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アルミニウム，マグネシウム合金板の温間粘塑性挙動・面内異方性の高精度モデル構築

アルミニウム合金板A5182-O材の室温から300°Cにおける応力緩和試験を実施し,室温および100°Cでは予ひずみ時には応力-ひずみ曲線に差が生じないが,100°Cでは顕著な応力緩和を示すことを明らかにした.また,300°Cでは応力がほぼ消滅することを見出した.続いて,温間二軸引張試験により等塑性仕事面を観察し,室温ではvon Misesに近く,300°CではTrescaに近づくことを明らかにした.最後に温間張出試験により成形限界線図を取得し,温度上昇に伴い成形限界が向上するが,成形速度の影響は小さいことを示した.本研究の目的は,金属板材の温間変形特性を調査し,それを記述する材料モデルを構築すること,そのモデルを有限要素法に導入することでプレス成形シミュレーション精度を向上させることである.初年度の研究活動では温間での二軸引張試験装置を開発し,アルミニウム合金板A5182-O材の室温,200および260°Cでの等塑性仕事面を観察した.また,温間での応力緩和試験について,ひずみ速度コントロールを可能とする試験装置と制御系を開発し,引張予ひずみ後にクロスヘッド変位ではなく試験片のひずみを保持可能とした.本試験機による応力緩和試験をアルミニウム合金板について実施し,温度と応力低下の依存性を調査した.今後は当初の研究計画で掲げた面内応力反転試験(引張から圧縮への負荷経路変化)を実施して,応力反転時のバウシンガー効果を詳細に観察する.さらに,温間二軸試験,応力反転試験においては温度とひずみ速度の依存性を,応力緩和試験においては,温度,ひずみ速度だけでなく引張予ひずみ量の影響を調査する.これら温間での変形特性は室温のそれとは大きく異なっており,温間中の材料組織変化が強く影響していることは定性的に知られている.そこで,今後は変形後の試験片の光学顕微鏡観察により結晶粒径を測定すると同時に,EBSDにより結晶方位を解析し,変形量,時間により組織がどのように班化するのかを詳細に検討して,変形特性の温度,速度依存性のメカニズムを明らかにする.さらにこれら変形特性を表現可能な材料モデルを提案し,有限要素法に組み込む.最後に張出試験とその数値シミュレーションを実施し結果を比較することで提案モデルの有効性を検証する.温間二軸試験機については,当初の予定よりも温度制御が困難であり,同時に変形特性の温度依存性が強いため目標制御温度を再設定したため予定よりわずかに開発に遅れが生じた.しかし,現在は既に開発を終えており実験を実施している.温間応力緩和試験機は保有していた試験機本体に不具合が生じ,そのメンテナンスに想定外の時間を要した.現在は既に問題を解決し,こちらも予定の試験を進めている.また,二年目に予定している材料モデルの有限要素法への導入については,現在提案されているモデルを導入する方法論を構築し,実際に市販のソフトウェアに導入して効果を確認しており,こちらは当初の計画を前倒しで進めている.アルミニウム合金板の室温から260°Cにおける二軸引張試験を実施して,温間等塑性仕事面を取得した.その結果,室温ではvon Misesの降伏関数によく一致したが,温間では平面ひずみ変形近傍の応力が低下し,Trescaの降伏曲面に近づいた.このことから,本供試材の異方性特性は温度とともに変化することが確認された.続いて,室温から300°Cにおける応力緩和試験を実施して,予ひずみ時の応力-ひずみ曲線と応力緩和中の応力-時間曲線を取得した.その結果,室温と100°Cでは予ひずみ変形中に流動応力の差が見られなかったにもかかわらず,応力緩和試験では100°Cの方が顕著な応力低下を示した.また,応力緩和率は温度の上昇に伴い大きくなった.予ひずみ変形時のひずみ速度が応力緩和特性に与える影響は小さく,応力緩和では温度の依存性が支配的であった.とりわけ,温度ごとに応力の収束値が異なっており,300°Cではほぼ0MPaまで応力が低下した.これらの現象は既存の速度依存型応力-ひずみ構成モデルでは表現できない.また,応力緩和後の再引張試験を実施したところ,100および200°Cでは再引張時の降伏応力が応力緩和開始時の応力よりも低下したため,動的回復が起こったと考えられる.しかし,300°Cでは再降伏応力と応力緩和開始時の応力がほとんど等しくなった.これは300°Cの高温化では予ひずみ変形時に動的回復が完了したためであり,したがって,応力緩和の支配的メカニズムが動的回復や動的再結晶ではなく,粒界すべりである可能性を示した.アルミニウム合金板A5182-O材の室温から300°Cにおける応力緩和試験を実施し,室温および100°Cでは予ひずみ時には応力-ひずみ曲線に差が生じないが,100°Cでは顕著な応力緩和を示すことを明らかにした.また,300°Cでは応力がほぼ消滅することを見出した.続いて,温間二軸引張試験により等塑性仕事面を観察し,室温ではvon Misesに近く,300°CではTrescaに近づくことを明らかにした.最後に温間張出試験により成形限界線図を取得し,温度上昇に伴い成形限界が向上するが,成形速度の影響は小さいことを示した.既に実験に必要な装置はおおむね準備が整っており,今後は計画的に試験を実施する予定である.材料は既に入手済みであり,計画に問題はない.また,数値解析についても既に経験を持っており,問題はないと考えている.塑性力学
関数空間の幾何学的研究

安尾は従来,種々のK理論に対してその分類空間となるような写像空間の考察に主としてホモトピー論的観点から取り組んで来たが,最近は考察の範囲を拡張して幾種類かの同変K理論に対しても同変ホモトピー論的観点より同様の研究を行うことを試みようとしている。この点に関しては,同変分類空間の構成法に関しての専門家である島川和久(岡山大学理学部)及び村山光孝(東京工業大学理学部)両氏との討論などを通して,トム・ディエックの意味での一般化された同変主バンドルに対する分類空間の構成に関して研究上の情報交換が行われ,その際に啓発される所も大きかった。現在特に,1960年代においてアティヤ-により導入されたKR理論の四元数ないしはクリフォード代数を用いた一般化を目指し,その方向から得られる新たな同変K理論に対する同変分類空間の考察は今後の研究課題である。既に,KR理論の或る意味での"四元数版"を考えることにより3次回転群SO(3)の各閉部分群Gに対しGを作用群とする一種の同変K理論が得られるという結果があり,これに関することは現在,安尾を含む数名の共同研究としてまとめつつあるが,KR理論や従来の同変K理論でアティヤ-が用いた楕円型作用素によるボット周期性の証明のアナロジーがこの仕事でも使えることが判ったのは共同研究者の一人である入江幸右衛門氏(大阪女子大学学芸学部)の指摘によるものであり,その他の点でも同氏とのその後の交流により幾つかの研究上の収穫があった。また,クリフォード代数の自己同型群にも考察の目を向けたが,これに関しては三村穫および田坂隆士両氏(ともに岡山大学理学部)それぞれとの討論によって啓発される所があった。中井は,前年度に中間的に発表した3次の連分数展開に関連する3次のテ-タ・ワイル和についての結果を整理し現在まとめつつある。
Ｃ型インフルエンザウイルスの増殖を制御するＮＳ１蛋白の機能ドメインの解明

