hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵癌の循環血中腫瘍細胞における細胞骨格タンパク質の役割の解明

TOFタイプのMSであるため前年度に使用したOrbitrap型MSとはペプチド検出のパターンが異なり、これまでと同様のMRMプログラムでは検出感度が著しく減少し、特にvimentinでは検出が困難となった。そのためペプチド検出パターンの再スクリーニングを行い、新しいフラグメントパターンによるMRMプログラムを用いた検出を試みたが、検出感度の大幅な改善は見られなかった。今後は、引き続きフラグメントパターンを精査し感度の高いMRMプログラムを構築していくのと同時に、他のEMT特異的発現タンパク質、特にvimentinより全長の長いタンパク質における絶対定量法の確立を検討していく。また、LC/MSによる絶対定量法が確立次第、次の目標である膵癌細胞におけるEMT発現タンパク質の発現パターンを評価するために、膵癌以外の癌細胞の発現パターンも解析し比較していく予定である。医歯薬学平成25年度の達成度は、「3やや遅れている」と考えられる。当初目標としていた「EMTにおける細胞骨格タンパク質の発現パターン変化の解析」を行う上で最重要となるE-cadherinとvimentinのLC/MSによる絶対定量法確立の土台作りを達成できたものの、その後の検量線検討、細胞のクルードタンパク質における検出検討まで進むことができなかった点が判断の根拠である。やや遅れた理由として、所属研究機関変更に伴う分析機器の変更による、使用調整に手間取ったこと、テーマに関して若干の軌道修正があったことが挙げられる。精密機械であるMSは、製造元が違うとそれを扱うためのアプリケーションも異なり、安定して分析操作ができるまで若干時間を要す。そのような環境変化の中、着目している2つのタンパク質のMRMプログラム設定までは達成できたため「遅れている」との判断はしなかった。前年度のnestinから始まりE-cadherin、vimentinと、安定的にタンパク質絶対定量のためのペプチドMRMプログラムの設定が着実に可能となってきていることは、今後別のタンパク質においてもより効率的にプログラムを設定するための知見と経験が蓄積してきたことを示唆している。平成24年度の達成度は、「2おおむね順調に進展している」と考えられる。「ヒト膵癌培養細胞の同所移植によるマウス転移モデルを用いた循環血中腫瘍細胞(CTCs)の分離採取」という今年度の目的に対し、(1)転移モデルマウスの血中からCTC細胞としてDsRed陽性細胞を分離採取できた点、(2)次年度の目標である「LC/MSによる細胞骨格タンパク質発現パターン解析」の足掛かりとなる、培養細胞サンプル中nestinをLC/MSで検出できた点、が判断の根拠である。(1)当初マウス一匹からの血中DsRed
古代鉄試料の放射性炭素年代測定のための試料調製法の簡便化

古代鉄製品の製作年代は,鉄中に残存する,製鉄や精錬に用いられた木炭起源炭素の14C年代測定から求まる.本研究では,鉄中炭素の抽出方法について検討した.これまで高周波加熱炉を用いて炭素回収を行ってきたが,新たな方法として,石英管封管法による鉄中炭素の抽出法を検討した.削り状の金属鉄については,鉄試料と助燃剤酸化銅の重量比を0.2以下にすることで,95%以上の炭素収率が達成できた.また,古代遺跡から回収される機会が多い鉄サビから抽出される炭素を用いて鉄の作成年代を推定する方法を検討した.鉄サビの14C年代測定が可能になれば,古代の製鉄や鉄の利用に関する研究が飛躍的に発展するものと期待される.古代の鉄製品の製作年代は,製鉄の時に酸化鉄の還元剤として用いられた木炭由来の炭素が鉄中にわずかに残っており,その炭素を回収して放射性炭素年代測定を行うことから推定されている.これまでの鉄中の炭素抽出は,高周波加熱炉を用いて金属鉄中の炭素を二酸化炭素として回収することが一般的に行われてきた.しかしこの方法では,高周波加熱装置が必要となる.そこで,封管法による鉄中の炭素抽出の検討を開始した.炭素含有率が明らかな鉄試料について,封管法を適用してCO2を抽出しその14C年代を測定した.その結果,(1)封管法で削り状の鉄試料中の炭素が抽出できる.(2)用いる鉄試料の量が少ないほど,炭素回収率は高い.(3)さらに,回収した炭素について14C測定を行った結果,現代の溶鉱炉作成鉄について数万年前の年代を示し,微量の現代炭素による汚染を示す年代が得られた.本年度は鉄サビからの炭素抽出と14C年代測定を行った.その結果以下のことが明らかとなった.(1)封管法でサビ鉄試料中の炭素が抽出できることが明らかとなった.残念ながら,炭素含有率が不明のため回収率は確認できない.(2)今回処理した9個のサビ鉄試料のうち,5個が加熱中に破裂した.炭素回収のため燃焼に用いるサビ鉄試料の量の調節を適正に行う必要がある.(3)一試料のみであるが,鉄サビから回収された炭素の14C年代を測定した.測定結果は,鉄サビ中の炭素として元来"dead carbon"であったものが,見かけの14C年代2949±24 BPを示した.これは,現代炭素が約70%混入していることに相当する.(4)今後,年代が既知の古代鉄のサビをこの方法で分析することにより,サビによる鉄の製造年代推定の確からしさを検討する予定である.今回の実験結果が示すところでは,サビの発生プロセスにおいて鉄試料の外界からの炭素の混入が推察される.古代鉄製品の製作年代は,鉄中に残存する,製鉄や精錬に用いられた木炭起源炭素の14C年代測定から求まる.本研究では,鉄中炭素の抽出方法について検討した.これまで高周波加熱炉を用いて炭素回収を行ってきたが,新たな方法として,石英管封管法による鉄中炭素の抽出法を検討した.削り状の金属鉄については,鉄試料と助燃剤酸化銅の重量比を0.2以下にすることで,95%以上の炭素収率が達成できた.また,古代遺跡から回収される機会が多い鉄サビから抽出される炭素を用いて鉄の作成年代を推定する方法を検討した.鉄サビの14C年代測定が可能になれば,古代の製鉄や鉄の利用に関する研究が飛躍的に発展するものと期待される.古代の鉄製品の製作年代は,製鉄の時に酸化鉄の還元剤として用いられた木炭由来の炭素が鉄中にわずかに残っており,その炭素を回収して放射性炭素年代測定を行うことから推定されている.これまでの鉄中の炭素抽出は,高周波加熱炉を用いて,高周波加熱と同時に酸素と金属鉄との酸化発熱反応で高温にして金属鉄を溶融して,金属鉄中の炭素を二酸化炭素として回収することが一般的に行われてきた.しかしこの方法では,加熱炉装置とCO2の分離・抽出真空ラインが必要となり,更に手間のかかる実験となる.そこで,名古屋大学のAMS施設では別なCO2抽出方法として封管法による鉄中の炭素抽出の検討を開始した.今年度は,予備実験として,炭素含有率が明らかな鉄試料について,封管法を適用してCO2を抽出しその14C濃度(年代)を測定した.炭素抽出実験では,削り状の鉄を外径6mmの石英管に入れ,それを鉄試料の重量の2倍強の酸化銅と共に外径9mmの石英管に入れ,真空に排気したあと石英管を封じきって,1000°Cで15時間加熱した.燃焼ガス中のCO2を精製・回収し,グラファイトに変えて,名古屋大学のタンデトロン加速器質量分析計を用いて,その14C濃度(見かけの年代)を測定した.今回実施した金属鉄試料に含まれる炭素の抽出実験の結果,及び今後の検討課題として,以下の4点が明らかとなった.(1)封管法で削り状の鉄試料中の炭素が抽出できる.(炭素回収率:75%100%)(2)用いる鉄試料の量が少ないほど,炭素回収率は高い.(鉄試料の重量が酸化銅の15%以下の場合には炭素回収率は100%に達する.(3)表面積/体積比の高い微粒子状や削り状の鉄では,鉄中炭素の回収ができることが明らかとなった.今後,おおきめの鉄塊試料をもちいてテストする必要がある.(4) 14C年代については,高周波加熱炉法と比較する必要がある.

