hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経科学的指標に基づく記憶定着の最大化

記憶は2つの段階を経て形成されていく。1つは学習中に起こる記銘段階で、もう1つは学習後に起こる定着段階である。神経科学的指標に基づく記憶定着の最大化方略を社会へと応用していく前段階として、後に起こる記憶の定着を予測する記銘時の神経活動パターンを同定するため、系列運動学習を対象として機能的磁気共鳴画像を用いた研究を実施した。本研究の成果として、系列運動技能の記憶痕跡は一次運動野に蓄積され、その定着には海馬を含む宣言的記憶システムが重要であることを示した。今後は本研究で明らかとした神経科学的指標を用いて、記憶定着を促進する介入手法の開発を目指していく。本研究の目的は、記憶定着を予測する学習中の神経科学的兆候を同定し、その神経科学的兆候を学習過程への介入によって操作することで、記憶の定着を最大化することである。本年度は、第1段階である記憶定着を予測する学習中の神経科学的兆候の解明を目的として、機能的磁気共鳴画像を用いた実験を実施した。具体的には、系列運動学習時の神経活動と後の記憶定着の関連性を明らかとするため、学習中に起こる神経活動に干渉を与える一定速度条件を加えた干渉群と、最大速度条件のみで学習を行う統制群を設定した。結果として、記憶定着を反映する睡眠後の成績上昇は、統制群では顕著に示される一方、干渉群では認められなかった。この結果は、一定速度条件を加えたことによって記憶定着に重要な神経活動に変化が生じ、後に起こる記憶定着が阻害されたことを示唆している。これらの成果について、平成27年度の北米神経科学会において発表を行った。本実験では機能的磁気共鳴画像により学習中の神経活動を同時に計測しているため、これらのデータから干渉群が学習時の神経活動に与えた影響について解析を現在実施中である。干渉群で影響を受けた学習時の神経活動を明確にすることにより、後の記憶定着に重要な学習時の神経兆候を明らかにすることができると考えられる。本研究の成果が展開されることにより、運動技能の記憶定着を予測する神経科学的兆候を指標とし、記憶定着を最大化する学習方略を開発することが十分に期待できる。そのため本年度は、第1段階である記憶定着を予測する学習中の神経科学的兆候の解明を目的とし、機能的磁気共鳴画像を用いた実験を行う計画であった。生理学研究所の2台の3T-MRI装置を利用することにより、2日間連続した機能的磁気共鳴画像実験を、当初の予定通りに完了した。これらの実験によって得られたデータについて、行動学的な検討は既に完了し、国際学術集会において成果を発表済みである。また、機能的磁気共鳴画像に基づく神経活動の解析も順調に進行しており、学習に伴う神経活動変化についての標準的な単変量解析は完了している。本研究ではこれらの単変量解析に加えて、神経活動の空間的パターンに着目する多変量解析も実施する計画であるが、現状では完了していない。従って、当初の計画は「おおむね順調に進展している」との自己評価に至った。昨年度実施した機能的磁気共鳴画像を用いた実験データから、学習中の神経活動に干渉を与える一定速度条件を加えた干渉群と、最大速度条件のみで学習を行う統制群における神経活動を比較した。結果として、海馬および後部帯状回といった宣言的記憶に関わる脳領域が、干渉群では終了時点で統制群に比べて活動量が有意に高い一方、翌日の再生時との比較では統制群の方が有意に大きな活動量上昇を示すことが明らかとなった。宣言的記憶システムにおける活動パターンが系列運動技能のパフォーマンスの変化と一致することから、宣言的記憶システムが系列運動技能の定着に寄与すると考えられる。今回明らかとなった宣言的記憶システムの活動を練習中に操作することで、記憶定着を最大化することが期待されるが、現時点でリアルタイムに神経活動をモニターする実験は実施できていない。また、学習の結果としての記憶痕跡がどの脳領域に保持されるかを検討するため、学習中に起こるネットワーク変化を干渉群のデータを元に解析し、運動前野ー頭頂葉ネットワークで記憶情報の集積が起こることを明らかとした。この成果は運動技能の記憶痕跡を明示的に扱う手法として今後も利用できると考えている。これらの研究成果を平成28年度の北米神経科学会および日本ヒト脳機能マッピング学会にて発表した。本年度の成果として、記憶定着を予測しうる学習中の神経科学的兆候の候補が明らかになりつつある。

今後の方針としては、より詳細な解析によって神経活動に関するデータを早急に精査し、神経科学的兆候の候補を絞り込むことが極めて重要である。その上で、実時間で機能的磁気共鳴画像による神経活動計測を行うreal-time fMRIを利用し、記憶定着を予測する神経科学的兆候をモニターしながら学習量を制御する試みを行う。生理学研究所では、real-time fMRIを行う装置が磁気共鳴画像装置に既に接続されていたが、本年度新たに複雑な解析を実時間で行うためのセットアップを実装した。従って、本研究の最終目的である、神経科学的指標に基づいて学習量を制御するための実験環境は既に整っている。現状では神経科学的兆候の同定が律速段階であるため、年度末に購入した高性能PCを活用し、神経活動の空間的パターンに基づく多変量解析をスピードアップしていく。脳機能イメージング年度末に購入した一部の物品の支払いが、翌年度に繰り越しになってしまったため、次年度使用額として繰り越しが生じてしまった。すでに本年度の助成金については、物品の購入および納品が完了しており、翌年度4月時に支払いが完了できる状況である。
MMP阻害剤や血管新生阻害剤等による腎癌のTumor Dormancy療法の検討

1)ヒト腎細胞癌組織における第8因子の発現および微小血管密度の検討手術摘出したヒト腎細胞癌15例において第8因子関連抗原の免疫染色を行い,微小血管密度(MVD)を求めた.また,術前には超音波パワードプラ法を施行し,血流信号についても検討した.術前に血流信号が多かったものはMVDが高い傾向が見られ,術前に血流信号が低いものはMVDが低い傾向が見られた.2)培養細胞におけるBPHAの効果今後さらに,腎癌培養細胞(RenCa,Caki-1,SN12等)においてMMP,TIMP,VEGF,bFGFの発現をRT-PCR法およびWestern blotにて検討する.BPHAによるMMP,TIMPの発現の変化をRT-PCR法およびWestern blotにて検討する.また,血管新生阻害剤の標的分子であると考えられるVEGF,bFGF等の発現を抑制するかをRT-PCR法およびWestern blotにて検討する.また,BPHAと血管新生阻害剤(TNP-470,SU101,SU5416),サイトカイン(IL-12,Apo-2)あるいは抗癌剤(Adriamycin,Cisplatin)との併用により,細胞増殖抑制効果が増強されるかを検討する.1)ヒト腎細胞癌組織における第8因子の発現および微小血管密度の検討手術摘出したヒト腎細胞癌15例において第8因子関連抗原の免疫染色を行い,微小血管密度(MVD)を求めた.また,術前には超音波パワードプラ法を施行し,血流信号についても検討した.術前に血流信号が多かったものはMVDが高い傾向が見られ,術前に血流信号が低いものはMVDが低い傾向が見られた.2)培養細胞におけるBPHAの効果今後さらに,腎癌培養細胞(RenCa,Caki-1,SN12等)においてMMP,TIMP,VEGF,bFGFの発現をRT-PCR法およびWestern blotにて検討する.BPHAによるMMP,TIMPの発現の変化をRT-PCR法およびWestern blotにて検討する.また,血管新生阻害剤の標的分子であると考えられるVEGF,bFGF等の発現を抑制するかをRT-PCR法およびWestern blotにて検討する.また,BPHAと血管新生阻害剤(TNP-470,SU101,SU5416),サイトカイン(IL-12,Apo-2)あるいは抗癌剤(Adriamycin,Cisplatin)との併用により,細胞増殖抑制効果が増強されるかを検討する.
有機材料のフォトリフラクティブ効果による光伝播制御技術の開発

