hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本語史資料としての古文書の研究─仮名文書の文体の成立と資料的価値について─

2は、計画通りに実施できた。3さらに当初の計画よりも進展させ、説話資料について古文書と比較し考察を行うことができた。以上の123を総合的に勘案して、おおむね計画通りに進展していると考える。平成30年度は、前年度に整備したテキストについて1文書内容と背景の調査を実施し、2仮名の多寡による文書分類(漢字専用文書、漢字主体文書、仮名半分文書、仮名主体文書)に基づいて用例調査を行い、3新たに一文の述語に着目した分析を試み、品詞による述語文の分類を実施し、4中古・中世の文学資料(広義の物語類)との比較を行った。5その結果、5-1漢字専用文書では動詞述語文の割合が低いが、物語類では高い。5-2仮名文書では漢字専用文書よりも動詞述語文の割合が高い。仮名が多い文書ほど割合が高く、物語類の割合に近づく。という2点が明らかになった。これを前年度に実施した「によりて」節内の述語の傾向と比較・分析した結果、仮名が多く使用されている仮名文書は、文章表現における具体性・個別性が強いこと、それが鎌倉時代の広い階層にわたる人々の口頭での表現に基づく可能性が高いことが明確になった。1の文書の内容と背景の調査については日本史関係の研究成果を収集して実施し、23の用例調査と分析については収集した原本の写真に依拠し、文章を分析して文を認定し、一文の述語の分類を行った。4については、平成29年度の調査対象文献に「日本霊異記」「将門記」「延慶本平家物語」等を新たに加え、平安・院政鎌倉時代の王朝物語・説話・軍記の各ジャンルの作品について、冒頭の文章を抽出して、古文書と同様の方法で分析し、それを古文書と対比した。5の結論については、次年度に雑誌論文として公開予定であり、仮名文書の文体研究の成果の一部は30年度10月刊行の『日本語学大辞典』の「口語体」「書状(日本語史資料)」の項目記述において公開した。平成30年度の計画としては、129年度に整備した古文書テキストについて原本の表記を調査し、2文体をはかるのに適した語句・語法を選定して、仮名文書・漢字専用文書におけるそれぞれの用法を比較検討する、3文書内容と背景の調査について、対象とした文書の内容、ならびに差出人・宛名人の身分・居住地域・性別・教養などについて日本史学による研究成果も利用しつつ調査を行う、4仮名文書は、仮名書き部分の多寡で三種に分類して用例採取を行い、漢字専用文書では仮名文書の用例に相当する内容の表現を採取する、という4項目を予定していた。実際には12と4は、計画通りに実施し、仮名文書において一文の述語に着目した分類・分析方法が有効であることを示す材料がそろい、進展があった。3の文書背景の調査については、おおまかな把握はできたが、まだ途上であり、差出人の教養について、新たに中世文学作品の需要・影響の度合いに着目して調査する必要が認識された。以上を総合的に勘案して、おおむね計画通りに進展していると考える。平成30年度は、以下の14を実施し、研究を推進する予定である。129年度に整備したテキストについて原本の表記を調査し、文書内容と背景の調査を実施し、分析方法の検討・開発をしつつ用例調査を行う。2文書内容と背景の調査について、対象とした文書の内容、ならびに差出人・宛名人の身分・居住地域・性別・教養などについて日本史学による研究成果も利用しつつ調査を行う。329年度に整備したテキストについて、文体をはかるのに適した語句・語法を選定して、仮名文書・漢字専用文書におけるそれぞれの用法を比較検討する。
羊胎仔尿路閉塞による胎児治療は多嚢胞性異形成腎の発生分子に影響をあたえるか?

【目的】ヒツジ胎仔尿路閉塞モデルを用いて,尿路閉塞後14日までの腎・膀胱組織を詳細に観察することで,胎児治療の至適時期を検討した.【対象および方法】妊娠60日の胎仔を尿路閉塞後2から14日の早期の腎・膀胱の変化(n=28)と胎生同時期の正常対照群(n=20)の腎膀胱組織に免疫組織化学を加えて比較した.【結果】尿路閉塞モデルの閉塞後2日ではすでにCD10免疫組織化学で同定される近位尿細管の選択的拡張がみられ,14日にはα-SMA陽性細胞による間質増生が始まっていた.また,膀胱の壁厚(μm)は尿路閉塞後2日で127.9±9.7μm,3日で97.8±67.5μm,4日で56.5±19.8μmと一旦伸展した膀胱壁が閉塞後5日になると206.1±28.2μm,7日で329.3±6.9μm,14日で345.6±144.9μmと肥厚し始め,満期で1056±398.6μmとなった.閉塞後7日と満期で正常膀胱よりも肥厚した膀胱壁となった(p<0.01).やα-SMA陽性細胞の増生,コロイド鉄染色による粘液多糖体の増加によるものであった.【結語】ヒツジ胎仔尿路閉塞モデルの腎膀胱形態変化は2週間で急速に進行する.胎児手術によって腎膀胱形態の温存が期待できる臨界点は閉塞後14日よりさらに早いタイミングにあると考えられた.【目的】ヒツジ胎仔尿路閉塞モデルを用いて,尿路閉塞後14日までの腎・膀胱組織を詳細に観察することで,胎児治療の至適時期を検討した.【対象および方法】妊娠60日の胎仔を尿路閉塞後2から14日の早期の腎・膀胱の変化(n=28)と胎生同時期の正常対照群(n=20)の腎膀胱組織に免疫組織化学を加えて比較した.【結果】尿路閉塞モデルの閉塞後2日ではすでにCD10免疫組織化学で同定される近位尿細管の選択的拡張がみられ,14日にはα-SMA陽性細胞による間質増生が始まっていた.また,膀胱の壁厚(μm)は尿路閉塞後2日で127.9±9.7μm,3日で97.8±67.5μm,4日で56.5±19.8μmと一旦伸展した膀胱壁が閉塞後5日になると206.1±28.2μm,7日で329.3±6.9μm,14日で345.6±144.9μmと肥厚し始め,満期で1056±398.6μmとなった.閉塞後7日と満期で正常膀胱よりも肥厚した膀胱壁となった(p<0.01).やα-SMA陽性細胞の増生,コロイド鉄染色による粘液多糖体の増加によるものであった.【結語】ヒツジ胎仔尿路閉塞モデルの腎膀胱形態変化は2週間で急速に進行する.胎児手術によって腎膀胱形態の温存が期待できる臨界点は閉塞後14日よりさらに早いタイミングにあると考えられた.羊胎児を用いた尿路閉塞実験において、妊娠早期の尿路閉塞が腎の嚢胞形成に関与し、また尿路閉塞により膀胱機能が障害されることが我々の過去13年間の胎生60日の尿路閉塞モデルで明らかになった。そこで、過去に作成した羊胎仔尿路閉塞モデルの腎臓・膀胱の組織を、後方視的に見直し、尿路閉塞が起こってからどの位の時期に膀胱や腎臓の不可逆的変化が起こるかを調べた。約1cm大の腎臓を摘出し、正中で二つに分けて切片を作成し、近位尿細管に認められる急性尿細管壊死(ATN : acute tubular necrosis)の所見に注目した。この所見は尿路閉塞後、2日から7日までに認められ、14日には消失していた。ATNの変化は胎児手術の血流障害か、あるいは嚢胞形成による二次的変化かを調べる目的にシャムモデルを作成し、尿細管の変化を追跡した。その結果、シャム手術をおこなったモデルにもATNの変化が認められ、また、子宮壁を損傷したモデルにもATNの変化を認めた。これらの結果からはATNは尿路閉塞にかかわらず、胎児の手術や胎児の胎内環境の血流障害を鋭敏に反映している所見の可能性が明らかとなり、その後正常尿細管構造を示す、可逆的変化であることがわかった。また、膀胱壁の変化を尿路閉塞後早期に調べると、その壁は尿路閉塞後3日までは組織の引き延ばされた変化が認められ、一時的に壁は菲薄化してくる。その後7-14日での変化は、ストレッチされた筋繊維の断裂が、組織の修復される過程で筋繊維芽細胞の出現を認め壁の肥厚が起こっていた。これらの所見から、尿路閉塞後7日以内の膀胱-腹腔内シャント術をおこなう必要があると思われた。この結果を得るための胎児手術や、解剖時の腎臓摘出、膀胱の壁の摘出に肉眼的には十分な視野が得られず、2,5倍のルーペを用いた。また、手術に際しては十分な光量が必要となり、ルーペとヘッドライトはセットで頭に装着し適切な組織を取り出すのに大変有用であり、作業効率が向上した。

