hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ジシランを軸とするプロペラ型環状化合物およびその誘導体の化学

[4.4.4]プロペランのX線結晶構造解析の結果、ケイ素-ケイ素結合距離は2.295(1)Åであり,通常の結合距離に較べ約2%短いことがわかった。これがHOMOのエネルギー準位を上昇させ(IP:7.96eV),低い電子遷移エネギー(λ_<max>=210nm)に反映されたものと推定した.さらに,単結晶中において,この結合軸方向に同じ向きの他分子が積層し,ケイ素-ケイ素結合は一直線上に整列している.分子間ケイ素-ケイ素原子間距離は約4.73Åであり,分子軌道計算により示された,環の外側に大きく張り出したLUMOの相互作用が期待できる範囲内である.実際,単結晶をアルゴン雰囲気下で紫外線照射すると,溶媒に不溶性の白色固体に変化する.環内のケイ素-ケイ素結合切断と分子間の同結合生成を伴う,開環重合物と推定される.プロペランのケイ素-ケイ素結合は,炭素鎖による立体保護にもかかわらずEt_3Si-SiEt_3より数倍速く臭素によって切断され,両方のケイ素原子上で立体の反転したout, out-双環状ビス(ブロモシラン)が生成する.この立体化学は通常のケイ素-ケイ素結合のハロゲン開裂の立体化学(一方で立体保持,他方で立体反転)とは異なり,立体保護の結果と推定される.ビス(ブロモシラン)を金属リチウムで還元すると,環歪みが再生するにもかかわらず,高収率でもとのプロペランのみが生成する.[4.4.4]プロペランのX線結晶構造解析の結果、ケイ素-ケイ素結合距離は2.295(1)Åであり,通常の結合距離に較べ約2%短いことがわかった。これがHOMOのエネルギー準位を上昇させ(IP:7.96eV),低い電子遷移エネギー(λ_<max>=210nm)に反映されたものと推定した.さらに,単結晶中において,この結合軸方向に同じ向きの他分子が積層し,ケイ素-ケイ素結合は一直線上に整列している.分子間ケイ素-ケイ素原子間距離は約4.73Åであり,分子軌道計算により示された,環の外側に大きく張り出したLUMOの相互作用が期待できる範囲内である.実際,単結晶をアルゴン雰囲気下で紫外線照射すると,溶媒に不溶性の白色固体に変化する.環内のケイ素-ケイ素結合切断と分子間の同結合生成を伴う,開環重合物と推定される.プロペランのケイ素-ケイ素結合は,炭素鎖による立体保護にもかかわらずEt_3Si-SiEt_3より数倍速く臭素によって切断され,両方のケイ素原子上で立体の反転したout, out-双環状ビス(ブロモシラン)が生成する.この立体化学は通常のケイ素-ケイ素結合のハロゲン開裂の立体化学(一方で立体保持,他方で立体反転)とは異なり,立体保護の結果と推定される.ビス(ブロモシラン)を金属リチウムで還元すると,環歪みが再生するにもかかわらず,高収率でもとのプロペランのみが生成する.
放射線性唾液腺障害に対する新規治療法の開発

頭頸部癌治療において有用な治療法である放射線治療は臓器を温存できるという利点の反面、治療後の半永続的な唾液分泌の低下といった有害事象をきたす。rapamycinは細胞内活性酸素を除去することにより、放射線による組織障害を予防できる可能性がある。本研究ではrapamycinが正常唾液腺細胞の活性酸素産生を抑制することを示した。これによりrapamycinが放射線照射に伴う活性酸素産生を抑制する可能性があり、放射線性唾液腺障害を予防できる可能性が示唆された。正常唾液腺細胞Hs917Tと舌癌細胞株HSC-2、HSC-4を用いた増殖能のassayを行った。評価方法としてはclonogenic assayとMTS assayを用いた。細胞数の最適化を行った上、それぞれの細胞でmTOR阻害剤のrapamyicinの濃度最適化を行った。rapamycinは正常唾液腺細胞に比べ、舌癌細胞株で有意に増殖を抑制した。また、同様のassayを放射線照射併用して行っている。放射線照射時の細胞内活性酸素量の測定も現在行っており、rapamycinの正常唾液腺細胞、舌癌細胞株での細胞障害の程度の定量も行っている。正常唾液腺細胞の増殖能が低いため、細胞数を確保するための時間が予想以上にかかっている。また、rapamycinの至適投与量の設定時に予想よりも低濃度で増殖抑制することがわかり、濃度設定にも時間を要した。評価方法としてはclonogenic assayとMTS assayを行った。細胞数の最適化を行った上、それぞれの細胞でmTOR阻害剤rapamycinの至適投与量の最適化を行った。また、同様のassayを放射線照射の併用でも行い、同様の結果を得た。放射線照射時の細胞内活性酸素量の測定はDCF-DA assayで行っており、舌癌細胞株での細胞内活性酸素の増加を確認した。また、rapamycinの正常唾液腺細胞、舌癌細胞株での細胞傷害の程度をアポトーシス、細胞老化の点から検討した。細胞株での実験と並行して、in vivoでの実験を行った。マウスへのrapamycin投与と放射線照射との関連を調べるための予備実験として、マウスの顎下腺の摘出手技を確立した。マウスへの唾液腺障害を起こす放射線量を2-6Gyの間で検討し、1回5Gyを至適照射量とした。照射後の顎下腺萎縮の程度をサイズ、重量を測定し、アポトーシスの程度を検討した。実験補助員が不在の期間が2016年4月から2016年12月とあったため、研究の進捗が遅れた。頭頸部癌治療において化学放射線療法は外科的治療とならぶ強力な治療法である。しかしながら、放射線性唾液腺障害や粘膜障害は頭頸部癌患者の治療後の著しいQOLの低下をきたす。我々は放射線性唾液腺障害の予防薬として転移・再発腎癌では臨床応用されているmTOR阻害剤、rapamycinに注目した。rapamycinは細胞内活性酸素産生を抑制することが知られており、放射線生唾液腺障害の一因である活性酸素の産生を抑制することで唾液腺細胞のアポトーシスを抑制する可能性がある。研究はin vitroで正常唾液腺細胞株Hs917.T、HSGと舌癌細胞株SCC9を用いて、rapamycinの効果を確認した。これらの細胞にrapamycinを投与し、正常唾液腺細胞のアポトーシス抑制効果、ひいては細胞内活性酸素の抑制効果と舌癌細胞株の細胞増殖抑制効果を確認した。至適投与量の設定や細胞増殖抑制効果についてはMTS assay、clonogenicassayを用いた。また、アポトーシス抑制効果についてはAnnexin-PI assayを行った。アポトーシス抑制効果の原因となりうる細胞内活性酸素の抑制効果はDCF-DA assayを行い、フローサイトメトリーを用いて解析した。舌癌細胞株に比べ、正常唾液腺細胞株はアポトーシスや細胞内活性酸素の産生が有意に抑制された。また、舌癌細胞株の細胞増殖抑制効果を確認した。これにより、正常唾液腺細胞は化学療法や放射線療法に対して、rapamycin投与によるアポトーシス抑制効果、ひいては放射線性唾液腺障害の予防効果がある可能性が示唆された。また、rapamycinは舌癌治療においても有用な薬剤であることが確認された。in vitroの研究と同時並行でin vitroの研究を進める予定。最終目標であるrapamycinの治療モデル(放射線性唾液腺障害に対する影響)をマウスで設立する。マウスへの唾液腺障害を起こす照射量を決定したため、rapamycinを投与し、唾液腺(顎下腺)萎縮の程度や顎下腺のアポトーシス、活性酸素量を測定する予定である。

