hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
顕著な不整形地盤上に立地する都市における南海地震の地震動予測－高知市に着目して－

論文はその後,歴史地震第30号(2015)に掲載された.以上のプロセスを経る中で震源モデル構築の問題点として,東南海地震の際に袋井市に被害が集中した要因は表層地盤の影響であり,震度インバージョン,体験談からの推定,いずれにおいても表層地盤の影響を考慮しないと震源モデルに影響を与えてしまうものと考えられ,今後,工夫が必要である.なお,南海地震の震源域に従前の震源モデルを用いた場合の高知市の基盤レベルの地震動については算出し,ほぼ妥当な結果を得ている.一方,表層地盤モデルの構築については,これまで観測点が見いだせず空白地帯となっていた国分川東側の地点や気象庁の強震観測点においても微動観測を追加実施した.表層地盤の応答解析は固有値解析に留まっており,今後,多点位相差入力による時刻歴解析へと発展させる必要がある.簡易な地盤調査との精度のバランスを考えた地盤モデル化手法を,高知市に適用した.高知市中心部の約70地点で常時微動観測を行い,地盤の卓越振動数を推定した.それをもとに簡易な地盤モデルを構築し,擬似3次元的に固有値解析を行った結果,軟弱地盤が厚く堆積する場所で顕著な地盤振動が生じることが確認された.南海トラフを震源とする昭和東南海地震,昭和南海地震について,各地から揺れに関する体験談をそれぞれ約310,350収集し,既存の震源モデルを検証した.その結果,既存の震源モデルは概ね,体験談を説明するものであったが,三重県沖の短周期発生域の位置やサイズなど,やや体験談との整合がとれない部分もあった.高知市の地震動予測,被害予測の精度を高めることが本研究の目的であるが,そのために,南海トラフを震源とする地震として,昭和南海地震,昭和東南海地震を考え,それらについて揺れに関する体験談を広く収集した.その結果,昭和南海地震については約350,昭和東南海地震については約310もの揺れに関する体験談を収集することができた.南海地震に関する体験談は,津波に関するものが圧倒的に多いため,揺れに関する体験談に特化してこれだけ収集した研究は他にないと思われる.大量の情報を収集,分析した結果,震源特性の様子がかなりわかってきて,既存のモデルの改善点が見えてきた.本来はこの揺れに関する体験談をもとに,従来の震度インバージョン解析を見直し,新たな震源モデルを構築することを目指していたがそこまで至っておらず,課題として残っているので,現在までの達成度を「やや遅れている」と評価した.地震工学課題の解決に努めるとともに,平成27年度の研究計画を遂行する.基盤レベルの地震動を評価することが1つの目的となっているが,現在,内閣府で想定されている震源モデルを仮定した場合についてはすでに解析を終えている.そのため,震度インバージョンに基づく震源モデルの構築,見直しを平成27年度の早い段階で実施し,震源モデルの入替えを行うことで,高知市の基盤レベルの地震動評価を可能にする.常時微動を含むこれまでの調査で,地表から沖積層基底面までの地盤特性の把握,モデル化については可能になってきたが,沖積層基底面より深い地盤のモデル化が不十分であることが新たな課題として見出された.この解決策としては,地表面レベルで観測された地震動を使った逆解析による推定法の実施を模索している.そのため,防災科学技術研究所のK-NETや気象庁の地震計,その他,高知港などで観測された強震記録の収集を進めている.必要に応じて,所有している簡易な地震計を現地に設置し,自分自身で強震観測を行うことも視野に入れている.
性的二色性メダカを用いる内分泌撹乱物質の環境リスク評価法の開発

本研究では、内分泌撹乱化学物質のin vivoでの毒性評価法として(1)遺伝的に雌雄で体色が異なる性的二色性メダカを用いて、形態及び体色変化をマーカーとした性転換に基づく内分泌撹乱化学物質のスクリーニング法と(2)雌特有の体内リン酸化蛋白質(ビテロゲニン)中の構成ホスホアミノ酸をバイオマーカーとする内分泌撹乱作用(エストロゲン様活性)の定量評価法を開発し、環境中の有害化学物質の毒性評価に応用することを目的とした。(1)では、緋色メダカが雄、白メダカが雌となる性的二色性メダカを用いて、孵化後の性分化が生じる時期にメダカを化学物質に曝露させ、形態学的雌雄(鰭の形状から判別)と遺伝的雌雄(色素斑点の有無から判別)を調べ、性転換魚の出現率を検討したが、稚魚が曝露中に死亡するケースが多く、明確な結論は得られなかった。(2)では、化学物質を含む水溶液中でメダカを一定期間飼育した後、5%トリクロロ酢酸を加えて蛋白質を沈殿回収した、得られた蛋白質を6N塩酸気相中で110°C、2時間加水分解した後、遊離したホスホアミノ酸は、水溶液中から簡単にN-イソプトキシカルボニルメチルエステル誘導体へ変換でき、FPD-GCにより選択的かつ高感度に分析できた。検出限界はGC注入量としてホスホセリン(P-Ser)50pg,ホスホスレオニン(P-Thr)40pgであった。雄の成熟メダカをβ-エストラジオール(E2)に曝露したところ、E2の入っていないコントロールに比べP-SerとP-Thrレベルが顕著に増加した、また、E2濃度(0.510ppb)及び曝露日数(010日)に依存してP-SerとP-Thrレベルは上昇したが、男性ホルモンのテストステロンによる曝露ではほとんどホスホアミノ酸レベルの上昇は認められなかった。さらに、合成エストロゲンであるEE2やDESでも著しいP-SerとP-Thrレベルの上昇が認められ、エストロゲン拮抗剤であるタモキシフェンの同時曝露によりこれらの上昇が抑制されたことから、蛋白質リン酸化レベルがエストロゲン様活性の指標になることが明らかとなった。この手法を用いて様々な環境化学物質の曝露によるエストロゲン様活性を調べたところ、フタル酸ジ-2-エチルヘキシル、ビスフェノールA、ノニルフェノール、PCBでは、5日間の曝露でほとんどエストロゲン様活性は観察されなかったが、60日間の長期曝露によりエストロゲン様活性を検出できることがわかった、これらの結果は、メダカを環境水中に曝露、あるいは環境中に生息する卵生生物のホスホアミノ酸レベルを調べることにより、環境汚染や生態系への影響を把握できることを示しており、内分泌撹乱化学物質の新しい毒性評価法として有効な手法になるものと期待される。

