hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝転移癌細胞の分泌する新しいエイコサノイド

AH100B細胞を体重80120gの雄呑龍ラット(本実験ではこの規格の動物を用いた)を開腹して胃,腸,膵,脾に,それぞれ移植して,転移動物実験モデルを作製した。各実験モデルでとに肝に約1粍の転移を形成した時に,ラットを屠殺して,肝転結節と原発巣の組織を,それぞれ1ケずつ少量の生食水とともに正常ラットの腹腔内に注入して,腫瘍結節の癌細胞を遊離化した。すなわち,約23週後(これはAH100Bを移植された臓器によって異なる),ラットから腹水が血性とならぬ時期に採取して,それぞれ,正常ラットに再移植す。7日後,腹水が血性とならざる時期に腹水を採取し,遠沈し上清を氷冷す。これらのラットにインドメサシン,リポキシゲナ-ゼ阻害剤を加え,4時間後,腹水を採取して遠心す。前述の上清とこれらの上清とについて,セパックC18(ウオタ-ズ製)により抽出したエイコサノイド画分を山口ら^*の方法にてB_2ーDMEQを用いて蛍光ラベルし,本研究費にて購入したHPLC(LC7A型)にて分離し,フラクションコレクタ-にて分取した。その際スタンダ-ドとして,6ケトPGF_<1α>,PGF_<1α>,PGF_<2α>,PGE_1,PGE_2,PGD_2,PGA_2,TXB_2,LTB_4,LTC_4を用いた。各実験モデルで,転移癌細胞から原発巣の癌細胞に認められないエイコサノイドと考えられる画分を得たので,GCーMSを用いてその構造の検討を行った。また,併わせて,これらの未知のエイコサノイドの生理活性,特に癌転移形成との関連についても検討を行った。AH100B細胞を体重80120gの雄呑龍ラット(本実験ではこの規格の動物を用いた。)の左總頚動脈内に注入し、2周後に開腹し、直径1粍前後の肝転移結節を採取し、その1個ずつを正常ラットの腹腔内に少量の生食水と共に注入して各転移結節の癌細胞を遊離化した。すなわち、約2週後、ラットから腹水を血性とならぬ時期に採取して、正常ラットの腹腔内に再移植す。対照は転移形成のために血管内に注入したAH100B細胞をラット腹腔内にて経代移植したものを用いた。インドメサシン投与群は転移癌細胞群も対照群でも腹腔内へ再移植5日目から開始し、7日目に各群から腹水を血性とならぬ時期に採取し、各群の腹水を遠心し、上清をセパックC18(ウオ-タ-ズ製)にアプライし、エイコサノイド画分を抽出し、アルゴン気中にて濃縮乾固し、これをアセトニトリルに溶解し、山口らの方法にてBr-DMEQを用いて蛍光ラベルし、本研究費にて購入したHPLC(送液系-LC7A型,蛍光検出器-RF525,島津製)にてエイコサノイドを高感度に検出・分離し、フラクションコレクタ-(フラック200、ファルマシア製)でピ-クを分取した。その際スタンダ-ドとして6ケトPGFα,PGF_<1α>,PGF_<2α>,PGE_1,PGE_2,PGD_2,PGA_2,TXB_2,LTB_4,LTC_4,を用いた。転移癌細胞を腹腔内移植した腹水は、対照のそれに比して6ケトPGF_<1α>,PGF_<2α>,TXB_2,PGE_2,などの濃度は高かったが、その他に未知のエイコサノイドと考えられるピ-クを認めたので、これらのものについては分取して、GC-MSを用いての分析により構造を明らかにすべく研究を行っている。さらに、それらの生理活性も追及中である。*山口ら:J・Chromatogr.,380巻,257頁,1986年AH100B細胞を体重80120gの雄呑龍ラット(本実験ではこの規格の動物を用いた)を開腹して胃,腸,膵,脾に,それぞれ移植して,転移動物実験モデルを作製した。

各実験モデルで,転移癌細胞から原発巣の癌細胞に認められないエイコサノイドと考えられる画分を得たので,GCーMSを用いてその構造の検討を行った。また,併わせて,これらの未知のエイコサノイドの生理活性,特に癌転移形成との関連についても検討を行った。
海馬におけるグルタミン酸輸送蛋白と同蛋白機能修飾因子としての酸化還元状態の解析

【緒言】てんかん原性獲得における興奮性増強の背景にはN-methyI-D-aspartateに(NMDA)受容体を主体とするグルタミン酸受容体の活性化がその一次的原因として重要視され、NMDA受容体活性化には単に興奮性増強の側面ばかりでなく、フリーラジカル発生を媒介とし細胞毒性を伴うことが特徴である。平成13年度ではin vivo状態下、NMDAをマイクロダイアリーシス法(MD)のプロープを用いて海馬に潅流投与し、潅流液をelectronspinresonance (EPR)のレゾネーターに直接誘導することによって、レドックス状態の変動検証を試み、てんかん性病態におけるグルタミン酸の神経興奮毒性を考察した。【方法】雄性Wistar系ラットにペントバルビタール麻酔を行い腹側海馬MDする目的でMD用のガイドカニューレを脳定位術にて固定した。本研究ではoxidized state(1.ラジカル発生の捕捉)とreduced state(2.抗酸化能力)の両面を検証することで海馬レドックス状態の変化を考察した。1.ラジカル発生の捕捉:2時間の125mMPOBN-aCSF溶解液をプロープを通じ左側海馬腹側部に潅流しその後、0.1mMNMDA+125mMPOBN-aCSF溶解液を60分間潅流投与、再度l25mMPOBN aCSF溶解液潅流に切り替え、POBN spin adductを追跡した。2.抗酸化能力:ニトロキシドラジカルが脳内の抗酸化能力によって還元され、その磁性が指数関数的減衰を示すことを利用して脳内抗酸化能力を評価した。【結果】1.ラジカル発生:NMDA群60分間のNMDA潅流時よりaN=15.7G, aH=2.5GのPOBN spin adductが生じ、spin adductはそのhfcより脂肪酸ラジカルと同定された。spin adduct発生は対照群では認められなかった。2.抗酸化能力: NMDA群並びに対照群のcarbamoyl-PROXYL半減期は以下のとおりであった。NMDA群;25.385+/-4.336min,対照群;16.582+/-4.001min。NMDA群で半減期が有意に延長していた。【考察】レドックス状態変化は神経伝達を修飾する重要なシナプス環境であると考える。EAAT_s構造内のシステインはレドックス感受性部位であり、酸化ストレス環境下でその機能であるグルタミン酸再取り込みが低下することが知られている。興奮系シナプス伝達効率の冗進変化と海馬硬化などの細胞障害性変化は、ともにNMDA受容体を支点として並列進行するてんかん性病態の大きな側面である。我々は、平成12年度研究補助によりwestern boltを用いた研究で、てんかん病態において、グルタミン酸輸送蛋白は発現が抑制していることを明らかにした。平成13年度の結果は、NMAD受容体活性化に伴い海馬細胞外環境において酸化ストレスが昂進し、レドックス状態の崩壊が惹起され、その帰結としてのEAAT_s機能障害過程もてんかん性病態において重要視されると考察した。

