hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シリル化合物によるシスチン含有ペプチドの実用的合成法の開発とその応用

平成12年度の研究実施結果について以下に述べる。本年度は前年度に確立した方法論,即ちTrpのインドール環の保護基として2,4-dimethylpent-3-yloxycarbonyl(Doc)基を使用し、シリルクロリドースルホキシド法と既存のジスルフィド結合形成反応を組み合わせて架橋した後、トリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)処理で、Doc基の除去を行うといった手順で、複数のジスルフィド架橋を有するペプチドの位置選択的な化学合成を行った。1.上述のペプチドの具体例として、その分子内に1個のTrp残基と2個のジスルフィド結合を有するエンドセリン-1(ET-1)を選択した。このペプチドはその完全還元体から空気酸化法にてランダムにジスルフィド結合を形成させた場合、約30%もの架橋異性体が副生が避けられない。よって、効率的に目的のET-1を得るためには、位置選択的架橋反応が不可欠なものとなり、ET-1は今回の方法論を評価するモデルとして最適であると考えた。2.各保護ペプチド樹脂の構築はFmoc法にて行い、トリフルオロ酢酸にて最終脱保護後、ヨウ素酸化法にて第1のジスルフィド結合(外側)を形成させ、続いて、シリルクロリドースルホキシド法にて2本目のジスルフィド架橋(内側)を形成、さらにTFMSA処理でTrpのDoc基の選択除去、精製後、最終品であるET-1を高純度で収率よく得ることができた。3.また、2本のジスルフィド結合を2とは逆の順序で形成させる場合でも、ほぼ同程度の純度・収率の中間体の生成が認められ、全体を通しての収率は2の場合と比較して約3倍もの高収率であった。以上、Trp含有シスチンペプチドを効率的の合成する際の問題点をほぼ解決できた。今後は、通常では合成困難な新規機能を有する人工ペプチド・蛋白質の合成実験を行っていく予定である。平成11年度の研究実施結果について以下,述べる.本年度は一般的なシスチンペプチド類を効率的に化学合成するための方法論を確立し,かつ位置選択的にジスルフィド結合形成を行うことができるようにTrpインドール環に最適な保護基を見いだすことを第一の目的に実験を行った。1.Trpインドール環の保護基の候補として,Mts基,Hoc基およびDoc基を考えた.予備試験では,いずれの保護基もFmoc法で通常使用する条件下にて安定であり,さらに,鍵工程であるシリルクロリドースルホキシド反応の間も安定であった.また,これら保護基の選択的な脱保護試薬として予定していたトリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)で副反応を伴わず,簡単に除去することが可能であった。2.次に,予備試験で判定した上述の3種類のTrpのインドール環の保護基のうち,どの保護基が最も有用であるか,ソマトスタチンを指標にし,実際にそれぞれソマトスタチンの合成を行った。その結果,Hoc基ではTFMSA系での脱保護反応が不完全であり,Mts基またはDoc基を場合では,各段階で満足できる純度あるいは収率で目的のソマトスタチンを得られることができた.さらに両者の比較すると,保護基除去の際にDoc基ではその選択的除去が4°C,30minといった温和な条件下で行える点,3-メチルインドールの添加が必要ない点から,Doc基が最も本合成法に適しているものと結論できた.以上の結果から,来年度に関しては,位置選択的なジスルフィド結合形成反応に本方法論を適用し,複雑で複数のジスルフィド架橋を有するモデルペプチドの化学合成を種々行う予定である。
1枚の画像からのアクティブ3次元画像計測

本研究では,モアレ縞の元になる投影格子の光強度を変調することによりモアレ縞本体の強度を変調し,縞の強度からその次数を決定する「強度変調モアレトポグラフィ」を考案し,実験によってその効果を確認した.強度変調モアレでは,投影格子の光強度をいかに精度良く計測できるかが全体の計測精度に大きく影響する.従来のCCDカメラ(512×512画素,濃淡256階調)では,強度差を識別できる観測格子の本数は20本程度であり,得られる強度変調モアレ縞の本数は8本程度であった.今回,新たに冷却CCDカメラシステム(1536×1024画素,65536階調)を導入した事により,強度差を識別できる観測格子の本数は30本以上となり,計測精度は大きく向上した.現有の格子投影用プロジェクタ(640×480画素,RGB各256階調)ではこれ以上高精度の投影格子を生成できない.次に,得られた強度変調モアレパターンから,モアレ縞の強度パターンに基づいて高精度の奥行き計測を行う「モアレ縞の位相解析」を提案し,実験によってその効果を確認した.本手法では,モアレパターンが正弦波状に変化していることに着目し,その位相を決定することで縞と縞の間の部分でも距離計測が可能であることを示した.強度変調モアレと組み合わせることで,モアレパターンの位相解析範囲を2π以内に押さえる事ができ,位相を一意に決定できる.対象物体の表面反射特性(反射率,色,テクスチャ等)による影響を補正するため,あらかじめ基準画像を撮影しておき,格子投影画像をこの基準画像で正規化する手法を開発した.この正規化においても,冷却CCDカメラによる階調分解能向上の効果はきわめて大きく,補正の精度は大きく向上した.本研究では,モアレ縞の元になる投影格子の光強度を変調することによりモアレ縞本体の強度を変調し,縞の強度からその次数を決定する「強度変調モアレトポグラフィ」を考案し,実験によってその効果を確認した.強度変調モアレでは,投影格子の光強度をいかに精度良く計測できるかが全体の計測精度に大きく影響する.従来のCCDカメラ(512×512画素,濃淡256階調)では,強度差を識別できる観測格子の本数は20本程度であり,得られる強度変調モアレ縞の本数は8本程度であった.今回,新たに冷却CCDカメラシステム(1536×1024画素,65536階調)を導入した事により,強度差を識別できる観測格子の本数は30本以上となり,計測精度は大きく向上した.現有の格子投影用プロジェクタ(640×480画素,RGB各256階調)ではこれ以上高精度の投影格子を生成できない.次に,得られた強度変調モアレパターンから,モアレ縞の強度パターンに基づいて高精度の奥行き計測を行う「モアレ縞の位相解析」を提案し,実験によってその効果を確認した.本手法では,モアレパターンが正弦波状に変化していることに着目し,その位相を決定することで縞と縞の間の部分でも距離計測が可能であることを示した.強度変調モアレと組み合わせることで,モアレパターンの位相解析範囲を2π以内に押さえる事ができ,位相を一意に決定できる.対象物体の表面反射特性(反射率,色,テクスチャ等)による影響を補正するため,あらかじめ基準画像を撮影しておき,格子投影画像をこの基準画像で正規化する手法を開発した.この正規化においても,冷却CCDカメラによる階調分解能向上の効果はきわめて大きく,補正の精度は大きく向上した.
口唇閉鎖機能の定量化による新治療目標への臨床応用

