hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
破骨細胞からの骨形成シグナルを利用した歯周病治療薬の応用開発

我々は、破骨細胞の分化と骨吸収機能を制御する骨芽細胞に発現するRANKLのデコイ受容体であるオステオプロテゲリン(OPG)の重要性について解析してきた。OPGの遺伝子欠損マウス(OPG-/-マウス)は、骨吸収が著しく亢進し骨粗鬆症を呈するが、骨形成も亢進する大変興味深い骨代謝カップリングモデルマウスである(Endocrinology 144:5441, 2003)。さらに我々は、OPG-/-マウスの歯槽骨吸収について解析した結果、OPG遺伝子の欠損によって著しい歯槽骨吸収が惹起されることを見出した(Endocrinology 154:773,2013)。この歯槽骨破壊は、骨粗鬆症治療薬として応用されているRANKL中和抗体やリセドロネート(ビスホスホネート)によって防止できることを明らかにした。また、野生型マウスの皮質骨や歯槽骨においては、骨細胞にOPGの発現が強く認められると共に、骨形成抑制因子であるスクレロスチン発現が強い。一方、OPG-/-マウスでは、スクレロスチン発現が低下していた(J Bone Miner Res 32:2074, 2017)。以上の実験結果から、石灰化組織の破壊吸収に関与するRANKLのデコイ受容体であるOPGは、骨細胞が産生することによって石灰化組織の結晶化状態を保つ働きを担っている可能性が考えられた。我々は、破骨細胞自身が発現・産生するLIF(白血病阻止因子)が骨細胞におけるスクレロスチンの発現を低下させ、骨芽細胞性の骨形成を促進する可能性を示した(J Bone Miner Res 32:2074, 2017)。そのような状況の中、我々は、成熟破骨細胞は、RANKを表面に発現するエクソソームを分泌し、骨芽細胞内のRANKLに結合し、PI3K-Akt経路を活性化することにより、骨芽細胞活性を上昇させるというリバースシグナルの存在様式を証明した(Ikebuchi Y et al. Nature 561:195, 2018)。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。破骨細胞が分泌するカテプシンKの阻害剤(オダナカティブ)は、骨基質の分解という破骨細胞の機能のみが標的となる。作用機序は、カテプシンKの活性中心のシステインを阻害剤が共有結合することで酵素活性を不活化する。我々は、高回転型骨粗鬆症を呈するオステオプロテゲリン(OPG)遺伝子欠損マウスにカテプシンK阻害剤を投与する実験を行った。【方法と結果】OPG欠損マウス(14週齢)にカテプシンK阻害剤(L006235:Tocris Bioscience)を毎日4週間経口投与した。OPG欠損マウスは、皮質骨における粗鬆化が著しく、皮質骨の海綿骨化が生じる。カテプシンK阻害剤投与は、大腿骨皮質骨における骨量増加作用を示した。カテプシンK阻害剤投与は、皮質骨粗鬆化面を減少させることから、粗鬆化面は骨形成に転じ、石灰化によって穴がふさがると考えられた。一方、OPG欠損マウスの腰椎では、二重標識の結果から、骨吸収、骨形成、石灰化の何れも著しく亢進した超高代謝回転を示し、骨量の著しい減少を呈す。カテプシンK阻害剤投与では、二重標識面が長くなり、かつ標識間の間隔が広くなり、骨量の増加が認められた。また、骨形態計測の結果から、カテプシンK阻害剤の投与では、破骨細胞面には有意差は認められず、骨芽細胞面は有意に減少しているが、骨形成速度を促進させ、骨量は増加していた。このことから、カテプシンK阻害剤は、破骨細胞の分化は阻害せず、骨芽細胞の活性を促進させることにより、骨量を増加させる可能性が示された。【考察】OPG欠損マウスにビスホスホネートを投与した場合は、破骨細胞が減少し、同時に骨芽細胞も減少することで骨代謝回転が低下して骨量が増加した。今回のカテプシンK阻害剤の投与実験では、破骨細胞の分化を阻害せず、骨形成を促進させることにより骨量を増加させると考えられた。OPG欠損マウスにカテプシンK阻害剤を毎日経口投与する実験から、カテプシンK阻害剤の投与は、破骨細胞の分化を阻害せず、骨形成を促進させることにより骨量を増加させると考えられた。一方、ビスホスホネートを投与した場合は、破骨細胞が減少し、同時に骨芽細胞も減少することで骨代謝回転が低下して骨量が増加する。以上の実験結果が得られたので、本研究課題はおおむね順調に進展していると評価した。【目的】ITAMは、T細胞やB細胞の受容体と会合する細胞膜アダプター分子の細胞内ドメインに共通してみられるモチーフとして発見された。破骨細胞では、DAP12とFcRγの発現が高く、ダブル欠損マウスは大理石骨病を呈する。最近、DAP12と会合する免疫グロブリンスーパーファミリー分子として、シアル酸受容体タンパク質Siglec-15が同定された。Siglec-15は破骨細胞の分化に伴って誘導される。Siglec-15遺伝子欠損マウスは、骨吸収が抑制され骨量が増加するが、破骨細胞数は減少しない。【方法と結果】