古代の鉄製品の製作年代は,製鉄の時に酸化鉄(鉄鉱石や砂鉄など)の還元剤として用いられた木炭由来の炭素が鉄中にわずかに残っており,その炭素を回収して放射性炭素年代測定を行うことから推定される.これまでの鉄中の炭素抽出は,高周波加熱炉を用いて金属鉄を加熱溶融し、鉄中の炭素を二酸化炭素として回収することが一般的に行われてきた.しかしこの炭素回収方法では,高周波加熱装置が必要で手間がかかる.そこで,石英管封管法による鉄中の炭素抽出の検討を進めた.炭素含有率が明らかな鉄試料について,封管法を適用してCO2を抽出しその14C年代を測定した.その結果,(1)封管法で削り状の鉄試料中の炭素が抽出できる.(2)用いる鉄試料の量が少ないほど,炭素回収率は高い(0.2%以下とするとほぼ100%の回収率).(3)回収した炭素について14C測定を行った結果,現代の溶鉱炉で作製された鉄について数万年前の年代を示し,ごく微量の現代炭素による汚染の可能性が示唆された.また鉄サビからの炭素抽出と14C年代測定を行った.その結果以下のことが明らかとなった.(1)封管法でサビ鉄試料中の炭素が抽出できることが明らかとなった.残念ながら,炭素含有率が不明のため回収率は確認できない.(2)今回処理した9個のサビ鉄試料のうち,5個が加熱中に破裂した.炭素回収のため燃焼に用いるサビ鉄試料の量の調節を適正に行う必要がある.(3)鉄サビから回収された炭素の14C年代測定結果は,鉄サビ中の炭素として元来"dead carbon"であったものが,見かけの14C年代2949±243244±27 BPを示した.これは,現代炭素が約6770%混入していることに相当する.今回の実験結果が示すところでは,サビの発生プロセスにおいて鉄試料の外界からの炭素の混入があり,サビ鉄の14C年代測定は困難と結論される.文化財科学金属鉄からの炭素抽出法はほぼ成功した.次に,鉄さびから抽出される炭素を用いて,鉄の作成年代を推定する方法を検討した.鉄サビから炭素を抽出する方法を検討した.一つ目の試料は,佐賀県の製鉄炉跡から回収された鉄サビである.土壌に覆われたサビ鉄を含む褐色の塊から鉄サビと思われる部分を採取して3組に分けた.2試料は永久磁石に対する反応は無かったが,一つは永久磁石に対して弱い反応を示した.二つ目は,長さ5cm程度の現代の鉄釘である.表面はサビていたが磁石にしっかりと反応した.三つ目は,大工作業に用いられる鉄釘であり,これらも表面はサビていたが磁石にしっかりと反応した.これらの試料をさらに分割して,試料からの炭素抽出及び14C年代測定を行った.石英管に封管した鉄サビ試料から二酸化炭素を回収するために,5個の試料につき,電気炉に入れて900°Cで8時間加熱したところ,隣り合う4個は加熱により破裂してしまった.最左に位置した試料のみが破裂を免れた.そこで,加熱条件については,温度を下げ(850°C ),加熱時間を短く(3時間)設定した.破裂を免れた試料について14C測定が終了した1試料は, 14C年代として2949±24 BP,δ13Cとして-15.4±1.0‰が得られている.この試料の起源は,石炭を用いて近代溶鉱炉において製鉄された鉄を起源としており,鉄釘に元々含まれていた炭素は14Cを含まないと考えられる.すなわち,鉄釘が大気中に放置された間に進んだサビ化において,14Cを含む炭素が鉄サビ中に付加され,平均的に見かけ上2949 BPに相当する14C濃度(69.3±0.2 pMC)に落ち着いたものと解釈される.
ジオキシンの発生障害作用の諸種環境要因による修飾

2、3、7、8四塩化パラジオキシン(TCDD)は極めて毒性の強い物質でマウス、ラットなどの実験動物で発生障害作用を示すことが知られている。一方、グルタチオンは活性のハロゲンやニトロ基をもつ化合物と抱合体を生成し、毒性物質の解毒、排泄に重要な役割を果たしている。また、TCDDの代謝にはチトクロームP-450モノオキシゲナーゼ系が関与しているとされる。本研究では、体内のグルタチオン濃度を低下させるブチオニン・スルホキシミン(BSO)、または肝臓のチトクロームP-450モノオキシゲナーゼを誘導する3メチル・コランスレン(3MC)前処置により、マウスにおけるTCDDの発生障害作用がどのように修飾されるかを検討した。Jcl:lCRマウスを交配し、前処置として、妊娠12日(膣栓=0日)にプロピレン・グリコールに懸濁したBSOの200mg/kg、または妊娠8日にコーン・オイルに溶解した3MCの50mg/kgを腹腔内に投与した。次に催奇形処置として、妊娠12日にコーン・オイルに溶解したTCDDの5ないし20μg/kgを経口投与した。妊娠18日に胎仔を取り出し、口蓋裂及び水腎症の有無を検索したところ、BSOによってはTCDDの口蓋裂及び水腎症誘発作用はほとんど修飾されなかった。3MCによる修飾実験では、TCDD20μg/kg投与による口蓋裂の頻度が、コーン・オイル前処置群で82%であったのに、3MC前処置群では57%とやや低下した。現在例数を増し、用量反応関係を検索中である。なお、これまでに得られたデータから、胎仔の性によるTCDDの催奇形作用に対する感受性の差を調べたところ、口蓋裂誘発に関しては明瞭な性差は認められなかったが、水腎症誘発に関しては明らかに雄胎仔の方が雌胎仔よりも感受性が高かった。TCDDの発生毒性感受性に性差が見られたことは、TCDDとステロイド・ホルモンの作用発現機構の類似性の観点から興味深く、今後さらに追究したい。
工場的利用をめざす二酸化炭素固定化酵素の構造-機能相関解析

