hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＭＲＩ空間歪みのアルツハイマー病画像解析への影響調査と発症予測診断法の開発

アルツハイマー病(Alzheimer disease: AD)は、様々な認知機能を奪い取る重大な病である。ADの制圧のため、世界各国でAD治療薬の開発が進んでいるが、臨床治験となるとその実施には長い時間と莫大な費用がかかることが指摘されている。アルツハイマー病の臨床治験の評価にはMRIを用いた画像解析が有効であるが、MRIは画像の幾何学的歪みがその信頼性を損ねる問題がある。本研究ではこの問題に対して歪み補正法を提案し、臨床治験の実施を促進するものである。被験者のMRI撮像の直後に取得するPhantom画像の基準点誤差から歪み場を推定し、それを基に画像変形を行うことによってMRI画像の補正を行う方法を考案し、その有効性をPhantom実験ならびにVoxel-Based-Morphometryによる脳画像計測の再現性が向上することを示した。この成果は国際学会誌であるMedical Physics誌に投稿し掲載が決定した。また歪み補正前後の脳画像をTensol-Based-Morphometry法によって空間座標毎の容積変化率を求め、アルツハイマー病の進行動態と密接に関係するとされている海馬や嗅内皮質などの解剖学的関心領域内の歪みによる影響を計測した。結果、海馬領域の容積変化率の中央値は8.02 %であり嗅内皮質内は8.91 %であった。アルツハイマー病における年間の海馬の委縮率はおおよそ5%程度であるとされているため、本手法による補正が海馬の委縮を評価するうえで重要であることが示される。装置メンテナンス等による歪みへの影響については、受信コイルのアップグレードや交換、RFパルスの調整、Heの充填などを行った前後とそれ以外の作業を行った場合のファントム基準点誤差を比較したところ、これらのメンテナンスを行った場合、有意に基準点誤差が変動していた。このことから、これらメンテナンスを行った直後にはファントム撮像を行い画像の歪みを補正する必要があることが示唆された。一方、歪み補正後の画像に対してFischlらの開発した自動関心領域分割ソフトウェア"FreeSurfer"によって得られた海馬および嗅内皮質の容積などを入力とし、決定木による機械学習法によって、アルツハイマー病の発症予測を行ったが有用な結果が得られなかった。被験者とほぼ同時に撮像される物理ファントムのMRI画像上の基準点の誤差から、MRIの歪みを補正する手法を提案し、その有効性を検証した。全国38施設42装置で撮像されたファントム画像の基準点誤差の平均自乗根(RMS)の補正前と提案手法による補正後を示す。補正前のRMSは0.72 (±0.28) mmであったが,補正後は0.28 (±0.53 ×10-1) mmであった. Willcoxonの符号順位検定を行ったところ,補正後画像では有意な改善がRMSについて見られた(p < 0.0001).歪み補正前と補正後の左右の海馬の年間萎縮率から求められる治験実施時の必要被験者数を示す。試算した結果、補正前でそれぞれ255名(左海馬)、176名(右海馬)であった被験者数が、補正後は148名(左海馬)、175名(右海馬)と大きな改善が見られる。補正前の画像から試算される被験者数が多くなる原因として、MRIの幾何学的歪みによる縮小が海馬領域に多く見られたため、海馬の年間萎縮率が過小評価されることが考えられる。提案手法による歪み補正により、ファントム内の歪みによる誤差が提案手法により軽減されることを示した。また海馬領域の歪みが改善されることにより、海馬の年間萎縮率がより顕著となるため、アルツハイマー病のバイオマーカーとしてより有用になり得ることが本研究の成果として示された。MRIを用いた画像解析の信頼性が提案手法を用いて向上されることから、今後の臨床研究あるいは臨床治験などが、より少ない被験者で実施できる。臨床治験における問題は、必要被験者数の増加に伴う、実施コストの増大が挙げられる。よって本研究の成果により、今後アルツハイマー病の新薬開発時の臨床治験の実施を推進することが期待できる。当初の予定通りファントムを用いた歪み補正法の開発を行い、その有効性を検証した。また検証結果を国際論文誌に投稿し採択された。また補正前後の脳画像の容積変化率を計測することにより、MRIの幾何学歪みが脳画像解析へ与える影響を調査した。この成果は2013年7月に米国ボストンで開催されるAlzheimer's Neuroscience Conference | Alzheimer's Associationで発表予定である。これらの実施状況と得られた成果から、MRI空間歪みの補正とそのアルツハイマー病画像解析への影響調査は順調に進展したと評価できるものと考える。一方でアルツハイマー病の発症予測に関しては本年度中は十分な成果が得られなかった。しかしながら、発症予測の実施自体は行ったため、全体としておおむね順調に進展していると評価した。25年度が最終年度であるため、記入しない。

本年度の研究結果として、FreeSurferを用いた海馬と嗅内皮質の容積解析からアルツハイマー病の決定木を用いた発症予測では十分な精度が得られないことが示された。FreeSurferで抽出した海馬領域と用手的に専門家が抽出した領域の空間的一致係数:Dice Coefficientがせいぜい60%程度にしか達しない場合があると文献で報告されている。すなわち、FreeSurferの関心領域の抽出精度が十分でないため、アルツハイマー病の発症予測に悪影響を与えているものと考えられる。そこで来年度は臨床画像において解剖学的な関心領域抽出に高い精度を示すとして近年注目されている、Multi-Label-Fusion法を適応した海馬抽出の新手法の開発を試みる。これは事前に用手的に抽出した多数の解剖学的領域内の画像特徴量を教師データとし、これから抽出しようとするMRI画像の局所的な特徴量と教師データの類似度を重みとして多数決投票を行うことによって、関心領域か否かを判別するものである。91例のOne Leave Out法によってそれぞれの海馬領域を抽出し、同一作業者によって抽出した海馬関心領域との空間的一致度から提案手法を評価する。開発した手法による海馬領域の容積を入力として機械学習を行い、アルツハイマー病の発症予測の精度改善を目指す。25年度が最終年度であるため、記入しない。
絨毛細胞障害のＣＤ４４細胞内シグナル伝達系を介した修復制御機構の検討

