hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脊髄損傷者の健康作りを目的とした立位歩行様受動運動の有効性と危険性に関する研究

伸張反射の振幅は交感神経活動の亢進とともに低下することが動物実験から示唆されている。一方、交感神経活動が立位歩行様受動運動中にも高まる可能性があることをこれまでの研究で明らかになっているので、同運動時に伸張反射の振幅が低下する可能性がある。しかしながら、この運動中に伸張反射を測定することは困難である。そこで、本研究では脊髄損傷者を安静座位にして、交感神経活動を高めることができる皮膚冷却刺激を加えた際の伸張反射応答を検討した。もし、伸張反射の振幅が低下した場合、立位歩行様受動運動に痙性抑止効果がある可能性を言及できると考えられたためである。対象者は脊髄完全損傷者(12名)と健常者(9名)であった。右側足関節を他動的に背屈させてヒラメ筋を伸張させ、ヒラメ筋に現れる伸張反射の振幅を求めた。伸張刺激は10秒毎に与えられたが、途中、左足大腿部にアイスパックで冷却刺激を行い、伸張反射応答の振幅が変化するか否かを検討した。その結果、胸髄6番目以上損傷者(n=8)では、冷却刺激が加わると伸張反射の振幅が低下した。逆に胸髄10番目以下損傷者(n=4)では上昇する傾向にあった。健常者においても同様に上昇した。胸髄6番目以上損傷者の伸張反射の低下は、顕著な循環応答(血圧上昇、徐脈)を伴っていた。このような循環応答は交感神経活動の上昇によるものと考えられた。したがって、伸張反射の低下も交感神経活動の上昇と関連して生じていることが示唆された。
高速水中音響ネットワークシステムの開発

下りと上りをそれぞれ1MHzと3MHzの搬送波を用いて、位相変調により200kbps/600kbpsの伝送速度の高速で実用性の高い水中音響ネットワークシステムを開発した。1MH_Zと3MHzの搬送波を用いて,音響送受信機を設計,試作し,プロトタイプの音響ネットワークを構築して,下りと上りそれぞれ200KBPSと600KBPSの高い伝送速度を達成した。1.システム構築計画時は2MHzから4MHzの搬送数を使用するとしたが,1MHz,2MHz,3MHz,4MHzのトランスジューサーを作成し特性を調べたところ,1MHzと3MHzの組み合わせが最も良かったので,それぞれ下りと上りの搬送波周波数にした。ハイドロホーンの指向性や音響インピーダンスを計算し,音響受信機,音響送信機を設計,試作した。小型水槽において双方向通信テストを実施し送受信機能を確認した。ノートパソコンをデータ処理装置として使用し,2ノードのプロトタイプ音響ネットワークシステムを構築した。2.送受信信号の同期M系列の信号を送信し相関処理より送受信間の同期を取る予定だったが,本研究では位相変調されたデータ信号自身を利用し同期を取った。M系列の信号を送る必要がなくなるので,その分伝送効率が向上する。3.マルチパス対策浅海域での海面や海底の反射によるマルチパスを対処するために,フィードフォワードフィルタ(FFF)とフィードバックフィルタ(FBF)から構成した自適応デジタル復調器を設計し,マルチパスに対する補償効果をシミュレーションで検証し,フィルタの最適段数や適応アルゴリズムを選定した。4.ネットワーク機能1ビット5波の位相変調を行い,下りと上りそれぞれ200KBPSと600KBPSの伝送速度を達成した。ネットワークのプロトコールは携帯電話などに広く使われているPPP(PointtoPointProtocol)を用いた。現在2ノードだけだが,ログインやPingできることは確認された。5.DSP化の準備プロトタイプを実用化に近づくために,データ処理用ノートパソコンをデジタル,シグナル,プロセッサー(DSP)化する必要があり,その開発環境構築を準備した。本研究で開発した技術は,海洋計測機器のネットワーク化への利用が期待される。初年度に作成したプロトタイプ音響ネットワークシステムは、キャリア周波数がメガオーダーで高いためビームの指向幅が狭く、海上で振動子同士を向き合わせるのは難しかった。それを改善するために、今年度は、曲面素子を設計し指向幅を30°に広げた。プロトタイプを小型化するために、デジタル信号処理プロセッサーDSPの実装研究を行った。ネットワークのベースとなる各種MAC(Medium Access Control)プロトコールを比較し、音響を伝送媒体とした場合の長短所をまとめ、その中から最適なプロトコールを選定した。さらに、MACプロトコールをベースに、音響ネットワークアダプターに必要な標準インタネットプロトコールのIPプコトコール、TCP/IPプロトコールの実装研究を行った。本年度で実施した主要研究項目:・曲面素子を用いて指向幅を30°に広げた・既存MACプロトコールの比較・音響伝送にふさわしいMACプロトコールを選定・IPプロトコールの実装研究・UCP/TCPプロトコールの実装研究・双方向対向試験実施・音響ネットワークによる画像伝送の研究いままで各種の海洋調査・観測活動が行われているが、水中での通信はケーブルを介して行うことが多いため、機器設置の妨げとなるだけでなく、水中ロボットの場合にはその行動範囲を制約されていた。この2年間の研究により、当初目的とした、近距離ではあるが下りと上りをそれぞれ1MHzと3MHzの搬送波に分けて、200kbps/600kbpsの伝送速度の高速で実用性の高い音響ネットワークシステムを開発した。本研究成果は今後実海域での応用が期待される。
チタンに対する過敏反応を検証する