(1)骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系で形成された破骨細胞のアクチンリング形成をSiglec-15抗体は濃度依存的に阻害した。また、象牙質切片上の吸収窩形成を抑制した。(2)骨髄細胞培養系にRANKLとM-CSFを添加し破骨細胞が誘導される条件で、Siglec-15抗体はTRAP陽性の多核破骨細胞の分化を阻害した。一方、アルカリホスファターゼ陽性の骨芽細胞が多数誘導された。この時、多核破骨細胞形成は完全に抑制されたが、単核TRAP陽性前破骨細胞の存在が認められた。(3)骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系でRANK陽性の破骨細胞前駆細胞(qOP)が出現する。Siglec-15抗体はqOPの形成に対しては抑制効果を示さなかった。(4)我々は、破骨細胞由来のLIFがスクレロスチン抑制を介して、骨形成を促進させるカップリング因子である可能性を見出した。Siglec15抗体で処理した破骨細胞においてカテプシンKおよびRANKの発現維持と同様に、LIF発現も維持されていた。以上の結果から、Siglec-15抗体で処理した破骨細胞における骨形成の促進作用に、LIF発現の維持が関与する可能性が示された。Siglec-15抗体は、多核破骨細胞の分化と骨吸収機能を阻害すると共に骨芽細胞の分化を促進する可能性を示すことができた。我々は、破骨細胞の分化と骨吸収機能を制御する骨芽細胞に発現するRANKLのデコイ受容体であるオステオプロテゲリン(OPG)の重要性について解析してきた。OPGの遺伝子欠損マウス(OPG-/-マウス)は、骨吸収が著しく亢進し骨粗鬆症を呈するが、骨形成も亢進する大変興味深い骨代謝カップリングモデルマウスである(Endocrinology 144:5441, 2003)。さらに我々は、OPG-/-マウスの歯槽骨吸収について解析した結果、OPG遺伝子の欠損によって著しい歯槽骨吸収が惹起されることを見出した(Endocrinology 154:773,2013)。この歯槽骨破壊は、骨粗鬆症治療薬として応用されているRANKL中和抗体やリセドロネート(ビスホスホネート)によって防止できることを明らかにした。また、野生型マウスの皮質骨や歯槽骨においては、骨細胞にOPGの発現が強く認められると共に、骨形成抑制因子であるスクレロスチン発現が強い。一方、OPG-/-マウスでは、スクレロスチン発現が低下していた(J Bone Miner Res 32:2074, 2017)。以上の実験結果から、石灰化組織の破壊吸収に関与するRANKLのデコイ受容体であるOPGは、骨細胞が産生することによって石灰化組織の結晶化状態を保つ働きを担っている可能性が考えられた。我々は、破骨細胞自身が発現・産生するLIF(白血病阻止因子)が骨細胞におけるスクレロスチンの発現を低下させ、骨芽細胞性の骨形成を促進する可能性を示した(J Bone Miner Res 32:2074, 2017)。そのような状況の中、我々は、成熟破骨細胞は、RANKを表面に発現するエクソソームを分泌し、骨芽細胞内のRANKLに結合し、PI3K-Akt経路を活性化することにより、骨芽細胞活性を上昇させるというリバースシグナルの存在様式を証明した(Ikebuchi Y et al. Nature 561:195, 2018)。異所性骨形成モデルを用いた解析正常マウス(C57BL/6J)、骨粗鬆症を呈するOPG欠損マウス、大理石骨病を呈するRANKL遺伝子欠損マウスに対して、骨誘導因子(rhBMP-2)を含むコラーゲンペレットを移植する。
全能性幹細胞からの器官形成誘導に関する研究

本研究課題では、多能性幹細胞能を有するEmbryonic stem(ES)細胞から歯形成能を有する細胞を誘導して、ES細胞に由来する歯を形成誘導することを目的とした。1.全能性幹細胞からの歯形成能を有する間葉細胞の誘導ES細胞から間葉細胞を取得するため、各種分化誘導法を試みるとともに遺伝子導入による歯胚間葉細胞への転換を検討したものの、取得した細胞と歯胚上皮組織との再構成から、歯の形成を認められなかった。以上の結果から、これらの遺伝子の中には歯原性間葉細胞への転換を誘導する遺伝子は存在しないと判断した。2.全能性幹細胞からの歯形成能を有する上皮細胞の誘導昨年度までに、ES細胞から分化誘導した上皮組織を、歯胚間葉組織と組み合わせて再構成歯胚を作製すると、硬組織を蓄積する歯の誘導が認められることを報告した。しかし、その歯の形成は非常に低頻度であることから、より歯形成能の高いEB由来上皮組織を選別するため、上皮組織を形態や各種分化マーカーによって分類し、歯の形成を確認した。その結果、歯形成能を有する上皮組織は比較的に分化度の低い上皮組織であることが示唆されたものの、歯形成能と相関するマーカーの特定には至らなかっだ。また、各種遺伝子の導入による歯形成上皮組織への転換を目指したものの、歯の形成頻度の上昇は認められなかった。以上の結果から、上皮・間葉誘導からなる器官の形成を異種細胞から人為的に誘導することは、これらの方法では非常に困難であると考えられた。3.人為的に作製した歯胚の成体マウス移植システムの構築ES細胞からの器官誘導には、人為的に誘導した歯胚の発生を評価するin vivoモデルが必要であるため、器官原基法により作製した再生歯胚を用いた成体マウス移植モデルの検討を実験項目に追加し、実施した。昨年度は、成体マウス口腔内に移植した再生歯胚が、正常に萌出して機能的な歯にまで成長することを報告した。今年度は、さらに長期的な経過観察を実施し、正常な歯と同等に長期にわたり機能する歯であるかどうかを解析した。その結果、6か月以上にわたり再生歯は安定して口腔内に生着し続けること、生理的に移動しながら長期にわたって対合歯と適切な咬合を維持することを明らかにした。以上の結果より、再生歯胚を成体マウスへ移植するシステムの構築に成功し、人為的に再生した器官原基から発生プログラムを利用して成体内で器官を再生させるという概念の構築に貢献した。1、ES細胞からの歯形成能を有する細胞の誘導ES細胞から胚様体(EB)を形成させ、浮遊培養により分化誘導を行なった。すると、培養6日目からEBの周囲にE-cadherin陽性、cytokeratin18陽性の上皮細胞層が認められることが判明した。そこで、培養14日目のEBから外科的に上皮細胞層を分離して、胎齢14.5日歯胚間葉組織と組み合わせて歯の形成能を評価したところ、低頻度ながら硬組織を蓄積する歯が誘導された。以上の結果から、ES細胞から誘導された上皮細胞層の中には、低頻度に歯の上皮組織へと分化する能力を有する細胞が存在し、器官原基法を用いることによって、ES細胞に由来する上皮組織を持った歯を形成誘導可能であることが示唆された。2、人為的に作製した歯胚の成体マウス移植システムの構築ES細胞から人為的に誘導した歯胚の発生を評価するin vivoモデルが必要である。そこで、器官原基法により作製した再生歯胚を用いて、成体マウス移植モデルの検討を新たに実験項目に追加して実施した。再生歯胚は、成体顎骨内移植により萌出して対合歯と咬合する再生歯を形成した。さらに、再生歯の歯根膜はメカニカルストレスに応答して歯槽骨のリモデリングを惹起すると共に、再生歯に侵入した神経線維は外部からの侵害刺激に応答して痛覚情報を中枢に伝達することが明らかになった。以上の結果は、本移植システムにより、ES細胞から誘導した人工歯胚のin vivoにおける発生と機能を評価できる可能性を示した。本研究の成果は、論文にまとめて投稿中である。

その結果、歯形成能を有する上皮組織は比較的に分化度の低い上皮組織であることが示唆されたものの、歯形成能と相関するマーカーの特定には至らなかっだ。また、各種遺伝子の導入による歯形成上皮組織への転換を目指したものの、歯の形成頻度の上昇は認められなかった。以上の結果から、上皮・間葉誘導からなる器官の形成を異種細胞から人為的に誘導することは、これらの方法では非常に困難であると考えられた。3.人為的に作製した歯胚の成体マウス移植システムの構築ES細胞からの器官誘導には、人為的に誘導した歯胚の発生を評価するin vivoモデルが必要であるため、器官原基法により作製した再生歯胚を用いた成体マウス移植モデルの検討を実験項目に追加し、実施した。昨年度は、成体マウス口腔内に移植した再生歯胚が、正常に萌出して機能的な歯にまで成長することを報告した。今年度は、さらに長期的な経過観察を実施し、正常な歯と同等に長期にわたり機能する歯であるかどうかを解析した。その結果、6か月以上にわたり再生歯は安定して口腔内に生着し続けること、生理的に移動しながら長期にわたって対合歯と適切な咬合を維持することを明らかにした。以上の結果より、再生歯胚を成体マウスへ移植するシステムの構築に成功し、人為的に再生した器官原基から発生プログラムを利用して成体内で器官を再生させるという概念の構築に貢献した。
核膜孔を介したRNA輸送のボトムアップ型再構成に向けての基盤整備

