hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海外における日本マンガ受容の実態と流通形態

次の各地を訪れて、現地のマンガ文化の在り方、その中での日本マンガの出版・流通状況について、市場調査および出版社・関係者への聞き取り調査を行った(中国・香港、韓国・タイ・ベトナム・インドネシア・シンガポール、フランス・ドイツ・イタリア、アメリカ)。その結果明らかになったのは、海外、とくにアジアでは、マンガは書店ではなく、ニューススタンドや専門店で売られることが多いということと、学習マンガの意外な存在感である。これは、学習マンガだけは書店で売られるという理由が大きい。また、アジアで読み切りマンガの人気が高いのも、バックナンバーが買えないという理由も大きいと考えられる。本年度は、北京・上海・香港・韓国・(アメリカ)・ドイツ・シンガポール・インドネシアについて市場調査や出版社からの聞き取り調査を行った。中国においては、2008年の広州国際動漫節を取材した経験と照らし合わせると、南部においては「マンガ」の重要性が認識されており、流通する雑誌の種類も多いのに対し、北に行くほどほぼ「アニメ」しか眼中になく、雑誌の種類が少ないことが観察された。また、流通形態に関しては、北京・上海では、かなり洗練された形態の「東方書報亭」と呼ばれるニューススタンドがマンガ雑誌販売の中心であるのに対し、香港ではほぼ露店に近い形態で、ここで独自の発展を遂げた「香港マンガ」が売られている。最近ではコンビニにも多くの雑誌やマンガ単行本が置かれるようになってきているのも特徴的である。また、調査を行ったアジアのほぼ全域で、貸本マンガ、そして「学習マンガ」の大きな市場があるのが明らかになった。とりわけ韓国では「学習マンガ」が盛んであり、シンガポール・インドネシアなどにも翻訳されて輸出されている。しかし香港では台湾産の学習マンガが多く売られており、これは露店でしか売られない独自の「香港マンガ」とは違って、一般の書店で大きなスペースを占めて売られている。また、シンガポールでは、台湾から輸入された中国語版(繁体語)の日本マンガが多く見られる一方で、独自の、簡体字の中国語版も出版されている。英語版も、輸入版とは別に独自の英語版も出版している。ドイツでは、他国に比べて、少女マンガとBL(ボーイズラブ)の女性向け市場が大きいことが改めて確認された。また、数年前の日本マンガブームに替わって、グラフィックノベル(GN)の市場が大きくなっていることが明らかになった。ドイツでは「マンガは子どものもの」という観念が根強く、GNならば書店に置きやすく、また定価が高いので利幅が大きい、というのもシフトの理由のようだ。23年度は東日本大震災やタイの洪水など不測の事態のため、予定していた調査がいくつか流れてしまい次年度に繰り越しにせざるをえなかったが、その中で、4月後半に中国の蘇州・杭州に調査を行い、3月にはベトナムのホーチミンとハノイの両方で調査を行い、期待していた以上の成果を得ることができた。まず、蘇州での調査では、上海ではほとんど見ることができなかった古い形式の「連環画」が蘇州の書店では普通に売られていることが確認できた。また、日本のエッセイマンガが、中国政府のマンガ輸入規制をかいくぐる形で出版され、人気を得ていることを発見したのも大きな収穫だった。蘇州大学での学生の意識調査では、学生の「貸本」の利用率がかなり高いことを確認することができた。杭州の動漫節では「動漫節」と銘打たれていても、このフェアが基本的に「アニメフェア」であることが確認でき、中国においてアニメがマンガよりはるかに優先されていること、中国のアニメ産業・アニメ産業基地の実際、携帯電話をつかっての「動漫配信」の展望、などについても多くのことを知ることができた。一方、ベトナムの調査では、JETRO、テレビ局と連携したマンガ出版社TVM、老舗のマンガ出版社TRE、海賊版でも知られる出版社、ドラえもんを最初に出したことで知られる国営の児童書出版社のキムドン、各種の書店、日本マンガの影響を受けたベトナムのローカル漫画でヒットを飛ばしたファンティ社、ベトナムローカルの人気漫画家、最も大きい出版取次であるFAHASA、貸本屋、マンガ喫茶、ファンコミュニティの中心にいる若い人......など、考えられる限りすべての側面から多面的な取材をすることができた。とりわけキムドン社では歴史的な経緯について詳しい証言を得ることができた。その結果見えてきたのは、ベトナムではまだ露店でマンガが売られることが多く、組織的な流通が確立していないことが、マンガの売れ行きの頭打ちにつながっているらしいことである。また、ベトナムでは日本マンガが入る前、ローカルなストーリーマンガはなかったと言われていたが、じつは南ベトナムでは、おそらくアメコミの影響を受けたレベルの高いマンガの萌芽があったことが確認できた。これもかなり画期的な発見であった。24年度はまず、7月にフランスのジャパン・エキスポを訪れ、現地出版社であるAtaka、トンカム、グレナ、KAZE&vizヨーロッパ、カステルマン各社を取材。

KAZEはVizが買収した出版社で、アニメとマンガとの相乗作用を狙っていることが特徴。これまで現地の出版社が担ってきた翻訳市場に、日本資本が直接参入したことは波紋を呼んでいる。各社への取材では、流通のシステム・掛け率等の具体的な数字、フランスでの性表現規制の実例等について詳しく取材。また、最近「ワンピース」が好調なこと、BLジャンルの出版物が急増していることに気づき、その過程の聞き取りを行った。加えて谷口ジローのフランスでの高い位置づけと、彼が人気を得ていく過程について詳しく取材。問題として、フランスでは中国製海賊版グッズが氾濫していることが、会場でも街でも確認された。8月末はタイを取材。事前にタトル・モリ・エージェンシーから情報提供と出版社の紹介を受け、90年代初めには100%だった海賊版マンガが現在わずか3%と、ほとんどが正規版に置き換わっていく過程を詳しく取材した。海賊版対策は「早さ」が勝負であり、『少年ジャンプ』を日本より10日早く出版したことが問題解決の鍵であった。また、海賊版時代には「表紙職人」と呼ばれる技術者がいたことを知り、これも具体的に取材。それと同時にローカルマンガの出版社2社を訪問し、「学習マンガ」がやはり大きな可能性を持っていることを確認するとともに、週刊のギャグマンガ誌がなんと100万部・75万部でているなど、今まで全く知られていなかった、タイの「下の市場」の予想外の強さを発見したのは大きな驚きだった。10月末11月初にはイタリアの「ルッカ・コミック&ゲームス」を訪れ、部数や流通等について出版社に取材するとともに、マンガ博物館等でイタリアのマンガの歴史について講義を受け、資料を購入した。調査に行った国や地域に関しては、思っていた以上の成果を得ることができた。ただ、震災やタイの洪水によって予定していたけれど先延ばしにせざるを得なかった調査もある。また、調査の結果は大学の講義や新聞・一般の雑誌などでは発表しているものの、あまりに調べた国、調査の成果が多いこともあって、学術的な場での発表がなかなかできていない。しかし、調査自体については、時間や予算の限界があるなかで、期待される以上の成果を得られたと思う。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年は最終年度になるので、予算は超過しても時間が許す限り、海外調査を行っていく予定である。夏にタイ・マレーシア(可能なら台湾)の調査が行えれば、アジアに関しては概況がわかってくる。ヨーロッパはさすがに時間と予算の限界があり、イタリアの調査はあきらめざるを得ないと思うが、フランスとスペインの調査が今年行えれば、だいぶ立体的になってくると思う。アジアにおける学習漫画の重要さも浮かび上がってきたので、秋には韓国の学習漫画についての追加調査も行いたい。今年は学術誌への投稿も考えており、調査が終わってから、おそらく2013年度になると思うが、調査の結果を一般単行本として出版したいと考えている。
話速変換機能を持つパソコンビデオを用いた日本語教師用音声教材の開発に関する研究

