hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規遺伝子改変法によるメサンギウムの糸球体形成と糖尿病性腎症への系譜的役割の解明

Foxd1-Creマウスは出生時にはメサンギウム細胞に(Development. 2014;141:346-54.)、生後1ヶ月の時点で糸球体全体にCre recombinaseが誘導されるため(J Clin Invest. 2016;126:1926-38.)、出生時糸球体形成へのメサンギウム細胞の役割を明確にするのに有用、かつタモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスとの掛け合わせにて起こる表現型を予測するのに効率的である。その掛け合わせにより、Foxd1-Cre陽性Cre依存的TGF-β1過剰発現マウスは胎生致死となることが確認できた。この所見から、タモキシフェン誘導型Foxd1-CreマウスとCre依存的TGF-β1過剰発現マウスの掛け合わせにてしか、メサンギウム細胞におけるTGF-β1過剰発現の表現型を検討できないことが明らかになり、目的とするタモキシフェン誘導型Foxd1-Cre陽性Cre依存的TGF-β1過剰発現マウスを作成した。生後1年まで生育し、表現型を観察中である。また、Cre依存的安定化β-catenin発現マウスにくわえて、Cre依存的β-catenin floxedマウスをJackson Laboratoryより入手しており、現在同様にタモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスとの掛け合わせを開始している。in vitroにおいては上記の確立した方法にて複数のタモキシフェン誘導型Foxd1-Cre陽性Cre依存的TSC1 floxedマウスから採取したメサンギウム細胞の全てのラインにおいてTSC1の発現が低下しており、メサンギウム細胞が比較的容易に採取できていることが確認できたことは順調な成果であるが、まだ以下に記載するマウスのメサンギウム細胞が採取されていないため、今年度の課題となる。in vivoにおいてタモキシフェン誘導型Foxd1-CreマウスとCre依存的TGF-β1過剰発現マウスの掛け合わせは順調に進み、すでに解析に入っている。Cre依存的β-catenin floxedマウスも順調に生育し、タモキシフェン誘導型Foxd1-Cre陽性Cre依存的β-catenin floxedマウスはすでに存在しており、成長を待っている。逆にCre依存的安定化β-catenin発現マウスは、掛け合わせにおいて、時間がかかっており、今年度の課題である。また、下流のmTOR経路に対して抑制的に働き、細胞増殖や肥大の制御を行っているTSC1のfloxedマウスとタモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスを掛け合わせることによりメサンギウム細胞にてmTOR経路の活性化→ribosomal protein S6のリン酸化をおこしたところTSC1が欠如した糸球体でcollagen IVの発現増加やPAM染色領域の増加がみられ、mTOR経路のみでもメサンギウム細胞にて細胞外基質の増加、形質変化を起こすことをin vivoにて初めて証明できたが、蛋白尿は顕著に排出されなかったことを論文として投稿し、そのrevisionに時間を要したものの、論文として採択された。よって総合的に考えると順調にきているとした。
活性酸素消去剤による外傷性てんかん焦点形成予防対策に関する研究

鉄イオン脳内投与による外傷性てんかん実験モデルを使用した研究の結果、外傷性てんかん焦点形成に際して活性酸素種が関与することが明らかとなった。このため本研究では、活性酸素消去剤を鉄イオン注入後長期間に渡り投与し、発作脳波出現などを予防できるか否かを検討した。この結果,以下の成果を得た.1.EPC-K1(ビタミンCとビタミンEの燐酸ジエステル)は鉄イオンによる細胞膜の酸化を抑制することを明らかにした.2.鉄イオンを注入し6月後の発作脳波活動の出現は、EPC-K1含有飼料で飼育すると少なく,EPC-k1には発作波誘発阻害作用のあることを明らかにした。3.鉄イオンを注入した後2-塩化アデノシン(Cl-Ado)含有水で飼育しても発作脳波活動発現率及び酸化物量に変化は認められなかった.また,Cl-Ado含有水で飼育した約33%のラット脳波には発作脳波活動が出現した.これはCl-Adoが外傷性てんかん焦点形成の予防には不適であることを示唆する.4.メラトニン(Mela)含有水で飼育したラットの飲水量は少なかったが,鉄イオン注入後Mela含有水で飼育したラットの発作脳波活動発現率は有意に低く,Melaには発作波誘発阻害作用のあることが明らかとなった。以上のごとく、平成1012年度にわたる3年間の研究により,ある種の活性酸素消去剤は鉄イオン注入によるけいれん発作焦点の形成を予防できることを明らかにした.活性酸素種は頭部外傷のみならず、脳内血腫や脳梗塞時などでも脳内で生成され、脳浮腫などの形成に関与している。このため、本研究は外傷性てんかん発症予防の道を明らかにしたばかりでなく、脳内血腫などで起こる脳浮腫の予防や治療を考える上にも重要である。鉄イオン脳内投与による外傷性てんかん実験モデルを使用した研究の結果、てんかん焦点形成に際して活性酸素種が関与することが明らかとなった。本研究では、活性酸素消去剤であるEPC-k1(ビタミンCとビタミンEのリン酸ジエステル)を鉄イオン注入後長期間に渡り投与し、EPCが神経細胞膜の過酸化、神経細胞の脱落、あるいは発作脳波を予防できるか否かを検討した。1:研究概要(1)雄Sprague-Dawleyラット(体重400500g)のブレグマより尾側1mm、左側方1mmの大脳皮質内に100mMに溶解したFeCl_3溶液を1μl/minの速度で5μl注入することにより、外傷性てんかんモデルラットを作成した。対照群のラットにはHClでpH1.8に調整した生理食塩水を注入した。(4) FeCl_3溶液注入の3日、7日、14日、1月、3月後にFe群とFe+EPC群の脳波変化を観察した。2:研究結果(1) FeCl_3溶液注入後3日目の脳波にはスパイク活動などの発作脳波活動が認められた。(2) FeCl_3溶液注入3日、7日、14日、1月、3月後の発作脳波活動は、Fe群の方がFe+EPC群に比べて有意に多かった。(3)以上の結果、EPC-k1には発作波誘発阻害作用のあることが明らかとなった。鉄イオン脳内投与による外傷性てんかん実験モデルを使用した研究の結果,てんかん焦点形成に際して活性酸素種が関与することが明らかとなった.本研究では,ヒドロキシルラジカル消去剤である2-塩化アデノシン(Cl-Ado)を鉄イオン注入後長期間に渡り投与し,Cl-Adoが神経細胞の酸化ストレス(TBARS量),神経細胞の脱落,あるいは発作脳波を予防できるか否かを検討した.1:研究概要(1)雄