これまでに確立しているニッケルアレルギーモデルマウスを作製方法を応用して,チタンを抗原としたアレルギーを誘導できるかどうか検討した.酸化チタンをマウス腹腔内に投与した後,耳介皮膚でアレルギーを発症させようとしたが,ニッケルのような抗原性の高い金属と同等の炎症症状を惹起することができなかった.次に,in vitroでチタンの抗原性を検討した.マウス骨髄由来樹状細胞を酸化チタンで刺激した後,金属アレルギー発症時に確認されるサイトカイン産生と種々の遺伝子発現を網羅的に解析したが,in vivo実験と同様に,ネガティブコントロールと比較して有意な差を認めなかった.我々はすでにニッケルに対するアレルギーモデルマウスを開発しているため,昨年度よりこのモデルを他の金属に応用できるかどうか検討してきた.このモデルマウスは,まず腹腔内にアジュバントと混合したニッケル溶液を投与し,2週間後に耳介に再度アジュバントと混合したニッケル溶液を皮下投与することで耳介にアレルギー反応を発症させるものである.このモデルを他のアレルギー原性金属(コバルト,クロム,パラジウム,金)で再現可能か検討し,各種金属(ニッケル,コバルト,クロム,パラジウム,金)を投与したマウスでは,ニッケルに対する耳介腫脹反応が著しく強かったものの,クロム,コバルト,パラジウムに対しても軽度のアレルギー反応を示した.同様の実験をチタンでも行ったが,チタン投与マウスではアレルギー反応を認めなかった.マウス骨髄由来の樹状細胞(Dendritic cells; DC)にこれらも金属を投与してDCの反応を解析したところ,チタンで刺激した群のみIFN-γやIL-12の産生が低く,DC表面のMHC classIIの発現も他の金属のようは増強されなかった.次に,チタン投与マウス脾臓からT細胞を採取し,チタンに対するサイトカイン産生量や表面抗原をELISA,フローサイトメーターで解析したが,アジュバントのみを投与しているコントロール群から採取したT細胞と比較して,IL-2,IFN-γ,IL-10の産生量や,CD44,CD45の発現に大きな変化を認めなかった.これまでの研究で,ニッケルアレルギー反応時,DC上でMKK6/p38の活性が増強することが示されている.そこでチタンを投与したDC上でのMKK6/p38活性と,チタンを投与したマウスの耳介皮膚でのMKK6/p38活性を,in vivo,in vitro両方から検討したが,どちらもネガティブコントロール群と比較して増強していなかった.これまでに確立しているニッケルアレルギーモデルマウスを作製方法を応用して,チタンを抗原としたアレルギーを誘導できるかどうか検討した.酸化チタンをマウス腹腔内に投与した後,耳介皮膚でアレルギーを発症させようとしたが,ニッケルのような抗原性の高い金属と同等の炎症症状を惹起することができなかった.次に,in vitroでチタンの抗原性を検討した.マウス骨髄由来樹状細胞を酸化チタンで刺激した後,金属アレルギー発症時に確認されるサイトカイン産生と種々の遺伝子発現を網羅的に解析したが,in vivo実験と同様に,ネガティブコントロールと比較して有意な差を認めなかった.ニッケルアレルギーモデルマウス作製方法と同様のプロトコールでチタンを投与し,アレルギーモデルマウス作製を試みた.チタンおよび各種アレルゲン金属試薬(ニッケル,コバルト,クロム)を作製し,正常C57BL6/J雌マウス腹腔に投与して感作した.2週間後,同金属試薬を耳介皮下に投与し,48時間後に耳介腫脹反応を測定してアレルギー発症の有無を確認した.その結果,耳介腫脹反応の強さ(大きさ)では,Ti<Co<Cr<Niで,チタンを投与した群では,生理食塩水を投与したコントロール群とほとんど差がなかった.チタンを投与したマウスの耳介皮膚と,チタン以外の金属に対するアレルギーを発症したマウスの耳介皮膚を,免疫組織科学により光学顕微鏡下で病理組織学的に観察した.その結果,ニッケル,コバルト,クロム投与群マウスの耳介皮膚には,T細胞を中心としたリンパ球浸潤を認めたが,チタン投与群ではそれを認めず,浸潤している好中球はアジュバンドに対する反応であると考えられた.次に,マウス骨髄から分化誘導した樹状細胞(dendritic cells: DC)に対して,チタンおよびアレルゲン金属による刺激を与え,DC表面のMHC classII発現,炎症性サイトカイン産生の違いをフローサイトメトリー,ELISA法で検討した.その結果,アレルゲン金属で刺激したDCではIL-12, IFN-γ産生およびMHC classII発現の増強を認めたが,チタンで刺激したDCでは,それらを認めなかった.以上の結果から,チタンに対してアレルギー反応が小さいのは,DCによる抗原提示能が小さいからである,という可能性が示唆された.次年度は,それぞれの群から採取したT細胞とDCを共培養して,各種遺伝子発現を比較検討し,チタンに対するT細胞の反応をin vivo,in vitro両面から観察する.ニッケルアレルギーモデルマウス製作方法を応用して,ニッケルの代わりにチタンを用いてアレルギーを誘発できるかどうか,昨年度より条件検討を行ってきた.酸化チタンを用いて,腹腔内投与+耳介皮下投与,腹腔内投与+耳介皮膚への直接塗布,腹部皮膚への直接塗布+耳介皮下投与,腹部皮膚への直接塗布+耳介皮膚への直接塗布,といった方法で,マウスをチタンで感作してアレルギーを惹起させようとしたものの,コントロール群と比較して有意な耳介の腫脹,すなわちアレルギー反応は見られなかった.また,同様に昨年度より引き続き,in vitroでのチタンの抗原性の検討として,マウス骨髄由来樹状細胞を酸化チタンで刺激した後,サイトカイン産生と種々の遺伝子発現を解析した.

その結果,ネガティブコントロール群との有意な差はいずれも見られなかった.特に,ニッケルで有意に活性が上昇するMKK6/p38経路もチタン刺激ではリン酸化が進行しなかった.さらに,チタンで刺激した樹状細胞もしくはT細胞を正常C57BL/6マウスの腹腔に移入してアレルギーの誘発を試みたが,明らかなアレルギー症状は観察されなかった.歯科補綴学昨年度からの続きの動物実験を行いながら,申請書に記載した本年度の予定通り,歯科金属に対するDCとT細胞の反応を解析し,チタンの刺激能も検討した.申請書に記載した研究の目的では,in vivoでの予備検討的な金属アレルギーモデル解析を行う予定であったが,今年度はin vivoの実験に加えて,来年度の予定であるDCの刺激能も観察した.しかしながら,初年度予定のチタン溶出の最適条件については,明確な結果を得ることができなかった.これまでの実験で,我々が開発した方法そのままではチタンアレルギーを発症させることができなかった.そこで,今年度は,アレルギー発症時に発現が増強している遺伝子を導入したDCを用いてチタンアレルギーの誘導を試みる.具体的にはMKK6もしくはp38遺伝子をトランスフェクションしたC57BL/6Jマウス由来DCに48時間チタン刺激を加えた後,48時間T細胞と共培養する.抗原提示を受けてチタンを記憶したT細胞,もしくはチタンに対する反応性が上昇した遺伝子導入DCを無感作正常C57BL/6Jマウスに移入し,2週間後にアレルギーが誘導されるか否かを観察する.アレルギーの発症が確認された場合,全身検索を行い,ニッケルアレルギー発症マウスと比較してチタンアレルギー症状の特異性の有無を検討する.in vivoとin vitroのデータを対照しながら実験を進めていく予定である.具体的には,in vitroで,チタンに対するDCの抗原刺激能が上昇しないことが示されたので,in vitroでそれぞれの金属刺激を与えたDCをマウス体内に戻して,実際のアレルギー反応を観察する.また,T細胞を用いて同様の実験を行う予定である.本年度はほぼ予定通りに研究費を使用したが,前年度からの繰り越し費用があったため,次年度使用額が生じた.本年度の繰り越し額は,マイクロアレイキットや抗体購入費用が予定金額よりも低く抑えられたことから生じた.次年度の研究費と併せて,マウスの購入と遺伝子導入や細胞培養にかかる試薬および消耗品の購入に充てる.次年度に使用する予定の研究費は,特にELISAキットを予定よりも少なく使用したため,追加購入をする必要が無く生じたものである.翌年度以降の研究費と併せて,主に試薬購入および消耗品購入(培養ディッシュ,培養メディウムなど)に充てる予定である.
薄膜酸素含有量評価法の確立と強相関系酸化物への適用