今回は羊の妊娠が成立したため、過去の実験に追加して、胎児期尿路閉塞モデルとシャム手術モデルを追加した。現在までの数が十分でなかった閉塞後24時間、3日,5日,7日,14日、145日(満期)の尿路閉塞モデルを安楽死させ、その早期の病理学的変化を検討した。今回は尿路閉塞モデル(28匹)、シャム手術(20匹)に対し手術を施行した。母羊を全身麻酔下に鎮静し、子宮を切開後胎生60日の尿路閉塞モデルを作成した。オスでは尿膜管と尿道を結紮、メスでは尿膜管と膀胱頸部を結紮した。今回はルーペとヘッドライトを使用したため生存率が向上した。その結果、尿路閉塞後早期の腎の変化は急性尿細管壊死(ATN : acute tubular necrosis)で、この変化が近位尿細管に強く認めた。また、この後に尿路閉塞群のみに、近位尿細管の拡張所見をとらえることができ、MCDK(Multiple cystic dysplastic kidney)の発生要因にATNの関与が示唆された。膀胱機能に関しては、尿路閉塞後5日までに膀胱壁の過伸展が認められ、その後過伸展で生じた膀胱壁の繊維化が少しずつ認められ、筋繊維芽細胞の発現を認めた。尿路閉塞後14日から出生までの間に膀胱壁の急激な肥厚と線維化が認められることから、尿路閉塞後、極めて早期の膀胱-羊水腔シャントをおこなわなければ膀胱機能を温存することができないと示唆された。今回の実験結果から、胎児期の尿路閉塞患児においては近位尿細管が最も早く障害され、その変化はATNの形であらわれていた。また、尿細管上皮の障害に引き続き尿細管に圧が加わることがMCDKの形成に関与が示唆された。本年は21匹の母羊の手術をおこなったが双胎は約半数に認められ36匹の胎仔手術が施行された。過去13年間おこなっているように尿膜管と雄では尿道、雌では膀胱頸部を結紮し、尿路閉塞モデルを作成し早期の腎・膀胱の変化をみた。尿路閉塞後48時間で胎児のみを取り出し安楽死させた尿路閉塞モデルを9匹、3日のモデルを5匹、5日のモデルを6匹、7日のモデルを5匹作成した。残りは満期145日まで飼育し分娩させた。この中で4匹は子官内発育不全を認め検討から除外し、3匹が術後死亡した(生存率92%)。病理学的な検討結果から過去3年間の研究で認められた早期の急性尿細管壊死(ATN : acute tubular necrosis)は胎児治療をおこなうと尿路閉塞後3日で7割に認められ、14日で改善した。胎児手術は侵襲が強く周術期の腎臓に変化を及ぼしやすく、ATNは近位尿細管に認めたが可逆性変化であった。尿路閉塞後7日で近位尿細管の拡張と間質の増生が顕著となり、この間質の繊維化が多嚢腎(MCDK)に関与していると考えた。また、膀胱壁は尿路閉塞後5日までは伸展され、その後徐々に繊維性に肥厚し、満期までに正常の膀胱壁の7倍の厚さになることが明らかになった。上記変化から胎児治療の時期は生後2週間程度と考えられたが当初予定している腎嚢胞形成にかかわる遺伝子のregulationの変化をとらえる事ができなかった。尿路閉塞モデルの数をふやし、ウエスタンプロットをおこなう必要があると考えた。
多様なレセプターチロシンキナーゼ遺伝子変異の消化管間質腫瘍の病態への影響