この手法を用いて様々な環境化学物質の曝露によるエストロゲン様活性を調べたところ、フタル酸ジ-2-エチルヘキシル、ビスフェノールA、ノニルフェノール、PCBでは、5日間の曝露でほとんどエストロゲン様活性は観察されなかったが、60日間の長期曝露によりエストロゲン様活性を検出できることがわかった、これらの結果は、メダカを環境水中に曝露、あるいは環境中に生息する卵生生物のホスホアミノ酸レベルを調べることにより、環境汚染や生態系への影響を把握できることを示しており、内分泌撹乱化学物質の新しい毒性評価法として有効な手法になるものと期待される。
フェライト・マルテンサイト鋼の照射誘起偏析と耐蝕性に関する研究

一連のFe-Cr合金試料を用い、16MeVプロトンによる照射効果のCr濃度依存性を調べた。照射による硬度上昇量はCr濃度によらずほぼ一定であり、11MeVプロトン照射の場合に比べ、最高値はほぼ2倍、深さ分布の広がりは約2倍になっている。これはプロトンの停止位置の広がりが強いエネルギー依存性を持つことを意味する。硬度上昇は生成照射欠陥量に比例し、Crの偏析には強く依存しない。メスバウアースペクトルより求めた内部磁場はCr濃度依存性を示し、10%以下のCr濃度の合金では照射効果を示さない。照射試料の時効熱処理の結果と合わせ考えると、過飽和固溶体では、低温においても照射により2相分離が促進されることを示唆するが、打ち込まれたプロトン原子の重畳効果に関しては未だ確証が得られない。HT-9鋼及び電解鉄の水素脆化の挙動を小型パンチ試験による破壊発生エネルギーの測定により明らかにした。HT-9鋼の場合には100300Kの範囲においてSPエネルギーの著しい低下が見られたが延性-脆性遷移温度には殆ど変化が見られなかった。特殊仕様のオートクレイブを開発し、小型パンチ試料による高温・高圧水中での耐蝕性評価法を確立した。この装置を用い、種々のオーステナイトおよびフェライト鋼、Cr濃度を系統的に変化させたFe-Cr合金の耐蝕性を電気化学的に測定し、250°Cにおいても12%Cr以下の鋼では耐蝕性が低下すること、耐蝕性は時効処理に敏感で、炭化物の析出等により著しく低下する場合があること等を明らかした。得られた結果は応力腐食感受性試験に必要な設定電位を与える基礎データとして重要である。250°Cの高温・高圧水中ではジルコニヤが電気絶縁用材料として仕様出来ないことが明らかになり、種々の材料を試験し部品材料選定に関する知見を得た。
Gタンパク質による神経細胞イオンチャンネルの調節

αβγの3種類のサブユニットよりなるヘテロ3量体GTP結合タンパク質(Gタンパク質)は、細胞外のシグナルを認識する受容体から細胞内2次伝達物質を生成する酵素、イオンチャンネルなどのエフェクター分子に情報を伝えるトランスデューサーとして働いている。一方、K^+チャネルは細胞内のK^+イオン濃度を調節することにより、膜電位の維持において重要な働きをしている。内向き整流K^+チャンネルは、過分極下において顕著な内向き整流を示す特徴を持つことにその名を由来するが、生理的条件下においては膜電位が静止膜電位(E_K)よりも僅かに脱分極した際に細胞内のK^+イオンを細胞外に放出して興奮を抑制していると考えられている。現在までに内向き整流K^+チャネルには数種類のサブファミリーの存在が報告されており、そのファミリーの一つであるGタンパク質共役内向き整流K^+チャネル(GIRK:G protein-coupled inward rectify K^+ channel)に関しては、心拍の低下や神経細胞の興奮の抑制を引き起こすことが電気生理学的にも明らかにされている。本研究では、GIRKのGタンパク質による活性制御機構を明らかにするために、GIRKのヘテロ複合体形成、およびGIRKとGタンパク質の各サブユニットとの相互作用を免疫沈降法を用いて解析した。ラット脳よりGIRK1、GIRK2、GIRK4のcDNAをPCR等によりクローニングした後、GIRK1のN末端にHAエピトープ、GIRK2のN末端にMycエピトープ、Gタンパク質γ_2サブユニットのN末端にFLAGエピトープを付加したDNAを作成し、哺乳動物細胞発現ベクターにサブクローニングした。これらをヒト胎児腎由来293細胞に共発現させ、抗HA抗体、抗Myc抗体、抗GIRK4抗体、抗FLAG抗体を用いて免疫沈降を行ない、それぞれのタンパク質間の相互作用を解析した。GIRK1、GIRK2、GIRK4のいずれか2種を共発現させ、一方に対する抗体で免疫沈降したところ、一緒に共発現させたGIRKの共沈が観察された。また、GIRK1、GIRK2、GIRK4のいずれかとβ_1γ_2を共発現させて抗FLAG抗体でγ_2を免疫沈降したところ、いずれの場合もβ_1とともにGIRK1、GIRK2、GIRK4の共沈がみられた。これらの結果から、GIRK1、GIRK2、GIRK4は細胞内でヘテロ複合体を形成できること、β_1γ_2はGIRK1、GIRK2、GIRK4のそれぞれと相互作用することが判明した。次に68番目のアミノ酸のシステインがセリンに置換されていて脂質修飾されないため、膜移行できない変異体γ_2とβ_1、GIRK1又はGIRK2を共発現させて、γ_2の免疫沈降を行ったところ、β_1は共沈してきたが、GIRK1、GIRK2の共沈はみられなかった。また、βサブユニットのC-末端の1アミノ酸(β_1ΔC1)、2アミノ酸(β_1ΔC2)、6アミノ酸(β_1ΔC6)を欠失した変異体、C末端にヒスチジンを6個(β_1His_6)付加した変異体のうちβ_1ΔC2、β_1ΔC6はγ_2と結合できないが、他の変異体は野性型β_1と同様にγ_2と結合することを既に我々は明らかにしている。これらの変異体β_1をγ_2、GIRK1又はGIRK2と共発現させて、抗FLAG抗体でγ_2の免疫沈降を行ったところ、β_1ΔC2、β_1ΔC6を発現させた場合には、GIRK1およびGIRK2の共沈はみられなかったが、他の変異体β_1の場合では、GIRK1およびGIRK2の共沈が観察された。次に、GIRK2とβ_1を共発現させ、逆にGIRK2を免疫沈降したところ、野性型および変異体いずれも共沈がみられ、β_1単独でもGIRK2との相互作用が可能であることが明らかとなった。以上の結果から、GIRKとβγとの相互作用にはβサブユニットが必要であり、かつβγサブユニットが細胞膜に存在することが必要であることが示唆された。β_1γ_2はMAPキナーゼファミリーのJNKとERKを活性化させるが、上記のC末端の変異により、それぞれ異なる阻害を受けるという実験結果が得られている。これらのことから、β_1γ_2がGIRKと複合体を形成する際には、MAPキナーゼを活性化させるシグナル伝達に関与する部位とは異なる部位を使用している可能性が示唆された。現在までに内向き整流K^+

