hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト嗅覚を検出器としたGC/MS法の確立とそれを用いた浄水異臭味の全体像の把握

塩素処理工程にて様々な物質が生成され、そのうちのいくつかは臭気を有するとの報告がある。しかしながら、どのような物質が、どの程度水道水の臭気に寄与しているのかは分かっていない。本研究では、ヒト嗅覚を検出器としたGC/MS法(GC-MS-O)を確立し、標準品が入手できないような生成物についても、水道水の臭気全体への寄与率が評価できることを示した。本研究では、モデル物質としてフェニルアラニンを用い、塩素処理後に生成される、標準品が入手できないN-クロロフェニルアセトアルドイミンと2-クロロ-2-フェニルアセトアルデヒドが臭気を有することを示した。また、これらのカルキ臭全体への寄与率を定量的に示した。本年度は、マイクロ固相抽出法を前処理としてGC-オルファクトメトリー(ヒト嗅覚をガスクロマトグラフの検出器とした官能試験法)を行うことにより、フェニルアラニンの塩素処理時に生成されるカルキ臭物質の探索を行った。その結果、これまでにカルキ臭に寄与するとして同定してきたフェニルアセトアルデヒド,フェニルアセトニトリル, N-クロロフェニルアセトアルドイミン,トリクロラミン,残留遊離塩素に加え、新たなカルキ臭物質を見いだすことに成功した。マススペクトルの解析から、この新たなカルキ臭寄与物質は、2-クロロ-2-フェニルアセトアルデヒド, 2-(2-クロロフェニル)アセトアルデヒド, 2-(3-クロロフェニル)アセトアルデヒド, 2-(4-クロロフェニル)アセトアルデヒドのいずれかであることが分かった。そこで、標準品が市販されている2-(3-クロロフェニル)アセトアルデヒドと2-(4-クロロフェニル)アセトアルデヒドをGCにて測定したところ、いずれもカルキ臭寄与物質とはGC保持時間が異なったため、候補から外すことができた。よって、この物質は、2-クロロ-2-フェニルアセトアルデヒドか2-(2-クロロフェニル)アセトアルデヒドのいずれかであることが示唆された(いずれの物質も市販されていない)。さらに、GC-オルファクトメトリーにより、この物質は、フェニルアラニンの塩素処理時に生成されたカルキ臭のうち2%程度を説明できることが分かり、これまでの研究により同定されたカルキ臭寄与物質と合わせると、フェニルアラニン塩素処理時に生成されたカルキ臭のうち60%程度が説明できた。以上より、GC-オルファクトメトリーにより、原体が入手できない物質の官能試験を行うことができること、また、その結果より、その物質のカルキ臭全体への寄与率が算定できることが示された。本年度は、実験計画にて予定していた「新規浄水異臭味官能試験法の構築」と「マイクロ固相抽出法による前処理法の確立」をいずれも達成できたため、「おおむね順調に進展している」と判断した。多くの生成物が塩素処理工程にて生成される。アミノ酸由来の生成物のいくつかは臭気を有するとの報告があり、浄水異臭味への寄与が疑われているものの、これらの生成物の浄水異臭味への寄与については定量的に議論できていない。その大きな理由は、浄水中に含まれる多くの物質の標準品が入手できないため、それらの物質が臭気を有するか否かの判断を、標準品に対する臭気三点比較法などの官能試験で直接調べることができないことにある。これに対し、本研究では、食品分野などで用いられるgas chromatograhy (GC)-mass spectrometry (MS)-olfactometry(GC-MS-O)を適用することにより、標準品がない物質を含めた官能試験法を構築し、フェニルアラニンの塩素処理をケーススタディとして、個々の生成物の臭気全体への寄与を推定した。その結果、標準品が入手できない2つの生成物(N-クロロフェニルアセトアルドイミン, 2-クロロ-2-フェニルアセトアルデヒド)が臭気を有することが分かった。さらに、GC-MS-O分析と臭気三点比較法を組み合わせることにより、フェニルアラニン塩素処理溶液の有する臭気の60%が説明でき、その内訳が、遊離塩素が13%, 2-クロロ-2-フェニルアセトアルデヒドが13%,トリクロラミンが12%,フェニルアセトアルデヒドが11%,フェニルアセトニトリルが8%, N-クロロフェニルアセトアルドイミンが2%であることが示された。以上より、GC-MS-Oを用いることにより、原体が入手できない物質の官能試験を行うことができること、また、その結果と従来の官能試験の結果を組み合わせることにより、混合物中の個々の物質の臭気全体への寄与率を算定することができることが示された。本年度に確立した、各種前処理法とGC-オルファクトメトリーを組み合わせた浄水異臭味官能試験法を、実浄水(全国の浄水処理場から水をお送り頂く)に適用し、浄水中で問題とすべき異臭味寄与物質の特定を試みる予定である。

環境保全学GCオルファクトメトリーの前処理に用いたマイクロ固相抽出法によるカルキ臭物質の濃縮/回収法の確立が予想以上にうまく進展したため、検討のために必要としていた試薬などの必要量を減らすことができた。そのため、27,449円の差額が生じた。前年度から繰り越しとなった27,449円を、実浄水へのGCオルファクトメトリー適用に際しての前処理法の検討に用いる予定である。増額分により、予定より検討回数を増やすことができるため、より高効率かつ高感度の試験法が確立されることが期待できる。
筋損傷後の筋硬度とelastography法による筋弾性特性の関係