ヒトGIST多発家系に新たにみられた生殖系列のc-kit遺伝子の傍細胞膜領域の変異が、imatinibやnilotinibにより効果的に抑制される機能獲得性変異であることを示した。また、散発性GISTにみられた新規の細胞外領域のc-kit遺伝子変異が、一般的な細胞外領域の変異に比べimatinibやnilotinibへの感受性が高いことを示した。我々は、消化管間質腫瘍(Gastrointestinal stromal tumor; GIST)が消化管のペースメーカー細胞であるカハールの介在細胞(Interstitial cell of Cajal; ICC)に由来し、c-kit遺伝子またはPDGFRα遺伝子の機能獲得性突然変異がGISTの発生原因であることや、germlineのc-kit遺伝子の機能獲得性突然変異がICCの過形成を基盤としたGISTの多発家系を引き起こすことを明らかにしてきた。c-kit・PDGFRα遺伝子の機能獲得性変異には細胞外領域や傍細胞膜領域、キナーゼドメインI・IIの様々なタイプが存在し、各々の変異は生物学的特性が異なると考えられ、またGISTやマスト細胞性腫瘍などで見られる変異タイプには特異性があることから、各種の遺伝子変異を導入した培養細胞や遺伝子改変マウスを用いて、c-kit,PDGFRα遺伝子変異がどのようなシグナル系を介して腫瘍化に関与するのかを明らかにすべく研究を行った。その中で、c-kit遺伝子のキナーゼドメインIIの遺伝子改変マウスのホモ接合体から樹立した、不死化培養マスト細胞における細胞内シグナル伝達系が、同じくホモ接合体に発生する盲腸GISTにおける細胞内シグナル伝達系とどのように異なっているのかについて検索し、そのデータの取りまとめを行っている。一方で、c-kit遺伝子の傍細胞膜領域に新規の生殖系列の変異を持つヒトGIST多発家系について解析し、その変異が分子標的薬にどのように反応するかなどを検討し、報告した。後者の研究では、この家系の患者に発生するGISTに分子標的薬が使用可能かどうかについての情報を与えることになり、実臨床にも貢献するものと考えられた。我々は、消化管間質腫瘍(GIST)が消化管のペースメーカー細胞であるカハールの介在細胞(ICC)に由来し、c-kit遺伝子またはPDGFRα遺伝子の機能獲得性突然変異がGISTの発生原因であることや、germlineのc-kit遺伝子の機能獲得性突然変異がICCの過形成を基盤としたGISTの多発家系を引き起こすことを明らかにしてきた。c-kit・PDGFRα遺伝子の機能獲得性変異には様々なタイプが存在し、各々の変異は生物学的特性が異なると考えられることから、本研究では、各種の遺伝子変異を導入した培養細胞や最近開発した遺伝子改変マウスを用いて、各々のc-kit, PDGFRα遺伝子変異における各種シグナル系の活性化の違いを明らかにすることを目的とした。本年度は、野生型マウスおよびc-kit遺伝子のキナーゼドメインIIにgermlineの突然変異を持つノックインマウスの骨髄細胞から培養マスト細胞を得た。また、ノックインマウスの培養マスト細胞の長期培養により得られた、恒常的に増殖するマスト細胞株の不死化の原因がc-kit遺伝子の新たな変異の付加であることを明らかにした。これらノックインマウス由来の様々な培養マスト細胞におけるシグナル伝達物質(KIT, MAPK, PI3K, Akt, Stat, S6Kなど)の活性化について免疫沈降・Western blot法を用いて調べ、不死化した培養マスト細胞におけるシグナル伝達物質の活性化の特性について明らかにした。さらに、これら培養マスト細胞の増殖に対する各種分子標的薬の抑制効果についても検討した。上記研究と並行して、キナーゼドメインIに新たなgermlineの突然変異を持つ家族性GISTにおける臨床病理学的な特性に関する研究や、平面的に増殖する特殊なGIST症例のc-kit遺伝子異常の検討なども行った。c-kit・PDGFRα遺伝子の機能獲得性変異には細胞外領域や傍細胞膜領域、キナーゼドメインI・IIの様々なタイプが存在し、各々の変異は生物学的特性が異なると考えられ、またGISTやマスト細胞性腫瘍などで見られる変異タイプには特異性があることから、各種の遺伝子変異を導入した培養細胞や遺伝子改変マウスを用いて、c-kit, PDGFRα遺伝子変異がどのようなシグナル系を介して腫瘍化に関与するのかを明らかにすべく研究を行った。そのうち、c-kit遺伝子のキナーゼドメインIIの遺伝子改変マウスのホモ接合体から樹立した不死化培養マスト細胞の不死化の原因について解析し、新たなc-kit遺伝子変異の付加を見つけた。現在この新たな遺伝子変異の生物学的特徴について検討している。一方で、c-kit

遺伝子の細胞外領域に新規の変異を持つGISTについて解析し、その変異が分子標的薬にどのように反応するかなどを検討して報告した。後者の研究では、通常の細胞外領域の変異に比べて新規の遺伝子変異が分子標的薬に対する感受性が高いことを示し、実臨床に貢献するものと考えられた。まずは遺伝子改変マウスを用いて、GIST(ICC由来腫瘍)とマスト細胞という2種類の異なった細胞腫において、同じc-kit遺伝子の異常がどのようなシグナル伝達系を使って細胞に影響を与えているのかを明らかにしていく予定であり、その一端が明らかにされつつある。25年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝子改変マウスを用いて、GIST(ICC由来腫瘍)とマスト細胞という2種類の異なった細胞種において、同じc-kit遺伝子の異常がどのようなシグナル伝達系を使って細胞増殖に影響を与えているのかを明らかにしていく予定であり、その一端が明らかにされつつある。培養細胞系を用いた解析も並行して進めていく予定である。また、ノックインマウスを用いた、ICCとマスト細胞以外のc-kit機能依存性細胞(生殖細胞など)に与える影響も検討する。
あくび行動の発現機序における中枢αーMSH法およびアドレナリン性神経の役割