ポリエチレングリコールで精製、結晶化したホウレンソウRuBisCoについては筑波高エネルギー物理学研究所放射光実験施設で高分解能の回折強度のデーター測定に成功した。それによって得られたデータを用いて構造解析を行った結果、2.0A分解能で結晶学的信頼度因子R=19.0%という精度での立体構造が得られた。得られた構造を、すでに2.4A分解能での解析が報告されている硫酸アンモニウムで精製結晶化したRuBiscoの構造と比較したところ、酵素活性を調節すると報告されたリジン残基の構造に違いが確認された。また、大腸菌PEPCについては、我々のこれまでの研究で結晶化の方法を確立しており、六方晶系のもの(P6222,a=131 A,c325 A)と斜方晶系のもの(I222,a-119A,b=252 A,c=83 A)とがあるが、斜方晶系の方が構造解析に適している。そこでNative結晶について回折強度測定を理学電気社製RAXIS-IICを用いて行い、3.41A分解能までの独立な反射9476個(収率87.6%)をRmerge7.43%という精度で測定した。引き続き構造解析に必要な重原子同型置換体結晶の作成を行ったところ重原子同型置換体結晶が得られたので"X線回折強度を測定し、Native結晶のデーターとあわせて構造解析した。また、単位格子が大きいことおよび迅速測定が可能であることから、放射光をりようしてNative結晶及び重原子同型置換体結晶のX線回折強度測定を行った。現代文明がもたらす過度の二酸化炭素放出から地球環境を守るために、新しい科学技術の開発が求められている。二酸化炭素固定の技術には生物的固定と化学的固定の両面から考えられなければならないが、本研究では生物的固定の工学的利用をめざす基礎となる研究を進める。本研究の対象は、ホウレンソウ等のC3植物の光合成において二酸化炭素の固定を触媒するリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RuBisCO)とトウモロコシ等のC4植物において同様の機能を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)であり、これらの結晶構造解析をX線回析法によって行うことにより、その構造-機能相関を解析することである。ホウレンソウのRuBisCOは従来硫酸アンモニウムで精製されたものが良く研究されており、すでに2.4A分解能の構造解析が報告されているが、最近の研究では硫酸アンモニウムで精製された酵素に比べポリエチレングリコール(PEG)で精製されたものはネイティブ酵素により近い反応性を示し、基質結合部位以外に活性制御部位の存在することが示唆されている。本研究の平成5年度の特筆すべき成果は、ホウレンソウのRuBisCOをPEGを用いて精製し、これまでにない良質の単結晶を得ることが出来た点である。結晶学的データの決定を行い、すでに2.5A分解能の回折強度を測定した。蛋白質データバンク(PDB)に登録されている硫酸アンモニウムで精製されたホウレンソウのRuBisCOの構造を用いて分子置換法で構造解析を進めたところ、構造解析に成功した。現在、さらに高分解能のデータ測定を行い構造の精密化を進める予定である。また、光合成細菌ChromatiumvinosumのRuBisCOについては、すでに結晶化を行っており、同様の研究を進める。タイプの異なる二種の二酸化炭素固定化酵素の構造-機能相関の解析を基に、その工学的利用をめざしたい。ポリエチレングリコールで精製、結晶化したホウレンソウRuBisCoについては筑波高エネルギー物理学研究所放射光実験施設で高分解能の回折強度のデータ測定に成功した。それによって得られたデータを用いて構造解析を行った結果、2.0A分解能で結果学的信頼度因子R=19.0%という精度での立体構造が得られた。

得られた構造を、すでに2.4A分解能での解析が報告されている硫酸アンモニウムで精製結晶化したRuBiscoの構造と比較したところ、酵素活性を調節すると報告されたリジン残基の構造に違いが確認された。また、大腸菌PEPCについては、我々のこれまでの研究で結晶化の方法を確立しており、六方晶系のもの(P622,a=131A,c=325A)と斜方晶系のもの(I222,a=119A,b=252A,c=83A)とがあるが、斜方晶系の方が構造解析に適している。そこでNative結晶について回折強度測定を理学電気社製RAXIS-IICを用いて行い、3.41A分解能までの独立な反射9476個(収率87.6%)をRmerge7.43%という精度で測定した。引き続き構造解析に必要な重原子同型置換体結晶の作成を行っており、重原子同型置換体結晶が得られれば、X線回折強度を測定し、Native結晶のデータとあわせて構造解析する。また、単位格子が大きいことおよび迅速測定が可能であることから、放射光をりようしてNative結晶及び重原子同型置換体結晶のX線回折強度測定を行う予定である。
相互運用可能な双方向グラフ変換に関する研究