口唇閉鎖機能不全と関連する生体への影響、口呼吸等の機能障害、形態異常等に伴う社会心理学的問題および正常な成長発育にも大きな影響を及ぼすなど多岐にわたり、これらに関連した患者QOLの低下は社会的問題の一つになっている。しかし、口唇閉鎖機能の評価法としてこれまで主流とされてきた形態的および機能的評価法は未だ不十分である。申請者は、スポーツ医学、リハビリテーション分野で、筋の緊張と硬さは連動するとの知見がすでに報告されていることに着目し、口唇閉鎖機能不全患者で口唇閉鎖時において口腔周囲筋が緊張状態にあると考え、その硬さ(筋硬度)に着目し、形態的、機能的および質的(筋硬度)側面から多角的アプローチを行ない、口唇閉鎖機能の定量化と口唇閉鎖機能不全診断法の確立を目指す。平成30年度は、正常咬合者における口腔周囲筋筋硬度の検索および、被験者の選定と術前前歯部形態再現デバイスの作製を進めながら分析を行ない、得られた結果から臨床応用を目指す。矯正歯科治療前後の口腔周囲軟組織の筋硬度の測定を行う。具体的には動的矯正治療終了患者を対象とし、デバイス装着時(口唇閉鎖不全状態)および非装着時(口唇閉鎖機能が改善した状態)で筋硬度測定を行う。得られたデータをそれぞれ、治療前の筋硬度( pretreatment muscle hardness:以下Premh)治療後の筋硬度(post treatment muscle hardness:以下Pomh )とし、それぞれのヒステリシスカーブを分析し、比較検討する。先端形状の改良により、筋硬度測定が行えるようになり、本年度も引き続きより多くの筋硬度データを採得する予定であったが、複数回計測によって得られるデータのバラツキが大きく、個性正常咬合者の筋硬度標準値の設定が困難であり、工学部のアドバイザーとディスカッションを行なったところ、押し込む速度を機械的に一定にする方法を検討する必要があるかもしれないとのことで、なかなか本データ採得が行えない状態となり、測定方法の改良と見直しを余儀なくされたために計画よりは遅滞した状況にある。研究デザインを大きく変更する必要性は少ないが、安定した筋硬度データ採得を可能とするために、工学部のアドバイザーの先生に協力を仰ぎながらデータのばらつきを少なくするための方法を引き続き模索し、本データ採得をおこなう。また、再現デバイスに関しては、モデリングを行い作成を行う予定である。研究初年度である平成29年度は本研究のメインとなる機器(押し込み硬さ測定装置)を購入し、個性正常咬合者における口腔周囲筋硬度の標準値を検索するための機器のセットアップを行い予備実験を行うところまでを行った。本研究は口唇閉鎖機能の定量化を目的とするため、再現性、正確性、繰り返しの測定に耐えうる強度を持った材質への機器の先端形状の改良を行うことが必要と判断した。そこで押し込み硬さ測定装置の販売元の技術部と綿密な打ち合わせと試行錯誤を繰り返し、時間は費やしたが、本研究の意義を鑑みると必要な作業であった。先端形状の改良により、筋硬度測定が行えるようになったため、次年度も引き続きより多くの筋硬度データを採得する予定である。本来であれば初年度では機器を購入し、個性正常咬合者のデータ採得を行う予定であった。しかし、実際に曲面構造である口腔周囲軟組織の筋硬度を測定する際に、元々の付随パーツである円形の先端パーツでは、計測にやや不利な素材とデザインであると判断した。そこで、まずは機器メーカーと先端パーツの改良を行うこととした。改良の結果、データ採得に申し分ない強度を有し、また、被験者の口腔周囲軟組織の表面正常にあまり影響を受けない先端パーツが完成した。しかし、パーツの素材、強度、デザインの改良は業者が遠方であるため、素材の選択や強度計算、先端パーツのデザイン変更し完成、納品までに時間を要した。以上の理由で研究がやや遅滞した。

矯正歯科治療前後の口腔周囲軟組織の筋硬度の測定を行う。具体的には動的矯正治療終了患者を対象とし、デバイス装着時(口唇閉鎖不全状態)および非装着時(口唇閉鎖機能が改善した状態)で筋硬度測定を行う。得られたデータをそれぞれ、治療前の筋硬度( pretreatment muscle hardness:以下Premh)治療後の筋硬度(post treatment muscle hardness:以下Pomh )とし、それぞれのヒステリシスカーブを分析し、比較検討する。先端形状の改良により、筋硬度測定が行えるようになり、本年度も引き続きより多くの筋硬度データを採得する予定であったが、複数回計測によって得られるデータのバラツキが大きく、個性正常咬合者の筋硬度標準値の設定が困難であり、工学部のアドバイザーとディスカッションを行なったところ、押し込む速度を機械的に一定にする方法を検討する必要があるかもしれないとのことで、なかなか本データ採得が行えない状態となり、測定方法の改良と見直しを余儀なくされたために計画よりは遅滞した状況にある。本研究でメインに用いる筋硬度測定器のセットアップが完了したため、計測手技、手順の習熟を行い、個性正常咬合者における口腔周囲筋の筋硬度データ量を増やし、正常値を検索する。また、術前前歯部形態再現デバイスの試作品の作成を行う。方法は初診時および動的治療終了時の研究用模型のデジタルデータをCADソフトウェア(space claim)にインポートし、治療前後の差分形状を抽出してモデリングを行う。モデリングしたデータはSTL形式で出力し、3Dプリンタで出力することで作製する。予定である。デバイスに関しては、口腔内に維持する機構が必須なため、その改良も行う予定である。研究デザインを大きく変更する必要性は少ないが、安定した筋硬度データ採得を可能とするために、工学部のアドバイザーの先生に協力を仰ぎながらデータのばらつきを少なくするための方法を引き続き模索し、本データ採得をおこなう。また、再現デバイスに関しては、モデリングを行い作成を行う予定である。押し込み硬さ測定装置の改良に時間がかかり、研究計画がやや遅滞し、予定していたデバイスの作成等について予算を執行していないため、翌年度以降に使用する予定である。研究機器の改良とデータ採得方法の大幅な見直しが必要となり、研究計画が遅滞し、予定していた予算額全額を執行するには至らなかった。
土壌中に存在する難溶性重金属の重金属超集積植物による溶解・吸収機構について

