hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経変性疾患へのAhRの関与に関する研究

また、神経系に影響を与える可能性のある化合物を代謝するCYP分子種の発現調節が神経系では他の臓器と異なるのかどうかも興味あるところであり、申請者らが既にcDNAを得ているアフリカツメガエルAhRおよびARNTの神経系での発現調節機構を解明することで、マウス等哺乳類での検討に必要な知見を得たいと考えている。アフリカツメガエルxAhR、xARNTおよびxARNT2に対する抗体を作成し、アフリカツメガエル成体各種臓器での発現を検討したところ、xAhRは雌雄ともに検討したほとんどの臓器での発現が認められた。xARNTは肝・脾・肺・心・脳・精巣に発現が認められたが、xARNT2は脳にのみ発現が認められた。初期発生過程における発現時期を検討したところ、xAhRは未受精卵の段階から神経胚中期まで非常にわずかなタンパク発現が認められ、神経胚後期からその発現量が上昇し始め、オタマジャクシで最も高い発現が認められた。xArntは未受精卵の時期から比較的多量に存在し、発生を通じてその存在が認められた。発生の初期では新たな転写や翻訳はほとんど行われず、卵内に蓄積された母性産物に依存することから、発生の初期に見られたxAhRおよびxArntは母性産物であると推察された。xArnt2は、神経胚後期からその発現が認められ、発生が進むにつれて発現量の上昇が観察された。初期発生過程におけるxAhR mRNAの発現部位をホールマウントinsituハイブリダイゼーションにより検討したところ、未受精卵ではほぼ全体に発現が認められたが、4細胞期に動物半球側へのmRNAの偏在が認められ、その傾向は胞胚期まで続いた。尾芽胚初期、後期になると主に頭部・上皮・外鰓に発現が認められるようになった。3-メチルコランスレンの影響を検討したところ、動物半球側での発現には変化がなかったが、その中の複数個の細胞についてxAhRの核への移行が認められた。以上より、xArnt2の脳での発現や初期発生過程での発現パターンなど、アフリカツメガエルのAhRおよびARNT関連タンパクの機能が哺乳類と共通している可能性が示唆され、哺乳類における相同タンパクの機能解明にアフリカツメガエルでの検討が寄与できることが確かめられた。
顎関節症発現に及ぼす性ホルモンの影響

大理石骨病(op/op)マウスは、機能的なマクロファージ・コロニー刺激因子(M-CSF)の欠如によって破骨細胞の顕著な欠乏を引き起こします。この動物は,下顎頭の発達が悪いことでよく知られています。さらに,このマウスは,一般に歯が萌出せず無菌症である。よって,下顎頭の発達遅滞はM-CSF欠損による大理石骨病と歯がないためによる機能的な刺激が加わらないための両面でおこると考えられる。すでに,M-CSFを多量に投与することで歯が萌出することは知られている。しかしある程度のM-CSFの量であると、歯が萌出しないことが,我々の実験から明らかとなった。その方法を用いることで,歯の機能は,ないままにM-CSF単独の下顎頭修復効果を観察することが可能となる。現在の研究では、私たちが、突然変異マウスの中でM-CSFの連続投与後に下顎の関節頭の骨および軟骨構成を観察しました。生後10日のop/opマウスは、下顎枝内部の骨再吸収がM-CSF投与後5日後より始まった。その骨吸収は生後15日後に、骨髄腔の形成とういうかたちで顕著に現れました。生後25日では、治療していないop/opマウスの関節頭が、軟骨組織で構成さたままであった。しかし,M-CSF投与によって治療されたop/opマウスは、骨改造,下顎頭および下顎枝の形態学的に下顎頭中の破骨細胞におけるM-CSFの役割によってほぼ完全に近い状態に回復されました。しかし,機能が加わっていないことから,関節円盤の軟組織が組織学的に脆弱であるように観察された。最初に,実験計画の通りマウスにおける両側卵巣,精巣摘出術の影響を下顎頭と大腿骨への影響を及ぼしているかの検討を行った。結果は,性ホルモンの減少によって骨芽細胞数の減少と破骨細胞の増加によって著しい骨量の減少が認められた。これまでの結果は,誌上発表を行った(Fujita T, Kawata T et al. Biomed. Res. 2001印刷中)。次に,下顎頭,及び大腿骨における機能的負荷減少における検討を行っている。・生後8週時に両側卵巣,精巣摘出術を施し,骨粗髪症モデルマウスとする。・また,未処置同日齢マウスを対照とする。・生後8週時に両側卵巣,精巣摘出術を施し,エストロゲンとアンドロゲンを投与する。・過度開口15mmの術後、2,4,8,12週のそれぞれ10日前より毎日10回行う。顎関節周囲骨の変化のとして破骨細胞数、骨芽細胞数を計測するため,各切片にtartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)染色、hematoxylin-eosin (H-E)染色を行い,顕微鏡にて観察している。また、骨内部の密度をpQCTにて測定する予定である。また,必要があれば電子顕微鏡による組織変化を観察する予定である。データをまとめて本研究に合致する学会での発表と,誌上発表を行う予定である。
活性窒素分子種によるニトロセイティブ・ストレスのプロテオミクス

