hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物オルガネラDNAの複製開始機構

植物独特のオルガネラであるプラスチドは,分裂組織におけるプロプラスチドから葉緑体やアミロプラストに分化する。この際、プラスチドDNAの塩基配列には変化がないが、細胞あたりのコピ-数は数百一万倍にまで大きく増加する。本研究では,コピ-数調節機構を明らかにする第一段階として,複製開始点の同定を行った。タバコ培養細胞BY2の定常期細胞を新鮮培地に移植するとプラスチドDNAの合成が核DNAに先行して起きる。^3Hーチミジンのとりこみを目的にして、複製開始直後の中間体を精製・濃縮した。この画分をプロ-ブとしてタバコ葉緑体DNAの制限酵素断片にハイブリダイズしたところ,葉緑体DNA中の逆位反復配列由来の制限酵素断片に強くハイブリダイズした。このことは,複製開始後,短時間しか経過していない複製フォ-クが逆位反復配列内に存在すること,即ち,複製開始点が逆位反復配列近傍に存在することを示している。より詳しいマッピングを行うため,複製中間体の電子顕微鏡による観察を行った。Dール-プを持つ断片の多くは,ハイブリダイゼ-ションで示されたものと同一の長さを示した。又,Dール-プを持つ断片を制限酵素地図上にならべると,Dール-プの位置までほとんど一致した。この地点(逆位反復配列の末端と23SrRUA遺伝子の間)の近くに複製開始点があると考えられた。又,2つの逆位反復配列の両方から,複製が開始されることが明らかになった。
日本食による神経精神疾患の予防効果に関する基礎的研究

ファーストフードやインスタント食品などによって,日本独特の食文化が衰退しており、ご飯や大豆を中心とした食生活の重要性が見直されている。平成16年度は2週間米を含む餌を食べたマウスと,米を含まない餌を食べたマウスの行動変化を観察したところ、市販のコーンスターチ入り飼料(コントロール)と比べて白米入り飼料や発芽玄米入り飼料を与えたマウスは水迷路試験で観察される空間学習能力が有意に高かった。そこで平成17年度はその神経調節機構について検討した。白米入り飼料や発芽玄米入り飼料を与えたマウスで見られた水迷路試験での学習能力の亢進作用はGABA(A)受容体拮抗薬ではなくNMDA受容体拮抗薬によってコントロールレベルまで抑制された。また、海馬におけるcalmodulin kinase II alpha(CaMKIIalpha)のリン酸化が有意に亢進していた。これらのことから米入り飼料の学習亢進作用の一部には海馬NMDA受容体/CaMKIIalphaを介する経路があることが示された。また、同様にICR系雄マウス(5週齢)を用い30日間の給餌後情動性に及ぼす影響について行動薬理学的に検討した。学習性無力および強制水泳の両試験において、コントロールと比較して白米入り飼料や発芽玄米入り飼料を与えたマウスにおいて抗うつ様作用が観察された。また行動実験終了後のマウス前頭皮質のセロトニン含量をHPLC法で測定したところ、コントロールと比較して白米入り飼料や発芽玄米入り飼料を与えたマウスにおいて有意に大きかった。したがって白米入り飼料や発芽玄米入り飼料は前頭皮質においてセロトニンの合成を高めることによって抗うつ様作用を示している可能性があることが明らかになった。生活環境の中で食事が健康に果たしている役割はかなり大きいものと考えられる.ファーストフードやインスタント食品などによって,日本独特の『米』文化が衰退してきている.統計によれば日本国民一人あたりの米の消費量は年々減り,今や一俵にも満たない.そこで毎日の食事の有用性を見出すために,日本人の主食であるご飯に着目し科学的に解析したいと考えた.平成16年度は一定期間米を含む餌を食べたマウスと,米を含まない餌を食べたマウスの行動変化を観察し比較することによって米の学習記憶機能に与える影響について検討した.ICR系雄マウス(5週齢)を用いて,実験を行った.まず,3グループに分けて飼育した.標準飼料(オリエンタル酵母工業社製,AIN-93G)群,『白米』混合飼料群,『発芽玄米』混合飼料群に分けて約1ヶ月間飼育した.そして給餌開始15日目より一日3回7日間の水迷路試験を行い特に空間学習能力に及ぼす影響について検討したところ,白米混合飼料や発芽玄米混合飼料を与えたマウスは標準飼料群よりも早くゴールにたどり着くようになった.このことから,白米混合飼料群や発芽玄米混合飼料群は標準飼料群よりも学習能力が優れていることを示していると考えられる.また給餌開始22日目にアルツハイマー型認知症の原因蛋白とされているβアミロイド蛋白(3nmol/3μL/mouse)をマウスの側脳室内に注入した.βアミロイド蛋白注入の7日後にY字型迷路試験により学習記憶障害の程度について評価した.その結果,標準飼料摂取群では自発的交替行動率が低下し短期記憶障害が観察された.また白米混合飼料摂取群でも同様な短期記憶障害が観察された.しかし,発芽玄米混合飼料摂取群では自発的交替行動率の低下は観察されなかったことから,β-アミロイド蛋白注入によるアルツハイマー型認知症になりにくくなっていることがわかった.ファーストフードやインスタント食品などによって,日本独特の食文化が衰退しており、ご飯や大豆を中心とした食生活の重要性が見直されている。
高電磁環境下での周期的多重過渡故障のオンラインマスク法

