hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トレハロース蓄積による植物への耐凍性付与に関する研究

それぞれの遺伝子についてスクリーニングをした結果,TPPに関しては1クローンのポジティブクローンが得られた.そのクローンは1,854bpからなり,384アミノ酸をコードしていることが明らかになった.また,相同性検索の結果,シロイヌナズナおよびイネのTPPのアミノ酸配列と相同性が高いことが明らかになったTPSについてはポジティブクローンを得ることができなかったため,5'-RACE法および3'-RACE法を行い,2,177bpの塩基配列ならびに676残基の推定アミノ酸配列が決定された.塩基配列から推定されたアミノ酸配列を基に相同性検索を行ったところ,シロイヌナズナおよびイネのTPSと高い相同性を示した.今後は二つの遺伝子の導入によるトレハロースの蓄積を目指していく予定である.
財政機能と機能不全に関する研究

現代の政府には市場機能を補完する重要な役割が期待されるが、政府の失敗が生じ、政府規模を顧慮するとその問題も大きいと推測され、したがってその原因を探り、政府の本来の機能回復を図ることが重要な課題となる。本研究は、現実の政策決定・政府行動における問題について事実に〓った調査を基礎とし、公共選択論等関連する経済理論の同問題への応用的展開を考え、わが国における政府失敗問題の実態・原因と解決方法を考察した。(1)現代の政府には市場機能を補完する重要な役割が期待されるが、現実の政府が必ずしもその想定のように機能しない政府の失敗が存在し、現在の政府規模を考慮すると失敗の規模も大きいと考えられることを顧慮すると、その原因を探り、問題を解消、本来の機能を政府に遂行させることは重要な課題であり、強く求められるものでもある。本研究は、現実の政策決定・政府行動における問題の調査・検証を基礎とし、公共選択論、プリンシパル-エイジェント理論、契約理論等関連する研究の現実の問題への応用的展開を考え、わが国における政府の失敗問題に適用し、その解明・解決を図る理論とその具体・応用方法を明らかにすることを目的としている。(2)研究は3年で行う計画で、第1-第2年の主要な課題の第1は、現実の政府の行動・機能がどのように理解され、どのように問題を生じ、またそれが政府構造・諸制度とどのように関係しているかを、資料および実地調査により徹底的に解明・整理すること、第2の課題は、わが国における政策・公共的意思決定、政策執行、それらと政府・財政制度の関わりの問題について、従来の公共選択論、組織論、契約理論、比較制度論等がどのように適用できるか、なぜ十分な解明を与えていないかを検討することである。(3)本年度はこのうち資料の収集・整理に多くの努力・時間を傾注し、問題およびその発生の態様等の理解については一定程度成果を得たと考えられる。これに対し、問題・同発生についての実地調査、およびそれら問題を生じる背景・構造等についての理論的検証・展開・統合化は不十分な状況にあると言える。したがって今後は、資料調査を継続しながら、実地調査および理論の検証・展開により多くの時間を注ぎ、研究の進展を図る。(1)現代の政府には市場機能を補完する重要な役割が期待されるが、現実の政府が必ずしもその想定のように機能しない政府の失敗が存在し、現在の政府規模を考慮し失敗の規模も大きいと推測されることを顧慮すると、その原因を探り、問題を解消、本来の機能を政府に遂行させることは重要な課題であり、強く求められるものでもある。(2)研究は3年で行う計画で、第1、第2年は、第1に現実の政府の行動・機能がどのように理解され、どのように問題を生じ、またそれが政府構造・諸制度とどのように関係しているかを、資料および実地調査により徹底的に解明・整理すること、第2に、わが国における政策・公共的意思決定、政策執行、それらと政府・財政制度の関わりの問題について、従来の公共選択論、組織論、契約理論、比較制度論等がどのように適用できるか、なぜ十分な解明を与えていないかを検討することを主要な課題としていた。(3)第2年度は、引き続き資料収集・整理を進め、主要な事例における政府意思決定・政策執行における問題と公共選択論・契約理論等の関連・対応を考察すること等によって、問題およびその発生の態様等の理解についてはさらに理解を深められたと考えられる。これに対し、問題・同発生についての実地調査、および問題を生じる背景・構造等についての理論的・統合的な検証・展開は十分な状況と言えない。したがって本年度(平成24年度)は研究最終年として、資料調査を継続しながら、実地調査および理論の統合的解明および展開を図り、問題の解明および解決方法・方向に関して研究成果を論文として纏める。(1)現代の政府には市場機能を補完する重要な役割が期待されるが、現実の政府が必ずしもその想定のように機能せず政府の失敗が生じ、現在の政府規模を顧慮するとその問題も大きいと推測される。したがってその原因を探り、問題を解消、本来の機能を政府に遂行させることは重要な課題である。本研究は、現実の政策決定・政府行動における問題について事実に沿った調査・検証を基礎とし、公共選択論、プリンシパル-エイジェント理論、契約理論等関連する研究の現実の問題への応用的展開を考え、わが国における政府失敗題の解明・解決のための理論展開とその具体・応用方法を明らかにし、問題解明に寄与することを目的としていた。

(2)研究は3年計画で、平成22,23年は、第1に現実の政府の行動・機能がどのように理解され、どのように問題を生じ、またそれが政府構造・諸制度とどのように関係しているかを、資料および実地調査により実態・実情を解明すること、第2に、わが国における政策・公共的意思決定、政策執行、それらと政府・財政制度の関わりについて、従来の理論がどのように対応するか、また、何故現実の問題について十分な解明がなされていないかを検討した。(3)平成24年度は、引き続き資料収集・整理を進め、主要な政策事例について政府意思決定・政策執行の特徴・問題、それらと公共選択論他の理論との関連・対応を考察・検討し、問題およびその発生の態様等についてはさらに理解を深められたと考えている。しかし、主要な政策事例について詳細な調査を行う程、一方でさらに調査が必要になり、他方問題・同発生の背景・構造等の従来の理論との乖離、事実・実際に沿った理論・統合的解明が困難に思われる状況にある。この一部は下記の論文にも示しているが、したがって今後も資料および実態の調査を継続しながら、実態に対応した理論・統合的解明・展開を図って行きたいと考えている。本研究の課題であるが、政府の失敗に関し異なる理論を統合的に適用・適合させることが本来容易でないこと、問題についての実地・実態の調査・検証が依頼先が限定される等のため容易でないこと、問題が多岐にわたりまた多様であるため統合・統一的理解が容易でないこと等、多くの問題が存在するためと考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。実績および達成度の項にも記述のように、問題および発生の状況を実地・実際において確認・検証する、問題発生の状況・構造について種々の理論の総合・統合的解明を図ることに大きな注意を注ぎ、研究計画の完成を目指す。
ゴナドトロピンレセプターの機能とその調節

