hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リンホカイン刺激を用いたリンホ-マ細胞のミエロ-マ細胞への変換の試み

中西は本研究により以下のことを明らかにした。CL-3細胞は,IL-5単独刺激をうけると一部抗体産生細胞に分化するが,最も高率に分化するためには、更にIL-2刺激が必要である。即ちIL-5は終末分化因子として作用するとともに、competent因子としての作用も有している。1.IL-2-competent状態の細胞は、(1)細胞容積の増大、(2)高親和性IL-2R数の増加、(3)結合した^<125>IーIL-2の内部移行の増強、(4)p75kDa-IL-2R蛋白に相当するバンドの増強、(5)p75kDa-IL-2RmRNAの発現の増強等を特徴としている。一方、2.抗体遺伝子と発ガン遺伝子発現との関係であるがIL-5刺激をうけると(1)μs-mRNAの発現増強とともに、(2)発現レベルは低いが有意なJ鎖mRNA発現がある。そのためIL-5刺激だけでもIgM産生細胞は誘導されるがそのレベルは低い。しかし更にIL-2刺激が加わると、(3)高親和性IL-2Rを介して細胞内にシグナルが伝達され、J鎖mRNAの発現が著明に増強され、極めて高率にIgM産生細胞が誘導される。我々は、この様な相互作用が、IL-5とIL-2の間で認められるB細胞分化における相乗的分化誘導作用の分子メカニズムではないかと考えている。(4)発ガン遺伝子であるc-mycとリンホカインの関係を解析したが、IL-5とIL-2で刺激され、形質細胞に変換すると、CL-3細胞内での発現は著明に抑制された。分化にともなう必然的なものか、c-myc発現の低下が細胞分裂能の喪失の直接の原因となるかは現在検討中である。最後に3.IL-6の作用であるが、IL-2と同様IL-5刺激をうけたCL-3細胞に作用して形質細胞に変換させる。即ち、マウスB細胞の分化において、IL-2と同様に終末分化因子としての作用を発揮するが、形質細胞腫への変換作用は認められない。IL-6刺激とc-mycの発現との相関を現在検討中である。
新規転写補助因子RMPによる転写制御とHBvX蛋白のトランス活性化

RNAポリメラーゼサブユニットRPB5がHBVX蛋白(HBx)と結合し、HBxのトランス活性化に関わる結果(EMBO.J.,1995)をもとに、HBxによる転写装置の修飾機構を検討した。本研究は転写装置と直接相互作用して転写を正又は負に修飾する転写制御の新しい局面を明らかにする研究である。得られた成果は、1)人為的プロモータを用いたin vitro及びin vivo転写系で、HBxは転写活性化能は示さず、転写補助因子能(Coactivator)を示し、種々の異なった転写活性化系にCoactivatorとして機能した。各種変異HBxを用いたcoactivator機能の必須領域はトランス活性化ドメインと一致し、精製はHBxはHeLa核抽出蛋白の内在性転写活性化因子の活性化転写を促進した(J.Biol.Chem.,1998)。これらの結果は、従来からのin vivoで報告されたトランス活性化はcoactivator能の結果であると推定された。2)RPB5結合蛋白がHBxの機能修飾と拮抗することを想定して、RPB5結合蛋白cDNAの単離を行い、新規のRMP(RPB5-mediating protein)を同定した(Mol.Cell.Biol.,1998)。RMPは、TBPやHBxとの結合能は示さず、RPB5と特異的に結合した。RMPの過剰発現はHBxトランス活性化に拮抗し、HBx非存在下で活性化転写を制御するCorepressor活性を示した。これらのRMPの転写抑制効果には、RPB5結合領域が必須であった。これらの結果は、RMPがHBxと機能的な拮抗因子であることを示唆した。
インタラクティブ映像メディア表現の構成学的研究

基礎的段階として、初年度・次年度にVJ表現やWebデザインの展開事例を実践研究として構成学的な観点から総括した。最終年度には、実践研究を継続するとともに、その源流を探る試みとして、バウハウスのルートヴィヒ・ヒルシュフェルト=マックによる「カラーライトプレイズ」を中心とする考察を行った。カラーライトプレイズは、ライトアートの美術史上のみならず、インタラクティブ映像メディア装置の源流として「カラーミュージック」の系譜のなかでも捉えられ、今日的な表現にまで至る、芸術と技術の融合による総合芸術的なあり方を確認することができ、初期バウハウスの「プロジェクト」が現在においても有効であることの例証となった。岩手大学教育学部研究年報において、「インタラクティブ映像メディア表現の構成学的研究に向けて-Webデザイン・コンテンツの展開事例とその基本原理の考察-」を掲載した。この論文は、本研究課題による初年度の準備的研究として考察した「VJ表現のメディアアートへの展開事例」と並行して、さらに「Webデザイン・コンテンツ」としての展開事例を対象に本研究課題の考察範囲を広げていくものであった。ここでWebデザイン・コンテンツを考察対象にするとはいえ、それを商業的な効果をもたらすためのノウハウや、卓越したサイトを制作するためのマニュアルとして扱うのではなく、一つの表現手段における構成学的な造形原理の問題として扱った。つまり,本研究課題に位置づけた「インタラクティブ映像メディア表現」の一つの存在形態として取り上げたものである。筆者が取り組んできたWeb上での制作事例を紹介し、その都度浮上してきた課題を整理しながら、その造形原理と表現としての展開の可能性について吟味した。内容構造としては、「はじめに」から、第1章「Webデザインの造形原理と表現の可能性」において、1マークアップによるWebデザイン、2Web標準とそれに準拠した制作事例、第2章「FlashによるWebデザインの可能性」において、1Happy Media Machineの構築、2Happy Media Machine以後のフルフラッシュ・サイト、第3章「Flashコンテンツのさらなる可能性」において、1アクションスクリプトによる造形、2AS3.0による構成主義抽象画の描画システム、最後の「まとめ」となっている。なお、第3章のAS3.0による構成主義抽象画の描画システムについては、初年度の「VJ表現のメディアアートへの展開事例」とも関連し、「A&T東北1021」イベント(芸術科学会東北支部)で成果発表を行った。最終年度の研究成果として、大学美術教育学会の学会誌である『美術教育学研究』において、拙稿「インタラクティブ映像メディア表現の構成学的研究-ルートヴィヒ・ヒルシュフェルト=マックによる「カラーライトプレイズ」の考察-」を発表した。本稿では、インタラクティブ映像メディア表現に関する源流を探る試みとして、バウハウスの学生及び教員であったルートヴィヒ・ヒルシュフェルト=マックによる「カラーライトプレイズ」を中心とする考察を行った。その際に、次の三つの観点を課題とした。1.近代におけるバウハウスの理念及び方法論に関する今日的な再評価、2.日本において未だ知名度の低い造形家・造形教育家ヒルシュフェルト=マックについての評価、3. VJ(ヴィジュアル・ジョッキー)表現及び広くインタラクティブ映像メディア表現に関する源流や造形原理の考察。バウハウスにおいてヒルシュフェルト=マックの開発したカラーライトプレイズは、ライトアートの美術史上のみならず、装置としての「カラーミュージック」の系譜のなかでも捉えることができる。その考察を通して、今日的な表現にまで至る、芸術と技術の融合による総合芸術的なあり方を確認することができ、初期バウハウスの「プロジェクト」が現在においても有効であることの例証となった。前年度までの成果は、「インタラクティブ映像メディア表現の構成学的研究」の基礎的段階として論文にまとめたが、その実践的な成果は、今年度に「イーハトーブ・バウハウスの実験」展(旧石井県令邸・盛岡市)の企画展を実施し、映像メディア作品や他者とのコラボレーションによる作品などを展示した。また、その記録はWebサイトとして公開している。インタラクティブ映像メディア表現については、VJ(ヴィジュアル・ジョッキー)、すなわち即興演奏的な映像表現についての造形原理を中心とした構成学的考察及び実践研究のうち、VJ表現の実践的検証を行うのが、本研究の初年度の課題であった。1. VJ表現の実践的検証については、これまでのVJ活動による表現技術の蓄積を示すものとして、岩手大学アートフォーラム主催による平泉国際交流展「アートでつなぐ」(2011年9月)のオープニングイベントに際して、野外での映像展示を実施した。音楽表現との融合において、VJ表現の基本的な技術との連動で作り出された映像を公開する好機となった。2.造形原理を中心とした構成学的考察については、「インタラクティブ映像メディア表現の構成学的研究に向けて- VJ表現のメディアアートへの展開事例とその基本原理の考察」(岩手大学教育学部年報)にまとめた。VJ表現の特質とその可能性について、VJは「インタラクティブ」な関係によって「リアルタイム」の映像生成をなす創造的な主体として捉えられることを示した。

