hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
部分的脾動脈塞栓術と自己骨髄細胞投与療法を組み合わせた新規肝線維化改善療法の開発

その後、四塩化炭素(CCl4)の腹腔内反復投与により作成された肝硬変マウスにPSLを施行し(LC/PSL model)、過去に我々が報告した「肝硬変マウスに対する脾摘モデル(LC/SP model) (J Gastroenterol. 2011)」と比較・検討する。続いて、肝硬変症(HBV, HCV,アルコール)に対するPSE症例を対象として、「肝線維化」に関連する各種サイトカイン・増殖因子の術前後の変化を血清学的・組織学的に解析する(臨床研究)。「肝硬変マウスに対するPSL(基礎研究)」の検討結果と比較することで、PSLやPSEの肝線維化に及ぼす影響およびそのメカニズムについて証明する。さらには、非代償性肝硬変患者に対する新規肝線維化改善療法「PSE先行ABMi療法」の開発を見据えて「PSL先行骨髄細胞投与モデル(PSL/BMI model)を作成し、GFP/CCl4モデルすなわち「骨髄細胞投与モデル(BMI model)」と比較することで、PSLとBMIが「肝線維化改善」にもたらす相乗効果を証明する。平成24年度の研究費において、「部分的脾動脈結紮術(PSL)マウスモデル」開発後の諸実験に必要な試薬・消耗品を購入予定であったが、モデル確立に至らなかったため未使用額が生じた。次年度は、動物モデルの作成および動物実験に必要な物品費、飼育費、試薬費として研究費を使用する予定である。また、臨床研究でPSEを施行する際に必要な物品(プロテクター・グラスなど)に対しても出費予定である。さらに、国内・国際学会に参加して知識・情報を習得し、研究成果の論文化にあたってnative check(英文校正)に提出予定である。
中枢神経疾患後の機能障害の進行と回復過程への学習メカニズムの関与

1)「機能」の回復と「使用」の回復のモデル構築と行動実験:本項目では、「機能」と「使用」の関係を明らかにできるような行動実験パラダイムを構築することを目指す。具体的には、課題の遂行が困難になるような外乱を片方の手に加えることで機能低下をシミュレートし、仮想的な片麻痺を作り出す。その状態で、左右どちらの手でも遂行できる課題を課したときの、仮想麻痺手の外乱に対する適応と、左右の手の選択確率の推移を観察する。本年度は、マニピュランダムを使用した実験データについて論文執筆に着手した。2)麻痺手の使用を促進する訓練システムの開発と検証:麻痺手の機能を訓練する手法は多く提案されているが、麻痺手の使用確率の向上をメインのターゲットとした訓練手法はあまり提案されていない。本項目では、左右どちらの手を使ってもよいからできるだけ速く正確にターゲットをヒットするという課題に、難易度を調整したり麻痺手をアシストしたりして、行動変容(使用確率向上)に貢献し、使用を促進する訓練装置を開発することを目的としている。本年度は、末梢へ電気刺激を加えて選択を変化させる実験システムの準備を進めた。また、VRを使用した訓練システムの構築にも着手した。3)脳刺激による麻痺手の使用向上可能性の探索:経頭蓋直流電気刺激により、一過的に脳活動を調整することが可能である。一般的に、陽極刺激は脳活動を促進し、陰極刺激は抑制すると言われており、それに対応して、運動野に陽極をおいた場合はその対側の手が使われやすく、陰極をおいた場合は同側の手が使われやすい傾向にあることが報告されている。本年度は、運動野より高次な選択の中枢と考えられている頭頂葉をターゲットとした刺激を行う予備実験を進めた。左右の頭頂葉にそれぞれ陰極と陽極を配置し、左右の手の選択確率が変化するかを検証するデータを取得中である。昨年度は立ち上げのため進捗が遅れていたが、今年度はほぼ実験環境が整ったため、本格的な実験を実施できるようになった。本研究に関わる大学院生も確保できたため、予備実験を開始した。昨年の遅れを取り戻すところまでではないが、比較的順調に進捗した。1)「機能」の回復と「使用」の回復のモデル構築と行動実験:既存のデータの論文化を進めるとともに外部での発表も積極的に行った。2)麻痺手の使用を促進する訓練システムの開発と検証:実験環境が整い、さまざまな試みができるようになった。また、VRの導入に向けて準備を進めている。3)脳刺激による麻痺手の使用向上可能性の探索:倫理審査会の承認も得て、予備実験を重ねた上で本実験を開始した。本年度は、すでに取得したデータについては、論文化を進め、その他については本実験を進める。また、新たな試みとしてVRを使った実験環境や訓練環境のプロトタイプを構築することを目指す。また、学会発表などのアウトリーチにも積極的に取り組む。1)「機能」の回復と「使用」の回復のモデル構築と行動実験:論文執筆を進め、投稿を目指す。並行し、VRを使って視覚運動変換を加える実験パラダイムを検討する。2)麻痺手の使用を促進する訓練システムの開発と検証:末梢への電気刺激を使用して左右の手の選択にバイアスを加える実験に本格的に着手する。その他、バイアスを加えられそうな介入手法を検討する。また、VRを使った訓練システムのプロトタイプに着手する。3)脳刺激による麻痺手の使用向上可能性の探索:手の選択(意志決定)に関与することが報告されている左右の頭頂葉にそれぞれ陰極と陽極、またその逆の経頭蓋直流電気刺激を付加し、選択のバイアスが起こるかを検証する本実験を進める。本年度は、予備実験データについて、モデル化に向けた解析を行った。本年度は、主に、装置の設定と実験プログラムの開発を実施した。また、手などの末梢への刺激を利用して選択を誘導する可能性について検討した。