1・昨年度の試用実験などの結果から、話速変換の日本語教育における有功利用の条件として(1)目標言語に関する既知の知識と実際の音声現象を照合させ再認するために、言語処理時間がより多く必要とされる場合に用いる、(2)繰り返し再生してもコミュニケーションの流れを阻害したり、情報を聞き逃したりする心配の無い場面で用いる、という結論を得て、論文を発表した。2・前年度に着手したビデオ映像と日本語字幕を同期させて任意の部分を話速変換して聞き返すことのできるシステムを完成した。試行する中で昨年度のままの環境では設備環境が十分ではないことがわかったので、実試用に耐え、汎用性のある設備環境を示すことを第一目的とし、装置技術者と協力して、ビデオ信号のデジタル化などにより、より使いやすい環境作りを行なった。システムの特徴は次の通りである。(1)パソコンで任意のビデオソフトに字幕をいれたオリジナル教材ソフトが作れる。(2)パソコン画面でビデオの映像情報と文字情報をむすびつけてコントロールすることができる。(3)任意の個所を「ゆっくり」から「早口」まで話速を変えてリスニングの練習ができる。(4)字幕をパソコン画面に表示し、保存したり印刷したりすることができる。3・映画「シコふんじゃった。」また、テレビニュースを使った教材を作成し、教室で試用した。4・1と2のシステムおよび教材を平成10年11月に開かれた東京農工大学科学技術展に出展した。本研究に必要なパソコンビデオ等の設備を調え、ビデオ映像と日本語字幕を同期させて任意の部分を話速変換して聞き返すことのできるシステム作りに着手した。試行により、字幕作成環境を調えて任意のビデオソフトに容易に文字情報を同期させることができれば、日本語教師のための教材作成のツールとして様々な可能性を持つことが確認できた。しかし、現存のシステムでは複雑な操作と試行錯誤を要し、設備環境としては十分ではないことがわかった。そこで、実試用に耐え、汎用性のある設備環境を示すことを本研究の第一目的とし、その一例としての教材を作成する、と目的を修正し、装置技術者と協力して、ビデオ信号のデジタル化などにより、より使いやすい環境作りを行なった。また映像の著作権について、映像に書き込むことは不可であることを確認し、映像の外部に字幕を出すこととした。話速変換の有効性については、難聴者や英語学習者を対象とした試用実験などの先行研究の成果と、申請者が平成7年度と8年度に日本語教育の現場で試用してみた結果を合わせて再検討し、これを有効に使う条件として、(1)目標言語に関する既知の知識と実際の音声現象を照合させ再認するために、言語処理時間がより多く必要とされる場合に用いる、(2)繰り返し再生してもコミュニケーションの流れを阻害したり、情報を聞き逃したりする心配の無い場面で用いる、という結論を得た。以上の点からも映画のビデオソフトやテレビ番組の録画ビデオなどを本システムを利用した教材に用いることが支持されたので、教材例としては映画のビデオを使ったものを作成することとし、適切なソフトを選定し、実際の授業に用いてビデオ教材の有効な使い方について考察した。
細胞内タンパク質分解機構の破綻と腎障害：分子機序の解明と治療戦略の確立

小胞体ストレス応答(UPR)とオートファジーはタンパク質恒常性を調整し、腎疾患の発症・進展に関与するとされる。本研究はUPRのIRE1経路(タンパク質分解系の調整)の活性化におけるオートファジーの調整因子(Atg)の役割を明らかにするものである。研究期間内に得られた成果は:1)AtgはIRE1のC末端に相互作用した、2)ストレス条件下でこれらの結合が大きく変動した、3)腎培養細胞でも同様に結合が変動した、4)AtgのIRE1への結合はIRE1経路の活性化に関与した。以上の結果から、Atgの結合よるIRE1経路の制御機序が、腎病態の進展に関与する可能性が示唆された。小胞体ストレス応答(UPR)はタンパク質恒常性(合成・分解・品質管理)を調整しており、多彩な疾患群の発症・進展に関与するとされる。腎臓病学の分野に於いてもその病理学的意義・重要性が注目されているが、UPRを標的とした腎疾患の治療戦略は未だ確立されていない。現在申請者はUPRのタンパク質分解系を調整するIRE1経路の制御機序にオートファジーの調整因子が関与することを明らかにしている。しかしながら、「この分子がどのようにしてIRE1経路を調整しているのか?」、さらに「腎機能の維持あるいは破綻のどちらに寄与するのか?」は不明であった。本研究ではオートファジー調整因子により調整されるIRE1の制御機序を明らかにし、腎障害におけるUPRのタンパク質分解機構の役割を明らかにすることを目的とする課題である。研究期間内に得られた成果は:1)オートファジー調整因子とIRE1は相互作用した、2)オートファジー調整因子はIRE1のC末端に結合した、3)小胞体ストレス条件下でこれらの結合が大きく変動した、4)腎細胞培養系でも同様に結合が変動した、5)オートファジー調整因子のIRE1への結合はIRE1経路の活性化に関与した。以上の結果から、オートファジー調整因子を介したUPRの調整が腎病態の進展に関与する可能性が示唆された。本研究はIRE1経路による細胞内タンパク質分解機構のバランス調整に係る分子機序を解明し、「タンパク質分解機構の機能異常の是正」を目的とした新規腎疾患治療戦略の確立を目指すものである。当該年度では、第一義に分子機序の解明を目指し、研究を実施した。これまでに、タンパク質分解機構のバランス調整に係る分子機序は、オートファジーの調節因子Atg12-Atg5がIRE1に直接的な結合により機能することを明らかにしている。しかし、IRE1とAtg12-Atg5が結合するメカニズム等は不明であった。まず、Atg12-Atg5がIRE1のどのアミノ酸領域に結合するのか検討した結果、Atg12-Atg5はIRE1のC末端側のkinaseおよびRNaseドメインの両方に結合していることが明らかになった。このことから、この結合がIRE1へ構造的な変化を与え、その結果IRE1の持つkinaseおよびRNase活性に影響を与えることにより、IRE1-XBP1経路(ユビキチン・プロテアソーム系)とIRE1-JNK経路(オートファジー)を逆相関的に調整していることが予想された。また、IRE1とAtg12-Atg5の結合レベルを経時的に解析したところ、その結合レベルは正常な培養条件下では、わずかながらに変動し、ユビキチン・プロテアソーム系とオートファジーを精密に調整していた。一方で、それはER stress条件下では著しく変動し、タンパク質分解機構のバランス多く撹乱していた。以上のことから、IRE1とAtg12-Atg5の結合を制御するには、IRE1のC末端領域を標的にすることにより、タンパク質分解機構のバランスを人為的に制限することが予想される。また、この結合レベルを指標とすることで、各種ストレス条件下でのタンパク質分解機構のバランス状態を提示することが出来る可能性がある。本研究では最終的に、「タンパク質分解機構の機能異常の是正」を目的とした新規腎疾患治療戦略の確立を目指している。そのためには、生体内でIRE1とAtg12-Atg12の結合を制限する技術を創出しなければならない。前年度までにターゲットとなるIRE1のアミノ酸領域を特定している事から、今後はその配列に対するペプチドまたはモノクローナル抗体を作製することを目指す。そして、各種腎障害モデルマウスを用いた解析により、腎障害におけるタンパク質分解機構のバランス是正の生理・病理学的役割を明らかにする必要がある。前年度には、その基盤となる研究が完了している事から、上記の達成度を提示した。前年度の研究成果により、ER stress時にIRE1とAtg12-Atg5の結合レベルが著しく変動し、タンパク質分解機構のバランスが大きく撹乱していた。

