hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エネルギー代謝を調節する核内受容体PPARδの新しい活性制御法の構築

近年の食生活や運動不足に起因するエネルギー過剰の状態を解消することは、生活習慣病発症の予防に繋がることから、骨格筋をターゲットとしたトレーニングによるエネルギー消費の促進や、トレーニング効果の得られる薬剤の開発が健康長寿社会を実現するためには重要である。核内受容体PPARδは、骨格筋の質の規定や骨格筋における脂肪燃焼を介したエネルギー消費の亢進に関与しており、PPARδの活性制御メカニズムを解明することは、トレーニング効果が期待出来る生活習慣病の予防・改善法の確立に重要と考えられる。これまでにPPARδが翻訳後修飾を受けることを明らかにして来たものの、それら翻訳後修飾による転写制御機構は明らかになっていない。それら機構を明らかにするために、翻訳後修飾部位で相互作用する因子を同定することとした。そこで、クロスリンク可能な非天然アミノ酸を導入したPPARδ変異体を細胞に発現させ、免疫沈降実験を行った。得られたPPARδとの複合体について質量分析法を用いた解析を行うことで、PPARδと相互作用する可能性のある因子を明らかとした。一方、独自に構築したPPARδの活性を指標とした評価系を用いて207種類の天然物由来の抽出エキスを評価した。その結果、PPARδの転写活性を2倍以上活性化するものを含め、いくつかの抽出エキスがPPARδを活性化することを明らかにした。今回見出した、PPARδの翻訳後修飾部位との相互作用因子、あるいは、PPARδの転写活性を制御する天然物由来抽出エキスは、PPARδを介したエネルギー消費の調節機構を解明する一端に繋がることから、意義深い研究成果だと考える。近年の食生活や運動不足に起因するエネルギー過剰の状態を解消することは、生活習慣病発症の予防に繋がる。骨格筋は糖や脂肪酸の燃焼に深く関わっている最大の臓器であり、骨格筋をターゲットとしたトレーニングによるエネルギー消費の促進や、トレーニング効果が得られる薬剤の開発が健康長寿社会を実現するためには重要である。核内受容体PPARδは、骨格筋の質の規定や骨格筋における脂肪燃焼を介したエネルギー消費の亢進に関与している。従って、PPARδの活性制御メカニズムの解明は、トレーニング効果が期待出来る生活習慣病の予防・改善法の確立に重要と考えられる。まず、ヒトの骨格筋におけるPPARδの機能を解析するために、培養細胞を用いた分化系の構築を行った。ヒト胎児横紋筋肉腫由来細胞株を用いて、培養条件を詳細に検討し、効率的かつ再現よく筋芽細胞から骨格筋へと分化させるin vitro分化系を構築した。次に、PPARδの転写調節に関わる翻訳後修飾について解析を行った。その結果、翻訳後修飾を受けるアミノ酸残基とその修飾の種類を明らかにした。この翻訳後修飾の有無によりPPARδの転写活性が変化したことから、リガンド非依存的な転写制御機構の解明に繋がることが期待できる。また、PPARδの相互作用因子を探索するために、光クロスリンクすることが可能な非天然型アミノ酸を有するPPARδを発現するためのシステムを構築した。従来の実験方法では、弱く相互作用している因子は免疫沈降等の実験操作の段階ではずれてしまい同定できない可能性があるが、本光クロスリンク法を用いた場合ではPPARδとそれら因子が共有結合するため、複合体を正確に解析することが可能となる。今後この非天然型アミノ酸を持つPPARδを利用することで、新たな相互作用因子の同定を目指す。本研究課題では、トレーニング効果が期待出来る生活習慣病の予防・改善法を確立することを目指して、骨格筋においてエネルギー代謝の調節を担っている核内受容体PPARδについて翻訳後修飾や相互作用因子などに着目して解析し、PPARδの新たな転写活性制御機構を解明することを目的とする。骨格筋における分子の役割を解析する培養細胞としては、マウスC2C12細胞やラットL6細胞を分化させる系が簡便で広く用いられているものの、ヒト由来の骨格筋細胞を用いた分化系はこれまであまり用いられていなかった。今回、ヒト胎児横紋筋肉腫由来細胞株を用いた分化系を構築したことは、ヒトでの骨格筋細胞におけるPPARδの機能制御機構を明らかにする上で非常に有用であると考えられる。また、PPARδのリガンド非依存的な転写制御機構の一つの可能性として、翻訳後修飾による制御を見出した。さらに、その領域を介した相互作用因子を同定するために、光クロスリンク可能な非天然型アミノ酸を持つPPARδを発現するための技術を確立した。今後、これら技術を駆使してリガンドとは異なる活性制御メカニズムを解明することにより、新しい機構を介した制御法の構築に繋がる可能性があり、非常に意義深い結果と考えられる。このように本研究は、概ね順調に進展している。近年の食生活や運動不足に起因するエネルギー過剰の状態を解消することは、生活習慣病発症の予防に繋がることから、骨格筋をターゲットとしたトレーニングによるエネルギー消費の促進や、トレーニング効果が得られる薬剤の開発が健康長寿社会を実現するためには重要である。まず、PPARδを活性化する成分を同定するスクリーニング系を構築し、種々天然成分のPPARδ活性を評価した。次に、申請者が同定したPPARδの翻訳後修飾を受けるアミノ酸残基について、翻訳後修飾を受けない変異体を作製した。野生型あるいは変異体を発現する細胞株を樹立し、PPARδのリガンドで処理した。