同一の組成SiO_2をもつ石英ガラスと水晶の間で、酸素共鳴シグナル強度は同一であった。すなわち完全な非晶質と完全な結晶の間ではNRERS散乱断面積の差はないと考えられる。一方、還元処理されたルチル型TiO_2(001)単結晶基板およびペロブスカイト型SrTiO_3(001)単結晶基板において、酸素共鳴シグナル強度は試料間で大きくばらついたが、共鳴強度と導電性やキャリア濃度との間には相関が見られなかった。以上の結果を総合すると、試料の単結晶/非晶質の差や導電性の差は共鳴シグナル強度に影響を及ぼさないと言える。次に実際の強相関系酸化物薄膜の酸素含有量を評価し、電気磁気特性との比較を行なった。様々な酸素分圧下で作製したペロブスカイト型Mn酸化物La_<1-x>Sr_xMnO_<3-y>薄膜の酸素含有量をNRERSにより評価したところ、酸素含有量は製膜酸素圧に対して単調増加せずにU字形の依存性を示した。酸素雰囲気中でのPLD製膜において酸素取り込み効率の悪い酸素圧が存在しうることが明らかになった。また様々な温度でArガス中アニール処理したペロブスカイト型Ru酸化物SrRuO_<3-y>薄膜試料について、酸素含有量と電気磁気特性の比較を行なった。NRERSで評価した各試料の酸素含有量は結晶構造が保持されている限りアニール温度上昇に伴って減少し、同時に電気特性も金属的から徐々に絶縁体的挙動へと移行した。以上のように、薄膜の電気特性が酸素含有量に対応して変化する様子が初めて定量的に示された。非ラザフォード共鳴散乱法(non-Rutherford elastic resonance scattering=NRERS)により酸化物薄膜の酸素含有量を評価し、物性との比較により物理的知見を得るという研究目的のもと、パーソナルコンピュータを導入し、NRERS測定データを元に薄膜酸素量を算出するプログラムを作成した。研究対象として、複数の条件で製膜もしくは還元処理したペロブスカイト型Mn酸化物La_<1-x>Sr_xMnO_<3-y>(LSMO)およびペロブスカイト型Ru酸化物SrRuO_<3-y>(SRO)の薄膜試料を準備し、それぞれ酸素含有量を実験的に評価するとともに電気磁気特性との比較を行なった。パルスレーザー堆積(PLD)法により様々な酸素圧力下でLSMO薄膜を作製した。NRERSにより評価された薄膜の酸素含有量は、酸素圧に対して単調増加せずにU字形の依存性を示した。酸素雰囲気中でのPLD製膜において酸素取り込み効率の悪い酸素圧が存在しうることが初めて明らかになった。良好なエピタキシャル結晶成長を進行させる条件と酸素取り込み効率の良い条件が類似していることもわかった。SrTiO_3基板上に堆積させたLSMO膜においてはキュリー温度が酸素含有量にほぼ対応しており、この振舞いは酸素欠損によるMn^<4+>存在量の変化で定性的に説明できる。(論文印刷中)化学気相堆積法により堆積した定組成SRO薄膜を、様々な温度でArガス中アニール処理した試料を準備した。薄膜がペロブスカイト構造を保持するようなアニール温度領域においては、NRERSで評価した各試料の酸素含有量はアニール温度上昇に伴って減少し、それに対応して電気特性も金属的から徐々に絶縁体的挙動へと移行した。アニール条件ひいては酸素含有量に対応して電気特性が変化する様子が初めて定量的に示された。

(論文投稿準備中)非ラザフォード共鳴散乱法(non-Rutherford elastic resonance scattering = NRERS)による酸化物薄膜の酸素含有量の高精度な評価手段を確立することを目的として、酸素量の既知な種々の酸化物試料に対し、測定結果に影響を与える可能性が考えられる様々なパラメータを変化させて酸素共鳴シグナルの強度比較を行なった。(1)結晶性(非晶質/単結晶):ランダム配置でNRERS測定を行なった場合、同一の組成SiO_2をもつ非晶質(石英ガラス)と単結晶(水晶)の試料を比較すると、酸素共鳴シグナル強度は同一であった。すなわち完全な非晶質と完全な結晶の間ではNRERS散乱断面積の差はないと考えられる。しかし後に述べるように、同一組成の結晶試料であっても結晶性の優劣により共鳴シグナル強度が変化する可能性がある。(2)導電性:酸素含有量にほとんど差がなく(NRERSの検出感度以下)、かつ導電性が異なる試料として、様々な温度および真空度で還元処理されたルチル型TiO_2(001)単結晶基板およびペロブスカイト型SrTiO_3(001)単結晶基板を用意した。ランダム配置でのNRERS測定の結果、酸素共鳴シグナル強度は試料間で大きくばらついたが、共鳴強度と導電性やキャリア濃度との間には相関が見られなかった。共鳴シグナル強度を変化させる要因として各試料の結晶性の差が考えられる。実際、X線回折ωスキャン測定により各試料の結晶性の評価を行うと、共鳴シグナルが弱い試料は結晶性も低いという関係が見られた。結論として、試料の結晶性がNRERSシグナル強度に影響する可能性がある。原因としては粒界の存在が考えられる。実際に試料を測定する際には他の結晶性評価手法(RBSチャネリング測定、X線回折測定など)を複合的に用いて酸素量の補正を行なう必要がある。
フロンの酸化および還元による相補的無害化破壊技術の開発