チャネルには数種類のサブファミリーの存在が報告されており、そのファミリーの一つであるGタンパク質共役内向き整流K^+チャネル(GIRK:G protein-coupled inward rectify K^+ channel)に関しては、心拍の低下や神経細胞の興奮の抑制を引き起こすことが電気生理学的にも明らかにされている。本研究では、GIRKのGタンパク質による活性制御機構を明らかにするために、GIRKのヘテロ複合体形成、およびGIRKとGタンパク質の各サブユニットとの相互作用を免疫沈降法を用いて解析した。ラット脳よりGIRK1、GIRK2、GIRK4のcDNAをPCR等によりクローニングした後、GIRK1のN末端にHAエピトープ、GIRK2のN末端にMycエピトープ、Gタンパク質γ_2サブユニットのN末端にFLAGエピトープを付加したDNAを作成し、哺乳動物細胞発現ベクターにサブクローニングした。これらをヒト胎児腎由来293細胞に共発現させ、抗HA抗体、抗Myc抗体、抗GIRK4抗体、抗FLAG抗体を用いて免疫沈降を行ない、それぞれのタンパク質間の相互作用を解析した。GIRK1、GIRK2、GIRK4のいずれか2種を共発現させ、一方に対する抗体で免疫沈降したところ、一緒に共発現させたGIRKの共沈が観察された。また、GIRK1、GIRK2、GIRK4のいずれかとβ_1γ_2を共発現させて抗FLAG抗体でγ_2を免疫沈降したところ、いずれの場合もβ_1とともにGIRK1、GIRK2、GIRK4の共沈がみられた。これらの結果から、GIRK1、GIRK2、GIRK4は細胞内でヘテロ複合体を形成できること、β_1γ_2はGIRK1、GIRK2、GIRK4のそれぞれと相互作用することが判明した。次に68番目のアミノ酸のシステインがセリンに置換されていて脂質修飾されないため、膜移行できない変異体γ_2とβ_1、GIRK1又はGIRK2を共発現させて、γ_2の免疫沈降を行ったところ、β_1は共沈してきたが、GIRK1、GIRK2の共沈はみられなかった。また、βサブユニットのC-末端の1アミノ酸(β_1ΔC1)、2アミノ酸(β_1ΔC2)、6アミノ酸(β_1ΔC6)を欠失した変異体、C末端にヒスチジンを6個(β_1His_6)付加した変異体のうちβ_1ΔC2、β_1ΔC6はγ_2と結合できないが、他の変異体は野性型β_1と同様にγ_2と結合することを既に我々は明らかにしている。これらの変異体β_1をγ_2、GIRK1又はGIRK2と共発現させて、抗FLAG抗体でγ_2の免疫沈降を行ったところ、β_1ΔC2、β_1ΔC6を発現させた場合には、GIRK1およびGIRK2の共沈はみられなかったが、他の変異体β_1の場合では、GIRK1およびGIRK2の共沈が観察された。次に、GIRK2とβ_1を共発現させ、逆にGIRK2を免疫沈降したところ、野性型および変異体いずれも共沈がみられ、β_1単独でもGIRK2との相互作用が可能であることが明らかとなった。以上の結果から、GIRKとβγとの相互作用にはβサブユニットが必要であり、かつβγサブユニットが細胞膜に存在することが必要であることが示唆された。
川崎病類似NLRリガンド誘発冠動脈炎モデルの病態の検討

川崎病類似NLRリガンド誘発冠動脈炎モデルの病変部における遺伝子発現を調べたところ、様々なサイトカイン・ケモカイン遺伝子が高発現していたことから、冠動脈炎はその血管がもつ内因的因子が重要であることがわかった。さらにこの冠動脈炎は様々な細菌構成物質の先行刺激により、頻度・重症度ともに増悪した。以上から、川崎病の部位特異性・多様性について本モデルで説明することができた。本モデルマウスの血清サイトカインを測定したところ有意な上昇を認めず、炎症の主座は末梢血ではなく組織そのものにあると考え、NLRの発現について検討を行った。正常マウス血管組織を回収し定量PCRを行いNLR mRNAの発現を検討したところ、血管組織で発現の差を認めなかった。さらに、正常マウス各組織のNLRの免疫染色を行ったところ、炎症が強く起こる冠動脈・大動脈弁と炎症が起こらない肺動脈ではNLRの発現に有意差はなかった。さらに、血管炎の病態を調べるために、NLR ligandを投与したマウスの組織の遺伝子発現をマイクロアレイ解析で検討した。すると、組織間で遺伝子発現に差を認め、大動脈起始部ではサイトカイン・ケモカイン、Mmp遺伝子の発現が高いことが分かった。以上から、本モデルマウスにおける、部位特異的血管炎症は組織それぞれの内因的因子によるものと考えられた。(Arterioscler Thromb Vasc Biol.2011.in press)また、SCIDマウスに対して、NLR ligand投与を行ったところ冠動脈炎を発症するものの、その炎症の強度は減弱しており、獲得免疫は病態の一部に関わっているのみと考えられた。(Arterioscler Thromb Vasc Biol.2011.in press)2.川崎病類似NLR ligand誘発冠動脈炎モデルの多様性に関する検討プライミング物質をLPS以外で行ったところ、OK432、Poly(I:C)などでLPS同様に血管炎発症の頻度、重症度を増悪させていた。NLR ligandだけでも様々な細菌から放出されるものであるが、それに加えて、それを増悪させる物質も様々であることから、未だ原因不明な川崎病同様に、本モデルでも原因として多様性があることがわかった。NLR ligandにより冠動脈炎が誘発されること、そしてその部位特異的血管炎症は組織それぞれの内因的因子によるものと考えられることを、Arterioscler Thromb Vasc Biol誌(2011)に公開することができた。さらに、その病態について評価するため、NOD1-/-骨髄をwild typeマウスに、さらにwild type骨髄をNod1-/-マウスに骨髄移植し、そのマウスで血管炎が発症するかについて検討を行ったところ、末梢血がild typeであっても組織でNLRが欠損していれば血管炎を発症し、末梢血のNLRが欠損していても、組織がwild typeであれば血管炎が発症することがわかった。以上から、このモデルでは末梢血はその血管炎の増強に影響するだけで、血管炎の本質はその組織にあることを解明することができた。また、血管炎発症に影響があると考えていたIL-6やCCL2をノックアウトしても、血管炎は発症することから、単一のサイトカインではなく、様々なサイトカイン・ケモカインの影響で血管炎が発症していることが分かった。動脈硬化病変を来すApoE KOを用い、5週齢のApoE KOマウスに対してNLR ligandを投与すると、動脈硬化の促進、特に早期の動脈硬化巣の促進を認めた。これについては、自然免疫リガンドであるNLR ligandでは今まで報告のない結果であり、常在細菌叢と動脈硬化の進展は以前より指摘されているものの裏付けるデータはなかったが、この結果がそれを裏付ける結果と考えられた。IL-6やCCL2が本モデルにおいて重要なサイトカイン・ケモカインと考えていたが、CCR2ノックアウトマウスに対してNLR ligandを投与しても冠動脈炎は発症した。さらに、抗IL-6抗体や抗CCR2抗体による追加実験を行ったところ、抗CCL2抗体では冠動脈炎発症は抑制できなかった。抗IL-6抗体については1/3で冠動脈の抑制効果と認めた。以上からも、本モデルにおいて、単一のサイトカイン・ケモカインが発症に関わっているのではなく、様々なサイトカイン・ケモカインが関わりながら発症していると考えられた。NLR ligandを動脈硬化モデルであるApoEノックアウトマウスに投与すると、動脈硬化が促進し、特に投与早期に関わっていることが分かっていたが、長期においては他の因子が加わってくるため、動脈硬化に大きな差は認めなかった。動脈硬化巣の組織のマイクロアレイにより、CCL5がこのNLR ligandによる動脈硬化促進に大きく関わっていることもわかった。NLR ligand誘発冠動脈炎についてArterioscler Thromb Vasc Biol誌に公表し、さらにその病態について様々なノックアウトマウスを使い解明できている。また、NLR ligandと動脈硬化についても新しい知見が得られている。24年度が最終年度であるため、記入しない。さらに様々なノックアウトマウスを組合せながら使い、病態を解明していく。また、NLR ligandと動脈硬化の新たな知見については、病理組織、免疫組織化学染色、定量PCR、マイクロアレイによる解析を加えながら、研究を進めていく。
虚血性骨壊死におけるToll-like receptor 4の役割の検討