一酸化窒素(NO)、二酸化窒素(NO_2)、亜酸化窒素(N_2O)、ペルオキシナイトライトなどの活性窒素分子種(reactive nitrogen species)は、ニトロセイティブ・ストレス(nitrosative stress)を生物に与えることが知られている。ニトロセイティブ・ストレスは、酸素ストレスと同様に生物のシグナル伝達や防御機構に重要な役割を持つ一方で、細胞や組織に損傷をもたらすことも知られている。植物においてもこれらの活性窒素分子種によるニトロセイティブ・ストレスが生体防御や成長・発生に関与していることが示唆されているが、その分子的実体についてはほとんど分かっていない。そこで、本研究ではニトロセイティブ・ストレスの分子的実体を明らかにするために、植物における活性窒素分子種への応答を網羅的に調査した。二酸化窒素(4ppm)を含むまたは含まない大気中、自然光下で栽培(4週間)したシロイヌナズナのシュートおよび根からタンパク質を抽出した。ついで二次元ゲル電気泳動法でタンパク質スポット(蛍光染色)を分離後、±二酸化窒素でスポットを比較した。差が観察されたスポットをゲル内消後peptide mass finger printing法により、タンパク質の同定を図った。その結果、シュートでは、約1000個のタンパク質スポットのうち、50-100個が、二酸化窒素曝露により、シグナルが減少または増加した。シグナルが減少するスポット数が相対的に多かった。これまでに、半数以上のタンパク質が同定された。これまで調べた限り、二酸化窒素曝露により、ストレス応答関連タンパク質シグナルは増加するのに対し、代謝関連応答タンパク質シグナルは減少する傾向が認められた。根については現在解析中である。一酸化窒素(NO)、二酸化窒素(NO_2)、亜酸化窒素(N_2O)、ペルオキシナイトライトなどいわゆる活性窒素分子種(reactive nitrogen species)は、ニトロセイティブ・ストレス(nitrosative stress)を生物に与えることが知られつつある。そこで、本研究ではニトロセイティブ・ストレスの分子的実体を明らかにするために、植物における活性窒素分子種への応答を網羅的に調査することを目的とした。本研究では応答たんぱく質を網羅的に調査解析するためにプロテオミクス解析を行った。植物材料としてシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を用いた。NOx暴露チャンバー内で8時間暴露後したシュートから粗タンパク質を抽出した。粗タンパク質抽出液を二次元電気泳動法により分離した。ゲル中のタンパク質スポットをメンブレンにブロッティング後、Sypro Ruby染色および抗亜硝酸還元酵素(NiR)抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った。または、銀染色後、GS-800 calibrateddensitometerを用いて泳動図を取り込み、PDQuestソフトウェアを用いてスポット解析を行った.植物葉の可溶性タンパク質の0.1%以下で、活性窒素種の一つであるNO_xによりその発現・活性が誘導されることが報告されているNiRについて解析した。抗NiR抗体を用いたウェスタンブロット解析とSypro Ruby染色の結果、抗NiR抗体と反応するNiRタンパク質スポットは、Sypro Rubyで染色され、検出された。さらに、銀染色の結果、暴露前後ともは、ゲル1枚あたり約1000個のスポットが観察され、その内の600スポットに高い再現性が観察された。約50個のスポットについてNO2暴露前後で4倍以上の差が観察された。
酸化活性種の新規反応特性評価法に基づく、高選択的な不活性分子活性化系の構築

シトクロムP450は、数あるへム酵素の中でも非常に高い酸化活性を有することが知られている。筆者は、この高い酸化活性の要因がその構造上の特徴でもあるチオレート配位構造にあるのではないかと考え、これを明らかにすべく実験を行ってきた。その結果昨年度までに、種々のアニソール類のO-脱メチル化反応機構を指標とすることで、チオレート配位鉄ポルフィリン錯体SR)の特徴的な反応特性を定量的に表現可能であることを見いだしてきた。本年度は、引き続きチオレート配位が活性種の反応特性に及ぼす効果を検討するため、新たに合成した水素結合型SR(HBSR)によるO-脱アルキル化反応機構の検討を行った。近年、シトクロムP450の反応サイクルの中で、0-0結合開裂の結果生成する活性種では、軸配位子チオレートはプロトネートしチオールとなっているのではないかとの推測がなされるようになってきた。そこで、分子内にチオレートに対する水素結合部位を導入したHBSRを合成し、これを用いてp^-ジメトキシべンゼンのO-脱メチル化反応機構を検討した。その結果k_Hk_D値はSRの7.6とほぼ同じ7.1という値が得られた。すなわち、チオレート軸配位子に対する水素結合は酸化活性種の反応特性にほとんど影響を与えず、ともに高い水素原子引き抜き活性を持つことが示唆された。一方で、アルカンの水酸化反応とアルケンのエポキシ化反応の競争反応においては、HBSRとSRではその結果に差が現れ、HBSRではよりアルケンのエポキシ化が進行しやすいという結果を得た。この結果が本賞的な反応特性の差を表しているのか、あるいは分子間競争反応によるものなのかを明らかにするため、現在分子内で競争反応可能な基質のデザイン・合成を行っている.合成が完了次第、HBSRとSRの反応特性を詳細に比較していく予定である。筆者はこれまでに、p-ジメトキシベンゼ2のO-脱アルキル化反応機構などを指標に、チオレート配位鉄ポノヒフィリン錯体(SR)の反応特性をシトクロムP450や他の軸配位子を持つ鉄ポルフィリン錯体のそれと比較し、シトクロムP450におけるチオレート配位の意義を明らかにしてきた。本年度は、より電子密度の高いテトラメトキシベンゼンを基質として、その反応機構をモデル系、酵素系で精査した。分子内同位体効果(KIE)を明らかにするための基質である、1-(OCD_3)-2,4,5-trimethoxybenzeneは、2,4,5-trimethoxybenzaldehydeよりmCPBAを用いたBaeyer-Villeger酸化を含む2工程で合成した。この基質のO-脱メチル化反応におけるKIEは、シトクロムP450系では7.6であり、ジメトキシベンゼンの時と同じく反応は主に水素原子引き抜き機構で進行することが明らかとなった。これに対して、シトクロムP450と同様にチオレート軸配位子を持つSRではKIEは1.3と小さく、反応は主にipso置換機構で進行することが明らかとなった。これまで用いてきたジメトキシベンゼンなどの基質では、SRとシトクロムP450は常に同じ反応機構で反応が進行したが、これは用いた基質の芳香環電子密度が反応特性の差を見るには十分高くはなかったためと考えられる。すなわち今回テトラメトキシベンゼンを用いてはじめて、SRとシトクロムP450の反応特性の質的に異なる面が明らかとなり、SR酸化活性種はP450活性種に比べ水素原子引き抜き力が弱いことが見出された。本結果は、テトラメトキシベンゼンを基質とすることで、触媒の構造と反応特性の相関をさらに詳細に検討することが可能となる事を示している。今後水素結合を分子内に有するSR類縁体などを用い、よりファインな触媒構造の反応特性に及ぼす効果を明らかにしていきたいと考えている。

この結果が本賞的な反応特性の差を表しているのか、あるいは分子間競争反応によるものなのかを明らかにするため、現在分子内で競争反応可能な基質のデザイン・合成を行っている.合成が完了次第、HBSRとSRの反応特性を詳細に比較していく予定である。
有機無機複合光成膜の合成・アミノ酸型ポルフィリンオリゴマーの利用

