hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺高血圧における肺動脈病変の血管内腔および血管壁観察ツールの開発

(2)肺高血圧症動物モデルにおける小肺動脈病変・肺動脈主幹部病変・右心機能の検討では、右室リモデリングは肺高血圧症早期から線維形成、血管周囲リモデリング、毛細血管の粗鬆化とアポトーシスを通して生じ、eNOS経路やコラーゲン代謝が関与している可能性が示唆された。<I>肺高血圧症患者におけるOCTイメージングワイヤーを用いた肺動脈病変の検討心臓カテーテル検査を施行した肺高血圧症患者(n=12)を対象とした。特に慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者(n=3)においては、OCTイメージングワイヤーにより血流を阻害していると思われる、特異的な網目状のweb像が得られた。この部分に対して経皮的肺動脈形成術を施行し、治療前後で以下の項目を検討した。1.自覚症状(WHO機能分類、身体活動能力指数:Mets)、2. BNP・血清尿酸値、3.罹患歴・治療歴、4.心臓カテーテル検査での血行動態(PCWP, PAP, RVEDP, RAP, CIなど)自覚症状は、半数がWHO機能分類III,IVであったが、全員がWHOIIに改善した。治療薬については、エポプロステノールの持続静注を7例で行っていたが、全例で中止し経口ベラプロスト製剤に変更出来た。またBNPや心臓カテーテル検査での血行動態(mPAP, RAP, CI, PVR)で有意な改善が認められた。今後も引き続きOCTイメージングワイヤーを用いて肺高血圧症患者における肺動脈病変の検討を継続していく。<II>肺高血圧症動物モデルにおける小肺動脈病変・肺動脈主幹部病変・右心機能の検討肺高血圧症動物モデル(低酸素誘発性肺高血圧症マウス、モノクロタリン誘発性肺高血圧症ラット)を用いて、肺動脈病変を作成し、生体内で肺動脈圧がかかった状態での小肺動脈病変の程度・肺動脈主幹部の血管径・ミラーカテーテルを用いた右心機能を比較検討中である。現在までに肺高血圧症患者(n=79)に対して心臓カテーテル検査並びにOCTイメージングワイヤーを施行することができた。特に慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者(n=22)においては、OCTイメージングワイヤーにより血流を阻害していると思われる、特異的な網目状のweb像が得られた。また、同部位に経皮的肺動脈形成術を施行することで、肺高血圧症が改善することも確認できた。薬物療法のみでは8名がWHO機能分類III,IVであったが、経皮的肺動脈形成術を施行することで全8例がWHOIIに改善した。エポプロステノールを導入しても、5年生存率60%と報告されている肺高血圧症患者において、今回の結果は有意義なものであると考える。また、肺高血圧症動物モデルにおける小肺動脈病変・肺動脈主幹部病変・右心機能の検討も継続していく。現在までに肺高血圧症患者(n=12)に対して心臓カテーテル検査並びにOCTイメージングワイヤーを施行することができた。薬物療法のみでは半数の6名がWHO機能分類III,IVであったが、経皮的肺動脈形成術を施行することで全12例がWHOIIに改善した。
コオロギの闘争行動において発達する神経修飾モデルと社会適応

本研究ではセロトニン神経の挙動について,数理的研究および実験的研究を行った.1.力学系によりセロトニン神経の数理モデルを構築した.モデルの構築の方針は,薬力学,薬物動態学の記述方法に基づいて行った.このモデルを安定性,過渡過程について解析を行ったところ,自己受容体結合能の低下により特徴的な2つの現象が発生する可能性が示唆された.1つは,細胞膜上の自己受容体量の安定状態に分岐が生じ,自己受容体量が多い状態と少ない状態の2つの状態がそれぞれ安定に存在しえるようになること.またもう1つは,自己受容体結合能の低下が自己受容体量の増加を引き起こし,この増加した状態から元の状態に戻るまでの過程に数日単位の長時間を要することである.またこの過渡過程は自己受容体阻害剤によって短くすることが可能であることも示された.数理モデル上,自己受容体量の増加はセロトニン放出量の低下に繋がることが示される.これらの結果は抑うつ病に関する過去の研究結果とよく合致する.2.数理的な解析結果を検証するために,生物実験を行った.本研究で用いる実験動物としてはクロコオロギを用いる.クロコオロギでは,敗北を経験した個体は他個体から逃走する傾向があるが,この敗北経験が2日から3日持続することが報告されている.第1回目の闘争を行わせる前に,ペアを組ませる個体のそれぞれに対して同量のセロトニン自己受容体5-H1IA選択的アンタゴニスト(WAY100635)を頭部へ注入した.第1回目の闘争の後6時間経った時点で,敗北個体がどれだけ影響を残しているか調べるため行動実験を行った.その結果,6時間後の時点で闘争行動が有意に回復していることを確認した.採用期間の後半,実験動物がvirus感染し予定の実験数を行うことが困難となったため,実験計画について若干の変更を行った.上述した実験動物のvirus感染について,状況が改善しつつあるため,改善次第当初の予定を進める.また,遅滞していた期間,当初の計画に含まれていた理論的部分を主に進めていたため,当初の計画に含まれていた実験以外に,いくつかの実験を提案することができるようになっている.以上のように,今後実験的な取り組みに移ることで当初の実験計画を遂行できる.本研究の目的は,コオロギにおいて社会的構造が内部状態(セロトニン)に与える影響の解明と,特にロボットを用いた社会的構造の制御である.平成22年度は,社会構造がコオロギ内部のセロトニン量に与える影響の解明を重点的に行った.本研究では種間の比較考察から,セロトニン仮説(5-HT仮説)によってコオロギの社会行動が調節されているという仮説を設定し,その仮説の妥当性検証を行った後,5-HTシステムの制御方法を確立するというアプローチをとっている.平成22年度は,5-HT仮説の数理モデルを構築し,力学的安定性と記憶効果の2側面から数学的に解析した.また共同研究をしている生物学者と共に,記憶効果について生物学的な検証実験を1つ行った.数理モデルの安定性については,力学的安定点の解析を行った結果,コントロールパラメータが少なくとも3つあり,不完全型超臨界Pitch-Fork分岐を発生する構造であることを明らかにした.今後,数理モデルの生物学的妥当性及び,更なる数学的解析を加えて行く予定である.次に,モデルの揺動に対する記憶効果について解析を行ったところ,5-HTが一旦何らかの影響で減退すると,その減退が2週間程度持続することを示した.上記の2つの解析のうち,特に後者について生物学的な検証を行った.5-HT1A選択的阻害剤を投与することによって,この持続時間が1024時間程度に短縮されることを示唆した.これらの解析を受けて,特に記憶効果の薬剤に対する応答について生物学的検証実験を行った.その結果,モデルの予測通り,記憶時間の大幅な短縮を確認した.本研究ではセロトニン神経の挙動について,数理的研究および実験的研究を行った.1.力学系によりセロトニン神経の数理モデルを構築した.モデルの構築の方針は,薬力学,薬物動態学の記述方法に基づいて行った.このモデルを安定性,過渡過程について解析を行ったところ,自己受容体結合能の低下により特徴的な2つの現象が発生する可能性が示唆された.1つは,細胞膜上の自己受容体量の安定状態に分岐が生じ,自己受容体量が多い状態と少ない状態の2つの状態がそれぞれ安定に存在しえるようになること.またもう1つは,自己受容体結合能の低下が自己受容体量の増加を引き起こし,この増加した状態から元の状態に戻るまでの過程に数日単位の長時間を要することである.またこの過渡過程は自己受容体阻害剤によって短くすることが可能であることも示された.数理モデル上,自己受容体量の増加はセロトニン放出量の低下に繋がることが示される.これらの結果は抑うつ病に関する過去の研究結果とよく合致する.2.数理的な解析結果を検証するために,生物実験を行った.本研究で用いる実験動物としてはクロコオロギを用いる.クロコオロギでは,敗北を経験した個体は他個体から逃走する傾向があるが,この敗北経験が2日から3日持続することが報告されている.第1回目の闘争を行わせる前に,ペアを組ませる個体のそれぞれに対して同量のセロトニン自己受容体5-H1IA選択的アンタゴニスト(WAY100635)を頭部へ注入した.第1回目の闘争の後6時間経った時点で,敗北個体がどれだけ影響を残しているか調べるため行動実験を行った.