本研究では,DC-ACインバータのスイッチングノイズによって引き起こされる,論理回路における過渡故障の検出手法について提案した.提案手法では,元の回路の一部の機能のみ等価な近似回路と,元の回路に対する双対な論理設計とを組合せた双対近似回路を導入する.小規模な回路に対するシミュレーションを行い,多重故障検出能力について評価した.また,双対近似回路を適用する回路の特定およびテストのため,クリティカルエリアを考慮したテストパターン生成手法の高速化についても検討した.2段階テスト生成およびウインドウベースの探索により,従来手法と比較して40%のパターン数削減と10倍以上の高速化を実現した.本年度は,当初の研究計画に基づいて,まず逆論理近似回路に基づく誤り検出回路構成法について検討を進めた.インバータのノイズによる過渡故障は,ある時刻に複数発生するが,全て互いに同相であると仮定する.提案手法では,元の回路の一部の機能のみ等価な近似回路と,元の回路に対する双対な論理設計とを組合せた双対近似回路を導入する.元の回路の出力と双対近似回路の出力を比較することによって,面積オーバヘッドを低減しつつ,同相な同時多重過渡故障の検出を実現する.小規模な組合せ論理回路F,およびISCAS'89ベンチマーク回路s27を用いてシミュレーション実験を行った.実験では,2重化,双対回路を用いた誤り検出,近似回路を用いた誤りマスク,双対近似回路を用いた誤り検出の各対象回路に対して,単一または2重縮退故障を挿入し,任意の1パターン,および可能な全パターンの入力を印加した場合の応答を観測し,多重故障検出能力および出荷前テストでの検出可能性について評価を行った.単一故障に対しては,全ての回路構成において全ての故障が検出可能であった.一方,同相2重故障も発生する場合,回路Fにおいては13個の故障が障害発生となったものの,多くはテスト可能であった.しかし,s27では84%の故障が障害となり,またテスト可能であったのは34%であった.これは,回路内のNOTゲートの配置によるものと考えられるが,現在原因を調査中である.また,クリティカルエリアに基づいた故障カバレージ算出法,インバータスイッチングノイズに耐性を持つネットワーク設計法,低消費電力テストベクトル生成法についても研究を進めた.研究成果の一部を5件の国際会議, 4件の国内研究会で発表した.当初の研究計画に基づいて,まず逆論理近似回路に基づく誤り検出回路構成法について検討を進めた.入力信号を除く信号に発生する単一故障に関しては,双対回路によってほぼ完全に検出可能であることが判り,概ね順調に進展していると言える.ロックステップDET-FF構成法に関しては進めていないが,これは実験の結果から,NOTゲートの前後に印加される多重過渡故障に関してはロックステップでの除去が困難という新たな知見が得られたためである.また,速度,自由度の面から,当面は評価用チップを作成せずにレイアウトデータを用いてシミュレーションを行うこととした.前年度に実施した,小規模回路に対する双対近似回路の有効性の評価から,双対近似回路では多重過渡故障に対して充分なマスク性能を発揮できない可能性があることが明らかとなったため,デバイスレベル,およびシステムレベルのマスク技術を補完的に組み合わせることを検討し,本年度は主にデバイスレベル,システムレベルの各要素技術について検討を進めた.本年度は,主に,(a)クリティカルエリアを考慮した故障検出に対する高速テストパターン生成法,(b)高電磁環境下での耐ノイズ性を考慮したネットワークおよびLSIの設計および評価法,および(c)スマートグリッド通信における耐故障データ集約,の3点について研究を進めた.(a)に関しては,これまで故障シミュレーションと貪欲法を用いた探索によってO(n^2)の計算量を必要としていたテストパターン生成アルゴリズムを改善し,ウインドウベースの絞込みによってO(n)の計算量を達成しつつカバレージ低下を抑制するアルゴリズムを提案した.成果を国際会議にて発表し,また2017年中の論文誌採録が決定した.(b)に関しては,宇宙環境での民生機器の使用を想定し,キャッシュメモリ多重化手法の性能・信頼度トレードオフモデルについて検討した.また,アンバイポーラ素子を用いたLSIの耐故障設計手法について検討を進めた.国内研究会,国際会議にて発表を行った.(c)に関しては,セキュリティ・プライバシーを考慮しつつ,スマートメーターの故障やノイズによる通信障害が発生しても電力使用量データ集約を可能とするプロトコルについて提案した.国内研究会にて発表し,2017年度中の国際会議発表に採録決定した.前年度に実施した,小規模回路に対する双対近似回路の有効性の評価から,双対近似回路では多重過渡故障に対して充分なマスク性能を発揮できない可能性があることが明らかとなったため,デバイスレベル,およびシステムレベルのマスク技術を補完的に組み合わせることを検討し,本年度は主にデバイスレベル,システムレベルの各要素技術について検討を進めた.各要素技術は,それぞれ単体で信頼度改善に寄与することを評価実験により示した.

今後,これらの手法を組み合わせることにより,当初想定したレベルの信頼度を達成することが可能であると期待できる.また,提案手法の評価に向け,性能・コスト・信頼性のトレードオフを考慮した評価指標についても策定した.前年度は,デバイスレベル,およびシステムレベルのマスク技術を補完的に組み合わせて総合的なオンラインマスク技術を確立することを指針として,主にデバイスレベル,システムレベルの各要素技術について検討を進めた.本年度は,デバイス・ネットワークレベルの要素技術をさらに高めることを目的として,(a)クリティカルエリアを考慮した故障検出に対する高速テストパターン生成法,(b)高電磁環境下での耐ノイズ性を考慮したネットワークおよびLSIの設計および評価法,および(c)スマートグリッド通信における耐故障データ集約,の3点について研究を進めた.(a)に関しては,2016年度に開発したアルゴリズムではO(n)の計算量を達成できないことが明らかとなったため,固定サイズのウインドウを用いてO(n)の計算量を達成する手法について検討した.また,複数の故障モデルを同時に考慮したパターン生成・並べ替えフローを提案し,成果を国際会議にて発表した.(b)に関しては,ノイズおよびプロトコルを考慮した車載ネットワークシミュレータの開発,IoTセンサネットワークにおける耐故障通信手法,多数センサが存在する環境でのリアルタイム無線データ伝送手法について検討を進めた.一部の成果を国際ワークショップ及び国内研究会にて発表した.(c)に関しては,昨年度の研究成果であるプライバシー考慮データ集約プロトコルに関して国際会議発表を行うとともに,国際会議での議論を踏まえ,プライバシーを考慮しつつ故障ノードを特定可能なデータ集約プロトコルを開発し,評価を行った.今後,国内研究会及び国際会議での発表を検討している.本研究では,DC-ACインバータのスイッチングノイズによって引き起こされる,論理回路における過渡故障の検出手法について提案した.提案手法では,元の回路の一部の機能のみ等価な近似回路と,元の回路に対する双対な論理設計とを組合せた双対近似回路を導入する.小規模な回路に対するシミュレーションを行い,多重故障検出能力について評価した.また,双対近似回路を適用する回路の特定およびテストのため,クリティカルエリアを考慮したテストパターン生成手法の高速化についても検討した.2段階テスト生成およびウインドウベースの探索により,従来手法と比較して40%のパターン数削減と10倍以上の高速化を実現した.双対近似回路を用いた場合の面積と信頼度のトレードオフが実験により示されたため,次年度は予定どおりクリティカルエリアを考慮した信頼度評価を行い,最適な近似回路構成法について検討を進める.また,実験で明らかとなったNOTゲート近傍の2重故障の問題に関して,論理合成に基づく対応策を検討する予定である.本年度の研究成果を踏まえ,デバイスレベル,回路レベル,システムレベルの耐故障設計技術を適切に組み合わせた多重過渡故障オンラインマスク手法について検討を進める.性能・コスト・信頼性のトレードオフを考慮した評価指標に基づいて,実用規模の回路において所望の正常動作率を達成するための最適冗長構成法について検討する.ディペンダブルコンピューティング海外出張旅費精算の際,適用される為替レート表の認識の違いにより1円の誤差が生じた.年度末の国際会議出張における出張旅費・学会参加費精算における為替変動旅費等に使用する.予定している国内・海外出張旅費の一部として適切に執行する.
感情病における血小板セロトニン_2受容体の生物学的マーカーとしての有用性の検討

