hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ソノポレーションを併用したホウ素中性子捕捉療法

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)ではホウ素化合物としてパラボロノフェニルアラニン(BPA)とボロカプテイト(BSH)が使用される。本研究では音響穿孔法(ソノポレーション)を用いて細胞膜に一過性の小孔を形成し、これらホウ素化合物の腫瘍細胞内濃度の向上をめざした。ヒト口腔扁平上皮癌の培養細胞ならびにヌードマウス腫瘍において、ソノポレーションで腫瘍細胞のホウ素濃度は上昇し、その後の中性子照射すなわちBNCTで、腫瘍細胞の増殖阻害が顕著となった。ソノポレーションはBNCTの抗腫瘍効果を増強する上で有用と考えられた。ホウ素中性子捕捉療法はあらかじめ腫瘍に取り込ませたホウ素が中性子を捕捉することで飛程距離の短い放射線を発生させ、腫瘍細胞を選択的に破壊する治療である。臨床では、ホウ素化合物としてパラボロノフェニルアラニン(BPA)とボロカプテイト(BSH)が使用される。本研究は低出力超音波を用いたソノポレーションによって、細胞膜に一過性の小孔を形成してホウ素化合物を取り込こませ、BNCTの効果を高めることを目標としたもので、初年度は培養ヒト口腔扁平上皮癌細胞SASでホウ素化合物の細胞内への取り込みがソノポレーションで向上することを明らかにした。本年はヌードマウスの口腔癌モデルを用いて、腫瘍内ホウ素濃度の測定を行った。SAS細胞の担癌ヌードマウスの腹腔内にホウ素化合物を投与し、2時間後に腫瘍にマイクロバブル存在下の超音波照射(S)を行って、腫瘍内ホウ素濃度を測定したところ、BPA、BSHのいずれの場合もソノポレーションによって上昇がみられた。次にBPAあるいはBSH投与後にソノポレーション、中性子照射を行う実験を行った。これらを組み合わせた実験群は、中性子単独(N)、BPA+N、BPA+S+N、BSH+N、BSH+S+Nであり、各実験群におけるヌードマウス腫瘍の物理線量は、それぞれ4.59、8.15、8.98、4.96、5.76 Gyであった。抗腫瘍効果に関して、BPA+N群ではN群と比較して腫瘍増加は抑制されたが、腫瘍の退縮には至らなかった。しかしながら、ソノポレーションを併用したBPA+S+N群では、腫瘍は顕著に縮小した。BSH+S+N群では明らかな効果は見られなかった。生存率において、BPA+S+N群で延長がみられ、他の実験群との間で有意差を認めた。したがって、ソノポレーションは腫瘍内のBPA濃度を上昇させ、BNCTの抗腫瘍効果を増強するものと考えられた。ホウ素中性子捕捉療法はホウ化合物をあらかじめ腫瘍に取り込ませ、ホウ素が中性子を捕捉することで飛程距離の短い放射線を発生させ、腫瘍細胞を選択的に破壊する治療である。ホウ素化合物として、パラボロノフェニルアラニン(BPA)とボロカプテイト(BSH)が使用される。BSHは濃度勾配で細胞内に移行するが、BPAはアミノ酸トランスポーターにより取り込まれる。そのため、静止期癌細胞ではBPA濃度が低下する。そこで、本研究では音響穿孔法(ソノポレーション)によって、細胞膜に一過性の小孔を形成してホウ素化合物を細胞内にとりこませ、BNCTの効果を高めることを目標とした。1.ヒト口腔扁平上皮癌細胞SASの懸濁液にBPAあるいはBSHを50 ppmの濃度で添加して旋回培養を行い、細胞内ホウ素濃度をICP-MSにて測定した。その結果、細胞内のホウ素濃度はBSHでは3 ppmの低いレベルであったが、BPAでは次第に上昇し、2時間で15 ppmとなった。2.ホウ素化合物を含む培養液で2時間培養したのち、マイクロバブル(MB)存在あるいは非存在下に超音波照射(US)を行った。実験群として非処理対照群、MB群、US群、MB+US群を設定した。BPA、BHSのいずれにおいても、MB+US群で、ホウ素濃度はそれぞれ、対照の1.6、3.5倍にまで上昇した。3.培養SAS細胞に対するBNCTでは、非処理対照群、中性子(N)群、MB+US+N群を設定した。MTT assayならびにコロニー形成法を行ったところ、いずれのホウ素化合物でも細胞増殖はMB+US+N群で最も強く抑制された。MTT assayの場合、BPA使用のN群とMB+US+N群との間で有意差を認めた。したがって、ソノポレーションは細胞内のBPAとBSH濃度を上昇させ、BNCTの抗腫瘍効果を増強するものと考えられた。口腔扁平上皮癌細胞ならびに癌組織内のホウ素濃度測定を誘導結合プラズマ質量測定計(ICP-MS)でppmレベルまで測定できることを確認した。培養癌細胞において、マイクロバブルを用いたソノポレーションを行うとBPAならびにBSHの細胞内への取り込みが向上した。このホウ素濃度が上昇した細胞に、原子炉から発生する熱中性子の照射、すなわちBNCTを行った結果、BNCTの細胞増殖抑制効果は増強することが明らかとなった。

初年度の研究で、培養ヒト口腔扁平上皮癌細胞に対するソノポレーションの効果が明らかとなったので、今後はヌードマウス腫瘍に対するソノポレーションを併用したBNCTの効果を検討する。さらに、腫瘍組織におけるソノポレーションの影響、BNCTの効果、アミノ酸トランスポーターの発現について、組織レベルで明らかにし、現在実施されているBNCTの臨床成績の向上に繋げたい。次年度は、ヌードマウス皮下に形成したヒト口腔扁平上皮癌組織を主な対象として、ソンポレーションを併用したBNCTの効果について検討する。1.静止期の細胞にいかにしてホウ素化合物を導入するかが重要である。そこで、静止期細胞を再現するため、血清濃度の低下や抗腫瘍薬5FUの添加で増殖能を低下させた口腔扁平上皮癌SAS細胞の系を作成し、ソノポレーションによる細胞内ホウ素濃度の上昇を調べる。2. SAS細胞を4週齢雌Balb/cヌードマウスの後足大腿部の皮下に接種して腫瘍を形成する。腫瘍径が5 mmになったのち、腹腔内にBPAでは250 mg/kg, BSHでは75 mg/kgを投与し、腫瘍内ホウ素濃度が上昇する2時間後にマイクロバブルを腫瘍内に投与し、トランスデュサーを腫瘍に密着させて超音波照射を行う。超音波照射条件は1 MH、出力1 W、duty cycle 20%で、時間は30秒、1分、2分と変化させる。直ちに腫瘍を採取し、組織中のホウ素濃度をICP-MSを用いて測定する。3. BNCTの抗腫瘍効果をみるため、超音波照射後に1 MWで運転中の京都大学原子炉から発生する熱中性子を照射する。腫瘍組織ホウ素濃度と熱中性子フルエンスから放射線物理線量を算定する。BPAあるいはBSHを腹腔内投与し、腫瘍へのソノポレーション後に熱中性子照射を行い、経時的に腫瘍径を測定して腫瘍体積を求める。4. BNCTによる腫瘍の組織変化につき、熱中性子照射後、経時的に腫瘍を採取し、HE染色標本を作成して組織像を観察する。BPAの取り込みはアミノ酸トランスポーターを介するため、抗LAP1抗体を用いた免疫組織化学染色でその発現を調べる。
サイクル域光パルスにより誘起される巨大加速度現象に関する研究

