hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒストンバリアントH2AXを介した染色体安定性維持機構

H2AXをコンディショナルに発現抑制すると、異常な染色体分配が起き、分裂期を経て細胞は死ぬことを見出した。H2AXpS121抗体を作製し細胞周期における変化を調べたところ、このリン酸化は分裂期においてセントロメア特異的に見られること、局在は活性化型AuroraBと一致することが分かった。さらに我々はH2AXを発現抑制し、H2AXS121Aを発現できる細胞株を樹立し、分裂期における重要な因子の活性化および局在を調べたところ、AuroraBの活性化、クロマチン上のHaspinおよびH3-T3のリン酸化、CENPA-S7のリン酸化が減少していることが分かった。これらの結果から、AuroraBの新たなターゲットであるH2AX-pS121は分裂期において重要なエピジェネティック修飾であると考えられる。本研究において我々はAuroraBが分裂期でH2AXのS121をリン酸化することを見出し、染色体分配におけるH2AXのS121のリン酸化の重要性を明らかにした。H2AXをコンディショナルに発現抑制すると、異常な染色体分配が起き、詳細に検討したところ、S121のリン酸化は活性化型AuroraBのセントロメアへの効率よいリクルートに関わり、AuroraBの時空間的な活性化に重要であることが分かった。細胞増殖においてAuroraBの活性および局在が厳密に制御されることが必須であり、S121のリン酸化は分裂期において重要なエピジェネティック修飾であると考えられる。新規リン酸化pS121による染色体分配制御、特にAurora Bの局在および活性化、染色体分配に重要なHaspinとの関連性について明らかにしていきたい。また作製したリン酸化抗体を用いて、分裂期およびDNA損傷後において、H2AX-pS121のダイナミックな時空間動態について観察する。新環境のもと本研究を遅延させることなく遂行するために、必要な備品、人件費を中心に計画的に使用する。蛍光イメージングや網羅的なゲノム解析については、研究協力者の助言を仰ぎながら進めていく予定である。細胞生物学他研究費で、本研究プロジェクトの計画の一部を推進することができたため、次年度使用額が生じた。次年度は新しく研究環境を整えることが必要となり、本研究課題を進める上で必要な物品を購入する予定である。
陸上植物の2倍体生活史進化多様性を生み出した分子機構の解明

ヒメツリガネゴケPpCLF遺伝子は配偶体世代で胞子体多能性幹細胞(胞子体頂端細胞)形成を抑制する働きを持っていることがわかった。そして、受精後にその発現が消失することによって、受精卵は胞子体幹細胞を形成し、胞子体幹細胞が活性を持つ間、胞子体は伸長を続ける。従って、ヒメツリガネゴケPpCLF遺伝子はシロイヌナズナCLF遺伝子と異なり栄養成長を抑制し、生殖成長を促進する働きがあることがわかった。このことから、PpCLF遺伝子のターゲットの変化によって、陸上植物の2倍体世代延長が引き起こされた可能性が高いことがわかった。PpCLF、PpFIE、PpMSIそれぞれの一重遺伝子欠失体、PpEMF1と2と3の三重変異体作成を試みた。前2遺伝子については遺伝子欠失体が得られたが、PpMSIについては数回の形質転換実験を試みたが全く欠失体が得られなかった。またPpEMFについてはそれぞれの一重欠失変異体、二重欠失変異体は野生型と変化が見られず、三重変異体はPpCLF、PpFIEの一重変異体に類似し、原糸体の以上と茎葉体の胞子体様組織への転換が見られた。これらのことから、PpEMFの組織による使い分けの可能性は低くなった。このことから、コンプレツクス形成ならびにPpMSI、PpEMFsの解析は行わず、以後の研究をPpCLF、PpFIEに集中することとした。PpCLF、PpFIE遺伝子欠失変異体は同様な表現型を示した。原糸体はクロロネマとカウロネマの中間的な形態を示し、側芽始源細胞のほとんどが胞子体様幹細胞へと転換し、胞子体様組織を形成した。PpCLFとPpFIE各遺伝子末端にシトリン遺伝子を導入し、融合タンパク質の発現解析を行った。その結果、原糸体、茎葉体頂端部、造卵器、造精器、卵細胞、精細胞で発現が観察できたが、受精卵では発現が消失していた。現在、胞子体発生段階において発現の有無を解析している。PpCLF、PpFIEをヒートショックによって一過的に誘導するための形質転換体の作出を行った。現在、形質転換実験を行い、突然変異体のスクリーニングを行っている。PpCLF、PpFIE遺伝子周辺のメチル化状態の解析、PpMET1、PpDMEの欠失突然変異体の作出については実験準備中である。PpCLFの全生活史を通した発現解析を行った。その結果、原糸体から原糸体、茎葉体形成時にはPpCLF遺伝子が発現し続けていることがわかった。さらに、茎葉体における造精器、造卵器形成時にも発現が継続していた。さらに、未受精卵ではPpCLFの発現が検出できるが、受精の前後で発現が消失することがわかった。さらに、胞子体幹細胞が分裂を停止する前後で発現が再び検出できるようになり、減数分裂、胞子形成時に発現しつづけていた。胞子においては発現検出できなかったが、胞子発芽直後より発現を検出できた。遺伝子破壊株の表現型観察(赤色光下における分化細胞から幹細胞分化における役割の解析)を行った結果、側芽形成にPpCLFが正の役割を果たすことがわかった。ヒートショックプロモーターにPpCLF cDNAを結合した遺伝子の導入によって、誘導的過剰発現実験を行った結果、胞子体様組織先端の頂端幹細胞が分裂を停止し、胞子嚢形成が開始した。しかし、減数分裂には至らなかった。上記の受精卵におけるPpCLFの発現消失について、これまで植物においては発生過程におけるヒストン修飾のゲノムワイドな変動は報告されておらず、今回の実験結果はたいへん興味深い。そこで、PpCLFが関係すると考えられるH3K27me3修飾について、免疫組織染色によりゲノム全体のヒストン修飾状態が変わっているかを調べるための実験系の確立を行っている。受精卵は造卵器に包まれているため、レーザーで穴を開けるなどの方法を開発中である。さらに、MET1遺伝子破壊体を作製したが、PpCLFに類似した表現型は得られなかった。
シロイヌナズナ完全長cDNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析

