hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
亜鉛フィンガータンパク質をフレームワークとする人工ペプチダーゼの開発

本研究では、Sp1亜鉛フィンガーの各フィンガードメインに対して、亜鉛イオン配位部位をHis4型に変えた変異体(FxH4、x=1,2,3)を作製し、それらが加水分解能を有していることを見出した。F1H4の場合、他のドメインと比べ高い加水分能を示すことが分かった。また、Sp1のC末端にF2H4を融合させたキメラタンパク質や、FxH4のNおよびC末端にSp1野生型を融合させた7フィンガーの作製に取り組んだ。その結果、いずれのHis型フィンガーも触媒活性を有していることが明らかとなった。これまでに、転写因子に存在するDNA結合ドメインである亜鉛フィンガータンパク質をフレームワークとして用いて、それらを人工的にリデザインすることにより新しい機能を有する人工機能性タンパク質の創製を試みている。本研究では、特に亜鉛イオン配位部位をターゲットとし、その部分をリデザインすることにより触媒機能(特にペプチド結合切断活性)を導入することを目的とする。申請者はSpl亜鉛フィンガーのフィンガー2の亜鉛イオン配位部位であるCys2His2型をHis4型に変えた変異体が高いエステルおよびリン酸エステル切断能を有していることをこれまでに見出している。そこで本年度はフィンガー2以外のフィンガー1および3についても同様にHis4型変異体を作製し、それらのリン酸エステル加水分解能およびDNA切断能に関する検討を行った。その結果、フィンガー1のHis4型を用いた場合、リン酸エステル化合物であるBNPPに対して他のフィンガードメインと比べて非常に高い加水分解活性があることが明らかとなった。また、フィンガー3に関してはHis4型では亜鉛イオンを加えても構造が誘起されないことが分かった。恐らく、亜鉛イオンに配位する2つのシステイン残基の間のアミノ酸数がHis4型変異体の構造形成に重要であることが考えられ、今後検討する予定である。また、Spl野生型亜鉛フィンガーのC末端側にフィンガー2のHis4型を融合させて人工キメラタンパク質を作製し、DNA結合能およびDNAの加水分解について検討を行った。その結果、GC配列と選択的に結合することが分かり、さらにGC配列の近傍を選択的に切断することが明らかとなった。亜鉛フィンガータンパク質は、転写因子に認められるDNA結合ドメインであり、Zn(II)およびDNAへの選択的結合能を有していることが知られている。したがって、亜鉛フィンガータンパク質は人工タンパク質のフレームワークとして用いて有用であると考えられる。本研究では、亜鉛フィンガーの金属配位部位をリデザインすることにより触媒機能(特にペプチド結合切断活性)をそれ自体に導入することを目的とする。申請者はSp1亜鉛フィンガーの各フィンガーに対して、亜鉛イオン配位部位をHis4型に変えた変異体(FxH4、x=1,2,3)を作製し、それらのリン酸エステル加水分解能を有していることを既に見出している。さらに、F1H4を用いた場合、リン酸エステル化合物であるBNPPに対して他のフィンガードメインと比べて非常に高い加水分解活性があることが明らかとなった。そこで、今年度はF1H4のDNA切断能について検討を行うために、FxH4のNおよびC末端にSp1野生型を融合させた7個のフィンガーからなるSp1FxH4Sp1(x=1,2)の作製に取り組んだ。その結果、遺伝子工学的手法を用いることにより目的のタンパク質をコードするプラスミドDNAの作製に成功した。また、大腸菌を用いたタンパク質発現実験においてもタンパク質の発現を確認した。今後は、DNAの結合能および切断活性について検討を行う予定である。また、Sp1野生型亜鉛フィンガーのC末端側にフィンガー2のHis4型を融合させて融合タンパク質を作製してペプチド結合切断についても検討を行った。現段階では明確な結果は得られていないが、His4フィンガーの近傍のペプチド結合が切断されることが分かっており、今後さらに詳細に検討を行っていく予定である。本研究では、亜鉛フィンガーの金属イオン配位部位をリデザインすることにより触媒機能をそれ自体に導入することを目的とする。申請者はSp1亜鉛フィンガーの各フィンガードメインに対して、亜鉛イオン配位部位をHis4型に変えた変異体(FxH4、x=1,2,3)を作製し、それらのリン酸エステル加水分解能を有していることを見出した。さらに、FIH4を用いた場合、リン酸エステル化合物であるBNPPに対して他のフィンガードメインと比べて非常に高い加水分能を示すことが分かった。そこで、今年度はFIH4のDNA切断能について検討を行うために、FxH4のNおよびC末端にSp1野生型を融合させた7個のフィンガーからなるSp1FxH4Sp1(x=1,2)の作製に取り組んだ。

今後は、DNAの結合能および切断活性について検討を行う予定である。また、Sp1野生型亜鉛フィンガーのC末端側にフィンガー2のHis4型を融合させて融合タンパク質を作製し、そのペプチド結合切断について検討を行った。その結果、His4フィンガー近傍のペプチド配列が選択的に切断されることが明らかとなり、His4がペプチダーゼ活性を有していることが分かった。
非接触音響探査を用いたコンクリートの強度評価に関する研究