本研究ではラットにおけるあくび行動の発現機序について検討を加え、以下の実験結果を得た。1.アポモルヒネ誘発あくび行動は、βー受容体遮断薬プロプラノロールおよびピンドロールの前処置で増強された。しかし、末梢性βー受容体遮断薬およびαー受容体遮断薬では影響されなかった。2.ピンドロールで増強したアポモルヒネ誘発あくび行動は、スピペロンあるいはスコポラミンで抑制されたが、SCH 23390では影響されなかった。3.さらに、ピンドロールは、フィゾスチグミンおよびピロカルピン誘発あくび行動を増強させ、この増強されたあくび行動は、スコポラミンにより抑制されたが、スピペロンおよびSCH 23390では影響されなかった。4.ドパミンDー2受容体作動薬であるタリペキソールあるいはSND 919を投与するとあくび行動が出現した。5.タリペキソールあるいはアポモルヒネによるあくび行動の出現は、レゼルピンあるいはパラクロロフェンルアラニンの前処置によって著しく増強されたが、αーメチルチロシンの前処置では影響を受けなかった。6.パラクロロフェニルアラニン前処置後のタリペキソールによって誘発される著明なあくび行動の出現は、スペピロンあるいはスコポラミンの投与によって著明に抑制されたが、SCH 23390によっては影響を受けなかった。7.SK&F 38393をあくび行動を誘発する小量のタリペキソールと併用投与しても常同行動を誘発しなかったが、大量との併用では常同行動を誘発した。以上の結果より、あくび行動はドパミンDー2受容体あるいはムスカリン受容体を介して発現し、さらにドパミンDー2受容体作動薬誘発あくび行動は、中枢アドレナリン性およびセロトニン性神経活動によって調節され、ムスカリン受容体作動薬誘発あくび行動はアドレナリン性神経活動で調節されていることが明らかとなった。また、あくび行動に関与するドパミンDー2受容体は常同行動に関与するDー2受容体より高い感受性を有することが示唆された。本研究ではラットにおけるあくび行動の発現機序について検討を加え,以下の研究結果を得た.1.ラットに特異的ドパミンD-2受容体作動薬であるB-HT920あるいはSND919を投与すると著しくあくび行動が発現し,本行動はドパミンD-2受容体遮断薬(スピペロン,YM-09151-2)およびムスカリン受容体遮断薬(スコポラミン)の前処置により抑制され,ドパミンD-1受容体遮断薬(SCH23390)では影響されなかった.2.中枢アドレナリン性β-受容体遮断薬(プロプラノロール,ピンドロール)の前処置により,ドパミンD-2受容体作動薬(B-HT920,SND919)およびコリン性神経作動薬(フィゾスチグミン,ピロカルピン)誘発あくび行動は著しく増強された.3.脳内セロトニン量を減少させるレセルピンやパラクロルフェニルアラニン前処置により,ドパミンD-2受容体作動薬誘発あくび行動は増強されたが,コリン性神経作動薬誘発あくび行動は増強されなかった.4.β-受容体遮断薬あるいは脳内セロトニン量を減少させる処置により増強されたドパミンD-2受容体作動薬

誘発あくび行動はドパミンD-2受容体遮断薬およびムスカリン受容体遮断薬により抑制されたが,ドパミンD-1受容体遮断薬では影響されなかった.5.ドパミンD-1受容体作動薬であるSK&F38393は単独投与,アドレナリン性β-受容体遮断薬との併用投与,あるいは脳内セロトニン量を減少させる前処置でもあくび行動を誘発しなかった.以上の結果より,あくび行動はドパミンD-2受容体あるいはムスカリン受容体を介して発現し,さらにドパミンD-2受容体作動薬誘発あくび行動は,中枢アドレナリン性およびセロトニン性神経活動によって調節され,ムスカリン受容体作動薬誘発あくび行動はアドレナリン性神経活動によって調節されていることが明らかとなった.本年度は62年度に続き、あくび行動の発現に関与する中枢アドレナリン性神経活動およびドパミンDー2受容体の特性について検討を加え、次のような結果を得た。1.ラットにドパミンDー1およびDー2両受容体の刺激効果を有するアポモルヒネを投与すると、あくび行動が発現した。このアポモルヒネの誘発あくび行動は、単独ではあくび行動を誘発しない中枢アドレナリン性βー受容体遮断薬(インデノロール、アルプレノロールあるいはブクモロール)で増強された。しかし、末梢性のβー受容体遮断薬であるカルテオロールおよびアテノロール、さらにαー受容体遮断薬のプラゾシンでは影響されなかった。2.逆にβー受容体作動薬であるサルブタモールで抑制された。3.特異的ドパミンDー2受容体作動薬タリペキソール(BーHT920)あるいはSND919の小量投与によってあくび行動が発現し、本行動はドパミンDー1受容体作動薬SK&F38393との併用投与により抑制された。4.しかしこれらのドパミンDー2受容体作動薬の単独大量投与時あるいはSK&F38393との併用投与時に、あくび行動は発現しなかった。5.大量投与時に軽度の常同行動が観察された。この常同行動はSK&F38393との併用により著しく増強された。6.しかし、あくび行動を誘発するタリペキソールあるいはSND919の小量とSK&F38393を併用投与しても常同行動は観察されなかった。7.あくび行動を誘発する小量のタリペキソールは基礎血清プロラクチン値およびαーメチルチロシン投与後の高プロラクチン値を減少させた。以上の結果より、あくび行動の発現は中枢アドレナリン性βー受容体を介して調節され、またあくび行動の発現に関与するドパミンDー2受容体は、下垂体のプロラクチン分必細胞に存在するドパミンDー2受容体に類似し、常同行動の発現に関与するドパミンDー2受容体より感受性が高いことが明らかにされた。
親油性及び親水性の両性質を有する新規抗酸化化合物の開発

交付申請書の研究の目的に記載したとおり、抗酸化作用を示す水溶性のビタミンCと脂溶性のカロテノイド(アスタキサンチン)の性質を併せ持つ化合物を合成し、抗酸化活性を測定しようとした。研究実施計画に基づき、まず、抗酸化作用を示すのではないかと考えた化合物の合成を行うことにした。容易に入手可能なα-iononeを出発原料として過酸による酸化、酸処理により4-hydroxy-β-ionone(レチノイド-カロテノイド系ナンバリングによる)へ導き、官能基変換、カルボニル基の隣接位への水酸基の導入を行って、3-hydroxy-4-keto体を合成した。その後、2位への酸素官能基の導入を種々検討したが、目的化合物は得られなかった。これは、シクロヘキセン環の4位から3位、2位へと酸素官能基を導入していく際に、1位メチル基の立体障害等により目的化合物が得られていないのではないかと考えた。そこで、合成の初期段階で2位に酸素官能基を導入する方法を検討することにした。文献の方法に従い、2,2,6-trimethylcyclohexane-1,3-dioneを収率よく合成し、これを2-hydroxy-β-iononeアナログに変換した。これを2-oxo体とした後、シリルエノールエーテルを経由して2-oxo-3-hydroxy体へ導き、官能基変換を行って、3-oxo体とした。最後に、4位に酸素官能基を導入するために、シリルエノールエーテル経由による水酸基の導入の検討、カルボニル基のα位に直接水酸基を導入する方法などを検討したが、残念ながら目的化合物の合成には至らなかった。交付申請書に記載した本年度の研究実施計画に従い、研究を開始した。すなわち容易に入手可能なα-iononeを出発原料として、m-クロロ過安息香酸による4,5位(レチノイド-カロテノイド系ナンバリングによる)の選択的なエポキシ化の後、アルカリ処理して4-hydroxy-β-iononeを71%の収率で得た。生じた水酸基をアセチル化後、水素化ホウ素ナトリウムを用いて9位カルボニル基を還元し、t-butyldimethylsilyl基で保護し、続いて水素化リチウムアルミニウムでアセチル基を除去した後、二酸化マンガンで酸化して収率よく4-keto体へ変換した。次に4-keto体をLDAで処理してオキサジリジン化合物を作用させて、3-hydroxy-4-keto体へ94%の収率で導いた。続いて、IBXを用いて3位水酸基を酸化して3,4位をカルボニル基とした。このとき、^1H-NMRの測定により3位はエノール化していることが判明した。この化合物のエノール化している2,3位をエポキシ化しようと種々検討したところ、Triton Bを塩基として過酸化水素を作用させる条件が最もよいことがわかったが、収率は38%までしか向上しなかった。得られたエポキシ体をジオール体へ導くために条件検討を重ねたが、目的の化合物は得られなかった。この結果から、酸素官能基を4位から3位及び2位へと順次導入していく経路は、立体障害等による困難さが伴うのではないかと考えられる。今後は、合成の初期段階で2位に酸素官能基を導入する合成法を確立し、目的化合物への誘導、得られた化合物の抗酸化作用の検討を行う予定である。まず、文献の方法に従い、2,2,6-trimethylcyclohexane-1,3-dioneを収率よく合成した。続いて、L-selectrideを用いて、3位のカルボニル基のみを選択的に還元し、生じた水酸基をt-butyldimethylsilyl(以後TBS)基で保護した。

