hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重度視覚障害者もみんなも使えるユニバーサルデザイン図形提示インタフェース

当研究は,タッチパネルが当り前に様々な機器に組み込まれ,最も普及した触角デバイスとなる未来予想を前提に,晴眼者を対象とした各種マルチメディアコンテンツに容易に追加可能な,「タッチパネルをなぞることによる全盲をも含む視覚障害者への情報補償技術」を提案することを目的に,2009年度2010年度に実施された.視覚障害者が図形と対応した音をタッチパネルを触れながら探すことによって図形の認識を行うというシンプルな方法を基礎に,視覚障害者のタッチパネル利用,図形認識に関する認知特性に適した図形と音との対応の工夫に関する基礎研究が行われた.当研究は,タッチパネルが当り前に様々な機器に組み込まれ,最も普及した触角デバイスとなる未来予想を前提に,晴眼者を対象とした各種マルチメディアコンテンツに容易に追加可能な,「タッチパネルをなぞることによる全盲をも含む視覚障害者への情報補償技術」を提案することを目的に,2009年度2010年度に実施された.視覚障害者が図形と対応した音をタッチパネルを触れながら探すことによって図形の認識を行うというシンプルな方法を基礎に,視覚障害者のタッチパネル利用,図形認識に関する認知特性に適した図形と音との対応の工夫に関する基礎研究が行われた.本研究の学術的興味は、視覚障害者特有のタッチパネル利用方法とそれを用いた図形認識方法の特徴を調査することと、タッチパネルと音を用いたシンプルな方法で視覚障害者の図形認識を助ける方法を実現することにある。これらの達成のための研究は完全に個別に進展するのではなく、解明された特性を図形提示方法の開発に生かし、また図形提示方法によって新たに特性が解明される、というふうに相互に影響し合いながら進展すべきで、H21年度は以下の2つのサブテーマを同時進行で実施した。<Sub-1>視覚障害者のタッチパネルを利用した図形認知特性の調査研究全盲もしくは全盲に近い重度視覚障害者10名を、点字習熟度の上級・中級・初級にグループ分けし、図形認識実験を行った。その結果、点字習熟度が指の動かし方に強い影響を与えること、我々の提案する図形提示方法が初級者にも有効であること、が分析を通して示された。本研究成果は国際会議2件、国内の研究会1件で発表された。また、現在、英語論文誌に1件投稿済・現在照会中、国際会議1件投稿済・現在査読中である。<Sub-2>タッチパネルと音とによるインタラクティブ図形提示方法の提案と評価研究地図コンテンツをタッチパネルを用いて視覚障害者に提供するための音声補助付き画面スクロール機能を実装し、全盲もしくは全盲に近い重度視覚障害者11名の地図認識実験を行った。その結果、スクロールや画面の切り替えを含んだ複雑なコンテンツであっても、経路を周囲の建物や目印の空間配置とともに理解し、再現できる被験者がいることが確認され、研究の新しい端緒を開くことができた。本研究のもう一つの学術的興味は,タッチパネルと音とを用いた視覚障害者向け図形提示方法を,その他の人々も楽しめたり役に立つようにユニバーサルデザイン(UD)化し,提案する視覚障害者向け情報補償技術が広く一般に普及可能とすること(ゴール3)である.H22年度は前年の成果をもとに,以下のサブテーマを実施した.〈Sub-3〉開発した図形提示方法のUD化の提案と評価研究前年度に開発した図形提示方法のUD化仮説の立案とコンセプトのデモを行うためのコンテンツとシステム双方の設計・製作を行う.そして,展示会,大学のオープンハウス・研究情報発信イベント等を利用した,多人数かつ様々なユーザによる被験者実験を実施した.具体的には,前年度に実装した実験システムをUDを考慮して改良・発展させ,地図・案内図等の実用的コンテンツ,パズルゲーム・インタラクティブアート等の娯楽・芸術的コンテンツ,を例にUD化仮説に基づいた図形提示方法の実装を行い,被験者実験に用いた.また,前年度のテーブル型システム,PCモニタ,大型テレビから個人用の小型ガジェットにダウンロードするシステムの3つを対象としたコンテンツ開発に加え,モバイル機器での利用を考慮した図形提示コンテンツの開発を行った.具体的には,タブレットPC,ミニPC,スマートフォンを購入し,実験システムの追加構築を行い,全盲もしくは全盲に近い重度視覚障害者を対象とした1年間のべ50人の被験者実験実施を通して,提案する図形提示方法がモバイルシーンにおいても有効となりうるように改良・評価を行った.
ナノ粒子による抗原特異的な免疫反応の制御とその細胞性機序の解明

本研究では親水性と疎水性のポリマーによる共重合体であるNPsに癌抗原ペプチド(TRP-2)およびアジュバント(CpG)を内包し、抗-DCs抗体(anti-DEC205)を表面に結合させNPs製剤(NPs-TRP2/CpG/anti-DEC205)を作成し、抗腫瘍作用を検討した。担ガン(悪性黒肉腫細胞株B16-F10)マウスにNPs製剤を投与したところ、15日目の腫瘍サイズは42mm3で、対照群では459mm3であり著明な抑制効果があった。またNPs製剤投与マウスのリンパ節で活性化DCsが増加していた。このことから、今回のNPs製剤はガンワクチンとして有用であることが示された。ナノ粒子(NPs)は目的とする組織・細胞への選択的な薬剤送達手段として用いられてきたが、近年免疫反応の制御法としても注目されている。今回、免疫反応をコントロールできるナノ粒子の開発を目的としている。すなわち、ナノ粒子にタンパク質を初めとする抗原や免疫増強物質(アジュバント)を内包し、さらに免疫細胞に対して選択的に反応する抗体を結合することによって効率的かつ選択的な免疫細胞(例えば、樹状細胞(DCs)ゃT細胞)の活性化を誘導し、液性免疫が感染予防に関わっている微生物の制御法及び細胞性免疫が主体をなしている悪性腫瘍に対する制御法の開発を目指している。ナノ粒子に抗原として卵白アルブミン(OVA)(ペプチド)を結合させ、体液性免疫の制御法を検討する。特に用いる抗原量やアジュバントによって誘導される体液性免疫のアーム及びどのような影響を与えるかを検討した。さらに、抗腫瘍免疫反応(細胞性免疫反応)の内因性癌ペプチドを抗原として、アジュバント及び樹状細胞指向性を有している抗体を内包したナノ粒子製剤を作製し、腫瘍予防・治療ワクチンとしての可能性を模索する。すなわち、ナノ粒子にタンパク質をはじめとする抗原や免疫増強物質(アジュバント)を内包しさらに免疫細胞に特異的な抗体を結合することによって、効率的かつ選択的に免疫細胞(例えば、樹状細胞(DCs)ゃT細胞)の活性化を誘導し、感染予防及び悪性腫瘍に対する制御法の開発を目指している。特に用いる抗原量やアジュバントによって誘導される体液性免疫のアーム及びどのような影響を与えるかを検討する。さらに、抗腫瘍免疫反応(細胞性免疫反応)の内因性癌ペプチドを抗原として、アジュバント及び樹状細胞指向性を有している抗体を内包したナノ粒子製剤を作製し、腫瘍予防治療ワクチンとしての可能性を模索する。癌ワクチンの作製:OVAをモデル腫瘍抗原として用いた系で、OVA-NPsを予めマウスに免疫しておくと、OVA発現腫瘍細胞(EG-7)のin vivoでの増殖は抑制された。さらに、腫瘍に対して抑制効果が期待できるIL-7を封入したOVA-NPs -IL-7を用いると、抗腫瘍効果が増強したが、親細胞EL-4の増殖には影響を与えなかった。OVA-Nps-IL-7を腫瘍接種の1週間前に投与した群では対照群に比べて著明にCTL反応が増加していた。これらの結果から、腫瘍抗原とIL-7を結合したNps製剤は効率よく、腫瘍の退縮をもたらすと推測された。3)内在性癌ペプチドを用いた癌ワクチンの作製:NP-TRP-2/CpGにDCs内包し、抗-DCs抗体(anti-DEC205)をNps粒子表面に結合した製剤を作製した。(NPs-TRP2/CpG/anti-DEC205)。1予防ワクチン作製:予めマウスにNPs-TRP2/CpG/anti-DEC205を投与し、7日後にB16-F10腫瘍細胞を皮下投与し、腫瘍サイズ、生存を経時的に確認した。NPs単独投与群では腫瘍接種16日目にはサイズが500mm3を超えたがNPs-TRP2/CpG/anti-DEC205投与群では20日目でも70mm3であり、腫瘍の増殖を強く抑制していた。2治療ワクチン作製:B16-F10腫瘍細胞投与後5日、12日にNP-TRP2/CpG/anti-DEC205製剤を2回投与し、腫瘍増殖を経時的に確認した。比較対照群として抗-DEC205抗体結合TRP-2内包した製剤は。15日目にはサイズが600mm3を超えたがNPs-TRP2/CpG/anti-DEC205投与群では200mm3と腫瘍の増殖を強く抑制しており、予防、治療ワクチンとして有用であることが示された。ナノ粒子(NPS)は目的とする組織・細胞への選択的な薬剤送達手段として用いられてきたが、近年では免疫反応の制御法としても注目されている。本研究では、研究協力者のナノキャリア株式会社(加藤、原田)と共に免疫反応をコントロールできるナノ粒子の開発を目的とした。すなわち、ナノ粒子にタンパク質を初めとする抗原や免疫増強物質(アジュバント)を内包し、さらに免疫細胞に対して選択的に反応する抗体を結合することによって効率的かつ選択的な免疫細胞(例えば、樹状細胞(DCs)ゃT細胞)の活性化を誘導し、微生物などに対する感染予防および悪性腫瘍に対する制御法の開発を目指している。