高度経済成長期に建設されたインフラの老朽化が近年社会問題となり,そのメンテナンスとマネージメントが重要視されている。特にコンクリート構造物の維持管理のため,欠陥検査だけでなく強度評価も必要とされている。提案している非接触音響探査法は,コンクリート構造物のコンクリート表層内部の欠陥を,遠隔から検出するための非破壊検査法として研究されている。コンクリート内部のひび割れ・剥離・空洞などの欠陥を検出するためには,実は,コンクリート健全部の評価が不可欠であることが次第に分かってきた。我々の測定では,遠隔から非接触で,コンクリート面を音響加振し,レーザドップラ振動計による2次元的な振動速度分布を計測する。一般的なコンクリート健全部においてはデータ解析から得られた2つの音響学的特徴量(振動エネルギー比とスペクトルエントロピー)の統計分布が正規分布を示す事実を明らかにしてきた。今までの実験から,某トンネルの天井部と側壁部のコンクリート健全部において,音響学的特徴量の分布に差があり,弾性波速度やシュミットハンマーによる硬さ測定結果と相関していることが判明した。以上までの結果は,国内外の複数の学会で報告され,学術論文にも掲載された。コンクリートはセメント・水・骨材・混和材料などで構成される複合材料で,形成材料の種類・品質・構成割合だけでなく,施工方法・養生方法・材齢などの条件が,コンクリートの強度を左右する。欠陥部に比べて,コンクリート健全部の2つの音響学的特徴量の分布の差は極めて小さいが,統計的に有意に差があるのかどうかを,硬さの異なるコンクリート供試体を用いて実験し,データ解析を行っている。2018年度(2年度目)は,3種類の異なる硬さ(設計基準強度16,30,45[N/平方ミリメートル])のコンクリート供試体を製作してコンクリート供試体における強度計測実験を行った。コンクリート強度は,水とセメントの水和反応によって時間をかけて発現する。水が供給され続ければ,水和反応は進行し,時間経過とともに強度は増大していく。コンクリート中の水が乾燥などによってなくなれば,水和反応は停止する。そのため、コンクリートは材齢28日を超えると,次第に硬さの変化が少なくなり,定常値に推移していくことが既に判明している。そこで,硬さだけでなく,養生ありと養生なしのグループに分け,作成直後からの材齢(1日,2日,1週間,2週間,28日,...)の硬さの経時変化を,非接触音響探査法による2次元面の振動速度の測定だけでなく,コンクリートコア圧縮強度試験・弾性波速度の測定を併用して計測した。また、それぞれの設計基準強度に達したコンクリートに対して非接触音響探査法により2次元測定も実施した。これらの結果より、経時変化する2次元的なコンクリート健全部の音響学的特徴量の分布情報を得ることができる。現在はデータ量が膨大なために、順次データ処理を行っている状況である。当初は,コンクリートが時間経過とともに硬化して,養生期間後に硬さが安定してから,本測定に入る予定であった。しかしながら,研究関係者からの意見もあり,コンクリート強度供試体の打込み→締固めの後,養生(封かん養生)あり・なしの過程での経時変化も測定することになった。その結果,膨大な測定データを得ることとなったが,データ解析に時間を要し,まだ十分にデータを整理できていない状況である。引き続き,これらのデータ解析を進めるとともに,硬さの異なるコンクリート供試体の実験結果を比較検討して,統計処理に基づいた解析を行う予定である。今後の解析結果より,コンクリートの硬さ(強度)によって2つの音響学的特徴量の2次元分布に統計的に有意な差が見られれば,その結果を,過去に測定した実構造物のコンクリート健全部に対する測定データに適用できるのではないかと考えている。非接触音響探査法では,送信音波の作成条件(周波数帯域,周波数パルスの並び)や表面音圧,音源やレーザドップラ振動計から測定面までの距離といった条件も絡んでくるため,慎重に検討していきたいと考えている。また非接触音響探査法では,レーザドップラ振動計を用いた測定を行うため,コンクリート表面に凸凹がない状態が良い。コンクリートが十分硬化完了してから,シュミットハンマーで表面を傷める前に非接触音響探査法の測定を行った。最後に,シュミットハンマーによる硬さ測定を行う予定である。1年目は,計画通り,今までに蓄積した実験データの中から,コンクリートの硬さを比較可能な事例に対して,データ解析を行った。また,コンクリートの健全部の統計解析を円滑に行うため,統計解析プログラムを使いやすいように改良・整備した。実際の適用例として,実コンクリート構造物であるトンネルの天井付近と側壁付近の健全と見られるコンクリート面に対して我々の非接触音響探査法で計測した事例をデータ解析した。我々の測定で得られる2つの音響学的特徴量(振動エネルギー比とスペクトルエントロピー)の分布から,天井付近のコンクリート健全部の振動エネルギーは,側壁付近のコンクリート健全部に比べて,その値が小さかった。ここで,振動エネルギーがより小さいということは,コンクリートが振動しにくいことを意味し,言い換えれば,より硬いといえる。つまり,天井付近のコンクリート健全部は,側壁付近のコンクリート健全部より硬い。このことを検証するため,天井と側壁の各健全部に対して,シュミット・ハンマーを用いてコンクリートの圧縮強度を測定し,さらに弾性波速度も測定した。その結果,天井付近のコンクリート健全部の方が,側壁のコンクリート健全部より,シュミット・ハンマーによる反発度が大きく,硬いことが分かった。

さらに,弾性波速度の結果では,天井部の方が側壁よりその値が大きく計測された。この結果を踏まえ,作成時期が異なるコンクリートの健全部に対して,測定で得られる音響学的特徴量の分布がどのように変化するか,さらに検討していくところである。また,2年目で作製する予定の硬さの異なるコンクリート供試体について,これらの基礎データを参考にして,検討していく。当初の予定通り進んでいる。今までの実験データから,コンクリート健全部の統計評価を行い,基礎データを積み重ねている。また,測定データの解析では,統計解析プログラムの整備を行い,使いやすいプログラムに改良した。実コンクリート構造物の事例に対しては,トンネルの天井と側壁のコンクリート健全部について,硬さの観点から良い解析結果が得られた。高度経済成長期に建設されたインフラの老朽化が近年社会問題となり,そのメンテナンスとマネージメントが重要視されている。特にコンクリート構造物の維持管理のため,欠陥検査だけでなく強度評価も必要とされている。提案している非接触音響探査法は,コンクリート構造物のコンクリート表層内部の欠陥を,遠隔から検出するための非破壊検査法として研究されている。コンクリート内部のひび割れ・剥離・空洞などの欠陥を検出するためには,実は,コンクリート健全部の評価が不可欠であることが次第に分かってきた。我々の測定では,遠隔から非接触で,コンクリート面を音響加振し,レーザドップラ振動計による2次元的な振動速度分布を計測する。一般的なコンクリート健全部においてはデータ解析から得られた2つの音響学的特徴量(振動エネルギー比とスペクトルエントロピー)の統計分布が正規分布を示す事実を明らかにしてきた。今までの実験から,某トンネルの天井部と側壁部のコンクリート健全部において,音響学的特徴量の分布に差があり,弾性波速度やシュミットハンマーによる硬さ測定結果と相関していることが判明した。以上までの結果は,国内外の複数の学会で報告され,学術論文にも掲載された。コンクリートはセメント・水・骨材・混和材料などで構成される複合材料で,形成材料の種類・品質・構成割合だけでなく,施工方法・養生方法・材齢などの条件が,コンクリートの強度を左右する。欠陥部に比べて,コンクリート健全部の2つの音響学的特徴量の分布の差は極めて小さいが,統計的に有意に差があるのかどうかを,硬さの異なるコンクリート供試体を用いて実験し,データ解析を行っている。2018年度(2年度目)は,3種類の異なる硬さ(設計基準強度16,30,45[N/平方ミリメートル])のコンクリート供試体を製作してコンクリート供試体における強度計測実験を行った。コンクリート強度は,水とセメントの水和反応によって時間をかけて発現する。水が供給され続ければ,水和反応は進行し,時間経過とともに強度は増大していく。コンクリート中の水が乾燥などによってなくなれば,水和反応は停止する。そのため、コンクリートは材齢28日を超えると,次第に硬さの変化が少なくなり,定常値に推移していくことが既に判明している。
糖尿病マウスにおける網膜細小血管症の初期変化

