hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パルサー法による温泉水中のレジオネラ属菌の検出に対する検討

温泉施設において,温泉水に生息するレジオネラ属菌をパルサー(PALSAR)法で測定するためには,レジオネラ属菌の回収方法が重要であると考えられる.そこで泉質の異なる14源泉を採取し,Legionella pneumopnila philadelphia-1(Lp01), L.pneumopnila Lp01, L.pneumophilaSuzukiの3種類のL.pneumophilaをそれぞれ一定量添加した後,レジオネラ属菌の回収方法である,冷却遠心濃縮法,ろ過濃縮法を用い,その回収率をPALSAR法,培養法およびReal-time PCR法によって評価した.その結果,1)ろ過濃縮法による回収では,ろ紙表面を綿棒で拭う方法に比べ,滅菌水にろ紙をカットおよびカットしないで入れた方法では共に回収率は大きく向上した.2)冷却遠心濃縮法による回収率は,ろ過濃縮法に比べ大きく劣っていた.3)実際の温泉からの検出では,冷却遠心濃縮法でも相応の菌数が検出できていた.このことは,レジオネラ属菌がアメーバあるいは粒子に付着し,沈殿しやすい状況にあるためと推察された.4)3種類のL.pneumophilaにおいてPALSAR法に関しては,ろ過濃縮法および冷却遠心濃縮法で大きな差は認められなかったが,培養法ではLp01が,Real-time PCR法ではL.pneumophila suzukiが,ろ過濃縮法で高い回収率を示した.PALSAR法に対する泉質の影響について検討を行った.その結果,PALSAR法による回収率は培養法にほぼ近似していた.しかし,硫化水素による硫黄の沈殿および炭酸カルシウムの沈殿を含む温泉では,PALSAR法は培養法に比べて低い回収率を示した.このことは,これらの沈殿がPALSAR法のプローブに影響していることが示唆された.レジオネラ属菌の16SrRNAを短時間で検出できるパルサー(PALSAR)法に着目し,各種消毒薬・抗菌薬で処理した培養サンプル及び温泉水を用いて、Real-time PCR法(TaqMan-PCR法)、培養法およびATP法と比較し、PALSAR法の有効性について検討した。次亜塩素酸ナトリウム処理による効果判定では、L.pneumophilaを添加した蒸留水に次亜塩素酸ナトリウムを一定量添加し、室温で1時間放置した後、PALSAR法、培養法及びRealtime-PCR法を用いてレジオネラ属菌の検出を行なった。PALSAR法は温泉水の消毒で推奨されている0.20.4ppmの処理濃度では、レジオネラ属由来のrRNAはまったく検出されなかった。一方、PCR法では、使用した全ての濃度において陽性を示した。培養法では、PALSAR法と同様に、0.20.4ppmの濃度において、菌の増殖は認められなかった。このことからPALSAR法は消毒薬の効果判定に有効である可能性が示唆された。銀イオン処理による効果判定では、PALSAR法の成績は培養法とATP法の成績と相関は認められなかった。レジオネラ属に対して作用メカニズムの異なる5種類の抗菌薬を用い、8MIC,1MIC,1/8MICの薬剤濃度での抗菌作用では、PALSAR法はいずれの抗菌剤に対しても、培養法、ATP法と同様に、抗菌剤の薬剤濃度に依存して発光強度の減少傾向を示したことから、生存・増殖しているレジオネラ属に対する抗菌効果を濃度依存的に反映していることが示唆された。温泉サンプルについては、滅菌した温泉サンプルを陰性対照として、PALSAR法でレジオネラ属を検出した結果、温泉サンプルの8検体中全ての検体で培養法と一致する判定結果が得られた。温泉施設において,温泉水に生息するレジオネラ属菌をパルサー(PALSAR)法で測定するためには,レジオネラ属菌の回収方法が重要であると考えられる.そこで泉質の異なる14源泉を採取し,Legionella pneumopnila philadelphia-1(Lp01), L.pneumopnila Lp01, L.pneumophilaSuzukiの3種類のL.pneumophilaをそれぞれ一定量添加した後,レジオネラ属菌の回収方法である,冷却遠心濃縮法,ろ過濃縮法を用い,その回収率をPALSAR法,培養法およびReal-time PCR法によって評価した.その結果,1)ろ過濃縮法による回収では,ろ紙表面を綿棒で拭う方法に比べ,滅菌水にろ紙をカットおよびカットしないで入れた方法では共に回収率は大きく向上した.2)冷却遠心濃縮法による回収率は,ろ過濃縮法に比べ大きく劣っていた.3)実際の温泉からの検出では,冷却遠心濃縮法でも相応の菌数が検出できていた.このことは,レジオネラ属菌がアメーバあるいは粒子に付着し,沈殿しやすい状況にあるためと推察された.4)3種類のL.pneumophilaにおいてPALSAR法に関しては,ろ過濃縮法および冷却遠心濃縮法で大きな差は認められなかったが,培養法ではLp01が,Real-time PCR法ではL.pneumophila suzukiが,ろ過濃縮法で高い回収率を示した.PALSAR法に対する泉質の影響について検討を行った.その結果,PALSAR法による回収率は培養法にほぼ近似していた.しかし,硫化水素による硫黄の沈殿および炭酸カルシウムの沈殿を含む温泉では,PALSAR法は培養法に比べて低い回収率を示した.このことは,これらの沈殿がPALSAR法のプローブに影響していることが示唆された.
子どもの体温リズムの実態と生活習慣関連因子との関わり