このようなアプローチによって治療・予防ナノ粒子ワクチンの開発につなげたい。NPsは、ポリエチレングリコールからなる親水性ポリマーとポリアミノ酸誘導体からなる疎水性ポリマーによる共重合体であることから、薬物キャリアとなり得て、がん組織等の病変部へ集積(標的化)し、副作用もないことが報告されている。本研究ではモデル抗原卵白アルブミン(OVA)或は内在性癌抗原ペプチド、アジュバント、及びDCs指向性を持つ抗体を内包させたNPs製剤を作製し、抗腫瘍作用及び抗体産生能を検討した。1)OVAをモデル腫瘍抗原として用いた系で、OVA-NPsを予めマウスに免疫しておくと、OVA発現腫瘍細胞(EG-7)の増殖はin vivoで抑制された。さらに、腫瘍に対して抑制効果が期待できるIL-7を封入したOVA-NPs -IL-7を用いると、抗腫瘍効果が増強した。しかしOVAを発現していない親細胞EL-4は増殖したことから、NPs製剤は抗原特異的に効果を発揮することが示唆された。OVA-Nps-IL-7を腫瘍接種の1週間前に投与した群では対照群に比べて著明にCTL反応が増加していた。以上のことから、今回設計したNPs-TRP2/CpG/anti-DEC205製剤は予防、治療ワクチンとして有用であることが示された。本研究では親水性と疎水性のポリマーによる共重合体であるNPsに癌抗原ペプチド(TRP-2)およびアジュバント(CpG)を内包し、抗-DCs抗体(anti-DEC205)を表面に結合させNPs製剤(NPs-TRP2/CpG/anti-DEC205)を作成し、抗腫瘍作用を検討した。担ガン(悪性黒肉腫細胞株B16-F10)マウスにNPs製剤を投与したところ、15日目の腫瘍サイズは42mm3で、対照群では459mm3であり著明な抑制効果があった。またNPs製剤投与マウスのリンパ節で活性化DCsが増加していた。このことから、今回のNPs製剤はガンワクチンとして有用であることが示された。1)体液性免疫応答機序の解析: NPsに卵白アルブミン(OVA)を粒子表面に結合した製剤を作製し、マウスの皮下に投与すると、血清中の抗原特異的な抗体産生が上昇し、アジュバント効果を発揮することを明らかにした(論文受理)。加えて今期は、体液性免疫応答のT細胞性機序について解析した。OVA-NPsで免疫されたマウス由来の脾臓からT細胞を純化し、in vitroで2次刺激を行い、産生されてくるサイトカインをフローサイトメーターによって解析したところ、PBS対照群と比較して有為にIFN-γ, IL-4, IL-21陽性T細胞が増加しており、T細胞がNPsのアジュバント効果に重要な働きをしていることを明らかにした。2)癌ワクチンの作製:OVAをモデル腫瘍抗原として用いた系で、OVA-NPsが抗腫瘍免疫反応を誘導できること明らかにした。すなわちOVA-NPsを予めマウスに免疫しておくと、OVA発現腫瘍細胞(EG-7)のin vivoでの増殖は抑制された。しかしOVA-NPs -IL-7は親細胞EL-4の増殖には影響を与えなかった。このことから、OVA抗原特異的な抗腫瘍免疫反応の誘導が予測されたので、細胞傷害性T細胞(CTL)反応の誘導を解析した。
化学気相析出法を用いたチタン酸カルシウム及びリン酸カルシウム被覆とその生体適合性

