hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血液型不適合肝移植術後患者の免疫寛容状態の解析

本年の研究課題では、血液型不適合肝移植後の長期経過において血液型抗原に対して抗体価の上昇を認めないことを証明した。移植時年齢が低い症例が長期経過後の血液型抗体価が有意に低いことが判明した。一方、成人症例では術前および術後のRituximabの投与が長期経過における血液型抗体価への影響については有意差がないことを確認した。長期経過における血液型抗体価が低下する原因として、血液型抗原を大量に発現する移植肝における抗体の吸着が原因であるとの仮説に対しては、血液型不適合移植後の再肝移植症例を検討した。血液型不適合移植後、血液型適合ドナーから再移植した症例では、血液型抗体の移植肝における吸着はおこらないが、再移植後であっても、初回血液型不適合移植を行った血液型に対する抗体の抗体価は低下したままの状態であった。また、血液型不適合移植後、再移植で、再び同じ血液型の不適合肝移植を行った症例では、初回、肝移植時には不適合血液型抗原に対する抗体価の上昇がみられたが、再移植時には、血液型抗体の上昇は認めなかった。このことから、不適合肝移植後に、不適合である血液型抗原に対する抗体産生の免疫反応が低下していることが判明した。血液型抗原に対する免疫反応を測定する方法を確立した。被験者の末梢血を採取し、リンパ球を分離して、免疫不全マウスに注入する。免疫不全マウスにヒトリンパ球が生着した後、赤血球を抗原として暴露させ、免疫不全マウスで産生される血液型抗体を測定することで血液型抗原に対する免疫能を評価する方法を確立した。肝移植今までの当科における血液型不適合肝移植の検討によって、乳児における血液型抗原に対する免疫応答が確立していないこと、また、血液型不適合肝移植後、長期経過における血液型抗原に対する免疫応答の不応性について推察された。今回、疫学的な検討に加え、in vitroで患者抹消血中の血液型抗原に対する応答性の研究を行った。In vitroにおけるB細胞の増殖および血液型抗原に対する応答については、抹消血中に存在する血液型抗原に対応するクローンの存在が少ないために非特異的反応の影響を除去することができなかった。現在は、効率よく血液型抗原に対するクローンの増殖をはかるために、免疫不全マウスを用いてin vivoで刺激を加えて増殖する実験を行っている。産生された抗体の測定する系はフローサイトメトリーを用いて測定する方法は確立している。また、移植後の血液型抗原の発現についてゼロバイオプシーおよび経過における肝生検そしきについて免疫染色で発現を検討している。今年度では、患者血液からの抗原特異的B細胞の同定および、測定を行う予定であったが、試薬の変更などの条件の変更に伴い、非特異的反応が生じているため、より確実な実験結果を得るために、慎重に条件の再設定および、実験系の改善を試みているため、その過程がやや遅れている。患者群の群別および、遠隔期の末梢血中の抗体価の測定および、ABO不適合移植の術後抗体関連型拒絶反応との関係については、予定通り、情報収集は進んでいる。現在、健常人の予備実験において、血液型抗原に応答するB細胞クローンの増殖および、その証明の実験を進めているところである。
複製ストレスによる複製フォーク複合体の変動と細胞応答機構の解析

ヒトフォーク因子複合体はS期のクロマチン画分でリン酸化型Mcm4を特異的に含むことを見出した。次に、マウスES細胞で発現解析したところ、フォーク因子や複製タイミング制御因子Rif1が高発現していた。発現抑制の実験などにより、Rif1の発現はES細胞の自然分化を抑制しiPS細胞の形成効率に必要である一方、多能性を亢進する二細胞期の遺伝子群を抑制するという双方向の作用を持つことがわかった。また、Rif1が分化誘導において重要な遺伝子のプロモーター領域に結合することも見出した。複製フォーク複合体はDNA合成に伴いゲノム上に形成されるため、増殖が盛んな細胞で発現が高いと考えられる。昨年度、胎生幹(ES)細胞におけるフォーク複合体タンパク質を調べたところ発現が予想以上に高いという予備的な結果を得た。そこで本年度は体細胞と未分化な幹細胞での発現を比較するため、ともに増殖の早い初代マウス胎児繊維芽(MEF)細胞とES細胞における複製因子やフォークタンパク質の発現量を網羅的に比較した。その結果、ES細胞で1)発現が非常に高い(10倍以上)、2)発現がやや高い(2から数倍)、3)発現がMEFとほとんど変わらない、という3つのグループに分類された。複製起点に結合するMcmタンパク質は2、GINSは3に分類されたが、フォーク複合体因子であるTimeless, Tipin, AND-1タンパク質は1であることが分かった。このことから、複製関連タンパク質の発現レベルは増殖速度だけではなく細胞の分化段階によっても規定されること、中でもフォーク因子はES細胞での発現が高く、幹細胞の機能維持に未知の役割を担っている可能性が示唆された。ES細胞におけるフォーク因子の機能をさぐるため、AND-1のDNAゲノム上の結合領域をChIP-seq法で調べ、現在データを解析中である。また、昨年度に引き続きRif1の細胞分化における機能解析を行い、マウス胎児繊維芽細胞でRif1の発現をなくすとiPS細胞の形成能が著しく抑制されることを見いだした。すなわち、Rif1が未分化状態の維持だけでなくリプログラミングにも重要であることが示唆された。Rif1は複製ドメインを制御することが報告されており、Rif1によるクロマチン構造の変換がリプログラミングに何らかの重要な役割をもつ可能性が想定される。複製フォーク複合体因子やその他の複製制御因子について、未分化細胞にて機能解析を行った。1) AND-1, Tipin:胎生幹細胞(ES細胞)では複製フォーク因子AND-1とTipinが高発現しており、分化誘導に伴い顕著に減少することを見出した。一方、複製開始に必要なMcmやGINSの発現量は分化の過程で顕著な変動がなかった。AND-1の結合部位をクロマチン免疫沈降DNA解析にて調べたところ、ES細胞特異的な転写因子Pou5f1, Nanog, Sall1, Sall4のプロモーター領域に蓄積していることを見出した。一方、分化を制御する転写因子など発現の低い遺伝子のプロモーター部位には弱い結合が見られるか、または遺伝子全体にわたり結合していた。増殖の早いES細胞はほとんどがS期(DNA合成期)にあり、転写物の多いゲノム領域は転写装置と複製複合体が衝突する頻度が高いため、高レベルで発現しているAND-1などの複製フォークタンパク質が一時的な複製停止部位にリクルートされることでゲノムの安定性を維持していると推測される。2) Rif1:Rif1(Rap1-interacting protein)は動物細胞でDNA損傷の応答に寄与し、また複製タイミングを制御する核タンパク質である。マウスES細胞でヒドロキシ尿素による複製ストレスを与えるとRif1は30分後までに複製停止部位の近傍にリクルートされ、ストレスの長期化により細胞核全体に分布した。複製ストレスで誘導および消失するRif1のリン酸化部位各2箇所を新奇に同定した。また、Rif1の発現をES細胞で抑制すると、分化が弱く誘導されるものの、2細胞期特異的に発現する遺伝子群が強く誘導され、全体として分化マーカーの変動は少なかった。また体細胞でRif1の発現を抑制するとiPS細胞の作製効率が20%程度に低下した。以上のことから、Rif1は未分化細胞において複製ストレスに応答し、また、他のリプログラミング関連因子と連動してES細胞の未分化能やゲノムの安定性を維持すると推測された。複製フォーク複合体は複製ストレス応答におけるシグナル伝達カスケードの要であり、上流のシグナルを、下流の複製チェックポイント、DNA修復、損傷バイパス複製の活性化へ橋渡しすると考えられる。本年度は以下の因子について解析を行った。1)Rif1:Rif1 (Rap1-interacting protein)は、動物細胞で複製ストレスに応答した局在を示し(Xuら、2004年)また、胎生幹(ES)細胞の未分化能の維持に必要である(Lohら、2006年)ことが報告されているが、その機構はいまだ未知である。増殖が盛んな細胞では複製ストレスからゲノム安定性を守る機構が重要であり、Rif1がその機能をもつと推定した。

