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急性腎不全における発症と機能回復に関する遺伝子発現の研究

急性腎不全は、適切な予防措置や早期の的確な対処により、腎機能が改善するが、およそ50%は末期腎不全に移行したり、合併症により死の転帰を迎える臨床上重要な疾患である。急性腎不全が発症した際にどのような変化が生じているかを知ることはその予防、治療の上で重要である。今回、臨床上頻度の高い虚血性急性腎不全モデルと、腎移植などに用いられ腎障害発症が問題になっているシクロスポリンによる急性腎不全モデルにおいて、エンドセリン-1mRNA、エンドセリン変換酵素、エンドセリン-1産生、エンドセリンA型受容体、エンドセリンB型受容体、等について検討した。(1)両モデルにおいてエンドセリン-1mRNAは30分より数時間後から発現の増加が認められ、エンドセリン-1産生が増した。(2)受容体のうちA型受容体は両モデルにおいて減少するが、B型受容体は虚血性急性腎不全モデルでは増加し、シクロスポリンによる急性腎不全モデルにおいては減少する。(3)エンドセリン変換酵素はシクロスポリンによる急性腎不全モデルにおいて減少していた。(4)エンドセリン変換酵素調節の機序解明のため培養内皮細胞系を用いて検討してみると、エンドセリン-1の投与によりエンドセリン変換酵素蛋白とエンドセリン変換酵素mRNAの減少がみられた。またエンドセリン-1の作用はB型受容体拮抗薬にて消失し、A型受容体拮抗薬存在下ではそのまま存在したことより、B型受容体をかいしてエンドセリン変換酵素を抑制しているものと考えられた。これらの成績より、虚血性急性腎不全モデルではA型受容体の減少とB型受容体の増加によりエンドセリンの作用を減弱させ、シクロスポリンによる急性腎不全モデルにおいてはA型受容体の減少とB型受容体をかいしてのエンドセリン変換酵素を減少させることにより、エンドセリンを低下させ腎障害の回復に寄与していると考えられた。今回、臨床上頻度の多い虚血性急性腎不全モデルと、腎移植などに用いられ腎障害発症が問題になっているシクロスポリンによる急性腎不全モデルにおいて、エンドセリン-1mRNA、エンドセリン変換酵素、エンドセリン-1産生、エンドセリンA型受容体、エンドセリンB型受容体、等について、また虚血性急性腎不全モデルにおいては腎障害からの回復過程における細胞内情報伝達系について検討した。両モデルにおいてエンドセリン-1mRNAは30分より数時間後から発現の増加が認められ、エンドセリン-1産生が増す。このため血管収縮がおこり腎障害をきたすと考えられる。このままこのシグナルが持続すると腎障害は果てしなく進行するが、それぞれのモデルにおいて異なった調節がなされている。受容体のうちA型受容体は両モデルにおいて減少するが、B型受容体は虚血性急性腎不全モデルでは増加し、シクロスポリンによる急性腎不全モデルにおいては減少する。また、エンドセリン変換酵素はシクロスポリンによる急性腎不全モデルにおいて減少していた。これらのことより、虚血性急性腎不全ではA型受容体の減少によりエンドセリンの作用減少に寄与するとともにB型受容体が増加することにより腎障害の回復に寄与していると思われる。シクロスポリンによる急性腎不全モデルにおいてはB型受容体は寄与しておらず、エンドセリン変換酵素を減少することにより、エンドセリンを低下させ腎障害の回復に寄与していると思われる。

虚血性急性腎不全モデルにおける腎障害からの回復過程の細胞内情報伝達系は、エンドセリン-1によりraf-1キナーゼ,MAPキナーゼキナーゼ,MAPキナーゼ,S6キナーゼなどのリン酸化が認められ回復過程における関与が推察された。急性腎不全は、適切な予防措置や早期の的確な対処により、腎機能が改善するが、およそ50%は末期腎不全に移行したり、合併症により死の転帰を迎える臨床上重要な疾患である。急性腎不全が発症した際にどのような変化が生じているかを知ることはその予防、治療の上で重要である。今回、臨床上頻度の高い虚血性急性腎不全モデルと、腎移植などに用いられ腎障害発症が問題になっているシクロスポリンにより急性腎不全モデルにおいて、エンドセリン-1mRNA、エンドセリン変換酵素、エンドセリン-1産生、エンドセリンA型受容体、エンドセリンB型受容体、等について、また虚血性急性腎不全モデルにおいては腎障害からの回復過程における情報伝達系について検討した。前年度、両モデルにおいてエンドセリン-1mRNAは30分より数時間後から発現の増加が認められ、エンドセリン-1産生が増す。受容体のうちA型受容体は両モデルにおいて減少するが、B型受容体は虚血性急性腎不全モデルでは増加し、シクロスポリンによる急性腎不全モデルにおいては減少する。また、エンドセリン変換酵素はシクロスポリンによる急性腎不全モデルにおいて減少していた。シクロスポリンによる急性腎不全モデルにおいては、エンドセリン変換酵素を減少することにより、エンドセリンを低下させ腎障害の回復に寄与していると思われる。今年度はこのエンドセリン変換酵素調節の機序解明のため培養内皮細胞系を用いた。エンドセリン-1の投与によりエンドセリン変換酵素蛋白とエンドセリン変換酵素mRNAの減少がみられた。またエンドセリン-1の作用はB型受容体培抗薬にて消失し、A型受容体培抗薬存在下ではそのまま存在したことより、B型受容体をかいしてエンドセリン変換酵素を抑制しているものと考えられた。このようにエンドセリンB型受容体はエンドセリンの産生自体を抑制する機能を持つことが示された。
肥大型及び拡張型心筋症の網羅的遺伝子解析によるテーラーメード治療の確立

