hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロデータを用いた再分配政策の評価に関する研究

また、調査対象者の居住都市の自治体における債務返済比率が、受給確率に有意に負の影響をあたえることを確認した。これは、いわゆる「水際作戦」と言われる福祉事務所の行動の一部を説明している思われる。すなわち、財政状況がよくない自治体ほど、受給者をより選別してる可能性がある。また、健康と生活保護受給の関係をみた場合、身体的な健康状態も一定の影響を与えているが、それよりも精神的な健康状態の方が圧倒的に強い影響を与えていた。本年度は、次のふたつの研究に重点的に取り組んだ。まず、中高齢者を対象としたパネル調査である「くらしと健康の調査(JSTAR)」を用いて、東日本大震災前後において寄付行動にどのような変化が生じたかを明らかにするマイクロ実証分析である。本研究においては、各個人のフロー所得、資産、家族状況、健康状況、政治的志向、社会参加状況が寄付行動のインテンシブマージン、およびエクステンシブマージンにどのような影響を与えているのか、という点について分析を行ったが、特に、社会参加行動が寄付行動に及ぼす内生性を考慮して、HeckitモデルおよびIV-Heckitモデルを用いて分析を行った。これにより、得られた主要な結論は、(1)平時(非災害時)においては資産ストックの多寡が寄付行動に影響を与えるが、(2)災害時にはフロー所得の多寡が重要な決定要因となること、(3)各個人の主観的健康状態の悪化と政府の役割に対する志向の強さは寄付行動と金額に負の影響をあたえること、さらには、(4)内生性を考慮しても日常からの社会参加行動は寄付行動を強く促進すること、などである。第二に、企業活動基本調査(経済産業省)の個票データと健康保険組合連合会が公開している各健保組合の財政データをマッチングして、企業の健康保険料負担が、設備・研究開発・対外直接投資にどのような影響を与えているかを実証的に分析した。分析の結果、健康保険料負担の増加は、(1)企業の国内投資を一定程度抑制させた可能性がある、(2)研究開発投資には大きな影響は与えていない、(3)海外進出を行うかどうかの意思決定には影響を与えていないものの、既に海外進出を行っている企業の対外直接投資を増加させた可能性がある、といった結果が得られた。所属機関の移籍により、研究環境の整備に幾分の時間を要したため、研究の進展に遅れが生じた。また、分析に使用している「くらしと健康の調査」および「企業活動基本調査」の整理に、想定以上の作業量が生じ、それによっても分析の実施に遅れが生じた。今年度は、「くらしと健康の調査」の最新年度調査分についてクのリーニング作業が完了し、分析に利用可能となる予定であり、それにより既存の研究にもより改善が図られるものと考えられる。企業活動基本調査を用いた研究については、データの利用期間のうちに分析を完了させることができたため、学術雑誌への掲載へ向けて着実なステップを踏んでいるところである。最終年度は、(1)東日本大震災前後における寄付行動の決定要因の変容についての研究、(2)企業の社会保険料負担の増大が投資活動に与えた影響についての研究、の二点に関する研究のを推進した。東日本大震災の経験は、大規模災害からの復興リソースとして、政府による税財源の他に、民間からの自発的、分権的な寄付が重要であることを明確にした。
超臨界二酸化炭素中での高分子被覆酵素の特異反応の評価と熱量学モデルの開発

本研究では、超臨界二酸化炭素中での高分子被覆酵素の特異反応の評価および熱力学モデルの開発について検討した。その結果、超臨界二酸化炭素を利用して高分子で酵素をマイクロコーティングする技術を確立した。また、基礎的な知見となる超臨界二酸化炭素と極性有機溶媒に対する高分子の溶解度を測定した。得られた溶解度データを用いて、超臨界二酸化炭素と極性溶媒に対する高分子の溶解度を予測する熱力学モデルを開発した。さらに得られた高分子被覆した酵素を用いて、ラクトンを原料とすることで超臨界二酸化炭素中で生分解性高分子を重合することができた。得られた高分子の分子量および分子量分布は、超臨界二酸化炭素の操作圧力を制御することでコントロールできた。特に超臨界二酸化炭素中で重合した高分子は、極めて狭い分子量分布を有することがわかった。また、同様にペプチド合成に関しても高分子被覆酵素を用いることにより、超臨界二酸化炭素中にてペプチド合成を行うことができた。超臨界二酸化炭素中での高分子被覆酵素の特異反応をペプチド・タンパク質・生体関連高分子の製造に適用し、環境に優しいバイオ関連物質製造技術の開発について検討した。特に、平成10年度は、超臨界二酸化炭素中における酵素と基質の反応におよぼす周囲の高分子・低分子物質の相互作用と溶解挙動を予測する分子熱力学モデルを提案するために、微粒子コーティング技術を用いて種々の高分子で酵素・タンパク質をコーティングし、超臨界二酸化炭素中での溶解、反応挙動について検討した。その結果、超臨界流体のコソルベンシーを用いることで、超臨界二酸化炭素中に特異的に高分子を溶解する技術を開発し、この技術を用いることで酵素を特異的に被覆した。
腎細胞癌に対するテーラーメイド癌ワクチン療法の開発

