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排卵機構におけるメラトニンの病態生理学的意義に関する研究

松果体より分泌されるmelatoninおよび下垂体より分泌されるprolactinはいずれも夜間に増量する日内変動を有することが知られているが、その分泌関連については未だ明確ではない。本研究では、正常月経周期を有する成熟婦人を対象に、種々の明-暗、睡眠-覚醒条件を設定し、両者の分泌関連を検討し、夜間に認められるprolactin分泌の増量には、睡眠とは別にmelatonin分泌の増量が強く関連していることが明かとなった。このmelatoninのprolactin分泌促進作用の詳細を、ラットを用いて検討すると、meiatonin投与後に、視床下部正中隆起のDopamine代謝回転は有意に減少しており、また、電気生理学的手法を用いた検討でも、Dopamine Neuron活性はmelatonin投与後に有意に減弱することが示された。一方、prolactinreleasing factorであるSerotonin系については、視床下部中止隆起中のSerotonin代謝回転に変動は認められなかった。また、Opioid系の関与についてはヒトを対象に検討すると、melatonin投与後に血中beta-endorphin濃度に変動は認められず、また、Opioid antagonistであるNaloxon投与下でもmelatoninのprolactin分泌促進パターンに差は認められなかった。即ち、以上の検討成績からmelatoninのprolactin分泌促進作用は、視床下部のDopamine Neuron活性を減弱させることに基づくことが強く示唆された。一方、病態学的には、夜間にのみ著明なprolactine分泌の増量を示すnocturnal hyperprolactinemia患者では夜間に著明なmelatoninの分泌増量を示すこと、また、日中のprolactin値が軽度上昇しているmild hyperprolactinemia患者ではmelatoninに対するprolactin分泌の著明な亢進を示し、これら疾患の発症病態にmelatonin分泌が密接に関連していることが明らかとなった。(1)臨床検討:夜間にのみProlactin(PRL)分泌の異常増量を示すNocturnal hyperprolactinemia(NH)患者、及び間脳下垂体に器質的な異常を認めず、しかも日中のPRL値が3060ng/mlを示すModrate hyperprolactinemia(MH)患者を対象とし、MelatoninとPRL分泌関連を検討した。いずれの疾患群も、夜間のPRL値は正常群に比し早期より分泌の増量を開始し、しかも著明な分泌の増量を示した。一方、Melatonin分泌は、MH群では血中濃度、増量パタ-ン共に、正常群と差は認められなかったが、NH群では、早期より増量を開始し、ピ-ク値も正常群に比し著明な増量を示した。このMelatoninーPRL分泌パタ-ンは睡眠因子を除外した暗条件下でも再現されることから、夜間のPRL分泌に対してMelatoninが強く関与していることが明らかとなった。更に、血中Melatoninが極めて低値で推移する日中に、Melatoninを内服負荷することで、MelatoninーPRL分泌関連を検討すると、MH群では、間脳ー下垂体のMelatoninに対する感受性が亢進していることに、またNH群では夜間のMelatonin分泌の著明な増量に、その機序が求められることを明らかにした。(2)基礎的検討:Melatoninのprolactin分泌機構を明らかにするために、卵巣摘除、成熟雌ラットを用いて検討した。Melatonin100μgを頚静脈より投与することで投与後4060分にピ-クを示すPRL分泌の増量を示した。下垂体門脈血中レベルのDopamin量となるように頚静脈よりDopamin0.4μg/kg/minを連続投与するとPRLの有意の低下がみられた。更に、この条件下でMelatoninのPRL分泌作用はDopamin示を有する機序によることが強く示唆された。

下垂体より分泌されるprolactinは、夜間に増量することが知られているが、筆者らは、この夜間のpro-lactinの増量には、松果体より分泌されるmelatoninが強く関与していることを明らかにしてきた。今回の研究は、このmelatoninのprolactin分泌機構を解明することを目的とした。次に、melatoninのOpioid系に対する影響を正常月経周期を有する成熟婦人を対象に検討した。melato-nin 1mgを日中13時に内服負荷させると、投与後3時間にピークを示すprolactin分泌の増量が示された。一方、OpioidのantagonistであるNaloxone(1.6mg/h)の連続投与下にmelatoninを内服負荷してもprolactin分泌パターンには差は認められなかった。また、melatonin投与後に血中β-endorphin値の変動は認められなかった。以上の検討成績から、melatoninのprolactin分泌の増量は、視床下部のDopamine Neuron活性を減弱させる機序に基づくことが強く示唆された。
ロシア沿海地方における渤海(698～926年)の考古学的研究

