hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規遺伝子増幅法による口腔癌センチネルリンパ節の術中転移診断法の確立

これまでの成果では、cytokeratin 19(CK19)を標的とし、リンパ節312個の正診率95. 2%,と良好な結果を得た。また、マイクロアレイ解析を用いて新たな診断マーカー候補Annexin A8-like 2(ANXA8L2), Desmoglein 3(DSG3)を同定した。markerの感度は3個のmarkerを合わせると100%の結果が得られた。本研究は、現在乳癌にて応用されているcytokeratin-19(CK-19)を標的遺伝子として検討することから開始した。実際の転移リンパ節を用いたOSNA法によりその目的遺伝子の増幅度(コピー数)と転移巣の大きさを比較検討することにより、口腔扁平上皮癌におけるOSNA法での診断基準を確立することを第一の目標とした。結果、対象リンパ節33症例91個に対して感度78.9%(15/19)、特異度98.6%(71/72)であり、正診率94.5%(86/91)であった。これらの結果より口腔扁平上皮癌における転移診断マーカーとしてはCK-19のみでは不十分であり、新規マーカーの探索が必要であることが示された。また、口腔癌におけるリンパ節転移新規標的分子の探索として担癌患者の転移リンパ節および非転移リンパ節、非担癌患者の頸部リンパ節より抽出したtotal RNAを用いてマイクロアレイ解析を行い新規マーカーの同定を2種類行った。本マーカーは「頸部リンパ節転移分析方法及び頭頸部癌の腫瘍マーカー(特願2009-292611、出願日2009年12月24日)」、および「頸部リンパ節転移分析方法及び頭頸部癌の腫瘍マーカー(国際出願番号PCT/JP2010/073129、出願日2010年12月22日)」として申請中である。また、これらのマーカーに対するOSNA primerを現在作製中である。今後、CK-19および新規プライマーによる感度、特異度等を検討し臨床応用に向けて研究を進める予定である。当院臨床研究倫理審査委員会承認後(愛大医病倫0701008号)、OSNA法を実際にセンチネルリンパ節生検に応用したところ、これまでの成果では、cytokeratin19(CK19)を標的とし、リンパ節312個の正診率95.2%,と良好な結果を得ている(Oral Oncology 2012 inpress)。しかしながら、口腔扁平上皮癌においてはCK19遺伝子の低発現や発現を認めないものがあることがわかり、診断精度向上のために、マルチマーカーによる診断が必要であることも分かった。このことよりマイクロアレイ解析を用いて新たな診断マーカー候補Annexin A8-like 2(ANXA8L2), Desmoglein 3(DSG3)を同定した。現在、転移陽性リンパ節24個、転移陰性リンパ節174個にて解析を行い各markerの感度はCK19では87.5%、ANXA8L2では87.5%、DSG3では83.3%であり、CK19+ANXA8L2では95.8%、CK19+DSG3では95.8%、3個のmarkerを合わせると100%の結果が得られた。本結果にて転移診断マーカーはマルチマーカーにより確立されたため、今後は症例を蓄積しさらに有用性の検討を行う必要がある。さらには、術中迅速診断が可能となるよう、遺伝子増幅を12分以内に行うことが可能なOSNA法のprimer設計が必要となる。
海洋天然物からの蛋白質プレニル化の阻害剤と内因性修飾物質の探索

近年、ファルネシルピロリン酸が低分子量GTP結合蛋白質rasやrhoAをプレニル化して活性化することで、細胞周期や細胞骨格系を制御することが明らかにされ、生体内イソプレノイド化合物による蛋白質のプレニル化が、ポストゲノムレギュレーション機構の一つとして注目されている。本研究では、海綿由来から各種のイソプレノイド誘導体(ステレッタマイドファミリー)を探索・構造決定してそれらの生理活性作用を明らかにした。また、生体内に存在するイソプレノイドであるFarnesolとVitamin Eの生理活性作用についても明らかにし、蛋白質プレニル化の阻害剤と内因性修飾物質の探索を行った。本研究により、(1)これまで明らかにしてきたStellettamide A、B、Cに加えて、Stellettadine A、Stellettazole A、B、C、Stelliferin A、Dなどの新たなステレッタファミリーの単離精製と構造決定に成功した。(2)Stellettamide Aの生理活性作用として、我々はすでにカルモジュリン活性の阻害とL型Caチャネル活性の阻害作用を見いだしてきたが、Stellettadin A、Stellettamide B、Vitamin EがStellettamide Aと同様のカルモジュリン活性阻害作用を示したのに対して、Stellettamide CやFarnesolにはほとんどカルモジュリンに対する阻害作用がないことを見いだした。(4)研究期間内に蛋白質プレニル化阻害剤を検出することはできなかったが、今後さらに研究を進める。
GPCRをターゲットとした新規インシリコリガンド探索手法の開発

