hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
RGS蛋白質による三量体G蛋白質サイクルの生理的制御機構の解明

本研究の目的は、G蛋白質サイクル調節蛋白質であるRegulators of G protein signaling (RGS)蛋白質が如何にして生理的に三量体G蛋白質シグナルを調節するか、その分子機構について統合的に解明することである。平成15年度に研究代表者は、RGS蛋白質が基底状態ではホスホリン脂質の一種である、ホスファチディルイノシトール3リン酸(PIP_3)によって抑制され、逆にカルモデュリン(CaM)がカルシウム依存性にPIP_3による抑制を脱抑制する調節機構があることを明らかにし、またこれが心房筋に存在するG蛋白質制御カリウムチャネル(G protein-gated K^+ channel : K_G)電流に見られるrelaxationと呼ばれるある特徴的な電位依存性特性の背景となっているものであることを解明した。平成16年度には研究代表者は、RGS蛋白質はホスホリン脂質のうちPIP_3と特異的に結合すること、またCaMはカルシウム依存性にRGS蛋白質に結合し、PIP_3とRGS蛋白質の結合を解離させることを明らかにした。これらPIP_3およびCaMとの結合はいずれもRGSドメイン上の塩基性アミノ酸残基クラスター上で行われ、このクラスターは20種類にもおよぶほとんどすべてのRGS蛋白質で保存されていることから、この調節機構は一般的なRGS蛋白質の制御機構であることが示唆された。さらに研究代表者は平成16年度中に、生細胞での蛍光イメージング技術(Fluorescent Resonance Energy Transfer ; FRET)を用いて、RGS蛋白質とCaMのin vivoでの結合を可視化することに成功した。また、RGS蛋白質の機能をシステムとして理解するため、G蛋白質サイクルの生理的な数理モデルを作成することに成功した。(773字)本研究の目的は、G蛋白質サイクル調節蛋白質(Regulators of G protein signalling ; RGS)による生理的な三量体G蛋白質シグナルの調節機構を解明することである。RGS蛋白質は三量体G蛋白質のαサブユニット上のGTPをGDPに加水分解する反応を促進する作用をもつため、RGS蛋白質がもし無制限に作動すればG蛋白質サイクルを完全に抑制してしまうことになる。これはRGS蛋白質を異所性に過剰発現させた場合によく観察される現象である。従って、RGS蛋白質による生理的なG蛋白質サイクルの制御機構を理解するためには、RGS蛋白質の機能がいかに統制されているかを知ることが極めて重要である。研究代表者は、RGS蛋白質が基底状態ではホスホリン脂質の一種である、ホスファチディルイノシトール3リン酸(PIP_3)によって抑制され、逆にカルモデュリン(CaM)がカルシウム依存性にPIP3による抑制を脱抑制する調節機構があることを明らかにし、またこれが心房筋に存在するG蛋白質制御カリウムチャネル(G protein-gated K^+channel : K_G)電流に見られるrelaxationと呼ばれるある特徴的な電位依存性特性の背景となっているものであることを解明した。さらに研究代表者は、ホスホリン脂質やCaMが如何にしてRGS蛋白質の機能を調節するかを明らかにするため、RGS蛋白質を発現・精製しホスホリン脂質との結合およびそれらに対するCaMの効果について検討した。その結果、RGS蛋白質はホスホリン脂質のうちPIP_3と特異的に結合することが分かった。またCaMはカルシウム依存性にRGS蛋白質に結合し、PIP_3とRGS蛋白質の結合を解離させることが分かった。またこれらPIP_3およびCaMとの結合はいずれもRGSドメイン上の塩基性アミノ酸残基クラスター上で行われ、このクラスターは20種類にもおよぶほとんどすべてのRGS蛋白質で保存されていることから、この調節機構は一般的なRGS蛋白質の制御機構であることが示唆された。(742字)本研究の目的は、G蛋白質サイクル調節蛋白質であるRegulators of G protein signaling (RGS)蛋白質が如何にして生理的に三量体G蛋白質シグナルを調節するか、その分子機構について統合的に解明することである。(773字)
薄膜ハイドロオキシアパタイトと顎骨骨梁との親和性に関する三次元画像解析

薄膜HAコーティングインプラント体(HA)および純チタン単体インプラント(Ti)をビーグル成犬の顎骨に植立し、界面部での骨新生過程ならびに骨融合形態の経時的変化を組織標本およびマイクロCT三次元画像を用いて観察した。また、試作の差分処理ソフトを併用し、実症例の骨構造の変化を定量的に解析した。動物実験ではインプラントを埋入してから3週から24週にかけて、また臨床症例に関しては術前から1年にわたり経時的に標本を作製した。顕微鏡下における観察結果の代表例として、埋入後3週後症例での新生骨添加は、HAではインプラント床上方1/2の母床骨表面のみでなくHA膜表面でも認められた。Tiでは母床骨表面のみで、インプラント体表面では線維性結合組織が進入していた。インプラント床下方1/2では両者間に差異はなかった。埋入後5週後症例においては、HAでは、インプラント床上方1/2の骨空隙が母床骨とHA表面に添加した新生骨によって完全に満たされ、母床骨とインプラント体は新生骨により確実な骨との骨結合(融合)が得られていた。一方、Tiでは、この空隙は新生骨に満たされておらず、線維性結合組織が介在していた。マイクロCT所見の代表例では、埋入後3週後症例でアーチファクトの発生が危倶されたが、骨とインプラント体との境界を立体的に捉えることができた。両インプラントともに、過大に形成されたインプラント床上方1/2の骨空隙部では骨欠損が認められたが、Tiでその傾向が強かった。HAの骨髄腔内では、骨梁の形成が認められ、それらは皮質骨と連絡していた。一方、Tiでは、骨髄腔内において、インプラント周囲に骨梁の形成はなく、皮質骨からわずかに形成されたことを示唆するようなインプラント方向へ延びる形成途中の骨梁が認められるのみにとどまった。差分処理では変化した骨領域の画素数をカウントした。吸収、リモデリングかの識別は困難であったものの変化領域を定量的に特定することができた。薄膜ハイドロオキシアパタイトがコーティングされた対象物として、インプラント体を利用した。ビーグル犬に埋入する事が前提となるため、人体に応用するインプラント体を特殊加工し、犬の顎骨にあった大きさに工夫した。一方、そのコントロールとして、チタン単体のインプラントも同じように小さく加工したものを準備した。ビーグル犬の片側に異種のインプラント体を1個ずつ並行に埋入し、全麻下においてマイクロctによる同部のRawデータを収集した。現在、1,2,4,5,6週例のrawデータの収集に成功している。Raw dataを用いて三次元画像構築をした結果、2週例より顎骨本体、インプラント表面の両側から骨梁の造成が確認できている。現在さらに、週例数を増し、データの収集に取り組むことを予定している。と並行して、人体の顎骨内にも薄膜ハイドロオキシアパタイトコーティングのインプラント体を埋入した40本についての口内法ディジタル画像データを経時的に収集し、骨質の状態、とくに界面部の変化を経過観察している。本所見では、骨梁の新生像を認識することはできないのが現状であるが、少なくとも埋入直後から3,4ケ月までは骨密度の低下が認められ、その後、上昇する結果を得ている。チタン単体インプラントを対象とした従来の報告にあるような単純な骨密度変化ではないことが推定できる。

