hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固体フッ素化高分子の完全構造解析の方法論の開発と構造-物性・機能の関係の解明

昨年度からの継続として、固体フッ素化高分子の完全構造解析の新しい方法論の確立と構造と物性・機能の研究を行い得られた成果の概要を報告する。共同研究グループのうち安藤・黒子らは今年度は三次元規則構造をもつフッ素化高分子の電子状態および^<19>F NMR遮蔽定数を評価するab initio MOレベルのソフトを完成し、それをフッ素化高分子および種々の高分子に適用し、分子内および分子間相互作用が及ぼす電子状態とNMR遮蔽定数を高い精度で計算し、NMR化学シフトを通して高分子の構造解析および電子状態解析の方法論を確立した。また、サリー大学のWebb教授はフッ素化低分子化合物の^<19>F NMR遮蔽定数を最も高い近似レベルのab initio MO法を用いた新しいNMR化学シフト理論により評価し、高い精度で分子の構造解析に応用できることがわかった。また、この方法は上記の安藤らの方法と組み合わせることにより、より高い精度の構造解析の方法論となることが明らかとなった。ダーラム大学のHarris教授はフッ素化高分子の高分解能固体^<19>F NMRスペクトルの測定方法の確立を行い、その方法を用いて種々のフッ素化高分子の固体高分解能^<19>F NMRスペクトルを行い、高い精度で構造解析を行った。また、上記の理論的な方法論と組み合わせた新しい優れた方法の開発を確立した。2年間の本国際共同研究によりこの分野において大きな研究成果を得たことを3つの研究グループで確認し、米国にて開催された国際会議で発表したことと、また研究論文を発表し、内外で高い評価を受けた。安藤・黒子両名が8月にイギリスサリ-大学に行きWebbおよびHarris教授と会合し、共同研究課題である「固体フッ素化高分子の完全構造解析の方法論の開発と構造-物性・機能の関係の解明」の内容を詳細に議論し、研究目的の内容を明確にするとともに、3つの研究グループの研究進行状況、安藤グループはフッ素化ポリペプチドの固体^<19>FNMR法の開発経過と測定データおよび構造解析の結果、Harrisグループはフッ素化オレフィンの固体^9NMR法の開発と測定データの結果、Webbグループは^<19>FNMR化学シフト理論の開発とその結果を報告し、それらについての議論を行った。それらの議論から本研究計画の発展の見込みを見い出し、今後の実験、理論解析についての方針を検討した。9月にWebb教授、10月にHarris教授が別々に東京工業大学に来て、8月以降の研究成果をセミナーにて発表し、議論を行い、共同研究の意義を確認した。それ以降は個別に電子メールを用いて研究成果を報告しあい、議論を行った。本年度は固体^<19>NMR法またNMR化学シフトの優れた方法論を確立したことと実際にいくつかのフッ素化高分子に応用し成功をしたことを成果として得た。これらの成果にもとずいて次年度ではいくつかのフッ素化高分子の構造解析に応用し、構造-機能の関係に解明に発展させることを3つの研究グループで確認しあった。また、サリー大学のWebb教授はフッ素化低分子化合物の^<19>F NMR遮蔽定数を最も高い近似レベルのabmitio MO法を用いた新しいNMR化学シフト理論により評価し、高い精度で分子の構造解析に応用できることがわかった。

また、この方法は上記の安藤らの方法と組み合わせることにより、より高い精度の構造解析の方法論となることが明らかとなった。ダーラム大学のHarris教授はフッ素化高分子の高分解能固体^<19>F NMRスペクトルの測定方法の確立を行い、その方法を用いて種々のフッ素化高分子の固体高分解能^<19>F NMRスペクトルを行い、高い精度で構造解析を行った。また、上記の理論的な方法論と組み合わせた新しい優れた方法の開発を確立した。2年間の本国際共同研究によりこの分野において大きな研究成果を得たことを3つの研究グループで確認し、米国にて開催された国際会議で発表したことと、また研究論文を発表し、内外で高い評価を受けた。
銀ナノ微粒子分散膜を用いるSERS分光法による薬物及び環境汚染物質の高感度検出

これまでに対向拡散法という独自の手法により銀ナノ微粒子分散セルロースゲル膜を作成し、表面増強ラマン散乱(SERS:Surface-Enhanced Raman Scattering)の検出基板として有用であることを示してきた。しかし条件によってはスペクトルに基板のアセチル基や検出物質の分解に基づくと思われるバンドが1300cm^<-1>付近に見られるので、この範囲にキーバンドを持つ物質の検出に対しては注意が必要であった。そこで、より耐光性の基板として銀微粒子分散アルミナゲル膜について検討した.AlCl_3水溶液にアンモニアを滴下し、生じた白色沈殿を濾過、洗浄後、酢酸を加えて加熱還流することで解膠し、透明アルミナゾルを得た。これにAgNO_3水溶液を加えゲル化させ空気中600°Cで2時間焼結した後、NaBH_4に浸して還元又は水素還元することにより銀微粒子分散アルミナ膜を作成した。この試料についてAr^+イオンレーザー(514.5nm)を励起源に用いたラマンスペクトル測定を行った。銀微粒子分散アルミナ膜の吸収スペクトルは銀コロイドに比べて銀微粒子の凝集分散をあらわすプラズモン吸収の広がりを示した。また、銀の分散量、還元方法によって吸収の位置や広がりが異なっており、使用光源波長に合った分散膜を調整できる利点がある。アルミナが両性て等電点が中性付近にあることから荷電物質の検出には有用と思われる。亜硫酸イオンのSERSスペクトルはAg-S伸縮振動のピークが見られ、S-O変角振動とS-O伸縮振動に帰属されるピークは低濃度まで観測された。また、塩酸を加えた0.1mo1/Lのフェネチルアミン水溶液中におけるSERSスペクトルでもベンゼンの環呼吸振動と環伸縮振動に帰属されるピークが見られた。これらより銀微粒子分散アルミナ膜のSERS検出基板としての応用が期待される。アセトン/ホルムアミド溶媒にとかした酢酸セルロース溶液より含水性のゲル膜を作成した.ゲル膜は3040%の水を含む.この膜を介して両側から硝酸銀水溶液と水酸化ナトリウム水溶液を各々接触拡散させて酸化銀分散ゲル膜を得た.次にこれを還元剤である水素化ホウ素ナトリウムやホルマリン溶液に浸すことにより,Agナノ微粒子分散セルロース膜として,種々の物質の検出基板として用いた.分散膜は均一固溶体状であり,1050nmのAg微粒子を15%前後含む.ゲル膜の製膜条件や還元剤の種類によってAg微粒子の分散状態が変化し,これによってプラズモン吸収の異なる膜が得られた.400700nmまで広がりのある膜も得られ,この範囲のレーザー光源を有するラマン分光器に対して基板として使用可能である.ここでは従来通りアルゴンレーザー(514.5nm)を光源として用いた.生理活性物質である利尿剤としてのテオブロミン水溶液を検出溶液として用いたところ,濃度10^<-3>Mまで環骨格,C-N等の伸縮振動を認めることができた.覚醒剤メタンフェタミンのモデル物質としてのフェネチルアミンでは濃度10^<-4>Mまで特徴的な環伸縮振動を認めることができた.しかしながら条件によってはスペクトルに基板のアセチル基や検出物質の分解に基づくと思われるバンドが1300cm^<-1>前後に見られるので,この範囲にキーバンドをもつ物質の検出に対しては注意が必要である.そこで,より耐光性の基板としてAg微粒子分散アルミナゲル膜をゾルゲル法により作成した.吸着しやすいと思われる硫酸イオン等の無機アニオンに対してはラマン増強が認められた.有機物質に対してはアルミナ膜が疎水性に乏しいため吸着が弱く,ラマン増強が弱かった.今後の課題として残される.これまでに対向拡散法という独自の手法により銀ナノ微粒子分散セルロースゲル膜を作成し、表面増強ラマン散乱(SERS:Surface-Enhanced Raman Scattering)の検出基板として有用であることを示してきた。これらより銀微粒子分散アルミナ膜のSERS
大脳皮質の錐体細胞間抑制性結合の機能的役割