その結果,6時間後の時点で闘争行動が有意に回復していることを確認した.採用期間の後半,実験動物がvirus感染し予定の実験数を行うことが困難となったため,実験計画について若干の変更を行った.上述した実験動物のvirus感染について,状況が改善しつつあるため,改善次第当初の予定を進める.また,遅滞していた期間,当初の計画に含まれていた理論的部分を主に進めていたため,当初の計画に含まれていた実験以外に,いくつかの実験を提案することができるようになっている.以上のように,今後実験的な取り組みに移ることで当初の実験計画を遂行できる.
近接場光学とその応用

日本側の研究者全員がソウル国立大学を訪問(平成7年8月30日9月2日)し、相手側のJhe博士と全体構想、当面の問題点などについて議論した。さらに、堀裕和(およびその研究協力者、学生)が再度訪問(平成7年12月11日12月16日)し、理論関係の詳細議論を行った。この他、Jhe博士の来訪時の討論、さらには日本側の研究者間の国内の討論を行った。これらにより以下の成果を得た。(1)エバネッセント光の理論大津はエバネッセント光の特性を評価するための近接場光学顕微鏡装置を開発した。まず、化学エッチング法により、ガラスファイバのコアを先鋭化し、その後金属膜を蒸着して開口を作成した。これにより、高分解能型(チップ寸法3nm)のプローブを実現することができた。これを用いて顕微鏡を動作させ、微粒子表面のエバネッセント光の寸法依存局在特性、偏光特性、などの基本特性を測定評価した。さらに、この顕微鏡の性能を表すシステム関数を測定し、空間分解能は0.8nmより良いことを推定した。一方、上記の化学エッチング法を修正して高感度型(光搬送効率10^<-3>)のプローブを作成し、光メモリ書き込み、光機能素子の実現の準備を行った。Jheはミ-散乱の理論を元に、大津の取得したエバネッセント光の寸法依存局在特性、プローブと試料との間の共鳴効果を求めた。さらに、イメージ双極子法を用いて偏光特性を解析した。北原は平面表面に励起された二つのエバネッセント光間の干渉により特殊偏光表面波が発生することを提案し、さらにその表面化学への応用を検討した。堀は理論に必要な関数の球関数展開の方法を開発した。さらに、量子力学理論との対応により、近接場光学理論の適用可能な試料寸法範囲を明らかにした。(2)原子の誘導実験大津は中空ファイバ中のエバネッセント光による高真空中での原子の誘導を行うために、原子の閉じこめのためのポテンシャル特性を計算した。中空ファイバに導波モードの光を結合するための光学系、さらに、中空ファイバを透過した原子を検出するための光イオン化法装置を設計した。これらを総合してR6原子の誘導に成功した。使用した中空ファイバの内径、長さがそれぞれ7μm、3cmの時、250mWの導波モードパワーに対し、光の非使用時にくらべ20倍の原子が誘導された。各種パラメータに対する誘導効率の依存性を測定評価した。さらに、この方法の応用として、Rb原子の二つの同位体のなかから、特定の一つを分離して誘導することを実現した。Jheは原子誘導実験の際に障害となる、中空ファイバ内壁の量子電気力学効果の大きさを推定した。これにより、実験装置の設計製作が可能になった。堀はエバネッセント光と原子との共鳴相互作用を検証するためのドプラーフリー分光データを取得することができた。

さらに、この方法の応用として、Rb原子の二つの同位体のなかから、特定の一つを分離して誘導することを実現した。Jheは原子誘導実験の際に障害となる、中空ファイバ内壁の量子電気力学効果の大きさを推定した。これにより、実験装置の設計製作が可能になった。堀はエバネッセント光と原子との共鳴相互作用を検証するためのドプラーフリー分光データを取得することができた。
渦鞭毛藻の有毒株を識別可能なDNAプローブの開発に関する研究