その結果、脂肪酸の燃焼に関わる標的遺伝子の発現量は、変異を導入することによって増加した。さらに、翻訳後修飾によるPPARδの転写制御機構を明らかにするために、その領域と相互作用する分子の探索を試みた。相互作用分子を同定するための光クロスリンク可能なPPARδ発現ベクターを種々用いてクロスリンク実験を行ない、SDS-PAGEを行なった。その結果、従来の免疫沈降実験では認められず、クロスリンク可能な発現ベクターを用いた時のみに認められる泳動バンドが検出されたことから、実際にこの領域を介してPPARδと相互作用する因子が存在することが示唆され、それら複合体を精製できたものと考えられた。以上より、PPARδは翻訳後修飾を受ける領域を介して複合体を形成すると共に、その領域の翻訳後修飾を制御することによって、より効率的にエネルギー消費を促すことが可能になると考えられた。本研究課題では、トレーニング効果が期待出来る生活習慣病の予防・改善法を確立することを目指して、骨格筋においてエネルギー代謝の調節を担っている核内受容体PPARδについて翻訳後修飾や相互作用因子などに着目して解析し、PPARδの新たな転写活性制御機構を解明することを目的とする。本研究により、PPARδの翻訳後修飾の有無が、人工的なレポーター遺伝子を用いた転写活性のみならず、細胞内における内在的な標的遺伝子の発現をも制御している事が示された。また、その領域を介する相互作用分子の存在が示された。さらに、PPARδ活性化成分を同定できるスクリーニング系を構築した。これら得られた結果は、PPARδの新たな制御機構を介した生活習慣病発症の構築予防に繋がる可能性があり、非常に意義深い結果と考えられる。このように本研究は、概ね順調に進展している。一方、当初の計画では、平成29年度中にPPARδの活性制御に関する研究成果を論文としてまとめて投稿する予定であり、論文投稿料を予算に計上していた。しかしながら、本研究成果を論文投稿するためには、追加実験が必要となった。そこで、当初予定していた平成29年度までの補助事業期間を平成30年度までに延長し、早急に論文化を行い論文の受理を目指すと共に、国際学会発表を行い広く世界に発信することとした。近年の食生活や運動不足に起因するエネルギー過剰の状態を解消することは、生活習慣病発症の予防に繋がることから、骨格筋をターゲットとしたトレーニングによるエネルギー消費の促進や、トレーニング効果の得られる薬剤の開発が健康長寿社会を実現するためには重要である。核内受容体PPARδは、骨格筋の質の規定や骨格筋における脂肪燃焼を介したエネルギー消費の亢進に関与しており、PPARδの活性制御メカニズムを解明することは、トレーニング効果が期待出来る生活習慣病の予防・改善法の確立に重要と考えられる。これまでにPPARδが翻訳後修飾を受けることを明らかにして来たものの、それら翻訳後修飾による転写制御機構は明らかになっていない。それら機構を明らかにするために、翻訳後修飾部位で相互作用する因子を同定することとした。
非有界^*-表現とその量子物理への応用

1.井上は,S.J.Bhatt,M.Fragoulopoulouと局所凸*-代数のwell-behaved*-表現について共同研究をすすめた.特に,井上とFragoulopoulouはテンソル(局所凸)*-代数のwell-behaved*-表現について研究した.さらに,井上,太田,黒瀬はこれらの研究の量子群への応用を考えた.3.井上,BhattはC*-代数の非可換微分構造の研究をすすめた.BlackadarとCuntzによって導入されたdifferential代数のスペクトラル不変性,C^∞-functional calculus等を調べた.さらに,C*-代数のsmooth部分代数,C*-structureについて研究した.4.井上,荻,高倉は,von Neumann代数の条件付期待値に関する研究の,O*-代数への一般化を考えた.弱条件付期待値,非有界条件付期待値の概念を定義し,それらの性質を調べた.特に,非有界条件付期待値がどのような条件のもとで条件付期待値になるかを調べた.5.井上,Bagarello,Trapaniは部分O*-代数の完全正値写像と微分の研究をすすめた.1.井上は,S.J.Bhatt,M.Fragoulopoulouと局所凸*-代数のwell-behaved*-表現について共同研究をすすめた.特に,井上とFragoulopoulouはテンソル(局所凸)*-代数のwell-behaved*-表現について研究した.さらに,井上,太田,黒瀬はこれらの研究の量子群への応用を考えた.3.井上,BhattはC*-代数の非可換微分構造の研究をすすめた.BlackadarとCuntzによって導入されたdifferential代数のスペクトラル不変性,C^∞-functional calculus等を調べた.さらに,C*-代数のsmooth部分代数,C*-structureについて研究した.4.井上,荻,高倉は,von Neumann代数の条件付期待値に関する研究の,O*-代数への一般化を考えた.弱条件付期待値,非有界条件付期待値の概念を定義し,それらの性質を調べた.特に,非有界条件付期待値がどのような条件のもとで条件付期待値になるかを調べた.5.井上,Bagarello,Trapaniは部分O*-代数の完全正値写像と微分の研究をすすめた.通常、非有界*-表現は有界*-表現では現れない病的なことがおこる。このため、病的な現象がおこらない"nice"*-表現とは何かを考え調べることが重要となる。もちろん"nice"*-表現は*-代数に依存する。Bhatt,井上,荻は非有界C^*-セミノルムから非有界*-表現のクラスを構成することができ、そのクラスの内で"nice"な*-表現(well-behaved *-表現とよぶ)とは何かを考え調べた。A[||・||]をC^*-normed代数,τを積が両側連続でノルム位相||・||より弱い局所凸位相とする。C Fragoulopoulou、井上,K.D.KurstenはC^*-代数A^^-[||・||]の単位球のτ-閉包B_τを調べることによりA[τ]の完備化A^^-[τ]はAllanのGB^*-代数である事を示した。これによりA^^-[τ]の代数的構造(可換な場合、∞をとる連続関数のつくる*-代数、非可換な場合、extended C^*-代数と同型)がわかった。3.O^*-代数の条件付期待値の研究von Neumann代数に対する条件付期待値の研究は非可換確率論の研究、またvon Neumann代数の構造論に対し重要な役割をしていることはよく知られている。井上、荻、高倉はその議論のO^*-代数への一般化を考え、O^*-代数の構造論、量子物理への応用を考えた。1.Well-behaved*-表現の研究井上は,M.Fragoulopoulouとテンソル積局所凸*-代数のwell-behaved^*-表現について共同研究をすすめた。さらに,井上,太田,黒瀬はこの研究の量子群への応用を考えた。4.0^*-代数と部分0^*-代数の研究井上,荻,高会は,von Neumann代数の条件付期待値に関する研究の,0^*-代数への一般化を考え成果を得た。F.Bagarello,井上,C.Trapaniは部分0^*-代数の完全正値写像と微分の研究をすすめた。
冬眠ハムスターの神経保護および神経機能維持機構解明に関する研究