自然発症糖尿病動物のKK-Ayマウスと、対照としてC57BLマウスを用いて、糖尿病により周皮細胞が変性消失する以前の網膜微小血管(細動脈細静脈)の形態変化を調べた。1)光顕:血管にその活性が高いアルカリフォスファターゼをアゾ色素法を用いて染色した。これにより網膜血管の三次元構造を明らかにするとともに、血管のアルカリフォスファターゼ反応の状態を検索した。結果として、糖尿病の早期より網膜血管は強い蛇行を起こし、アルカリフォスファターゼ反応の増加により血管透過性の亢進も生じていることが判明した。2)透過電顕:生後440週令のマウスを用い、網膜血管の変化を調べた。(現在までの報告例は生後早期については検討されていなかった。)今回用いた糖尿病マウスでは生後16週令になると網膜表層にある前毛細血管の周皮細胞が著明に肥大していた。この肥大は、細動脈の分岐部にある前毛細血管括約部から始まっていた。また、網膜深層の毛細血管の閉塞を認めた。これまで糖尿病網膜症の初期変化として、網膜血管の周皮細胞が選択的に変性消失すると言われてきた。本実験の結果は、より早期の糖尿病状態の網膜血管においては、前毛細血管括約部前毛細血管の周皮細胞は血流動態の変化と関連して肥大して収縮能が増加しており、これが深層の毛細血管の閉塞にも影響を与えていることを示唆した。この血流動態の異常が更に進行すると、周皮細胞の変性消失が生じてくると思われる。
TDM(交通需要マネジメント)政策を導入したまちづくりの手法研究

21世紀の交通のあり方が今大きく問われている。20世紀は「自動車と航空機の時代」といわれるが、自動車社会の行き詰まりが20世紀末に大きく問われ出したのである。自動車交通の3悪(交通事故、自動車交通公害、道路渋滞)は解決するどころか激化し、その他の諸矛盾も深まってきている。都市がマイカーと共存することはむずかしく、どの都市も増大する自動車需要に必死で追随していったが、しかし自動車交通の3悪を止めることができなかった。そうしたことから世界の都市交通政策は大転換をし、自動車交通量を抑制して交通全体を合理的にマネジメントする方向に変わった。これが現在の世界の都市交通政策の流れとなっている「交通需要マネジメント」(Transportation DemandManagement : TDM)政策といわれるものである。TDMとは自動車の走行という交通需要そのものにメスを入れ、自動車の効率的な利用促進や公共交通への転換など交通行動の変換により、道路渋滞や環境負荷の軽減を図る体系といえる。本研究では、自動車先進国アメリカをはじめヨーロッパの諸都市、アジア諸都市で採用されているTDM実施状況を各種文献調査や現地調査で明らかにした。日本ではいまなお交通需要追随の道路建設・拡張政策が色濃いとはいえ、TDM政策の採用が試行錯誤で進められてきている。各地での交通社会実験を紹介し、日本のTDMの導入方向を評価した。そこでの取り組みの経緯、問題点や課題等を明らかにし、海外調査との比較作業をおこなった。現在、世界の先進都市の都市交通政策は大転換をし、自動車交通量を抑制して交通全体を合理的にコントロールする方向に向かっているが、日本の各都市でも順次採用されつつある。今年度の調査で、日本の市町村で交通需要マネジメント(TDM)政策として採用されたり、社会実験がされたり、あるいは検討されるべきとあげられた施策としては、次のものが主であった。(1)トリップ(trip)そのものを減らす施策ー例)自宅勤務/サテライト勤務/SOHO(2)トリップ(trip)の時間分布を変えるー例)時差出勤/混雑料金の徴収=ロード・プライシング(3)自動車からの転移ー例)公共交通手段のサービス向上等により/歩行者道路や自転車専用道路整備により(4)混雑料金の徴収(混雑時・混雑箇所の道路利用の料金賦課=ロード・プライシング)によりマイカーの抑制(5)自動車の流入規制ー例)パーク・アンド・ライド(P&R)/トランジット・モール/歩行者優先の道路づくり(ボンエルフ等)/トラフィック・カーミング今年度は各種文献調査以外に、TDMに意欲的に取り組んでいる、あるいは、今から取り組もうとしている市町村をいくつかえらんで、現地実態調査を行なった。そこでの取り組みの経緯、問題点や課題等を明らかにし、教訓化の作業をおこなった。来年度は、中心市街地の活性化で、交通をどうしようとしているのかを、TDM政策との関連で調査していきたい。海外の諸都市交通の調査も日本のTDMの導入方向を評価する上で必要となろう。日本ではパーク・アンド・ライド(P&R)とコミュニティ・バスないし100円バスの運行が中心であった。しかし石原東京都知事が東京都での都心乗り入れ有料制度化の方針を打ち出したことで、ロード・プライシング(R.P.)に一挙に注目が集まりだした。日本の市町村で交通需要マネジメント(TDM)政策として採用されたり、社会実験がされたり、あるいは検討されるべきとあげられた施策としては、次のものが主であげられる。(1)トリップ(trip)そのものを減らす施策--例)自宅勤務/サテライト勤務/SOHO(2)トリップ(trip)の時間分布を変える--例)時差出勤/混雑料金の徴収=ロード・プライシング(3)自動車からの転移--例)公共交通手段のサービス向上等により/歩行者道路や自転車専用道路整備により(4)混雑料金の徴収(混雑時・混雑箇所の道路利用の料金賦課=ロード・プライシング)によりマイカーの抑制(5)自動車の流入規制--例)

パーク・アンド・ライド(P&R)/トランジット・モール/歩行者優先の道路づくり(ボンエルフ等)/トラフィック・カーミング今年度は昨年度に引き続き各種文献調査を行い、上記(3)(4)(5)の施策に意欲的に取り組んでいる、あるいは、取り組もうとしている市町村をえらんで、現地実態調査を行なった。そこでの取り組みの経緯、問題点や課題等を明らかにし、教訓化の作業をおこなった。中心市街地の活性化で、交通をどうしようとしているのかを、TDM政策との関連で重点的に調査した。
生体深部の三次元多色イメージングを実現する三光子励起発光型希土類金属錯体の開発

