hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵素による反応加速の分子機構ーその解析と生化学反応への応用

酵素の活性な形は天然native(E)にはなく、変性(E')に至るまでの中間体(E^*)にある、と言う思い切った仮説を設定した。すると、反応加速の分子機構は、天然酵素の立体構造が遷移して活性な形をとる、模式E【double half arrows】E^*→E'と言うことになる。そこで、加熱ならびに近赤外線照射の技法を駆使し、実験的に酵素の構造遷移を惹起して、本研究で提唱した仮説を実証しようとした。模式から、変性の速度式は、v=k'[E^*]で表され、k'は速度定数である。E'は変性した酵素で活性を持たないから、活性な形がEであるか、E^*であるかが判定できればよい。速度式を解くと、リガンド(S)共存下で、変性の速度を観測し、vが[S]に依存して減少するなら、E^*が活性な形であり、依存しないならEであると予測された。実験では、基質は触媒作用を受けるので、遷移状態アナログのグルカノラクトンをリガンドとして用いた。熱因子(60°C、pH4.5)による酵素(グルコアミラーゼ)の変性速度vを280nmの吸収を指標として観測し、S共存の効果を調べた結果、vは[S]に対し飽和曲線に乗って減少することが知られた。また△v[S]プロットから求めた、リガンドー酵素複合体の解離定数Kd(3、8mM)は既報の値と略一致した。以上から、E^*が活性な酵素の形と考えてよいことになり、実験結果が仮説に矛盾しないことが知られた。近赤外線の優れた電磁特性に着目し、照射による反応加速を試みた。まず、光源と分光器を購入し「近赤外線照射装置」を製作した。酵素α-アミラーゼとチロシナーゼについて、変性ではなく触媒活性の観測から、製作器の試験と調製を繰り返した。酵素の水解活性は加速されたが、今のところ顕著な加速効果を得る段階には至っていない。加熱に依らない反応加速には、強力な光源を用いる必要のあることが知られ、レーザの導入による照射試験と装置の改良を引き続き実施していく予定である。酵素は生の状態と変性した状態との間に中間体があって、これが酵素の活性な形である、と考え、近赤外線照射に依って、酵素は中間体へ移行する、と言う反応加速に関する仮説を立てて、以下の実験を試みた。1、先ず、酵素の構造・機能相関に関する実験資料を得た。αーアミラ-ゼの6Mユレアに依る構造変化は、二段階に生じ、一段階目は、触媒機能に関与しないことが知られた。ザイロ-スイソメラ-ゼは、NaCl濃度に依存して、4量体→2量体の転移が生じ、触媒活性と基質の取り込み能は、転移に依っても変化しなかった。シクロアミロ-スグルカノトランスフェラ-ゼの化学修飾を試み、構造と触媒機能との相関をトリプトファン残基を目印として観測できた。グルコアミラ-ゼの熱に依る構造変化を分光光度法を駆使して観測した結果、構造変化の時間経過を観測・記録・解析できることが判明した。

2、遷移状態アナログ(グルコノラクトン)の共存下で、熱に依る構造変化を観測したところ、アナログ濃度に依存して、速度は遅くなり、グルコノラクトンが構造変化を抑制することが知られた。変化速度のアナログ濃度依存性から求めた、酵素ーアナログ複合体の解離定数は3.8mMで、他の技法を用いて求めた値に略一致した。以上の結果、本研究で立てた、作業仮説は実験に矛盾するものでないことが判明した。3、本研究の経費で購入した機器及び部品を用い、波長域400ー2,500nmにわたって、近赤外光が照射できる装置を組み立てた。本装置の基本性能試験を、水、緩衝液、酵素溶液等に付いて行った。その結果、液の温度を上昇させないで、酵素試料に照射する波長を特定することが、ほぼ可能となった。今後、光ファイバ-を購入して、試料に効率よく照射できるよう装置を改良し、よりよい実験成績を得て、仮説の実証を行っていきたい。近赤外線は濃厚な溶液とか、固体試料をも透過する、極めて有為な電磁特性を持っている。本年度は、酵素の触媒活性に及ぼす照射効果を検討しようとした。光源(島津ハロゲンランプユニット)および分光器(島津スペクトロメイト)を組み合わせて近赤外線照射装置を製作した。製作器の性能試験を各種実施した処、光量は充分でないことが判明し、フィルター及びスリットを撤去するなどの調製を行った。また、可視光ならびに赤外光が検出できる機器ベータムービー及びベータマックスの部品、パーツなどを用い、近赤外線を受光できる装置を組み立てた結果、検出器として活用できる良い成績を得た。ただ、当初計画した光ファイバーは、近赤外線に専用ファイバーの製造に時間と経費を要すること、間口と出口との間で光量がかなり減少してしまうこと等の難点を考慮し、本年度内の導入を断念することとした。細菌(Bacillus)の産生するα-アミラーゼ(17μM、pH6)をセルにとり、近赤外線を照射したのち、澱粉を基質とした触媒活性をアミラーゼ自動活性測定器を用いて観測した。1,500nm、10V、20minの照射に依って、澱粉の水解は約2倍加速された。また、生体内の酸化還元作用に関与する酵素チロシナーゼ(マッシュルームからの標品)に対する照射効果を調べた。酵素溶液(0.5mg/ml)を四面石英セルにとり、反応測定装置の観測室に置き、近赤外線(1000及び700nm、14V)を照射(30min)し、または照射(60min)しながら、チロシンを基質とした触媒活性を、280nmにおける吸収を指標として経時的に観測した。照射により、チロシナーゼ反応の加速が観測された。ただ、現段階では加速効果は充分ではない。そこで、光源に大容量のレーザを導入し、分光器を改造して波長精度をあげ、水フィフターを製作して、反応加速に及ぼす近赤外線照射の効果を格段に高める試験・研究に、引き続き取り組んでいく。
蛋白質ダイナミクスのin-cell NMR解析