NMDA群で半減期が有意に延長していた。【考察】レドックス状態変化は神経伝達を修飾する重要なシナプス環境であると考える。EAAT_s構造内のシステインはレドックス感受性部位であり、酸化ストレス環境下でその機能であるグルタミン酸再取り込みが低下することが知られている。興奮系シナプス伝達効率の冗進変化と海馬硬化などの細胞障害性変化は、ともにNMDA受容体を支点として並列進行するてんかん性病態の大きな側面である。我々は、平成12年度研究補助によりwestern boltを用いた研究で、てんかん病態において、グルタミン酸輸送蛋白は発現が抑制していることを明らかにした。平成13年度の結果は、NMAD受容体活性化に伴い海馬細胞外環境において酸化ストレスが昂進し、レドックス状態の崩壊が惹起され、その帰結としてのEAAT_s機能障害過程もてんかん性病態において重要視されると考察した。
高速流動層による直接還元製鉄プロセスの開発

本研究は微粉鉄鉱と石炭乾留チャー粒子とを高速流動層で流動させながら鉄の還元と石炭ガス化を同時に行う複合機能プロセスを開発することを目的としている。そのために高速流動層内ガス及び粒子の挙動に関する実験と鉄鉱意志の還元とチャーのガス化の同時反応実験を実施し、下記の成果を得た。1.高速流動層におけるガス及び粒子の流動特性と二成分粒子の混合特性高速流動層内は粒子が上昇する中心部領域と粒子が下降する環状領域に分割されることが粒子速度の測定より明らかとなった。また、層内ガス速度は粒子上昇流領域にプラントルの1/7乗則を適用した分布式で記述できることを見い出した。また、粒子ホールドアップの空間分布の測定より、ガス速度が2m/s以上で、その分布が相似になることを見い出し、さらに層断面平均のホールドアップは層高と共に減少し、その高さ方向変化が指数関数で表現できることを明らかにした。粒径、密度の異なる二成分粒子の混合特性については、低粒子循環量で粗粒子の濃厚な層が底部に形成された。しかし、循環量が増大すると、粗粒子の重量分率は高さ方向にほぼ一様となり、ガス速度が粗粒子の終末速度以下でも、粗粒子のセグリゲーションの傾向がなくなることを明らかにした。2.高速流動層における鉄の還元特性鉄鉱石とチャー粒子の混合粉を高速流動層に用いて鉄鉱石の還元実験を行った。ガスと粒子の化学分析より、鉄鉱石は水素および一酸化炭素によって還元され、45分程度でウスタイト(FeO)に変化することが明らかとなった。また、還元中、層は安定な高速流動化状態を保つことがわかった。さらに、粗粒チャーを用いる方が高い還元性雰囲気を長時間維持する上で有利であることを見い出した。以上のように、本プロセス開発の上で重要な基礎的事項が明らかとなった。大型溶鉱石による大量生産方式が全く国際的競争力を失った現在、わが国の製鉄業は低品位の微粉鉱石を処理することができ、生産量の調節が容易で、しかも石炭のガス化をも行ってエネルギー生産装置にもなる高効率の新しい還元プロセスの開発を必要としている。本研究は、そこで微粉鉄鉱と微粉砕された石炭粒子を高速流動層で流動させながら鉄の還元と石炭ガス化を同時に行う複合機能プロセスを開発しようとするものである。本年度は、下記の実験を実施し、所定の成果を得た。(1)高速流動層におけるガスと粒子の混合機構の解明内径20cm、高さ5.5mの装置に、トレーサとして蛍光染料を塗布した微粉を導入して、ガスの半径方向の速度分布を測定し、塔中央部は平均流速以上の高速で吹き抜け、壁面では流下する粒子に引きずられて下向きの流速を有することを見い出した。一方、光学繊維を用いた検知器によって粒子のホールトアップ測定を行い、大部分の粒子は壁面近傍を下降し、塔中央部に僅かの粒子が浮遊することを見い出した。(2)高速流動層セグリゲーションの解析内径10cm、高さ5.5mの装置で、鉄鉱石と砂粒子の2成分混合系を流動させて、両者の混合と分級状況を調べて、高速流動状態になる程に粒径や比重が異なる粒子系でも混合が良くなることが見い出された。(3)高温流動層による還元実験内径3cm、高さ1.5mの反応管を大型電気炉で加熱して高速流動層を構成し、60100メッシュのブラジル鉄鉱石を高速の水素ガスで還元する実験を実施した。反応管出口で窒素ガスを導入して反応を停止させて、ガスと粒子の反応率を測定した。温度8001000°Cで、ガス流速、粒子滞留時間など操作条件と還元率との関係を求めた。

本研究は微粉鉄鉱と石炭乾留チャー粒子とを高速流動層で流動させながら鉄の還元と石炭ガス化を同時に行う複合機能プロセスを開発することを目的としている。そこで、本研究の最終年度にあたる本年度では、前年度である程度明らかになった高速流動層内ガス及び粒子の流動特性と二成分粒子の混合特性について、さらに実験に実施し、理論的検討も行った。また、これら流動、混合特性に基いて実験条件を設定し、鉄の還元とチャーのガス化の同時反応実験を実施し、以下の成果を得た。1.高速流動層におけるガス及び粒子の流動特性と二成分粒子の混合特性:高速流動層内は粒子が上昇する中心部領域と粒子が下降する環状領域に分割されることが明らかとなった。一方、ガス速度は粒子上昇流領域にプラントルの1/7乗則を適用した分布式で記述できることを見い出した。また、粒子ホールドアップの層半径方向分布は高ガス速度域で相似になることを見い出し、さらに層断面平均のホールドアップは層高と共に減少し、その高さ方向変化が指数関数で表現できることを明らかにした、粒径、密度の異なる二成分粒子の混合特性については、低粒子循環量で粗粒子の濃厚な層が底部に形成された。しかし、循環量が増大すると、粗粒子の重量分率は高さ方向にほぼ一様となり、粗粒子のセグリゲーションの傾向がなくなることを明らかにした。2.高速流動層における鉄の還元特性:鉄鉱石とチャー粒子の混合粉を高速流動層に用いて鉄鉱石の還元実験を行った。ガスと粒子の化学分析より、鉄鉱石は水素及び一酸化炭素によって還元され、45分程度でウスタイト(FeO)に変化することが明らかとなった。また、還元中、層は安定な高速流動化状態を保つことがわかった。さらに、粗粒チャーを用いる方が高い還元性雰囲気を長時間維持する上で有利であることを見い出した。
圧力センサーによる細胞増殖圧の測定と固定化細胞の漏出機構のモデル化