本研究では、モデル高等植物のシロイヌナズナを用い、シロイヌナズナ完全長cDNAマイクロアレイを用いた解析により、種々のストレス、ホルモンおよび光に応答する遺伝子等を単離、同定する。同定された遺伝子に関してプロモーター解析を行う。ビオチン化cap trapper法によりシロイヌナズナの完全長cDNAライブラリーをこれまでに19種類作製し、これまでに約155,144個のcDNAクローンを単離した。それらをクラスタリングしたところ、14,668個の独立したcDNAグループに分類された。これまでに単離した約7000個の完全長cDNAクローンを用いて完全長cDNAマイクロアレイを作製し、乾燥、低温、塩などのストレスおよび植物ホルモンABAに応答する遺伝子の同定を試みた。その結果、乾燥、低温、塩およびABA誘導性遺伝子はそれぞれ、299個、54個、213個、245個同定された。これら同定された誘導性遺伝子の中には転写因子と相同性を持つものが40個存在しており、乾燥、低温、塩、ABAのシグナル伝達経路には多くの遺伝子発現制御機構が存在していることが明らかとなった。同定された誘導性の転写因子の中には、NACファミリーやWRKYファミリーなどの植物特異的な転写因子も存在していた。また、ABA誘導性遺伝子の多くは乾燥および塩ストレス処理により誘導され、ABAと乾燥ストレスの両方により誘導される遺伝子は、ABAと低温ストレスの両方により誘導される遺伝子よりもはるかに多く存在していた。これらの結果は、これまでに考えられていたモデルと一致した。さらに、同定されたABA誘導性遺伝子のプロモーターについて解析したところ、ABA誘導性の遺伝子発現に関与する既知シス配列をプロモーター領域に持たない遺伝子が10個存在しており、ABA誘導性の遺伝子発現に関与する新規なシス配列の存在が示唆された。
自走粒子の集団運動実験を通した非平衡自己組織化現象の理解

今年度はヤヌス粒子の集団運動系から得られる統計量からヤヌス粒子同士の粒子の相互作用の推定を目指した。具体的には集団運動が実現されているときとされていないときとで個々の粒子における速度ベクトルと極性ベクトルの相互相関関数を計算した。その結果t=0に対して、非対称な相関関数が得られた。具体的には先に速度ベクトルが変化して、それに追随するように極性が変化することを示唆する相関が計算された。数十kHzの高周波数の交流電場下でのヤヌス粒子の相互作用は全く知られておらず、今回の結果によって新たにヤヌス粒子の相互作用を知る手がかりが得られたことになる。また、大腸菌の抗生物質下での進化実験におけるトランスクリプトーム解析を行なった。トランスクリプトームから抗生物質耐性(MIC)を予測する統計モデルを構成、さらに特徴量抽出を行い、その後主成分分析を行なった。この解析により、進化の終着点が与えたストレスの種類より少ない高々15個程度しかないことを突き止めた。この大腸菌実験室進化のフィットネス空間におけるアトラクター構造が何に起因するものかは今後調べていく予定である。また、進化株において確認された共通変異を親株に導入することで、一つの変異がストレス耐性に及ぼす効果を定量した。その結果として、ストレス下で一か月実験室進化した株の多くは一つの変異ではなく、複数の変異の組み合わせとして耐性を獲得していることを示唆する結果が得られた。ヤヌス粒子の集団運動に関して、集団運動中の粒子の軌跡と極性時系列から相互相関関数を計算することにより、ヤヌス粒子同士の相互作用に関する知見が得られた。交流電場下でのヤヌス粒子の相互作用についてはこれまで十分に調べられておらず、今回の結果はヤヌス粒子をアクティブマター理論の実験的検証のプラットフォームとして用いるにあたって重要な一歩となる。また、近年アクティブマターのシミュレーションにおいて粒子極性と粒子速度を別に定義することで新規な集団運動の可能性が示唆されている。ヤヌス粒子における相互相関関数の結果は粒子速度と極性が非対称な役割を果たしていることを示唆しており、ヤヌス粒子での集団運動を異なるパラメータ領域で調べることにより、今後理論と実験との間でのさらなる相互作用が期待される。また大腸菌を用いた実験室進化のトランスクリプトームを含めたマルチオミクス解析を通して、大腸菌のストレス適応、進化に対する新たな知見が得られた。マクロな統計量として大域的秩序からのゆらぎの相関関数のべきの傾きがあるが、ヤヌス粒子の系においてはこれがくりこみ群による理論解析の結果と乖離していることがわかっている。今回、ヤヌス粒子の相互作用に関する知見が得られたので、このミクロな相互作用がマクロな集団運動に与える影響を相関関数の結果などを用いてから考察する。大腸菌進化のトランスクリプトーム解析に関しては国際会議にて発表し、論文にまとめて報告する予定である。また今回の解析において、進化の行き先が進化の経路に依存していることを示唆する結果が得られた。今後は実験室進化において進化の経路における情報を密に抽出できる実験系をデザインし、経路が進化にどのような影響を与えるかをより詳しく研究していく。

マクロな統計量として大域的秩序からのゆらぎの相関関数のべきの傾きがあるが、ヤヌス粒子の系においてはこれがくりこみ群による理論解析の結果と乖離していることがわかっている。今回、ヤヌス粒子の相互作用に関する知見が得られたので、このミクロな相互作用がマクロな集団運動に与える影響を相関関数の結果などを用いてから考察する。大腸菌進化のトランスクリプトーム解析に関しては国際会議にて発表し、論文にまとめて報告する予定である。また今回の解析において、進化の行き先が進化の経路に依存していることを示唆する結果が得られた。今後は実験室進化において進化の経路における情報を密に抽出できる実験系をデザインし、経路が進化にどのような影響を与えるかをより詳しく研究していく。
造血細胞および単球における糖鎖発現の解析

I抗原は、CD34陽性細胞には発現せず単球に発現し、sialosyl-I抗原は、骨髄のCD34陽性のCFU-GM、単球に発現していた。健常ヒトの骨髄細胞からCD34陽性細胞を分離し、G-CSF,GM-CSF,IL-3,IL-6の存在下に培養すると、I陽性CD14陽性とsialosyl-I陽性CD14陽性の単芽球が出現した。健常ヒトの末梢血単球を濃縮し、GM-CSFまたはM-CSF存在下に培養し、macrophageへ分化させると、I抗原の発現は増加したがsialosyl-I抗原の発現は低下した。また、末梢血単球を濃縮し、IL-4,TNFα,SCF存在下に培養し樹状細胞へ分化させると、I抗原とsialosyl-I抗原の発現は低下した。以上から、I抗原は単芽球から単球、macrophageに発現し、sialosyl-I抗原はCFU-GMから単芽球、単球に発現することが明らかとなった。癌化学療法後、G-CSFを投与すると骨髄中のCD34陽性細胞は末梢血に動員されることが知られている。そこで、骨髄中のCD34陽性細胞中のsialosyl-I陽性細胞の割合と、動員された末梢血CD34陽性細胞中のsialosyl-I陽性細胞の割合を比較したところ、動員された末梢血CD34陽性細胞中のsialosyl-I陽性細胞は骨髄中のそれに比して有意に低下していた。この結果から、sialosyl-Iは接着因子として作用している可能性が示唆された。リンパ系細胞における検討では、I抗原は、B細胞の一部、大部分のT細胞、リンパ性白血病細胞に発現していたが、sialosyl-I抗原はリンパ系細胞には発現していなかった。B前駆細胞であるCD34陽性CD19陽性細胞は、I,sialosyl-Iを発現していなかった。I抗原とsialosyl-I抗原の基本構造であるi抗原の血液細胞における発現を検討した。i抗原は、CD34陽性細胞、好中球、単球、リンパ球に広く発現していた。以上から、i抗原は、血液細胞に広く発現しているが、i抗原の分枝型であるI抗原とI抗原にシアル酸が付いたsialosyl-I抗原は、血液細胞の分化に伴い特異的な細胞系列に発現することが明らかとなった。血液細胞におけるI抗原とsialosyl-I抗原の発現を、抗I抗体と抗sialosyl-I抗体を用いて検討した。I抗原は、末梢血の単球の一部とB細胞の一部、大部分のT細胞に発現していたが、好中球とG-CSFによって動員された末梢血CD34陽性細胞と骨髄CD34陽性細胞には発現していなかった。sialosyl-I抗原は、末梢血の単球の一部と骨髄CD34陽性細胞の一部に発現していたが、好中球とG-CSFによって動員された末梢血CD34陽性細胞に発現していなかった。末梢血の単球を、GM-CSF存在下にmacrophageに分化させると、I抗原の発現は増加し、sialosyl-I抗原の発現は低下した。