データの相互変換は情報システムにおける重要な操作であるが、双方向変換は、その変換をこえて双方向に更新を伝播させることができる。本研究は、双方向変換の(1)他の枠組への組み込み、(2)他のシステムと対等で相補的な統合、(3)双方向変換システム自身への他のシステムの組み込みに必要な相互運用性という三つの相互運用性を通して、扱うグラフの表現力の向上、変換の性能や能力の向上等を目指し、単方向変換の部分翻訳に基づく部分双方向化の枠組、枝間の順序の導入による記述能力の向上、双方向変換のモジュール性につながる変換の加法性の提案などの成果が得られた。あらゆる応用、変換、機構との相互運用の可能な双方向変換に向けたグラフや変換の記述能力の向上、特に順序の導入や順序つき/なしの枝の混在の扱いについて、順序の有無に共通して必要となる機構を明確化した。具体的には、ベースとしているグラフ変換言語についてソース・ターゲットグラフ、その間の変換プログラム中の言語要素間を結びつけるトレース情報の、ノードと枝、変換連鎖に対応した設計とそれを用いた追跡方式、逆変換におけるビュー上の編集操作の伝搬、ビュー更新による制御フロー(条件分岐)変更の検出、ビュー上で同じソース枝に由来する枝の解析方法を設計した。このことにより、双方向変換であることの条件である双方向性(振る舞いの良さ)の達成条件をより明確にした。この成果は一般に困難と言われている逆変換の振舞いの予測も容易にする。更に、順序を導入して枝の入れ替えなどの記述能力を付加した構造再帰について、枝毎の変換からノード単位の変換に視点を移すことにより構造再帰内でのモジュール構造を明確にした。その他の記述能力向上については、これまで特にSQL風構文糖レベルで不可能だった変換内での新たな循環の生成の手法を考案し、静的に循環中の経路の長さと種類が固定されるといった限界を明確にした。その他、28年度以降に計画されていた研究事項の一部である、言語同士の対等な相互運用に関する前倒しの成果として、単方向モデル変換言語ATLから双方向グラフ変換言語への翻訳の基本方針を示すことができた。具体的には、翻訳元言語レベルの双方向性の、既存双方向言語の双方向性による証明体系を構築した。この成果は他の言語同士の組み合わせにも用いることができる汎用性の高いものである。また、属性つきグラフと枝ラベルつきグラフ間の相互変換、翻訳におけるメタモデル(型情報)の組み込みを行なった。ATLの循環生成機能の翻訳の道筋も示した。あらゆる応用、変換、機構との相互運用の可能な双方向変換に向けて、言語同士の対等な相互運用として単方向モデル変換言語ATLから双方向グラフ変換言語への部分翻訳の基本部分を設計し、プロトタイプを実装し、研究発表や国際会議への投稿等とそのフィードバックを通して、部分双方向化全体の健全性の証明体系の精緻化、部分双方向化が可能となる条件の明確化を達成した。特に、前年度に明確でなかった、翻訳対象部分とそれ以外の切り分けを、ソース言語レベルでの射影のフェーズを独立させることにより明確化した。また、共同研究を通して、トレース情報をより広範な編集操作の軽量な伝搬に適用するために必要なトレース情報の一般化も行った。トレース情報による相互運用性の向上についても、これまで十分に追跡できていなかった言語要素(ラベルを束縛する変数)をGUI上で強調表示できるようになり、ラウンドトリップ性に背く可能性をより分かりやすくユーザに提示できるようになった。双方向変換の相互運用性の向上に資する複数のサブテーマで進捗が得られた。具体的には、トレース情報自体の考察を進め、変換レベルの細粒度の追跡を可能にするとともに、より効率的な更新伝搬に必要なトレース情報の拡張についても明確にすることができた。さらに、他のシステムとの対等な統合による相互運用について、統合を可能にする条件を明確にすることができた。あらゆる応用、変換、機構との相互運用の可能な双方向変換に向けて、28年度は以下のことに取り組んだ。本研究課題のサブテーマの一つである枝間の順序の導入については、逆方向解釈において、昨年度の順序なしグラフの双方向変換における追跡情報に関する成果を融合させた定式化を行い、先行研究との対応付けを強化し、国際会議に投稿した。双方向変換の相互運用に際し、効率的な相互運用には軽量な変換伝搬のための分析が不可欠である。28年度はグラフ双方向変換言語の意味に従い追跡情報の半静的解析を行うことにより、更新伝搬を逆方向解釈なしに行うことで逆方向変換を軽量化する手法を提案し、その適用条件と健全性を示し、技術報告として公表した。前述の解析は、変換が検査しない領域を特定することにより、その領域内の挿入、削除を含む任意の更新が可能であることも示すものである。更に、サブテーマの一つである相互運用に必要なインタフェースの設計に関して、相互運用に必要なモジュラリティの基本となる、モデル変換のモジュラリティの分析の指標として加法性の概念を形式化し、二つの異なるモデル・グラフ変換言語から、文脈とモノイド、単調性を用いて加法性を系統的に抽出する方法を提案し、国際会議に投稿した。加法性はデータベース分野で研究されているquery containmentの概念に関係するが、ここでは変換の間の包含関係を構文的に導出するものであり、再計算不要な部分変換の特定に役立ち、本研究課題のサブテーマの一つである、高速化のための漸進処理にも寄与する。

昨年度に今後の方策として示した、本課題を基課題とする国際共同研究強化事業により変換言語レベルの相互運用、新たな相互運用可能双方向変換システムの構築などを行うことができ、更に、効率的な相互運用のための、健全な更新伝搬を逆方向解釈なしに行う手法を示すことができた。研究課題の一部であるモジュール性に関しても、加法性という指標を提案してモジュール性への応用の道筋を示すことができた。データの相互変換は情報システムにおける重要な操作であるが、双方向変換は、その変換をこえて双方向に更新を伝播させることができるため、設計から実装までの工程をモデル変換で実現するモデル駆動開発に於いて、下流での修正の上流への伝播(=再実装への不具合波及抑止)を実現する枠組として期待されている。本研究は、代表者が双方向グラフ変換言語をモデル(=グラフ)駆動開発に応用してきた過程で直面した実用上の問題を(1)他の枠組への組み込み、(2)他のシステムと対等で相補的な統合、(3)双方向変換システム自身への他のシステムの組み込みに必要な相互運用性という三つの相互運用性の切口で捉え、扱うグラフの表現力の向上、変換の性能や能力の向上等を通して、既存の双方向変換を含む、より明快で強力な枠組を提案するものである。本年度は、(2)において、性質の異なる双方向変換を相互運用する際の注意点、具体的には、性質の強い双方向変換と弱い双方向変換を合成して弱い双方向変換を構成するには、接続部分により強い制約が求められることを示した。また、部分翻訳に基づく部分双方向化のための翻訳機構を系統的に構築する手法を提案した。具体的には、翻訳元と翻訳先の言語が加法性(変換の構文の異なる階層における言語要素の列を短縮することにより変換結果が厳密に小さくなるという性質)を持つ場合、翻訳器自身もそのような言語構造にしたがって自然に漸進的に構築できることを示し、プログラミングに関する研究会で発表した。更に、共同研究において、編集操作を双方向変換で定義する手法をコードクローン間の選択的変更伝搬に応用する手法を提案した。具体的には、複製元を中心とした恒等双方向変換のco-targetial合成で複製間を関係づけた上、他のクローンに伝搬させたい変更は双方向変換により伝搬させ、そうでない場合は変更を表現する双方向変換を挿入する。データの相互変換は情報システムにおける重要な操作であるが、双方向変換は、その変換をこえて双方向に更新を伝播させることができる。本研究は、双方向変換の(1)他の枠組への組み込み、(2)他のシステムと対等で相補的な統合、(3)双方向変換システム自身への他のシステムの組み込みに必要な相互運用性という三つの相互運用性を通して、扱うグラフの表現力の向上、変換の性能や能力の向上等を目指し、単方向変換の部分翻訳に基づく部分双方向化の枠組、枝間の順序の導入による記述能力の向上、双方向変換のモジュール性につながる変換の加法性の提案などの成果が得られた。改良対象としている、関数プログラミングスタイルにより変換連鎖に対応した双方向グラフ変換言語について、その双方向変換能力向上に資するべく、変更の逆伝搬に重要な役割を果たすトレースの再設計をしたことにより、トレースに基づく双方向変換の核心部分を強化できたことで双方向変換のより明快で強力な枠組みの提案に大きく近づくことができた。
制御不能な部分システムを含む最適化問題

