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高原子価金属錯体の酸化反応特性と基質酸化反応機構制御要因の解明

1.新規六配位ルテニウム(IV)-オキソ(Ru(IV)=O)錯体及び既報のRu(IV)=O錯体を合成し、それら2つのオキソ錯体の結晶構造を決定した。それらの錯体について、トリフルオロ酢酸(TFA)存在下における、各種電子供与体からRu(IV)=O錯体へのプロトン共役電子移動(PCET)における再配列エネルギーを、マーカス理論に基づいて1.26eV及び1.20 eVと決定した。その結果、それぞれの錯体の電子移動(ET)の再配列エネルギー(1.70 eV及び1.88 eV)に比べて小さな値であることが明らかとなった。この結果は、Fe(IV)=O錯体において、ETとPCETにおける再配列エネルギーが殆ど変わらない、という報告例とは異なっており、Ru(IV)=O錯体の電子移動反応性の特異性を示している。これらの成果については、現在論文投稿中である。2.水素結合部位としてアミドN-Hを導入した5座ピリジルアミン配位子を有するルテニウム(II)-アクア錯体を合成し、そのキャラクタリゼーションとそのアミド酸素の配位平衡について熱力学的解析を行った。さらに、その錯体のPCET酸化によって生成するRu(III)-ヒドロキソ錯体の合成と結晶構造解析、及びPCET酸化によるRu(IV)=O錯体の生成とキャラクタリゼーションを行った。そのRu(IV)=O錯体の水溶液中での有機化合物に対する酸化反応性の検討を行った。そのRu(IV)=O錯体は、C-H酸素化反応には反応性を示さなかったが、シクロヘキセンのエポキシ化を進行させ、生成物としてシクロヘキサンジオール、開環生成物であるアジポアルデヒド及びアジピン酸を触媒的に与えることがわかった。この反応では、オキソ配位子へのアミドN-Hプロトンの水素結合が、オキソ錯体のC=C2重結合への求電子的反応性を向上させていることが示唆された。1.最近、Cr(V)-オキソ、Fe(IV)-オキソ、Ru(IV)-オキソ錯体の電子移動の再配列エネルギーと、C-H結合酸化の遷移状態に関するBell-Evans-Polanyiの式の係数との間の直線的相関関係を初めて見いだした。これをさらに一般化して、金属-オキソ錯体の電子移動特性とC-H酸化反応の遷移状態制御が、どのように相関しているのかを明らかにするための研究を行っている。2.Ru(IV)=O錯体によるアセトニトリル中でのC-H酸化反応について、プロトン存在下の酸化反応速度を検証した。Ru(IV)=O錯体の還元電位は、TFA濃度の上昇に伴って上昇した。酸化電位が低い3,4,5-トリメトキシベンジルアルコール(TMBA)を基質とした場合、プロトン濃度の上昇に伴い、Ru(IV)=O錯体のRu(II)錯体への見かけの還元反応速度定数は直線的に上昇し、1プロトン(TFA一分子)が関与していることがわかった。一方、酸化電位が高いベンジルアルコールを基質とした場合。その見かけの速度定数は、TFAの濃度によらず一定であった。さらに、TMBAを基質とした場合の反応速度定数は、2電子2プロトンのPCETにおけるマーカス曲線に一致して変化した。このことは、1プロトンが相互作用したRu(IV)=O錯体に、TMBAがPCET酸化されることを示唆している。1.金属-オキソ錯体の電子移動の再配列エネルギーとC-H酸化反応における遷移状態制御の関係性を明らかにするため、2種類のMn(IV)=O錯体の電子移動における再配列エネルギーを決定するとともに、C-H酸化反応の速度論的解析を行って、Bell-Evans-Polanyi式の係数を決定する。それらの2つのパラメータの相関が、これまでに得られた直線的相関関係と一致するかを検証する。さらに、この直線的相関関係に関する考察と意義づけを行い、論文として発表する。2.ほとんど報告例のない、Ru(V)-オキソ(Ru(V)=O)錯体の合成とキャラクタリゼーション、及びその有機化合物の酸化反応における反応性と反応機構を明らかにする。Ru(V)状態を安定化するために、配位子として、アニオン性3座配位子である酸化耐性の高い環状無機物であるシクロトリフォスフェート(P3O9(3-))、及び置換基による電子的効果を検討しうる2,2'-ビピリジン(bpy)を2座配位子として用いる。Ru(V)=O錯体の合成は、有機溶媒中でのRu(III)-メトキソ前駆体錯体とメタクロロ過安息香酸などの過酸化物との反応により行う。合成したRu(V)=O錯体については、X線結晶構造解析、各種分光学的手法によりキャラクタリゼーションを行う。有機基質の酸化反応については、C-H酸化及びオレフィンのC=C結合酸化を主眼とする。1.水溶液中におけるルテニウム(V)-イミド(Ru(V)=NH)錯体によるC-H酸化反応について、数多くの知見を得ることができた。その中で、各種有機化合物のC-H結合の酸化反応に関して、速度的解析に基づく反応機構の解明を行った。その結果、水溶性エチルベンゼン誘導体のベンジル位におけるC-H結合の酸化反応では、速度論的同位体効果(k(H)/k(D))が21であり、水溶媒の同位体効果が72であった。

