を早急に行う。その後、研究対象者のリクルートを開始し、1年間で200人を目標として登録を行う。フレイルの評価は、Friedによる定義・厚生労働省によるチェックリストを用いて行い、サルコペニアの診断は、筋肉量をDEXAまたはバイオインピーダンス法で行い、筋力は握力、機能は歩行速度で評価する。また、透析導入時の通常の血液検査項目に加え、合併症、内服薬等の項目を記録する。各施設から、研究対象者の血清サンプルを搬送することが可能となれば、中央研究機関である東京医科歯科大学にてミオスタチン等のバイオマーカーの測定を行う。3年間追跡し、合併症(心血管疾患、感染症、悪性腫瘍)の発症、生命予後との関係を前向きに検討する。

2.地域基幹病院における透析導入患者のフレイル・サルコペニアの実態とその予後についての検討多施設研究の研究計画の作成、各施設における倫理委員会での承認がまだできておらず、症例の登録ができていない状態である。1.東京医科歯科大学腎臓内科外来患者におけるCKD患者の解析登録後2-3年目のデータ収集を行い、収集完了後に統計解析を行う予定である。ベースラインの各種パラメータ(年齢、性別、腎機能、ミオスタチン値、サルコペニアの有無等)を独立変数、心血管疾患、透析導入、クレアチニン値の2倍化、死亡を従属変数としてCox回帰分析にて検討する。2.地域基幹病院における透析導入患者のフレイル・サルコペニアの実態とその予後についての検討多施設共同研究の研究計画書の作成と各施設での倫理委員会での承認を早急に行う。その後、研究対象者のリクルートを開始し、1年間で200人を目標として登録を行う。フレイルの評価は、Friedによる定義・厚生労働省によるチェックリストを用いて行い、サルコペニアの診断は、筋肉量をDEXAまたはバイオインピーダンス法で行い、筋力は握力、機能は歩行速度で評価する。また、透析導入時の通常の血液検査項目に加え、合併症、内服薬等の項目を記録する。各施設から、研究対象者の血清サンプルを搬送することが可能となれば、中央研究機関である東京医科歯科大学にてミオスタチン等のバイオマーカーの測定を行う。3年間追跡し、合併症(心血管疾患、感染症、悪性腫瘍)の発症、生命予後との関係を前向きに検討する。2018年度に行う予定であった多施設共同研究におけるデータベースの作成、研究対象者の検体の配送、試薬の購入に必要な費用をそのまま2019年度に使用することになる。具体的には参加施設に研究対象者登録のためのデータベースを作成、配布する。研究対象者の血清の中央研究機関(東京医科歯科大学)への輸送、ミオスタチン、アクチビンなどのバイオマーカー測定のための試薬の購入が主な用途となる。
睡眠時無呼吸の間歇的及び持続的低酸素が血小板凝集能及び脂肪細胞に与える影響の検討

中・重症の閉塞型睡眠時無呼吸(obstructivesleepapnea:OSA)患者では血小板凝集能は亢進しており、心血管障害危険因子保持患者ではOSAを伴うことによって血小板凝集能が亢進することが明らかになった。90日間の持続気道陽圧療法は血小板凝集能を改善した。また、我々が開発した機器により、OSA類似の間欠的低酸素はHela細胞にTNF-αを誘導し、持続的低酸素はHIF-1を誘導した。本年度は閉塞型睡眠時無呼吸患者の血小板凝集能と凝集能に対する経鼻持続気道陽圧(continuous positive airway pressure: CPAP)療法の影響について検討し以下のような結果を得た。連続124人の閉塞型睡眠時無呼吸または健常人に夜間の酸素飽和度を測定して、前値に比較して酸素飽和度の3%以上の低下を睡眠時無呼吸・低呼吸の指標として測定し、1時間当たりの3%以上の酸素飽和度の低下の数をoxygen desaturation index (ODI)3として評価した。血小板凝集能はADP付加法とコラーゲン付加法にて測定した。ODI3が15以上の中、重症の閉塞型睡眠時無呼吸患者ではADP付加血小板凝集能が亢進しており(p=0.029)、多変量解析ではODI3が有意に凝集能に寄与していた。