hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
What linguistic factors relatively contribute to the perceived comprehensibility?

実際に英語圏で英語を使用して生活している上級日本人英語学習者や、日本の英語教育のみを受講した初級日本人英語学習者のスピーキングデータを集め、言語学的に分析し、「日本人が目指すべきスピーキング能力」について解明した。また同時に発展研究として、日本人英語学習者が英語圏にて滞在中に、また国内にてどの様に英語オーラルコミュニケーション能力を向上させるのかも研究した。その結果、査読付き国際学術誌へ15本の論文が受理・出版さた。将来、国際社会で活躍する優秀な日本人のビジネスリーダー、研究者をより多く育成する上で最も重要な問題の一つが、業務を英語で遂行出来る「高度な運用能力」の習得である。現在英語は世界共通言語として広く使われ、実際世界の英語使用者の三分の二は英語ネイティブではない学習者である。したがって、ネイティブスピーカーだけでなく、ノンネィティブスピーカーとも、スムーズな英語コミュニケーションを達成する事は非常に大切である。本研究において、18歳以降に英語圏(カナダ)に渡航し、日常的に英語で仕事をしている日本人(上級者)や、海外滞在経験が全く無く、日本国内での教室学習のみで英語を習得した国内在住日本人(初・中級者)など、様々な学習背景とスピーキング能力を持つ200人以上の英語学習者を対象に様々な英語スピーキングテストを行った。そのテストデータを、音声、語彙、文法、ネィティブ・ノンネィティブスピーカーによる聞き取りという多角的観点から分析し、その結果、日本人英語学習者が「聞き取りやすい英語発話能力」を習得するために、どの発音・語彙・文法要素を優先的に勉強していくべきか具体的な指標を示す事を目指した。最終年度には、研究実施計画に基づき、データ分析を終了させ、その結果を国内・国際学会で発表、また論文として査読付き国際学術誌へと投稿・出版することを目指した。1.研究結果:研究結果としては英語圏に滞在し、日常的に英語を使う上級者から、日本国内の英語教育のみを受けた初級・中級者まで、多くの日本人英語学習者のスピーキングデータを取集し、またそれを発音・流暢さ・語彙・文法の3点から分析を行った。また発展研究として、日本人英語学習者の英語スピーキング能力を、モノリンガルネィティブスピーカーだけではなく、マルチリンガル(様々な言語を日常的に使う話者)や、ESL教師など、アクセントに寛容なレーターを採用しデータを比べた。さらに少人数のボランティア大学生を対象に、様々なトレーニングプログラムを受講してもらい、どれだけ短期間でスピーキング能力を向上させる事が出来るか解明した。特に後者は将来の発展研究の土台となる貴重な結果をもたらした。2.国際学会・論文発表:これらの研究結果を2015年5月に外国語教育メディア学会関西支部シンポジウム、そして同年8月に、ヨーロッパ応用言語学会(フランス)にて論文発表を行った。上記の研究結果をテーマ別にまとめて、合計10本の論文を作成し、それらを全て査読付き国際学術誌へと提出した。現在は査読結果を待ち、また校正を行い、論文の最終出版へと備えている。トレーニングプログラム関連の論文はLanguage Learning (Wiley-Blackwell)とModern Language Journal (Wiley-Blackwell)より2016年、2017年度に出版されることが決まった。他の論文も査読が終了、そして受理され次第、随時主研究者のホームページにて情報を公開していく予定である。交付申請書に記載した最終達成目標は、研究分析結果を論文としてまとめ、インパクトファクターが比較的高い国際学術誌に発表することであった。2014年以内に研究者が専任教員として所属する早稲田大学にて、また客員教授として所属するカナダ・コンコーディア大学にて、様々な英語スピーキング能力を持つ日本人英語学習者のデータを収集した。その後データ分析を早稲田・コンコーディア大学にて行いつつ、同時に共著・単著論文を20本作成し、11本を査読付き国際学術誌にて受理され2015年、2016年内での出版が決まった。これらの学術誌は全てインパクトファクターが1を超えており、心理言語学、第二言語習得学の領域では最も権威が高いものとされている。また共著者も同学術界において著名な研究者が多く、したがって同研究プロジェクトの業界における学術的波及効果は大変高いことが期待される。英語教育現在5本の論文が査読中であり、また同時に2015年度以内に10本の論文を作成し、インパクトファクターの高い学術誌(Bilingualism: Language and Cognition, Studies in Second Language Acquisition)へと投稿する予定である。さらに本研究は研究者の専門研究領域である音声学に重視していたものであったが、今後の研究の発展を踏まえて、より語彙学・文法学へとその重点を移行しつつある。そこでより最新の語彙・文法分析を行うため、予備調査を2015年度以内に実行する予定である。これらの研究結果も全て論文として研究実施期間内にまとめ、比較的萌芽的研究を受け入れる国際学術誌(Language Learning)へと提出予定である。次年度使用額は3932円のみであり、2015年度に充当されている研究費(直接経費10万円;間接経費3万円)と共に全て、次回のプロジェクト準備としてデータ収集・分析を行うために使用する。
鶏ロイコチトゾーン原虫のin vitro培養に関する研究

鶏ロイコチトゾーン原虫の第二代メロゾイトの感染した赤血球をin vitro培養し、生殖母体形成機構の一端を解析した。平成4年度では培地と気相の種類、正常人赤血球の添加、血清の種類と濃度、感染に用いる鶏の年齢、感染量の多少の影響および培養に用いる感染赤血球の感染後の日数などについて検討した。結果として、熱帯熱マラリア原虫の培養に用いられている改良型RPMI1640培地に、ウマ血清と正常人赤血球を添加して、第二代メロゾイトの感染した感染後15日目の感染赤血球を培養すると、成熟型の生殖母体にまで発育させることができた。しかし、その数はin vivoの成績よりも少なかった。平成5年度では培地へのビタミン類の追加、塩類やNaClの濃度、ヘパリンの添加、及び培養した熱帯熱マラリア原虫では生殖母体誘発効果のあるハイブリドーマ上精液(HybS)と抗原虫薬のBerenilの添加について検討した。結果として、培地の塩濃度はまたはNaCl濃度を1.11.2倍に濃くしたり、ヘパリンを10u/ml添加することによって、より発育した生殖母体の割合が増加した。HybS液とBerenilは生殖母体誘発効果を示さなかった。平成6年度では感染鶏から人為的に放血し、未熟型の赤血球を増加させて、その後の未熟型の赤血球に侵入した第二代メロゾイトの成熟型の生殖母体への発育状況をin vivoとin vitro培養で比較検討した。感染鶏から血液を放血した群では未処置群よりも未熟型の赤血球数がより多く増加し、未熟型の赤血球に侵入した第二代メロゾイト数も増加した。これによって、in vivoでの成熟型の生殖母体の出現率の増加とin vitro培養での発育した生殖母体の割合の増加をもたらした。しかしながら、未熟型の赤血球へ侵入した原虫数と成熟型の生殖母体数との関係を見ると、第二代メロゾイトの未熟型の赤血球への侵入は必要十分条件ではないと考えられた。先に行った研究により、in vitroで鶏ロイコチトゾーン原虫を培養することが出来るようになった。本実験では先ず、1.鶏赤血球内における生殖母体の発育に最も適した培養条件を設定することを目的として実験を行った。その結果、1)鶏ロイコチトゾーン原虫のin vitroでの培養は鶏にスポロゾイトを接種して原虫に感染させた後、最も多くの原虫が赤血球内に認められる15日目の感染赤血球を培養材料として用いると発育が悪く、原虫が比較的少なくても14日目の感染赤血球を培養するとその後の発育が良いことが分かった。2)培地はRPMI1640培地を基礎にして熱帯熱マラリア原虫培養用に考案された改良培地を用いたが、鶏ロイコチトゾーン原虫の培養では熱帯熱マラリア原虫の培養と異なりグルタミンの発育促進効果はあまりみられなかった。3)培養に用いるガスは5%二酸化炭素+空気の気相、即ち通常の炭酸ガス孵卵器を用いると溶血も少なく、原虫の発育が良好であった。4)次にRPMI1640培地中に含まれる塩類濃度の影響を検討した。塩類濃度を1.2倍濃くすると感染赤血球の溶血が阻止され、原虫の発育が良好になることが認められた。