蛋白質中のジスルフィド(SS)結合の安定性(酸化還元電位)は、SS結合の溶媒露出度に加えてシステイン残基周囲の構造揺らぎに依存する。また、環境の還元電位やpHに依存するため、細胞の状態によってダイナミックに変動する。一般に、細胞内の還元電位はグルタチオンの濃度で決まるとされるが、活性酸素種の影響も受ける。加えて、細胞内環境自体が蛋白質の構造や揺らぎに影響を及ぼすことから、細胞内におけるSS結合の状態は試験管内の知見から簡単には予測できない。本課題では、NMRを利用して、細胞内でSS結合がどの程度還元され、SH型になっているかを調べ、細胞状態や蛋白質機能との関連を調べる方法の構築を目指し、モデル蛋白として、Csk SH2ドメインを用い、これを電気穿孔法で細胞に導入しNMR測定を行うことを試みた。昨年度までに、15N標識したSH2試料の調製方法の確立は完了していたが、電気穿孔法によって細胞に導入できるSH2ドメインの量が不十分であったため、今年度も引き続きその検討を行った。SH2の代わりに、蛍光を使った検出が容易なGFPを用いて、電気パルスの長さやタイミング、印加電圧を様々に変えて電気穿孔を行ない、GPFの導入効率を検討した。さらに、GFPが最も効率良く導入できた条件の近傍で、SH2の導入条件の検討を行った。これにより、SH2ドメインのNMRスペクトル(2D 1H-15N HMQC)を得ることに成功した。しかし、定量的な解析を行うにはNMR信号の強度が十分ではなく、細胞内でSS結合が還元されていく速度や、還元電位を精確に求めるには至らなかった。アミド水素のスピン緩和時間を長くするために、それら以外を重水素化した試料を用いるなど、さらなる検討が必要であると考えられた。28年度が最終年度であるため、記入しない。また、環境の還元電位やpHに依存するため、細胞内の状態によってダイナミックに変動する。本課題では、NMRを使ってこの細胞内SS結合の安定性を評価する方法の構築を目指した。モデルとして、Csk(C-terminal Src kinase)のSH2ドメインを用いた。CskはSH2ドメイン中にジスルフィド(SS)結合を有するが、これが還元的に切断されるとCskのキナーゼ活性が10倍ほど上昇する事が知られている。細胞質は還元的ではあるものの、グルタチオン濃度が0.510mM程度である。一方、Csk SH2のSSは、50 mM DTTという極めて強い還元条件下でも、半分程度しか還元されないため、細胞中でCsk SH2のSSは切断されずに残ると予想される。本年度は、まず、大腸菌を用いた15N標識SH2の発現と精製を行った。引き続き、その細胞内導入条件の検討を行った。細胞へのタンパク質導入は電気穿孔法を用いることとし、その電気パルスの条件(パルス長、印加電圧、回数など)を変えて、導入されるタンパク質の量を評価した。電気パルスの条件(パルス長、印加電圧、回数など)を変えて、導入されるタンパク質の量を評価したが、高感度にNMR測定を行うためには導入量が十分ではないため。引き続き電気パルスの条件を検討する。

また、細胞の培養条件や株を変更することで、タンパク質の導入効率を向上させることを検討する。さらには、NMR測定に供する細胞の数を増やすことで良好なNMR信号を得ることを目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。
G蛋白質βγサブユニットの機能解析と創薬への利用技術の開発

G蛋白質共役型受容体(GPCR)刺激によってG蛋白質は活性化され,αとβγサブユニット(Gβγ)とに解離するが、αサブユニットに加えて、Gβγもいくつかのエフェクター分子の活性を直接制御することが見出されている。本研究では、Gβγが種々の効果器の活性を調節する分子機構について解析するとともに,110-kDaβ触媒(p110β)/85-kDa調節(p85)サブユニットからなる2量体型イノシトールリン脂質3-キナーゼ(PI3K)について解析し,以下の知見を得た。1.Gβγによる2型アデニル酸シクラーゼの活性化において、Gβはその第1WDモチーフを中心として相互作用することが,一方,酵母のtwo-hybrid系による解析から、Raf-1キナーゼはGβの第3及び第6WDモチーフと相互作用する可能性を見出された。2.p110β/p85-PI3Kは,Gβγとリン酸化チロシンを含むペプチドによって相乗的に活性化された。3.構成的に活性化型のp110β-PI3Kと相互作用する分子を酵母のtwo-hybrid系を用いて検索し,低分子量GTPaseファミリーのRab5を同定した。4.Ser/ThrキナーゼのAkt(PKB)は,PI3Kの産物であるPIP3により活性化されるが,インスリン刺激に応答するAktの活性化は,活性化型Rab5の遺伝子導入で増強され,不活性化型Rab5により抑制された。5.活性化型Rab5の相互作用分子をtwo-hybrid系を用いて検索し,SH2ドメインをもつ新規分子群を同定した。エフェクターとしての役割が期待されるこの新規Rab5結合蛋白質群は,初期エンドソームに局在化することが示された。6.リンパ球細胞において,Fcγ受容体でチロシンリン酸化されるPI3Kのアダプター分子として,Gab2を同定した。このアダプターはGPCRである化学遊走因子受容体の刺激によりそのセリン/スレオニン残基がリン酸化されるというユニークな挙動を示した。細胞膜受容体刺激によってG蛋白質はαサブユニットとβγサブユニットとに解離するが、αサブユニットに加えて、近年βγサブユニット(Gβγ)もいくつかのエフェクター分子の活性を直接制御することが見出されてきた。Gβには約40アミノ酸単位からなるWDモチーフと呼ばれる配列が7回繰り返して存在するが、最近のX線構造解析から、GβはWDモチーフの1つがプロペラの羽根の部分を形成し、全体として7枚羽根のβプロペラ一様構造をとるように配置されていることが示された。本研究では、Gβγが、種々の効果器の活性を調節する分子機構について解析し、以下の知見を得た。1、チロシンリン酸化を引き起こすインスリンとG_i-共役型受容体のアゴニストである化学走化性因子fMLPの両者で好中球細胞を刺激すると、相乗的なイノシトールリン脂質3-キナーゼ(PI3K)の活性化が観察された。2、チロシンリン酸化ペプチドとG-βγによって相乗的に活性化されるPI3Kとして、110-kDaβ-触媒/85-kDa調節サブユニット2量体を同定し、Gβγが110-kDaβ-触媒サブユニットに作用することを見出した。3、G_S-

α存在下のGβγによる2型アデニル酸シクラーゼの活性化において、Gβはその第1WDモチーフを中心として相互作用することが示された。4、酵母のtwo-hybrid系を用いた解析から、Raf-1キナーゼはGβのC末端側の第6WDモチーフ及び第3WDモチーフと相互作用する可能性が見出された。すなわち、Gβγ-効果器間の結合においては、Gβの7つのWDモチーフがエフェクターの種類によって使い分けられていることが見出された。細胞膜受容体刺激によってG蛋白質は活性化され,αとβγサブユニットとに解離するが,αに加えて,βγ(Gβγ)もいくつかのエフェクター分子の活性を直接制御することが見出されている。我々は先に,チロシンキナーゼ系とGβγによって相乗的に活性化されるイノシトールリン脂質3-キナーゼ(PI3K)として,110-kDaβ触媒(p110β)/85-kDa調節(p85)サブユニットからなる2量体型PI3Kを同定したが,平成11年度は,この分子種のPI3Kを中心にさらに解析を進め,以下の知見を得た。1.構成的に活性化型のp110β-PI3Kと相互作用する分子を酵母のtwo-hybrid系を用いて検索し,低分子量GTPaseファミリーのRab5を同定した。2.Ser/ThrキナーゼのAkt (PKB)は,PI3Kの産物であるPIP3により活性化されるが,インスリン刺激に応答するAktの活性化は,活性化型Rab5の遺伝子導入で増強され,不活性化型Rab5の介在が初めて示された。3.活性化型Rab5の相互作用分子をtwo-hybrid系を用いて検索し,SH2ドメインをもつ新規分子群を同定した。4.エフェクターとしての役割が期待される新規Rab5結合蛋白質群は,初期エンドソームに局在化することが示された。5.リンパ球細胞において,Fcγ受容体刺激でチロシンリン酸化されるPI3Kのアダプター分子として,癌遺伝子産物p120^<c-cb1>と100-kDa蛋白質を同定した。100-kDa蛋白質は,G蛋白質共役型受容体刺激によりそのセリン/スレオニン残基がリン酸化されるというユニークな挙動を示し,Gab2であることを見出した。
GISを用いた地理情報の伝達とナヴィゲーションの支援に関する研究