有機金属化学気相析出(MOCVD)法を用いTi(o-i-Pr)(dpm)_2、Ca(dpm)_2および(C_6H_5O)_3PO有機金属錯体により、チタン酸カルシウム-リン酸カルシウム傾斜組成膜を、レーザーCVD法によりリン酸カルシウム系膜を合成し、XRDによる相同定、SEMによる微細組織の観察および成膜速度の測定、擬似体液中への浸漬実験により、リン酸カルシウム膜上へのアパタイト形成の様子を調べた。ガラス基板およびCP-Ti基板上に合成したCa-Ti-O/Ca-P-O傾斜組成膜はガラスおよびCP-Ti基板いずれにおいても、CaTiO_3,HApおよび少量のα-TCPの回折ピークが観察され、傾斜構造を有していることが示唆された。また、傾斜組成膜の表面は粒径が1μm程度の粒状の結晶であり、断面は微粒子層→柱状晶層→緻密層からなる傾斜構造を有していた。基板近傍における微粒子層および柱状晶の領域は、CaTiO_3膜でのみ観察された構造であることから、Ca-Ti-O/Ca-P-O傾斜組成膜が合成されたと考えられる。また、表面部分は、X線回折の結果から、HApとα-TCPの混合層であることが考えられ、α-TCPの高い溶解性がHApのアパタイト形成をさらに促進させる駆動力となることが期待される。レーザーCVD法により合成したHAp膜の表面微細組織は、粒径が1μm程度の粒状結晶を有し、断面はいずれの成膜条件においても緻密な柱状晶であった。また、合成条件を変化させることにより、結晶配向か(300)および(002)へと変化した。さらに、擬似体液中への浸漬実験から、(300)配向した膜は浸漬12h後で粒径が10nm程度のアパタイトの粒子で表面全体が覆われた。一方、(002)配向したHAp膜は浸漬6h後には表面全体が10nm程度のアパタイトで覆われ、レーザーCVD法は生体セラミックス膜の合成法として有用であることが明らかとなった。有機金属化学気相析出(MOCVD)法を用いCa(dpm)_2および(C_6H_5O)_3PO有機金属錯体により、リン酸カルシウム系膜を合成し、XRDによる相同定、SEMによる微細組織の観察および成膜速度の測定、擬似体液中への浸漬実験により、リン酸カルシウム膜上へのアパタイト形成の様子を調べた。基板温度(T_<sub>),反応室圧力(P_<tot>)およびCaとPの原料モル比(R_<Ca/P>)の変化により,生成した結晶相は変化し、得られた膜の微細組織は、いずれの膜も表面は粒径が1μm程度の粒状結晶であり、断面は緻密な構造であった。成膜速度はP_<tot>=0.8kPa、T_<sub>=1073Kの時最大の6.0nm/s(20μm/h)であり、スパッタリング法を用いた場合の40倍の成膜速度が得られた。擬似体液中への浸漬実験では、HAp膜は浸漬前はなめらかな表面構造を有し、緻密な構造であった。浸漬1時間後に膜の窪みでアパタイトが新たに生成した。浸漬6時間後では、試料の表面全体は針状のアパタイトで覆われ、浸漬12時間後では、新たに形成したアパタイトの微細組織は針状から網目状へと構造が変化した。本研究において、MOCVD法により合成されたHAp膜はアパタイト形成速度が最も速かった。また、MOCVD法により合成したカリフラワー状の表面組織を有するチタン酸カルシウム膜も比較的アパタイト形成速度が速く、擬似体液中におけるアパタイト形成には、膜の骨伝導能の他に、膜の表面構造が重要であることが明らかとなった。

さらに、擬似体液中への浸漬実験から、(300)配向した膜は浸漬12h後で粒径が10nm程度のアパタイトの粒子で表面全体が覆われた。一方、(002)配向したHAp膜は浸漬6h後には表面全体が10nm程度のアパタイトで覆われ、レーザーCVD法は生体セラミックス膜の合成法として有用であることが明らかとなった。
直列型多点電極の開発と大脳皮質における縦方向の情報処理の研究

大脳皮質の柱状構造は、情報処理の単位モジュールと考えられており、各層の細胞は情報の入力、演算、出力などそれぞれ異なった役割を持っている。柱状構造内での、情報入力から出力に至る一連の流れを解明することで、大脳皮質における情報処理の基本原理を解明できると考えられるが、その詳細はまだ明らかになっていない。このような柱状構造内での縦方向の情報処理や、各層の細胞の役割について明らかにするため、1から6層までの各層の神経活動を独立かつ同時に記録可能な直列型多点微小電極の開発を行った。電極は半導体製造技術およびマイクロマシン製造技術によって製作した。電極製作の技術指導を、研究分担者の山川研究室が担当、電極の設計・製作は研究代表者の花沢研究室が担当した。開発プロセスは主に以下のような4段階を繰り返し行った。1)CADによる電極形状・配線デザインおよびフォトマスク作成。2)シリコンウェハ電極形状成形。3)電極配線成形。4)作成物の観察、問題点の検討。電極形状成形はシリコンウェハの異方性エッチングにより行った。電極のサイズは、それぞれ長さ3,2,1cm、幅300,200,100μmである。現在、形状および配線成形のための技術はほぼ確立し、接点部分の製作を課題として取り組んでいる。今後、齧歯類を用いた性能テストの後、マカクサル大脳皮質視覚関連領野において、柱状構造内の情報処理を明らかにするための生理実験を行う。3)電極配線成形。
火山層序および放射性炭素年代による高分解能な噴火史の編年

過去の火山噴火は,噴火堆積物と火山地形に記録されている。この研究において,(1)地形図や空中写真による地形観察,(2)地形・地質学的調査および試料採取,(3)放射性炭素年代測定などから,高分解能な噴火史を編年することを試みた。調査対象としては,大雪山旭岳,北八甲田,焼岳,由布岳,霧島,姶良カルデラなど,北海道から九州までの諸火山である。まず,テフラ直下の腐植土の放射性炭素年代がテフラの噴出年代を示すことを利用してこれらの火山の高分解能な噴火史を構築した。最近約1万年間の完新世では,放射性炭素年代から較正された暦年代を用いて議論する必要があり,ウイグルマッチング法による年代推定が有効であると考えられる。そこで,テフラを挟在する泥炭層を測定試料として,この方法が適用可能であるかも検討した。霧島火山についての予察的結果では,腐植土から推定された年代とも良く一致しており,その適用の可能性が示唆された。また,大雪山旭岳では,泥炭層中に4枚のガラス質火山灰層を識別し,EPMAによる火山ガラスの化学組成からB-Tmなどの広域テフラに対比した。テフラと同時に泥炭層も採取しており,この火山でも泥炭層の放射性炭素年代を用いたウイグルマッチング法を検討する予定である。この研究で確立された噴火史の高分解能な編年は,火山噴火の中・長期予測の基礎資料としてだけでなく,考古遺跡の編年や古環境復元など,隣接した分野の研究にも活用されることが期待される。この研究は,テラフが良く保存されている泥炭層で小規模な噴火を読み取ると共に,Wiggle Matching法を用いて噴火年代の高精度決定をめざしている.泥炭層中には,乾陸上では削剥される薄い噴火堆積物も保存されることが期待できる.しかし,再堆積によって噴火堆積物を過剰に見積る可能性もあるので,露頭での産状および複数のボーリング・コアの比較による考慮が必要である.本年度は,現地調査を南九州の肝属平野,中部地方の白山火山で実施して,良好な泥炭試料が得られた.どちらも^<14>C年代測定を含めた分析作業が現在進行中である.特に,泥炭試料を細かく区分して,最適試料の選別を検討している.また,分析作業の効率化をはかるため,その改善も行っているがこれまでのところ十分な成果は得られていない.肝属平野では桜島および霧島の両火山起源のテフラの層序関係が確認でき,白山では南九州の鬼界カルデラから噴出したアカホヤ火山灰を確認した.これらの事実の認識によって,より精密な年代推定が可能になることが期待できる.さらに来年度は北海道の大雪山旭岳において泥炭層を調査する予定であり,そのための準備作業も行っている.来年度は,上記の2地点と共にこれらの結果をとりまとめる予定である.また,泥炭試料との比較のために,中九州の由布岳中部地方の焼岳,東北の北八甲田火山で土壌試料を用いた^<14>C年代測定も実施し,それぞれの火山の完新世噴火史を明らかにしている.過去の火山噴火は,噴火堆積物と火山地形に記録されている。
光応答性RNAを用いたRNA機能の光スイッチング