これまでに我々は、大脳皮質視覚野2/3層錐体細胞間の神経結合を解析し、錐体細胞の軸索が抑制性細胞の細胞体を介さずに、抑制性細胞の軸索終末を直接活性化し、伝達物質を放出させるという全く新しいタイプの抑制性神経回路を見出した。本年度は、錐体細胞間抑制性伝達を仲介する抑制性終末の起始ニューロンのサブタイプの同定を行った。ラットの大脳皮質視覚野から切片標本を作製し、2/3層錐体細胞からホールセル記録法を用いて錐体細胞間抑制性反応を記録した。錐体細胞間抑制が錐体細胞の細胞体に入力しているかを調べるために、カイニン酸受容体遮断薬を封入したピペットを用いて、局所的な遮断薬投与を行った。細胞体近傍にカイニン酸受容体を投与すると、錐体細胞間抑制は著しく減弱した。従って、この抑制性反応には錐体細胞の細胞体周辺にある抑制性シナプスが関与していると考えられる。細胞体に抑制性入力するのは、パルブアルブミンまたはCCKを発現している2種類の抑制性ニューロンサブタイプが報告されている。抗パルブアルブミン抗体または抗CCK抗体を用いて抑制性神経終末を、抗VgluT1抗体を用いて興奮性神経終末を染色し、抑制性反応を担うシナプスを可視化したところ、どちらの抑制性ニューロンタイプの終末にも興奮性シナプス終末が隣接している染色像が多く観察された。以上の結果は両方の抑制性ニューロンサブタイプが錐体細胞間抑制性反応を担うことを示唆する。本年度は、ラット一次視覚野スライス標本を用いて、この抑制性結合と、錐体細胞間に通常みられる興奮性シナプス結合の発達と視覚体験依存性について調べた。近傍にある2個の2/3層錐体細胞からホールセル記録を行い、両細胞間のシナプス結合を調べた結果、錐体細胞間抑制性シナプス後電流(IPSC)が興奮性シナプス後電流(EPSC)よりやや高い頻度で観察された。EPSCおよびIPSCは、発達初期(生後14-17日齢)の視覚野では発達後期(生後21-25日齢)に比べて低頻度でしか観察されなかった。興奮性結合と抑制性結合の発達は共に視覚体験に依存したが、その影響の方向は逆であった。興奮性結合の形成は生後直後からの発達後期までの暗室飼育により抑制され、結合がみられたペアでもEPSCの振幅は正常視覚環境飼育に比べて小さかった。一方、錐体細胞間IPSCは、正常視覚環境飼育より、暗室飼育の方が高頻度で観察され、その平均振幅も大きかった。以上の結果は、視覚入力がない場合には2/3層において、錐体細胞間の興奮性結合の発達は抑えられ、錐体細胞間の抑制性結合の発達は促進されることを示唆している。言い換えると、視覚入力を受けると発達と共に興奮性結合が抑制性結合に比べて優位になり、視覚体験により視覚野細胞の視覚反応が強化されると考えられる。
わが国の初等・中等教育における地理情報システムの活用に関する研究

地理情報システム(GIS)の利用は、1990年代に入って行政やビジネス分野で急激に拡大してきたが、教育分野でも大きな可能性が期待される。そこで本研究では、初等・中等の学校教育におけるGISの有用性を解明しながら、そのわが国における活用方策を具体化することを目的とした。具体的には、わが国における教育課程や内容の検討、諸外国における先進事例の調査、データの収集やシステムの検討、さらには教育現場での試行的な実践を行った。また、これらを通じて、関連データやツール等の教材を整備・提供するとともに、GISの教育利用にかかわる今後の課題を整理・検討することも試みた。その成果として本年度は、全体で220ページを超え、21本の論文を収録した「研究成果報告書」(冊子体)をとりまとめ、また前年度までに、『授業のための地理情報-写真・地図・インターネット-』(井田仁康・伊藤悟・村山祐司編著、2001年11月、古今書院刊)、『教育GISの理論と実践』(村山祐司編、大関泰宏・井田仁康・伊藤悟・鵜川義弘・杉盛啓明ほか著、2004年10月、古今書院刊)などの書籍も刊行した。研究を進めるにあたってはその研究課題の先端性から、成果を学会等において可及的かつ積極的に公表し、それによって議論を得るように心がけた。それゆえに上記報告書や書籍に収録した論文は、これら公表済みの成果をその後の検討を踏まえてブラッシュアップしたものである。同時に、学校現場で試みたGIS利用の実践に関する記録は、資料的にも貴重なものとして可能な限り残すようにした。以上、本研究は膨大な成果の蓄積をはかりながら、初等・中等教育におけるGISの有用性と、そのわが国における具体的な活用策の検討と解明を行うことができたのである。本研究の目的は、初等・中等の学校教育(以下、学校教育と呼称)における地理情報システム(Geographic Information System;以下GISと略称)の有用性を解明しながら、その学校教育における活用策を具体化することにある。このため平成13年度においては、(1)「わが国における教育課程や内容の検討」、(2)「データの収集やシステムの検討」、(3)「海外における先進事例の調査」に重心をおいて作業をすすめた。まず、(1)では、各教科や分野について「学習指導要領」などの資料や教育現場でのヒアリング等から、GISがどのような領域と方法で有用になるかを具体的に解明することを試みた。その結果、「環境教育」や「地理教育」などにおいて特にGISの適用性が高いことと、そこでの「地図教材」の取り扱いに留意すべき点が幾つも存在することなどを明らかにした。また、(2)では、学校教育でのGIS利用において、どのようなデータやツールが教材として必要か、あるいは適切かについての検討を行った。その結果として、第1に、新規データの発掘も試みながら、データの授業における活用方策などの考案を行った。第2に、既存GISシステムやプログラムにおける教育利用上の問題点を考察しながら、その改良にも着手した。以上のほか、(3)では、上記(1)と(2)を進めるために必要な資料や情報を収集し、関係研究者へヒアリングを試みた。特に本年度は、意志決定支援への応用などでユニークな取り組みをしているオーストラリアや、ヨーロッパにおける最大のIT先進国であり、歴史地図情報のウェブGIS公開を行っているスウェーデンなど調査対象とした。本研究では、初等・中等の学校教育におけるGISの有用性を解明しながら、わが国の学校教育における活用策を具体化することを目的としている。