まず、Rif1の抗体を2種作製し、複製ストレスを与えたES細胞で損傷マーカーとRif1の局在を解析した所、複製ストレス部位(γH2AX)のごく近傍にRif1がリクルートされることを見いだした。また、Rif1のノックダウンや欠失変異体の過剰発現がES細胞の分化を誘導することを見いだした。現在、Rif1の変異体を作成し未分化能維持に必要な部位の同定を行っている。2)AND-1およびTipin:ES細胞におけるAND-1の発現を調べたところ、未分化能を維持している細胞核特異的に高い発現が見られた。Tipinも同様であった。3)TFII-I:基本転写因子であるTFII-Iは転写活性化能を持ち、癌抑制遺伝子BRCA1の結合因子でもある。共同研究者により、TFII-IはBRCA1やSIRT1のDNA損傷部位への局在に必要であることが示された。本研究では、TFII-IがないとDNA二重鎖切断の相同組換え修復の効率が半分程度に低下すること、TFII-Iの結合タンパクであるDBC1や、BRCA1の下流であるSIRT1のノックダウンでは1/10程度に低下することを見いだした。本年度は、ES細胞と体細胞における複製因子とフォークタンパク質の発現プロファイルを網羅的に解析し、AND-1, Timeless, Tipinなどが未分化細胞で高く発現しているという新たな知見を得た。また、同様にES細胞で発現の高いRif1タンパク質の機能をより詳細に解析するため、Rif1を条件的に欠損するiPS細胞の樹立なども達成した。また、Tif1 beta欠損細胞、Rif1およびTif1 betaのshRNAや、Tipin, AND-1, Tif1 beta抗体など、研究資材の収集と評価もほぼ完了した。計画していた実際の複合体の精製実験は予備実験の段階であるが、資材や基礎データの準備が整ったため、来年度は効率よく研究を遂行できるものと考える。本年度は停止した複製フォーク近傍に局在するRif1の抗体を作製し、その機能解析を行った。また、フォーク因子のES細胞における動態も観察した。これまでの癌細胞と並行してES細胞を材料に用いることで、複製フォーク因子の未分化細胞での機能、すなわち、複製ストレス応答が胎生未分化細胞で果たす役割についても調べることができると考えている。当初の計画で予定していた、フォーク複合体の精製と構成因子の変動などの解析は遅れているが、本年度の成果で得られた良質なRif1の抗体を用いることで、複数の構成因子の解析を効率よく進めることができると考えている。1)フォーク複合体の精製と構成因子の解析:抗体によるアフィニティー精製と各種クロマトグラフィーを組み合わせ複合体を精製する。タンパク質によっては弱い結合を保持するために架橋剤を用い、細胞画分や、複製ストレスの有無、分化状態(がん細胞、未分化細胞、体細胞)など、条件を変えて複合体を比較する。2)今年度に樹立したRif1 Flox/FloxノックアウトiPS細胞を用いて、リプログラミングに必要な転写因子の発現への影響を解析する。
感染防御を目的とした腸内有用乳酸菌の上皮細胞の接着機構の解明

本研究では乳酸菌の乳酸菌の腸内定着性を細胞生化学的に解明し病原微生物に対する感染予防のための基礎的研究をすることを目的とした。この目的のため申請者らがすでに明らかにしてきたLactobacillussp.JCM1038株の糖鎖認識部位、レクチン分子の特定さらにレクチン遺伝子を明らかにすることとした。本菌株のの糖鎖認識部位を赤血球凝集(HA)反応およびTLC-免疫染色法によって検討した。本菌株のHA活性に差は見られたもののヒツジ,ヒトO型、ウマおよびモルモット赤血球を凝集した。またこれらの赤血球をノイラミニダーゼ処理するとヒトO型赤血球に対する活性は消失した。これらのことから糖鎖エピトープとしてシアル酸が関与していることが考えられたが、糖鎖エピトープは複数存在していることも推察された。そこで1038株の抗体を作製し、グロボ系およびガングリオ系糖脂質に対する結合試験をTLC-免疫染色法によって行った。その結果シアル酸を含むガングリオシドGM1、GM2およびGM3に結合し、さらにこれらの糖脂質からシアル酸を除去したアシアロGM1およびアシアロGM2に結合することも明らかとなった。レクチン分子を明らかにするために菌体表層タンパク画分を固定化赤血球と反応させたところ、52および58kDaタンパク質赤血球に結合することが示され、この2種類のタンパク質がレクチンであることが明らかとなった。この2種類のレクチンは陽イオン交換クロマトグラフィーで容易に精製され、現在これらのレクチンの糖鎖認識部位を検討しているところである。さらに2種類のレクチンのN末端アミノ酸配列25残基およびエンドプロテアーゼ処理によって得られたペプチドのアミノ酸配列を決定した。これらのアミノ酸配列をもとにオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、PCR反応を行ったところ、それぞれのレクチンに対応する665bpおよび425bpの遺伝子をクローニングすることができた。
磁性細菌のGタンパク質融合型鉄輸送体 -精製と再構成-