124名中で喫煙、高血圧、糖尿病、高脂血症の心血管疾患危険因子のある59人の閉塞型睡眠時無呼吸患者の多変量解析ではODI3が血小板凝集能への有意な寄与因子(p<0.01)であり、SpO2 90%以下時間は有意な因子ではなかった。CPAP治療開始後、ADP付加血小板凝集は30日後では一時的に有意に悪化し(p=0.035),90日後では改善した。以上の結果から中・重症の閉塞型睡眠時無呼吸患者では血小板凝集能は亢進しており、心血管障害危険因子保持患者ではOSAを伴うことによって血小板凝集能が亢進することが明らかになった。本結果は現在投稿中である。また、本研究費の一部で購入した冷凍庫に保存されている血清、血漿から凝集能に関連すると思われれる諸因子の関連を検討していく予定である。また、細胞に間欠的低酸素を暴露する実験を開始した。
Si系新チャネル材料MOSトランジスタにおけるキャリア輸送特性の研究

二軸ひずみ一軸ひずみが共存するひずみ印加に対して、移動度向上に与える影響は、そのメカニズムも含めて不明な点が多い。今年度は、緩和SiGe上の二軸引張りひずみSiチャネルを使って、これに一軸の機械ひずみを印加して、移動度への影響を系統的に調べた。チャネル方向をオリフラに対して系統的に変化させることで、二軸応力ひずみの移動度向上率とせん断応力ひずみによる移動度向上率を分離して測定できることを明らかにした。一軸応力は、二軸応力の効果とせん断応力の効果の両方を併せ持っている。二軸応力のピエゾ係数とせん断応力のひずみ係数の二軸引張りひずみ量依存性を測定した結果、せん断応力による移動度向上は、二軸ひずみによる移動度向上とは独立の効果(理論計算の結果から有効質量低減の効果)であることが分かった。このことは、二軸ひずみ一軸ひずみを併用することで、更に移動度向上を実現できることを示している。結果として、二軸のグローバル引張りひずみに一軸のローカル引張りひずみを組み合わせる方法は、nMOSFETの更なる移動度向上に極めて有効であること、またせん断応力ひずみによる移動度向上が有効に働くことから、<110>方向への一軸ひずみの印加と組み合わせることが有効であるということが、明らかとなった。一方、緩和SiGe基板上のひずみSiにおける二軸ひずみによる移動度向上の実測結果は、ピエゾ係数からだけでは説明できず、機械的ひずみに対して期待される値よりも更に高い値が得られることが明らかとなった。この効果は、ひずみSi基板を直接酸化によって形成したMOS界面特有の材料起因の効果であると考えられる。本研究では、Si系新チャネル材料MOSFETである、ひずみSi、SiGe、GeチャネルMOSFETの反転層キャリアの輸送特性の明確化に関する研究を進めている。今年度は、微細化とともに重要になっているクーロン散乱に与えるひずみの効果とその物理的機構の解明を行うため、界面準位と基板不純物それぞれに起因するクーロン散乱により決まる反転層移動度を抽出し、これらに与えるひずみの効果を、nチャネルMOSFETを用いて、実験的に調べた。結果として、基板不純物に起因するクーロン散乱移動度は引っ張りひずみ印加により向上する一方、界面準位によるクーロン散乱移動度はひずみ印加により低下することを見出した。これらは、電子のサブバンド占有率と散乱確率の観点から理解できることが明らかとなった。二軸引張りひずみの印加により2重縮退バレーの電子が増大すると、平均的有効質量は軽くなる一方で、波動関数により決まる電子の平均位置は界面に接近する。このことから、散乱確率が場所に依存しない基板不純物に起因するクーロン散乱移動度では、ひずみの印加により有効質量の効果により移動度が向上する一方、界面に近づくほど散乱確率が増える界面準位によるクーロン散乱移動度では、移動度が低下することになる、ということが分かった。更に、一軸ひずみと二軸ひずみの効果を分離して測定することを可能にするため、ウェハ上の素子に機械ひずみを印加する測定系を構築し、初期データを取得した。ひずみのないSi MOSFETに、この装置を用いて機械ひずみを印加した結果として得られたピエゾ係数は、これまでの報告値とよく一致することを確認し、測定系の妥当性が保障できた。また、応力の最大値として、300MPaまでの一軸応力が印加可能な測定系であることを明らかにした。