強力なNa^+チャンネル阻害剤を生産し麻痺性貝毒(PSP)の原因藻であるAlexandriumtamarenseおよびA.catenellaは、世界中に発生を拡大し大きな社会問題となっている。そのため発生の初期予察が重要であるが、本属の形態は酷似し変異も多いことから形態分類が困難であり、簡便で客観的な識別法が求められている。本研究は有毒渦鞭毛藻Alexandrium属の種間、種内ならびに有毒株を分子レベルで識別可能なDNAプローブを開発することを目的とし、以下のような研究成果が得られた。(1)日本各地の沿岸から分離されたA.tamarenseおよびA.catenellaの無菌・クローン株を用いてPSP毒を抽出してHPLC蛍光分析を行ったところ、地域により毒組成に差異が認められたので毒タイプにより個体群をグル-ピングし、分子分類の基礎データを構築した。(2)本藻各株の5.8SrDNAおよび内部スペーサー(ITSI,2)領域をPCR法により遺伝子増幅し、得られたDNA断片について制限酵素断片長解析を行った結果、本属藻類の種間識別が簡便に行えることが明らかになった。(3)日本、タイおよび北米産のAlexandrium属6種24株の5.8SrDNAと内部スペーサー領域(約520bp)の塩基配列を決定し近隣結合法により分子系統樹を作成した。その結果、毒性の高いA.tamarenseと低いA.catenellaを明確に区別可能であり、また無毒種のA.affine,A.insuetumやA.pseudogonyaulaxともそれぞれ識別可能であった。(4)ITS1の3'末端領域は、種特異的なマーカーとして有用であるので、有毒種のA.tamarenceとA.catenellaに特異的な2種の蛍光化DNAプローブを合成し、insituハイブリダイゼーションを行ったところ、種間識別が可能であることが明らかになった。従って有毒渦鞭毛藻の有毒性を識別可能なDNAプローブの開発が可能となった。麻痺性貝毒の原因藻として知られる渦鞭毛藻Alexandrium catenellaおよびA.tamarenseは、毎年貝類を毒化させ増養殖ならびに食品衛生上深刻な問題となっている。しかし本属の形態は酷似しかつ変異も多いことから、形態分類が極めて困難であり、また毒量も個体群や株により異なることから、現場における対応も遅れていた。従って発生のモニタリングに、簡便で客観的な識別法が急務となっている。本研究は有毒渦鞭毛藻Alexandrium属の種間・種内ならびに有毒株を分子レベルで識別可能なプローブを開発することを目的とした。その結果本年度は以下のような研究成果が得られた。(1)日本各地の沿岸から分離されたA.tamarenseおよびA.catenellaの無菌・クローン株を用いてPSP毒を抽出してHPLC蛍光分析を行ったところ、地域により毒組成に差異が認められたので毒タイプをグルーピングし、DNA解析用の基礎データーを構築した。(2)両種の細胞を液体窒素中で破砕し常法を改変しCTAB処理を行うことにより、本藻より初めて精製度の高い全DNAの分離法の確立に成功した。有毒渦鞭毛藻AlexandriumtamarenseおよびA.catenellaは麻痺性貝毒の最大の原因藻であるが、形態分類が困難なため発生のモニタリングに簡便で客観的な識別法が急務となっている。本研究は有毒鞭毛藻

Alexandrium属の種間・種内ならびに有毒株をDNAレベルで識別可能なプローブを開発することを目的とした。その結果本年度は以下のような研究結果が得られた。(1)日本各地の沿岸、タイおよび北米産のAlexandrium属6種24株の無菌・クローン株を用いて、昨年度の研究において制限酵素断片長多型解析により本属の識別が可能とされた5.8SrDNAと隣接するITS領域(内部スペーサー)をPCR法により遺伝子増幅を行い、クローニングした後に本領域の全塩基配列を決定した。これらの塩基配列(約520bp)を用いてJukes-Cantarの式により各株の遺伝子距離を求め、さらに近隣結合法によりその分子系統樹を作成した。その結果、A.tamarenseとA.catenellaは各々1つのブランチに入り両種を明確に区別することが可能であった。しかしタイ産A.tamarenseは、日本や北米産の形態学的同種とは遺伝的距離が大きかった。上記有毒2種は、無毒種であるA.affine、A.insuetumやA.pseudogonyaulaxとは明確に識別可能であることが明らかになった。(2)ITS1の3'未満の149bpから177bpの塩基配列は、種内では同じであるが種間では多くの塩基置換が見られ、本属藻類の種特異的なマーカーとなり得る可能性が強く示唆された。そこで有毒種のA.tamarenseとA.catenellaに特異的な2種の蛍光でラベルされたDNAプローブを合成し、insituハイブリダイゼーションを行ったところ、両プローブで有毒2種の識別が可能となったことから有毒種に特異的なDNAプローブ開発の基礎が確立された。
PPARγ Ligandを用いた食道癌に対する分化誘導療法

当科にて樹立したヒト食道扁平上皮癌(KE-5,KE-8,KE-10)では,PPARγは遺伝子・蛋白レベルで発現しており,そのリガンドであるthiazolidinedion(troglitazone)によりin vitroにおいては,著明な腫瘍細胞増殖抑制効果が認められた.その増殖抑制のメカニズムとして,troglitazone処理後にG0/G1期細胞が増加し,さらに増殖期細胞に特異的に発現するKi-67陽性細胞が減少することより,troglitazoneは食道癌細胞の細胞周期へ負の影響を及ぼすことが示された.また扁平上皮細胞の分化マーカーとして知られるinvolucrinは,食道癌においてその発現が強く減弱していることが知られている.今回の検討にてtroglitazone処理により食道癌培養細胞におけるinvolucrin発現は増強された.このことからtroglitazoneは食道癌細胞の分化を惹起することが示され,PPARγリガンドの食道癌に対する分化誘導療法としての可能性も示唆された.しかし,troglitazone処理によってDNA fragmentationは明らかでないことから,in vitroでのtroglitazoneによる食道癌細胞増殖抑制効果におけるアポトーシスの関与は強くないことが示された.上記の結果を踏まえ,食道癌培養細胞をヌードマウスに移植し,連日troglitazoneを経口投与し,移植腫瘍に対するtroglitazoneの抗腫瘍効果の有無を検討したが,今回用いた3種の培養細胞で4週間の観察期間でいずれもin vivoでの抗腫瘍効果を認めなかった.本研究において,PPARγリガンドであるtroglitazoneは食道扁平上皮癌に対してin vitroでは増殖抑制効果を認めたが,in vivoでは抗腫瘍作用は認めなかった.今回in vivoではtroglitazoneの経口投与を行ったが,現在数多くのPPARγリガンドが合成されている.その他のPPARγリガンドの効果も検討すべきと考えている.当科にて樹立したヒト食道扁平上皮癌(KE-5,KE-8,KE-10)では,PPARγは遺伝子・蛋白レベルで発現しており,そのリガンドであるthiazolidinedion(troglitazone)によりin vitroにおいては,著明な腫瘍細胞増殖抑制効果が認められた.その増殖抑制のメカニズムとして,troglitazone処理後にG0/G1期細胞が増加し,さらに増殖期細胞に特異的に発現するKi-67陽性細胞が減少することより,troglitazoneは食道癌細胞の細胞周期へ負の影響を及ぼすことが示された.また扁平上皮細胞の分化マーカーとして知られるinvolucrinは,食道癌においてその発現が強く減弱していることが知られている.今回の検討にてtroglitazone処理により食道癌培養細胞におけるinvolucrin発現は増強された.このことからtroglitazoneは食道癌細胞の分化を惹起することが示され,PPARγリガンドの食道癌に対する分化誘導療法としての可能性も示唆された.しかし,troglitazone処理によってDNA fragmentationは明らかでないことから,in vitroでのtroglitazoneによる食道癌細胞増殖抑制効果におけるアポトーシスの関与は強くないことが示された.上記の結果を踏まえ,食道癌培養細胞をヌードマウスに移植し,連日troglitazoneを経口投与し,移植腫瘍に対するtroglitazoneの抗腫瘍効果の有無を検討したが,今回用いた3種の培養細胞で4週間の観察期間でいずれもin vivoでの抗腫瘍効果を認めなかった.本研究において,PPARγリガンドであるtroglitazoneは食道扁平上皮癌に対してin vitroでは増殖抑制効果を認めたが,in vivoでは抗腫瘍作用は認めなかった.今回in vivoではtroglitazoneの経口投与を行ったが,現在数多くのPPARγリガンドが合成されている.その他のPPARγリガンドの効果も検討すべきと考えている.[結果]今回検討した食道癌培養細胞株は全ての株においてmRNA,蛋白レベルともPPARγを発現しており,TZDにより細胞増殖は濃度依存性に抑制された.100uMのTZDにて処理後3日目にはコントロールに比較して約80%の増殖抑制を認めた.PPARγリガンド処理により,処理細胞では細胞周期GO/G1期の細胞分画が約20%増加し,細胞増殖期マーカーであるKi-67染色を行うと,TZD処理によりKi-67陽性細胞は80%から16%に著明に減少した.DNA fragmentationはTZD処理前後で変化を認めず,Annexin-V染色によるアポトーシス細胞は約4%と少なかった.また扁平上皮の分化マーカーであるinvolucrinの発現は3倍以上に増加した.[考察]食道癌においてはPPARγが発現しており,そのリガンドであるthiazolidinedionにより増殖抑制が認められたことより,新たな食道癌治療の標的となる可能性が示唆された.また,PPARγリガンドにより細胞周期GO/G1 arrest,ならびに扁平上皮への分化がみられたことより,増殖抑制の機序としては細胞周期の抑制および細胞分化が示唆された.平成13年度結果概要:当科にて樹立したヒト食道扁平上皮癌細胞株KEシリーズ全てにおいてperoxisome proliferator-activated receptor(PPAR)γの発現が認められ,さらにそのリガンドであるthiazolidinedion(troglitazone : TZD)処理によって3日目にはコントロールに比較して約80%の増殖抑制が認められた.その機序として,TZD処理により細胞周期におけるG0/G1 arrestが惹起され,さらに扁平上皮の分化マーカーであるinvolucrinの発現が増加したことから分化誘導も関与していることが明かとなった.