核膜孔は、約60 kDa以下の分子の自由拡散とより大きな分子の能動輸送とを双方向的に司る輸送装置である。近年、核膜孔構成タンパク質Nupの形成するヒドロゲルが透過障壁、能動輸送場の両方のコアとなることが、タンパク質を輸送基質とした解析で判ってきた。しかし、RNAの輸送に関してNupの果たす役割の研究は遅れていた。そこで申請者は、RNAの核-細胞質間輸送の理解のため、輸送の方向性を再現できるRNA輸送のin vitro系構築をボトムアップ的に進めた。本研究計画では、1)様々なRNAに対して透過障壁となるNupヒドロゲルの作成、2)輸送担体依存の核外・核内双方向の輸送が知られているtRNAについて、その能動輸送を反映する特性をNupゲルが持つかの検討、3)Nupゲル薄膜を用い、方向性を持った輸送を再現できる再構成系の構築、4)Nupの特性を反映した化学構造のより単純な人工ゲルの開発とゲルが必要とする構造特性の解明、の4点に関して構成的システム生物学的な解析を展開する。本年度は昨年度に引き続き、出芽酵母由来のNupヒドロゲル形成のための複数のNup(Nsp1、Nup49、Nup100、Nup116)のFGリピート領域の精製、さらに、精製Nupを用いてヒドロゲル形成の条件検討を行った。また、tRNAの核膜孔透過を再現するのに必要なtRNAの細胞内濃度を決定するため、酵母の各tRNA種の絶対量を定量する手法を確立した。この中で、ヒドロゲル形成において、高濃度のNup組換えタンパク質の取り扱いが予想以上に困難であることが明らかとなり、その条件検討に多くの時間を費やすこととなり、年度内にRNA浸潤アッセイに進むことができなかった。前述のように高濃度のNup溶液の取り扱いの困難さから、2018年度はNup組換えタンパク質の精製、ヒドロゲル作製の条件検討の段階に到達したに留まったが、ようやく、高濃度タンパク質を用いたゲル化の条件が整いつつある。合わせて、人工ヒドロゲル構築のためのモノマー合成の検討にも入っており、1)項と4)項について予定よりは遅れているものの、計画を進めている。また、出芽酵母の細胞内での個々のtRNA種の濃度がtRNA絶対定量法からおよそ0.510 μMの範囲にあることが判ったので、in vitroの実験はこのtRNA濃度を参考に実施する。前述の様に計画に遅れがあるのでこれを取り戻すべく、今年度は研究の進捗を急ぐ予定である。研究材料に関しては揃いつつあるため、当初の計画を順次、時間が許す限り進めることとする。なお、NupヒドロゲルへのRNAの浸潤アッセイの結果がある意味、その後の研究計画の可否に関してキーとなるデータを与える。現時点では遅れを取り戻すため、NupヒドロゲルによるRNA浸潤アッセイと合成モノマーを利用した人工ヒドロゲルによるRNA浸潤アッセイを並行して行い、その結果を持って以降の研究展開の修正が必要かどうかの判断する予定である。本課題が年度途中から発足したため、研究課題に学生を適切にアサインすることが出来ず、限られた人的資源で研究を進めざるを得なかった。そのため、前述の様に必要なタンパク質群の精製手法の確立、精製の実施、ヒドロゲル作製の条件検討の段階に到達したに留まった。H30年度は適切な人材配置ができており、予定の遅延を取り戻し、H30年度以降の研究計画を推進できる体制が整った。まずは、Nupヒドロゲルブロックを用いたRNAの浸潤アッセイを行い、NupゲルのRNAに対する透過障壁能の解析以下の実験計画を遂行する。本研究計画では、1)様々なRNAに対して透過障壁となるNupヒドロゲルの作成、2)輸送担体依存の核外・核内双方向の輸送が知られているtRNAについて、その能動輸送を反映する特性をNupゲルが持つかの検討、3)Nupゲル

薄膜を用い、方向性を持った輸送を再現できる再構成系の構築、4)Nupの特性を反映した化学構造のより単純な人工ゲルの開発とゲルが必要とする構造特性の解明、の4点に関して構成的システム生物学的な解析を展開する。本年度は昨年度に引き続き、出芽酵母由来のNupヒドロゲル形成のための複数のNup(Nsp1、Nup49、Nup100、Nup116)のFGリピート領域の精製、さらに、精製Nupを用いてヒドロゲル形成の条件検討を行った。また、tRNAの核膜孔透過を再現するのに必要なtRNAの細胞内濃度を決定するため、酵母の各tRNA種の絶対量を定量する手法を確立した。この中で、ヒドロゲル形成において、高濃度のNup組換えタンパク質の取り扱いが予想以上に困難であることが明らかとなり、その条件検討に多くの時間を費やすこととなり、年度内にRNA浸潤アッセイに進むことができなかった。前述のように高濃度のNup溶液の取り扱いの困難さから、2018年度はNup組換えタンパク質の精製、ヒドロゲル作製の条件検討の段階に到達したに留まったが、ようやく、高濃度タンパク質を用いたゲル化の条件が整いつつある。合わせて、人工ヒドロゲル構築のためのモノマー合成の検討にも入っており、1)項と4)項について予定よりは遅れているものの、計画を進めている。また、出芽酵母の細胞内での個々のtRNA種の濃度がtRNA絶対定量法からおよそ0.510 μMの範囲にあることが判ったので、in vitroの実験はこのtRNA濃度を参考に実施する。前述の様に人的資源配置の問題で当初の計画に対して多少の遅れがあるので、それを取り戻すべく、今年度は研究の進捗を急ぐ予定である。研究材料に関しては揃いつつあるため、当初の計画を順次進めることとする。なお、NupヒドロゲルへのRNAの浸潤アッセイの結果がある意味、その後の研究計画の可否に関してキーとなるデータを与える。その時点で、以降の研究展開の修正が必要かどうかの判断する予定である。前述の様に計画に遅れがあるのでこれを取り戻すべく、今年度は研究の進捗を急ぐ予定である。研究材料に関しては揃いつつあるため、当初の計画を順次、時間が許す限り進めることとする。現時点では遅れを取り戻すため、NupヒドロゲルによるRNA浸潤アッセイと合成モノマーを利用した人工ヒドロゲルによるRNA浸潤アッセイを並行して行い、その結果を持って以降の研究展開の修正が必要かどうかの判断する予定である。
甲状腺眼症の病態解明と新規治療法の確立

