hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん不均一性メカニズム解明に基づいた難治性癌の先進的治療開発

成果の1つは、可視化癌幹細胞と非癌幹細胞をそれぞれ抽出してChIP解析を行い、癌幹細胞特異的遺伝子がクロマチン動的変動の不均一性によって発現制御されることを明らかにした点である(Ito, Tanaka, et al. PLosOne 2016)。クロマチン動的変動は単に幹細胞性の制御のみならず、治療抵抗性を惹起することを見出しており、臨床的に有用な治療バイオマーカーを同定し、治療抵抗性克服の臨床開発を展開する実践的成果が得られた(Ohata, Tanaka, et al. Mol Cancer Ther 2017)。もう1つの成果は、CRISPR/Cas9ゲノム編集を用いてクロマチン再構築複合体を解析し、ARID2変異によってヒト肝癌細胞ではDNA修復異常を惹起すること、臨床例では腫瘍変異負荷が有意に高いhypermutationを呈することを明らかにした点である(Oba, Tanaka, et al. J Hepatol 2017)。幹細胞のhypermutationによる発癌機序が報告され(Jager et al. Cell 2013)、腫瘍変異負荷は免疫チェックポイント阻害剤の有効性と相関することが注目されている(Le et al. NEJM 2015, Riaz etal.Cell2017)。ごく最近、腎癌とメラノーマにおいてARID2および同複合体因子の不活化が、免疫チェックポイント阻害効果と有意に相関することが臨床・基礎両面から報告され(Miao et al. Science 2018, Pan et al. Science 2018)、宿主免疫におけるARID2ファミリーの重要性が強く指摘された。本研究によりDNA修復異常、腫瘍変異負荷を標的としたARID2変異特異的な治療開発を推進する画期的成果が得られている。さらに上記成果に基づいた技術開発として、レンチウイルスベクターを用いた高効率ゲノム編集法を作成しており(論文投稿中)、難治性癌の不均一性を解明する新たな研究展開が始まっている点も計画以上の進展が認められる。本研究は、幹細胞可視化システムによる難治性癌の不均一性分子基盤解析と、その臨床応用を目指した先進的治療開発という二つの視点を特徴とする。幹細胞可視化システムを用いた解析の結果、クロマチン動的変動の不均一性により癌幹細胞転移能が制御されていることを見出し(PloS One 2016)、様々な癌腫で特徴的なクロマチン・ヒストン制御異常のサブタイプ特異性を解明するため、Crisp/Cas9ゲノム編集技術による解析を進めた(J Hepatol 2017)。ヘテロクロマチン形成を制御するDAXXは膵神経内分泌腫瘍PNETの特異的変異遺伝子として報告されたが、分子生物学的意義を解明するためゲノム編集技術を用いてDAXX欠失ヒトPNET細胞を作成した。その結果、幹細胞遺伝子プロモーター領域のヒストンH3.3メチル化を介した発現制御機序が破綻し、癌幹細胞性・造腫瘍性を惹起することを見出した(Endocr Relat Cancer 2018)。
自己免疫疾患における腸管自然免疫を介したＴリンパ球機能スペクトラムの制御

我々は、免疫疾患「ベーチェット病(BD)」において末梢血T細胞分化異常を報告してきた。近年、同細胞の分化に腸内細菌叢が密接に関わるとの報告が相次いでいる。そこで同疾患における腸内細菌叢メタゲノミクスを実施した。結果は、BDにおいてActinobacteria門ーBifidobacterium属系統が有意に優勢であり、逆に健常人では、Clostridia綱ーMegamonas属系統が優位であった。腸内細菌叢が何らかの機序でT細胞分化異常を生じさせているものと推察する。好ましくない腸内細菌叢の変化を「Dysbiosis」と呼ぶが、BDのDysbiosisの一つのパターンを発見したものと考える。本研究は、近年目覚ましく発展している腸内細菌メタゲノム解析データが、ヒトリンパ球機能と相関しているという仮説のもとに、健常人および自己免疫疾患患者(ベーチェット病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、再発性多発軟骨炎等)におけるそれぞれのパラメータを収集および解析するものである。初年度のメタゲノムおよびリンパ球解析の研究実績の概要は以下の通りである。腸内細菌メタゲノム研究は本研究組織においては実験系の立ち上げであったが、おおよそ二年間の準備期間を経て、すべて本研究組織に属する研究員および器材のみで開始することができた。このことは正確な測定を確保するにあたって重要であったと考える。複雑な次世代シーケンサを使用するためさらなる経験を要すると考えられるが、現在までに実験の再現性は十分に得ている。シーケンサより得られたデータの解析は、すべてインターネット上に公開されている、クラウド環境を用いる解析ソフトを使用して開始した。今後は市場調査にてより高度な解析が可能であるソフトの使用も視野に入れる。ヒトリンパ球機能研究においては、現時点で利用可能と考えられる解析パラメータの選択を終了させた。腸内細菌メタゲノム研究結果を反映するだけの鋭敏性は確保できたと推察している。こちらもすべて本研究組織に属する研究員および器材のみで測定可能であり、正確性は確保されている。このヒトリンパ球機能研究はおおよそ6年前に開始させているが、現在までの総合結果をまとめた論文を現在投稿中である。その論文の受理は、本研究を推進するにあたって必須であると考えている。収集検体は、血液、便に加えて消化管組織も対象となっているが、所属の臨床試験倫理審査を経て、収集を開始した。再発性多発軟骨炎においては、患者会を通じた検体収集も計画している。次年度のメタゲノムおよびリンパ球解析の研究実績の概要は以下の通りである。初年度後半の倫理審査委員会の承諾を待って、サンプルの収集を開始した。便サンプルに関しては、健常者10検体、ベーチェット病患者10検体、炎症性腸疾患(クローン病)1検体を収集し、随時解析を実施している。炎症性腸疾患患者1名に関しては、組織検体も収集している。解析に関しては、16S rRNA遺伝子による菌ゲノムをオープンソフトのQIIMEにて菌叢解析とα多様性解析を、健常人は全員、ベーチェット病患者においては5名まで終了させている。現在引き続きその解析を継続するとともにβ多様性解析方法の確立を試みている。解析結果によって対象疾患の拡張も図る。ヒトリンパ球機能解析は、現在健常者にてプロトコールの最終チェックを実施している。解析項目は、メモリーT細胞を用いSTAT蛋白およびTh17細胞関連遺伝子発現の動向観察が適当と判断した。ただし本研究目的に合致していることとは考えているが、個体差および経時変化が大きく研究プロトコールが最終的なものにはなっていない。さらに準備的な研究及び発表論文への反応を参考に、リンパ球機能解析を開始する予定である。ただし本研究の論文発表に関しては、もちろん結果いかんによるものの、現在解析中の便メタゲノム解析のみでも可能であると推察している。本研究は、近年目覚ましく発展している腸内細菌メタゲノム解析データが、ヒトリンパ球機能と相関しているという仮説のもとに、健常人および自己免疫疾患患者におけるそれぞれのパラメータを収集および解析するものである。平成27年度は、ベーチェット病12検体、健常人12検体まで測定検体を増やし、解析および論文作成を実施した。解析においては、昨年同様にオープンソースのQIIMEソフトウェアを中心に実施した。具体的には、元データの2.4GBのFastqファイル(テキストファイル、遺伝子約8千4百万リード数の解析結果)を同ソフトでフィルタリング・アノテーション・クラスタリングを実施した。その結果の菌種構成割合を統計処理するとともに、さらに同ソフトでαおよびβ多様性を計算した。また同データを、PICRUStというソフトにて解析することによって、菌種構成の分岐図を作成し、引き続き有意差をもって疾患およびコントロールそれぞれに優勢となっている菌遺伝子機能を検討した。以上の結果、ベーチェット病に特徴的な菌種構成が得られ、そのことを論文化・投稿し採択された(Shimizu J etal.PLOS ONE、印刷中)。また、菌遺伝子機能までの情報をまとめて邦文誌に総説を投稿した(清水らアレルギーの臨床2016;36:147-152)。このベーチェット病における腸内細菌叢遺伝子機能のデータは、他疾患のデータと比較し論文化する予定である。