酸化法ではフロン12をモデル物質としてリン酸-ジルコニア触媒による接触分解を検討した。オキシ硝酸ジルコニウムから沈澱法により得られたジルコニアにリン酸を含浸させ、500°C700°Cで焼成したリン酸-ジルコニア複合触媒は、100%硫酸の酸強度をしのぐ超強酸性を示し、フロン12を300°Cという低温で完全に分解した。この触媒の耐久性は今までに検討した多種の酸化物触媒の中では比較的優れていたが、25時間の使用によりフロン12の転化率は20%にまで低下した。触媒の失活は反応中生成する無機フッ素との反応により表面にフッ化物ができるためである。このフッ素を除去するために水素源として水を添加した。その結果、若干失活はするものの、30時間後でもフロン12は60%以上分解されることがわかり、実用的なフロン接触分解プロセス開発の期待が持たれた。還元法ではリチウムおよびナトリウムナフタレニドによるフロン113の分解を行った。ナフタレニド法によるフロンの無害化技術は確立されているので、本年度はフロンを有効再利用するために、選択的な脱塩素反応により有用なフッ素化合物を得ることを目的とした。その結果、還元剤としてナトリウムよりリチウムを用いる方が脱フッ素化反応が抑えられること、溶媒としてジエチルエーテルが有効であること等を見い出した。酸化的分解処理について:フッ素に対して耐久性のあるリン酸とジルコニアを組み合わせた触媒系のフロン12分解性能を検討した。市販のジルコニアに対するリン酸担持量を変化させた結果、PO4/Zr=0.005(モル比)で最高活性となった。この触媒の酸強度は-5.6<HO≦-3.0であり、酸点が分解の活性点であることがわかった。耐久性を500°Cで調べたところ、初期では100%のフロン12分解が起こるが、6時間後から分解率が悪くなり30時間後では25%の分解率で安定した。分解率の低下は大きいものの、現在までに知られる最も安定なBPO4触媒よりは優れていることがわかった。より強い酸点を持つ触媒として、オキシ硝酸ジルコニウムを中和沈澱し、200°C乾燥した後にリン酸を担持させ500°Cで焼成することにより超強酸を合成した。この酸強度は-14.52<H0≦-13.16であった。この触媒は300°Cでフロン12を完全分解することができ、いままで検討した触媒の中で最も高い活性を示した。現在この触媒についてその耐久性を検討中である。還元的処理について:金属LiおよびNaから調製したナフタレンアニオンラジカルを用いてパ-フルオロカ-ボン(PFC)の還元を行なった。Liを用いた場合脱フッ素率は50%どまりであり、還元力を増強するための手段(ポリエチレングリコ-ルエ-テルの添加、紫外線照射)を用いても効果がなかった。対照的にNaの場合には同じ条件下でほぼ定量的に脱フッ素が進行した。また、液体アンモニア中で金属NaおよびLiによるBirch還元をPFCに適用した。この場合にもLiの低転化に対してNaではほぼ100%の転化が起こった。安価なNaの処理効率が高いことは実用面での利点であり、現在NaとLiの挙動の違いについて検討中である。フロンの酸化分解に対して活性、耐久性のある酸触媒の開発を、フロンのモデル物質としてフロン12を用い検討した。種々の触媒について検討した結果、生成する無機フッ素に対して反応性の低い非金属元素を構成元素とするBPO_4の耐久性が優れていることが認められた。しかし、BPO_4も長時間の使用で揮発性BF_3を生成して失活した。リン酸根はフッ素に対し安定であるのでこれと比較的耐久性のあるジルコニアを組み合わせると、長期の使用に対してはBPO_4よりすくれていることが認められた。この知見に基づき、反応条件を緩和するために100%硫酸より強い酸性を示す超強酸リン酸-ジルコニア触媒を調製した。

この触媒によってフロン12は300°Cという低温で分解した。触媒の失活は反応中に金属フッ化物が生成するためである。このフッ素をHFとして除き触媒を再生するために、超強酸リン酸-ジルコニア触媒を用いた反応系内に水素源として水を添加してその影響を検討した。その結果、水無添加の場合には25時間後にフロン12の転化率は20%以下に低下するが、水存在下では30時間後でも60%以上の転化率を保ち、水の触媒再生剤としての効果が認められた。以上の結果から、リン酸-ジルコニア触媒のさらなる改良と、反応条件を検討することにより、実用的フロン分解プロセスの開発が可能と考えられる。還元法としてはアルカリナフタレニドによるフロンの脱ハロゲン無害化を行った。フロン113を用い、反応中間体の解析を行い反応機構について考察を行った。紫外線の照射は反応効率を高めることを見い出した。また、フロン類の選択的脱塩素反応により有用フッ素化合物を得るための条件を検討した。還元剤としてナトリウムより、リチウムを用いる方が脱塩素選択率は高く、またジエチルエーテルが脱塩素反応の溶媒として適していることがわかった。
環境変異原検出のための霊長類細胞株の樹立と性状解析

本研究目的は、各種霊長類より変異原検出、あるいは、その他のバイオアッセイ等に用いうる細胞株を樹立することである。変異原性の試験には、従来、バクテリアあるいはげっ歯類の細胞が多く用いられてきたが、薬剤その他に対する感受性は生物種によって異なるため、「人間への影響」という観点からはヒト由来の材料を用いることが望ましいが、未だ適当な系は存在していない。霊長類は、げっ歯類に近い原猿からヒトに近縁な類人猿まで百以上もの多種に分化した生物群である。この多様な霊長類を対象として種々の細胞株の糸を樹立することによって、これまでげっ歯類の糸で外挿していた距離を縮め、ヒトに近いもしくはヒトに代わる糸として確立することが可能と考えられる。研究の経過、成果、および考察材料の収集と細胞株の樹立は昨年度にひき続きおこなった。樹立した霊長類細胞株のうち、ヒトから見て遠い原猿のキツネザル由来Tリンパ芽球細胞株(LecT)、ガラゴ由来皮膚線維芽細胞、そして近い類人猿のオランウ-タン由来Bリンパ芽球細胞株、ボノボ由来Bリンパ芽球細胞株およびヒトBリンパ芽球細胞株の染色体数のモ-ド、おおよその細胞倍加時間、細胞当りの自然発生染色体異常及びヒト由来の細胞株のみ認められた。NaFの結果を手がかりに今後は原猿と類人猿との間をうめる旧世界ザルも検索の対象にすると共に、他の環境物質の変異原性について検索を進めたい。
地域コミュニーケーションの活性化を目的としたメディアデザイン・プロジェクトの研究

