hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｃ型肝炎ウイルス増殖に関与する宿主ストレス誘導性リン酸化酵素の解析

本研究はゲノムワイドsiRNAスクリーンにおいてC型肝炎ウイルス(HCV)複製を支持する宿主因子であることが示唆されたストレス誘導性リン酸化酵素に関して、HCVの複製、病原性促進様式を解明しそれを標的とした抗C型肝炎戦略の開発を目指している。これまでに本酵素機能欠失変異体の解析より酵素活性と酵素自身のリン酸化活性化がHCV増殖と線維化シグナル促進に寄与し、本酵素阻害活性が報告されている糖尿病治療薬が抗HCV効果と抗線維化シグナル効果をもたらすことを報告した。そこで新たに上記変異体解析系を用いて探索的調査を行った結果、本酵素が発癌機構にも関与していることを見出し、酵素自身のリン酸化とリン酸化酵素活性が重要であることが判明した。この新規作用を受けて酵素活性標的分子やその薬剤による阻害可能性の検討が進行している。加えて酵素結合因子、酵素転写阻害剤、酵素活性阻害剤等探索等を継続して進めており、これらの情報は基質候補データや上記発癌機構と共に考慮することで、本酵素による標的リン酸化の生病理、ウイルス増殖新機構、肝癌に至る肝病態詳細に迫る端緒となる。以上、HCV感染により発現が亢進した本酵素が、自己リン酸化等の異常な活性化を経てHCV増殖と線維化シグナルを促進したうえ発癌をも誘導しているが、上記糖尿病治療薬あるいはより特異的な酵素阻害剤により、それらC型肝炎病態の改善に加えて発癌ポテンシャルの低減がもたらされる可能性が示唆された。本最終年度までに得られた知見を踏まえ、今後一層の研究推進が望まれる。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究はゲノムワイドsiRNAスクリーニングによりC型肝炎ウイルス(HCV)複製を支持する宿主因子として同定されたストレス誘導性リン酸化酵素についてそのHCV複製、病原性支持機構を明らかにし、それを標的とした抗C型肝炎戦略創出を目的としている。本酵素に関してはこれまでの機能欠失変異体の解析より酵素活性と酵素自身のリン酸化活性化がHCV増殖、線維化シグナル促進に寄与することを明らかにしてきたが、本年度の研究においてはさらなる知見を得た。細胞内過剰発現系では本酵素のスレオニン残基におけるリン酸化を検出したが、それは酵素不活化変異、非リン酸化変異によって失われた。この結果は既報に一致して本酵素の自己リン酸化を示唆しており、本実験では関与する責任残基として酵素活性部位アミノ酸とリン酸化部位アミノ酸を提示することができた。加えて本系に肝癌細胞において酵素活性阻害が報告されている承認済治療薬を添加したところ、濃度依存的にリン酸化レベルが低下した。また当治療薬はHCV培養細胞感染系において抗HCV活性を有することをこれまでに見出しているが、本リン酸化酵素のノックダウンによりその濃度依存的抗ウイルス効果が減弱した。さらに共同研究機関の臨床検体において、本酵素の発現レベルがHCV慢性感染者で顕著に上昇していることが明らかになった。以上のことからHCV感染により発現が上昇した本酵素は自己リン酸化を含めた異常な活性化を経てHCV増殖と線維化シグナルを促進しているが、既に臨床的に用いられており本酵素の阻害活性が見出された承認済治療薬により、HCV増殖抑制と共に肝炎の病態改善が実現される可能性が示唆される。本研究はゲノムワイドsiRNAスクリーンにおいてC型肝炎ウイルス(HCV)複製を支持する宿主因子であることが示唆されたストレス誘導性リン酸化酵素に関して、HCV複製、病原性促進様式の解明とそれを標的とした抗C型肝炎戦略の開発を目指している。本酵素については機能欠失変異体の解析より酵素活性と酵素自身のリン酸化活性化がHCV増殖、線維化シグナル促進に貢献することを見出してきたが、本年度の研究においてもさらなる進捗があった。本酵素を上流で活性化するマスターレギュレーターとして知られるリン酸化酵素も線維化シグナル促進に関与することを明らかにした。加えて肝癌細胞株での酵素阻害活性が報告されている糖尿病治療薬が本リン酸化酵素に依存した抗HCV効果と抗線維化シグナル促進効果を特異的に示したこと、また共同研究機関のHCV慢性感染者臨床検体において、HCV感染培養細胞系での結果と一致して、本酵素発現レベルの顕著な上昇が認められたことを含め考察するに、HCV感染により発現が亢進した本酵素は自己リン酸化を含めた異常な活性化を経てHCV増殖と線維化シグナル伝達を亢進しているが、当糖尿病治療薬によりそうしたC型肝炎病態が改善される可能性が示された。以上の結果と議論の報告はJournal of Hepatology誌に受理された。加えてプロテインアレイを用いて基質候補の複数同定に成功したが、新たにがん遺伝子、シグナル伝達経路上分子が標的となる可能性が示唆されており、リン酸化の実際と、ウイルス生態、肝病態における意義を調査中である。

そこで新たに上記変異体解析系を用いて探索的調査を行った結果、本酵素が発癌機構にも関与していることを見出し、酵素自身のリン酸化とリン酸化酵素活性が重要であることが判明した。この新規作用を受けて酵素活性標的分子やその薬剤による阻害可能性の検討が進行している。加えて酵素結合因子、酵素転写阻害剤、酵素活性阻害剤等探索等を継続して進めており、これらの情報は基質候補データや上記発癌機構と共に考慮することで、本酵素による標的リン酸化の生病理、ウイルス増殖新機構、肝癌に至る肝病態詳細に迫る端緒となる。以上、HCV感染により発現が亢進した本酵素が、自己リン酸化等の異常な活性化を経てHCV増殖と線維化シグナルを促進したうえ発癌をも誘導しているが、上記糖尿病治療薬あるいはより特異的な酵素阻害剤により、それらC型肝炎病態の改善に加えて発癌ポテンシャルの低減がもたらされる可能性が示唆された。本最終年度までに得られた知見を踏まえ、今後一層の研究推進が望まれる。26年度が最終年度であるため、記入しない。HCV増殖と病原性を促進するリン酸化酵素の活性化機構解明を進め、それを標的とした承認済治療薬の効果を示唆する結果を得た。これは本研究の目指す現実的な抗C型肝炎戦略を支持するデータである。加えて当初の計画通り本酵素自身とその基質リン酸化の薬剤による制御を目指す探索システムの準備が整い、次年度以降の解析の土台が据えられた。HCV増殖と病原性を促進するリン酸化酵素の滑性化機構様式解明と承認済治療薬によるその抑制効果を示唆する結果を国際誌に報告した。また計画通りプロテインアレイ解析を用いて酵素基質探索が実施されたうえ、本酵素の発現や基質リン酸化の薬剤による制御を目指す探索システムの準備が整い順次解析が開始されている。HCV増殖過程と肝線維化シグナル伝達経路上の分子のうち本リン酸化酵素が直接影響を及ぼす標的をプロテオミクスにより探索する。また本酵素転写調節領域を連結したルシフェラーゼレポータシステムにより各種ケミカルライブラリを用いた酵素転写調節薬剤の探索を行う。同時に本酵素の基質候補探索と基質リン酸化解析、機能解析、そして薬剤による制御を目指す。さらに肝癌細胞株を用いたcDNAアレイ解析を行い、本酵素の生理的、病理的意義を検証する。本リン酸化酵素が直接基質としてあるいは間接的に影響を及ぼすことが示唆された分子のうちとりわけHCV増殖過程と肝病態シグナル伝達経路上にて機能する可能性が示唆される候補についてそのリン酸化と影響を調査する。また本酵素転写調節領域を連結したルシフェラーゼレポータシステムと共に酵素活性評価レポータシステムによりケミカルライブラリを用いた酵素制御薬剤の探索を行い、酵素阻害剤によるHCV関連肝疾患の改善策創出を目指す。
高血圧発症関連遺伝子群の解明

