hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
欠陥・組成制御した環境共生型マグネシウム系熱電材料の高性能化

Mg_2SiSn系熱電半導体における元素置換による置換型欠陥導入により生成するキャリアの輸送特性と伝導機構の解明と熱電特性への影響を調べるためにMg_2Si_<0.25>Sn_<0.75>組成にMgとの置換元素としてLiとAgを二重添加した化合物を液-固相反応合成法とホットプレス法を併用して作製した。総添加量を25000ppmとし、AgおよびLi単独添加試料とLi5000ppmとAg20000ppmおよびLi20000ppmとAg5000ppm二重添加した試料を準備した。得られた合成物はXRD解析から全て単相であることがわかった。無添加試料の比抵抗は5.27×10<-3>Ωmと大きいが、単独添加試料の比抵抗はLi添加で3.84×10<-5>Ωm、Ag添加で2.78×10<-5>5Ωmと二桁も減少し、二重添加した試料では2.46×10<-5>ΩmとAg単独添加試料に比べて僅かなに低減した。これはキャリア濃度がAg単独添加と同程度あることが原因で、二重添加による置換型欠陥の影響は認められない。ゼーベック係数は全温度領域で正の符号を示し、p型伝導である。二重添加試料のゼーベック係数もAg単独添加試料に比べて僅かに減少した。熱伝導率はAg単独で2.32Wm^<^1>k^<-1>が一番小さく、次に無添加試料の2.39で、Li単独添加が2.65と一番大きい。二重添加ではLi20000ppm+Ag5000ppm試料が2.48、Ag20000ppm+Li5000ppm試料で2.40と無添加試料より僅かに大きくなった。二重添加した原子は、両方ともにMg原子位置と置換しており、Mg原子と置換した原子の原子量や原子径の違いが熱伝導率のフォノン成分に大きく影響することがわかった。また、真性領域の温度域ではバイポーラ成分によって熱伝導率が急激に増加する。熱電性能指数の温度依存性は約500Kで最大値を示し、Ag20000ppm+Li5000ppm試料で0-55×10^<-3>K^<-1>であった。二重添加した試料の熱起電力の温度依存性は温度差の増加に伴って単調に増加した。熱起電力の最大値は約98mVであった。出力特性は最大で温度差が約500Kで82W/mと単独添加に比べて約37%も向上した。さらに結晶粒界が熱電特性に及ぼす影響を調べるために結晶粒径の違う試料を準備した。7538μm粉末で作製した焼結体試料の室温におけるゼーベック係数は、-189と-159μV/Kであった。一方、38μm以下の粉末で作製した焼結体試料では、341と34.57μV/Kを示した。室温における熱伝導率は7538μm粉末焼結体試料ではゼーベック係数が異なっていても約2.42W/Kmで一致していた。しかし、38μm以下粉末焼結体試料では約2.30と約2-23W/Kmとわずかに小さくなった。全ての試料のゼーベック係数は80Kでp型を示し、p型からn型に転移する温度は7538μm粉末の948Kで焼結した試料は約155K、928Kで焼結した試料では約195Kであった。一方、38μm以下粉末では928Kで焼結した試料は約341K、焼結温度を873Kに下げた試料では、422Kであった。この転移温度の変化は結晶粒径に依存しており、結晶粒界によるバンド歪みによってトラップ準位が形成されることがわかった。このトラップ準位によって電子が粒界にトラップされ、温度上昇に伴って正孔と電子が増加するが試料内における正孔と電子の比率が変化するため、伝導型が変化することがわかった。粒界欠陥でゼーベック係数の増加は認められるが、比抵抗の増加により、熱電性能の向上は認められない。p型Mg_2SiSn系熱電半導体における性能向上には欠陥制御は有効であることが示された。
スキル胃癌における浸潤と間質誘導の機序に関する分子生物学的解析

スキルス胃癌の間質増生におけるTGFーβの意義を解明する目的で、スキルス胃癌細胞株から活性型TGFーβの分泌を明らかにし、その活性化の機序を検討した。スキル胃癌細胞株KATOIIIのconditioned medium(CM)中には強いTGFーβ活性が認められたが、酸処理をしてもTGFーβ活性に変化がみられず大部分が活性型で存在した。このKATOIIIのcell lysate中のTGFーβ活性は未処理では検出されず、酸処理により強いTGFーβ活性が検出された。また、KATOIII由来のTGFーβの分子量はTGFーβ前駆体に相当する約50kDaであった。従って、KATOIII由来のTGFーβは細胞内では不活性型で存在し、細胞外に放出された後に活性化されると推察された。このKATOIIIのCMをHPLCで分析したところ、分子量約6ー7万の位置に不活性型TGFーβを活性型に変換する因子が存在した。この因子は、熱、酸、trypsin、各種serine protease inhibitorで失活したが、α_2plasmin inhibitorや他のprotease inhibitorには安定であった。以上より、スキルス胃癌由来細胞KATOIIIは不活性型TGFーβとともにそれを活性化するplasminとは異なる種のserine proteaseを産生、放出し、細胞外で活性型TGFーβに変換することが示唆とされた。一方、スキルス胃癌におけるカドヘリンの発現と浸潤能との関連を明らかにする目的で、E型カドヘリン発現ベクタ-(pBATEM_2)をKATOIIIに遺伝子導入し、その接着性、浸潤性に与える影響を検討した。KATOIII細胞はWestern blotでカドヘリンの発現を認めなかったが、pBATEM_2導入KATOIIIは124KDのE型カドヘリンの発現が確認され、しかも細胞どうしの接着性が亢進していた。さらに、in vitroのdouble chamberを用いたinvasion assayにおいてその浸潤性は低下していた。従って、スキルス胃癌ではカドヘリン発現の低下が細胞間接着機構を失なわせ、癌細胞の細胞塊からの遊離をうながし浸潤、転移を起こしやすい状態にすると考えられた。スキルス胃癌は、癌細胞のびまん性浸潤と間質の著明なコラ-ゲン増生を特徴とする。本研究では、癌細胞の産生する間質誘導物質、すなわち、Paracrineの機序で線維芽細胞に作用してそのコラ-ゲン合成を高める物質のTransforming growth factorβ(TGFーβ)に注目しスキルス胃癌組織におけるその発現と活性化の機序を検討した。TGFーβがスキルス胃癌細胞株で分泌されるかどうかを各種胃癌細胞で検討した。スキルス胃癌由来細胞株4種(KATOIII、JRー1、OCUMー1、HSCー39)、非スキルス胃癌由来細胞株3種(TMKー1、MKNー28、MKNー45)のうち、スキルス胃癌由来株4種すべてと非スキルス胃癌由来株1種(TMKー1)の培養上清(CM)中にTGFーβ活性をみとめた。中でもスキルス胃癌KATOIIIのCM中のTGFーβ活性が最も強かった。

