hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨髄由来の間葉系幹細胞を利用した遺伝子治療法の開発

間葉系幹細胞(MSC)を利用した遺伝子治療法の開発研究を行った。第1に、MSCが腫瘍集積性を有することに着目し、担癌ヌードマウスを用いたモデル実験でそのメカニズムを調べ、癌遺伝子治療のプラットホームとしてMSCを用いる際に有用な知見を得た。第2に、MSCの遺伝子操作の際の安全性を確保するため、アデノ随伴ウイルスの19番染色体AAVS1領域特異的ゲノム組込み機構を利用した遺伝子導入法の基盤研究を行った。1)MSCの腫瘍集積性に着目し、癌遺伝子治療のプラットホームとしてMSCを利用する治療戦略の開発を進めた。抗腫瘍性サイトカインとしては可溶型TRAIL [TNF(tumor necrosis factor)-related apoptosis-inducing ligand]を検討することとし、MSCへの遺伝子導入実験には、ファイバー変異型アデノウイルスベクターを用いた。可溶型TRAIL発現MSCが大腸癌細胞株などの増殖を抑制することをin vitroで確認した。腫瘍集積性については、そのような性質のない線維芽細胞との違いを調べ、TNF-α刺激による血管内皮細胞への接着性亢進がMSCでのみ観察されたことから、MSC-血管の相互作用が重要と考えられた。尚、各種サイトカイン刺激による遊走能には、MSCと線維芽細胞の間で有意の違いを認めなかった。2)MSCを用いた再生医療/細胞治療の有効性を高めるには遺伝子操作を絡める必要があり、その安全性を確保するための染色体部位特異的遺伝子組込み法の基盤研究を行った。即ち、野生型アデノ随伴ウイルス(AAV)が第19番染色体のAAVS1領域に組み込まれる性質を利用し、ITRとRepというAAVの二つのコンポーネントを用いたAAVS1特異的遺伝子組込み法の開発研究を進めた。ヒトMSCのモデル細胞株としてUEET1を用い、導入遺伝子がAAVS1に組み込まれた株、コントロールの非AAVS1株を複数樹立した。両群とも、徐々に導入遺伝子の発現が低下し、プロモーター/エンハンサー領域のメチル化が起こっていた。またAAVS1株ではAAVS1領域の内因性インスレーターが遺伝子組込みにより破壊されており、導入遺伝子発現の低下の一因と考えられた。1) MSCの腫瘍集積性に着目し、癌遺伝子治療のプラットホームとしてMSCを利用する治療戦略の開発を進めた。抗腫瘍性サイトカインとしては可溶型TRAIL[TNF(tumor necrosis factor)-related apoptosis-inducing ligand]を検討することとし、MSCへの遺伝子導入実験には、ファイバー変異型アデノウイルスベクターを用いた。前年度に引き続き、可溶型TRAIL発現MSCが大腸癌細胞株などの増殖を抑制することをin vitroで確認するために、ルシフェラーゼを安定に発現する大腸癌細胞を作製し、その発光強度から癌細胞の生存率を求めることが可能な測定系を構築した。この測定系は本研究での使用だけでなく、今後様々な共培養実験において標的細胞の増殖度合いを調べることが可能になるシステムである。2) MSCを用いた再生医療/細胞治療の有効性を高めるには遺伝子操作を絡める必要があり、その安全性を確保するための染色体部位特異的遺伝子組込み法の基盤研究を行った。即ち、野生型アデノ随伴ウイルス(AAV)が第19番染色体の飴VS1領域に組み込まれる性質を利用し、ITRとRepというAAVの二つのコンポーネントを用いたAAVS1特異的遺伝子組込み法の開発研究を進めた。導入遺伝子のメチル化等によるサイレンシングを防ぐためトリβグロビン遺伝子もしくはc-mycのインスレーター配列を搭載したGFP/ブラスト耐性遺伝子発現プラスミドもしくはインスレーター非搭載プラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションし薬剤耐性コロニー数を比較したところ、両者では有意の差が認められなかった。ヒトMSC由来の細胞株UEET1株にトランスフェクションし同様の比較が必要と考えられた。第1に、MSCが腫瘍集積性を有することに着目し、癌遺伝子治療のプラットホームとしてMSCを利用する治療戦略を開発した。即ち、抗腫瘍性サイトカインを発現するヒトMSCを担癌ヌードマウスに血管内投与し、生存期間の延長を図る遺伝子治療モデル実験を行った。抗腫瘍性サイトカインとしては可溶型TRAIL[sTRAIL; soluble TNF-related apoptosis-inducing ligand]を使用した。この分子中にイソロイシンジッパードメインの配列を付加して効率的且つ安定的な三量体形成を図ることによって殺腫瘍細胞効果が増強されることを確認した。さらに、HDAC阻害剤であるTSAの併用によって、TRAIL受容体の発現亢進を介して腫瘍細胞のTRAIL感受性を高めることができた。ヒト大腸癌細胞を皮下接種した担癌マウスの治療実験では、sTRAIL発現MSCとTSAの併用によって腫瘍の増殖抑制が観察された。また、この治療実験の結果から、MSCがより集積しやすい腫瘍ほど治療効果が高いことが示された。第2に、MSCを用いた再生医療/細胞治療の有効性を高めるには遺伝子操作を絡める必要があり、その安全性を確保するための染色体部位

特異的遺伝子組込み法の基盤研究を行った。即ち、野生型アデノ随伴ウイルス(AAV)のゲノムが第19番染色体長腕AAVS1領域に組み込まれる性質を利用し、AAVS1特異的遺伝子組込み法の開発研究を行った。今年度は、導入遺伝子のサイレンシングを抑制する目的でトリβグロビンもしくはc-mycのインスレーター配列を搭載したGFP/薬剤耐性遺伝子プラスミドを293細胞に導入し、薬剤耐性コロニー数を比較したところ、インスレーター非搭載プラスミドと比べて両者とも有意差はなかった。
神経膜性角膜症の重症例での角膜実質融解機序の解明に基づいた治療戦略の樹立

神経麻痺性角膜症は三叉神経第1枝が障害され角膜知覚が低下した症例で角膜上皮障害や角膜創傷治癒遅延が惹起される難治性の疾患である。マウス三叉神経第1枝を18G針(重症モデル)および20G針(軽症モデル)でバイポーラ熱凝固することで重症度を変えた神経麻痺性角膜症モデルの作成に世界で始めて成功した。重症モデルでは三叉神経障害に伴うと考えられる局所の炎症と角膜実質の融解、角膜潰瘍からの穿孔を来たし、眼球が崩壊した。この重症モデルでの実質幹細胞の恒常性破綻(アポトーシス)の病態への関与と神経障害による炎症惹起機序の解明の解析、さらにそれらを標的とした新規の治療戦略の探索のための研究計画を立案した。
TEM-EELSによる惑星物質のサブミクロンスケールでの構造・化学解析