5)原虫の培養には血清が必要であり、各種の血清即ち鶏、人、馬、仔牛、牛胎児などの血清を使用して発育に及ぼす効果を比較した。その結果、馬血清を使用し、人正常赤血球を添加すると生殖母体の発育が良好で、生殖母体が成熟型にまで発育することが認められた。次に、2.培養した鶏ロイコチトゾーン原虫に対する各種薬剤の効果を検討した。先ず、1)培養熱帯熱マラリア原虫で生殖母体形成誘発効果のあるBerenil(最終濃度500ng/ml)を作用させたが、生殖母体形成率を高める効果は認められず、本原虫の生殖母体形成機構が熱帯熱マラリア原虫のそれとは異なることが考えられた。なお、2)ヘパリン(最終濃度110u/ml)を培地に添加すると、感染赤血球の溶血が防止され発育の進んだ生殖母体が多く出現した。前年度迄の成績に基づいて鶏ロイコチトゾーン原虫の培養を行つたが、本年は培地だけではなく宿主細胞即ち鶏赤血球側の要因についても調べ、赤血球内で作られる生殖母体数の増加、生殖母体の発育維持に最も適した培養条件を検索した.その結果、1)原虫の培養に必要な馬血清の濃度は従来の10%よりも20%で用いた方が成熟した生殖母体の出現に良い事が分かつた.2)培地成分の塩類濃度として本年は塩化ナトリウムの濃度のみ種々な濃度に高めて培養に対する影響を調べた所、1.1倍の濃度が原虫の発育に最適であつた.3)赤血球内での原虫発育状態が用いた鶏の月令によつて変わるかどうかを調べたが、若い月令の鶏の赤血球を用いた方が生殖母体の形成が良好である事が分かつた.4)培養に用いる赤血球の原虫感染率の高低と培養後の成熟生殖母体出現率との関係を調べた.その結果、赤血球における原虫感染率が低ければ成熟生殖母体が多く出現する事が分かつた.5)本原虫では第2代メロゾイトが赤芽球、網状赤血球など未熟赤血球に侵入し、生殖母体に発育するといわれている.そこで鶏から血液10mlを採血して未熟赤血球を末梢血液中に出現させ、それらの赤血球に感染した原虫を培養する試みを行つた.その結果多数の成熟した生殖母体が出現することが見出された.本研究の主題である鶏ロイコチトゾーン原虫の第2代メロゾイトの培養を試みた。感染赤血球の培養に最も適した培養条件を検討したが、本年も宿主細胞即ち鶏赤血球側の要因を更に調べることによって、赤血球内で作られる生殖母体数の増加、生殖母体の発育維持に最も適した培養条件を検索した。本原虫は鶏体内では赤芽球、網状赤血球など未熟型赤血球に進入した時にのみ、発育して成熟型の生殖母体になるものと考えられているが、その実態は明らかではない。そこで、その点を調べた。2ケ月令の鶏に原虫を感染させ、採血して感染赤血球の培養を開始する感染14日目の2日前、即ち12日目に予め血液10mlを鶏から取り、鶏に貧血を起こさせた。そして14日目に原虫感染未熟型赤血球を大量に得、これを培養に供した。In vitro培養はこれまでの培養成績を基礎にして行い、培地はRPMI1640培地を用いて5%CO_2+空気の気相下で37度で培養した。培地は馬血清を10%、人正常赤血球を0.5ml、ヘパリンを10u/m1、NaC1を1.1倍になるように添加して用いた。培養を8日間行った。その結果、発育した生殖母体数を比べると、採血群即ち、未熟赤血球が多く含まれている感染赤血球で生殖母体の形成が良好であった。この成績は鶏体内と同様、培養においても未熟感染赤血球の方が正常感染赤血球よりも生殖母体形成を起こし易いことを示している。今後はこのような条件下で原虫の培養を行い、生殖母体形成の機序を調べていく予定である。
糖尿病患者における受診再開支援システムの開発-生活習慣記録機の活用-

【目的】2型糖尿病患者の療養行動の継続と中断者の受診再開を促すために、インターネットを活用した客観的評価による、活動、血糖、食事に関する総合的な介入が血糖やQOL、生活行動の変化に及ぼす効果を明らかにすることである。【方法】インスリンを使用していない患者を対象に、活動、血糖、食事に関する情報の解析と客観的な評価に対する対象者の認識と活動、QOLの変化を縦断的に調査した。研究者は、患者の生活情報を“けんこうダイアリー(スズケン)"を利用してインターネットで共有し、電話やメールでタイムリーに認識や行動に関する情報を収集した。介入前後に糖尿病特異尺度DTSQ、PAIDの調査を行った。【結果】対象は、男性18名女性3名、平均年齢50.8±8.7歳、糖尿病歴8.6±5.2年であった。HbA1cは、介入前(ベースライン)7.58±1.08%から6ヵ月後7.21±0.95%で有意に改善した。DTSQはベースライン21.9±6.2点から、6ヵ月後24.0±3.6点で有意に満足度が高くなった。ベースラインのPAID50.0±10.6点、6ヵ月後47.6±13.6点で負担感は軽減傾向にあったが有意な差はなかった。21名の平均歩数は、6ヶ月間の調査期間を通じて9,000歩前後で経過した。しかし、個人の平均歩数は、ほとんど変化のない対象者から6,000歩の差がある対象者まで様々であった。身体活動の増大が血糖値の低下に影響することを認識できた対象者は、歩数が増える傾向にあった。しかし、活動の効果を認識しても家族の介護や職場の配置転換など様々なライフイベントが活動量の維持・増大を妨げていた。血糖値を目安に食事内容の改善を図った対象者は、急激な活動量の低下や活動を増やすことが困難な状況でも食事療法を工夫することによりHbA1cが改善していた。対象者の生活情報を研究者が共有することによって,対象者は専門家の観察を受けることができる安心感を持ち,医療者はライフスタイルに応じてタイムリーな助言が可能になったと思われる。【目的】インスリンを使用していない2型糖尿病患者の身体活動、血糖値、食事に関する生活情報の蓄積と自動解析による客観的な評価指標に基づく患者の自己管理と認識の変化を縦断的に評価する。【方法】調査期間は6ケ月間で、研究者は患者の生活情報を"けんこうダイアリー(スズケン)"を利用してインターネットでタイムリーに共有した。日常の生活習慣を客観的な指標を用いて評価するために、様々な機器を検討した結果、身体活動量にはライフコーダEX(スズケン)、血糖値にはグルテストPROR(三和化学)を使用した。さらに、2週間ごとにメールや電話で、患者の認識を調査する方法を検討した。【結果】調査機器や調査方法の有効性を健常者で確認後に、対象者で調査を継続中である。6ケ月の調査を終了した患者からは、以下のような結果が得られた。