一般に、不活性型TGFーβは酸処理により活性型になるが、KATOIIIのCMは酸処理をせずとも濃度依存性に軟寒天培地中におけるNRK細胞のコロニ-形性能(TGFーβ活性)を示した。このCM中のTGFーβ活性は抗TGFーβ抗体で抑制された。また酸処理してもTGFーβ活性の増強はなかった。以上から、KATOIIIのCM中のTGFーβは活性型で存在すると考えられた。一方、KATOIII細胞内のTGFーβはWestern blotでは、酸処理で抽出したものは約13KD(活性型)であったが、中性条件下で抽出したものは約50KD(TGFーβ前駆体に相当)であったことから、不活性型で存在すると推定された。そこで、KATOIIICM中のTGFーβの活性化の機序を検討する目的で、CMをHPLCで分析すると、Void volumeと分子量約2万の位置にTGFーβ活性を認めたほかに、分子量約7万の位置に不活性型TGFーβを活性型にする因子の存在を認めた。この因子は熱、酸、トリプシン、プロテイナ-ゼインヒビタ-で失活することから何らかのプロテイナ-ゼと考えられた。現在、本因子の精製・抽出を試みている。一方、スキルス胃癌の特徴の一つにsparseな癌細胞の浸潤があげられるが、我々はこの特異な浸潤の機序の一つとして、細胞間接着物質E型カドヘリンの欠如ないしは減少を想定している。スキルス胃癌におけるカドヘリンの発現と浸潤能との関連を明らかにする目的で、E型カドヘリン発現ベクタ-(pBATEM_2)をKATOIII(カドヘリン未発見)に遺伝子導入した。その結果、pBATEM_2導入KATOIIIは124KDのE型カドヘリンの発現が確認され、細胞どうしの接着性が亢進していた。今後、in vitroおよびin vivoでのinvassion assayを行う予定である。スキルス胃癌の間質増生におけるTGFーβの意義を解明する目的で、スキルス胃癌細胞株から活性型TGFーβの分泌を明らかにし、その活性化の機序を検討した。スキルス胃癌細胞株KATO IIIのconditioned medium(CM)中には強いTGFーβ活性が認められたが、酸処理をしてもTGFーβ活性に変化がみられず大部分が活性型で存在した。このKATO IIIのcell lysate中のTGFーβ活性は未処理では検出されず、酸処理により強いTGFーβ活性が検出された。また、KATO III由来のTGFーβの分子量はTGFーβ前駆体に相当する約50kDaであった。従って、KATO III由来のTGFーβは細胞内では不活性型で存在し、細胞外に放出された後に活性化されると推察された。このKATO IIIのCMをHPLCで分析したところ、分子量約6ー7万の位置に不活性型TGFーβを活性型に変換する因子が存在した。この因子は、熱、酸、trypsin、各種serine protease inhibitorで失活したが、α_2 plasmin inhibitorや他のprotease inhibitorには安定であった。以上より、スキルス胃癌由来細胞KATO IIIは不活性型TGFーβとともにそれを活性化するplasminとは異なるある種のserine proteaseを産生、放出し、細胞外で活性型TGFーβに変換することが示唆された。
カロリー制限が子ども期放射線被ばく誘発肝がんの発生を低減する

カロリー制限は、がんの発生を予防する方策として注目されている。しかし、成長期であるこどもの場合、カロリー制限をすることはできない。我々は、こども期に被ばくしても、成体期からカロリー制限を行うことによって、肝がん発生が有意に低減することをマウスを用いて実験的に証明した。本研究では、カロリー制限による放射線発がんの抑制メカニズムを解明することを目的とし、1突然変異検出マウス(gptトランスジェニックマウス)を用いて、被ばく後の突然変異の蓄積を解析した。2発生した肝がんにおけるゲノムや遺伝子発現解析により、カロリー制限で抑制される発がん経路の同定を行った。H25年度は年度計画に従って、以下の実験を行った。1. B6C3F1マウスを用いた発がん実験:肝がんサンプルからDNAを抽出し、アレイCGHを用いて、カロリー制限の有無による肝がんのゲノムコピー数変化の違いを比較して、肝がん特徴的なゲノムコピー数変化パターンを見つけた。2.アレイCGHに合わせて、肝がんサンプルのLOH解析も行って、高頻度にLOHが起こったゲノム領域を見つけた。3.肝がんサンプルからRNAを抽出し、遺伝子発現アレイを用いて、カロリー制限による遺伝子発現変化の違いを網羅的に解析して、カロリー制限の有無によって、肝がんサンプルの遺伝子発現パターンが異なることを見つけた。4. B6C3F1マウスを用いた発がん実験の結果を論文にまとめて、投稿して、受理された。H24年度は年度計画に従って、以下の実験を行った。1. B6C3F1マウスを用いた発がん実験:合計240匹マウスの飼育観察、解剖と病理解析を全て終了した。カロリー制限によって肝がんの発生が遅くなることを確認できた。2.突然変異検出に用いたB6C3F1gpt+/-マウスの経時的解剖、サンプル採取(各タイムポイント5匹、合計80匹)が既に完了した。3. B6C3F1gpt+/-マウス肝臓組織からゲノムDNAを抽出し、gpt assay、を行って、変異頻度を算出し、変異の経時的蓄積の変化を調べた。また、変異コロニーを回収し、DNA配列を解読した。引き続きデーター解析を行って、結果をまとめる。4. B6C3F1gpt+/-マウス肝臓組織からRNAを抽出し、遺伝子発現アレイを用いて、カロリー制限による経時的に発現が変化する遺伝子を調べた。データー解析は進行中であったが、カロリー制限の有無によって、発現量が変動するパスウェイを見つけた。本研究では、カロリー制限による放射線発がんの抑制メカニズムを解明することを目的とし、発生した肝がんにおけるゲノムや遺伝子発現解析により、カロリー制限で抑制される発がん経路の同定を行った。前年度までにB6C3F1マウスを用いた発がん実験では、肝がんサンプルのアレイCGH解析と遺伝子発現マイクロアレイ解析を行った。しかし、サンプル数が少なく、個体差が大きいため、ゲノムコピー数の変化パターンと遺伝子発現パターンの違いを見つけたが、カロリー制限のターゲットになるがん関連遺伝子の抽出までには至らなかった。そこで今年度は、解析する肝がんサンプル数を追加して、全染色体のLOH解析、アレイCGH解析、遺伝子発現マイクロアレイ解析を行った。LOHとアレイCGH解析の結果から、非照射群に比べて、照射群のゲノム欠失や増幅の頻度が高く、ゲノムコピー数が変化しないサンプルの一部には、mitotic recombinationを介したLOHを示すサンプルが確認された。これらの現象は、照射群の中では、カロリー制限群に比べて非制限群で頻繁に観察された。遺伝子発現マイクロアレイ解析の結果からも、カロリー制限によって遺伝子発現パターンの違いが確認され、パスウェー解析から、カロリー制限による細胞増殖の抑制、細胞周期の停止、炎症反応の低減が示唆された。これらの結果を論文に纏めて、投稿準備中である。放射線発がんおおむね年度計画に従って、実験を行った。発生した肝がんサンプルを用いて、ゲノムコピー数変化、LOH解析及び遺伝子発現アレイ解析を行った。アレイCGHのコストが高いため、解析数が限られていて、統計的有意差を出す為に追加実験が必要となる。予定していた学会をキャンセルして、旅費支出を減らして、来年度追加実験に経費を工夫した。おおむね年度計画に従って、実験を行った。変異検出実験に関して、当初の予想とおり、カロリー制限によって変異頻度が低いため、また、in vitro packing効率が予想より低いため、予定よりサンプルを追加して、多めに解析した。それによってgpt assayとSpi assay両方を行うに必要な試薬を全量購入できないので、解析効率のいいgpt assayを優先した。さらに、予定していた2つの学会を1つにし、旅費支出を減らした。