高温・高圧・高酸素分圧が惑星物質に与える鉱物学的影響を調べるため,石質隕石の高温酸化実験と衝撃回収実験を行った.この結果,1)鉄に富むカンラン石の酸化による超構造への相転移と赤外スペクトル変化との関連性,2)1万気圧程度の弱い衝撃の加熱においては,含水鉱物の脱水反応は顕著ではないこと,を明らかにした.また,石質隕石の主要鉱物である斜長石の静的圧縮実験を行い,3)斜長石の圧力誘起非晶質化は温度及び時間依存性を持つことを,明らかにした高温・高圧・高酸素分圧が惑星物質に与える鉱物学的影響を調べるため,石質隕石の高温酸化実験と衝撃回収実験を行った.この結果,1)鉄に富むカンラン石の酸化による超構造への相転移と赤外スペクトル変化との関連性,2)1万気圧程度の弱い衝撃の加熱においては,含水鉱物の脱水反応は顕著ではないこと,を明らかにした.また,石質隕石の主要鉱物である斜長石の静的圧縮実験を行い,3)斜長石の圧力誘起非晶質化は温度及び時間依存性を持つことを,明らかにした3種類の炭素質コンドライト隕石の基質(マトリクス)を空気中で約600°Cまで加熱し,高温下での赤外スペクトルその場観察実験を行った.試料は主に鉄に富むかんらん石(フォルステライト成分15-74%)からなる.477°Cまでの加熱において,中赤外スペクトルはかんらん石に特徴的な10,11,12ミクロン付近の強いピークを示したが,大きなスペクトル変化はみられなかった.しかし,572°C以上の加熱では,11ミクロンのピークのスプリット,及び10ミクロン,llミクロンのピーク強度の逆転が生じた.また,合成したFeに富むかんらん石(ファヤライト成分53%)の空気中600°Cでの加熱実験を行い室温に冷却後,赤外スペクトル測定を行ったところ,コンドライトと同様のスペクトル変化が観察された.更にこのスペクトル変化の原因を精査するため,隕石,合成かんらん石の冷却後の試料を透過電子顕微鏡で詳しく観察した結果,それぞれの試料のかんらん石は,加熱前の試料には全く見られない(001)面上の積層欠陥を高頻度で有し,この欠陥はかんらん石C軸の3倍に相当する超構造(ライフーナイト)に相当することが明らかになった.以上の事から,空気中の加熱によるコンドライトマトリクスの赤外スペクトル変化は,隕石中の鉱物間の化学反応や部分溶融ではなく,マトリクスの第一成分であるかんらん石中のFeの酸化に伴う超構造への構造変化に起因することが明らかになった.この赤外スペクトル変化は,将来の探査機による火星や小惑星の赤外スペクトル観測において,表層の酸化還元状態を知るための有用な標準データと成りうる.激しい衝撃変成を受けた石質隕石中では、その主要構成鉱物である斜長石の一部が固相のままガラス化しており、衝撃スケールの重要な一指標となっている。従来は、衝撃回収実験のみからガラス化の圧力が見積もられてきた。しかし、衝撃実験における圧力保持時間は10-6secオーダーであり、天然の隕石母天体(100secオーダー)と比較すると極めて短い。従って、相転移に必要な時間が十分与えられず、ガラス化圧力が過剰に評価されてい可能性がある。本研究課題では、圧力保持時間をより長くとることのできる外熱式ダイヤモンドアンビルセルを用い、Ab99Anl組成の斜長石粉末の圧縮実験を行った。試料は20-41GPaの圧力範囲で加圧後、室温のまま、あるいは170°C、270°Cまで加熱して約30分保持した後、室温まで冷却し、その後減圧して回収物をラマン分光装置で構造を固定、ガラス化メカニズムを調べるため、一部の試料は透過電子顕微鏡(TEM)でも解析した。その結果、1)静的圧縮により斜長石が完全にガラス化する圧力は、170°Cでは室温とほとんど変わらず37GPa程度であるが、270°Cでは31GPaと有意な圧力低下がみられた。この結果は斜長石のガラス化は熱活性化過程であることを示唆すること、2)隕石母天体でのガラス化圧力を圧力保持時間の影響も考慮して見積もると、従来衝撃回収実験に基づも求められた圧力より10GPa以上低いこと、3)回収試料のTEM観察によると、ガラス化は結晶ドメインサイズの減少によるものであり、隕石や衝撃回収試料に見られるラメラ状のガラス化は確認できなかった。出発物質の粒径がガラス化圧力とメカニズムに与える効果も検討する必要があること、が明らかになった。本年度は、小惑星表層試料の弾丸打ち込みサンプリング法における、含水物質への衝撃加熱の影響を探ることを目的とし、含水炭素質コンドライトの衝撃実験と回収試料の透過電子顕微鏡(TEM)観察を行った。試料は窒素ガス銃によりステンレス弾丸を打ち込むことで約1GPaの衝撃圧を与えたマーチソン隕石である。回収物を試料の形状と大きさに応じて、従来型イオンミリング装置、イオンスライサ、集束イオンビーム装置(FIB)を使い分けて薄膜試料を作成し、TEM観察を行った。弾丸付着物、破砕飛散物試料共にマーチソン隕石マトリクス本来の微細組織をかなり残しており、含水層状鉱物である短冊状、チューブ状、繊維状のtochilinite, Fe-Mg serpentineが確認された。短冊状の粒子は結晶度の高いFe-Mg serpentineであった。アルゴンイオンで作成した試料中のチューブ状、繊維状粒子の多くは、Fe-Mg serpentineとtochiliniteの中間組成を持つ。

これらが示す電子線回折リングの一部はFe-Mg serpentine、tochiliniteで指数付けできるが、magnetite、troiliteの回折リングも観察された。衝撃実験で約600°C以上の加熱を受けたマーチソン試料について過去に報告されたの同様な、Fe-Mg serpentine, tochiliniteの分解反応が生じたと考えられる。Fe-Mg serpentine, tochiliniteの常圧での分解温度はそれぞれ500-600°C、245°Cであり、薄膜加工時のアルゴンイオン照射による加熱(200°C以下)が原因とは考えにくい。少なくとも一部のFe-Mg serpentineは、衝撃加熱が原因で分解した可能性が高い。今後、衝撃前試料の薄膜加工ダメージも詳細に検討し、含水鉱物の分解プロセスを明らかにしていく予定である。
(IL-6関連遺伝子+bcl-2遺伝子)欠損・導入によるT細胞分化及び生存機構