本研究では、比較的安価な温度ロガーを用いて、日常生活の支障とならない末梢(手首)の皮膚温を測定することで、児童の生活リズムの評価を試みた。1日の変動は、就床前後にすみやかに上昇し、就寝中に高く、起床後すみやかに低下した。温度ロガーによる起床・就床時刻の算出結果と、行動ロガーによる算出結果に高い相関がみられた。児童を対象とした簡便で安価な生活リズム評価システムを構築できる可能性を示した。近年、子どもの生活習慣は大きく変化し、生活リズムの乱れが指摘されている。生活リズムの評価の方法として、自己申告による起床・就床時刻の調査は行われているものの客観性に欠ける面がある。また行動ロガーによる睡眠リズムの調査は高価な装置を必要とし、大規模調査が困難である。そこで本研究では、比較的安価な温度ロガーを用いて、また日常生活の支障とならない末梢(手首)の皮膚温を測定することで、児童の生活リズムの評価を試みた。またアンケートによる生活習慣の調査を行い、リズムと実態の関係性について調査した。A小学校5・6年生児童32名(男16名、女16名)を対象とした。温度および加速度ロガーを取り付けたリストバンドを装着し、10日間のデータ収集を実施した。温度ロガーによる手首皮膚温の1日の変動は、すべての被験者において単相矩形波を示した。就床前後にすみやかに上昇し、就寝中に高く(33°C)、起床後すみやかに低下した(28°C)。日中の変動は±2°C以内であった。温度情報より得られた睡眠覚醒リズムの安定性を求め、同児童に対して行った食習慣や運動習慣に関するアンケート調査の結果との関連を解析した。しかし、両者に有意な相関は認められなかった。本研究から、温度ロガーによる末梢皮膚温の連続測定により、児童を対象とした簡便で安価な生活リズム評価システムを構築できる可能性を示した。今後、生活リズムを改善する取り組みにおいて、客観的な指標として利用されることが期待される。体温リズムの測定には、リストバンドを用い、その中に温度および加速度センサー・ロガーを入れ計測する方法を用いた。子どもの生活リズムとして重要となる睡眠/覚醒リズムを反映させるため、末梢の皮膚温を指標とすることが最も実用的かつ正確であると考えた。適正なリストバンドの作成、温度・加速度センサーの保護など、「リストバンド皮膚温計」のデバイスの確立に半年間費やし、11月から小学校へ研究実施の説明および募集を行った。1月から2月にかけて、計34名の児童を対象として、10日間リストバンド皮膚温計を付けて、学校および家庭生活を送ってもらった。開始を月曜日からとし、土曜日・日曜日の休日をはさみ、翌週の水曜日に回収した。その間、日誌を配布し、特別な運動やイベントなどとともに、保護者の協力を得ながら起床時刻と就床時刻の記録を続けてもらった。34名中、3名の児童は途中で痒みなどを感じ、リストバンドを外し測定を中断した。それ以外の児童については、付け忘れなどの期間が3日以上続いた場合と、土曜日・日曜日のいずれかの日に付け忘れ測定ができていない場合には、データ解析から外す対象とし、1名が該当した。したがって、30名分のデータの解析を行った。現在のところ、個人データのまとめを終えたところであり、24時間の皮膚温の推移を10日間の平均で算出し、皮膚温が急上昇する時刻とその後急降下する時刻を、それぞれ就床時刻および起床時刻と仮定し、その結果については、各児童にフィードバックした。今後、加速度データとの関連および生活習慣アンケートとの関連から、生活リズムとの関連因子を算出する。測定方法の変更はあったものの、小学生のデータについて1年目で収集し終えている。昨年度のデータから当初の計画通り、リストバンド皮膚温計による生活リズムの測定についての方法論に関する論文を執筆する。また小学生を対象としたリストバンド皮膚温計によるデータ収集を進めるとともに、中学生を対象としたデータを新たに取得する。デバイスについては概ね購入済であるが、故障の可能性は常に考えられるため、測定前に予めチェックをしながら、追加の購入を検討する。募集やフィードバックが昨年以上に多くなるため、印刷代・書類関連の費用を確保しておく。
ムチン遺伝子発現にみられる角膜上皮分化機転と結膜杯細胞の関与に関する研究

角膜上皮は非角化重層扁平上皮からなり、涙液と接しながら外界に対するバリアー機能を果たすと同時に角膜の透明性を維持しながら光学的な屈折力を生み出している。角膜上皮の恒常性は、細胞増殖、細胞分化、アポトーシスなどのバランスにより維持されているが、増殖面においてはstem cellや基底細胞が、また機能面においてはterminal differentiateした表層細胞が特に重要な役割を担っている。最表層細胞には膜結合型ムチンMUCIが発現し涙液の安定化に寄与している。今回我々は角膜表層に存在するムチン(H185抗原)をニトロセルロース膜にて除去し、局所での涙液被覆状態の変化を観察した。正常涙液状態では変化がないもののドライアイ状態では局所の涙液は不安定化しnon-invasive breakupが出現し、臨床的にみられるpatchy type SPKの形成メカニズムの主原因であることを報告した。また可溶性ムチンであるMUC7については角膜上皮より抽出したRNAを使用しMUC7に特異的なプライマリーによりRT-PCR法により増幅が認められた。抗MUC7抗体を用いた免疫学的検索では涙液、上皮蛋白からはMUC7蛋白は検出できなかった。以上の結果より少なくとも可溶性ムチンであるMUC7は遺伝子レベルでは角膜上皮での発現が証明できた。さらに角膜、結膜上皮の分化機転の検索を目的としたin vitroのシステムを確立するため羊膜をculture bedとした培養システムを確立した。羊膜上に角膜上皮を3T3fibroblastとco-cultureすることにより増殖、分化を促進することができた。形態的にも正常に近い細胞接着装置の発現が観察され、免疫学的にも角膜上皮特異的なマーカーであるケラチン3、12の発現を誘導することができた。今後、角膜移植のための培養角膜上皮シートとして、また今研究の目的である上皮の分化機転を解明していく上で有用なモデルとして期待できる。
1回のトレーニングセッションによる筋の一過性の応答と長期的効果の関連

本研究は、レジスタンストレーニングの1セッション(1日分)後に観察される一過性の応答と、そのトレーニングセッションを長期的に継続した際の効果との関連を明らかにすることを目的とした。単関節動作(実験1)および多関節動作(実験2)を対象とした一連の実験の結果、1回のトレーニングセッションにおける筋活動の部位差は、長期(3ヶ月程度)のトレーニングによる筋肥大の部位差に対応することが示された。レジスタンストレーニングの1セッション(1日分)のように激しい運動を行うと、血中乳酸濃度、ホルモン濃度、Magnetic Resonance Imaging (MRI)法により求められる横緩和時間(T2)の変化や腫脹など一過性の応答が観察される。これらの一過性の応答が習慣的に繰り返されることで生体に適応が起こり、長期のトレーニング効果として表れることを考慮すると、1回のトレーニングセッションが引き起こす一過性の応答は、トレーニングによる長期的変化と関連が深いと推測される。本研究では、トレーニングセッション直後に観察される筋の一過性の応答に着目し、それらとトレーニングセッションを長期的に繰り返した際の効果との関連を明らかにすることを目的とした。平成21年度は1回のトレーニングセッションによるT2値の変化および腫脹(筋断面積の増加)について、特に単一筋内の部位差に着目して実験を行った。成人男性12名に肘伸展筋群を対象としたレジスタンストレーニングを1セッション行わせた。被験者は、仰向けで肩関節90度屈曲位での肘関節伸展・屈曲運動を行った。1回最大挙上重量の80%に相当する重量のダンベルを用いて、上記運動の8回の反復を1セットとし、5セット行わせた。トレーニングセッションの前と直後に,MRI法を用いて上腕のT2強調画像を撮影し、上腕三頭筋のT2値および筋断面積を計測した。その結果、T2値の変化および筋断面積の変化率は遠位(肘に近い部位)に比べて近位(肩に近い部位)でより大きかった。この結果は、レジスタンストレーニングを行った直後の筋の一過性の応答は、同一筋内であっても部位によって異なることを示唆するものであった。平成22年度は、1回のトレーニングセッションによる主働筋の横緩和時間(T2)変化の部位差と、長期トレーニングによる筋肥大の部位差との関連を検討した。成人男性12名に上肢筋群を対象とした多関節動作によるレジスタンストレーニングを、週3回の頻度で12週間行わせた。トレーニング動作は「ダンベルプレス」と同様の動作で、仰向けで腋の真上に持ったダンベルを、垂直に上下動させるものであった。この運動の1回最大挙上重量を測定し、その80%に相当する負荷で、8回の反復を1セットとし、5セット行わせた。第1回目のトレーニングセッション前後に、MRI法を用いて上腕のT2強調画像を撮影し、上腕三頭筋のT2値を計測した。また、12週間のトレーニング期間前後に、MRI法により上腕のT1強調画像を撮影し、上腕三頭筋の筋断面積を計測した。その結果、1回のトレーニングセッションによるT2値の変化は、上腕三頭筋の近位(肩に近い部位)に比べて中位から遠位(肘に近い部位)で大きかった。同様に、12週間のトレーニングによる筋断面積の増加率は、上腕三頭筋の近位に比べて中位から遠位で高かった。この結果は、一過性のT2変化の部位差が長期トレーニングによる筋肥大の部位差と関連が深いことを示唆するものであった。また、本研究で用いた手法を応用することにより、長期トレーニングによる筋の肥大パターンを、一過性のT2変化から予測できる可能性が示された。
フグ毒(TTX)産生細菌に関する研究-毒産生の最適化と産生機構の解明

