hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
TPF療法の免疫調節作用の解明と新たな免疫化学療法の開発を目指した基礎研究

本研究の目的は、頭頸部扁平上皮癌患者に対する化学療法が、末梢血中の免疫細胞に及ぼす影響について解析することである。はじめに未治療患者の末梢血中における免疫細胞サブセット解析および活性化について解析を行った。頭頸部扁平上皮癌患者では健常者と比較し、CD8陽性T細胞においてナイーブT細胞が減少し、エフェクターメモリーT細胞(TEM)が増加していた。加えて進行癌患者では、早期癌と比較しTEMが減少する一方、エフェクターT細胞(TEFF)が増加しており、TEM・TEFFいずれにおいても活性化マーカーであるCD38の発現が亢進していた。CD4陽性T細胞においては、患者群において免疫抑制性のサブセットである制御性T細胞が増加していた。単球系細胞では、免疫抑制性に作用するmyeloid-derived suppressor cellsが患者群において増加していた。こうした結果から、頭頸部扁平上皮癌患者の末梢血においては、より細胞障害性の高いサブセットが増加・活性化しており、特に進行癌においてその傾向が強い一方で、免疫抑制性に作用する細胞も増加していることが示された。次に、化学療法前後における末梢血中の免疫細胞の変化を解析した。TPF療法開始前、化学療法6日目・21日目の3回採血を行い、免疫細胞サブセットの変化を解析した。化学療法の前後の比較では、CD8陽性細胞においてセントラルメモリーT細胞が減少、TEFFが増加した。また化学療法の前後でTEM・TEFFにおけるCD38の発現が増加した。こうした結果から、TPF療法により細胞傷害性の高いCD8陽性T細胞が増加・活性化し、化学療法の効果の一端を担っている可能性が示唆された。予定より順調に症例を集積し解析することが出来たため、当初の計画より早く研究を進めることが出来た。今後はこれまで得られた結果を元に、患者予後との関連性について解析を行う。これにより、免疫細胞サブセットの予後予測マーカーとしての有用性、およびTPF療法の治療効果予測マーカーとしての有用性について検討してゆく。さらに、TPF療法に用いる薬剤が免疫細胞サブセットにもたらす影響について、in vitroでの解析を行う予定である。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を利用した、ロンベルグ症候群の病因解明に関する研究

本研究では、ロンベルグ症候群患者より得られた歯根膜細胞の幹細胞特性について検討を行った。ロンベルグ症候群歯根膜細胞は健常歯根膜細胞に比べてICAM-1、NCAM-1、SSEA-4の発現が有意に高かった。また、脂肪細胞および骨芽細胞への分化能が健常歯根膜細胞と比較して有意に低かった。ICAM-1・NCAM-1・SSEA-4に対する中和抗体を添加することによって脂肪細胞分化および骨芽細胞分化能が改善された。このことから、ICAM-1・NCAM-1・SSEA-4の発現の亢進がロンベルグ症候群の表現型の一つの原因である可能性が示唆された。平成26年度に実施した研究成果として、ロンベルグ症候群歯根膜細胞に特異的に発現する遺伝子の同定を行った。平成25年度の研究においてフローサイトメトリーによるロンベルグ症候群歯根膜細胞の表面抗原マーカーの発現の違いを調べたが、その結果として、ロンベルグ症候群歯根膜細胞は正常歯根膜細胞と比較してICAM-1、NCAM-1、SSEA-4の発現が高く、ICAM-2の発現は低かった。しかし、これら表面抗原の発現は細胞膜に存在する物質に限定されるため、ロンベルグ症候群歯根膜細胞の生物学的現象を説明するには不十分であると考えられた。そのため、ロンベルグ症候群歯根膜細胞に特異的に発現している遺伝子を網羅的に解析するために、mRNAを回収しマイクロアレイにて解析を行った。方法としては、フローサイトメトリーを行った時と同じく、培養ロンベルグ症候群歯根膜細胞と対照群として健常ヒト歯根膜細胞を用い、それぞれのmRNAを回収して解析を行った。その結果、ロンベルグ症候群歯根膜細胞で発現している遺伝子群の上流にPOU3F2、PSCD1、TNFSF8、SPASTが存在していることが明らかとなった。また、これらの研究に加えて、ロンベルグ症候群歯根膜細胞を用いたiPS細胞の作成も行った。フローサイトメトリーおよびマイクロアレイでロンベルグ症候群歯根膜細胞に特異的に発現していることが確認できた遺伝子群がロンベルグ症候群歯根膜細胞の表現型に関与しているのかについて確認するためにはこのiPS細胞化したロンベルグ症候群歯根膜細胞を用いる必要がある。この細胞が樹立できれば、これらの遺伝子の機能解析を行っていく予定である。平成24年度に実施した研究成果として、まずロンベルグ症候群歯根膜細胞の採取を行い、培養してロンベルグ症候群歯根膜細胞の樹立を行った。そして、このロンベルグ症候群歯根膜細胞を用いて、間葉系幹細胞特性の同定を行った。間葉系幹細胞の特性としては、1細胞付着性、2表面抗原マーカーの発現、3多分化能、の3項目について検討を行った。比較は、健常者から採取された健常歯根膜細胞を用いた。その結果、ロンベルグ症候群歯根膜細胞は、細胞付着性に違いは認められなかった。しかし、表面抗原マーカーの発現パターンには違いが認められ、ロンベルグ症候群歯根膜細胞は健常歯根膜細胞に比べてICAM-1、NCAM-1、SSEA-4の発現が高く、ICAM-2の発現が低いことが確認された。また、多分化能の違いを調べるために、脂肪細胞、骨芽細胞への分化能を比較した。その結果、ロンベルグ症候群歯根膜細胞は、oil red O染色性の脂肪滴を形成する脂肪細胞への分化能は有していたが、その形成能は健常歯根膜細胞と比較して有意に低かった。また、同様に、alizarin red S染色性の石灰化物沈着能を有する骨芽細胞への分化能も有していたが、その形成能も健常歯根膜細胞と比較して有意に低かった。また、ロンベルグ症候群歯根膜細胞を用いたiPS細胞の作成も行った。この細胞は今後の研究を行うためにも必要であるので、複数のクローン細胞株を樹立し、それぞれのクローン細胞株の特性や違いを明らかにするための検討を行った。平成26年度に実施した研究成果として、フローサイトメトリーおよびマイクロアレイでロンベルグ症候群歯根膜細胞に特異的に発現していることが確認できた遺伝子群がロンベルグ症候群歯根膜細胞の表現型に関与しているのかについて確認するための研究を行った。まず、ロンベルグ症候群歯根膜細胞をiPS細胞化した細胞株の作成を行った。この細胞が樹立できれば、ロンベルグ症候群歯根膜細胞に特異的に発現する遺伝子の機能解析を行っていくことができる。しかし、実際にはロンベルグ症候群歯根膜細胞にOCT4・SOX2・KLF4・C-MYC等の遺伝子導入を行いiPS細胞化することができなかった。これまでヒト歯根膜細胞を用いてiPS細胞を作成したという報告はあるので、今回用いたロンベルグ症候群歯根膜細胞に遺伝子導入がされにくい特性があったことが考えられる。