このことから、IRE1とAtg12-Atg5の結合レベルを指標にすることで、各種腎障害におけるタンパク質分解機構のバランスの異常を明らかにすることが出来る。このことから、今後の研究の推進方策に関しては、第一義に各種腎疾患モデル(培養細胞、モデルマウス)におけるIRE1とAtg12-Atg5の結合レベルをモニタリングし、タンパク質分解機構のバランス異常が起こっている事実を検証する。そして、前年度に特定にしたAtg12-Atg5との結合に不可欠なIRE1のアミノ酸領域に特異的に作用するペプチドおよびモノクローナル抗体を作製し、腎疾患におけるタンパク質分解機構のバランス異常の是正を目指したい。前年度には、主に分子機序の解明をすることを第一義の目的にしており、免疫沈降法および抗体等の消耗品の購入がメインであった。研究内容に関しては、特に問題も発生せずに、円滑に進める事が出来たために、予想よりも下回る研究費で遂行することで可能となった。今年度は、主に動物実験をメインにしており、マウスやモデルマウス作製のための試薬、TUNEL染色キット等の購入をしなければならない。また、大量のサンプルを免疫沈降することにより、ラージスケールで抗体を購入しなければならない。また、今年度は研究報告のために、日本分子生物学会および日本生化学会に参加し、口頭発表を行う予定でいる。そのため、前年度よりも多くの研究費が必要となる。
膵島の自己組織化ならびに保護機構における神経堤由来シュワン細胞の役割

今年度の主な検討として、ヒトに発生するインスリノーマでは、Glucose-induced insulin secretion(以下GSIS)に観るような生体の恒常性維持のための調節機能は失われて栄養素に非依存的に調節が失われて不適切な過剰分泌を起こす。このことに着目して、我々の担当した一例について、慈恵医大倫理委員会の承認のもと、手術材料のインスリノーマからゲノムDNA、total RNAおよびタンパク質成分を抽出した。これと対比させながら、同一人(インスリノーマ患者)のgermlineのゲノムを反映していると考えられる末梢血の有核細胞からのゲノムと比較した。血球(germline)のゲノムの解析:16億5千万リード、2480億塩基、インスリノーマのゲノムの解析:19億2千万リード、2879億塩基を行ったところ、国際標準UCSC hg19と比較した変異としては、血球とインスリノーマ合計で130万箇所、シークエンスの精度の高いリードに限ると54万箇所(以下PASSとする)があった。またPASSのうち、血球で変異が無く、インスリノーマで変異があるもの67遺伝子で、またPASSのうち、インスリノーマで変異が無く、血球で変異があるもの92遺伝子であった。さらにこのPASSのうち、エクソン部分の変異90787箇所、このうちPathogenic 41箇所、Likely Pathogenic 7箇所であることが判明した(但し、これらは血球とインスリノーマの双方でUCSC hg19と異なっていた)。このexon部分の48箇所のvariationについて、GSISなど生体の恒常性維持希望と関連する遺伝子ついて、今後はその機能変異の同定を行うことで、膵島の自己組織化と生体恒常性維持のメカニズムが明らかにできる道が開かれた。膵島周囲に存在するperi-islet Schwanncellのin vivo解析に先立ち、in vitroでの解析を行う準備を施行した。特にマウスastroglia cellがSchwann細胞と同種同等であると考えられることを突き止めた。これに基づき、培養細胞IMS32細胞がislet Schwann細胞と同種同等であると考え、これを入手することがかなった。現在、この培養細胞を用いて酸化ストレス応答遺伝子であるnrf2をはじめとした計画されたmiRNAによる酸化ストレス応答の変化をin vitroの系で検証するところにある。また研究分担者らと実験の手順や当該分野における新規理論的背景について、議論を重ねているところである。当該年度は、膵島のモデルシステムとして引き続き、培養細胞を用いてインスリン分泌機能を有するβ細胞が膵島というコンパートメントにおいてどのような機序で分泌調節をなされるのか、検討した。特にマウス樹立β細胞であるMIN6細胞を用い、グルコース刺激に対する応答性を種々の条件で調べた。まず膵島の構築として存在する神経堤由来シュワン細胞の樹立株であるIMS32細胞をMIN6と共に共培養したところ、MIN6からのブドウ糖応答性インスリン分泌に増強作用が観られた。しかしIMS32のconditioned mediumはこれを増強することはなかった。以上のことは膵島内の構築において、シュワン細胞は液性因子を介さずにβ細胞への直接的な接触による保護、インスリン分泌促進作用を有することが判明した。さらに糖尿病を惹起するとされている酸化ストレスのモデルとして、過酸化水素による処理を行ったところ細胞死が惹起された。またMTTアッセイにより細胞死が起こっていない状態を設定した上で調べると、H2O2容量依存的にインスリン分泌を抑制した。また一方で、このH2O2によるインスリン分泌不全は、IMS32の共培養によっても回復しなかった。したがって膵島シュワン細胞の抗酸化ストレス作用は認められなかった。研究の計画時には想定していなかったが、シュワン細胞が抗酸化ストレス作用が弱い可能性がある。また動物における膵島構築の形態学的検討を優先する必要性が出てきたため。昨年度までの検討にてβ細胞を神経堤由来シュワン細胞とともに共培養するとブドウ糖応答性インスリン分泌(glucose-stimulated insulin secretion; GSIS)が亢進した。今年度は、この現象をより正確に検証することとした。β細胞(Min6)を単独で様々な濃度で培養を行うときに同じ細胞密度の一細胞あたりにおけるGSIS能を決定する方法を確立した。Min6細胞を1wellあたりの細胞数を一定にしたときの培地中インスリン濃度をELISA法で測定し、Min6一細胞あたりへの換算はRealtime PCRにて定量したGlut2mRNA量により換算(標準化)した。その結果、まずMin6単独培養では細胞密度が増すとGSISは低下する傾向が観られた。またシュワン細胞株、IMS32細胞と共培養した。これによるとMin6一細胞あたりのGSISは、同じMin6細胞数であってもIMS32との共培養により亢進する傾向を示した(有意差は確認中)。さらに間葉系細胞由来の線維芽細胞NIH3T3細胞とも共培養し同様の結果であった。この効果は、Min6がIMS32から分泌される物質により影響を受けたためかどうかを知るため、IMS32のconditioned mediumをMin6の培地へ添加したところ逆にGSISは抑制され、これは共培養のGSIS亢進メカニズムでないことが判明した。さらに細胞間の接触による情報伝達装置としてのgap junctionにつき、その構成分子であるCx36のsiRNAによるknock downを試みた。その結果、GSISの低下傾向が観られたが、有意差が得られなかった。

