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イオンチャネル制御と小胞体ストレス応答制御による膵島の恒常性維持とその応用

膵島分離・移植プロセスにおいて、Clイオンチャネルによる細胞容積調節および小胞体ストレス応答の両機構を制御し、膵島喪失を回避することを目的とした。膵消化の過程ではClイオン流入阻害により細胞死は抑制されるが、培養過程では細胞死抑制効果はなく、細胞周囲環境によってClイオンチャネルに対する制御法は異なることが示唆された。一方、本実験系では小胞体ストレスの強い応答変化は捉えられなかった。Microarrayを用いて分離後膵島にかかるストレスを網羅的に解析したところ、IL1βやTNFを上流制御因子とする変化が確認され、これら炎症性サイトカインが引き起こすストレス経路の制御の重要性が示唆された。膵島移植はインスリン依存状態糖尿病根治の可能性を有する低侵襲治療法として確立が期待されているが、膵島分離・移植プロセスでの膵島障害による膵島の喪失が不可避で、この治療の定着の大きな障害となっている。膵島分離・移植プロセスにおけるClイオンチャネルによる細胞容積調節および小胞体ストレス応答の両機構を把握・制御し、膵島細胞の「恒常性維持」を達成し膵島の細胞死および喪失を回避することを目的とした。まず、膵島分離過程でのClイオンの移動と細胞容積変化の経時的観察を行い、膵島分離環境ではClイオンの細胞内流入が惹起され、ネクローシス型細胞死が起こり得る環境であることを確認した。また、膵島分離・培養後の膵島収量およびViabilityの基礎データの取得のため、ラットから膵島分離および3日間の培養を行ったところ、従来法のViability assayにて確認されるviabilityは維持されるものの、培養後の膵島の消失が確認され、またその消失は培養中に起こるネクローシス型細胞死が関与することが確認された。続いて、膵島分離、培養によって小胞体ストレスシグナルがどのように活性化するかをWestern blot法で解析した。小胞体ストレスセンサーとして同定されている3種の小胞体膜貫通タンパク質(IRE1アルファ、PERK、ATF6)に注目し、それぞれの上流、下流のタンパク質発現の変化を検討したところ、膵島分離直後では、PERK経路の小胞体ストレス反応(UPR)の関与が示唆され、培養時にはATF6経路のUPRが関与している可能性が示唆された。これらの結果より、膵島分離中のClイオンチャネル制御と、培養中の小胞体ストレス制御により、膵島の恒常性維持を図りうることが示唆された。膵島移植はインスリン依存状態糖尿病根治の可能性を有する低侵襲治療法として確立が期待されているが、膵島分離・培養・移植プロセスでの膵島障害による膵島の喪失が不可避で、この治療の定着の大きな障害となっている。膵島分離プロセスにおけるClイオンチャネルによる細胞容積調節および小胞体ストレス応答の両機構を把握・制御し、膵島細胞の「恒常性維持」を達成し膵島の細胞死および喪失を回避することを目的とした。Clイオンインディケーターを用いた共晶点レーザー顕微鏡下での連続的な観察により、膵島分離過程ではClイオンの細胞内流入とネクローシス型細胞死が起こりえることが確認された。またその過程でClイオンの流入を阻害する環境を作成すると、いくつかのモデルにおいて細胞死の抑制が得られることが確認された。続いて、膵島分離・培養各ステップでの小胞体ストレス応答反応を、分子生化学的手法を中心に用いて明らかにする試みを行った。小胞体ストレスセンサーとして同定されている小胞体膜貫通タンパク質に注目し、Western blot法や免疫染色にて、小胞体ストレスシグナルの活性化の有無を捉えようとしたが、本実験系で惹起される小胞体ストレスは、当初の予想より小さなストレス変化でとどまっていることが明らかとなった。低酸素培養によりさらに強いストレスを与えても小胞体ストレスの強い惹起は確認されなかった。膵島分離・培養中により膵島が被るストレスを明らかにするために、各段階での培養膵島のmRNAを抽出して、Microarrayにてその遺伝子変化を網羅的に捉える実験を行った。その結果でも培養中には強い小胞体ストレスは惹起されていないことが示唆され、一方でTNFαやIL1βを上流因子とする各種の変化が強く惹起されており、これら炎症性サイトカインの制御が重要であることが示唆された。医学膵島分離・移植プロセスにおいて、Clイオンチャネルによる細胞容積調節が必要であるのは膵島分離過程で、小胞体ストレス応答の制御が必要であるのは分離後培養中であることが示唆される結果が得られつつあり、膵島細胞の「恒常性維持」の達成に向けた手がかりは解明しつつある。一方、培養中に惹起される小胞体ストレスは、予想よりは小さなストレス変化にとどまっており、さらなる確認作業が必要と思われた。小胞体ストレス応答の変化が乏しいと判断した場合は、低酸素培養や各種サイトカインの添加など、ヒト膵島分離で想定されるさらなるストレスを負荷する実験を加える。また、Clイオンチャネル阻害および小胞体ストレス応答制御による「恒常性維持」が細胞死を回避しうるかどうかの検証を行う。

膵消化の際にはClイオンチャネル阻害が有効であると思われるが、さらに他のステップで有効な場面がないかどうか検討する。さらに、N-Acetyl-L-cysteineおよびL-glutathione等を膵島分離あるいは培養へ添加し小胞体ストレスの緩和を図る。実験結果に応じてその他の制御方法を追加する。この介入によって、最も細胞死を抑制出来うる条件を明らかにする。
閉経モデルマウスを用いた狭窄性腱鞘炎の病態解析

