hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重力支配域における氷のクレータースケール則の確立と冥王星の進化史の解明

また、既存の高速度衝突装置を用いた多孔質氷の高速度クレーター形成実験を開始した。冥王星は50K以下と極低温で、その表面の水氷は未焼結状態であると考えられている。未焼結の氷粒子集合体を標的としたクレーター形成実験を行うため、前年度から新たな弾丸加速装置の開発を行っている。装置は、設置を予定していた低温装置付きチャンバーではなく、低温室内の大型チャンバー(真空度20Pa)に取り付けた。これにより、より簡易に発射準備ができるようになった。この装置は高圧部に導入するHeガス量と弾丸の質量によって、速度を制約する仕組みとなっている。そこで、銃身内径と同じ直径4.5mmのポリアセタール球を弾丸に用いて、ガス量を0.5-11気圧まで変化させて弾丸速度を調べた。その結果、110-165m/sと変化することが確認された。また,直径2mmの弾丸を加速するため、サボシステムを用いた弾丸加速を行った。その結果、弾丸のみを標的に衝突させることに成功し、その速度は60-180m/sとなることが確認された。小天体は数km/sで冥王星に衝突することも考えられるが、上記の装置では高速度は再現できない。そこで、既存の高速度衝突装置を用いた雪のクレーター形成実験を開始した。標的は、2-7日間焼結させた空隙率50-60%の雪を用いた。弾丸は2mmのアルミ球で、衝突速度は2.5または4km/sとした。その結果、標的中央に形成された深い孔周囲にスポールと呼ばれる引張力によって形成した浅い孔が確認された。さらに、深い孔の壁面と貫入した弾丸の周囲には衝突溶融層、さらに深い孔の入口には圧密層が観察された。29年度は、新たな弾丸加速装置を開発・導入し、予備実験により装置の特性であるガス量と衝突速度の関係を、大気圧下および真空下、両方において明らかにすることが出来た。そして、銃身内径より小さな弾丸も、サボシステムを用いて加速することに成功した。この予備実験により、未焼結雪を用いたクレーター形成実験を開始することができる。ただし、そのためには、サボシステムを用いた弾丸加速において、弾丸の後方から加速されてくるHeガスが、サボストッパーによって完全に停止し、標的に弾丸が衝突した後にHeガスによって標的からの噴出物の軌道が乱されないかを確認する必要がある。29年度はそのガス停止確認実験を行うまでに留まり、未焼結雪を用いた実験まで至ることができなかった。一方で、サボシステムによって後続ガスが停止するかは現在試験を行っているところであり、まもなく完了する予定である。また、未焼結雪の作成方法の確立も現在行っているところであり、その後すぐに未焼結雪のクレーター形成実験は開始することができる。さらに、幅広い衝突速度でクレーター形成実験を行う必要があることがわかったため、そちらは既存の装置を用いて29年度末から開始し、継続して今年度も行うことにしている。以上のことから、未焼結雪を用いたクレーター形成実験の開始まで至っていないが、その準備はほぼ完了していることから、「やや遅れている」という判断をした。30年度は前年度開発した装置を用いて,極低温下における未焼結多孔質氷のクレーター形成実験を行った.また,前年度に引き続き,既存の高速度衝突装置を用いた多孔質氷の高速度クレーター形成実験を行った。
在宅ケアにおける医師の指示と訪問看護婦の業務範囲と法的責任

今回、医療依存度の高い患者を対象とした61項目全てが実施されており、うち実施割合が5割を超えるのは36項目,管理・指導に関する全15項目は「対象患者がいれば実施する」を合わせると50%を超え、今後、積極的に実施していく行為と考えられる。「実施しない,するつもりはない」の割合が高い4項目は、施設の「しない規則になっている」割合の高い項目と一致していた。「褥創の処置」を除く全項目において、この割合が高く看護婦の判断で実施を見合わせていることが推測される。グレイゾーンの9項目から、一人で実施する機会の多い在宅ケアでは、「する」か「しない」かのいずれかに意思決定がされていることが窺われる。訪問看護ステーションよりも病院基盤の施設の方に実施割合は高く、医療器械,滅菌操作,異物挿入,薬液注入に関連するものに差がみられた。訪問看護経験年数を5年目で区分し実施割合を比較してみると、病院基盤の施設には差はなく、訪問看護ステーションでは5年未満の者に高い項目がみられ、5年未満の者のみの比較でも病院基盤の実施割合が高い。臨床経験部署別では、実施割合に差はみられない。以上の実施状況から、設置主体、経験年数により特徴がみられ、また、施設の方針よりもサービスの直接の提供者である看護婦自身の状況判断が優先されていることが窺われた。医療依存度の高い患者を対象とする訪問看護を推進するには、各施設で看護婦の具体的業務内容及び、医師の指示は「包括的」か「個別・具体的」であるべきかについても書面で明示される必要があり、これにはプロトコール等の規定が有効である。今後、アメリカのナ-ス・プラクティショナ-のように薬剤をプロトコールに基づいて使用するには、より実践的で高度な知識・技術を研修等により修得する必要がある。在宅サービスを効果的かつ効率良く提供していく上で、今後整備すべき一つの方向性が明らかにされたといえる。研究の方向と計画についての打ち合わせを行い、調査票項目作成の準備として訪問看護ステーションの施設長に面接調査を行った。各施設で実施されている看護業務と、その時の状況について聞き取り調査を実施したところ、訪問看護婦は、医師の在宅ケアに対する理解と判断力・技術能力を査定し「指示」を求めていた。また、施設の方針として指示があっても受けない行為を定めており、訪問看護婦が主体的に看護業務・行為を自制している状況が窺われた。これらの状況は、医師の指示・訪問看護婦の責任範囲を規定し、教育のあり方やプロトコールに関わる問題を新たに提供するものである。以上の視点をふまえて調査票を作成し、平成6年度までに開設した全国の訪問看護ステーションと訪問看護実施病院に、平成8年3月に調査票を発送したところである。回収後には、次の視点で分析する予定である。在宅ケアで訪問看護婦が、1.自身の判断で実施しているもの,2.現状では実施するつもりはないもの,3.将来、条件が揃えば実施したいと考えているもの,4.医師の個別的・具体的指示の基に実施されているものに分類し、実施していないものについてはその理由を明らかにする。地域別,施設別にも分析する。I.回収状況:配布数933,回収数315,無効回答数28,有効回答287(28.9%)II.調査結果1.属性:病院基盤136(47.4%),訪問看護ステーション109(38%),不明42(14.6%)2.実施状況:

1)今回調査した61全行為項目が実施されており、50%を超えていた22項目の内、管理・指導に関するものは服薬,膀胱留置カテーテル,経管栄養,在宅酸素療法,自己注射,気管カニューレである。処置は、褥創・創傷処置,機能回復訓練,気管内吸引,経管栄養,膀胱留置カテーテル交換,吸入(ネブライザー)である。これらの処置は、「対象患者がいれば実施する」を含めると90%以上となる。褥創の処置は全施設が実施している。このことは、在宅ケアの対象者のADLは低く医療依存度の高いことを示している。2)(1)「実施している」,(2)「対象患者がいれば実施する」,(3)「将来的に実施したい」に重複回答はほとんどみられず、(1)に(2)を加えると36項目が50%を超える。3)その一方で、1)の内、(4)「対象患者がいるが実施していない」と(5)「対象患者がいても現状でも実施するつもりはない」を加えた率が30%を超えるものは、褥創の壊死部の処置,気管カニューレ(金属)の交換,天滴注射の実施の3項目である。(1)+(2)+(3)を実施する意思がある行為とすると(4)+(5)は、実施する意思のない行為といえるが、在宅ケアに携わる看護職者間で実施判断が異なり、その差がみられるものといえる4)「褥創の処置」を除いた全項目で、(4)+(5)(していない,するつもりはない)の率が、「看護婦は実施しない規則になっている」という施設方針の率よりも多くなっている。このことから、対象者、現場の状況その他の理由により実施者である看護職者自身の判断により実施を見合わせていることが窺われる。5)(4)+(5)が、50%を超えるものは、動脈採血,抗ガン剤のワンシヨツト,気管内洗浄,死亡時刻の確認の4項目である。これらは、通常、病院内では医師が実施しているものである。平成9年度は、1)看護職者間で実施,判断の異なる項目とその理由,2))年齢,臨床経験,教育背景による違い,3)医師の支持状況,4)施設間の違い等の視点から分析していく。今回、医療依存度の高い患者を対象とした61項目全てが実施されており、うち実施割合が5割を超えるのは36項目、管理・指導に関する全15項目は「対象患者がいれば実施する」を合わせると50%を超え、今後、積極的に実施していく行為と考えられる。「実施しない、するつもりはない」の割合が高い4項目は、施設の「しない規則になっている」割合の高い項目と一致していた。「褥創の処置」を除く全項目において、この割合が高く看預婦の判断で実施を見合わせていることが推測される。クレイゾーンの9項目から、一人で実施する機会の多い在宅ケアでは「する」か「しない」かのいずれかに意思決定がされていることが窺われる。訪問看護ステーションよりも病院基盤の施設の方に実施割合は高く、医療器械,滅菌操作,異物挿入,薬液注入に関連するものに差がみられた。訪問看護経験年数を5年目で区分し実施割合を比較してみると、病院基盤の施設には差はなく、訪問看護ステーションでは5年未満の者に高い項目がみられ、5年未満の者のみの比較でも病院基盤の実施割合が高い。臨床経験部署別では、実施割合に差はみられない。以上の実施状況から、設置主体,経験年数により特徴がみられ、また、施設の方針よりもサービスの直接の提供者である看護婦自身の状況判断が優先されていることが窺われた。
磁性ナノ粒子を用いた毛細血管を含む三次元組織構築法の開発

本年度は、昨年度に引き続き、磁力を用いた細胞パターニング法についての研究を行った。細胞パターニングとは、細胞を目的の場所に配置させる技術の事であり、組織工学や細胞解析において有用な技術である。現在、開発されている細胞パターニング法は、高価な装置や煩雑な処理が必要である場合が多い。そのため、現在用いられている手法では、組織工学への応用が限られてしまう。したがって、組織工学では新たな細胞パターニング法の開発が求められている。我々の研究室では、磁性ナノ粒子と磁力を用いた組織工学を提案.しており、新たな三次元組織構築法を開発している先この手法では、磁性ナノ粒子で磁気ラベルした細胞を磁力で目的の場所に配置させて、組織を構築している。本研究では、緻密な組織の構築を目指し、細胞をマイクロメートルオーダーでパターニングする技術の開発を行った。具体的には、デバイスの作製、磁気シミュレーションによる磁力の解析、パターニングした細胞のアッセイや組織構築に関する研究を行った。デザインした毛細血管様組織を構築するために、非常に薄く直線状に加工した鉄製のデバイスを磁化して、直線状の細胞パターニングを行った。この技術を用.いて、マトリゲル上でヒト血管内皮細胞を直線状にパターニングして血管新生を誘導し、直線状にデザインした毛細血管組織を作製した。また、低接着性の培養皿上で細胞パターニングを行い、紐状組織の作製と回収を行った。これらの結果は、血管や腱、筋組織の構築に繋がる結果である。したがって1本研究では、組織工学において有用な手法を開発できたと考えられる。この他に、細胞をアレイ状に配置させる研究も行っており、毛細血管以外の組織構築9)可能性を示した。このように、今年度の研究では複雑な毛細血管を含む組織構築に向けた技術を開発できた。我々は磁性ナノ粒子と磁力を用いた三次元組織構築法の開発を行ってきた。これまでに、我々は表皮細胞シートや心筋細胞シートなどの構築に成功している。しかし、三次元的な組織を作製した場合、組織内まで酸素や栄養が行き渡らないため、移植後の組織が機能しない場合が考えられる。そこで、私は組織内に血管を含ませる研究を行った。我々が開発した手法である磁性ナノ粒子を用いた三次元組織法では、組織を回収する際に酵素処理が必要ない。したがって、組織として重要な成分である細胞外マトリクスが、作製した組織内に保たれたままであると考えた。そこで、組織断面の免疫染色を行ったところ、作製した組織内にフィブロネクチンやコラーゲンといった細胞外マトリクスの成分が含まれている事が確認できた。そこで、作製した組織とヒト血管内皮細胞(HUVEC)を共培養させたところ、血管新生を誘導させ、作製した組織内に毛細血管を形成させる事に成功した。今後の課題としては、心臓のような複雑な組織の構築が挙げられる。しかし、これらの組織内では細胞が配置され機能しているため、生体に近い複雑な組織を作製するためには、細胞を精密に並べる必要がある。つまり、細胞をパターニングさせる技術の開発が重要である。そこで私は、磁性ナノ粒子と磁力を用いて細胞を並べる技術を開発し、デザインした毛細血管様組織の構築を行った。この技術は複雑な装置を必要とせず、簡単な手法であるため、様々な分野で有用なツールであると考えられる。また、物理的な力で細胞を配置させているため、ゲルや低接着性の培養皿上でも細胞のパターニングが可能であるという大きな利点を持っている。私はこの技術を用いて、パターン化した毛細血管様組織を構築した。またHUVECの紐状組織の作製を行い、回収にも成功した。今年度の研究により、毛細血管を含む生体に近い組織とデザインした毛細血管様組織の構築が可能になったと考えられる。

この他に、細胞をアレイ状に配置させる研究も行っており、毛細血管以外の組織構築9)可能性を示した。このように、今年度の研究では複雑な毛細血管を含む組織構築に向けた技術を開発できた。
マルチプルカルボキシラ-ゼ欠損症の分子生物学的研究