今後は詳細に実験データを集計、解析し、カロリー制限の特徴的ゲノムコピー数変化や遺伝子発現変化に注目し、発がん抑制機序の解明を目指す。今後は変異解析の結果に基づき、変異蓄積に影響を与える、抗酸化経路やDNA修復系、炎症応答に注目し、遺伝子発現のグローバルな変化を解析する。また、発生した肝がんにおけるゲノム(ならびにエピゲノム)や遺伝子発現解析により、カロリー制限で抑制される発がん経路の同定を行う。予定額より安く試薬を購入できた。また、旅費支出をしなかった。投稿論文印刷代が未定のため、支払いが来年度になった。アレイCGH追加実験のための試薬購入に使用する予定。該当なし
木部細胞におけるセルロース合成酵素の動的解析

1.免疫電顕法とフリーズフラクチャ法を組み合わせてセルロース合成酵素の局在部位が細胞膜に局在してみられる顆粒体にあることを高等植物細胞についで、酢酸菌においても証明した。2.GFPベクターにGhCesA遺伝子を組み込んだGhCesA::GFPを調製した。3.GhCesA::GFP融合タンパク質を細胞に導入するため、マイクロインジェクション法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法を試みた。その結果パーティクルガン法による遺伝子導入方法が細胞へのダメージが一番少ない方法であることがわかった。4.GhCesA::GFP融合タンパク質の蛍光パターンと小胞体を染色するDiOC6染色像の比較により、細胞質中に認められた網目状構造は小胞体であると確認された。5.末端側不完全長CesA3遺伝子のみでも小胞体で発現することが示された。6.小胞体の編目状構造と密接に関係している小球状蛍光体の局在様式および蛍光直径の類似から、GhCesA::GFP融合タンパク質のゴルジ体での局在の可能性が示唆された。(1)セルロース合成酵素の解媒タンパク質を活性にすることで知られるサイクリックジグアニリル酸タンパク質の抗体を調製しフリーズフラクチャー免疫電顕法で抗体の局在を調べた結果酢酸菌のターミナルコンプレックスに特異的にラベルされた。このことにより、サイクリックジグアニリル酸タンパク質がセルロース合成酵素複合体に組みこまれていることが判明した。(2)綿のセルロース合成酵素をコードする遺伝子GhCesAのcDNAがすでにクローニングされている。GhCesAの5'末端から1.4kbの遺伝子断片をGFP(Green fluorescent Protein)をコードする遺伝子を含むCMV35s-sGFP(S65.T)-NlS3'ベクターのGFP遺伝子の5'上流部に結合させた。得られたCMV35s-GhCesA-sGFP(S65.T)-NlS3'ベクターをエレクナロポーレーション法によりダバコBY-2細胞に導入しGhCesAの一過性の発現を本研究交費で設置した。コンフォーカル・レーザースキャン顕微鏡で観察しているセルロース合成酵素の植物細胞膜での発現を可視化するためにコンフォーカルレーザー顕微鏡で観察した結果、セルロース合成酵素遺伝子(CesA)とGFPの融合遺伝子の導入後3時間目から蛍光が認められた。蛍光の消失は導入後36時間以降であった。蛍光を発する細胞は全体の約0.001%であった。CesAの局在様式はコントロールと比較すると全く異なっていた。(1)核では蛍光が認められないこと、(2)蛍光が細胞質全体に広がるのではなく網目状の構造として局在することが観察された。導入後3時間では網目状構造は認められないが、核周辺に蛍光が見られ、蛍光は核全体を取り囲んでいた。細胞質での網目状構造は導入後6時間で認められた。網目状構造は、細胞膜付近及び核膜周辺においてはっきりと観察された。網幅は1.0-2.0μm程度であった。その後時間経過と共に網幅が粗い網目状構造として局在する細胞が混在した。小胞体を特異的に染色するDiOC6による染色像と網目状構造の局在は一致した。しかし細胞膜上で蛍光は検出できなかった。コントロールでのGFP発現様式はすでに報告されているものと同様であり、遺伝子導入が成功していることを意味している。しかし、発現率の低さは今後の課題である。DiOC_6による染色によりCesAは小胞体で強く発現していることが確認された。これはCesA3のアミノ末端から724番目に小胞体輸送に働く疎水性シグナル配列が含まれるため、融合タンパク質の局在が小胞体で認められたと考えられる。そして、5'末端側不完全長CesA3遺伝子のみでも小胞体輸送に働くことが示された。セルロース合成酵素の植物細胞膜での発現をコンフォーカルレーザー顕微鏡で可視化することを試みた。タバコ培養細胞BY-2へ導入するセルロース合成酵素の遺伝子として綿繊維細胞から単離されたGhCesA3遺伝子の5'末端から約1.4kbを使用した。カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、GFP遺伝子、ノパリン合成酵素ターミネーターが組み込まれたプラスミド上のGFPのすぐ上流領域へCesA遺伝子を組み込んだ。この構築したカセットをpBI121バイナリーベクターに組み込み遺伝子導入用のベクターとした。

BY-2への導入は形質転換させたアグロバクテリウムを介して行い、カールツァイス製Axiovert 200M型共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果、CesA::GFP融合タンパク質は小胞体、ゴルジ体、原形質膜付近の小胞において蛍光が確認できた。そしてセルロース合成酵素活性場所と考えられる原形質膜でも発現が見られた。BY-2培養液であるLS培地に0.4Mとなるようにマンニトールを加え、形質転換体BY-2を原形質分離させた。その結果原形質膜だけでなく細胞壁にも蛍光が確認できた。セルロース合成酵素の輸送経路として、細胞内で発現したCesA::GFP融合遺伝子が核内でmRNAに転写され、リボソーム上に結合し小胞体に取り込まれる。この後ゴルジ体へと運ばれ、小胞に包まれて原形質膜付近に輸送され小胞が原形質膜に融合されることによって膜タンパク質になると考えられる。
わが国の小児インフルエンザ菌感染症の実態に関する研究