157名のサルコメア遺伝子変異保因者を検出し、そのうち107名について心エコー図検査指標を経時的解析した。7年間の観察期間中、12名に左室収縮不全が認められた。対象をミオシン結合蛋白C遺伝子保因者(MYBPC3群)と非ミオシン結合蛋白C遺伝子保因者(non-MYBPC3群)とに分けてカプランマイヤー法で解析した所、non-MYBPC3群はMYBPC3群と比較して、より高頻度に左室収縮不全をきたすことが判明した。本年度は、遺伝子解析にて遺伝子変異を認めた心筋症家系について、詳細に臨床病態を分析した(Int Heart J.51:214-217,2010)。その結果、たとえ同じ遺伝子変異により心筋症を発症した症例においても、長期的な臨床病態が異なることが判明した。具体的には、心筋トロポニンI遺伝子のLys183del変異を有する肥大型心筋症2例の長期経過と病理所見を比較した。一方の74歳女性は、長期経過において次第に左室収縮機能が低下し、74歳の死亡時の病理所見では、心室中隔の菲薄化および心室中隔を中心としたびまん性かつ貫壁性の心筋線維化が認められた。他方の92歳の男性は心筋梗塞を発症するまでは左室収縮機能を保ち、病理解剖時にも非対称性中隔肥厚を示し、典型的な肥大型心筋症の病態を呈していた。このような同一遺伝子変異保因者における臨床病態の差異を生ずる原因として、レニンアンジオテンシン系の多型が関与する可能性を考え、その解析に取り組んだ(Circ J.74:2674-2680,2010)。具体的には、サルコメア遺伝子変異により肥大型心筋症を発症した遺伝子変異保因者(49家系中の126名、男性64名、平均年齢51歳)において、網羅的にレニンアンジオテンシン系の多型を解析した。その結果、レニンアンジオテンシン系多型のうち、ACE多型のD alleleおよびAT1受容体多型-1166のC alleleを有する遺伝子変異保因者において、左室の拡大や左室の収縮機能低下が認められやすいことが判明した。以上の結果より、サルコメア遺伝子およびレニンアンジオテンシン系多型を網羅的に解析することにより、左室収縮機能低下を示しやすい保因者を早期に発見・治療すること、すなわちテーラーメード治療を行うことが可能となり、心筋症患者の予後改善に寄与できる可能性を示した。本年度は心筋症、特に肥大型心筋症の遺伝子解析にて変異を検出したサルコメア遺伝子変異保因者について、臨床病態の解明に取り組んだ。その結果、119名もの多数の変異保因者について、臨床病型や死亡要因を検討することができた。119名の変異保因者の内訳は、心筋ベータミオシン重鎖遺伝子が16名、心筋ミオシン結合蛋白C遺伝子が40名、心筋トロポニンT遺伝子が14名、心筋トロポニンI遺伝子が49名であった。心筋ミオシン結合蛋白C遺伝子変異保因者が多く認められるのは全国的、かつ世界的に共通の現象であるが、心筋トロポニンI遺伝子変異保因者が多く認められるのは北陸地方、特に石川県を中心とした地域特有の現象であることが再認識された。これらの遺伝子変異保因者をミオシン群(心筋ベータミオシン重鎖遺伝子および心筋ミオシン結合蛋白C遺伝子変異保因者)56名、トロポニン群(心筋トロポニンTおよびI遺伝子変異保因者)63名に群分けして検討した所、左室駆出率50%未満の左室収縮不全に伴う死亡は、トロポニン群でより早期に認められることを明らかにした。以上の結果より、サルコメア遺伝子変異保因者の中でもトロポニン群に属する症例では、より早期に収縮不全を検出・治療することが重要であることが明らかとなり、テーラーメード治療の推進に一歩近づいた。この結果を2011年11月に米国オーランドで開催されたAmedcan Heart Association's Scientific Sessionsで発表した所、高く評価された。他にも、遺伝子変異を有する家族性高コレステロール血症患者における最適な治療に関する研究(Am J Cardiol.109:364-369.2012)や、心臓や副腎におけるNR4AやNR5A1などの核内受容体遺伝子の役割に関する研究(J Hypertens.29:1185-1195.2011)も行い、成果が得られた。本年度は、遺伝子解析にて変異を検出したサルコメア遺伝子変異保因者について、臨床病態の解明に取り組んだ。67の独立した肥大型心筋症家系において、157名のサルコメア遺伝子変異保因者を検出できた(男性87名、平均年齢46.5±20.5歳)。157名中、心エコー図検査による経時的観察が可能であった107名について、心エコー図検査指標を経時的解析した。

平均観察期間は7年で、107名中12名に観察期間中に左室駆出率が50%未満となる左室収縮不全が認められた。多変量解析の結果、収縮不全の出現は、加齢および観察開始時の左室駆出率低値と関連することが判明した(それぞれ、P<0.001とP=0.020)。また原因遺伝子としては、ミオシン結合蛋白C遺伝子(MYBPC3)変異を有する変異保因者では、左室収縮不全が認められにくいことが判明した(P=0.042)。この結果より、107名の対象をミオシン結合蛋白C遺伝子保因者(MYBPC3群)と非ミオシン結合蛋白C遺伝子保因者(non-MYBPC3群、すなわち心筋ベータミオシン重鎖遺伝子変異保因者、心筋トロポニンT遺伝子変異保因者、および心筋トロポニンI遺伝子変異保因者)とに分けて生存曲線を作成した。カプランマイヤー法での解析により、MYBPC3群ではnon-MYBPC3群と比較して左室収縮不全が認められにくいことが判明した(log-ranktest、P=0.010)。左室収縮不全が認められた12名中、11名は平均8.3年の観察期間中に死亡した。以上より、non-MYBPC3群のサルコメア遺伝子変異保因者は、MYBPC3群のサルコメア遺伝子変異保因者と比較して、より高頻度に左室収縮不全をきたすことが判明した。従って、non-MYBPC3群のサルコメア遺伝子変異保因者については特に、左室収縮不全の出現に注意して加療を続けるべきであると結論づけた。119名もの多数のサルコメア遺伝子変異保因者について、臨床病型や死亡要因を検討することができた。2011年11月に米国オーランドで開催されたAmedcan Heart Association's Scientific Sessionsにおいて研究結果を発表した所、高く評価された。24年度が最終年度であるため、記入しない。臨床病型を解明することができた119名を含めて、現時点で157名の遺伝子変異保因者を特定することができた。これら157名に関して、特に左室駆出率が50%未満となる左室収縮不全発症年齢を検討している。心筋ミオシン結合蛋白C遺伝子変異保因者については、それ以外の遺伝子変異保因者と比較して左室収縮不全発症年齢が高い傾向にあることが示されつつある。今後、この研究結果をまとめて、英文誌に投稿する準備を進めていく予定である。
多数目的最適化に有効な進化型アルゴリズムの開発