Sprague-Dawleyラット(体重400500g)のブレグマより尾側1mm,左側方1mmの大脳皮質内に100mMに溶解したFeCl_3溶液を1μl/minの速度で5μl注入することにより,外傷性てんかんモデルラットを作成した.対照群のラットには塩酸酸性生理食塩水(pH1.8)を注入した.(4)FeCl_3溶液注入の3日,7日,1月,3月,6月後にラットの脳波変化,TBARS量を観察した.2:研究結果(1)FeCl_3溶液注入群のラット脳波にはスパイク活動などの発作脳波活動が認められた.(2)Fe群とFe+Ado群との間に発作脳波活動発現率及びTBARS量に差は認められなかった.(4)約33%のAdo群ラット脳波にもスパイク活動などの発作脳波活動が認められた.(3)以上の結果,今回研究に使用した量のCl-Adoでは酸化ストレスの防止に効果は認められず,発作波誘発作用もあることから,外傷性てんかん焦点形成の予防には不適であることが明らかとなった.鉄イオン脳内投与による外傷性てんかん実験モデルを使用した研究の結果,てんかん焦点形成に際して活性酸素種が関与することが明らかとなった.本研究では,ヒドロキシルラジカル消去剤であるメラトニンを鉄イオン注入後長期間に渡り投与し,メラトニンが神経細胞の酸化ストレス,神経細胞の脱落,あるいは発作脳波を予防できるか否かを検討した.1:研究概要(1)雄Sprague-Dawleyラット(体重400500g)のブレグマより尾側1mm,左側方1mmの大脳皮質内に100mMに溶解したFeCl_3溶液を1μl/minの速度で5μl注入することにより,外傷性てんかんモデルラットを作成した.対照群のラットには塩酸酸性生理食塩水(pH1.8)を注入した.(2)モデルラットは4群に分け,それぞれHCl注入群,HCl注入+メラトニン投与群(Mela群),FeCl_3注入群(Fe群),FeCl_3注入+メラトニン投与群(Fe+Mela群)とした.(3)HCl+Mela群とFe+Mela群には大脳皮質内溶液注入直後にメラトニンを50mg/kg腹腔内に投与し,以後はメラトニンを2.2mM含む水で飼育(メラトニン摂取量約35mg/kg/day)した.(4)FeCl_3溶液注入の3日,7日,1月,3月,6月後にラットの脳波変化を観察した2:研究結果(1)今回使用したラットは飲水量が多くメラトニンの投与量は平均投与量は45mg/kg/dayになった.(2)HCl+Mela群とFe+Mela群の飲水量はHCl群及びFe群の87%であった.(3)4群間の食餌量に差はなかったが,Fe群とFe+Mela群ラットの体重増加は少なかった.(4)スパイク活動などの発作脳波活動はFeCl_3溶液注入群では82%,Fe+Mela群では36%のラット脳波に認められ,Fe+Mela群の発作脳波活動発現率はFe群に比べて有意に低かった.(5)以上の結果,メラトニンには発作波誘発阻害作用のあることが明らかとなった。しかし,今回研究に使用した量のメラトニンを投与されたラットの飲水量は有意に減少したことから,外傷性てんかん焦点形成の予防に使用するためにはさらなる検討が必要であることが明らかとなった.
環境依存型性決定研究のモデル化とメカニズム解析

爬虫類(ワニ)と甲殻類(ミジンコ)の環境依存型性決定機構をモデルとして、性決定時における環境シグナルの受容機構と、環境因子と生体内因子との間の相互作用の解明を目的とした。ワニではTRPV4による環境温度の受容機構を解明した。また、雌雄それぞれの産生温度において、エピゲノム修飾因子が温度依存型性決定に寄与する可能性を示した。ミジンコでは幼若ホルモンと脱皮ホルモンの生合成遺伝子群の単離と発現解析を行い、主要内分泌システムの分子基盤を整備した。さらに、性特異的なスプライシングやクロマチン修飾機構、雌特異的な脱皮ホルモンシグナル経路の活性化により雌雄形質の発現が制御されている可能性を示した。幼若ホルモン処理によってミジンコ類の雄産生が誘導されることから、自然環境下では成長や生殖に不向きな環境情報を感受した個体内では幼若ホルモン経路が活性化し、雄産生が引き起こされていると考えられる。我々はDaphnia pulexのWTN6系統を用いて日長時間に応じて仔虫の性比をコントロールできる実験系を確立している。性決定の臨界期における幼若ホルモン経路関連因子の探索を目的にトランスクリプトーム解析を実施し、オス産生に関与する幼若ホルモン経路の上流制御因子としてイオンチャネル型グルタミン酸受容体、さらに、下流応答因子の候補としてセリン/スレオニンキナーゼの一種であるPKCを選抜した。PKCと幼若ホルモンの制御関係を明らかにするため、薬剤曝露試験を実施した。その結果、BIM投与(PKC阻害剤)によって短日(雄誘導)条件の母親ミジンコの雄誘導率が著しく低下することが分かった。一方で、長日(雌誘導)条件下ではBIM投与によって雄産生の誘導は見られなかった。これらの結果は、PKCがミジンコの雄誘導機構に関与していることを強く示唆した。ワニの温度依存型性決定に関して、アメリカの共同研究者が急逝したため、本年度は新たなサンプルを手に入れることができない状況となった(当初の卵を使った研究計画は、予算の繰り越し申請が認められたため、翌年度に行うこととなった)。本年度は既にランを終えているRNA-seq解析の詳細なデータ解析を行なった。既に注目していたエピゲノム関連遺伝子や、代謝に関わる遺伝子が雄産生温度由来の生殖腺で高発現していることが新たに見出され、性決定と細胞代謝との関連性を強く示唆する結果が得られた。ミジンコの研究は概ね順調に研究が進んでいるが、アメリカの共同研究者が急逝したため、本年度は新たなサンプルを手に入れることができない状況となったため、卵を使った実験は翌年度に行うことになったため。昨年度から引き続き、幼若ホルモン制御に関連するプロテインキナーゼC(PKC)の雄産生に関わる作用機構を調べるため、PKCインヒビターであるBIMと幼若ホルモン(MF)の共投与試験を行なった。MFのみの単独投与によって本系統の雄誘導率もMF濃度に正比例していることを確認した。さらにBIMとMFの共投与によってもMF濃度依存的な雄誘導パターンは維持された。このことはPKCがイオンチャネルグルタミン酸受容体経路と同様、幼若ホルモン経路の上流制御因子としてミジンコの雄誘導機構に関与していることを示している。さらに、幼若ホルモンが制御する性決定・分化遺伝子カスケードを包括的に理解するために、性決定期以前の卵母細胞から性分化進行中の後胚発生期に及ぶサンプルのランスクリプトーム解析を行う。既にシークエンスのランを終え、データ解析を始めている段階である。ワニの温度依存型性決定に関して、我々は温度センサーであるTRPV4が精巣分化に強く関連することを見出している。一方で卵巣分化に関与するTRPの存在を調べるため、TRPM2のアゴニスト及びアンタゴニストを卵に塗布し、性比との関連を調べたが顕著な影響は見られなかった。また、エピゲノム状態が温度依存型性決定に与える影響を解析するため、ワニ胚の生殖腺を用いてChIP解析を行った。本年度は手法を確立するために、雄マーカーであるSox9、Amh及び雌マーカーであるアロマターゼのプロモーター領域におけるヒストンH3のリジン27のトリメチル(H3K27me3)修飾に注目した。いずれ領域でも、雌産生温度でH3K27me3修飾の割合は低く、これは脱メチル化酵素活性を持つJARID2等の遺伝子発現が卵巣で高いことと相関が見られた。当初の計画とおり、概ね順調に計画は進んでいる。動物の性決定・性分化については、多くの場合染色体の構成で決まるが(遺伝型性決定)、光や温度、個体密度など、周囲の環境によって性が決まる動物がいる(環境依存型性決定)。本研究は、ミシシッピーワニ(ミシシッピーアリゲーター)と節足動物のミジンコの環境依存型性決定機構をモデルとして、環境性決定における環境シグナルの受容機構と、そのような外部環境シグナルとホルモンを含む生体内環境調節因子との間の遺伝子・シグナルネットワークを明らかにすることを目的としている。ワニの温度依存型性決定に関して、我々は温度センサーであるTRPV4が精巣分化に強く関連することを見出した。トランスクリプトーム解析を詳細に解析し、TRP下流の分子イベントを推定し、雌雄それぞれの一連の生殖腺分子カスケードの一端を明らかにした。ミジンコについては、光周期依存的な性決定機構とそれに続く性分化機構に関する因子を特定するため、前年度から引き続きトランスクリプトームのデータ解析を行なった。雌雄の胚発生期の時系列データを詳細に解析し、雌性分化過程において脱皮ホルモンシグナル