本計画は「緑色植物の光合成チタコイド膜を参考に、有機・無機複合型ナノ構造を構築すること」である。この課題に対して平成18年度は以下の成果を得た。1)1417年度にかけて我々はシアノバクテリアの光捕集蛋白質を参考に新しい原理に基づくアンテナクロロフィルの開発をおこない、また、長い蛍光寿命を有するポルフィリンアレイの構築と色素アレイのスペクトル制限分子力学シミュレーションプログラムの開発を行なってきたが、本年度はその集大成として色素配向の分布構造を明らかにし、PSIとの比較をおこなった。また、この成果は今後クロロフィル型の高効率光エネルギー輸送系の構築をおこなう基礎になると期待できる。2)ヒドロゲナーゼのモデル化に関する生物無機化学的研究を試み、[NiFe]活性中心に関して、システイン含有テトラペプチドを配位子とするニッケル塩の合成・構造解析(NMR、EXAFS)に成功し、[NiFe]ヒドロゲナーゼ中心構造構築のためのプラットフォームづくりをおこなった。この成果は今後Feを導入し、安定な光合成型光エネルギー変換水素発生系を構築するための基礎になるものと期待される。3)クロロフィル誘導体を用いて、シアノバクテリアPSIIの光電変換中心であるいわゆるスペシャルペアの忠実構造モデルの合成に成功した。このモデルは今後アクセサリークロロフィルのモデルやフェオフィチンモデルを結合させた系への発展の基礎になるものと考えている。4)上記アンテナクロロフィルモデルをシリコン型ベシクルの脂質2重膜中に高密度に閉じ込めることに成功した。この成果は、将来、初発電荷分離の反応中心、水素発生サイト、酸素発生サイトをシリコンナノベシクルの表面に組み込む基礎になるものと期待される。人工の光合成チラコイド膜を用いた水の可視光分解を目指して、耐久性と金属酸化物半導体等との組み合わせ可能性を兼ね備えた系として、シリコン系の脂質2重膜に着目し、アンテナモデルの包埋、要素触媒点の生物無機化学的アプローチによる準備を目指した。1)アンテナクロロフィルモデルを閉じ込めたシリコン型ベシクルの構築では、先ず、アンテナモデルの合成法の改良を試みた。アンテナモデルとしてアミノ酸型ポルフィリンを直接カップリング後ゲルろ過分取した。得られたオリゴマーの重合数はおよそ47であった。一方、シリコン型ベシクルの形成条件の検討を、ベシクル形成・粒径分布(動的光散乱)に及ぼすpHと注入速度の影響を明らかにした。更に、シリコン型ベシクルの脂質膜中へのアンテナモデルの包埋条件の検討を行なった。種々条件を検討し、得られた緑色ベシクルのSEM、TEM、EDX、蛍光顕微鏡観測、共焦点レーザー顕微鏡の観測、等から脂質2重膜への包埋に成功したことを明らかにした。次いで、包埋濃度の検討を行い、最大濃度ではアンテナポルフィリン間に蛍光移動が起こることを示唆する結果を得た。蛍光寿命の測定から、ポルフィリンは2重膜表面近傍に存在する可能性が高いことが分かった。2)光合成酸素発生中心(OEC)にあるマンガン・カルシウムクラスターにならい、新しいマンガンクラスターの合成を試みた。その結果、新規にカルシウム含有マンガンクラスターの合成に成功した(世界で2例目)。今後更にOECに類似した構造の混合クラスターに達する出発物質になるものと位置づけている。一方、既に酸素発生を行なうことが判明しているマンガンμ-oxoダイマーを直径数ナノメーターのシリコンナノベシクルの親水領域に包埋する検討を行い、2本鎖逆ミセルの使用が可能性を有することを見出した。3)水素発生を行なうヒドロゲナーゼ活性点のモデル化を目指して、新しいペプチド形ニッケル錯体の合成とその構造解析に成功した。また、その、石英表面上への移植にも成功した。
ファジー環境における最適化理論のための基礎数理

ファジィモデルの解析にはさまざまな様相により,多くの研究がなされてきているが,本研究では,ヘルマンの動的計画法の考えにもとづき,多段意志決定として定式化を行い,理論的な解析をおこなった。得られた結果としては,離散パラメータの無限計画問題として,動的ファジィ・システムを議論し,ファジィ利得の最適停止問題に応用した。ここに至る展開や経過に対して,日本数学会統計分科会の特別講演,「ある動的ファジィ・システムの最適化」吉田祐治,於東京工業大学,平成5年9月や企画特別講演「ファジィ・システムの数理」吉田祐治,於名城大学,平成10年3月で報告されている。これを総括したものが後で掲げた雑誌論文のひとつである。内容のうち項目をまとめると以下の通り:・ファジィ決定過程のための基礎理論の構築を試みて,ファジィ数列の収束,ファジィ・マックス順序について考察をおこなった。この結果を利用して,いわゆる動的計画法の最適性方程式に対応する、再帰関係式を考え、その解の存在について議論をおこなった。・応用問題として,動的システムにおけるファジィ停止時刻を考察した。通常の確率変数をファジィ化する必要があるが,この定義にアルファカットをもちいて構成した(ただしかなり不明碓な部分もあり,今後の研究が必要とされる)。議論展開に必要な仮定には,単調性の概念というよい性質を導入することで,スカラー化した利得関数における最適化問題として議論した。概ね当初の目的を一応到達しているとは考えるが、ファジィ化した確率変数による停止時刻は、2値関数ではないから、そもそもの解釈から困難を極めている。今後の課題としたい。多段決定過程の最適化構造を調べるのに、最も完成されたモデルはマルコフ決定過程である。我々は、このモデルの中にファジ-構造を導入しつつ、新たに派生した多段決定過程の構造を研究することを目的としている。本年度の研究では、応用上重要である最適停止問題に焦点を置き、研究を行った。本年度発表した基礎研究のうち主なものは、つぎの3編である。ファジ-状態の線形推移を単調性を持つ推移に拡張し、従来の結果を含む極限の解析を行った(学術論文)。一般の効用関数を持つマルコフ決定過程(学術論文)及び最適停止問題(学術論文)において、最適方程式を導き、その性質を考察した。現在は、ファジ-数の多次元化を行うため、最適化問題を研究しているグループと連絡をとりながら、半順序での最適基準の研究中である。またこの過程で得られた結果は、そのつど、春秋の数学会と京都数理解析研究所の研究集会などで発表している。特に、1998年度春の数学会で、吉田祐治氏が特別講演を予定している。これらの研究と論文の作成にあたり、研究集会及び研究打ち合わせの旅費、マイコン・ワークステーションの環境整備等の補助金に感謝致します。意思決定のモデル化には一般に不確実な状況にあることから,極めて困難な問題点に遭遇することが通常である。昨年度は初年度であることから主として,従来のファジィ最適化理論に関する成果がどこまで達していて,われわれの目標とすることとは,どの程度まで関わりをもつかが重点であった。今年度ではこれを踏まえて,簡単な概説を発表して,それらの成果の中で,分担者の相互の協力により考えられる拡張を試みることとした。いままでの研究実績を踏まえて,ファジィ順序の新しい拡張を定義し,それから得られる結果を調べた。最適化には通常,全順序が当たり前で,最適点がどのように特徴付けられるか,それを求めるアルゴリズムは,という問題発想である。これに対して,そもそもファジィ理論では順序が半順序にしかならない困難さに遭遇してしまう。ここで考えた順序はもちろん一つの提案に過ぎないし,これはここでの目標に対して,はたして有効かどうかはまだ検証を続けていかなけばならない。順序という基礎的な概念が確立できれば,これを応用して,様々な最適化理論が可能であり,より多くの成果や発展を期待している。
GH30 β-1,6-グルコシダーゼの構造機能解析と有用糖質合成への応用