本研究では、生体内におけるTLR4の骨壊死への機能解析のために、TLR4遺伝子ノックアウトマウスに、虚血性骨壊死を誘導し、野生型マウスと比較することで、TLR4欠損が骨壊死にどのように影響するのかを詳細に検討する。また、骨壊死を誘導したマウスモデルに、TLR4阻害剤(TAK242)を投与し、生理食塩水を投与した群と比較することで、TAK242が骨壊死を制御するのかについても詳細に検討する。
アルツハイマー病の抗神経細胞死ペプチド性因子ヒューマニン療法の構築

1、HNの細胞内シグナル伝達機構に関する研究我々が発見したアルツハイマー病関連神経細胞侵害刺激を抑制するペプチド性因子ヒューマニン(HN)の作用機構を明らかにする目的で、主としてHNの構造活性相関に関する研究を行った。その結果、HNのそれぞれのアミノ酸をアラニンに置換したHN変異体を作成し、二量体化には影響しないが神経保護作用を有しないHNアンタゴニスト(P3A, L12A, S14A, P19A HN変異体)を作成した。また、その細胞死抑制シグナルについては詳細が明らかになっていないが、我々はこれまでに何らかのチロシンキナーゼが関与している事を見いだしている。そこで種々のシグナル阻害剤および変異遺伝子導入を用いた実験の結果、HNの作用機構にはSTAT3が関与している事を明らかにした。この事から、HNはSTAT3を下流分子とする受容体複合体を介してアルツハイマー病関連神経細胞死を抑制しているものと考えられた。2、アミロイド前駆体タンパク質(APP)の神経細胞死誘導性リガンドの同定に関する研究我々はこれまでにAPPの細胞外領域を認識するモノクローナル抗体(22C11)が培養神経細胞に強力な細胞死を誘導する事を見出している。また我々は、この細胞死はAPPの細胞内領域に結合した百日咳毒素(PTX)感受性Goタンパク質とその下流分子から出力されている事を報告している。各種結合実験や細胞死誘導実験から、Transforming Growth Factor β2(TGFβ2)がAPPの細胞外領域に結合し神経細胞死を誘導する天然リガンドである可能性を示唆した。また、アルツハイマー病モデルであるTg2576の大脳においてTGFβ2の発現の増強が観察された。これらの結果は、アルツハイマー病の発症にTGFβ2が関与している可能性を示すものである。3、アミロイドβペプチドが誘導する新規神経細胞死機序の解明アルツハイマー病患者脳に沈着するアミロイドβペプチド(Aβ)がp75ニューロトロフィン受容体(p75NTR)に作用し神経細胞死を誘導することを昨年我々は報告した。今年度はp75NTRに相同性を有し、かつそれに結合し得るPLAIDDを用い、Aβが誘導する神経細胞死機序を更に検討した。その結果、PLAIDDは独自の神経細胞死シグナルを百日咳毒素感受性Gi蛋白質を介して出力することが明らかとなった。このAβ/p75NTR/PLAIDDが誘導する神経細胞死を、HNは抑制することを明らかにした。ヒューマニンアンタゴニストの作成我々が発見したアルツハイマー病関連神経細胞侵害刺激を抑制するペプチド性因子ヒューマニン(HN)の作用機構を明らかにする目的で、主としてHNの構造活性相関に関する研究を行った。