C型インフルエンザウイルスのNS1がsplicingを促進する機序を解明するために、NS1がsplicingの行われる核内に局在するための核移行シグナルの同定を試みた。1-246番目のアミノ酸からなる野生型のNS1のC末端側から種々の欠失変異を導入したものをCOS-1細胞に発現させ、その局在を蛍光抗体法で解析した。1-154番目は、野生型と同様に主に細胞質に局在したが、1-108番目では細胞質優位の局在が失われ、核と細胞質に局在したので、NS1の109から154番目の領域に核から細胞質に移行するための配列(核外移行シグナル)が存在すると示唆された。splicingを促進する機序を解明することを目標に、NS1がsplicingの行われる核内に局在するための核移行シグナルの同定を以下の方法で試みた。246個のアミノ酸からなる野生型のNS1蛋白のN末端にFLAG tagをもつFLAG-NS1 1-246およびFLAG-NS1 1-246のC末端側から種々の欠失変異を導入したものをCOS-1細胞に発現させ、その局在を抗FLAG抗体を一次抗体に用いた蛍光抗体法で解析した。平成23年度は、以下の成績を得た。FLAG-NS1 1-246は発現の初期には核に局在するが後期には大部分が細胞質に一様に分布するようになるが、C末端側の46アミノ酸を欠失させると後期には細胞質に一様でなく凝集塊のように分布した。従ってこの欠失領域に一様に細胞質に分布するための配列が存在すると示唆された。発現後期にFLAG-NS1 1-154は細胞質に局在したが、FLAG-NS1 1-108は核と細胞質に局在したので、NS1の109から154番目の領域に核から細胞質に移行するための配列が存在すると示唆された。平成24年度は、以上の成績から示唆されたNS1の細胞内局在に関与する領域を同定することを目的に、NS1のC末端側から詳細な欠失変異を導入し、同様の方法で解析した。FLAG-NS1 1-246のC末端側から4残基欠失しても発現後期に野生型と同様に細胞質に一様に分布するが、さらに3残基欠失すると細胞質に顆粒状に分布するようになった。以上からNS1の240-242番目の配列が発現後期に細胞質に一様に分布することを決定することが明らかになった。さらにその領域の欠失で、Western blotでNS1蛋白の発現量が減少した。それが蛋白の不安定化によるのか否かをパルスチェイス実験で解析し、240-242番目の配列がNS1蛋白の安定化にも関与することが示唆された。NS1がsplicingを促進する機序を明らかにするために、splicingが行われる核内に局在するための核移行シグナルの同定を試みた。246アミノ酸からなる野生型NS1タンパク質のN末端にFLAGをもつFLAG-NS1(1-246)を作製し、さらにC末端から種々の長さの欠失変異を導入した変異体を作製し、これらをCOS-1細胞に発現させ、抗FLAG抗体を用いた蛍光抗体法で解析し、NS1の細胞内局在を担う領域の同定に迫った。FLAGをN末端にもつ1-62番目のアミノ酸からなるNS1変異体FLAG-NS1(1-62)が主に核に局在する成績から、1-62番目の領域に核移行シグナルが含まれる可能性が示唆された。塩基性アミノ酸のクラスターが見られる36KMKTSTKARLK46の配列が核移行シグナルの候補と推測されたので、今後は、これらの塩基性アミノ酸をアラニンに置換した変異体で核の局在が消失するかで、核移行シグナルを同定する。また、感染細胞内でsplicingが促進されすぎないように制御して、spliced mRNAとunspliced mRNAの量のバランスがとれるように核内のNS1量を調節するため、核外移行シグナルがNS1に存在する可能性が推測された。蛍光抗体法で野生型FLAG-NS1(1-246)が主に細胞質に局在したため、その可能性が強く示唆された。109番目以降のアミノ酸を欠失したFLAG-NS1(1-108)で細胞質優位の局在が失われたので、109番目以降の領域に核外移行シグナルが含まれる可能性が示唆された。117FDGNVWEATM126は核外移行シグナルのコンセンサス配列を満たすので、今後は、この候補部位の疎水性アミノ酸に置換変異を導入し、NS1の細胞質優位の局在が消失するかで核外移行シグナルを同定する。

これまでに我々は、C型インフルエンザウイルスのmRNAのsplicingが亢進している現象が、C型のNS1がsplicingを促進するためであることを明らかにした。そこで我々は、C型のNS1はsplicing促進能により、ウイルス増殖を調節しているという作業仮説を提唱した。本研究の第一の目的は、この作業仮説を検証することである。第二の目的はsplicingを促進する機序を解明することである。平成23年度は第二の目的を解明するために、その前提条件であるNS1がsplicingの行われる核内に局在するための核移行シグナルの同定の解析を行い、以下の成績を得た。246個のアミノ酸からなるNS1蛋白のN末端にFLAG tagをもつFLAG-NS1 1-246を一過性発現ベクターpME18Sにsubcloningし、それをCOS-1細胞にtransfectionして、発現したNS1の局在を抗FLAG抗体を一次抗体に用いた蛍光抗体法で解析した。さらにFLAG-NS1 1-246のC末端側から種々の欠失変異を導入し、発現した各NS1変異体の局在を蛍光抗体法で解析した。FLAG-NS1 1-246は発現の初期には核に局在するが後期には大部分が細胞質に一様に分布するようになる。C末端側の46アミノ酸を欠失させると後期には細胞質に局在するが、一様でなく凝集塊のように分布した。したがってこの変異領域に細胞質での分布に関与する配列が存在すると示唆された。C末端側の92アミノ酸を欠失させると後期でも核と細胞質に局在するようになったので、この変異領域に核から細胞質に移行するための配列が存在すると示唆された。今後の推進方策として平成24年度に計画した、細胞内の局在に関与するシグナルを同定するために、平成23年度の候補領域に更に細かい欠失変異を導入して、細胞内の局在を担うアミノ酸配列を同定する解析をほぼ計画どおり順調に行うことができた。得られた結果から、240-242番目の配列が細胞質に一様に分布できることを決定する配列であることを明らかにした。さらに同配列がNS1蛋白の安定化にも関与することを明らかにした。しかし、splicingを促進する作用を発揮するために、splicingの行われる核内にNS1が局在するための核移行シグナルの同定には至っていない。また、NS1と相互作用するsplicingに関係する宿主因子の同定という研究課題の成績が得られておらず、達成はやや遅れている。平成23年度は、当初の研究実施計画では平成24年度に行う予定だったsplicingが行われる核内に局在するための核移行シグナルの同定の解析を、FLAGをN末端にもつNS1に種々の欠失変異を導入し、COS-1細胞に発現させた各NS1変異体の局在を抗FLAG抗体を一次抗体に用いた蛍光抗体法で行った。細胞内の局在に関与する配列を含む領域の候補が見つかったが、その領域をさらに狭めて移行シグナルを同定する実験が必要である。また平成23年度に予定していたC型インフルエンザウイルスNS1蛋白のsplicing促進活性を担う領域を決定し、その領域がウイルスの増殖と病原性に必要であるか否かを明らかにするという研究課題は手つかずであり、平成24年度、25年度に行う必要があり、達成がやや遅れている。1. NS1がsplicingの行われる核内に局在するための核移行シグナルの同定:核移行シグナルの候補がNS1のN末端側に2か所あるため、同領域を含むGFP融合蛋白を発現させ、蛍光顕微鏡で核に局在することを確認する。その後、核移行シグナルの候補部位に変異を導入することにより核への移行が障害されることで、核移行シグナルを同定する。2. NS1が直接splicingに影響を与えるならばNS1がRNA結合能をもつ可能性があるので、以下の計画でRNA結合能を証明し、それを担う領域を同定する。
昆虫ステロイドホルモン産生器官におけるステロイド取り込み・輸送の時空間的制御機構