本研究は、筋硬度変化から筋機能を評価するために、従来の押し込み法による筋硬度評価と近年研究が始まった超音波画像診断によるelastography法による筋弾性評価を比較し、筋硬度計測の妥当性を検討する。筋機能変化として安静時、筋収縮時、筋疲労及び回復過程等の条件変化を加える計画であるが、特に筋損傷実験の世界的研究者であるEdith Cowan大学の野坂和則氏を研究協力者に迎え、筋損傷実験前後の比較から検討をすることが最大のねらいとなる。そのため、研究代表者が従来から検討を重ねている、押し込み量が大きな独自の据置型筋硬度計測装置を同大学に持ち込み、現地からelastographyの他、筋損傷実験システムの提供等を受けて行うものである。上記を踏まえ、平成25年度は、まず野坂氏との連携準備・現地での計画打合せを進めた。また現地での計測法比較に先立ち、国内において押し込み法に関して据置型と簡易型筋硬度計との安静時比較を行った。生体模擬物質(ゼリー様の弾性体および皮革)を用い、筋・皮下組織・皮膚の層構造をモデルし、押圧から筋硬度を推定する精度を比較したところ、深部の筋硬度評価において据置型の優位性が認められた。しかし、模擬物質の弾性率に対し計算値が過大評価となる結果が得られた。この点については、皮膚を模擬した皮革の特性が影響する可能性があり、elastography法との比較検討課題が浮き彫りとなった。これを受け、現地において押し込み法とelastography法の比較として、安静時の検討を行った。その結果、両者の筋弾性率の計算には開きがあることが示された。ただしelastography法においては、弾性率が既知の基準物質との相対的関係をソフトウェアから計算する過程において、さらに検討が必要なことも明らかとなった。本研究は、研究代表者が従来から検討を重ねてきた、押し込み量が大きな独自の据置型筋硬度計測装置(Pressure Meter:以下PM)と超音波画像診断によるReal-time Tissue Elastography(以下RTE)による筋硬度評価を詳細に比較検討する。RTEについては研究協力者の野坂和則氏のEdith Cowan大学から提供を受け、同大学にPMを持ち込み実験を進めている。筋硬度変化から筋機能を評価するために、安静時、筋収縮時、筋疲労及び回復過程等の条件を設定する。このうち、平成26年度は、上腕二頭筋を対象に安静状態および筋収縮時のPMとRTEの比較実験を行った。安静状態の計測は、左右各3点の計測点を設定し21名を対象にデータを収集することが出来た。この結果、PMで計測された弾性率とRTEで得られたひずみ率(Strain Ratio :SR)にはべき乗関数で回帰可能な曲線関係が得られた。しかし決定係数は0.5程度で、SRとPMの弾性率間の推定精度は低かった。従って、PMとRTEの硬さ評価は異なる意味を持つ可能性がある。一方、筋収縮においては最大随意収縮力(MVC)の15,30,45,60,75,90%を肘関節角度90,60,30度(最大伸展0度)の条件で16名を対象に比較を行った。MVCレベルの上昇とともにPM,RTEいずれも筋硬度の増加傾向が観察されたが、RTEのSRはMVC45%から60%でひずみ率が下限に達する例が多かった。一方、PMもその上昇率はMVC60%以降やや低くなるものの硬度の値は増加を示した。ここでも、両者の硬さ評価には不一致があり、同じ筋の特性を検出しているわけではないと考えられた。関節角度別の特徴については現在詳細な検討を行っているところである。本研究は、研究代表者が従来から検討を重ねてきた、押圧量が大きな据置型筋硬度計測装置(Pressure Meter:以下PM)と超音波画像診断によるReal-time Tissue Elastography(以下RTE)による筋硬度評価を比較検討したものである。今年度は最終年度として筋損傷前後の筋硬度変化について検討した。野坂和則氏(Edith Cowan大学:研究協力者)の協力のもとダンベルを用いたeccentric運動とconcentric運動を左右の上腕に実施し筋損傷を誘発した。また、RTE計測の専従者として稲見崇孝氏(早稲田大学)を迎え実験を実施した。被験者10名においてeccentric運動側に負荷直後から4日後にかけて肘関節角度減少、最大筋力低下、筋痛が生じた。一方、concentric運動側では負荷直後に筋力低下が生じるものの1日後には回復に転じ、関節可動域減少と筋痛も軽微なものであった。この際の、筋硬度変化として肘関節の強制伸展時(EAMG)及び安静状態(RANG)のPMとRTEを比較した。PMはEANGにおいて運動直後から4日後まで有意な筋硬度の増加(運動前:21.6 ±2.0 kPa , 4日後:30.1 ±3.7 kPa )が観察されたが、RANGでは有意な増加は認められなかった。一方、RTEでは筋硬度に対応するひずみ率(Strain Ratio :SR)がconcentric運動側の運動直後で30%低下したもののeccentric運動側では運動4日目までに20-28%の低下に留まった。つまり、運動による筋硬度の増加(ひずみ率の低下)は観察されたが、PMとRTEの間に有意な相関は認められなかった。

前年度からの基礎的検討である安静時、筋収縮時のPMとRTEの比較においてもPMの筋硬度とRTEのSR間の推定精度は低かった。これらを総合しPMとRTEは異なる特性を評価している可能性が示された。今後こうした所見をスポーツ科学の現場に提示するため更なる検討を加える必要がある。平成25年度において、研究協力者の野坂氏とともにEdith Cowan大学での実験の実際とそのスケジュール等について現実的な検討を行い、計画の修正など再計画を練り上げた。平成26年度は、まずRTEの計測における諸問題がクリアされ、安静状態と筋収縮条件の計測を行うことが出来た。しかし、その成果の公表・論文作成のための検討・打ち合わせが遅れている。E-mailでの検討に加え、野坂氏の来日に合わせた検討の機会を持ったが、研究代表者の研究エフォートが当該年度まで特に低い状況も重なったことが原因であった。平成27年度はエフォート率上昇の見込みであり、遅れを取り戻すべく取り組む予定である。運動生理学3年間の計画について、研究代表者および研究協力者の研究エフォートを考慮し、現実的な内容に修正した上で、実験計画は最終段階の筋損傷前後の筋硬度評価を残すところとなった。この実験に際しては回復過程の追跡が必要となり、一定の日数を要するため、平成27年度の夏季休業を利用し4週間集中的に行う。また、この実験に際し、RTE計測の専属者として早稲田大学の稲見崇孝氏を研究協力者に加え、この実験に同行してもらうこととなった。これにより、計測の精度およびデータ処理などの効率が大幅に上昇する見込みである。また、5月中には研究倫理審査をEdith Cowan大学に提出し、実験への協力者を早期募集する計画であり、十分なデータ量を確保するように努める。これと平行し、平成26年度の安静時および筋収縮時のPMとRTEの比較研究の論文投稿を早急に進める。この投稿過程の審査を基礎に、最終的な筋損傷実験においては損傷筋が呈する筋stiffnessの変化とPMやRTEによる筋のhardnessの関係を検討する。これにより、PMとRTEの一致および違いから浮き彫りとなる筋機能変化の非侵襲的検出の可能性、大きな筋機能低下時に硬度や弾性率がどのように指標化できるか、という点の解明に繋がると考えている。平成25年度は、まず研究協力者の野坂氏と3年間の実験計画およびオーストラリア・Edith Cowan大学での実験スケジュール等について打ち合わせを行った。その他、データ検討の具体的内容としては、押し込み法とElastography法の計測値の比較について基礎的検討を行う予定であった。これに対し、3年間での研究達成範囲について現実的な検討を行い、計画の修正など再計画を練り上げた。その上で、オーストラリア・Edith Cowan大学に赴き、研究代表者の据置型の押圧筋硬度計と現地のElastographyによる計測を行った。しかし、Elastographyにおいて弾性率が既知の基準物質を用いて相対的に弾性率を計算する上で、ソフトウエアの仕様に不十分な部分があり、押圧筋硬度計との比較検討に課題が残った。この点は、ソフトウェアの改善を済ませ、次年度早々に再度現地にて基礎的検討を追試する予定である。この基礎検討をふまえ、次年度の計画を新たに進める計画のため、平成25年度の達成度としては十分とは言えなかった。
社会システムにおけるジレンマ的状況と協力の可能性〜安定集合による分析〜

