hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
緑膿菌の抗菌薬耐性に関わる外膜蛋白質変異の迅速検査法の開発とサーベイランスの実践

緑膿菌Pseudomonasaeruginosaのカルバペネム系薬耐性に関与しているOprD変異をタンパク質レベルで迅速に検出することが可能な測定系および外膜タンパク質抽出法を構築した。さらに,カルバペネム系薬耐性株として臨床分離されたP.aeruginosaの収集を行い,本研究で構築した測定系および外膜タンパク質抽出法を用いてOprD変異によるカルバペネム系薬耐性に関するサーベイランスを実施した。緑膿菌Pseudomonas aeruginosaにおいて,抗菌薬耐性は治療を困難にさせるだけでなく病院感染症のアウトブレイクの原因となる頻度を高くする。なかでも,外膜タンパク質であるOprD/OprMの変異はP. aeruginosaにおけるカルバペネム系薬耐性の主な機序の一つであるが,現在のところ,これを日常診療の臨床検査で検出することは不可能である。そこで,今回, OprD/OprM変異をタンパク質レベルで定量または定性するための測定系を構築し,最終的には,迅速かつ簡便で臨床応用が可能な測定系として完成させることを目的に研究を行うこととした。さらに,構築した検出系を用いてOprD/OprM変異によるP. aeruginosaのカルバペネム系薬耐性の分布状況を明らかにするための疫学的解析(サーベイランス)をできるだけ規模を大きくして行い,適切な抗菌薬療法を推進するためのエビデンスを得ることも視野に入れた研究を展開する。平成20年度は,カルバペネム系薬耐性にOprD/OprM変異を高敏感度かつ特異的に検出することを可能とする抗体のスクリーニングならびに検出条件の適正化の検討を重ねた。ウェスタンブロット法による検出糸では,高速免疫染色装置を導入することなどにより検出時間の大幅な短縮を可能とした。一方, ELISA系による検出系については現在のところ条件を最適化するまでに至っていないが,継続して条件検討を進めている。また,同時に,これまでに構築した外膜タンパク質の抽出法についての工夫や改良を行った。とくに,簡便性と迅速性を高めるための検討を重ね,抽出法の諸条件の特性を明らかにした。なかでも,外膜タンパク質であるOprD/OprMの変異はP.aeruginosaにおけるカルバペネム系薬耐性の主要な機序の一つであるが,現在のところ,これを日常診療の臨床検査で検出することは不可能である。そこで,今回,OprD/OprM変異をタンパク質レベルで定量または定性するための測定系を構築し,最終的には,迅速かつ簡便で臨床応用が可能な測定系として完成させることを目的に研究を行うこととした。さらに,構築した検出系を用いて,OprD/OprM変異によるP.aeruginosaのカルバペネム系薬耐性の分布状況を明らかにするための疫学的解析(サーベイランス)をできるだけ規模を大きくして行い,適切な抗菌薬療法を推進するためのエビデンスを得ることも視野に入れた研究を展開する。平成21年度は,当該研究課題の終了予定年度(平成22年度)で計画しているサーベイランスの実践において必要となる分子生物学的解析法の確立に向け,カルバペネム系薬耐性に関わるOprD変異を高感度かつ特異的に検出するための諸条件の適正化に関する検討を継続した。成果として,効率的な外膜タンパク質抽出法を構築するとともに,高速免疫染色装置を利用したウェスタンブロット法による検出系とELISA系による検出系の二つのOprD変異迅速検出系を確立した。現在,これらの手法を用いたサーベイランスの実践に向け,準備を進めているところである。さちに,構築した検出系を用いて,OprD/OprM変異によるP.aeruginosaのカルバペネム系薬耐性の分布状況を明らかにするための疫学的解析(サーベイランス)をできるだけ規模を大きくして行い,適切な抗菌薬療法を推進するためのエビデンスを得ることも視野に入れた研究を展開する。平成22年度(最終年度)は,これまでの研究で構築してきた種々の測定系を利用してサーベイランスを開始した。カルバペネム系薬耐性株として臨床分離されたP.aeruginosaの収集を行い,それぞれの株について,イミペネム,メロペネム,ドリペネムの最小発育阻止濃度を決定した。

現在,これまで構築した外膜タンパク質迅速抽出系,Western Blot法による検出系,ELISA法による検出系を用いて,OprD変異の検出を進めている。平成22年度内に完了することが困難であるため,平成23年度以降も継続して研究することにしている。
未来社会に求められる科学的資質・能力に関する科学教育課程の編成原理

米国,英国等での渡航調査と文献調査から,海外での科学的資質・能力の育成を目指した科学教育課程編成の基本原理について研究し,わが国における科学的資質・能力の育成を目指した科学教育課程の編成原理とその具体モデルについて検討するとともに,児童生徒への全国的な質問紙調査を行い,科学への学習意欲形成過程の分析することで,一般市民と将来の科学技術人材育成の両面から科学技術教育の在り方について検討した。(1)前年度末に開催した「科学的探究能力育成のカリキュラムに関する講演会・フォーラム」の参加者への質問紙調査の結果を分析し,英国での科学的探究能力の育成の諸側面に関するわが国有識者の反応をまとめた。(2)認知的促進(CA)プログラムについて,今年度,英国で開催されたCA研究学会の年次大会とワークショップに参加し,CASEとそれ以外のCAプログラムの研究と実践の状況について情報収集した。(3)これまで収集分析してきた情報を基に,改革的な科学教育課程を編成する構成観点について学会報告した。その要旨は,構成の観点を,教育目標面,教育内容面,教育方法面,教育評価面,制度面,社会面という6側面と,大衆市民と科学技術の専門家の2対象との2次元の分析枠組みで捉えるものである。(4)OECD/PISA調査で良好な結果を示しているフィンランドなど北欧の教育モデルについても,科学教育課程の編成原理の考察対象として検討した。その結果,中等教育段階での学力の学校間格差や個人の格差をできるだけ縮小し,どの学校に属しても高い水準の学力が達成されることを目指す北欧の教育モデルが高い効果を上げていることが示唆され,スウェーデンにおける科学技術教育について,専門家を招聘し情報を収集した。(5)小中高等学校児童生徒への全国的な質問紙調査を行い,科学への学習意欲形成過程を分析した。(1)文献調査米国の中学校科学教科書"Science Plus"(2002)を分析し、内容構成その他の特徴について、7月に日本科学教育学会年会にて報告した。見出された特徴とは「インテグレートされた単元」「豊富な情報量」「インテグレートされた内容(内容面、単元を超えたテーマ、STSトピック、科学のプロセススキル、利用可能なテクノロジー)」「オーセンティックな評価の強調」「全米スタンダードNSESとの明確な関連」である。また、英国の中学校"Design and Technology"科の教科書(Collins社)を分析し、デザイニングを主体とした創造的問題解決過程について分析し、成果を日本科学教育学会年会にて報告した。(2)英国に関する渡航調査9月に英国関連諸機関でインタビュー調査を行い、「科学的探究能力」の指導と評価について情報収集した。また、ロンドン大学フィリップ・アデイ教授から、「科学教育を通じた認知的加速(CASE)」プログラムの開発と実践について最新の研究情報を得た。英国での調査から、わが国の初等中等科学教育全般に渡って、「科学的探究能力」の指導と評価の改善に資する取り組みを多く知ることができた。2月16日に東京で、2月19日に京都で、研究成果公開とアデイ教授の講演会を兼ねた「科学的探究能力育成のカリキュラムに関する講演会・フォーラム」を開催するとともに、アンケートによって公開した研究情報に対する参加者の意識を調査した。研究中間報告書『英国における科学的探究能力育成のカリキュラムに関する調査』を刊行した。(3)米国に関する渡航調査急速に普及しつつある「アドバンスト・プレイスメント」について、7月に渡航調査した。その結果、動向として、高い学力の追求と思考力の向上をねらったPre-APコースの開講、ウェブを活用した学習方法の増加、現職教育の強調などが見られた。
性的二型と闘争・求愛行動の進化