本研究課題で得られた成果は,以下のようにまとめられる。(1)空間認知研究とGIS研究との接点で浮上してくる理論的・応用的諸問題を4つに大別し、既往の研究成果と今後の展望について考察した。(2)方向感覚質問紙(SDQ-S)を基にナヴィゲーション・スキルを測定する方法を検討し、経路探索をはじめとする空間的課題遂行との関連性が明らかになった。(3)熟知した環境の空間情報伝達を道案内図と道案内文を用いて比較したところ、選択地点の記述における相違が顕著にみられた。(4)中等教育におけるGISの導入可能性を探るために、学校教育向けGISソフトと地形図を中学校の授業で使用し、各々の学習効果が異なることが判明した。(5)大量の地理情報を効率的に可視化するシステムを開発し、渋谷周辺の飲食店を事例にしてその効果を検討した。(6)主題図の表現で多用されてきたコロプレス図の分級法について、最適化という観点から整理し直した。(7)道案内図を用いた所在地の同定とナヴィゲーションの成立条件に関する実験を行い地図の情報と表現ならびに個人の空間的能力の影響を明らかにした。(8)名古屋市内で行った現地調査に基づいて、路上の障害物を記録した道路ネットワーク・データを整備し、GISを用いた車椅子利用者向け経路案内システムを試作した。(9)GISを用いて視覚障害者向けの経路選択を支援する地図を作成するために、大阪市を事例として歩きやすさの観点から歩行環境を得点化し、障害者による評価と比較した本研究課題で得られた成果は,以下のようにまとめられる。(9)GISを用いて視覚障害者向けの経路選択を支援する地図を作成するために、大阪市を事例として歩きやすさの観点から歩行環境を得点化し、障害者による評価と比較した本研究課題を構成する2つのテーマについて、今年度に得られた成果は、以下の通りである。1.GISを用いた地理情報の伝達過程(1)道案内図を用いた所在地の同定とナヴィゲーションの成立条件に関する実験を行った結果,空間的能力の高い者ほど少ない情報から所在地を推理でき,道案内図による認知地図形成とナヴィゲーションの遂行には,空間的能力の個人差が関係していることが明らかになった。(2)細密数値情報からメッシュ単位での土地利用図を作成し、空間単位の集計化やデータの平滑化が土地利用パターンの表現に与える影響を検討した。この結果を基にして、次年度は主題図の表現によって伝達される情報がどのように異なるかを詳しく分析する予定である。このほか、地図利用能力の性差、障害児に対する地図指導の方法、初等教育におけるGISの導入可能性、地理情報伝達の異文化比較などについての検討も行い、とりまとめ作業が進行中である。2.GISによるナヴィゲーションの支援(1)GISを用いて障害者向け経路案内システムを作成するために、名古屋市今池地区で現地調査を行い、路上の障害物を記録した道路ネットワーク・データを整備中である。(2)多次元GISを応用したVET(ヴァーチャル環境技術)のもとでの空間学習とナヴィゲーションの遂行に関する実験を行ったところ、被験者が用いる方略によって学習結果やナヴィゲーションの遂行に差がみられることが明らかになった。以上の作業は、いずれも引き続きデータ解析ととりまとめを行っており、研究成果を学会誌等に発表する準備を進めている。本研究課題を構成する2つのテーマについて、今年度に得られた成果は、以下の通りである。1.GISを用いた地理情報の伝達(1)大量の地理情報を効率的に伝達するための可視化システムを開発し、渋谷周辺の飲食店を事例にしてその効果を検討した。(2)コロプレス図の分級法に関する新しい最適化手法を考案し、その効果を検討した。(3)中等教育におけるGISの導入可能性を探るために、学校教育向けGISソフトと地形図を中学生に使用させて比較する授業を行った。その結果、地図利用の初心者にはGISは効果的だが、上級者にとっては地形図の方が使用しやすいことがわかった。(4)大学生の地図利用実態調査を行い、デジタル地図を含めた各種地図の利用パターンとその個人差の規定因について統計解析を行った。

その結果、利用パターンに基づくと各種地図は「案内地図」「汎用地図」「デジタル地図」に分けられ、それらの利用は地図の好き嫌い、方向感覚、PCの使用などに応じて異なることがわかった。2.GISによるナヴィゲーションの支援(1)名古屋市今池地区で行った現地調査に基づいて、路上の障害物を記録した道路ネットワーク・データを整備し、GISを用いた障害者向け経路案内システムを試作した。(2)GISを応用したヴァーチャル環境のもとでの空間学習とナヴィゲーションの遂行に関する実験を行った。その結果、空間学習に用いられる方略によって、ナヴィゲーションの遂行や適した道案内図のスタイルに差がみられることが明らかになった。(3)道案内図と道案内文を用いて地理情報の伝達効果を比較した。これらの研究成果を公開するために、15年3月末に開催される日本地理学会春季学術大会で「GISのよる新しい地理情報伝達と空間行動支援の可能性」と題したシンポジウムを開催する準備を進めている。
自家蛍光観察システムを用いた新しい術中心筋モニターの開発

