hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬力学および免疫機能モニタリングによる臓器移植患者の包括的支援体制の構築

臓器移植後に使用される各種免疫抑制剤の薬剤暴露時間によるリンパ球の増殖抑制効果について健常人の末梢血リンパ球を用いたin vitroの系で検討した。始めに、添加した免疫抑制剤の洗浄方法について検討を行い、分析機器(シクロスポリン:CLIA法、ミコフェノール酸HPLC)の検出限界以下まで洗浄できていることを確認後以下の実験を行った。CFSE染色した末梢血リンパ球に免疫抑制剤(シクロスポリン、ミコフェノール酸)添加後、anti-CD3/28 microbeadsで刺激し3日間培養した。培養期間中、刺激1日または2日後に薬剤洗浄を行った。3日間培養後各々の群におけるTリンパ球をCD3で染色し、細胞増殖抑制効果をフローサイトメトリーにより観察し、薬剤間における特徴を比較検討した。その結果シクロスポリンは3日の薬剤暴露に比し1日の暴露後の薬剤除去で同程度のリンパ球増殖抑制効果が観察された(3日の暴露で47±15%の抑制、1日の曝露で37±13%の抑制)。一方、ミコフェノール酸では1日の暴露後の洗浄ではリンパ球増殖は十分抑制されず、暴露時間によるリンパ球の増殖抑制効果に関してシクロスポリンとは異なる傾向を示した(3日の暴露で83±10%の抑制、2日の暴露で73±6%の抑制、1日の暴露で29±11%の抑制)。これらの結果からミコフェニール酸モフェチルは時間に依存した免疫抑制効果を発揮し、シクロスポリンに関しては一度リンパ球の増殖を抑制することにより継続的な効果が期待できることが示唆された。このことはT細胞受容体の刺激後速やかなカルシニューリンの活性を阻害することが重要であり、初期段階の阻害によりその後の細胞増殖はある程度の期間抑制できることが示唆された。
胎内炎症曝露が及ぼすエピジェネティック変化とその制御

胎内炎症曝露により自閉症スペクトラム様所見を呈したモデルをMIA(maternal immune activation)モデルとして解析してきた。また、このMIAモデルに出生前に分子状水素投与した群(水素投与群)では、自閉症スペクトラム様所見が改善していることはすでに確認している。今年度は、自閉症スペクトラム様所見が改善するメカニズムについて、5週齢のマウスでアストロサイト活性化が抑制されていることが判明し、論文としてまとめ受理、出版となった。さらに、炎症が児に及ぼす影響のみならず、母体における病態解明および水素投与による影響について解析をおこなった。マウスにLPSを投与し、早産モデルを作成した。LPS投与群では、18.3±8.8時間で分娩に至ったのに対し、水素投与群では、33.5±3.4時間と有意な妊娠延長効果が認められたが、早産防止には至らなかった。cyclooxygenase-2の子宮での発現亢進の抑制がその機序のひとつとして考えられた。また、早産防止として海外でその効果が証明されているプロゲステロンについて、有意な上昇も認められた。これらの結果は、論文報告した。臨床現場での効果としては、早産防止、妊娠期間延長効果は弱く、胎児の脳保護作用が期待される結果となった。現在、MIAモデルが出生した、出生直後から5週齢までのマウスについて、大脳摘出し、ミクログリアを分離して、CD11cなどの各種活性化マーカーの発現について解析中である。これまで、MIAモデルにおいて、ミクログリア活性化については、活性化を認めるとする報告と認めないとする報告が多数あり、判明していない。今回、CD11cのマーカーについて検討しており、変化を確認している。論文受理されたこと、ミクログリアの活性化の検討の手法が安定化し、引き続き時系列で検討中である。現在、分子状水素を用いて、胎児の肺高血圧にも効果があるか検討中である。こちらでの分子的機序の成果も統合し、さらに水素の作用について検討していく予定である。また、このMIAモデルに出生前に分子状水素投与した群(H2投与群)では、自閉症スペクトラム様所見が改善していることはすでに確認している。今年度は、これらの病態および改善したメカニズムを解明するために、エピジェネテイクスな観点から解析を行った。MIAモデル群、H2投与群およびコントロール群の3群について、受傷直後(8時間後)および5週齢において、仔脳組織を回収し、各種ヒストン修飾について検討した。その結果、受傷直後における評価では、MIAモデルにおいてH3K9アセチル化の亢進を認めたのに対し、ヒストンのメチル化修飾であるH3K4me3,H3K27me1,H3K27me2, H3K27me3は有意な変化は観察されなかった。また、H2投与群においては受傷直後(8時間後)において、H3K9アセチル化はコントロール群と同じレベルにまで低下していた。このことから、MIAモデルの仔脳組織ではH3K9アセチル化が亢進しており、これが出生前に分子状水素投与により軽減したことから、MIAモデルで自閉症スペクトラム様所見を呈するのに脳組織におけるH3K9アセチル化の亢進が関与しており、これの抑制が所見の改善と関連している可能性が示唆された。なお5週齢で同様の検討を行ったところ、同様の傾向は認めたものの、有意差は認められず、エピジェネテイックな変化は週齢により一部消失していくことが示唆された。H3K9アセチル化の変化がMIAモデルで観察されたことから、少なくとも胎内炎症曝露により何らかなエピジェネテイックな修飾の変化が生じていることは確認された。

論文受理されたこと、ミクログリアの活性化の検討の手法が安定化し、引き続き時系列で検討中である。脳組織全体での解析では、病態解明に限界があるため、ミクログリア、アストロサイト、ニューロンなどの分離に詳しい学内の研究室と協議し共同研究を立ち上げ、各構成細胞におけるエピジェネテイック変化にも着目して検討していく方針とした。現在、分子状水素を用いて、胎児の肺高血圧にも効果があるか検討中である。こちらでの分子的機序の成果も統合し、さらに水素の作用について検討していく予定である。
オリーブ油の長期摂取に対する栄養評価