新生児型マルチプルカルボキシラ-ゼ(MCD)欠損症は生後まもなくから著明な代謝性アシド-シスを呈する有機酸代謝異常症である。本症の一次性障害はアポカルボキシラ-ゼにビオチンを結合するホロカルボキシラ-ゼ合成酵素(HCS)にある。本研究の目的は本症の病因病態を分子レベルで明らかにすることがある。1.ヒトHCScDNAのクロ-ニングHCSを先ず牛肝細胞質分画より精製した。その方法は硫安分画、アルミナゲル、DEAEセファロ-ス、CLー6B、セファクリルSー200HR、ハイドロキシアパタイト、フェニルスウパ-ロ-スHRによった。分子量は67,000であり,モノメトリックな酵素である。精製酵素をAchromobacter protese Iで消化後、アミノ酸配列の分析を行った。得られたアミノ酸配列の情報をもとに、オリゴヌクレオチドを合成し、牛肝cDNAライブラリ-から牛HCScDNAを得た。牛HCScDNA断片をプロ-ブとして、ヒト肝cDNAライブラリ-をスクリ-ニングし、全長cDNAを単離し構造解析をおこなった。現在、HCS欠損症患者の遺伝子変異を検索中である。2.HCS反応機構HCS反応はアポカルボキシラ-ゼとビオチンを結合してホロカルボキシラ-ゼにする反応である。ビオチンとATPからbiotinylーAMPを生成する第一段階とbiotinylーAMPとアポカルボキシラ-ゼを基質としホロカルボキシラ-ゼを生成する第2段階の2段階反応からなる。この2段階反応が同一酵素によってなされるか否かについては未だ明かではない。今回我々はMCD欠損症由来培養リンパ茅球でHCSの2段階反応が共に欠損していることを明かにし、2段階反応が単一酵素によってなされることを示唆した。新生児型マルチプルカルボキシラ-ゼ(MDC)欠損症は生後間もなくから著明な代謝性アシド-シスを呈する有機酸代謝異常症である。本症の一次性障害がホロカルボキシラ-ゼ合成酵素(HCS)にあることを明らかにするとともに、分子レベルでの病態解明を目的としてHCSの精製に着手した。1.簡易HCS活性測定法の開発とそれを用いての酵素診断法の確立;測定原理はアポプロピオニルCoAカルボキシラ-ゼ(PCC)を基質としてビオチン、ATPの存在下でのPCC活性の上昇を見ることによってHCS活性を測定した。この際、基質としてHCS欠損患者由来のリンパ芽球のPCC(ほとんどがアポ酵素として存在)を使用したのが特色である。この方法で正常人由来リンパ芽球のHCS活性の平均は3.1U/mg proteinで2例の患者の活性は各々0.38,0.76U/mgであった。本法は従来のビオチン欠乏から精製したアポPCCを基質とした方法と異なり、培養リンパ芽球のアポPCCを利用するため、必要なときに何時でも測定可能であり、臨床的にきわめて有用である。2.牛肝細胞質よりのHCSの精製;牛肝細胞質分画より硫安分画、アルミナゲル、DEAEセファロ-スCLー6B、セファクリルSー200HR、ハイドロキシアパタイト、フェニルスウパ-ロ-スHRで精製した。分子量は67,000であり、モノメトリックな酵素であると考えられる。3.牛HCScDNAのクロ-ニング;精製酵素のアミノ酸配列をもとに合成したオリゴヌクレオチドを用いて牛肝cDNAライブラリ-からHCScDNAを得た。新生児型マルチプルカルボキシラ-ゼ(MCD)欠損

症は生後まもなくから著明な代謝性アシド-シスを呈する有機酸代謝異常症である。本症の一次性障害はアポカルボキシラ-ゼにビオチンを結合するホロカルボキシラ-ゼ合成酵素(HCS)にある。本研究の目的は本症の病因病態を分子レベルで明らかにすることにある。1.ヒトHCScDNAのクロ-ニングHCSを先ず牛肝細胞質分画より精製した。その方法は硫安分画、アルミナゲル、DEAEセファロ-スCLー6B、セファクリルSー200HR、ハイドロキシアパタイト、フェニルスウパ-ロ-スHRによった。分子量は67,000であり、モノメトリックな酵素である。精製酵素をAchromobacter protease Iで消化後、アミノ酸配列の分析を行った。得られたアミノ酸配列の情報をもとに、オリゴヌクレオチドを合成し、牛肝cDNAライブラリ-から牛HCScDNAを得た。牛HCScDNA断片をプロ-ブとして、ヒト肝cDNAライブラリ-をスクリ-ニングし、全長cDNAを単離し構造解析をおこなった。現在、HCS欠損症患者の遺伝子変異を検索中である。2.HCS反応機構HCS反応はアポカルボキシラ-ゼとビオチンを結合してホロカルボキシラ-ゼにする反応である。ビオチンとATPからbiotinylーAMPを生成する第一段階とbiotinylーAMPとアポカルボキシラ-ゼを基質としホロカルボキシラ-ゼを生成する第2段階の2段階反応からなる。この2段階反応が同一酵素によってなされるか否かについては未だ明かではない。今回我々はMCD欠損症由来培養リンパ芽球でHCSの2段階反応が共に欠損していることを明かにし、2段階反応が単一酵素によってなされることを示唆した。
パンコムギのもつコムギ連近縁種との交雑バリアーに関する分子細胞遺伝学的解析