耳鼻咽喉・頭頸部外科計画がやや遅れており、in vitroで使用する試薬の購入を行っていないものがあるため。2016年4月から2016年12月まで研究補助員が不在であったため、研究が停滞した。マウスに対して、放射線照射とrapamycinと投与を行い、rapamycinの唾液腺障害に対する効果を実際に確認する予定である。また、免疫不全マウスに対して舌癌細胞株を舌に局注し、舌癌モデルを作成し、rapamycinの腫瘍抑制効果も確認する。
線虫におけるGタンパクを介した温度受容

宇宙空間に数多ある他の惑星と違い、地球に多様な生命が存在できるのは、生命活動に適したきわめて狭い範囲で温度が保たれているためである。温度はあらゆる生体反応に直接関与するため、環境中の温度を感知することは、全ての動物にとって非常に重要な能力である。本研究は、生命現象の観察に極めて適したモデル生物である線虫C.elegansの温度走性行動を用いて、Gタンパクαサブユニットを介した温度受容に関わる新規分子の同定、および機能の解析を目的としている。これまでの研究により温度走性に関与することが示唆されていた古典的MAPキナーゼシグナル伝達経路の変異体について、細胞特異的な回復実験と二重変異体の作成と変異体の行動解析を行った。また、神経回路レベルにおける感覚受容器から特定の神経細胞が司る行動までのシグナル処理機構の解析に、光遺伝学的手法を利用するため、これまで線虫への応用例が報告されていなかった、光刺激に応じて神経細胞の興奮を抑制する作用を持つ光駆動型プロトンポンプArch、ArchTを線虫に導入した系統を作成した。汎神経、体壁筋においてArch及びArchTを発現させた線虫に緑色光を照射し、移動運動を観察した結果、Arch及びArchTが線虫において有効に興奮性細胞抑制効果を持つことを初めて明らかにした。更に回路内の特定の神経細胞をArchによって抑制することで、線虫の特定の自律的な行動に選択的に影響を与えることに成功し、Archを用いることによって回路内の特定の神経細胞の活性を光遺伝学的に制御できることを明らかにした。これまでの研究において、Gタンパクを負に制御する因子であるRGSの遺伝子の変異体は温度走性行動に異常を示し、温度情報が哺乳類の視覚や嗅覚系と同様にGタンパクとcGMPを介して伝達されることが示唆されている。しかし、温度受容体そのものや、シナプスへの情報の伝達機構など、その経路には未だ解明されていない部分が残されている。本研究者らはGタンパクを介した温度情報の伝達機構を明らかにするため、RGSの変異体が示す温度走性の異常を抑圧する新規変異体の単離と解析を行った。新規変異体の中には、すでに温度走性に関与することが知られている遺伝子の変異体も存在した。原因遺伝子が判明していない新規変異体1系統について、遺伝学的解析を行い、原因遺伝子の染色体上の位置を特定した。加えて、当該系統について、大量の塩基配列を解読することができる次世代シーケンシング技術を利用して、候補となる遺伝子を決定した。宇宙空間に数多ある他の惑星と違い、地球に多様な生命が存在でさるのは、生節活動に適したきわめて狭い範囲で温度が保たれているためである。また、感覚受容器からのシグナル出力がどのように処理されて神経特定の行動につながるかを神経回路レベルで解析するために、解析単一細胞に限局して遺伝子を発現させるIR-LEGOシステムを習得し、単一の神経細胞でレポーター遺伝子(GFP)を発現させることに習熟した。また、光遺伝学的手法を用いるために、光駆動型イオンチャネル、ポンプを線虫に導入した系統を作成した。

更に回路内の特定の神経細胞をArchによって抑制することで、線虫の特定の自律的な行動に選択的に影響を与えることに成功し、Archを用いることによって回路内の特定の神経細胞の活性を光遺伝学的に制御できることを明らかにした。
エピジェネティクスによるうつ病発症・難治化の機序解明

研究課題1)未治療・難治性うつ病の末梢血白血球由来BDNFGDNF,MeCP2 mRNA発現とBDNF,GDNF遺伝子プロモーター領域のメチル化の解析未治療うつ病21例(SSRI, SNRIいずれかによる単剤治療)・難治性うつ病12例(修正型電気けいれん治療)・健康対照者12例を対象に、BDNF,GDNF,MeCP2 mRNA発現をreal-time PCR法にて解析したところ、治療前では未治療群でBDNFの難治性群ではMeCP2の、対照群と比較しての有意な減少がみられた。治療前・後での比較では、難治性群でBDNFの治療後での有意な発現亢進と、GDNFの治療後での発現亢進傾向がみられた。BDNF遺伝子exon1の上流のコア領域内のCpGアイランド部分のシトシン・メチル化を、methylation specific-PCR法にて解析した。その結果、電気けいれん治療を受けた難治性群では治療前・後で、メチル化の相対的な減少がみられた。抗うつ薬による治療を受けた未治療うつ病群では治療前・後で、難治性群と同様にメチル化の減少した症例もみられたが、メチル化に変化のない症例もあった。GDNF遺伝子のメチル化の解析も同様に行ったが、未治療群・難治性群ともに顕著な変化は検出されなかった。(研究課題2)急性拘束ストレスによるラット海馬のBDNF遺伝子プロモーター領域のメチル化の解析急性拘束による海馬でのBDNF遺伝子exonl上流のCpGアイランド内のシトシン・メチル化を、同様に解析した結果、ストレスによるメチル化の相対的な亢進が検出された。本研究の結果は、ストレスによって特に難治性群ではBDNF遺伝子プロモーター領域のメチル化が亢進し、電気けいれん治療の新たな作用機序として亢進したメチル化の減少という機序が提唱される。BDNFやGDNFの発現低下が、遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化異常に伴う転写抑制に起因するか否かを明らかにするためにBDNFおよびGDNFのプロモーター領域においてメチル化状態に特異的なプライマーを作成した。乳癌細胞株8株および乳癌症例13例を対象として、DNA500ngをsodium bisulfiteにより処理した後、メチル化特異的PCR法によりメチル化状態を解析した。BDNFでは乳癌細胞株の75%(6/8)および乳癌症例の69%(9/13)に、同様にGDNFでは乳癌細胞株の38%(6/8)および乳癌症例の31%(4/13)に遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化異常の存在を明らかとなった。研究課題2)ヒト末梢血白血球由来MeCP2 mRNA発現の解析研究課題3)ラット海馬および末梢血白血球由来のBDNF mRNA発現の関連の検討ラット海馬・末梢血白血球由来のBDNF mRNA発現の関連を検討する目的で、急性拘束ストレス負荷ラットでBDNF mRNAを計測した。その結果、未処置群と比較して海馬では30-40%の減少をみたが、白血球由来では30%程度の減少であった。現在、難治性うつ病患者および健常者由来の血液について解析を行っている。
歯科用スマートセメントの基礎的検討　―強固な接着と容易な除去の両立を目指して―