本研究では、市販オリーブ油の長期摂取による生体への影響を調べ、栄養評価を行うことを目的とした。1)平成9年度:実験動物には雄モルモットを用い、オリーブ油摂取に伴う成長を観察した。オリーブ群には精製オリーブ油と市販オリーブ油を1:1で毎回混合し、比較としてラード群、対照群には生理食塩水を与えた。飼育期間中にオリーブ群およびラード群では体毛より油成分の分泌が認められ、オリーブ群では対照群に比べ行動も鈍いことが観察された。体重増加は、飼育21日目のオリーブ群は対照群の約半分であり体重差は100gに達し、実験群12匹中2匹が死亡し他の動物にも衰弱がみられた。2)平成10年度:実験動物には雄ラットを用い、西欧型食生活を模倣して高脂肪・高コレステロール飼料で飼育した。コレステロール添加基本飼料に15%の割合で市販エキストラバージン油(EXO)およびピュアオリーブ油(PO)を混合し、対照群にはラードを与えた。4及び8週間飼育後の結果では、期間が長期になるに従い、EXO群およびPO群は羽毛からの油脂成分の分泌による背部羽毛の黄変が観察された。また、4週間飼育ではEXO群が対照群に比べて肝臓、血清中コレステロール値、特にコレステロールエステルは高かったが、PO群は対照群と顕著な違いは認められなかった。8週間では各脂質濃度の全体のレベルが高くなるものの3群間における差はなく、長期摂取は脂肪の種類の違いによる影響は少ないことが示された。以上のことから、高脂肪・高コレステロール飼料の8週間摂取においては脂肪の種類による影響は少ないが、EXOの4週間摂取では、肝臓、血清中のコレステロールエステル濃度を上昇させることが明らかとなり、今後、その栄養評価は継続して行われる必要のあることが示された。オリーブ油はオレイン酸を多く含むのが特徴であり、栄養的な利点が注目されている。しかし、長期投与における影響については明らかにされていない。本研究では、オリーブ油の長期摂取による生体への影響および安全性を調べ、総合的な栄養評価を行うことを目的とした。今年度は、実験動物にオリーブ油を摂取させ成長を観察した。また、脂肪酸の酸化に必要なカルニチン投与の影響について検討した。実験動物には雄モルモットを用いた。オリーブ群には精製オリーブ油と市販オリーブ油を1:1で毎回混合し、一日一匹当たり1.0mLを経口投与した。比較としてラ-ドを一日一匹当たり1.0mL投与したラ-ド群を設けた。対照群には生理的食塩水を与えた。オリーブ群、ラ-ド群、対照群はさらに2群に分け、一方にはカルニチンを25mg/日/匹経口投与した。オリーブ群、ラ-ド群、対照群の脂肪摂取割合はそれぞれ8.2、8.6、3.4%であった。飼育期間中に、オリーブ群およびラ-ド群では体毛より油成分の分泌が認められた。オリーブ群では対照群に比べ行動も鈍いことが観察された。体重増加については、飼育21日目のオリーブ群は対照群の約半分であり体重差は100gに達し、また、実験群12匹中2匹が死亡し他の動物にも衰弱がみられたため解剖を行った。一方、ラ-ド群は順調に成育し、飼育28日目において対照群と同レベルの体重増加を示した。カルニチンは高脂肪食の場合に組織濃度が低下すると報告されているが、いずれの群においてもカルニチン投与の効果は顕著ではなかった。今後、投与量、投与方法についての検討を行う予定であり、また、安全性は変異原性および細胞増殖活性による評価を検討している。実験動物には雄ラットを用い、西欧型食生活を模倣し高脂肪・高コレステロール飼料で長期間飼育した。

基本飼料に対し15%の割合で市販のエキストラバージン油(EXO)およびピュアオリーブ油(PO)を混合し、さらに、コレステロールを添加した飼料を調製した。飼育期間中は成長、外観等を観察記録し、飼育後血清、組織脂質レベルを測定した。対照群にはラードを与えた。4週間および8週間飼育後解剖を行い、採血後肝臓を摘出、血清中の脂質レベルは酵素法で、肝臓中の脂質レベルはイアトロスキャンにより測定を行った。この結果、動物の成長曲線においては3群に差は認められなかった。しかし、飼育期間が長期になるに従い、EXO群およびPO群は羽毛からの油脂成分の分泌により背部羽毛の黄変が観察され、これはEXO群において特に顕著であった。これに対してL群の場合には羽毛よりの分泌は認められなかった。血清ならびに肝臓中のコレステロールエステル濃度は、4週間飼育においてEXO群が対照群に比べて高い値を示したが、PO群は対照群と顕著な違いは認められなかった。8週間飼育においては、各脂質濃度の全体のレベルが高くなるものの3群間における差はなく、長期摂取は脂肪の種類の違いによる影響は少ないことが示された。さらに、HDLコレステロールは統計的に有意ではないが、これまでの報告と同様にPO群で高い傾向が示されたが、EXO群は対照群と比べて顕著な差は認められなかった。以上のことから、高脂肪・高コレステロール飼料の8週間摂取において脂肪の種類による影響は少ないが、EXOの4週間摂取では、肝臓、血清中のコレステロールエステル濃度を上昇させることが明らかとなり、今後、その栄養評価は継続して行われる必要のあることが示された。
英国労働党政権の教育政策の展開と変容に関する分析

平成20年度は主に労働党政権第一期(1997年から2001年程度)を対象として、教育政策の分析を行った。その結果、ブレア政権の教育政策の主たる目的は、生涯学習社会の構築にあり、そこから逆に照射された義務教育制度の整備をであることを明らかにした。しかし、生涯学習社会における自らが学び、自らに投資する学習者像を義務教育制度を通じて養成するという目的は、基礎学力水準の向上という目的とは短期間的には相反する様相を呈している。テストを前提とした従来の学習スタイルが保持されていたからである。また生涯学習社会の構築のために、高等教育の拡充がいくつかのタイプの新たな学位号の導入によって図られたことがわかった。大学に1年でも在学したことを資格と結び付けているのである。日本でも昨今言われている学士力、社会人基礎力といったものとの比較は重要となるであろう。あらたに検討すべき問題として、イギリスにおける「個人」の復権というプロジェクトの存在についてである。これこそイギリスの教育改革の背景に存在していたさらに大きな課題だったのではないか。とくに若者の政治的無関心は、日本にも共通する課題でもある。そんななか、格差に対する新たな挑戦としてステークホルダー論、また具体的にはイギリスで導入された通称Baby Bond(すべての新生児に対する薪補助金制度)などが注目される。今後はこれに関する研究を進める必要があることがわかった。シチズンシップ教育との関連性も重要である。
浅い土砂埋没時の圧迫圧力に関する実験的研究