上記の結果より、本研究の柱の一つである末梢血の「T細胞機能」の検討は大幅に簡略化可能と判断し、プロトコール作成を完了させた。すでに研究機関を本学に加え三宿病院、自衛隊中央病院、ともクリニックまで拡張しているが、今後さらに、横浜市立大学病院付属市民総合医療センター(炎症性腸疾患センター)および防衛医科大学校病院(消化器内科、膠原病アレルギー内科)も参加予定である。我々は、免疫疾患「ベーチェット病(BD)」において末梢血T細胞分化異常を報告してきた。近年、同細胞の分化に腸内細菌叢が密接に関わるとの報告が相次いでいる。そこで同疾患における腸内細菌叢メタゲノミクスを実施した。結果は、BDにおいてActinobacteria門ーBifidobacterium属系統が有意に優勢であり、逆に健常人では、Clostridia綱ーMegamonas属系統が優位であった。腸内細菌叢が何らかの機序でT細胞分化異常を生じさせているものと推察する。好ましくない腸内細菌叢の変化を「Dysbiosis」と呼ぶが、BDのDysbiosisの一つのパターンを発見したものと考える。初年度の反省点として、臨床試験倫理審査の準備不足により試料収集の開始に遅れが生じたことを挙げた。本年度は試料収集に着眼を置いたため、その遅れは穴埋めされたものと判断している。すなわち、健常人およびベーチェット病患者においては試料収集が研究の予定収集数に達することができた。現在、フリーソフトQIIMEにより解析を実施中であり、再解析を含めてバリデーションを同時に施行している。仮に所見が得られた場合には(健常人とベーチェット病の間での有意差の存在)には、我々の検討した範囲では論文報告可能なレベルになるものと推察している。またその結果によっては、膠原病を中心とした他疾患の試料収集の検討も開始する。さらにはβ多様性解析のためにバーコードを用いたゲノム抽出も開始しているが、現時点では解析に至っていない。論文には反映したいと考えている。リンパ球機能解析については、最終的なプロトコールの微調整を実施している段階である。しかし、健常人および患者の選定および同意取得はすでに終了しており、実施に大きな障害はない。微調整を要する理由の一つとして免疫学でのリンパ球機能概念の大きな変動が挙げられる。すなわち、次世代シークエンサー等を用いたいわゆるビッグデータによってTh1/Th2概念の見直しが進められているためである。我々には興味深い多数の新規知見が発表されつつある。それらのデータを加味してほぼ観察分子や培養時間等の設定を終了したので、新年度より解析を開始する予定である。現在我々のリンパ球機能解析方法の結果につき新たに論文化し投稿中である。可能であればこの論文に対する反応もプロトコールに反映させたい。内科学現時点での重点項目は、リンパ球機能解析プロトコールの決定にある。最善のプロトコール選択のために重要な点は、最新情報の収集にあると考えている。
RNAiを用いたショウジョウバエ変異体ライブラリーの構築

RNAiは二本鎖RNAを用い、標的遺伝子の発現(mRNA)をノックアウト(分解)する新技術である。ゲノム計画により明らかにされた遺伝子の系統的な機能解析にきわめて適している。本研究の目的は1)逆方向反復配列からなるRNAを発現させるDNA(IR-cDNA)を系統的に作成し、それをP因子導入法でショウジョウバエ個体に導入した変異体ライブラリーを系統的かつ網羅的に作成する技術を開発すること、及び2)1000系統からなる初期的な変異体ライブラリを実際に作成し、発生分化の機構解明に利用することにある。平成13年度は、以下の成果を得た。1)PCRプライマーの制限酵素サイトを2重にし、クローニングサイトを改良したベクターを改良した。また、至適なプライマー配列をコンピューターにより計算し、11000遺伝子について得ている。2)逆方向反復配列の間にイントロン配列を挿入することにより、RNAi効果を増強した。現在までに約1800遺伝子のIR-cDNAを作成し、またmicroinjectionによるハエの形質転換は700遺伝子について終了た。3)emc IR-cDNAと欠失染色体を用いた遺伝学的な解析から、多数のエンハンサー・サプレッサーの存在が明らかになり、これまで第3染色体上にそれぞれ2カ所の領域を特定、そのうちの1染色体領域に存在する65の遺伝子について、培養細胞でのルシフェラーゼ・アッセイを利用し、RNAiにおよぼす影響を検討した。3種の遺伝子がRNAiに必要である可能性があることが分かり、現在詳細な解析をおこなっている。4)dsR NAを2lbpに切断する酵素候補として、Dicer 1とDicer 2が知られていたが、Dicer 2の遺伝子は、N末のごく一部に対する配列しか分かっていなかった。完全なDicer 2のcDNAを単離し、配列を決めた。dsR NA切断の分子物差し機構を解明するためにDicerのds RNA結合ドメインとRnase IIIドメインを大量調製し結晶化した。構造解析の専門家と共同実験を始めている。
古生代後期における海山棲化石生物群の巨大化メカニズムの解明