このため本年度は、前年度と同様に(1)「教育課程や内容の検討」、(2)「データやシステムの検討」、(3)「海外先進事例の調査」を行うとともに、新たに(4)「教育現場での試行的実践」についても着手した。すなわち、(1)「教育課程や内容の検討」では、昨年に引き続き、既存資料の検討や教育現場でのヒアリング等から、GISがどのような領域と方法で有用になるかを検討したが、とりわけ本年度は「環境教育」「地理教育」「社会科教育」のみならず「総合的学習の時間」との関連性も考慮した。また、(2)「データやシステムの検討」と(4)「教育現場での試行的実践」は表裏一体の課題として、必要なデータやツールの開発や整備を昨年度と同様に進めながら-本年度は特にインターネットによる都市・地域・環境学習用の教材提供や学校教育用の時空間GISの開発など-、それらの教育現場(特に中学校・高等学校)における試行実験も実施した。さらに(3)「海外先進事例の調査」では、上記(1)や(2)、(4)を進めるために必要な資料や情報を収集し、関係研究者へヒアリングも行った。これらの成果は、論文として公刊するとともに、地理情報システム学会の本年度学術大会(2002年10月:東京)において本科研のセッションを設定したり、海外の研究者を交えた一般公開の国際シンポジウムを2002年12月に名古屋市で開催するなどを通じて、他の研究者や初等・中等教育現場の教員等へ向けて幅広く発信することに努め、同時にその内容を深化させることを試みた。本研究では、初等・中等の学校教育におけるGISの有用性を解明しながら、わが国の学校教育における活用策を具体化することを目的としている。このため、(1)「教育課程や内容の検討」、(2)「データやシステムの検討」、(3)「海外先進事例の調査」、(4)「教育現場での試行的実践」などを、研究期間中に段階的に進めているところである。すなわち、前年度までは(1)(3)に重心をおいてきたが、本年度はそれらを深化させるとともに、(4)の作業を精力的に推し進めた。それぞれの具体的内容は次の通りである。まず、(1)「教育課程や内容の検討」では、昨年に引き続き、既存資料の検討や教育現場でのヒアリング等から、GISがどのような領域と方法で有用になるかを検討した。本年度の重点課題である(4)「教育現場での試行的実践に関しては、これまでに進めてきた(2)「データやシステムの検討」と連携させながら、実際の教育現場における試行実験(実験授業)を行い、それらの効果や課題等の解明を図った。と同時に、現職教員等に対してGISの講習会を実施することによって、教員側の課題を探るなど、新たな取り組みも行った。さらに(3)「海外先進事例の調査」に関しても、必要な資料や情報の一層の収集に努めた。以上から本年度の進展を総括するとすれば、本研究はGISの教育利用について今後の課題を次第に整理する段階に入ってきたといえよう。なお、以上の成果は論文として発表するとともに、地理情報システム学会の本年度学術大会(2003年10月:東京)において、本科研のスペシャル・セッション(シンポジウム)を開催するなどを通じて、他の研究者や初等・中等教育現場の教員等へ向けて幅広く発信に努めたことも、最後に付け加えたい。
非熱的に駆動されたバイオマターの非平衡動力学

非熱的場により駆動されたバイオマターとそのモデル系のメソスケールのゆらぎと力学応答に関する実験的研究を行った。流れや揺らぎに対して多重のフィードバックで追随しながら計測を行うマイクロレオロジー測定系を開発し、生きている細胞内部や細胞抽出液のレオロジー計測を行った。その結果、細胞質は混みあいによりガラス化するが、細胞内部は代謝活性により流動化していることが明らかとなった。非熱的に駆動された非平衡流体である液晶電気対流とバクテリア懸濁液に関して、前者では拡散定数と非平衡度の関係を、後者では系の特徴的なサイズと相互作用源の濃度により、その揺らぎがガウス分布とレビ分布の間を変化することを見出した。バイオマターの複合体が織りなす非線形・非平衡系の動力学を究明するための有効な手段であるマイクロレオロジーを用いて、様々な非熱的場により駆動されたバイオマターのメソスケールのゆらぎと力学応答に関する実験的研究を行い、以下のような成果を得た。[1]細胞内力学物性に与える高分子混み合い効果細胞内の力学的性質は、従来アクチン等の細胞骨格により決定されると考えられてきたが、細胞内は、様々なタンパク質等からなる高濃度の高分子溶液で満たされており、高分子の混み合いも細胞内の力学特性へ強く影響することが予想される。本年度は、単成分の高分子溶液と多成分高分子からなる3種類の細胞抽出液を用い、高分子濃度を変化させながら光褪色後蛍光回復法測定とマイクロレオロジー計測を行い、高分子濃度と粘性率の相関を評価した。その結果、全ての試料で濃度増加に伴う粘性率の上昇が観察され、その濃度依存性はガラス転移点近傍の振る舞いを表す経験的な式であるVogel-Fulcher-Tamman式に従うことがわかった。粘性が発散する高分子濃度は単一系では乱雑最密充填の濃度と一致するが、多成分系では細胞種によらずほぼ一定となり、その濃度は単一系の約半分であった。以上から、大きさや形状、表面電荷などが不均一となる多成分系の粘性は、単一系よりも高くなることが示唆される。[2]液晶電気対流での粒子の運動電圧で非平衡度が制御可能な液晶電気対流系を用いて、1次元の周期的対流ロール中での粒子運動を調べた。その結果、低電圧下では粒子は特定のロール中にローカルに束縛されているが、高電圧下でロール構造が乱れる欠陥乱流状態においては、ロールの組換えに従って軸と垂直方向に拡散的な運動を示すことがわかった。この時、拡散定数が印加電圧に対して単調に増加していくこと、拡散定数は平衡状態での粘性から予想される値の数百倍の大きな値を示すことがわかった。本研究では、様々な非熱的場により駆動されたバイオマターおよびそのモデル系のメソスケールのゆらぎと力学応答に関する実験的研究を行っており、本年度は以下の研究成果を得た。(1)多重フィードバックマイクロレオロジーの開発(水野)マイクロレオロジー法はメソスケールのゆらぎと力学応答を同時に観測することが可能な有力な方法であるが、揺らぎ応答の精密観測に光学的な手法(光トラップ)を用いるために、試料内部の揺らぎがトラップ用レーザー光の収束径を超える強い非平衡系には適用できない。逆に、トラップ力を強くするとプローブ粒子を計測域に閉じ込めた場合、光トラップ自体がプローブの運動や試料の状態に影響を与えてしまう。本年度は試料を保持するピエゾステージをフィードバック制御することで、細胞内部の揺らぎや原形質流動に追随しつつ、弱いレーザー光でプローブの揺らぎ応答を広帯域観測することに成功した。(2)流体相互作用する駆動多粒子系が形成するクラスター構造の解明(木村)流体中を運動する微粒子および微生物系では、流体相互作用に起因した非自明な集団運動や動的な構造形成がしばしば報告されている。本研究では、流体相互作用しつつ運動する微粒子系の単純なモデルとして、同一円周上を一定の駆動力を与えられて運動する多粒子系をリング光渦により実験的に実現し、この系で現れるさまざまな集団運動を研究している。本年度は粒子サイズの不均一がある場合の粒子の集団運動を実験および流体相互作用を考慮した数値シミュレーションの双方を用いて調べた。その結果、サイズ比によりクラスターの形成と分裂を伴うリズミックな集団運動と定常的なクラスター形成の間の動的な相転移が起こることを見出した。本年度は、様々な非熱的場により駆動されたバイオマターおよびそのモデル系のメソスケールのゆらぎと力学応答に関する以下に列挙するような研究を行った。[1]流体相互作用しつつ運動する微粒子系の単純なモデルとして、同一円周上を一定の駆動力を与えられて運動する多粒子系をリング光渦により実験的に実現し、この系で現れるさまざまな集団運動を研究した。[2]楕円体コロイド粒子は方向がランダムである配向ガラスと重心位置がランダムである通常のガラス状態の2つのガラス状態を示す系として注目されている。本年度は2次元での液体状態(面積分率50%程度)における並進秩序と配向秩序を調べた。その結果、軸比の増大とともに長軸がそろった状態であるネマチック秩序が急速に増大することがわかった。[3]マイクロレオロジー(MR)を非平衡環境下で実行するために、流れや揺らぎに対して多重のフィードバックで追随しながら計測を行うシステムを開発した。当該システムを用いて生きている細胞内部や細胞抽出液のレオロジー計測を行った結果、細胞内部は混みあいによりガラス化するはずの濃度にありながら、代謝活性により流動化していることがわかった。