感情病(うつ病)における血小板セロトニン_2受容体(5-HT_2受容体)の生物学的マーカーとしての有用性について検討した。5ml程度の少量の血液サンプルで5-HT_2受容体の解析ができる新しい方法として、血小板ペレットを用いたレセプターオートラジオグラフィー法による解析法を確立し(薬物・精神・行動vol.12,p392,1992)、本法を用いて、予め書面により研究への協力の同意の得られた未治療あるいは2週間以上服薬していない大うつ病患者(DSM-III-R診断、ICD-10診断)と、正常対照者の血小板5-HT_2受容体の解析を行った。5-HT_2受容体結合特性は、Scatchard解析によりKd値、Bmax値を求め、有意差検定は関連のない2郡間のt検定を用いた。Kd値は、患者群、対照群においてそれぞれ0.89±0.12nM、0.82±0.05nMであり、有意差を認めなかった。Bmax値はそれぞれ5.84±0.83fmol/mg,3.22±0.34fmol/mgであり、患者群において有意な増加が認められた。以上のように、うつ病における血小板5-HT_2受容体の最大結合数の増加が認められ、血小板5-HT_2受容体の生物学的マーカーとしての有用性が示唆された。また、これまで指摘されてきた中枢5-HT_2受容体の機能亢進を反映している可能性も示唆された。現在、本法の利点を活かして、治療開始後1周目、2週目、4週目、寛解時に血小板5-HT_2受容体の解析および臨床症状の評価を行っており、治療反応性と同受容体数の関係について検討している。更に、5-HT再取り込み阻害作用の強い抗うつ薬、ノルエピネフリン再取り込み阻害作用の強い抗うつ薬、炭酸リチウム、電気けいれん療法等治療薬治療法の違いによる血小板5-HT_2受容体への影響について調べ、治療上の生物学的マーカーとしての有用性について検討したい。なお、今回の結果については、第19国際神経精神薬理学会議(Washington,D.C.,1994年6月)にて報告予定である。
顆粒球コロニ-刺激因子受容体の解析

本研究では、顆粒球コロニ-刺激因子(GーCSF)受容体の構造と機能を明らかにすることを目的とし、以下の成果を得た。まず、発現クロ-ニング法によりマウスGーCSF受容体cDNAを単離し、このcDNAをプロ-ブとしてヒトGーCSF受容体cDNAを単離した。塩基配列の解析から、GーCSF受容体は約800アミノ酸残基から成り、単一の膜貫通ドメインを有する膜タンパクであることが示された。細胞外ドメインは免疫グロブリン様ドメイン,他のサイトカイン受容体との相同性を有するドメイン,3個のフィブロネクチンタイプIIIドメインから構成され、細胞質ドメインはILー6受容体β鎖(gp130)の細胞内領域と有意な相似性を示した。また、GーCSF受容体染色体遺伝子を単離し、さらに染色体マッピングを行なった。その結果、本遺伝子は17個のエクソンから構成されており、ヒトでは第1染色体短腕(1p35ー34.3)に、またマウスでは第4染色体に存在することが示された。次いで、クロ-ニン化したGーCSF受容体の細胞増殖,分化における機能を調べる目的で、種々の細胞にGーCSF受容体cDNAを導入し、これを構成的に発現する形質転換株を樹立した。ILー3依存性骨髄球細胞株FDCーP1およびproーB細胞株BAFーB03の形質転換株ではGーCSF依存性の細胞増殖が観察され、導入したGーCSF受容体がILー3受容体と同様に機能することが示された。また、FDCーP1ー形質転換株をGーCSF存在下で培養することにより、Mac1,Mac2分化抗原の誘導やThy1,F4/80抗原の発現抑制が観察され、導入したGーCSF受容体が細胞増殖のみならず細胞分化にも機能することが示唆された。さらに、いろいろな変異GーCSF受容体cDNAをFDCーP1細胞で発現させてGーCSF結合性および応答性について解析した結果、GーCSFの認識には細胞外領域のサイトカイン受容体相似ドメインが必須であること、GーCSF依存性細胞増殖には細胞質ドメインの76アミノ酸残基からなる領域が不可欠であることが明らかになった。平成2年度は、顆粒球コロニ-刺激因子(GーCSF)受容体のcDNAおよび遺伝子をクロ-ン化して、その分子構造,遺伝子構造を明かにすることを目的とし、以下の成果を得た。まず、COSー7細胞を用いた発現クロ-ニング法により、マウスNFSー60細胞のcDNAライブラリ-からGーCSF受容体cDNAを単離した。次いで、このcDNAをブロ-ブとしてヒトU937細胞および胎盤のcDNAライブラリ-からヒトGーCSF受容体cDNAを単離した。これらのcDNAを発現させたCOSー7細胞では^<125>IーGーCSFの高親和性結合(Kd=290550pM)が観察された。塩基配列の解析より、GーCSF受容体は812アミノ酸残基(マウス)あるいは813残基(ヒト)から成り、単一の膜貫通ドメインを有する膜タンパクであることが明らかになった。