本年度は、サイクル域光パルスに関する以下の成果を得た。1.石英ファイバー中の12fs(4.5サイクル)光パルスの非線形伝播に関して、すべての次数の分散、遅延ラマン応答を含む非線形応答を取り込んだ時間領域有限差分(FDTD)法による計算を行い、別に行った実験結果をよく再現する結果を得た。この結果から、12fsのような時間領域では、石英ファイバーの遅延応答ラマン効果を考慮することが重要であることを見いだした。2.アルゴンガス充填ファイバー中に、チタニウムサファイアレーザー増幅器からのフェムト秒光パルス(基本波,中心波長780nm)を伝播させ、自己位相変調効果を効率的に生じさせることにより超広帯域コヒーレント光波発生を発生する。この光波を、回折格子、凹面鏡、空間位相変調器によって構成される4f-非線形チャープ補償光学系により位相補償した。この空間位相変調器のみによる位相補償により、従来用いられてきたフリンジ分解自己相関法より正確な周波数分解光ゲート装置を用いた測定では世界最短パルス幅5.0fs、サイクル数2.2サイクルの極短光パルスの発生に成功した。3.上記周波数分解光ゲート装置よりもより広帯域光パルスを測定可能な電場再構築スペクトル干渉装置を作製し、世界最短パルス幅5.0fs、サイクル数2.2サイクルの極短光パルスの発生に成功した。また、この方法により、1オクターブを超える超広帯域パルスの電場振幅・位相の測定にも成功している。4.高エネルギー領域の振動状態を効率よくコヒーレントに選択励起する手法として、その振動状態周波数とパルス列繰り返し周波数、ならびに光周波数差とを同時に一致させた2色フェムト秒パルス列励起法の提案を行い、この手法に我々が行っている波長多重波形整形技術が有用であることを示した。本年度は、以下の成果を得た。1.アルゴンガス充填ファイバー中に、チタニウムサファイアレーザー増幅器からのフエムト秒光パルス(基本波;中心波長780nm)を伝播させ、自己位相変調効果を効率的に生じさせることにより超広帯域コヒーレント光波発生を発生する。この光波を、回折格子、凹面鏡、空間位相変調器によって構成される4f-非線形チャープ補償光学系により位相補償し、パルス幅4.1fs、サイクル数1.8サイクルの極短光パルスの発生に成功した(フリンジ分解自己相関法による測定)。2.サイクル域のような極短光パルスはその超広帯域性から、反射といった単純な現象でも反射係数の波長分散により位相の変調を受けてしまう。また、非線形相互作用に関しても、その非線形性の波長分散が極短光パルスに大きな影響を与える。したがって、このような極短光パルスの場合、その発生と同時に重要となることは、特性を測定する装置を作製することである。本研究では、超広帯域に適した光学部品を用いることにより、サイクル域光パルスの測定に耐え得る周波数分解光ゲート測定装置(FROG)ならびに直接電場再構成用スペクトル位相干渉計(SPIDER)を作製し、どちらも5.0fs(2.2サイクル)の光パルスの測定が可能であることを確認した。3.サイクル域光パルスの伝播を考える場合、従来の光パルス解析法で用いられている包絡波近似を用いることはできない。包絡波近似を用いず、Maxwell方程式を直接解く方法として、新たに「Fourier直接法」の開発、ならびに時間領域有限差分(FDTD)法によるモノサイクル光パルスの伝播解析を行った。これら2つの方法は、従来の計算では取り込まれていなかった後方伝播、光3次高調発生をも考慮しているという特徴を持つ。また、これらの解析結果は、1.における超広帯域光パルス発生結果とよく一致している。4.巨大加速度現象による熱輻射・赤外光発生の際に重要となる物質の3次非線形光学応答の測定も行った。
小学生の習熟度レベルに応じた走運動の評価・指導法の開発