[4]非平衡系における揺らぎは必ずしもガウス分布に収束しない。本研究では、べき的な相互作用の和として得られる極限分布の新しい解析的な表現を見出した。この新しい極限分布は、系の特徴的なサイズと相互作用源の濃度により、ガウスとレビの間を連続的に接続する。この新しい非ガウス分布の解析的表現が、現実系(遊走微生物懸濁液やアクチン/ミオシンゲル)で観測される非平衡揺らぎを定量的に説明すること実験、理論、および数値シミュレーションを用いて明らかにした。流体相互作用する系における少数多体系の示す特徴的な運動の解明(木村)、フィードバックマイクロレオロジーによる細胞の高精度レオロジー測定(水野)、非ガウス揺らぎの起源を解明する研究(水野)を行い、それぞれの成果を学術論文、国際学会発表などを行った。本研究では、様々な非熱的場により駆動されたバイオマターおよびモデル系のメソスケールのゆらぎと力学応答に関する実験的研究を行なっている。本年度は以下のような研究を行った。(1)高濃度の界面活性剤水溶液中に分散したミクロ油滴は、界面活性剤分子の界面吸着により生じた表面張力の勾配に起因するマランゴニ対流により自己駆動する。本研究では大きさ数数百ミクロンの等方的な油滴およびネマチック液晶液滴を界面活性剤水溶液中に分散し、それらが示すサイズの依存した特徴的な自発運動を明らかにした。(2)生体内では、様々な分子機械がATPの加水分解を燃料として力学的仕事を行っている。その一つであるキネシンは、細胞内で小胞体などの荷物を運ぶ生体分子モーターとして働く。その詳細な分子メカニズムは明らかになりつつあるが、1分子のキネシンを一つの非平衡散逸系と見立てた際のエネルギー収支については、定量的な理解が進んでいない。我々は、高速フィードバック制御を導入した光ピンセットを用いた1分子計測手法を用いて、キネシンが荷物となるプローブ粒子を運ぶ際に散逸される非平衡散逸流を定量した。また、2状態マルコフ遷移モデルとランジュバンダイナミクスを組み合わせたモデルシミュレーションとその解析解により実験結果の評価も行った。(3)モデル非平衡系である遊走微生物懸濁液では、多数の遊走微生物からの流体力学的な相互作用の和が揺らぎとして観測される。その統計分布は、個々の相互作用の分散が有限である時にはガウス分布に、分布の裾野が冪的に広がり発散する場合にはレビ分布に収束することが期待される。しかし遊走微生物懸濁液中の揺らぎは、そのどちらにも属さない。我々は、前年度までに見出した新しい非ガウス分布の解析的表現が、遊走微生物懸濁液で観測される非平衡揺らぎを定量的に説明することを実験、理論、数値シミュレーションを用いて明らかにした。バイオマターならびにそのモデル系を用いた非平衡ダイナミクスに関する研究が当初の予定通り進行している。例えば、1分子のキネシンを一つの非平衡散逸系と見立てた際のエネルギー収支については、単一分子の非平衡系を記述する難しさから、定量的な理解が進んでいなかった。しかし、原田・佐々らによって提案された新しい非平衡等式により、速度のゆらぎと外力に対する応答を計測することで、系からの非平衡散逸流を定量することが可能となる。
非アルコール性脂肪性肝障害の発症機序の解明と、発症機序に基づいた栄養療法の開発