本研究では,4つ以上の目的関数を同時に最適化する多数目的最適化問題に有効な進化型アルゴリズム(MOEA)の開発を目的として,精緻に解の優?を決定するためにパレート支配を部分的に適用する方法と,解の支配領域を自己決定する方法,さらに解探索を促進するために交叉による遺伝子変化量を抑制する方法を開発した.テスト問題を用いた性能検証実験によって,開発したアルゴリズムが多数目的最適化問題におけるMOEAの解探索性能を著しく改善することを明らかにした.本研究では,4つ以上の目的関数を同時に最適化する多数目的最適化問題に有効な進化型アルゴリズム(MOEA)の開発を目的として,精緻に解の優?を決定するためにパレート支配を部分的に適用する方法と,解の支配領域を自己決定する方法,さらに解探索を促進するために交叉による遺伝子変化量を抑制する方法を開発した.テスト問題を用いた性能検証実験によって,開発したアルゴリズムが多数目的最適化問題におけるMOEAの解探索性能を著しく改善することを明らかにした.本研究は,多数目的最適化問題(MaOP)に有効な進化型アルゴリズム(MOEA)を開発することを目的としている.研究計画に示した解の支配制御パラメータSの適応的決定法に関して,世代的にSを変更する方法を検討した結果,雑誌論文1件の成果が得られた.その後,解集団中の個体ごと適応的に解の支配領域を決定する方法を考案し,論文を国際会議に投稿中である.この方法では,従来の解の支配領域制御法のパラメータSの設定を不要にし,さらに研究計画に示した別の課題である,パレート最適解集合(POS)の多様性も改善する実用的なアルゴリズムを実現出来た.MaOPにおけるMOEAの解探索性能のさらなる向上が急務であることから,研究計画にあげたPOSの視覚化法の検討より優先して新しいMOEAの開発に取り組んだ.その結果,パレート部分支配を用いるMOEA(PPD-MOEA)を提案し,国際会議論文1件と雑誌論文1件の成果が得られた.従来のMOEAは,m個全ての目的関数を同時に考慮して解の支配関係を算出するが,PPD-MOEAは,m個の目的関数の中から取り出したr個の目的関数に対してパレート支配を部分的に適用した親選択を行う.さらに,r個の目的関数を何世代かごとに時間的に変更することによって,最終的に全目的関数を最適化するアルゴリズムを実現した.410目的のテスト問題を用いたシミュレーション実験の結果,従来法であるIBEA,CDAS,MSOPSと比較して,PPD-MOEAによって獲得されたPOSは,最適なパレートフロントへの収束性と多様性の両面でバランスの良い解探索を実現できることが確かめられた.従来のMOEAでは十分な解探索性能が得られない4目的以上の同時最適化において,PPD-MOEAは高い解探索能力を示し,MOEAによる多目的最適化の適用範囲の拡大に貢献できたと考えられる.まず,解の支配領域を自己制御するS-CDAS法を開発した.解の支配領域制御法(CDAS)は,解集団の最適なパレートフロントへの収束性を高めることによって進化型アルゴリズムの多数目的最適化性能を高めることが出来る、しかし,十分な解探索性能を得るためには,解の支配領域を決定するパラメータを実験的に求めなければならない点と,得られるパレート最適解集合(POS)の多様性が低下する点に問題がある.これらを解決するために,S-CDASでは各目的関数の最大値を有する解を支配しない範囲で,それぞれの解の支配領域を自己制御することにより,CDASからパラメータを排除し,最適なバレートフロントに対する収束性と多様性を同時に満足する方法を実現した.これより,多数目的最適化に有効なアルゴリズムの利便性を高め,さらに意思決定者により多様な解を提示可能になった.次に,平成21年度に開発したパレート部分支配を用いるMOEA(PPD-MOEA)において,解探索中に獲得したPOSに対して,解の支配領域を拡大したCDASによってアーカイブする解を取捨選択する方法を開発した.これにより,より最適なパレートフロントに対する収束性が高いアーカイブ集団から,パレート部分支配による親選択を繰り返すことによって,さらに解探索性能が改善されることを明らかにした.また,これらの検討の中で,求めるべきPOSが目的関数の数の増加に伴って,解空間中に広範に分布することが明らかになった.解空間を満遍なく探索する場合,解集団中の遺伝子が多様化し,従来の遺伝的操作法の有効性が低下する.そこで,多数目的最適化に有効な遺伝的操作法を実現する目的から,交叉遺伝子量の制御(CCG)法を開発した.CCGは,交叉する遺伝子量をパラメータで制御する,実験の結果,多数目的最適化では交叉する遺伝子量を極めて小さく設定した場合に解探索性能が著しく改善され,親の遺伝子構造を破壊しにくい遺伝的操作法が多数目的最適化に有効であることを明らかにした.
細胞内エストロゲンシグナル経路の可塑性とアロマターゼ阻害剤耐性機序の解明

アロマターゼ阻害剤(AI)耐性機序の解明を目的とし、我々が以前樹立したERE-GFP導入ER陽性乳癌細胞を親株にして、長期エストロゲン枯渇状態やアンドロゲン添加状態で生き残ったコロニーをER活性によるGFP蛍光を指標にして複数株を単離・樹立することによって最終的に6種類の耐性機序の異なった細胞を作製した。それらの性質を詳細に解析した結果、PI3K-Akt経路を介したERのリガンド非依存的活性化による耐性細胞、エストロゲン様活性を有するアンドロゲン代謝産物を産生して利用する耐性株やアンドロゲンそのものに依存してアンドロゲン受容体を介して増殖促進するものなど、複数の新規耐性機序を明らかにした。昨年までに樹立した各種耐性細胞のうち、細胞内リン酸化経路が関与している可能性が考えられるType 1, Type 2, Type 3について、ERやその標的遺伝子、PgR, pS2, EGR3, Cyclin Dなどの発現や、Her family、MAPK系やPI3K-AKT系の蛋白の発現やリン酸化を解析した。また、網羅的リン酸化プロテオミックス解析法を用いてType1細胞内の蛋白のリン酸化状態を親株と比較検討した。その結果、Type 1およびType 3細胞は、PI3K, Akt経路によってERがリン酸化され、活性化されている可能性が示された(論文投稿中)。また、これらの細胞はタモキシフェンやフルベストラントなどの抗エストロゲン薬やHer familyを標的とした、各種分子標的治療薬に対する感受性を示した。このような機序を持つ耐性症例には、2次治療としてこれらの薬剤が有用である可能性が示唆される。さらに、Type 4細胞はエストロゲン様活性をもつステロイドである3β-androstandiolの産生が増強され、ERに対するリガンドとして作用していることが示唆された(論文投稿中)。また、Type 5細胞は、硫酸抱合体エストロゲンの細胞内取り込みに作用するOATPとその代謝酵素であるSTSの亢進が観察され、E1Sを積極的に取り込み、代謝することでエストロゲン枯渇状態をしのいで生存を図っている可能性が示唆された。現在、これらの耐性株のマウス移植実験を進めている。近年の閉経後乳癌の内分泌治療の中心はアロマターゼ阻害剤(AI)である。最初の第3世代のAIが臨床に用いられるようになって10年近くが経過し、近年その再発や耐性が大きな問題となっている。その原因には治療に伴う細胞内のエストロゲンシグナル経路の変化がひとつの大きな要因になっていると思われる。そこで我々が以前樹立したERE-GFP導入ER陽性乳癌細胞を親株にして各種耐性モデル細胞を作製し、そのシグナル経路を解析した。長期エストロゲン枯渇状態やin vivoに近い、アンドロゲン添加状態やAI剤添加状態で生き残ったコロニーをER活性によるGFP蛍光を指標にして複数株を単離・樹立することによって最終的に6種類の耐性機序の異なった耐性モデル細胞を作製した(特許申請中:特願2011-152458特願2013-108774)。そしてそれらのcharacterizationを詳細に行った結果、従来も報告されていたPI3K-Akt経路を介したERのリガンド非依存的活性化による耐性細胞が得られたが(原著論文J. Steriod Biochem. Mol. Biol., 139: 61-72, 2014)、他にもエストロゲン様活性を有するアンドロゲン代謝産物を産生して利用する耐性株(原著論文Breast Cancer Res. Treat. 139: 731-740, 2013及びBreast Cancer Res. Treat. 143(1),69-80, 2014)やアンドロゲンそのものに依存してアンドロゲン受容体を介して増殖促進するもの(投稿中)など、これまでに知られてない複数の新規耐性機序を明らかにした。今後、さらに研究を進めて、それぞれの機序を識別するバイオマーカーを明らかにし再発乳癌の個別化を可能にすることで2次治療の奏効性を上げ得るかもしれない。今年度は今後の研究材料となる、アロマターゼ阻害剤に対する異なった複数の耐性機序をもつような各種耐性細胞を樹立することを行った。すなわちERE-GFPレポーター遺伝子を安定導入したER陽性乳癌細胞MCF7-E10を親株にして、生細胞中のエストロゲン活性をモニターしながら分離することにより、想定される耐性メカニズムのそれぞれを獲得したと思われるエストロゲン枯渇耐性株およびアロマターゼ阻害剤耐性株を複数樹立した。(1)MCF7-E10細胞を親株として長期エストロゲン枯渇耐性細胞を、GFP蛍光をモニターしながら、蛍光を発するコロニーと発しないコロニー、2種類を選択的に3個ずつ分離し、それぞれを細胞株として樹立した。