細菌由来の酵素「β-1,6-グルコシダーゼ」の立体構造と機能の関係を明らかにする。得られた知見を活用して、「β-1,6-グルコシド結合」(抗腫瘍性糖質、有用細菌の増殖を促進するオリゴ糖、苦味を呈するユニークな糖質などに存在する結合)を含む新規糖質や有用希少糖質の合成を試みる。食品・医薬品・化粧品の成分の製造や、糖質および関連酵素の機能解析に役立つ成果を得ることを目指す。
単一幹細胞による臓器および個体の再生と家禽育種への活用

多能性を保持する胚性幹細胞及び体性幹細胞の樹立を試みた。さらに、これらの幹細胞の分化制御による家禽育種への活用を試みた。放卵直後のニワトリ胚盤葉より多能性を保持する幹細胞を採取した。この幹細胞をドナーとし、レシピエントに移植し、生殖細胞系列キメラを効率的に作出した。体性幹細胞は、初生雛の骨髄細胞から採取した。この細胞をドナーとしレシピエント胚に移植したところ、キメラの血管系や心臓部に集積し、血管内皮細胞として再生した。また脂肪由来幹細胞の培養によって骨細胞への分化制御が可能となった。これらの結果から鶏幹細胞の分化制御により各種の臓器や器官を再生する新規の実験系を確立した。これらの成果は家禽育種へ活用し得るものと期待された。培養条件下で様々な組織や器官に再生し得る胚性幹細胞(ES細胞)や万能細胞(iPS Cell)が主にヒトやマウスなどの哺乳動物で樹立されている。これらの幹細胞から様々な臓器の再生が試みられている。幹細胞の樹立や分化制御技術は再生医療や生物生産に多大な貢献をもたらすものと期待されている。しかし、鳥類においては完全な幹細胞は、未だ樹立されていない。そこで本年度においては、鳥類の初期胚や体細胞から多能性を持つ細胞を峻別することを目的として研究を行った。まず放卵直後のニワトリ受精卵中で発生する初期胚から胚盤葉を採取した。これらの胚の周囲に付着する卵黄、血球、卵白を、PBSを用いた洗浄によって完全に除去した。こうして得られた胚由来の細胞をFACSによって分離した。また孵化直後の初生雛の大腿骨から骨髄を採取した。これらの骨髄の周囲に付着する、血球、脂肪を、PBSを用いた洗浄によって完全に除去した。こうして、胚性細胞由来のサンプル、及び、体性細胞由来のサンプルをそれぞれ得た。得られた胚性細胞、及び、体性細胞をEACSによって分離した。さらに、これらの細胞から少数の多能性幹細胞を特異的に精選した。得られた幹細胞をin vitroで培養したところ、様々な形態を示すコロニーが確認された。またこの胚性幹細胞は多能性マーカーであるAP及びSSE-A1で強く検出された。また骨髄細胞を培養したところ血管再生能を保持することが示唆された。今後は、これらの細胞の遺伝的特徴を把握し、鳥類幹細胞の特異性を明らかにする必要が考察された。このため、単一の鳥類幹細胞(SP細胞)を確実に増殖し得る実験系を確立することが必須であろうと思われた。これらの研究の遂行によって家禽育種に新たな活路を拓き得るものと考察された。ヒトやマウスなどの哺乳動物で、様々な組織・器官・個体に再生し得る胚性幹細胞(ES細胞)や万能細胞(iPS Cell)が樹立されている。再生医療や生物生産への応用を目指し、これらの幹細胞から様々な臓器・器官や個体の再生が試みられている。しかし現在に至るも、鳥類においては完全な幹細胞は樹立されておらず、また完全な臓器や個体の再生はなされていない。家禽においてこれらの幹細胞株を樹立し、その分化制御が可能となれば家禽生産や希少鳥類の増殖や保全に多大な貢献がもたらされることが期待される。本年度において、多能性を持つ細胞を厳密に分取し、その分化を培養条件下で人為的に制御することを目的として研究を行った。受精卵中で発生する初期胚から胚盤葉明域中央部細胞を採取した。胚盤葉明域の周囲に付着する不要物を、PBSを用いた洗浄によって完全に除去した。また初生雛から得られた骨髄細胞をFACSによって分離した。こうして、胚性細胞由来の細胞サンプル、及び、体性細胞由来の細胞サンプルをそれぞれ得た。得られた胚性細胞、及び、体性細胞から少数の多能性幹細胞を厳密に分取した。これらの胚性幹細胞及び体性幹細胞を培養したところ、様々な形態を示す細胞コロニーが確認された。またこの胚性幹細胞は多能性マーカーであるAP及びSSE-A1で強く染色された。培養骨髄細胞の遺伝子発現の解析によって、これらの細胞において血管発生制御遺伝子が強く発現していることが明らかとなった。さらに骨髄細胞は、放射線照射によって退縮したレシピエント胚における血管の再生能を保持することが示唆された。さらに、単一の鳥類幹細胞(SP細胞)を培養条件下で確実に増殖し得る実験系の開発を試みた。単一幹細胞を培養したところ活発に増殖し、細胞塊を形成することが明らかとなった。