小学校生の走運動の循環モデルを作成し、36点の運動観察的な動作の評価尺度を構成した。小学生553名を対象に50m走の中間疾走部の動作画像並びに走速度を分析し、構造方程式モデリングにより走運動循環モデルが妥当に走運動動作を評価できていることを確認した。また、習熟度レベルに応じた走動作の重要性を明らかにし、小学14年生では、学年が進むにつれて重要となる動きが項目反応理論の結果から順序だって説明でき、走動作と走スピードとの高い関連性が確認できた。小学校5・6年では、走スピードは向上するが走動作が向上せず、思春期の急増期に動作がうまくできない時期が存在することが明らかとなった。小学生における走動作について、動作因果関係モデルを作成し、そのモデルの適合度について検討した。研究の主要な手順は、1動作の因果関係を示すモデルを特性要因分析を応用して表し、そのモデルの応性概念妥当性を検証するために、構造方程式モデリングを適用した。2さらに走動作の基準関連妥当性を検証するために、項目反応理論を用いて、各走動作の特性値を求めると共に、対象者の動作得点を算出し、走記録との関連性を検討した。本年度は評価観点の追加など有る場合に備えて、特に走動作の発達の著しいといわれる3年生に限定して評価を行い、年齢差による記録の向上を排除した。対象者は小学3年生男子43名、女子49名、合計92名であった。50m走において、25-35m区間の走動作を側方および前方より毎秒60コマで撮影した。その映像をスローモーションならびにコマ送りで再生し、36観点の走動作の評価を行った。探索的因子分析の結果より、キャッチープッシュ動作と離地脚のスイング動作の動作因果関係を考慮し、スイング動作、キャッチング動作、乗り込み動作、弾性運動、プッシュ動作の循環型モデルを構成した。モデルの適合度はモデルの適合度はχ2=77.91(df=50)、GFI=0.886、AGFI=0.823、RMR=0.020、RMSEA=0.078であった。潜在変数として、乗り込み動作→弾性運動→プッシュ→脱力・スイング→脚ムチ動作の循環を確認することができた。項目反応理論を用いた動作の評価では、スイング動作からキャッチ動作に移行する膝の高さ(困難度=2.378、以下省略)ならびに膝の角度(1.469)が難しい動作であることが明らかとなった。また児童の疾走タイムと動作得点の間にはr=-0.791(p<0.01)の関連性が見られ、走動作と疾走タイムの関連性は高かった。小学校の体育における基礎的な運動動作の中で走運動(ジョギングと全力疾走)に焦点を絞り、運動観察的な動作の評価尺度を構成する。本年度は、走運動の運動観察法による評価に関する先行研究をレビューし、走運動の動作因果関係を考慮した評価観点に関わるモデルを提案することを目的とした。Dillman(1975)や小林(1990)の走動作のサイクルを考慮しつつ、天野(1985)、宮下(1986)、八木(1988)、Haywood & Getchell(2005)などをレビューした。これらの走運動の多くの評価観点は、足部の動作に注目されており、前方への移動相において足部の移動が高い位置であること、スプリンターでは接地相とキック相のバランスが重要であることが指摘されている。これに走サイクルの情報を付加すると、振り下ろし局面やキック局面についての観点が不十分であった。また、腕の振り方の評価として、交互前後方向に振られていることが指摘されている。しかし、足の動きと腕の動きの連動に関する記述はなく、評価観点に加える必要がある。今日までの走動作の評価では、主に足と腕の動きの指摘が主であるが、これらの動きを支える体軸についての評価は十分に行われていない。以上のレビューに基づき、走動作の因果ー観察モデルはフィッシュボーンダイアグラムを適用して作成され、地面キャッチ、ドライブ、スイング動作の3個の主要な動き、25の観測観点を含むサイクルモデルを考案した。これらの観点を用いて撮影された小学生30人の中間疾走フォームを予備的に分析した。因子分析の結果、2因子が抽出され、、第1因子に21変数が高い因子負荷量を示し、また走時間との間にr=-0.374の有意な相関が得られ、走技能を反映していることが示唆された。しかしながら、ピッチとストライドの観点が十分に評価基準に含まれていないなど、改善点も明らかとなった。昨年度までに予備的解析を含めて作成した動作の因果関係モデルの36個の評価観点を用いて、小学校3・4年生189名の50m走における25-35m区間の疾走の走動作を側方および前方より毎秒60コマで撮影し、その映像をスローモーションならびにコマ送りで再生し、走動作を分析した。また当該区間における疾走タイムを光電管を用いて測定し、疾走速度を用いた。走動作の一次元性確保のために、カテゴリカル主成分分析を用いて、第一主成分との負荷量が0.4以上の26項目を解析の対象とした。動作の特性を明らかにするために、項目反応理論の段階反応モデルを用いて、各動作項目の困難度、識別力並びに対象者の能力値を求めた。

項目反応理論の適用に際して、問題となっていた局所独立の仮定について、対象者を能力値によって5つのグループに分類し、それぞれのグループ内で動作因果関係が仮定できる項目間の独立性をカイ2乗検定を用いて確認した。項目反応理論を用いた動作の評価では、スイング動作からキャッチ動作に移行する膝の高さならびに膝の角度、腕振りの肘の動き、離地時のプッシュの強さ、そして、弾み感が難しい動作であることが明らかとなった。疾走速度と動作得点の間にはr=0.842の関連性が見られた。また、簡易評価として、膝の最高点、乗り込み動作、前腕の振り下ろし動作、腕振りの肘の動きならびに肘の角度、弾み感、プッシュの七項目を用いた結果、全評価項目を用いた場合の得点とr=0.953であり、また疾走速度との間にr=0.841の関連性が見られ、簡易測定項目でも適切に走動作を評価できることが明らかとなった。本研究では小学生の50m走中間疾走局面における運動観察法による走動作について,走運動全体に与える各動作の関与の程度ならびに各動作の動作の難しさがどのように学年によって変化するかを検討することを目的とした。対象者は奈良県の小学校に在籍する小学生男子257名、女子278名、合計553名であった。50m走において、25-35m区間の走動作を側方および前方より毎秒60コマで撮影した。その映像をスローモーションならびにコマ送りで再生し、走動作の評価として、昨年度までに構築した)の36の評価観点(図1,表2)を用いて評価した。評価した動作について、動作達成率ならびに1次元性を確認できた25項目に対して,項目反応理論(IRT : Item Response Theory)を適用し,項目特性値ならびに各個人の動作能力値を算出した。算出した能力値に対して,学年と性別を要因とした2元配置の分散分析を施し,学年差のみ有意であることを確認した上で,学年別(1・2年生,3・4年生,5・6年生)別に再度IRTを適用し,3・4年生を基準に得られた項目特性値ならびに能力値を等化し,有効となる変数ならびに特異項目機能より,動作の難しさなどの変化を検討した。また,得られた能力値と疾走スピードの間の関連性を検討した。その結果,腕振りなどの上半身の動作,接地動作は1・2年生では走動作に連動していないことが明らかとなった。走動作は4年生までは改善するが,それ以降は大きな変化が見られないことが明らかとなった。加えて,5・6年生ではスピードは向上するが、動作得点が向上しない場合もあり、第二次性徴を迎えた子どもは,スピードが高いが身体のコントロールが難しく,動作のバランスが悪くなる傾向にある。以上を踏まえて、それぞれの発達段階での走運動の指導の方法について、考察することができた。小学校生の走運動の循環モデルを作成し、36点の運動観察的な動作の評価尺度を構成した。小学生553名を対象に50m走の中間疾走部の動作画像並びに走速度を分析し、構造方程式モデリングにより走運動循環モデルが妥当に走運動動作を評価できていることを確認した。また、習熟度レベルに応じた走動作の重要性を明らかにし、小学14年生では、学年が進むにつれて重要となる動きが項目反応理論の結果から順序だって説明でき、走動作と走スピードとの高い関連性が確認できた。小学校5・6年では、走スピードは向上するが走動作が向上せず、思春期の急増期に動作がうまくできない時期が存在することが明らかとなった。本年度中に小学校1年生6年生の全対象者550名の解析を修了する予定であった。
電子線直接描画選択成長法による量子細線形成法の研究