1.冬眠関連物質の神経保護機構に関する知見初代培養ハムスター海馬神経細胞を用いて、低温誘発神経細胞死を惹起させる実験系を確立した。この実験系を用いて下記の知見を得た。(1)低温誘発神経細胞死は、caspase依存性のアポトーシス様神経細胞死である。(2)ハムスターの冬眠時体温制御に関与する物質のうち、アデノシン、オピオイド、ヒスタミンなどの体温下降作用を有する物質が低温誘発神経細胞死に対する保護作用を有する。一方、thyrotropin-releasing hormoneなどの体温上昇作用を有する物質は神経保護作用を発現しない。(3)神経保護作用発現に関与する受容体は、いずれもG蛋白共役型受容体であるが、その細胞内情報伝達系は、adenylate cyclase-cyclic AMP-protein kinase A活性系、adenylate cyclase-cyclic AMP-proteinkinase A抑制系、および、phospholipaseC-IP3、DAG-protein kinase C活性系と様々であり、共通のメカニズムは見いだされなかった。以上の知見より、冬眠時に体温制御に関わる物質は、体温を下降させる、あるいは、低体温を維持させると同時に、低温により惹起される神経細胞死から神経細胞を保護し、神経機能維持に働いていることが示唆された。2.冬眠維持期の体温制御機構に関する知見冬眠ハムスターを用いて実験を行い、下記の知見を得た。(1)冬眠維持期にμ1受容体の拮抗薬、あるいは、抗β-エンドルフィン抗体を側脳室に投与することにより冬眠が中断された。(2)弓状核において、冬眠開始1時間後は神経細胞の細胞体でβ-エンドルフィン免疫反応性が増強し、冬眠開始17時間後では神経線維で免疫反応性が増強した。(3)冬眠開始17時間後の終盤脈絡器官において、神経線維におけるβ-エンドルフィンの免疫反応性増大が観察された。以上の知見より、冬眠維持期の体温は、弓状核で産生されたβ-エンドルフィンが、軸索輸送により終盤脈絡器官に輸送され、μ受容体を活性化することにより制御されていることが示唆された。平成18年度は、申請した研究計画に基づき、下記の研究を推進して知見を得た。(1)低体温による神経障害(神経細胞死)から神経を保護する新規物質の検索と神経保護機構の解明に関する研究実績(1)砂ネズミを用いた一過性の虚血モデルにおいて、冬眠ハムスターの血清は、虚血に伴う海馬CA1錐体細胞の脱落を抑制した。(2)初代培養海馬ニューロンを用いた実験において、22°C以下で培養することにより神経細胞死が発現した。また、この神経細胞死はミトコンドリアからのcytochrome C遊離に起因するcaspase依存性のアポトーシスであることを示す知見が得られた。(3)ハムスターの冬眠時体温制御に関与する物質のうち、アデノシン、オピオイドなどの体温下降作用を有する物質が低温誘発神経細胞死に対する保護作用を有すること、thyrotropin-releasing hormoneなどの体温上昇作用を有する物質は神経保護作用を発現しないことを明らかにした。(4)冬眠時に活動している神経細胞からの神経保護物質を見いだすために、c-Fosを指標に、冬眠時の神経活動を検索した。その結果、視床下部の弓状核で冬眠後にc-Fosの発現が増加することが明らかとなった。

(5)非冬眠ハムスターの視床下部から、cDNAライブラリーの作成を行う研究を遂行中である。(6)さらに、冬眠維持期の神経機能維持機構を解明するために、冬眠開始後27時間と30時間の視床下部からmRNAを抽出し、differential display法を用いて、冬眠維持期に特異的に発現してくる遺伝子の解析を行っている。平成19年度は、平成18年度に得られた知見に基づき研究を遂行し、下記の知見を得た。1.冬眠維持期の体温制御機構に関する知見(1)冬眠維持期にμl受容体の拮抗薬、あるいは、抗β-エンドルフィン抗体を側脳室に投与することにより冬眠が中断された。(2)弓状核において、冬眠開始1時間後は神経細胞の細胞体でβ-エンドルフィン免疫反応性が増強し、冬眠開始17時間後では神経線維で免疫反応性が増強した。さらに、冬眠開始30時間後では、β-エンドルフィンの免疫反応性は冬眠前のレベルに戻った。(3)冬眠開始17時間後の終盤脈絡器官において、神経線維におけるβ-エンドルフィンの免疫反応性増大が観察された。(4)エンドモルフィン-1、エンドモルフィン-2、ダイノルフィン、メチオニンエンケファリンは、いずれも冬眠後に免疫反応性は低下していた。以上の知見より、冬眠維持期の体温は、弓状核で産生されたβ-エンドルフィンが、軸索輸送により終盤脈絡器官に輸送され、μ受容体を活性化することにより制御されていることが示唆された。2.冬眠制御に関わる遺伝子発現に関する知見冬眠開始27時間後と30時間後の視床下部から抽出したmRNAのdifferential displayを行うことにより、冬眠維持期に特異的に発現してくる遺伝子の解析を行った。(1)解析の結果、4つのmRNAが冬眠開始27時間後から30時間後にかけて特異的に発現してくることが明らかになった。(2)4つのmRNAの相同性解析より、若年性網膜分離症関連蛋白質、脱ユビキチン化酵素、GTP結合性蛋白αサブユニット、hexose-6-phosphate dehydrogenaseをコードする遺伝子である可能性が示された。
肝再生不全克服に向けた成熟肝細胞および肝前駆細胞の再生機構に関する研究