本態性高血圧の感受性遺伝子を同定するため,1.全国レベルの大規模症例収集,2.候補遺伝子の選択,3.候補遺伝子のハプロタイプ構築,4.候補遺伝子のハプロタイプ関連解析,をおこなった.全国レベルの大規模症例収集は循環器外来を中心とした収集に加え,地域および職域集団を対象にした.最終的に高血圧症例約1600検体,地域および職域集団から2200検体を得た.この中から,症例および対照,各200例を抽出した.候補遺伝子は長期塩分負荷によりマウス腎臓で発現が変化した遺伝子および文献上,興味深い遺伝子,腎臓で発現する遺伝子を121個,抽出した.この候補遺伝子領域にあるSNPを,日本人SNPデータベースを中心に選び,ハプロタイプ解析をおこなった.その結果,我々が決めた基準を満たしたハプロタイプ構築が完成した73遺伝子を対象に解析を進めた.タイピング対象検体は我々が収集した検体に,高血圧グループの愛媛大学,大阪大学,日本大学の検体を加えた症例888例,対照840例である.関連解析は,2個以上のSNPsタイピングができる69遺伝子を対象にcontigency table法でおこなった.permutation p valueが0.05以下になったものをpositiveと判断した.その結果,全体でpositiveになったものは合計12遺伝子,男性および女性でpositiveになったものはそれぞれ12個と23個であった.全体と男性でpositiveになったものは9個,全体と女性でpositiveになったものは5個,全てでpositiveになったものは3個であった.さらに絞り込むためhaplotype infbrence法で関連解析をおこなったところ,男性,女性,全体のいずれかでpositiveになった遺伝子は,合計10個であった.現在,この10遺伝子の内,3遺伝子に関して詳細な解析を実施中である.ゲノム資源を利用して,本態性高血圧をはじめとするヒト多因子疾患を理解するためには,臨床的に良く検討された質の高い検体を多数,集める必要がある.本研究では全国の施設から,遺伝子研究のガイドラインを遵守した方法で新たに検体を収集し,ゲノムワイドな探索による新しい発症関連遺伝子の単離同定を目的としている.1.本態性高血圧症例と地域,職域集団のDNA検体の収集.これまでに内科外来における本態性高血圧症例598例,疫学集団995例の血液試料を収集した.2.遺伝子多型頻度の地域差を検討し,対照集団設定の方法を検討する.遺伝子多型の地域差の有無をAGTのM235T多型とアンジオテンシン変換酵素(ACE)のI/D多型を使って調べた.対象地域は熊本,島根,北海道B町とした.いずれの地域でも遺伝子頻度に有意差はなかった3.アンジオテンシノーゲン(AGT)遺伝子のハプロタイプ解析.AGT遺伝子領域のSNPs,42種類でハプロタイプ解析をおこなった.大部分の検体は頻度の高いハプロタイプ3-4種類に,収束することがわかった.高血圧症例の目標数は3000例である.現在,遺伝的要因が強いと思われる100症例を使用して,ゲノムワイドのスクリーニングを計画している.遺伝子頻度の地域差をAGTとACEの2遺伝子で検討したが,いずれも有意な差は検出できなかった.日本人では地域差を考慮する必要は少ないかもしれない.今後マイクロサテライト多型においても検討する予定である.AGT遺伝子の解析より,ひとつの遺伝子あたり連鎖不平衡が高くない3-4種類のSNPsを使ってハプロタイプ解析をおこなえば,高血圧発症関連遺伝子をとらえる事ができる可能性が高いと考えられる.仮に3種類で可能であるとすれば,ヒトの4万遺伝子をカバーするために12万個の遺伝子近傍のSNPsを解析すれば良いことが推測できる.本態性高血圧の感受性遺伝子を同定するため,1.全国レベルの大規模症例収集,2.候補遺伝子の選択,3.候補遺伝子のハプロタイプ構築,4.候補遺伝子のハプロタイプ関連解析,をおこなった.全国レベルの大規模症例収集は循環器外来を中心とした収集に加え,地域および職域集団を対象にした.最終的に高血圧症例約1600検体,地域および職域集団から2200検体を得た.この中から,症例および対照,各200例を抽出した.候補遺伝子は長期塩分負荷によりマウス腎臓で発現が変化した遺伝子および文献上,興味深い遺伝子,腎臓で発現する遺伝子を121個,抽出した.この候補遺伝子領域にあるSNPを,日本人SNPデータベースを中心に選び,ハプロタイプ解析をおこなった.その結果,我々が決めた基準を満たしたハプロタイプ構築が完成した73遺伝子を対象に解析を進めた.タイピング対象検体は我々が収集した検体に,高血圧グループの愛媛大学,大阪大学,日本大学の検体を加えた症例888例,対照840例である.関連解析は,2個以上のSNPsタイピングができる69遺伝子を対象にcontigency table法でおこなった.permutation p valueが0.05以下になったものをpositiveと判断した.その結果,全体でpositiveになったものは合計12遺伝子,男性および女性でpositiveになったものはそれぞれ12個と23個であった.全体と男性でpositiveになったものは9個,全体と女性でpositiveになったものは5個,全てでpositiveになったものは3個であった.さらに絞り込むためhaplotype infbrence法で関連解析をおこなったところ,男性,女性,全体のいずれかでpositiveになった遺伝子は,合計10個であった.現在,この10遺伝子の内,3遺伝子に関して詳細な解析を実施中である.