これはsiRNA導入時の操作の影響が強く、統計学的な有意差を持った明確な結果は得られなかった可能性がある。そこで次年度に向け、ゲノム編集技術を応用した方法を検討中である。当初、Schwann細胞の機能として予想していた抗酸化作用はメインでは無いと考えるような実験結果が出始めており、むしろ別の機能、特にgap junctionを介した細胞間の情報伝達の重要性に研究内容がシフトしたため。生体の膵内分泌の構造単位である膵島においては、β細胞が単独で存在するのではなく他の内分泌細胞、間質の細胞、さらには神経堤由来のシュワン細胞などに三次元的に取り囲まれた構造を持ち、インスリン分泌に関してもこれらの細胞との間での作用により複雑な調節がなされていると考えられる。前年度までの検討において、インスリン分泌にはこれらの脂肪におけるGap junctionが膵島内の細胞間情報伝達に重要な役割を担っている可能性が示唆された。本年度は新たな三次元・低重力下培養装置を用いてGSISならびに形態学的な観察を行うことも、これを確認した。次に、この現象の分子基盤を明確にするため、Gap junctionを構成するConnexin36遺伝子のゲノム編集技術によるノックアウトクローンの作製を行った。しかしこの過程でSchwann細胞由来の培養細胞がこの遺伝子産物がない状況では増殖が非常に遅く、実験が困難に直面している。生体の膵内分泌の構造単位である膵島の三次元構造をin vitroで再現し、これがインスリン分泌(GSIS)にどのように影響するかを検討する計画であった。β細胞株Min6細胞とマウスastrocyte/Schwann由来の培養細胞であるIMS32細胞をマトリゲル基底膜マトリックスを用いて三次元培養したところ、Min6単独に比べてこの共培養によりGSISにおけるインスリン分泌量が3倍に増加した。さらに三次元培養に基づく形態的変化を観察を培養状態のまま観察の可能なデジタル顕微鏡を用いて行った。本年度における三次元培養は微小重力環境下に培養の可能な細胞培養装置ZEROMO(北川鉄工所)をCO2 incubator内に設置して行った。予備的な実験として、0.5×105/mlのIMS32細胞を12wellプレートへ4ml/wellでseedした。培養した細胞を観察したところ、平常の1Gでの培養に比べGを下げた低重力培養条件では細胞が大きくなり、プレートから上部に向かって立体的に増殖していることが観察された。これまで行ってきた実験結果から、GSISの増加は細胞間の分子、特にGap junctionを構成するConnexin 36 (GJD2)タンパクが関与している可能性が示唆された。そこでGjd2を欠失させたIMS32細胞がWTと同様にMin6細胞のGSISにおけるインスリン分泌量を増大させるかどうか、さらに共培養した際に形態的にどのような変化が観察されるのかについて知るため、CRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を用いGjd
ミトコンドリアの共生を規定する、排除と維持の監視メカニズムの解明

膜電位の低下したミトコンドリアにParkinを呼び寄せる機構として、PINK1によるParkinおよびユビキチン鎖のリン酸化がその本態であることを、昨年度明らかにした。今年度はそれを受け、Parkinと共にリン酸化ユビキチン鎖に呼び寄せられる分子群を質量分析解析とRNA干渉スクリーニング、ショウジョウバエ(以下、ハエと表記)による遺伝的相互作用により同定し、その機能喪失が及ぼす影響をノックアウト細胞において解析した。これら分子はオートファジーに関与することが示唆され、本計画はさらに遂行中である。一方、個体レベル、特にヒトにおいてのリン酸化ユビキチンシグナルの関与の評価に関しても研究を進めた。具体的には、まずPINK1, Parkinノックアウトハエにおいてリン酸化ユビキチンシグナルの検出を行い、Parkinノックアウトハエで顕著な蓄積を認めた。対照的にPINK1ノックアウトハエでは全く認められず、培養細胞と同様のシグナル伝達が働いていることが示唆された。さらにiPS細胞をドーパミン神経に分化させ、人為的に膜電位低下させた。その結果、Parkin変異によりリン酸化ユビキチン形成が低下することが明らかとなった。ヒトにおいては、遺伝性および孤発性パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症病理切片を用いてリン酸化ユビキチンシグナルの検出を試み、疾患特異性を評価した。これら一連のリン酸化ユビキチンシグナルの解析は、次年度の前半までにデータをまとめ発表予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、PINK1のリン酸化基質としてモノユビキチンおよびポリユビキチン鎖を質量分析解析により同定し、その生理的意義を明らかにした。すなわち、リン酸化モノユビキチンはParkinのユビキチンリガーゼ活性の活性化に関与した。一方、ミトコンドリア上でのリン酸化ポリユビキチン鎖の発現がParkinのミトコンドリアへの移行およびParkinの活性化に必要であることを培養細胞で明らかにした。さらに、ショウジョウバエにおいてミトコンドリア上にリン酸化ポリユビキチン鎖の模倣体を発現させることにより、PINK1ノックアウトハエのミトコンドリア変性と運動機能の低下が抑制できることを示した。以上から、リン酸化ポリユビキチン鎖は、PINK1-Parkinシグナルを介したミトコンドリア品質管理に重要な役割を担うことが明らかになった。一方、Parkinユビキチンリガーゼの活性に関与する共役酵素として、K63リンクポリユビキチン鎖を形成するユビキチン結合酵素Ubc13の重要性が示唆されていた。Ubc13は、異物排除に関与するToll様受容体を介した免疫シグナルで重要な役割を担う。そこで、Ubc13ノックアウトマウス由来の線維芽細胞を用いたマイトファジーアッセイおよびUbc13ノックダウンハエを用いた遺伝的相互作用解析によりその役割を評価した。その結果、Ubc13はマイトファジーにおけるParkinの共役酵素として機能しないことが示唆された。Parkinが不良ミトコンドリアを認識して移行する分子メカニズムとして、PINK1とParkinが協働して形成するミトコンドリア上のリン酸化ポリユビキチン鎖の重要性を明らかにした。さらにリン酸化ポリユビキチン鎖形成によるParkinのミトコンドリア移行に関するポジティブフィードバックループの存在を指摘し、論文として報告することができた(Shiba-Fukushima, PLoSGenet 10: e1004861, 2014)。ほぼ同時に独立して論文を発表したハーバード大学のグループも同様の結果を報告しており(Ordureau, Mol Cell 56: 360-375, 2014)、ミニレビューとして両成果が取り上げられた(Riley, PLoSGenet 11: e1004952, 2015)。リン酸化ユビキチン鎖の存在はこれまで全く存在が報告されてなく、そのインパクトは大きい。