9週齢メタボリック症候群モデルラットおよび通常のSDラットに高脂肪・高コレステロール食を9週間自由摂食させたところ、高度な肝線維化を伴う非アルコール性脂肪肝炎(NASH)を発症した。SDラットではコレステロールを添加していない高脂肪食を摂取した場合はNASH様肝病変および肝線維化の発症はみられなかった。このことより、食餌性コレステロールがNASHの発症・進展に関与している可能性が示唆された。また、この餌に抗酸化作用および抗炎症作用があるフィコシアニンを添加して与えたところ、血清ASTおよびALT値はフィコシアニン添加濃度依存的に低下する傾向を示したが、明らかな肝組織学的な改善はみられなかった。昨年度の研究において、高脂肪だけではなく高コレステロールの食餌をラットに投与すれば線維化を伴うNASHモデルの作成が可能であることが判明したため、今年度はメタボリック症候群モデルラットであるSHR/NDmcr-cpラットに代えて通常のラットであるSplague-Dawley(SD)ラットを用いて、肝線維化を伴ったNASH動物モデルを作成し、その発症機序を検討することとした。9週齢雄性SDラット計20匹を、普通食(脂肪エネルギー比13%)投与群、高脂肪食((脂肪エネルギー比59%)投与群、コレステロール1.25%およびコール酸2%を含む高脂肪・高コレステロール食(脂肪エネルギー比58%)投与群、コレステロール2.5%およびコール酸2%を含む高脂肪・高コレステロール食(脂肪エネルギー比57%)投与群の4群に分け(各群5匹ずつ)、自由摂取下で9週間飼育した。18週齢時に屠殺し血液および肝臓組織を採取し比較したところ、血清および肝臓の総コレステロール濃度は投与したコレステロール濃度依存的に有意に高値を示し、肝臓の病理組織学的評価においては普通食投与群に比較して高脂肪食投与群では線維化を伴わない軽度の脂肪沈着と炎症がみられた。一方、高脂肪・高コレステロール食投与群では高度の脂肪沈着、炎症、肝細胞の風船様膨化および線維化がみられ、特にコレステロール2.5%を含む高脂肪・高コレステロール食投与群では5匹中2匹(40%)が肝硬変に進展していた。肝臓からのVLDL排泄の律速酵素であるmicrosomal triglyceridetransfer proteinや肝臓から胆汁へのコレステロール排泄を促進するATP-bindingcassette transporter G5のmRNAレベルと、肝臓でのβ酸化の指標であるcarnitine palmitoyltransferase酵素活性は、コレステロール濃度依存的に有意に低値を示した。9週齢雄性SHR/NDmcr-cpラット計28匹を、普通食(脂肪エネルギー比10%)投与群、普通食+フィコシアニン0.25%混餌食投与群、普通食+フィコシアニン0.5%混餌食投与群、普通食+フィコシアニン1.0%混餌食投与群の4群に分け(各群7匹ずつ)、自由摂取させ25週間飼育した。34週齢時に屠殺し血液および肝臓組織を採取し比較したところ、血清脂質や肝組織には有意差はみられなかった(肝臓には明らかなNASHの所見がみられなかった)が、フィコシアニン投与群において用量依存的に高血圧抑制効果がみられ、この効果はアディポネクチンを介した内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)発現誘導によることが推察された。また、9週齢雄性SHR/NDmcr-cpラット計18匹を、コレステロール5%およびコール酸2%を含む高脂肪・高コレステロールHFC食(脂肪エネルギー比28.6%)投与群、HFC食+フィコシアニン0.5%混餌食投与群、HFC食+フィコシアニン1.5%混餌食投与群の3群に分け(各群6匹ずつ)、自由摂取させ9週間飼育した。18週齢時に屠殺し血液および肝臓組織を採取した。HFC投与群においては、血清トリグリセリド値および総コレステロール値の高値を認め、全てのラットで高度線維化を伴うNASH(非アルコール性脂肪性肝炎)の組織像が確認された。フィコシアニン投与群との血清学的、組織学的な差はみられなかった。NASHの病態解明や治療法の確立のためにはNASHの動物モデルの確立が必要とされるが、齧歯類では肝線維化は生じにくく、長期間の飼育を要するとされている。今回の結果から、9週間という短い期間で肝硬変を伴うNASHの組織像が確認されたが、コレステロール含有飼料の意義の解明とともに、フィコシアニンの効果を確認するには軽度から中等度の線維化を伴うNASHの動物モデルの作成が必要であると考えられた。昨年度の研究では、通常のラットであるSplague-Dawley(SD)ラットを用いて、高脂肪・高コレステロール食を9週間与えることにより、高度な肝線維化を伴ったNASH動物モデルを作成した。

このモデルにおいて、肝臓における脂質代謝関連遺伝子発現および酵素活性を検討した結果、脂肪酸β酸化に関与するCPT活性は高値を示す一方で、肝臓における脂質排出経路の一つである超低密度リポタンパク質の合成に関与するMTPのmRNA発現量は低下していたことから、HFC食摂取によって脂肪酸β酸化能の低下やトリグリセリドおよびコレステロール排出能の低下を生じていることが示唆された。今年度は、引き続き高脂肪・高コレステロール食の摂取によるNASH発症の機序の検討を行った。肝臓における胆汁酸代謝関連遺伝子の発現の検討では、胆汁酸合成の律速酵素であるCYP7A1のmRNA発現量は高値を示した一方で、肝臓コレステロールを胆汁中へ排出する輸送担体であるABCG5のmRNA発現量は低下傾向にあり、胆汁酸合成の亢進および胆汁酸抱合・排出の低下が示唆された。それには核内受容体farnesoid X receptor (FXR)による胆汁酸恒常性の維持の破綻が関与している可能性が考えられた。また、肝臓の線維化に関連するコラーゲンタンパク質コード遺伝子であるCOL1A1およびCOL4A1のmRNR発現量は高値を示し、線維化の誘因因子であるTGF-β1もコラーゲン遺伝子と類似したmRNA発現傾向を示した。続いて、このラットモデルを用いてフィコシアニンを9週間同時摂取させることにより、NASH発症が抑制されるか、肝臓の病理組織学的検討を行った。その結果、血清ASTおよびALT値はフィコシアニン添加濃度依存的に低下する傾向を示したが、フィコシアニン非添加群に比べて、肝脂肪沈着の程度はやや軽度であったものの、肝線維化を含めて明らかな肝組織学的な改善はみられなかった。栄養学今年度の研究結果より、遺伝子的欠損がない動物を用いて、高脂肪・高コレステロール食という栄養学的にヒトが摂取する、より現実的な食事を短期間摂取させることで、9週間という短い期間で肝硬変を伴うNASH動物モデルを作成することが可能であることが明らかとなった(論文投稿中)。今年度の研究により、フィコシアニンがNASHだけでなく、アディポネクチンを介した内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)発現誘導による高血圧抑制効果も持っていることが推察された。当初の実験モデルでは、交付申請書の「研究目的」に記載した「フィコシアニンによるNASH発症抑制効果およびその機序」の解明には不適当であったため、高脂肪食にコレステロールを添加した食餌をラットに与えて肝組織への影響を検討したところ、著明な肝線維化を伴うNASHモデルが観察された。この2つの結果はこれまで報告されておらず、貴重な成果だとおもわれる。今年度の研究結果より、高脂肪・高コレステロール食投与により9週間という短い期間で肝硬変を伴うNASH動物モデルを作成することが可能であることが明らかとなった。しかし、この飼育期間では40%のラットで肝硬変に進展しているに過ぎず、より確実な肝硬変モデルを作成するには、より長期間の飼育が必要であるとおもわれる。次年度においては、ほぼ全てのラットで肝硬変を伴うNASHモデルを作成したい。また、その上で、肝線維化をきたす機序の解明と、前年度検討したフィコシアニンのNASH予防効果を再検討したい。今年度行った2つの動物実験では、明らかなNASHの組織所見がみられなかったり、線維化が高度であったために、フィコシアニンの効果を検証することができなかった。
種々のスポット溶接継手における初期隙間が溶接性に及ぼす影響に関する力学的検討