FDA蛍光とNADH蛍光の強度は血液などによる蛍光吸収の不均一性の影響を受けるが、同じ蛍光波長の強度比(FAD/NADH)は不均一性の影響を受けにくい事を新たに確認することに成功した。さらに本研究では、自家蛍光強度比(FAD/NADH)を求め、血液などによる蛍光吸収の不均一性が補正し、リアルタイム画像処理の撮影に成功した。また、二波長励起光源の照明のムラや撮像フレーム条件などの開発システムの基本性能ついて評価を行い、これまでの実験で、UVライトと発光ダイオードの50/秒の切り替えで心筋障害部位の観察出来ることが明らかとなってきた。これまで数ミリであった可視範囲を、ラット心臓程度までは可能とした。リアルタイム自家蛍光強度比(FAD/NADH)演算部の試作および基礎実験交互に得られる二つの蛍光画像の比(FAD/NADH)をリアルタイムに算定し、心筋代謝機能イメージングを実現した。二種類の励起によって得られる蛍光波長は緑色帯域であるために血中ヘモグロビンによる吸収を受けやすい。そのため、観測できる蛍光強度は血管の分布の状況、血管内血液量の変化の影響を受けることが想定できる。本研究では、FDA蛍光とNADH蛍光の強度は血液などによる蛍光吸収の不均一性の影響を受けるが、同じ蛍光波長の強度比(FAD/NADH)は不均一性の影響を受けにくいことを明らかとした。そのため、これまでに得られた予備実験のデータを基に、FAD/NADHのコンピューターによる演算部を試作した。模擬実験として、ラット心臓に対して、UVライトと発光ダイオードの50/秒の切り替えで、障害心筋の観察出来ることが明らかとなってきた。現在、種々のアシグルにより模擬実験を行い二波長励起光源の照明のムラや撮像フレーム条件などの開発システムの基本性能について評価実験を行っている。その後、犬の心モデルの模擬実験に移行し、撮影条件の設定を行う予定である。そのため、これまでに得られた予備実験のデータを基に、FAD/NADHのコンピューターによる演算部を試作してきた。現在、種々のアングルにより模擬実験を行い二波長励起光源の照明のムラや撮像フレーム条件などの開発システムの基本性能について評価実験を行っている。今後、犬の心モデルの模擬実験に移行し、撮影条件の設定を行う予定である。開心術中に冠循環、心筋redox、さらには心筋エネルギー代謝の状態が無侵襲でかつvisualにリアルタイムに評価できれば、より早く問題点を検出し、迅速な対応が可能となり、手術リスクの軽減と成績向上が見込まれる。我々のグループは、NADH蛍光観測システムを開発し、臨床応用に向けて長年研究を続け、従来困難とされてきたlnvivOの計測にも成功した。今回、このシステムを発展させ、より鋭敏で鮮明なイメージが得られるようにNADH・FAD蛍光観測システムを改良し、心臓機能の評価法としての可能性を動物実験で評価した。これまでの研究で、二種類の励起によって得られる蛍光波長は緑色帯域であるために血中ヘモグロビンによる吸収を受け易く、そのため、観測できる蛍光強度は血管の分布の状況、血管内血液量の変化の影響を受け、得られた画像が心筋障害を適切に反映していないことが判明した。また、二波長励起光源の照明のムラや撮像フレーム条件などの開発システムの基本性能のついて、これまで評価を行ってきた。これまでの実験で、UVライトと発光ダイオードの50/秒の切り替えで観察出来ることが明らかとなってきた。これまで数ミリであった可視範囲を、ラット心臓程度までは可能とした意義は大きい
Ｔｏｌｌ様受容体を介した肝特異的転移前微小環境の構築

がんが転移する場合には、あらかじめ転移先臓器に、転移前微小環境を形成する可能性が示唆されている。大腸がんの場合には、主に肝臓優位に転移することが知られているが、分子機序は不明である。肝臓特異的な転移前微小環境形成の分子機序を解明するために、担癌マウスの転移前フェーズにおける肝臓から抽出したRNAを用いてマイクロアレイ解析を行った。顕著に発現が上昇する遺伝子群の中から、ケモカイン様タンパク質に注目し、TLR依存性の転移前肝微小環境の形成について解析を行った。本研究は、大腸癌が転移する前の段階で、肝臓に形成されるToll様受容体を介した炎症惹起による微小環境構築の分子機序を解明し、転移性癌予防や転移性癌治療法の開発のための分子標的を提案することを目的とする。この目的のために、前年度では、同所移植担癌マウスの転移前肝臓から抽出したRNAを用いたDNAマイクロアレイ解析により、発現が顕著に上昇したケモカイン様タンパク質に着目し、ケモカイン様タンパク質による肝転移促進能と検証した。精製リコンビナントタンパク質をマウスに連日投与した後、蛍光標識マウス大腸癌細胞を移植すると、肝臓への転移が亢進することを見いだした。本年度は、前年度の実験結果をふまえ、以下の実験結果を得た。候補因子であるケモカイン様タンパク質に対するレセプター欠失マウスにマウス大腸癌細胞を移植すると野生型マウスに比べ、生存率が改善する可能性を示唆した。また、転移前微小環境の臓器間特異性について検証するために、肺における制御因子である血清アミロイドA3 (SAA3)によるToll様受容体4(TLR4)/MD-2活性化の分子機序について解析を行い、SAA3のTLR4/MD-2活性化には、MD-2が必須であり、SAA3(43-57)が結合に関与していることを見いだした。また、SAA3 (43-57)ペプチドをマウスに尾静脈経由で投与すると、肺におけるCD11bGr1陽性細胞の集簇が亢進することを示唆した。本研究では、大腸癌が肝転移を誘導する前段階で、転移を促進する転移前微小環境が肝臓に形成されていると考え、転移前肝臓内微小環境形成に関わる因子を探索するために、担癌マウスの転移前フェーズでの肝臓RNAを用いて、DNAマイクロアレイ解析を行った。その結果、発現が顕著に変化した遺伝子群には、ケモカイン様タンパク質を含め、炎症に関わる因子が多く含まれており、癌細胞が肝臓に生着する以前の段階で、炎症反応を伴った微小環境の形成が示唆された。まず、転移前微小環境形成に関わる候補因子の中で、ケモカイン様タンパク質に注目し、リコンビナントタンパク質の精製を行った。リコンビナントタンパク質を腹腔内に投与し、一週間後に門脈経由にて大腸癌を移植したところ、肝臓への大腸癌の生着が優位に認められた。一方、肺への癌細胞の生着はケモカイン様タンパク質の投与の有無により影響を受けなかった。よって、本ケモカイン様タンパク質の上昇が肝転移を促進する可能性を示唆した。さらに、ケモカイン様タンパク質をブロックすることにより肝転移を抑制できるかを検討することとした。ケモカイン様タンパク質に対する市販の抗体には、中和活性を保有していなかったため、リコンビナントタンパク質を精製後、ポリクローナル抗体を作成した。作成した抗体のうち、in vitroでの活性を濃度依存的に抑制する抗体を得ることができた。来年度は本抗体を担癌マウスに注入し、肝転移への影響を検討することを予定している。本研究は、大腸がん同所移植肝転移マウスモデルを用いて、転移する前の段階において、肝臓で形成されるToll様受容体を介した炎症惹起による微小環境構築の分子機序を解明し、転移性がん予防や治療法の開発のための分子標的を提案することを目的とする。前年度までに、マウス大腸がん同所移植担がんマウスの転移前肝臓から抽出したRNAを用いたDNAマイクロアレイ解析を行い、発現が顕著に上昇したケモカイン様タンパク質を転移前肝微小環境形成における候補因子とした。さらに、高純度精製ケモカイン様タンパク質投与により、肝臓への転移が亢進することを見いだした。本年度は、前年度までの実験結果をもとに、以下の実験結果を得た。1. Toll様受容体依存性NF-κBレポーター細胞をケモカイン様タンパク質にて刺激すると、ケモカイン様タンパク質はToll様受容体依存性のNF-κB活性を上昇させたことから、内因性リガンドになり得ることが示唆された。また、ケモカイン様タンパク質に対するToll様受容体欠失マウスでは、マウス大腸がん細胞を移植すると野生型マウスに比べ、生存率が改善したことから、ケモカイン様タンパク質はToll様受容体を介してがんの増悪化に関与していることが示唆された。