パンコムギの染色体置換系統を元にして開発した組換え近交系統を利用してライムギとの交雑親和性に関するQTL解析を行ったところ、交雑親和性遺伝子がパンコムギの5B染色体短腕に位置することが判明した。共焦点レーザー顕微鏡によるライムギ花粉のパンコムギ雌蕊での花粉管伸長の観察から、パンコムギの交雑親和性と花粉管長との間に有意な相関がみられた。これらのことから、交雑親和性は、5B染色体短腕に位置するSkr遺伝子が異種花粉の花粉管の伸長を雌蕊内の花柱で阻害していることによることが明らかとなった。パンコムギの交雑親和性は、遠縁交雑の花粉を拒絶する生殖隔離の機構である。パンコムギの交雑親和性は5B染色体長腕に座乗するKrl遺伝子が最も強く関与していると考えられてきた。本年度は、交雑親和性遺伝子座に連鎖する分子マーカーを捜索するために、CS/Hope RIL集団において、ライムギとの交雑結実率でQTL解析を調査した。この結果、5B染色体短腕末端のSSRマーカーのみにQTLが検出され、長腕側のKrl領域にはQTLは検出されず、このマッピング集団では交雑親和性の形質はSkr遺伝子座のみが分離していると考えられた。この集団はKrlの座乗位置を決めたテロソミックマッピングに用いられた組み合わせであることから、交雑親和性を制御しているKrlは短腕のSkrに相当すると考えられた。この形質は花粉管伸長との相関が高く、Skr遺伝子の効果が異種花粉管の伸長阻害であることを明らかにした。また、CS/Cheyenne、CS/Mara、CS/Hopeの3集団で比較マップを行ったところ、交雑親和性はcfb306、cfb341、gwm234のSSRマーカーにおいて強い連鎖を示すことが示唆された。これらのマーカーは、コムギ遺伝資源プール活用のため、交雑親和性遺伝子の導入を行う際のマーカー利用選抜育種に有効であると期待できる。これらの集団より,、準遺伝子同質系統を作成のための戻し交雑を行い、Skrヘテロ接合型でもマーカー利用選抜が有効であることを確認した。パンコムギの近縁異種植物との交雑親和性に関与する遺伝子はパンコムギの第5同祖群染色体に座乗していることは明らかとなっている。いずれも異種植物の花粉を授精させた場合に、授精を抑制する優性遺伝子である。それらの中でも、5B染色体に座乗するKr1遺伝子が最も抑制効果が大きい。Kr1遺伝子の座乗位置については5B染色体長腕であると考えられてきたが、最近、5B染色体短腕に大きな効果をもつSkr遺伝子の存在が明らかとなった。そこで、従来、交雑親和性遺伝子の分析に用いられてきたパンコムギ品種Hopeについて、一昨年の結果を再検証すべく、新たにCS/Hope5BのRIL集団においてQTL解析を行うとともに、共焦点顕微鏡を用いて花粉管の伸長について詳細な観察を行った。その結果、5B染色体上で交雑親和性に関与する遺伝子は、明らかにSKrであり、従来考えられていた5B染色体長腕上のKr1遺伝子は存在しないという結果を得た。また、ライムギとの交雑によって得られる雑種種子形成率によって測定される交雑親和性と、パンコムギ柱頭から花柱に至るライムギ花粉の花粉管伸長の程度とが相関関係にあることが判明した。以上のことから、パンコムギにおける交雑親和性を制御する遺伝子は5B染色体短腕上のSkrと命名された遺伝子であり、これが従来のKr1に相当するものであって、5B染色体長腕には交雑親和性に関与する遺伝子は存在しないと結論できる。パンコムギには近縁のコムギ連植物との間に交雑親和性に関する遺伝的変異が存在し,その遺伝学的分析が行われてきた。本研究は,特に大きな効果をもたらすことが判明しているパンコムギの5B染色体に座乗する遺伝子の座乗位置の特定とその機能を明らかにし、その遺伝子に対応するDNA断片の単離を目ざすものである。昨年度、コムギ品種Chinese Spring(CS)へ品種Hopeの5B染色体を導入した系統に由来する組換え近交系集団を用いたQTL分析の結果、品種Hopeのライムギに対する交雑親和性が5B染色体短腕に座乗するSkr遺伝子によることを明らかにした。今年度はさらにその普遍性を明らかにする目的で、コムギ品種Maraのもつ交雑親和性遺伝子がSkrと同一のものかどうかを確認すれため、CS(Hope5B)及びCS(Mara5B)の二つの染色体置換系統に由来する組換え近交系集団を用いてQTL解析を行った。その結果、両系統に関する集団において交雑親和性がSkrによるものであることが明らかとなり、その座乗位置を5BS上に特定することができた。

すでに、パンコムギ品種Cheyenneのもつ交雑親和性遺伝子も5B染色体上の遺伝子によることを明らかにしている。これらのことから、パンコムギのライムギに対する交雑親和性は5B染色体短腕に位置するSkrと命名された遺伝子に制御されていることが明らかとなった。さらに、この遺伝子の作用を明らかとするため、共焦点レーザー顕微鏡による雌蕊内での花粉管伸長を観察した。ライムギとの交雑親和性の高い品種Chinese Spring(CS)と低い品種Hope、Cheyenne、及びMaraの5B染色体を置換した系統を用いて調査したところ、交雑親和性の低い品種においては、花粉管の身長が柱頭及び花柱で阻害されており、花粉管の長さが交雑親和性の高低と高い相関関係にあることを見出した。パンコムギの異種植物との交雑親和性を制御する遺伝子が5B染色体短腕に座乗することが明確に示されたこと、および花粉管の伸長の程度と交雑親和性との間に相関が存在することを明らかにしたことにより、おおむね順調であると自己評価した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、本遺伝子がどのような性質の遺伝子であるのか明らかにする必要があり、そのためマップベースクローニングを検討したが、パンコムギのゲノムサイズの大きさと分子マーカーの密度を考慮すると、その手法は困難であることから、イネやBrachypodiumとのゲノムシンテニーから該当する遺伝子の探索を行うこととしている。また、5A染色体、5D染色体上の同祖遺伝子についても解析のための材料づくりを開始する。
他花受粉性ハウス作物における送粉昆虫マメコバチの実用化

他花受粉性のハウス作物(イチゴ,メロン,トマトなど)の送粉昆虫としてマメコバチを実用化し,農業技術として普及させるには商品化を図る必要がある.これを具現するには,1.周年利用できる管理技術の開発,2.大量増殖法の開発,3.人工巣の開発,4.受粉効果の実証が不可欠である.本科研では,これらの4つの課題について次のような成果を得た.1.前蛹態の発育遅延性を利用することで,長期間発育を抑制できた.最適温度は10°Cで,この温度下で420日間は生存率を低下させることなく貯蔵できた.利用までの手順は,A(前蛹を10°Cで保存)-B(前蛹を22°Cで加温して蛹化)-C(蛹を26°Cで加温して羽化)-D(羽化した成虫を26°Cで加温して糖類の蓄積促進)-E(成虫休眠を5°Cで覚醒)となる.B,C,Dは最短日数で処理することが好ましい.そうすれば,Bは約20日間,Cは約25日間,Dは約20日間である.Aでは最大420日間,Eでは最小90日間,最大270日間延長が可能である.AEを合計すると,755日間も保留できる.利用時期に合わせてAとEを任意に操作すればよい.2.レンゲは開花期間が長い.休閑田を利用すれば大量の花資源が準備できる.ここで放飼することで,増殖比率(生産されたメス数/放飼メス数)は6にまで達した.また,良質の繭が生産された.北日本におけるリンゴ園での増殖比率は23である.3.人工巣は紙筒である.これらを発砲スチロールの溝に挿入した.発砲スチロール板と紙筒を着色することでハチの巣の識別能力を促進できた.4.イチゴとトマトで受粉効果を実証した.イチゴでの受粉効果は抜群で,花粉採餌蜂であればわずか15個体/5アールで経済的なイチゴの生産ができた.他花受粉性のハウス作物(イチゴ,メロン,トマトなど)の送粉昆虫としてマメコバチを実用化し,農業技術として普及させるには商品化を図る必要がある.これを具現するには,1.周年利用できる管理技術の開発,2.大量増殖法の開発,3.人工巣の開発,4.受粉効果の実証が不可欠である.本科研では,これらの4つの課題について次のような成果を得た.1.前蛹態の発育遅延性を利用することで,長期間発育を抑制できた.最適温度は10°Cで,この温度下で420日間は生存率を低下させることなく貯蔵できた.利用までの手順は,A(前蛹を10°Cで保存)-B(前蛹を22°Cで加温して蛹化)-C(蛹を26°Cで加温して羽化)-D(羽化した成虫を26°Cで加温して糖類の蓄積促進)-E(成虫休眠を5°Cで覚醒)となる.B,C,Dは最短日数で処理することが好ましい.そうすれば,Bは約20日間,Cは約25日間,Dは約20日間である.Aでは最大420日間,Eでは最小90日間,最大270日間延長が可能である.AEを合計すると,755日間も保留できる.利用時期に合わせてAとEを任意に操作すればよい.2.レンゲは開花期間が長い.休閑田を利用すれば大量の花資源が準備できる.ここで放飼することで,増殖比率(生産されたメス数/放飼メス数)は6にまで達した.また,良質の繭が生産された.北日本におけるリンゴ園での増殖比率は23である.3.人工巣は紙筒である.これらを発砲スチロールの溝に挿入した.発砲スチロール板と紙筒を着色することでハチの巣の識別能力を促進できた.4.イチゴとトマトで受粉効果を実証した.イチゴでの受粉効果は抜群で,花粉採餌蜂であればわずか15個体/5アールで経済的なイチゴの生産ができた.1.成虫の長期保存法の開発と人工巣の開発周年利用には、発育促進による2化性化か発育抑制による2年1化性化の2つの方法がある。前者では、1世代に190日間を要したので、11月以降に限って有効であった。後者では、夏眠性をもつ前蛹態を発零点(12°C)で保存することで270日間の貯蔵可能であった。前蛹で発育抑制をするだけで、翌年の9月以降に休眠覚醒した成虫を任意に出現させることが可能となった。無理に成虫を長期間保存する必要はない。工巣は平成8年度に有効性をテストできるよに試作した。2.早期休眠覚醒法の検索炭酸ガスと合成幼若ホルモン(住友化学株式会社製S-31183)を用いた。前者はハチの羽化後の日数や処理時間数に関係なく、まったく無効であった。後者は前処理(羽化後22°Cで20日間加温)後に、個体当たり1μg/mlを成虫態に直接連続5回処理すれば効果があった。繭のまま処理できる方法を開発しなければ、幼若ホルモンは実用性がない。3.大量増殖法の確立

