hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分裂病の出生季節偏りの要因を特定し予防法確立の手がかりを得るための多施設共同研究

しかし、これまでその研究は不十分で、気温、インフルニンザその他の感染、日照など様々な候補のうちいずれが関与しているのかは明らかでない。本研究の目的は、同じ日本国内でも気候の条件が全く異なる北海道、東北、関東、東海、九州各地方で、その地方で出生した分裂病患者の出生季節の偏りを調べ、ピークの月や、年による変動などを比較することで、具体的にどのような要因が分裂病の出生季節の偏りに影響を与えているかを明らかにすることである。平成14年度の成果は以下の通りである。まず、これまで不十分ながら出生季節の偏りと様々な季節性要因との関連を調べたこれまでの論文の詳細なreviewを改めて行った。やはり結論に達するような結果は、これまでめ研究を総合しても得られなかった。また、分裂病との関連が最も多く調べられているインフルエンザ感染は、従来のように妊娠第2期(second trimester)でその影響が最も大きいと考えると、これまで観察されてきた出生季節の偏りには大きく影響する可能性は低いことが示唆された。気温との関連は一部その関連を示唆する研究が見られた。しかし、いずれの研究も他の変数のコントロールが不十分で、今後は多変量解析の導入とそれに見合う規模のデータ収集の必要性が示唆された(投稿中)。なお、データの収集解析に関しては、これまで東京周辺の5,500人分と東北地方北部出生の1,300人分のデータを解析し、投稿準備中である。北海道、三重、長崎のデータも収集中であるが、統計解析に耐えるデータ規模にするためさらに作業を続行中である。統合失調症発病には遺伝とともに環境要因が関与している。具体的にどんな環境要因が関与しているのかは、発病機序の解明と予防法確立のために重要な課題である。本研究では、環境要因解明の手がかりとして、統合失調症での出生季節偏り(冬季出生増加と夏季出生減少)に注目、季節に関わるどのような要因がどのような機序で発症に影響し得るかを検討した。これまで日本人の研究では、夏季出生の減少(特に男性)に比し、冬季出生の増加は不明瞭であった(Tatsumi他2002)。昨年度はこの地域差を検討するため、東北地方出身者と、それ以外の患者とで比較し、出身地域を限定しない場合に比べて、東北地方出身の患者では夏季出生減少のみでなく冬季出生の増加が男女を問わず著しい傾向にあることが認められた(Hibino他投稿中)。今年度はさらに北海道と九州出身の患者データとの比較を行った。その結果、九州出身患者に比較すると東北地方出身患者は出生季節の偏りが著しく、特に男性ではその傾向が強かった(冬季と夏季5ヶ月の出生の割合は東北地方出身男性患者では48%と36%、九州出身男性患者では44%と42%)。しかし意外なことに北海道出身患者では、出生季節の偏りは九州出身患者よりも小さく、冬季・夏季各5ヶ月の出生の割合は男性患者でも43%と42%で、夏冬の差が認められなかった。この理由には、屋内暖房状況の北海道とそれ以外の地方との違い、感染症の流行時期の違い、対象規模の問題など多くの可能性が考えられるが明らかでない。なお具体的な環境要因についてこれまでの諸文献をreviewして検討した結果では、従来注目されがちであったインフルエンザ感染より、むしろポリオ等他の感染症や外気温・日照時間などの気象条件について詳細な検証を行う必要性のあることが示唆された(Tochigi他2004)。
リン脂質をミトコンドリアへ供給する新規輸送分子の機能解明

ホスフアチジルコリン(PC)はミトコンドリア膜の主要な構成成分であるが、ミトコンドリア自身はPCを合成できない。そのため、小胞体やゴルジ体などで合成されたPCがミトコンドリア-供給される細胞内輸送機構が存在すると考えられるが、分子レベルでの解明は行われていなかった。本研究では、ミトコンドリア-PCを輸送する活性を有する新規タンパク質starD7を兄いだし、リン脂質の細胞内輸送の新局面を展開した。細胞膜やオルガネラ膜は、リン脂質を主要構成成分とする脂質二重膜で構成されている。ところが多くのオルガネラは、自身の膜を構成するのに必要なリン脂質を生合成することができない。ミトコンドリアにおいては、外膜・内膜とも主にホスファチジルコリン(PC)で形成されているが、ミトコンドリア自身はPCを合成することはできず、リン脂質合成器官である小胞体からの供給に依存している。これまでは、ミトコンドリアへのリン脂質の供給は、ミトコンドアと小胞体との直接的かつ局所的な膜同士の接触(あるいは膜融合)によるリン脂質移動によって行われると考えられてきた。これに対し、申請者はリン脂質と結合し、ミトコンドリアへ輸送する可能性を有する可溶性リン脂質輸送タンパク質StarD-IIを見いだした。本年度では、StarD7-IIのミトコンドリア移行シグナルの解析および輸送リン脂質リガンドの同定を試みた。StarD7-IIのN末端側の75アミノ酸残基は、免疫細胞染色による解析の結果、ミトコンドリア移行シグナルであることが明らかになった。この配列を緑色蛍光タンパク質(GFP)に付加すると、GFPの細胞内局在が細胞質からミトコンドリアへと変化することも明らかにした。特異的な抗体を調製し、ショ糖密度勾配による細胞分画やプロテアーゼプロテクションアッセイを行った結果、StarD7-IIはミトコンドリア外膜と細胞質に局在していることがわかった。大腸菌を用いて発現・精製したStarD7-IIを調製し、蛍光標識した各種リン脂質を用いて輸送活性を測定した結果、このタンパク質はPCを特異的に輸送することが明らかになった。以上の結果から、StarD7-IIはPCをミトコンドリア外膜へ輸送する可能性が高い。今後は、StarD7-IIによるミトコンドリアへのPC輸送が、ミトコンドリア形成や機能維持、およびリン脂質生合成においてどのような役割を果たしているのかを解析する。ミトコンドリア膜の主要な構成成分であるホスファチジルコリン(PC)は、小胞体やゴルジ体で合成される。ミトコンドリア自身はPCを合成できないため、小胞体などで合成されたPCはミトコンドリアへ供給さ)れなければならない。しかし、PCのミトコンドリアへの細胞内輸送が、どのような分子によって行われているのはかこれまで明確にされていなかった。申請者は昨年度、StarD7はミトコンドリア移行配列と脂質輸送ドメインであるStarD(Steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer domain)を持つことを見いだし、このタンパク質がミトコンドリアへPCを供給する輸送分子である可能性を指摘した。今年度ではStarD7の細胞内局在や脂質輸送活性についてさらに詳細に検討した。StarD7は、細胞密度に依存してミトコンドリアあるいは細胞質に細胞内局在を変えることがわかった。StarD7のリン脂質輸送活性を試験管内で調べたところ、PCを特異的に輸送する活性が確認された。さらに、StarD7を過剰発現したHepa-1細胞では、PCをミトコンドリアへ輸送する活性が上昇していた。内在性のStarD7をノックダウンした細胞では、ミトコンドリアのATP合成能が低下するだけでなく、クリステ数も減少していた。これらの結果から、StarD7はミトコンドリアへのPC輸送活性を有するとともに、ミトコンドリアの機能および形態維持にも重要な役割を果たすことが示唆された。
歯の器官原基の初期誘導と分化を制御する分子機構の解析