本研究はロシア沿海地方における渤海の実態を考古学的に解明することを目的とし、遺跡データベースの構築と遺跡や出土遺物の調査を行った。研究の結果、渤海はウスリースク平野までの沿海地方南部を面的に支配し、ウスリー川流域やシホテアリン山脈など沿海地方北部では鉱物資源の採掘場所や金属生産の拠点と交易拠点を中心に支配していた可能性の高いことが明らかとなった。調査経過ロシア科学アカデミー極東支部(ウラジオストク市に所在。以下、研究所と記す)に出かけ、調査計画の打合せをするとともに5月8日付けで研究協定を締結。9月10日24日にかけて、小嶋・佐々木ほか3名の計5名とロシア側3名でラズドリナヤ河流域の遺跡を中心として踏査。各遺跡の地形立地や土塁の状況などを観察した。10月29日11月5日には、研究所のゲルマン氏を招へいし研究交流をおこなう。2月7日14日には、小嶋ほか3名がラズドリナヤ河流域出土資料を中心に実測・写真撮影し研究交流をした。3月21日25日には、小嶋がウラジオストクで開催されたシンポジウム「極東の古代・中世における民族・文化の交流」で調査成果を報告した。また、研究所のニキーチン氏が中心となってラズドリナヤ河流域の渤海を主とする遺跡データベースを構築した。調査成果今回の遺跡踏査で、ラズドリナヤ河をはさんで渤海遺跡の様相が異なることに気づいた。ラズドリナヤ河右岸には渤海の仏教寺院遺跡が4ヵ所あるが、左岸以北にはこれまでのところ未発見である。山城の石垣の構築技法も、河を挟んで異なっている。この差異の背景について、次年度以降の遺跡踏査を続ける中で検討を進めたい。また、ラズドリナヤ河流域の靺鞨から渤海・女真の土器を実測・撮影し、この地域の土器様相について把握することができた。次年度はウスリー河流域の土器を調査する予定で、地域ごとの土器様相の差異を明らかにしたい。今年度に調査したラズドリナヤ河流域は渤海の率賓府に含まれる地域と推定しており、今回の調査によりその考古学的な様相を把握できた。次年度以降の調査で、渤海の領域北辺部について実体を明らかにできると期待している。調査経過5月7日10日にロシア科学アカデミー極東支部歴史学民族学考古学研究所(以下、研究所と略す)博物館長のニキーチン氏を招へいし、青山学院大学の教室を借用して「2009年度調査の概要報告と2010年度調査について」と題する研究会を開催した。9月5日8日にウラジオストクで開催されたクラスキノ城跡発掘30周年記念シンポジウムに小嶋芳孝が参加し、「渤海の交通路」について報告。9月9日19日に、中澤寛将、福永徹と合流してニキーチン館長らと共にウスリー河流域の遺跡踏査を実施した。2月10日17日にかけて、小嶋芳孝がウラジオストクとノヴォシビルスクのロシア科学アカデミーシベリア支部を訪問。ノヴォシビルスクには、研究所からイブリエフ副所長、ニキーチン館長、研究生のE.ニキーチン、テレリュエフの四名が同行した。3月20日24日にかけて、小嶋芳孝と中村晋也(金沢学院大学准教授)がウラジオストクの研究所を訪問して資料調査を行った。調査成果6月の研究会では、ラズドリナヤ河流域に分布する遺跡の状況について報告検討を行った。9月のウスリー河流域とイマン川流域の遺跡踏査では、約20ヵ所の遺跡を踏査した。踏査した山城や平地域の多くは渤海末期の10世紀代に造営が始まっており、渤海滅亡前後にこの地域で社会的な変動のあったことを想定できる。また、今回の踏査でウスリー川流域の谷平野からカヴァレロヴォやダルニエゴルスクへ至る谷筋にチュグエフカ城跡やコクシャロフカ2遺跡などの大型平地域が造営されていることがわかり、両遺跡が交通の要衝に立地していることに気づいた。イマン川流域では予想以上に遺跡が多く分布していた。ニキーチン氏によると、イマン川の北方にあるビキン川流域では遺跡数が少なくなっており、ラズドリナヤ河からイマン川の間が一つの領域として設定できるようである。2月のノヴォシビルスクでの調査は、シベリア支部が1980年代以前に調査した沿海地方のボリソフカ遺跡などの渤海遺跡から出土した遺物を中心に調査した。3月のウラジオストクでの調査は、9月の調査で採集した遺物の実測と写真撮影を実施した、また、極東大単博物館が所蔵するアプリコス寺院出十の遺物も、実測・撮影を行った。調査経過6月23日26日に小嶋がウラジオストクに出かけ、ロシア科学アカデミー極東支部(以下研究所と記す)のY.ニキーチン氏を訪ねて夏季調査の打ち合わせをした。調査対象地域は沿海地方海岸部のルドナヤ・プリスタニからアムグーとし、期間は9月11日25日となった。9月11日25日に夏季調査を実施。

小嶋は11日に出発し、12日14日までクラスキノ城跡の調査に参加。15日に、青森県教育委員会の中澤寛将氏が訪ロして小嶋と合流。Y.ニキーチン氏をはじめとするロシア側チーム(4名)と共にダルニエゴルスクに向かう。24日まで海岸部の遺跡を踏査し、25日に小嶋と中澤は帰国。2月9日14日に、小嶋と研究所のY.ニキーチン氏、イブリエフ氏がサハリン州のユジノサハリンスクを訪問。サハリン州立大学とサハリン郷土博物館が所蔵する土器を調査。3月8日15日に、研究所のE.ニキーチン氏とテレリュエフ氏を日本に招聘。金沢で調査報告会を開催し、その後、奈良国立文化財研究所が所蔵する渤海関係資料などを調査。3月19日26日に、小嶋と石川県立金沢商業高校教諭の河村好光氏が訪ロ。ウラジオストクの研究所で、沿海地方出土の装身具を中心に資料調査。調査成果9月の調査では、沿海地方北部における海岸地域の様相を把握することができた。途中立ち寄った、コクシャロフカ遺跡(研究所と韓国文化財庁が共同調査)では、下層から渤海の土器が出土していた。このことは、北緯*度付近までは渤海が領域としていた時期のあったことを示す。今回調査したルドナヤ・プリスタニからアムグーの海岸地域では、テルネイあたりから針葉樹林が卓越して落葉広葉樹林が減少している。昨年度調査したイマン川の北を流れるビキン川流域でも同様の植生変化が見られるようであり、落葉広葉樹林地帯が渤海の領域と関わっている可能性が高い。ルドナヤ・プリスタニからアムグーにいたる地域では、見晴らしの良い岬に710世紀頃と推定される遺跡がいとなまれている事例を多く見た。2月のサハリンでの調査は、セデイフ遺跡やシラヌシ遺跡から出土した遺物を中心に調査した。3月のウラジオストクでの調査は、9月の調査で採集した遺物の実測と写真撮影を実施した。また、沿海地方の靺鞨・渤海の遺跡から出土している管玉やガラス玉などの装身具類の実測・撮影を行った。
制御性T細胞とTh17細胞を標的とした慢性移植片対宿主病治療の開発