本年度は、前年度の結果から得られたアッセイ結果より、予測に有効である情報(パラメータ)を抽出し、それらを新たなファーマコフォアとして定義し、本手法の精密化を行った。また、ケモカイン受容体の予測の他に、別のGPCRであるGPR54における予測も行った。この研究においては、今までアゴニストしかほとんど報告がなかったターゲットに対する、アンタゴニスト候補化合物の創出に成功した。また、上記の研究に並行して、タンパク質-化合物の相互作用情報を用いて、薬物動態における重要なタンパクである、CYPファミリーをターゲットとした、化合物の阻害予測モデルを構築した。データベースより得られたCYPと化合物の相互作用情報を用いて、正準相関分析(Canonical Correlation Analysis : CCA)を行った。モデルの評価には5-fold cross validationを用い、学習セットにおける正答率は90%以上であった。このモデルに対して、外部セットの化合物の予測を行った。用いた化合物はLOPACの化合物ライブラリー1280化合物で、検証のために4種類のCYP(CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6)に対する阻害実験を行い、1280化合物の各CYPに対する阻害情報を得た。得られた実験結果を元に、CCAモデルでの予測を行ったが優位に予測できるものと予測ができないCYPがあるという知見を得た。バイオインフォマティクスとケモインフォマティクスの融合であるケミカルゲノミクス情報に基づく新規なインシリコ創薬手法を用いて、GPCRであるケモカイン受容体CXCR4およびCXCR4と共通のSDF1(CXCL12)を内在性アゴニストとするGPCRとして近年明らかにされたリガンド未知のケモカイン受容体CXCR7に対する相互作用予測を行った。既存のデータベースより、GPCRに相互作用する既知化合物約3800、GPCR約390の配列情報、およびそれらの相互作用データ約8000を収集した。収集した化合物の特徴量をDRAGONXによって、GPCRの配列情報をミスマッチカーネルによってそれぞれ数値化し、それらの多種多様な相互作用パターンを機械学習モデルの一つであるサポートベクターマシン(以下SVM)を用いて学習させ、予測モデルとした。構築したモデルに対して、ナミキ商事に収められている約300万化合物を予測対象とした大規模バーチャルスクリーニングを行った。これらの化合物を予測するのに要した時間は約1か月であり、ドッキングシミュレーション等の従来法に比べてもSVMによる手法は、はるかに短時間で予測ができることが明らかとなった。予測スコアが高かった化合物に対して、実際にCXCR4およびCXCR7の阻害実験を行い、それらの結果から、いくつかのヒット化合物を得ることができた。本手法はこれまで広く用いられてきた化合物の構造的な類似性からリガンドを創出するものではないので、従来法では見つけることのできなかった非常に多様性に富む新規骨格を有する化合物の創出も可能となり、既知化合物とタイプの異なる化合物の探索への適用も期待される。
極端条件下での中性子分光実験によるYbモノプニクタイドのスピン相関の研究

YbモノプニクタイドYbX(X=N,P,As)は「少数キャリアー近藤物質」等と呼ばれ、その特異な物性は、近年非常に注目され、精力的に研究が行われている。特に、少数キャリアー系での低温でのスピン相関の解明は、非常に興味ある問題である。これまでの筆者らの実験により、YbXにおいて転移点よりかなりの高温から、転移点以下での磁気秩序とは異なる別のスピン相関の発達がみられた。この特異なスピン相関が、転移点近傍でどのようにふるまうかを明らかにする事は、この系の理解に非常に重要な意味を持つ。そこで、本研究では、超低温での中性子分光実験により、YbXでの低温でのスピン相関の発達を明らかにすること、とくに単結晶試料を用いた磁気励起測定により、YbXの転移点近傍でのスピンの空間相関を明らかにする事を目的し、実験を行った。試料は、東北大理学部で作成された高品質単結晶試料を用いた。測定は日本原子力研究所に設置された高分解能三軸型中性子分光器HERを用いた。本研究の結果、YbAs単結晶での実験では、転移点以下で長距離秩序が実現する(1,0,0.5)を中心として、全ブリリアンゾーンに広がる非常にブロードな磁気散乱を転移点以上で観測している。さらに、(1,0,0.5)では半値半巾0.3meVのシャープなエネルギースペクトルが観測されるのに対し、(1,0,0)では半値半幅1.1meVの非常にブロードなスペクトルが観測されている。この事から、転移点以上のスピン相関に2種類あるのではないかと予想している。この点を明らかにできれば、YbXの特徴である秩序状態での磁気モーメントの収縮などの現象を、2種類のスピン相関の競合によって理解できる可能性がある。そこで、今回の実験により、転移点を含む0.120Kの温度領域での、(1,0,0.5)、(1,0,0)およびその周辺でのスピン相関の移り変わりを明らかにする事で、少数キャリアー系YbXの低温物の理解に重要な情報が得られると考えている。
ミトコンドリアDNA変異をもつレ-ベル遺伝性視神経症症例の視機能障害の解析