本研究の目的は,微生物細胞の増殖圧を圧力センサーを用いて直接測定し,固定化細胞の漏出挙動と結び付ける漏出モデルを提案することである。具体的には、以下の実験および検討を行った。(1)細胞の増殖圧測定装置の試作と各種細胞の増殖圧の測定実験には,主としてアルコール発酵細菌,大腸菌,などで用い,増殖圧測定のための装置を試作した。圧力トランスジューサ-を装着した細胞保持部に培地を連続供給し,出力を連続的に記録した。細胞層の保持方法が重要であった。その結果、アルコール発酵細菌では,約2.7atm,大腸菌では,約2.5atmの最大増殖圧を記録した。最大増殖圧に達する時間は,炭素源の濃度に依存したが,最大圧はほぼ一定であった。このような高い増殖圧が発生する状況では,細胞濃度は極めて高く,物質移動抵抗の増大から,細胞の生存率は約70%に低下していた。(2)ゲルからの細胞の漏出挙動の測定上記の細胞をアルギン酸カルシウム,κ-カラギ-ナンに固定化し,灌流培養によってその漏出挙動を実測した。細胞が漏出する時点では,細胞表層のゲルが中の細胞コロニーの増殖に従い半球状に膨らみ,その一部に穴が生じて漏出していることが観察された。(3)担体ゲル強度データを組み合わせた細胞漏出モデルの構築と検証固定化担体粒子からの細胞漏出挙動を定量的に表現する簡単なモデルを作成した。しかし、ゲルの引張破壊強度は、最大増殖圧のさらに数倍から十数倍であるため,細胞漏出は,ゲルマトリックスの引張に起因する網目の拡大によるもの,あるいは,ゲル中の欠陥近傍の破壊によるものと推定された。
地球環境観測データ活用のための相互参照可能な現象アーカイブスシステムの構築

地球規模の全体像を研究し,地球環境を理解するための総合的な解析支援環境の構築が望まれている.我々は,地球環境観測データを活用するための相互参照可能な現象アーカイブスシステムの構築目指した.そして,その実現のために不可欠な,大規模地球環境観測データベースの構築手法,分散データベースコンテンツを相互参照・配信する手法,データベースからテキストデータにおけるキーワード検索のように現象を検索する手法の開発を行った.地球規模の全体像を研究し,地球環境を理解するための総合的な解析支援環境の構築が望まれている.我々は,地球環境観測データを活用するための相互参照可能な現象アーカイブスシステムの構築目指した.そして,その実現のために不可欠な,大規模地球環境観測データベースの構築手法,分散データベースコンテンツを相互参照・配信する手法,データベースからテキストデータにおけるキーワード検索のように現象を検索する手法の開発を行った.本年度は,地球環境観測データ活用のための相互参照可能な現象アーカイブスシステム実現のために必要な基礎的技術検討として,次の3つの項目の研究開発を行った.1.汎用データフォーマットの検討:従来の研究成果より,特徴分析が進んでいるあけぼの衛星によるVLF帯電磁波動スペクトルデータに焦点を絞り,8秒平均値をサンプルデータとして登録した(2.1GByte).最終的には全観測データ(15TByte)を取扱うため,できる限り容量を抑え,さらに,観測データの特性を生かした上でデータの互換性を確保できるように,自己記述型汎用データフォーマット(CDF)を導入した.2.現象の抽象的な特徴の定量化に基づく類似現象検索法の開発:観測された各種自然現象の抽象的な特徴を定量化し,検索キーとして類似現象をデータベースから抽出する方法を検討した.前項で述べたCDF形式のあけぼのVLFデータに対し,研究者が解釈に用いる時間・周波数変化などの物理量を特徴量データベースとして利用し,ユーザが指定した観測データと類似データを検索・閲覧できる方法を提案した.さらに,膨大なデータに対し,同手法が適用できるよう,検索アルゴリズムの高速化を図った.これらの検討に基づき,Webブラウザで利用できる類似現象検索システムを実装し,その有用性を実証した.3.分散管理されているデータ・資料の連携:国内外の研究機関で分散して蓄積しているデータや資料を管理,連携するためのシステムとして,多様なアクセス制限に対応可能なWeb-DB管理システム(公開用Web-DBシステムの一元的な管理・公開を可能とする汎用プラットホーム)とデジタル学術情報リポジトリ(写真・動画などのコレクションや実験資料などの各種研究資料を対象とした汎用プラットホーム)のプロトタイプシステムを開発し,1.で登録したデータをはじめ複数種のデータに適用することで有用性を実証した.次年度は,この研究成果を基に,抽象的特徴表現法の評価,現象目録化のための分類指標の検討,および,データの相互参照方式の開発,システムの詳細設計,実装を行う予定である.本研究では,地球環境観測データ活用のための相互参照可能な現象アーカイブスシステム実現のために必要な技術の獲得とシステム化を目的とする.本年度は,昨年度の実践を踏まえ,以下について検討を進めた.1.分散管理されているデータ・資料の連携:国内外の研究機関で分散蓄積されている観測データ・研究資料の公開法として,昨年度までに提案・試作したシステムを改良するとともに一般化を図った.その成果として,3種類の共通プラットフォーム((1)研究資料等のコンテンツ公開のための共通プラットフォーム.(2)Web-DBシステムの一元的な管理・公開を可能とする共通プラットフォーム.(3)実験・観測データを配信するための共通プラットフォーム)を開発し,複数のコンテンツに適用した.2.国内外に分散している組織間での認証の連携:前項の共通プラットフォームを利用した公開システムをはじめとする各種公開システムの認証機構の共通化を図るための基礎技術獲得を目的として,Shibbolethによるシングルサインオン実証システムの研究開発を行った.さらに,得られた成果を複数の公開システムに適用し,その有用性を実証した.3.現象の抽象的な特徴の定量化に基づく類似現象検索法の開発:昨年度までに実施した現象の抽象的な特徴量の定量化に基づき,抽象的特徴表現法の評価と類似現象の抽出のための分類指標の検討を行った.分類指標を前年度に研究開発した類似現象検索システムに適用するとともに,抽出アルゴリズムの一般化を図り,多様な観測データに対応できる汎用的なシステムに改良した.次年度は,実践的評価を実施するために,複数種の観測データを登録し,類似現象検索システムを用いての現象抽出とその目録化,および,共通認証機構を備えた公開システムの実装と公開を行う.本研究では,地球環境観測データ活用のための相互参照可能な現象アーカイブスシステム実現のために必要な技術の獲得とシステム化を目的とする.本年度は,昨年度の実践を踏まえ,以下について検討を進めた.1.現象の目録化:前年度までの成果である,分類指標策定と現象抽出アルゴリズムの高速化・一般化に基づき,開発中の類似現象検索システムの改良を行った.複数種の観測データを登録し,改良した類似現象検索システムの実践的な評価を実施した2.共通認証方式の検討:公開システムの認証機構の共通化を図るため,前年度開発したShibbolethによるシングルサインオン実証実験システムを基に,多様な公開システムにも適用可能な改良を行った.さらに,異領域間でデータを相互参照するためのシステムのプロトタイプを開発した3.公開用共通プラットフォームの確立:前年度までの成果である内外の研究機関で分散蓄積されている観測データ・研究資料の公開ための共通プラットフォム((1)研究資料等のコンテンツ公開のための共通プラットフォーム.(2)Web-DBシステムの一元的な管理・公開を可能とする共通プラットフォーム.