(2)また、このMCF7-E10細胞にアンドロゲンを加えながら長期エストロゲン枯渇耐性株をGFPをモニターしながら作製を試み、アンドロゲン代謝産物依存性を持つと思われる耐性株を2株樹立した。(3)T47D-TE8細胞を親株として増殖因子カクテルを加えて長期エストロゲン枯渇耐性細胞を1と同様GFP蛍光をモニターしながら3株樹立した。(4)さらにMCF7-E10細胞にアロマターゼ発現ベクターを安定導入し、アロマターゼを有するERE-GFPレポーター細胞を樹立した。この細胞を親株にしてアロマターゼの基質であるテストステロンとアロマターゼ阻害剤(AI)を加えて長期に培養し、AI耐性株を樹立した。その際にGFP活性をモニターしながら、単なる枯渇耐性(1や2で作成した細胞)のクローンを排除しながら、真のAI耐性と思われる株、2株を樹立した。以上のように、これまでに機序の異なると思われる5種類の耐性株(計13株)の樹立に成功した。次年度以降、これらを用いて各々の耐性機序について解析していく。これらの株については東北大学より特許を出願した。概要で述べたように、当初の交付申請書に記載した平成24年度研究実施計画のほぼすべてを達成し、研究全体も計画通り、順調に推移している。さらに昨年度、樹立して、特許申請した5つの細胞株以外にも、本年度、6番目の機序として新たにアンドロゲンに依存した増殖を示すAR依存性細胞株の樹立にも成功した。このように当初の計画以上に進展していると言える。概要で述べたように、当初の交付申請書に記載した本年度の研究実施計画のすべてについて達成し、5種、13株の耐性細胞株を樹立できた。さらにこれらの細胞株を特許生物寄託センターに寄託し、特許を出願した。ちなみに今回樹立し、出願した細胞株は以下の5種類である。Type1耐性細胞:ER活性(GFP+)を保持したエストロゲン(E2)枯渇耐性MCF-7細胞Type2耐性細胞:GFP蛍光を失ったE2枯渇耐性MCF-7細胞Type3耐性細胞:GFP蛍光を失ったE2枯渇耐性T-47D細胞Type4耐性細胞:GFP+のアンドロゲン依存性のE2枯渇耐性MCF-7細胞Type5耐性細胞:GFP+でType1耐性ではないアロマターゼ阻害剤耐性細胞今後、これらの細胞の耐性機序についてさらに詳細に、また、浸潤能、転移能についてもin vitro, in vivo両面から検討する。なお、in vivoでの詳細な検討、各種薬剤の治療効果の検証を行うため、マウスに移植してその増殖能や転移能の違いや抗エストロゲン薬や分子標的治療薬の腫瘍縮小効果を検討する。さらに、増殖した腫瘍をマウスから単離、培養し、in vitroの結果を参考にしながら、その分子生物学的解析を行う。これらの結果を総合して、AI耐性機序として起こりうる分子レベルでの現象について推察し、それらの個別化、それぞれの機序の克服のためにとりうる治療法を明らかにする。また、可能であれば、乳癌再発の手術施行例から検体を採取し、それらについてER活性を測定し、それまでの研究結果から示唆されたメカニズムが実際のAI再発乳癌で寄与しているのかどうかについて各種分子生物学的手法の検討を行いたい。
イネの葉維管束組織におけるグルタミン酸合成統御を介したイネ白葉枯病防御の分子基盤