ウシにおける脂肪細胞の消失機構に関する研究

ウシにおける最長筋組織・腎周囲脂肪組織・皮下脂肪組織をコラゲナーゼ処理することで得られた遊離細胞に対し、遠心分離を行い、浮遊してくる筋肉内・腎周囲・皮下脂肪細胞を分離した。この分離脂肪細胞を天井培養することでそれら3つの組織における脂肪前駆細胞を調製した後、インスリン・デキサメタゾン・イソブチルメチルキサンチン刺激を加えることで、その脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を誘導した。脂肪細胞分化に関わる転写因子であるC/EBPファミリーおよびPPARγ遺伝子並びに脂肪細胞分化マーカーであるleptin遺伝子について、その分化過程における経時的な発現パターンを解析した。これら3タイプのウシ脂肪前駆細胞において、C/EBPβおよびδ遺伝子の発現は増殖期の段階ですでに高くなっており分化誘導によりさらに発現上昇が生じる点、分化誘導直後からC/EBPα遺伝子発現の上昇が生じる点、およびleptin遺伝子の発現は分化過程の後半に起きる点等については、多くの知見が得られているマウス3T3-L1細胞と類似した発現パターンが観察された。その一方、PPARγ遺伝子発現は3T3-L1細胞では分化誘導直後から検出されるが、ウシ脂肪前駆細胞では増殖期からすでに高くなっていること、および3T3-L1細胞で観察される分化過程後半でのC/EBPα遺伝子の持続的発現がウシ脂肪前駆細胞では観察されないこと等の顕著な差もみられた。この差は種間差(ウシ対マウス)、由来組織の差(脂肪対胚)、および継代数や倍数性といった培養細胞系の差によるものと考えられた。さらに、3タイプの脂肪前駆細胞間でも、増殖期におけるC/EBPβ、δおよびPPARγ遺伝子の発現量、分化誘導直後におけるC/EBPファミリー遺伝子の発現上昇速度、分化過程後半におけるC/EBPα、δおよびPPARγ遺伝子の発現量に差が検出された。この結果は、脂肪細胞分化の制御機構が脂肪組織の体内部位間で異なっていることを示唆している。また、上記のように調製された3つの組織由来のウシ脂肪細胞について、PPARγの4種のアイソフォームの発現レベルを解析した結果、腎周囲および皮下に比べ筋肉内において、γ1aおよびγ1bに対するγ2の相対的な発現レベルが極端に低下していた。このことは、成熟脂肪細胞の性質が脂肪組織の体内部位間で異なっていることを示唆するものであった。本年度は実験材料の準備を行った。まず最初に、ウシ脂肪組織および筋肉組織をコラゲナーゼ処理することで細胞を遊離した後、遠心分離により浮遊してくる細胞を分離した。その分離細胞およびそれが由来する組織よりRNAを単離し、脂肪細胞分化マーカーであるレプチンの発現レベルをcompetitive RT-PCR法により解析したところ、脂肪および筋肉組織に比べその組織から分離した細胞において高い発現レベルがみられたことから、この分離細胞は脂肪細胞とみなされると考えられた。このような検討は脂肪組織としては、皮下および腎周囲脂肪において、また筋肉内脂肪組織としては、尾根部および縦隔膜筋肉を用いて行われた。こうしてこの方法により分離された細胞は各体内部位の脂肪細胞特性の解析に有用な実験ツールになると期待された。次に、上記の方法で脂肪細胞を単離し、その細胞を天井培養することにより、脱分化を引き起こした、形態学的には繊維芽様の細胞が得られた。細胞質内の脂肪滴は完全に消失していた。また、生理学的解析として、脂肪細胞分化マーカーであるレプチンの発現レベルをccompetitive RT-PCR法により調べた結果、脂肪細胞に比べて顕著に発現量が減少していた。こうして、天井培養により前駆脂肪細胞株が樹立されたと考え、この細胞をインスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン添加分化培地にて培養し分化誘導を行ったところ、オイルレッド染色陽性の細胞が検出されるようになり、この細胞は脂肪を蓄積するという脂肪細胞への分化能力をもつことが示された。また、細胞質内に脂肪滴を蓄積する形態学的変化に伴い、脂肪細胞分化マーカーであるレプチンの発現レベルも増加した。皮下、腎周囲および筋肉内脂肪細胞に由来するいずれの前駆脂肪細胞についても脂肪蓄積の程度および分化マーカーの発現状況より判断される脂肪細胞分化能力は同じ傾向を示すことが明らかにされた。こうしてこの前駆脂肪細胞株を分化させた細胞も脂肪細胞の各体内部位間比較に有効なツールとなると考えられた。

