hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ステント内膜肥厚抑制の新しいアプローチ-Ezetimibeの効果検証

背景・目的:高脂血症治療薬として広く用いられているEzetimibeは小腸コレステロールトランスポーター阻害薬として脂質代謝に作用しているが、その他にも抗粥状動脈硬化作用等も報告されている。しかしながら静脈グラフトに関する効果はいまだ検討されていないのが現状である。そこで今回Ezetimibeの血管内膜肥厚に与える効果についてウサギ自家静脈グラフトモデルを用いて検討した。結果:摘出静脈グラフトを4分割しプレパラートを作製、各プレパラートにおいて任意の8か所で内膜・中膜を測定し内膜中膜比を計測。合計32か所の計測の平均をそのウサギの内膜中膜比とした。内膜中膜比:コントロール群1.2、Ezetimibe群0.586で有意にEzetimibe投与群で内膜肥厚を抑制した。今後の予定:静脈グラフト内膜肥厚の成因において重要な役割を持つと考えられている血管平滑筋の増殖及びアポトーシスに与えるEzetimibeの影響を検討するため、14日目の静脈グラフトを採取しKi-67染色を行い細胞増殖活性を、TUNEL染色を行いアポトーシスに与える影響を検討する。コントロール群のウサギ静脈グラフトではアセチルコリンに対する血管弛緩反応の欠如が認められる。これは内皮機能障害に起因している。そこでEzetimibe投与群においてアセチルコリンに対する血管弛緩反応を測定しEzetimibe投与が内皮機能に与える影響を検討する。
脳科学的根拠のある利き手・非利き手別リハビリテーションプログラムの開発

運動課題では利き手であるか否かにより大脳活動は異なり、非利き手の動作では個人差が、特に複雑動作で著明となったが、感覚入力課題に対しては利き手と非利き手で明らかな違いはなく、リハビリテーションにおいて運動課題では利き手を考慮する必要があり、感覚入力課題では考慮する必要がない可能性が示唆された。tDCSは運動課題遂行能力ならびに運動イメージ能力を向上させ、感覚能力も向上させる可能性があることが示唆された。ミラーセラピーは運動課題に対しては有効であることが脳科学的に裏付けられたが、感覚入力課題に対しての有効性は確認できなかった。1.経頭蓋直流電気刺激(tDCS)の至適刺激強度を検討するために右利き健常成人17名を対象に前頭前野を1又は2mAで10分間電気刺激し,ワーキングメモリー課題を実施した.1mA,10分間刺激することで有意に課題遂行能力が向上することが判明した(p<0.05)が,1mAと2mA間には有意差はなかった.課題遂行能力向上のためのtDCSは1mA,10分間刺激が適当であることが判明した.2.運動関連領域へのtDCSが運動イメージに与える影響について明らかにするために以下の研究を行った.右利き健常成人19名を対象に,tDCSは脳の活動性を促進させるanodal刺激(刺激強度1mA)とsham刺激の2条件とし,左運動野を10分間刺激した.運動イメージ課題として手のメンタルローテーション課題(MR課題)を用い,MR課題の反応時間と誤答数をtDCSの刺激前後および刺激条件間で比較した.anodal刺激後の反応時間は刺激前と比較して有意に短くなった(p<0.01)が,sham刺激で差はなかった.また,刺激後の反応時間はanodal刺激でsham刺激より有意に短くなった(p<0.05).誤答数はanodal,sham刺激ともに有意差はなかった.運動関連領域へのtDCSは同領域の活動性を促進することで運動イメージ能力を向上させ,tDCSがより効率的で対象者に優しいリハビリテーション法開発の一助になる可能性のあることが判明した.3.昨年研究者らは正常人を対象にミラーセラピーを手の運動課題として行なう際のより効果的な条件設定を脳科学的に示した.本年は感覚刺激課題でのミラーセラピーの有効性を健常成人を対象に脳磁図を用いて解析した.現在までのところその有効性と利き手,非利き手間での差異も示せていないが,現在解析を続行している.運動課題では利き手であるか否かにより大脳活動は異なり、非利き手の動作では個人差が、特に複雑動作で著明となったが、感覚入力課題に対しては利き手と非利き手で明らかな違いはなく、リハビリテーションにおいて運動課題では利き手を考慮する必要があり、感覚入力課題では考慮する必要がない可能性が示唆された。同一利き手群での利き手、非利き手運動時の脳活動の特徴を調査する目的で、右利き健常成人30名を対象に、腱のグライディングエクササイズを利き手、非利き手および両手で行った際の左右大脳皮質運動野領域の脳活動を近赤外分光法で測定した。課題遂行開始に伴い利き手、非利き手、両手課題全てにおいて、一次運動野でOxy-Hb濃度が増加した。右手課題時は左運動野領域での活性化はより広範囲で、左手、両手課題時には両側に賦活が見られたが、右半球においてより広範囲であった。一次運動野のOxy-Hb濃度変化量を比較した結果、利き手課題では対側の賦活が有意で(p<0.01)、非利き手課題、両手課題では左右で有意差はなかった。Oxy-Hb濃度変化量を同一被験者内で比較した結果、利き手課題時のみ有意差あり群(n=15)、利き手、非利き手課題時に有意差あり群(n=7)、利き手、両手課題時に有意差あり群(n=3)、利き手、非利き手、両手課題時に有意差あり群(n=3)、どの課題時にも有意差なし群(n=2)の5つに分類された。以上より、腱のグライディングエクササイズを利き手、非利き手、両手で行う際その中枢制御は一定ではなく、リハビリテーションの効果、進行状況に影響を及ぼす一因として考えられた。つまり、障害手が利き手か非利き手であるか、また個人によってリハビリテーションの効果、進行状況が異なる可能性が示唆された。経頭蓋直流電気刺激の課題動作遂行に及ぼす影響を調査する目的で、健常成人5名を対象に片手でのゴルフボール廻し課題を行なわせたところ、一次運動野電気刺激後でボール廻し回数が有意に増加した。本刺激は上肢運動能力を上昇させ、上肢運動障害に対するリハビリテーションに応用できる可能性があることが示唆された。運動解析:単純と複雑動作時の脳活動が動作手の違い(利き手あるいは非利き手)により変化するのかを明らかにする目的で、動作中の脳活動をfNIRSで計測した。利き手動作時には、両動作ともに左半球が賦活したが、複雑動作時のみ小さい領域で右半球が賦活した。非利き手動作時には、両動作ともに両半球で賦活があり、賦活領域は単純動作より複雑動作の方が大きい傾向があり、同じリハビリテーション課題でも利き手と非利き手では脳活動に違いがあることが判明した。

