hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高感度次世代抗体チップ開発のためのタグ付抗体産生マウスの作製と 抗体機能の検討

抗体チップは網羅的にタンパク質の発現を解析するツールである。本研究ではダイアモンド様表面加工特殊基板にタグ付蛋白を結合させる技術を利用し、高感度次世代型抗体チップを開発する目的で、遺伝子組み換え技術を用いて免疫グロブリンG(IgG)にタグを付加したモノクローナル抗体を作製した。タグを導入したIgGを培養細胞発現系で作製し、基板に固定し、基板上でのタグ付抗体の固定状態を評価した。本研究の遂行には純度の高いタグ付抗体を大量に作製する必要があることが確認され、タグ付抗体の大量生産システムの開発を行った。本研究の目的はマレイミド基導入ダイアモンド様表面加工基板(DLCマレイミド基板)にオリゴシステインタグ(Cys-タグ)付蛋白を結合させる技術を利用し、産業的に大きな波及効果が期待できる抗体チップの開発を行うことである。この目的の達成のために、今年度は以下の研究を行った。1.組み換え型抗体蛋白へのCys-タグの導入抗体蛋白である免疫グロブリンIgGは重鎖と軽鎖が2分子ずつ重合した4量体で、抗原認識部位は遺伝子組み換えによる多様性がある。IgG重鎖遺伝子のC末端部にCys-タグを付加した組み換え蛋白発現ベクターを構築し、培養細胞系で組み換え型Cys-タグ付IgG重鎖がIgG軽鎖と重合するか検討を行った。1)抗ヒスチジンタグ(ヒスタグ)マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを樹立した。2)このハイブリドーマからIgG重鎖とIgG軽鎖の遺伝子を5'-RACE法でクローニングした。3)得られたcDNAでCys-タグ付IgG重鎖発現ベクターとIgG軽鎖発現ベクターを作製した。4)3)のIgG重鎖発現ベクターとIgG軽鎖発現ベクターを共にCOS7細胞にトランスフェクションし、培養上清からプロテインGカラムでIgG分画を回収した。5)回収したCys-タグ付IgGについて、Native-PAGEとウェスタンブロッティングを行い、分子量160万の位置にバンドを確認した。陽性コントロールのハイブリドーマから産生される抗ヒスタグ抗体とほぼ同じ位置にバンドを確認したので、組み換え型Cys-タグ付IgGは4量体を形成していることが証明された。2.Cys-タグ付抗体産生遺伝子改変(ノックイン)マウスの作製Cys-タグ付抗体産生マウスは様々な抗原に対するCys-タグ付モノクローナル抗体を効率的に生産するために必須である。よって、IgG1重鎖のC末端部にCys-タグ配列を挿入したノックインマウスを作製する。1)ターゲティングベクターの構築:マウスIgG1重鎖ゲノムの第7エクソンにあるストップコドンの直前にシステインの繰り返し配列を挿入し、第7エクソンのpolyAサイトから約0.5kb下流にloxPサイトではさまれたネオマイシン耐性カセットを挿入したターゲティングベクターを作製した。2)ターゲティングベクターのマウスES細胞への導入を行った。本研究の目的はマレイミド基板マレイミド基板にCys-タグ付蛋白を結合させる技術を利用し、産業的に大きな波及効果が期待できる抗体チップの開発である。1.組み換え型Cys-タグ付抗体の作製とマレイミド基板への固定(1)細胞培養ディッシュにCOS7細胞を播種し、IgG重鎖発現ベクターとIgG軽鎖発現ベクターをトランスフェクションした。(2)トランスフェクション後、3日目で培養上清を回収し、ProteinGによるアフィニティークロマトグラフィーで組換え型抗体を回収した。(3)抗体溶液をマレイミド基板にスポッティングで固定し、蛍光標識抗マウスIgGで検出した。(4)通常の細胞培地で調製した組換え型IgGはCys-タグの有無に関わらず検出が困難であった。(5)培地のウシ血清由来のIgGの混入により、基板への固定に支障が生じたと考えられたので、無血清培地で組換え抗体の作製を行った。(6)無血清培地で作製できた抗体の量は培地1Lあたり100μg程度であった。ハイブリドーマが培地1Lあたり24mgの抗体が回収されたのと比較して、極めて微量であることが分かった。よって、研究の遂行のためにはタグ付抗体の大量生産システムの開発が必須の技術課題であることが明確になった。2.Cys-タグ付抗体産生遺伝子改変(ノックイン)マウスの作製(1)マウスIgGl重鎖ゲノムのストップコドンの直前にタグ配列を挿入したターゲティングベクターをES細胞に導入し、Balb/cマウスの胚盤胞にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製した。(2)キメラマウスとC57/BL6マウスとを交配し、Flマウスを作製した。(3)FlとCre-マウスを交配させ、NeoR遺伝子を除去した。

(4)さらにC57/BL6と交配させ、Cre配列を除去し、ヘテロ接合体を作製した。抗体チップは小型の基板に多数の抗体を固定し、試料中の抗原を網羅的に検出するツールである。現在は研究用製品を中心に開発・販売されているが、今後需要の増加が見込まれる。その核となる技術は抗体の固定方法や抗体に結合した抗原の検出方法で、様々な技術改良がなされている。本研究の目的はダイアモンド様表面加工特殊基板にタグ付蛋白を結合させる技術を利用し、産業的に大きな波及効果が期待できる高感度次世代型抗体チップの開発を行うことである。平成24年度は組換え型タグ付抗体の基板固定とタグ付抗体大量生産システムの開発を行った。1.組換え型タグ付抗体の基板固定培養細胞発現系でタグ付抗体発現ベクターをトランスフェクションし、培養上清を回収して組換え型抗体を作製した。得られた抗体の活性をELISAで確認し、濃度はBradford法で測定した。純度の検定はSDS-PAGEとNative-PAGEで行った。その結果、少量であるが純度の高いタグ付抗体が得られた。基板に作製した抗体をスポッティングし、免疫蛍光抗体法で抗体の固定状態を評価した。2.タグ付抗体大量生産システムの開発1.の結果実用化を目指した研究開発の遂行には純度の高いタグ付抗体を大量に作製する必要があることが確認された。よって、タグ付抗体安定発現細胞株の樹立を行った。今後、樹立した細胞を材料として研究を遂行し、実用化を目指す。研究期間内の目標であった、タグ付抗体の構造と機能の保持について、組換え型タグ付抗体を培養細胞系で作製し確認できた。タグ付抗体大量生産システムの確立のために必須である遺伝子改変マウスの作製も予定どおり進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。1.タグ付抗体大量生産システムの開発1)Cys-タグ付IgG重鎖産生遺伝子改変マウスホモ接合体の作製2)各種タグ付抗体産生ハイブリドーマの樹立※研究成果有体物として、随時特許出願予定2.ハイブリドーマ由来Cys-タグ付抗体を用いた抗体チップの作製1)マレイミド基板への固定条件の検討2)抗原検出反応の検討3)Cys-タグ付抗体チップの優位性の証明24年度が最終年度であるため、記入しない。
フランス植民地史研究と歴史認識－サハラ以南アフリカを手がかりに