従来の数理計画法あるいは最適化理論に共通して、制御可能性の仮定という言葉でまとめることのできるパラダイムがある。つまり、対象システムの変数を、決定者が自在に制御できるとの仮定がそれである。その下で、何らかの評価関数を目的関数として掲げ、その最適化を目指すのが、これまで行われてきたことである。しかし、制御不能な部分システムが存在する場面ではこのような取り扱いでは明らかに不十分である。全体システムとして社会を、制御不能な部分システムとしてそれぞれの効用関数の最大化をその行動規範とする個人を想定すると、本研究の対象は民主的決定に関わる社会厚生関数や社会選択関数に集約できる。これに関しては、相互評価の設定の下でも、古典的な不可能性定理と同様に、否定的結果しか得られないことを示した。ただし、操作不可能性に関してはいくらかの肯定的結果を得た。また、公正な費用負担問題については、解の候補であるコアの存在について幾つかの結果を得た。最適化すべき対象としてネットワークを、制御すべき変数としてネットワークの枝上の流れを想定し、ネットワークに存在する部分システムによって枝集合が幾つかの部分集合に分割制御されている場面を想定して、ネットワークの設計問題を対象として研究した。これはネットワークの効率がどの程度まで悪化する可能性があるかを検証する試みであり、それに対して大域的最適化に基づく算法を提案し数値実験を行った。また、上記の大域的最適化問題の幾つかは相補性条件を持つ数理計画問題に変換できるため、相補性問題を解く効率的算法の研究を行い、内点法に関して幾つかの改良を提案した。全体として、研究成果はかなり数の論文と口頭発表に結実したが、論文は研究成果報告書にまとめて報告する。対象としているシステムが幾つかの部分システムから成り立っており、決定すべき変数の幾つかに全体決定者の制御が及ばず、その決定が部分システムの決定者に委ねられているような問題では、全体決定者の侍っている目的関数が、彼がすべての変数を制御できる場合と比べて、どの程度悪化するかを予め把握しておくことが、システム設計の際に重要となる。本研究では、そのような対象として輸送ネットワークを考え、極大流のなかで流量最小のものを求めることによってこれを評価しようとした。この問題は実行可能領域が非凸集合となるため、NP困難な問題となるが、それに対して局所探索と最適性の保証を与える大域的手法とを組み合わせた算法を堤案し、数値実験を行った。また、上記の問題のあるものは相補性条件のある最適化問題に帰着できるので、その問題に対しても大域的最適化手法に基づいた算法を提案した。関連ある問題として凹関数の利得を持つネットワーク流問題に対しても算法を提案している。1.今年度は制御不能な部分システムを持つ最適化問題の典型例である、最小極大流問題に対してアルゴリズムを提案し、計算機実験結果と合わせて、2篇の論文Shigeno-Takahashi-YamamotoとGotoh-Thoai-yamamotoに報告した。外部近似に基づく前者のアルゴリズムは計算機実験でも良い結果を示したが、分枝限定法に基づく後者のアルゴリズムは、計算機実験では芳しい結果を得る事ができなかった。Iwata-McCormick-Shigenoの論文ではネットワーク流問題の基礎的な問題に対して効率よいアルゴリズムを与えた。2.上記の最小極大流問題はKarush-Kuhn-Tucker条件を介して相補性条件の追加された線形計画問題に変形できる。Thoai-Yamamoto-Yoshiseの論文はこの問題に対するアルゴリズムの提案である。残念ながらこのアルゴリズムは計算機実験では満足できる性能を示していない。改善が必要である。3.ゲーム理論からは社会的厚生関数の存在に関して、興味深い結果を導く事ができ、安藤-小原-山本に発表した。

1950年代のアローの不可能性定理を相互評価の設定に持ち込んだ結果、アローの公理系よりも緩い公理系の下で、社会的厚生関数の非存在が導かれた。相互評価の設定は、循環プロファイルを許すためにこのような結果が得られるが、さらに循環プロファイルを排除するような設定でこの研究を進展させている。また、Matsubayashi-Umezawa-Masuda-Nishinoもゲーム理論に関連した成果である。4.その他、八森は組み合わせトポロジーの分野で、イリチュは多変量解析の分野で成果を上げた。最適化の対象となるシステムが、自律的な部分システムを含みそれらが個別に最適化すべき目的を持っている場合、それらの部分システム固有の変数は部分システム個々の最適化のプロセスによって決まるため、制御不能であったり、制限されたりします。全ての変数が制御可能である理想的な状況と上のような自律的な部分システムを含む状況とで、システム全体の効率がどの程度変化するかをとらえる方法を開発することがこの研究の主な目的で、本年度は、「最小極大流問題」、「非対称データに対する多次元尺度法」、「社会的厚生関数」について研究を進めました。初めのテーマについては、山本、後藤、N.v.Thoai(ドイツTrier大学教授)の論文に続いて、山本、吉瀬、N.v.Thoaiの論文もJournal of Optimization Theory and Applicationsに出版されました。計算実験では以前の高橋、繁野、山本の論文に及びませんでした。理由は、分枝限定法で用いた部分問題の緩和方法が十分でなかった事によると考えられます。まだ改善すべき点が残っています。また、2番目のテーマについては、地域間の電話の通話件数や、人の移動などのデータから得られる非対称データを3次元程度の低い次元の空間に埋め込み、視覚的にその非対称性を認識できるようにする方法の開発を目指して、重力モデルをその一部に取り込んだモデルを提案しました。茨城県の通勤,通学データを対象に分析した結果、循環構造のないデータに対しては既存の非対称データに対する多次元尺度法に比べて、解釈の容易な出力を与えることが分かりました。計算時間もさほど負担になるほどではありませんでした。
前立腺癌における機能性RNAの分子生物学的意義および標的遺伝子の解析