昆虫ステロイドホルモン産生器官である前胸腺では、前駆物質であるコレステロールおよび7-デヒドロコレステロールが発育に伴い増加することがLC-MS/MS分析の結果分かった。また、ステロイド類の多変量解析の結果を他の組織と比較したところ、前胸腺は他の組織とは異なるステロイド特性を持つことが示された。さらに、ステロイド輸送タンパク質であるリポフォリンおよび抱合コレステロールの局在解析からも前胸腺に特有なステロイド取り込み機構があることが支持された。さらに、前胸腺においてリポフォリンからのステロイド取り込みに関わる分子と思われるスカベンジャーレセプターをひとつ同定することができた。これまでの予備的な実験結果の再現性を確認するとともに以下の実験を行った。1.昆虫ステロイドホルモン産生器官である前胸腺におけるコレステロールをはじめとしたステロイド類の発育に伴う変動をLC-MS/MSで定量分析した。その結果、5齢期においてコレステロールの増加は発育に伴って徐々に増加するのに対し、7-デヒドロコレステロールはエクジソン(ステロイドホルモン)生合成に先立ち急激に上昇し、脱皮後減少することが明らかとなった。2.コレステロールの輸送タンパク質と考えられるリポフォリンの精製法を確立し、前胸腺器官培養系を用いてリポフォリンおよび前胸腺刺激ホルモン(PTTH)の効果を検討した。その結果、リポフォリン単独やPTTH単独では前胸腺へのコレステロールの取り込みは促進されなかったが、リポフォリンとPTTHを同時に作用させた場合に前胸腺へのコレステロールの取り込みが約2倍に促進された。この結果は、前胸腺におけるコレステロールの取り込みにおいてリポフォリンが主要な役割を果たし、その作用はPTTHによって促進されることを示している。3.リポフォリンを介した前胸腺へのコレステロールの取り込み機構を解析するために、リポタンパク質の蛍光標識したリポフォリンならびに蛍光標識したコレステロールを抱合させた標識リポフォリンを作製するための条件検討を行った。その結果、予備的であるが、リポタンパクならびにコレステロールを蛍光標識した蛍光リポフォリンの作製に成功した。今後、この方法を詳細に検討し、前胸腺へのコレステロール取り込み機構を解析する予定である。前年度に、リポフォリンと前胸腺刺激ホルモン(PTTH)を共培養することによって、前胸腺のコレステロール量が増加することがわかった。今年度は、重水素でラベル化したコレステロール(コレステロール-d7)のリポフォリンを作製し、前胸腺への取込みについてLC-MS/MSで解析した。その結果、インタクトなリポフォリンの結果と同様にPTTHによってコレステロール-d7の取込みが2倍に促進されることがわかった。リポタンパクを蛍光標識したリポフォリンおよび蛍光標識したコレステロールを抱合させたリポフォリンを用いて、PTTHによって前胸腺に取り込まれるリポフォリンが増加するかどうか共焦点顕微鏡で観察したところ、リポフォリンならびにコレステロールの前胸腺への集積が確認された。これらの結果から、リポフォリンが前胸腺におけるコレステロールの取り込みにおいて主要な役割を果たし、PTTHによって取込みが促進されることがわかった。前胸腺に取り込まれたコレステロールが実際にエクジソン生合成に利用されるか否かについて、コレステロール-d7を抱合したリポフォリンを用いてコレステロールの代謝をLC-MS/MSを用いて解析した。その結果、7-デヒドロコレステロール-d7およびその代謝物であるエクジソン-d6が検出され、エクジソン-d6の産生量はPTTHによって増加した。これらの結果からリポフォリンに抱合されたコレステロールの前胸腺へ乗り込みを促進し、取込まれたコレステロールはエクジソン生合成に利用されることがわかった。更に、PTTH刺激によってリポフォリンレセプターの発現を上昇することを見出した。PTTHはこれまでエクジソン生合成酵素の発現上昇に関与していることが明らかにされてきたが、リポフォリンレセプターの発現を促進させることが今回初めて明らかになった。本年度は以下の2点を中心研究を行った。1.組織ごとのステロイド量の時空間変動解析カイコの様々な組織を用いて、コレステロール及び植物ステロール量の変動をステージごとにLC-MS/MSを用いて解析した。終齢期のカイコの血液中にはコレステロールが多量に含まれ、さらに少量ではあるが様々な植物ステロールが含まれていた。これらのステロイド濃度は摂食期よりも蛹化に向けて摂食を行わなくなった終齢期後半に濃度が増加した。脂肪体やマルピーギ管など、リポフォリンの輸送先の組織では血中の植物ステロール及びコレステロール量の増加のタイミングが血中の濃度上昇と同時期であったため、血中の濃度上昇に伴い取り込み量が増加すると考えられる。一方、脳及び前胸腺では血中とは異なるステロイド量の時期的な変動が見られた。また、組織内のコレステロール量が他の組織より常に高いことも明らかになった。よって、脳・前胸腺ではそれぞれ、組織特有のコレステロール取り込み機構、さらに量の補償機構が存在すると考えられる。2.前胸腺におけるステロイド類の取り込みに必要な新規因子の探索リポフォリンを介したステロイド取り込みに必要な因子の再探索を行った。スカベンジャー受容体(SR-B1)がリポフォリンの受容体となりうる可能性から、スカベンジャー受容体の探索を試みた。項目1の結果から、脳及び前胸腺でコレステロールの要求量が高く、効率の良い取り込み機構があると考えられたため、両組織で発現がみられるSR-B1を探索した結果、15種あるカイコSR-B1のうち、3及び12が脳・前胸腺で発現することを見出した。

