hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネ花粉の発達過程における転写制御と高温障害による不稔のメカニズム

イネより単離した新規転写因子遺伝子について、シロイヌナズナのMYB80と比較すると、MYBドメインとMYB80に特有な領域を含む保存領域のアミノ酸配列では、88%と非常に高い相同性を示した。CRISPR/Cas9システムにより、遺伝子欠損系統を作出したところ、開花期の葯が小さく扁平で内部に花粉粒のない状態となり、この遺伝子が正常な花粉の形成に必須の役割を担っていることが示された。このイネMYB80様遺伝子は、小胞子期の葯に特異的な発現を示し、高温不稔を誘導する条件下で発現が著しく抑制された。その動態はすでに同定されている高温応答性遺伝子群と類似しており、現在その制御様式の解析を進めている。本研究は、イネの高温不稔を主題として、成熟花粉形成の分子基盤と高温ストレスに対する応答とを明らかにすることを目指している。これまでの研究から、高温によりタペート内での遺伝子発現制御が攪乱され、花粉の柱頭への相互作用能が低下して不稔が起こるというモデルが立てられている。そこで本研究では、タペートの機能不全を中心課題と位置づけ、タペートで働く転写因子に着目し、その制御様式や機能を明らかにする。今年度は、2つのMYB様転写因子遺伝子を単離した。これら2つの転写因子は、アミノ酸配列で約28%の相同性、約64%の類似性を示し、いずれも小胞子期の葯で特に発現が高い。これまでの研究において、2日間の高温処理によって不稔が誘導されることがわかっているが、その高温処理の時期とこれらの転写因子遺伝子の発現時期が重なることが確認された。また、すでに同定している高温応答性遺伝子群のなかには、MYB結合配列をもつものがあり、これらの転写因子の制御を受ける可能性が考えられる。そこで、これらの転写因子の花粉の発達過程における機能を明らかにする目的で、遺伝子の過剰発現やノックダウン解析を行うための形質転換イネを作製している。これらの形質転換体が得られた後、その表現型を解析するとともに、高発現や発現抑制により影響を受ける下流の遺伝子群を探索する予定である。また、高温によってどのような障害を受けるのかを明らかにする目的で、花粉の発芽特性を解析する。イネ花粉の培地上での発芽試験は、実験材料や実験を実施するときの環境条件によって左右されやすく、無処理花粉でも発芽効率が低いという問題点がある。そこで、まず無処理の花粉が安定して高い発芽率を示すような実験条件を設定するための検討を行った。本研究は、イネの高温不稔を主題として、成熟花粉の形成過程の分子基盤と高温ストレスに対する応答機構を明らかにすることを目指している。これまでの研究から、高温によるタペートの機能不全が不稔を引き起こしていると考えられる。そこで本研究では、タペートで働く転写因子に着目し、その制御様式や機能を明らかにすることを目指す。前年度までに単離したイネのMYB様転写因子遺伝子についての解析を進めた。単離したイネ遺伝子とシロイヌナズナMYB80遺伝子とで、まずコード領域を比較すると、MYBドメインを含む保存領域では88%と非常に高い相同性を示したが、その他の領域にはほとんど類似性が見られなかった。プロモータ領域については、一部の転写因子結合モチーフを除いて類似性がほとんど見られなかった。シロイヌナズナMYB80のプロモータ領域にはMYB転写因子結合モチーフが2つあり、負の自己発現制御の可能性が示唆されているが、イネの場合には、はっきりしたMYB転写因子結合モチーフが見つからないことから、シロイヌナズナとは発現制御様式が異なる可能性が考えられた。イネとシロイヌナズナのプロモータ領域に共通して存在する転写因子結合モチーフの機能解析に重点を置きながら、詳細な解析を行う必要がある。また、高温が花粉に与える影響を調べる目的で、花粉の発芽特性を解析している。イネ花粉の培地上での発芽試験は、実験材料や実験環境によって左右されやすく、正常な花粉を用いた場合でも発芽効率が低いという問題点があった。実験条件や実験手技の改良を行ったところ、発芽効率の改善が見られたので、今後は、高温処理後の花粉について、正常花粉との比較解析を行う予定である。本研究は、イネの花粉形成過程の分子制御システムと高温条件下での不稔の発生メカニズムを明らかにすることを目的としている。これまでの研究から、高温ストレスによるタペートの機能不全が鍵となって不稔が誘発されると考えられる。そこで本研究では、タペートで働く転写因子に着目して、花粉形成過程における機能や制御様式を明らかにすることを目指す。イネより単離したMYB様転写因子遺伝子についての解析を進めた。CRISPR/Cas9システムを用いて、MYB様転写因子のコード領域のうち、MYB転写因子に共通のドメインとMYB80に特有の領域とに変異の導入を試みた。機能欠損の程度が様々に異なると予想される変異が導入された多数の変異体が得られたので、現在、それらの変異が花粉形成に与える影響を調べている。また、これまでに同定した高温により発現が低下する遺伝子群のうちで、MYB転写因子結合モチーフをもつと考えられるものについて、上流領域の単離と解析を進めているところである。また、高温が花粉に与える影響を明らかにする目的で、花粉の発芽特性の解析を進めている。イネ花粉の培地上での発芽試験の条件を改善し、安定的な発芽効率が認められるようになった。高温処理後の花粉は、無処理の花粉に比較して、培地上に飛散する花粉数が少なく発芽効率も低いことが確かめられた。

これは、高温処理条件下のイネの穎花で観察されていた、開花期に柱頭上に付着する花粉粒数が少なく発芽率も悪いという事象に矛盾しない結果である。高温処理後の花粉粒の飛散が少ないという点に関しては、葯の裂開が正常に起こっているかどうか、花粉粒の性質が変化して飛散しづらくなっているのかどうか、について調べていく予定である。イネより単離したMYB様転写因子遺伝子について、多様な変異をもつ機能欠損型の変異体が複数得られるなど、おおむね順調に研究が進んでいる。本研究は、イネの花粉形成過程の分子制御システムと高温条件下での不稔の発生メカニズムを明らかにすることを目的としている。これまでの研究から、高温ストレスによる不稔の発生には、タペートの機能不全が鍵となっていると考えられる。そこで本研究では、タペートで働く転写因子に着目して、花粉形成過程における機能や制御様式を明らかにすることを目指す。イネより単離したMYB様転写因子遺伝子について、シロイヌナズナのMYB80と比較すると、MYB転写因子群に共通のドメインとMYB80に特有の領域を含む保存領域では88%と非常に高い相同性を示したが、その他の領域にはほとんど類似性が見られなかった。この遺伝子の機能を解析する目的で、CRISPR/Cas9システムを用いて遺伝子機能欠損系統を作出した。MYB様転写因子のコード領域の内部でコドンの読み枠がずれるような変異が導入された変異系統は、開花時の葯が野生型に比較して小さく内部に花粉のない状態となり、雄性不稔の表現型を示した。MYBドメインとMYB80に特有の領域の3カ所に変異を導入したが、いずれの部位においても同様の結果となり、この転写因子が正常な花粉の形成に必須の役割を担っていることが示された。今後、これらの変異系統を詳細に観察し、花粉形成のどの過程で異常が生じているのかを詳細に解析する予定である。このMYB様転写因子遺伝子は小胞子期の葯に特異的な発現特性を示し、葉や根、成熟した葯などの器官ではmRNAが検出されなかった。また、高温不稔を誘導する条件下で、このMYB様転写因子遺伝子のmRNAレベルは高温処理開始後速やかに低下し、高温応答に関与する可能性が示唆された。このMYB様転写因子が、すでに同定されている高温応答性遺伝子群の転写制御に関わっているかどうか解析を進めている。イネより単離した新規転写因子遺伝子について、シロイヌナズナのMYB80と比較すると、MYBドメインとMYB80に特有な領域を含む保存領域のアミノ酸配列では、88%と非常に高い相同性を示した。CRISPR/Cas9システムにより、遺伝子欠損系統を作出したところ、開花期の葯が小さく扁平で内部に花粉粒のない状態となり、この遺伝子が正常な花粉の形成に必須の役割を担っていることが示された。このイネMYB80様遺伝子は、小胞子期の葯に特異的な発現を示し、高温不稔を誘導する条件下で発現が著しく抑制された。その動態はすでに同定されている高温応答性遺伝子群と類似しており、現在その制御様式の解析を進めている。前年度までに単離したイネのMYB様転写因子遺伝子について、機能解析やプロモータ領域の解析を進めるなど、おおむね計画に従って進んでいる。
分化細胞を幹細胞に変えるマスターレギュレーターSTEMINの機能解析