そこで、このiPS細胞化したロンベルグ症候群歯根膜細胞の作成と別に、培養ロンベルグ症候群歯根膜細胞を用いて、これまでフローサイトメトリーやマイクロアレイで発現の違いが認められた遺伝子等がロンベルグ症候群歯根膜細胞の表現型に関与しているのかどうかを調べた。ICAM-1・NCAM-1・SSEA-4に対する中和抗体を用いて脂肪細胞および骨芽細胞への分化能を調べた結果、これらの中和抗体を添加することによってin vitroにおける脂肪細胞分化および骨芽細胞分化が促進されることが認められた。このことから、ICAM-1・NCAM-1・SSEA-4の発現の亢進がロンベルグ症候群の表現型の一つの原因である可能性が示唆された。矯正歯科本研究の目的は、人工多能性幹細胞(iPS細胞)を用いて、顎顔面形態に異常を及ぼす先天性疾患の一つである「ロンベルグ症候群」の病因を解明することである。この目標を達成するために、平成24年度の研究計画では、「1.ロンベルグ症候群歯根膜細胞の幹細胞特性を明らかにする」ことと、「2.ロンベルグ症候群歯根膜細胞がin vivoにおいて組織形成へ及ぼす影響を明らかにする」ことを行い、平成25年度以降の研究計画では、「3.ロンベルグ症候群歯根膜細胞に特異的に発現する遺伝子の同定を行う」ことと、「4.ロンベルグ症候群歯根膜細胞に特異的に発現する遺伝子の機能を明らかにする」ことを行う予定にしていた。このうち1については、平成24年度のうちにロンベルグ症候群患者から採取した歯根膜細胞の培養を行い、間葉系幹細胞特性を調べた。このことから、この研究については順調に進展していると考えられる。また、2については、平成24年度から引き続き平成25年度もロンベルグ症候群歯根膜細胞を用いて人工多能性幹細胞(iPS細胞)の作成を進めていたが、完成にはいたらなかったため、免疫不全マウスへの移植実験は平成26年度に行う予定にしている。また、3については、平成24年度に行ったフローサイトメトリー、および平成25年度に行ったマイクロアレイによって、ロンベルグ症候群歯根膜細胞に特異的に発現する遺伝子群の同定ができたため、この研究については順調に進展していると考えられる。4については、iPS細胞化されたロンベルグ症候群歯根膜細胞を用いる必要があるため、細胞が出来次第行う予定である。以上のことから、平成25年度までの研究はおおむね順調に進展していると考えられる。交付申請書に記載した本研究の目的は、人工多能性幹細胞(iPS細胞)を用いて、顎顔面顎顔面形態に異常を及ぼす先天性疾患の一つである「ロンベルグ症候群」の病因を解明することであった。この目的を達成するために、平成24年度の研究計画では、「ロンベルグ症候群歯根膜細胞の幹細胞特性を明らかにする」ことと、「ロンベルグ症候群歯根膜細胞がin vivoにおいて組織形成へ及ぼす影響を明らかにする」ことを行う予定としていた。このうち前者については、岡山大学病院矯正歯科を受診したロンベルグ症候群患者から病変部の歯を採取し、歯根膜細胞の培養を行った。また、このロンベルグ症候群歯根膜細胞の間葉系幹細胞特性を調べ、細胞付着性、表面抗原マーカーの発現、多分化能、について検討を行った。このことから、平成24年度の研究計画の「ロンベルグ症候群歯根膜細胞の幹細胞特性を明らかにする」については、研究は順調に進展していると考えられる。
N体的数値計算法による分布関数の再現に関する研究

N体計算と同様に粒子を使用する方法で、無衝突恒星系の位相空間を再現する方法を考案した。この方法の信頼性を確かめるために、球対称を仮定し、ここでの方法で再現された位相空間と、無衝突Boltzmann方程式を直接数値積分する方法によって得られた位相空間を比較した。モデルは、一様密度球で速度分布はMaxwellianとし、初期ビリアル比を1/2とした。そのcollapseの時間進化を適当な時間ごとに位相空間を両方の方法で再現して比較した。まず、位相空間を再現するために、系の密度とポテンシャルを適当な基底関数系で展開して、ポアソン方程式を解く必要があるが、使用する基底関数系によっては位相空間の構造に非物理的な影響が現れることがわかった。これは、Hernquistモデルに基づいた基底関数系では中心部で力が正の領域が現れるためで、角運動量の小さな星は中心部で一種の散乱を受けることになり、位相空間の構造が乱されることが明らかになった。しかし、力が正になる領域は中心部の非常に限られた部分ため、質量のほとんどを占める星が持つ角運動量範囲では全く影響がないこともわかった。一方、Plummerモデルに基づいた基底関数系では、中心部に特異性がないので、全ての角運動量の位相空間に対して、無衝突Boltzmannシミュレーションから得られる位相空間と非常によく一致した。分布関数自身についても基本的に、ここで用いた方法でよく再現されることがわかった。このことは。基底関数系で展開するシミュレーション法では星の軌道が十分な精度で追跡されていることを意味するものである。従って、この方法は、星の軌道分類にも応用できることがわかった。なお、結果はすでに論文にまとめ、The Astrophysical Journal誌に投稿している。このことは。
蛋白質フォールディング機構の物理化学的解明