胎児発育遅延の主なる原因である胎盤絨毛細胞障害の、妊娠中の自己修復制御機構は知見が乏しい。合胞体栄養細胞は絨毛間腔を形成し、細胞膜表面にはへパラン硫酸/へパリンといった陰性荷電を有する糖鎖が豊富に存在している。へパラン硫酸/へパリンはその受容体であるCD44および各種増殖因子受容体を介しPAK、Stat3、Aktといった細胞内シグナル伝達系分子により細胞遊走を促し、創傷治癒にかかわることを不死化絨毛細胞株(TCL-1)を用いて検討した。その結果、絨毛細胞がheparin/HSにより他の増殖因子のシグナリングを直接的には介さず、CD44v3を介して細胞移動を促進し組織修復を行うことを示した。胎児発育不全の主なる原因として胎盤絨毛細胞障害があるが、修復過程の制御機構については知見が乏しい。合胞体栄養細胞は絨毛間腔を形成し、細胞膜にはヘパラン硫酸/ヘパリンといった糖鎖が豊富に存在している。昨年までの研究では、抗CD44v3抗体ならびにsiRNA CD44感染TCL-1細胞を用いて、ヘパラン硫酸/ヘパリンはその受容体であるCD44v3を介して直接細胞内筋骨格シグナル伝達系PAK1リン酸化に働きかけ、他の増殖因子シグナル伝達系とは独立して細胞遊走に関与していることを示した。今回の研究ではこうした物理的細胞障害が、従来観察されてきている低酸素下におけるsFLT1の増加とVEGFの低下といった増殖因子の調節に関与するsFLT1放出にどの程度関与するかの検討を行った。方法)インビトロスクラッチ法により、スクラッチの有無によりTCL-1細胞上清中、膜分画のsFLTタンパク発現をWesternblot法により検討した。また、同様にRT-PCR法によりsFLT1mRNA発現の検討を行った。さらに、chymotrypsin inhibitorの存在下非存在下でchymotrypsin投与を行い、上清中のsFLT1抗原濃度を検討した。結果)スクラッチ物理的障害下ではsFLT1放出が抑制された。sFLT1mRNAおよびタンパク発現に変化は認められなかった。上清中sFLT1濃度はchymotrypsin依存性であった。結論)物理的細胞障害ではsFLT1放出は細胞膜chymotrypsin活性により調節され、VEGF濃度の低下を抑制する可能性が示唆された。胎児発育遅延の主なる原因として胎盤絨毛細胞障害があるが、妊娠中の自己修復過程の制御機構については知見が乏しい。へパラン硫酸/へパリンはその受容体であるCD44および各種増殖因子受容体を介しPAK、Stat3、Aktといった細胞内シグナル伝達系分子により細胞遊走を促し、創傷治癒にかかわると考えられる。しかしながら、絨毛細胞障害とその自己修復をどのように調整制御しているのか、また、さらには絨毛細胞自身が局所でどのような他の調節機序、過程を経て自己修復するのかについては十分明らかとななってきていない。母体血と直接接し栄養ガス交換に関与する障害を受けた胎盤絨毛細胞の自律的修復の制御機構、並びにその修復障害について受容体ー細胞内シグナル伝達系の異常に注目し、その機序について検討を行った。胎盤由来ヒト不死化細胞TCL-1細胞を用いて、in vitro scratch assay、Western blot (WB)法によるヘパリン誘発PAK1リン酸化の検討、Lipofectamine法によるsiRNACD44によるヘパリン誘発PAK1リン酸化の抑制により、heparin/HS存在下で閉創率の有意な上昇、抗ヒトCD44多クローン抗体またはsiRNACD44存在下閉創率の有意な低下、Heparin/HS並びscratchによるPAK1リン酸化(Ser199/204およびThr423)、抗CD44v3抗体存在下でヘパリン誘発PAK1リン酸化(Thr423)の抑制、siRNA CD44感染TCL-1細胞のCD44発現抑制を観察した。絨毛細胞がheparin/HSにより他の増殖因子のシグナリングを直接的には介さず、CD44v3を介して細胞移動を促進し組織修復を行うことを示した。胎児発育遅延の主なる原因として胎盤絨毛細胞障害があるが、修復過程の制御機構については知見が乏しい。合胞体栄養細胞は絨毛間腔を形成し、細胞膜にはへパラン硫酸/へパリンといった糖鎖が豊富に存在している。

自律的修復の制御機構について受容体ー細胞内シグナル伝達系に注目し検討した。[方法]1)胎盤由来ヒト不死化細胞TCL-1細胞を用いへパリン存在下、抗ヒトCD44多クローン抗体、siRNACD44を添加し、各種条件でインビトロスクラッチ法をおこなった。2)ウェスタンブロット(WB)法によりTCL-1細胞膜上の受容体の発現を検討した。3)へパリン並びスクラッチによるPAK1リン酸化、及びに抗CD44v3抗体存在下でのヘパリン誘発PAK1リン酸化をWB法により検討した。4)リポフェクタミン法によるsiRNACD44処理後、CD44経時的発現を検討した。[結果]1)へパリン存在下で閉創率がコントロールと比較して有意に上昇した。一方、抗ヒトCD44多クローン抗体またはsiRNA CD44存在下では、へパリン存在下での閉創率と比較して有意に低下していた。2) CD9、cytokeratin-7、CD44、CD44v3、EGF受容体の発現を認めた。3)へパリン並びスクラッチによるPAK1リン酸化を認めた。抗CD44v3抗体存在下でヘパリン誘発PAK1リン酸化は抑制された。4) siRNACD44感染TCL-1細胞はCD44発現が抑制された。[考察]絨毛細胞がへパリンにより他の増殖因子のシグナリングを直接的には介さず、CD44v3を介して細胞移動を促進し組織修復を行うことを示した。それまでの実験の基礎の存在ヒト絨毛細胞初回培養細胞を用いた研究主として絨毛細胞初代培養に用いる。ヒト絨毛細胞初回培養細胞の単離本年度の研究については主として既存の実験系により遂行したため、試薬等の消耗も予想を下回り、当該研究費が生じが、本年は新たな実験系により検討を行う。ヒト絨毛培養細胞におけるCD44機能の検討a)多クローン抗CD44抗体およびその抗splicing variant form抗体存在下でI-A)で用いた方法によりTCL-1、HTR-8/SVneoおよびヒト胎盤絨毛培養細胞での遊走能を検討する(。b)CD44機能抑制因子であるガレクチン-9によるTCL-1、HTR-8/SVneoおよびヒト胎盤絨毛培養細胞での遊走能を検討する。c)入手可能なヒトCD44 (HCAM) siRNAのTCL-1、HTR-8/SVneoおよびヒト胎盤絨毛培養細胞への感染導入によりCD44発現をknockdownし、その遊走能を検討する(杉村、牧野、大学院生2名)。なお、Western blottingおよび半定量RT-PCR法によるCD44たんぱく発現ならびにCD44遺伝子発現について確認を行う。また、細胞内でのリン酸化への影響を検討するためにIn-Cell Western assay法を用いる。
短繊維強化複合材料の内部構造解析