1.(IL-6遺伝子+bcl-2遺伝子)導入マウスを用いた解析;このマウスの胸線細胞を同系癌FBL-3や同種異系癌p815でin vitro刺激すると、胸線細胞の生存数及び^3H-サイミジン取り込みはIL-6遺伝子導入マウスやbcl-2遺伝子導入マウスの胸線細胞に比し50100倍の相乗効果が認めらた。キラーT細胞誘導活性においても約200倍の活性が示された。これらの相乗効果は胸線細胞のみでなく、脾及びリンパ筋T細胞を用いても認められた。さらに、長期培養の28日MLTCにおいても(IL-6+bcl-2)double TgマウスT細胞のみがキラー活性を保持し、また、相乗的な長期生存率上昇を示した。さらに、in vivoにおいても、(IL-6+bcl-2)double Tgマウスは免疫2ヵ月後(通常マウスではキラー活性消失)の脾・リンパ節・PEC中に抗原特異的なCD8^+キラーT活性が維持された。このリンパ球をadoptive transferし、2ヵ月後のリンパ球生存を解析した。その結果、両遺伝子が強制発言されたリンパ球において最もキラー活性を保持したまま長期生存することを明らかにした。2.(IL-6遺伝子+bcl-2遺伝子)ダブルノックアウトマススの作製;IL-6遺伝子ノックアウトマウスとbcl-2遺伝子ノックアウトマウスを交配しダブルノックアウトマウスの作製を試みた。両遺伝子欠損マウスにおいては脾臓は正常の約1/20の大きさでin vitroのキラーT分化誘導は著明に抑制された。3.IL-6遺伝子ノックアウト及びIL-6Tgマウスを用いたT細胞分化の解析;これらの担癌マウスに前記のIL-6R遺伝子とgp130遺伝子をアデノウイルスベクターを用いて治療を行った。その結果、担癌IL-6Tgマススでは腫瘍特異的キラーT誘導の相乗効果が認められ、IL-6(-/-)マウスでは認められなかった。これらの結果よりIL-6関連遺伝子+bcl-2遺伝子欠損・導入モデルはT細胞分化と生存機構の解明に有力な武器を提供することが示唆された。
環境大気中の炭素安定同位体比の高頻度、高精度測定のための導入系の開発

元素分析計のキャリア流路に,気体試料の導入部を組み込み,定量ループなどから気体試料を導入できるように改良した.この装置を用いて,元素分析計と質量分析計とを接続した際に分析精度を支配している要因として,室温,元素分析計内のフラクショネーション,質量分析計の圧力効果などの点について検討した.最も単純な導入系である,GCカラムなしで元素分析計から直接,質量分析計へスプリット導入した場合,50回の連続分析で,標準偏差0.2‰以内の分析値が得られた.ベローズからレファレンスガスを導入して測定した場合,レファレンスの同位体比変動が0.06‰に対し,元素分析計からの同位体比変動は0.09‰までさせることができた.元素分析計からのガス試料の導入能力自体は,安定同位体用の質量分析計に匹敵することがわかった.ただし,スプリット比が時間変化するためのサンプルビーム強度のドリフトと空調機のスイッチングが原因である13分程度の周期的な比の変動がレファレンス,サンプルともに認められた.質量分析計イオン源内の圧力効果を検討したところ,キャリア流量がバックグラウンド値に影響し,同位体比の変化は流量に依存して変化しており,通常行われるビーム強度で同位体比を補正する方法は有効でないことがわかった.コールドトラップを利用した場合,フロー系とバッチ系で系統的な同位体比の変動が認められ,30分程度の測定時間に比して同位体比の精度が向上しなかった.結論として,元素分析計をガス試料の導入系とした場合,元素分析計の燃焼系が比の値に,設置環境が比の精度に影響しており,精度を向上させるには,高度な空調とスプリット導入系の改良が必要であった.元素分析計のキャリア流路に,気体試料の導入部を組み込み,定量ループなどから気体試料を導入できるように改良した.この装置を用いて,元素分析計と質量分析計とを接続した際に分析精度を支配している要因として,室温,元素分析計内のフラクショネーション,質量分析計の圧力効果などの点について検討した.最も単純な導入系である,GCカラムなしで元素分析計から直接,質量分析計へスプリット導入した場合,50回の連続分析で,標準偏差0.2‰以内の分析値が得られた.ベローズからレファレンスガスを導入して測定した場合,レファレンスの同位体比変動が0.06‰に対し,元素分析計からの同位体比変動は0.09‰までさせることができた.元素分析計からのガス試料の導入能力自体は,安定同位体用の質量分析計に匹敵することがわかった.ただし,スプリット比が時間変化するためのサンプルビーム強度のドリフトと空調機のスイッチングが原因である13分程度の周期的な比の変動がレファレンス,サンプルともに認められた.質量分析計イオン源内の圧力効果を検討したところ,キャリア流量がバックグラウンド値に影響し,同位体比の変化は流量に依存して変化しており,通常行われるビーム強度で同位体比を補正する方法は有効でないことがわかった.コールドトラップを利用した場合,フロー系とバッチ系で系統的な同位体比の変動が認められ,30分程度の測定時間に比して同位体比の精度が向上しなかった.結論として,元素分析計をガス試料の導入系とした場合,元素分析計の燃焼系が比の値に,設置環境が比の精度に影響しており,精度を向上させるには,高度な空調とスプリット導入系の改良が必要であった.
超伝導体ナノチューブの新合成と新規量子現象の探索

微小結晶のメビウス結晶作製技術の応用としてNbSe2のC60によるテンプレート成長法の確立を目指した。(Nature公表417(2002)397)NbSe2ナノチューブ、NbSe2ナノファイバー、TaS2ナノチューブの合成に成功した。NbSe2ナノチューブの合成に関しては、化学的気相輸送法をもちいた。特にC60テンプレートを用いることにより径がナノサイズの大きさのものがコントロールよく合成できることを発見した。NbSe2ナノチューブの径は10nmから100nmのサイズであり長さは1μmである。温度コントロール(720°Cから800°C)を精密に行うことにより、最初にナノサイズのNbSe3の単結晶を作製し(720°C)その後温度を780°Cにしばらく設定しそのNbSe3から脱Se化反応によりNbSe2のナノファイバー、ナノチューブを合成する。その際NbSe3のもつナノファイバー性を利用するいわゆる自己テンプレート型製法を確立した。脱Se化反応においては曲率をもって作製されることがわかっておりその過程においてナノチューブが合成されるというメカニズムを解明した。TaS2ナノチューブに関しては室温にてCDW転移を示していることが透過電子顕微鏡により観測された。CDWに基づく超格子周期の衛星反射の観測がみられ、かなり薄い結晶においてもCDWが存在することが明らかとなった。NbSe2ナノファイバー、ナノチューブに4端子電極をつけ転移温度を測定した。電極に関してはFIBによる電極直接接合法と電子ビーム露光法を用いた。Tcは5.0Kでありバルクで報告されているTc=7.2Kより低い温度で超伝導になることがわかった。これらの結果はいずれも世界初の結果である。通常の結晶形とトポロジー的に異なる構造を持つ、NbSe_3の"nπ-ひねりループ"結晶の作成に初めて成功した。これらの成長機構及びCDW(電荷密度波)転移について報告する。三セレン化ニオブNbSe_3は、一方向に導電性の良い伝導チェインを持つ、擬一次元性物質である。低次元導体に特有なCDW秩序状態を持つ代表的物質としてよく研究されている。この物質はホイスカー(ひげ結晶)を形成するのみであると従来信じられてきた。しかしNbSe_3の新規な結晶形が発見した。これらは円周に沿って一周するときのひねり数、nπで分類され、明らかに直線的なホイスカーとは異なるトポロジーを持つため、トポロジカル物質と呼ぶ。発見されたループ結晶のサイズは、外径10300μm、内径は最小で1000Å程度である。NbSe_3のコヒーレンス長(数μm)と同程度のループを得ることもできる。ループ結晶に対し、直流2端子法により300-4.2Kの範囲で抵抗率測定を行った。その結果、通常のNbSe_3結晶と同様に、約Tc_1=141K,Tc_2=59Kにおいて2度のCDW転移が観測された。しかし、nπループには最大で4Kという大きな転移温度の降下が見られた。Tcはd(Inρ)/d(1/T)のピークで定義される。この転移温度降下にはサンプル依存性が見られた。しかし、Tableのように、サイズの小さいものほど強くCDWが抑制される傾向がある。特筆すべき特徴として、大幅な降下(4K)は2πサンプルでのみ観察され、0πサンプルはホイスカとほぼ同じ性質であった。これはトポロジーによる定性的な差が生じているといえる。
クロマチン構造にゆらぎを生み出す分子基盤の解明