各種日常生活動作で、利き手、非利き手別で手関節運動角度に差があるか否かを検討する目的で、片手で日常生活活動課題をモーションセンサーを装着して遂行し、手関節の運動範囲を計測した。巧緻運動課題では非利き手の手関節可動域が有意に大きく、単純動作では利き手の方が大きい傾向があった。利き手と非利き手では動作の違いにより動作戦略が異なることが示唆された。知覚解析:刺激の違い及び利き手、非利き手の違いで、感覚入力に対する脳活動の違いを確認する目的で、示指と小指に触覚あるいは痛覚刺激を両側別々に行ない、MEGを使用して脳活動を計測した。いずれの刺激でも一次体性感覚野の賦活部位は同じであり、利き手、非利き手別でも明らかな差異は認めなかった。感覚入力に対しては利き手を考慮する必要はないと考えられた。経頭蓋直流電気刺激が刺激側および非刺激側の一次体性感覚野の活動に与える影響をMEGを用いて検討し、陽極刺激時に刺激側の一次体性感覚野の神経活動が刺激前と比較し有意に増加すること、非刺激側の一次体性感覚野には影響がないことが明らかとなった。触覚刺激の鏡像観察が体性感覚野の活動および利き手、非利き手による活動に差があるかをMEGを用いて検討し、触覚刺激の鏡像観察が体性感覚野の活動を高めることを脳科学的に示すことはできず、利き手・非利き手で活動に差がないことが明らかとなった。リハビリテーション概ね順調に伸展しているが,以下の点でやや遅れている.2.当初予定していた単純動作が複雑動作課題の脳活動に与える影響についての解析が研究途中(有意な影響が確認できていない)である.当初予定していた単純動作が複雑動作課題の脳活動に与える影響についての解析が研究途中(有意な影響が確認できていない)である。1.単純動作課題内容を検討・変更し研究を継続する.2. tDCSとNIRS計測を即時的に行なえる環境設定を整えたので,これを使用し研究を続行する.3.上肢運動に対するtDCSの脳レベルでの影響について、近赤外分光法と脳磁図を使用し計測中であり,続行する.4.既に完了した研究について英文学術雑誌に投稿する.単純動作課題内容を検討・変更し研究を継続する。上肢運動に対する経頭蓋直流電気刺激の脳レベルでの影響について、近赤外分光法と脳磁図を使用し計測予定である。一部研究が完了せず,学会発表,論文投稿が完了していないものがあるため.消耗品費:計測機器使用上の消耗品、実験データ解析に伴う消耗品等の購入に使用予定旅費:国内及び海外学会での研究成果の発表、研究者間での施設往来に使用予定その他:論文作製費用として使用予定消耗品費:計測機器使用上の消耗品、実験データ解析に伴う消耗品等の購入に使用予定旅費:国内及び海外学会での研究成果の発表、研究者間での施設往来に使用予定その他:論文作製費用として使用予定
グリア細胞生存決定因子としてのグルタミントランスポーターに関する分子薬理学的研究

ラット大脳皮質由来培養アストログリア細胞には、神経細胞と同様にグルクミントランスポーター(GlnT)が機能的に発現すること、および、アデニル酸シクラーゼ活性化薬であるForskolin曝露に伴い、GlnTプロモーターの活性化を通して、GlnT mRNA発現およびGln輸送活性増強が出現することを以前に示した。さらに、GlnT過剰発現実験からGlnT mRNA発現増強はアストログリア細胞の酸化的ストレス脆弱性を惹起することが判明した。そこで、GlnTによるアストログリア細胞の酸化的ストレス脆弱性惹起メカニズム解明およびアストログリア細胞の機能変化が神経細胞死に与える影響を解析する目的で、GlnT安定発現C6Glioma細胞株を作製した。まず、GlnT安定発現株においてHPLCを用いて細胞内Gln濃度を測定したところ、著明な細胞内Gln濃度の増加が観察された。さらに、過酸化水素曝露細胞死を検討したところ、PI陽性細胞数の増加が観察された。この時、GlnT抗体を用いた免疫染色法を行ったところ、GlnTたんぱく質は細胞膜上ではなく、細胞間接着面において局在性が観察され、さらに、ROS蛍光指示薬であるHydroethidineを用いてROS産生能を評価したところ、産生能はGlnT安定発現株において著明に増加していた。次に、グルタミン酸誘発性海馬神経細胞死に対するGlnT安定発現株のコンディション培地の影響を解析したところ、著明な回復効果が観察された。そこで、神経栄養因子発現量を解析したところGlnT安定発現株において、NGFおよびNT4/5mRNA発現量の著明な増加が観察された。以上の結果より、C6 Glioma細胞において、GlnTの安定発現は酸化的ストレス脆弱性を惹起すると共に、Glu誘発性神経細胞死に対しては神経栄養因子を介した防御作用を発揮する可能性が示唆された。ラット大脳皮質由来培養アストログリア細胞には、神経細胞と同様にグルタミントランスポーター(GlnT)が機能的に発現すること、およびリポポリサッカライド曝露による細胞活性化に伴い、GlnTプロモーター活性の低下を通じて、GlnT mRNA発現量低下とGln輸送活性減少が誘発されることを以前に示したが、続いて代表的な細胞内シグナルであるcAMP分子に着目して、GlnT機能調節への関与の可能性を検討した。その結果、培養アストログリア細胞において、アデニル酸シクラーゼ活性化薬であるForskolin曝露に伴い、細胞内cAMP蓄積量の著明な増加が観察された。この時、Gln輸送活性の増加とともにGlnT mRNA発現量も時間および用量依存的に増加した。このGlnT mRNA発現量増加が転写活性の変化によるものかを検討する目的で、GlnTプロモーター活性を測定したところ、Forskolin曝露に伴い、GlnTプロモーター活性は有意に増加し、さらにPKA阻害薬であるH89で阻害された。次に、PKAシグナル下流の代表的な転写因子であるcAMP response element binding protein(CREB)のリン酸を解析したところ、Forskolin曝露に伴ってリン酸化CREBたんぱく質が著明に増加した。この転写因子とGlnTプロモーターの直接的な相互作用を解析する072的でChIPアッセイを行ったところ、リン酸化CREBはGlnTプロモーターと直接的に相互作用することが明らかとなった。以上の結果より、ラット大脳皮質由来培養アストログリア細胞に発現するGlnTはForskolin曝露によって輸送活性が増加するが、その分子機構にはGlnTプロモーター活性に対するリン酸化CREBの直接的な関与が示唆される。
キナーゼ抗体ライブラリーを用いた新規口腔がん治療標的分子の探索