狭窄性腱鞘炎は閉経後や周産期の女性に多くみられる疾患であるが、その発症機序は未だ不明である。我々は閉経モデルマウス(以下OVT)を用いて、狭窄性腱鞘炎の病態解明を試みた。リアルタイムPCRによる解析では、OVT群の滑膜内腱ではエストロゲン受容体αの発現増加を認めた。また、RNAシークエンスの結果、OVT群で2倍以上の発現増加を認める30種類の遺伝子が検出され、その中にSAA1,SAA3などの急性炎症マーカーである遺伝子群が含まれていた。本研究結果より、エストロゲンが滑膜内腱の恒常性維持に重要な役割を担っており、エストロゲン欠乏による恒常性の破綻が狭窄性腱鞘炎発症に関与していると推測された。エストロゲン受容体にはERαとERβの2種類が存在する事が知られており、骨組織においては破骨細胞のERαが骨量維持に重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。しかし手指の滑膜内腱とその周辺組織におけるエストロゲン受容体の発現やその局在は未だ不明である。我々は、研究初年度にまず閉経モデルに用いるマウス(ddyとC57BL6)の滑膜内腱と腱鞘滑膜において、2種類のエストロゲン受容体が実際に発現しているかどうかを調べた。マウスの滑膜内腱および腱鞘滑膜よりmRNAを抽出し、エストロゲン受容体の発現をリアルタイムPCRにより確認したとろ、滑膜内腱ではERβの発現は確認されたが、ERαの発現は確認できなかった。また腱鞘滑膜においては、滑膜内腱と比較して採取できる組織量がごく微量であったため、得られたデータにばらつきが出てしまい、十分な評価が出来なかった。続いて、滑膜内腱とその周辺組織におけるエストロゲン受容体の局在を調べるため、免疫組織化学的手法により解析を行った。その結果、ERα、ERβ共に滑膜内腱のエピテノンならびにエンドテノンにおいて腱細胞と思われる細胞に一致して発現が認められた。また、腱鞘滑膜においても両受容体の発現が確認された。一方エストロゲン受容体のmRNAレベルでの発現の局在を調べる目的でin situ hybridizationを計画していたが、未だ予備実験の段階であるため、具体的な結果が得られていない。滑膜内腱におけるエストロゲン受容体のmRNAレベルでの発現をリアルタイムPCRにより解析したところ、2種類の受容体のうちERβのみの発現が確認されたが、免疫染色による解析ではERαとERβ両方の発現が観察された。本結果は2種類のマウスいずれにも認められたが、このような矛盾した結果が得られた原因として、まずERαを検出する際のリアルタイムPCRの至適条件が十分に得られていないことが考えられた。この点については、現在実験条件の検討を再度行っている。また免疫組織学的解析においてもパラフィン切片を用いた酵素抗体法でしか評価ができていないことから、より多角的に評価するために、現在蛍光抗体法による解析を行っている。またin situ hybridizationの予備実験が未だ終了していない事も遅れの原因となっているが、本実験についても今後出来る限り早く実験系を確立し、mRNAレベルでの発現の局在を評価する予定である。さらに、腱鞘滑膜のサンプルがごく微量であったため,PCRでの検出が出来ていない点については、サンプルの回収個所を増やすなど、実験方法の再検討が必要である。エストロゲン受容体はERαとERβの2種類が存在する事が知られており、骨組織においては破骨細胞のERαが骨量維持に重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。閉経、妊娠などによるホルモンの不均衡は腱鞘炎発症の要因の一つと考えられており,エストロゲン受容体の発現変化が腱鞘炎の病態に関与している可能性がある.しかし,手指の滑膜内腱におけるエストロゲン受容体の発現やその局在は未だ不明である.我々は,初年度に引き続き閉経モデルに用いるマウス(ddyとC57BL6)の滑膜内腱(長趾屈筋腱)において、2種類のエストロゲン受容体が実際に発現しているかどうかをリアルタイムPCRにより調べた.その結果,滑膜内腱においても骨や筋肉など他の組織と同様,ERαとERβが共に発現していることが確認された.また,免疫染色による解析においてもERα、ERβ共に滑膜内腱のエピテノンならびにエンドテノンにおいて腱細胞と思われる細胞に一致して発現が認められた.閉経モデルマウスを用いた実験では、まず卵巣摘出からサンプル回収までの期間の検討を行った.その結果,卵巣摘出後8週でコントロールマウスと比較して両受容体の発現が上昇する傾向が見られたが,優位な差が得られなかったため,現在引き続き条件検討を含め再現性の確認を行っている.RNA sequenceについては,サンプル回収の至適条件がほぼ得られており,閉経モデルマウスを用いた解析の準備を進めている.リアルタイムPCRによる滑膜内腱におけるエストロゲン受容体の発現解析では,当初2種類の受容体のうちERβのみの発現が確認されたが,免疫染色による解析ではERαとERβ両方の発現が観察されたため,RNAの抽出方法を含めたリアルタイムPCRの条件検討を再度行う必要があり,それに予想以上の時間を要してしまった.また,我々の研究グループにおいて,閉経モデルマウス作成は今回初めてであったため,作成のための技術習得とモデル作成からサンプル回収までの期間の検討にも時間を要したことが遅れの原因となっている.

本研究では閉経および周産期にしばし発症する狭窄性腱鞘炎の病態解明、さらには新規治療法の開発へと結びつく研究基盤を確立することを目的とし、女性ホルモン欠乏が滑膜内腱と周辺組織に与える影響について閉経モデルマウスを用いて解析を行った。閉経モデルマウスには骨粗鬆症のモデルとしても用いられるC57/BL6を用いた。卵巣切除後8週時に後肢滑膜内腱を採取しRNAを抽出した。エストロゲン受容体(ER)の2つのアイソフォームであるERα、ERβの発現量をリアルタイムPCR、免疫染色で評価した。また、RNAシークエンス(Seq.)法を施行し閉経モデルマウスの滑膜内腱の遺伝子発現を網羅的に解析した。組織学的解析ではC57/BL6マウスの滑膜内腱および腱鞘内にERα,ERβの発現を認めた。遺伝子発現解析では、閉経モデルマウスの滑膜内腱においてERαの発現増加を認め、閉経後の時間経過とともに発現は増加傾向を認めた。一方、ERβは発現に有意な変化を認めなかった。またRNA-Seq.では閉経モデルマウスの滑膜内腱において2倍以上の発現増加を認める遺伝子が30種類検出され、その中にSaa1、Saa3などの急性炎症マーカーを含む遺伝子群が含まれていた。一方、発現低下を認めた遺伝子は325種類認めた。以上の研究結果は、エストロゲンが滑膜内腱の恒常性や機能の維持に重要な役割を担っており、エストロゲンの欠乏が狭窄性腱鞘炎発症に関与していることを示唆するものであった。今後さらなる組織学的評価、in vitroでの解析と検討が必要である。閉経モデルマウスを用いて得られた本研究結果は、第33回日本整形外科学基礎学術集会において発表予定である。また現在英論文として国際学術雑誌に投稿する為の準備を行っている。狭窄性腱鞘炎は閉経後や周産期の女性に多くみられる疾患であるが、その発症機序は未だ不明である。我々は閉経モデルマウス(以下OVT)を用いて、狭窄性腱鞘炎の病態解明を試みた。リアルタイムPCRによる解析では、OVT群の滑膜内腱ではエストロゲン受容体αの発現増加を認めた。また、RNAシークエンスの結果、OVT群で2倍以上の発現増加を認める30種類の遺伝子が検出され、その中にSAA1,SAA3などの急性炎症マーカーである遺伝子群が含まれていた。本研究結果より、エストロゲンが滑膜内腱の恒常性維持に重要な役割を担っており、エストロゲン欠乏による恒常性の破綻が狭窄性腱鞘炎発症に関与していると推測された。これまでの実験において、少なくとも滑膜内腱においてエストロゲン受容体が発現している事が確認されたことから、閉経に伴うエストロゲンの変化が何らかの形で滑膜内腱に影響を及ぼしている可能性が示唆された。今後は平成27年度までに行ってきた実験の条件検討と結果の評価を引き続き行いながら、平成28年度以降に予定していた実験を平行して進めていく。具体的には、閉経モデルマウスの作成とRNA sequenceを行うための至適RNA量の決定を先ず行い、これらが終了したところで、実際に閉経モデルマウスとコントロールマウスの滑膜内腱および腱鞘滑膜から解析用サンプルを回収し、RNA sequenceによる遺伝子発現の網羅的解析を行う。続いて、シーケンスにより得られたデータの解析とプロファイリングによって変化を認めた遺伝子の定量をリアルタイムPCRにて行い、コントロールマウスとの比較を行う。
軟骨細胞分化の運命決定と関節防御ーＣＣＮ３分子機能の新局面