同種造血幹細胞移植は、白血病など血液悪性疾患に治癒をもたらす治療法として確立しているが、移植片対宿主病(GVHD)は致死的合併症として今日なお克服すべき最大の課題である。本研究ではまず、慢性GVHD発症マウスモデルを用いて体内のT細胞を解析したところ、従来考えられていたTh2細胞に加えてTh1細胞およびTh17細胞が移植後後期に増加していることが明らかとなった。さらに血清中のTh1およびTh17サイトカインが増加している、IFN-γ/IL-17ノックアウトマウスの移植後に慢性GVHDが軽減することからTh1およびTh17細胞が慢性GVHD発症に関与していることが強く示唆された。最後に合成レチノイドであるAm80は、Th1・Th17への分化抑制作用をもち、移植後に投与することで慢性GVHDが抑制されることが明らかとなった。慢性移植片対宿主病(GVHD)は、自己免疫疾患や免疫不全様の病態を呈し、同種造血幹細胞移植における移植後晩期の主要な死因のひとつである。レチノイン酸(ATRA)は、免疫制御作用を有しまた、合成レチノイドであるAm80はATRAに比較してレセプターへの結合活性が強く、アレルギー性脳脊髄炎などの自己免疫疾患モデルマウスにおいて発症進展を抑制することが知られている。我々はATRAやAm80が慢性GVHDに及ぼす影響を、慢性GVHDマウスモデル(ドナー:Bl0.D2、ホスト:BALB/c)を用いて検討した。移植後day21よりAm80(1.0mg/kg)投与した群はコントロール群に比べ有意に慢性GVHDの臨床スコアが改善した。また、移植後day0より連日、ATRA(200μg/body)あるいはAm80を経口投与すると、慢性GVHDの臨床スコアはATRA投与群で軽度改善、Am80投与群では明らかに慢性GVHDの発症を抑制した(p=0.0003)。皮膚病理組織でもA80投与群では病理スコアが改善し(p=0.003)、線維化因子であるTGF-βのmRNA発現も有意に減少していた。移植後day16の末梢皮膚所属リンパ節における細胞内サイトカインをFACSで検討したところIFN-γ、IL-17陽性細胞がAm80投与群では有意に減少していた。さらに、リンパ節細胞からのサイトカイン産生能もAm80投与群でIFN-γ、IL-17、TNF一α、IL-6が有意に減少していた。リンパ節における細胞内Foxp3陽性細胞と皮膚組織Foxp3mRNA発現を測定したところ、Am80投与群では減少しており、本モデルにおいてはIL-6やTGF-βの低下により制御性T細胞はむしろ低下したと考えられた。宿主抗原提示細胞からのアロ抗原提示によってドナーリンパ球の急激な増殖と、それに続く体内でのサイトカインの急激な上昇により、移植片対宿主病(GVHD)が発症する。GVL効果を保持したGVHD制御には、この急激なドナーリンパ球の増殖を抑えることが重要であると考えられる。GVHDとGVLはともに抗原提示細胞からのアロ抗原提示を認識し活性化すが血液系細胞以外の細胞に発現するアロ抗原がGVLにどのような影響があるかはいまだ、明らかとなっていない。マウスモデルを使い調べたところ、上皮系細胞に発現するPD-1によりドナー細胞がアポトーシスを起こし、GVL効果を減弱させることがあきらかとなった。また、移植後期に発症する慢性GVHDは急性GVHDと発症時期が異なるだけでなく、その病態も異なると考えられている。慢性GVHDは、移植細胞により免疫が再構築される段階で、自己抗原反応性T細胞が出現し自己免疫疾患に類似した臨床像を呈すると想定されている。慢性GVHD後のサイトカインをまず検討し、IL-17 IFN-gammaを産生するドナー細胞が増加していることを明らかとなった。IL-17欠損マウスによって慢性GVHD発症が抑制されるかを検討したところ、慢性GVHD発症が抑制されTh17細胞の関与が示唆された。また、IFN-gamma欠損マウスによっても慢性GVHD発症が抑制されIL-17、IFN-gammaの関与が示唆された。そこでIL-17、IFN-gammaを低下させるAm80を移植後投与したところ慢性GVHD発症が抑制され、発症予防、治療効果が認められ、新たな治療薬としての可能性が示唆された。同種造血幹細胞移植は、移植片対白血病効果により白血病に治癒をもたらす治療法として確立している。一方、合併症であるGVHDは原疾患以外の最大の移植後死亡原因である。GVHDは急性GVHDと移植後100日以降に発症する慢性GVHDに大別される。

移植後期に発症する慢性GVHDは急性GVHDと発症時期が異なるだけでなく、その病態も異なると考えられている。急性GVHDに比べ慢性GVHDはこれまで十分な研究がなされていないのが現状である。臨床的にも有効な治療法がなく、急性GVHDの予防・治療に用いられるシクロスポリンなどのカルシニューリン阻害薬では慢性GVHDに効果を認めず、その病態の解明と新たな治療法の開発は急務である。本研究においてはマウス同種移植モデルを使い、まずシクロスポリンが新規Tregによる長期の免疫寛容再構築を阻害するのに対し、m-TOR阻害剤は阻害しないことを明らかにし、慢性GVHD予防法としてm-TOR阻害剤が有用であることを明らかにした。次に、慢性GVHD発症マウスモデルを用いて体内のT細胞を解析したところ、従来考えられていたTh2細胞に加えてTh1細胞およびTha7細胞が移植後後期に増加し、慢性GVHDの標的臓器である肝臓や肺に浸潤していることが明らかとなった。さらに血清中のTh1(IFN-・)およびTh17(IL-17)サイトカインが増加していること、およびIFN-・ノックアウトマウス,IL-17ノックアウトマウスの移植後に慢性GVHDが軽減することからTh1およびTh17細胞が慢性GVHD発症に関与していることが強く示唆された。最後に合成レチノイドであるAm80は、Th1・Th17への分化抑制作用をもち、移植後に投与することで慢性GVHDが抑制されることが明らかとなった。本研究によりTh1・Th17細胞が慢性GVHD発症に関与すること、Am80がTh1・Th17細胞の抑制を介して慢性GVHDを改善することが明らかとなった。本研究の結果により、慢性GVHD発症の新たなメカニズムが解明されたとともに、これまでステロイド以外に有効な治療法がなかった慢性GVHDに対し、Am80は全く新たな作用機序をもつ薬剤として臨床応用される道が開かれた。
アクロメリン酸の選択的神経細胞障害の発現機序:グルタミン酸受容体との関連

アクロメリン酸は特異な選択的神経細胞障害作用を持つ非NMDAタイプの強力な興奮性アミノ酸であるが、その作用する受容体を明らかにする目的でグルタミン酸受容体に対する結合能を測定した。1.[ ^3H]カイニン酸、[ ^3H]AMPAのラット脊髄シナプトゾ-ム分画に対する結合能をフィルタ-法により測定し脊髄におけるカイニン酸、AMPA受容体の特性を明らかにした。脊髄のカイニン酸受容体、AMPA受容体とも結合部位は一種類であり、それぞれの解離定数(Kd)とBmaxは6.2+0.9nMと52+4.0fmol/mg protein、および7.6+1.5nMと70+5.6fmol/mg proteinであり、共に脳でのそれぞれの受容体の高親和性結合部位に近い性質を持つことが明らかになった。2.これら受容体に対するアクロメリン酸を含む種々のリガンドの結合能の強さを[ ^3H]カイニン酸(2.2nM)、[ ^3H]AMPA(3.0nM)結合の阻害作用により測定した。親和性の高さは、カイニン酸受容体ではド-モイ酸>カイニン酸>アクロメリン酸>>キスカル酸=AMPA、AMPA受容体ではキスカル酸>AMPA>アクロメリン酸>ド-モイ酸>カイニン酸の順であった。アクロメリン酸のAMPA受容体に対する親和性がカイニン酸より強いが、比較的純粋なカイニン酸受容体を持つ脊髄後根神経C線維においては、AMPA、キスカル酸共に弱い脱分極作用を持つにもかかわらずアクロメリン酸がカイニン酸よりも高い脱分極作用を持つのでAMPA受容体に働くとは考えにくい。これらの結果はアクロメリン酸の極めて強力な脱分極作用および選択的神経細胞毒性の発現には、カイニン酸受容体、AMPA受容体のいずれとも異なった受容体(アクロメリン酸受容体)が関与しているることを強く示唆する。3.Autoradiographyは現在進行中である。
スピン偏極した不安定核ビーム生成法の開発