1.N-FeoBの大量発現と抗N-FeoB抗体の作製FeoBを精製するには、高感度なアッセイ系が必要である。そこで、本年度は、抗-FeoB抗体を作製した。具体的には,FeoBのN末端ドメイン(245アミノ酸残基)をコードするDNA断片をPCRで増幅、PCRエラーが無いことを確認し、pET-15b vectorにクローニングした。大量発現には大腸菌BL12株を用いた。N-FeoBは封入体として発現しており、大腸菌より封入体を調製し、変性条件下でNiアフィニティクロマトグラフィにより精製した。大量発現の結果得られたN-FeoBをトロンビンで処理しHis-tag部分を取り除き、SDS-PAGEしたゲルから切り出すことで、更に精製した。得られた精製標品を抗原としてウサギに免疫した。抗体価は二重免疫拡散法とドットブロット法により測定し、アッセイに十分な抗体価をもつ抗血清が得られた。2.磁性細菌M.magnetotacticumの大量培養と膜画分の調製M.magnetotacticumを120Lの合成培地で培養し、25gの細胞を得た。細胞をフレンチプレスで破砕し遠心分離(8,000xg)によって未破砕細胞とマグネトソームを取り除き、更に、超遠心(100,600xg)し沈澱を回収することで膜画分(細胞膜と外膜を含む)を調製した。3.FeoBの検出抗N-FeoB抗体を用いてWestern blotを行い、M.magnetotacticumの膜画分からFeoBの検出を行った。その結果、73.6kDaのメジャーなバンドと2つのマイナーバンド(81.5,61.1kDa)が確認できた。メジャーなバンドの分子量はfeoB遺伝子の塩基配列から推定される分子サイズとほぼ一致した。このことから本細菌のFeoBは膜画分に存在していることが明らかになった。4.FeoBの精製(可溶化条件の検討)FeoBの精製を行う為、膜可溶化条件を検討した。可溶化効率はWestern blotによって検出したバンドをルミノイメージアナライザーによって定量し、求めた。その結果、デオキシコール酸ナトリウムが最も効率的にFeoBを可溶化できることが分かった。現在,アフィニティ、イオン交換、ゲルろ過、ハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィによりFeoBの精製を試みている。
結び目、３次元多様体の量子不変量に潜む幾何学的性質の研究

結び目の量子不変量の一つである、n-colored Jones polynomialに関する予想「slope conjecture」さらにより強い「strong slope conjecture」について研究を推進した。nが十分大きいとき、n-colored Jones polynomialの最大次数と最小次数は、nについての2次の多項式となることが知られており、その2次の係数が結び目の幾何的不変量であるboundary slopeであるというのが「slope conjecture」である。更にそのslopeを与える曲面のtopologyを1次の係数が与えているというのが「strong slope conjecture」である。結び目Kのcablingによって得られる結び目についてのslope conjectureについてのkalfagianniとTranによる証明にミスがあることがわかり、その証明の修正を行った。さらに実際にkalfagianniとTranの証明が使えない例を構成した。その結果を金沢における研究集会において発表した。KのWhitehead doubleより、より一般的なtwistedgeneralized Whiteheaddoubleの「strong slope conjecture」に関するBaker氏、茂手木氏との共同研究によって昨年得ていた結果にミスがあることがわかり、その修正を行い、Baker氏が所属するマイアミ大学において3人で議論をすることにより、より分かりやすい証明を与えることができた。また3次元多様体の(Chen-Yangの)量子sl(2)不変量について、田中氏によって得られたskeinをもちいたンズ空間L(p,q)に対する公式の漸近挙動に関する結果をえた。Kalfagianni, Tranの証明にミスがあり、その結果をもちいたgraph knotのstrongslope conjectureの証明の修正,またtwisted generalized Whiteheaddoubleのstrongslope conjecture証明の修正に時間を割いてしまったが、修正においてより明確な証明の手法を発見し、その手法は今後の研究の推進に役立つと思われる。またレンズ空間の量子不変量の漸近挙動について挙動について結果を得た。Cablingについての証明において追加した条件について一般の結び目でも成り立つと予想される。それが証明できれば、われわれの結果がより広範囲の結び目について適用することができる。twisted generalized Whiteheaddoubleについての証明の修正においてえたより明確な証明手法をもちいることにより、他の結び目操作のもとでのstrong slope conjectureについて研究をおこなう。前年度に引き続きMasur doubleについて「strong slope conjecture」について得た結果を論文にまとめる。さらに、n-colored Jones polynomialに関する他の予想との関連についても調べたい。大槻氏との共同研究によってある3つの例外ファイバーをもつある特別なクラスについて他のクラスの漸近挙動についての研究を行う。結び目の量子不変量の一つである、n-colored Jones polynomialに関する予想「slope conjecture」さらにより強い「strong slope conjecture」について研究を行った。実施計画で考えていた、結び目KのWhitehead doubleより、より一般的なtwisted generalized Whitehead doubleについて、Kについてある条件のもとで、「strong slope conjecture」をBaker氏、茂手木氏との共同研究によって証明した。研究成果をカナダにおいて開催された国際研究集会において発表した。更に、他の結び目のクラスである、Mazur doubleについてもある条件のもとで予想を証明した。また3次元多様体の(Chen-Yangの)量子sl(2)不変量について、田中氏によって得られたskeinをもちいたンズ空間L(p,q)に対する公式の漸近挙動について考察し、(p.q)について条件を課した場合、挙動の結果を推測した。大槻氏との共同研究によってある3つの例外ファイバーをもつある特別なクラスについての漸近挙動についての研究についての成果をフランスで開催された国際研究集会において発表した。slope conjectureについては、計画よりより一般的な結び目について、証明するとともに、より強い予想についても、証明できた。また、計画では考えていなかった結び目のクラスについてもslope conjectureを証明することが出来た。レンズ空間の量子不変量の漸近挙動について挙動が予想できる結果を得た。

Kalfagianni, Tranの証明にミスがあり、その結果をもちいたgraph knotのstrongslope conjectureの証明の修正,またtwisted generalized Whiteheaddoubleのstrongslope conjecture証明の修正に時間を割いてしまったが、修正においてより明確な証明の手法を発見し、その手法は今後の研究の推進に役立つと思われる。またレンズ空間の量子不変量の漸近挙動について挙動について結果を得た。前年度におけるtwisted generalized Whitehead doubleについて、Kについてある条件のもとで、「strong slope conjecture」をBaker氏、茂手木氏との共同研究によって証明したがその際、除外した場合にも興味深い幾何的な情報が含まれている可能性があることわかった。その研究を進展させ、他の予想についての解決を試みる。前年度に引き続きMasur doubleについて「strong slope conjecture」の証明を目指す。また最近、発表されたLee氏のcolored Jones polynomialの最大次数、最小次数に関する公式を用いて、他の結び目のクラスについてのslope conjectureの解決をめざす。未解決の8交点をもつ双曲
サルモネラエフェクターの網羅的解析と宿主応答の分子基盤