(3)実験・観測データを配信するための共通プラットフォーム)を改良し3種類の汎用的な公開方式として確立した.さらに,実装した一部の公開システムに,2.の共通認証方式を組み合わせ,複数の大学間でデータの公開・共有が可能なシステムを実装し実証運用を行った
Wntシグナルによる細胞増殖、分化、運動の制御機構

本年度は最終年度であるので、β-カテニンの安定化の抑制機構について重点的に解析した。Dickkopf1(Dkk1)はWnt/β-カテニン経路の阻害分子であるが、その抑制作用は十分に理解されていない。私共はこれまでに、LRP6がカベオリンの局在する細胞膜上の領域(脂質ラフト画分)に存在し、インターナリーゼーションされることがWntによるβ-カテニンの安定化に重要であることを明らかにしてきた。Dkk1はLRP6を細胞膜上の脂質ラフト画分から非脂質ラフト画分に移動させ、クラスリン依存性にインターナリーゼーションさせることにより、β-カテニン経路を抑制した。さらに、Dkk1は低分子量Gタンパク質Rab5を介してLRP6を早期エンドソームに移行し、Rab11を介して細胞膜にリサイクリングさせた。しかも、リサイクリングしたLRP6は再びWnt3aとDkk1に応答した。一方、Wnt5aもWnt3a依存性のβ-カテニン経路を抑制することが知られており、核内でβ-カテニンと転写因子Tcf4の結合を阻害すると考えられていた。しかし、Wnt5aはWnt3aが作用する受容体Fzに競合して結合する結果、β-カテニン経路を抑制した。したがって、β-カテニン経路を抑制するために複数の経路が存在することが明らかになった。Wntシグナルによる細胞極性の制御機構を明らかにするために、上皮細胞(MDCK細胞とHPPL細胞)を3次元培養の実験系により解析した。MDCK細胞は肝細胞増殖因子(HGF)刺激により管構造を形成するが、DvlをノックダウンするとHGF依存性の管形成が認められなくなった。また、HPPL細胞が管形成を行う場合に、その伸長先端部の細胞の先進部にDvlとAPCが濃縮した。興味深いことに、DvlとAPCは互いに結合して、Wnt5aはこれを増強した。さらに、DvlとAPCは細胞接着斑のパキシリンとFAKとも複合体を形成した。これらの結果を端緒に、Wntシグナルによる細胞形態や極性の制御に関する分子機構が解明されることが期待される。以上、この3年間でWntシグナルによる細胞増殖、分化、運動に関する成果が得られたと考えている。本年度はWnt-3aによるβ-カテニンの安定化の分子機構を明らかにすることを試みた。まず、Wnt-3aを精製して、その翻訳後修飾について解析した。Wnt-3aにはパルミチン酸に加えて、87番と298番のアスパラギンに糖鎖が附加されていた。糖鎖の修飾はパルミチン酸化に必要であり、また、Wnt-3aの分泌に必須であった。パルミチン酸化は分泌には必要ではなかったが、パルミチン酸化されていないWnt-3aはFrizzledやLRP6等のWnt受容体と結合できなかった。Wnt-3aがLRP6と結合した後に、LRP6はインターナリゼーションされた。この際にLRP6はカベオリンと複合体を形成して、カベオリンRNAiによりインターナリゼーションが抑制された。カベオリンは細胞膜の脂質ラフトに存在しているが、LRP6も脂質ラフトに局在した。脂質ラフトを破壊するnystatinにより、LRP6のインターナリゼーションが阻害された。したがって、Wnt-3aはカベオリン依存性にLRP6のインターナリゼーションを引き起こすことが明らかになった。Wnt-3aによりLRP6はリン酸化されるが、リン酸化LRP6とAxinは強く結合して、カベオリンはリン酸化LRP6を介してAxinと複合体を形成した。この複合体中では、カベオリンはAxinとβ-カテニンの結合を抑制した。β-カテニンはAxinと結合することで分解されるので、カベオリンはβ-カテニンの安定化に必要とされると推測された。この予想に一致して、カベオリンRNAiとnystatinによりWnt-3a依存性のβ-カテニンの安定化が抑制された。これらの結果から、(1)Wnt-3aはカベオリン依存性のLRP6のインターナリゼーションを引き起こすこと(2)カベオリンがLRP6に結合したAxinに作用することにより、β-カテニンをAxinから遊離して、β-カテニンを安定化することが明らかになった。本年度は、昨年度に引き続き、Wnt3aによるβ-カテニンの安定化の分子機構を明らかにすることを試みた。Wnt3aが受容体LRP6と結合した後に、LRP6はリン酸化され、インタナリーゼーションされるが、これらは独立した事象であり、両者が起こらなければβ-カテニンは安定化しなかった。私共は、カベオリンがWnt3aによるβ-カテニンの安定化に必要であることをすでに明らかにしている。本来不活性型であるLRP6の細胞質領域(LRP6C)にカベオリンを融合させる(LRP6C-Cav)と、この融合蛋白質はリン酸化され、やはり細胞内で小顆粒状に存在し、カベオリンと複合体を形成して、β-カテニンを安定化した。さらに、カベオリンの膜結合領域を融合させるだけで活性型になることも判明した。これらの結果から、LRP6がカベオリンの局在する細胞膜状の領域(脂質ラフト画分)に存在することが、Wntによるβ-カテニンの安定化に重要であることが明らかになった。