本研究の目的は、作業者が建設工事中の土砂崩壊で被災することを防止するための保護具を開発することである。災害防止には土砂崩壊そのものが発生しないようすることが第一である。しかしながら、単なる崩壊防止だけでは人的被害を無くせない技術的な困難さが労働現場には残されている。過去に発生した災害の占有割合を調べると大規模工事よりもむしろ小規模な掘削中に労災事故は多い。特に、深さ1.5m以下の浅い掘削は労働安全衛生規則による規制の対象外であることから土止め対策は強制的となっておらず、発注者も経費を計上しにくい現状がある。力学的には深さ1.5mの掘削壁はN値が2以上であれば理論上は自立する。したがって、相当な軟弱地盤であってもこの程度の深さでは通常崩れない。しかし実際に崩壊して多くの労働者が被災している原因は浅い掘削特有の問題にある。具体的には、過去の埋設工事によって埋め戻された土と地山の間に人工的な境界が発生したり、周囲の環境変化によって地下水の流れや水位が変わって不安定化したりする問題がある。さらに、土という材料の特性上危険に気づきにくい問題もある。したがって、掘削工事の安全には単に崩壊防止を指導するだけでなく「もし崩壊したらどうするか?」すなわち安全を多面的に捉えることが重要である。過去の被災事例では胸部までの浅い埋没にもかかわらず重篤な災害に至ったケースが見られた。そこで本研究では人的被害の防止の観点から、たとえ胸部まで埋没しても生存可能な保護具の開発を行うこととした。平成28年度に開始した本研究は平成30年度末をもって3年間の研究を終了した。この間、本研究はほぼ計画通りに実行され、目標とした胸部保護具が具備すべき構造とその必要強度を実験的検証に基づいて明らかにした。以上のとおり、本研究では土砂崩壊による労働災害について新たな安全対策を提案するための検討を行った。本研究では,土砂の圧迫から胸部を守るための保護具に必要な強度と構造の解明を目的に実験的な検討を行っている.その内容は、まず、崩土の圧力を計測するために胸部の模型を開発する。次に,この模型を崩壊土砂に埋没させて圧力を実測するための実大実験を行う.そして,人間工学的な検討から生存限界の作用圧力と限界たわみ度の関係を仮定し,胸部の圧縮係数を推定する.さらに、保護具を装着した胸部の状態を並列バネでモデル化し,土圧による傷害レベルが軽傷以下とするために必要な圧縮係数と強度を検討する。今年度(平成28年度)は初年度であることから、一連の研究のベースとなる胸部模型の開発に注力した。この開発では複雑な形状を有する胸部表面で土砂の作用圧力を精度良く計測するための工夫を行った。具体的には、表面に埋設するセンサーは小型のものを選択せざる終えない。これは先に述べたとおり胸部の表面は複雑な起伏を有するため面積が大きいセンサーを埋設することができないためである。一方、面積が小さな小型センサーによって土圧を直接計測する場合は、土との接触状態が問題となる。すなわち、これは土圧の計測値が土との接触状態に大きく依存するためであり、局所的に接触が不完全になると圧力が実際よりも過小に評価される問題を生じるためである。そこで本研究ではこの問題を解決するために、液体パックを介した間接的な計測手法を導入した。これによって計測データの信頼性が向上した。液体パックでは起伏を有する表面で面積を拡大させて受圧することが可能になる。そのため、パックの面積で平均化された圧力を安定的に計測出来るようになった。以上のとおり,本研究では小規模崩壊をターゲットに,労働者が土砂に埋没しても命を守るために必要な胸部保護具の性能の考え方を検討している.土砂崩壊によって作業者が生き埋めとなる事故状況を実大規模の模型実験で再現し,その時の土圧を計測した.本研究ではレスキュー用マネキンを用いて人型供試体を開発した。マネキンの内部に軽石を充填して重量を調整し、関節部の抵抗力は摩擦板を追加して調整した。さらにマネキンの胸部には圧力計を取り付けた。ここでは、液体パックを介した間接的な土圧の計測システムを開発した.次に、研究所内の実験場内に高さ4mの盛土を行い、これを切土して模型斜面を作製した。法先から1m離れた位置にコンクリート製のL型擁壁を設置し、その前面に人型供試体を座るように設置した。建設機械のバケットで盛土天端に上載荷重を与えて崩壊を誘発させ、落下した崩土が人型供試体に衝突した後に埋没する状況を計測した。実験ではその様子をビデオで記録すると共に土圧の時刻歴データを記録した。本実験の結果,落下時に作用する衝撃的な圧力が埋没時の最大圧力であり,これが人体にダメージを与えることがわかった.平成28年度は斜面の高さが異なる条件で崩壊実験を再現し,埋没時の土圧を計測しデータの蓄積を行った.本研究の目的は、作業者が建設工事中の土砂崩壊で被災することの防止である。労災防止には土砂崩壊そのものが発生しないようすることが第一である。しかしながら、単なる崩壊防止(の指導)だけでは人的被害を無くせない問題の難しさがある。災害の占有割合を調べると大規模掘削よりもむしろ小規模掘削中に労働災害は多い。

特に、深さ1.5m以下の浅い掘削は労働安全衛生規則による規制の範囲外であることから対策は強制されておらず、発注者も土止め費用を認めにくい現状がある。深さ1.5mの掘削壁はN値が2以上であれば理論上は自立する。したがって、相当な軟弱地盤であっても掘削壁はそう簡単には崩れない。しかし現実には崩壊して多くの労働災害が発生している。その背景には地盤工事特有の問題がある。例えば、過去の工事で地盤構造が変っていたり、周辺環境の変化によって地下水位が上昇することがある(直接原因)。さらに、危険に気づかず逃げ遅れる問題もある(間接原因)。自立性の地山では降伏後に塑性変形がゆっくりと進むがその変形量自体が小さく目視では前兆に気づきにくい。掘削からしばらく経ってから崩れるケースではこのタイムラグが作業者を油断させる。注意して作業を行っていても危険に気づかず逃げ遅れるのである。したがって、掘削工事において単に崩壊防止を指導するだけでは十分でなく、「もし崩壊したらどうするか?」。すなわち安全を多面的に考えることが重要となる。過去の被災事例では、胸部までの浅い埋没にもかかわらず重篤な災害に至ったケースが見られた。そこで本研究では人的被災の防止の観点からたとえ胸部まで埋没しても生存可能な保護具の開発を行っている。特に、ここでは基礎的研究として保護具の構造と強度に着目した実験的調査を行っている。以上のとおり、本研究では土砂崩壊による労働災害について新たな安全対策を提案するための検討を行っている。平成28年度に開始した本研究は第2年目を終了した。この間、ほぼ計画通り研究を遂行できた。初年度は、既往の研究から仮定した保護具の強度的な必要性能に従って簡易な第一段階の試作を行い、これを載荷試験して構造的課題を整理した。具体的には、脱着性と運動性を同時に満足させるための構造を検討した。両性能を満足するためにはフレーム接合部を背面側には設けるべきではなく、左右独立した一対の構造とすべきことがわかった。しかし、接合部を有しない構造は荷重載荷に対する安定性と抵抗性に乏しく、特に抵抗力増加が容易でない問題が明らかとなった。第2年目は左右独立した一対構造のコンセプトをベースに、抵抗力増加の方法を検討した。その結果、梁部を背面と地盤で挟み込むように保持させることで抵抗力増加が可能なことを発見した。保護具の一部を片持ち梁支点とさせるアイディアであり、保護具全体を曲げ変形させて土圧を支持させるものである。運動性と抵抗性は通常相反する関係のものであったが、種々の試行を通じて両性能をある程度同時に満足可能な構造を考案できた。深さ2mの掘削溝を模擬した部分に人型供試体(マネキン)を設置した。このマネキンには試作第2段の保護具を装着させた。設置後、溝脇の地盤表面に高さ約1.5mまで盛土して地山を不安定化させた。これは残土の設置を模擬したものである。その後、溝壁部分は勢いよく崩壊し、マネキンは頭部を残して胴体部分が完全に埋没した。この時の埋没深さは約1mであった。埋没までに生じた荷重的変化をマネキン表面の圧力計と保護具フレームに貼り付けたひずみゲージで計測した。その結果、表面圧力の値は全く増加することなく、崩壊土砂による荷重は全て保護具側で支持された。以上より、本研究で考案した構造の保護具は胸部圧迫を大幅に軽減する可能性が見いだされ、労働災害防止が期待できることを明らかにした。
近赤外多波長LEDを用いた試薬レス透析液廃液多成分連続モニタシステムの開発