前立腺癌の進行の分子生物学的機序は未だ明らかでない。本研究では新しい概念である機能性RNA(マイクロRNA)に注目し、前立腺癌において重要な役割をするマイクロRNAと、その標的遺伝子の同定・機能解析を行った。まず、白血病の発生にかかわると言われているmiR-15aとmiR-16-1の機能ついて、前立腺癌細胞株を用いて検討し、標的遺伝子を同定した。さらに、前立腺癌にて発現するマイクロRNAを網羅的に解析し、機能解析を行った。近年、蛋白質をコードしないnon-coding RNAが発見され機能性RNAとして注目されている。その中でmicroRNA(以下miRNA)と呼ばれる19-23塩基の短い二本鎖RNAは標的となる蛋白コード遺伝子のcoding regionもしくは3'-UTRをブロックして蛋白合成を妨げる働きをすると考えられている。特に、癌の領域ではmiRNAが癌抑制遺伝子の発現調節に深く関与しており、癌の発生や進展に関わっていることが報告されている。前立腺癌においてもmiRNAが重要な役割を果たすことが示されており、前年度研究者はmiR-15-a,miR-16が前立腺癌の増殖抑制を持つことを、細胞株を用いて示した。本研究では、前立腺癌の進展の分子メカニズムの解明に向けて、前立腺癌臨床検体を用いて、miraVanaアレイシステム(Ambion社)を用いた高感度のマイクロアレイにて、進行前立腺癌と正常前立腺に発現するmiRNAの発現プロファイリングを行った。前立腺癌および癌な検体を5例ずつマイクロアレイにて発現プロファイル比較し、最も発現が増加したmiroRNAと低下したmicroRNAを同定した。特に癌において発現の低下したmiR-184,miR-187,miR-200a,miR-205,miR-31に注目し、検討を行った。まず、前立腺癌細胞株(LNCaP,PC3,DU145)にこれらのmicroRNAを遺伝子導入し、XTTアッセイを行ったところ、細胞増殖は明らかに発現が低下した。次に前立腺針生検で採取した前立腺組織癌20例、正常20例におけるmiR-184,miR-187,miR-200a,miR-205,miR-31の発現をRT-PCRを用いて行ったところ、前立腺癌において明らかにこれらすべての発現がすることが示された。今後はこれらのmiRの発現と前立腺癌進行の意義について研究を進める予定である。癌の発生、進展の発現調節機構としてnon-coding RNA (microRNA)が近年注目されている。本研究は前立腺癌の進展の分子メカニズムの解明に向けて、前立腺癌臨床検体を用いたmicroRNA(以下miRNA)の発現プロファイルの作成を行うことを第1の目的として行った。次に、前立腺癌症例において発現の低下しているmiRNAを前立腺癌細胞株に遺伝子導入することで、前立腺癌細胞の増殖や細胞死に対する影響を調べた。前立腺針生検から得られた進行前立腺癌の前立腺癌組織と、癌の含まれない前立腺組織それぞれ5例からRNAを抽出し、発現するmi-RNAのプロファイリングを作成した。さらに、症例数を40例に増やして、注目されるmiRNAの発現をRT-PCR法にて調べた。進行性前立腺癌において著明に発現の低下していたmiRNAを前立腺癌細胞株であるLNCaP、PC3およびDU145に遺伝子導入し、細胞の増殖をXTT assayにて検討し、アポトーシスの有無をflow-cytometlyにて検討した。Low Density Micro RNA Arrayによる解析の結果、進行性前立腺癌において最も発現の低下のみられたのはmiR-184,miR-187,miR-205,miR-200a^*,miR-31であった。これらのmiRNAを前立腺癌細胞株に導入すると、LNCaP、PC3細胞では増殖抑制を示したが、DU145細胞では変化を認めなかった。これらのmiRNAは、前立腺癌の症例において、前立腺組織での発現が明らかに低下することがRT-PCRにて示された。以上から、網羅的な遺伝子解析により、進行前立腺癌の増殖や進展を抑えるmiRNAを同定できる可能性が示唆された。今後、本研究から示唆されたmiRNAのなかでも前立腺癌に特徴的なmiRNAを選別し、さらに前立腺癌進展の分子メカニズムを解明するために、それらのmiRNAが制御している標的蛋白コード遺伝子の探索を行う予定である。
可逆的に光応答する機能界面の構築

熱可逆なフォトクロミック化合物は多くの種類があるが、熱不可逆なものは、フルギド類、ジアリールエテン類、および我々が最近開発したビスアリールブタジエン類、などごく限られた種類しかない。ビスアリールブタジエン類について、これまでの研究で、6-フェニル-6,7-ジヒドロベンゾチオフェンおよび5-フェニル-4,5-ジヒドロベンゾチオフェン骨格をもつ化合物を最初に合成した。これらの無色体に紫外光を照射すると6π電子環状反応による開環反応でo-キノジメタン型の着色体が生成し、それが暗所室温でゆっくり退色することを示した。退色速度を高めた化合物を得るために、2-フェニル-1,2-ジヒドロナフタレンを合成した。しかしこの化合物は退色が速く、-100°C前後の低温でなくては着色を観測できなかった。そこで本年度は、2-(4-ピリジル)-1,2-ジヒドロナフタレン骨格をもつ化合物を合成し、ジヒドロナフタレン環の6,7,8位にメトキシ基を導入することと併せて、分子内電荷移動による着色体の安定化と吸収極大の長波長化を目指した。無置換体1,7-メトキシ体2、6,8-ジメトキシ体3を合成した。これらの化合物を含むPMMAフィルムはいずれも室温以下で着色が観測された。1は最も着色性がよく、2は光照射によって二種類の着色体を生じ、3は最も高い温度で着色した。また、2-methyl-THF中における着色は、ビリジルジヒドロナフタレンの方がフェニルジヒドロナフタレンより着色温度域が広く、また相対的に高温域で着色を示した。2の二種類の着色体は、100nmほど吸収極大波長が異なっているが、長波長側に吸収をもつものの方が熱及び光に対して無色体に戻りやすく、短波長側の方が戻りにくかった。これらのことから、二種の着色体はキノジメタンの二重結合の異性体であると結論した。DNAは、リン酸部分がナトリウム塩となっている。このナトリウムカチオンを四級アンモニウム塩で置き換えたもの(DNA-QAICと略する)は、有機溶媒に可溶となり、丈夫なフィルムを形成でき、このフィルムは延伸することができる。フォトクロミック化合物をこのフィルムの中に取り込ませると、フォトクロミックフィルムが形成できる。今年度、スピロピランあるいはジアリールエテンを取り込ませた、サケの白子由来のDNA-QAICを調製した。スピロピランは、通常の有機溶媒中と同様のフォトクロミズムを示した。ジアリールエテンは、置換基として水酸基をもつものがDNA-QAICとの親和性がよいことがわかった。また、分子の外殻に水酸基をもつものはDNA-QAICと強く相互作用するもののフォトクロミック反応を示すが、分子の内側に水酸基をもつものは、DNA-QAICフィルム中だけでなく、DNA-QAICとジアリールエテンが有機溶媒に溶解している状態でもフォトクロミズムを示さないことがわかった。これらのことは、ジアリールエテンがDNA-QAICの塩基対間にインターカレートしていることを示唆している。外側に水酸基をもつビスベンゾチエニルエテンをDNA-QAICにドープし、延伸すると、DNA鎖が延伸方向に伸び、従って塩基対が延伸方向に垂直に並ぶため、インターカレートしたジアリールエテンも延伸方向に垂直に配列する。そのため、紫外光照射により生じた着色体に、延伸方向よりも、延伸方向に垂直な吸収の方が大きい、という二色性が現れた。また、光反応によって旋光度の大きな可逆的変化が起きた。この現象は、フォトクロミズムを高密度大容量フォトンモード光記録材料に用いた時に、非破壊で記録を読み出す方法の原理となる。