本研究の目的はヒト集団を利用して本態性高血圧の発症関連遺伝子を同定する事である.ヒトゲノム計画の急速な進展によって,多くの塩基配列,SNPs情報がウェブ上で利用ができるようになった.また,日本人のSNPs情報も蓄積されてきた.これらのゲノム資源を利用して,本態性高血圧をはじめとする複雑なヒトの多因子疾患の発症関連遺伝子を同定するためには,質の高いヒト集団のDNA検体が必須である.そこで,本研究では全国の研究者と共同で,3000例以上の症例・対照群を収集し,候補遺伝子アプローチおよびゲノムワイドスクリーニングにより,発症関連遺伝子の同定を目指している.1.内科外来において収集した検体は約1400例である.一方,地域・職域集団では約2000検体を収集した.検体の臨床情報から,高血圧群として,男性,60歳未満で発症,160/100mmHg以上または降圧剤内服中,第一度近親に高血圧家族歴がある,BMI25以下の条件で200例を抽出した.対照群として,男性,50代以上,BMI22以上で,高血圧の既往がない260例を抽出した.2.多型の地域差を検討するため,北海道,島根,熊本の3地域から収集した検体で,biallelic多型2種類,マイクロサテライトDNA多型3種類を比較したところ,1種類のマイクロサテライトDNA多型で有意な地域差が見られた.3.特に地域集団で収集した血液は量が限られているため,DOP-PCRによる遺伝子DNA増幅を試み,SNPsタイピングに使用可能であることを確かめた.4.マウスの塩分負荷により腎臓で発現の変化する遺伝子と,これまでの報告等から100遺伝子を選択し,ハプロタイプによる各200例の症例・対照研究を実施中である.主に日本人SNP情報を利用し,12-16人のDNAでハプロタイプ解析をおこない,これまで約60個の候補遺伝子の解析が終わった.本態性高血圧の発症関連遺伝子を同定する事を目的に,日本全国をカバーする共同研究者と検体を収集してきた.検体の一部はゲノムワイドスクリーニングに提供しているが,我々のグループでは主に候補遺伝子アプローチを行ってきた.収集した検体を,以下の基準で症例を選択し,候補遺伝子スクリーニングに用いた.高血圧症例は,男性,第一度近親に高血圧の家族歴がある,60歳以前に発症,BMIが25以下.正常血圧対照は,男性,50歳以上,BMIが22以上とした.各200例の症例対照による関連解析をおこなった.まず,文献,マウスの塩分負荷による腎臓での発現変化などのデータを参考に,120個の候補遺伝子を選んだ.各侯補遺伝子のSNPs情報を主にJ-SNPデータベースより抽出し,16人の日本人集団でハプロタイプの構築を行った.SNPsのマイナーアレル頻度が10%以上,SNPs間の連鎖不平衡がr^2<0.5,最多ハプロタイプ60%以下という条件をクリアした場合,ハプロタイプ構築が完成したと定義した.その結果,111遺伝子を解析した段階で,ハプロタイプ完成に至ったものは70遺伝子であった.他はSNPsの情報不足,強度の連鎖不平衡の存在などで実際のタイピングに使うことができなかった.
小脳グルタミン酸作動性tripartiteシナプス膜の分子ネットワークと生理機能

重合性GTPaseセプチンは脳で高発現し、細胞骨格や足場としてシナプス前・後・周囲(グリア)膜直下に集積し、多様なシナプス関連分子と相互作用する多機能蛋白質ファミリーであるが、シナプス伝達や精神・神経病態における役割には不明な点が多い。応募者らは、ユニークな構造と細胞内局在を示すセプチン・サブユニットを欠損するマウスが報告例のない空間認知・弁別障害を呈することを見出し、その責任領域である嗅内皮質-海馬歯状回顆粒細胞間シナプスを詳細に解析した。運動学習の中枢である小脳の中で圧倒的多数を占める平行線維-プルキンエ細胞間のグルタミン酸作動性シナプスとそれを取り巻くグリア突起までを含めた機能単位としての(PFーPC)/BG tripartiteシナプスに着目し、1)後シナプス領域のセプチン系必須サブユニットSEPT7をCre-Lox系で選択的に破綻させ、a)神経化学的(主要シナプス蛋白質と神経伝達物質の分析)、b)微細形態学的(2Dおよび3D免疫電子顕微鏡法)、c)機能的(運動学習課題)に精査する。2)シナプスとスパイン包囲・被覆するバーグマングリア突起膜ドメイン直下のCDC42EP4を欠損させることで、下流にあるセプチン系とグルタミン酸トランスポーターGLASTを含む分子ネットワークを破綻させ、そのインパクトを1)と同様に精査している。細胞形態制御のシグナル分子として重要な低分子量G蛋白質CDC42がGTP結合型のときエフェクター分子CDC42EP/BORGに会合すること、セプチン複合体もCDC42EPの別のドメインに会合するが、CDC42-GTPと会合したCDC42EPにはアロステリック阻害のため会合できないことなどを代表者らは以前報告した(Nat Cell Biol 2001, Dev Cell 2002)。帰国後、研究を中断していたが、この3者間分子ネットワークの生理的意義が依然不明であるため、研究を再開し、i)CDC42EP1-5ファミリーのうちCDC42EP4がバーグマングリア選択的かつ多量に発現すること、ii)CDC42EP4がバーグマングリア突起の中でもスパインやPF-PCシナプスを包囲・被覆する葉状突起の細胞膜直下に集積すること、iv)でセプチン複合体やグルタミン酸輸送体GLASTと共局在すること、v)小脳抽出物の免疫沈降-質量分析でCDC42EP4-SEPT2/3/4/5/6/7/8/10/11-GLAST分子間相互作用を見出した(Nat Commun 2015)。小脳皮質に高密度に存在する興奮性シナプスからグルタミン酸を除去するトランスポーターGLASTは、バーグマングリア細胞(大型化し、高度に分化した放射状アストログリア)の突起に大量に集積するが、集積の分子機構や生理的意義は不明であった。本研究では、セプチン、非筋型ミオシンIIB/MYH10、CDC42EP4などを含む蛋白質複合体がシナプス周囲のグリア突起膜直下に集積していることを見出した。CDC42EP4欠損マウス小脳試料の生化学的、微細形態学的、電気生理学的、行動学的解析により、1)GLASTがセプチンから解離して2)シナプスから遠ざかり、3)グルタミン酸が残留して神経伝達が過剰となり、4)軽度の運動学習障害を呈し、5)正常個体には無効な低用量のトランスポーター阻害剤に過敏に反応して著しい運動障害を呈した。以上および先行研究から、上記複合体がGLASTをシナプス近傍に集積させる足場ないし拡散障壁としてグルタミン酸クリアランスの効率化に寄与していることがわかった。GLASTは一部の運動失調症、てんかん、統合失調症、緑内障の原因遺伝子であり、統合失調症脳ではCDC42EP4やセプチンの発現ないし含有量に量的異常がみられることから、上記および関連する遺伝子改変マウス系統の異常を病態モデルと想定して解析を続けている。本研究では、ユニークな構造と細胞内局在を示すセプチン関連分子CDC42EP4を欠損するマウスが報告例のない神経機能障害を呈することを見出し、その責任領域であるシナプスを詳細に解析した。本研究では、ユニークな構造と細胞内局在を示すSEPT3を欠損するマウスが報告例のない空間認知・弁別障害を呈することを見出し、その責任領域を絞り込んだ。すなわち、a)野生型マウス海馬歯状回(DG)へのAAV-shRNAベクター局所注入による枯渇によって空間弁別障害が再現されること、さらにb) Sept3欠損マウスDGへのAAVベクター局所注入によるSEPT3発現によって空間弁別障害がレスキューされることに基づき、DGが責任領域であることを確定するとともに、発生過程を通じてのSEPT3慢性欠損に起因する「発達障害」の可能性が否定された。嗅内皮質から貫通線維を経由してDG顆粒細胞へと入力するグルタミン酸作動性pp-DGシナプスはパターン分離による空間弁別に重要とされている。