サルモネラ感染後の宿主高次機能の多岐にわたる変化は、未だ同定されていない多数の病原分子(エフェクター)と標的分子の存在を強く示唆している。本研究は、申請者らが開発したインフォマティクス支援インタラクトーム網羅的解析法によって同定された新規エフェクター候補について、病原性状さらに感染細胞における宿主応答の分子機構解明に取り組んだ。その結果、新規のエフェクターとして同定されたGogA、GtgA2は、感染初期にSalmonellapathogenicityisland1(SPI1)-Type3secretionsystem(T3SS)により宿主細胞に輸送され、感染マクロファージ内でCaspase8活性化を導くことが明らかとなった。GogA、GtgA2はcaspase-8の2面性(サイトカインの誘発とアポトーシスイニシアエーター)制御を介した感染細胞の生死を決定するキーエフェクターであると考えられる。さらにエフェクター候補STM1239はSPI1-T3SSとSPI2-T3SSにより輸送され、マクロファージ内では細胞質に存在することが明らかとなった。本研究は申請者らが開発したインフォマティクス支援インタラクトーム網羅的解析法によって昨年度までに同定された新規エフェクター候補3種について、宿主標的分子の同定と相互作用解析を行い、サルモネラ病原戦略と宿主応答の分子機構を解明することを目的として行った。その結果候補の中でSTM1055がサルモネラのIII型分泌装置により宿主細胞へ輸送され、サルモネラのマクロファージ内増殖に関係するエフェクターであることが明らかとなった。又、昨年ゲノムワイドトランスクリプトーム解析により発見したCaspase-8活性化を介して感染宿主細胞の運命を決定するキーエフェクターGogA,GtgAの標的分子が、自然免疫のパターン認識受容体RIG-1ファミリーに属するDdx50であると考えられたことから、GogA,GtgAの機能解析を通して、サルモネラ感染によるRIG-1ファミリー分子を介した炎症と細胞死誘導の分子機構解明を第2の目的として研究を行った。GogA,GtgA2は、マクロファージ細胞内でCaspase-8活性化を介してNF-кBを活性化し、IL-1β等の炎症性サイトカイン遺伝子の転写を誘導することが明らかとなった。さらにGogA,GtgAはDdx50に結合することさらにその結合には、Ddx50のHELICcドメインとDEADcドメインが必須で有ることが明らかとなった。DRIG-1ファミリーはウイルスRNAの認識受容体として知られているが、細菌関連分子を認識するという報告はない。本研究により得られる成果は広く細菌感染と宿主応答研究に大きなインパクトを与えると期待できる。本研究は申請者らが開発したインフォマティクス支援インタラクトームによってリスト化したエフェクター候補を基軸として、サルモネラ病原戦略と宿主応答の分子機構を解明することを目的としている。本年度は下記の研究成果を得た。(1)新規エフェクター候補分子の機能解析平成22年度新たに同定された新規エフェクター候補12遺伝子産物について、Cya-translational fusionsystemを用いてエフェクター(宿主細胞への輸送)の可能性を検討した。その結果。6種の新規蛋白質がマクロファージ細胞質へ輸送されるエフェクターであることが明らかとなった。さらにこれらのエフェクター候補分子の細胞内局在を共焦点顕微鏡観察により検討した結果、現在までにSTM1239がサルモネラ感染マクロファージの細胞質に存在することが明らかとなった。他の候補分子についても同様の解析に取り組んでいる。(2)新規エフェクターGogA、GtgA2の宿主細胞内標的分子の同定GogA、GtgA2は我々の先行研究において、サルモネラ感染マクロファージ内でCaspase8活性化を導く新規のエフェクターとして同定されたものである。GogA、GtgA2によるCaspase8活性化機構を解明するためにマクロファージ内標的分子の同定に取り組んできた。今年度はYeast Two Hybrid法を用いて、GogA、GtgA2がRNAヘリカーゼファミリーのDdx50と相互作用をすることを見出した。さらに結合に必要なGogA上のドメインを決定した。

本研究は申請者らが開発したインフォマティクス支援インタラクトームによってリスト化したエフェクター候補を基軸として、サルモネラ病原戦略と宿主応答の分子機構を解明することを目的としている。本年度は下記の研究成果を得た。(1)新規エフェクターGogA、GtgA2の機能並びに細胞輸送に関する解析GogA、GtgA2は我々の先行研究において、サルモネラ感染マクロファージ内でCaspase8活性化を導く新規のエフェクターとして同定されたものである。両エフェクターの宿主細胞への輸送に関わるシステムについて検討した結果、GogA、GtgA2の輸送は、感染初期にはSPI1-T3SSにより中盤以降はSPI2-T3SSによると考えられた。Caspase-8の活性化により炎症性サイトカインが誘発された。さらにGogA、GtgA2高発現サルモネラ感染マクロファージでは、Caspase8の過剰活性化に続いてCaspase-9, Caspase-3が活性化され、マクロファージがアポトーシスに陥ることを見出した。GogA、GtgA2はcaspase-8の2面性(サイトカインの誘発とアポトーシスイニシアエーター)制御を介した感染細胞の生死を決定するキーエフェクターであると考えられる。(2)新規エフェクター候補分子の機能解析前年度までに新たに同定された新規エフェクター候補の中で2つのエフェクター、STM1239とSTM4575について機能解析を行った。エフェクター候補分子の細胞内局在を共焦点顕微鏡観察により検討した結果、STM1239がサルモネラ感染マクロファージの細胞質に存在することが明らかとなった。現在Yeast-Two hybrid法を用いて宿主細胞内標的分子の探索を行っている。一方、STM4575はいまだ細胞内への輸送は確認できてないが、SPI1発現条件下で発現することを明らかにした。我々が独自に開発したインフォマティクス支援インタラクトームによって十数種の新規エフェクター候補がリスト化されたが、このなかで今年度までに7種の分子がエフェクターであることがほぼ立証された。このことから、今後の研究の飛躍的な発展が期待できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、サルモネラ感染マクロファージを用いて、エフェクター候補分子の機能を感染生物学的観点から研究を推進していく。
3次元マイクロマシニングによる微小細管の作製と血球細胞の解析