本研究においては,「囚人のジレンマ」および「社会的ジレンマ」に対して,「逸脱の連鎖を考慮した安定集合」による分析を行い,以下の成果を得た.1囚人のジレンマ:2人の主体が独立に行動する場合には,共に「協力する」か共に「裏切る」状態が安定な状態になること,また,選択の確率混合(混合戦略)を許すと,すべての確率混合の組が安定な状態になりうることを示した.2人の主体の話し合いを許した場合には,たとえ協定に拘束力がなくとも,2人の主体が共に「協力する」する状態のみが安定な状態となること,また混合戦略まで考えた場合にはパレート最適な状態のみが安定な状態となること,を明らかにした.さらに,安定集合による分析結果と,2人の主体が交互に戦略を変えていくゲームの定常的な均衡による分析結果を比較し,前者による安定な状態が,後者の均衡状態とほぼ同じ結果を与えることを示した.2社会的ジレンマ:多人数からなるより一般的な社会的ジレンマの状況において,たとえ主体間の話し合いの結果得られた取り決めに拘束力がなくそれから逸脱しても罰せられることがないとしても,すべての主体が自発的に逸脱せずそれを遵守するような協定が必ず存在すること,さらに,このような協定はパレート最適で個人合理的なものに限られること,を理論的に明らかにした.本研究においては,「囚人のジレンマ」および「社会的ジレンマ」に対して,「逸脱の連鎖を考慮した安定集合」による分析を行い,以下の成果を得た.1囚人のジレンマ:2人の主体が独立に行動する場合には,共に「協力する」か共に「裏切る」状態が安定な状態になること,また,選択の確率混合(混合戦略)を許すと,すべての確率混合の組が安定な状態になりうることを示した.2人の主体の話し合いを許した場合には,たとえ協定に拘束力がなくとも,2人の主体が共に「協力する」する状態のみが安定な状態となること,また混合戦略まで考えた場合にはパレート最適な状態のみが安定な状態となること,を明らかにした.さらに,安定集合による分析結果と,2人の主体が交互に戦略を変えていくゲームの定常的な均衡による分析結果を比較し,前者による安定な状態が,後者の均衡状態とほぼ同じ結果を与えることを示した.2社会的ジレンマ:多人数からなるより一般的な社会的ジレンマの状況において,たとえ主体間の話し合いの結果得られた取り決めに拘束力がなくそれから逸脱しても罰せられることがないとしても,すべての主体が自発的に逸脱せずそれを遵守するような協定が必ず存在すること,さらに,このような協定はパレート最適で個人合理的なものに限られること,を理論的に明らかにした.本年度の研究においては,2人の主体の間の「囚人のジレンマ」,および多人数の主体の間の社会的ジレンマの一つの形態である「湖の汚染をめぐるジレンマ」の2つの社会的ジレンマを取り上げ,ゲーム理論,特にその一つの解である「安定集合」を用いた分析を行った.1囚人のジレンマ:逸脱の連鎖を考慮しない場合には,2人の主体が共に「協力する」か共に「裏切る」状態が安定な状態になること,また,選択の確率混合(混合戦略)を許すと,すべての確率混合の組が安定な状態になりうることを示した.なお,2人の主体の間の話し合いを許した場合には安定な状態が存在しないことも明らかにした.さらに,逸脱の連鎖を考慮した場合には,2人の主体が独立に行動すれば,逸脱の連鎖がない場合とほぼ同じ結果が得られるが,両者の間の話し合いを許したときには,たとえ協定に拘束力がなくとも,2人の主体が共に「協力する」する状態のみが安定な状態となること,また混合戦略まで考えた場合にはパレート最適な状態のみが安定な状態となること,を明らかにした.2湖の汚染をめぐるジレンマ:逸脱の連鎖を考慮しない場合には,囚人のジレンマと同様,明確な結果が得られないが,考慮した場合,特に2人の主体の間の話し合いを許した場合には,多くの工場が自発的に排水を浄化してから湖に放出するという協力的行動をとる状態が実現されることを明らかにした.以上の結果から,逸脱の連鎖を考慮した安定集合の方が,社会的ジレンマの分析においてはより適当な概念であることが明らかになった.来年度以降は,この概念を用いて「共有地のジレンマ」など他の社会的ジレンマを分析すると共に,社会的ジレンマの解決にはどのような方法をとればよいかを考えていく予定である.本年度の研究においては,昨年度の「囚人のジレンマ」,および「湖の汚染をめぐるジレンマ」に対する「逸脱の連鎖を考慮した安定集合」を用いた分析をより進展させ,以下の成果を得た.1 n人囚人のジレンマ:主体の数が3人以上である囚人のジレンマ(社会的ジレンマ)における主体の行動を,逸脱の連鎖を考慮した安定集合を用いて分析した.得られた成果は以下の通りである.主体間の話し合いが許された状況では,たとえ話し合いの結果得られた取り決めに拘束力がなく,それから逸脱しても罰せられることがないとしても,協定から逸脱する主体が,その後他の主体も逸脱する可能性を考えるとすれば,すべての主体が自発的に逸脱せずそれを遵守するような協定が必ず存在すること,さらに,このような協定はパレート最適で個人合理的なものに限られること,を理論的に明らかにした.

この結果は,多数の主体から成る囚人のジレンマにおいて,全員が協力行動をとるという協定が実現されれば,たとえそれが拘束力を持たないものであっても,誰もその協定から逸脱した行動をとることはなく,協定が自発的に守られることを示すものであり,特に,環境問題に対する国際的な取り決めなど,逸脱者を罰することが事実上不可能な場合においても,協定が実効性を持つ可能性を明らかにするものである。2 2人囚人のジレンマの安定集合と定常的な均衡:昨年度の「2人の囚人のジレンマ」についての安定集合による分析結果と,2人の主体が交互に戦略を変えていくゲームの定常的な均衡による分析結果を比較し,前者による安定な状態が,後者の均衡状態とほぼ同じ結果を与えることを示した.この結果は,来年度計画している,安定集合の背後にある動的な主体間の動きを明らかにする一つの出発点と成るものである.本年度の研究においては,昨年度の「囚人のジレンマ」および「社会的ジレンマ」に対する「逸脱の連鎖を考慮した安定集合」および「プレイヤー間の交渉をモデル化した非協力ゲームにおける定常均衡」を用いた分析をより進展させ,以下の成果を得た.1 2人囚人のジレンマの安定集合と定常的な均衡:昨年度の,「2人の囚人のジレンマ」についての安定集合による分析結果と2人の主体が交互に戦略を変えていくゲームの定常的な均衡による分析結果との相違を詳細に検討し,定常均衡に比べ分析が容易に行える安定集合による分析をどの程度まで適用できるかを明らかにした.2社会的ジレンマ:逸脱の連鎖を考慮した安定集合を用いた昨年度の分析をより発展させ,より一般的な社会的ジレンマの状況においても,昨年度得られたと同様な結果が成り立つことを明らかにした.つまり,たとえ主体間の話し合いの結果得られた取り決めに拘束力がなくそれから逸脱しても罰せられることがないとしても,すべての主体が自発的に逸脱せずそれを遵守するような協力が必ず存在すること,さらに,このような協定はパレート最適で個人合理的なものに限られること,を理論的に明らかにした.さらに,環境問題に対する国際的な取り決めなど,逸脱者を罰することが事実上不可能な場合において,交渉だけで決着できない場合,投票による決定なども含めどのようなプロセスで協定を定めていけばよいかも検討し,いくつかの実行可能なプロセスを与えた.
DNA三次元ナノプリンター