1.αラクトアルブミンとリゾチームは互いにアミノ酸配列の類似した相同蛋白質であり、それらのフォールディング反応が類似しているか否かを実験的に明らかにすることは、蛋白質のフォールディング問題を考える上で重要である。昨年までの研究で、ヤギαラクトアルブミンのフォールディング反応の速度論的解析を行い、フォールディングの遷移状態で構造化する領域は、Cヘリックスとα-βドメイン境界にあるカルシウム結合部位近傍に局在化していることが明らかになっている。本年は、イヌ乳リゾチームのフォールディング反応の速度論的解析を行い、遷移状態ではカルシウム結合部位の構造は形成されていないことが明らかとなった。したがって、αラクトアルブミンとリゾチームは互いに相同で立体構造も類似しているがフォールディング経路が異なることになる。2.大腸菌のシャペロニンGroEL/ES複合体が、生理的条件下において、GroELとGroESのモル比が1:1の非対称な構造(弾丸型)を持つのか,あるいは,モル比が1:2の対称な構造(フットボール型)を持つのかは依然解決がついていない。電子顕微鏡の画像解析を利用した研究では,弾丸型であるとする結果とフットボール型であるとする結果の両方が報告されている。溶液X線小角散乱法は溶液中の蛋白質超分子複合体の構造を解析する有効な実験手法である。溶液X線散乱法を用いて,ATP存在下の生理的条件下におけるGroEL/ES複合体の立体構造を解析し,複合体が非対称な弾丸型の構造を持つことを明らかにした。ATP+BeF_x存在下では対称なフットボール型構造が形成されることも明らかとなったので,ATP加水分解を伴ったシャペロニン・サイクル中過渡的にフットボール型となることも期待される。水と生体分子が織り成す生命現象として、蛋白質フォールディングは最も基本的なものであり、蛋白質フォールディングの分子機構解明は物理化学と生物科学との接点を担う重要な問題である。この問題を、(1)試験管内での自発的フォールディングの分子機構解明、(2)細胞内での蛋白質フォールディングに関わる分子シャペロンの作用機構解明の二つのテーマに分け、物理化学の立場から原理的に理解することを目的とする。以下の成果を得た。1.大腸菌の分子シャペロンであるGroELのヌクレオチドによるアロステリック転移は、ATPに対する高い選択性を示し、ATPが明確な転移をもたらすにもかかわらず、ADPやATPγS, AMP-PNPなどのATP類似物ではアロステリック転移はもたらされない。このようなATP選択性の要因を明らかにするため、GroELのフッ化金属ADP複合体によるアロステリックな構造転移をX線溶液散乱とピレン化GroELの蛍光スペクトルを利用して研究した。その結果、上記の高いATP選択性が、GroEL上ATPγリン酸基結合部位の幾何学と配位子数によりもたらされていることが明らかとなった。2.プロリンペプチド結合異性化反応などの、変性状態における遅い異性化反応がないとき、蛋白質フォールディング速度過程はどのように表されるであろうか。これを明らかとするため、6ヶのプロリンを全て他のアミノ酸に置換した、スタフィロコッカル・ヌクレアーゼを作成し、その巻き戻り速度過程をストップトフロー・ダブル・ジャンプ法を用いて研究した。フォールディングが安定な中間体を持った多重経路機構で起こっており、プロリンがないにもかかわらず複雑な多重指数関数的速度過程となることが明らかになった。この結果は、このような速度過程が蛋白質フォールディングの複雑なエネルギー地形を直接的に反映していることを示唆している。水と生体分子が織り成す生命現象として、蛋白質フォールディングは最も基本的なものである。この蛋白質フォールディングの分子機構解明の問題を、(1)試験管内での自発的フォールディングの分子機構解明、(2)細胞内での蛋白質フォールディングに関わる分子シャペロンの作用機構解明の二テーマに分け、物理化学の立場から原理的に理解することを目的とする。以下の成果を得た。1.ヤギα-ラクトアルブミンの種々の変異蛋白質を作成して、それらのフォールディングとアンフォールディングの速度過程における遷移状態構造のマッピングを行った(Φ値解析)。遷移状態の構造化領域は局在化して、カルシウム結合部位を中心としたαドメイン-βドメイン境界に集中しており、ここがフォールディング開始部位であることがわかった。2.緑色蛍光蛋白質の酸変性と巻き戻りの速度過程をCDスペクトルと蛍光スペクトルを用いて解析した。このタンパク質のフォールディングは、非特異的凝縮によるバースト相中間体と約0.5秒で形成される経路上中間体(モルテン・グロビュール)の二つの中間体を経て進行することがわかった。3.上記緑色蛍光蛋白質などのわれわれのデータも含め、中間体を含む非二状態蛋白質のフォールディング速度に関する実験データを文献から収集して、フォールディング速度と天然立体構造パラメータとの間の相関に関する統計解析を行った。その結果、非二状態蛋白質と二状態蛋白質の双方を含めたフォールディングの統一的描像を得ることが可能であることがわかった。4.シャペロニンGroELのATPによるアロステリック転移の速度過程を明らかとするため、停止フロー装置を用いてアロステリック転移の可逆性に関する速度論的研究を行った。ATP結合によるアロステリック転移は可逆であり、速度論的Monod-Wyman-Changeuxモデルで表されることがわかった。

この蛋白質フォールディングの分子機構解明の問題を、(1)試験管内での自発的フォールディングの分子機構解明、(2)細胞内での蛋白質フォールディングに関わる分子シャペロンの作用機構解明の二テーマに分け、物理化学の立場から原理的に理解することを目的とする。本年度は以下の成果を得た。1.蛋白質のフォールディングとアンフォールディングの速度過程に関する実験結果を計算機中に再現することを目的として、ヤギαラクトアルブミンの組換え体と真性体の高温(389K)分子動力学シミュレーションを行った。真性体に比べ組換え体はアミノ末端にMet残基を一個余分にもっている。実験から、組換え体のアンフォールディング速度は真性体よりも数十倍速く、熱力学的にもより不安定であることがわかっている。5nsの熱変性シミュレーションを10回行い、それらのトラジェクトリーを平均化することによって、実験結果を再現するシミュレーション結果が得られた。また、シミュレーション結果から真性体をより不安定化する変異を予測し、実験によってこの予測の正当性を確認することができた。(横浜市立大の池口(満)助教授のグループとの共同研究である)。2.イヌ・ミルク・リゾチームのモルテン・グロビュール(MG)状態は他の蛋白質のMG状態よりも大変安定であり、天然状態の特徴である特異的三次構造も一部兼ね備えている。このMG状態とフォールディングの速度論的中間体との関係を明らかにするため、イヌ・ミルク・リゾチームの巻き戻り反応をストップトフロー円二色性(CD)スペクトルと蛍光スペクトルを用いて調べた。巻き戻りにはバースト相中間体とその後の速度論的中間体があり、バースト相中間体が平衡MG状態と等価であることがわかった。1.昨年度までの研究で、速度論的なフォールディング中間体を蓄積する非二状態蛋白質のフォールディング速度過程に関する実験データを収集し、その統計解析から、非二状態蛋白質の中間体形成速度(速度定数の対数値ln k_I)や天然状態形成速度(ln k_N)も同様にQ_dと強く相関することを見出している。そこで、ln k_Iやln k_Nのこれらの相関関係の原因を探るため、12個の非二状態蛋白質のフォールディング速度定数の実験データをもとに以下の解析を行った。(1)そもそも、ln k_Iとln k_Nとはどのくらい相関するのかを調べた。(2)ln k_Iやln k_Nと最も良く相関する構造パラメータを蛋白質立体構造のコンタクトマップを利用して調べた。その結果、(1)ln k_Iとln k_Nは相関係数0.97という極めて高い相関を示すこと、(2)コンタクトマップから得られる非局所的コンタクトクラスター数(N_c)がln k_I及びln k_Nの双方と同様の極めて高い相関を示すことが明らかとなった。また、k(k_Iまたはk_N)とN_cとの間ではkN^vで表されるスケーリング則が成り立ち、スケーリング指数vはk_Iに対しては2.8、k_Nに対しては3.5であった。N_cは蛋白質天然構造中のサブ構造の全体的な配置を示すので、今回の結果は、蛋白質フォールディングの初期段階と後期段階のいずれにおいてもサブ構造間の配置が重要な過程となっていることを示唆する。
他者行為知覚時の脳内ダイナミクスに関する発達的研究:EEG/MEG計測による検討