多機能性化合物が単一成分でフォトリフラクティブ効果を発現するモノリシックフォトリフラクティブ材料となり得ることを明らかにし、位相共役波を用いた乱れた波面の補正や連想想起光メモリの実証実験を行った。この材料に2種類のイメージ像を角度多重記録し、そのホログラムに不完全な入力像を入射させたところ、ビームが回折し元の完全なイメージ像が再生されたことにより連想想起光メモリとして機能することが確認された。(雀部)アゾ系色素膜による位相共役波の発生効率はゲート光の偏光に強く依存することを明らかにした。さらに、ホログラムを位相共役干渉に利用する際に材料固有の位相が付加するので、その影響を無視できる条件を明らかにした。(藤原)アセチレン結合で架橋した拡張共役系チオフェン誘導体の合成およびそれらの物性について検討した。対応するチオフェンアセチレン体の酸化的カップリング反応により合成に成功した。電子吸収スペクトルにおいて、アセチレン結合の数の増大とともにポリアセチレン系に特有の微細構造がチオエフェン共役系の電子構造に大きく干渉することから、ジアセチレン結合が拡張共役系に組み込む最適の架橋基であることがわかった。ジアセチレン結合により架橋されたビチオフェン異性体では、ビチオフェン部の配向性を制御することにより、吸収帯の電子構造を保持したままで極大値を著しくシフトさせることができた。(尾島)カルバゾールデンドリマ-やカルバゾールオリゴマーを合成し、その光導電性および電気光学効果を調べた。また、ポーリングによってこれらの色素固体薄膜は二次非線形光学応答を示すことを光第二高調波発生により確認した。このポーリングした薄膜がフォトリフラクティブ効果を示すことを2光波結合により確かめ、これら多機能性色素が有機モノリシックフォトリフラクティブ材料として有望であることを見いだした。(雀部)位相共役光を発生させる際の偏光特性の異なる二色素を混合した高分子膜では、二色素の混合比を変えることにより、非線形感受率の実部と虚部の値を変えることと、ある程度位相共役光の偏光状態を制御することが可能となることを実験的に確認した。この二色素混合膜を偏光保存の位相共役光の発生、多色位相共役光の発生や位相共役干渉法などへ利用することを検討している。(藤原)末端に一つまたは二つの置換基をもつオリゴチオフェン誘導体の合成を行い、それらの分子構造と電子物性について検討した。オリゴチオフェン類は、内部ビチオフェンがジグザグ配座に連なった分子構造をとることがわかった。二置換誘導体では、置換基の電子求引性の増大とともに最長波長吸収帯の長波長シフトが観察され、また、ほぼ電子求引性の順に非線形光学効果も向上した。一方、一置換誘導体では、二置換体の吸収スペクトルにみられる傾向と同様の性質を示したが、非線形光学効果は置換基の電子求引性の強さとは相関せず、ブロモ体が最も大きな分子超分極率<γ>を有することが分かった。(尾島)アクセプター導入カルバゾールオリゴマーの光キャリヤ発生および電気光学効果を調べ、フォトリフラクティブ効果の発現に必要な多機能性を有することを確認した。擾乱によって乱れた画面の波面の補正が4光波混合による位相共役波によって可能となった。(雀部)キサンテン系色素とアゾ系色素を含む二色素混合膜による、互いに直交した二種類の位相共役波の偏光特性の測定から、実効的な非線型感受率の振幅と位相差を調べた。二色素の混合比を変えることにより、実効的な非線型感受率の振幅と位相差をある範囲で変化させることができた。この色素膜に固有の位相差を位相補償板を用いて打ち消すことにより、ノベルテイフィルタリングや位相共役干渉が可能となった。(藤原)本研究では、一方の末端に電子供与性の強さが異なる置換基(SMeおよびOMe)を有する一連の分子内電荷移動型ビチオフェン誘導体の合成を行い、それらの分子構造と電子物性について検討した。電荷移動吸収帯の遷移エネルギーが溶媒の極性(π^*値)と負の一次の相関関係があり、その感受率はSMe誘導体の方がOMe誘導体よりも大きいことを見いだした。また、低エネルギーシフトする程度について、OMe誘導体の場合は、共役長の長短に依存せず、一方、SMe誘導体の場合はねじれ型配座の分子構造の方においてより大きく現れる傾向を見いだした。(尾島)多機能性化合物が単一成分でフォトリフラクティブ効果を発現するモノリシックフォトリフラクティブ材料となり得ることを明らかにし、位相共役波を用いた乱れた波面の補正や連想想起光メモリの実証実験を行った。

電子吸収スペクトルにおいて、アセチレン結合の数の増大とともにポリアセチレン系に特有の微細構造がチオエフェン共役系の電子構造に大きく干渉することから、ジアセチレン結合が拡張共役系に組み込む最適の架橋基であることがわかった。ジアセチレン結合により架橋されたビチオフェン異性体では、ビチオフェン部の配向性を制御することにより、吸収帯の電子構造を保持したままで極大値を著しくシフトさせることができた。(尾島)
直接教示による作業スキルを実現するマクロ・マイクロ型組立ロボットシステム