透析液廃液成分の光学的モニタリングに関する基礎的検討として、FT-IR装置により尿素(Ur)、尿酸(Ua)及びクレアチニン(Cr)の単一成分低濃度水溶液のスペクトル計測を行い、PLS回帰分析により濃度推定の可能性を検証した。なお波長範囲は750nm2500nm(波長分解能:1.667nm)、濃度範囲はUr:1070mg/dl, Ua: 0.72.0mg/dl, Cr: 1.04.0mg/dl、光路長は0.5mm, 0.25mm, 0.15mm, 0.05mmの4種類とした。溶媒である水及びサンプル溶液の透過光強度スペクトルから差分吸光度(⊿Abs)を求め、各波長における⊿Absと各成分の濃度からPLS解析により検量モデルを作成し、実測濃度と予測濃度の相関分析を行った。その結果、尿酸及びクレアチニンについては、いずれの光路長においてもγ<0.5となり高精度の濃度予測は困難であった。一方、尿素については光路長:0.5mmにおいては相関係数:γ=0.302,標準予測誤差:SEP=23.3mg/dlと予測精度が低かったが、光路長:0.05mm, 0.15mm及び0.25mmにおいてはγ>0.8、SEP<11mg/dlといずれも良好な予測精度が得られた。この結果より、70mg/dl以下の低濃度領域においても近赤外光を用いて尿素濃度を推定可能であることが確認された。また次年度に試作予定の簡易吸光分析システムのための近赤外多波長LEDと光検出器(フォトダイオード:PD)それぞれのドライバ回路の仕様策定を行なった。その際、現状で特注可能な多波長LEDの最大チップ数として「24チップ」、最多波長数を10波長と想定してドライバ回路の条件設定を行った。透析液廃液成分として選定した尿素、尿酸及びクレアチニンの単一成分低濃度水溶液の濃度推定において、尿素については光路長:0.5mm以外の3種類(0.25mm, 0.15mm及び0.05mm)で相関係数:γ>0.8と良好な濃度推定精度が得られたが、尿酸及びクレアチニンについてはγ<0.5となり濃度推定困難という結果となった。そもそも透析終了の指標としては透析液廃液中の「尿素濃度」を用いる予定で、尿酸及びクレアチニンはあくまでも「尿素計測の際の妨害物質」という位置付けである。従って両物質の濃度を高精度で計測する必要は無いのだが、これらの濃度が推定できれば尿素濃度推定精度に及ぼす影響を低減できる可能性があり、次年度においても引続き尿酸及びクレアチニンの濃度推定法について検討する予定である。1.FT-IR装置を用いた尿酸及びクレアチニンの低濃度水溶液の濃度推定法の検討:上述したように前年度に引続き近赤外分光法による両物質の濃度推定を試みる。要検討事項としては、PLS解析に用いる波長域や光路長の選定などが挙げられる。2.低濃度尿素水溶液の予測精度の更なる向上:上記と同様、使用する波長域や光路長などを適切に選定することで尿素濃度予測精度の向上を図る。3.光源に近赤外多波長LED使用を前提とした波長の絞込み:FT-IRを用いた上記解析結果と最低でも同程度、出来ればそれ以上の測定精度となる波長組合せを見出す。その具体的な方法としては、通常の感度波長だけでなく「陰性吸光度」を示す負の感度波長も積極的に利用し、10波長程度の感度波長を各溶質毎に選び出し、これら複数波長の総当たり重回帰分析を行う。そして相関係数:γおよび標準予測誤差:SEPを指標として最適波長数とその組み合わせを成分毎に決定する。使用するサンプル溶液については、まずは上記3物質の単一成分水溶液をサンプルとし各溶質に適した波長組合せを把握したうえで、これら3物質にタンパク質を加えた4成分混合水溶液(模擬透析液廃液)をサンプルとし、各成分の濃度変動が予測精度に及ぼす影響を把握したうえで最適な波長組合せを決定する。一方、尿素については光路長:0.5mmにおいては相関係数:γ=0.302,標準予測誤差:SEP=23.3mg/

dlと予測精度が低かったが、光路長:0.05mm, 0.15mm及び0.25mmにおいてはγ>0.8、SEP<11mg/dlといずれも良好な予測精度が得られた。この結果より、70mg/dl以下の低濃度領域においても近赤外光を用いて尿素濃度を推定可能であることが確認された。また次年度に試作予定の簡易吸光分析システムのための近赤外多波長LEDと光検出器(フォトダイオード:PD)それぞれのドライバ回路の仕様策定を行なった。その際、現状で特注可能な多波長LEDの最大チップ数として「24チップ」、最多波長数を10波長と想定してドライバ回路の条件設定を行った。透析液廃液成分として選定した尿素、尿酸及びクレアチニンの単一成分低濃度水溶液の濃度推定において、尿素については光路長:0.5mm以外の3種類(0.25mm, 0.15mm及び0.05mm)で相関係数:γ>0.8と良好な濃度推定精度が得られたが、尿酸及びクレアチニンについてはγ<0.5となり濃度推定困難という結果となった。そもそも透析終了の指標としては透析液廃液中の「尿素濃度」を用いる予定で、尿酸及びクレアチニンはあくまでも「尿素計測の際の妨害物質」という位置付けである。従って両物質の濃度を高精度で計測する必要は無いのだが、これらの濃度が推定できれば尿素濃度推定精度に及ぼす影響を低減できる可能性があり、次年度においても引続き尿酸及びクレアチニンの濃度推定法について検討する予定である。1.FT-IR装置を用いた尿酸及びクレアチニンの低濃度水溶液の濃度推定法の検討:上述したように前年度に引続き近赤外分光法による両物質の濃度推定を試みる。要検討事項としては、PLS解析に用いる波長域や光路長の選定などが挙げられる。2.低濃度尿素水溶液の予測精度の更なる向上:上記と同様、使用する波長域や光路長などを適切に選定することで尿素濃度予測精度の向上を図る。3.光源に近赤外多波長LED使用を前提とした波長の絞込み:FT-IRを用いた上記解析結果と最低でも同程度、出来ればそれ以上の測定精度となる波長組合せを見出す。その具体的な方法としては、通常の感度波長だけでなく「陰性吸光度」を示す負の感度波長も積極的に利用し、10波長程度の感度波長を各溶質毎に選び出し、これら複数波長の総当たり重回帰分析を行う。そして相関係数:γおよび標準予測誤差:SEPを指標として最適波長数とその組み合わせを成分毎に決定する。使用するサンプル溶液については、まずは上記3物質の単一成分水溶液をサンプルとし各溶質に適した波長組合せを把握したうえで、これら3物質にタンパク質を加えた4成分混合水溶液(模擬透析液廃液)をサンプルとし、各成分の濃度変動が予測精度に及ぼす影響を把握したうえで最適な波長組合せを決定する。
放射光真空紫外円二色性による生体分子の精密構造解析