本項目では、刺激と訓練と組み合わせることで、麻痺手を使うことを習慣づける、すなわち選択確率を学習する、といったことが促進できるかどうかを検証することを目指しており、本年度は、実験装置を導入し、実験の設定を行った。研究代表者がATRから早稲田大学に異動し、4月研究室がゼロからの立ち上げとなり、また、ポスドクや大学院生、助教などの研究に関われる人材を配属できなかったため、全体的に遅延している。また、閉鎖空間で実験できる実験室が配備されていなかったため、本格的な実験は開始できなかった。実験装置については年度末にほぼ整い、動作確認や実験プログラムの開発、予備的な実験を開始した。1)「機能」の回復と「使用」の回復のモデル構築と行動実験:ロボットで外乱を付加するような大型実験装置の設置は現時点、現環境では困難であることが判明し、ATRで取得したデータの解析を行った。2)麻痺手の使用を促進する訓練システムの開発と検証:異動に伴い実験装置やプログラム開発環境を再構築する必要があり、また、ハード、ソフトともに、以前の設定は古くなっており、環境をアップデートしたため、設定に時間を要した。3)脳刺激による麻痺手の使用向上可能性の探索:経頭蓋直流電気刺激を導入し、操作法の習得、予備的実験を実施したが、介入実験と見なされるため、本格的な実験の実施には倫理審査会の承認が必要であり、本格的な実験には至らなかった。1)「機能」の回復と「使用」の回復のモデル構築と行動実験:本項目では、「機能」と「使用」の関係を明らかにできるような行動実験パラダイムを構築することを目指す。具体的には、課題の遂行が困難になるような外乱を片方の手に加えることで機能低下をシミュレートし、仮想的な片麻痺を作り出す。その状態で、左右どちらの手でも遂行できる課題を課したときの、仮想麻痺手の外乱に対する適応と、左右の手の選択確率の推移を観察する。本年度は、マニピュランダムを使用した実験データについて論文執筆に着手した。2)麻痺手の使用を促進する訓練システムの開発と検証:麻痺手の機能を訓練する手法は多く提案されているが、麻痺手の使用確率の向上をメインのターゲットとした訓練手法はあまり提案されていない。本項目では、左右どちらの手を使ってもよいからできるだけ速く正確にターゲットをヒットするという課題に、難易度を調整したり麻痺手をアシストしたりして、行動変容(使用確率向上)に貢献し、使用を促進する訓練装置を開発することを目的としている。本年度は、末梢へ電気刺激を加えて選択を変化させる実験システムの準備を進めた。また、VRを使用した訓練システムの構築にも着手した。3)脳刺激による麻痺手の使用向上可能性の探索:経頭蓋直流電気刺激により、一過的に脳活動を調整することが可能である。一般的に、陽極刺激は脳活動を促進し、陰極刺激は抑制すると言われており、それに対応して、運動野に陽極をおいた場合はその対側の手が使われやすく、陰極をおいた場合は同側の手が使われやすい傾向にあることが報告されている。本年度は、運動野より高次な選択の中枢と考えられている頭頂葉をターゲットとした刺激を行う予備実験を進めた。左右の頭頂葉にそれぞれ陰極と陽極を配置し、左右の手の選択確率が変化するかを検証するデータを取得中である。昨年度は立ち上げのため進捗が遅れていたが、今年度はほぼ実験環境が整ったため、本格的な実験を実施できるようになった。本研究に関わる大学院生も確保できたため、予備実験を開始した。昨年の遅れを取り戻すところまでではないが、比較的順調に進捗した。
早期胃癌に対する内視鏡治療の組織学的適応基準の最適化を目指した病理組織学的解析

現在の早期胃癌に対する内視鏡治療はリンパ節転移リスクの少ない分化型癌を主な対象としているが、Glypican3を発現する胃癌は分化型が多いもののリンパ節転移リスクが高いなどの特徴を有する高悪性度胃癌であることを示し、適応には慎重な判断が必要であると考えられた。一方Epstein-Barr Virus関連胃癌は未分化型が多いがリンパ節転移リスクは極めて低く、内視鏡治療に適していることを示した。早期胃癌に対する内視鏡治療の適応基準の最適化を目指して、胃癌のリンパ節転移や遠隔転移をはじめとずる悪性度の指標となる所見、マーカーを見出すため、当施設の胃癌症例のreview、tissue micro arrayを用いた免疫組織学的マーカーの検索を行った。926例の胃癌症例を検討した結果、特に有用なマーカーの一つとしてGlypican 3を見出し、今年度はこれを中心に解析を進めた。胃癌の11%がGlypican 3陽性であったが、早期胃癌の中で術後経過観察中に転移をきたして再発した例はすべてGlypican3陽性であった。また早期胃癌においてGlypican 3陽性例は陰性例に比して有意にリンパ管侵襲、静脈侵襲が高率であった。Glypican 3陽性例は組織像にも特徴があり、日本の胃癌取扱い規約分類ではpor1,pap,tub2の像を示し、特にclear cell pattem,hepatoid atternを示す例の大部分はGlypican 3陽性であった。AFP産生胃癌は早期から肝転移を起こし得る予後不良な胃癌で、分化型であっても内視鏡治療の適応外とすべきであるが、血清値や免疫染色で早期よりAFPを同定することは困難な場合が多い。今回の検討では25例のAFP産生胃癌は全例Glypican 3陽性であり、Glypican 3の方がより早期より発現がみられることから、Glypican 3陽性胃癌の一部が進行とともにAFP産生性となる可能性が考えられた。Glypican 3は血清マーカーとしての有用性も肝細胞癌などで示されており、胃癌においても早期より高悪性度胃癌を検出する血清および免疫組織学的マーカーとなり得ると考えられた。これらの結果は2008年の日本胃癌学会総会で発表し、現在投稿準備中である。926例の胃癌症例の検討では、早期胃癌で術後経過観察中遠隔転移をきたした例はすべてclear cell type,あるいはhepatoid typeの組織像を示していた。これらの組織像を示す胃癌の一部はAFP産生を示すことが以前より知られていたが、本研究者はこれらの高悪性度胃癌のより高感度なマーカーとしてGlypican3を見出した。926例の解析からGlypican3を発現する胃癌は分化型胃癌に多く、脈管侵襲の頻度が高く、リンパ節転移をきたしやすいことを明らかにし、これらの成果をCancerScience誌や胃癌関連の学会で発表した。内視鏡治療の適応となる分化型早期胃癌でも、Glypican3陽性例に対しては慎重に適応を検討する必要があると考えられる。一方、現時点では未分化型胃癌は内視鏡治療の対象外とする施設が多いが、今後は未分化癌の中でもリンパ節転移を来しにくい群を抽出し、安全な内視鏡治療の適応拡大を検討することが求められている。本研究者は胃癌の約10%を占めるEpstein-Barrウイルス(EBV)関連胃癌に注目し、内視鏡治療適応の可能性について検討した。EBV関連胃癌はリンパ球性間質を伴う未分化型胃癌の組織像を示すことが多いが、一般に比較的予後良好な胃癌と考えられている。1990年以降の早期胃癌から70例のEBV関連胃癌を見出し、臨床病理学的検討を行ったところ、EBV陰性胃癌と比較してリンパ管侵襲、静脈侵襲ともに低頻度であった。リンパ節転移例は粘膜下層浸潤距離が2mm以上の2例のみであり、内視鏡治療の対象となり得るsmlまでの病変であればリンパ節転移の可能性は非常に低いと考えられた。EBV関連胃癌は内視鏡治療のよい適応病変である可能性を示したが、今後はより多数例での検討が必要である。
バキュロウイルスの全身感染効率を規定する新たな分子メカニズムの解明