本研究により、甲状腺眼症患者から摘出した外眼筋組織サンプルからMIP-1β、STNFRI等、マクロファージ関連炎症因子の活性上昇が判明した。これらの結果を踏まえ、2014年度よりTNFの抗体製剤であるインフリキシマブを甲状腺眼症患者に対し投与する臨床研究を開始した(「甲状腺眼症に対するインフリキシマブ(レミケード)投与による治療効果の検討」兵庫医科大学倫理委員会第1501号)。対象は従来の治療でコントロール不良であった難治性甲状腺眼症患者で、実際に3名がエントリーした。2名はすでに一連の治療は終了しているが、自覚症状の緩解を得られたものの、他覚的所見の明らかな改善は認められなかった。本年度までに得られた組織サンプルのRayBio Human Inflammation AntibodyArrayを用いた解析により、甲状腺眼症外眼筋組織ではMIP-1beta, sTNFRI,IL-6等マクロファージ関連炎症因子などの活性上昇、IL-16などの活性低下を認めた。また興味深いことに、甲状腺眼症の眼窩周囲脂肪組織では結果が異なり、マクロファージ関連炎症因子の中でも特にMIP-1δやM-CSFなどの活性上昇を発見した。元来、甲状腺眼症では甲状腺自己抗体による外眼筋、眼窩内脂肪組織の炎症性肥厚・細胞増殖がメインであると考えられてきたが、その炎症誘導の機序が組織によって違う可能性が示唆されたことは興味深い。同時に各抗体に対する免疫組織学染色・ELISA等の解析を並行して現在も行っている途中である。また、今回得られた結果より、炎症カスケードにおけるTNFやIL-6の抗体製剤でかつ、すでに日本において関節リウマチなどに適応のあるレミケードやアクテムラの重症甲状腺眼症への拡大適応も視野にいれ、現在臨床治験を計画中である。平成23年から25年度にかけて、組織サンプルのRayBio Human Inflammation Antibody Arrayを用いた解析により、甲状腺眼症外眼筋組織においてMIPー1β、STNFRI、ILー6等、マクロファージ関連炎症因子の活性上昇、ILー16の活性低下を認めた。同じ甲状腺眼症患者からの眼窩周囲脂肪組織では、解析結果が異なり、マクロファージ関連炎症因子の中でも特にMIPー1δやMーCSFなどの活性上昇を発見した。甲状腺眼症では甲状腺自己抗体による外眼筋・眼窩内脂肪組織の炎症性肥厚・細胞増殖が主であると考えらてきたが、その炎症誘導の機序が各組織間で隣接しているにも関わらず異なっている可能性があることが示唆され興味深い。これらの組織サンプルからの解析結果を踏まえて、平成26年度より「甲状腺眼症に対するインフリキシマブ(レミケード)投与による治療効果の検討」を、兵庫医科大学の倫理委員会規程に基づき(兵庫医科大学倫理委員会第1501号)臨床研究を開始した。具体的にはステロイドパルス療法でコントロール不良な難治性甲状腺眼症患者に対し、インフリキシマブの投与を計画的に行うものである。H26.5.16現在、2名の患者がエントリーし、本臨床研究は継続中である。眼窩抗原の眼周囲組織に対する炎症惹起への関与を明らかにする目的で、外科的治療が必要な甲状腺眼症患者より、外眼筋および眼周囲組織を採取した。得られた標本をRayBio Human Inflammation Antibody Arrayにより解析、外眼筋と脂肪組織が主な眼周囲組織とで抗体発現に顕著な違いが見られた。また、標本の一部より凍結切片作製とタンパクの抽出を行った。平成23年から25年度にかけて、甲状腺眼症患者から摘出した組織サンプルのRaybio Human Inflammation Antibody Arrayを用いた解析により、甲状腺眼症外眼筋組織においてMIP-1β、STNFRI、IL-6等、マクロファージ関連炎症因子の活性上昇、IL-16の活性低下を認めた。同じ甲状腺眼症患者からの眼窩周囲脂肪組織では解析結果が異なり、マクロファージ関連炎症因子の中でも特にMIP-1δやM-CSFなどの活性上昇を発見した。甲状腺眼症では甲状腺自己抗体による外眼筋・眼窩内脂肪組織の炎症性肥厚・細胞増殖が主であると考えられてきたが、その炎症誘導の機序が各組織間で隣接しているにも関わらず異なっていることが示唆され興味深い。これらの組織サンプルからの解析結果を踏まえて平成26年度より「甲状腺眼症に対するインフリキシマブ(レミケード)投与による治療効果の検討」を、兵庫医科大学の倫理委員会規程に基づき(兵庫医科大学倫理委員会第1501号)臨床研究を開始した。具体的には従来の治療であるステロイドパルス療法ではコントロール不良な、難治性甲状腺眼症患者に対し、インフリキシマブの投与を計画的に行うものである。H27.5.13現在2名の患者が本研究に参加し、一連の治療、経過観察を終了しており、更にもう1名がエントリーしたところである。重篤な合併症等は発生せず、自覚的には楽になったと研究に参加した甲状腺眼症患者は話している。

しかしながら、他覚的変化は劇的に効果ありとはいえず、サンプル数が少ないため、効果のほどを結論付けるだけの結果は得られていない。神経眼科研究遅延の最大の原因は必要サンプル数が絶対的に足りていない状況である。眼科形成術が必要となるような重症例はなかなか見当たらず、なおかつ当教室における斜視手術の基本原則が手術侵襲低減も考え、筋短縮から筋移動になってきていることもサンプル数が足りない理由の一つであると考えられる。ようやく、インフリキシマブの甲状腺眼症への試験的投与まで実施することができたが、いまだにエントリー数は2名であり、さらなるサンプル数増加が統計学的検討には必要である。しかし、その有効性はこの2例に関しては認められている。手術の際に切除される不用な組織が非常に小さく、予想していたよりもサンプル数が得られない為。実績概要で述べたように、サンプルの組織解析、分子生物学的解析をさらに行う予定である。また、レミケードやアクテムラの重症甲状腺眼症への拡大適応も視野にいれ、現在臨床治験を計画中である。先に述べたように、本臨床研究に参加できる患者サンプル数を増やす。本年度末にはまず神経眼科学会等で現時点での結果報告を行う予定である。現在得られている結果に統計的な有意差を出すため、さらに組織を採取し、RayBio Human Inflammation Antibody Arrayを行う予定である。この結果をもとに、保存されている切片およびタンパクを用いて免疫組織学的検討・生化学的検討を行う。達成度で述べたように、サンプル数が足りず研究に遅れが出ている為研究費の使用も遅れている状況である。次年度は分子生物学的解析の為の抗体やモジュール式インキュベーター等の使用に加え、臨床治験薬のレミケードやアクテムラに使用する予定である。現在TNF抗体製剤であるレミケードを用いた臨床研究を行っている。昨年度末時点でエントリーできた患者数は1名であり、今後も継続してエントリー数を増やし結果を検討する予定である。本状況により、エントリー予定者用の薬剤代が未使用となっている予算の一部である。今後の臨床試験に使用する薬剤の購入代金となる。RayBio Human Inflammation Antibody Arrayに5サンプル、約100万円を使用する予定である。また、免疫組織学的検討・生化学的検討に用いる抗体等に約50万円を使用する予定である。
高温における微小欠陥初成のメゾスコピック・シミュレーション