これは、基質のC-H結合からRu(V)=NH錯体への水素移動反応(HAT)がトンネリングを経て進行しており、溶媒である水分子の遷移状態への関与を示唆している。また、シクロブタノールを基質とした場合、シクロブタノンが反応生成物として得られ、開環化合物は認められなかった。この結果は、基質のC-H結合からRu(V)=NH錯体へのHATは、水素としてではなく、ヒドリドとして移動していることを示している。この反応の遷移状態に関するDFT計算でも、ヒドリド移動の遷移状態のほうが水素移動のそれよりも遙かに安定であることが支持されている。2.新規六配位ルテニウム(IV)-オキソ(Ru(IV)=O)錯体及び既報のRu(IV)=O錯体を合成し、アセトニトリル中での各種電子供与体からの電子移動による還元反応をマーカス式に基づいて速度論的に解析し、それらRu(IV)=O錯体の電子移動の再配列エネルギーをそれぞれ1.92 eV及び1.7 eVと決定した。これは、Ru(IV)=O錯体のλ値を決定した初めての例である。これらの値は鉄(IV)-オキソ錯体の報告値と比べて小さく、Ru(IV)=O錯体の方が電子移動における構造変化が小さい事が明らかになった。1.先に述べたように、Ru(V)=NH錯体のC-H酸化反応機構の解明については、ほぼ完了し、投稿論文(full paper)を作成する段階まで来ている。ただし、オレフィン類のC=C2重結合に対する反応性については、まだ詳細を明らかにするには至っていない。2.六配位のRu(IV)=O錯体における電子移動の再配列エネルギーを意義ある精度で決定することができた。これについては、もう少し電子供与体の種類を増やして、λ値の精度を上げたいと考えている。一方、我々が生成に成功した水溶液中で生成する低スピン状態にある7配位構造のRu(IV)=O錯体については、まだ電子移動の再配列エネルギーを決定するには至っていない。さらに、プロトンが存在する条件下で、各種電子供与体からRu(IV)=O錯体への電子移動反応をマーカス理論に基づいて速度論的に解析し、プロトン共役電子移動におけるλ値の決定を行い、電子移動過程との差異を明らかにする。これらを含めて論文を作成し、投稿する予定である。1.新規六配位ルテニウム(IV)-オキソ(Ru(IV)=O)錯体及び既報のRu(IV)=O錯体を合成し、それら2つのオキソ錯体の結晶構造を決定した。それらの錯体について、トリフルオロ酢酸(TFA)存在下における、各種電子供与体からRu(IV)=O錯体へのプロトン共役電子移動(PCET)における再配列エネルギーを、マーカス理論に基づいて1.26eV及び1.20 eVと決定した。その結果、それぞれの錯体の電子移動(ET)の再配列エネルギー(1.70 eV及び1.88 eV)に比べて小さな値であることが明らかとなった。この結果は、Fe(IV)=O錯体において、ETとPCETにおける再配列エネルギーが殆ど変わらない、という報告例とは異なっており、Ru(IV)=O錯体の電子移動反応性の特異性を示している。これらの成果については、現在論文投稿中である。2.水素結合部位としてアミドN-Hを導入した5座ピリジルアミン配位子を有するルテニウム(II)-アクア錯体を合成し、そのキャラクタリゼーションとそのアミド酸素の配位平衡について熱力学的解析を行った。さらに、その錯体のPCET酸化によって生成するRu(III)-ヒドロキソ錯体の合成と結晶構造解析、及びPCET酸化によるRu(IV)=O錯体の生成とキャラクタリゼーションを行った。
難治性胸部悪性腫瘍の炎症性癌微小環境を標的とした画期的抗体療法

2018年度は、特発性間質性肺炎(IPF)を代表とする肺の慢性炎症とS100および肺癌の関連性に注目して検討を行った。IPF合併原発性肺癌手術例から得られた組織を用いた検討では、IPF肺癌は喫煙歴を有し、扁平上皮癌が多く、EGFR変異などのドライバー変異を有する頻度が少ないことを明らかにした。また免疫染色を行い、特に扁平上皮癌ではS100蛋白の発現を高頻度で認めることを確認した。間質性肺炎合併肺癌では、化学療法(細胞障害性抗がん剤・分子標的治療薬・免疫チェックポイント阻害剤)や放射線治療、外科的治療のいずれの治療においても、間質性肺炎急性増悪が問題となる。そのため従来の治療とは全く異なった治療標的を見出すことは非常に意義があると考えられる。抗S100ファミリー中和抗体の開発については、様々なS100タンパク質ファミリーに対する中和抗体の作成を行い、治療効果の高い抗体産生細胞クローンをELISAで選別している。さらに細胞モデル・マウスモデルを用いてその治療効果の評価を開始している。今後、まず単剤での腫瘍増殖抑制効果を評価し、さらに効果の期待される抗S100中和抗体を数種類組み合わせ腫瘍免疫への影響を含む抗腫瘍効果を検討へと展開する予定である(抗S100中和抗体カクテル療法)。分泌型S100ファミリー関連シグナル経路の解明については、中和抗体の開発が完了すれば、それらを用いて、抗体が細胞のmRNA発現プロファイル・タンパク質リン酸化プロファイルに及ぼす影響を検討することで、S100ファミリー関連シグナル経路を明らかにする。S100に親和性の高い中和抗体の作成は順調に進展しており、マウスモデルを用いた治療行為化評価も並行して進めている。したがって、研究計画に沿って概ね順調に進んでいると考えられる。昨年度に引き続き、腫瘍増殖抑制効果の高い様々な中和抗体を作成する。これらの中和抗体による癌細胞の増殖抑制効果をin vitroで検討するとともに、効果が期待される抗S100中和抗体を数種類組み合わせ、担癌マウスモデルへ投与し、腫瘍免疫への影響を含む抗腫瘍効果をin vivoでも検討する(抗S100中和抗体カクテル療法)。また、治療後の腫瘍を採取し、網羅的遺伝子発現解析・蛋白リン酸化解析などを行うことにより、S100ファミリー関連シグナル経路の解明を行う。当研究室ですでに保有していた分子生物実験試薬を使用することにより、次年度使用額が生じた。引き続き次年度予定している分子生物実験試薬の使用を予定している。
終末糖化産物の受容体(RAGE)を標的とする糖尿病合併症の予防・治療薬の探索