肝臓が重症の肝障害を負った時に,肝臓の再生を担うのは通常の肝細胞(成熟肝細胞)ではなく,それより未熟な細胞である肝前駆細胞といわれているので,この細胞の増殖に必要な刺激物質あるいは細胞内の刺激伝達経路および臨床的血清マーカーを実験的に検索した.急性肝不全の患者血漿では肝前駆細胞の増殖が引き起こされたが,健常者の血漿では増殖しなかった.その刺激の伝達経路はP2Y受容体,JNKおよびATF2であることを確認した.急性肝不全症例での前駆細胞の動員は血清AFPと比較的強く相関し.マーカーとして有用であった.肝臓が重症の肝障害を負った時に,肝臓の再生を担うのは通常の肝細胞(成熟肝細胞)ではなく,それより未熟な細胞であるオーバル細胞といわれているので,この細胞の増殖に必要な刺激物質あるいは細胞内の刺激伝達経路を実験的に検討した.急性肝不全の患者血漿ではオーバル細胞の増殖が引き起こされたが,健常者の血漿では増殖しなかった.増殖にはJNKと呼ばれる転写因子の活性化が必須で,患者血漿中に含まれるATP受容体(P2Y2)刺激物質あるいはTNFαがその刺激惹起物質と推定された.また,両者の刺激が共同して増殖に関与していることも確認された.以上のことから,急性肝不全血漿中にはオーバル細胞の増殖を刺激する物質が複数あり,これらが複合的に関与していることが明らかになった.肝臓が重症の肝障害を負った時に,肝臓の再生を担うのは通常の肝細胞(成熟肝細胞)ではなく,それより未熟な細胞であるオーバル細胞といわれているので,この細胞の増殖に必要な刺激物質あるいは細胞内の刺激伝達経路を実験的に検討した.急性肝不全の患者血漿ではオーバル細胞の増殖が引き起こされたが,健常者の血漿では増殖しなかった.そこで,急性肝不全の環境では,オーバル細胞のような未分化な細胞が,肝臓の組織修復や再生に動員されているものと推察され,その刺激の伝達経路も明らかになった.上記の結果をふまえて26年度は,急性肝障害の患者において,肝臓組織の修復や再生に動員されるオーバル細胞の割合が,肝障害の程度により異なるのか,また,それをどのようにしたら患者に侵襲を与えずに検出できるのかを検討した.方法は,様々な程度の急性肝障害患者の肝臓の組織を採取し,特殊な顕微鏡観察で未分化(未熟)な細胞の割合を算出した.これと血液中の物質と比較することにより,肝臓内に動員されている未分化な細胞(オーバル細胞)の割合を,血液の所見から推定できるかを解析した.また,血液の解析は,正常な肝臓の切除モデルともいえる肝移植のドナーでも行い,病的な肝臓(急性肝障害)の場合と比較した.その結果,急性肝障害の患者では,肝組織内に重症度に応じて未分化な肝細胞(CK19陽性細胞)が動員されており,その割合は,血液中の胎児性蛋白(AFP)と比例することが明らかになった.また,肝移植ドナーでは,AFPは上昇しないことも明らかになった.このことは,病的肝臓(急性肝障害)では,肝組織の修復・再生に,オーバル細胞が動員され,その動員程度は,血中のAFPである程度推定できることが示された.肝臓が重症の肝障害を負った時に,肝臓の再生を担うのは通常の肝細胞(成熟肝細胞)ではなく,それより未熟な細胞であるオーバル細胞といわれているので,この細胞の増殖に必要な刺激物質あるいは細胞内の刺激伝達経路を実験的に検討した.急性肝不全の患者血漿ではオーバル細胞の増殖が引き起こされたが,健常者の血漿では増殖しなかった.そこで,急性肝不全の環境では,オーバル細胞のような未分化な細胞が,肝臓の組織修復や再生に動員されているものと推察され,その刺激の伝達経路も明らかにした.そこで,重症の実際の肝障害の患者で,肝臓組織の修復や再生に動員されるオーバル細胞の割合が,肝障害の程度により異なるのか,また,それをどのようにしたら患者に侵襲を与えずに検出できるのかを検討した.その結果,急性肝障害の患者では,肝組織内に重症度に応じて未分化な肝細胞(CK7, CK19陽性細胞)が動員されており,その割合は,血液中の胎児性蛋白(AFP)と比例することが明らかになった.また,肝移植ドナーでは,AFPは上昇しないことも明らかになった.このことは,病的肝臓(急性肝障害)では,肝組織の修復・再生に,オーバル細胞が動員され,その動員程度は,血中のAFPである程度推定できることが示された.さらに,マウスの肝を焼き切るような手法で切除して病的肝臓のモデルを作成し,切除部分の組織再生を観察したところ,局所に偽胆管と呼ばれる構造を確認した.この構造は肝不全に陥った肝臓でよく見られるもので,再生不全の所見と考えられている.偽胆管を構成する細胞の性質も確認し,前述と同様,肝前駆細胞の性質を備えていることを確認した.また,この部分の組織の遺伝子発現を見ると炎症が強いことがわかり,病的肝臓では強い炎症反応が未分化な肝細胞を動員する環境を作り,その細胞が偽胆管を形成するという機序が想定された.

肝臓が重症の肝障害を負った時に,肝臓の再生を担うのは通常の肝細胞(成熟肝細胞)ではなく,それより未熟な細胞である肝前駆細胞といわれているので,この細胞の増殖に必要な刺激物質あるいは細胞内の刺激伝達経路および臨床的血清マーカーを実験的に検索した.急性肝不全の患者血漿では肝前駆細胞の増殖が引き起こされたが,健常者の血漿では増殖しなかった.その刺激の伝達経路はP2Y受容体,JNKおよびATF2であることを確認した.急性肝不全症例での前駆細胞の動員は血清AFPと比較的強く相関し.マーカーとして有用であった.研究開始初年度は,基礎的研究により,急性肝不全の血液により,未分化な細胞が増殖するシグナルを解明した.2年目に当たる26年度はこれをふまえて,臨床場面で未分化な細胞の動員状況を把握する手法を見いだすことを目的とし,血液中のAFPがふさわしいことを見いだした.しかし,当初想定していたFGF7の臨床的意義はAFPほど明確ではなく,次の段階でFGF7の基礎的検討に入る計画を変更することとなった.消化器病学上記研究成果をふまえ,実際の肝障害局所では,未分化な細胞の動員・増殖に,どのような物質やシグナル伝達が関わっているのかを,実験的に検討し,肝再生の至適環境解明に向けた基礎的な成果を上げたい.具体的には,肝の凝固切開モデルを用いて,炎症を伴う肝局所障害モデルを作成し,急性肝障害局所の細胞の遺伝子発現,蛋白発現を網羅的に検討し,再生環境を解明する予定である.25年度は,急性肝不全患者の血漿内の肝細胞増殖促進因子の推定を行う予定であったが,オーバル細胞の増殖激物質として,ATP受容体(P2Y2)刺激物質,TNFαを候補としてあげる事ができた,また,そのシグナル伝達経路も概ね解明できた.成熟肝細胞である初代培養肝細胞についても同様の手法で,肝移植ドナー血漿中にこれを見出脱予定であったが,検体の不足から進捗は十分とは言えなかった.物品の購入費を予算内に押さえるため,購入量をなるべく抑えたところ.購入額の端数と支給額との間に差が生じた.肝不全では肝細胞の再生不全が予後不良の大きな要因である.臨床的な知見からは,オーバル細胞の至適増殖条件は,成熟肝細胞にとっては増殖抑制条件の可能性がある.今後は,肝移植ドナー血漿による成熟肝細胞の増殖促進機構の解明を目指し,基礎的実験を進める予定である.次年度の試薬購入に充てたい.実験が予定より若干遅れ,試薬の購入が予定より少なくて済んだため.予定していた実験を次年度に行うため,その分の試薬購入に充てる予定
cAMP/PKA系による遺伝子発現の空間及び時間調節機構の解明