レーザ光もしくは可視光を母材が通し,表面下に存在する繊維が観察可能であるならば,汎用性の高い共焦点レーザ走査形顕微鏡や光学顕微鏡を用いて内部構造を知ることがより現実的な方法といえる.ところが,表面に近い繊維については問題ないのだが,表面から離れるにつれて,繊維にそれより手前にある繊維が重なる確率が高くなる。このことが共焦点レーザ走査形顕微鏡,光学顕微鏡を用いた短繊維強化複合材内部構造解析に大きな壁として立ちはだかる.当該研究においては,この問題を解決するための基礎的な研究を行った.まず繊維と複合材の相対的な位置を分類し,各分類についての表面への投影長さ分布を求めた.次に,それを利用して表面下の繊維の可視部分の長さ分布を計算した.この研究を受けて,次に表面下の繊維の完全投影長さおよび不完全投影長さ分布を理論的に誘導した.誘導した理論式を用い,短繊維強化複合材中の繊維長さの変化に対する完全投影長さおよび不完全投影長さの変化を求め,本理論による繊維長さ分布推定の可能性について検討した.さらに,完全投影長さおよび不完全投影長さに与える様々な因子の影響について検討した.先の研究では,繊維の重なり部分の幅を求めるための式が,漸化式となっている.このため,計算精度がどうしても上がらない.繊維の重なった部分の幅の分布を多項式で表現することに挑戦した.繊維が表面に平行な面内でランダムに配向された短繊維強化複合材,いわゆる2次元短繊維強化複合材を表面から観察したときの繊維の重なり部分の幅を解析的な手法により誘導した.当該研究で得られた理論を現実の複合材料に適用することも試みた.表面下の繊維像をある程度は捕らえられたが,3次元的な繊維配置取得までは至らなかった.今後,早急に繊維配置取得までは至らなかった原因を究明して,当該研究で得られた成果を現実の複合材料に適用することを行いたいと考えている.レーザ光もしくは可視光を母材が通し,表面下に存在する繊維が観察可能であるならば,汎用性の高い共焦点レーザ走査形顕微鏡や光学顕微鏡を用いて内部構造を知ることがより現実的な方法といえる.ところが,表面に近い繊維については問題ないのだが,表面から離れるにつれて,繊維にそれより手前にある繊維が重なる確率が高くなる。このことが共焦点レーザ走査形顕微鏡,光学顕微鏡を用いた短繊維強化複合材内部構造解析に大きな壁として立ちはだかる.当該研究においては,この問題を解決するための基礎的な研究を行った.まず繊維と複合材の相対的な位置を分類し,各分類についての表面への投影長さ分布を求めた.次に,それを利用して表面下の繊維の可視部分の長さ分布を計算した.この研究を受けて,次に表面下の繊維の完全投影長さおよび不完全投影長さ分布を理論的に誘導した.誘導した理論式を用い,短繊維強化複合材中の繊維長さの変化に対する完全投影長さおよび不完全投影長さの変化を求め,本理論による繊維長さ分布推定の可能性について検討した.さらに,完全投影長さおよび不完全投影長さに与える様々な因子の影響について検討した.先の研究では,繊維の重なり部分の幅を求めるための式が,漸化式となっている.このため,計算精度がどうしても上がらない.繊維の重なった部分の幅の分布を多項式で表現することに挑戦した.繊維が表面に平行な面内でランダムに配向された短繊維強化複合材,いわゆる2次元短繊維強化複合材を表面から観察したときの繊維の重なり部分の幅を解析的な手法により誘導した.当該研究で得られた理論を現実の複合材料に適用することも試みた.表面下の繊維像をある程度は捕らえられたが,3次元的な繊維配置取得までは至らなかった.今後,早急に繊維配置取得までは至らなかった原因を究明して,当該研究で得られた成果を現実の複合材料に適用することを行いたいと考えている.短繊維強化複合材表面下の繊維が試料表面より観察可能の場合について,まず繊維と複合材の相対的な位置を分類し、各分類についての表面への投影長さ分布を求めた.次に,それを利用して表面下の繊維の可視部分の長さ分布を計算した.得られた知見は以下のとおりである.1試料表面から観察して繊維の可視部分の長さを求めるという観点から,繊維と短繊維強化複合材の相対的な位置を5種類に分類された.2複合材中の平均繊維長さが試料の厚さ以下のときには,投影長さは短く,繊維端のどちらかまたは両方が複合材中に存在する繊維がほとんどである.複合材中の平均繊維長さが試料の厚さを超えると,表面および裏面の両面で切られる繊維が多くなり,投影長さも長くなる.さらに平均繊維長さが長くなって,試料の厚さの5倍以上になると、ほとんどの繊維が表面および裏面の両面で切られる繊雑となり,それ以上平均繊維長さが長くなっても投影長さ分布にはあまり影響を与えない.3繊維体積含有率が0.1程度の短繊維強化複合材では,平均繊維長さが繊維直径の30倍以上になると可視部分の長さの平均値はあまり変化しない.4繊維体積含有率が増加すると,可視部分の長さの平均値は減少する.また,繊維に挟まれてできる可視部分や,試料表面に切られたところと他の繊維の間の可視部分の割合が増加し,試料中に埋没した繊維端と他の繊維でできる可視部分や,繊維全体が見える割合は減少する.

短繊維強化複合材より切り出した試料の表面下に存在する繊維が試料表面から観察可能と仮定して,表面で切られる繊維の完全投影長さおよび不完全投影長さの分布を理論的に誘導した.繊維の多くはそれよりも手前にある何本かの繊維が重なって,部分的にしか観察可能でない.他の繊維が重なる部分の位置と幅の分布を確率論に基づいて求めた.式は,漸化式の形となった.誘導した理論式を用いるとともに,昨年度の実績で報告した繊維と複合材の相対位置関係を考慮して,短繊維強化複合材中の繊維長さの変化による完全投影長さおよび不完全投影長さの変化を求め,本理論による繊維長さ分布評価の可能性について検討した.さらに,完全投影長さおよび不完全投影長さに与える様々な因子の影響について検討した.得られた知見は以下のとおりである.(1)他の繊維が重なる部分の位置や幅の分布を確率論に基づいて求め,完全投影長さ分布および不完全投影長さ分布を求めるための理論式を誘導した.(2)完全投影長さや不完全投影長さを用いて繊維長さを推定する場合,推定できる繊維の長さに上限が存在することが指摘された.(3)繊維方向分布が3次元ランダムであるならば,計算を行ったほとんどの範囲で,繊維長さ,繊維体積含有率および試料厚さが変化しても,繊維の投影長さと不完全投影長さは近い値をとることがわかった.(4)試料表面に平行に近い繊維がより多くなると,繊維の投影長さと不完全投影長さの値の差が広がることがわかった.レーザ光もしくは可視光を母材が通し,表面下に存在する繊維が観察可能であるならば,共焦点レーザ走査形顕微鏡や光学顕微鏡を用いて内部構造を知ることがより現実的な方法といえる.ところが,表面に近い繊維については問題ないのだが,表面から離れるにつれて,繊維にそれより手前にある繊維が重なる確率が高くなる.このことが共焦点レーザ走査形顕微鏡,光学顕微鏡を用いた短繊維強化複合材内部構造解析に大きな壁として立ちはだかる.当該研究においては,この問題を解決するための基礎的な研究を行った.具体的には,繊維の重なり部分の幅の分布を多項式で表現することに挑戦した.まず手始めに,繊維が表面に平行な面内でランダムに配向された短繊維強化複合材,いわゆる2次元短繊維強化複合材を表面から観察したときの繊維の重なり部分の幅を解析的な手法により誘導した.ここで得られた主な知見は以下のとおりである.(1)繊維が単独で重なることを近似した四角形が単独に存在する場合の個数分布は四角形の個数,存在範囲および四角形の幅の関数となることがわかった.(2)重なり部分を近似した長方形の幅が四角形の幅の整数倍nを超えるたびに,長方形の個数分布は四角形の幅のn-2次式が加わる形で表されることがわかった.以上のように,短繊維強化複合材の表面下に観察される繊維の様相について理論的に解析した.当該研究で得られた理論を現実の複合材料に適用することも試みた.試みの過程で得られた繊維像の写真を成果報告書参考資料1および参考資料2のFig.1に示してある.写真のように表面下の繊維像をある程度は捕らえられたが,3次元的な繊維配置取得までは至らなかった.今後,早急に繊維配置取得までは至らなかった原因を究明して,当該研究で得られた成果を現実の複合材料に適用することを行いたいと考えている.
0157大腸菌感染ストレス誘導レプチンによるGb3結合志賀毒素活性化機序