糖尿病の合併症である網膜症、腎炎、神経症はすべて、血中の糖と蛋白質が反応して生じる終末糖化産物(AGE)が受容体(RAGE)と結合して血管内皮細胞に誘導される現象に起因する。NMR, X線結晶解析、構造エネルギー計算、超遠心分析、等温滴定型熱量測定などから得られる構造情報と熱力学的情報を考慮し、この相互作用を阻害する候補物質を設計・化学合成し、糖尿病血管合併症に対する予防・治療薬の開発を進めている。AGEがRAGEに結合することで種々の細胞現象が誘導されることが見出され、AGE-RAGE相互作用によるシグナル伝達を阻害する物質を見出せれば、糖尿病血管合併症の予防・治療薬に成る得ると考え、その阻害剤の探索を行ってきた。リガンドーレセプターの相互作用に関する研究はリガンドに関する知見から始めるのが一般的であるが、リガンドが同定されていないこのAGE-RAGE系では事情が大きく異なっている。我々はレセプターの構造よりアプローチする戦略をとり、まずRAGEのAGE結合部位を含むと考えられるドメイン(vRAGEと名付けた)の構造をNMRにより決定した。この構造情報を用いてコンピュータ上でのバーチャルスクリーニングにより、特異的にRAGEに結合することが期待される候補物質約100種を抽出した。その化合物に対しELISA実験を行い、糖化アルブミンと競合的に結合するものを4種見出した。それらはAGEがRAGEに結合することにより惹き起こされる細胞内シグナルの一つである転写因子NF-□Bの活性化を阻害する活性を細胞レベルで示した。これら化合物の誘導体の化学合成を行い、合成した誘導体についてそれぞれBiacore測定や,NF-□Bの活性化阻害を指標としたレポーターアッセイを行うとともに、合成過程にフィードバックすることにより活性の高いものを見出す努力を重ねた。活性の高いものについてレセプターとの結合を種々の物理化学的手法を用いて熱力学的な解析を行っている。得られた情報を用いて結合部位の同定、結合様式の解析、並びに、in vivo, in vitroにおける生物活性を解析し、リード化合物の最適化を行っている。最終糖化産物AGEがその受容体RAGEに結合することで種々の細胞現象が誘導されることが見出され、AGE-RAGE相互作用によるシグナル伝達を阻害する物質が糖尿病血管合併症の予防・治療薬に成り得ると考え、その阻害剤の探索を行ってきた。我々はまずRAGEの構造をNMRにより決定し、この構造情報を用いてコンピュータ上でのバーチャルスクリーニングにより候補物質を抽出し、ELISA実験を行い、糖化アルブミンと競合的に結合するものを見出した。それらはAGEがRAGEに結合することにより惹き起こされる細胞内シグナルの一つである転写因子NF-κBの活性化を阻害する活性を細胞レベルで示した。これら候補物質の誘導体の化学合成を行い、合成した誘導体についてそれぞれBiacore測定や,NF-□Bの活性化阻害を指標としたレポーターアッセイを行うとともに、合成過程にフィードバックすることにより活性の高いものを見出す努力を重ねた。活性の高いものについてレセプターとの結合様式を詳細に検討するため結合サイトの同定を遺伝子操作による変異体の合成により行った。次にtrNOE、STD法、water LOGSY法など分子間相互作用に直接寄与する1Hを低分子側であるリガンド(薬剤)で選択的に検出するNMR手法を種々検討した。またRAGEの結晶化を試み、結晶に候補化合物をソーキングして、複合体の解析を試みた。特に予算の都合で購入できなかった極低濃度での測定が可能な蛍光による超遠心分析は実現しなかったが、変わりに購入できた等温滴定型熱量計による相互作用解析を開始した。しかし全ての候補化合物の溶解性が低くNMRの場合と同様実験条件の探索を行なっている段階である。試料は異なるが、本テーマと同様の研究目的を持って行なっている核内レセプターPPARγについて、ITCを用いたリガンドとの相互作用について熱力学的解析に成功している。この経験を用いて、AGE-RAGE系について実験計画を策定している。本研究では、従来の合理的薬物設計(Structure-Based Drug Design : SBDD)の手法の改良を目指し、受容体とリガンドの複合体の立体構造解析に加え、両者の相互作用を熱力学的に解析し、迅速な薬剤設計法の創出を目論んでいる。この創薬の手法の開発に際し、特に(1)最近AGE受容体(RAGE)を介して糖尿病に特徴的な血管細胞を変化させ、その結果血管障害が生じることが明らかとされたAGE-RAGE相互作用の阻害剤を探索すること、(2)II型糖尿病治療薬の標的蛋白質として注目されている核内受容体PPARγとリガンドとの相互作用解析を二つの大きなテーマとした。(1)については、昨年度中に合成した候補化合物の内、結合のある程度強いもの、活性の高いもの200種以上の候補物質について、結合サイトの同定を遺伝子操作によるRAGEの変異体の合成により行い、次にtrNOE、STD法、water LOGSY法など分子間相互作用に直接寄与する^1Hを低分子側であるリガンド(薬剤)で選択的に検出するNMR手法を種々検討した。

(2)について等温滴定型熱量計(ITC)よりリガンド依存的な複合体形成に伴う熱力学パラメータの求めた結果、中間の活性をもつリガンドが最も強い親和性を示した。これは一般に信じられてきた結合親和性を高くすると活性強度が向上するとの考えを否定していて、我々のエントロピー項の検討が新規薬剤設計に重要であるとの主張が裏付けられたことになる。このリガンドの複合体形成に伴うエントロピー変化の実体を明らかにするため水和量の変化の視点から捉える事を試みた。すなわち複合体形成に伴う疎水的相互作用の結果現れる脱水和を溶質の偏比容の変化として測定できると考え、その測定法および結果の解析法を検討した。
パラミクソウイルスの分子生物学と感染病理学

昭和62年度は本研究の最終年度にあたるため,主として60, 61年度に得られた成果のとりまとめ,公表に努力すると共に,結果の総合的検討,今後の展望の論議を行った.本年度中に新たに得られた成果は,各種パラミクソウイルスについての遺伝子構造の解析がさらに進んだこと,これをもとに,パラミクソウイルス全体の,あるいは特定のウイルス種における毒力の異なる株の進化についての解明が進んだこと,ウイルスの抗原決定基の形成に必要な構造が明らかになったこと,などがあげられる.総合検討により,本研究のような分子生物学と病理学が結合,融合した新しいウイルス学の傾向がさらに大きく展開され,ウイルス病制御の新しい方法論の開拓へと結実することが強く期待されることを確認した.本研究の目的はパラミクソウイルス科の諸ウイルスの分子生物学と感染発症機構に関する新しい知見を得ることであった.約15000塩基のウイルス遺伝子の全構造の解明がセンダイウイルス, 3型パラインフルエンザウイルスについて完了した.後者では,その病原性を支配する遺伝子産物が同定された.ニューカッスル病ウイルス(NDV)についてはウイルスの体内伝播と発症の鍵を握る遺伝子信号が,酸毒株と弱毒株糖蛋白遺伝子の比較により,明らかにされた.センダイウイルスのマウス気道での病巣形成の鍵を握る宿主プロテアーゼの特異性が,各種変異ウイルス株の遺伝子解析で明らかとなった.この他,牛ジステンパーウイルスの糖タンパク遺伝子塩基配列が解明された.また, NDVではモノクローン抗体選択株の遺伝子解析により,抗原決定基に関与するアミノ酸が同定され,ムンプスウイルスでは,細胞性免疫応答の解析のための系が確立された.この他に,ウイルスー細胞相互作用の解析をもとに,パラミクソウイルスのアセンブリーにおける細胞骨格の関与などの新知見も得られた.要約して,本研究は,ウイルスの分子生物学と感染病理学との結合又は融合という,ウイルス研究の新局面を開いた.このような新しい傾向の研究がさらに発展ウイルス病制御のための新しい概念を提起することが期待される.昭和62年度は本研究の最終年度にあたるため,主として60, 61年度に得られた成果のとりまとめ,公表に努力すると共に,結果の総合的検討,今後の展望の論議を行った.本年度中に新たに得られた成果は,各種パラミクソウイルスについての遺伝子構造の解析がさらに進んだこと,これをもとに,パラミクソウイルス全体の,あるいは特定のウイルス種における毒力の異なる株の進化についての解明が進んだこと,ウイルスの抗原決定基の形成に必要な構造が明らかになったこと,などがあげられる.総合検討により,本研究のような分子生物学と病理学が結合,融合した新しいウイルス学の傾向がさらに大きく展開され,ウイルス病制御の新しい方法論の開拓へと結実することが強く期待されることを確認した.1.ウイルスゲノム一次構造とウイルス病原性センダイウイルス全ゲノムのうち残された下流域の塩基配列が決定され、本ウイルスの全ゲノム構造が解明された。ニューカッスル病ウイルス(NDV)では、強毒株と弱毒株のウイルス糖タンパク遺伝子の一次構造が決定され、毒力の差を規定するFタンパクの開裂部位のアミノ酸配列の特徴、HNタンパク前駆体の生成機序が解明された。亜急性硬化性全脳炎ウイルス遺伝子の一次構造の解明により、本症発症の基盤と考えられるウイルスMタンパク合成皮下の分子的基盤が明らかとなった。さらに狂犬病ウイルス遺伝子の一次構造が近縁のVSVと比較され、遺伝子発現機序、毒力の基盤が論じられた。牛パラインフルエンザ遺伝子も一次構造が解明され、病原性の異なる株の各変異部位が同定された。センダイウイルスFタンパクの開裂活性化部位の構造基盤が、各種変異株を用いて明らかにされた。2.ウイルス抗原性の解析各種モノクローン抗体と多価抗体を用いて、NDVHN糖タンパク上のエピトープの構造基盤の解明、牛パラインフルエンザウイルスHNのエピトープの同定、センダイウイルスと宿主細胞との初期反応の解析、ヒト型及び動物型パラミクソウイルスの抗原的相関地図の作成、などが行われた。3.その他の知見センダイウイルスの新鮮分離株による病原性解析のモデル系の確立、同ウイルス粒子のagingによる生物活性の著しい変化の機序の解明、センダイウイルス粒子表面上の糖タンパクスパイク数の免疫電顕法による定量化の試みが行われた。
小児肥満児に対する適度な運動・食事療法が内蔵脂肪蓄積状態に及ぼす影響について-X線CT画像解析による検討-

