hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
廃水処理汚泥の脱水性とケーク構造

1.研究目的活性汚泥プロセスから排出される多様な微生物と有機物からなる汚泥の脱水特性を解析することを目的として、汚泥中の粘質物に着目し、圧縮透過実験により部分濾過比抵抗や空隙比に対する粘質物の影響を調べるとともに、粘質物自身の濾過特性を限外濾過により求め、汚泥の濾過特性との関係について検討した。2.研究成果の概要ビール工場余剰汚泥を用いて濾過圧搾実験を行った結果圧搾圧力の増加とともに、ケーク内の空隙比の減少がみられ汚泥ケークは圧縮性ケークであることが確認されたが、汚泥より分離抽出した粘質物の添加による空隙比の変化はほとんどなく、粘質物添加効果は部分比抵抗の増大によることが判った。次に限外濾過実験により各種汚泥とそれぞれの汚泥から抽出した粘質物自身の濾過比抵抗を側定し比較したところ、平均過比抵抗が大きい汚泥ではその粘質物の平均濾過比抵抗も大であるという傾向が見られた。また昨年度の研究で粘質物を汚泥に加えると汚泥の脱水性が著しく悪くなることが確認されており、粘質物の脱水性は汚泥の脱水を決定する重要な因子であることが示唆される。一般に汚泥に凝集剤を加えると脱水性が改善されることは知られているが、汚泥より抽出した粘質物に少量の高分子系凝集剤を添加すると粘質物自体の脱水性が良くなることを確認した。従って凝集剤は単に汚泥中の固形分を凝集させるだけでなく、固形分内の空隙を閉息すると推察する粘質物にも作用して脱水性を改善させたものと考えられる。以上の研究結果から、汚泥の濾過圧搾特性に対して濾過ケーク中の粘質物が大きく影響することが示唆された。今後、部分比抵抗および平均濾過比抵抗、修正圧密係数に及ぼす粘質物の影響ならびに固形分のケーク内における立体構造について詳細な検討を加えることにより生物系廃水処理汚泥の脱水性改善を図れるものと考えられる。
陶材前装外冠コーヌスクローネシステムの確立とそのメカニズムの解析

本研究では多目的用金合金と専用低融陶材がコーヌスクローネ外冠前装に適用可能かどうかについてこれまでコーヌスクローネに用いられてきた従来型システムとを垂直変位量で比較検討した.As castでの各合金の垂直変位量の平均値と標準偏差はDegunormが27.38μmと最も適合が良く,次いでKIK-WINGの30.03μm, DENTITANの31.14μm, Degudent LTGの34.85μmの値の順であった.ディギャシング終了後の各合金の垂直変位量はいずれの合金もAs castの時よりも大きくなり,焼成により鋳造体の寸法が変化していることが確認された.ディギャシングを行った後の垂直変位量はDegunormが38.14μmと最も小さく,次いでKIK-WINGの40.23μm, Degudent LTGの40.55μmで, DENTITANの変位量は最も大きく54.67μmであった.オペーク陶材焼成後の各合金の垂直変位量はKIK-WINGが最も小さくなり,その値は48.10μmであり,次いでDegudent LTGの52.70μm, Degunormの55.67μm, DENTITANの63.68μmの順であった.ボディ陶材焼成後の各合金の垂直変位量ではDegunormの48.90μm,次いでDLTの52.72μm, KIK-WINGの53.05μmであり, DENTITANはこれらの合金に比べて74.21μmと有意に大きな値を示した.グレーズ焼成後の各合金の垂直変位量はDegunormが39.87μm, Degudent LTGが47.06μm, KIK-WINGが52.607μm, DENTITANが70.39μmの順であった.全ての焼成ステップ終了後の垂直変位量において比較するとDENTITANと他の合金およびDegunormとKIK-WINGの間において有意差が認められた.本研究では多目的用金合金と専用低融焼付用陶材がコーヌスクローネ外冠前装に適用可能かどうかについてこれまでコーヌスクローネに用いられてきた陶材焼付合金と陶材を用いて比較検討した.多目的用金合金の表面性状の違いによる陶材引張側による三点曲げ試験の焼付強度は,鋳造体焼付面の表面処理をクロスカーバイドバー+アルミナサンドブラスト処理+ボンディング陶材の塗布(条件1)は60.0MPa,クロスカーバイドバー+サンドブラスト処理後(条件2)は45.4MPa,クロスカーバイドバー+ボンディング陶材(条件3)は50.1MPa,クロスカーバイドバー(条件4)は46.4MPaであった.t-検定では条件1と条件2,3,4の間ではの間にはp<0.01,条件2と条件3,条件3と条件4の間にはp<0.05で有意差が認められたが,条件2と条件4には有意差が認められなかった.焼付強度試験後の各試験片の陶材剥離面の観察では条件1では陶材が金属側に強固に付着していたが,条件2,条件4では陶材は金属表面から剥離していた.条件1と条件4の焼付強度試験後の破断面のSEM像の観察では,条件1のSEM像では試験片は金属,ボンディング陶材,オペーク陶材,ボディ陶材の4層がみられたが,オペーク陶材とボンディング陶材の境界は不明瞭であった,条件4では金属,オペーク陶材,ボディ陶材の明確な3層がみられた,亀裂線は条件1と条件4ともにオペーク陶材とボディ陶材の界面で消失しており,金属面までは達していなかった.これは500倍に拡大したSEM像でも同様だった.またEDX分析でも条件1と条件4の間には各元素の拡散状態が明確ではなく大きな相違は認められなかった.本研究では多目的用金合金と専用低融陶材がコーヌスクローネ外冠前装に適用可能かどうかについてこれまでコーヌスクローネに用いられてきた従来型システムとを垂直変位量で比較検討した.As castでの各合金の垂直変位量の平均値と標準偏差はDegunormが27.38μmと最も適合が良く,次いでKIK-WINGの30.03μm, DENTITANの31.14μm, Degudent LTGの34.85μmの値の順であった.ディギャシング終了後の各合金の垂直変位量はいずれの合金もAs castの時よりも大きくなり,焼成により鋳造体の寸法が変化していることが確認された.ディギャシングを行った後の垂直変位量はDegunormが38.14μmと最も小さく,次いでKIK-WINGの40.23μm, Degudent LTGの40.55μmで, DENTITANの変位量は最も大きく54.67μmであった.オペーク陶材焼成後の各合金の垂直変位量はKIK-WINGが最も小さくなり,その値は48.10μmであり,次いでDegudent LTGの52.70μm, Degunormの55.67μm, DENTITANの63.68μmの順であった.

