hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大気圧プラズマ照射によるマウス生殖細胞および受精卵活性化法の開発

本研究は、大気圧プラズマの照射により、老齢マウスの卵子および受精卵のバイアビリティを高め、ヒト生殖補助医療へ応用可能な研究の基盤作りを目指すことを目的とし、昨年度は「1.受精率や胚発生率が上昇する卵子および受精卵への大気圧プラズマ照射法を開発する。」ことを目的として研究を行った。その結果、若齢雌マウス由来の受精卵を大気圧プラズマ処理し、産子への発生率が上昇する条件を決定することができた。昨年度は、多数の卵子採取が可能かつ卵子採取までの飼育期間が短い若齢雌マウスを用いて受精卵を作製し、研究に使用した。しかしながら、若齢雌マウス、妊娠・出産適週齢の性成熟雌マウス、老齢雌マウスにおいては、卵子の質が異なる可能性もあるため、今年度は、大気圧プラズマ処理が、性成熟雌マウス、老齢雌マウス由来の受精卵においても胚盤胞期胚への発生率や産子への発生率を上昇させるか否かの確認を行った。その結果、培養胚の胚盤胞期胚への発生率上昇は確認できたものの、産子への発生率改善については、各実験区内の移植後の発生率にばらつきがみられた。そのため、今後も移植実験を行い、細かい条件検討を続ける予定である。さらに今年度は「2.大気圧プラズマ照射が細胞内に与える影響について調べる。」の研究計画について、受精卵や培養胚における酸化ストレスの有無およびミトコンドリア活性を確認するための条件検討を行った。今年度の成果を基に、来年度は「3.プラズマ照射による卵子および受精卵活性化の作用機序を明らかにする。」の研究計画に繋がる研究を行う。老齢雌マウスの卵子は採取するまでに1年程度の飼育が必要であること、採卵数が非常に少ないことから、昨年度から今年度にかけて、老齢雌マウスからの採卵、体外受精卵作製を随時行い、これらの受精卵を研究に使用した。当研究室が開発した超過剰排卵誘起法では、従来の過剰排卵誘起法を用いるより多くの卵子を採取することができ、老齢雌マウスの受精卵作製と凍結保存を大変効率良く進めることができた。昨年度決定したプラズマ処理条件で性成熟雌マウス、老齢雌マウス由来の受精卵を処理し、培養後の胚盤胞期胚発生率や移植後の産子への発生率を確認した。その結果、胚盤胞期胚への発生率改善は確認できたものの、産子への発生率は、実験区によるばらつきが大きかったため、今後実験を重ねデータの信頼性を得ることが必要と考える。また、効率的な受精卵の作製が可能な若齢雌マウス由来の凍結受精卵を用いて、「2.大気圧プラズマ照射が細胞内に与える影響について調べる。」の研究計画についても条件検討を行い、受精卵や培養胚における酸化ストレスの有無およびミトコンドリア活性確認のための手法をプロトコール化することができた。今後は、性成熟雌マウス、老齢雌マウス由来の受精卵においても大気圧プラズマ処理が細胞内に与える影響を酸化ストレスの有無およびミトコンドリアの活性確認によって調べていく。来年度は、今年度の成果をもとに、性成熟雌マウス、老齢雌マウス由来の大気圧プラズマ処理受精卵を移植する実験を続行し、産子への発生率改善について検討を重ねる。また、大気圧プラズマ処理では活性酸素種の産生やミトコンドリアへの障害を考慮する必要があるため、今年度に若齢雌マウスの受精卵を使用して決定した手法によって、性成熟雌マウス、老齢雌マウス由来の受精卵や培養胚においても酸化ストレスおよびミトコンドリア活性を確認し、大気圧プラズマ処理が細胞内に与える影響を調べる。大気圧プラズマ処理により、酸化ストレスの障害が出ている場合には、抗酸化物質の使用を検討し、より細胞内障害の少ない方法を模索する。大気圧プラズマ処理による細胞内の影響を確認しつつ、卵子や受精卵活性化の作用機序を明らかにするための基礎実験を行うことも考慮したい。本研究は、大気圧プラズマの照射により、老齢マウスの卵子および受精卵のバイアビリティを高め、ヒト生殖補助医療へ応用可能な研究の基盤作りを目指すことを目的とし、今年度は「1.受精率や胚発生率が上昇する卵子および受精卵への大気圧プラズマ照射法を開発する。老齢雌マウスの卵子は採取するまでに約1年の飼育が必要であり、採卵数が非常に少ないことから、採取までの飼育期間が離乳までの約4週間と短く、当研究室で開発した超過剰排卵誘起法を用いることにより、非常に多数の卵子を採取可能な若齢雌マウスを用いて、今年度の条件検討を行った。培養液中の受精卵へ数分から数十秒のプラズマ照射を行い、培養を続けたところ、ほとんどの卵が死滅あるいは発生を停止した。そこで、胚発生へ障害のないプラズマ条件を決定するため、プラズマ処理後、培養液を交換し、その影響を調べた。使用するディッシュ、培養液およびその液量、プラズマの照射時間・距離について詳細な検討を行い、最適条件を決定した。採卵卵子塊あるいは受精卵へのプラズマ直接照射では、体外受精率および胚盤胞期胚発生率は照射無のコントロール区と同等あるいは若干低下し、その効果を確認できなかったため、直接照射ではなく、プラズマ処理培養液で卵子や受精卵を処理し、その影響を調べた。採卵卵子塊の処理では、体外受精率および胚発生率はプラズマ処理無の培養液を用いたコントロール区とほぼ同等であったが、受精卵の処理では、コントロール区に比べ胚発生率が上昇した。