また、VJ表現における造形要素的分析の基礎として、構成学的な美的構造は「カラーライト」(色光)、「モーション」(運動)、「サウンド」(音)、「インタラクティビティ」(対話性)、そして「リアルタイム」(同時性)であることを確認した。さらに「VJ表現のメディアアートへの展望」に関する実践の経緯をまとめるとともに、「プラネタリウムVJイベント」(盛岡市子ども科学館)、志波城古代公園映像ショー、「アート&テクノロジー東北2008」(INSアート&テクノロジー研究会)、「第3回岩手県公会堂アートショウ+(プラス)」(文化庁、岩手県公会堂アートショウ実行委員会)における展開の経緯を確認し、VJ表現のメディアアートとしての可能性を音楽との関連、表現する主体の観点で検証した。「研究実績の概要」で示した通り、本研究課題の計画に準じた成果を得ている。本研究課題は、実践研究を含んであり、その活動においても順調に進行しており、それが理論研究と相補的な関係を持ちつつ進行している。以下に記述した計画の内容については、一定の成果を得ているため。初年度においては、まず本研究課題の基礎的段階として、特にバウハウスやメディアアート関連の理論的な考察のための文献調査・資料収集を行いつつ、下記のような内容での実践研究も実施する。VJ表現の実践的検証として、音楽との関連性をもつ映像表現の造形原理について、その美的構造をなす光(色彩)、運動、音声、対話性、そして同時性等の観点から造形思考の発展的展開を試みる。ここでは、VJの実験的実演を通して、その美を織りなす構造に関与するライブの操作性に重点をおき、音楽との同期、ライブ感、インタラクティブ、リアルタイムという観点を実践的に検証していく。この操作においては、映像用機材とともにVJ専用のミキサーを使用する。造形原理に関する考察において、VJ表現に使用する基礎造形としての映像素材制作は、ミキサーによる映像の重なりやスイッチングによる切換を前提として作られる。その映像素材には、その場でのライブ映像、ビデオ撮影に基づく実写を編集加工したもの、2DのFlashアニメーションによるもの、3DCGによるものなどがあるが、それぞれの表現手段における特徴を抽出し、実制作を伴いながら実証的に内在する造形原理を明らかにしていく。今後は本研究課題の最終年度となるため、これまでに実施してきた研究の成果を再度見直すとともに、歴史上のバウハウスにおける映像表現の事例も理論研究として追加し、今日的な表現のあり方を追求するともに、歴史的な流れについても補完的に研究成果を出すつもりである。つねに実践研究と理論研究のバランスをとりながら、最後のまとめを行いたい。
^<31>P-,^1H-MRSによる虚血再潅流時の腎代謝に及ぼす高血糖の影響の解析

腹部大動脈瘤に対する外科手術を受ける患者の約10%は糖尿病を合併すると言われているが、高血糖が大動脈遮断による腎虚血にどう影響するかの報告はない。そこで今回大動脈遮断によるラット腎の虚血再潅流に及ぼす高血糖の影響を燐核磁気共鳴法を用いて、高エネルギー燐酸化合物や細胞内pHの変化から検討した。高血糖群は50%糖液を対照群は生理的食塩水をそれぞれ6ml/kg、腎虚血作製30分前に腹腔内投与し作成した。腎虚血前の血糖値は高血糖群で301mg/dl、対照群で122mg/dlであった。虚血開始30分後には、細胞内pHは対照群の6.37に比べて高血糖群では6.23と有意に低下し、再潅流後も回復が遅延した。一方エネルギー代謝には両群に有為差はなかったが、両群とも虚血前値には回復しなかった。今回の結果より、虚血前の高血糖により虚血再潅流時にアシドーシスの遷延、エネルギー代謝の回復遅延が認められた。これは腎のNa^+-^+ATPaseに代表される尿細管機能の低下を引き起こし、細胞内にNaが増加し、細胞が膨化し、細胞機能が低下し腎障害に進展していくと思われる。そこで、この推測を証明するために申請者は現在ナトリウム核磁気共鳴法を用いて、虚血時に細胞内ナトリウムが増加するかどうかを検討している。
関節リウマチの病態形成における炎症性組織再構築メカニズムの統合的理解