U937細胞を、vitamin D3とretinoic acid存在下に単芽球に分化させると、sialosyl-I抗原の発現が増加したが、I抗原の発現はみられなかった。骨髄CD34陽性細胞から、CD34陽性sialosyl-I陽性細胞を分離し、colony形成能を検討したところ、CD34陽性sialosyl-I陽性細胞からgranulocyte/macrophagecolonyとmacrophatecolonyが形成された。骨髄CD34陽性細胞を、各種cytokineの存在下に短期液体培養すると、I陽性CD14陽性細胞とsialosyl-I陽性CD14陽性細胞が出現した。これらの細胞の形態は、単芽球様でbutyrate estrase陽性であった。白血病患者から得られた白血病細胞を用いての検討では、急性リンパ性白血病でI抗原の発現が認められたが、sialosyl-I抗原の発現は認められず、急性骨髄性白血病ではI抗原とsialosyl-I抗原の発現は低かった。以上より、I抗原は、単芽球、単球、macrophage、リンパ球、リンパ性白血病細胞に発現し、sialosyl-I抗原はCFU-GM、単芽球、単球に発現することが明らかとなった。特に、sialosyl-I抗原は、単球の分化に伴って特異的に発現することが判明した。昨年の研究で、I抗原は単芽球から単球に発現し、sialosyl-I抗原は、骨髄のCD34陽性のCFU-GM、単芽球、単球に発現することを見いだした。G-CSFで動員された末梢血のCD34陽性細胞は、sialosyl-Iをほとんど発現しないことを見いだした。また、I抗原は、正常リンパ球やリンパ性白血病細胞にも発現することを見いだした。本年は、1.macrophageや樹状細胞の分化とI,sialosyl-Iの発現との関係を検討した。2.正常のB前駆細胞であるCD19陽性CD34陽性細胞におけるI,sialosyl-Iの発現を検討した。3.I抗原の基本構造であるi抗原の血液細胞における発現を検討した。1.に関しては、末梢血単球をpanningを用いて濃縮後、GM-CSFまたはM-CSF存在下に培養し、macrophageへ分化させた。また、濃縮した単球をIL-4,TNFα,SCF存在下に培養し樹状細胞へ分化させた。GM-CSFで誘導されたmacrophageではI発現は増加したがsialosly-Iの発現は低下した。M-CSFで誘導されたmacrophageでも、同様の結果が得られた。IL-4+TNFα+SCFで誘導された樹状細飽では、Iとsialosyl-Iの発現は低下した。2.に関しては、健常ヒト骨髄単核細胞から磁気ビーズを用いてCD34陽性細胞を濃縮し検討した。B削駆細胞であるCD34陽性CD19陽性細胞は、I,sialosyl-Iを発現していなかった。3.に関しては、i抗原に特異的に結合するレクチンであるDSAを用いて検討した。i抗原は、CD34陽性細胞、好中球、単球、リンパ球、骨髄性白血病細胞、リンパ性白血病に広く発現していた。以上から、i抗原は、血液細胞に広く発現しているが、i抗原の分枝型であるI抗原とI抗原にシアル酸が付いたsialosyl-Iは、血液細胞の分化に伴い特異的な細胞系列に特異的に発現するが、その前駆体であるi抗原は広く血球に発現することが明らかとなった。
呼吸酵素活性の可視化診断に基づく青果物の鮮度低下速度予測