本年度は,昨年度に引き続き光点運動のみからヒトの運動を知覚することが可能であるバイオロジカルモーション(以下,BM)刺激の処理過程に関する神経メカニズムを脳磁図(MEG)および脳波(EEG)計測により明らかにした。特に(1)成人を対象としたMEG/EEGによる研究,(2)Williams症候群の成人を対象としたMEGによる研究の2つを柱に研究を遂行した。(1)前年度の研究において見出したBM知覚処理に関連した脳磁図成分か(a)マスキングによりどのように変調されるか,(b)意思決定によりどのように変調されるか(c)二人のエージェントが相互作用するBM刺激でどのように変調されるかを調べた。その結果,(a)BM検出の個人成績とBM知覚処理に関連した脳磁図成分の振幅が有意に相関すること,(b)意図とは異なる方向のBMが提示された場合には脳磁図成分が有意に変調されること(c)半球間で二人のエージェントの相互作用に関する処理が異なる可能性を見出した。また脳波による実験では,BM知覚時にみられる二つの陰性成分がそれぞれ局所および大域運動情報によりそれぞれ変調されることを示し,BM知覚処理には階層的な処理が行われている可能性を示した。(2)昨年度に引き続き,Williams症候群の成人を対象にしたBM知覚時の脳活動をMEGを用いることにより明らかにした(愛知県心身障害者コロニーとの共同研究)。その結果,Williams症候群の成人においてもBM知覚処理に関連した成分の振幅および潜時がコントロール群の値の2SD以内であることが判明した。この知見はこれまで報告されている行動実験の結果と矛盾しなかった。本年度は,他者行為刺激の一つとして,光点運動のみからヒトの運動を知覚することが可能であるバイオロジカルモーション(BM)刺激の処理過程に関する神経メカニズムを脳磁図(MEG)および脳波(EEG)計測により明らかにした.特に(1)成人を対象としたMEGによる研究,(2)小学生,中学生および高校生を対象としたEEGによる発達的研究,(3)非定型発達児(Williams症候群)を対象としたEEGによる研究の3つを柱に研究を遂行した.(1)BM処理に固有の脳活動を抽出する実験系を組み,MEG計測を行った.その結果,BM知覚処理に固有の反応が右後側頭部において刺激提示後350msec付近において計測された.更に信号源推定を行った結果,上側頭溝付近に信号源が推定された.(2)5歳から16歳までの児童および成人(合計約100名)を対象とし,BM刺激提示時の脳波計測実験を実施した.実験の結果,5-6歳児のグループにおいて,既にBM知覚処理に関連した活動が計測されていることが明らかになった.また,10-11歳児においては計測される波形の形状が他の年齢群の児童と比較して異なっていることが明らかになった.(3)非定型発達児(Williams症候群)におけるBM知覚時の脳活動を愛知県心身障害者コロニーとの共同研究によりEEG実験を行った.その結果,Williams症候群の児童においてもBM知覚時の活動がコントロール群と類似している場合があることが判明した.しかしながら,個人差が大きく,他の認知機能との相関を明らかにした上で慎重に議論する必要があると思われる.次年度は他の認知機能と脳活動の相関を明らかにし,非定型発達児における社会的知覚処理の神経メカニズムを明らかにしていく予定である.本年度は,昨年度に引き続き光点運動のみからヒトの運動を知覚することが可能であるバイオロジカルモーション(以下,BM)刺激の処理過程に関する神経メカニズムを脳磁図(MEG)および脳波(EEG)計測により明らかにした.特に(1)成人を対象としたMEG/EEGによる研究,(2)小学生および中学生を対象としたEEGによる横断および縦断的研究,(3)WilliamsおよびCatch22症候群の児童を対象としたEEGによる研究の3つを柱に研究を遂行した.(1)前年度の研究において見出したBM知覚処理に関連した脳磁図成分が(a)マスキングによりどのように変調されるか,(b)意思決定によりどのように変調されるかを調べた.その結果,(a)BM検出の個人成績とBM知覚処理に関連した脳磁図成分の振幅が有意に相関すること,(b)意図とは異なる方向のBMが提示された場合には脳磁図成分が有意に変調されることを見出した.(2)5歳から16歳までの児童および成人(合計約60名)を対象とし,BM刺激提示時の脳波計測実験を実施した.うち30名については昨年も実験に参加した児童であり,同一被験者の発達変化を二年連続して計測した.実験の結果,初期成分については発達による変調が見られたが,後期成分については発達による変化はなく,BM刺激条件がコントロール刺激条件よりも有意に活動が増大することを確認した.(3)昨年度に引き続き,Williams症候群およびCatch22症候群の児童におけるBM知覚時の脳活動を愛知県心身障害者コロニーとの共同研究によりEEG実験を行った.その結果,Williams症候群の児童においてもBM知覚時の活動がコントロール群と類似している場合があることが判明した.本年度は,昨年度に引き続き光点運動のみからヒトの運動を知覚することが可能であるバイオロジカルモーション(以下,BM)刺激の処理過程に関する神経メカニズムを脳磁図(MEG)および脳波(EEG)計測により明らかにした。

(1)前年度の研究において見出したBM知覚処理に関連した脳磁図成分か(a)マスキングによりどのように変調されるか,(b)意思決定によりどのように変調されるか(c)二人のエージェントが相互作用するBM刺激でどのように変調されるかを調べた。その結果,(a)BM検出の個人成績とBM知覚処理に関連した脳磁図成分の振幅が有意に相関すること,(b)意図とは異なる方向のBMが提示された場合には脳磁図成分が有意に変調されること(c)半球間で二人のエージェントの相互作用に関する処理が異なる可能性を見出した。また脳波による実験では,BM知覚時にみられる二つの陰性成分がそれぞれ局所および大域運動情報によりそれぞれ変調されることを示し,BM知覚処理には階層的な処理が行われている可能性を示した。(2)昨年度に引き続き,Williams症候群の成人を対象にしたBM知覚時の脳活動をMEGを用いることにより明らかにした(愛知県心身障害者コロニーとの共同研究)。その結果,Williams症候群の成人においてもBM知覚処理に関連した成分の振幅および潜時がコントロール群の値の2SD以内であることが判明した。この知見はこれまで報告されている行動実験の結果と矛盾しなかった。
糖尿病が誘発する筋機能低下の分子メカニズムの解明