インフルエンザ菌Hiは欧米で小児全身(深部)感染症の原因菌の首位にあり、予防接種も勧告実施されている。そこでわが国Hi感染症の実態を検討した。1.Hi全身感染症の実態調査。血液、穿刺液からのHi検出例。(1)全国調査[I]19821984年対象は全国主要病院小児科[II]19851988年対象は日本小児科学会認定医研修施設。[I]では213症例、[II]では427症例が集計された。91%が髄膜炎、他は肺炎・膿胸・咽頭蓋炎・関節炎・敗血症など。2/3が2歳未満、致命率は[II]で2.6%に半減したが、後遺症22%は改善されず、予後は尚重大である。(2)population study:千葉県下小児科標傍病院を対象に実施した。Hi症例最多の1988年でも04歳児人口10万人対全身感染症4.8、髄膜炎3.9で米国CDC調査の100、60に比して低率であった。(3)Hi肺炎の臨床的細菌学的検討:病原診断の確実な36症例(全国より収集)について分析した。2.全身感染症由来Hi菌株の血清型-生物型-抗生剤感受性:わが国37施設からの77分離株について検討した。髄膜炎株の98%は血清型b、93%は生物型IまたはII、77株中35%がABPC耐性、β-lactamase産生株であり、CP耐性7%中の77%はABPC耐性に付随していた。3.CIEによるHi莢膜抗原の検出:(1)肺炎入院患児288例の血清・尿についてCIEを試み、抗原血症または抗原尿症を証明、Hib型による肺炎4症例を診断し得た。(2)Hiを有意に検出し得た喀痰46検体中2検体からHib型抗原を証明しHib型による診断した。他は無莢膜株であった。4.Hib型鼻咽腔保有状態:抗Hib血清培地を用いてHib型髄膜炎児の兄が通園する幼稚園児110例中10.0%にHibを検出、対照とした乳児検診児181例中1.7%、他の保育園児183例中2.2%に比してHib保菌率が有意に高いことを警告した。わが国の小児インフルエンザ菌(Hi)感染症の実態を把握するため、全国主要病院小児科の協力の下にHi全身(深部)感染症症例に関する質問紙調査を実施、先ず19821984年の成績を前回19791981年の成績と比較検討した。Hi全身感染症は現在までに213症例集計され、全国的に分布しているが、症例数は東京・沖縄・岡山・福岡・広島に多く、小児人口比では沖縄・香川・岡山・島取・徳島の順である。

年齢別では1歳迄に76.1%,2歳迄に86.4%,3歳迄に92.0%,病型では髄膜炎92.0%は前回とほぼ同率、敗血症6.1%,肺炎・膿胸4.7%,候頭蓋炎,関節炎各0.5%であった。敗血症は0歳児に多く、髄膜炎は2歳迄に77.5%で前回に比べ低年齢化している。菌検出部位は髄液・血液・胸水の順で、莢膜抗原検索は千葉大小児科を除いて未だ普及率が低い。死亡5.2%,後遺症22.5%で死亡例は2歳末満に集中し、予後は、改善されていない。MIC,β-lactamaseにより確認されたABPC耐性Hiによる全身感染症は24例(11.3%,髄膜炎23,膿胸1)、耐性の疑は20例(9.4%)でABPC耐性症例11.320.7%の間にあり、前回の5.413.0%を大きく上回り、憂慮すべき問題である。Hiは1986年千葉大小児科における気管支肺感染症137例の原因菌としても首位にある。洗浄喀痰から原因菌(判定基準:上原1971)の判明した72例中Hiは50例70%、うちβ-lactamase陽性ABPC耐性株は21例42%に認められ、難治例に多発している。下気道由来株の血清型ではb型は稀で95%以上が無莢膜株,生物型では【II】型44%,【I】・【III】型,【IV】・【V】型の順であった。遷延例における完全除菌は困灘で、宿主側要因を含めて検討を進めている。Hib型の鼻咽腔保有率を一般培養3培地に抗Hib血清加Levinthal培地を加えて検索を始めた。0歳児中心の乳児121例中Hi陽性47例,b型保菌2例(1.7%)で同一保育園児であった。全国主要病院小児科の協力の下に原因菌の確実な肺炎症例(1984-86)の報告を得た結果,インフルエンザ菌(Hi)は146例中16例(11.6%)でブドウ球菌,肺炎球菌に次いで3位であることが明らかになった.別にHi全身感染症についての全国調査から得られたHi肺炎症例を加えた36例について各施設に補足調査協力を仰ぎ,臨床的・細菌学的検討を行った.男女比は1.6=1,年齢は2歳以下77%, 1歳にピークがありHi髄膜炎よりも年長に傾いていた.県別では沖縄11,東京9,千葉5,北海道3,埼玉石川各2,他は1例以下,予後は死亡11.4%,後遺症5.5%,軽快83.3%,生後0日敗血症・肺炎の未熟児例もあった.分離菌のABPC耐性3株, ABPC・CP耐性1株,血清型別は不明が大多数で抗血清の入手の困難性を反映していた.インフルエンザ菌肺炎症例の分折はわが国ではじめて試みである.Hi感染症について基礎的臨床研究に接するため,上原は文部省在外研究員として米国NIH, TEXAS大学に2ヵ月間滞在し,臨床レベルで応用可能な手技の導入を考えた.RIAによるHib型抗体の測定, Outermembrane protein(OMP)のsubtyping等について今後研究協力が得られることになった.手技上のポイントを得てOMP subtypingに検討を加え,わが国のパターンを政米のそれと比較すべく進行中である.Hiの抗菌剤感受症について,最小阻止濃度MICを測定し1987年の143株中ABPC耐性21.0%, CP耐性2.8%, TC耐性11.2%であり, ABPC耐性株はすべてβ-ラクタマーゼ産生株であった.Hi感染症の疫学調査として乳児検診児181名の咽頭Hi, Hib型保有率を抗血清加倍地を用いて検索しHib1.7%を認めた.また2つの保育園児についても, Hi骨髄炎児との関係においてHib保有状態を検索し,血清型別・生物型別検討を進めている.1)小児インフルエンザ菌(Hiと略)感染症の全国調査(1985-1988)を小児科学会認定医研修施設を対象に実施した。Hi全身感染症は256施設から427例集計され漸増傾向にある。1歳未満38%、2歳未満67%で従来よりも高年齢化傾向にある。髄膜炎91%、肺炎膿胸3.6%、関節炎1.6%、蜂崇繊炎1.4%、喉頭蓋炎0.9%など、血清型別では92%がb型、予後では志望と2.6%で半減したが後遺症は21%で改善されていない。
次世代超高密度光記録膜用新規酸化物材料に関する研究