アブラナ科野菜花蕾部の鮮度低下速度分布と呼吸酵素の関係について研究を行った。光センシングによりブロッコリー花蕾部の黄化速度分布の非破壊推定精度には、750 nm付近の光反射率が影響し、これはクロロフィル蛍光に起因する光反射であることが確認できた。カリフラワー花蕾部の褐変速度分布の非破壊推定は、スクリーニングレベルの精度で可能であった。ブロッコリー花蕾部の黄化速度は呼吸酵素の1種「オルタナティブオキシダーゼ(AOX)」量の増減と関係が深く、AOX量増加が抑制される環境条件で、黄化が抑制された。このことから、呼吸酵素がアブラナ科野菜の鮮度低下速度制御に影響を及ぼすことが明らかになった。青果物の鮮度低下に大きく影響を及ぼす要因の一つが呼吸であり、保有する同化産物を消耗する生物反応であることから、収穫後においては外観品質の劣化、栄養分の消耗、目減り等を引き起こす。そこで、細胞内に取り込んだO2分子の大部分を消費し、鮮度保持期間と関係が深い呼吸酵素「シトクロムcオキシダーゼ(COX)」の青果物組織中での活性分布を、光センシングを利用して非破壊的に予測する手法を確立する。部分的に呼吸速度と品質変化の程度が異なり、呼吸酵素濃度分布と鮮度低下速度の関係に関する研究を行う実験試料として適しているブロッコリーを試料として研究を行った。ブロッコリー花蕾部組織内の微小空間における分光吸収スペクトルは部位によって異なった。部分最小二乗回帰分析(PLSR)の結果、COX活性の非破壊推定が可能であることが明らかになった。野菜組織におけるCOXの存在は微量であるかもしれないが、過去にはネコの脳において当該酵素の光吸収を非破壊で測定した研究例も存在する。従って、本研究で得られた成果は、野菜中における当該酵素活性の非破壊予測も十分可能であることを示唆する。本研究のPLSRで得られたスコアプロットから示された結果から、特定の波長における光吸収が、COX活性の非破壊推定に寄与していると考えられた。COXとともに植物細胞内でO2を消費する酵素としてオルタナティブオキシダーゼ(AOX)が存在する。COXとの違いは、酸化的リン酸化に関与せず、高エネルギー化合物(ATP)を生成しないため、生理活性の促進に影響しないことである。トマトを試料として環境温度、O2濃度を変えて貯蔵し、COXとAOXの活性比率を測定したところ、O2濃度はAOX活性に影響を及ぼしたが、温度の影響は小さかった。そこで細胞内に取り込んだO2分子の大部分を消費し、鮮度保持期間と関係が深い呼吸酵素「シトクロムcオキシダーゼ(COX)」の青果物組織中での活性分布を、光センシングを利用して非破壊的に予測する手法を確立する。本研究では、部分的に呼吸速度と品質変化の程度が異なり、呼吸酵素濃度分布と鮮度低下速度の関係に関する研究を行う上で、実験試料として適しているブロッコリー(Brassica oleracea var. italica)を選択した。花蕾部の切片をクリオスタットで調製し、顕微紫外可視分光光度計で測定した酵素活性染色前の分光吸収スペクトルと、染色後の活性程度とを部分最小二乗回帰分析で関連付けることにより、非破壊でブロッコリーの呼吸酵素濃度を推定可能であることを確認した。推定可能である理由を探るため、花蕾部からミトコンドリアを抽出・精製し、分光吸収スペクトルを測定した。その結果、424 nm付近における光吸収が、酵素濃度推定に寄与していると考えられた。併せてプロテオーム解析の結果、精製物中にCOXのサブユニットが含まれることも確認した。COXとともに植物細胞内でO2を消費する酵素としてオルタネティブオキシダーゼ(AOX)が存在する。ブロッコリーを試料として環境温度、O2濃度それそれ2水準のもとで貯蔵し、COXとAOXの活性比率を測定したところ、O2濃度はAOX活性に影響を及ぼしたが、温度の影響は小さかった。これらは昨年度のトマトを用いた実験結果と一致した。そこで細胞内に取り込んだO2分子の大部分を消費し、鮮度保持期間と関係が深い呼吸酵素「シトクロムcオキシダーゼ(COX)」の青果物組織中での活性分布を、光センシングを利用して非破壊的に予測する手法を検討した。本研究では、部分的に呼吸速度と品質変化の程度が異なり、呼吸酵素濃度分布と鮮度低下速度の関係に関する研究を行う上で、実験試料として適しているブロッコリー(Brassica oleracea var. italica)とカリフラワー(Brassica oleracea var. botrytis)を選択した。

今年度は、試料(ブロッコリー)を鮮度保持に有効と報告されている低O2、高CO2環境で貯蔵し、大気中で貯蔵した場合と上記2種の酵素活性比率を比較した(貯蔵温度1°C、貯蔵期間21 d)。質量分析と電気泳動の結果、2種類とも活性が低下した。COXは高エネルギー化合物(ATP)の生成に関与することから、環境気体組成制御による鮮度保持は、COXの活性低下に起因することが明らかになった。昨年度のブロッコリーに加え、カリフラワーについてもCOX濃度分布を分光分析で非破壊推定する方法を明らかにしたうえ、推定精度に関与する光波長まで明らかにできたことで、本成果は科学的根拠を持つことが確認された。これらは本年度の達成目標であったことから、おおむね順調に進展していると考えられる。さらに、青果物の貯蔵環境条件がCOXとAOXの活性比率に及ぼす影響について、従来の質量分析に加え電気泳動でも調べたところ、酵素の活性比率の動態に加え、タンパク質量の違いについても評価が可能となった。これは本年度の達成目標であったことから、おおむね順調に進展していると考えられる。青果物の鮮度低下に大きく影響を及ぼす要因の一つが呼吸であり、保有する同化産物を消耗する生物反応であることから、収穫後においては外観品質の劣化、栄養分の消耗、目減り等を引き起こす。本研究では、部分的に呼吸速度と品質変化の程度が異なり、呼吸酵素濃度分布と鮮度低下速度の関係に関する研究を行う上で、実験試料として適しているブロッコリー(Brassica oleracea var. italica)を選択した。花蕾における呼吸速度分布を光センシングにより推定し、品質低下速度分布との関係を明らかにすることを試みた。今年度は、ブロッコリー花蕾における呼吸速度分布を、クロロフィル蛍光測定により推定することを試みた。当該手法による呼吸速度推定は、過去に海外の研究者によって検討された事例があり、その有効性を本研究で確認した。その結果、クロロフィル蛍光と花蕾の黄化速度との間に相関関係が認められた。黄化速度は呼吸速度の関数となっていることが報告されているため、クロロフィル蛍光は、黄化速度を媒介変数として間接的に呼吸速度を予測する方法として有効であることが明らかになった。今年度は並行して、試料(ブロッコリー)を鮮度保持に有効と報告されている低O2、高CO2環境で貯蔵し、大気中で貯蔵した場合と上記2種の酵素活性比率やタンパク質量を比較した(貯蔵温度25°C)。貯蔵期間中経時的にオルタナティブオキシダーゼ(AOX)量は増加し、チトクロムcオキシダーゼ(COX)量は減少した。変動量はAOXの方が数倍大きかったことから、環境O2の変動に伴いAOX量を調節し、細胞内における水素イオン消去を制御していると考えられた。両酵素の活性比率は貯蔵期間中安定していた。COX量は減少していたが、活性は安定的に維持し、ATPを継続的に合成することにより、収穫後においても生命活動を維持していることが示唆された。昨年度までの分光分析に加え、クロロフィル蛍光でもブロッコリー花蕾における呼吸速度分布を予測することが可能であることが明らかになった。可視・近赤外光のセンシングに比べて蛍光の方が感度が高いことから、より精度の高い呼吸速度の非破壊推定が可能となった。さらに、青果物の貯蔵環境
新しい概念(エピジェネティクス)を応用した難治性心不全発症分子メカニズムの解明