バキュロウイルスは全身感染性の昆虫ウイルスで、actin rearrangement-inducing factor 1遺伝子(arif-1)により宿主体内における感染拡大効率を飛躍的に向上させているが、その詳細な分子メカニズムは不明であった。本研究では、ARIF-1に様々な変異を導入することで、ARIF-1の機能に重要なアミノ酸領域を同定した。また、感染組織の詳細な観察から、これまで想定されていなかった新規の感染ルートを発見し、ARIF-1が新規感染ルートからの感染に必須な因子であることを突き止めた。Actin rearrangement-inducing factor 1 (ARIF-1)はチョウ目昆虫特異的に感染するバキュロウイルスに保存された4回膜貫通型タンパク質である。昨年、私達はARIF-1が宿主昆虫への感染においてウイルスの全身感染効率を向上させる機能を持つことを明らかにしたが、その詳細なメカニズムは不明であった。そこで本研究では、ARIF-1が作用する分子メカニズムを解明し、それをin vitroの感染実験系で実証することを目標とする。H27年度は、ARIF-1に様々な変異を導入した組換えウイルスを用いることで、ARIF-1の機能に重要なアミノ酸領域の特定を試みた。その結果、ARIF-1の機能に重要であるアミノ酸領域を2箇所特定し、さらにそのうちの1箇所について、その機能に必須なアミノ酸残基を5つ明らかにした。また、ウエスタンブロッティングによる解析の結果、ARIF-1は細胞膜画分で検出されること、感染の進行に伴い何らかの修飾を受ける可能性があること、機能欠損変異を導入したARIF-1においては修飾の割合が著しく低下することが判明した。以上の結果から、細胞内外のアミノ酸領域を介して修飾を受けることがARIF-1の機能に重要であると推測される。また、ARIF-1の機能をin vitroで実証するための基盤として、組織培養系および3D培養系の確立を目指した。しかしながら、現時点では摘出した気管組織や培養細胞の凝集体において、ウイルス感染の内部への進行がほとんど見られなかったことから、培養条件等をさらに検討する必要がある。H27年度はまず、C末端GFP融合ARIF-1発現BmNPV(ARIF-GFPウイルス)をベースにARIF-1を部分的に欠損させた組換えウイルスを新たに作製し、フェノタイプへの影響を調査した。その結果、ARIF-1の細胞外ループ2およびC末端のPro-rich領域がARIF-1の機能に重要であることが判明した。また、さらなる解析の結果、細胞外ループ2においてチョウ目特異的NPVで完全に保存された5つアミノ酸残基がARIF-1の機能に重要であることが明らかになった。ARIF-1の機能に重要なアミノ酸領域を特定できたことは、ARIF-1の作用機序の解明へとつながる大きな進捗であると言える。次に、感染細胞および組織より得られたタンパクサンプルを用いてウエスタン解析を行った。まず、ARIF-GFPウイルス感染BmN細胞を経時的にサンプリングし、抗GFP抗体を用いてウエスタンブロッティングを行ったところ、ARIF-1は細胞膜画分にて検出された。また、感染の進行に伴いバンドシフトが見られたことから、ARIF-1は感染の進行とともに何らかの修飾を受ける可能性が示唆された。さらに、C末端欠損ウイルスや点変異ウイルスにおいてはバンドシフトの程度が大きく低下することが明らかになった。同様の結果はARIF-1が機能する主要な組織である気管由来のサンプルからも得られたことから、ARIF-1は細胞外ループ2の保存されたアミノ酸残基およびC末端のPro-rich領域を介して何らかの修飾を受け機能すると推測される。また、H27年度はARIF-1の機能をin vitroで実証するための基盤として、組織培養系および3D培養系の確立を目指した。Actin rearrangement-inducing factor 1 (ARIF-1)はバキュロウイルスの4回膜貫通タンパク質で、宿主昆虫の組織におけるウイルス感染拡大効率を格段に向上させることを明らかにしたが、その詳細なメカニズムは不明であった。そこで本研究では、ARIF-1が作用する分子機構を解明し、それをin vitroの実験系で実証することを目標として研究を行った。平成27年度の成果により、AIRF-1の一部のアミノ酸領域がその機能や修飾に重要であることが明らかになったため、平成28年度はARIF-1の機能に重要なアミノ酸領域をより詳細かつ網羅的に同定することを試みた。その結果、ARIF-1の第1および第2細胞外ループに存在する種間で保存性の高いアミノ酸残基がARIF-1の機能に重要であり、かつARIF-1のリン酸化修飾や出芽ウイルス粒子へのリクルートに重要であることが明らかになった。一方、ARIF-1のC末端側に存在する細胞内領域も機能やリン酸化修飾に重要であり、そのうち第4膜貫通ドメイン以降の約120アミノ酸残基の領域がヌクレオキャプシドとの結合に重要であることが示唆された。また、これまでバキュロウイルスが体液中から組織内に進入する際は、気管の末端の細胞からのみ侵入できると考えられていた。しかしながら、ウイルス感染組織の詳細な観察の結果、ARIF-1が存在することで気管の非末端領域からも侵入できるようになることが明らかになった。すなわち、バキュロウイルスはARIF-1を介した新規の感染ルートという、当初の予想とは異なるメカニズムで全身感染効率を向上させていることが明らかになった。

バキュロウイルスは全身感染性の昆虫ウイルスで、actin rearrangement-inducing factor 1遺伝子(arif-1)により宿主体内における感染拡大効率を飛躍的に向上させているが、その詳細な分子メカニズムは不明であった。本研究では、ARIF-1に様々な変異を導入することで、ARIF-1の機能に重要なアミノ酸領域を同定した。また、感染組織の詳細な観察から、これまで想定されていなかった新規の感染ルートを発見し、ARIF-1が新規感染ルートからの感染に必須な因子であることを突き止めた。H27年度の研究において、アミノ酸の点変異や部分欠損により機能欠損したARIF-1を発現する組換えウイルスを作製した。そこでH28年度は、これらのウイルス感染組織を用いて共免疫沈降を行うことで、ARIF-1と結合し、その機能に重要なタンパク質を回収する。ARIF-1は気管で重要な機能を果たすと考えられるため、気管を用いて免疫沈降を行う。回収したタンパク質を質量分析計で解析することにより、ウイルスあるいは宿主由来のどのタンパク質であるか同定する。さらに、同定したARIF-1結合タンパク質の機能解析を行うことで、ARIF-1が全身感染効率を向上させる分子メカニズムの解明を試みる。BmNPVとカイコはどちらもゲノム情報やトランスクリプトーム情報、cDNAクローン等の豊富な遺伝資源が利用可能であり、また遺伝子組み換え体の作製も可能である。これらの資源や技術を活用することで、ARIF-1結合タンパク質の発現パターンや細胞内局在、カイコ組織における本来の機能を明らかにするとともに、ARIF-1が結合タンパク質に与える影響を調査する。また、H27年度は組織培養系および3D培養系の確立を目指したが、系の確立には至らなかった。考えられる原因として、1組織培養の培地が不適である、2組織の摘出自体がin vivoの感染進行の模倣を不可能にしている、3培養細胞においてはARIF-1と相互作用する宿主タンパク質が発現していない、等が考えられる。そこで、H28年度は初代培養用の培地による組織培養を試し、組織培養条件の改善を図る。また、摘出組織にウイルスを感染させるのではなく、カイコ幼虫体内でウイルスを感染させた後に感染組織を摘出し観察することで、より自然な感染条件下で組織摘出の影響を評価する。また、3D培養についてはARIF-1結合タンパク質の解析結果を元に、方針を検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。昆虫病理学28年度が最終年度であるため、記入しない。
超励起状態の関与する動的過程の理論的研究