腎細胞癌に対する新規ペプチドワクチン(5種類のターゲット分子)の開発に着手し、一部の新規ペプチド(EPORxx)を同定した。現在特許申請準備中である。また、以前に開発したVEGFR1ペプチドワクチンを用いた第1/2相臨床試験を18人の患者に対し施行し、安全性と有効性について示した。研究目的であるHLA-A拘束性の各種ペプチド(CA9, PDL, HIF-1α, EPOR, VEGFR)を98%の純度で約60種類(各510mg)とコントロールペプチド(HLA-A24, A2, A3用)を外注し合成した。本研究は、腎細胞癌担癌患者の血液サンプルが必要となるため、近畿大学医学部倫理委員会に研究内容を提出し、本学倫理委員会承認のもと各HLAタイプの腎細胞癌担癌患者30人に研究内容について説明し(インフォームドコンセント)同意を得た上で、免疫CTL反応検査用血液サンプル30mlを採血し、比重遠心分離法によりPBMC分画をセルバンカーと共に-80°Cで保存した。始めにCTL反応検査であるIFN-y releaseアッセイの標準化を目的として、共同研究者である島根大学医学部免疫学教室(責任者:原田守)と同時進行にて健康成人血液サンプルを用いたCTLアッセイの標準化をnegativeコントロールとしてHIV, PositiveコントロールとしてEBV, Fluを用いて行った。今回、HLA-A3ファミリーに対するペプチド発現用培養細胞が確立されていなかったため、各HLA-A3,ファミリーのプラスミドを用いてCIR細胞に遺伝子導入し、発現細胞を再度確立した。次に、スクリーニングの効率化を計るため、PDLとHIF-1αを島根大学医学部にてその他の分子については近畿大学医学部でCTLアッセイを行うこととし、各ペプチドを分注して配布した。次年度は、2大学で保存している腎細胞癌患者PBMCを用いて各分子10種類のペプチドより2-3種類に絞り込むことを目的としてCTLアッセイを行う。23年度は健康成人および腎細胞癌担癌患者から採取した抹消つンパ球を用いて、22年度に作成した5種類の抗原蛋白に対するMHCクラスIペプチド44種類のワクチン候補ペプチドを絞り込むための、CTLスクリーニングアッセイ(IFN-γreleasing assay)を、近畿大学医学部と共同研究施設である島根大学医学部免疫学教室で同じアッセイ系を用いて同時に行った。現在のところ、CA9、VEGFR、HIF-1の3種類についてある程度の絞り込みを行ったが、PDL、EPORについては、反応性が高く再度アッセイ系の見直しを行っている。おそらくEPORについては、正常細胞にも広く発現しており、腎癌特異性が乏しい場合には異なる分子としてCTLA4やIGFRを再度スクリーニングする必要性が示唆された。このことから新たなペプチドを合成し、スクリーニングを開始した。また、患者サンプルに同抗原の各ペプチドな対する反応性のばらつきがみられたことから、当初予定していた各抗原から1種類のみのペプチド選択は、効果の面で妥当ではない可能性も示唆された。それゆえ、マルチペプシドワクチンの概念から、6-10種類のペプチドを同時に混和したものを最終的に調整すべきではないかと思われた。また、どのコンビネーションのペプチドがワクチンとして最も有用であるかについては、多くの日本人由来の腎細胞癌培養細胞株が必要と思われ、本邦で確立された腎癌細胞株6種類を、各大学(京都大、大阪大、大分大、慶応大、香川大)の協力のもと提供していただき、各細胞株の抗原発現などの特徴についてスクリーニングしたうえで、CTL検査の標的細胞として使用する予定である。腎細胞癌、担癌患者より約30mlの採血をお願いして、患者リンパ球を用いたCTLアッセイを行っているため、頻回に血液サンプルを得られるわけでなく、患者血液サンプルの取得に苦慮している。24年度が最終年度であるため、記入しない。最も重要なポイントは、CTLアッセイ用の血液サンプルを患者より効率的に提供いただくことであり、より多くの腎癌患者にお願いすることで鋭意努力する。
遺伝難病である多発性嚢胞腎の治療や予後に評価するバイオマーカーの探索研究

常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)は進行性疾患であり、加齢とともに腎嚢胞および腎容積は直線的に増大する。しかし、40歳代前後まで多くの場合は腎機能が保たれていても腎容積は増加し、ADPKDの病勢としては進行していく。したがって血清クレアチニンや推定GFRなどの腎機能評価より、ADPKDの治療効果の評価や予後予測、病勢を適切に反映するバイオマーカーの必要性が、従来よりも極めて重要です。多発性嚢胞腎患者の治療効果や予後に関連するバイオマーカーを探索するため、Tolvaptanで治療を受けている2名の多発性嚢胞腎患者さんから同意を得て、2014年8月から2016年7月までに毎月1回採血し、採集した検体を室温3,000gにて10分間遠心し、上清を2mlチューブに分注し実験するまでに-30°Cにて保存する。1名20検体の全部で40検体からターゲット蛋白Endothelin-1, Kidney injury molecular 1の発現を酵素免疫測定法(ELISA)にて解析しました。
極低周波変動磁界曝露による副腎皮質ホルモン分泌刺激作用の網羅的検討

交流電源の送電線や家庭用電気機器から放出される50Hzないしは60Hzの周波数を持つ磁界である「極低周波変動磁界」が副腎皮質に対し直接ホルモン分泌を誘導する刺激作用を持つかどうかについてマウス培養細胞を用いて検討を行った。その結果、副腎皮質細胞は直接ELF-MFより副腎ステロイドホルモンの分泌を刺激されることが明らかとなり、そのメカニズムは細胞内のホスホジエステラーゼという酵素の活性抑制が関与することが示された。ただし同様に行ったヒト培養細胞を用いた実験ではその効果は軽微であった。まず、極低周波変動磁界(ELF-MF)の曝露によるマウス副腎皮質由来細胞株であるY-1細胞における副腎皮質ホルモン分泌刺激作用の曝露時間に対する依存性を明らかにするために、6時間、12時間、24時間および48時間曝露での副腎皮質ホルモン分泌量変化について検討したところ、24時間および48時間曝露によりコルチコステロン、アルドステロン分泌量はELF-MF曝露群において有意に増大した。さらにY-1細胞の副腎皮質ホルモン合成酵素群発現量の定量を行ったところ、ステロイド合成の律速酵素であるCyp11a1の有意な増大が示された。この副腎皮質ホルモン分泌増強のメカニズムを探るためにDNAマイクロアレイ解析を行った結果、ELF-MF曝露によりGタンパク共役型受容体(GPCR)の発現に有意な変化が示された。GPCRの下流にあり、ステロイドホルモン合成の誘導に関わるとされる細胞内の環状アデノシン一リン酸(cAMP)濃度も1時間、6時間、および24時間のELF-MF曝露により有意に増大し、cAMPの増加によりリン酸化が進む転写因子であるcAMP応答配列結合タンパク(CREB)のリン酸化も24時間ELF-MF曝露により有意に増大したことから、ELF-MF曝露による副腎皮質ホルモン分泌刺激作用のメカニズムとしてELF-MF刺激による細胞内cAMPの増加が関与していることが示唆された。加えてこれらのELF-MF曝露による副腎皮質ホルモン分泌刺激作用がヒトにおいても起こりうるかについて基礎的な知見を得るために、ヒト副腎皮質由来細胞株であるH295R細胞に同様のELF-MF曝露実験を行った結果、12時間、24時間のELF-MF曝露によりアルドステロン分泌の有意な増加が認められた。この結果から、ヒトにおいてもELF-MF曝露による副腎皮質ホルモン分泌刺激作用が起こりうる可能性が推察された。平成26年度の研究として、特に「慢性極低周波変動磁界(ELF-MF)曝露による副腎皮質ホルモン分泌刺激作用メカニズムの検討」および「慢性ELF-MF曝露による副腎皮質ホルモン分泌刺激作用の磁界強度依存性の検討」について検討を進めた。昨年度までの結果として、マウス副腎皮質由来細胞株であるY-1細胞においてELF-MF曝露が細胞内の環状アデノシン一リン酸(cAMP)濃度上昇を誘導することで副腎皮質ホルモン分泌を刺激することが示された。細胞内cAMP濃度は、合成酵素であるアデニル酸シクラーゼ(AC)活性と、分解酵素であるホスホジエステラーゼ(PDE)活性の比によって決定される。そこでACを活性化させるGタンパク質Gsαサブユニットの拮抗薬であるNF449の投与がELF-MF曝露によるcAMP濃度上昇を抑制させるか、およびELF-MF曝露によりPDE活性が変化するかについて明らかにすることで、ELF-MF曝露による細胞内cAMP濃度上昇のメカニズムについて検討を行った。結果として、NF449の投与により細胞内cAMP濃度は有意に減少した。しかし、疑似曝露群とELF-MF曝露群間の細胞内cAMP濃度差は有意にELF-MF曝露群が高いままで維持されていた。一方、PDE活性はELF-MF曝露による有意な減少が認められた。以上より、ELF-MF曝露による細胞内cAMP濃度上昇は、PDE活性の抑制によるものであることが示唆された。またELF-MF曝露影響の磁界強度依存性について、0.253mTの磁界強度において24時間のELF-MF曝露を行いコルチコステロン濃度を検討したところ、コルチコステロン濃度の上昇は0.5mT以上の曝磁群において認められた。このことから、ELF-MF曝露による副腎皮質ホルモン分泌刺激作用は少なくとも0.5mT以上の磁界強度において現れることが示唆された。平成26年度の研究計画として「慢性ELF-MF曝露による副腎皮質ホルモン分泌刺激作用メカニズムの検討」および「慢性ELF-MF曝露による副腎皮質ホルモン分泌刺激作用の磁界強度依存性の検討」を挙げていた。この2つの研究計画について当該年度において順調に研究を進めることができ、それぞれの計画についてある程度の結論を得ることができたと考えている。これらの理由により、本研究はおおむね順調に進展していると評価する。環境生理学今後の研究計画として、予定されている研究計画である「慢性ELF-MF曝露影響の細胞特異性の検討」について進めるとともに、これまでの研究内容をまとめ成果論文として発表することを推進する予定である。