ヒメツリガネゴケの転写因子STEMIN1は、茎葉体に単独で発現させるだけで、葉細胞から幹細胞を直接誘導することができる。本研究により、STEMIN1とSTEMIN1パラログ遺伝子は、傷害刺激によって誘導される幹細胞化だけでなく、通常発生過程での幹細胞化も制御していることが明らかになった。またSTEMIN1直接標的遺伝子には、転写抑制に機能しているヒストンH3K27me3が局在しており、STEMIN誘導後には、その修飾レベルが低下したことから、STEMIN1はヒストン修飾制御を介して、幹細胞化に必要な遺伝子の発現を制御していることが示唆された。(1) STEMINパラログ遺伝子の機能解析:STEMINL1およびSTEMINL2遺伝子のプロモーターにGFP-GUS融合遺伝子を連結させたコンストラクトをヒメツリガネゴケに導入し、それらのプロモーター活性を調べた。STEMIN遺伝子のプロモーターと同様、切断葉および原糸体での幹細胞化過程でそれらのプロモーターの活性が上昇した。またSTEMIN遺伝子破壊株では、幹細胞化に遅れはなかったが、STEMIN、STEMINL1、STEMINL2遺伝子の3重破壊株で幹細胞化が遅れた。一方、STEMINL1およびSTEMINL2遺伝子をエストロジェン発現誘導系を用いて茎葉体でそれぞれ発現させたが、幹細胞化を誘導しなかった。以上のことから、STEMINパラログ遺伝子も幹細胞化に関与しているが、その機能はSTEMINと異なることが示唆された。(2) STEMINの標的遺伝子および結合因子の探索: STEMIN遺伝子にYFP遺伝子をノックインしたラインを作製したが、幹細胞化過程でYFPの蛍光は観察されなかった。また、エストロジェン発現誘導系を用いてSTEMIN-YFPタンパク質を発現誘導したが、予想外にもSTEMIN-YFPタンパク質の蓄積レベルが低いことが分かった。STEMINの推定アミノ酸配列を調べると、ユビキチンープロテアソーム分解系の標的配列であるD-ボックスが存在していた。そのためSTEMINタンパク質は不安定であると考えられたので、STEMIN-YFPタンパク質を安定化させるための条件検討を行い、クロマチン免疫沈降シークエンスのための実験条件は、ほぼ確立した。(3)トランスクリプトーム解析および幹細胞化に関わる他の因子との関連性:今後の実験を進める上でSTEMINタンパク質の安定化が優先課題であるため、本年度はSTEMIN-YFPタンパク質の抽出条件検討に集中した。STEMIN遺伝子の幹細胞化における機能、および単独で幹細胞化誘導するメカニズムの解明を行うため、以下の解析を行った。(1) STEMINの標的遺伝子の探索:前年度までに、茎葉体を用いたクロマチン免疫沈降の実験方法をほぼ確立したが、さらに断片化したゲノムDNAの回収率を高める必要があった。そこで超音波破砕法からエンドヌクレアーゼであるMicrococcal NucleaseでゲノムDNAを断片化したところ、回収率が上昇し、これまでに二つのSTEMIN直接標的遺伝子を同定することに成功した。この独自に開発した方法を組み合わせて、クロマチン免疫沈降シークエンス(ChIP-seq)を行う予定であったが、ChIP-seqを行えるだけのDNA断片を回収できないことが分かった。そこで、培養が容易で数日のうちに多量の組織を回収できる原糸体に変更し、原糸体を用いたChIP-seqの条件検討を始めた。(2) STEMINタンパク質の安定化: STEMINのD-ボックス配列に変異を入れたmSTEMIN-YFPタンパク質を茎葉体に発現させたところ、mSTEMIN-YFPタンパク質が安定化したが、幹細胞化を誘導できなかった。このことから、STMEINによる幹細胞誘導は、STEMINタンパク質の分解が必要であることが示唆された。(3)トランスクリプトーム解析および幹細胞化に関わる他の因子との関連性: STEMINの機能を明らかにするうえで、STEMINの直接の標的遺伝子の探索が最優先課題であるため、ChIP-seqの条件検討に集中した。1. STEMIN標的遺伝子の探索:(a) STEMIN-YFPを発現する原糸体を用いてChIP-seqを計画したが、STEMINにMycタグを融合させたタンパク質を発現するライン(STEMIN-Mycライン)で、茎葉体サンプルのChIP-seqに成功し、STEMIN結合部位を同定できた。また、茎葉体にSTEMINを12時間発現誘導したときのRNA-seqデータを勘案し、STEMINの直接標的遺伝子として98遺伝子を同定した。それら多くの遺伝子は、遺伝子発現の抑制に機能しているヒストンH3K27me3と、遺伝子発現の活性化に機能するヒストンH3K4me3の両方でマークされている状態、すなわちバイバレントな状態であることが分かった。(b)茎葉体サンプルでのChIP-seqに成功したため、STEMIN誘導後の経時的なRNA-seq解析も、原糸体を取り止め茎葉体で行うことにした。STEMIN標的遺伝子は、切断葉の幹細胞化過程において切断後24時間目までに発現が上昇することから、STEMIN誘導後、1, 3, 6, 12, 24時間目の茎葉体のサンプリングを行った。2. STEMIN結合タンパク質の探索:STEMIN-Mycラインを用いることで、茎葉体サンプルでの免疫沈降が可能であることが分かった。そこで、STEMIN-Myc複合体を精製するためのタンパク質抽出の条件検討を開始した。3. STEMIN