本年度の研究遂行にあたり主軸として掲げてきたものは,赤坂石灰岩の巨大貝類化石群集において代表的な分類群であるシカマイア属二枚貝類の分類と古生態の解明である.このことを明らかにするために,赤坂石灰岩における野外調査と試料採取を行い,高精度な柱状図を作成し,シカマイア属二枚貝の産状を詳細に観察した.その結果,赤坂石灰岩中・上部層から新たに未記載の3種を見出した.この結果,日本におけるシカマイア属は,前期ペルム紀後期(Kungurian)から中期ペルム紀後期(Capitanian)にかけて5種存在したことが判明した.シカマイア属の古生態については,「光を透過する殻から太陽光を取り入れ,共生する藻類が光合成を行うことで殻を成長させた」とする光合成共生説が定説であった.しかし申請者らによる近年の研究により,光を透過できない殻体微細構造と黒色有機質石灰岩中に密集する化石の産状から,「ヘドロ状の堆積物から硫化水素に富む海水を取り込み,硫黄酸化細菌を軟体部に共生させることで殻を成長させていた」とする化学合成共生説が提唱されている.この新説に関して,新たに見出された3種においても検討を行ったところ,3種全ての殻体微細構造は,光を透過できない構造であることが判明した.また,どの種も黒色有機質石灰岩から密集して産出しており,新説を裏付ける結果となった.先行研究によると,現生二枚貝類殻体における安定炭素同位体比特性は食性により4つ(濾過食性・光合成共生・メタン細菌共生・硫黄酸化細菌共生)に分かれることが知られている.シカマイア殻体の安定炭素同位体比を測定したところ,硫黄酸化細菌共生に特徴的な値の傾向(古海洋の炭素同位体比よりも重い値)が示され,新説を地球化学分析の観点から検証される結果となった.本年度の成果により,シカマイア属は硫黄酸化細菌共生系二枚貝類であった可能性が高いことが判明した.本研究の調査地域であり,赤坂石灰岩が分布している岐阜県大垣市赤坂の金生山は,稼働中の石灰石鉱山であり,自由に野外調査を行うことが難しいが,地元の化石研究会の協力のもと,本年度も問題なく調査を行うことができた.そこで得られた化石試料は,筑波大学と国立科学博物館において,順調に剖出作業と薄片観察を行うことができた.貝類化石の記載古生物学的研究は,本研究において最も基礎となるデータであり,最も時間を要するものであった.特にシカマイア属二枚貝類はこれまで,石灰岩中から剖出することができず標本の3次元的な観察が行えなかったために,分類はおろか殻形態すら判明できていなかった.シカマイア属二枚貝類に関する一連の研究は,申請者のこれまでの研究で培われた化石の剖出技術と観察眼によるところが大きい.また,シカマイア属二枚貝類の種構成と古生態が解明されたことによって,赤坂石灰岩の巨大軟体動物化石群の特性を明らかにするうえで大きな手がかりになると確信している.2019年度は前年度同様,野外調査として,赤坂石灰岩岐阜県大垣市赤坂の金生山と周辺のペルム系中部の石灰岩体分布地域で地質調査を行う.赤坂石灰岩全体における高精度の柱状図を作成し,岩相層序,堆積相,シカマイア属二枚貝類を含む巨大貝類化石の層準と層序分布を明らかにする.申請者のこれまでの野外調査で得られた柱状図によると,赤坂石灰岩下部層最下部,中部層最上部,上部層ー最上部層境界付近のデータが乏しい状況であるため,それら層準が分布している鉱区へ可能な限り調査を試みる.巨大貝類化石はしばしば中型,小型,微小貝類化石を伴うため,それらの種構成,層序分布,古生態に関しても調べる.その為には,採取してきた試料の剖出作業と分類学的研究を進める.赤坂石灰岩の堆積環境,ひいては巨大貝類化石の生息環境復元をより鮮明なものにしていくために,採取してきた岩石試料に対して,安定同位体比や成分分析を行い,化石に残らないような情報の収集にも努める.巨大貝類化石層準のように,特徴的な層準に関しては,その前後の層準と共に可能な限りバイオマーカー分析も行っていく.得られた成果は,関連する学会や集会において発表すると共に,学術雑誌などで公表する.本年度の研究遂行にあたり主軸として掲げてきたものは,赤坂石灰岩の巨大貝類化石群集において代表的な分類群であるシカマイア属二枚貝類の分類と古生態の解明である.このことを明らかにするために,赤坂石灰岩における野外調査と試料採取を行い,高精度な柱状図を作成し,シカマイア属二枚貝の産状を詳細に観察した.その結果,赤坂石灰岩中・上部層から新たに未記載の3種を見出した.この結果,日本におけるシカマイア属は,前期ペルム紀後期(Kungurian)から中期ペルム紀後期(Capitanian)にかけて5種存在したことが判明した.シカマイア属の古生態については,「光を透過する殻から太陽光を取り入れ,共生する藻類が光合成を行うことで殻を成長させた」とする光合成共生説が定説であった.しかし申請者らによる近年の研究により,光を透過できない殻体微細構造と黒色有機質石灰岩中に密集する化石の産状から,「ヘドロ状の堆積物から硫化水素に富む海水を取り込み,硫黄酸化細菌を軟体部に共生させることで殻を成長させていた」とする化学合成共生説が提唱されている.

この新説に関して,新たに見出された3種においても検討を行ったところ,3種全ての殻体微細構造は,光を透過できない構造であることが判明した.また,どの種も黒色有機質石灰岩から密集して産出しており,新説を裏付ける結果となった.先行研究によると,現生二枚貝類殻体における安定炭素同位体比特性は食性により4つ(濾過食性・光合成共生・メタン細菌共生・硫黄酸化細菌共生)に分かれることが知られている.シカマイア殻体の安定炭素同位体比を測定したところ,硫黄酸化細菌共生に特徴的な値の傾向(古海洋の炭素同位体比よりも重い値)が示され,新説を地球化学分析の観点から検証される結果となった.本年度の成果により,シカマイア属は硫黄酸化細菌共生系二枚貝類であった可能性が高いことが判明した.本研究の調査地域であり,赤坂石灰岩が分布している岐阜県大垣市赤坂の金生山は,稼働中の石灰石鉱山であり,自由に野外調査を行うことが難しいが,地元の化石研究会の協力のもと,本年度も問題なく調査を行うことができた.そこで得られた化石試料は,筑波大学と国立科学博物館において,順調に剖出作業と薄片観察を行うことができた.貝類化石の記載古生物学的研究は,本研究において最も基礎となるデータであり,最も時間を要するものであった.特にシカマイア属二枚貝類はこれまで,石灰岩中から剖出することができず標本の3次元的な観察が行えなかったために,分類はおろか殻形態すら判明できていなかった.シカマイア属二枚貝類に関する一連の研究は,申請者のこれまでの研究で培われた化石の剖出技術と観察眼によるところが大きい.また,シカマイア属二枚貝類の種構成と古生態が解明されたことによって,赤坂石灰岩の巨大軟体動物化石群の特性を明らかにするうえで大きな手がかりになると確信している.2019年度は前年度同様,野外調査として,赤坂石灰岩岐阜県大垣市赤坂の金生山と周辺のペルム系中部の石灰岩体分布地域で地質調査を行う.赤坂石灰岩全体における高精度の柱状図を作成し,岩相層序,堆積相,シカマイア属二枚貝類を含む巨大貝類化石の層準と層序分布を明らかにする.申請者のこれまでの野外調査で得られた柱状図によると,赤坂石灰岩下部層最下部,中部層最上部,上部層ー最上部層境界付近のデータが乏しい状況であるため,それら層準が分布している鉱区へ可能な限り調査を試みる.巨大貝類化石はしばしば中型,小型,微小貝類化石を伴うため,それらの種構成,層序分布,古生態に関しても調べる.その為には,採取してきた試料の剖出作業と分類学的研究を進める.赤坂石灰岩の堆積環境,ひいては巨大貝類化石の生息環境復元をより鮮明なものにしていくために,採取してきた岩石試料に対して,安定同位体比や成分分析を行い,化石に残らないような情報の収集にも努める.巨大貝類化石層準のように,特徴的な層準に関しては,その前後の層準と共に可能な限りバイオマーカー分析も行っていく.得られた成果は,関連する学会や集会において発表すると共に,学術雑誌などで公表する.
腕の到達運動に伴う視覚的注意の変化