2.転移前微小環境の違いによる転移先決定能を検証するため、前年度に解析を行った、転移前肺微小環境に関わる血清アミロイドA3 (SAA3)に追加して、S100A8によるToll様受容体4(TLR4)/MD-2活性化の分子機序について解析を行い、結合部位を同定した。以上、本研究により、転移前肝臓に形成される微小環境を制御する候補因子として注目したケモカイン様タンパク質がToll様受容体を介して肝転移を促進する可能性を示唆した。腫瘍生物学本研究は、大腸癌が転移する前の段階で、肝臓に形成されるToll様受容体を介した炎症惹起による微小環境構築の分子機序を解明し、転移性癌予防や転移性癌治療法に対する分子標的を提案することを目的としており、候補因子ケモカイン様タンパク質投与実験や、レセプターノックアウトマウスの解析により、本ケモカイン様タンパク質が肝転移を亢進する可能性を見いだしている。また、転移前肺微小環境に関わるSAA3のTLR4/MD-2に対する結合領域を特定することができ、来年度解析を予定している臓器決定能の解析に新たな知見を得ることができたと考えられる。本研究の目的は肝特異的な微小環境形成に関わる候補因子を特定し、将来的に転移癌に対する分子標的を決定づけることにある。現在までに、肝転移微小環境形成に関わる候補因子の一つとして、ケモカイン様タンパク質に注目し、リコンビナントタンパク質を用いた実験により、転移前肝臓において、ケモカイン様タンパク質による転移を促進する微小環境の存在を示唆できた。さらに、ケモカイン様タンパク質に対する中和抗体を作成することができ、次年度での解析が望まれる。並行して、肺転移前微小環境形成に関わる因子Serum amyloid A3(SAA3)によるTLR4/MD-2活性化の分子機序について、SAA3がMD-2に直接結合することを見いだした。肺を転移先として決定する分子機序について新たな知見を得ることができた。来年度以降、転移先臓器決定性の解析に有用な知見と考えられる。1.肝転移前微小環境形成による肝転移促進の分子機序前年度までに、候補因子ケモカイン様タンパク質が肝転移を促進する可能性を見いだしている。候補因子ケモカイン様タンパク質による転移能の亢進が臓器特異的であるかを、入手可能なマウス癌細胞を用いてさらに検証する。候補因子の肝臓特異性が得られた場合には、転移前肝微小環境に存在する間質細胞や集簇した免疫担当細胞について、特異的な抗体を用いて免疫組織学的またはフローサイトメトリーにより解析を行う。2.初代培養肝細胞を用いたin vitro微小環境による解析マウス正常肝臓からコラゲナーゼ還流とPercoll密度勾配遠心分離、CD146マイクロビーズやCD11bマイクロビーズを用いることにより、肝細胞と類洞内皮細胞、未分化骨髄球を単離する。単離した初代培養細胞を用いて、肝細胞シート、類洞内皮細胞シートを積層化することにより、in vitroにおいて肝臓内微小環境を構築させる。構築したin vitro肝臓内微小環境内に精製した候因子を添加した際の微小環境の構造学的もしくは分子レベルの変化を、基底膜特異的マーカーを用いて免疫組織学的手法にて染色を行い、共焦点顕微鏡により検証する。1.ケモカイン様タンパク質による肝転移促進能の解析平成24年度に作成したケモカイン様タンパク質に対する中和抗体を担癌マウスに注入し、転移巣の数、大きさ、病理像を調べる。同時に、解析の際に、マウス肺の採材も行い、同様の解析を行う。
頭頸部扁平上皮癌におけるJunBおよびAP-1遺伝子群の転移機構の解明

1)AP-1遺伝子群に発現調整される遠隔転移の制御に関わる候補タンパクの同定当研究室が所有する頭頚部扁平上皮癌細胞株のうち,既報で述べた肺転移高形成細胞株に対しJunBおよびFosL1を標的とするsiRNAを導入しJunBおよびFosL1をノックダウンした細胞を作成,それらを用いてプロテオーム解析を行った.scramble siRNAを導入した細胞をコントロールとし,タンパク発現量を比較,発現変動の解析を行った.その結果から,HMGA1をAP-1遺伝子群に発現調整される遠隔転移の制御に関わる候補タンパクとした.2)AP-1遺伝子群に発現調整される遠隔転移関連因子の同定と,その機能解析HMGA1をターゲットとするsiRNAを頭頚部扁平上皮癌細胞株に導入し,HMGA1の発現抑制による機能解析を行った.複数の頭頚部扁平上皮癌細胞株を用いて,scratch assayを行い,HMGA1発現抑制により細胞株の遊走能の低下を認めた.その後,安定的HMGA1発現抑制細胞株の作成に取り組んでいるが,作成することができず,それ以降の機能解析が行えていない.並行してFOSL1についても検討した.肺転移,頸部リンパ節転移高形成細胞株を用いて,siRNA FOSL1による発現抑制を検討したところ,細胞株の遊走能の低下を認めた.そこで,shRNAによるFOSL1の安定発現抑制細胞株を作成し,その先の検討を行っている.1)AP-1遺伝子群に発現調整される遠隔転移の制御に関わる候補タンパクの同定当研究室が所有する頭頸部扁平上皮癌細胞株のうち,既報で述べた肺転移高形成細胞株に対しJunBおよびFosL1を標的とするsiRNAを導入しJunBおよびFosL1ノックダウン細胞を作成,それらを用いてプロテオーム解析を行った。RNAi効果がでない配列を導入した細胞をコントロールとしタンパク質発現量を比較し発現変動の解析を行った。その結果から我々は、HMGA1をAP-1遺伝子群に発現調整される遠隔転移の制御に関わる候補とした。2)AP-1遺伝子群に発現調整される遠隔転移関連因子の同定と,その機能解析HMGA1をターゲットとするsiRNAを頭頸部扁平上皮癌細胞株に導入し、RT-PCRでmRNAの発現低下およびWestern BlottingでHMGA1タンパク質の発現が低下していることを確認し機能解析を行った。複数の頭頸部扁平上皮癌細胞株を用いてinvasion assayを実施、遊走能の低下を認めた。申請書に記載した計画のとおり候補遺伝子を同定し、機能解析で有意な差を得られた。しかし予定していたinvasion assayしか実施できていないため、migration assay含めた細胞機能解析を可及的に実施したい。1)AP-1遺伝子群に発現調整される遠隔転移の制御に関わる候補タンパクの同定当研究室が所有する頭頚部扁平上皮癌細胞株のうち,既報で述べた肺転移高形成細胞株に対しJunBおよびFosL1を標的とするsiRNAを導入しJunBおよびFosL1をノックダウンした細胞を作成,それらを用いてプロテオーム解析を行った.scramble siRNAを導入した細胞をコントロールとし,タンパク発現量を比較,発現変動の解析を行った.その結果から,HMGA1をAP-1遺伝子群に発現調整される遠隔転移の制御に関わる候補タンパクとした.2)AP-1遺伝子群に発現調整される遠隔転移関連因子の同定と,その機能解析HMGA1をターゲットとするsiRNAを頭頚部扁平上皮癌細胞株に導入し,HMGA1の発現抑制による機能解析を行った.複数の頭頚部扁平上皮癌細胞株を用いて,scratch assayを行い,HMGA1発現抑制により細胞株の遊走能の低下を認めた.その後,安定的HMGA1発現抑制細胞株の作成に取り組んでいるが,作成することができず,それ以降の機能解析が行えていない.並行してFOSL1についても検討した.肺転移,頸部リンパ節転移高形成細胞株を用いて,siRNA FOSL1による発現抑制を検討したところ,細胞株の遊走能の低下を認めた.そこで,shRNAによるFOSL1の安定発現抑制細胞株を作成し,その先の検討を行っている.昨年度末からCRISPR/cas9システムを用いてHMGA1を安定的ノックアウトした頭頸部扁平上皮癌細胞株を作成に取り組んでいるが、未だ作成に至っていない。ベクターの配列が最適ではない、標的遺伝子が細胞生存において重要な役割を果たしている、など様々な要因が考えられる。ベクターの変更や導入するRNAiの配列を変更あるいはその他実験手法の変更を検討しつつ、HMGA1以外の候補遺伝子の実験も並行して実施していく。候補遺伝子の安定的ノックアウトした頭頸部扁平上皮癌細胞株が作成でき次第、invasion assayならびにmigration assayによる遊走能および浸潤能の評価をおこなう。ワイルドタイプと比べていずれの能力とも低下が認めれた場合、作成した細胞株をマウスに投与し頸部リンパ節転移および遠隔転移において有意差が得られるか検討する。さらに臨床検体におけるAP-1遺伝子群および,同定した遠隔転移関連因子のタンパク発現検証の実験を実施する。当初購入を予定していた試薬やキットが想定より安価に購入することができたこと、予定していた実験migration assayを完遂することができなかったため次年度使用額が生じた。今年度は昨年度実施できなかった実験を行い、かつ他の候補遺伝子の検証実験に使用する計画である。
極端環境下における元素合成過程の解明