昨年度は、数種のテトロドトキシン(TTX)産生細菌を対象に、培養条件について若干の検討を加え、いずれも低塩分(1%以下)、低pH(56)、高温度(2528°C)で比較的安定したTTX産生を示すこと、培養液に有毒コモンフグ、あるいは無毒養殖トラフグの組織片(腸管、肝臓、卵巣等)を添加して培養すると、培地1ml当たり最高4.8MUに達するTTX量の顕著な増加が認められる場合もあること、などを明らかにした。本年度も引き続き、培地への組織片添加実験を行ってきたが、十分なデータが得られる前に、研究分担者の外国人特別研究員採用期間が終了した。現在、研究分担者は、母国において実験を継続するとともに、日本で得たデータのとりまとめとその解析を実施中である。一方、腸内細菌がTTXを産生することが知られているTTX保有生物の一種、カブトガニCarcinoscorpius rotundicaudaのカンボジア産個体について、TTX産生菌の分離に先立ち、毒性と毒組成を調査した。その結果、供試した20個体は、乾期/雨期にかかわらず、いずれも有毒で、最高毒性値は315MU/gに達した。高毒性の1個体は、肝膵臓と卵の毒性が高かったが、他の個体では、部位による毒性の差は比較的少なかった。LC/MS分析により、毒の主成分はTTXと同定された。研究分担者は、これまでに中国産フグ類を対象として、分類、生態、ないし毒性学的研究を行ってきたが、その過程で、有毒種の内臓から強力なフグ毒テトロドトキシン(TTX)産生能を有する細菌を分離することに成功した。本研究では、この成果に基づき、まずTTX産生細菌について至適毒産生条件の構築を目指す。研究分担者は、平成16年8月14日の来日以来、実験機材や試薬類などの準備を整えるとともに、TTXの生合成経路の解明、TTX産生遺伝子のクローニングなども視野に入れ、関連文献の検索を行ってきた。加えて、既に分離しているTTX産生細菌につき、当研究室における継代培養を確立後、中規模培養を行ってTTX産生能を再確認した。一方、種々の生物から細菌を分離し、TTX産生能のスクリーニングを行った。フグ毒保有生物としては、長崎県産のコモンフグ、ヒガンフグ、ニホンイモリ、および沖縄県産のツムギハゼ、ウモレオウギガニを、無毒生物として長崎県産の養殖トラフグ、ベラ、メゴチ、ヒメダカを用いた。各生物の体表または腸管から計30菌株を分離し、各々ORI培地を用いて、室温で7日間培養した。このうち22菌株の培養液(菌体を含む)については、超音波処理後、酢酸を添加して加熱し、0.45μmのフィルターで濾過した上、LC/MS分析に供した。残り8菌株の培養液については、同様に超音波処理後、活性炭処理に付し、得られたTTX画分をTTX-ELISAに供した。その結果、LC/MS分析では、供試した22菌株中ヒガンフグ腸管由来の1菌株から、培地1ml当たりΦ1MUに相当する量のTTXが検出された。一方、TTX-ELISAでは、供試した8菌株(コモンフグ、イモリ、ハゼ、カニ、トラフグの体表由来それぞれ2、1、2、1、2菌株)すべてから、培地1ml当たり2.1×10^<-3>3.4×10^<-3>MUに相当するごく微量のTTXが検出された。昨年度は、研究分担者が既に分離しているフグ毒(TTX)産生細菌につき、当研究室における継代培養を確立後、中規模培養を行ってTTX産生能を再確認するとともに、種々のフグ毒保有生物から細菌を分離し、TTX産生能のスクリーニングを行った。その結果、LC/MS分析において、ヒガンフグ腸管由来の1菌株から培地1ml当たり0.1MUに相当する量のTTXが、またTTX-ELISAにおいて、トラフグ、コモンフグ、ツムギハゼ、ウモレオウギガニおよびニホンイモリの体表由来8菌株から培地1ml当たり2.1×10^<-3>3.4×10^<-3>MUに相当するTTXが検出された。しかしながら、これらの細菌のTTX産生量が非常に微量であったため、本年度は、まず培養条件について若干の検討を加えてみたところ、低塩分(1%以下)、低pH(5^-6)、高温度(2528°C)で比較的安定したTTX産生が認められた。次いで、培養液に有毒コモンフグ、あるいは無毒養殖トラフグの組織片(腸管、肝臓、卵巣等)を添加して培養したところ、コモンフグの腸管および卵巣を添加したもので、培地1ml当たり最高4.8MUに達するTTX量の顕著な増加が認められた。一方、フグの毒化機構に関連して、香港北東部のMirs湾に共存する海産フグ4種、すなわちオキナワフグ、サザナミフグ、シロサバフグおよびコモンダマシの食性について若干の検討を加えた。その結果、いずれの種においても消化管の形態〔相対腸管長(RIL)およびZihler指数(ZI)〕から推定した食性と消化管の内容物組成はよく一致しており、それらからオキナワフグは肉食性、他の3種は雑食性と判断された。