一方、Lys63にリンクするユビキチン鎖形成に関与するUbc13のParkinを介したマイトファジーにおいての重要性は以前から報告されていたが、Ubc13ノックアウト細胞およびUbc13ノックダウンハエにおいて、Lys63にリンクするユビキチン鎖の影響がそれほど大きくないことを明らかにし、論文として報告した(Shiba-Fukushima, J Biol Chem 289: 33131-33136, 2014)。以上の成果から、研究の進捗はおおむね順調であると判断される。27年度が最終年度であるため、記入しない。リン酸化ポリユビキチン鎖がマイトファジーのシグナル伝達の足場となる可能性が考えられ、マイトファジー時にリン酸化ポリユビキチン鎖に結合する分子の質量分析解析による網羅的同定および培養細胞とショウジョウバエモデルを用いた機能スクリーニングを行う予定である。さらに、スクリーニングで同定された分子のミトコンドリア共生における生理的意義、その破綻による病理的な意味をショウジョウバエモデルと培養細胞を用いて明らかにしていく。また、不良ミトコンドリアを排除するマイトファジーと細菌を排除するゼノファジー、両応答においてのシグナル伝達因子の共通性、類似性から、リン酸化ユビキチンシグナルが異物排除の一般的なシグナルであるか、進化的な観点も含め様々なモデル生物および細菌を使った研究グループと共同研究により合わせて明らかにしていきたいと考えている。
姿勢評価システムによる判定数値と中高生の体力との関係について

本校では、体をはかるというテーマで、中学1年生から高校2年生まで、5年間継続して姿勢学習を実施している。本人および保護者の理解得て、水着姿で直立姿勢を正面・側面・背面からの撮影した3枚の写真と、超音波診断装置用いて腹直筋厚および皮下脂肪厚、大腿部中央の筋厚および皮下脂肪厚を測定し、プリントアウトされたものを各自台紙に貼りつけ、分析を行っている。本研究は姿勢測定解析ソフトを用いて算出されたデータと、本校で実施しているスポーツテスト等のデータと比較検討することで、今後の姿勢学習において新たな一歩を踏み出す事ができると計画した。【研究方法】2010年度に筑波大学附属駒場中高等学校に在籍する男子生徒のみ中学1年生123名、中学2年生123名、中学3年生123名、高校1年生164名、高校2年生164名、高校3年生164名、合計861名の生徒を対象に実施する。(1)形態について(2010年4月下旬に実施する身体計測による身長・体重・胸囲の3項目)(2)体力調査について(2010年4月中旬から5月初旬にかけて実施する体力テストの測定結果による)(3)姿勢写真撮影および超音波診断装置による測定について(2010年5月中旬に撮影する)(4)姿勢測定アプリケーションソフトBodyConciergeによる、姿勢分析を実施する。(5)統計処理はPASW Statistics18を使用し、統計学的有意水準は5%に設定する。【研究成果】研究当初、姿勢測定アプリケーションソフトBody Conciergeを用いて、姿勢分析の実施を試みたが、予想以上に作業時間がかかることが判明した。そのため、全員を分析することを今回は断念し、特徴がある生徒を選定し分析を行った。残念ながら今回は、計画していたスポーツテスト等のデータとの比較検討はできなかった。しかし、姿勢測定アプリケーションソフトBody Conciergeを活用することで、姿勢への興味関心は高まった。さらに姿勢分析による客観的なデータは、これまで本校の姿勢学習で踏み込めなかった、体のねじれの部分についても明示されるため、今後の本校の教育活動において大きな1歩を歩みだすことができた。今年度の反省をもとに、次年度以降対象を絞り込み、継続研究していきたい。
多核活性点構造を有する新規ポリオキソメタレートの合成と触媒特性