ボディ陶材焼成後の各合金の垂直変位量ではDegunormの48.90μm,次いでDLTの52.72μm, KIK-WINGの53.05μmであり, DENTITANはこれらの合金に比べて74.21μmと有意に大きな値を示した.グレーズ焼成後の各合金の垂直変位量はDegunormが39.87μm, Degudent LTGが47.06μm, KIK-WINGが52.607μm, DENTITANが70.39μmの順であった.全ての焼成ステップ終了後の垂直変位量において比較するとDENTITANと他の合金およびDegunormとKIK-WINGの間において有意差が認められた.
自閉スペクトラム症者の自己に対する意識を高める看護介入プログラムの効果維持の検討

青年期以降の自閉スペクトラム症者(以下、ASD者)に対する治療は、二次障害の症状に対する薬物療法だけでは対人関係の改善や長期的な社会適応は見込めず、心理社会的介入が必須となる。ASD者への心理社会的介入として、自己への意識を高めるような介入が有用と指摘されているが、看護師が実践できる心理社会的介入は報告されていない。そこで、自己への意識を高めることを目的とした看護師が実践できる看護介入プログラムを作成した。看護介入プログラムを実施した結果、自己への意識が高まったことと対人機能の改善に影響を与えることが示され、ASD者に対する有用性が示唆された。ASD者に対する心理社会的介入の確立に向けては、看護介入プログラムの効果の維持についての検討は不可欠である。平成30年度は18名を対象として、看護介入プログラム実施6か月後及び12か月後の効果維持の評価を行った。評価の結果、実施6か月後及び12か月後ともに評価尺度の数値に有意差は認められなかった。このことから、看護介入プログラムの効果は維持されていることが示唆された。一方、実施後6か月後及び12か月後のインタビューデータの質的分析から、日記を書くことや自分の気持ちや疲労度の確認を心掛ける等の「自己モニタリングの継続」、運動や休息をとることを心掛ける等の「日常生活管理の継続」、家族や職場の人と話すことを心掛ける等の「他者との関わりの継続」、服薬の継続やデイケアの利用を心掛ける等の「医療とのつながりの継続」の4つのカテゴリーが抽出された。以上より、看護介入プログラムはASD者の自己への意識を高めることが期待でき、自己への意識が高まることによって、自分自身をモニタリングして把握しようとする意識や、自分自身や日常生活をコントロールしようとする意識や行動が維持される可能性があると推測できた。青年期以降の自閉スペクトラム症者に対する治療的介入は、二次障害に対する薬物療法が中心であるが、対人関係の改善や長期的な社会適応、主観的QOLの改善に向けては社会心理的介入が必須である。自閉スペクトラム症者に対する社会心理的介入として、自己への意識を促すような介入が有用と指摘されている。そこで、自己モニタリング機能の活性化を促すことによって自分に対する意識を高めることを目的とした看護介入プログラムを作成した。作成したプログラムを自閉スペクトラム症者に実施したところ、自己に対する意識が高まったことと対人機能の改善に影響を与えることが示され、自閉スペクトラム症者に対する有用性が示唆された。この研究からは、看護介入プログラムの効果の維持については明確にはなっていない。そこで、看護介入プログラムの効果の維持について検討することを目的に本研究を実施した。平成28年度は、自閉スペクトラム症者8名(前半組)から研究参加への同意を得て看護介入プログラムを実施した。8名を対象にプログラム実施前後で比較したところ、認知行動的セルフモニタリング尺度では、実施前の中央値は23.5、実施後の中央値は20.0で実施後の方が有意に低かった(p<0.05)。自意識尺度日本語版では、実施前の中央値は41.0、実施後の中央値は36.0で実施後の方が有意に低かった(p<0.05)。SRS-IIでは、実施前の総合計の中央値は83.5、実施後の中央値は78.0で実施後の方が有意に低かった(p<0.05)。これらの結果より、看護介入プログラムの実施により、自己に対する意識が高まったことと対人機能の改善したことが示唆された。対象者であるが、Aデイケアの主治医や施設長から予定以上の20名を対象者候補として選定していただいており、平成28年度は8名(前半組)から同意を得て実施しているため。また、平成29年度の研究実施に向けて9名(後半組)から研究参加の同意を得ているため。青年期以降の自閉スペクトラム症者に対する治療は、二次障害の症状に対する薬物療法だけでは対人関係の改善や長期的な社会適応は見込めないことから、心理社会的介入が必須となる。自閉スペクトラム症者に対する心理社会的介入として、自己への意識を促すような介入が有用と指摘されているが、看護師が実践できる心理社会的介入は報告されていない。そこで、自己への意識を高めることを目的とした全10回の個人面接による看護介入プログラムを作成した。看護介入プログラムを実施した結果、自分に対する意識が高まったことと対人機能の改善に影響を与えることが示され、自閉スペクトラム症者に対する看護介入プログラムの有用性が示唆された。青年期以降の自閉スペクトラム症者に対する心理社会的介入の確立に向けては、看護介入プログラムの効果の維持についての検討は不可欠であるが、明確にはなっていない。そこで本研究では、看護介入プログラムの効果の維持について検討することを目的とした。平成29年度は、後半組10名を対象に看護介入プログラムを実施した。看護介入プログラム実施前後で比較したところ、認知行動的セルフモニタリング尺度では、実施前の中央値は20.0、実施後は25.0で実施後の方が有意に高かった(p<0.05)。自意識尺度日本語版では、実施前の中央値は39.6、実施後は41.0で実施後の方が有意に高かった(p<0.05)。SRS-IIでは、実施前の中央値は97.1、実施後は83.5で実施後の方が有意に低かった(p<0.05)。