心不全の慢性変化および難治性変化の分子生物学的機序を明らかにするために、遺伝子そのものにおけるエピジェネティックな変化に注目し、心不全の病態解明を目指すことを本研究の目的とした。心不全においては胎児期において特異的に発現していた蛋白が再度発現上昇することが知られており、病態とのかかわりが示唆されている。なかでもANPおよびBNPと呼ばれる胎児性ペプチド蛋白は心不全の治療薬として使用されているばかりでなく、心不全により極端に発現誘導されることから、心不全重症度の診断にも臨床現場で汎用されている。ところがその発現誘導のメカニズムはいまだ不明であった。本研究において、我々は慢性心不全におけるANPおよびBNPの発現誘導に従来考えられていた転写因子以外の因子が強く関与することを明らかにした。双方の遺伝子周辺のヒストンの修飾を詳細に検討することにより、その修飾および遺伝子上での分布が変化することを見出し発現変化との関係を明らかにした。このことは心不全の病態を感知して発現誘導されるこられの遺伝子群は従来とは異なる分子機構あるいは遺伝子領域を必要とすることを示唆する。興味深いことにはこれらの変化は急性の発現誘導では観察されず、慢性の心不全において発現誘導されるときのみ観察された。このことは慢性疾患においては、繰り返しおこる発現誘導刺激により遺伝子自身が独自の分子機構をとって遺伝子発現を調整していることを示唆する。この考えは他の臓器における慢性疾患にも当てはまる新しい概念と考えられる。さらに、ヒストン修飾に関与する重要な分子であるヘテロクロマチンプロテイン1という蛋白の生化学的解析も合わせて行いその特異的な酸化ストレスに対する応答性、それにかかわるAMPKというキナーゼの機能も明らかにした。これらの成果は慢性疾患の概念を変化させその解明へ向けた戦略のパラダイムシフトとなると期待される。
クロマチンインスレーターの多機能性と超ゲノム制御の解明

クロマチンインスレーターは、ゲノム上の個々の遺伝子および遺伝子座を調節するための境界を形成している。インスレーター結合タンパク質CTCFがクロマチン・ループを形成することで、エンハンサー、プロモーター、インスレーターの相互作用が規定されることを見出した。染色体コンフォメーション捕捉法を用いて、ヒト遺伝子座(炎症性サイトカインTNF/LT、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子INK4/ARF)の高次構造を解析した。クロマチン・ループの形成とその動態が、炎症応答に働くTNF/LT遺伝子座、細胞老化で働くINK4/ARF遺伝子座の発現制御に不可欠であった。インスレーターの機能の観点から、超ゲノム(エピゲノム)による生命情報発現の機序のひとつを明らかにした。本研究では、インスレーター結合因子CTCF(CCCTC結合因子)の多機能性に着目し、高次の遺伝情報制御機構を明らかにすることを目的とする。CTCFのタンパク質複合体の実体を解明するとともに、その転写調節、インスレーター(クロマチンの境界)、クロマチン・ループ形成等の多機能について、ヒト遺伝子クラスター領域で解析を行い、細胞機能と生命現象における意義を明確にすることが全体構想である。各種培養細胞株を用いて、CTCF、共役因子RAD21に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降を行い、ChIP-Chip/Seq解析を用いて、結合部位およびインスレーターの候補部位を同定した。さらに、発生分化、炎症反応、細胞周期制御に関わる遺伝子クラスター等の領域を抽出し、クロマチン免疫沈降を行い、遺伝子クラスター内のCTCF結合部位をリアルタイムPCR法で確認した。また、遺伝子プロモーターとエンハンサー、CTCF結合配列を組み込んだルシフェラーゼ発現ベクターを作製し、エンハンサー遮断作用、サイレンサー作用等を検討した。CTCF、RAD21に対するRNA干渉法を用いて、ノックダウン下での遺伝子クラスターの発現変化および染色体コンフォメーションキャプチャー法で検討し、遺伝子クラスター領域全体におけるCTCFの重要な役割を明らかにした。関連するクロマチン因子(ジンクフィンガータンパク質、DNAメチル化・複製の関連因子)について機能解析を行い、超ゲノム制御の機構の一端を報告した。各種培養細胞株を用いて、CTCF、その共役因子RAD21に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降を行い、ChIP-Chip/Seq解析を用いて、結合部位およびインスレーターの候補部位を同定した。その結果を基に、炎症応答におけるTNF/LT遺伝子クラスター、細胞リプログラミングにおけるINK4/ARF遺伝子クラスターの高次元のエピゲノムを解析した。クロマチン免疫沈降を行い、遺伝子クラスター内のCTCF結合部位をリアルタイムPCR法で確認した。また、遺伝子プロモーターとエンハンサー、CTCF結合配列を組み込んだルシフェラーゼ発現ベクターを作製し、エンハンサー遮断作用、サイレンサー作用等を明らかにした。CTCF、RAD21に対するRNA干渉法を用いて、ノックダウン下での遺伝子クラスターの発現変化を確認し、これらの因子が発現制御に不可欠であることを示した。さらに、染色体コンフォメーションキャプチャー法で検討し、遺伝子クラスターの高次クロマチン形成におけるCTCFの重要な役割を明らかにした。これらの研究によって、CTCFによる超ゲノム制御の機構の一端を解明した。本研究では、インスレーター結合因子CTCFの多機能性に着目し、高次の遺伝情報制御機構を明らかにすることを目的とした。各種培養細胞株を用いて、CTCFとその共役因子RAD21に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降を行い、ChIP-Chip/Seq解析を用いて、結合部位およびインスレーターの候補部位を同定した。その結果を基に、細胞リプログラミングにおけるINK4/ARF遺伝子クラスター、炎症応答におけるTNF/LT遺伝子クラスターの高次元のエピゲノムを解析した。CTCF、RAD21に対するRNA干渉法を用いて、ノックダウン下での上記の遺伝子クラスターの発現変化を確認し、これらの因子が発現制御に不可欠であることを示した。

さらに、染色体コンフォメーションキャプチャー法で検討し、上記の遺伝子クラスターのクロマチン・ループ形成におけるCTCFの重要な役割を明らかにした。これらの研究によって、CTCFによる超ゲノム制御の機構の一端を解明した。クロマチンインスレーターによるヒト遺伝子クラスターのエピゲノム制御について、新知見を得て、最先端の論文発表等の成果が出たため。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、当初の計画以上に進展しているため、研究計画の変更なしに推進する。
先天性第VII因子異常症の分子生物学的解析によるヒト凝固第VII因子の機能研究