そのシナプス面積やスパイン体積は正常であるが、Ca2+貯蔵・放出の場である滑面小胞体の含有率が低下しており、初代培養顆粒細胞でもスパインへの小胞体侵入頻度が減少していた。スパイン内小胞体局在の制御はシナプス制御機構の一部であるが、分子メカニズムは小脳プルキンエ細胞でミオシンVaの関与が示唆されている以外不明である。今後も引き続き、スパイン内小胞体制御機構にアプローチするツールとしてSept3欠損マウスと培養系を活用し、行動、電顕、生化学など多階層の手法を駆使して空間弁別機能を支える未知のシナプス制御機構の探索を継続する必要がある。重合性GTPaseセプチンは脳で高発現し、細胞骨格や足場としてシナプス前・後・周囲(グリア)膜直下に集積し、多様なシナプス関連分子と相互作用する多機能蛋白質ファミリーであるが、シナプス伝達や精神・神経病態における役割には不明な点が多い。応募者らは、ユニークな構造と細胞内局在を示すセプチン・サブユニットを欠損するマウスが報告例のない空間認知・弁別障害を呈することを見出し、その責任領域である嗅内皮質-海馬歯状回顆粒細胞間シナプスを詳細に解析した。統合失調症の一部で報告されているグルタミン酸トランスポーターの遺伝子変異や発現異常、死後脳でのCDC42EP4やセプチンの量的異常は、上記と類似したメカニズムで精神病態に関与する可能性がある。いずれも網膜の放射状グリアであるMuller細胞にも発現しており、CDC42EP4欠損マウス網膜の解析(共同研究による未発表データ)から、放射状グリアに共通する傍シナプス装置としてグルタミン酸代謝に寄与することが示唆されているため、今後も解析を続けていく。29年度が最終年度であるため、記入しない。分子神経生物学29年度が最終年度であるため、記入しない。
軽度認知障害のアルツハイマー病への移行を予測する神経心理学検査の検討

本研究では、アルツハイマー病(AD)のスクリーニング検査として開発された竹田式三色組合せテスト(TTCC)が、認知症予備軍である健忘型軽度認知障害(aMCI)のスクリーニングおよびADへの移行予測に有用であるか否かを検討した.その結果、TTCCがaMCIを検出する感度は39.4%であったが、2年後の経過観察ではTTCCで陽性(認知症の可能性あり)と判定された人の多くはADに移行していた.以上より、TTCCはaMCIからADへの移行を予測する神経心理学検査として有用である可能性が高いことが示唆された.平成24年度は、昨年度に引き続き当該研究に関する先行研究のレビューおよびデータの収集を行った。先行研究のレビューでは、国内外の先行研究のうちMCIやADおよびADへの移行に関する知見について文献研究を行い、本研究への応用発展に寄与した。一方、データの収集では、研究協力医療機関においてMCIと診断された患者のTTCCにおける弁別力を検定すると同時に、MCIと診断された患者のうち半年から1年の時間間隔で経過観察ができた研究協力者のデータを収集した。半年から1年ごとにデータを収集するにあたり、医師によるADへの移行判定のほかに、TTCC、Mini Mental State Examination(MMSE)、Clinical Dementia Rating(CDR)を実施し、対象者の認知的変化と生活レベルを継時的に追跡した。今年度に実施した研究は、MCIをスクリーニングするための神経心理学検査としてのTTCCの有用性について議論する価値のあるデータとなった。本研究では,アルツハイマー病(AD)のスクリーニング検査として開発された竹田式三色組合せテスト(TTCC)が,健忘型軽度認知障害(aMCI)のスクリーニングおよびADへの移行予測に有用であるか否かを検討した.対象は,もの忘れを主訴として鳥取生協病院心療科を受診し,aMCIの診断基準を満たし,2年の経過観察を終えた33人であった.初診時にTTCCで陽性を示した人は13人であり,陰性を示した人は20人であった.これらの結果より,TTCCがaMCIを検出する際の感度は39.4%であった.一方,2年間に33人中10人がaMCIからADに移行し,23人がaMCIのままであった.この結果より,年間のADへの移行率は14.7%であった.aMCIからADに移行した群を移行群,移行しなかった群を非移行群としたところ,移行群と非移行群で年齢,男女比,教育歴,Mini-Mental State Examination得点に有意差を認めなかった.初診時において,移行群でTTCCに陽性を示した人は9人,陰性を示した人は1人であったのに対し,非移行群でTTCCに陽性を示した人は4人,陰性を示した人は19人であった.初診時のTTCC,MMSE,教育歴を説明変数とし,群を目的変数としてロジスティック回帰分析を行った結果,TTCCのみが有意な項目であった(オッズ比:42.8, 95%CI:4.2-439.6).本結果より,TTCCのaMCIに対する感度は39.4%と低く,aMCIを検出するツールとしては十分とはいえないことが示された.しかし,移行群と非移行群で初診時におけるTTCCの結果に有意な差を認め,TTCCはaMCIからADへの移行を予測する神経心理学検査として有用である可能性が高いことが示唆された.本研究では、アルツハイマー病(AD)のスクリーニング検査として開発された竹田式三色組合せテスト(TTCC)が、認知症予備軍である健忘型軽度認知障害(aMCI)のスクリーニングおよびADへの移行予測に有用であるか否かを検討した.その結果、TTCCがaMCIを検出する感度は39.4%であったが、2年後の経過観察ではTTCCで陽性(認知症の可能性あり)と判定された人の多くはADに移行していた.以上より、TTCCはaMCIからADへの移行を予測する神経心理学検査として有用である可能性が高いことが示唆された.本研究では、認知症の代表的疾患であるアルツハイマー病(AD)に移行しやすい軽度認知障害(MCI)をスクリーニングするためのツールとして、竹田式三色組合せテスト(TTCC;Takeda et al., 2010)の有用性について検討することを目的としている。TTCCは、3色の正方形の組合せからなる見本図形を記憶し、記憶と無関係な干渉課題を行った後に、3枚のカードを用いて記憶した見本図形を再生する課題である。MCIのうちTTCCで陽性および陰性を示した者のうち、3年間でAD発症率に差がないか否かを検討する予定である。平成23年度は、まずMCIやAD、神経心理学検査に関するレビューを行った後、ADの重症度によってTTCC陽性者が示す課題の反応の仕方に違いがあるか否かを検討した。その結果、TTCCはADの重症度によって見本図形の再生の仕方に違いがあることが示された。見本図形と形は同じだが色が異なる場合ADの重症度は軽度であるが、見本図形と形も色も異なる場合ADの重症度は軽度から中等度であり、カードを用いた構成が不可能である場合はADの重症度は中等度から重度である可能性が示唆された。また、再生の仕方が悪くなると、被検者の認知機能も低下することが示された。