近年、安定領域から遠く離れた不安定核を大量に生成しビームとして供給する、不安定核ビーム施設が稼働しつつある。本研究は、任意の不安定核のスピンを偏極させる方法を開発しようというものである。それによって、不安定核の波動関数を求めるための核分光的測定が可能となり、不安定核の特異な構造を解明することが可能になる。われわれの採用したのは、スピン偏極した電子を不安定核イオンに受け渡すという方法である。偏極電子としてアルカリ原子(Rb)の最外殻電子を用いる。電子スピンは、レザー光ポンピング法によって、100%近く偏極させることが可能である。イオンビームに受け渡された電子と原子核の間に働く超微細構造相互作用によって核偏極が生成される。この方法は陽子については非常な成功を収めているが、重い核については例がない。そこで、その有効性を実証し、最適条件を探るためのテスト実験装置を製作した。今年度全ての装置が完成し、この新しい偏極法を実証する実験を開始した。そして、安定核ビーム窒素14の核偏極度2%程度、ビームの透過率60%程度を達成出来た。これは充分に実用になる性能である。成功すれば、不安定核の波動関数を求めるための核分光的測定が可能となり、不安定核の特異な構造を解明することが可能になる。さらに、不安定核が崩壊する際に放出する放射線を用いて物資内部や生体内部の様子を探るという新しい応用にもつながる。偏極電子としてアルカリ原子の最外殻電子を用いる。これは陽子については非常な成功を収めているが、重い核については例がない。実験装置は、安定核イオンビームを供給する部分、アルカリ原子Rbの最外殻電子を光ポンピングによって偏極させイオンビームと衝突させる部分、ビームフォイル分光法に基づいて核偏極を測定する部分からなる。平成10年度末までに、装置の9割が完成した。これまでに、Rbを90%程度に偏極させることに成功した。また、核偏極を非常に高感度で測定出来るシステムを完成させた。核偏極を生成する実験の準備がほぼ整ったと言える。実験は平成11年度の早い時期に行うことが出来るであろう。近年、安定領域から遠<離れた不安定核を大量に生成しビームとして供給する、不安定核ビーム施設が稼働しつつある。
フェレットを用いた高次視覚神経系の形成過程の分子メカニズム解析

外界からの視覚情報は網膜で検出され、中継核である視床の外側膝状体(LGN)を介して、大脳皮質一次視覚野へと伝達される。右もしくは左眼由来の軸索はLGN内で異なる場所を支配していることが知られており(眼特異的投射)、眼特異的投射は神経回路形成のメカニズムを解析するための代表的なモデル系として使われている。発生段階の早期には、左右両眼からの軸索はLGN内で完全にオーバーラップしており、支配領域の分離は見られない。フェレットやマウスでは生直後より両眼由来の軸索の分離が始まり、生後10日には分離が完成することが知られている(眼特異的軸索分離)。従来の研究によれば、この眼特異的軸索分離は網膜からの感覚入力により形成することが知られているが、一端、軸索分離が完成した後にさらに眼特異的投射は可塑的に変化できるのか、臨界期はいつまでかという点はあまり分かっていなかった。そこで我々は、眼特異的投射が完成した後の生後10日齢に一側の眼球を除去し、反対側の残存眼由来の軸索のLGN内での分布を検討した。その結果、残存眼に対して、同側および対側のLGNでいずれも残存眼由来軸索の投射領域が有意に広がっていることを見出した。この片眼切除による残存眼由来軸索投射パターンの変化は、片眼切除5日後にはすでに見られ、15日後には最大値に達していた。これらの結果は、眼特異的投射が完成した後でも、さらに軸索投射パターンが可塑的に変化する性質を持ち続けていることを意味している。さらに臨界期を検討するために、片眼切除を行うタイミングを検討した。生後22日に片眼切除を行ったところ、投射領域は広がるものの広がりの程度はごく軽度であった。生後34日に片眼切除を行った場合には、投射領域の広がりはまったく見られなかった。これらの結果は、片眼切除による残存眼由来軸索投射の可塑的変化には臨界期が存在しており、生後22日から34日までの間に臨界期が終了していることを示唆している。LGN内では、LGNの表面に沿って網膜軸索retinotopyマップが広がり、表-深層方向に質的に異なる情報が投射されている可能性が報告されている。そこで、LGN表面に対して、平行方向、および垂直方向への残存眼由来軸索投射の可塑的変化を検討した。その結果、残存眼由来軸索は垂直方向に広がりやすく、平行方向には広がりにくいことを見出した。この結果は、LGN内において、網膜由来軸索投射の可塑的変化の起きやすい方向があることを意味しており、何らかの分子的制約がかかっている可能性がある。今後は、本研究により見出されたLGNにおける網膜軸索投射の可塑性、臨界期の分子メカニズムの解明が重要な課題であ外界の視覚情報は網膜で検出され、中継核である視床の外側膝状体(LGN)を介して、大脳皮質視覚野へと伝達される。網膜からLGNへと至る神経回路は、神経回路の形成過程を解析する上での代表的なモデル系である。LGN内では、右もしくは左眼由来の軸索が異なる場所を支配していることが知られている(眼優位性投射)。しかし発生段階の早期には、左右両眼からの軸索はLGN内で完全にオーバーラップしており、生直後より両眼由来軸索の分離が始まる(眼優位性軸索分離)。網膜自発発火を抑制すると眼優位性軸索分離が阻害されることから、眼優位性軸索分離には網膜自発発火が重要であることが示されてきた。従来、網膜自発発火の阻害効果は、RGC軸索の競合阻害により生じると考えられてきたが、もう一つの可能性、即ち網膜自発発火の抑制がLGNの分化過程を阻害し、その結果として眼優位性軸索分離が阻害されるという可能性は検討されてこなかった。そこで我々は、発生過程においてLGNに発現する遺伝子群のスクリーニングを行い、LGNの分化進行とともに発現が変化するLGN分化マーカーを単離することに成功した。これらの分子の発現を指標としてLGNの分化過程の進行を検討したところ、網膜自発発火を抑制してもLGNの分化過程の進行を止めないことを見出した。さらにLGN培養系を用いてもLGN分化過程が進行したことから、眼優位性軸索分離時期のLGN分化は網膜自発発火非依存的であることが示唆された。

そこで我々は、眼特異的投射が完成した後の生後10日齢に一側の眼球を除去し、反対側の残存眼由来の軸索のLGN内での分布を検討した。その結果、残存眼に対して、同側および対側のLGNでいずれも残存眼由来軸索の投射領域が有意に広がっていることを見出した。この片眼切除による残存眼由来軸索投射パターンの変化は、片眼切除5日後にはすでに見られ、15日後には最大値に達していた。これらの結果は、眼特異的投射が完成した後でも、さらに軸索投射パターンが可塑的に変化する性質を持ち続けていることを意味している。さらに臨界期を検討するために、片眼切除を行うタイミングを検討した。生後22日に片眼切除を行ったところ、投射領域は広がるものの広がりの程度はごく軽度であった。生後34日に片眼切除を行った場合には、投射領域の広がりはまったく見られなかった。これらの結果は、片眼切除による残存眼由来軸索投射の可塑的変化には臨界期が存在しており、生後22日から34日までの間に臨界期が終了していることを示唆している。LGN内では、LGNの表面に沿って網膜軸索retinotopyマップが広がり、表-深層方向に質的に異なる情報が投射されている可能性が報告されている。そこで、LGN表面に対して、平行方向、および垂直方向への残存眼由来軸索投射の可塑的変化を検討した。その結果、残存眼由来軸索は垂直方向に広がりやすく、平行方向には広がりにくいことを見出した。この結果は、LGN内において、網膜由来軸索投射の可塑的変化の起きやすい方向があることを意味しており、何らかの分子的制約がかかっている可能性がある。今後は、本研究により見出されたLGNにおける網膜軸索投射の可塑性、臨界期の分子メカニズムの解明が重要な課題であ
原子レベルで制御したイリジウム酸化物における新奇超伝導相の創出