平成8年度1、ヒト凝固第VII因子(FVII)の機能研究を行うため、先天性FVII欠乏/異常症12家系30例について検索した2家系の発端者はcross reactive material(CRM)-例、10家系の発端者はCRM^+例であった。2、SSCP法でCRM^+例はExon2、Exon4、Exon5に各1例、Exon8に4例の異常バンドを検出した。CRM-例には異常は検出されなかった。3、Exon4の異常例は組織因子の違いによってFVII活性に差が見られた。この症例はFVII遺伝子の6055番目のグアニン(G)がアデニン(A)に置換した結果、FVII分子の79番目のアルギニンがグルタミンに変異した。本例は既に著者が報告した変異例と同じものであり、遺伝子組み換え型変異第VII因子と組織因子との相互作用は検討し(Biochem,33:14162,1994)。平成9年度1、Exon8の異常例については1例目が11514番目のシトシン(C)がチミン(T)に置換した結果、FVII分子の359残基のスレオニンがメチオニンに置換した。本症例はArbiniらの報告例(Blood,89:5085,1997)と同じ変異であった。2例目は11429番目のGがAに置換して、331残基のグリシンがセリンに変異した。これはZhengらの報告例(Blood Coag Fibrinol,7:93,1996)と同じ変異であった。3例目は11267番目のCがTに置換して、277残基のアルギニンがシステインに変異した。4例目は11482番目のTがGに置換して、348残基のヒスチジンがグルタミンに置換していることが明かとなった。2、遺伝子組み換え型変異第VII因子を作成するため、HepG2細胞より得られたRNAからRT-PCR法によって第VII因子遺伝子のcDNAを作製した。第VII因子cDNAを発現ベクターPEE14GSに導入して、CHO cellにトランスフェクションとしてwild型遺伝子組み換えFVIIを発現した。ELISA法にて第VII因子の発現を確認した後、培養液中にビタミンKを加えて培養した。第VII因子除去血漿を基質として培養上清液中の第VII因子凝固活性を測定したところ、凝固活性を検出した。3、wild typeの第VII因子発現と同様に発現ベクター〓4GSに導入すべく、塩基配列の分析によって得られた成績から変異型DNAを作製中である。ヒト凝固第VII因子の機能研究を行うため先天性第VII因子欠乏/異常症12家系30例について検索した。1、2家系は第VII因子活性および抗原を欠如したCRM-例、10家系は第VII因子活性が欠如もしくは低下するも抗原を正常量もつCRM+例であった。

CRM+例の9家系は3種類の組織因子(ヒト胎盤組織、ウサギ脳組織、およびウシ脳組織由来組織因子)による第VII因子活性に差は見られなかったが、1家系は第VII因子活性に差異が見られた。3、SSCP法でエキソン4に異常のあった症例は組織因子の違いによって第VII因子活性に差が見られたCRM+例であり、Arg79がGlnに置換していた。本例は著者が既に報告した症例と同じ変異をもち、その分子構造の変化と第VII因子活性との関係は明らかとなっている。残りの症例については現在検索中であり、塩基配列の分析によって得られた成績から遺伝子組み換え型異常第VII因子を発現をして、ヒト凝固第VII因子の機能研究を行う。平成8年度2、SSCP法でCRM^+例はExon2、Exon4、Exon5に各1例、Exon8に4例の異常バンドを検出した。CMR-例には異常は検出されなかった。Exon4の異常例は組織因子の違いによってFVII活性に差が見られた。この症例はFVII遺伝子の6055番目のグアニン(G)がアデニン(A)に置換した結果、FVII分子の79番目のアルギニンがグルタミンに変異した。本例は既に著者が報告した変異例と同じものであり、遺伝子組み換え型変異第VII因子と組織因子との相互作用は検討し(Biochem,33:14162,1994)。平成9年度1、Exon8の異常例については1例目が11514番目のシトシン(C)がチミン(T)に置換した結果、FVII分子の359残基のスレオニンがメチオニンに置換した。本症例はArbiniからの報告例(Blood,89:5085,1997)と同じ変異であった。2例目は11429番目のGがAに置換して、331残基のグリシンがセリンに変異した。これはZhengらの報告例(Blood Coag Fibrinol,7:93,1996)と同じ変異であった。3例目は11267番目のCがTに置換して、277残基のアルギニンがシステインに変異した。4例目は11482番目のTがGに置換して、348残基のヒスチジンがグルタミンに置換していることが明かとなった。2、遺伝子組み換え型異変第VII因子を作成するため、HepG2細胞より得られたRNAからRT-PCR法によって第VII因子遺伝子のcDNAを作製した。第VII因子cDNAを発現ベクターPEE14GSに導入して、CIIO cellにトランスフェクションしてwild型遺伝子組み換えFVIIを発現した。ELISA法にて第VII因子の発現を確認した後、培養液中にビタミンKを加えて培養した。第VII因子除去血漿を基質として培養上清液中の第VII因子凝固活性を測定したところ、凝固活性を検出した。3、wild typeの第VII因子発現と同様に発現ベクターPEE14 GSに導入すべく、塩基配列の分析によって得られた成績から変異型DNAを作製中である。
東アジアにおける文明の衝突と「天」の観念の変容

中国・韓国・日本の東アジア三国における西洋文明の急速な受用と近代化への着手は、「西洋の衝撃」と呼ばれるほど伝統思想に大きな変革を迫った。中でも、儒教や仏教・道教の中核的観念である「天」は、各国の政治思想状況によって独自の再解釈が盛んに実施されたが、今回の共同研究によって、一見多様に見える各国の再解釈も、「秩序を維持する天」から「変革を養護する天」への変容という点では共通しているということを明らかにすることができた。当初の計画通り、8月に「打ち合わせ会議」を開催し、本研究プロジェクトの趣旨と今後の進め方についてあらためて確認した。本研究は日中韓東アジア三国の前近代から近代にかけての思想の変容を扱うというスケールの大きなプロジェクトではあるが、研究者は各々の専門領域における研究を尊重し、その分野から抽出できる「天」の観念を自由に紹介し合い、その結果として、日中韓それぞれの近代化の特徴および差異が描き出せるように研究会を積み重ねることで合意した。12月に「第一回研究発表会」を開催し、以下の発表を行った。【日本前近代】「伊藤仁斎における天」(木村純二)【韓国前近代】「韓国性理学派の「天」の思想-「天」と「心」の関係を中心に-」(井上厚史)【中国前近代】「王陽明の「天」について」(橋本啓司)研究討論の結果、それぞれの発表は当初の予想に反し、様々な問題点を提起することになった。たとえば、(1)伊藤仁斎の「天」解釈は、程明道のそれと極めて類似している部分があること、(2)李退溪の思想は、朱子よりも王陽明の思想に近い部分があること、(3)王陽明が韓国や日本に及ぼした影響は、いわゆる「陽明学派」だけにかぎられるものではないということ、などである。これは、つまりこれまで日中韓で「天」を巡る議論がいかになされてこなかったかということの証明でもあり、特に韓国儒教をどう解釈するかは、本研究の大きな課題となることが予想される。次年度は、この研究成果を踏まえて、前半で前近代の「天」の解釈について日中韓それぞれ別の立場からの発表を行い、前近代における各国の「天」観念の特徴をまとめる。次に、後半ではいよいよ「西洋の衝撃」による三国の伝統思想がどのように変容していくかについて、「天」を中心に討議を重ねる予定である。本年度は、本研究テーマに対する国内外における予想外の関心の高まりを受け、当初計画した二回の研究会のみならず、年間で四回の研究発表会を実施した。〔1〕8月に、「第二回研究発表会」を静岡県立大学で開催し、以下の三本の研究発表を行った。【日本前近代】「国学派の「天」」(吉田真樹)、【韓国前近代】「韓国実学派の「天」」(朴倍暎)【中国前近代】「仏教における「天」」(刑東風)〔2〕9月25・26日に、台湾大学中文系研究グループと本研究グループとで、「天、自然與空間」國際學術検討會を共同開催し、本研究グループからは、「關於李退溪對天解釋的研究」(井上厚史)、「封平田篤胤思想中的「天」的概念的研究」(吉田真樹)、「封荻生徂徠的「天」的概念的研究」(木村純二)、「阮籍的天和空間」(橋本敬司)、「關於朱弁的碑文、史蹟及其與佛教的關係之考察」(刑東風)の五本の研究発表を行った。〔3〕10月に、日本思想史学会2008年度大会において、本研究グループでパネルセッション「日中韓における洋学の伝来と「天」観念の変容」を開催し、井上厚史が司会をし、「平田篤胤における「死」の空間一天・地・泉との関わりにおいて」(吉田真樹)、「丁若〓における「天」観念とその倫理的意味について」(朴倍暎)、「日中韓における洋学の伝来と「天」観念の変容」(安部力)の三本の研究報告を行い、コメンテーターや参加者と議論を行った。〔4〕12月に、「第三回研究発表会」を大阪商業大学で開催し、以下の二本の研究発表を行った。【日本前近代】「啓蒙思想家の「天」観念」(菅原光)、【韓国前近代】「丁若〓の「天」観念」(朴倍暎)上記以外にも、個人の資格で本テーマに関する研究発表も活発に行った。いずれの研究発表会においても、関心の高まりゆえか、活発な質疑応答が繰り返された結果、本研究メンバーのテーマに関する理解が研究会を開催するたびに深められていくことを実感できた一年だった。この研究成果をもとに、来年度開催予定の総括としてのシンポジウムを東京で開催することを決定し、各自が与えられたテーマに関する良質の論文を作成することを確認した。