標的(ターゲット)に向けて腕を伸ばす到達運動が空間的注意に及ぼす影響を調べた.到達運動中に標的が左右に不意に移動した場合,素早い修正運動が引き起こされたが,この潜時は腕と対側半空間に標的が移動した方が同側半空間よりも早く,最終的な到達位置も正確であった.この非対称性は,運動空間と視覚空間を乖離させたバーチャル環境下でも観察されたが,特に腕の動きが視覚空間に見えていることが重要であった.さらに,実際の到達運動のみならず,他者が到達運動を行っている映像を観察する際にも,空間的注意が実際の到達運動と同様に変化することを発見した.標的(ターゲット)に向けて腕を伸ばす到達運動が空間的注意に及ぼす影響を調べた.到達運動中に標的が左右に不意に移動した場合,素早い修正運動が引き起こされたが,この潜時は腕と対側半空間に標的が移動した方が同側半空間よりも早く,最終的な到達位置も正確であった.この非対称性は,運動空間と視覚空間を乖離させたバーチャル環境下でも観察されたが,特に腕の動きが視覚空間に見えていることが重要であった.さらに,実際の到達運動のみならず,他者が到達運動を行っている映像を観察する際にも,空間的注意が実際の到達運動と同様に変化することを発見した.到達運動中にターゲットの不意な移動によって誘発される修正運動を用いて,到達運動に伴う空間的注意の変化に関する3つの研究を実施した.1)運動中に時々左右いずれかに変化するターゲットの呈示時間を短く(8ms)した場合の修正運動および知覚を検討した.短潜時のターゲットの呈示であっても,被験者は新しいターゲットに向けて運動を修正できた.しかしながら,ターゲットが知覚できない試行はターゲットが到達運動を行う腕の同側半空間に移動した場合の方が反側半空間よりも多く,最終的な到達位置も不正確であった.2)到達運動開始前にターゲットの左右いずれかに呈示される妨害刺激(60ms)がその後のスイッチング運動に及ぼす影響を調べた.その結果,同側半空間への修正運動は妨害刺激が反側半空間に呈示された試行で促進した.他方,反側半空間への修正運動は妨害刺激の影響を全く受けなかった.3)最終的な到達位置の手の配置の影響を調べた.右手の到達運動において,ターゲットを触れる人差し指を左側にむける条件と右側に向ける条件で比較したところ,これまで認められた修正運動の非対称性は左側を向ける条件では認められたが,右側を向ける条件では認められなかった.以上のような結果, 1)到達運動中の空間的注意は同側半空間から反側半空間へダイナミックに変化すること, 2)その結果,同側半空間のターゲットの知覚が低下すること, 3)ターゲットに触れる手の配置が空間的注意に影響を及ぼすことが明らかとなった.本年度,2つの研究を実施した.(1)CCDカメラを利用して運動空間と視覚空間を乖離したバーチャル環境を開発し,到達運動が空間的注意に及ぼす影響を検討した.被験者はCCDカメラを介して腕およびターゲット(LED)が呈示されたモニターを見ながら到達運動を実施した,その結果,モニター上に腕が呈示される条件では,これまでの報告と同様に空間的注意は腕と対側半空間にダイナミックに移動した.他方,腕の視覚情報が遮断され,ターゲットのみが見える条件では,空間的注意の非対称性は観察されなかった.この結果により,バーチャル環境下における到達運動に伴う視覚的注意の変化には,映像を通して身体図式の延長が重要であることが示唆された(2)到達運動の観察が観察者の空間的注意に及ぼす影響を眼球運動(サッケード)の計測により調べた.被験者は点灯する中央のLED(ターゲット)が左右いずれかに時々ジャンプする3種類の映像を観察した.A)スタート位置の右腕が全く動かない映像,B)スタート位置から中央のターゲットへ右腕が到達運動を行っている途中にターゲットが左右いずれかにジャンプし,腕が新しいターゲットに向かって修正を行う映像,C)中央のターゲットに対する右腕の到達運動中にターゲットがジャンプするが,腕は常に中央のLEDに向けて真っ直ぐ到達する映像であった.課題は,最初に中央のターゲットを固視し,ターゲットが移動した場合には素早く新しいターゲットに視線を向けることであった.映像上の右腕がスタート位置で全く動かない場合(A),左右のサッケード潜時に有意な差は認められなかった.これに対し,映像上の右腕が中央のターゲットへ移動中にターゲットがジャンプした場合(B,C),左側へのサッケード潜時の方が右側よりも有意に3040ms短かった.この運動観察中の視覚的注意の変化の要因として,脳内のミラーニューロンが関与している可能性が高いと思われる.今後,この現象をさらに詳しく調べる予定である.
インド仏教中観学派論書の文献学的研究(聖提婆の『四百論頌』を中心に)

チベット大蔵経にその翻訳完本が残る、聖提婆の『四百論頌』及び月称の注釈『四百論疏』の総合的な研究を目指す本研究は、原典の校訂、和訳、比較思想研究、及びデータベース化を計画したものであるが、年度内でその全体を完了するには至っていない。しかし、いずれの部もその完成の目処をつけるに至り、下記の諸成果を得た。1.同書の前半8章の内、第6、7、8章の和訳について、難解な部分を残しているが、一応の完成を見、次年度に発表する予定でいる。また、データのコンピュータ入力を進めている段階である。2.後半8章では、非仏教との対論あるいは批判について、どの学派の何を対象とした対論・批判であるか、その根拠の解明が困難なため、当初計画した第15章和訳は、5割程度の進行である。しかし、これまでに進めていた第14章の和訳を目下、思想比較を加えながらまとめ、発表しつつある。3.文献全体のコンピュータ情報化については、漢訳に残る護法の注釈書『広百論釈論』のデータ入力、チベット訳及びサンスクリット原典(断簡)の入力を進め、第14章はほぼ完了、そのデータベース処理について検討を進めている。術語の検索のみならず、サンスクリット・チベット・漢語の対応をも連関させたデータ入力・データ処理を、市販されているソフト(データベース型)にて進めているが、多様なソフトが提供されている現在ではあるが、特殊な古典言語の処理、他の研究者との相互利用をも考慮して広く活用できる方向を模索している段階である。ひとまず、MS-DOSベースのテキスト・ファイル型データとして蓄積し、他のソフトへの変換・汎用の可能性を考慮しながら、諸検索可能なデータに編集しつつある。その成果は、WORD-INDEXの形で、次年(あるいは2年後)に発表する予定である。
超低投入持続型水稲栽培システムのメカニズム解明と応用技術の開発