休閑田に栽培したレンゲを利用して飼養したマメコバチの増殖比率(健全生産メス数/放飼メス数)は、従来増殖基地として利用されいるリンゴ園のそれ(2.23.1)の2倍にも達した。また、生産された繭の品質も良好で、繭重もリンゴ園のそれよりも重かった。レンゲ畑は増殖基地として十分活用できる。1.人工巣の適正評価:開発した人工巣は紙筒である。これらを発砲スチロール板に半円型の溝を開けたものを2枚重ね合わせてできる円型穴に挿入した。各板はハチが自己巣を識別しやすいように着色した。営巣された巣のおける巣当たりの育房数、性比、子孫の死亡率、繭のサイズには天然巣(葦筒)と比較して差異はなかった。しかし、選択率は天然巣に比べて劣った。また、帰巣したハチが自己巣の識別に当たり迷うことがあった。2.ハウス作物における受粉効果:イチゴにおける高い受粉効果を証明した。花粉採餌を行なっているマメコバチは正常果(平均受精種子率が85%)が1回の訪花で、またオスでも4回の訪花でもたらされた。一方、ミツバチでは7回もの訪花が必要であった。5アール当たりの必要最低飼養個体数は、花粉採餌蜂では15匹、花蜜だけの採餌蜂では50匹、オスでは130匹と試算された。ミツバチのそれは1群(ワーカー数56000匹)とされている。3.性配分の操作によるメス比の増大:マメコバチは、性配分に規則性があり、かつ任意に産下する卵の性を決定できる。巣筒の奥側にメス、入り口側にオスをそれぞれ連続したシリーズで配置する(♀♂型)。この性配分の規則性を利用して、オス卵のシリーズ中に、新しい巣筒と交換することでメス卵のシリーズを再開させることができる。これを利用して、無交換の場合のメス比の理論値(0.5188)を2回巣筒の交換を行なうことで、メス比の理論値を飛躍的に増大(0.9220)させうる。実験結果によると、メス比は対照区に比べてわずかに増加した。他花受粉性のハウス作物(イチゴ.メロン,トマトなど)の送粉昆虫としてはマメコバチを実用化し,農業技術として普及させるには商品化を図る必要がある.これを具現するには,1.周年利用できる管理技術の開発,2.大量増殖法の開発,3.人工巣の開発,4.受粉効果の実証が不可欠である.本年度は3を実施し,全体のまとめを行なった.3の結果の要約は以下の通りである.人工巣が求められる条件には,1.好んで選択し営巣すること,2.天敵その他による幼態の死亡率が低いこと.3.巣当りの育房数とメス比が低下しないこと,4.ハチが迷うことなく自分の巣に帰巣すること,5.巣内の天敵が防除しやすいこと,6.価格が安すことなどである.1.試作した人工巣は,発砲スチロール製のトレイが半円形の溝をもつもので,これを2枚重ね合わせてできる円形の孔に紙筒を挿入するタイプである.2.天然巣(葦筒)と人工巣を同時供試すれば,選択性は前者に比べて悪かったが,単独で供試すれば,定着率には遜色がなかった.3.天敵その他による死亡率は,人工巣と天然巣で差異がなかった.4.巣当りの育房数とメス比も,天然巣のそれらと同値であった.5.ハチの迷いは,発砲スチロールのトレイとこれに挿入する紙筒の先端を異なった色のペンキで着色し,色の識別を促すことで解消できた.6.発砲スチロールに比較的高いコストを要するが,これは耐久性があるのでかなりの年月にわたり再利用でいる.紙筒も大量生産体制に入れば,天然巣の葦筒の準備に要するコストよりも安い.これらのことから,今回試作した人工巣は十分に実用化できると判断した.
細菌べん毛モーターの発生トルク制御機構の力学解析