関連遺伝子が顕著に活性化されていることを見出した。本解析を通して、ミジンコの性決定・性分化過程では、外部環境(日長時間など)情報が内分泌(幼若ホルモン)情報へと変換されることで次世代個体の雄への発生運命が決まり、その一方で、雌では脱皮ホルモンの作用によって雌形質の発現が制御されている可能性が示唆された。爬虫類(ワニ)と甲殻類(ミジンコ)の環境依存型性決定機構をモデルとして、性決定時における環境シグナルの受容機構と、環境因子と生体内因子との間の相互作用の解明を目的とした。ワニではTRPV4による環境温度の受容機構を解明した。また、雌雄それぞれの産生温度において、エピゲノム修飾因子が温度依存型性決定に寄与する可能性を示した。ミジンコでは幼若ホルモンと脱皮ホルモンの生合成遺伝子群の単離と発現解析を行い、主要内分泌システムの分子基盤を整備した。さらに、性特異的なスプライシングやクロマチン修飾機構、雌特異的な脱皮ホルモンシグナル経路の活性化により雌雄形質の発現が制御されている可能性を示した。ミジンコについては、プロテインキナーゼとPKCと幼若ホルモンの制御関係をより詳細に解析するために、他のPKC阻害剤やPKC活性化剤、さらには他のプロテインキナーゼ(PKAなど)に関わる投薬試験を通して、雄性決定機構を明らかにしていく。さらに、幼若ホルモンの生合成制御機構を含めた性決定・分化遺伝子カスケードの包括的な理解を目的に、性決定期以前の卵母細胞から性分化進行中の後胚発生期に及ぶ複数タイムポイントのサンプルを用いた時系列トランスクリプトーム解析を行う。ワニの温度依存型性決定に関して、我々は電気生理学実験から温度センサーであるTRPV4が雄産生温度域(高温度域)で活性化され、さらに卵への薬剤塗布実験からこのタンパク精巣分化に強く関連することを明らかにしている。一方低温度域で活性化されるTRPについては、温度感受域の測定や、薬剤による性決定への寄与に関する知見はない。そこで、他動物種のTRPの温度感受域の情報を元に、低温感受性TRPのワニ温度依存型性決定への関連性を調べる。また、トランスクリプトーム解析の結果から明らかとなった、エピゲノム修飾が性決定に及ぼす影響を解析する。エピゲノム修飾とヒストン修飾酵素の性決定における重要性はJumonjiファミリーのひとつであるJmjd1aノックアウトマウスでも報告されている。このような観点から、我々はJumonjiファミリーであり、ヒストン修飾酵素/ポリコーム複合体の構成因子の一つであるJARID2が、雌産生温度特異的に発現が低下することを見出している。そこで本研究では、ヒストン修飾が環境温度によってどのように変化するか解析する。前年度までは特に性決定期である卵母細胞の成熟期に焦点を当て、その時期に雄特異的に発現する遺伝子の同定を進めてきた。現在は、幼若ホルモンの生合成制御機構を含めた性決定・分化遺伝子カスケードの包括的な理解を目的に、性決定期以前の卵母細胞から性分化進行中の後胚発生期に及ぶ計10の時点での時系列トランスクリプトーム解析を行なっている。特に、遺伝子共発現ネットワーク解析によって、各時点における雌雄特異的な共発現遺伝子群(モジュール)を探索している。
アンセリジオ-ゲンにより誘導されるシダ造精器分化の機構の解析