今まで理解されてきた視床下部からのGnRHと下垂体ゴナドトロピンによる中枢からの卵巣への調節と、末梢の卵巣からのステロイドホルモンによる下垂体へのフィードバック機構以外に、卵胞液より発見単離された生理活性物質が視床下部-下垂体-卵巣系の調節に関与する事が報告されている。インヒビン、アクチビン、フォリスタチンは卵巣内で、傍分泌、あるいは自己分泌作用をもち卵巣内のステロイド代謝に影響を及ぼすことが知られている。アクチビンが、ゴナドトロピンレセプターに対して誘導に促進的であることが報告され、されに我々はアクチビンがFSHレセプターのmRNAレベルでも単独で強力な誘導作用を持つことを示した。この結果は、アクチビンの作用機序フォリスタチンの合成調節を明らかにすることは卵胞発育の機序解明に重要と考えられた。フォリスタチンがアクチビンに結合しアクチビンのレセプター誘導作用を抑制することは示されているが、されにその作用機序の検討のためcAMP、PMAのフォリスタチンmRNAに及ぼす影響を検討し、cAMP,PMA共に、フォリスタチン合成に促進的であることをしめした。さらにアクチビンが最も強い促進作用を示したことから、アクチビンの自己制御作用の一部が明らかとなった。卵胞発育に対するゴナドトロピンによる制御は、既知の事実あるが、最近明らかとなってきた卵胞内の新しい生理活性物質によるゴナドトロピンレセプターに対する影響は、局所での細胞間相互作用に重要な意味を持つと考えられる。この機序の解明は卵巣内で単一の卵胞発育機序を解明する糸口になる。本研究では、これらの因子相互作用を独自にクローニングしたcDNAを活用し、分子生物学的手法を用いて検討した。
昆虫サイトカインレセプターの多様性の実証

分子生物学的手法と生化学的手法を用いてアワヨトウ幼虫血球細胞からGBPレセプタータンパク質または遺伝子の同定を試みた。まず、前者の方法は、血球細胞からcDNAを調製し、これらをアフリカミドリザル由来のCos7細胞で発現させ、その中からGBPと親和性を持つ膜タンパク質を提示している細胞をパニング法あるいはセルソーターによってスクリーニングし、最終的にGBPレセプター遺伝子の同定を試みるというものである。この方法によって血球由来のcDNAからGBPに特異的親和性を示す細胞膜タンパク質の遺伝子の同定に成功した。単離したcDNAフラグメントの全長は約1.6kbpで、アミノ末端側に細胞膜貫通ドメインが一ケ所存在する。現時点ではcDNA全長の塩基配列決定には至っていないが、これまで決定したcDNAフラグメント塩基配列の情報を基に、ORFの全長を明らかにすべく、RACE法によって5',3'両末端の一次構造を目指している。さらに、cDNAの全長のクローニングができ次第、再度Cos7細胞で発現させGBPとの結合の特異性を詳細に検討する必要がある。次に、生化学的手法を用いて、分子量77Kdaのレセプター候補細胞膜タンパク質(P77)の同定と単離に成功した。P77は、血球細胞をGBPで刺激すると数分以内にチロシンリン酸化される細胞膜一回貫通型膜タンパク質である。P77 cDNA(ORF:1,686bp)のクローニングの過程で、分子内に一部のDNA鎖欠失が観察される2種の相同遺伝子(ORFがそれぞれ1,368bpと957bp)が同定できた。この3種の遺伝子とも転写レベルでは血球細胞で発現していることを確認し、特に、P77mRNAは血球細胞のうち免疫活性が最も高いプラズマ細胞でのみ発現していることを証明した。P77遺伝子の膜外領域には、IgG様モチーフが存在し、また、細胞内領域にはITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)の存在が明らかになった。したがって、P77自体がGBPレセプターである可能性は十分あり得るため、現在、Cos7細胞やSL2細胞で発現し^<125>I-GBPとの直接結合性を証明すべく実験を続けており、まもなく結論付けられる。GBP(growth-blocking peptide)は多機能性をもうサイトカインである。多様な機能の中でも血球活性化と細胞増殖作用は代表的生理活性であり、それらに関わるレセプターは各々異なることが間接的に証明されている。この証明は、GBPの多機能性を多様なレセプターの存在によって説明する上でも重要な意味を持つ。今年度、私達は昆虫培養細胞(High five)とアワヨトウ幼虫血球細胞からGBPレセプターの単離を目指してきた。現在、大きくは二通りの方向からレセプターの単離を進めている。一方は、生化学的手法でGBPをリガンドにアフィニティークロマトグラフィーを基本にGBPに親和性を持つ細胞膜タンパク質を単離する方法。

もう一方は、培養細胞と血球細胞からcDNAを調製し、これらのcDNAをアフリカミドリザル由来のCos7細胞で発現させて、その中でGBPと親和性を持つ膜タンパク質を提示している細胞をスクリーニングすることによってGBPレセプター遺伝子を同定しようとする分子生物学的手法である。最近、前者の方法によって血球細胞からGBPレセプターと考えられる細胞膜タンパク質4種の単離に成1功した。各々、分子量は、106kDa、103kDa、95kDa、88kDaとなる。アフィニティークロマトグラフィーによって単離したこれらの4種のタンパク質が遊離のGBP(個定化していない)に結合するか否かを検定するために、結合競争阻害実験を行った。膜タンパク質可溶化画分を様々な濃度のGBPと共にインキュベーションし、それぞれをアフィニティークロマトグラフィーにかけ、詰合画分を解析した。その結果、GBP濃度依存的に結合阻害が起こることが確認できた。以上の結果は、4種の膜タンパク質がいずれもGBPレセプターである可能性を示している。現在、これらの単離タンパク質を電気泳動法によって精製し、その1次構造の決定を目指している。GBP (growth-blocking peptide)は多機能性をもつ昆虫から始めて同定されたサイトカインである。多様な機能の中でも血球活性化と細胞増殖作用はその代表的生理活性であり、それらの活性発現に関わるレセプターは各々異なることが間接的に証明されている。このことは、GBPの多機能性を多様なレセプターの存在によって説明する上でも重要な意味を持つ。本研究ではこの点を実証するために、昆虫培養細胞(HighFive)とアワヨトウ幼虫血球細胞からGBPレセプターの単離と構造決定を目指してきた。現在、大きく二通りの方向からレセプターの単離を進めている。一方は生化学的手法で、GBPをリガンドにアフィニティークロマトグラフィーを用いてGBPに親和性を持つ細胞膜タンパク質を単離する方法。もう一方は分子生物学的手法を用いる方法で、培養細胞や血球細胞からcDNAを調製し、これらをアフリカミドリザル由来のCos7細胞で発現させ、その中からGBPと親和性を持つ膜タンパク質を提示している細胞をスクリーニングすることによってGBPレセプター遺伝子の同定を試みるというものである。今年度は、後者の方法によって血球由来のcDNAからGBPに特異的親和性を示す細胞膜タンパク質の遺伝子の同定に成功した。単離したcDNAの全長は約1.6kbpで、アミノ末端側に細胞膜貫通ドメインが一ケ所存在する。今回、塩基配列を決定したcDNAフラグメントの情報を基に、ORFの全長を明らかにすべく、RACE法によって5',3'両末端の一次構造を目指している。さらに、cDNAの全長のクローニングができ次第、再度Cos7細胞で発現させGBPとの結合の特異性を詳細に検討する必要がある。GBP(growth-blocking peptide)は多機能性をもつ昆虫から始めて同定されたサイトカインである。
農耕地の土壌炭素貯留量推定とその変化予測手法の確立