光照射で分子構造が大きく変化するアゾベンゼンをRNAに導入することで、光応答性RNAを作成した。導入したアゾベンゼン分子の光異性化により、RNA/RNA又はRNA/DNA二重鎖の形成と解離の光制御を実現した。更に、多数のアゾベンゼンをエンザイム機能を持つリボザイムに導入し、光照射でリボザイムの高次構造を変化させ、RNA鎖の特異的な切断の光制御も実現し、細胞内でRNA機能を光で制御できることが示唆された。本研究では、光応答性RNAの構築とRNA機能の光制御を目指した。最終的には、RNAiなどのプロセスを光制御することで、遺伝子発現の光制御を実現する。平成20年度の計画では、光応答性分子であるアゾベンゼンをRNAに導入することで、光応答性RNAを合成し、そのRNA又はDNAへのハイブリダイゼションの光制御能を評価する。研究を行った結果、D-threoninolを介し、アゾベンゼンを合成収率の比較的に低いRNAへの導入に成功した。合成したDNAをPAGEで精製し、TOF-MSなどの方法で同定した。更に、RNA/RNA二重鎖とRNA/DNA二重鎖の光制御能をT_m測定により評価した。その結果、同じ配列を持つDNA/DNAの場合よりも、高い光制御能を示された。配列依存性を調べたところ、調べた数種類の光応答性RNAに対してすべて高い光制御能をもつことが分かった。また、一本のRNAに2個以上のアゾベンゼン導入が可能で、更なる高効率な光制御に成功した。即ち、光応答性RNAを用いることで、RNA/RNA二重鎖の形成と解離の可逆的な光制御に成功した。次に、アゾベンゼン導入した二重鎖siRNAを構築し、RNAiによる遺伝子発現への影響を調べた。具体的にターゲット遺伝子(Mouse Piasy)を含むPlasmidを細胞に導入することで発現させ、二重鎖RNAを導入した場合のRNA干渉効果をWestern Blottingによって検出した。アゾベンゼンを導入したRNA配列をアゾベンゼンがtrans体の状態で用いた場合、RNA干渉におけるアゾベンゼンの影響は導入位置によって大きく異なることが明らかとなった。これはsiRNAと酵素や認識タンパクとの相互作用においてアゾベンゼンが局所的に影響していることを示していることから、光照射によってアゾベンゼンをcis体へと異性化させることで二重鎖の局所的な構造変化を引き起こし、RNA干渉を光制御することが期待できる。平成21年度では、光応答性siRNAを導入した細胞を光照射し、遺伝子発現の光制御を試みる。例えば、RNAiなどのプロセスを光制御することで、遺伝子発現の光制御を実現する。平成21年度の計画では、アゾベンゼン残基をsiRNAに導入し、導入位置などのRNAi効果の影響を調べる。また、細胞に導入した光応答性siRNAの効果を評価し、そのメカニズムの解明を目指した。アゾベンゼンを導入したsiRNAを用いて、遺伝子発現の抑制効果を調べたところ、導入位置により、RNAi効果が大きく変化することが分かった。興味深いことに、センス鎖の5'末端に近い位置に導入する場合、天然のsiRNAと比べ1/10以下の濃度で、十分なRNAi効果を有することを見出した。これは、センス鎖とアンチセンス鎖を識別することがRNAiのプロセスに大きく影響することを示唆する。この機構を基づいて、医療やバイオテクノロジーのツールとして高機能性siRNAの開発が可能になる。また、アゾベンゼンを含む二重鎖siRNAを細胞に導入し、光照射によってcis体へと異性化させることで二重鎖の局所的な構造変化を引き起こし、RNA干渉の効果において有意な差が観察された。分子設計を最適化することで、高効率な光制御が可能である。更に、機能性核酸に光応答性DNAをつけることによりRNA切断の光制御を狙い、DNAハイブリダイゼーションの高効率な光制御を実現した。即ち、DNA塩基対とアゾベンゼンが1:1の割合で構成する人工二重螺旋の構築に成功し、完全の二重鎖形成と解離の光制御を実現した。将来的には、この新規な光応答性人工螺旋を使用することで、機能性RNAの遺伝子調節を光制御することが期待できる。平成22年度においては、アゾベンゼンに導入したsiRNAのRNAi効果調べ、アゾベンゼンの導入によるRNAiへの影響のメカニズムを解明した。また、多数のアゾベンゼンをRibozymeの両末端に導入することで、光応答性機能性RNAを構築し、高高率なRNAの特異的な切断の光制御を実現した。アゾベンゼンを導入したsiRNAを用いて、遺伝子発現の抑制効果を調べたところ、Sense鎖の5'から2番旧から5番目まで導入した場合、RNAi効果が大きく増大することが分かった。一方、Antisense鎖の場合は、ほとんどの場所に導入しても、RNAiへの影響は少なかった。

そのメカニズムは、センス鎖をDISCに取り込むことがアンチセンス鎖への導入より難しくなると推定した。また、逆方向の遺伝子を作成して確認したところ、やはり以上のメカニズムと一致する結果が得られた。以上の結果により、アゾベンゼン修飾siRNAは、遺伝子発現を高効率に抑制するsiRNA試薬として有効であることが分かり、これに関する特許を出願した。最後に、アゾベンゼンを多数に導入したRibozymeを構築し、Ribozymeのトポロジカル構造の光制御により、RNA切断の高効率な光制御に成功した。この新しい方法は、機能性RNAの活性がある部位にアゾベンゼンを導入せずに光制御の結果が得られたので、機能性RNAのトポロジカル構造を制限しないONの状態では、完全に天然の機能性RNAと同じ活性を持つ。
水溶液プロセスによる透明導電性ＺｎＯ膜の実現と透明電子回路への挑戦