昨年度は、数種のテトロドトキシン(TTX)産生細菌を対象に、培養条件について若干の検討を加え、いずれも低塩分(1%以下)、低pH(56)、高温度(2528°C)で比較的安定したTTX産生を示すこと、培養液に有毒コモンフグ、あるいは無毒養殖トラフグの組織片(腸管、肝臓、卵巣等)を添加して培養すると、培地1ml当たり最高4.8MUに達するTTX量の顕著な増加が認められる場合もあること、などを明らかにした。本年度も引き続き、培地への組織片添加実験を行ってきたが、十分なデータが得られる前に、研究分担者の外国人特別研究員採用期間が終了した。現在、研究分担者は、母国において実験を継続するとともに、日本で得たデータのとりまとめとその解析を実施中である。一方、腸内細菌がTTXを産生することが知られているTTX保有生物の一種、カブトガニCarcinoscorpius rotundicaudaのカンボジア産個体について、TTX産生菌の分離に先立ち、毒性と毒組成を調査した。その結果、供試した20個体は、乾期/雨期にかかわらず、いずれも有毒で、最高毒性値は315MU/gに達した。高毒性の1個体は、肝膵臓と卵の毒性が高かったが、他の個体では、部位による毒性の差は比較的少なかった。LC/MS分析により、毒の主成分はTTXと同定された。
歯肉溝滲出液中の好中球機能の歯周病の診断マーカーとしての応用に関する研究

研究期間の3年間を通じて、歯周組織が健康な被験者および歯周病患者を対象に、末梢血、唾液、歯肉溝滲出液より好中球を分離し、それぞれの環境における各種の好中球機能変化に関する検索を行い、好中球の機能変化が診断マーカーとして利用可能かどうかを検索した。初年度は好中球のおかれる環境が正常な状態に関する検索をとおして手技の確立を行い、2年目から最終年度にかけて、好中球周囲環境が病的状態におかれた場合を想定して周囲環境を様々に変化させたものと、歯周病患者から採取した好中球の機能変化を、Flow Cytometry Cytoenzymology、共焦点レーザー顕微鏡観察などの手法で検索した。なお、資料提供を得た被験者とは十分なインフォームドコンセントを確立し、協力を得た。その結果、健常な状態と比較して、周囲環境の変化に伴い、唾液、歯肉溝滲出液中の好中球の食作用、アポトーシスの発現頻度、細胞内のエラスターゼ、コラゲナーゼ、カテプシンなどの酵素活性や活性酸素産生能に変化が見られた。以上のことから、歯肉溝中または唾液中の好中球の機能変化が歯周病の重篤度を示すパラメーターとなり、歯周病診断応用への可能性が高く、歯周病患者のスクリーニングなどに有用であるということが示唆された。近年、試薬として各血液細胞の構成成分に対する様々なマーカーが提供されるようになり、計量細胞学的な解析機器の進歩とともに、微細な細胞の変化が探知可能となってきた。本年度は、歯周組織中の末梢血管より歯肉上皮を通過し、場合によっては歯周病の病原因子と出会いながら歯肉溝、そして口腔内へ移動してくる好中球(歯肉溝滲出液中の好中球)などを採取、その機能の変化から局所の病態に関する各種の情報を比較的簡便に引き出す手技の確立と、実際に細胞に生じる様々な現象の検索を目的とした。まず、歯周組織が健康な被験者で、末梢血、唾液、歯肉溝滲出液中好中球の機能の検索を行い、これらの結果を、対照値すなわち正常値として把握するとともに、様々な刺激を加えた後の状態と比較検討した。すなわち、全身疾患を伴わず歯周病を有さない被験者より末梢血、歯肉溝滲出液、唾液中より好中球を分離採取し、炎症のメディエーター(LPS、TNFαなど)やタバコの煙の中に含まれる、ニコチンやコチニンなどによる刺激後に、細胞内酵素活性をCytoenzymologyの技術により個々の細胞レベルで検索した。また、各細胞のアポトーシスの発現状態をAnnexin V FITC Kitで、各種表面レセプターの変化をFlow cytometryにて検索した。その結果、各炎症のメディエーター刺激に対する各細胞集団の反応に特有の傾向がみられ、特に歯肉溝滲出液中の好中球は、歯周組織中の様々な情報を移動中に有し、他の部位から分離された好中球と異なる応答を示すことが示唆された。本年度は、前年度に引き続いて,歯肉溝滲出液(GCF)中の好中球を採取,その機能の変化から局所の病態に関する各種の情報を比較的簡便に引き出す手技の確立と,実際に細胞に生じる様々な現象の検索を行った。まず全身疾患を伴わない歯周病を有さない被験者より,末梢血,GCF,唾液中好中球を分離採取し,様々な条件下で刺激した後の各好中球内の酵素活性を検索した。すなわち各好中球群を,PBS,PMA,FMLP,唾液,熱処理唾液にて37°Cで30分間インキュベート後に,各群の細胞内エラスターゼ,コラゲナーゼ,カテプシン活性をCell ProbeTMを使用して蛍光染色した。その後に,フローサイトメーターにて平均蛍光強度を計測後,統計解析を行った(Cytoenzymologyの手技の確立)。さらに炎症メディエーター(LPS、TNFαなど)やタバコの煙の中に含まれる,ニコチンやコチニンなどの刺激後の細胞内酵素活性変化も解析した。その結果,無刺激の状態では,末梢血好中球の各酵素活性はGCF,唾液内のものより低いこと,炎症メディエーターやタバコの煙の中の物質にさらされると,その活性が上昇することが示された。

また,GCFや唾液中の好中球は最初から酵素活性は高いが,刺激による反応は鈍い傾向にあった。よって現在試みているCytoenzymologyは,好中球内の酵素活性を簡便に測定可能で,このことは歯周組織に加わっている様々な侵襲の強さを,好中球の酵素活性変化を通して探知可能であることが示された。このことは好中球内の酵素活性を診断マーカーと考え,それをもとに診断システムを確立する上で,重要な要素になると考えられた。昨年度までは歯周組織が健康な被験者の末梢血、唾液、歯肉溝滲出液中好中球機能の検索を行い、実験手技の確立を行うとともに、これらの結果をコントロール、すなわち正常値として規定する仕事を進めてきたが、本年度は病的な状態における好中球機能変化に関する検索を行った。すなわち、前年度は好中球のおかれる環境が健常な状態に関して検索したのに対して、本年度は好中球周囲の環境が病的状態におかれた場合を想定して様々に周囲環境を変化させ、その後の変化をFlow Cytometry, Cytoenzymology,共焦点レーザー顕微鏡観察などの手法で検索した。なお、資料提供を得た被験者とは十分なインフォームドコンセントを確立し、協力を得た。その結果、周囲環境の変化に伴って、唾液、歯肉溝滲出液中の好中球の食作用、アポトーシスの発現頻度、細胞内のエラスターゼ、コラゲナーゼ、カテプシンなどの酵素活性や活性酸素産生能に変化が見られた。以上のことから、歯肉溝中または唾液中の好中球の機能変化が歯周病の重篤度を示すパラメーターとなり得ることが示され、歯周病診断応用への可能性が高いことが示唆された。
イヌ乳癌細胞の転移過程におけるマトリックス・メタロプロテイネース発現機構の解析