当該年度の研究計画として、「慢性ELF-MF曝露による副腎皮質ホルモン分泌作用の磁界強度および曝露時間依存性の検討」および「慢性ELF-MF曝露による副腎皮質ホルモン分泌作用に関わる遺伝子発現変化の解明」を挙げていた。磁界強度の依存性については本年度は行っていないが、それ以外の内容については遂行することができ、さらに次年度以降の研究計画に挙げていた「慢性ELF-MF曝露による副腎皮質ホルモン分泌刺激作用メカニズムの検討」および「ヒト由来副腎皮質細胞株に対する慢性ELF-MF曝露による影響の検討」についても、研究を進めることができた。これらの理由より、研究計画当初の計画以上に進展していると評価する。未使用額13,080円については、第92回日本生理学会参加費(H27年3月21日23日)として使用したが、支払いが完了していないため。今後の研究計画として、本年度遂行していない「慢性ELF-MF曝露による副腎皮質ホルモン分泌作用の磁界強度依存性の検討」を行うとともに、「慢性ELF-MF曝露による副腎皮質ホルモン分泌刺激作用メカニズムの検討」についてより詳細な検討を進めたい。加えて、次年度以降の研究計画に予定されている「慢性ELF-MF曝露影響の細胞特異性の検討」についても研究を進める予定である。第92回日本生理学会参加費は、4月に支払い予定である。
磁場の創傷治癒への影響

(1)皮膚微小循環血流への影響ラット背部に永久磁石を作用させサーモグラフィーを用い皮膚温度およびレーザーマップを用い皮膚表面血流量の変化を観察した.実験群はコントロール群,1800ガウス作用群とした.各群5匹のWister種ラットを用いた。コントロール群と1800ガウス作用群間では表面皮膚温度および皮膚表面血流量において統計的有意差をもって上昇を認めた。(2)創傷治癒への影響(1)肉芽形成モデルSD種ラット背部に直径24mmの皮膚全層欠損創を作成.創部収縮防止にringを装着し,各10匹のコントロール群およびプロスタンディン投与群(2μg/日),プレドニン投与群(1mg/日)につき肉芽組織の質的評価を試みた。肉芽組織を1週,10日,2週,3週,4週において各2匹4個所ずつより採取して,抗コラーゲンタイプI・III抗体および抗PCN抗体を一次抗体として用い免疫組織学的染色により組織の状態を観察した。(2)磁場作用群との比較SD種ラット背部に直径24mmの皮膚全層欠損創を作成.創部収縮防止にringを装着し,各2匹のコントロール群(CEZ0.5mg/日)およびプロスタンディン投与群(CEZ0.5mg/日+PGE_12μg/日),プレドニン投与群(CEZ0.5mg/日+PSL1mg/日),プロスタンデヂィン・プレドニン投与群(CEZ0.5mg/日+PGE_12μg/日+PSL1mg/日),磁石作用群(CEZ0.5mg/日+1800ガウス作用)につき肉芽組織の質的評価を試みた。肉芽組織を3週において各2匹4個所ずつより採取して,抗コラーゲンタイプI・III抗体および抗PCNA抗体を一次抗体として用い免疫組織学的染色により組織の状態を観察した。
環境に優しい新規な無機顔料の開発