1)CCN3の過剰発現がラット初代関節軟骨細胞の単層培養系で分化形質の発現を促進したので、関節軟骨ペレット培養系でもこの点を確認した。その結果、ペレットがCCN3過剰発現細胞では対照に比べやや大きくなり、組織標本を作製してトルイジンブルー染色を行うと、CCN3過剰発現ペレットでは対照に比べ、濃く染色されその領域も広かった。即ち、CCN3過剰発現でin vitroでの軟骨形成の促進がみられた。2)ヒト組み換えGST-CCN3タンパク質とその対照としてのヒト組み換えGSTタンパク質を徐放剤としてのgelatin hydrogelに吸着させ、ラット膝関節腔に投与し、その1日後にモノヨード酢酸(MIA)を同ラット膝関節に投与して、変形性関節症を誘発したところ、ヒト組み換えGST-CCN3タンパク質前投与群ではMIAによる関節軟骨のプロテオグリカンの分解が抑えられていることがトルイジンブルー染色で確認できた。また、tidemarkのintegrityも、GST-CCN3タンパク質の投与群では、対照のMIA単独処置群に比べ高かった。さらに、関節軟骨表層のマーカー分子であるlubricinは、MIA投与により変形性関節症を誘発すると消失するのに対し、CCN3タンパク質を前投与することにより、この消失が防御でき、lubricinが関節表層を綺麗に覆っていることが免疫染色で観察できた。すなわち、CCN3は関節軟骨の分化形質を促進する作用を有し、MIA誘導性実験的変形性関節症を防御する作用があることが明らかとなった。以上の結果は、前年度および前々年度に報告した結果と併せて一つの論文に纏めて、国際誌に投稿し、現在revise中である。27年度が最終年度であるため、記入しない。まず、当研究室において組換えCCN3タンパク質を生産が出来るシステム、並びにより安全かつ安定的にCCN3タンパク質を過剰発現させるシステムを確立した。そのため、piggyBacトランスポゾンに基づくヒトCCN3のドキシサイクリンによる誘導性発現ベクターを作製した。piggyBacトランスポゾンは二つの逆向き反復末端を有する。これらをトランスポザーゼ酵素が認識し、反復末端に挟まっているDNA断片を細胞の染色体へ組み込む結果、安定な発現を可能にする。また、この方法は非ウィルス的方法であるため、安全性も高い。こうして得られたHAタグ付きヒトCCN3 (CCN3HA)およびレポーター遺伝子であるtdT。matoを含有したpiggyBacトランスポゾンを軟骨前駆細胞株ATDC5 (ATDC5細胞)へ導入した。'対照実験としてCCN3HAを除去したpiggyBacトランスポゾンも別個のATDC5細胞へ導入した。組換えタンパク質の発現を確認するために、ウェスタンブロットとレポーター遺伝子発現実験を行ったところ、ドキシサイクリン添加への応答としてCCN3HA組換えタンパク質の発現が見られた。さらにドキシサイクリン添加の下で、安定的にヒトCCN3タンパク質(rCCN3HA)を発現するATDC5細胞を利用し、どの程度組換CCN3HAが軟骨前駆細胞に関節軟骨の形質を付与できるかを解明することを目指し、上記の外来遺伝子を持ったATDC5細胞を、11日間亜セレン酸・インスリン・トランスフェリン(ITS)及びドキシサイクリンを添加しながら高密度培養(マイクロマス培養)した。この実験の結果、CCN3HAを持ったpiggyBacトランスポゾンを持ったATDC5細胞のみで細胞の凝集がみられ、その凝集塊がアルシアンブルー染色で染まった。以上の現象はCCN3HAを発現するpiggyBacトランスポゾンを持ったATDC5細胞においては、軟骨形成が促進されうることを示している。(1)まず、10週齢ラットの膝関節腔にモノヨード酢酸(MIA)を注入して変形性関節症を誘発させ、免疫組織染色にてCCN3の発現とその局在を調べたところ、正常な膝関節と比較して、MIAにより変形性関節症を誘発した膝関節では染色性の低下消失の見られた領域、つまり、プロテオグリカンが少ない領域では、CCN3タンパク質は検出出来なかった。一方、軟骨修復機転とされている軟骨細胞クラスターではCCN3の存在が確認出来た。(2)次に、piggyBacトランスポゾンシステムにてHAタグ付きヒトCCN3(rCCN3HA)をドキシサイクリン誘導性に発現するベクターを構築し、ラット関節軟骨初代培養細胞に導入し、同細胞がコンフルエント状態になったところで、ドキシサイクリン4μg/mLを添加してCCN3を誘導し、二週間後にRNAを回収して、リアルタイムPCRおよびアルシアンブルー染色を行った。その結果、関節軟骨細胞に特異的な遺伝子であるTenascin-CとLubricinのmRNAが上昇し、軟骨共通マーカーであるCollagen Type 2のmRNAが上昇した。更にプロテオグリカンの蓄積量も増加した。(3)低出力超音波パルス(LIPUS)がラット変形性関節症モデルでCollagen Type 2の発現を上昇させることが報告されているため、7週齢ラットの膝をLIPUS処理し、4時間後に大腿骨膝関節軟骨からRNAを抽出し、リアルタイムPCRにてCCN3mRNAの変動を調べたところ、対照(対側大腿骨膝関節軟骨)と比べ、LIPUS処理を受けた膝関節軟骨の方ではCCN3mRNAが上昇した。