志賀毒素(Stx)産生腸管出血性大腸菌(STEC)0157:H7感染が引き起こす致死的合併症(溶血性尿毒症症候群:HUS)の基本病態は、血管内皮障害とフィブリン/血栓形成で、特異受容体(Gb3)に結合したStxの毒性と炎症性サイトカインの協調作用がその原因とされている。今回の研究において、StxとTNF-α存在下における標的細胞でのNO産生亢進が、HUS病態成立に深く関与し、TNF-α刺激により産生亢進するレプチンが、両因子の協調作用を更に促進させていることが確認された。このレプチンの作用は、既に報告したIV型ボスポジエステラーゼ阻害剤(PDEI)の効果に拮抗するものであった。STEC経口感染後18時間までに、腸管組織および血中にTNF-αが有意に産生亢進され、血中には16時間目移行レプチン量が上昇し、この上昇と併行して、血中及び腎、脳内でのNOレベルの亢進が確認され、脳内でのアポトーシス細胞が増加した。Stx非産生大腸菌の経口感染では、これらの変化は確認されなかった。神経細胞を用いた解析から、志賀毒素の標的細胞への毒性発現に細胞内NO産生亢進が不可欠であり、レプチン処理神経細胞ではStx存在下でNO産生充進が著しく増加し、Stx感受性の顕著な元進が認められた。レプチン処理の効果には、細胞膜non-raft中のABCA1発現低下とlipidraft中でのGb3発現増強が認められ、Gb3結合Stxの細胞内取り込み亢進による、神経細胞のアポトーシス増強が認められた。PDEIは、逆にABCA発現亢進とGb3のre-distributionを招き、レプチン作用に拮抗作用をしめした。今回の研究ではleptinの作用機序については明らかにしえなかったが、レプチンによる毒素活性亢進作用はSTEC感染感受性の個体差の一因と推察された。腸管出血性大腸菌(STEC)感染においては、腸管内からの志賀毒素の血中への移行を介してGb3発現標的細胞への到達が、HUS発症の重要な初期過程であり、この過程におけるサイトカインの役割は極めて重要と考えられる。β2ミクログロブリン欠損マウスにおいてはSTEC感染後、NK細胞の内毒素感受性亢進に基づいてIFN-γの過剰産生が生じる。次に、IFN-γ産生により活性化された単球・マクロファージからのTNF-α産生亢進により、脊髄のglia細胞でのGb3発現が増強し、志賀毒素が効率的に中枢に到達し得ることが確認された。さらに、感染後血中レプチン量の上昇と併行して腎・脳組織でのGb3発現増強が観察された。血中レプチンとTNF-α量の増加に伴い、両臓器においてNO産生細胞が増加し、志賀毒素の標的細胞への毒性発現が亢進し、特に神経細胞への毒性発現にNOの存在が不可欠であることが、培養神経細胞を用いた解析で明らかになった。培養血管内皮や神経細胞への志賀毒素の活性発現においては、毒素とTNF-αの共存が最も効果的であったが、同時にレプチンで細胞を前処理することで、毒素作用は顕著に亢進した。レプチンによる毒素活性亢進作用はNO阻害剤の添加で抑制しえたが、グレリンの添加では認められなかった。

NO産生亢進と同時に神経細胞のアポトーシスが誘導されることが認められた。また脳内においては、免疫染色で志賀毒素がparaventricular areaに強染色され、近辺の細胞においてはiNOs及びnitrotyrosine陽性細胞が顕著に増加していた。以上の結果から、両因子(志賀毒素とTNF-α)存在下における標的細胞でのNO産生誘導が、本マウスにおけるSTEC感染に起因するHUS病態成立に関与しており、内毒素や志賀毒素刺激による単球・マクロファージからのレプチン産生亢進は、両因子の協調作用を促進させていると考えられた。昨年度の研究において、StxとTNF-α存在下における標的細胞でのNO産生亢進が、HUS病態成立に深く関与し、TNF-α刺激により産生亢進するレプチンが、両因子の協調作用を更に促進させていることが確認された。本年度の研究では、STEC経口感染後18時間までに、腸管組織および血中にTNF-αが有意に産生亢進され、血中には16時間目移行レプチン量が上昇し、この上昇と併行して、血中及び腎・脳内でのNOレベルの亢進が確認され、脳内でのアポトーシス細胞が増加した。Stx非産生大腸菌の経口感染では、これらの変化は確認されなかった。神経細胞を用いた解析から、志賀毒素の標的細胞への毒性発現に細胞内NO産生亢進が不可欠であり、レプチン処理神経細胞ではStx存在下でNO産生亢進が著しく増加し、Stx感受性の顕著な亢進が認められた。レプチン処理の効果には、細胞膜non-raft中のABCA1発低下進とlipid raft中でのGb3発現増強が認められ、結果としてGb3結合Stxの細胞内取り込みが亢進し、神経細胞のアポトーシスが増強されることが認められた。しかし、レプチン処理によるアポトーシス増強作用は血管内皮細胞では確認されなかった。本研究ではレプチンの作用機序については明らかにしえなかったが、レプチンによる毒素活性亢進作用はSTEC感染感受性の個体差の一因と推察された。
カンキツ花芽における葉の発生・成長機構の解析