また、Wntシグナルによる細胞形態、極性の制御機構を解明するために、上皮細胞(MDCK細胞)の3次元培養と神経細胞(胎児海馬神経細胞)の初代培養の実験系を確立した。Wntシグナルの構成分子であるDv1をノックダウンすると、MDCK細胞の頂底部極性形成が阻害された。また、MDCK細胞はHGF刺激により管構造を形成するが、Dv1をノックダウンするとHGF依存性の管形成が認められなくなった。胎児海馬神経細胞は極性を獲得することにより、軸索と樹状突起を伸長するが、Wnt3aとWnt5aを作用させると、軸索と樹状突起の伸長に異常が認められた。これらの結果から、Wntシグナルによる細胞形態、極性の制御に関与することが示唆された。本年度は最終年度であるので、β-カテニンの安定化の抑制機構について重点的に解析した。Dickkopf1(Dkk1)はWnt/β-カテニン経路の阻害分子であるが、その抑制作用は十分に理解されていない。私共はこれまでに、LRP6がカベオリンの局在する細胞膜上の領域(脂質ラフト画分)に存在し、インターナリーゼーションされることがWntによるβ-カテニンの安定化に重要であることを明らかにしてきた。Dkk1はLRP6を細胞膜上の脂質ラフト画分から非脂質ラフト画分に移動させ、クラスリン依存性にインターナリーゼーションさせることにより、β-カテニン経路を抑制した。さらに、Dkk1は低分子量Gタンパク質Rab5を介してLRP6を早期エンドソームに移行し、Rab11を介して細胞膜にリサイクリングさせた。しかも、リサイクリングしたLRP6は再びWnt3aとDkk1に応答した。一方、Wnt5aもWnt3a依存性のβ-カテニン経路を抑制することが知られており、核内でβ-カテニンと転写因子Tcf4の結合を阻害すると考えられていた。しかし、Wnt5aはWnt3aが作用する受容体Fzに競合して結合する結果、β-カテニン経路を抑制した。したがって、β-カテニン経路を抑制するために複数の経路が存在することが明らかになった。Wntシグナルによる細胞極性の制御機構を明らかにするために、上皮細胞(MDCK細胞とHPPL細胞)を3次元培養の実験系により解析した。MDCK細胞は肝細胞増殖因子(HGF)刺激により管構造を形成するが、DvlをノックダウンするとHGF依存性の管形成が認められなくなった。また、HPPL細胞が管形成を行う場合に、その伸長先端部の細胞の先進部にDvlとAPCが濃縮した。興味深いことに、DvlとAPCは互いに結合して、Wnt5aはこれを増強した。さらに、DvlとAPCは細胞接着斑のパキシリンとFAKとも複合体を形成した。これらの結果を端緒に、Wntシグナルによる細胞形態や極性の制御に関する分子機構が解明されることが期待される。以上、この3年間でWntシグナルによる細胞増殖、分化、運動に関する成果が得られたと考えている。
思春期・青年期の性的少数者と自殺予防:学校における自己構築を支えるモデルの構築

本研究課題では、【研究1】性的少数者の学校生活における経験と対処方略の検討、1研究2】学校現場の教師および養護教諭の性的少数者に対する対応の検討、【研究3】性的少数者に対する学生(非当事者)の態度に関する検討、【研究41学校における自殺予防教育〇普及啓発・自殺予防教育のコンテンツの整理の4つの研究を行う。今年度は、【研究1】【研究2】【研究4】について研究成果に進展がみられた。【研究1】女性から男性に性別を変更した性同一性障害者の当事者1名にインタビューを行った。なお、インタビューの内容について本人に逐語記録を送付し、内容を確認および補足してもらったうえで、承認を得て分析を行った。その結果、自分の扱い方が分からずに(対処方略のなさ)、「普通」からはみでてしまう自己が見出された。はみでる自己の在り様に気付きながらも、Bは自分の抱えている問題についてばれてはならないと考えていた。Bの語りには「無難に無難に」「隠れみのにする」といった自分の存在を隠す方略が伺えた。このことは、クラスで性的少数者の存在を伝えようとするマイノリティ教育を当事者への配慮の観点から再検討する必要性を示唆している。【研究2】中学校および高校教員を対象とした質問紙調査のデータをもとにKJ法を行った結果、大カテゴリとして(1)学校における対応(トイレ・体育・制服・行事・他生徒への説明)、(2)生徒の有する問題行動と心理的脆弱性、(3)理解できない、(4)性的少数者としてのアイデンティファイ、(5)情報の共有(生徒間、教員間)、(7)教員側のリソース不足、(8)相談にうまくのれない、(9)将来の心配という9つのカテゴリが抽出された。教員一生徒の相互関係において性的少数者生徒と教員の認識のずれ(例:性的少数者生徒の現状をサポートすることと将来、社会で自立して生きられること)や一教員のなかでの認識の分裂(教員として理解し、支えることVSどこかで否定しているかもしれない)がみられた。【研究4】昨年度開発した自殺予防教育GRIPを別の中学校で実施し、教員のための視覚材料(ビデオ)を作成した.現場の反応をもとに、内容の見直しを行った。【研究1】および【研究2】は、データの分析を行っている段階にあり、研究知見を積み上げている。また、研究成果を学会や一般市民向けの講演を通じて発表している。【研究4】は、プログラムの内容を見直し、より現場の教員が使いやすいよう教材の工夫や補助教材の開発を行っている段階にある。上記の理由により、研究はおおむね順調に進展しているといえる。しかし、【研究3】に関してはデータが未収集であり、遅れている状況である。【研究1】、【研究2】については、論文に投稿する準備を進める。また、引き続き一般市民向けの理解を促進するためのツールづくり(たとえば、パンフレットやHPなど)を行っていく予定である。【研究4】については、今年度はプログラム内容の確定をするとともに、プログラムの効果測定を行う。【研究3】については、早急に質問紙調査を実施する。そのためには性的少数者に対する態度を測定する尺度を確定する必要がある。大学生を対象とした調査を行う準備はすでに整っている。今年度(2010年4月2010年10月末)は【研究1】性的少数者の経験と対処方略、【研究2】教師および養護教諭の当事者に対する対応の2つの研究に関してフィールド開拓を行いながら、性的少数者当事者への聞き取りと、教師・養護教諭への聞き取りおよび質問紙調査を行った。1.【研究1】:2010年4月より、都市部および地方でのフィールド開拓(自助グループの開催および参加、当事者が集るイベントへの参加)を行い、数名への聴き取りが可能になった。今後もフィールド開拓および聞き取りを継続し、質量ともに豊かなデータを収集する。2.【研究2】:2010年4月に、高等学校および中等学校に在籍する学校教員および行政職に携わる元教員を対象に、<学校における性的少数者の生徒および対応に関するアンケート>を郵送で配布した。対象は、関東圏の高校および総合教育センター(各1機関)、近畿圏の高等学校、中学校および総合教育センター(各1機関)、中国圏の中学校(1校)で、教員経験のある者を対象とした。有効回答は全機関からの回答あわせて180名であった。アンケートでは、性的少数者とのかかわりの経験、性教育の賛否、(性の問題を含めた)授業で扱いにくいテーマと理由、性的少数者とかかわりをもったときの気持ち、校内における自殺予防の取り組みへの態度について尋ねた。さらに、元中学校教員(元管理職)2名を対象に性的少数者に対する教員の意識と学校の対応、および学校やクラスで性的少数者に関する授業をすることについて2時間程度のヒアリングを行った。3.本研究の意義:これまで学校空間において性的少数者は不可視的な存在とされていたために、我が国の学校現場における性的少数者と彼らを取り巻く教師・養護教諭の対応や構えについて聞き取りを行って検討した研究は皆無である。そのため、学校現場に特化した実証的な知見は積み重ねられていないのが現状である。本研究では、性的少数者の学校経験について聞き取りを行うだけでなく、教師・養護教諭・学生といった異なる立場の者が性的少数者と関わるなかでの経験や当事者への態度・構えおよびその変化について着目する。