家族性アルツハイマー病原因遺伝子誘導性神経細胞死に対するヒューマニンの効果の検討家族性アルツハイマー病原因遺伝子であるプレセニリン-2のM239V変異体が神経細胞死を誘導することを明らかにし、HNがこの遺伝子が誘導する神経細胞死を抑制することを明らかにした。アミロイドβペプチドが誘導する新規神経細胞死機序の解明アルツハイマー病患者脳に沈着するアミロイドβペプチド(Aβ)がp75ニューロトロフィン受容体(p75NTR)に作用し神経細胞死を誘導することを昨年我々は報告した。今年度はp75NTRに相同性を有し、かつそれに結合し得るPLAIDDを用い、Aβが誘導する神経細胞死機序を更に検討した。その結果、PLAIDDは独自の神経細胞死シグナルを百日咳毒素感受性Gi蛋白質を介して出力することが明らかとなった。このAβ/p75NTR/PLAIDDが誘導する神経細胞死を、HNは抑制することを明らかにした。1ヒューマニン(HN)の作用機構の解明とHN誘導体の作成我々が発見したアルツハイマー病(AD)関連神経細胞死を抑制するHNの細胞内シグナルに関わる分子を検討した。その結果、HNの抗AD神経細胞死抑制活性は、チロシンキナーゼ阻害剤処理および優性抑制性STAT3変異遺伝子の導入により消失すること見い出した。このことから、HN受容体を構成する分子群は、STAT3を活性化出来、膜受容体型チロシンキナーゼ活性を有しているものと考えられた。現在HN受容体を構成する分子の同定を進めている。また、種々の神経毒性に対し拮抗する活性依存性神経栄養因子(ADNF)は9アミノ酸からなる単鎖ペプチドである。このADNFペプチドのC末端にHN誘導体の1つであるAGA-C8R-HNG17を付加したペプチド「コリベリン(Col : Colivelin)」を作成し、in vitroおよびin vivoの両面からその効果を検討した。その結果、ColはAD治療薬候補なる十分な可能性があることを見い出した。2アミロイド前駆体タンパク質(APP)のリガンドの同定APPの細胞外領域に対する抗体で神経細胞を刺激することや家族性ADに連鎖するAPP変異遺伝子産物が細胞死を誘導することを我々を含む複数のグループが報告している。これらのことから、APPには細胞死を誘導する受容体としての機能があることが予想されていた。APPの細胞外領域に結合する分子を探索した結果、TGFβ2が、APPの細胞外領域に結合し、かつAPP依存性に神経細胞死を誘導出来るリガンドであることを発見した。また、現在最も広く使用されているADモデルであるTg2576マウス(18ケ月齢)の大脳皮質においてTGFβ2が増加していることを明らかにした。これらのことは、局所的なTGFβ2の増加が、現在のところ未知である孤発性ADの発症原因の1つとして考えられることを示唆している。
ジグザグ形状微小磁性体における磁気・伝導現象

電子線リソグラフィおよびリフトオフの手法を用いて,高品質なCoおよびNiジグザグ細線を作製した.作製したジグザグ細線のジグザグ波数ベクトルkに対して磁場を平行および垂直に印加することにより,ジグザグ形状の角付近に異なる磁区構造を形成されることに成功した.次に形成した異なる磁区構造に対する電気抵抗測定から,異なる磁区構造が電気伝導に与える影響を検討した.Co細線においては,ジグザグ形状の角付近に現れる磁化配列が電気抵抗を減少させるのに対して,Ni細線においては,磁化配列が電気抵抗を増加させることが明らかとなった.これらの相違は,物質の形状異方性の違いを反映したジグザグ形状の角付近における微視的なスピン配列の違いに起因するものと推察される.このような微視的なスピン構造の違いを明確にするために,マイクロマグネティクスシミュレーションにより,ジグザグ形状の角付近におけるスピン構造を予測した.その結果,Coに対しては磁束が細線の角からわき出す対称的な磁化配列が得られるのに対して,Niに対しては磁束のわき出しに加え,細線の角付近での磁化配列に変調が加えられた構造が得られた.また,磁気力顕微鏡によりジグザグ形状の角付近における磁区構造観察を行った.観察結果はマイクロマグネティクスシミュレーションによる計算結果と非常に良く対応しており,CoおよびNi細線の磁気抵抗の相違が,この磁化配列の微視的な変調に起因しているという考察を支持するものである.電子線リソグラフィおよびリフトオフの手法を用いて,高品質なCoおよびNiジグザグ細線を作製した.作製したジグザグ細線のジグザグ波数ベクトルkに対して磁場を平行および垂直に印加することにより,ジグザグ形状の角付近に異なる磁区構造を形成されることに成功した.次に形成した異なる磁区構造に対する電気抵抗測定から,異なる磁区構造が電気伝導に与える影響を検討した.Co細線においては,ジグザグ形状の角付近に現れる磁化配列が電気抵抗を減少させるのに対して,Ni細線においては,磁化配列が電気抵抗を増加させることが明らかとなった.これらの相違は,物質の形状異方性の違いを反映したジグザグ形状の角付近における微視的なスピン配列の違いに起因するものと推察される.このような微視的なスピン構造の違いを明確にするために,マイクロマグネティクスシミュレーションにより,ジグザグ形状の角付近におけるスピン構造を予測した.その結果,Coに対しては磁束が細線の角からわき出す対称的な磁化配列が得られるのに対して,Niに対しては磁束のわき出しに加え,細線の角付近での磁化配列に変調が加えられた構造が得られた.また,磁気力顕微鏡によりジグザグ形状の角付近における磁区構造観察を行った.観察結果はマイクロマグネティクスシミュレーションによる計算結果と非常に良く対応しており,CoおよびNi細線の磁気抵抗の相違が,この磁化配列の微視的な変調に起因しているという考察を支持するものである.
溶融分散冷却法での芯材滴離脱・合一の速度論的解析と高含有単核マイクロカプセル調製