本研究では,高温下において1ミクロン以下の微細要素に発生するナノ・オーダーの微小な欠陥形成のメカニズムを,原子モデルに基づき計算機シミュレーションによって明かにすることを目的とした.とくに,高温では,表面や粒界等に沿った高速拡散が微小欠陥の発生・成長に大きな影響を及ぼす.そこで,応力が負荷された条件下において高速拡散によって表面と粒界の会合点に形成される粒界溝に重点をおいて検討した.大規模集積回路(LSI)上の配線にはアルミニウムが用いられているが,配線幅が1ミクロン程度になると,ストレス・マイグレーションと呼ばれる応力に誘起された原子の移動による粒界欠陥が形成され,配線破断に至る場合がある.本研究では,原子のポテンシャル・エネルギのバランスに着目したモンテカルロ法を提案し,メゾスコピックな視点から表面と粒界の会合部における欠陥初成の様子をシミュレーションした.その結果,初成の挙動がうまく再現できた.次に,界面のシミュレーションにおける原子間ポテンシャルとして信頼性が高く,かつ,多数の原子の挙動をシミュレーションできる原子埋め込み法(Embeded Atom Method,ニッケル原子)を採用して,複数の界面(粒界や表面)が会合する部分について分子動力学計算を行った.購入の設備は,この結果の表示に使用した.表面エネルギや粒界エネルギを計算した後,表面と表面,表面と粒界,2つの表面と粒界の会合点近傍の原子の安定性について検討した.計算結果より会合点の原子が非常に不安定であり,欠陥初成の起点となることが判明した.また,この傾向は引張り力の負荷によって助長されることがわかった.本研究では,高温下において1ミクロン以下の微細要素に発生するナノ・オーダーの微小な欠陥形成のメカニズムを,原子モデルに基づき計算機シミュレーションによって明かにすることを目的とした.とくに,高温では,表面や粒界等に沿った高速拡散が微小欠陥の発生・成長に大きな影響を及ぼす.そこで,応力が負荷された条件下において高速拡散によって表面と粒界の会合点に形成される粒界溝に重点をおいて検討した.大規模集積回路(LSI)上の配線にはアルミニウムが用いられているが,配線幅が1ミクロン程度になると,ストレス・マイグレーションと呼ばれる応力に誘起された原子の移動による粒界欠陥が形成され,配線破断に至る場合がある.本研究では,原子のポテンシャル・エネルギのバランスに着目したモンテカルロ法を提案し,メゾスコピックな視点から表面と粒界の会合部における欠陥初成の様子をシミュレーションした.その結果,初成の挙動がうまく再現できた.次に,界面のシミュレーションにおける原子間ポテンシャルとして信頼性が高く,かつ,多数の原子の挙動をシミュレーションできる原子埋め込み法(Embeded Atom Method,ニッケル原子)を採用して,複数の界面(粒界や表面)が会合する部分について分子動力学計算を行った.購入の設備は,この結果の表示に使用した.表面エネルギや粒界エネルギを計算した後,表面と表面,表面と粒界,2つの表面と粒界の会合点近傍の原子の安定性について検討した.計算結果より会合点の原子が非常に不安定であり,欠陥初成の起点となることが判明した.また,この傾向は引張り力の負荷によって助長されることがわかった.
含ハロゲン船底防汚物質のケミカルバイオロジー

含ハロゲントリテルペノイドを生産する紅藻マギレソゾに含まれるハロゲン化酵素の性状解明を目指した.まず,合成した推定生合成前駆体のスクワレンテトラエポキシド,紅藻に含まれるトリテルペノイド類の同時分析方法を種々検討した結果,APCIのイオン源を用いるLC/MSによる方法を確立した.次にマギレソゾのバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼであるLsVBPO2の大腸菌による組み換え酵素の精製方法を種々検討した結果,これまでより高活性の酵素を安定的に精製することに成功した.以上をもとにスクワレンテトラエポキシドをLsVBPO2との反応に供し,LC/MSによる分析を行ったところ,臭素化された化合物2種と酸化のみ進んだ化合物1種が得られた.生成物の大量分取を試みたが,NMRで構造を同定するのに十分な量は得られなかった.そこで,反応条件を詳細に検討した.その結果,pHを6.0から7.5に変えることで反応率が2.3倍に上昇した.溶液の組成を変更して2倍に反応効率を増加させた.さらに,酵素濃度をあげるとそれに応じて反応が進んだ.さらに,以前は反応の容量を大きくすると反応効率が下がっていたが,その他の条件を最適化した上で,反応容量を大きくすると,それに応じて反応が進んだ.また,これまでは反応時間が長すぎることもわかった.以上のことから,大スケールの反応を実施するための条件が整った.別種のソゾが生産する臭素を含むオマエザレンを付着阻害物質として報告しているが,活性機構解明を目指して各種類縁体,構造の一部を除いたもの,蛍光官能基を結合させた化合物などを合成して,付着阻害活性を評価した.最終年度において,マギレソゾのバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼの反応産物を明らかにできる準備が十分整ったため.マギレソゾのバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼの反応産物を明らかにして,ブロモペルオキシダーゼの天然物生合成における役割を示す論文発表を行う予定である.また,計画に沿って,これまで得られた付着阻害物質の類縁体合成,およびラン藻の新規ハロゲン化合物の構造決定を進める.防汚作用を有する臭素を含むトリテルペノイドであるチルシフェロールを生産するマギレソゾから得られたバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼの性状を調べた。比較的安定な組み換えタンパク質として得られるLsVBPO2を大量に調製することに成功した。有機合成によって調製したスクワレンエポキシドを用いて、組換え酵素による反応に供した。その結果、1H NMRを測定できる程度の産物が得られた。解析の結果、完全な構造決定には情報が不足していたものの、臭素を含むある種のトリテルペノイドに非常に近い構造であることが判明した。新規付着阻害物質を探索するため、紅藻のみならずラン藻も対象に広げてスクリーニングを実施した。その結果、サウジアラビアで採集したOkeania sp.にタテジマフジツボ幼生に対するきわめて強い付着阻害活性が見いだされた。活性物質の精製を試みたところ、付着阻害活性は示さないが塩素を有する環状化合物と、不活性かつハロゲンを含まないアシルアミド、および顕著に付着を阻害するドラスタチン16を単離した。ドラスタチン16の全合成にも成功し、合成品も付着阻害活性が高いことと細胞毒性を示さないことを確認した。また、マレーシアで採集したMoorea bouilloniiから上記アシルアミドに近い構造で塩素を有する化合物を単離した。平面構造を決定した後、立体配置を検討している。アミノ酸残基中の立体配置は常法により決定できたが、長鎖アシル基中の塩素が結合している不斉炭素の立体配置決定は現在検討中である。マギレソゾのバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼについては、これまでより大量の組換え酵素を使って反応を検討できるようになり、反応に用いる前駆体を有機合成で調製できており、大きく前進した。一方、次世代シークエンサー解析については、質の高いサンプルを準備できていないので、進捗していない。顕著な付着阻害活性を示すドラスタチン16の全合成に成功したことは大きな成果である。また、ラン藻も研究対象に加えることにより、興味深い塩素を有する化合物が得られて、今後の発展が期待できる。ハロゲン化合物を生産する紅藻ソゾ類の生合成酵素解明のためRNA-seq解析を試みることとした。しかしながら、採集藻体を分析すると多くの生物が混入して解析が困難になるため、単藻培養を実施した。数種について培養を試みたが難航した。ついにローレンシンを生産するウラソゾの四分胞子の放出が確認され、そこから単藻培養に成功した。得られた藻体からRNA-seq解析を実施した。その結果、非メバロン酸経路、セスキテルペンサイクレース、バナジウム依存性ブロモペルオキシダーゼなどの酵素遺伝子を取得することができた。また、天然藻体の解析結果と比較することで、天然藻体に混入している生物種を確認することができた。ソゾの生産するトリテルペノイドの臭素化反応を精査するために必要な前駆体を合成した。サウジアラビアで採集した藍藻Okeania sp.から塩素を有するペプチドであるlyngbyabellin類を単離し、2種の新規化合物について絶対立体構造を含めて決定することができた。既知化合物を含めて4種のlyngbyabellin類についてタテジマフジツボのキプリス幼生に対する付着阻害活性とMCF-7に対する細胞毒性を調べたところ、顕著な活性が認められたが、活性に重要な構造が異なることが明らかになった。マレーシアで採集した藍藻Moorea