骨体、薄膜ハイドロオキシアパタイト表面の両面からの骨梁の造成、ならびにその造成速度を裏付けるものと推定している。薄膜HAコーティングインプラント体(HA)および純チタン単体インプラント(Ti)をビーグル成犬の顎骨に植立し、界面部での骨新生過程ならびに骨融合形態の経時的変化を組織標本およびマイクロCTを使用して観察した。埋入のためのインプラント床を設定し、上方2mmはキャップを装着するためのスペース、残り6mmのうち下方4mmをインプラント体が実際に顎骨に固定される部分とした。周囲への線維性結合組織の迷入を防止するために、吸収性膜によってインプラント体上面を被覆した。インプラントを埋入してから3週から24週にかけて経時的に標本を作製した。顕微鏡下における観察結果の代表例として、埋入後3週後症例での新生骨添加は、HAではインプラント床上方1/2の母床骨表面のみでなくHA膜表面でも認められた。Tiでは母床骨表面のみで、インプラント体表面では線維性結合組織が進入していた。インプラント床下方1/2では両者間に差異はなかった。埋入後5週後症例においては、HAでは、インプラント床上方1/2の骨空隙が母床骨とHA表面に添加した新生骨によって完全に満たされ、母床骨とインプラント体は新生骨により確実な骨との骨結合(融合)が得られていた。一方、Tiでは、この空隙は新生骨に満たされておらず、線維性結合組織が介在していた。マイクロCT所見の代表例では、埋入後3週後症例でアーチファクトの発生が危倶されたが、骨とインプラント体との境界を立体的に捉えることができた。両インプラントともに、過大に形成されたインプラント床上方1/2の骨空隙部では骨欠損が認められたが、Tiでその傾向が強かった。HAの骨髄腔内では、骨梁の形成が認められ、それらは皮質骨と連絡していた。一方、Tiでは、骨髄腔内において、インプラント周囲に骨梁の形成はなく、皮質骨からわずかに形成されたことを示唆するようなインプラント方向へ延びる形成途中の骨梁が認められるのみにとどまった。
代替フロンの回収技術に関する研究

本研究は,炭素系吸着剤による代替フロンの先導的回収技術の創生を目的としたものである。代替フロンは,特定フロンのハロゲン原子1,2個を水素の置換した構造を有しており,分解しやく,オゾン層破壊係数が特定フロンよりも小さくなっている。しかし,代替フロンであっても回収せずに大気中に放出するとオゾン層破壊や地球温暖化の原因となる。また,代替フロンの化学構造が臨床吸入麻酔薬と類似の構造を有していることより,代替フロンの麻酔作用が懸念される。したがって,本年度においては,代替フロンの麻酔作用,分解性について検討し,また代替フロンの先導的回収技術に関して,表面改質活性炭および高表面積活性炭を調製し,それらに対する代替フロンの吸着特性について検討した。その結果,代替フロンには吸入麻酔薬であるエンフルレンと同程度の麻酔作用を有するものが存在すること,また,代替フロンは特定フロンに比べ,回収時に分解されやすいことが認められた。すなわち,地球インパクトや人体への影響を考慮した場合に,代替フロンは大気中に放出せずに回収することが必要である。そこで,表面を硝酸または水素ガスで処理した活性炭および水酸化カリウム処理により表面積ならびに細孔容積を増大させた活性炭を調製し,代替フロンの回収能について検討した。その結果,活性炭の代替フロン回収能は,吸着剤の表面化学的因子よりも,むしろ表面積ならびに細孔容積などの物理構造的因子によって,主に支配されていることが判明した。
一次元鎖状構造をとる新しい多核金属錯体の合成と物性

近年、ランタノイドイオンを含む金属錯体は磁性体や発光材料、触媒などへの応用目的からさかんに研究が行われている。しかし、それらの錯体の多くは単核、もしくはランタノイドイオンのみが配位子で架橋された多核構造をとるものが大半を占めている。そこで、報告者は新たにランタノイドイオンと他の遷移金属イオンを含むヘテロ多核金属錯体を合成することを試みた。すなわち、酸化還元やスピンクロスオーバー、光化学反応を起こす遷移金属イオンをランタノイドイオンに近接させたヘテロ多核金属錯体を構築し、金属間の協同的な相互作用から新たな機能や物性、反応性を持つ新しい物質をつくることを目的とした。その結果、一次元鎖状構造をとる多核金属錯体は合成できなかったが、5座のシッフ塩基配位子を用いてV-Ln-Ln-Vの骨格を持つV(V)-Ln(III)4核錯体(Ln=Eu, Gd, Tb)とV-Ce-Vの骨格を持つV(V)-Ce(IV)3核錯体の合成と構造決定に成功した。その中で、V(V)-Tb(III)4核錯体は従来のTb(III)錯体より、強い強度の蛍光スペクトルを示すことが明らかになった。また、V(V)-Ce(IV)の3核錯体の電気化学的性質についてCVで調べたところ、この3核錯体は-0.06V付近(vs.Ag/Ag^+)に2電子の可逆な酸化還元波を示すことがわかった。この錯体のようなヘテロ多核金属錯体では、ランタノイドイオンと遷移金属イオンの組み合わせを変えれば数多くの錯体の合成が可能であり、それぞれの中心金属の特性に応じてさまざまな化学が展開すると期待される。不対電子を持つ金属錯体が一次元に並んだ高分子錯体では、導電性や強磁性などの特徴ある物性を示すものがあり、今日、その構造と物性について盛んに研究が行われている。例えば、一次元鎖状構造(...V=O...V=O...)をとるオキソバナジウム(IV)錯体[VO(salpn)]では鎖中の分子間に強磁性的相互作用(J=+5.2cm^<-1>)が見られる。今回、報告者は新たに...Cr≡N...Cr≡N...の一次元鎖状構造をとるニトリドクロム(V)錯体[CrN(salpn)]の合成を行った。この錯体のN...Cr距離(2.508Å)は一次元鎖状構造をとる[VO(salpn)]のO...V距離(2.213(9)Å)にくらべて長く、Cr≡Nユニット間の相互作用は弱いことがわかった。しかし、[CrN(salpn)]では、鎖中の分子間に強磁性的相互作用(J=+8.4cm^<-1>)が見られ、その相互作用は同じ(d_<xy>)^1の電子配置を持つ[VO(salpn)](J=+5.2cm^<-1>)に比べて大きいことが明らかになった。現在、これらの錯体について電子密度とスピン密度の計算を行い、強磁性的相互作用が発現する機構について考察を行っている。
細胞機能を制御するための多機能ケージド化合物の創成