その結果、ペレットがCCN3過剰発現細胞では対照に比べやや大きくなり、組織標本を作製してトルイジンブルー染色を行うと、CCN3過剰発現ペレットでは対照に比べ、濃く染色されその領域も広かった。即ち、CCN3過剰発現でin vitroでの軟骨形成の促進がみられた。2)ヒト組み換えGST-CCN3タンパク質とその対照としてのヒト組み換えGSTタンパク質を徐放剤としてのgelatin hydrogelに吸着させ、ラット膝関節腔に投与し、その1日後にモノヨード酢酸(MIA)を同ラット膝関節に投与して、変形性関節症を誘発したところ、ヒト組み換えGST-CCN3タンパク質前投与群ではMIAによる関節軟骨のプロテオグリカンの分解が抑えられていることがトルイジンブルー染色で確認できた。また、tidemarkのintegrityも、GST-CCN3タンパク質の投与群では、対照のMIA単独処置群に比べ高かった。さらに、関節軟骨表層のマーカー分子であるlubricinは、MIA投与により変形性関節症を誘発すると消失するのに対し、CCN3タンパク質を前投与することにより、この消失が防御でき、lubricinが関節表層を綺麗に覆っていることが免疫染色で観察できた。すなわち、CCN3は関節軟骨の分化形質を促進する作用を有し、MIA誘導性実験的変形性関節症を防御する作用があることが明らかとなった。以上の結果は、前年度および前々年度に報告した結果と併せて一つの論文に纏めて、国際誌に投稿し、現在revise中である。正常な関節軟骨に存在するCCN3が、MIAにより変形性関節症を誘発した軟骨では、軟骨細胞外マトリックスが減少した部位では消失し、軟骨修復機転と考えられる軟骨クラスターには存在すること、また、CCN3が関節軟骨培養細胞の細胞外マトリックス産生を促進することを明らかにした。つまり、CCN3が関節軟骨において軟骨防御効果があることを示唆するデータを得た。今後、CCN3が変形性関節症に対する防御効果を示す直接的な証拠、即ちin vivoでの実験結果を得ることが出来れば、本研究の目的を果たすことが出来る。27年度が最終年度であるため、記入しない。1) IPUSがin vivoでCCN3発現を上昇させることを見いだしたので、モノヨード酢酸(MIA)による変形性関節症の誘発をLIPUSで防御出来るかどうかを明らかにする。2) piggyBacトランスポゾンでrCCN3HAの発現を誘導するシステムを構築したのでこれを用いて、関節軟骨初代ペレット培養細胞において軟骨形成を促進するか否かを調べる。3)これらの間接的証拠だけではなく、直接的証明として、CCN3がMIAにより誘導される変形性関節症に対し防御効果を有することを明らかにすべく、ヒト組換えGST-CCN3を適切な徐放性を有するgelatin hydrogelを徐放剤として選択し、MIAと共にラット膝関節腔へ投与し、MIAによる変形性関節症の誘発を防止するか否かを、組織学的に調べる。rCCN3HAの生産および過剰発現用のベクター作製を完成した。
超低体温下逆行性脳灌流法における脳内酸素飽和度の安全限界と許容時間に関する検討

弓部及びその近傍の大動脈瘤手術に際し、補助手段として超低体温逆行性脳灌流(RCP)法を用い、さらに弓部全置換症例には逆行性脳灌流時間を最小限にするために弓部分枝を先に再建するArch Fist法を用いて手術を行った、術中に近赤外線分光法を用いて酸化Hb,還元Hb,脳組織酸素飽和度(rSO_2)を連続測定し、RCP法での脳酸素モニター上での安全限界値とそれに到達する時間(許容時間)を検討した。またArch First症例では弓部分枝再建後の変則脳分離体外循環中の至適脳灌流条件の算出を試みた。対象は成人症例17例であり、年齢は2885歳,男女比は10:7であった。最低鼓膜温18±0.3°Cであり、RCP時間は34.6±6.9分(2146分)であった。rSO_2値の変動は手術開始時点を1.0(63.2±1.7%)とすると、超低温につれてRCP直前で1.07(70.1±2.5%)まで増加した後、RCP中は緩余に低下。その後通常循環再開にてRCP直前値に回復し復温から離脱にかけて0.91に低下した。最低脳組織酸素飽和度は我々が設定したRCP安全限界値0.7以下となる症例はなかった(最低値0.81)。Arch First法の7例は、RCP時間38.3±5.2分,選択的脳灌流時間58.5±13.7分であった。RCP単独症例でのRCP終了から復温過程においてrSO_2値と鼓膜温との間に有意な一次相関が存在した(左右rSO_2=-0.01×鼓膜温+1.3,p<0.0001)。この式をリファレンスとしてArch First症例の至適灌流条件を求めると、鼓膜温25°Cで平均脳送血量1315ml/kg/min, rSO_2値は1.0前後に維持されていれば、脳灌流としては問題ないことが示唆された。今後さらに個々の症例の解析を重ねてより詳細なRCP中の単位時間あたりの脳内酸素飽和度の減少率を算出し、逆行性脳灌流許容時間予測式を確立することと順行性脳灌流時の至適灌琉条件を更に詳細にしていきたい。弓部及びその近傍の大動脈瘤手術に際し、補助手段として超低体温逆行性脳灌流法を用いた。その際近赤外線分光法を用いて、逆行性脳灌流中の酸化ヘモグロビン,還元ヘモグロビン,脳組織酸素飽和度を連続測定し、近赤外線分光法頭部酸素モニター上での安全限界値とそれに到達する時間(許容時間)を検討した。対象は成人症例15例であり、年齢は2785歳,男女比は3:2であった。最低鼓膜温18±0.6°Cであり、逆行性脳灌流時間は2651分(平均41±3.5分)であった。術後脳神経障害は1例に静脈洞血栓症による脳梗塞を認めたが、体外循環中の脳灌流との関連性は乏しいと考えられた。体外循環前の脳組織酸素飽和度は5174%(65±10%)であり、全例冷却による温度低下に従って脳組織酸素飽和度上昇し、逆行性脳灌流開始直前では6085%(78±8%)となり体外循環前値との比は1.2±0.24であった。逆行性脳灌流開始と同時に時間経過に従って減少傾向に転じていき、逆行性脳灌流終了時点では4670%(59±10%)であり、体外循環前値との比率は0.82±0.1となった。逆行性脳灌流時間をX,脳組織酸素飽和度の変化率をYとして、脳酸素飽和度減少率を予測式で表すと、脳酸素飽和度変化率=1.043×e^<-0.005*逆行性脳灌流時間>となり、安全限界を0.7と仮定したならば、逆行性脳灌流許容時間は68分という結果に至った。今後さらに症例を重ねてより詳細な逆行性脳灌流中の単位時間あたりの脳内酸素飽和度の減少率を算出し、逆行性脳灌流許容時間予測式を確立したい。さらにS-100蛋白や動静脈乳酸値の変動から代謝面においてもその安全性について検討していきたい。