平成14年度研究結果概要:上記の結果よりin vitroでのPPARγリガンドによる食道癌培養細胞株における抗腫瘍効果が明かとなったため,in vivoでのPPARγリガンドの食道癌培養細胞を移植したBALB/cヌードマウスにおける抗腫瘍効果を検討した.[方法]3種類のヒト食道扁平上皮癌培養細胞KE-5,KE-8,KE-10をそれぞれ1×107個,BALB/cヌードマウス背部皮下に接種し,腫瘍が長径5mmになった時点よりTZDを5投2休で500mg/kg/dayを4週間経口投与し,週3回腫瘍径を計測した.[結果]KE-5,KE-8,KE-10についてコントロール群,TZD投与群とも各々10匹づつ腫瘍径を観察した.KE-5,KE-8,KE-10いずれでも腫瘍径,マウス重量ともコントロール群,TZD処理群間で差を認めなかった.[まとめ]PPARγリガンドであるtroglitazone(TZD)は,食道癌移植ヌードマウスを用いたin vivo実験において抗腫瘍効果を認めなかった.
健康寿命の遺伝素因の解明と延長のための戦略的研究

本申請では、最終目標として健康寿命延伸を目指している。その目標達成の為に寿命制御遺伝子および老化制御遺伝子の解明グループおよびゲノム医学応用に向けた基盤研究グループを有機的に組織するための企画調査を行い、平成16年度発足特定領域申請を行った。研究項目は4項目で、哺乳類における長寿命遺伝子の探索(代表:白澤)、寿命変異体のモデル解析(代表:石井)、寿命と老化の制御メカニズムの解明(代表:森)、高齢者の疫学ゲノム(代表:村松)。(1)白澤班では、主にインスリンシグナル、酸化ストレス応答シグナル、ミトコンドリアシグナルと個体寿命の関係、固体老化との関係をモデルマウスを用いて解析する。また、それぞれのモデルマウスにDNAチップを応用し、寿命シグナルに応答している遺伝子群を網羅的に検索する。(2)石井班では、線虫およびショウジョウバエのモデル系を用いて、主に遺伝学的手法をもちいて、寿命制御遺伝子の検索・同定を行う。更に、これまでに明らかにされてきたインスリンシグナル、ミトコンドリアシグナルの寿命制御メカニズムを線虫やショウジョウバエなどのモデル動物を用いて解析する。(3)森班では、主に老化のシグナルに焦点をあて、既に報告されているShc長寿命マウスやカロリー制限動物における寿命シグナルの作用機構の解明により、老化機構制御のインターベンションの可能性を探索する。また、逆のアプローチとして老化促進マウスやウエルナー症のモデルから、老化速度を規定しているゲノム側の制御因子を明らかにする事により、老化遅延戦略も探索する。(4)村松班では高齢者のゲノム解析により、長寿命関連遺伝子およびQOL関連遺伝子の観点から関連遺伝子の検索を行う。DNA解析班はSNP、Sib解析、関連解析を予定している。本企画調査では上記の研究を有機的に推進するために、7月に一泊二日の勉強会、10月に班会議、1月に国内の研究者を招聘した公開シンポジウムを企画・実施し、研究推進に資するとともに、国内の研究者を啓発した。主要な経費はこのための資料作成、研究者や講演者の旅費、会合費、通信費などに当てられた。
光ナノセンシングデバイスの微小光学・機構の融合設計法の研究