この受精卵を移植したところ、3回の移植実験の結果、コントロール区の平均産子率は35.4%であるのに対し、プラズマ処理区では平均48.8%であった。今年度は、若齢雌の受精卵を使用し、良好な産子への発生率を得られるプラズマ処理方法を決定することができ、来年度以降の研究を進めるための基盤を築くことができた。老齢雌マウスの卵子は採取するまでに1年程度の飼育が必要であること、採卵数が非常に少ないことから、今年度は、若齢雌マウスの卵子や受精卵を使用し、条件検討を行った。当研究室が開発した超過剰排卵誘起法では、従来の過剰排卵誘起法を用いるより2-3倍多くの卵子を採取することができるため、動物愛護・福祉の面からみても非常に有用な方法であり、大変効率良く作業を進めることができた。また、今年度はこの超過剰排卵誘起法を用い、老齢雌マウスからの採卵、体外受精卵作製も随時行っており、これらの受精卵は凍結保存している。実験に必要な数の受精卵が保存でき次第、今年度決定したプラズマ処理条件で老齢雌マウス由来の受精卵を処理することにより、培養後の胚盤胞期胚発生率や移植後の産子への発生率を上昇させることが可能か確認を行う。しかしながら、若齢雌マウス、妊娠・出産適週齢の性成熟雌マウス、老齢雌マウスにおいては、卵子の質が異なる可能性もあるため、上記、3種の雌マウスの受精卵を使用し、プラズマの効果を確認していく。性成熟雌マウス、老齢雌マウス由来の受精卵においてプラズマの効果を確認できない場合には、連携研究者である本学パルスパワー科学研究所の王准教授、浪平准教授から技術協力を得ることにより、装置の開発・改良を含め最先端の技術を用いて研究の推進を図る。本研究は、大気圧プラズマの照射により、老齢マウスの卵子および受精卵のバイアビリティを高め、ヒト生殖補助医療へ応用可能な研究の基盤作りを目指すことを目的とし、昨年度は「1.受精率や胚発生率が上昇する卵子および受精卵への大気圧プラズマ照射法を開発する。」ことを目的として研究を行った。その結果、若齢雌マウス由来の受精卵を大気圧プラズマ処理し、産子への発生率が上昇する条件を決定することができた。昨年度は、多数の卵子採取が可能かつ卵子採取までの飼育期間が短い若齢雌マウスを用いて受精卵を作製し、研究に使用した。しかしながら、若齢雌マウス、妊娠・出産適週齢の性成熟雌マウス、老齢雌マウスにおいては、卵子の質が異なる可能性もあるため、今年度は、大気圧プラズマ処理が、性成熟雌マウス、老齢雌マウス由来の受精卵においても胚盤胞期胚への発生率や産子への発生率を上昇させるか否かの確認を行った。その結果、培養胚の胚盤胞期胚への発生率上昇は確認できたものの、産子への発生率改善については、各実験区内の移植後の発生率にばらつきがみられた。そのため、今後も移植実験を行い、細かい条件検討を続ける予定である。さらに今年度は「2.大気圧プラズマ照射が細胞内に与える影響について調べる。」の研究計画について、受精卵や培養胚における酸化ストレスの有無およびミトコンドリア活性を確認するための条件検討を行った。今年度の成果を基に、来年度は「3.プラズマ照射による卵子および受精卵活性化の作用機序を明らかにする。」の研究計画に繋がる研究を行う。
新たなケロイド治療法開発を目指した新規ケロイド幹細胞維持機構の解明

ケロイド患者のケロイド部(1ケロイド発赤部と2ケロイド肥厚部)と3正常真皮から線維芽細胞および幹細胞様細胞を培養した。同時に、4ケロイドを認めない健常人の真皮から得た線維芽細胞および幹細胞様細胞も培養し、本研究のコントロールとした。平成29年度は、1-4から得られた、線維芽細胞及び幹細胞様細胞を用いて、その増殖能や形態的特徴などを検討した。各細胞から、total RNAおよび蛋白を抽出し、遺伝子発現について比較検討した結果、1から4の各細胞は増殖能も形態的にも特徴があり、幹細胞関連遺伝子発現にも、違いが認められた。また、われわれが注目しているA遺伝子の発現は、幹細胞様細胞において、4と比較して1-3で有意に高く、A遺伝子が関与するシグナル関連遺伝子の発現も同様であった。A遺伝子をターゲットとした治療薬を細胞に作用させると、ケロイドで高発現を認めた遺伝子の発現は抑制された。そこで、平成30年度は、A遺伝子のケロイドにおける機能的解析を行った。ケロイド由来線維芽細胞において、高発現が報告されている遺伝子(COL1A2, FN1, IL-6, CTGFなど)の発現が、A遺伝子阻害剤投与により、抑制されるかどうか、一方、正常真皮由来線維芽細胞にAを作用させて、それらの遺伝子発現が亢進するかなどについて、RNAレベル、タンパクレベルで行った。その結果、A遺伝子は、ケロイド由来線維芽細胞で高発現している遺伝子群に影響を与えている可能性が示唆された。現在、論文報告された動物モデルを用いたケロイド由来細胞移植実験に取り組んでいる。細胞抽出・細胞培養方法などが安定したため。動物モデルへのケロイド由来細胞移植を進めて、ケロイド様の塊が得られたら、A遺伝子阻害剤などを投与してその効果を確認する。効果が確認できれば、A遺伝子が関与するpathwayの上流について検討し、ケロイド治療薬として最適なターゲットを見つけたいケロイドは動物モデルが確立されていないため、その発生メカニズムの解明や特効薬の開発には至っていない。主に線維芽細胞に注目した研究が進んでいるが、他の細胞あるいは環境の関与が報告され始めている。組織幹細胞は、組織の損傷が生じた際の修復過程や組織恒常性の維持にも関与する。近年、組織幹細胞の異常が、癌化や慢性炎症による線維化などを引き起こすことが報告されている。皮膚真皮にも幹細胞が存在することが知られており、最近では、創傷治癒過程は幹細胞が主役を担っているとする報告もある。従って、皮膚幹細胞の異常が創傷治癒過程の異常であるケロイド発生に関与している可能性はとても高い。そこで、われわれは、ケロイド患者のケロイド部(1ケロイド発赤部と2ケロイド肥厚部)と3正常真皮から幹細胞を培養し、4ケロイドを認めない健常人の真皮から得た幹細胞の遺伝子発現と比較検討した。平成29年度は、1-4から幹細胞様細胞を培養し、得られた各幹細胞様細胞の増殖能や形態の特徴を検討するともに、各細胞から、total RNAおよび蛋白を抽出し、幹細胞関連遺伝子発現について比較検討した。その結果、1から4の各細胞は増殖能も形態的にも特徴があり、幹細胞関連遺伝子発現にも、違いが認められた。また、われわれが注目しているA遺伝子の発現は4と比較して1-3で有意に高く、A遺伝子が関与するシグナル関連遺伝子の発現も同様であった。A遺伝子をターゲットとした治療薬を細胞に作用させると、ケロイドで高発現を認めた遺伝子発現は抑制された。現在、マイクロアレイ法にて1-4の遺伝子発現プロファイルの網羅的解析中である。皮膚組織から、幹細胞様細胞を安定して培養するまでに、予定より時間がかかったためケロイド患者のケロイド部(1ケロイド発赤部と2ケロイド肥厚部)と3正常真皮から線維芽細胞および幹細胞様細胞を培養した。