1)シダ造精器の同調的誘導系の開発生殖器官分化の機構解析のためには、分化が同調的に誘導される系の開発が政是非とも必要である。そのために、カニクサ配偶体に同調的に造精器が分化する系の開発に取り組んだ。その結果、GA_3およびGA_4ーmethyl esterを加えた寒天培地を用いて原糸体細胞上に造精器を同調的に誘導することに成功した。また、試料のサンプリングが容易な液体培地では、GA_3により赤色光を照射することにより、ほぼ同調的な造精器分化誘導系の作出に成功した。またカニクサでは配偶体から酵素により単離したプロトプラストを培地の浸透圧を段階的に低下させた後,ジベレリン(GA_3)を含む培地で培養した。その結果プロトプラストからの再生体にGA_3投与後3日目に90%以上の個体に造精器を誘導させることに成功した。2)造精器形成時に特異的に出現するタンパク質の解析カニクサ胞子をGA_3を含む培地に蒔き同調的に造精器を形成した配偶体から抽出した可溶性画分から、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりタンパク質の分離を試みた。その結果、10^<ー5>M GA_3を加えた培地では造精器形成とほぼ同じ時期に分子量約38,000及び69,000の新しいタンパク質のバンドの出現が確認された。今後、2次元電気泳動、^<32>Sメチオニンの取り込み等により造精器分化に特異的なタンパク質の出現を確認する予定である。1)シダ造精器の同調的誘導系の開発生殖器官分化の機構解析のためには、分化が同調的に誘導される系の開発が是非とも必要である。そのために、カニクサおよびモエジマシダ配偶体に同調的に造精器が分化する系の開発に取り組んだ。その結果、モエジマシダでは、ワラビ配偶体を培養した培地より抽出したアンセリド-ゲンを加えた培地に蒔いた胞子の発芽後4日目に青色光照射を照射することにより同調的に原糸体細胞の分裂および造精器の分化を誘導することに成功した。その結果再生したプロトプラストの90%以上に6日後に造精器を誘導させることに成功した。また、密度勾配遠心法によりサイズの異なるプロトプラストを分離し、それぞれのサイズの細胞を培養することにより、造精器分化を同調化させることを試みた。2)造精器形成時に特異的に出現するタンパク質の解析カニクサ胞子をGA_3を含む培地に蒔き、造精器を同調的に誘導し、造精器を形成した配偶体から抽出した可溶性画分から、ゲル電気泳動によりタンパク質の分離を試みている。現在の所、特異的に誘導されるタンパクの出現は確認されていない。今後、2次元電気泳動等より精度の高い検出法を用いて特均タンパクの確認を試みる予定である。1)増精器形成時に特異的に出現するタンパク質の解析カニクサ胞子をGA_3を含む培地に蒔き同調的に造精器を形成した配偶体から抽出した可溶性画分から,SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりタンパク質の分離を試みた。その結果、10^<ー5>M GA_3を加えた培地では造精器形成とほぼ同じ時期に分子量約38、000及び69,000の新しいタンパン質のバンドの出現が確認された。2)シダ胞子からの突然変異体の単離造精器分化の機構を遺伝子発現のレベルで解明するための手段として、アンセリジオ-ゲンに対する感受性、アンセイリジオ-

ゲンの合成能、感受性等に関する突然変異体の単離のための基礎実験を試みた。カニクサ、ホウライシダ、モエジマシダおよびアメリカミズワラビ胞子を突然変異誘発剤EMS(ethyl methyl sulfonate)で処理、寒天培地に蒔き、生じた原糸体、前葉体の変異を観察した。その結果、それぞれの種において、細胞分裂、原糸体の成長の異常な個体、葉緑体を欠く個体等が現れた。今後、これらの個体をさらに追跡し、胞子体から胞子を得、突然変異体であることを確認する予定である。
高度な統語・意味解析情報を持つコーパスの開発とその応用

科学研究費基盤研究(C)「高度な統語・意味解析情報を持つコーパスの開発とその応用」では、日本語テキストに正確な統辞・意味解析情報を付加した日本語コーパスの構築法を研究し、また実際にそれにもとづいてコーパス開発を行うことを目標としている。平成29年度の研究では、引き続きこれまでに開発したアノテーション法にもとづいて現実の大量テクストに対し統辞・意味解析情報を付与した。この作業は研究補助員が担当した。以上の作業を進めながら、形態素解析の方法を根本的に変えるための改定作業を進めた。新しい方式では、各単語の統語カテゴリーや機能情報がより詳しく示される。特に、活用、派生や複合語形成において、その内部構造と各構成素の持つ統語カテゴリー・機能情報が表示されるので、よりきめ細かい検索が可能になる。単語に対して英語のグロスをつけ、日本語に習熟しない人にも利用しやすくする。また、竹内孔一講師(岡山大学)との共同研究により、述語に対し概念フレームと意味役割を付与した述語項構造情報を与える作業を開始した。新しい形態素解析は、宮田スザンネ教授(愛知淑徳大学)が構築してきたCHILDES方式の幼児言語発達コーパスに対して適用可能であり、同データを利用した、日本語幼児言語発達ツリーバンクの開発につながるものである。また、コーパスに対し述語項構造情報を与えることにより、コーパスのデータについて、より意味的側面に立ち入った利用が可能になる。平成28年度の研究では、これまでに開発したアノテーション法にもとづいて現実の大量テクストに対し統辞・意味解析情報を付与した。またこの作業を通じて、アノテーション法の改良および研究補助員をまじえたチームによる共同開発を適切に行うために必要な規則の客観化および明確化を検討した。今回は特に、(1)格役割のアノテーションについて場合分けを行って明確にし、(2)コントロールの種類ごとに、それが行われる条件とともに明確化し、(3)量化表現構文を単純なスキーマに還元し、さらに(4)曖昧性を持つ語形について、それらを見分けるためのノウハウを明文化した。また、多人数のチームによる共同作業を可能にするために規則やノウハウをこれまでにまとめて作成したマニュアルの改良を行った。マニュアルの主要な改善点としては、(1)格役割のアノテーションは、格名詞句が明示されているか省略されているか、および格が必須か任意かという条件によって変わることから分かりにくいので、それらの間の区別を明確にし、(2)日本語の関係節(連体修飾節)には2種類あり、それらの間の区別が必ずしも容易でないので、区別のための条件を分かりやすく提示し、(3)様々に異なるコントロールが行われる条件をそれぞれ簡素化して平易に説明し、(4)多様な量化表現を単純な構文スキーマに還元してアノテーションをより簡単にし、また(5) 1語で複数の文法機能を持つ曖昧な語を対象として、簡単に区別するための方法を示した。統語・意味情報付きコーパス開発の一部として、約1万文にアノテーションを施し、国語研ウェブサイトより公開を開始した。その際、アノテーションの一貫性と基準の明確化について検討をあわせ行った。特に、セグメンテーションや形容詞修飾の問題について、国立国語研究所のバトラー、ホーン両研究員と意見を交換しながら改良を進めた。また、アノテーション作業の効率化のために、マニュアルの改訂を行った。とりわけ、2種類の関係節や形態論的に曖昧な表現の区別の明確化に関して改善を行った。今回は特に、(1)品詞タグ体系を抜本的に改善(助詞Pへの機能タグ付与による細分化等)し、(2)従属節種類ごとに、コントロールが行われる条件を明確化し、(3)「に」「の」「と」のコピュラ助動詞としての用法を明確に規定し、さらに(4)曖昧性を持つ語形について、それらを見分けるためのノウハウを明文化した。マニュアルの主要な改善点としては、(1)格助詞「に」「を」の必須文法役割および任意文法役割表示の区別を明確にし、(2)日本語のいわゆる「外の関係」の関係節が使用される条件を明確にし、(3)様々に異なるコントロールが行われる条件をそれぞれ簡素化して平易に説明し、(4)多様な量化表現を単純な構文スキーマに還元してアノテーションをより簡単にし、また(5) 1語で複数の文法機能を持つ曖昧な語を対象として、簡単に区別するための基準を明確化した。さらに、コーパスを利用した日本語学習者支援システムを開発し、評価実験を行った。