肥満に伴う内臓脂肪の過剰な蓄積は糖・脂質代謝異常や心血管系疾患と密接に結びついていることが知られている。本研究は食事、運動量の管理を十分できる入院管理下で治療を行っている肥満児童を対象に、各個人毎に設定した至適運動強度での運動療法および食事療法が肥満児の体脂肪分布、成人病危険因子に対してどのような影響をもたらすか検討した。被検者は長期入院治療を行う単純性肥満児童9名(年齢11.4±1.3歳)とした。各児の体力レベルを判定するために自転車エルゴメータを用いた漸増負荷試験を行った。運動療法は19週間にわたる病院の日課としての運動(ジョギング、縄跳び、肥満体操等)と、そのうち10週間は自転車エルゴメータを用いた50%Vo2 max強度の運動を1日2030分、週34回行った。食事療法は肥満度に応じて12001800kcalの間で行った。皮下・内臓脂肪量の定量は臍高部CT画像より行った。採血は早朝空腹時に行い、成人病罹患に関わる項目をそれぞれ食事+運動療法前後において比較検討した。食事+運動療法終了後、体重は平均60.5kgから51.3kg(-14.7%)へと有意な減少(p<0.001)を示した。体重あたりの最大酸素摂取量は運動療法後29.8から36.9ml/kg/minへと有意な(p<0.05)増大を示した。皮下脂肪面積は平均で249.5cm2から158.9cm2(p<0.01)、内臓脂肪面積は46.0cm2から28.5cm2(p<0.05)へと有意に減少した。皮下・内臓脂肪の減少に伴い血液性状からみた成人病危険因子は有意に低下した(p<0.05)。以上の結果より、個人毎に設定した食事+運動療法の併用は、摂取カロリーの制限と消費カロリーの増大から体脂肪の減少を促し、それに伴い体重、体脂肪率の減少、各種成人病危険因子を低下させ、将来の成人病予防に対して有効であることが示唆された。
フォトレジスト塗布機への旋回噴流の適用およびその流れ構造の解明

今年度は,昨年度製作したスピンコーティング実験装置により,熱線流速計により排気流量を変化させてウェーハ上の気流を詳細に計測した.回転数は3000rpmに固定し,排気流量を0.03.0m^3/minと変化させて,ウェーハの回転と同期した計測を行った.その結果,昨年度油膜法による可視化実験で観察されたエクマンスパイラルがウェーハ上に約31本の等高線の筋として観察された.昨年度の可視化実験では,排気流量による差異はほとんど見られなかったが,今年度の実験では,排気流量による差異がはっきりと現れた.排気流量の増加とともに,エクマンスパイラルが発生し始める半径位置,つまり臨界レイノルズ数が増加することが確認された.しかしながら,ウェーハ上の境界層が乱流に遷移する半径位置,つまり遷移レイノルズ数はさほど変化は見られなかった.また,排気流量の増加に伴い,エクマン螺旋に相当する等高線の輪郭がはっきりと観察された.高さ方向に詳細に計測した結果,高さ方向でエクマンスパイラルの存在位置が異なることが観察され,このエクマンスパイラルが三次元的な構造を持つことが示唆された.ウェーハよりかなり上方では,流れはウェーハ外縁の局所的な領域に集中することが分かった.今回の計測では,ウェーハの回転と同期しているType-Iのエクマンスパイラルを観察することができ,これがウエーハ上の境界層の乱流遷移に大きく関与していることが分かった.しかしながら,今回の計測ではウェーハの回転と同期しないType-IIのエクマンスパイラルは観察されておらず,このことは今後の課題である.今年度は,まず実際の半導体製造工程で用いられるスピンコーティング装置を改良した実験装置を製作し,円盤には12inchのウェハを使用した.スピンコーティングへの旋回噴流の適応性を考慮するため,ウェハの回転で生じる気流の挙動を実験的に調査した.その方法には,油膜法による可視化を採用した.その結果,回転速度が2000rpm以上ではウェハ表面の油膜に筋が生じることが分かった.この筋は回転速度の増加に伴い,よりウェハ中心側で出現した.またその筋の本数は回転数に依らず3032本であった.この可視化結果は,スピンコーティングの際レジストの再付着を防ぐためにウェハ外縁より排気を行うが,その流量によらず,ほぼ同じ傾向を示した.これらの可視化実験の結果から,筋の出現半径位置および角速度に基づくレイノルズ数を算出したところ2.22.5×10^5であった.この結果は,回転円盤上の境界層が層流から乱流へ遷移するレイノルズ数とよく一致しており,この筋はその遷移領域に出現した何からの流れ構造をもつ気流の軌跡だと推察される.これは,いわゆるエクマン螺旋渦として知られており,この筋が薄膜の一様性を妨げることが過去の研究で報告されている.実際のスピンコーティングではこの筋ができないよう回転数を制御しながら操作されている.このエクマン螺旋渦の発生メカニズムはいまだ未解明である.この解明のためには,ウェハ表面上の気流の計測が必要不可欠であり,旋回噴流の適用の観点からも非常に重要である.今後はこの詳細な気流計測に取り組んでいく予定である.今年度は,昨年度製作したスピンコーティング実験装置により,熱線流速計により排気流量を変化させてウェーハ上の気流を詳細に計測した.回転数は3000rpmに固定し,排気流量を0.03.0m^3/minと変化させて,ウェーハの回転と同期した計測を行った.その結果,昨年度油膜法による可視化実験で観察されたエクマンスパイラルがウェーハ上に約31本の等高線の筋として観察された.昨年度の可視化実験では,排気流量による差異はほとんど見られなかったが,今年度の実験では,排気流量による差異がはっきりと現れた.排気流量の増加とともに,エクマンスパイラルが発生し始める半径位置,つまり臨界レイノルズ数が増加することが確認された.しかしながら,ウェーハ上の境界層が乱流に遷移する半径位置,つまり遷移レイノルズ数はさほど変化は見られなかった.また,排気流量の増加に伴い,エクマン螺旋に相当する等高線の輪郭がはっきりと観察された.高さ方向に詳細に計測した結果,高さ方向でエクマンスパイラルの存在位置が異なることが観察され,このエクマンスパイラルが三次元的な構造を持つことが示唆された.ウェーハよりかなり上方では,流れはウェーハ外縁の局所的な領域に集中することが分かった.今回の計測では,ウェーハの回転と同期しているType-Iのエクマンスパイラルを観察することができ,これがウエーハ上の境界層の乱流遷移に大きく関与していることが分かった.しかしながら,今回の計測ではウェーハの回転と同期しないType-IIのエクマンスパイラルは観察されておらず,このことは今後の課題である.
自閉スペクトラム症児における心の理論の獲得過程と関与する要因の検討