ケージド化合物とは、光分解性保護基で生理活性物質の活性部位を保護し、光によってその活性を時空間レベルで制御できる化合物のことである。ケージド化合物にターゲット認識能、細胞膜透過性、水溶性等の機能を付与できれば、これまでにない新しいタイプのプローブ分子となり、ケージド化合物の有効性を更に高めることができる。基本戦略は、ケージド化合物をモジュール化することによる多機能化である。すなわち、ケージド化合物を、ターゲット認識部位、光分解性保護基、および生理活性部位の3つのモジュールに分ける。各モジュールについて複数の分子を用意できれば、用途に応じてモジュールを選んで組み合わせることで、さまざまな細胞機能を自在に光制御する最適な組み合わせを見つけることができる。本研究では多機能性ケージド化合物の開発を目的に、key building blockとなる化合物の設計と合成をし、ターゲット認識能を持っ分子の導入を検討した。まず、key building blockとなる分子を設計し合成した。この化合物は、Bhc-diazoの7位にリンカーを介してアミノ基反応性の官能基を付けたもので、「ターゲット認識部位」を導入することができる。また、4位のジアゾメチル基によりヌクレオチド性の「生理活性分子」をケージド化合物に変換できる。7位にオクチルアミンを導入した化合物の合成に成功し、アミノ基を持つ分子の導入が可能であることが確認された。さらに末端がアミノ基のリンカーを持っビオチンを「ターゲット認識部位」として導入した化合物の合成にも成功した。
前立腺肥大症治療薬のオフターゲット効果による再燃前立腺癌の新規治療戦略

腫瘍微小環境において、癌間質を構成する主要な成分:癌関連線維芽細胞(CAFs)は腫瘍形成に重要な役割を担う。前立腺肥大症治療薬ナフトピジルが細胞周期阻害作用を発揮するための細胞内標的を同定する目的で、我々は文科省科研費・新学術領域・がん支援・化学療法基盤支援活動班から無償で分与された標準阻害剤キットを活用した。その結果、ヒト前立腺腫瘍から初代培養して得られたCAFsの1つ、PCaSC-8においてGSK-3とCDKに対する阻害剤がナフトピジルに近似した作用を示すことを見出した。さらに、ナフトピジル処理によるGSK-3のリン酸化阻害およびCDK2タンパク質量の低下を確認した。以上から、ナフトピジルのオフターゲット効果である細胞増殖抑制作用(G1 cell cycle arrestの誘導)に関わる細胞内シグナル伝達経路をGSK-3およびCDK2シグナルと絞り込むことに成功した。本年度は、前立腺肥大症治療薬ナフトピジルによる細胞増殖抑制の程度が異なる1市販の正常ヒト前立腺ストローマ細胞PrSC(Lonza社)と2ヒト前立腺腫瘍から初代培養して得られた癌間質細胞PCaSC-8を用いて、ナフトピジルによる細胞増殖抑制に関わる細胞内シグナル伝達経路の同定を試みた。【検討1】文科省科研費・新学術領域・がん支援・化学療法基盤支援活動班より無償で分与された、320種類以上の化合物を含む標準阻害剤キットを用いてナフトピジルと同じ細胞増殖抑制パターンを示す化合物を探索した。その結果、GSK-3に対する阻害剤(GSK-3 inhibitor II, IXやAlsterpaullone)とCDKに対する阻害剤(Cdk1/2 inhibitor IIIやAlsterpaullone)がナフトピジルに近似した作用を示すことを見出した。【検討2】ウェスタンブロッティング法により、ナフトピジル処理によるGSK-3のリン酸化阻害とCDK2タンパク質量の低下を確認した。320種類以上の化合物を含む標準阻害剤キットを用いた網羅的な解析により、ナフトピジルによる細胞増殖抑制に関わる細胞内シグナル伝達経路をGSK-3, CDK2経路と絞り込むことに成功した。現在のところ、臨床で用いられているGSK-3阻害剤はない。よって、GSK-3阻害作用を有する既存薬ナフトピジルを有効活用して、GSK-3シグナルが強く関わるアルツハイマー病など他の疾患治療薬として再開発していく可能性が示唆された。本年度は、ヒト前立腺腫瘍から初代培養して得られた癌間質細胞PCaSC-8を用いて、ナフトピジルをはじめとする前立腺肥大症治療薬への反応性を検証し、さらにナフトピジルによる細胞周期阻害作用機構の解明を行った。【検討1】市販の正常ヒト前立腺ストローマ細胞PrSC(Lonza社)に対する増殖抑制作用と比較して弱いものの、ナフトピジルはPCaSC-8の細胞増殖を有意に抑制した。ナフトピジル以外に実臨床で使用される前立腺肥大症治療薬タムスロシンやシロドシンによる抑制作用は極めて弱いものであった。【検討2】PrSCをTGFβで処理すると細胞増殖が有意に抑制された。そこで、TGFβで前処理したPrSCに対してナフトピジルを作用させたところ、ナフトピジルによる増殖抑制作用は観察されなかった。アンドロゲン低感受性ヒト前立腺癌細胞に対して細胞周期阻害作用を発揮するナフトピジルは、ヒト前立腺腫瘍から初代培養して得られたPCaSC-8に対しても強い増殖抑制作用を示したため、癌間質を標的とした再燃前立腺癌の新規治療法の確立に向けた第一歩となる結果が得られた。また、TGFβにより細胞増殖を停止させた間質細胞に対してナフトピジルが増殖抑制作用を発揮しなかったため、ナフトピジルは体内において活発に増殖する癌細胞を特異的に標的とする、すなわち正常細胞への攻撃が弱く、副作用が出にくい薬剤である可能性が示唆された。ヒト前立腺腫瘍から初代培養した癌間質においても、ナフトピジルによる増殖抑制が観察されること。さらに、ナフトピジルはTGFβにより細胞増殖を止めた間質細胞に対して増殖抑制作用を発揮できないことを見出した。ナフトピジルのオフターゲット効果を引き出す標的分子の同定については、現在、ナフトピジルをFGビーズへ固定化する準備を進めている。ナフトピジルのオフターゲット効果を引き出す標的分子の同定については、ナフトピジルをFGビーズに固定化した後、前立腺癌細胞のタンパク質抽出液と混合させ、ナフトピジルと結合する癌細胞内タンパク質の精製および同定へ向けた作業を進める。また、ナフトピジルによる癌間質を標的とした再燃前立腺癌の増殖抑制については、低アンドロゲン感受性細胞株と癌間質を混合し、免疫不全マウス