次に、リチウムヘキサメチルジシラジドを塩基として、N-フェニルトリフルオロメタンスルホンイミドを作用させ、トリフレート体へ導いた後、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウムを触媒として、メチルビニルケトンとのカップリング反応を行い、2-hydroxy-β-ionone(レチノイド-カロテノイド系ナンバリングによる)TBSエーテルを合成した。続いて、このエーテルを4-ブロモ体へ変換した後、これを4-hydroxy体もしくは、3,4-dehydro体に導こうと種々検討したが、目的化合物は全く得られなかった。そこで、2-hydroxy-β-iononeTBSエーテルの2位のTBS基を脱保護しアセチル化後、9位カルボニル基を還元して水酸基とし、続いてTBS基で保護した。さらに2位のアセチル基を還元し、IBX(o-iodoxybenzoic acid)で酸化して2-ケト体を高収率で合成した。次に、3位へ酸素官能基を導入するために、2-ケト体をシリルエノールエーテルとした後、MCPBAで酸化、続く酸処理でα-ケトアルコール体へ導いた。その後、3位水酸基をアセチル化し、2位カルボニル基を還元、生じた水酸基をTBS基で保護した後、3位アセチル基を還元、酸化して3-ケト体とした。最後に、4位に酸素官能基を導入するために、シリルエノールエーテル経由による水酸基の導入の検討、カルボニル基のα位に直接水酸基を導入する方法などを検討したが、残念ながら現在のところ目的化合物の合成には至っていない。
トリパノソーマ原虫における複合型糖鎖合成経路のミッシングリンクの解明

哺乳類に寄生するアフリカトリパノソーマ原虫は生存および増殖のために複合型糖鎖を必要とすると考えられているが,その合成の初発段階を触媒する酵素GnT-Iは,ゲノム解析では見つからない。本研究ではトリパノソーマ原虫の抽出液中に見いだされるGnT-I活性を指標として,その同定を試み,TbGT11と呼ばれるタンパク質を必須の構成因子とする約400 kDaのタンパク質複合体であることを強く示唆する結果を得た。さらに,TbGT11自身がN-結合型糖鎖で修飾されることがGnT-I活性に必要であることを明らかにした。Trypanosoma bruceiはアフリカ睡眠病の原因となる寄生性単細胞真核生物(原虫)である。本原虫は単細胞生物であるにもかかわらず,多細胞生物と同様のN-結合型複合糖鎖を細胞表面に発現するが,この糖鎖の役割はほとんど明らかになっていない。その理由の一つに,複合糖鎖形成に必要な一連の糖転移酵素が,ゲノム上に見つからず,遺伝子ノックアウト解析ができないことが挙げられる。本研究は,哺乳類の複合糖鎖形成の初発段階を触媒するGnT-Iと同じ機能を果たす糖転移酵素(=TbGnT-I)をタンパク質レベルで同定し,それをコードする遺伝子を決定しようとするものである。これにより,T. bruceiにおける複合糖鎖の役割の解明が可能になると期待される。本年度は,研究実施計画に基づき,純粋培養した原虫からTbGnT-Iの精製を進めた。TbGnT-Iは膜画分に回収されるため,非イオン性界面活性剤で可溶化し,活性画分を各種カラムクロマトグラフィーで精製した。ゲル濾過クロマトグラフィーでは,活性画分の分子量は約400 kDaであることを明らかにした。ここに含まれるタンパク質を質量分析し,同定したすべてのタンパク質をコムギ無細胞系で発現させた。しかし,いずれの組換えタンパク質にもTbGnT-I活性は検出されなかった。一方で,2014年3月28日発行のJ. Biol. Chem.に英国のグループからTbGnT-Iを同定した論文(J. Biol. Chem. (2014) 289, 9328)が発表された。申請者も,該当タンパク質について組換え酵素の活性測定を実施していたが,TbGnT-I活性は検出されておらず,報告されたタンパク質が真にTbGnT-Iをコードしているかについては議論の余地が残されている。本研究は,アフリカ睡眠病の原因原虫であるTrypanosoma bruceiにおいて,N-結合型複合糖鎖形成の初発段階を触媒する糖転移酵素TbGnT-Iを同定しようとするものである。これまでに,TbGnT-I活性測定系の確立と,ミクロソーム画分に回収されるTbGnT-Iの可溶化および部分精製に成功し,TbGnT-Iの分子量は約400 kDaであることを明らかにした。一方で,英国のグループが逆遺伝学的手法によりTbGnT-Iをコードする遺伝子を同定したこと発表した。しかし,当該遺伝子(Tb927.3.5660)にコードされるタンパク質(TbGT11)が単独でTbGnT-I活性を発揮するのか,他のタンパク質との複合体形成等,別の因子を必要とするのかは明らかにされていなかった。そこで,本年度は論文の検証を行うとともに,TbGnT-I活性のin vitroでの再構成およびTbGT11と複合体を形成するタンパク質の同定を試みた。T. bruceiで過剰発現させたTbGT11はTbGnT-I活性を示したことより論文内容の正しさが確認できた一方で,リポソーム存在下・非存在下の無細胞発現系および哺乳動物細胞発現系(COS7細胞)のいずれで発現させたTbGT11もTbGnT-I活性を示さなかった。このことから,TbGnT-Iの活性発現にはTbGT11に加えて,T. bruceiに存在する別の因子が必要であると考えられた。そこで免疫沈降法により,過剰発現させたTbGT11に結合するタンパク質を精製し,2種のhypothetical proteinの同定に成功した。アフリカ睡眠病の原因となる原虫,Trypanosoma brucei,はN-結合型複合糖鎖を発現しており,その形成過程でMan3GlcNAc2という五糖にGlcNAcを転移させる。哺乳類ではGlcNAc転移酵素,GnT-I,が単独でこの反応を触媒できるが,T. bruceiではGnT-Iと異なるタンパク質ファミリーに分類される酵素,TbGT11,がその役割を担うと報告されている。しかし,無細胞発現系や哺乳細胞発現系で得た組換え型TbGT11には酵素活性が検出されないことから,GlcNAc転移活性の発現には翻訳後修飾と他因子との複合体形成が必要であると考えられた。そこでC末端領域に存在する3か所の糖鎖修飾モチーフに注目し,これらを個別にまたは全て破壊したTbGT11を,TbGT11ノックアウト原虫に発現させ,その酵素活性を調べた。その結果,TbGT11自身が糖鎖修飾を受けていることおよび,3か所の内もっともN末端よりのモチーフを修飾する糖鎖がGlcNAc転移活性の発現に必須であることを明らかにした。そこで,T. bruceiと同じ科の原虫で,同様の糖鎖修飾