本研究は、植民地支配の過去をめぐる歴史認識について、フランスを事例に考察したものである。日本に比すると、フランスはアルジェリアを除けば旧植民地からの批判にさして直面してはおらず、そもそも植民地支配の過去が必ずしも「負」の歴史と捉えられているわけでもない。本研究では、フランス植民地のなかでも独立前から親仏的傾向が強いサハラ以南アフリカに注目し、社会史的手法によって、本国側の認識がいかに形成されていったかを考察した。本研究は、植民地支配の過去をめぐるフランスの歴史認識のあり方に注目し、その背景を歴史的に探究することで、近年盛んになっている植民地・帝国史研究に比較の視座を提供することをおもな目的としている。とりわけ親仏的傾向の強かったサハラ以南アフリカに焦点を当てることで、通常考えられている植民地像とは異なる側面を考察するのが狙いである。そうした大きな目的のなかで、平成26年度は、第一次世界大戦から戦間期にかけてのサハラ以南アフリカの歴史を、フランスとのかかわりにおいて整理することを第一の作業としていた。ちょうど一年間の研究休暇を得ていたので、5月にはフランスに短期渡航して史料館でこのテーマに関する最終確認をし、ほぼ半年をかけて単著『アフリカを活用するーフランス植民地からみた第一次世界大戦』を脱稿した(人文書院から10月に刊行)。これは大きな成果の一つである。平成26年は大戦の開戦100周年にあたっており、このテーマをめぐって数多の書物が刊行されたが、本書はそれらとは異なる視点からこの戦争を捉えたもので、新しい視座を提供したと考えている。その他、共著が2点刊行の運びとなった。なかでもコモンウェルスをめぐる共同研究の成果として、フランス版コモンウェルスといえる「フランコフォニー(フランス語圏の意)」に関する論文を完成させることができた。この組織は、親仏的なフランス領アフリカのエリートたちが熱心に推進したものであり、本研究をこれから進展させるうえで、やはり基本となる論点である。以上に加えて、10月からフランスに滞在した際に、史料館や国立図書館で関連資料の収集・整理を行った。またサハラ以南アフリカとエリートの心性が類似しているフランス領カリブ海に出張し、現地社会を観察すると同時に当地の歴史家に面会したことも重要な成果だった。平成27年度の成果として、5点の論考を公刊できた。ここではそのうち3点に言及しておきたい。まずはインド洋の島、マイヨットを素材に論じた「国民国家と植民地主義」である。マイヨットは4つの島からなるコモロ諸島の一つで、19世紀半ばにコモロの中では最も早くフランスに植民地化された。他の3つの島と政治的に一体だったことはなく、むしろ対立の歴史が続いていた。1975年にコモロが独立した際も、住民投票でマイヨットのみは仏領への残留を決めた。従属の継続を積極的に望む植民地の姿勢が、宗主国フランスの認識に与える影響は小さいものではないだろう。こうした選択の理由はさまざまだが、とくに19世紀の奴隷制廃止の経緯から、マイヨットはフランスを「自由の国」だとみなしてきた。実際の利害はさておき、この種の物言いが従属地域から発せられる現実を無視することはできない。フランスには自らの植民地支配をめぐって、肯定的な歴史認識が今日でも色濃くみられる面があり、マイヨットはそれを植民地の側から補強したともいえる。今後、考察を深めるに際しても、立ち返って参照すべき事例である。次に「シャルリ・エブド襲撃事件とフランス」を取り上げる。ムハンマドの風刺を執拗に掲載していた風刺画新聞社が、襲撃を受けた事件を扱ったものである。この事件を植民地支配の延長上に位置づけるつもりでは、もちろんない。とはいえ、上述のような根強いフランスの歴史認識を背景に、被支配の側に連なる人びとに負の価値づけをする姿勢が続いているようにみえるのもまた、否定できない。事態を単純化することなく、歴史的経緯に目配りしながら解きほぐしていかなければならない論点であろう。最後に『人形の文化史』に掲載した、ヨーロッパの「黒人人形」をめぐる小論がある。「黒人」は本研究から導き出される大きなテーマの一つであり、次年度への思考の架け橋とすることができた。平成27年度は、植民地史をめぐる「歴史認識」というテーマの重要性を、再確認する結果となった。植民地支配が種々の暴力を伴ったことは、いうまでもない。しかしそれが後の時代にどのように認識されているかは、レベルの異なる議論である。当該年度に公刊したマイヨットの事例は、植民地化の経緯や時期は若干異なるものの、サハラ以南アフリカをめぐる状況と比較対照するに、格好の素材であった。サハラ以南アフリカは広大な領域であり、単純に類似の歴史をたどった地域であるとはいいがたい。しかし別の観点からすれば、この地を特殊な「植民地」と結論づけることを戒める意味においても、マイヨットのような事例を参照し、比較考察することの重要性を認識することができた。さらに平成27年度からは、「歴史認識」から発展して、フランスにおける「黒人」の認識も視野に入れている。フランスの植民地支配をめぐる歴史認識を検討するにさいして、長らく被支配の側に置かれた「黒人」にどのようなまなざしが向けられてきたのかは、重要な一つの要素である。この問題が単純でないのは、奴隷制時代の書き物などにおいて、あからさまに差別的なことを書くのではなく、ニュアンスを含んだ複雑な文体で書かれるケースも少なくないため、読解が一様でないことがある。