本研究課題では、上皮・間葉組織の相互作用により誘導される歯胚の初期発生の時期特異的、空間的制御の分子メカニズムを明らかにする目的で、私たちが開発した器官原基法によって作製した人工器官原基の初期発生における遺伝子発現を網羅的に解析した。さらに、再生歯胚発生は正常歯胚発生を再現することから、再生歯胚と正常歯胚発生の初期発生において共通に発現している遺伝子は、歯胚発生に必須の遺伝子群である可能性が高いと考えられた。そこで、正常歯胚発生過程における遺伝子発現変動を網羅的に解析し、発生時期特異的に発現が上昇する379遺伝子の発現時期と発現部位を解析した。その結果、83遺伝子が歯胚特異的に発現し、そのうち11遺伝子が歯胚発生のシグナルセンターであるエナメルノットで特異的に発現することが判明した。エナメルノットは、各種サイトカイン、転写因子を発現することによって、歯胚形成・歯胚発生を統合的に調節するとともに、細胞増殖を負に制御することで歯の形態形成を制御することが知られている。これらのことから、上記の11遺伝子は、歯胚の初期発生・形態形成において重要な役割をもつ可能性が示唆された。そこで、歯胚発生における遺伝子機能を解析するために、高タイターアデノウイルスを歯胚の任意の部位に局所的に注入する、遺伝子導入型歯胚の作製技術を確立した。この技術を用いて、上記の遺伝子群を歯胚上皮組織のエナメルノット外の領域に局所的に遺伝子導入した。その結果、3つの核内分子が細胞増殖マーカーであるKi67陰性の細胞増殖停止領域を異所的に誘導した。さらに、これらの遺伝子を歯胚上皮細胞株に強制発現させたところ、細胞増殖を有意に抑制した。以上の結果から、歯胚の初期発生過程の網羅的な遺伝子発現解析とその分子機能の解析から、エナメルノットで特異的に発現し、歯胚の形態形成に関わる細胞増殖を制御する新規の3遺伝子を同定した。本研究課題では、上皮・間葉組織の相互作用により誘導される歯胚の初期発生の時期特異的、空間的制御の分子メカニズムを明らかにする目的で、私たちが開発した器官原基法により作製した人工器官原基の初期発生における遺伝子発現を網羅的に解析した。その結果、歯胚初期発生期に相当する人工器官原基の培養10時間から20時間にかけて遺伝子発現が4倍以上変動する240遺伝子を抽出した。さらに歯の初期発生に関与する可能性の高い遺伝子群を絞り込むために、文献情報や各種データベース情報を参照してノックアウトマウスが発生のごく初期に死亡する遺伝子や、歯以外の器官発生に関与することが知られている遺伝子などを含む76遺伝子を選択した。選択した76遺伝子から、歯胚初期発生時期のマウス胎仔顎で発現している遺伝子を選別するために、歯胚の初期誘導が起こる胎齢10.5日齢マウスにおける遺伝子発現部位をWhole-mount in situ hybridizationで解析した。その結果、下顎切歯歯胚が誘導される部位である下顎正中部において局所的に発現する17遺伝子を同定した。これらの17遺伝子にはヒトにおいて顎顔面形成異常を引き起こす症候群の原因遺伝子やマウス膵臓形成において重要な役割を担うことが証明されている転写因子が含まれていた。このことから、これらの17遺伝子に歯胚形成に関与する重要な遺伝子が含まれている可能性が強く示唆された。以上の結果から、歯胚形成を生体外で再現する人工器官原基の初期発生における遺伝子発現解析によって、歯胚の初期誘導に関与する可能性が高い17遺伝子をスクリーニングした。また、同定した遺伝子の歯胚発生における分子機能を解析するために、レトロウイルス、アデノウイルスおよびプラスミドDNAの電気的導入法の開発を行い、歯胚組織および細胞に遺伝子を導入する分子機能解析法を確立した。これらの方法を応用することによって、上記のスクリーニングにより選択した候補遺伝子群の歯胚発生における分子機能を解析できると期待される。その結果、歯胚の初期発生に歯胚の初期発生に関与する候補遺伝子として76遺伝子を選択し、そのうち18遺伝子が歯胚発生過程において特異的に発現することが判明した。再生歯胚発生は正常歯胚発生を生体外で再現することから、再生歯胚と正常歯胚の初期発生において共通に発現している遺伝子を見出すことによって、歯胚発生に必須の遺伝子群を選択的に抽出できる可能性が高いと考えられた。そこで、正常歯胚発生過程における遺伝子発現変動を網羅的に解析し、歯胚発生過程において時期特異的に発現が上昇する185遺伝子の発現時期と発現部位の特異性を解析した。その結果、30遺伝子が歯胚特異的に発現し、そのうち7遺伝子が胎齢12日の予定歯胚形成領域、12遺伝子が胎齢14日の歯胚において発現することが判明した。以上の結果から、正常歯胚の網羅的遺伝子発現解析から歯胚発生の時期特異的に発現する遺伝子を抽出できることが明らかとなった。現在、正常歯胚と人工歯胚の遺伝子発現を比較解析することによって新たな候補遺伝子の選別を試みている。また、上記の遺伝子群の歯胚発生における機能を解析することによって、歯胚発生過程の分子機構の解明を進めたいと考えている。選別した候補遺伝子の歯胚発生における分子機能を解析するために、アデノウイルスを用いて歯胚へ局所的に遺伝子導入する方法や、独自手法である器官原基法を応用して遺伝子導入型人工歯胚を作製する方法を開発している。