亜鉛イオンを含む原料液とpH調整用のアンモニアに加えて酢酸3ナトリウムを入れた反応液を加熱基板上に噴霧して作製する透明酸化亜鉛膜の低抵抗化ならびに紫外線照射条件の最適化による透明電子回路の形成に挑戦した。紫外線処理前に水素雰囲気処理を行うことにより、これまでで最も低い1.8×10-3 Ω・cmの抵抗率の達成に成功した。また、プラスティック基板(PES)上でも透明導電性酸化亜鉛膜を作製した。最適の紫外線波長を調べた上で照射領域を限定し、酸化亜鉛膜中に透明電子回路を描画することに成功した。また、アンミン錯体を用いることにより、一液から透明導電性亜鉛膜を作製可能にするプロセスの確立にも成功した。平成24年度は以下の(1)(3)のテーマに関して研究を進めた。(1)溶液条件による膜の微細構造制御と透過率の評価スピンスプレー法によりガラス基板上にZnO膜を堆積する際の溶液条件と基板温度の変化による膜構造制御を行った。この結果、基板温度を85100°Cと変化させると温度上昇ともに膜厚が増加する傾向が見られた。クエン酸濃度については、0→10mMと変化させると膜の構造がロッド状から連続した透明膜へと変化し、透過率が7→90%と大幅に変化した。(2)紫外線照射によるZnO膜の低抵抗化と条件最適化(1)の条件で堆積直後の膜は、90%と高い透過率を持つZnO膜でも2×10^1Ω・cm程度と非常に高抵抗であった。これを300°Cで数時間熱処理した試料では、抵抗率が僅かに減少するか、条件によっては増加する場合もあった。これに対して、キセノンランプとバンドパスフィルターを用いて中心波長を変化させた紫外線を照射した試料では、大幅な抵抗率の減少が観測されたので、それらを赤外分光、熱脱離分析法、FT-IRにより評価したところ、堆積直後の試料では膜中に有機物であるクエン酸が含まれるものの、紫外線照射によりそれらの分解により生成したCやHがドープされてZnO膜が低抵抗化することが推察できた。2.5μm厚の膜に中心波長365nmの紫外線を24時間照射した試料で最も低い抵抗率の8×10^<-3>Ω・cmと85%と高い透過率を達成し、これと比べて1μmと比較的薄い膜では6時間程度の短い照射時間でも4×10^<-2>Ω・cmまで減少した。(3)溶液調整による他金属イオンドープによる低抵抗化Alイオンを含む原料液を用いてAlドープを試みたところ、膜中Alイオン濃度は最大で1%程度にとどまるものの、3×10^<-2>Ω・cmという最も低い抵抗率と80%と高い透過率を達成した。但し、更にAlイオン置換を行ってキャリア濃度を増加させた場合には膜の透過率が減少することも予測された。1)紫外線照射条件の最適化:抵抗率の低下には、波長350 nmの紫外線が最も適していること、一定以上の照射強度が必要であることを明らかにした。2)溶液調整によるZnO膜の微細構造ならびに組成制御による低抵抗化:AlならびにGaドープZnO膜の作製を試みたが、いずれも低抵抗化されるに十分なドープ量を含む膜とはならなかった。原因としては、クエン酸錯体の形成により膜成長面から排出されて膜中に取り込まれていないことが原因であると考えられた。クエン酸3ナトリウム以外でカルボキシル基をもつ有機物として酢酸ナトリウム、リンゴ酸2ナトリウム、ETDAを用いて行った薄膜作製では十分な透過率は得られなかったが、スルホン基を持つPSSを用いた場合は平均で60%程度と不十分ながらも半透明膜が作製できた。これより、透明な膜を得るにはカルボキシル基を持つクエン酸イオンが最も効果的ではあるものの、必ずしもカルボキシル基を含めば良いのではなく、その他の要因を明らかにする必要があることが分かった。堆積したZnO膜を水素雰囲気中還元処理後にブラックライトによる紫外線照射を施すことにより、35×10^-3 Ωcmの低抵抗膜の作製に成功した。3)低耐熱性プラスティック基板にZnO膜を堆積する条件の確立:透明プラスティック基板の中ではPSSが最も透過率の高い膜の堆積が可能であることを明らかにするとともに、抵抗率も3×10^-2 Ωcm程度と透明導電膜として応用可能なレベルまで低抵抗化することができた。4)紫外光による透明な低抵抗部分の作製:クエン酸3ナトリウムを含む溶液から堆積したZnO膜にマスクを施した上で紫外線照射すると、照射部の抵抗値が照射されていないところと比べて、510倍あるいはそれ以上も抵抗値が低くなることを確認した。1)紫外線処理条件による低抵抗化:スピンスプレー法で作製した緻密な構造の酸化亜鉛膜中のクエン酸イオン等の有機物を分解し、CやHのドープによりキャリア濃度を増加させた。1.1μmの厚みを持つ酸化亜鉛膜は9.7x1019 cm-3の高いキャリア濃度、1.2 cm2/V・sの移動度、そして2.4x10-2 Ω・cmの低い抵抗率を示した。2)水素処理及び紫外線処理による移動度の向上とさらなる低抵抗化:1)の膜はキャリア濃度自体はスパッタ法の膜と比べても遜色の無い高い値であるので、より低抵抗化するには移動度の向上が課題であった。

最適化された紫外線照射条件と還元熱処理条件において、高キャリア密度1.5x1020 cm-3と高移動度11.2 cm2/V・sが得られ、1.8x10-3 Ω・cmと透明導電膜として十分に応用可能な膜の作製に成功した。移動度向上の理由は膜中の粒界表面に存在するO2-イオンや有機物が水素処理によって脱離し、ポテンシャル障壁が減少したのが原因と考えられる。3)透明プラスチック基板上の透明導電性酸化亜鉛膜:柔軟で透明なポリエーテルサルフォン(PES)シートを基板とした場合でも85%と高い透明性を持つ緻密なZnO膜が堆積可能であり、紫外線照射の最適化により、9.1x10-3 Ω・cmと高い導電性が得られることを明らかにした。また屈曲試験では500回までの折曲であれば10-2 Ω・cm以下の低抵抗率が維持されることも確認した。4)マスクを用いた紫外線照射による透明回路の作製:堆積した酸化亜鉛膜の上に直線、矩形の窓を持つアルミ製マスクを配置して紫外線処理を行ったところ、照射領域のみが低抵抗となることが明らかになった。そこで回路網状の窓を持つマスクを用いた照射実験を行い、透明酸化亜鉛膜中に導電性回路の描画が可能であることを示した。平成27年度は主に以下の3点について成果が得られた。(1)異なる波長の紫外線照射による低抵抗化の調査UV-A(320-380 nm)、UV-B(280340 nm、UV-C(260 nm)と3種類の波長の異なる紫外線ランプとUVカットフィルターの組み合わせにより、波長領域の異なる紫外線を溶液作製した酸化亜鉛膜に照射する実験により、酸化亜鉛膜の低抵抗化にはUV-Aの紫外光とフィルターにより360 nm近傍の紫外光を照射することが最も適していることを明らかにした。(2)紫外線マスクを用いた透明回路の描画ウィンドウを設けたマスクにより紫外線照射領域を限定することで、溶液作製した酸化亜鉛膜中に任意の形状・サイズにて透明回路が描画可能であることを確認した。さらにはより強い紫外線の照射を用いてより長時間照射することにより、照射していない部分と比べて3桁ほど低い抵抗値とできることを見いだした。(3)Mgイオン置換ZnO膜の作製と評価溶液作製した酸化亜鉛膜はn型のものしか得られていないことから、p型酸化亜鉛膜の作製を目指す基礎実験として、Mg置換酸化亜鉛膜を溶液作製した。十分な低抵抗化をはかれなかったものの、微量ながらもMgイオンが置換されていることが確認できた。亜鉛イオンを含む原料液とpH調整用のアンモニアに加えて酢酸3ナトリウムを入れた反応液を加熱基板上に噴霧して作製する透明酸化亜鉛膜の低抵抗化ならびに紫外線照射条件の最適化による透明電子回路の形成に挑戦した。紫外線処理前に水素雰囲気処理を行うことにより、これまでで最も低い1.8×10-3 Ω・cmの抵抗率の達成に成功した。また、プラスティック基板(PES)上でも透明導電性酸化亜鉛膜を作製した。最適の紫外線波長を調べた上で照射領域を限定し、酸化亜鉛膜中に透明電子回路を描画することに成功した。また、アンミン錯体を用いることにより、一液から透明導電性亜鉛膜を作製可能にするプロセスの確立にも成功した。1)紫外線ランプを用いた処理による低抵抗化についてはほぼ最適な条件を見いだす事に成功している。2)水素処理及び紫外線処理による移動度の向上とさらなる低抵抗化では、水素処理条件と紫外線処理をそれぞれ最適化することにより、1.8x10-3 Ω・cmとこれまで達成された値に比べて大幅に低い抵抗値の達成に成功し、当初の目標以上の成果が得られたと言える。
臓器障害におけるシトルリン化分子の網羅的同定と応用

ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)は、蛋白質中の塩基性アミノ酸であるアルギニンを中性アミノ酸であるシトルリンに変換する酵素である。蛋白質シトルリン化反応は、蛋白質の高次構造に著しい変化をもたらす。生体内には5種類のアイソフォーム(PAD1,2,3,4/5,6)が存在し、活性化にカルシウムイオンを必要とする。特に、PAD2は脳全体に広く分布し、他型PADは検出されない。本研究では、シトルリン化された分子種を網羅的に同定し臨床検査薬を開発することを目的とした。(1)神経細胞株SH-SYSY細胞において酸化ストレスによりシトルリン化蛋白質が誘導される(2)シトルリン化蛋白質分子の同定のために二次元電気泳動法、質量分析計を用いてアルツハイマー病脳試料についてプロテオーム解析を行った。その結果、ミエリン塩基性蛋白質(MBP)、グリア繊維酸性蛋白質(GFAP)、ビメンチンがシトルリン化されていることを同定した。この成果は基にシトルリン化分子特異的抗体を作製に資するものである。培養神経細胞SH-SY5を用いて6-ヒドロキシドーパミンによる酸化ストレスがカルシウム存在下でPeptydilarginedeiminase(PAD)を活性化し、シトルリン化を生ずることを証明した。現在、このシトルリン化された分子の同定をプロテオーム解析および質量分析機による解析を行っている。レチノイン酸処理によりSH-SY5にはPADの発現が亢進することがわかった。しかし酸化ストレスによってはPAD発現が亢進しないことが明らかとなった。また初代培養神経細胞においても同様の治験が得られており、アルツハイマー病脳に於けるシトルリン化分子の増加を説明できる現象と考えられる。ヒトPADを遺伝子組み換え技術により作製した。その組み替え蛋白質の活性はin vitroで種々の分子をシトルリン化することを確認している。これらの組み替え蛋白を用いてヒトの各サブタイプに対する抗体を作製して血中レベルでの測定系を開発している。現在、収集している健常者と多様な患者血清中のPADの定量化を行う予定である。
モノクロ-ナル抗体を用いる新しい核医学診断法、治療法の開発に関する研究

放射性同位元素で標識したモノクロ-ナル抗体は試験管内、生体内で対応する抗原に特異的に結合する。従って、核医学的手法を用いて標識モノクロ-ナル抗体の生体内分布を映像化することにより、癌、心筋梗塞、血栓症の画像診断ができるのみならず、副作用の少ない新しい癌治療法に発展するものと期待される。これまでの放射性同位元素標識モノクロ-ナル抗体を用いる研究をさらに発展させ、その安全性、臨床的有用性を検討するとともに、投与したモノクロ-ナル抗体の体内分布に影響する因子についても検討した。動物実験ではI-131、In-111標識モノクロ-ナル抗体を用いて高い病巣/正常組織比が得られ、大腸癌、血栓症、心筋梗塞の画像診断を行うことができる。同じI-131、In-111標識モノクロ-ナル抗体をヒトに投与し、その臨床的有用性ならびに安全性を検討したが、いずれの抗体の投与でも副作用は認められず、安全に投与されることが確かめられた。例えばIn-111で標識したCEAに対する抗体ZCE-025を用いれば、5例中5例とも大腸癌の原発巣を診断することができる。またX線CTなどこれまでの画像診断では得られない情報を得られ、本法が大腸癌のスクリ-ニングにも応用されることを示唆する。しかし投与した抗体はいずれもマウス由来のため、患者血中に抗マウス抗体ができることは避け難い。F(ab′)_2、Fabを用いれば、抗マウス抗体はほとんど生じないことが明らかとなったが、大部分をヒト型としたマウス/ヒト・キメラ型抗体は、生じた抗マウス抗体とほとんど反応しないなど、安全性に関する研究も進みつつある。今後さらに画像診断に適したモノクロ-ナル抗体の開発に伴って、同じ原理により治療への臨床応用も発展するものと期待される。基礎的検討としてヒト癌細胞を移植したヌードマウス、血栓を作成したウサギを用いて放射性ヨード、インディウムー111、ガリウムー67、テクネティウムー99mなどの放射性同位元素で標識したモノクローナル抗体を投与。経時的に抗体の体内分布を測定し、画像診断の基礎的な検討を行った。抗体の標識に用いるキレート剤および結合試薬によりその体内分布、腫瘍集積性は著しく異なる。生体内で放射性同位元素とモノクローナル抗体が安定した結合を示し、腫瘍に強く集積したのはチオエーテル(-C-S-)結合であることが明らかとなった。従って画像診断に用いる放射性同位元素と抗体の結合のみならず、抗癌剤とモノクローナル抗体の結合にもチオエーテル結合が最も望ましいと考えられた。これまで癌に対するモノクローナル抗体は多数作製されているが、インビボ利用に適した抗体の選択法は確立していない。そこで放射性同位元素で標識したモノクローナル抗体と手術より得られた癌組織とを用いた簡便な方法を開発した。臨床応用として悪性黒色腫、大腸癌患者を対象にインディウムー111標識モノクローナル抗体を用いるシンチグラフィの臨床的有用性を検討した。動物実験のみならず悪性腫瘍患者でも抗体は腫瘍に集積し、癌の部位、性状が明らかとなった。免疫組織染色による抗原の存在とシンチグラムの所見が一致し、抗原、抗体反応により放射性同位元素で標識した抗体が、腫瘍に集積すると考えられる。これらモノクローナル抗体を用いた画像診断は特異性に優れており、全身を検索できる有用な検査法で、これまで副作用は経験していない。核医学的手法を用いて標識モノクロ-ナル抗体の生体内分布を映像化することにより、癌、心筋梗塞の画像診断の安全性、臨床的有用性を検討するとともに臨床応用に適したマウス/ヒト型キメラ抗体に関する基礎的研究を行った。Ih-111標識モノクロ-

ナル抗体を用いる大腸癌、心筋梗塞の画像診断で、70-80%の病巣を検出し、臨床的にも有用であった。しかし小さな病変、早期癌の診断は困難であり、腫瘍/正常組織比も3-10倍で、治療に用いるには十分な放射線吸収線量を得ることができない。今後さらに腫瘍/正常組織比を高くすること、肝臓、骨髄への取り込みを減少させる研究が欠かせないと思われる。いずれのモノクロ-ナル抗体の投与でも副作用は認められず、安全に投与されることが確かめられた。しかし投与した抗体はいずれもマウス由来のため、患者血中に抗マウス抗体ができることは避け難い。放射性同位元素で標識したモノクロ-ナル抗体の投与後に患者血中に産生される抗マウス抗体価は、投与する抗体がIgGか、あるいはそのF(ab')_2、Fab分画か、および投与する抗体量により異なり、Fab分画では406例中5例と著しく少ない。さらに抗原結合部位のみマウス型を残し、他をヒト型抗体と置換したマウス/ヒト型キメラ抗体を作製したところ元のマウス型抗体とほぼ同じ免疫活性、病巣集積性を有すること、抗マウス抗体の産生はF(ab')_2、Fab分画の場合よりもさらに低くなることより、マウス/ヒト型キメラ抗体の臨床検討が待たれる。今後さらに画像診断に適したモノクロ-ナル抗体の開発に伴って、同じ原理により治療への臨床応用も発展するものと期待される。
脊髄損傷および中枢神経疾患により失われた排尿制御機能に対する細胞移植神経再生治療