本研究は、電子ビ-ムを用いた表面改質効果によるCaF_2上への半導体の選択成長を新しいメゾスコピック構造の製作法として提案し、その可能性を明らかにすること目的として行っている。本年度は、電子ビ-ム露光とGaAs成長とを分離して選択成長ができるプロセス(以下、分離プロセスと称する)の開発と、これにより集束電子ビ-ムを用いて細線構造を実現することを具体的目標とした。分離プロセスに対しては、CaF_2の表面清浄度の維持が重要である。この対策として、CaF_2表面に金属Asの膜を堆積してプロセス中の汚染から保護する方法を検討した。まず、MBE成長室中で室温以下に冷却した試料上に金属As膜を均一に堆積する条件を明らかにした。この方法でCaF_2上に約300nmのAs膜を堆積して、その保護効果を調べたところ、大気中への取り出しに対しても大きな効果があることがわかった。また、この保護層をGaAs成長前に完全に除去するために700°Cの熱処理が必要であるが、これによっても電子ビ-ム露光領域の改質表面には影響が無いことを確めた。続いて、金属As保護膜を透過してCaF_2を電子ビ-ム露光するエネルギ-およびド-ズ量の最適化を行い、これをもとに集束電子ビ-ムによるパタ-ン露光を行い、GaAs細線の選択成長を試みた。その結果、線幅約10μmの線状パタ-ンの選択成長に成功した。ビ-ム径(<1μm)に比べてまだパタ-ン幅が広いことについては、金属As保護膜におけるビ-ムの散乱や二次電子の影響等が考えられるが、現在検討中である。線幅を小さくするためには、現在並行して検討を進めている、(1)真空搬送法、(2)水素ラジカルによる表面処理の方法、を併用することによって、保護膜を薄くするないしは全く用いなくすることが有効と考えている。
インスリン様成長因子II(IGF-II)の病態生理的意義に関する研究

インスリン様成長因子II(IGF-II)の病態生理学的意義に関して以下の検討を行った。抽出操作なしの血清IGF-IIのWestern immunoblotの臨床応用の有用性の検討:大分子量IGF-IIの検討にはWestern immunoblot(WIB)法が用いられるが,IGF-IIは血中でIGFBPと結合して存在するため,酸-エタノール抽出物をサンプルとしてを用いてきた。本研究ではこの前処理なしに全血清を用いて,より簡便に大分子量IGF-IIの検出する方法を確立した。腫瘍組織におけるIGF-II遺伝子のloss of imprinting(LOI)に関する検討:IGF-II産生NICTHでのIGF-II遺伝子のLOIについてallele-specific PCR法を用いて検討した。10例の組織で全てに発現しており,7例がヘテロ接合体であった。この7例のうち5例にLOIが認められた。Apa Iによる制限酵素断片長多型を用いた方法と比較したところ,Apa Iを用いた場合一例においてLOIが認められるともとれる薄いバンドを検出したが,AS-PCRでは認めなかった。以上の成績よりAS-PCR法はIGF-II遺伝子のLOIを検討するために,簡便かつ有用な方法であることが示唆された。インスリン様成長因子II(IGF-II)の病態生理学的意義に関して以下に示す検討を行った。血糖を呈するIGF-II生産膵外腫瘍での低血糖の発症機構の検討:低血糖を呈する膵外腫瘍(non-islet cell tumorhypoglycemia:NICTH)にはIGF-IIを産土するものがあるが,このIGF-II産生NICTHでは血中IGF-IIは必ずしも高値でなく,IGF-II値のみで本症の低血糖を説明することはできない。この低血糖の発症にlGF-IIの作用を調節するIGFBPが関与することが考えられている。IGFBP-3はその多くは150kDaのIGF-IGFBP-3-ALSの三量体として存在するが,他のIGFBP同様に血中ではIGF-IGFBP複合体の二量体(40kDa)としても存在する。我々は本症では血中IGFBP-3の減少,IGFBP-2の増加およびIGF-IIは三量体を形成せず,多くは二量体として存在することを報告してきた。二量体IGF-IIは遊離型IGF-II同様に毛細血管を通過しうるが,三量体IGF-IIは通過できず,この三量体の形成不全がbioavailableなlGF-IIの増加を来たし,低血糖を引き起こすのではないかと考えられる。そこで,IGF-II産生NICTH33例において,三量体の構成成分であるALSをRIAおよびWestern immunoblot(WIB)にて測定した。血中ALS値は0.511.6mg/Lに分布し,平均3.5±0.5mg/Lと健常成人に比し有意に低値であった(16.2±0.5mg/L:P<0.001)。腫瘍を摘出後,低血糖が消失した6例では,術後,血中ALS値は有意に増加した(5.9±1.4mg/L,vs11.2±1.8mg/L;P0.05)。WIBでは<血中ALSは健常人と同様に80/78kDaのdupletとして検出され,ALSのサイズに差異を認めなかった。WIBで測定した血中ALS値(管理血清の%で算出)は28.3±3.8%と低値であり,この値はRIAで測定したALS値と有意な正の相関を認めた(r=0.85,P<0.0001)。以上の成績はIGF-II産生NICTHでの三量体形成不全にALSの減少が関与することを示唆するものである。また,本症での大分子量IGF-II自身の変化が低血糖に関与することが考えられる。本症の大分子量IGF-IIは正常にもわずか認められる大分子量IGF-IIと同様に0型糖鎖と結合したpro-IGF-II-(El-21)であったが,その糖鎮のサイズは症例によって異なり,正常でみられるものよりも大であった。抽出操作なしの血清IGF-

IIのWesterm immunoblotの臨床応用の有用性の検討:IGF-II産生NICTHのスクリーニングにはWestern immunoblot(WIB)法による大分子量のIGF-IIの測定が有用であるが,IGF-IIは血中でIGFBPと結合して存在するため、WIBのサンプルとして血清IGF-IIの酸-エタノール抽出物を用いてきた。本研究ではこの前処理なしに全血清を用いて,より簡便に大分子量IGF-IIの検出が可能か否か検討した。血清量として410μLを用いて抽出操作なしのWIBでは酸-エタノール抽出物を用いたWIBと同様にIGF-IIのサイズの解析は可能であり,より簡便にスクリーニングしうる方法であると考えられた。インスリン様成長因子II(IGF-II)の病態生理学的意義に関して本年度は以下に示す知見を得た。低血糖を呈する膵外腫瘍が産生する大分子量IGF-IIの性状【結果】N端側(E10-21)を認識する抗体ではNICTHでは1820kDaの免疫活性を認めたが,健常人血清ではごくわずかな免疫活性(10kDa)を認めた。C端側(E71-89)抗体ではNICTHでは10kDaの免疫活性を認め,この抗体がIGF-IIを認識しないことから,C端fragmentと考えられた【考案】NICTHにおける大分子量IGF-IIはfull lenghth proIGF-IIではなく,そのprocessingの結果生成されるpro-IGF-II-(E1-21)であり,その副産物のC端fragmentも血中に存在することが示唆された。
リボソームのタンパク質合成メカニズムの1分子機能解析