カンキツの花芽は、花のみがあらわれる「直花(無葉花)」と花とともに葉と枝があらわれる「有葉花」の2種類に分けられる。果実は直花あるいは有葉花のいずれかを由来とするが、それぞれの花からできる果実の落果率や肥大速度、果実内成分量は異なる。このため、直花と有葉花の数やバランスは果実の収量や品質を左右する。そこで本研究では、花芽における葉の発生・成長あるいは退化にどのような遺伝子や植物ホルモンが関わっているかを明らかにする。具体的には、直花を有葉花に変える薬剤を処理した後の花芽において、葉の分化と成長を形態的に観察するとともに、増減する発現遺伝子群や植物ホルモンなどを調査する。
血中脂肪細胞特異的脂肪酸結合蛋白質、脂肪酸分画と糖代謝異常に関する疫学研究

2008年に前向きコホート調査を実施した2060歳の男性労働者を6年間追跡し、血清脂肪細胞特異的脂肪酸結合蛋白質(FABP4)と糖代謝異常およびメタボリックシンドローム(MetS)発症との関連を検討した。その結果、血清FABP4濃度の上昇とともに糖代謝異常およびMetS発症率は有意に上昇した。また、多変量調整後の相対危険は血清FABP4濃度の上昇とともに糖代謝異常では上昇する傾向を示し、MetS発症においては有意に上昇した。以上のことより、血清FABP4濃度の上昇は、MetS発症リスクの上昇と有意に関連することが示され、MetSの進展状況を予測する指標となる可能性が示唆された。平成25年度は、平成20年度に徳島県の職域コホートに参加した方の保存血清を用いて血清中の脂肪細胞特異的脂肪酸結合蛋白質(FABP4/A-FABP)濃度を測定した(中央値:男性10.1ng/ml、女性10.5ng/ml)。痩せた女性が多く参加しているため、女性の濃度が比較的低い値を示し、更に代謝異常や糖代謝異常の発症数が不十分であった。このため、平成20年度に疫学調査を受診した2060歳の男性労働者を5年間追跡し、血清FABP4濃度と糖代謝異常およびメタボリックシンドローム発症との関連を検討した。(1)糖代謝異常(空腹時血糖値110mg/dl以上又はHbA1c6.0%以上)の既往がなく、再度糖代謝異常の有無を判定できた394名を解析対象者とし、追跡期間中に35例の糖代謝異常の発症を認めた。血清FABP4濃度を3分位し、血清FABP4のレベル別に糖代謝異常の発症率を検討したところ、血清FABP4濃度の上昇とともに有意に増加した(p for trend<0.005)。更に、多変量調整後の糖代謝異常発症の相対危険も、血清FABP4濃度の上昇とともに上昇する傾向が認められた。(2)メタボリックシンドロームの既往がなく、再度メタボリックシンドロームの有無を判定できた366名を解析対象者とし、追跡期間中に55例のメタボリックシンドロームの発症を認めた。メタボリックシンドロームについても同様の解析を行ったところ、血清FABP4濃度の上昇とともにメタボリックシンドロームの発症率は有意に増加し(p for trend<0.001)、多変量調整後のメタボリックシンドロームの相対危険も有意に上昇した(p for trend<0.005)。以上のことから、血清FABP4濃度の上昇は、糖代謝異常およびメタボリックシンドローム発症リスクの上昇と有意に関連することが示唆された。平成25年度までに、血清脂肪細胞特異的脂肪酸結合蛋白質(FABP4)濃度の上昇とともに糖代謝異常およびメタボリックシンドローム(MetS)発症の相対危険が上昇する可能性を認めた。そこで、本年度は平成20年度に疫学調査を受診した2060歳の男性労働者を6年間追跡し、FABP4と関連の深い脂肪酸分画を考慮した上で血清FABP4濃度と糖代謝異常およびMetS発症との関連を検討した。まず、糖代謝異常(空腹時血糖値110 mg/dl以上又はHbA1c6.0%以上)との関連性では、血清FABP4濃度の上昇とともに糖代謝異常の発症率は有意に増加した(p for trend<0.005)。しかし、発症者数が少ないため、追跡期間を延長し更なる検討が必要であると考えられる。次に、MetSとの関連性では、血清FABP4濃度の上昇とともにMetS発症率は有意に増加し、多変量調整後のMetS発症の相対危険も有意に上昇した(p for trend<0.005)。更に、細胞内では脂肪酸とFABP4は関連が深いと考えられているも、血清FABP4濃度と血中脂肪酸分画との相関は弱く、血清FABP4は血中脂肪酸分画とは独立して、有意にMetS発症と関連していた(p for trend<0.01)。一方、血中脂肪酸分画の変化も血清FABP4とは独立して、有意にMetS発症と関連していたため(p for trend<0.05)、血清FABP4及び血中脂肪酸分画の変化はMetS発症に対して各々異なる経路で関与している可能性が示唆された。以上のことから、血清FABP4濃度の上昇は、MetS発症リスクの上昇と有意に関連することが示唆され、MetSの進展状況を予測する指標となる可能性が示唆された。医歯薬学当初の計画通り、平成20年度に徳島県の職域コホートに参加した方の保存血清を用いて脂肪細胞特異的脂肪酸結合蛋白質(FABP4/A-FABP)濃度を測定した。

また、平成25年度の追跡調査を行い、代謝異常や糖代謝異常発症の情報収集を実施できている。更に、血清FABP4濃度と糖代謝異常および代謝異常発症との関連の解析も進んでいる。しかし、女性の代謝異常や糖代謝異常の発症者数が不十分であったため、男性のみでの解析となっており、引き続き追跡調査にて発症情報の収集が必要である。平成26年度も追跡調査を実施し、代謝異常や糖代謝異常発症の情報収集を継続する。追跡期間の延長による代謝異常や糖代謝異常の発症者数を増やすことで、脂肪細胞特異的脂肪酸結合蛋白質(FABP4/A-FABP)と糖代謝異常および代謝異常発症との関係に関するより詳細な検討が可能になると思われる。また、平成26年度は追跡開始時の血中脂肪酸分画と糖代謝異常および代謝異常発症との関連も検討し、血中脂肪酸分画の影響を考慮した上で血清FABP4濃度と糖代謝異常および代謝異常発症との関連について解析を行う。脂肪細胞特異的脂肪酸結合蛋白質(FABP4/A-FABP)測定キットの購入を最優先としたため、次年度使用額分では必要とする統計解析ソフトを購入することができなかった。このため、次年度使用額分と翌年度分として請求した助成金とを合わせて、統計解析ソフトを購入する目的で次年度使用額が生じた。(1)代謝異常や糖代謝異常発症の情報収集のため、引き続き徳島県の職域コホートの追跡調査を実施する。その一環として、平成26年度も追跡調査にて、臨床情報の聞き取り、血液検査、身体測定などを実施し、発症に関する情報を収集する。この調査における必要物品費として研究費を使用する。(2)追跡調査で得られたデータを基にして、データベースを整備し、脂肪細胞特異的脂肪酸結合蛋白質(FABP4/A-FABP)と糖代謝異常および代謝異常発症との関係を明らかにしていく。また、得られた研究成果は国内学会、国際学会で報告するとともに、英文誌への投稿を予定している。これらの統計解析に使用する備品・消耗品類、および学会参加費用、投稿費用として研究費を使用する。
神経可塑性関連タンパク質の入力特異的なシナプスへのソーティング機構の解析