口腔がんの分子標的治療薬剤のバリエーションは他のがん種に比べて少ない。現在、各種がん治療に利用される分子標的には、タンパク質リン酸化酵素(キナーゼ)が選択されることが多い。口腔がんにおけるキナーゼ発現プロファイルから、口腔がんに特有な新規分子標的治療法を開発できる可能性がある。そこで、口腔がんをキナーゼ抗体を用いて網羅的に発現解析から口腔がんキナーゼプロファイルを完成させ、新規分子標的の可能性があるキナーゼを同定した。そのうち1つは口腔がんの浸潤先進部に強く発現し、口腔がん転移阻止治療の開発に貢献する可能性を示した1)埼玉県立がんセンターで、舌扁平上皮がんの組織マイクロアレイを作製するのに必要な倫理審査を受け、研究許可を受けた。2)国立がん研究センター中央病院で手術された舌扁平上皮がん患者のうち、T1/T2NO舌がんのがん部および健常舌粘膜部を76症例分を搭載した組織マイクロアレイを作製した。3)がん部と健常粘膜部を2値化するために必要な上皮マーカーのスクリーニングを行い、免疫染色に必要な条件を確定した。4)口腔扁平上皮がんを含むホルマリン固定された150細胞株の細胞ペレットアレイを作製し、抗体スクリーニングための基盤開発を行った。5)口腔扁平上皮がん細胞株を含む90細胞株から抽出したタンパク質をマイクロアレイする逆相タンパク質アレイの技術基盤を作製し、リン酸化抗体によるリン酸化タンパク質発現プロファイルに着手した。6)キノーム抗体の1次スクリーニングを開始した。I・II期舌がんに対する組織マイクロアレイを作製し、1000種類以上のモノクローナル抗体を用いて免疫染色を行った。タンパク質の発現状況は国立がん研究センターでインハウスに開発された組織マイクロアレイ抗原発現定量解析ソフトウェア(HistroCaluculator)で患者毎にプロファイルし、口腔がんの転移と予後にかかわるキナーゼ1種類と細胞内骨格タンパク質の同定に成功した。候補キナーゼは、健常扁平上皮には発現を全く認めなかったが、一部の扁平上皮がんの浸潤先進部で強発現が観察された。強発現する患者の全生存期間は、発現の認められない患者群に比較して、統計学的な有為性を持って短かった。国立がん研究センター中央病院の症例だけでなく、多施設共同研究で検証を行うために、東京歯科大学、東京医科歯科大学の倫理審査委員会に研究申請を行い、東京歯科大学倫理審査委員会から承認を得た。現在、多施設共同研究として検証するために、I-II期舌がんの手術標本の未染色切片を東京歯科大学から収集を行っている。舌がんの細胞株パネルと細胞株セルアレイを作製し、候補タンパク質のタンパク質発現プロファイルを取得した。舌がん細胞株中で、同キナーゼを強発現する細胞株を見いだし、RNA干渉法を用いて舌がん細胞株による候補タンパク質発現を現弱させて、がん浸潤に対する分子標的としての意義を検討した。舌がん60例強の組織マイクロアレイを作成した。特に舌がんの組織マイクロアレイと430抗体のキナーゼ抗体ライブラリーを用いて蛍光免疫染色を行った。すべての蛍光免疫染色画像はデジタル病理イメージに変換し、共同研究者らが同時に閲覧できる画像ライブラリーを構築した。この画像ライブラリーを、国立がん研究センター研究所創薬臨床研究分野が開発中の画像処理ソフトを利用して、キナーゼタンパク質の網羅的定量的発現プロファイルを取得した。上記プロファイルのバイオインフォマティクス解析から、患者生命予後と相関するキナーゼを3個抽出した。そのうち一つは、現在まで口腔がんでは報告されていない膜型チロシンキナーゼで、強発現症例は、非発現症例に比較して全生存期間が短いことを見出した。また、臨床病期I/II期の早期舌がん原発巣切除症例のみの検討で、後発頸部リンパ節転移症例に高発現するキナーゼを見出した。キナーゼは、がん治療の分子標的として最も注目されている。現在、分子標的としての有用性を検証している。キナーゼ抗体だけにとどまらず、当分野が所有する酵素や細胞骨格、がん関連タンパク質等を網羅する抗体ライブラリーによる免疫組織化学解析を行い、早期舌がんの後発頸部リンパ節転移を予測するバイオマーカーを見いだした。本分子は、19番染色体長腕に位置する遺伝子で、舌がん組織でFISH法を用いて遺伝子コピー数の検討を行ったところ、早期舌がん症例からでも遺伝子コピー数の増加を見出した。後発リンパ節予測は、手術法の適応や術後化学療法の選択に重要である。本バイオマーカーの発見は、実臨床の個別化医療に大きく貢献すると思われる。1I/II期舌扁平上皮がんを搭載した組織マイクロアレイを作製し、キナーゼ抗体を含めた1000種類程度抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。タンパク質発現は国立がん研究センター研究所でインハウスで開発された組織マイクロアレイ抗原発現定量ソフトウエアのヒストロカリキュレータを用いて、患者毎にプロファイルし、口腔扁平上皮がんの予後に関わるキナーゼ3種類と、転移に係わるアクチン結合タンパク質1種類を同定した。同定されたキナーゼ候補に内の1種類は、EGFRシグナル活性抑制に関わることが頭頸がん以外のがん種で報告されているキナーゼで、本キナーゼ活性を抑制することにより抗EGFR抗体治療抵抗性患者の薬効増強に貢献する可能性を考えている。現在、本分子を強制発現するベクターを構築中で、分子生物学的アッセイの開発を行っている。アクチン結合タンパク質については、タンパク質強発現症例のうちの30%程度に染色体上での遺伝子コピー数の増加が確認された。

FISH法を用いて、国立がん研究センターおよび東京歯科大学で舌部分切除術を施行さた症例の病理標本を用いて遺伝子コピー数を確認したところ、遺伝子増幅症例は、ノーマルコピー数の症例に比べて極端に全生存期間が短かった。さらに台北医科大学と協力して、台北医科大学の手術標本で免疫染色を行い、タンパク質発現状況と予後との相関を、日本のコホートのみならず、国外の検体で検証した。本分子のリン酸化が転移活性の増強に関与することが報告されている。現在、本分子をリン酸化に関与する責任酵素とリン酸化部位をプロテオミクスに手法を用いて探索している。口腔がんの分子標的治療薬剤のバリエーションは他のがん種に比べて少ない。現在、各種がん治療に利用される分子標的には、タンパク質リン酸化酵素(キナーゼ)が選択されることが多い。口腔がんにおけるキナーゼ発現プロファイルから、口腔がんに特有な新規分子標的治療法を開発できる可能性がある。そこで、キナーゼ抗体ライブラリーを用いて網羅的発現解析から口腔がんキナーゼプロファイルを完成させ、新規分子標的の可能性がある3個のキナーゼを同定した。そのうち1つは口腔がんの浸潤先進部に強く発現し、口腔がん転移阻止治療の開発に貢献する可能性を示した。そこで、口腔がんをキナーゼ抗体を用いて網羅的に発現解析から口腔がんキナーゼプロファイルを完成させ、新規分子標的の可能性があるキナーゼを同定した。そのうち1つは口腔がんの浸潤先進部に強く発現し、口腔がん転移阻止治療の開発に貢献する可能性を示した舌がんと唾液腺がんの組織マイクロアレイを作製した。舌がんの組織マイクロアレイを抗体を用いてキノームプロファイルを取得し、創薬候補を同定した。候補のうち1つは現在臨床で応用されているEGFRシグナルに抑制的に働く可能性が報告されている分子であった。本分子は、非小細胞肺がんのゲフェイチニブの抵抗性に関わる可能性が報告されているが、口腔がんでの発現に言及された報告はない。さらに本分子を高発現する口腔扁平上彼がんの全生存期間は、発現が認められない症例に比較して統計学的に有意に短く、治療標的としての可能性も高い。27年度が最終年度であるため、記入しない。外科系歯学臨床材料を用いて検討は着実に進んでいるが、理論的に根拠となる分子生物学的な表現系解析を本年度は重点的に行う予定である。また、抗EGFR抗体であるセツキシマブに対する薬効との相関解析や本分子阻害薬との併用による増殖抑制についても検討する予定である。当初の計画通り年度内に組織マイクロアレイ、細胞株ペレットアレイ、逆相タンパク質マイクロアレイ等の基盤開発はほぼ終了した。計画通り、キノーム抗体ライブラリーの1次スクリーニングに着手した。研究計画通り、キノーム発現プロファイルの取得は終了した。
歯冠形質からみた東アジアの基層集団ーその起源と分化に関する人類学的研究