4He(アルファ粒子)が2つのアルファ粒子を逐次捕獲して12Cを合成するトリプルアルファ反応は、宇宙における元素合成過程において最も重要な反応のひとつである。しかし、高温あるいは高密度な極端環境下におけるトリプルアルファ反応率には、既知の値に比べ数倍から100倍も増大する可能性が指摘されており、大きな問題となっていた。本申請課題では、・逆運動学条件下における12Cからのアルファ非弾性散乱の測定・新しいアクティブ標的を用いた12Cからの中性子非弾性散乱の測定により、極端環境下におけるトリプルアルファ反応率を決定し、宇宙における元素合成過程を明らかにすることを目指す。
海洋島における外来生物の侵略性：植物の栄養利用特性と生態系の土壌特性との相互作用

本研究は「外来生物の侵略性は、その種の生物学的な形質と侵入先の生態系の特徴との相互作用によって決まる」という仮説を検証する。海洋島(大陸と陸続きになったことがない島)である小笠原諸島に侵入した侵略的外来植物(モクマオウ、ギンネム、アカギ)において、前2種は甚大な生態系影響をもたらしているのに対し、アカギは母島以外では著しい侵略性を示さない。これは、現状のリスク評価法では現実の侵略性の程度を適正に評価できないことを示唆する。これら3種の比較を通し、これまでのリスク評価で見逃されてきた外来生物の侵略性を決める要因を明らかにするとともに、侵略性のリスクを評価するための新しい手法を開発する。
骨髄線維症発症における血小板由来の増殖因子PDGF、TGF-βの役割

ヒト骨髄線維症の成立には骨髄巨核球や、白血病細胞由来のPDGF,TGF-βが関与する可能性が示唆されているが、本研究はPDGFとTGF-βの本症成立に果たす役割を解析し、広く臓器線維症の発症機構の解明に役立てることを目的とした。まず、慢性骨髄性白血病(CML)の急性転化例にみられる骨髄線維化と白血病細胞中のPDGF発現との関係について検討した。CML急性転化で骨髄線維化にみられた症例より樹立された細胞株をTPA処理することにより、PDGF-A鎖とB鎖及びTGF-βmRNAの発現を認め、PDGF-ABへテロダイマーが分泌されることを明らかにした。さらに、実際の骨髄線維化を伴った骨髄性急性転化の症例ではPDGF-A鎖、B鎖の両者のmRNA発現と培養液中へのPDGF分泌を認め、線維化を伴わなかった症例ではA鎖mRNAのみ認めPDGF分泌は認めなかったことから、白血病細胞におけるPDGF-B鎖の遺伝子発現が骨髄線維化に重要であることを示した。次に、ヒト骨髄線維芽細胞の増殖にはオートクリン機構が関与することを見出し、本増殖に関与する因子は非耐熱性、酸に安定な分子量約100×10^4の蛋白であり、PDGFやIL-1,TNFなどとは異なることを明らかにした。ヒト骨髄線維症の発症に骨髄巨核球や白血病細胞由来のPDGF,TGFーβが果たす役割を解析し、次のような結果を得た。1)ヒト巨核球性白血病細胞株におけるPDGFの遺伝子発現と蛋白生合成分泌過程を明らかにした。すなわち、本細胞株をTPAにて分化誘導することにより、PDGFーA鎖とB鎖のmRNAが発現され、PDGFーA鎖とB鎖からなるヘテロダイマ-が合成、分泌されることを示した。本細胞株においてPDGFが細胞外に分泌されることは、骨髄線維症患者において、骨髄中で腫瘍性巨核球からもPDGFが細胞外に分泌される可能性を示唆しており、骨髄線維症のモデルとなりうると考えられる。2)ヒト骨髄線維芽細胞の増殖にはオ-トクリン機構も関与していることを示した。すなわち、ヒト骨髄線維芽細胞の培養上清中には、線維芽細胞コロニ-及び継代線維芽細胞の増殖を促進する活性が認められたため、その性状を検討したところ、本増殖に関与する因子は非耐熱性、酸に安定な分子量約100×10^4の蛋白であることが明らかとなった。抗体を使った結果より、本因子は現在知られている線維芽細胞増殖因子及びその結合蛋白との複合体のうちPDGF,ILー1,TNFなどとは異なっていた。分子量から細胞外マトリックスを構成する蛋白あるいはプロテオグリカン等の可能性が考えられる。3)骨髄線維化の認められる患者の骨髄生検材料より巨核球あるいは白血病細胞上のPDGFとTGFーβ及び骨髄線維芽細胞上のPDGFとTGFーβレセプタ-をそれぞれmRNAレベルと蛋白レベルで検出する条件の検討を行った。CML急性転化で骨髄線維化にみられた症例より樹立された細胞株をTPA処理することにより、PDGF-A鎖とB鎖及びTGF-βmRNAの発現を認め、PDGF-ABヘテロダイマーが分泌されることを明らかにした。