分子イオンと電子の衝突によって引き起こされる諸過程の理論的研究を行った.イオン分子としては,H^+_2とHeH^+,およびそれらの同位体を扱った.1994年度の中心テーマは,HD^+およびH^+_2と電子の解離性再結合の理論的解析をleV以上の衝突エネルギーに拡張することである.衝突によって二電子励起共鳴状態と相互作用が生じるとその影響は大きく,この状態に遷移することで分子イオンは解離するし,振動回転励起の確率も大きくなる.衝突エネルギーが0.1eV以下の低エネルギーでは,せいぜい数個の二電子励起状態を考慮すればよかったが,エネルギーが上がると二電子励起状態のRydberg系列全体を取り扱わなくてはならない.一電子励起状態も,高振動状態はもちろん化学結合の解離極限を超えた状態が寄与しうる.この2つの問題を克服するために,多チャンネル量子欠損理論に解離状態のエネルギー離散化の手法を組み込み定式化するとともに,10eV以下のエネルギーで数値計算を実行した.その結果,解離性再結合,振動励起に加え解離性励起の断面積を得た.また解離原子の電子状態分布についてもおおまかな知見を得た.従来の方法は,分子イオンの振動状態が励起されるにしたがって急激に破綻することがわかった.結果の一部は,3月と9月の日本物理学会で発表し,日本原子力研究所の委託調査報告書としてまとめた.現在,論文を投稿準備中である.分子イオンと電子の衝突によって引き起こされる諸過程の理論的研究を行った.イオン分子としては,H^+_2とHeH^+,およびそれらの同位体を扱った.1994年度の中心テーマは,HD^+およびH^+_2と電子の解離性再結合の理論的解析をleV以上の衝突エネルギーに拡張することである.衝突によって二電子励起共鳴状態と相互作用が生じるとその影響は大きく,この状態に遷移することで分子イオンは解離するし,振動回転励起の確率も大きくなる.衝突エネルギーが0.1eV以下の低エネルギーでは,せいぜい数個の二電子励起状態を考慮すればよかったが,エネルギーが上がると二電子励起状態のRydberg系列全体を取り扱わなくてはならない.一電子励起状態も,高振動状態はもちろん化学結合の解離極限を超えた状態が寄与しうる.この2つの問題を克服するために,多チャンネル量子欠損理論に解離状態のエネルギー離散化の手法を組み込み定式化するとともに,10eV以下のエネルギーで数値計算を実行した.その結果,解離性再結合,振動励起に加え解離性励起の断面積を得た.また解離原子の電子状態分布についてもおおまかな知見を得た.従来の方法は,分子イオンの振動状態が励起されるにしたがって急激に破綻することがわかった.結果の一部は,3月と9月の日本物理学会で発表し,日本原子力研究所の委託調査報告書としてまとめた.現在,論文を投稿準備中である.
脂肪酸代謝経路の分子進化

本研究課題の目的は、脂肪酸代謝経路の生物進化の中における形成過程を、分子進化の手法を用いて明らかにしてゆく事である。本年度より脂肪酸合成酵素をその解析対象とし、研究を開始した。脂肪酸合成酵素は、生物種によってその分子構造が究めて異なっている。例えば大腸菌由来の酵素では、各機能ドメインがサブユニットを形成し多機能複合体を形成とているのに対し、真核生物由来の酵素は、1本あるいは2本のポリペプチド鎖より構成される多機能酵素として働いている。しかし、同じ真核生物であっても菌類由来の酵素と、脊椎動物由来の酵素では各機能ドメインの一次構造中における連結の順序が全く異なっている。本酵素について、各機能ドメインごとに分子系統樹を作成し、それらを統合する事によって脂肪酸合成酵素の進化史を再構築すること、また各機能ドメインの進化的起源を調査するため相同性検索を行うことを計画した。また種々のポリケタイド合成酵素が脂肪酸合成酵素と相同であることが報告されているが、その系統関係は明らかにされていないので、その調査も計画に含めた。しかし、先述の通り本酵素の分子構造は複雑であり、報告されているアミノ酸配列の類似度も究めて低いものである。そこで本年度は、上記の配列解析を行う準備のため、各機能ドメインの一次構造における位置の同定、及びそれらの各相同配列ごとの分類を計画としてあげていた。予定よりも早く計画していた作業が終了したので、予備的に各相同配列のマルチプルアラインメント及び系統樹を作成した。その結果、(1)脂肪酸合成酵素は分子系統樹上で大きく3つのグループに分類でき、各グループの分子構造は類似していること、(2)ポリケタイド合成酵素は、脂肪酸合成酵素から進化の過程で独立に数回分岐していること、(3)各機能ドメインのいくつかについては、他の代謝経路に関与する酵素と配列類似性を示すこと等が判明した。次年度は、アラインメントの精密化や、系統樹や配列類似度の統計検定を行い、解析結果のチェックを進めたい。また、本年度は脂肪酸由来の情報伝達物質であるエイコサノイドの受容体蛋白質のアラインメント及び系統関係の解析を行い論文として公表した。
アミノ酸配列相同性が著しく高いにも拘らず立体構造の異なるタンパク質の構造構築原理