近年、半導体レーザーの短波長化が進み光記録膜の高密度化が期待され、短波長レーザーに対応した光記録膜材料の開発が急務となった。そこで、本研究では大きなバンドギャップを有する酸化物材料を用いた光記録膜の基礎的な研究を行った。酸化物材料としてZnOとIn_2O_3を組み合わせたスプリットターゲットを用い、パルスレーザー堆積法により積層構造の薄膜をガラス基板およびポリカーボネイト基板(DVD-R用基板)上に堆積させた。レーザーにはArFエキシマレーザー(波長193nm)を用いた。ZnOとIn_2O_3のトレース比(2つのターゲット上をレーザーが移動する割合)を1:1とし層数を15020層と変化させた場合、層数が少なくなるに従ってas-depo.と熱処理後(480°C×10min)の透過率差は大きくなることが分かった。青色のL.D.での記録を想定しているので、波長405nmでの透過率差は55%であった。また、波長350nmにおいて透過率差33%の値が得られ、さらに短波長レーザーでも記録が可能であることが分かった。記録を想定して熱処理前後の膜において、高分解能透過型電子顕微鏡により膜の断面観察を行った。熱処理前(記録前)の状態では、積層構造となり熱処理後(記録後)の膜においては単層膜となり、透過率が小から大へと変化することと関連付けることができた。ZnOとIn_2O_3のトレース比を1:1とし層数を変化させた場合および層数を60層に固定しトレース比を変化させてP.C.基板上に膜を堆積させ、DVDテスターによりCN比を測定した。トレース比を変化させた場合、1:1付近の膜において書き込みパワー2mWで50dB以上の値が得られ、組成がずれると大きな書き込みパワーが必要となることが分かった。また、層数を変化させた場合、層数が80層以上になると単層膜となりCN比は小さな値となった。60層の場合最も大きなCN比67dB(書き込みパワー3.2mW時)が得られた。2040層の場合1.5mWで50dB以上となり、低いパワーでの記録を達成した。従来の材料の場合6mW以上であるのに対し、低いパワーで記録できる材料であることが分かり、レーザーの寿命を延ばすことができ実用化を目指したときには最適な特性であることが分かった。酸化物材料としてGa_2O_3とIn_2O_3及びZnOとIn_2O_3を組み合わせたスプリットターゲットを用い、パルスレーザー堆積法により積層構造の薄膜をガラス基板上に堆積させた。Ga_2O_3とIn_2O_3の積層構造の場合Ga_2O_3:In_2O_3=3:1の組成比(トレース比)のとき、波長300nmにおいて熱処理前後での透過率差は49%、ZnOとIn_2O_3の場合ZnO:In_2O_3=1:10のとき、波長350nmにおいて透過率差33%の値が得られた。XRD及びXPSの測定より、熱処理前後の透過率変化は酸化の度合いに起因していることが分かった。また、Nd:YAGレーザーの第3高調波(355nm,3ns)のパルス光を用いて記録ドットの書き込みを確認した。実用化を目指した場合、スパッタリング法の方が有利であるため、Ga_2O_3,In_2O_3及びZnOの酸化物材料を種々組み合わせRFマグネトロンスパッタ法で積層膜を作製した。その結果、ZnOとIn_2O_3の積層構造が最も大きな透過率差(熱処理前後において)が得られ、その値は波長400nmにおいて47%であった。次に、金属のInやZnを用いGa_2O_3と組み合わせについても実験を行ない、In:Zn:Ga(Ga_2O_3)=48:48:4の膜の場合、波長350nmにおいて透過率差50%の大きな値が得られた。この膜をポリカーボネイト基盤(DVD-R用基盤)上に堆積し、CNR測定を行った。書込パワー8mW,読取りパワー0.6mWの条件下で約50dB程度の実用可能な、良好な値のCN比が得られた。

青色のL.D.での記録を想定しているので、波長405nmでの透過率差は55%であった。また、波長350nmにおいて透過率差33%の値が得られ、さらに短波長レーザーでも記録が可能であることが分かった。記録を想定して熱処理前後の膜において、高分解能透過型電子顕微鏡により膜の断面観察を行った。熱処理前(記録前)の状態では、積層構造となり熱処理後(記録後)の膜においては単層膜となり、透過率が小から大へと変化することと関連付けることができた。ZnOとIn_2O_3のトレース比を1:1とし層数を変化させた場合および層数を60層に固定しトレース比を変化させてP.C.基板上に膜を堆積させ、DVDテスターによりCN比を測定した。トレース比を変化させた場合、1:1付近の膜において書き込みパワー2mWで50dB以上の値が得られ、組成がずれると大きな書き込みパワーが必要となることが分かった。また、層数を変化させた場合、層数が80層以上になると単層膜となりCN比は小さな値となった。60層の場合最も大きなCN比67dB(書き込みパワー3.2mW時)が得られた。2040層の場合1.5mWで50dB以上となり、低いパワーでの記録を達成した。従来の材料の場合6mW以上であるのに対し、低いパワーで記録できる材料であることが分かり、レーザーの寿命を延ばすことができ実用化を目指したときには最適な特性であることが分かった。
サル前頭連合野コラムの個体発生機構

本研究の目的は、サルの前頭連合野の機能コラムの個体発生をin vitroで明らかにすることにある。H7年度は、とくに成年期のサルの前頭連合野において、機能コラムの特徴を明らかにする目的での研究を行った。まず、マカクザルの前頭連合野の主溝周辺領域(46野)から厚さ400μmのスライス標本を作成し、倒立顕微鏡のチェンバー内で培養しつつ、電位感受性色素RH482で染色した。ついで、皮質の各層をタングステン電極で電気的に刺激し(単一パルス、40300μA、通常は200μA)、刺激による活動伝播の時空間パターンを光学記録装置を用いて光学的に記録した。記録領域は通常4ミリ四方とし、皮質の全層での活動を記録できるようにした。この実験により、興奮性の活動がコラム状に伝わることを見つけた。すなわち、ニューロン活動は刺激した点から皮質表面に対して縦方向に広がり、横方向の広がりはある範囲内(6001000μm)に収まった。このコラム状活動にはっきりとした境界があるかどうか調べるため、刺激電流の強さを変えて、コラム状伝播の幅がいかに変化するかを調べた。コラム状伝播の幅は刺激を強くすると広くなったが、刺激が一定の強さ(200μA)以上になるとプラトーに達し、一定の幅(6001000μm)以上には広がらなかった。また、同じスライスで刺激の位置をずらし、コラム状活動の領域がいかに変化するかを調べた。この場合、刺激の位置をずらすとコラム状活動伝播の領域は変わったが、通常、異なった領域が活動し、明瞭なオーバーラップはみられなかった。また、ずらす距離が近い場合(<300μm)には、ほとんど同じコラム状領域が活動した。これらのデータは、前頭連合野に、はっきりとした「機能コラム」があることを示す。こうした機能コラムが前頭連合野の担う高次機能の情報処理単位となっていると考えられる。
自我障害は統合失調症に特異的か？－自我障害の神経基盤研究