患者は、客観的な指標から運動量の不足を認識し、自分の生活スタイルに合わせて日中に運動する時間を追加し、食事の量だけではなく内容によっても血糖値に反映されることを自覚して食事の方法を変更していた。しかし、仕事環境の変化や体調不良などが療養行動を継続することを困難にしていた。平成17年度の調査では、インターネットを使用した情報の収集、2週間毎の追跡調査方法についての具体的な方法を確立することができた。これらの方法を生かし、対象者を増やして調査を継続する予定である。さらに生理学的な指標である代謝コントロールなどについても経時的な評価を予定している。【目的】2型糖尿病患者において生活情報の蓄積と自動解析を活用した客観的な評価指標に基づく対象者の行動変容の関係を明らかにする。【方法】インスリンを使用していない2型糖尿病患者を対象に、(1)91名の身体活動を横断的に調査し、(2)6ヶ月間にわたる調査が終了した7名の身体活動、血糖値、食事に関する情報の蓄積と自動解析を活用した客観的な指標に基づく対象者の自己管理の変化を縦断的に評価した。研究者は患者の生活情報を"けんこうダイアリー(スズケン)"を利用してインターネットでタイムリーに共有した。身体活動量の測定にはライフコーダEX(スズケン)、血糖値の測定にはグルテストPROR(三和化学)を使用した。さらに、2週間ごとにメールや電話で、対象者の認識を調査した。【結果】91名の1日の平均歩数は、9,269歩で7名.のベースラインとほぼ一致していた。7名の歩数は、調査期間を通して9,000歩台で経過し、HbA1cは8.0%から終了時に7.0%まで改善した。HbA1cが0.9%以上改善した3名に共通する自己管理は、身体活動における具体的な数値目標に対する自己評価と血糖値を正常範囲に近づけるための食事内容の修正であった。対象者は、設定した身体活動の目標を達成するために車での移動回数を減らす、週末の歩行距離を延長するなど、個人のライフスタイルに応じて行動を変化させた。また、血糖値に反映されやすい食品やメニューを自覚して、対象者それぞれが摂取量や内容を修正した。客観的な評価が、自己管理の継続を支援していると思われた。平成18年度の調査では、インターネットを使用した情報収集、2週間毎の調査方法の確立により患者の自己管理行動をタイムリーに分析することが可能になった。【目的】1.2型糖尿病患者において生活情報の蓄積と客観的な評価に対する認識と行動の関係を明らかにする。2.インターネットを活用した支援システムの効果を明らかにする。【方法】インスリンを使用していない2型糖尿病患者を対象に、身体活動、血糖値、食事に関する情報の蓄積と自動解析を活用した客観的な評価に対する対象者の認識と活動の変化を縦断的に調査した。研究者は患者の生活情報を"けんこうダイアリー(スズケン)"を利用してインターネットで共有し、電話やメールを活用してタイムリーに認識や行動に関する情報を収集した。また、介入前後にHbA1cの測定とQOLの調査を行った。【結果】対象は、男性14名女性3名、平均年齢51.8±8.3歳、糖尿病歴8.2±5.0年であった。HbA1cは、調査開始時7.4±1.2%から6ヵ月後7.1±0.9%まで改善したが有意な差はなかった。17名の平均歩数は、6ヶ月間の調査期間を通じて10,000歩前後で経過した。
器械運動の「つまづき」をなくすための運動アナロゴンの開発と体系化

平成17年度の研究成果は以下の通りである。・とび箱運動のつまづきは、各機能局面ごとにそれぞれ特徴的な傾向をもつ。・現象学的・モルフォロギー的な運動志向性分析の理論をとび箱のつまづきに関する研究に用いることによって、これまでとは異なった視点を提示することができ、指導法の改善につながるものと期待できる。以上の研究成果をもとにして、平成18年度は以下の成果を得た。・中学校および高等学校におけるとび箱運動の授業をビデオ撮影することによって、さまざまなつまづきの映像を収集することができた。この映像の中のつまづきを各機能局面ごとに分け、それぞれの局面に典型的なつまづきを抽出することに成功した。・収集されたつまづき類型を現象学的・モルフォロギー的な発生分析を行って分かるのは、とび箱運動の開脚とびに限らず、その運動の練習に積極的に取り組まない生徒、あるいは、練習に取り組んでもすぐにつまづいてしまう生徒は「原志向位相」から「探索位相」を経て「偶発位相」という習熟位相に至るまでの指導側からの学習援助、あるいは、指導法に問題があるのではないかということである。学習段階のまずはじめには、生徒が目標とする技を「なんとなく嫌な感じはしない」ために、支持跳躍運動に感覚的に類似した経験を持つ必要があり、探索位相から偶発位相に至るには、目標技を「できるような気がする」ための「コツ」を構成する運動アナロゴンを豊富に提供する必要がある。支持跳躍運動の構造分析を行った結果、とび箱運動の運動アナロゴンとして従来一般的に有効だといわれている「腕を支点とした体重移動」のみならず、幅広い運動経験の必要性が浮かび上がった。平成17年度は以下の研究成果は以下の通りである。・とび箱運動の授業で生じる生徒のつまづきの事例収集と類型化を行うに先立ち、とび箱運動の運動局面ごとに生じるつまづきにどのような特徴や傾向があるか、あるいは、予期しなかったつまづきなどについて、器械運動授業担当者への聞き込み調査を行った。その結果、とび箱運動のつまづきは、各機能局面ごとそれぞれに特徴的な傾向をもつということが分かった。・スポーツ運動学あるいは運動伝承論にかかわる文献を収集し、現象学的・モルフォロギー的研究の方法論に関する最新の理論を把握した。特に、運動の志向性分析の理論はこれまでの自然科学的運動研究の手法と全く異なる視野と応用領域の広がりを持ち、この志向性分析の理論をとび箱のつまづきに関する研究に用いることの有効性が確認できた。平成18年度は、平成17年度の研究成果をもとにして以下のような活動を行う予定である。・とび箱運動の授業へ出向き、つまづき事例の映像を収集する。・収集したつまづき事例を類型化し、指導段階や指導環境、年齢の違いなどとの関連を検討して体系化を行う。・つまづき類型に現象学的・モルフォロギー的立場から志向性分析を行い、つまづきを解決するための運動アナロゴンを開発する。・以上をまとめて、とび箱運動のつまづきとその解決法というかたちで指導法を提示する。