細胞外ドメインは免疫グロブリン様ドメイン,他のサイトカイン受容体との相同性を有するドメイン,3個のフィブロネクチンタイプIIIドメインから構成され、細胞質ドメインはILー4受容体やILー6受容体β鎖のそれと有意な相似性を示した。また、この他の分子種として、U937細胞からは膜貫通ドメインを欠失した分泌型の受容体と考えられるcDNAが、胎盤のライブラリ-からは細胞質ドメインに27アミノ酸残基の挿入を含むcDNAが得られた。Northern解析の結果、GーCSF受容体の発現は骨髄細胞,骨髄性白血病細胞および胎盤で認められた。特に胎盤では骨髄性白血病細胞の約20倍のmRNAが発現しており、GーCSFが胎盤の細胞にも作用する可能性が示唆された。さらに、GーCSF受容体cDNAをプロ-ブとしてヒト遺伝子ライブラリ-よりの染色体遺伝子を単離した。構造解析の結果、ヒトGーCSF受容体遺伝子は全長約18kbにわたっており、17個のエクソンから成ることが明らかになった。また、染色体マッピングにより、GーCSF受容体遺伝子はヒト染色体1番短腕(1p35ー34.3)に存在することが示された。研究代表者らは、平成2年度の本研究によって、マウスおよびヒトの顆粒球コロニ-刺激因子(GーCSF)受容体cDNAをクロ-ン化し、その構造を明らかにした。平成3年度は、まず、GーCSF受容体cDNAをプロ-ブとして、ヒトおよびマウスGーCSF受容体染色体遺伝子を単離し、さらに染色体マッピングを行なった。その結果、本遺伝子は17個のエクソンから構成されており、ヒトでは第1染色体短腕(1p35ー34.3)に、またマウスでは第4染色体に存在することが示された。次いで、クロ-ン化したGーCSF受容体の細胞増殖、分化における機能を調べる目的で、種々の細胞にGーCSF受容体cDNAを導入し、これを構成的に発現する形質転換株を樹立した。ILー3依存性骨髄球細胞株FDCーP1およびproーB細胞株BAFーBO3の形質転換株ではGーCSF依存性の細胞増殖が観察され、導入したGーCSF受容体がILー3受容体と同様に機能することが示された。他方、ILー2依存性T細胞株CTLLー2の形質転換株においてはGーCSF依存的DNA合成が一過的にのみ観察された。また、FDCーP1の形質転換株をGーCSF存在下で培養することにより、Mac1、Mac2分化抗原の誘導やThy1、F4/80抗原の発現抑制が観察され、導入したGーCSF受容体が細胞増殖のみならず細胞分化にも機能することが示唆された。さらに、いろいろな変異GーCSF受容体cDNAをFDCーP1細胞で発現させてGーCSF結合性および応答性について解析した結果、GーCSFの認識には細胞外領域のサイトカイン受容体相似ドメインが必須であること、GーCSF依存性細胞増殖には細胞質ドメインの76アミノ酸残基からなる領域が不可欠であることが明らかになった。また、GーCSF受容体の装胞外領域を成長ホルモン受容体のそれと置換したキメラ受容体cDNAを発現させたFDCーP1細胞では、成長ホルモンに依存した細胞増殖が観察された。この結果から、リガンドの結合による受容体分子の活性化には、両者の受容体に共通した分子機構が関与していることが示唆された。
環境機能とう台水機能の調波を目指した河道内植生の管理

(1)多摩川をフィールドに河岸に生育するオギとヨシを有する河岸が植生護岸として有効に機能する外力と河岸の条件を明らかにした。河岸の土壌は上層が砂で、下層はシルトを含んだ礫であることが多い。砂層内にオぎの根がマット状に広がっているときオギの根茎の土壌保用作用によって上層の侵食低抗力は高くなる。このため、相対的に低抗力の弱い下層が侵食され、オギの根を含む上層が残りヒサシ状の形態をとる。このヒサシが河岸の侵食速度を小さくすることを明らかにした。原位置試験器を開発し、さらにオギの節の直接引張強度を測定した。オギ一本当りの引張り強度は27Kgfであった。このオギの地下茎の引張り強度を用いて、オギをもつヒサシ状河岸が破壊する限界流速を求めた。計算結果は現地の測定結果を適切に説明できた。(2)ヨシ原群がポートの造る波のエネルギーをどの程度反射し、減衰させるかを荒川下流部での現地調査と造波水槽によって調ベた。調査地点は荒川の14.5Km右岸で、用いた船は河川巡視船“すみだ"と“あらかわ"の2隻である。水深は船の航行位置で約6m、ヨシ原前面で1.01.5mである。ヨシ原で波は不完全反射し、部分重複波となる。波の峰の包絡線と谷の包絡線を観測し、Healyの方法で反射率KRを求め、また伝達率を実測した。この結果、波がヨシ原を8mを透過するとエネルギー損失率は(6080)%にも達する。“あらかわ"がつくる大きな波のエネルギーに対しても、ヨシ原のエネルギー減衰効果は大きく、ヨシ原の背後の河岸に対する波の侵食力は、ヨシ原が数mあるとほぼゼロとみなしてよいことが明らかとなった。また、ヨシ原での波の反射率はわずか0.050.15となり、テトラポットの反射率0.20.35よりも十分小さく、水面利用の上からもヨシ原は有効であることを示す。
高度技術社会における日米の児童・生徒の「数と計算」に関する比較文化的研究

算数・数学科の「数の計算」に関する授業において、「見積もり」と「数感覚」に関わる教師の役割は最も重要な研究課題である。本研究は「数と計算」の指導過程において、生徒が使用する方略および彼らが経験する困難点を、まず、日本において研究することからはじめた。ここでのキ-ワ-ドを「見積もり」と「数感覚」において、「数と計算」における教授と学習に関するインタビュ-を行い、認知プロセスを具体的に解明しょうと現在も研究を進めているところである。特に、「数と計算」の調査問題を分析し、「見積もり」と「数感覚」に関する『変形』、『相殺』、『移行』などのストラテジ-を同定し、小学校2年生と4年生と6年生そして中学校の2年生及び教員養成大学の学生の優秀な者と普通の生徒に対して、インタビュ-を実施しているところである。その結果を利用して児童・生徒の発達に即した指導内容と方法を考慮したカリキュラムの研究をする予定であったが、これは今後の課題である。本研究では「数と計算」の指導過程において、電卓・コンピュ-タの導入に際して、教師が指導する仕方に依存して、生徒が使用する方略および彼らが経験する困難点を、教師が行う指導との関連で捉え、日本と米国という異なる文化環境のもとで捉え直す比較研究を行っているところである。現在、暗算で処理するための基礎的な研究である、見ることと聞くことによる情報の処理の相違を明らかにしたところである。これによると簡単な整数と暗算の四則計算は見ても聞いても処理のうえで有為差は見られなかったが、複雑な情報の処理、例えば、分類表現や文章で提示された情報では、明らかに見ることを通した方が、情報全体を正確に把握し、処理することが分かった。この点を人間の理解過程の解明に活用して、情報のインプットとアウトプットとその間のブラック・ホ-ルの解析に活用して行きたい。そして、わが国と米国の教育環境異同、つまり教室文化や地域社会の文化などを考慮して比較研究を行った。本研究は、「数と計算」の指導過程において、電卓・コンピュ-タ-の導入に際して、教師が指導する仕方に依存して、生徒が使用する方略および彼らが経験する困難点を、教師が行う指導との関連で捉え、日本と米国という異なる文化環境のもとで捉え直す比較研究を行うことを目的として実施した。当研究では、主な研究領域を日米で特に重要視されている「見積り」と「数感覚」において行い、「数と計算」における教授と学習に関するカリキュラムと評価の観点から、調査した。まず、小・中学校の「数と計算」に関するカリキュラムを「見積り」と「数感覚」におき、それらの観点から調べ、電卓・コンピュ-タ-の導入によって、一層指導効果が上がると思われる方法を明らかにした。また生徒が陥り易い誤った見方や考え方を同定し、その治療的指導を電卓・コンピュ-タ-で行うことを目的とした。本年度は、次のような計画にもとづいて研究を行った。(1)6月中旬に研究計画についての協議を持つ、そこでは、日本と米国の教育環境、殊に教室での数学の学習活動育の様相を分析し、教育方法や科学技術教育等の立場から高度技術社会の実態を検討した。(2)8月中旬に日本と米国の算数・数学のカリキュラム・教科書などに見られる「数と計算」の展開の仕方を分析した。この際、「見積もり」と「数感覚」の使用場面に留意して調査問題の試案を作成した。