Vesl-1S/Homer-laタンパク質の細胞内局在化制御機構の解析:LTPに伴い発現誘導されるVesl-1Sタンパク質はグループI代謝調節型グルタミン酸受容体(mGluR1/5)やシナプス後タンパク質Shankと相互作用するドメインを持つ。一方誘導されたmRNAは神経細胞体でのみ検出され、樹状突起では観察されない。このことはVesl-1Sタンパク質が何らかの制御を受けてシナプス部位に局在化する可能性を示唆する。私どもは海馬初代培養細胞を抗Vesl-1S抗体で免疫細胞染色することにより、Vesl-1Sの細胞内局在を検討したところ、常態では細胞質内に比較的拡散的に存在するVesl-1Sの免疫シグナル(Vesl-1S IR)がphorbol esterの刺激によりシナプス後領域に蓄積することを見出し報告した。さらにphorbol esterによるシナプス領域でのVesl-1S IRの蓄積を阻害する薬剤を探索したところ、MEK阻害剤であるPD98059を見出した。さらに内在性のMAP kinase活性化因子であるBDNFの投与により、Vesl-1Sはシナプス領域に蓄積することを明らかにした。Phorbol esterまたはBDNFの投与により活性型のMAP kinase(リン酸化MAP kinase)の量が増加していることを見出した。このことはMAP kinaseカスケードが活性化されることによりVesl-1S IRはシナプス領域に蓄積することを示している。Vesl-1Sのシナプス領域への蓄積はタンパク質の新規合成非依存的に生じること、その際Vesl-1Sのタンパク質量は増加していないことからVesl-1SIRのシナプス部位への蓄積は翻訳後に生じていることを示唆する。Vesl-1Sの分解制御機構の解析: Vesl-1Sは他の構成的に発現している類縁タンパク質Vesl-1L, Vesl-2, Vesl-3とは異なり、ユビキチンプロテアソーム系により分解されており、分解に必要な領域はVesl-1S特異的なC末端11アミノ酸であることを明らかにした。さらにユビキチンプロテアソーム系をMG132, lactacystinで阻害することによりVes1-1S IRはシナプス部位に蓄積することを明らかにした。てんかんモデルマウスにおけるVesl-1SmRNAの誘導:てんかんのモデルマウスとして知られているElマウスにおいて、痙攣発作後1-3時間後にVesl-1S mRNAの誘導が観察された。本研究は合成されたVesl-1Sがどのような分子機構を通じて機能すべきシナプスに輸送されるのかを知ることを目的とする。海馬初代培養において、Vesl-1Sの免疫反応(Vesl-1S-IR)は比較的拡散的に存在しているのに対し、phorbol ester(PMA,PDBu)で処理することにより、神経細胞の細胞体周縁部でドット状のVesl-1S-IRが出現した。抗シナプトフィジン抗体との共染色からドット状のVesl-1S-IRシナプス領域であること、さらに電子顕微鏡による観察からシナプス後領域であることがわかった。PMA処理により、Vesl-1Sのタンパク量は1.5倍程度増加するが、タンパク質の新規合成を阻害するアニソマイシンの投与によりVesl-1Sタンパク量の増加をブロックしてもPMAによるドット状構造の出現は観察されたことから、PMAによるドット状構造の出現がタンパク量の増加と局在変化の両方に起因していることが明らかとなった。phorbol esterによるVesl-1S-IRの変化が神経活動によっても起きるかどうかを調べるために、90mMKClで刺激をしてVesl-1S-IRを評価した。Vesl-1Sの分解制御機構の解析: Vesl-1Sは他の構成的に発現している類縁タンパク質Vesl-1L, Vesl-2, Vesl-3とは異なり、ユビキチンプロテアソーム系により分解されており、分解に必要な領域はVesl-1S

特異的なC末端11アミノ酸であることを明らかにした。さらにユビキチンプロテアソーム系をMG132, lactacystinで阻害することによりVes1-1S IRはシナプス部位に蓄積することを明らかにした。てんかんモデルマウスにおけるVesl-1SmRNAの誘導:てんかんのモデルマウスとして知られているElマウスにおいて、痙攣発作後1-3時間後にVesl-1S mRNAの誘導が観察された。
AlGaInPAs混晶の構造と物性に関する研究

材料パラメータとしては帯端エネルギー,屈折率をとりあげ、計算を行った。GaAsに格子整合する組成領域で、強結合モデルと新たに導入した有効ボンド長を用いて価電子帯上端のエネルギーを求めた。これにより五元混晶を用いたヘテロ接合のバンド不連続を近似的に求められるようになった。屈折率は前の計算を修正し、新しい経験則を用いて計算を行った。これらの計算から材料パラメータのとり得る範囲と組成との関係を明らかにした。液相エピタキシャル法によるAlGaInPAsの結晶成長に関しては、従来の850°Cでの成長ではごくせまい組成範囲に限られたので、温度を900°Cにあげて成長を試みた。この結果成長可能範囲が少く広くなった。作製した五元混晶のフォトルミネッセンスを測定した。77Kのスペクトルは高温で成長した結晶が単一のピークをもち、半値幅もせまいことがわかった。エレクトロリフレクタンスを室温で測定し、そのスペクトルから禁制帯幅,スプリッティングエネルギーなどのバンドパラメータを求め、計算と比較的よく一致することを示した。ラマン散乱の測定によりフォノン系の性質を調べ、この五元混晶に含まれる二元系のフォノンモードが独立に観測できることを示した。五元混晶のEXAFSの測定を行い、格子間距離に関する情報を得た。五元混晶の電気的性質をキャパシタンス法などを用いて調べた。今後は五元混晶の物性についてさらに深く調べるとともに、応用に関する検討も行う予定である。
厳密な不斉反応場の構築を指向した立体配座固定型触媒の開発