その一方、PPARγ遺伝子発現は3T3-L1細胞では分化誘導直後から検出されるが、ウシ脂肪前駆細胞では増殖期からすでに高くなっていること、および3T3-L1細胞で観察される分化過程後半でのC/EBPα遺伝子の持続的発現がウシ脂肪前駆細胞では観察されないこと等の顕著な差もみられた。この差は種間差(ウシ対マウス)、由来組織の差(脂肪対胚)、および継代数や倍数性といった培養細胞系の差によるものと考えられた。さらに、3タイプの脂肪前駆細胞間でも、増殖期におけるC/EBPβ、δおよびPPARγ遺伝子の発現量、分化誘導直後におけるC/EBPファミリー遺伝子の発現上昇速度、分化過程後半におけるC/EBPα、δおよびPPARγ遺伝子の発現量に差が検出された。この結果は、脂肪細胞分化の制御機構が脂肪組織の体内部位間で異なっていることを示唆している。また、上記のように調製された3つの組織由来のウシ脂肪細胞について、PPARγの4種のアイソフォームの発現レベルを解析した結果、腎周囲および皮下に比べ筋肉内において、γ1aおよびγ1bに対するγ2の相対的な発現レベルが極端に低下していた。このことは、成熟脂肪細胞の性質が脂肪組織の体内部位間で異なっていることを示唆するものであった。
iPS細胞技術を用いたガンマグロブリン不応川崎病に対する新規治療標的分子の同定

iPS細胞技術を用いて川崎病におけるIVIG不応の病態を解明することを目的とした。川崎病患者4例から体細胞を採取しiPS細胞を作製し、血管内皮細胞(ECs)へ誘導した。RNA-seq解析を用いて、IVIG反応例由来ECs 2例、IVIG不応例由来ECs 2例の比較解析を行ったところ、chemokine XがIVIG不応例由来ECsで有意に高発現であった。GSEA解析では、IL-6関連遺伝子群がIVIG不応例由来ECsにおいて高発現であり、IVIG不応の病態への関与が示唆された。白血球の遊走に関連しているchemokine Xは、IVIG不応の病態に関連している可能性が示唆された。【目的】本研究は、ガンマグロブリン療法(IVIG)反応および不応川崎病患者からiPS細胞を樹立し、川崎病の病態を模倣する新規試験管内疾患モデルの確立とそれを用いたIVIG不応の機序解明を目的とする。【方法】対象は、IVIG反応例2例(ともに16歳女性)、IVIG不応例2例(12歳、14歳男性)。患者由来の皮膚線維芽細胞(n=3)または末梢血T細胞(n=1)にエピソーマルベクターを用いて初期化6因子(OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, p53 shRNAの6因子)を導入しiPS細胞を作製した。【結果】川崎病患者4例から皮膚組織または末梢血を採取し、iPS細胞を樹立した。川崎病患者由来iPS細胞は、ヒトES細胞と同様の遺伝子発現と三胚葉への多分化能を有し、さらに、川崎病の病態形成に重要な役割を果たす血管内皮細胞および単球にin vitroで分化誘導可能であった。作製された単球の機能解析を行ったところ、生体内の単球と同様のサイトカイン産生能を示した。現在、マイクロアレイを用いて患者由来iPS細胞から誘導した血管内皮細胞の遺伝子発現解析を行っており、本発表においては解析結果についても提示したい。【考察】川崎病患者の体細胞からiPS細胞の樹立が可能であった。さらに、患者由来iPS細胞から血管内皮細胞および単球への分化誘導が可能であった。今後、作製された血管内皮細胞および単球を用いて、共培養実験系を用いたIVIG不応関連分子の探索を行う方針である。本研究は、ガンマグロブリン静注療法(IVIG)反応例および不応例川崎病患者の体細胞からiPS細胞を樹立し、血管、免疫細胞に分化させることにより、新規の疾患モデルの構築を行うことを目的としている。