本研究では、アニオン性金属酸化物クラスターであるポリオキソメタレート(POM)を無機配位子として種々の金属多核構造を有するPOMを創製し、カチオン交換能、触媒特性について検討した。アルミニウム二置換POMのテトラブチルアンモニウム(TBA)塩を三量化させることでABCスタッキングの層状化合物を得た。リチウムカチオン存在下三量化させるとAAスタッキングの層状化合物を得た。これらの化合物はスタッキングのずれを伴いながら、可逆にリチウムとTBAのカチオン交換が可能であることが明らかとなった。有機溶媒中で二欠損型POMとイットリウムアセチノアセトナートなどの希土類金属を反応させることで二つの希土類金属を二つの欠損型POMで挟んだPOMが得られた。このPOMはカルボニルのシアノシリル化反応に対して高い触媒活性を示すことが明らかとなった。中でも、n-ヘキサナールを基質とした場合、ターンオーバー頻度(TOF)は540,000h^<-1>におよび、既報と比べて最高であった。有機溶媒中で二欠損型POMと酢酸銀を反応させることで、四核銀クラスター構造を二つの欠損型POMで挟んだPOMが得られた。これは三核以上の金属クラスター構造をPOMアニオン中に取り込んだ初めての報告であった。このPOMを触媒としてシランと水を反応させることでシラノールと水素が得られることが明らかとなった。ジメチルフェニルシランを基質としたときのTOFは27,000h^<-1>であり、既報と比べて最高であった。このように本研究で提示した有機溶媒中でのPOMの合成法は種々の金属に対して適応可能であり、得られたPOMは導入した金属の特徴を活かした高機能触媒として働くことが明らかとなった。該当年度において、これまで新規合成が困難とされていた、金属多核構造を有するいくつかの新規ポリオキソメタレートの合成に成功した。また、それらのポリオキソメタレートを用いた高効率有機合成反応系の開発に成功した。これまでに開発した新規ポリオキソメタレートの合成法は様々な金属に応用できる。新たに合成したポリオキソメタレートを用いることで金属の特性を活かした高効率触媒反応系の開発が期待できる。また、銀クラスター構造を欠損型ポリオキソメタレートで安定化させることが出来たことから、構成原子数、幾何構造を制御した金属クラスターの合成が期待される。近年、金属クラスターは、単核やバルクとは異なる光学、触媒特性を示すため、注目を集めている。これらの構造と物性の関係を明らかにすることでさらなる機能性材料の創製が期待できる。本研究では、ポリオキソメタレートを基盤とした多核金属活性点構造の創製とその特長を活かした高機能触媒の開発を行うことを目的としている。これまでに活性点構造を明らかにしたジルコニウム、ハフニウム置換ポリオキソメタレート(Zr2,Hf2,Zr4,Hf4)、アルミニウム置換ポリオキソメタレート(Al2)に関して、金属核を架橋している水酸基について電位差滴定によりキャラクタリゼーションを行った。Zr2、Zr4はすべての架橋水酸基がブレンステッド酸点として機能するが、Al2の架橋水酸基は滴定によるブレンステッド酸性は確認できなかった。Al2はIR、^<29>Si NMR、^<183>W NMR、電位差滴定、X線構造解析によりキャラクタリゼーションをおこない、ピリジンとの反応により、ルイス酸点を明らかにした。また、Al2を触媒とした(-)-シトロネラールの分子内環化反応では(+)-イソプレゴールが87%のジアステレオ選択性で得られた。この値はこれまでの報告例と比較しても、同等、あるいはそれ以上であることが明らかとなった。(J.Am.Chem.Soc.2008,130,15872-15878)さらに、新規3d金属置換ポリオキソメタレートの合成を検討した。これまで、多核3d金属核構造を有するγ-Keggin構造は報告されていない。従来、水溶液中での合成が試みられてきたが、異性化、単核のみの置換と、多核構造を構築するのが困難であった。そこで、当研究室において単離に成功した[γ-SiW_<10>O_<36>]^<8->のテトラブチルアンモニウム塩(TBA-SiW10)を用いて、有機溶媒中での合成を検討した。過酸化水素を用いた2-シクロヘキセン-1-オールの酸化反応ではTBA-SiW10を触媒とするとエポキシアルコールが多く生成し、亜鉛アセチルアセトナート錯体では反応が進行しない。一方、TBA-SiW10と亜鉛アセチルアセトナート錯体を混合すると、2-シクロヘキセン-1-オールの酸化反応においてエノンが高選択的に生成し、TBA-SiW10とは異なる反応性を示した。そこで、TBA-SiW10と亜鉛アセチルアセトナート錯体をアセトン中で反応させることにより亜鉛置換ポリオキソメタレート(Zn4)を合成することに成功した。化合物Zn4の構造は単結晶X線構造解析により明らかとした。(Angew.Chem.submitted.)本研究では、ポリオキソメタレートを基盤とした多核金属活性点構造の創製とその特長を活かした高機能触媒の開発を行うことを目的としている。

アセトン中で、二欠損型シリコタングステートのテトラブチルアンモニウム塩と亜鉛アセチルアセトナートを反応させることで四核亜鉛構造を有するγ-KegginポリオキソメタレートTBA_8[{Zn(OH_2)(μ_3-OH)}_2{Zn(OH_2)_2}_2{γ-HSiW_<10>O_<36>}_2](γ-Zn4)を合成することに成功し、単結晶X線構造解析により構造を明らかにした。化合物γ-Zn4は二価の3d金属カチオンを置換したγ-Kegginポリオキソメタレートの初めての報告であった。アセトン、水の混合溶媒中で^<29>Si NMRでは-83.2ppmに単一のシグナルが、^<183>W NMRでは5本のシグナルが-97.2,-112.2,-124.7,-144.8,-169.7ppmに観測されたことから溶液中でも構造を保持していることが明らかとなった。化合物γ-Zn4はアセトン中でin-situで調製可能であり、過酸化水素を酸化剤とした種々の二級アルコールに対して対応するケトンが高収率で得られた。化合物γ-Zn4は、亜鉛原子に配位したアクア配位子の水素結合により、構造が安定化していた。化合物γ-Zn4を真空下、150°Cで2時間熱処理することにより、六角柱構造[{Zn_2W(O)O_3}_2]^<4+>が二つの[SiW_9O_<33>]^<8->ではさまれた二種類の新規サンドイッチ型ポリオキソメタレートTBA_8[{Zn_2W(O)O_3}_2H_4{α-SiW_9O_<33>}_2]・5H_2O(α-Zn4)とTBA_8[{Zn_2W(O)O_3}_2H_4{β-SiW_9O_<33>}_2]7H_2O(β-Zn4)が得られた。六角柱構造は二つの平行な椅子型六員環{Zn_2WO_3}で構成されていた。二種類の金属と酸素原子によって構成された六角柱構造はこれまで報告されていない。化合物α-Zn4、β-Zn4は、過酸化水素を酸化剤とした種々のアルコールの酸化反応に高い触媒活性を示し、対応するケトンが高い過酸化水素有効利用率、高選択的に得られた。化合物β-Zn4を反応後、過剰のジエチルエーテルを加えることにより回収した触媒は、活性を低下させることなく、再使用可能であった。本研究では、アニオン性金属酸化物クラスターであるポリオキソメタレート(POM)を無機配位子として種々の金属多核構造を有するPOMを創製し、カチオン交換能、触媒特性について検討した。アルミニウム二置換POMのテトラブチルアンモニウム(TBA)塩を三量化させることでABCスタッキングの層状化合物を得た。リチウムカチオン存在下三量化させるとAAスタッキングの層状化合物を得た。これらの化合物はスタッキングのずれを伴いながら、可逆にリチウムとTBAのカチオン交換が可能であることが明らかとなった。有機溶媒中で二欠損型POMとイットリウムアセチノアセトナートなどの希土類金属を反応させることで二つの希土類金属を二つの欠損型POMで挟んだPOMが得られた。このPOMはカルボニルのシアノシリル化反応に対して高い触媒活性を示すことが明らかとなった。中でも、n-ヘキサナールを基質とした場合、ターンオーバー頻度(TOF)は540,000h^<-1>におよび、既報と比べて最高であった。有機溶媒中で二欠損型POMと酢酸銀を反応させることで、四核銀クラスター構造を二つの欠損型POMで挟んだPOMが得られた。これは三核以上の金属クラスター構造をPOMアニオン中に取り込んだ初めての報告であった。
合成オリゴヌクレオチド修飾電極を用いるバイオセンサ