聞き取りと質問紙調査を行うことで実証的に検討する点が独創的であり、将来的な研究の積み上げの第一歩となると思われる。本研究課題では、【研究1】性的少数者の学校生活における経験と対処方略の検討、【研究2】学校現場の教師および養護教諭の性的少数者に対する対応の検討、【研究3】性的少数者に対する学生(非当事者)の態度に関する検討、【研究4】学校における自殺予防教育・普及啓発・自殺予防教育のコンテンツの整理の4つの研究を行う。今年度(出産による研究中断があったため、2012年6月2013年3月が研究遂行期間であった)は、【研究1】性的少数者の経験と対処方略に関するインタビューの分析と、【研究4】学校における自殺予防教育の実践に関して主に研究を進めた。【研究1】インタビューの内容について本人に逐語記録を送付し、内容を確認および補足してもらったうえで、承認を得て分析を行った「もう自然と」「気付いたら」「今思うと」「自分の中ではフツウのこと」という語りが性同一性障害に特徴的に見られることが明らかになった。語られたエピソード自体は現在の性的少数者である自己を規定する(しつつある)重要な要素であるにもかかわらず、当事者自身が当該の経験や出来事に関して言語化のしにくさや無自覚があるように思われた。この結果は、学校という場で当事者が対処する対象先が確固としたもの(人物や状況)ではないことを意味しており、重要な発見である。分析の結果、対処する対象が見えぬままに「自分が今の環境の中でどう過ごしていくか」ばかりに目を向け、対処(スキルアップ、感情を殺し機械的に生きる)しつづけている事態が明らかになった。本研究課題では、【研究1】性的少数者の学校生活における経験と対処方略の検討、1研究2】学校現場の教師および養護教諭の性的少数者に対する対応の検討、【研究3】性的少数者に対する学生(非当事者)の態度に関する検討、【研究41学校における自殺予防教育〇普及啓発・自殺予防教育のコンテンツの整理の4つの研究を行う。今年度は、【研究1】【研究2】【研究4】について研究成果に進展がみられた。【研究1】女性から男性に性別を変更した性同一性障害者の当事者1名にインタビューを行った。なお、インタビューの内容について本人に逐語記録を送付し、内容を確認および補足してもらったうえで、承認を得て分析を行った。その結果、自分の扱い方が分からずに(対処方略のなさ)、「普通」からはみでてしまう自己が見出された。はみでる自己の在り様に気付きながらも、Bは自分の抱えている問題についてばれてはならないと考えていた。Bの語りには「無難に無難に」「隠れみのにする」といった自分の存在を隠す方略が伺えた。このことは、クラスで性的少数者の存在を伝えようとするマイノリティ教育を当事者への配慮の観点から再検討する必要性を示唆している。【研究2】中学校および高校教員を対象とした質問紙調査のデータをもとにKJ法を行った結果、大カテゴリとして(1)学校における対応(トイレ・体育・制服・行事・他生徒への説明)、(2)生徒の有する問題行動と心理的脆弱性、(3)理解できない、(4)性的少数者としてのアイデンティファイ、(5)情報の共有(生徒間、教員間)、(7)教員側のリソース不足、(8)相談にうまくのれない、(9)将来の心配という9つのカテゴリが抽出された。教員一生徒の相互関係において性的少数者
FAK阻害薬の骨原発悪性腫瘍への早期臨床応用実現を目標とした転移抑制機構の解明

骨肉腫およびユーイング肉腫(ES)は小児・若年成人に多い骨原発悪性腫瘍であるが、転移例の予後は極めて不良でその対策は急務である。申請者はFAKとIGF-IRの二重チロシンキナーゼ阻害剤を用いることで骨肉腫およびES細胞の増殖、転移能を抑制することを明らかにしたが、その機序については明らかになっていない。本研究ではxenograftおよびPDX(Patient-derived xenograft)モデルを用いて1)小児骨原発悪性腫瘍の転移能を有する細胞分画の同定とFAK活性の評価2)転移を制御する上流分子の同定とFAK阻害療法の開発を行い、転移阻害剤として臨床応用するための基礎研究を行う。
磁気繊毛の反磁界低減と小型平面アクチュエータの試作