細胞塊において、上記の多能性細胞マーカーを強く発現していることが明らかになった。今後の研究の進展によって、家禽育種や家禽資源再生に新たな活路を拓き得るものと考察された。哺乳動物(ヒト、マウス等)で、多様な組織・器官・個体に再生し得る胚性幹細胞(ES細胞)や万能細胞(iPS Cell)が樹立されている。これらは再生医療や生物生産への応用を目指し、様々な臓器・器官や個体の再生が試みられている。一方、鳥類においては幹細胞は樹立されておらず、また完全な臓器や個体の再生はなされていない。家禽においてこれらの幹細胞株を樹立し、その分化制御が可能となれば生産性向上や個体増殖や保全に多大な貢献がもたらされることが期待される。本年度において、幹細胞を厳密に分取し、その分化を培養条件下で人為的に制御することを目的として研究を行った。家禽初期胚から胚盤葉明域中央部細胞を採取した。胚盤葉明域の周囲に付着する不要物を、PBSを用いた洗浄によって完全に除去した。また初生雛から得られた体性細胞をFACSによって分離した。こうして、胚性細胞由来の細胞サンプル、及び、体性細胞由来の細胞サンプルをそれぞれ得た。胚性細胞、体性細胞から少数の多能性幹細胞を厳密に分取した。これらの胚性幹細胞及び体性幹細胞を培養したところ、多能性細胞コロニーが確認された。またこの胚性幹細胞は多能性マーカーであるCVH及びSSEA-1の強い発現性が確認された。遺伝子発現の解析によって、これらの細胞において分化制御制御遺伝子が強く発現していることが明らかとなった。さらにこの細胞は、放射線照射によって退縮したレシピエント胚における血管の発生能、及び、再生能を保持することが確認された。さらに、単一のSP細胞を培養条件下で確実に増殖し得る実験系の開発を行った。今後の研究の進展によって、遺伝的に高い能力を持ち、経済性の高い鶏卵や鶏肉を産出する家禽の効率的生産や希少鳥類の再生・増殖に新たな活路を拓き得るものと考察された。近年、哺乳動物においては、多能性を保持する胚性幹細胞(ES細胞)や万能細胞(iPS Cell)が樹立されている。再生医療や生物生産への応用を目指し、これらの幹細胞から様々な臓器・器官や個体の再生が試みられている。しかし現在に至るも、鳥類においては完全な幹細胞は樹立されておらず、また完全な臓器や個体の再生はなされていない。家禽においてこれらの幹細胞株を樹立し、その分化制御が可能となれば家禽生産や希少鳥類の増殖や保全に多大な貢献がもたらされることが期待される。ニワトリ初期胚から、多能性を持つ細胞を厳密に分取し、その分化を培養条件下で人為的に制御することを目的として研究を行った。受精卵中で発生する初期胚から胚盤葉明域中央部細胞を採取した。また初生雛から得られた脂肪幹細胞を分離した。得られた胚性細胞、及び、体性細胞から少数の多能性幹細胞を厳密に分取した。これらの胚性幹細胞及び体性幹細胞を培養したところ、様々な形態を示す細胞コロニーが確認された。またこの胚性幹細胞は多能性マーカーで強く染色された。培養脂肪幹細胞の遺伝子発現の解析によって、これらの細胞において骨芽細胞遺伝子が強く発現していることが明らかとなった。
睡眠時無呼吸症候群患者用スプリントの臨床的評価

閉塞型睡眠時無呼吸疾侯群(OSAS)患者に対する保存的療法の一つとしてスリープスプリントが広く応用されているが,スプリント装着前後における症状の変化について詳細に検討した報告は少ない.某内科病院においてポリソムノグラフィーを用いて睡眠時の状態を観察し,睡眠時無呼吸症候群(SAS)と診断された患者四十数名に対して,スリープスプリント(Thera Snore)を装着した.我々が使用したスリープスプリント(SS)について,その製作法について検討するとともに,OSAS患者に対してSS装着前後の終夜睡眠ポリグラフィー(PSG)による夜間睡眼検査を施行し,術前術後の症状の変化について比較検討したところ,本研究に使用したSSは,本来直接法で製作するよう指示されているが,軟化圧接による火傷の防止および適合性の面から,間接法による製作の方が優れでいると思われた.また,SS装着により,無呼岐指数,無呼吸-低呼吸指数,中途覚醒指数,日中傾眠の減少、および最低酸素飽和度の上昇が認められたことより,OSAS患者に対するSSによる治療の有効性が示唆された.閉塞型睡眠時無呼吸疾侯群(OSAS)患者に対する保存的療法の一つとしてスリープスプリントが広く応用されているが,スプリント装着前後における症状の変化について詳細に検討した報告は少ない.某内科病院においてポリソムノグラフィーを用いて睡眠時の状態を観察し,睡眠時無呼吸症候群(SAS)と診断された患者四十数名に対して,スリープスプリント(Thera Snore)を装着した.我々が使用したスリープスプリント(SS)について,その製作法について検討するとともに,OSAS患者に対してSS装着前後の終夜睡眠ポリグラフィー(PSG)による夜間睡眼検査を施行し,術前術後の症状の変化について比較検討したところ,本研究に使用したSSは,本来直接法で製作するよう指示されているが,軟化圧接による火傷の防止および適合性の面から,間接法による製作の方が優れでいると思われた.また,SS装着により,無呼岐指数,無呼吸-低呼吸指数,中途覚醒指数,日中傾眠の減少、および最低酸素飽和度の上昇が認められたことより,OSAS患者に対するSSによる治療の有効性が示唆された.某内科病院においてポリソムノグラフィーを用いて睡眠時の状態を観察し,睡眠時無呼吸症候群(SAS)と診断された患者二十数名に対して,スリープスプリント(Thera Snore)を装着した.現在,これらの患者のスプリント装着時における睡眠状態を計測中である.統計処理をするにはまだ至っていないが,傾向としては,いびきの減少,日中の傾眠傾向の減少,睡眠時無呼吸の減少がほとんどの患者で認められており,有用性が示唆されている.また,UCLA Sleep Centerおよび歯学部におけるSASに対する治療の現状と抱えられている問題点を把握するとともに資料収集を含め平成13年2月5日2月10日の期間UCLAを訪れ,調査を行った.UCLAでは,Oral Medicine & Orofacial Pain ClinicにおいてSASの歯科的アプローチが行われており,Prof.Glenn Clarkが考案したsleep splintが使用されている.このsplintはtwo piece typeであり,上下のsplintはHarbst Attachmentによって結合されている.患者は装着時に開閉口,側方,前方運動が可能であり,違和感が非常に少なく,かなり優れたsplintである.また,下顎前方位での装着であるため,顎関節症状との関連性について長期的に経過観察が行われている.医学部のsleep labでは従来からのCPAPに加えてOPAPと呼ばれているCPAP用マスクのかわりに特製のOral Splintを装着させ経鼻陽圧ではなく経口陽圧による治療の検討が行われている.某内科病院においてポリソムノグラフィーを用いて睡眠時の状態を観察し,睡眠時無呼吸症候群(SAS)と診断された患者四十数名に対して,スリープスプリント(Thera Snore)を装着した.これらの患者のスプリント装着時における睡眠状態を再度ポリソムノグラフィーを用いて計測し,術前術後の比較検討を行った.傾向としては,いびきの減少,日中の傾眠傾向の減少,睡眠時無呼吸の減少がほとんどの患者で認められており,有用性が示唆されている.また,UCLA Sleep Centerおよび歯学部におけるSASに対する治療の現状と抱えられている問題点を把握するとともに資料収集を含め平成13年2月5日2月10日の期間UCLAを訪れ,調査を行った.UCLAでは,Oral Medicine & Orofacial Pain ClinicにおいてSASの歯科的アプローチが行われており,Prof. Glenn Clarkが考案したsleep splintが使用されていた.このsplintはtwo piece typeであり,上下のsplintはHarbst Attachmentによって結合されている.患者は装着時に開閉口,側方,前方運動が可能であり,違和感が非常に少なく,かなり優れたsplintである.また,下顎前方位での装着であるため,顎関節症状との関連性について長期的に経過観察が行われていた.医学部のsleep labでは従来からのCPAPに加えてOPAPと呼ばれているCPAP用マスクのかわりに特製のOral Splintを装着させ経鼻陽圧ではなく経口陽圧による治療の検討が行われていた.
超高周波音響情報を用いた気分障害に対する非薬物療法開発のための生物学的検討