これらの結果より、平成29年度の対象者においても自分に対する意識が高まったことと対人機能の改善に影響を与えたことが示唆され、自閉スペクトラム症者に対する看護介入プログラムの有用性が示唆された。また、平成30年度に実施する維持調査に向けて対象者18名に再度計画を説明し、研究協力の同意が得られた。平成29年度は、計画よりも多くの対象者から同意を得ることができ、看護介入プログラムを実施することができたため。また、実践前後の評価指標の比較から、自分に対する意識が高まったことと対人機能の改善に影響を与えたことが示唆され、自閉スペクトラム症者に対する看護介入プログラムの用性が示唆されているため。さらに、平成30年度の維持調査に向けて、対象者から引き続き研究協力の同意を得られたため。青年期以降の自閉スペクトラム症者(以下、ASD者)に対する治療は、二次障害の症状に対する薬物療法だけでは対人関係の改善や長期的な社会適応は見込めず、心理社会的介入が必須となる。ASD者への心理社会的介入として、自己への意識を高めるような介入が有用と指摘されているが、看護師が実践できる心理社会的介入は報告されていない。そこで、自己への意識を高めることを目的とした看護師が実践できる看護介入プログラムを作成した。看護介入プログラムを実施した結果、自己への意識が高まったことと対人機能の改善に影響を与えることが示され、ASD者に対する有用性が示唆された。ASD者に対する心理社会的介入の確立に向けては、看護介入プログラムの効果の維持についての検討は不可欠である。平成30年度は18名を対象として、看護介入プログラム実施6か月後及び12か月後の効果維持の評価を行った。評価の結果、実施6か月後及び12か月後ともに評価尺度の数値に有意差は認められなかった。このことから、看護介入プログラムの効果は維持されていることが示唆された。一方、実施後6か月後及び12か月後のインタビューデータの質的分析から、日記を書くことや自分の気持ちや疲労度の確認を心掛ける等の「自己モニタリングの継続」、運動や休息をとることを心掛ける等の「日常生活管理の継続」、家族や職場の人と話すことを心掛ける等の「他者との関わりの継続」、服薬の継続やデイケアの利用を心掛ける等の「医療とのつながりの継続」の4つのカテゴリーが抽出された。以上より、看護介入プログラムはASD者の自己への意識を高めることが期待でき、自己への意識が高まることによって、自分自身をモニタリングして把握しようとする意識や、自分自身や日常生活をコントロールしようとする意識や行動が維持される可能性があると推測できた。平成28度に同意を得た8名の対象者(前半組)については、6か月後調査、12か月後維持調査を実施する。平成29度に同意を得た9名の対象者(後半組)については、看護介入プログラムを実施する。また、実施後は前後の比較を行う。平成30年度は、前半組8名と後半組10名の計18名を対象として、6か月後維持調査及び12か月後維持調査を行う。また、調査後は全体分析・考察を研究を進めていく。謝金について、平成28年度分と平成29年度を一括して支払う方法に変更になったため謝金や旅費の額が変更になったため。平成30年度の調査関連の費用に充てる。調査関連の費用に充てる
細菌O抗原多糖が多様性を獲得する機構に関する研究

グラム陰性菌のリポ多糖体(LPS)は外膜に局在する分子で、O多糖とリピドAが、コアオリゴ糖を介して結合した分子である。O多糖はO抗原として細菌の血清型別に利用され、多様性に富んだ構造をしている。この構造多様性は、繰り返し単位を構成する糖の種類、それらの結合様式の違いなどによる。本研究では、O多糖構造が類似し、その合成遺伝子も90%以上の相同性を示すE.coli O9とO9a、Klebsiella O3をモデルとし、これらの菌のO多糖構造の違いがどのような遺伝的違いに起因するかを詳細に検討した。これらの菌の多糖合成遺伝子群は8個の遺伝子で構成され、これらのO多糖構造の違いは、wbdA遺伝子にコードされたマンノース転移酵素(WbdA)に依存していることを明らかにした。さらに、クローニングしたwbdA遺伝子構造と遺伝子産物の比較から、14ヶ所のアミノ酸置換がO多糖構造に関係していることを推定した。hybrid wbdA遺伝子を作成し、WbdAのN末側ドメインがO多糖構造を決定することを明らかにした。この領域では8ヶ所のアミノ酸置換があった。合成DNAを用いてこれらのアミノ酸置換をO9由来のwbdAに導入し、55番目のシステインをアルギニンへ置換した場合のみ、O9多糖がO9a多糖へ構造変化することを明らかにした。O9a由来のwbdAにアルギニンからシステインという逆のアミノ酸置換を導入してもO9多糖への構造変化は起きなかった。以上の結果から、点変異の結果起こるたった一つのアミノ酸残基置換により、E.coli O9a株がE.coli O9株から生じた可能性が強く示唆された。このように、細菌は遺伝子の水平伝搬に加え、点変異の蓄積によりO多糖構造を多様化する機構を明らかにした。前年度までに、Escherichia coli O9a株のO多糖合成遺伝子領域に存在するマンノース転移酵素遺伝子(wbdA)が、二つの独立した遺伝子の融合により構築されたことを示した。さらに、二つのドメイン構造をもつその遺伝子産物WbdAは、N末端側ドメインだけでもO多糖を合成することを明らかにした。このように、WbdAは糖転移酵素としては特異な酵素であり、その遺伝子が進化の過程でどのように構築されたかを明らかにすることは、細菌がO多糖構造多様性を獲得する機構を明らかにする点からも興味深い。そこで、E.coli O9aによく似た構造のO多糖を合成するE.coli O9株、Klebsiella O3株のwbdA遺伝子をクローニングし、その塩基配列の決定を行った。これらの遺伝子構造の比較から、wbdAのN末側ドメインにあるいくつかのアミノ酸置換が、E.coli O9とO9aの構造の違いに関与していることが推定された。人為的な点変異をwbdA遺伝子に導入することで、多糖構造の変化に直接関わるアミノ酸残基を決定した。E.coli O9株WbdAの55番目のシステイン残基をアルギニンに置換すると、合成されるO多糖はO9aに変換された。また、逆にE.coli O9a株WbdAの55番目のアルギニン残基をシステインに変換すると、O9多糖は合成されず不規則な構造のO多糖が合成された。これらの結果は、E.coli O9a株が点変異による一つのアミノ酸置換によりE.coli O9株から生じた可能性を示唆する。さらに、E.coli O多糖の構造多様性が、すでに提案されている大規模な遺伝子の再構築に加え、点変異の蓄積によっても獲得されることが実験的に示された。
輸送小胞特異蛋白によるリソソーム系輸送経路の識別とAPP処理過程に関する研究