腎被膜下へ移植する動物実験モデルにおいてナフトピジルの作用を検証する。in vivo腫瘍形成実験で用いる免疫不全マウスの購入と、ナフトピジルと結合する癌細胞内タンパク質の精製および同定に必要な試薬等
特異乳化現象の発見に基づく新規粒子調製法の確立と経肺投与への応用

有用物質の植物細胞内への輸送を目指し、数百nm程度のカプセル状粒子(PICsome)の調製を行った。得られた粒子の物性評価と植物内での粒子の挙動を観察した。酵素重合によってポリリジンの合成を行い、PEGとの重縮合によってカチオン性のブロックポリマー(PEG-Plys(NH2))の合成を行った。ポリリジン部のユニットに無水コハク酸を付加することで、アニオン性のポリマー(PEG-Plys(COOH))を得た。カチオン性のポリマー、アニオン性のポリマーの両者を水中に溶解し、混合しポリイオンコンプレックスを形成することで、数百nmサイズの粒子を調製した。FE-SEMによる詳細な観察の結果より、内部に空洞を有する粒子であることが判明し、得られた粒子はPICsomeである事が明らかとなった。また、粒子調製時に蛍光物質を導入し、蛍光物質を担持した粒子の調製を試みた。得られた粒子を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した結果、蛍光物質を有する、数百nm程度の粒径を有する粒子が得られたことがわかった。蛍光物質担時粒子をシロイヌナズナ(arabidopsis thaliana)の気孔に純水と一緒に注入し、粒子の形態について経過観察を行った結果、一ヶ月近く安定に粒子が存在していることが判明した。担持物の放出制御を行うために、粒子の構成高分子の再検討が必要であることがわかった。平成28年度では、特異的な表面構造の形成機構の解明を目標とし、(1)粒子形成に使用する高分子の合成と、(2)エマルションの形成条件が多孔質粒子の形成に及ぼす影響の解明について取り組んだ。(1)粒子形成に使用する、様々な分子量組成比を有する、親水性ブロック(ポリエチレングリコール、PEG)と疎水性ブロック(ポリ乳酸、PLA)から構成される両親媒性ブロック共重合体(PEG-b-PLA)をリビングアニオン重合法によって合成した。合成された高分子は1H NMRとGPCによって分子量、分子量組成、分子量分散を測定した。(2)自己乳化現象後に得られたw/oエマルションを水と混合し、撹拌することによって得られるw/o/wエマルションの経時観察を行った。光学顕微鏡によるエマルションの詳細な観察を通して、時間が経過するに従い、w/o/wエマルションの粒子径が減少し、内部水滴(w/oエマルション)が凝集し、多孔質粒子が形成する様子が観察された。これらの結果より、PEG-PLAを用いた多孔質粒子の本調製法において、自己乳化現象により得られた、無数に存在するw/oエマルションが空洞を形成し、多孔質状の粒子が形成したと考えられる。また、自己乳化現象の解明を目標として、光学顕微鏡と高速度カメラを組み合わせた装置により、両親媒性ブロック共重合体が含有する有機溶媒と水とが接触した、油水界面の瞬間的な観察も行った。界面の詳細な観察を行ったことで、油と水の界面に「ずり」が生じた際にエマルションが形成していく現象を捉えることに成功した。現状では形成機構の解明にまで至ってはいないが、油水界面に生じる「ずり」は両親媒性ブロック共重合体の油水界面への配向に基づく界面張力の低下によって生じたものであると考えられ、自己乳化現象の解明の糸口となると考えられる。様々な分子量を有する両親媒性ブロック共重合体の合成に成功しており、得られた高分子を用いることで、多孔質粒子の形態の観察を行うことが可能となった。SEM観察による定量的な評価を通して、多孔質粒子の空孔数、空孔径の変化を評価した。その結果、PEG分子量が空孔径、空孔数に大きく影響を及ぼすことが確認され、PEG-PLAの分子量を制御するということと、使用量を調整するということで、粒子表面の形態を制御可能であることがわかった。この結果は、肺への薬物輸送に適した表面形態を有する粒子を容易に調製可能であることを示しており、経肺投与法に適する最適な粒子形態を明らかにすると考えられる。また、自己乳化型のw/oエマルションが形成する瞬間を観察することによって、これまでに観察されていない、瞬間的な乳化現象を捉えることに成功した。今回の条件により得られた結果は、多孔質粒子の調製における乳化現象であるが、今回使用したPEG-PLAは非イオン系界面活性剤の一種であるため同様の構造を有する、一般的な非イオン系界面活性剤を用いた場合であっても、同様の乳化現象が生じると考えられる。そのため、今回の自己乳化現象の瞬間を捉えることに成功したという結果は、高分子系界面活性剤を用いた際に生じる、自己乳化機構の解明の糸口になると考えられる。そのため、自己乳化エマルションの形成機構が界面科学の未知なるサイエンスの解明に及ぼす影響は大きいと考えられる。これらの発見により、当該年度における研究成果は、肺への薬物輸送技術に与える影響、及び、界面科学に与える影響が大きいと考えられるため、おおむね順調に進展しているといえる。