能をもつLeishmaina tarentolaeを用いて,TbGT11を単独で,また前年度に同定した2種のhypothetical proteinと同時に発現させたが,いずれの場合も組換え酵素にGlcNAc転移活性は検出できなかった。以上,T. bruceiが有するGlcNAc転移活性の再構築には至らなかったが,その生化学的性状およびT. bruceiにおける糖鎖機能の一端を明らかにした。哺乳類に寄生するアフリカトリパノソーマ原虫は生存および増殖のために複合型糖鎖を必要とすると考えられているが,その合成の初発段階を触媒する酵素GnT-Iは,ゲノム解析では見つからない。本研究ではトリパノソーマ原虫の抽出液中に見いだされるGnT-I活性を指標として,その同定を試み,TbGT11と呼ばれるタンパク質を必須の構成因子とする約400 kDaのタンパク質複合体であることを強く示唆する結果を得た。さらに,TbGT11自身がN-結合型糖鎖で修飾されることがGnT-I活性に必要であることを明らかにした。本年度は,TbGT11を原虫で過剰発現させ,先行研究の検証を行うとともに,TbGT11以外のタンパク質がTbGnT-I活性の発現に必要か否か,必要であればそのタンパク質の同定を進めることを目指した。そのために,TbGT11を種々の発現系で作製し,in vitroでの酵素活性構築を目指した。TbGT11のC末端にHAタグを融合して,T. bruceiで発現させた場合,先行研究と同様の結果を得ることができた。また,本課題研究中に開発した方法で,T. bruceiから過剰発現タンパク質を可溶化し,未変性分子量がネイティブの酵素と同じであることも確認した。一方で,無細胞発現系や異種細胞を用いた発現系から得たTbGT11には,TbGnT-I活性が検出されないことから,原虫内でTbGT11と複合体を形成する未知タンパク質が必要であると考えられた。この結果を受けて,TbGT11と複合体を形成する2種のhypothetical proteinを同定した。これらをTbGT11と共発現させたところ,TbGnT-I活性は検出されなかったものの,in vitroでTbGT11と複合体を形成することは確認された。以上のことから,TbGnT-I複合体のin vitro再構築は部分的に達成されており,進捗状況はおおむね順調であると判断した。生化学・分子寄生虫学これまでに,TbGT11とともにTbGnT-I複合体を構成するタンパク質として,2種のhypothetical proteinを同定したが,現在までに機能的な複合体の再構築には至っていない。その理由のひとつとして,TbGT11が適切な翻訳後修飾を受けていないことが考えられる。翻訳後修飾は哺乳動物細胞でも可能であるが,COS7細胞で発現させたTbGT11がTbGnT-I活性を示さないことから,TbGnT-I活性の発現にはT. brucei独自の翻訳後修飾が関わっている可能性がある。その代表的なものが糖鎖修飾である。TbGT11には,C末端領域に3か所のN-結合型糖鎖修飾モチーフが存在するため,これらモチーフを各々または組み合わせて破壊したTbGT11をT. bruceiで発現させ,TbGnT-I活性への影響を明らかにする。また,引き続きTbGT11と複合体を形成するタンパク質の探索を行う。以上により,TbGT11を中心とした機能的なTbGnT-I複合体の再構築を行い,TbGnT-Iの全体像を明らかにする。本年度は,TbGnT-I精製のための可溶化条件の検討からはじめ,TbGnT-Iの同定までを計画していた。
伝達関数同定に基づく人の把持力制御メカニズムの解明