人体や環境に悪影響を及ぼさない元素のみから構成される新しい無機顔料の開発を目指し、セリウム、ジルコニウム、アルミニウム、ケイ素、ビスマス、酸素の中から、いくつかの元素を組み合わせた複合酸化物を合成した。本研究で合成した試料はいずれも鮮やかな黄色を呈した。組成を最適化した顔料の色座標を調べ、黄色の着色力を定量的に評価したところ、市販の優環境型顔料を凌ぐ大きな黄色度を有していることが明らかとなった。従来用いられている黄色無機顔料には黄鉛(PbCrO_4)、カドミウムイエロー(CdS)、ニッケルチタンイエロー(TiO_2-NiO-Sb_2O_3)、バナジン酸ビスマス(BiVO_4)などがあるが、これらは有害な元素を含んでいるため、無害な元素のみからなる代替顔料の開発が求められている。本研究では、一般塗料やトラフィック用塗料などで大きな需要がある黄色無機顔料について、鮮やかな色を示し、かつ有害元素を含まない新規な優環境型の黄色顔料の開発を目指した。基本的な設計指針としては、Ce_4f-O_2p軌道間の電荷移動吸収により淡黄色となるCeO_2-ZrO_2およびCeO_2-SiO_2複合酸化物を母体として選択し、その格子内にBi^3+を固溶させ、O_2p軌道とBi_6sの混成軌道を形成させることにより黄色の着色を強めることを目的とした。CeO_2-ZrO_2-Bi_20_3複合酸化物については、Ce(NO_3)_3、ZrO(NO_3)_2、Bi(NO_3)_3、クエン酸の水溶液を化学量論比で混合後、溶媒を留去してゲル化させ、大気中1000°Cで1時間焼成して試料を得た。一方CeO_2-SiO_2-Bi_2O_3複合酸化物については、Ce(NO_3)3、Bi(NO_3)_3の各水溶液とテトラエトキシシラン(TEOS)のエタノール溶液を化学量論比で混合後、アルカリ触媒によってゲル化させ、大気中750°Cで1時間焼成し試料とした。合成した各複合酸化物の色座標を調べたところ、本研究で合成した試料はいずれも良好な色彩を呈しており、最大の黄色度を示したCe_<0.35>Si_<0.33>Bi_<0.32>O_<1.84>は市販品プラセオジム黄よりも大きな黄色度を示した。Ce_<0.35>Si_<0.33>Bi_<0.32>O_<1.84>の可視光吸収領域は他の顔料と比べてより長波長側にまで及んでいるため、黄色の補色である青色光をより効果的に吸収できる。その結果、市販品を超える大きな黄色度が得られたと考えられる。黄色無機顔料はプラスチックの色味の調整や、道路のセンターラインなどのトラフィック用顔料として用いられるため、特に需要が大きいことで知られている。しかしながら、現在、工業的規模で用いられている黄色無機顔料である黄鉛(PbCrO_4)、カドミウムイエロー(CdS)、ニッケルチタンイエロー(TiO_2-NiO-Sb_2O_3)などには、有害な元素(Pb, Cr, Cd, Ni及びSb)が含まれているため、構成元素として有害な元素を含まない無害な代替顔料の開発が求められていた。本研究では、Ce_<4f>-O_<2p>軌道間の電荷移動吸収により淡黄色となるCeO_2-SiO_2複合酸化物を母体として選択し、その格子内にBi^<3+>とAl^<3+>を固溶させ、黄色の着色と耐熱性を併せ持つ新規な環境調和型黄色無機顔料を開発した。本研究で合成した試料はいずれも鮮やかな黄色を呈することがわかった。なかでも、複合酸化物の組成がCe_<0.35>Si_<0.24>Bi_<0.32>Al_<0.09>O_<1.795>のときに、波長435480nmの青色に相当する可視光を極めてよく吸収することが明らかとなった。青色と黄色は補色の関係にあるので、この新顔料は鮮やかな黄色を呈すると考えられる。この試料の黄色度を色彩色差計にて評価したところ、市販の環境調和型黄色顔料であるプラセオジム黄よりも大きな黄色度を示した。なかでも、850°Cで焼成した試料が青色光を最も効率よく吸収することがわかった。赤外吸収スペクトル測定の結果より、この試料において、BiO_6ユニットのBi-O振動に帰属される吸収(約850cm^<-1>)が最も大きく、Bi6s軌道とO2p軌道の混成軌道形成の効果が最大となることが明らかとなった。これが黄色の着色が大きくなる原因であることがわかった。さらに、Ce_<0.35>Si_<0.24>Bi_<0.32>Al_<0.09>O_<1.795
減数分裂誘導因子の研究

(1)セルトリ細胞と精原細胞との相互作用:生体内でのホルモン等の影響をできるだけ除くため、精原細胞ステージの精巣を-FSHの条件で3日間培養した後、精巣を解離し、メトリザマイドの密度勾配遠心によって精原細胞と体細胞(主にセルトリ細胞)を分離し、精原細胞のみ、あるいは、精原細胞とセルトリ細胞を混ぜたものを旋回培養し、〔^3H〕チミジンを20時間取り込ませて、取り込まれた放射能量を測定した。その結果、精原細胞のみでは±FSHによる差がほとんどないが、セルトリ細胞を混ぜると+FSHでの取り込みが顕著に増加した。LH(luteinizing hormone)はほとんど影響がなかった。また、精母細胞ステージの精巣を解離して生殖細胞と体細胞を分離し、〔^<125>1〕ヒツジFSHの結合を調べたところ、体細胞に結合することが明らかになった。これらの結果より、FSHはセルトリ細胞に結合し、活性化されたセルトリ細胞が精原細胞に働いてDNA合成を開始させることが強く示唆された。(2)immunoldifferential screeningによる第一精母細胞特異的に発現する遺伝子の分離:精原細胞ステージの精巣と精母細胞ステージの精巣をそれぞれ抗原としてウサギに免疫し、得られたそれぞれの抗血清を用いて、精母細胞ステージの精巣から抽出したmRNAをもとにlambdagt11で作成したcDNAライブラリーをスクリーニングした。その結果、(a)減数分裂の開始と共にmRNA量が増加するクローンを2つ、(b)mRNA量が減少するクローンを2つ、得た。塩基配列のホモロジー検索の結果から、(a)のcDNAの1つは、ウシのannexin5と約70%、他の1つはラットのglutatione S-transferaseと約70%、(b)のcDNAはヒトのhnRNA構成タンパク質と約60%の相同性がみられた。このうち、annexin5は、細胞内情報伝達に関わるカルシウム結合タンパク質であるannexinfamilyの1つであり、イモリannexinをコードしていると考えられる。
ビデオ画像処理による近見反応の連続測定とその眼科臨床への応用