・収集されたつまづき類型を現象学的・モルフォロギー的な発生分析を行って分かるのは、とび箱運動の開脚とびに限らず、その運動の練習に積極的に取り組まない生徒、あるいは、練習に取り組んでもすぐにつまづいてしまう生徒は「原志向位相」から「探索位相」を経て「偶発位相」という習熟位相に至るまでの指導側からの学習援助、あるいは、指導法に問題があるのではないかということである。学習段階のまずはじめには、生徒が目標とする技を「なんとなく嫌な感じはしない」ために、支持跳躍運動に感覚的に類似した経験を持つ必要があり、探索位相から偶発位相に至るには、目標技を「できるような気がする」ための「コツ」を構成する運動アナロゴンを豊富に提供する必要がある。支持跳躍運動の構造分析を行った結果、とび箱運動の運動アナロゴンとして従来一般的に有効だといわれている「腕を支点とした体重移動」のみならず、幅広い運動経験の必要性が浮かび上がった。
北中国地塊における中生代火成活動の元素・Nd-Sr-Pb同位体地球化学

研究結果の概要1.北中国地塊南部に当たるWu'an, Xishu地域に分布する花崗岩類の年代測定結果や貫入関係などから、これらは白亜紀後期(約130Ma前後)に相次いで貫入したものであることが明らかとなった。2.上記の花崗岩類は、多くはアルカリ岩系列の岩石で、モンゾナイト、モンゾガブロ、閃長岩花崗岩に分類され、それぞれ岩石タイプごとに異なった分布を示すことが明らかとなった。また、これらの岩石とともに、同時期の火山岩類も分布し、それらもアルカリ岩系列の岩石であることが判明した。3.全岩化学組成(主要元素、微量元素)の分析結果から、Xishu, Wu'anおよびHongshan岩体は、ガブロモンゾナイトの組成で、やや高いMg#、および右下がりのREEパターンがあることが判明した。3岩体ともにSr同位体組成は類似し、0.70500.7078の範囲に入るが、Nd同位体組成は、3岩体ともにわずかに異なる傾向が示された。またPb同位体組成にも違いがあることが明らかとなった。Nd-Sr-Pb同位体図や、同位体一元素濃度図において、3岩体のデータは多くの場合直線状を示し、それらのデータはEM1マントルとLCC(下部大陸地殻)を端成分とする位置にプロットされた。この結果は両端成分を起源としたマグマの混合を示唆しているか、あるいはEM1マントル由来のマグマが結晶の分別を伴いながら、上昇し、下部地殻物質を混合したかのどちらかで説明が可能である。Hongshan岩体は起源は類似するが、マグマの結晶分別が優先したものと推定された。4.同地域に含まれる幾つかの小岩体、および同時期の火山岩類の元素分析とNd-Sr-Pb同位体組成分析の結果もふくめ、これらは、大陸の薄層化にともなって生じたものと結論付けられた。今年度の研究実績の概要は以下のとおりである。1.北中国地塊北東部に位置するShandong半島周辺域の中生代火成岩類の分布や地質調査結果(前年度実施)のまとめと、問題点の列挙。この地域の火成岩類の多くは,過去に実施された年代測定結果から、白亜紀後期に形成されたものであることがわかった。2.上記中生代火成岩類(花崗岩類と火山岩類)(採取済み試料)の肉眼観察と、偏光顕微鏡による造岩鉱物の詳細な観察の実施。この観察結果で、多くの火成岩類は、アルカリ岩系列に区分できることが明かになった。3.一部の試料の蛍光X線分析装置による全岩化学組成(主要元素・微量元素組成)の測定(埼玉大学と北京大学の装置を利用)。主要元素組成からは,深成岩類の多くは、モンゾナイト、ショショナイトに分類され,一部アルカリはんれい岩が含まれることが明らかとなった。微量元素組成の結果からは,一部の岩体(Xishu、Wu'an)が液相濃集元素にやや富んだ傾向を示した。またREE(希土類元素)パターンからは、正のEu異常が示された。4.一部の試料について、Sr,Nd同位体組成の測定を行った。測定は筑波大学のFinnigan MAT262固体質料分析計を利用した。上記Sr,Nd同位体組成は,EM-1タイプのマントルと下部地殻との中間の値を示した。このことは、マントル由来のマグマと下部地殻との混合を示唆している。