人の把持力制御メカニズムの解明を目的として,負荷力の増加に伴い指の接触面に発生する初期滑りと,把持カ変化との関係を伝達関数で近似した.実験を行うために把持運動計測装置を開発した.この装置は指に任意の負荷力を伝達するためのカ制御可能なリニアステージ,接触面の指紋画像を計測するための高解像度カメラ,そして把持・負荷力を計測するための6軸カセンサから成る.カメラから得た画像列を独自に開発した画像レジストレーションプログラムで処理することで,初期滑り(接触面内で局所的に発生する滑り)の発生部位を10um程度の分解能で特定することができる.実験として,0.5Nのステップ状に増加する負荷力に対して,把持力を増加させることで相対的な滑りの発生を阻止するというSlipPreventionタスクを行った.被験者に関わらず,単位時間あたりの固着率(滑っていない領域の接触領域に対する割合)の変化と,単位時間あたりの把持力の変化との間に強い正の相関があることが分かった.これらの関係を,比例・微分・積分成分とむだ時間から成る伝達関数を用いて近似した.むだ時間の値は0.1から0.2sec程度となった.これは人の感覚フィードバック系に存在する遅れと同程度であり,妥当な値である.同定した伝達関数を用いて,別条件で計測した単位時間あたりの固着率の変化から,人が制御する把持力の変動を推定したところ,再現精度が60%程度となった.定性的にではあるが,人の把握力制御特性を再現することができた.把握運動時の指先変形と把握力とを同時に計測可能な,触覚イメージング装置を開発した.計測部は,高精度カメラと,力センサに支えられた透明ガラス面で構成されている.前者を用いて指先接触面の指紋画像を計測し,後者を用いて把握力を計測する.この計測部を力制御可能なリニアステージ上に設置したことで,任意の粘性・弾性場の中での把握運動計測を行うことが出来るようになった.また,計測した指紋画像から接触面内の変形情報を抽出するための,画像レジストレーションプログラムを開発した.画像の輝度勾配拘束条件を用いて,画像中に等間隔に設定された制御点における変位を計算することで,連続する二枚の画像間の対応点を計算することができる.制御点でのみ変位の計算を行えば良いため,高解像度な画像に対しても高速かつ安定に対応点を求めることが出来るようになった.本装置に搭載したカメラのフレームレートが30FPS,解像度が20um/pixelであるため,指先接触面の微小な変形も確実に計測することができる.最後に,開発した計測装置を用いた予備実験を行った.具体的には弾性・粘性場内での把握運動計測実験を行った.その結果,重力環境とは異なる力学場内でも把握力と負荷力との間に協調関係が出現することが確認できた.また,計測した画像を処理することで,接触面の境界付近から滑り始める初期滑り現象を計測することができた.人の把持力制御メカニズムの解明を目的として,負荷力の増加に伴い指の接触面に発生する初期滑りと,把持カ変化との関係を伝達関数で近似した.実験を行うために把持運動計測装置を開発した.この装置は指に任意の負荷力を伝達するためのカ制御可能なリニアステージ,接触面の指紋画像を計測するための高解像度カメラ,そして把持・負荷力を計測するための6軸カセンサから成る.カメラから得た画像列を独自に開発した画像レジストレーションプログラムで処理することで,初期滑り(接触面内で局所的に発生する滑り)の発生部位を10um程度の分解能で特定することができる.実験として,0.5Nのステップ状に増加する負荷力に対して,把持力を増加させることで相対的な滑りの発生を阻止するというSlipPreventionタスクを行った.被験者に関わらず,単位時間あたりの固着率(滑っていない領域の接触領域に対する割合)の変化と,単位時間あたりの把持力の変化との間に強い正の相関があることが分かった.これらの関係を,比例・微分・積分成分とむだ時間から成る伝達関数を用いて近似した.むだ時間の値は0.1から0.2sec程度となった.これは人の感覚フィードバック系に存在する遅れと同程度であり,妥当な値である.同定した伝達関数を用いて,別条件で計測した単位時間あたりの固着率の変化から,人が制御する把持力の変動を推定したところ,再現精度が60%程度となった.定性的にではあるが,人の把握力制御特性を再現することができた.
生活習慣病及び食習慣を考慮した食品中化学物質の新規リスク評価手法の確立

アクリルアミド(AA)は食品中変異・発がん物質であり、薬物代謝酵素CYP2E1により代謝活性化され、強力な発がん物質であるグリシドアミド(GA)に変換される。CYP2E1は糖尿病やアルコール摂取時に発現量が増強する。したがって、糖尿病の発症やアルコール摂取により、AAの遺伝毒性が変動すると考えられる。本研究では、糖尿病モデル及びアルコール摂取マウスにAAを投与し、AAの遺伝毒性の変動を評価した。正常群に比べ、糖尿病モデル群及びアルコール摂取群で、小核誘発能が増強し、各臓器でDNA損傷性が増強したことから、生活習慣病や食習慣により、AA等の化学物質の毒性が変動することが推測された。現在、糖尿病、肥満など生活習慣病の患者数が増加し、大きな社会問題となっている。また、食品中には多種多様な化学物質が存在しており、これら化学物質の安全性を評価するために正常の実験動物を用いた毒性試験が行われるが、実際のヒトに対するリスクを考えた場合、生活習慣病や食習慣により化学物質の生体内挙動などに変化が生じ、その毒性が変動することが考えられる。本研究では生活習慣病状態により食品中化学物質の毒性発現が変動するかin vitroおよびin vivoの各種毒性試験(小核試験、コメットアッセイ等)を用いて確認する。また、化学物質の生体内での挙動がこれらの要因により変動するか機器分析等を用いて調べる。さらに、生活習慣病状態時における生体内での薬物代謝酵素の活性および発現について正常状態時と比較して確認する。以上のことを実施することにより、食品中化学物質のヒトに対する安全性を評価する上で新たな知見を見出す。平成26年度では、ストレプトゾトシンをICRマウスに投与してI型糖尿病モデルマウスを作成し、これらまたは正常マウスに食品中化学物質であるアクリルアミドを経口投与した。投与後に解剖を行い、各種遺伝毒性試験を用いて遺伝毒性の変動を調べた。その結果、正常群にアクリルアミドした場合よりも糖尿病群群で有意な遺伝毒性の増強がみられた。また、各臓器中で薬物代謝酵素CYP2E1の活性や発現の上昇が確認できた。さらに、アクリルアミドの代謝物であるグリシダミドの生体内濃度を測定したところ、有意な増加がみられた。これらの成果より、糖尿病状態時においては、摂取する食品中化学物質または成分により遺伝毒性の増強が起こることが示唆された。アクリルアミドは、ポテトチップ等の日常食品に含まれる変異・発がん物質である。アクリルアミドは摂取後、生体内において薬物代謝酵素であるCYP2E1により代謝・活性化され、より強力な発がん物質であるグリシダミドに変換される。このCYP2E1は、糖尿病や慢性的なアルコール摂取により誘導されることが報告されている。したがって、これら生活習慣病や飲酒による発がん率増加の要因として、アクリルアミドの遺伝毒性の増強が考えられる。平成27年度では、アルコール摂取時におけるAAの遺伝毒性の変動についてラットを用いて検討した。15%のアルコールを6日間自由摂取させたWistarラットに50mg/kg b.w.のアクリルアミドを経口投与した。投与24時間後にコメットアッセイ試験を用いてDNA損傷性を、小核試験を用いて染色体異常誘発能を調べた。その結果、アルコールの摂取及びアクリルアミド単独投与によりDNA損傷性及び染色体異常誘発能が誘導された。また、アルコール摂取時におけるアクリルアミド投与により、DNA損傷性及び染色体異常誘発能が有意に増強されることを確認した。アルコール摂取によりアクリルアミドの遺伝毒性が増強した要因としてCYP2E1の活性上昇が考えられた。そこで、肝臓におけるCYP2E1の活性を調べたところ、活性は有意に増強していた。また、アクリルアミドの解毒酵素の活性を調べるため、GST活性及びグルタチオン(GSH)量を測定したところ、アルコール摂取により低下していることを確認した。さらに、GSHの減少に伴い酸化ストレスへの曝露指標である酸化型グルタチオン(GSSG)量が有意に増加したことから、生体内の酸化ストレスが増加していることが示唆された。以上の結果より、アルコール摂取によりCYP2E1が活性化され、さらにアクリルアミドの主要な排泄機能が弱まることから、摂取されたアクリルアミドの生体内での遺伝毒性が増強し、発がんリスクが高まることが考えられた。平成27年度では、食習慣を考慮してアルコールを慢性的に摂取した場合の、アクリルアミドの遺伝毒性の変動について調べた。これらの結果については、さらにメカニズム等の解析を行い、平成28年度中に学会発表及び論文投稿をする予定である。ICRマウスにストレプトゾトシン(STZ)を腹腔内投与し、I型糖尿病モデルマウスを作製した。糖尿病発症4週間後に肝臓を摘出し、リアルタイムRT-PCR及びウエスタンブロッティングにより、CYP2E1の発現量を調べた。また、I型糖尿病モデルマウス及び正常マウスに、解剖24及び3時間前に40 mg/kg b.w.の量でAAを経口投与した。解剖時に骨髄細胞を取り出して小核試験に供し、染色体異常誘発能を評価した。さらに、摘出した肝臓、腎臓、脳等については、コメットアッセイ試験に供し、各臓器におけるDNA損傷性を評価した。I型糖尿病モデルマウスの肝臓におけるCYP2E1遺伝子及びタンパク質の発現量は正常マウスと比較して、それぞれ約1.5倍、約1.4倍であり、有意な発現の上昇が確認できた。正常マウスへのAAの投与により、非投与群に比べて骨髄細胞において小核誘発能の上昇傾向が確認できた。また、肝臓、腎臓、脳において有意なDNA損傷性が誘導された。