遺伝子制御ネットワークの解明:STEMINの機能を明らかにするうえで、STEMINの直接標的遺伝子、およびその結合タンパク質の探索が最優先課題であるため、上記の1.2.の実験に集中した。STEMIN-YFPラインを用いたが実験条件を多数検討してもChIP-seqのための沈殿が生じなかったため。(1)幹細胞化におけるSTEMINの機能:STEMINが結合する多くの遺伝子領域に、転写抑制に機能しているヒストンH3K27me3が局在していたことから、STEMINがヒストン修飾の制御を介して、幹細胞化に必要な遺伝子の発現を制御している可能性が考えられた。STEMINの機能を解明するうえで、この仮説の検証が必要不可欠であると考え、STEMIN誘導後のヒストン修飾変化に焦点をあてた。(a) H3K27me3抗体を用いたChIP-seq解析によりSTEMIN発現誘導後のH3K27me3レベルを調べたところ、多くのSTEMIN標的遺伝子においてH3K27me3レベルが減少することが分かった。(b) STEMIN誘導後の経時的なRNA-seq解析を行なう予定であったが、STEMIN標的遺伝子の発現とヒストン修飾変化の関係を調べることが優先課題であると考え、いくつかの標的遺伝子について、STEMIN誘導後の経時的な遺伝子発現とH3K27me3レベル変化について解析を行っている。(2) STEMIN結合タンパク質の探索:STEMIN-Mycラインを用いてインタラクトーム解析を計画していたが、STEMIN-Mycタンパク質が不安定であるため、質量分析を行うための十分量の免疫沈降産物を得ることができなかった。そこで、アミノ酸置換により安定化させた変異型STEMINとMycタグを融合したタンパク質を発現させた茎葉体から核タンパク質を抽出し、Myc抗体を用いて免疫沈降を行い、質量分析計で解析したところ、免疫沈降産物に含まれているいくつかのタンパク質を特定することに成功した。(3) STEMIN遺伝子制御ネットワークの解明: STEMINによるヒストン修飾の制御、およびSTEMIN結合タンパク質の探索が最優先課題であるため、上記の(1)、(2)の実験に集中した。ヒメツリガネゴケの転写因子STEMIN1は、茎葉体に単独で発現させるだけで、葉細胞から幹細胞を直接誘導することができる。本研究により、STEMIN1とSTEMIN1パラログ遺伝子は、傷害刺激によって誘導される幹細胞化だけでなく、通常発生過程での幹細胞化も制御していることが明らかになった。またSTEMIN1直接標的遺伝子には、転写抑制に機能しているヒストンH3K27me3が局在しており、STEMIN誘導後には、その修飾レベルが低下したことから、STEMIN1はヒストン修飾制御を介して、幹細胞化に必要な遺伝子の発現を制御していることが示唆された。STEMIN-YFPタンパク質を発現させた茎葉体を用いて、ChIP-qPCRの実験条件を確立し、二つのSTEMIN標的遺伝子を同定することに成功した。ChIP-seq解析も、茎葉体から原糸体に変更することで、十分量な組織を回収することが期待でき、次年度でChIP-seq解析を行うことが可能となった。
新構造をもつ0価パラジウム、白金平面四核錯体の合成と機能開拓

有機ケイ素配位子、有機ゲルマニウム配位子を有するパラジウム、白金の平面四核錯体の合成と構造決定を行なった。シリル架橋、ゲルミル架橋白金二核錯体を独自の方法によって合成し、その反応経路について詳細に検討した。すなわち、トリシクロヘキシルホスフィン配位子を有する0価白金錯体とジアリールシラン、ジアリールゲルマンとを反応させることによって、架橋シリルおよび架橋ゲルミル配位子で連結された二個の1価白金からなる二核白金錯体を合成することができた。架橋シリル二核白金錯体の生成反応においては、中間に生成する非対称型の二核錯体の存在を確認することができ、この二核錯体が有機ケイ素化合物と反応して熱力学的に安定な対称型二核錯体を生成していることを明らかにした。二核構造を有する架橋ジフェニルシリル基白金錯体と架橋ジフェニルゲルミル基二核白金錯体をキレート性のビスホスフィンと混合加熱したところ、それぞれ3個の架橋シリレン、架橋ゲルミレン配位子を有する平面型四核白金錯体が生成した。これらの錯体はいずれもX線結晶構造解析によって分子構造を明確に決定した。架橋シリレン四核錯体と架橋ゲルミレン四核錯体とでは白金-ケイ素、白金ゲルマニウム結合の長さの違いによって、その分子サイズが異なることが明確になった。架橋ゲルミレン四核白金錯体の生成機構について、モデル錯体を用いて検討を行った。キレートイホスフィン配位子を有する単核0価白金錯体と二個のゲルミル配位子を有する単核二価白金錯体との反応を行なったところ、これら錯体の消失とともに、四核錯体が一部生成していることが、溶液のスペクトル変化を観察することによってわかった。0価錯体は溶液中では一部二核0価錯体との平衡にあることから、このような錯体が中間体として四核錯体の生成に関わっていることが理解できた。パラジウムおよび白金を中心金属とする同種および異種金属複核錯体を多数合成した。まず、白金とパラジウムとが有機ケイ素配位子で橋かけした異種金属二核錯体の合成経路を開発した。すなわちジシリル白金錯体と0価パラジウム錯体との反応によってシリレン架橋白金-パラジウム異種金属二核錯体を得ることができた。ここで、シリルパラジウム錯体と0価白金錯体との反応では目的生成物は得られず、合成反応の設計が重要である。各種ホスフィン配位子を用いて同様の化合物を得てその構造を比較した。これらの異種金属二核錯体とイソニトリルとの反応によって新しい単核のシラメタラサイクルを得ることができた。上記で得た、パラジウム-白金二核錯体を原料としてキレート性ビスホスフィン配位子を添加したところ、シリル配位子とボスフィン配位子をもっパラジウム-白金平面四核錯体が生成した。X線結晶構造解析によってその分子構造を明らかにすることができた。中心を白金が占め、その周囲に3つのパラジウム中心がとりかこんでいる。これらの金属間の距離は金属間結合の存在を示唆する。この錯体はNMRによって溶液中でも同じ構造を有していることが明らかになった。分子軌道計算を用いて白金-パラジウム平面四核錯体の構造と結合の解明を行った。構造解析によるパラメーターを用いると、計算が良好に収束し、この分子構造が妥当であることが明らかになった。さらに、結合についても考察したところ、金属間の結合が存在すること、パラジウム同士の結合は、白金-パラジウム間の結合に比較して安定性が低いことを明らかにした。