近年の歯科用セメントの進歩の結果,修復物と歯質の接着は強固になり,予期せぬ脱落のリスクは大きく減少した。また,歯列矯正においてはブラケットと歯面の接着力が向上し,より大きな矯正力の付与が可能となった。さらに,セメント固定式インプラントの上下構造物間の接着力が向上し,安定して咬合力を発揮することが可能となった。その反面,接着箇所の分離が必要となっても,分離は困難になっている。例えば,修復部の再治療時の修復物の除去,矯正治療終了後のブラケットの除去,メンテナンス時のインプラント上部構造物の取り外し等の際に強い力を加える必要があり,歯質にダメージを与えることがある。しかし,強固な接着と容易な除去,という相反する性質を両立するのは容易ではない。本研究では,使用時には強固な接着力を発揮し,除去したい時には接着力をオンデマンドで低下させ,容易な除去を可能とする歯科用スマートセメントの開発を目指している。昨年度までに,歯科用グラスアイオノマーセメント(GIC)にイオン液体(IL)を含有させると,通電によって接着力を有意に低下可能であることを見出した。平成30年度はGICを水中に浸漬した際の特性変化を調べた。その結果,ILを添加しないGICでも水中浸漬後は電気伝導性を示し,通電により接着強度の低下も可能であることを見出した。しかし,電気伝導度はIL添加GICの方が高く,効率的な接着強度の低下が可能と考えられた。一方,IL添加GICを水中浸漬すると,経時的に電気伝導度が低下する傾向が認められた。これは,GIC表面からILが溶出し,GIC表面の電気伝導度が低下した結果と考えられた。また,ILを添加したレジン添加型GICを光硬化させると電気伝導度が低下した。これは,GIC表面でレジンの重合が先行し,IL含有ポリアクリル酸ゲルのネットワークが発達しなかったためと推定された。近年の歯科用セメントの目覚ましい進歩の結果,歯質欠損部を修復するインレーやクラウンといった修復物と歯質の結合は強固になり,使用中に脱落するリスクは大きく減少した。また,歯列矯正において,歯に力を伝える部材であるブラケットと歯面の接着力も向上し,矯正の効果が向上している。その他にも,歯質と材料,あるいは材料と材料の接着が向上し,脱離までの寿命が伸びて患者のQOL向上に繋がっているケースは多い。一方,結合箇所を分離する必要に迫られるケースでは,分離が困難になっているのも事実である。例えば,歯質修復箇所で2次齲蝕や根尖病巣再発が生じた際,多くの場合は修復物の除去が必要である。しかし,結合が強固であるため,除去時には強い力や振動を加える必要があり,患者に不快感を与えるだけでなく,歯質にダメージを与えることすらある。しかし,強固な接着と容易な除去,という相反する性質を両立することは困難である。本研究では,使用時には強固な接着力を維持し,必要になったときは接着力を低下させ,容易な除去を可能とする歯科用スマートセメントの開発を目指している。その機構として,歯科用セメントにイオン液体を添加することで導電性を持たせ,通電することで接着力の低下が可能か検討した。その結果,市販の歯科用グラスアイオノマーセメント(GIC)およびレンジ添加型GICで金属を接着した場合,この機構が有効であることを見出した。また,イオン液体の添加量を最適化すれば,元のセメントと同等の接着力を維持することが可能であることを明らかにした。本研究のスマートセメントの機能発現の機序は今のところ明らかではなく,その解明は今後の開発でも重要な情報となる。元々のセメントの接着力は被着物に依存するため,イオン液体を添加したスマートセメントの通電による接着力低下量も一様ではない。しかし,通電特性は被着物によらず同じ傾向を示し,通電直後には電流が容易に流れるが,急激に電流量が減少する。また,積算電荷密度と接着力の減少の相関にも類似性が認められ,接着部の脱離は被着物によらずアノード側で生じている。以上から,接着力低下の機序はアノード側の金属表面で生じる電気化学反応による金属の腐食と密接に関係すると推定している。被着物が耐食性の高い金属の場合,同じ電荷密度でも接着力の低下量が小さく,この仮説を補強するが,さらに詳細な検討が必要である。通電にともなう電流量の低下は,GIC内でのイオン液体の電気泳動による分極と推定しているが,接着部の脱離にともなう通電面積の減少も影響している可能性がある。GIC内でのイオン液体の存在形態や位置の特定は,スマートセメントの開発において重要と考えているが,直接観察する手段の開発が必要であり,今後の課題である。これまでに3種類のイオン液体を用いてレジン添加型GICベースのスマートセメントを試作したが,特性には違いがあるものの,いずれも通電により接着力の低下が可能であり,イオン液体の種類を問わない可能性が高い。現在市販されているイオン液体で経口摂取可能との認証を得ているものはなく,当面は試作セメントでの評価を続けることになるが,イオン液体の種類を変更しても基本的な特性は維持できると推定され,経口摂取可能なイオン液体が入手できれば,スムーズに材料開発を進めることが可能と思われる。近年の歯科用セメントの目覚ましい進歩の結果,歯質欠損部の修復物と歯質の結合は強固になり,予期せぬ脱落のリスクは大きく減少した。