本研究は、金属錯体をベースとしたプローブを用いて生体深部での三次元多色イメージングを実現することを目指した。希土類金属錯体をデザインする上で、最適な配位子を明らかにし、実際に生体透過性の高い、1030nmで発振するフェムト秒ファイバーレーザーでの多光子イメージングに成功した。また、研究期間内において、金属錯体プローブのさらなる機能化にも取り組み、金属錯体プローブを用いた生体中の酸素マッピングを実現した本研究では、生体深部の三次元多色イメージングを低侵襲で実現するために、発光帯が狭い(バンド幅&#12316;30 nm)希土類金属錯体により多光子励起用発光プローブを開発する。具体的には、1050 nmの光源で三光子励起が可能なEu(発光極大波長= 600 nm)、Sm(650 nm)、二光子励起が可能なYb(970 nm)の3種の希土類金属錯体を開発する。開発した希土類金属錯体に、生体内の特定の場所に局在する機能を付与し、実際に三次元多色イメージングを行う。現在までのところ、近年開発されている1050 nm付近で発振するフェムト秒ファイバーレーザーで励起可能な三光子吸収特性を有する希土類金属錯体を明らかにすることが出来た。中心金属として用いる希土類としては、ユーロピウム、サマリウムを用いた化合物の開発に成功している。これらの中心金属を持ち、配位子としてnaphtoyltrifluoroacetonate)を有する錯体が、浜松ホトニクス社製のフェムト秒ファイバーレーザーで励起可能で、生物細胞を染色でき、三光子励起顕微鏡画像を取得できることを実証することが出来た。その結果は、日本化学会の速報誌Chemistry of Lettersに投稿し、掲載が決定している。また、国際学会において1件、国内学会において1件報告している。関連する技術として、二光子蛍光プローブ材料の開発にもあわせて取り組んでおり、そちらの結果も、いくつかの論文および学会での報告を行なっている。現在までのところ、平成27年度に終わらせる課題は、全てクリアーして、その結果を論文として報告することも出来ている。論文としての投稿にまでは至っていないが、既にtris(naphtoyltrifluoroacetonate)を有するサマリウム錯体の合成にも成功しており、当初計画よりも順調に研究を進めることが出来ている。平成28年度は、酸素センシング能を有する金属錯体を用いた多光子イメージングに取り組んだ。金属錯体としては、生体透過性の高い赤色で高効率に発光するイリジウム錯体を用いた。まず、イリジウム錯体の多光子吸収スペクトルを測した。その結果、750 1100 nm帯の波長域で、効率的に多光子吸収が生じることが明らかになった。この測定により、多光子励起に適したレーザー光源のスペックを明らかにでき、次世代の多光子顕微鏡の光源として期待されている1030 nmで発振するフェムト秒ファイバーレーザーで多光子励起可能、すなわち多光子顕微鏡観察が可能であることがわかった。次に、市販されている1030 nmの波長で発振するフェムト秒ファイバーレーザーを組み込んだ多光子顕微鏡を自作した。通常の顕微鏡は、可視光を励起光として用いることが想定されているため、近赤外光を励起光源として用いると光源のロスが非常に大きくなった。顕微鏡で用いられているパーツを近赤外光に対する透過率、反射率が高い光学素子とすることで、大きなロスなく対物レンズまでレーザー光を届けられることを明らかに出来た。このように、1030 nmを光源として用いることに特化した顕微鏡を組み上げた。この顕微鏡を用いて、開発した金属錯体で染色したヒト由来の細胞の多光子励起顕微鏡観察を行った。その結果、明瞭な顕微鏡像を取得することができた。この結果は、Japanease Journal of Applied Physics誌に、学術論文として報告した。これまでの研究で、フェムト秒ファイバーレーザーで多光子励起することが可能なプローブ材料を、10種程度見出しており、1000 nm帯での励起過程に必要な化合物の設計、開発に関する知見は、十分な蓄積が出来ている。さらに、本研究の過程で、新たな機能性発光プローブ材料の創出にも成功しており、研究は計画通り順調に進展している。本研究では、多光子顕微鏡用の生体プローブ材料に関する研究を行なってきた。本年度は、特に錯体の配位子の機能性部位としての有機分子発色団の開発を行なった。中でも、通常多光子顕微鏡の光源に用いられるチタンサファイアレーザーと比較して、温度変化に対して非常に安定に発振し続けるフェムト秒ファイバーレーザー励起に適した発色団の探索において、大きな進展があった。一つは、ファイバーレーザーの励起波長の1030 nmで効率よく励起できるスチリル系色素を見出すことに成功したことである。500 nm付近に吸収帯を有する化合物は、1030 nmで多光子励起を生じることが期待できる。そこで、そのような一光子吸収帯を示すスチリル化合物を4種類用いて、一光子及び多光子の分光学的性質を精査した。この調査を通して、フェムト秒ファイバーレーザーで最も効率よく多光子励起発光を生じる発色団を見出した。単純に最も多光子吸収効率に優れる化合物でなく、蛍光量子収率、励起波長とのマッチングが優れているスチリル化合物が実用上最も優れていることを見出すことができた。

研究期間内での論文としての報告は間に合わなかったが、5月中にはいずれかのジャーナルに投稿する予定である。もう一つは、ミトコンドリア膜電位に応答して局在箇所を変化する多光子吸収発色団に関する研究である。発色団のπ電子系を拡張、あるいは縮小することで、青色から赤色まで、様々な発光色を示すミトコンドリア膜電位応答性の化合物を5種類得ることに成功した。これらの化合物は、いずれも1030 nmのファイバーレーザーで励起可能であることも明らかにできた。この成果は、一件特許として出願した。また、論文としても既に投稿しているが、研究期間内の掲載には至っていない。本研究は、金属錯体をベースとしたプローブを用いて生体深部での三次元多色イメージングを実現することを目指した。希土類金属錯体をデザインする上で、最適な配位子を明らかにし、実際に生体透過性の高い、1030nmで発振するフェムト秒ファイバーレーザーでの多光子イメージングに成功した。また、研究期間内において、金属錯体プローブのさらなる機能化にも取り組み、金属錯体プローブを用いた生体中の酸素マッピングを実現した当初の計画通り順調に研究を推進することが出来ているため、今後も計画通り研究を進めていく予定である。今後は、細胞内の特定の部位をターゲッティングするための技術開発に取り組む。合成化学的な手法により、特定のタンパク質認識する部位を1000 nm帯で多光子励起を効率よく生じる配位子を取り付ける。これにより、異なる中心金属を有する希土類金属錯体を複数個細胞内に導入し、多光子、多色顕微鏡観察を行えるようにする。機能物質化学初年度で購入予定であった、光電子増倍管を他の予算で準備できたため。初年度の研究経費を抑えることが出来た。他の経費を用いて、いくつかの光学パーツを購入したため、その差額が生じた。抑える事ができた予算を用いて、国内学会、国際学会での報告の為の旅費、および錯体の合成に必要な、高額な試薬の購入にあてる予定である。平成29年度は、有機合成が必要なため、試薬の購入にあてる予定である。
粘膜免疫系における記憶B細胞の選択機構