脳磁図研究では、自己の名前、他人の名前、無意味な文字列を視覚呈示し、反応を記録した。健常対照者は、自己の名前>他人の名前>無意味な文字列というパターンだったが、統合失調症者では自己の名前という自己関連刺激に対する特異的な反応が失われていた。さらに、統合失調症、双極性障害、正常対照者の脳磁図反応を記録し、成果の一部を論文発表した(Schizophr Res, Bipolar Disord, PLoSONE誌など)。脳構造研究では、平成25年度までに合計で、正常対照者131名、双極性障害者23名、統合失調症90名のMRIを撮像した。上側頭回の構造異常は、統合失調症に比較的特異的であった。脳磁図研究では、306チャンネル脳磁計を用いて自己の名前、他人の名前、無意味な文字列を視覚呈示し、反応を記録した。健常対照者20名、統合失調症者20名を対象に行った。刺激提示後190msecー210msec、周波数70Hzー120Hzの範囲の視覚誘発反応Power値に関して、反復測定分散分析を行ったところ、群間と刺激種類との間に有意な相互作用を認めた。post-hoc検定で、健常対照者は、自己の名前>他人の名前>無意味な文字列というパターンだったが、統合失調症者では三つの刺激間でPower値に有意差は認められず、自己の名前という自己関連刺激に対する特異的な反応が失われていた。国際学会にて研究成果を発表した。また、脳磁図を用いた双極性障害のauditory steady-state responseについて、PLoS ONEに研究成果を報告した。現在自己の顔に対する神経振動活動の研究のセットアップを行った。以上のようなアプローチにより自我障害の神経基盤を明らかにする。また、脳磁図を用いた統合失調症のauditory steady-state responseについて、Schizophrenia Researchなどの国際誌に研究成果を報告した。脳構造研究では、3T MRI装置を用いて、T1・T2・DTI (Diffusion Tensor Imaging)撮像を行った。平成23年度には正常対照者20名、双極性障害者10名、統合失調症5名のMRIを撮像した。得られた画像デジタルデータについて、MATLAB上で動作するstatistical parametric mapping (SPM5)を使用し、voxel based morphometry (VBM)法にて解析を行っている。脳磁図の結果と統合し、自我障害の神経基盤を明らかにしていく。自己の名前に対する神経振動は解析を行い、論文作成中である。統合失調症では自己の名前に対する神経活動の上昇がないことが明らかになり、自我障害の基盤が検索できると思われる。また、MRI撮像の被験者数は大きく進展した。自己の顔に対する研究も準備中である。以上のことから、おおむね順調であると判断できる。自己の名前を呈示した際の脳磁図研究は、記録・解析まで終了しており、論文作成準備中であり、おおむね順調に進展していると判断した。MRIについては、進行中であり、今後も撮像を継続する。自己の顔に対する視覚誘発反応を調べることで、他のモダリティーでも自己関連刺激に対する反応の障害が統合失調症で認められるかを検討する。

自己の名前に対する反応は現在論文作成中であり、研究成果を国際誌に発表する予定である。MRIについては適宜症例数を増やして行く。自己の名前を呈示した際の脳磁図研究は、記録・解析まで終了しており、他のモダリティーによる自我障害の神経基盤研究を進める予定である。具体的には、自己の顔に対する脳活動を調べる予定である。MRIについては、進行中であり、今後も撮像を継続する。解析の補助としてMac Miniを追加で購入する(10万円程度)。国内国際学会に積極的に参加し、研究成果を公表する(60万円程度)。また、脳磁図使用料金(50万円程度)を計上する予定である。脳磁図記録用機器:700千円脳磁図記録オープンラボ代:400千円学会参加費:310千円
DNA修復欠損マウスの精子形成不全における精巣幹細胞のゲノム維持機構の解析

A群色素性乾皮症(XP)遺伝子(Xpa遺伝子)を欠損したXpa遺伝子欠損マウス(Xpaマウス)が、XP患者の皮膚癌だけでなく、2年令で発育不全、悪性腫瘍の多発、精子形成不全を示し、XPの病態モデルとなることを示した。経時的な遺伝子発現の詳細な分析から、DNA修復、細胞周期(チェックポイント)、細胞死に関わる遺伝子の発現異常が検出された。さらに、これら遺伝子発現異常を示す同月令のXpaマウス精巣病変を精細管のステージも考慮して調べたところ、興味深いことに組織変性と細胞増殖の混在した病変が見られ、今後の病態解明につながるものと思われる。DNA修復欠損マウスの精子形成不全における精巣幹細胞のゲノム維持機構に注目し解析を進め、以下の実験を行い結論を得た。A群色素性乾皮症遺伝子(XPA遺伝子)を欠損したXPA遺伝子欠損マウス(XPAマウス)の解析から、このマウスがXP患者の臨床症状の皮膚癌だけでなく、24ヶ月令で発育不全、悪性腫瘍の高頻度発生、精子形成不全を示すことから、XPの病態モデルとなることを論文として発表した(DNA Repair,7:1938-50,2008)。これまでの解析からXPAマウスを新たに凍結胚から作成する必要があることが判明し、マウスコロニーを立ち上げながら実験を開始している。このため昨年度に引き続き、各月令XPAマウス精巣のDNA修復関連遺伝子[塩基除去修復(BER)、ヌクレオチド除去修復蛋白質(NER)、損傷乗り越え修復蛋白質(TLS)、ミスマッチ修復(MMR)等]の発現を解析する。これらの遺伝子の発現の変化を確認するため、RT-PCR(reverse transcription PCR)、免疫染色、Western blotting、Real-time PCR等で解析する予定である。さらに、生後5日令XPAマウス精巣および成獣XPAマウス精巣における精原細胞(実験的停留精巣)にDNA損傷を与え、精原細胞の増殖・分化能を調べるために病変を調べ、同時に前述の遺伝子発現解析で変化の見られた遺伝子の発現を検索する。上記の実験から、DNA修復欠損マウスの精子形成不全における精巣病変とDNA修復関連遺伝子の発現変化との関係が明らかになることで、DNA修復欠損マウスの精子形成不全における精巣幹細胞のゲノム維持機構の病態が解明される。DNA修復欠損マウスの精子形成不全における精巣幹細胞のゲノム維持機構に注目し解析を進め、以下の実験から結論を得た。A群色素性乾皮症(XP)遺伝子(XPA遺伝子)を欠損したXPA遺伝子欠損マウス(XPAマウス)が、XP患者の皮膚癌だけでなく、2年令で発育不全、悪性腫瘍の多発、精子形成不全を示し、XPの病態モデルとなることを発表した(DNA Repair,7:1938-50, 2008)。凍結胚から得た3ヶ月令、6ヶ月令XPAマウス精巣の遺伝子発現解析を行ったところ、既に得ていた12ヶ月令XPAマウス精巣で発現異常を示していたDNA修復、細胞周期、細胞死に関わる遺伝子にも発現異常が検出された。現在、これらの遺伝子発現の変化を確認するため、RT-PCR (rever8e transcription PCR)、免疫染色、Western blotting、Real-time PCR等で解析している。この解析を通して、進行性の精子形成不全の病変とそれに関わる遺伝子の発現異常の検討が可能になる。また同時に、精原細胞しか存在しない生後5-8日令XPAマウス精巣において上記の遺伝子発現を検索し、精巣幹細胞への関与を探る。上記の実験から、DNA修復欠損マウスの精子形成不全における精巣病変とDNA修復・細胞周期・細胞死関連遺伝子の発現変化との関係が明らかになることで、DNA修復欠損マウスの精子形成不全における精巣幹細胞のゲノム維持機構の病態が解明される。DNA修復欠損マウスの精子形成不全における精巣幹細胞のゲノム維持機構に注員し解析を進め、以下の実験かち結論を得た。A群色素性乾皮症(XP)遺伝子(Xpa遺伝子)を欠損したXpa遺伝子欠損マウス(Xpaマウス)が、XP患者の皮膚癌だけでなく、2年令で発育不全、悪性腫瘍の多発、精子形成不全を示し、XPの病態モデルとなることを発表した(DNA Repair, 7 : 1938-50, 2008)。本研究開始当初、12ヶ月令XPAマウス精巣で精巣幹細胞に特異的な遺伝子発現の低下があり精巣幹細胞の機能低下を考えたが、さらに3ヶ月令、6ヶ月令精巣の遺伝子発現の検索において顕著な差がみられなかった。しかし、3ヶ月令、6ヶ月令および12ヶ月令XPAマウス精巣の経時的な遺伝子発現の詳細な分析から、DNA修復、細胞周期(チェックポイント)、細胞死に関わる遺伝子の発現異常が検出された。さらに、これら遺伝子発現異常を示す同月令のXPAマウス精巣病変を精細管のステージも考慮して調べたところ、興味深いことに組織変性と細胞増殖の混在した病変が見られ、今後の病態解明につながる糸口になると思われる。