本年度は,これまでの研究成果から低レベル重金属汚染に対するファイトレメディエーション機能の高いことを確認した植物を用いて,それらのファイトエクストラクション能力と植物生育の関連性に着目して検討した。具体的には,重金属キレート剤と植物成長促進ホルモンの作用の相乗的効果を調べることで,植物の成長と植物による重金属可溶化効果の関連性を明らかにすることを試みた。EDTAやクエン酸のようなキレート剤施用はトウモロコシとソルガムの地上部の生育量を減少させた。生長ホルモンの添加は生育量を増大させることで結果的に金属の吸い上げ量を増加させた。また,低濃度サリチル酸処理区はブラシノイドの処理区より効果が高かった。例えば,トウモロコシのEDTA区やクエン酸区でサリチル酸を噴霧したものは,噴霧しない場合に比べてEDTA区で24%,クエン酸区で97%も地上部の生育量が増加した。EDTAは重金属が根部から地上部へ移動するのをキレート剤として助ける働きをもつことが知られているが,この研究でカドミウム,銅,亜鉛についてはクエン酸よりも効果の高いことがわかった。またクエン酸施用は両植物の地上部組織への銅の集積を減少させた。トウモロコシでサリチル酸噴霧の場合,EDTA区で銅とカドミウムの地上部への集積量が増加し,これはサリチル酸とEDTAの相助効果によると考えられたが,ソルガムではこの効果は見られなかった。これらの結果は,植物ホルモンであるサリチル酸が重金属とキレート剤による植物生育阻害作用に対して低濃度で保護的役割をはたすことを示す。従って,植物を利用した環境修復における植物ホルモンの効果は無視できないものであることを明らかにした。2.重金属汚染土壌,および鉱物組成を異にする土壌(アロフェン質火山灰土壌,沖積土,花崗岩性の畑土壌)に植物(超集積植物を含む8種類の植物の種子を播種し栽培している。3.上記,植物種子を砂耕栽培し,砂を洗浄し新鮮な植物を回収した。回収した根を蒸留水に浸積し,根から分泌させる有機酸やその他の物質の回収を行った。現在,これらの分泌物が重金属を含む土壌あるいは難溶性重金属を含め鉱物からの溶解能力を計測中である。4.根分泌物を回収した後,新鮮な根を採取し,根表面に存在するキレート活性の能力を測定するためのモデルとなる難溶性鉱物の検索を行っている。本年度は火山灰土壌および沖積土壌における様々な稲の重金属吸収能力について試験をおこなった。その結果,供試した植物種の伸長バイオマスは,沖積土壌よりも火山灰土壌で小さいことがわかった。また,稲の品種間で比較した場合,土壌型に関係なくチョーコウココ,WRC28,WRC30が最も高い重金属集積特性を示すことがわかった。続いて,低濃度の重金属溶液を用いたモデル実験により,根部の細胞壁と根滲出液の重金属溶解能力についても試験した。その結果,根の細胞壁による重金属可溶化試験においては,WRC30とササニシキが他の品種よりもカドミウムと鉛をより可溶化することがわかった。また,ニッポンバレは他の品種より亜鉛をより可溶化することがわかった。しかし,共試植物から収集・濃縮した根滲出液は,鉛を除いて有意に重金属を可溶化しなかった。これらの結果から,根細胞壁による重金属可溶化が,おそらく稲の比較的高いカドミウムや鉛,亜鉛の集積の主要な原因であることを考察した。これらの試験研究活動に加えて,国内外の多くの学会に参加した。また,ポルトガルのコイムバラ大学を2009年11月232009年12月1日に訪問し,重金属汚染土壌における重金属超集積性植物による環境修復能力の活用,ならびに,重金属集積性植物に関する最新の根圏プロセスの探求について議論や意見交換をおこなった。現在は重金属の可動性と植物重金属吸収における低分子有機酸などの金属錯体の役割について焦点を当て,様々な植物種の進化による重金属汚染土壌における重金属の可動性と吸収に関する研究に取り組んでいる。

これらの結果は,植物ホルモンであるサリチル酸が重金属とキレート剤による植物生育阻害作用に対して低濃度で保護的役割をはたすことを示す。従って,植物を利用した環境修復における植物ホルモンの効果は無視できないものであることを明らかにした。
乳がん細胞におけるビスフェノールＡのエストロゲン様活性増強の分子メカニズム

ビスフェノールA(BPA)は乳がん細胞増殖作用を示す。我々は、エストロゲン受容体(ER)とエストロゲン関連受容体(ERR)が共存すると、BPA活性が相乗的に増強されることを発見した。本研究では、この増強作用の分子機構解明に取り組んだ。まず、乳がん細胞に存在するERとERRを調べ、BPA暴露による発現量変化を解析した。その結果、ERα、ERRαとERRγの活性増強への関与が判明した。また、コアクチベーターも特定のものが関与していることが判明した。さらに、BPAが結合するのはERで、ERRは協働作用に働くこと、DNA結合エレメントには必須な構造要因があることなどが判明した。本研究の最大の目的は、乳がん細胞においてビスフェノールAがエストロゲン受容体α(ERα)とエストロゲン関連受容体γ(ERRγ)の協働作用による増殖作用を示すメカニズムを分子レベルで解析し、解明することである。平成25年度は、(1)MCF7、T47D、MDA-MB-361細胞の3種乳がん細胞において、内在性のER2種、ERR3種の遺伝子発現量の解析に成就した。いずれの細胞にもERαは多量に発現、ERRαとERRγの発現はわずか、ERβとERRβは非常に低発現であることが分かった。また、転写共役因子4種について、SRC1は多く発現し、SRC2は中程度で、pGC1α、pGC1βは低発現していることが判明した。(2)T47D細胞に10 nMのBPAおよびE2を暴露させると、ERβとERRβの発現量が上昇することが判明した。ERα、ERRαとERRγの発現量は減少した。二つの集団を分別する要因の存在が示唆された。(3)MCF7細胞にERsとERRs受容体の各発現プラスミドを導入し、BPA暴露による活性変化を調べたところ、ERα、ERRα、ERRγの発現はBPA活性を増強した。一方、ERβ、ERRβ発現は活性を抑制した。(4)化学物質E2、BPA、BPAF、BPC、HPTEをMCF7細胞へ暴露し、WST-1アッセイにより細胞増殖効果を解析したところ、いずれも約2倍の増殖作用を示した。(5)ERα/ERRα、あるいはERRγ発現系によるBPA活性増強の分子機構の基盤を解明するために、これらの変異受容体を発現し、レポーター遺伝子アッセイにより解析した。その結果、BPAのエストロゲン様活性はBPAがERに結合して発揮されること、また、ERRα、あるいはERRγは協働的に作用し、これらへのBPA結合無しに増強されることが明らかとなった。(6)ER/ERRの協働作用を示す応答配列の実態を調べるため、EREを複数、あるいはEREとERREを一つずつ含む天然型応答配列の作製を実施した。乳がん細胞の増殖は、エストロゲン受容体(ER)へのエストロゲンの結合が引き金となる。近年、この増殖作用は内分泌撹乱物質・ビスフェノールA(BPA)でも観察され、大きな問題となっている。最近我々は、ERとエストロゲン関連受容体(ERR)が共存すると、活性が相乗的に増強されることを発見した。そこで本研究では、乳がん細胞におけるこの増強作用の分子メカニズム解明を目指す。平成26年度には、まず、DNAに活性増強に必要な構造要因があるかの解明に取り組んだ。すなわち、EREエレメントは通常3回リピートであるが、この繰り返し数の影響を調べた。15回リピートのEREを持つレポーター遺伝子アッセイの結果、4回リピートで最大になった。また、3回リピートでリピート間スペースについて検討したところ、22 bpで最大になった。このように、DNAのエレメント構造にはER-ERRの協働作用に必須な構造要因があることが判明した。一方、核内受容体側の構造要因について調べたところ、活性増強にはER、ERRともにホモダイマー構造が必要なことが明らかとなった。さらに、これら受容体ホモダイマーについて直接的な相互作用はないことが判明した。以上の結果は、ERとERRの協働作用ではDNAエレメント構造に適合する他の転写活性化因子が介在している可能性が判明した。乳がん細胞MCF7でBPAの活性増強を調べたところ、SRC1以外の全てのコアクチベーター遺伝子の発現量が減少することが明らかとなった。これは17βーエストラジオール(E2)でも起こった。MCF7にBPA、あるいはE2を暴露すると、pGC1αの発現量が上昇し、他は減少した。これらの結果より、BPAの活性増強には特定のコアクチベーターが関与していることが推定された。環境解析学平成25年度では、3種の乳がん細胞において、E2暴露およびBPA暴露の有無で内在性9種類の受容体の遺伝子発現量の変化解析に成就した。さらに、ERおよびERRの一過性発現によるBPA活性の増強、あるいは抑制する場合のあることが判明した。