1985年、2001年、2012年及び2013年の衛星データ、深さ030cmから採取した土壌試料から求めた炭素量を用いて農耕地土壌の炭素貯留量の推定を行った結果、可視域の反射率から土壌炭素貯留量を推定することが可能であった。次に衛星データから推定した土壌炭素量を炭素動態モデルRothCの初期の炭素量として将来の変化量予測値を計算した結果、初期値が大きい土壌は将来減少し、初期値が小さい土壌は増加する予測結果となった。また、同じ土壌タイプでも乾燥している土壌の方が将来減少する傾向が見られ、土壌炭素増減には暗渠排水の施工の有無が影響していることが示唆された。本研究は、リモートセンシングデータを活用した土壌炭素貯留量推定手法、および土壌炭素動態モデルを組み込んだ解析により貯留量の将来予測の手法を確立することを最終目的としている。H24年度は日本を代表する畑作地帯である北海道十勝地域を対象として土壌炭素貯留量の推定および変化量の把握を行い、以下の結果が得られた。(1)1985年と2012年に撮影された衛星画像とそれらに対応する実測調査データを用いて土壌炭素量の推定式を作成し、第1層の土壌炭素量を算出した。(2)母材、土壌、地形区分別の土壌炭素量の分布の特徴を調べた結果、母材区分では1985年、2012年共に同様の傾向が見られ、火山灰由来で85.2Mg/haと最も蓄積炭素量が多く、次いで火山灰/沖積由来で84.5Mg/ha、沖積由来では75.5Mg/haであった。火山灰由来が支配的な母材から沖積由来が支配的な母材になっていくにつれて炭素量は相対的に少なくなる傾向が確認された。土壌区分別に見た場合も、湿性黒ボク土で相対的に多く炭素量が蓄積されており、次いで褐色森林土、乾性黒ボク土、低地土の順に炭素量が多く、両年とも類似した傾向を示していた。地形区分別では、山麓地で炭素量が最大となり、扇状地性低地で最小であった。ローム台地では中位で炭素量が多く、次いで下位から上位に向かうにつれて炭素量が少なくなっていた。(3)27年間の炭素量の増減を調べた結果、火山灰由来、火山灰/沖積由来の農地で土壌炭素蓄積量が増加しており、沖積由来の農地では減少していることが確認された。地力保全基本調査では表層である第1層より第2層の方の全炭素率が高い地点が調査地点39地点中に16地点存在していた。2012年に実施した土壌断面調査においても、第1層に下層土が混合したケースが数箇所確認されている。近年、耕うん技術の発達によって作土深が深くなっていることからも、第1層よりも第2層で全炭素率が高いような場所では、表層土壌に深層土壌が混入することによって見かけ上炭素量が増加していることが推察された。土壌炭素貯留の現存量推定手法の精度向上を図るために、新たな調査地点を30地点程度追加し、各地点の深さ030cm土壌から試料を採取した。また、2013年5月に撮影されたSPOT6号の衛星データと表層土壌炭素量との関係式を用いて、対象地域全域について8m解像度で炭素量を推定しGISデータを併せてマップ化した。また、深さ1m程度までの土壌断面調査を数箇所で行い、これらのサンプルから、容積重、土壌炭素濃度をそれぞれ分析し、各調査地点の土壌炭素貯留量(現存量)を算出した。この圃場断面調査を実施した圃場の畑作経営において、有機物投入の実態調査を行なった。調査経営では、テンサイーバレイショーコムギーコムギーマメ類の5年4作の輪作のもと、コムギ連作後にエンバク緑肥とバーク堆肥(約2t/10a)の鋤き込みが行なわれるとともに、コムギ以外の残渣が全て圃場に鋤き込まれていた。また、20年前より暗渠施工による排水改良が行われていたこと、約10年前に客土が実施されていたことが明らかになった。以上の畑作経営の営農実態、および各作物の地域平均収量をベースに、改良版Roth-Cモデルを用いて土壌炭素量の推移をシミュレーションした。シミュレーション結果と現地における耕地/未耕地の断面調査データを比較したところ、調査地点によって推定値と実績値に異なる乖離が見られた。今後、全ての調査地点において、有機物投入実態調査を行ない、調査地点毎の推定を行なうことで予測精度の向上を図る予定である。2013年及び2001年5月に撮影された衛星データ、深さ030cmから採取した土壌試料から求めた炭素量データを用いて農耕地土壌の炭素貯留量の推定を行った。

その結果、両年ともに可視域の反射データから土壌炭素貯留量を推定することが可能であった。推定した炭素量の分布状況を母材区分別に広域に調べたところ、火山灰土壌で炭素貯留量が多い傾向が見られた。火山灰土壌はリン酸吸収係数が高いことからより多くの腐植物質を含んでいることが推察された。また、土壌区分別では、乾性黒ボク土より湿性黒ボク土の方が炭素量が多く、12年間の土壌炭素増減量は乾性黒ボク土よりも湿性黒ボク土の方が炭素量が減少していることが明らかとなった。次に衛星データから推定した土壌炭素量を炭素動態モデルRothCの初期の炭素量として将来の変化量予測値を計算した結果、初期値が大きい土壌(炭素量が多い)は将来減少し、初期値が小さい土壌(炭素量が少ない)は減少する予測となり、同じ土壌タイプでも乾燥している土壌の方が将来減少する傾向が見られた。さらに、土壌炭素貯留量の変化の要因を検討するために、未耕地(防風保安林、耕地防風林の土壌)と耕地(調査した保安林及び防風林と隣接する圃場)の土壌断面調査・土壌分析を行った。生産者への聞取り調査と併せて考察した結果、耕地化による土壌炭素増減には暗渠排水の施工の関与が高いなど、作物残差や堆肥等による圃場への炭素還元以外の要因が大きく影響していることが示唆された。そして耕地化に伴うその減少量は、対象地域における経済活動に伴う炭素放出量の約1.3年分程度に相当した。26年度が最終年度であるため、記入しない。農学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画していた、衛星データと現地実測データから表層の土壌炭素量を推定することに加えて、母材、土壌、地形区分別の変化量の把握を行ったこと、未耕地と耕地の土壌断面調査を行って炭素量の比較を行ったこと、炭素量が変化した要因特定のために生産者からの聞取り調査を実施したことなどの理由から、当初の計画以上に進展していると評価した。衛星データと現地調査データを用いて過去から現在までの炭素量を推定出来ていること、土壌断面調査や聞取り調査をベースにしてRoth-Cモデルを用いて土壌炭素量の推移をシミュレーションしたことから、研究は計画通りに進んでいる。衛星データを用いた土壌炭素量の推定精度の向上を図ること、土壌炭素貯留量の将来変化を見積るために、衛星データから推定したピクセルベースの土壌炭素貯留量を初期値として用い、RothCモデルによる土壌炭素貯留量の変化が計算可能になるような方法論を検討すること、将来予測のためのシナリオを行う。過去の衛星データを用いた土壌炭素量の推定精度を向上させ、2013年時点の炭素量との比較を行いその増減量を詳細に把握する。さらに、Roth-Cモデルによる土壌炭素量の推移をシミュレーション結果と実測値に乖離が見られたことから、その乖離幅を小さくするための手法を明らかにしていく予定である。衛星データの新規撮影リクエストを入れたが、良好な画像が取得できなかったので購入を断念した結果、次年度使用額が生じた。旅費:400,000円(米国の国際会議について研究成果を発表)謝金:1,100,000円(最終年度の研究とりまとめを行うために解析補助員が必要)
先天性チアノーゼ型心疾患におけるトロポニンTの発現様式の研究