1.社会的条件に応じた可塑的な求愛戦術の使い分けこれまでの研究から、D. prolongataのオス前脚は"leg vibration"という特徴的な求愛行動に用いられることが明らかになっている。今年度実施した実験により、leg vibrationには雌の交尾受容性を高める効果があることが確認できた。一方で、leg vibrationにはリスクが伴うことも見出した。すなわち、複数のオス存在下ではメスの奪い合いが生じるが、特にleg vibrationを行った場合に高い確率でメスが奪われることが分かった。これは、leg vibrationの適応的効果が他のオスの有無という社会的条件に応じて反転することを意味する。さらに、単独求愛時に比べて他のオスの存在下ではleg vibrationの頻度が減少することが分かった。ライバルの有無により求愛戦術を切り替える現象は、昆虫では初めての報告であり、動物全体でも他に1例しか知られていない。2.ゲノム配列解析交尾受容性の高い系統と、闘争性の高い系統、および標準的な系統の3つについて、Hiseq1レーンずつを使ってゲノム配列解析を行った(100PE)。VelvetによるアセンブルでN50が40kb50kbとなるコンティグを得た。これに対し各系統のリードを相互マッピングしたところ、系統間には多くのSNPが存在することが分かった。3.遺伝子導入システムの構築キイロショウジョウバエで広く用いられているφC31インテグレースを用いた遺伝子導入系を確立することにした。そのためには、まずトランスポゾンを用いたベクターによりattP配列を導入した系統群を作製しなければならない。そこでpiggyBacを用いた形質転換を行い、約2,000個の受精卵へのマイクロインジェクションから最終的に40の独立したattP配列導入系統を得た。26年度が最終年度であるため、記入しない。発現変動遺伝子の解析前年度までに、成虫の脳内で発現する遺伝子の種間比較を行ったが、転写物の種間での対応付けに用いた方法に改善の余地があった。そこで、オルソログの対応付けにOrthoDB7を用いて新たにリードカウントのやり直しを行った。また、DEGの検出にiDEGESを用いた。その結果、発現変動の認められる遺伝子の数は以前の方法に比べて増加した。突然変異体のスクリーニングENUによる突然変異体の作成とスクリーニングを500系統行った。その結果、複眼色の突然変異体(vermilion)を得た。これは、オス間の精子競争に関する実験などでマーカーとして用いることができ、今後の研究遂行のために有用であると考えられる。CRISPR/Cas9による遺伝子ノックアウトTALENを用いるとしていた計画を修正し、CRISPR/Cas9を用いることにした。初期胚へのRNA溶液注入の方法を最適化し、まずwhite遺伝子をターゲットに実験を行っている。遺伝子ノックアウトが成功したかどうかについては現時点ではまだわかっておらず、次年度も継続して実験を行う。闘争行動の解析定量的な行動解析を行い、近縁種3種(D. kurseongensis、D. rhopaloa、およびKB866)と比較して、D. prolongataだけが例外的に闘争性が高いことを確認した。一方、闘争行動に含まれる要素(動作)およびその出現順序は、いずれの種においてもキイロショウジョウバエで報告されているものと同様であった。これは、行動のプログラム自体は種間で保存されており、行動遷移における閾値の変化など比較的単純なメカニズムで闘争性が亢進している可能性を示唆している。単一メス由来系統群の解析単一メス由来系統群を用いて闘争行動と求愛行動を定量的に解析したところ、顕著な系統間差を見出した。

用いる実験手法について若干の変更は行ったものの、予定した作業を遂行できている。CRISPR/Cas9によるゲノム編集今年度から継続して、次年度もwhite遺伝子をターゲットとした実験を継続する。これに成功した場合、キイロショウジョウバエで闘争性を制御することが明らかにされた遺伝子について破壊した突然変異系統の作成を試みるなどして、闘争性の進化の遺伝的基盤を明らかにしていく。piggyBac+attPによる遺伝子導入系の確立行動進化の神経基盤を解析するために、温度感受性チャネルを神経特異的に発現させる実験手法を用いたい。そのためには、遺伝子導入系を確立することが必要である。ファージ由来の組換え酵素を用いたシステムにより、キイロショウジョウバエで用いられているベクターコンストラクトがそのままD. prolontagaでも使えるようにすることが望まれる。
tRNA修飾酵素群が創出する癌の不均一性の分子機構解明とそれに基づく治療戦略構築