また,歯列矯正においてブラケットと歯面の接着力が向上し,より大きな矯正力の付与が可能となった。その他にも,歯質と材料,あるいは材料と材料の接着が向上し,脱離までの寿命が伸びたケースは多い。一方,結合箇所を分離する必要に迫られた場合に分離が困難になっているのも事実である。例えば,修復部で根尖病巣が再発し修復物の除去に迫られた場合,結合が強固であるために強い力や振動を加える必要がある。その結果,患者に不快感を与えるだけでなく,歯質にダメージを与えることすらある。しかし,強固な接着と容易な除去,という相反する性質を両立するのは容易ではない。本研究では,使用時には強固な接着力を発揮し,除去したい時には接着力をオンデマンドで低下させ,容易な除去を可能とする歯科用スマートセメントの開発を目指している。昨年度までに,歯科用グラスアイオノマーセメント(GIC)にイオン液体を含有させることで,通電によって接着力を有意に低下させることを見出した。平成29年度はイオン液体の含有率とセメントの接着特性との相関を調べた。その結果,元のGICと同程度の接着力を示すとともに,通電によって接着力を有意に低下させることが可能であるイオン液体の含有率の範囲内を明らかにすることができた。イオン液体の種類を変えて試作したセメントは,電気伝導性や接着力の低下の幅に差異はあったが,通電により接着力を低下可能という性質には変わりがなく,イオン液体の種類を問わない可能性が高いと考えられた。現在量産されているイオン液体で経口毒性が否定されているものはほとんどないが,今後,安全なイオン液体が開発された場合,どのような種類であっても,同様の性能を発揮する可能性が高いと期待できる。本研究の開発目標である歯科用スマートセメントには,十分な接着力と,必要に応じた接着力の低下の両立が求められる。本研究では,平成28年度に通電により接着力の低下が可能であることを,平成29年度にイオン液体の含有率最適化により十分な接着力を示すことを,それぞれ確認しており,本研究の材料設計が有効であることが証明された。含有率を大きくすると,セメントのマトリックスゲルにイオン液体が溶解しきれず,液滴として遊離する状態となり,マトリックスの強度を低下させることが原因と考えられた。一方,含有率を小さくすると,セメントの電気伝導率が低下し,効果的な通電が困難となるため,接着力の低下が生じにくいと考えられた。この両者の間に,有効な含有率が必ず存在するかは不明だが,これまでに用いた複数種類の歯科用GICとイオン液体の組み合わせでは,有効な含有率は存在していた。ただし,イオン液体の種類によって電気伝導性が異なり,接着力低下に必要な通電時間が異なることが明らかとなり,より高い電気伝導性を示すイオン液体が望ましいと考えられた。接着する金属の種類によって接着力の低下量に差異があるかを調べるため,従来の銅に加えてチタン,歯科用銀合金を用いた評価を行った。その結果,通電時に同じ電荷密度を与えても,チタンと銀合金では低下量が小さいことが明らかとなったが,接着力の低下そのものは維持されており,被着金属種を選ばないと考えられた。現時点での接着力低下の機序の仮説は,アノード側の被着金属表面での金属イオンの溶出にともなう金属ーセメント界面の破壊である。耐食性の高いチタンと銀合金で接着力低下量が小さいことは,この仮説と矛盾していない。
脳虚血の病態進展におけるコラーゲン分解酵素とアストロサイトの関与

脳虚血モデルおよび脳脂肪塞栓モデルで,脳浮腫の発現およびアストロサイト,水チャネルアクアポリン4(AQP4)およびbasal laminaの経時的変化を検討した。【方法】:Wistar ratを用いた.麻酔薬はイソフルランを用いた.MCAO群(n=12):モノフィラメント糸による中大脳動脈閉塞を2時間行った.triolein群:右外頚動脈断端から総頚動脈分岐部にカテーテルを留置し、99% triolein 2μLを5分かけて注入.それぞれ2時間(2時間群n=12),24時間(24時間群n=12),72時間(72時間群n=12)観察した.対照群(n=12):生理食塩水2μLを同様に注入し2時間観察した.各群で脳を摘出し(n=7)、左右の皮質・皮質下および小脳の水分量を乾燥重量法で測定した.各群(n=5)でHE染色およびAQP4,GFAP,type IVコラーゲン抗体によるbasal laminaの染色をおこなった.【結果】:脳水分量はtriolein注入2時間72時間で対照およびMCAO群と比べて著明に増加した.2時間群では障害部倍において胞体の膨化及び核濃縮、空胞変性がみられた.時間経過ともに細胞浸潤を伴った壊死性変化を示した。MCAO群では虚血領域で核濃縮を認めた。AQP4の染色性は傷害中心部で低下、周辺部で亢進し、72時間後まで継続した.GFAP染色性は2時間群では傷害部周辺で軽度亢進し,72時間では肥満星状膠細胞やmitosisがみられた。MCAO群ではGFAPに軽度の反応性がみられたが、AQP4染色性に変化はなかった。basal laminaの変化はMCAO群でははっきりしなかったが,triolein群では染色性が弱い傾向がみられた.【考察】:trioleinによるラット脳脂肪塞栓モデルでは、局所脳虚血モデルに比べて2時間という短時間で著明な脳浮腫が形成され、AQP4の変化も著しいく,basal laminaも傷害される傾向がありvasogenicな因子が関与していると考えられる.脂肪塞栓では早期からAQP4とmatrix metalloproteinaseが病態の形成に関与していると考えられた.脳虚血モデルおよび脳脂肪塞栓モデルで,脳浮腫の発現およびアストロサイト,水チャネルアクアポリン4(AQP4)およびbasal laminaの経時的変化を検討した。basal laminaの変化はMCAO群でははっきりしなかったが,triolein群では染色性が弱い傾向がみられた.【考察】:trioleinによるラット脳脂肪塞栓モデルでは、局所脳虚血モデルに比べて2時間という短時間で著明な脳浮腫が形成され、AQP4の変化も著しいく,basal laminaも傷害される傾向がありvasogenicな因子が関与していると考えられる.脂肪塞栓では早期からAQP4とmatrix metalloproteinaseが病態の形成に関与していると考えられた.脳虚血モデルおよび脳脂肪塞栓モデルで,脳浮腫の発現およびアストロサイト,水チャネルアクアポリン4 (AQP4)の経時的変化を検討した。【方法】:Wistar ratを用いた.麻酔薬はイソフルランを用い,側頭筋温は37°C,PaCO_2は調節呼吸下3842mmHgとした.MCAO群(n=12):モノフィラメント糸による中大脳動脈閉塞を2時間行った.Triolein群:右外頚動脈断端から総頚動脈分岐部にカテーテルを留置し、99% triolein 2μLを5分かけて注入.それぞれ2時間(2時間群n=12),24時間(24時間群n=12),72時間(72時間群n=12)観察した.対照群(n=7):生理食塩水2μLを同様に注入し2時間観察した.【結果】:脳水分量はtriolein注入2時間,24時間,72時間群で対照およびMCAO群と比べて著明に増加した.

2時間群では頭頂部を中心とした同側皮質と海馬また一部対側皮質において胞体の膨化及び核濃縮、空胞変性がみられた.皮質下では傷害はごく軽度だった。時間経過とともに傷害は拡大し細胞浸潤を伴った壊死性変化を示した。MCAO群では虚血領域で核濃縮のみを認めた。AQP4の染色性は傷害中心部で低下、周辺部で亢進し、72時間後まで継続した.GFAP染色性は2時間群では傷害部周辺で軽度亢進し,経時的にGFAP反応性は増大し24時間では樹状突起の延長、72時間では肥満星状膠細胞やmitosisがみられた。MCAO群ではGFAPに軽度の反応性がみられたが、AQP4染色性に変化はなかった。【考察】:Trioleinによるラット脳脂肪塞栓モデルでは、局所脳虚血モデルに比べて2時間という短時間で著明な脳浮腫が形成され、AQP4の変化も著しい.このことは脂肪塞栓モデルでは早期に血液脳関門が強く破綻していることを示唆すると考えられる.今後これらのモデルにおけるmatrix metalloproteinaseの発現とbasal laminaの経時的な変化を検討していくよていである.脳虚血モデルおよび脳脂肪塞栓モデルでbasal laminaの経時的変化を検討した。【方法】:前年度のモデルすなわちMCAO群:triolein飛散群(2時間群,24時問群,72時間群),およびC群(生食注入)各群(n=5)のホルマリン標本を用いて,type IV抗体を用いてbasal laminaの染色を行い経時的変化を評価した.basal laminaの変化は実験群を知らない人が評価し,肉眼的に観察した.【結果】:C群に比べてMCAO群ではbasal laminaの変化ははっきりしなかったが,triolein群では染色性が弱い傾向がみられた.【考察】:trioleinによるラット脳脂肪塞栓モデルでは、局所脳虚血モデルに比べて2時間という短時間でbasal lamina変化が生じている可能性があり,脳浮腫の形成と結果は一致する.脂肪塞栓では早期からmatrix metalloproteinaseとそれによるbasal laminaの破綻が病態の形成に関与していると考えられた.
オートファゴソーム膜伸展機構の解明