先天性チアノーゼ型心疾患20例(ファロー四徴症19例、重症肺動脈狭窄1例)、非チアノーゼ型心疾患4例(心室中隔欠損及び肺動脈弁下部狭窄2例、大血管転位術後肺動脈狭窄1例、純型肺動脈狭窄術後肺動脈弁再狭窄1例)の右心室流出路心筋を用いて、トロポニンTの発現様式を検討した。RT-PCR法を用いてトロポニンTのcDNAを増幅し、得られたPCR産物の塩基配列解析を行って、アイソフォームの発現の程度を調べた。チアノーゼ型心疾患において、低酸素状態に適応するため、通常は優位ではない胎児型トロポニンT(アイソフォームTnT1)がより多く検出されるのではないかと予想していたが、いずれも成人型アイソフォーム(アイソフォームTnT3)のみ検出された、種々のPCR条件でトロポニンTの検出を行ったが、胎児型アイソフォームは得られなかった。今回胎児型トロポニンTが検出されなかったのは、実際に存在しないためか、抽出方法等に問題があったため不明であるが、過去にフォロー四徴症で胎児型トロポニンTの蛋白レベルの発現が認められたという報告があり、今後抽出方法等を再検討して研究を続行する予定である。先天性チアノ-ゼ性心疾患と、非チアノ-ゼ性心疾患の手術時の切除心室筋を用いて、cDNAレベルでトロポニンTのアイソフォームを検討した。チアノ-ゼ性心疾患としてファロ-四徴症4例、非チアノ-ゼ性心疾患として当初予定していた肺動脈狭窄の手術例がなく、心室中隔欠損1例、心房中隔欠損1例、さらに両者の移行症例として、大血管転位根治術後(心筋切除時チアノ-ゼなし)1例を検討した。心筋は切除後マイナス80度で凍結保存した。ホモジェナイズした心筋からmRNAを抽出し、逆転写反応でcDNAを作成した。トロポニンTのアイソフォームの差異を認める部分(30塩基対のエクソン)を領域に含むプライマーを設定し、polymerase chain reaction(PCR)を行った。チアノ-ゼ群、非チアノ-ゼ群、移行群各々において、PCR産物の泳動距離の差が認められなかった。さらに、ダイデオキシ法により、得られた産物の塩基配列を直接解析したが、いずれもトロポニンTの成人型アイソフォームのみ検出された。今回検討した結果が、実験手技の不備に起因するものなのか、実際にチアノ-ゼ型心疾患で胎児型のトロポニンTの残存がないことに起因するのかについては、さらに検体数を増やし、かつ反応条件(プライマーの調製等)を変えて検討中である。
富栄養湖沼における"不快昆虫"ユスリカの大発生とその防除対策-音響ライトトラップを用いたユスリカ成虫野外捕獲実験-

ユスリカ科の多くの種類は、雄が特定の地形的マーカーの周辺で蚊柱を形成し、そこへ飛来する雌と空中で交尾するという配偶システムを持っている。この時雌は、雄の発する羽音を手がかりに、同種の形成する蚊柱に確実に誘引され、同所的に分布する近縁種間の行動的生殖隔離を成立させている。本研究では「種特異的」な成虫の発する羽音を利用して、選択的に防除対象種であるユスリカ成虫の大量捕獲を試み、富栄養湖周辺で社会問題化しているユスリカ防除の対策研究に役立てようするものである。初年度は疑似羽音発信テープを用いて、オオユスリカの季節型と誘引される羽音について検討し、次年度はアカムシユスリカやクロユスリカの成虫に注目し、誘引された羽音と成虫の羽の長さ、蚊柱形成時の気温・照度・風力などとの関係について検討した。さらに、これまでに報告されている本邦のユスリカ種について、それぞれ誘引される羽音や測定時の気象条件についてまとめ、音を用いた防除に関する基礎データの整理を試みた。得られた結果は以下の通りである。1.夏(22.5°C)に発生するオオユスリカ成虫は270-300Hzに誘引されるが、秋(20.0°C)に発生するオオユスリカ成虫は300-330Hzに誘引され、誘引される羽音に違いのあることが明らかとなった。2.秋(14,0°C)に発生するアカムシユスリカ成虫はオオユスリカ同様大型種であるにもかかわらず150-180Hzに誘引され、蚊柱形成時間も日没前の3:005:00までの明るい時期であった。3.夏(23.0°C)に発生するクロユスリカ成虫は前二者に比べると非常に小型の種類であるが、240-270Hzに誘引されることが明らかとなった。本邦におけるこれまでの報告と、本研究の結果をまとめると、ユスリカ成虫が誘引される羽音は、成虫の大きさ(羽長や質重量)に依存するのではなく、蚊柱形成時の気温に強く影響されていることが示唆された。今後はこうしたデータを基に誘因源として光と音の組み合わせによって、効率の良い成虫大量防除法を検討していきたいと考えている。(1)諏訪湖におけるターゲット種の成虫発生予測:湖東岸に設置したライトトラップの調査結果より、湖沿岸からは18種類のユスリカ成虫が記録され、オオユスリカ,Einfeldia dissidens,アカムシユスリカの3種で、全体の86%を占めていた。オオユスリカは年3回の発生がこれまで知られていたが、年によっては年2回しか発生しないことが明らかとなった。E.dissidensは5-10月の間、継続的に発生しており、はっきりとしたピークは認められないのに対し、アカムシユスリカの場合は10-11月に大量発生のピークを持っていた。(2)ターゲットとなるユスリカ成虫の羽音の解析:湖から羽化したばかりのオオユスリカの雄、ならびに雌の羽音を実験室内で成虫体を固定して測定した。羽化日数で羽音に若干の違いはあるものの、雄で535.6±35,雌で285.6±39Hzであった。(3)ターゲット種についての疑似羽音発信テープの作成:オオユスリカ成虫について、雌や雄を誘引する疑似羽音を上記(2)に従ってオシロスコープを用いて作成した。同じ音を間隔無く発信し続けると、誘引される成虫の反応が鈍くなることが明らかとなったので、一定間隔で発信するテープを作成した。来年度の研究計画:上記で作成したテープを用いて行った予備実験の結果、雄の羽音で雌が、雌の羽音で雄が大量に誘引されることが観察された。来年度はこれをきちんとデータにすることと、誘引源としてこれまで用いられてきた光との組み合わせにより、より効率的な捕獲方法を模索していくことが考えられる。また、他のユスリカ類について、音による反応をオオユスリカ同様に検討していくことも重要な課題の一つである。