本研究では,細菌べん毛モーターの出力制御について1分子機能解析をおこなった.自然界の大腸菌は水素イオン駆動型のべん毛モーターを持つが,我々は水素イオンとナトリウムイオンの両方を同時に利用できるハイブリッドエネルギー型を作り出すことに成功した.また,このモーターは外環境に応じてモーター素子を入れ替えることで,自動的に出力を制御していることを見出した.細菌べん毛モーターは直径約50 nmの超分子回転ナノマシンであり,イオン流をエネルギー源として駆動する.モーターはらせん状のべん毛フィラメントをスクリューのように回転させて細菌遊泳の原動力を生み出す.大腸菌べん毛モーターは,走化性関連タンパク質CheYの結合解離によって時計回り・反時計回りと回転方向の切り替えをおこなっている.また,モーターの回転速度についても外環境に応じて制御されることが知られており,YcgRやH-NSなどの因子がモーター本体に直接結合することによる速度変化が着目されている.一方,ロドバクターや海洋ビブリオ菌などの細菌がもつべん毛モーターは,CheYが結合することでモーター回転の停止や速度調節がされる.本研究では,べん毛モーターの様々な回転制御様式について,発生トルクが変化する様子を直接的に観察し,その制御機構を分子レベルで明らかにすることを目的として,本年度は以下の2点について研究を遂行した.1.モーターの速度制御機構.ビブリオ菌側べん毛モーターはCheYの結合によってモーター回転速度が低下するが,機能解析の難しさから分子レベルの理解には至っていない.そこで,回転計測系が確立している大腸菌内に,ビブリオ菌モーターを構成する素子群を発現・機能するようなキメラモーターの作製を試みている.2.入力エネルギーに依存したモーター制御.大腸菌のべん毛モーターは水素イオン流をエネルギー源としているが,遺伝子改変によりナトリウムイオン流を利用できる構成素子が報告されている.そこで,両素子を同時に作用させたところ,それらは協同的に機能することが明らかとなった.また,外環境のイオン濃度(エネルギー源)に依存してモーター素子の数を制御することで出力を最適化していることが明らかとなった.本研究では,超分子回転ナノマシンである細菌べん毛モーターがみせる様々な回転制御機構を分子レベルで解明することを目的としている.最も分子レベルで研究が進んでいる大腸菌・サルモネラ菌のべん毛モーターにおいては,リン酸化された細胞内情報伝達タンパク質CheYのモーターへの結合解離によって時計回り・反時計回りと回転方向の切り替えをおこす.一方,海洋ビブリオ菌は極べん毛と側べん毛の2種類のべん毛をもつが,1種類のCheY結合によって極べん毛では大腸菌・サルモネラ菌と同様に方向変換,側べん毛では速度低下がおこる.そこで,これまで解析があまり進んでいないビブリオ菌側べん毛モーター速度制御機構を解析するために,回転計測系が確立している大腸菌内においてビブリオ菌側べん毛モーターの再構成させることを試みた.具体的には,ビブリオ菌側べん毛モーターの構造構築・トルク発生に関わるタンパク質群を様々に改変をしつつ,大腸菌モーター欠損株で発現させた.現在のところモーター機能の再現までには至っていないが,べん毛構造の構築までは確認できている.次に,大腸菌における方向変換制御機構を研究するために,CheY結合を必要としないで自発的に回転方向変換をおこすモーター系の構築を試みた.具体的には,モーター方向変換に関わる回転子タンパク質FliGの変異体を,ある割合でモーターに組み込むことによって,ハイブリッド回転子を作成してモーター方向制御機構を解析することにした.変異FliGの発現量を制御することで,任意の方向変換頻度を生み出すモーターを作成する条件を見出すことができた.細菌べん毛モーターは直径約50 nmの超分子回転ナノマシンである.モーターはらせん状のべん毛フィラメントをスクリューのように回転させて細菌遊泳の原動力を生み出す.大腸菌べん毛モーターは時計回り・反時計回りと両方向に回転することができ,その回転方向制御システムは分子レベルでの解析が行われてきた.一方,モーターの回転速度については,入力エネルギーであるプロトン駆動力との相関は詳細な研究が行われてきたものの,他の因子による速度制御について注目されることはほとんどなかった.本研究では,モーターの回転子または固定子に作用する制御因子に着目してモーター回転計測をおこなった.今年度に行った実験結果は以下の通りである.・モーター回転子FliGの回転方向が時計回りに固定した変異体(FliG(dPAA))を野生型FliGと混在させる条件を昨年度探索した.今年度は,様々な配合比率のミックス回転子の回転をビーズアッセイを用いて1分子レベルで計測したところ,回転方向だけではなく平均回転速度にも影響を与えていることを示せた.・H-NSはDNAに結合するタンパク質であるが,近年,べん毛モーターにも直接相互作用してモーター速度を制御するというデータが発表されていた.そこで,H-NSの発現とべん毛モーター遺伝子発現の調節を注意深く制御してモーター機能を観察した.その結果,H-NSがモーターに直接影響を与えているという過去の報告とは異なり,H-NSはべん毛遺伝子発現への関与が主たるものであることが確認できた.本研究では,細菌べん毛モーターの出力制御について1分子機能解析をおこなった.自然界の大腸菌は水素イオン駆動型のべん毛モーターを持つが,我々は水素イオンとナトリウムイオンの両方を同時に利用できるハイブリッドエネルギー型を作り出すことに成功した.

また,このモーターは外環境に応じてモーター素子を入れ替えることで,自動的に出力を制御していることを見出した.本年度に作成したハイブリッド回転子について,機能解析からほぼ作成条件を確立できたと考えているが,蛍光観察による直接証明が必要であった.しかし,機器故障等の要因により蛍光観察以外の実験を優先させたため,この点についてやや遅れていると評価した.生物物理学緑色蛍光タンパク質(GFP)を融合した回転子タンパク質のモーター1個当たりの個数を見積もり,ハイブリッド回転子が期待通り作成できていることを確認し,モーター回転速度,回転方向の同時観察をおこなう.ビブリオ菌モーターの大腸菌内再構成については少し遅れがみられるものの,モーター回転機能解析に関しては論文として成果報告ができるなど,全体としてはおおむね順調と考えられるため.平成26年度に,蛍光標識したべん毛モーター関連分子群を観察する実験もおこなう予定であったが,高感度カメラが故障したことによる機器修理,装置の復旧・調整・基礎データの取得等に時間がかかり,その期間は一部計画を変更して既存の装置を用いた機能解析の実験を重点的に進めたため,次年度使用額が発生した.ビブリオ菌モーターの大腸菌内再構成を試みるとともに,他の回転速度制御因子の機能解析や回転制御方法の開発へと研究を展開する.蛍光観察に関する試料作成,実験条件の検討等に必要となる経費に未使用額を当てる予定である.遺伝子改変と機能解析を並行して遂行する計画であったが,機能解析の研究が予想以上に順調に進んだため,論文として報告することを優先するべきと判断した.そのため,遺伝子組換えの実験で計画していた物品費の使用額が計画よりも少なくなった.モーター制御因子のクローニングや蛍光タンパク質の融合などの実験材料の準備をするために遺伝子組換え実験に使用する計画である.
ランダムなキラル対称性の破れをもたらす反応システム内の自己組織化現象の研究