さらに、作製された血管、免疫細胞の遺伝子発現解析を行い、IVIG不応例の細胞において特異的な発現を示す病態関連分子を探索する。得られた候補分子について、in vitroとin vivoの実験系、臨床検体などを用いた検証を行うことによって、新規の治療標的分子を同定することを目標としている。現在までの研究実績は以下の通りである。1疾患特異的iPS細胞の樹立:IVIG反応川崎病2例、IVIG不応症例2例から皮膚組織もしくは末梢血を採取し、疾患由来iPS細胞を既に樹立した。樹立したiPS細胞株の評価は、(1)ゲノムintegrationの解析、(2)OCT3/4やNANOGなどの未分化マーカーの発現、(3)胚様体形成法(EB法)及び奇形腫形成法にて三胚葉への分化能の評価、(4)血管内皮細胞および単球への分化誘導効率、の4点を行うことにより評価を終了した。2病態関連分子の探索:樹立したiPS細胞から分化誘導した血管内皮細胞を用いて、IVIG反応川崎病とIVIG不応川崎病における遺伝子発現の差異について、マイクロアレイ法を用いて解析を行った。IVIG不応の病態に関連する候補遺伝子が発見された。【目的】iPS細胞技術を用いて川崎病の病態を模倣する新規試験管内血管モデルを確立し、ガンマグロブリン療法(IVIG)不応の病態を解明する。【方法】川崎病患者IVIG反応例2例およびIVIG不応例2例から皮膚線維芽細胞あるいは末梢血T細胞を採取し、エピソーマルベクターを用いて初期化6因子を導入しiPS細胞を作製した。樹立したiPS細胞から血管内皮細胞(ECs)への分化誘導は既報のプロトコールを用いた。マイクロアレイを用いて、誘導したECsの遺伝子発現解析を行った。【結論】IVIG不応川崎病症例において、血清IL-6の上昇は既に報告されていることから、血管内皮細胞におけるIL-6関連遺伝子群の発現の上昇は、IVIG不応の病態に関連している可能性が示唆された。また、白血球の動員や遊走に関連しているGene Xは、IVIG不応の病態や川崎病の重症度に関連している可能性が示唆された。

白血球の遊走に関連しているchemokine Xは、IVIG不応の病態に関連している可能性が示唆された。(1)疾患特異的iPS細胞の樹立:IVIG不応川崎病2例、IVIG反応川崎病2例から皮膚組織もしくは末梢血を採取し、疾患特異的iPS細胞を樹立しており、達成している。(2)病態関連分子の探索:マイクロアレイ解析を用いて、疾患iPS細胞由来血管内皮細胞の解析を行い、IVIG不応に関連のある候補遺伝子を抽出できたため、達成している。(3)共培養実験系を用いた病態関連分子の探索:患者iPS細胞由来の単球と血管内皮細胞の共培養実験系を用いた病態関連分子の探索を行う。現在、共培養実験系を作成している段階である。(4)病態関連候補分子のin vitroでの検証:(2)で得られたIVIG不応関連候補分子について機能解析を進める予定。小児循環器・川崎病(3)共培養実験系を用いた病態関連分子の探索:患者iPS細胞由来の単球と血管内皮細胞の共培養実験系を用いた病態関連分子の探索を行う。具体的には、患者iPS細胞由来の単球と血管内皮細胞の共培養に、炎症性サイトカインを添加し、試験管内で病態を再現するモデル系の確立を目指す。また、IVIG不応患者iPS細胞由来の単球と健常人iPS細胞由来の血管内皮細胞、逆に、IVIG不応患者iPS細胞由来血管内皮細胞と健常人iPS細胞由来単球の共培養も試み、IVIG不応患者血管内皮細胞と単球の異常を検証する。なお、川崎病患者特異的iPS細胞から単球への誘導については、既存の方法を用いることにより、既に確立できている。(4)病態関連候補分子のin vitroでの検証:同定した病態関連候補分子のsiRNA, cDNAの強制発現系を構築し、候補遺伝子のうち病態への関与の疑われる分子の絞り込みを行う。上記の検討にて同定された病態関連分子は、その遺伝子改変マウスの作製や川崎病モデルマウスとの掛け合わせによる解析にて治療標的分子であるかを検証する研究へと発展させる。また、臨床検体(血清、尿)中の濃度とIVIG反応性との相関などの検討による新規診断法の開発研究に繋げる予定である。