平成30年度は、小学1年生から6年生までの定型発達(TD)の児童40名と自閉スペクトラム症の児童24名を対象として、アニメーション版心の理論課題およびアイトラッカーを用いた潜在的誤信念課題を実施した。まず、心の理論課題成績の経年変化を分析し、誤信念理解の発達を検討した。また、心の理論に関係すると考えられる以下の3課題を実施した。(1)ASD者はASD者の作成したストーリーを理解しやすいかどうかを評価する幾何図形アニメーション理解課題。(2)向社会性の一側面である「分けること」を検討する分配選好課題および最後通牒課題。(3)記銘した語を想起する際の手がかりとしての自己と他者に関する情報の参照効果を評価する自己関連づけ記憶課題。その結果、心の理論課題成績の経年変化については、ASD児において誤信念の理解は学齢期を通じて発達し、それに言語発達が関係している可能性が示唆された。そして、通過時の語い年齢の平均は、一次誤信念課題は9歳台、二次誤信念課題は11歳台であることが明らかとなった。また、心の理論に関連する3つの課題においては以下の結果が得られた。(1)ASD児は心の理解課題の得点が高いほどASD者が作成したアニメーションの理解度が高かった。(2)分配選好課題では、ASD児もTD児と同様に知らない子どもより仲の良い友達に多く分けていた。分ける量を相手に提案し相手が受け入れたら自分にも相手にも提案された量が与えられる駆け引きの要素をもつ最後通牒課題では、ASD児では心の理論課題成績が良好な児童の方が最終的な獲得量が多くなる分配を行っていた。(3)ASD児において自己関連付け効果がみられたが高学年になるとみられなくなった。このことから、ASD児は他者よりも自己に関係づけるほうが記憶しやすいこと、成長とともに他者に関係づけることも有効になっていくことが示唆された。平成30年度は、小学1年生から6年生までの、定型発達(TD)の児童40名、自閉スペクトラム症(ASD)の児童24名を対象として、アニメーション版心の理論課題、潜在的誤信念課題、幾何図形アニメーション理解課題、分配選好課題・最後通牒課題、自己参照条件と他者参照条件を含む記憶課題、CCC-2日本語版、PVT-R、レイヴン色彩マトリックス検査を実施した。当初の計画では、TD児とASD児それぞれ20名を目標としたが、それを上回る参加者が得られ、データを収集することができた。その点では、当初の計画以上の進展がみられたと評価できる。また、心の理論に関係すると考えられる以下の新たな観点からの検討を行った。(1)ASD者はASD者に共感するという“Autistic Empathy"理論に基づき、ASD者はTD者による心の状態の表現よりもASD者による表現のほうが理解しやすいのではないかという仮説を検討した。(2)心の理論に関わる日常的な行動として向社会的行動を取り上げ、その一側面である分ける行動に焦点を当てて、心の理論との関連を検討した。(3)心の理論に関係する自己/他者認知と記憶のしやすさとの関連を検討した。そのように、心の理論の発達に関連する様々な要因について、最新の知見を反映させながらより多角的な検討が実施できた。一方、オリジナルに作成する予定であった日常生活における心の理論に関する質問紙は、平成30年度も引き続き検討を続けたが完成に至らず実施できなかった。海外で使用されている心の理論質問紙(The Theory of Mind Inventory)の内容を精査するにとどまった。また、アイトラッカーを用いた潜在的誤信念課題についてはデータの収集は前年度に引き続いて行い、データの蓄積はしたが分析は行っていない。以上より、総合的に「おおむね順調に進展している」と評価した。令和元年度は、当初の計画通り、平成29年度、平成30年度に引き続いて参加する児童に対して、アニメーション版心の理論課題とアイトラッカーを用いた潜在的誤信念課題を実施する。また、日常生活における心の理論質問紙を完成させ実施する。そして、本研究の実施期間である3年間の心の理論と関連する諸測度について経時的変化をまとめ、心の理論の発達に関連する要因についての分析と検討を行う。その成果は、ヨーロッパ自閉症学会(12th International Congress of Autism-Europe)および日本発達心理学会で発表する予定である。平成29年度は、小学1年生から6年生までの定型発達(TD)の児童44名と自閉スペクトラム症(ASD)の児童33名を対象として、(1)読書の経験や好みと心の理論の発達の関係、(2)物語り文の読解力と心の理論の関係、(3)依頼表現における丁寧さと心の理論の関係、(4)セリフのないアニメーションの内容を語る課題における心的状態の言語表現、について検討した。その結果、以下の知見が得られた。(1)読んだことのある本の数と心の理論課題の通過数はTD群の方がASD群より有意に多かった。そして、ASD群において、心の理論課題成績と読んだことはないがタイトルを知っている本の数との間に有意な正の相関がみられた。このことから、ASD児は定型発達児に比べると読書経験が乏しく心の理論の発達も遅れていることと、本への興味の芽生えと心の理論の発達には関係があることが示唆された。(2)物語文の読解力において、ASD群とTD群の間に有意差はみられなかった。