1.2次元平面動作でのマクロ・マイクロロボットの構築:2次元平面内で動作し,現有のダイレクトドライブ・スカラ型ロボットアームの先端に取り付けてマクロ・マイクロロボットとできるようなパラレルリンク構造の平面3自由度のマイクロロボットを設計した.2.2次元単純はめ合い作業の直接教示からのスキル抽出と再生:現有の4指平行スティックハンドと6軸垂直多関節型産業用ロボットを組み合わせて,ワールドロボットサミット(WRS)ものづくり分野の製品組立チャレンジ・トライアル競技で使用したギヤユニットの組立を試みた.その結果,現有の4指平行スティックハンドと6軸垂直多関節型産業用ロボットを組み合わせたロボットシステム単体で,ギヤユニットの組立をすべて終えることができ,4指平行スティックハンドの汎用性を確認できたことに加え,精密なはめ合い動作のスキル及びギヤやシャフトなど様々な形状の部品の初期位置誤差を吸収する把持戦略を見出すことができた.3.単純はめ合い作業の物理シミュレーション手法の検討:製品組立における部品同士のはめ合い作業のような,精密な接触判定が必要な物理シミュレーションにおいて,研究分担者が開発している物理エンジンSpringheadの適用可能性を検討すべく,環境を整備した.4.3次元はめ合い作業用の平行スティック付きマイクロロボットの設計:次年度の3次元はめ合い作業の実験のための6自由度パラレル機構を有するマクロ機構の設計を行った.また次年度の組立作業実験で想定している対象製品の各部品を把持するために必要な平行スティックハンドの指配置や自由度の検討が可能な理論的枠組みを構築した.2次元平面動作でのマクロ・マイクロロボットの設計・製作は,設計変更を繰り返したため当初の予定より遅れているが,その代わりに現有の4指平行スティックハンドと6軸垂直多関節型産業用ロボットを組み合わせたロボットシステムによるギヤユニットの組立に成功し,有益な組立スキルを抽出することができた.また,3次元のマイクロロボットの設計については,ほぼ設計を終えており,次年度に製作を開始できる予定である.次年度は,3次元のマイクロロボットの製作を優先的に進め,今年度に既に達成したギヤユニットの組み立てにおける精密はめ合い作業のスキルと,直接教示によるはめい合い作業のスキルとの間で,部品の位置変動などに対するロバスト性の比較を行う予定である.1.2次元平面動作でのマクロ・マイクロロボットの構築:2次元平面内で動作し,現有のダイレクトドライブ・スカラ型ロボットアームの先端に取り付けてマクロ・マイクロロボットとできるようなパラレルリンク構造の平面3自由度のマイクロロボットを設計した.2.2次元単純はめ合い作業の直接教示からのスキル抽出と再生:現有の4指平行スティックハンドと6軸垂直多関節型産業用ロボットを組み合わせて,ワールドロボットサミット(WRS)ものづくり分野の製品組立チャレンジ・トライアル競技で使用したギヤユニットの組立を試みた.その結果,現有の4指平行スティックハンドと6軸垂直多関節型産業用ロボットを組み合わせたロボットシステム単体で,ギヤユニットの組立をすべて終えることができ,4指平行スティックハンドの汎用性を確認できたことに加え,精密なはめ合い動作のスキル及びギヤやシャフトなど様々な形状の部品の初期位置誤差を吸収する把持戦略を見出すことができた.3.単純はめ合い作業の物理シミュレーション手法の検討:製品組立における部品同士のはめ合い作業のような,精密な接触判定が必要な物理シミュレーションにおいて,研究分担者が開発している物理エンジンSpringheadの適用可能性を検討すべく,環境を整備した.4.3次元はめ合い作業用の平行スティック付きマイクロロボットの設計:次年度の3次元はめ合い作業の実験のための6自由度パラレル機構を有するマクロ機構の設計を行った.また次年度の組立作業実験で想定している対象製品の各部品を把持するために必要な平行スティックハンドの指配置や自由度の検討が可能な理論的枠組みを構築した.2次元平面動作でのマクロ・マイクロロボットの設計・製作は,設計変更を繰り返したため当初の予定より遅れているが,その代わりに現有の4指平行スティックハンドと6軸垂直多関節型産業用ロボットを組み合わせたロボットシステムによるギヤユニットの組立に成功し,有益な組立スキルを抽出することができた.また,3次元のマイクロロボットの設計については,ほぼ設計を終えており,次年度に製作を開始できる予定である.次年度は,3次元のマイクロロボットの製作を優先的に進め,今年度に既に達成したギヤユニットの組み立てにおける精密はめ合い作業のスキルと,直接教示によるはめい合い作業のスキルとの間で,部品の位置変動などに対するロバスト性の比較を行う予定である.
MDS・AML由来エキソソームによる間質機能修飾機構の解析と新規治療法の開発