本年度は、真空紫外円二色性(VUVCD)分散計と本研究課題で開発した新規解析プログラム(VUVCD-NN法)を用いて、これまで解析困難であった非天然状態(アルコール変性・アミロイド線維状態)にある蛋白質の構造解析を行った。6種類のタンパク質のVUVCDスペクトルを、トリフルオロエタノール(TFE:050%)およびメタノール(MeOH:070%)水溶液中(pH2.0、25°C)で、それぞれ170nmおよび175nmまで測定した。VUVCD解析を行った結果,各タンパク質の50%TFEによる変性状態では、α-helix構造が多く形成され,他はturnやrandom構造であった。さらにα-helix本数の予測結果を考慮すると、TFE変性構造は、長い数本のα-helixの集合体であることが示唆された。70%MeOHによる変性では、α-helix構造の形成だけでなく,β-strand構造の形成も観測された。また,α-helixの長さはジスルフィド結合の数によって大きく制限されることが示唆された。これらの結果より,アルコール変性構造はタンパク質やアルコールの種類に依存し,酸、低温、熱、塩酸グアニジンなどによる他の変性状態とは大きく異なり、多くの二次構造を持つことが分かった。β2-microglobulin(β2-m)は,酸変性条件下(pH2.5)でアミロイドを形成する蛋白質であるが,その断片ペプチド#21-31は,中性条件下でもアミロイドを形成し,β2-mのアミロイド化に重要な役割を担っている。アミロイド化した断片ペプチドのVUVCDスペクトルを測定し,二次構造解析を行った。続いて,#21-31フラグメントの分子動力学計算から得られた構造よりCDを算出し,実測値と比較することで水溶液中のアミロイド断片ペプチドの立体構造を予測した。今後は,β2-mのアミロイド構造の解明や,VUVCD分光法を用いた蛋白質-蛋白質相互作用系の立体構造解析法の確立を目指す。本年度は、真空紫外円二色性(VUVCD)分散計を利用し,様々な糖類のVUVCDスペクトルのデータベースを作成した。また、タンパク質のアミノ酸配列からその二次構造を予測するニューラルネットワーク(NN)法にVUVCD分光法を組み合わせたタンパク質の新規構造解析ソフトの開発を行った。(1)グリコシド結合の立体配座の違いとVUVCDとの関係を調べるために、二糖類であるKojibiose, Nigerose, Sophorose, Laminaribiose, Melibioseのスペクトル測定を200nmから160nmまで行い、また、比較のため三糖類のPanoseの測定も行った。さらに、N-Acetyl-amino sugarやuronic acidを試料とし、水溶液中でのCarboxylとAcetamido基のVUVCDスペクトルへの影響を調査した。これまで蓄積したデータと今回得られた結果から、今まで困難であった糖類の各発色団のVUVCDへの影響を見積ることができ、細胞膜あるいはタンパク質に結合した複雑な多糖類の構造解析に応用される。(2)タンパク質の二次構造部位予測法の一つであるNN法に,VUVCDから予測した二次構造データを組み込むことにより,部位予測精度の向上を図った。部位予測精度はNN法だけでは59.5%であったが,部位特異的スコア行列を付加することにより70.9%まで向上し,二次構造含有率を加えることにより72.1%に,さらに,α-ヘリックスやβ-ストランドの本数を加えることにより72.5%に上昇した。また,VUVCDデータベースの最適化により最終的に74.9%まで上昇し,VUVCD分光法が,タンパク質の二次構造の部位予測に対して有効であることがわかった。本年度は,真空紫外円二色性(VUVCD)分散計を,単糖類や多糖類の構造解析そして生体膜と相互作用したタンパク質の二次構造解析に応用した。(1)D-glucoseのC-1位のOH基をメチル化したmethyl α-D-glucopyranoside (α-D-Glc)のVUVCDスペクトルを,密度汎関数法(DFT)と時間依存密度汎関数法(TDDFT)で求めた理論スペクトルと比較することで,α-D-Glcの水和を含めた構造や水溶液中でのα-anomerの二つのconformer(α-GGとα-GT)のCDへの寄与を調べた。その結果,水分子はOH基と水素結合することで水分子ネットワークを形成し,α-D-Glcの構造を制御していることが分かった。また,これらの計算スペクトルは,水分子の位置や数によって大きく影響を受けることが分かった。(2)Glycosaminoglycans(GAGs)は,様々な生物学的機能を有する重要な多糖類であるが,水溶液中での構造は,構成する糖の種類により複雑に影響を受ける。そのため,VUVCD分散計を用い,6種のGAG(chondroitin,chondroitin sulfates,hyaluronic acid,heparin)とそれらの構成糖(N-acetylaminosugars,uronic acid)のVUVCDスペクトルを,水中で240から160nmの波長範囲で測定し,GAGの環内酸素孤立電子対の高エネルギー遷移に及ぼす官能基(sulfate,carboxyl,hydroxyl,hydroxymethyl,acetamido等)やグリコシド結合の寄与を明確にした。これらの結果は,GAGの水中での詳細な構造解析やCDの理論解析に対して重要な情報を与える。