平成25年度の1年間で1川崎病患者の体細胞からiPS細胞の樹立、2患者由来iPS細胞から血管内皮細胞および単球への分化誘導の確立まで行うことができ、極めて順調に実験が遂行できていると判断している。実験計画上、上記金額よりも高額の物品が必要な状況であったため、次年度に繰り越すことに決定しました。1川崎病患者iPS細胞由来血管内皮細胞および血管平滑筋細胞のマイクロアレイ解析が現在進行しており、川崎病冠動脈障害に関する病態関連分子の探索を行う。2共培養実験系を用いた病態関連分子の探索:患者iPS細胞由来の血管内皮細胞と単球の共培養実験系を用いた病態関連分子の探索を行う。3上記の実験から得られた病態関連候補分子のin vitroでの検証:同定した病態関連候補分子のsiRNA, cDNAの強制発現系を構築し、候補遺伝子のうち病態への関与の疑われる分子の絞り込みを行う。iPS細胞から誘導した血管内皮細胞を用いた刺激実験を繰り返し施行している状況であり、新規試薬の購入を一時待機していたため、次年度繰越となった。iPS細胞の培養液が非常に高額(500ml 22000円)であり、次年度繰越金はこれにあてる予定である。
金属表面上の活性酸素による炭化水素の酸化

メタンは天然ガス中に豊富に含まれており、これを他の有用な炭化水素やアルコールなどに変換することは有効な資源利用と言う点からも強く望まれている。また、最も反応性に乏しい炭化水素であるメタンをいかに効率良く変換するかという点は学問的にも非常に興味深い問題である。このメタンの変換過程で最も重要と考えられるのがCH結合の活性化であり、本研究では、金属表面、ここでは特に白金表面という反応の場でメタンを光によって活性化することを試みた。気相中のメタンは160nmより短波長の真空紫外光によって光解離することが知られている。しかし、このような波長領域の強い光源を得ることは不可能ではないがあまり現実的ではない。一方、金属や半導体表面に吸着した分子が6eV程度以下の紫外光照射によって生成される光電子やホットな電子による解離性付着による解離を含む多彩な光化学的過程を引起こすことが最近知られるようになってきた。しかし、メタンのように物理吸着した分子種が6eV程度の紫外光照射によって解離性付着を引起こすためには、2eV以下の低い負イオン状態を有している必要がある。これに対して、気相中や金属表面に吸着した多層膜に存在するメタンは8eV以上のエネルギーを持つ電子によって解離性付着が引起こされることがわかっている。従って、上記のような光誘起過程を金属表面上で引起こすことは一見極めて困難に思える。それにもかかわらず、本研究ではPt(111)表面上に単分子層吸着したメタンが193nm(6.4eV)の光照射によって有効に解離し、水素原子とメチルラジカルの吸着種を生成することを昇温脱離、X線光電子分光によって明らかにすることができた。
摺動負荷培養モデルによる生体潤滑機能の構築・維持・破綻メカニズムの解明

軟骨組織から取り出した軟骨細胞をアガロースゲル内に分散し3次元培養した再生軟骨モデルの表面に,プラスチックローラーを用いて摺動(摩擦)負荷を加え,再生組織表面への潤滑機能の構築と,組織の健全性に及ぼす影響を評価した.その結果,組織表面に加わる適度な摺動負荷は,組織形成を促進するだけで無く,組織内に生体軟骨に見られるような構造的異方性の形成を促すことが示された.また組織表面の潤滑性は確認できなかったものの,潤滑の破綻により5%程度のせん断ひずみが組織に生じると,細胞の一部が死んでしまい組織がダメージを受ける可能性が示された.軟骨組織から取り出した軟骨細胞をアガロースゲル内に分散し3次元培養した再生軟骨モデルの表面に,プラスチックローラーを用いて摺動(摩擦)負荷を加え,再生組織表面への潤滑機能の構築と,組織の健全性に及ぼす影響を評価した.その結果,組織表面に加わる適度な摺動負荷は,組織形成を促進するだけで無く,組織内に生体軟骨に見られるような構造的異方性の形成を促すことが示された.また組織表面の潤滑性は確認できなかったものの,潤滑の破綻により5%程度のせん断ひずみが組織に生じると,細胞の一部が死んでしまい組織がダメージを受ける可能性が示された.