カチオン性のポリマー、アニオン性のポリマーの両者を水中に溶解し、混合しポリイオンコンプレックスを形成することで、数百nmサイズの粒子を調製した。FE-SEMによる詳細な観察の結果より、内部に空洞を有する粒子であることが判明し、得られた粒子はPICsomeである事が明らかとなった。また、粒子調製時に蛍光物質を導入し、蛍光物質を担持した粒子の調製を試みた。得られた粒子を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した結果、蛍光物質を有する、数百nm程度の粒径を有する粒子が得られたことがわかった。蛍光物質担時粒子をシロイヌナズナ(arabidopsis thaliana)の気孔に純水と一緒に注入し、粒子の形態について経過観察を行った結果、一ヶ月近く安定に粒子が存在していることが判明した。担持物の放出制御を行うために、粒子の構成高分子の再検討が必要であることがわかった。次の二項目を遂行する予定である。(1)薬物キャリアとしての性能評価これまでに作成された多孔質粒子は肺への送達性能や粒子の分解性、崩壊性について調査されていなかった。また、薬物の封入効率や封入率についての検討もなされていない。そこで、カスケードインパクターと吸入器を用いた多孔質粒子の吸引試験を行い、多孔質粒子の気流中における挙動を評価することで、多孔質粒子の表面形態が肺への送達性能に与える影響を詳細に評価する。粒子の分解性、崩壊性は肺内環境を模した条件を構築し、その環境下に粒子を留置し、SEMによって粒子の形態変化を経時観察する。モデル薬物としてローダミンやリファンピシンを選択し、粒子内部に封入し、薬物封入粒子の薬物封入率、封入量を紫外可視分光光度計によって評価する。(2)特異乳化現象の解明自己乳化現象の解明として、これまでに、顕微鏡と高速度カメラを組み合わせた装置を用いて、高分子が含有する有機溶媒と水とが接触した瞬間のエマルションの形成する瞬間の撮影に成功している。これまでの実験では一種類の高分子のみで評価しており、自己乳化現象の詳細は明らかになっていない。そこで、様々な分子量組成比を有する高分子を用いて同様の実験を行い、高分子系界面活性剤の有する特異的な界面現象を明らかにする。それに伴い、組成比、分子量、分子が異なる非イオン系界面活性剤(両親媒性ブロック共重合体)の合成を行う。近年、環境への低負荷の点から酵素による高分子の重合法(化学酵素重合)が数多く報告されており、高分子合成の段階で、化学酵素重合を取り入れ、より環境にやさしい手法を通して得られる非イオン系界面活性剤を用いた、界面科学的現象の探求も視野に入れる予定である。
計算機顕微鏡を指向した電子顕微鏡像・分子動力学法統合による原子モデルの構築

分子動力学計算ソフトウェアNAMDを利用して、電子顕微鏡像をポテンシャルとする外力(Steering Force)として分子動力学計算に組み込んだ新規のアルゴリズムを開発した。我々は、これを、空間制限分子動力学法(Spatially-Restricted Molecular Dynamics)と呼ぶ。平行移動、回転などのマイクロ秒からミリ秒の時間スケールの動きを、酔歩として組み込み、電子顕微鏡像の分解能を変更することにより、電子顕微鏡像による空間拘束をアニーリングとして取り扱うアルゴリズムも導入した。これにより、モータータンパク質分子の構造変化を模擬することに成功した。この手法は、HFSPの国際シンポジウム、生物物理学会年会で報告した。この原子モデル構築アルゴリズムを適用するための三次元画像取得することを目的として、画像解析法の開発とモータータンパク質の単粒子三次元再構成を行った。高分解能3次元構造を得るために、数多くの画像を取得し、平均化することが重要であった。そこで、電子顕微鏡による粒子画像の自動取得を目的とした新しい手法を開発し、査読付国際会議で発表した。また、三次元画像再構成のための新規アルゴリズムを開発し、日本生物物理学会年会において報告した。この手法を用いて、ミオシンVI、ダイニン、シトクロム酸化酵素の三次元再構成を行った。さらに、画像分類・統計処理法を用いて、シャペロニン構造の基質結合により誘導された構造変化を捉え、Protein Science誌に報告した。この手法は、モータータンパク質の高分解能構造の妥当性を検討する上でも重要である。また、ナノメータ分解能の電子顕微鏡三次元画像から原子モデルを構築するためのアルゴリズムを開発した。これらは、2004年生物物理学会年会にて報告した。分子動力学計算ソフトウェアNAMDを利用して、電子顕微鏡像をポテンシャルとする外力(Steering Force)として分子動力学計算に組み込んだ。更に、平行移動、回転などのマイクロ秒からミリ秒の時間スケールの動きを、酔歩として組み込んだ。また、電子顕微鏡像の分解能を変更することにより、電子顕微鏡像による空間拘束をアニーリングとして取り扱うアルゴリズムも導入した。これらにより、30度程度の回転や分子の構造変化に対しては対応できることが分かった。一方で、未だ、エネルギー極小値に捉われ、目標とする構造に至らない場合も存在した。今後、更に、ナノ秒からマイクロ秒の動きにあたるノーマルモード解析などの情報を組み込むことにより、この極小値問題を解決すべく研究を進めている。これらの結果は、2003年度日本生物物理学会年会にて、「電子顕微鏡3次元像と原子モデル間のDocking問題:分子動力学法を用いた解決を目指して」として報告した。また、アクチン・ミオシン硬直複合体のクライオ電子顕微鏡像もナノメータを超える分解能に達した。これにより、αヘリックスの同定が可能となり、現在、アクチン・ミオシン硬直複合体の原子モデル構築を行っている。本結果も、2003年度日本生物物理学会年会にて報告した。更に、フラクタル的空間分解能試験アルゴリズムを新しく開発し、空間分解能の妥当性を検討した。また、電子顕微鏡三次元像のエネルギー論的解析の可能性を探っている。共同研究者は、溶媒の問題を取り扱い、アクチン周辺の水和エネルギーの可能性を探り、それらを報告した。
大腸内酪酸濃度の制御による実験的大腸炎の抑制効果とその作用機序の解析