5.また、比較のために北西中国の西ジュンガル帯の花崗岩類の元素組成やSr-Nd同位体組成も測定を行った。6.問題点としては、各火成岩体の絶対年代の測定と,火成岩の種類の空間分布をより詳細に明らかにする必要がある。また議論を明瞭にするために,残りの試料の各種分析が必要不可欠である。平成18年度の研究実績の概要は以下のとおりである。1.北中国地塊北東部に位置するShandong半島周辺域の中生代火成岩類の分布や地質調査結果のまとめ(研究協力者Chen Bin氏と議論)。2.中生代火成岩類(花崗岩類と火山岩類)(Chen Bin氏採取試料)の肉眼観察と、偏光顕微鏡による造岩鉱物の詳細な観察の実施。この観察結果で、多くの火成岩類は、アルカリ岩系列に区分できるが一部カルクアルカリ系列の花崗岩も含まれることが明らかとなった。3.採取試料の蛍光X線分析装置による全岩化学組成(主要元素・微量元素組成)の測定(埼玉大学と北京大学の装置を利用)。主要元素組成からは,深成岩類の多くは、モンゾナイト、ショショナイトに分類され,一部カルクアルカリ質の花崗岩が含まれることが明らかとなった。微量元素組成の結果からは,一般に液相濃集元素にやや富んだ傾向を示し、またREE(希土類元素)パターンは、一部、正のEu異常が示され、分化したマグマであることが推定できた。4.15-20試料について、Sr,Nd同位体組成の測定を行った。測定は筑波大学のFinnigan MAT262固体質料分析計を利用した。上記Sr,Nd同位体組成は,EM-1タイプのマントルと下部地殻との中間の値を示し、このことから、マントル由来のマグマと下部地殻との混合が示唆された。5.また、昨年同様、比較のために北西中国の西ジュンガル帯の花崗岩類の元素組成やSr-Nd同位体組成も測定を行った。今後の問題点としては、調査、分析を行った北中国地塊の北東部の白亜紀火成岩体の年代と種類の空間分布を詳細にまとめ、マグマ起源や、その活動の時空変化を推定する必要がある。また,研究のまとめに向かい、残りの試料の各種分析が必要である。今年度の研究実績の概要は以下の通りである。1.北中国地塊南部に当たるWu'an, Xishu地域に分布する花崗岩類の年代測定結果や貫入関係などから、これらは白亜紀後期(約130Ma前後)に相次いで貫入したものであることがわかった。2.上記の花崗岩類は、多くはアルカリ岩系列の岩石で、モンゾナイト、モンゾガブロ、閃長岩花崗岩に分類され、それぞれ岩石タイプごとに異なった分布を示すことが明らかとなった。また、これらの岩石とともに、同時期の火山岩類も分布し、それらもアルカリ岩系列の岩石であることが判明した。3.蛍光X線分析装置による全岩化学組成(主要元素、微量元素)とICP-MSによる微量元素の分析結果から、Xishu, Wu'an両岩体は、ガブロモンゾナイトの組成で、やや高いMg#、およびREEパターンからは小さな正のEuの異常があることが判明した。両岩体ともにSr同位体組成は類似し、0.70500.7078の範囲に入るが、Nd同位体組成は、εNdがXishuでやや高い(-17-11)傾向が示された(Wu'anは-18-13)。またPb同位体組成にも違いがあることが明らかとなった。この結果は、両岩体を形成したマグマの起源物質の違いを示すが、Nd-Sr-Pb同位体図や、同位体一元素濃度図において、両岩体のデータは多くの場合直線状を示した。それらのデータはEM1マントルとLCC(下部大陸地殻)を端成分とする位置にプロットされ、この結果は両端成分を起源としたマグマの混合を示唆しているか、あるいはEM1マントル由来のマグマが結晶の分別を伴いながら、上昇し、下部地殻物質を混合したかのどちらかで説明が可能である。
価電子共鳴光励起による相転移臨界挙動の研究

本研究は、金属ハロゲン化物結晶を材料として、電子励起状態の格子緩和が結晶構造の変化、とりわけ構造相転移とどのような相関挙動をもつかを解明したものである。(1)ハロゲン化鉛結晶における励起子の電荷分離型緩和構造の解明PbBr_2やPbCl_2結晶の励起子光励起による電子スピン共鳴の実験により、電子・正孔の自己束縛状態の構造を決定した。格子振動との強い相互作用によって励起子は対分解し、自己束縛電子は鉛イオン対に、自己束縛正孔はハロゲン分子(PbBr_2)や鉛原子(PbCl_2)に局在することが明らかになり、光照射による構造変化、化学変化の原始過程が解明された。Cs_2CdI_4およびRb_2CdI_4結晶の低温から400Kにわたるひろい温度領域で光学測定を行い、Mnイオン不純物に起因した発光のスペクトルや減衰時間を調べ、局在電子励起状態の緩和と相転移の相関を調べた。Cs_2CdI_4では3段階の相転移のうち中間のインコメンシュレート相に特徴的な強い格子緩和が生じることが明らかになった。Rb_2CdI_4でも同様の現象が確認され、これまでに報告されていなかった複数の相転移の存在が明瞭になった。本研究の目的は、構造相転移のある金属ハロゲン化物結晶において、電子励起状態の緩和と相転移の相関挙動を解明しようとするものである。以下にこれまでの研究状況の概要を示す。(1)強弾性相転移をもつCsPbCl_3結晶における相転移の電子励起による応答これまでに、この結晶の励起子発光特性を調べ、170K近傍において相転移と関係していると思われる励起子緩和の変化を観測したが、相転移点の明確な確認はなされていなかった。今回、光音響効果の測定を行い、電子励起に伴って発生する音響波の位相変化が160Kにおいて明確に不連続性を示すことを見出し、相転移の発現を確認した。(2)強誘電性相転移をもつRb_2CdI_4結晶における相転移と光学応答の測定・純粋なRb_2CdI_4結晶、およびMn、Pb等のイオンを不純物として添加したRb_2CdI_4結晶の良質単結晶試料を作成した。・これらの結晶の発光スペクトルを調べ、これまでに知られていなかった励起子固有発光の存在を確認した。・吸収端におけるUrbach吸収スペクトルの温度変化を調べた。σ=0.4の小さなsteepness constant値を求め、励起子の大きな格子緩和が起こることが明らかになった。・Mn不純物に起因した発光のスペクトルや減衰時間の温度依存性を測定し、強誘電相転移点近傍での励起状態緩和機構の変化があることが示唆された。今年度は、強弾性および強誘電性の相転移を持つ結晶として知られているCs_2CdI_4とRb_2CdI_4結晶を対象として、構造相転移と電子励起状態,緩和の相関に関する研究を進めた。これらの結晶にMnイオン不純物を添伽した試料を作成し、不純物発光特性の温度による変化を調べ、以下のような結果を得た。●両結晶とも、Mnイオンによる吸収帯を光励起すると、緑色(G)発光と赤色(R)発光が観測される。低温で観測されるG発光は、温度が相転移点(Tc)を超えると強度が減少し、代わりにR発光が現れる。さらに温度が上昇すると室温近辺でR発光は弱くなり、再びG発光の強度が回復してくる。●低温のG発光の減衰時間はR発光の立ち上がり時間と一致していることが確認され、Tcにおける相転移によって、G発光の始状態からさらにR発光の始状態への格子緩和が誘発されることが明らかになった。●Cs_2CdI_4結晶では、高温の高対称相から温度低下に伴ってインコメンシュレート相転移があることが知られている。室温近辺におけるR発光とG発光の強度交代はこの相転移と対応していることが確認された。●Rb_2CdI_4結晶では、室温付近を挟んでエネルギーがわずかに異なる2種のG発光が入れ替わり、この変化に明瞭なヒステリシスが観測された。

このヒステリシスは熱測定によっても確認され、インコメンシュレート相転移と思われる相転移の存在と発光スペクトルの相関が明らかになった。以上のように、電子励起緩和の情報が相転移研究に有効な知見を与えることが示された。
ケージドmRNA技術とノックダウン法による前脳形成遺伝子間相互作用の解明