牛の中指骨遠位端から採取した軟骨組織から,酵素消化法により単離した初代軟骨細胞をアガロースゲルに播種し,生体組織モデルとした/この生体組織モデルの表面に対し,シリコンゴム表面層を持つポリプロピレンローラにより摺動負荷を加えながら培養し,培養軟骨細胞による摺動負荷に適応した組織内部構造の構築と組織表面への潤滑機能の発現について実験的に検証した.培養実験では,モデル表面に対しローラを初期押し込み深さ0.2mmにて接触させ,ストローク1.6mmの純転がり往復しゅう動を1Hzにて12 hour/dayだけ加え,3週間培養した.この間,培地は毎日交換した.また対照群として,同一形状の試験片を同一環境にて摩擦負荷を与えずに3週間培養した.培養後の組織モデルについて,H型コラーゲンおよびグリコサミノグリカン(GAG)の一種であるケラタン硫酸を抗体染色法により蛍光標識し,培養中に産生されたこれら細胞外マトリックス(ECM)成分によりモデル内に形成された組織構造を共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)により観察した.また培養後の組織モデルのしゅう動部および非しゅう動部から直径3mmの円柱状試験片を採取し,購入したゲル粘弾性測定装置を用い,その粘弾性特性を評価した.CLSMにより取得された組織構造の画像より,しゅう動負荷を加えられたモデルでは,しゅう動部周辺で他の部位と比較し著しくコラーゲン線維量が増加していることが確認された.このしゅう動部周辺では細胞数の増加も画像から認められた.またしゅう動負荷培養後のモデル表面には,ケラタン硫酸が多く分布していることも確認された.これらの構造的特徴は対照群には認められず,組織表面へのしゅう動負荷が,表面近傍の細胞のECM産生と細胞分裂を選択的に刺激した可能性が示唆された.また粘弾性特性評価の結果,しゅう動負荷培養後のモデルは,対照群と比較し,貯蔵弾性率が高くなるとともに,損失弾性率も著しく高くなった.つまり,しゅう動負荷による組織構造の発達が機械的強度とエネルギー吸収特性の向上につながったことが確認された.これまで,組織表面に加わる摺動負荷が軟骨細胞による組織形成を促進する効果について,摺動負荷培養実験により評価してきた.しかし,軟骨組織に対する過度な機械的負荷は,組織や内部の細胞に対し損傷を引き起こし,変形性関節症等の関節疾病の主な症状である組織の退行性変化の引き金になると考えられる.そこで本年度は,培養組織に過大な機械的ひずみを与え,内部に存在する軟骨細胞の生存率に対する影響を実験的に評価した.ここでは,初年度に導入したレオメータを再生組織モデルに定量的なせん断ひずみを繰り返し負荷しながら培養するための力学負荷培養装置に改造し使用した.アガロース2wt%のゲルに軟骨細胞を初期細胞密度106 cell/mlで播種した外径20mm,内径3mm,厚さ2mmの円筒形再生組織モデルをまず4日間静置培養した後,レオメータに取り付けた平行円盤により10%の圧縮ひずみを与えた上で往復回旋運動により最大25%のせん断ひずみを1Hzで6時間繰り返し負荷しながら2日間培養した.その後さらに2日間静置培養した後,蛍光染色による組織内の細胞について生死判定を行った.この実験では,再生組織モデルの中心から外側に向かってせん断ひずみが線形に増加するため,半径方向に細胞の生存率の分布を計測することで,組織に加わるせん断ひずみ量と細胞生存率の関係を得ることができた.その結果,せん断ひずみ量が10%程度まで増加するにつれ,細胞生存率がそれに比例して減少した.この結果より,組織への過大な機械的ひずみの負荷が,組織内部の細胞死と組織の退行性変化の原因となる可能性が確認された.再生組織モデルに対する摺動負荷培養実験も継続して実施し,摺動負荷により培養組織内に構造的異方性が生じることを確認した.しかし,細胞外マトリックス産生量および組織の粘弾性特性について,負荷群と対照群の間で統計的有意差を変化を確認できなかった.牛の軟骨組織から酵素消化法により単離した初代軟骨細胞を,アガロースゲルに播種し生体組織モデルとした.