申請者は、金属-硫黄配位結合を利用したDNAの固定化、及びこれを修飾電極に応用したDNAバイオセンサについて研究してきた。これを背景に、ここでは遺伝子センシングシステムについて検討した。この方法では、金電極に固定化したオリゴヌクレオチド、これと相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド、及び酸化還元活性な置換基を導入したオリゴヌクレオチドの組合わせによって起こる、サンドイッチ複合体形成反応を利用する。5'末端付近をホスホロチオエステル化したオリゴヌクレオチドを合成し、金電極にオリゴヌクレオチドをキャストした。この手法により、非常に安定なDNA修飾層を得ることができた。また、末端にフェロセニル基を導入した、酸化還元活性オリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成した。コンジュゲートは、オリゴヌクレオチド合成段階で末端にアミノ基を導入し、活性エステル化フェロセンカルボン酸とのカップリングにより得た。オリゴヌクレオチド修飾電極とコンジュゲートを組合わせると、固定化オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を持つDNAフラグメント(ターゲットDNA)の検出が可能であった。すなわち、ターゲットDNAの共存によりコンジュゲートを含んだサンドイッチ複合体が形成される。この反応は、電極表面へのフェロセンユニットの濃縮につながり、フェロセンの酸化還元反応に伴う電流をモニタすることでターゲットDNAの検出が可能であった。ターゲットDNAと非ターゲットDNAとの間では、電流値に明らかな差異が認められ、遺伝子センサとしての可能性を示すことができた。
描画と言語プロトコルの統一的分析法の開発とそれに基づく臨床社会心理学的研究

心理学や精神医学では、投影的描画や言語プロトコルが人格や行動の全体的理解や査定のために用いられている。我々は、描画や言語プロトコルデータの客観性の不足を補うために統計的画像解析と特異値分解の手法を用いることを提案した。我々は、大学生や患者の心理過程を解釈するために樹木の描画と言語プロトコルを分析する新しい提案手法を用いた。我々は、大学生と精神疾患患者の描画と言語プロトコルを分析し、特性不安、状態不安、自己評定の抑鬱テスト、ベック抑鬱尺度、矢田部・ギルフォード人格テストなどと解析結果との相関を計算した。結果は、画像や言語報告の統計的特徴と抑鬱が有意な相関していることを示した。臨床の現場においては、クライエントに描画をさせ、その描画の特徴から、臨床的な診断を行うということがなされている(岩満他,2004)。しかし、このような方法は、客観性が乏しいとの批判がなされている。我々は、このような問題から、描画の統計的画像解析の技法を開発して、描画を行列としてみなして分解する方法を示し、精神病院の患者や一般成人を対象に、研究を行ってきた。しかし、実際の臨床現場では、描画だけでなくクライエントの言語報告も重要になる。言語報告も定性的なデータとして扱われることが多く、描画の分析と同様の問題を抱えている。描画と言語報告(言語プロトコル)のより客観的な分析が必要とされる。本研究は、描画と言語プロトコルの統一的観点に立った分析法を開発し、その方法に基づいて臨床社会心理学的研究を行った」。本研究では、調査研究で得られる描画と言語プロトコルを同時に開発する計量的方法を開発することを第一の目的とした。また、開発した方法を用いて、臨床場面での描画とそれに対応する言語プロトコルの計量的特徴次元と抑うつやストレスや行動指標などとの関連分析を行い、臨床社会心理学的知見を得ることを第二の目的とした。最後に、本研究で開発した方法をもとに、精神疾患患者や社会的弱者への偏見を測定し、偏見解消の処方箋を求めることを第三の目的とした。本研究では、描画像は、スキャナーを用いて計算機の画像に描画を取り込み、画像をいくつかに分割する。また、言語プロトコルは、単語の頻度情報から、局所的エントロピーと大域的なエントロピーから重要度行列を作成し、その行列を同時に特異値分解する方法を開発する。言語も画像も一種の行列とみなしてこれを分解する方法をとった。また、種々の社会的状況での現地面接調査や描画法とプロトコール法を用いた調査を大ない結果を解析し、学会において研究発表を行った。本研究は、描画と言語プロトコルを、従来の研究ように、評定者が評定して統計解析するという種類のものではなく、描画と言語プロトコルを無限次元空間内のベクトルとして捉えて数学的解析を加え、評定者の解釈が一切入らない形で分析を行うものである。そのため、臨床場面などでも描画と言語プロトコルのより客観的な分析が可能となると期待できる。昨年度は、描画像を、スキャナーを用いて計算機の画像に描画を取り込み、言語プロトコルは、単語の頻度情報から、局所的エントロピーと大域的なエントロピーから重要度行列を作成し、その行列を同時に特異値分解する方法を開発したが、本年度から、フーリエ解析法やウェーブレット法の適用を試みた同時分析を検討している。また、臨床的観点を援用して社会心理学における新しい描画と言語プロトコルの取り扱いを探索するために、臨床心理学者、精神医学者からの定性的評価も参考にして、分析を行った。本年度は、精神病院の精神疾患患者のデータだけでなく、対照群となる丼年齢の一般市民にも描画調査を行った。また、他の身体的疾患の患者にも描画テストを行った。さらに、絵の体験が描画に影響を及ぼす可能性があるので美術大学生や芸術関係の仕事をしている成人に描画調査を行った。研究協力者としてスエーデン国立ストックホルム大学、ロシア国立サンクトペテルブルグ大学での描画とプロトコールを収集した。また、事例収集として、歴史的な民俗資料における描画や言語プロトコルを収集し、定性的分析を行った。また、描画と言語プロトコルの分析によって得られたパラメータを、状況依存性を仮定した意思決定モデルに組み込んで、調査に得たデータをもとに、選好と意思決定の予測を行い、提案する手法の有効性を確認した。本研究は、描画と言語プロトコルの統一的観点に立った分析法を開発し、その方法に基づいて臨床社会心理学的研究を行った。1.描画と言語プロトコルの統一的観点に立った分析法を開発本研究では、描画法と言語プロトコルの解析法を新しく展開する。描画像は、スキャナーを用いて計算機の画像に描画を取り込み、画像をフーリエ解析、ウェーブレット解析、特異値分解等を行った。また、言語プロトコルも、単語の頻度情報から、同様の方法を用いた、分析法を開発して、その成果を発表した。