DNAナノ構造体は、一本鎖DNAの自己会合によりつくられた超分子構造体である。材料科学、生命科学、医療などの分野で、利用が期待されている。大きな三次元DNAナノ構造体の構築を困難にしている原因の一つがL3乗問題である。この問題は、三次元プリンターの原理である積層造形法を利用すると解決できる。本研究では、三次元DNAナノ構造体を構築するための、ナノスケールの積層造形法の開発を行った。相補的なDNA配列をもつアダプタが特異的に結合する2つのポートを、大きな二次元アレイを形成するDXABタイルの構造に導入することにより、ナノスケールの積層造形法で必要とされる性質を満たすDNAインクの開発に成功した。現在、DNA鎖の自己集合により様々な形のDNAナノ構造体をつくる研究が、新しいナノテクノロジーの一つとして注目されている。しかし、三次元DNAナノ構造体をつくろうとすると、一辺の長さの3乗に比例する数の特異性の高いDNA配列が必要になる。そのため、一辺が100ナノメートルを超える三次元DNAナノ構造体は実現していない。この問題を解決するために本研究では、DNAインクにより、マクロスケールの三次元プリンターで用いられている積層造形法をナノメートルスケールで実現することを計画した。これにより、必要なDNA配列が一辺の2乗に比例する数に減るため、ナノメートルの空間分解能とマイクロメートルの大きさをもつ任意の形状の三次元DNAナノ構造体をつくることが可能になる。本年度は、研究目的を達成するために、基板となる第0層とその上に形成される第1層を作成する方法の開発に着手した。第0層はDNAオリガミ、その上の第1層はDNAインクで作成する予定であったが、第0層の作成も可能なDNAインクを開発することで、第0層も含むすべての層が同じDNAインクで作成できるように研究を進めた。積層造形法を実現するためのDNAインク粒に必要な性質は、1)粒が下層の指定された位置に付着する性質、2)固着するか否かを粒ごとに選択できる性質、3)付着したのち粒が平面状に広がり新しい下層を形成する性質の3つである。これらの性質をすべて満たすDNAインクを実現するために、DNAインク粒のナノ構造体をいくつか考えて検討した。その中で2つの構造体を選び、実際にDNAインクを作成して性質を調べた。蛍光を利用した融解曲線と形成曲線の測定、および原子間力顕微鏡による構造観察の結果、作成したDNAインクが性質1と性質3を満たすことを確認した。これにより、DNAインクによるナノスケールでの積層造形法の実現に向けて一歩前進した。-当初計画にあった、鋳型依存のDNA光化学反応による断面構造の安定化の実験、すなわち、DNAインク粒に求められる性質2を調べる実験が実施できなかった。これは、DNAインク粒をつくるために使用するDNA配列の設計が遅れたためである。DNA相補鎖のハイブリダイゼーションを利用してDNAインク粒を下層の指定された位置に付着させる反応は、下層が十分に安定な低い温度で行われる。そのため、このように低い温度でも、ハイブリダイゼーション速度の低下をもたらす安定な自己二次構造を形成しない配列を使用する。しかし、そのような配列であってもハイブリダイゼーション速度が配列によって二桁も異なる。その大きな違いをDNA配列から予測できるようにする研究が遅れたため、DNAインクの配列設計が遅れてしまった。なお、積層化のための流路の作製と流路中での積層実験も実施しなかった。これは、とくに積層化のための流路を作製する必要がないことが判明したからである。DNAオリガミではなく第0層もDNAインクで作成したため、第0層がDNAオリガミの場合よりはるかに大きくなり、インク粒より十分に強くマイカ表面へ吸着されるようになったからである。ー本研究では、DNAでつくられたインク粒を含むDNAインクを基板表面に繰り返し塗布することにより、積層造形法の原理に基づいて、ナノスケールの三次元構造体を構築する方法の開発を目指している。使用するDNAインク粒には、粒が下層の指定された位置に付着する性質、固着するか否かを粒の付着位置ごとに選択できる性質、付着したのち粒が平面状の新しい下層を形成する性質、さらに、多段の積層を可能にする高い積層効率が求められる。最初に、昨年度に設計した、2段の積層が確認されたDNAインク粒について、積層効率を調べた。これまで用いた、原子間力顕微鏡により積層を確認する方法は、手間がかかるだけでなく、リアルタイムでの観察もできないので、反応条件を変えて積層効率を調べることが難しい。そこで、蛍光顕微鏡を用いて、積層反応を温度制御しながらリアルタイムで観察できる方法を開発した。その方法により、昨年度に設計したDNAインク粒の積層効率を調べたところ、繰り返して積層するには効率が十分でないことがわかった。原因を調べたところ、付着したDNAインク粒が形成する層構造の乱れが大きいことが示唆された。この結果に基づいて、積層効率を向上させるための新しいDNAインク粒を設計した。DNAインク粒が形成する層構造の乱れを小さくするために、2層で積層のための土台となる層を形成するようにした。また、UV光でDNAインク粒を固着状態に変えるための仕組みを、より安定な層構造が形成できるように変更した。これらの改良の結果、DNAインク粒の積層効率が顕著に向上した。以上のように、本研究により、積層造形法の原理に基づくナノスケール三次元構造体構築の基盤として最も重要な、DNAインク粒を開発することができた。今後、積層段数を数百回にまで増やし、どの程度の高さの構造体が構築できるかを明らかにしていきたい。