山口市は、大内氏(室町時代)が市内を流れる一の坂川を京都の鴨川に見立てて築いた城下町である。歴史的建造物の立ち並ぶ川の上流は、現在でもゲンジホタルの見られる景観地区とされている。しかし、市民生活の中心である商店外裏の下流は、将来的な景観再開発などが論議される地区である。本研究では、米屋町商店街裏手の千歳橋付近の一の坂川上に複数のスクリーンを設置し、山口の文化・歴史をイメージさせる映像を投影し、一の坂川景観プロジェクト「bridging landscape-景観に橋をかける」を実施した。写真、ビデオ、コンピュータグラフィックスを組み合わせた映像と、街で採録した雑踏の音や、風、水の音などを織りまぜ周辺の環境にとけ込むようなサウンドを作成し、環境音+景観映像で、大内時代以来の山口のシンボルとしての一の坂川を浮かび上がらせた。映像に使用した写真やビデオは、数年来にわたり地元主催の文化事業と連携して撮影してきたもので、山口市内に点在する文化的・歴史的建造物や景観から、日常の街角まで多岐にわたる。また、山口市在住の美術家、写真家、子供たちが撮影した写真も取り込み、市内に住む人々が、日常の生活空間の中でふと発見した一の坂川沿いの景観も盛り込んだ。写真やビデオは、従来通りに撮影したものだけでなく、カメラ・オブスキュラを用いて撮影したものも含む。性質の異なる写真やビデオとコンピュータグラフィックスの映像も織り交ぜることで、複合的な映像演出の可能性を探求した。この景観演出プロジェクトは、1ケ月以上にわたり山口市全域で展開された「ミュージアム・タウン・ヤマグチ2007」の一環として企画され、最終日二夜を飾るイベントとして開催された。そのほか本研究においては、歴史的文化財・建造物などを利用した地域コミュニケーションの実態を調査するため、2007年度開催されたドイツのドクメンタ12(カッセル市)、スクルプチュア・プロジェクト2007(ミュンスター市)、イタリアのベネチア・ビエンナーレなど、諸芸術祭を視察した。ドイツ・ケルン市では、地元美術家やデザイン教育関係者に、地元密着型プロジェクトの動向について取材も行った。2006年度山口県山口市で開催された「第21回国民文化祭・やまぐち2006」美術展および特別展「雪舟への旅」展の諸文化事業と連動し、コミュニティ・メディアデザイン・プロジェクトを展開した。県立美術館、県立図書館・文書館等の文化施設、作家などと連携しながら、ワークショップ企画、広報活動(8月10月)、展示・映像演出(11月)などを実際に手掛けることで、地域コミュニケーションの活性化をはかる上での地元のニーズや問題点を調査・分析した。11月の美術展開催期間中には山口県旧県会議事堂前で、ワークショップ成果物を共通木枠キューブによる野外展示で公開し昼の景観を演出した。子どもたちの作品、記録写真・ビデオ等の視覚的リソースを複合的に編集し映像にまとめ、建物正面で上映し、昼間とは違う夜の景観演出を行った。特別展「雪舟への旅」展(山口県立美術館)においては、約16mにわたる雪舟の真蹟図巻「四季山水図」の映像演出を行った。美術館休憩室に設置した5台の大型液晶モニター上で高精細画像から編集した映像をコンピュータから再生し、展示室の作品現物の観賞とは違った作品鑑賞を体験させた。これは芸術資料等の地域の文化的リソースを共有する方法として、将来的な展示室における大型スクリーンによる映像演出も想定に入れ、11月の展覧会期間中、実験的な検証も含め実施された。各種企画開催前後の半年以上にわたり、企画の記録だけでなく、地域の様々な歴史的文化的景観等を、通常撮影およびカメラオブキュスラを通して撮影することによって、性質の異なる写真、ビデオ映像の映像リソースを収集した。質感の違う映像を組み合わせて、断片的に映像プロトタイプを作成することによって、レンズ越しの像を基礎とする映像メディアの特性を研究し、コンピュータグラフィックスがもつ映像の性質との共通性と差違、複合的表現の可能性について検証した。

この景観演出プロジェクトは、1ケ月以上にわたり山口市全域で展開された「ミュージアム・タウン・ヤマグチ2007」の一環として企画され、最終日二夜を飾るイベントとして開催された。そのほか本研究においては、歴史的文化財・建造物などを利用した地域コミュニケーションの実態を調査するため、2007年度開催されたドイツのドクメンタ12(カッセル市)、スクルプチュア・プロジェクト2007(ミュンスター市)、イタリアのベネチア・ビエンナーレなど、諸芸術祭を視察した。ドイツ・ケルン市では、地元美術家やデザイン教育関係者に、地元密着型プロジェクトの動向について取材も行った。
パールカンーSHH相互作用を介した細胞外環境による歯根形態形成制御機構の解明

歯根形成の進行に伴いパールカンは上皮鞘基底膜から消失する一方でその分解酵素であるヘパラナーゼは上皮鞘細胞へ限局する。そこでパールカンがヘパラナーゼによって分解される過程で遊離されるソニックヘッジホッグ(SHH)が歯根形成に関わると仮説を立てた。本研究ではin vitroでこの仮説の解明を試みたが、既存の系では歯根完成期までを再現する事は困難であった。そこで様々な手法で改善を試みるも残念ながら歯根完成期まで再現する系の確立には至らなかった。今後、これらの結果を基にさらなる歯根形成機構の解明につなげていきたい。本年度は歯根形成過程でのHertwig上皮鞘(以下HERS),歯小嚢細胞,間葉組織の増殖帯およびセメント芽細胞におけるパールカン・ヘパラナーゼとソニックヘッジホック(SHH)の局在,発現について免疫組織細胞化学的な手法を用いて検索した,その結果,ヘパラナーゼはHERS,Malassezの上皮遺残に局在していた.SHHはin situ hybridizationの結果からHERS,間葉組織の増殖帯に局在しているものと予想されるが,結論を導くには本年度の観察結果に加えて来年度も引き続き観察が必要である.また,マウス下顎骨器官培養を先行実施し,培養歯胚での歯根形成状態の観察およびSHHの局在状況を確認した.マウス下顎骨器官培養には下顎第一臼歯が歯根形成期へ移行する直前である生後5日齢のICRマウスの下顎骨を使用し,7日間培養した,培養歯胚の歯根形成状態を確認するために,下顎骨採取時(以下DO)の下顎第一臼歯歯胚と培養3,5,7日目(以下D3,5,7)の下顎第一臼歯歯胚のHERS-歯胚全長比を比較した.その結果,D7ではDOの1.7倍HERSが伸長していた.この結果は他の器官培養報告と比較して遜色のない結果であったが,ヘパラナーゼの局在結果より培養環境で歯根形成後期を再現する必要性が生じた,そのため,来年度は培養期間の長期化などの工夫を新たに行なう予定である,またSHHの局在を免疫組織細胞化学的な手法で検討した結果,HERSと間葉組織の増殖帯での局在が示唆される結果を得たものの,来年度更なる観察が必要であった.本年度は歯根形成過程でのHertwig上皮鞘(以下HERS),歯小嚢細胞,間葉組織の増殖帯およびセメント芽細胞におけるソニックヘッジホック(SHH)とその下流にあたるGLI1,PTCHの局在,発現について免疫組織細胞化学的な手法を用いて検索した.hybridizationの結果からHERS,間葉組織の増殖帯に局在しているものと予想されるが,結論を導くには本年度の観察結果に加えて来年度も引き観察が必要である.また,昨年度より開始したマウス下顎骨器官培養で培養した歯胚での歯根形成状態の観察およびSHHの局在状況を確認した.マウス下顎骨器官培養では下顎第一臼歯が歯根形成期へ移行する直前である生後5日齢のICRマウスの下顎骨を使用し,7日間培養した.培養歯胚の歯根形成状態を確認するために下顎第一臼歯歯胚のHERS-歯胚全長比を比較した結果,D7ではDOの1.7倍HERSが伸長していた.この結果は他の器官培養報告と比較して遜色のない結果であったが,ヘパラナーゼの局在結果より培養環境で歯根形成後期を再現する必要性が生じた.また,培養装置の形状により培地交換が困難である事や培地の容量から各種因子の阻害剤を多量に必要とする事から各種の改良が必要であると考えられた。そのため,来年度は培養期間の長期化に加えて、培養装置の工夫を新たに行なう予定である.従来のマウス下顎骨器官培養では培養期間の長期化および培養装置の工夫が必要である事が昨年度の結果から判明したため,本年度は歯胚器官培養で実績のあるTrowell培養器を用いたマウス下顎骨器官培養を行った.この方法に変更する事により培地交換が容易となり,培地使用量の減少にもつながった.また,従来14日間行っていた培養を28日間に長期化し、下顎第一臼歯歯胚の歯根形成状態の観察を行った.マイクロCTによる観察では個体差が比較的大きいものの,培養14日目と培養28日目では歯根形成状態に大きな変化を認めなかった.