関節リウマチでは炎症性の骨吸収が過剰にとなる。本研究においては、種々の臓器における炎症と病態形成メカニズムのリンクを明らかとすることで関節リウマチにおける特異的な骨破壊機序に迫り、NFkB分子の新規活性化メカニズムの解明(Nature Immunol 2012; Cell Reports 2012; Blood 2016)、臓器の炎症性線維化に関わる細胞サブセットの同定(PNAS 2014)、イオン透過性チャネルやアクチン結合タンパク質の骨代謝における役割の解明(Science Signaling 2016; Scientific Reports 2017)などの成果を得て報告した。硬組織の健常性維持には、骨の生成と吸収の均等なバランスが重要であるが、関節リウマチの骨量減少病態においては、骨形成にくらべて破骨細胞性の骨吸収が過剰になり、次第に骨構造が侵される。これまでの骨代謝研究では破骨細胞と骨芽細胞のバランスのみが注目されがちであったが、真に骨量減少病態を理解するには、炎症によって誘導される他の細胞系列との相互関係も考慮する必要がある。今年度は、(1)関節リウマチの病態形成に関与する細胞群の同定をほぼ完了するとともに、(2)同定された各々の細胞の発現するmRNAや蛋白質についての検討を推進した。また、(3)上記より得られた知見をもとに、種々の因子が間葉系幹細胞に与える影響についての解析を行い、間葉系細胞の分化に関連する重要因子(候補)を同定した。また、(4)同定された因子につき、loss-of-function実験による機能解析をおこなった。これらにより、関節リウマチの病態発症時に、種々の関連細胞が骨内という特殊な微小環境の中でどのように連関して組織破壊と組織再構築を行っているか、その礎となる知見が得られつつある。現在、関節リウマチ誘導動物モデルを用いた実証実験を開始している。硬組織の健常性維持には、骨の生成と吸収の精緻なバランスが重要であるが、関節リウマチの骨量減少病態においては、骨形成にくらべて破骨細胞性の骨吸収が過剰になり、次第に骨構造が侵される。これまでの骨代謝研究では破骨細胞と骨芽細胞のバランスのみが注目されがちであったが、真に骨量減少病態を理解するには、炎症によって導かれる他の細胞系との相互関係をも考慮する必要がある。前年度までに、(1)関節リウマチに関与する細胞群の深い理解を目指し、動物モデルを利用することで、病態形成に重要と目される細胞の特性解析を行い、(2)同定された細胞系列が発現するmRNAや蛋白質についての検討や、(3)その中から重要と考えられる因子についてloss-of-function実験等による機能解析を行うことで、関節リウマチの病巣部位、特に、骨付近の微小環境にて、種々の関連細胞がどのように連関して、組織破壊と組織再構築を行っているかを検討してきた。本年度は、病変部位に局在して病態形成を促進すると目される細胞群をin vitroで誘導する実験系を用いて、その性質をより詳細に明らかとするとともに、得られた細胞が発現する種々の因子に対して、これを認識するポリクローナル抗体の作成を行って、組織での発現等について検討を加えた。さらに引続き、ノックダウン手法等による、関節リウマチモデル動物を用いた治療的検討を行うことで、得られた知見の生体における意義や妥当性について明らかとする予定である。当該年度において、関節リウマチの病態形成に関与する細胞群の同定や間葉系細胞の分化機序に密接に関与する因子の特定が順調に進んだことは、計画以上の進展だと言える。一方、特定された因子の個体レベルでの検討がまだ不十分であることなどを含めて総合的に考え、全般的な達成度については、「おおむね順調に進展している」が妥当であると判断した。病態解析学、免疫学現在までの解析結果を考慮すると、研究方針に大きな変更を加える必要はないと考えられたため、引続き、関節リウマチの病態形成にかかわる細胞群の相互作用や、あるいは、内部分子メカニズムについての解析を重点的に押し進めることで、当初の計画に基づく、細胞間相互作用を考慮した関節リウマチの病理解明を目指す。当該年度において、関節リウマチの病態形成に関与する細胞群の同定や間葉系幹細胞の分化機序に密接にかかわる因子の同定が順調に進んだことは、計画以上の進展だと言えるが、まだ生化学的・分生成物学的な検討が不十分であることなどを含めて総合的に考え、全般的な達成度については「2おおむね順調に進展している。」を選択した。共同研究者との打合せ費用を勘案して旅費を計上していたが、遠隔地会議システムの導入により、会議の一部を遠隔地会議で行うことができたため研究費の旅費使用が大幅に減じた。また、研究計画の遂行のために研究委託を行うことを計画していたが、使用が簡便なキット類を使うことにより、現状の人員で対応できたため、当初計画よりも人件費や謝金における研究費使用が大幅に減少した(ただし、物品費への充当は増えている)。

以上のような理由により次年度使用額が生じた。現在までの解析結果を考慮すると、研究方針に大きな変更を加える必要はないと考えられたため、関節リウマチの病態形成にかかわる細胞群の相互作用や、あるいは内部分子メカニズムについての解析を重点的に研究を押し進めることで、当初の計画通り、細胞間相互作用を考慮した関節リウマチの病理解明を目指す。上述の理由により生じた次年度使用額分の研究費については、トランスクリプトーム解析やプロテオーム解析のための試薬や、必要な抗体の購入費として、平成27年度に有効に利用する。共同研究者との打合せ費用を勘案して旅費を計上していたが、所属研究機関への遠隔地会議システムの導入により、会議の一部を遠隔地会議で行うことができたため研究費の旅費使用が大幅に減じた。また、研究計画の遂行のために実験補助員を雇用する予定であった測定実験について、使用が簡便なキット類を使うことにより、現状の人員で対応できたため、当初計画よりも人件費や謝金における研究費使用が大幅に減少した(ただし、物品費への充当は増えている)。上述の理由により生じた次年度使用額分の研究費については、トランスクリプトーム解析やプロテオーム解析のための試薬や、必要な抗体の購入費として、平成26年度以降に有効に利用する。
T細胞アナジー誘導によるアレルギー炎症の制御