両受容体共に、摂食期よりも終齢期後半の発現量が高く、エクジステロイド生合成能の増加と一致するため、コレステロール取り込みに必要な受容体である可能性が高い。今後実際に取り込みに関わることを培養細胞系等を用いて検証する予定である。スカベンジャー受容体については解析が終了し、前胸腺で発現している受容体遺伝子を同定することに成功した。また、光学顕微鏡および電子顕微鏡による形態学的解析も徐々にではあるが進んでいる。一方で、コレステロールの取り込みに重要な機能を担っていると考えているタンパク質に対する抗体作製に手間取っている。1.カイコ組織ごとのステロイド量の時空間変動解析主要な組織(脳、前胸腺、脂肪体、マルピーギ管)中のコレステロールと植物ステロール量の変動を発育ステージごとにLC-MS/MSを用いて分析した。その結果、コレステロール量だけではなく植物ステロールの量も組織により大きく異なることを見出した。さらに統計的な解析により、組織ごとにグループ分けされ、前胸腺や脳は独自なステロール組成を示したことから、組織ごとにステロイドの取り込み機構が異なることが予想された。さらに、血液中からエクジソンと20-ヒドロキシエクジソン以外に、生合成中間体である7-デヒドロコレステロール(7dC)が検出された。2.前胸腺におけるステロイド類の取り込みに関わる新規因子の探索前胸腺で発現していたスカベンジャー受容体(SR-B1)のうち、どの受容体がステロイドの取り込みに関わっているか培養細胞で検証した結果、ある特定の受容体がコレステロールの取り込みを促進することがわかった。3.マダニのコレステロール取り込みに関わる分子の探索マダニのRNA-seqデータから、リポタンパク質受容体(LpR)及びスカベンジャー受容体(SR-B1)の探索を行った。LpRと相同性を持つ配列は、LpRとリポホリンとともにメジャーな輸送タンパク質であるVitellogeninの受容体(VgR1、2)であった。LpRは様々な組織で発現しており、様々な組織における脂質の取り込みに関わると考えられる。また、吸血から数時間で発現量が上昇することから、栄養摂取に応答して発現が誘導されると考えられる。マダニは卵巣でエクジソンが生合成され、エクジソンによって卵成熟が誘導される。したがって、LpRはコレステロールの取り込み量を増加させるとともにエクジソン生合成の原料供給に関わることで、マダニの卵巣発達に関わると考えられる。昆虫ステロイドホルモン産生器官である前胸腺では、前駆物質であるコレステロールおよび7-デヒドロコレステロールが発育に伴い増加することがLC-MS/MS分析の結果分かった。また、ステロイド類の多変量解析の結果を他の組織と比較したところ、前胸腺は他の組織とは異なるステロイド特性を持つことが示された。さらに、ステロイド輸送タンパク質であるリポフォリンおよび抱合コレステロールの局在解析からも前胸腺に特有なステロイド取り込み機構があることが支持された。
シガトキシンの全合成研究

1.珊瑚礁周辺の魚介類によって広範囲に起こり,年間2万人以上が中毒するシガテラ中毒の原因毒であるシガトキシン(1)は,中員環を含むAMまでの13個の環状エーテルがトランスに縮環した複雑な化合物でる。この巨大分子1の絶対配置の決定および全合成は,有機合成化学的に興味深いテーマである。2.私は,1を4つのフラグメントに分け,それらを連結する収束的な合成ルートを計画し,それに基づいて合成研究を行った。まず,環化反応を用いて合成することがエントロピー的に不利と思われる中員環部分を,環拡大反応を利用して構築する事にし,共通の合成中間体からメソ型7,8および9員環エーテルをそれぞれ合成する事に成功した。また,これらを酵素反応を利用した不斉アセチル化により,良好な選択性で光学活性体に誘導する事にも成功した(投稿準備中)。また、側鎖を含むAB環部分をD-グルコースから立体選択的に合成し,励起子キラリテイー法を用いて1の絶対配置を決定する事に成功した(発表済)。更に,LM環部を光学活性なアリルアルコールから立体選択的に合成する事にも成功した(投稿準備中)。
先天性二分脊椎マウスを用いた二分脊椎発生機序の遺伝子レベル的解析

1.GFAPならびにNFPの発現;胎仔脊髄を摘出後固定し、抗GFAPならびに抗NFP抗体を用いて免疫染色を行った。Spd/Spdマウスでは、脊髄披裂部の背側面で胎齢14日目頃よりGFAP陽性細胞が日数につれて過剰に出現し、かつ内側へと増生してきた。このような所見は正常マウスでは全く認められなかった。陽性細胞は主に脊髄披裂部の羊水に接しているところに集中して存在しており、胎生期の一次神経管癒合障害のあとにもグリオーシスが進行していることが示唆された。しかしNFP陽性細胞はほとんど検出されなかった。2.p53の発現;抗p53モノクローナル抗体をもちいて、正常ならびに二分脊椎マウスの脊髄の免疫染色を行った。二分脊椎マウスの脊髄ではp53陽性細胞が散見されたが、正常マウス脊髄ではp53陽性細胞は認められなかった。しかし、二分脊髄マウス脊髄の染色におけるp53発現は再現性に乏しく、さらに標本数を増やし、統計学的有意差がでるかどうかを検討したい。各種成長因子の発現;計画では各種成長因子受容体の発現をRT-PCRで調べる予定であったが、ヒトと異なり、クローニングされていないものが多いため、成長因子自体の発現を調べることとした。正常ならびに二分脊椎マウスの脊髄からmRNAの抽出を行った。これからRT-PCRを行ったが、まずmRNAが変成していないかを確認するためにベータ-アクチンを増幅させ、PCR産物を電気泳動し、バンドを確認した。次にTGF、FGF、PDGFそれぞれに対するプライマーを用いて各成長因子の発現を調べた。いずれの成長因子においても発現量が少なく、またmRNA自体の量的な問題もあり、一定の結果を得ることはできず、正常と二分脊椎マウス脊髄間で明らかな有意差は得られなかった。これは現在も検討中である。4.アポトーシス細胞の有無;p53の発現に関連して、アポトーシス細胞の出現が二分脊椎マウス脊髄において認められるのではないかとの予想のもとに、Tunel法を用いてアポトーシス細胞の染色を現在施行中である。二分脊椎マウス(Spd/Spd)ならびに正常C57BL/6Jマウスの妊娠12日の胎仔を取り出し、それから脊髄を摘出した。その脊髄の細片より得られた培養細胞群に対し、抗マウスGFAP抗体ならびに抗マウスNFP抗体を用いて免疫染色を行ったところ、多くの細胞はGFAP陽性であり、NFP陽性細胞はほとんど認められなかった。そこでこれをinvivoで確かめるべく、胎仔脊髄を摘出後固定し、両抗体を用いて染色を行ったところ、Spd/Spdマウスでは、GFAP陽性細胞が多数出現していた。これは主に脊髄披裂部の羊水に接しているところに集中して存在していた。次に羊水中の成長因子との関係を検討することとした。上記培養脊髄細胞にマウス羊水を10%添加してその細胞増殖を調べたところ、羊水添加群にて明らかに脊髄細胞増殖の亢進が認められた。現在、二分脊椎マウス(Spd/Spd)ならびに正常C57BL/6Jマウス胎仔