(3)これまでのIEAとNCTMの「数と計算」の調査問題を分析し、「見積もり」と「数感覚」に関するストラテジ-を同定し、小学校3年生と5年生、中学校の2年に対して、調査を実施した。その結果を(1)で述べた観点から分析した。なお、今年度の研究成果を国際会議や国内の学会等で研究発表した。算数・数学科の「数と計算」に関する小・中・高等学校で占める授業の割合は大きい。わが国は高度技術社会に向けて変容しつつある中で、学校教育、特に算数・数学科の授業に電卓・コンピュ-タ-の導入は避けて通れない時期に来ている。そこでの教師の役割は最も重要な研究課題である。本研究は「数と計算」の指導過程において、電卓・コンピュ-タ-の導入に際して、教師が指導する仕方に依存して、生徒が使用する方略および彼らが経験する困難点を、教師が行う指導との関連で捉え、日本と米国という異なる文化環境のもとで捉え直す比較研究を行っているところである。現在、暗算で処理するための基礎的な研究である、見ることと聞くことによる情報の処理の相違を明らかにしたところである。これによると簡単な整数と暗算の四則計算は見ても聞いても処理のうえで有為差は見られなかったが、複雑な情報の処理、例えば、分数表現や文章で提示された情報では、明らかに見ることを通した方が、情報全体を正確に把握し、処理することが分かった。この点を人間の理解過程の解明に活用して、情報のインプットとアウトプットとその間のブラック・ホ-ルの解析に活用して行きたい。そして、わが国と米国の教育環境異同、つまり教室文化や地域社会の文化などを考慮して比較研究を行った。当研究では、比較的容易に解明できる「数と計算」の領域から始める。ここでの主な研究領域を日本で特に重要視されている「見積もり」と「数感覚」の関連を教師と子どもとにおける教授と学習に関するカリキュラム評価の観点から、具体的な提言をする予定であったが、「数と計算」におけるカリキュラムの「見積もり」と「数感覚」の関連を解明するのに時間がかかった。特に、「数感覚」の解明には、多くの時間を必要とした。また生徒が陥り易い誤ったストラテジ-を同定することはできた。また。その治療的指導のプログラムを開発する手掛かりを得た。
乳歯歯髄由来細胞における抗炎症メカニズムの解析

結合組織の修復や再生に深く関与している乳歯歯髄細胞において、炎症反応の抑制機序解明および適切な培養条件の検討を目的として研究を行った。LPSおよび熱刺激(41°C15分)を乳歯歯髄由来細胞に処置後、増殖能および遺伝子発現変動について検討を行った。また無血清培地で培養した細胞について、細胞形態変化および遺伝子発現変動を検討した。LPSおよび熱刺激により細胞増殖能は一時的に低下するものの、72時間後には回復がみられた。PT-PCRではIL-6およびIL-12の増加が認められ、HSP70の発現増加も認められた。また、無血清培地で培養した細胞は、細胞形態および遺伝子発現に変動が認められた。平成25年度は、heat shockを乳歯歯髄由来細胞に単独処置した後、まず細胞形態変化、増殖率および生存率に対する影響について検討を行った。実験に先立ち、まずは加えるheat shockの条件について検討を行った。heat shock39°C、40°C、41°C、42°Cについて検討し、heat shockを加えた後の培養条件についても、37°C0分、30分、60分、90分について検討した。その結果、39°C40°Cのheat shockを与え、その後37°Cで3060分培養した細胞は、無刺激のものと比較して、細胞増殖能に影響がみられないことを確認した。さらに、細胞保護において重要であるとされるheat shock protein(HSP)の産生について検討を行った。HSPの産生能についても、heat shockを与える時間やその後の場合用条件によって、HSPの産生能に変化がみられることを確認した。本研究では、様々な細胞への分化能を有することで注目されているヒト乳歯歯髄細胞において、炎症部位の組織破壊をもたらす種々のサイトカインやMMP、そして抗炎症作用を持つアデノシンやHSPが、どのように関連しているかについて解明し、歯髄炎に対する治療指針の可能性の範囲を拡大させるとともに、幹細胞として有用である歯髄細胞の保存に向けて再生医療への路を拓くことを第一の目的とする。まずは、heat shockの条件について検討を行い、39、40、41、42度について、また培養条件においても、30、60、90分について検討を行った。その結果、3940度のheat shockを与え、その後37度で3060分培養した細胞は、無刺激のものと比較して細胞増殖能の影響がないことを明らかにした。さらに細胞保護に重要であると考えられているHSP産生について検討を行った結果、3940度のheat shockを与え、その後37度で3060分培養した細胞はheat shock proteinA1の遺伝子発現が最も増強することが明らかとなった。また、タンパク発現について、Elisa kitを用いて検討を行った結果、HSP70の産生増強が確認できた。また、近年ヒト間葉系組織や間葉系培養細胞において多能性を有するが腫瘍性を持たないとされる新たなタイプの体性幹細胞Multilineage- differentiating stress enduring (Muse)細胞が報告され、種々の研究が進められていることから、乳歯歯髄由来培養細胞に存在するMuse細胞の比率について検討を行った。その結果、乳歯歯髄由来細胞には、約0.67%のMuse細胞が存在することが明らかとなった。今後は、この乳歯歯髄由来Muse細胞とHSPの関連性についても検討を行っていく予定である。本研究は、様々な細胞への分化能を有することで注目されているヒト乳歯歯髄細胞において、炎症部位の組織破壊をもたらす種々のサイトカインやMMP、そして抗炎症作用を持つアデノシンやHSPが、どのように関連しているかについて解明し、歯髄炎に対する治療指針の可能性の範囲を拡大させるとともに、幹細胞として有用である歯髄細胞の保存に向けて再生医療への路を拓くことを目的として行った。その結果、3940度のheat shockを与え、その後37度で3060分培養した細胞は、無刺激のものと比較して細胞増殖能への影響がないことを明らかにした。さらに細胞保護に重要であると考えられているHSP産生について検討を行った結果、3940度のheat shockを与え、その後37度で3060分培養した細胞は、heat shock proteinA遺伝子発現が最も増強することが明らかとなった。また、タンパク発現についてElisa kitを用いて検討を行った結果、HSP70の産生増強が確認できた。また、乳歯歯髄由来培養細胞に存在するMuse細胞を組織修復へと応用することを目的として、まずは乳歯歯髄由来培養細胞からMuse細胞を分離し、分離した細胞における分化能の検討、損傷歯髄組織に対する修復能の検討、さらにはMuse細胞の精製、存在比率を上げる方法について検討を行った。その結果、乳歯歯髄由来細胞には約0.67%のMuse細胞が存在する可能性が示唆され、クラスターの形成が確認出来た。Muse細胞を分離するための乳歯歯髄細胞を購入予定であったが、ドナーの不足により入手困難となり、予定していた実験数を行うことができなかったため。本研究では、様々な細胞への分化能を有することで注目されているヒト乳歯歯髄細胞において、炎症部位の組織破壊をもたらす種々のサイトカインやMMP、そして抗炎症作用を持つアデノシンやHSPが、どのように関連しているかについて解明し、歯髄炎に対する治療指針の可能性の範囲を拡大させるとともに、幹細胞として有用である歯髄細胞の保存に向けて再生医療への路を拓くことを目的として行った。