2の二種類の着色体は、100nmほど吸収極大波長が異なっているが、長波長側に吸収をもつものの方が熱及び光に対して無色体に戻りやすく、短波長側の方が戻りにくかった。これらのことから、二種の着色体はキノジメタンの二重結合の異性体であると結論した。
超高圧電子顕微鏡による内耳感覚細胞とその神経終末の研究

厚い連続切片を超高圧及び高圧電子顕微鏡にて観察することにより、モルモット蝸牛内・外有毛細胞と神経終末の形態学的研究を行なった。全体で89個の外有毛細胞における神経終末の支配様式を観察したが1個の外有毛細胞において求心性及び遠心性終末の数は535個の間であった。神経終末の数はhook portionで最も少なく、上方回転に行くに従って増加し、第三回転第二、第三列おいて最も多かった。次に第三回転から蝸牛頂に向かってその数は減少した。求心性神経終末は前述した終末の合計数と同様の変化を示したが、遠心性終末の数の増減は比較的少なかった。更に列別に分けて神経終末の観察を行なった。第1列では遠心性終末が第二回転の終りから第三回転に数多く認められたが、第2、第3列では基底回転に最も多く存在した。求心性終末は第2、第3列の第二回転から第三回転にかけて極めて数多く認められた。次に各々の外有毛細胞における求心性および遠心性神経終末の比率を検索した。全ての回転における27個の内有毛細胞及びその神経終末を観察した。1個の内有毛細胞における求心性および遠心性神経終末の数はそれぞれ8個から24個、4個から7個であった。求心性終末の数は基底回転の内有毛細胞において最も多く、上方回転やhook portionに向うにつれて減少していた。一方遠心性神経終末の一個の有毛細胞における数はバラツキが大きく、各回転による分布の違いは認められなかった。又明らかに内有毛細胞とシナプスを形成していた遠心性終末はわずかに6.4%であった。求心性シナプスにおける内有毛細胞のsynapticbodyの出現頻度は60%で、各回転ごとの差異は観察されなかった。又求心性の放射状繊維が分岐する頻度はわずかに6.9%であった。厚い連続切片をHVEMにて観察することにより,モルモット蝸牛外有毛細胞の神経終末を観察した.連続切片法においてはHVEMが通常の透過型電子顕微鏡に比べてはるかに簡便であり,本研究に適した方法であった.全体で89個の外有毛細胞において神経終末の支配様式を観察したが1個の外有毛細胞における求心性および遠心性神経終末の数は535個の間であった.hook portionでは神経終末の数はもっとも少なく,上方回転に行くに従って増加し,第三回転第二,第三列においてもっとも多かった.次に第三回転から蝸牛頂に向かってその数は減少した.求心性神経終末は前述した神経終末の合計数と同様の変化を示したが,遠心性終末の数の増減は比較的少なかった.さらに列別に分けて神経終末の観察を行った.第一列では遠心性神経終末が第二回転の終わりから第三回転に数多く認められたが,第二,第三列では基底回転にもっとも多く存在した.求心性神経終末は第二,第三列の第二回転から第三回転にかけてきわめて数多く認められた.次におのおのの外有毛細胞における求心性および遠心性神経終末の比率を検索した.また946個の求心性神経終末の最大径を測定し, 1700nm以上の大きな神経終末が存在することを報告した.内耳の感覚細胞の一つである蝸牛内有毛細胞は音の受容に関して極めて重要な構成要素である。しかしながらその細胞と神経終末に関する形態学的研究の中で定量的な検索は極めて少ない。

今回3匹のモルモットを用いて、気管切開、人工呼吸下に手術用顕微鏡を用い、グルタールアルデヒド・パラホルムアルデヒドで外リンパ潅流を行ない生体固定を行なった。断頭後、側頭骨を摘出し、オスミウムにて後固定し、脱水包埋した。蝸牛を各回転別に分解し更にそれらを小片に分け、各々基底回転端よりおおよその距離を記録した。ウルトラトームにて300nmの厚さの連続切片を作り電子染色を行なった。試料を超高圧電子顕微鏡(JEOL-1000)あるいは高圧電子顕微鏡(H-700)にて写真撮影を行ない、これをもとに蝸牛内有毛細胞の神経終末(求心性及び遠心性神経終末)や内有毛終末)のシナプス棒の数を検索した。又遠心性神経終末については内有毛細胞とのシナプス形成の有無を調べた。全部で11個の内有毛細胞を観察したが、細胞1個に接している求心性と遠心性神経終末の合計数は36個から13個の間であった。求心性の神経終末のそれは27個と9個の間で、遠心性終末は4個と11個の間で変化していた。求心性神経終末の数は基底回転で最も多く上方回転に行くに従い減少する傾向があった。遠心性終末に関しては求心性のものと同様の傾向が認められたが、求心性終末程著明ではなかった。又遠心性神経終末と内有毛細胞のシナプス形成は希にしか認められなかった。内耳の感覚細胞の一つである蝸牛内有毛細胞は音の受容に関して極めて重要な構成要素である。しかしその細胞と神経終末についての定量的な形態学的研究は極めて少ない。今回3匹のモルモットを用いて、気管切開、人工呼吸下に手術用顕微鏡にて、固定液を外リンパ潅流し生体固定を行なった。断頭後側頭骨を摘出し後固定を行ない、脱水包埋した。蝸牛を各回転別に分解し更にそれらを小片に分けて、各々基底回転端よりおおよその距離を記録した。ウルトラト-ムにて300nmの厚さの連続切片を作り電子染色を行なった。試料を高圧電子顕微鏡(H-700)にて観察写真撮影を行ない、これをもとに蝸牛内有毛細胞における神経終末や内有毛細胞のシナプス棒の数を検索した。又遠心性神経終末については内有毛細胞とのシナプス形成の有無を観察した。前年度はわずかに11個の内有毛細胞しか観察できなかったが、今年度は合計で27個の細胞を全回転にわたって検索した。一個の内有毛細胞における求心性神経終末の数は8から24個であった。この数は基底回転で最も多く、しかもバラツキが少なく、上方回転に行くに従ってその数は減少し、特に第3回転の終りから頂回転にかけてはかなりのバラツキが認められた。hook portionは求心性終末の数が基底回転に比べて小さい傾向を示した。一方遠心性神経終末は4から17個が内有毛細胞において認められたが、明瞭なシナプスを形成しているものは少なく、やはりその主な働きはaxodendriticなものであると考えられた。又これらの神経終末数は回転による違いが明らかではなかった。内有毛細胞求心性シナプスにおけるシナプス棒の出現頻度は60%で外有毛細胞のそれ(18%)と比較し明らかに高かった。尚前庭・半規管の観察は固定状態が不良で、今後更に研究を続ける予定である。
中枢化学受容器を中心とした呼吸と運動の自律並列的な制御