これらの方法を応用することによって、上記のスクリーニングにより選択した候補遺伝子群の歯胚発生における分子機能を解析できると期待される。本研究課題では、上皮・間葉組織の相互作用により誘導される歯胚の初期発生の時期特異的、空間的制御の分子メカニズムを明らかにする目的で、私たちが開発した器官原基法によって作製した人工器官原基の初期発生における遺伝子発現を網羅的に解析した。さらに、再生歯胚発生は正常歯胚発生を再現することから、再生歯胚と正常歯胚発生の初期発生において共通に発現している遺伝子は、歯胚発生に必須の遺伝子群である可能性が高いと考えられた。そこで、正常歯胚発生過程における遺伝子発現変動を網羅的に解析し、発生時期特異的に発現が上昇する379遺伝子の発現時期と発現部位を解析した。その結果、83遺伝子が歯胚特異的に発現し、そのうち11遺伝子が歯胚発生のシグナルセンターであるエナメルノットで特異的に発現することが判明した。エナメルノットは、各種サイトカイン、転写因子を発現することによって、歯胚形成・歯胚発生を統合的に調節するとともに、細胞増殖を負に制御することで歯の形態形成を制御することが知られている。これらのことから、上記の11遺伝子は、歯胚の初期発生・形態形成において重要な役割をもつ可能性が示唆された。そこで、歯胚発生における遺伝子機能を解析するために、高タイターアデノウイルスを歯胚の任意の部位に局所的に注入する、遺伝子導入型歯胚の作製技術を確立した。この技術を用いて、上記の遺伝子群を歯胚上皮組織のエナメルノット外の領域に局所的に遺伝子導入した。その結果、3つの核内分子が細胞増殖マーカーであるKi67陰性の細胞増殖停止領域を異所的に誘導した。さらに、これらの遺伝子を歯胚上皮細胞株に強制発現させたところ、細胞増殖を有意に抑制した。以上の結果から、歯胚の初期発生過程の網羅的な遺伝子発現解析とその分子機能の解析から、エナメルノットで特異的に発現し、歯胚の形態形成に関わる細胞増殖を制御する新規の3遺伝子を同定した。
高輝度陽子・陽子衝突実験におけるミューオン・トリガーの研究

7TeVでのLHC衝突実験のデータから、エンドキャップ部でのミューオン・トリガーについて、トロイド磁石近傍から発生した荷電粒子に起因するフェイク・トリガーが大部分を占めており、スモール・ウィールの検出器で、衝突点からトラックが来ていることを要求することが重要であることを示した。また、このトリガーを実現するための、トリガー・プロセッサーの基本設計を行なった。LHCは2009年秋より衝突実験が開始されたが、本格的な7TeVでの実験は2010、11年に行われる。ルミノシティを10倍の10^<35>/cm^2/secに増強するSLHC実験の計画も少し遅れる予定であるが、R&Dは進められている。本研究の平成21年度においては、SLHCでのミューオン・トリガー準備研究として、モンテカルロ・シミュレーションを行い、ミューオンの運動量分布、トラック・レートについて評価を行った。その結果、現在のレベル1・トリガーのスキームでも、ミューオン以外のバックグラウンドは少ないが、運動量分解能が不足しているためにトリガーレートが、データ収集の限界を大幅に超過するおそれがあることが判った。また、トリガー・プロセッサーのプロトタイプの設計の為に、FPGAを搭載したテスト用モジュールを製作し、様々なconfigurationでの動作テストを行った。また、光通信や高速シリアル通信の性能の確認の為の通信テストを行った。LHCは2010年春より7TeVでの衝突実験が開始され、ルミノシティを5×10^<34>/cm^2/secに増強するSLHC実験の計画も2021年から予定され、R&Dが進められている。平成22年度においては、SLHCでのミューオン・トリガー準備研究として、運動量分解能を補い、トリガーレートをデータ収集の要求以下におさめるために、エンドキャップ部スモール・ウィールをもちいた新しいトリガースキームについて研究を行なった。位置分解能及び角度分解能に優れた検出器を設置して、衝突点からトラックが来ていることを要求することで、効果的にトリガーレートを抑制できることが、モンテカルロシミュレーションで判った。また、SLHCにはレベル1のレーテンシーを伸ばすためにフロントエンド・エレクトロニクスの置き換えが計画されており、そのスキームにおいてのトリガー・プロセッサーの設計を行なった。また、FPGAを搭載したテスト用モジュールを製作し、様々configurationでの動作テストを行った。LHCは2011年7TeVで3×10^<33>/cm^2/secのピークルミノシティを達成し、5fb^<-1>の衝突実験データを蓄積した。またルミノシティを5×10^<34>/cm^2/secに増強するHL(High Limnosity)-LHC実験の計画も2023年から予定され、R&Dが進められている。平成23年度においては、2019年に予定されているPhase Iアップグレードでのミューオン・トリガー準備研究をおこなった。まず実験データからの解析により、Fake Triggerの原因がエンドキャップ・トロイド付近から発生した荷電粒子(主として陽子)によりものであることが判った。これらのFake Triggerを除去し、トリガーレートをデータ収集の要求以下におさめるために、エンドキャップ部スモール・ウィールをもちいた新しいトリガースキームについて研究を行なった。位置分解能及び角度分解能に優れた検出器を設置して、衝突点からトラックが来ていることを要求することで、効果的にトリガーレートを抑制できることが、モンテカルロシミュレーション及び実データの解析から判った。また、このためのトリガー・プロセッサーの設計を行ない、FPGAを搭載したテスト用モジュールで、光通信や高速シリアル通信の性能の確認及び、動作テストを行った。
セルロプラスミン遺伝子ノックアウトマウスの作製と、それに於ける膵B細胞の機能解析

糖尿病の病因には遺伝因子と肥満、運動不足などの環境因子の両方がある。このうち糖尿病の遺伝因子については遺伝様式の研究から、特殊な症例を除けば、多因子が関与している事が判かっている。私達は、Cp遺伝子が糖尿病の病因の1つではないかと考えている。しかし、血清Cp値の低下あるいは欠損が糖尿病の発症に関与する病態は不明である。そこで、Cp欠損あるいは減少が膵B細胞減少とどのように関係するのか、その機序を詳細に調べるために、Cp遺伝子のノックアウトマウスの作製を行うこととした。Cp遺伝子ノックアウトマウスの作製。Cp遺伝子のエクソン2にインフレームでn-LacZをつなげ、エクソン3にプロモター付きのネオマイシン耐性遺伝子(PGK-Neo)を挿入したコンストラクトを完成させた。これにより、ネオマイシンによる選別法で相同組み換えをおこしているES細胞を得る事が可能となり、またベーター・ギャル染色にて組み換え体を持っている細胞の確認が可能となった。現在、本コンストラクトを用いてCp遺伝子のエクソン2及び3をノックアウトしたマウスを作るべく、ES細胞への本ベクターを導入する実験を行う準備をしている。今後、相同組み換えが行われたES細胞を桑実胚にいれた後、仮親の子宮で発育させキメラマウスを得、さらにそれの交配を続けてノックアウトマウスを得るという実験を常法に従い行なった。遺伝因子については遺伝様式の研究から、特殊な症例を除けば、多因子が関与している事が判かっているが、私達はCp遺伝子もその1つではないかと考えている。種々の病態より、血清Cp値の低下あるいは欠損が膵B細胞減少に関与していると考えられるが、その機序は不明である。そこで、その機序を詳細に調べるために、Cp遺伝子のノックアウトマウスの作製kする事とした。本マウスを用いる事により、Cp欠損の影響を胎生期からの経時変化も含めて、個体レベルのみならず各臓器レベルで調ベる事が可能になる。また、ホモ異常とヘテロ異常(血清Cp値は約半分)による病変の違いについても検索出来る。現在、Cp遺伝子ノックアウトマウスの作製中である。Cp遺伝子は、人では全構造が、ラットではエクソン1及び5'上流領域の構造が報告されているが、マウスでは全く報告されていない。そこで、まずマウス遺伝子の単離を行い、エクソン1から3を含む領域をカバーする染色体DNAクローンを単離した。本クローンを用いてノックアウトマウス作製用の遺伝子ベクターを作製する。Cpのエクソン2にインフレームでn-LacZをつなげ、エクソン3にプロモター付きのネオマイシン耐性遺伝子(PGK-Neo)を挿入したベクターの作製をほぼ完了した。以上により、ネオマイシンによる選別法で相同組み換えをおこしているES細胞を得る事が可能となり、またベーター・ギャル染色にて組み換え体を持っている細胞の確認が可能となる。現在、ES細胞への本ベクター導入実験を行う準備も同時に進めている。私達は、Cp遺伝子が糖尿病の病因の一つではないかと考えている。しかし、血清Cp値の低下あるいは欠損が糖尿病の発生に関与する病態は不明である。そこで、Cp欠損あるいは減少が膵B細胞減少とどのように関係するのか、その機序を詳細に調べるために、Cp遺伝子のノックアウトマウスの作製を行った。Cp遺伝子のエクソン2にインフレームでn-LacZをつなげ、エクソン3にプロモーター付きのネオマイシン耐性遺伝子(PGK-Neo)を挿入したコンストラクトを完成させた。これにより、ネオマイシンによる選別法で相同組み換えをおこしているES細胞を得ることが可能となり、またベーター・ギャル染色にて組み換え体を持っている細胞の確認が可能となった。