本研究は肥満2型糖尿病による筋力低下の要因に細胞内Ca2+調節が関連していると仮説を立て検証した。また、代謝疾患の予防・改善に効果的である継続的な運動(運動トレーニング)による効果も合わせて実施した。肥満2型糖尿病モデル動物(以下db/db)を対象に、単離した骨格筋の電気刺激時の発揮筋力およびCa2+イメージング法による細胞内Ca2+レベルを測定した。db/dbはコントロールのdb/+よりも電気刺激時による筋力および細胞内Ca2+放出能が著しく低下していること、電気刺激時および薬理学的手法による細胞内Ca2+放出が著しく低下していることを明らかにした。さらに、実験動物用トレッドミル装置による6週間の運動トレーニングをdb/dbに実施させたところ、db/dbの全身性糖代謝能(糖負荷試験による血糖降下率)に変化はないものの、筋力の低下および細胞内Ca2+放出能の低下が改善されることを明らかにした。これらの結果は、肥満2型糖尿病による筋力低下は血糖調節(高血糖)が主要因ではなく、細胞内Ca2+放出の障害が糖尿病の筋力低下に大きく関与していることを示唆している。今後は、糖尿病が誘発する骨格筋機能低下と細胞内Ca2障害+の関連性及び分子機序の解明を行う。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。生活習慣病である糖尿病は代謝調節能の障害のみならず、骨格筋の萎縮および筋力低下といった形態的、機能的損失を併発する。本研究は肥満2型糖尿病モデル動物による筋力低下の要因に細胞内Ca2+調節が関連していると仮説を立て検討した。2型糖尿病は高血糖、インスリン抵抗性、肥満などが複合的に生じた疾患であることから、まず筋力低下の規定因子を明らかにするため、ヒトの肥満型糖尿病に類似した症状を発現する自然2型糖尿病モデル動物のdb/dbマウスおよび高脂肪食の摂取によるインスリン抵抗性モデルマウスを用いた。まず、db/dbマウスは電気刺激による発揮筋力が低下していた。また、細胞内Ca2+は骨格筋の収縮、弛緩速度を規定するが、db/dbマウスでは収縮、弛緩速度が有意に遅延し、それに付随して、Ca2+関連タンパク質も低下していた。一方、高脂肪食摂取による肥満インスリン抵抗性モデルマウスは電気刺激時による発揮筋力がdb/dbマウスと同様に低下していた。しかしながら、インスリン抵抗性モデルマウスは骨格筋の収縮および弛緩速度には変化がなく、Ca2+関連タンパク質レベルにも差がなかった。以上の得られた知見から、高脂肪食性肥満モデルには細胞内Ca2+調節が障害されている可能性は低いことが示唆された。したがって、高血糖を誘発する糖尿病モデルとインスリン抵抗性モデルはそれぞれ別のメカニズムによる筋力低下の障害が生じていると推察している。高脂肪食性肥満モデルマウスを対象として得られた知見は国際学術雑誌に公表した(Eshima et al. Physiolo Rep. 2017)。平成28年度は2型糖尿病モデルおよびインスリン抵抗性モデルを用いて、これらのモデルの発揮筋力が著しく低下していること、糖尿病モデルのみに細胞内Ca2+調節の障害が生じている可能性があることを見出したため、おおむね順調に進展していると判断した。今後は肥満2型糖尿病モデルを対象とした筋力低下の要因を詳細に解明していく。細胞内Ca2+調節はバイオイメージング法によって明らかにする。肥満2型糖尿病モデルでは、骨格筋の収縮、弛緩速度が遅延していた点やタンパク質レベルによる機能不全を見出しているため、細胞内Ca2+調節が障害されていることが予想できる。得られた知見から、介入研究への着手も検討する。
申請者はこれまで、結晶化を含む「階層的な自己集合体形成」に関する数多くの研究を行い、様々な機能材料の開拓に成功してきた。最近その過程で「Screw Dislocationが提供するトポロジカル欠陥」が「結晶の核形成と成長」を促すことを直接示す現象を発見した。本研究課題ではこの現象の理解と深化を行い「結晶学における新学理」を構築する。
Rab GTPase Sec4pと、そのエフェクターによる開口放出制御の構造基盤

Sec4pとそのエフェクターに関する研究については複合体の結晶を得ることができず進捗がなかった。一方、平行して昨年度実施したRAP80及びTAB2・TAB3によるK63結合型ポリUb鎖特異的認識機構についての研究は、結晶構造からそのメカニズムを明らかとし成果は学術誌に掲載された。ユビキチン(Ub)は76残基からなるタンパク質で、標的タンパク質のリジン残基とイソペプチド結合を介して結合することでタンパク質の機能を制御する。また、結合したUbのリジン残基にさらにUbが付加して形成されるポリUb鎖によって標的タンパク質の機能を制御することも多く、この場合どのリジン残基を用いてポリUb鎖を形成するかでその役割は異なってくる。細胞内で最も多く存在しているのはK48結合型のポリUb鎖でプロテアソームによる分解シグナルとして働く。一方、K63結合型ポリUb鎖はプロテアソーム系ではなく、タンパク質合成、受容体の分解、DNAの修復、免疫や炎症に関わる細胞内シグナル伝達といった様々な生命現象に関与する。例えば、K63結合型ポリUb鎖はDNA二重鎖切断が生じた部位に形成され修復シグナルとして働き、RAP80はK63結合型ポリUb鎖を認識し、様々な修復酵素をDNA損傷部位へと集める働きを持つ。また、TNFαなどのサイトカインの刺激によりK63結合型ポリUb鎖が形成され、TAB2・TAB3がK63結合型ポリUb鎖を特異的に認識することで最終的にNF-κBシグナルが活性化される。我々はRAP80及びTAB2・TAB3のK63結合型Ub二量体の複合体の結晶構造をそれぞれ決定し、Lys63結合型ポリUb鎖の特異的認識メカニズムを明らかにした。この成果はどちらも「The EMBO Journal」に掲載された。開口放出は分泌の最終経路で分泌小胞が細胞膜と融合することによって起こる.その膜融合は,主に低分子量GTPaseであるRabとエフェクターとの相互作用によりGTP依存的に制御されている、Rabは活性化状態であるGTP結合型と不活性化状態であるGDP結合型の2つの状態を転移することで,開口放出を制御する分子スイッチとして働く.出芽酵母の開口放出はRabの一つであるSec4pによって制御されている,Rabの活性型への変換はグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)によって行われているが,Sec4pのGEFとしてSec2pが同定されており,また,そのGEFドメインは2量体化して180Å以上におよぶ非常に長い平行コイルドコイル構造を持つことを最近明らかにした.また,ごく最近核酸非結合型のSec4pとSec2p複合体の構造も明らかにされ,Sec2pはSec4pのスイッチ領域,およびP-loopの構造を大きく変化させることがわかった.しかし,この構造は分解能が3.3Åと低く,詳細な結合様式を議論するためには不十分であった.そこで,我々はSec2pによるSec4p活性化の機構を明らかにするため,Sec4p・Sec2p複合体の結晶構造を2.7Åの分解能で決定し,Sec4pとSec2pの詳細な結合様式を明らかとした.また,我々の構造は,通常グアニンヌクレオチドのβ位のリン酸の結合に関わるP-loopに,リン酸イオンが結合していた.このため,P-loopは安定化され,核酸結合型のSec4pと類似した構造をとっていた.このことから,我々の決定したSec4p・Sec2p・リン酸複合体の構造はGDP解離反応の遷移状態を模していると考え,Sec4p活性化の反応モデルを提案した.開口放出は分泌の最終経路で分泌小胞が細胞膜と融合することによって起こる.その膜融合は,主に低分子量GTPaseであるRabとエフェクターとの相互作用によりGTP依存的に制御されている.Rabは活性化状態であるGTP結合型と不活性化状態であるGDP結合型の2つの状態を転移することで,開口放出を制御する分子スイッチとして働く.出芽酵母の開口放出において分泌小胞か適切な場所へと輸送されるには,RabエフェクターであるSec15pがGTP結合型Sec4pとGDP結合型Sec4pの識別を行い,GTP結合型Sec4pと特異的に結合することが必要である.また,Sec15pはSec4pと結合することが引き金となってexocyst複合体を形成し,分泌小胞を標的膜へとつなぎとめると考えられており,Sec4pとの結合によってSec15pに生じる構造変化が解明されれば,これまで未知であったexocyst複合体形成の分子機構の理解につながる.そこで,Sec15pのSec4p結合領域の発現系構築を行い,発現量が十分なSec15pの発現系の構築と,Sec15p・Sec4p複合体の結晶構造決定を目指した.現在までに,すでに決定されているショウジョウバエSec15のRab結合領域を参考に作成した発現系で,結晶構造解析に十分な量のSec15pを得ることに成功している.以降は,GTP結合型のSec4pと混ぜ合わせて結晶化のスクリーニングを行い,複合体の結晶を得ることを目指す.Sec4pとそのエフェクターに関する研究については複合体の結晶を得ることができず進捗がなかった。