歯胚発育の悪い個体では歯胚下部の骨の除去が十分ではない場合が多く,この事からマウスからのサンプル採取・調整を一定にする事は困難である事が判明した.また,ヘパラナーゼの免疫組織細胞化学的局在結果より培養環境で歯根形成後期を再現する必要性があるが,培養28日では歯根形成後期まで再現する事は不可能であった.これらのサンプルを用いて,歯根形成過程のHertwig上皮鞘(以下HERS),歯小嚢細胞,間葉組織の増殖帯およびセメント芽細胞におけるソニックヘッジホック(SHH)とその下流にあたるGLI1,PTCHの局在,発現について免疫組織細胞化学的な手法を用いて昨年度に引き続き検索した.また本年度はこれらの因子に加えて、SHHと同様にパールカンより修飾制御されるFGFファミリーについても追加検討した.これらの因子の局在,発現結果は,他の報告で見られるin situ hybridizationの結果よりHERS,間葉組織の増殖帯に局在しているものと予想されるが,明確な結果を得られなかったので,今後も抗体の選択などを検討する必要がある.
GATA転写制御因子の発現調節と病態

1.GATA-4遺伝子の転写は、ラット心臓、胃、精巣でほぼ同じ領域から始まっていた。心筋細胞分化のモデル系P19.CL6細胞において、DMSO誘導時にGATA-4の転写が早期に活性化されること、GATA-4の転写には転写開始点近傍の、E-ボックス配列と2個並ぶGC-ボックス配列が大事であることがわかった。プロモーター領域をGFP遺伝子に融合してP19.C16細胞の染色体に組込むと、E-ボックス配列とGC-ボックス配列が存在する124塩基の領域のみではGFPの発現誘導には不十分で、転写開始点上流の1251312塩基の領域が必要と考えられた。2.cAMP依存のGATA-6分解経路がCHO-K1細胞に備わっていることを明らかにした。GATA-6上の分解に必須な領域について検討を加え、Aキナーゼによるリン酸化部位やC末側PEST配列は関与しておらず、Aキナーゼの標的は他の細胞内蛋白である可能性が示唆された。今後、Aキナーゼ経路の新たなシグナル伝達因子が明らかになることが期待される。3.5'側上流に翻訳開始コドンがin frameでもう一つ存在するため、通常サイズのS型と共に146アミノ酸残基分長いL型が、GATA-6 mRNAから翻訳される。L型特異的な領域の16アミノ酸残基からなる配列が無いと物理化学的性質が変化し、L型は分子サイズが予想より小さくなる。またL型は転写活性化能が高かった。L型特異的領域とどのような蛋白分子が相互作用し、複合体形成や転写制御を調節しているかが興味深い。4.ヒト癌由来の培養細胞のGATA-6の発現を調べたところ、L型及びS型ともに翻訳されていることが明らかになった。GATA-6を介した癌細胞の増殖制御の検討が興味今後深い。本研究においては、(1)GATA-4やGATA-6の遺伝子上流域(プロモーター)の解析、(2)それらGATA因子の機能領域の解明、(3)精巣のライデイッヒ細胞におけるGATA-4依存の転写の総合的な検討、(4)種々薬剤、化合物、内因性のGATA因子と相互作用する調節物質の探索、などを目的として行い、以下のような成果をこれまでに得た。(1)GATA因子の発現制御の評価系構築を目指し、心臓、胃、精巣において転写されるGATA-4のmRNA転写開始点の比較を行った。その結果ほぼ同様の位置から開始していることが判り、転写開始の位置は臓器によらないことを明らかにした。(2)GATA因子の機能の評価系構築を目指し、GATA-4やGATA-6の発現プラスミドを培養細胞に導入し、レポーター遺伝子アッセイが確実に行える実験条件を設定することができた。また、GATA-6のAキナーゼを介する分解経路を明かにする検討を進め、ユビキチンイソペプチダーゼ活性の阻害効果から、確かにプロテアソームを介していることを証明した。(3)精巣のライデイッヒ細胞におけるGATA-4依存の転写を解明する目的で、マウスのTM3,TM4細胞を用いてレポーター遺伝子アッセイを行う系を確立した。(4)GATA因子の分子サイズが詳細に検討されていなかったため、特にGATA-6の翻訳を検討し、複数のmetコドンが開始コドンとして使われていることを明らかにし、さらにその選択機構を解明する糸口を得た。昨年と同様、(1)GATA-4やGATA-6の遺伝子上流域(プロモーター)の解析、(2)それらGATA因子の機能領域の解明、(3)精巣由来の細胞におけるGATA-4依存の転写の総合的な検討、