平面四核錯体にヨウ化銅を添加したところ、金属の形成する平面に銅が橋かけ配位し、3種類5個のd^<10>金属が生成した。これについても結晶構造解析、NMRの測定を行い、結合に関する情報を得た。有機ケイ素配位子、有機ゲルマニウム配位子を有するパラジウム、白金の平面四核錯体の合成と構造決定を行なった。四核錯体の前駆体となるシリル架橋、ゲルミル架橋白金二核錯体の合成反応を詳細に検討した。すなわち、トリシクロヘキシルホスフィン配位子を有する0価白金錯体とジアリールシラン、ジアリールゲルマンとを反応させることによって、架橋シリルおよび架橋ゲルミル配位子で連結された二個の1価白金からなる二核白金錯体を合成することができた。架橋シリル二核白金錯体の生成反応においては、中間に生成する非対称型の二核錯体の存在を確認することができ、この二核錯体が有機ケイ素化合物と反応して熱力学的に安定な対称型二核錯体を生成していることを明らかにした。架橋ジフェニルシリル基二核白金錯体と架橋ジフェニルゲルミル基二核白金錯体をキレート性のビスホスフィンと混合加熱したところ、それぞれ3個の架橋シリレン、架橋ゲルミレン配位子を有する平面型四核白金錯体が生成した。これらの錯体はいずれもX線結晶構造解析によって分子構造を明確に決定した。架橋シリレン四核錯体と架橋ゲルミレン四核錯体とでは白金-ケイ素、白金ゲルマニウム結合の長さの違いによって、その分子サイズが異なることが明確になった。架橋ゲルミレン四核白金錯体の生成機構について、モデル錯体を用いて検討を行った。キレートイホスフィン配位子を有する単核0価白金錯体と二個のゲルミル配位子を有する単核二価白金錯体との反応を行なったところ、これら錯体の消失とともに、四核錯体が一部生成していることが、溶液のスペクトル変化を観察することによってわかった。0価錯体は溶液中では一部二核0価錯体との平衡にあることから、このような錯体が中間体として四核錯体の生成に関わっていることが理解できた。
記憶によるミツバチの巣仲間識別機構の解析

ミツバチの巣仲間識別が環境臭と体表ワックスの「記憶・学習」によるとの仮説に基づき、1)匂いによる識別の行動アッセイ、2)認識指標となる非揮発性体表ワックスの動態の解析3)識別・記憶反応の吻伸展反射による連合学習アッセイ法の開発、4)匂いと非揮発性ワックス成分の識別と記憶の解析、を行った。1)生きた蜂を提示するアッセイ法のほかに、抽出物によるアッセイ形を開発し、同群、異群間の蜂による攻撃度を定量的に評価できるようにした。2)体表ワックスで組成をガスクロマトグラフィーで分析した。組成はコロニーごとに異なっていたが、同一コロニーでは季節を通じてかなり安定しており、それが蜂間どの体表物質のミキシングおよび巣板ワックスのバッファー作用によることが推察された。3)匂いの連合学習を利用する実験系は既に研究に用いられているが、新たに非揮発性のワックス成分に対する吻伸展反射連合学習のアッセイ系を開発、確立した。検討した項目は、条件刺激と無条件刺激の与え方、条件づけの回数と間隔、報酬の糖濃度と学習率の関係、空腹度と学習率の関係、加齢と学習率の関系などである。4)これらのアッセイ系を用い、匂い、非揮発性ワックス成分に対するハチの識別、学習能力を比較解析し、これらがともに高いことを明らかにした。巣仲間識別における自巣の匂い(環墳臭)と仲間間で共有する体表ワックスの「記憶」,およびその更新の重要性を明らかにする目的で,吻伸展反射と連合学習をアッセイ系とした解析を行った.まず連合学習の成立にかかわる基本的条件(空腹度,条件刺激と非条件刺激の回数やタイミング,報酬の与え方など)を検討した後,2種の条件刺激の識別の有無をみる方法として,スクロース水(1.5モル)の報酬と食塩水(2モル)の罰を組み合わせる系を作り,さらに,揮発性のないワックス成分の識別・記憶が評価できる系を新たに開発した.その結果,1)蜂自身が発している匂いと体表ワックスから揮散する環境臭の双方が読まれること,また2)蒸気圧の高い物質を除いた後の体表ワックスも触角で読まれることがわかった.体表ワックスは10^<-2>から10^<-3>蜂当量でも識別が可能で,炭化水素分画にも活性はあったが,遊離脂肪酸を主とする酸性分画がもっとも識別・記憶されやすいことがわかった.これらの結果を踏まえ,蜂が季節その他の要因で動く自巣の匂いやワックス成分の情報をモニターしながらその記憶を常に更新し,チェックを受けるべき蜂から得た情報を,それと照合しながら識別している,とのモデルを作った.2年目は環境臭のワックスヘの吸着と揮散のモデル分子を使った解析と,蜂により合成される非揮発性可読物質群のさらなる検討を行いたい.ミツバチの巣仲間識別が環境臭と体表ワックスの「記憶・学習」によるとの仮説に基づき,1)認識指標となる体表ワックスの動態,2)記憶(テンプレート)の書き換え,3)記憶能力の発現に及ぼす加齢と経験の影響を解析した.1)体表ワックス組成はコロニーごとに異なっていたが,同一コロニーでは季節を通じてかなり安定していた.それが蜂間での体表物質のミキシングおよび巣板ワックスのバッファー作用によることが推察された.また,生合成されるワックスの組成は,加齢状態や共存する蜂の有無などの社会的環境によって可塑的に変わることが示唆された.2)異群の蜂に接していると,かなり短時間の間にそれらの蜂からの情報により,識別する側のテンプレートが書き替えられることが確認された.巣仲間識別の場面では,こうして常に更新されているテンプレートと被検蜂からの認識指標が照合され,異物感がある場合に“非巣仲間"として認識されるものと考えられた.3)巣仲間識別に重要とされる記憶・学習能力を,吻伸展反射時の連合学習をアッセイ系として解析した結果,学習能力は加齢に伴って発達し,働き蜂では十分な学習能力を獲得するのに7から10日間かかった.学習能力の発達と維持には,匂いや仲間からの社会的な刺激(経験)が重要であることも判明した.
がん細胞観察／除去のための新奇マルチモーダルバイオイメージングシステムの開発