一方、ASD群においてのみ、心の理論課題の成績は読解力に有意な影響を与えており、特にスマーティー課題の成績が寄与していた。このことより、登場人物の心の状態の変化を理解できるかどうかが物語の読解に重要であることが示唆された。(3)他者に依頼を行う場面において、TD群は相手や状況によって丁寧さを変えているが、ASD群は一貫して丁寧な表現をする傾向がみられた。またASD児においては、目上の人への丁寧さと心の理論の成績の間に有意な正の相関がみられ、対人場面での丁寧表現は心の理論の獲得と関係することが示唆された。(4)セリフのないアニメーションの内容を語る課題において、心的状態の表現の生起数はASD群とTD群の間に有無差はなかった。ASD群の平均語彙年齢は10歳レベルであり、このレベルの言語力を有していると心的状態の言語表現はTD群と同様にできると考えられた。平成29年度は、小学1年生から6年生までの、定型発達(TD)の児童44名、自閉スペクトラム症(ASD)の児童33名を対象として、アニメーション版心の理論課題、潜在的誤信念課題、読解力テスト、著書認知テスト、読書アンケート、ポライトネス課題、フィクショナル・ナラティブ課題、CCC-2日本語版、PVT-R、レイヴン色彩マトリックス検査、ADOS-2を実施した。当初の計画では、TD児とASD児それぞれ20名を目標としたが、それを大幅に上回る参加者が得られ、データを収集することができた。その点では、当初の計画以上の進展がみられたと評価できる。実施した課題については、交付申請書の提出以降に、発達語用論を専門とする研究分担者とともに検討し直し、心の理論に密接に関わると考えられる語用論の側面を評価できる課題として、依頼表現における丁寧さを評価する課題とセリフのないアニメーションの内容を言語表現する課題を追加した。また、読書の経験や好みを詳細に評価するために著書認知テストを作成し追加した。一方、オリジナルに作成する予定であった日常生活における心の読み取りに関する質問紙は、平成29年度は準備が間に合わず実施できなかった。また、アイトラッカーを用いた潜在的誤信念課題についてはデータの収集は行ったが分析まではできなかった。以上より、総合的に「おおむね順調に進展している」と評価した。なお、研究実施にあたっては本学の研究倫理委員会の承認を得た。平成30年度は、小学1年生から6年生までの定型発達(TD)の児童40名と自閉スペクトラム症の児童24名を対象として、アニメーション版心の理論課題およびアイトラッカーを用いた潜在的誤信念課題を実施した。まず、心の理論課題成績の経年変化を分析し、誤信念理解の発達を検討した。また、心の理論に関係すると考えられる以下の3課題を実施した。(1)ASD者はASD者の作成したストーリーを理解しやすいかどうかを評価する幾何図形アニメーション理解課題。(2)向社会性の一側面である「分けること」を検討する分配選好課題および最後通牒課題。(3)記銘した語を想起する際の手がかりとしての自己と他者に関する情報の参照効果を評価する自己関連づけ記憶課題。その結果、心の理論課題成績の経年変化については、ASD児において誤信念の理解は学齢期を通じて発達し、それに言語発達が関係している可能性が示唆された。
オーキシン主要生合成酵素YUCCAに特異的に作用する発展型阻害の追求

独自に保有する化合物・抽出物ライブラリー約200種より、YUCCA酵素阻害試験(in vitro)およびシロイヌナズナ初期生育試験(in vivo)を用いてスクリーニングした結果、紅藻ソゾやアメフラシ類の抽出物ならびにTRPチャネル阻害剤の2-APBに強い阻害効果が認められた。上記の抽出物より、既知のYUCCA阻害物質とは異なる化学構造を有する天然物として、laurane型の含ハロゲンセスキテルペン3種を取得することに成功した。その内、laurinterolと2-APBは、in vivo試験において既知の阻害物質よりも強い阻害効果を示すことが確認できた。オーキシンIAAの生合成を制御するという利点を活かした農薬の開発例は過去にない。本研究では、新しいタイプの除草剤や植物成長調節剤などの開発につながる発展型阻害剤の取得を目指している。研究代表者が申請時とは研究分野が異なる機関に移動し、一から研究室の立ち上げを行う必要があったため、研究設備環境が著しく異なってしまい、研究計画調書作成時の計画を大幅に変更・修正する必要が生じた。そのため、最初は本研究を遂行するために最低限必要な装置や器具の導入および試薬の購入などに優先して時間を費やし、基盤整備を行った。当初は、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC-MS/MS)を用いて、IPyA(インドールピルビン酸)などの微量なIAA生合成中間体類の植物内生量を網羅的かつ選択的に分析することで、既存のものとは異なるタイプの阻害剤を探索する予定であった。しかしながら、現有設備では全く対応ができなかったため、IAA主要生合成酵素の一つで、IPyAからIAAの変換反応を担うYUCCA酵素に作用する特異的な阻害剤の探索に急遽変更した。本年度は、より酵素活性の高いYUCCA酵素を発現・精製することに成功した。また、蛍光検出器を備えたHPLC装置を導入することによって、微量なIAAを検出することも可能となり、新たな阻害剤スクリーニング評価系を構築することができた。さらに、インドール系およびトリプトファン系の合成化合物と海洋生物から単離した天然物を含む低分子有機化合物ライブラリーからスクリーニングを行った結果、数少ないYUCCA酵素阻害剤であるyucasinと同等の阻害活性を示し、既知の阻害剤とは異なる化学構造を有する化合物を取得することができた。当初の研究計画を大幅に変更したものの、昨年度(初年度)は、より高い活性を示すYUCCA酵素の発現・精製および蛍光検出器を備えたHPLC装置によるIAAの微量検出を可能にしただけでなく、阻害剤のスクリーニング評価系を構築するところまで達成することができた。さらに、保有する低分子有機化合物ライブラリーの一部についてスクリーニングを行った結果、紅藻ソゾ属の海藻が産生するcupalaurenolに高い酵素阻害活性が確認できた。今までに報告されたYUCCA阻害剤は全て合成品であり、天然物としての報告は初めてとなった。有望な阻害活性を示す海洋天然物の存在が示唆されたことから、今年度は、独自に保有する多様な沖縄産海洋生物由来の抽出物ライブラリーからの探索を中心に進めた。まずは約40種類についてスクリーニングを進めた結果、紅藻のミナミソゾやコブソゾならびに緑藻のアオサ、タマバロニア、クロミルに強い阻害活性がみられた。中でも顕著な活性を示した紅藻ミナミソゾに着目して阻害活性物質の探索を行った結果、活性本体は含ハロゲンセスキテルペンのlaurinterolであると同定した。初年度に取得したcupalaurenolも広義的には同じlaurane型の含ハロゲンセスキテルペンであり、既知の阻害剤とは異なる化学構造を有する活性物質の取得に成功した。また、シロイヌナズナやコマツナを用いた植物初期生育阻害試験(in vivo)において、laurinterolは既知のYUCCA阻害剤であるyucasinや4-phenoxyphenylboronicacidよりも強い生育阻害効果を示した。低分子有機化合物ライブラリーのみならず、独自に保有する多様な海洋生物由来の抽出物ライブラリーを活用して探索源を広げた結果、既知の阻害剤とは異なる化学構造をもつ有望な阻害活性物質laurinterolの取得に成功した。Laurintrolは様々な生物活性を示すことが知られているが、植物の生育に関与する文献等は見当たらない。その上、今までにYUCCA酵素阻害活性を示す天然物の報告例もなく、本研究より新たな知見が得られた。また、当初の計画通り、実際の植物体を用いた生育阻害試験にも着手し、in vitroだけでなく、in vivoにおいても高い阻害効果を確認することができた。取得したlaurinterolの安定性は比較的高いものであったが、溶解性の検討課題が残っている。シロイヌナズナ内のオーキシンの生合成に関わる主な酵素としてYUCCAが知られている。YUCCA酵素の働きを阻害する薬剤の発見は、新たなタイプの除草剤等の開発を行う上で大いに期待できるものである。しかしながら、現在のところ、わずか2種類の阻害物質(非天然物)しか報告されていない。そこで、本研究では、高活性で既知のものとは異なるタイプの阻害剤の取得に向けて、独自に保有する様々な抽出物ライブラリーや化合物ライブラリーより探索を試みた。70種類を超える沖縄産海洋生物由来の抽出物について、YUCCA酵素阻害試験(in vitro)を行ったところ、約20種類のサンプルに阻害作用が認められた。さらに、シロイヌナズナの初期生育試験(in vivo)を用いてスクリーニングを行った結果、紅藻ソゾや軟体動物アメフラシに強い阻害効果が確認できた。