オートファジーの中心を担うオートファゴソームという細胞内小器官が発見されてから今日まで,オートファゴソームを単離してタンパク質組成や脂質組成を分析しようとする様々な試みがなされてきた.しかしながら今まではっきりとした報告はなかった.報告者は,本研究課題を通じてオートファゴソーム濃縮画分を得る方法を確立し,ショットガンプロテオミクスにより,オートファゴソーム内部に取り込まれるタンパク質を網羅的に同定することに成功した.オートファジーの中心を担うオートファゴソームという細胞内小器官が発見されてから今日まで,オートファゴソームを単離してタンパク質組成や脂質組成を分析しようとする様々な試みがなされてきた.しかしながら今まではっきりとした報告はなかった.報告者は,本研究課題を通じてオートファゴソーム濃縮画分を得る方法を確立し,ショットガンプロテオミクスにより,オートファゴソーム内部に取り込まれるタンパク質を網羅的に同定することに成功した.オートファジーはオートファゴソーム(以下AP)と呼ばれる,脂質二重層の二重膜により区画化されたオルガネラを介して,タンパク質やオルガネラを非選択的に液胞に輸送する細胞内分解システムである.最近になって,タンパク質やオルガネラがAPに選択的に取り込まれることが細胞の機能維持に重要であることが分かってきた.申請者は,APを単離した後,質量分析法を用いて新規のマーカータンパク質を同定することを目標に本年度の研究を進めてきた.これらのタンパク質はAP形成の分子装置である可能性と,新たな積荷タンパク質である可能性がある.これらの解析を通じて,オートファジーの分子機構と生理的な意義を一層深く理解できると期待される.APの内容物から細胞質成分を排除するためにAPの積荷タンパク質としてよく知られているアミノペプチダーゼ1(以下Ape1)を過剰発現した.ApelはAPに最優先で取り込まれ,Apelで満たされたAPが形成されることが確認された。また,GFPを融合したApe1を発現させることにより,生細胞内または細胞破砕液中でAPを蛍光顕微鏡下に追跡する手法を確立した.この手法を用いて,APに様々な処理を行い,APの化学的性質を詳細に解析した.また,本年度は電子顕微鏡を用いて細胞破砕液中のAPを同定することに初めて成功した.これまで確立したAPのモニタリング法を統合して応用することにより,生化学的手法を用いてAPを濃縮した画分を得ることに成功した.現在,AP画分に特異的に検出される複数の候補タンパク質を質量分析法により同定しつつある.オートファジーの中心を担うオートファゴソーム(以下AP)という細胞内小器官が発見されてから今日まで,APを単離してタンパク質組成や脂質組成を分析しようとする様々な試みがなされてきた.しかし,これまでは細胞破砕液中のAPの安定性を検証する方法が限られていたことから,明確な結果は得られていない.報告者は,昨年度の研究を通じて,(1)細胞破砕液中では,APは浸透圧の低下に敏感に反応し,崩壊すること,(2)細胞破砕液中でAPを形態的に検出するには,積荷タンパク質であるApelの過剰発現が必須であること,(3)GFP-Apelを蛍光顕微鏡観察することによってAPの存在をモニターできることを示してきた(すべて未発表データ).今年度はこれらのモニタリング法を利用し,密度勾配遠心法を用いてAPを濃縮した画分を得ることに成功した.質量分析法を用いて野生株とAP形成不能株の間のタンパク質組成を比較することにより,AP内部に取り込まれるタンパク質を網羅的に同定した.AP内部には細胞質タンパク質が非選択的に取り込まれるが,その中でも選択的にAP内部に取り込まれるタンパク質が複数個存在することがわかった.かつて我々のグループが同定したAld6もその一つである.Ald6がAPに選択的に取り込まれる機構は未知だったので,Ald6の分解を指標に細胞質タンパク質がAP内部に選択的に取り込まれる分子機構を解析した.本年度はその解析から同定された因子が他の細胞質タンパク質にも共通であるかどうかを確認し,その分子機構に迫ることを目標とする.オートファジーの中心を担うオートファゴソーム(以下AP)という細胞内小器官が発見されてから今日まで,APを単離してタンパク質組成や脂質組成を分析しようとする様々な試みがなされてきた.しかし,これまでは細胞破砕液中のAPの安定性を検証する方法が限られていたことから,明確な結果は得られてこなかった.報告者は,昨年度までの研究を通じて,(1)細胞破砕液中では,APは浸透圧の低下に敏感に反応し,崩壊すること,(2)細胞破砕液中でAPを形態的に検出するには,積荷タンパク質であるApe1の過剰発現が必須であること,(3)GFP-Ape1を蛍光顕微鏡観察することによってAPの存在をモニターできること,(4)これらのモニタリング法を利用し,密度勾配遠心法を用いてAPを濃縮した画分が得られること,(5)ショットガンプロテオミクスにより,AP内部に取り込まれるタンパク質を網羅的に同定できることを示してきた(すべて未発表データ).今年度はプロテオミクスのデータを分析することにより,AP内部に選択的に積み込まれるタンパク質の候補を数十個同定した.近年報告のあったリボソームを構成するタンパク質や,かつて我々のグループが同定したAld6などが候補に挙がっている.

リボソームやAld6がAPに選択的に取り込まれる機構は未知だったので,リボソームとAld6の分解を指標に細胞質タンパク質がAP内部に選択的に取り込まれる分子機構を解析し,それに関わっているタンパク質を同定した.本年度はその因子が他の細胞質タンパク質にも共通に必要であるかどうかを確認し,その分子機構に迫ることを目標とする.
迅速測定による結晶相反応場の動的解析

本研究は、近年注目されている結晶相反応の動的過程について、特に反応部位周りの環境つまり反応場の形状が反応におよぼす影響を調べる事を目的とした。結晶相反応には反応速度が速かったり、反応の進行にしたがって結晶状態が悪くなるものもあるため、通常の4軸型のX線回折計では反応過程の分子構造を観測することが困難である。そこで、本研究では低分子結晶用に開発された、イメージングプレート・ワイセンベルグカメラを使い、数時間以内に全回折強度データを測定することにより、時分割結晶構造解析を行なった。シクロヘキサンを結晶溶媒として含むsyn-tricyclo〔4.2.0.0(2,5)〕octane誘導体結晶では、この分子はX線の照射により結晶相で四員開裂反応を起こして、わずか数時間で中央部に八員環をもつcis, cis-1,5-cyclooctadiene誘導体に変化することがわかっている。これまでの研究から、報告者はIPワイセンベルグカメラを使うことにより、四員開裂反応の過程を追跡することが可能であることを示してきた。本研究では、さらに詳細に反応部位周辺の結晶構造を検討したところ反応により分子構造が大きく変化する方向に結晶溶媒(シクロヘキサン)が存在していることが分った。結晶溶媒であるシクロヘキサンは、かなり大きな熱振動をしており、これは結晶中でシクロヘキサン分子が動きやすいことを意味している。つまり、結晶中では分子は密にパッキングしてはいるが、反応する部位周辺は動きやすい結晶溶媒によってかこまれており、反応を可能にしていることを明かにした。このように、本研究では結晶相反応においては反応部位周辺の反応場の構造や大きさが重要であることを明かにした。また、キラルなコバロキシム錯体の結晶相光ラセミ化反応についても、Pワイセンベルグカメラを利用した時分割測定を行い、反応部位の周辺の反応場と分子構造の変化を動的に解析し、反応の進行を調べた。このような測定によりこれまで直接には観測できなかった有機化学反応過程を動的に解析し、分子の反応メカニズムの解明に寄与することができると考えられる。
金属空気電池に適用できる高性能な触媒材料の合成と触媒活性支配因子の探索