近見反応三要素を同時に測定する機械を開発し,これを眼科臨床に応用することを目的とした.装置の原理としては画像解析法を使用した.輻輳機能の異常は,核上性の器質的異常による輻輳麻痺のみならず,屈折や調節機能と関連した輻輳不全,調節性内斜視などのAC/A異常が良く知られている.これらの輻輳機能は,臨床的にはプリズムカバーテスト(PCT)や自覚的検査を利用した眼位の測定により調べられているが原理的に装置上の問題があった.前眼部の赤外線画像から瞳孔中心,瞳孔径,角膜反射像位置を解析し,さらにナイフエッジ法を利用して眼底からの反射像から調節を求める予定であった.このうち,瞳孔径,角膜反射像位置の解析は画像取り込みボードとパーソナルコンピュータで実現できた.両眼の前眼部とプルキン工像をTVカメラにより同時に捕捉し,瞳孔中心と角膜反射像の位置関係から画像解析により両眼眼球運動を連続的に計測する装置を作成した.残るナイフエッジ法を利用した調節の測定は,眼球光学系の収差の影響か,理論どおりには解析が困難であった.そのため,スタティックな測定になってしまうが,トプコン製のビデオレフラクションユニットを利用した.これらの装置により,一点固視状態での輻輳・調節・瞳孔の動揺を各視距離にて,両眼同時に調べた.このために,片眼の視覚刺激を遮断しつつ,測定光を透過させる赤外フィルターと赤外反射可視透過のダイクロイックミラーを用いた視標提示装置を用意した.つぎに近見負荷を与えた後,近見反応が消滅するのにどのくらい時間がかかるかを測定した.この結果,本装置は近見反応の基礎的なデータであるAC/AS・AC/ARの他覚的測定とその臨床応用,近見負荷の調節に及ぼす影響の測定,輻輳順応の測定とその臨床応用等の用途に十分な機能を持つことがわかった.近見反応三要素を同時に測定する機械を開発し,これを眼科臨床に応用することを目的とした.装置の原理としては画像解析法を使用した.輻輳機能の異常は,核上性の器質的異常による輻輳麻痺のみならず,屈折や調節機能と関連した輻輳不全,調節性内斜視などのAC/A異常が良く知られている.これらの輻輳機能は,臨床的にはプリズムカバーテスト(PCT)や自覚的検査を利用した眼位の測定により調べられているが原理的に装置上の問題があった.前眼部の赤外線画像から瞳孔中心,瞳孔径,角膜反射像位置を解析し,さらにナイフエッジ法を利用して眼底からの反射像から調節を求める予定であった.このうち,瞳孔径,角膜反射像位置の解析は画像取り込みボードとパーソナルコンピュータで実現できた.両眼の前眼部とプルキン工像をTVカメラにより同時に捕捉し,瞳孔中心と角膜反射像の位置関係から画像解析により両眼眼球運動を連続的に計測する装置を作成した.残るナイフエッジ法を利用した調節の測定は,眼球光学系の収差の影響か,理論どおりには解析が困難であった.そのため,スタティックな測定になってしまうが,トプコン製のビデオレフラクションユニットを利用した.これらの装置により,一点固視状態での輻輳・調節・瞳孔の動揺を各視距離にて,両眼同時に調べた.このために,片眼の視覚刺激を遮断しつつ,測定光を透過させる赤外フィルターと赤外反射可視透過のダイクロイックミラーを用いた視標提示装置を用意した.つぎに近見負荷を与えた後,近見反応が消滅するのにどのくらい時間がかかるかを測定した.この結果,本装置は近見反応の基礎的なデータであるAC/AS・AC/ARの他覚的測定とその臨床応用,近見負荷の調節に及ぼす影響の測定,輻輳順応の測定とその臨床応用等の用途に十分な機能を持つことがわかった.
コーカサス地方における初期家畜の由来と飼育行動を探る考古科学研究

【研究項目「家畜の由来」】古代DNA解析は、高橋遼平(分担者)と安達登(連携者)が所属する山梨大学の古代DNA専用の実験室で行った。標本数の多い家畜ヤギとヒツジに焦点を当て、昨年度までに用意したプライマーを用いて、古代ヤギとヒツジの骨サンプルからミトコンドリアDNAの増幅を行った。系統研究がより蓄積しているヤギについては、増幅されたミトコンドリアDNAの系統解析を行った。その結果、これまでの見込みとおよそ矛盾しない結果が得られ、コーカサスの初期家畜ヤギが外来であることを示すデータを補強した。タンパク質化学の分析は、中沢隆(分担者)が所属する奈良女子大学の実験室で行った。ヤギとヒツジを区別するアミノ酸配列の部位を昨年度までに明らかにした結果を基に、古代ヤギとヒツジの骨の分析を進めた。これまでに15点の標本を分析し、ヤギとヒツジの同定を行った。その結果、骨の形態による同定と矛盾しない結果が得られた。また骨の形態では区別できない標本でもアミノ酸配列からヤギとヒツジを区別することができた。この研究は、奈良女子大学の学士課程教育の一環としても行われ、その成果が卒業論文に至った。【研究項目「家畜の飼育」】古代家畜の歯エナメル質の酸素・炭素安定同位体分析を本格的に開始し、200点以上の古代サンプルの分析を行った。対象とした家畜はヤギとヒツジに加えて、ウシとブタも含む。ヤギ・ヒツジ・ウシからは酸素・炭素同位体比の季節的な変動パターンを示す良好な結果が得られた。その解析も進めた結果、高地と低地のあいだの季節的な移動の可能性がヤギとウシの一部に認められた。また、一部の家畜については酸素の安定同位体分析が示す季節変動に対して炭素同位体比の変動があまりみられないパターンも明らかになった。この研究は、名古屋大学環境学研究科の博士課程教育の一環としても行っている。研究項目2つ(「家畜の由来」と「家畜の飼育」)に関わる分析を予定通りに実施することができた。今年度特に進展があったのは安定同位体分析である。昨年度までに名古屋大学博物館(代表者の所属)において整えた実験環境において、今年度200点以上の古代サンプルを処理し、分析結果を得ることができた。その結果は、家畜の飼育行動に関して、研究以前は予想しなかった新たな知見を与えてくれた。家畜の由来についても、古代DNAの分析結果を増加することができ、家畜ヤギの外来説を補強するデータを蓄積できた。タンパク質分析による動物種の同定分析も着実に進行しており、骨の形態による同定結果に照らし合わせ、それを追認するだけでなく補完することができた。この研究に関わった学部学生が興味を深め、大学院へ進学した。また、論文や学会での成果発表も行うことができた。これらの点から、本研究は順調に進行していると考えられる。【研究項目「家畜の由来」】古代DNA分析については、研究分担者の高橋遼平氏と協力し、昨年度に開始した古代ヤギとヒツジの分析を継続する。昨年まではギョイテペ遺跡からの標本を中心に分析を進めたが、今年はさらに古い農耕村落(コーカサス地域最古)のハッジ・エラムハンル遺跡からの標本の分析も行う。このようにサンプルを増加させ、昨年得られた系統解析の結果を確認する。タンパク質分析については、これまでヤギとヒツジの同定基準を確立し、古代骨の分析サンプルを増加させた。その結果、骨の形態ではヤギかヒツジか区別が難しい標本についても区別を正確に行うことができる見通しが立ち、今年はそのサンプル数をさらに増加させる予定である。それによって、ヒツジとヤギの頻度の違いを明らかにすることを目的にしている。現在のところ、家畜ヤギの起源は外来で、アナトリア方面からコーカサスに持ち込まれたと考えられるが、持ち込まれた当初は数が少なく、次第に増加していくことを示すデータを積み上げることが今年度の目標である。【研究項目「家畜の飼育」】昨年度、古代家畜の歯エナメル質の炭素・酸素安定同位体分析を本格的に開始し、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタのデータを積み上げた。その結果、一部の家畜のみを季節的に移動している可能性が示された。今年度はさらにサンプル数を増加させ、昨年度得られた結果を補強・検討する予定である。比較標本として、現生ヤギのみを用いていたが、今年度はウシとヒツジも増加させる予定である。それにより、古代家畜のデータの解釈を補強することができる。また今年度は、ストロンチウム安定同位体の分析も行い、動物の移動に関するデータとその解釈を補強する。ストロンチウム安定同位体の分析は、比較データとして調査地域における標高が異なる各地の土壌サンプルを既に採取している。【研究項目「家畜の由来」】名古屋大学(代表の門脇誠二の所属)と東京大学(連携者の西秋良宏の所属)に収蔵されている骨標本を用いて、古代DNAとタンパク質化学の分析を開始した。古代DNA解析は、高橋遼平(分担者)と安達登(連携者)が所属する山梨大学の古代DNA専用の実験室で行った。ヤギのDNAを増幅するためのプライマーが目的通りに反応するかどうかについて、現生標本を用いた実験を繰り返した結果、プライマーの挙動を確認することができた。その結果、ヤギに特有なアミノ酸配列を検出することに成功した。