その結果、3940度の熱刺激を30分与え、その後37度で3060分培養を行った細胞は、無刺激のものと比較して細胞増殖能に影響がないことを明らかにした。さらに細胞保護に重要と考えられているHSP産生について検討を行った結果、3940度の熱刺激を30分与え、その後37度で3060分培養を行った細胞は、heat shock proteinA遺伝子が最も増強することが明らかとなった。またタンパク発現についてElisa kitを用いて検討を行った結果、HSP70の産生増強が確認できた。さらに、短時間での熱刺激(5分)を与えた際のHSPの影響についても検討を行い、短時間の熱刺激ではHSP27遺伝子の変動を明らかにした。また、乳歯歯髄細胞に存在するMuse細胞を組織修復へと応用することを目的として、まずは乳歯歯髄由来培養細胞からMuse細胞を分離することを試みた。その結果、0.67%のMuse細胞が存在することが示唆され、乳歯歯髄細胞由来Muse細胞のクラスター形成が確認できた。結合組織の修復や再生に深く関与している乳歯歯髄細胞において、炎症反応の抑制機序解明および適切な培養条件の検討を目的として研究を行った。LPSおよび熱刺激(41°C15分)を乳歯歯髄由来細胞に処置後、増殖能および遺伝子発現変動について検討を行った。また無血清培地で培養した細胞について、細胞形態変化および遺伝子発現変動を検討した。LPSおよび熱刺激により細胞増殖能は一時的に低下するものの、72時間後には回復がみられた。PT-PCRではIL-6およびIL-12の増加が認められ、HSP70の発現増加も認められた。また、無血清培地で培養した細胞は、細胞形態および遺伝子発現に変動が認められた。ヒト乳歯歯髄細胞において、炎症部位の組織破壊をもたらす種々のサイトカインやMMP、そして抗炎症作用を持つアデノシンやHSPが、どのように関連しているかについて明らかにすることができた。乳歯歯髄細胞を購入でき次第、当初予定していた実験およびその成果発表を学会にて行う予定である。小児歯科学近年ヒト間葉系組織や間葉系培養細胞において多能性を有するが腫瘍性を持たないとされる新たなタイプの体性幹細胞Multilineage- differentiatingstress enduring (Muse)細胞が報告され、研究が進められている。Muse細胞は1細胞から3胚葉性の細胞に分化可能で、またストレス耐性能、多能性幹細胞マーカーの発現、自己複製能などを有するとされている細胞である。また生体に存在することから腫瘍性増殖を示さないという大きな利点を有し、間葉系幹細胞と多能性幹細胞の両方の特徴を備えており、間葉系マーカーCD105とヒトES細胞マーカーSSEA-3の二重陽性細胞として組織や間葉系の培養細胞から単離可能であると報告されている。さらに、腫瘍を作らないという安全面だけでなく、分化誘導もせずにそのまま生体内に投与するだけで組織修復細胞として働くことが確認されており、Muse細胞の母集団となる間葉系幹細胞は現在世界中で数多くの臨床試験が展開され、安全性が確認されている。
高機能チップを用いた細胞機能解析システムの構築

古細菌のエーテル脂質カルドアーキオールを簡略化したモデルを設計し、C21のアルキル鎖の両端をトリエチレングリコールで修飾し、一端をスルフヒドリル化した人工細胞膜の合成を行った。基本的にはこれまでやってきた11-ブロモウンデセンとトリエチレングリコールを出発原料とし、DMF中NaHでアルコキシドを発生させて縮合後、水酸基を保護した後にWittig反応で炭素-炭素結合を形成した。続いて一端をチオアセチル化し、脱保護し、人工細胞膜の構成成分であるPEGアルカンチオールを合成した。合成したPEGアルカンチオールは2mMのエタノール溶液とし、金薄膜を蒸着したガラスチップを浸漬することで自己組織化膜を形成させた。このチップをXPSと大気中AFMにより表面を観察することによって自己組織化膜の確認をした。またこの膜構成成分を用いて基板上で膜タンパク質を再構成させることができるかどうか検討するために、緩衝液中でリポソームを形成させることができるかどうかを試みた。しかし、溶解性も悪くリポソームの構成ができなかったので、末端の水酸基のリン酸化を試みている。膜タンパク質としては古細菌のエネルギー変換装置であるバクテリオロドプシンを選択し、サントリー生物有機化学研究所よりその産生株の譲渡を受け、培養系を立ち上げた。
歴史リテラシー獲得を支える認知的要因および社会的要因の分析