レ-ベル遺伝性視神経症(レ-ベル病)は、若年男子好発の母系遺伝性視神経萎縮である。すでにミトコンドリア(mt)DNAの3460,11778,14484変異と本疾患の関連が知られている。しかし、細胞レベルでの主たる病変部位は未だ不明である。今回我々は、polymerase chain reaction法を利用し、上記のmtDNA変異の有無を調べ、矯正視力0.1以下で中心暗点を有する両眼性視神経症26例を区別し、光刺激瞬目反射の短潜時反射成分(PBR)の潜時を比較した。26例中11例にmtDNA変異を認め、そのうち10例は11778変異を、1例は3460変異を有していた。正常20例のPBRはこれまでの報告通り50.3±2.4 msec.の潜時であった。変異陽性11例中10例は正常なPBR潜時を示したのに対し、変異陰性15例中12例はPBR潜時の遅延を認め、統計学的に有意な差であった。レ-ベル病では、他の視神経疾患と異なり、対光反応が正常であることが多い。対光反応求心線維はW網膜神経節細胞由来であること、また、PBRの短潜時反射経路も対光反応と同様に脳幹経由で、求心線維は視蓋前域に投射することが報告されている。今回の結果より、PBR短潜時反射の求心線維の由来もW細胞であるらしいこと、および、レ-ベル病ではW細胞が障害を選択的に免れているらしいことが明らかになった。しかし、X.Y細胞の両者またはいずれかが選択的に障害されているのか、また、どのように発症が誘発されるのかは課題として残された。今後は発症誘因の可能性が示唆されている免疫学的異常についても研究していく予定である。
雪氷コア解析による過去200年間のアリューシャン低気圧活動の復元

ウシュコフスキー氷冠コア(212m)を物理・化学的に解析し、種々のシグナルからアリューシャン低気圧活動に関連する情報を読みとることで、アリューシャン低気圧活動の復元を試みた。分析した陽イオンはNa^+,K^+,Mg^<2+>,Ca^<2+>,陰イオンはCl^-,NO^-_3、,SO^<2->_4である。Na^+,K^+,Mg^<2+>,Ca^<2+>,Cl^-, SO^<2->_4は、火山灰の層準で著しいピークを示し、これらのイオン種が火山噴火に影響を受けることが示唆される。一方、NO^-_3は35.49mのベズィミヤニィ火山起源の火山灰層と、51mの給源未知の火山灰層の層準を除き、火山灰とは明瞭な対応が見られない。NO^-_3には、火山灰層と無関係の周期的な変動が認められる。その変動は、Shiraiwaet al.(1999)によって季節変動が確認されている酸素同位体比と良く一致する。従ってNO^-_3も季節変動するものと思われ、その原因は、工業活動の乏しいカムチャッカ半島では、季節的な裸地の拡大と森林火災などに求められる可能性がある。次いで、酸素同位体比とNO^-_3のひとつひとつの季節変動幅を読みとり、これに密度を乗じ、モデルによってThinning rateの補正を施すことで、ウシュコフスキー氷冠の年々の質量収支(水当量)変動を読みとった。これをウシュコフスキー氷冠の山麓の町、クリュチの年間降水量と比較したところ、5年間の移動平均で見る限り、両地点の降水量には良い関係が見られ、氷コアから降水量の復元が可能であることを示唆する。また、1970年代中頃から生じたアリューシャン低気圧の強化に応じるように1980年代中頃までウシュコフスキー氷冠での総降水量が増加している。これは、近年注目されている、DICE(Decadal Interdecadal Climatic Event)の記録が本コアに記録されている可能性があることを強く示唆するものである。以上のことから、当初の目的である過去200年には及ばないものの、過去70年間に関しては、アリューシャン低気圧活動の一つの側面である総降水量の復元が可能となった。また、同じ手法を更に深部まで延長することにより、DICEの復元ができる可能性を示すことができた。以上を本研究の結論と位置づける。1996年8月にウシュコフスキー氷冠から採取した27m雪氷コアの融解試料、および1997年6月に同地点から採取した雪氷コア試料についてクリーンルーム・低温室を主体に以下の分析を実施した:(a)層位、(b)酸素・水素同位体比、(c)pH、(d)電気伝導度、(e)ECM。