また、結合したUbのリジン残基にさらにUbが付加して形成されるポリUb鎖によって標的タンパク質の機能を制御することも多く、この場合どのリジン残基を用いてポリUb鎖を形成するかでその役割は異なってくる。細胞内で最も多く存在しているのはK48結合型のポリUb鎖でプロテアソームによる分解シグナルとして働く。一方、K63結合型ポリUb鎖はプロテアソーム系ではなく、タンパク質合成、受容体の分解、DNAの修復、免疫や炎症に関わる細胞内シグナル伝達といった様々な生命現象に関与する。例えば、K63結合型ポリUb鎖はDNA二重鎖切断が生じた部位に形成され修復シグナルとして働き、RAP80はK63結合型ポリUb鎖を認識し、様々な修復酵素をDNA損傷部位へと集める働きを持つ。また、TNFαなどのサイトカインの刺激によりK63結合型ポリUb鎖が形成され、TAB2・TAB3がK63結合型ポリUb鎖を特異的に認識することで最終的にNF-κBシグナルが活性化される。我々はRAP80及びTAB2・TAB3のK63結合型Ub二量体の複合体の結晶構造をそれぞれ決定し、Lys63結合型ポリUb鎖の特異的認識メカニズムを明らかにした。この成果はどちらも「The EMBO Journal」に掲載された。
放射線防護剤のスクリ-ニングに関する化学的研究

放射線治療あるいは放射線被曝環境下における防護剤を開発するために、生体構成物質であるDNAあるいは核酸塩基の放射線化学反応系における防護剤の性能と培養細胞系における活性の相関を調べ、下記の成果を得た。1.各種防護剤を添加したチミン水溶液に^<60>Co-gamma線を照射し、放射線ヒドロキシル化反応生成物であるチミングリコ-ルの生成G値を求め、防護剤の放射線化学的活性を比較検討した。2.チミン水溶液の放射線分解およびチミングリコ-ル生成に及ぼすアルコ-ル類およびチオ-ル類添加の影響を調べ、放射線化学初期活性種の反応性ならびに防護反応機構を考察した。3.各種リポアミド誘導体を合成し、放射線化学的評価系における防護活性について検討した。4.EMT6培養細胞の放射線不活性化に対する各種防護剤の防護活性は、放射線化学系におけるチミングリコ-ル生成に対する抑制活性が大きいものほど大きいという一義的な関係にあることを明らかにした。5.上記の一義的関係から、放射線化学反応論に基づく放射線防護剤のスクリ-ニングが可能であることが示された。6.チオアミド基を側鎖にもつN_1-置換-1,2,4-トリアゾ-ルをマウスに静脈注射し、薬物動態を調べた結果、この薬剤は血中で代謝され難く、長時間に亘って一定濃度に保持されるという特性を示すことを明らかにした。以上のように、放射線化学系ならびに培養細胞系を用いた放射線防護剤のスクリ-ニング法を確立した。将来の課題として、実験動物を用いた<in(1)ー> vivo防護活性を評価することが必要である。エネルギー,医療,滅菌,あるいは材料科学などの分野において低線量放射線暴露に起因する障害が問題になりつつある.これら予防するための高活性放射線防護剤の開発を目的として,放射線防護剤の新しい化学的スクリーニングシステムの確立をめざした研究を行い,次の成果を得た.1.放射線損傷DNAのモデル化合物となるヒドロキシル化DNAのモノマーであるチミジングリコール,および本年度に主要設備として購入した自動DNA合成装置を用いた防護剤のスクリーニング用プローブ化合物であるオリゴチミジル酸(チミジン5量体)の合成の最適条件を確立した.2.上記のオリゴチミジル酸水溶液に^<60>Coγ線を照射して放射線分解を行い,分解生成物の構造を確認するとともにγ線のエネルギー100eVあたりの分解分子数,すなわちG値を求めた.また,チミン水溶液の放射線分解におよぼすチオール類およびアルコール類添加の影響を調べ,生体防護の分子機構について考察した.その一例を示すと,メタノール,エタノール,イソプロピルアルコール,第三ブチルアルコール,あるいはエチレングリコールの存在下で,亜酸化窒素または窒素を飽和させたチミン水溶液にγ線を照射すると,チミン分解のG値がアルコール無添加系と比べて著しく減少すると同時に,チミングリコールなどのヒドロキシル化合物生成の選択率が減少した.特に,第三ブチルアルコールおよびエチレングリコールによるチミン減少の抑制効果が顕著で,亜酸化窒素飽和系におけるチミン減少のG値がそれぞれ無添加系の約1/3および1/4に減少した.亜酸化窒素飽和系では,水の放射線分解によりおもに生じる水酸ラジカルと反応しやすい第三ブチルアルコールがチミンに対する防護効果を示したと考えた.3.63年度には,オリゴチミジル酸をプローブとしてアルコール,アミンなどの放射線防護作用を検討する.医療や材料科学などの分野における低線量放射線障害を予防するための高活性放射線防護剤の開発を目的として、放射線防護剤の新しい化学的スクリーニングシステムの確立をめざした研究を行い、次の成果を得た。1.62年度において、チミン水溶液の放射線分解に対してチオール類およびアルコール類の防護効果が確認された。本年度は細胞浸透性ならびに生体内安定性を実験的に検討した結果、トリアゾールやイミダゾール環の側鎖に含硫黄官能基導入することが、防護作用を向上させることがわかった。そこで、2,3の含硫黄化合物を試験的に合成し、培養細胞における防護活性を検討した。