本研究の狙いは、光の波長を下回る100nmサイズの微小開口を、金属パターンド媒体表面にごく近接走査することにより、超高密度・大容量かつ高速で情報記憶が可能な光メモリを実現することにある。研究を推進するに当たっては、開口周辺の場と媒体の相互作用などの基本原理検証にとどまらず、高記録密度(空間分解能)を、高転送速度および高信号S/Nにおいて、しかもコンパクトなデバイス構成をもって実現することを基本とする。交付全期間(平成17年度19年度)にわたる実証目標としては、ビット長が70-80nm長の微細パターンを、周波数帯域10MHz以上、信号S/N18dB程度以上の条件にて検出することに置く。当該年度は、前年度まで蓄積した研究成果を受けて、10050nm線幅の超高密度の光信号の検出実証を進めた。主な内容には、(1)線幅100nm以下の精密パターンド媒体を用い、三角開口と偏光とを組み合わせた検出系の有効性確認、(2)同三角開口を浮上面から突出させることによる実効スペーシング低減検証、(3)サブミクロンから50nm線幅のパターンド媒体の加工性等が含まれる。(1)に関しては代表寸法140nmの三角開口と偏光を組み合わせ、50nmのシングルスペースまでの応答と、少なくとも150nmのライン/スペースまでの交番信号を高S/Nで検出できた。(2)についても、シングルスペースの信号レベルから、実効スペーシング低減効果が確認できたが、まだ実効スペーシングが3040nmと推定され、三角開口本来の性能が発揮できる10nmあるいはそれ以下での動作検証には至らなかった。(3)については、線幅70nm程度まではほぼ規定のパターンが構成できたが、それ以下の密パターンについては、エッチング時に不均一が発生したり、露光の不完全などにより良好な交番パターンの構成に至らなかった。本研究は、光の波長を下回る超微小開口を媒体表面に極近接走査することにより、超高密度・大容量かつ高速で情報記憶が可能な光メモリを実現しようとするものである。本研究を進めるに当たり、開口周辺の原理検証にとどまらず高記録密度を、高転送速度および高信号S/Nにおいて、一体構成可能なデバイス形態をもって実現することを基本的な考え方とする。交付全期間にわたる実証目標としては、ビット長が70-80nm長の微細パターンを、周波数帯域10MHz以上、信号S/N18dB以上の条件にて検出することに置く。当該年度は、これまで蓄積した基盤研究の成果を受けて、超高密度の光信号実証に向けた「基盤技術インフラ」を徹底整備する。主なものには、1.100nmの線幅を下回る精密パターンド媒体の作製、2.浮上面から突出した開口の実効スペーシング、グライド高さの精密評価、3.サブミクロンから100nmを下回る有限幅の記録パターンを想定したトラッキング特性予測、4.光ヘッドアセンブリの小型化(1.61.2mm角のナノからピコ光スライダ)構成のための要素技術、等が含まれる。このうち1.の精密パターンド媒体に関しては、遮光膜厚を30nm弱として最小線幅70nmまでのパターンを作製し、80nmのシングルスペースまでは再生信号を確認できた。2.の開口実効スペーシングおよびグライドハイトに関しては、1.5mm有効長の小型光ヘッドアセンブリにより、30-35nmのグライドハイトを確認した。3.のトラッキング特性に関しては、直線状に形成した350nmパターン縁の横断波形を採取することにより、信号の重畳近似を用いて100nm幅までのトラッキング特性を予測した。

4.の小型ヘッド化に関しては、有効スライダ長1.5mmのアセンブリを用い、1mm長のパターン領域走査時の再生信号エンベロープから安定な浮上状態を実現できていることを確認した。本研究では光の波長を下回る100ナノメートルサイズの微小開口を媒体表面に近接走査することにより、超高密度・大容量かつ高速で情報記憶が可能な光メモリを実現する。研究を進めるに当っては場の相互作用など原理検証にとどまらず高記録密度を、高転送速度および高信号S/Nにおいて、コンパクトなデバイス形態をもって実現することを基本とする。交付全期間にわたる実証目標を、a)ビット長が70-80nm長の微細パターンを、b)周波数帯域10MHz以上、c)信号S/N18dB以上の条件にて検出することに置く。当年度の主な検討内容は、[1]100nmの線幅を下回る精密パターンド媒体による再生信号評価、[2]浮上面から突出した開口の実効スペーシング低減効果の検証、[3]サブミクロンから100nmを下回る有限幅の記録パターンを想定したトラッキング特性予測等である。このうち[1]の精密パターンド媒体による信号評価については、遮光膜厚30nm弱で最小線幅70nmの媒体により、70nmまでのシングルスペースパターンの応答を確認した。ただし浮上すきまの低減が十分でないことから場の広がりが200nm以上あり、最密交番パターン(L/S)については200nmL/Sまでは明瞭に確認できたが、100nmL/SではS/Nがかなり劣化した。[2]の開口突出効果については、非突出型とナノステップ加工による20nm突出開口とを比較した。開口形状等のパラメータが同一ではないため直接の比較はできないが、半値幅は確実に低減でき、また信号S/Nも向上していることから、突出型開口が有効であると判断できる。[3]のトラッキング特性に関しては、直線パターンによる特性評価法を用いる前提でこれに適したパターン形状の選定を行い、50nmの最小線幅を目標に加工を進め、パターンのデューティにむらがあるものの60nmパターンまでの加工性を確認した。本研究の狙いは、光の波長を下回る100nmサイズの微小開口を、金属パターンド媒体表面にごく近接走査することにより、超高密度・大容量かつ高速で情報記憶が可能な光メモリを実現することにある。研究を推進するに当たっては、開口周辺の場と媒体の相互作用などの基本原理検証にとどまらず、高記録密度(空間分解能)を、高転送速度および高信号S/Nにおいて、しかもコンパクトなデバイス構成をもって実現することを基本とする。交付全期間(平成17年度19年度)にわたる実証目標としては、ビット長が70-80nm長の微細パターンを、周波数帯域10MH_z以上、信号S/N18dB程度以上の条件にて検出することに置く。当該年度は、前年度まで蓄積した研究成果を受けて、10050nm線幅の超高密度の光信号の検出実証を進めた。主な内容には、(1)線幅100nm以下の精密パターンド媒体を用い、三角開口と偏光とを組み合わせた検出系の有効性確認、(2)同三角開口を浮上面から突出させることによる実効スペーシング低減検証、(3)サブミクロンから50nm線幅のパターンド媒体の加工性等が含まれる。(1)に関しては代表寸法140nmの三角開口と偏光を組み合わせ、50nmのシングルスペースまでの応答と、少なくとも150nmのライン/スペースまでの交番信号を高S/Nで検出できた。
DNA脱メチル化機構の包括的理解と生物・非生物ストレス応答への新展開