その後通常循環再開にてRCP直前値に回復し復温から離脱にかけて0.91に低下した。最低脳組織酸素飽和度は我々が設定したRCP安全限界値0.7以下となる症例はなかった(最低値0.81)。Arch First法の7例は、RCP時間38.3±5.2分,選択的脳灌流時間58.5±13.7分であった。RCP単独症例でのRCP終了から復温過程においてrSO_2値と鼓膜温との間に有意な一次相関が存在した(左右rSO_2=-0.01×鼓膜温+1.3,p<0.0001)。この式をリファレンスとしてArch First症例の至適灌流条件を求めると、鼓膜温25°Cで平均脳送血量1315ml/kg/min, rSO_2値は1.0前後に維持されていれば、脳灌流としては問題ないことが示唆された。今後さらに個々の症例の解析を重ねてより詳細なRCP中の単位時間あたりの脳内酸素飽和度の減少率を算出し、逆行性脳灌流許容時間予測式を確立することと順行性脳灌流時の至適灌琉条件を更に詳細にしていきたい。
遺伝子導入膵ランゲルハンス島(膵島)移植の臨床応用に関する研究

研究1.「Polyamine transfection reagentsを用いたラット膵島への遺伝子導入の基礎的研究」:ラットより膵島を分し,遺伝子導入を行った。導入はリポソーム法で行い,Polyamine transfection reagentsを使用し,導入VectorはpZeoSV2/lacZを用いた。遺伝子導入後もラ島の構築は良好に保たれ,各群ともにDithizone染色にて良好な染色性を示した。遺伝子導入効率は90%以上を示した。リポソーム法にてラ島への効率的な遺伝子導入の可能性が確認され,遺伝子導入に際し,有効と考えられた。研究2.「イヌ膵島への効率的遺伝子導入法に関する基礎的研究」:ビーグル犬膵島に蛍光発色性のあるpCMS-EGFPを、以下にて遺伝子導入した。1)遺伝子銃、2)電気穿孔法、3)Lipofection法。導入効率はLipofection法で95%と遺伝子銃の35%、電気穿孔法の43%に比較し良好であった。遺伝子銃、電気穿孔法では膵島数、インスリン含有量の著明な減少がみられたのに対し、Lipofection法では非遺伝子導入膵島と同程度に膵島数、インスリン含有量が保たれLipofection法の低障害性が示された。研究3.「当院で施行した臨床膵島分離・凍結保存・膵島移植症例の検討」:平成15年9月12日平成16年7月末までに8例の膵島分離を行った。脳死ドナー1例、心停止ドナー7例であった。膵島収量は18,693-491,040IEQ、純度は30-80%であった。分離膵島はすべて機能を有していた。うち1例が新鮮膵島移植に使用された。移植後は合併症無く、血糖コントロールの改善と低血糖発作の消失、インスリン使用量の減少が得られ、高感度C-peptide値は0.05→0.4ng/mlと上昇した。インスリン離脱は得られなかったが患者QOLの著明な改善がみられた。<1.膵島への効率的遺伝子導入法の検討:>___-1)ラット膵島への遺伝子導入2)イヌ膵島への遺伝子導入<2.Notch関連遺伝子を用いた膵β細胞分化誘導の試み:>___-1.膵島への遺伝子導入法の確立:2.純化酵素、無血清培地による安全な膵島分離、培養技術の開発:本院では膵・膵島移植研究会ワーキンググループの事務局がおかれ、わが国における臨床膵島移植実施準備を進めている。臨床膵島移植実施また遺伝子導入膵島移植実現のためには安全性の高い分離、培養時術が必須である。今回純化酵素(リベレース)、無血清培地の有効性を検討した。イヌ膵よりリベレース用いて膵島を精製、無血清培地(1% ITS加CMRL1066)にて培養した。膵島収量、純度は4233IEQ/g、93%と良好であり、1日培養後のインスリン分泌能も良好であった。純化酵素と無血清培地の使用は、安全性の高い技術を提供し得る。1.ヒト膵島分離・凍結保存:本院には膵・膵島移植研究会ワーキンググループの事務局がおかれ、わが国における臨床膵島移植実施準備を進めてきた。

その成果として全国で8例の膵島分離が行われた。うち当院で5例の膵島分離が施行されている。1例が移植に用いられ、他の4例は凍結保存された。以下に5例の分離結果を示す。ドナー:1例が脳死、4例が心停止、44.6±17.3才、温阻血時間:8.6±4.5分、膵島収量:186144±185042IEQ、純度:53±17%であった。すべて、一般細菌、真菌、抗酸菌の培養結果は陰性であった。Staticincubationによる内分泌機能検査のStimulation Indexは4.18±3.15と良好であった。4例は13時間36時間無血清培地にて培養した後、Program freezerを用いて、凍結保存した。1例は新鮮膵島移植に用いた。2.臨床膵島移植症例:本院では平成16年4月24日国内で2例目の臨床膵島移植を実施した。[ドナー]16才男性。頭部外傷による心停止後に膵臓を摘出。温阻血時間は5分、総阻血時間は222分であった。[膵島分離]膵重量は89g、組織学的検索にて、膵内外分泌組織、膵管系、血管系に異常を認めなかった。千葉東病院法にて膵島を分離。膵島収量は491,040IEQ、純度50%と良好であった。無血清培地にて16時間の培養を行った後の膵島数は364,653IEQ、純度75%と新鮮膵島移植基準を満たしたため、移植を実施した。[膵島移植]16才、女性。5才時より1型糖尿病にてインスリン使用している。局所麻酔下に門脈穿刺、カニュレーション、門脈造影にて位置確認の上、膵島移植施行した。移植後の免疫抑制法はEdmonton protocolに従い、Silorimus, Tacrolimus, Zenapaxを投与した。移植後の合併症は認めず、血中C-peptide値は0.4hg/ml(移植前0.05未満)でインスリンは使用しているものの血糖値は100300mg/dlで変動は有意に減少した。
嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群の分離培養および機能解明

嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群の分離培養および機能解明を目的として,1)メタゲノム解析による嫌気性フェノール廃水処理上昇流スラッジブランケット(UASB)反応槽保持汚泥中の未知アーキアのゲノム構築および機能推定, 2)嫌気性廃水処理汚泥中で高頻度に検出される門レベルで未培養なWWE1門の集積培養を試みた。1)本年度は,“Parvarchaeota"門に近縁なアーキアが約12%検出されたフェノール廃水を処理する中温UASB反応槽保持汚泥のメタゲノム解析を行い,未知アーキアのゲノム構築および機能推定を試みた。DNAシークエンシングは,3つの異なるタイムポイントでサンプリングしたグラニュール汚泥を試料として用いた。ゲノム情報に基づいた分子系統解析を行った結果,2種類のBinがDPANN上門に属していた。この結果は,16S rRNA遺伝子配列情報に基づいた分子系統解析と一致していた。得られた2種類のBinはゲノムサイズが0.6-1 Mb程度と小さく,TCA回路やアミノ酸合成経路などがほとんど存在していなかった。2)本年度は,嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物の分離培養を目的として門レベルで未培養なWWE1門バクテリアの集積培養と最適培養条件の推定を試みた。既往の報告でWWE1門に属する系統分類群の一部が利用すると考えられているセルロースを新たな基質候補として加え,集積培養を試みた。結果,プロピオン酸,セルロースとアミノ酸混合液を基質とした培養系では,継代培養時にメタンの生成が確認できたものの,WWE1門のバクテリアを検出することができなかった。一方,プロピオン酸とアミノ酸混合液を添加した培養系では,植種汚泥に依らず継代培養系内でWWE1門が維持でき,2回の継代培養でWWE1門に属するバクテリアの集積率は,全バクテリアに対し40%程度となった。27年度が最終年度であるため、記入しない。嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群の分離培養および機能解明を目的として, 1)嫌気性廃水処理汚泥を構成する未知微生物群の検出パターンの把握, 2)培養法による嫌気性廃水処理汚泥を構成する未知微生物群の分離培養の試みの2項目について研究を行った。以下にそれぞれの結果を示す。1)嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群の検出パターンの把握次世代DNAシークエンサーを用いて様々な嫌気性グラニュール汚泥の網羅的微生物群集構造解析を行い,嫌気性廃水処理汚泥を構成する未知微生物群の環境条件の把握を試みた。結果、門レベルで未培養なWWE1, GNO2, Caldiserica門に属する未培養系統分類群(WCHB1-03)に属する系統分類群が検出され,各嫌気性グラニュール汚泥の環境条件に応じて異なる検出パターンを示した。今後,これら未知微生物群の分離培養を行うことで,嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群に関する基礎的知見の収集ができることが示唆された。2)培養法による嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群の分離培養の試み培養法による嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群の培養を試みた結果,糸状性の細胞形態を持つ微生物の集積培養に成功し, 16SrRNA遺伝子に基づいた相同性検索の結果,既知の分離株のchristensenella minutaと相同性が約90% (592/657bp), Catabacter hongkongensisと約90% (590/658bp)と遠縁であった。今後,寒天培養などによる単離を試みることで,嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群の生理学的機能を推定できる可能性が示唆された。嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群の分離培養および機能解明を目的として,本年度は,1)未知反応である嫌気的硫黄酸化反応に関与する微生物群の機能解明の試み,2)メタゲノム解析による嫌気性フェノール廃水処理反応槽保持汚泥中の未知微生物群の機能推定, 3)嫌気性廃水処理汚泥中で高頻度に検出される門レベルで未培養なWWE1門細菌の集積培養を試みた。1)申請者が所属する研究グループでは,下水を処理する上昇流スラッジブランケット(UASB)反応槽内において還元された硫酸塩がUASB反応槽内で再酸化される現象を見出した。16S rRNA/rDNAを対象とした微生物群集構造解析を行った結果,硫酸塩還元細菌とメタン生成古細菌が本反応に重要であることが示唆された。2)嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群の機能解明を試みるにあたり,高濃度フェノール廃水を処理するUASB反応槽内グラニュール汚泥を対象とした。MiSeq (illumina)を用い,16S rRNA遺伝子を対象とした微生物群集構造解析の結果,未培養門に属する系統分類群が優占して検出された。そこで,これら未培養系統分類群の機能を解明するためにHiSeqシステム(illumina)を用いたメタゲノム解析を行い,得られたゲノムを基に代謝経路推定を行っている。3)嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物の分離培養を目的として門レベルで未培養なWWE1門細菌の集積培養を試みた。ゲノム解析により,WWE1門細菌は水素資化性微生物と共生系を構築することでプロピオン酸酸化を行うことが示唆されていた。ゲノム情報によりアミノ酸を炭素源・エネルギー源として利用することが示唆されていた。

本研究ではこれらの情報を基にしてWWE1門細菌の培養を試みた。結果,WWE1門細菌が全微生物中約20%まで増殖していることが確認された。嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群の分離培養および機能解明を目的として,1)メタゲノム解析による嫌気性フェノール廃水処理上昇流スラッジブランケット(UASB)反応槽保持汚泥中の未知アーキアのゲノム構築および機能推定, 2)嫌気性廃水処理汚泥中で高頻度に検出される門レベルで未培養なWWE1門の集積培養を試みた。1)本年度は,“Parvarchaeota"門に近縁なアーキアが約12%検出されたフェノール廃水を処理する中温UASB反応槽保持汚泥のメタゲノム解析を行い,未知アーキアのゲノム構築および機能推定を試みた。DNAシークエンシングは,3つの異なるタイムポイントでサンプリングしたグラニュール汚泥を試料として用いた。ゲノム情報に基づいた分子系統解析を行った結果,2種類のBinがDPANN上門に属していた。この結果は,16S rRNA遺伝子配列情報に基づいた分子系統解析と一致していた。得られた2種類のBinはゲノムサイズが0.6-1 Mb程度と小さく,TCA回路やアミノ酸合成経路などがほとんど存在していなかった。2)本年度は,嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物の分離培養を目的として門レベルで未培養なWWE1門バクテリアの集積培養と最適培養条件の推定を試みた。既往の報告でWWE1門に属する系統分類群の一部が利用すると考えられているセルロースを新たな基質候補として加え,集積培養を試みた。結果,プロピオン酸,セルロースとアミノ酸混合液を基質とした培養系では,継代培養時にメタンの生成が確認できたものの,WWE1門のバクテリアを検出することができなかった。一方,プロピオン酸とアミノ酸混合液を添加した培養系では,植種汚泥に依らず継代培養系内でWWE1門が維持でき,2回の継代培養でWWE1門に属するバクテリアの集積率は,全バクテリアに対し40%程度となった。嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群の分離培養および機能解明までには至らなかったが,目標を達成するためのいくつかの改善点を見出すことが可能であった。遺伝子ベースの解析では,次世代DNAシークエンサーを用いた16S rRNA遺伝子もしくは16S rRNAの解析を行うことで,未知の物質循環「嫌気的硫黄酸化反応」に関与する微生物群の推定やフェノールを嫌気的に処理するリアクター内のグラニュール汚泥中に存在する未知微生物群の存在の確認を行うことができた。また,メタゲノム解析を行うことでフェノール廃水を処理する嫌気性グラニュール汚泥を構成する未知微生物群のゲノムをそれぞれ回収することが可能であった。培養ベースの解析では,ゲノム情報を基にして未知微生物の代謝を推定し,それを培養にフィードバックすることで,これまで培養成功の報告が無い高次分類群レベルで未培養なWWE1門細菌を全微生物中約20%まで集積することができた。また,これらの成果をまとめ,本年度に査読付き論文発表を連名含め6件行うなど,客観的にも成果を着実に出していると言える。加えて,現在得られている結果をまとめ,論文を連名含め4件準備中である。以上の結果から本研究はおおむね順調に進展していると考える。27年度が最終年度であるため、記入しない。
高圧培養による深海底由来メタン菌が生成するメタンの同位体組成の再評価