2018年度は、がんの不均一性の本態を「転写と翻訳の乖離に起因する現象」と捉えることで、主に悪性脳腫瘍の複雑な病態の解明に専念している。我々は、翻訳を司る根幹として、tRNAが最も重要な因子の一つであると位置付けて、特にtRNA修飾様式と悪性脳腫瘍の病態との関連を解析している。一連の解析の結果、我々は特定のtRNA修飾酵素(酵素X)が、悪性脳腫瘍のがん幹細胞性を調節することで、悪性脳腫瘍の不均一性を制御していることを明らかにした。酵素Xは、腫瘍細胞のなかでも特にがん幹細胞性の高い細胞集団で強く発現しており、酵素XをshRNAを用いてノックダウンすることで幹細胞性の著しい脱落が観察された。ほかに、酵素XによるtRNAの修飾は、低酸素環境など腫瘍細胞の周囲の微小環境に大いに左右されることも明らかとなった。非常に興味深い点として、酵素Xは、腫瘍幹細胞の特異な代謝経路によって蓄積する毒性物質を解毒させる方向に機能することがわかった。このことは、酵素XがtRNA修飾酵素としての従来の役割とは全く異なる様式で、悪性腫瘍の増悪させていることを明らかにした点で、極めて重要な発見と言える。さらに、酵素Xに構造上類似したアミノ酸一次構造を有するtRNA修飾酵素(酵素Y)についても、悪性脳腫瘍の幹細胞性を司る重要な因子の一つであることを突き止めた。これらの知見は、当初の研究計画書に基づき追加で立案された実験によって得られたものであり、今後同様の手順で他のtRNA修飾酵素についても、既知の作用とは異なる様式で、悪性脳腫瘍の病態に関与していることが明らかになると思われる。悪性脳腫瘍の病態を制御するtRNA修飾酵素を2種類同定しており、それらの生化学的・病態生理学的な役割についても数多くの知見が得られているため、当初の研究計画以上に進展していると考える。今回同定したtRNA修飾酵素はいずれも悪性腫瘍との関連が知られておらず、また、解明した生化学的な特徴についても、これまで全く知られていなかった新しい様式で悪性脳腫瘍の幹細胞性を制御することから、広くがん生物学において重要な知見をもたらすことが可能になると思われる。2019年度も、同様の手法を用いて、他のtRNA修飾酵素に関して悪性脳腫瘍の病態との関連を考察していきたい。前述の通り、本研究計画は当初の予定以上の成果を出せていると考える。そこで2019年度は、2018年度と同様の手法を用いて、他のtRNA修飾酵素に関しても網羅的な解析を行いたい。これにより、悪性脳腫瘍の病態とtRNA修飾およびそれに起因する翻訳の不均一性との関連が一般化できるようになるかも知れない。今後は、本研究計画で明らかにした知見を拡張することで、がん生物学において重要になりつつある「転写と翻訳の乖離に起因する不均一性」についての学問領域を確立したいと考えている。また、同定したtRNA修飾酵素が創薬標的として優れたものであるとわかれば、それに基づいた創薬基盤を確立することで、新たな制癌戦略の構築に寄与したいと切望している。

そこで2019年度は、2018年度と同様の手法を用いて、他のtRNA修飾酵素に関しても網羅的な解析を行いたい。これにより、悪性脳腫瘍の病態とtRNA修飾およびそれに起因する翻訳の不均一性との関連が一般化できるようになるかも知れない。今後は、本研究計画で明らかにした知見を拡張することで、がん生物学において重要になりつつある「転写と翻訳の乖離に起因する不均一性」についての学問領域を確立したいと考えている。また、同定したtRNA修飾酵素が創薬標的として優れたものであるとわかれば、それに基づいた創薬基盤を確立することで、新たな制癌戦略の構築に寄与したいと切望している。所属機関の会計事務の手続きのミスにより次年度使用額が14,621円生じたため、次年度に細胞培養に要する消耗品(ピペット)を購入する予定である。
急性腎障害における短鎖脂肪酸受容体GPR43を介する腎保護作用の解明

急性腎障害は従来「治る疾患」と考えられてきたが,近年,致死率が高いのみならず,慢性腎臓病や末期腎不全に至る予後不良の病態であることが明らかとなり,対策が求められている.我々は新規治療ターゲットとして腸内細菌叢によって産生される短鎖脂肪酸受容体であるGPR43に着目し,1)ヒト腎尿細管組織におけるGPR43の発現,2)短鎖脂肪酸産生Bifidobacterium製剤投与による慢性腎臓病患者の蛋白尿の改善,3)ヒト培養腎尿細管上皮細胞でのGPR43を介する抗炎症作用を見出した.本研究では,急性腎障害モデルにおいてGPR43を介する腎保護作用メカニズムを解明し,新たな治療法の確立を目指す.急性腎障害は従来「治る疾患」と考えられてきたが,近年,致死率が高いのみならず,慢性腎臓病や末期腎不全に至る予後不良の病態であることが明らかとなり,対策が求められている.我々は新規治療ターゲットとして腸内細菌叢によって産生される短鎖脂肪酸受容体であるGPR43に着目し,1)ヒト腎尿細管組織におけるGPR43の発現,2)短鎖脂肪酸産生Bifidobacterium製剤投与による慢性腎臓病患者の蛋白尿の改善,3)ヒト培養腎尿細管上皮細胞でのGPR43を介する抗炎症作用を見出した.本研究では,急性腎障害モデルにおいてGPR43を介する腎保護作用メカニズムを解明し,新たな治療法の確立を目指す.
固体塩化物を用いた気相法によるⅢ族窒化物擬似基板及びデバイスの単一プロセス作製

III族窒化物半導体(BN, AlN, GaN, InNおよびそれらの混晶AlxGa1-xN等)の持つ優れた物性は、既に実用化された高輝度白色LEDや短波長レーザダイオードのみならず、地球規模で取り組むべき創・省エネルギーに貢献するパワー半導体素子、太陽電池用材料としての応用にも極めて高いポテンシャルを秘めている。本研究では、固体塩化物の比較的高い蒸気圧を活用し、塩化物原料を気化させ用いる新規気相成長法により、大きな成長速度が必要となる基板結晶の作製から、積層構造の急峻な界面制御が必要となるデバイス構造の作製までを単一の結晶成長装置で作製可能とする手法を確立する。
風工学における乱流現象を対象とする数値風洞の開発研究

本研究は、3次元乱流の数値シミュレーション手法がその実用的可能性を示すに至っこの機会を捉え、これを利用した「風工学に於ける乱流を対象とする『数値風洞』システムの開発を目的としている。本研究では、まずLES、K-ε型2方程式モデルを用いた高精度の予測技術の開発を目的とした一遍の数値実験を行い、これらの結果を風洞実験と詳細に比較した。ここで検討した項目は、(1)メッシュ分割、(2)境界条件、(3)差分スキーム(4)数値定数等であり、これらの計算条件が予測結果に与える影響を系統的に研究し、建物周辺気流を数値シミュレーションにより予測する際の、適切な計算条件に関して検討した。これらの項目の中でも建物近傍のメッシュ分割は特に解に大きな影響を与えることが明らかになったので、最適なメッシュ分割を出来るだけ少い格子点数で可能とするために、Adoptive GridとGrid Generationを導入し、その有効性を確認した。又、本研究では、数値シミュレーション結果の画像処理システム及び同システムによる数値シミュレーション結果の可視化技術の開発も行い、Computer Graphicsを用いた流れの可視化学法が建物周辺の複雑な乱流場を3次元的に理解する上で極めて有効であることを確認した。昭和60年度は数値風洞の基本的構成要素である3次元乱流の数値シミュレーションシステムとシミュレーション結果の画像処理システムの基本的枠組を作ることを目的とした研究を行った。乱流の数値シミュレーションについては、Large Eddy Simulationとk-ε型2方程式モデルにより建物周辺の3次元乱流場を予測するためのプログラムを作成し、比較的単純な形状の建物周辺の気流分布、ガスの濃度分布の計算を行った。又、これと同時に数値シミュレーションと同じ建物モデルを用いた風洞実験を行い、両者の結果を詳細に比較することにより、数値シミュレーションによる予測の有効性を確認するとともに、数値定数、境界条件、差分スキーム、メッシュ分割等の各種パラメーターがシミュレーション結果に及ぼす影響について調べ、これらのパラメーターの最適な設定方法に関する検討を行った。今後さらにこれらのパラメーターに関する検討を継続して行い、シミュレーションの予測精度を向上させていく予定である。次に画像処理システムに関しては、ワークステーションApollo DomainDN550を中心とするシステムを購入し、大型計算機で計算されたシミュレーション結果を転送し動画像として表示するシステムを開発し、単独建物回りの流れ場を示すサイエンテイフィックアニメーションを作成した。又、流れ場を詳細に観察することが可能な画像処理システムの開発をめざして、コンピュータグラフィックスの手法を用いた流れの可視化手法に関して様々な検討を行った。
成人T細胞白血病(ATL)細胞のアポトーシス制御因子の探索