窒素栄養は、植物の多量必須栄養素であり、その生育や生産性を支配する。イネにおいて、グルタミン応答的遺伝子発現を介したグルタミン酸生合成制御は窒素利用に重要である。また、グルタミン酸生合成は、イネ白葉枯病の発症とも密接に係わることが示唆されている。本研究成果として、微生物グルタミンセンサーのグルタミン結合ACTドメインに相同なドメインを有するイネACT-domain repeat protein 9 (OsACR9)が、イネにおけるグルタミン酸生合成関連酵素遺伝子のグルタミン応答的発現に係わること及び窒素・炭素代謝に重要であることが示唆された。今年度は、イネ葉維管束組織グルタミン酸生合成統御系でのグルタミン情報感知候補OsACR9とその相互作用因子OsVOZ2の個別・連携機能解析を主に行った。・BiFC法により、OsACR9とOsVOZ2のin vivo相互作用を解析した。OsACR9及びOsVOZ2のC末端にN末端側またはC末端側の分割EGFPを融合したキメラタンパク質の遺伝子を、粒子銃法により、タバコ葉で一過的導入発現させ、各遺伝子翻訳産物の相互作用に起因した再構成EGFP蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。この結果、OsACR9とOsVOZ2の相互作用に起因する蛍光を核とサイトゾルで観測し、植物細胞内でのOsACR9とOsVOZ2の相互作用が示唆された。また、アグロバクテリア浸潤法により、タバコ葉でOsACR9-HisタグとOsVOZ2-FLAGタグの組換えタンパク質の遺伝子を一過的に個別・共導入発現する実験系を構築し、共沈降解析を遂行中である。・OsVOZ2-mRFPキメラタンパク質遺伝子を、粒子銃法にてタバコ葉に導入し、一過的に発現させる実験系を構築した。今後、FRAP法により、in vivoでのOsVOZ2の細胞内動態と消長を解析する。・OsACR9のRNA干渉法遺伝子を導入した形質転換イネ自家受粉後代(T2)において、分げつ未抽出葉でのRNA干渉法遺伝子発現と顕著なOsACR9タンパク質減少が認められた独立2系統を選抜した。これらの系統の自家受粉T3世代の幼植物の根では、グルタミン供給後のグルタミン応答性IDHc;1遺伝子の発現が顕著に抑制された。以上は、OsACR9がグルタミン情報伝達系に機能関与することを示唆した。なお、OsACR9とOsVOZ2の遺伝子破壊イネ候補のTos17挿入変異体を、三次元ライブラリースクリーニングしたが、変異体は検索できなかった。本年度は、OsACR9とOsVOZ2の植物細胞内での相互作用を示すことができた点や、OsACR9発現抑制イネを用いて、OsACR9がグルタミン情報伝達系に関与することを示唆できた点は、評価できると考える。しかし、共沈降解析のための、OsACR9とOsVOZ2の各種タグ融合タンパク質の植物細胞内での一過的個別・共導入発現系の構築が、発現タンパク質の分解などにより困難を極めた。この一過的個別・共導入発現系を構築できたが、大腸菌内発現組換え(r)OsACR9とrOsVOZ2を用いた、in vitroでのシグナル候補分子存在下での相互作用解析や、イネ葉OsACR9-OsVOZ2情報伝達系上流・下流相互作用因子の選抜ならびに、OsVOZ2の細胞内移行・分解関連因子の検討を行うことができなかった。また、本研究では、イネ白葉枯病菌の発症エフェクターXopNのイネ標的因子OsVOZ2を介した防御応答阻害機作の解明も行うが、XopNの遺伝子単離とOsVOZ2との相互作用解析は遂行できなかった。さらに、OsVOZ2特異抗体を作成できなかった。本研究では、イネ葉維管束組織グルタミン酸(Glu)生合成統御系でのグルタミン(Gln)情報感知候補OsACR9とその相互作用候補転写因子OsVOZ2の個別・連携機能を解明すること、また、OsVOZ2とイネ白葉枯病菌の発症エフェクターXopNの相互作用を介した防御応答阻害機作も解明し、窒素代謝調節に立脚したイネ白葉枯病防御モデルの提案を目指した。先ず、OsACR9とOsVOZ2の相互作用を解析した。タバコ葉での一過的BiFC解析では、OsACR9とOsVOZ2;2の相互作用に起因する再構成蛍光が観察され、植物細胞内での両者の相互作用が確認された。しかし、pull down解析では、各タンパク質の推定分子量よりも低分子のポリペプチドが特異的に検出され、OsACR9とOsVOZ2;2が相互作用後に分解されている可能性が考えられた。次に、OsACR9のGln情報伝達系への関与を解析した。単独窒素源としてGlnを短期供与したOsACR9発現抑制イネ幼植物の根では、Gln応答的に発現し、かつ、アンモニウム初期同化系のNADH-グルタミン酸合成酵素1反応への炭素骨格基質供給に重要な酵素遺伝子の発現量が、野生型よりも著減した。さらに、Glnを単独窒素源として長期供与したOsACR9発現抑制イネ幼植物では、野生型と比較して、乾燥重と窒素・炭素含量が、根で著減し、地上部でも減少傾向を示した。

以上より、イネ幼植物根では、OsACR9が、アンモニウム初期同化・Glu合成へ炭素骨格供給する酵素のGln応答的遺伝子発現制御に関与し、窒素・炭素代謝に重要であることが示唆された。窒素栄養は、植物の多量必須栄養素であり、その生育や生産性を支配する。イネにおいて、グルタミン応答的遺伝子発現を介したグルタミン酸生合成制御は窒素利用に重要である。また、グルタミン酸生合成は、イネ白葉枯病の発症とも密接に係わることが示唆されている。本研究成果として、微生物グルタミンセンサーのグルタミン結合ACTドメインに相同なドメインを有するイネACT-domain repeat protein 9 (OsACR9)が、イネにおけるグルタミン酸生合成関連酵素遺伝子のグルタミン応答的発現に係わること及び窒素・炭素代謝に重要であることが示唆された。OsVOZ2抗体の作成、OsVOZ2遺伝子にT-DNAが挿入されたイネ変異体の韓国浦項工科大学からの入手及びイネ白葉枯病菌のXopN遺伝子の単離を最優先で行う。また、タバコ葉でOsACR9-HisとOsVOZ2-FLAGの組換えタンパク質を一過的に個別・共発現する実験系を構築できたため、共発現後の共免疫沈降解析によるOsACR9とOsVOZ2の相互作用の再検証やこの際に共沈降するタンパク質のペプチド解析によるOsACR9-OsVOZ2系上流・下流相互作用因子候補の選抜を遂行する。同個別発現後の各粗酵素液を脱塩処理後にシグナル候補分子添加下で混合してから、共沈降解析することにより、シグナル分子同定を試みる。OsACR9発現抑制形質転換イネは獲得できたので、これらの葉における窒素代謝系・関連炭素代謝系の酵素群とOsVOZ2の発現蓄積ならびに窒素利用機能・バイオマス生産の解析及びトランスクリプトーム解析を遂行し、イネ葉維管束組織グルタミン酸生合成統御系でのOsACR9とOsVOZ2の連携機能に関わる知見を得る。これらの研究とともに、平成28年度研究計画を遂行する。植物分子栄養学平成27年度研究計画においては、特にOsVOZ2抗体の作成とOsVOZ遺伝子破壊イネの単離を完遂することができなかった。平成27年度からの継続研究計画の内、OsVOZ2抗体の作成と韓国浦項工科大学からのOsVOZ2遺伝子T-DNA挿入イネ変異体の入手に関わる研究費は、平成27年度から平成28年度に持ち越した。また、平成28年度の研究計画遂行にかかる研究費は申請額と同額である。従って、研究遂行に問題は無いと考える。
メダカ属魚類におけるXY型からZW型への性決定機構の進化