培養筋細胞を用いてリソソーム経路に関与する輸送小胞を特異的蛋白によって識別して、Aβ産生機構における輸送小胞の役割について免疫病理学的、生化学的検討を加えた。1.輸送小胞に特異的な蛋白に対する抗体の樹立:輸送小胞にはclathrin被覆小胞とβ-COPなどのCootmer蛋白をもっている非被覆小胞がある。Clathrinならびにβ-COPのアミノ酸配列からペプチドを合成して、特異抗体の樹立した。Concanamycin A(Con A)に被覆小胞によるエンドサイトーシスを選択的に阻害する。1)組織病理学的検討:Con A添加により細胞膜下に多数の空胞が出現する。2)免疫病理学的検討:APP、Aβに対する抗体を用いるとCon A非添加でも細胞質、細胞表面が顆粒状に染め出されるが、Con A添加により空胞の一部は明らかに陽性となった。Clathrin抗体は細胞表面、細胞膜下に多数の小胞様構造が染め出された。Con A添加により形成された空胞の一部も陽性であった。β-COP抗体では細胞内に特有の染色像が見られた。ERGIC53、galactosyltransferase抗体では明瞭な変化は見られなかった。3)生化学的検討:Con A添加ないし非添加条件で^<35>S-メチオニンを用いてパルスラベルを行い、APP、Aβ抗体で免疫沈降を施しオートラジオグラフィーにて検討した。Con A非添加条件で4kDaのAβが検出されるが、Con A添加によってこの4kDaバンドは減少したが明らかに存在した。以上の結果は細胞表面からclathrin被覆小胞を介してリソソームに至る経路とこれとは別のnon-clathrin型の輸送小胞を介してリソソームに至る経路がAβの生成に重要な役割を演じていることを示唆する重要な知見と考えられる。AD脳には、40個前後のアミロイドβ蛋白(Aβ)の沈着による特有の組織病変がみられる。Aβは700個前後のアミノ酸からなる膜蛋白であるアミロイドの前駆体蛋白(APP)が分解をうけて生成されることが知られている。この前駆体蛋白がどの様な場合に、どこで、どの様な機構により処理をうけ43個のAβが形成され沈着するのかという問題は依然解決されていない重要な課題である。この問題の解決には、蛋白の細胞内輸送とAPPの分解処理過程を明らかにする必要がある。本年度は以下の検討を行った。1)clathrin,adaptor proteinに対する抗体の樹立:clathrin,adaptor protein(AP-1,AP-2,AP-3)は、それぞれアミノ酸配列が明らかにされている。そのうち特徴のあるドメインを合成して、その合成ペプチドに対するポリクローナル抗体の作成を試みた。clathrinやAPにたいする抗体は、ELISAでは抗体価は高いものの免疫染色ではsensitivityが優れていないため再度試みている。2)培養細胞におけるLys系関連経路とAPP分解過程に関する生化学的研究:HUT78(T細胞系)、U937(モノサイト系)を培養して細胞の画分を得る。Golgi分画、ミクロゾーム分画をさらに密度勾配法によりLys、輸送小胞を分ける。この各分画の蛋白を可溶化してウエスタンブロッティングを行い、APP断片の性質を明らかにした。これまで知られていたamyloidogenicなAPP断片50kDa,20kDaの他にRIを用いることにより6-5kDaさらに4-3kDaのAβに極めて近い断片の検出が可能となった。3)培養細胞におけるLys系関連経路とAPP分解過程に対するロイペプシン、クロロキンの影響:ロイペプシン、クロロキンを加えて細胞を培養したのち、画分を得て同様にウエスタンブロッティングを行いAPP断片、特に10kDa以下の断片の増減を調べた。

現在までに得られた所見から、Lys経路はAPPの輸送システムとして重要でありAβの形成に関係が深そうであること、いくつかの細胞内輸送経路と標的地(細胞小器官)があり異なった処理機構が働いていることを示唆すると考えられる。細胞内コンパートメント特異的な蛋白によってリソソーム(Lys)経路を同定して、アミロイド前駆体蛋白(APP)の細胞内処理過程を明らかにするために以下の実験を行った。1)細胞内コンパートメントならびに輸送小胞に特異的蛋白に対する抗体の樹立:2)培養細胞株におけるLys関連経路の組織学的同定:APPの各ドメイン、Aβに対する特異抗体と前述のコンパートメント特異抗体を選択して免疫染色を行ない、レーザー顕微鏡により観察した。各コンパートメントと特徴のある染色像を呈し同定が可能となり、Aβを含むAPP断片の局在がある程度明らかにされた。細胞内輸送経路に円経を与える薬剤を加えて細胞を培養した場合も現在観察しており興味ある結果が得られている。3)培養細胞株におけるLys系関連経路におけるAPP分解過程に関する生化学的研究:ブレフェルヂン、クロロキン、塩化アンモニウム、バフィロマイシンなどのLys系関連経路の細胞内輸送に影響を与える薬剤を加えて、各細胞画分におけるAPP断片の性質をウエスタンブロッテイングにより輸送小胞の性質とAPPの性質を調べた。Lys系関連経路の中でも各々相違がありそうであり、更に分析を行っている。
マイクロ/ナノトライボロジーの超微細加工への応用

将来様々な分野への応用が期待されるマイクロ/ナノシステムの実現に必要なSi単結晶の微細加工技術として、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて微小荷重で引掻き摩擦による加工を試み、得られた加工形状や微構造変化を解明して、加工プロセスを推定した。本研究では、まずマイクロ/ナノシステム等に使用する可能性が高いSi単結晶を試料として、AFMを用いて微小荷重で引掻き加工を行い、加工形状や微構造変化を透過型電子顕微鏡(TEM)等を用いて解明し、加工プロセスを推定した。特に、これまで未解明なアモルファス相の挙動や、転位の生成成長過程等の詳細な構造変化とともに、加工に伴う表面の機械的性質の変化を明らかにすることができた。以下がSi単結晶の微細加工に関する主な成果である。(1)AFMを用いた微小荷重の引掻き加工では、加工の進展に伴い加工深さが増大し、しだいに加工粉が表面に生じてくる。(2)AFM加工により、Si単結晶中に大きな歪みと微細な転位が多数導入され、加工表面の一部はアモルファス化し、そのアモルファス相の量は加工の進展に伴い増加する。さらに加工が進展すると歪みは小さくなり、転位はサイズが増大し、アモルファス相は表面から剥離して減少していく。次に、SiC単結晶を試料として同様にAFMを用いて微小荷重で引掻き加工を行い、その加工形状や微構造変化を解明し、Si単結晶の場合と比較した。以下が本研究で得られたSiC単結晶の微細加工に関する主な成果である。(1)Si単結晶と同様に、SiC単結晶でもAFM加工の進展に伴い加工深さが増大するが、加工深さはSi単結晶よりも浅い。これはSiC単結晶の高硬度に起因するものと考えられえる。(2)ダイヤモンド構造を持つSi単結晶では転位は(111)容易すべり面に生じるが、最密六方構造を持つSiC単結晶では(0001)容易すべり面に観察されるだけではなく、その他の結晶面にも見られ、複雑な変形過程となる。本研究では、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて、種々の材料および環境下におけるマイクロ/ナノトライボロジーおよび微細加工と、それに伴う微構造変化について調べた。微構造変化を調べる手法としては、微小な摩耗部・加工部を集束イオンビーム装置(FIB)で薄片化し、その断面を透過型電子顕微鏡(TEM)で観察する独自の方法をとった。得られた結果を以下に示す。(1)AFMの探針とシリコンウエハ表面間に電圧印加した状態で探針を走査することにより、線状にナノスケールの凸加工をすることができた.FIB装置を用いて加工部の薄片化を行い、透過型電子顕微鏡で断面形状と組織を調べた結果,アモルファス構造であることが明らかになった。(2)人工骨材料として実用されている水酸アパタイトを試料として、AFMを用いて微小荷重で引掻き摩擦を行うことで、マイクロ/ナノトライボロジーと微細加工の可能性について調べた。その結果、荷重の増加に伴って摩耗量は増加し、引掻き回数が増加すると摩耗粉が発生した。摩耗に伴う微構造変化をTEM観察した結果、水酸アパタイト結晶中に歪みや転位が発生するとともに、微細な結晶が現れてくる様子が観察された。この結果より、AFMを用いて水酸アパタイトの微細加工が可能であると思われる。(3)走査プローブ顕微鏡(SPM)よる微細の加工メカニズムを解明するために、TEM内で、薄片化したシリコンウエハ試料とSPM探針の間に応力や電圧を付加して、それに伴う試料の構造変化をその場観察できる装置を開発できた。これを用いて探針を試料に接触させて微小荷重を負荷した結果、試料中に弾性歪みや転位が発生する様子を観察することができた。
核スピンメーザーの開発と^<129>Xe原子の永久電気双極子能率の高感度探索