(3)VUVCD分光法は,タンパク質の二次構造(α-helix,β-strand,turn,random構造)の含有率とその本数を決定するだけでなく,アミノ酸配列情報を用いたNeural Network(NN)法と組み合わせることで,アミノ酸配列上での二次構造の位置を高精度で予測することができる。我々は,α_1-酸性糖タンパク質(AGP)の生体膜(リポソーム)との相互作用による二次構造の変化をVUVCD分光法で解析することで,その相互作用のメカニズムや構造-機能相関について新たな知見を得ることに成功した。本年度は、真空紫外円二色性(VUVCD)分散計と本研究課題で開発した新規解析プログラム(VUVCD-NN法)を用いて、これまで解析困難であった非天然状態(アルコール変性・アミロイド線維状態)にある蛋白質の構造解析を行った。6種類のタンパク質のVUVCDスペクトルを、トリフルオロエタノール(TFE:050%)およびメタノール(MeOH:070%)水溶液中(pH2.0、25°C)で、それぞれ170nmおよび175nmまで測定した。VUVCD解析を行った結果,各タンパク質の50%TFEによる変性状態では、α-helix構造が多く形成され,他はturnやrandom構造であった。さらにα-helix本数の予測結果を考慮すると、TFE変性構造は、長い数本のα-helixの集合体であることが示唆された。70%MeOHによる変性では、α-helix構造の形成だけでなく,β-strand構造の形成も観測された。また,α-helixの長さはジスルフィド結合の数によって大きく制限されることが示唆された。これらの結果より,アルコール変性構造はタンパク質やアルコールの種類に依存し,酸、低温、熱、塩酸グアニジンなどによる他の変性状態とは大きく異なり、多くの二次構造を持つことが分かった。β2-microglobulin(β2-m)は,酸変性条件下(pH2.5)でアミロイドを形成する蛋白質であるが,その断片ペプチド#21-31は,中性条件下でもアミロイドを形成し,β2-mのアミロイド化に重要な役割を担っている。アミロイド化した断片ペプチドのVUVCDスペクトルを測定し,二次構造解析を行った。続いて,#21-31フラグメントの分子動力学計算から得られた構造よりCDを算出し,実測値と比較することで水溶液中のアミロイド断片ペプチドの立体構造を予測した。今後は,β2-mのアミロイド構造の解明や,VUVCD分光法を用いた蛋白質-蛋白質相互作用系の立体構造解析法の確立を目指す。
HIV-1プロテアーゼの作用機構の解明

HIV-1プロテアーゼは、ウイルス前駆体タンパク質を加水分解し、HIV-1の複製に必要である構造タンパク質や複製酵素を生成する酵素である。この酵素は、通常、哺乳動物の各種エンドペプチダーゼが切断することのないPhe-Pro及びTyr-Proペプチド結合を切断する。従って、このような特異的基質のHIV-1プロテアーゼによる加水分解機構を解明することは、有効なHIV-1プロテアーゼ阻害剤の開発に大きく貢献すると期待される。本研究においては、分子動力学計算と量子化学計算によってHIV-1プロテアーゼの作用機構について、原子レベルの解析を行った。まず、酵素-基質(ES)複合体の生体内条件下での安定性について分子動力学計算により研究した結果、ES複合体の触媒活性部位が酵素活性を発現する構造を保持するためには、触媒活性部位近傍に存在する2つの水分子が必要不可欠であることがわかった。これは、HIV-1のRNA遺伝子上にコードされているプロテアーゼ蛋白のみではHIV-1プロテアーゼのES複合体が酵素活性を発現出来ないことを示している。次に、HIV-1プロテアーゼの基質加水分解機構を量子化学計算により研究した結果、本酵素の特異的基質切断部位であるPhe-Proペプチド結合の加水分解機構は3つの素反応から構成されていることがわかった。この加水分解反応の律速段階の活性化エネルギーは23.95 kcal/molであり、実際に酵素が働く生体内温度で、これらの反応は十分に起こり得るものと考えられる。以上の分子動力学計算および量子化学計算による研究結果は、論文として纏められ、発表予定ならびに受理審査中である。現在まで、HIV-1プロテアーゼに様々な阻害剤が配位したX線結晶解析構造が示されているが、これらの構造の分析から、本酵素空洞内には、いくつかの水分子が特定の場所に存在することがわかってきた。中でも、ループ状活性部位近傍の4個の水分子と阻害剤とフラップ領域の間に存在する水分子は高頻度で観察される。本研究では、これらの水分子の役割について、理論的な解析を進めてきた。ループ状活性部位に存在する水分子は、アミノ酸残基との間で複数の水素結合が形成する。また、フラップ領域の水分子も、阻害剤とフラップ領域の間で複数の水素結合を形成している。これらの水分子が酵素活性を現すES複合体の構造と密接に関係していると推定している。また、ループ状活性部位の水分子は、同様のループ状活性部位を有するレニンやペプシンにおいても観察されることから、アスパラギン酸プロテアーゼに共通するループ状活性部位の安定性に非常に重要な役割を担っている可能性が強い。本研究では、以上の水分子がHIV-1プロテアーゼのES複合体の形成の維持にどのような役割を果しているのかを分子動力学(MD)シミュレーションを用いて明らかにしつつある。例えば、ループ状活性部位に水分子が配位していない場合は、HIV-1プロテアーゼの構造が保てないことを示した。一方、フラップ領域の水分子はプロテアーゼの構造保持には、直接的に関与しないことが判った。この結晶は、HIV-1プロテアーゼを初めとする生体内の有効なアスパラギン酸プロテアーゼの作用機構において、水分子が重要な要素であることを示唆している。
中心エンジンから解き明かすガンマ線バースト放射機構