本研究では、互いに近縁でありながら異なる性決定システム(XY型およびZW型)をもつメダカ属3種[ハウザンメダカ(XY型)、ハブスメダカ(ZW型)、ジャワメダカ(ZW型)]について、各種の性決定遺伝子を同定し、これら3種とその外群にあたるインドメダカ(XY型;性決定遺伝子:Sox3Y)を含めた4種で性決定機構を比較し、その進化メカニズムを解明することを目的とした。今年度の実績を以下に要約する。XY型のハウザンメダカについては、常染色体上のDmrt1がY染色体に重複転座していること(Dmrt1Y)が判明した。そこでゲノム編集によって本遺伝子に機能欠失変異を導入したところ、Y染色体に変異をもつXY個体がメスに性転換した。このことから、本種のオス分化にY染色体上のDmrt1Yが必要であることが明らかになった。また、ZW型のハブスメダカとジャワメダカについては、性染色体上に存在する複数の性決定遺伝子候補について、ノックアウト個体の作出を行った。しかし、いずれの候補遺伝子も性転換を誘導せず、両種が未知の性決定遺伝子をもつと考えられた。そこでZ染色体あるいはW染色体の一方のみをもつ半数体を作出し、現在これらの半数体について全ゲノム解析を進めている。これにより、性染色体特異的な性決定遺伝子候補を探索する予定である。また、メダカやルソンメダカにおいて共通してオス分化に関わるGsdf遺伝子について、XY型のインドメダカとZW型のハブスメダカにおいて機能解析を行った。その結果、前者のGsdfノックアウト個体では性転換が生じ、後者では性転換を生じなかった。このことから、XY型とZW型では性決定遺伝子の作用点が異なる可能性が予想された。本研究では、互いに近縁でありながら異なる性決定システム(XY型およびZW型)をもつメダカ属3種[ハウザンメダカ(XY型)、ハブスメダカ(ZW型)、ジャワメダカ(ZW型)]について、各種の性決定遺伝子を同定する。これら3種とその外群にあたるインドメダカ(XY型;性決定遺伝子:Sox3Y)を含めた4種で性決定機構を比較し、その進化メカニズムを解明することを目的としている。平成28年度の実績を以下に要約する。XY型のハウザンメダカについては、性染色体がメダカ10番染色体と相同であったため、当初Sox3を性決定遺伝子候補と考えていた。しかし、詳細な連鎖解析により、メダカでは9番染色体に存在するDmrt1遺伝子が本種の性決定遺伝子座に転座(あるいは遺伝子重複)していることが判明した。そこでDmrt1の定量RT-PCRを行ったところ、性分化時期のXY個体で特異的に高発現することが明らかになった。現在は本遺伝子を性決定遺伝子の最有力候補として、CRISPR/Casシステムを用いたノックアウト個体の作出を試みている。また、ZW型のハブスメダカとジャワメダカについては、これまでの解析から得られた複数の性決定遺伝子候補について、ノックアウト個体の作出を行っている。これらについて来年度以降に詳細な表現型解析を行う予定である。また、これまでの研究から、メダカ属のオス分化に関わる共通の因子としてGsdfが同定されている。そのため、XY型のインドメダカとZW型のハブスメダカについて、Gsdf遺伝子のノックアウト解析も並行して進めている。これにより、XY型とZW型における性決定機構の相違点と共通点を解明したいと考えている。いずれのメダカ近縁種についてもノックアウト個体の作出が進んでいる。次年度以降の表現型解析によって、各候補遺伝子が性決定機能をもつかどうかを明らかにできると考えている。XY型のハウザンメダカについては、性決定遺伝子候補としてDmrt1を同定した。ゲノム編集によって機能欠失変異を得ることができたため、現在ノックアウト個体の表現型解析を進めている。また、ZW型のハブスメダカとジャワメダカについては、性染色体上に存在する複数の性決定遺伝子候補について、ノックアウト個体の作出を行ったが、これまでのところ性転換を誘導する遺伝子は得られていない。現在ジャワメダカについて全ゲノム解析を行っており、今後は集団ゲノミクス解析とRNA-seq解析により候補遺伝子の探索を行う予定である。一方、メダカやルソンメダカで共通してオス分化に関わるGsdfについて、インドメダカとハブスメダカでも機能解析を行った。このことから、メダカ属のオス分化カスケードにはGsdf依存的なものと非依存的なものがあることが判明した。いずれのメダカ近縁種についてもノックアウト個体の作出が進んでおり、次年度以降の表現型解析によって、性決定カスケードを明らかにできると考えている。

本研究では、互いに近縁でありながら異なる性決定システム(XY型およびZW型)をもつメダカ属3種[ハウザンメダカ(XY型)、ハブスメダカ(ZW型)、ジャワメダカ(ZW型)]について、各種の性決定遺伝子を同定し、これら3種とその外群にあたるインドメダカ(XY型;性決定遺伝子:Sox3Y)を含めた4種で性決定機構を比較し、その進化メカニズムを解明することを目的とした。今年度の実績を以下に要約する。XY型のハウザンメダカについては、常染色体上のDmrt1がY染色体に重複転座していること(Dmrt1Y)が判明した。そこでゲノム編集によって本遺伝子に機能欠失変異を導入したところ、Y染色体に変異をもつXY個体がメスに性転換した。このことから、本種のオス分化にY染色体上のDmrt1Yが必要であることが明らかになった。また、ZW型のハブスメダカとジャワメダカについては、性染色体上に存在する複数の性決定遺伝子候補について、ノックアウト個体の作出を行った。しかし、いずれの候補遺伝子も性転換を誘導せず、両種が未知の性決定遺伝子をもつと考えられた。そこでZ染色体あるいはW染色体の一方のみをもつ半数体を作出し、現在これらの半数体について全ゲノム解析を進めている。これにより、性染色体特異的な性決定遺伝子候補を探索する予定である。また、メダカやルソンメダカにおいて共通してオス分化に関わるGsdf遺伝子について、XY型のインドメダカとZW型のハブスメダカにおいて機能解析を行った。その結果、前者のGsdfノックアウト個体では性転換が生じ、後者では性転換を生じなかった。このことから、XY型とZW型では性決定遺伝子の作用点が異なる可能性が予想された。各種における性決定遺伝子候補のノックアウト系統を作出し、その表現型解析を進める。また、性分化関連遺伝子の発現解析と機能解析によって、種間における性決定機構の相違点と共通点を明らかにする。また、ZW型の2種についてはゲノム解析を行って候補遺伝子の単離と機能解析を行う。ノックアウト個体の表現型解析の一部を本年度内に行うことを予定していたが、この実験に関連する予算を次年度に使用することにした。当初本年度に実施する予定であった表現型解析を次年度に実施する。また、この実験に使用する消耗品等も次年度に購入する。
試験・試合に勝つ：状況的意志力のコントロールによるパフォーマンスの向上効果の検証

本申請研究は、10分程度の短期間でやる気や集中力など【状況的意志力】を調整する方法を実施し、試験や試合でベストパフォーマンスを出せるかどうかを実験状況(実験1と実験3)と現実状況(実験2と実験4)の2側面から検討する。そのため、本研究では、英語試験(TOEIC)と水泳の試合でのパフォーマンスを効果検証の指標とする。本計画は、学際的なアプローチから、どうすれば試験・試合に勝つことができるのかという日常的な疑問に対して、栄養・認知・運動を用いて【状況的意志力】をコントロールすることで、日常的な課題・現実的な場面でベストパフォーマンスを出すことを目指すという世界で初めての試みである。
プラスチック分解酵素のポリマー分解機構の解明と機能強化