次に、ヒト骨髄線維芽細胞の増殖にはオートクリン機構が関与することを見出し、本増殖に関与する因子は非耐熱性、酸に安定な分子量約100×10^4の蛋白であり、PGDFやIL-1,TNFなどとは異なることを明らかにした。
AM菌とフィチン分解菌のインタラクションによる新しいフィチン分解メカニズムの探索

フィチン酸(IHP)は土壌中の有機態リンの主要な形態の一つであり,IHP分解は植物-土壌圏でのリン循環において重要な役割を果たすと考えられる。アーバスキュラー菌根(AM)菌は土壌から無機態リンを吸収するが,IHPを分解して無機態リンを取り出すことができない。近年,AM菌がIHP分解菌の関与によりIHP由来リンを吸収することが示されたが,どのような細菌が関与しているかは明らかになっていなかった。本研究では,アルギン酸ビーズを用いた改変釣り餌法により,AM菌菌糸圏のIHP周辺で優占するIHP分解菌の分離に成功した。これらの株はAM菌を介したIHP由来リンの吸収に関与すると考えられた。アーバスキュラー菌根(AM)菌菌糸周辺で植物残渣中の有機態リン(フィチン)を分解し、フィチン分解により生じた無機態リンをAM菌に供給するフィチン分解菌の分離を目的とした。土壌から直接フィチン分解菌を分離してもAM菌に無機態リンを供給しない可能性が考えられるため、AM菌がフィチン由来のリンを吸収する環境を整え、AM菌菌糸およびフィチン周辺からフィチン分解の分離を行った。すなわち、宿主植物としてミヤコグサ(Lotus japonicas)にAM菌を感染させ、ポット内にAM菌菌糸は通過するが植物根は通過しないナイロンメッシュで作成したメッシュバッグ内に微生物接種源となる畑土壌とフィチン含有アルギン酸ビーズを添加もしくは無添加で栽培試験を行った。アルギン酸ビーズ添加区と無添加区でミヤコグサのリン吸収の差があることを確認し、メッシュバッグ内から取り出したアルギン酸ビーズから計192株のフィチン分解菌を分離した。分離したフィチン分解菌のうち89株はSphingomonas属細菌で、16株はCaulobacter属細菌であった。分離源としたアルギン酸ビーズからDNAを抽出し、16S rRNA遺伝子を対象とした変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法で菌相解析を行ったところ、主要なバンドはMassilia属細菌、Sphingomonas属細菌、Caulobacter属細菌の配列と一致した。また、同じDNA中のフィチン分解酵素(beta-propeller phytase, BPP)をクローンライブラリー法により解析した結果、ほとんどが分離したSphingomonas属細菌もしくはCaulobacter属細菌のBPPの配列と一致した。以上の結果から、AM菌がフィチン由来の無機態リンを吸収する状況でAM菌菌糸周辺に優占するフィチン分解菌の分離に成功した。前年度までに分離していたフィチン(IHP)分解菌192株の中から、分離源としたCa-IHP周辺から回収した微生物群集DNAと16S rRNA遺伝子およびIHP分解酵素遺伝子が近似する菌株を選抜した。それらの中から、土壌条件では不溶性であるCa-IHPを分解する能力の高い菌株を選抜し、Ca-IHP分解菌の接種によりCa-IHP由来PがAM菌を介して吸収されることを確認した。すなわち、川砂と赤玉土の低P混合培土が入ったポットに滅菌した畑土壌とCa-IHP含有アルギン酸ビーズが入ったメッシュバッグ(AM菌菌糸は侵入できるが植物根は侵入できない区画)を埋設し、AM菌が感染したミヤコグサを移植した。この時、Ca-IHP分解菌4株(Sphingomonas sp. 2株、Caulobacter sp. 2株)をそれぞれ単独でメッシュバッグに接種した。移植後6週間栽培したミヤコグサ地上部のP含量は、接種した4株のうち1株(Caulobacter sp. CaGL4株)のみで非接種区と比較して有意に増加していた。植物根はメッシュバッグ内に到達できないため、Caulobacter sp. CaGL4株がCa-IHPを分解し、その結果生じた無機態PをAM菌が吸収し、ミヤコグサへ供給したと考えられた。これまで、土壌微生物によるCa-IHP分解で生じた無機態PをAM菌が宿主植物に輸送するメカニズムが示唆されていたが、Ca-IHPを分解する土壌細菌は特定されていなかった。今年度の研究では、Ca-IHPを分解してAM菌に無機態Pを受け渡すCa-IHP分解菌のうちの一つがCaulobacter sp. CaGL4株であることが示された。土壌に蓄積する有機態リン(P)の大部分を占めるフィチン酸(IHP)は、酸性条件では鉄(Fe)やアルミニウムと強固に結合するため、Fe-IHPから無機態Pを放出する微生物はこれまで報告されていない。しかし、前年度までの試験でアーバスキュラー菌根(AM)菌がFe-IHP由来のPを宿主植物に輸送することから、Fe-IHP周辺で細菌によるFe-IHP分解が起こる可能性を見いだし、選択培地を用いて優占するIHP資化菌(Sphingomonas属細菌、Arthrobacter属細菌)を分離していた。本年度は、これら分離株のFe-IHP分解能の評価を行った。Fe-IHPを唯一のP源とする液体培地にIHP資化菌を単独で接種し、25°C暗所で7日間震とう培養した。培養後、培地上清に遊離した無機態P濃度を測定したところ、いずれの培養物でも非接種区と比較して無機態P濃度が上昇し、接種細菌によるFe-IHP分解が示された。培地pHは3.0程度に低下していたため、酸性条件でIHPをFe-IHPから遊離するメカニズムが存在すると考えられた。