細胞の性質は基本的に遺伝子により規定されるが、その発現には「ゆらぎ」が存在し、個体間・細胞間の性質の差として現れる。これは生命のもつ柔軟性・可塑性の表れであり、ゆらぎの制御機構の理解は生命の本質の理解に重要である。本研究では、遺伝子発現の「ゆらぎ」の分子機構の解明に取り組みEpe1というタンパク質が、種々のタンパク質とともに過度のゆらぎを抑制する因子であることを明らかにした。生命の柔軟性・可塑性の細胞レベルでの一つの分子基盤がクロマチン構造上の“ゆらぎ"にあると考え、“ゆらぎ"をひきおこすヒストン修飾とそれを一定方向に推進させ新たな状態に遷移させる因子の存在を仮定した、「2段階のゆらぎ」の存在を考える仮説を考えた。その仮説に基づき“ゆらぎ"を生み出す分子基盤とその“ゆらぎ"がクロマチン動態、遺伝子発現に与えるインパクトの解明を目指す。本仮説では「小さな“ゆらぎ"」はヒストンのモノユビキチ化が関与すると考え、「大きな“ゆらぎ"」にはヒストンシャペロンFACTの関与を想定している。これはFACTがヒストンH2A/Bの脱着をおこない、おおきな自由度をもつ6量体あるいは4量体ヌクレオソームをつくることができるためである。本年度はゆらぎ制御の標的遺伝子の選定をめざした。ゆらぎ制御を受ける遺伝子ではゆらぎの現象によりその転写が低下することが予想される。そこでモノユビキチン化に働く、rhp6破壊によって発現変動する遺伝子を、トランスクリプトーム解析を行い検索した。その結果、rhp6破壊により発現が減少するいくつかの候補遺伝子の選出に成功した。また、FACTに関しては、ヘテロクロマチン領域においてFACTの欠損により6量体あるいは4量体とおもわれるヌクレオソームが出現し、遺伝子の抑制状態が解除されることを見いだした。これは上記仮説の逆の反応をFACTが遂行していることを示唆している。またヒストンユビキチン化酵素rhp6破壊株ではヘテロクロマチンの転写抑制状況が強化され、ユビキチン化は想定通りクロマチン構造を緩める方向に機能する事が示唆された。これらの結果から、FACTはヒストンのユビキチン化の程度に応じてH2A/H2Bの出し入れを行う可能性が浮かびあがった。本研究ではゆらぎ制御の標的遺伝子の選定をめざした。次のステップとして、モノユビキチン化の程度をを候補遺伝子で定量的に測定する必要がある。そのためにはH2Bのモノユビキチン化特異的な抗体が必要であるが、解析にもちいることができる質の抗体がなく、みずから抗体の作成を試みた。ラビットのポリクローナル抗体の作成をユビキチン化ペプチドを用いて行ったが、必要な質の抗体をえることができなかった。分子生物学当初25年度中に1)rhp6破壊株でのトランスクリプトーム解析とH2Bモノユビキチン化抗体を用いたChIP-sequencingによる、モノユビキチン化により制御をうける遺伝子の同定。2)1)で選別した遺伝子におけるクロマチン構造変化の解析の二つの解析をおこなうよていであった。1)のトランスクリプトーム解析は順調に解析が進み予定の結果を得たが、ChIP-sequencingのために必須のモノユビキチン化抗体の質がわるいために解析がすすまず、その段階で解析が停滞している。まず、良質のH2Bモノユビキチン化抗体を得てChIP-sequencingをおこなう。そのために抗体を我々の手で作成することも試みる。ChIP-sequencingで標的遺伝子を選別した後に、予定通りMNase-qPCR法を用いてクロマチン構造の揺らぎ状態の解析をおこなう。以上の解析と平行して、当初予定していた、

他のヒストン修飾とモノユビキチン化の相関関係の解析、及び、ヘテロクロマチン拡張へのモノユビキチン化、FACTの影響を解析し、2段階揺らぎ仮説を検証する。一方、ヘテロクロマチンでのユビキチン化、FACTの影響を見いだしているので、この二つの因子がヘテロクロマチン領域のクロマチン構造制御においてどのような関係にあるのか、二重破壊株の作成や、ヒストンH2A/Bの過剰発現など、分子遺伝学的なアプローチで解析を進める。当初の予定では、H2Bモノユビキチン化抗体を用いたChIP-sequencingを行う予定であったが、抗体の質がわるいため、免疫沈降がうまくいかず、実験が行えなかった。そのためChIP-sequencingの試薬代に計上していた予算をつかわず、次年度使用額が生じた。上記ChIP-sequnecingは本年度中に良質の抗体を獲得あるいは作成して行う予定で有り、前年度から繰り越された予算を用いて必要な試薬を購入する。また、これと平行して他の諸実験は予定通りに遂行する。
必須脂肪酸代謝におけるγ-リノレン酸の生理的意義の解明