粘膜附属リンパ組織では、IgA抗体が多量に産生され、病原体の感染防御に重要な役割りを果たす。粘膜免疫系でのIgA優位の産生は、粘膜免疫組織環境下でIgMからIgAへの優位な変換が誘導される事が原因となることが推察されている。我々は粘膜免疫系におけるB細胞の反応を明らかにする目的で、NP-CGとコレラトキシンをネズミ鼻腔両側に投与し、投与後、鼻咽頭免疫組織(Nasal-associated lymphoid tissue : NALT)で活性化される胚中心B細胞と記憶B細胞の性状を解析するとともに、精製純化した細胞が発現するH鎖Ig遺伝子の構造と蓄積する体細胞変異のパターンを解析した。この結果、免疫後NALTでは、IgGとIgAの陽性胚中心B細胞が認められるが、IgG胚中心B細胞がIgA陽性胚中心B細胞と比較し優位となることを明らかにした。また増殖の過程で、両細胞集団のH鎖Ig遺伝子に高親和性を促す体細胞変異が蓄積され、高親和性B細胞が選択されることを明らかにした。しかし、NALT附属リンパ節である後頸部リンパ節(PCLN)に免疫後出現する記憶B細胞集団では高親和性IgA細胞が優位であり、高親和性IgG陽性細胞はほとんどみとめられなかった。同様に、NALT一次刺激後の二次刺激において産生される高親和性抗体において、IgAサブクラスが優位であることが示唆された。これらの結果は、NALTにおいて一旦選択されたIgGとIgAの陽性胚中心B細胞から、IgA陽性の高親和性記憶B細胞を優位に選択する機構があることを示唆した。これまでに不明であった粘膜免疫組織一次免疫反応における記憶B細胞の産生と動態を解析する目的で、C57BL/6マウス鼻腔粘膜免疫組織(nosal-associated lymphocytic tissue,NALT)を微量のコレラトキシンとハプテンNP-CGで一次刺激し、産生される胚中心及び記憶B細胞の動態を免疫学的方法を用いて解析した。この結果、免疫後7-9日をピークとしてIgA,IgG,IgM陽性胚中心B細胞が増殖するが、抗体産生前駆細胞の産生は少ないことが示唆された。免疫後7-11日にかけての胚中心B細胞をFACSを用いて精製・純化し、NP特異的IgA,IgG発現遺伝子の塩基配列をPCRにより決定した。その結果、胚中心反応初期にIgA陽性B細胞でIg遺伝子に体細胞変異が導入され、約2割のクローンで高親和性の獲得に関与する塩基置換が認められた。一方、NALTIgG主要細胞であるIgG2b B細胞のIgにおいても体細胞変異が導入されるが、高親和性獲得に関与する変異の導入時期はIgA B細胞がIgG B細胞と比較し早期に導入されることが明らかとなった。粘膜を介した刺激で産生された記憶B細胞は粘膜局所に留まるとともに粘膜以外のリンパ組織(脾臓)へ移動し長期に維持され、同一抗原2次免疫により高親和性を有するIgA抗体産生細胞へと成熟することが示唆された。IgG記憶B細胞も抗体産生細胞へと成熟するが、抗体の親和性はIgAと比較して低値である。これらの結果は、粘膜免疫反応において、IgA B細胞がIgG B細胞と比較してより優位に高親和性を有する記憶B細胞として選択される可能性を明らかにした。粘膜附属リンパ組織では、IgA抗体が多量に産生され、感染防御の中枢をなす。これまでにIgA優位は、粘膜免疫組織環境下での免疫グロブリン(Ig)クラス変換においてIgMからIgAへの優位な変換が原因であると推察されていた。

我々はこの機構を明らかにする目的で、NP-CGとコレラトキシンをネズミ鼻腔両側に投与し、投与後、鼻咽頭免疫組織(Nasal-associated lymphoid tissue:NALT)で活性化される胚中心B細胞と記憶B細胞を精製純化して、各細胞が発現するIg遺伝子クロノタイプ及び蓄積する体細胞変異の数とパターンを解析した。この結果予想に反し、免疫後NALTでは、IgMからIgG,IgAのクラス変換が効率よく導入され、IgG,IgA陽性胚中心B細胞が増殖し、その数はIgG胚中心B細胞が優位となることが明らかにされた。また増殖の過程で、両細胞集団において同等に高親和性B細胞の選択が誘導されることが明らかとなった。しかし、驚いたことに、NALT附属リンパ節である後頸部リンパ節(PCLN)に免疫後出現する記憶B細胞集団では高親和性IgA細胞が優位であり、高親和性IgG陽性細胞はほとんど認められなかった。同様に、NALT一次刺激後の2次刺激において産生される高親和性抗体において、IgAサブクラスが優位であることが示唆された。以上の結果は、NALTにおいてIgAアイソタイプに依存した高親和性記憶B細胞の選択に関わる調節機構が備わっていることが示唆された。
川崎病におけるＩＬ－１ＲＡ関連因子および遺伝子多型の検討と、治療薬としての可能性

川崎病患者の血液からDNAを抽出し、PCRにて第2染色体上に存在するIL-1RA遺伝子の第2イントロン領域を増幅し、反復配列遺伝子多型分析(VNTR)について、IL-1RA濃度、治療の有効性との関連を検討している。福島県立医科大学および福島県内の関連施設小児科において入院加療を行った新規川崎病症例のうち、ご家族からの同意が得られた症例について、全血および免疫グロブリン(IVIG)療法前後の血清を凍結保存し、収集しているところである。今後、IL-1RA, IL-1α、IL-1β、およびIL-1RA産生に関与するIL-4、IL-10、TGFβ、GM-CSFを測定する。また我々のこれまでの検討で重症度と関連があると考えられたHGF、IL-6、IP10、および、これ以外に文献的に重症度との関連が指摘されているIL-8、TNF-αを合わせて測定する。これらのサイトカイン測定は、蛍光マイクロビーズシステムによるマルチプレックス免疫アッセイで同時測定し、IVIG前後の変動と、臨床症状、IVIG有効性、合併症との関連を検討する。すでに解析済みの結果も加えて解析し、川崎病の発症病態、心血管系病変形成等に強く関与する因子を絞込み、特にIL-1RAがIVIG有用性と関連するかどうかについて検討する。また、sIL-1RI、sIL-1RII、IL-1α中和抗体を測定し、IL-1RA、IL-1α、IL-1β動態との関連を検討し、IL-1RAが川崎病の治癒に関わる機序を検討する。福島県立医科大学および福島県内の関連施設小児科において入院加療を行った新規川崎病症例のうち、ご家族から同意が得られた症例について、全血および免疫グロブリン(IVIG)療法前後の血清を収集している。全血からDNAを抽出し、PCRにて第2染色体上に存在するIL-1RA遺伝子の第2イントロン領域を増幅し、遺伝子多型の一つであるvariable number of identicaltandem repeats(VNTR)について、IVIG療法前後のIL-1RA濃度、および治療の有効性との関連を検討している。また、IL-1RA、IL-1α、IL-1β、およびIL-1RA産生に関与する、IL-4、IL-10、TGFβ、GMCSF、我々のこれまでの検討で重症度と関連があると考えられたHGF、IL-6、IP10、および、これ以外に文献的に重症度との関連が指摘されているIL-8、TNF-αを合わせて測定している。これらのサイトカイン測定は、蛍光マイクロビーズシステムによるマルチプレックス免疫アッセイで同時測定しており、IVIG前後の変動と、臨床症状、IVIG有効性、合併症との関連を検討している。すでに解析済みの結果も加えて解析し、川崎病の発症病態、心血管病変形成等に強く関与する因子を絞り込み、特にIL-1RAがIVIG有効性と関連するかどうかについて検討中である。また、sIL-1RI、sIL-1RII、IL-1α中和抗体を測定し、IL-1RA、IL-1α、IL-1β動態との関連を検討し、IL-1RAが川崎病の治癒に係わる機序を検討している。目標症例数に達しつつあるが、IVIG無効例が少なく、IVIG有効群と無効群の比較検討にはまだ不十分であり、研究を継続する。研究を開始するにあたり、福島県立医科大学および福島県内の関連施設の倫理委員会の承認を受けるのに時間を要した。そのため、研究開始が遅れている。小児循環器学今年度も川崎病患者は例年通り発生しており、目標症例数に達成することが可能と考えられる。ただし、IVIG有効群と無効群の比較検討に際し、無効群の発生率は1020%と予想され、無効群が少ない場合には、症例数を増やす必要がある。研究開始が遅れたため、支出額が所要額に達しなかった。次年度は研究が進み、支出額が、翌年度分として請求した助成金および次年度使用額と同額となるように計画している。
企業不祥事・企業危機の早期回避システムの整備