共同研究最終年の本年度は、以下に示すように、台湾および中国で開催された国際学会に積極的に参加して研究発表を行う一方、国内でも2回の研究発表会を行い、国内外の研究者と真剣な議論を積み重ねることができた。(1) 5月7・8日に開催された「伝統中國形上學的當代省思」国際学術検討会(於台湾大学哲学系)において、以下の研究発表を行った。井上厚史「丁若〓的<天>観念」、橋本敬司「荀子的天人観」、〓東風「関於仏教的"天"与世界図式」、菅原光「西周:近代日本的「哲學」的發明」(2) 8月7・8日に開催した第4回研究発表会(弘前大学)において、以下の研究発表を行った。【中国前近代】安部力「『天主実義』における「天」について(及び「西洋学術」の東アジアにおける影響)」、【中国近代】干臣「梁啓超の天」、【韓国近代】南相虎「東学党の天」(3) 12月5・6日に開催された「国際儒学論壇2009」(中国人民大学孔子研究院)において、以下の研究発表を行った。井上厚史「李退渓的修養論」、橋本敬司「筍子之心与学問修養」、〓東風「関于鈴木大拙的『古代中国哲学史』」(4) 12月12・13日に、3年間の研究の総括となる第5回研究会(専修大学)を開催し、以下の研究発表を行った。【中国前近代】キリ・パルモア(オランダ・ライデン大学)「日本の耶蘇教論と排耶論における「天」観念-明清からの影響・明清との相違-ハビアンと利瑪賓、相沢安と楊光先を中心に」、【日本近代】長妻三佐雄「三宅雪嶺と長谷川如是閑における「天」の観念」、【中韓日近代】井上厚史「中国・韓国・日本の近代における「天」観念の変容-康有為・東学党・元田永孚を中心に-」三年間の成果を踏まえて、今後も各自がそれぞれの専門領域において「天」観念の変容を追求していくことを確認して、研究発表会を締めくくった。
フェムト秒レーザーによる光誘起構造変化を利用した光機能性材料の設計と作製

本研究の目的はガラス内部に可視領域で波長選択的に発光する三次元の微細構造を、結晶相の成長と元素分布を空間選択的に制御することによって作製することである。超短パルスレーザーを用いたマイクロメートルレベルでの微細な発光構造の作製に取り組んできた。微細な発光構造は光学への応用で非常に興味深いが、三次元の微細な発光構造の作製に成功した報告例はほとんどない。そこで我々は三次元の微細な多機能光源を作製するための効率的な戦略を提案した。結晶相の成長とドーパントの分布をフェムト秒レーザー照射によって同時に制御するというものである。一つの例として、二つのナノ結晶(Ga203, LaF3)を析出し得る新規なガラスを作製した。超短パルスレーザーの繰り返し周波数を250 kHzに調整し、ライン状の構造変化を誘起した。構造変化領域では、発光に寄与する元素の分布が変化すると同時にナノ結晶の析出も起こっていた。この結果は空間選択的な光学特性の制御を意味し、緑と青の多色の発光が微小領域で実現できた。これは三次元のマイクロエミッターに応用が期待できる。我々は同時にフェムト秒レーザーによって誘起される元素分布形成と結晶化のメカニズムについても研究を進めた。元素の分布は各元素の拡散係数で部分的に説明できる。これに基づいて、様々な種類の活性中心に対して適切なレーザー照射を行うことができ、例えば、ラインではなく一点一点照射することにより、青色の発光特性が改善されたリング状の構造を形成するのに成功した。新規な多機能発光材料の開発を目的に、任意に発光中心が制御可能なガラス材料の探索を実施した。その結果、Ga2O3とLaF3のナノ結晶が析出可能なガラス組成を発見し、これらのナノ結晶中に選択的に2種類の発行中心(Ni2+、Er3+)をドープすることに成功した。この材料は、発光中心とホスト(ナノ結晶)との選択が可能であることから、2種類の発行中心間でのエネルギー移動による損失が抑えられ、広帯域波長多重光コミュニケーションにおいて利用される1200nm1600nmの波長において非常にブロードな発光が得られることを確認した。本ガラス材料は、熱分析により調べた熱特性の結果から、ファイバー形状に整形することが可能であることを確認しており、開発した発光材料が、広帯域光光ファイバー増幅用として有望であることを示唆する。加えて、このガラス中のGa2O3ナノ結晶とEr3+ドープLaF3ナノ結晶は、それぞれブルーとグリーンの波長領域においても発光が確認でき、新規な多機能発光素子への応用も期待できる。また、このガラスに超短パルスレーザーを照射することで、均一なガラス内部に元素分布(組成分布)が形成できることも確認した。元素分布形成のメカニズムを詳細に調べ、元素移動を制御することで、局所的に発光波長が異なるマルチカラー発光材料が実現でき、局所的な組成制御とナノ結晶析出および発行中心の制御とを組み合わせることで、複数の発光機能を統合したコンパクトな発光素子やデバイスが創製できる可能性がある。
無限変数解析