レジスタントスターチ(RS)の摂取は、TNBS誘発ラット大腸炎モデルに対して予防効果を示すことを見い出した。効果の判定には、潰瘍部面積および結腸組織中のミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性を測定した。15または30%RS添加飼料をあらかじめ10日間摂取したラットでは、TNBS投与8日後の障害像を用量依存的に抑制していた。TNBS投与直前のRS摂取群では、大腸内短鎖脂肪酸(SCFA)量の増大による大腸粘膜組織の肥厚化に加え、消化管内IgAおよび大腸粘膜組織中ムチン量の有意な増加が認められた。一方、RS摂取群の遠位結腸内でのEvans-blue透過性は、対照群に比べ有意に低下していた。これらの結果は、RS摂取がSCFA産生の増大により大腸粘膜のバリア機能を増強し、障害部位からのバクテリア透過を抑制することで大腸炎を軽減することを示唆している。さらに、RSに加えRPを組み合わせた飼料条件により大腸内SCFA濃度をさらに高める飼料を調製し、大腸炎に対する治療効果を評価した。大腸炎を誘発したラットに24時間後から、タンパク質源を25%カゼイン、炭水化物源を65%コーンスターチとする対照飼料、または炭水化物源の一部をRSで置換した20%RS飼料、さらに炭水化物源およびタンパク質源の一部をRSおよびレジスタントプロテイン(RP)で置換した20%RS/25%RP飼料を4週間摂取させた。対照群に比べ、20%RS群および20%RS/25%RP群の結腸組織中のMPO活性は有意に低い値を示したが、この効果は20%RS/25%RP群で顕著であり、治癒促進と大腸内SCFA濃度の間には正の相関を認めた。難消化性デンプン(RS)は、極端に味覚を損なうことなく食品へ添加することが可能である。大腸に流入したRSは腸内細菌によって効率よく短鎖脂肪酸(SCFA)に変換されるが、SCFAは大腸上皮細胞のエネルギー源であると同時に、腸管免疫の修飾による抗炎症作用を示すと考えられている。平成14年度の本研究助成により、RSの摂取は、TNBS(トリニトロベンゼンスルホン酸)誘発ラット大腸炎モデルに対して劇的な予防効果を示すことを見い出した。効果の判定には、潰瘍部面積、単位長あたりの結腸組織重量および結腸組織中のミエロペルオキシダーゼ活性を測定した。15または30%RS添加飼料をあらかじめ10日間摂取したラットでは、TNBS投与8日後の障害像を用量依存的に有意に抑制していた。TNBS投与直前のRS摂取群ではSCFAによる大腸粘膜組織の肥厚化(粘膜重量、タンパク質、核酸含量の増加)に加え、消化管内IgAおよびムチン分泌量の亢進が認められた。また、RS摂取群の遠位結腸内でのEvans-blue透過性は、対照飼料群に比べ有意に低下していた。これらの結果は、RS摂取が大腸粘膜のバリア機能を増強し、障害部位からのバクテリア透過を抑制することによってTNBS大腸炎を軽減することを示唆している。TNBS投与8日後の大腸炎症部位および門脈血中の炎症性サイトカイン(TNF-α、IFN-γ)濃度は群間で差が認められなかったが、RS摂取群のIL-10濃度は対照群に比べ高値を示す傾向にあった。次年度はRSに加えレジスタントプロテインを組み合わせた飼料条件により大腸内酪酸濃度を制御した試験系を設け、TNBS大腸炎に対する予防および治療効果を解析する。

TNBS投与直前のRS摂取群では、大腸内短鎖脂肪酸(SCFA)量の増大による大腸粘膜組織の肥厚化に加え、消化管内IgAおよび大腸粘膜組織中ムチン量の有意な増加が認められた。一方、RS摂取群の遠位結腸内でのEvans-blue透過性は、対照群に比べ有意に低下していた。これらの結果は、RS摂取がSCFA産生の増大により大腸粘膜のバリア機能を増強し、障害部位からのバクテリア透過を抑制することで大腸炎を軽減することを示唆している。TNBS投与8日後の大腸炎症部位および門脈血中の炎症性サイトカイン濃度は群間で差なかったが、RS摂取群のIL-10濃度は対照群に比べ高値を示す傾向にあった。さらに、RSに加えRPを組み合わせた飼料条件により大腸内SCFA濃度をさらに高める飼料を調製し、大腸炎に対する治療効果を評価した。大腸炎を誘発したラットに24時間後から、タンパク質源を25%カゼイン、炭水化物源を65%コーンスターチとする対照飼料、または炭水化物源の一部をRSで置換した20%RS飼料、さらに炭水化物源およびタンパク質源の一部をRSおよびレジスタントプロテイン(RP)で置換した20%RS/25%RP飼料を4週間摂取させた。対照群に比べ、20%RS群および20%RS/25%RP群の結腸組織中のMPO活性は有意に低い値を示したが、この効果は20%RS/25%RP群で顕著であり、治癒促進と大腸内SCFA濃度の間には正の相関を認めた。また炎症部位のIFN-γ濃度は、20%RS/25%RP群で有意に低い値を示した。
複雑現象工学による燃焼不安定の予測と制御

非線形カオス力学の視点から,旋回流を伴う希薄予混合火炎の不安定挙動の決定論的性質を明らかにし,火炎面挙動の短期予測を行った.相互情報量,順列エントロピー,相関次元,サロゲート法を組み合わせた並進誤差の特徴を調べることによって,火炎面挙動は中次元程度以上の複雑なダイナミックスを有するが,決定論的カオスが存在することが明らかとなった.また,非線形予測法を用いることで,火炎面挙動の短期予測の可能性が示された.非線形カオス力学の視点から,旋回流を伴う希薄予混合火炎の不安定挙動の決定論的性質を明らかにし,火炎面挙動の短期予測を行った.相互情報量,順列エントロピー,相関次元,サロゲート法を組み合わせた並進誤差の特徴を調べることによって,火炎面挙動は中次元程度以上の複雑なダイナミックスを有するが,決定論的カオスが存在することが明らかとなった.また,非線形予測法を用いることで,火炎面挙動の短期予測の可能性が示された.希薄予混合燃焼は環境にクリーンな燃焼方法として近年着目されているが,燃焼不安定が生じやすく,燃焼状態の適切な予測と最適な制御技術の開発が望まれている.本研究では,これまでの燃焼研究で導入されていない非線形カオス力学の考え方を導入し,不安定な燃焼状態の評価と予測を行うことを目的としている.本年度では,消炎限界付近で形成される燃焼不安定の火炎面挙動をレーザートモグラフィー法によって測定し,火炎面の時間変動に対して時系列カオス解析(位相状態空間,相互情報量,相関次元,並進誤差)を適用した.その結果,火炎面の時間変動から構築される位相状態空間の軌道の特徴は高次元カオスを示唆するものであるが,決定論的な特徴が十分存在することが明らかとなった.さらに,位相状態空間の軌道の並行度に着目し,Sugihara & May (Nature, vol. 344, p. 734, 1990)によって提案される非線形予測法を用いた結果,火炎面挙動を短期的に予測することが可能であることを明らかにした.また,火炎面挙動がカオス的になるメカニズムとして,反応物(予混合気)と燃焼生成物の界面で生じるレーリー・テーラー不安定が関連していることも明らかにした.希薄予混合燃焼は環境にクリーンな燃焼方式として近年着目されている.しなしながら,燃焼不安定が生じやすく,燃焼状態の適切な予測と制御が困難とされる.そのため,超希薄条件下で安定に燃焼を維持できる燃焼制御技術の確立が強く望まれている.非線形カオス力学に基づく時系列解析は,物理系のみならず生命科学・情報系などの幅広い分野で着目されており,複雑に変動する非線形現象の解明や予測・制御に対して適用されつつある.燃焼は流動,熱・物質拡散,化学反応が相互に作用し合う複雑な非線形現象であることから,非線形力学の考え方が燃焼ダイナミックスの取り扱いに対しても有効であると思われる.ガスタービンやパルス燃焼器内の燃焼現象とカオスの関連性が論じられているが,非線形力学の視点から火炎挙動の決定論的性質を抽出し,刻々と変化する燃焼状態を予測する研究例は,報告されていない.そこで,本研究では,非線形カオス力学の視点から,時間的・空間的に不規則に変動する火炎面挙動の決定論的性質を調べ,火炎面挙動の短期予測を行った.相互情報量,順列エントロピー,相関次元,サロゲート法を組み合わせた並進誤差の特徴を調べることによって,火炎面挙動は中次元程度以上の複雑なダイナミックスを有するが,決定論的カオスが存在することが明らかとなった.また,状態空間内の軌道同士の距離の変化に着目した非線形予測法を用いることで,火炎面挙動の短期予測の可能性が示された.
細胞膜間コミュニケーション評価のための細胞膜のストレス応答ネットワーク解析