超低投入持続型水稲栽培(緑肥区)における水稲の生育調査、収量及び品質調査を行い、慣行栽培水田(対照区)と比較したところ、収量レベルや品質において両区に有意差はみられなかったが、緑肥区は対照区に比べて栽培開始時期によるバラツキが大きいことが明らかとなった。5月下旬に栽培を開始した緑肥区は、シロクローバーの生育が十分ではなく、固定された窒素量が比較的低かったため、栽培前期の養分吸収が十分ではなく、収量が比較的低くなった。一方、6月中旬に栽培を開始した緑肥区水田の水稲生育は、対照区を上回っており、比較的高収量になることが示された。本栽培体系においては、シロクローバー生育量が、直接窒素供給量に結びつき、その後の水稲生育に非常に大きな影響をもたらすことが明らかになった。緑肥分解後に生じる土壌還元および緑肥由来炭素によりメタンガスが多量に発生することが問題と考えられるが、緑肥区において中干し時期を1週間早めることにより、メタンガス発生が大幅に減少することを明らかにした。水稲栽培後に発生する主要な雑草であるスズメノテッポウを4月上旬に採取し、スズメノテッポウ内部に生息するエンドファイト微生物の抽出と16SrDNAアンプリコンによる微生物相の解析を行った。緑肥区の微生物相についてはデータを得ることができ、変動が少ないデータが得られたが、対照区のサンプル処理がうまく行かなかったため、現時点で比較することは難しいと考えられた。田面水および土壌表層に生息する土壌生物を定期的に採取し、個体数や重量を測定したところ、緑肥区での生物量が多いことを明らかにした。また田面水中の緑藻類の定量を行い、緑肥区で発生量が高い傾向にあることが示された。水稲栽培データ、収量データは確実に蓄積されており、今年度からは対照区の圃場数を増加させてデータの信頼性を高めている。また土壌生物に関する調査については、通常の昆虫類、クモ類、甲殻類、環形動物類、貝類の他に、土壌微生物相のメタ解析や土壌酵素活性の測定なども追加してデータを収集している。本栽培体系では、土壌温暖化ガス発生が大幅に増加することが、前年度明らかになったが、今年度は、中干しによる発生抑制対策が適切に機能し、大幅に減少させることができ、予想以上の成果が得られた。しかしながら、雑草中のエンドファイト微生物による窒素固定については、技術的な問題が残っており、改良が必要と考えられる。また、圃場全体の養分動態解明については、バラツキが大きいことから、測定点数を増やすなどして全容を明らかにする必要がある。今年度は3年目の中間年であるため、昨年に引き続き、水稲栽培、土壌養分、土壌生物、養分循環に関して着実に圃場からデータ収集を行い、年度末には研究発表ができるレベルになるようデータの解析を行う。上記に加え、雑草根圏や田面水微生物における窒素固定活性、土壌酵素活性と養分動態の関係解明、土壌微生物相の解析、圃場全体の養分動態解明に今後注力する。供試圃場、特に緑肥区の土壌成分が不均一であるため、土壌養分測定に大きな誤差が生じてしまうことから、測定サンプル数の増加、あるいはミニプロットによる実験などの対策を講じる。本研究は、超低投入水稲栽培システムのメカニズム解明と応用技術開発を目的とするものである。今年度から予定通り研究圃場において水稲栽培実験を行い、データの蓄積を開始しているが、初年度であるため、研究環境の整備および研究全般の流れや問題点のチェックを特に注意して行った。今年度に行った研究内容および実績は次の通りである。1水田土壌および水稲における養分・元素(C,N,P,K,Ca,Mg,Fe等)動態を測定し、詳細に動態を解明してバランスシートを作成した。2植物(緑肥、雑草、水稲)の元素保持・供給能力を明らかにし、適用条件や範囲を明確化した。室内インキュベーション実験を行ったところ、土壌微生物による緑肥や雑草の分解は湛水後1週間目にピークとなり、無機塩類の放出や有機酸の生成が生じることが明らかになった。また雑草が混入することで窒素供給速度が低下し、緩効的になることが明らかになった。3作物学的見地から水稲生育・収量・品質について詳細なデータを得た。超低投入区は、化学肥料区より初期生育がやや遅れたが、後半の生育が順調に推移すること、土壌からの窒素無機化(アンモニア生成)が後半まで持続していたことが、安定生産メカニズムの一因であると考えられた。4雑草中のエンドファイト(植物共生微生物)の検出に関する研究を始めるための準備を開始し、次年度開始直後にすぐ実験が開始できるようにした。5水田から発生する地球温暖化ガス(CO2、CH4、N2O)の発生量を定期的に測定を行い、超低投入水田からは、多量のCH4ガスが発生しており、環境保全のために栽培管理システムの修正が必要であることが明らかになった。この炭素源は緑肥や雑草由来と考えられる。6上記の研究成果の一部について学会発表を3課題行い、広く情報発信を行った(日本土壌肥料学会関西支部会、日本作物学会四国支部会)。研究を当初の予定通り遂行しており、初年度から十分な研究成果が得られた。また測定のタイミングや方法については若干修正が必要なことが明らかになり、より実態に近いデータを得ることができるようになった。さらに超低投入