初期隙間を有するスポット溶接継手の溶接過程は次の様に分けられる。1)初期隙間が閉る(初期接触)まで2)初期接触以後における加圧力の上昇とともに接触面積が増加する過程3)加圧力を保持した状態で、通電加熱し溶接を行なう4)加圧力を保持した状態で、冷却凝固5)加圧力の開放本研究では、上記の第1)および第2)段階における加圧変形を詳細に解析するための有限要素法のプログラムを開発した。さらに、このプログラムを用いて、加圧変形および接触状態に及ぼす初期隙間量、継手の寸法、材料の降伏応力の影響を検討し以下の結論を得た。1)加圧変形においては塑性変形と大たわみの影響が無視できない。2)初期接触までの加圧時の変形には相似則が成立し、ひとつの曲線と、パラメ-タμおよび継手形状を反映する係数αにより現象が整理できる。さらにこれに基づき、任意なスポット溶接継手に対して、初期隙間を閉るに要する加圧力を推定する方法を示した。3)初期接触後の板間の接触状態の変化に注目すると、初期隙間がある臨界値を超えると、接触力と接触面積の関係がほとんど一致することが明らかとなった。また臨界値についてもパラメ-タ-μを用いて推定できることを示した。さらに、これらの事実に基づき、初期隙間を有するスポット溶接継手における接触状態おにび許容し得る限界隙間を予測する方法を提案した。一方、第3段階以降の現象の解析のために、軸対称熱弾塑性解析プログラムを開発し、発熱量を電流密度の解析から計算するための定式化を行った。当初計画に従い下記の成果を得た。1.プレス成形材における初期隙間の形態を調査・分類した。2.標準すき間付試験庁およびハット型試験庁を対象に、有限要素法を用いた系統的な解析を行ない、初期隙間を有する継手の加圧変形時の力学特性と諸パラメーターの関係を検討し次の結論を得た。(1)解析結果を実験結果と比較し、有限要素モデルの妥当性を検証した(2)加圧変形時の変形では、塑性変形と大たわみの影響が無視できない(3)加圧変形時の変形には相似則が成立し、3ケのパラメーターと、継手の形状で定まる定数によって現象は整理できる。(4)上記の相似則を用いると、無次元表示された推定典線が求まり、任意の板厚、降伏応力、初期隙間に対して初期隙間を閉るに必要な加圧力が計算できる。(5)推定典線を近似的に求めるためには、実験条件(板厚や降伏応力)が異る2ケースの実験を行なえば良い。3.次年度は初期接触以降における電極ー板間および板ー板間の局所的接触状態と溶接性との関連を定量的に検討する予定であり、今年度は、そのために必要な軸対称熱弾塑性プログラムを開発した。1.加圧変形時における電極ー板間および板ー板間の局所的接触状態を解析することができる軸対称弾塑性大変形解析プログラムを開発した。2.大変形問題および接触問題について上記の解析プログラムの精度を解析解との比較により検証した。3.理論解析の結果を実験結果と比較し、その妥当性を検証した。4.軸対称隙間付きモデルを対象として、部材の板厚、直径、降伏応力および初期隙間の大きさを変化させてシリ-ズ計算を行い、次の結論を得た。(1)加圧力は接触圧力と板の支持反力の和と釣り合うが、接触圧力と接触面積の関係に注目すると、初期すきまがある臨界値以上の場合、接触圧力ー接触面積曲線はほとんど一つの曲線(臨界曲線)に重る。(2)板厚tが一定の場合、降伏応力σrが異っても接触荷重をσrt^2で無次元化すると、上述の臨界曲線はほとんど一致する。(3)一方、臨界点に対応した臨界加圧力の無次元値P^*_ee=Pc/σrt^

2はパラメ-タ-μ=(σ_Y/E)(W/t)^2とほぼ直線関係を有する。(4)したがって、(1)の臨界曲線および(3)のP^*_e-μ曲線があらかじめ分っていれば、任意の降伏応力σ_Y、直径(幅)W、初期隙間Cを有する継手の加圧時における接触面積の予測が可能となる。(5)溶接性の立場から、限界接触面積が与えられると、上述の結果を用いて、許容限界隙間を定めることができる。(6)詳細な接触状態に注目すると、加圧の中間段階では、リング状の接触状態が認められた。5.与えらえた接触状態に対して電流密度および温度分布を有限要素法により解析するための定式化を行った。
高分子電解質膜を用いた次世代医療用アクチュエータの開発

イオンポリマーメタル複合体は、ナフィオンなどの導電性高分子に白金・金などの貴金属を化学めっきした複合体で、センサとしてもアクチュエータとしても動作する。1-3Vの電圧で大きな変位を発生し、任意形状に加工が可能で、無音で動作する、制御の容易な人工心筋のアクチュエータとして最適な材料である。平成20年度は、イオンポリマーメタル複合体のインピーダンス計測を行い、電圧・電流に対する発生張力、応答変位特性のメカニズムを検討した。成果を計測自動制御学会SI部門、Actuator2008-International Confbrence and Exhilition on New Actuators and Drive Systems(Bremen, Germany)および幕張メッセテクノブロンティア2009モーションエンジニアリング展に発表・出展した。特定領域内共同研究として、森島(東京農工大)グループの筋細胞に対して,伊原(鈴鹿医療科学大)グループの成果である電解質アクチュエータを適用し,力学的・電気的に同時刺激できる新規ストレッチデバイスの共同開発が行われ、成果が報告された。則次(岡山大学)グループの「空気圧ソフトアクチュエータの開発と人間親和メカニズムへの応用」に対して、伊原(鈴鹿医療科学大)グループの電解質アクチュエータの素材を、パワーアシスト把持装置のセンサとして応用し、パワーアシストを開始するタイミングを決めるトリガー信号検出に応用が試行された。平成19年度は、イオンポリマーメタル複合体の人工呼吸器回路内喀痰排泄用アクチュエータをより実用に近い形に試作した。また、センサとしての特性を計測し、パワーアシストハンド用センサを開発した。また、その電圧・電流に対する発生張力、応答変位特性を計測し、膜の変形メカニズムを検討するとともにアクチュエータ作成に最適な動作条件を検討した。成果を計測自動制御学会SI部門、SPIE Smart Structure and Material(San Diego,USA)および幕張メッセテクノフロンティア2008モーションエンジニアリング展に発表した。特定領域内共同研究として、森島(東京農工大)グループの筋細胞に対して,伊原(鈴鹿医療科学大)グループの成果である電解質アクチュエータを適用し,力学的・電気的に同時刺激できる新規ストレッチデバイスの共同開発が始まった。則次(岡山大学)グループの「空気圧ソフトアクチュエータの開発と人間親和メカニズムへの応用」に対して、伊原(鈴鹿医療科学大)グループの電解質アクチュエータの素材を、パワーアシスト把持装置のセンサとして応用し、パワーアシストを開始するタイミングを決めるトリガー信号検出に応用計画が進められている。
有機溶剤による動因変失症候群に関する神経科学的研究