2.新規含硫黄放射線防護剤の合成(1) Nー(2ーメトキシエチル)ー2ートリアゾリルチオアセトアミド(以下チオアミドと略す)の合成。1Hー1,2,4ートリアゾール(TA)とブロモ酢酸エチルを原料とし、3段階で目的物を得た。NMR,IR,元素分析により確認した。(2) Nー(2ーメルカプトエチル)ー2ートリアゾリルアセトアミド(以下チオールと略す)の合成。べンジルメルカプタン,2ーブロモエチルアミン臭化水素塩、および(1)の中間生成物を用い、3段階で目的物を得た。3.培養細胞系にチオアミドを添加すると酸素存在下の照射では生存率が無添加に比べて増大して、防護作用が認められた。また、酸素非存在下では、増感効果も防護効果も示さなかった。一方、トリアゾール環にニトロ基を導入すると、酸素非存在下において放射線増感作用を示した。平成元年度は、チオール,チオケトン,およびチオリン酸などの含硫黄新規防護剤を合成し、防護作用を検討する。放射線治療あるいは放射線被暴環境下における防護剤を開発するために、生体構成物質であるDNAあるいは核酸塩基の放射線化学反応系における防護剤の性能とin vitro培養細胞系における活性の相関を調べ、下記の成果を得た。1.N,N-ジエチル-α-リポアミドなど、6種類のリポアミド誘導体を合成し、チミン水溶液の放射線分解に及ぼすこれら誘導体の添加効果を調べた。リポアミド誘導体を添加(0.1mM、チミンの1/5量)することにより、チミン分解のG値はN_2雰囲気下で1455%に、空気雰囲気下で7290%に減少した。また、チミングリコ-ル生成のG値はN_2雰囲気下で3163%に減少したが、空気雰囲気下における減少率の最高値は無添加系の76%であり、まったく抑制効果を示さないものもあった。2.in vitro培養細胞系におけるリポアミド誘導体の効果を調べた。空気雰囲気下における無添加時の酸素増感比は2.31であったのに対し、リポアミド誘導体添加(1mM)時には、1.972.31に変化し、明らかに防護活性を有するものが見いだされた。3.チミン水溶液系およびin vitro培養細胞系における防護活性の間には一定の相関が認められ、放射線化学反応論的見地から、防護剤のスクリ-ニングが可能であることを明らかにした。4.チオアミド基を側鎖にもつN,-置換-1,2,4-トリアゾ-ルをマウスに静脈注射した後の薬物動態を調べた結果、このものは血中で代謝され難く、長時間(2時間以上)一定濃度に保持されるという特性を示した。現在、マウスを用いたin vivo活性を調べている。
アポトーシス発現機序の分子病理学的解析

1. FasTfマウス肥満細胞株P815(P815Fas)に及ぼす細胞周期及び薬剤の作用機序検討:Fas遺伝子をP815細胞にTfしFasを強く発現するP815Fas細胞株を樹立した。P815Fas細胞は抗Fas抗体の刺激によりG2期の細胞が減少し、死細胞が増加する。Apo細胞はtime-dependentに増加し、2時間で40%に達する特有の性質を明らかにした。nocodazol(NZ)でP815Fas細胞を処理すると抗Fas抗体によるApoが阻止されることも確認した。しかし、bleomycin(BM)のApoではG2細胞の増加が起こり、NZにより阻止されないことも観察した。3. P815FasのApoに及ぼす諸因子の効果の検討:1)諸Tf細胞による抑制:APO抑制遺伝子bcl-2およびbclxL、p53のdominant negative mutant minip53,ストレス経路で最終的にc-Junの燐酸化に関与するSEKなどをP815Fas細胞にダブルTfし、stable cloneを樹立した。bc1-2およびbclx Lでは抗Fas抗体におけるApoが全く阻止されないが、minip53ではG2細胞の減少は少なくなり、Apoは強く阻止される成績を得た。2)ペプチド(P)による抑制:Z-VADで300μMおよびDEVDで300μM各3時間で抗FasにおけるApoが強く阻止されるが、YVADで600μM、3時間ではごく軽度の阻止に留まることを観察した。3)P分解活性:抗Fas刺激ではDEVDの分解が強く起こるが、YVDAの分解は見られないこと、いっぽう、BMやCMでは分解活性が見られないことを確認した。4)CPP32(apopain)の分解活性:抗Fas刺激とBMおよびCM刺激では前者が強い分解活性を示すが、後者には全く活性が見られない成績を得た。5)C-Junの燐酸化:抗Fas刺激では燐酸化は殆ど見られないが、CMではとBMおよびCMや熱刺激では強い燐酸化が見られることを観察した。6)p53、p21およびbclxの集積:抗Fas抗体刺激ではp53の変化は見られないこと、p21は減少し、bclxは増加すること、いっぽう、BMおよびCMでは抗Fas抗体刺激ではp53およびp21の増加が見られ、bclxには変化が見られないことを観察した。4.イースト系における検討:bcl-2やICEが細胞周期やmutationに関与する可能性を検討するためにS.cervisiaeにbcl-2あるいはICEをTfし、0-12.5Kradのγ線照射によりG1,S,G2/M期の細胞数の割合を形態の違いで計数した。また、γ線照射により生じるmutationの頻度をminimal plate上のコロニーの数で比較した。しかし、有意の成果はえられなかった。5.その他:P815細胞にIPTG-inducibleな条件下にRb,アンチセンスRbを電気穿孔法でTfし、細胞増殖の違いやDNA障害因子によるAPOの程度を検討中である。1.FasTfマウス肥満細胞株P815(P815Fas)に及ぼす細胞周期および薬剤の作用機序検討:Fas遺伝子をP815細胞にTfしFasを強く表現するP815Fas細胞株を樹立した。3.P815FasのApoに及ぼす諸因子の効果の検討:1)諸Tf細胞による抑制:APO抑制遺伝子bcl-2およびbclxL、p53のdominant negative mutant minip53,ストレス経路で最終的にc-Junの燐酸化に関与するSEKなどをP815Fas細胞にダブルTfし、stable cloneを樹立した。bcl-2およびbclxLでは抗Fas抗体におけるApoが全く阻止されないが、minip53ではG2細胞の減少は少なくなり、Apoは強く阻止される成績を得た。