これまで代表研究者らの研究室では、高塩食を投与したラットの副腎において特異的に誘導される塩誘導性キナーゼ(SIK)は副腎皮質を副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)で刺激すると誘導され,ステロイド産生の律速酵素であるコレステロール側鎖切断酵素CYP11Aの遺伝子発現をプロモーター領域のCyclic AMP-responsive element (CRE)に結合するタンパク質CREBを介して抑制することを明らかにした(J.Biol.Chem.277.15629-15637 2002)。さらに、SIKのCRE調節機構には、その細胞内局在が深く関係することを示し(J.Biol.Chem.2002.42334-42343)、さらに転写抑制機構との相関について研究を進め転写抑制に関わる領域を探索したところ、SIK1のNLSは細胞内局在だけでなく、転写抑制効果に影響を及ぼしていることがわかった。また核内のSIKだけが転写抑制機能を持つのではなく、細胞質のSIKも同様の作用を示すことを明らかとなり、SIKの単純な局在ではなく、核-細胞質間移動によって転写抑制作用が調節されていることが示唆された。代表研究者は、SIKによるCREB抑制が細胞質・核両方において発揮されることから、SIK-CREB間に介在する分子の存在を予想し、基質の同定を試みた。そして、今年、SIKが最近同定されたCREB bZIPに結合するCoactivatorであるTORC(Transducer of Regulated CREB Activity)をリン酸化することを示した。TORCはCaシグナルで脱リン酸化され核内移行し、CREBに結合して転写を促進するが、cAMPシグナルーSIKによってリン酸化されると細胞質に止まり転写活性化は抑制される。つまり、SIKのCRE抑制作用はTORCの細胞内局在の制御を介することが明らかとなった(Screaton et al.,2004,Cell.,Katoh et al.,2004Eur J Biochem)。研究代表者らの研究室でクローニングしたSalt Inducible kinase(SIK1)は、これまでACTH/cAMP/PKA系で誘導されるステロイドホルモン合成酵素の発現を抑制することが示されており、この転写抑制作用はSIKの細胞内輸送に深く関わっているとして研究を進めてきた。その結果、SIK1はPKAシグナルによってSer577がリン酸化され、核外へ移行すること、SIK1は核内移行シグナル(NLS)と核外移行シグナル(NES)を有し、核外移行にはさらにキナーゼ活性が必要であることがわかった。リン酸化Ser577の抗体を用いた実験で、SIKはACTH刺激後、核外移行してから再び核へ戻るまでの間、リン酸化状態が維持された。Ser577を脱リン酸化したSIK1では転写抑制機能が増強されるため、核外移行後約6時間後に脱リン酸化されたSIKが核内へ移動して転写抑制に働いているということが示唆された。研究代表者は以上の結果を「adrenal2002」(サンフランシスコ、7月)「International Congress on Hormone Steroids and Hormones and Cancer」(福岡、10月)にて発表した。SIKの細胞内動態を明らかにしたのち、さらに転写抑制機構との相関について研究を進め転写抑制に関わる領域を探索したところ、SIK1のNLSは細胞内局在だけでなく、転写抑制効果に影響を及ぼしていることがわかった。この結果は2003年4月の「Workshop on Molecular Steroidogenesis」(イギリス)にて報告する予定であり、現在、論文としてもまとめている段階である。これまで代表研究者らの研究室では、高塩食を投与したラットの副腎において特異的に誘導される塩誘導性キナーゼ(SIK)は副腎皮質を副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)で刺激すると誘導され,ステロイド産生の律速酵素であるコレステロール側鎖切断酵素CYP11Aの遺伝子発現をプロモーター領域のCyclic AMP-responsive element (CRE)に結合するタンパク質CREBを介して抑制することを明らかにした(J.Biol.Chem. 277.15629-15637 2002)。さらに、昨年度の研究においてSIKのCRE調節機構には、その細胞内局在が深く関係することを示し(J.Biol.Chem. 2002. 42334-42343)、さらに転写抑制機構との相関について研究を進め転写抑制に関わる領域を探索したところ、SIK1のNLSは細胞内局在だけでなく、転写抑制効果に影響を及ぼしていることがわかった。また核内のSIKだけが転写抑制機能を持つのではなく、細胞質のSIKも同様の作用を示すことを明らかとなり、SIKの単純な局在ではなく、核-細胞質問移動によって転写抑制作用が調節されていることが示唆された。この結果は2003年4月の「Workshop on Molecular Steroidogenesis」(イギリス)にて発表した。またSIKファミリー内の詳細な解析を行い、転写抑制能や酵素活性の発現などについて比較検討を行った。SIKは大きく分けて3種類のクローンが同定されており、同じファミリー間で局在や活性制御の違いなど興味深い結果が得られている。これらの結果は今年度の日本生化学学会(横浜)にて報告する予定である。

現在は引き続き,SIKファミリーの下流の因子の同定を試みると共にSIK自身の酵素活性制御機構の解明に取り組んでいる。これまで代表研究者らの研究室では、高塩食を投与したラットの副腎において特異的に誘導される塩誘導性キナーゼ(SIK)は副腎皮質を副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)で刺激すると誘導され,ステロイド産生の律速酵素であるコレステロール側鎖切断酵素CYP11Aの遺伝子発現をプロモーター領域のCyclic AMP-responsive element (CRE)に結合するタンパク質CREBを介して抑制することを明らかにした(J.Biol.Chem.277.15629-15637 2002)。さらに、SIKのCRE調節機構には、その細胞内局在が深く関係することを示し(J.Biol.Chem.2002.42334-42343)、さらに転写抑制機構との相関について研究を進め転写抑制に関わる領域を探索したところ、SIK1のNLSは細胞内局在だけでなく、転写抑制効果に影響を及ぼしていることがわかった。また核内のSIKだけが転写抑制機能を持つのではなく、細胞質のSIKも同様の作用を示すことを明らかとなり、SIKの単純な局在ではなく、核-細胞質間移動によって転写抑制作用が調節されていることが示唆された。代表研究者は、SIKによるCREB抑制が細胞質・核両方において発揮されることから、SIK-CREB間に介在する分子の存在を予想し、基質の同定を試みた。そして、今年、SIKが最近同定されたCREB bZIPに結合するCoactivatorであるTORC(Transducer of Regulated CREB Activity)をリン酸化することを示した。TORCはCaシグナルで脱リン酸化され核内移行し、CREBに結合して転写を促進するが、cAMPシグナルーSIKによってリン酸化されると細胞質に止まり転写活性化は抑制される。つまり、SIKのCRE抑制作用はTORCの細胞内局在の制御を介することが明らかとなった(Screaton et al.,2004,Cell.,Katoh et al.,2004Eur J Biochem)。
活動量測定器を用いた患者指導が人工関節置換術後成績に及ぼす効果