マイクロアレイの結果から、ケロイドで特徴的な遺伝子発現プロファイルをピックアップして、それらの上流にある遺伝子やシグナルなどとの関連性を検討し、ケロイド予防あるいは治療標的となりうる遺伝子の発見を目指す。動物モデルへのケロイド由来細胞移植を進めて、ケロイド様の塊が得られたら、A遺伝子阻害剤などを投与してその効果を確認する。効果が確認できれば、A遺伝子が関与するpathwayの上流について検討し、ケロイド治療薬として最適なターゲットを見つけたいマイクロアレイ解析結果の納品が平成29年度中に間に合わなかったため、その支払い分が平成30年度に持ち越されることになったため。平成29年度の研究の遅れにより、予定していたマイクロアレイ解析が半分程度しかできなかったため。平成31年度初めに残りのマイクロアレイ受託解析用のサンプルを準備し、提出した。
好酸球と鼻粘膜構成細胞の相互作用からみた好酸球性鼻副鼻腔炎の病態と新治療法の開発

好酸球性鼻副鼻腔炎の組織リモデリングにおける好酸球の役割を検討した。好酸球と上皮細胞の共培養により、MUC5ACムチンとPDGF,VEGF,TGF-beta,IL-8の分泌が、加えた好酸球数に依存して著しく増加し、好酸球と上皮細胞の相互作用が粘液産生やサイトカイン産生を引き起こすと考えられた。こうした共培養による粘液・サイトカイン分泌は、EGF受容体阻害薬で抑制され、EGF受容体のリガンドであるamphiregulinやTGF-alphaの中和抗体やmetalloprotease阻害薬でも抑制されたことから、EGF受容体のtransactivationを介していることが明らかになった。好酸球性副鼻腔炎の病態を解明する目的で、好酸球由来細胞株であるEoL-1細胞と気道上皮細胞の細胞株であるNCI-H292細胞を共培養して、その相互作用を検討した。当該年度においては、末梢血から分離した正常好酸球を用いた検討を行い、正常好酸球においても上皮細胞との共培養により著明なムチン産生が生じることを確認した。また、こうした相互作用は培養好酸球の上清で上皮細胞を刺激しても生じないが、好酸球と上皮細胞の接着をフィルターで遮っただけでは抑制されず、液性因子を介した好酸球と上皮細胞の相互作用が関与していると考えられた。さらに、共培養後に上皮細胞と好酸球を回収してmRNAの発現を検討したところ、ムチンやVEGFは上皮細胞から産生され、EGF受容体の活性化に関わるamphiregulinやTGF-alphaも上皮細胞から産生されることも明らかにした。免疫染色を用いてEGF受容体が鼻粘膜上皮細胞に発現していることも確認した。以上の結果から共培養によるEGF受容体のtransactivationは上皮細胞の細胞膜上で生じていると考えられた。好酸球性鼻副鼻腔炎に特徴的な、鼻茸形成、杯細胞化生などの組織リモデリングにおける好酸球の役割を検討する目的で、好酸球と上皮細胞を共培養してその相互作用が病態にどうかかわっているか検討した。好酸球由来の細胞株EoL-1細胞と、気道上皮由来の細胞株NCI-H292細胞を24時間共培養したところ、分泌型ムチンであるMUC5ACと、鼻茸形成などの組織リモデリングに重要なprofibrotic cytokineのPDGF、VEGF、TGF-β、好中球遊走因子のIL-8の分泌が、加えた好酸球数に依存して著しく増加した。また、MUC5ACのmRNA発現も増強し、血液から分離した正常好酸球と上皮細胞株の培養でも、MUC5AC蛋白とmRNAの発現が増強した。次にこうした相互作用の機序を検討したところ、EGF受容体阻害薬であるAG1478が共培養によるMUC5AC分泌を抑制した。さらに共培養によりEGFRリガンドであるamphiregulin産生が増加し、amphiregulinとTGF-αの中和抗体が共培養による作用を抑制したこと、膜結合型amphiregulinやTGF-αを切断するmetalloprotease阻害薬でも共培養による作用が消失したことから、こうした作用がEGF受容体のtransactivationを介することが明らかになった。共培養によるPDGF、VEGF、IL-8産生もAG1478で抑制され、同様な機序が考えられたが、TGF-β産生は抑制されず、異なった機序が考えられた。このように好酸球は上皮細胞との相互作用により、粘液産生やprofibrotic cytokine産生を引き起こして、鼻茸形成、杯細胞化生などの組織リモデリングに関わると考えられた。さらに、EGF受容体のtransactivation抑制が新たな治療法の開発につながる可能性が示唆された。好酸球由来の細胞株であるEoL-1細胞と上皮細胞細胞株NCI-H292細胞の共培養により、ムチン産生やPDGF, VEGF, TGF-beta, IL-8などのサイトカイン産生が著明に促進され、好酸球性副鼻腔炎で特徴的にみられる、杯細胞化生(粘液産生)や鼻茸形成などの組織リモデリングの病態に好酸球と上皮細胞の相互作用が重要であることが明らかにできた。また当該年度においては、末梢血から分離した正常好酸球でもこうした作用が確認できた。さらに液性因子を介した好酸球と上皮細胞の相互作用が、上皮細胞上のADAM(a disintegrin and metalloprotease)を活性化して、膜結合型のamphiregulinやTGF-alpha放出を介して、上皮細胞のEGF受容体をtransactivationして生じていることも明らかにできた。