この研究は本来無限変数を目指すものであるが、本年度の成果としては以下述べるようにその準備としての有限変数にとどまってしまった場合が多い。1.バナッハ空間のテンソル積には、適切なノルムが無限個存在する。これを利用すれば一変数ソボレフ空間のテンソル積によって多くの新しい関数空間が作り出せる。それらの空間における波動方程式の適切性を考察した。これはディラック方程式についてのファインマン経路積分に関係している。2.上記の経路積分は、ベクトル値シリンダ-測度に深くかかわっている。その一端を明らかにした。3.上積分を一般化した可算劣可法的関数に関するファトゥ-型定理などを考察し、調和関数の境界挙動を調べた。更にこの結果をノイマン条件の考察に応用した。4.スピン多様体上のディラック作用素の指数に対するアティア-ヒルツェブルフの定理とリヒネロウィッツの定理の関係について考察した。5.佐藤超関数およびマイクロ関数の第二解析的波面集合の関手的性質を考察した。その応用として、第二波面集合と第二超局所特異台の同値性を示した。6.解析写像の概念を、一意接続の性質を保つ範囲で一般化することを種々試みた。また、これらと非源形方程式の解の一意性との関係についても考察を試みた。しかし、これらの結果は現在進行中で、まとめるに至っていない。
神経変性性遺伝子病の希少動物モデルの分子基盤解明、診断、予防および治療法開発

次世代シーケンサーによる全ゲノム解析データを得ていた犬の家族性成犬発症型運動失調症、オロット酸尿症およびメチルマロン酸尿症について、次のようなことが解明された。家族性成犬発症型運動失調症においては、以前に実施したゲノムワイド関連解析で絞り込まれていた関連染色体領域に、候補となりうる変異が存在することが明らかになった。現在、その候補変異の遺伝子型を判定する検査法を開発して、その遺伝子型と表現型の一致性を犬集団(疾患関連および非関連集団)のDNAを用いて解析しはじめた。犬のオロット酸尿症およびメチルマロン酸尿症は、全ゲノム解析データを使って、候補となる数種の遺伝子配列を調べたが、これまでは原因遺伝子候補となる変異は見つかっていないため、調査を継続中である。新たに犬のエーラス・ダンロス症候群、神経セロイド・リポフスチン症およびカロリ病、ならびに猫のライソゾーム蓄積病について、全ゲノム解析を実施した。いずれの疾患でもまだ原因変異を同定していないが、一部の疾患で候補となる原因変異を見いだしているため、その真偽を評価する解析を進めている。また、新たに解析を開始した犬のムコ多糖症では、VI型(ARSB遺伝子)を調査したが変異は存在しなかったため、VII型(GUSB遺伝子)の解析を開始した。米国で同定された柴犬のサンドホフ病の原因変異について、日本の柴犬集団(約500頭)で遺伝子型調査をしたが、この変異を有するキャリアは見いだされなかったため、日本国内の柴犬集団は保有していないと強く示唆された。発酵食品由来の抗酸化サプリメントを用いた犬の変性性脊髄症に対する治療試験については、分子疫学調査により発症リスクのある個体を20数頭見出し、実際の治療試験を開始した。これについては、経過を観察している段階で効果を判定する時期に達していないが、副作用など問題は観察されていない。解析を開始した疾患の中では、本研究目的の中心となる家族性成犬発症型運動失調症の原因変異の同定に関して、最終確認の実験が必要なものの、ほぼ確定的はレベルに至っている。その他の疾患についても、すでに数疾患に関して全ゲノム解析データが得られたため、今後はこれらのデータを基盤として順調に調査することができる。その中でも次年度には全貌解明できる疾患がいくつか出てくると思われる。柴犬のサンドホフ病の疫学調査では、国内には同変異がほぼ存在しないことを示せたため、本疾患を予防対象とする必要がないことが明らかとなった。抗酸化サプリメントを使った臨床試験を20頭以上の変性性脊髄症の発症リスクの犬に適用でき、副作用などの問題もなく順調に経過を観察できている。さらに、研究期間中に見いだされた新規の疾患(カロリ病、猫のライソゾーム病)が同定されて、それらを本研究に追加して研究対象の範囲はさらに広げることができた。期待以上の結果が得られている疾患(家族性成犬発症型運動失調症)については、原因変異の同定という最終的な段階に進めて行く。また、計画通りに解析が進んでいる疾患(犬のオロット酸尿症およびメチルマロン酸尿症)および新たに研究計画に加えた疾患(犬のエーラス・ダンロス症候群、神経セロイド・リポフスチン症およびカロリ病、ならびに猫のライソゾーム蓄積病)については、それらの全ゲノム解析データに基づいて、着実に変異候補を選択してその真偽を評価していく。抗酸化サプリメントを使った治療試験については、犬の変性性脊髄症への効果は今後も観察していくが、同様に蛋白ミスフォールディングが病態進行に関与するような他の疾患についても、本サプリメントのよい効果が期待できるため、そのようなタイプの疾患が診断された場合には適用する予定である。さらに、今後も新たに同定診断される動物疾患を本研究計画に加えていく予定である。平成29年度は、家族性成犬発症型運動失調症、犬のオロット酸尿症およびメチルマロン酸尿症のそれぞれ1家系を対象に、次世代シーケンサーによる全ゲノムシーケンス解析を実施した。家族性成犬発症型運動失調症では、一定の関連領域を見出し、そこに2つの候補遺伝子が存在したが、エクソン領域に候補変異になりうる配列異常は認められなかった。しかし、同遺伝子のあるイントロン領域に数百塩基対の挿入が認められることがわかり、この領域を解析しているところである。一方、犬のオロット酸尿症およびメチルマロン酸尿症は、全ゲノム解析が完了したところであり、今後、候補遺伝子と変異を検索していく予定である。分子疫学調査(予防)および治療試験は、一旦、犬の変性性脊髄症に切り替えて実施した。犬スーパオキシドジスムターゼ遺伝子の2種類の変異(c.118G>Aおよびc.52A>T)を同一犬舎内の犬集団で調査した。その結果、変性性脊髄症の両変異は集団内に高い割合で存在したため、次世代に本疾患の発症リスクとなる遺伝子型を有した個体を作成しないような繁殖コントロールを実施した。さらに、すでに存在する発症リスクの犬に対しては、抗酸化能を有する発酵食品由来のサプリメントを投与する臨床試験を開始した。一方、柴犬のサンドホフ病が米国で同定されたため、日本の柴犬集団の変異アレル頻度調査を実施した。その結果、現時点で日本の柴犬にキャリアは存在しなかった。さらに、アジア諸国の家猫集団における赤血球ピルビン酸キナーゼ欠損症の変異アレル頻度の調査を開始した。その結果、東南アジアでは、本疾患の変異アレルがかなり高い頻度で存在することが明らかとなった。