現在、本コンストラクトを用いてCp遺伝子のエクソン2及び3をノックアウトしたマウスを作るべく、ES細胞への本ベクターを導入する実験を行っている。今後相同組み換えが行われたES細胞を桑実胚に入れた後、仮親の子宮で発育させキメラマウスを得、さらにそれの交配を続けてノックアウトマウスを得るという実験を常法に従い行なった。
角層バリア形成の分子基盤の解析

本研究では、皮膚がウイルスや化学物質など外部環境から身を保護するバリアとして機能するために重要と考えられているコーニファイドエンベロープ(CE)形成の分子基盤を明らかにすることにより、皮膚疾患の新たな治療法の開発に貢献することを目的とする。皮膚表皮最外層の角質に変化する直前のSG1細胞でCEが形成されることから、SG1が角質に変化する過程を観察できる方法を確立する。さらにSG1細胞の特定の遺伝子発現を抑制させる方法も確立し、CE形成過程で標的遺伝子がどのような役割を担っているのかを明らかにする。
アイヌ文化の基層と形成過程における古代日本文化の影響に関する基礎的研究

本研究では、古代日本(とくに東北地方)の文化と、同時代の北海道文化・アイヌ文化との関係について、宗教や儀礼の側面から、具体的な比較検討をおこなった。特に、宗教・儀礼にかかわる金属製品や木製品などの分布や形態、機能について検討した。それにより、アイヌ文化における宗教・儀礼の道具の源流が、擦文時代やそれ以前に遡る可能性が指摘できた。また、古代北海道やその隣接地域における宗教・儀礼の痕跡が、交易や交流において重要な場所に多くみられる傾向を指摘することができた。2015年度は当該研究の初年度であり、10月に青森で全体研究会および巡検調査を実施した。日本古代の祭祀・宗教および儀礼具、民族誌的なアイヌの祭祀・宗教および儀礼具についての総論を提示することで、研究チーム内部で基本的な事実関係や認識を共有し、当該研究課題を具体的に深めていくための基礎となる視座を得ることができた。さらに、五所川原市十三盛遺跡や青森市新田(1)(2)遺跡における10-11世紀頃の発掘調査成果、とくに木製品、祭祀具について、発掘調査担当者の協力のもとに、遺物に即した検討をおこない、豊富な情報を得て意見交換をおこなうことができた。また、北日本の古代祭祀に関わりの深い錫杖状鉄製品や出土文字資料、漆器等についても議論を深めた。11月には札幌、厚真、平取、白老にて古代・中世の遺物調査および近現代の民具調査をおこなった。調査の結果、研究分担者の笹生によって、北海道には、すでに続縄文文化後半期に遡って、本州古墳文化の祭祀と関連する遺物のあることが指摘された。このことで、当該研究課題は、少なくとも5世紀に遡って検討すべき必要性があることが認識された。また、あわせてアイヌ協会の主催するカムイノミ(神々への祈りの儀礼)、シンヌラッパ(祖先祭祀)にも参加した。それによって、儀礼における献酒行為の重要性や、その際に用いる儀礼具の形態や意味について考察を深める必要性が再認識された。3月には、列島北方地域との比較史的視点を得るため、鹿児島での調査を実施し、古代隼人の社会・祭祀・葬送の実態および古代日本との交流に関して知見を得た。本研究課題の初年度は、当初よりフィールドワークによる情報の収集を主たる目的としていた。その意味で、古代北日本、とくに平安期の青森の木製品・祭祀具について、発掘調査担当者からの多大な協力を得て、いくつもの重要な知見を得ることができたことは大きな成果であった。それらの情報の整理と歴史的意義の検討はこれからであるが、残り2年間の研究期間において具体的に掘り下げるべき論点を絞り込むことができた。また、擦文期の北海道において本州の祭祀・儀礼との接触があった可能性は、先行研究においても指摘されることがあったが、古墳時代の倭系祭祀が続縄文期の北海道と接触・交流し、影響を与えている可能性は、当該研究によってはじめて着想され、成果の期待できる新視点であるといえる。2016年7月、北海道江別市の北海道埋蔵文化財センターにおいて資料調査を実施した。特に、千歳市美々8遺跡、千歳市ユカンボシC15遺跡から出土した、続縄文期擦文期中近世にかけての考古資料のうち、木製品を中心に多くの点数を調査した。発掘担当者からの助言も得つつ、詳細な調査検討を行うことができた。とりわけ、続縄文文化期擦文文化期に遡る可能性のある祭祀具(イクパスイとされる資料などを含む)を数十点実見し、検討できたことは大きな成果である。これらの資料の具体的な用途・機能などを、後世の民具資料や民俗事例との比較検討などから歴史的・具体的に把握するための議論を深めることができた。また、道埋文センターに近い江別市の北海道式古墳(後藤遺跡)を現地踏査した。さらに、平取町、恵庭市において、多数のアイヌ民具および続縄文擦文期中近世の考古資料、遺跡を調査した。擦文後期の祭祀遺跡の可能性のある平取町カンカン2遺跡と、付近のチャシとの位置関係を現地踏査により確認した。これにより、前近代のアイヌ(あるいはその祖先集団)の祭祀行為を、周辺環境および景観のなかで具体的にイメージすることができた。2017年2月、長崎県での現地調査を実施した。大村市竹松遺跡で、列島内外の貿易陶磁器や、宗教・儀礼に関わる製品などを実見調査し、担当者からのコメントを得つつ議論を深めることができた。また、佐世保市門前遺跡に関して、同様の資料群を実見調査した。さらに、古代・中世において、南西諸島から列島北方地域まで流通した滑石製石鍋の主産地である西彼杵半島の西海市ホゲット遺跡を現地踏査し、多くの知見を得た。これらにより、列島周縁地域の国際交流と宗教・儀礼の関係について多大な成果が得られた。それは、列島北方地域およびアイヌの交易と宗教・儀礼のかかわりについても、比較検討の材料として、重要な参考事例となる。北海道の古代中世の木製品の調査・検討は、本プロジェクトの「本丸」ともいうべき中心的領域であり、計画当初から詳細に検討することが必須であった。これについて、過去の2年間において、北海道および本州北部の古代祭祀具、あるいは祭祀に関連する可能性のある木製品の大半を実見・検討することができたことは大きな成果である。北海道でも、古いものでは続縄文後半期に遡る層位から出土した木製品のなかに、木製祭祀具(民俗例の祖形)としての可能性が指摘されている資料の存在が確認でき、そうした資料について、本州の祭祀