それらの抽出物に含まれる活性本体を解析した結果、既知のものとは異なる化学構造を有する天然物として、ハロゲンを含むlaurane型のセスキテルペン3種(cupalaurenol、isolaurinterolおよびlaurinterol)を取得することに成功した。中でもlaurinterolが最も強い活性を示し、in vivo試験においては既知の阻害物質よりも強い生育阻害効果を示すことが確認できた。Laurane型の含ハロゲンセスキテルペン類に植物の生育阻害作用の報告はなく、新たな知見を得ることができた。さらに、化合物ライブラリーからスクリーニングを行った結果、TRPチャネル阻害剤として知られている2-APB(2-aminoethyl diphenylborinate)が、既知の阻害物質よりも強い効果を示すことが判明した。また、沖縄土壌由来の各種糸状菌より作製した培養液の中に、上記の化合物よりもさらに有望な阻害効果を示す物質の存在を確認することができた。独自に保有する化合物・抽出物ライブラリー約200種より、YUCCA酵素阻害試験(in vitro)およびシロイヌナズナ初期生育試験(in vivo)を用いてスクリーニングした結果、紅藻ソゾやアメフラシ類の抽出物ならびにTRPチャネル阻害剤の2-APBに強い阻害効果が認められた。上記の抽出物より、既知のYUCCA阻害物質とは異なる化学構造を有する天然物として、laurane型の含ハロゲンセスキテルペン3種を取得することに成功した。その内、laurinterolと2-APBは、in vivo試験において既知の阻害物質よりも強い阻害効果を示すことが確認できた。計画の大幅な変更があったものの、新たに設定した初年度の目標に到達することができた。目的の阻害剤を探索するための新たなアッセイ系には、1)YUCCA酵素の発現・精製、2)酵素反応条件の改良、3)蛍光検出器を備えたHPLCによる微量IAAの検出法の確立という3つの課題を克服する必要があったが、初年度中に全てを達成することができた。また、構築したアッセイ系を活用して保有する化合物ライブラリーから探索を行った結果、紅藻類に含まれる一部の含ハロゲンニ次代謝産物に顕著な阻害効果が見出された。今までに報告されたものや取得してきたものとは化学構造が全く異なっており、新しいタイプの阻害剤を発見することに成功した。本研究においてシード化合物の取得は要となるため、次年度も残りの化合物および抽出物ライブラリーからの探索・スクリーニングは継続して着手する予定である。選抜されたlaurinterol等の候補物質については、高速液体クロマトグラフィー質量分析装置(LC-MS/MS)等を用いて、微量なIAAおよびインドールピルビン酸(IPyA)の植物内生量を測定し、IAA生合成に対する阻害効果を正確に評価する予定である。また、取得したlaurinterolは天然物としては収量も多く、比較的安定性の高い化合物であるが、低極性・難水溶性であるため、溶解性の問題などを化学変換や官能基変換等によって改良・最適化する必要がある。
伝導電子数の制御による局在f電子系に対する結晶場の出現機構の研究

昨年度作製したTm_<0.05>La_<0.75>Yb_<0.2>Te(x=0.75)とTm_<0.05>La_<0.55>Yb_<0.4>Te(x=0.55)のについて,より低温で,低エネルギーの中性子非弾性散乱スペクトルを詳細に調べるため,最低温度2Kまでの中性子散乱実験(KENS,LAM-D分光器)を行った.その結果,x=0.95の段階ではっきりと見えていた結晶場分裂は,x=0.75で既にブロードに広がり,約10meVまで連続的に磁気励起が存在し,低エネルギー部分もエネルギーゼロまで有限のスペクトルがつながっていることがはつきりと判った.更にx=0.55になると,磁気励起はほとんど消失して幅2meV程度の準弾性散乱となるが,これについてもより精度の高い実験結果が得られ,確かにギャップが消失して準弾性散乱になることがはっきりとした.これらの結果について,中性子散乱スペクトルと磁気比熱の結果を説明するためのモデルを構築し,解析を行っ.た.x=0.55では,基底状態の状態密度幅が約23Kであり,これは中性子非弾性散乱実験で観測された準弾性散乱の幅と同程度であることが判った.またx=0.75では,中性子散乱スペクトルの広がりは,Tmの周囲に存在するYbとTmの2価イオンの分布に対応していることが確立された.この状態はx=0.95の状態と基本的には同じものであり,x=0.75からx=0.55になるところで,周囲の2価イオンの数の平均が5ないし6個程度になり,そこが結晶場分裂のギャップが開くか,ギャップが消失して局所的な揺らぎが生じるかの分岐点になっていることが判った.この実験結果から,全体の濃度領域で結晶場分裂がどのように変化していくのか,ほぼ全貌を明らかにすることができた.今年度はTm_<0.05>La_<0.75>Yb_<0.2>Te(x=0.75)とTm_<0.05>La_<0.55>Yb_<0.4>Te(x=0.55)の試料を作製し,比熱の測定と中性子非弾性散乱(KENS, LAM-D分光器)の実験を行った.測定システムの整備では,引き抜き磁化測定装置が完成した.その結果,x=0.95の段階ではっきりと見えていた結晶場分裂は,x=0.75で既にブロードに広がり,約10meVまで連続的に磁気励起が存在すること,ゼロ磁場でも最低温度まで磁気比熱が現れることが判った.非弾性散乱スペクトルと磁気比熱の結果から,LaをYbで置換することで,すなわち伝導電子数を減らすことにより,単に結晶場分裂が小さくなるだけではなく,混成効果により4f準位そのものも不安定になって幅が広がることが判った.更にx=0.55になると,磁気励起はほとんど消失して幅2meV程度の準弾性散乱となり,それに伴ってゼロ磁場の磁気比熱がより大きくなることも判った.これらの磁気比熱は基底状態の不安定化による幅の広がりの効果でほぼ説明できそうである.実際x=0.55の磁気比熱を簡単なモデルで解析してみると,基底状態の幅が約23Kであり,これは中性子非弾性散乱実験で観測された準弾性散乱の幅と同程度であるので,対応したものであると考えられる.x=0.75ではまだ結晶場分裂らしき構造があるらしく,この簡単なモデルでは実験結果の再現はできず,幅の広がった状態と広がっていない状態とを矛盾なく記述するようなモデルを構築しなければならない.今年度の実験結果から,全体の濃度領域で結晶場分裂がどのように変化していくのか,ほぼ全貌が明らかになってきており,来年度より詳細な研究につなげていく上で,十分な基礎データをとることができた.昨年度作製したTm_<0.05>La_<0.75>Yb_<0.2>Te(x=0.75)とTm_<0.05>La_<0.55>Yb_<0.4>Te(x=0.55)のについて,より低温で,低エネルギーの中性子非弾性散乱スペクトルを詳細に調べるため,最低温度2Kまでの中性子散乱実験(KENS,LAM-D分光器)を行った.その結果,x=0.95の段階ではっきりと見えていた結晶場分裂は,x=0.75で既にブロードに広がり,約10meVまで連続的に磁気励起が存在し,低エネルギー部分もエネルギーゼロまで有限のスペクトルがつながっていることがはつきりと判った.更にx=0.55になると,磁気励起はほとんど消失して幅2meV程度の準弾性散乱となるが,これについてもより精度の高い実験結果が得られ,確かにギャップが消失して準弾性散乱になることがはっきりとした.これらの結果について,中性子散乱スペクトルと磁気比熱の結果を説明するためのモデルを構築し,解析を行っ.た.x=0.55では,基底状態の状態密度幅が約23Kであり,これは中性子非弾性散乱実験で観測された準弾性散乱の幅と同程度であることが判った.またx=0.75では,中性子散乱スペクトルの広がりは,Tmの周囲に存在するYbとTmの2価イオンの分布に対応していることが確立された.