複エマルション系を利用した溶融分散冷却法において,液滴調製時の高せん断過程や動的に物性が変化するマイクロカプセル化過程での芯材滴/壁材滴の離脱等の分散挙動を流体力学的,界面科学的検討を行った。また,分散挙動に関する相関式をもとにマイクロカプセルの最適な高含有化・単核化操作プロセスを検討した。そして,マイクロカプセルの構造制御への分散挙動に関する速度式の応用の可能性が示唆された。平成22年度に実施した研究の実績概要は以下のとおりである。まず,芯材滴/壁材のW/O型分散系および芯材滴/壁材滴/連続相のW/O/W型複エマルション系における各液滴の分散挙動の,界面科学的,流体力学的検討を実施した。この際,壁材として,溶融分散冷却法でのマイクロカプセル化への展開を考慮して,脂肪酸類およびパラフィン系炭化水素類を採用した。その結果,芯材滴/壁材および芯材滴/壁材滴/連続相の分散系において,異なる界面活性剤および壁材種を用いて,ゼータ電位,界面張力,粘度等が,各液滴の合一・分裂挙動ならびに芯材滴の漏洩率に及ぼす影響を明らかにした。特に,粘度については終末速度式により評価可能であることが示唆された。このような各液滴の分散挙動は,複エマルション系を利用したマイクロカプセル化過程における各液滴間の合一や離脱などの挙動を検討するうえで重要な基礎的知見である。次に,この知見をもとに,マイクロカプセル化を試みた。具体的には,溶融分散冷却法において,冷却速度および分散相粘度等を変化させることで,芯材滴の離脱を抑制し,含有率の高いマイクロカプセルの調製が可能となった。以上の知見は,マイクロカプセル化過程とともに刻々と変化する各液滴の分散挙動をもとにマイクロカプセルの構造制御(単核化など)やさらなる高含有化を検討するためにきわめて重要な知見である。これらの構造制御および高含有化の検討は平成23年度実施する予定である。これまでのマイクロカプセル化では最適操作条件を決定するために試行錯誤的な手法や経験が少なからず必要であった。そのため,マイクロカプセル化をより幅広い分野に展開するためには,カプセル化過程の現象を定量的に解析し一般化する必要がある。そこで平成23年度では一般化のために不可欠な芯材滴/壁材滴の分散挙動の速度論的解析を行なった。また,その結果をもとに高含有単核型マイクロカプセルへの展開を行なった。まず,反応系内の素材の物性が芯材滴/壁材滴の離脱・合一・分裂速度に及ぼす影響を検討した。具体的には,溶融分散冷却法により,冷却温度や撹拌速度などの実験条件を段階的に変化させてマイクロカプセルを調製し,素材の諸物性,芯物質の漏洩率などを経時的に測定した。その結果,それぞれの因子が芯材滴の離脱・合一速度に及ぼす影響を明らかにした。これらの知見をもとに,芯材の離脱および合一速度の制御により,高含有単核型マイクロカプセルの調製を試みた。すなわち,芯材の離脱防止と合一促進の最適条件を求め,高含有率で単核型マイクロカプセルの調製を試みた。その結果,芯材の高含有化が達成されるとともに,単核型の割合が高いマイクロカプセルの調製が可能となった。以上の成果は,溶融分散冷却法のみならず,他の方法によるマイクロカプセルの調製や複合エマルションの調製などにおいて,構造制御する上で極めて重要な知見である。次年度はこの結果をもとに,他のマイクロカプセル化方法への応用を検討する予定である。複エマルション系を利用した溶融分散冷却法において,液滴調製時の高せん断過程や動的に物性が変化するマイクロカプセル化過程での芯材滴/壁材滴の離脱,合一,分裂の分散挙動を流体力学的,界面科学的検討を行った。また,分散挙動に関する速度式をもとにマイクロカプセルの最適な高含有化・単核化操作プロセスを検討した。具体的には,まず,前年度までに得られた各物性値の冷却温度,撹拌速度等への依存性を定量化し,液滴の分散挙動に関する速度式での検討を行なった。次に,得られた液滴の分散挙動に関する速度式から,粒径,含有率,内部構造(単核の度合い)などの特性に関して定量的な検討を行ない最適操作条件の検討を行なった。また,複エマルション系を利用したその他のマイクロカプセル化方法へも展開し,速度式の有用性を検討した。最後に,これらの成果の波及効果について調査を行なった。液滴の合一と離脱に及ぼす液物性の影響から,目的としている高含有単核型マイクロカプセル調製のために制御すべき因子が明らかになったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。溶融分散冷却法の工学的体系化とその応用を実施する。

その際,予期しない合一や離脱といった誤差のない分散挙動の観察を行うために,壁材としてUV樹脂を利用した検討を行う。これにより,芯材滴/UV樹脂滴/連続相の複エマルション系にUVランプを照射することで瞬時に硬化させることが可能となり,分散挙動を正確に評価できるものと考える。また,分散挙動を単純化するために,合一領域と分裂領域とが明確に分離したループリアクターの利用や,滴径分布の影響を排除するために,オリフィス法などを用いた液滴調製による検討を試みる。24年度が最終年度であるため、記入しない。
《中国の対中東戦略》が米中関係に及ぼす影響

1980年代から2006年2月現在に到る《中国の対中東戦略》ならびに《中国の対中東関係》が国際関係の枠組みの変更や、未申それぞれの安全保障戦略のなかで如何に形成され、また、それが米中関係に及ぼした影響について研究を行いました。1980年代以降、中国から中東(特にイラン)への武器移転問題は、アメリカの議会などで問題にされていました。しかし、冷戦期に、対ソ連戦略のもと、アメリカ政府は武器移転問題を大きな対立軸にしませんでした。しかし、1990年にアメリカ政府による中国の戦略的位置づけが変更され、武器移転問題が、米中間の主要対立軸の1つになりました。本研究では、特に、WMD(大量破壊兵器)の移転問題や、中国から中東湾岸諸国への移転と、イスラエルから中国への移転を並行的にとらえることで、その複雑な移転環流構造を分析しました。さらに、中国と中東というと、日本のではマスメディアを中心に、エネルギー戦略のみの視角からとらえられがちですが、本研究では、エネルギー戦略はもちろんのこと、武器・軍事技術移転、地政学的戦略、人権外交、大国外交戦略などの複合的な戦略から研究を行い、それらの関連構造を明らかにしました。以上の研究成果は、本紙裏画記載の小論以外にも、アジア政経学会全国大会、中東調査会などにおいて情報を提供して参りました。また、小論を読んだ韓国外交通商部の北東亜細亜課の課長補佐がインタビューに来たり、講演を聴いた中国社会科学院の雑誌編集者から寄稿を求められるなど、実りのあったものだと思われます。課題研究1年目の本年は、日中米における資料の収集やインタビューを行うとともに、学会での研究報告と雑誌論文による成果の公表を行いました。6月までは、中国の対中東関係強化の現状と戦略について研究し、そのうち成果のあったイラン、イラク、イスラエルをめぐる米中関係について、6月に南山大学で行われたアジア政経学会西日本大会において報告しました。その報告論文は学会HPに掲載されました。このアジア政経学会における報告を基に、中国の対イラン・対イスラエル関係の強化をめぐる米中関係について研究を推し進め、その成果を『問題と研究』に掲載しました。これは、アジア政経学会での報告を聞いて下さった防衛大学教授の推薦によるものです。米中の安全保障戦略については、クリントン政権期からブッシュ政権期の米中両国の安全保障戦略について研究を行い、6月には中国の社会科学院が刊行している学術雑誌『日本学刊』にその成果が刊行されました。また、7月には、日本の南窓社から刊行された『9・11後のアメリカと世界』(五味俊樹先生と滝田賢治先生の共編著)に、米中関係と米中双方の安全保障戦略に関する研究成果が掲載されました。8月から9月にかけて、中国の北京・上海において、国際関係の研究者やジャーナリストにインタビューを行いました。また、中国において、文献資料の収集にも努めました。夏以降は、冷戦期から現代に至る中国・イラン関係に焦点を絞って研究を推し進め、その成果を『中国研究月報』に投稿し、掲載されました。この論文を読んで下さった『季刊アラブ』から寄稿の依頼があったことから(2005年夏掲載予定)、評価できる成果を上げられたと思います。2月には、米国で大学・シンクタンクの研究者やジャーナリストにインタビューしました。3月には、『世界週報』でEUの対中国武器禁輸解除がアジアと中東の安全保障と米・EU関係に及ぼす影響を論じました。(以上800字)1980年代から2006年2月現在に到る《中国の対中東戦略》ならびに《中国の対中東関係》が国際関係の枠組みの変更や,米中それぞれの安全保障戦略のなかで如何に形成され,また,それが米中関係に及ぼした影響について研究を行いました。1980年代以降,中国から中東(特にイラン)への武器移転問題は,アメリカの議会などで問題にされていました。