そして、乳がん細胞増殖試験により、BPAが乳がん細胞増殖作用を示し、それがERを介していることが明らかとなった。また、BPAが活性増強のために結合する受容体はERであることが判明した。一方、応答配列の作製、siRNAの導入条件の最適化に時間がかかったため、当初予定したsiRNAによる受容体の発現抑制による解析では結果を出すまでには至らなかったが、実施条件は明らかにできた。このように、本年度の研究はおおむねに順調に進展している。今後の研究については、まず、乳がん細胞において、共存するERRα、ERRγ受容体をsiRNAによるノックダウンし、BPA暴露のエストロゲン様の活性変化を解析する。そして、協働作用する核内受容体とERタンパク質間の相互作用を共免疫沈降法、BN-PAGE法、蛍光免疫染色やゲルシフトアッセイなど手法を用いて詳細に解析する。また、平成25年度の引き続き、天然の応答配列を用いて、活性増強作用を調べる。さらに、BPAによるエストロゲン様活性増強の分子メカニズムを確認・検証するため、ER、ERR受容体に1 μM以下の強さで結合する新世代ビスフェノールおよびフラボイド化合物など約30物質について、乳がん細胞でBPAと同様の手法で、細胞増殖に与える影響を解析と作用に関わる受容体の同定を行う。注文していた試薬の納品が、在庫切れのために間に合わなかったため。4月に納品予定である。
敗戦後の日本語ナショナリズム言説に関する基礎的研究-元宣教師の日本語教育経験から

本研究の仮説は,敗戦後の日本語教育において,日本人や日本文化の優位性・特殊性を強調する授業が行われていたのではないかというものであった。2009年度には,現在アメリカに居住している元在日宣教師11名へのインタビュー調査を実施し,2010年度には,補足調査としてアメリカ・ミシガン州ホランド市にて史料調査を実施した。それらの調査を2011年度に分析した結果,元在日宣教師らは主に東京日本語学校で日本語を学んだ経験をもっており,その授業内で特に日本文化の優位性・特殊性を強調した教育実践は行われていなかった,あるいは調査対象者の記憶には残っていなかったことが明らかとなった。[平成21年度前半]日本在住経験のある元/現宣教師に対するインタビュー調査の準備および現地(アメリカ・ミシガン州)での調査を行った。現地調査では,元/現宣教師,計13名に平均1時間強程度のインタビューを実施し,東京日本語学校等における日本語や日本文化の教授メソッド・教授内容を詳細に聞き取るとともに,学校組織以外での日本語や日本文化学習に関する個人的な学びの経験,困難について聞き取りを行った。同時に,宣教師によって書かれた手記やそれが掲載された雑誌の存在,また改革派教会の日本での活動に関する資料についての情報および収集方法に関する知識を得た。[平成21年度後半]インタビュー調査の結果の文字化を進めた。[研究実施内容の意義]占領期終了直後から1960年代にかけての日本語・日本文化教育および学びについて,従来の文献調査研究や教育者の回想ではなく,学習者自身の語りを通して実態を明らかにしうるという見通しを得た。他方で,当初の分析対象であった占領期については,インタビュー対象者に当該時期に在日していた者がおらず調査しえなかった。占領期下については,当時の文献収集・分析,宣教師以外のアメリカ軍関係者等を調査対象とするなど,別の研究方法が求められよう。平成21年度実施のインタビュー調査の文字化および分析を進めた上で,アメリカ・ミシガン州ホランド市のThe Joint Archivesにて関連文献の収集および第一次分析を実施した。インタビュー対象者であった元在日宣教師の多くが,The Joint Archivesに当時の私信や改革派協会とやりとりした文書などを収めており,The Joint Archivesのみで閲覧可能な,多数の資料群を収集することができた。また,日本では閲覧不可能な,改革派協会の各地での宣教活動を記録したThe Church Heraldの閲覧と関連記事の収集も実施した。これらの文献資料の第一次分析によれば,教育機関修了後の日本語使用における困難などについて書かれた文書は存在したものの,日本語教育機関で学んでいる当初に,その教育内容について記したという文書はほぼ皆無であった。すなわち,被調査者自身によって,同時代に日本語教育機関における教育の実態を記したものはないということになるが,このことにより,平成21年度に実施したインタビュー調査の重要性が増したということもできる。インタビュー調査では,1950年代から60年代にかけて日本語教育機関がどのような教授法でどのように日本文化的内容を扱っていたのかが,学習者の視点から具に語られた。平成22年度の文献収集調査により,本研究におけるインタビュー調査を,当時の日本語教育の実態を示す数少ない証言として位置づけることができた。今後はインタビュー調査の分析結果および文献資料の分析結果を公刊したのち,日本語教育などの研究者の共有資料とするためデータベース化を進める予定である。本研究の最大の目的は,敗戦後の日本語教育において,国家や文化というものがどのように教えられていたのかを明らかにすることであった。2011年度は,2009年度実施の元宣教師へのインタビュー調査を資料化するとともに,そのインタビュー調査結果および2010年度実施のアメリカ・ミシガン州ホランド市での史料調査の分析を行った。インタビュー調査となった元在日宣教師の来日時期から,占領期終了直後が主な考察対象時期となった。この時期,宣教師たちは東京日本語学校など,いわゆる長沼スクールで1年ほど日本語を学んでいたが,日本語の授業内で特に日本文化が強調されたという記憶をもつものは少なく,むしろ,直接法の日本語授業についていくのがやっとだったなど,授業で採用された教授法についての感想が述べられる場合が多かった。日本語授業の後,課外活動として日本人の家庭を訪れ茶道などを学んだという者はあったが,敗戦を経ても失われていない日本・日本人の文化を誇るという教育実践は行われていなかった,あるいは調査対象者の記憶には残っていなかったことが明らかとなった。他方で,文化との関わりはないものの,長沼スクールの教育実践の姿や,その方法を学習者がどのように捉えていたのかについては,当時の記憶,また現在から振り返っての評価を聞くことができた。