D-カンファー誘導体の1,3-アミノアルコール(ジアミン)型触媒としての活用例は少なく、検討された不斉反応も限られている。その背景下、本研究ではカンファー特有の不斉環境を最大限活かした新規1,3-アミノアルコール(ジアミン)型キラル触媒の合成を行い、それらキラル触媒の不斉反応への適用を試みることにした。本年度に得られた研究成果を以下に示す。1)カンファー型キラル触媒の合成新たな触媒として1,3-スルホンアミドアルコール型リガンド、1,3-ジアミン型リガンドの合成を行った。スルホンアミドアルコール型リガンドは昨年度の方法に従い合成した10-ベンジルアミノイソボルネオールから脱ベンジル化後、スルホニル化することにより得た(4種類合成)。一方、ジアミン型リガンドの合成に関しては、ボルナン骨格の2位に導入されたアミノ基の立体異性体(endo化合物とexo化合物)の立体選択的合成及びそれらの分離精製が困難であった。引き続き、ジアミン型リガンドの合成検討を行っていく予定である。2)不斉求核付加反応への適用ベンズアルデヒド及びアセトフェノンの不斉アルキニル化反応を検討した。ベンズアルデヒドの不斉アルキニル化反応の場合、トシルアミドを持つリガンドを用いることで収率86%、36%eeで目的とするアルキニル化合物が得られた。本反応をcis-2,6-ジメチルピペリジン構造を持つ1,3-アミノアルコール型リガンドを用いて行った場合、最高90%、31%eeと上記リガンドと同程度の結果を与えた。一方、アセトフェノンの場合、トシルアミドを持つリガンドが最も効果的であり、45%収率(原料回収42%)、27%eeで目的とするアルキニル化合物が得られた。しかし、これら反応における不斉収率は満足のいく結果とは言えない。今後リガンドの構造最適化を行い、さらなる不斉収率の向上を目指していく予定である。1)カンファー型キラル触媒の合成まず1,3-アミノアルコール型触媒として10-ジアルキルアミノイソボルネオールの合成を行った。具体的には塩化D-カンファースルホン酸を出発原料として用い、D-ケトピン酸へと変換後、アミド化続く還元反応により様々な種類のジアルキルアミノ基を有する1,3-アミノアルコール型触媒を合成した。ジアミン型触媒の合成に関しては、現在検討中である。2)不斉求核付加反応への適用アミノアルコール型触媒存在下、ベンズアルデヒドとジエチル亜鉛との反応を行い、反応条件(反応溶媒、反応温度)を詳細に検討した。その結果、室温下ヘキサン中での反応が効果的であり、ジアルキルアミノ部分にグラナタニン構造を持つアミノアルコール型触媒を用いたところ目的とするアルコール体を単離収率99%、光学純度94%eeで得ることに成功した。本勢媒は他の脂肪族、芳香族アルデヒドとの反応においても良好な不斉収率(最高95%ee)を与えることを見出した。また、ベンズアルデヒドのアルキニル化反応についても本1,3-アミノアルコール型触媒を用いることで不斉が誘起されることを確認している。今後、不斉アルキニル化反応の詳細な検討並びに芳香族ケトンとの反応に関しても検討を行っていく予定である。
アクションと連動する衣類状態の視覚認識に関する研究

高齢化社会を迎え、介護や福祉の目的で日常的な環境で働けるロボットが期待されており、ロボットが衣類のような柔らかな日用品も適切に扱えることが望まれている。しかし、柔軟な物体は扱う過程でその形が刻々と変化するため、扱うために必要な形状情報を視覚認識することの自動化は難しい。本研究では、対象物に加えるアクションの情報を積極的に活用して、そのアクションによる形状変化を予測しながら観測画像を解析することにより、効率良くかつ信頼性高く、衣類の形状認識を行う技術を開発した。平成19年度は、1)距離画像を用いた衣類状態推定手法、2)ヒューマノイドと3眼ステレオを用いた実験システムの構築、3)入力情報の高度化、の3点に関して次のように研究を行った。1)購入したモデリングソフトウェアを用いて算出した衣類の予測3次元形状を観測距離画像形式に揃えるように変換し、2次元的な見え方の類似性判定に予測奥行と実際の観測奥行の一致度を組み込む手法の開発を行った。予備実験、ヒューマノイドを用いた実験を通じ、一定の効果は見られたものの、予測形状の精度を高める必要性が判明した。2)視覚認識結果に基づき自動算出されるヒューマノイドアクションを実現するために、視覚認識部からアクションをトリガーできるオンライン全身動作生成モジュールを構築した。また、ヒューマノイドと3眼ステレオシステムのキャリブレーションのため、把持したマーカ物体を3箇所以上の既知の点に動かし,ヒューマノイドのハンド座標系とビジョン座標系の間の剛体変換を自動的に推定するソフトウェアを開発し、3m離れた場所において35mmのキャリブレーション精度を達成した。これら基盤モジュールを利用し、ヒューマノイドアクジョンシミュレータ及びヒューマノイドロボット実機で予備実験を開始した。3)今年度購入した1394デジタルカメラを用いて、広視野ステレオの実験を行い、ベースライン20cm程度で視野角160度の範囲においてステレオ計測が行えることを確認、した。また、3眼ステレオビジョンシステムのリアルタイム性に関して,8コアのワークステーションを用いた場合に640×480の入力画像に対して30frames/secでシーンの3次元情報が復元できることを確認した.さらに、購入した触覚センサー式を用いて、ヒューマノイドのハンドに装着する触覚センシングシステムを構築し、衣類との接触時のデータ収集、解析を開始した。平成20年度は、前半に1)3眼ステレオビジョンシステムから得られる3次元データを入力とする衣類状態認識手法を開発し、後半は、この手法を用いて、2)ヒューマノイドによる衣類ハンドリング実験を行い、認識とアクションとの連動に関する検討を行った。1)では、少ない数の代表的な形状候補を予測し、この各候補形状を初期形状とする衣類の柔軟変形モデルを観測3次元データに引き寄せるように変形することにより、観測衣類の状態を詳細な3次元情報まで認識する手法を開発した。2)では、今年度購入したヒューマノイド操作用コンピュータを用いて、分散オブジェクトシステムによるオンラインアクション生成システムを構築し、1)の認識手法の結果に基づいて、シミュレーションおよびヒューマノイド実機の両方で実験を行った。その結果、「状態推定結果からアクションを実現するためのハンドの理想的な位置・姿勢の自動生成が可能なこと」、「算出された理想的な位置・姿勢が、物理的拘束により実現できない局面が多く存在するが、理想値を修正した近似値でもアクション実現可能であること」などが明らかになった。この他、より高度な視覚情報入力が行えることを目指し、以下の研究も並行して行った。3眼ステレオビジョンの高速化を行い、640x480の入力画像に対する3次元復元が6コアCPUマシン上30frames/secで実現できるようになった。さらに、剛性と平面性の高いガラス製のキャリブレーションボードを新たに開発し、再投影誤差を0.30.4pixe1から0.10,2pixel程度まで低減した.また、将来的にヒューマノイド自身のカメラを利用することを目指し、USB魚眼デジタルカメラを用いた広視野ステレオ計測システムを構築し、計測精度の評価を開始した。平成21年度は、以下の2点を中心に研究を行った。1.「衣類モデルを核とする特定部位把持手法」昨年度までに開発した、変形可能な衣類モデルを用いるモデル駆動型衣類状態推定法に基づき、片手で空中に把持した衣類の特定部位をもう片方の手で掴み上げるために必要な情報を自動算出する手法を開発した。ヒューマノイドを用い、様々な状態で把持したトレーナに対してこの手法を適用し、把持動作のためのハンドの理想的な位置と姿勢が多様な状況となることを明らかにした。この実験を通じ、衣類の状態から算出されたハンドの理想動作計画を、ロボット側の制約を考慮して実現可能な動作計画に最適化する課題の重要性をその仕様とともに明確化した。また、いくつかの状態で把持動作を実現し、算出された理想動作計画の実有用性を確認した。2.「アクションを活用した状態推定性能の向上」対象衣類の状態によっては、目標タスクの遂行に必要な観測情報が十分に得られない場合がある。このような場合に、情報を得るためのアクションを行い、能動的に必要情報を取得する研究を行った。