タンパク質合成の活性を評価するためにはまず、合成されたタンパク質を1分子レベルで可視化する必要がある。その計測系については前年度の報告書で述べたが、その成果が論文として発表された(Uemura, S. , Nucleic Acids Research2008)。同時計測系の構築は難航しており、現在AOD(音響光学素子)を用いて蛍光励起用レーザーと光ピンセット用赤外レーザーを交互にON-OFFする実験系の構築を試みている。一方、我々は新しい計測技術(ZMW法)を用いて従来では計測不可能であった高濃度蛍光色素存在下において、ZMW基板に固定したリボソーム分子への蛍光tRNAの結合をはじめて直接観察することに成功した。ZMW基板はアルミニウムを蒸着させた石英基板に100nm程度の穴を電子線で開けることにより、穴の内部で近接場を発生させイメージングを行う方法である。これにより1μM蛍光tRNA存在下においてリボソーム分子への3段階の階段状の蛍光強度変化が観測された。これは3つのtRNA分子が同時にリボソーム結合部位に結合できることを示唆しており、従来モデルにはない新しいモデルを提唱することができた。そこで基板に固定したリボソームを用いて蛍光タンパク質である変異GFPを翻訳させた。さらに新生タンパク質である変異GFPがリボソームから解離できないようなSecM配列を導入したことにより、翻訳過程をイメージングすることに成功した。また、変異GFPの成熟過程を1分子レベルで調べることにより蛍光発生過程を捉えることができた。これらの成果はタンパク質合成の活性を調べられるだけでなく、タンパク質翻訳メカニズムや新生タンパク質がどのようにフォールディングし機能を発揮するのかをリアルタイム計測により解明するための重要な手法となる。これらの成果は現在論文投稿中である(Uemura, S., Submitted 2008)。一方、同時計測系では、光ピンセット用赤外レーザーによる蛍光分子の退色を解消するために、AOD(音響光学素子)を用いて蛍光励起用レーザーと光ピンセット用赤外レーザーを交互にON-OFFする実験系の構築を試みた。現在はAODをレーザー光路に挿入後、光軸調整を行っている段階である。光軸調整の次の段階では赤外レーザー照射時に蛍光色素の退色の影響を調べ、力測定が可能な光ピンセットバネ定数を保持しているかどうかを検討する必要がある。
巨視的機能発現を目指した金属ポルフィリン・配位子導入ゲル集積システムの構築

金属ポルフィリンとアミノ酸の配位結合により高分子ヒドロゲルが自己集積するシステムを構築した。鉄ポルフィリン(Fe-Por)とL-ヒスチジン(L-His)をそれぞれポリアクリルアミドゲルに導入した。Fe-PorゲルとL-Hisゲルを緩衝液中で振とうすると、接触すると同時に2種類のゲルが接着した。Fe-PorゲルとL-Hisゲルの集積体にL-Hisの水溶液を添加すると、個々のゲルに解離した。これらのゲルを洗浄すると再びゲルが自己集積した。このゲル着脱は可逆的なpH応答性を示した。平成25年度は本研究において中心的な役割を果たす材料合成を行った。鉄ポルフィリン又はL-ヒスチジンをそれぞれ導入したポリアクリルアミドゲルを合成した。これら2種のゲルの合成は、最初にN-スクシンイミド誘導体をアクリル酸モノマーに修飾し、これをアクリスアミド、ビスアクリルアミドとの共重合により行った。鉄ポルフィリンゲルは、プロトポルフィリン鉄錯体内の2つのカルボン酸の片方にアルキルジアミンを反応させて末端にアミノ基を導入し、先に合成したプレカーサーゲルと縮合反応を行うことにより合成した。合成した2種類のゲルを水中で振とうさせて、2種類のゲルが接着するか否かを確認した。鉄ポルフィリンと軸配位子(L-ヒスチジン)のゲルへの導入率を可変させたところ、両成分の導入料増大に伴い、ゲルの接着力が強まることがわかった。また、その接着力は、接触する2つのゲル界面の面積に比例することがわかった。一方、フリーベースポルフィリン(金属がポルフィリンの中心に無いもの)を固定したゲルとL-ヒスチジンゲルは接触させても2つのゲルが固定化・接着することはなかった。フリーベースポルフィリンゲル中のポルフィリンにメタル(ここでは鉄)イオンの導入反応を行ったところ、最初は接着していなかったゲルが、ポルフィリンのメタレーション反応が進行するにつれて接着するようになった。ポルフィリンの中心元素である鉄にヒスチジンが配位下結果、2種のゲルが接着したと考えられた。ゲルの集積体に過剰量のヒスチジン水溶液を添加するとゲル集積体は解離し、ヒスチジン水溶液を取り除くと再び2種のゲルが接着するという可逆性が見られた。昨年度に引き続き鉄あるいは亜鉛ポルフィリンを結合したポリアクリルアミドゲル並びにL-ヒスチジンゲルとの水中での接着現象に注目した。鉄ポルフィリンと軸配位子(L-ヒスチジン)のゲルへの導入率を可変させて、それぞれのゲル間の接着挙動を観察した結果、各機能性分子導入率の増大に伴って接着力の増大が観察され、再現性を確認できた。本年度は天然酵素の一つである西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)を熱応答性合成高分子の一つであるN-isopropylacrylamide (NIPAM)に導入することで、天然高分子特有の機能に人工系による機能を付与した、新たな機能性高分子材料の開発を試みた。全モノマー濃度を1Mとし、NIPAM (98 mol%), N,N'-Methylenebisacrylamide (1mol%) ,アクリル酸(1 mol%)から、架橋度1%のNIPAM-アクリル酸共重合ゲルを合成した。40 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC)、40 mM N-hydroxysuccinimide (sulfoNHS)をゲルに添加したのち、HRPを加えて、HRP導入NIPAMゲルを合成した。合成したゲルは、20°Cでは0.21 gであったが、37°Cでは0.15 gに収縮する熱応答がみられた。ゲルに修飾した触媒の特性を評価するため、HRP導入NIPAMゲル、過酸化水素0.2 mM存在下、ピロガロール18 mMの酸化反応を観察した。HRP修飾ゲルを浸した基質溶液の温度が20°Cのときと37°Cのときでは異なる反応挙動を示すことがわかった。本研究課題では天然のヘム酵素をモデルとして、金属ポルフィリンと配位子、さらには金属ポルフィリンと配位性アミノ酸含有タンパク質をそれぞれ高分子材料に導入することで、新たな機能性高分子集積体を創製することを目的とした。金属ポルフィリンと配位子を導入した高分子ヒドロゲルの集積では、鉄ポルフィリン(ヘム)とヒスチジンをそれぞれ導入したヒドロゲルが水中で振とうするだけで接着し、その接着をpHによって制御できた。本年度はこの現象を拡張し、ヒスチジンに代わり、アポタンパク質(ここでは西洋わさびのペルオキシターゼからヘムを取り除いた生体高分子)をアクリル酸、アクリルアミド、そしてビスメチレンアクリルアミドからなる高分子ヒドロゲルに導入したゲルを用いた。その結果、これらのゲルに導入したヘムとアポタンパク質の固定量、およびゲル界面の面積に応じて接着強度が変化することを見出した。一方、ヘム導入ゲルとポリアクリルアミドゲル(アポタンパク質を導入していないゲル)、あるいはポリアクリルアミドゲルとアポタンパク質導入ゲルを接触させても、接着することはなかった。これらのことからヘムがアポタンパク質に取り込まれることによりゲルが接着することが分かった。さらに、これらのゲルが接着することにより、天然酵素ホーソラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)と同様の酸化反応が進行することを見出した。天然酵素HRPの基質となるABTSをこれらのゲルに内包させて、2種のゲルを接着されると、基質の酸化反応生成物(青色の化合物)がゲルの界面より生成していることが観察できた。この反応は2種ゲルを剥離することで停止できた。