近年の急速な高齢社会の進展に伴い,慢性的に痛みを呈する変形性関節症の有病率が高まっている。変形性関節症に対する治療には人工関節置換術が広く行われており,術後成績の向上のためにリハビリテーションの発展が求められている。人工股関節・膝関節置換術後のリハビリテーションでは,痛みに難渋する症例が少なくないが,痛みにかかわる精神心理機能との関連については未だ不明な点が多い。本研究の目的は,活動量測定器を用いた患者指導が,人工股関節・膝関節置換術後の痛みにかかわる精神心理機能と運動機能に及ぼす効果を明らかにすることである。当研究代表者所属施設にて,人工股関節または膝関節置換術と通常理学療法を実施した患者を対照群とし,同手術と通常理学療法に加えて活動量測定器を用いた患者指導を実施した患者群を実験群とした。活動量の測定には活動量測定器(ライフコーダ)を用い,手術翌日から14日後まで実施した。患者は活動量測定器から得られた身体活動量を記録し,その結果に基づき理学療法士が患者指導を行った。評価指標は,術前と術14日後において, 10m最大歩行速度,下肢筋力,四肢周囲径,四肢関節可動域, Pain Catastrophizing Scale (PCS)を測定した。術前と術14日後において,実験群と対照群を比較した結果,それぞれの評価指標において両群間に有意な差が認められなかった。人工関節置換術後のリハビリテーションでは,身体機能に対する介入を行うだけではなく,痛みにかかわる精神心理機能および身体活動量に対する介入が必要であることが指摘されている。本研究課題の成果は,痛みを呈する患者に対する効果的で効率的なリハビリテーションの発展へ向けた基礎的資料を提供することができるものと考える。
手術侵襲と痛みに対する生体ストレス反応の評価とオピオイドの意義に関する研究

本研究では、麻酔科学および集中治療医学の重要なテーマである生体ストレス反応の機序とその制御について検討した。その結果、亜酸化窒素の作用にはκオピオイド受容体が重要な役割を果たしていること、オピオイドによる免疫抑制にはDNA損傷やオピオイド受容体以外の機序が関与すること、低酸素誘導因子を介する遺伝子発現に対して各種薬剤や低体温が影響を及ぼすことが明らかになった。周術期に頻用される吸入麻酔薬の作用機構と周術期における遺伝子発現変化の分子機構について検討した。1.亜酸化窒素の鎮痛機序ノックアウトマウスあるいは阻害薬を用いた検討により、亜酸化窒素の鎮痛作用には、オピオイド受容体ファミリーに属するκオピオイド受容体およびノシセプチン受容体が関与する可能性を示した。2.全身麻酔と低酸素誘導因子を介するエリスロポエチン(EPO)発現EPOは、主として腎臓において産生される赤血球増生因子であるが、脳においても虚血や低酸素に反応して発現し、神経保護に重要な機能を有しうる。我々は、全身麻酔が低酸素下での脳内EPO発現に与える影響について検討した。低酸素による脳内EPO発現誘導は、イソフルランにより濃度依存的に有意に抑制された。一方、腎臓における低酸素下のEPO発現誘導は全身麻酔の影響を受けなかった。脳におけるEPO抑制機序として、低酸素下にEPOを誘導する転写因子hypoxia-inducible factor(HIF)-2の脳内活性が、イソフルラン投与下で有意に抑制されることが確認された。3.硫化水素(H_2S)が低酸素誘導性遺伝子応答に及ぼす影響H_2Sは、臓器虚血耐性の獲得を促し臓器保護効果を有し、HIF-1は低酸素下で活性化して様々な低酸素誘導性遺伝子応答を担う転写因子である。我々は、H_2Sが低酸素下HIF-1活性化に及ぼす影響について検討した。Hep3B細胞、SH-SY5Y細胞において、H_2Sは用量依存性に低酸素誘導性のHIF-1α細胞内蛋白質発現量を抑制し、HIF-1の標的遺伝子であるglucose transporter-1、vascular endothelial growthfactorの発現誘導を抑制した。低酸素下におけるH_2SによるHIF-1活性抑制はHIF-1α分解促進によると考えられる。周術期管理に関係する以下の研究を行った。1.亜酸化窒素の鎮痛機序κオピオイド受容体欠損マウスにおいて亜酸化窒素の作用を検討し、亜酸化窒素の鎮痛作用はκオピオイド受容体欠損により消失するが、鎮静作用は変化しないことが明らかになった。2.全身麻酔と低酸素誘導因子(HIF)を介するエリスロポエチン(EPO)発現EPOは、脳において虚血や低酸素に反応して発現し、神経保護に重要な機能を有する可能性がある。我々は全身麻酔が低酸素下での脳内EPO発現に与える影響について検討し、低酸素あるいは急性貧血による脳内EPO発現誘導は、揮発性麻酔薬イソフルランにより濃度依存的に抑制されたれることを示した。脳におけるEPO抑制機序として、アストロサイトにおいて低酸素下にEPOを誘導するHIF-2の活性が、イソフルラン投与下で有意に抑制されることが確認された。