ヒト血清アルブミンと結合するGAドメインとIgGのFc領域に結合するGBドメインの関連タンパク質の中で特にアミノ酸配列相同性が88%,95%, 98%と極めて高いにも拘らず互いに異なるa構造と4b+a構造をとるタンパク質を対象とし、残基間平均距離統計に基づく方法を用いて、アミノ酸配列から立体構造に関する情報を抽出を試み、さらに進化解析も行った。まず一般的方法論の確立をめざし、リゾチーム、b-トレフォイルなどのタンパク質に応用し、有効性を確認しGA・GBドメイン関連タンパク質に応用した。その結果、最終構造に重要な残基を特定した。さらにGoモデルシミュレーションも行い、本結果を検証した。平成26年度においては、当初の計画を実行した。すなわちヒト血清アルブミン結合GAドメインである2FSL(GAタンパク質、3alpha束構造)と連鎖球菌細胞表面タンパク質G由来のIgG結合GBドメイン1PGA(GBタンパク質、4alpha+beta構造)のアミノ酸配列のBLAST検索を行った。その結果、BLAST検索のみでは2つの構造を完全には識別できないことが分かった。そこで、相同タンパク質の中でも98%の配列相同性示しながら立体構造が異なる2LHGと2LHC(GAタンパク質、3alpha束構造)および2LHDと2LHE(GBタンパク質、4beta+alpha構造)を選び、アミノ酸間平均距離統計解析に基づいて、アミノ酸配列上のフォールディング部位の情報抽出を試みた。本手法はF値解析法というもので、タンパク質の構造がランダムな状態においてある残基に注目し、その残基が他の残基とコンタクトをどの程度とるか調べ、タンパク質立体構造形成の初期過程において構造を形成する部位の予測を行う。またBLAST検索の結果得られた配列に対し、それぞれの構造を示す配列群に分け、マルティプルアラインメントを作成し、保存疎水残基を特定した。保存疎水残基のうちF値解析によって得られた構造形成部位に相当するものは構造形成過程において重要であると考えられるが、2つの構造においてその特徴に大きな違いがあることがわかった。すなわち3alpha束構造の場合は、3つのへリックスを結合させる疎水パッキングを形成する残基が重要と思われるのに対し、4beta+alpha構造の場合は中央のへリックスの周りの比較的局所的な疎水パッキングが構造形成に重要であることが示唆された。この結果は予備的なGoモデルシミュレーションでも示された。平成27年度においても平成26年度に引き続き、ヒト血清アルブミン結合GAドメインである2FSL(GAタンパク質、3alpha束構造)と連鎖球菌細胞表面タンパク質G由来のIgG結合GBドメイン1PGA(GBタンパク質、4beta + alpha構造)から作られた人工タンパク質のアミノ酸配列のうち、配列相同性が極めて高いにも拘わらず立体構造が異なるタンパク質に対し、アミノ酸平均距離統計解析に基づいて、アミノ酸配列上のフォールディング部位の情報抽出を行った。この手法をF値解析法と呼ぶ。このF値解析により得られた情報と昨年度にすでに得られている保存疎水残基の情報を組み合わせ、構造形成に重要な残基の特定を試みた。当該年度はGoモデルシミュレーションを本格的に行い、フォールディング遷移状態の残基間コンタクトが、F値ピーク近傍保存疎水残基により形成されることを確認した。さらに対象タンパク質を比較的相同性の低いタンパク質に広げた。すなわち配列相同性が30%、77%、88%、95%ありながら立体構造が異なるGA・GBタンパク質を取り上げ、平成26年度に行った考察がそのまま適用されるかどうか検討した。88%相同性があり立体構造の異なるものはPDBコードで示せば、2JWS(GA88)と2JWU(GB88)、95%相同性があるものはそれぞれ、2KDL(GA95)と2KDM(GB95)である。30%および77%相同性をもつものはまだProtein Data Bankに登録されていないので、詳細な立体構造的検証はできないが解析対象とした。その結果、フォールディングに重要と思われる残基はGA98、GB98の場合と同様の結果が得られた。すなわちいずれの場合も3D構造を決める残基は類似していることがわかる。Goモデルシミュレーションでも同様の結果が得られた。平成27年度においては研究の目的は、前年度の研究結果を踏まえGoモデルシミュレーションを本格的に進めることであった。前年度の結果というものは、F値解析により、ランダム状態でのコンタクト頻度の高い残基、つまり変性状態において他の残基との相互作用の大きい残基が特定されるが、その近傍の保存疎水残基が3α束構造か4β+α構造をとるかを決定する可能性があると予測したことである。平成27年度においては、その予測結果をGoモデルによる再現を試みた。Goモデルによる結果は、予測結果を支持していることが示された。さらに比較的相同性の低いタンパク質、すなわち配列相同性が30%、77%、88%、95%ありながら立体構造が異なるGA・GBタンパク質に対象を広げ、構造形成に重要な産機を特定し、構造形成メカニズムが類似していることが推定された。このことは、当初計画通り研究が進んでいることを意味しており、研究が順調に推移していることを示している。2つのタンパク質のアミノ酸配列の相同性が高ければ、その3D構造は類似しているとされるが、最近この経験則から大きく逸脱するタンパク質がデザインし合成されている。これらはStreptococcus protein Gを基にしている。このタンパク質はヒト血清アルブミン(HAS)と結合するGAドメインとIgGのFc領域に結合するGBドメインから成る。この2つのドメインは配列相同性も低く当然立体構造は異なる。

これらの構造は3α-へリックス束と4β-シート+ α-へリックスである。本研究では、アミノ酸配列相同性が88%, 95%, 98%にのぼるが3D構造が互いに異なるGAドメイン関連タンパク質とGBドメイン関連タンパク質を取り上げる。しかしながら標準的なアミノ酸解析法では本問題の解決は困難である。本研究では、アミノ酸間平均距離統計に基づくコンタクトマップ(Average Distance Map, ADM)による方法、及びこの統計を利用して導き出した残基間ポテンシャルを用いた変性状態シミュレーションにおける残基間コンタクト頻度(F値)の計算からこの問題に取り組んだ。さらに疎水残基の進化的保存性についても解析を行った。さらにCaGoモデルによっても検証を行った。まず方法論の確立から試みた。本研究の仮説は、ADMによる予測領域が、タンパク質初期フォールディング部位であり、F値ピーク近傍の保存疎水残基がフォールディングに深く関わる残基であるというものである。この仮説はリゾチームやヘモグロビンのフォールディングについて検証された。その結果2つの構造を決める要因は疎水凝縮の強さと中央へリックスの安定性との拮抗であることが示唆された。ヒト血清アルブミンと結合するGAドメインとIgGのFc領域に結合するGBドメインの関連タンパク質の中で特にアミノ酸配列相同性が88%,95%, 98%と極めて高いにも拘らず互いに異なるa構造と4b+a構造をとるタンパク質を対象とし、残基間平均距離統計に基づく方法を用いて、アミノ酸配列から立体構造に関する情報を抽出を試み、さらに進化解析も行った。まず一般的方法論の確立をめざし、リゾチーム、b-トレフォイルなどのタンパク質に応用し、有効性を確認しGA・GBドメイン関連タンパク質に応用した。その結果、最終構造に重要な残基を特定した。さらにGoモデルシミュレーションも行い、本結果を検証した。平成26年度における研究の目的は、以下のとおりであった。(1)タンパク質立体構造データバンク(Protein Data Bank, PDB)の配列データを用い、BLASTによる相同配列検索を行い、マルティプルアラインメントを作成する。同じ立体構造をとっていることに留意しながら、保存疎水残基を特定する。(2)平均距離統計に基づいてランダム構造の残基間のコンタクト頻度を計算し、特に初期構造形成残基を推定する。さらに、保存疎水残基の位置との比較を行う。(3)保存疎水残基のうち、特に初期構造形成に寄与しそうな残基を、3alpha束構造、4beta+alpha構造それぞれにおいて特定し、構造形成機構の推定を諮る。実際に平成26年度に行ったことは、2FSL(GAタンパク質、3alpha束構造)と1PGA(GBタンパク質、4alpha+beta構造)のBLASTによる配列検索であり、これは上記(1)に対応する。
励起子共鳴領域におけるフェムト秒パルスの異常伝搬