この点で,インタビュー調査の映像・音声資料および文字資料(牲川波都季,2012,『敗戦後の日本語ナショナリズム言説に関する基礎的研究-元宣教師の日本語教育経験から-資料集:文字資料編』秋田大学,牲川波都季2012,『敗戦後の日本語ナショナリズム言説に関する基礎的研究-元宣教師の日本語教育経験から-資料集:映像・音声資料編』秋田大学)は,1950年代半ばの教育実践の実態を,実際に受講していた学習者の視点で知ることのできる一次史料と位置づけられる。ただし本資料は,固有名詞の残し方・削除のあり方について検討が必要であり,現時点ではあくまでも希少なインタビュー内容の保管目的のものと位置づけられる。今後,検討と再整理を行い公開資料化する予定である。
Ｘ染色体を中心とした新たな化学物質毒性メカニズムの体系化と影響評価システムの構築

X染色体の遺伝子は1000種類以上あり、特に脳や精巣の発達に重要なものが多いが、XistとTsixというわずか二つの遺伝子によって多くが制御され、母胎内の化学物質に脆弱性が高いと推察される。そこで脳や精巣毒性が知られるビスフェノールA、ベンゾaピレン、DEHPを妊娠マウスに投与、その出生仔を解析したところ、XistやTsixの変化とともに多くの脳や精巣の発達に重要なX染色体の遺伝子が変化しており、毒性学上の全く新しい作用の可能性を提起した。さらに、これらの遺伝子の変化に一定の法則性を見出し、XistとTsixをバイオマーカーとして化学物質の次世代健康影響の予測システムへの応用可能性を示した。X染色体不活性化は単一の遺伝子で制御されその機構も不完全要素が多いが、脳神経系や生殖系など作用が広範に波及することから化学物質胎児期曝露に対する脆弱性が危惧される。我々はディーゼル排ガス胎仔期曝露について報告し(Kumamoto et al.,JToxSci,38(2),2013)、また、前年までにビスフェノールA胎仔期曝露がマウス大脳でX染色体不活性化因子(Xist,Tsix)の発現変動とともにX連鎖性脳発達関連遺伝子(Fmr1、Pak3、Gdi1、Nlgn3)を発現変動させることを見出している(Kumamoto and Oshio,JToxSci,2013,in press)。さらにX染色体不活性化因子と脳発達関連遺伝子のDNAメチル化解析を進めたが有意な変動は認められず影響はノンコーディング遺伝子であるXist,Tsix RNAを介するものと推察された。さらにXistを中心に探索を進め、ベンゾaピレン胎仔期曝露で顕著な差が見いだされた。ICR系妊娠マウスに妊娠7-15日目まで一日おきに20および80、320mg/kgを経口投与、その出生仔を検討し、雌出生仔の4日齢でXistの曝露濃度依存的な発現減少が認められたが、Nlgn3の減少を除きTsixおよびX連鎖性脳発達関連遺伝子に有意な差はなく、現在、発達過程での影響を検討中である。雄出生仔の7週齢で曝露濃度依存的な精巣萎縮と精子形成異常が認められ、その精巣中遺伝子発現を検討、Xistおよび検討した全てのX連鎖性精子形成関連遺伝子(Tex11、Tex13、Usp26、Taf2q、Taf7L、Nxf2、Fthl17)の曝露濃度依存的な発現減少が認められた。Tsixに差はなかったが、DNAメチル化酵素Dnmt1やヒストン脱アセチル化酵素Hdac1に有意な差がみられ、今後エピジェネティカルな影響について検討していく予定である。X染色体の活性は胎生期でXist遺伝子に制御されるが、X連鎖遺伝子は脳神経系や雄性生殖系など広範に作用することから化学物質に対する脆弱性が高いと推察される。これまでディーゼル排ガス胎生期曝露がXistとそのアンチセンスであるTsixの発現を曝露濃度依存的に上昇させることを見出していた。今回、ビスフェノールA胎生期曝露で成長後の大脳部位で有意なXistの発現減少とTsixの発現上昇を認め、さらにX連鎖性の脳発達に重要な遺伝子であるFmr1、Nlgn3、Pak3、Gdi1が総じて減少、既知の行動異常等の要因となりうることを示した。またDNAメチル化解析を行ったが変化は限定的であり、影響機序はノンコーディングRNAとして機能するXistとTsixのRNAレベルでの変化が重要であることが示唆された。加えて雄性生殖機能への影響を検討、精巣重量やAGD、精子産生量の変化に加え、精巣でXistとTsixが共に減少したがX連鎖性遺伝子群の変動は限定的であった。続いてベンゾaピレンの胎生期曝露を実施、若年齢の大脳部位でXist、Nlgn3、Ophn1の有意な発現減少を認めた。7週齢ではTsixの減少、Pak3、Gdi1の上昇を認めた。雄性生殖機能へは精巣重量や精子産生量の減少、AGD短縮等の影響に加え、XistおよびTaf2q、Tex11、Tex13、Nxf2、Fthl17、Usp26等のX連鎖性の雄性生殖発達に重要な遺伝子の有意な発現減少を認め関連性が考えられた。以上より、XistとTsixの変化の方向性が脳と雄性生殖発達を含む多くのX連鎖遺伝子群の発現調節に重要であるという知見が得られ、生体影響評価システムへの応用可能性が示された。X染色体を介した影響は化学物質の新たな毒性機構を提示することに加え、胎生期に確立されることから胎生期化学物質曝露の成長後影響の一因となりうることが示唆された。