不斉コバルト錯体の合成反応及びビナフチルの結晶化においては、キラル自動触媒系により鏡像異性体の一方が自発的に優先生成することを、これまでに報告してきた。本年度は、この自動触媒機構をさらに詳細に検討すると共に、より高光学純度が発生するための条件の探索を行った。コバルト錯体の合成反応においては、その速度論的解析の結果、生成物が高過飽和状態でクラスターを形成して自動触媒性が発現することが見い出されていた。そして、この結果に基づいた動力学モデルは、反応温度を低下させることで、自動触媒性が顕著に高まる過飽和度の実験的実現が容易であることを予測した。そこで、この実験的証明を試みたところ、25°Cにおける20回の反応で、最大光学純度69%が達成された。勿論、本反応では、高次の自動触媒反応によるゆらぎの成長の結果、自発的に一方の異性体が生成するため、常に高光学純度で生成物が得られることはない。しかし、あらかじめ一方の異性体の結晶を反応系に添加すると、20回の実験中4回は、添加した異性体と同じ異性体が、光学純度40%以上で優先的に生成された。ビナフチルの結晶化については、異なった過冷却状態にて無撹拌での実験を行い、その光学純度に対する影響についての検討を行った。その結果、低過冷却度の実験では生成物の光学純度はランダムにばらつくが、高過冷却度となるとほぽラセミ体に近い生成物しか得られなかった。そこで、系内に生成するそれぞれの結晶を途中で取り出し、その光学純度を測定したところ、低過冷却度の場合はどちらか一方の異性体を優先的に含むが、高過冷却度ではほぼラセミ体となることが認められた。しかし、この高過冷却度の条件でも、撹拌を行うことで一方の異性体が常に優先的に生成することから、生成するのは単結晶ではなく多結晶で、過冷却度が大きくなるにつれて両方の異性体の混合した多結晶になるものと考えられた。反応系内で自動触媒的自己集積及び自己組織化現象が進行する場合、キラルな物質を合成した際にその両異性体は等しく合成されるという有機合成化学の常識は成り立たなくなる。このような現象が観察される不斉コバルト錯体の合成反応及びビナフチルの結晶化の速度論的解析を行い、一連の速度式の組み合わせである動力学モデルを構築した。このモデルのシミュレーションにより、自動触媒性が出現する機構について検討を行った。コバルト錯体の合成反応においては、生成物が非常に高過飽和な状態でクラスターを形成することにより自動触媒性が発現し、そのための会合度は約10以上であることが見い出された。但し、このような高過飽和状態は、反応系が完全に均一であると出現しないことも確認された。本反応は、反応系の内外が35°Cの温度差を持つ状態で開始するため、系内の混合の不完全性に基づく温度不均一性、及びそれによりもたらされる濃度不均一性の結果、局所的な高過飽和状態が出現し、その部位から自動触媒系が機能し始めることが認められた。このような局所的高過飽和度の出現は確率過程なため、収率及び光学純度は試行毎にランダムにばらつくと説明付けられる。ビナフチルの結晶化については、大小2種類の容器内で実験を行った。いずれの場合も、各実験毎に生成する結晶数は5個以下であり、これが全て一方の異性体の単結晶であるならば、光学純度はランダムにばらつくはずであり、シミュレーションではそのような結果となった。しかし、実際の実験では、小さい容器を用いた場合はシミュレーションと同様の結果となったが、大きい容器の場合はほとんどラセミ体に近い結晶しか得られなかった。これは、大きい容器では空気に接触する面が大きいため気液界面付近の過冷却度が大きくなり、一方の異性体の結晶表面を利用したもう一方の異性体の核生成も進行し、多晶体が生成したことを意味している。

そこで、系内に生成するそれぞれの結晶を途中で取り出し、その光学純度を測定したところ、低過冷却度の場合はどちらか一方の異性体を優先的に含むが、高過冷却度ではほぼラセミ体となることが認められた。しかし、この高過冷却度の条件でも、撹拌を行うことで一方の異性体が常に優先的に生成することから、生成するのは単結晶ではなく多結晶で、過冷却度が大きくなるにつれて両方の異性体の混合した多結晶になるものと考えられた。
分裂組織におけるメチオニン生合成制御の分子機構

遊離メチオニンを過剰に蓄積するシロイヌナズナのmtol変異株を用いた研究により,メチオイニンン生合成の鍵となる段階を触媒するシスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)の遺伝子はmRNAの安定性のレベルでフィードバック制御を受けており,しかもこの制御にCGSタンパク質の第1エキソンポリペプチドが関与していることが明らかになった.35Sプロモーター〓CGS第1エキソン〓GUSを持つトランスジェニック・シロイヌナズナから液体培養カルスを誘導し,メチオニンの効果をmRNAレベルで調べた.その結果,野生型の第1エキソンを持つ株のGUSmRNAのレベルはメチオニン添加により減少したのに対して,mtol変異型の第1エキソンを持つ株では減少は見られなかった.これまでCGS第1エキソンの機能解析は一過的発現系におけるレポーター活性により行ってきたが,この結果は,CGS第1エキソンが実際にmRNAレベルでの制御に機能を持つことを示している.また,培養細胞ラインを用いた一過的発現系の確立を行った.野生型とmtol-1変異型のCGS第1エキソンについて,35Sプロモーター*CGS第1エキソン〓GUSをタバコBY2細胞に電気穿孔法により導入して一過的発現を調べたところ,シロイヌナズナの液体培養カルスを用いた場合と同様のメチオニン応答性を示した.この結果は,タバコBY2細胞が実験系として有望であることを示している.既にAgrobacteriumを用いて上記のDNAを導入した形質転換ラインを得ており,BY2に内在性のCGS遺伝子と導入遺伝子についてCGSmRNAの安定性の解析を行っている.遊離メチオニンを過剰に蓄積するシロイヌナズナのmtol変異株を用いた研究により,メチオイニンン生合成の鍵となる段階を触媒するシスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)の遺伝子はmRNAの安定性のレベルでフィードバック制御を受けており,しかもこの制御にCGSタンパク質の第1エキソンポリペプチドが関与していることが明らかになった.35Sプロモーター〓CGS第1エキソン〓GUSを持つトランスジェニック・シロイヌナズナから液体培養カルスを誘導し,メチオニンの効果をmRNAレベルで調べた.その結果,野生型の第1エキソンを持つ株のGUSmRNAのレベルはメチオニン添加により減少したのに対して,mtol変異型の第1エキソンを持つ株では減少は見られなかった.これまでCGS第1エキソンの機能解析は一過的発現系におけるレポーター活性により行ってきたが,この結果は,CGS第1エキソンが実際にmRNAレベルでの制御に機能を持つことを示している.また,培養細胞ラインを用いた一過的発現系の確立を行った.野生型とmtol-1変異型のCGS第1エキソンについて,35Sプロモーター*CGS第1エキソン〓GUSをタバコBY2細胞に電気穿孔法により導入して一過的発現を調べたところ,シロイヌナズナの液体培養カルスを用いた場合と同様のメチオニン応答性を示した.この結果は,タバコBY2細胞が実験系として有望であることを示している.既にAgrobacteriumを用いて上記のDNAを導入した形質転換ラインを得ており,BY2に内在性のCGS遺伝子と導入遺伝子についてCGSmRNAの安定性の解析を行っている.
低配位状態のリン・硫黄結合を持つ活性化学種の安定化および硫化剤としての応用の研究