急性骨髄性白血病や骨髄異形成症候群患者において,骨髄間質細胞の異常なサイトカイン発現などを初めとした,様々な異常がみられることが報告されている。しかしながら,これらの異常が惹起される分子機構は明らかとされていない。本研究により,細胞外小胞(エクソソーム)が骨髄微細環境内に高濃度で存在し,白血病細胞から分泌されるエクソソームが骨髄間葉系幹細胞に移行し作用することを見出した。また、エクソソームは、造血幹細胞支持因子などの遺伝子を不安定にすることで、正常造血支持能を低下させることを明らかとした。これらことは、エクソソームを標的とした新規治療標的につながることを示唆している。骨髄異形成症候群(MDS)/白血病(AML)細胞の遺伝子解析の結果、その遺伝子変異の概要が明らかとされつつある。一方、最近になって、骨髄間質細胞特異的なSbds/β-cateninノックアウト・マウスにおいては、血球細胞の遺伝子異常が蓄積された結果、MDS/AMLを発症することが見出され、ヒトMDSの発症進展におけるニッチ異常が注目されている。そこで、間質細胞におけるHematopoiesis関連遺伝子の発現をPCRアレイで解析した結果、MDS/AML由来間質において、多数の遺伝子群が低下していることを見出した。特に造血前駆・幹細胞分画を制御する因子に着目して、AML/MDS由来の骨髄間質細胞における遺伝子発現を解析した結果、SCF、HHIP、Jagged-1の発現が、全例で低下していた。さらに、この異常が誘導される分子機構を解析した結果、MDS/AML細胞と間質細胞はBoyden chamberを用いた接着および非接着培養の両者において、遺伝子異常が誘導された。これまで解析していなかった細胞外小胞(extracellular vesicle)の関与を想定し、CD34+AML細胞にGFP遺伝子を導入し、細胞膜をPKH26で赤色蛍光標識した後に、間質細胞との共培養を行った。超解像顕微鏡による解析の結果、ヒト骨髄間質細胞内にGFPシグナルが、び漫性に検出され、PKH26陽性膜成分が細胞膜および細胞内エンドソームに検出されることが明らかとなった。これらのことは、MDS/AML細胞から分泌されたエキソソームは、ヒト骨髄間質細胞にトランスファーされ、多彩な遺伝子群の発現異常を誘導することを示唆しているものと考えられた。本年度に関しては、当初予定していたどおり研究が進行し、順調に成果がえられている。このことから、おおむね順調に進展していると判断した。一方、最近になって、ヒトMDSの発症進展におけるニッチ細胞の遺伝子発現異常が注目されているが、その発現異常を惹起する分子機構は不明である。前年度の研究で、MDS/AML細胞から分泌された細胞外小胞(extracellular vesicle)が、骨髄間質細胞にトランスファーされることを明らかとした。今年度は、細胞外小胞の種類の分類、小胞内に内包される物質の解析を行った。電子顕微鏡で細胞外小胞を観察した結果、20-50 nMの大小不同の細胞外小胞が観察され、骨髄微細環境には複数の種類の細胞外小胞が存在することが示された。小胞の蛋白質を解析したところ、CD63抗原、TSG101抗原およびALIX抗原が検出されたことから、エクソソーム分画が含まれることが明らかとなった。細胞外小胞内のマイクロRNAをマイクロアレイで解析したところ、AML由来の細胞内小胞ではmiR-4286,miR-8073およびmiR-7977が高値を取ることが示された。患者由来骨髄間質血清中のマイクロRNAを測定したところ、miR-4286,miR-8073およびmiR-7977ともに、コントロール(リンパ腫stageI)よりも増加していたが、なかでもmiR-7977は、MDSが増悪しAMLに進展していくにつれて増加傾向にあることが示された。今後、miR-7977の標的分子を同定していく予定である。本年度は、当初予定していたとおりに研究が進展しており、骨髄間質異常および病態進展との関連を明らかにするという本研究の最終目的の糸口にたどりつけている。治療への応用については着手していないため、おおむね順調に進展していると自己評価した。昨年度までの研究により骨髄異形成症候群(MDS)/白血病(AML)細胞から、AMLから多量のエクソソームが分泌され、その内容としてmiR-4286、miR-8073およびmiR-7977が高濃度に内包化されることを明らかとしてきた。なかでも、miR-7977は、MDSからAMLに病状が進行するにつれて、骨髄間質液中の濃度が増加することから、その標的分子の同定を試みた。まず、miRDBを用いることでバイオインフォマティクスの手法で予測される標的分子をスクリーニングした。その結果、poly(rC) binding protein 1(PCBP1)というメッセンジャーRNA(mRNA)の安定化因子およびserine/threonine kinase 4(STK4)という細胞の過剰増殖を抑える因子が選択された。PCBP1は幾つかの癌腫の腫瘍幹細胞の形成に不可欠であることが報告され、サイトカインおよび接着分子の発現増加に関与している。このため、PCBP1 mRNAにmiR-7977の結合配列の有無をスクリーニングした。

その結果、5 ́端および3 ́端にそれぞれ1カ所づつ、合計2カ所の結合可能配列の存在が確認された。そこで、間葉系幹細胞にmiR-7977を導入した後に、PCBPの発現レベルを解析したところ、mRNAおよびタンパク質ともに発現低下が惹起されることが示された。さらに、PCBP1の3 ́端をプロテクトするtarget protectorを用いて解析した結果、miR-7977は同部位に結合することが明らかとなった。PCBP1により発現が増加しているサイトカインおよび接着分子をスクリーニングした結果、ANGPT1、SCF、JAG1がPCBP1の制御を受け、miR-7977が作用すると発現低下が惹起されることが明らかとされた。さらに、miR-7977導入間葉系幹細胞はCD34+CD38-細胞分画に対する造血支持能が著しく低下することが明らかとされた。これらの結果からAML細胞から分泌されるmiR-7977は、近接したニッチ細胞の正常造血機能を破綻させることが明らかとされた。急性骨髄性白血病や骨髄異形成症候群患者において,骨髄間質細胞の異常なサイトカイン発現などを初めとした,様々な異常がみられることが報告されている。しかしながら,これらの異常が惹起される分子機構は明らかとされていない。本研究により,細胞外小胞(エクソソーム)が骨髄微細環境内に高濃度で存在し,白血病細胞から分泌されるエクソソームが骨髄間葉系幹細胞に移行し作用することを見出した。また、エクソソームは、造血幹細胞支持因子などの遺伝子を不安定にすることで、正常造血支持能を低下させることを明らかとした。これらことは、エクソソームを標的とした新規治療標的につながることを示唆している。今年度の研究により白血病細胞から間質細胞に、エクソソームがトランスファーされることが明らかとなった。今後、エクソソーム内のどの成分が遺伝子発現異常を惹起するのか明らかにする必要がある。また、MDS患者においてもエクソソームのトランスファーが造血不全を惹起する一因となるのか解析する必要がある。マイクロRNAデータベース、miRNAパスウエイ解析を行うことで分子標的をスクリーニングしていく。このような、バイオインフォマティクス的手法で、ある程度ターゲットが絞り込めた後に、ターゲットプロテクターアッセイ、ルシフェレースアッセイなどで、マイクロRNAのターゲットを証明する予定である。その後に、新規治療法開発に応用可能か検討する予定である。血液腫瘍学
体外循環後の脳浮腫・血液脳関門破綻の発生機序に関する研究