1.Bhc-diazoによるケージドmRNAの合成法の確立と応用:新規に開発されたケージド試剤Bhc-diazoをmRNAのリン酸基に結合させることにより、両者の複合体(ケージドmRNA)の効率的合成系の確立に成功した。ケージドmRNAは構造上翻訳が不能であるが、低線量の紫外線照射によるBhc基の解離により通常のmRNAに戻り、翻訳活性を回復する。本原理を応用し、試験管内で合成した任意の遺伝子に対応するmRNAをケージし、ゼブラフィッシュ受精卵に導入後任意の発生段階に任意の部位に紫外線スポット光を瞬間照射することで標的部位に特異的翻訳誘導をなし、「時空間特異的遺伝子発現誘導系」の開発に成功した。2.上記の実験系を用いて転写制御因子Engrailed(En)の前脳特異的過剰発現を行った結果、中脳領域の著明な拡張と終脳および間脳領域の縮小が観察され、Enの前脳テリトリー確立への具体的関与が示唆された。3.次に本法とアンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド(AMO)の併用により、前脳形成に関与する複数の遺伝子群の機能的相互作用解明のアプローチを行った。すなわち密接な機能的関連が示唆される2種の遺伝子の一方をAMO法で機能阻害した個体に同時に導入した他方の遺伝子に対応するケージドmRNAを適切な時期および部位に翻訳誘導し、機能阻害効果を救出するか否かを判定した。もし救出効果が再現されれば翻訳誘導された遺伝子産物は機能阻害された遺伝子の機能的下流に位置する可能性が高く、対象実験として機能阻害される遺伝子と翻訳誘導される遺伝子を入れ替えた実験で救出効果が認められなければ上記の可能性の裏付けとなる。本実験系により、前脳形成において2種の転写因子(six3とlh2a)の間でSix3がLh2aの機能的上流で働くことを示すことができた。
低分子量G蛋白質Rap2のエフェクターキナーゼ群とがん細胞の分化異常

私共は低分子量G蛋白質Rap2がHGK、TNIK、MINKの3つのMAPKKKキナーゼと結合することを見出し、Rap2のエフェクターと考えている。また、TNIKが上皮系細胞のbasolateral細胞膜に局在してJNKと無関係に細胞接着を制御することも見出し、Rap2はMAPキナーゼ経路と未知の経路を介して分化異常などがん細胞の異常形質に関与する可能性があると考えている。未知の経路の解析では、各キナーゼに結合する蛋白質のアフィニティー精製と質量分析による同定を進めており、TNIK結合蛋白質として、トリコペプタイドリピート、アンキリンリピート、コイルドコイル領域、PDZドメイン結合モチーフを持つ200kDaの足場蛋白質を同定した。なお、TNIK自身も同定され、TNIKがホモ複合体を形成する可能性が示された。また、二次元電気泳動によりRap2、TNIKに依存して細胞内リン酸化が変化する蛋白質を複数見出し同定を進めている。がん細胞の形質への関与については、転移性との関連を示唆する例を見出した。マウスで低分化型扁平上皮癌を形成するが殆ど転移しない親株から4種類の高転移株が樹立されており、親株はRap2を強く発現するのに対し全ての高転移株でRap2の発現が顕著に抑制されていた。親株ではRap2、TNIK、E-カドヘリンが細胞間接着部位に集積したが、高転移株では集積が見られなかった。高転移株にRapのGDP/GTP交換因子Epacを活性化するcAMPアナログを添加すると、親株に近い形態に復帰した。また、TNIKの優性抑制型変異体が細胞間接着形態の異常を引き起こすことを見出し、機構の解析を進めている。さらに、MAPキナーゼ経路と未知の経路の制御に関する遺伝学的解析のため、TNIK遺伝子、Rap2A,B,C遺伝子についてコンディショナルノックアウトマウスの作製を進めている。
未分化胚性幹細胞を用いた生体内分化誘導型小口径ハイブリッド型人工血管の開発

ES細胞を人工基材に組み込んだハイブリッド型人工血管モデルを開発し、ES細胞の循環系人工臓器への適用の可能性を検討している。マウスES細胞を内径1.5mmのポリウレタン製人工血管内腔面に播種し、ヌードラットの腹部大動脈に移植するモデルで検証を行った。植え込み後グラフト内腔面には組み込んだES細胞が生着していた(LacZで確認)。さらに移植後1週間後には、グラフトの内腔面に形成された血栓層内でもES細胞の存在が確認できた。これら細胞の一部はLacZとPCAM-1の二重染色で陽性であり、植え込み時に比べて血管内皮細胞に近い性質を持つ可能性があった。植え込まれたES細胞が直接生体内で血液と力学的ストレスに曝された結果生体内でさらなる分化誘導を受けて血管壁細胞に近づきつつある過程を示唆するものであった。in vitroにおける培養系でグラフトに拍動流を負荷するシステムを開発した。この装置を用いて体外で力学的ストレスを負荷する事により、生体内で認められたと同様の分化誘導が再現できるかどうかの検証にも着手した。現時点で行っている予備的実験では、グラフト内のES細胞がずり応力と周期的伸縮性ストレスの2種の力学的ストレスを受けることにより、それぞれ細胞の存在部位に応じて最内腔面ではPCAM-1陽性細胞に、壁内ではSMA陽性細胞に変化する事が観察された。すなはち生体血管の階層構造に類似した構築(内膜-内皮細胞、中膜-平滑筋細胞)が形成されつつある過程と考える事も出来る。このことによりin vivoだけでなくin vitroにおいてもハイブリッド型人工血管の成熟度を変化させる事が出来る可能性が示唆された。しかしマウスの実験系ではES細胞は非常に細胞接着性が悪く、人工基材を用いた場合長期観察を得ることが出来ず、ハイブリッド型人工血管の実験系確立は困難であると考えられた。このため現在管状の自家結合組織を生体内で作成する技術を開発中である。管状組織体バイオチューブ人工血管は非常に良好な組織治癒課程を示したが、2週間以内の急性期には内腔面にコラーゲンや繊維芽細胞が露出しており、血栓性が高いのが欠点である。この内腔面にES細胞を播種することにより、バイオチューブ人工血管の短所を克服すべく研究を開始している。ES細胞と自家結合組織という新しい概念のハイブリッド型人工臓器の確立を視野に入れて今後の研究を行っていく予定である。ES細胞を人工基材に組み込んだハイブリッド型人工血管モデルを開発し、ES細胞の循環系人工臓器への適用の可能性を検討する試みを行った。マウスES細胞を予めVEFG存在下に分化増殖させた後、内径1.5mmのポリウレタン製人工血管内腔面に播種した。このグラフトをヌードラットの腹部大動脈に移植し、形態学的・及び免疫学的に評価した。植え込み後2日以内に摘出したグラフト内腔面には多角形の細胞が生着していた。細胞はこの時点では典型的な血管壁細胞の形態を呈していなかったが、LacZ染色により組み込んだES細胞由来のものであることが確認できた。