本年度は,昨年度に構築した蛍光3次元計測の実験系を元に,位相3次元計測可能なディジタルホログラフィック顕微鏡の光学系を導入し,蛍光と位相の同時計測可能なマルチモーダルディジタルホログラフィック顕微鏡を構築した。細胞核に蛍光タンパク質を導入したヒメツリガネゴケを用いて蛍光と位相の同時センシングを行ない,再構成伝搬計算から焦点の合った3次元像の再構成に成功した。蛍光イメージングからは細胞核の3次元情報が得られ,位相イメージングからは細胞壁などの細胞の構造情報が得られている。このことより,蛍光と位相の同時イメージングにより対象物体から様々な情報を得ることができることを実証した。これらの研究成果をまとめ学術論文に投稿している。さらに国際会議で発表し,研究成果の情報発信を行なった。今後はヒメツリガネゴケの幹細胞化プロセスを観察するためにタイムラプス計測可能なシステムに拡張する。細胞の厚みや核の変化などを同時計測し,細胞の正常及び異常の判定に応用することを試みている。そのために安定した位相計測法の確立が必要である。これまでに構築した物体光と参照光を空間的に分離したオフアクシス光学系から共通光路型に変更する光学系を考案した。ビームスプリッタにより2光束に分離し,片側にはピンホールを挿入することでほぼ同軸型の配置で一様な強度分布をもつ参照光を生成することができる。解像度チャートを用いた位相計測結果から時間的に安定し,かつ定量的に位相計測が可能であることを実証した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は,位相計測用のディジタルホログラフィック顕微鏡と蛍光顕微鏡を組み合わせたマルチモーダルディジタルホログラフィック顕微鏡システムの構築に取り組んだ。はじめに,位相変調型空間光変調素子に回折格子付レンズを表示させ,オフアクシスホログラムの形成による蛍光3次元イメージングを行なった。測定対象として,LED光源からの光を直径10 umのシングルモードファイバに導入し,その射出光を用いた擬似点光源と,直径2-10 umの蛍光ビーズの2つを用いて原理検証実験を行なった。LED光源からの光は蛍光ビーズに比べて強度が大きいため,光学系の調整及び実験検証用として用いた。位相変調型空間光変調素子を用いて回折格子付き焦点レンズを実装し,ターゲットであるLEDからの光及び蛍光ビーズからの蛍光を透過光及び回折光の干渉縞を形成した。実験パラメーターとして,回折角度及び焦点距離を変化させ,種々のオフアクシスホログラムを取得した。LED及び蛍光信号は干渉性の低い低コヒーレンス光源であるため,干渉条件によりホログラムの質が劣化する。取得したホログラムから光波伝搬計算により再生像を取得し,焦点位置で観測したオリジナルなLED射出光と蛍光像とを比較した。蛍光ビーズの深さ位置を移動ステージで変更し,最適な実験条件を取得した。複数の蛍光ビーズを用いた実験により,細胞における3次元蛍光像の観察に向けた実験条件を確認した。また,別のアプローチとして,パターン照明を用いた位相分布計測手法について検討した。10月からの研究を実施したが,蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡システムの構築を行ない,LED及び蛍光ビーズを用いた原理検証実験に成功しているため,おおむね順調に進展しているとした。今年度に構築した蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡に,位相計測を行なうディジタルホログラフィック顕微鏡を導入することで蛍光及び位相の3次元同時計測システムを構築する。構築したシステムを用いて,細胞応用を行なう。
食細胞による高分子微小球の貧食に及ぼす諸因子の研究

従来モルモット多形核白血球による異物粒子の貧食作用に関しては両者の表面電位の違いから論じてきたが、本年度は更に、表面電位はモルモット多形核白血球のそれとほぼ等しいが粒径の異なるラテックス粒子を用いて貧食の程度を検討した。その結果、ラテックス粒子の粒径がおよそ500nmのときに貧食が最大となり、粒径がこれより大きくてもまた小さくても貧食の程度が減少することが分かった。なお、本研究において貧食の程度は食細胞による酸素消費速度の大小により判定している。更に、異物粒子表面上の化学種の種類は食細胞による貧食に大きな影響を及ぼすことが知られているので各種の糖をラテックス粒子表面に化学的に結合し、モルモット多形核白血球によるラテックス貧食に及ぼす糖の種類の影響を検討した。使用した糖類はグルコ-ス、ガラクト-ス及びNーアセチルニュ-ラミン酸で、いずれも6ーアミノヘキシル鎖をスペ-サ-としてラテックス粒子表面のカルボキシル基に結合させた。ラテックス粒子の粒径はほぼ450nmでその表面電位は糖鎖で修飾したものを含むすべての試料に対しておよそー25mVであった。グルコ-ス及びガラクト-ス修飾ラテックス粒子のモルモット多形核白血球による貧食は、粒径及び表面電位の等しい対照ラテックス試料の貧食と比較してほぼ同程度か若干大きくなった。これに対し、Nーアセチルニュ-ラミン酸修飾ラテックスの場合、対照ラテックス試料と比べてその貧食の程度は明らかに低く、しかもラテックス粒子表面のNーアセチルニュ-ラミン酸濃度の高いほど貧食されにくいことが判明した。したがって、異物粒子表面上の化学種、糖鎖、がモルモット多形核白血球による貧食に大きな影響を与えることが明らかとなり、糖の種類を変えることにより、貧食のコントロ-ルが可能となるであろうと予測され、製剤設計上有益な結果が得られた。
赤外熱画像伝送のためのチューブリーキーファイババンドル

ガラス線引法を用いた製作が可能なバンドル型チューブリーキーファイバを提案し,コア径80 μm以下の245本の素子数をもつバンドルの作製に成功した.誘電体層の光学膜厚を波長の1/4の厚さにすることにより,低損失な光伝送が可能となる.製作したファイババンドルは,素子径が小さいにも関わらず低損失な伝送特性を有していることを確認した.続いて硬性内視鏡への応用を考え,長さ30 cmのファイババンドルと直径2 mmのハーフボールレンズを用いて,内視鏡に挿入可能な細径なイメージングシステムを構築した.このシステムの最低検出温度は32.0 °C,体内温度付近での温度の分解能が0.7 °Cであることを確認した.本研究の目的は,内視鏡下での温度画像観察を可能にする細径な赤外光イメージ伝送路を実現するために,複数の空孔がハニカム状に配列されているバンドル型チューブリーキー導波路の開発を行うことである.今年度はまずガラス線引法による導波路作製を試みた.現有の線引き装置を利用し,誘電体薄膜として機能するガラス材料は,比較的低温で線引き可能でかつ可視から中赤外までの広い透過域を有するホウケイ酸ガラスを利用した.あらかじめ先端を封止した直径1 mm程度のガラスキャピラリを20 mm径程度のガラス管に挿入してプリフォームを形成し,それを900°C程度に加熱延伸することでバンドルを形成するが,ここでキャピラリ内部を加圧,外部を減圧することにより,キャピラリ間のデッドスペースをなくし,有効面積を最大化することに成功した.そしてガラス膜厚の制御は,プリフォームに利用するガラスキャピラリの肉厚,線引時の延伸比,および付加圧力差によって行い,対象とする波長3-5ミクロンで低損失となる膜厚を得ることができた.そして硬性内視鏡への応用を考え,製作した長さ30cmのファイババンドルと直径2mmのハーフボールレンズを用いて,内視鏡に挿入可能な細径なイメージングプローブを構築した.このプローブとInSbサーモグラフィーカメラとを組み合わせた熱画像観察システムを構成し,熱画像伝送実験を行ったところ,体温程度のサンプルの熱画像を得ることに成功し,最低検出温度が32.0 °C,体内温度付近での温度の分解能が0.7 °Cという実用レベルの性能を有していることを確認した.初年度は線引き法によるバンドルファイバ製作および製作したファイバの基本的伝送特性の評価の2項目の実施を予定していたが,予定よりさらに進展し,実際に熱画像伝送が可能なシステムの構築およびその特性評価まで到達した.またこの成果はジャーナルに掲載され,国際会議でも発表し大きな反響があった.内視鏡下での温度画像観察を可能にする細径な赤外光イメージ伝送路を実現することを目的として,複数の空孔がハニカム状に配列されているバンドル型チューブリーキー導波路の開発を行った.チューブリーキー導波路とは誘電体薄膜のみで構成されたものであり,本研究では,導波路をバンドル状とした場合の導波路間の結合を考慮した理論検討モデルを構築するともに,ガラス線引法による導波路作製を試み,熱画像伝送が可能な細径伝送路の実現について検討した.本年度ではおもに,バンドル型導波路の導波路間クロストーク抑制の検討を行った.バンドル化した導波路では,通常の導波路間結合のほかに漏れモードによる導波路間クロストークが生じ,それが画像の解像度を低下させる.そこでビーム伝搬法によるシミュレーションや結合についての解析的な手法を用いて,評価を行うとともに,結合を抑制するための構造について検討した.導波路の伝搬定数に差異がある場合には,導波路間の結合係数は低く抑えられるため,素子の直径に故意にゆらぎをもたせた構造について,理論的および実験的検討をおこなった.形状ゆらぎの分布方法としては系方向に直径が変化するタイプや,周方向に分布するタイプなどについて計算を行うとともに試作を通して最適な形状を探索した.次に実際に製作したバンドル型チューブリーキー導波路による熱画像伝送実験を行った.さまざまな条件で作製したバンドル型導波路のクロストークの評価を行った.また放射する赤外光パワーが微弱となる体温程度の物体の観察を試み,位置分解能,温度分解能,最低検出温度などについて,実験によりこれらの評価を行った.また,導波路先端に微少なレンズを取り付けることにより,視野を拡大する方法についても実験的に検討を行った.ガラス線引法を用いた製作が可能なバンドル型チューブリーキーファイバを提案し,コア径80 μm以下の245本の素子数をもつバンドルの作製に成功した.誘電体層の光学膜厚を波長の1/4の厚さにすることにより,低損失な光伝送が可能となる.製作したファイババンドルは,素子径が小さいにも関わらず低損失な伝送特性を有していることを確認した.続いて硬性内視鏡への応用を考え,長さ30 cmのファイババンドルと直径2 mmのハーフボールレンズを用いて,内視鏡に挿入可能な細径なイメージングシステムを構築した.このシステムの最低検出温度は32.0 °C,体内温度付近での温度の分解能が0.7 °Cであることを確認した.今後は熱画像伝送システムの性能向上を目指し,バンドルファイバを構成するそれぞれのファイバ素子の直径にばらつきを与えることにより,ファイバ間のクロストークを低減し,解像度を改善する.そのための理論的な設計およびファイバ製作工程の最適化を行う予定である.医用光工学
凍結濃縮法における氷の結晶軸と除去性能の関係