トルエン長期乱用者における動因喪失症候群(amotivational syndrome)では,積極性の欠如、無関心、感情の平板化、意欲の低下、集中力の欠如などが認められ、この症候群のメカニズムを明らかにするために以下の実験をおこない解析した。(1)GFAPの動態と電子顕微鏡的変化有機溶剤の主成分であるトルエン高濃度(2000PPM)の1ヵ月曝露群では、海馬全体においてGFAP免疫反応が増大し、特に歯状回においてGFAP免疫陽性細胞・突起ともに染色性が高まり突起の面積も有意に増加した。さらに肥厚し染色性の高いGFAP免疫陽性突起が数多く顆粒細胞層へ伸展する像が認められた。この変化はおおよそ1ヵ月でピークを示した。電顕では、1ヵ月曝露群では顆粒細胞の間を、太く電子密度の高いglialfilamentを有したアストログリアが伸展する像が観察されたが明瞭な顆粒細胞の変性はみられなかった。3ヵ月曝露動物では、顆粒細胞群で明瞭に変性した細胞を捉えることができた。このことから、トルエン曝露に対して、短期間はアストロサトンの神経の保護作用が高まっているが、3ヵ月といった長期にわたる曝露においては、トルエンの神経毒性とアストロサイトの神経保護作用との均衡が破綻し、徐々に顆粒細胞が変性に陥っていくものと推定された。(2)行動薬理実験トルエン吸入後のラットの行動の変化を受動的回避反応により観察した。対照群・トルエン1・3ヵ月曝露群の動物を用いた。明室から暗室に入った直後に電気ショックを3秒間床グリッドに与え、直ちに取り出しホームケージへ戻し、24時間後に同様にラットを明室に入れ、暗室に移動するまでの時間(mean latency)を最大300秒まで測定した。対照群(289.45sec)、1ヵ月曝露(245.67sec)、3ヵ月曝露(60.56sec)と3ヵ月曝露ラットにおいて、有意な潜時の減少を認めた。このことから、トルエンの長期曝露により著明な学習障害が惹起されることが明らかとなった。ウィスター系雄性ラットを用い、1日4時間のトルエン吸入曝露を1・3カ月施行した。次いで床からの電気ショックによる受動・回避反応を用いた行動実験をおこない、学習障害(+)群と(-)群の2群に分け、その後、電子顕微鏡の実験に供した。おおよそ学習障害(+)群は3カ月曝露でみられ、学習障害(-)群は1カ月曝露群でみられた。両群を4%パラホルムアルデヒド(0.1Mリン酸緩衝液)で灌流固定し、海馬・帯状回皮質・前頭葉を取り出し、オスミウム固定の後型通りにアセトンで脱水後、エポン包理した。超薄切片を作成し、鉛・酢酸ウラン染色を行い、変性の有無(細胞死、空胞変性の出現、細胞内小器官の形状の不整、シナプス形状の変化)を観察した。電子顕微鏡では、学習障害(-)群では、海馬顆粒細胞層において各細胞間に電子密度の高いGlial filamentが伸展する像がみられたが、細胞体自体には明瞭な変化はみられなかった。学習障害(+)群において、海馬顆粒細胞において、細胞質内の小器官が減少ないし消失し、一見無構造に見えたり、時に空胞変性像・核膜の不鮮明像が観察され、細胞の変性像が電子顕微鏡で確認された。

さらに、ヒトの有機溶剤乱用者でみられる無気力、記銘力の低下を含む認知機能障害などを主症状とする動因喪失症候群の責任病巣と考え得る領域、すなわち海馬以外の辺縁系である帯状回皮質および前頭葉においても海馬顆粒細胞と類似の所見が得られつつある。トルエン長期乱用者における動因喪失症候群(amotivational syndrome)では、積極性の欠如、無関心、感情の平板化、意欲の低下、集中力の欠如などが認められ、この症候群のメカニズムを明らかにするために以下の実験を行い解析した。(1)GFAPの動態と電子顕微鏡的変化有機溶剤の主成分であるトルエン高濃度(2000 PPM)の1ヶ月曝露群では、海馬全体においてGFAP免疫反応が増大し、特に歯状回ににおいてGFAP免疫陽性細胞・突起ともに染色性が高まり突起の面積も有意に増加した。さらに肥厚し染色性の高いGFAP免疫陽性突起が数多く顆粒細胞層へ進展する像が認められた。この変化はおおよそ1ヶ月でピークを示した。電顕では、1ヶ月曝露群では顆粒細胞の間を、太く電子密度の高いglialfilamentを有したアストログリアが伸展する像が観察されたが明瞭な顆粒細胞の変性はみられなかった。3ヶ月曝露動物では、顆粒細胞群で明瞭に変性した細胞を捉えることができた。このことから、トルエン曝露に対して、短期間はアストロサイトの神経の保護作用が高まっているが、3ヶ月といった長期にわたる曝露においては、トルエンの神経毒性とアストロサイトの神経保護作用との均衡が破錠し、徐々に顆粒細胞が変性に陥っていくものと推定された。(2)行動薬理実験トルエン吸入後のラットの行動の変化を受動的回避反応により観察した。対照群・トルエン1・3ヶ月曝露群の動物を用いた。明室から暗室に入った直後に電気ショックを3秒間床グリッドに与え、直ちに取り出しホームケージへ戻し、24時間後に同様にラットを明室に入れ、暗室に移動するまでの時間(mean latency)を最大300秒まで測定した。対照群(289.45sec)、1ヶ月曝露(245.67sec)、3ヶ月曝露(60.56sec)と3ヶ月曝露ラットにおいて、有意な潜時の減少を認めた。このことから、トルエンの長期曝露により著明な学習障害が惹起されることが明らかとなった。
根本的治療法確立のための遺伝性自己免疫疾患の病態解明