たとえば啓蒙思想家モンテスキュー『法の精神』の奴隷制に関する記述をどう解釈するかは、近年大きな議論となっており、複数の立場からの論考も出されている。これは「黒人」認識を考えるのに、避けて通れない論点ともなっている。幸い当該年度のフランス出張で、いくつか文献を収集できたと同時に、フランス人研究者へのインタヴューも実現した。多様な読みが可能な文章から、どのような結論を導くか、今後も考え続けなければならないテーマである。本研究3年目の着地点をめざすにあたり、重要な示唆を得ることができた。平成28年度は雑誌論文1点、および書評2点を成果として公刊することができた。ここでは論文を取り上げる。フランスで1848年に奴隷制が最終的に廃止された際、それを記したデクレの第7条に次のような文言があった。「フランスの地に足を踏み入れた奴隷は解放されるという原則は、共和国の植民地と海外所領に適用される」。この原則が何かを論じたのが「奴隷制時代のフランスにおける「黒人」ー見えないものから見えないものへ」である。近年の研究によれば、フランスでは16世紀後半から17世紀前半にかけて、現実との齟齬はともかく、自由の地フランスという原則が根づいていったと考えられている。それは大西洋を隔てたカリブ海植民地を中心とする地域で、黒人奴隷制が開始され発展していった時期に重なっている。植民地の開拓が進んで奴隷が増えていくと、奴隷を本国に連れ帰る主人も増えてくるが、王国政府は徐々に奴隷、すなわち「黒人」は本国に足を踏み入れても解放されないという方向に舵を切り、18世紀後半には「黒人」のフランスへの入国を全面的に禁じる法を制定した。他方で、フランスは奴隷を解放する自由の国であるという「神話」は根強く残り、植民地とは異なる法令においてもこの原則が喚起される状況となっていた。そのことが1848年の奴隷制廃止に際して、フランスがこの原則を植民地にも適用して奴隷を解放する、という文言につながったと考えられるのである。これは昨年度の研究成果とも合わせ、今後の研究の方向性を見定める上で重要な論点となる。平成28年度末にはフランスへの短期の出張も行った。フランスにおける植民地支配の歴史認識を歴史的にたどるのに加え、同時代の認識を追っておくことが本研究の進展には重要である。出張の折に、21世紀に入って関心の高まった歴史をめぐる「法制化」に関する資料調査を進めることができたのは、今後の準備として有益であった。本研究はサハラ以南アフリカにおもな焦点を当てて、フランスの植民地支配の過去をめぐる歴史認識を問うものである。この地に注目する主たる理由は、支配と被支配という二項対立で語られがちな植民地時代の状況、さらにはその歴史認識を相対化しうる地域と考えられることにある。これまでのところフランスの歴史認識の形成を考える一つの事例として、第一次世界大戦における仏領アフリカについて単著一点を上梓した。また現代フランスに残された旧植民地の位置づけ、またそれから考えられるフランスの歴史認識についても、近年新たに「海外県」となったインド洋のマイヨットの事例を扱う論文を公刊した。
遺伝子治療用ウイルスベクターに混入する増殖性ウイルスの迅速・高感度検出法の開発

ウイルスベクターの製造過程で混入する可能性のある増殖性ウイルスの検出は、遺伝子治療用ウイルスベクターの品質、安全性確保上重要な課題である。本研究ではウイルスベクターに混入する増殖性アデノウイルス(RCA)及び増殖性レトロウイルス(RCR)を、ウイルスの指向性細胞への感染性とリアルタイム定量PCRの迅速性、高感度性、定量性を組み合わせた感染性(R7-)PCR法により検出する方法を開発した。RCAは、HeLa細胞に感染させ、一定期間増幅後、細胞中のRCAのゲノムDNAをガラスビーズ法により簡便で効率よく抽出し、リアルタイム定量PCRで測定する感染性PCR法を確立した。感染性PCR法では、10^9 particlesのアデノウイルスベクターにスパイクした1pfuのRCAを感染3日目で検出可能であり、従来法の細胞変性効果(9日目で10,000pfuを検出)による検出と比較して、より短時間の培養で10,000倍も高感度にRCAを検出可能であることを明らかにした。RCRは、M.dunni細胞に感染させ、一定期間増幅後、上清中のRCRをポリエチレンイミン(PEI)結合磁気ビーズで濃縮し、ビーズ画分からRCRのゲノムRNAを抽出してリアルタイム定量RT-PCRで測定する感染性RT-PCR法を確立した。感染性RT-PCR法では、従来法のフォーカスアッセイと比較してより短時間の培養で10倍以上高感度にRCRを検出可能であった。また、上清中のRCRの替わりに細胞内に増幅したウイルスRNAをガラスビーズ法で抽出後に測定すると、より短時間の培養でウイルス検出が可能であった。さらに、RCRをPEI磁気ビーズと混合後に磁場の上で強制感染させる高効率ウイルス感染系を確立した。この感染系を利用して感染性RT-PCR法を行うと、さらに10倍以上高感度にRCRを検出できることを明らかにした。ウイルスベクター製造過程で混入する可能性のある増殖性ウイルスの検出は、遺伝子治療用ウイルスベクターの品質、安全性確保上重要な課題である。本研究ではウイルスベクターに混入する増殖性アデノウイルス(RCA)及び増殖性レトロウイルス(RCR)を、ウイルスの指向性細胞への感染性とリアルタイム定量PCRの迅速性、高感度性、定量性を組合わせたInfectivity PCR法により検出する方法の開発を検討した。感染性のRCAの検出は、HeLa細胞に感染させた後、細胞内で増幅したRCAのゲノムDNAをリアルタイム定量的PCRにより高感度に検出する手法を開発した。すなわち、細胞内に増幅したRCAを測定することで上清中のRCAを測定するよりも高感度にRCAを検出可能であり、また細胞内のウイルスゲノムDNAは新たに開発したガラスビーズ法により簡便で効率よく抽出可能であることが判明した。Infectivity PCR法にガラスビーズ抽出を組合せることで、10^9 particlesのアデノウイルスベクターにスパイクした1pfuのRCAを感染3日目で検出可能であり、従来のRCA検出法の細胞変性効果(9日目で10,000pfuを検出)と比較して迅速・高感度にRCAを検出可能であることを明らかにした。感染性RCRの検出は、M.dunni細胞に感染させた後、RCRのゲノムRNAを抽出し、リアルタイム定量的RT-PCRにより高感度に検出する手法を開発した。すなわち上清中に得られるRCRのポリエチレンイミン磁気ビーズ濃縮とInfectivity RT-PCR法の組合わせにより、従来のフォーカスアッセイより、迅速、高感度にRCRの検出が可能であること、また上清でさまなく細胞内のウイルスRNAをガラスビーズで抽出する方法とInfectivity RT-PCR法を組合わせるとさらに高感度化が可能であることを明らかにした。

本研究ではウイルスベクターに混入する増殖性アデノウイルス(RCA)及び増殖性レトロウイルス(RCR)を、ウイルスの指向性細胞への感染性とリアルタイム定量PCRの迅速性、高感度性、定量性を組み合わせた感染性(RT-)PCR法により検出する方法を開発した。RCAは、HeLa細胞に感染させ、一定期間増幅後、細胞中のRCAのゲノムDNAをガラスビーズ法により簡便で効率よく抽出し、リアルタイム定量PCRで測定した(感染性PCR法)。その結果、10^9 particlesのアデノウイルスベクターにスパイクした1pfuのRCAを感染3日目で検出可能であり、従来法である細胞変性効果(9日目で10,000pfuを検出)による検出と比較して、より短時間の培養で10,000倍も高感度にRCAを検出可能であることを明らかにした。RCRは、M.dunni細胞に感染させ、一定期間増幅後、上清中のRCRをポリエチレンイミン(PEI)結合磁気ビーズで濃縮し、ビーズ画分からRCRのゲノムRNAを抽出してリアルタイム定量RT-PCRで測定した(感染性RT-PCR法)。RCRの場合も従来のRCR検出法のフォーカスアッセイと比較して、より短時間の培養で10倍以上高感度にRCRを検出可能であった。また、上清中のRCRではなく、細胞内に増幅したウイルスRNAをガラスビーズ法で抽出後に測定すると、さらに短時間の培養でウイルス検出が可能であった。また、RCRをPEI磁気ビーズと混合後に磁場の上で強制感染させることによる短時間で高効率なウイルス感染系を確立した。この感染系を利用して感染性RT-PCRを行うことにより、さらに10倍以上高感度にRCRを検出できることを明らかにした。
ニューラルネットワークによる変形文字パターンの認識機構に関する研究