一方、TTCCのMCIに対する感度を捉えるため、MCIの被検者に対してTTCCを実施し、ADへの移行を予測し得る神経心理検査として有用であるか否かを検討するため、現在のところ半年ごとにMCIの被検者に対してTTCC及び関連する変数に関するデータの収集を実施している。今年度の研究より、TTCCはADのスクリーニングのみならず、ADの重症度を予測し得る神経心理検査として有用である可能性があることが示唆された。当該年度では、MCI患者の追跡を60名程度行っていく予定であったが、実際ドロップアウトなどもあり、対象者が当初予定した人数に満たない。そのため、「やや遅れている」と自己評価した。TTCCがADへの移行を予測し得る神経心理学検査であるか否かを検討するために、まずTTCCが認知機能の程度によって結果に違いが生じることを明らかにした。また、ADへの移行を予測するためにMCIへの被検者に対してTTCCを実施するとともに、半年ごとのデータの収集も開始した。したがって、おおむね順調に進展していると評価した。当該年度で得たデータは、MCIをスクリーニングすうるえでのTTCCの感度を明らかにするために今後分析を行う予定である。全MCI数を分母とし、TTCCで陽性と判定された者の数を除して、MCIに対するTTCCの感度を求める。一方、継時的に追跡しているデータのうち、TTCCの結果によってADへの移行率に差を認めるか否かを分析する予定である。解析には、ロジスティック回帰分析を用いる。MCI患者のうちADに移行した群を移行群、移行しなかった群を非移行群として両群を従属変数とする。一方、TTCC結果、教育歴、MMSE得点など、ADへの移行を予測する可能性のある変数を独立変数とする。この分析により、MCIからADへの移行を予測する神経心理学検査としてTTCCが有用であるか否かについて検討を行う。以上の研究によって得られた知見について、国内外の関連学会で発表を行い、学会誌にその成果を投稿する予定とする。今後も、引き続きデータの集積を行う。MCIのデータが一定数集まると、全MCI数を分母とし、TTCCで陽性と判定された者の数を除して、MCIに対するTTCCの感度を求める。一方、MCIの対象者は半年ごとに医療機関受診の際に追跡調査を行い、AD等の認知症を発症していないか否かを確認し、Mini-Mental State Examination(MMSE; Folstein et al., 1975)及びClinical Dementia Rating(CDR; Morris, 1993)の実施と日常生活の様子についての面接を実施する。診察は、研究協力者である専門医が行い、日常生活についての面接は、研究代表者および研究協力者であるコメディカル・スタッフが実施する。3年間のデータの集積が終了すると、データ解析を始める。解析には、比例ハザード分析を用い、半年ごとのAD発症の結果を生存変数に、状態変数をAD発症の有無とし、独立変数にTTCC結果および年齢、性別、教育歴、MMSE得点等の要因を投入する。該当なし次年度の研究費の使用については、以下のように実施する。まず、資料収集や調査のための旅費と、研究成果発表及び研究資料収集のための国内外学会での旅費として、研究費を使用する。また、研究遂行上必要となるデータ解析用ソフトウェア、レーザープリンターインクジェット、データ保存媒体などの消耗品および研究関連図書費等の物品費として研究費を使用する。
Ｘ線ＣＴ撮影はじめ科学的分析を応用した東アジア古漆器の製作技法と保存修復の研究