本研究では、情報環境の適正化をはかることによって、気分障害に対する薬物治療を補完しその効果を高める新しい非薬物治療法の基盤となる作用機序の生物学的解明を目的とする研究を行った。熱帯雨林環境音を呈示した音環境でマウスを飼育したところ、通常の暗騒音条件下で飼育したマウスより、寿命が統計的有意に延長することが示され、自発活動量も有意に多かった。しかし、寿命と自発活動量の間には、有意な相関はなかった。以上から、熱帯雨林環境音を呈示した飼育環境は、マウスの自然寿命を延長させる効果をもつこと、自発活動の増加が寿命延長の主要因ではない可能性が高いことを示唆するものと考えられる。気分障害と認知症の行動・心理症状に対して、情報環境、特に音情報の適正化をはかることによってストレスを軽減し、従来の薬物治療を補完しつつその効果を飛躍的に高める新しい非薬物治療法として音響療法(ハイパーソニック・セラピー)を開発し、その臨床研究を実施している。本研究では、げっ歯類モデル動物を用いて、複雑に変化する超高周波振動情報が豊富に含まれる音情報が気分障害治療効果と予防効果を行動試験によって検討するとともに、脳内神経伝達物質の計測によって、音響療法の基盤となる作用機序の生物学的解明を目的とする。今年度は以下の研究を実施した。1げっ歯類モデル動物をもちいた実験環境の確立:音環境の厳密な比較のため、高度な音遮蔽条件をもちつつ、それ以外の環境要因はできるだけ通常と同じになるように、特注の防音飼育箱を導入し飼育環境を構築した。また、超高周波空気振動を含む音を飼育ケージ内の動物に呈示するため、特別仕様の呈示装置を構築した。2行動評価系の構築:複数の行動試験を組み合わせて総合的に評価する実験系を構築した。また、日常行動をビデオで記録して観察できるシステムを構築するとともに、活動の活発性や攻撃性などを評価する指標を抽出する。3脳内神経伝達物質計測の実験系の確立:超高周波空気振動をモデル動物に呈示しながら、同時にドーパミンやセロトニンなどの脳内神経伝達物質をIn vivo microdialysis法によって計測する手法を確立した。4上記の実験系を用いて、音響情報呈示がマウスの行動量や自然寿命に対する影響を評価する実験を実施した。その結果、熱帯雨林環境音の呈示下で飼育したマウスは、通常の暗騒音条件下で飼育したマウスより、寿命が統計的有意に延長することが示された。今年度は、実験に必要な基盤技術を確立すること、すなわち、実験環境の確立、行動試験系および脳内神経伝達物質計測系を確立することが進捗目標であったが、それらについては予定通り完了した。加えて、健康なマウスの行動量や自然寿命に対する効果を検討し、統計的有意な寿命延長の結果を得ることができた。本研究では、げっ歯類モデル動物を用いて、複雑に変化する超高周波振動情報が豊富に含まれる音情報が気分障害治療効果と予防効果を行動試験によって検討するとともに、脳内神経伝達物質の計測によって、音響療法の基盤となる作用機序の生物学的解明を目的とする研究を行った。音環境の厳密な比較のため、高度な音遮蔽条件をもちつつ、それ以外の環境要因はできるだけ通常と同じになるように、特注の防音飼育箱を導入し飼育環境を構築した。また、複数の行動試験を組み合わせて総合的に評価する実験系を構築するとともに、日常行動をビデオで記録して観察できるシステムを構築した。上記の実験系を用いて、音響情報呈示がマウスの行動量や自然寿命に対する影響を評価する実験を実施した。その結果、熱帯雨林環境音の呈示下で飼育したマウスは、通常の暗騒音条件下で飼育したマウスより、寿命が統計的有意に延長することが示され、自発活動量も有意に多かった。体重は群間で有意な差はなかった。1うつ病モデル動物に対する治療効果の検討:慢性拘束ストレス負荷によって作成したうつ病モデル動物を、通常の環境下で飼育するグループと、超高周波振動情報を含む音を呈示しながら飼育するグループとの2つのグループにわける。前年度に検討した行動評価系によって、抑うつ症状の改善効果が見られるかどうかを、継続して比較・検討する。

2健常動物に対する予防効果の検討:健常な動物を、通常の環境下で飼育するグループと超高周波振動情報を含む音を呈示しながら飼育するグループとの2つのグループにわける。強制水泳テストによるストレス耐性試験などを行い、抑うつ症状の予防効果が見られるかどうか検討する。3脳内神経伝達物質の計測による作用機序の検討:前年度に検討したin vivo microdialysis法およびPETをもちいて、超高周波振動情報を含む音をモデル動物に呈示しながら、脳内のドーパミン、セロトニンなどの神経伝達物質を計測する。神経科学音響コンテンツの制作の一部が年度内に完成しなかったため、次年度に実施することとなった。音響コンテンツの制作に使用する。
跨環型o′対照ジオールの環不斉識別による新規汎用性キラル素子の創製

我々が開発した新規汎用性キラル素子1および2を活用する応用研究を行い,以下の成果を挙げることができた.1)キラル素子1からはmethyN,O-diacetylspicigerinate(3)の初のキラル合成を行い,母核アルカロイドであるspicigerine(4)の絶対配置を確定することができた.(Scheme1)2)キラル素子1から容易に導かれるエナミノエステル5の立体選択的Michael反応を開発し,インドリチジン,キノリチジン型矢毒ガエルアルカロイドの柔軟性に富む合成経路を確立することができた.(Scheme2)3)キラル素子2からはセスキテルペンであるelemol(6)の形式的キラル合成を達成した.(Scheme3)我々が開発した新規汎用性キラル素子1および2を活用する応用研究を行い,以下の成果を挙げることができた.1)キラル素子1からはmethyN,O-diacetylspicigerinate(3)の初のキラル合成を行い,母核アルカロイドであるspicigerine(4)の絶対配置を確定することができた.(Scheme1)2)キラル素子1から容易に導かれるエナミノエステル5の立体選択的Michael反応を開発し,インドリチジン,キノリチジン型矢毒ガエルアルカロイドの柔軟性に富む合成経路を確立することができた.(Scheme2)3)キラル素子2からはセスキテルペンであるelemol(6)の形式的キラル合成を達成した.(Scheme3)
高温超伝導体・有機物超伝導体の各種輸送現象における非フェルミ液体的挙動の理論