近年,マイクロマシンの要素技術である電磁型アクチュエータは、より小型化あるいは薄膜化される傾向にあり,反磁界の影響をどう抑えるかが,アクチュエータ開発の重要なポイントとなっている.本研究では,この問題を解決するために,アルミニウム(以後,Alと略する.)の陽極酸化磁性皮膜を改良し,直径0.2μm,長さ100μmの針状の磁性粒子を膜面に垂直に無数に並べた磁気繊毛を開発し,これを利用して,小型平面アクチュエータを試作することを目的とした.本科学研究費補助金により,直径0.1μm,長さ90μm,すなわち,アスペクト比900の針状の磁性体が,膜面に垂直に無数に並び,膜面に垂直方向の保磁力が400Oe程度の垂直磁気異方性を有する磁性皮膜を作製した.以下に,本研究の概要を示す.(1)バリヤ層貫通処理の微細孔深さ依存性の検討高アスペクト比を有する針状磁性体を作製するために,膜面に垂直に微細孔を有するAl酸化皮膜の膜厚を10μm90μmと増やし,Coの直流電析を行った.しかし,60μm以上では,電析時に皮膜に割れを生じ,Coの電電析行えなかった.めっき液と地下Alの電気導通をとるために行うバリヤ層(微細孔の底と地下Alの間に存在する絶縁層)の貫通処理時の電流波形を観察した結果,微細孔が深くなると,バリア層を溶解するための酸性液の拡散が困難となることがわかった.(2)穴の深さに依存しないバリヤ層貫通処理の検討膜厚90μmの酸化Al皮膜を有する陽極酸化後の試料に,陽極酸化とは逆の極性の電流を流し,バリヤ層に貫通孔を開け,かつ,酸化Al皮膜を地下Alから剥離した(逆電剥離法).剥離後の酸化Al皮膜に,スパッタにより,直流電析のためのCu電極を作製し,Co直流電析を可能とした.この方法により,酸化Al皮膜の膜厚に依存しない直流電析が可能となった.Co直流電析後の試料の針状磁性体の回りを覆っている酸化Alを,化学溶解し,直径0.1μm,長さ90μm,アスペクト比900の針状のCo磁性体が、膜面に垂直に並んだ磁気繊毛皮膜を作製した.(3)2段階陽極酸化による反磁界の低減針状磁性体間には相互作用による反磁界が存在し,皮膜の膜面に垂直方向の磁化を妨げている.微細孔の間隔を決める陽極酸化時の極間電圧を2段階(40V/120V)にすることにより,下地Alまで至る微細孔に選択的なものとし、Co直流電析が行われる微細孔の間隔を従来の3倍に広げた.この結果,膜面に垂直方向に磁化した場合の磁化曲線の角形比(残留磁化/飽和磁化)を,従来の限界値0.5から0.85と大幅に増大することに成功した.近年,マイクロマシンの要素技術である電磁型アクチュエータは、より小型化あるいは薄膜化される傾向にあり,反磁界の影響をどう抑えるかが,アクチュエータ開発の重要なポイントとなっている.本研究では,この問題を解決するために,アルミニウム(以後,Alと略する.)の陽極酸化磁性皮膜を改良し,直径0.2μm,長さ100μmの針状の磁性粒子を膜面に垂直に無数に並べた磁気繊毛を開発し,これを利用して,小型平面アクチュエータを試作することを目的とした.本科学研究費補助金により,直径0.1μm,長さ90μm,すなわち,アスペクト比900の針状の磁性体が,膜面に垂直に無数に並び,膜面に垂直方向の保磁力が400Oe程度の垂直磁気異方性を有する磁性皮膜を作製した.以下に,本研究の概要を示す.(1)バリヤ層貫通処理の微細孔深さ依存性の検討高アスペクト比を有する針状磁性体を作製するために,膜面に垂直に微細孔を有するAl酸化皮膜の膜厚を10μm90μmと増やし,Coの直流電析を行った.しかし,60μm以上では,電析時に皮膜に割れを生じ,Coの電電析行えなかった.めっき液と地下Alの電気導通をとるために行うバリヤ層(微細孔の底と地下Alの間に存在する絶縁層)の貫通処理時の電流波形を観察した結果,微細孔が深くなると,バリア層を溶解するための酸性液の拡散が困難となることがわかった.(2)穴の深さに依存しないバリヤ層貫通処理の検討膜厚90μmの酸化Al皮膜を有する陽極酸化後の試料に,陽極酸化とは逆の極性の電流を流し,バリヤ層に貫通孔を開け,かつ,酸化Al皮膜を地下Alから剥離した(逆電剥離法).剥離後の酸化Al皮膜に,スパッタにより,直流電析のためのCu電極を作製し,Co直流電析を可能とした.

この方法により,酸化Al皮膜の膜厚に依存しない直流電析が可能となった.Co直流電析後の試料の針状磁性体の回りを覆っている酸化Alを,化学溶解し,直径0.1μm,長さ90μm,アスペクト比900の針状のCo磁性体が、膜面に垂直に並んだ磁気繊毛皮膜を作製した.(3)2段階陽極酸化による反磁界の低減針状磁性体間には相互作用による反磁界が存在し,皮膜の膜面に垂直方向の磁化を妨げている.微細孔の間隔を決める陽極酸化時の極間電圧を2段階(40V/120V)にすることにより,下地Alまで至る微細孔に選択的なものとし、Co直流電析が行われる微細孔の間隔を従来の3倍に広げた.この結果,膜面に垂直方向に磁化した場合の磁化曲線の角形比(残留磁化/飽和磁化)を,従来の限界値0.5から0.85と大幅に増大することに成功した.
霊長類視覚トップダウン結合のin vivo二光子イメージング

本研究の技術的目標のうち重要な要素は2つある。1つはミクロレベルでの機能解析を可能にするためにマーモセット神経細胞にGCaMPを発現させ、神経活動を観察する実験系を構築することである。現在では、プロモーターの選択によりマーモセットV1で良好なGCaMP6の発現が得られている。2つ目の技術的目標は、カラムレベルの機能解析を行う実験系を構築することである。これについては、血流由来の内因性シグナルを光学的に観察する方法が適用可能であることを確かめた。更に、カルシウムイメージングでカラムレベルの神経活動を観察することに成功した。これらの成果を組み合わせることでトップダウン信号の機能解析が可能である。本研究では、マーモセットにおいて、「高次視覚皮質から一次視覚皮質(V1)」及び「高次視床からV1」の二種類のトップダウン結合の視覚反応特性と、その受け手であるV1機能カラムの視覚反応特性との対応関係を解明する。初年度は本研究に必要な実験技術の最適化を行った。先ず、神経細胞にGCaMP6sを発現させるAAVのセロタイプは複数を試した。プロモーターは、神経細胞に特異的なSynapsinプロモーター、および非特異的で協力なプロモーターであるCAGプロモーターを使用した。この結果、二光子顕微鏡で複数の細胞がGCaMPを発現していることは確認することができ、いくつかの細胞においては自発発火活動と思われる輝度の変化も観察された。しかしながら、視覚刺激の提示に対する反応を記録することは難しかった。この点については、最近開発されたTETシステムを利用した更に強力な遺伝子発現システムを利用することにより解決されることが期待できる。二光子イメージングの条件検討をするため、OGB1-AMを使用した二光子イメージング実験を行った。この結果、V2の方位選択性マップを観察することに成功した。二光子イメージングの撮像部位と内因性シグナルイメージングの撮像部位との位置合わせについても成功し、方位選択性マップが両者で合致した結果になることを確認した。更に、CCDカメラを用いた一光子のカルシウムイメージングでも方位選択的な神経集団の活動を捉えることに成功した。本年度においては、AAVを用いたGCaMPの遺伝子導入方法の最適化と、主に二光子カルシウムイメージングにより視覚反応を取得する実験条件の最適化を行った。AAVを用いた遺伝子導入は、本年度試した組み合わせに関しては著しい結果が得られなかったものの、遺伝子発現が弱い原因が実験手技によるものではなくプロモーターの強さによるものであることを明らかにすることが出来た。また、遺伝子を大脳皮質に注入する実験手技に関しては最適化することができるようになり、遺伝子注入から二光子イメージングの実験を行うまで動物を維持することにも成功した。本年度に開発した最近開発されたTETを利用した強力な遺伝子発現力を持つAAVを用いることで、来年度にはGCaMPによるカルシウムイメージングが問題なく行えるものと考えられる。機能イメージングに関しては著しい進捗があった。OGB1-AMを用いた二光子カルシウムイメージングによりマーモセットV2で方位選択的なカラム構造を明らかにした。これは、V2での二光子カルシウムイメージングの成功はマーモセット以外も含めた霊長類で世界初の成果だと考えられる。また、内因性シグナルイメージングやCCDカメラを用いた一光子カルシウムイメージングでも方位選択的な神経活動を観察することに成功した。AAVにより大脳皮質の広範囲でGCaMPを発現した個体において、これらの技術を用いることにより、来年度はより大規模なマーモセット視覚野の構造を明らかにできるものと考えられる。本年度においては、二次視覚野から一次視覚野へのフィードバック結合の機能解析に必要な個々の技術開発を完成させた。本年度の前半では、昨年度に検討をした神経細胞への遺伝子導入に関しては、TETを使用したAAVによる大きな進展があった。先行研究に更に工夫を加えることで、10mm四方以上の非常に広範囲にわたる皮質神経細胞にGCaMPを感染させることが可能になった。本年度の後半では、前半に開発した遺伝子導入技術により一光子、二光子イメージングの実験を行った。一次視覚野および二次視覚野において、自発活動と視覚応答の両方を観察することに成功した。特に、一光子イメージングによって機能的に一次視覚野と二次視覚野を精確に同定する方法を開発した。また、一光子イメージングによってメゾスケールの機能を同定したあとに、二光子イメージングで細胞レベルでの機能解析を行うことに成功した。更に、高解像度の二光子イメージングを行うことにより樹状突起や軸索末端のカルシウム応答を観察することに成功した。これにより、本研究のターゲットである二次視覚野から一次視覚野へのフィードバック結合の機能解析を行うために必要な技術を全て開発することができた。