さらに移植期間が長くなるとグラフトの内腔面は血栓層に覆われたが、この血栓内でもES細胞の存在が確認できた。これら細胞の一部はLacZとPCAM-1の二重染色で陽性であり、植え込み時に比べて血管内皮細胞に近い性質を持つ可能性があった。これは植え込まれたES細胞が直接生体内で血液と力学的ストレスに曝された結果生体内でさらなる分化誘導を受け血管壁細胞に近づきつつある過程を示唆するものであった。予備的実験を行ったモデルでは植え込み時期に伴い、内腔の血栓層が厚くなり、最終的には閉塞に陥るため1週間以上の長期開存は得られず、長期観察が不可能であった。その後新たな構造を持つポリウレタン機材を開発し、更に接合カフのデザインを改めることにより、血栓形成が抑制され安定した移植実験が行える様になりつつある。また同時にin vitroにおける実験系にも着手した。本実験モデルは、循環器における生体内Hemodynamic Stress下でのES細胞の動態に対する重要な情報を与えるものと考えられる。今後更に長期観察を行うためのモデルの最適化を進め、上記結果の再現性を確認する予定である。ES細胞を人工基材に組み込んだハイブリッド型人工血管モデルを開発し、ES細胞の循環系人工臓器への適用の可能性を検討している。マウスES細胞を内径1.5mmのポリウレタン製人工血管内腔面に播種し、ヌードラットの腹部大動脈に移植した。植え込み後グラフト内腔面には組み込んだES細胞が生着していた(LacZで確認)。さらに移植後1週間後には、グラフトの内腔面に形成された血栓層内でもES細胞の存在が確認できた。植え込まれたES細胞が直接生体内で血液と力学的ストレスに曝された結果生体内でさらなる分化誘導を受けて血管壁細胞に近づきつつある過程を示唆するものであった。また本年はin vitroにおける培養系でグラフトに拍動流を負荷するシステムを開発した。この装置を用いて体外で力学的ストレスを負荷する事により、生体内で認められたと同様の分化誘導が再現できるかどうかの検証にも着手した。現時点で行っている予備的実験では、グラフト内のES細胞がずり応力と周期的伸縮性ストレスの2種の力学的ストレスを受けることにより、それぞれ細胞の存在部位に応じて最内腔面ではPCAM-1陽性細胞に、壁内ではSMA陽性細胞に変化する事が観察された。すなはち生体血管の階層構造に類似した構築(内膜-内皮細胞、中膜-平滑筋細胞)が形成されつつある過程と考える事も出来る。このことによりin vivoだけでなくin vitroにおいてもハイブリッド型人工血管の成熟度を変化させる事が出来る可能性が示唆された。本年は血管壁の基材として人工物ではなく、宿主由来組織からなる結合組織管を用いてES細胞の接着性を高め、長期生着を得る試みを推進し、同時にin vitroにおける再構築化に向けての研究を行う予定である。マウスES細胞を内径1.5mmのポリウレタン製人工血管内腔面に播種し、ヌードラットの腹部大動脈に移植するモデルで検証を行った。
急性肺傷害における肺被覆液中の炎症消退脂質分子のＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｎ）解析

急性肺傷害においてレゾルビン等の脂質活性分子が炎症消退に大きな役割を持つことが発見された。今回、急性肺傷害患者の肺上皮被覆液を気管支マイクロサンプリング法(BMS法)で採取し、含まれる炎症消退脂質分子が急性肺傷害の病態形成にどのように関わるか調べた。その結果気管支鏡下マイクロサンプリングBMS法を用いて、人工呼吸下の患者を対象に肺上皮被覆液ELFを採取し、市販のレゾルビン等を利用してLC-ESI-MS(n)分析できるように繰り返し行ない調整することで、BMS法による微量サンプル中の炎症消退に関わる脂質分析ができることが確認された。今後疾患ベースの分析に応用していく道が開けるものと考えられた。急性肺障害は、時に予後不良な致死性病態に陥る。その機序には炎症反応の消退が何らかの原因により失敗し、炎症反応が慢性化して急性呼吸窮迫症候群(ARDS)のようになってしまうことが関与する。近年、アラキドン酸やドコサヘキサエン酸(DHA)、エイコサペンタエン酸(EPA)などの多価不飽和脂肪酸由来のリポキシン、レゾルビンなどの脂質活性分子が炎症消退に大きな役割をもつことが発見された。今回急性肺障害患者の肺上皮被服液を気管支マイクロサンプリング法(BMS法)で採取し、含まれる炎症招待脂質分子を液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化質量分析法LC-ESI-MS(n)で解析し、これらの脂質分子が急性肺障害の病態形成にどのように関わるか、研究を進めている。急性肺傷害は、時に予後不良な致死性病態に陥る。近年、アラキドン酸やドコサヘキサエン酸(DHA)、エイコサペンタエン酸(EPA)などの多価不飽和脂肪酸由来のリポキシン、レゾルビンなどの脂質活性分子が炎症消退に大きな役割を持つことが発見された。今回、急性肺傷害患者の肺上皮被覆液を気管支マイクロサンプリング法(BMS法)で採取し、含まれる炎症消退脂質分子を液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化質量分析法LC-ESI-MS(n)で解析し、これらの脂質分子が急性肺傷害の病態形成にどのように関わるか、研究を進めている。その機序には炎症反応の消退が何らかの原因により失敗し、炎症反応が慢性化して急性呼吸窮迫症候群(ARDS)のようになってしまうことが関与する可能性が示唆されている。アラキドン酸やドコサヘキサエン酸(DHA)、エイコサペンタエン酸(EPA)などの多価不飽和脂肪酸由来のリポキシン、レゾルビンなどの脂質活性分子が炎症消退に大きな役割を持つことが発見された。今回、急性肺傷害患者の肺上皮被覆液を気管支マイクロサンプリング法(BMS法)で採取し、含まれる炎症消退脂質分子を液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化質量分析法LC-ESI-MS(n)で解析し、これらの脂質分子が急性肺傷害の病態形成にどのように関わるか、研究を進めた。その結果、侵襲度が低い気管支鏡下マイクロサンプリングBMS法を用いて、人工呼吸下にある患者を対象に肺上皮被覆液ELFを引き続き採取し、市販のレゾルビン等を利用して、LC-ESI-MS(n)分析できるように繰り返し行ない調整することで、BMS法で採取された微量なサンプル中の炎症消退に関わる脂質分析を行うことができることが確認された。今後、疾患ベースの分析に応用していく道が開けるものと考えられた。麻酔科学対象患者の同意を得て、サンプルを採取することに関して、目的とする患者数に到達出来ていない。対象患者の同意を得て、サンプルを採取することに関して、目的とする患者数に到達できていない。加えて、LC-MS/MSの手技をマスターして、安定してサンプル解析につなげる上で、手技上のトレーニングに予想以上に時間がかかっている。侵襲度が低い気管支鏡下マイクロサンプリングBMS法を用いて、人工呼吸下にある患者を対象に肺上皮皮膚植木ELFを引き続き採取し、紫斑のレゾルビン(Cyman Chemicasis)等を利用して、LC-ESI-MS8n)分析できるように繰り返し行ない調整する。侵襲度が低い気管支鏡下マイクロサンプリングBMS法を用いて、人工呼吸下にある患者を対象に肺上皮被覆液ELFを引き続き採取し、市販のレゾルビン(Cyman Chemicals)等を利用して、LC-ESI-MS(n)分析できるように繰り返し行ない調整する。液体クロマトグラフィー・マススペクトロメトリー法LC-ESI-MS8n)使用にまで研究が進まなかったため。液体クロマトグラフィー・マススペクトロメトリー法LC-ESI-MS8n)使用料、薬剤購入液体クロマトグラフィー・マススペクトロメトリー法LC-ESI-MS(n)
中心体複製異常を指標とした新しい膀胱癌治療の試み