1.夏(22.5°C)に発生するオオユスリカ成虫は270-300Hzに誘引されるが、秋(20.0°C)に発生するオオユスリカ成虫は300-330Hzに誘引され、誘引される羽音に違いのあることが明らかとなった。2.秋(14,0°C)に発生するアカムシユスリカ成虫はオオユスリカ同様大型種であるにもかかわらず150-180Hzに誘引され、蚊柱形成時間も日没前の3:005:00までの明るい時期であった。3.夏(23.0°C)に発生するクロユスリカ成虫は前二者に比べると非常に小型の種類であるが、240-270Hzに誘引されることが明らかとなった。本邦におけるこれまでの報告と、本研究の結果をまとめると、ユスリカ成虫が誘引される羽音は、成虫の大きさ(羽長や質重量)に依存するのではなく、蚊柱形成時の気温に強く影響されていることが示唆された。今後はこうしたデータを基に誘因源として光と音の組み合わせによって、効率の良い成虫大量防除法を検討していきたいと考えている。
夜間のストレスが子どもの概日リズムと心身の健康に与える影響の究明

これまでに得た調査データを分析し、以下の結果を得た。1-A.幼児の保護者を対象に行った調査で、ストレスを感じる様子の見られる幼児が最も多い時間帯は夕方であった。いずれの時間帯でもストレスを感じる様子がない幼児は、朝型で心身の不調の頻度が低かった。B.朝食を毎日定時に、栄養バランスのよい朝食をとっている幼児は心身の不調が少なかった。また、朝食での納豆摂取の幼児の朝型化効果は、朝食でのトリプトファン摂取量増加によると示唆する結果を得た。2幼児と保護者の概日タイプ度の差が小さいほど、幼児の休日の就寝時刻は遅く、休日の朝に寝坊する傾向がみられ、大人と子供の生活時間を分けることで、子どもの睡眠衛生が保たれることが再確認された。3幼児教育に携わる保育士・幼稚園教諭のバーンアウト傾向と概日タイプの関係を調査したところ、バーンアウト傾向の高い者は、起床に関するスコアが夜型化し、就床に関するスコアが朝型化することで、休息期が伸びる傾向が見られた。4学生を対象に行った調査では、夜間に活動する学生のうち、その活動で強いストレスを感じる学生は夜型で、平日の睡眠時間が長かった。ただし、身体運動を伴う活動では、趣味で行う緊張状態を伴う夜間の運動は夜型化を引き起こすが、学生アスリートでは、夜間、心理的刺激を受ける運動が朝型化を起こす可能性が示唆された。音楽の嗜好とストレス傾向、概日タイプ度に関連が見られ、特に、激しい曲調を好んで聴く学生では、夜型生活や睡眠習慣の乱れによりストレス傾向が高まると、ストレス解消や励ましを求めて音楽を聴く傾向があることが示唆された。以上の通り、生活リズムの乱れとストレスの間には強い関連があり、心身の不調を引き起こすこと、特に夜間の強いストレスは体内リズムを乱す可能性が示唆された。子どもたちの心身の健康維持には、夜間の過ごし方にも注意を払うことが必要である。本年度は、幼児、大学生、中学生を対象に、生活リズム、夜間の活動や心身の不調に関する調査を実施した。大学生を対象に行った質問紙調査の結果からは、夜間の活動に関する分析の結果、夕方以降の活動で日常的に強いストレスを受けていると回答した学生は他の学生より夜型で、夜間頻尿などの不調を訴える者が多い傾向が見られており、夕方以降の強いストレスは、夜型化と心身の不調を招く可能性が示唆された。学生の運動習慣に関する分析からは、同じく夜間に実施するトレーニングでも、格闘技など、強度や心理的負荷の高い種目では、他の種目より精神衛生が悪い傾向が見られており、時間帯や強度、心理的負荷の違いにより、運動が健康に及ぼす影響が異なることが示唆された(いずれも、学会発表済み)。子どもたちは部活や学習塾通いなど、夕刻以降も様々な活動をするが、彼らの健康を守るためにも、それらの活動で高頻度に過度なストレスがかからないような配慮が必要である。また、前年度に学生アスリートを対象に予備的に行っていた調査結果の分析から、学生選手の競技パフォーマンス自己評価には、身体能力・競技技能だけでなく、社会的スキルの要素である感情処理能力やストレス対処能力などの競技に関わる精神的要因、また、基本的生活習慣の確立が影響することが示唆された(学会発表済み)。この学生アスリートの調査に関しては、同様の調査を16年度にも実施しており、かつ、両年度の間で彼らがトレーニングを行う時間帯が変化していることから、今後は運動時間帯の変化による影響の分析を実施予定である。同様に、前年度に小学校で実施した調査の分析から、生活改善の取り組みによって、平日の睡眠時間が延びた児童の算数の成績が改善した、という結果が得られた。夜型で睡眠時間が短縮しがちな児童にとって、生活改善による睡眠時間の増加は学業成績改善に役立つことが実証された(学会発表済み)。これまでに蓄積してきた生活リズムに関する膨大なデータと、前年度までに行っていた予備調査等の結果の分析をもとに第一回目の調査で使用する質問紙を作成した。協力校園との関係は概ね良好であり、これらの校園の協力が得られたことから、16年度は、大学生、幼児、中学生を対象に、夕方以降の活動や生活リズムに関する第一回目の生活習慣質問紙調査を実施済みである。ただし、協力校の都合により、16年度は小学校での調査は実施できていない。大学生の調査では、さらに、運動習慣についての調査も実施している。一部は分析を終えて結果を学会発表済みである。また、残りのデータも分析中で、17年度には学会発表、論文発表を予定しており、研究は順調に進展している。また、16年度の調査の分析結果から、17年度に行う調査の方向性の検討も実施済みである。特に、研究が進展している部分として、学生アスリートの調査については、15年度と同様の調査を16年度にも実施しており、かつ、両年度の間でトレーニング時間帯が変化していること、記号による個々のデータの対照が可能なことから、最終年度に予定していた、トレーニング実施時間を変化させて影響を調査する、介入研究と同様の分析が可能なデータを得ることができたことである。これまでに実施した質問紙調査データから、以下のような結果を得た。1大学生の調査データの分析から、午前中にストレスを感じる学生は、感じない学生より夜型で、甘い菓子などの間食を摂取する頻度が高かった。夜型化によるコルチゾールリズムの乱れにより、午前中のストレス感受性が高まり、午前中に強いストレスを感じることで、夕方以降のコルチゾールレベルの低下に影響が出る、という悪循環が起こっている可能性が示唆された。