X染色体の活性は単一の遺伝子で制御され不完全要素が多いながら脳神経系や生殖系、免疫系など広範に影響が波及すること、さらにその機構は多くの化学物質の作用点として見出されているエピジェネティクスによるものであり化学物質に対する脆弱性が高いと推察される。この毒性メカニズムの解明と体系化を目指し、脳発達や雄性生殖、エピジェネティクスへの影響が報告されているビスフェノールA 0.02,50mg/kgをICR系妊娠マウスに妊娠6,15日齢に経口投与、その出生仔について検討した。雌性出生仔は2、4日齢、3、7週齢で解剖しその大脳中遺伝子発現量をリアルタイムPCR法で検討、特に3、7週齢でX染色体不活性化因子であるXistの有意な発現減少とそのアンチセンスであるTsixの発現上昇が認められ、不活性化の維持機構への影響が示唆された。さらに精神神経疾患の原因遺伝子でありかつ分子機構が明らかなX連鎖遺伝子の発現変動を検討、3、7週齢でFmr1(神経細胞でmRNA輸送、脆弱X症候群に関与)、Nlgn3(シナプス連結、遺伝性自閉症に関与)、Pak3(ニューロン伸長、X連鎖精神遅滞に関与)、Gdi1(神経伝達物質放出、X連鎖精神遅滞に関与)の有意な発現減少が認められ、X染色体を介した影響がこれまで報告されてきた行動異常や組織障害の作用機序となりうることが示唆された。さらにXistとTsixのメチル化レベルをMSP法で検討、ほぼすべての時期で大きな変動は認められず影響はXistおよびTsix RNA(ノンコーディングRNAとして機能)を介するものと考えられた。なお肛門生殖器官距離や性ホルモンレセプターの発現変動など性染色体としての影響も生じている。雄性出生仔については7週齢で検討、精巣重量や精子正常形態率、一日精子産生量の有意な減少が認められ、現在精子形成や生殖能獲得に重要なX連鎖遺伝子を検討中である。上記のとおり、ビスフェノールA胎仔期曝露での成果を中心にベンゾaピレン胎仔期曝露での影響を見出しかつ進展させておりおおむね順調である。ビスフェノールA胎仔期曝露の成果については論文として発行された。研究実施計画に記載した曝露、遺伝子解析、DNAメチル化検討、雄の検討は概ね完了しており、ヒストン化学修飾解析は精度上昇に努めている。ビスフェノールA胎仔期曝露については雄性生殖およびエピジェネティクスへの影響を進展させる。ベンゾaピレン胎仔期曝露について成長に応じた変化を検討していく。必要に応じて新たな探索を進める。各種化学物質の影響評価として、ベンゾ[a]ピレン、TCDD等エピジェネティクスや脳神経系、雄性生殖系への影響が報告されている化学物質を胎仔期曝露し、平成23年度で得た評価項目を実施し比較検討することでさらなる生体影響評価システムの構築を目指す。上記に必要な遺伝子及びエピジェネティクス解析用試薬、動物、曝露物質など物品購入、学会旅費、論文投稿および英文校正費に使用する。上記に必要な曝露物質、動物、遺伝子およびエピジェネティクス解析用試薬など物品購入、学会旅費等に使用する。
新規アレルギー応答調節因子III型分泌性ホスホリパーゼA_2のマスト細胞における役割

アナフィラキシー誘発物質であるハチ毒に大量に含まれるホスホリパーゼA_2(PLA_2)の哺乳動物ホモログIII型分泌性PLA_2(sPLA_2-III)がマスト細胞介在性アナフィラキシーを制御することを見出した。すなわち、本酵素はマスト細胞に発現しており、マスト細胞の活性化だけでなく、分化成熟そのものを制御する。脂質メディエーター関連分子群(合成酵素・受容体)のノックアウトマウスとの比較から、sPLA_2-IIIの下流でマスト細胞の調節に関わるユニークな細胞間脂質ネットワークを解明しつつある。ホスホリパーゼA_2(PLA_2)分子群のうち、唯一III型分泌性PLA_2(sPLA_2-III)の欠損マウスのみマスト細胞主体のアナフィラキシーが顕著に改善することを明らかとしている。欠損マウスの組織マスト細胞は、未熟な顆粒を含有し、刺激に不応答であった。当該年度は(1)(2)(3)(4)の4項目に焦点を絞って検討を行った。マウスならびにヒトの皮下組織において、sPLA_2-IIIはマスト細胞の分泌顆粒に特異的に発現しており、刺激に伴い分泌されることを見出した。sPLA_2-IIIは細胞外分泌性の特徴を生かして機能することがうかがえる。未成熟な骨髄由来培養マスト細胞を皮下マスト細胞に類似の形質を持つ細胞へと分化成熟させ、この過程における遺伝子発現変動をマイクロアレイにより包括的に解析した。野生型マスト細胞では、分化成熟に伴い顆粒の育成、すなわち、ヒスタミン合成やプロテアーゼ合成に関わる因子の発現誘導が見られたが、欠損マスト細胞では見られなかった。これは欠損マウスの皮下マスト細胞が未成熟であることを示唆するものである。sPLA_2-IIIの欠損マウスでは、全身性アナフィラキシーショックや卵白アルブミン誘発皮膚アナフィラキシーの顕著な改善が見られた。したがって、sPLA_2-IIIは即時型アレルギー応答に普遍的に関与することが判明した。以上の解析を通じて申請者は、マスト細胞の前駆細胞が組織に定着した際にsPLA_2-IIIは未成熟マスト細胞から分泌され、マスト細胞を取り巻く微小環境中のリン脂質に作用し、局所環境から産生された何らかの脂質代謝物がマスト細胞の分化成熟を制御するという仮説を立てた。リン脂質代謝酵素III型分泌性ホスホリパーゼA_2(sPLA_2-III)はマスト細胞の分泌顆粒に発現しており、脱顆粒とともに細胞外に分泌されることや、本酵素の遺伝子欠損マウスの組織マスト細胞は形態的および機能的に未成熟であり、マスト細胞主体の即時型アナフィラキシーが野生型マウスと比べて顕著に軽減することを明らかとしている。本年度は、sPLA_2-IIIがどのような脂質代謝を引き起こすのか?に焦点を絞った解析を行い、大きく次のような結果を得た。(1)アラキドン酸代謝系関連酵素ならびに受容体欠損マウスの包括的アナフィラキシー応答解析(18種類)プロスタグランジンD_2(PGD_2)産生酵素L-PGDSおよびPGD_2受容体DP1の欠損マウスにおいてsPLA_2-III欠損マウスと同様アナフィラキシーの軽減が認められた。(2)マスト細胞分化成熟におけるPGD_2の関与i)マウス骨髄から調整した培養マスト細胞と繊維芽細胞の共生的成熟培養において、L-PGDSは繊維芽細胞側に、DP1受容体は成熟しつつあるマスト細胞に発現していた。ii)DP1受容体欠損マウス由来の培養マスト細胞は分化成熟異常を来した。iii)共生的成熟培養系によるマスト細胞の分化成熟はDP1アンタゴニストの添加により抑制された。したがって、sPLA_2-IIIは未成熟なマスト細胞から分泌され、微小環境中のリン脂質に作用し、局所環境でL-PGDSを介して産生されたPGD_2がマスト細胞のDP1受容体に作用することでマスト細胞の分化成熟は正に制御されているものと推察される。
サイドチャネル攻撃耐タンパ性のためのプログラム検証・プログラム合成技術