RSO4にIgM抗Fas抗体を添加培養してもapoptosisは起こさない。さらにproteosomeの特異的阻害剤であるlactacystinによってcaspase 8が活性化されapoptosisを誘導できることから、RSO4細胞質のapoptosisのpathwayには異常がないことが確認された。RSO4のFas遺伝子解析の結果、179番目の塩基アデニンがチミンへ変化する点突然変異を検出した。この結果、60番目のヒスチジンがアルギニンに変異し、三次元解析によって細胞外部分の5258アミノ酸付近の構造に大きな変化が生じることが判明した。この構造変化によってFasタンパクの正常な三量体形成が阻害され、apoptosisのシグナル伝達がdominant negativeに抑制された結果、RSO4は抗Fas抗体抵抗性を獲得したものと考えられた。2.抗Fas抗体抵抗性のATL細胞株OMTOMT細胞株のFas遺伝子解析の結果、1132番目のチミンからシトシンへの点突然変異を検出し、この結果exon9の313番目のアミノ酸がイソロイシンからトレオニンへ変異することが判明した。この変異によってdeath domainに構造変化をきたし、下流のFADDとの正常なassociationが阻害された結果、OMTが抗Fas抗体抵抗性を獲得した可能性が考えられる。3.膜型Fasタンパク低発現ATL細胞膜Fasタンパク陰性のATL症例7例の腫瘍細胞について検討した結果、ATL細胞は明らかに抗Fas抗体に抵抗性であり、7例中4例で遺伝子変異(point mutation、2bpのdeletion)を検出した。ATL細胞のapoptosis制御機構の一つとして、Fas遺伝子の様々な変異が深く関与していることが判明した。IgM抗Fas抗体抵抗性のATL細胞株であるRSO4の樹立に成功した。この細胞株にIgM抗Fas抗体を添加培養してもapoptosisは起こさず、細部増殖にもほとんど影響を与えないことが確認された。このRSO4からtotal RNAを抽出し、Fas遺伝子をtargetにしたprimer pairでRT-PCRを実施した後、subcloningを行いFas抗原遺伝子cDNA全長のsequenceを行った。この結果、開始コドンから179番目の塩基アデニンがチミンヘ変化する点突然変異を検出した。この変異によってFas抗原の細胞外部分であるexon 1の44番目のヒスチジンがアルギニンに変異していることとなる。この点突然変異を有したFas抗原蛋白の三次元解析では、正常のFas抗原に比し細胞外部分の3642アミノ酸付近の構造に大きな変化が生じることが予想された。抗Fas抗体によるapoptosisはFasと抗体との結合と、これに引き続いて起こるFasの三量体形成によって生じ、epitope mappingにより抗体結合部位は126135アミノ酸部位と考えられていることから、RSO4の変異はFasの正常な三量体形成を阻害している可能性が示唆される。現在、変異Fas遺伝子を他の細胞に導入することで、機能解析を実施している段階である。RSO4とは別系統のATL細胞株としてOMTを樹立した。IgM抗Fas抗体に抵抗性を有しているが、添加培養によって遅発的に軽いapoptosisを起こす。RT-PCRで得られたFas遺伝子cDNA全長のsequence解析では変異がないことが確認された。現在、レトロウイルスベクターによる発現cDNAライブラリーを作成している段階である。この細胞株にIgM抗Fas抗体を添加培養してもapoptosisは起こさず、細部増殖にもほとんど影響を与えない。さらにproteosomeの特異的阻害剤であるlactacystinによってRSO4のcaspase 8が活性化され、正常のapoptosisを誘導できることから、RSO4細胞質のapoptosisのpathwayには異常がないことが確認された。

このRSO4から抽出したRNAを用い、Fas抗原遺伝子cDNA全長のsequenceを行った結果、開始コドンから179番目の塩基アデニンがチミンへ変化する点突然変異を検出した。この点突然変異はFasタンパクの細胞外部分である60番目のヒスチジンがアルギニンに変異していることを意味し、この点突然変異を有したFasタンパクの三次元解析では、正常のFasタンパクに比し細胞外部分の5258アミノ酸付近の構造に大きな変化が生じることが判明した。この構造変化によってFasタンパクの正常な三量体形成が阻害され、apoptosisのシグナル伝達がdominant negativeに抑制されたものと考えられる。2.膜型Fasタンパク低発現ATL細胞抗Fas抗体抵抗性のATL細胞株にはFas遺伝子の変異が高率に認められることから、膜Fasタンパク陰性のATL症例7例を蓄積し、この症例のATL細胞について検討した結果、ATL細胞は明らかに抗Fas抗体に抵抗性であり、7例中4例で遺伝子変異(pointmutation、2bpのdeletion)を検出した。ATL細胞のapoptosis制御因子の一つとして、Fas遺伝子の様々な変異が様々な機序で関与していることが考えられる。
ヒト型三・四分枝糖鎖の精密半合成を利用するエリスロポエチンの系統的合成