統語・意味情報付きコーパス開発の一部として、本年度も約1万文にアノテーションを施し、国語研ウェブサイトより追加公開を行った。その際、アノテーションの一貫性と基準の明確化について検討をあわせ行った。特に、品詞タグ改良の問題について、国立国語研究所のバトラー、ホーン両研究員と意見を交換しながら改良を進めた。また、アノテーション作業の効率化のために、マニュアルの改訂をさらに進めた。また、コーパスを利用した日本語学習者支援システムを開発し、評価実験を行った。科学研究費基盤研究(C)「高度な統語・意味解析情報を持つコーパスの開発とその応用」では、日本語テキストに正確な統辞・意味解析情報を付加した日本語コーパスの構築法を研究し、また実際にそれにもとづいてコーパス開発を行うことを目標としている。平成29年度の研究では、引き続きこれまでに開発したアノテーション法にもとづいて現実の大量テクストに対し統辞・意味解析情報を付与した。この作業は研究補助員が担当した。以上の作業を進めながら、形態素解析の方法を根本的に変えるための改定作業を進めた。新しい方式では、各単語の統語カテゴリーや機能情報がより詳しく示される。特に、活用、派生や複合語形成において、その内部構造と各構成素の持つ統語カテゴリー・機能情報が表示されるので、よりきめ細かい検索が可能になる。単語に対して英語のグロスをつけ、日本語に習熟しない人にも利用しやすくする。また、竹内孔一講師(岡山大学)との共同研究により、述語に対し概念フレームと意味役割を付与した述語項構造情報を与える作業を開始した。新しい形態素解析は、宮田スザンネ教授(愛知淑徳大学)が構築してきたCHILDES方式の幼児言語発達コーパスに対して適用可能であり、同データを利用した、日本語幼児言語発達ツリーバンクの開発につながるものである。また、コーパスに対し述語項構造情報を与えることにより、コーパスのデータについて、より意味的側面に立ち入った利用が可能になる。これまでのコーパスのアノテーションを通じて明らかになった諸問題を整理し、アノテーション方式の一層の洗練のためにフィード・バックさせる。コーパス開発に当たっては、1つの形式が2つのカテゴリーにまたがって分類しうる例に遭遇することが非常に多く、開発上の最大の障害となっている。しかし、事象間の共通点も多く、解決のための一般的な原則を立てることが可能であると考えられる。これについて検討し、学会発表を行う。開発したコーパスを利用して日本語学習者の読解支援システムを開発し、習得実験を行う。基礎となる形態素解析に問題が多いので、抜本的な解決を図る。また、開発したコーパスの、日本語教育教材や脳認知科学実験基礎データとしての応用について検討を進める。年度末に人件費支払いに当てたが、人件費(労働保険料を含む)が正確にいくらになるか事前に知ることは困難であったため、次年度使用額が生じた。残金は物品費等として有効に使用する予定である。
「運動する楽しさ」の脳科学的解明

(目的)これまでにラットを用いた運動トレーニングの実験の中で、ラットには良く走る「運動好きラット」と全く走らない「運動嫌い」ラットの存在することに気付き、興味深い現象として観察し続けてきた。これらのラットの脳内で発現している「自発活動誘発および抑制因子」を同定し、その調節機構を包括的に理解することは、身体活動低下に起因する生活習慣病を始めとする健康問題の解決につながる可能性が考えられる。最終的な目的は、「自発活動誘発および抑制因子」の同定であるが、本研究では第一の段階として、ラットを回転ケージで飼育し自発走行量に個体間で差が生じるかについて定量的に検討した。また、これまでの研究から加齢による体脂肪の蓄積増大によって走行距離が低下する可能性が考えられるので、脂肪組織で分泌され脳で摂食やエネルギー代謝を調節するレプチンの血中濃度と走行距離の間に関係が存在するか否かについても合わせて検討した。(方法)3週齢のWistar系雄ラットを回転ケージで35週齢まで飼育し、走行距離を毎日、体重、摂食量を2日毎に測定した。また、体重の増加が緩やかになる27週齢まで、2週間毎に尾静脈より採血をし血清レプチン濃度をELISA法で定量した。(結果と考察)1.12匹のラットを回転ケージで35週齢まで飼育したところ、自発走行距離の継時的変動パターンから、3つのグループに分類できることが明らかになった:#1 good runner(走行距離に継時変動が見られず、常に良く走るラット、n=2)、#2 good-bad runner(加齢に伴って自発走行距離が低下するラット、n=4)、#3bad runner(走行距離に継時変動が見られず、全く走らないラット、n=4)。これらのラットの脳を部位別に分離し、自発活動誘導・抑制遺伝子同定のためにー80°Cにて保存した。2.1の結果の典型的なラット各群2匹を摘出し、自発走行距離と体重および血中レプチン濃度の相関関係を、ピアソンの相関係数の方法で求め検定した。その結果1)いずれのグループにおいても体重の増加に伴ってレプチン濃度が上昇することがわかった。(体脂肪の蓄積に依存)。#1グループは血清レプチン濃度が上昇しても良く走ることが、#2,3グループについては、レプチン濃度が上昇すると活動量が低下することが明らかになった。しかし、その走行距離の絶対量には大きな差があった。
コラーゲン結合蛋白産生性齲蝕原性細菌の脳出血誘導機序の解明と治療法開発への挑戦

脳出血の病態理解は,近年劇的に変容した.脳出血の発症には未知の因子が関与しており,その診断・治療法の開発にもパラダイムシフトが必要と考えられている.申請者らは,コラーゲン結合蛋白Cnmを産生する齲蝕原性細菌が脳出血および脳微小出血に強く相関することを見出したことから,更なる研究開発を進めることで,脳出血の分子標的予防法を開発できる可能性が高く,まずはその病態モデルを確立し,脳出血発症の機序を明らかにすることを目指す.脳出血の病態理解は,近年劇的に変容した.脳出血の発症には未知の因子が関与しており,その診断・治療法の開発にもパラダイムシフトが必要と考えられている.申請者らは,コラーゲン結合蛋白Cnmを産生する齲蝕原性細菌が脳出血および脳微小出血に強く相関することを見出したことから,更なる研究開発を進めることで,脳出血の分子標的予防法を開発できる可能性が高く,まずはその病態モデルを確立し,脳出血発症の機序を明らかにすることを目指す.
有機クロム反応剤による高効率的新規増炭素手法の開拓