以上の結果、好酸球性副鼻腔炎においては、浸潤した多くの好酸球と鼻粘膜上皮細胞の相互作用によって、ムチンやサイトカイン産生が著しく亢進し、鼻茸形成や粘液産生などの特徴的な組織リモデリングが生じると考えられた。当初の予定通り、好酸球由来の細胞株であるEoL-1細胞と気道上皮細胞の細胞株であるNCI-H292細胞の共培養により、上皮細胞からのムチン(MUC5AC)分泌やサイトカイン(PDGF、VEGF、TGF-beta、IL-8)分泌が有意に増加することが確認できた。また、特に粘液分泌に関する相互作用には、TGF-alphaやamphiregulinを介したEGFRのtransactibvationが関わっていることも明らかにできた。また、EGFRはPDGF、VEGF、IL-8の産生にも関わるが、TGF-beta産生には別の機序が関わることも確認した。さらに、文字数の関係で記載できなかったが、こうしたムチン産生の増加は、好酸球の上清を加えただけでは生じなかったが、フィルターを利用して好酸球と上皮細胞の接着を妨げても観察できた。以上の結果より、好酸球と上皮細胞の間には相互に液性因子を介して刺激しあう機序が存在することが考えられた。このように好酸球と上皮細胞の相互作用により、粘液、サイトカイン産生が生じ、鼻茸形成などの組織リモデリングに働くことが明らかにできた。好酸球と上皮細胞の相互作用によって、ADAMを介した上皮細胞のEGF受容体のtransactivationが生じていることは確認できたが、どのような機序によってADAMが活性化されるかについてはまだわかっていない。ロイコトリエンの受容体拮抗薬がこうした作用を抑制することは確認できているが、ロイコトリエンがどうかかわっているかについては不明なままである。こうしたADAM活性化の機序についての検討を進める予定である。好酸球と上皮細胞の相互作用をターゲットとした新たな治療手段の確立を次の目標にしたい。現在ステロイド以外に有効な薬物療法がない好酸球性副鼻腔炎に対する新たな薬物療法を検討する目的で、ラットのアレルギーや炎症モデルを利用して、EGF受容体抑制薬やmetalloprotease抑制薬を全身あるいは局所投与してその効果を検討する予定である。さらに可能であれば、EGF受容体の抑制薬では抑制されなかったTGF-alpha分泌の機序や、好酸球と線維芽細胞の共培養の効果についても検討したい。最初に好酸球と上皮細胞の相互作用について、正常細胞でも同様な現象が生じているかどうか確認する必要がある。次に、相互作用の結果どのようにEGFRがtransactivationされるのかを検討する。予備実験においてロイコトリエン受容体拮抗薬がこうした相互作用を抑制することがわかったが、どのような機序で抑制しているのか検討する予定である。また、EGFRを介さないTGF-beta産生の機序についても検討したい。さらに、ステロイド以外に適切な薬物療法のない好酸球性副鼻腔炎に対する新たな治療薬を検討する目的で、好酸球と上皮細胞の相互作用に注目し、EGFRのtransactivationをターゲットとして、EGFRの受容体阻害薬やmetalloprotease阻害薬の作用を動物モデルを利用してin vivoで検討する予定である。
溶液の非平衡過程の分子論的アプロ-チ・ミクロ集合体のゆらぎ

本研究班は「ゆらぎ」という観点から、液体あるいは溶液中の分子やイオンの動的挙動を明らかにし、化学反応を溶媒分子の関与する種々の非平衡過程との関係で捉え、明らかにするのが目的である。昨年度設置した高感度ラマン分光器にファブリ-ペロ-干渉計(バ-レ-社、RCー43)をタンデム方式に配置して高分解能ラマン散乱測定のための光学系を構築した。ラマン分光器からのラマン光の安定な干渉分光を行うための測定条件を確立中である。これにより0.01cm^<ー1>の分解能のラマン測光が可能となる。野村は、溶液中の化学反応の速度理論に於けるKramersの遷移状態理論の検証を行なうために、ヘキサンやフタル酸ジイソブチルを溶媒としてジブロモエタン溶液の100MHzから8GHzにおける超音波緩和スペクトルの解析よりジブロモエタン回転異性化反応の反応速度と粘度との関係を実験的に明らかにした。森田は、二値ノイズによる弱い有色ノイズをランダムな力と見なし、平衡分布関数がMaxwellーBoltzmann則に従うとして、反応速度定数を計算し、KramersのTurnoverの出現は、衡突により反応が促進される領域から衝突により反応が疎外される領域が存在することに相当することを明らかにした。さらに野村は、超音波複屈折測定装置を試作し分子の配向運動の研究に応用した。また水・DMF混合溶液中の硫酸イオンのラマン線の測定より硫酸リチウムで観測されるラマンの非対称性は硫酸イオンの周りの局所構造の乱れに起因することも明らかにした。冨永は、蛍光消光反応速度の過渡効果を解析しミクロな領域での拡散過程とバルクでの拡散過程に差のあることを指摘した。イオン性ミセルの相互拡散係数とトレ-サ-拡散係数を測定し、その濃度依存性を明らかにした。さらに陰イオン性がポルフィリンの酸性溶液中での会合体の挙動を粘度から検討した。
学術的知識の導入が企業におけるイノベーション創出に及ぼす影響

本研究では、大学や公的研究機関の研究開発の成果が、迅速な社会還元や画期的なイノベーション創出を生じるために効果的な条件・要因やシステム等を明らかにすることを目的として、(1)組織間連携の効果分析、ならびに(2)先端的研究成果の社会実装に影響する社会システム・法制度・政策等の分析を行った。また、学術的知識の社会・経済へのインパクトを把握しようとする取り組みとして、(3)インターネットを用いた企業の研究開発者に対するアンケート調査、(4) NEDOプロジェクトに関するアンケート調査データの分析、ならびに(5)高被引用度のスター・サイエンティストと特許・企業活動との関わりの調査を行った。大学・公的研究機関の学術研究によって生み出された学術的知識が企業における研究開発やイノベーション創出にどの程度貢献しているか、という本研究の課題について、先行研究の調査・体系化を行った。このテーマに関連して研究代表者・分担者がこれまでに実施した調査研究の整理とデータ・分析手法の再検討も行った。また、学術的知識を踏まえた医薬品開発に関する国内外の状況、業種を問わず非上場企業も含む各企業の年次業績、特許出願に記された学術的知識等について、どのようなデータを分析に用いることができるかを検討し、これらに関連するデータ分析の知見を有する専門家を招いて意見交換会を行った。次に、企業の研究者が、学術的知識を活用してどのような態様でイノベーションを実現しているかを把握するためのアンケート調査を行うため、質問項目を検討した。特に、以下のような点が明らかになるよう留意した。回答者(研究者)が自社内で携わる研究開発において、国内および国外の大学・公的研究機関から知識を導入したことがあるか否か、また、その知識導入の頻度。国外の大学・公的研究機関から知識を導入している場合、どこの国の機関か。回答者が自社内で携わる研究開発において、どのような方法で国内および国外の大学・公的研究機関からの知識を導入しているか、また、それが研究開発およびイノベーションに役立っているか。回答者の経験から、自社内での研究開発やイノベーションに役立った学術的知識は、どの段階において役立ったのか。回答者の経験から、学術的知識を導入しなかったとしたら生み出され得なかったイノベーションは何割程度か、など。加えて、学術的知識がイノベーションを通じた社会実装にどのように活かされているのかについての定性的な事例研究として、ドイツの医療イノベーションに着目し、状況を調査した。大学・公的研究機関の学術研究によって生み出された学術的知識が企業における研究開発やイノベーション創出にどの程度貢献しているか、という本研究の課題について、研究代表者・分担者がこれまでに実施した調査研究の整理とデータ・分析手法の再検討も含めて、先行研究の調査・体系化を行うことができた。また、どのようなデータを分析に用いることができるかを検討し、理解を深めることができた。企業において研究開発・イノベーション創出を行っている研究者を対象として、業種横断的に、大学・公的研究機関における学術的知識の導入の態様について尋ねるためのアンケート調査を実施するために、これまで質問項目を検討するなどの準備段階を実施してきた。調査自体は2016年度に実施されることとなる。また、学術的知識がイノベーションを通じた社会実装にどのように活かされているのかについての定性的な事例研究として、ドイツの医療イノベーションに着目し、状況を調査することができた。大学・公的研究機関で行われている研究成果が、産業にどのような形で活用されているかについて、日本の民間企業に所属している研究開発担当者に対してインターネットによるアンケート調査を行った。回答者234人のうち,、大学・公的研究機関の研究成果から得られる知識を活用して、発明、特許出願、イノベーションの創出のいずれかを経験したことのある人は130人であり、半数以上であった。次に、「民間企業における研究開発において、どのような方法で国内および国外の大学・公的研究機関からの知識を導入していましたか?」という質問に対して19の選択肢を用意し、(1)大学・公的研究機関からの知識を使ってイノベーションを実現したことがある人と(2)そうでない人の回答を比較した。企業の研究開発従事者が大学・公的研究機関から知識を導入するルートの中で、人と人との個人的コンタクトを通じて知識を導入することは、イノベーションの実現との関連が深いことが示された。次に、新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)が資金的支援を行ったプロジェクトの参加企業に対して実施したアンケート調査の結果を利用した分析を行った。その結果、大学との連携・他企業との連携のいずれに関しても、それに対する評価が高いほどプロジェクトの目標達成度が高い傾向があることが示された。また、NEDOプロジェクトにおいて、大学と共同で特許を出願している企業は大学の評価が高くなり、他企業と共同で特許を出願している企業は他企業との連携に対する評価が高くなる傾向があり、大学との連携ならびに他企業との連携はいずれも役立っていることが示唆された。加えて、学術的知識がイノベーションを通じた社会実装にどのように活かされているのかについてシステム解明を行うための事例研究や、先端科学技術の受容性に関するアンケート調査を実施した。大学・公的研究機関で生み出されている学術的知識が起業におけるイノベーション創出にどの程度活用されているのかを知るために、日本の民間企業に所属している研究開発担当者に対してインターネットによるアンケート調査を行い、回答者の半数以上は大学・公的研究機関の研究成果から得られた知識を研究開発活動に活用しているという結果を得たが、研究開発従事者に特化したインターネット調査ではサンプル数に限界があり、200名程度の回答しかえられなかった。