1.高温超伝導体の擬ギャップ領域における輸送現象の理論:高温超伝導体の低ドープ領域では擬ギャップ温度T^*以下で各種物理量が擬ギャップ的振舞いを示し、そのメカニズムの解明は最近の高温超伝導体の研究における中心的課題である。最近Stanford大学のOng達により、高温超伝導体の常伝導相におけるネルンスト係数が詳細に計測され、擬ギャップ領域でネルンスト係数が著しく増大するという、通常の金属では考えられない特異な挙動を示すことが明らかになった。この実験結果から、Ong達は擬ギャップ領域で多数のボルテックス・反ボルテックス対が熱的に励起されていると考え、議論を呼んだ。一方、我々は擬ギャップ領域で強い超伝導揺らぎが発達しているという立場に立ち、フェルミ液体論の立場からネルンスト係数の計算を行った。その結果、カレントに対する多体効果であるバーテックス補正項を考慮することで、T^*以下におけるネルンスト係数及び磁気抵抗の急激な増大が再現されることがわかった。本研究により、高温超伝導における様々な輸送係数(ホール係数、磁気抵抗、熱起電力及びネルンスト係数)の複雑で特徴的な振舞いが、反強磁+超伝導揺らぎの理論に基づき統一的に理解できることが明らかになり、特に擬ギャップ領域において強力な超伝導揺らぎが発達していることが結論された。2.強相関電子系における熱・電気的輸送係数の一般理論:強相関電子系における熱流と電流が絡んだ輸送現象の研究の為には、電子相関に関する詳細な考察が必要である。Littingerの線型応答理論('64)によると熱起電力は電流と熱流の相関関数より与えられるが、熱流のオペレーターは相互作用項に由来する2体項を含むため多体電子系では一般に複雑であり、バーテックス補正の理論的解析は過去不十分であった。我々は局所的エネルギー保存則から導かれるワード恒等式に着目して,熱起電力やネルンスト係数に対する厳密かつ簡便な一般的表式を導出した。これらの表式に含まれるバーテックス補正(前方散乱項)Γ^Iを,ワード恒等式Γ^I=δΣ/δGをみたすよう計算することで,各種輸送係数に対する保存則を満たす近似(Baym-Kadanoffのconserving approximation)がはじめて可能となった。1.高温超伝導体における磁気抵抗、磁場中輸送係数:高温超伝導体では広い温度領域で磁気抵抗Δρ/ρがT^<-4>に比例し、Kohler's ruleは完全に破れている。さらに磁気抵抗、ホール係数、電気抵抗の三者の間に成立するmodified Kohler's rule:Δρ・ρ∝R_H^2=const.は、この系の磁気抵抗とホール係数の異常の背後に共通のメカニズムが存在する事を強く示唆する。そこで本研究では、磁気抵抗を必要なバーテックス補正をとり入れる手法で研究し、この未解明の現象の理論的解明に着手した。まず、久保公式に基づき緩和時間τに関する最強発散項(O(τ^3))に関して厳密な磁気抵抗の一般的表式の導出に初めて成功し、conserving approximationに基づく磁気抵抗の計算方法を確立した。次に、その表式に基づき数値計算的研究を行い、modified Kohler's ruleを満足に再現するという結果を得た。その際、カレントに対する多体効果であるバーテックス補正項が、非フェルミ液体的挙動をもたらすことが明らかになり、磁気抵抗に関する謎は解明された。本研究により、高温超伝導における異常な(磁場中)輸送現象は、反強磁性相関の効果としてフェルミ液体の立場から理解できることが明らかになった。2.高温超伝導体における熱起電力の理論:高温超伝導体では、熱起電力(S)やネルンスト係数などの熱・電気的輸送係数も顕著な異常を示すことが知られている。たとえば熱起電力は、通常金属では広い温度領域でS∝Tとふるまう。しかし高温超伝導体のSは、擬ギャップ温度T以上の高温領域では降温につれて発散的な振る舞いを示し、そのメカニズムが長年謎であった。まず我々はLuttingerの線形応答理論に基づき、0(τ)に関する厳密な熱起電力の一般的表式の導出に成功した。その際、局所的エネルギー保存則から導かれるWard恒等式を適用して、電子相関がある場合でも絶対零度まで正しい答えを与える公式を得ている。次に得られた表式に基づき、FLEX近似の範囲で必要なバーテックス補正をすべて取り入れる手法で数値計算を行い、その結果ホールドープ系ではS>0,一方電子ドープ系ではS<0という、実験結果と一致する結論を得た。

本研究により、高温超伝導における様々な輸送係数(ホール係数、磁気抵抗、熱起電力及びネルンスト係数)の複雑で特徴的な振舞いが、反強磁+超伝導揺らぎの理論に基づき統一的に理解できることが明らかになり、特に擬ギャップ領域において強力な超伝導揺らぎが発達していることが結論された。2.強相関電子系における熱・電気的輸送係数の一般理論:強相関電子系における熱流と電流が絡んだ輸送現象の研究の為には、電子相関に関する詳細な考察が必要である。Littingerの線型応答理論('64)によると熱起電力は電流と熱流の相関関数より与えられるが、熱流のオペレーターは相互作用項に由来する2体項を含むため多体電子系では一般に複雑であり、バーテックス補正の理論的解析は過去不十分であった。我々は局所的エネルギー保存則から導かれるワード恒等式に着目して,熱起電力やネルンスト係数に対する厳密かつ簡便な一般的表式を導出した。これらの表式に含まれるバーテックス補正(前方散乱項)Γ^Iを,ワード恒等式Γ^I=δΣ/δGをみたすよう計算することで,各種輸送係数に対する保存則を満たす近似(Baym-Kadanoffのconserving approximation)がはじめて可能となった。
逆磁場ピンチにおけるプラズマ電流波形の制御