我々が開発した一般相対論的磁気流体コードにより、ガンマ線バースト形成のシミュレーションを行い、高速回転するブラックホール程、より強力なジェットを噴出することを示しました。このようなシミュレーションは現在我々のものを含めて世界に二例しか報告がありません。また相対論的なガンマ線バーストジェット伝搬のシミュレーションを行い、光球面からの熱的放射の足し合わせを計算し、ガンマ線バーストの光度・エネルギー関係式をほぼ説明しました。我々はガンマ線伝搬モンテカルロシミュレーションを行い、ガンマ線バーストの特徴的スペクトルを再現し、日本の衛星IKAROSが検出したガンマ線バーストの強い偏光度も再現しました。ガンマ線バーストの放射機構(爆発エネルギー、スペクトル、時間変動)を、中心エンジンまで遡って第一原理から解明します。本研究ではこの一連の過程を「ガンマ線バースト中心エンジン」、「相対論的ジェットの伝搬」、「ガンマ線伝搬過程」の3つのパートに分類し、それぞれのパートの研究精度を上げ、最終的にそれらを統合することにより、ガンマ線バースト放射機構に対する世界最先端の理解を目指します。パート1「ガンマ線バースト中心エンジン」長滝が開発した一般相対論的磁気流体コードにより、大質量星に於けるガンマ線バースト形成のシミュレーションを行いました。重力崩壊の結果、高速回転しているブラックホールが中心に形成されたと仮定し、ブラックホールの回転エネルギーがBlandford-Znajek過程によってどの程度引き抜けるのか、またその引き抜きによってガンマ線バーストジェットは形成出来るのかということを数値シミュレーションによって検証しました。その結果、より高速回転するブラックホール程、より強力なジェットを噴出することが明確に示されました。パート2「相対論的ジェットの伝搬」長滝と、共同研究者の水田晃氏(KEK)により、相対論的なガンマ線バーストジェット伝搬のシミュレーションを行いました。またその光球面からの熱的放射の足し合わせを計算し、観測的に知られているガンマ線バーストの光度・エネルギー関係式をほぼ説明することが出来ました。パート3「ガンマ線伝搬過程」長滝と、共同研究者の伊藤裕貴氏(京大)により、ガンマ線伝搬モンテカルロシミュレーションを行いました。結果として、ガンマ線バーストの特徴的なスペクトルの再現に成功しました。ガンマ線バーストジェット中を伝搬する光子をモンテカルロ計算し、観測されるガンマ線バーストスペクトルと比較した。特に本年度は2重構造を持つガンマ線バーストジェットを想定した時、観測される冪型スペクトルを良く再現することを発見した。また論文投稿中段階ではあるが、同様の構造の下、期待されるガンマ線バーストの偏光度を評価した。我々の計算は、近年日本の衛星IKAROSで検出したガンマ線バーストの偏光度を説明出来る程度の強い偏光度を示し、大きな成果を挙げられたと確信している。その他、ガンマ線バーストに付随するジェット型超新星爆発の下での元素合成計算、及びそのような超新星が形成するであろう超新星残骸についての理論的研究も行い、順調な成果を挙げることが出来た。またコラプサーモデルを念頭に置きながら高速自転を伴う超新星コアの相対論的3次元流体計算を行い、重力崩壊とコアバウンス後初期の動的進化を詳細に調べた。その結果、非軸対称モードが従来よりも早いタイムスケールでコアバウンス後に成長し、銀河中心の超新星に対しては現在の重力波干渉計の検出限界に届く強い重力波が放射されることが分かった。またこの非軸対称な流体不安定性の存在により、乱流モードが従来の軸対称を仮定した計算に比べてより小さなスケールまでカスケードしてしまうので、3次元モデルで爆発を再現するのはより難しいことも明らかにできた。上述の爆発に際して放射される重力波(Kotake (2013))に加え、中性子星の冷却曲線、更には高エネルギーニュートリノについても考慮し、これらのマルチメッセンジャーのシグナルを総合的に解析することで如何に中心エンジンの動的進化の情報に迫れるか詳細な検討を行った。重力崩壊の結果、高速回転しているブラックホールが中心に形成されたと仮定し、ブラックホールの回転エネルギーがBlandford-Znajek過程によってどの程度引き抜けるのかを検証しました。長滝は3次元コードを開発し、従来の2次元計算を更に上回るハイレベルの数値シミュレーションを実現しました。パート2「相対論的ジェットの伝搬」

長滝と、共同研究者の水田晃氏(KEK)により、相対論的なガンマ線バーストジェット伝搬のシミュレーションを行いました。またその光球面からの熱的放射の足し合わせを計算し、観測的に知られているガンマ線バーストの光度・エネルギー関係式をほぼ説明することが出来ました。またAsaf Peerも共同研究者に加わり、数値シミュレーションとモンテカルロ計算の結合に着手を始めました。パート3「ガンマ線伝搬過程」長滝と、共同研究者の伊藤裕貴氏(京大)により、ガンマ線伝搬モンテカルロシミュレーションを行いました。結果として、ガンマ線バーストの特徴的なスペクトルの再現に成功しました。また偏向計算についても初期の成果を出すことが出来ました。研究実績概要にありますように、全ての研究パートに於いて初期成果を挙げることが出来ました。また研究計画当初では想定していなかった、ガンマ線バーストの光度・エネルギー関係式の再現やガンマ線バーストの特徴的なスペクトルの再現に成功しました。25年度が最終年度であるため、記入しない。そればかりか研究計画当初には予定していませんでした、偏向計算まで行うことが出来ました。これは日本のガンマ線バースト衛星イカロスがガンマ線バーストから偏向を受けたとの報告を行ったことを受けてのものです。タイムリーな話題に素早く対応することが出来ました。また研究計画当初には予定していませんでした、Asaf Peer氏との共同研究も開始することが出来ました。彼は我々のプロジェクト加入はこれまでの研究課題達成にも大きく寄与しましたし、今後も期待されます。現在のところ当初の計画以上に研究は進展している。しかし今年度に於いては、来年度研究代表者が組織委員長を務める国際会議「Supernovae and Gamma-Ray Bursts 2013」の準備時期にさしかかる。この組織委員には研究分担者の固武氏、連携研究者の伊藤氏も含まれている。準備のために多少研究遂行の時間を割かれることも予想されるので、今後一層共同研究の連携を深め、研究の効率をあげると共に更なる共同研究者を募り、より確実に研究遂行することを目指す。現在のところ当初の計画以上に研究は進展しています。しかし今年度に於いては、平成25年度は研究代表者が組織委員長を務める国際会議「Supernovae and Gamma-Ray Bursts 2013」の準備時期にさしかかります。
羽色の性差と加齢変化を創出する分子機構の解明