本年度は(1)トリコロール近藤超格子によるエキゾチック超伝導相の創出(2)カイラル超伝導体のエッジ電流の検出に向けたMicro-SQUIDの作製(3)酸化物分子線エピタキシー装置の立ち上げの3点に関する研究を行った。各々の研究実績の詳細について説明する。(1)d波超伝導体CeCoIn5(n = 5, 7層)と非磁性金属化合物YbCoIn5(3層)、及びYbRhIn5(3層)の3物質を交互積層させたトリコロール近藤超格子を分子線エピタキシー装置により作製し、グローバルな空間反転対称性の破れと超伝導の関連性について評価を行った。その結果、上部臨界磁場の温度依存性と角度依存性からCeCoIn5のパウリ対破壊効果が強く抑制されていることを明らかにした。更にHc2に変曲点が存在することを確認し、ヘリカルもしくはストライプ超伝導などのエキゾチック超伝導相が実現している可能性を示した。(2)カイラル超伝導体におけるカイラルエッジ電流を検出するために、Nb薄膜を用いてMicro-SQUIDの作製を行い、その素子の動作確認を行った。その結果、IV測定によりSIS接合に由来したJosephson電流の観測に成功し、更にMicro-SQUIDのリンク幅を変化させることでJosephson電流の臨界電流値が制御可能であることも明らかにした。今後は磁場中におけるMicro-SQUIDの動作性能を向上させ、URu2Si2の低温化における磁化測定を行うことを計画している。(3)酸化物の薄膜や人工超格子の作製に必要な酸化物分子線エピタキシー装置の立ち上げ及びルテニウム酸化物Sr2RuO4薄膜の作製を試みた。その結果、蒸着中に周期的なRHEED振動を確認し、薄膜X線構造解析からc軸方向への高い配向性を有することを明らかにし、Sr2RuO4のエピタキシャル薄膜の成膜に成功した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
標準模型の有限温度での振る舞いについて

高温高密度では、ハドロンを構成しているクォークは束縛から解放されクォーク・グルオン・プラズマ状態になる。本研究は、有効伝搬関数と有効頂点関数を用いて、ゲージ不変なクォークとグルオンの有効自己エネルギー及び有効n点関数を求め、さらにその情報からクォーク・グルオン・プラズマ状態についての現象論的予言をすることである。成果として、ピンチテクニックの処方を使って1ループのレベルで有限温度でのゲージ不変なグルオンの有効自己エネルギー(2点関数)を求めるのに初めて成功した。得られた表式は少々複雑であるが、それは、ゲージ不変であるだけでなく、独立な成分が2成分だけであるといういわゆる「トランスヴァーサリティ」関係式を満たすことがわかった。また得られた有効2点関数からグルオンの減少率を計算すると、以前別の方法で求められていた結果と一致した。これらの成功は、ピンチテクニックの処方を用いたゲージ不変なクォークとグルオンの有効n点関数の導出法の有用性を示唆している。また、クォークとグルオンの力学を記述するQCD理論を用いて核子や光子のスピン構造を調べた。特に、核子については、そのスピン構造関数のひとつ、g^2は、カラーの自由度、N_c→∞の極限では、簡単なQ^2-発展方程式に従うこと;さらに、光子については、光子の中のクォークとグルオンのスピン分布関数が摂動の2次のオーダーまでパラメーターなしで予言できることなどが示せた。今年度の成果として、ピンチテクニックの処方を使って1ループのレベルで有限温度でのゲージ不変なグルオンの有効自己エネルギー(2点関数)を求めるのに初めて成功した。同じ方法を用いて、現在、グルオンのゲージ不変な1ループ有効3点関数を求める研究が進行中である。そのあと、求めた有効3点関数と有効2点関数との間にQED的な簡単なワード・高橋恒等式が成り立つことを示し、さらに、結合定数の温度依存性の情報を提供するゲージ不変な熱β関数をグルオンの有効自己エネルギーから導くことが、目標である。特に、核子については、そのスピン構造関数のひとつ、g_2は、カラーの自由度、N^C→∞の極限では、簡単なQ^2-発展方程式に従うこと;
手術中のアーチファクト存在下でのBIS値およびAEP値の信頼性の比較検討