bouilloniiから単離した塩素を含む脂肪酸アミドであるcolumbamide類について、その絶対立体構造を明らかにするためcolumbamide Dの可能な4種の立体異性体を全合成した。その結果、キラルHPLCで比較することによって、絶対立体構造を明らかにすることができた。ソゾの単藻培養に成功し、次世代シークエンサーによるRNA-seq解析を終了することができて大きく前進した。マギレソゾのバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼについて、酵素の調製、前駆体の調製などが順調に進んでいる。ラン藻の塩素を有する化合物については、絶対立体構造の解明や細胞毒性とは別の構造が必要な付着阻害活性を見いだすことができて、大きく前進した。含ハロゲントリテルペノイドを生産する紅藻マギレソゾに含まれるハロゲン化酵素の性状解明を目指した.まず,合成した推定生合成前駆体のスクワレンテトラエポキシド,紅藻に含まれるトリテルペノイド類の同時分析方法を種々検討した結果,APCIのイオン源を用いるLC/MSによる方法を確立した.次にマギレソゾのバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼであるLsVBPO2の大腸菌による組み換え酵素の精製方法を種々検討した結果,これまでより高活性の酵素を安定的に精製することに成功した.以上をもとにスクワレンテトラエポキシドをLsVBPO2との反応に供し,LC/MSによる分析を行ったところ,臭素化された化合物2種と酸化のみ進んだ化合物1種が得られた.生成物の大量分取を試みたが,NMRで構造を同定するのに十分な量は得られなかった.そこで,反応条件を詳細に検討した.その結果,pHを6.0から7.5に変えることで反応率が2.3倍に上昇した.溶液の組成を変更して2倍に反応効率を増加させた.さらに,酵素濃度をあげるとそれに応じて反応が進んだ.さらに,以前は反応の容量を大きくすると反応効率が下がっていたが,その他の条件を最適化した上で,反応容量を大きくすると,それに応じて反応が進んだ.また,これまでは反応時間が長すぎることもわかった.以上のことから,大スケールの反応を実施するための条件が整った.別種のソゾが生産する臭素を含むオマエザレンを付着阻害物質として報告しているが,活性機構解明を目指して各種類縁体,構造の一部を除いたもの,蛍光官能基を結合させた化合物などを合成して,付着阻害活性を評価した.最終年度において,マギレソゾのバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼの反応産物を明らかにできる準備が十分整ったため.ソゾのハロゲン化合物の生合成研究を推進すると共に、構造決定困難な塩素を直鎖に有する化合物の立体化学解明に挑戦する。進捗していない次世代シークエンサー解析に必要な上質のサンプルを得るため、ソゾの培養実験を進める。マギレソゾのバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼと反応前駆体の調製が進んでいるので、その反応解析に注力する。マギレソゾのバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼの反応産物を明らかにして,ブロモペルオキシダーゼの天然物生合成における役割を示す論文発表を行う予定である.また,計画に沿って,これまで得られた付着阻害物質の類縁体合成,およびラン藻の新規ハロゲン化合物の構造決定を進める.
新酒泡盛の官能検査のための迅速前処理方法の開発

沖縄県の蒸留酒である泡盛は、独特の香味を呈する本格焼酎として知られている。最近では、泡盛を3年以上熟成させた古酒(クース)は、新酒に比べて味、香りもまろやかになることから、県内外で注目されている。一方、蒸留したての新酒泡盛は発酵過程で生産された硫黄化合物、遊離脂肪酸等の成分も含んでおり油臭や独特の臭気を呈するため官能検査を行うためには、特異臭を除去する必要がある。本研究では、蒸留したての新酒泡盛から官能検査阻害物質を除去し、迅速に官能検査が行なえる手法の検討を行うことを目的とした。まず、本研究では、泡盛酒造所の協力を得て、(1)蒸留直後の泡盛、(2)濾過前の泡盛、(3)濾過後の泡盛のサンプルをいくつか入手した。これらのサンプルについて、バニリン、4-ビニルグアヤコール(4-VG)など香味成分と低級アルコール、エチルエステル類など香気成分をUPLCならびにHS/GCにより定量を行った。ガス臭は、芳香族アルデヒドであるフルフラールを、油臭はTBA価をその指標として分析を行った。珪藻土を主体とする濾過材を用いて官能検査阻害物質の除去を試みたところ、遊離脂肪酸や脂肪酸エステル類を効率よく吸着でき、ガス臭であるフルフラールの濃度を低減させることはできるものの、官能検査を行えるほど低減させることは困難であった。特に、古酒の豊潤な香り成分を形成する脂肪酸エチルエステルやバニリンの前駆体である4-VGの吸着が著しく、濾過材による吸着のみでこれらを除去することは、困難であることが明らかとなった。そこで本研究では統計解析の手法を導入し、新酒泡盛74銘柄の成分分析ならびにその解析から、新酒泡盛を特徴づける12成分を抽出した。濾過試験に供したサンプルのほか、12成分をもとに作成した模擬泡盛について系統解析を行ったところ、酒質の特徴付けを行うことができ、官能検査においても酒質の方向性を見出すことができた。
画像解析装置による遺伝子発現解析を用いた細胞間相互作用解析システムの開発