文宇に限らず音声、画像などのパターンの認識は人間が最も得意とする分野である。しかし、最新の画像技術を導入してもパターン認識が人間並みに認識できないことも情報処理技術者なら周知の事実でもある。このような背景から、ニューラルネットワークによるパターン認識に関する研究が活発に行われている。本研究は3次元空間内を移動する視点から見える文字パターンを認識することができるニューラルネットワークの認識機構に関する研究についてまとめたものである。文字を見る視点を移動すれば、文字は幾何学的な変換を受ける。視点が文字平面の中心に近寄れば文字パターンは遠近感を受ける。現在のところ、このような変形文宇を認識できるニューラルネットワークは提案されていない。本研究はニューラルネットワークに複写学習法を導入し、変形文字が認識できる認識機構を提案している。本研究を以下のようにまとめる。(1)視点移動と入力パターン分解能が3層BPネットの認識率に及ぼす影響を調べた。実験により、視点移動時における入力パターン分解能と文字認識率の関係を明らかにした。本研究は視点移動と文字認識の相補性の解明および3次元空間内に散在する文字などからの情報収集に基礎的な役割を果たす。(2)本研究は文字平面と規点間の距離を変化させ、遠近感のある文字パターンに対して学習・認識実験を行った、これにより、距離の変化と認識率の関係を明らかにした。(3)基本文字を学習するだけで、変形文字や重ね文字から基本文字を分離・認識することができる複写学習モデルを提案した。本研究は歪な文字や文字同士が重なった文字の認識実験を行い、提案モデルの有効性について示した。以上、提案モデルは従来のネットモデルに比べ、ネット構造が簡素で構築が簡単である。学習法が簡単なため文字パターンの学習時間が短いなどの利点がある。本研究は汚れ文字、絵と文宇の重ね、文字同士の重ね文字の分離・認識へと発展させる予定である。従来のニューラルネットワークによる文字認識は、文字平面と視線が垂直条件を保った状態の認識を論じていた。この条件で視点が幾何学的変化を受けると文字パターンに回転・位置ずれ、スケーリングの変化を受けることになる。このような文字パターンの認識に関しては、我々は既に制約付き学習モデル、複写学習モデルなどを提案した。今回の研究は、文字平面と視線の垂直条件を取り払い3次元空間内の任意の視点から見える文字を対象とする。すなわち、視点が文字平面に近づき、視線と文字平面が垂直でない場合は文字パターンに遠近感が現れる。このような回転・位置ずれ・スケーリング以外にも遠近感を伴う文字パターンに関する認識機構の研究報告例はない。本研究は、まず3次元空間内の任意の視点から見える文字パターンを自動生成するパターン生成シミュレーションを開発した。これは基本文字を与えると任意の視点移動から見える文字パターンを任意の分解能で生成することができるものである。これにより、ニューラルネットの視点移動と文字認識の相補性に関する研究を発表した。次に、ニューラルネットワークによる遠近感のある文字パターンの認識に関する様々な認識実験を行い、視線角度と遠近パターンの関係や認識率の関係に基づき空間的変化を論じた。これらの成果を学術論文誌及び研究会等に発表した。本研究はあと2年間で、複雑な変形文字パターンを認識するメカニズムを明らかにすると同時に、それを裏付けるための実験を遂行する予定である。平成9年度に3次元空間内を自由に移動することができる視点(カメラ)から見える文字パターンを自動生成するシミュレー夕を開発した。

また、このシミュレータを用いて、任意の視点から見える変形文字をニューラルネットワーク(神経回路網)の学習と認識実験に利用できる環境作りを行った。平成10年度は、9年度の実績をもとに、以下の項目について研究を行った。(1)基本文字だけの学習で認識可能な視点移動の範囲を求めた。(2)事前にどの程度の視点移動を受けたときに見える文字パターンを学習しておけば、大きく視点移動しても認識できるのかを実験的に求めた。(3)1と2から、実験に基づき、視点移動と文字認識の相補性を調べた。(4)視点を文字平面に近づけると文字は遠近感のあるパターンになる。このような変形文字に対する認識を明らかにした。(5)入力パターン分解能を変化させたときの文字認識について実験を行い、視点移動と認識率を高める入力パターン分解能の関係を求めた。(6)4と5から、視点移動と入力パターン分解能の変化がニューラルネットワークの学習と認識に及ぼす影響を明らかにした。以上の成果を、平成9年度から現在まで、査読付き論文2編、国際学会1編、大学紀要・研究論集2編、研究会2編、学会口頭発表4を行っている。来年度以降はこれまでの研究を発展させ、複雑な変形を受けた文字に対する認識率向上のための学習・認識メカニズムについて研究を遂行する予定である。文字、音声、画像などのパターンの認識は人間が最も得意とする分野である。しかし、最新の画像技術を導入してもパターン認識が人間並みに認識できないことも情報処理技術者なら周知の事実でもある。このような背景から、ニューラルネットワークによるパターン認識に関する研究が活発に行われている。本研究は3次元空間内を移動する視点から見える文字パターンを認識することができるニューラルネットワークの認識機構に関する研究についてまとめたものである。文字を見る視点を移動すれば、文字は幾何学的な変換を受ける。視点が文字平面の中心に近寄れば文字パターンは遠近感を受ける。現在のところ、このような変形文字を認識できるニューラルネットワークは提案されていない。本研究はニューラルネットワークに複写学習法を導入し、変形文字が認識できる認識機構を提案している。本研究を以下のようにまとめる。(1)視点移動と入力パターン分解能が3層BPネットの認識率に及ぼす影響を調べた。本研究は視点移動と文字認識の相補性の解明および3次元空間内に散在する文字などからの情報収集に基礎的な役割を果たす。(2)基本文字を学習するだけで、変形文字や重ね文字から基本文字を分離・認識することができる複写学習モデルを提案した。本研究は歪な文字や文字同士が重なった文字の認識実験を行い、提案モデルの有効性について示した。以上、提案モデルは従来のネットモデルに比べ、ネット構造が簡素で構築が簡単である。学習法が簡単なため文字パターンの学習時間が短いなどの利点がある。
自己学習をする生化学論理デバイス(バイオケミカルニューロン)のハードウエア化