(4)種々薬剤、化合物、内因性のGATA因子と相互作用する調節物質の探索、などを目的として行い、以下のような成果を本年度は得た。(1)GATA因子の発現制御の評価系構築を目指し、P19CL6細胞が心筋様細胞に分化する系を導入し検討を加えた。その結果、分化時にGATA-4が転写活性化されること、転写開始点はこれまで臓器や他の発現培養細胞で決定した部位と大きく違わないことを明らかにした。(2)GATA因子の機能の評価系構築を目指し、GATA-6がAキナーゼを介して分解される経路を明かにする検討をさらに進めた。比較的低濃度のAキナーゼ阻害剤を加えた時には、Cキナーゼ阻害剤を共存させるとGATA-6の分解が抑制されることを見い出し、複数のキナーゼが関与する可能性を明らかにした。しかし、MAPキナーゼやSrcキナーゼは関与しないことを示した。(3)精巣のセルトリ細胞やライデイッヒ細胞におけるGATA-4依存の転写を解明する目的で、マウスのTM3,TM4細胞を用いてレポーター遺伝子アッセイを行った。その結果、転写開始点のすぐ上流にある2個並んだSp1結合配列とE-box配列が基本転写に重要であることを明らかにした。(4)GATA-6の翻訳を検討し、N末側にあるPEST様配列が分解シグナルとしてではなく、L型の翻訳産物を安定化する可能性を示した。(1)P19CL6細胞が心筋様細胞に分化する系を用い、GATA-4遺伝子上流の配列中で保存されたSp1結合配列とE-box配列の役割、またそれらのモチーフに結合するタンパクを解析することを目指した。その結果、少なくともE-box配列にはdHANDが結合することが示唆された。P19CL6細胞においてGATA-4遺伝子上流配列のどの部分が分化誘導時に働いているのかを明らかにするため、安定導入型のレポータープラスミドを構築した。(2)GATA-6がジブチリルcAMPにより分解誘導される経路について、GATA-6のどの部分が分解に必要なのかを明らかにするため、Aキナーゼによる推定リン酸化部位の変異体やC末側にある分解シグナルとなりうるPEST様配列の欠失体をCHO-K1細胞に安定発現させた。その結果、いずれも分解誘導がかかるため、両部位が分解に必須の配列ではなく、他の細胞内因子がcAMP依存の情報を受取りそれが引き金となりGATA-6が分解されることが示唆された。また、内在性のGC-box結合蛋白質は分解されないため、GATA-6に特異的な分解であることが示された。(3)GATA-6は翻訳時、N末側にあるPEST様配列が分解シグナルとしてではなくL型翻訳産物の安定化に働くので、その分子レベルでの解析を目指し、PEST様配列に変異導入を行ない翻訳のされ方を検討した。後半部分のセリン残基のクラスターをアラニン残基に置換した結果、セリン残基のクラスターは重要ではないことが明かとなった。一方、前半部分のプロリン残基に富んだ部分のプロリン、セリン、スレオニン残基を個々にまたは同時にアラニン残基に置換すると、いずれの場合にも翻訳産物の分子量の低下が見られ、前半部分が全体として役割を果している可能性が示唆された。(1)P19
現行刑法典の成立過程

従来、我が国の刑法学研究は、主として、ドイツ刑法学との関連のうえに行われてきた。それじたいは、我が刑法典が当時のドイツ刑法学に多くのものを学んで成立したものである以上、当然のことであるといえよう。しかし我が刑法典の成立過程を明らかにすることなしに、その性格および各条項の意味を十分に理解することは因難であろう。本研究は、このような我が国の刑法学研究の方法において欠けていたと思われる点を修正しようとして、開始されたものであった。そのため、これまで各研究分担者が旧刑法と現行刑法の各条項を比照し、新設規定,削除規定,構成要件や法定刑等に部分的変更のあった規定を抽出確認したうえ、各草葉の理由書ならびに議事録その他の文献資料により、その意義を確認することに務めてきた。特に、本年度は、現行刑法成立後に行われた数次にわたる刑法の部分的改正について、これに関する資料の発見・収集・分析を行うとともに、大正10年以降企図された刑法の全面的改正に関する各改正案についても、同様の作業をつづけてきた。その結果、倉橋他編「刑法沿革綜覧」に収録されている明治23年改正案から同34年改正案に至る過程において、ここには収録されていない現行刑法の原型となる重大な改正案が刑法審査会及び法典調査会によって作成されていることが確認された。そこには、罪刑法定主義に関する規定の削除、競合犯についての吸収主義の排除、加重単一刑主義の原則的採用等、現行刑法の基本的思想の基礎が確立されている。このような旧刑法及び明治23年改正案からの刑法上の基本的思想の転換は、帝国議会創設後の明治国家体制の確立と無縁ではあるまい。我々の研究は、ひとり刑法学にとどまらず、さらに法制史学、法社会学の領域にも貢献しうる膨大な知見を得たものであると自負するものである。
純音同定における聴覚的注意の効果の検討 -感受性、反応バイアス、反応時間による分析-

本研究では、純音同定実験で刺激と同一周波数の純音を手がかりとして呈示し、特定周波数への選択的注意の効果を検討した。使用した刺激は3周波数(100、1000、8000Hz)と4強度(60、63、66、69Hz)の組み合わせからなる12個で、呈示時間200ミリセカンドであった。刺激音と同一周波数の音を手がかりとして呈示する条件(手がかり条件)と手がかりが全く呈示されない条件(手がかり無し条件)で実験を行い、2条件の刺激強度同定の反応時間と正答率を測定した。そして、正答率から感受性と反応バイアス(信号検出理論のd′とβ)を計算した。現時点では2実験が終了した。実験結果は次の通りである(Mori,1995)。1.手がかり条件では手がかり無し条件と比べて平均反応時間が約100ミリセカンド速く、d′も高いが、βは2条件でほとんど同じであった(実験1、2)。2.周波数による同定反応の変化は観察されなかった(実験1、2)。3.60dBと69dBの反応時間は63dBと66dBと比べて速く、d′も高かった(実験1、2)。4.手がかり音と刺激音の時間間隔を02000ミリセカンドの間で変化させると、時間間隔が短くなるほど2条件の反応時間とd′の相違が小さくなった(実験1)。5.手がかり音の呈示時間を201000ミリセカンドで変化させると、100ミリセカンドの呈示時間で2条件の反応時間とd′の相違が最も大きくなった(実験2)。以上の結果は、手がかり音によって聴取者の注意が刺激音の周波数に誘導されるため、刺激への感受性は向上するが、反応バイアスは変化しないことを示している。また、注意誘導による促進効果も手がかり音と刺激音の時間間隔や手がかり音の呈示時間に依存することを示唆しており、これは視空間注意の結果と類似している(森,1995)。
ダイコン変異体の解析による自家不和合性反応に関与する未知因子の同定