この研究は、奈良女子大学の修士課程教育の一環としても行われ、その成果が修士論文に至った。【研究項目「家畜の飼育」】古代ヤギの歯エナメル質の安定同位体分析を行う準備として、現生ヤギの歯標本を用いて安定同位体比の分析を行った。その結果、第2大臼歯と第3大臼歯の成長に伴って、炭素と酸素の安定同位体比が変動することが確かめられた。この研究は、名古屋大学環境学研究科の博士課程教育の一環としても行っており、その大学院生にはアゼルバイジャンの調査にも参加してもらい研究指導を行った。また、家畜の移牧を示唆する証拠として建築物や居住行動に関する研究も進めた。具体的には、建築物が使用された期間を放射性炭素年代と層序のデータを組み合わせて計算した。その成果をQuaternaryInternational誌に発表した。また、放射性炭素年代測定の新たな方法を試みる研究にも試料を提供し、その成果は名古屋大学環境学研究科の卒業論文として提出された。海外調査による研究標本の収集、および研究項目2つ(「家畜の由来」と「家畜の飼育」)に関わる分析を予定通りに実施することができた。古代DNA分析とタンパク質分析に関しては、すでに実験環境が整っている分担者の機関において進められたため、順調な成果を得ることができた。安定同位体分析についても、名古屋大学博物館において実験環境を整えることに成功し、予備的な分析を始めると共に、来年度から多くのサンプルを処理する見込みを得ることができた。また、居住行動に関する遺跡の分析や、家畜に伴って西アジアで普及した穀物栽培に関わる道具(鎌刃)に関する分析も進めることができ、これらについては国際誌に論文を発表した。これらの点から、本研究は順調に進行していると考えられる。【研究項目「家畜の由来」】古代DNA解析は、高橋遼平(分担者)と安達登(連携者)が所属する山梨大学の古代DNA専用の実験室で行った。標本数の多い家畜ヤギとヒツジに焦点を当て、昨年度までに用意したプライマーを用いて、古代ヤギとヒツジの骨サンプルからミトコンドリアDNAの増幅を行った。系統研究がより蓄積しているヤギについては、増幅されたミトコンドリアDNAの系統解析を行った。その結果、これまでの見込みとおよそ矛盾しない結果が得られ、コーカサスの初期家畜ヤギが外来であることを示すデータを補強した。タンパク質化学の分析は、中沢隆(分担者)が所属する奈良女子大学の実験室で行った。ヤギとヒツジを区別するアミノ酸配列の部位を昨年度までに明らかにした結果を基に、古代ヤギとヒツジの骨の分析を進めた。これまでに15点の標本を分析し、ヤギとヒツジの同定を行った。その結果、骨の形態による同定と矛盾しない結果が得られた。また骨の形態では区別できない標本でもアミノ酸配列からヤギとヒツジを区別することができた。この研究は、奈良女子大学の学士課程教育の一環としても行われ、その成果が卒業論文に至った。【研究項目「家畜の飼育」】古代家畜の歯エナメル質の酸素・炭素安定同位体分析を本格的に開始し、200点以上の古代サンプルの分析を行った。対象とした家畜はヤギとヒツジに加えて、ウシとブタも含む。
乳牛における増乳効果を有する飼料中機能性成分の探索とその飼養技術の応用開発