メタンの炭素・水素同位体比は深海環境でのメタン生成起源を推定するための指標として利用されてきたが,高圧条件で生育するメタン生成菌が生成するメタンの同位体比に関する知見は極めて少ない。本研究では、南海トラフの深海底表層堆積物より分離したメタン生成菌(Methanosarcina sp. NT-MS1株)を用いて,大気圧および深海の圧力条件でメタノールを基質に培養した際の細胞増殖速度,メタン生成活性,および生成メタンの炭素および水素同位体比を測定し,圧力が深海底堆積物由来のメタン生成菌の増殖能およびメタン生成活性だけでなく,生成するメタンの炭素・水素同位体比にも影響を及ぼすことを明らかにした。メタンの炭素および水素同位体比は、自然界におけるメタンの生成起源を推定する指標として利用されてきた。メタン生成菌が生成するメタンの炭素同位体比に関しても良く研究されており、一般的にその分別効果はマグマや地殻内に存在する有機物の熱分解によるメタン生成よりも大きいとされてきた。しかしながら、その根拠となるデータは、すべて大気圧下における培養において得られたものである。連携研究者である高井は、好熱性メタン生成菌(Methanopyrus kandleri)による高圧条件におけるメタン生成では、その炭素同位体分別効果が-12‰以下であることを示した。本研究では、この現象が深海(低温高圧環境)由来メタン生成菌において普遍的なものかどうかを評価するため、深海底堆積物から分離した低温性メタン生成菌を高圧条件で培養して生成するメタンの炭素および水素同位体を網羅的に解析する。2013年度は、供試菌株のうち数株を高圧条件で培養し、増殖速度、メタン生成活性および炭素同位体のデータを取得した。増殖速度およびメタン生成活性は、加圧(1535MPa)により増加した。また、メタンの炭素同位体比にも圧力の影響がみられたが、増殖速度およびメタン生成活性との関連性は認められなかった。さらに、これらの成果に加え、深海底堆積物より新たにメタン生成菌の分離に向けた集積培養に成功した。このメタン生成菌はメチルアミンからメタンを生成することから、本研究課題の目的であるメチル化合物から生成するメタンの同位体分別の評価にあたり非常に有用であると考えられるので、早急に純粋分離を試みる。本研究では、この現象が深海(低温高圧環境)由来メタン生成菌において普遍的なものかどうかを評価するため、深海底堆積物から分離した低温性メタン生成菌を高圧条件で培養して生成するメタンの炭素および水素同位体比を網羅的に解析する。平成26年度は、供試菌株をメチル化合物存在下、高圧条件で培養した際の増殖速度、メタン生成活性に関するデータを取得すると伴に、昨年度より試みていた深海底堆積物からの新たなメタン菌の純粋分離にも成功した。来年度以降の実験においては、この新規分離株についても、高圧条件下における増殖およびメタン生成特性に関するデータを取得する予定である。また、一連の研究に使用してきた高圧培養法に関して、Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocolsへ論文を寄稿し、受理された。メタンの炭素および水素同位体比は,自然界におけるメタンの生成起源を推定する指標として利用されてきた。メタン生成菌が生成するメタンの炭素同位体比に関しても良く研究されており,一般的にその分別効果はマグマや地殻内に存在する有機物の熱分解によるメタン生成よりも大きいとされてきた。しかしながら,その根拠となるデータは,すべて大気圧下における培養において得られたものである。連携研究者である高井は,好熱性メタン生成菌(Methanopyrus kandleri)による高圧条件におけるメタン生成では,その炭素同位体分別効果が-12‰以下であることを示した。本研究では,この現象が深海(低温高圧環境)由来メタン生成菌において普遍的なものかどうかを評価するため,深海堆積物から分離した低温性メタン生成菌を高圧条件で培養して生成するメタンの炭素および水素同位体比を網羅的に解析する。平成27年度は,供試菌株をメチル化合物存在下,高圧条件で培養した際に生成するメタンの炭素および水素同位体比を網羅的に測定した。一連の研究を通して,深海由来メタン生成菌に関して,1)圧力が細胞の増殖およびメタン生成活性に影響を及ぼすこと,2)メタン生成における同位体分別効果は,細胞の増殖速度やメタン生成活性とは独立して,圧力により影響を受けることが示された。