ラットの初代培養肝細胞とHep G2細胞の両培養細胞系を用いて、γ-11、レン酸(n-6、c18:3)の代謝に及ぼすアラキドン酸(n-6、C20:4)、EPA(n-3、C20:5)、DHA(n-3、C22:6)などの影響を検討した。また、これらの脂肪酸を予じめ細胞内に取り込ませた時の必須脂肪酸代謝への影響につていも検討を加えた。その結果、ラットの肝細胞とヒト肝ガン由来のHep G2細胞ではn-6、n-3両系列の必須脂肪酸の代謝において大きな違いがあることが明らかにされた。まず、第1にn-3系列ではラット初代培養肝細胞ではα-リノレン酸とC18:4の間の不飽和化反応が進行しないのに対し、HepG2ではC20:4とC20:5の間の不飽和化反応がほとんど進行しないことが明らかになった。同様にn-6系列ではラット初代培養肝細胞ジリキ-ル酸とγ-リノレン酸の間、HeP G2ではC20:3とC20:4の間の反応がほとんど進行しないという特色をもつことを明らかにした。この結果は、従来の研究でラットの結果をヒトに応用する場合代謝上大きな違いがあるという視点で再検討が必要なことを意味する。次に、n-6系列とn-3系列の相互作用ではγ-リノレン酸の取り込み、代謝に対し、EPA、DHAが阻害作用を示すこと、同じ系列のアラキドン酸に阻害結果を示した。このことはn-3、n-6両系列の脂肪酸の代謝で互いにn-3、n-6系列の脂肪酸に拮抗作用を示すことを意味するものである。また、アラキドン酸、EPA、DHAを両細胞にとりこませると、その取り込み量に応じて、細胞内濃度を一定に保つように代謝され、アラキドン酸とDHAではレトロコンバ-ジョンが、EPAではより進んだ代謝物に代謝された。アラキドン酸ではこの濃度低下作用が大きく、一定の細胞内濃度を保つように代謝が調節されているようである。以上の如く、γ-リノレン酸の生理作用の一端を明らかにすることが出来たと考えられる。γ-リノレン酸はn-6系列の必須脂肪酸であり、生体内ではリノール酸からアラキドン酸への中間代謝物である。このγ-リノレン酸のラット肝初代培養細胞、ヒト肝ガン由来のHepG2細胞系での取り込み、代謝をn-6系列の必須脂肪酸であるリノール酸、ジホモ-γ-リノレン酸、n-3系列のγ-リノレン酸と比較すると共に、これらの必須脂肪酸の取り込み、代謝上での相互作用について検討した。まず、ラット肝細胞、HepG2細胞共に、これらの脂肪酸の取り込み量はリノール酸が最も大きく、次いでγ-リノレン酸であり、γ-リノレン酸からC2が結合してC20となったジホモ-γ-リノレン酸の取り込み量はα-リノレン酸とほぼ同じ程度で近かった。また、これらの脂肪酸の代謝物は、γ-リノレン酸からはその添加濃度、時間に応じてジホモ-γ-リノレン酸の顕著な生成が見られた。しかし、両細胞系そにアラキドン酸量には変化は観察されなかった。また、α-リノレン酸添加時には、HepG2細胞においてのみC20:4(n-3)の生成が微量であるが観察された。この結果、両細胞系においてγ-リノレン酸を倍地に添加した際、細胞内のジホモ-γ-リノレン酸(C20:3、n-6)/アラキドン酸(C20:4、n-6)比は大きく変化し、その変化はHepG2でより大きく、対照の細胞に比べて約20倍に達した。次に、これらの脂肪酸または代謝物のリン脂質画分への取り組みを観察した結果、γ-リノレン酸及びその代謝物であるジホモ-γ-リノレン酸はホスファチジル-コリン、-エタノールアミン、-イノントールの各画分に取り込まれていた。このことは、γ-リノレン酸由来のジホモ-γ-リノレン酸がプロスグランジン及びロイコトリエンの前駆体として機能することを示唆するものである。なお、γ-リノレン酸とα-リノレン酸は両細胞系において代謝上拮抗作用をもつことが確かめられた。このことはn-6、n-3系列の必須脂肪酸の代謝が密接に関係していることを示すものといえよう。

この結果は、従来の研究でラットの結果をヒトに応用する場合代謝上大きな違いがあるという視点で再検討が必要なことを意味する。次に、n-6系列とn-3系列の相互作用ではγ-リノレン酸の取り込み、代謝に対し、EPA、DHAが阻害作用を示すこと、同じ系列のアラキドン酸に阻害結果を示した。このことはn-3、n-6両系列の脂肪酸の代謝で互いにn-3、n-6系列の脂肪酸に拮抗作用を示すことを意味するものである。また、アラキドン酸、EPA、DHAを両細胞にとりこませると、その取り込み量に応じて、細胞内濃度を一定に保つように代謝され、アラキドン酸とDHAではレトロコンバ-ジョンが、EPAではより進んだ代謝物に代謝された。アラキドン酸ではこの濃度低下作用が大きく、一定の細胞内濃度を保つように代謝が調節されているようである。以上の如く、γ-リノレン酸の生理作用の一端を明らかにすることが出来たと考えられる。
1型糖尿病におけるGAD65抗体のエピトープに関する研究

【成績】急性発症1型糖尿病血清とキメラGAD-Aとの反応は46例中38例が陽性であったのに対し、SPIDDMの全例が反応した。キメラGAD-Dとは急性発症1型糖尿病例で全例が反応せず、SPIDDMでは全例が反応した。キメラGAD-Eとの反応はいずれのタイプでも全例が陽性を示した。GAD-Nとは急性発症1型糖尿病では全例が陰性であったがSPIDDMの10例中9例が陽性であった。このエピトープはlinear epitopeであった。経時的なエピトープの変化(epitope spreading)はいずれの病型でも5年間の観察ではみられなかった。【結論】(1)急性発症1型糖尿病においてはその大部分のエピトープがGAD65分子の中心部分に存在する。(2)SPIDDMではGAD65分子のN端側1751AAにもlinear epitopeが存在する。(3)epitope spreadingはみられなかった。【成績】急性発症1型糖尿病血清とキメラCAD-Aとの反応は10例中7例が陽性であったのに対し、SPIDDMでは全例が反応した。キメラGAD-Gとの反応はいずれのタイプでも全例が陽性を示した。経時的なエピトープの変化(epitope Spreading)はいずれの病型でもみられなかった。【結論】(1)急性発症1型糖尿病においてはその大部分のエピトープがGAD65分子の244443位AAに存在する。(2)SPIDDMではGAD65分子のN端側183AAにもlinear epitopeが存在する。
マイクロチップ化キャピラリー電気泳動によるがんの高性能遺伝子診断システムの開発

昨年度までに行ってきた、キャピラリーアレイ電気泳動-レーザー蛍光検出装置(CAE-LIF)およびF-SSCP法を有機的に結合したがんの遺伝子診断システムの開発に成功したので、本研究においては、研究をさらに発展させるために、マイクロチップ化したキャピラリー電気泳動によるがんの超高性能遺伝子診断システムの開発を目的として、以下の研究を行った。1.単一のマイクロチャンネルを有するマイクロチップを作製し、マイクロチップ用の高電圧印加装置およびレーザー誘起蛍光検出装置を開発した。この装置を用いた、DNAの高速解析法を確立するために、マイクロチャンネル中にDNA解析用の分離担体を満たし、種々の条件下で電気泳動を行なった。その結果、1000塩基までのDNAをわずか、1分間で解析できることを明らかにした。この装置の開発と解析条件の検討によりマイクロチップ化キャピラリー電気泳動を開発した。2.さらに、マイクロチップ化キャピラリー電気泳動(MC-CE)とF-SSCPの有機的結合によるがんの高性能遺伝子診断システムの開発のための基礎的検討を行った。このシステムを用いた場合の、がん関連遺伝子の変異および多型を検出するための最適条件を調べた結果、300塩基までの1本鎖DNAをわずか、5分程度で解析できることを明らかにした。これらの成果は、がんの遺伝子診断を高速化・高精度化する上で重要な貢献をなすものである。以上の研究成果を基礎に、今後は、さらに、複数のマイクロチャンネル中を泳動するDNAを同時に検出できるマイクロチップ化キャピラリーアレイ電気泳動システムを開発し、多数のがん関連遺伝子の多型を同時に検出できるがんの超高速遺伝子診断システムを確立するための検討を行う。
結び目理論の数学実験による、科学教育施設での教育利用の効果について