具の研究者や、アイヌの民具や伝統文化の研究者などを交えて、実物を手に取りながらの活発な意見交換を行うことができた。それにより、本州北部における類例や、民俗事例との比較検討についても、具体的な論点や課題が浮き彫りとなってきた(それらの具体的なポイントについては整理中である)。さらに、こうした祭祀の場、祭祀具の出土地点が、いずれも交流・流通の要衝であることをどのように考えるべきか、問題が明瞭になってきた。こうした点については、「西」「南」の九州や南西諸島における古代・中世のアジア的交流の状況からも、比較検討すべき多くの示唆を得ることが可能となっている。このように、祭祀・儀礼と交易・交流のかかわりについて、普遍性・共通性の視点と、北方地域・アイヌならではの独自性の視点との両面から検討するための素材が整いつつある。最終年度には、当初の予定どおり、これらの調査のデータとその検討結果を整理・分析し、「アイヌ文化の形成と基層」における祭祀・儀礼と交流・交易の実態・意義について、いくつかの仮説的な見通しの提示をおこなうことができると期待される。2018年2月10日に厚真町での遺物調査を実施した。宇隆1遺跡出土の12世紀代の常滑産陶器壺を観察し、平泉との交流の可能性や、祭祀遺物としての評価に関して意見交換した。上幌内モイ遺跡出土の炭化イナキビや、破砕され被熱した銅鋺、五所川原産須恵器などを観察し、擦文期の儀礼と、同時期の本州北部の儀礼、民族誌的なアイヌ文化の儀礼との異同について検討した。さらに、オニキシベ2遺跡出土の刀剣類、玉類・銭貨や、スタンプ文をもつ漆器、上幌内2遺跡出土の刀剣類ほか、12世紀代の秋草双鳥鏡(コイル状鉄製品と共伴)などを調査した。翌11日-12日には北海道大学アイヌ・先住民研究センター(札幌市)を会場として総括研究会を実施した。11日は、厚真町の約10年間の発掘調査のうち、特に祭祀・儀礼にかかわる考古学的事例が報告された。また、北海道出土の木製品に関する年代測定の事例報告がなされた。12日には個別テーマの研究報告と意見交換をおこなった。古代の列島北方地域における祭祀・儀礼に関する遺物について、先行研究をまとめ、錫杖状鉄製品、銅鋺、コイル状鉄製品などの出土状況を集成し、それらの遺物の機能や、分布の意味などについて意見交換した。さらに、古代東ユーラシアにおける交易商人と仏教とのかかわりや、中世九州の在地社会における荘園と仏教信仰との関係、近世蝦夷地における場所経営と祭祀・信仰とのかかわりに関する研究報告がなされた。以上によって、前近代のアイヌ・北方地域においては、交通・交流・交易の要衝に祭祀・儀礼の痕跡が多い傾向が明瞭となった。また、祭祀・儀礼の概念について、機能論や行為論の視座から具体的に掘り下げる必要性が指摘された。アイヌの固有信仰の形成・展開における古代日本の祭祀・儀礼との関連について、現時点で断案は示しえないが、今後の研究の方向性を探るうえで基礎となる研究成果を得ることができた。本研究では、古代日本(とくに東北地方)の文化と、同時代の北海道文化・アイヌ文化との関係について、宗教や儀礼の側面から、具体的な比較検討をおこなった。特に、宗教・儀礼にかかわる金属製品や木製品などの分布や形態、機能について検討した。それにより、アイヌ文化における宗教・儀礼の道具の源流が、擦文時代やそれ以前に遡る可能性が指摘できた。
ニュータウン・大規模団地の地域住環境運営における中間集団の役割と可能性