1.新規な立体保護基の開発およびジチオキソホスホラン類の合成本研究では、かさ高い立体保護基として、従来用いてきた2,4,6-トリ-t-ブチルフェニル基に加えて、新たに、オルト位の一方あるいは両方の置換基をエチル基、プロピル基、イソブチル基等に変換した立体保護基を開発した。また、新規な安定化基として、前述の2,4,6-トリ-t-ブチルフェニル基のオルト位の一方あるいは両方の置換基をメトキシ基、ジメチルアミノ基、ジメチルアミノメチル基、シアノメチル基、ニトロメチル基等に変換した置換基も開発した。さらに、これらの置換基を有するジチオキソホスソラン類の誘導を検討し、幾つかの安定化ジチオキソホスホランを合成した。2.架橋したジフェニルメチレンを有するホスファルケン類の合成ならびに硫化反応2,4,6-トリ-t-ブチルフェニル基を立体保護基として用いて、架橋および非架橋ジフェニルメチレンを有するホスファルケン類を合成し、その硫化反応について検討した。また、ジホスフィニデンシクロブテン、ホスファブタトリエン、ホスファアルキン等、これまで硫化反応が検討されていなかった化合物についても硫黄との反応を検討した。なお、本研究において、ホスファアルケンP-スルフィドとチアホスフィランの間に光原子価異性化反応が存在することを初めて見い出した。3.低配位状態のリン・硫黄結合を持つ化合物のケトンとの反応以上のように、リンと硫黄の結合を有する特異な構造の化合物を種々合成することができたので、これらの化合物とベンゾフェノンとの反応について検討した。その結果、ホスファアルケンP-スルフィドやアミノ基を持つ安定化ジチオキソホスホランは硫化作用を示さなかったが、メトキシ基を持つジオキソホスホランは硫化剤として働くことがわかった。
Th2サイトカイン等による気道過敏性形成における上皮-平滑筋機能連関の関与

気管支喘息の主要な病態のひとつである気道過敏性は各種刺激に対して気道が過剰に収縮する状態で、気道平滑筋の機能的及び形態的変化によって生じる。炎症細胞から分泌されるinterleukin(IL)-4,-5,-13などのTh2サイトカインが喘息の病態に強く関わることが知られている。はじめに本研究ではIL-4とIL-13が気道平滑筋の収縮能に及ぼす影響を検討し、IL-4で平滑筋細胞包埋ゲルの収縮が著明に減少し、IL-13で著しく増強され、そのどちらもPI3-kinase阻害薬のwortmanninで阻害され、これらの反応がPI3-kinaseを介しているとの結果を得た。これらのTh2サイトカインはCa^<2+>濃度に影響を及ぼさず、平滑筋細胞の収縮に関わるミオシン軽鎖リン酸化レベルにも差を認めなかった。さらに、平滑筋の弛緩に関わるミオシン脱リン酸化酵素の発現量とその活性に影響する脱リン酸化酵素のリン酸化レベルを検討したが、これにも差を認めなかった。従って、IL-13とIL-4は単一の平滑筋レベルの収縮には影響を与えないものと考えられ、細胞外環境の調節により組織収縮能が変化する可能性が考えられた。この観点からマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の発現に与えるTh2サイトカインの作用をリアルタイムPCRで検討したところ、MMP-1,2,3,9,13のうち、MMP-1のmRNA発現量がIL-13とIL-4で増大しており、その増大量はIL-4で著しかった。従って、Th2サイトカインは平滑筋細胞からMMPを分泌させて細胞外マトリックスを融解させ、その発現量によって組織収縮が増大ないし減弱するものと考えられた。MMP-1は病的条件下で上皮細胞でも産生されることが知られており、上皮細胞が気道平滑筋の収縮能に与える影響のメカニズムの一端を本研究は明らかに出来たものと思われる。本研究は、気道における上皮と平滑筋の機能連関が気道過敏性の形成にどのように関わるかを明らかにすることを目的とする。本年度は以下の結果を得た。炎症細胞から分泌されるinterleukin(IL)-4,-5,-13などのTh2サイトカインが喘息の病態に強く関わることが知られているが、これらがどのような機序で気道過敏性を発現するのかについては一定の結論が得られておらず、この反応における上皮-平滑筋連関の役割も不明である。本年度は、IL-4とIL-13が気道平滑筋の収縮能に及ぼす影響を、平滑筋包埋コラーゲンゲルを用いて検討した。IL-4でゲルを前処置したところ、アゴニスト(ATP)及びカルシウムイオノフォア(A23187)で生じる収縮が著明に減少した。またIL-13で前処置したゲルの収縮は著しく増大した。これらのサイトカインは共通の受容体(IR-13Rα)を活性化すると考えられているが、平滑筋収縮には抑制と増強という正反対の作用を示したことは、それらで生じる細胞内情報の相違点が気道収縮性に影響を与えることを意味しており、この点が治療ターゲットとなり得ると考えられた。ATPとA23187で生じる細胞内

カルシウム濃度の上昇はIL-4とIL-13によって影響を受けず、これらの収縮への影響がカルシウム濃度の修飾によるものではないことが明らかになった。さらに、このIL-4による収縮抑制とIL-13による増強のどちらもPI3-kinase阻害薬のwortmanninで阻害され、これらの反応がPI3-kinaseを介して生じていることが示唆された。PI3-kinaseの下流の情報と気道収縮性との関連、及びこの系への上皮の影響について、第二年度に検討を行う。気管支喘息の主要な病態のひとつである気道過敏性は各種刺激に対して気道が過剰に収縮する状態で、気道平滑筋の機能的及び形態的変化によって生じる。炎症細胞から分泌されるinterleukin(IL)-4,-5,-13などのTh2サイトカインが喘息の病態に強く関わることが知られている。昨年度、IL-4とIL-13が気道平滑筋の収縮能に及ぼす影響を検討し、IL-4で平滑筋細胞包埋ゲルの収縮が著明に減少し、IL-13で著しく増強され、そのどちらにもPI-3 kinaseが関与するという結果を得た。本年度はこの細胞内機序について検討を加えた。平滑筋細胞の収縮に関わるミオシン軽鎖リン酸化レベルを検討したところ、IL-13処理細胞とIL-4処理細胞の間に差は認めなかった。さらに、平滑筋の弛緩に関わるミオシン脱リン酸化酵素の発現量とその活性に影響する脱リン酸化酵素のリン酸化レベルを検討したが、これにも差を認めなかった。従って、IL-13とIL-4は単一の平滑筋レベルの収縮には影響を与えないものと考えられ、細胞外環境の調節により組織収縮能が変化する可能性が考えられた。この観点からマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の発現に与えるTh2サイトカインの作用をリアルタイムPCRで検討したところ、MMP-1,2,3,9,13のうち、MMP-1のmRNA発現量がIL-13とIL-4で増大しており、その増大量はIL-4で著しかった。従って、Th2サイトカインは平滑筋細胞からMMPを分泌させて細胞外マトリックスを融解させ、その発現量によって組織収縮が増大ないし減弱するものと考えられた。MMP-1は病的条件下で上皮細胞でも産生されることが知られており、上皮細胞が気道平滑筋の収縮能に与える影響のメカニズムの一端を本研究は明らかに出来たものと思われる。