^<129>Xe原子の永久電気双極子能率(EDM)の測定精度は、従来の方法においてスピンの自由歳差運動の減衰時間、すなわち横緩和時間T_2が有限であることによって制限されている。これを乗り越えて従来より高い精度でEDMの探索を行なうために、^<129>Xeを動作物質とするスピンメーザーの開発を行なった。すなわち、歳差に伴うスピン磁化の振動によってコイルに生じた誘導起電力を、タンク回路を経てコイルに帰還し、生じた振動磁場によって歳差運動を自己保持する機構を発現させる。これまでに、メーザー発振に必要な^<129>Xeスピン偏極生成のための、光ポンピング用レーザー、その光学系およびポンピングセル用オ-ブンの組立・整備を行ない、100torrの圧力で偏極度P_<Xe>=69.4±1.9%を得ることに成功した。また、磁気シールドを製作し、磁場の不均一度を3mG/cm以下まで抑えることができた。さらに歳差検出器系の開発を行なって、^<129>Xeスビンの自由歳差の観測に成功している。この測定から現在のところ横緩和時間がT_2440msと得られている。発振のためには、T_2をコイルとスピンとの結合度で決まる輻射減衰時間τ_<RD>40Sより長くする必要がある。磁気シールドはT_2を長くするに十分な特性を持っており、短いT_2の原因である磁場の不均一度は種々の測定から^<129>Xeセルの近傍の部品にわずかながら含まれる磁性不純物の起因するものと見られる。現在、T_2の延伸とメーザーの発振実現をめざして、装置部品の磁性に関する詳細な検討を行なっている。
歯周病原菌代謝産物のエピジェネティク制御遺伝子への作用と難治性全身疾患への影響

Epstein-Barrウイルス(EBV)再活性化や感染細胞の異常増殖がおこり伝染性単核球症や上咽頭がんなどが発症する。われわれは、歯周病原細菌の代謝産物である酪酸がEBVの再活性化に必須である最早期遺伝子ZEBRAの発現を転写レベルで誘導する事を見出した。ZEBRAは他のウイルス蛋白やRNAの発現を誘導しEBV関連疾患を引き起こすことから、歯周病がEBVを再活性化し口腔毛様白板症やがんおよび重度の歯周病の進展に深く関与している可能性を示唆している。また、ラットを用いた実験により、歯肉に接種した酪酸が長時間組織に停滞し、ミトコンドリアに強い酸化ストレスを誘導することが判明した。われわれは、歯周病原因菌P. gingivalisの代謝産物・酪酸がHIVプロモーターのHDACを阻害しクロマチン構造を変換することで潜伏感染HIVを再活性化し、歯周病がエイズ進展に関与する事を報告してきた。最近、ヘルペスウイルスやHTLV1などの潜伏感染成立にもエピジェネティック制御が深く関わっていることが報告されており、歯周病が他の潜伏感染ウイルスにも影響を及ぼしている可能性がある。Epstein-Barrウイルス(EBV)はB細胞に感染後、潜伏感染状態となる。ウイルスと宿主の共存関係が破綻すると、EBV再活性化や感染細胞の異常増殖がおこり伝染性単核球症や上咽頭がんなどが発症する。近年、EBVの活性化が歯周病や慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎等の炎症疾患の発症に関与しているとの報告が多数なされているが、EBVの再活性化機構は良くわかっていない。われわれはEBVのゲノムDNAが宿主細胞に感染した後に環状となり、クロマチン構造をとることに着目し研究を行った。その結果、歯周病原菌の主要な代謝産物である酪酸がEBVの再活性化に必須である最早期遺伝子ZEBRAの発現を転写レベルで誘導する事を見出した。転写因子ZEBRAは他のウイルス蛋白やRNAの発現を誘導しEBV関連疾患を引き起こすことから、歯周病がEBVを再活性化し口腔毛様白板症やがんおよび重度の歯周病の進展に深く関与している可能性を示唆している。歯周病原菌がレトロウイルスのみならずDNAウイルスの複製にも影響を及ぼすことが明らかとなり、歯周病がウイルス感染症の進展に深く関与している可能性がある。酪酸を介する歯周病研究を通して、EBVが関連する炎症疾患の分子基盤が明らかになることが期待される。われわれは、歯周病原因菌P. gingivalisの代謝物・n-酪酸が潜伏感染HIVプロモーターのHDACを阻害しクロマチン構造を変換することによりHIVを再活性化することから、歯周病がAIDS進展に関与する可能性を報告した。n-酪酸はClostridium属、Fusobacterium属等腸内や女性生殖器内から検出される多くの菌が産生することから、口腔外においても広く同様の現象が認められるとの仮説をたて、立証した。近年、ヘルペスウィルスやHTLV1等の潜伏感染成立にもepigenethic制御の関与が報告されており、歯周病が他の潜伏感染ウィルス再活性化にも影響を及ぼしている可能性がある。Epstein-BarrウィルスはB細胞に感染後、潜伏感染状態となるが、ウィルスと宿主の共存関係が破綻しEBV再活性化することにより伝染性単核球症や上咽頭がん等が発症する。近年、EBV活性化が歯周病や慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎等の炎症疾患の発症に関与するとの報告なされているが、その再活性化機構は解明されていなかった。われわれはEBVのゲノムDNAが感染後に環状形態のクロマチン構造をとることに着目し研究を行った結果、n-酪酸がEBV再活性化に必須な最早期遺伝子ZEBRAの発現を転写レベルで誘導することを見出した。転写因子ZEBRAは他のウィルス蛋白やRNAの発現を誘導しEBV関連疾患を引き起こすことから、歯周病によるEBV再活性化が口腔毛様白板症、がんや重度の歯周病発症に関与している可能性が示唆された。歯周病原菌がレトロウィルスのみならずDNAウィルスの複製にも影響を及ぼすことが明らかとなり、歯周病がウィルス感染症の進展や種々のウィルス性全身疾患の発症に深く関与している可能性がある。また、動物実験から歯肉に接種されたn-酪酸は組織内に長時間停滞し、ミトコンドリアに強い酸化ストレスを誘導することが判明した。歯周病が種々の慢性疾患誘導に深く関わる事実として極めて興味ある結果と思われる。われわれは、歯周病原因菌P. gingivalisの代謝産物・n-酪酸がHIVプロモーターのクロマチン構造を変換し潜伏感染HIVを再活性化することにより、歯周病がAIDS進展の危険因子となる可能性を示した(J. Immunol. 2009)。n-