大規模団地、ニュータウンにおける中間集団の実態を多角的に調査し、中間集団の、出入り自由なon/off的な性質、対照的に集団の内外が明確なin/out型の性格が抽出され、on/off的な集団も、それが空間的実態を持つことで、安定的継続性を得る一方、in/out型の性格を強くする傾向もみられた。またin/out型の自治会のような集団が、in/out的な緩やかな集団をつくる契機となること、またその逆のケースも散見でき、中間集団の多様なあり方や形成のプロセス、発展、継続の契機を抽出し、それらがニュータウン・大規模団地の地域住環境運営に果たす役割について明らかにできた。最終年度には、公開シンポジウム「集住とコミュニティ-コミュニティはデザインできるか-」を開催し、研究成果の開示、及び、広く意見の収集を行なった。共同研究会を4月、9月、12月に開催し、初回の研究会では、現在までのそれぞれの研究内容の報告をするとともに、新たな住まい方の試みとして注目されているコレクティブハウス「かんかん森」(東京都荒川区)を見学し、この企画にあたった「コレクティブハウジング社」の担当者、及び居住者へのインタビューを行った。共用の食事室を持ち、コモンミールを取り入れたコレクティブハウスの運営について説明をうけ、結果として多世代の居住者構成となっている実態を把握した。9月には、外国人居住者が多く居住者し、独特の自治会組織を形成している「横内団地」(神奈川県平塚市)を見学、自治会の役員へのインタビューを行った。外国人居住者との共生における問題の中から、自治会の役割が変化していくプロセスを知ることができた。12月の研究会では、大阪市西淡路地区の建て替えプロジェクト・現代長屋「TEN」を見学し、企画者の寺川政司氏、および居住者へのインタビューを行った。公営住宅の建て替えにあたり、良質な地域コミュニティの維持という観点からの公有地の定期借地と、コーポラティブ方式により建設のプロセスを共有することによる居住者ネットワークの形成の可能性について知見をえた。また、12月17日には京都文教大学人間学研究所公開シンポジウム「ニュータウンで育てる/ニュータウンを育てる」(主催京都文教大学・協賛科研「ニュータウン・大規模団地の地域住環境運営における中間集団の役割と可能性」(基盤研究B)において、大月敏雄が「関東地方のニュータウンの現在」を報告。また、韓国ソウルにおいて篠原聡子がニュータウンにおける共用空間について調査を開始。初年度の報告をソウルカンウン大学において行った。その他、イギリス・ロンドン郊外、台湾・台北におけるニュータウンの視察を行った。共同研究会を以下のようにおこなった。4月14日16日日本女子大において、昨年度の各自の研究報告と今年度の研究のすすめ方についての報告が行われた。10月27日29日日本女子大学において、研究分担者の中間報告が行われた。千里ニュータウン、赤羽台団地、高蔵寺ニュータウン、ロンドン・パリ・ベルリン近郊のニュータウン、ソウル、マニラなど、各地における中間集団に関する事例報告を通じて、大規模団地の歴史的特性、及び現在の状況の共通点、相違点の整理の手がかりを得た。また、「多文化社会におけるコレクティブハウジングの暮らし、住まい、まち」のシンポジウムに参加し、建て替え後の江戸川アパートの見学を行った。2月25日26日京都文教大学において、今後の取りまとめの方針まとめ、富井正憲氏から「韓国・中国・台湾における住宅営団の残した住宅のその後の変容」についてのレクチュアを受け、東アジアにおける大規模団地における住宅計画の歴史的知見を得た。また、次年度以降の取りまとめの方針を以下のように決めた。・篠原聡子私的領域内の中間集団との接続空間(台北・東京・ソウル・北京の集住)・小谷部育子コモンと中間集団の持続的運営(かんかん森、巣鴨、フェルドクネッペン)・中村直美中間集団とその可能性(大塚女子アパートメント、赤羽台単身者棟)・大月敏雄戸建住宅地の住環境運営における中間集団のパターンのモデル化(まちなみコンクール)・西川祐子ネットワーク媒体の変化と中間集団(高蔵寺他)・森正美国家政策と中間集団(GK/マハルリカビレッジ・マニラ民生社区・台北)その他、3月26日に台湾の淡江大学において、「東京・ソウル・台北における住まいとネットワーク」として、篠原、森、大月が研究発表を行った。6月7日日本女子大学において・昨年度の研究報告と今年度の研究の進め方についての報告が行われた。高蔵寺ニュータウン・赤羽台団地・台北など・各地における中間集団に関する事例報告を行い・大規模団地における中間集団の活動報告などを通じて各事例における現在の状況の共通点・相違点についての知見を得た。また・ホームページにて研究報告をするにあたっての検討を行った。7月15日16日京都の西川邸において研究分担者の中間報告が行われた。

新たな事例報告に加え・千里ニュータウン・赤羽台団地・高蔵寺ニュータウン・ヨーロッパのニュータウンなど・各地におけるこれまでの中間集団に関する事例報告を踏まえて共通点・相違点などの整理をし・今後の取りまとめについては引き続き以下の方針にて各自で進めるように決めた。・篠原聡子私的領域内の中間集団との接続空間(台湾・東京・沖縄・ソウル・マニラ・ロンドン・ベトナム・北京)・小谷部育子コモンと中間集団の持続的運営(かんかん森・巣鴨・フェルドクネッペン)・中村直美中間集団とその可能性(大塚女子アパートメント・赤羽台単身者棟)・大月敏雄戸建住宅地の住環境運営における中間集団のパターンのモデル化(まちなみコンクール)・西川祐子ネットワーク媒体の変化と中間集団(高蔵寺ニュータウン他)・森正美国家政策と中間集団その他・2月に台湾の淡江大学において篠原・大月が台湾のニュータウンをテーマとしてワークショップを行い・現状をより広範囲な視点から調査を行った。20年度は、本研究の最終年度となるために、研究分担者の研究を総合した成果とするための研究会、また研究成果を発信するためのシンポジウムを開催した。6月28日・29日の京都での研究会では、各研究者が分担の項目について発表し、取りまとめの方針、並びに成果を発信するためのシンポジウムについて打ち合わせをおこなった。10月19日には、日本女子大学で「集住とコミュニティーコミュニティはデザインできるか-」と題して、シンポジウムを開催した。(共催野村不動産株式会社)シンポジウムではまず、研究分担者が以下のような報告を行った。・「空間はコミュニティをつくれるか-民間分譲集合住宅PROUDにおける居住者コミュニティ-」(小河麻衣子・篠原聡子)・「大規模団地におけるネットワーク居住の実態-東京都内の定住型分譲集合住宅Sの事例-」(中村直美)・「関係性をデザインする-フィリピンのサブディビジョンの事例から-」<森正美>・「コミュニティ・ネットワークと媒体-高蔵寺ニュータウンのNPO法人まちのエキスパネットの事例から-」(西川祐子)その後、パネリストに井関和朗氏(UR都市機構)、藤村龍至氏(建築家)を招き、大月敏雄が加わり篠原聡子が司会をつとめて、パネルディスカッションを行った。近年大規模な集合住宅にみられるゲーテッドな構成に対する本研究の示唆する方向など、実態社会に対する本研究の意義が話し合われた。シンポジウムの内容をとりまとめたDVDを作成し、関係者に配布した。3月8日には、最終の研究会を行い、ニュウータウン及び大規模団地における中間集団の類型化と発生の契機、展開、発展、継続に関係する要因について整理し、本研究の継続の可能性とさらなる発信の方法について話し合った。
SEREX法を用いた魚類食細胞マーカー膜タンパク質の探索