2幼児を対象に行った調査データより、夜遅い時間帯に活動する幼児は、しない幼児に比べて夜型になるが、特に、運動する幼児では、運動中に興奮したり緊張したりする様子が見られる幼児の方が、そのような様子が見られない幼児に比べて、強い夜型化が見られるという結果が得られた。3学生を対象に行った調査データから、運動頻度と運動中の心理状態の違いによって、夕方以降に行う運動と概日リズムの関係が異なると言う結果が得られた。また、中学生を対象に行った調査データより、夜間の活動で慢性的に強すぎるストレスを感じている生徒では、その時刻が遅くなると、概日位相の夜の位相ポイントが前進し、睡眠時間を延ばす方向の変化が起きる可能性が示唆された。42015-16年度に学生アスリートに行った調査データの分析から、調査前後で主な練習開始時間帯を夕方から朝6時台に変更した学生では、睡眠時間が短縮したものの、概日タイプ度が朝型になり、心身の不調項目の合計数が減少していた。(いずれも学会発表済)また、29年度は、幼児(の保護者)を対象に、幼児が最もストレスを感じていると思われる時間帯について問う項目を新しく追加した質問紙による調査を、予定の2倍以上の2700名超を対象に実施、1800名超から回答を得ることができた。大学生でもふだんストレスを感じることが多い時間帯についての項目をふくむ質問紙による調査を行った。2016年度までに実施した調査データの分析を進め、学会発表など、順調に成果発表を実施している。また、2016年度に引き続き、2017年度も幼児・大学生で質問紙調査を実施し、データの更なる蓄積を図ることができた。質問紙には、昨年度までの調査結果から得られた、夜間活動を行う時間帯が同じでも、心理的負担を感じているかどうかで、その影響が異なるという結果に基づいて、新たに、活動を限定せず、日常生活でストレスを感じることが多い時間帯(強度・頻度を含む)についての項目を追加した質問項目が含まれている。小学生での調査は実施できなかったが、幼児で2015年度の倍にあたる規模の調査を行い、回答を得て、充分なデータの蓄積を図ることができた。大学生では、夕方以降の活動、運動習慣に加えて、日常生活でストレスを感じる時間帯とその頻度と程度、原因についての項目を含む質問紙調査を実施しており、日常、夜間に受けるストレスの影響について、詳細な分析を行うことが可能である。さらに、2015-16年度に、トレーニング時間の変更を挟んで学生アスリートを対象に、前後データを対照できる形で行った調査のデータの分析を行い、トレーニング時間の変更がもたらす影響の検討を行うことができた。さらに、この調査では、同時に、競技力の自己評価尺度の調査を実施していることから、引き続き、トレーニング時間が競技パフォーマンスに与える影響の分析も行う予定である。以上のように、蓄積したデータをもとに、学会発表、論文の学術誌への掲載を行うための作業も順調に進んでいる。これまでに得た調査データを分析し、以下の結果を得た。1-A.幼児の保護者を対象に行った調査で、ストレスを感じる様子の見られる幼児が最も多い時間帯は夕方であった。いずれの時間帯でもストレスを感じる様子がない幼児は、朝型で心身の不調の頻度が低かった。B.朝食を毎日定時に、栄養バランスのよい朝食をとっている幼児は心身の不調が少なかった。
新しいアルツハイマー病関連遺伝子LRP1Bの研究

LRP1Bによるシグナル伝達機構を明らかにするために、LRP1Bの細胞内部分に結合する蛋白質を酵母Two Hybrid法によりスクリーニングした結果、JNKシグナル伝達因子群のスカフォールドとなるJIP-1b、PZDドメインを持ち膜蛋白質の局在にかかわるPICK1、低分子量G蛋白質のRanBP9、などが単離された。種々の欠失変異体やアミノ酸置換変異体の解析から、LRP1Bは、C-末端の疎水性アミノ酸領域でPICK1のPZDドメインと結合し、またNPXYモチーフでJIP-1bと結合することが明らかになった。これらの結合様式は、既に知られているPICK1やJIP-1bと他の蛋白質との結合様式と一致しており、LRP1Bとの結合が生理的な意味を持ちうる可能性を強く示唆した。そこでまず、JIP-1bがJNKのスカフォールドとして機能し、JNK活性を変化させるか検討した。293T細胞をUVで刺激しJNKを活性化させる条件でJIP-1bを強制発現させたが、JIP-1bの有無によりJNKの活性化状態に大きな変化は見られなかった。次に、グルタミン酸受容体の細胞内取り込みをPKCα依存的に促進するPICK1について、同様の活性をLRP1Bに対して示すか、293T細胞の細胞表面に発現させたLRP1B受容体をビオチン化して細胞内取り込みを定量した。PICK1の発現の有無に関係なく、LRP1Bの細胞取り込みは非常に遅かった。このため、LRP1Bと非常に良く似たLRP1について同様な検討を行なった。LRP1はLRP1Bよりもずっと強くJIP-1bとPICK1に結合した。また、LRP1は、LRP1Bに比較し非常に早い速度で細胞内へ取り込まれた。以上の結果から、LRP1BとLRP1は非常に良く似た分子であるにかかわらず、受容体として異なる挙動をとることが明らかになった。マウス脳内でのLRP, LRP1B, gp330/Megalinの分布と相対的な量を明らかにするために、我々が作成したマウスLRP1Bに対するウサギ抗血清を用いて、脳のWestern Blottingと免疫組織染色を行ったが、いずれの場合も明瞭なシグナルが得られなかった。そのため、この抗血清を、硫安沈殿し免疫グロブリン画分を精製する、あるいはプロテインAカラムによる精製を行った後に再度検討することとした。LRP1Bによる、シグナル伝達機構を明らかにするために、LRP1Bの細胞内部分に結合する蛋白質の遺伝子を酵母Two Hybrid法によりスクリーニングした。この結果、JNKシグナル伝達因子群のスカフォールドとなるJIP-1bとJIP-2、PZDドメインを持ち膜蛋白質の局在にかかわるPICK1、低分子量G蛋白質のRanBP9、SH2ドメインをもちErbB2のシグナル伝達に関るGrb7が単離された。種々の欠失変異体やアミノ酸置換変異体の解析から、LRP1Bは、C-末端の疎水性アミノ酸を多く含む領域でPICK1のPZDドメインと結合し、また細胞内部分のNPXYモチーフでJIP-1bと結合することを明らかにした。これらの結合の仕方は、既に知られているPICK1やJIP-1bと他の蛋白質との結合様式と一致しており、LRP1Bとの結合が生理的な意味を持ちうる可能性を強く示唆している。今後は、JNK活性の測定や、LRP1B蛋白質の局在に及ぼすPICK1蛋白質の効果について培養細胞を用いた形質転換の系で解析する。LRP1Bのヘテロ変異マウスを掛け合わせて、LRP1B欠損マウスを作成した。欠損マウスは正常に成長し、交配して子孫を残すことができた。今後は、脳内のアミロイドβペプチドの量を、正常と変異マウスの老化の進行を追いながらELISAにより解析する。