有機金属化合物のカルボニル基への官能基あるいは立体選択的な求核付加反応は、最も有効な選択的増炭素手法である。この研究では有機金属反応剤として有機クロム化合物を取りあげ、その高選択的な合成反応への応用について検討した。主な研究実績を以下に列挙する。(1)従来、有機クロム反応剤の調製法としては、有機リチウムやマグネシウムからの金属-金属交換と、低原子価のクロム塩による有機ハロゲン化物の還元の二通りの方法がある。温和な条件下に有機クロム反応剤をつくり出す手法としては後者が望ましいが、クロム(II)塩の還元力があまり強くないために、還元される有機ハロゲン化物としては活性なものに限られていた。ハロゲン化アルケニルは還元されにくいハロゲンであるが、クロム(II)塩とともにニッケル触媒を用いることにより、すみやかにアルケニルクロム反応剤へと変換できることがわかった。このと遷移金属による触媒作用を検討した結果、ビタミンB_<12>などのコバルト触媒を用いると、ハロゲン化アルキルからアルキルクロム反応剤を調製できることを見いだした。この手法を用いると、温和な条件下に官能基選択的なアルキルクロム反応剤がつくり出せる。(2)1,1-ジクロロ-Z-ブテン類をクロム(II)塩で還元すると、α-クロロアリルクロム反応剤が調製できること、さらにこの反応剤とアルデヒドの反応では、トレオでZ型の付加体が高い立体選択性で得られることを見いだした。新しい鎖状化合物の立体選択的な合成手法である。(3)アクロレインジアルキルアセタールをルイス酸共存下にクロム(II)塩で還元したところ、γ-アルコキシ置換アリルクロム反応剤が得られることを見いだした。この反応剤はアルデヒドと反応してエリトロ型の1,2-ジオール体を選択的に与える。1,2-ジオールの部分構造は多くの天然物に含まれるものであり、その立体選択的な合成法の開発は重要である。
無衝突衝撃波による高エネルギー粒子の起源:粒子法計算によるアプローチ

研究目標:衝撃波による粒子加速の問題は、高エネルギー天体プラズマ物理学の中心課題の一つであり、活動銀河核や超新星などでの高エネルギー粒子の起源を理解していく上でも重要である。本研究では運動学的粒子法による数値シュミレーションの手法を用いて、プラズマ集団現象による加速粒子と波との相互作用に焦点を当てた研究を行い相対論的粒子加速の過程を明らかにしていく事を目標とする。特に、相対論的な大きなマッハ数での衝撃波の構造を調べプラズマ粒子間のエネルギー輸送の問題に焦点を置く。研究成果:イオンと電子の2成分プラズマ中では、衝撃波上流のプリカーサ波動が粒子の加速に重要な役割を果たしていることが解った。そして、電子は、衝撃波上流でのイオンの運動エネルギーにほぼ等しくなるところまで加速されることが明らかになってきた。これは次のように理解できる。無衝突衝撃波では衝撃波上流から来た粒子が衝撃波面で反射され、その局所的熱平衡から外れた速度分布関数が電磁波を励起する。相対論的な大きなマッハ数になると衝撃波上流のプラズマ系では励起される波の振幅が大きくなり、波の非線形作用としての「動重力」が効きイオンと電子のエネルギー交換が行われる。これまでの一連の相対論的衝撃波の研究で、シンクロトロン星雲のような電子・陽電子・イオンの3成分系での衝撃波でも又より一般的なイオン・電子の2成分系での衝撃波でも、運動学的加速過程は異なってもマクロに見たレプトンの加速効率はほぼ同じで慣性の大きいイオンの持つエネルギーがレプトンに渡されることが明らかになった。
神経損傷後の痙縮症状に対するリハビリ効果定着のための細胞機能制御に関する研究

脊髄損傷後の痙縮に対するリハビリ効果の定着メカニズムを明らかにするため、前年度に設定したラット脊髄損傷モデル、Swimmingテストによる行動評価、免荷式歩行訓練の実験系を引き続き行った。Swimmingテストにより痙縮症状が強く出る個体を選別することが可能となり、免荷歩行訓練による介入実験が効率よく行えるようになった。痙縮症状が顕在化している脊髄損傷ラットに対して免荷歩行訓練を4週間継続することで、Swimmingテストで検出される痙縮症状が減少することが明らかとなった。その背景となる分子メカニズムについて、網羅的解析と並行して候補分子に着目した実験を行った。候補分子としては運動ニューロンの興奮性に関与するセロトニンシグナルに着目した。組織学的解析から痙縮症状の増悪とともにセロトニンシグナルの過活動(セロトニン受容体の過剰発現)が脊髄損傷部以遠の運動ニューロンで確認され、これが歩行訓練によって減弱することが確認された。そこでセロトニンシグナルを修飾する薬剤を投与することで症状の継続的な改善を得ようとしたが、初期の検討では十分な効果が得られず次年度以降の課題となった。一方、脊髄組織内のグリア細胞の機能を選択的に評価するためにセルソーターによる分離評価の検討を行った。表面マーカーによる分離の他に、アストロサイト特異的に発現するAldh1l1分子の発現に応じてGFPを発現するレポーターマウスを用いることも検討したが、成体脊髄からのアストロサイトの分離回収を安定して実施することは困難だった。今後、上記のセロトニンシグナル関連の候補分子に着目した介入を中心に進めていく。実験系は安定して実施されており、当初仮定していた脊髄損傷による痙縮の出現と、それに対する歩行訓練効果は順調に得られている。今後もこの実験系を用いてサンプル採取と介入実験を行うことで、予定の研究を遂行することができると考える。おおむね予定に沿った方針で進める予定である。脊髄損傷ラット痙縮モデルに対する訓練介入実験では、前年度から脊髄損傷後のリハビリ効果の定着を促進する候補分子として、セロトニン関連分子に着目し、関連する神経作動薬の投与実験を開始している。今年度も引き続き脊髄損傷モデルラットに対する神経作動薬の投与と訓練の併用実験を継続し、その行動学的変化を歩行機能によって観察する。同時に痙縮の変化について、Swimmingテストと生理学的検査によって評価する。組織学的解析については、脊髄損傷後の治療介入(薬理介入の有り無し)での組織学的変化を脊髄腰膨大レベルで観察する。セロトニンシグナルを中心にアストロサイトおよびニューロンにおける関連候補分子の発現パターンを解析する。中枢神経障害によって生じる四肢の痙縮症状は脊髄前角の下位運動ニューロンの過剰な興奮性によって生じ、脊髄損傷をはじめ様々な疾患で機能回復の妨げとなる。現状において痙縮症状に対する集中的リハビリテーションは神経回路の運動学習効果を介して効果を発揮することが知られているが、訓練終了後にその効果の持続を得ることは難しい。本研究は運動学習がニューロンの変化だけでなく、周囲のグリア細胞からの影響を受けながら形成されるという視点に立ち、痙縮に対する運動訓練の効果定着のメカニズムを分子レベルで明らかにし、ラット脊髄損傷後の痙縮に対し薬剤介入によって訓練効果の定着を誘導することを研究期間内に試みる。こうした基礎知見によって痙縮に対して分子レベルの治療法開発を進めることが本研究の目的である。本研究期間の目標は以下の項目とする。1脊髄損傷ラットによる痙縮モデルにおいてリハビリ介入におけるニューロン・グリア相互作用にかかわる分子を網羅的に解析する。2培養実験を用いて1で得られた候補分子によるニューロンの機能制御作用をスクリーニングし、ニューロンの過剰な興奮性を抑制する液性因子を同定する。3最終的に脊髄損傷ラットの痙縮モデルにおいてリハビリ介入で痙縮を軽減させた状態で、標的分子に対して介入実験を行い、リハビリ中断後も痙縮の改善効果が得られるかを検証する。本研究はニューロン・グリア細胞間で働く液性因子に着目することで、訓練効果定着の分子メカニズムを明らかするだけでなく、定着を促進する新たな創薬開発への可能性を生むものである。これは分子標的介入によるリハビリ効果の最大化という、新たなフィールドをリハビリテーション医学にもたらすことが期待される。研究計画に沿ってラット脊髄損傷モデルにおける痙縮評価の実験系を作成した。水中の遊泳を用いた痙縮評価では安定した評価が可能であることを確認した。また、訓練として実施するトレッドミル上の歩行訓練の実験系も設定を行い、実施可能な状態となった。今後の生化学的解析のため、グリア細胞を個別にソートして解析するための条件設定を行い、生後間もない個体ではアストロサイトをセルソーターで分離する条件を設定することができた。