昨年までに、イヌ乳がん由来細胞株のSCIDマウスへの移植実験により作成した肺転移モデルを用いて、原発巣と肺転移巣におけるMMP-2およびMMP-9の発現動態を解析した。その結果、肺転移巣において、原発巣では検出されないMMP-9の大量発現が起きていることを確認した。このことから、肺転移巣形成にはこのがん細胞のMMP-9発現能獲得が重要であると考えられた。さらに、このがん細胞の単層培養系およびコラーゲン・ゲル内培養系でのMMP-9発現を比較したところ、単層培養系ではMMP-9発現は全く観察されないにもかかわらず、コラーゲン・ゲル内培養を行うことによりその強い発現を確認した。この結果は、このがん細胞が肺転移過程においてコラーゲンと相互作用を行うことによりMMP-9発現能を獲得していることを意味している。本年度は、このがん細胞のMMP-9発現のメカニズムについて、コラーゲン・ゲル内培養系を用いることにより、がん細胞のコラーゲン認識機構とMMP-9発現との相関関係に関与するシグナル伝達系の解明を試みた。その結果、以下の点について新たな知見を得た。(1)本研究で用いたイヌ乳がん由来細胞株においては、コラーゲン・ゲル内培養下でα2インテグリンを発現することがMMP-9発現と関連していると考察され、このことは抗α2インテグリン抗体存在下でゲル内培養を行うことでMMP-9発現が抑制される、という結果から証明された。(2)種々のシグナル伝達系の阻害剤をコラーゲン・ゲル内培養系に添加することにより、MMP-9発現を抑制する阻害剤を検索したところ、コラーゲン・ゲル内におけるMMP-9発現にはチロシンキナーセ、PI3キナーゼおよびプロテインキナーゼCの関与が明らかになり、MAPキナーゼカスケードとは無関係であることが分かった。また、MMP-9発現と細胞によるコラーゲンゲル収縮との間に明らかな相関が見られたことから、アクチンの重合がMMP-9発現へ影響を及ぼしていることが推察された。イヌ乳腺由来骨肉腫様細胞(OS細胞)は単層培養系ではMMP-2のみを発現する培養系細胞であるが、I型コラーゲンを用いたコラーゲン・ゲル内培養系ではMMP-9の発現が見られる。このOS細胞はコラーゲンとの接触によりMMP-9を発現するものと考えられたため、この細胞-マトリックス相関におけるMMP-9発現のシグナル伝達系について解析した。OS細胞を1x105/mlとなるように0.15% I型コラーゲン・ゲル内に包埋し、Genistein、RO31-7549、PD98059、LY294002などのkinase inhibitor、Cytochalasin Dおよびintegrinに対する抗体などの存在下、無血清培地中で一定期間培養を行った。この培養後の上清についてゼラチン・ザイモグラフィーを行い、MMP-9の発現変化を解析した。対照培養系では培養後1日目より、コラーゲン・ゲルはgel contractionを開始するとともに、MMP-9発現が観察された。一方、種々のinhibitor添加群ではGenistein、LY294002、Cytochalasin D、或いは、integrin α2およびα6/β1に対する抗体を添加することによりMMP-9の発現低下が観察された。

この結果より、コラーゲン・ゲル内培養におけるMMP-9発現には、ある種類のintegrin、tyrosine kinase、phosphatidylinositol 3-kinase(PI3 kinase)およびactinの重合が関与していることが示されたが、MAP kinase、protein kinase Cとの関連は見られなかった。なお、抗integrin α2抗体添加系では明瞭なgel contractionを起こしたにも関わらずMMP-9発現が抑制されたことから、gel contractionはMMP-9発現に必須の現象ではないと考えられた。以上のことから、OS細胞はintegrin-FAN(focal adhesion kinase)系を介してコラーゲンを認識することにより、MMP-9を発現する可能性がある。今後、integrin分子種の同定やより詳細なシグナル伝達系について解析する予定である。昨年までに、イヌ乳がん由来細胞株のSCIDマウスヘの移植実験により作成した肺転移モデルを用いて、原発巣と肺転移巣におけるMMP-2およびMMP-9の発現動態を解析した。その結果、肺転移巣において、原発巣では検出されないMMP-9の大量発現が起きていることを確認した。このことから、肺転移巣形成にはこのがん細胞のMMP-9発現能獲得が重要であると考えられた。さらに、このがん細胞の単層培養系およびコラーゲン・ゲル内培養系でのMMP-9発現を比較したところ、単層培養系ではMMP-9発現は全く観察されないにもかかわらず、コラーゲン・ゲル内培養を行うことによりその強い発現を確認した。この結果は、このがん細胞が肺転移過程においてコラーゲンと相互作用を行うことによりMMP-9発現能を獲得していることを意味している。本年度は、このがん細胞のMMP-9発現のメカニズムについて、コラーゲン・ゲル内培養系を用いることにより、がん細胞のコラーゲン認識機構とMMP-9発現との相関関係に関与するシグナル伝達系の解明を試みた。その結果、以下の点について新たな知見を得た。(1)本研究で用いたイヌ乳がん由来細胞株においては、コラーゲン・ゲル内培養下でα2インテグリンを発現することがMMP-9発現と関連していると考察され、このことは抗α2インテグリン抗体存在下でゲル内培養を行うことでMMP-9発現が抑制される、という結果から証明された。(2)種々のシグナル伝達系の阻害剤をコラーゲン・ゲル内培養系に添加することにより、MMP-9発現を抑制する阻害剤を検索したところ、コラーゲン・ゲル内におけるMMP-9発現にはチロシンキナーセ、PI 3キナーゼおよびプロテインキナーゼCの関与が明らかになり、MAPキナーゼカスケードとは無関係であることが分かった。また、MMP-9発現と細胞によるコラーゲンゲル収縮との間に明らかな相関が見られたことから、アクチンの重合がMMP-9発現へ影響を及ぼしていることが推察された。
20世紀オーストリアにおける地域社会の変動と国民意識の再編