一方、精巣組織全体の遺伝子発現の解析結果が、各精細管の遺伝子発現異常にどの程度関与しているかを注意深く検討する必要がある。今後、上記遺伝子発現解析の確認のとれたDNA修復欠損マウスとXpaマウスとの2重欠損マウス精巣の解析によって、DNA修復欠損マウスの精子形成不全における精巣幹細胞のゲノム維持機構の病態が解明される。
Tri-Phaseエピタキシー手法による酸化物単結晶薄膜の作製と新機能探索

酸化物の新機能材料はますます多成分化し、薄膜の作製も困難になる一方である。例えば高温超伝導体RBa_2Cu_3O_<7-d>(RBCO)の薄膜をスパッタ法やパルスレーザー堆積(PLD)法でエピタキシャル薄膜を作製しても、転位、析出物を多く含んでいるのが現状である。この問題を解決するために我々のグループではバルク単結晶プロセスのフラックス法を薄膜プロセスに応用したTri-Phaseエピタキシー(TPE)法を開発し、RBCOの単結晶薄膜の作製に成功した。本手法は高温超伝導体だけでなく、強誘電体(Bi_4Ti_3O_<12>)など他の酸化物材料の薄膜化にも応用できる可能性を有している。本研究では、そのための新しいフラックス材料の探索や薄膜作製条件最適化にコンビナトリアル薄膜技術を適用し、TPE法を用いた複酸化物のエピタキシー技術の確立を目的とする。昨年度は新しいフラックス材料を見つけるためのコンビナトリアル装置の開発、強誘電体のBi_4Ti_3O_<12>薄膜のTPE合成を重点に研究を行ってきた。本年度はこの新しいコンビナトリアル装置を用いて、強誘電体のBi_4Ti_3O_<12>薄膜成長のためのフラックスを探索した。その結果、新しいフラックスを発見することができ、強誘電体Bi_4Ti_3O_<12>の単結晶薄膜、配向制御ナノプレート構造の作製に成功した。その詳細について以下に記す。(1)TPE手法による強誘電体Bi_4Ti_3O_<12>単結晶薄膜の作製3成分系のコンビナトリアル手法を用いて、強誘電体Bi_4Ti_3O_<12>の単結晶薄膜成長のためのフラックス材料を探索した。そのスクリーニングの結果、新しいフラックス材料Bi-Cu-Oフラックスを発見することができた。このフラックス材料を使用することで、原子レベルで平坦、大きなグレイン、高い絶縁性を有するBi_4Ti_3O_12単結晶薄膜を作製することに成功した。(2)フラックスエピタキシー手法による強誘電体Bi_4Ti_3O_<12>薄膜の配向制御とそのナノプレート構造の作製フラックスによって、強誘電体Bi_4Ti_3O_<12>薄膜の配向を制御することを試みた。フラックスの選択にはコンビナトリアル3成分組成傾斜薄膜法を用いた。その結果、配向制御を促進させるVO_xフラックスを発見することができた。このフラックスはBi_4Ti_3O_<12>の配向を制御するだけでなく、結晶構造の異方性に基づく結晶成長を促進させ、(110)配向のナノプレート構造を作製することを可能にした。酸化物の新機能材料はますます多成分化し、薄膜の作製も難しくなる一方である。一方、液相エピタキシー(LPE)法を用いれば、高品質な薄膜を作製することができるが、膜厚の制御が難しくデバイス作製には適していない。そこでLPE法とPLD法の長所を組み合わせたTri-Phaseエピタキシー(TPE)法を開発し、これまでにR123の単結晶薄膜の作製に成功した。本手法はバルク単結晶を作製する方法の一つであるフラックス法に基づいており、高温超伝導体だけでなく、強誘電体(Bi_4Ti_3O_<12>)や非線形光学材料(BaB_2O_4)など他の酸化物材料の薄膜化にも応用できる可能性を持っている。本年度は新しいフラックス材料を見つけるためのコンビナトリアル装置の開発、強誘電体のBi_4Ti_3O_<12>薄膜のTPE合成を重点に研究を行った。以下に詳細について記す。(1)コンビナトリアル手法を利用したフラックス材料の探索フラックス材料として自己フラックスが用いられることが多い。しかしながら、産業ベースでより大きな単結晶を作製するにはYIGで用いられているPb-B-Oなどのような不純物をフラックスとして用いることも必要である。しかしながら不純物フラックスを選択するための一般則はなく、適切なフラックス材料の選択は困難を要する。フラックス材料の探索を高速かつ系統的に行うべく、2成分系のコンビナトリアル装置を3成分系のシステムへ拡張し、実験の効率化を図った。(2)強誘電体のBi_4Ti_3O_<12>薄膜のTPE合成TPE手法を用いてBi_4Ti_3O_<12>のバルク単結晶を作製することを試みた。Bi_4Ti_3O_<12>のバルク単結晶はBi_2O_3がフラックス材料に使用されており、Bi_4Ti_3O_<12>の単結晶薄膜の合成においてもBi_2O_3をフラックスにして実験を行った。このように作製されたBi_4Ti_3O_<12>