脊髄の細片より得られた培養細胞群ならびに胎仔脊髄標本自体からmRNAを抽出しているところであり、RT-PCRの手法を用いることにより、まず各成長因子に対する受容体の有無を検索しているところである。1. p53の発現;抗p53モノクローナル抗体をもちいて、正常ならびに二分脊椎マウスの脊髄の免疫染色を行った。二分脊椎マウスの脊髄ではp53陽性細胞が散見されたが、正常マウス脊髄ではp53陽性細胞は認められなかった。しかし、二分脊椎マウス脊髄の染色におけるp53発現は再現性に乏しく、さらに標本数を増やし、統計学的有意差がでるかどうかを検討したい。2.各種成長因子の発現;計画では各種成長因子受容体の発現をRT-PCRで調べる予定であったが、ヒトと異なり、クローニングされていないものが多いため、成長因子自体の発現を調べることとした。正常ならびに二分脊椎マウスの脊髄からmRNAの抽出を行った。これからRT-PCRを行ったが、まずmRNAが変性していないかを確認するためにベータ-アクチンを増幅させ、PCR産物を電気泳動し、バンドを確認した。次にTGF、FGF、PDGFそれぞれに対するプライマーを用いて各成長因子の発現を調べた。いずれの成長因子においても発現量が少なく、またmRNA自体の量的な問題もあり、一定の結果を得ることはできず、正常と二分脊椎マウス脊髄間で明らかな有意差は得られなかった。これは現在も検討中である。3.アポトーシス細胞の有無;p53の発現に関連して、アポトーシス細胞の出現が二分脊椎マウス脊髄において認められるのではないかとの予想のもとに、Tunel法を用いてアポトーシス細胞の染色を現在施行中である。
新規細胞内環境モニター蛍光タンパク質開発技術の確立

本研究は、生体内の微細環境をリアルタイムモニターする細胞内環境モニター蛍光タンパク質の開発を目指した。特に注目したのは、細胞内のレドックス変化のモニターと生体内低分子代謝産物のモニターである。生体内のレドックス状態変化については、既に開発したOba-QやRe-Qの設計思想を活かして、新たに細胞内の酸化還元制御の鍵タンパク質であるチオレドキシンのレドックス状態を直接モニターすることの出来るタンパク質の開発に成功した。生体内の低分子代謝産物に関しては、十分な蛍光変化を示すタンパク質を得るには到らなかった。蛍光顕微鏡技術の発達により、細胞内の観察が非常に容易になってきている。一方、細胞内に存在する代謝産物などの低分子化合物については、必ずしもモニターが簡単になったわけではない。本研究では、我々が最近成功した環境応答型蛍光タンパク質の開発実績を踏まえて、細胞内の様々な代謝産物の増減をリアルタイムで直接モニターすることの出来る新規細胞内環境モニター蛍光タンパク質を開発するための技術を確立する。これによって、すでに開発されている細胞内ATPやcAMPのFRETによる測定系を超越する実験系を完成し、ROSやNADPH等の酸化還元物質、グルタチオンやATP,GTPなどの生体分子の変動をリアルタイムにモニターすることを目指す。そこで、本研究では、次の二項目について研究を実施している。1酸化還元物質を検知して蛍光が変化する新規蛋白質の開発では、我々がすでに開発した酸化状態で蛍光が急激に消光する蛋白質Oba-Qをベースとして、酸化還元に関わる細胞内低分子と電子の授受を行う蛋白質をOba-Qに融合することで、新規にこれらの細胞内低分子の検出することが出来るシステムの開発を行っている。初年度は、アンテナとなる蛋白質のスクリーニングを実施する。2生体内低分子を検知して蛍光が変化する蛋白質のスクリーニングについては、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、グルタチオン、および、その他の生理活性低分子について親和性を持ち蛍光が変化する蛋白質の作成を試みている。1酸化還元物質を検知して蛍光が変化する新規蛋白質の開発では、酸化還元に関わる細胞内低分子と電子の授受を行う蛋白質をOba-Qに融合することで、新規にこれらの細胞内低分子の検出することが出来るシステムの開発を目指した。酸化還元応答蛍光蛋白質として実績のあるroGFPで成功例のあるグルタチオンペルオキシダーゼを融合した蛍光蛋白質では、活性酸素に対する明確な蛍光感受性を得られるが、その他の蛋白質を用いた活性酸素検出形の確立には到っていない。一方、酸化還元応答蛍光蛋白質自体の開発については、新規に酸化還元に応答することによって蛍光色が変化するユニークな蛋白質の単離に成功した(特許出願準備中)。2生体内低分子を検知して蛍光が変化する蛋白質のスクリーニングについては、まだ適切な候補蛋白質を得られていない。本研究では、近年の蛍光タンパク質利用技術、及び、その検出機器の発展を最大限に活用し、生体内の変化をリアルタイムモニターすることを目指して、当研究室で既に作成に成功している環境応答型蛍光タンパク質の開発実績を踏まえ、細胞内の代謝系の変化を直接モニターすることの出来る新規細胞内環境モニター蛍光タンパク質の技術開発を実施した。1酸化還元物質を検知して蛍光が変わるタンパク質としては、既に開発した酸化によって蛍光消光を示すOba-Q、及び、還元によって蛍光消光をするRe-Qの分子設計を基本として、新規に細胞内のレドックスを検知するシステム開発を行った。その結果、細胞内の酸化還元変化を中心的に他のタンパク質に伝達するチオレドキシンの酸化還元状態をモニターする新規蛍光センサータンパク質THISの開発に成功した。このタンパク質は、チオレドキシンによって特異的に還元され構造変化するタンパク質の部分配列を利用して、励起・蛍光は長の異なる二種類の蛍光タンパク質を接続しFRETを誘導するもので、部分配列の工夫により、植物葉緑体の二種類の主要なチオレドキシンアイソフォームであるf型とm型の酸化還元状態を特異的に見分けることに成功した。このユニークなタンパク質を、シアノバクテリアや緑色植物葉緑体内に導入し、in situでのリアルタイム観察を進めている。2生体内低分子の動態を検知して蛍光が変化するタンパク質の開発については、アデニンヌクレオチド、グルタチオン、および、関連低分子に対して親和性を持ち蛍光が変化するタンパク質の作成を試みているが、充分な蛍光変化を示すタンパク質は得られなかった。本研究では、近年の蛍光タンパク質利用技術、および、その検出技術の発展を最大限に活用するため、我々が作成に成功した環境応答型蛍光タンパク質の開発実績を踏まえて、細胞内の様々な代謝産物の増減をリアルタイムで直接モニターすることの出来る新規細胞内環境モニター蛍光タンパク質を開発するための技術を確立することを目指した。これによって、すでに開発されている細胞内ATPやcAMPのFRETによる測定系を超越する実験系を完成し、ROSやNADPH等の酸化還元物質、グルタチオンやATP,GTPなどの生体分子の変動をリアルタイムにモニターすることを目指した。