短期間に大量のアレルゲンを投与する急速減感作療法の成績から、治療早期にTh2型細胞の無応答性が誘導できる知見を得た。この無応答性のメカニズムを解析する目的で試験管内で種々のアレルゲン量を投与し、T細胞がどのように反応するかを検討した。ダニおよびネコアレルゲンに過敏な喘息患者より抹消血単核球を採取し、抗原量による反応性の相違を検討した。低濃度のアレルゲン投与では増殖反応を惹起しないが,IL-4産生を強く誘導し、さらに至適アレルゲン量で二次培養すると強い二次増殖を示し,IL-4,IL-5を産生した。一方、大量抗原を投与した場合には、一次培養時高い増殖反応を示すが、二次培養では増殖反応を示さず,IL-4,IL-5,IL-10,IFN-γとTh1,Th2サイトカイン両者とも産生しなかった。同様の反応性は猫毛の主要アレルゲンであるFeldI特異的Th2細胞株でも示された。大量抗原曝露後無応答になったT細胞の応答性はIL-2の投与で回復し、少なくとも一部の細胞はいわゆるアナジー状態に陥っていることが示唆された。無応答に陥った細胞はCD28の発現の低下は認めず、さらに抗CD28抗体の投与によっても無応答性は解除できなかった。FeldI高濃度曝露後、抗原特異的T細胞株を樹立し、FeldIの主要エピトープであるPC1とPC2の反応性を検討したが、通常の方法で樹立した場合と主要エピトープに対する反応性に差異はなかった。以上より、大量アレルゲンを投与することにより、Th2型細胞にいわゆるアナジー類似状態を誘導で急速減感作療法でTh2型細胞の無応答性を誘導できた一つの要因であることが示唆された。またアレルギー惹起性の主要エピトープ反応性T細胞に大量の主要エピトープペプチドを投与することによりアナジーが誘導できることが明らかになった。暴露するアレルゲン量により、Th2、Th1型反応を制御できる可能性が報告されている。さらに、我々は急速減感作療法の前後でダニ抗原特異的T細胞株の機能を解析し、急速減感作療法により、Th2型細胞の無応答性を誘導できる知見を得た。そこで、大量抗原を投与することにより、T細胞の反応性をどのように制御できかin vitroで検討を試みた。活動性気管支喘息患者より、末梢血リンパ球を採取し、500μg/mlの大量ダニ抗原または10-1μg/mlの至適抗原量と共に一次培養を10日間行った。洗浄後24-48時間静止化した後、至適量の抗原刺激を加えた。二次培養時の増殖反応及びサイトカイン産生性、転写因子活性(AP-1,NF-_kB)を比較検討した。至適抗原量で一次培養した場合は著明な2次反応を認め、IL-5、IL-4を産生したのとは異なり、大量抗原で一次培養すると、二次培養時、増殖反応およびサイトカイン産生(IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ)は認めなかった。この無応答性はIL-2で解除され、細胞死の誘導ではないことが示された。さらに、抗原特異的な細胞の反応をより詳細に検討する目的でネコ毛の主要アレルゲンであるFeld1特異的T細胞株を作成し、大量抗原暴露の効果を検討し、同様の無応答性の成立を認めた。

また、両細胞のCD28抗原発現には差異がなく、大量抗原による無応答性の誘導は抗CD28抗体の投与によって解除されなかった。さらに、転写因子活性を検討すると、大量抗原投与群にAP-1の発現の著明な低下が認められた。抗原提示細胞存在下で、大量抗原を投与する事により、Th2型細胞にアナジー類似状態を誘導できることが明らかになった。短期間に大量のアレルゲンを投与する急速減感作療法の成績から、治療早期にTh2型細胞の無応答性が誘導できる知見を得た。この無応答性のメカニズムを解析する目的で試験管内で種々のアレルゲン量を投与し、T細胞がどのように反応するかを検討した。ダニおよびネコアレルゲンに過敏な喘息患者より末梢血単核球を採取し、抗原量による反応性の相違を検討した。低濃度のアレルゲン投与では増殖反応を惹起しないが、IL-4産生を強く誘導し、さらに至適アレルゲン量で二次培養すると強い二次増殖を示し、IL-4,IL-5を産生した。一方、大量抗原を投与した場合には、一次培養時高い増殖反応を示すが、二次培養では増殖反応を示さず、IL-4,IL-5,IL-10,IFN-γとTh1,Th2サイトカイン両者とも産生しなかった。同様の反応性は猫毛の主要アレルゲンであるFeldI特異的Th2細胞株でも示された。大量抗原曝露後無応答になったT細胞の応答性はIL-2の投与で回復し、少なくとも一部の細胞はいわゆるアナジー状態に陥っていることが示唆された。無応答に陥った細胞はCD28の発現の低下は認めず、さらに抗CD28抗体の投与によっても無応答性は解除できなかった。FeldI高濃度曝露後、抗原特異的T細胞株を樹立し、FeldIの主要エピトープであるPC1とPC2の反応性を検討したが、通常の方法で樹立した場合と主要エピトープに対する反応性に差異はなかった。以上より、大量アレルゲンを投与することにより、Th2型細胞にいわゆるアナジー類似状態を誘導で急速減作療法でTh2型細胞の無応答性を誘導できた一つの要因であることが示唆された。またアレルギー惹起性の主要エピトープ反応性T細胞に大量の主要エピトープペプチドを投与することによりアナジーが誘導できることが明らかになった。
MHCクラスI遺伝子の分子進化と多型性獲得機構の解明