代表的なサイドチャネル攻撃の一つであるタイミング攻撃に関する研究を行った。具体的には、bucketingというプログラム変換によるタイミング攻撃に対する防衛手法について研究を行った。この研究ではどのようなプログラムおよび攻撃者に対してbucketingが有効であるのか調査することを目指し、bucketingにより安全性の保証を得るための必要条件および十分条件に関する成果を得た。これら、必要条件・十分条件は解析対象システムの正規チャネルとサイドチャネルの安全性を分離して議論することを可能とする枠組みであり、また、過去の観測に依存した動作を行える強力なadaptiveな攻撃者を考慮している。この研究の成果をまとめた論文はセキュリティに関する国際会議The 8th International Conference on Principles of Security and Trust (POST 2019)に採録された。加えて、一階述語不動点論理による時相仕様検証や循環証明による分離論理のための定理証明など、関連するより一般的なプログラム検証および定理証明についての研究も行った。研究はおおむね順調に進展している。「研究実績の概要」で述べたとおり、今年度は特にタイミング攻撃に関する研究を行い成果を得た。加えて、定理証明などプログラム検証・プログラム合成のための基盤技術の研究において成果を得た。今回は、特にサイドチャネル攻撃に関する研究として主にタイミング攻撃に限定して成果をあげたが、研究で得られた知見は電力解析など他のサイドチャネル攻撃にも一般化できると期待される。今年度の研究で得られた知見を元に研究を推進する。まず以下のテーマに取り組む計画である:(1)タイミング攻撃防衛に関する研究の深化、(2)adaptiveなサイドチャネル攻撃に関する研究。具体的に、(1)ではbucketingによるタイミング防衛手法により得られる安全性のより厳密な必要条件・十分条件の導出および他のサイドチャネル攻撃に対する防衛手法への一般化などを目指す。(2)ではadaptiveなサイドチャネル攻撃に関して一般的な議論を行うための枠組みの構築などを目指す。加えて、電力解析などのサイドチャネル攻撃に対して有効な防衛手段であるleakage resilienceについての研究なども行う。有償ソフトウェア・サービスの代わりに無償ソフトウェア・サービスの利用および早めの航空券購入などにより次年度使用額が生じた。当該助成金は翌年度分として請求した助成金と合わせて、国内外の学会参加および共同研究者との打ち合わせなど旅費および、研究資料購入など物品費として使用する計画である。
安定な架橋型三本鎖核酸を合成する新手法の開発

5-ヨード-2'-デオキシウリジンを出発原料とし、パラジウム触媒を用いた一酸化炭素挿入反応により5位にトリフルオロエトキシカルボニル基を導入した。5'水酸基をジメトキシトリチル基で保護した後に、3'水酸基を亜リン酸化しアミダイトユニット(1)を得た。DNA自動合成機を用い、ホスホロアミダイト法によって5'末端に1を含むオリゴヌクレオチド(2)を合成した。2を種々のアルキルジアミン(エチレンジアミン、ジアミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミノヘプタン)で処理し、脱保護、樹脂からの切り出しと同時にデオキシウリジン5位にアミノリンカーを導入した。つづいて、得られたオリゴヌクレオチドのアミノリンカー上にピリジルジチオプロピオニル基を導入した。得られたオリゴヌクレオチドの組成は、酵素で加水分解することにより確認した。さらに、ジチオスレイトールで処理しチオール誘導体へと変換した後に、酸素雰囲気下でジスルフィド結合を形成させ4種類の架橋型オリゴヌクレオチドを得た。得られた4種類の架橋型オリゴヌクレオチドのポリプリン・ポリピリミジン交互配列から成るDNA二本鎖に対する三本鎖形成能を熱変成により50%融解温度(Tm)を測定することにより比較検討した。その結果、合成した4種類の架橋型オリゴヌクレオチドはすべて、未架橋のオリゴヌクレオチドよりも高いTm値を示した。また、4種類の架橋型オリゴヌクレオチドのうち、エチレンジアミンで架橋したオリゴヌクレオチドが最も高いTm値を示した。
グローバルな炭素循環モデル構築を目的とする深海堆積物中のココリス分布の研究

E.huxleyiは温帯の堆積物に多く見られるナノ化石で、熱帯や亜熱帯地域の遠洋性堆積物ではFlorisphaera profundaが主要種として発見されている(7090%)。しかしF.profundaが生息生息するためには、海水に成層構造が発達していることが必要である。従って、成層構造が季節的にしか発達しない地域や湧昇が起こっている赤道と沿岸地域では、F.profundaは生息し難い。よって、湧昇の程度とF.profundaの生息数は負の相関関係を示す。例えば、現在アフリカ北西海域の海底表層の堆積物中のナノ化石のうち、2540%がF.profundaだが、湧昇が激しかったと考えられる最終氷期末の氷河後退期にはその割合は低く約315%である。一方、最終氷期から現在までのE.huxleyiの割合はおよそ一定である。これはE.huxleyiの生息に湧昇の与える影響が少ないか、またはE.huxleyiが湧昇を好む種であるためと思われる。長期的に見ればE.huxleyiの割合は一定であるが、時間分解能を上げて見ると、この地域では、北大西洋のハインリッヒイベントによる短期間の寒冷化の繰り返しに応じてE.huxleyiの割合も減少を繰り返しているなど、気温による影響が見られる(特にH2とH4のイベント)。また、プエルトリコ沿岸での1995年3月5月の期間の2週間に1度のサンプリングによれば、日照時間の増加に伴い急激にその数が減少していることが判明している。地球全域で見ると、E.huxleyiの割合が主要になったのは、温帯地域では73ka、湧昇地域では、1035kaからであり、湧昇地域のほうが温帯地域よりも短期間に繁殖することができたと考えられる。従って、湧昇地域でのE.huxleyiのアクメ帯は熱帯域や北極域よりも早い時期に形成されたものと考えられる。
パラリンピックの無形のレガシーに関する研究

平成30年度は以下の調査研究を実施した。1地域における障害者スポーツ競技団体の実態に関する調査研究:2000年に設立されたA県ボッチャ協会のマネジメントに関するヒアリング調査を実施し、組織の設立経緯、会員の実態、財務状況等について明らかにした。組織の目的が競技普及に偏っていること、1団体からの寄付に頼った経済基盤であること、マネジメントスタッフの少なさが組織の課題として明らかになった。2学校におけるパラリンピック教育の実態と効果:愛知県内の小学校において、パラリンピック教育を実施し、授業の前後での子どもの意識の変化、教員の意識について調査した。現在分析中である。3障害者スポーツの認知度に関する実態調査:障害者スポーツ大会名や競技名に関する認知度に関する全国調査を実施した。ボッチャとパラバドミントンは過去の調査結果と比較して認知度が上がっていた。また、年齢別では比較的年齢の高い層で認知度が高かった。居住地別では明らかに関東地区居住者がそれ以外の地区の居住者よりも認知度が高かった。近親者に障害者がいるかどうかの比較では、近親者に障害者がいる人の認知度が高かった。4障害者に対する意識および障害者スポーツに対する意識調査:障害者および障害者スポーツに対する意識調査をインターネット調査によって実施した。障害者スポーツを見たことがある人、体験したことがある人がない人と比べて障害者や障害者スポーツに対してポジティブな意識を持っていた。しかしながら、2014年、2016年の調査と比較して大きな変化があるとは言えないことがわかった。障害者スポーツ大会観戦者数に関する実態調査を行う予定であったが、大会の日程と調査可能な日程の調整がつかず、実施できなかった。今年度再度日程調整を行い実施したい。今年度は、障害者スポーツ人口の推移を日本障がい者スポーツ協会の協力を得て実施する予定である。各競技団体の登録者数の推移、地方障害者スポーツ大会の参加者の推移を中心に調査予定。また引き続きA県のボッチャ協会のマネジメントについてフィールド調査、およびパラリンピック教育に関する調査を行う。昨年実施できなかった障害者スポーツ大会観客数についても日程調整をして実施する予定である。さらに障害者の雇用実態に関する調査を実施する予定である。現在分析中である。今年度実施予定であった障害者スポーツ観戦者数調査が日程調整ができず、実施できなかったため次年度使用額が生じた。次年度においてこの調査を実施する予定であり、調査旅費等に今年度未使用分を充当する。
オーダーメイド治療を目指した日本人白血病細胞株バンクの整備と抗がん剤感受性の解析