DNAナノ構造体は、一本鎖DNAの自己会合によりつくられた超分子構造体である。材料科学、生命科学、医療などの分野で、利用が期待されている。大きな三次元DNAナノ構造体の構築を困難にしている原因の一つがL3乗問題である。この問題は、三次元プリンターの原理である積層造形法を利用すると解決できる。本研究では、三次元DNAナノ構造体を構築するための、ナノスケールの積層造形法の開発を行った。相補的なDNA配列をもつアダプタが特異的に結合する2つのポートを、大きな二次元アレイを形成するDXABタイルの構造に導入することにより、ナノスケールの積層造形法で必要とされる性質を満たすDNAインクの開発に成功した。平成27年度に作成したDNAインクが、必要とされる性質2、すなわち、インク粒が固着するか否かを粒ごとに選択できる性質を有しているかを確認する実験をまず行う。その後、当初計画通り、中空の無い立体構造の作成、中空のある立体構造の作成へと研究を進める。当初計画では、作成したDNAインクの性質を調べるためにゲル電気泳動も利用することになっていた。しかし、蛍光分子を利用した融解曲線と形成曲線を測定する方法の方が簡便で情報量も多いことがわかったので、ゲル電気泳動は使わず、これらの曲線の測定と原子間力顕微鏡による観察で研究を進めることにする。生物物理学研究の進捗状況に合わせて予算を執行するため次年度の決定額と合わせて執行
ビニルモノマー化ケイ光プローブの合成と高分子ミクロ環境の評価

近年,熱や光などさまざまな外的刺激により高分子化合物の有する機能が変化するいわゆるインテリジェント高分子が注目されている。このような高分子化合物の構築するミクロ環境や外的刺激によるミクロ環境の変化については,市販のケイ光性分子をミクロ環境プローブとして用いた研究か数多くなされている。本研究では,申請者らが見い出したケイ光プローブ分子9-(4-N,N-ジメチルアミノフェニル)フェナントレン(DP:DMA-Phen)に重合性官能基を化学修飾した新規のビニルモノマー化ケイ光プローブを合成し,これらを分子内ケイ光プローブとして感熱応答性アクリルアミド系ポリマー類の水溶液中での高分子ミクロ環境やその変化を詳細に検討し,以下の成果を得た。1.今回,新たにDPユニットを持つビニルモノマー化ケイ光プローブとしてメタクリル酸メチル(MMA)誘導体のDP-MMAを合成した。2.ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド),ポリ(N-n-プロピルアクリルアミド),ポリ(N-イソプロピルメタクリルアミド)などの感熱応答性を示すアクリルアミド系ポリマーの水溶液中での熱相転移現象を分子内ケイ光プローブ法により追跡し,相転移に伴う高分子ミクロ環境の変化を評価した。3.ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)の熱相転移温度並びに高分子ミクロ環境を制御することを目標として,N-イソプロピルアクリルアミドと種々のモノマーとの共重合体を合成し,それら共重合体の水溶液系の熱相転移挙動や高分子ミクロ環境を分子内ケイ光プローブ法により検討し,熱相転移温度並びに高分子ミクロ環境の制御の可能性を示した。近年,光・熱やpHを始めとするさまざまな外的刺激により高分子化合物の有する機能が変化するいわゆるインテリジェント高分子が注目されている。このような高分子化合物の構築する微環境や外的刺激による微環境の変化については,市販の8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸塩やピレンなどのケイ光性分子を微環境プローブとして用いた研究が数多くなされている。本研究においては,申請者らが見い出した新規のケイ光プローブ分子9-(4-N,N-ジメチルアミノフェニル)フェナントレン(DP:DMA-Phen)が光感応性基とするビニルモノマーを合成し,共重合によりDPユニットを微量種々の高分子に組み込み,DPユニットのケイ光挙動より幹ポリマーの構築するミクロ環境の評価を行う。今年度は,これまでに合成したDP誘導体モノマーと種々の水溶性モノマーの共重合体を合成し,以下に示す高分子ミクロ環境の評価実験を行うと同時に,本科学研究費補助金で購入した検出器を利用して,新規のDP誘導体モノマーの合成を行っている。1.ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)やポリ(N-ノルマルプロピルアクリルアミド)などの感熱応答性アクリルアミド系ポリマーの水溶液系での熱相転移現象をケイ光プローブ法により追跡し,そのミクロ環境の変化を検討した。2.2種のアクリルアミド系ポリマーが共存する混合水溶液系での熱相転移挙動をケイ光プローブ法により追跡し,ポリマー-ポリマー間相互作用について検討した。3.ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)の熱相転移温度を制御することを目的として,数種のモノマーとの共重合体を合成し,ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)共重合体水溶液系のミクロ環境を比較検討すると共に,熱相転移現象に伴う高分子ミクロ環境の変化を検討した。このような高分子化合物の構築するミクロ環境や外的刺激によるミクロ環境の変化については,市販の8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸塩やピレンなどのケイ光性分子を微環境プローブとして用いた研究が数多くなされている。

本研究においては,高分子ミクロ環境についてのより詳細な情報を得るため,申請者らが見い出したケイ光プローブ分子9-(4-N,N-ジメチルアミノフェニル)フェナントレン(DP:DMA-Phen)に重合性官能基を化学修飾した新規のビニルモノマー化ケイ光プローブを合成し,これを共重合によりごく微量種々の高分子に組み込み,DPユニットのケイ光挙動より溶液中で幹ポリマーが構築する高分子ミクロ環境の評価を行い,以下の成果を得た。1.ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド),ポリ(N-n-プロピルアクリルアミド),ポリ(N-イソプロピルメタクリルアミド)などの感熱応答性を示すアクリルアミド系ポリマーの水溶液中での熱相転移現象を分子内ケイ光プローブ法により追跡し,相転移に伴う高分子ミクロ環境の変化を評価した。2.ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)の熱相転移温度並びに高分子ミクロ環境を制御することを目標として,N-イソプロピルアクリルアミドと種々のモノマーとの共重合体を合成し,それら共重合体の水溶液系の熱相転移挙動や高分子ミクロ環境を分子内ケイ光プローブ法により検討し,熱相転移温度並びに高分子ミクロ環境の制御の可能性を示した。
サブ・サハラ・アフリカに適した「低投入環境保全型グリーンレボリューション」の検討