ヒラメの食細胞mRNAを基に作製した哺乳類細胞発現ライブラリーを、食細胞に対する抗血清でスクリーニングし、膜タンパク質遺伝子を含むクローンを選択的に分離した。本手法で得られたクローンの60.4%が膜タンパクをコードしていた。抗体スクリーニング前のライブラリーでは、膜タンパクをコードする割合は20%程度であり、本手法により効率的に膜タンパク遺伝子を単離できた。発現解析により幾つかの遺伝子は食細胞に特異的に発現することが明らかとなった。ヒラメ食細胞の膜タンパク遺伝子を網羅的に取得するために,ヒラメ食細胞cDNAライブラリーの抗血清によるスクリーニングを行った。膜タンパク質に対する抗血清は,市販のキットを用いてヒラメ食細胞から膜タンパクを精製し,マウスに複数回免疫することで作成した。また,食細胞をそのままラットに接種し,食細胞全タンパク質に対する抗血清も作成した。作成した抗血清は,いずれも10000倍以上に希釈してもヒラメ食細胞に反応が認められ,充分に高い力価が得られた。大腸菌を宿主とした発現ライブラリーでは,交叉反応が多く,抗体によるスクリーニングが有効に行えなかった。そこで,レトロウイルスをベクターとした哺乳類細胞を用いた発現ライブラリーの作成を試みた。まず,ヒラメ食細胞cDNAをレトロウイルスプラスミドベクターに組み込み,3.1×10^5サイズのプラスミドライブラリーを作成した。プラスミドライブラリーをパッケージング細胞に組み込み,約1×106/mLの力価の組替えウイルスを作成した。ウイルスをマウス由来のNIH3T3細胞に感染させ,ヒラメ遺伝子をNIH3T3細胞に組み込んだ。現在までに,ウイルスを感染したNIH3T3細胞はヒラメ由来の遺伝子をゲノム上に保有していることをPCRで確認している。今後,抗血清を用いて発現スクリーニングを行う。抗体に反応した細胞はクローニングし,インサートをシークエンスし,塩基配列を決定する。得られた塩基配列を基に既知の遺伝子との相同性を調べるとともに,ヒラメ白血球における発現解析を行う。ヒラメの食細胞mRNAを基に作製した発現ライブラリーを,食細胞の膜タンパク質を抗原として作製した抗血清でスクリーニングする事で,膜タンパク質遺伝子を含むクローンを特異的に選抜することを目的とした.大腸菌を宿主とした発現ライブラリーでは,交叉反応が多く,抗体によるスクリーニングが有効に行われなかった.そこで,哺乳類細胞を用いて発現ライブラリーを用いて,細胞表面に発現したヒラメ膜タンパク質を,食細胞全タンパク質を抗原として作製した抗血清でスクリーニングする方法を試みた.レトロウイルスをベクターとした方法では,組替えタンパクの発現量が少なく,抗体によるスクリーニングが困難であった.一方,哺乳類細胞用の発現プラスミドベクターにヒラメ白血球のcDNAを組み込み,COS7細胞にプラスミドをトランスフェクションした一過性発現ライブラリーでは,組替えタンパクの発現量が充分で,スクリーニングを行うことができた.本ライブラリーと抗血清を反応し,抗体に反応した細胞を磁気ビーズで標識した2次抗体を用いて分離することで,効率的なライブラリーのスクリーニングが可能となった.抗体を用いて分離した細胞からプラスミドを再抽出し,大腸菌にクローニングした.ランダムに48クローンの塩基配列を決定したところ,60.4%が膜タンパクをコードしていた.抗体によるスクリーニング前のライブラリーでは,膜タンパクをコードする割合は20%程度であり,本手法により効率的に膜タンパク遺伝子を単離できたと考えられる.得られた配列の約80%はヒラメで新規の遺伝子,約5%は魚類で新規な遺伝子であった.既存のモノクローナル抗体を用いて組分画したヒラメ白血球からRNAを抽出し,18遺伝子について発現解析を行ったところ,GCSFR, CD209, ADAM19は食細胞に特異的に発現していた.
気候変動と農家の適応行動に関する定量分析：品種選択ダイナミクスと生産への影響

本研究の目的は、気候が農家の適応行動を通じて農業生産におよぼす影響を構造的かつ動的に明らかにすることである。特に、適応行動のひとつである品種選択行動と気候変化の関係に着目し、品種選択が作物の単収や品質に与える影響について長期パネルデータを用いながら定量分析を行なった。まず、分析に必要となる時系列データとして、水稲の品種データと生産データおよび気候データをそれぞれ入手し、1970年2009年(40年間)の都道府県別長期パネルデータを構築した。なかでも品種データについては、膨大な資料を電子データベース化するために、2年間を通じて多くの時間と労力を費やした。整備した品種データを基に、早晩性や耐冷性、食味など単収や品質に影響を与えうる品種特性を数値化し、各品種の都道府県内作付面積を重みづけに用いた都道府県レベルの品種特性インデックスをそれぞれ作成した。次に、構築した様々な品種特性インデックスを被説明変数として用いる県レベルの集計モデルを基に、各種気象条件が品種特性の選択にあたえる影響をパネル推定した。その結果、猛暑や強風などの短期的な気象影響が耐病性や耐倒伏性といった特性への対応を促す一方で、早晩性、耐冷性、品質、食味などの特性については長期的な気温の変化に伴い適応選択が行われていることが示唆された。本年度は昨年度よりも時間軸をさらに拡張したパネルデータを用いたが、昨年度と類似の結果を得た。また本年度は、品種選択を考慮した単収・品質への気候影響についても計量分析を行ない、品種選択を考慮しない場合の推定結果と比較した。その結果、品種選択の変化により気象条件が単収・品質におよぼす影響に違いをもたらしうることが示唆された。本研究は、気候が農業生産におよぼす影響を構造的かつ動的に明らかにするために、(A)気候条件の変化や品種特性の更新が農家の品種選択におよぼす影響の定量分析と(B)品種選択を内生的に考慮した単収・品質への気候影響の定量分析を段階的に行なう。2017年度は、(A)に該当する事項として、(1)データベースの構築、(2)品種選択モデルの構築、(3)計量分析を以下の通り遂行した。(1)データベースの構築:(A)の定量分析に必要となる時系列データとして、品種データ、気候データ、作物生産データをそれぞれ入手し、1990年2009年の都道府県別パネルデータを構築した。なかでも品種データについては、早晩性や耐冷性、食味などの品種特性を数値化し、各品種の都道府県内作付面積を重みづけに用いた都道府県レベルの品種特性インデックスをそれぞれ作成した。(2)品種選択モデルの構築と(3)計量分析:(1)で作成した様々な品種特性インデックスを被説明変数として用いる県レベルの集計モデルを基に、各種気象条件が品種特性におよぼす短期・中長期的影響をそれぞれ推定した。その結果、耐病性と耐倒伏性については高温や強風などの短期的な気象影響がそれぞれの特性への対応を促す一方で、早晩性、耐冷性、品質、食味については長期的な気温の変化に伴い適応選択が行われていることが示唆された。特に、品質や食味は最終生産物である米の等級に無視できない影響を及ぼす可能性があることを考えれば、2018年度に実施予定である(B)の分析につながる重要な知見を得ることができたといえる。上記の通り、現状において20年間のパネルデータを構築できたものの、気候変動の影響分析をより高い精度で行うには、より長期のパネルデータに拡張することが求められる。しかしながら、品種データの入手元である「水陸稲・麦類・大豆奨励品種特性表」の電子化には膨大な時間と労力を費やすため、1990年以前のデータベース化については現在も作業過程にある。とはいえ、モデルの構築につながった論文サーベイについては予定通りに進めることができた上、現存のパネルデータを用いた計量分析からは上述したような興味深い結果を得ることもできたので、おおむね順調に進展していると考えられる。

また本年度は、品種選択を考慮した単収・品質への気候影響についても計量分析を行ない、品種選択を考慮しない場合の推定結果と比較した。その結果、品種選択の変化により気象条件が単収・品質におよぼす影響に違いをもたらしうることが示唆された。上述したパネルデータの拡張については、研究補助を引き続き利用してできる限り速やかにデータを整備し、分析(A)を再度執り行うことを目標とする。また、これと並行して、2018年度は(B)に該当する構造推定モデルの構築ならびに計量分析を行い、品種選択を考慮しない場合の推定結果と比較しつつ、構造推定モデルの妥当性を検証する。想定を上回る人件費支出の都合上、2017年度の購入を見送った高速ワークステーションを2018年度は入手し、構造推定モデル分析の際に生じうる膨大な計算処理を迅速に行えるようにする。また、上記パネルデータの整備に必要な研究補助への支出を当初予算より増額する予定である。
神経再生関連プロテアーゼの機能解析