申請者は本研究を開始した平成28年度から現在に至るまで、金属空気2次電池に適用できる高性能な酸素発生触媒の開発と酸素発生反応(OER)のメカニズムの解明を目的に、OER活性の決定因子を探索してきた。まず始めに、液相合成と固相合成を組み合わせることによって得たMn2-xCoxO3のナノ粒子の触媒活性を測定した結果、Coの置換量が増えるにつれて(OER活性は維持したままで)酸素還元活性が飛躍的に向上した。これは、遷移金属イオンのeg電子数が1付近の時、遷移金属酸化物は酸素発生・還元反応において最大の触媒活性を示すという原則が支配的でないことを意味する。そこで、"Mn3+をベース"という括りをはずして、eg電子数が0の材料についても触媒探索を行ったところ、高圧合成法によってパイロクロア構造のRu酸化物が得られた。平成29年度には、このRu酸化物の酸素発生活性を系統的に調べることで、(結晶構造が同一でも)電子構造の僅かな差がOER活性に決定的な影響を与えること、活性サイトのRuが金属的かつ絶縁体的な電子状態を併せ持つと初期活性だけでなく安定性も高い高性能なOER触媒になることを明らかにした。最終年度の平成30年度には、申請者は2種類以上の陰イオンを有する混合アニオン化合物のOER触媒が従来の遷移金属酸化物とは異なるOER機構を有すると考え、その中でも超伝導体と関連の深い、特異な電子状態をもつSr2VFeAsO3-dのOER活性・反応機構を系統的に研究した。その結果、OERの活性サイトは陽イオンや陰イオンではなく、酸素欠損サイト自体が活性サイトの役割を果たし、酸素欠損サイト間の距離が十分に短ければ反応中にO-O結合が形成されてOER活性が著しく増強されることを見出した。酸素還元・発生反応に高活性な触媒材料の合成と粒径制御によって、金属空気電池への適用を視野に入れた触媒材料の高性能化を行った。まず、本研究のメインテーマであるMn3+をベースとした酸素発生触媒・酸素還元触媒の合成を行い、その電気化学特性をRRDE(回転リングディスク電極)測定装置によって評価した。具体的には、液相合成と固相合成を組み合わせることによって、Mn2-xCoxO3のナノ粒子を得た。Mn2-xCoxO3合成の狙いは、Mn2O3が元来Mn3O4を凌駕する酸素還元活性を有しているのに対し、(代表的な活性サイトである)Mnに比べて酸素還元活性が低いとされるCoで化学置換したときに活性が減衰するのかを調査するためである。Mn2-xCoxO3の触媒活性を測定した結果、その酸素還元活性は減衰することなく、Coの置換量が増えるにつれて活性が飛躍的に向上した。特に平均電子数は、ほぼ4に収束し、過酸化水素が発生する2電子反応を無視できるレベルまで減少させることができたと言える。Mn3-xCoxO4を用いた以前の研究によって酸素発生反応ではMn3+O6八面体のヤーンテラー歪みの抑制によって、触媒活性が向上することが明らかになっていたが、今回の研究成果により酸素還元反応についても、ヤーンテラー歪みが抑制されると活性が向上することが示唆された。これは、遷移金属イオンのeg電子数が1付近の時、遷移金属酸化物は酸素還元・発生反応において最大の触媒活性を示すという原則が支配的でないことを意味する。そこで、"Mn3+をベース"という括りをはずして、eg電子数が0の材料についても触媒探索を行ったところ、Mn3+、Ni3+, Co3+をベースとしたものよりも酸素発生活性の高い物質群が得られた。当初の計画では遷移金属イオンのeg電子数が1付近の時、遷移金属酸化物は酸素還元・発生反応において最大の触媒活性を示すという原則をベースに研究を行っていたが、eg電子数が0の物質群においてMn3+、Ni3+, Co3+をベースとしたものよりも高い酸素発生活性が得られたため、eg電子数が0の系においても八面体の歪みを抑制するなどの工夫を行うことで触媒活性を更に向上させることができると考えられる。これは、触媒探索の幅を広げるものであり、今後さらなる成果が期待できる。Suntivichらによって、遷移金属のeg電子数が1-1.2付近の時、最大の酸素発生活性を示すと報告されているが、Mn3+を含むLaMnO3などは酸素発生活性が低いなどの反例が多い。そのため、電子数にこだわらず、電子構造の括りで酸素発生触媒の支配因子を見つけなければならない。研究例の多い絶縁体や通常の金属では実現できない特殊な電子構造をもった触媒材料に目を向けるべく、2017年度の研究では、パイロクロア酸化物のHg2Ru2O7が室温において金属的な電子状態と絶縁体的な電子構造を併せ持つ「非フェルミ流体」となることに着目して、その酸素発生活性を評価した。その結果、金属的な電子状態と絶縁体的な電子構造を併せ持つHg2Ru2O7は、既存の酸化物の中で最も過電圧が低く(150 mV, 10mA/cm2)、電流密度も非常に高い(1.5 V vs. RHE, 100 mA/cm2)ということが明らかになった。Hg2Ru2O7は、電気伝導率および格子定数がほぼ同じで、Ruが5価のCa2Ru2O7やCd2Ru2O7と比較しても、全ての面で優れた酸素発生活性を示しており、その並外れた活性が特異な電子構造に起因することは明らかである。