従来、ハプスブルク帝国の崩壊からドイツ第三帝国への編入に至る20世紀前半の歴史的経験から、オーストリア国民意識の形成については、ドイツからの自立の側面が強調されてきた。本研究では、「国民に対する無関心」など、新しい研究動向を考慮に入れながら、オーストリア国民意識を支えるべき地域社会が必ずしも国民意識の形成に寄与していないことを明らかにした。本年度は研究計画の初年度として、研究史と研究視角の相互共有を図り、研究会を四回にわたって開催した。第一回は、科研参加者全員がそれぞれコンセプトペーパーによる構想報告を行い、相互批判を通じて問題意識を共有した。第二回は、米国を中心とするNationalIndifference論の研究動向、ナチズムや第二次世界大戦についてのオーストリアの記憶論、オーストリア・ハンガリー境界領域について最新の研究成果および現地調査の結果を検討した。第三回は、研究代表者がブルゲンラント・西ハンガリーという歴史的地域にアプローチするための多様な論点と研究方法について報告し、それをもとに地域形成のオーストリア内比較史について議論した。第四回は、地域史を扱う手法についてオーストリア史以外の研究者から報告を得て、比較史の観点の有効性を検証した。現地調査としては、オーストリアのウィーン、ハンガリーのショプロンといった都市の重層性の調査、クロアチアからブルゲンラントを経てスロヴァキアに至る「クロアチア人ディアスポラ」の存在形態調査を行った。これらの現地調査については、適宜研究会で報告し、研究分担者間で成果の共有を進めている。さらに、科研参加者間の史学史、文献情報、文書館・図書館・歴史系博物館等情報の共通化を実現するために、オーストリア科研ブログを作成した。ブログでは、1年間で約120のエントリを掲載しており、将来的には、20世紀オーストリア史の研究リソースとして公開ないし出版する予定である。本年度は、3回の研究会を通じて20世紀オーストリアを境界領域から把握する事例として、ブルゲンラント・クロアチア人、南ティロールのラディン人、下シュタイアーマルクのドイツ人とスロヴェニア人の関係、フォアアールベルクの社会編成と結社を取り上げた。同時に、「オーストリア国民」を形成する運動として登山協会の活動に着目すると同時に、第一次世界大戦中の「ドイツ」「オーストリア」「中欧」を総体として把握するために植民地との関係を取り上げた。これによって、しばしば外交史上でオーストリアとハンガリー、オーストリアとイタリア等といった対抗図式で語られることの多かった境界領域について、他のアクターの視点を導入することによって、別個の問題群を解明することが可能となった。国外のフィールド調査においては、ドイツ・オーストリアの文書館における南ティロール問題の史料調査、都市ウィーンの社会空間の調査、ブダペシュト・ショプロンにおける西ハンガリー問題の史料調査、ベルリンにおける「中欧」関係史料調査を行った。国内では、奈良女子大学、大阪市立大学、京都大学に所蔵されている関連文献の調査・収集を行った。これらのフィールド調査によって、問題群を把握するための基礎的な史資料を得ることができたのと同時に、現場に即した問題の連関を把握することができた。西ハンガリー問題はブルゲンラントと連結し、都市ショプロンに根拠を置く研究視角は、オーストリアとハンガリーの国民史の枠組みでは捉えることのできない、都市固有の問題の解明につながる。ウィーン10区ファヴォリーテンの問題は、チェコ系、トルコ系、アフリカ系といった都市周縁の歴史的変遷を把握することに接続する。本年度は、こうした研究視角の刷新につながる論点を抽出することができた。今年度は、3度の総合研究会を開催し、1)平成27年度の研究計画と総括、2)ナショナリズム論としての比較研究の視座の検討、3)地域研究の方法的革新について議論した。地域としては、フォアアールベルク、南ティロール、南シュタイアーマルク、オーストリアアルプスといった多様な地域からオーストリア国民概念を相対化する視点を確立すると同時に、理論的には新自由主義による地域の再編過程および史学史における「国民への無関心」論の展開などを扱った。地域に関する論点では、フォアアールベルクでは、ドイツ、スイス、北イタリアといった周辺地域との関係がウィーンとの関係よりも重要であること、これらが繊維産業と労働という産業構造や市場の再編成と関連していることが明らかとなった。南ティロールでは、ドイツかイタリアか、オーストリアかティロール愛郷主義か、という従来から存在する二項対立の図式を超えて、現代におけるバルカン諸国や北アフリカからの移民労働者の存在を踏まえた新たな視点を獲得する必要性が認識された。南シュタイアーマルクでは、スロヴェニアとの境界領域において、南スラヴ国家建設後のドイツ語系都市における失地回復運動や文化運動の意味を歴史的に検討した。また、オーストリアアルプスの登山協会の運動を通じて、ドイツナショナリズム、オーストリアナショナリズム、登山協会の政治的分化との相互関係が解明された。理論的には、特に近年アメリカ合衆国で展開されている「国民への無関心」論の検討を踏まえ、ナショナリズムに収斂しない、多様な運動や社会の動向を把握する必要が認識された。この観点からは、「オーストリア国民」という枠組みへの無関心という新たな認識方法の可能性について議論した。今年度までに、オーストリア各地域および境界地域の微視的分析については、西のフォアアールベルクから東のブルゲンラント、南はティロールやシュタイアーマルクに至るまで、現地調査を踏まえた実証的な分析を遂行することができた。研究計画では、当初、ウィーン10区ファヴォリーテン、16区オッタクリング等、首都における外国人労働者集住地域の実地研究を行い、時間軸から見て19世紀末からのチェコ系、第二次世界大戦後のトルコ系、現代のアフリカ系オーストリア人の存在状況からオーストリア国民意識の歴史的展開を把握することを予定していた。