脊髄損傷および中枢神経疾患によって排尿制御機能が失われる状態というのは、臨床的な病態としては、尿の排出障害もしくは頻尿・尿失禁をおこす蓄尿障害である。今年度の研究においては蓄尿障害についての解明に研究の重点をおいた。そのターゲットとして、われわれが注目したのは、平成15年度までの研究成果より、アドレナリン受容体とニューロキニン受容体である。これらの受容体と、最近、注目されているATPについての関連性の検討を行った。SD種雌ラットを使用して実験を行った。膀胱内のニューロキニン受容体を選択的に不活性するレジニフェラトキシンを前日に投与して、カプサイシン、酢酸、ATP膀胱内注入による膀胱内圧曲線上の変化を検討した。カプサイシンおよび酢酸は膀胱内のニューロキニン受容体を特異的に刺激し、膀胱過活動を誘発するが、レジニフェラトキシンを投与した動物においては、その膀胱過活動はみられなかった。しかし、ATPを投与したラットにおいては、膀胱の過活動は弱いながらも認めた。このことより、ATPを介する膀胱収縮にはニューロキニン受容体も一部、関与する可能性があることを突き止めた。この新しい機序の解明結果に基づいて、神経再生の可能性についての検討も行ったが、明確な結論を得るまでにはいたらず、今後の検討課題として残った。しかしながら、臨床応用の可能性についての検討も行っている。脊髄損傷の患者における頻尿・尿失禁は膀胱のニューロキニン受容体を介するものであることが示唆されている。そのため、ニューロキニン受容体を脱感作する薬剤であるカプサイシンおよびレジニフェラトキシンを実際に7名の脊髄損傷患者の膀胱内に注入し、一定の効果が得られることを解明した。また、膀胱に尿がたまると痛みを生じるために頻尿を生じる疾患である間質性膀胱炎についてもニューロキニン受容体の関与の可能性があることも突き止めた。平成15年度は神経再生医療を行うための、脊髄損傷および中枢神経疾患病態モデルの確立を主に行った。1.コントロールとしての正常ラットの膀胱内圧検査法の確立メスのSD種ラットを用いて、膀胱内圧用のカテーテル、および薬剤投与(経動脈、経静脈、脊髄内、大脳側室内)用のカテーテルを留置し、覚醒状態で膀胱内圧検査を行えるモデルを確立した。2.脊髄損傷モデルの確立胸椎7-8レベルでの脊髄損傷モデルを、マイクロウェーブを利用して凝固する手法を用いて作成した。損傷後3日目より膀胱内圧検査を行ったが、約2週目より排尿反射弓の過活動による膀胱収縮が認められることが判明した。3.パーキンソン病モデルの確立ラットの腹腔内にCarbidopaおよびL-DOPAを投与することにより、中枢の大脳黒質を薬剤で刺激する手法を用いて、パーキンソン病ラットで認められる膀胱過活動状態を再現することが可能となった。4.脳血管障害モデルの確立ラットの片方の内頚動脈を閉塞する手法を用いて脳血管障害モデルを作成した。その後、翌日より膀胱内圧検査を行い、翌日には膀胱過活動状態を認めることが判明した。5.上記の病態モデルに対して、コントロールと同様に膀胱内圧用のカテーテル、および薬剤投与(経動脈、経静脈、脊髄内、大脳側室内)用のカテーテルを留置し、覚醒状態で膀胱内圧検査を行える手技を確立したこれらの実験結果をもとに、再生が可能であるかを平成16年度に行う予定である。

そのターゲットとして、われわれが注目したのは、平成15年度までの研究成果より、アドレナリン受容体とニューロキニン受容体である。これらの受容体と、最近、注目されているATPについての関連性の検討を行った。SD種雌ラットを使用して実験を行った。膀胱内のニューロキニン受容体を選択的に不活性するレジニフェラトキシンを前日に投与して、カプサイシン、酢酸、ATP膀胱内注入による膀胱内圧曲線上の変化を検討した。カプサイシンおよび酢酸は膀胱内のニューロキニン受容体を特異的に刺激し、膀胱過活動を誘発するが、レジニフェラトキシンを投与した動物においては、その膀胱過活動はみられなかった。しかし、ATPを投与したラットにおいては、膀胱の過活動は弱いながらも認めた。このことより、ATPを介する膀胱収縮にはニューロキニン受容体も一部、関与する可能性があることを突き止めた。この新しい機序の解明結果に基づいて、神経再生の可能性についての検討も行ったが、明確な結論を得るまでにはいたらず、今後の検討課題として残った。しかしながら、臨床応用の可能性についての検討も行っている。脊髄損傷の患者における頻尿・尿失禁は膀胱のニューロキニン受容体を介するものであることが示唆されている。そのため、ニューロキニン受容体を脱感作する薬剤であるカプサイシンおよびレジニフェラトキシンを実際に7名の脊髄損傷患者の膀胱内に注入し、一定の効果が得られることを解明した。また、膀胱に尿がたまると痛みを生じるために頻尿を生じる疾患である間質性膀胱炎についてもニューロキニン受容体の関与の可能性があることも突き止めた。
微粒子を含む系の凝固における分子間力の作用と制御