そこで、別の切り口から分析を行うこととし、新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)が資金的支援を行ったプロジェクトの参加企業に対して実施したアンケート調査のデータを活用することにした。それにより、大学との連携に対する評価が高いほどプロジェクトの目標達成度が高い傾向があることや、プロジェクトにおいて大学と共同で特許を出願した企業は大学の評価が高くなる傾向があることを示すことができた。Clarivate Analytics社が公開している高被引用の論文をもつ研究者のリスト、Highly Cited Researchers(HCR)のデータを用いて、こうした研究者が産業界とどのようにかかわっているのかについて分析を行った。日本の研究機関に所属するスター・サイエンティストを抽出し、その学術的側面だけではなく産業界における役割についても検討するため、日本のスター・サイエンティストの特許の状況について分析を行った。特許の登録数や被引用回数についてスター・サイエンティストの間でも差は大きいものの、彼らの半数以上が少なくとも特許登録をしたことがあり、また半数近くが特許の被引用もされていることが明らかになった。次に、米国において、大学・企業・自治体などの多様な関係者によってイノベーションが継続的に実現される、いわばイノベーション・エコシステムが形成されている地域クラスターの一つとして注目される、サンディエゴ地域のスター・サイエンティストにフォーカスして、彼らが実際に企業とどのように関わり影響を与えているのかを調査した。上記のデータの中から、サンディエゴ地域に所在する機関に所属しているスター・サイエンティスト66人が抽出され、各人について、学術論文と特許のデータを収集し、インターネット上の情報から履歴や企業との関わりに関するデータを得た。その結果、抽出したスター・サイエンティストの中で相対的に特許を重視する人々のみならず、相対的に論文を重視する人々においても、企業の共同設立者となるケースや、企業のアドバイザリー・ボードのメンバーになっているケースが多く、企業とのかかわりが深いことが明らかになった。また、システムレベルの分析では、ドイツやスウェーデンの事例調査により、効果的な組織間連携として、双方の組織をつなぐことのできる中心的な人材の存在が必要であることが示された。本研究では、大学や公的研究機関の研究開発の成果が、迅速な社会還元や画期的なイノベーション創出を生じるために効果的な条件・要因やシステム等を明らかにすることを目的として、(1)組織間連携の効果分析、ならびに(2)先端的研究成果の社会実装に影響する社会システム・法制度・政策等の分析を行った。また、学術的知識の社会・経済へのインパクトを把握しようとする取り組みとして、(3)インターネットを用いた企業の研究開発者に対するアンケート調査、(4) NEDOプロジェクトに関するアンケート調査データの分析、ならびに(5)高被引用度のスター・サイエンティストと特許・企業活動との関わりの調査を行った。
脾臓内移植マウス歯髄細胞の分化と石灰化形成について

新生仔マウスの臼歯歯胚から分離した歯髄細胞を1週間同系マウスの脾臓内に移植し,これらの硬組織形成能を電顕及び組織化学的(アルカリホスファタ-ゼ活性)に検索した。歯髄細胞はトリプシン処理により,エナメル器を機械的に除去した後,メンブランフィルタ-上を転がし,象牙芽細胞層を含まない細胞集団として得られた。移植後3日では、歯髄細胞の大半が大型の紡錘形細胞に替わり,周りは多くのコラ-ゲン線維によって囲まれていた。移植日数の増加に伴って,これらの細胞にはGolgi-ER系がよく発達し、細胞外質にはコラ-ゲン性の石灰化が開始された。移植後7日では、不規則で、細管構造のない骨様象牙質が形成された。これらの基質内には多くの細胞が散在性に取りこまれ,その周辺には高円柱状の象牙芽様細胞が規則正しく配列していた。細胞遠心端には細胞質突起が形成されているが,それらが骨様象牙質中に進入することはなかった。硬組織内には不規則な形態を示す細胞が取り込まれていたが,これらは基本的には象牙芽細胞と同様の構造を示していた。アルカリホスファタ-ゼ活性は硬組織に接する象牙芽様細胞の細胞膜に強い活性が認められたが,散在する歯髄細胞や,基質中に完全に包埋された細胞には活性は認められなかった。これらの観察から、歯髄細胞は象牙芽細胞からの連続的な分化・誘導指令がなくてもosteo-dentin様の硬組織形成能を発現することが明らかとなった。
遺伝子制御ネットワークの動的挙動の解明:制御論的理論解析と実験による検証