東アジア、太平洋地域に分布する56集団のデ-タを分析した結果、歯冠形質、頭骨形態の両面から、この地域における最も基層的集団はネグリト、ダヤクに代表される、いわゆるプロトマレ-と総称される集団ではないのかと考えられる。彼らの計測的、非計測的歯冠形態、頭骨形態のいずれもが中国大陸、日本列島、東南アジア、ミクロネシア、ポリネシア地域に分布する様々な集団と共通性を持ち、しかも、彼らを中心とする生物学的距離と地理的な分布距離もおおよそ一致する。この様な分析結果はたとえばポリネシア、ミクロネシア集団の縄文人との類似性、あるいは、東アジア大陸に分布する集団にみられるような南から北へ大きく変化するクラインを無理なく説明し得るものと考えられる。すなわち、東アジア、太平洋といった広大な地域に分布する集団は、比較的最近、せいぜい23万年前後に、拡散を開始いていったのではないだろうか。遺伝子浮動と拡散地域に於ける環境への適応はそれぞれの地域でそれぞれの形態的特徴を形成させたことは容易に想像できるが、彼らの地理的分布と一致した形態の連続的変化を追跡してみると東南アジア、特に島嶼部に集約してくる。私の分析ではそのような集団こそプロトマレ-ではないだろうかと考えられる。しかし、このことは今のところ東アジア、太平洋地域に於ける集団の分化に関する作業仮説の一つでしかない。今期解明すべき問題は、このプロトマレ-という集団がどのような点で現在でも比較的古い形質を保持しているのかを明らかにする必要があるであろう。この問題へのアプロ-チとしてはまず、東南アジアの古人骨デ-タを分析する必要があろう。すなわち、縄文人、東南アジア大陸部のTam Pong,Tam Hang,Ban Na Di,Non Pa Kluay,Non Nok Tha,Ban Dang,Con Do Ngua等を含めた分析が急務であると思われる。
前十字靭帯不全膝の前方引き出しに対する制御機構の解明-PETによる評価を用いて-

膝前十字靭帯(ACL)は,膝関節の支持性をになう重要な靭帯の一つである.ACL不全によって生じた前方引き出しを制御する代償機能についての研究は,未だ一定の見解は示されていない.全身の動的な筋活動が評価できるPositron Emission Tomography(PET)を用いて,ACL不全膝における膝周囲筋の筋活動を評価し,それにより膝安定化に寄与する筋群を同定できないだろうかと考え,今回の研究をおこなった.ACL不全膝と診断され,受傷後3カ月以上経過した慢性例を対象とした.運動負荷としてACL不全膝患者が不安定性・不安感を感じやすい運動である下り坂でのランニングをおこなった.負荷6時間前より絶飲食とし,運動開始10分前に,18F-fluorodeoxyglucose(FDG)を37MBq静注した.運動負荷をおこなった直後に,SET-2400W-Sを用い下半身を3次元収集モードで撮像した.関心領域以下ROIを両大腿前面,大腿後面,下腿後面にそれぞれ設定した.FDGの筋肉内への取り込みはStandardized Uptake Value(SUV)を用いて半定量的に評価した.大腿後面と大腿前面との取り込みの比をH/Q比,大腿後面と下腿後面との取り込みの比をH/G比,下腿後面と大腿前面との取り込みの比をG/H比とし,それらを用いて各筋群間の比較をおこなった.患健側に有意差はなかったが,大腿前面と下腿後面で患側の取り込みが多い傾向にあった.H/Q比,G/Q比,H/G比より,ACL不全膝は大腿前面の筋群が大腿後面の筋群より多く活動し,健側や健常者より下腿後面の筋群が多く活動していることを示唆していると考えられる結果が得られた.今回の結果は,大腿四頭筋・下腿三頭筋がより強く活動し,関節面にCompression Forceが生じ,その力が前方引き出しに対抗するとする説を支持していると考える.スタビリティシステムBDX-STを用いた動的な姿勢制御能力の評価法には様々なものがあり,その難易度も様々である.若年者の一般的な平均値がない(メーカー発表)ため実験に先立ち対象外の健常人や膝に疾患をもう人をBDX-STの様々な方法で測定した.その結果ダイナミックリミットオブスタビリティを用いることとした.スタビリティのレベルは1(最も不安定なレベル)として,片側立位での測定が今回の実験には適していることがわかった.ACL不全膝と診断され,受傷後3ヵ月以上経過した慢性例で男性1例,コントロール群として下肢に外傷の既往がない健康男性2例が本年度測定できた.FDGを37MBq静注後,下り勾配をつけたトレッドミルでランニングを20分間おこなった直後に,PET(SET-2400W-S)を用い下半身を3次元収集モードで撮像した.東北大学大型計算機センターのSuper Computer (SX3/44R)を用いて画像処理をおこなった.パーソナルコンピューター上でその画像を用い,関心領域以下ROIを両大腿前面,大腿後面,下腿後面にmanualでそれぞれ設定した.FDGの筋肉内への取り込みはStandardized Uptake Value以下SUVを用いて半定量的に評価した.その結果downhill runningではACL不全膝,健常人とも大腿四頭筋・下腿三頭筋の取込みが多いことがわかった.ACL不全膝1例であるため比較はできないが,ACL不全膝の患側は大腿四頭筋の取込み量が多かった.それに対し,Hamstringsは比較的少なかった.ACL不全によって生じた前方引き出しを制御する代償機能の主たるものはHamstringsとする多くのバイオメカニクスによる知見とは違っている可能性があることが考えられる.前年に引き続き例数を増やした.スタビリティシステムBDX-STを用いた動的な姿勢制御能力の評価を行い,ポジトロンエミッショントモグラフィー(PET)を行った例は,コントロール群として下肢に外傷の既往がない健康男性3例であった.前十字靱帯不全膝と診断され,受傷後3ヵ月以上経過した慢性例は今年測定できたものはなかった.18F-デオキシブドウ糖(FDG)を37MBq静注後,下り勾配をつけたトレッドミルでランニングを20分間おこなった直後に,PET(SET-2400W-S)を用い下半身を3次元収集モードで撮像した.東北大学大型計算機センターのSuper Computer(SX3/44R)を用いて画像処理をおこなった.パーソナルコンピューター上でその画像を用い,関心領域以下ROIを両大腿前面,大腿後面,下腿後面にmanualでそれぞれ設定した.FDGの筋肉内への取り込みはStandardized Uptake Value以下SUVを用いて半定量的に評価した.その結果昨年と同様downhill runningでは前年と同様に大腿四頭筋・下腿三頭筋の取込みが多いことがわかった.昨年行ったACL不全膝の患側は大腿四頭筋の取込み量が多く,Hamstringsは比較的少なかった.本年はACL不全膝ができなかったため比較はできないが,下り坂のランニングではACL不全膝とコントロール群間に差が生じる可能性があった.CL不全によって生じた前方引き出しを制御する代償機能の主たるものはHamstringsとする多くのバイオメカニクスによる知見とは違っている可能性があることが考えられる.コントロール群としては5例となった.血清生化学的データや心拍数も個人間でほぼ安定しており,対照としての平均は取ることができた.膝前十字靭帯(ACL)は,膝関節の支持性をになう重要な靭帯の一つである.