ヒト型三分枝複合型糖鎖を半合成法によって簡便に合成し、さらに新たな糖ペプチド合成法を用いることで、三分枝及び二分枝シアリル複合型糖鎖を有するエリスロポエチンの合成に初めて成功した。採用第二年度までに確立していた糖鎖半合成法と新規糖ペプチド合成法を用いることで、まず三分枝糖鎖を有する糖ペプチドの合成をおこなった。糖鎖アスパラギンと保護ペプチドとの縮合反応を液相で行うことで、従来のペプチド固相合成法よりも高収率で糖ペプチドを得た。続いて、合成した三分枝糖鎖をもつ糖ペプチドと、別途合成したペプチド、二分枝糖鎖を持つ糖ペプチドとを段階的に連結し、166アミノ酸残基からなるエリスロポエチンの合成に成功した。三分枝糖鎖を持つ糖ペプチド以外のセグメントに関しては以前の報告例に従って調整し、これらを一般的なペプチド連結反応によって全長糖ポリペプチド鎖へと変換した。最後に、三次元構造を得るためのフォールディング操作によって、三分枝シアリル糖鎖を一本、二分枝シアリル糖鎖を二本持つエリスロポエチンを合成した。本研究結果により、糖タンパク質上の糖鎖分枝の影響を調べるために必要な、糖タンパク質の合成基盤を確立することができた。糖タンパク質上の複合型糖鎖には分枝度のばらつきが見られるが、その生物的な必要性や影響ははっきりとわかっていない。これまで、二分枝糖鎖を持つ糖タンパク質は広く合成されてきたが、三分枝シアリル糖鎖をもつ糖タンパク質については合成報告例がなかった。本研究では生理活性評価までは届かなかったものの、三分枝糖鎖の簡便な半合成法を確立し、さらに三分枝糖鎖を持つエリスリポエチンの合成を達成することができた。この合成法の開発は、今後のさらなる複合糖質研究に貢献できると考えられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、鶏卵から単離可能な二分枝糖鎖を利用したヒト型多分枝複合型糖鎖の新規合成法の開発ををおこなう。この合成法の確立により、二種類の三分枝糖鎖と四分枝糖鎖を合成し、これらの糖鎖合成法を利用して糖タンパク質であるエリスロポエチンの合成を目指す。分枝の異なる糖鎖を持ったエリスロポエチンを作り分けてそれぞれの赤血球造血誘導活性などを調べることで、糖鎖分枝の意義について新たな知見を得ることが期待される。本年度は、天然から単離可能な二分枝糖鎖を原料とする多分枝複合型糖鎖の新規合成法を検討した。これはオリゴ糖を原料とした新規糖鎖合成法である。前例のない合成法であり、従来法では合成が非常に困難であった多分枝糖鎖を単工程で合成できるようになると期待される。今年度は、二分枝糖鎖を利用した三分枝糖鎖の新規合成法を検討した。これまでに、1種類の三分枝糖鎖の短工程合成法を確立していたが、これを利用して別のヒト型三分枝糖鎖の合成を検討した。これまでに確立していた合成ルートの中間体を用いることで、新たな糖受容体へと誘導化し、グリコシル化反応と脱保護反応によって二種類目のヒト型三分枝糖鎖の合成を達成した。従来法では70もの工程数を必要とした三分枝糖鎖の合成であるが、本研究成果により二分枝糖鎖から二種類の三分枝糖鎖への変換がわずか10工程あまりで可能となった。また今年度はエリスロポエチン合成のためのペプチド合成法、および、新規糖ペプチド調製法を検討するためにマサチューセッツ工科大学のB.L.Pentelute博士の研究室に行き実験をおこなった。彼らの研究室ではフロー化学を用いた迅速ペプチド固相合成法を開発しており、従来法と比べて短時間でペプチドを調整することができる。この手法を用いた新規糖ペプチド調整法を検討するとともに、エリスロポエチン合成に向けてペプチド化学を十分に学ぶことができた。三分枝糖鎖を持つエリスロポエチンを合成するためには、貴重な三分枝糖鎖を使っていかに効率的に糖ペプチドを調整するかが鍵であり、まず二分枝糖鎖を用いて糖ペプチドの新規合成法を検討した。従来法では、固相上で糖鎖アスパラギンを過剰量用いて縮合し、またセグメント全長の純度によっては糖ペプチドの単離収率が低くなることがある。そこで、貴重な糖鎖アスパラギンに対してC, N末端側のペプチドを液相中で縮合する戦略を考えた。まず、三分枝糖鎖を導入するセグメントの糖鎖アスパラギン以外を従来のFmoc法によって保護ペプチドとして合成した。C末端側のペプチドに関しては、そのC末端をヒドラジド、N末端を遊離アミンへと変換した。続いて、二分枝糖鎖アスパラギンとの縮合反応を、活性化剤としてPyBOP、溶媒としてDMF/DMSOを用いて行った結果、効率的に糖ペプチドを得られることを見出した。さらに、N末端側のセグメントとの縮合をPyBOP、DMFを用いて行った結果、目的の糖ペプチドセグメントを単離収率30%で得ることができた。現在、エピメリ化のリスクを下げつつさらに縮合効率を上げるために種々の条件検討を行っている。また、三分枝糖鎖を導入するセグメント以外のセグメントに関しても、過去の報告例に従って合成を進めており、現在までに3つのセグメントの調整を完了している。

残る二つのセグメントに関しても順調に合成を進めており、それぞれのセグメントがそろい次第、ペプチド-ペプチド連結反応であるNative Chemical Ligationによって順次ペプチド鎖を連結していく予定である。今年度中に3分枝糖鎖を持つエリスロポエチンを合成する予定であったが、現在はまだ各ペプチドセグメントの調整を行っている。これは鍵となる新たな糖ペプチド合成法の確立に時間を要したのと、これまでの研究の総括である糖鎖合成の論文の執筆およびリバイスに時間を要したためである。この論文出版に関しては、追加実験や数回の訂正を求められたためであるが、全て順調に対処し、アメリカ化学会誌に出版することができた。新規合成法の開発に関しては、保護ペプチドの反応開発が想定していた以上に難しかったために時間を要したが、今現在は問題を克服し、エリスロポエチン合成に必須な新たな方法論の開発をすることができた。ヒト型三分枝複合型糖鎖を半合成法によって簡便に合成し、さらに新たな糖ペプチド合成法を用いることで、三分枝及び二分枝シアリル複合型糖鎖を有するエリスロポエチンの合成に初めて成功した。採用第二年度までに確立していた糖鎖半合成法と新規糖ペプチド合成法を用いることで、まず三分枝糖鎖を有する糖ペプチドの合成をおこなった。糖鎖アスパラギンと保護ペプチドとの縮合反応を液相で行うことで、従来のペプチド固相合成法よりも高収率で糖ペプチドを得た。続いて、合成した三分枝糖鎖をもつ糖ペプチドと、別途合成したペプチド、二分枝糖鎖を持つ糖ペプチドとを段階的に連結し、166アミノ酸残基からなるエリスロポエチンの合成に成功した。三分枝糖鎖を持つ糖ペプチド以外のセグメントに関しては以前の報告例に従って調整し、これらを一般的なペプチド連結反応によって全長糖ポリペプチド鎖へと変換した。最後に、三次元構造を得るためのフォールディング操作によって、三分枝シアリル糖鎖を一本、二分枝シアリル糖鎖を二本持つエリスロポエチンを合成した。本研究結果により、糖タンパク質上の糖鎖分枝の影響を調べるために必要な、糖タンパク質の合成基盤を確立することができた。糖タンパク質上の複合型糖鎖には分枝度のばらつきが見られるが、その生物的な必要性や影響ははっきりとわかっていない。これまで、二分枝糖鎖を持つ糖タンパク質は広く合成されてきたが、三分枝シアリル糖鎖をもつ糖タンパク質については合成報告例がなかった。本研究では生理活性評価までは届かなかったものの、三分枝糖鎖の簡便な半合成法を確立し、さらに三分枝糖鎖を持つエリスリポエチンの合成を達成することができた。この合成法の開発は、今後のさらなる複合糖質研究に貢献できると考えられる。当初の研究計画では、1年目に三分枝糖鎖を一本有するエリスロポエチンの合成を計画していたが、今年度は二種類の三分枝糖鎖合成をまとめて学術雑誌へ投稿するために、まず二種類目の三分枝複合型糖鎖の合成を検討した。その結果、期待通りに二つ目の三分枝糖鎖の合成に成功した。現在論文投稿に向けて最終調整をしているところであり、新規糖鎖合成法の確立に関してまとめることができる。また、MITのPentelute博士のもとで彼らの迅速合成法を学びつつ、糖タンパク質合成のために必要なペプチド化学を理解し、糖ペプチド合成に関しても経験することができた。これらの経験を活かして、次年度はエリスロポエチンの合成を円滑に進められると考えている。三分枝糖鎖を持つエリスポエチン合成に向けて、その鍵となる糖ペプチド合成法の開発、および糖鎖合成は完了している。今後は既知の合成ルートに従ってセグメント調整、および連結反応を繰り返すことによって目的化合物を合成していくだけである。
少子高齢化と経済成長における政治経済分析