催乳効果を有する機能性飼料を開発するために、ミルク分泌が完全に停止する乾乳期の乳腺組織においてエンドセリン受容体の遺伝子発現が有意に増大することを昨年度までに解明した。そこで、最終年度の本年度は、実際に反芻動物に対してルテオリン(エンドセリン合成・放出阻害効果を有する機能性ポリフェノール;B.B.B発表済み)を給与した時の、エンドセリン産生部位におけるエンドセリン遺伝子発現量を検討した。あらかじめ、第一胃にフィステルを装着させた乾乳期の雌ヒツジ10頭(平均体重94.Okg)を用いた。処理区5頭には、0.1%ルテオリン含量の市販食用シソエキスを一日21g(ルテオリンとして21mg)を第一胃内へ注入した。注入は朝の給餌時の直前に行なった。給餌は対照区5頭、処理区5頭ともにグラスサイレージを自由採食とした。同一飼育管理下で2週間飼育した後に、安楽死による試験屠殺をして、肺動脈と心臓の2部位を摘出した。摘出臓器からフェノール・クロロホルム法にて総RNAを抽出し、さらに逆転写反応にてcDNAを合成し、リアルタイムPCR法にてエンドセリンおよび受容体の遺伝子発現を測定した。その結果、各臓器における遺伝子発現は変動しなかった。マウスによる予備実験では、ルテオリンの胃内注入によりエンドセリン阻害効果が示されたが、本ヒツジ実験では遺伝子発現抑制効果などは示されなかった。その原因として、ルテオリンが第一胃内微生物に代謝され、効果を発揮する充分量のルテオリンが吸収されなかったのかもしれない。今後の課題として、血中濃度を現在検討中であり、その結果次第では、第一胃をパイパスさせて、小腸以降で吸収させた方がルテオリンの効果が期待できるかもしれない。エンドセリン作用系を抑制する飼料由来成分を探索し、その因子を含む飼料を給与させることで、乳腺退行を遅らせて泌乳量を増大させる飼養管理技術を開発するために、初年度は、乳腺上皮細胞の培養系確立と乳腺組織におけるエンドセリン作用系の有無を確認した。健常なウシの初乳(分娩後3日以内)と常乳500mLから1.065,1.070,1.080の密度勾配を形成したパーコール密度勾配法にて上皮細胞に富んだ細胞群を回収することとした。その結果、健常なウシの常乳中から接着能および増殖能が有する細胞は回収できなかった。また、初乳中の比重1.065以上の軽い細胞はシャーレに接着しなかった。1.070-1.080の範囲の細胞にはシャーレに接着する細胞が認められたが、増殖しなかった。この結果から、ミルク中から上皮細胞を回収できるものの、増殖能は低いため機能性因子スクリーニングには難しいことがわかった。今後は、生体組織から酵素による消化法やウシ以外の哺乳動物における乳腺上皮細胞を供試してエンドセリンとルテオリンの効果を検討する。次に、泌乳初期(分娩後1週間以内)と泌乳後期(分娩後280-300日)のホルスタイン種泌乳牛をそれぞれ2頭から乳腺組織を回収して、RNAを抽出してRT-PCR解析を行った。リガンドであるエンドセリン-1、とその受容体であるエンドセリンA受容体とエンドセリンB受容体の遺伝子発現を検討した。その結果、すべての個体において3種類の遺伝子発現が認められた。この結果は、乳腺においてオートクリン因子としてエンドセリン作用系が機能していることを意味している。つまり、エンドセリン阻害剤であるルテオリンの効果が期待できることを示唆している。1.目的シソ科植物に豊富に含まれるポリフェノール(ルテオリン)が、エンドセリン(ET)分泌および合成を抑制することが明らかにしている。また、泌乳最盛期のマウスの乳腺において、ET発現が増大することも明らかにしている。加えて、ETは、血管収縮により血流を低下させたり、上皮細胞のアポトーシスを促進することが知られている。つまり、飼料中機能性成分であるルテオリン給与はET分泌を抑制することで乳腺上皮細胞のアホトーシスを制御させ、泌乳量を増大させることが期待できる。昨年度はウシ乳腺にETが発現していることを明らかにした。本年度は、いつルテオリンを給与すればよいのかを明らかにするために(ET抑制効果を期待できる泌乳ステージを解明するために)、泌乳期ごとにET-1およびエンドセリンA型受容体(ETA-R)の遺伝子発現量を測定した。2.方法供試動物:北海道農業研究センターで一般飼育条件下にて飼育されたホルスタイン種の泌乳初期(分娩1-2週後;6頭)、中期(分娩5-6ヶ月後;7頭)、後期(分娩9-10ヶ月後:4頭)および未経産牛(3頭)の乳腺組織を摘出して、実験に供試した。定量的PCRおよびRNA:ET-1およびETA-Rの配列は、ジーンデータベースで公開済みの配列を供試した(NM181010,NM174308)。特異的プライマーおよび蛍光プローブを用いた定量的PCR測定系を確立した。組織から抽出した総RNAを逆転写反応にてcDNAを合成した後に、定量的PCR解析を行なった。発現解析は、内部標準としてアクチン遺伝子発現を用いた。3.結果の概要(1)ET-1遺伝子発現は、各処理区間において有意差は認められなかった。(2)未経産牛の乳腺ETA-R遺伝子は、泌乳期のそれと比較して有意に増大した(ANOVA,ボンフェノーニ多重比較検定

P<0.001)4.まとめ泌乳にはETシグナルの抑制が必要であるので、ルテオリンを全泌乳期通じて給与すればよいことが示唆された。催乳効果を有する機能性飼料を開発するために、ミルク分泌が完全に停止する乾乳期の乳腺組織においてエンドセリン受容体の遺伝子発現が有意に増大することを昨年度までに解明した。そこで、最終年度の本年度は、実際に反芻動物に対してルテオリン(エンドセリン合成・放出阻害効果を有する機能性ポリフェノール;B.B.B発表済み)を給与した時の、エンドセリン産生部位におけるエンドセリン遺伝子発現量を検討した。あらかじめ、第一胃にフィステルを装着させた乾乳期の雌ヒツジ10頭(平均体重94.Okg)を用いた。処理区5頭には、0.1%ルテオリン含量の市販食用シソエキスを一日21g(ルテオリンとして21mg)を第一胃内へ注入した。注入は朝の給餌時の直前に行なった。給餌は対照区5頭、処理区5頭ともにグラスサイレージを自由採食とした。同一飼育管理下で2週間飼育した後に、安楽死による試験屠殺をして、肺動脈と心臓の2部位を摘出した。摘出臓器からフェノール・クロロホルム法にて総RNAを抽出し、さらに逆転写反応にてcDNAを合成し、リアルタイムPCR法にてエンドセリンおよび受容体の遺伝子発現を測定した。その結果、各臓器における遺伝子発現は変動しなかった。マウスによる予備実験では、ルテオリンの胃内注入によりエンドセリン阻害効果が示されたが、本ヒツジ実験では遺伝子発現抑制効果などは示されなかった。その原因として、ルテオリンが第一胃内微生物に代謝され、効果を発揮する充分量のルテオリンが吸収されなかったのかもしれない。今後の課題として、血中濃度を現在検討中であり、その結果次第では、第一胃をパイパスさせて、小腸以降で吸収させた方がルテオリンの効果が期待できるかもしれない。
マウスにおける性特異的ペプチド性フェロモンの鋤鼻神経系での受容メカニズムの解明