本研究の目的は代謝系に数多く存在する生化学論理デバイス(バイオケミカルニューロン)に着目し、その機能発現原理を模倣した新しいタイプの人工ニューロンのハードウエア化である。この素子は、多入力1出力で、"短期記憶を持ったしきい値論理機能"を有しており、この素子の構成要素となるネットワークを使って、複雑な時系列入力パターンを識別・分類することができる。この素子を基本構成要素とすると、要素間の結合様式を変えるだけで、A/D信号変換システムや、自己組織システムを構築することができる。構築した人工神経回路網を使って、様々な神経生理学的実験事象を追証できることから、この素子のハードウエア化は、より生体系に近いニューロシミュレータの開発につながる。具体的に得られた結果を以下にまとめる。1)時系列アナログ信号のパターン分類用ネットワークの確立:時々刻々入力される時系列信号を過去からの入力パターンの変化として捉えたり、瞬間の変化として捉えたりすることができる人工ニューラルネットワークをバイオケミカルニューロンを基本要素として構築した。またそれを拡張して、時系列信号の類似性認識システムを考案した。このシステムの有用性を検証した結果、テキスト依存型の話者照合に適用できることが明らかになった。2)Spiceシミュレーションでの生化学論理デバイスの安定性評価:バイオケミカルニューロンのプロトタイプをすでにアナログ電子回路のボードレベルで試作しているが、ニューロンシナプス部の可塑性を取り入れたバイオケミカルニューロンを開発するため、CAEシステムを用いてSpiceシミュレーションを行った。
異種移植における遅延型拒絶反応の抑制-補体制御と糖鎖抗原の改変-

1.補体制御に必要な抑制因子の再検討。2.DAFの機能ドメインSCR2-4を重合しCHO細胞およびブタ血管内皮に遺伝子導入した。DAFの重合化は異種細胞上で補体制御に極めて有効であった。α1,3GTのknockout vectorを作成、ブタの血管内皮にknockoutをかけ得た。ブタ胎児繊維芽細胞のknockoutは、2000 cloneほどあげたが失敗した。「DAF+GnT-III発現、ホモα1,3GTのknockoutブタ」の血管内皮を検討。α1,3GT活性は感度以下を示した。またGSI-B4の測定でα-galの発現はほぼ0であった。しかし、ヒト血清に対する反応性は、GnT-IIIが同時に影響するにもかかわらず、15%程度残存した。ブタisletの糖鎖抗原の解析。賭場ブタの膵臓のislet(API)を分離し、抗体染色およびHPLCにてα-Galの発現を確認したが、認めなかった。次に、その新生児ブタのislet=NPCCを分離し、9日間の培養し抗原性を検討した。NICCではα-Galの活性および発現を確認した。トランスジェニックブタの移植実験1.補体制御に必要な抑制因子の再検討。トランスジェニックブタの移植実験1。補体抑制因子による膜残存補体C4,C3に対する機能の検討【方法】まず、DAFのもつ補体制御機能をMCP、膜型C1-INHと比較した。次に、cofactor活性を持つ分子間、MCP、CR1(SCR8-11)、膜型C4bp(SCR1-3)で比較した。これらをCHO細胞に遺伝子導入し、安定発現株を作成した。FACSで発現を確認した後、細胞障害抑制機能をLDH assayで、また補体沈着(C4,C3)量をFACSで測定・検討した。【結果】1.全分子ともCHO細胞に高発現した。2.DAFはC3沈着、引き続く細胞傷害をよく制御したが、C4沈着は制御しなかった。3.MCPはDAFに比べ、C3沈着および細胞傷害の制御に劣ったが、若干のC4制御機能をしめした。4.膜型C1-INHはC4沈着を約40%制御した。5.CR1(SCR8-11)はDAF機能に類似した。6.C4bp(SCR1-3)は弱いながらもC4、C3の双方の沈着を抑制した。【まとめ】DAFに求め得ない機能であるC4沈着を避けるには、膜型C1-INHと膜型C4bp(SCR1-3)が有効であった。2。α-Gal抗原後の糖鎖抗原の検討をするために、α1,3GTのknockoutvectorを作成し、まず、ブタの血管内皮(PEC)をつかってin vitroでknockoutをかけ、目的cloneを得た。次に、ブタ胎児繊維芽細胞を使ってknockoutをかけたが、現在2000cloneほどあげたが、目的とするものはなかった。3。賭場よりブタの膵臓を入手し、isletを分離し、α-Galの発現をみたが、抗体染色(His、FACS)およびHPLCにてα1,3GTの活性を調べたが、いずれもα-Galの発現・活性を認めなかった。1、補体制御に必要な抑制因子の再検討。>DAF, MCPと膜型C1-INH(C1-INH-PI)をhybrid化し、C1+DAFおよびC1+MCPを作成した。発現ベクターpCXNに組み込みブタ血管内皮に発現させ、抗補体作用を比較検討した。(1)、C1+DAFはDAF単独と比較し抗補体作用は同程度であったが、DAFではみられないC4の沈着抑制作用がみられた。(2)、C1+MCPはMCP単独に比して明らかに抗補体作用がすぐれていた。また、C4及びC3の沈着抑制作用の増強がみられた。2、α-Gal抗原後の糖鎖抗原の検討。>DAF+GnT-III発現、ホモα1,3GTのknockoutブタを作成した。この血管内皮を検討した。(1)、HPLCでGnT-IIIの活性を認めた。

(2)、α1,3GT活性はヘテロでは2-3割減少したに過ぎないが、ホモでは感度以下=0をしめした。(3)、同時に、ホモではGSI-B4で測定するとα-galの発現はほぼ0であった。(4)、一方、ヒト血清に対する反応性は、GnT-IIIが同時に影響するにもかかわらず、15%程度残存した。3、ブタisletの糖鎖抗原の解析。>賭場より新生児ブタを入手し、その新生児ブタのislet=ICCを分離し、9日間の培養に成功した。また、抗原性を検討した。成ブタにはα-Galの発現およびα1,3galactosyltransferaseの活性がなかったが、ICCではα-Galの活性および発現を確認した。<補体制御因子DAF(CD55)の重合化することによる機能の変化・増強を検討><トランスジェニックブタの移植実験>GnT-IIIを発現したトランスジェニックブタより分離したadult porcineislets(APIs)はカニクイザルへの移植実験において生着が延長した。
幹細胞の可塑性と未分化性維持機構