この反応の促進・停止をゲルの接着・剥離により制御できることがわかった。金属ポルフィリンとアミノ酸の配位結合により高分子ヒドロゲルが自己集積するシステムを構築した。鉄ポルフィリン(Fe-Por)とL-ヒスチジン(L-His)をそれぞれポリアクリルアミドゲルに導入した。Fe-PorゲルとL-Hisゲルを緩衝液中で振とうすると、接触すると同時に2種類のゲルが接着した。Fe-PorゲルとL-Hisゲルの集積体にL-Hisの水溶液を添加すると、個々のゲルに解離した。これらのゲルを洗浄すると再びゲルが自己集積した。このゲル着脱は可逆的なpH応答性を示した。平成26年度は接着したゲルが天然のカタラーゼやペルオキシダーゼのような酸化還元酵素と同様の触媒能を有するか、天然酵素とは異なる触媒能を有するかを検討する計画のもとで実験を行なった。共重合するモノマーとしてアクリルアミド以外に様々なモノマーとしてイソプロピルアクリルアミドを選び、触媒反応の基質となる化合物との相互作用を調整した。アクリルアミドとイソプロピルアクリルアミドではゲルに導入した酵素の反応性が異なることがわかり、予測通り、天然酵素に合成高分子を導入することで基質の酸化反応挙動が異なることを見出しており、計画通りに進展している。高分子化学本ゲル接着系ではゲルを構成しているポリマー鎖の密度と動きの自由度を変えることができる。構成成分(モノマー単位)や架橋剤の濃度を可変することにより、金属ポルフィリン近傍の活性中心・反応中心となる空間を自由に調整することができる。この空間は溶媒や温度、pH等の外的要因によっても制御可能になると予想されるため、同一材料でありながら反応の種類に応じた最適化が可能になると考えられる。このように至適温度や至適pHを有する天然酵素とは性質を異にする「人工酵素」の創製を目指す。本研究の計画段階における予測の通り、2種類のヒドロゲル間に特異的な相互作用がもたらされるような因子をゲルにそれぞれ固定することにより、これまで分子レベルで観察されてきた分子間の相互作用を材料の接着現象として利用することができた。配位結合を介した材料接着であり、可逆的に高分子材料が接着・解離することがわかった。これらの基礎研究結果をもとに、金属ポルフィリンと軸配位子との組み合わせに限らず、アポ酵素と補因子をそれぞれ導入した高分子ゲルや、合成配位子を固定したゲルを用いて金属イオン添加により高分子ゲルが集積するようなシステムの構築ができるのではないかと期待している。本年度は天然酵素であるペルオキシダーゼを高分子ヒドロゲルに導入して天然高分子と合成高分子のハイブリッド化にともなう機能発現実験、ならびにこのペルオキシダーゼからヘムを抜き出し、アポタンパク質とヘムをそれぞれ別々の高分子ヒドロゲルへ固定することで、アポタンパク質と補因子のドッキングによる不均一触媒創製を行う実験を計画していた。研究の進展に伴い、前者のハイブリッド化における詳細検討により合成高分子の役割を解析することになった。一方、後者のアポタンパク質とヘムの各成分分離も同時進行しているが、現時点では少量を用いた試行実験である。今後、量産した上で合成高分子へ化学反応を介して固定することになる。
水銀汚染を受けた水田におけるメチル水銀の生成とその生態系への影響

水銀汚染を受けた水田土壌でのメチル水銀の生成とその生態系への影響を調べるため,10 mg/kgとなるように土壌にHg(II)イオンを添加した模擬水田を調製し稲の育成を進めた.2015年から3年間同一の土壌を用いて稲の栽培を行い,その期間の土壌や稲を試料として採取した.結果として,水田土壌ではHg(II)イオンの添加により容易にメチル水銀が生成し,その濃度は土壌組成や環境により変化することが確認された.また米の水銀濃度は,メチル水銀濃度の高い土壌で栽培されたものほど高いことが確認され(玄米で最大1.3 mg/kg),実際に玄米に含まれる水銀の80%ほどがメチル水銀であった.本研究では,水田土壌の水銀汚染レベル(水銀濃度),汚染形態(金属水銀,硫化水銀,水銀イオン,酢酸フェニル水銀etc.),土壌環境(化学成分,温度,水分量,pH etc.)をコントロールし,メチル水銀がどのような環境で生成しやすいのか,そして生成したメチル水銀がどのような挙動(存在形態・場所,移動,生体への取込)を示すのかを詳細に明らかにすることを目的として実験を進めた.今年度は,人工水銀汚染土壌(土壌に10 ppmとなるように水銀イオンを添加)をバケツに調製し,湛水条件で土壌でのメチル水銀の生成と稲への取り込みを調査した.結果として,水銀添加一ヶ月後の試料採取でメチル水銀の生成が確認され,1年間を通して総水銀濃度に対するメチル水銀濃度の割合が0.1%程度の状態であった.この土壌で育てた稲の玄米からは0.5 ppm程度の総水銀濃度が検出された.今後の米の評価法を確立するため,採取した1つの稲穂において各籾に含まれる水銀に差がないか等についても検討を進めた.また籾を部位別(籾殻,胚芽,ぬか,胚乳)に分け,各部位の水銀濃度とメチル水銀濃度について検討したところ,特に胚芽において高い水銀濃度が確認され,またすべての部位で含まれる水銀の80%がメチル水銀であることが確認された.研究期間内で稲を栽培できる回数が限られているため,水銀汚染土壌での稲栽培を1年前倒しで実施した。結果として,水田土壌への無機水銀添加によりメチル水銀が生成し,それが米に蓄積することを確認できた.昨年度に引き続き,無機水銀を10 mg/kgになるように添加した土壌をバケツに調製し,稲の育成を行った.昨年度,最大0.2 mg/kgまでメチル水銀の生成が確認された市販育苗土だが,今年度は同様に調製したものでも最大0.04 mg/kg程度のメチル水銀生成であった.これは設置している温室の温度等の環境の違いによるものと考えている.加えて昨年度使用した土壌や,土壌環境を変化させるためにフミン酸や酸化鉄を加えた土壌でも実験を進めており,これら土壌について現在分析を進めているところである.稲については昨年度採取されたものの測定を完了した.結果,最も高濃度なもので玄米中の総水銀濃度が1.2 mg/kgに達するものが確認された.この玄米は最大(0.2 mg/kg)のメチル水銀が確認された市販育苗土で栽培されたものであり,一方,無機水銀を10 mg/kgになるように添加してもメチル水銀がほとんど生成しなかった(0.005 mg/kg以下)土壌で栽培された玄米では,総水銀濃度は0.06 mg/kg程度であった.つまり,土壌中で生成したメチル水銀が優先的に玄米に蓄積していると言える.一穂中の玄米を一粒ずつ測定したところ,総水銀濃度にほとんど変化はなかった(CV 10%程度)が,穂ごとでは濃度が倍近く変わっているものもあった.これは穂の育成時期に差があり、育成時の土壌中メチル水銀濃度が反映されているのではないかと考えている.また籾の成長段階ごとに試料を採取して測定したところ,籾の重量と水銀量の関係に直線関係が得られた.これは籾の成長中は,水銀濃度が一定であることを意味し,籾の成長に合わせ水銀が取り込まれていることを示しているといえる.稲の栽培と土壌採取,土壌測定と稲の測定があるため,稲(米)の測定が完了しないまま次の稲の栽培をスタートしている.結果,目的をもって栽培状況を変更できていない.しかし,様々な状況でのデータが蓄積されつつあり,研究は順調に進んでいるといえる.無機水銀濃度が10 mg/kg程度になるように調製した土壌を昨年に引き続き使用し(3年目),稲の育成を進めた.結果,この土壌のメチル水銀生成濃度(最大値)は,初年度に比べ低下していっていることが確認できた.これは添加した水銀イオンが最も化学変化を受けやすく,徐々にその存在形態がメチル水銀になりにくい無機水銀形態に変化していっているためと考えられた.また昨年度より,フミン酸や酸化鉄を土壌に加えることでメチル水銀生成に変化があるか確認を進めてきた.しかし,明確な差を確認することができなかった.この原因は,同一条件・設置環境の栽培ポットでも土壌で生成されるメチル水銀濃度が大きく異なったためである.実験室での土壌のみの生成実験では,再現性よくメチル水銀が生成していたこと,この実験では小型のバケツを利用しており,稲の根がバケツ全体に張り巡らされていたことなどから,稲(の育成)が土壌状態に影響を与え,メチル水銀濃度を変化させたのではないかと考えている.