凍結濃縮法において,生成する氷に一定の結晶軸を持たせることにより,固液界面と結晶軸との関係により不純物の取り込み率にどのような違いが生じるかを実験的に明らかにし,最も除去性能の良い製氷方法を提案することを目的とした.その結果,単結晶氷のc軸を法線方向に持つ面から成長させると,取り込み濃度が2桁ほど近く小さくなることを発見し,そのメカニズムについて明らかにした.さらに,その中でもフラジルアイスからスタートさせる方法が一番取り込み量の少ない方法であることを示した.凍結濃縮法において,生成する氷に一定の結晶軸を持たせることにより,固液界面と結晶軸との関係により不純物の取り込み率にどのような違いが生じるかを実験的に明らかにし,最も除去性能の良い製氷方法を提案することを目的とした.その結果,単結晶氷のc軸を法線方向に持つ面から成長させると,取り込み濃度が2桁ほど近く小さくなることを発見し,そのメカニズムについて明らかにした.さらに,その中でもフラジルアイスからスタートさせる方法が一番取り込み量の少ない方法であることを示した.不純物などの濃縮による除去方法の一つに凍結濃縮法がある。中でも界面前進法は冷却面上に氷を生成させる方法であり、エネルギー消費は大きい反面、除去性能が良いことで知られている。しかし、その際に生成される氷は特に制御していない多結晶であり、氷の異方性という特異な性質を生かす研究は見当たらない。本研究では、生成する氷に一定の結晶軸を持たせることにより、固液界面と結晶軸との関係により不純物の取り込み率にどのような違いが生じるかを実験的に明らかにし、最も除去性能の良い界面前進法を提案することを目的としている。具体的には、塩化ナトリウム水溶液の凝固実験を行い、別途作成した単結晶氷を用いることにより、多結晶、単結晶(c軸を法線方向にしたもの)、単結晶(a軸を法線方向にしたもの)の3種類の氷を冷却面上で成長させ、その上に塩化ナトリウム水溶液を流し、各種氷が凝固成長する際に取り込む溶質の濃度の測定を行った。その結果、結晶構造及び流量,成長速度をパラメータとした凍結濃縮実験の結果から,水溶液中に生成する氷の成長方向に濃度分布が生じることを明らかにした。また、多結晶氷が水溶液中で生成する際、氷の成長と共に結晶の粒径が縮小し,結晶粒子界面での溶質の取り込み量が増加することを明らかにした。さらに、溶質の取り込み量は,多結晶氷,単結晶a軸方向,単結晶c軸方向の順に減少することを明らかにしました.特に、c軸を法線方向に持つ氷の面を成長させると、取り込み濃度が2桁近く小さくなることを明らかにし、違いが生じるメカニズムについても考察を行った。不純物などの濃縮による除去方法の一つに凍結濃縮法がある。中でも流下液膜法は冷却面上に氷を生成させる方法であり、エネルギー消費は大きい反面、除去性能が良いことで知られている。しかし、その際に生成される氷は特に制御されていない多結晶であり、氷の異方性という特異な性質を生かす研究は見当たらない。本研究では、生成する氷に一定の結晶軸を持たせることにより、固液界面と結晶軸との関係により不純物の取り込み率にどのような違いが生じるかを実験的に明らかにし、最も除去性能の良い製氷方法を提案することを目的としている。昨年度は、予め単結晶を作り、c軸を法線方向に持つ氷の面を成長させると、取り込み濃度が2桁近く小さくなることを明らかにすることが出来た。今年度はc軸を法線方向に持つ氷単結晶の製氷方法を2種類検討した。一つ目は、伝熱面温度を融点近傍に保つことにより低い過冷度で自然解消させ、伝熱面上に薄い氷を生成させる方法。固液界面の法線方向はc軸となる。過冷度が大きいと法線方向にデンドライト状の氷が生成してしまい、単結晶とはならないので注意が必要。二つ目は、伝熱面を上面に持ち融点近傍に保った水溶液中に下部からフラジルアイス(単結晶)を投入する方法。フラジルアイスは平らなため、浮力により上昇し伝熱面に到着するとc軸は伝熱面の法線方向を向く。その後伝熱面温度を下げていき結晶を成長させる。予め単結晶を設置する方法も含め、3種類の方法で取り込み濃度の比較を行った。その結果、フラジルアイスからスタートさせる方法が一番取り込み量の少ないベストな方法であることが分かった。
オーダーメイド治療を目指した口腔癌の発生や進展に関わる新規分子の臨床応用の研究