本特定領域研究では1)細胞の初期化の機構の解明、2)幹細胞の未分化性維持機構、3)幹細胞の多様性と可塑性の三つの柱を中心に5年間にわたり研究を進めた。ES細胞、組織幹細胞のそれぞれにおいて研究が大きく進展したが、最近2年間に本特定領域研究の分担研究者である山中伸弥教授らによって遺伝子導入によって体細胞を多能性幹細胞に変換する技術が開発され、再生医療・幹細胞研究に大きな転換を迎える事態となったことは特筆すべきことである。厳しいガイドラインのため本邦においてはヒトES細胞研究が諸外国と比して進展に遅れていたが、倫理的問題を含まないiPS細胞技術の登場により、多能性幹細胞の分野にも今後大きな研究の進展が見込まれる。そこで昨年度は新しく開発されたiPS細胞産生技術を中心に「幹細胞研究を支える新しいテクノロジー」というテーマのもとでシンポジウムを開催した。産業界を含む300名近い研究者が参加し意見を交換することにより、本研究領域における研究で得られた知見を速やかに共有することができた。また、総括班メンバーを中心に今後の幹細胞研究の進め方などについても討議がなされた。本年度は本プロジェクトの最初の年であることから9名の計画研究メンバーにより申請書に計画研究にあった通り、1)細胞の初期化の機構、2)幹細胞の未分化性維持機構、3)幹細胞の多様性と可塑性の3つの課題について研究が進められた。最初の年でもあり、総括班会議は開催しなかったが、本年5月30日に第一回の班会議と総括班会議を予定している。また、領域は急速に展開している新しい学際的分野であるためそれぞれの課題について公募研究を募集したところ200件を越える応募があった。研究代表者ならびに総括班員の一部の人が委員として審査委員会に加わり公募研究を審査し、200件を越える応募の中から40件を選んだ。計画研究代表者間での研究交流も活発に行っていて、共同研究がいくつも並行して進んでいる。また、5月末に予定している公開班会議に向けて会場の準備等を進めた。二年目の年に入り、計画研究代表者9名および200件を超える応募からえばられた約40件の公募研究の代表者を加えて、申請書に計画研究にあった通り、1)細胞の初期化の機構、2)幹細胞の未分化性維持機構、3)幹細胞の多様性と可塑性の3つの課題について研究が進められた。まだ本プロジェクトを開始してから1年しか経過していないが、ES細胞の未分化性維持を制御する遺伝子nanogの同定、腸管粘膜細胞の可塑性を利用したインスリン産生細胞の誘導、非対称性分裂による造血幹細胞のコミットメントと自己複製の様式の解明など、着々と成果が得られている。5月には第一回の公開班会議を大阪で開催し、計画研究代表者9名がそれぞれ研究成果を発表した。また、公開班会議の際に第一回の総括班会議を開催し、総括班員、計画研究柱長を交えて本プロジェクトの研究活動に関する方針、計画研究の進捗状況、公募研究の応募ならびに審査状況について.さらに平成16年の公開班会議の場所について検討がなされた。平成16年度の公開班会議は東京の経団連ホールにおいて4月27・28日に開催する予定で、現在準備が進められている。今回の班会議では計画研究代表者、公募研究代表者全員が研究成果を発表する予定である。計画研究代表者9名および39件の公募研究の代表者を加えて、申請書に計画研究にあった通り、1)細胞の初期化の機構、2)幹細胞の未分化性維持機構、3)幹細胞の多様性と可塑性の3つの課題について研究が進められた。3年目に入り以下のような研究成果が得られている。1.マウスのES細胞を無血清、無フィーダー細胞で培養できる系の確立。2.骨髄ニッシェにおけるAng-1-Tie-2を介した造血幹細胞の保護機構3.造血幹細胞の数と能力を負に制御する細胞内アダプターたんぱく質Lnkの発見4.造血幹細胞分離方法の確立と造血幹細胞の高いホーミング能5.カドミウム処理と精細管内への精巣細胞移植による精子幹細胞ニッシェの再構成法の確立7.ポリコーム群タンパクBmi-1による造血幹細胞、神経幹細胞、精子幹細胞に共通な自己複製制御機構の解明8.膵臓における多能性前駆細胞の同定昨年4月ならびに本年2月に公開班会議を開催し、計画研究代表者および公募研究代表者全員が研究成果を発表し、活発な討論が行われた。公開班会議以外でも幹細胞や再生医学関する学会、シンポジウムが国内外で数多く開催されていて、班員間の研究交流も極めて活発に行われている。本年11月にはES細胞に関する国際シンポジウムを開催する予定である。二回目の公募研究募集には209件の申請があり、およそ40件の研究課題を採択した。本年4月より新たなメンバーによって研究が開始される予定である。新たに計画研究に加わった平尾敦教授を加えて合計10名の計画研究代表者および40名の公募研究代表者を加えて、1)細胞の初期化の機構、2)幹細胞の未分化性維持機構、3)幹細胞の多様性と可塑性の3つの課題について研究が進められた。

造血幹細胞の骨髄ニッチにおける静止期状態が線虫のDauer formationやリスの冬眠と同じ機構であること、転写制御因子Hes-1の発現量による膵臓への分化方向の決定機構、ES細胞からの膵臓細胞ならびに造血幹細胞、肥満細胞の分化誘導技術の確立、OCT3/4とCdx2の相互作用によるES細胞の分化運命決定機構の解明、色素幹細胞の維持機構の解明、老化寿命制御と幹細胞自己複製機構の相同性、骨髄間葉系幹細胞の純化法の確立等、造血幹細胞の自己複製を制御するアダプター分子の同定、ケモカインCXCL12とCXCL12高発現細胞による造血幹細胞の動態制御機構の解明など、今年度も多くの独創的な成果が挙がっている。本年度は本特定領域研究の最終年度にあたるため、平成18年5月と平成19年2月に公開班会議を開催し、研究成果の発表と研究交流を行なった。5月の班会議は幹細胞シンポジウムと合同で学術総合センターにおいて開催され800名を超える参加者が、また医科研講堂において開催された2月の公開班会議には220名を超える参加者があり、活発な討論が行なわれた。それぞれ開催された総括班会議では本研究領域における研究の進捗状況ならびに今後の幹細胞研究の方向性、次期特定領域研究領域の申請などについて検討を行なった。来年度は成果を総括する意味で班員を中心としたシンポジウムを開催する予定である。本特定領域研究では1)細胞の初期化の機構の解明、2)幹細胞の未分化性維持機構、3)幹細胞の多様性と可塑性の三つの柱を中心に5年間にわたり研究を進めた。ES細胞、組織幹細胞のそれぞれにおいて研究が大きく進展したが、最近2年間に本特定領域研究の分担研究者である山中伸弥教授らによって遺伝子導入によって体細胞を多能性幹細胞に変換する技術が開発され、再生医療・幹細胞研究に大きな転換を迎える事態となったことは特筆すべきことである。厳しいガイドラインのため本邦においてはヒトES細胞研究が諸外国と比して進展に遅れていたが、倫理的問題を含まないiPS細胞技術の登場により、多能性幹細胞の分野にも今後大きな研究の進展が見込まれる。そこで昨年度は新しく開発されたiPS細胞産生技術を中心に「幹細胞研究を支える新しいテクノロジー」というテーマのもとでシンポジウムを開催した。産業界を含む300名近い研究者が参加し意見を交換することにより、本研究領域における研究で得られた知見を速やかに共有することができた。また、総括班メンバーを中心に今後の幹細胞研究の進め方などについても討議がなされた。
ナノ構造を制御した環境浄化触媒の自動車排ガス浄化およびVOC燃焼への応用