マウスのオスの涙に分泌されるペプチドESP1が、メスの性行動を誘導するフェロモンであることを明らかにした。哺乳類における初めてのペプチド性の性フェロモンであり、直接接触による個体間コミュケーションが存在することが明らかになった。また、ESP1を認識する鋤鼻受容体を同定し、その神経の投射先と神経回路の可視化に成功した。ESP1はマウスの繁殖行動の制御に使える可能性があるので特許出願をおこなった。哺乳類で「フェロモン分子」から「行動」までの経路を明らかにした初めての研究であり、行動を司る脳神経関連研究領域に大きな学術的波及効果がある。多くの生物は、交尾して子孫を残すために、揮発性のフェロモン物質を使って同種の異性を正確に識別する。以前、我々は、マウスにおいて、揮発性のフェロモンだけでなく、空間を飛ばない不揮発性のペプチド(ESP1と命名)が、異性間のコミュニケーションに使われている可能性を見いだした。ペプチドESP1は、涙腺から外部にでて、個体同士の直接接触などによって、他個体のマウスの鼻腔前方にある鋤鼻器官というところで感知される。鋤鼻器官はマウスでフェロモン行動に深く関わる組織であることがわかっているので、ESP1の情報は、鋤鼻神経系の特定の受容体を介して脳に伝達され、異性や個体の信号(フェロモン)として処理されると予想される。本研究では、オスのマウスが涙に分泌するESP1の、メスに対するフェロモン機能とその作用機構を解明することを目的とする。具体的には、ESP1のフェロモン効果を明らかにする。ESP1を感知する受容体を見つけ、受容体によって認識された信号がどのような神経回路で脳に伝わりフェロモン効果が引き起こされるのかを解明する。鋤鼻神経におけるc-Fosタンパク質の発現を活性化の指標として、オス涙から分泌されてメス鋤鼻器官に取り込まれて鋤鼻神経を発火させる新規の性特異的ペプチド(約7kDa)を見つけ、ESP1と名付けた。本研究では、ESP1ペプチドを認識する受容体の同定およびその受容体を発現している神経が脳のどこに投射しているかという神経回路の可視化を行う。また、ESP1がどのようなフェロモン作用をもつか、行動/内分泌解析、およびESP1受容体ノックアウトマウスの解析によって明らかにする。本年度は、ESP1を認識する鋤鼻受容体の同定、同定したV2R型鋤鼻受容体のESP1応答の再構成、ESP1-V2R型鋤鼻受容体の情報伝達経路の解明を目的として行った。まず、鋤鼻神経に発現する約60種類のV2R受容体のなかから、ESP1刺激によって発現誘導されるc-Fosと二重染色されるV2R遺伝子のタイプを同定し、V2Rp5と命名した。V2Rp5が本当にESP1を受容するか解析するため、培養細胞HEK293にV2Rp5を強制発現させ、カルシウムイメージング法によって応答を再構成しようと試みたがうまくいかなかった。そこで、V2Rp5を発現する鋤鼻神経を可視化したトランスジェニックマウスを作製した。具体的には、V2Rp5遺伝子の下流にDsRedタンパク質コード配列を挿入したBac cloneを作製し、V2Rp-DsRedトランスジェニック系統を樹立した。情報伝達経路の解析を目的に、TRPC2ノックアウトマウスを入手し、V2Rp-DsRed Tgマウスとの掛け合わせを開始した。本研究では、オス涙から分泌されてメスの鋤鼻神経を発火させる性特異的ペプチドESP1(約7kDa)を認識する受容体の同定およびその受容体を発現している神経が脳のどこに投射しているかという神経回路の可視化を行う。また、ESP1がメスに対してどのようなフェロモン作用をもつか行動解析を行う。最終的には、ESP1受容体ノックアウトマウスを用いて、「ESP1-鋤鼻受容体-神経回路-行動」の一連のシグナル経路を明らかにする。本年度は、ESP1の機龍として、メスの性行動について解析したところ、ESP1にさらされたメスマウスにおいてロードシス行動(オスに対する受け入れ態勢行動)が増長されることがわかった。哺乳類における初めてのペプチド性の性フェロモンである。また、ESP1の受容体であるV2Rp5遺伝子のノックアウトマウスを作製したところ、ノックアウトメスではESP1のフェロモン効果が消失していることが明らかとなった。これらの知見は、ESP1のフェロモン効果は、V2Rp5受容体を介した特定の鋤鼻神経回を介していることを示している。さらに、ESP1は、近交系およびクローズドコロニーにおいては、BALBおよびDBA系統でのみ、オス涙に分泌されており、他のほとんどの系統では検出できなかった。

それに対して、ほとんどの野生由来のオスマウスの涙には大量のESP1が分泌されていることが明らかになった。ESP1はマウスにとって交尾のために重要なフェロモンであるが、研究用マウスは小さなケージで何代も継代された結果、その必要性が低下し発現量が落ちていったという、興味深い分子進化が示唆される。本研究では、オス涙から分泌されてメスの鋤鼻神経を発火させる性特異的ペプチドESP1(約7kDa)を認識する受容体の同定およびその受容体を発現している神経が脳のどこに投射しているかという神経回路の可視化を行う。また、ESP1がメスに対してどのようなフェロモン作用をもつか行動解析を行う。最終的には、ESP1受容体ノックアウトマウスを用いて、「ESP1-鋤鼻受容体-神経回路-行動」の一連のシグナル経路を明らかにする。22年度は、オスの涙に分泌されるペプチドESP1が、V2Rp5受容体を介してメスの性行動を誘導するフェロモンであることを明らかにした成果を、Nature誌に発表した。哺乳類における初めてのペプチド性の性フェロモンであり、揮発性のフェロモンだけでなく、不揮発性のフェロモンで直接接触による個体間コミュケーションが存在することが明らかになった。様々な近交系のマウスおよび野生由来のマウスにおいて、ESPペプチドファミリーの外分泌腺における発現を解析した結果、ESPファミリーの発現パターンが系統間によって異なることがわかった。ESPファミリーの発現パターンが個体間の認識に使われている可能性を示唆している。また、V2Rp5のESP1応答の再構成、ESP1刺激により活性化されるメスマウス神経回路の解析および放出される神経伝達物質や神経ペプチドの同定は引き続き継続中である。一方、オス涙中にESPファミリー以外の鋤鼻刺激因子が新たに存在することを見出した.本研究では、オス涙から分泌されてメスの鋤鼻神経を発火させる性特異的ペプチドESP1(約7 kDa)を認識する受容体の同定およびその受容体を発現している神経が脳のどこに投射しているかという神経回路の可視化を行う。最終的には、ESP1受容体ノックアウトマウスを用いて、「ESPI-鋤鼻受容体-神経回路-行動」の一連のシグナル経路を明らかにする。23年度は、ESP1受容体であるV2Rp5の培養細胞での機能発現系の確立を目指し、培養細胞HEK293やアフリカツメカエル卵母細胞でのESP1とV2Rp5の応答の再構成を試みたが未だに成功していない。ESP1刺激により活性化されるメスマウス脳神経回路の解析を行い、視床下部領域の他いくつかの脳領域において活性化される神経細胞の存在を認めた。メスマウス脳においてESP1刺激により放出される神経伝達物質や神経ペプチドの同定をするために、マイクロダイアリシス法を立ち上げた。22年度に、オス涙腺にESP1以外のメス鋤鼻神経活性因子が存在する予備結果を得たので、副嗅球c-Fos発現誘導アッセイを指標に、HPLCによる活性因子の精製をおこなったところ、新規鋤鼻活性タンパク質をひとつ同定した。ESP1-V2Rp5刺激による高次神経回路を可視化するためにV2Rp5-ires-Creトランスジェニックマウスの作製に着手した。