MHC分子群は、古典的MHC分子におけるペプチド結合ドメインに相当するドメインが、ユニークな構造を有している。このドメインの由来は現在の所全く不明である。従って、MHC分子群の生成機構は謎に包まれている。分子構造に基づき、クラスIとクラスIIに分類されるが、両クラスの分岐がいつどの様に生じたのかに関しても、明らかになっていない。軟骨魚類は、MHC分子等、獲得免疫機構で活躍する主要分子を擁していることが明らかとなっている最も原始的な動物であり、脊椎動物における免疫機構の確立において重要な位置を占めている動物である。本研究で対象とする軟骨魚類MHC遺伝子群は、現在、単離されているMHC遺伝子群の中で最も原始的な生物由来である。1.MHC遺伝子群の解析による多様性の解明。軟骨魚類より単離した複数のMHCクラスI関連遺伝子の遺伝子座に関する解析を行なった。MHC関連遺伝子の数種類が、リンクして存在する結果が得られた。2.軟骨魚類のMHCクラスI遺伝子の多型性に関しては、詳細な報告を行なってきたが、硬骨魚類のクラスI遺伝子の多型性に関する解析を行なった。ペプチド結合ドメインの組み合わせにより、ペプチド結合領域の多様性が生じていることが判明した。その程度は、脊椎動物の中においても非常にユニークであると考えられる。3.MHCクラスI関連遺伝子の分子進化を探求するために、MR1分子に関する解析を行なった。重鎖と軽鎖が会合することを明らかにし、発表した。軟骨魚類は、獲得免疫機構で活躍する主要分子を擁していることが明らかとなっている最も原始的な動物であり、脊椎動物における免疫機構の確立において重要な位置を占めている動物である。本研究で対象とする軟骨魚類MHCクラスI遺伝子は、現在、単離されているMHCクラスI遺伝子の中で最も原始的な生物由来である。1.軟骨魚類MHCクラスI遺伝子の遺伝子構造の解明。解析対象として、既にMHCクラスI遺伝子cDNA塩基配列が判明しており、Trsc-UAAのα2ドメインに2種類のlineageを有し、Trsc-UBA遺伝子をも有する軟骨魚類サメ個体を選択した。その血球DNAより調製したgenomic libraryをスクリーニングし、MHCクラスI遺伝子陽性genomicクローンを単離した。対立遺伝子及び遺伝子座が異なるMHCクラスI遺伝子のクローンを選別し、それらの塩基配列を決定した。得られた軟骨魚類MHCクラスI遺伝子構造と、他の脊椎動物から報告されているMHCクラスI遺伝子構造との比較を行ない、exon/inron構造の保存性について検討した。また、転写開始領域を解析し遺伝子発現調節に重要な5'領域のDNA塩基配列について解析した。MHCクラスI遺伝子では、複数の遺伝子調節配列が存在していることが知られており、これらの有顎脊椎動物における普遍性について検討した。2.MHC関連遺伝子群の解析による多様性の解明。軟骨魚類より単離した複数のMHCクラスI関連遺伝子のcDNA及びgenomcクローンを基に決定された塩基配列を古典的MHCクラスI遺伝子及び他のMHC関連遺伝子と比較検討した。また、これらのMHC関連遺伝子の遺伝子座と古典的MHC遺伝子座との関係を明らかにした。MHC関連遺伝子の数種類と古典的MHC遺伝子とはリンクしない結果が得られた。本研究で対象とする軟骨魚類MHC遺伝子群は、現在、単離されているMHC遺伝子群の中で最も原始的な生物由来である1.MHC遺伝子群の解析による多様性の解明。

MHC関連遺伝子の数種類が、リンクして存在する結果が得られた。2.軟骨魚類のMHCクラスI遺伝子の多型性に関しては、詳細な報告を行なってきたが、硬骨魚類のクラスI遺伝子の多型性に関する解析を行なった。ペプチド結合ドメインの組み合わせにより、ペプチド結合領域の多様性が生じていることが判明した。その程度は、脊椎動物の中においても非常にユニークであると考えられる。3.MHCクラスI関連遺伝子の分子進化を探求するために、MR1分子に関する解析を行なった。重鎖と軽鎖が会合することを明らかにし、発表した。
ヘッジホッグシグナル伝達におけるFusedの機能解析

昨年度に引き続き、ヘッジホッグシグナル伝達の負の制御因子Sufuが、キナーゼGSK3βを転写因子Gli3にリクルートすることによって、Gli3のプロセシング(転写抑制因子の生成)に寄与する可能性について検討した。今回、Sufuのノックアウトマウス由来の繊維芽細胞におけるGli3のプロセシングの有無を調べたところ、Sufuのノックダウンと同様に(昨年度)、プロセシングが阻害されており、またレトロウイルスを用いてSufuの発現を戻すと、プロセシングが再び観察されることがわかった。この結果はGli3プロセシングにおけるSufuの重要性を強く示唆している。またSufuのΔGSK変異体(Gli3と結合するが、GSK3βとは結合しない変異体)を用いて、GSK3βによるGli3のリン酸化における、Sufuの効果を調べたところ、野生型Sufuで見られていたリン酸化促進効果がΔGSK変異体では見られないことがin vitroおよび細胞内で観察された。これらの結果および、SufuのΔGSK変異体ではSufuノックダウンによるGli3プロセシングの阻害が救済されないという結果(昨年度)は、冒頭の仮説を強く支持するものであり、本研究成果はSufuの機能解析に大きく貢献することができたと考えられる。ショウジョウバエにおいてはキネシン用蛋白質Cos2が転写因子Ciのプロセシングに必要なキナーゼをリクルートし、Sufuはほとんど機能していないと考えられている。一方、哺乳類ではCos2のホモログはヘッジホッグシグナルに寄与していないと考えられている。興味深いことに、哺乳類SufuのGSK3β結合部位のアミノ酸配列はショウジョウバエSufuでは保存されていない。本研究によって、哺乳類Sufuは進化の過程でCos2の機能を相補するようになったのではないか、ということも推測される。はじめに、Fusedの安定発現細胞株を樹立し、Fusedの最も主要な結合タンパク質としてCdc37/Hsp90を同定した。さらに、Fusedに対する抗体を作成し、内在性のFusedとCdc37との結合を免疫沈降法により確認した。Cdc37あるいはHsp90の阻害剤を用いたところ、Cdc37/Hsp90がFusedの存在量が減少することがわかり、Cdc37/Hsp90がFusedの安定化に非常に重要な働きを持つことを明らかにした。Fusedはショウジョウバエにおいてhedgehogシグナルを正に制御することが知られているが、ほ乳類では機能がよくわかっていない。そこで、Fusedの転写因子Gliに対する機能をルシフェラーゼアッセイによって調べた。すると、Fusedの共発現によってGli1,Gli2のレポーター活性が増強されることがわかった。このときGli1,Gli2の存在量が、それぞれ単独で発現させた時に比べて増加することもわかった。また、このGli1,2に対するFusedの効果は、Hsp90の阻害剤geldanamycinによるFusedの分解で打ち消されることもわかった。これらの結果から、FusedにGli1,Gli2を安定化する働きがあることが示唆された。hedgehogシグナルの亢進はヒト癌化と関連していることが報告されている。FusedがGliを正に制御することが先の実験により示唆されたため、癌細胞に対するFusedの機能阻害の効果を次に調べた。Hedgehogシグナルが元進していると報告されている、ヒト前立腺癌の細胞株PC3をgeldanamycinで処理すると、PC3細胞の増殖が抑えられることがBrdUの取り込み実験によりわかった。さらに、Gli1を安定に発現するPC3細胞株ではgeldanamycinの効果が弱まることもわかった。これらの結果は、Fusedが抗癌剤開発の新たな分子標的となりうる事を示唆している。そして、以上の研究成果を論文に発表した(Kise et al.,2006)。Sufuは哺乳類Hhシグナルの主要な負の制御因子である。細胞内強制発現系において、Gliに結合してその核移行を抑制することが報告されているが、内在性のSufuがいかにしてGliを抑制しているのかについては未だにわかっていない。そこで内在性Sufuの機能を調べるために10T1/2細胞においてSufuのノックダウンをおこなったところ、Gli3のプロセシングが抑制されている事を見出した。一方、私たちの研究室は以前にsufuの新規結合蛋白質としてGsK3bを同定している。GsK3bはGli3をリン酸化し、転写抑制因子へのプロセシングに必須の分子である。そこで私は、GsK3bによるGli3のリン酸化におけるsufuの効果を検討した。ln vitroキナーぜアッセイを行ったところ、Sufuの存在化でGSK3bによるGli3のリン酸化が促進される事がわかった。次にsufu,Gli3,GsK3bの複合体形成について解析したところ、GsK3bがsufu依存的にGli3と三者複合体を形成することがわかった。GSK3bのSufu結合部位を詳細に詰め、GSK3bとは結合しないが、Gli3との結合を保持しているsufuの変異体sufu(ΔGsK)を作成した。次にノックダウン耐性の野生型Sufu(WT)、変異型Sufu(ΔGSK)を安定に発現する10T1/2細胞株をそれぞれ作成し、Sufuのノックダウンを行ったところ、Sufu(WT)発現細胞ではGli3のプロセシングがレスキューされたのに対して、Sufu(ΔGSK)発現細胞ではレスキューされなかった。