縦隔手術野の返血操作が血液脳関門に与える影響(動物実験)と脳障害のマーカとして注目されている血清中のS100b蛋白,NSEへの影響を検討した(臨床研究)【動物実験方法】家兎を胸骨切開し,経左室的に送血管(サーフロー路針20G)を上行大動脈に挿入した(ヘパリン投与後),家兎の右眼に経頭蓋ドップラーモニタを装着し,コントロール群はこの状態で60分維持,返血群は内胸動脈などを擦過損傷させ90分で75mlの血液を送血管より返血した.その後エバンスブルー100mg/kgを緩徐に静注し10分後生理で潅流固定を行い脳を取り出し,脳の水分含量,エバンスブルー漏出の程度を検討した.さらに組織学的にHE染色,MAP2染色,GFAP染色を行った.【結果】返血に伴って経頭蓋ドプラで塞栓が著明に検出され,エパンスプルーの漏出を認めた.辺血に伴いGFAPの染色性の増加がみられ,アストロサイトの形態学的変化がみられた.【臨床研究対象と方法】CPB群:通常のCPB手術症例18例,SCP群:脳分離循環(SCP)手術7例.手術中から術後2日目にかけて7測定点でS100b蛋白およびNSEを測定した.CPB群5例では縦隔術野血中のS100b蛋白およびNSEを測定し,うち3例ではセルセーバ血の両蛋白を測定した.【結果】S100b蛋白の平均値はそれぞれ大動脈遮断解除/SCP終了後に最大となった(2.08±200v.s.1.46±0.77ng ml-1).NSE値はそれぞれCPB終了後/手術終了時に最大となった(29.1±14.0v.s.31.2±13.6ngml-1).3例で脳障害が生じたが,これらの症例のS100b蛋白およびNSE値と脳障害を生じなかった症例との差は値なかった.縦隔術野血中のS100b蛋白およびNSEは,それぞれ52.5±56.3ngml--1,249±181ng ml-1と血清と比べてそれぞれ375倍,17倍高く,セルセーバ血中の値は差がなかった.【まとめ】今回の検討から,縦隔手術野血の返血が血液脳関門の破綻を生じる原因になるが,同時にS100b蛋白およびNSEの動脈血への混入を招いていることがわかった.縦隔手術野の返血操作が血液脳関門に与える影響(動物実験)と脳障害のマーカとして注目されている血清中のS100b蛋白,NSEへの影響を検討した(臨床研究)【動物実験方法】家兎を胸骨切開し,経左室的に送血管(サーフロー路針20G)を上行大動脈に挿入した(ヘパリン投与後),家兎の右眼に経頭蓋ドップラーモニタを装着し,コントロール群はこの状態で60分維持,返血群は内胸動脈などを擦過損傷させ90分で75mlの血液を送血管より返血した.その後エバンスブルー100mg/kgを緩徐に静注し10分後生理で潅流固定を行い脳を取り出し,脳の水分含量,エバンスブルー漏出の程度を検討した.さらに組織学的にHE染色,MAP2染色,GFAP染色を行った.【結果】返血に伴って経頭蓋ドプラで塞栓が著明に検出され,エパンスプルーの漏出を認めた.辺血に伴いGFAPの染色性の増加がみられ,アストロサイトの形態学的変化がみられた.【臨床研究対象と方法】CPB群:通常のCPB手術症例18例,SCP群:脳分離循環(SCP)手術7例.手術中から術後2日目にかけて7測定点でS100b蛋白およびNSEを測定した.CPB群5例では縦隔術野血中のS100b蛋白およびNSEを測定し,うち3例ではセルセーバ血の両蛋白を測定した.【結果】S100b蛋白の平均値はそれぞれ大動脈遮断解除/SCP終了後に最大となった(2.08±200v.s.1.46±0.77ng ml-1).NSE値はそれぞれCPB終了後/手術終了時に最大となった(29.1±14.0v.s.31.2±13.6ngml-1).3例で脳障害が生じたが,これらの症例のS100b蛋白およびNSE値と脳障害を生じなかった症例との差は値なかった.縦隔術野血中のS100b蛋白およびNSEは,それぞれ52.5±56.3ngml--1,249±181ng ml-1と血清と比べてそれぞれ375倍,17倍高く,セルセーバ血中の値は差がなかった.【まとめ】今回の検討から,縦隔手術野血の返血が血液脳関門の破綻を生じる原因になるが,同時にS100b蛋白およびNSEの動脈血への混入を招いていることがわかった.心臓手術後の脳浮腫・血液脳関門の破綻の原因が,縦隔手術野の血液を返血することにより生じるのかどうかを検討した.

従来の報告から体外循環を単純に回しただけでは脳浮腫・血液脳関門の破綻は生じないとされており,今回は家兎を開胸し,縦隔手術野の返血モデルを作成した.【方法】イソフルランを用いて家兎を麻酔し,筋弛緩薬で非動化・人工呼吸を行なった.右の大腿動脈,左の外頚静脈からそれぞれ血圧,中心静脈圧を測定した.胸骨切開後ヘパリンを投与(5mg/kg)し,活性凝固時間を450秒以上とした.経左室的に送血管(サーフロー路針20G)を上行大動脈まですすめ,コントロール群はこの状態で60分維持,返血群は内胸動脈などを擦過損傷させ60分でおよそ50mlの血液を縦隔内に出血させ送血管より返血した.返血群では家兎の左眼に経頭蓋ドップラーモニタを装着し,眼動脈より塞栓の検出を試みた.その後エバンスブルー100mg/kgを緩徐に静注し10分後に4%ホルマリンで潅流固定を行い脳を取り出した.エバンスブルー漏出の程度を検討した.【結果】返血群では返血に伴って経頭蓋ドプラで塞栓が著明に検出された.コントロール群ではエバンスブルーの漏出は見られなかったが,返血群では軽度の漏出を認めた.【まとめ】今回の検討から,縦隔手術野血の返血が血液脳関門の破綻を生じる原因になっている可能性が示唆された.今後脳浮腫・血液脳関門の破綻の程度をより詳細に検討し,原因となっている塞栓の性状の検討を行ってゆきたい.S-100蛋白やneuron-specific enolaseが脳以外からも分泌されていることを臨床症例で確認した.したがってこれらが常に脳障害や血液脳関門破綻の指標となるとは限らないため,今後はサイトカインの定量と脳浮腫・血液脳関門の破綻の関連を検討し,フィルターの予防効果や,抗サイトカイン療法,実際に臨床で使用されているステロイドやアプロチニンが脳浮腫やサイトカイン値にどのように影響するかを検討していく予定である.体外循環(CPB)を用いた心臓大血管手術症例で,血清中の脳グリア細胞由来のS100b蛋白と神経細胞由来のNeuron specific enolase (NSE)を測定し,これらの値と脳障害との関連を検討した.【対象と方法】CPB群:通常のCPB手術症例18例,SCP群:脳分離循環(SCP)手術7例を対象とした.手術中から術後2日目にかけて7測定点でS100b蛋白およびNSEを測定した.CPB群5例では縦隔術野血中のS100b蛋白およびNSEを測定し,うち3例ではセルセーバ血の両蛋白を測定した.【結果】S100b蛋白の平均値はそれぞれCPB群SCP群ともに大動脈遮断解除/SCP終了後に最大となった(2.082.00 v.s. 1.46±0.77ng ml^<-1>).NSE値はそれぞれCPB終了後/手術終了時に最大となった(29.1±14.0 v.s. 31.2±13.6 ng ml^<-1>).3例で脳障害が生じたが,これらの症例のS100b蛋白およびNSE値と脳障害を生じなかった症例の値は区別がつかなかった.縦隔術野血中のS100b蛋白およびNSEは,それぞれ52.5±56.3ng ml^<-1>,249±181ng ml^<-1>と血清と比べてそれぞれ375倍,17倍高く,セルセーバ血中の値は差がなかった.【考察・まとめ】S100b蛋白およびNSEはCPBを用いた心臓手術で上昇するが,脳障害を生じた症例と生じた症例で明らかな差はみられなかった.これらの蛋白は縦隔術野血液中に著明に含まれ,CPBでこの血液を吸引返血することにより血清中の上昇を招いていると考えられる.したがって,CPBを用いた心臓手術でのS100b蛋白およびNSEの血清中の上昇は必ずしも脳障害を反映しない.CPBを用いた手術でこれらの蛋白を脳障害の指標とするためには,縦隔術野血液を返血しないかあるいはセルセーバへの回収洗浄操作が必要である.
病原性放線菌ノカルジアのレジストームの解明