顎骨骨切り術中のBISモニターとAEPモニターによる鎮静度評価の信頼性について比較した。手術前、骨切削時、骨分割時、手術終了時について検討したところ、ストレス反応の指標(血清コルチゾル濃度、心拍・血圧変動解析により評価した交感神経活動指標、心拍数・収縮期血圧)に変化は認めなかったが、BIS値およびAEP指数の平均値は骨切削時および骨分割時にやや高値を示す傾向があり、特にBIS値は骨切削時に有意に変動が大きかった。両者とも鎮静度評価の面で臨床的に問題はないが、特にBIS値は骨切削時の評価に注意が必要であると考えられた。意義および重要性:近年、全身麻酔時に、術中覚醒や麻酔薬の過量投与を防ぐため、BISモニターを使用して鎮静度を評価することが一般的になっている。しかしBIS値による評価は、切削機器による振動や電気メス、頭部の筋電図等がアーチファクトになる点や、使用麻酔薬により信頼性が異なる等、問題点も多い。本研究は、特にアーチファクト混入が顕著である顎骨骨切り術に焦点を絞り、BIS値をもう一つの鎮静度評価法である聴覚脳幹誘発電位(AEP)値と比較検討する。また、自律神経活動解析や血清コルチゾル濃度測定により鎮痛状況の確認も行うことで、より詳細で正確な鎮静度評価を行い、鎮静度評価方法の向上を目指すものである。具体的内容:歯科口腔外科手術である顎骨骨切り術を施行される患者を対象とし、AEP値を鎮静度の指標として、全身麻酔管理を行う。取得データとして、AEP値、BIS値、循環動態、自律神経活動指標を連続的に測定する。また、血清コルチゾル濃度を、侵襲が大きくアーチファクト混入が起こりやすい骨切削時および骨分割時、侵襲が少なく麻酔状態が安定する手術前および手術終了時の4時点で測定する。自律神経活動解析や血清コルチゾル濃度により推測されるストレス反応をもとに、疼痛反応のない時点でのAEP値とBIS値の変化を比較検討し、麻酔安定時だけではなく、特に手術侵襲時の鎮静度評価の正確性について考察を行う。当該年度に実施した研究の成果:当該年度は研究倫理審査委員会の承認を受け、研究に必要な機器及び物品等を揃えて研究環境を整え、被験者を募集して研究データの取得を行っている段階である。本研究は、顎骨骨切り術施行予定の患者を対象としている。顎骨骨切り術は、20歳前後の若年者を対象にすることが多いため、学生の場合、夏季休暇等の長期休暇を利用して手術が施行されるケースが多い。研究代表者が、厚生労働省派遣医師事業である沖縄県重度心身障害者全身麻酔下歯科治療事業(平成28年7月6日から同年8月3日まで)へ参加することになり、学生の夏季休暇期間に当たる期間に当研究を行えない時期があったために、研究データを取得できた被験者数が予定していた人数よりも少なくなった。また、当初は研究協力の意思を自身で決定できる成人患者のみを対象としていたが、想定していたよりも未成年の患者割合が多く、研究対象となる患者数が少なかったことも一因である。近年、全身麻酔時に、鎮静度評価のためにBISモニターを使用することが一般的になっている。しかしBISモニターによる評価は、手術中に使用する切削機器による振動や、電気メス等がモニター評価の妨害因子になる可能性がある。評価不能や評価誤認は、麻酔薬の過少・過量投与に繋がる危険性がある。本研究では、特に妨害因子の混入頻度の高い歯科口腔外科手術である顎骨骨切り術の際のBIS値を、もう一つの鎮静度評価法である聴覚脳幹誘発電位(AEP)値と比較検討した。また、循環動態、自律神経活動解析や血清コルチゾル濃度測定により術中のストレス反応の確認も併せて行うことで、より詳細な考察を目指した。顎骨骨切り術を施行された患者を対象とし、全身麻酔中のAEP値を鎮静度の指標として全身麻酔管理を行い、データを取得した。取得データとして、AEP値、BIS値、循環動態、自律神経活動指標を連続的に測定した。また、ストレス反応を反映する血清コルチゾル濃度を、手術操作による妨害因子の混入が起こりやすい骨切削時および骨分割時、麻酔状態が安定する手術前および手術終了時の4時点で測定した。循環動態、自律神経活動解析や血清コルチゾル濃度により推測されるストレス反応では、測定時全てにおいて異常高値や上昇反応を認めず、全身麻酔中の鎮痛および麻酔深度は保たれていると考えられた。各時点でのAEP値とBIS値の変化を比較検討したところ、BIS値は、特に骨切削時および骨分割時に値の変動が大きくなる傾向が認められたものの、平均値としては大きな乖離は認めず、AEP値と同等の麻酔深度を示した。これにより、麻酔深度や疼痛刺激にかかわらず、おそらく手術中の妨害因子により、BIS値は大きく変動する傾向があり、連続的な観察が必要であることが示唆された。

平成29年度は、本研究の対象患者である顎骨骨切り術施行予定である患者が多くなる夏季休暇を含めて、研究を行える環境がすでに整っているため、前年度よりも大幅に被験者数が増加すると考えられる。また、できるだけ被験者数を増やすために、当初は成人患者を対象としていたが未成年の患者も対象に含めて研究を行う予定である。このために当病院の研究倫理審査委員会に変更申請を行う予定である。歯科麻酔学本研究では血清コルチゾル検査を外部業者に委託しているが、その検査費用は平成29年度に一括して支払う予定になったため、平成28年度に支払うことを想定して申請していた金額を使用しなかった。国際学会への参加を予定していたが参加を見合わせた。次年度に血清コルチゾル検査費用を支払う予定である。
塔状構造物に生じる高風速渦励振の発生機構の解明

円柱を片持ち支持した模型(展望用タワーや橋梁主塔などの塔状構造物の単純なモデルと考えられる)において、2次元円柱において予想される渦励振発言風速において発生する通常の渦励振とは別に、その3倍程度の高風速域において渦励振のような限定振幅振動が発現する。この現象を本研究では「高風速渦励振」と呼ぶが、その発現メカニズムを解明することを目的に実験的研究を行なった。高風速渦励振は、塔状構造物上端周りの流れによって生じる変動空気力が原因となって起こると考えられる。そこで予備的検討として、上端部に円柱直径よりも1.7倍大きな直径をもつ円盤を取り付けた模型についてその応答を測定したところ、高風速渦励振は発現しなかった。上端周りの流れが変化したことがその理由と考えられる。また、円柱模型の上端周りの流れの可視化を行なったところ、大きな3次元的な渦が発生していることが確認された。大きな渦はより低周波数の空気力を作用させることから、この渦が高風速渦励振の原因となっている可能性が高い。研究計画では、圧力模型を用いて作用する空気力と模型後流の風速変動の関係を明らかにする予定であったが、圧力模型は寸法を大きくする必要があるので、まずそれに対応する直径50mm、高さ1250mmの1自由度振動模型を製作し、こうした大きな模型においても高風速渦励振が発現することを確認した。また、後流の風速変動の詳細な計測も行なっており、現在はデータの解析を行なっている。圧力模型を用いた実験はまだ行なえていないが、本研究により実現の見込みがついたので、今後実施し、現象の詳細な発生メカニズムを検討していく予定である。
P.gingivalis歯性感染による早期出産におけるTLR2の役割の解明

我々はこれまでに歯周病原細菌P.g.の歯性感染による早期出産の誘導、Toll like receptor2(TLR2)経路が関わる可能性を報告したが、その機序が明らかでない。本研究で、1P.g.歯性感染時胎盤におけるTLR2発現上昇は、出産関連因子産生促進を介し早産発生関与するか、2TLR2の抑制は歯性感染の誘導する早産を予防できるか、3歯周炎に罹患した妊婦胎盤でTLR2発現上昇と出産関連因子産生増加がみられるか、研究を進めることで、P.g.歯性感染が誘導する早産におけるTLR2の役割を解明し、早産予防にTLR2を標的とした新たな治療戦略を確立するための基礎的データとする。
心身障害児教育に向けた脳の構造と機能の三次元マルチメディアデータベース構築の研究