PDMSの型となるネガ型フォトレジスト(SU-8)に対するグレイスケールリソグラフィを行い、形成したレジストの3次元構造体をPDMSに転写して、感光性ガラスより透明なPDMSの3次元流路構造体、すなわちPDMSを基板とするμ-Fluidic Deviceの作製を行った。これにチャネル構造の覆いとなるPDMS対向基板にサンプル流出入孔を設け、両者を圧着して3次元微小細管を作製、またマイクロポンプを装着し、流量可変のサンプル液量制御を行った。別途Au・Kr電極を真空蒸着した薄板状ガラス基板をサンドイッチ構造に圧着して電界効果を利用したサンプル制御を行った。これは複素誘電率ε_p^*の微小サンプルが複素誘電率ε_m^*の媒質内に浮遊しているとき、この媒質の両側に不平等電界E_<rms>を印加すると、誘電泳動力F_dが電界の二乗の勾配に比例する力としてサンプルに作用するという誘電泳動現象を利用したものである。この誘電泳動力によりデバイス内のサンプルを旋回・攪拌することが可能となる。サンプルの検出系には高速ビデオ画像処理方式を使用し、血球細胞とくに血小板の凝集状態を蛍光可視化解析することに成功した。本研究では、数値シミュレーションにより誘電泳動力に対する電界強度、印加周波数、電極配置、サンプル誘電率、サンプル粒子径などの諸パラメータの依存性を検討した。上記で得たμ-Fluidic Deviceに対して、以下の検討を行った。(1)流路の流体力学的特性評価、(2)サンプルの旋回流れの観測、(3)機械的手段を用いないサンプルの攪拌・混合・沈殿防止・壁面付着防止の実現、(4)血球細胞とくに血小板の流動・粘着能の評価、などであるが、実測結果は数値シミュレーションともよく一致し、赤血球の変形流動能の観測や血小板凝集能亢進過程の観測に有効であることが示された。平成15年度前半は,感光性ガラスに対するグレイスケールリソグラフィを応用して,連続的に深さを変化させた全ガラス製3次元微小細管を製作方法の確立を行った.エッチングによる溝切りで製作される3次元微小細管は,最終的に上部を透明なガラスカバーで覆う必要がある.しかし感光性ガラスの熱処理・エッチング工程後には必然的に変形と表面荒れが生じ,これがカバーガラスの接合に大きな障害となっていた.そこで3次元微小細管を形成した後のガラスに対して新たに研削工程を施し,変形と表面荒れを除去した.さらに,水ガラス溶液によるガラス部品同士の接着を新たに行うことで全ガラス製3次元微小細管の製作に成功した.微小細管の幅は500μm,最大深さは300μm程度である.連続して傾斜を設けた微小細管中の流れをフェノールフタレイン溶液の呈色を用いて観察し,流れのよどみによって2液の混合が促されることを確かめた.これらの成果は2003年の国際会議(μ-TAS2003)で報告した.年度後半はバイオ用微小デバイス材料に広く用いられているPDMS(ポリジメチルシロキサン)の3次元微細加工を試みた.ますPDMSの型となるネガ型フォトレジスト(SU-8)に対するグレイスケールリソグラフィを行った.ネガ型レジストでは紫外線照射部分が硬化するため,紫外線量の少ない場所でのレジストと基板の密着性の確保が問題となる.そこで,透明な基板側からグレイスケールマスクを通じて露光を行う新規露光法を試みた.この手法により露光現像後のレジスト高さをマスクにより制御できることを確かめた.さらに形成したレジストの3次元構造体をPDMSに転写してPDMSの3次元構造体を得ることに成功した.PDMSの3次元構造体は感光性ガラスに比べ透明であり,より微小な細管を製作できるという特徴がある.来年度はこのPDMSの3次元微小細管の検討も行っていく予定である.感光性ガラスに対するグレイスケールリソグラフィを応用して,連続的に深さを変化させた全ガラス製3次元微小細管を製作する方法の確立を行った。エッチングによる溝切りで製作される3次元微小細管は,最終的に上部を透明なガラスカバーで覆う必要がある。しかし感光性ガラスの熱処理・エッチング工程後には必然的に変形と表面荒れが生じ,これがカバーガラスの接合に大きな障害となっていた。そこで3次元微小細管を形成した後のガラスに対して新たに研削工程を施し,変形と表面荒れを除去した。さらに,水ガラス溶液によるガラス部品同士の接着を新たに行うことで全ガラス製3次元微小細管の製作に成功した。微小細管の幅は200μm,最大深さは300μm程度である。連続して傾斜を設けた微小細管中の流れをフェノールフタレイン溶液の呈色を用いて観察し,流れのよどみによって2液の混合が促されることを確かめた。バイオ用微小デバイス材料に広く用いられているPDMS(ポリジメチルシロキサン)の3次元微細加工を試みた。まずPDMSの型となるネガ型フォトレジスト(SU-8)に対するグレイスケールリソグラフィを行った。ネガ型レジストでは紫外線照射部分が硬化するため,紫外線量の少ない場所でのレジストと基板の密着性の確保が問題となる。そこで,透明な基板側からグレイスケールマスクを通じて露光を行う新規露光法を試みた。この手法により露光現像後のレジスト高さをマスクにより制御できることを確かめた。

さらに形成したレジストの3次元構造体をPDMSに転写してPDMSの3次元構造体を得ることに成功した。PDMSの3次元構造体は感光性ガラスに比べ透明であり,より微小な細管を製作できるという特徴がある。これらの微小細管内への細胞導入と流動現象を顕微鏡下で観測したが、細管壁への細胞粘着性の流速依存性を確認した。赤血球の変形流動能の観測や血小板凝集能亢進過程の観測に有効であることが示唆された。PDMSの型となるネガ型フォトレジスト(SU-8)に対するグレイスケールリソグラフィを行い、形成したレジストの3次元構造体をPDMSに転写して、感光性ガラスより透明なPDMSの3次元流路構造体、すなわちPDMSを基板とするμ-Fluidic Deviceの作製を行った。これにチャネル構造の覆いとなるPDMS対向基板にサンプル流出入孔を設け、両者を圧着して3次元微小細管を作製、またマイクロポンプを装着し、流量可変のサンプル液量制御を行った。別途Au・Kr電極を真空蒸着した薄板状ガラス基板をサンドイッチ構造に圧着して電界効果を利用したサンプル制御を行った。これは複素誘電率ε_p^*の微小サンプルが複素誘電率ε_m^*の媒質内に浮遊しているとき、この媒質の両側に不平等電界E_<rms>を印加すると、誘電泳動力F_dが電界の二乗の勾配に比例する力としてサンプルに作用するという誘電泳動現象を利用したものである。この誘電泳動力によりデバイス内のサンプルを旋回・攪拌することが可能となる。サンプルの検出系には高速ビデオ画像処理方式を使用し、血球細胞とくに血小板の凝集状態を蛍光可視化解析することに成功した。本研究では、数値シミュレーションにより誘電泳動力に対する電界強度、印加周波数、電極配置、サンプル誘電率、サンプル粒子径などの諸パラメータの依存性を検討した。上記で得たμ-Fluidic Deviceに対して、以下の検討を行った。(1)流路の流体力学的特性評価、(2)サンプルの旋回流れの観測、(3)機械的手段を用いないサンプルの攪拌・混合・沈殿防止・壁面付着防止の実現、(4)血球細胞とくに血小板の流動・粘着能の評価、などであるが、実測結果は数値シミュレーションともよく一致し、赤血球の変形流動能の観測や血小板凝集能亢進過程の観測に有効であることが示された。
神経細胞死抑制への新規GRP78結合タンパク質の関与と細胞内可視化