本研究は、少子高齢時代を迎えたわが国の公共政策、特に公共政策の主要な担い手である地方財政に注目して分析を行った。また、高齢人口の増加に伴い、介護保険費の増加が予想されており、どのように介護保険を提供するのかを分析した。本年度は、少子高齢時代を迎えたわが国の公共政策、特に地方財政に注目して分析を行った。高齢人口の増加に伴い、社会保障費の増加が予想されており、どのように社会保障を提供するのかを分析することは重要である。まず、Hirota and Yunoue(2008)では、介護保険の保険者である市町村が広域行政を実施することによる歳出面への影響について分析を行った。平成の合併が一段落した現在、市町村合併以外の広域行政による効果を分析することは重要である。類似団体という分類を利用して、介護保険に関する広域行政の影響を分析したところ、一部事務組合に比べて広域連合において歳出が抑制される傾向が確認された。次に、Saito and Yunoue(2009)では、補助金改革、税源移譲と地方交付税の見直しを同時に行う「三位一体改革」による地方財政への影響についてシミュレーション分析を行った。地方交付税基準財政需要額の取り扱いや歳出削減努力の有無について、いくつかのケースに分けて分析した結果、三位一体改革によって、地方税収の格差が拡大することや、現状において補助金や地方交付税に大きく依存している地域での歳入減が大きいことが明らかとなった。本研究で得られた結果は、少子高齢時代における公共政策のあり方を議論する上で重要であるだけでなく、地方分権化の流れの中で、社会保障の一翼を担う地方財政がどのような影響を受けるかということに対して新しい視点を与えており、意義深いものである。地方歳出についての実証分析を行うと共に、地方自治体の市町村合併に焦点をあてて研究してきた。世界でもっとも高齢化の進んだわが国では、国レベルだけでなく、地方自治体のレベルにおける対応が重要となってくる。地方自治体が市町村合併によってどのように財政改革を行ってきたのかを考察した。まず、地方歳出に注目した湯之上・倉本・小川(2009)では、確率フロンティア分析を用いて,全国都市の費用関数を推定した。交付団体と不交付団体において,費用関数の構造が異なっていることを示した。定数項だけでなく、人口についての係数パラメータについても相違が存在していることが明かとなった。次に、広田・湯之上(2009)では、市町村合併における歳出面の変化を決算額と類似団体別市町村財政指数表(総務省自治財政局)の分類を用いて算出した合成値を比較することで検証した。その結果、合併初期は一時的に歳出が増加するが、その後減少することや、その一方で歳出の削減幅は、合併経過年数を経るにつれて縮小することが明らかとなった。また経済的・制度的要因を考慮した分析を行うため歳出と合併経過年数の関係を検証するパネルデータ推定を行ったところ、前半の分析と同様に、合併経過年数を経るごとに歳出削減効果があるが、大きな削減幅ではない可能性であることが示された。また、長峯・湯之上(2009)では、自治体職員に対してアンケート調査を行った。自治体職員の合併に対する評価は肯定派と否定派に分かれていること、職員の年齢層や従事した職種よって、合併への評価が異なっていることなどが明らかとなった。本研究で得られた結果は、少子高齢時代における公共政策を担う重要な位置を占める地方自治体のあり方を議論する上で、新しい視点を与えており意義深いものである。
多剤耐性癌の放射線感受性の検討

1まず、多剤耐性細胞LZ(チャイニーズハムスターV79細胞の多剤耐性株)と親株のV79細胞を用いて、単層培養において、生存率曲線を求めた。親株のV79細胞のD0(平均致死線量)は、160cGyで、n(外挿値)は、7.0であった。ところが、多剤耐性細胞LZのD0は、122cGyで、n(外挿値)は、12.0であった。これは、LZのほうが、亜致死障害の回復能は大きいが、より放射線感受性が大きいことを意味している。2 V79細胞とLZ細胞を用いて、直径100μmの小さなSpheroidを作成し、アドリアマイシン感受性を比較した。V79細胞とLZ細胞とも、Spheroidのほうが、単層培養より、アドリアマイシン抵抗性であった。次に、多剤耐性細胞のアドリアマイシン抵抗性を減弱させる薬剤として知られているベラパミールをアドリアマイシンと併用した所、単層培養においては、LZ細胞のアドリアマイシン感受性は、IC50(生存率を0.5に低下させるのに必要なアドリアマイシン濃度)で比較すると、22μg/mlから1.0μg/mlに低下し、22倍の増感率が得られたが、Spheroid培養では、IC50値は、48から28にしか低下せず、増感率はわずか、1.7であった。ノーザンブロット及びウエスタンブロットで、単層培養及びSpheroidにおけるP-糖蛋白質のmessage及び他の白質量を分析したが、差がみられず、上記のSpheroidのアドリアマイシン及びベラパミール抵抗性の原因は、現在の所、不明である。3今年度は、V79細胞とLZ細胞のSpheroidを用いて、その放射線感受性を単層培養と比較する予定である。
G蛋白質GSPT1のトリプレットリピート増幅が引き起こす胃癌発症のメカニズム