原因不明の難病である自己免疫疾患に対して、根本的な治療法を確立するには、本症の原因を明らかにする他に取るべき手段はない。本研究では、その機能障害がヒトに遺伝性の自己免疫疾患をもたらす転写因子AIREを研究対象に選び、遺伝子改変マウスを駆使して自己免疫疾患の原因究明に取り組んだ。AIREは胸腺上皮細胞に発現し、胸腺における負の選択機構にはたらく。得られた成果は以下の2点である。1)負の選択を確立するためのAIREの機能胸腺髄質上皮細胞においてのみ発揮され、胸腺皮質上皮細胞ではそのような機能は発揮されなかった。2)全ての胸腺髄質上皮細胞は成熟過程において、一度はAIREを発現する。しかしながら、自己免疫疾患の病態は複雑多岐にわたるため、何を研究対象として、どのようにアプローチするかを見定めることが、きわめて困難であった。本研究では、その機能障害がヒトに遺伝性の自己免疫疾患をもたらす転写因子AIREを研究対象に選び、遺伝子改変マウスを駆使して自己免疫疾患の原因究明に取り組んでいる。本年度はAIRE発現細胞の免疫学的性状を明らかにする目的で、薬剤(Tamoxifen)誘導型AIRE/Creノックインマウスを樹立し、AIRE発現胸腺髄質上皮細胞(AIRE+ medullary thymic epithelialcell: AIRE+ mTEC)のvivoでの動態を解析した。すなわち、いわゆるfate mapping解析により、AIRE+ mTECのAIRE発現後の半減期を測定したところ、およそ8日であることが明らかになった。この点については、AIREにproapoptoticな活性があるとする報告が他の研究ブループによって成されているので、この仮説を検証するために、薬剤誘導型AIRE/CreノックインマウスをAIRE欠損マウスと交配し、AIRE存在下、あるいはAIRE非存在下におけるAIRE+ mTECの半減期を算定した。その結果、AIREの有無によってAIRE+ mTECの寿命が変化しないことが判明した(AIRE存在下における半減期は8.0日;AIRE非存在下における半減期は8.7日)。すなわち、AIREに明らかなproapoptotic活性は認められなかった。私どもは、AIREがmTECの分化を誘導する作用を持つと考えており、今後はAIRE欠損により、mTECのどの分化段階で成熟化が停止しているかを明らかにする必要があると考えている。それによって、自己免疫疾患の原因究明を基盤として、本症に対する根本的治療法の確立を目指している。前年度の研究に引き続いて、新規遺伝子改変マウスを樹立し、AIREの真の役割、およびAIRE欠損に伴う自己免疫病態のメカニズム解明を図った。1)AIRE/DTRノックインマウス:AIRE+ mTECがジフテリアトキシン受容体(DTR)を発現するを樹立した(西川・松本が担当)。本ノックインマウスでは、ジフテリアトキシン(DT)を投与することによって、DTRを発現するAIRE+ mTECのみを選択的に胸腺から除去することが出来る(正常マウス細胞はDTRをもたないため、DTに非感受性)。すなわち、AIRE+ mTECを生後どの時期に除去することが自己免疫疾患の発症をもたらすかを検討出来る。本年度はAIRE+ mTEC特異的にDTRが発現されていることを確認したので、引き続き、AIRE+ mTECを生後どの時期に除去することが自己免疫疾患の発症をもたらすかを検討するための条件検討を行う。2)AIRE/GFPノックインマウス:AIRE+ mTECがGFPを発現するマウスを本遺伝子改変マウスを用いて、AIRE欠損マウスmTECにおける自己抗原遺伝子の発現異常はAIRE欠損に伴うmTECの分化障害が本質的原因であるとするモデルを検証した(西嶋・毛利・松本が担当)。すなわち、、AIRE(+/GFP)ノックインマウスおよびAIRE(GFP/GFP)ノックインマウス(後者ではAIRE発現lineageの細胞は存在するが、その細胞ではAIRE蛋白を欠如する)のGFP発現mTECと非発現mTECとをそれぞれsortingし、microRNAを標的とするarray解析を行った。現在、得られたデータについてinformaticsを導入した解析に着手している。Aireは胸腺髄質上皮細胞(mTEC)の中の3040%の細胞で発現し、Aire陽性mTECが組織特異的自己抗原発現に特化した特殊なサブセットであると考えられてきた。しかしながら、一部のmTECで発現するAireの欠損によって、mTEC全体からの組織特異的自己抗原発現が低下するのは不思議な現象であった。この問題を解決する目的で、ヒトAIRE遺伝子とGFP遺伝子との融合遺伝子をAire遺伝子座に挿入した新たなAireレポーターマウス(Aire/huAIRE-GFPノックインマウス)を樹立した。この場合、Aireはnuclear dot蛋白として局在するが、そこには同時にGFP蛋白が存在し、その一致率は100%となる。Aire/huAIRE-GFPノックインマウス

由来のmTECを従来通り抗Aireモノクローナル抗体を用いてAire発現細胞を解析すると、やはりmTECの中の3040%の細胞がAire陽性mTECと判定されたが、これをGFP蛍光を指標としてAire陽性mTECを測定すると、約65%の細胞がAire陽性mTECであることが判明した。この結果を成熟mTECに限って見てみると、ほぼ80%の細胞がAireを発現していることになる。さらに、このレポーターアレルをホモで保有する個体の解析では約80%の細胞がAire陽性mTECであり、成熟mTECに限ると、ほぼ95%の細胞がAireを発現しており、Aire陽性mTECが組織特異的自己抗原発現のための特殊なlineageである可能性を否定する結果であった。すなわち、ほぼ全ての成熟mTECは発現レベルに違いはあってもAireを発現しており、個々のmTECが死ぬまでの過程を考慮すると、全てのmTECが一度はAireを発現すると考えられた。原因不明の難病である自己免疫疾患に対して、根本的な治療法を確立するには、本症の原因を明らかにする他に取るべき手段はない。本研究では、その機能障害がヒトに遺伝性の自己免疫疾患をもたらす転写因子AIREを研究対象に選び、遺伝子改変マウスを駆使して自己免疫疾患の原因究明に取り組んだ。AIREは胸腺上皮細胞に発現し、胸腺における負の選択機構にはたらく。得られた成果は以下の2点である。1)負の選択を確立するためのAIREの機能胸腺髄質上皮細胞においてのみ発揮され、胸腺皮質上皮細胞ではそのような機能は発揮されなかった。2)全ての胸腺髄質上皮細胞は成熟過程において、一度はAIREを発現する。本研究課題では様々なAIRE遺伝子改変マウスを用いて、AIREの分子遺伝学的解析を進めるが、新規遺伝子改変マウスの樹立も達成しており、実際のデータの取得にも着手出来ている。AIREトランスジェニックマウスについて、エピジェネティックな観点から自己免疫病態の解析を行う研究についても、早急に着手する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。免疫学平成25年度に得られた結果を基にして、引き続き、AIRE欠損に伴う自己免疫病態のメカニズム解明を図る。また、AIREの機能にはエピジェネティックな遺伝子発現制御機構が関与していると考えられるため、やはりエピジェネティックな手法を駆使した研究に着手する必要がある(主に西嶋・松本が担当)。さらに、樹立に成功したAIRE/DTRノックインマウスについては、AIRE欠損とAIRE+ mTEC欠損との相違点を明確にして、AIRE+ mTECの自己寛容成立機構における役割を明確にする必要がある(主に毛利・松本が担当)。いずれの実験も条件検討等については既に着手しており、当初の予定通り、実験を行って行く。薬剤誘導型AIRE/Creノックインマウスに加えて、当初、作製・解析を計画していた他の遺伝子改変マウスの実験もおおむね順調に進展している。成果発表の機会が次年度当初にあることが判明したため。