我々がクローニングした新規GRP78結合タンパク質は、組織レベルでの発現解析により、脳、特に胎児および生後の神経細胞に高発現し、加齢に伴って減少することが明らかになっている。この新規GRP78結合タンパク質は、膜貫通ドメインとproline-richドメインを有するものの、既知のタンパク質との相同領域を持たないことからその機能は依然不明である。そこで本研究では、新規GRP78結合タンパク質の機能解析の一端として、Two-hybrid法を用いて新たな結合因子の探索を行った。実験は、新規GRP78結合タンパク質を全長、N末端またはC末端を解析用ベクターに組み込み、各コンストラクトとマウス脳由来のcDNA libraryを元にしたスクリーニングを行った。その結果、GABA receptor associated protein like 1、cyclophilin Aが候補遺伝子として得た。そこで、Neuro2aまたはHEK293細胞に各々の遺伝子導入を行い、両者がGRP78結合タンパク質と会合するか否かを免疫沈降法にて解析した。その結果、両候補タンパクともに、既知の結合因子GRP78と比べると新規GRP78結合タンパク質に対してほとんど結合能を有しないことが明らかになった。今後、GRP78結合タンパク質-GST融合タンパク等も用いた別のスクリーニング法によって結合因子の探索を行う予定である。また本年度は、種々の細胞系における新規GRP78結合タンパク質の発現とsiRNAによる内在性GRP78結合タンパク質ノックダウンについても検討した。その結果、siRNA処理後72時間以上にわたり新規GRP78結合タンパク質をノックダウンできる系を確立した。現在、siRNA処理ににより変動する遺伝子群をマイクロアレイ法によって解析中である。一方、heat shock protein familyの一つであるGRP78は、様々な細胞に対し保護作用が報告されているものの、その詳細な機構は十分に明らかにされていない。そこで、本年度は以下の点について検討した。1,ラットGRP78結合タンパク質のGRP78との結合解析2,GRP78結合タンパク質のマウスホモログKIAA1583 cDNAを用いた細胞内局在・機能解析ラットGRP78結合タンパク質のC末端を約1/3また2/3欠損したMycタグコンストラクトとGRP78のHEK293細胞へのco-transfectionによる遺伝子導入の後に、免疫沈降法によって両者の結合を検討した。その結果、GRP78結合タンパク質N末端約1/3でも、全長型と同程度にGRP78との結合能を有することが明らかとなった。また、ラットGRP78結合タンパク質マウスホモログ(KIAA1583)においてもGRP78との結合能を確認した。さらに、マウスGRP78結合タンパク質のC末端欠失コンストラクトを3種類を作製しCOS7細胞内での局在を観察した。その結果、C末端約2/3を欠失したものにおいても全長型と同様に核周囲・小胞体に強く局在しており、GRP78との結合実験と同様にN末端に重要なドメインが存在する可能性が示唆された。更に、これらコンストラクトをもとに、GST融合GRP78結合タンパク質およびtwo-hybrid用コンストラクトを作製した。来年度はこれらを用いて網羅的にGRP78結合タンパク質に対する結合因子の探索を行う予定である。
原子発光分析法による絶対分析システム開発の試み

本研究では、近年新しい高感度分析法として普及している誘導結合アルゴンプラズマ(ICP)発光分析法において、標準溶液を用いないで多元素分析を行なう新しい分析システムを開発することを目的とした。分析化学においては現在種々の機器分析が普及している。ICP発光分析法もそのような機器分析法の一種であり、高感度で多元素同時または迅速分析ができる特長を有する。しかしながら、機器分析法により元素または化合物の定量を行うには、信号の濃度に対する標準化のために標準溶液が必要であり、検量線法による相対分析法である。一部の電気化学分析法では信号応答に物理学位を用いるために、標準を必要としない、すなわち絶対分析法が実現されている。ただし、その応用範囲は極めて狭い。そこで、本研究では励起光源として非常に安定なアルゴンICPを用い、絶対分析システムを行うための基礎的研究を行った。具体的には、濃度既知の多元素(原理的には数10元素可能であるが、本実験では10元素とした)の発光スペクトルをまず測定し、特定波長の分析線の発光強度を標準発光強度としてコンピューターに記憶させる。次に、測定試料をICP中に導入し発光強度を測定し、コンピューター内蔵の標準発光強度との相対発光強度比を求めて、試料中の元素濃度を算出する。標準発光強度の変動がなければ、この原理にもとづいて分析のための標準溶液て必要としない絶対分析システムが可能となる。しかしながら、実際にはプラズマ光源,分光器,検出器,増幅器等の変動があるために、全測光系の補正が必要となる。そのためには、標準光源による補正が有効であるが、実用的分光分析システムで使用できる標準光源がないので、実際には1元素だけ(この場合鉄)の標準溶液を用いて標準発光強度を規格化する。1元素標準化法を開発し、実用化した。
種々の高機能鋼板の成型性およびその予測