本研究の目的は、神経再生関連分子Damage-induced neuronal endopeptidase (DINE)の働きを解明することである。前年度までに、運動ニューロン特異的にGFPを発現するHb9::eGFPトランスジェニックマウスと交配させることにより、DINEノックアウトマウスの全身の運動神経の可視化に成功した。そこで本年度は、作製したマウスを使ってGFP抗体のwhole mount免疫染色を行い、DINE欠損がマウス運動神経の発達に与える影響を詳細に解析した。胎生期11.5日齢(E11.5)のマウスの上肢では、DINEノックアウトマウスとコントロールマウスの運動神経の形態に明らかな差はみられず、ともに腕神経叢の形成が認められた。しかし、E12.5では、コントロールマウスと比較し、ノックアウトマウスの運動神経は分岐が乏しくなっていた。この傾向は発達が進むとさらに顕著になり、E14.5では運動神経末端の細かい分岐がほとんどみられなかった。このような運動神経の樹枝状分岐の異常は、上肢のみでなく、下肢、体幹部、顔面神経でも同様に認められた。以上の結果から、DINEが全身の運動神経において筋内での樹枝状分岐に必須の役割を果たしていることが明らかとなった。最近、DINEのヒトホモログに変異が入ると先天性関節拘縮症を発症し、上肢や下肢などで運動障害を生じることが報告されている。本研究の結果を踏まえて解釈すると、DINEが正しく機能しなくなることが、ヒト・マウスという種の壁を超えて、全身の運動系の構築異常につながる可能性が示唆される。(抄録なし)1.酵素であるDINEの機能を解明するためには、酵素としての性質を明らかにすることが欠かせない。そこで、合成基質ライブラリーを使って、DINEの好む配列を同定することを目指した。当初は生体組織からDINEタンパクを直接抽出することを予定していたが、精製の煩雑さ、予想収量の低さを改善するために、分泌型DINEを作製する計画に変更した。ポジティブコントロールとなる分泌型NEPとともに、HisタグをN末に付加して簡便に精製できるようにした。十分量の分泌型タンパクが精製できた段階で活性チェックに進む。2.機能解明のために最も重要な基質の同定であるが、今年度はサンプル調整の方法を確立することができた。次の課題は、より良い基質探索の方法を模索し、決定した後、野生型とKOの組織を用いて網羅的な比較を行うことである。3.特定の病態との関連を見出すことは、遺伝子の機能の手がかりを掴むためには欠かすことができない。DINEが属するNEP familyは、NEPを始め、ECE1、ECE2、NEP2でADとの関連が示唆されており、DINEも同様にADとの関連が疑われた。そこで、ADモデルマウス、およびAD患者の死後脳を用いて、DINEがAD病態において発現変動するか否かを探索した。ADモデルマウスでは大脳皮質、海馬で野生型マウスと比較して差はみられなかった。また、ヒト死後脳の側頭葉においてもADと健常者間でDINE mRNAの発現に変化は認められなかった。1.ペプチダーゼDINEの機能を調べるために、合成基質ライブラリーを用いて、DINEの好む配列を同定することを目指した。Flagタグ付き分泌型DINEをカイコに発現させ、Flagtagに対するAffinityカラムを用いて回収・精製した。構造が類似するペプチダーゼNEPをポジティブコントロールとして用いて、活性評価系を確立させた後に、分泌型DINEと基質ライブラリーを混ぜ、反応させた。様々なbuffer条件下で評価を行ったにもかかわらず、明確なDINE活性は得られなかった。糖鎖修飾、あるいは細胞質ドメインの欠如がDINEの活性に影響している可能性が考えられる。2.サンプル組織の煮沸、ホモジェナイズ法の修正、10kDa cut off filterのprewashなど細かい変更を加えることで安定してペプチドを抽出することが可能となった。また、抽出条件を従来の酢酸bufferからメタノール:酢酸bufferに変更することで、ペプチド同定数が約5倍に増加した。さらに、標準ペプチドを加えることで、iTraqラベルを用いて相対的なサンプル定量が可能となった。3.運動ニューロン特異的にGFPを発現するHb9 tgマウスとDINEノックアウトマウスを交配し、DINEノックアウトマウスの運動神経を可視化することに成功した。このDINE/Hb9 tgマウスを詳細に解析することで、横隔神経、肋間神経などの特定の運動神経のみでなく、上肢や下肢でも運動神経の分岐が減少していることが明らかとなった。

この傾向は発達が進むとさらに顕著になり、E14.5では運動神経末端の細かい分岐がほとんどみられなかった。このような運動神経の樹枝状分岐の異常は、上肢のみでなく、下肢、体幹部、顔面神経でも同様に認められた。以上の結果から、DINEが全身の運動神経において筋内での樹枝状分岐に必須の役割を果たしていることが明らかとなった。最近、DINEのヒトホモログに変異が入ると先天性関節拘縮症を発症し、上肢や下肢などで運動障害を生じることが報告されている。本研究の結果を踏まえて解釈すると、DINEが正しく機能しなくなることが、ヒト・マウスという種の壁を超えて、全身の運動系の構築異常につながる可能性が示唆される。本年度中に予定していた、野生型マウスとKOマウスの組織間での網羅的な基質探索を実行に移すことができなかったため、計画からみれば遅れていると言える。しかし、当初予定していなかったヒト病態との関連を詳細に解析することができた。DINEの機能に関して、貴重なinformationが得られたため、(3)と評価した。ペプチドミクスの手法の改善により、サンプル間の相対定量が安定してできるようになった。現在、胎生期の野生型マウスとDINEノックアウトマウスの様々な組織間で比較を行っている。また、運動ニューロン特異的にGFPを発現するマウスを利用して、DINEノックアウトの新たな表現型を見いだした。次年度は、引き続きDINEの基質特異性の決定、生体内での網羅的な基質探索を進める。また、次年度は、新たな取り組みとして、DINE欠損の影響を評価できるような培養系の樹立を目指す。生体内での網羅的な基質探索は、生体組織の複雑さのために障害が多い。単一あるいは2種類の細胞のみからなる培養系でDINEの評価系が確立すれば、基質同定への道のりが大幅に短縮できると予想される。さらに、本研究の最終ステップである機能の解明においても、培養系の確立は重要な意味をもつ。今後は、本年度確立したペプチドミクスの手法を用いて、様々な組織間で相対定量、絶対定量を行い、DINEの生理的な基質の同定を試みる。また、作製したDINE/Hbgtgマウスを活用し、DINEノックアウトマウスの運動神経の分岐の減少がどの時期からどのように生じるのかを明らかにする。さらに、DINE/Hbgtgマウスから脊髄前角のみを切り出して器官培養し、in vitroの機能評価系を構築する。(抄録なし)