薄膜は原子レベルで平坦であり、結晶構造の半ユニットに相当するステップ構造が観察され、高品質な薄膜を作製することができた。酸化物の新機能材料はますます多成分化し、薄膜の作製も困難になる一方である。例えば高温超伝導体RBa_2Cu_3O_<7-d>(RBCO)の薄膜をスパッタ法やパルスレーザー堆積(PLD)法でエピタキシャル薄膜を作製しても、転位、析出物を多く含んでいるのが現状である。この問題を解決するために我々のグループではバルク単結晶プロセスのフラックス法を薄膜プロセスに応用したTri-Phaseエピタキシー(TPE)法を開発し、RBCOの単結晶薄膜の作製に成功した。本手法は高温超伝導体だけでなく、強誘電体(Bi_4Ti_3O_<12>)など他の酸化物材料の薄膜化にも応用できる可能性を有している。本研究では、そのための新しいフラックス材料の探索や薄膜作製条件最適化にコンビナトリアル薄膜技術を適用し、TPE法を用いた複酸化物のエピタキシー技術の確立を目的とする。昨年度は新しいフラックス材料を見つけるためのコンビナトリアル装置の開発、強誘電体のBi_4Ti_3O_<12>薄膜のTPE合成を重点に研究を行ってきた。本年度はこの新しいコンビナトリアル装置を用いて、強誘電体のBi_4Ti_3O_<12>薄膜成長のためのフラックスを探索した。その結果、新しいフラックスを発見することができ、強誘電体Bi_4Ti_3O_<12>の単結晶薄膜、配向制御ナノプレート構造の作製に成功した。その詳細について以下に記す。(1)TPE手法による強誘電体Bi_4Ti_3O_<12>単結晶薄膜の作製3成分系のコンビナトリアル手法を用いて、強誘電体Bi_4Ti_3O_<12>の単結晶薄膜成長のためのフラックス材料を探索した。そのスクリーニングの結果、新しいフラックス材料Bi-Cu-Oフラックスを発見することができた。このフラックス材料を使用することで、原子レベルで平坦、大きなグレイン、高い絶縁性を有するBi_4Ti_3O_12単結晶薄膜を作製することに成功した。(2)フラックスエピタキシー手法による強誘電体Bi_4Ti_3O_<12>薄膜の配向制御とそのナノプレート構造の作製フラックスによって、強誘電体Bi_4Ti_3O_<12>薄膜の配向を制御することを試みた。フラックスの選択にはコンビナトリアル3成分組成傾斜薄膜法を用いた。その結果、配向制御を促進させるVO_xフラックスを発見することができた。このフラックスはBi_4Ti_3O_<12>の配向を制御するだけでなく、結晶構造の異方性に基づく結晶成長を促進させ、(110)配向のナノプレート構造を作製することを可能にした。
不整脈疾患モデル心筋細胞による機能解析と薬剤スクリーニングの検討

CHIR99021とIWP-4の2種の化合物を用いて、iPS細胞から心筋細胞への誘導に成功した。従来のActivinAやBMP4等のタンパク質を用いる方法と同様に約10日で拍動が観察された。誘導した心筋細胞についてRT-PCRと免疫染色を行い、心筋細胞特異的な遺伝子やタンパク質が発現している事を確認した。KCNQ1遺伝子に変異を持つ患者より誘導した心筋細胞について、交感神経作動薬を加えた時の拍動数と活動電位変化の比較を行ったが、健常人との差は見られなかった。今後、iPS細胞由来の心筋細胞を用いて、様々な薬物負荷試験が可能になると考えられる。活動電位の再分極に働くカリウムイオンチャネルをコードするKCNQ1の遺伝子変異(G1768A)は、膜移行能が約60%低下し、膜電流も半減するが、正常型と共発現させた場合はそれらの機能は正常型と変わらないことが判明している。この遺伝子変異をヘテロで持つ患者は、心電図はQT間隔がやや延長しているものの(QTc: 463ms)、これまでに既往歴、または家族歴もないことから、野生型遺伝子によるレスキューが働いていると考えられる。しかしながら運動時など交感神経が優位に働く際のチャネル機能不全、また二次性(薬剤性)不整脈を引き起こす可能性が健常人より高いことも考えられ、今後の不整脈リスク管理に役立てるべく患者iPS細胞由来の心筋細胞を用いて薬物負荷試験を行った。Multi Electrode Array(MEA)上に撒かれた心筋細胞に対し、交感神経刺激としてイソプロテレノールを順に10、30、100 nMで投与し、薬物投与後の細胞外電位持続時間(Field Potential Duration: FPD)と拍動数変化を健常人由来の心筋細胞と比較した。FPDは薬物投与前を1として投与後の短縮時間の割合を求めたところ、正常型では10 nM、30 nM、100 nMの順に1.4 ±4.0 %、26.5 ±6.7 %、31.9 ±9.1 %短縮し、変異型ではそれぞれ12.8 ±7.9 %、25.5 ±8.6 %、36.4 ±5.4 %短縮した。10 nMで変異型の短縮割合が大きい結果となったが、有意差はなかった。拍動数の変化は、正常型で投与前、10 nM、30 nM、100 nMの順に41.5 ±2.7 bpm、57.8 ±4.3bpm、62.3 ±3.7bpm、68.8 ±4.3 bpmであったのに対し、変異型でそれぞれ38.8 ±0.7 bpm、63.7 ±3.9 bpm、69.6 ±5.8 bpm、72.6 ±2.8 bpmであり全濃度で有意差はなかった。今回の結果では、変異型チャネルを発現する心筋細胞の異常な薬物応答性は観察されなかったが、今後はより薄い濃度での薬物応答性を調べる必要がある。健常人ヒト末梢血からiPS細胞を樹立し、心筋細胞誘導に成功した。末梢血を採取後、単核球を単離し、T細胞の増殖を促すため、IL-2/CD-3抗体を添加した培地で4日間培養した。活性化T細胞はセンダイウイルスベクターにより山中4因子を感染後、マウス胎児繊維芽細胞上で約10日間培養した。初期iPSコロニーは継代時にセンダイウイルスベクター特異的なsiRNAを発現させることにより、効果的にベクターの除去を行うことができ、感染から約1ヶ月で成熟iPS細胞を誘導することができた。得られたiPS細胞は免疫染色を行い、幹細胞マーカーであるNanog、SSEA3、Oct4、Tra-1-60の発現を確認した。iPS細胞から心筋細胞への誘導には、GSK-3β阻害剤でwnt/βカテニンシグナル経路活性化に働くCHIR99021と、wnt/βカテニンシグナル経路アンタゴニストであるIWP-4の2つの化合物を用いた。iPS細胞をマウス胎児繊維芽細胞非存在下で培養し、コンフルエントになった時点で誘導を開始した。培地には拍動するまでRPMI+B27サプリメント(インスリン不含)を、拍動後はRPMI+B27サプリメント用いた。誘導1日目はCHIR99021(8μM)を添加し中胚葉分化を導き、誘導3日目にはIWP-4(10μM)を添加することにより心筋細胞分化を誘導した。本方法では約10日で拍動する心筋細胞を確認することができた。