人体に有害な一酸化炭素(CO)の無害化には担持貴金属触媒が有効であるが、資源的およびコスト的制約から貴金属成分やレアアースの使用量低減が必要である。そこで本研究課題では、ナノ構造制御により白金とセリウムの使用量を低減化した触媒を開発し、自動車排ガスに含まれる一酸化炭素の浄化や揮発性有機化合物(VOC)の燃焼反応へ応用することを目的とした。セリウム含有量が25%のセリアジルコニア固溶体を共沈法により調製し、白金溶液を含浸することでセリアジルコニア担持白金触媒(Pt/Ce_<0.25>Zr_<0.75>O_x)を得た。白金の高分散担持および使用量低減化のために、白金担持量は0.001wt. %, 0.01wt. %, 0.1wt. %, 1.0wt. %とした。また、熱処理が触媒活性に与える影響を調べる為に、焼成温度は800度と1,000度の2種類とした。白金ナノ粒子の分散度を測定した結果、白金担持量が少ないほど高分散状態で存在していた。特に0.001wt. %Pt/Ce_<0.25>Zr_<0.75>O_x触媒では原子状で高分散担持されていることが示唆された。次に、CO酸化反応における触媒活性を調べた結果、白金担持量の低下に伴い活性は低くなるが、1,000度で焼成した0.001wt. %ePt/Ce_<0.25>Zr_<0.75>O_x触媒でも400度以下で100%の転化率を達成した。また、全ての触媒においてセリアジルコニア担体に由来する約0.4mmo119の酸素貯蔵能(OSC)を有することが確認された。以上のように、白金およびセリウム含有量が少ないPt/Ce_<0.25>Zr_<0.75>O_x触媒においても、白金ナノ粒子の高分散状態の維持およびセリアジルコニア担体の酸素貯蔵能により、高いCO浄化率を達成できることを見出した。(抄録なし)人体に有害な一酸化炭素(CO)の無害化には担持貴金属触媒が有効であるが、資源的およびコスト的制約から貴金属成分やレアアースの使用量低減が必要である。(抄録なし)
脱皮ホルモンから迫るミジンコの性分化機構の解明

生物をとりまく生息環境は絶えず変化しており、多くの生物はその環境変動に迅速に適応するため、環境要因に応じて柔軟に個体発生過程を改変する能力を有している。ミジンコ類は雌雄の発生運命が環境要因に依存する環境依存型性決定様式を示す。これまでの性決定期から性分化過程に及ぶ時系列トランスクリプトーム解析から、雄性分化期特異的に脱皮ホルモン経路の関連遺伝子群が活性化されることを見出した。このことから本研究では、ミジンコの脱皮ホルモンの生合成器官を明らかにし、雌雄の胚発生過程における脱皮ホルモン動態の解析や生合成器官の発生時系列に沿ったトランスクリプトーム解析、そして抗脱皮ホルモン薬の投与による表現型解析から、ミジンコの性分化過程における脱皮ホルモンの生理作用の全容解明を目指している。本年度は、ELISA法を用いてミジンコDaphnia pulexの体内脱皮ホルモン(ecdysteroids)の濃度の定量をおこなった。既報の通り、成体メスの生殖脱皮周期間で明瞭なecdysteroidsの変動を解析できた。本方法により、胚発生期間の個体を供試することで生体内のecdysteroidsの濃度に雌雄差があるか検証可能となった。現在は本解析用のサンプリングを進めている。また、同様の解析をオオミジンコDaphnia magnaでも進めており、胚発生期間におけるecdysteroids動態の種間比較を進めていく予定である。さらに、RNAseqのデータ解析からいくつか性分化期間で脱皮ホルモン関連遺伝子の発現パターンと相関を示す遺伝子群を見出すことに成功した。本年度は、ELISA法によってミジンコDaphnia pulexの体内脱皮ホルモン(ecdysteroids)の濃度の定量をおこなった。既報の通り、成体メスの生殖脱皮周期間で明瞭なecdysteroidsの変動を捉えることができた。トランスクリプトームデータの解析から、メスの性分化過程において脱皮ホルモン関連遺伝子と共発現パターンを示す複数の候補遺伝子を抽出し、gene ontologyやpathway解析によってそれらの候補遺伝子が特定のシグナル経路に関連することを見出した。今後、これらの候補遺伝子が実際に脱皮ホルモン応答遺伝子であるかを培養細胞を用いたミジンコ脱皮ホルモン受容体のレポーターアッセイ系で調べることが可能である。さらに、ミジンコ以外の甲殻類においても脱皮ホルモンの生理作用やその制御機序を明らかにするために、複数の甲殻類種の研究にも着手した。ミジンコと同じ鰓脚類に属するものからエビ・カニ類の十脚類など広い分類群のサンプリングを進めている。CRISPR/Cas9による脱皮ホルモン生合成遺伝子のGFP knock inの作出は予定より遅れているが、次年度中には実施可能である。それと並行して脱皮ホルモン濃度の定量解析や性分化への関連が示唆される遺伝子については培養細胞を用いたレポーターアッセイによる脱皮ホルモン受容体の直接のターゲットかどうかを検証する実験や、薬剤投与、あるいはRNAi法などでその遺伝子の機能に迫っていく。CRISPR/Cas9による脱皮ホルモン

生合成遺伝子のGFP knock inの作出は予定より遅れているが、次年度中には実施可能である。それと並行して脱皮ホルモン濃度の定量解析や性分化への関連が示唆される遺伝子については培養細胞を用いたレポーターアッセイによる脱皮ホルモン受容体の直接のターゲットかどうかを検証する実験や、薬剤投与、あるいはRNAi法などでその遺伝子の機能に迫っていく。
インスリン抵抗性を指標とした新しいインターフェロン治療効果予測因子の実用化