当該年度は、脊髄運動ニューロンの興奮性の指標としてH反射とF波を測定項目に加え、吸入CO2濃度(4%と7%)がヒラメ筋のEMG応答(SSMA、H反射、F波)に及ぼす影響(実験1)および呼吸条件(CO2再呼吸、低O2吸入、随意過換気)がヒラメ筋のEMG応答(同上)に及ぼす影響(実験2)を調べた(進行中)。その結果、実験1では、H反射およびF波は条件間に有意な差は認められなかった。SSMAについては、統計分析に必要なサンプル数を確保することができず比較ができなかった。実験2では、H反射、F波に条件間での有意な差は認められなかったが、CO2再呼吸時にSSMAが増大する傾向が認められた。このように、当該年に実施した二つの実験では先行研究を支持する結果は得られなかった。前年度に当該年度の課題として挙げたSSMA誘発法の改善に想定以上に時間を要したため、上記実験の遂行が遅れ成果の公表が未完であり、また、当初計画していたもう一つの実験に着手できなかった。この実験に関しては次年度に実施することになる。当該年度に実施できなかった実験を速やかに開始する。また、CO2あるいは呼吸の下肢EMG応答(SSMA、H反射、F波)への影響だけでなく、行動への影響も観察し、呼吸と運動の連関を明らかにしていきたい。脳幹の中枢化学受容器は、CO2センサーとして、呼吸制御に重要な役割を果たしていることが知られている。申請者は、先行研究の検討と自身の予備研究から、中枢化学受容器へのCO2刺激が、呼吸亢進を招くだけでなく、四肢筋の運動を脊髄レベルで修飾している可能性を見出している。本研究では、脊髄運動ニューロンの自律性活動を反映する自律持続性筋活動(self-sustained muscle activity, SSMA)を下腿筋で評価することによって、中枢化学受容器と運動制御の関連を明らかにすることを目的としている。検討項目は、1)中枢化学受容器に対するCO2刺激強度とSSMAの関係、2)中枢化学受容器のCO2感受性の違い(個人差)がSSMAに及ぼす影響、3)呼吸筋活動がSSMAに及ぼす影響、4)中枢化学受容器に対するCO2刺激が足関節角度調節およびその感覚に及ぼす影響、の4つである。当該年度は、上記検討に関する予備研究の結果を論文化し、Respiraotry Physiology & Neurobiology(2018, 24-30 )に掲載された。そこで報告したように、現時点では、下腿三頭筋におけるSSMAが、正常呼吸条件に比べてCO2再呼吸条件において有意に増強することを確認した。現在、上記項目2)および3)の検討を進めている。研究実績の概要に記したように、本研究の出発点となる重要な知見を国際誌に報告することができた。研究を進める上でいくつかの課題はあるが、研究計画の変更を迫られるような事態は生じておらず、おおむね順調に進展していると判断している。今後の研究は当初の計画通りに進める予定であるが、SSMA誘発の確率を上げることが課題となっている。SSMA誘発のための電気刺激法の改善、刺激電極の改良等を進めている。さらに、SSMAに加えてF波の測定を行うことも検討している。発注済みの物品(混合ガス、ボンベ、圧力調整器)の納品が遅れていること(約11万円)、実験は予備的段階であり謝金支出がなかったこと、成果報告(学会発表)に旅費が不要であったことなどが理由として挙げられる。成果報告に至らず旅費や投稿費の支出がなく、また、計画していた実験の一つが実施できなかったために、次年度使用額が生じた。次年度はこれらを使用して未完の報告および未実施の実験をすすめる。
電位依存性チャネルの作動原理の直接観察

本研究では、膜電位依存的なイオンチャネルの機能構造を明らかにするために、脂質小胞に再構成したイオンチャネルの構造クライオ電子顕微鏡単粒子解析により取得し、脂質小胞に異なる膜電位を印加した際のチャネルの電位依存的な構造変化を改造することを目的にしている。これまでに米国Yale大学のFred Sigworth教授と共に方法論開発を進めており、電位センサーである膜貫通ヘリックスの相対配置の解像に成功している。研究の進め方として、初年度に当たるH30年度では、電位センサーの一部分の解像度が低くなっている点を改善することを計画していた。電位センサーである膜貫通ヘリックスの解像度は、イオンチャネル全体の構造に対してノイズが目立っている。これは脂質膜に埋め込まれた状態を直接観察しているために仕方ないとも言える。そこで、全体の解像度を底上げすることで、膜貫通ヘリックスの部分についてもよりクッキリと解像できるように、画像データを大量に取得することを計画した。これまでの結果から、データセットを増やすことで、分解能を5オングストローム程度まで向上させることが可能であると予想していたが、予想以上にリポソームを固定する炭素支持膜のノイズが問題となり、分解能の向上が難しかった。現在、ノイズの少ない代替支持膜として同じ炭素材料のグラフェンの利用を検討している。電子顕微鏡試料を用いて、他の手法で電位依存的な構造変化の評価するために、膜電位の変化を蛍光色素で評価する系を導入している。これまでには、予想に反してシグナルが小さく、リポソームからの内容物の漏えいなどの問題が懸念されていたが、蛍光色素およびその固定化方法を検討することで、我々が構造解析する試料においても、試料凍結までに膜電位が十分な時間保持されることが確認できた。平成30年度はYale大学のTitan Kriosの利用を念頭に系の再検討を行ってきたが、マシンタイムを定期的に確保することが難しく、また、国内での予備実験についてもAMED BINDSとクライオ電顕ネットワークを利用したマシンタイムの確保が十分にできなかった。平成30年度末に新規にクライオ専用電顕を理化学研究所放射光科学研究センターに導入したことで、令和元年度以降はその問題点を改善できる体制が整った。ノイズの問題からグラフェンの利用を検討しているが、歩留まりが悪いこと、リポソームとグラフェンの親和性を改善するための検討が必要なことが明らかになってきている。現在、プラズマを使ったドライプロセスでの処理を検討しているが、ウェットプロセスについても検討することで、問題解決を図りたい。電位のかかった状態を維持できるという結果が以前よりは確度の高いものであると考えているので、グラフェンの機能化を果たし、最終年度には分子動力学計算を開始したい。H30年度は、所属機関で電子顕微鏡を調達していたために、外部へ出かけての使用することになり、使用機会がそれほどなく、消耗品の使用が予定ほどではなかった。