東アジア古漆器のX線CT撮影、X線撮影を応用した構造分析、修復への実際の応用、産地時代判定へのデータ蓄積を継続した。毎年継続の専門学会での発表には、文化財保存修復学会第40回大会(会場高知カルポート、会期6月16・17日)において「近世文箱類の器形と木地構造ーX線CT撮影はじめ非破壊分析による保存修復への応用ー」、野口明日香研究代表、小池ほか「桜燕蒔絵源氏物語書箪笥の修復と木地構造の科学的分析」の2件のポスター発表をした。上海博物館が初めて企画した中国漆器を特集した特別展「中国歴代漆器藝術千文万華In a Myriad of Forms:The Ancient Chinese Lacquers](展覧会会期2018.11.15-19.2.26)の開幕に併せて開催された国際シンポジウムに小池は11月15日に招待発表し、翌日の午後のセッションの司会を担当した。発表題目「宋代漆器ー伝世品を中心とした彫漆・無紋・螺鈿の様式と編年及びX線CT撮影による非破壊分析」(予定稿『中国漆器国際学術検討会説文稿』164ー176頁上海博物館編)。最終年度の成果報告の1つとして、「うるし研究の最前線」と題して鶴見大学文化財学会の主催による秋季公開シンポジウムに研究代表者の小池の総論をはじめ研究に参加・協力した4人を含めて公開シンポジウムを開催した。(会場・鶴見大学会館、日時・平成30年11月17日土曜日、聴衆120人)。テーマは以下、小池富雄「総論文化財学としての漆工芸研究」、室瀬祐(本学非常勤講師・博士)「漆工文化財の保存修復ー日本の指定文化財と在学作品の修復」、渡邉裕香(本学・大学院研究生)「X線CTはじめ科学的な分析を応用した漆工文化財研究ー本学での事例を中心にー」、野口明日香(本学・大学院生)「桜燕蒔絵源氏物語書物箪笥(本学新収品)の保存修復と科学分析」。鶴見大学文学部および歯学部付属病院の科学的分析機器、臨床用医療機器を利用して多数の様々な東洋漆器を分析し、そのうち3点を保存修復を施工した。およそ30点の個人所蔵、博物館所蔵作品を鶴見大学に搬入して預かり、分析調査した。前年度から継続した分析・保存修復施工をした作品については、大学と所有者の間で受託研究契約を締結して、1年間の預かり期間に様々な分析と修復施工を実施した。この成果は専門学会でもポスター発表した。従来の東洋漆工史研究は、表面からの目視による観察、様式からの編年や産地同定などが行われてきたが、後世による塗り直しや修復施工、改造によって正しく把握できない例もしばしばある。このたびの科学的な分析(X線CT撮影、ソフトエックス線撮影、電子顕微鏡、実態顕微鏡)などの科学的な分析を踏まえて、分析および修復施工のデータ蓄積を初年度としては十分な量と質を蓄積できた。文学部の科学的分析機器および歯学部附属病院の臨床用医療機器を利用して,東洋古漆器の分析(構造・内部破損などを含む)による産地同定、製作年代、製作地比定などの漆工史的研究をおこなった。加えて、保存修復を実際に施工して、漆工芸文化財を実戦的に研究した。いわば文理の融合による東洋古漆器文化財の「健康診断と治療」である。26年度以来の継続作業により、100点を超す公私の漆工品(12世紀20世紀)を分析、調査した。従来の東洋漆工史研究では、表面からの目視による美術史的な様式論の研究が主体であったが、本研究では内部構造、顕微鏡レベルでの観察、成分の分析など非破壊分析を基本として様々なデータを蓄積して、編年、産地分析などの判断基準とした。保存修復作業においては、科学的な分析データを併行して実施する保存修復作業に直ちに反映して生かすことができた。このような知見と経験は研究成果として、専門学会に発表をした。以下が主たる学会発表である。1.文化財保存修復学会第37回大会於京都工芸繊維大学。2.2015東アジア文化遺産保存国際シンポジウム、於奈良。また招待による発表、シンポジウム参加が2件あった。3.招待講演;中国浙江省杭州市、浙江省博物館、10月21日中国漆器文化研究的回顧与展望国際学術検討会において「宋時代彫漆的産地ー杭州(臨安)ー日本伝世在銘作紹介」を口頭発表した。4.招待参加;九州国立博物館10周年記念シンポジウム「X線CTを用いた文化財の研究と活用」九州国立博物館2015年12月19日において、ポスターと発表意見交換をした。予定稿集同館博物館科学課編集発行pp82-83。本研究と同様の最新機材を用いた切り口は、今年度になって、東京国立博物館、韓国ソウル国立中央博物館、中国・上海博物館でも始まり、今後の研究成果の競争・交流により、さらなる進展が期待できる。(理由)学内外の協力者、研究者、参加した院生の深い理解と支援により、多数の分析サンプルを大学内に一時的に預り、分析・調査ができた。また明治大学、九州国立博物館、東京国立博物館などの同じ領域研究機関との情報交流も緊密にできた。東京国立博物館では、7億円の高額なX線CT撮影装置3基が導入されて、本年度本格的な運用が始まった。

鶴見大学の同様な設備は、附属病院における臨床医療用の機器であり、患者の健康を第一に配慮するために、X線出力や精密度に制約があるものの、ほかの後発の同様研究をする機関と情報交流することにより、さらに今後の進展が期待できる。すでに本研究を開始して26年度、27年度で、100点を超すサンプル分析ができた。当年度でのCT撮影は10点余、ソフトエックス線などでの調査は30点余であった。(本研究の開始以後の3年間でCT撮影の総点数は、延べ30点余、ソフトX線はじめデジタル画像撮影などにより調査した文化財の累積総数はおよそ100点)。日本、中国、朝鮮などの古漆器を調査して画像の判読、分析と相互間の比較検討をした。時代判定、真贋判定、破損状態判定など有効な画像データを集積している。蓄積した分析データ量も東洋の古漆器に限定すれば学会の最大水準と考えている。【専門学会での発表】1.渡邉裕香、小池富雄「X線CTを利用した黒漆椿捻子文螺鈿香合における層状紙胎構造の非破壊分析」ポスター発表文化財保存修復学会第38回大会6月26-27日於東海大学湘南キャンパス。2.小池富雄、松本達弥、小菅太一、渡邉裕香、野口明日香ポスター発表「朱漆鳥獣草花図箔絵手箱の保存修復と分析ーX線CT撮影はじめ科学的分析を応用した保存修復ー」東アジア漆工芸プログラムinハノイ(ベトナム語ポスター)於ハノイ国立美術博物館8月19日25日。【報告書】下記を他の研究費で刊行した。小池富雄『漆芸文化財のX線CT調査報告ー東アジア古漆器を中心にー』渡邉裕香編6月26日。鶴見大学文学部文化財学科小池富雄研究室発行。【口頭発表】国際シンポジウム招待発表には、小池富雄「新安船の中国漆器から判明する漆工史上の重要な知見」韓国国立中央博物館新安沈船発掘40周年記念国際シンポジウム、2016年9月2日於ソウル国立中央博物館講堂。国内シンポジウムの招待発表には小池富雄「永楽の堆朱と茶の湯における唐物漆器の受容」茶の湯文化学会、平成28年度大会シンポジウム、2016年6月11日於名古屋文化短期大学。学内外の研究協力者の熱意と努力により、更なる分析とデータ収集に務めることができた。しかしながら研究協力者の大学院生の多くが、当年度は休学・退学したために実働人員が減少し、加えてまた修士論文の執筆はじめ大学院生各自の論文執筆が重なったために、撮影と撮影画像判読のための時間が持ちにくかった。平成28年度末の終わりころから、進学・復学してきた大学院生が再び揃い、当初の計画した人員組織で研究の進行に復活できた。一時停滞した研究の進行を、参加者全員の努力で取り戻した。当該年度でのCT撮影は13点、他にソフトエックス線、デジタル撮影などによる調査作品は、20点余りであった。日本・中国・朝鮮など東アジアの古漆器の調査をして、画像の判読、分析と相互間の比較検討をおこなった。時代判定・産地判定・真贋判定・破損状態判定等有効な画像データを集積した。【専門学会での発表】1文化財保存修復学会第39回大会於金沢7月1日ー2日。初期高台寺蒔絵食籠(新出在銘作)の保存修復のための分析ーX線CTはじめ科学的診断=(ポスター発表P057)X線CTによる黒漆五稜花形小皿の紙胎構造分析(ポスター発表p060研究代表
海水中ナノプラスチックの限外濾過法による捕集と化学的手法による同定・特徴づけ

ナノプラスチックの環境中での存在が予想され、生体影響が懸念されている。しかし、その実測のための手法は開発されていない。本研究では海洋環境中のナノプラスチックの同定と計測手法を開発することを目的とする。海水からタンジェンシャルフローの限外濾過によりコロイド粒子(ナノ粒子)を捕集し、化学処理(フッ酸、過酸化水素による分解、加水分解)・生化学処理(酵素処理)により共存する無機物、有機物を分解・除去する。精製したナノ粒子を電子顕微鏡、熱分解装置付きGC-MSによるポリマー特異的なフラグメントの測定、加速型質量分析計(AMS)による放射線炭素同位体比の測定によりプラスチックの同定・定量を行う。
教室での知識の創出と進化を促す学習作業空間の構成に関する総合的研究