歴史の理解と学習を支える歴史リテラシーがどのように獲得されていくのか、その獲得を支える要因の分析を学習者および教師の認知的側面と、日本における学習環境の特徴という社会的側面から行うことを目的とした。前年度までに行った研究の知見は以下のとおりである。歴史の学習に関する先行研究を概観した。複数の研究知見から示唆されるのは、歴史の学びにおいて各種史料を呈示する順番が学習者の理解で重要ということである。その観点で日本の教科書を省みると、そこで学習者がどのように情報に接していくのか、その順番の配慮がわかりにくい構成となっていた。さらに、歴史の学びでは、メタディスコースすなわち語りの文に敏感になることが重要であり、パラフレーズすなわち学習者が自分の言葉で反芻することが学びをはぐくむものであることを示した。学習者の持つ「認識についての信念」に関わる文献を収集し、それをもとに調査を行った。この結果、学習の方法の信念に関しては、先行研究の報告とは異なっている可能性が示唆された。また、学習者のもつ信念のひとつとして、文章のスタイルを調べ、それが読解時の行動とも関わる可能性を指摘した。教師の意識に関して文献を収集し、検討した。歴史教育における学習材である教科書について検討した。とくに、学習指導要領の変遷を踏まえて教科書の時代変化を考察し、また現行の小中学校の社会科・歴史教科書の特徴をあきらかにした。上記を踏まえた本年度の研究では、教科書の研究を中心に行った。歴史教育における重要な学習材である教科書は、様式および形態が多種多様である情報の読解を必要とする点が特徴である。このように複数の情報を読み、自分の意見を形成する過程について、大学生を対象として検討した。その結果、それぞれの情報を丁寧に読み、それを自分の言葉で言い換えできた学生のみが、うまく自分の意見を深められたことがあきらかとなった。本研究は歴史の理解と学習とについて、以下の観点から研究を進めている。1.学習者のもつ信念と歴史リテラシーの研究:学習者側の意識の検討2.日本の教育実践現場での歴史の学習の特徴の研究:教師の意識の検討3.多様な学習材で構成される学習環境の特徴の研究:学習材・教材の検討上記1に関する研究では、歴史の学びでは、メタディスコースすなわち語りの文に敏感になることが重要であり、パラフレーズすなわち学習者が自分の言葉で反芻することが学びをはぐくむものであることを示した(『歴史の学びで何が培えるのか:パラフレーズそしてメタディスコース(書名「認知心理学者新しい学びを語る」)』)。上記2に関する研究では、教師の意識に関して文献を収集し、検討した(『学習意欲と学習指導(書名「教育心理学:<エクササイズ>で学ぶ発達と学習」)』)。上記3に関する研究では、歴史教育における学習材である教科書について検討した。とくに、学習指導要領の変遷を踏まえて教科書の時代変化を考察し、また現行の小中学校の社会科・歴史教科書の特徴を明らかにした(『歴史という教科の学び』)。これらの知見を踏まえて、来年度は上記3を中心に実験と調査を行って、さらに研究をすすめる予定である。
顎顔面領域における神経因性疼痛の発生機序解明と炎症性サイトカインの関連性

神経挫滅や神経切断によって生じるallodyniaやhyperalgesia(痛覚過敏)、いわゆる神経因性疼痛の発症に炎症性サイトカインであるIL-1βやTNFαが関与していることが報告されている。そこで本研究では、顎顔面領域における神経因性疼痛の実験的発症モデルを作製し、モデルの妥当性を検証するとともに、本モデルを用いて神経因性疼痛の発症における炎症性サイトカインの役割を明らかにすることを目的とした。ラット眼窩下神経絞扼モデルを作製し、三叉神経脊髄路核の星状膠細胞と小膠細胞に着目し、神経因性慢性疼痛の発現機序について検索した。その結果、以下の所見が明らかとなった。1)眼窩下神経絞扼によりwhisker padおよびmasseterにおいて神経因性疼痛が処置後3-7日で発現し、本モデルが神経因性疼痛モデルとして有効であることが示された、2)眼窩下神経絞扼モデルラットの三叉神経脊髄路核において星状膠細胞と小膠細胞の活性化が確認された、3)眼窩下神経を絞扼後、三叉神経脊髄路核のIL-1βの発現亢進、星状膠細胞におけるIL-1β発現が認められた。また、IL-1β拮抗薬投与によりwhisker padおよびmasseterでの神経因性疼痛の抑制が認められた、4)眼窩下神経絞扼後、三叉神経脊髄路核におけるP2X_7受容体の発現亢進と小膠細胞でのP2X_7発現が認められた、5)P2X_7受容体特異的作動薬の髄膜下投与により、機械的痛覚過敏の亢進と三叉神経脊髄路核におけるP2X_7受容体発現の亢進が認められた、6)Gap junction遮断薬を投与すると神経因性疼痛が抑制され、星状膠細胞と小膠細胞の発現と活性の抑制、IL-1βとP2X_7の発現抑制が確認された。以上の結果から、眼窩下神経絞扼後、gap junctionを介して三叉神経脊髄路核における星状膠細胞の活性化とIL-1βの産生が生じることが示唆された。また、三叉神経脊髄路核の小膠細胞ではP2X_7は強発現し、疼痛発現に関与していることが示唆された。実験としては、まずラットの上顎神経の分岐である眼窩下神経を剖出し、6-0号のナイロン系でゆるく結紮することにより、神経因性疼痛モデルを作製した。本モデルの妥当性の検証のため、行動テストとしてフォンフライを用いた咬筋部とひげの部分の疼痛反応を観察した。結果として、眼窩下神経の結紮後、1日から10日目まで明らかな上顎神経領域内の神経因

性疼痛が生じることが明らかとなった。さらに、薬剤投与用チューブを通して脊髄腔内にIL-1βの拮抗薬を注入することによって神経因性疼痛の発生が抑制されることを明らかとした。また、ラット脳幹の免疫組織化学染色により、IL-1βはアストロサイトに限局して発現していることが明らかとなった。以上の所見により、神経因性疼痛の発生に炎症性サイトカイン1L-1βが関与していることが明らかとなったことため、今後は三叉神経節における炎症性サイトカインのウェスタンブロット法による定量解析を実施するとともに、神経因性疼痛の治療薬として、炎症性サイトカインのantagonistの脊髄腔内投与の有効性についても検索する予定である。神経挫滅や神経切断によって生じるallodyniaやhyperalgesia(痛覚過敏)、いわゆる神経因性疼痛の発症に炎症性サイトカインであるIL-1βやTNFαが関与していることが報告されている。そこで本研究では、顎顔面領域における神経因性疼痛の実験的発症モデルを作製し、モデルの妥当性を検証するとともに、本モデルを用いて神経因性疼痛の発症における炎症性サイトカインの役割を明らかにすることを目的とした。ラット眼窩下神経絞扼モデルを作製し、三叉神経脊髄路核の星状膠細胞と小膠細胞に着目し、神経因性慢性疼痛の発現機序について検索した。その結果、以下の所見が明らかとなった。1)眼窩下神経絞扼によりwhisker padおよびmasseterにおいて神経因性疼痛が処置後3-7日で発現し、本モデルが神経因性疼痛モデルとして有効であることが示された、2)眼窩下神経絞扼モデルラットの三叉神経脊髄路核において星状膠細胞と小膠細胞の活性化が確認された、3)眼窩下神経を絞扼後、三叉神経脊髄路核のIL-1βの発現亢進、星状膠細胞におけるIL-1β発現が認められた。また、IL-1β拮抗薬投与によりwhiskerpadおよびmasseterでの神経因性疼痛の抑制が認められた、4)眼窩下神経絞扼後、三叉神経脊髄路核におけるP2X7受容体の発現亢進と小膠細胞でのP2X7発現が認められた、5)P2X7受容体特異的作動薬の髄膜下投与により、機械的痛覚過敏の亢進と三叉神経脊髄路核におけるP2X7受容体発現の亢進が認められた、6)Gap junction遮断薬を投与すると神経因性疼痛が抑制され、星状膠細胞と小膠細胞の発現と活性の抑制、IL-1βとP2X7の発現抑制が確認された。以上の結果から、眼窩下神経絞扼後、gap junctionを介して三叉神経脊髄路核における星状膠細胞の活性化とIL-1βの産生が生じることが示唆された。また、三叉神経脊髄路核の小膠細胞ではP2X7は強発現し、疼痛発現に関与していることが示唆された。
共鳴ラマン分光法によるチトクロムC酸化酵素のプロトン輸送機構の解明