ACL不全によって生じた前方引き出しを制御する代償機能についての研究は,未だ一定の見解は示されていない.全身の動的な筋活動が評価できるPositron Emission Tomography(PET)を用いて,ACL不全膝における膝周囲筋の筋活動を評価し,それにより膝安定化に寄与する筋群を同定できないだろうかと考え,今回の研究をおこなった.ACL不全膝と診断され,受傷後3カ月以上経過した慢性例を対象とした.運動負荷としてACL不全膝患者が不安定性・不安感を感じやすい運動である下り坂でのランニングをおこなった.負荷6時間前より絶飲食とし,運動開始10分前に,18F-fluorodeoxyglucose(FDG)を37MBq静注した.運動負荷をおこなった直後に,SET-2400W-Sを用い下半身を3次元収集モードで撮像した.関心領域以下ROIを両大腿前面,大腿後面,下腿後面にそれぞれ設定した.FDGの筋肉内への取り込みはStandardized Uptake Value(SUV)を用いて半定量的に評価した.大腿後面と大腿前面との取り込みの比をH/Q比,大腿後面と下腿後面との取り込みの比をH/G比,下腿後面と大腿前面との取り込みの比をG/H比とし,それらを用いて各筋群間の比較をおこなった.患健側に有意差はなかったが,大腿前面と下腿後面で患側の取り込みが多い傾向にあった.H/Q比,G/Q比,H/G比より,ACL不全膝は大腿前面の筋群が大腿後面の筋群より多く活動し,健側や健常者より下腿後面の筋群が多く活動していることを示唆していると考えられる結果が得られた.今回の結果は,大腿四頭筋・下腿三頭筋がより強く活動し,関節面にCompression Forceが生じ,その力が前方引き出しに対抗するとする説を支持していると考える.
学校管理職の資格要件と養成プログラムの開発に関する基礎的研究

本研究は,学校経営をめぐる環境変化の中で,学校経営の責任を担う学校管理職に求められる資質能力を保障しうる資格制度の在り方と養成プログラムの開発を目的に,その基礎となる分析を行ったものである。まず,戦後新たに校長免許状制度を導入した教育職員免許法の成立過程について分析し,その意味と意義について検討を行った。その結果,校長には教員としての力量に加え,学校経営,学校管理の側面での専門的な力が求められており,大学での特別な養成が予定されていた。しかし,この制度は1954年の免許法改正によって廃止され,その後は管理職研修という形で必要とされる力量の形成が図られることになった。当初,その内容は教育指導と学校管理に重きが置かれていたが,次第に学校の経営に関わる能力・指導力の育成に重点が移行していったことが明らかとなった。そして,今日では管理職固有の専門的能力である「マネジメント能力」を軸に管理職研修のプログラムが実施されている実態にあることも解明できた。ここには,それまでの優れた教育者が学校経営者になるというモデルから,学校の経営管理に関する専門的な能力を有した管理職への変化を読み取ることができる。しかし,当事者である管理職が必要とする力量については,具体的な職務遂行に関わるレベルでの力量であり,そうした行動を支える専門的な知識の獲得については必ずしも高い必要性認識を示していないという結果も本研究によって得られている。研修を提供する側と受講する側との間にある相違である。また,管理職の育成システムについては,管理職になるまでのキャリア形成という観点からのシステムづくりが課題であることも明らかとなった。今後は,本研究の成果をもとに現在検討が進められつつある専門職大学院構想での管理職養成問題の検討を行うことが課題である。本研究は,学校経営の責任を担う学校管理職(校長・教頭)に求められる資質能力を保障しうる資格要件の在り方と養成プログラムの開発を目的とするものである。本年度は,研究の1年目ということで,戦後新たに校長免許状制度を導入した教育職員免許法の成立過程について関連資料を収集し,その意味と意義について校長に求められる資質能力という観点から分析した。合わせて,戦後直後に実施されたIFEL (The Institute of Edocational Leadership,教育指導者講習会)等での研修内容についての資料収集を行った。その結果,校長免許状制度においては,校長に求められる専門的な力量について,教員に求められる力量に加えて,学校経営,学校管理という側面からの力量を重視していた点が明らかになった。具体的には,「教育理論」「学校制度の組織」「カリキュラムの原理」「学校管理」「学校経営」「教育法令」「学校を経営する能力」「学校の内部管理」「外部官公署その他との折衝」「地域社会との連携」などの知識や力量が校長に求められる専門的力量として捉えられていた。また,こうした力量は単に教員を経験していれば身につくというものではなく,「校長学」として養成される必要があると捉えられていた。そのため,校長は大学で養成することが予定されていたのである。こうした理念が,その後の免許法の改正により,どのように変質し,校長養成の在り方にどのような変化をもたらしたのかを明らかにすることが次年度の課題である。本年度は、校長免許制度廃止後の学校管理職研修の内容等について,特に,1970年度に開始された中央研修を分析対象に,その研修内容(テーマ)等の資料収集に基づく作業を実施した。