そこでセロトニンシグナルを修飾する薬剤を投与することで症状の継続的な改善を得ようとしたが、初期の検討では十分な効果が得られず次年度以降の課題となった。一方、脊髄組織内のグリア細胞の機能を選択的に評価するためにセルソーターによる分離評価の検討を行った。表面マーカーによる分離の他に、アストロサイト特異的に発現するAldh1l1分子の発現に応じてGFPを発現するレポーターマウスを用いることも検討したが、成体脊髄からのアストロサイトの分離回収を安定して実施することは困難だった。今後、上記のセロトニンシグナル関連の候補分子に着目した介入を中心に進めていく。実験系は安定して実施されており、当初仮定していた脊髄損傷による痙縮の出現と、それに対する歩行訓練効果は順調に得られている。今後もこの実験系を用いてサンプル採取と介入実験を行うことで、予定の研究を遂行することができると考える。初年度に設定した脊髄損傷に対する歩行訓練モデルを用いて、実際に訓練を実施するとともに痙縮がどのように変化するかを行動学的また組織学的に評価を行う。その際に生じる変化を生化学的に評価するためにセルソーターを用いたグリア細胞種別の解析方法の条件検討を進め、実際に動物個体からサンプルを得ることを試みる。網羅的解析と並行して、訓練前後の動物の組織サンプルを解析し、神経機能制御のかかわる既知の分子の変化について分析を行う。おおむね予定に沿った方針で進める予定である。脊髄損傷ラット痙縮モデルに対する訓練介入実験では、前年度から脊髄損傷後のリハビリ効果の定着を促進する候補分子として、セロトニン関連分子に着目し、関連する神経作動薬の投与実験を開始している。今年度も引き続き脊髄損傷モデルラットに対する神経作動薬の投与と訓練の併用実験を継続し、その行動学的変化を歩行機能によって観察する。同時に痙縮の変化について、Swimmingテストと生理学的検査によって評価する。組織学的解析については、脊髄損傷後の治療介入(薬理介入の有り無し)での組織学的変化を脊髄腰膨大レベルで観察する。セロトニンシグナルを中心にアストロサイトおよびニューロンにおける関連候補分子の発現パターンを解析する。
硫酸カルシウムから作製した多孔質炭酸アパタイトと骨髄幹細胞による骨再生医療の開発

当該年度は主に動物実験での評価を行った.これまでと同様の方法で,硫酸カルシウム粉末と各種径の(直径50, 120, 205μm)ナイロンの繊維を焼成混和して硬化後にナイロン繊維を除去することで硫酸カルシウムの多孔体を作成し,これを炭酸ナトリウム水溶液,リン酸水素ナトリウム水溶液に浸漬することで炭酸アパタイト多孔体へ組成変換した.ついで顆粒径が11.4mmとなるように粉砕,分粒し,炭酸アパタイト多孔体顆粒を作製した.次に炭酸アパタイト多孔体顆粒とコントロールとして炭酸アパタイト緻密体顆粒をウサギの頭蓋骨にトレフィンバーにて径8mmの欠損を作製し埋入を行った.2, 4, 8週後に摘出し組織学的に観察を行った.新生骨量は組織切片上でImage Jにて計測した.2週では,骨欠損内の顆粒内部にそれぞれの気孔径を持つことが確認でき,断端付近には新生骨が確認された.緻密体は顆粒辺縁のみに新生骨が認められるが,気孔径50,120μmの多孔体は,すでに気孔内部にも新生骨が形成されていることが確認できた.気孔径205μmの顆粒ではこの時点では気孔内での骨形成は認めなかった.4週では断端部分では顆粒周囲の新生骨が増加しているのが確認できた.また欠損中央でも顆粒周囲と気孔内部に新生骨の形成が確認できた.さらに8週になると,欠損部全体で骨形成を認め,緻密体と比べ多孔体は顆粒内部の骨形成も顕著に進んでいることが確認できた.新生骨量はそれぞれの埋入期間において,緻密体と気孔径205μmの顆粒が同程度で,気孔径50μmと120μmの顆粒の骨形成量が多かった.気孔部の骨形成は,埋入2週では205μmの気孔部には新生骨が認めなかった,埋入4,8週では気孔径が120,50, 205μmの順で骨形成量が多かった.当該年度は,炭酸アパタイト多孔体の実験動物への埋入を主に行ってきたが,結果に関しては,概ね予期していたとおりであった.ただ,研究代表者の異動により少し研究が中断したため,進捗状況としてはやや遅れており,研究期間を1年延長するに至った.炭酸アパタイト多孔体の気孔径と,骨形成との間の相関関係がはっきりしないため,今後はさらに新たな気孔径の炭酸アパタイト多孔体顆粒を作製し,動物実験で骨形成に関して評価する予定である.硫酸カルシウム粉末と蒸留水を混和水比0.2で練和し、ナイロンの短繊維(直径50μmおよび200μm,長さ約2mm)を、50μmは5wt%、200μmは10wt%で混和し、硬化した後にナイロン繊維を焼却することによって試料を多孔質化した。ついで試料を炭酸化、リン酸化することにより炭酸アパタイト多孔体を作製し、試料の走査型電子顕微鏡による形態観察を行った。次いで、ウサギの下顎骨に欠損を作製し、試料を埋植して、4、12週後に下顎骨を摘出し、マイクロCTを撮影した後、非脱灰切片を作製して組織学的な評価を行った。対照はナイロン繊維を混和しない緻密体を用いた。走査型電子顕微鏡による形態観察ではナイロン繊維の大きさに一致した細孔構造が観察された。組織学的所見では、埋植4週後では、CO3Ap緻密体は試料の吸収や骨形成がほとんどみられなかったのに対し、多孔体では、試料辺縁からの吸収を認め、新生骨の形成が見られた。埋植12週後では、多孔体では内部に骨形成を認めた。試料の選定、動物実験に関してはほぼ予定どおり進捗しているが、培養実験が予定より遅れている。これは、最適な試料の選定に予定より時間がかかってしまったためである。硫酸カルシウム粉末とナイロンの短繊維(直径50,120および205μm,長さ約2mm)をファイバーの重量比が10 wt%となるように混合し,混水比0.2で練和後,冷間等方圧加圧法(Cold isostatic pressing)により50 MPaの圧力下で硬化させた.硬化後,700°C(昇温速度0.13°C/分)で5時間焼成することによってファイバーを除去し,これを前駆体とした.その後,顆粒径が1.0 1.4 mmとなるように粉砕,分粒し,炭酸ナトリウム水溶液およびリン酸水素ナトリウム水溶液に浸漬し,CO3Apへ組成変換を行った.変換前後における形態学的観察は走査型電子顕微鏡を用いて行い,組成分析に関してはX線回折装置およびフーリエ変換赤外分光光度計を用いて行った.前駆体である硫酸カルシウムは炭酸ナトリウム水溶液に7日間浸漬することで炭酸カルシウムに組成変換し,これをリン酸水素ナトリウム水溶液に14日間浸漬することでCO3Apへ組成変換した.気孔径の違いによる変換速度に差は認めなかった.