物質中での光パルスの伝搬は、波数kとエネルギーωの分散関係がわかっていれば、基本的に理解できる。しかし、共鳴領域におけるフェムト秒パルスの伝搬では、パルスが単純に群速度で伝搬するという描像は成り立たなくなる。半導体・絶縁体での励起子共鳴領域では光パルスは励起子ポラリトンとなって物質内を伝搬するが、ポラリトン以外にも奇妙な伝搬波形が2種類観測されている。それは、ポラリトンパルスの前にそれよりも速く伝搬する比較的大きなピークと真空中の光速よりも速く伝搬しているように見える小さなピークの2つである。この2つのピークはこれまでの研究で、プリカーサーとsuperluminal伝搬パルスであることが判明した。以下に具体的な研究成果を述べる。(1)透過波形の時間分解スペクトル波形を測定し、二つのピークのスペクトル成分を調べた。この結果より、速く伝搬する成分のうち大きな方のピークは低周波数成分から構成されており、20世紀の始めに理論的に研究されていたプリカーサーであることが判明した。(2)入射パルスのエネルギー、強度、パルス波形、および試料の温度、厚さなども変化させた系統的な実験を行い、入射パルス依存性、試料依存性を調べた。プリカーサーは線形伝搬現象であるため、強度に対して線形に増大することが確認された。また、パルスのスペクトル形状の裾に非常に敏感で、裾の形と分散曲線の関係でプリカーサーが見えるかどうかが決定されることが判明した。(3)真空中の光速よりも速く伝搬するsuperluminal伝搬のスペクトル幅依存性および入射強度依存性を詳細に調べた。その結果、スペクトル幅が狭ければ群速度で伝搬し、強度を上げると励起子の高密度効果が伝搬に影響を与えることがわかった。本研究の研究目的は、観測された二つのピークの起源を明らかにする、ことにある。その起源を調べるため、次の研究を行った。(3)これらの系統的な実験結果をもとに伝搬方程式を用いた解析を行い、プリカーサーが観測される条件を導いた。
地域性に対応した地域福祉活動プログラムの推進方法の実証的研究

1.本年度の研究の実施状況と研究の成果(1)「都市の貧困」に対応して発生した、セツルメントの足跡と現在についてのヒヤリングの実施「都市の貧困」の変容によりセツルメントは減少したが、生き残ったセツルメント系の福祉施設が施設機能を生かして、「思想に基づく信頼関係」という方法で地域福祉活動を推進している。(2)「農村の貧困」対応した山形県の社会福祉協議会の、現在の活動についてのヒヤリングの実施「農村の貧困」から過疎へと問題が変容する中で、社会福祉協議会の役割のなかでも地域福祉活動のプログラムの推進だけではなく、介護保険に対応するサービスの提供やケアマネジメントが重視されるようになっている。職員も地域福祉を推進する業務にかかわる時間がなくなり、地域福祉活動にかける費用も削減されるといった、組織の運営問題をかかえるなかで、「地域福祉活動の生き残り」を図るためには、地域福祉活動のプログラムを選択するための内発的な方法と、主体形成につなげるための福祉文化的な方法が重要である。2.2年間の研究を通じて得られた知見これまでの地域組織化理論は、地域福祉活動プログラムを推進する方法として、「問題の発見→活動計画の策定→計画の実施→評価」という過程と「調査、広報・福祉教育、話し合い」という技術を示してきたが、本研究では、(1)経済的要因が存在する地域や時期においては調査を、(2)思想的要因が存在する地域や時期においては広報・福祉教育を、(3)住民組織的要因が活用できる地域や時期においては話し合いを、というように、地域的な要因に合わせて方法を選択することで、地域福祉活動プログラムを推進できることが明らかになった。社会福祉では住民による地域福祉活動を推進する方法として「地域組織化」(コミュニティ・オーガニゼーション)が発展してきたが,理論としては「調査,広報・福祉教育,話し合い」という技術を用いて,「問題の発見→活動計画の策定→計画の実施→評価」という過程を進めるという,素朴な方法を示しているのにすぎない.本研究では地域組織化理論を,地域性などの要因も考慮して地域福祉活動のプログラムを開発する方法を示すことができるような水準にまで引き上げることを目的として,以下のように研究を進めてきた.まず地域福祉活動が発展した「地域性」を,都市の貧困地区と農村の貧困に整理し,前者で発展したセツルメント活動について日本地域福祉施設協議会と連携して,日本のセツルメントの現状と課題について調査を実施した.また後者については,山形県で発展した社会福祉協議会による地域組織化活動についての歴史的資料を収集するとともに,筆者が山形で過去5年にわたって進めてきた研究成果を社会福祉協議会の職員たちに報告し,意見交換を行った.上の作業を通じて明らかになった「地域組織化の方法」は,中間報告の段階であるが,以下の通りである.1経済的要因により発生する生活問題を明らかにする「社会調査」2役所まかせや諦めを克服し,住民主体という思想的な要因を育てるための「話し合い」3個人や住民組織等の要因の力を貸り,つなげながら活動を広げる「連携」4自助努力の限界と「ソーシャル・アクション」一人件費などを行政に求めざるを得ないという組織構造的な制約と運動のバランス1.本年度の研究の実施状況と研究の成果(1)「都市の貧困」に対応して発生した、セツルメントの足跡と現在についてのヒヤリングの実施「都市の貧困」の変容によりセツルメントは減少したが、生き残ったセツルメント系の福祉施設が施設機能を生かして、「思想に基づく信頼関係」という方法で地域福祉活動を推進している。
非線形ネットワークによるナノ自動合成

1.ネットワークの集団挙動の制御興奮性結合と抑制性結合を用いて、ネットワークのクラスター化と集団挙動が観測できる。集団挙動は、電極が最近接する結合節(ノード)の興奮・抑制で支配される場合(対称グラフ)は易しい。結合強度が空間変調される非対称グラフの場合、数理モデルは、常微分方程式では、取り扱えない。ネットワークの動態の記述は、泳動・拡散を露わに含む偏微分系へと変化するので、ab initioな計算は難しい。そこで、実験的に求めたArnold Tongueから、結合定数を経験的なパラメーターとして、連立常微分方程式から半経験的な数理モデルを構築した。2.生理神経回路の構成的研究同一の機能を発現する複数のネットワークの中から、生体系が特定の回路を選んだ背後には、生理的あるいは発生学的な拘束条件があると思われる。腎盂機能を再構成した際には、腎臓細胞と尿管の平滑筋細胞の解剖学的な配列を手引きとして、経験的にトイモデルに機能を発現させた。ネットワークの数理の見通しが良くなれば、計算機を補助的手段として、この逆問題を実験でもとめる。得られた振動子配列から、生理系の設計図を読み解く事ができる、このことを、腎盂のしごき運動を例に実証した。このように、電気化学系のモデルで記述される緩和振動子の同期の特徴およびメカニズムは、神経系の緩和型ニュウロンの連成および電気化学振動子の連成計でみられた実験結果と一致した。連成電気化学振動子系が、神経系の緩和型ネットワークの多くの特徴を模擬できることが示された。硫酸銅-乳酸系は、Cu/Cu_2Oが交互析出する特異な反応系である。また、Ag-Sb系も構造形成を行う電気化学反応であるが、螺旋波の積み上げよりも、ナノからミクロン幅のCu/Cu_2O系析出の方が、電子素子・光素子の機能媒体として期待が持てる。硫酸銅-乳酸系の電位振動と、SHG(非線形2次高長波発生)、AFM(走査型原子間力顕微鏡)を測定した。電位の時間変化を示す振動と同時に、反応表面が、金属銅と酸化銅が交互に交代する際の2次の非線形感受率変化を捉えたSHG強度の時間振動を捉えた。数層以上に析出がおよぶと、不均一核発生-核成長が進み、面内の均一性が破れた。面内均一性が担保されると、電子のドブロイ波長と近いナノメータ幅の積層で、共鳴トンネル現象が期待できる。現状では、不均一性のため、量子現象の出現率は、低いと言わざるを得ない。積層幅を、100倍厚みとして、可視光領域の干渉材料に展開したところ、酸化銅中に金属銅が分散する2次構造のため、見込角によらず色合いが変化しない、人工モルフォ蝶ができた1.ネットワークの集団挙動の制御興奮性結合と抑制性結合を用いて、ネットワークのクラスター化と集団挙動が観測できる。
地震発生直後の緊急災害情報システムの適用に関する研究