本研究では、位相数学の研究分野の1つである「結び目」理論の、小・中学校の教育分野における有効性を検証し、初等数学としての「結び目」の教育効果を立証するための活動と位置づけた。結び目理論の数学的教具・教材の開発はまだ研究段階にあり、本研究期間内に科学館や社会教育施設や教育現場で実践授業を進めていく中で、より適した教具・教材へ進展させていくことを目的とした。具体的には、一般市民を対象とした学習者や小学生を中心とした児童に、科学的な視点をもった「結び目」教具を作成してもらい、「結び目」を空間図形としてとらえるように指導を行なった。最初に、身近な生活にある「結び目」の例を挙げ、サイエンスコミュニケーションの学習手順を通して、最後には抽象的な「数学的結び目」の概念が構築できるように実践を行なった。具体的な紐を用いた結び目を作って空間認識の一助とし、モールを使った結び目をプリンカップに入れて多面的に観察する手法をも試みた。パズル的な要素を取り入れた「結び目」の学習方法を採用することで、小学生から大人までを対象とした参加者は、楽しくかつ興味深く取り組むことができたという評価を得た。特に、自明な結び目と同値である結び目を見つける問題では、小学校高学年以上の児童において、ライデマイスター移動をヒントに試行錯誤する姿が顕著にみられた。本研究では、学校教育現場とは違って、継続した教育効果を得ることが難しく、結び目の本質を短時間で実践しなければならない科学館などの社会教育では、実物を体験する実験や工作を通して理解を図る手法を確立したといえる。
弱毒単純ヘルペスウイルスベクターの神経筋疾患治療への応用のための基礎研究

本研究では、弱毒HSVベクターの神経筋疾患の遺伝子治療への適応の可能性を明らかにすることを目的とした。そこで、β-galを組み込んだHSVベクター(βH1)の脊髄、筋組織における外来遺伝子、ウイルス遺伝子の発現様相とこれらの発現にともなう脊髄、筋機能に与える影響を検討した。さらに、βH1を用いた結果を基礎として、神経細胞の栄養因子等の遺伝子を挿入したHSVベクターの作製を試みた。その結果、以下に述べる研究実績を得た。1.脊髄、筋組織におけるβ-gal発現、活性の検討:ラットの片側腓腹筋へのβH1接種後3ヶ月目の両側脊髄前角神経細胞、両足腓腹筋にβ-gal活性、mRNAの発現が認められた。接種後10ヶ月目では、脊髄前角神経細胞でβ-gal活性、mRNAの発現が細められたが、両足腓腹筋ではmRNAの発現が検出されなかった。組織学的に異常な所見は認められなかった。2.脊髄と脊髄後根神経節でのウイルス抗原分布の比較検討:βH1をラットの右腓腹筋に接種後10ヶ月後でも両側脊髄前角神経細胞にβ-gal、β-gal mRNA,ウイルス蛋白質gC, TKとそれらのmRNAが検出できた。しかし、脊髄には感染性ウイルスが認められなかった。長期での脊髄後根神経節でのウイルス遺伝子発現が認められないことから、脊髄後根神経節とは異なる脊髄での発現様相が明らかになった。3.βH1を用いた脊髄前角細胞の機能解析:接種後7日、3ヶ月目のラット両側坐骨神経線維の電気刺激閾値、坐骨神経刺激による腓腹筋の刺激閾値にβH1接種の影響が認められなかった。4.新たな組換えウイルスの作製:βH1に種々の外来遺伝子を挿入するため、新たな組み換えHSVを作成できるカセットを作成した。現在、BDNF(神経栄養因子)をこのカセットに挿入し、新たなHSVベクターを作成している。これらの結果、脊髄、筋で外来遺伝子、ウイルス遺伝子の発現が長期間認められたにもかかわらず、神経、筋での電気生理学的機能に影響が認められなかったことよりβH1の神経、筋での発現に対する安全性が確認できた。事後、BDNFを挿入したHSVベクターを用いて外来遺伝子発現による中枢神経系機能変化を明らかにしたい。本研究では、これまで開発した弱毒HSVベクターの神経筋疾患の遺伝子治療への適応の可能性を明らかにすることを目的として、β-galを組み込んだHSVベクター(βHl)の脊髄前角神経細胞の機能に与える影響を検討する。さらに、βHlによる脊髄前角細胞機能解析実験を基礎として、神経細胞の栄養因子や成長因子等の遺伝子を挿入したHSVベクターを作製し、これら外来遺伝子の発現分布と脊髄前角神経細胞機能に与える影響をベクター単独の影響と比較検討する。これらを達成するため、本年度は以下に述べる研究実績を得た。1.新たな組換えウイルスの作製:βHlのβ-gal遺伝子を種々の外来遺伝子に置き換え、新たな組み換えHSVを作成できるカセットを作成した。現在、BDNFをこのカセットに挿入し、新たなHSVベクターを作成している。

2.脊髄、筋組織におけるβ-gal発現、活性の検討:ラットの片側腓腹筋へのβH1接種後3ヶ月目の両側脊髄前角神経細胞、両足腓腹筋にβ-gal活性が認められた。この時、β-gal mRNAの発現も同定できた。接種後10ヶ月目では、脊髄前角神経細胞でβ-gal活性、mRNAの発現が認められたが、両足腓腹筋では検出されなかった。いずれの場合にも組織学的に異常な所見は認められなかった。接種後3ヶ月目の両側の坐骨神経線維の刺激閾値、坐骨神経刺激による腓腹筋の刺激閾値は、非接種群と有意な差が認められなかった。以上のように、電気生理学的機能への神経、筋組織でのβ-gal発現の影響が認められないことから、βH1の安全性が確認できた。今後、これらの結果を基にして、種々の遺伝子の組み換えHSVベクターの遺伝子発現の影響を比較検討し、本ベクターの遺伝子治療への適応の可能性を明らかにしたい。中枢神経系で外来遺伝子であるβ-ガラクトシダーゼを長期的に発現できる弱毒HSVベクター(βH)を用いて、神経保護作用のあるBDNF(神経栄養因子)、NGF(神経成長因子)遺伝子を外来遺伝子として本ベクターに挿入し、将来の遺伝子治療への応用の可能性を検討している。今年度は、神経細胞生存に有用な外来遺伝子産物の中枢神経系機能に与える影響を検討するために、種々の外来遺伝子を容易に挿入できるカセットを作製し、このカセットにBDNF遺伝子を挿入して作製した組換えウイルスベクターの安定性を検討している。また、これと平行してこれまで解析してきたラットの腓腹筋接種モデルを用いて、中枢神経系に導入されたβHベクターのウイルス抗原の分布と感染性ウイルス粒子形成の可能性を脊髄と脊髄後根神経節で比較検討した。βHをラットの右腓腹筋に接種後10ヶ月後でも両側脊髄前角神経細胞にβ-gal活性、β-galmRNA,ウイルス蛋白質gC、TKとそれらのmRNAが検出できた。しかし、脊髄には感染性ウイルスが認められなかった。長期での脊髄後根神経節でのウイルス遺伝子発現が認められないことから、脊髄後根神経節とは異なる脊髄での発現様相が明らかになった。一方、接種後3ヶ月では両足腓腹筋にβ-gal活性が認められたが、10ヶ月後では検出できなかった。さらに、接種後7日、3ヶ月目の両側のラット坐骨神経線維の電気刺激閾値、坐骨神経刺激による腓腹筋の刺激閾値にβH1接種の影響が認められなかった。したがって、脊髄でβ-gal活性,βgal mRNAあるいはウイルスmRNA,抗原が、腓腹筋でβ-gal活性が長期に渡って認められたにもかかわらず、神経、筋での電気生理学的機能に影響が認められなかったことよりβHの神経、筋での発現に対する安全性が確認できた。今後、BDNFを挿入したHSVベクターを用いて、外来遺伝子発現、活性の分布、中枢神経系における生理学的機能の検討を行い、外来遺伝子発現による中枢神経系機能変化を明らかにしたい。
海洋フロント域の混合過程における二重拡散対流の影響