米の水銀濃度は,土壌で生成するメチル水銀濃度が下がったことから,初年度に比べ低く高いものでも0.5 mg/kg程度であった(初年度1.3mg/kg).また28年度に同一バケツで栽培された稲穂でも,穂ごとに水銀濃度が2倍程度異なったことから,29年度は,各穂の出穂日を記録し,穂(籾)が土壌環境(土壌のメチル水銀濃度)を反映して,濃度変化が起こっているのか確認を進めた.しかし,同一出穂日であっても籾に含まれる水銀濃度は異なった.これは稲の根の状態などが影響しているものと考えている.このように土壌でのメチル水銀生成の時空間変化と,稲の成長とそれに伴うメチル水銀取込みが同時に起こるためデータ解釈が難しいことから,メチル水銀がどのように稲に取り込まれるのかについて水耕栽培による予備検討を進めた.水銀汚染を受けた水田土壌でのメチル水銀の生成とその生態系への影響を調べるため,10 mg/kgとなるように土壌にHg(II)イオンを添加した模擬水田を調製し稲の育成を進めた.2015年から3年間同一の土壌を用いて稲の栽培を行い,その期間の土壌や稲を試料として採取した.結果として,水田土壌ではHg(II)イオンの添加により容易にメチル水銀が生成し,その濃度は土壌組成や環境により変化することが確認された.また米の水銀濃度は,メチル水銀濃度の高い土壌で栽培されたものほど高いことが確認され(玄米で最大1.3 mg/kg),実際に玄米に含まれる水銀の80%ほどがメチル水銀であった.土壌の化学組成と無機水銀の化学形態とメチル水銀生成について,コニカル管を用いた室内実験を進める.これと同時に昨年度の結果から,土壌の状態がメチル水銀生成に重要と考えられる結果が得られたため,各種電極と間隙水採取のための装置を取り付けた水銀汚染水田バケツにて稲の育成をすすめ,土壌の状態変化と水銀の化学形態変化に関する詳細な知見を得る.また稲,特に籾の水銀取り込みについて,成長段階と水銀量を詳細にモニタリングする.水銀汚染土壌で水銀の化学形態変化と稲への影響を同時に検討してきたが,1.土壌中のメチル水銀濃度が稲の栽培期間の間に大きく変化する.2.生成したメチル水銀が優先的に米に蓄積する.この2点が明らかになったため,土壌でのメチル水銀生成と米のメチル水銀取込みを分けて考えるため,「湛水した土壌における水銀の化学形態変化」と「水耕栽培によるメチル水銀の稲への取り込み」の2テーマに大別して研究を進める.29年度が最終年度であるため、記入しない。環境分析化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
抗ウイルス自然免疫応答解析による上気道疾患病態解明と治療戦略個別化の探索