優れたOER活性は初期活性ばかりでなく、10mA/cm2となる電位での安定性・CVサイクル特性についても、どのペロブスカイト酸化物よりも優れていた。すなわち、過電圧が低いという金属の長所を発揮しつつ、高電位で電流密度が低く安定性も低いというRuO2等が有する短所を克服できた。本成果については、オープンアクセス誌であるAdvanced Science誌の4巻のpp.1700176において公表した。また、Hg2Ru2O7にCa2Ru2O7やCd2Ru2O7を含めた非フェルミ流体が優れた酸素発生触媒となることを特許として出願した(特願2017-14257)。ここまで、Hg2Ru2O7が既存の酸化物の中で最も過電圧が低く、電流密度も非常に高いということを見出したばかりでなく、オープンアクセス誌であるAdvanced Science誌への論文発表、特許の出願に直結した研究ができたため、当初の計画以上に本研究が進展していると言える。特に、「金属的な電子状態と絶縁体的な電子状態を併せ持つ触媒材料」という指針を明確に打ち出すことができたため、今後の触媒探索が容易になったと言える。今回の知見を得るには、特殊な電子構造をもった触媒である必要があったため、貴金属や重元素が必要であったが、今後の研究では、3d遷移金属なんどの安価な金属を中心に触媒設計を行うことができる。そのため、金属空気電池の正極材料として試すことのできる触媒設計に向けて、大きく前進したという現況である。申請者は本研究を開始した平成28年度から現在に至るまで、金属空気2次電池に適用できる高性能な酸素発生触媒の開発と酸素発生反応(OER)のメカニズムの解明を目的に、OER活性の決定因子を探索してきた。まず始めに、液相合成と固相合成を組み合わせることによって得たMn2-xCoxO3のナノ粒子の触媒活性を測定した結果、Coの置換量が増えるにつれて(OER活性は維持したままで)酸素還元活性が飛躍的に向上した。これは、遷移金属イオンのeg電子数が1付近の時、遷移金属酸化物は酸素発生・還元反応において最大の触媒活性を示すという原則が支配的でないことを意味する。そこで、"Mn3+をベース"という括りをはずして、eg電子数が0の材料についても触媒探索を行ったところ、高圧合成法によってパイロクロア構造のRu酸化物が得られた。平成29年度には、このRu酸化物の酸素発生活性を系統的に調べることで、(結晶構造が同一でも)電子構造の僅かな差がOER活性に決定的な影響を与えること、活性サイトのRuが金属的かつ絶縁体的な電子状態を併せ持つと初期活性だけでなく安定性も高い高性能なOER触媒になることを明らかにした。最終年度の平成30年度には、申請者は2種類以上の陰イオンを有する混合アニオン化合物のOER触媒が従来の遷移金属酸化物とは異なるOER機構を有すると考え、その中でも超伝導体と関連の深い、特異な電子状態をもつSr2VFeAsO3-dのOER活性・反応機構を系統的に研究した。その結果、OERの活性サイトは陽イオンや陰イオンではなく、酸素欠損サイト自体が活性サイトの役割を果たし、酸素欠損サイト間の距離が十分に短ければ反応中にO-O結合が形成されてOER活性が著しく増強されることを見出した。遷移金属イオンのeg電子数を0から2まで自由に変化させた上で、化学置換によって八面体の歪みを変化させたり、結晶構造を圧力によって相転移させたりすることで酸素発生活性・酸素還元活性の更なる向上を目指す。そして、触媒活性の比較によって高活性な触媒の支配因子の決定を行う。
アミノ酸シグナルに応答した臓器特異的な脂質代謝制御機構の解明と脂肪蓄積法の開発

本研究は、アミノ酸の欠乏が組織特異的に脂質代謝を制御するメカニズムを解明することを目的としている。今回の研究成果により、Arg欠乏食の給餌は肝臓からの脂肪分泌を阻害することによって、低アミノ酸食の給餌は肝臓での脂肪合成を促進することによって肝臓への脂肪蓄積を誘導していることを示した。一方、Lys欠乏食は筋肉の遅筋化を介して、筋肉への脂肪交雑を誘導していることを示唆するデータを得た。さらに、自己組織化マップと多層パーセプトロン解析という機械学習手法で、血中アミノ酸濃度のみで、肝臓の脂肪蓄積量が決定できることを示した。この手法は血中アミノ酸と疾病との関連性解析など医学的な応用が期待できる。肝臓における低アミノ酸状態による脂肪蓄積の分子機構の解明するため、低アミノ酸栄養状態で変化する脂質代謝段階の同定を試みた。その結果、細胞への糖取り込み活性、脂肪合成に関わる酵素(FAS)の活性が、低アミノ酸栄養状態で上昇していた。低アミノ酸栄養状態で、IRS2タンパク質が著増していたため、IRS2と結合するタンパク質を網羅的に探索したところ、脂質代謝関連タンパク質がいくつか単離されてきた。筋肉において低アミノ酸状態による脂肪蓄積の分子機構を解明するため、筋肉細胞を低アミノ酸培地で培養したところ、脂肪蓄積は認められなかった。この結果は、筋肉細胞は細胞自律的にアミノ酸濃度をモニターして、脂肪蓄積を誘導しているわけではないことが明らかとなった。このため、肝臓と筋肉では低アミノ酸状態によって脂肪が蓄積する機構が全く異なると考えられた。さらに、アミノ酸量を変化させた種々の餌を作成し、これをラットに給餌、ラットの血中アミノ酸濃度と肝臓脂肪量を測定し、これらのデータを機械学習で解析した。その結果、肝臓への脂肪量を血中アミノ酸濃度からエラー率数%で予想することが可能となった。さらに同じデータを自己組織化マッピングで解析したところ、血中のアミノ酸濃度からラットの生理状態を滑らかに分類することができた。肝臓組織において、低アミノ酸栄養状態によって上昇する脂質代謝段階を同定することができた。さらにIRS-2結合タンパク質の中に多くの脂質代謝関連酵素を見出すことができた。筋肉は細胞自律的に低アミノ酸状態をモニターしていないため、in vivoでの解析が必要であることが明らかとなった。さらにニューラルネットワークを用いて、血中アミノ酸濃度から肝臓への脂肪量を予測することが可能となった。このように当初の計画した解析結果はすべて得られており、研究は順調に進展している。今年度は、アミノ酸欠乏によって活性化または不活性化されるシグナル系を解析した。その結果は、mTOR系の不活性化が顕著であったため、mTORの活性阻害剤を添加して、脂肪蓄積量を追跡した。その結果、mTORの活性阻害剤の添加によって、肝臓細胞への脂肪蓄積量は顕著に増加した。この結果から、肝臓細胞はアミノ酸欠乏によって生ずるmTORの不活性化を介して脂肪蓄積を誘導することが示された。また筋肉細胞であるL6細胞、および脂肪細胞である3T3-L1細胞をアミノ酸欠乏培地で培養しても脂肪蓄積は誘導されなかった。このことから、アミノ酸欠乏によって誘導される脂肪蓄積は肝臓細胞特異的に引き起こされることが明らかとなった。しかし、リジン欠乏食を給餌したラットにおいては、筋肉への脂肪交雑や脂肪組織量の増加が認められることから、アミノ酸欠乏による脂肪蓄積は肝臓組織と、筋肉・脂肪組織とでは分子メカニズムが異なることが明らかとなった。また、脂肪蓄積を誘導するアミノ酸を同定するため、食餌中から一つのアミノ酸のみを欠乏させた食餌、および低アミノ酸食に一つのアミノ酸のみを加えた食餌を給餌したところ、アルギニンとスレオニンを欠乏した食餌では肝臓に、リジンを欠乏した食餌では筋肉と脂肪組織に脂肪が蓄積することが明らかとなった。また、セリンとグリシンを低アミノ酸食に加えた場合は、成長遅滞を伴わずに脂肪蓄積を誘導することを明らかとした。続いて、肝臓細胞を用いて、アミノ酸欠乏によって変化する脂質代謝経路を測定した。その結果、アミノ酸欠乏によって脂質合成経路の活性が上昇しており、脂質分解経路に変化は認められなかった。さらに糖取り込みが上昇していたことから、アミノ酸欠乏によって糖取り込みが上昇し、これが脂質合成の基質となり、脂質合成が促進したと考えられた。これまでは、低アミノ酸食の給餌によって肝臓、筋肉、脂肪組織に脂肪が蓄積することを示していた。今回、食餌中のアミノ酸は一つのアミノ酸によって脂肪蓄積量が調節されているが、一方で、血中に存在するアミノ酸に関しては、一つのアミノ酸量ではなく、アミノ酸量のバランスによって肝臓への脂肪蓄積量が調節されていることを示すことができた。一方で、筋肉への脂肪蓄積量や、脂肪組織量は血中のアミノ酸量の低下をモニターして引き起こされているわけではないことが明らかとなった。このことから肝臓と、筋肉・脂肪組織では、低アミノ酸によって誘導される脂肪蓄積が異なる機構で引き起こされていることを明らかにすることができた。このように、これまで一般的に受け入れられている仮説を覆すような成果が得られたと考えられるため。我々は、低タンパク質食や低アミノ酸食を給餌したラットにおいて、肝臓に脂肪が蓄積し、皮下脂肪が肥厚、筋肉内に脂肪交雑が認められることを明らかにしてきた。今回、低アルギニン食または低スレオニン食を給餌したラットでは肝臓のみに、低リジン食を給餌したラットでは筋肉と皮下のみに脂肪が蓄積することを明らかにした。このことは、餌中のアミノ酸濃度を変化させるだけで、自在に臓器選択的な脂肪蓄積が誘導可能であることを示している。