本研究は、遺伝子制御ネットワークの動的挙動の解明を目指した理論体系化と実験系構築に向けた基礎的研究であり、「非線形フィードック制御論に基づく系統的理論解析手法の提案」と「実験環境を望み通りに調整可能な単純モデルによる実験的検証」からなる。理論解析とその実験による検証を有機的に結びつけ研究目的を達成するために、研究テーマを大きく「理論解析」、「モデル化」、「検証実験」の3つに分けて行っている。それぞれに対する本年度の研究成果は、以下の通りである。(1)理論解析:「一般化周波数変数を持つ動的システムモデル」に基づいて、非線形遺伝子制御ネットワークの平衡点周りのロバスト安定性解析を行い、それを支配する重要な生物学的パラメータを抽出し、定性的性質を明らかにした。また、その周期現象発現を解析し、そのプロファイルと生物学的パラメータとの関係を明らかにした。(2)モデル化:実験データから画像処理の前処理を経て、単一細胞の動的モデルを構築するパラメータ同定法について検討した。(3)検証実験:バクテリアの各種リプレッサー蛋白質と蛍光蛋白質の融合タンパク質発現遺伝子の安定発現株を確立し、転写活性制御と蛋白質分解速度の制御のための実験系を用いて、転写活性、タンパク質分解速度と遺伝子産物蓄積量の平均値とそのゆらぎ量を計測する実験を試みた。しかし、検証のレベルには至らなかった。(1)理論解析:「一般化周波数変数を持つ動的システムモデル」に基づいて、非線形遺伝子制御ネットワークの平衡点周りの安定性解析を行い、その周期現象発現(リミットサイクル)の解析的条件を導出した。得られた条件は幾つかの規格化された生物学的パラメータ(無次元量)で表されており、それに基づいて定性的性質を明らかにした。(2)モデル化:実験における計測データから画像処理を行い、単一細胞の動的モデルの構築とそのパラメータ同定法を提案した。現在、その有用性を検証中である。(3)検証実験:バクテリアの各種リプレッサー蛋白質と蛍光蛋白質の融合タンパク質発現遺伝子の安定発現株を確立し、転写活性制御と蛋白質分解速度の制御のための仕組みを組み込んだ実験系のセットアップを行った。この実験系を用いて、転写活性、タンパク質分解速度と遺伝子産物蓄積量の平均値とそのゆらぎ量を計測する予備実験を行った。
不登校予防要支援児童生徒への学級状態に応じた学校活動状況を支援する方法の構築

学校に行きたくない気持ち(不登校傾向)と行かなければならない気持ち(登校義務感)の観点から適応状態を再検証し、登校意欲の改善に有用な学習活動支援を検討した。その結果、不登校傾向が低く登校義務感が高ければ適応が高く、満足感が高い学級で登校意欲が高まることが明らかとなった。また、学習への自信の獲得は有効な支援である一方、特に中学生への学習方略の獲得は、一時的に登校意欲を高めるのみであると示唆された。本研究では,登校しながらも学校に行きたくないと感じている児童生徒に対し,その学校活動状況の特徴を「学習」の観点から把握することを目的としている。その上で,「学習」のいかなる側面に対して援助することが,「登校したくない気持ち」を低減させるのかを明らかにすることが最終的な目的である。当該年度においては,前年度に作成した「小中学生共通用・不登校傾向尺度」ならびに「小中学生共通用・登校義務感尺度」をもとにして,1それらの組み合わせから課題となる児童生徒を特定すること,2それらの組み合わせから課題があると考えられる児童生徒の「学習」の特徴を検討すること,3以上について,個人のみならず学級の状況も踏まえた検討を行うこと,の3点を主に目的とした調査研究を実施した。具体的には,4つの公立小学校・計15クラスの45年生,ならびに2つの公立中学校・計23クラスの12年生に対し,「小中学生共通用・不登校傾向尺度」「小中学生共通用・登校義務感尺度」ならびに「ストレス反応尺度」「学習への自己効力感尺度」「学習方略尺度」から成る質問紙調査を実施するとともに,標準化された学級状態の測定検査を実施した。その結果,全般的に学級満足感が高い方が不登校傾向は低く,登校義務感は高いということや,特定の学習スタイルと特定の不登校傾向タイプとの間に関連が見いだされる傾向があった。これらの点についてさらに詳細な検討を進めることにより,不登校への予防的支援の一環として,学習支援の有効性を検証でき,その具体的方法を明らかにすることができるものと考える。本研究では,登校しながらも学校に行きたくないと感じている児童生徒について,その学校活動状況の特徴を「学習」の観点から把握することを目的としている。そのことによって,学習のいかなる側面への支援が不登校傾向の予防に有効であるのかという点を明らかにすることが,本研究の最終的な目的である。当該年度においては,初年度に作成した「不登校傾向尺度」ならびに「登校義務感尺度」をもとにして,それらの尺度から考えられる要支援児童生徒の「学習」の特徴を検討するための追跡調査を実施した。その際,学校活動状況は,児童生徒が所属する学級の状態によって左右される可能性があることから,クラス替えによって学級に変化が起きた場合をも含めた前年度からの追跡調査を計画した。最終的に,4つの公立小学校15学級271名,2つの公立中学校23学級440名から,年間ならびに年度をまたいだ欠損値のない調査結果が得られた。現在までに行った分析によって,小学生では,「なんとなく行きたくない」傾向はあらゆる学習方略低下と,遊びを優先させて学校に目が向かない傾向は作業方略の低水準での維持と,心理的な不調を伴う不登校傾向は人的リソース方略の低下と,それぞれ関連することが確認された。また,学級状態の変化については,「なんとなく登校したくない」傾向や「遊びを優先させたい」傾向は,新学級での承認感の低さおよび新旧双方の学級での被侵害感の高さに関与することなどが示された。中学生では,「なんとなく行きたくない」傾向は作業方略の低下と,遊びを優先させて学校に目が向かない傾向は柔軟的方略・認知的方略の低下と関連していた。また,学級状態の変化については,「なんとなく登校したくない」傾向はその時点の学級における被侵害感の高さに関与し,心理的な不調を伴う不登校傾向は,新旧双方の学級での被侵害感の高さに関与することなどが示された。本年度は研究課題全体の遂行の基礎となる「小中学生共通用・不登校傾向尺度」と,「小中学生共通用・登校義務感尺度」を作成することを目的とした。そのため,まず2011年5月6月に養護教諭ならびに臨床心理士を対象に予備調査を実施し,各尺度項目案が作成された。その上で,2011年11月12月に小中学生を対象とした本調査を実施した。その結果,「小中学生共通用・不登校傾向尺度」は「全般的な登校意欲の喪失傾向」「享楽的活動の優先傾向」「心理的な不調傾向」の3因子構造であることが明らかとなった。信頼性は,十分な内的整合性を有していた。また,妥当性に関しては,基準連関妥当性ならびに内容的妥当性が検証された。ただし,確証的因子分析を実施したところ,中学生においては若干の適合性の低さが認められた。また,「小中学生共通用・登校義務感尺度」は単一構造であることが明らかとなった。信頼性については,十分な内的整合性を有していた。