この目的を達成するため、本研究では、主として次の二項目およびそれに関連する課題について研究を実施した。1酸化還元物質を検知して蛍光が変化する新規蛋白質の開発では、我々がすでに開発した酸化状態で蛍光が急激に消光する蛋白質Oba-Qをベースとして、酸化還元に関わる細胞内低分子と電子の授受を行う蛋白質をOba-Qに融合することで、新規にこれらの細胞内低分子の検出することが出来るシステムの開発を行った。適切な融合タンパク質を用いることで活性酸素種の検出は可能になったが、他の低分子については適切なものを見いだせなかった。2生体内低分子を検知して蛍光が変化する蛋白質のスクリーニングについては、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、グルタチオン、および、その他の生理活性低分子について親和性を持ち蛍光が変化する蛋白質の作成を試みた。さらに、様々な細胞内環境に対応できるようにルシフェラーゼを融合したBRET型のセンサータンパク質の作成を行った。1酸化還元物質を検知して蛍光が変化する新規蛋白質の開発では、酸化還元に関わる細胞内低分子と電子の授受を行う蛋白質をOba-Qに融合することで、新規にこれらの細胞内低分子の検出することが出来るシステムの開発を目指した。酸化還元応答蛍光蛋白質として実績のあるroGFPで成功例のあるグルタチオンペルオキシダーゼを融合した蛍光蛋白質では、活性酸素に対する明確な蛍光感受性を得られたが、その他の蛋白質を用いた活性酸素検出系の確立は出来なかった。一方、酸化還元応答蛍光蛋白質自体の開発については、新規にチオレドキシンによって特異的に還元され蛍光変化を示すユニークな蛋白質の作成に成功した(特許出願準備中)。2生体内低分子を検知して蛍光が変化する蛋白質のスクリーニングについては、BRET型のタンパク質のスクリーニングを続けているが、まだ適切な候補蛋白質を得られていない。1酸化還元物質を検知して蛍光が変化する新規蛋白質の開発では、引き続き蛍光変化を最大限に引き出すことの出来るアンテナ蛋白質の探索を行う。また、平成27年度までに作成に成功した蛍光色の変化する新規酸化還元応答蛋白質と活性酸素結合蛋白質の融合蛋白質を作成し、細胞内の酸化還元電位の変化をより詳細に測定することの出来る実験系の確率を目指す。また、蛋白質の構造変化と蛍光変化の関係に着目し、より簡便に、かつ、高感度に生理活性低分子の存在をリアルタイムモニターする系の開発を行う。植物生化学、生体エネルギー変換酸化還元物質を検知して蛍光が変化する新規蛋白質の開発では、新規に作成したチオレドキシンに特異的に還元されるセンサータンパク質の改良に取り組む。これにより、生体内の酸化還元情報の伝達の鍵を握るチオレドキシンの動態を可視化する実験系が確立できるものと期待している。
一酸化窒素で活性化される腸管平滑筋細胞のアパミン感受性イオンチャンネルの同定

ニトロソシステイン(NO-Cys)はラット胃平滑筋細胞、ウサギ胃細胞、回腸細胞、門脈細胞において著明なアパミン感受性膜過分極を発生する。そこでこのアパミン感受性過分極に関与するイオンチャネルを同定するため、ラット胃平滑筋細胞および単離化の簡単なウサギ回腸平滑筋細胞を常法通り酵素処理により単離し、NO-Cysで活性化される電流の記録を試みた。通常のホールセル電位固定法では電位依存性電流(Ca,K電流)は記録できた。約10%の細胞で(保持電位0mV)10-20pAの外向き電流が記録できたが、大部分の細胞でNO-Cys(100uM)により誘発される外向き電流は検出出来なかった。細胞内から内因性物質が消失するのを防ぐため、ニスタチンによるホールセル電位固定法でNO-Cysの効果を検討したが、改善は認められなかった。次に酵素処理がなんらかの原因でNO-Cysに対する反応を減弱させる可能性を検討するため、組織標本(ウサギ回腸輪走筋)を用いてNO-Cysで誘発される過分極に対するコラゲナーゼ(0.1-0.3%)、トリプシン(0.1%)の影響を微小電極法により調べた。しかし、両酵素ともNO-Cysで誘発された過分極を抑制しなかった。脱分極刺激により惹起される電位依存性K電流に対して、NO-Cysは増強作用を持たなかった。また細胞内Ca貯蔵部位からのCa遊離に関係ある電流振動は確実に抑制された。しかし、インサイドアウト法により記録されたCa依存性Kチャネル電流にはNO-Cys(10uM)は無効であった。以上のことからNO-Cysで活性化されるKチャネルは少数の細胞にしか存在しない可能性があること、電位依存性KチャネルやCa依存性Kチャネルには作用しないことがわかった。現在上記の可能性を探るため、酵素処理によらない少数細胞標本を作成し、微小電極法により検討中である。
視覚障害患者への情報保障：適切な点字医療文章表現と文章自動変換プログラムの研究

漢字仮名交じりの文章を表音文字である点字にそのまま点訳すると、文字数が増大し文書量が過大になる。加えて、表音文字である点字では同音異義語や敬語が理解の妨げとなる可能性がある。そこで本研究では、通常の医療文章から視覚障害の患者が理解しやすい簡潔な点字文章への自動変換の実現を目的に、文章表現の解析とプログラムの研究開発に取り組んだ。その結果、形態素単位での削除や言い換えに加え、構文の単位である文節の削除をプログラムに実装する必要性を明らかにした。本研究の目的は、視覚障害を有する患者が理解しやすい点字の医療文書提供の実現である。通常の漢字仮名混じり文を単純に点訳した場合、点字が表音文字であるために文字数が増大し文書量が過大になる。また、同音異義語や敬語は点字が表音文字であるが故に、理解を妨げる可能性がある。そこで、点字文書に最適な文章表現の解析、点字文書向け表現に自動変換するプログラムの研究開発、を実施する。今年度は、患者用クリニカルパスの点字化のための文章表現変換プログラムの研究と試作したプログラムの問題点を解明した。患者用クリニカルパスに着目した理由は、2013年に成立した「障害を理由とする差別の解消の推進に関する法律」で視覚障害者への「合理的な配慮」が求められることが予想され、患者に手渡す文書として重要と考えたからである。文章表現変換プログラムの作成では、既に人間が点訳用に簡略化した文章の解析を基に、プログラムへ実装する文章表現の変換規則を作成した。その際、変換規則の適用基準も決定した。プログラムへの実装後に、その変換精度を解析した。その結果、誤変換とされたが正解と判定すべき文章変換があった。現状の変換規則は不充分であり、今後は変換規則抽出対象を拡大して正確な規則を抽出する予定である。通常の漢字仮名混じり文を点訳した場合、点字が表音文字であるために文字数が増大し文書量が過大になる。また、同音異義語や敬語は理解を妨げる可能性がある。前年度に引き続き、医療文章表現の解析に取り組み、医療文章自動変換プログラムに実装する変換規則の対象として、品詞等のデータの組み合わせで対応可能な場合と不可能な場合を解析した。具体的には、健常者向けの文章(変換前の文章)と点訳用の文章(変換後の文章)を形態素解析ソフトMeCab(http://mecab.googlecode.com/svn/trunk/mecab/doc/index.html)で形態素解析し、係り受け解析ソフトCaboCha(http://taku910.github.io/cabocha/)で解析して構文構造を解析した。その結果、形態素解析で変換規則に利用可能なデータは変換対象の語句とその前後の形態素の品詞、品詞細分類、活用形、活用型、原形であった。構文解析では、変換前後の文章で文節単位の圧縮や係り受け関係を持つ文節の距離の違いがあり、これらも変換規則に反映させる必要があることが明らかになった。本研究の目的は、視覚障害を有する患者が理解しやすい点字の医療文書の自動生成の実現である。通常の漢字仮名混じり文をそのまま点訳した場合、点字は表音文字であるために文字数が増大し文書量が過大になると共に、同音異義語や敬語は理解を妨げる可能性が高い。前年度に実施した、本院の外来案内と入院案内健常者向けの文章(変換前の文章)と点訳用の文章(変換後の文章)の構文解析結果を精査した。文節数の比較では、変換後の文章は変換前の約8割に減少していた。また、1文中10文節以上の文章が占める割合は、変換前の文章は全体の約2割、変換後の文章は約1割であった。今回の精査結果から、簡潔な文章への変換には、和語から漢字熟語への変換、等語句の言い換えと、文節の削除が考えられ、プログラムに実装するためには、前者は言い換えのデータベースが必要であり、後者は文節間の係り受け関係を基に削除対象の文節を判定する必要があると結論した。本研究成果は、第16回日本クリニカルパス学会学術集会にて発表し、座長賞を共同受賞した。文章表現変換プログラムに実装する変換規則の作成を目的として文章解析を進めている。今年度はさらに構文解析も実施した。看護学文章解析と変換規則の作成を継続する。また、我々が作成した医療文書コーパスを利用して、変換後の文章の作成し解析対象の文章を増やす。