さらに、H4IIEなどの肝がん細胞や初代培養肝細胞を、アミノ酸不含培地で培養すると、培地中にホルモンや脂質が含まれていないにもかかわらず、細胞内に脂肪が蓄積することが明らかとなった。一方、筋肉細胞ではアミノ酸不含培地で脂肪蓄積が誘導されないため、肝臓細胞は血中のアミノ酸濃度の低下をモニターし、細胞自律的に脂肪蓄積を誘導すること、さらに、この現象は肝細胞に特異的であることが明らかとなった。続いて、肝臓への脂肪蓄積に重要な働きをするアミノ酸を同定するために、アミノ酸量を変化させた様々な餌を給餌させ、血中アミノ酸濃度と肝臓や筋肉の脂肪量を測定し、その関係を解析した。その結果、一つの血中アミノ酸量の変化だけで、肝臓の脂肪蓄積誘導を説明することができなかった。しかし、機械学習(AI)の解析法である自己組織化マップおよび多層パーセプトロンにより、血中の複数のアミノ酸のバランスが肝臓の脂肪量を決定づけていることを明らかにした。さらに、培養細胞をアミノ酸濃度の変化した培地で培養すると、インスリンなどのホルモン非依存的に、糖新生や脂質代謝、ホルモン合成量などが劇的に変化することを明らかにした。これは、アミノ酸自体がホルモン非依存的にシグナル分子のように機能して、いろいろな遺伝子の転写を直接制御して、代謝を制御することを示している。現在はこの分子メカニズムの解明を試みている。本研究は、アミノ酸の欠乏が組織特異的に脂質代謝を制御するメカニズムを解明することを目的としている。今回の研究成果により、Arg欠乏食の給餌は肝臓からの脂肪分泌を阻害することによって、低アミノ酸食の給餌は肝臓での脂肪合成を促進することによって肝臓への脂肪蓄積を誘導していることを示した。一方、Lys欠乏食は筋肉の遅筋化を介して、筋肉への脂肪交雑を誘導していることを示唆するデータを得た。さらに、自己組織化マップと多層パーセプトロン解析という機械学習手法で、血中アミノ酸濃度のみで、肝臓の脂肪蓄積量が決定できることを示した。この手法は血中アミノ酸と疾病との関連性解析など医学的な応用が期待できる。阻害剤を用いた研究成果より、IRS-2以外のシグナル分子も低アミノ酸栄養状態による脂肪蓄積に大きな影響を与えていると考えられた。そこで平成28年度は、当初の研究計画に加えて、IRS-2以外のシグナル分子も候補分子と考えて解析を行う。さらに、筋肉組織においては肝臓とは全く異なる脂肪蓄積機構が存在することが明らかとなった。そこで筋肉組織における脂肪蓄積はin vivoやex vivoの系を使いながらメカニズム解明を試みる。機械学習により血中アミノ酸状態から肝臓の脂質量を予測することが可能となった。この予測式を利用して、肝臓により多く脂肪を蓄積させる最適化された餌組成の予測、さらに肝臓に脂肪を蓄積するメカニズムの解明を試みる。今後は、肝臓と、筋肉・脂肪組織では異なるアプローチで研究を進めていく必要がある。肝臓については、肝臓初代培養系や肝臓細胞ラインを用いて分子的なメカニズム解明を進めていく必要がある。
大学附属病院歯科診療室における粉塵の成分分析について

1.研究の目的:本研究は、粉塵の粒度と構成成分との関連性について分析することを目的として、粒度別粉塵濃度の測定と同時にエアサンプラーによる粉塵の捕集を行い、X線回折ならびにEPMA(電子線マイクロアナライザー)により、定性分析および元素分析を行った。2.材料および方法:測定は本学歯学部附属病院の補綴科(1995年8,10月)ならびに保存料(1995年9,11月)にて,各月任意の4日間を選び粉塵の測定を行った。粉塵の粒度分布は,自動微粒子測定器PARTICLE COUNTER PCK-3010 A型(柴田科学)にて1日3回(8:30,10:30,15:00)測定を行い1lに換算した値を測定値とした。粉塵の成分分析には,労研TRサンプラー(柴田科学)で1日7時間(28時間/月)集塵を行い、定性分析にはX線回折(島津XD-3A型),元素分析にはEPMA(島津EPMA-8705)を用いた。3.結果および今後の予定:各診療室の粉塵粒度分布(0.30.5,0.51.0,1.02.0,2.05.0,5.0μm以上)の幾何平均値は、補綴科(201113,34274,1826,302,75count/l),保存科(112696,16752,1589,297,66cout/l)であり、補綴科の方が粉塵濃度は高い傾向にあった。しかし粒度分布の割合は両診療室とも類似しており、約85:14:1:0.2:0.04であり、0.31.0μmの粒度粉塵で99%を占めていた。X線回折分析では、補綴科の8月28.5,22.8,23.3(2θ・)、10月38.3,20.4,39.6(2θ・)、保存科の9月26.3,26.4,28.1(2θ・)、11月26.7,23.0,28.8(2θ)に回折線の存在が認められた。EPMA分析では、K,Ca,Si,S,Cd,Ba元素が検出された。今後これらの分析結果を基にさらにSEM(走査型電子顕微鏡)による粉塵の形態観察、有機質粉塵との関係について解明するとにより、歯科診療室粉塵の病原性について検討したい。