IHPはFeなどの金属と強く結合するキレート物質であるが、微生物が産生する強力なFeキレート物質としてシデロフォアが知られている。シデロフォアの中にはIHPよりもFeとの親和性が高いものも存在するため、微生物が産生するシデロフォアによってFe-IHPのFeがキレートされ、その結果遊離したIHPが分解されることが疑われた。そこで、Sphingomonas属細菌とArthrobacter属細菌の菌体懸濁液とFe-IHPを含むバッファーを短時間(4時間)反応させ、Fe-IHPから遊離する無機態P濃度の変化からこれら菌体培養液にFe-IHP分解活性があることを確認した。この時、シデロフォアの一種であるデスフェリオキサミンを添加したところ、Arthrobacter属細菌の菌体懸濁液ではFe-IHP分解活性の増加が認められた。このことから、Arthrobacter属細菌によるFe-IHP分解がシデロファオにより促進されることが示された。フィチン酸(IHP)は土壌中の有機態リンの主要な形態の一つであり,IHP分解は植物-土壌圏でのリン循環において重要な役割を果たすと考えられる。アーバスキュラー菌根(AM)菌は土壌から無機態リンを吸収するが,IHPを分解して無機態リンを取り出すことができない。近年,AM菌がIHP分解菌の関与によりIHP由来リンを吸収することが示されたが,どのような細菌が関与しているかは明らかになっていなかった。本研究では,アルギン酸ビーズを用いた改変釣り餌法により,AM菌菌糸圏のIHP周辺で優占するIHP分解菌の分離に成功した。これらの株はAM菌を介したIHP由来リンの吸収に関与すると考えられた。「土壌細菌の働きによりフィチンから遊離した無機態Pをアーバスキュラー菌根(AM)菌が吸収して宿主植物に輸送するメカニズム」が存在することを確認し、その関係を成立させるAM菌とフィチン分解菌の組み合わせの選抜に成功した。すなわち、当年度の目標としていた「植物-AM菌-フィチン分解菌」の三者間共生培養モデルの作成に成功したため。現段階までは、土壌に蓄積するフィチンのうち比較的溶解しやすいカルシウム塩を用いてきたが、今後は土壌条件ではほとんど溶解しない鉄イオンと結合したFe-IHPを分解するフィチン分解菌に注目する。フィチン分解菌単独でのFe-IHP分解能の確認にとどまらず、AM菌とのインタラクションによる分解能の変化にも注目する。平成25年度は、AM菌が宿主植物に感染してメッシュバッグ内からフィチン由来のリンを吸収する栽培条件の確立を目的としていたが、栽培試験が順調に行われ、計画よりも早くAM菌菌糸周辺からのフィチン分解菌分離に着手できた。さらに、菌相解析により分離菌株がAM菌菌糸周辺で優占する種であることを確認した。投稿論文準備のための英文校閲料および掲載料として計上していたが、論文作成が遅れたため使用しなかった。分離したフィチン分解菌をメッシュバッグ内にフィチンを含む宿主植物-AM菌の栽培系に接種し、フィチン分解菌が宿主植物のリン吸収に与える影響を評価する。また、栽培後に残存したフィチンの量を定量し、フィチン分解量とAM菌を介して植物が吸収したリンの量と比較する。このとき、AM菌接種区と非接種区の比較を行うことにより、AM菌がフィチン分解菌の増殖およびフィチン分解活性に与える影響を評価する。次年度に作成する投稿論文の英文校閲料および掲載料とする。
汎用コンピュータを利用した平衡機能の加齢現象に関する研究

従来のルーチンの重心動揺検査項目の再検討を行い、より多くのパラメータでの研究が可能となった。私達と同様な振動刺激を用いた研究をしているスウェーデン、ウプサラ大学と共同研究を行った。この研究で次のことが明らかになった。1)下腿に100Hzまでの振動刺激を20dBステップで与えると青壮年群(平均年齢25才)、および中年(平均年齢43才)では100Hzで最も動揺が大きくなった。しかるに高齢者群(平均年齢69才)では、60Hzで動揺が最大になった。2)男女別に検討すると、高齢者の男性は女性と比較して動揺が大きく、逆に中年の女性は男性と比較して動揺が大きく性差がみられた。3)外乱である振動刺激に対する反応は中年男性が最も安定していた。この結果は、日本平衡神経科学会およびスウェーデン耳鼻咽喉科学会春期総会にて報告された。さらに減圧環境下での重心動揺も測定した。視覚刺激による重心動揺の変化およびその加齢変化については、DOS-V機、PC98シリーズに使用可能な網膜刺激パターンを数種類作成した。この検討から、最も視覚による姿勢制御に影響をおよぼすパターンが明らかになり、さらに加齢に従って、その影響の程度が大きいことが判明した。現在、刺激方法について検討継続しており、この結果は日本平衡神経科学会等に報告予定である。ついで、体平衡機能と密接に関連あるとされる視性自覚的垂直位:SSV (subjective visual vcrtical)について研究を行った。1)正常人において垂直位の誤差は平均1.22°であり加齢の影響はうけないこと2)メニエール病発作期のSSVは有意に大きく、緩解期では減少するものの正常には回復しなかった。この結果は、Danavoxメニエール病シンポジウムで報告された。重心動揺における固有受容体の寄与を明らかにすることを目的に、外乱刺激方法の改良のための基礎的研究を行った。ルンド大学で開発されたコンピュータによる重心動揺開発装置を用いて検討した。この結果、重心動揺は若年(30歳以下)、中年(3550歳)と比較して高齢者では増大すること、外乱に対する変化が異なることが再確認された。また、振動の与え方については、コンピュータで周波数および時間を制御することが最適と考えられ、われわれのグループでも開発することにした。また、高齢者の病的症例としてメニエール病に対するゲンタシン注入療法を施行した症例について経時的に重心動揺の変化を記録した。このデータは、高齢者の機能回復の検討に有効なものである。更に臨床的問題の検討として、中高年発症のメニエール病症例について調査研究を行った。この結果、メニエール病の間歇期においても、前庭骨髄路の異常が認められた。高齢者でのリハビリは、メニエール病においてもその必要性が認められた。コンピュータ等のハードウエアについての検討を行った。なお、国外ではPC-DOSにより分析がなされている施設が多かったが、当教室においては従来からの継続性を重んじてNEC社製のものでシステムを開発することとした。更に頭部動揺計の改良を行い、データを取り込み、分析可能にするために検討中である。

1)下腿に100Hzまでの振動刺激を20dBステップで与えると青壮年群(平均年齢25才)、および中年(平均年齢43才)では100Hzで最も動揺が大きくなった。しかるに高齢者群(平均年齢69才)では、60Hzで動揺が最大になった。2)男女別に検討すると、高齢者の男性は女性と比較して動揺が大きく、逆に中年の女性は男性と比較して動揺が大きく性差がみられた。3)外乱である振動刺激に対する反応は中年男性が最も安定していた。この結果は、日本平衡神経科学会およびスウェーデン耳鼻咽喉科学会春期総会にて報告された。さらに減圧環境下での重心動揺も測定した。視覚刺激による重心動揺の変化およびその加齢変化については、DOS-V機、PC98シリーズに使用可能な網膜刺激パターンを数種類作成した。この検討から、最も視覚による姿勢制御に影響をおよぼすパターンが明らかになり、さらに加齢に従って、ぞの影響の程度が大きいことが判明した。現在、刺激方法について検討断続しており、この結果は日本平衡神経科学会等に報告予定である。ついで、体平衡機能と密接に関連あるとされる視性自覚的垂直位: SSV(subjective visual vertical)について研究を行った。この研究で次のことが明らかになった。1)正常人において垂直位の誤差は平均1.22°であり加齢の影響はうけないこと2)メニエール病発作期のSSVは有意に大きく、緩解期では減少するものの正常には回復しなかった。この結果は、Danavoxメニエール病シンポジウムで報告された。