本研究では,細胞膜のストレス応答の解明を目的とし,細胞膜モデルを固定化したメンブレンチップを開発した。細胞膜モデル間の膜-膜間相互作用を評価すると,コレステロールが誘導する膜構造および膜特性の変化が,細胞膜間の相互作用・ネットワークを制御している可能性が示唆された。また,その評価プローブとして用いた蛍光コレステロールが,生体内特に脳内に存在する酸化コレステロールと同様の特性を示すことを明らかにした。1.細胞膜モデルのリポソームを固定化したメンブレンチップを開発し,2種の評価手法を用いて膜-膜間相互作用を評価した。(1)蛍光漏出法を用いた系では,細胞膜の主成分であるコレステロールに着目し,コレステロールが誘導する膜構造および特性の変化が,膜-膜間作用の重要な因子であることを示した。(2)蛍光コレステロールを用いた系では,熱ストレス条件下における比較的強いリポソーム膜-膜間相互作用を検出できると同時に,(1)と同様の相互作用を検出できた。また,アルツハイマー症の原因タンパク質による細胞膜成分の酸化が,膜-膜間相互作用を強める可能性を示した。2.1(2)で用いた蛍光コレステロールに着目し,リポソーム膜から膜への物質移動を評価すると,蛍光コレステロールの膜間移動速度など種々の特性が,酸化コレステロールと同様であることがわかった。本研究で得られた知見は,コレステロールが誘導する膜構造に起因する膜-膜間相互作用の変化が,通常の細胞機能やストレス応答,アルツハイマー症などの疾病発症に,寄与する可能性を示唆している。また,脳内のコレステロール代謝に関わるコレステロール誘導体,酸化コレステロールと本研究で用いた蛍光コレステロールが,同様の特性を示すことを明らかにした。酸化コレステロールはまた,脳内で発生するアルツハイマー症との関連性が注目されており,蛍光コレステロールが酸化コレステロールの脳内動態の解析に有効であると期待できる。膜間相互作用の定量化を目的として、本年度はメンブレンチップの設計・開発に主眼を置いた。これまでの研究より、リポソームを固体基板上に固定化すると、本来の構造を保てない場合が多く、検出用素子をリポソーム内水相に保持できない。そこで、本年度では、(1)膜間湘互作用の解析のためのメンブレンチップの設計、(2)相互作用解析手法の構築、に着目して検討を進めた。(1)「膜間相互作用の解析のためのメンブレンチップの設計電極へのリポソームの物理吸着/化学吸着による固定化条件の最適化を図った結果。嵩高い結合部位(カルボキシル基)を有するリガンドを修飾したリポソームを、アミノ基を末端に有するチオール自己集合膜に固定化する手法が最も効果的であった。固定化密度など、改善すべき点は残っているが、現状では相互作用解析に利用できる技術水準には達したと考えられる。(2)相互作用解析手法の構築メンブレンチップでは、相互作用情報が網羅的に得られるので、多変量解析による情報抽出が最も効果的である。そこで、膜間相互作用を主成分分析により解析した。その結果、膜の表面状態に応じて相互作用強度が異なることが示唆された。以上より、メンブレンチップにより、膜間相互作用の定量化、および、膜特性や定量化の難しい表面状態と相互作用強度との関連性を議論できることが分かった。
電界成長を用いた自己組織化による高輝度ナノカーボン電子源の作製と評価