細胞呼吸を担っていて生命の維持に不可欠の膜タンパク質の一つにチトクロムC酸化酵素がある。本酵素は酸素分子を水に変換するとともにプロトン(水素イオン)を膜の内側から外側へポンプする。本酵素のしくみを明らかにするためには共鳴ラマン分光法によりピコメートルレベルの微細構造を決定する必要がある。本研究ではプロトンのポンプを効率良く行うために必要な寿命の短い中間構造と2つのヘムの協同的構造変化を検出した。さらに、プロトンポンプに関わるいくつかのヘム側鎖のラマン信号の帰属決定を行った。ヘムaのヒドロキシファルネシルエチル(HFE)基由来のラマン線チトクロムc酸化酵素(CcO)の2つのヘムのうち6配位のヘムaはプロトンポンプの駆動を担うと考えられている。この反応において、ヘムa側鎖HFE基の-COHが回転する。このHFE基のコンフォメーション変化のマーカーとなるラマン線を探した。CcOの重水中と軽水中の共鳴ラマンスペクトルの比較、側鎖に-COH置換基を持つモデル化合物と持たないものの比較などをもとに、CcOの1247cm^<-1>のラマン線をヘムaのHFE基のv_<C-O>モードに帰属した。ヘリックスXの構造ダイナミクスCO結合型CcOのCOを光解離し、6配位構造から5配位の平衡構造への構造変化を時間分解共鳴ラマン分光法(△t=10ns-5ms)により追跡した。Fe-His伸縮振動由来のラマン線はCO光解離10nsから100nsまでは220cm^<-1>で不変であったが、その後、遅延時間に対して指数関数的に低波数シフトし、平衡状態の215cm^<-1>に近づいた。変化の速度定数は、1.3×10^6s^<-1>であった。比較のためFe-プロトポルフィリンに配位子として1,2ジメチルイミダゾールとCOを配位させたモデル化合物について、同様の測定を行ったところ、Fe-N振動数は全時間領域で197cm^<-1>であり不変であった。したがって、CcOのFe-His結合におけるk=1.3×10^6s^<-1>のダイナミクスはヘリックスXの構造変化を反映していると思われる。チトクロムc酸化酵素はミトコンドリアの呼吸鎖電子伝達系の末端にあり、分子状酸素を水にまで還元する反応に共役してプロトンポンプを行う細胞呼吸の鍵酵素である。2つのヘム(ヘムα_3とヘムα)を持つが、ヘムα_3が酸素還元の触媒部位であり、ヘムαはプロトンポンプ駆動部位である。本研究の目的は、共鳴ラマン分光法により、ヘムの酸化還元に伴う側鎖置換基や軸配位子の動的構造変化が如何にしてプロトンポンプに結びつくのかを明らかにすることである。ヘムα側鎖(ヒドロキシファルネシルエチル基およびプロピオン酸基)のラマン線の帰属を決定するために側鎖と相互作用するアミノ酸を置換してその共鳴ラマンスペクトルへの影響を調べる。また、ヘムα_3におけるFe-His結合のダイナミクスを観測する。今年度の実績は下記の通りである。(1)ヘムα側鎖と相互作用することが結晶構造よりわかっているアミノ酸残基の部位特異的変異体を調製するために発現ベクターを導入した6種類の宿主菌(Paracoccus denitrificans)を作成した。(2) CO結合型ウシ心筋チトクロムc酸化酵素のCO光解離後10ns5msの時間分解共鳴ラマンスペクトルを測定したところ、5ms以降にヘムα_3側鎖ビニル基とタンパクとの相互作用が大きくなることがわかった。これはCO結合型から平衡状態還元型への構造変化に伴い、ヘムが水平方向に変位することを意味するが、結晶構造の結果と矛盾しない。(3) CO光解離後のFe-His結合の張力が時定数約1μsで減少する事が初年度にわかっていたが、その理由を説明するためにヘミンに1,2-ジメチルイミダゾールを結合させたモデル化合物についてタンパク質と同様の実験を行った。チトクロムc酸化酵素(CcO)は分子状酸素を還元して水を生成するとともにプロトンポンプ反応によりプロトン駆動力を形成し、ATP合成に寄与する。2つのヘムのうちヘムαがプロトンポンプを駆動するとされる。本研究ではヘムα側鎖に由来する共鳴ラマン線の帰属を決定することが目的である。そのためヘムα側鎖2位ヒドロキシファルネシルエチル(HFE)基のOH基または側鎖7位プロピオン酸基と水素結合しているアミノ酸に変異を導入しラマンスペクトルの変化を調べる。ウシ心筋酵素では困難であるため、細菌Paracoccus denitrificansを用いた。

T50A、S417AおよびのY406Fの3種の点変異CcOを作成し、可視吸収スペクトルおよび電子伝達活性を測定したところ野生型(WT)と比べで差がなかった。次に励起波長413.1nmの共鳴ラマンスペクトルを還元型について測定し比較した。WTで1251cm^<-1>のラマン線はT50Aでは低波数シフトしたが、S417Aでは変化が検出されなかった。この結果から、1251cm^<-1>のラマン線をHFE基に由来すると帰属した。OH基はT50と水素結合していることがはっきりした。これは結晶構造の再検討を促す結果である。一方、WTで364cm^<-1>のラマン線はY406Fでは低波数シフトしたのでこれをを7位のプロピオン酸基のC_βC_cC_d変角振動に帰属した。これらの新規帰属はプロトンボンプ機構を解明するための強力な手掛かりを与える。CO結合型CcOのCO光解離後のヘムの構造ダイナミクスをΔt=10ns5msの時間領域で共鳴ラマン分光法により追跡した。平衡状態還元型とCO結合型の中間的コンフォメーションを検出した。また、2つのヘムの協同的ダイナミクスがΔt=5ms以降に検出された。これらの結果は、酸素還元とプロトンポンプの共役機構を研究する上で重要な知見である。