解析の結果で得られた変換規則をプログラムに実装し、評価する。昨年度の研究遂行過程で、文章表現変換プログラムの誤変換の解析の必要性が判明し、研究に有用な知見を得た。加えて、本研究の成果の一部を2013年11月の第14回日本クリニカルパス学会学術集会で発表し、第14回学術集会優秀賞、同座長賞を受賞するなど、学術的にも高く評価された。情報収集のために参加する学会を変更したため、当初予定よりも国内旅費にかかる費用が少なくなったため。文章表現変換プログラムの誤変換の解析を継続し、正解と判定すべき文章変換を精査する。そしてプログラムの誤変換の原因を明らかにし、必要に応じて変換規則の修正や追加を行う。また、我々が作成した医療文書コーパスを用いて文章表現変換規則を抽出し、文章表現変換プログラムに追加実装する。そして、変換後の文章表現が視覚障害者に理解しやすいか否かを解析する。研究支援者を雇用する。また、研究成果の発表・関連研究の情報収集のための旅費やその他物品費等で研究費を使用する予定である。参加した学会の中で、開催地域が当初想定していた地域と異なる学会があり、国内旅費にかかる費用が少なくなったため。研究支援者を雇用し、研究成果の発表・関連研究の情報収集のための旅費やその他消耗品等で研究費を使用する予定である。
複素解析的高次元クライン群理論の試み

3次元コンパクト複素多様体で3次元射影空間内の直線の近傍と正則同型な領域を含む多様体(Class Lの多様体1982年)の構造を明らかにすることが今年度の目標であった。まず第1は、1次元のKlein群の理論でよく知られたKlein-Maskitcombinationtheoremの3次元における類似の結果の精密化を行うことによってClass Lのcompact多様体の中に含まれる『直線』の存在範囲の構造を調べることであった。『直線』の存在範囲の問題は、当初考えていたものとは違う方法で解決がついたため、3次元のKlein-Maskit combinationtheoremの精密化はそのまま問題として残されてしまった。将来この問題を考えたいと思う。『直線』の存在範囲については、次の定理を得た。定理1。複素射影構造をもつSchottkey型のCompactなClass Lの多様体には、その任意の点に対して、その点を通る『直線』がある。定理2。複素射影構造をもつSchottkey型のCompactなClass Lの多様体上の任意の『直線』は、付随するDouady空間の同一の4次元既約成分上の点に対応する系。複素射影構造をもつSchottkey型のCompactなClass Lの多様体の複素解析的なhandleattachmentは、その多様体とM_gとの解析的連結和の複素解析的変形である。ここで、M_gは3次元射影空間からねじれの位置にある2本の直線を除いた領域の無限巡回群によるコンパクト商多様体を表す。一般に『直線」が動く範囲には複素射影構造が入るが、それが全体空間でないとき、射影構造の入らない部分に関する研究も少し進展したがまだ十分ではない。その他、実双曲多様体上のflat twistor空間の複素解析的変形の問題は、計算機のプログラムが未完成で研究開始に至っていない。定理1。定理2。
地域サーベイランスシステムによる薬剤耐性菌伝播リスクの疫学的・細菌学的解析