平成30年度は,研究の全体計画にしたがって理論面の検討を進めつつ,将来的な実用上の必要性に応えるべく,探索的に実証的活動も進めた。本研究は,中核理論・設計方法論・カリキュラム評価の三層のプロジェクトによって進めることとしており,特に本年度は中核理論の確立を中心とした。中核理論は次の3つからなるものである:対象の生成と存在による数学的知識の特徴づけ,数学的に有意味な世界の生起ー維持ー変容,教室内当事者による行為の構造。たとえば数学的知識には何らかの問題解決のために作られる側面と<知識の生成>,知識の確実性を保障するための方法(たとえば証明をしたり,他の知識との関連づけをしたりすること)とがあり<知識の存在>,これらのいずれについても議論することが教室を数学的にしている。数学的知識を生み出す場や,「について数学的に議論する」といったとき,何らかの記号を用いて記述するという性格があり,議論が進むにつれてその記述物に対する見方や扱い方が変わる。このような理論上の検討は,翻って授業者にとってのリアルタイムの授業分析の枠組みになる潜在性がある。年度後半には,次年度以降のカリキュラム評価を行うべく,またエナクティヴィズム思想による授業分析のための視点を確立するために,研究協力者とともに中学校数学科授業の設計と観察,分析を行った。事前に授業者とこれまでの研究成果と方針を共有した上で,授業者による授業観を尊重しつつ,「比例・反比例」「平面図形」の2つの単元の設計し,エピソード分析を行った。その結果,教科書などにはのせられていないが当事者(教師と生徒ら)にとって意味や意義のわかる語をめぐってのやりとりが,中核理論のうちの有意味世界の生起に貢献することがわかってきた。研究全体の計画に照らしてみたとき,中核理論・設計方法論・カリキュラム評価という三層のプロジェクトは当初から意図していたものではないが,研究の遂行上,必要と判断された。事前の計画通りとは必ずしもいえないが,五カ年計画の本研究課題としてみたときには概ね順調に進展しているといえる。理論検討と実証的検討との両面について,これまでは研究代表を中心に,また数学教育研究の文脈で進めてきた。研究組織の学際性をいかしてこれらの成果の一般化,実際の教育現場を想定した実践化を図りたい。平成29年度は,研究の全体計画にしたがって理論検討を中心に進めた。数学的知識の創出と進化に関する哲学・思想の検討がその中心であり,関連する文献や資料のレビューを行った。あわせて,本研究で重視している身体化およびエナクティヴィズムに基づく数学教育研究を進めているD.Abrahamson氏,A.Bakker氏,J.F.Maheux氏らとの交流を通して,(1)教室での学習の複雑さを説明する暫定枠組みの構築,(2)学習作業空間のデザインとしての哲学・思想の具体化,についての示唆を得た。(1)については「有意味世界の生起」を鍵言葉として,生徒は何に従事し没頭しているか(engagement),行為を支える多様な世界は教室のなかでどのように同居するか,世界の多様さにあいまって行為の変容を促す要因は何か,実践中の数学的対象の位置や役割は何か,という諸点を挙げた。(2)についてはコンテンツの論理的配列と,それらコンテンツが行為からの創発になるようなカリキュラムおよび学習作業空間のデザインについて検討した。カリキュラムといえど実践からは引き離されないため,実践中教師による行為の道筋の再組織化という課題があることが指摘された。年度後半には,以上のような分担者とともに,談話分析をベースとしつつ,記述性という数学の特性と,心身一元論による身振り手振りの分析とを加味した,研究方法論の開発を目指した。これは全体計画では次年度半ばまでこれを進める計画であり,引き続き教室の複雑さを捉える方法論の開発を目指す。研究全体の計画に照らしてみたとき,研究方法論の開発の点で十分な共同的検討がなされていない。当初の理論的検討は計画通りであることと合わせて,概ね順調であるといえる。

その結果,教科書などにはのせられていないが当事者(教師と生徒ら)にとって意味や意義のわかる語をめぐってのやりとりが,中核理論のうちの有意味世界の生起に貢献することがわかってきた。研究全体の計画に照らしてみたとき,中核理論・設計方法論・カリキュラム評価という三層のプロジェクトは当初から意図していたものではないが,研究の遂行上,必要と判断された。事前の計画通りとは必ずしもいえないが,五カ年計画の本研究課題としてみたときには概ね順調に進展しているといえる。研究に適切な研究方法論の開発は,実践上の有用性に支えられて進められる。具体的には継続的に数学科授業の実証データを得られる環境が必要であるが,本研究課題の意図を承知しつつ,かつ教育現場で取り組みたいこととがうまく合致するいくつかの実践者と密な交流を持たねばならない。研究当初はこのあたりはややあいまいであったが,平成29年度後半からはそうした関係性を作ることができてきたので,引き続き理論面と実証面の両輪で進めていくことができる。理論検討と実証的検討との両面について,これまでは研究代表を中心に,また数学教育研究の文脈で進めてきた。研究組織の学際性をいかしてこれらの成果の一般化,実際の教育現場を想定した実践化を図りたい。
長寿関連因子WDR6と抗酸化ストレス物質の相互作用の解析