しかし、研究代表者の日程上の都合から、現地調査の実施が遅延した。また、これまでの研究から明らかになった論点を総合するには、これまで開催した研究会に加え、あと2回程度の研究会の開催が必要である。特に新自由主義によるオーストリアにおける産業構造の変化、EU内における東方あるいはEU外への産業構造のシフト、労働市場の全面的再編(労働の不定期化、流動化)によるアフリカ系オーストリア人の増大が、従来ドイツとの差異化の中で議論されてきた「オーストリア国民」意識の再編過程にどのような影響を与えているのか、といった重要な論点を探究する必要がある。本年度は、研究計画の最終年度として、研究のとりまとめを行った。そのさい、1.ウィーンを地域ととらえること、2.理論的な総括を行うこと、に留意した。1.では、ウィーンの都市内地域を社会空間の差異から認識することで、20世紀から21世紀にかけて、外国人労働者や移民との日常的な接触・非接触の過程で、「オーストリア国民」意識がどのように変容し、それが都市政治や国政における投票行動などにどの程度反映しているのかを検証した。ハプスブルク帝国期から第一共和国期にかけてチェコ人を中心とする他者が、10区ファヴォリーテン、16区オッタクリングなど特定の空間に集住していたこと、第二共和国期になると、同じ空間にトルコや旧ユーゴスラヴィアからの外国人労働者が集住したこと、1990年代以降になると、アフリカ系住民がやはり同じ空間に集住し、「他者」が重層化して、「オーストリア国民」の定義も重層的なものにならざるをえないこと、などが明らかとなった。2.理論的には、「国民への無関心」論を踏まえ、国民意識がそれとして展開するのではなく、社会的状況によって規定されていること、グローバリゼーションの進行によりグローバル、EUといった上位の概念によって国民概念が規定されるため、グローバルと少数者としての他者を直結させる議論が中心を占めること、等が明らかとなった。国民国家が「国民競争国家」「市場国家」等として再定義されるからこそ、「オーストリア国民」も消滅の過程にあるというよりも、むしろ繰り返し再生産されていくことが明らかとなった。従来、ハプスブルク帝国の崩壊からドイツ第三帝国への編入に至る20世紀前半の歴史的経験から、オーストリア国民意識の形成については、ドイツからの自立の側面が強調されてきた。本研究では、「国民に対する無関心」など、新しい研究動向を考慮に入れながら、オーストリア国民意識を支えるべき地域社会が必ずしも国民意識の形成に寄与していないことを明らかにした。本年度までに、オーストリア各地及びハンガリー、クロアチア、イタリア、ドイツといった隣国との接触領域・境界面におけるフィールド調査を行い、史資料の収集をはじめ重要な成果を挙げることができた。
小惑星における流体存続期間の推定

小惑星は太陽系円盤にて形成した物質が46億年前に集積した天体で,放射壊変や衝突現象によって加熱され化学平衡に近づき,現在に至る年月の中で化学及び物理プロセスを経て多様性を獲得する.小惑星物質の進化における流体の寄与は顕著で,あらゆる炭素質コンドライトに水質変成の痕跡が確認される一方,流体プロセスの継続期間について,定量的に論じるに至らない.本研究は,隕石の解析により流体プロセスの痕跡を求め,初期数百万年に限定することなく,小惑星構成物質が最後に流体と反応した年代を明らかにする.小惑星は太陽系円盤にて形成した物質が46億年前に集積した天体で,放射壊変や衝突現象によって加熱され化学平衡に近づき,現在に至る年月の中で化学及び物理プロセスを経て多様性を獲得する.小惑星物質の進化における流体の寄与は顕著で,あらゆる炭素質コンドライトに水質変成の痕跡が確認される一方,流体プロセスの継続期間について,定量的に論じるに至らない.本研究は,隕石の解析により流体プロセスの痕跡を求め,初期数百万年に限定することなく,小惑星構成物質が最後に流体と反応した年代を明らかにする.
海産動物由来タンパク製毒素の構造と機能

今回,我々は猛毒を有することで知られる刺胞動物群のタンパク質毒素について研究を行い,以下のような成果をあげることができた.強い毒性を有することで知られる立方クラゲ類,ハブクラゲ,アンドンクラゲ,Carybdea alataの3種類からその主要タンパク質毒素を活性を保持したままの単離に成功した.また,これら毒素群をコードしている遺伝子の全塩基配列ならびにアミノ酸一次配列の解明に成功した.これら立方クラゲ類のタンパク質毒素群は,今までに知られている生理活性タンパク質とはまったく異なる新しいタンパク質ファミリーを形成していることが判明した.ウンバチイソギンチャクおよびフサウンバチイソギンチャクは強い毒性で知られている.これらから,主要タンパク質毒素であるPsTX-60AおよびAvTX-60Aをそれぞれから単離し,その全塩基配列ならびに全アミノ酸一次配列を明らかにした。そして,これらはMACPFドメインタンパク質の新しいメンバーであることが明らかとなった.ウンバチ、フサウンバチの両イソギンチャクによる刺症が極めて激しいことは、これら主要毒素のMACPFドメインタンパク質としての細胞障害作用が原因になっていると推測される。今回の発見は、すべての生物を通してMACPFドメインタンパク質が自己生体外において毒素として働くことを示した初めての例であった。本研究を通して立方クラゲ類やウンバチイソギンチャク、フサウンバチイソギンチャクといった猛毒を有する刺胞動物毒素の研究から、刺胞動物は新しい化学的性状や興味深い作用メカニズムをもつ生理活性タンパク質の宝庫であることが示された。今後、多くの海洋危険生物のタンパク質毒素の性状や作用メカニズムが解明されることにより、新しいタンパク性医薬製剤や刺傷被害に対する効果的な治療法の開発につながることを期待する。立方クラゲの一種であるCarybdea alataのタンパク質毒素の研究を行った。本種は世界中の熱帯・亜熱帯域に広く生息する種類であり、ハワイにおいて刺傷被害の多いことが知られる。CaTX-A(43kDa)およびCaTX-B(45kDa)と命名した二つの強い溶血活性を示すタンパク質毒素をC.alataの触手から効率的に単離した。毒素の単離に用いた方法はアンドンクラゲ由来のタンパク質毒素精製時に開発したものであるが本法は不安定な海産動物由来の不安定なタンパク質毒素の精製に有効であることが改めて示された。単離したC.alataの刺胞から毒素を精製したところ得られたにはCaTX-AのみでありCaTX-Bは得られなかった。このことはアンドンクラゲ同様、刺胞に局在する分子量のやや小さいCaTX-Aが刺傷被害時の炎症の主活性成分として働いている可能性を示している。そこでこのタンパク質毒素CaTX-Aについてその化学的性状の追求を行った。その結果、CaTX-Aをコードとする全長塩基配列とそれに対応する463個のアミノ酸からなる一次配列を明らかにすることができた。このC.alata由来のCaTX-Aは、アンドンクラゲ由来のCrTX-Aと43.7%の相同性を示した。これら両タンパク質毒素ともに分子内に両親媒性のα-ヘリックス構造部分を持つ可能性が示唆された。これらクラゲ由来の両毒素とも既知のタンパク質とはまったく相同性を示さなかった。従って、今回得られた結果は全く新規な一連の生理活性タンパク質群の一端を明らかにしたものと位置づけられる。猛毒で知られるハブクラゲの刺胞から粗毒素液を抽出し、SDS-PAGE(ポリアクリルアミド電気泳動)に供した。その結果、以前アミノ酸一次配列を明らかにしたハブクラゲの主要毒素CqTX-A以外にも、刺胞内に大量に含有されるいくつかのタンパク質の存在が明らかとなった。それらを、各々PVDF膜に転写後、N末端アミノ酸配列の解析を行った。CqTX-Aと極めて相同性の高いN末端を有する3種類以上のタンパク質の存在が確認された。これらはすべてCqTX-Aよりも分子量が小さかった。