DNA脱メチル化に代表されるエピゲノム情報制御は、植物の発生や環境応答など様々な局面で重要であると理解されている。本研究では、ゲノムインプリンティングの制御機構の解析から見つかった鉄硫黄クラスターアセンブリー経路の構成因子が、生殖過程の中央細胞のインプリント遺伝子の制御のみならず、栄養組織において植物免疫系の遺伝子やストレス応答系の遺伝子の制御に関わっていることを明らかにした。DNA脱メチル化に代表されるエピゲノム情報制御は、植物発生や環境応答などの様々な局面に重要であると理解されている。しかしながら、生殖過程および種子形成を制御するゲノムインプリンティング以外の生命現象においては、その多くが未解明である。本研究では、インプリント遺伝子のDNA脱メチル化に影響を与えるalac4 (alarm clock for FWA imprinting)変異体から明らかになりつつある新たな展開に着目し、広くエピゲノム制御が関わる生命現象を理解することを目的とした。平成26年度は、alac4の原因遺伝子の特定によりCIA(Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly)経路が浮かび上がっており、alac4の原因遺伝子の機能解析の詳細を報告した(Buzas D., et al, PNAS 2014)。CIA経路は、Fe-Sクラスターを補因子として必要な多くの酵素に対して、Fe-Sクラスターを生合成して、それをローディングするために必須の蛋白質群である。alac4はCIA経路の中でも、N末にDNAメチルトランスフェラーゼに類似のドメインとC末にFe-Sクラスター結合サイトを持つことより、エピジェネティックな機能が推測されていたが、実際にFWAインプリント遺伝子のDNA脱メチル化に影響することが明らかとなり、実際にエピジェネティックな機能を示すことができた。また、詳細な細胞内局在の解析、雌性配偶体中央細胞特異的プロモーターを用いた解析からAtDRE2蛋白質は細胞質と核に局在し、中央細胞にて機能していることが強く示唆された。DNA脱メチル化に代表されるエピゲノム情報制御は、植物の発生や環境応答などの様々な局面に重要であると理解されている。本研究では、インプリント遺伝子のDNA脱メチル化に影響を与えるalac4 (alarm clock for FWA imprinting)/atdre2変異体から明らかになりつつある新たな展開に着目し、広くエピゲノム制御が関わる生命現象を理解することを目的としている。平成27年度は、atdre2変異体から、僅かに得られるホモ接合体を用いてメチローム解析を行った。atdre2の原因遺伝子は、細胞質において鉄硫黄クラスター生合成に重要な役割を果たすことが、酵母やほ乳類の研究から明らかになっている。一方、そのタンパク質のN末にはメチルトランスフェラーゼ様のドメインが存在し、我々が単離した変異体では、多くのインプリント遺伝子のDNA脱メチル化に影響することが明らかになっている。予備的な結果からatdre2ホモ接合体では、ゲノムワイドにDNAメチル化への影響が見られており、インプリント遺伝子以外にも多くの標的を制御していることが示唆された。平成27年度に関して、AtDRE2が標的としているDNA脱メチル化領域に関して予備的な解析を進めることができた。予想どうりの結果が得られているので、今後シロイヌナズナだけではなく、イネにおいても遺伝子破壊することにより単子葉、双子葉での一般性を検討するための基礎データが得られている。しかしながら、生殖過程および種子形成を制御するゲノムインプリンティング以外の生命現象においては、その多くがまだ未解明である。本研究では、インプリント遺伝子のDNA脱メチル化に影響を与えるalac4(alarm clock for FWA imprinting)/atdre2変異体の解析から明らかになった新たな展開に着目し広くエピゲノム制御が関わる生命現象を理解することを目的とした。その結果、平成28年度までに、植物耐病性に関わる遺伝子の制御などが明らかとなった。平成28年度は、これまでにシロイヌナズナの解析から得られた知見を活用して、イネへの研究展開を開始した。シロイヌナズナで得られたdre2変異体の原因遺伝子は、細胞質Fe-Sクラスター生合成に関与する構成因子の一つであった、シロイヌナズナと比較してトランスポゾンなどの反復配列が圧倒的に多いイネを用いることでさらなるDNAメチル化の生物学意義を理解できると考え、イネのOsDre2遺伝子とその上流に位置する構成因子のホモログをCrispr/Cas9法を用いてノックアウトの作成を進めた。平成26年度は、AtDRE2の機能解析に関して、概ね順調に進展している。論文の査読者から強く求められていた改訂ポイントに沿って実験を行い、AtDRE2が機能している組織、細胞の特定、さらには細胞内の局在などの詳細を理解できる結果を得ることができている。さらには、種子のalac4/atdre2種子の致死性を部分的に相補した形質転換シロイヌナズナの作成から、alac4/atdre2の発芽可能なホモ接合体を得ることができている。

このことにより、AtDRE2の栄養組織における機能解析、栄養組織を用いたゲノムワイドメチローム解析が可能となっており、現在これを進めている。生物・非生物ストレスに対するエピゲノム制御の解析が本研究の最終的な目的であるため、シロイヌナズナにおいて標的サイトを明らかにするとともに、今後はイネを用いた解析も進める。イネはシロイヌナズナと比較して遙かにトランスポゾン配列が多く、しかもユークロマチンに広く散在している。当研究室では、共同研究によりCrisprによる遺伝子破壊の系を導入しつつあり、加えて当研究室で開発した人工気象器を用いたバイオトロンブリーディングの系で、シロイヌナズナと同様レベルの研究が屋内環境で実施できる。今後、イネに関しても生物・非生物ストレスに対するエピゲノム制御の解析を実施する。28年度が最終年度であるため、記入しない。植物分子遺伝学今後は、引き続きAtDRE2のゲノムワイドなメチローム解析を通じて、栄養組織におけるDNA脱メチル化の標的遺伝子、すなわち変異体でDNAメチル化の変化が観察される遺伝子の同定を通じて、AtDRE2のさらなる役割を明らかにすることを予定している。予備的なポジティブな結果を得て、平成27年度の一部研究計画を修正し、平成28年度にイネを用いた計画を追加したため。予定した技術補佐員の確保が困難であったこと、また論文リバイズに予想以上に時間がかかり、次の実験に関わる発注に若干の送れが生じたため。平成28年度までに、イネを用いたノックアウト変異体を作成し、その個体の遺伝子発現解析をマイクロアレイ等を用いて行う。高度な技術を有した技術補佐員の確保が難しいため、研究室内の博士研究員にある一定期間、ゲノムワイドメチローム解析にエフォートを割いてもらうこととし、繰り越し分と合わせて雇用することにより研究をさらに加速化させる予定である。
高齢者のライフ・スキルとサクセスフル・エイジングに関する実証研究

サクセスフル・エイジングは、社会老年学やエイジング研究と呼ばれる領域では早くからもっとも多くの関心を集めてきたテーマであるが、高齢者(高齢期)のライフ・スキルと関連させた研究は内外ともにほとんどない。本研究では、サクセスフル・エイジングやライフ・スキル、コンピテンスに関する理論的検討を行った後に、神戸市在住の65歳以上の男女二十数万人の中から5千人を無作為に抽出し、A4判31頁、総質問数約700問の調査票を用いて郵送調査を行った。2,732人から回答があり、回収率は55%である。その調査結果に基づいて、探索的因子分析および共分散構造分析を用いて、サクセスフル・エイジングに関する尺度として、それぞれ2つの1次元尺度からなる「老後生活観尺度」、「アフェクト・バランス尺度」、「主観的老化度尺度」を作成するとともに、類似尺度を含めて54個のライフ・スキル/コンピテンスに関する1次元尺度を開発した。その中からそれぞれ独立な29個の1次元尺度を高齢者のライフ・スキル/コンピテンスを測定する尺度として提案した。そして、以上の諸尺度を用いて、ライフ・スキルがサクセスフル・エイジングにどのように作用しているかを分析した。その結果、以下のことが明らかになった。「自分を大切にする」、「目標設定」、「ストレス処理」、「明朗快活」といったライフ・スキルは、年齢や経済水準よりも「肯定的老後生活観」をより強く促進していること、「自分に忠実」や「怒りの処理」、「孤高」、「積極的親密性」といったライフ・スキルは、「年齢」という人口学的要因よりも「否定的老後生活観」をより強く促進していること、「アスピレーション」や「手先の器用さ」、「個性が強い」といったライフ・スキルは「ポジティブ・アフェクト」を促進し、「おしゃれ」、「ナルシシズム」、「親和性」といったライフ・スキルは「ネガティブ・アフェクト」に促進的に作用していること、「孤立性」、「自分に忠実」、「孤高」、「依存性」、「ナルシシズム」、「個性が強い」、「ノーティ」といったライフ・スキルは「主観的老化度」を促進していること。以上の結果は、サクセスフル・エィジングをめぐるこれまでの理解や施策として取り入れられている諸事業や学習・訓練プログラムなどに再検討を求める新たな知見であると考える。ライフスキルやサクセスフル・エイジングに関する著書や論文、資料、情報の収集とそれらのレヴュ-を通じて、ライフスキルおよびサクセスフル・エイジングに関する過去から現在に至る研究成果や論議を整理した。この作業の中には、各種の雑誌や読み物、新聞に掲載された記事、一般向けの単行本や各種機関、団体が発行したパンフレット類の収集、整理を含んでいる。