軽量化を目的とした高強度鋼板,耐食性や美的要求からの表面処理鋼板やステンレス鋼板など,これらの高機能,高付加価値化は,板材成形においては必ずしも好都合とはならず,むしろ成形性の低下をもたらす場合が多い.新材料に適した成形技術および成形条件を確立するためには,まず,成形中の材料の破断予測を的確に行えるようにすることが不可欠である.従来,板材の成形限界予測には塑性不安定ないし分岐理論が広く用いられてきた.しかし,塑性不安定ないし分岐理論による予測は,材料の塑性特性が十分に把握され,精度よく数式化されていることが前提となる.種々の高機能鋼板の場合,それらの塑性特性は不明な点も多く,また,それぞれの鋼板について,個々に複雑な塑性構成式を作成するのも得策とは考えられない.これに対し,本研究組織は最近の研究で,より基本である破壊という現象に着目することによって,成形限界予測の適用範囲を広げることを試みてきている.すなわち,板材成形の有限要素シミュレーションで計算される応力・ひずみ分布およびそれらの履歴から,延性破壊条件式を用いて破壊発生の有無を予測する方法を提案してきた.本研究では,これらの背景をふまえ,まず,高張力鋼板,表面処理鋼板,ステンレス鋼板などの種々の高機能鋼板の深絞り,張出し,伸びフランジなどの基本的な板材成形性および引張特性を実験的に明らかにした.つぎに,それらの成形加工を有限要素シミュレーションするとともに,延性破壊条件式を適用して成形限界や破断発生場所を予測できる計算プログラムを作成した.実験結果との比較検証により,上記のやや特殊な鋼板に対しても有効な成形限界予測方法を確立し,それぞれの鋼板に最適な成形方法や条件を明らかにした.さらに,鋼板のみならず,鋼板と他種金属との積層複合板についての成形限界予測も行い,良好な結果を得た.軽量化を目的とした高強度鋼板,耐食性や美的要求からの表面処理鋼板やステンレス鋼板など,これらの高機能,高付加価値化は,板材成形においては必ずしも好都合とはならず,むしろ成形性の低下をもたらす場合が多い.新材料に適した成形技術および成形条件を確立するためには,まず,成形中の材料の破断予測を的確に行えるようにすることが不可欠である.従来,板材の成形限界予測には塑性不安定ないし分岐理論が広く用いられてきた.しかし,塑性不安定ないし分岐理論による予測は,材料の塑性特性が十分に把握され,精度よく数式化されていることが前提となる.種々の高機能鋼板の場合,それらの塑性特性は不明な点も多く,また,それぞれの鋼板について,個々に複雑な塑性構成式を作成するのも得策とは考えられない.これに対し,本研究組織は最近の研究で,より基本である破壊という現象に着目することによって,成形限界予測の適用範囲を広げることを試みてきている.すなわち,板材成形の有限要素シミュレーションで計算される応力・ひずみ分布およびそれらの履歴から,延性破壊条件式を用いて破壊発生の有無を予測する方法を提案してきた.本研究では,これらの背景をふまえ,まず,高張力鋼板,表面処理鋼板,ステンレス鋼板などの種々の高機能鋼板の深絞り,張出し,伸びフランジなどの基本的な板材成形性および引張特性を実験的に明らかにした.つぎに,それらの成形加工を有限要素シミュレーションするとともに,延性破壊条件式を適用して成形限界や破断発生場所を予測できる計算プログラムを作成した.実験結果との比較検証により,上記のやや特殊な鋼板に対しても有効な成形限界予測方法を確立し,それぞれの鋼板に最適な成形方法や条件を明らかにした.さらに,鋼板のみならず,鋼板と他種金属との積層複合板についての成形限界予測も行い,良好な結果を得た.近年,材料の軽量化や複合化などによる高機能化にともない,板材成形の分野でも,これまで加工の対象としてこなかったような材料への対応がせまられている.鉄鋼材料を例にとれば,軽量化を目的とした高強度鋼板,耐食性や美的要求からの表面処理鋼板やステンレス鋼板の使用などが挙げられる.これらの高機能,高付加価値化は,板材成形においては必ずしも好都合とはならず,むしろ成形性の低下をもたらす場合が多い.新材料に適した成形技術および成形条件を確立するためには,まず,成形中の材料の破断予測を的確に行えるようにすることが不可欠である.従来,板材の成形限界予測には塑性不安定ないし分岐理論が広く用いられてきた.しかし,塑性不安定ないし分岐理論による予測は,材料の塑性特性が十分に把握され,精度よく数式化されていることが前提となる.種々の高機能鋼板の場合,それらの塑性特性は不明な点も多く,また,それぞれの鋼板について,個々に複雑な塑性構成式を作成するのも得策とは考えられない.さらに,くびれの明瞭な発生なしに破断するような材料,あるいは加工硬化指数のn値よりも伸びが小さいような材料の場合には,塑性不安定理論や分岐理論から破断予測することは非常に困難である.これに対し,本研究組織は最近の研究で,より基本である破壊という現象に着目することによって,成形限界予測の適用範囲を広げることを試みている.すなわち,板材成形の有限要素シミュレーションで計算される応力・ひずみ分布およびそれらの履歴から,延性破壊条件式を用いて破壊発生の有無を予測する方法を提案している.

本年度は,種々の特殊鋼板を含む板材の深絞り,穴拡げなどの基本的成形における破断予測モデルを作成した.近年,材料の軽量化や複合化などによる高機能化にともない,板材成形の分野でも,これまで加工の対象としてこなかったような材料への対応がせまられている.鉄鋼材料を例にとれば,軽量化を目的とした高強度鋼板,耐食性や美的要求からの表面処理鋼板やステンレス鋼板の使用などが挙げられる。これらの高機能,高付加価値化は,板材成形においては必ずしも好都合とはならず,むしろ成形性の低下をもたらす場合が多い。新材料に適した成形技術および成形条件を確立するためには,まず,成形中の材料の破断予測を的確に行えるようにすることが不可欠である。従来,板材の成形限界予測には塑性不安定ないし分岐理論が広く用いられてきた。しかし,塑性不安定ないし分岐理論による予測は,材料の塑性特性が十分に把握され,精度よく数式化されていることが前提となる。種々の高機能鋼板の場合,それらの塑性特性は不明な点も多く,また,それぞれの鋼板について,個々に複雑な塑性構成式を作成するのも得策とは考えられない。これに対し,本研究組織は最近の研究で,板材成形の有限要素シミュレーションで計算される応力・ひずみ分布およびそれらの履歴から,延性破壊条件式を用いて破壊発生の有無を予測する方法を提案している。昨年度は,種々の特殊鋼板を含む板材の深絞り,穴拡げなどの基本的成形における破断予測モデルを作成した。本年度はこれを発展させ,数種類の延性破壊条件式を適用してその有効性を比較するとともに,数値実験を行って,それぞれの鋼板に対する最適な加工条件を見いだした。また,鋼板のみならず,鋼板と他種金属との積層複合板についての成形限界予測も行い,良好な結果を得た。
健康増進運動のためのバーチャルリアリティを用いた環境作り