酪酸は腸内細菌の主な代謝産物の一つで、当該年度では潜伏感染HIV再活性化における腸内および膣内の常在嫌気性細菌の影響を検討した。その結果、腸内細菌ではClostridium属、Eubacterium属、Fusobacterium属菌株において顕著なHIV複製と転写活性化が認められた。膣内細菌のAnaerococcus tetradius、Anaerococcus vaginalisやPeptoniphilus asaccharolyticusなども再活性化を誘導した。活性化の認められた全ての細菌の培養上清からは高濃度のn-酪酸が検出され、その量はHIV複製能に相関していた。活性化機構を検討した結果、n-酪酸はHIV LTRのヒストンアセチル化を促進することでクロマチン構造を「不活性化型」から「活性化型」に変換し、HIVの転写と複製を促進することが判明した(Cell. Mol. Life Sci. in press)。n-酪酸の歯周組織に及ぼす影響については、口腔上皮粘膜のHIVレセプターCCR5およびCXCR4の発現が歯周病原菌の培養上清により促進される結果が得られた。また、歯周組織内に浸潤したn-酪酸の動向については、13C-n-酪酸(1 mol/L)をラット歯肉組織内に接種し、頸静脈より経時的に採血し、血中n-酪酸量をUPLC/MS/MS systemにより測定した。その結果、90分後をピークに採血終了の120分(2μmol/L)まで検出された。しかし、腸管内に接種では腸管周囲静脈からn-酪酸は全く検出されなかった。研究成果の一部をまとめ、いくつかの学会で発表を行った。また、歯周病原菌の酪酸を介するEBV再活性化に関する研究は論文としてまとめ、公表する事が出来た。潜伏感染HIVウイルスの再活性化が腸内および膣内嫌気性常在菌の培養上清によっても誘導されることが判明した。また、その活性化機序について検討した結果、クロマチンの構造変化が誘導されていることが判明した。これらの再活性化作用を持つ培養上清から、n-酪酸以外の再活性化促進物質は検出できなかことなどn-酪酸が直接HIVゲノムに作用している点は、「微生物間相互作用」の観点から興味深い。これらの結果から、ウイルス研究の平成23年度目標であるヒストン修飾を介する潜伏感染HIVウイルスの再活性化機序の解明については、概ね達成できたと考える。HIV感染の初期段階において、腸管粘膜下でウイルスが爆発的に増殖することが報告されていることから、HIVの再活性化と腸内細菌叢との関係は極めて興味深い。n-酪酸により口腔上皮粘膜のHIVレセプターCCR5およびCXCR4の発現が促進される結果からは、歯周病などの口腔感染症により、HIVの経口感染が促進される可能性も示唆された。現在、上清中にこれらのレセプター発現促進物質が他に存在するか否かについて検討を行っている。また、歯周組織内に浸潤したn-酪酸の動向については、13C-n-酪酸の血中n-酪酸量をUPLC/MS/MS systemにより測定した結果から、腸内細菌叢により産生された高濃度の酪酸は、腸管粘膜組織に維持されることなく急速に希釈されるものの、歯周病原菌により産生され歯周組織内に浸潤した酪酸は、組織内に停滞・維持されることが判明した。細菌の代謝産物の体内動向を知る上で組織による差があることが判明したことは、極めて興味深い。
12/15-リポキシゲナーゼで合成される脂質シグナル分子の病態生理機能

リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)は,不飽和脂肪酸に酸素を添加する酵素であり,マルチジーンファミリーを形成している。炭素数20個のアラキドン酸への酸素添加の位置の違いによって,5-,8-,12-,15-リポキシゲナーゼがある。5-リポキシゲナーゼは炎症や免疫に関与するロイコトリエンを生合成し,12/15-リポキシゲナーゼは動脈硬化症などの炎症性疾患において注目されている。動脈硬化病巣においては,低比重リポタンパク質(LDL)の酸化,酸化LDLの受容体やスカベンジャー受容体が重要である。しかし,酸化LDLの詳細な発生機構は不明である。生体内ではLDLの酸化が単なる自動酸化ではなく,脂肪酸の種類や位置特異性を示す酵素が関与することが示されている。このような不飽和脂肪酸の特異的酸化を触媒する酵素としては,リポキシゲナーゼしかない。そこで,12/15-リポキシゲナーゼの動脈硬化発症における病態生理機能の解明を目的として,この酵素をマウスマクロファージ様J774A.1細胞に過剰発現させて実験を行った。12/15-リポキシゲナーゼを過剰発現する細胞によってLDLが酵素的に酸化されること,この酸化LDLはスカベンジャー受容体に認識されることを明らかにした。さらに,細胞内に存在する12/15-リポキシゲナーゼによる血清中のLDLの酸化には,LDL受容体やスカベンジャー受容体ではなく,LRP(LDL receptor-related protein)が関与することを明らかにした。このマクロファージのLRPを介した12/15-リポキシゲナーゼによるLDL酸化機構を詳細に解析したところ,LRPがLDL粒子を細胞内に取り込むのではなく,LDL粒子中のコレステロールエステルのみを細胞膜に選択的に取り込むことが示唆された。さらに,抗12/15-リポキシゲナーゼ抗体を用いた実験により,この酵素が細胞質から細胞膜にトランスロケーションすることが示された。動脈硬化病巣においては,低比重リポタンパク質(LDL)の酸化,血管内皮細胞の酸化LDLの受容体やマクロファージのスカベンジャー受容体が重要な役割を果たしている。しかしながら,生体内における酸化LDLの発生機構については不明な点が多い。これまでの実験事実は,生体内ではLDLの酸化が単なる自動酸化ではなく,脂肪酸の種類や位置特異性を示す酵素が関与することを強く示唆している。このような不飽和脂肪酸の特異的酸化を触媒する酵素としては,リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase,LOX)しか知られていない。そこで,12/15-LOXの動脈硬化発症における病態生理機能の解明を目的として以下の実験を遂行した。まず発現ベクターpEF-BOSに,ネオマイシン耐性遺伝子とLDLに対する反応性が異なる白血球型および血小板型12-LOXのcDNAを組み込んだ。これら遺伝子をマウスマクロファージ由来J774A.1細胞株に導入し,安定形質発現株を得た。各12-LOX発現細胞では,ともにアラキドン酸から12-LOX産物が生成された。この白血球型および血小板型12-LOX発現細胞とLDLを反応させ,脂質過酸化物をチオバルビツール酸反応物質(TBARS)アッセイで測定すると,コントロール細胞のそれぞれ約4倍,2.5倍の増加が認められた。酸化LDLに含まれる脂質の分子種を解析すると,主要生成物はリノール酸から由来する13-HODE(Z,E)であり,コントロール細胞の約2倍以上産生された。