鳥類ではオスが派手な婚姻色を示し,雌は地味な保護色を示すことが広く知られている。しかし,この羽装色の性差を作り出す仕組みはわかっていなかった。本研究では,おかやま地どりを用い,この問題の解明を試みた。その結果,ニワトリの羽装色が,羽が形成される羽包内の局所ホルモン系(メラノコルチン系)により制御されていることが判明した。また,ニワトリの羽装色はオス型がデフォルトであり,メスでは卵巣由来のエストロジェンがASIP(アグーチシグナルタンパク)の産生を制御することでメス型の羽装色を作っている可能性が示唆された。さらに,本研究では羽形成の仕組みを解明するために重要と考えられる新規の遺伝子が同定された。本研究は,ニワトリの雄鞍部に生じる中雛型羽と成鶏雄型羽,卵巣由来の雌性ホルモン(E2)処理することで生じる成鶏雌型羽の詳細な形態的特徴付けを行うとともに,これらの羽形成過程における遺伝子発現の違いを網羅的に解析することで,羽という皮膚付属器の加齢変化と性差を作り出す分子機構を明らかにすることを目的とする。前年度(初年度)は,鞍部に生じる中雛型羽と成鶏雄型羽,及びE2処理することで雄に生じる成鶏雌型羽が形成される羽包における遺伝子発現の違いをDNAアレイにより網羅的に解析した。その結果,羽の性差形成に関与する可能性のある候補遺伝子を複数同定した。本年度は以下を実施した。1.成鶏雌の皮下に雄性ホルモン(DHT)を投与し,羽形成に及ぼす影響を調べた。その結果,DHTは羽の雌雄差形成に関与しないことが分かった。成鶏雄の皮下にE2を投与した結果(Oribe et al., 2012)等と併せると,羽装色パターンは雄型がデフォルトであり,雌型は雌性ホルモンの働きによって形成される可能性が強く示唆された。本研究成果は第2回サイエンス・インカレで発表され,奨励表彰を受賞した。2.DNAアレイ解析で見つかった性差形成に関与する可能性のある候補遺伝子について,その発現の詳細をRT-PCR法により解析した。また,DNA配列から推測される翻訳産物に対する抗体を作製し,翻訳産物の性格付けを行った。その結果,雌雄の形態的違い(小羽枝の有無)に完全に相関した遺伝子(Blsk)が同定された。また,E2の働きを仲介する可能性のある分泌性の新規糖鎖付加ペプチド(MFF)が同定された。3.成鶏雄鞍部の羽の小羽枝構造欠損の仕組みを明らかにするため,羽構造が形成される羽包の形態観察を行った。その結果,雄の羽形成では,雌に匹敵する数の小羽枝細胞が一度出現し,その後消失することが確認された。最終年度である本年度は,前年度,マイクロアレイ解析で同定し,羽の雌雄差形成に関係すると考えられた2つの新規遺伝子について,その性格付けを行った。1.小羽枝特異的ケラチン遺伝子の同定爬虫類や鳥類ではβケラチン遺伝子の遺伝子重複が観察される。この遺伝子重複が,爪やうろこ,羽を生じさせたと考えられている。しかし,各βケラチン遺伝子が皮膚付属器の形成にどのように関わっているのかについては不明であった。本研究では,小羽枝をもたない成鶏雄の羽と小羽枝をもつ成鶏雄の羽のそれぞれに発現する遺伝子を比較することで,小羽枝の形成に特異的に働くβケラチン遺伝子を同定した。この結果は,遺伝子重複によって増加したβケラチン遺伝子が様々な羽形成に関与したとする従来の仮説を支持するものであり,羽の進化を考える上で重要な知見となった。また,本結果は,小羽枝の初めての分化マーカー遺伝子の同定としても価値のあるものであった。本研究成果は科学雑誌「GENE」に報告した(Kowata et al., 2014)。2.小羽枝形成のステップを制御する局所因子の同定小羽枝細胞はメラニン色素による着色を受けた後,ケラチンによる角質化が起こり,やがて,細胞が死んで羽構造の一部となる。この過程で,メラニンによる着色からケラチンによる角質化に移行するのを制御すると考えられる新規シグナル分子(PBCF)を同定した。このタンパクに対する抗体を羽形成時に作用させたところ,小羽枝形成に異常を示す羽が生じた。この新規因子の同定は,器官形成のイベントの進行・スイッチングが局所因子により制御されている可能性を示唆するものであり,順序だった器官形成の仕組みを理解する上で,貴重な知見となるものと考えられる。

本研究は,ニワトリの雄鞍部に生じる中雛型羽と成鶏雄型羽,卵巣由来の雌性ホルモン(E2)処理することで生じる成鶏雌型羽の詳細な形態的特徴付けを行うとともに,これらの羽形成過程における遺伝子発現の違いを網羅的に解析することで,羽という皮膚付属器の加齢変化と性差を作り出す分子機構を明らかにすることを目的とする。本研究は,ニワトリの鞍部の羽が中雛では雌雄差を示さないが,成長に伴ってデフォルトとして成鶏雄型羽形成に移行すること, E2存在下ではデフォルトの成鶏雄型羽形成が成鶏雌型羽形成に変更されること,を示した申請者らの実験結果に基づいて立案されたものである。初年度である平成23年度は以下を実施した。1.本研究の前提となる従前の実験結果を再確認し,2つの論文にまとめて発表した(Yoshihara et al. 2012; Oribe et al. 2012)。2.鞍部に生じる中雛型羽と成鶏雄型羽,成鶏雌型羽,及びE2処理することで雄に生じる成鶏雌型羽が形成される羽包における遺伝子発現の違いをDNAアレイにより網羅的に解析した。その結果,中雛型羽と成鶏雌型羽の発現パターンは成鶏雄型羽とは異なり,互いに類似していることが判明した。また,羽色遺伝子の発現量が羽色と相関していつことが明らかとなり,このことを論文にまとめて発表した(深尾他,2012)。また,羽の性差形成に関与する可能性のある候補遺伝子を複数同定した。平成24年度の実施計画では,1鞍部に生じる羽の雌雄差,すなわち小羽枝の有無が細胞増殖によるのか,アポトーシスによるのかを明らかにするとともに,2DNAアレイ解析で,鞍部に生じる中雛型羽と成鶏雄型羽,及びE2処理することで雄に生じる成鶏雌型羽のそれぞれの羽包で発現量が大きく異なる遺伝子についてリアルタイムPCRでそれを確認することを目的としていた。1に関しては,研究実績の概要にも記したように組織切片標本の観察から,アポトーシスの可能性が示唆された。2に関しては,リアルタイムPCRは行えなかったものの,研究実績の概要にも記したように,羽の雌雄差形成に深く関与する可能性のある遺伝子,BlskとMFFを詳細なRT-PCR解析から同定した。このようなことから,本研究はおおむね順調に進展していると評価した。平成23年度の実施計画では(1)鞍部に生じる中雛型羽,成鶏雄型羽,成鶏雌型羽,及びE2処理することで雄に生じる成鶏雌型羽を光学顕微鏡レベル,および走査電子顕微鏡レベルで観察し,その違いを明確化する。(2)上述の羽が形成される羽包における遺伝子発現の違いをDNAアレイによる解析によって調べることを挙げている。(1)については,成鶏雄の鞍羽先端部に他の羽と異なり小羽枝を欠くことが明らかとなった。また,(2)については実績に挙げたような結果を得たことから,おおむね順調であると評価した。本研究の最終年度である平成25年度は,羽の雌雄差形成に深く関与する可能性のある遺伝子,BlskとMFFをより詳細に性格付けすることで,羽という皮膚付属器性差を作り出す分子機構を明らかにする。具体的には,in situ hybridizationや免疫組織化学による当該遺伝子発現細胞の同定,in vivoおよびin vitroにおけるE2によるこれら遺伝子の発現制御の解析,抗体による中和阻害などを行う。平成23年度に得られた結果,即ち,鞍部に生じる中雛型羽と成鶏雄型羽,成鶏雌型羽,及びE2処理することで雄に生じる成鶏雌型羽の明確化された形態的差異(特徴)が,細胞増殖の違いによって生じるものであるのか,アポトーシスの違いによって生じるものであるのかを組織化学的解析によって調べる。