しかし,冷戦期に,対ソ連戦略のもと,アメリカ政府は武器移転問題を大きな対立軸にしませんでした。しかし,1990年にアメリカ政府による中国の戦略的位置づけが変更され,武器移転問題が,米中間の主要対立軸の1つになりました。本研究では,特に,WMD(大量破壊兵器)の移転問題や,中国から中東湾岸諸国への移転と,イスラエルから中国への移転を並行的にとらえることで,その複雑な移転環流構造を分析しました。さらに,中国と中東というと,日本のではマスメディアを中心に,エネルギー戦略のみの視角からとらえられがちですが,本研究では,エネルギー戦略はもちろんのこと,武器・軍事技術移転,地政学的戦略,人権外交,大国外交戦略などの複合的な戦略から研究を行い,それらの関連構造を明らかにしました。以上の研究成果は,本紙裏面記載の小論以外にも,アジア政経学会全国大会,中東調査会などにおいて情報を提供して参りました。また,小論を読んだ韓国外交通商部の北東亜細亜課の課長補佐がインタビューに来たり,講演を聴いた中国社会科学院の雑誌編集者から寄稿を求められるなど,実りのあったものだと思われます。
神経細胞質封入体「斑点小体」の微細構造解析と構成分子スクリーニング

胎盤由来未知抗原hPAX-P2抗体で標識される神経細胞質封入体「斑点小体stigmoid body(STB)」のマーカーとしてHuntingtin-associated protein 1(HAP1)が注目される。本研究では、初めにこのHAP1のSTBへの局在と培養細胞内cDNA導入によるSTBの出現が確認された。また種々の分子生物学的・組織化学的手法を駆使して、hPAX-P2抗体がHAPlAとHAPlBの共通C末近傍領域XP2Sを認識し、HAP1がhPAX-P2Sそのものであったことを証明し、XP2S領域はSTB形成時に露出され、細胞質内分散時に被覆され、STB形成の鍵を握ることを示した。免疫電顕解析では、HAP1の局在は主としてSTBと近傍の小胞体様管腔構造にあるが、KDEL配列等小胞体マーカー抗体、Golgi装置、ミトコンドリア、エンドゾームマーカー等の抗体では検出できず、IHCとISHによるその他の構成分子のスクリーニングでもSTB内局在分子は同定できなかった。病態への関与については、STB/HAP1が、ハンチントン病と同様なpolyQ伸長性疾患である球脊髄性筋萎縮症(SBMA)の原因分子、アンドロゲン受容体のリガンド結合部位とpolyQ長依存性に結合し、核移行の動態制御を介してアポトーシスを抑制することを突き止めた。この発見は、SBMA患者の脳における神経変性の発症が、STBがあまり存在しない下位脳幹・脊髄運動核等のアンドロゲン受容体発現部位に特異的に起こり、STBが共存する辺縁系・視床下部では起きにくい事実を説明する。最近、米国から17型脊髄小脳変性症(SCA17)の原因分子TATA結合蛋白(TBP:ataxin17)でも同様にSTB/HAP1が結合性に核移行制御を行なうという斑点小体STBのHAP1細胞保護仮説を支持する報告がなされた。平成17年度の研究成果として、ラット内側視索前野・視床下部・扁桃体領域においてHAP1タンパク質とHAP1mRNAのニューロン内局在を、透過型免疫電顕法(IHC-TEM)とin situ hybridization電顕法(ISH-TM)により明らかにし、また、AODO法を用いた高解像度走査型電顕法による斑点小体stigmoid bodyの細胞内観察にも成功し、以下の点を明らかにした。特に1)、2)については平成17年度の顕微鏡学会と解剖学会で報告した。1)IHC-TEM法によるHAP1タンパク質の細胞内局在HAP1タンパク質の細胞内局在は、主として斑点小体stigmoidbody (STB)に局在していたが、近傍の小胞体様管腔構造にも局在していた。詳細な観察を行うと、STBの形成過程と思われるHAP1陽性小胞体様管腔構造の毛玉状集積像が時に見られることがわかった。2)ISH-TEM法によるHAP1mRNAの細胞内局在HAP1mRNAの細胞内局在は、主として粗面小胞体に観察されたが、STBにおいても、時にその周辺部に局在するシグナルが検出された。しかし大きなSTBの中央部にはシグナルが検出できなかった。3)高解像度SEM(HR-SEM)によるSTBの3次元微細構造解析AODO法を用いた高解像度HR-SEM法による内側視索前野のニューロン内STBの観察により、STBが1535nm径の線維構造と510nm径の線維構造の毛玉状集積から成る所見が得られている。また、それぞれの線維構造には数個の分子複合体が一定間隔で結合して配列している様子が観察された。4)IHCとISHによるSTBの構成分子のスクリーニングの準備