本研究では微生物由来の生分解性プラスチック分解酵素の遺伝子構造、および基質特異性について詳細に検討を加えるとともに、その産業利用を目指した生産条件の検討も視野に入れて各種検討を行った。まずRoseateles depolymerans TB-87株の全ゲノム解析を行い、分解酵素遺伝子を特定するとともに、TB-71株由来の分解酵素とのホモロジーについて解析した。さらに、シャペロン様タンパクの機能解析や、近縁種の分解酵素についての解析を行い、アミノ酸配列と基質特異性との関連を明らかにした。さらに、これらの微生物酵素の高発現化を目指して培養条件、培地コストの検討を行った。本研究室保有の生分解性プラスチック分解菌Roseatelesdepolymerans TB-87株は、基質特異性や分解活性のよく似た2種類の分解酵素Est-H、Est-Lを分泌する。今年度はTB-87株のドラフトゲノム解析と精製酵素の内部アミノ酸配列分析によるEst-H、L遺伝子の特定、および周辺領域の解析を行った。また、それらと相同性のあるタンパク質を検索した。内部アミノ酸配列解析の結果とTB-87株全ゲノムデータより、酵素遺伝子の特定を行った。その結果、Est-H、L遺伝子と考えられるORFそれぞれ1083bp、870bpを特定した。両遺伝子は互いに高い相同性を持ち、それらはシャペロン様遺伝子を挟んで近接していた。また周辺には多数の機能未知の遺伝子が確認された。当研究室保有の他の生分解性プラスチック分解菌(TB-71株)にも酵素遺伝子の近傍にシャペロン様遺伝子が存在するものがあり、Est-H、L遺伝子とシャペロン様タンパク質の相互作用の解明は、生分解性プラスチック分解酵素遺伝子の発現機構解明につながる可能性がある。BLASTによるアミノ酸相同性検索の結果、一部のクチナーゼやエステラーゼなど加水分解酵素と高い相同性が見られた。中でもThermobifida alba AHK119株由来の好熱性の生分解性プラスチック分解酵素と高い相同性を持っていた。両者の酵素タンパク質の構造上の類似点や差異を研究することで、生分解性プラスチックの耐熱化に関する情報が得られ、その応用に大きな進展をもたらす可能性がある。これまでにTB-87株のドラフトゲノム解析と精製酵素の内部アミノ酸配列分析によるEst-H、L遺伝子の特定、および周辺領域の解析を行った。今年度は本酵素の大腸菌での発現を試みた。各種ホスト、ベクターの組み合わせ、シグナルの有無と置換、培養温度、コドン最適化等各種の検討を行った結果、Est-Lについては封入体での発現が確認できたが、EST-Hについては発現が認められなかった。タンパク質工学、進化工学的改変には導入した遺伝子の発現が必要であるが、現時点では大腸菌での活性のある状態での発現が認められない。今後はホストの変更、無細胞系の検討等が必要であると考えられる。また、他のプラスチック分解酵素ではアミノ酸の一部改変が有効であったとのことから、erroe-prone PCR等のランダム変異を導入した発現を試みる。本研究室において分離されたプラスチック分解菌Roseatelesdepolymerans TB-87株は、脂肪族型のみならず脂肪族ー芳香族型の生分解プラスチックを固体のまま高効率で分解する。本菌株のプラスチック分解酵素について検討したところ、本菌株は基質特性や分解活性のよく似た2種類の分解酵素Est-H, Est-Lを分泌することが明らかになっている。これまでにTB-87株のドラフトゲノムの解析と、精製酵素の内部アミノ酸配列から両酵素の遺伝子を特定し、クローニングを行った。大腸菌での発現を目指して各種宿主ーベクター系の検討、コドン改変、リーダーペプチドの改変を試みたところ、Est-Lのみ発現が認められた。しかし、発現タンパクは封入体を形成し、活性は見られなかった。本酵素はプラスチックを分解する際に疎水的相互作用による表面への付着を行うための疎水性ドメインを有していると考えられる。しかし、その疎水性ドメインの存在が大腸菌での発現時のフォールディングを阻害している可能性が考えられた。そこで、誘導時期の検討と並行して界面活性剤の添加やヒートショックを試み、フォールデングの促進を促したところ、界面活性剤としてdeoxy-BIGCHAPを用いた場合に、わずかに活性が認められた。またプラスチックリサイクルへの応用を目指し、他の微生物由来の分解酵素についても検討を行った結果、高い分解性を持つ酵母を選択し、そのプラスチック分解能の検討を行った。さらに本酵素の低コストな発酵生産法を検討し、一定の成果を得た。

さらに、シャペロン様タンパクの機能解析や、近縁種の分解酵素についての解析を行い、アミノ酸配列と基質特異性との関連を明らかにした。さらに、これらの微生物酵素の高発現化を目指して培養条件、培地コストの検討を行った。今年度はTB-87株のドラフトゲノム解析と精製酵素の内部アミノ酸配列分析によるEst-H、L遺伝子の特定、および周辺領域の解析を行った。その結果とEst-H、Lはそれぞれ独立した、しかし極めて相同性の高い遺伝子からコードされていることを明らかにした。さらにそれらはシャペロン様遺伝子を挟んで近接していた。両遺伝子の比較と部位特的変異による実証は、プラスチック分解酵素の機能解明に有効である。さらに、両遺伝子は好熱性の生分解性プラスチック分解酵素と高い相同性を持っていた。両者の酵素タンパク質の構造上の類似点や差異を研究することで、生分解性プラスチックの耐熱化に関する情報が得られ、その応用に大きな進展をもたらす可能性がある。酵素の発現に関して検討したが、そのままではうまくフォールディングされないことが明らかになっている。シャペロン様遺伝子の機能解明とともにこの点のブレークスルーが次年度のキーとなる。問題となっている発現については、アミノ酸置換が有効であるとの情報を得たので、ランダム変異を用いた改変を試みる。また、酵素の応用例としてプラスチックフィルのリサイクルへの利用を試みる28年度が最終年度であるため、記入しない。産業微生物資源学各種検討に向け、酵素の大腸菌へのクローニングと大量調製を試みる。これまでの検討で、TB-71株由来の分解酵素の大腸菌の菌体内での大量発現は宿主の死滅を招くことが示されている。そこで、シグナル付与による菌体外への分泌を検討するとともに、放線菌や酵母等の大腸菌以外の宿主を用いた発現系の確立を検討する。また、TB-87株由来の酵素も、ショットガンクローニングが全く成功しなかった経験があるため、同様の可能性が考えられる。このため、こちらについても検討を行う。本酵素のポリマーとオリゴマーに対する基質特異性の違いに関連するアミノ酸残基にターゲットを絞り、PCRを用いた部位特異的変異による機能改変を試みる。アミノ酸残基の特定は前年度に行うランダム変異の結果とシュミレーションモデリングによる立体構造の情報を参考にする。得られた変異体を大量調製し、その基質特異性を詳細に解析するとともに、その立体構造の変化について検討する。申請者は数十株のプラスチック分解菌を自然界より取得、保有している。これらのうちのいくつかはその分解酵素、遺伝子を特定している。しかし、これまでに得られた分解酵素や遺伝子は、他の研究者によるものを含めて、真菌のクチナーゼ関連酵素以外ほとんどが互いに全く異なるポリペプチド鎖からなっており、酵素同士の比較検討が困難であった。
表皮の非対称細胞分裂と重層化を制御する上位シグナルの解明