Insulin/IGF-Iシグナルや糖・脂質代謝は、老化および老化関連疾患の発症に重要な役割を担っている。私の所属する千葉研究室は、WDR6のKOマウスにおいて、mTORC1経路の下流に存在するS6Kのリン酸化が抑制されている可能性を報告してきた。本研究では、WDR6がmTOR経路の下流にあたるオートファジー制御に関与するかについて、WDR6の発現低下が糖脂質代謝に与える影響についてWDR6をノックダウンした培養細胞を用いて解析を行った。まず、HeLa細胞に対してsiRNAを用いてWDR6をノックダウンし、LC3タンパク質発現解析を行った結果、WDR6をノックダウンしたHeLa細胞においても、コントロールと比較してLC3-I, IIの発現がともに上昇した。さらにフラックスアッセイを行うとともに、mTORC1経路のリン酸化状態を解析したが、オートファジーを活性化したという明確な結果を得られなかった。続いてHeLa細胞とHepG2細胞に対してWDR6をノックダウンし、リアルタイムPCRを行い、遺伝子発現解析を行った。その結果、HeLa細胞においてWDR6のKDによって糖代謝、脂質代謝、そして腫瘍抑制因子の発現が有意に低下することが示された。そしてHepG2細胞では糖新生、脂質代謝そしてDNAの修復に関わる遺伝子の発現が有意に上昇した。さらに糖代謝、脂質代謝、ミトコンドリア生合成、腫瘍抑制因子の遺伝子発現が有意に低下することが示された。以上より、WDR6はmTORC1活性とオートファジー制御に影響を与えるとともに、糖・脂質代謝に大きな影響を与えることが示唆された。興味深いことに、WDR6の発現低下はmTORC1の活性を抑制し、LC3の発現を上昇させるが、必ずしもオートファジーの活性化を引き起こさない可能性が示唆された。まず、HeLa細胞に対してsiRNAを用いてWDR6をノックダウンし、WesternBlotting法を用いてタンパク質発現解析を行った。その結果、WDR6をノックダウンしたHeLa細胞においても、コントロールと比較してLC3-I, IIの発現がともに上昇した。さらにオートファジーの進行度合いを確認するフラックスアッセイと飢餓応答解析を行うとともに、mTORC1経路のリン酸化状態を解析した。その結果、WDR6のノックダウンによってmTOR関連経路が抑制されていることが示されたが、明確にオートファジーを活性化したといえる結果とならなかった。続いてHeLa細胞とHepG2細胞に対してsiRNAを用いてWDR6をノックダウンし、リアルタイムPCRを行い、遺伝子発現解析を行った。その結果、HeLa細胞においてWDR6のKDによって糖代謝に関わるG6PD、糖・脂質代謝に関わるPPARA脂質代謝に関わるMogat1とPNPLA2、腫瘍抑制因子であるp53の発現が有意に低下することが示された。そしてHepG2細胞では糖新生に関わるPCK1、脂質代謝に関わるCD36、そしてDNAの修復・細胞周期の停止に関わるp21の発現が有意に上昇した。さらに糖・脂質代謝に関わるPPAPA、脂質代謝に関わるACC1、脂質代謝に関わるMLXIPL、脂質代謝に関わるMogat1、ミトコンドリア生合成に関わるPPARGC1A、腫瘍抑制因子であるp53の発現が有意に低下することが示された。今後の解析の準備としてmRFP-GFP-LC3を遺伝子導入したHeLa細胞を取得し、研究室での培養と順化を行っている。これまでの研究結果から、WDR6の遺伝子発現の変化が様々な遺伝子発現に対して大きな影響を与えていることが強く示唆された。そこでWDR6 KOマウスに対して、次世代シークエンサーを用いて網羅的な遺伝子発現の変化を解析することを計画している。それと同時に、WDR6がオートファジーに関して影響を与えていることが強く示唆されたことから、オートファジー関連の遺伝子を組み込んだ細胞を用いて解析を行う予定である。次世代シーケンサーによる網羅的解析だが、通常の野生型マウスとWDR6をノックアウトしたマウス間での遺伝子発現の解析を行う予定である。これによりWDR6とmTOR経路やオートファジー経路の間に存在する経路について解析すると共に、いまだに明らかにされていないWDR6の関連経路についても解析が可能となると考えている。続いてオートファジー関連の遺伝子を組み込んだ細胞として、オートファゴソームを形成するLC3タンパクにGFPとRFPを結合したmRFP-GFP-LC3を導入した細胞を用いた解析を予定している。このタンパクは細胞質中ではmRFPとGFPが励起して発光するが、オートファジーが起こりリソソームと結合するとpHが変化してGFPの励起が阻害されmRFPのみが励起して赤に発行するという性質を持つ。つまり細胞内の蛍光の色の割合でオートファジーの進行度合いを可視化できるということになる。この性質を利用し、mRFP-GFP-LC3を導入した通常細胞、WDR6のノックダウン細胞、WDR6を過剰発現させた細胞において蛍光顕微鏡で観測することでWDR6とオートファジーの関係性について明らかにすることができるだろう。

まず、HeLa細胞に対してsiRNAを用いてWDR6をノックダウンし、LC3タンパク質発現解析を行った結果、WDR6をノックダウンしたHeLa細胞においても、コントロールと比較してLC3-I, IIの発現がともに上昇した。さらにフラックスアッセイを行うとともに、mTORC1経路のリン酸化状態を解析したが、オートファジーを活性化したという明確な結果を得られなかった。続いてHeLa細胞とHepG2細胞に対してWDR6をノックダウンし、リアルタイムPCRを行い、遺伝子発現解析を行った。その結果、HeLa細胞においてWDR6のKDによって糖代謝、脂質代謝、そして腫瘍抑制因子の発現が有意に低下することが示された。そしてHepG2細胞では糖新生、脂質代謝そしてDNAの修復に関わる遺伝子の発現が有意に上昇した。さらに糖代謝、脂質代謝、ミトコンドリア生合成、腫瘍抑制因子の遺伝子発現が有意に低下することが示された。以上より、WDR6はmTORC1活性とオートファジー制御に影響を与えるとともに、糖・脂質代謝に大きな影響を与えることが示唆された。興味深いことに、WDR6の発現低下はmTORC1の活性を抑制し、LC3の発現を上昇させるが、必ずしもオートファジーの活性化を引き起こさない可能性が示唆された。まず、HeLa細胞に対してsiRNAを用いてWDR6をノックダウンし、WesternBlotting法を用いてタンパク質発現解析を行った。その結果、WDR6をノックダウンしたHeLa細胞においても、コントロールと比較してLC3-I, IIの発現がともに上昇した。さらにオートファジーの進行度合いを確認するフラックスアッセイと飢餓応答解析を行うとともに、mTORC1経路のリン酸化状態を解析した。その結果、WDR6のノックダウンによってmTOR関連経路が抑制されていることが示されたが、明確にオートファジーを活性化したといえる結果とならなかった。続いてHeLa細胞とHepG2細胞に対してsiRNAを用いてWDR6をノックダウンし、リアルタイムPCRを行い、遺伝子発現解析を行った。その結果、HeLa細胞においてWDR6のKDによって糖代謝に関わるG6PD、糖・脂質代謝に関わるPPARA脂質代謝に関わるMogat1とPNPLA2、腫瘍抑制因子であるp53の発現が有意に低下することが示された。そしてHepG2細胞では糖新生に関わるPCK1、脂質代謝に関わるCD36、そしてDNAの修復・細胞周期の停止に関わるp21の発現が有意に上昇した。さらに糖・脂質代謝に関わるPPAPA、脂質代謝に関わるACC1、脂質代謝に関わるMLXIPL、脂質代謝に関わるMogat1、ミトコンドリア生合成に関わるPPARGC1A、腫瘍抑制因子であるp53の発現が有意に低下することが示された。今後の解析の準備としてmRFP-GFP-LC3を遺伝子導入したHeLa細胞を取得し、研究室での培養と順化を行っている。これまでの研究結果から、WDR6の遺伝子発現の変化が様々な遺伝子発現に対して大きな影響を与えていることが強く示唆された。