これらの結果は、sufuがGsK3bをGli3にリクルートすることによってGli3のリン酸化、その後のプロセシングを促進することを強く示唆している。そして本研究によってSufuによるGliの抑制機構の一端を明らかにする成果が得られた。昨年度に引き続き、ヘッジホッグシグナル伝達の負の制御因子Sufuが、キナーゼGSK3βを転写因子Gli3にリクルートすることによって、Gli3のプロセシング(転写抑制因子の生成)に寄与する可能性について検討した。今回、Sufuのノックアウトマウス由来の繊維芽細胞におけるGli3のプロセシングの有無を調べたところ、Sufuのノックダウンと同様に(昨年度)、プロセシングが阻害されており、またレトロウイルスを用いてSufuの発現を戻すと、プロセシングが再び観察されることがわかった。この結果はGli3プロセシングにおけるSufuの重要性を強く示唆している。またSufuのΔGSK変異体(Gli3と結合するが、GSK3βとは結合しない変異体)を用いて、GSK3βによるGli3のリン酸化における、Sufuの効果を調べたところ、野生型Sufuで見られていたリン酸化促進効果がΔGSK変異体では見られないことがin vitroおよび細胞内で観察された。これらの結果および、SufuのΔGSK変異体ではSufuノックダウンによるGli3プロセシングの阻害が救済されないという結果(昨年度)は、冒頭の仮説を強く支持するものであり、本研究成果はSufuの機能解析に大きく貢献することができたと考えられる。ショウジョウバエにおいてはキネシン用蛋白質Cos2が転写因子Ciのプロセシングに必要なキナーゼをリクルートし、Sufuはほとんど機能していないと考えられている。一方、哺乳類ではCos2のホモログはヘッジホッグシグナルに寄与していないと考えられている。興味深いことに、哺乳類SufuのGSK3β結合部位のアミノ酸配列はショウジョウバエSufuでは保存されていない。本研究によって、哺乳類Sufuは進化の過程でCos2の機能を相補するようになったのではないか、ということも推測される。
完全拘束系の量子論とその重力理論への応用

平成8年度から平成10年度までの期間に行った研究で得られた成果は以下の通りである。1)局所一様系の正準構造:コンパクトな3次元空間上の局所一様系に対して,初期データの微分同相類全体が作る相空間の正準構造を決定する一般的手続きを与え,モジュライ自由度が運動の保存量となることを示した.さらに,この一般論を用いて,ThurstonタイプがE^3,Nil,Solの純粋重力系の正準構造を完全に分類し,正準構造がモジュライセクターでしばしば退化することを見いだした.2)量子Bianchiモデル:1)の結果に基づいて,コンパクトな空間を持つE^3型時空の量子論的ダイナミクスを,研究代表者の提案した新しい理論形式(Web理論)を用いて解析し,従来のWheeler-DeWitt方程式に基づく議論と比較した.最も重要な成果は,Web理論での量子ダイナミクスは一般にはWheeler-DeWitt方程式の解ではなく,その一種の超関数的拡張により記述されることを明らかにした点である。3)膨張宇宙におけるスカラ場の摂動論:空間的に一様等方な膨張宇宙の背景でのスカラ場と重方場からなる系のゲージ不変摂動論の構造を詳しく調べ,摂動解の長波長極限と一様なモデルの一様摂動の対応関係を一般的に明らかにした.さらに,この対応関係を用いて,インフレーション直後の宇宙再加熱時での超ホライズンスケールのゆらぎの進化を解析的に調べ,この時期におけるBardeenパラメーターの保存則を確立した.4)ブラックホール熱力学:エンタングルメントというアイデアに基づいて,平坦な時空およびブラックホール時空上での量子スカラ場に対してエンタングルメント熱力学を構成し,それがブラックホール時空に対しては古典的なブラックホール熱力学と同じ構造を持つことを示した.平成8年度から平成10年度までの期間に行った研究で得られた成果は以下の通りである。3)膨張宇宙におけるスカラ場の摂動論:空間的に一様等方な膨張宇宙の背景でのスカラ場と重方場からなる系のゲージ不変摂動論の構造を詳しく調べ,摂動解の長波長極限と一様なモデルの一様摂動の対応関係を一般的に明らかにした.さらに,この対応関係を用いて,インフレーション直後の宇宙再加熱時での超ホライズンスケールのゆらぎの進化を解析的に調べ,この時期におけるBardeenパラメーターの保存則を確立した.4)ブラックホール熱力学:エンタングルメントというアイデアに基づいて,平坦な時空およびブラックホール時空上での量子スカラ場に対してエンタングルメント熱力学を構成し,それがブラックホール時空に対しては古典的なブラックホール熱力学と同じ構造を持つことを示した.本年度は研究計画に従って、主に有限自由度重力系について研究し、次のような成果を得た。1.(2+1)次元重力系:4次元局所一様時空のダイナミクスを調べる準備として、空間が2次元トーラスとなる場合に対して、3次元局所一様時空に対する微分同相変換で不変な状態空間の構造を調べ、それがレンズ空間型の軌道体特異点を持つことを示した。2.4次元局所一様時空(古典論):4次元局所一様時空に対する微分同相変換不変な位相空間の一般的な構成法を、サ-ストンの定理を基礎として、普遍被服空間上の正準データとモジュライの分類という視点から与え、空間が3次元トーラスとなる場合に対して、位相空間を具体的に構成した。それにより、位相空間が、3次元局所一様系と同様、レンズ空間型の軌道体特異点を持つこと、その上の正準構造がVII(0)型の場合モジュライ自由度の部分で退化することを確認した。このことは、すでに東工大のグループにより示されているが、さらに、この退化する自由度がモジュライ変数のうち、局所一様群を保存しないモジュライの変形の自由度と一致すること、また、それらが時空の局所一様性の保存という外的な整合性条件で決まることを示した。これは、局所一様系が正準的に閉じていないことを意味している。3.4次元局所一様時空(量子論):トーラス上の局所一様系より得られる完全拘束系の量子論を構成し、最近提案した新しい定式化を用いてそのダイナミクスを調べた。まず、ハミルトン拘束作用素がもっとも自然なラプス関数に対して無限個の自己共役な拡張を持つことを示し、各自己共役な拡張に対して、スペクトル分解を用いて対応する物理的非因果部分空間とその間の因果写像を決定した。特に、新しい定式化では、通常の波動関数に当たる量がWheeler-DeWitt方程式の解とはならず、その超関数的極限となることを見いだした。