1.常磐、鹿島灘沖海域にかけて二年間にわたってCTD,XCTD,ADCP観測を行った。(1)親潮系と見られる低塩分水の広がりに対応して水温塩分の鉛直分布に顕著な逆転構造が発達した。この構造中では、低温低塩な水塊と高温高塩な水塊が鉛直方向に交互に重なり合っていることから、二重拡散対流が発達する可能性があることが示唆された。(2)観測時の鹿島沖では水温逆転は沿岸より沖合で多く見られ、弱い逆転は観測海域全域で見られたのに対し、強い逆転は北方で多く見られた。強い逆転が多く見られたのは、異なった水塊が水平方向に接し、異なった特性を持つ水塊の水平貫入が示唆される場所であった。一方、弱い逆転が見られたのは、冷水塊の下層であった。2.北海道南から、黒潮続流域までの広範囲にわたってとられたCTDデータの中立面解析を行い、キャべリングとソルトフィンガーが北太平洋中層水の変質過程に重要な役割を持つことが示唆された3.極域での深層水形成に関わる深い対流プロセスを調べるために、thermobaric効果により引き起こされる対流の物理機構を数値実験によって調べた。(1)線形近似を行った場合、安定な密度成層にも係わらず、計算開始とともに初期擾乱が発達し、plumeが発生し,その後深い対流へと発達し、thermobaric効果による対流発生が確認された。(2)(1)のケースについて、塩分拡散係数と温度拡散係数の比をτ=K_S/K_T<1.0とした結果、二重拡散がactiveな場合には対流の発達が抑えられることが示唆された。4.Lock-exchange型流れに対する二重拡散対流の影響の数値実験を、過去に行ったものから境界条件を変更させて行った。その結果、二重拡散対流による鉛直輸送により、一成分系の密度流で発生するK-H不安定が押さえられること、また、境界の形状が異なることなどを見いだした。1.常磐、鹿島灘沖海域にかけてCTD,XCTD,ADCP観測を行った。その結果(1)親潮系と見られる低塩分水が緯度経度で2×2度の領域全体で表層、中層に広がっていた。これは前年度のほぼ同時期の行われた観測で中層のみに低塩分水が見られたことと大きく様相を異にした。(2)沖合側の2測線の限られた範囲で、表層と中層の低塩分水が鉛直方向に連続した分布を示した。このことはこの領域で親潮系の水塊が沈み込み、中層で拡散している可能性を示唆するものであった。2.極域での深層水形成に関わる深い対流プロセスを調べるために、thermobaric効果(海水の熱膨張係数の圧力依存性が温度によって異なり、低温ほど大きくなること)により引き起こされる対流の物理機構を数値実験によって調べた。その結果(1)非線形近似を行った場合、安定な密度成層にも係わらず、計算開始とともに初期擾乱が発達し、4時間後にはスケールが選択されplumeが発生し深い対流へと発達し、thermobaric効果による対流発生が確認された。(2)線形近似を行った場合、初期条件の水中の密度場は不安定となり、(1)と同様にplumeの発生と急激なoverturningが起こった。(3) (1)のケースについて、塩分拡散係数と温度拡散係数の比をτ=K_S/K_T<1.0とした結果、二重拡散がactiveな場合には対流の発達が抑えられることが示された。

3.ソルトフィンガー型対流発生の数値実験可視化について、ロンドン市立大学と共同研究を行い、室内実験との整合性について協議した。この結果は現在解析中である。4. Lock-exchange型流れに対する二重拡散対流の影響の数値実験を、過去に行ったものから境界条件を変更させて行った。、その結果、二重拡散対流による鉛直輸送により、一成分系の密度流で発生するK-H不安定が押さえられること、また、境界の形状が異なることなどを見いだした。A.常磐、鹿島灘沖海域にかけて矩形(30'×30')の観測領域(16点)をもうけ、ほぼ二日において2回CTD、ADCP観測をおこなった。その結果1)観測海域全体で、全層にわたって北向きの流れが卓越しており親潮系と見られる低温低塩分水は1回目の観測では、より沿岸に近い海域の300m深付近のみで観測され、この付近でのみ1回目に南向流れが観測されたのに対して、2回目の観測では300m以深全体に広がっていた。2)この親潮系水の広がりに対応して、水温温度の鉛直分布に顕著な水温、塩分の逆転構造が発達した。この構造中では、低温低塩な水塊と高温高塩な水塊が鉛直方向に交互に重なり合っていることから、二重拡散対流が発達する可能性があることが示唆された。3)親潮系の低温低塩分水は北方より南方で、また、1回目より2回目で多く観測された。このことと、流れの場の観測から、親潮系水は沿岸7付近を南下し、強い北上流によって北向きに観測海域付近に広がった可能性があると考えられた。4)1998年のより広い海域(2度×2度)のCTDデータから水温逆転に注目し解析した。その結果4)-1観測時の鹿島沖では水温逆転は沿岸より沖合で多く見られ、弱い逆転は観測海域全域で見られたのに対し、強い逆転は北方で多く見られた。4)-2強い逆転が多く見られたのは、異なった水塊が水平方向に接し、異なった特性を持つ水塊の水平貫入が示唆される場所であった。一方弱い逆転が多く見られたのは、冷水塊の下層であった。B..北海道南方から、黒潮続流域までの広範囲にわたってとられたCTDデータを解析し、中立面解析を用いることにより、キャンベリングとソルトフィンガーが北太平洋中層水の変質過程に重要な役割を持つことが示唆された。キャンベリングとソルトフィンガーが起こりうるのは親潮系水が黒潮系水中に観入する中層域の境界付近であった。
日本語の読み書きの発達の生物学的指標の検討