本研究では、南海トラフの深海底表層堆積物より分離したメタン生成菌(Methanosarcina sp. NT-MS1株)を用いて,大気圧および深海の圧力条件でメタノールを基質に培養した際の細胞増殖速度,メタン生成活性,および生成メタンの炭素および水素同位体比を測定し,圧力が深海底堆積物由来のメタン生成菌の増殖能およびメタン生成活性だけでなく,生成するメタンの炭素・水素同位体比にも影響を及ぼすことを明らかにした。研究分担者であった今野氏の退職に伴い、ガス分析に関するデータの取得が遅れてはいるが、微生物の増殖に関するデータは着実に蓄積できている。当初計画していた低温条件(2-4°C)での培養実験は、時間の都合上、まだ着手できていない。微生物学人員が減ったこともあり、時間的に可能な範囲で実験項目を見直す必要が出てきた。まずは昨年度の培養実験で採取したガスサンプルについて、網羅的にメタンの炭素および水素同位体比の測定にとりかかる。一連の実験で得られたデータに関しては、学術会議(日本微生物生態学会を予定)において発表する。供試菌株が一般的な微生物実験法が適用できない性質を有していたために、一部の実験において実験手法の検討が必要になるなど想定外な事象もあったが、研究は概ね順調に進展している。昨年度の実験における懸案事項も現在はほぼ解決しており、当面は支障なく実験を進められると考えている。さらに、本研究課題以外の研究からも本研究に応用できる事象が見つかるなど、当初の想定以上に今後の研究が発展することも期待できる。研究分担者の退職に伴い、人員が減ったことで当初予定していた分析の進捗が遅れ、分析に使用するヘリウムガスの購入を見送ったため。既にサンプルガスを採取しているものについてはメタンの水素同位体比測定を行う。供試菌株のうち培養が完了していないものについては逐次培養を行い、比較解析に必要なデータを取得する。また、初年度は至適生育温度でのみ培養を行ったが、平成26年度は当初の計画通り2-4°Cの低温条件でも高圧培養を実施する。平成26年度の実験で採取し、分析が完了していないガス試料を同位体質量分析ガスクロマトグラフで分析する際に使用するヘリウムガスの購入に使用する。一部の実験項目において一般的な微生物実験法が適用できないことが判明した。研究遂行にあたり必要不可欠な部分であった為、急遽検討に取りかかった。懸案事項は解決したが予定していたガス試料の分析が完了せず、分析に要する経費が余剰となった。平成25年度の実験で採取し、分析が完了していないガス試料を同位体質量分析ガスクロマトグラフで分析する。予算は分析に必要となる標準ガスおよびガスクロマトグラフの移動相として使用するヘリウムガスの購入に充てる。
大気乱流中の雲とエアロゾルを通しての太陽光による熱エネルギー伝達メカニズムの解明

気候変化の数値予測精度を向上させるためには、大気乱流中の雲やエアロゾルを通しての太陽からの熱エネルギー伝達のメカニズムを解明し、それを正確にモデル化することが重要である。本研究では、室内実験と数値シミュレーションにより、液滴(雲粒)の蒸発や液滴-周囲流体間の温度差が液滴に働く抗力や液滴の後流渦特性に及ぼす影響、および雲内の放射特性(反射・吸収・透過特性)に及ぼす乱流の影響を明らかにした。近年、大気海洋大循環モデル(GCM)を用いて地球の温暖化を予測するための研究が国内外で活発に進められているが、その信頼性は必ずしも高くはない。その原因として指摘されている項目の中で最も重要なものは、地球全体の熱収支に及ぼす雲の影響が正確に評価できていないことである。そこで本研究では、太陽光による熱エネルギーの大気乱流中における反射・吸収・透過プロセスに及ぼす雲の影響を明らかにすることを目的とする。近年,大気海洋大循環モデル(GCM)を用いて地球の温暖化を予測するための研究が国内外で活発に進められているが,その信頼性は必ずしも高くはない.その原因として指摘されている項目の中で最も重要なものは,地球全体の熱収支に及ぼす雲の影響が正確に評価できていないことである.そこで,本研究では,太陽光による熱エネルギーの大気乱流中における反射・吸収・透過プロセスに及ぼす雲の影響を,精巧な室内実験および高精度の数値シミュレーションを行うことにより解明することを目的としている.平成20年度の実施概要を以下に示す.(1)単一液滴の内外部流と熱輸送に関する研究単一液滴の内外部流流れに三次元直接数値シミュレーション(DNS)を適用することにより,空気の相対湿度が水液滴の蒸発速度や熱移動特性に及ぼす影響を明らかにした.また,単一液滴の蒸発速度に及ぼすレイノルズ数空気温度および相対湿度の影響を実験的にも検討するための実験装置を設計,製作した.具体的には,単一液滴を毛細管を用いて固定し,流量,温度および湿度を調整した空気を下方から流した.流れ場をLDVにより,また,蒸発による液滴の粒径および液滴温度の変化を高速度ビデオカメラと流体温度計測システムを用いて計測可能とした.現在は,本装置を用いて詳細な計測を進めている.(2)分散二相乱流の熱輸送に関する研究太陽光による熱エネルギーの反射・吸収・透過プロセスを模擬可能な,実験室規模のシミュレーション装置の設計,製作を試みた.具体的には,現有の風洞装置を改良し,雲を噴霧装置により,また,太陽光の熱エネルギーをレーザ光や波長域の異なるハロゲンランプ,キセノンランプにより再現することを試みた.しかし,実際の雲に比べて,これまでに得られている風洞内の乱流は弱く,噴霧の濃度が薄いことがわかった.そこで,現在はより実際の雲に近い状況を作るための対策を検討中である.近年,大気海洋大循環モデル(GCM)を用いて地球の温暖化を予測するための研究が活発に進められているが,その長期予測の信頼性は必ずしも高くはない.その原因の1つとして,温暖化の進行過程において特に重要となる地球全体の熱収支に及ぼす雲およびエアロゾルの影響が正確に評価できていないことが挙げられる.そこで,本研究では,太陽光による熱エネルギーの大気乱流中における反射・吸収・透過プロセスに及ぼす雲の影響を,精巧な室内実験および高精度の数値シミュレーションを行うことにより解明することを目的とする.平成21年度の研究実施概要を以下に示す.(1)単一液滴の内外部流と熱輸送に関する研究:前年度までに開発した,蒸発に伴う外部気流の密度変化を無視した単一液滴の内外部流れを解くための三次元直接数値シミュレーション(DNS)コードを,密度変化の効果を考慮可能なコードへと改良した.また,前年度までに構築した単一液滴の蒸発速度を検討するための実験装置を用いて,レイノルズ数,空気温度および相対湿度を変化させた条件下で実験を実施し,計算結果との詳細な比較検討を行った.(2)分散二相乱流の熱輸送に関する研究:太陽光による熱エネルギーの反射・吸収・透過プロセスを模擬可能な実験室規模のシミュレーション装置の設計,製作を試みたが,実際の雲に比べて風洞内の乱流が弱く,かつ,液滴径分布および熱エネルギーの計測を既存の測定装置では十分な精度で評価できないことが明らかになった.そこで,太陽光による熱エネルギーの反射・吸収・透過プロセスを模擬可能な三次元直接数値シミュレーション(DNS)コードの開発を行った.現在は,本コードを用いて,熱エネルギーの反射・吸収・透過率に及ぼす噴霧の濃度,層厚み,さらには乱流分散やPreferential Motionの影響解明にめけた検討を進めている.近年,大気海洋大循環モデル(GCM)を用いて地球の温暖化を予測するための研究が活発に進められているが,その長期予測の信頼性は必ずしも高くはない.その原因の1つとして,温暖化の進行過程において特に重要となる地球全体の熱収支に及ぼす雲およびエアロゾルの影響が正確に評価できていないことが挙げられる.