平成30年度は、平成29年度の鹿児島感染制御サーベイランスシステム; KICA)に入力された各医療機関の薬剤耐性菌検出データ解析を引き続き行った。黄色ブドウ球菌に占めるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)の比率および緑膿菌に占めるカルバペネム耐性株・2剤耐性株・3剤耐性株の比率は引き続き経時的に低下傾向を認めていた。今後さらにKICAの手指消毒薬使用量・抗菌薬使用量のデータも評価し検討を進めていく予定である。また鹿児島大学病院で発生した多剤耐性アシネトバクターや多剤耐性緑膿菌多発事例について菌株の解析を行うと同時に、環境から検出された薬剤耐性グラム陰性桿菌の解析を進めた。菌株間ではプラスミドを介した薬剤耐性遺伝子の伝達が推定され、プラスミドの解析についても進めていく予定である。医療環境からは通常臨床検体では検出されないカルバペネマーゼ遺伝子保有のグラム陰性菌が検出されており、さらなる解析を進める予定である。MRSAに関しては検出頻度の多い整形外科病棟やICUでの検出株の解析を行った。市中感染株の拡大が問題となっているが、院内では従来のNY/Japanクローンと呼ばれる院内感染株の伝播や多発事例が確認されており、これら菌株の拡大要因について今後さらに解析をすすめていく。また県内で検出された多剤耐性緑膿菌やカルバペネム耐性腸内細菌科細菌等の菌株収集を行い、次年度も継続し評価を行っていく予定である。当初計画と比較し、データ解析が研究時間の確保が困難となったため、やや遅れている。今後さらに菌株収集を進め、データ解析の時間を確保し解析を進めていく。今年度行った、薬剤耐性菌サーベイランスのデータ解析や遺伝子タイピングの検討に加え、地域ネットワークを活用し菌株収集の強化を図る。鹿児島県内医療機関の手指消毒使用量や抗菌薬使用量のデータが集積されており、これらのデータも活用し、さらなる検討を進める。平成29年度は、平成27-28年度の鹿児島感染制御サーベイランスシステム; KICA)に入力された各医療機関の薬剤耐性菌検出データ解析を行った。黄色ブドウ球菌に占めるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)の比率および緑膿菌に占めるカルバペネム耐性株・2剤耐性株・3剤耐性株の比率は経時的に低下傾向を認めていた。また厚生労働省院内感染対策サーベイランス事業(JANIS)検査部門による全国データと比較し、KICAデータは耐性緑膿菌の比率は有意に低いものの、ペニシリン耐性肺炎球菌や第3世代セファロスポリン耐性大腸菌の比率は有意にKICAデータが高く、耐性菌の検出頻度は菌種によって地域差があることが判明した。本研究結果は第29回日本臨床微生物学会で報告を行った。今後さらに手指消毒薬使用量・抗菌薬使用量のデータも評価し検討を進めていく予定である。カルバペネム耐性腸内細菌科細菌(CRE)は現行の薬剤感受性結果ではスクリーニングされないという問題点も提起されており、今後CREサーベイランスを強化するため、低濃度のメロペネムに対する薬剤感受性試験を行い、スクリーニングが可能かどうか検討するため、薬剤感受性試験の方法について検討を行い、平成30年度以降でスクリーニングを実施していく予定である。また県内で検出された多剤耐性緑膿菌やCRE菌株の収集を行うと同時に、当院の患者から得られた耐性アシネトバクター保菌株・感染症発症株の保存菌株を用い、基礎的遺伝子タイピングを行い、伝播リスクなどに関する検討を行った。収集菌株数は想定より少なかったが、次年度も継続し評価を行っていく予定である。当初計画である、データ解析や菌株収集と基礎的遺伝子タイピングはほぼ予定通りに進行している。ただし収集菌株数が想定より少なく、今後さらに収集を進めていく必要があるため。

今年度行った、薬剤耐性菌サーベイランスのデータ解析や遺伝子タイピングの検討に加え、さらに菌株の収集を進め、今後当初の計画に基づき、薬剤耐性菌多発事例の疫学調査に有効な遺伝子タイピング方法の検討を行う。さらに、実地臨床で菌種同定とともに行われている薬剤感受性結果を基にした、流行型クローンやハイリスククローンのスクリーニング法に関する検討を進める予定である。今年度行った、薬剤耐性菌サーベイランスのデータ解析や遺伝子タイピングの検討に加え、地域ネットワークを活用し菌株収集の強化を図る。鹿児島県内医療機関の手指消毒使用量や抗菌薬使用量のデータが集積されており、これらのデータも活用し、さらなる検討を進める。収集菌株数が予定より少なく、また耐性アシネトバクターに関しては比較的安価で可能なタイピング方法を用いたことから、物品費の支出が少なかったため。2018年度に実施予定だった菌株解析が一部遅れており、次年度使用額が生じた。2019年度に予定していた解析を進めていく予定である。
静電相互作用モデルに基づくテロメア四重鎖DNA結合性ポルフィリンの創製と解析

ポルフィリンのメソ位と末端にピリジニウム基を導入し分子の陽電荷を増加させることで、テトラカチオン性ポルフィリンより強い静電引力によりテロメア四重鎖DNAと相互作用するオクタカチオン性ポルフィリンの分子設計、分子ドッキング、分子動力学シミュレーション、及び合成を行った。さらにテロメア四重鎖DNA複合体の結晶化を試みた。本研究では、テロメア四重鎖DNAに強く結合する新規オクタカチオン性ポルフィリンの静電相互作用モデルに基づく分子設計と合成、複合体の分子ドッキングシミュレーション(DOCK)と分子動力学シミュレーション(MD)による結合様式と結合自由エネルギー(ΔG)の予測、複合体の融解温度と熱力学的諸量の測定による安定化能、結合能の検証と評価、複合体の単結晶化とそのX線結晶構造による原子レベルでの詳細な解析、テロメラーゼ阻害活性と抗腫瘍細胞増殖活性の検討と評価を目的としている。このように本研究の特色は、四重鎖DNAを標的とすること、その構造の特徴を生かし相互作用させる分子基盤として大環状芳香族化合物のポルフィリンを用いること、さらに分子シミュレーションを駆使した論理的開発を行うというユニークな創薬コンセプトである。今年度は、まず、オクタカチオン性ポルフィリン3Pyの分子設計と化学合成を進めた。ピリジン、臭化チオニル、パラホルムアルデヒドからPyBrを合成し、これをTPyP3と反応させ3Pyを得た。またインシリコ解析として、3Py, 4Py, 3Tm, 4TmのDOCKとその初期配座から4ナノ秒のMDを行った。そのトラジェクトリを用いたMM/PBSAによるΔGの見積を行ったところ、3Pyが最も良くテロメア四重鎖DNAに強く結合することが示唆された。また構造生物学的解析のため、TBzPyP3とテロメア四重鎖DNAの複合体の単結晶化を行ったが微結晶しか得られず、引き続き単結晶化を進めている。今年度は、アルキル鎖長の異なるオクタカチオン性ポルフィリンの分子設計と化学合成を進めた。まずTPyP3を合成後、ジヨードメタン、ジヨードエタン、ジヨードプロパン、ジヨードブタンを反応させた。このうち、ヨードエチル基、ヨードプロピル基、ヨードブチル基をもつTPyP3誘導体が得られた。さらにこれらとピリジンを反応させたところ、ヨードプロピル基ヨードブチル基をもつTPyP3誘導体がオクタカチオン性ピリジニウム付加物を与えた。また構造生物学的解析のため、これらとテロメラ四重鎖DNAの複合体の単結晶化を行ったが結晶が得られず、引き続き単結晶化を進めている。本研究では、テロメア四重鎖DNAに強く結合する新規オクタカチオン性ポルフィリンの静電相互作用モデルに基づく分子設計と合成、複合体の分子ドッキングシミュレーションと分子動力学シミュレーションによる結合様式と結合自由エネルギーの予測、複合体の融解温度と熱力学的諸量の測定による安定化能、結合能の検証と評価、複合体の単結晶化とそのX線結晶構造による原子レベルでの詳細な解析、テロメラーゼ阻害活性と抗腫瘍細胞増殖活性の検討と評価を目的としている。昨年度に、ピリジニウムを末端に持つプロピル基あるいはn-ブチル基を介したオクタカチオン性TPyP3誘導体が得られたので、今年度は引き続き構造生物学的解析のため、これらとテロメア四重鎖DNAの複合体の単結晶化を行った。DNAの塩基配列、沈殿剤、温度等種々の条件検討を行ったが、現在まで単結晶は全く得られていない。また、四重鎖DNA選択的結合性を示すカチオン性ポルフィリンの開発を試みたが、ヨードプロピル基あるいはヨードブチル基を持つテトラカチオン性ポルフィリンと置換基を有するピリジン類との反応性が悪く、現在まで合成できていない。