サブサハラにおける「低投入環境保全型」農業モデルを提唱するため、ウガンダにおいて農家調査、栽培試験、パピルス湿地開田試験、関連2次資料収集を行った。これら基礎データの分析により、陸稲作・水稲作の普及により稲作生産を飛躍的に拡大するポテンシャルは極めて大きく、サブサハラにおいて、環境に負荷を与えることなく「緑の革命」を達成する条件は整っており、それを達成することが農村の貧困解消にも貢献することが明らかとなった。本研究では,サブサハラにおける「低投入環境保全型」農業モデルを提唱するための基礎的なデータ収集をウガンダにおいて行うことを初年度の目標とした。予備調査として,大雨季に1名が現地を訪問し,作物利用の実態を把握すると同時に,研究協力者と,東部・南部・西部の各農業実態を調査した。その結果から,調査地候補を東部に絞り,小雨季に4名が現地を訪問して,具体的な調査地の選定,調査対象の絞込みを行った。ウガンダにおける主食作物はバナナ,サツマイモ,トウモロコシ,キャッサバ,コメであり,最も一般的な主食はバナナを蒸した「マトケ」である。近年になり,コメの需要が高まってきており,主食としての利用が多くなってきている。また,多様なマメの利用が見られた。野菜の利用は余り多いとは言えず,トマト,トウガラシ,キャベツ,ササゲと菜類が主要な野菜であったが,食べる量・頻度もアジアに比べて低い様であった。ウガンダは国土が高地にあり,水資源が豊富であるため,気候的に見ても農業生産のポテンシャルがかなり高い。また,土壌肥沃度がかなり高く,多くの農家では無施肥で作物栽培を行っていた。農業体系は,プランテーション,畑作,水田に大別され,コメの需要拡大に伴って水田開発が進んできている。これらから考えて,ウガンダには陸稲ネリカより水稲ネリカを導入した方が適していると考えられた。このことから,水田開発に伴う問題点を検討した。ウガンダは広大な湿地があり,そこの主要植生であるパピルスが保護されているため,湿地の開発許可を得ることは難しい。しかし,パピルス地帯を水田にした場合の環境負荷の実態は明らかになっていない。そこで,来年度の目標を,水田開発を行った場合の環境負荷の推定と低減,環境浄化型野菜の検討とすることにした。併せて,陸稲としてのネリカ米の作付可能性について,他の主要畑作物を含む作付体系において検討する。サブサハラにおける「低投入環境保全型」農業モデルを提唱するために、本年度はウガンダにおいて基礎的なデータ収集を継続すると共に、農業生産のポテンシャルを推定するための基礎試験を実施した。交代で現地を訪問すると共に、試験圃場でのデータ収集を行った。基礎的なデータ収集は、昨年度決定した調査地の一つである、東部大規模灌漑地域ドホ周辺において、農家の作付体系、営農実態とコメを中心とした栽培体系に関する聞き取り調査を行った。この結果、コメの栽培においては、施肥は苗代でのみ見られ、肥料成分による環境負荷は殆どなかった。一方で、農薬の施用は日常的に見られたことから、今後、農薬による環境負荷の増大が懸念される。一方、農業生産のポテンシャルを推定するために、2品種のネリカを含む5種類の穀類を斜面圃場に植え付け、地形による作物選択の基礎データを収集した。その結果、斜面圃場では最低地から高地に向かってソルガム、トウモロコシ、ネリカ4、ネリカ10、シコクビエの順に割り当てれば収量が確保できることが明らかとなった。また、水田面積の拡大を想定して、パピルス湿地を開墾して水田とした場合の環境負荷発生量とその周辺部のパピルス生育への影響を評価するために、2008年7月にパピルス湿地を開墾して作付けを開始し、施肥成分、濁度などの1年間の推移を観測するとともに、伐採した周辺部のパピルスの再生速度をモニタリングした。その結果、開田と水稲の作付けが周囲のパピルス植生の生長に負の要因となる可能性は低いと判断された。サブサハラにおける「低投入環境保全型」農業モデルを提唱するために、本年度は昨年度に引き続き実施した(a)ウガンダ農家のネリカ栽培を含む営農実態調査、作付体系調査、(b)ウガンダ中央農事試験場における)斜面圃場でのネリカ、メイズ、シコクビエの栽培試験、(c)サブサハラにおける大小規模灌漑開発プロジェクト資料収集より得られた基礎的なデータを用い、(A)農家のネリカ採用要因の分析、(B)斜面圃場における最適作付体系のシミュレーション分析、(C)サブサハラにおける灌漑プロジェクトの費用便益分析を行った。これらの分析の結果、農家によるネリカ採用を規定している要因は旱魃の危険性、農民組織への参加の有無、精米所へのアクセスであり、さらに耐旱性の強い陸稲品種の育成、農民組織の育成、市場へのアクセスの改善がネリカの普及を促進することが明ちかとなった。また、ネリカは老齢、寡婦、低教育水準の農家により採用される傾向があり、農村の弱者の所得向上に貢献することが検証された。

また、最適作付体系は、地下水位からの標高5m未満の斜面下部ではネリカの作付率が90%超、5m以上の斜面上部ではネリカ20%、メイズとシコクビエそれぞれ40%となり、ウガンダにおけるネリカ栽培のポテンシャルが極めて大きいこと、ネリカの普及に当たって斜面上での適地栽培を指導することの重要性が明らかにされた。さらに、灌漑開発に当たって小規模プロジェクトの優越性が検証され、水稲作普及のポテンシャルも高いことが示された。パピルス湿地の開田も十分な経済性を持つことも明らかにされた。収量は陸稲で3t/ha、水稲で5t/haが、殆ど無施肥で達成可能であることから、これまでの本プロジェクトにおける研究成果と併せ、陸稲、水稲の普及により、環境に負荷を与えることなく、サブサハラにおける「緑の革命」の達成が可能であることが明らかとなった。
スクールソーシャルワーカーを活用した地域相談支援体制の構築に関する実践的研究