栽培システムをより環境保全的に改良するための栽培管理案を作ることができ、当初計画よりもより研究を深化させることができる可能性がある。雑草体内からエンドファイト細菌遺伝子を効率的に抽出するには、特殊技術が必要であるが、他機関研究者の援助を受けることになり、この部分の小課題が順調に遂行する見通しとなった。超低投入持続型水稲栽培(緑肥区)における水稲の生育調査、収量及び品質調査を行い、慣行栽培水田(対照区)と比較したところ、収量レベルや品質において両区に有意差はみられなかったが、緑肥区は対照区に比べて栽培開始時期によるバラツキが大きいことが明らかとなった。5月下旬に栽培を開始した緑肥区は、シロクローバーの生育が十分ではなく、固定された窒素量が比較的低かったため、栽培前期の養分吸収が十分ではなく、収量が比較的低くなった。一方、6月中旬に栽培を開始した緑肥区水田の水稲生育は、対照区を上回っており、比較的高収量になることが示された。本栽培体系においては、シロクローバー生育量が、直接窒素供給量に結びつき、その後の水稲生育に非常に大きな影響をもたらすことが明らかになった。緑肥分解後に生じる土壌還元および緑肥由来炭素によりメタンガスが多量に発生することが問題と考えられるが、緑肥区において中干し時期を1週間早めることにより、メタンガス発生が大幅に減少することを明らかにした。水稲栽培後に発生する主要な雑草であるスズメノテッポウを4月上旬に採取し、スズメノテッポウ内部に生息するエンドファイト微生物の抽出と16SrDNAアンプリコンによる微生物相の解析を行った。緑肥区の微生物相についてはデータを得ることができ、変動が少ないデータが得られたが、対照区のサンプル処理がうまく行かなかったため、現時点で比較することは難しいと考えられた。田面水および土壌表層に生息する土壌生物を定期的に採取し、個体数や重量を測定したところ、緑肥区での生物量が多いことを明らかにした。また田面水中の緑藻類の定量を行い、緑肥区で発生量が高い傾向にあることが示された。水稲栽培データ、収量データは確実に蓄積されており、今年度からは対照区の圃場数を増加させてデータの信頼性を高めている。また土壌生物に関する調査については、通常の昆虫類、クモ類、甲殻類、環形動物類、貝類の他に、土壌微生物相のメタ解析や土壌酵素活性の測定なども追加してデータを収集している。本栽培体系では、土壌温暖化ガス発生が大幅に増加することが、前年度明らかになったが、今年度は、中干しによる発生抑制対策が適切に機能し、大幅に減少させることができ、予想以上の成果が得られた。しかしながら、雑草中のエンドファイト微生物による窒素固定については、技術的な問題が残っており、改良が必要と考えられる。また、圃場全体の養分動態解明については、バラツキが大きいことから、測定点数を増やすなどして全容を明らかにする必要がある。研究環境が整ったことから、今後は本格的にデータの収集や解析を行う。昨年度に引き続き、水稲生育の定期的な調査、収量調査を行うとともに、土壌、土壌生物、環境水、ガス発生など元素動態解析に必要なデータ収集をさらに精度を高めて行う。具体的には次の事項について研究を行う。1対象水田生態系における各元素のシンクとソース動態に関するデータを収集する。2定期的に土壌、作物、緑肥、雑草、環境水を採取し、窒素・炭素安定同位体元素濃度を測定し、生体元素の動態解析のためのデータを収集する。3水田に生息する土壌生物の生息数やバイオマスの測定を行う。
潜在的なダイズ黒根腐病菌の感染による 大豆の生育，大豆の根粒活性へ及ぼす影響

国内の大豆生産の改善に向け、様々なアプローチが試されている。しかし,未だ現場では原因不明生育不良が観察され国内のダイズ収量は低迷している。我々はこの生育不良に黒根腐病が係わっている可能性を検討し、その詳細について研究してきた。研究代表者らは、これまでの研究により黒根腐病菌を接種したダイズが観察上健全株と変わりないにも関わらず、根粒窒素固定能(アセチレン還元能,ARA)が著しく低下することを発見した。また、黒根腐病菌以外の他の病原菌の影響を調査したところ、このARAの低下が他の立枯性病菌ではみられず、黒根腐病菌に特有の現象である可能性を示した。つづいて、緻密な共生関係を構築し窒素固定をおこなっていると考えられる「根粒菌-ダイズの共生関係」に黒根腐病菌が介入してきた場合の影響を調査した。根分け法を応用して調査した結果、黒根腐病菌を接種した片側のポットのみARAの低下がみられ、ARAの停止が部分的におこっていることを示す結果となった。次に、接種条件の解明にむけて、異なる量の黒根腐病菌を接種した場合のARAに及ぼす影響を調査した。病原菌接種前および、接種後1週間おきに経時的にARAを測定して、ダイズのARAの低下・変化を明らかにした。接種病原菌が黒根腐病菌体(培養物)の場合、明確な差がなく全ての菌量接種区でARAが低下した。培養物の場合接種量の管理が難しいため、病原菌の接種状態を変えた。接種病原菌が黒根腐病(分生胞子数)の場合、接種する量によってARAが低下する場合としない場合があった。また,接種病原菌が黒根腐病(微小菌核)の場合も、分生胞子数と同様な結果となった。以上のことより、接種病原菌を培養物(菌体)から、分生胞子・微小菌核へ変更しても黒根腐病菌のARAへの影響が確認できた。また、接種する黒根腐病菌の量によりARAに及ぼす影響に差がある可能性が示唆された。国内の大豆生産の改善に向け,様々なアプローチが試されているが未だ現場での原因不明生育不良が観察され,国内のダイズ収量が低迷している.我々はこの生育不良に黒根腐病が係わっている可能性を検討し,その詳細について研究してきた.本研究者らは,これまでの研究により黒根腐病菌を接種したダイズが観察上健全株と変わりないにも関わらず,根粒窒素固定能が著しく低下することを発見した.似たような報告として,根粒に内生する非共生土壌細菌による窒素固定阻害や根粒内への非共生土壌細菌の進入により窒素固定低下の可能性を指摘した報告がある.このことから,根粒に他の微生物が感染する場合に,一般的な現象として,根粒の機能が停止すると考えることもできる.そこで,黒根腐病菌と他の病原菌(立枯病菌・炭腐病菌の2種類)を接種したダイズの根粒窒素固定能(アセチレン還元能,ARA)の変化を調査した.この2つの病原菌は日本で問題となっているダイズの生育後半の土壌病害を選択した.試験は,非破壊的で同一個体を連続的に測定する通気型アセチレン法を使用した.病原菌接種前および,接種後1週間おきに経時的にARAを測定して,感染ダイズのARAの低下・変化を明らかにした.試験の結果,炭腐病菌と立枯病菌を接種した場合,ARAの低下が観察されず,ほぼ接種後のARAは一定の値を示す結果となった.当然,対照区(接種菌なし)も同様にARAの低下が見られなかった.これに対して,黒根腐病菌の接種のみでARAの低下が見られ,接種後10日過ぎから著しい低下が見られた.以上のことから,根粒窒素固定能の低下は,黒根腐病菌に特有の現象である可能性を示す結果となった.本研究の進捗状況は,おおむね順調に進展している.本研究所の実験設備,構築した実験系,システム等も問題なく使用でき,実験を滞りなく遂行できた.また,本研究所に勤務する共同研究者(元研究分担者)との関係も良好で,今後の協力を得ることもできている.そのため,病原菌の取得,情報交換等も可能であり,今後の研究体制の構築にも問題はない.よって,全体計画としても順調に進めることができている.国内の大豆生産の改善に向け、様々なアプローチが試されているが未だ現場での原因不明生育不良が観察され、国内のダイズ収量が低迷している。代表研究者らは、これまでの研究により黒根腐病菌を接種したダイズが観察上健全株と変わりないにも関わらず、根粒窒素固定能が著しく低下することを発見した。つぎに、根粒の窒素固定の共生システムに他の微生物が関与した場合の一般的な現象として、根粒の機能が停止する可能性を検討した。そこで、黒根腐病菌以外の他の病原菌の影響を調査したところ、この窒素固定能低下が他の立枯性病菌ではみられず、黒根腐病菌に特有の現象である可能性を示した。続いて、研究代表者は緻密な共生関係を構築し窒素固定をおこなっている「根粒菌-ダイズの共生」に黒根腐病菌が介入してきた場合の共生関係の崩壊について調査した。水ストレスによる窒素固定停止が全身的か?