ノカルジア菌(Nocardia)は放線菌と呼ばれる菌群の一種で、主に土壌中に生息するが、まれにヒトや動物に感染しノカルジア症をひきおこす日和見病原菌である。ノカルジア症の治療を困難にしている原因のひとつは、ノカルジアが多くの抗生物質に耐性を示すことであるが、それら耐性の原因はほとんど調べられていない。そこで、ノカルジアのすべての薬剤耐性因子を明らかにするために遺伝子解析を行った結果、リファンピシン、アミノグリコシド、クロラムフェニコール耐性に関わる遺伝子を明らかにした。ノカルジアのゲノム解析によって見出された、カナマイシンやストレプトマイシンなどのアミノ配糖体抗生物質をリン酸化して失活させる新規なアミノ配糖体リン酸転移酵素(APH)遺伝子と考えられるnfa31340、nfa38480およびnfa38620を、発現ベクターpET-19bにクローニングし、大腸菌にタンパク質を生産させ、タンパク質を精製し、APH活性の有無を調べた。その結果、すべてのタンパク質にAPH活性が認められ、その基質特異性からnfa31340、nfa38480およびnfa38620は、それぞれAPH(2")、APH(3')およびAPH(6)であることを明らかにした。これら3つの遺伝子は、ノカルジアのトブラマイシン、カナマイシンおよびストレプトマイシン耐性の原因遺伝子である可能性が考えられる。同じくノカルジアのゲノムに見出された、リファンピシンを酸化して失活させる酵素の遺伝子と考えられるnfa35380を、発現ベクターpET-19bにクローニングし、大腸菌にタンパク質を生産させた。その結果、nfa35380遺伝子を持つ大腸菌はリファンピシン耐性となった。さらに、休止菌体を用いてリファンピシンの変換反応を行った結果、リファンピシンよりも分子量が16大きい物質が生成した。このことから、nfa35380はリファンピシン酸化酵素をコードすることが明らかとなり、ノカルジアのリファンピシン耐性を担う可能性が考えられた。Nocardia farcinicaゲノムに存在する「全ての薬剤耐性遺伝子(レジストーム)」を明らかにし、その耐性機構を解明することを目的として、以下の研究を行った。nfa35380遺伝子は、19年度にリファンピシン酸化酵素(モノオキシゲナーゼ)をコードすることが明らかとなったので、リファンピシン酸化物を精製、分析した結果、この酵素は新規な代謝物2'-N-hydroxy-4-oxo-rifampicinを生成することが明らかになり、その反応機構も新規であると考えられた。この物質の抗菌力は大幅に低下していたが、一部のグラム陽性菌に対しては依然として抗菌力を有していた。一方、nfa35380遺伝子の破壊株を作製した結果、破壊株のリファンピシン耐性は野生株と同等であった。したがって、N.farcinicaのリファンピシン耐性の主要なメカニズムはrpoB2遺伝子によると考えられた。しかしながら、rpoB2遺伝子の破壊株においてnfa35380遺伝子を過剰発現させると、リファンピシン耐性が8倍になったことから、nfa35380遺伝子もある程度はリファンピシン耐性に貢献していると考えられた。また、N.farcinicaはリファンピシンを脱色・分解する活性を持つが、nfa35380遺伝子の破壊株では脱色が起こらないことから、リファンピシンの脱色・分解過程は、nfa35380遺伝子産物によるリファンピシンの酸化によって開始されると考えられた。16個のMFSあるいはSMR型トランスポーター遺伝子の大腸菌での発現を試み、そのうち6個の発現を解析した結果、MFS型のnfa18410がクロラムフェニコール、ナリジクス酸、テトラサイクリン耐性を与えることが明らかとなり、この遺伝子がN.farcinicaのクロラムフェニコール耐性を担っていることが示唆された。Nocardia farcinicaゲノムに存在する全ての薬剤耐性遺伝子(レジストーム)を明らかにし、その耐性機構を解明することを目的として、以下の研究を行った。1.MFSおよびSMR型薬剤排出ポンプをコードすると予測される16個の遺伝子を、pET-19bを用いて大腸菌にクローニングした結果、5個がアクリフラビン耐性、1個がナリジクス酸耐性、1個がクロラムフェニコール耐性を示したことから、これらの遺伝子が本菌の薬剤耐性に関与していることが示唆された。2.前年度に明らかにした3個のアミノグリコシドリン酸化酵素遺伝子(aph(2")、aph(3')およびaph(6))の遺伝子破壊株を作成した結果、各遺伝子に対応するアミノグリコシド耐性が消失したことから、本菌のアミノグリコシド耐性はこれらの遺伝子によって担われていることが証明された。

3.イソニアジドをアセチル化するアリルアミンアセチル化酵素をコードするnfa18420の遺伝子破壊株を作成したが、イソニアジド耐性が消失あるいは減じなかったことから、本菌のイソニアジド耐性因子は別にあることが明らかになった。
多点同時計測LDVを用いたマイクロチャネル流速計測法の開発