逆磁場ピンチ装置ATRAS-RFPの特徴はエネルギー閉じ込め時間に最適なプラズマ電流波形を見いだすためのプラズマ電流波形の制御用として二つのオーミックコイルを装着していることである。全プラズマ電流の最大値は約150KAである。全プラズマ電流が時間的にはほぼ一定状態(flat-top電流状態)を早期に達成出来ることを変形ベッセル関数モデル(MBFM)に基づいたシミュレーションにより確かめられ、従って、MHD活性の弱いクワイセンスの早期発生及びその持続時間に最適なプラズマ電流波形が得られることが知られる。一般に早期のflat-top電流波形の放電は、MHD活性が弱くなると同時にVolt・Secが小さくて済むという利点があるが、ループ電圧が放電初期に於いて高くなるという欠点があり炉設計に不利となる。然るに、現在のような二つのオーミック電流の重ね合わせによる早期のflat-top電流波形の達成法では電圧が低くなりオーミックコイルへの衝撃的な応力が小さくなるという利点を持っている。従って、現在のプラズマ電流波形の制御法はMHD活性、Volt・Sec電圧の全ての点で従来のような一つのオーミックコイルのみのflat-top電流達成法に比し優れていると考えられる。次に、MBFMに基づいたシミュレーションの結果と実験結果の比較についてのべる。従来のRFP電流波形の場合に関して電総研のTPE-1、RM15装置での実験結果はシミュレーションの結果と良く一致している。即ち、放電初期のプラズマ電流の上昇過程では、トロイダル磁束の減少に伴ってΘ値が増大し、flat-topではほぼ一定になっている。このΘ値の増大はMHD活性を強める原因となっている。このような実験結果とシミュレーションの結果との一致はATRAS-RFP装置での実験結果に関してもシミュレーションによる予測が期待されるので、本研究の研究目的が達成可能であることを示唆している。
骨格筋損傷に有効な寒冷・温熱療法の刺激条件とは?

骨格筋損傷後の再生に重要なマクロファージの動態を調べたところ、寒冷刺激だけでなく、尾部懸垂によってもマクロファージの遊走は遅延し、筋再生が阻害された。今回、マクロファージの遊走に重要な因子であるMCP-1(CCL2)の免疫組織化学を行い、筋線維内、衛星細胞などに局在していることを明らかになり、基礎理学療法学会で学会発表を行った。MCP-1はマクロファージが損傷部に集積する前の時点で、筋線維や衛星細胞に発現していることが明らかになってきた。筋損傷の刺激によって衛星細胞が活性化され、そこにMCP-1が発現し、それによってマクロファージが筋の損傷部位へ集積するのではないか、と考えられる。マクロファージそのものにもMCP-1が発現しており、その後のマクロファージの集積をさらに呼び込んでいる可能性が示唆された。今回は筋損傷後に温熱刺激を試みた。すると、対照群よりも早く、温熱刺激を与えた動物のMCP-1発現が衛星細胞において観察できた。その後の筋線維に浸潤するマクロファージ数を経時的に観察したところ、各時点において浸潤するマクロファージ数が温熱刺激を与えた群で多いという結果を得た。筋損傷後の温熱刺激が筋再生にとってプラスの効果を与えている根拠として考えたい。本研究は国際学会で発表予定である。さらに、マクロファージのタイプが変化する可能性を鑑み、iNOSで免疫染色してM1マクロファージの動態を観察した。すると、好中球が集積、浸潤した後に衛星細胞などにMCP-1が発現し、その後M1マクロファージが集積していることが明らかとなった。M1マクロファージはNOを産生し、周囲の筋線維を溶解させる。それによって、一次的な損傷の後の二次的な筋損傷が拡大していく可能性が示唆された。また、NOによって衛星細胞が刺激され、集積する可能性も考えられた。本結果も早期に発表予定である。研究成果を学会発表していっている。論文作成準備段階である。現在、M1マクロファージの免疫染色としてiNOSを使用している。iNOSが各種温度刺激により、損傷筋内でアップレギュレートしているのかをWestern blottingで確認中である。M2マクロファージも免疫染色で明らかにしていきたい。さらには筋再生が進行しているかどうかを調べるため、衛星細胞をPax7で同定し、MyoDと共発現するのかどうかを調べたい。骨格筋損傷後の再生に重要なマクロファージの動態を調べたところ、先行研究通り、寒冷刺激でマクロファージの遊走は遅延し、再生は阻害された。今回、先行研究で報告されていた寒冷刺激時間を10分に短縮して、同様な解析を行った。すなわち、CD68免疫組織化学を行い、マクロファージの動態を観察した。その結果、寒冷刺激時間を短縮するとマクロファージの初期の遊走が阻害されていた。また、マクロファージの損傷筋繊維への浸潤度が低かった。しかし、20分寒冷刺激を加えた群よりはマクロファージの集積は阻害されていなかった。その後の筋再生を見ると、10分寒冷刺激を与えた群は、20分間寒冷刺激を与えた群よりも再生筋線維数は若干の再生筋線維の早期の再生、再生筋線維の成熟が見られたが、寒冷刺激を与えない群よりは再生、成熟ともに阻害されていた。さらに、マクロファージの遊走に重要な因子であるMCP-1(CCL2)の免疫組織化学を行い、筋線維内、衛星細胞などに局在していることを明らかになりつつある。MCP-1はマクロファージが損傷部に集積する前の時点で、筋線維や衛星細胞に発現していることが明らかになりつつある。すなわち、筋損傷の刺激によって衛星細胞が活性化されると、そこにMCP-1が発現し、それによってマクロファージが筋の損傷部位へ集積するのではないか、と考えられる。もしかしたら、マクロファージそのものにもMCP-1が発現し、その後のマクロファージの集積をさらに呼び込んでいる可能性も示唆された。研究成果が集積しつつあるため、次年度以降で公表の準備に入っていきたい。

さらに、マクロファージのタイプが変化する可能性を鑑み、iNOSで免疫染色してM1マクロファージの動態を観察した。すると、好中球が集積、浸潤した後に衛星細胞などにMCP-1が発現し、その後M1マクロファージが集積していることが明らかとなった。M1マクロファージはNOを産生し、周囲の筋線維を溶解させる。それによって、一次的な損傷の後の二次的な筋損傷が拡大していく可能性が示唆された。また、NOによって衛星細胞が刺激され、集積する可能性も考えられた。本結果も早期に発表予定である。研究成果を学会発表していっている。論文作成準備段階である。今後はMCP-1の免疫組織化学だけでなく、IGF-1、MyoD、CD-8をマーカーにして、筋再生にマクロファージやその他細胞が与える影響を観察し、寒冷刺激でこのような因子の発現がどのように変化するかを明らかにしていきたい。現在、M1マクロファージの免疫染色としてiNOSを使用している。iNOSが各種温度刺激により、損傷筋内でアップレギュレートしているのかをWestern blottingで確認中である。M2マクロファージも免疫染色で明らかにしていきたい。さらには筋再生が進行しているかどうかを調べるため、衛星細胞をPax7で同定し、MyoDと共発現するのかどうかを調べたい。消耗品の発注後、値引きがあったために生じた余十分であり、ほぼ計画通り使用している。消耗品の発注後、値引きがあったために生じた余十分が次年度使用額として計上されたものである。ほぼ計画通り使用している。本次年度使用額は少額ではあるが、次年度の実験用消耗品に使用する計画である。