この課題は基本的には準備および予備実験に留まっているが、ある種の細胞骨格系タンパク質や受容体タンパク質がstigmoid bodyに局在している所見が得られている。平成18年度は、HAP1/stigmoid body(STB)がアンドロゲン受容体(AR)を核移行制御するという興味深いデータが得られ、ラット内側視索前野・視床下部・扁桃体領域HAP1/STBの解析においても、以下の結果を得ている。2)ISH-TEM法とIHC-TEM法によるによるHAP1mRNAとHAP1タンパク質の細胞内局在HAP1mRNAの細胞内局在は、粗面小胞体と小型のSTBにシグナルが観察された。しかし,大きなSTBではほとんどシグナルは検出できず成長過のSTBで時に周辺部に局在してシグナルが見られるのみであった。HAP1タンパク質の細胞内局在については、主として斑点小体stigmoidbody(STB)と近傍の小胞体様管腔構造に見られた。また、形成過程と思われるHAP1陽性小胞体様管腔構造の毛玉状集積像も時に観察された。3)AODO法を用いた高解像度SEM(HR-SEM)によるSTBの3次元微細構造解析高解像度HR-SEM観察により、STBが1535nm径の線維構造と510nm径の線維構造の毛玉状集積から成る所見が得られている。また、それぞれの線維構造には数個の分子複合体が一定間隔で結合して配列している様子が観察された。4)IHCとISHによるSTBの構成分子のスクリーニング5)また、HAP1と性ステロイド受容体と関連の中で脳内アロマテースの制御を解明しISH・IHCとの比較から脳内に2種類以上のAROMが存在することを明らかにし、英文論文を作成し、J.Comp.Neurol.に受理/掲載された。斑点小体stigmoidbodyは胎盤由来抗原hPAX-P2S抗体によって同定され、視床下部等に豊富に存在することが知られるが、その後、HAP1の遺伝子導入によりSTBを誘導でき、HAP1は主要な構成要素であることがわかったが、hPAX-P2Sとの関係は不明であった。種々の分子生物学的・組織化学的手法とHAP1フラグメントを使った抗体吸収等の方法を駆使して、H19年度の研究で初めて、hPAX-P2S抗体がHAP1AのC末でHAP1B共通領域XP2Sを認識し、hPAX-P2SがHAP1そのものであることを証明した。XP2S領域は、HAP1がSTB形成時には露出され細胞質内分散時には被覆され、STB形成の鍵を握る領域であることが示された。免疫電顕法でHAP1は主としてSTBと近傍の小胞体様管腔構造に見られるが、KDEL配列等小胞体マーカー抗体、Golgi装置、ミトコンドリア、エンドゾームマーカー等の抗体でも検出できず、そのオルガネラ由来は未解決のまま残った。さらにSTB構成分子の免疫組織化学的スクリーニングの結果、in vitroで推察されるSTB関連が推察されるSortilin, SorLA/LR 11, InsP3R, tublin, neurofilament M, Dynactin P150glued, kinesin heavy chain, Duo/PCIP10, dynin, Hrs, NeuroD等のSTB内局在は証明できなかった。
p53結合蛋白、53BP1 53BP2の癌細胞における変異とその機能に関する研究

p53は発癌の抑制に関与する転写因子であり、p53の遺伝子の異常が各種のヒト癌の発症に関係することが明らかになってきている。我々はyeast two hybrid systemを用いて、p53のDNA結合ドメインを介して野性型p53とのみ結合する2種の細胞性蛋白質53BP1,53BP2を見い出し報告してきた。本研究機間に53BP1,53BP2の機能に関して以下のような結果を得た。1.1972残基から成る53BP1の全アミノ酸配列を明らかにした。p53との結合領域であるC末270残基は、酵母蛋白質RAD9および乳癌抑制遺伝子産物BRCA1のC末に見られるBRCTdomainと呼ばれるモチーフと相同性を示した。2.53BP1、53BP2のゲノム遺伝子はそれぞれ染色体上の15q15-21、1q41-42に位置した。3.動物細胞内で53BP1、53BP2の^cDNAからそれぞれ22kD以上、150kDの大きさの蛋白質が産生された。抗53BP1抗血清によるウェスタンブロッテイング法で、肺癌細胞株H358細胞に^cDNAからのものと同じサイズの内因性53BP1を検出した。4.53BP1は1)細胞質と核内2)核内に均一3)核内にドット状と3つの局在パターンを示したが、53BP2は常に細胞質に局在した。5.53BP1、53BP2はp53の転写活性化因子としての機能を増強させた。BRCTdomainは細胞周期のチェックポイントに関与する蛋白質に広く見い出されており、又、両蛋白がp53による転写を活性化する事から、両蛋白はp53のシグナル伝達経路のなかでp53の上流に位置する可能性がある。今後、両蛋白によるp53活性化の機序を検討する予定である。yeast two-hybridsystemを用いてライブラリーをスクリーニングし見い出された、2種のp53結合蛋白質、53BP1、53BP2の機能について検索を行った。GSTとの融合蛋白、GST-53BP1,GST-53BP2を精製し、ウサギに免疫し、抗53BP1抗体、抗53BP2抗体を得た。抗53BP1抗体を用いて、ウエスタンブロッティングを施行したところ、正常線維芽細胞W138細胞抽出液中に230KDの蛋白が検出されたが、p53欠失細胞株H358(肺癌細胞株)Saos-2(骨肉腫細胞株)の細胞抽出液中は検出されなかった。2種のヒトcDNAライブラリーをスクリーニングし、1972アミノ酸残基から成るfull sizeの53BP1cDNAを得た。HA-Tagを付けた53BP1をH358細胞に発現させると、HAに対するモノクローナル抗体12CA5を用いたウエスタンブロッティングで約230KDの蛋白が検出された。53BP2のfull sizecDNAはStanford大学のNaumovski博士より供与を受けた。53BP1,53BP2をCOS-1細胞に発現させ免疫染色を施行したところ、両蛋白とも細胞質内に局在した。H358細胞へ、p53により転写が活性化されるCATレポータープラスミドと供にp53発現プロスミドを導入し、CATアッセイを施行した。

さらに、この系に53BP1または53BP2を同時に発現させ、p53による転写活性化に対する53BP1,53BP2の影響を検討したところ、53BP1はp53による転写活性化を抑制し、53BP2は増強させた。今後、p53による転写活性化機能の53BP1,53BP2による修飾の機序について検討する予定である。p53は発癌の抑制に関与する転写因子であり、p53の遺伝子の異常が各種のヒト癌の発症に関係することが明らかになってきている。我々はyeast two hybrid systemを用いて、p53のDNA結合ドメインを介して野性型p53とのみ結合する2種の細胞性蛋白質53BP1,53BP2を見い出し報告してきた。本研究期間に53BP1,53BP2の機能に関して以下のような結果を得た。1.1972残基から成る53BP1の全アミノ酸配列を明らかにした。p53との結合領域であるC末270残基は、酵母蛋白質RAD9および乳癌抑制遺伝子酸物BRCA1の末に見られるBRCT domainと呼ばれるモチーフと相同性を示した。2.53BP1、53BP2のゲノム遺伝子はそれぞれ染色体上の15q15-21、1q41-42に位置した。3.動物細胞内で53BP1、53BP2のcDNAからそれぞれ220kD以上、150kDの大きさの蛋白質が産生された。抗53BP1抗血清によるウェスタンブロッテイング法で、肺癌細胞株H358細胞にcDNAからのものと同じサイズの内因性53BP1を検出した。4.53BP1は1)細胞質と核内2)核内に均一3)核内にドット状と3つの局在パターンを示したが、53BP2は常に細胞質に局在した。5.53BP1、53BP2はp53の転写活性化因子としての機能を増強させた。BRCT domainは細胞周期のチェックポイントに関与する蛋白質に広く見い出されており、又、両蛋白がp53による転写を活性化する事から、両蛋白はp53のシグナル伝達経路のなかでp53の上流に位置する可能性がある。今後、両蛋白によるp53活性化の機序を検討する予定である。