本研究では近年活発に開発が行われているマイクロデバイス周囲の流動計測を目的に,マイクロチャネル内の流速分布を計測する手法を確立することを目指した.本研究ではまたMEMSにおいて開発研究が活発なマイクロジェットやマイクロフレームにおける計測を含めた空気流れをも計測可能であるシステムを目指し,レーザー流速計を応用しマイクロフィールド用の多点同時計測LDVの構築を行った.前年度において概ね光学システムおよびその電気的処理システムの構築を完成させており,今年度は特に実流動場における計測を行い,その測定精度また測定能力についての検討を行った.まず,本システムにおける空間分解能は光ファイバーコア径0.24mmおよびオブジェクティブレンズの拡大率25倍から水平-垂直方向に10マイクロm程度となっている.実際のバースト信号から確認される水平方向分解能は20マイクロmであり,若干大きくなるが概ね整合している.これは従来のLDVからすると非常に小さい分解能となっている.また奥行き方向には焦点深度をそれとし1.2マイクロmと考えられる.この空間分解能を鑑み,実流動場としてはマイクロチャネル流路0.5mmx1mmを作成し,その流速分布を計測することに成功した.流量は15ml/minでRe=85となる流速条件において,概ねポアズイユ流れになっていることが確認された.また,逆流や非定常性を含んだ流れ場として,燃料電池におけるセパレータを模擬した曲がり管における流速分布の計測を行った.曲がり管は1mmx1mmのダクトが直角にベント後1mmx1.5mmの長さが1mmのダクトを通過後再び直角にベントし1mmx1mmのダクトに流入するというものである.その結果得られた速度分布は三次元数値計算の結果とも比較的良く一致した.この流れ場は非常に三次元性が強いことが予想されるために,測定体積が大きい場合には測定誤差が大きく含まれることになるが,そのようなことがなく,したがって本計測法が十分に対応していることが証明された.本研究では近年活発に開発が行われているマイクロデバイス周囲の流動計測を目的に,マイクロチャネル内の流速分布を計測する手法を確立することを目的とした.本研究では簡便かつ高精度に速度分布を計測するシステムとして,レーザー流速計を応用しマイクロチャネル用の多点同時計測LDVの構築を行った.まず,マイクロチャネル内における微粒子からの散乱信号が非常に微弱なことを考慮し,この微小信号を検知することのできるシステムとして,マルチフォトダイオードアレイによる受光系を構築した.これにより,比較的強度の低いバースト信号を検知できるようになり,またSN比の向上によりより精度の高い計測が可能になった.また,レンズの被写界深度による測定位置の推定法についての検討を合わせて行った.信号処理系としては,流速が比較的遅いことを考慮したハイパスフィルターおよびアンプにより構成した.また,本研究においては,多点での計測のため最終的にはワンピットによるサンプリング方式を目標としている.コンパレータにより二値化は容易であるが,この信号をパソコンに取り込む際にノイズが発生することを考慮し,光ファイバーによるデータ転送システムを構築した.実計測においては本年度はまず,マイクロチャネルとして,直径0.8mmのキャピラリチューブ内の計測を行った.流速は約0.01m/s,散乱粒子として直径5μmのポリスチレン粒子を使用した.その結果,壁面による散乱光強度が大きく,また,キャピラリチューブがレンズの役目をするために,十分な計測結果を得ることができなかった.しかしながら,レーザー光の強度および信号処理におけるアンプ等の調整により,本システムによりマイクロチャネル内流動を計測できる可能性があることを示した.本研究では近年活発に開発が行われているマイクロデバイス周囲の流動計測を目的に,マイクロチャネル内の流速分布を計測する手法を確立することを目指した.本研究ではまたMEMSにおいて開発研究が活発なマイクロジェットやマイクロフレームにおける計測を含めた空気流れをも計測可能であるシステムを目指し,レーザー流速計を応用しマイクロフィールド用の多点同時計測LDVの構築を行った.前年度において概ね光学システムおよびその電気的処理システムの構築を完成させており,今年度は特に実流動場における計測を行い,その測定精度また測定能力についての検討を行った.まず,本システムにおける空間分解能は光ファイバーコア径0.24mmおよびオブジェクティブレンズの拡大率25倍から水平-垂直方向に10マイクロm程度となっている.実際のバースト信号から確認される水平方向分解能は20マイクロmであり,若干大きくなるが概ね整合している.これは従来のLDVからすると非常に小さい分解能となっている.また奥行き方向には焦点深度をそれとし1.2マイクロmと考えられる.この空間分解能を鑑み,実流動場としてはマイクロチャネル流路0.5mmx1mmを作成し,その流速分布を計測することに成功した.流量は15ml/minでRe=85となる流速条件において,概ねポアズイユ流れになっていることが確認された.また,逆流や非定常性を含んだ流れ場として,燃料電池におけるセパレータを模擬した曲がり管における流速分布の計測を行った.曲がり管は1mmx1mmのダクトが直角にベント後1mmx1.5mmの長さが1mmのダクトを通過後再び直角にベントし1mmx1mmのダクトに流入するというものである.その結果得られた速度分布は三次元数値計算の結果とも比較的良く一致した.この流れ場は非常に三次元性が強いことが予想されるために,測定体積が大きい場合には測定誤差が大きく含まれることになるが,そのようなことがなく,したがって本計測法が十分に対応していることが証明された.
戦後日本における「女性職」の形成・定着過程に関する実証的研究

本研究は、長期雇用、年功賃金などの日本的雇用慣行が適用される「男性職」とは区別される形で、いかにして「女性職」が形成されてきたのかを探ることを通じて、女性労働史を再構成することを目的としている。そのために、女性労働の集積地域である福島県北・川俣町の織物産業に従事した女性労働者を調査対象としてとりあげ、そのライフヒストリー分析を軸に、雇用労働と家族生活とがどのように接合されてきたのかを明らかにした。19年度は、まず実態調査の対象地域として福島県北地域(川俣町、伊達市保原、梁川)を選定し、この地域における産業変動過程を把握するためのインタビュー調査、資料収集に取り組んだ。そこから浮かび上がってきたのは次の諸点である。1.まず、対象地域ではいずれも繊維業(絹織物とニット産業)の蓄積があつく、女性労働に大きく依存してきたという特性がある。繊維業の衰退にともなって企業誘致がなされ、電子産業、縫製業などが進出するとともに、女性の就労構造に変化が生じている。この地域の女性のキャリアヒストリーをとりおさえれば、地域産業変動過程をつぶさに把握することが可能となる。また誘致企業は低賃金を前提に女性労働を目当てに進出してきているが、同時にこれは、この地域における日本的雇用慣行をはじめて導くものであったことが明らかとなった。2.こうした点をふまえると、研究の焦点は当該地域の女性のキャリアヒストリーの詳細な聞き取りにおかれるべきであり、またその聞き取りにおいては、女性たちの就労を支えてきた地域的ケアワーク体制(育児・介護)の変遷を読みとりつつ、地域自身が編成してきたケアワーク政策の実態的変遷、労働市場における女性ケアワーカーの位置づけをこれと組み合わせてアプローチすべきことが明らかとなった。3.最後に、相対的高学歴層については、19年度は十分にアクセスしえなかったが、この層の位置づけを探ることが、製造業現業労働者像を深めるために不可欠な対象であることが、確認された。平成20年度は、引き続き福島県北地域(川俣町、伊達市保原、梁川)に関する文献資料の収集、女性労働者のインタビュー調査を集中的に実施し、次の4点が明らかになった。1.まず、川俣地域の絹織物に従事した経験をもつ元女工、および絹織物業者のおかみの調査から、地域の中核的産業の担い手像が明確になった。元女工の証言を裏付けるために、元男工へのインタビューを実施する必要があることが明らかになった。2.伊達市保原および梁川において戦後期に中核的産業として展開したニット産業に従事した女性の経験を、インタビュー調査を通じて収集することができた。上記1の比較群としてこれを位置づけることによって、隣接するふたつの地域における女性労働史を立体的に把握することが可能であるという見通しを得た。3.ふたつの地域のケアワーカーへの聞き取りをさらに深め、また上記の絹織物、ニット産業への従事者が、自らの就労と育児・介護ケアをどのようにこなしてきたのかに関するライフヒストリーの分析から、当該地域における女性労働史、および女性間関係を幅広い視点から掘り下げうることが明らかになった。4.最後に、両地域における相対的高学歴女性層へのインタビューのルートを開拓し、これに着手した。1および2の製造業現業職に従事した女性労働者像を深めるために不可欠な対象であることが確認された。なお、もうひとつ取り上げる予定であった小売業に従事する女性の経験については、研究の焦点が拡散することを避けるために研究対象からはずして、製造業女性を中心に据えつつ、ケアワーカー、高学歴女性層の比較検討を通じて分析する重要性が浮かび上がった。最終年度にあたる平成21年度は、川俣町を中心とする文献資料の収集を継続し、女性労働者を中心とするインタビュー調査をさらに追求し、地域を基盤とするモノグラフを描くためのデータ収集を行った。またこれまで収集されてきたデータ分析のための研究会を積み重ね、まとめの方向性を確認した。1.川俣地域を事例とする女性労働のあり方は、絹織物女工が三世代家族における嫁として、あるいは夫婦家族における共働きの妻として継続的に働き続け、家計を支える強力な存在として位置づいていた。男工は、監督者として女工とは異質な立場にあり、機屋の経営者とおかみは、それぞれに異なる位置関係にあったが、規模の小さい機屋の場合、おかみは女工同様に現場労働に従事して熟練性を高めることが求められていた。2.これらの機屋のおかみがリードするかたちで、子どもを職場に連れてくる女工対策として保育所を求める動きがおこり、女工と保育労働者との接点ができあがった。相対的高学歴層の女性は、たとえ機屋の娘であっても女工とは別世界の住人であり、接点はほとんどなかった。以上が、地域内で展開する女性間関係の姿であった。3.絹織物女工においては、三世代家族の場合は夫婦の収入を親世代に手渡して小遣いをもらうという慣行のもとにおかれていたものと、夫婦家族で自由な意志決定によって消費行動を決定できるものとでは大きなちがいがあった。