その結果,中央研修での学校管理職研修の内容としては,教養関係講義,学校管理関係講義,教育指導と学校管理,教育内容・方法関係講義,演習等で構成されていること,特に,学校管理・運営に関する講義・演習に重点が置かれている実態が明らかになった。こうした点は,校長免許状制度において求められていた校長の専門的力量である学校経営,学校管理という側面との密接な関連性のもとで,研修内容が組み立てられ,その中で実践的な力量形成をはかっていったのではないかという結論を得ることができた。と同時に,時代的な変遷も見られ,特に2002年度からは,新たに校長等研修と中堅研修の双方で「組織マネジメント研修」が追加されており,民間企業の組織マネジメントの代表的な手法に,学校や教育委員会で活用できる工夫を加え,研修として提供することで,学校運営の改善を担える管理職の養成,スキル・アップが図られようとしていることが明らかになった。次年度は,こうした実態を踏まえ,さらに地方での研修の内容の分析や最近の学校経営論,校長論等の分析を進めるとともに,研究全体のまとめを行うこととする。本研究は,学校経営の責任を担う学校管理職(校長・教頭)に求められる資質能力を保障しうる資格要件の在り方と養成プログラムの開発を目的とするものである。本年度は,新任教頭を対象とした学校管理職としての力量形成の課題を明らかに調査と現在,組織マネジメント研修への取り組みを資料収集に基づく分析によって行うとともに,研究全体のまとめを行った。新任教頭対象の調査では,学校管理職としての必要と認識している力量内容が一定程度明らかになった。具体的には,危機管理や経営ビジョンの提示等の説明能力,さらには決断力といった具体的な行動レベルでの力量の必要性は高く感じているが,学校経営に関する専門的知識といった知識レベルでの必要性については必ずしも高い認識を見いだすことはできなかった。知識レベルでの必要性については,校長免許制度や従来の管理職研修で重視されてきた部分でもあり,提供する側と受講者(管理職)との間での認識のズレを示すものでもある。ただ,こうした具体的な行動レベルでの資質能力の形成については,近年,進められつつある組織マネジメント研修の中で重視している点でもあることから,これからの学校管理職の育成プログラムの開発に当たって留意すべき課題だといえる。また,学校管理職の育成システムについては,これまでの教頭・校長になってからの研修に重点をおくことから,管理職に就く前の段階に重点をおくシステムに移行する自治体も現れてきており,教員のキャリア形成という観点からの分析も必要になるといえる。その際,大学院教育の在り方,専門職大学院の構想,さらには校長・教頭の免許・資格制度の是非を含めたトータルな研究が必要になると考えられる。今後の課題としたい。
大域的超低エネルギー化を実現するLSI抽象モデルと上位下位統合化LSI設計技術

本研究では,LSI自動設計にて上位工程と下位工程の垣根を越えたエネルギー最適化を実現すべく,第一にLSI内部の三要素(レジスタ,制御回路,機能モジュール)に結合という概念を導入することで,LSI内部を単純化・抽象化することを提案,LSI抽象モデルを構築した.第二に提案したLSI抽象モデルのもと上位・下位工程を統合し超低エネルギー化を実現するLSI自動設計技術を構築,アルゴリズム体系化した.その結果,上位工程で極めて精度良く下位工程を予測・制御可能とし大域的な超低エネルギー化LSI自動設計を実現する.従来技術に比べ50%以上のエネルギー削減}を可能とするLSI自動設計技術を構築した.平成25年度には研究計画全体の基礎となる研究項目(I)(III)を実施した.(I) LSI抽象モデルの構築:本研究で提案するLSI抽象モデルを採り入れ,実際のアプリケーションを試行設計した.試行設計の結果,動作記述で数千行を越える実大規模応用プログラムにおいて電源制御,クロック制御,周波数制御可能によりエネルギー削減の可能性を確認した.(II)LSI抽象モデルの検証: (I)によって設計された回路動作を「形式検証」した.特にここでは意味結合・強/弱-物理結合によるLSI抽象モデルが,従来のLSI設計モデルと等価であることを検証した.これに加えて検証結果を用いて等価性を担保した制御回路分割を検討し(III)にてアルゴリズム化を検討した.(III)低エネルギー統合化LSI自動設計技術の構築・検証(フェーズ1-電源制御): (I)および(II)により,提案するLSI抽象モデルの妥当性が検証された後,これをベースに統合化LSI自動設計フローを構築・検証した.仮想物理設計にて,実物理制約を緩和し上位工程の面から見た理想的な物理設計をし,これと実物理設計との「距離」を小さくすることを基本とするものを考えた.距離として各機能モジュールの位置の差の総和あるいは差の二乗和としている.『意味結合』として電源『意味結合』モジュールを対象に,パワーゲーティング,複数電源電圧制御および基板電圧制御を想定,低エネルギー指向統合化LSI自動設計技術を構築・検証した.さらにこれを計算機上に実装,複数の応用プログラムに適用することで評価した.平成26年度には,平成25年度に構築したLSI抽象モデルをもとに,以下の研究課題(IV-1)ならびに(IV-2)に取り組んだ.(IV-1)低エネルギー統合化LSI自動設計技術の構築(フェーズ2-クロック制御):一般に集積回路の消費エネルギーにおいて,クロック木が全消費エネルギーの25%以上を占めると言われる.これを踏まえ「クロック木設計ならびにクロック供給制御」に焦点を当てた.特にクロック『意味結合』モジュールを対象に上位工程と下位工程の双方を採り入れた大域クロック木設計とこれに基づくクロックゲーティングを確立した.意味結合されたモジュールに供給されるクロックタイミングにおいて,上位工程段階でそのタイミングをあわせることを目指し(これを同時実行指向スケジューリング・バインディングと呼ぶ),これをもとに下位工程を実行していくフローとした.(IV-2)低エネルギー統合化LSI自動設計技術の検証(フェーズ2-クロック制御): (IV-1)によって提案・構築された低エネルギー統合化LSI自動設計技術のアルゴリズムにおいて,これによって設計される集積回路動作を「形式検証」する.前年と同様に,意味結合・強/弱-物理結合によるLSI抽象モデルが,従来のLSI抽象モデルと数学的に等価であるかを検証した.「類似性」の概念を導入することによってこれを実現した.これら(IV-1)ならびに(IV-2)で構築した技術を計算機上に実装し,各種の応用プログラムに適用することで,低エネルギー化設計技術の評価を行った.平成27年度において以下の研究に取り組んだ:(V-1)低エネルギー統合化LSI自動合成技術の構築(フェーズ2-周波数制御) (研究代表者担当):平成27年度は低エネルギー統合化LSI設計技術の構築にあたり,まず静的周波数制御・動的周波数制御に着目し,周波数『意味結合』モジュールを形成することにより,上位下位統合化低エネルギー化統合化LSI設計技術を確立した.周波数によって意味結合されたモジュールに対して,最適な周波数を静的あるいは動的に供給し,また異なる周波数を持つモジュール間のタイミングを最適制御することによって,性能を維持したまま低エネルギー化を実現した.(V-2)低エネルギー統合化LSI自動合成技術の検証(フェーズ2-周波数制御) (研究分担者:木村晋二教授担当): (V-1)によって提案・構築された上位下位低エネルギー統合化LSI設計技術のアルゴリズムにおいて,これによって設計された集積回路の検証を行った.周波数によって意味結合されたモジュールから形成される抽象モデルに着目して検証を行った.上記(V-1)と(V-2)の結果ならびに平成25年度平成27年度に得た(I)(IV)までの結果を統合することで,最終的に低エネルギー統合化LSI自動合成技術全体を構築した.いくつかのベンチマークアプリケーションに適用し,提案した低エネルギー統合化LSI自動合成技術を評価した結果,既存のアルゴリズムの組み合わせと比較して最大で50%を超える低エネルギー化を達成した.これは本研究の当初の目標を達成したものであり,提案技術が成功したものと判断できる.本研究では,LSI自動設計にて上位工程と下位工程の垣根を越えたエネルギー最適化を実現すべく,第一にLSI内部の三要素(レジスタ,制御回路,機能モジュール)に結合という概念を導入することで,LSI内部を単純化・抽象化することを提案,LSI抽象モデルを構築した.