口腔扁平上皮癌(以下OSCC)は、特に進展例において拡大手術や放射線、化学療法などの補助治療によって加療後に重篤な障害をきたし患者のQOLを著しく低下させ得る。他の癌腫と同様に早期診断・治療が予後やQOLの改善にとって喫緊の課題であるが、OSCCの癌部あるいは非癌部における腫瘍増殖に関連する因子は未だ十分に明らかとされていないのが現状である。本研究の目的は、OSCCの早期診断、治療予後予測因子、また抗腫瘍薬剤の感受性に影響を生じ得る分子を、患者検体の癌部・非癌部の組織から得られた核酸の解析・比較を行うことで抽出し、治療計画立案に有用な臨床応用可能なマーカー分子を同定することである。平成29年度からは口腔細菌のOSCCへの影響を検出するため、新たに唾液検体の解析を行っている。1.ゲノム網羅的解析による候補遺伝子の抽出:OSCC患者及び口腔白板症患者、健常者の唾液検体と、OSCC組織検体から核酸を抽出し、マイクロアレイで網羅的に遺伝子発現を検索した。また、OSCCに特徴的な細菌叢を抽出するため、OSCCなどの唾液を採取し、次世代シークエンサーで菌叢を解析した。2.症例の蓄積とデータベース構築:症例情報や遺伝子、菌叢データ等を入力・保存した。3.得られた情報の解析:マイクロアレイで抽出された候補細菌の検証、NGSで解析した細菌叢に対しての多様性解析などを行い、有力なバイオマーカとしての可能性について検討した。4.当該分野における最新の知見の情報収集、結果報告:平成29年度には研究分担者及び研究協力者がAACR annual meeting 2018に出席し、当該研究に関する情報収集を行い、口腔癌に関わる口腔細菌叢の変化について研究協力者が発表を行った。平成30年度には得られた知見を論文化し国際誌への採択を目指し投稿した。今後も学会発表と論文報告を継続する予定である。当初に設定した研究計画に大きな遅延なく研究が進行している。腫瘍検体採取のペースに合わせて、得られた検体からのRNA・DNA抽出を行い、随時マイクロアレイ及び次世代シークエンサーで解析を行った。最終的な解析は、十分な検体が得られ次第行う。当初に設定した組織検体目標には到達したが、より信頼性、説得力のある結果を得るべく、平成30年度末まで検体採取を継続した。結果は得られつつあるが、その解析にはやや時間を要している。1.臨床症例における候補遺伝子の定量的解析:口腔癌の唾液検体、組織検体から得られた遺伝子変異情報を解析し、腫瘍関連遺伝子として有力な変異を選定し、それに対してRT-PCRなどを用いて定量的解析をおこなう。そのために必要な試薬等を科学研究費にて購入予定である。2.臨床病理学的因子との相関についての検討:OSCC関連遺伝子の候補遺伝子・遺伝子変異の定量解析の結果と、各症例の臨床病理因子との相関について解析を行う。3.口腔細菌叢変化と臨床因子との相関についての検討:OSCC関連細菌を検出し、その中から臨床的診断マーカ、予後予測因子を抽出すべく臨床因子との相関について解析を行い、遺伝子変異の結果も合わせて解析し新規の臨床マーカ因子を見出したい。4.学会発表、論文投稿:同定し得たOSCCの新規関連遺伝子や菌叢変化について一定数の症例の解析が終了した段階で、国内外の関連学会にて発表、論文化を行う。最終的には、マイクロアレイによる新規OSCC分子マーカの抽出と、OSCCに特異的な口腔細菌叢を組み合わせることで、これまでにない新規のOSCC臨床バイオマーカの特定を行う。口腔扁平上皮癌(以下OSCC)は特に進展例において加療後に重篤な障害をきたし患者のQOLを著しく低下させる。他の癌腫と同様に早期診断・治療が喫緊の課題であるが、OSCCの癌部における腫瘍増殖の関連する因子は未だ十分に明らかになっていない。近年では癌の発生や進展に関わる遺伝子変異や発現異常が報告されている。OSCCの早期診断、治療予後因子、また抗腫瘍薬剤の感受性に変化を生じうるような分子を、患者検体の癌部・非癌部の組織から得られた核酸の解析・比較を行うことで抽出し、治療計画立案の一助となりうる臨床応用可能なマーカー分子や変化として同定することが本研究の目的である。平成28年度の研究実施計画に基づき研究を遂行した。1.ゲノム網羅的解析による候補遺伝子の抽出:核酸を抽出すべき腫瘍検体の採取を行い、現在までに19検体採取されている。また、OSCC関連遺伝子の発現異常を検出すべく腫瘍患者からの唾液採取を行った。唾液採取には専用のキットを必要とし、科研費で購入した。これまでに30検体を採取し、各検体より核酸を抽出した。現在、マイクロアレイによるゲノム網羅的な解析を行っている。2.症例の蓄積とデータベース化:症例の集積を行うにあたり、連結可能匿名化のうえ、臨床病理的因子を含めた症例情報のデータベース化を確立した。データベース化には科研費で購入したコンピュータ及びハードディスクを用いた。3.当該分野における最新の知見の情報収集:研究分担者がAACR annual meeting 2016(会期2016/4/15-21)に出席し、当該研究に関する情報の収集を行った。当初に設定した研究計画に大きな遅延はなく研究が進行している。OSCCの発生・進行に関連する候補遺伝子を抽出すべく、腫瘍患者から採取した検体から核酸を抽出し解析を行っており予定通りである。

データベースの構築に関しては、当該研究のために購入した機材を用いて確立しており、これも予定通りである。口腔扁平上皮癌(以下OSCC)は、特に進展例において拡大手術や放射線、化学療法などの補助治療によって加療後に重篤な障害をきたし患者のQOLを著しく低下させ得る。他の癌腫と同様に早期診断・治療が予後やQOLの改善にとって喫緊の課題であるが、OSCCの癌部あるいは非癌部における腫瘍増殖に関連する因子は未だ十分に明らかとされていないのが現状である。本研究の目的は、OSCCの早期診断、治療予後予測因子、また抗腫瘍薬剤の感受性に影響を生じ得る分子を、患者検体の癌部・非癌部の組織から得られた核酸の解析・比較を行うことで抽出し、治療計画立案の一助となり得る臨床応用可能なマーカー分子や変化を同定することである。過年度の研究実施計画に基づき研究を遂行したが、口腔内微小環境(主に口腔細菌)の口腔癌への影響を検出するため、新たに唾液検体も検討に加えて解析を行った。1.ゲノム網羅的解析による候補遺伝子の抽出:OSCC患者及び口腔白板症患者、健常者の唾液検体計16例と、癌組織・非癌部組織5例(計10検体)から核酸を抽出し、マイクロアレイで網羅的な遺伝子発現を同定し、現在結果を解析中である。また、OSCCにおける細菌叢変化を抽出するため、OSCC24例、白板症14例、健常者10例の唾液を採取し拡散を抽出し、次世代シークエンサーで各疾患群の菌叢を解析した。2.症例の蓄積とデータベース構築:科学研究費で購入したPCとハードディスクを使用し、症例情報や遺伝子、菌叢データ等を入力・保存した。3.当該分野における最新の知見の情報収集、結果報告:研究分担者及び研究協力者がAACR annual meeting 2018(2018/4/14-18)に出席し、当該研究に関する情報収集を行い、口腔癌に関わる口腔細菌叢の変化についてAACR annual meeting 2018にて研究協力者が発表を行った。当初に設定した研究計画に大きな遅延なく研究が進行している。腫瘍検体採取のペースに合わせて、得られた検体からのRNA・DNA抽出を行い、随時マイクロアレイ及び次世代シークエンサーで解析を行っている。最終的な解析は、十分な検体が得られ次第行うこととなるが、現状で当初に設定した組織検体目標数30例は採取できている。より信頼性、説得力のある結果を得るべく、今後さらに奨励数を増やしていきたいと考えている。本研究の目的は、OSCCの早期診断、治療予後予測因子、また抗腫瘍薬剤の感受性に影響を生じ得る分子を、患者検体の癌部・非癌部の組織から得られた核酸の解析・比較を行うことで抽出し、治療計画立案に有用な臨床応用可能なマーカー分子を同定することである。平成29年度からは口腔細菌のOSCCへの影響を検出するため、新たに唾液検体の解析を行っている。
多巣性運動ニューロパチーの伝導ブロック部における血液神経関門破綻の証明