現在、重度重複化が進んでいる障害児教育において、その障害に何らかの形で脳機能の障害が関与している場合が多くなってきている。このような現状を踏まえ、本研究は、障害児教育において必要とされる脳の構造と機能に関する知識を、障害児教育に携わる教師が容易にしかも正確に理解し、障害児教育の実践に有効に活用することができるようにすることを目的としたものである。すなわち、障害児教育において必要とされる脳に関する知識を、最低限必要な基礎的知識から脳性麻痺、てんかん、自閉症および注意欠陥多動性障害など障害児教育の現場で接する機会の多い脳機能障害に至るまで体系的に理解できるようなデータベースの構築を検討した。多岐にわたる脳とその機能についての知見を整理し、肉眼的構造から神経細胞の微細構造にいたる脳の構造的な側面と、それらの構造と機能との関係、脳内核部位の相互関係をどのような形で提示するのが望ましいかを検討した。そして、複雑な脳の肉眼的構造を理解しやすいように、三次元画像を作成し、また、理解のしやすさと操作性の分かりやすさを考えてマルチメディア技術を応用して、使う人が自然に系統的な知識が得られるようなデータベースの構造を検討した。これらの結果に基づいて、実際に脳の構造と機能のマルチメディア三次元データベースのプロトタイプを作成した。本年度は、まず研究代表者と研究分担者が何回か集まって、脳の構造と機能の三次元マルチメディアデータベースの構成と盛り込むべき内容とその可能性の検討を、資料の収集および検討と併せて行ってきた。これにより、目標とするデータベースの概要が明確になったので、必要とされる情報を収集する役割の分担を行い、それらを三次元マルチメディアデータベースとして構築するに適した基本的なオーサリングソフトを検討し、マルチプラットフォームをサポートするもので、かつ使いやすい物を選定して、試用した。三次元の脳の構造の基本データとして、マクロの脳のスライス標本を収集し、一部を画像ソフトを用いてコンピュータに入力を開始した。ミクロの画像としては、何段階かの拡大率で部位を限定して顕微鏡写真を画像としてコンピュータに取り込むこととし、これは、マクロ画像と関連させて整理している。臨床的に用いられる脳の構造画像であるMRIなどの画像もデータベースに組み込むこととしたが、この作業は次年度に行うこととした。これらを集合する三次元データとしては、完全な三次元デジタルデータとして構成することは予算的に困難であるとの結論から、二次元画像の多スライスによる疑似三次元データとして構成することとし、その基本設計を行った。脳機能データに関しては、文献・資料の収集と整理を行い、分化した機能で局在が明確なものを中心にして入力に向けてまとめつつある。より微細な構造については、別の基準によって整理する必要が認められ、検討を行っている。また、小規模な三次元マルチメディアデータベースのプロトタイプを作成し、完成版のイメージをつかみやすくして作業することの必要性が明らかとなり、その準備を開始した。本年度は、脳の肉眼的構造について、3名の健常者のMRIを撮影し、その写真をスキャナーでデジタルデータに変換した。この2mmスライスの詳細なデータを元に脳の三次元データを作成し、これに、脳機能のデータを組み合わせられるように、各部位に分けたデータとしても、作成した。これらの成果を、前年度に行った脳のスライス標本と照合する作業を開始し、継続的に行っている。脳機能については、先行研究の文献や資料を収集して、コンピュータに入力し、画像データと関連されていく作業を継続的に行った。マルチメディアデータベースを構築する際の基本構造として、どのような設計をするかについて、現在主として用いられている形式について、それぞれの開発用のソフトウェア(オーサリングソフトウェア)を用いて試験的なデータベースを構築して、それぞれが、どの程度の機能を持っているか、使用者にとっての操作が容易で分かり易いか、データの量についての制限はどうか、閲覧する際の速度はどうか、などについてテストを行った。また、近年のインターネットの普及を考えて、WWWを通しての公開ができるようなシステム構築についても検討し、ソフトウェアの選定や一部でテストを行って、その機能や操作性を調べた。本年度は、これまでに収集しデジタル化した脳の肉眼的構造と機能のデータを整理し、開発用のオーサリンgソフトウェアとその支援ソフトウェアを用いて、マルチメディアデータベースとして組み立てる作業を行った。これによって、プロトタイプのデータベースを作成した。

基本的なオーサリングソフトウェアとしては、将来的なWWWによる公開を考慮して、その機能を持つマクロメディアディレクターを用い、これにデジタル化した画像データを組み込み、文字情報の入力を行った。特に、障害児教育に密接に関連する、脳性麻痺、学習障害、てんかんなどについては、それらの障害の原因やメカニズムが十分に分かりやすく表現されるように、データ間の連結を整理・統合するようにした。以上のようにして作成されたマルチメディアデータベースについて、試用した上、さらに改良すべき点について検討し、可能なものについてはデータベースの改変を行った。このような、脳の構造と機能の三次元マルチメディアデータベースの作成過程において検討された、データの内容、操作や検索の容易さ、そのための対応策や課題、データ構造のあり方などについて報告書にまとめた。
オリゴDNA修飾マイクロ電極を用いた新規バイオセンサーの開発

DNA鎖中で一つの塩基が他の塩基で置換される一塩基多型(SNPs)の検出に対して、脱塩基含有DNAをプローブとし、核酸塩基認識能を持つ電気化学活性小分子を用いたSNPs検出法の開発を目的とした。また、電極をナノ構造化することで電極面積の増大や速い電子移動速度の実現など、電気化学分析にとって効果的効果が期待できる。このことを考慮して、ナノ電極アレイを、金ナノワイヤーと導電性高分子とを複合化してバイオセンサーとしての適用性を検討した。一塩基多型(SNPs)は、薬剤耐性や病気の罹りやすさの指標となることから、迅速・簡易・廉価・正確なSNPsの検出法の開発は、ポストゲノム時代における遺伝情報を利用したテーラーメイド医療の実現に向けて極めて重要である。従来法ではDNAやRNAへの蛍光ラベル化が必要であったり、完全相補DNAとそうでないものとの識別に精密な温度調整が必要などの煩雑さがあった。これに対し、本研究では、脱塩基含有DNAをプローブとし、標的DNAと二重鎖を形成させて脱塩基空間を作り、この空間に核酸塩基認識能を持つ小分子をとりこませる。小分子が結合すると、脱塩基空間の無いDNA二重鎖ができ、電気伝導性が脱塩基空間のあるDNA二重鎖とは異なることになる。このことに着目して、SNPsの電気化学的検出に成功した。また、陽極酸化アルミナ膜細孔内に金ワイヤーを電析し、この金ワイヤー上に導電性高分子を成長させた電極アレイを作成し、生理活性物質であるNADHの高感度検出を達成した。一般的に遺伝子検出に用いられている既存の方法では、検出に用いる装置や試薬が特殊であることや、非常に高価であることなどの問題があり,簡便・安全・安価な検出方法の開発が現在強く望まれている。そこで、本研究では電気化学分析法が装置的にコンパクトであり且つ高感度であること、所用試料量が少ないことに着目し、1)ターゲットDNAへのラベル化を必要とせず、2)ミスマッチに関与する塩基の決定を可能にする電気化学一塩基多型(SNPs)検出法の開発を目的とする。これまでに,フラビンを検出リガンドとした電気化学検出が成功しているが,検出感度の向上のためには,リガンドの特性のみならず電極の改質も求められる。そこで,本年度は,陽極酸化アルミナ膜を鋳型とすることで金あるいはポリアニリンのナノロッドが集積したナノロッドアレイ電極を開発すると共に,その電気化学特性を検証した。アニリンモノマーあるいは塩化金酸を出発物質として,陽極酸化アルミナ膜を鋳型としたナノロッドアレイ電極を電積により作製したところ,アルミナ細孔を転写したロッド状構造物が試料電極上に直立・集積化されていることを走査型電子顕微鏡測定により確認した。また,得られたナノロッドアレイ電極を用いて,様々な溶液条件でサイクリックボルタモグラム(CV)測定を行ったところ,良好なCV応答が観測されて,SNPs検出用電極として使用可能であることが分かった。次年度は,このナノロッドアレイ電極を用いたSNPs検出への応用を目指す。本研究では、APサイトを有するプローブDNAを電極表面に固定化し、APサイトにおける水素結合性リガンドの電気化学応答を検出するDNAセンシングを目指している。電気化学的なDNA検出においては、電極表面の微細化による比表面積の増大が望まれる。また、電極表面に金属ナノ構造体を固定化させることで、比表面積の増大の他に、通常の平板電極では得られない触媒活性や光電気化学応答が得られる。このように、任意に制御された金属ナノ構造体を固体電極表面に形成することは、高感度な電気化学的DNA検出において重要である。さらに、固体電極表面における長鎖DNAのハイブリダイゼーション反応のためには、固体電極表面に高分子の被膜を形成させることが必須である。本年度は、特に固体電極表面に金ナノワイヤーを集積させた金ナノアレイの作製と共に、金ナノアレイに対するポリアニリンの電気化学的被服を試みた。さらに、ポリアニリンを被覆した金ナノアレイの電気化学応答について精査した。金ナノアレイの作製は、多孔性陽極酸化アルミナ膜を用いた鋳型電析によって行い、直径200nmの金ナノロッドが高密度で直立したものとした。この金ナノアレイに対してポリアニリンを数nmの厚さで皮膜させ、金ナノアレイとポリアニリン薄膜のハイブリッドアレイを作製した。作製したハイブリッドアレイについては、電気化学的に評価すると共に、NADHの触媒的電気化学酸化の応答について検討したところ、高感度なNADH検出に対して応用可能であることが分かった。