本研究では、日本語話者の子どもにおける読み書き能力の習熟とその神経基盤を解明することが目的であった。かなと漢字という異なる文字体系を持つ日本語の習得、習熟は特異的である可能性があり、そのメカニズムを明らかにすることは、多様な言語の習得に関して有用な示唆が期待できる。ひらがなと漢字の読み書き能力は、個々人の習熟度の違い、つまり読み書きが得意な子と苦手な子の差が大きかった。よって、発達的変化ではなく、子どもにおけるひらがな及び漢字それぞれの読み書き能力に対応する神経基盤を検討することで、日本語の習熟に関わるメカニズムを明らかにすることを目的とした。ひらがな漢字混じりの文章の読み流暢性(早さ)、ひらがな単語の読み流暢性と、漢字の読みの正確性を検査し、それらの得点と脳の関係を検討した。読み困難児において小脳を中心とした広い範囲で白質容量が減少しており、視覚、音韻処理といった機能を協調させた試行錯誤学習が日本語の読み発達に重要であることが示唆された(20172018年に成果発表)。ひらがなの読み成績が左下前頭回と左中前頭回の機能的連絡強度と関係しており、それは文字から構音への変換の熟達がひらがなの読みに関わることを示唆した。漢字の読みは、左下頭頂皮質と左右の前頭前野との連絡強度と相関しており、視覚、音韻処理に加えて意味処理の統合と制御が関わっていることが示唆された(国際的専門誌で査読中)。これらの結果は、ひらがなと漢字の習得・習熟に異なるメカニズムが必要であり、かつ、それぞれ複数の機能が関わった複雑な処理であることを示した。2つの文字体系を習得する日本語話者の子どもは、多くの脳機能を有機的に制御することが求められており、その習熟の困難さには適切な対応、教育が必要であると考えられる。本研究では、日本語の読みと書きの習熟に伴う脳の発達的変化を明らかにする。小学1年生から6年生のひらがな、カタカナ、漢字の読みの流暢性と正確性および、書きの正確性を各学年ごとに測定し、それぞれの得点と脳構造の関係を、磁気共鳴画像法(Magnetic Resonance Imaging)を用いて明らかにすることを目的とする。当該年度は、小学1年生から6年生の70名を対象に、ひらがな、カタカナ、漢字の読みの流暢性と正確性、書きの正確性の検査を実施し、脳形態・脳活動をMRIを用いて撮像した。本研究の意義は、文字の習熟と脳の関係を検討することで、子どもの学習の基礎となる読み書き能力の詳細な発達神経基盤を明らかにするである。日本語における3種類もの文字の読み書きを習得できているメカニズムは十分に検討されていない。日本語では読み書き障害は少ないとされるが、読み書きが苦手な子の生物学的基盤が明らかになれば、新しいアプローチによる指導や学習方法を検討するきっかけとなる期待ができる。参加者の数、データの種類ともに、ほぼ計画通りに進んでいる。本研究では、小学生のひらがな、カタカナ、漢字の読み書き得点と脳構造の関係を、磁気共鳴画像法を用いて検討している。各学年20名で120名のデータ取得を目標とし、初年度は70名、本年度は最終的に50名のデータを取得した。読み書きの成績を検討した結果、ひらがな、カタナカ、漢字が入った文章における読みの流暢性と、漢字の書きの成績が最も分散が大きいことが明らかになった。他の成績は分散が小さく、脳構造との関係性に明白な傾向が期待できないため、上記の2つの成績と脳構造の関係を検討することとした。また、各学年において標準化してある読み書き検査を用いているため、発達的変化が検出されにくく、今回のデータにおいては年齢横断的な検討は難しいことが示された。一方で、その読み書き検査は読み書き障害のスクリーニングを目的としたものであるため、読み書き障害児と定型発達児を峻別する検査としては有用である。そこで、本研究において読み書きに問題がないと判断された子どもと、その検査により読み書き障害児と診断された子どもの脳構造の差異を検討する研究へ発展をさせることができた。その結果、灰白質容量に差は無いが、皮質-小脳領域の白質容量が読み書き障害児において低下していることが明らかになった。皮質-小脳領域の白質容量低下は、流暢な読みに必要な複数のスキルの獲得に関わる神経連絡の弱さを反映していると考えられた。その成果を国内学会で発表した。データ取得が少し遅れたことに加え、読み書き検査における成績の個人差が小さく、結果の解釈に時間がかかっている。解析方法等を変更して継続中であるが、計画はやや遅れている。

読み困難児において小脳を中心とした広い範囲で白質容量が減少しており、視覚、音韻処理といった機能を協調させた試行錯誤学習が日本語の読み発達に重要であることが示唆された(20172018年に成果発表)。ひらがなの読み成績が左下前頭回と左中前頭回の機能的連絡強度と関係しており、それは文字から構音への変換の熟達がひらがなの読みに関わることを示唆した。漢字の読みは、左下頭頂皮質と左右の前頭前野との連絡強度と相関しており、視覚、音韻処理に加えて意味処理の統合と制御が関わっていることが示唆された(国際的専門誌で査読中)。これらの結果は、ひらがなと漢字の習得・習熟に異なるメカニズムが必要であり、かつ、それぞれ複数の機能が関わった複雑な処理であることを示した。2つの文字体系を習得する日本語話者の子どもは、多くの脳機能を有機的に制御することが求められており、その習熟の困難さには適切な対応、教育が必要であると考えられる。前年度に引き続き、50名のデータを取得する。それらの結果をまとめて、学会及び海外の学術誌において成果を発表する。データ取得は終了しているため、データ解析を行い、成果発表を行う。被験者数が計画よりも少なかったことと、情報収集のための学会参加等に時間が取れなかったことによる。データ解析が遅れており、成果発表費用が必要である。当初の計画よりも次年度の被験者数を増やし、情報収集や成果発表を積極的に行う。
GLP-1受容体作動薬による大動脈手術時の脊髄保護効果の検討

GLP-1受容体作動薬は、脳梗塞や心筋梗塞に対する保護効果を有することが、臨床、実験レベルで報告されている。本研究は、糖尿病治療薬であるGLP-1受容体作動薬が、脊髄虚血による脊髄梗塞に対する保護効果を有するかを検討することを目的としている。ウサギを用いて、全身麻酔下に大腿動脈を露出、バルーンカテーテルを15cm中枢にすすめ、15分間バルーンを閉塞し、脊髄虚血モデルを作成する。Sham手術群、単純虚血群、GLP-1受容体作動薬投与群の3群比較により、GLP-1受容体作動薬の保護効果を検討している。GLP-1受容体作動薬としてリラグルチドを3日前から50&micro;g/kg/日皮下注する。血中濃度の動態を考慮し、投与は虚血再灌流時の3時間前に投与することとした。症状の評価としてmodified Tarlov scoreで評価したところ、虚血再灌流2日後、7日後の症状はGLP-1受容体作動薬投与群で有意に改善していた。現在、組織学的な評価で梗塞巣が縮小しているのを確認するとともに、生物学的評価により、アポトーシス関連蛋白などの出現を評価し、機序の一端を明らかにしようとしている。これまでに心筋梗塞や脳梗塞モデルで報告にあったような梗塞巣縮小効果が得られている傾向にある。組織学的な評価で梗塞巣が縮小しているのを確認するとともに、生物学的評価により、アポトーシス関連蛋白などの出現を評価し、機序の一端を明らかにしようとしている。(未使用が生じた理由)予定よりも消耗品の支出が少なく済んだため、次年度使用額が生じた。(次年度使用計画)平成30年度経費の中で383,818円の未使用分があり、これを次年度に繰り越し、平成31年(令和元年)度は合わせて1,683,818円を消耗品費を中心に使用して研究を実施する予定である。