翻訳終結因子eRF3/GSPT1のN末端にはGGCトリプレットリピートによってコードされるポリグリシンが存在し、健常人においてはこの繰り返しが10前後であるのに対し、12以上になると胃癌発症の危険率が20以上に増大する。また一方で、eRF3/GSPT1は各種ストレスによってN末端が特異的に切断され、その際露出したN末端配列がカスパーゼ阻害因子IAPと特異的に結合してカスパーゼを活性化し、アポトーシスを誘導する。従って、eRF3/GSPT1のN末端領域におけるトリプレットリピートの増大は、ストレスによるN末端の切断を阻害し、アポトーシスの誘導を阻害することにより胃癌の発症率増大を引き起こしている可能性が高い。本研究においては、このような仮説を含め、eRF3/GSPTのトリプレットリピート増幅が胃癌の発症率増大を引き起こす分子メカにズムを解明することを目的として解析を行なった。(1)eRF3/GSPT1のトリプレットリピートアイソフォームの作製グリシンをコードするGGCトリプレットリピートが、それぞれ0、5、10、12であるアイソフォームをPCR法を用いて作製し、細胞にトランスフェクトして細胞染色による細胞内局在性について検討した。各種アイソフォームはどれも細胞質において発現し、細胞内局在性における変化はとくにみられないことを確認した。(2)トリプレットリピート多型性がeRF3/GSPT1による遺伝子発現制御におよぼす影響の検討eRF3/GSPT1のトリプレットリピートアイソフォームをβグロビンのレポーター遺伝子とともにHeLa細胞に遺伝子導入をおこない、細胞内での過剰発現がβグロビンの遺伝子発現に与える影響について検討した。その結果、どのアイソフォームにおいてもβグロビンの発現量に変動は観察されなかった。(3)トリプレットリピート多型性がストレスによるeRF3/GSPT1N末端領域の切断に及ぼす影響eRF3/GSPT1のトリプレットリピートアイソフォームをHeLa細胞に遺伝子導入し、アミノ酸飢餓ストレスを加えた際に観察されるN末端の切断活性について検討を行なった。その結果、正常なリピートをもつGly11に対して胃癌発症率が増大するGly12の場合においてN末端の切断効率が低下することが観察された。なお、本研究は新学術領域研究の採択に伴い廃止したため約8ヶ月間の研究期間で行なったものである。
間接雇用の拡大による「流動的労働市場」の形成と改革に関する国際比較研究

本研究では、派遣労働や業務請負などの人材仲介業が創出した「間接雇用」によって、「労働条件の低い流動的な労働市場」が形成されていることに着目し、労働力供給地域と受け入れ地域の調査をとおしてその現状を考察した。製造ラインにおいて間接雇用(社内下請)の増加が注目される韓国では法規制の厳しさに加えて、独立系の人材ビジネス業の未発達もあって日本のような流動的労働市場の形成が見られないことが明らかになった。1[間接雇用形態の労働者の送り出し地域における調査研究]沖縄県那覇市に進出した県外の人材仲介業(派遣労働・業務請負)の営業所を対象に募集人員の実績、ユーザー企業への供給実態(送り出し人員数)について聞き取り調査を実施した。2008年末から09年にかけて大幅に縮小した、東海・近畿地域への労働力供給が、自動車産業などの景気回復にともなって一部で増加傾向に転じていることが明らかとなった。県外就労ができない若年求職者が沖縄県内に滞留し、失業率を押し上げている労働市場の現状について、沖縄労働局への調査から明らかにした。2[韓国における間接雇用と流動的労働市場の動向に関する調査研究1韓国で人材仲介業者が介在した流動的労働市場が全国的に形成されているかどうか、その実態について調査研究を行い、日本との相違点を明らかにした。韓国を代表するA自動車のX工場において社内下請労働者の活用実態や出身地域、労働組合の対応などについて実態調査を行った。あわせて韓国労働研究院や非正規労働センターに対する聞き取り調査を実施し、韓国では日本のような人材仲介業者が介在する流動的労働市場の全国的形成が見られないことが明らかになった。3[EUにおける間接雇用の現状と規制に関する研究]EU諸国の間接雇用の動向を概観したうえで、特に、スウェーデンの最新動向を明らかにした。派遣労働に関するEU指令(2008年)は登録型派遣を禁止していないが、スウェーデンでは労働協約によって登録型派遣を規制していること、派遣と派遣の中断期間における賃金保障があること、及び賃金保障の具体的内容等を最新の労働協約をもとに明らかにした。(1)[日本の間接雇用(派遣労働、業務請負など)と流動的労働市場の現状に関する調査研究]・昨年度に引き続き、沖縄県那覇市に進出した県外の人材仲介業(派遣労働・業務請負)の営業所および求人情報誌企業を対象に募集人員の実績、ユーザー企業への供給実態(送り出し人員数)の推移について聞き取り調査を実施した。2010年以降、自動車・電機産業などの景気回復にともなって東海・近畿地域への労働力供給が引き続き回復基調にあること、その規模はハローワークを経由した県外就労を上回る規模になること、さらに人材仲介業者を介して東日本大震災の被災地への労働力の供給が一部行われていることなどが明らかになった。・東日本大震災の被災地(福島県いわき市)を対象に、震災により失職した失業者を対象とする人材仲介業者およびハローワークによる就職斡旋の動向について調査した。被災者用仮設住宅での行政サービス業務を人材仲介業者が請け負い、求職者を採用している事例および震災復興関連事業への労働者派遣の事例が明らかになった。(2)[韓国における間接雇用と流動的労働市場の動向に関する調査研究]韓国の主力自動車メーカーB社Y工場において社内下請労働者の活用実態や出身地域、労働組合の対応などについて実態調査を行った。また、事務職を対象とする派遣業者および派遣業界団体に対する聞き取り調査を実施した。韓国では財閥系企業が直轄する社内下請制(業務請負)が強固であり、独立系の人材派遣業者が参入する余地が少ないことが明らかになった。このことが韓国で人材仲介業者が介在する流動的労働市場の全国的形成が見られない要因となっていることを示した。(3)[EUにおける間接雇用の現状に関する研究]ドイツ、イギリス、スウェーデンなどの間接雇用の最新の動向について文献をとおして考察した。本研究では、日本において派遣労働や業務請負などの人材仲介業が創出した「間接雇用」によって、「労働条件の低い流動的な労働市場」が新たに形成されていることに着目し、その規模や就労実態及び改革に向けた政策課題を国際比較をとおして明らかにすることを目的とする。1.日本では東日本大震災以降、流動的労働市場に変化が生じていることに着目し、沖縄・九州・北海道・青森などの相対的に雇用機会の少ない地域から、人材仲介業者を介して福島第一原発の事故収束・除染作業に多数の労働者が動員されている実態を現地調査により明らかにした。労働者派遣法や職業安定法に違反する多重派遣なども多発しており、労働市場の流動化とともに原発労働の現場では労働者供給事業が復活していることが浮かび上がった。2.韓国の間接雇用について、自動車部門に続いて本年度は造船部門の実態調査をしたが、日本のような流動的労働市場の形成は見られないことが判明した。造船業の間接雇用の形態は自動車部門と同様に「社内下請」(その大半が偽装請負)であるが、社内下請業者の無期雇用の労働者のほかに「物量チーム」と呼ばれる雇用の調整弁となる労働力のプールが組織されていること、その多くは地元出身の労働者であることを明らかにした。