小児急性リンパ性白血病(ALL)の薬剤感受性に関与するゲノム要因を同定するために、93株のBCP-ALL株と24株のT-ALL株(うち86株と7株が日本人由来)からなる、他に類のない大規模な細胞株バンクを構築し、さまざまな遺伝学的解析方法を用いて各細胞株のゲノム・レベルでの特徴を明らかにした。また、実際に細胞株バンクを用いて標準的な化学療法剤および新規治療薬の感受性と関連するゲノム要因を同定し、その研究成果を3つの英文論文を発表した。こうした研究成果から、本細胞株バンクが小児ALLの薬剤感受性に関与するゲノム要因を同定する上で有用であることが明らかになった。1、白血病細胞株バンクの整備;BCP-ALL株は日本人由来が83株に、海外で樹立された株も含めると合計90株が解析可能となった。これら全ての細胞株について凍結保存チューブを作製し、大規模災害等に備えて広島大学にも送付して保管を行っている。2、B前駆細胞型ALL細胞株における基本治療薬6剤に対する感受性因子の同定;新たに解析対象に加わった20株余りの日本人由来B前駆細胞型ALL細胞株について、小児ALLに対する基本薬6剤(ステロイド・ビンクリスチン・ダウノルビシン・ロイナーゼ・エンドキサン・キロサイド)に対する感受性解析を進めるとともに、未解析であった基本治療薬であるメトトレキセートとロイケリンに対する感受性を、全細胞株を対象に解析を進めてデーターベース化した。また、これらの化学療法剤に対する感受性遺伝子において、既報の遺伝子多型および変異、さらにはメチル化状態と薬剤感受性との関連性に関する解析を進めている。一方、新規の薬剤感受性遺伝子を明らかにするために、聖路加国際大学のKevin Urayama博士との共同研究で、72細胞株を対象に各薬剤感受性に関するGWAS(genome-wide association study)解析を開始した。既にSNPについては解析を終えており、現在はステロイド、ビンクリスチン、ロイナーゼに対する感受性について関連するSNPを同定するべくGWAS解析を進めている。3、B前駆細胞型ALL細胞株におけるクロファラビンに対する感受性因子の同定;クロファラビンはキロサイドと同系統の薬剤であり両者に対する感受性は中等度の相関を示したが、クロファラビンの殺細胞活性はキロサイドよりも高かった。キロサイド耐性と関連する遺伝子群の発現レベルも、クロファラビンの感受性への影響が弱いことが判明した。1、白血病細胞株バンクの整備;国内の諸施設に呼びかけて、新たに福島県立医科大学、三重大学、広島大学から合計5株のBCP-ALL細胞株の提供を受け、解析対象に加わった。当科で樹立して凍結状態にあった細胞株のうち、5株で再培養に成功して新たに解析可能となったほか、期間中に新たにBCP-ALL株を1株樹立した。2、B前駆細胞型ALL細胞株における基本治療薬6剤に対する感受性因子の同定;BIM遺伝子のメチル化状態がステロイド剤を含む複数の薬剤感受性と相関することを明らかにして、英文論文を投稿準備中である。さらに、ビンクリスチン、ロイナーゼ、キロサイドのそれぞれにおいて感受性を規定する遺伝子を同定し、現在は論文化に向けてさらなる解析を進めている。3、B前駆細胞型ALL細胞株におけるクロファラビンに対する感受性因子の同定;キロサイドに耐性を示す可能性が高いと考えられる症例を対象に、クロファラビンを用いることが現実的であると考えられる。そこで、キロサイドの耐性をより確実に予測できる因子を明らかにすることを目指して解析を進めている。1.白血病細胞株バンクの整備; BCP-ALL細胞株は日本人由来が3株増えて86株に、非日本人由来株も含めると93株が解析可能となった。T-ALL細胞株は日本人由来が7株で、海外で樹立された17株も含め24株が解析可能となった。2.ボルテゾミブおよびカルフィルゾミブに対する感受性因子の同定; IKZF1遺伝子の欠失を有する株がボルテゾミブに高感受性を示す一方で、P-gp陽性のALL細胞株はカルフィルゾミブに選択的に耐性を示しP-gp阻害剤との併用で耐性が克服されることを明らかにした。3.ゲノム編集技術を応用した薬剤感受性遺伝子の機能解析;CRISPR-Cas9を用いて、BCP-ALL株のキロサイドの感受性と関連するDCK遺伝子をノック・アウトし、キロサイドとクロファラビンに対して著明な耐性を認めた。さらに、遺伝子の変異や多型の薬剤感受性への影響を検証するために、CRISPR-Cas9による相同組み換え技術を応用して目的の遺伝子変異や多型を導入する実験系の最適条件を決定した。4. L-asparaginase感受性におけるASNS遺伝子のメチル化状態の意義;ロイナーゼ(L-asparaginase)に対する感受性が、ALL細胞におけるASNS遺伝子のメチル化状態と強く相関することを明らかにして、ASNS遺伝子のメチル化状態を指標にL-asparaginase感受性を予見できる可能性が示唆されたので、臨床応用を目指してHPLC法による解析方法を企業と共同で開発中である。5.薬剤感受性におけるGWAS解析;日本人由来のB前駆細胞型ALL細胞株の72株を対象に遺伝子多型(SNP)の網羅的アレイ解析を行ってデータ・ベース化し、GWAS(genome-wide association study)解析を能動的に活用するための体制を構築した。1.白血病細胞株バンクの整備; BCP-ALL細胞株は93株、T-ALL細胞株は24株の計117株の多様なALL細胞株が解析可能となった。2.遺伝子多型(SNP)の網羅的アレイ解析データ・ベースを活用した薬剤感受性関連SNP同定のためのGWAS