PEG-IFN+RIB治療を受けた遺伝子型1b、高ウイルス量のC型慢性肝炎例でインスリン抵抗性マーカーであるRBP4が著効に関係する有意なマーカーであるかを検討した。C型肝炎患者に2型糖尿病の発生率が高いことは古くから知られており、近年のメタアナリシスでも実証されている。C型慢性肝炎患者の肝組織中には脂肪化(steatosis)が多く観察される。このようにC型肝炎の持続感染は、個体に様々なレベルのインスリン抵抗性を誘発し病態に関与することが確立されている。一方治療に観点を移すと、C型肝炎患者のインスリン抵抗性はインターフェロン+リバビリン治療に対する抵抗性と相関すると考えられているが、その機序に関しては不明である。我々はペグインターフェロン+リバビリン治療を受けた遺伝子型1b、高ウイルス量の難治性C型慢性肝炎82例に関し、著効(SVR)達成に関係する種々の背景因子を検討した。その結果宿主遺伝子マーカーのIL28Bと並んで、インスリン抵抗性のマーカーである血中RBP4値が著効に関係する有意なマーカーとして抽出された。上記のように血中のRBP4値はIFN抵抗性と相関することが判明したが、理論的根拠は不明確であった。そこで申請者らは培養細胞系において、RBP4がIFNの効果を抑制するかを検討した。結果、興味深いことに、IFNによるPKRの発現にはほとんど変化は見られなかったが、ISGの発現は軽度増強し、また2`-5'OASの発現は顕著に増強した。従ってRBP4が特定のIFNシグナルを抑制することが分かった。次に実際にHCV蛋白を発現する細胞を用いて解析を行った結果、RBP4をノックダウンした時に、加えたIFNの濃度依存性にHCV蛋白の減少効果が増強した。従って実際にRBP4がIFNによるHCVの抑制効果に対する抵抗因子として働くことが証明された。興味深いことにIFNを添加しない場合においてもRBP4のノックダウンに伴いHCV蛋白は低下したことより、RBP4はHCV増殖をサポートする因子であることが分かったC型肝炎(HCV)に2型糖尿病の発生頻度が高いことは疫学的によく知られた事実であり、近年のメタアナリシスでも実証されている。C型慢性肝炎患者の肝組織中には脂肪化(Steatosis)が多く観察される。このようにC型肝炎の持続感染は個体にさまざまなレベルのインスリン抵抗性を引き起こし、それが脂肪化を誘発しさらには肝線維化の原因となると考えられる。HCVのコア蛋白を遺伝子に組み込んだトランスジェニックマウスでは脂肪肝が発生し、ひいては肝細胞がんを高率に合併する。一方C型肝炎の治療に観点を移すと、患者のインスリン抵抗性の程度はインターフェロン(IFN)+リバビリン(RBV)治療に対する抵抗性と相関すると考えられているがその機序は不明である。我々はペグインターフェロン+リバビリン治療を受けた遺伝子型1b、高ウイルス量の難治性C型慢性肝炎82例において、著効(SVR)達成に関係する因子について検討した。その結果宿主遺伝子マーカーのIL28Bと並んで、インスリン抵抗性のマーカーである血中RBP4(Retinol-binding protein 4)の値が治療開始後の早期ウイルス減少率に関与する因子として抽出された。そこで申請者らは培養細胞系においてRBP4がIFNの効果を減弱させるか検討した。結果、興味深いことに、RBP4をノックアウトした場合IFNによるISGや2'-5'OASの誘導効果の増強が認められ、RBP4が特定のIFNシグナルを抑制することがわかった。次に実際にHCV蛋白を発現する細胞でRBP4をノックアウトした場合、加えたIFNの濃度依存性にHCV蛋白の発現抑制効果が増強した。従ってRBP4がIFNによるHCVの抑制効果に対する抵抗因子として働くことが証明された。興味深いことにIFNを加えない場合においてもRBP4のノックダウンによってHCV蛋白の発現は低下したことにより、RBP4はHCV増殖をサポートする因子であることが判明した。ペグインターフェロン(PEG-IFN)+リバビリン治療を受けた遺伝子型1b、高ウイルス量の難治性C型慢性肝炎例に関し、著効(SVR)達成に関係する種々の背景因子を検討した結果、解析した因子の中でIL28Bと並んでインスリン抵抗性マーカーである治療前の血中RBP4値が著効に関係する有意な(P<0.05)マーカーであった。つまり、RBP4が高値であればあるほど、インスリン抵抗性が増大し著効に至りにくいという結果が得られた。多変量解析でもRBP4値はSVR達成の関与する因子として抽出された。即ち、RBP4はIFN治療抵抗性を反映する新規のIFN効果予測因子の候補になりうると考えられた。上記のように血中のRBP4値はIFN抵抗性と相関することが判明したが、理論的根拠は不明確であったため、申請者らは培養細胞系において、RBP4がIFNの効果を抑制するかを検討した。RBP4を発現するHepG2細胞にRBP4特異的なSiRNAを導入し、IFN投与によって誘導される抗ウイルス蛋白の発現を検討した。結果、PKRの発現にはほとんど変化は見られなかったが、ISGの発現は軽度増強し、また2`-5'OASの発現は顕著に増強した。

次に実際にHCV蛋白を発現する細胞を用いて解析を行った結果、RBP4をノックダウンした時に、加えたIFNの濃度依存性にHCV蛋白の減少効果が増強した。従って、実際にRBP4がIFNによるHCVの抑制効果に対する抵抗因子として働くことが証明された。興味深いことにIFNを添加しない場合においてもRBP4のノックダウンに伴いHCV蛋白は低下したことより、RBP4はHCV増殖をサポートする因子であることが分かった。一方RBP4導入細胞では逆にIFNシグナルは減弱することが判明した(Takahashi et al. Hepatogastroenterology. In press.)PEG-IFN+RIB治療を受けた遺伝子型1b、高ウイルス量のC型慢性肝炎例でインスリン抵抗性マーカーであるRBP4が著効に関係する有意なマーカーであるかを検討した。本研究の達成度に関して以下に示した個々の研究目的に対して述べる。1,IFNをベースにした抗HCV療法におけるRBP4の治療効果予測因子としての有用性の検討(達成度)遺伝子型1b、高ウイルス量の患者に対するPEG-IFN+RBV+シメプレビル療法の多施設共同研究(新潟大学第三内科関連施設)の症例登録は終了し、現在著効(SVR)達成に関係する因子の統計学的な解析中である。これによってRBP4がこの治療法の効果予測因子として有用であるか否かが明らかになると期待される。2,RBP4のIFNシグナル抑制機構を解析し、治療効果予測因子の理論的根拠を確立する。(達成度)培養細胞を用いた実験が進行中である。HCV全長レプリコン発現細胞でRBP4を特異的SiRNAによってノックダウンし、発現に影響を受けるIFNシグナル関連遺伝子群を同定中である。3,新規IFN治療薬であるIFNλのシグナル経路へのRBP4の関与の解析(達成度)RBP4がIFNλシグナルを抑制するか否かについて解析中である。消化器病学1,IFN-Baseの3者併用療法効果予測における治療前RBP4利用指針の作成。治療効果予測に関してはHCVのコア変異、ISDR変異に加えIL28BのSNP解析によって効果予測がかなりの精度で可能になってきており、テーラーメイド医療が実現されつつある。今回研究対象として提案したRBP4のこれらのマーカーに関する付加価値に関して検討中である。これまでの解析によりすべての患者においてIL28Bのような正確な予測因子となる可能性は低いと考えられる。しかしながら、特殊な背景因子(肥満や耐糖能異常を有する患者など)を持つ患者においては有意な効果予測マーカーとなる可能性がある。今後患者の背景因子を層別化してRBP4が有意義な患者群の同定に努める。2,培養細胞を用いてRBP4のシグナル抑制機構を解析する。本研究ではRBP4によるIFNシグナル伝達抑制機構はSTAT1などの因子を経由しているのか、また全長のHCV遺伝子を発現するOR-6レプリコン細胞を用い、実際にRBP4の発現がHCV増殖にいかなる影響を有するか否かについて解析する。本研究目的の達成度に関して、申請時に以下に示した個々の研究目的に対して述べる。目的1、RBP4の、IFNをベースにした抗HCV療法の治療効果因子としての有用性を、前向き臨床研究で実証する。患者の層別化解析によってRBP4が特に有用な患者群を同定し、これを実際に臨床応用する際の指針を作成する。