後者は、共働きを支えるため、家電製品を次々に購入する積極的な行動パターンをとるものが少なくなかった。4.この事例を中心とした女性職の形成過程について、(1)問題意識と方法、(2)労働市場の特質、(3)絹織物自営業者の経営と労務管理、(4)絹織物女工-家族と職歴-、(5)絹織物女工-職業と育児ケア-として学会で発表する(2010年11月)ため、データ分析を進めている。
微生物分泌性ナノ粒子を用いた標的細胞制御技術の基盤構築

本研究では、微生物から分泌されたベシクルの標的指向性を解明するとともに、標的の微生物細胞へ物質を運搬するツールとしてベシクルを利用法できるようその技術基盤を構築することを目的とした。Enterobacteriaceae科に属する細菌のベシクルは、同属の細菌に選択的に取り込まれる事が示された。当細菌におけるベシクルの特異的結合メカニズムを解析したところ、ベシクルと細菌間での低い静電的反発力が示された。さらに、ベシクルに抗生物質を保持させることにより、特定の細菌に対してのみ殺菌効果を示した。以上の結果から、標的細胞に物質を送達するツールとしてのベシクルの有用性が示された。細菌や古細菌を含む原核生物は、細胞外に直径20-200 nmのナノ粒子であるベシクルを分泌する。リン脂質二重層で構成されるベシクルはDNAや酵素、病原因子等の物質を高濃度に含有し、宿主細胞や他の微生物細胞に内部の物質を送り届ける媒体として機能している。しかし、分泌されたベシクルがどの細胞に内包物質を伝達するのか、その点について未知な点が多い。本研究では、微生物から分泌されたベシクルの標的指向性を解明するとともに、標的の微生物細胞へ物質を運搬するツールとしての新しいベシクル利用法を提示することを目的としている。様々な細菌を対象に、分泌されたベシクルと微生物細胞への結合性を網羅的に解析した。多くの細菌から分泌されるベシクルは多種多様の細菌に非特異的に結合したのに対し、Enterobacteriaceae科に属する細菌のベシクルは、同属の細菌に特異的に結合する事が示された。当細菌におけるベシクルの特異的結合メカニズムを解析するために、細胞とベシクルの粒子径ならびに表面電位を解析した。その結果、当細菌が分泌するベシクルと同属細菌間では静電的反発力が低い事が示された。また、金コロイド標識透過電子顕微鏡法により観察を行ったところ、ベシクルは細胞表面に吸着するだけではなく、同属の細胞に融合している様子が観察された。さらに、ベシクルを介して同属細菌に効率的にDNA伝達する現象も確認された。以上の結果により、ベシクルを介して特定の細胞に情報を伝達する例が初めて示され、標的細胞に物質を送達するツールとしてベシクルの有用性が示唆された。本研究では、微生物分泌性ベシクルを介して行われる選択的情報伝達機構を解析し、複合微生物系内の標的微生物細胞のみに物質を送達する新規技術確立に繋げる事を目的としている。平成27年度では、細胞ーベシクル間の物理化学的エネルギーが標的微生物細胞への作用に重要であることを示すとともに、実際にベシクルを介してDNAを伝播している事を示した。以上から、順調に進展していると判断した。多くの微生物は、細胞外に直径20-200 nmのナノ粒子であるベシクルを分泌している。リン脂質二重層で構成されるベシクルはDNAや酵素、病原因子等の物質を高濃度に含有しており、他の細胞に内部の物質を送り届ける媒体として機能している。しかし、分泌されたベシクルがどの細胞に作用するのか、ベシクルの受け取り側に関して未解明な部分が多い。本研究では、微生物から分泌されたベシクルと微生物細胞間における特異性の有無を検証するとともに、ベシクルを標的の微生物細胞へ物質を運搬するツールとして利用するためのプラットフォーム構築を目的としている。初年度はEnterobacteriaceae科に属するButtiauxella属細菌がベシクルを同属内情報伝達ツールとして利用している点を示した。平成28年度は、そのメカニズムを解明することにより、ベシクルを用いた物質送達に繋がる知見を得ることを目指した。Buttiauxella属に分類される7種の細菌を対象にベシクルの取り込みを解析したところ、全ての細菌で同種が分泌するベシクルに対する高い取り込み能が確認された。また、紫外線照射した微生物細胞であってもベシクル取り込みは起こることが示された。ベシクルならびに微生物細胞から細胞外マトリクスを除去した場合、あるいはプロテナーゼ処理を行った場合に微生物細胞-ベシクル間の結合が低下したことから、膜表層に存在するタンパク質がベシクル取り込みに関与している可能性が示された。そこで、B. agrestisが分泌するベシクルを精製し、その構成タンパク質を質量分析により同定した。ベシクルの構成タンパク質をコードする遺伝子の欠損株を作製したところ、特定のタンパク質の欠落によりベシクル取り込みが低下することが見いだされた。以上の実験により、微生物細胞がベシクルを取り込む際に関与する因子が初めて示された。今後はベシクル-微生物細胞間における特異的相互作用のメカニズムを解明し、標的微生物のみを制御する新規技術の基盤を構築する。