また,13-HODE(Z,E)の水酸基の異性体分析においては,12-LOX発現細胞ではS体が有意に多く産生されており,LDLが酵素的に酸化されていることが分かった。この12-LOX発現細胞で産生された酸化LDLはマクロファージのスカベンジャー受容体で取り込まれることが^<125>I酸化LDLのdegradationアッセイで明らかになった。低比重リポ蛋白(LDL)の酸化は動脈硬化の発症・進展に重要であることはよく知られている。これまでの酸化LDL産生機構に関する研究で,生体内ではLDLの酸化が単なる自動酸化ではなく,LDLに含まれる不飽和脂肪酸の特異的酸化を触媒する酵素としてリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase, LOX)の関与が強く示唆されている。私たちはこれまで,マウスマクロファージ様J774A.1細胞に過剰発現させた12/15-リポキシゲナーゼによってLDL内に過酸化脂質の増加を認め,その反応は酵素的におこること,この12/15-LOX発現細胞で産生された酸化LDLはマクロファージのスカベンジャー受容体で取り込まれることを明らかにしてきた。しかし,細胞内に存在する12/15-リポキシゲナーゼが,どのようにして細胞外のLDLを酸化するかについては明らかにされていない。細胞内の12/15-リポキシゲナーゼによるLDL酸化にはなんらかの細胞膜受容体が関与していることが推定されるので,その機構を解析するために以下の実験を行った。12/15-リポキシゲナーゼを高発現させたマウスマクロファージ由来J774A.1細胞を,LDLあるいはコレステロール存在下で48時間前培養すると,LDL酸化能は低下し,逆にリポ蛋白除去血清との前培養では上昇した。この細胞のLDL受容体およびLDL receptor-related protein(LRP)の発現レベルは,先の培養条件の変化によって変動することがRT-PCRで示された。12/15-リポキシゲナーゼ発現細胞によるLDLの酸化は,LRPに対する抗体によって濃度依存的に抑制されたが,LDL受容体の抗体によっては阻害されなかった。さらに,LRPのアンチセンスオリゴヌクレオチドはLDL酸化能を抑制したが,LDL受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは無効であった。以上の結果から,LDL受容体やスカベンジャー受容体ではなく,LRPが細胞内12/15-リポキシゲナーゼによる細胞外のLDLの酸化に関与することが明らかになった。動脈硬化の発症・進展において,低比重リポ蛋白(LDL)の酸化が重要である。生体内ではLDLの酸化が単なる自動酸化ではなく,リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase, LOX)によって開始されることが示唆されている。私たちはこれまで,12/15-リポキシゲナーゼをマウスマクロファージ様J774A.1細胞に過剰発現させ,LDLの酸化修飾機構の解析を行ってきた。LDL酸化に関与する細胞膜受容体の関与を,特異的抗体やアンチセンスオリゴヌクレオチドによって解析したところ,LDL受容体やスカベンジャー受容体ではなく,LDL受容体関連蛋白(LRP)が細胞内12/15-リポキシゲナーゼによる細胞外のLDLの酸化に関与することが明らかになった。このマクロファージのLRPを介した12/15-リポキシゲナーゼによるLDL酸化機構を,蛍光色素DiIで標識したLDLを使って詳細に解析した。
悪性黒色腫細胞の増殖と転移に果たす各種プロテアーゼ及びインヒビターの役割について

(1)B_<16>アウスメラノーマ培養細胞に種々のプロテアーゼインヒビターを添加し腫瘍細胞の増殖と細胞内プロテアーゼの挙動を検索したところ、サイオールプロテアーゼインヒビターの中のロイペプチン,キモスタチン,アンチパインは、カテプシンB活性を抑制するどころか逆に産生を増加させることが示された。(2)繊維肉腫細胞を用いた実験でもロイペプチン添加によりカテプシンB及びヘモグロビンハイドロラーゼ活性が上昇することが観察された。(3)ケラチノサイド系の腫瘍魂を用い腫瘍の悪性度と種々のプロテアーゼ活性との相関を検討したところ悪性度の高いものほど、さらに未分化度が増すほど腫瘍細胞内のタイプI及びIVコラゲナーゼ活性が高値を示すことを報告した。(1)(3)の報告は腫瘍細胞自身のプロテアーゼ活性に着目したものであるが、さらにin vitroにおいて悪性腫瘍細胞と腫瘍構成成分との相互関係を各種プロテアーゼをアーカーとして検討した。(4)その結果、線維肉腫細胞は正常皮膚線維芽細胞内のカテプシンBおよびヘモグロビンハイドロラーゼの産生を賦活化する作用を有する低分子物質を産生、放出しておりその物質は熱やトリプシン処理に安定であることを報告した。(5)また逆に、線維肉腫細胞は周辺正常組織構成成分であるコラーゲンやフィブリンを培養溶液中に添加培養することにより、細胞内カテプシンB活性が上昇することを報告した。(4)(5)のような腫瘍細胞と間質構成成分及び細胞との相互関係について今後さらに検討を続けてゆきたい。(6)また、現在腫瘍組織におけるプロテアーゼインヒビターの抗体を用い、免疫組織学的に検討し興味ある結果を得つつある。〈昭和61年度研究実績〉1)【B_(16)】マウスメラノーマの【F_1】株,【F_(10)】株,BL6株の培養上清中及び細胞内の種々のプロテアーゼ活性を測定し、比較検討した。その結果、3者間にプロテアーゼ活性の有意な差は認められなかった(unpublished data)。これは我々の当初の予測とも,従来の1部プロテアーゼ測定による結果とも,相反するもので、意外な結果であった。その理由として、使用した【F_1】,【F_(10)】,BL6株がオリジナルな性質を喪失している可能性があり、現在検討中である。2)【B_(16)】,【F_(10)】マウスメラノーマ培養細胞に種々のプロテアーゼインヒビターを添加した場合の腫瘍細胞の増殖と腫瘍細胞内プロテアーゼの挙動について検索した(Nakao et al.,Comp.Biochem,Physiol)。特にカテプシンBとその阻害剤に焦点を絞ると阻害剤の1つである【E_(64)】は、カテプシンB産生を抑制したが、Dイペプチン,アンチパイン,キモスタチンは予想に反して、カテプシンB産生量を増加させるという興味ある現象を示した。これはプロテアーゼインヒビターを用いた腫瘍治療上、重要な点で、インヒビターを厳選すると奏効するが、反面いいかげんなものを使うとむしろ増殖を促すということを示唆するものである。3)摘出手術より得られた皮膚腫瘍塊(有棘細胞癌,基底細胞上皮腫,脂漏性角化症)をホモジナイズし、種々のプロテアーゼを測定して、細胞侵襲性,転移能との関連性について比較検討した(Tsuboi et al.J.Invest Dermatol submitted)。良性腫瘍の脂漏性角化症に比べ、悪性腫瘍の有棘細胞癌では、type【I】および【IV】コラゲナーゼ活性が有意に上昇しており、これらの酵素がコラーゲンを主とするタンパク性構築物を破壊するのに重要な役割を担っていることが推察された。〈今後の研究計画について〉