粒子を含む液体が凝固するとき,その粒子を捕捉しながら凝固層を形成するのが一般的である。しかし,粒子状物質が細かく凝固速度が遅い場合,微粒子は凝固の進行に伴い掃き出され,粒子を含まない凝固層を形成する現象が生じる。本研究では,凝固時に生じる粒子状物質および気泡の掃き出し・捕捉現象に対し,電気二重層力を主としたモデルによる理論を示すとともに,実験結果と比較検討することにより以下の事項を明らかにした。(1)表面電位の異なるシリカ粒子,アルミナ粒子およびベントナイト粒子を対象として,粒子を含む水の一方向凝固実験を行い,粒子の掃き出しおよび捕捉現象を凝固速度および粒子径と関係づけて明らかにした。(2)分子間力として電気二重層力およびvan der Waals力を考慮し,粘性抵抗力,重力を加えたモデルにより限界凝固速度を理論的に求め,実験結果との比較検討を行った。(3)ガラス粒子一塩化ナトリウム水溶液系の一方向凝固実験を行い,塩化ナトリウム水溶液中では粒子の掃き出し現象がほとんど生じないことを示し,限界凝固速度に対する理論結果と実験結果との比較検討を行った。(4)多数の粒子が液中に分散して存在する粒子分散液の凝固実験を行い,コロイド液体の凝固の立場から,粒子の掃き出し・捕捉現象を明らかにした。(5)液中の溶存空気が飽和状態の場合と不飽和状態の場合に対し,溶存気体を含む水の凝固時における気泡の捕捉・掃き出し現象を実験的に明らかにするとともに,凝固時における捕捉・掃き出し現象に対する固体粒子と気泡の違いを明らかにした。粒子状物資を含む液体が凝固するとき,その粒子を捕捉しながら凝固層を形成するのが一般的である。この現象は,粒子強化複合材料の生成,凍結分離,食品凍結,寒冷地における凍土において重要な課題である。本研究では,凝固時に生じる粒子状物質の掃き出し・捕捉現象を統一的に理解することを目的とするもので,本年度は具体的には以下の事項を明らかにした。(1)ガラス粒子-水系の一方向凝固実験により,粒子の掃き出し・捕捉現象が凝固速度および粒子径に大きく依存することを示し,粒子径が小さくなるほど粒子の掃き出し限界となる凝固速度は上昇することを実験的に明らかにした。(2)ガラス粒子-塩化ナトリウム水溶液系の一方向凝固実験により,塩化ナトリウム水溶液中では粒子の掃き出し現象がほとんど生じないことを示し,電気二重層力が重要な意味を持つことを実験的に明らかにした。(3)凝固時に生じる粒子の掃き出し・捕捉の挙動において,電気二重層力およびvan der Waals力が重要となることを示し,粘性抵抗力,重力を加えたモデルを提示し,限界凝固速度を理論的に求め,実験結果との比較によりモデルの妥当性を示した。(4)マイクロ波を付与した場合の一方向凝固実験を行い,粒子の掃き出しおよび捕捉現象を観察するとともに、マイクロ波の付与により限界凝固速度が低くなることを実験的に明らかにした。本研究では,凝固時に生じる粒子状物質の掃き出し・捕捉現象を統一的に理解するとともに,添加物の付与により電気二重層力の制御による限界掃き出し凝固速度について理論的・実験的に検討し,以下の事項を明らかにした。(1)ガラス粒子-水系の一方向凝固実験を行い,粒子の掃き出しおよび捕捉現象を凝固速度および粒子径と関係づけて明らかにした。

(2)分子間力として電気二重雇力およびvan der Waals力を考慮し,粘性抵抗力,重力を加えたモデルにより限界凝固速度を理論的に求め,実験結果との比較検討を行った。(3)ガラス粒子-塩化ナトリウム水溶液系の一方向凝固実験を行い,塩化ナトリウム水溶液中では粒子の掃き出し現象がほとんど生じないことを示し,限界凝固速度に対する理論結果と実験結果との比較検討を行った。(4)ガラス粒子-塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム水溶液系の一方向凝固実験を行い、吸着性の高い表面活性剤イオンによる電気二重層力の効果を明らかにするとともに,粒子が掃き出される限界凝固速度を増大させる可能性を示した。(5)気体を含む水溶液の凝固実験を行い,気泡の捕捉・掃き出し現象を実験的に明らかにするとともに,凝固時における掃き出し・捕捉現象に対する固体粒子と気泡の違いを明らかにした。
Na^+ポンプとH^+ポンプのエネルギ-変換と調節の分子機構

Na^+ポンプとH^+ポンプのエネルギ-変換と調節の分子機構1.Na^+ポンプに蛍光供与体・受容体となる2種類のケイ光プロ-ブ(BIPMとFITC)を導入した標品を用い両プロ-ブ間のエネルギ-移動をNa^+ポンプ反応サイクル中の反応中間体蓄積条件下で測定した。その結果両プロ-ブ間のエネルギ-移動はNaE_1からE_1P及びE_2Pの形成に伴って全体としては増加の方向へ、E_2PからKE_2更にNaE_1への変化でエネルギ-移動が減少する方向に変化することが明らかにされた。この間に両プロ-ブ間の流動性はほとんど変化しないことも明らかになった。一方BIPMSANMを導入した標品を用いて同様の解析を行い、現在BIPMーFITCプロ-ブ間のエネルギ-移動と逆の変化が検出され始めている。目下、これらのエネルギ-移動がプロ-ブ間距離の変化を示しているのか否かを研究している。2.Na^+ポンプとH^+ポンプのリン酸化と脱リン酸化及び構造変化を比較した。その結果、Na^+ポンプに関してリン酸化及び脱リン酸と構造変化は強く共役しておらず、構造変化を反映するのは、Na^+とK^+のNa^+ポンプ分子内の移動であることが強く示唆された。従来ポンプの反応機構は化学的に安定な反応中間体EPのADPとKに対する反応性の差をメルクマ-ルに解析されてきた。E_1P及びE_2Pは共にアスパルテイルリン酸結合をもつ安定な化学種である。しかし我々の従来までの研究成果は、E_1P及びKE_2にそれぞれコンフォメ-ション的に区別できる状態の存在することを強く示唆している。実事、Na^+とK^+のポンプ分子内の移動は連続した現象であり、イオン輸送の機構を解明するためには、我々の発見したE_1PやKE_2におけるイオンの分子内移動を定量化する事が重要と思われる。H^+ポンプの構造変化を内因性トリプトファン残基の蛍光、BIPM及びFITCプロ-ブを導入した標品を用いて研究した。トリプトファン(Trp)の蛍光はH^+結合酵素(HE_1)がMgATPと反応し蓄積した後に増加する事が示唆された。K^+結合酵素(KE_2)のTrp蛍光はHE_1のそれと区別できなかった。一方BIPM蛍光の減少とEP形成の増加の時間経過はほぼ一致した。KE_2形成に伴いBIPM蛍光はわずかに増加した。従ってTrp蛍光とBIPM蛍光はすでにNa^+ポンプで我々が明らかにしたようにH^+ポンプにおいても異なった状態を反映していることは明白である。3.Na^+ポンプのATP結合部位付近をpyrdoxal phosphateでラベルしpyridoxalケイ光でポンプの構造変化を追跡可能にする事を確立することを試みた結果、pyrloxal phosphateがNaE_1ではLys664にKE_2ではLys469とLys664に導入されていることが示唆された。現在この点を確認中である。またこの標品はATPからのEP形成能を欠くがactyl phosphateによるリン酸化能はあまり阻害されていないことが示された。4.Na^+ポンプにおけるリン脂質の役割を構造変化を目安に研究した。その結果、BIPMプロ-ブ(Cys966)近くの微少環境はphospholipase処理の感受性であるがFITC(Lys501)プロ-ブ近くのそれは非常に安定であることが示された。従来リン脂質がポンプタンパクのどの部位に存在するかは不明であったがこれらの研究でCys964の近くにリン脂質の存在することが示唆された。5.Na^+ポンプとH^+ポンプの調節がポンプのc末端付近に存在するArgArgXSer配列のSer残基のリン酸化によって調節されるか否かを明らかにするため、この部位をリン酸化すると思われるCyclicAMP依存プロテインキナ-ゼを我々がNa^+ポンプを精製しているブタ腎赤外髄質から精製した。この標品を用いるとNaポンプのα鎖当り約1モルのリン酸化が生じた。目下本キナ-ゼによるNa^+ポンプのリン酸化による活性変動及びリン酸化部位の同定を試みている。