阪神大震災では、情報の欠如あるいは無規格な情報の流通が連鎖的に2次的・3次的な問題を引き起こし、その集合が複合化・長期化した。そこで本研究では、災害情報の流通・管理についての体系的な研究の第一歩として、建物の被災情報ならびに人的被害情報の流通・管理の問題について検討を行った。解析対象地域として西宮市を選び、阪神・淡路大震災で得られたデータを基に解析をおこなった。阪神・淡路大震災における対応事例の解析から、被災情報の流通・管理には、1)羅災台帳の数値化、2)地理情報システムの導入、3)日常業務にも利用できるデータベースの構築、4)災害情報システムへの組み込み、などの機能が必要であることが明らかになった。羅災台帳の数値化に関しては、阪神・淡路大震災における西宮市の建物羅災証明に基づいて、コンピュータ上で建物被災データベースを構築した。この建物被災データベースは、地理情報システムを用いて構築され、被災状況が色分けてされて表示可能となった。これによって、空間的に分布する建物被災状況が一目で把握でき、台帳の修正、ガレキの処理、建物解体などにも有効であることが明らかになった。さらにこのデータベースは課税台帳を基本とし、その台帳に被災関連の項目を追加するだけで建物被災台帳データベースとして利用できるように設計されているために、平時からデータの更新等も容易である。つぎに、阪神・淡路大震災における西宮市の人的被害の状況をこのデータベースに取り込み、データの充実を計った。さらにこのデータベースを用いて、人的被害状況を町丁目別に集計し、建物全壊率と死亡者の関係を明らかにした。今後、地震動推定および建物被害推定法の開発により、死者数の推定ならびに空間分布が推定可能となり地域防災計画策定等に大きく寄与できると考えられる。
犬の悪性リンパ腫における新規分子標的治療薬の開発

犬の悪性リンパ腫に対する新規分子標的治療薬の開発を最終目的として基礎的研究を実施した。犬における治療標的分子(CD20, CD25, Syndecan 4)の遺伝子クローニングおよびこれら標的分子の犬のリンパ腫における発現状況を評価した。また、標的分子に結合するキメラ抗体を作製するため、犬のIgG定常領域(Fc)の遺伝子クローニング、標的分子の遺伝子組換えタンパク質の作製、標的分子に結合する抗体提示ファージライブラリーの作製を行った。これらを用いて、臨床応用へむけた研究を継続中である。昨年度は、一昨年度にクローニングした犬リンパ腫に対する標的分子の遺伝子断片および遺伝子組換え蛋白を用いて以下の研究を遂行した。1ファージディスプレイ法を用いた抗犬標的分子モノクローナル抗体の作製1-1抗体ライブラリーの作製:昨年度作製した標的分子の遺伝子組換えタンパクを抗原として, BALB/cマウスに免疫した。免役後,脾臓を摘出,脾細胞を分離し,定法に従ってTotal RNAを抽出した。抽出したRNAからオリゴd(T)プライマーを用いてcDNAを合成した。次にマウスの抗体結合部位である重鎖,軽鎖の可変領域(Fab)に対する特異的なプライマーを用いたPCRにより抗体遺伝子断片を増幅し、目的とするFab領域の免疫グロブリン重鎖(約700 bp)および軽鎖(750 bp)遺伝子を得た。得られた遺伝子をM13由来ファージベクターに挿入し、Fab遺伝子抗体ライブラリーとした。さらに、構築したFab遺伝子抗体ライブラリーを用いて、1×10の13乗種のの分子種を提示した抗体提示ファージライブラリーを作製可能であった。1-2パニングによる抗体ライブラリーのスクリーニングならびにファージクローンの選択現在、抗原として,昨年度作製した標的分子遺伝子組換えタンパクを用いて,固相法によりファージライブラリーから目的とする抗体を提示するファージ集団を濃縮中である。H25年度はH24年度に作製した、犬のCD20、CD25およびシンデカン4(SD4)に対する抗体提示ファージライブラリーから、H23年度に作製したそれぞれの遺伝子組換えタンパクを用いて固相法により目的とする抗体を提示するファージ集団の濃縮、効率よく犬の標的分子に結合する抗体遺伝子の選別を試みた。1)SD4に関しては、目的とするファージ集団の濃縮が可能で、犬の遺伝子組換えSD4に結合するFab遺伝子を選択することができた。具体的には、抗原を固相化→ファージライブラリーとの結合反応→洗浄→抗原結合ファージの溶出→大腸菌への感染・増幅を繰り返し行なう事により、濃縮した。最終ラウンドの後、可溶性Fabを発現するプラスミドに転換し、可溶性Fabを調整し、得られた可溶性Fabを用いて遺伝子組換えSD4タンパクに特異的に結合するFabを選択した。現在、作製した可溶性Fabの抗原に対する親和性、特異性および交差反応性などについて詳細に検討している。同時にH23年度に作製した犬のCLおよびCH遺伝子を組み込んだプラスミドベクターに挿入することで、抗イヌSD4キメラ抗体の発現系を構築している。2)犬のCD20およびCD25に結合する、効率の高いFab遺伝子を選別することが出来なかった。原因として、作製した抗体提示ファージライブラリの多様性が低いことが考慮されたため、これらについて、別の発現系を用いて作製した抗原を用意し、マウスに免疫することを計画している。3)犬のリンパ腫サンプルは概ね計画通り採集することが可能であった。(1)犬リンパ腫における標的分子(Syndecan 4およびCD20)の遺伝子クローニング:健常ビーグル犬由来のリンパ球からTotal RNAを抽出し、オリゴd(T)プライマーを用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、それぞれの標的分子の細胞外ドメインに特異的なプライマーを用いて、PCRにより増幅した。増幅産物についてサブクローニングを行なった。配列解析を行ない、他の動物種と比較する事により、目的の遺伝子である事を確認した。(2)Syndecan 4およびCD20の遺伝子組換えタンパクの作製:大腸菌による蛋白の発現・精製のために、発現ベクターであるpet16Bにクローニングした標的分子の遺伝子を挿入し、Hiss-Tag融合蛋白として発現させ、目的の遺伝子組換え蛋白を作成した。(3)犬IgG定常領域(CHおよびCL)の遺伝子クローニング:キメラ抗体作成のため、(1)にて作製したcDNAより犬IgGの定常領域(軽鎖および重鎖)をサブクローニングした。(4)犬悪性リンパ腫症例からのサンプル採集:本学付属獣医臨床センターに来院したリンパ腫症例の中から、外科的切除などによる組織生検によって病理組織学的に診断可能な症例を選択し、以下の研究に供した。(4)-1リンパ腫組織の分類:摘出腫瘍組織の病理組織学的検索,モノクローナリティ解析(T細胞レセプターγ鎖再構成あるいは免疫グロブリンH鎖再構成)およびFACSによる表面抗原解析によってリンパ腫の腫瘍型を特定した。(4)-2リンパ腫における標的分子の発現