以上の成果については現在論文を作成中である。また、これらと平行して、インフレーション宇宙モデルでのゆらぎの進化、およびブラックホール熱力学についての研究を行い、成果を論文として発表した。本年度は、昨年度の有限自由度重力系について研究を発展させると共に、無限自由度系の正準構造と密接に関連する、一様膨張宇宙における線形摂動とブラックホール熱力学の2つの問題を研究した。得られた成果は次の通りである。1.4次元局所一様時空:本年度は、昨年度の研究を発展させ、サ-ストンタイプがE^3型、Nil型、Sol型のコンパクトな空間を持つ局所一様重力系の相空間とそのシンプレクティック構造およびハミルトニアンを、すべての可能なトポロジーと局所一様群に対して決定した。これにより、SL_2R型を除いて、自明でないモジュライ自由度を持つすべてのコンパクト局所一様重力系の正準構造が決定されたことになる。特に、この解析の結果として、昨年度トーラス上のVII(0)型系で見いだした、シンプレクティック構造のモジュライセクターでの退化が他の系でもしばしば起こることを見いだした。さらに、ラプス関数が一様という条件下で、どのようなコンパクト局所一様系でもモジュライ自由度が力学的に凍結することを証明した。2.膨張宇宙における線形摂動:平坦な空間を持つ一様等方宇宙における線形摂動の長波長極限と、完全に一様等方な有限自由度系に対する摂動との関連を詳しく分析し、それらの対応関係を一般に明らかにした。特に、物質が多成分スカラ場からなる系に対しては,一個のモードを除くと、両者が一致することを示した。3.ブラックホールの熱力学:ブラックホール熱力学と量子重力理論との関係を明らかにするために、球対称ブラックホール時空上で量子スカラ場に対するエンタングルメント熱力学を構成し、温度を含めて、エンタングルメント熱力学がブラックホール熱力学と同じ構造を持つことを示した。以上の成果のうち、1)についてはすでに論文を発表した(研究発表参照)。また、2)、3)については現在論文を投稿中である。本年度は、無限自由度系の例として、アシュテカグループにより発展させられたループ重力理論の構造の分析および、昨年度の研究の継続として、無限自由度系の正準構造と密接に関連する、一様膨張宇宙における線形摂動とブラックホール熱力学の2つの問題を研究した。研究の詳しい内容と成果は次の通りである。1.ループ重力:ルーブ重力理論における量子古典対応を見るために、負の宇宙項を持つ(2+1)次元ブラックホール解(BPZ解)に対応する時空におけるループ変数の正準構造の分析を行った。この研究は現在続行中である。2.膨張宇宙における線形摂動:平坦な空間を持つ一様等方宇宙における線形摂動の長波長極限が、一様等方な有限自由度系に対する摂動により完全に決定されることを昨年度の研究で示したが、本年度はこのことを用いて、インフラトンが多成分スカラ場で記述される系に対して、宇宙再加熱時での長波長揺らぎの振る舞いを調べた。結果として、バーディーンパラメーターの保存がこの場合にも良い近似で成り立つことが示した。
イオンチャンネルセンサーの実試料への応用のための新規検出法と膜化学

薄い液膜(厚さ数マイクロメートル)を貼り付けた電極に基づいたICSの新しい原理イオンチャンネルセンサー(ICS)で一般的に用いられる単分子膜を修飾した電極ではなく,イオノフォアを含む液膜で表面を覆われた電極を作製することにより,電気化学活性マーカーを試料溶液中に溶かし込むことなしにピコないしナノmol/Lレベルの検出が可能になると考えられる.電気化学活性マーカーとしては,H+イオノフォアferrocenemethylamine誘導体FMを用いる.電気化学無活性のイオノフォアはバリノマイシンを用いる.液膜作製には電気化学活性と電気化学無活性イオノフォアだけではなく,可塑剤,高分子量のPVCを用いる.液膜が金電極表面に良く貼り付くように,金電極表面に予めアルカンオールの単分子膜を修飾しておく.液膜は,上述の物質を溶かしたテトラヒドロフラン溶液を,チオール単分子膜修飾金電極上にコートすることにより形成させる.四つの可塑剤の膜を使って電気化学活性マーカーFMの選択制はBEHS膜中で一番高いと分った。K+よりH+に百億倍以上応答している。現在、微少料の酸化されたFMを合成するためにNOBF4を使って、ferroceniumとferroceneを含む膜を作り、電位差測定モードとインピーダンス測定モードを比較している。オリゴヌクレオチドの相補性の検出:10塩基からなるペプチド核酸(peptide nucleic acid,PNA)単分子膜を修飾した電極を用いて,相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを10-6Mレベルで検出することに成功した.また,一塩基変異を持つオリゴヌクレオチドとの間で選択的に検出することも示した.薄い液膜(厚さ数マイクロメートル)を貼り付けた電極に基づいたICSの新しい原理イオンチャンネルセンサー(ICS)で一般的に用いられる単分子膜を修飾した電極ではなく,イオノフォアを含む液膜で表面を覆われた電極を作製することにより,電気化学活性マーカーを試料溶液中に溶かし込むことなしにピコないしナノmol/Lレベルの検出が可能になると考えられる.電気化学活性マーカーとしては,H+イオノフォアferrocenemethylamine誘導体FMを用いる.電気化学無活性のイオノフォアはバリノマイシンを用いる.液膜作製には電気化学活性と電気化学無活性イオノフォアだけではなく,可塑剤,高分子量のPVCを用いる.液膜が金電極表面に良く貼り付くように,金電極表面に予めアルカンオールの単分子膜を修飾しておく.液膜は,上述の物質を溶かしたテトラヒドロフラン溶液を,チオール単分子膜修飾金電極上にコートすることにより形成させる.四つの可塑剤の膜を使って電気化学活性マーカーFMの選択制はBEHS膜中で一番高いと分った。オリゴヌクレオチドの相補性の検出:10塩基からなるペプチド核酸(peptide nucleic acid,PNA)単分子膜を修飾した電極を用いて,相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを10-6Mレベルで検出することに成功した.また,一塩基変異を持つオリゴヌクレオチドとの間で選択的に検出することも示した.
ポ-セレン修復物作製のためのアルミナ系耐火模型材の結合材について