2.描画と言語プロトコルを用いた面接と社会調査の実施と分析国内および海外の一般成人を対象者として樹木法による描画と生活一般についての言語記述を求めた。この方法に加えて、SDS,YG,STAI、BDIなどの質問紙調査を行い、社会や人間関係の社会的認知に関する質問紙調査を行った。これらのデータをまず、研究開発した分析法で描画像と言語プロトコルデータを分析した。また、描画は、筆圧や描画の順序を把握できるペンタブ入力装置を利用する方法も検討を試みた。また、質問紙調査項目との関連性分析を行った。3・精神障害者、外国人に対する偏見や対人認知を検討するための描画と言語プロトコルを用いた調査の実施と分析国内および海外の一般成人を対象者として精神疾患患者や外国人に対するイメージ画を描かせ、対象者についての言語記述も求めた。また、対象地域での歴史的文書の資料分析や現地調査も行った。
ヌクレオソーム構造に特異的なヌクレオチド除去修復機構の解析

sV40のミニ染色体を用いた無細胞ヌクレオチド除去修復系の精製因子による再構成を目指し、昨年度中に、裸のプラスミドDNAを用いた系により明らかにされている既知のヌクレオチド除去修復因子のうち反応の初期過程、即ちDNA鎖の切断までに必要な因子である、XPA、MPC-hHR23B、XPF-ERCC1、XPG、RPA、TFIIHを精製した。本年度は、これらの因子を用いて、反応系を再構成し、その反応機構について明らかにし、さらにヌクレオソーム構造上の損傷に特異的に要求される因子の検索を目的とした。まず、精製因子による再構成を試みたところ、上記の因子により、裸のDNA上における修復反応に比べて効率は低いものの修復反応が再構成された。しかし、粗抽出液を分画して得た画分に比べ、特に、RPAについて、粗抽出液画分よりも精製酵素では、多量の蛋白質を添加する必要があった。この結果より、粗抽出液中には、RPAの活性化、もしくは、RPAと協調的に機能する未同定の因子が存在すると考えられる。現在、この因子の同定を試みている。すでに、我々は、粗抽出液系を用いて、XPC-hHR23B複合体が、ヌクレオチド除去修復反応において最初に損傷DNAを認識する因子であることを示している。そこで、精製酵素による再構成系を用いて、各因子がどのような順番で反応に関与するかを調べた。その結果、XPC-hHR23B複合体が、やはり、最初に必要なこと、続いて、TFIIH複合体が、損傷DNAとXPC-hHR23Bとの複合体上へ導入されることを明らかにした。SV40のミニ染色体を用いた無細胞ヌクレオチド除去修復系の精製因子による再構成を目指し、まず、裸のプラスミドDNAを用いた系により明らかにされている既知のヌクレオチド除去修復因子のうち反応の初期過程、即ちDNA鎖の切断までに必要な因子である、XPA、XPC-hHR23B、XPF-ERCC1、XPG、RPAを組み換え蛋白質として発現して精製した。さらに、XPBとXPDを含む高分子複合体であるTFIIHを、HeLa細胞より精製して用意した。一方、細胞抽出液を分画することにより、それぞれのヌクレオチド除去修復因子を3つの画分(CF-I、CF-II、CF-III)に分けた。これらの精製蛋白質および粗抽出液分画画分を用いて、再構成を試みた。DNA鎖切断反応までを検出する系を用いて、再構成実験を行った結果、XPA、XPF-ERCC1、XPG、RPAについては、精製蛋白質でも、粗抽出液分画画分(CF-I、CF-II)でも同程度の活性が得られた。しかし、XPC-hHR23BとTFIIHについては、精製蛋白質ではほとんど活性は見られず、粗抽出液画分(CF-III)が必要であった。この結果は、XPC-hHR23BとTFIIHを含む画分(CF-III)に、未知のヌクレオチド除去修復因子が含まれていることを示唆している。現在、この因子の同定を進めるとともに、この因子がヌクレオソーム構造上の修復反応に特異的に要求されるものであるのかについて検討している。
ライム病ボレリアと媒介マダニの地域特性

オーストラリアに生息するボレリア媒介マダニ種の特定と分布状況、寄生ボレリアの分離培養と同定を目的として本研究を行った。シドニー市近郊でマダニ刺咬を受け遊走性紅斑を有する患者皮膚生検から分離したボレリアを免疫学的、分子生物学的に検討してBorrelia gariniiと同定した。ボレリア抗体陽性者が多く分布するシドニー市北部地域のマダニを採集した。すべてのマダニ個体をボレリア分離培養と直接PCRによるDNA増幅に供したがボレリア検出はできなかった。マダニ腸管内容物の顕微鏡観察で約5%にスピロヘータ様微生物が観察でき、通常の培地では増殖できない種類のスピロヘータであると考えられる。我々はマダニrRNA遺伝子のスペーサー領域塩基配列比較して定量的にIxodes holocyclusの系統分類をおこない、この種はフサマダニと近縁で、ライム病ボレリアや関連ボレリアを媒介するIxodes ricinus species種とは遺伝的に隔たりが大きいことを明らかにした。これはI. holocyclusがライム病ボレリアとは異なる種のスピロヘータを保有することを支持する。マダニ種とボレリア種の対応についてB. gariniiは、Ixodes属マダニ種のなかで比較的近縁なI. ricinusspeciesにのみ寄生でき、遺伝的に遠いマダニ種にはそれぞれ分化した別のボレリア種が寄生対応する。ITS2領域の配列による系統樹はI. holocyclusやフサマダニがIxodes属のなかでもっとも遠い位置にあることを示したが、フサマダニがB. gariniiを保有することが報告されているので、この結果とは矛盾するのでさらなる調査検討が必要である。オーストラリア国においてライム病原因ボレリアを保有媒介すると推定されるマダニの生態調査と捕獲を行った。さらにこれらのマダニからボレリアの分離培養と、マダニの遺伝的同定を行った。マダニの捕獲場所はシドニー市近郊のライム病様患者発生のみられる地域の公園、サンクチュアリー、リザーブ、牧場である。これらの地域において平成10年10月12日から19日の間に、6日間延べ10回の捕獲を行い、112匹のマダニを得た。内訳はLxodes属成虫61匹、若虫38匹、Amblyomma属成虫2匹、若虫3匹、幼虫2匹、不明マダニ種5匹である。オーストラリア国は砂漠が国土のほとんどを占め、樹木の生育がみられるのは南東部海岸地帯のみである。ライム病ボレリアを保有媒介するマダニ類は森林地帯を好み、供血動物の存在も必須であるためにこの国での分布地域は限られるが、この地域は同時にヒトの居住に適した場所でもある。このためこの地域での宅地開発が進み、マダニ生息環境は次第に限定縮小傾向にあり、マダニの分布密度は非常に疎であるとともに分布種も単純であった。マダニ優占種はIxodes holocyclusで、成虫5匹のITS2塩基配列比較からこれらの地域に生息するマダニはclonalであることが裏付けられた。すなわちこの調査地域ではマダニ生息地は飛び石的で、比較的広い場所では小脊椎動物が生息しておりそれぞれの発育段階のマダニが見らるが、狭い場所では成虫のみが生息する。公園、リザーブなど狭い場所では野鳥が供血動物となるとともにマダニの遠隔地運搬しているものと考えられる。得られたマダニからボレリアの分離培養を試みたが現在までにボレリア細菌は得られていない。