多巣性運動ニューロパチー(MMN)症例の伝導ブロック(CB)のない腓腹神経と,CBのある末梢神経を用いて病理検討を行った.光顕像観察の後に,電子顕微鏡で撮像を行い,神経内膜内血管における血管内皮細胞間tight junctionの破綻の有無を観察して,tight junction破綻の割合を定量的に評価した.結果は光顕像ではCBを確認した末梢神経に脱髄性変化をみとめた.tight junctionの破綻割合は,同末梢神経でのみ上昇を認めた.いずれの症例でも血管内皮細胞の超微形態に変化を認めなかった.MMNでは運動神経において局所的に血液神経関門の破綻を生じている可能性が考えられた.多巣性運動ニューロパチー(MMN)症例の伝導ブロック(CB)のない腓腹神経と,CBのある末梢神経を用いて病理検討を行った.光顕像観察の後に,電子顕微鏡で撮像を行い,神経内膜内血管における血管内皮細胞間tight junctionの破綻の有無を観察して,tight junction破綻の割合を定量的に評価した.結果は光顕像ではCBを確認した末梢神経に脱髄性変化をみとめた.tight junctionの破綻割合は,同末梢神経でのみ上昇を認めた.いずれの症例でも血管内皮細胞の超微形態に変化を認めなかった.MMNでは運動神経において局所的に血液神経関門の破綻を生じている可能性が考えられた.免疫性末梢神経障害と考えられている伝導ブロック(CB)を伴う多巣性運動ニューロパチー(MMN)は治療可能な疾患にもかかわらず筋萎縮やfasciculationを認めることから,難治性の筋萎縮性側索硬化症との鑑別がしばしば問題となる.MMNの診断においてCBを証明して,早期診断・治療介入が必要である.これまでMMNではin vitroで血液神経関門(BNB)の破綻が示唆されているが,主病変のCBとBNBの破綻の存在についての直接の証明はなされていない.今回の検討で病理学的にMMNにBNBの破綻が存在することと,CBにBNBの破綻が存在する可能性が示唆された.本研究により,将来的にMMNにおいてBNBの修復を目的とした新たな治療戦略の確立に寄与する可能性がある.臨床検体は多巣性運動ニューロパチー(MMN)症例の伝導ブロック(CB)のない末梢神経と,直視下で電気生理学的にCBを確認した末梢神経を用いる.検体を採取して2.1%グルタールアルデヒド液に固定したのちに,エポン包埋トルイジンブルー染色の光顕像を観察して,脱髄の有無の検索を含めた病理学的に検討を行う.引き続き,電子顕微鏡による撮像を行い,神経内膜内の血管密度,平均血管内皮細胞面積,平均血管内腔面積,平均血管内皮細胞核数を超微形態,核の大きさ,細胞の大きさについて病理変化を確認するとともに,定量的に検討する.また,神経内膜内血管における血管内皮細胞間tight junctionの破綻の有無を1末梢神経につき60か所以上観察することで定量的に評価して,末梢神経におけるBNB破綻の分布を明らかにする.免疫性末梢神経障害と考えられている伝導ブロック(CB)を伴う多巣性運動ニューロパチー(MMN)は治療可能な疾患にもかかわらず筋萎縮やfasciculationを認めることから,難治性の筋萎縮性側索硬化症との鑑別がしばしば問題となる.MMNの診断においてCBを証明して,早期診断・治療介入が必要である.これまでMMNではin vitroで血液神経関門(BNB)の破綻が示唆されているが,主病変のCBとBNBの破綻の存在についての直接の証明はなされていない.本申請では病理学的にMMNにBNBの破綻が存在するのか,CBにBNBの破綻が存在するのかを明らかにすることを目的とした.臨床検体はMMN症例でCBのない腓腹神経と,直視下で電気生理学的にCBを確認した内側胸筋神経を用いた.採取した検体のエポン包埋トルイジンブルー染色の光顕像を観察して,脱髄の有無を確認した.さらに電子顕微鏡による撮像を行い,神経内膜内の血管密度,平均血管内皮細胞面積,平均血管内腔面積,平均血管内皮細胞核数を定量的に検討した.また,血管内皮細胞間tight junctionの破綻の有無を定量的に検討して,MMNの末梢神経におけるBNBの破綻の分布を検討した.その結果,超微形態では血管内皮細胞と血管周細胞自体の変化はないが,CB付近から採取した内側胸筋神経ではtight junctionの破綻があり,一方で腓腹神経ではtight junctionの変化は認められないことを確認した.これにより,MMNでは運動神経において局所的にBNBの破綻を生じている可能性が示された.本研究により,将来的にMMNにおいてBNBの修復を目的とした新たな治療戦略の確立に寄与していくと考えられる.末梢神経末梢神経の標本の電子顕微鏡による撮像を行い,超微形態を詳細に観察することができたため.今後,電子顕微鏡による神経内膜内の血管密度,平均血管内皮細胞面積,平均血管内腔面積,平均血管内皮細胞核数を超微形態,核の大きさ,細胞の大きさについて,定量的に検討する.また,神経内膜内血管における血管内皮細胞間tight junctionの破綻の有無を1末梢神経につき60か所以上観察することで定量的に評価して,末梢神経におけるBNB破綻の分布を明らかにする.

末梢神経の病理学的検索の実験が順調に進行し,末梢神経の電子顕微鏡写真の撮像枚数が,当初の予定よりも少なく実施できたため.また,当初購入予定であったダイアモンドナイフについては,一時ミクロトームの故障があったことから次年度に購入することとしたため.末梢神経の電子顕微鏡写真をさらに撮像して,神経内膜内血管における血管内皮細胞間tight junctionの破綻の有無を1末梢神経につき60か所以上観察することで定量的に評価して,末梢神経におけるBNB破綻の分布を明らかにするための費用に使用する.
新型エーラスダンロス症候群の皮膚症状の疾患モデル動物確立と病態メカニズム解明

筋拘縮型エーラスダンロス症候群(mcEDS)は、信州大学医学部から報告されたCHST14遺伝子の変異を原因とする疾患で、重篤な皮膚症状を呈する。現在、mcEDSの病態メカニズムは不明な点が多く、治療法開発には至っていない。病態メカニズムや治療法を明らかにするためには、その疾患に適したモデル動物が必要になる。本研究では、申請者が開発したChst14 KOマウスを用いて、本疾患のモデル動物を確立する。さらに、皮膚組織の構造・血液凝固・炎症・細胞増殖の解析や、原因組織の探索を行い、将来的な治療標的を絞り込む。本研究により、mcEDSの病態の理解および新規治療法の開発に貢献することが期待される。