また、LRP1は、LRP1Bに比較し非常に早い速度で細胞内へ取り込まれた。以上の結果から、LRP1BとLRP1は非常に良く似た分子であるにかかわらず、受容体として異なる挙動をとることが明らかになった。
虚血性脳障害におけるα2アゴニストと低体温の併用効果に関する研究

ラット一過性脳虚血モデルを用いてα2アゴニスト(デキサメデトミジン:以下Dex)と軽度低体温併用療法の脳保護効果を、神経学的及び組織学的所見(平成11年度)、脳内グルタミン酸遊離(平成12年度)、脳内ノルエピネフリン遊離(平成13年度)の見地から検討した。ハロタン麻酔下の雄Sprague-Dawleyラット(300-400g)の内頸静脈(脱血用)および尾動脈(血圧測定用)にカテーテルを留置した。ラットを対照(C)群(側頭筋温37.5°C+生理食塩水1ml/kg)、Dex(D)群(37.5°C+Dex3μg/kg)、低体温(H)群(35°C+生理食塩水1ml/kg)、Dex+低体温(DH)群(35°C+Dex3μg/kg)の4群に分け、それぞれ生理食塩水またはDexを脳虚血30分前に皮下注した。脱血による低血圧(収縮期血圧45-50mmHg)および両側頸動脈閉塞により前脳虚血状態(平坦脳波)とし、10分後、頸動脈閉塞解除および返血により再灌流を行った。【平成11年度】虚血1週間後の神経学的所見ではDH群がD群より有意に障害が軽度であった。海馬CA1生存細胞数はH群がC群より有意に多かったが、D、DH群はC群と差がなかった。【平成12年度】横軸に時間、縦軸にマイクロダイアリシスにより測定した海馬CA1グルタミン酸濃度をとったグラフにおける虚血中のarea under the curveは、H群がDH群より有意に小さかった。【平成13年度】虚血開始前値に対する虚血後の線条体ノルエピネフリン濃度上昇率は、H群が他の3群より有意に低かった。【結論】一過性前脳虚血に対する軽度低体温の脳保護作用がDexの併用により減弱することが示された。軽度低体温の一過性前脳虚血後の脳内グルタミン酸およびノルエピネフリン遊離抑制作用が、Dex併用により減弱することがその機序として示唆された。ラット一過性脳虚血モデルを用いてα2アゴニスト(デキサメデトミジン:以下Dex)と軽度低体温併用療法の脳保護効果を神経学的並びに組織学的に検討した。雄Sprague-Dawleyラット(300-400g)16匹をハロタンで麻酔導入した後気管内挿管し、内頚静脈(脱血用)および尾動脈(血圧測定用)にカテーテルを留置した。ラットを各群4匹ずつ対照(C)群(側頭筋温37.5°C+生理食塩水1ml/kg)、Dex(D)群(37.5°C+Dex3μg/kg)、低体温(H)群(35°C+生理食塩水1ml/kg)、Dex+低体温(DH)群(35°C+Dex3μg/kg)に分け、それぞれ生理食塩水またはDexを脳虚血30分前に皮下注した。

脱血による低血圧(収縮期血圧45-50mmHg)および両側頸動脈閉塞により前脳虚血状態とし、10分後、頸動脈閉塞解除および返血により再灌流を行った。生理食塩水またはDexを脳虚血3、12、24、48時間後に同量皮下注した。虚血24、48時間および1週間後に神経学的検査(異常なし=0点、最重症=100点)を行った。虚血1週間後にホルマリンにて脳を灌流固定し、ヘマトキシリン-エオシン染色を行った。神経学的検査では、虚血24、48時間後および1週間後の点数が、C群:32点、23点、11点、D群:28点、32点、15点、H群:6点、6点、16点、DH群:23点、12点、8点であり、虚血24時間後ではH群が他の3群より低く、48時間後ではH、DH群が他の2群より低かったが、1週間後ではDH群が他の3群よりも低かった。組織学的検査では海馬CA1領域、大脳皮質、尾状核の生存細胞数が低体温群(H群、DH群)で多かった。結論として、α2アゴニストと軽度低体温の併用療法はそれぞれの単独療法と比較すると、一過性脳虚血から1週間後の神経学的および組織学的予後を改善させた。ラット一過性前脳虚血モデルを用いてα2アゴニスト(デキサメデトミジン;以下Dex)と軽度低体温併用療法の脳保護効果を脳内グルタミン酸遊離に及ぼす影響から検討した。雄Sprague-Dawleyラット(300-400g)24匹をハロタンで麻酔導入後気管切開し、尾動脈(血圧測定・採血用)、右頚静脈(薬物投与、輸液、脱血用)にカテーテルを留置した。側頭筋に脳波電極および体温測定プローブを挿入した。脳定位的にグルタミン酸測定用酵素電極を海馬CA1に刺入した。ラットを対照(C)群(側頭筋温37.5°C+生食1ml/kg)、Dex(D)群(37.5°C+Dex3μg/kg)、低体温(H)群(35°C+生食1ml/kg)、およびDex+低体温(DH)群(35°C+Dex3μg/kg)の4群に分け、各群(n=6)において体温を所定の値に調節後、生食または薬物を脳虚血の30分前に皮下注した。両側頚動脈閉塞と脱血による低血圧(収縮期血圧45-50mmHg)により前脳虚血状態(平坦脳波)とし、10分後、両側頚動脈閉塞解除と返血によって脳の再灌流を行った。マイクロダイアリシスバイオセンサーシステム(EES-800)にて、前脳虚血開始から虚血1時間後まで脳内グルタミン酸濃度を測定した。すべてのラットにおいて前脳虚血開始とともに海馬CA1グルタミン酸濃度は上昇し、数分でほぼプラトーに達し、再還流開始により徐々に基線まで低下するという経過をたどった。横軸に時間、縦軸にグルタミン酸濃度をとったグラフにおける虚血開始から終了までのarea under the glutamate concentration curve (μM・sec)は、C群:8978±1379、D群:9873±3530、H群:4333±431、DH群:5047±566と、HおよびDH群がCおよびD群と比べ小さかった。結論として一過性前脳虚血に伴う海馬CA1領域のグルタミン酸濃度上昇は、低体温単独療法およびα2アゴニストと低体温の併用療法において抑制された。ラット一過性前脳虚血モデルを用いてα2アゴニスト(デキサメデトミジン;以下Dex)と軽度低体温併用療法の脳保護効果を、脳内ノルエピネフリン(NE)遊離に及ぼす影響から検討した。雄Sprague-Dawleyラット(300-400g)24匹をハロタンで麻酔導入後気管切開し、尾動脈(血圧測定・採血用)、右内頚静脈(薬物投与、輸液、脱血用)にカテーテルを留置した。脳定位的にマイクロダイアリシスプローペを線条体に刺入した。
糖尿病における海馬機能低下の腎不全による修飾：小胞体ストレスの関与