1本研究の目的会社法は、監査役・取締役会が自ら情報集め、自ら監査・監督すると定めるが、本研究は、企業不祥事を早期に解消するためには、企業組織内でコンプライアンスに関する情報が早い段階から集まる仕組みを作ることと、企業組織内のあらゆる圧力(支配株主・経営者)にも屈せず、集めた情報を活用できる中立機関を作ることが不可欠であると提唱している。この構想を実現するためには、二つの課題がある。第一は、そうしたシステムの理論的根拠を明らかにすることであり、第二は、このシステムを利用しやすいインフラを整備することである。2第一の課題の解決このシステム、とくに中立機関の理論的根拠を示すためには、新たな企業理論が必要である。これまで株式会社制度を分析することで、新たな企業理論のための基礎的理論を展開してきたが、必ずしも十分ではなかった。今回、本研究によって、株式会社制度における会社支配の仕組みが、効率性の最大の制度的仕組みであることを明らかにすることができた。その結果、新たな企業理論を、効率性とその規律づけという簡明な対極構造で構成することが可能になった。3第二の課題に解決このシステムのインフラとして、具体的に、中立弁護士制度を整備することが肝要である。中立弁護士、従業員、監査役・取締役会の連携によって、このシステムは機能することになる。以下の二つの事情によって、このシステムの実現可能性は高まったと考える。一つは、別の共同研究が、本研究の提唱する新システムこそ、コンプライアンス・プログラムのベストプラクティス・モデルとなりうるものと認めたことである。他は、福岡市の第三セクターである博多港開発株式会社が、このシステムの導入を決定したことである。企業不祥事を徹底排除する仕組みを採用すれば、市民と信頼関係を再構築できると考えたのである。1企業におけるコーポレート・ガバナンスの取組み状況の調査・帝人、オムロン、花王における先進的な取組みに関するヒアリング・その他の企業・わが国の企業におけるガバナンスの取り組みは二極分化が進みつつあることを実感。すなわち、法よりはるかに高度の質のガバナンスを真剣に模索する企業と法の要求する程度で足りるとする企業に、はっきり分かれつつある。2コンプライアンス・システムの運用状況の調査・みずほインベスターズ証券における先進的取組みの実態調査・運用における弁護士の役割の調査3企業不祥事を起こした企業における背景調査(薬品会杜・総合商社)4わが国における企業の不正行動の類型化の作業・株主代表訴訟に関する判例資料を分析し、わが国における企業の不正行動がどのような事実関係のなかで生じているかを分析本研究は、企業不祥事・企業危機の早期回避システムを整備することを目的としている。13年度は、企業不祥事の事例研究を行った。サンプルとして選んだ公開大規模会社からヒアリングを行った。また、株主代表訴訟事件の判例に現れた企業不祥事の事実関係を整理し類型化を試みた。14年度は、引き続き、株主代表訴訟事件の判例の事実関係について、類型化を図りつつ、わが国で、企業不祥事が具体的にどのようにして行われているかを分析しつつある。当初の14年度計画では、中立監査役制度の具体化を行う予定であった。しかし、東京で開催されたガバナンス研究会の全体研究会、個別研究会を通じて、従業員を巻き込んだ形で展開していくためには、大義名分となる明確な理論の確立が必要であり、その解決なくして、新たな制度を導入することは、困難であると指摘された。そこで、当初の予定とは異なるが、森理論のより明確な深化に重点をおいて計画の軌道修正を行った。こうした計画の軌道修正は、申請時に予測されていなかった商法改正および社会的関心の変化という新たな状況に因るところも大きい。そこで、主として、以下の諸点について、具体的な検討を行った。

その第一は、平成14年商法改正により、委員会等設置会社が導入された場合には、監査役制度が強制廃止されることに伴い、中立監査役構想では不十分となった。中立監査役でなく、委員会等設置会社では、企業内中立機関として構想されるべきとされた。第二に、内部統制の制度化を受けて、内部統制組織と社内中立機関の関係について、具体的な検討を行った。第三に、食品会社の不祥事に関連して、社会的に内部告発の仕組みの整備を求める動きが高まってきた。本研究の目的とする企業不祥事早期回避システムが、この内部告発の制度化とどのように関係するのか、について具体的な議論を行った。第四に、社内中立機関を利用した従業員保護は、健全性確保の観点からだけでなく、効率性確保の上でも重要であることを明らかにし、より幅広い補完的システムとして、整備していくべきとされた。1平成15年度の研究計画に沿って,まず第一に,労働組合のコーポレート・ガバナンスに関する意識調査を行った。(1)どの労働組合にヒアリング調査を行うか,事前打診の段階で,労働組合はコーポレート・ガバナンスに関して関心は有するものの,具体的な取り組みをしているところがほとんどなく,調査対象を限定せざるをえなかった。(2)企業の社会的責任に関する社内体制づくりについてアンケート調査を行い,労働・雇用に関する企業行動規範について取組みを進めている全日本金属産業労働組合からヒアリングを行った。(3)もっとも着実に取組みを進め,また本研究と同じ方向性でガバナンス活動を捉えていたのは,ゼンセン同盟であった。(4)東京電力が,企業内部のコーポレート・ガバナンス体制において,従業員の観点からかなり踏み込んだ仕組みを採用しており,その実情についてヒアリング調査した。2企業のコンプライアンス・プログラムに大きな影響を及ぼす公益通報者保護法案の骨子が明らかになるなど,内部告発をめぐる状況が変わってきた。そこで,(1)とくに会社外部に従業員の情報提供の受け皿を作ろうとしている企業(東京ガス,東京電力,内田洋行,富士ゼロックス)に対応策についてヒアリング調査を行った。(2)また,内部告発を行ったことで不利益を受けた労働者の救済活動を行っている労働弁護団からヒアリング調査を行った。以上の調査を通じて,本研究がスタートした当時に比べて,企業不祥事を摘発・抑止するための企業側の取組み,法制度の整備が,大きく前進している状況を確認できた。1研究目的の到達度本研究の目的は、企業不祥事・企業危機を早期に回避するには従業員の協力が不可欠であり、そうした従業員が協力しやすい仕組みをどのように整備していくかを調査・分析・提言するところにあった。4年間の研究期間のなかで、本研究テーマをめぐる状況は以下のように大きく変化した。第一に、ガバナンス意識の高まりである。第二に、多くの企業でコンプライアンス・プログラムが導入されるようになったことである。第三に、労働組合でもガバナンス・コンプライアンスに関する取り組みを始め、かつ積極的に実践する先進的な労働組合が登場したことである。
骨格と爪からなる支持構造を利用した柔軟ロボット指先の触感覚機能の実現