また,妥当性に関しては,基準連関妥当性ならびに内容的妥当性が検証された。ただし確証的因子分析で,中学生において若干の適合性の低さが認められた。以上より,若干の問題点は残されるものの,小中学生の不登校傾向ならびに登校義務感を測定し,その比較検討をする際に有用な尺度が作成された。このことは,(1)今まで作成されていなかった「学校に行かなければならない」という心理的傾向を測定することが可能となった,(2)今まで不可能であった小中学生の不登校傾向の比較検討が可能となった,(3)児童生徒自身が認知する「学校に行きたくない気持ち」(不登校傾向)のみならず,その認知がなく「学校に行かなければならない」(登校義務感)と感じ,その後急激に登校意欲を失う状況を把握することが可能となった,という成果を示す。よって本研究結果は,本研究課題の遂行のみならず,広く学校教育臨床の研究の進展に寄与するものである。本研究は、小中学生の「学校に行きたくない気持ち」(不登校傾向)と「行かなければならない気持ち」(登校義務感)の観点から適応状態を再検証し、登校意欲の改善に有用な学校活動状況(特に、学習活動に焦点を当てる)について、それぞれの児童・生徒が所属する学級状況の違いも併せて検討することとした。研究の結果、(1)小中学生の双方に使用可能な「不登校傾向尺度」を作成することができた。(2)小中学生の双方に使用可能な「登校義務感尺度」を作成することができた。(3)不登校傾向が低く登校義務感が高ければ、学校適応および心理的適応が高いことが示された。(4)個人の学級への満足感は登校意欲を高める傾向にあることが確認されたほか、学級への満足感をどのくらいのクラスメイトが高く抱いているかにもよって登校意欲は左右されることが明らかとなった。(5)クラスメイトに対して被侵害的な感情を抱いている場合、登校意欲の低下という影響は長期に及ぶことが示唆された。(6)具体的な学校活動状況である「学習」については,何らかの学習方略が身についているかどうかということよりも,学習に対して自信をもって取り組めているかどうかという点が登校意欲と強く関連していることが示された。特に、中学生への学習方略の獲得は一時的に登校意欲を高めるのみであり、学習への方法的なスキル獲得に先立って、「やればできる」という感覚の蓄積が重要であることが示唆された。学校心理学研究計画の段階で,一番に危惧されていた「追跡調査への協力校」が確保でき,既に一部について開始できている。次年度以降への協力についても書面にて確認が取れている。計画段階で最も困難が予測された追跡調査が実施できている。そのため,既に調査結果の分析を開始する段階に入っており,早期の研究成果公表ができると予測される。当初に計画していた通り,本年度までに,「小中学生共通用・不登校傾向尺度」ならびに「小中学生共通用・登校義務感尺度」作成のため,小学生と中学生を対象とした予備調査と本調査が実施され,その検証までが実施済みである。そのため,本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。次年度以降は,現在の追跡調査をさらに進め,年度をまたいで学級や担任教員が変化した場合,不登校傾向やそれを取り巻く関連要因がどのように変化するのかという点を明らかにしたい。これまでに,調査校からの要望によって,複数校に対して調査結果をもとにしたコンサルテーションや研修会を実施している。
う蝕ハイリスク児における介入可能な育児要因の解明

1歳6か月時で3. 7%であったう蝕経験者率は2年後の3歳時で31. 3%にまで増加した。各対象者のこの2年間のう蝕経験歯数(dft)の増加の有無を従属変数とし、1歳6か月で得られたアンケート項目と口腔診査結果を独立変数としてロジスティック回帰分析を行った。その結果、従来から報告されていた「プラークの付着が多い」、「間食回数が3回以上である」、および「家庭でフッ化物を使っていない」などの子供自身に関する要因に加え、母親自身の保健行動も児のう蝕発症に直接影響を及ぼすことが明らかになった。本研究の目的は、1歳6か月から3歳までのコホート調査において、母親自身の要因や子どもへの育児方法についての要因が子どものう蝕に影響を及ぼすという仮説モデルを検証し、子どものう蝕に直接の影響を及ぼすと考えられる育児方法についての要因を明らかにすることである。本研究の結果、子どものう蝕に直接影響を及ぼす育児方法についての要因を明らかになり、子どもへの充実した保健指導のあり方に貢献することができ、ハイリスク児のう蝕の減少につなげられると考えられる。本研究は、1歳6か月と3歳児歯科健診の場を利用した2年間のコホート調査であり、長崎市の協力を得て、すでに平成19年4月から調査を開始しており、平成19年度の1歳6か月児歯科健診受診者のデータを収集した。アンケート調査を実施するにあたり、平成19年1月19日に長崎大学医歯薬学総合研究科倫理委員会の承認(承認番号:0729)を得た。平成21年度では研究計画通りに3歳児歯科健診受診者のデータを収集した。3歳児歯科健診の場では、本調査のために雇上げた1名の者が、事前にアンケート用紙を郵送し保護者に回答してもらったアンケート用紙を回収、回答漏れに対する聞き取り調査と転記を行なった。また、アンケート調査に対して協力を得られた保護者に、お礼として仕上げ磨き用の歯ブラシを配布した。平成22年度では3歳児健診で得られたアンケートの結果を入力し、長崎市で実施された歯科健診結果と合わせて統計学的解析(川下、齋藤、福田が担当)を行う。本研究は、1歳6か月と3歳児歯科健診の場を利用した2年間のコホート調査である。長崎市の協力を得て、平成19年4月から調査を開始し、1歳6か月児歯科健診受診者のデータを収集した。平成21年度では3歳児歯科健診受診者のデータを収集した。平成22年度では3歳児健診で得られたアンケートの結果を入力し、長崎市で実施された歯科健診結果と合わせて統計学的解析(川下、齋藤、福田が担当)を行った。その結果、海外の報告にあるように、子どものう蝕と母親の社会的背景や喫煙状況との関連が認められず、母親の歯科保健行動や子どもの間食回数と家庭でのフッ化物の使用状などの育児方法が子のう蝕に直接影響を及ぼすことが示唆された。本研究により、1歳6か月児や3歳児歯科健診での充実した歯科保健指導に貢献することができ、う蝕ハイリスク児のう蝕の減少につなげることができると考えられる。この研究結果は、第60計日本口腔衛生学会総会には発表予定であり、演題登録された。本研究の目的は、1歳6か月から3歳までのコホート調査において、母親自身の要因や子どもへの育児方法についての要因が子どものう蝕に影響を及ぼすという仮説モデルを検証し、子どものう蝕に直接の影響を及ぼすと考えられる育児方法についての要因を明らかにすることであった。本研究は、1歳6か月と3歳児歯科健診の場を利用した2年間のコホート調査であった。アンケート調査を実施するにあたり、平成互9年1月19日に長崎大学医歯薬学総合研究科倫理委員会の承認(承認番号:0729)を得た。