部分的か?を検討した報告を参考に根分け法を用いて黒根腐病菌による窒素固定能の停止が全身的にコントロールされているか?を調査した。この場合、仮説「窒素固定停止が部分的な場合、黒根腐病菌接種のポットのみ窒素固定の低下がおこり、全身的な場合、黒根腐病菌接種がなされていないもう片側のポットも窒素固定の低下がおこる。」を検証した。調査は、密閉できる根分けポットを用いてダイズを根分け法で栽培し、片方のポットに黒根腐病菌を接種し、対照-対照区と対照-黒根腐区の2区を設定し、非破壊的な通気型アセチレン法で測定した。試験の結果、黒根腐病菌の接種した片側のポットのみ窒素固定の低下がみられ、窒素固定の停止が部分的におこっていることを示す結果となった。本研究の進捗状況は、おおむね順調に進展している。実験の設備、測定システム等も問題なく使用できているので、実験を経時的におこなうことが可能である。また、昨年度までは共同研究者(元研究分担者)の協力も得ることができていたので、病原菌の取得、情報交換等も問題なくおこなわれ研究体制の構築ができており、順調に進めることができている。よって、全体計画としても順調に進めることができている。国内の大豆生産の改善に向け、様々なアプローチが試されている。しかし,現場では未だ原因不明の生育不良が観察され、国内のダイズ収量は低迷している。我々はこの生育不良に黒根腐病が係わっている可能性を検討し、その詳細について研究してきた。研究代表者らは、これまでの研究により黒根腐病菌を接種したダイズが観察上健全株と変わりないにも関わらず、根粒窒素固定能(アセチレン還元能,ARA)が著しく低下することを発見した。また、黒根腐病菌以外の他の病原菌の影響を調査したところ、このARAの低下が他の立枯性病菌ではみられず、黒根腐病菌に特有の現象である可能性を示した。つづいて、緻密な共生関係を構築し窒素固定をおこなっていると考えられる「根粒菌-ダイズの共生関係」に黒根腐病菌が介入してきた場合の影響を調査した。根分け法を用いて、調査した結果、黒根腐病菌を接種した片側のポットのみARAの低下がみられ、根粒窒素固定能の停止が部分的におこっていることを示す結果となった。当初の予定では、様々な接種条件の検討を予定していたが、黒根腐病菌の解明につながるデータとして、異なる量の黒根腐病菌を接種した場合の根粒窒素固定能に及ぼす影響を調査した。試験は、非破壊的で同一個体を連続的に測定する通気型アセチレン法を使用した。病原菌接種前および、接種後1週間おきに経時的にARAを測定して、ダイズのARAの低下・変化を明らかにした。試験の結果、異なる菌量(黒根腐病菌培養物)の場合、明確な差がみられず、すべての菌量接種区で根粒窒素固定能が低下した。それに対して、異なる菌量(分生胞子数)の場合、接種する量によって根粒窒素固定能が低下する場合としない場合があった。以上のことより、接種する黒根腐病菌の菌量により根粒窒素固定能に及ぼす影響に差がある可能性が示唆された。本研究の進歩状況は、やや遅れている。根粒窒素固定測定に関しては、実験の設備・測定システム等も問題なく使用できているので、実験を経時的におこなうことが可能である。本研究課題前半(H27- 28年度)は、当初参画予定であった共同研究者(元研究分担者)との協力が得られていたが、本研究課題の後半(H29年度以降)は、人事異動によって、病原菌の取得・情報交換等が難しくなったため、計画がやや遅れている。予定では、病原菌の作成を自分自身でおこない、培養・調整に多少時間をかけて洗練させれば問題ないと考えていたが、思ったよりも進められなかったことが原因であると考えている。
β-ジケトンキレート化学気相成長法を利用した希土類およびアクチノイド化合物合成

本研究は、化合物合成法としてβ-ジケトンキレートガスと反応性ガスとの気相反応を用いる化学気相成長法(CVD Chemical Vapor Deposition Method)を利用して、高純度で良質の結晶性の希土類およびアクチノイド固体化合物を得ようとするものである。本研究を通してCVD法を用いて希土類およびアクチノイド元素の高結晶性酸化物、硫化物および窒化物、フッ化物を合成しようとした。さらに本研究では、新たに2成分の金属を含む化合物を、(1)2種類のジピバロイルメタンキレートを利用、(2)昇華性の含2金属ヘキサフロロアセチルアセトンキレートを利用、によってCVD法で合成しようと試みた。その結果、新しいTlLn(hfa)_4型原料キレートおよびTl(dpm)型原料キレートを開発し,CVD原料として利用できるよう方法を確立した。結果を纏めると(1)酸素と水との反応:Tbを除く希土類Lnの場合は合成された化合物は共に酸化物Ln2O3であったが、Tbでは酸素による酸化物はTb4O7、水による酸化物はTb2O3であった。ウランでは酸素による生成物はU3O8の高温相であるのに対して、水との生成物はU4O9であった。(2)硫化水素との反応:生成物は重ランタノイドではオキシ硫化物Ln2O2S、Euでは一硫化物EuSであった。軽ランタノイド、トリウムとの生成物はアモルファス化合物で組成を同定できなかったが、蛍光X線分析の結果金属とイオウが一定の比で存在していることが確認でき、硫化物であることを示唆していた。(3)フレオン12との反応:ランタノイド3価キレートではLnOFとLnF3を分別合成することがわかった。(4)2金属成分化合物:Tlとランタノイドの両方を含む酸化物や硫化物、フッ化物の合成が可能となった。研究代表者および分担者は、数年前より共同で、β-ジケトンキレートガスと反応ガスとの気相反応を用いる化学気相成長法(CVD法)を利用して、高純度で良質の結晶性の希工類およびアクチノイド固体化合物を得、そのキャラクタリゼーションを行ってきた。本科学研究もその一貫して展開している。本年度の主な展開点を整理して述べる。1。これまで常圧による熱CVD装置を使用し展開してきたが、今年度真空装置と連結することにより、減圧熱CVD系を新しく作製し、その予備的検討を行った。減圧法は常圧法に比べ残留不純ガスを除去できるため化合物の純度が高くなった。今度実際のCVD膜を作成する際に有効に働くと考えられる。2。反応ガスとして、アンモニアを用いて窒化物を合成する実験を主として組んだ。窒化物の合成には未だ成功していない。この原因はβ-ジケトンキレートガスの問題点として、アンモニアの分解とキレートの分解の温度の違いにあると考えられた。3。反応ガスとして、次にフロンと酸素の混合系を利用する。フッ化物、塩化物の合成を考えた。この系での実験は成功した。各種フッ化物(三フッ化物、オキシフッ化物等)が分別合成できる点を発見した。三フッ化物は今度種々の原料化合物として、オキシフッ化物は光材料特に放射線計測材料として注目されている。この点は平成5年度の課題である。4。