解析:採集したリンパ腫組織からtotal RNAを作製し、逆転写反応後、標的分子を増幅するために設計したプライマーをもちいてリアルタイムPCR法による標的分子の発現解析を行なった。その結果、T細胞型リンパ腫ではCD25の発現が有意に高いことが判明した。H26年度は、標的分子として設定したCD20およびCD25に関して、前年度までに、効率の良いFab遺伝子の選別が出来なかったことから、新規の抗原を作製し、マウスに免疫する計画とした。1.犬のCD20およびCD25細胞外ドメイン領域をコードしている遺伝子を、pGEX-6P-1ベクターに挿入し、大腸菌に形質転換し、GST融合タンパクを発現させた。発現させた蛋白室を、GSTカラムにより精製後、プロテアーゼでGSTを切断し、濃縮することで、犬のCD20およびCD25組代えタンパクを作製した。これらを抗原としてBALB/cマウスに免役後,脾臓を摘出し,脾細胞を分離し,定法に従ってTotal RNAを抽出した。抽出したRNAからオリゴd(T)プライマーを用いてcDNAを合成した。次にマウスの抗体結合部位である免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のFab領域をPCRにより増幅し、M13由来ファージベクターに組み込んで大腸菌を形質転換し、ペルパーファージを感染させることで抗体提示ファージライブラリーを作製した。2.犬のCD20およびCD25について、抗原を固相化→ファージライブラリーとの結合反応→洗浄→抗原結合ファージの溶出→大腸菌への感染・増幅を繰り返し行い、目的とするファージ集団を濃縮した。最終ラウンドの後、Fabを発現するプラスミドに転換し、これらを用いて、それぞれの抗原(CD20および25)に結合するFab提示モノクローナルファージをELISA法により評価、選択した。3.選択したモノクローナルファージから抽出したFab遺伝子を含むプラスミドベクターを鋳型として、PCRにより増幅する。増幅した遺伝子断片をこれまでに作製した犬のFC領域の重鎖および軽鎖遺伝子を組み込んだプラスミドベクターに挿入し、抗犬標的分子キメラ抗体発現用のプラスミドベクターを構築している。獣医外科学標的タンパク質の発現状況を明らかにするとともに、標的タンパク質(Syndecan 4, CD25およびCD20)に特異的に結合する犬化抗体(キメラ抗体)を作製する事により、小動物獣医療における新たな治療法を開発する事を目的として計画した。この目的に沿って、平成24年度は平成23年度に作製した遺伝子断片や組換え蛋白体を用いて、1ファージディスプレイ法を用いた抗犬標的分子モノクローナル抗体の作製、標的分子に対する抗体提示ファージライブラリーの作製、パニングによる抗体提示ファージライブラリーのスクリーニングならびに効率の良いファージクローンの選択を計画した。現在、それぞれの標的分子に対して、Fab遺伝子抗体ライブラリーおよび抗体提示ファージライブラリーを作製が完了し、効率の高いFab遺伝子を選択中である。
最終処分場での硫黄酸化細菌が改質硫黄水銀固型化物の水銀溶出・揮発に及ぼす影響評価

最終処分場における改質硫黄水銀固型化物(以下、水銀固型化物)の適正管理構築に向けた基礎的知見を得るため、硫黄酸化細菌が水銀固型化物の劣化および水銀溶出・揮発に及ぶす影響のマスバランス評価を行い、固相、液相、気相への移行率を明らかとする。微生物反応による、水銀の溶出や、水銀の揮発に関与する機能遺伝子のレビューを行い、候補遺伝子を整理する。硫黄酸化細菌による水銀固型化物の劣化、水銀の溶出・揮発に関与する機能遺伝子の特定を試みる。加えて、実最終処分場における硫黄酸化細菌の実態を明らかとする。
敗血症時の多臓器不全防止に対する新しい治療法-NO吸入療法の確立に関する研究

【1】血中NO濃度の測定法:ラットのエンドトキシン血症で血中NO濃度をESRを用いニトロシルヘム(NO-Hb)として測定した。10mg/Kgを静脈投与した場合、4-6時間で約40μM、12時間で65μMと安定して検出された。【2】NO吸入による循環動態と血中NO濃度の測定:吸入NO濃度の決定のため正常ラットを用いて、10、50、100、300、1000、3000、10000ppmの濃度で、1時間の吸入実験を行った。300ppm以上では血圧低下を来たし、3000ppmでは45分以内に死亡した。100ppm以下では血圧は安定していた。従って実用可能な濃度を100ppm以下と設定した。100ppmにおけるNO-Hb濃度は200±20μMとエンドトキシン10mg/Kg投与時の4-5倍の値を示した。【3】NO吸入による肝エネルギー代謝の変化:正常ラットの肝エネルギーチャージ(EC)と分離肝ミトコンドリアの酸化的リン酸化能(PR)を、NOの吸入濃度50、100、300、1000ppmでそれぞれ60分後に測定した。50および100ppmではECは対照群と差はなかったが、300以上では有意に低下した。PRは50ppmでは変化がなかったが100ppmでは対照の約70%の増加を認め、NOの吸入によって肝ミトコンドリアの機能亢進が見られることが示唆された。300ppmでは対照群と差はなく、1000ppm以上ではかえって低下した。したがってNO至適吸入濃度を100ppmと判定した。【4】敗血症ラットへのNO吸入療法の応用:盲腸結紮穿刺による敗血症ラットでは肝ミトコンドリアは6-12時間で60%のPRの増加を認め以後低下し24時間で死亡する。この間ECは12時間まで緩やかな低下を認め、以後急速に低下し続ける。12時間でNO吸入療法を100ppm1時間で行ったところ肝ミトコンドリアの機能亢進は15時間まで続いたが、以後は対照群と同様に低下し24時間では死亡して生存時間の延長は認められなかった。ECの変化では、15時間までは緩やかな低下であり、以後は急速に低下した。【結論】敗血症ラットでNOの吸入は肝ミトコンドリアの機能亢進を延長させ、肝エネルギー代謝の劣化を遅らせることが示唆された。条件設定の工夫により生存率の改善も可能であると考えられた。