スクールソーシャルワーカー(SSW)が、愛知県内の学校に新たに配置され始めた。学校で第三者の役割を担うSSWの存在は重要で、SSWが協働することで学校内の問題の解決が促進されることがわかった。教員がSSWを活用するためには、教員にとって、新しい考え方である。ソーシャルワークについての基礎知識を学び、SSWの仕事内容を理解することが不可欠である。一方、SSWも学校の組織や文化を理解することが求められるが、現状では、大学等でのSSWの養成が不十分な実態であるため、SSWの養成は大きな課題であると言える。9月より愛知県日進市内の小学校2校に、スクールソーシャルワーカー(SSWer)1名を配置し、ソーシャルワークの実践を開始した。まず教員に対しSSWerについて知ってもらう、SSWerは役に立つということを理解してもらうことから始めた。7ヶ月ほど経過し、SSWerを配置した学校ではSSWerに対する理解が深まり、受け入れ体制が整ってきた。学校は家庭環境が複雑で教員では十分に情報収集ができないケースや学校外で起こったケースなど、特に保護者対応が求められ、教育的アプローチだけでは対応できない子どもについての支援を、SSWerに求めていることがわかってきた。児童相談所や子ども家庭課(家庭児童相談員)、教育支援センターなど複数の機関が係わる事例について11月に事例検討会を行い、情報共有や役割分担などの地域相談支援体制の構築に向けての課題が明らかになった。また、2月にSSWerと教員で事例検討会を行い、教員の子どもに対する見立てが適切ではないことも課題のひとつとして考えられ、全教員対象のソーシャルワーク技法を理解するための研修の必要性を改めて確認した。12月と3月にSSWerに対し、スーパーバイザーによるスーパービジョンを行い、スーパービジョンがSSWerの資質向上に効果があることが確認できた。2年目である26年度は、1名のスクールソーシャルワーカー(SSWer)を、主にA小学校とB中学校を担当し、教員と協働して問題解決に向けスクールソーシャルワーク(SSW)を実践した。小学校と中学校では問題の種類が異なることがわかった。SSWerの専門性について理解を深めることと、ソーシャルワークを知ることが、教員とSWerが協働するためには重要である。そこで、日進市内のすべての小中学校の教員(参加者合計293名)を対象に、約1時間の「スクールソーシャルワーク研修」を行った。この研修終了後、自由記述のアンケートを行った。その結果、SSWerの存在を初めて知った。SSWerへ積極的に相談することが大事。教員ではない第三者による対応の必要性。担任が一人で抱え込まずに困ったときに相談してよいことがわかったなど、SSWerを活用したいという意見が多かった。相談したい内容としては、「保護者対応」と「問題行動」が圧倒的に多かった。また、ケース会議のやり方や必要性、エコマップ(援助者が、利用者を支援するために利用者、家族、社会資源の関係性を図にしたもの)の有用性がわかったという意見も多かった。1時間程度の研修で基本的なSSWerの役割や福祉的な考え方が理解できることがわかった。勤務する学校にSSWerが配置されるまでは、SSWer不在で問題解決に取り組まざるを得ないため、福祉的な発想のケース会議やエコマップを理解する教員が増えると、学校の問題解決能力の向上が期待できると考えられ、教員向けの「スクールソーシャルワーク研修」が有意義であることがわかった。今後教員がSSWerと協働して問題解決に取り組むために、教員がSSWerの役割や職務内容を理解しておくことは必要不可欠と考えられる。実際にSSWerと協同して問題解決ができたことを経験できると、SSWerに対する理解が深まることもわかった。本研究の一環で、小学校1校と中学校1校で、1名のスクールソーシャルワーカー(以下SSWer)が2年間活動した。学校教員にとってSSWerという専門職の存在すら知らない状況でSSWerを配置した。2年間経過しSSWerの仕事内容が教員に理解され、福祉的な視点が理解されることで教員の視野も広がり、チーム支援体制ができた。特に保護者対応についてSSWerは有効であった。本研究のまとめとして,学校教員がSSWerを活用する際の注意点とSSWerが学校で活動する際の注意点をまとめた。1.学校教員がSSWerを活用する際の注意点は以下の3点であった。1SSWerの仕事内容を理解するための教員向け研修会を実施する。2先生ではない立場の人が入るということに意味がある。たとえば、SSWerは教員では入手できないような個人的な事情等を得ることができる。3とにかく相談してみる。学校職員だけで保護者の背景も含め対応するということには限界がある。子どもを理解しようとするとき,学校での出来事を見るだけでは不十分で、その子どもの家庭や成育歴からいろいろなことがわかる場合が多い。2.SSWerが学校で活動する際の注意点1教員にSSWerの仕事内容を理解してもらう。2配置される学校の特徴を理解する学校での動き方やその学校での役割を校長先生の考え方や校務分掌などから検討する。小学校と中学校で組織の動かし方が異なる。3先生との信頼関係を築く。4従来からある相談機関等と役割分担を決める。SSWerが新たに加わることになるため、従来から学校と関わりがある相談機関等とSSWerとの役割分担を決め、連携に支障をきたさないように配慮する。5保護者は先生よりもSSWerのほうが話がしやすい。

保護者の話を聞く役割が重要である。また、保護者は学校の先生には知られたくないと思っている。教員向けSSWer活用マニュアルとSSWer向けのガイドブックの作成を本研究の成果物と考えているが、まとめの検討が遅れ、2つの成果物の作成が遅れたため愛知県内の学校で、スクールソーシャルワーカー(以下SSW)が配置される学校が増えてきた。児童生徒の問題解決のためには、教職員がSSWと協働することが不可欠であるが、ほとんどの教職員がSSWの仕事の内容について理解できていないのが現状と言える。そこで、平成25年度に本研究の一環としてSSWを配置した日進市で、SSWの仕事について、1時間程度の研修を受けた293名の教職員のアンケートの記述の中に、教職員とSSWの協働を進めるためのヒントになると考えられる記述が多く見られた。その記述は教職員にとってSSWの活用に関することとソーシャルワークの考え方を理解することに役立つと考えられたので、アンケートの記述に関してSSWの活用とソーシャルワークの考え方の理解の2点について、報告書(27ページ)にまとめ、愛知県立大学の近隣の11の教育委員会に配布した。SSWの活用については、以下のような理解が有効ではないかと考えられた。1ケース検討会のファシリテーター((司会)の役割を担う、2学校と児童の抱える問題環境の間に入って、冷静に双方をとりもつ役割を担う、3他の機関をコーディネートする。4学校と保護者、児童を客観的にみる。5教員が身近に相談する。ソーシャルワークの考え方の理解については、以下のような理解が有効ではないかと考えられた。1エコマップが問題を明確にするのに有効である。2ストレングスから支援を考えていく。3困る子は困っている子、4自分ひとりで悩まずに周りの人に相談することが大切。5家庭の大切さ。6相手を先入観で見ない。7多面的にみる。子どもたちは問題行動を起こす何らかの環境要因がある。スクールソーシャルワーカー(SSW)が、愛知県内の学校に新たに配置され始めた。学校で第三者の役割を担うSSWの存在は重要で、SSWが協働することで学校内の問題の解決が促進されることがわかった。教員がSSWを活用するためには、教員にとって、新しい考え方である。ソーシャルワークについての基礎知識を学び、SSWの仕事内容を理解することが不可欠である。一方、SSWも学校の組織や文化を理解することが求められるが、現状では、大学等でのSSWの養成が不十分な実態であるため、SSWの養成は大きな課題であると言える。教員向けのSSWer活用マニュアルとSSWer向けのガイドブックの作成を本研究の成果物と考えている。教員向けのマニュアルについては、教員向けの研修会を実施し、教員がSSWerに対して期待していること、活用の仕方などについてのデータが得られた。しかし、典型的な事例の整理などが遅れ、SSWer向けのガイドブック作成のためのデータ収集が遅れている。本研究の成果物である、教員向けSSWer活用マニュアルとSSWer向けのガイドブックを作成する。
新興真菌症の薬剤耐性機序－真菌にも耐性菌選択濃度域があるのか－