3.オピオイド鎮痛薬がHIF-1活性に及ぼす影響神経細胞腫培養株におけるHIF-1活性とHIF-1依存性遺伝子発現に対してオピオイド鎮痛薬が及ぼす影響について検討した。オピオイド鎮痛薬投与後8-24時間で、μオピオイド受容体の活性化を介してHIF-1活性が上昇し、GLUT1、LDHA、VEGF遺伝子発現の増加することが明らかになった。4.人工心肺(CPB)による単核球アポトーシスの機序CPB後の臓器機能不全や免疫抑制の機序として、ヒト単核球(PBMC)のアポトーシスがある。我々は、CPB後のアポトーシスの機序としてヒトPBMCのDNA損傷を検討した。CPB後のPBMCにはDNA損傷が検出され、DNA損傷修復過程でみられるDDB2及びP53蛋白量の増加、P53のリン酸化が確認された。CPB導入前から好中球エラスターゼ阻害薬シベレスタットが投与された症例では、非投与例に比べてPBMCのCPB後DNA損傷は有意に軽度だった。1.亜酸化窒素の鎮痛機序κオピオイド受容体欠損マウスにおいて亜酸化窒素の作用を検討し、亜酸化窒素の鎮痛作用はκオピオイド受容体欠損により消失するが、鎮静作用は変化しないことが示され、鎮痛作用はκオピオイド受容体を介するが、鎮静作用はオピオイド受容体以外の機序を介することが明らかになった。今後は、亜酸化窒素により脳内でκオピオイド受容体発現神経細胞あるいはダイノルフィン分泌神経細胞が活性化することを示す必要がある。2.オピオイドによる免疫抑制機構ヒト末梢血由来T細胞およびヒトT細胞由来細胞株でモルヒネ投与後にT細胞受容体を活性化すると、モルヒネ投与を行わない場合に比べて、extracellular signal-regulated kinaseの燐酸化は増強され、nuclear factor κB経路の活性は減弱されることが明らかになった。これらの作用はナロキソンで抑制されないことから、オピオイド受容体を介さない作用であることが示唆された。3.全身麻酔と低酸素誘導因子(HIF)を介するエリスロポエチン(EPO)発現EPOは、脳において虚血や低酸素に反応して発現し、神経保護に重要な機能を有する可能性がある。本研究では、麻酔薬が低酸素に曝露したマウス脳におけるEPO発現に与える影響について検討し、検討したすべての麻酔薬(イソフルラン、セボフルラン、ハロタン、バルビツレイト、プロポフォール、ケタミン)がEPO発現を抑制することを明らかにした。さらに、培養細胞を用いた検討から、アストロサイトにおいてEPO発現が麻酔薬によって抑制されることが明らかになった。近年、麻酔薬が神経発達に影響することが注目されているが、EPOが神経発達において重要な役割を果たすことが知られているので、本研究で示された麻酔薬によるEPO発現抑制が麻酔薬の神経発達への影響に関与している可能性がある。周術期管理に関係する薬物である吸入麻酔薬とオピオイドの作用機構、周術期管理において重要な病態である低酸素、急性貧血、人工心肺に関して、生化学的、分子生物学的、薬理学的手法を用いて多方面から解析を行い、新しい知見が得られた。24年度が最終年度であるため、記入しない。
パンサラッサ海遠洋域におけるペルム紀末～前期三畳紀の海洋環境変動の研究

有機炭素同位体比分析:堆積物を酸処理し、質量分析計を用いて有機炭素同位体比を測定した。結果、前期三畳紀末から中期三畳紀へ炭素同位体比の値が増加することが確認された。硫黄同位体比の測定:堆積物より硫化物を抽出し、質量分析計で硫黄同位体比を測定した。結果、日本・ニュージーランドのペルム紀三畳紀境界層で硫黄の同位体比がともに10‰減少することが明らかになった。また、前期三畳紀オレネキアン期後期には有機炭素同位体比と硫化物硫黄同位体比は共に増加するが、上位の中期三畳紀アニシアン期ではこの共変化がみられないことを明らかにした。堆積物の元素組成分析:日本のペルム紀末-前期三畳紀の堆積物をEDXRF、ICPMS、XGTを用いて分析し、堆積物の元素組成を明らかにした。得られたデータは、ペルム紀末の堆積物中にMoとPbの濃度が増加することを示した。学会講演・論文投稿:日本のセクションから得られたパンサラッサ海遠洋におけるペルム紀末三畳紀前期の炭素同位体比の研究成果について国際学会(International Conference of Geobiology,中国、武漢)で口頭発表を行い、同様の内容で投稿していた論文を査読者のコメントをもとに改定し、国際誌Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecologyに受理させた。日本のペルム紀末-三畳紀前期の硫黄同位体比の研究成果について国際誌Chemical Geologyに投稿した。日本のペルム紀-三畳紀境界層の元素分析の研究、ニュージーランドのセクションから得られた後期ペルム紀-前期三畳紀の硫黄同位体比の研究、日本の前期三畳紀-中期三畳紀の炭素・硫黄同位体比の研究成果について投稿原稿をまとめた。また、これまでの研究成果をまとめ、博士論文を執筆した。1.野外調査・試料採取:遠洋性深海堆積物の地層セクションが位置する岩手県(安家森セクション),愛知県(桃太郎神社セクション)において野外調査を行い,分析試料を採取した。更に古環境変動の比較検討対象として,ニュージーランド北島と南中国において地質調査・試料採取を行った。2.化石年代の検討:安家森セクション,桃太郎神社セクションより示準化石を見出し,各地層セクションの化石年代を特定した(後期ペルム紀-前期三畳紀,前期三畳紀-中期三畳紀)。3.有機炭素同位体比測定:安家森セクションと桃太郎神社セクションの各層準から得られた有機炭素の同位体比を質量分析計で測定し,同位体比の変動曲線を表した。4.ケロジェン熱分解分析:安家森セクションの堆積物よりケロジェンを抽出し,熱分解装置とガスクロマトグラムを用いて分析した。その結果,わずかながらケロジェンから古環境解析に有効な有機分子を見出すことができた。5.有機分子の炭素同位体比:産業技術総合研究所の坂田将(東北大准教授併任)の協力を得て,桃太郎神社セクションから得られた多環式芳香属炭化水素の炭素同位体比を測定した。その結果,これらの有機分子は,海生藻類を起源物質とする可能性が高いことが明らかになった(論文に投稿済み)。6.硫化物抽出:堆積物より硫化物を抽出する手法を習得し,安家森セクションと桃太郎神社セクションの堆積物より硫化物を抽出した。今後,硫化物の硫黄同位体比を測定していく予定である。7.学会講演・論文投稿:上記の研究成果とこれまでの研究成果を論文にまとめ,2編の論文が国際誌に受理された。また,国内の主要学術学会において研究発表を行った。1.野外調査・サンプリング:岩手県に位置するペルム紀三畳紀境界層(安家森セクション)、愛知県犬山地域(桃太郎神社セクション)、ニュージーランド北島においてに地質調査を行い、分析試料を採取した。2.示準化石の収集と同定、化石年代の検討:安家森セクションよりコノドント化石を見出し、化石年代のデータを蓄積した。桃太郎神社セクションからコノドント化石を見出し、セクション下部の前期三畳紀Smithian期の層序が存在することを新たに明らかにした。3.硫化物の抽出と硫黄同位体比の測定:安家森セクションのペルム紀末-前期三畳紀の堆積物と桃太郎神社セクションの前期三畳紀-中期三畳紀の堆積物から硫化物を抽出し、その硫黄同位体比を質量分析計(IRMS)で測定した。その結果、硫化物の硫黄同位体比は、ペルム紀末に約10‰の減少幅で値が減少し、前期三畳紀にはその減少前の程度の水準値に増加していたことが確認された。4.フランボイダル黄鉄鉱の確認と粒径測定:安家森セクションのペルム紀末-前期三畳紀の研磨薄片を、走査型電子顕微鏡(SEM)、電子線マイクロアナライザ(EPMA)を用いて観察した。結果、堆積物中に多数のフランボイダル黄鉄鉱を発見した。還元的環境を背景に形成されたと考えられる。5.堆積物の元素分析:安家森セクションのペルム紀末-前期三畳紀の堆積物をエネルギー分散型蛍光X線分析装置(EDXRF)を用いて分析を行った。6.学会講演・論文投稿:上記の研究成果とこれまでの研究成果を論文にまとめ、1編の論文が国際誌に、1編の論文が国内雑誌に公表された。また、国内の主要学術学会において研究発表を行った。