ポ-セレンを支台歯模型材に取り付けたまま焼成するための耐火模型材の開発を試みているが、本研究ではアルカリ土類酸化物ーアルミナ系複合粉末に室温で硬化する結合材を用いた場合の反応や物性などの検討をおこなった。結合材にはリン酸水溶液、リン酸二水素アンモニウム、アルミナゾルの3種を使用した。しかし、リン酸二水素アンモニウムを用いると加熱時の収縮が、アルミナゾルの場合は硬化時の乾燥収縮が大きくなり、耐火模型材の結合材としては問題が生じた。またアルカリ土類酸化物は数種の使用を試みたが、結合材との組合せから基材粉末には酸化亜鉛ーアルミナ系配合物を、結合材にはリン酸水溶液を用いた結果を中心に記述する。等モル比の酸化亜鉛ーアルミナ複合粉末をリン酸水溶液で練和した場合、濃度3050%では反応が激しいため、短時間で硬化したが、高濃度や低濃度の場合は適度な硬化時間となった。硬化体の昇温下における寸法変化を調べた結果、リン酸の濃度が高くなるにつれて反応膨張が低下する傾向がみられた。しかし、濃度15%までは1300°C焼成でも焼成体は原形より小さくならないことがわかった。また濃度60%以上ではガ-ナイトの生成による反応膨張はみられなかった。硬化体および焼成体の強さは高濃度の練和液を用いた方が高くなる傾向を示した。リン酸濃度10%の焼成体は6MPaの曲げ強さが得られた。硬さを微小硬度計で調べた結果、硬化体の硬さは普通石膏よりも高く、硬石膏より低い値を示した。また焼成体の硬さは硬化体より高く、ビッカ-ス硬度(Hv)約40を得ることができた。以上の結果から、結合材の濃度や配合比を調整することにより原形と寸法差の生じず、しかも充分な硬さと強さを有する耐火模型材が可能であることがわかった。本研究については第16回日本歯科理工学会(平成2年10月)で内容の一部を口頭発表したが、詳細については近日中に論文公表する予定である。
Flt3L遺伝子導入を付加した骨髄非破壊的幹細胞移植による固形腫瘍治療の検討

化学療法あるいは放射線による悪性腫瘍の治療は、一部の悪性腫瘍を除きその効果には限界がある。免疫療法は、腫瘍抗原を特異的に認識したリンパ球に腫瘍細胞を攻撃させることにより腫瘍を治療する方法である。しかし、治療効果は必ずしも期待されるほど高くはない。リンパ球が抗腫瘍効果を発揮するためには免疫能を増強するための何らかの工夫が必要であることを示す。樹状細胞は抗原提示能力が高く、抗原特異的なT細胞を誘導することが知られている。実際腫瘍抗原を樹状細胞に提示させることにより腫瘍に特異的な細胞傷害性T細胞を誘導することが可能である。癌抗原をコードしたRNAを樹状細胞にトランスフェクションすることにより、抗原提示を増強し、腫瘍抗原に得意的な細胞傷害性T細胞を誘導し治療を行うことは、対癌治療戦略の一つとして有望である。Flt3Lは樹状細胞の抗原提示能力を活性化させることが知られているが、今回、Flt3Lのプラスミドを用い、in vivoでの遺伝子移入に成功した。またRNAを樹状細胞へ効率的に導入・発現させるためのエレクトロポレーションの至適条件を決定できた。さらにLPSあるいはOK-432による樹状細胞の成熟化はトランスフェクトしたRNAからの発現を増強することを示した。RNAトランスフェクションは抗原タンパクの発現のみならずGM-CSFやINFαなどのサイトカインを樹状細胞内に発現させることにより樹状細胞の成熟化を誘導し、より強力な免疫療法への応用が期待される。本年度は基礎実験が主体となっているため、これに伴う実験結果について報告する。腫瘍の投与MC38(C57BL/6マウス由来の大腸癌、H-2^b>(5x10^5 cell)をC57BL/6マウス(H-2^b>の背部に皮下注することによる腫瘍の増殖曲線の作成を行った。MCA205(C57BL/6マウス由来の線維肉腫、H-2b)(5x10^5 cell)をC57BL/6マウスの背部に皮下注することによる腫瘍の増殖曲線の作成を行った。プラスミドDNAは以下の二種類を作成した。これらいずれかのプラスミドDNAを、C57BL/6マウスに、electroporetorを用いて、両側の後肢前脛骨筋に遺伝子導入を行った。それぞれFlt3LあるいはEGFPの発現を確認することができ、electroporetionの条件設定が行われた。固形腫瘍の治療に対する骨髄非破壊的幹細胞移植による新しい治療法として、樹状細胞を動員することにより腫瘍抗原特異的な細胞障害性T細胞を誘導する以下の方法を考案した。担癌マウスにエレクトロポレーションによりFlt3L遺伝子を導入した後、アロジェニックマウスより骨髄非破壊的幹細胞移植を行い、抗腫瘍効果をin vitroおよびin vivoで検討することを計画した。しかし、Flt3Lの遺伝子導入に予想以上に困難を伴った。そこで、基礎実験として抗原RNAを樹状細胞にエレクトロポレーターを用いて導入する実験を行った。C57BL/6の骨髄由来樹状細胞にそれぞれ構造の異なるEGFP及びlacZのRNAをエレクトロポレーションにより導入した。種々の電圧,時間,回数及びRNA量を用いエレクトロポレーションを施行し,その発現の経時的変化及び樹状細胞の成熟化による影響を検討した。その結果25μgのcapped EGFPRNAを300V,500μs,1パルスの条件でエレクトロポレーションすることにより少ない毒性で最良の発現が得られ、in vitroでのエレクトロポレーションによる遺伝子導入が、至適条件を調整することにより確実に実施可能であることを示した。