本研究は、偶発的に見出された自家和合性を示すダイコン変異体における自家和合性の原因を探り、自家不和合性に関与する未知の因子を同定し、自家不和合性反応の分子機構の全容解明につなげていくことを目的としている。そこで期間を通して、1.ダイコンS遺伝子の整備と変異体のS遺伝子型同定、2.既報の自家不和合性関連遺伝子の検証、3.新規原因遺伝子の探索、4.候補遺伝子の分子遺伝学的を行う。本年度は3の課題に着手し進めた。3ー1.リ・シーケンスによるDNA多型の探索自家和合性変異体と、そのもとになった品種(野生型)のゲノム塩基配列を、次世代シーケンスにより決定した。変異体と野生型の品種それぞれから2個体を供試し、72.58 Gbの品質の高い塩基配列情報を得た。得られたリードの配列をダイコンゲノムのリファレンス配列にマッピングした結果、9597%の率でマッピングされた。その情報をもとに、リファレンス塩基配列に対するSNPを検出し、さらにそれらSNP座における変異体と野生型品種間のSNPを調査した。その結果、コーディング領域において、変異体2個体間で再現性があり、かつ、非同義的置換を引き起こす3,723のSNPが見出された。しかしながら予想より多くSNPが検出されたことから、これらSNPを絞り込むべく、QTL解析を行うこととした。3ー2.QTL解析自家和合性変異体とハマダイコンを交雑親とするF1個体を作出し、さらにF1世代の2個体を栽培して自殖し、F2分離世代を得た。F1世代に由来するF2世代の約100個体(分離集団)を栽培し、自家不和合性の程度を調査した。F1世代は自家不和合性を示したが、F2世代の分離集団は自家不和合性と自家和合性に二分され、分離比が約9:7に分離した。一方で、F2集団のゲノムワイドな多型を得るために、MIG-Seq法とRAD-seq法の両方法で分析を進めている。計画どおり、変異体の元になった親品種と変異体の両方をリシーケンスして塩基配列情報を得、両者のSNP検出を行った。しかしながら、変異候補のSNP数が多いことからリシーケンス情報のみによる変異箇所の同定は困難であると判断した。このことは想定の範囲内であり、その回避策として計画していたQTL解析も進めることとした。F2分離集団の表現型分析を終え、遺伝子型分析を迅速に得るために、2方法で分析を進めているところであり、関連する遺伝子座の検出が得られると期待される。検出されるQTL座の近傍と、リシーケンスで得たSNP情報を照合し、変異候補箇所を絞り込んでいくことができると考えている。リシーケンスによる変異型SNPの検出の結果、非常に多くの多型が検出されたことを受け、本研究課題にて計画していた別のアプローチとして、QTL解析も進めることとした。自家和合性変異体と野生型(自家不和合性)個体のF1およびF2分離集団を作出し、自家不和合性・和合性検定を行っている。また、F2分離集団のゲノムワイドな遺伝子型分析を迅速に進めるために、次世代シーケンサーを利用したMIG-Seq法やRAD-seq分析法を取り入れている。分離比から、2因子の補足遺伝子による支配であると推測されたため、関与する遺伝子の座を容易に特定することができると考えている。再現性を得るために、もう一度QTL解析を行うが、同様に迅速に2回目の試験を実行していく。検出された関与領域のゲノム塩基配列は、研究代表者が独自に整備したダイコンゲノム情報を参照できるため、リシーケンスで得られたSNP情報とともに、関与遺伝子の絞り込みを進めて行く。絞り込んだ遺伝子を候補遺伝子として、遺伝子の発現量、発現場所を中心に、RNAまたはタンパク質量を指標にさらに分子遺伝学的にその特性の分析を詳細に進めていく。1.ダイコンSハプロタイプの整備独自に揃えた23個のSハプロタイプについてのホモ系統のうち、12のSハプロタイプについて、SCR, SRKまたはSLG対立遺伝子の塩基配列決定を進めていた。残り11個についてそれぞれの対立遺伝子の塩基配列決定を試み、SCR, SRKまたはSLGの全てまたはいずれかの塩基配列を決定した。SCR対立遺伝子特異的なプライマーをデザインし、変異体のS遺伝子型を調査した結果、変異体はS-23ハプロタイプであることが分かった。2.既報の自家不和合性関連遺伝子の検証変異体がもつS-23ハプロタイプのSCR, SRK遺伝子において、機能喪失に結びつくような塩基配列の変異は無く、また、いずれの遺伝子も正常に発現していた。現在考えられているシグナル経路のMLPK1、ARC1、Exo70A1遺伝子は正常に発現していた。MLPK遺伝子においては、form1型のMLPKにフレームシフトを引き起こす1塩基挿入が見られたが、柱頭特異的なform2型は正常な塩基配列を有していた。

また、この1塩基多型は自家不和合性を示す他の系統にも存在することから、自家和合性を引き起こす変異ではないことを確認した。これらの遺伝子と自家和合性との連鎖関係を調査したが、いずれも連鎖関係はなかった。変異体の元になった親品種と変異体の両方をリシーケンスした。現在両者間の多型の箇所を精査している。当初の計画では、変異体の元になった親品種と変異体の両方をリシーケンスして、変異体特異的な多型の同定と自家和合性原因遺伝子の候補を推定し終えているところであるが、リシーケンスに時間がかかったため、予定より進捗がやや遅れている。また、両者間の多型の箇所が予想より多いことが分かり、これがシーケンスミスによるものなのか否かを含め、精査しているところである。本研究は、偶発的に見出された自家和合性を示すダイコン変異体における自家和合性の原因を探り、自家不和合性に関与する未知の因子を同定し、自家不和合性反応の分子機構の全容解明につなげていくことを目的としている。そこで期間を通して、1.ダイコンS遺伝子の整備と変異体のS遺伝子型同定、2.既報の自家不和合性関連遺伝子の検証、3.新規原因遺伝子の探索、4.候補遺伝子の分子遺伝学的を行う。本年度は3の課題に着手し進めた。3ー1.リ・シーケンスによるDNA多型の探索自家和合性変異体と、そのもとになった品種(野生型)のゲノム塩基配列を、次世代シーケンスにより決定した。変異体と野生型の品種それぞれから2個体を供試し、72.58 Gbの品質の高い塩基配列情報を得た。得られたリードの配列をダイコンゲノムのリファレンス配列にマッピングした結果、9597%の率でマッピングされた。その情報をもとに、リファレンス塩基配列に対するSNPを検出し、さらにそれらSNP座における変異体と野生型品種間のSNPを調査した。その結果、コーディング領域において、変異体2個体間で再現性があり、かつ、非同義的置換を引き起こす3,723のSNPが見出された。しかしながら予想より多くSNPが検出されたことから、これらSNPを絞り込むべく、QTL解析を行うこととした。3ー2.QTL解析自家和合性変異体とハマダイコンを交雑親とするF1個体を作出し、さらにF1世代の2個体を栽培して自殖し、F2分離世代を得た。F1世代に由来するF2世代の約100個体(分離集団)を栽培し、自家不和合性の程度を調査した。F1世代は自家不和合性を示したが、F2世代の分離集団は自家不和合性と自家和合性に二分され、分離比が約9:7に分離した。一方で、F2集団のゲノムワイドな多型を得るために、MIG-Seq法とRAD-seq法の両方法で分析を進めている。計画どおり、変異体の元になった親品種と変異体の両方をリシーケンスして塩基配列情報を得、両者のSNP検出を行った。しかしながら、変異候補のSNP数が多いことからリシーケンス情報のみによる変異箇所の同定は困難であると判断した。このことは想定の範囲内であり、その回避策として計画していたQTL解析も進めることとした。F2分離集団の表現型分析を終え、遺伝子型分析を迅速に得るために、2方法で分析を進めているところであり、関連する遺伝子座の検出が得られると期待される。検出されるQTL座の近傍と、リシーケンスで得たSNP情報を照合し、変異候補箇所を絞り込んでいくことができると考えている。