骨格と爪からなる支持構造を持つ柔軟ロボット指先における触感覚機能の実現のための研究開発を行った.ヒト指先内に存在する感覚受容器は,刺激がある間は継続して発火し続けるSA型と,刺激が生じた最初の瞬間のみ発火するFA型の2種類があることから,この特性をロボット指先で再現するため,それぞれに対応するセンサ素子として歪みゲージとPVDFゲージを採用した.柔軟ロボット指先にこれらの素子を埋め込むとき,素子の数が多ければそれだけ多くの接触情報が得られる.しかし,必要以上に多数の素子を埋め込むことは手作業の妨げとなるし,コストの面からも望ましくない.そこで,これらの触覚素子を柔軟ロボット指先内部に埋め込む際の分布密度に関する調査実験を行った.実験では,物体把握を作業モデルとして,物体の把握を行う際の把握の型の認識を行うのに必要な触覚素子の分布密度を求めた.具体的には,触覚センサ素子を手掌部全体に多数配置してモデルとした把握を行った際の各素子の出力を取得し,この出力に基づいて把握の型を認識するために最低限必要となる触覚センサ素子の数と配置を,ID3による決定木を作成して導出した.この結果,指部は手掌部の数倍程度の配置密度が必要となることと,指部の中でも指先先端部にはより密に配置する必要があることがわかった.また,この実験で得られた配置密度をヒト手の感覚受容器の分布密度と比較したところ,ほぼ同様の配置密度となっていることがわかった.これにより,得られた触覚素子配置密度の正当性を確認することができた.昨年度の研究成果と合わせて,骨格と爪からなる支持構造を持つ柔軟ロボット指先における触覚素子の種類,柔軟被覆の硬度,素子の分布密度などに関する設計指針を得ると共に,基本的な触感覚機能として物体材質の判別を行えることを明らかにした.骨格と爪からなる支持構造を持つ柔軟ロボット指先における触感覚機能の実現のための基礎実験を行った.まず,指先内部に配置するセンサ素子の選定を行った.ヒト指先内に存在する感覚受容器は,刺激がある問は継続して発火し続けるものと,刺激が生じた最初の瞬間のみ発火するものの2通りがあることから,この特性をロボット指先で再現するため,それぞれに対応するセンサ素子として歪みゲージとPVDFゲージを採用し,その基本動作を確認するための基礎実験を行った,まず,指先骨格部と爪部に貼り付けられたセンサ素子を用いて,柔軟指先の表面で加えられた押し込み応力による刺激をひずみ量として計測できるかを,センサ素子の貼付位置および,刺激を与える指先表面位置のそれぞれを変化させながら調査した.その結果,刺激を与えた位置からの距離に加えて,爪部に装着したセンサ素子の方が骨格部に装着した場合より感度よく刺激を計測できることがあるなど,骨格部と爪のどちらに装着されているかで計測状況に違いが出ることがわかった,次に,柔軟被覆の柔らかさを変化させて触覚センシングにおける影響を調査した.形状は同じであるが柔軟被覆の硬度が異なる柔軟ロボットを用いて比較実験を行った.柔軟指をアルミの板,ベークライト,発泡スチロール,木材,それぞれの物体表面で滑らせた際の柔軟被覆の振動をセンサ素子で計測し,得られた歪みの周波数特性から物体表面材質を識別した,柔らかい被覆では振動を計測できず物体材質の識別ができなかったが,より硬い被覆を用いることで振動を計測し,物体材質を識別できた.これにより,柔軟被覆の硬度が,触覚センシングの精度に影響を与えることを確認した.骨格と爪からなる支持構造を持つ柔軟ロボット指先における触感覚機能の実現のための研究開発を行った.ヒト指先内に存在する感覚受容器は,刺激がある間は継続して発火し続けるSA型と,刺激が生じた最初の瞬間のみ発火するFA型の2種類があることから,この特性をロボット指先で再現するため,それぞれに対応するセンサ素子として歪みゲージとPVDFゲージを採用した.柔軟ロボット指先にこれらの素子を埋め込むとき,素子の数が多ければそれだけ多くの接触情報が得られる.しかし,必要以上に多数の素子を埋め込むことは手作業の妨げとなるし,コストの面からも望ましくない.そこで,これらの触覚素子を柔軟ロボット指先内部に埋め込む際の分布密度に関する調査実験を行った.実験では,物体把握を作業モデルとして,物体の把握を行う際の把握の型の認識を行うのに必要な触覚素子の分布密度を求めた.具体的には,触覚センサ素子を手掌部全体に多数配置してモデルとした把握を行った際の各素子の出力を取得し,この出力に基づいて把握の型を認識するために最低限必要となる触覚センサ素子の数と配置を,ID3による決定木を作成して導出した.この結果,指部は手掌部の数倍程度の配置密度が必要となることと,指部の中でも指先先端部にはより密に配置する必要があることがわかった.また,この実験で得られた配置密度をヒト手の感覚受容器の分布密度と比較したところ,ほぼ同様の配置密度となっていることがわかった.これにより,得られた触覚素子配置密度の正当性を確認することができた.昨年度の研究成果と合わせて,骨格と爪からなる支持構造を持つ柔軟ロボット指先における触覚素子の種類,柔軟被覆の硬度,素子の分布密度などに関する設計指針を得ると共に,基本的な触感覚機能として物体材質の判別を行えることを明らかにした.
頭頸部癌癌幹細胞における血管内皮細胞増殖因子の微小環境としての働きに関する研究