I型糖尿病モデルマウスにAAを投与したところ、非投与群に比べて、有意な小核誘発能の上昇が確認できた。また、肝臓、腎臓、脳においては有意なDNA損傷性の増強がみられた。さらに、正常マウスにAAを投与した群に比べても、小核誘発能の上昇傾向がみられ、肝臓においては有意なDNA損傷性の増強が、また腎臓においては増強傾向がみられた。以上の結果より、糖尿病発症時ではCYP2E1の発現の上昇に伴って、AAのGAへの代謝活性化が促進されることで、AAの遺伝毒性が増強することが推測された。したがって、食品中化学物質を摂取する上で、正常な実験動物を用いたリスク評価だけでなく、糖尿病等の生活習慣病や飲酒等の食習慣を考慮したリスク評価が必要であると考えられた。アクリルアミド(AA)は食品中変異・発がん物質であり、薬物代謝酵素CYP2E1により代謝活性化され、強力な発がん物質であるグリシドアミド(GA)に変換される。CYP2E1は糖尿病やアルコール摂取時に発現量が増強する。したがって、糖尿病の発症やアルコール摂取により、AAの遺伝毒性が変動すると考えられる。本研究では、糖尿病モデル及びアルコール摂取マウスにAAを投与し、AAの遺伝毒性の変動を評価した。正常群に比べ、糖尿病モデル群及びアルコール摂取群で、小核誘発能が増強し、各臓器でDNA損傷性が増強したことから、生活習慣病や食習慣により、AA等の化学物質の毒性が変動することが推測された。平成26年度では、生活習慣病モデル動物として、糖尿病モデルマウスを作成し、これらに食品中化学物質であるアクリルアミドを経口投与し、毒性、生体内挙動、薬物代謝酵素の活性および発現変動について調べた。これらの成果は当初の予定通りに順調に進展しているといえる。平成26年度では、糖尿病発症時において、また平成27年度では、食習慣を考慮して、慢性的なアルコール摂取時におけるアクリルアミドの遺伝毒性の変動を調べた。平成28年度においては、これら生活習慣病及びアルコール摂取時におけるアクリルアミドの生体内代謝物であるグリシダミドのヘモグロビン付加体及びDNA付加体量を測定し、実際にグリシダミドが生成しているのか検討する。また、生活習慣病として、肥満モデル動物を用いて、同様の試験を行う。さらに、これら実験動物より腸内細菌を採取して、アクリルアミドとともに培養し、得られた代謝物の遺伝毒性を評価する。食品衛生学平成26年度において、糖尿病モデル動物に食品中化学物質であるアクリルアミドを投与することにより、染色体異常やDNA損傷性等の遺伝毒性の増強がみられ、薬物代謝酵素CYP2E1活性および発現の上昇、アクリルアミドの生体内代謝物であるグリシダミドの増加がみられた。平成27年度では、各種肥満モデルマウスにアクリルアミド等の食品中化学物質やモルホリン等の食品成分を経口投与し、遺伝毒性の変動、化学物質の生体内挙動の確認、各種薬物代謝酵素の活性および発現の変動について、様々な試験法を用いて調べる。
標的組換え法によるシナプス局在蛋白欠失マウスの作製とその分子細胞生物学的解析

神経伝達物質の放出においてシプナス前部の蛋白の機能が最近明らかになってきている。例えば、シナプシン1はシナプス小胞の近傍に存在する約70kdの蛋白であり,シナプス小胞同士及びシナプス小胞をシナプス前部のアクチン線維につなぎとめておくことで、シナプス小胞からの神経伝達物質の放出を調節していると考えられている。近年、シナプシン1を始めとして、シナプスに局在する蛋白の遺伝子のいくつかが単離され、培養細胞等を用いた実験によってこれらの遺伝子の発現がシナプス形成自体にも重要であることが示されている。本研究は上記の点を検討するために、gene targetingを用いて作成したシナプシン1欠失マウスを解析する事を目指している。最近シナプシン1欠失マウスの解析が他のグループによって報告され、シナプシン1の欠失によって、ある種の短期記憶に障害がおこることが明らかとなった。しかしこの研究ではシナプス前部の構造の解析は十分になされておらず、当研究室において構造の解析を中心にした新しい角度からの検討を加えることができる。我々はシナプシン1遺伝子のゲノムDNA断片からtargeting vectorを作成し,それをES細胞に電気穿孔法によって導入して相同組み換えをおこしたES細胞を数line手に入れることができた。それらの細胞からgermline chimeraの作成に成功したため,現在,chimeraの仔を交配しシナプシン1欠失マウスを作成しているところである。解析予定の項目として(1)急速凍結ディープエッチ法を始めとする電子顕微鏡法による、シナプス及び細胞骨格系の微細構造の変化の解析。(2)変異マウスからの初代培養細胞又は神経組織切片を用いたシナプス伝達の電気生理学的解析。(3)変異マウスの行動学的解析(4)複数のシナプス局在蛋白遺伝子欠失マウスが得られた場合、これらを交配することで、double mutationが入った個体を作製し、同様の方法で解析する。等を予定している。等を予定している。