6)p53、p21およびbclxの集積:抗Fas抗体刺激ではp53の変化は見られないこと、p21は減少し、bclxは増加すること、いっぽう、BMおよびCMでは抗Fas抗体刺激ではp53およびp21の増加が見られ、bclxには変化が見られないことを観察した。4.イ-スト系における検討:bcl-2やICEが細胞周期やmutationに関与する可能性を検討するためにS.cervisiaeにbcl-2あるいはICEをTfし、0-12.5Kradのγ線照射によりG1,S,G2/M期の細胞数の割合を形態の違いで計数する。また、γ線照射により生じるmutationの頻度をminimal plate上のコロニーの数で比較中である。5.その他:P815細胞にIPTG-inducibleな条件下にRb,アンチセンスRbを電気穿孔法でTfし、細胞増殖の違いやDNA傷害因子によるAPOの程度を検討中である。1. FasTfマウス肥満細胞株P815(P815Fas)に及ぼす細胞周期及び薬剤の作用機序検討:Fas遺伝子をP815細胞にTfしFasを強く発現するP815Fas細胞株を樹立した。P815Fas細胞は抗Fas抗体の刺激によりG2期の細胞が減少し、死細胞が増加する。Apo細胞はtime-dependentに増加し、2時間で40%に達する特有の性質を明らかにした。nocodazol(NZ)でP815Fas細胞を処理すると抗Fas抗体によるApoが阻止されることも確認した。しかし、bleomycin(BM)のApoではG2細胞の増加が起こり、NZにより阻止されないことも観察した。3. P815FasのApoに及ぼす諸因子の効果の検討:1)諸Tf細胞による抑制:APO抑制遺伝子bcl-2およびbclxL、p53のdominant negative mutant minip53,ストレス経路で最終的にc-Junの燐酸化に関与するSEKなどをP815Fas細胞にダブルTfし、stable cloneを樹立した。bc1-2およびbclx Lでは抗Fas抗体におけるApoが全く阻止されないが、minip53ではG2細胞の減少は少なくなり、Apoは強く阻止される成績を得た。2)ペプチド(P)による抑制:Z-VADで300μMおよびDEVDで300μM各3時間で抗FasにおけるApoが強く阻止されるが、YVADで600μM、3時間ではごく軽度の阻止に留まることを観察した。3)P分解活性:抗Fas刺激ではDEVDの分解が強く起こるが、YVDAの分解は見られないこと、いっぽう、BMやCMでは分解活性が見られないことを確認した。4)CPP32(apopain)の分解活性:抗Fas刺激とBMおよびCM刺激では前者が強い分解活性を示すが、後者には全く活性が見られない成績を得た。5)C-Junの燐酸化:抗Fas刺激では燐酸化は殆ど見られないが、CMではとBMおよびCMや熱刺激では強い燐酸化が見られることを観察した。4.イースト系における検討:bcl-2やICEが細胞周期やmutationに関与する可能性を検討するためにS.cervisiaeにbcl-2あるいはICEをTfし、0-12.5Kradのγ線照射によりG1,S,G2/M期の細胞数の割合を形態の違いで計数した。
日系食品産業の中国・台湾・香港市場における販売戦略に関する研究

本研究では、日本の食品産業の海外進出において、中国・台湾・香港等市場への新たな販売戦略の構築について検討した。研究では、進出企業にたいする現地調査成果を蓄積し、これらの市場で有効な日系食品産業の販売戦略の構築のための諸条件を検討した。研究で明らかになった日系食品産業が直面する課題は以下の通りである。1中国における特有の商慣行(入場料等)への早急な対応が必要なこと、2日本で培った技術・ノウハウを進出先国へどのように応用していくのか、3日本食品の優位点である安全・安心戦略を進出先国においてどのように確立するのか、4急速に拡大するネット市場での販売をどのように進めていくのか、等であった。日本の食品産業(ここで食品産業とは、農業企業、食品加工企業、外食産業、食品小売業等をさす)の海外進出は、1990年代以降中国を中心に大きな進展をみた。しかし、2000年代に入り、中国における労賃・原材料等のコスト上昇の要因により、日本への原料供給基地としての役割は低下し、かわって、消費者の購買力の向上等を背景とした、中国・台湾・香港・マカオ市場等向け販売の強化という経営戦略の転換が大きな課題となっている。この状況の中で、本研究では、日本食品産業の新たな発展の方途として、中国・台湾・香港等市場への新たな販売戦略の構築について検討する。具体的には、進出企業にたいする現地調査成果を蓄積し、これらの市場で有効な日系食品産業の販売戦略の構築のための諸条件を検討するものである。2015年度は研究計画に基づいて、中国事情への販売実績を有している日系企業の調査を実施した。山東省莱陽市の、1山東朝日緑源農業高新技術有限公司・山東朝日緑源乳業有限公司(牛乳生産販売、アサヒビール現地法人)、2山東日龍食品有限公司(食肉加工販売、日本ハム現地法人)、3山東龍藤不二食品有限公司(大豆製品製造販売、不二製油現地法人)、4莱陽花楽町有限公司(花苗の栽培販売、ハルディン現地法人)、広東省広州市の5広東順徳日清食品有限公司(カップ麺等の製造販売、日清食品現地法人)である。これらの調査から、各社が急速に日本への原料生産拠点から中国販売拠点に転換しつつあることが明らかになった(とくに2、3、4の事例)。また、各社の中国市場販売の展開と課題(とくに中国特有の商習慣への対応策、中国市場でのマーケティング戦略等)が明らかになりつつある。今後とも調査結果の分析を進めていきたい。本研究の研究期間は3年間を計画している。主要な研究としては、各国に展開する日系食品産業(農業企業・食品企業、外食企業・流通企業等)にたいする実態分析を十分に行うため、企業および関係機関を対象とした面接調査、アンケート調査に重点を置き、この新販売戦略の構築・発展のための条件を明らかにする。2015年度は、以下のヒアリング研究と資料研究を計画した。(1)国内関係機関(農林水産省、経済産業省、ジェトロ等)、関連企業(主に食品メーカー、アサヒビール、ハルディン、日本ハム等の親会社)からの聴取調査と関連行政資料収集。主な調査項目:本新システムにかんする関連政策の把握と各企業の生産・販売戦略。(2)朝日緑源・ハルディン・日本ハムを対象とした中国現地調査。朝日緑源・ハルディン・日本ハムを対象とした中国現地調査を実施し、これまでの進出過程での課題(制度規制、農地取得等の困難、生産上・販売上の課題)、生産、販売情況を把握する。(3)関係資料(新聞・雑誌記事、研究書、統計書等)の分析に基づく、企業の新規事業、各国の関連政策の転換等の情報収集。(1)(2)(3)の研究を総合して、2016年度以降の研究の基礎データを作成する。この計画にたいして、実際には、以下のように実施した。概ね計画通り実施できたと考えている。(1)ジェトロ、アサヒビール本社への訪問調査を実施した。関連資料の収集と、アサヒビールの海外戦略(とくに中国戦略)にかんするヒアリング調査を実施した。(2)朝日緑源・ハルディン・日本ハム・不二製油・日清食品の中国現地法人を対象とした中国現地調査を実施した。これまでの進出過程での課題(制度規制、農地取得等の困難、販売上の課題)、生産、販売情況(中国特有の商習慣への対応等)を把握した。(3)関係資料の分析に基づく、企業の新規事業、各国の関連政策の転換等の情報を収集した。2016年度は研究計画に基づいて、中国事情への販売実績を有してる日系企業の調査を実施した。山東省莱陽市の、1山東朝日緑源農業高新技術有限公司・山東