本研究の目的は中心体複製異常(以下CA)の責任遺伝子を制御するmicroRNA導入治療により中心体複製異常およびパクリタキセル耐性を克服できるかを検討することである。Array-CGH法にてCA陽性例と陰性例の間でコピー数が有意に異なる遺伝子をピックアップし、同定された遺伝子の標的microRNAを検索し、hsa-miR-1225-5pおよびGBASがリストアップされた。同遺伝子をCA非発現培養細胞株(KK47)に強制発現させた株ではCAが有意に増加し、CA陽性株となった。現在、親株と樹立株の間で増殖、浸潤能、パクリタキセル感受性について検討中である。本年度の目標は(1)新たに同定された中心体複製異常(以下CA)に関連する遺伝子の発現状況を臨床検体で解析し、複製異常を規定する遺伝子を同定すること(2)同定された遺伝子を抑制するmRNAをデータベースより解析し、同mRNA投与により発現抑制実験を行い、当研究室が保有する膀胱癌培養細胞株を用いて複製異常細胞数の割合を検討すること(3)非侵襲的臨床検体(膀胱洗浄液)を用いて、筋層非浸潤性膀胱癌の予後予測が臨床的に可能か否かを検討することの3点であった。(1)CAの有無を判定しえた臨床検体76例のarrayCGH解析結果を指数関数の重みを用いた重み付きt検定で解析した結果、ABI1、C10orf51、ZNF253、ZNF93、XRCC5、SPOP、SLC35B1、ZNF713、MRPS17、GBAS、PSPH、CCDC83の遺伝子群がCA陽性例で有意のコピー数変異をきたしていた。本結果については論文として掲載された。(2)AuroraA関連遺伝子を制御する可能性のあるmiRNAで、KK47で特異的に変動しているmiRNAとしてhsa-let-7c、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1268、hsa-miR-17、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-19a、hsa-miR-92aがリストアップされ、(1)の遺伝子群をターゲットとしている可能性のある関連を2つの異なるデータベースで検索した結果、共通するmicroRNAおよびそのターゲット遺伝子としてhsa-miR-1225-5pおよびGBASがリストアップされた。現在解析結果をもとに膀胱癌継代細胞株を用いて機能解析実験を行っている。(3)膀胱洗浄液78検体を使ったCA解析にて腫瘍進展(筋層浸潤)の独立予後予測因子であることが証明され、予後予測マーカーとしての有用性が示唆された。本研究の目的は膀胱癌の腫瘍進展に強い影響を与える中心体複製異常(以下CA)の責任遺伝子の臨床検体における発現を検討し、同遺伝子を制御するmicroRNA導入治療により中心体複製異常を改善できるか、また複製異常是正によりパクリタキセル耐性を克服できるかを検討することである。方法:(1)Array-CGH法にてCA陽性例と陰性例の間でコピー数が有意に異なる遺伝子をピックアップし、(2)同定された遺伝子群をターゲットとしている可能性のあるmicroRNA (以下miR)を公開データベースで検索し、標的microRNAおよびその遺伝子を絞り込んだ。また(3)同定された遺伝子をCA非発現培養細胞株(KK47)に強制発現させた株を用いて親株との差異を検討した。結果:(1) XRCC5、SPOP、SLC35B1、ZNF713、MRPS17、GBAS、CCDC83などの遺伝子群がCA陽性例で有意のコピー数変異をきたしていた。(2)AuroraA関連遺伝子を制御し、KK47で特異的に変動しているmiRとしてhsa-let-7c、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1268、hsa-miR-17、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-19a、hsa-miR-92aがリストアップされ、(1)の遺伝子群をターゲットとしている可能性のある関連を2つの異なる公開データベース検索した結果、共通するmicroRNAおよびそのターゲット遺伝子としてhsa-miR-1225-5pおよびGBASがリストアップされた。(3)CA陰性であるKK47株にGBASを強制発現させた株を樹立し、親株と比較検討したところ、CAは有意に増加し、CA陽性株であることが確認された。本年度目標とした3つの項目はおおむね達成され、その研究結果は2本の論文として雑誌に掲載されたため。

当初推定していたTPPP発現と中心体異常との関連が本研究では見られなかったため、再度arrayCGHデータをバイオインフォーマティクス解析による再解析を余儀なくされたためである。その結果、前回とは異なる染色体領域が同定され、現在その領域上の遺伝子検索中である。これまでに得られた知見をもとに25年度は以下を解明する予定である。(1)中心体複製異常をコントロールしていると推定されるmicroRNAとしてhsa-miR-1225-5p、そのターゲット遺伝子としてGBASに注目し、膀胱癌継代培養細胞株を用いた機能解析実験をおこなう。(2)GBASの関与が証明された場合、中心体複製異常の有無を検討した症例(約120例)を用いて免疫組織染色により、検証作業をおこなう。今後の研究は今回新たに同定された遺伝子と中心体複製異常との関連を検討すべく、1)臨床検体を用いた同遺伝子の発現状況と中心多複製異常との関連検索2)有意の関連が見られた遺伝子に対するmiRNAの検索(データベース解析)3)同定されたmiRNAを用いた培養細胞接触実験と中心体複製異常細胞数の増減検討4)上記によるパクリタキセル感受性の検討以上の4ステップで研究を進める予定である。本年度の実験において膀胱癌継代培養細胞株を用いた機能解析実験が行えなかったため平成24年度未使用額(457,609円)が生じた。この未使用額については平成25年度の研究費と併せて、機能解析実験に使用する予定である。平成24年度は以下の実験をおこなう予定である。1)今回新たに同定された中心体複製異常に関連する遺伝子の発現状況を臨床検体で解析し、複製異常を規定する遺伝子を同定する。2)同定された遺伝子を抑制するmRNAをデータベースより解析し、同mRNA投与により発現抑制実験を行い、当研究室が保有する膀胱癌培養細胞株を用いて複製異常細胞数の割合を検討する。上記実験のデータ整理、試薬購入などのため研究員に謝金を支払う。今年度施行できなかったmiRNA解析を次年度おこない、今年度執行できなかった経費を次年度執行の予定である。