運動習慣を身につけるためには,運動意欲を維持することが重要である.本研究ではバーチャルリアリティ(VR)技術を用いて,運動者の動きに応じた映像を見せることにより,アミューズメント性を高め運動意欲を促進させることを目的としたシステム開発を行い,生理心理的視点から運動促進効果を検討することを目的とした.対象とした大学生の体力調査を行った結果(15年度に実施),最大酸素摂取量と閉眼片脚立ちテスト(平衡機能)が全国平均値より低値を示したため,持久力を高める運動として自転車運動を,平衡機能を鍛える運動として,バランス運動を取り入れたシステムを開発した.開発したシステムの概要は,2人1組でバーチャル空間を進んでいくというものである,システム構成は,自転車エルゴメータ,バランス器具(左右に動揺),100インチスクリーン,プロジェクタ2台(立体視のために左眼用と右眼用),映像用PC,制御用PCからなる.コンテンツは,目標物(鳥)を追いかけて道路上の10箇所の壁をすり抜けて進むものとし,運動に興味をもたせ意欲を高めるように工夫した.運動によってバーチャル空間を移動させるために,ペダル回転数を前進スピードとし,バランス器具の左右の傾きを映像の左右位置になるように視点位置を制御している.15年度では単発の実験を行い,運動量が増えているにも関わらず主観的運動強度が変わらないという結果を得られていることからVRを用いることによって運動促進効果がみられることが示されている.本年度は,開発したシステムを繰り返し使用し実際のトレーニング効果について検討するために,1ヶ月間,週2回,合計8回のトレーニング実験を行った.被験者の大学生(18名)には文書にて実験参加の同意書を得た.被験者はバランス運動を行う12名(バランス群)と自転車運動を行う6名(エルゴ群)の2群にわけ,ペアで運動を行った.運動時間が6分間と短かったためエルゴ群は,バランス群の2人とペアを組んで1日に2回運動(65%HRmax相当の負荷)を行った.その結果,エルゴ群ではHRmaxに至るまでの負荷がトレーニング後に増加した人数が3/6名,バランス群において,左右への動揺が改善傾向にあったのが7/12名であった.被験者にトレーニング中の主観調査を行ったところ,思わず速く自転車を漕いでしまう(運動量の増加),2人で一緒に運動できるので楽しい,体力増進になったという意見が得られた一方,コンテンツが何パターンか選べるといい,点数方式で目標が得られるといいといった改善点も挙げられた.本研究で開発したシステムを用いることで短期間のトレーニングでも健康維持のための体力増進がみられること,また,VR技術を用いることによって運動意欲の促進効果が期待できることが明らかとなった.生活習慣病のリスクファクターの一つに運動不足という因子がある.健康増進のためには一過性に運動を行うというよりも,運動習慣を身につける必要性が高い.しかし,トレーニングにはしんどい,面白くない,退屈といったマイナスのイメージがあり,生活の中にトレーニングを取り入れる運びにならない.本研究は,バーチャルリアリティ(VR)映像を用いてトレーニング時にどのような環境を作れば飽きずに運動を継続できるのか,あるいは,主観的運動強度がより低く感じられるのかについて検討することを目的としている.平成15年度は,大学生の体力調査を行い体力のどの項目が劣っているのかについて予備調査を行った.対象は情報科学部の大学1年生の350名である.東京都立大編の日本人の体力標準値2000の19歳標準値と比較し,持久力の指標である最大酸素摂取量,12分間走,筋力を示す握力,背筋力,バランス能力の指標となる閉眼片脚立ちが劣っていることが示された.そこで,持久力とバランス能力をトレーニングできるVRシステムの作成を行い,VR映像が運動に及ぼす生理心理的効果について実験を行った.被験者(14名)に文書にて同意書を得た後,2人1組のペアで自転車漕ぎ運動とバランス運動をVRあり条件とVRなし条件でそれぞれ6分ずつ運動を行った.その結果,主観的運動強度(RPE)は,両条件とも相違がみられなかった.しかしVRありではVRなしに比較して,自転車のペダル回転数が増加し,その結果心拍数も増加するという結果が得られた.主観的には,同じ強度の運動をしていると感じているが,実際はより高い運動を意識せずに行っており,VR映像の効果としては,運動促進の効果があるのではないかと推察される.今年度は単発の実験であり,継続効果が検討できていないので,今後トレーニング実験を行い,どの程度継続してVR映像の効果がみられるのかについて検討を行いたい.運動習慣を身につけるためには,運動意欲を維持することが重要である.

本研究ではバーチャルリアリティ(VR)技術を用いて,運動者の動きに応じた映像を見せることにより,アミューズメント性を高め運動意欲を促進させることを目的としたシステム開発を行い,生理心理的視点から運動促進効果を検討することを目的とした.対象とした大学生の体力調査を行った結果(15年度に実施),最大酸素摂取量と閉眼片脚立ちテスト(平衡機能)が全国平均値より低値を示したため,持久力を高める運動として自転車運動を,平衡機能を鍛える運動として,バランス運動を取り入れたシステムを開発した.開発したシステムの概要は,2人1組でバーチャル空間を進んでいくというものである,システム構成は,自転車エルゴメータ,バランス器具(左右に動揺),100インチスクリーン,プロジェクタ2台(立体視のために左眼用と右眼用),映像用PC,制御用PCからなる.コンテンツは,目標物(鳥)を追いかけて道路上の10箇所の壁をすり抜けて進むものとし,運動に興味をもたせ意欲を高めるように工夫した.運動によってバーチャル空間を移動させるために,ペダル回転数を前進スピードとし,バランス器具の左右の傾きを映像の左右位置になるように視点位置を制御している.15年度では単発の実験を行い,運動量が増えているにも関わらず主観的運動強度が変わらないという結果を得られていることからVRを用いることによって運動促進効果がみられることが示されている.本年度は,開発したシステムを繰り返し使用し実際のトレーニング効果について検討するために,1ヶ月間,週2回,合計8回のトレーニング実験を行った.被験者の大学生(18名)には文書にて実験参加の同意書を得た.被験者はバランス運動を行う12名(バランス群)と自転車運動を行う6名(エルゴ群)の2群にわけ,ペアで運動を行った.運動時間が6分間と短かったためエルゴ群は,バランス群の2人とペアを組んで1日に2回運動(65%HRmax相当の負荷)を行った.その結果,エルゴ群ではHRmaxに至るまでの負荷がトレーニング後に増加した人数が3/6名,バランス群において,左右への動揺が改善傾向にあったのが7/12名であった.被験者にトレーニング中の主観調査を行ったところ,思わず速く自転車を漕いでしまう(運動量の増加),2人で一緒に運動できるので楽しい,体力増進になったという意見が得られた一方,コンテンツが何パターンか選べるといい,点数方式で目標が得られるといいといった改善点も挙げられた.本研究で開発したシステムを用いることで短期間のトレーニングでも健康維持のための体力増進がみられること,また,VR技術を用いることによって運動意欲の促進効果が期待できることが明らかとなった.