結果、前期三畳紀末から中期三畳紀へ炭素同位体比の値が増加することが確認された。硫黄同位体比の測定:堆積物より硫化物を抽出し、質量分析計で硫黄同位体比を測定した。結果、日本・ニュージーランドのペルム紀三畳紀境界層で硫黄の同位体比がともに10‰減少することが明らかになった。また、前期三畳紀オレネキアン期後期には有機炭素同位体比と硫化物硫黄同位体比は共に増加するが、上位の中期三畳紀アニシアン期ではこの共変化がみられないことを明らかにした。堆積物の元素組成分析:日本のペルム紀末-前期三畳紀の堆積物をEDXRF、ICPMS、XGTを用いて分析し、堆積物の元素組成を明らかにした。得られたデータは、ペルム紀末の堆積物中にMoとPbの濃度が増加することを示した。学会講演・論文投稿:日本のセクションから得られたパンサラッサ海遠洋におけるペルム紀末三畳紀前期の炭素同位体比の研究成果について国際学会(International Conference of Geobiology,中国、武漢)で口頭発表を行い、同様の内容で投稿していた論文を査読者のコメントをもとに改定し、国際誌Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecologyに受理させた。日本のペルム紀末-三畳紀前期の硫黄同位体比の研究成果について国際誌Chemical Geologyに投稿した。日本のペルム紀-三畳紀境界層の元素分析の研究、ニュージーランドのセクションから得られた後期ペルム紀-前期三畳紀の硫黄同位体比の研究、日本の前期三畳紀-中期三畳紀の炭素・硫黄同位体比の研究成果について投稿原稿をまとめた。また、これまでの研究成果をまとめ、博士論文を執筆した。
緑膿菌臨床分離株の産生する新奇な白血球障害性毒素に関する研究

本研究の目的は緑膿菌臨床分離株が培養上清中に産生する、Chinese Hamster Ovary(CHO)細胞の円形化を引き起こす活性(R活性)を示す物質(TOX)の分離を行い、この物質が白血球細胞に毒性を示すか検討することにあった。精製TOXは、分子量約54,000のサブユニット構造を持たない蛋白であった。24時間以内に1x10^4個のCHO細胞を円形化するのに必要なTOX量は50ngであった。また、精製TOXはヒト白血病由来培養細胞であるHL-60細胞に細胞障害活性は示さなかった。精製TOXのN-末端アミノ酸配列を決定したところ、緑膿菌アルカリ性プロテアーゼ(APR)のN-末端アミノ酸配列のある部分と完全に一致した。精製TOX標品は蛋白分解酵素活性を示し、TOXはAPRそのものであることが強く示唆された。以上、R活性は、APRがCHO細胞アンカーリング蛋白の培養器への付着を切断することで発揮されたことが示唆された。TOX/APRはヒト白血球系培養細胞に細胞障害性を示さなかったことより、本研究が目的とした新奇な白血球細胞障害性毒素の発見には至らなかったが、APRの緑膿菌病原性への関与を強く裏付ける重要な研究結果と考える。
ゼオライト膜を用いた光誘起電子ベクトル輸送系

1.ゼオライト表面化学修飾有機溶媒中に分散したゼオライト粒子の積層法をゼオライト膜調製法のひとつとして検討する。そのためには、現存のゼオライトは本来、その外表面にヒドロキシル基が露出しているため親水性であり、有機溶媒には分散しない。ゼオライト膜調製のための予備的段階として、ゼオライト粒子外表面の化学修飾を行い、疎水性発現法の検討を行った。化学修飾剤として、アルキルシリルクロライドを選択し、真空系中で処理したゼオライトに種々の条件でアルキルシリルクロライドを接触させ、拡散反射型FTIR表面分析を行った。その結果、NaYゼオライトでは室温でアルキルシリルクロライドが表面に固定化されることがわかった。表面吸着水は反応を阻害する。HYゼオライドはNaYに比べ、反応性が低いことも判明した。2.酸化チタン薄膜調製アルコキシド法で調製したゾル液を用いた酸化チタン薄膜の調製法の検討を行った。チタンイソプロポキシドを出発原料とし、その加水分解で得たゾル液をオートクレーブ中で処理することにより結晶粒子径の成長を行うことによって得られたゾル液を導電性ガラス表面に塗布することによって得た膜を焼成し、2から10μmの透明でかつ均質な酸化チタン薄膜を調製することができた。3.金属硫化物超微粒子調製法ゼオライト膜中にゲストとして取り込ませる目的で、硫化カドミウムおよび硫化亜鉛、酸化チタン、酸化亜鉛のナノサイズ超微粒子の粒径とその分布制御法の検討を行った。
CD4陰性HeLa細胞へのHIV-1感染

HeLa細胞をクローニングし、HIV-1にまったく感染しないCD4陰性のN7HeLa細胞を得た。HIV-1の感染にはCD4とケモカインレセプターであるCXCR4あるいはCCR5が必要とされる。このHIV-1の複雑な初期感染様式を理解するため、CD4のないN7HeLa細胞にウイルス感染を試み、逆説的にHIV-1の細胞への吸着・侵入機構を解析した。まずポリ-L-リジン(PLL)がCD4陽性のHeLa細胞であるMAGI細胞でHIV-1の感染を最も増強することを確認した。PLLでコートされた培養プレートにHIV-1を処理(室温1時間)しN7HeLa細胞を培養すると、このCD4陰性細胞に(効率は悪いが)HIV-1を感染させることができた。ウイルスを0.025あるいは0.05%の低濃度のトリプシンで処理すると、PLLを使用したN7HeLa細胞への感染効率は上昇した。また、低pH、TPAあるいはMT-4細胞培養上清を作用させると、同様にこの感染効率を上げることができた。CD4陰性のN7HeLa細胞への感染には、PLLによるウイルス粒子と細胞膜との附着強化とHIV-1エンベロープ糖蛋白の開裂が必要であった。さらに細胞側の何らかの活性化がこの人工的感染系での感染効率を上げるのに重要であると思われた。