しかしN末端アミノ酸配列がCqTX-Aと若干異なることからCqTX-Aの一部が切断されて生成したものではないことは自明である。今後、これらタンパク質の活性などの確認を行う予定である。東京湾で2001年夏にミズクラゲの試料収集を行った。ハブクラゲに用いたのと同様の手法を使ってミズクラゲの刺胞のみを単離することに成功した。ミズクラゲ刺胞の特徴は刺胞のサイズが毒性が強いといわれる立方クラゲ類の刺胞と比較してサイズが30分の1程度と非常に小さいことであった。ミズクラゲ刺胞粗抽出物もヒツジ赤血球に対して溶血活性を示し、溶血毒素の存在が示唆された。ミズクラゲ刺胞の粗抽出物についてもSDS-PAGEを行ったところ複数のタンパク質の存在が確認された。このうち量が多く含まれていた4本のバンド(分子量3万から10万)をPVDF膜に転写後、プロテインシークエンサーによりN末端配列の解析を行った。しかし、すべてN末端がブロックされているためか配列を読むことができなかった。今後、溶血活性を指標に活性本体を単離し、その化学的性状を明らかにしていく予定である。刺胞動物門に属するクラゲはすべてが刺胞毒を有し、そのうち強力な刺胞毒を有するいくつかのクラゲは世界中で海水浴客や漁民に刺傷被害を与え、死亡例も報告されている。クラゲの毒素の化学的性状の解明についてはほとんど手つかずの状況であった。これは、それまで研究されたすべてのクラゲ毒素が非常に不安定であることに主に起因していた。このような状況のもと、我々は非常に不安定なクラゲタンパク質毒素を比較的安定に取り扱う方法を見出し、クラゲ数種からタンパク質毒素を活性を保持したまま単離することに成功した。さらに分子生物学的手法を用いてアンドンクラゲ(Carybdea rastoni)、ハブクラゲ(Chiropsalmus quadrigatus)、Carybdea alataの計三種の立方クラゲのタンパク質毒素の全アミノ酸一次配列の解析に成功した。これはクラゲ毒素類の化学的性状が明らかにされた初めての例である。これら立方クラゲ類の毒素同士は相同性があるが、既知のタンパク質とは全く相同性を有していなかった。つまり、我々の研究により新奇な生理活性タンパク質ファミリーの一群を見出すことができた。さらに、クラゲと同じく刺胞動物であるイソギンチャク類の中で最も激しい刺傷被害を引き起こす種のひとつであるウンバチイソギンチャク(Phyllodiscus semoni)を研究対象と、計3つのタンパク質毒素をその刺胞から単離することに成功した。このうちPsTX-20A(20kDa)とPsTX-60A(60Da)については、その全アミノ酸一次配列ならびにそれをコードする全塩基配列を決定した。PsTX-60Aは、無脊椎動物から初めて得られた補体様生理活性タンパク質であった。
生体機能発現メカニズム解明に向けた液中高分解能電荷分布計測の開発

前年度の研究において、lambdaDNA分子を基板に吸着させたものを用いて、3次元周波数シフトマップ法による測定を行い、固液界面において分子スケールでの局所表面電荷密度計測が可能であることを示したが、測定に時間がかかるため、熱的なドリフトによって高分解能観察が困難であるという問題があった。FM-AFMでは保存力は周波数シフト、非保存的力(散逸力)はエネルギー散逸として独立で測定することが可能である。これまでの周波数シフトおよびエネルギー散逸の同時測定の実験結果から、電気二重層力(浸透圧力と静電気力)は完全な保存力であるために、周波数シフトのみにしか表れないことを明らかにしてきた。そのため、周波数シフトを探針ー試料間距離制御のためのフィードバック信号として用いた上で、エネルギー散逸を同時計測することで、エネルギー散逸量から相対的な表面電荷密度を見積もることが可能であることを見出した。物質の親疎水性の違いが固液界面における溶媒和構造や電荷密度分布とどのような関係にあるか明らかとなっておらず、親疎水性制御を用いたデバイス作製などのために、親疎水性原理の解明は重要である。界面活性剤SDSの溶液中においてHOPG基板上で周波数シフトマップ測定を行い、半円筒形状のミセルを可視化することに成功した。しかしながら、測定領域を決める周波数シフトlimit値を上げることで、探針側のミセルの破壊も観察されることが分かった。また、探針と試料のミセル間に働く相互作用力として、電気二重層力だけでなく、探針と試料表面ミセルの変形に伴う粘弾性力も働くことが分かった。更に検討を行った結果、DDABを用いることで試料表面のみにミセルを形成することが分かり、また表面要素積分法を3次元に拡張した手法の開発にも成功し、ミセル表面の表面電荷密度分布計測に成功した。医学、製薬、バイオセンサーなどへの応用の観点から、溶液中におけるタンパク質の分子レベルでの構造解析、さらには局所電荷分布解析技術の開発が強く求められている。近年、周波数変調型の原子間力顕微鏡(FM-AFM)の技術革新が進み、液中においても微弱な力を検出し、原子・分子レベルでの表面形状計測が可能となってきた。超高真空中においては、KPFMと呼ばれる手法により、ナノメートルスケールでの静電気力計測は可能であったが、水中においては固液界面において電気二重層が存在するため、その静電的相互作用は複雑であり、容易ではない。本研究ではFM-AFMを用いた固液界面における局所電荷分布計測手法の開発を目的として行った。実験ではモデル生体試料系としてlambda DNA分子を基板に吸着させたものを用いた。DNA分子は溶液中で負に帯電しており、正に帯電したpoly-L-lysineをコートした白雲母基板に静電的に固定させて用いた。作製した試料表面上において周波数シフトマップを行い、探針が試料に接近するとともに、分子上では周波数シフトが増加するのに対し、基板上では減少することが分かった。このことから分子および基板上でそれぞれ電気二重層斥力および静電的引力相互作用が検出されたことが分かる。分子上で得られた曲線より分子上の電荷密度を計算したところ、-0.2 C/m2であることが分かった。一方で、分子上のリン酸基のプロトンが全て解離しているとして計算した分子上の電荷密度は-0.3 C/m2であることが分かった。このことから固液界面における分子スケールでの電荷密度計測手法の開発に成功したと言える。エネルギー散逸測定で得られる散逸量から、分子上での電荷密度を見積もるためのアルゴリズムの開発にも取り組んでおり、学術論文や特許出願のために必要な実験データの多くの取得することに成功している。目標であった生体分子上における電荷密度計測に成功した。

更には試料表面上における3次元的な電場の広がりも可視化することに成功しており、計画通りに研究は進んでいると言える。生体分子の電荷密度計測手法の開発には成功したが、空間分解能は1nm程度であり、分子内の電荷密度分布を測定するためには、更なる改良が必要となる。今後、エネルギー散逸をフィードバック信号として用いるなどして、更なる空間分解能の向上を検討していく。