昭和61年度は順調に実験が進み、一部翌年度の実験も消化した。今後は新たに、線維芽細胞由来の腫瘍についても検討を加え、悪性黒色腫細胞のそれと比較してゆく予定である。2.手術標本で得られた皮膚腫瘍塊のプロテアーゼ活性を測定し悪性度の高いものほどコラゲナーゼ(タイプI,IV)活性が高いことを既に報告した(Tsuboi et al.,J.Invest,Dermutol.).現在,手術標本で得られた腫瘍塊からの細胞を培養しそのプロテナーゼ活性を検討中である.3.また,腫瘍細胞(線維肉腫細胞,メラノーマ細胞)と周辺正常構成成分(線維芽細胞,コラーゲン)との相互関係を検索し興味ある結果を得つつある. (栗田ら,日皮会誌,Kurita et al,J.Invest,Dermutol,submitted)<昭和63年度研究実績>これまでに(1)B_<16>マウスメラノーマ細胞の高転移株と低転移株を用い、また更に正常皮膚線維芽細胞とその悪性細胞である線維肉腫細胞を用いて、各種プロテアーゼインヒビターがこれら細胞のプロテアーゼ産生あるいは活性に及ぼす影響を比較検討してきた(Nakao et al.Int.J.Biochem,Comp.Biochem.Physiol,Kurita et al,Chin.Invest.Dermatol,submitted)。(2)また、ケラチノサイト由来の良性及び悪性皮膚腫瘍塊を用い種々のプロテアーゼ活性を比較検討し、悪性度の高いものほどタイプI及びIVコラゲナーゼ活性が高いことを報告してきた(Tsuboi lt al,J.Invest.Dermatol.)。(3)本年度は、in vitroにおいて腫瘍細胞(線維肉腫細胞とメラノーマ細胞)と腫瘍周辺の構成成分(線維芽細胞や細胞外マトリクス)との相互関係を各種プロテアーゼをマーカーとして検討してきた。その結果、線維肉腫細胞は、正常ヒフ線維芽細胞内のカテプシンB及びヘモブロビンハイドロラーゼの産生を賦活化せしめるような低分子物質を産生放出していることを報告した。またこの物質はメラノーマ細胞では認められなかった。(4)さらに、細胞外マトリクスが線維肉腫細胞の細胞内プロテアーゼに及ぼす影響を検討したところ、フィブリン、コラーゲンともに線維肉腫内カテプシンB活性を上昇させることが認められた。(栗田ら、日皮会誌)。このことは腫瘍細胞と間質正常成分及び正常細胞の相互関係の存在を示唆するものと思われる。さらに本年度は腫瘍細胞周辺の防御機構を検索するため皮膚悪性腫瘍塊のプロテアーゼインヒビターの局在を各種プロテアーゼインヒビターの抗体を用い、免疫、織学的に検討し興味ある結果を得つつある(矢口ら、日皮会誌、投稿中)。
再生研究・治療のための生体吸収性ハイドロゲル微粒子を含む機能増強細胞集合体の創製

細胞親和性の高いゼラチンハイドロゲル微粒子を内部に含むラット骨髄由来間葉系幹細胞からなる細胞集合体を調製した。ゼラチン微粒子を含むことにより、集合体内部の細胞の酸素、栄養状態がよくなり、微粒子を含まない場合に比べて、集合体内の生細胞数が有意に増加し、骨分化も促進された。本研究の目的は、細胞集合体を利用した細胞生物学研究を進めるための技術・方法論を開発することである。細胞を利用した創薬研究や再生医療のためには、細胞-細胞間相互作用をもつ細胞集合体の形成とそれを用いた研究が必要不可欠である。しかしながら、細胞集合体の内部への栄養、酸素の供給、老廃物の排泄が悪く、しばしば、細胞が死滅、機能低下し、研究の継続が難しくなることが問題となっている。この解決法として、本研究では、細胞増殖因子の徐放化ができ、しかも細胞親和性の高いゼラチンハイドロゲル微粒子を細胞集合体の内部に組み込むことを行った。ゼラチンを熱脱水架橋することによって、大きさの異なるハイドロゲル微粒子を作製した。これをラット骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)とともにポリビニルアルコールコーティングされた培養皿の上で培養した。その結果、微粒子を含むMSC集合体が得られた。細胞の好気的代謝の指標であるL-乳酸産生量/グルコース消費量比を測定したところ、微粒子を含むMSC集合体の値は、微粒子を含まない細胞集合体に比べて、有意に低下した。その値は酸素、栄養状態のよい平面培養した場合のMSCの値と同じレベルであった。このことは、微粒子と含むことにより集合体内部の細胞の酸素、栄養状態のよいことを示している。また、集合体内の生細胞数も微粒子を含ませることにより有意に増加した。加えて、微粒子サイズが集合体内部の細胞状態に影響することもわかった。発生学、細胞生物学、およびその応用としての細胞を利用した創薬研究や再生医療のためには、細胞-細胞間相互作用をもつ細胞集合体の形成とそれを用いた研究が必要不可欠である。この解決法として、本研究では、細胞増殖因子の徐放化ができ、しかも細胞親和性の高いハイドロゲル微粒子を細胞集合体の内部に組み込むことを行う。このことにより、細胞集合体の内部に物質透過の空間ができるとともに、細胞増殖因子の供給も可能となり、細胞の生物機能は増強される。前年度の結果をもとに、本年度は、細胞集合体内に生体吸収性の異なるゼラチン微粒子を含ませ、微粒子の吸収性が集合体内の細胞に与える影響について検討した。細胞としては、ラット骨髄由来の未分化間葉系幹細胞を用いた。微粒子の生体吸収性に関係なく、均一に微粒子が分散された細胞集合体が形成された。微粒子を含ませることによって、微粒子のない集合体に比べて、集合体内の細胞の増殖性を有意に高まった。しかしながら、生体吸収性の高い微粒子では、低いものに比較して、微粒子が速く吸収されることから、細胞の増殖性は低くなる傾向があった。細胞の好気的代謝の指標であるL-乳酸産生量/グルコース消費量比を測定したところ、微粒子を含む細胞集合体の値は、微粒子を含まない細胞集合体に比べて、有意に低下した。その値は酸素、栄養状態のよい平面培養した場合の細胞の値と同じレベルであった。このことは、粒子を組み込むことで、細胞集合体内部の酸素と栄養状態がよくなっていることを示している。細胞外マトリクスの分泌能や骨分化能を調べたところ、微粒子を含まない細胞集合体に比べて、微粒子を含む細胞集合体では有意に高まることがわかった。