第二に提案したLSI抽象モデルのもと上位・下位工程を統合し超低エネルギー化を実現するLSI自動設計技術を構築,アルゴリズム体系化した.その結果,上位工程で極めて精度良く下位工程を予測・制御可能とし大域的な超低エネルギー化LSI自動設計を実現する.従来技術に比べ50%以上のエネルギー削減}を可能とするLSI自動設計技術を構築した.すでに最大40%の低エネルギー化設計技術を確立しており,計画以上に研究が進展していると考える.27年度が最終年度であるため、記入しない。集積回路設計平成27年度には,平成25年度・平成26年度の成果を踏まえ,さらに(V)低エネルギー統合化LSI自動設計技術の構築・検証(フェーズ2-周波数制御)に取り組む.当初,すでに30%を超える低エネルギー化を達成しており,計画以上に研究が進展していると考える.27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度もアルゴリズムレベルの研究開発を中心に行った.理論的な研究であり,そのため当初予定していた設計環境の導入を見送り次年度使用額が生じた.なお,現有資産を用いたシミュレーション実験を多数行い,昨年に引き続き開発は当初予定より進んでいる状態である.27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度には,平成25年度の研究成果を踏まえ,さらに(IV)低エネルギー統合化LSI自動設計技術の構築(フェーズ2-クロック制御)に取り組む予定である.平成27年度には,チップ試作や多数のPCを用いた評価環境の構築などを通し,実アプリケーションの評価環境を提案技術の有効性を評価する.27年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は,アルゴリズムレベルの研究開発を中心に行った.そのため,サーバ計算機を使用せずに理論的な研究が主たるものであり,次年度使用額が生じた.なお,予想以上にアルゴリズムレベルの研究開発が進み,またサーバ計算機を用いずに現有資産で多数のシミュレーション実験を行ったため当初予定に比較して研究に遅れはない.平成26年度は,サーバ計算機を導入し,実アプリケーションに対して提案技術の有効性を評価する.
Z型アルケンを含む共役系ポリエンの立体特異的合成と天然物合成への応用

これまで、1,1-ジブロモアルケンをパラジウム触媒下にスズヒドリドにより加水素分解を行って立体選択的にZ-ブロモアルケンやZ-ブロモジエンを導き、そして、これらをパラジウム触媒下にクロスカップリング反応をさせてZ型ポリエン化合物やエンイン化合物を合成した。本研究では、これらの反応の具体的な応用として、海洋産フラノテルペノイドである(2Z)-デヒドロデンドロラシン及び視覚物質として重要な(11Z)-レチナ-ル類の合成を達成した。(2Z)-デヒドロデンドロラシンはオーストラリアのグレートバリアリ-フに生息する海綿から単離された酸や光や熱に極めて不安定な油状化合物である。その構造は末端のフラン環とZ,E,E型に連続したトリエン部分とがメチレン鎖でつながった特徴を有している。本合成では、3-フリルアセトアルデヒドを原料に5段階で(2Z)-デヒドロデンドロラシンに導く事が出来た。この際、トリエンに由来する幾何異性体は全く観察されなかったことから、一連のポリエン合成方法は極めて有効であることがわかった。(11Z)-レチナ-ルはレチノイド蛋白のオプシンと特異的に結合し、視覚の発現制御にかかわっている。その過程でレチナ-ルが視物質のシグナル分子として働くには、11位のGeometryがその発色機能に不可欠である。(11Z)-レチナ-ルの合成においては、11位のZ型構造を含む5つの連続した共役アルケンを如何に立体化学をコントロールして合成できるかが問題である。そこで、これまで展開してきた1,1-ジブロモアルケンから(1Z)-ブロモアルケンの合成法、およびパラジウム触媒下の立体特異的なクロスカップリング反応を用いて合成を試みたところ、幾何学的に純粋な(11Z)-レチナ-ルを合成することが出来た。
“先祖返り"したイルカの造血器官に関する比較免疫学的研究

ハンドウイルカの好中球にのみ特異的に反応するモノクローナル抗体を作出し、同モノクローナル抗体がイルカ血液細胞の高純度分離に有用であることを明らかにした。ハンドウイルカにおいて造血細胞に特異的に発現しているCD34分子の遺伝子クローニングを行った。なおイルカの骨髄においてCD34 mRNAが強く発現していた。イルカの上腕骨の骨頭に存在する骨髄において造血が行われていることを形態学的に証明した。(1)イルカの造血幹細胞あるいは造血前駆細胞である未分化白血球を同定するために必要な血液細胞の基本的な分類マーカーとなるモノクローナル抗体を作出する。(2)得られたモノクローナル抗体を利用したイルカ血液細胞・造血細胞の分離法を確立する。(3)イルカ造血幹細胞あるいはそのニッチ細胞を特定するために必要な遺伝子マーカーを単離し、その遺伝子発現解析系を確立する。(4)造血器官の候補として予想される臓器における免疫組織学的観察および遺伝子発現解析を行い、イルカにおける造血器官を機能形態学的に同定する。(5)ヒトやマウスで明らかにされている造血関連因子のオルソログをイルカで単離し、発現細胞の特定、組換え型ケモカインの作出および特異抗体を用いたニッチ細胞の証明を行う。(6)組換え型ケモカインを用いた各種血液細胞の遊走を観察することによって、イルカ造血幹細胞の造血巣への定着・ホーミング機序を探る。以上の研究項目を検討することによって、イルカの造血器官を特定する。水棲動物であるイルカにおける造血器官の存在場所は明確にされておらず、造血器官の形成および造血機序も不明である。本研究は、イルカ血液細胞の供給源である造血幹細胞の定着器官、幹細胞の移動に関わる走化性因子およびその受容体を同定することによって、哺乳動物において特異なイルカの造血の成立機序を明らかにし、その系統発生学的な意義を解明すると同時に、未だ不明な点の多い造血幹細胞の造血微小環境への定着機構および造血に必須な因子・条件を見出すことを目的とする。当該年度は、バンドウイルカの血球をラットに免疫してイルカ血液細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の作出を試みた。イルカの顆粒球に対する数種のモノクローナル抗体を作製し、その中からバンドウイルカ好中球に対して特異的に反応する抗体をスクリーニングした。得られた特異抗体のうち、DN1抗体は、バンドウイルカ好中球のみを認識し、他の顆粒球である好酸球、また単核球であるリンパ球および単球を認識しなかった。DN1抗体は、ヒトおよびウシ白血球のいずれにも反応しなかった。DN1抗体を用いた免疫磁気ビーズ細胞分離法によって、バンドウイルカの顆粒球分画から好中球および好酸球を高純度に分離する方法を見いだした。これまでイルカ白血球の高純度分離法は確立されていなかったため、本法の応用によって、水棲哺乳動物の血液細胞および特定細胞群の分離・同定が容易となり、それぞれの細胞機能をより詳細に探索することが可能となった。本研究は、イルカ血液細胞の供給源である造血幹細胞の定着器官、幹細胞の移動に関わる走化性因子およびその受容体を同定することによって、哺乳動物において特異なイルカの造血の成立機序を明らかにし、その系統発生学的な意義を解明すると同時に、未だ不明な点の多い造血幹細胞の造血微小環境への定着機構および造血に必須な因子・条件を見出すことを目的とした。当該年度は、各種イルカの骨格構造および骨髄組織の観察を中心に検討を行った。まずバンドウイルカ幼若個体の全身CTスキャンによって、骨格構造の把握および骨髄組織の探索を行い、またシワハイルカおよびコビレゴンドウの前鰭に存在する上腕骨および前腕骨内部を解剖・組織学的に観察した。その結果、上腕骨骨頭の海綿骨腔内に陸生哺乳動物の赤色骨髄に類似した組織が肉眼的および組織解剖学的に認められた。同部位へのコア穿刺によって得られた塗沫標本には、陸生哺乳動物の骨髄組織に存在するものと同様な造血細胞群、すなわち巨核球、骨髄球、赤芽球、幼若単核球などの血液前駆細胞が多数観察され、イルカ類においても骨髄造血が行われていることが確認された。したがって、イルカ類の前鰭基部の上腕骨骨頭部が骨髄バイオプシー検査の標的として応用できる可能性が示唆された。なお、骨髄から得られる血液前駆細胞の機能解析や分化能の有無および骨髄以外の器官・臓器における造血の可能性について継続的検討を行っている。水棲動物であるイルカにおける造血器官の存在場所は明確でなく、造血器官の形成および造血機序は不明である。