本試験研究は、心臓における遺伝子・機能発現をより詳細に検討するため、in vivoの細胞間相互作用を保った混合培養系を作成し、光学顕微鏡下に細胞の遺伝子・機能発現を解析するシステムを作成することを目的とした。1)培養系の確立新生ラット、成熟ラットより心筋細胞、微小血管内皮細胞を単離培養し、種々の単培養、混合培養系を、顕微鏡系での観察可能なガラスチャンバー上に作成、その表現型を検討した。2)遺伝子導入従来のcell lineとは異なる、これら初代培養の心筋細胞への遺伝子導入を試みた。当初計画していたインジェクター購入が不可能であったため、リン酸カルシウム法、エレクトロフォレーションなどを検討し、リポフェクション法の改変により収率良く、遺伝子導入が可能となり、心筋特異的遺伝子発現調節領域の検討が可能となった。3)顕微鏡系の作成遺伝子発現の検出としてルシフェラーゼアッセイ、心筋細胞の機能発現の検出として細胞内カルシウム濃度をそれぞれ顕微鏡下で観測するため、微弱光検出装置、ならびに落射蛍光検出装置を付属させた倒立顕微鏡系を作成した。さらに、ステージ上での細胞機能の保持、インターベンションの負荷を可能とさせるため、微量高速潅流装置を付属させた。4)機能発現心筋細胞系での遺伝子、機能発現解析の端緒として、筋小胞体のカルシウム放出チャネルに着目し、in vitroでの遺伝子導入(2))に続いて、同細胞での細胞内カルシウム動態の画像解析を行った。時間経過を詳細に検討するため画像メモリーの増加が必要であったが、遺伝子導入細胞でのダイナミックな変化を記録することが可能であった。光学的特性の差異により、微弱光測定と蛍光測定を同時に行うことが不可能なため、今後実験プロトコールの改良と、心筋細胞における他の遺伝子・機能発現系への応用を検討中である。1)混合培養系の確立成熟ラット心臓より心筋細胞、冠微小循環内皮細胞を単離し、長期間の単培養、混合培養を行った。この際、2)の光学系への応用上、ガラススライドグラスを底面に持つ培養器を用いたが、ガラスのアルカリ処理ならびに、ラミニン被覆を行うことにより従来のプラスティック培養器と同様の細胞表現型を得られた。さらに、培養器全体を含む気相灌流可能な密閉容器を作成し低酸素-再酸素負荷などの予備実験を行った。しかし、マイクロマニピュレーターが購入不可能であったため、細胞内への遺伝子導入に関しては、従来法により発現ベクター、基質、プローベなどの導入を試みている。単離心筋細胞の特異性より、従来のDEAE-デキストラン法にては細胞死をもたらし、リポフェクション法の効率化を試みている。2)光学系の作成1)において確立した培養系の位相差像、ならびに、光子の積算像を浜松ホトニクス社のArgusシステムを用いて得ることが可能であった。素材と残存自家発光との検討を行い、一定のS/N比の下に、本培養系では従来のプラスティックを用いた上述の密閉容器を用いても有意な光子画像を得られることを確認した。しかし、当初の計画と異なり解析装置の記憶容量が不足しているため、動態画像の解析には記憶容量の追加が必要となった。本年度は、昨年度までに確立した初代培養細胞系、初代培養細胞への遺伝子導入、作成した光学系を用いて、実際に培養心筋細胞系における遺伝子・機能発現の検討を行うことを目的として研究を進めた。1)光学顕微鏡系の改良心筋細胞の機能発現として、先ず、心筋内カルシウム濃度を検討するため、微弱光検出装置とともに、落射蛍光検出装置を付属させた。さらに、ステージ上での心筋細胞機能の保持、インターベンションの負荷を可能とさせるため、微量高速灌流装置を付属させた。

また、細胞内でのカルシウム動態を経時的に記録するため、画像メモリーを増加させた。2)心筋細胞の遺伝子・機能発現心筋細胞系での遺伝子・機能発現解析の端緒として、筋小胞体のカルシウム放出チャネルに着目した。リポフェクション法を改変することにより、心筋細胞の初代培養細胞にカルシウム放出チャネル遺伝子の5'調節領域をサブクローニングしたルシフェラーゼアッセイベクター導入し、その遺伝子発現の検出に成功した。さらに、カルシウム放出チャネル遺伝子を導入した細胞における、細胞内カルシウム動態の画像解析を顕微鏡系を用いて行い、遺伝子導入細胞でのダイナミックな変化を記録することが可能であった。本顕微鏡系においては、光学的特性の差異により、カルシウム放出チャネルの微弱光測定による遺伝子発現測定と蛍光測定による機能発現測定とを同時に行うことは不可能であったが、今後、混合培養系、交感神経刺激などの負荷条件下、心筋細胞における種々の蛋白質の遺伝子・機能発現の検討に応用する予定である。
慢性関節リウマチに伴う骨破壊・骨量減少の機序とサイトカイン結合プチペドによる制御