昨年度までの実験結果の分析により、対象衣類の深い折れが推定を難しくする主要因であることが判明しており、このような場合を自動判断し、衣類を押し広げるためのアクションを自動生成する手法を開発した。把持しているハンドとの干渉問題など、いくつかの課題を明らかにするとともに、そうした問題が解決すれば、この戦略が有効に働くことを複数の実験で確認した。また、上記実験を行う過程で、昨年度までに構築した広視野カメラシステムを用いた手元の状況観察データ、リアルタイム3眼ステレオシステムでの時系列3D情報のデータ収集を行い、動的で広範囲な視覚情報獲得技術および獲得したデータの活用技術の開発を開始する準備を整えた。本プロジェクトの最終年度として、このプロジェクトで得られた技術を示すデモビデオを作成し、WEB公開した。
新規受容体標識法によるケモカイン受容体の機能解析と創薬展開

GPCRは現在の医薬品ターゲットの50%を占めており、その多様な生理現象の解明やリガンド探索が新規医薬品創製における課題となっている。研究代表者は、これまでの研究において、ケモカイン受容体CXCR4を選択的に検出するプローブとして、CXCR4アンタゴニストT140の蛍光誘導体、およびCXCR4アゴニストSDF-1の蛍光誘導体を創製している。本年度の研究では、得られた蛍光プローブを応用することにより、T140誘導体が受容体局在変化に与える影響と薬理作用を発現するための機序を精査した。まず、リガンド刺激による受容体内在化プロセスの可視化および定量化を目的として、コイルドコイル相互作用を用いた標識法により細胞膜表面のCXCR4を特異的に標識可能な細胞株を構築した。つづいて、本法とSDF-1蛍光誘導体を組み合わせることで、SDF-1刺激後のCXCR4の局在変化を追跡したところ、細胞内部でのCXCR4とSDF-1の共局在の様子が観察された。この実験系にT140誘導体を作用させると、その度合いは低いもののCXCR4/T140誘導体複合体の細胞内部への移行の様子が観察された。さらに、受容体とリガンドの複合体の細胞内での局在を検証したところ、アゴニストおよびアンタゴニストの双方のリガンド刺激時において、エンドソームへと局在していることが示唆された。これらの結果は、CXCR4受容体がアゴニスト刺激だけでなくアンタゴニストの刺激によっても内在化を誘起することを示唆している。また、CXCR4アンタゴニストによる受容体内在化効果が、アンタゴニスト活性、及び、その薬理作用の発現に寄与していることを示す研究成果であり、CXCR4を標的とする創薬研究の発展に寄与する重要な知見を提供すると判断される。これまでの研究において、研究代表者は、GPCRに属するケモカイン受容体CXCR4選択的蛍光プローブを創出した。本プローブおよびCXCR4内因性アゴニストSDF-1の蛍光誘導体の利用により、CXCR4発現細胞株の受容体局在の様子を比較することで、アンタゴニスト・アゴニスト刺激時の受容体動態の変化の観測が可能である。本年度の研究において、フルオレセインやテトラメチルローダミンといった様々な蛍光波長を有する蛍光物質で標識したリガンドを調製し、VenusやDsRedといった蛍光タンパク質をそれぞれ融合した受容体、および、疎水的・静電的相互作用により細胞膜を選択的に標識可能なタグを融合した受容体の安定発現細胞株を構築した。現在、SDF-1を認識すると報告されているケモカイン受容体CXCR7についても同様の細胞実験系を構築しており、リガンド刺激時における各受容体の動態変化の比較・評価を行う予定である。また、腫瘍イメージングのための放射標識プローブの開発を行った。まず、煩雑な合成プロセスが必要であったペプチドへのDTPA標識を固相樹脂上で行うことにより、選択的かつ簡便にDTPA標識ペプチドを得る方法を確立した。さらに、1分子のDOTAに2分子のCXCR4拮抗剤を結合した新規プローブを創製した。今後、各プローブを大量合成し、本プローブの有用性を検証する。これまでの研究において、研究代表者は、GPCRに属するケモカイン受容体CXCR4を選択的に染色するアンタゴニスト性蛍光プローブを創出した。本蛍光プローブおよびCXCR4内因性アゴニストSDF-1の蛍光誘導体をCXCR4安定発現細胞に添加し蛍光の局在を比較することで、アンタゴニスト・アゴニスト刺激時の受容体動態の変化の観測が可能である。本年度の研究においては、それぞれの蛍光プローブを細胞に添加し共焦点顕微鏡で観察を行ったところ、アンタゴニスト性蛍光プローブにおいても蛍光の細胞内部への集積が観察された。現在、アゴニスト性蛍光プローブをCXCR4に作用させた際との違いを、特異的な標識が可能なタグや蛍光タンパクを融合した受容体、および各オルガネラの染色試薬を組み合わせることにより検証を行っている。これまでに確立した新規DTPA標識法を利用することで、CXCR4を指向したDTPA標識プローブを作成した。これらのCXCR4への親和性を評価したところ、既知のDTPA標識プローブより強い結合活性を示した。

つづいて、本法とSDF-1蛍光誘導体を組み合わせることで、SDF-1刺激後のCXCR4の局在変化を追跡したところ、細胞内部でのCXCR4とSDF-1の共局在の様子が観察された。この実験系にT140誘導体を作用させると、その度合いは低いもののCXCR4/T140誘導体複合体の細胞内部への移行の様子が観察された。さらに、受容体とリガンドの複合体の細胞内での局在を検証したところ、アゴニストおよびアンタゴニストの双方のリガンド刺激時において、エンドソームへと局在していることが示唆された。これらの結果は、CXCR4受容体がアゴニスト刺激だけでなくアンタゴニストの刺激によっても内在化を誘起することを示唆している。また、CXCR4アンタゴニストによる受容体内在化効果が、アンタゴニスト活性、及び、その薬理作用の発現に寄与していることを示す研究成果であり、CXCR4を標的とする創薬研究の発展に寄与する重要な知見を提供すると判断される。