RSV感染で誘導されるI,III型インターフェロンの産生をクラリスロマイシン(CAM)は抑制した.これには転写因子としてのIRF3が関与しているが,CAMはIFN-βのプロモーター領域の転写因子活性を抑制することが分かった.RSVで誘導されるリン酸化にはCAMは関与していないが,CAMはpoly I:CやRSV感染によりIRF3の二量体形成,細胞質から核内への移行するのを阻害してすることで炎症性サイトカイン産生やIFN誘導抑制効果を示すと考えられ,気道上皮のウイルス炎症を抑制する薬剤の新たな機序を解明した.また,ストレス顆粒やNIP-SNAPとウイルス性炎症とのかかわりを解明した.ウイルスのライフサイクルと宿主細胞の相互作用の検討:呼吸器ウイルスは上皮細胞への感染・複製・放出を経て発症し,その後宿主の防御機構によりウイルスが排除される.このウイルスのライフサイクルと宿主細胞の機能を検討することで,宿主のウイルス自然除去能が評価できる.そこで,臨床的検討としてRSウイルス感染の小児の鼻汁を用いた遺伝子解析をおこなっている.すでに倫理委員会へプロトコールを提出している.許可が得られれば,実際の臨床検体を用いたウイルスと宿主細胞の相互作用,特にウイルス排出機構との関連が明らかになる.ウイルス排除と重症化バイオマーカーを探索し本年の学会に発表予定である.基礎的検討としては,インターフェロンのウイルスの排除機構についての検討を開始している.ウイルス排除機構を検討する前に,ウイルス排除が阻害されている系として,上皮細胞へのウイルス持続感染系を確立し,これを応用して,ウイルスがなぜ排除されないのか,インターフェロンとはどのように関与しているかを検討することとし,今年度からこの課題を中心に検討を進めている.上皮細胞でのIFN誘導経路の抑制について検討をおこなうことにより,サブタイプの機能についての解析につながる.また実際に使用されている薬剤がウイルス感染時に抑制的に働くものをスクリーニング中である.この研究の応用として,IFN産生系にどのように作用しウイルスを除去する際の作用点について検討を進めている.さらに,ウイルスの鼻粘膜上皮感染による防御的粘液分泌の変化:粘液分泌にはMUC5AC遺伝子の関与が報告されている.今年度は粘膜上皮でのこの遺伝子発現とロイコトリエンの関与について検討し発表した.この研究はウイルス感染の自然免疫機構についての検討であり,ウイルス防御とのかかわりについて検討した.本年度は上気道ウイルス感染とIII型IFNに関して以下の2つの成果を得た.1.humanrespiratory syncytialvirus:以下HRSVは生後2歳までにほぼ100%の乳幼児が初感染を受けるが,その中にしばしば上気道炎にとどまらず重篤で特徴的な下気道感染症,細気管支炎をおこすことが知られている。近年,HRSVは宿主細胞に強力な免疫誘導を起こすことが指摘されており,分担者である横田らは肺胞上皮由来細胞株に対するHRSV処置後の炎症性サイトカインの産生誘導が、CAMの投与によって抑制されることを報告している(Yokota S et al. 2012)。しかし鼻粘膜上皮に関しての検討は行われていない。そこで,鼻粘膜上皮細胞を用いて,HRASV感染による各種サイトカイン誘導能を検討すること,およびCAMを含めた複数の抗菌薬を用いて,HRASV感染によって誘導されたサイトカイン産生がどのように影響を受けるのかを検討した。予備的な結果では,既報告と同様に各種抗生剤は濃度依存性あるいは非依存性にHRASV感染によって誘導されるIL-8産生を抑えることが示唆された。2.麻疹ウイルスはリンパ球系に感染するが,免疫抑制作用により全身にウイルスが広がる.この機序の一つとして抗ウイルス物質の産生が抑制されると考られ,その詳細な機序について検討した.各種のインターフェロンで誘導される遺伝子発現により抗ウイルス活性物質は誘導されるが,麻疹感染細胞ではI型さらにIII型IFNにより誘導された遺伝子発現は抑制され,活性節何時の産生も抑制されていた.興味深いことに,この抑制はウイルスの株により異なり,抑制を強く誘導する株が病原性の高い麻疹ウイルスと考えることができる..III型インターフェロンのサブタイプの研究は少し遅れているが,各種ウイルスによる上皮細胞さらに麻疹ウイルスを用いたリンパ球系細胞への感染実験における抗ウイルス作用の抑制についての検討が進んでおり,この点では大きな成果が得られた.さらに現在,細胞内ストレス顆粒やλインターフェロンサブタイプの結果も出てきており.次年度には研究成果として論文発表できるものと思われる1.抗ウイルス作用を示す薬剤の機序解明クラリスロマイシン(CAM)は抗菌効果以外にも多くの作用が知られている.CAMは気道上皮細胞においてRSウイルス(RSV)によって誘導されたinterleukin (IL)-6、IL-8を抑制するが、その作用機序は不明である.hTERT導入鼻粘膜上皮細胞、肺胞上皮由来細胞株A549を用いてRSV感染に対するCAMの免疫調節効果の機序を探った.これらの細胞にRSV感染を行い、CAMの影響を検討した。CAMは気道上皮細胞におけるRSV感染においてIFN-λの産生を抑制した.転写因子活性ではA549にRSV感染を行うと、活性化されたIFN-βP-125とPRD III-I(IRF3結合ドメイン)制御下のレポーター活性はCAM処置により抑制された.免疫染色でIRF-3の細胞内局在を検討すると、CAMはRSV感染により細胞質から核へ移行するIRF-3を阻害した.

CAMはRSVにより誘導されるIRF-3の核移行を抑制することで、シグナル伝達経路を止めていることが示唆された.2.ウイルス感染時に出現するストレス顆粒の研究ストレス顆粒はウイルス感染時に細胞内に出現するが,その作用はウイルス抑制と促進の両者の性質を持つ.ムンプスウイルス感染系を用いてこのストレス顆粒の作用機序を経時的に観察した.PKR依存性に出現するストレス顆粒はIII型インターフェロンの産生を一部抑制することが分かったことから,ストレス顆粒が部分的に感染促進的に働いていることが推定された.3.麻疹ウイルスのIFN誘導遺伝子に対する作用IFNにより誘導されるISGはウイルスに対する抵抗性を獲得するための重要な機序の一つである.麻疹ウイルスが全身に播種される機序として免疫機構に対する直接作用が考えられているが,ISGに対する強い抑制作用を野生株の麻疹ウイルスにが持っていることが分かった.インターフェロン,特にIII型インターフェロン(IFN)に注目してきた.この理由はIII型IFNが粘膜上皮から主に産生されること,粘膜に感染するウイルスに対する初期の防御作用に重要であることからである.上気道の最前線に位置する鼻粘膜がは呼吸器ウイルスのターゲットであり,特に小児のウイルス感染は免疫学的に未熟であること,あるいはワクチンの普及に関する問題点などから,新しい治療戦略の開発が急がれている.このことから本課題では,III型IFNの基礎研究の中からこの問題点の解決法を模索している.現在までに,マクロライド系の抗ウイルス作用(RSウイルスに対する抑制作用),抗炎症作用の機序に関し新たな知見を得た.IRF3の核内意向が重要であること,また,ミトコンドリアタンパクが子の作用機序に関与していることも明らかにした.さらに,ムンプスウイルス感染系を用いた検討では,PKR依存性に出現するストレス顆粒がウイルス抑制効果を持つIFN産生を抑制することも分かった.麻疹ウイルス感染の免疫抑制作用の機序として,野生株のウイルス抑制物質産生遺伝子を抑制する効果が実験室株よりも高いことが分かったなど,III型IFNの基礎的研究が順調に進んでいる.Type I, III IFNはあらゆるウイルス感染に対して宿主の炎症反応を惹起することで、非特異的な抗ウイルス効果を発揮する。産生されたtype I, III IFNは細胞のIFN受容体に作用し、細胞を抗ウイルス状態に導く。しかし、ウイルスがその細胞ですでに感染している状況では、その高度な炎症惹起反応が逆に宿主に有害であることが近年指摘されているクラリスロマイシン(CAM)は抗菌効果以外に抗炎症作用を持つことが知られている。その中でもRSウイルス誘導性pro-inflammatory cytokinesを抑制することが確認されているが、その作用機序は不明である。我々はヒト由来上気道上皮細胞を用いてRSV感染を行い、CAMの持つ抗炎症作用機構を詳細に検討した。我々はCAMが新たにRSV誘導性type I, III interferons (IFNs)の産生を抑制することを発見した。