本研究では、電界放出誘起成長(FEIG)法を用いて、電子顕微鏡用の電子源として使用可能な高輝度ナノカーボン電子源の作製を行うことに成功した。作製したナノカーボン電子源は直径1nm程度のカーボンナノカプセルで構成されており、一般的な単結晶タングステンより1桁以上高い輝度を達成した。FEIG法の自己整合性により、作製したナノカーボン電子源は電子線の軸調整が容易である。また、作製したナノカーボン電子源は、単結晶タングステンと同程度の引き出し電圧で駆動でき、既存の電界放出電子銃への適応性が極めて高いことが実証された。本研究課題は、電界誘起成長(Field Emission Induced Growth: FEIG)による自己組織的な作製方法を用いて、電子顕微鏡用の新規な高輝度電子源を開発し、既存研究で行われている単原子電子源やカーボンナノチューブ(CNT)電子源の最大の弱点である軸調整の困難さを解決することを目的としている。初年度にはFEIG用の成長システムを構築し、これによって作製したFEIG電子源が軸調整が極めて容易で且つ走査電子顕微鏡電子源として十分実用的な性能を出せることを実証した。本研究計画の2年目である平成25年度は、成長中の電子源の状態を解析するため、成長中の電流・電圧特性が測定できる計測システムを構築し、これによって以下の成果を得た。1)成長したFEIG電子源はCNT電子源並みの小さな電子放出面積(単結晶タングステン電子源の数百分の1)を持ちつつ単結晶タングステン電子源並みの小さな電界増強因子(CNT電子源の十分の1以下)を持っていることを明らかにした。これはFEIG電子源が高輝度電子源として理想的な形状であることを意味している。2)成長の様子は放出電流として成長中にモニタすることが可能であり、成長の制御を行うことが原理的に可能であることを示した。3)同条件下で得たCNT電子源に対する相対輝度はほぼ同程度であると見積もられた。本研究課題の目的は、これまでに電子顕微鏡用に研究されている高輝度電子源である単原子電子源やカーボンナノチューブ(CNT)電子源の問題点である軸調整の困難さを解決できる新規な高輝度電子源を実現することである。このため、電界成長を用いてナノ電子源を自己組織的に作製すること、ナノ電子源の輝度や安定性などの基本性能を評価すること、市販走査電子顕微鏡(SEM)の実機に搭載して像観察や寿命評価等の実用試験を行うことを具体的な目標としている。初年度に行った研究内容は以下の通りである。1)定電流で高電界を印可できる電界成長システムを構築し、再現性良くナノ電子源の成長が行えるようにした。2)メタンガス導入装置を電界成長装置に導入し、残留ガスに替えてメタンを同圧力で導入すると成長速度が倍増することが明らかとなった。3)作製した電子源を市販(無改造)のSEM電子銃に搭載し、以下の実機試験を行った。電子線の軸調整:当初の目論見通り、電界成長で作製した8本全てが、特別な調整機構なしに軸出し可能であった。エミッション電流安定度の評価:エミッション電流の安定度は従来型の単結晶タングステン電子源とほぼ同程度(電流変動率3%)であった。この値はCNT電子源(電流変動率1%)には及ばないものの実用範囲内である。SEM像観察:分解能評価用の標準試料を用いてSEM像評価を行い、CNT電子源と同等の空間分解能を達成できること、CNT電子源の5倍のビーム電流が得られるために像コントラストが大幅に改善すること、CNT電子源よりも機械振動に強いことを実証した。以上の結果から、電界成長を用いたナノ電子源が電子顕微鏡用電子源として極めて有望であり、輝度、寿命や大気暴露性能といった実用化に求められる性能評価を進める価値があることが示された。本研究課題の当初の研究目的は、電界放出誘起成長(Field Emission Induced Growth: FEIG)による自己組織的な手法を用い、既存の電界放出電子顕微鏡等で使用されている単結晶タングステン電子源から置換可能な高輝度電子源を開発することであった。この目標を達成するために、初年度には既存の電界放出顕微鏡を成長ガス(メタン)導入可能に改良し、また試作したFEIG電子源を市販の電界放出走査電子顕微鏡(FE-SEM)に搭載して、その動作検証を行った。その結果、高輝度電子源として期待されているカーボンナノチューブ(CNT)電子源と比較して、軸調整がはるかに容易であり、且つ、高コントラストで低ノイズのSEM像が得られることを明らかにした。平成25年度には、成長中の電子源の電流-電圧特性の測定を行い、FEIG電子源の電子放出面積がタングステン電子源の数百分の1、且つ、CNT電子源の10分の1以下の電界増強因子を持つことを明らかにした。これは、FEIG電子源が高輝度電子源として極めて有望であることを示している。

本研究計画の最終年度である平成26年度には、成長した電子源の組成や構造を調べし、また、輝度計算を行うことで、実際に高輝度電子源が実現できているかどうかの評価を行った。成長した電子源を透過電子顕微鏡で観察したところ、ベースとなるタングステンの上にアモルファス状の下地(アモルファスカーボンと思われる)が成長し、その上に乱れたグラファイト構造の層、そしてグラファイト層の一部が直径数nmのカプセル状カーボン構造を形成しており、このカーボンナノカプセルの突起がが電子源となっていることを見いだした。また、電界分布と電子軌道計算を用いたシミュレーションから、成長したFEIG電子源の輝度は、通常のタングステン電子源の100倍程度の輝度を有することが明らかとなった。表面物理、ナノ材料応用初年度は当初の研究計画2年目に行う予定であった実機による実用試験を優先して行い、本研究の推進意義を明確にした。平成25年度(2年目)は当初計画の1年目に予定していた成長プロセスや輝度の評価を行った。実績欄にも記載したように、成長中の電流・電圧測定の測定と解析には成功し、成長による電子源形状の変化を捉えることができた。また、輝度もCNT電子源並みであることを実証した。しかし、予定していた透過電子顕微鏡(TEM)による先端形状・組成の解析は、作製した電子源をTEM試料台へ移送することの困難さ(許容できる試料のサイズが非常に小さいため、作製した試料を加工しないとTEM試料台へ搭載できない)に阻まれ、現時点では成功していない。また、先端形状が計測できていないため電界シミュレーションとの対応をつけることができない状態である(電界シミュレーションは既に実行可能な準備を整えている)。現在は最終年度の計画と平行してTEM観察実現のための努力を継続しているところである。当初計画では、初年度に行う研究内容として、メタンおよびエタンガス導入可能な電界成長システムを構築してガス種が与える成長への影響の解明、作製したナノ電子源の輝度評価、ナノ電子源の組成・構造解析を行うこととしていた。また、平成25年度には走査電子顕微鏡の実機に搭載して実用試験を行う予定であった。しかし、今後の研究の方向性を見定めるためには、ナノ電子源が実用に堪え得るかどうか検証するほうが輝度評価や構造解析よりも優先順位が高いと判断し、平成25年度に想定していた実機評価を前倒しして実施し、逆に輝度・構造解析は平成25年度に繰り越すこととした。また、ガス導入試験に関しては当初計画通りガス導入機構を装備し、メタンを用いた基礎実験までは行うことができた。順序を入れ替えて研究を進めたため当初計画どおりではないが、研究計画全体から見ると概ね妥当な進捗状況であると判断される。特に、本手法で作製したナノ電子源が実用に堪えるものであることを早期に実証できたことは、今後の研究を進めるにあたっても、非常に大きな成果であった。最終年度(平成26年度)は達成度に記したように現在遅れているTEM観察と平行して以下の計画を実行する。1) FEIG電子源の寿命評価:これまでの試験では数時間程度のエミッション(数μA)を数回繰り返す程度の評価はできているが、エミッション電流を増やして加速試験を行い、寿命や電流耐性を調べる。2) FEIG電子源の再生可能性の検証:寿命が尽きた(成長させたナノ電子源が失われた状態の)