重層扁平上皮では、基底細胞の基底膜に対して垂直方向におこる非対称分裂が細胞の分化と上皮の重層化とを決定する。しかしながら、非対称分裂をつかさどる上位のシグナル分子は不明であった。我々はphosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1)が上皮の非対称分裂に重要な分子であることを明らかにした。表皮の基底細胞において、細胞の上方の細胞接着刺激は、PI3-キナーゼ-PDK1経路の活性化を介して細胞の非対称分裂を促進し、表皮の分化と重層化とを支配すると考えられた。重曹扁平上皮では、基底細胞の基底膜に対して垂直方向におこる非対称分裂が細胞の分化と上皮の重層化とを決定する。phosphatidylinositol triphosphate (PIP3)の産生とPDK1の活性化は基底細胞の上方の細胞間接着部位で起こる。PDK1によって、非定型protein kinase C (aPKC)が基底細胞上方へと分布して非対称に活性化し、apical complexを形成する。PDK1を欠損する表皮ではapical complexを形成できず、基底細胞の非対称分裂が減少する。また、PDK1を欠損するケラチノサイトではカルシウムによるaPKCの活性化も起こらない。PDK1欠損表皮では、非対称分裂の下流で細胞の分化に機能するNotchの発現が低下する。活性化型Notchの強制発現によってPDK1欠損ケラチノサイトの分化は回復する。以上より、PDK1シグナルは、基底細胞の上方において、aPKCおよびapical complexの活性化、形成を介して、基底細胞から有棘細胞への分化を支配することが示唆された。表皮生物学
進行食道癌化学放射線療法感受性に対する予後規定因子の検索およびその臨床応用

BMI1は、hedgehog(Hh) pathwayのDownstreamに位置し、癌幹細胞の増殖、血液幹細胞、神経細胞、腸管細胞のself-renewalに重要な役割を果たすことが知られている。近年の私どもの報告では、Hh signal活性化は、進行食道癌の早期再発が予測されることを報告してきた。しかしながら術前化学放射線療法(以下CRTと略する)を行った食道扁平上皮がんにおけるBMI1発現の臨床的意義については明らかにされていない。食道扁平上皮がんと診断され、術前CRTを行った78名の患者を検討した。その結果、24名の患者はBMI1陽性であった。BMI1陽性患者の予後は、そうでない患者に比べ有意に不良であった(mean DFS time : 16.8 vs 71.2 months ; 3-yrDFS : 13.3% vs49.9%,p=0.002 ;OStime 21.8 vs 76.6 months ; 3-yr OS 16.2% vs 51.7%,p=0.0005)。p16とBMI1発現の相関性は認めなかった。今回の研究は、(1)BMI1発現は、進行食道癌CRT後切除患者の早期再発と予後のPredictorとなりえる。(2)Hh pathwayにおけるBMI1 signalの活性化は、進行食道癌CRT後の癌再発と進行のpromotionする可能性がある。進行食道がんの予後向上のために、私ともは術前化学放射線療法(CRT)を施行してきた。CRTresponderの予後は良好であるが、再発する症例も経験される、当然CRTNon-responderの予後は不良である。その予後因子を検索するために、今回の研究を立案した。本年度は、進行食道がん化学放射線療法後手術症例の切除標本において免疫組織学的染色を行い、その悪性度、予後との相関性を検討した。評価Biomarkerは、COX-2,VEGFおよびCXCR4である。40名の患者さんを対象に免疫組織学的染色を行った。14名の患者さんは、病理学的CRであった。COX-2,VEGF発現は17名、13例の患者さんにそれぞれ認めた。COX-2発現は相関性を示し、COX-2発現は、腫瘍再発、リンパ節転移と相関性を示した。さらに、進行食道がん化学放射線療法後の患者さんでCOX-2発現とVEGF発現を呈する患者の予後は、そうでない患者に比べ有意にDFSが不良であった。結論として、COX-2おびVEGF発現は、進行食道がん化学放射線療法後の患者さん再発および後因子になりうる可能性を示唆した。それゆえに、進行食道がんの治療において、COX-2およびVEGFのAntagonistの投与が有効である可能性が示唆された。進行食道癌の予後はきわめて不良であるが、近年の3領域リンパ節郭清術の進歩、および化学放射線療法によりその予後は向上しつつある。今回の研究では、食道癌術前化学放射線療法(CRT)後の切除標本を用い、各種Biomarkerの免疫組織学的検索を行い検討した。(対象および方法)78名の術前CRTを行った進行食道扁平上皮癌患者の切除標本の免疫組織学的染色を行い、VEGF、COX-2およびサイトカインCXCR3,4の免疫組織学的染色を行い検討した。さらに近年注目されている癌幹細胞Bmi-1、Gli-1の染色も同時に行い予後との関連性を検討した。(結果)1)CXCR3,4発現患者の予後(3年生存率、5年生存率)は、そうでない患者に比べ予後は不良であった(p=0.0017)。2)同様にVEGF、COX-2発現患者の予後もそうでない患者に比べ不良であった。3)癌幹細胞マーカーについて、(1)Gli-1の核内発現患者の予後はきわめて不良でほとんどの症例が1年以内に再発、死亡していた。(2)Bmi-

1発現患者の予後はそうでない患者に比べ不良であった。(意義)現在、癌幹細胞とその周囲環境であるニッチが注目されており、双方が共同で働くことが知られている。今回の研究では、癌幹細胞におけるヘッジホック経路のひとつの因子であるGli-1およびその下流に位置するBmi-1の発現が進行食道癌CRT後患者の予後規定因子のひとつになることが証明され、さらにその周囲環境のニッチ(VEGF,COX-2,サイトカインなど)もこれらの患者さんの予後に関与することは明らかになった。分子標的治療薬の臨床応用が始まっている今日、これらの知見は治療薬剤選択に参考となり、食道癌患者の予後を向上させる可能性があると考えられた。