新たなβ-ジケトンキレートガスの探求も始めている。従来はジピバロイルメタンキレートを主として展開してきたが、今含フッ素β-ジケトン配位子を利用している。この研究は、CVD法の金属蒸気源の研究として注目されている。以上の成果をもとに、平成5年度も引き続き上記テーマを展開する。研究代表者は,研究分担者と共にβ-ジケトンキレートを金属蒸気源とする化学気相析出(CVD)法を,ランタノイドおよびアクチノイド化合物の微量合成法に利用しようとしている。昨年までは主として,揮発性,熱安定性に優れたジピバロイルメタンキレートを原料として選び,すでにランタノイドおよびトリウム,ウラン酸化物,ランタノイド硫化物,およびフッ化物の調製法を開発してきた。今年度は,2成分の金属を含む化合物を,(1)2種類のジピバロイルメタンキレートを利用(2)昇華性の含2金属ヘキサフロロアセチルアセトンキレートを利用によってCVD法で合成しようという試みた。まず(2)の対象として新しい原料キレートTlLn(hfa)_4型を開発し,Ln(III)の軽ランタノイドとしてNd(III)を,重ランタノイドとしてYb(III)を選び調製し検討した。これまでにTlLn(hfa)_4の合成についての報告はないので,合成の基本的な方針はCsLn(hfa)_4の方法とまず同じように行い検討した。その中で次の方法が良い収率であった。エタノール中でTl(I)酢酸塩を良く撹拌しながら,配位子ヘキサフロロアセチルアセトン(H-hfa)を当量加えることにより,Tlhfaが生成する。TlhfaとLn(NO_3)_3とをエタノール性水溶液中で(4:1)の割合で反応させる。pHを8-9に調整することにより合成した。また(1)の対象としてこれも新しいTl(dpm)キレートを合成しCVD原料として利用できるよう方法を確立した。
胸腺T細胞におけるT細胞受容体(TCR)の発現様式

末熟Tリンパ球におけるT細胞受容体(TCR)の発現過程を検索する目的で、TーALL(T細胞性急性リンパ性白血病)やTーLL(T細胞性リンパ芽球性リンパ腫)を主体とするT細胞性腫瘍につき、βF1、δTCS1、ωT31などの単クロ-ン抗体を用いて免疫組織化学的に検索を行なった。βF1は、TCRβ鎖、δTCS1はTCRδ鎖、ωT31はTCRαβ鎖をそれぞれ認識する抗体であるとされている。検索した症例はTーALL10例、TーLL10例、末梢性Tリンパ腫8例の合せて28例のリンパ腫と反応性リンパ節2例である。βF1による検索ではTーALL5例、TーLL4例、末梢性Tリンパ腫7例が陽性であった。δTCS1陽性例は無かった。ω31による検索ではTーLL1例と4例の末梢性Tリンパ腫が陽性であった。βF1が陽性であったTーALLおよびTーLL症例9例のうち、6例はCD1(OKT6)陽性であり、一方CD1陽性7例のうち6例がβF1陽性であった。従って我々はTCRβはCD1の発現が始まる胸腫Tリンパ球段階のT細胞とほぼ同じかややそれより未熟な段階のT細胞に発現されるものと推測した。我々の免疫電顕による検索ではβF1に対する陽性反応はTーALL、TーLL、末梢性Tリンパ腫および反応性Tリンパ球の胞体内にのみ認められ、細胞表面には認められなかった。一方ωT31に対する陽性反応は腫瘍性並びに反応性Tリンパ球の細胞膜に局在していた。末梢性Tリンパ腫の約半数のみがωT31陽性を示した。このことからTCRβ鎖はcommon thymocyteの段階で胞体内に発現され、common thymocyteのかなり後期の段階になってはじめてTCRのβが細胞膜表面に発現されると推測される。
肝細胞癌に対する抗腫瘍免疫反応の意義の解明

本研究の最終目標は、免疫学的観点から個々の患者に最適な医療を提供することで、難治性である消化器癌の治療成績向上に寄与することである。平成28年度は、主な研究テーマである「肝細胞癌に対する抗腫瘍免疫反応の意義の解明」について、これまでに構築した研究実施体制に基づき、別途策定した研究計画に沿って、以下の13の研究を実施した。1:当院にて肝細胞癌と診断されて切除が行われた肝細胞癌患者の同定、2:病理診断後に保存された病理検体の病理学的レビュー及び薄切切片の作成、3:2のうち、102例について、病理検体を用いて、肝細胞癌局所に浸潤した免疫細胞に発現する表面抗原の網羅的な染色(延べ2000枚以上の免疫染色の実施)。一部の表面抗原については、平成29年度に実施予定であった、治療後の生存期間との関連についての予備的な検討を開始しており、発現が認められる免疫細胞については、腫瘍周囲及び周囲内部への浸潤が、癌切除後の無増悪生存期間及び生存期間と関連している知見が得られた(未発表データ)。当該所見は、これまで、腫瘍因子のみならず、患者の抗腫瘍免疫反応により、治療効果や患者予後が異なる可能性を示唆する所見である。今後、必要に応じて更に症例を蓄積した上で、残りの表面抗原についても同様に解析した結果に基づき抗腫瘍免疫応答の違いによる肝細胞癌の新たなグルーピングを行い、患者背景因子、治療効果及び患者予後との関連を詳細に検討することにより、治療選択に際して新たな有益な情報を付加することが可能になると考えられる。以上のように、腫瘍に浸潤した免疫細胞の数、特性、局在を評価することで、肝細胞癌局所に浸潤した免疫細胞に発現する表面抗原の網羅的なプロファイルが得られた。また、並行して、研究課題に関連した消化器疾患に関する臨床研究データの取り纏めを行っている。本年度は2つの国際学会を含む4つの学会にて口演発表を行い、論文発表を行った。本研究では、別途策定した研究計画に沿って、下記13の研究を平成29年度に実施する予定である。1:末梢血単核細胞(PBMC)についての免疫細胞の定量的評価及び腫瘍関連抗原(TAA)に対する特異的な免疫反応の検討、2:患者の背景因子、治療効果、患者予後等に関する情報収集、3:腫瘍組織を皮下へ移植したモデルマウスを用いた抗悪性腫瘍剤の抗腫瘍効果の検討。1について、肝細胞癌患者から得られたPBMCについて、表面抗原の免疫染色を行うとともに、各種免疫学的アッセイ法(ELISPOTアッセイ、CTLアッセイ、テトラマー法)により、TAAに対する特異的な免疫反応の有無を評価する。得られた結果を、平成28年度の検討でグルーピングされた患者群間で比較し、抗腫瘍免疫反応と関連を明らかにする。2について、肝細胞癌患者の患者背景(臨床的因子:年齢、性別、肝予備能等、病理学的因子:肉眼形、大きさ、分化度、脈管浸潤等、治療効果:無増悪生存期間、患者予後:全生存期間)に関する情報を収集する。得られた結果を、平成28年度の検討でグルーピングされた患者群間で比較し、抗腫瘍免疫反応との関連を明らかにする。3について、肝細胞癌を皮下へ移植したモデルマウスを作成し、既存治療薬(Sorafenib、CDDP等)及び開発中の免疫治療薬(Nivolumab等)を投与して抗腫瘍効果を検討する。