また、高齢者のライフスキルに関する研究や実践で多大の成果を上げているイギリスのギルフォード(Guildford)にあるイギリス・北アイルランド退職前教会(Pre-Retirement Association of Great Britain and Northern Ireland : PRA)および同地にあって高齢者研究、退職者研究に数多くの実績を残しているサリ-大学を訪れて、PRAの所長(director)であるMary Davies博士や研究員のAnthony Chiva博士、Joanna Walker博士、サリ-大学教授のPeter Jarvis博士から多くの最新情報と本研究上の助言、指導を得ることができた。以上の研究成果については、「退職に関する新たな視点とサード・エイジの生活課題」と題して、『神戸大学発達科学部研究紀要』第5巻第2号に発表した(1998年3月刊)。そこでは、サクセスフル・エイジング(successful aging)や老後生活に関するこれまでの社会老年学研究の多くは、就業・退職形態についてはあまり注意を払ってこなかったが、最近になって、就業・退職形態の多様性をエイジング研究に反映させる試みが現れてきていること、そして、その鍵概念となっているのがサード・エイジ(the third age)であることを指摘し、近年の就業・退職形態の動向とそれに関する先行研究およびサード・エイジに関する論議を整理し、次年度以降に行うサクセスフル・エイジングへ向けたサード・エイジにおける生活課題とライフスキル(life skills)に関する調査の枠組みを検討した。ライフ・スキルの概念を明確にするために、これまでの内外の著書、研究論文、各種出版物を収集し、検討した。ライフ・スキルは、個人の社会的適応能力の醸成、社会的環境条件の整備、社会的合意形成といったサクセスフル・エイジングの3つの課題のうち第一の課題に関わるものであるが、第二の課題に関わるものとして、高齢期の所得確保と年金制度について最近の動向を考察した。ライフ・スキル概念は、個人が自立および自律して社会生活を送るために必要な課題処理能力を指して用いられているが、高齢期におけるライフ・スキルに関しては、老化に伴う身体的活動能力の低下と関連して、ADLからIADL、そして社会生活上の心理社会的能力まで広範な側面に焦点が当てられるとともに、多様な生活場面における活動能力が議論されている。以上の検討を通じて、ライフ・スキルの測定尺度を作成するための項目を選定・考案し、約200項目からなる多次元の測定尺度を試験的に作成した。そして、この測定尺度の妥当性と信頼性を確かめることと、ライフ・スキルとサクセスフル・エイジングとの関連性を明らかにするために、調査票を用いた郵送調査を行った。調査票は、主質問69問、A4版で32頁に及ぶ大部のものである。調査は、神戸市在住の65歳以上の男女を対象として行った。平成11年1月現在、神戸市全9区に在住の65歳以上人口は236,874人である。このうち男女5千人を全区を対象に選挙人名簿を用いて無作為に抽出した。抽出方法は、まず、各区の抽出数を男女5歳階級別人口に比例配分して決め、次に、各区それぞれの全投票区の中から性・年齢階級別6カテゴリ(男65-69歳、男70-74歳、男75-79歳、男80歳以上、女65-69歳、女70-74歳、女75-79歳、女80歳以上)に対応してそれぞれ6つの投票区を乱数を用いて無作為に抽出し、各カテゴリに該当する投票区から対象者を無作為に抽出した。調査結果の集計と解析は来年度に行う。本研究は、"gold standard"として一般に受け入れられているものは今のところないと言われている(Diehl,1998)高齢者の日常生活活動能力の測定尺度の開発を試みたものである。神戸市在住の65歳以上の男女23万人の中から無作為で抽出した5千人を対象とする郵送調査を行い、2,700から回答を得た。
間質性肺炎と薬剤性肺障害における新規バイオマーカーの開発

研究目的:間質性肺疾患、薬剤性肺障害の新規バイオマーカーを開発すること研究成果:細胞外マトリックス蛋白であるぺリオスチンが、間質性肺障害の新規血清バイオマーカーであることを証明した。具体的には、血清ぺリオスチンは、間質性肺障害の診断マーカーとして高い感度、特異度を有することをROC解析で証明した。さらに、間質性肺障害の呼吸機能の低下や予後の予測バイオマーカーであることを統計学的に証明した。【背景】細胞外マトリックス蛋白であるペリオスチンの血清値がIPFのスクリーニングマーカーであり、呼吸機能の低下と相関することを報告した(ERJ 2011)。【目的】血清ペリオスチン値についてさらに解析を行い、長期予後規定因子としての役割、胸部高分解能CTの異常陰影の範囲(HRCTスコア)との関連を解析した。【方法】長期間(最長5年間、平均約960日間)の観察あるいはHRCTの評価を行ったIPF 29例を対象として、overall survival (OS)、time-to-event(TTE)の規定因子、HRCTスコアなどの臨床データのベースライン値と6か月間の変化率との相関の解析を行った。HRCTスコアは、線維化スコア(牽引性気管支拡張像[TBE]を有する異常影、網状影、蜂巣肺の面積(%)の総和)、炎症スコア(TBEを有さない異常影の面積(%)の総和)、3段階のTBEグレードを設定した。TTEのイベントは、死亡、10%以上のVC低下、急性増悪とした。【成績】血清ペリオスチン値は、6か月間の肺活量(P=0.0009)、肺拡散能(P=0.006)の低下率、蜂巣肺(P=0.0484)、TBEグレード(P=0.0659)と有意な相関あるいはその傾向があった。TTEの独立規定因子は、OSがベースラインの血清ペリオスチン値、肺活量、拡散能のベースライン値と6か月間の低下率、ベースラインのHRCTスコア(トータルと線維化スコア)、TTEがベースラインの血清ペリオスチン値と肺活量、拡散能であった。【結論】ペリオスチンは、呼吸機能の低下、線維化病変拡大および長期予後の予測マーカーである可能性がある。研究の背景、目的:間質性肺炎、薬剤性肺障害で簡便に測定できる血清バイオマーカーとして、KL-6、SP-D、SP-Aがあるが、エビデンスは十分ではない。我々は、細胞外マトリックス蛋白であるぺリオスチン、炎症性サイトカインであるIL-18など、間質性肺炎、薬剤性肺障害の新たな血清バイオマーカーと成り得る蛋白を報告した。本研究目的は、間質性肺炎、薬剤性肺障害の新規の血清バイオマーカーの開発である。研究成果:我々は、ぺリオスチンが特発性間質性肺炎の新規で実用性の高い血清バイオマーカーであることを証明し、英文発表した。具体的には、1ぺリオスチンは、間質性肺炎のongoingな線維化病変に組織学的に発現増加していること、2特発性間質性肺炎の診断マーカーとして高い感度を有することをROC解析で証明、3間質性肺炎の呼吸機能の低下や胸部CT上の異常陰影の範囲の拡大との強い相関を示すバイオマーカーであること、4約5年間の長期予後規定因子であることを証明した。結論、考察:ぺリオスチンは、特発性間質性肺炎の診断、病状悪化、予後の予測に有用なバイオマーカーである。ぺリオスチンは、新規治療薬の登場で「オーダーメイド医療」の重要性が増している特発性間質性肺炎のコンパニオン診断薬となり得る。呼吸器内科既に間質性肺炎の新規バイオマーカーとして報告したペリオスチンについては、臨床検体の解析により、バイオマーカーとしての今までにはない性能を証明し、順調に進んでいる。また、可溶化IL-18レセプター受容体複合体などのペリオスチン以外のバイオマーカーは解析中であり、今後の研究で明らかにしていきたい。可溶化IL-18受容体複合体、L-18、TRX1などの間質性肺炎の新規バイオマーカーの網羅的解析をさらに進めていく。
アトピー眼症における組織線維化とナチュラルヘルパー細胞の制御