近年、慢性腎臓病(CKD)が認知機能低下に関連することが報告されている。海馬は記憶形成において重要な役割を演じている。本研究では、CKDマウス海馬におけるストレス関連タンパク質の発現変化を検討した。脂質過酸化マーカーである4-hydroxynonenal付加タンパク質のCKDマウス海馬における発現レベルは、5/6腎摘出8週間後に有意に増加した。また、小胞体ストレスマーカーである78-kDa glucose-regulated proteinの発現が、CKDマウス海馬では増加した。以上より、酸化的ストレスだけでなく、小胞体ストレスも、CKDマウスの認知機能障害に寄与することが示唆された。近年、糖尿病は鬱病や認知症といった海馬の機能低下が関与する疾患を誘発・増悪する要因の1つであることが示唆されるものの、そのメカニズムについては不明なままである。本研究は、この糖尿病による海馬機能低下のメカニズムを、糖尿病に伴う腎不全が海馬機能低下を増悪する病態修飾因子となる可能性について検証することで解明する。特に、研究代表者がこれまでに見出している小胞体ストレス抑制薬を用い、小胞体ストレスが病態モデルマウスのシナプスの変性や海馬機能低下に及ぼす役割を精査するとともに、治療薬開発の可能性についても検証する。また、小胞体ストレス可視化マウスを用いて作製した病態モデルマウスの海馬においても小胞体ストレス応答のイメージングを行うことから、小胞体ストレスを起点とした解明を行うことを目的とする。本年度は、腎臓の5/6を摘出した慢性腎不全モデルマウス(CKDマウス)の海馬における小胞体ストレス関連因子の発現変化について検討した。しかし、先行研究で示されているような記憶障害を示すCKDモデルマウスの作製に苦慮した。また、マウス海馬神経細胞由来HT22細胞を用いたin vitroモデルにより小胞体ストレス抑制薬の検索を行ったところ、これまでに報告されているような化合物よりも強い保護効果を示す化合物を見出すことに成功した。次年度は、引き続きCKDマウスでの小胞体ストレス関連因子の発現変化について解析するとともに、本年度見出した小胞体ストレス抑制薬が及ぼす影響をモデルマウス等で検討する予定である。本研究は、糖尿病に伴う腎不全や慢性腎不全が海馬機能低下を増悪する病態修飾因子となる可能性について検証することを目的にする。なかでも、記憶の形成に重要な役割を演じている海馬神経細胞に着目し、小胞体ストレスを起点としたした病態メカニズムの解明を行うとともに、治療薬の開発の可能性を検証することを目的とする。本年度は、腎臓の5/6を摘出した慢性腎不全モデルマウスの海馬および小脳における小胞体ストレス関連因子(GRP78、GRP94、caspase-12、CHOPなど)およびシナプス構成タンパク質(PSD-95、SNAP-25、synaptophysinなど)の発現レベルの変化をWestern Blot法により解析した。また、小胞体ストレス抑制作用を有することを報告しているS-allyl-L-cysteine(SAC)に化学修飾を加えた化合物を合成し、初代培養ラット海馬神経細胞を用いてその効果を検証したところ、S-propyl-l-cysteineがSACよりも強力な小胞体ストレス誘発細胞死抑制作用を示すことを見出した。さらに、マウス海馬由来HT22細胞を用いたin vitroモデルに尿毒症の原因物質が小胞体ストレス関連因子の発現に及ぼす影響をWestern Blot法により検討した。加えて、昨年度見出した小胞体ストレス抑制作用を持つ化合物については、日本大学産官学連携知財センター(NUBIC)を介して特許出願を行った。CKDによる尿毒症の原因物質(尿素、クレアチニン、副甲状腺ホルモン、ミオイノシトール、β2ミクログロブリンなど)のマウス海馬由来HT22細胞への暴露によるPSD-95および小胞体ストレス関連因子の発現変化をWestern Blot法により検討した。その結果、短期曝露で、小胞体ストレスを誘発する物質は認められなかった。また、腎臓の5/6を摘出した慢性腎不全モデルマウス(CKDマウス)の海馬および小脳における小胞体ストレス関連因子の発現変化について、Western Blot法で検討した。海馬ではGRP78およびGRP94の発現が顕著に増加したが、小脳では変化は認められなかった。同様にシナプス構成タンパク質の発現も検証したが、海馬、小脳とも顕著な発現変化は認められなかった。さらに、研究代表者がこれまでに小胞体ストレス抑制作用を持つことを報告しているS-allyl-L-cysteine (SAC)の修飾体を化学合成し、培養海馬神経細胞を用いてその効果を検証したところ、S-propyl-l-cysteineのような既存のSACより強い細胞保護効果を示す化合物を見出した。加えて、昨年度見出した小胞体ストレス抑制作用を持つ化合物については特許出願を行った。本年度は、腎不全による海馬機能低下における小胞体ストレスの関与を詳細に検討するとともに、新規に見出した小胞体ストレス抑制薬のメカニズムについて検討した。昨年度までの検討により慢性腎不全モデルである5/6腎臓摘出マウス(CKDマウス)の海馬で上昇することが明らかとなったストレス関連タンパク質の発現レベルと血液生化学検査値との関係について検証した。その結果、海馬では、小胞体ストレスのマーカータンパク質であるglucose-regulated protein 78(GRP78)や酸化ストレスのマーカータンパク質である4-hydroxynonenal (HNE)付加タンパク質の発現レベルが、腎機能のマーカーである血清Blood Urea Nitrogen値や血清Creatinine値に相関して増加することが明らかになった。