この状態はx=0.95の状態と基本的には同じものであり,x=0.75からx=0.55になるところで,周囲の2価イオンの数の平均が5ないし6個程度になり,そこが結晶場分裂のギャップが開くか,ギャップが消失して局所的な揺らぎが生じるかの分岐点になっていることが判った.この実験結果から,全体の濃度領域で結晶場分裂がどのように変化していくのか,ほぼ全貌を明らかにすることができた.
レポーターファージを用いた植物検疫システムの開発

海洋細菌VibriofisheriのluxA-luxBにトランスポゾンTn3,Tn5の両端(IR)部を持たせプラスミドを作成し、これらがin vitro,in vivoの系でトランスポジションがおこることを確認した。次に、これらを用いて、一般大腸菌及び大腸菌O157株検出用レポーターファージを分離した。これらのレポーターファージを用いると、特定の細菌一個を3時間以内で検出出来ることがわかった。この検出テストでは、土壌、他の細菌、植物組織、畜産物の存在下でも、発光量に変化は見られなかった。なお、発光基質としてテトラデカナールを用いた。基質溶解用各種溶媒について検討を行ったが、水が最も発光強度、酵素の安定性において優れていた。植物病原細菌Xanthomonasaxonopodis pv.citri,Erwinia amylovora,Ralstonia solanacearumのそれぞれに特異的に感染するファージから、それぞれの植物病原細菌を検出する発光ファージを分離するため、上記Tn3,Tn5のIRを両端に持つluxA-luxBカセットを広宿主プラスミドにクローニングした。また、細菌一個当りのファージを多数感染させて、溶菌後、細胞内成分(DNA、アルカリフォスファーターゼ、β-ガラクトシダーゼ)の量や活性を計測することによって、特定細菌を検出する方法についても検討を行った。その結果、感度は約千分の一になったが、この方法によっても検出が可能であることが判った。この場合は、レポーターファージの分離を必要としないメリットがある。海洋細菌Vibriofisheriiの発光遺伝子とluxAとluxBを含む断片とカナマイシン耐性カセットとを広宿主プラスミド上のトランスポゾンTn5及びTn3の末端部に挿入した。まず、このプラスミドを大腸菌形質転換体にλファージを感染させ、この溶菌液より得たファージを再度大腸菌に感染させた後、カナマイシン耐性により発光遺伝子導入ファージを分離し、本トランスポゾンが種々細菌検出用発光ファージを分離するために有用であることを示した。大腸菌検出用ファージを用いて迅速且つ正確な検出があることを確認した。また、発光遺伝子として、アメリカホタルのルシフェラーゼが、基質(ルシフェリン)の取り扱い、感度とも優れていることが判り、本遺伝子の融合用プラスミドも作成した。神戸植物検疫所、名古屋植物検疫所を見学し、特にカンキツかいよう病菌及びナシ・リンゴ傷病菌の植物検疫における問題点について討論し、本法の迅速な多検体検査システムの構築の必要性を学び、フォトカウンティングによる高感度化学発光測定機を用いる方法の他、高感度ポラロイドフィルム(ISO20,000)を用いた検査システムについても検出試験を行った。則ちろ紙に微量の検体懸濁液をスポットし、発光をフィルムで観察した。その結果、正確な定量的測定は難しいが、約40検体の検査を一枚のフィルムで検査できることが判った。海洋細菌Vibriofisheriiの発光遺伝子群よりluxA-luxBのルシフェラーゼ構造遺伝子或いはさらにカナマイシン耐性遺伝子を持たせた融合用トランスポゾンTn3及びTn5を作成し、これらを用いて大腸菌O157:H7株等の細菌を特異的に検出する発光ファージを分離した。これらの発光ファージを用いた場合、特定の細菌を3時間で1個検出できること、他の細菌を混在させても、土壌、植物粗抽出液等を混在させても、発光量に影響がないことが判り、広く植物病原細菌の検出に応用できることを示すことが出来た。また、特異的に感染する野生型ファージを用いて、大量のファージを感染させた後、細胞内から溶出するATPをルシフェリン-ルシフェラーゼ反応によっても、特異的に病原細菌を検出出来ることが分かった。但し、この場合の検出限界は1000個であった。

上記の実験には、高感度化学発光測定装置を用いたが、他に、高感度(ISO20000)のポラロイドフィルムを用いても、特定細菌の検出が可能であった。但し、検出限界は1000個と発光ファージ法に比べて低くかった。しかし、操作が簡便で、安価であることから、応用の場面が広がることであろう。