トリコスポロンという環境に多く存在している病原性のある酵母に着目して、試験管内や臨床分離株による研究解析を行った結果、抗真菌薬の標的タンパクの構造変により、抗真菌薬へ耐性化することが明らかになった。MIC付近濃度との抗真菌薬との接触によって容易に、真菌の遺伝子に変異を生じる可能性が示唆された。抗真菌薬の使用以外に、バイオフィルムの形成によって、酵母は抗真菌薬へ耐性化することもわかった。バイオフィルム形成真菌では、抗真菌薬は無効であることも明らかになった。研究者らは、トリコスポロンは生体内に留置する医療デバイス(血管内留置カテーテル、尿道留置カテーテル)の表面に、バイオフィルムを形成し、これらは、国内での使用可能な抗真菌薬に耐性を示すことを明らかにした。トリコスポロンのバイオフィルム生成菌に、キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸(EDTA)やエタノールを添加することにより、トリコスポロンのバイオフィルム形成能が低下することがわかった。これらの結果により、トリコスポロンの薬剤耐性化の機序に真菌のバイオフィルム形成関与していること、医療デバイス上で生成されたトリコスポロンのバイオフィルムに対しては、EDTAやエタノール治療(カテーテルロック療法)が有用であることが示唆された。一方、研究者らは、臨床から分離された多剤耐性傾向の強いトリコスポロンの培養液中にEDTAを添加すると、トリコスポロンの発育が有意に抑制されることを見出した。すなわち、EDTAは、それ単独でも抗真菌作用を有している可能性があることが示された。研究者らが発見した抗真菌薬耐性のトリコスポロンのERG11の点変異部位をSaccharomyces cerevisiaeで発現したところ、アゾール系薬への感受性著しく低下することがわかった。このことにより、アゾール系薬の標的蛋白であるERG11の点変異が、トリコスポロンの耐性機序に、重要な役割を担っていることが明らかになった。試験管内でトリコスポロンの真菌薬の耐性誘導実験を行ったところ、抗真菌薬との接触により、容易に多剤抗真菌薬に対する耐性が誘導されることを明らかにした。アゾール系抗真菌薬の標的酵素である14αdemethylase(14DM)をコードするerg11の全遺伝子配列を解明し、更に、アミノ酸変異を見出して、論文発表を行なった。治療に抗真菌薬が使用された臨床分離株の中から高度薬剤耐性を示すトリコスポロン株を見出した。同じく14DMをコードする遺伝子の別の部位にアミノ酸変異が生じていることを発見した。薬剤排泄ポンプの亢進機序による耐性機序も想定されるた。アゾールと同じ細胞内動態を呈するローダミンを用いて、薬剤耐性トリコスポロン株に接触させたところ、薬剤感受性真菌に比べ、耐性真菌ではローダミンの濃度が低いことが判明した。これにより、トリコスポロンのような担子菌においても、カンジダと同様に、薬剤排泄ポンプの亢進が、薬剤耐性機序に関与していることが推測された。また、トリコスポロンは生体内に留置する医療デバイス(血管留置カテーテル、尿道留置カテーテル)の表面に、バイオフィルを形成することを明らかにした。バイオフィルムを形成したトリコスポロン株は浮遊菌に比べ、複数のアゾール系抗真菌薬や、ポリエン系抗真菌薬に対して、薬剤感受性が低下することを明らかにした。臨床では、トリコスポロンによるカテーテル感染や尿路持続感染を経験するが、これらの現象には真菌のバイオフィルム化が関与している可能性が示された。Trichosporon属の薬剤耐性機序はCandida属やAspergillus属と比較し十分に解明されていない。前年度までに、in vitroでT. asahiiと高濃度のフルコナゾールを長期間接触することで同薬剤に対するMIC値が16倍以上上昇することを確認し、高度耐性を獲得する過程を示した。さらに、T. asahiiのアゾール標的酵素であるlanosterol14-α-demethylase (ERG11)の遺伝子配列を決定し、in vitroで作成したフルコナゾール高度耐性株のERG11にアミノ酸単一置換(G435R)が生じていることを報告した。最終年度では、今回発見されたアミノ酸の単一変換が、真菌の薬剤薬耐性に関与しているか、クローニングした遺伝子の機能解析を行うことにより、明らかにした。すなわち、野生株T. asahii OU 239 (血液由来)と、G453Rの変異株それぞれのERG11をpAUR123ベクターに導入した。これらをSaccharomyces cerevisiaeにtransformationし、最少培地を用いてhaploid formationを行って、PCR法でhaploidscreeningを行った。この株を利用して、フルコナゾールとイトラコナゾールに対する最小発育阻止濃度を測定し、その値に差があるかを検討した。

その結果、野生株のERG11を導入したSaccharomycesに比べ、G453Rの変異株のERG11を導入したSaccharomycesでは、アゾール系薬に対する最小発育阻止濃度が有意に上昇していることが明らかになった。これによって、ERG11 (G453R)変異は、真菌の耐性化に寄与していることが明らかになった。この薬剤耐性変異は、接触する抗真菌薬により誘導されるという一連の事象が解明された。医歯薬学トリコスポロンに対する薬剤耐性の機序として、バイオフィルム形成や、アゾール系薬の標的蛋白であるERG11の点変異であることなど、トリコスポロンの薬剤耐性の機序を明らかにすることができた。また、抗真菌薬以外の物質(EDTA)が、抗バイオフィルム作用や、抗真菌作用があることも明らかにした。トリコスポロンに対する薬剤耐性機序を段階的に解明することができている。トリコスポロンのバイオフィルム形成能と薬剤耐性化現象を示すデータを得ることができた。生体内においても抗真菌薬が接触することでERG11の点変異が生じるのか、生体内おけるEDTAの抗トリコスポロン作用と毒性について、マウスを用いた播種性感染モデルで検討を行う予定である。研究者らが発見した14DMのアミノ酸変異が、普遍的に薬剤耐性に関与するのか、一般に真菌での形質転換に用いられるSaccharomycesで形質転換し、薬剤耐性化現象が起きるかどうかを明らかにする。耐性機序に薬剤排泄ポンプの亢進の関与を明らかにするために、ラジオアイソトープ標識したアソール抗真菌薬を用いたトリコスポロンの菌体内へ取り込み、排泄実験を行なう。キレート剤やマクロライドなど、一般細菌でみられるバイオフィルム形成抑制物質が、トリコスポロンのバイオフィルム形成抑制にも働くか研究する。ラジオアイソトープ標識した抗真菌薬を用い薬剤排泄ポンプの関与を検討する予定であったが、予備実験において、コントロール株と耐性株では、薬剤の取り込みや排泄に差が認められなかったため、ラジオアイソトープの購入を見合わせた。薬剤耐性機序には、薬剤排泄ポンプの意義は明らかにならなかったが、薬剤標的タンパクの点変異が関与していることが明らかになったため、次年度には、標的タンパクの解析に充てることにしたい。主に、14DM変異遺伝子の形質転換による耐性化の確認と、薬剤排泄ポンプの解明を行なう。形質転換に必要なSaccharomycesやプラスミドの準備を次年度早々に行なう予定である。