また,CO3Apへ変換後も前駆体で形成した気孔径は維持されており,炭酸含有量に気孔径の違いによる差は認めなかった.以上のことから,ファイバー含有石膏を焼成し,これを前駆体として組成変換を行うことにより,種々の気孔径を有するCO3Ap顆粒の調整に成功した.多孔体の気孔率の向上を目的に,ナイロン繊維の混合比上昇のため,冷間等方圧加圧法という新たな手技を取り入れたため,試料の選定に時間を要した.当該年度は主に動物実験での評価を行った.これまでと同様の方法で,硫酸カルシウム粉末と各種径の(直径50, 120, 205μm)ナイロンの繊維を焼成混和して硬化後にナイロン繊維を除去することで硫酸カルシウムの多孔体を作成し,これを炭酸ナトリウム水溶液,リン酸水素ナトリウム水溶液に浸漬することで炭酸アパタイト多孔体へ組成変換した.ついで顆粒径が11.4mmとなるように粉砕,分粒し,炭酸アパタイト多孔体顆粒を作製した.次に炭酸アパタイト多孔体顆粒とコントロールとして炭酸アパタイト緻密体顆粒をウサギの頭蓋骨にトレフィンバーにて径8mmの欠損を作製し埋入を行った.2, 4, 8週後に摘出し組織学的に観察を行った.新生骨量は組織切片上でImage Jにて計測した.2週では,骨欠損内の顆粒内部にそれぞれの気孔径を持つことが確認でき,断端付近には新生骨が確認された.緻密体は顆粒辺縁のみに新生骨が認められるが,気孔径50,120μmの多孔体は,すでに気孔内部にも新生骨が形成されていることが確認できた.気孔径205μmの顆粒ではこの時点では気孔内での骨形成は認めなかった.4週では断端部分では顆粒周囲の新生骨が増加しているのが確認できた.また欠損中央でも顆粒周囲と気孔内部に新生骨の形成が確認できた.さらに8週になると,欠損部全体で骨形成を認め,緻密体と比べ多孔体は顆粒内部の骨形成も顕著に進んでいることが確認できた.新生骨量はそれぞれの埋入期間において,緻密体と気孔径205μmの顆粒が同程度で,気孔径50μmと120μmの顆粒の骨形成量が多かった.気孔部の骨形成は,埋入2週では205μmの気孔部には新生骨が認めなかった,埋入4,8週では気孔径が120,50, 205μmの順で骨形成量が多かった.当該年度は,炭酸アパタイト多孔体の実験動物への埋入を主に行ってきたが,結果に関しては,概ね予期していたとおりであった.ただ,研究代表者の異動により少し研究が中断したため,進捗状況としてはやや遅れており,研究期間を1年延長するに至った.今後、研究計画どおり進めていくが、特に前年度、進捗が遅れている、培養を重点的に進めていく予定である。具体的には、炭酸アパタイト多孔体の培養骨髄細胞の骨芽細胞への分化能を評価するとともに、骨髄幹細胞を注入した炭酸アパタイト多孔体をウサギ大腿骨に形成した骨欠損部に移植し、骨形成の評価を行う。今後も研究計画どおりに進めていくが,動物実験を重点的に進めていく予定である.具体的にはウサギ頭蓋骨に形成したクリティカルサイズの骨欠損部に炭酸アパタイト多孔体を移植し,骨形成の評価を行う.さらに近交系ラットの大腿骨から骨髄細胞の細胞懸濁液を調整し,多孔質炭酸アパタイトに注入し,骨芽細胞分化促進培地で培養した後,アルカリフォスファターゼ活性,オステオカルシン産生等を生化学的に検討するともに,これをウサギ大腿骨の骨欠損部に移植し,骨形成の評価を行い,炭酸アパタイト緻密体と比較する.炭酸アパタイト多孔体の気孔径と,骨形成との間の相関関係がはっきりしないため,今後はさらに新たな気孔径の炭酸アパタイト多孔体顆粒を作製し,動物実験で骨形成に関して評価する予定である.培養の研究の進捗が遅れているため、次年度使用額が生じた。(理由)動物実験の進捗が遅れているため,次年度使用額が生じた.(使用計画)動物実験に重点的に使用する予定である.当該年度は,炭酸アパタイト多孔体の実験動物への埋入を主に行ってきたが,研究代表者の異動により少し研究が中断したため,進捗状況としてはやや遅れており,研究期間を1年延長するに至った.今後はさらに新たな気孔径の炭酸アパタイト多孔体顆粒を作製し,動物実験で骨形成に関して評価する予定である.培養試薬に重点的に使用する予定である。