現代自動車の社内下請に関する大法院判決(社内下請も派遣労働に該当するため、2年以上勤務した社内下請労働者は、正規職と見なければならないとし、現代自動車の社内下請を派遣法違反と判示)は2012年5月に確定したが、使用者はこれに抵抗しつづけているため、間接雇用の抜本的改革は進んでいない。韓国雇用労働部への調査により、人材仲介業(労働者派遣業および有料職業紹介業)の大半を零細業者が占め、大手人材ビジネス業者の形成・参入が見られないことが明らかになった。このことが労働市場の流動化を抑制していることと深く関わっていると考えられる。日本および韓国における間接雇用形態による流動的労働市場の形成について、現地調査を踏まえて実態を明らかにしている。韓国について最新の動向を論文にまとめた(印刷中)。ドイツ・イギリス・スウェーデン・オーストラリアについては予算の制約もあって現地調査が難しいため、文献研究による最新動向の把握に努めている。24年度が最終年度であるため、記入しない。日本および韓国の間接雇用形態による流動的労働市場の実態について引き続き現地調査を実施し、より詳細に明らかにする。ドイツ・イギリス・スウェーデン・オーストラリアについては文献をとおした考察になるが、重点をドイツとイギリスに置くことにする。
甲殻類心臓の興奮性制御における神経およびホルモンの二重賦活機構

海産大型甲殻類オニヤドカリ(Aniculus aniculus)の摘出心臓を用いて、囲心器官ホルモン(プロクトリン等)および興奮性心臓調節神経および心臓調節大細胞の神経伝達物質(ドーパミン)の効果を調べた。標的細胞に対する直接作用を調べるため(1)心臓調節大細胞、(2)同神経節小細胞および(3)心筋細胞への効果を個別に調べた。その際、テトロドトキシン(TTX,10^<-6>M)を用いて心臓神経節の影響の除去も試みた。ドーパミンは心臓神経節大細胞、小細胞および心筋細胞に直接作用し、心臓神経節群放電の活性化および心筋の持続的収縮を引き起こした。プロクトリンは低濃度(10^<-12>M)で心臓神経節インパルス発火頻度を増加させ安定した群放電を維持させた。一方、比較的高濃度(10^<-8>M10^<-6>)でプロクトリンの心筋への直接作用が発生し、張力を発生させた。プロクトリンの心筋作用は心筋細胞膜の電気的性質の変化を介さないことが明らかになった。この作用は、低カルシウム溶液中、5mMコバルト含有溶液中で抑制された。アデニル酸シクラーゼ合成活性化剤(フォルスコリン)で心臓神経節活動の活性化、筋収縮の増強が見られた。フォスフォジエステラーゼ阻害剤(IBMXまたは3-メチルキサンチン)+TTX存在下でプロクトリン筋収縮作用は増強された。プロクトリンの神経興奮作用にはサイクリックGMPではなくサイクリックAMPが細胞内情報伝達物質として介在することが明らかになった。TTX(10^<-6>M)存在下でプロクトリンは心臓調節神経細胞の自発律動性ドライバー電位を活性化した。プロクトリンによるドライバー電位誘発機構およびドライバー電位そのものの自発発生機構にはカルシウムイオンが不可欠であることが明らかになった。海産大型甲殻類オニヤドカリ(Aniculus aniculus)の摘出心臓を用いて、囲心器官ホルモン(プロクトリン等)および興奮性心臓調節神経および心臓神経節大細胞の神経伝達物質(ドーパミン)の効果を調べた。標的細胞に対する直接作用を調べるため(1)心臓神経節および(2)心筋細胞への効果を個別に調べた。心筋への効果ではテトロドトキシン(TTX,10^<-6>M)を用いて心臓神経節の影響を除去する方法または心臓神経節を摘出する方法をとった。ドーパミンは心臓神経節大細胞、小細胞および心筋細胞に直接作用し、心臓神経節群放電の活性化および心筋の持続的収縮をひきおこした。プロクトリンは低濃度(10^<-12>M)で心臓神経節インパルス発火頻度を増加させ安定した群放電推持させることが明らかになった。一方、比較的高濃度(10^<-8>M10^<-6>M)でプロクトリンの心筋への直接作用が発生し、張力を発生させた。アデニル酸シクラーゼ合成活性化剤(Forskolin)で心臓神経節活動の活性化、筋収縮の増強がみられた。フォルスコリン+TTX存在下でプロクトリン筋収縮作用は増強された。ホスホジエステラーゼ阻害剤(IBMX又は3-メチルキサンチン)+TTX存在下でも、プロクトリン筋収縮作用は増強された。

従ってプロクトリンの筋肉への作用には環状ヌクレオチドが細胞内情報伝達物質として介在することが示唆された。この情報伝達物質がサイクリックAMPかサイクリックGMPか決定することも今後の課題である。細胞内侵透能力に優れたダイブチリル型サイクリックAMP又はGMPの投与実験からは現在のところ結論が得られていない。海産大型甲殻類オニヤドカリ(Aniculus aniculus)の摘出心臓に対する甲殻類の代表的ペプチドホルモン、プロクトリン、の効果を調べた。プロクトリンの標的細胞に対する直接作用を、心臓を構成する3種類の興奮性細胞(1)心臓神経節大細胞(2)同神経節小細胞および(3)心筋細胞で個別に解析した。プロクトリンは低濃度(10^<-11>M)で心臓神経節大小細胞の不規則な群放電をリズミカルに同一パターンを繰り返す群放電に変えた。低い濃度では心筋に対する直接作用が観察されなかった。高濃度(10^<-6>M-10^<-5>M)のプロクトリンは、心臓神経節のインパルス発火頻度を増大させた。即ち、心臓神経節大小細胞両方で群放電内インパルス数が著しく増大した。一方、これに伴い心臓神経節群放電発生頻度は低下こそすれ増大することはなかった。また高濃度プロクトリンは心筋に持続的張力を発生させた。これらの解析から、プロクトリンの心臓に対する「正の変力性」、「正の変緊張性」および「負の変時性」効果発現効果が作用部位の点で明らかにできた。次に、TTX(10^<-6>M)存在下での実験から、プロクトリンの作用は心臓神経節神経細胞の自発律動性ドライバー電位を活性化することによるということが明らかになった。また、プロクトリンによるドライバー電位誘発機構およびドライバー電位そのものの自発発生機構にはカルシウムイオンが不可欠であることが明らかになった。さらに、プロクトリンによる心臓興奮性作用にはサイクリックGMPではなくサイクリックAMPが介在することが明らかになった。