これに対し、本研究では、脱塩基含有DNAをプローブとし、標的DNAと二重鎖を形成させて脱塩基空間を作り、この空間に核酸塩基認識能を持つ小分子をとりこませる。小分子が結合すると、脱塩基空間の無いDNA二重鎖ができ、電気伝導性が脱塩基空間のあるDNA二重鎖とは異なることになる。このことに着目して、SNPsの電気化学的検出に成功した。また、陽極酸化アルミナ膜細孔内に金ワイヤーを電析し、この金ワイヤー上に導電性高分子を成長させた電極アレイを作成し、生理活性物質であるNADHの高感度検出を達成した。
ｔ（８；２１）ＡＭＬ発症におけるＡＭＬ１－ＥＴＯタンパク質の機能解析

AML1/Runx1は造血に重要な転写因子であり、ETO/MTG8は転写抑制因子である。急性骨髄性白血病(AML)罹患患者の一部において検出される異常な融合タンパク質AML1-ETOは、ETOの転写抑制機能によりAML1に対してドミナントネガティブに働いてAMLを引き起こす癌遺伝子と考えられるが、その分子機構は不明である。本研究はAML1-ETOタンパク質の機能解析により、t(8;21)AML発症のメカニズムを解明することを目的とする。我々は、co-factorからAML1-ETOの機能を明らかにするために結合分子を探索し、特に興味深い新規AML1-ETO結合タンパク質AEBP(AML1-ETO binding protein)について機能解析を行っている。昨年度までに、ヒト血球系培養細胞株等を用いた実験により、AML1とAEBPとの結合活性および相互作用について検討を行った。今年度は、血液系ガン患者特異的に検出される変異型AML1に着目した。変異型AML1とAEBPとの異常な相互作用により、疾患が誘導される可能性が考えられるためである。ヒトのMDS(骨髄異形成症候群)、慢性骨髄性白血病(CML)、あるいはAML患者において報告されている7種類の変異型AML1について発現ベクターを作成し、まず、AEBPとの結合活性について、免疫沈降法およびウエスタンブロッティングにより、野生型AML1との比較を行った。興味深いことに結合活性には顕著な差が見られた。次に、AEBPによる変異型AML1の転写活性への影響をレポーターアッセイにより検討したが、これらの変異体は転写活性を有さず、この実験系では結果が得られなかった。更に、siRNAを用いた実験により、AEBPによる変異型AML1タンパク質の安定性の制御は野生型に比べて弱いことが示された。現在、本研究について論文を準備中である。28年度が最終年度であるため、記入しない。まず、AML1-ETOgaとその新規結合タンパク質AEBP (AML1-ETO binding protein)の結合にっいて過剰発現系を用いた免疫沈降法によって確認し、結合部位を決定した。また、内在性タンパク質についてもヒト血球系細胞株であるK562細胞を用いて免疫沈降を行い、結合を確認した。更に、免疫染色法により、細胞内で共局在していることが示された。次に、DNA damageへの感受性を検討するために、HeLa細胞株を用いてCPTあるいはエトポシド処理によってDNA damageを与えた後に、AEBP、Histone H2A. X、TOPOIおよびTOPOIIの活性や発現量がどのように変化するのかということについて、Western Blotting法により調べた.また、ヒト血球系培養細胞株であるU937細胞株を用いてCPTあるいはエトポシド処理後のアポトーシスについて検討した。また、K562細胞株を用いてAEBPのノックダウンを行い、遺伝子の転写活性化への影響についてレポーターアッセイを行って検討し、複数のターゲット配列について共通の結果を得た。更に、K562-AEBPノックダウン細胞株からRNAを抽出し、転写制御を受ける遺伝子についてアジレント発現アレイ解析を行って検索し、細胞のガン化やアポトーシスに関連する分子などを見出した。このように、AML1-ETOによる遺伝子の転写制御、あるいはAEBPによるDNA代謝について相互作用が示唆されたのは大変興味深い。AML1/Runx1は造血に重要な転写因子であり、ETO/MTG8は転写抑制因子であることから、急性骨髄性白血病(AML)罹患患者の一部で検出されるAML1-ETOは、ETOの転写抑制機能によりAML1に対してドミナントネガティブに働いてAMLを引き起こす癌遺伝子である可能性が考えられるが、その分子機構は不明である。本研究はAML1-ETOタンパク質の機能解析によりt(8;21)AML発症のメカニズムを解明することを目的とする。我々は、co-factorからAML1-ETOの機能を明らかにするためにAML1-ETOの結合分子を検索し、特に興味深い新規AML1-ETO結合タンパク質(AML1-ETO binding protein, AEBP)について解析を行っている。今年度、我々はヒトの血球系培養細胞株を用いてAML1の過剰発現あるいは発現抑制を行い、AEBPの発現量および活性に対する影響を調べた。次に、DNA損傷薬剤処理後にAEBPの発現量や活性がどのように変化するのかということについて、Western Blotting法および免疫染色法によって検討したところ、コントロール細胞とAML1を過剰発現させた細胞との間に差が見られた。これらの結果から、AML1の発現量は血球系培養細胞株におけるAEBPの発現量や活性に変化を及ぼし、DNA損傷薬剤に対する感受性にも影響するという大変興味深い知見が得られた。