TETシステムを利用したAAVによりV2やMTの神経細胞にGCaMPを発現させ、皮質-皮質間結合の解析を行う。これに平行して、視床-皮質間結合の解析も行う。公開されているマーモセットの脳アトラス(Yuasa et al., 2010)を参考にして高次視覚視床(Pulvinar)にAAVを注入し、GCaMP6sを発現させる。Pulvinarの神経細胞のうちV1へ投射しているものの活動を、軸索末端における二光子カルシウムイメージングで解析する。PulvinarからV1への軸索末端も、多くが皮質表層に分布するので、二光子イメージングは可能であると考えている。二光子イメージング直後には、内因性シグナルイメージングで、軸索が分布していた部位におけるV1の機能マップを調べる。この組み合わせが実行可能であることは今年度の成果により既に分かっている。その後、皮質-皮質間結合の時と同様に、Pulvinarからのトップダウン結合の機能と、それらが分布するV1機能マップとの空間的対応を調べる。4頭(8半球)のマーモセットを使用して視床-皮質間結合の解析を行う。最後に、皮質-皮質間結合と視床-皮質間結合で、視覚反応特性およびV1機能マップとの関係性に違いが見られるかを検討する。違いが認められる場合は、それが先行研究から予想される2種類の結合の認知的な機能差と関連しているものか検討する。これらの結果をまとめて、国内外の学会や学術論文に報告する。28年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学28年度が最終年度であるため、記入しない。
サイトカインによるガストリン分泌及びその受容体発現と癌細胞増殖に関する研究(2)

加齢に伴う早郭胃癌の発生増殖に高ガストリン分泌環境が関津していること、進行胃癌において高ガストリン血症群が低ガストリン群より予後が不良であること(特に、低分化型癌においてその傾向が強く、ガストリン値が予後因子となる可能性があるう、癌遺伝子産物やEGF, EGFR, PCNA, Ki-67の発現が高ガストリン群が低ガストリン群より有意に亢進していることを確認した。また、胃癌組織におけるガストリン受容体遺伝子の発現をRT-PCR法を利用し47例中5例の腫瘍においてその発現が認められ、臨床病理学的な検討から、高ガストリン分泌環境と腫瘍におけるガストリン受容体の発現が腫瘍増殖能や悪性度に影響を及ぼしている可能性も指摘した。さらに、基礎的に、モルモット胃の幽門洞粘膜からPercoll密度勾配遠心法で得られた分画を用い、G細胞の単離、初代培養系を作成し、サイトカインの刺激実験を行い、炎症性サイトカイン(IL-1β,TNF-α,IL-8)がG細胞よりガストリンの産生、遊離を有意に促進したことも確認し、ガストリン分泌が炎症状態や担癌状態のReactant(生体反応物質)となる可能性も指摘した。これらの結果から、内因性のガストリン分泌が胃癌の増殖能や病態を考える上で重要であると考えられた。本研究では、これまでの研究に続いて、基礎的に各種サイトカインの刺激に対するG細胞からのガストリン分泌、産生機序を解明し、さらに、ヒト胃癌切除標本よりG細胞の単離・初代培養系を作成し、サイトカインに対する反応が同様に得られるかどうか、その機序を解明することが目的である。われわれがこれまで開発してきたPercoll密度勾配遠心法により得られたモルモットG細胞の単離、初代培養系を用い、サイトカインの刺激実験を行った(モルモット幽門洞粘膜をDispase,Collagenase酵素処理後、細胞浮遊液をPercoll密度勾配遠心法(不連続勾配)によりG細胞のrich分画を同定した。同分画より得られたG細胞浮遊液をcollagen type 1でcoatされたcultue wellに播種し、DMEM/F12(1:1)培養液に36時間培養、単層培養系を作成した後、各種cytokineの刺激実験(2時間)を行った。培養液中と細胞内のガストリン濃度を測定した)。その結果、炎症性サイトカインであるIL-1β,-6,-8 TNF-αが濃度依存性にガストリン分泌を促進する事が確認された。現在、インフォームドコンセントの下、ヒト胃癌切除標本の幽門洞粘膜から酵素処理を行い、ヒトG細胞のrich分画を得るため基礎的実験を進行中である。これまでの研究に続いて、基礎的に各種サイトカインの刺激に対するG細胞からのガストリン分泌、産生機序を解明し、さらに、ヒト胃癌切除標本よりのガストリン受容体発現と胃癌患者におけるガストリン分泌能について検討した。同分画より得られたG細胞浮遊液をcollagen type 1でcoatされたculture wellに播種し、DMEM/F12(1:1)培養液に36時間培養、単層培養系を作成した後、各種cytokineの刺激実験(2時間)を行った。培養液中と細胞内のガストリン濃度を測定した。その結果、炎症性サイトカインであるIL-1β,-6,-8TNF-αが濃度依存性にガストリン分泌を促進する事が確認された。胃癌組織におけるガストリン受容体遺伝子の発現においては、RT-PCR法を利用し47例中5例の腫瘍においてその発現が認められた。臨床病理学的な検討から、高ガストリン分泌環境や腫瘍におけるガストリン受容体の発現が腫瘍の増殖能や悪性度に影響を及ぼしている可能性が考えられた。