慢性関節リウマチ(RA)の特徴的病変は滑膜増殖と骨破壊といえる。RA滑膜炎局所ではサイトカインやケミカルメディエーター、蛋白分解酵素が産生されており、破骨細胞の誘導、活性化や骨、軟骨基質の融解により骨破壊と関連すると考えられている。しかし、RAの炎症性肉芽(パンヌス)が骨を破壊する機序は不明で、また滑膜炎が周囲の骨髄や骨組織におよぼす影響についても明らかでない。今回、骨髄細胞培養系でサイトカイン等の活性物質非存在下で、骨髄液を添加することによりin vitroで骨吸収活性を定量的に評価する系が確立できた。この実験系からアジュバント関節炎モデルでは、骨髄培養で前骨芽細胞の減少、破骨細胞形成亢進がみられ、この骨形成一骨吸収連鎖不均衡の一因として骨髄で増加しているIL-1等のサイトカインの重要性が示唆された。一方、関節炎に伴う骨破壊や骨量減少の治療として、サイトカインを直接抑制する可能性が考えられる。IL-1とTNFαはRAにおける滑膜増殖や骨破壊に重要な役割を果たしていると考えられる。IL-1抑制療法の一つとして、ヒトtype IIL-1RのIL-1結合部位を同定し、IL-1と特異的に結合しin vivo,in vitroでIL-1の作用を抑制する8つのアミノ酸からなるペプチド(IL-1 bindingpeptide:IL-1BP)を開発した。本研究で実験的関節炎動物にみられる骨髄の骨形成能低下や骨吸収能活性亢進状態がIL-1BP治療により改善し、骨髄液中の破骨細胞誘導因子の抑制もみられた事からは,IL-1BPがRAにみられる骨量低下に有効である可能性が示唆される。また、同様に21個のアミノ酸からなるペプチドがTNFαと結合することを見いだし、その骨吸収抑制作用、関節炎抑制作用について検討中である。一方、破骨細胞様細胞がRAのパンヌス-骨接合部や急速破壊型股関節症の肉芽種組織中にみられることが注目されている。今回、滑膜細胞を特殊なsurface上で培養することにより、形態学的、機能的に破骨細胞と同じ特性を持つ細胞がin vitroで形成でき、今後、骨破壊の機序や治療法の研究に有効と考えられる。1.IL-1抑制薬の関節炎及び関節炎にともなう骨量減少に対する改善効果ラットアジュバント関節炎(AIA)を用いIL-抑制ペプチド及びIL-1抑制作用のあるmethotrexate(MTX)の関節炎、骨代謝動態の変化、骨量減少に対する効果を検討した。アジュバント接種後、9日目より多関節炎を認め、その時期に一致して骨髄細胞培養における骨髄細胞からのosteogenic precursor cell colony(fibroblast-colony forming unit:FCFU)形成の低下と破骨細胞の形成亢進がみられた。大腿骨、脛骨とも関節炎近傍部を中心に骨密度が低下した。IL-1抑制ペプチド(human type I IL-1 receptorの86-93の部分の誘導体)腹腔内投与(4mg/kg/day以上)あるいはMTXの経口投与(3mg/kg/week)で関節炎の抑制及び骨髄細胞の骨形成能の増加と骨吸収能抑制がみられ、骨密度の増加もみられた。

以上から、IL-1を直接的あるいは間接的に抑制することにより関節炎に伴う骨代謝異常と骨量減少が改善することが明らかとなった。2.培養ヒト滑膜細胞による骨吸収RA患者滑膜組織より滑膜細胞を分離し、in vitroで破骨細胞様細胞を誘導した。この多核巨細胞はCD68陽性で滑膜のマクロファージ様細胞より分化したものと考えられた。電顕ではruffled borderを有し、ライソゾームが著明に発達しており、象牙片上で吸収窩を形成した。本細胞の分化や機能抑制により慢性関節リウマチの骨破壊を抑制できる可能性があり、現在、IL-1抑制薬などで検討中である。慢性関節リウマチ(RA)の特徴的病変は滑膜増殖と骨破壊といえる。RA滑膜炎局所ではサイトカインやケミカルメディエーター、蛋白分解酵素が産生されており,破骨細胞の誘導、活性化や骨、軟骨基質の融解により骨破壊と関連すると考えられている。しかし、RAの炎症性肉芽(パンヌス)が骨を破壊する機序は不明で,また滑膜炎が周囲の骨髄や骨組織に及ぼす影響についても明らかでない。昨年度,アジュバンド関節炎モデルでは,骨髄培養で前骨芽細胞数の減少、破骨細胞形成亢進がみられ、この骨形成一骨吸収連鎖不均衡の一因として骨髄で増加しているIL-1等のサイトカインの重要であることを明らかにした。サイトカイン抑制療法の一つとして,ヒトtypeIIL-1RのIL-1結合部位を含む8つのアミノ酸からなるペプチド(IL-1bindingpeptide:IL-1BP)がアジュバント関節炎にみられる骨量低下に有効であったことから,同様な手法で21個のアミノ酸からなるペプチドがTNFaと結合することを見いだし,その骨吸収抑制作用,関節炎抑制作用について検討中である。一方,破骨細胞様細胞がRAのパンヌス-骨接合部や急速破壊型股関節症の肉芽腫組織中にみられることが注目されている。今回,ヒト滑膜細胞を特殊なsurface上で培養することにより,誘導因子や間質細胞の非存在下で破骨細胞様細胞がin vitroで形成できた。本細胞はマクロファージの表面マーカーをもち,V-ATPase,TRAP,カテプシンが陽性で,強力な破骨細胞能を有していた。変形性関節症の滑膜組織からも同様な破骨細胞様細胞が形成されるが,RA滑膜組織由来の破骨細胞は6ヶ月以上に渡って培養維持が可能で,またTRAP活性も有意に高かった。現在,破骨細胞の機能抑制やアポトーシス誘導の検討しており,RAにおける骨破壊の機序や治療法の研究に有用と考えられる。
新噴出火山灰による農林災害の火山別特性に関する比較研究

火山は、本年度(1991)も雲仙普賢岳、ピナトゥボ山のように地球規模で活発で人命の損失をはじめ、経済活動に重大な影響がでた。ここでは北海道、関東、九州(新たに雲仙関係を追加)の火山を対象に研究を行った。(1)新噴出火山灰付着成分の化学性:桜島降灰(採取地鹿児島大・鹿児島市内)は経年変化を示し、各ピ-ク値でみると1991.41992.1でpHが3.22(かなりの低下)、イオン類ではF^ーが554mg/Kg(上昇)、Cl^ーが1440mg/kg(上昇)、SO_4^<2->は2250mg/kg(前年並)であった。水圏に可溶性成分として供給された量はフッ化物イオン1070t/y、塩化物イオン2970t/y、硫酸イオン7550t/yと推定された。北海道有珠山の1977年の新噴出火山灰では、pH:6.71、Cl^ー:103mg/kg、SO_4^<2->:50mg/kgであった。雲仙のF^ーとCl^ー溶出量は桜島より極めて少なかった(採取前に雨に濡れか)。(2)農作物の被災地のリモ-トセンシング解析:(1)伊豆大島噴火後の森林被害地ではランドサットバンド4の反射特性が大きく低下し、その値はスコリア堆積量に反比例した。(2)桜島火山灰の作物の葉面堆積量は分光反射特性値により推定可能で、その算定式を提案した。(3)新噴出火山灰の農作物の生育抑制機構と被害発生予測法の検討:(1)土壌に灰を混和させても伸長した根を土層とは空間をおいた水耕液に直接導くと灰の影響が全く出ない場合が認められた。これは栽培の新方式の芽となりうる。(2)被覆面の堆積灰の影響:遮光は作物の生育を抑制し、遮光の悪影響は長期ほど顕著であった。(3)桜島、雲仙の灰を株元に堆積されたカブの栽培では、根部に形状異常が発現した。(4)灰で汚れたプラスチックフィルムの光透過率は、フィルム面からの距離が離れるほど小となる。(5)雲仙火砕流による植物焼失限界は(温度*接触時間)と葉内水分量で決まり、生理機能の高温破壊が認められた。