本研究は、イルカ血液細胞の供給源である造血幹細胞の定着器官、幹細胞の移動に関わる走化性因子およびその受容体を同定することによって、哺乳動物において特異なイルカの造血の成立機序を明らかにし、その系統発生学的な意義を解明すると同時に、不明な点の多い造血幹細胞の造血微小環境への定着機序および造血に必須な因子や条件を見出すことを目的とした。当該年度は、前年度までの研究の結果、造血が行われていることが組織学的に示唆された上腕骨の骨頭部より骨髄組織を取り出して、それらに含まれる骨髄細胞の遺伝子発現像を解析し、さらに骨髄細胞が培養下で増殖・分化能を有するかを確認することによって造血細胞の存在について検討した。バンドウイルカの上腕骨から分離した骨髄単核細胞(BMMC)はヒトやマウスと同様に造血細胞に特異的な遺伝子発現像を示し、造血細胞群であることが示唆された。造血細胞の増殖能を評価するCFU assayにより、BMMCは優れた分化・増殖能を有することが明らかにされ、その形態から3種類のコロニー形成が確認された。3種類のコロニーは、コロニー構成細胞の形態学的特徴とその遺伝子発現像から、好中球、単球/マクロファージ、巨核球および好酸球に分化する造血前駆細胞の増殖によって形成されており、BMMCは少なくとも3種類の造血前駆細胞を含むことが明らかになった。以上より、バンドウイルカのBMMCは、様々な血液細胞に分化する造血前駆細胞を有する造血細胞群であり、イルカの上腕骨の骨髄組織は造血器官であることが明らかとなった。
ヘムオキシゲナ-ゼの構造と機能の関連、及びミクロソ-ム膜への定着機構

本研究では主としてヘムオキシゲナ-ゼの活性中心の構造解析と膜定着機構の解明を目指した。その結果、次のような興味ある知見を得た。1.本酵素はそのC末端側に存在する疎水性ドメイン部分でミクロソ-ム膜に結合している。ミクロソ-ムをトリプシン処理するとN末端側に存在する可溶性ドメインが得られる。今回、この可溶性ドメインの精製に成功し、このドメインがヘム分解活性を保持していることを明らかにした。一般に、可溶性蛋白の方が膜蛋白よりも結晶化が容易なので、この可溶性ドメインを用いればX線回折法による構造解析がより容易になるものと期待される。2.ラットのヘムオキシゲナ-ゼを大腸菌で発現させることに成功し、更にC末端の膜結合ドメインを欠く可溶性酵素の発現にも成功した。この系を用いて精製標品を大量に得、上記1と同様の目的の実験に供することも可能である。3.基質であるヘムが結合する部位が本酵素の活性中心を構成していると思われる。ヘムを結合した本酵素のスペクトルはヘモグロビンのそれと酷似しているので、本酵素での活性発現にはヒスチジン残基が重要な役割を担っていることが予想される。そこでPCR法で部位指定特異変異を行い、変異酵素を上記の大腸菌発現系で発現させた。その結果、His25が本酵素活性発現に重要であることを明らかにした。現在His25の詳細な役割を検討中である。4.本酵素の膜定着機構についてはコス細胞での発現系を確立し、この系を用いて研究を行っている。その結果、発現された本酵素はミクロソ-ムに、また、上記の可容性酵素は細胞質に局在することが知られた。現在、C末端の膜結合部のアミノ酸配列を種々変異させ、その変異が膜定着にどのような影響を及ぼすかを検討している。本年度は次の点が明確になった。1.ヘムオキシゲナ-ゼは、そのC末端側に存在する疎水性ドメインの部分でミクロソ-ム膜に結合している。ラット肝ミクロソ-ムを低濃度のトリプシンで処理するとヘムオキシゲナ-ゼはそのC末端側で切断され、N末端側に存在する可溶性ドメインが遊離してくる。私共はこの可溶性ドメインの精製に成功した。高純度に精製されたこの可溶性蛋白質は基質であるヘムの結合部位を持ち、また、アスコルビン酸のような人工的な還元系によってそのヘムがビリベルジンまで分解されることが明らかになった。可溶性蛋白質の結晶化などは膜結合蛋白質に比べて遥かに簡単であるので、X線回折法などの研究がより容易なるものと期待される。2.ラットのヘムオキシゲナ-ゼを大腸菌で発現されることに成功した。一般に大腸菌で発現された異種蛋白質は封入体として隔離されることが多いのに反し、本酵素は大腸菌の膜画分に結合して存在していた。本酵素はそのC末端側に存在する疎水性領域で試験管内では人工膜にさえ結合できる性質を持っているので、おそらく大腸菌の膜にもそのまま容易に結合したものと思われる。この発見は本来の細胞での膜定着機構の解明にも手掛かりとなるものである。3.大腸菌での発現系が確立できたので、これを用いていわゆる部位指定突然変異技法を用いて、蛋白質の特定のアミノ酸を変異されることも可能になった。現在これを用いてヘムポケットの構造解析を行なっている。