その結果、海外の報告にあるように、子どものう蝕と母親の社会的背景や喫煙状況との関連が認められず、母親の歯科保健行動や子どもの間食回数と家庭でのフッ化物の使用状などの育児方法が子のう蝕に直接影響を及ぼすことが示唆された。このことから、乳幼児健診の場などを利用して、保護者を通じた子どもの歯科保健指導をより充実させることで子どものう蝕の減少に貢献できると思われた。
Dicerによる小分子RNA産生の構造的基盤

前年度までにコクヌストモドキTribolium castaneumのDicer-1、Dicer-2について、SUMOタグを用いた発現・精製系を確立した。得られたタンパク質を用いた結晶化スクリーニングをおこない、RNAやATPなどとの共結晶化を試みるなど数多くの結晶条件を試行したものの、結晶は得られなかった。また、並行して進めていた昆虫細胞によるDicer全長の発現系についてコンストラクトの改良を行い、ネッタイシマカAedes aegypti及びショウジョウバエDrosophila melanogasterのDicer-1、Dicer-2について結晶化を試みたが、結晶は得られなかった。また、前年度時点での展望として、結晶構造解析に加えて電子顕微鏡による構造解析を行うことを検討していた。本年度において申請者は、共同研究者の指導のもと、電子顕微鏡の操作や得られた画像の解析等のトレーニングを行ったが、Dicerを用いた単粒子解析は行えていない。これについては、申請者は来年度に共同研究先の研究室において博士研究員として雇用されることが決定しており、来年度以降に引き続き研究を続けていく予定である。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。本研究では昆虫Dicer-1およびDicer-2のhelicaseドメイン、もしくは全長の結晶構造解析を行うことで、RNAi経路における小分子RNA生合成過程の分子基盤を明らかにすることを目的としている。本年度の進捗としては、申請した研究実施計画に従って結晶化に適したコンストラクトの作製を進めている。ネッタイシマカAedes aegypti,ショウジョウバエDrosophila melanogaster,コクヌストモドキTribolium castaneumのDicer全長あるいはhelicaseドメインの発現コンストラクトを作製し、特にコクヌストモドキDicerのhelicaseドメインにSUMOタグを付加することで大腸菌での発現・精製が可能になることを見出した。このコンストラクトを用いて大量発現をおこない、精製系を確立することに成功した。精製したタンパク質はプロテアーゼによる分解を受けやすい、溶液中でのアグリゲーションが起こりやすいなど不安定な性質を持つことが明らかとなったが、基質と予想されるRNAとの複合体形成により安定性が若干向上した。現在このコンストラクトを用いて、単独での結晶化またはATP加水分解アナログやRNAとの共結晶化実験を行なっている。市販の結晶化キットと結晶化ロボットを用いたハイスループットなスクリーニングにより、各サンプルについて数百条件ずつの結晶化条件を試したが、現在までにタンパク質の結晶は得られていない。今後、コンストラクトの改善やターゲットとする生物種の変更などにより、結晶を得ることを目指していく予定である。前年度までにコクヌストモドキTribolium castaneumのDicer-1、Dicer-2について、SUMOタグを用いた発現・精製系の確立し、結晶化スクリーニングをおこなったが結晶は得られていなかった。本年度では、引き続き得られたタンパク質を用いた結晶化スクリーニングをおこない、結晶を得てX線回折データを収集し構造解析を行うことを目標としていた。しかしながら、RNAやATPなどとの共結晶化を試みるなど数多くの結晶条件を試行したものの、現在までに目的の結晶は得られていない。また、前年度に構築した昆虫細胞によるDicer全長の発現系についてコンストラクトの改良を行い、ネッタイシマカAedes aegypti及びショウジョウバエDrosophila melanogasterのDicer-1、Dicer-2について結晶化に挑戦しているが、結晶は得られなかった。今後も引き続きコンストラクトの改良と結晶化スクリーニングを進めていくが、同時に電子顕微鏡を用いた構造解析を行うことを検討している。Dicerは単体で約200 kD以上の巨大なタンパク質であり、これは電子顕微鏡による単粒子解析を行うことが可能な大きさである。近年では技術の進歩により電子顕微鏡を用いてタンパク質を原子分解能で構造解析した報告が増加しており、Dicerについてもこれが可能であるか検討していく。現在までに、交付申請書に記載した昆虫DicerのX線結晶構造解析を目指した発現コンストラクトの作製と精製系の確立を達成し、結晶化条件のスクリーニングを行なっているところである。したがって申請した研究計画と比べて目立った遅れはないと考えられる。

実験計画では本年度の研究においてDicerの結晶を得て構造解析を行うこととしていたが、現在までに結晶を得られていない状況であり、達成度としてはやや遅れていると言わざるを得ない。前述のとおり本研究課題は研究計画にしたがって順調に進展していると考えられ、今後は予定通りにタンパク質の結晶化を行い、放射光施設でのX線回折実験を行なっていく。ただし、得られているタンパク質はやや不安定であり、このまま結晶が得られるとは限らないため、更なる結晶化コンストラクトのスクリーニングもおこなう。大腸菌の発現系では精製できなかったコンストラクトも真核細胞を用いた発現系ならば精製できる可能性もあるため、発現系の見直しも行う予定である。また、昆虫Dicerは主にショウジョウバエでのみ生化学的な実験が行われてきている背景があり、ショウジョウバエ以外のタンパク質で結晶化ができれば、その生物種のDicerを用いた生化学的な解析も行なっていく必要がある。Dicerは全長で200kDa以上、helicaseドメインのみでも50kDaを超える大きなタンパク質であり、プロテアーゼによる限定分解の結果などから不安定なタンパク質であることがわかっている。現在までに数多くの結晶化条件をスクリーニングしてきたが、いずれの条件でもタンパク質の結晶は得られなかった。そこで、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析をおこなうことによってDicer全長の高分解能な構造を決定することを検討している。共同研究先と打ち合わせを始めている状況であるが、実際に単粒子解析が可能であるかどうか、まずは比較的低分解能の構造を得られるかどうか試してから原子分解能レベルの解析にまで挑戦する予定である。