舌癌は頸部リンパ節転移が生じやすい癌である。後発頸部リンパ節転移と癌幹細胞との関連および、血管内皮細胞増殖因子と頸部リンパ節転移について検討した。RT-PCRにて癌幹細胞関連遺伝子の発現を舌癌細胞株の癌幹細胞様細胞のSP細胞とnon SP細胞で比較した結果、SP細胞でOct3/4、Nanogの発現が高く、また遊走能と浸潤能が高かった。舌癌臨床検体において癌幹細胞マーカーOct3/4,Nanogの免疫組織化学染色、血管内皮細胞増殖因子受容体VEGFRや,VEGF-cの免疫組織染色を行った。舌癌のリンパ節転移群は、転移陰性群にくらべてOct3/4.Nanogの発現が高かった、またVEGFRの発現もリンパ節転移群のほうが高かった。癌幹細胞はリンパ節転移に寄与している可能性が考えられた。また血管内皮細胞増殖因子受容体もリンパ節転移に寄与している可能性が考えられた。臨床検体での臨床病理学的因子も調べると、リンパ節転移群とvascular invasionが正の相関を認めた。舌癌細胞株において癌幹細胞様細胞SP細胞、non-SP細胞を抽出し、RT-PCRを行うとSP細胞群は幹細胞マーカーのOct3/4,Nanogの発現が高かった。microarrayを行うと、同様にSP細胞がOct3/4,Nanogなどの幹細胞マーカーの発現が高かった。今後細胞株においては血管内皮細胞増殖因子を投与して、増殖能やアポトーシス変化などを調べる予定である。臨床検体においてはOct3/4,Nanogの染色陽性部位が血管との位置関係について調べる予定である血管内皮細胞増殖因子の頭頸部扁平上皮癌癌幹細胞における微小環境・ニッチとしての役割の一端を明らかにすることである。本年度は、臨床検体として、舌癌ステージ1・2における原発巣の血管内皮細胞増殖因子VEGFおよび血管内皮細胞増殖因子受容体VEGFR、頭頸部扁平上皮癌癌幹細胞の発現としてOct3/4,Nanog免疫組織化学染色を行った。舌癌の臨床検体においては、後発頸部リンパ節転移と癌幹細胞マーカーであるOct3/4,Nanogと正の相関関係が見られた。臨床病理学的因子としては後発頸部リンパ節転移と血管浸潤との正の相関関係が見られた。血管浸潤部位周囲に血管内皮細胞増殖因子VEGFの発現が認められる傾向があった。癌幹細胞マーカーOct3/4,Nanogの近傍に血管浸潤が認められ、血管内皮細胞増殖因子VEGFも近傍にある傾向があることから、微小環境・ニッチが近傍に位置するのではないかと考えられ、さらに解析を行っている。頭頸部扁平上皮癌細胞株に、Hoechst33342を投与し、染色されたSP細胞を1%程度確認した。これらは癌幹細胞様細胞と考えられた。SP細胞とnon-SP細胞をOct3/4,Nanog,ABCG2をRT-PCRで比較すると,SP細胞に癌幹細胞様細胞マーカーOct3/4,NanogおよびABCG2の発現が高いことが確認された。また、頭頸部扁平上皮癌細胞株に血管内皮細胞増殖因子VEGFを刺激すると細胞増殖能、細胞遊走能の亢進が認められることを確認した。血管内皮細胞増殖因子の頭頸部癌癌幹細胞における微小環境・ニッチとしての役割の一端を明らかにすることである。本年度は臨床検体として舌癌における原発巣の血管内皮細胞増殖因子VEGFおよび血管内皮細胞増殖因子受容体VEGFR、頭頸部扁平上皮癌癌幹細胞における癌幹細胞マーカーとしてOct3/4,Nanogの免疫組織化学染色を行った。舌癌の臨床検体ステージI/IIにおいては後発頸部リンパ節転移(DNM:delayed neck metastasis)と癌幹細胞マーカーOct3/4,Nanogの発現に正の相関関係がみられた。臨床病理学的因子としては後発頸部リンパ節転移と血管侵襲の間に、正の相関関係が見られた。進行癌を含めた舌癌では、血管内皮細胞増殖因子VEGFの発現と、頸部リンパ節転移に正の相関関係が見られた。血管侵襲部位周囲に血管内皮細胞増殖因子受容体VEGFRが認められる傾向があった。癌幹細胞マーカーOct3/4,Nanogの近傍に血管侵襲が認められることから微小環境・ニッチが近傍に位置する可能性があると考えられた。頭頸部扁平上皮癌細胞株に、Hoechst3342を投与し、染色された細胞が約1%前後でありSP細胞であり、癌幹細胞を多く含んだ細胞と考えられた。SP細胞とnon-SP細胞にOct3/4,Nanog,ABCG2をRT-PCRで比較するとSP細胞はOct3/4,Nanog,ABCG2の発現が高いことが確認された。また頭頸部扁平上皮癌細胞株に血管内皮細胞増殖因子VEGFを刺激すると細胞増殖、細胞遊走能の亢進が認められることも確認した。舌癌臨床検体において、血管内皮細胞増殖因子VEGFや癌幹細胞マーカーのOct3/4,Nanogの免疫組織化学染色は順調に進行し、症例数もふやせた。頭頸部癌細胞株において、血管内皮細胞増殖因子VEGF、血管内皮細胞増殖因子受容体VEGFRの発現ベースラインも確認した。またVEGF刺激による遊走能、増殖能の亢進なども確認した。

頭頸部扁平上皮癌細胞株から抽出した癌幹細胞様細胞(SP細胞)へ血管内皮細胞増殖因子VEGFを投与する刺激実験が、SP細胞抽出が安定しなかったため、やや遅れた。舌癌は頸部リンパ節転移が生じやすい癌である。後発頸部リンパ節転移(delayed neck metastasis: DNM)と癌幹細胞との関連および、血管内皮細胞増殖因子VEGF関連と頸部リンパ節転移について検討した。1舌癌細胞株SCC4における癌幹細胞様細胞:SP細胞の有無,2SP細胞におけるa.癌幹細胞関連遺伝子の発現,b.増殖能・遊走能・浸潤能などの機能3舌癌臨床検体における癌幹細胞関連遺伝子およびVEGF-C、VEGF-R3の発現とその臨床的意義について検討した。RT-PCRにて癌幹細胞関連遺伝子の発現をSCC4ののSP細胞とnon SP細胞で比較した結果、SP細胞で転写因子Oct3/4、Nanogの発現が高く、免疫細胞染色でも同様の結果が示された。機能は、細胞増殖能は明らかな有意差は認めなかったが、遊走能と浸潤能はSP細胞が優位に高かった。Oct3/4とNanogは舌癌の有用な癌幹細胞マーカーになるのではないか、そして高い遊走能と浸潤能を介してDNMを起こすことに寄与しているのではないかと考えられた。後発頸部リンパ節転移と癌幹細胞との関連および、血管内皮細胞増殖因子と頸部リンパ節転移について検討した。RT-PCRにて癌幹細胞関連遺伝子の発現を舌癌細胞株の癌幹細胞様細胞のSP細胞とnon SP細胞で比較した結果、SP細胞でOct3/4、Nanogの発現が高く、また遊走能と浸潤能が高かった。舌癌臨床検体において、血管内皮細胞増殖因子VEGFや癌幹細胞マーカーであるOct3/4,Nanogの免疫組織化学染色は順調に進行している。頭頸部癌細胞株において、血管内皮細胞増殖因子VEGF刺激による遊走能の亢進、増殖能の亢進などは確認しているが、頭頸部癌細胞株から抽出した癌幹細胞様細胞(SP細胞)へのVEGF刺激実験の進行がやや遅れている。そのため動物による実験は進めていない。年度初めのころにSP細胞の抽出に、安定性がなかったためと思われた。舌癌臨床検体における血管内皮細胞増殖因子VEGF、血管内皮細胞増殖因子受容体VEGFR、癌幹細胞マーカーOct3/4、Nanogの免疫組織化学染色の症例数はふえたので、あらたに統計学的解析を行い予後、転移などの臨床データとの相関関係の解析を進める。頭頸部扁平上皮癌細胞株の癌幹細胞SP細胞とnon-SP細胞に血管内皮細胞増殖因子VEGFを投与して遊走能、増殖能、細胞生存能力、自己複製能などを比較検討する予定である。舌癌臨床検体は、ステージI/II以外にも、進行癌での検体症例数がふえたので、臨床検体の実験結果と細胞株の実験結果をあわせて評価する予定である。頭頚部癌舌癌臨床検体における血管内皮細胞増殖因子VEGFや癌幹細胞マーカーのOct3/4,Nanogの免疫組織化学染色の進行は進んでおり、統計学的解析を行い予後・転移・臨床データとの相関関係の解明を進める。頭頸部癌細胞株から頭頸部癌癌