涙腺に多量に存在するナチュラルヘルパー(NH)細胞がアトピー性炎症の発症時に涙液(導管)経由で、またはリンパ管、血管経由で移動するのかを明らかにするため、涙腺を除去したマウスにブタクサ花粉結膜炎を発症させ、NH細胞除去の影響を検証した。その結果、涙腺除去は好酸球浸潤数には影響しない一方、涙腺除去マウス(特にIL-33欠損涙腺除去マウス)において強い角膜炎を認めた。この結果はNH細胞が角膜の恒常性維持に貢献している可能性を示唆するものである。本年度は以下の実験を試行した。(1)Rag2(-/-)IL-13-YFP-Tgレポーターマウスの樹立をおこなった。問題点としてレポーター色素の強度が弱くNH細胞のトレースに十分では無かったため、あらたにレポーター色素をYFPからTOMATOに変更して、NH細胞のトレースを試みている。今後FACSを含めた細胞トレース方法の感度向上を検討してゆく。(2)当初の計画にもとづき、アトピー網膜剥離、アトピー白内障、アトピー緑内障の手術中に得た前房水、網膜下液、水晶体前嚢、線維柱帯組織におけるIL-33発現定量をこころみた。前房水中からはELISA法にてIL-33タンパクが検出され、また、水晶体前嚢からはIL-33mRNAの発現が確認された。一方で網膜下液からは検出限界以上のIL-33が検知されず、タンパク質分解を受けている可能性をふくめて今後検討してゆく。(3)アトピー網膜剥離モデルとアトピー緑内障手術モデルに関して、マウスを用いたモデルの確立を行った。網膜剥離モデルに関してはNH細胞の維持に関連するIL-33分子の有無によって網膜組織の瘢痕化に関わる遺伝子群の発現に差異が見られることが明らかになり、学会発表を予定している。また、アトピー緑内障手術モデルに関してはTh2サイトカインの投与等、十分な組織瘢痕化を伴う状態でのモデル作成のための条件検討を鋭意進めており、H27以降の実験遂行のための基礎的データを収集した。本年度は以下の実験を遂行した。(1)アトピー緑内障手術モデルの作成。当初予定していたマウス前房中へのシリコンチューブ挿入に代えて、33G針を前房中に挿入する新規緑内障手術モデルを樹立し、安定した手術手技を確立した。現在、アトピー性炎症を惹起したマウスに緑内障手術を施行して、解析を行っており、学会発表に向けてデータのとりまとめ中である。予定していたM2マクロファージの観察、ならびに機能評価も施行することができた。(2)NH細胞の観察系。IL-13トマト色素レポーターマウスを用いて、NH細胞のin vivo観察を施行している。(3)NH細胞の活性阻止実験。抗CD25抗体を用いたNH細胞の除去実験に成功した。約80%のNH細胞を除去することが可能であり、今後病態モデルへの応用を施行する。(4)パパイン浸漬角膜炎モデルの併用。NH細胞の機能解析に、今まで実績のあるパパイン浸漬コンタクトレンズ誘発角膜炎モデルを併用した。このモデルでNH細胞を除去した際の組織線維化の状態をタンパクレベル、遺伝子レベルで検証する予定である。アトピー緑内障手術モデルの樹立は順調で、すでに学会発表レベルのデータを得ている。アトピー網膜剥離モデルは再現性に問題があり、現在網膜へのレーザー障害モデルへの切り替えを行っている。アトピー白内障モデルマウス作成のための準備実験も試行しており、概ね順調な研究進捗状況と考える。また、既に確立しているパパイン結膜炎モデルも解析対象とした。IL-33ならびにNH細胞が2型免疫反応において眼組織瘢痕化に果たす役割:アトピー眼症マウスモデルの実験をIL-33ノックアウトマウスと対照マウスとの間で再現し、アトピー緑内障手術モデルにおける組織瘢痕化の程度を組織瘢痕化マーカー(α-SMA、collagen type1/type3)発現量と免疫組織学的な解析法(炎症細胞の浸潤、マクロファージの活性化状態)を用いて評価することで、2型炎症に伴う眼組織の瘢痕化におけるIL-33およびNH細胞の役割を評価した。また、マウスモデルにおける網羅的遺伝子発現解析を施行し、IL-33やNH細胞の有無によって影響を受けるマーカーを同定し、臨床マーカーとなりうる分子の候補をリストアップすることを目標に研究を遂行した。NH細胞活性化阻止実験: NH細胞活性化因子であるIL-33のデコイ受容体(可溶型ST2)を投与して、2型眼炎症に伴う組織瘢痕化モデルにおけるNH細胞の活性の抑制を試みた。NH細胞活性化の指標として、NH細胞数、IL-13発現量、好酸球浸潤、組織瘢痕化マーカーの発現量を用いた検討を行った。NH細胞遊走阻止実験:NH細胞の遊走阻止を試みるため、マウスの眼窩外涙腺を切除するモデルを作成して、アレルギー性結膜炎を発症させ、その重症度とNH細胞の存在の有無との相関を比較した。その結果、NH細胞の結膜内への遊走防止はアレルギー性結膜炎の重症度に影響しない一方で、涙腺除去によるドライアイ所見の悪化に需要な役割を果たしていることを発見した。これはNH細胞が眼表面の恒常性維持に働いているという新たな知見である。