その結果、以下の点が判明した:1.雪氷コアはフィルンから構成されるが、部分的に融解・再凍結による氷板を含む;2.雪氷コア中には火山灰が挟在し、27mコアの底部にある火山灰は1968年の噴出物である;3.酸素・水素同位体には明瞭な季節シグナルが残っている;4.pHは7に近く、アルカリ性を示す;5.電気伝導度は火山灰と良い対応を示す;6.ECMも火山灰と良い対応を示す。雪氷コア解析と並行して行った気候データの解析結果および氷冠の動力学的な考察は、以下のことが雪氷コアから読みとれる可能性を示した:1.氷冠の年涵養量はカムチャッカ半島沿岸域の冬期降水量と正の相関がある;2.氷冠の年涵養量に占める割合は、カムチャッカ上空の夏の気温と良い相関がある;3.ウシュコフスキー氷冠の厚さが180mと仮定すると、最深部の年代は520年である.以上より、ウシュコフスキー氷冠の全層掘削(1998年6月実施予定)から、少なくとも過去520年間にわたるカムチャッカの夏期気温、冬期降水量(=アリューシャン低気圧活動)の復元が可能となることが判明した。1998年6月にウシュコフスキー氷冠で掘削された212mの雪氷コアの化学・物理解析を開始した。また、クレーターに発達する氷河の熱・力学結合モデルを開発し、掘削されたコアの年代を推定した。コアの酸素・水素同位体比解析によれば、これらの安定同位体比は1年に1数回のサイクルをもつことが判明した。しかし、これらのサイクルを決める気候的要因については不明である。一方、酸素・水素同位体比によって定義される過剰重水素は1年に1回のサイクルを持ち、冬季に重く、夏季に軽い。過剰重水素の値は、一般に水蒸気の起源における蒸発過程によって決定される。ウシュコフスキー氷冠に降る冬季降水の起源は北太平洋と推定されるので、冬季の過剰重水素の値は、アリューシャン低気圧活動の指標となることが期待されるが、分析が終了した年数が少ないため、両者の関係を定量的に提示する段階に至ってはいない。コアのpH,電気伝導度(EC)の解析結果は、両者が季節変動をすることを示している。pHは夏に酸性度が増し、ECは大きな値をとる。但し、これらについても現段階では分析数が少ないため、環境要素との因果関係はまだ不明である。氷冠の数値シミュレーションによれば、掘削された212mのコアは過去約500年間の年代を包含しており、当初予定した200年間という年代を大幅に上回る予定である。数値シミュレーションの結果は、コア中に介在する数層の年代既知の火山灰層によってほぼ妥当であることが確認された。最終年度(平成11年)は分析数を増やすことを第一に進め、その後、気候要素とコアの各種シグナルの関係を定量的に求め、最終目標であるアリューシャン低気圧活動の復元を試みる予定である。ウシュコフスキー氷冠コア(212m)を物理・化学的に解析し、種々のシグナルからアリューシャン低気圧活動に関連する情報を読みとることで、アリューシャン低気圧活動の復元を試みた。分析した陽イオンはNa^+、K^+、Mg^<2+>、Ca^<2+>、陰イオンはCl^-、NO^-_3、SO^<2->_4である。Na^+、K^+、Mg^<2+>、Ca^<2+>、Cl^-、SO^<2->_4は、火山灰の層準で著しいピークを示し、これらのイオン種が火山噴火に影響を受けることが示唆される。一方、NO^-_3は35.49mのベズィミヤニィ火山起源の火山灰層と、51mの給源未知の火山灰層の層準を除き、火山灰とは明瞭な対応が見られない。NO^-_3には、火山灰層と無関係の周期的な変動が認められる。その変動は、Shiraiwa
ブロードバンドを用いた遠隔教育による高大連携教育の基礎研究

(1)ブロードバンドネットワークを用いた高大連携教育の方法および学習システムの研究高速通信ネットワーク(ブロードバンド)を用いた同期双方向通信および、オンデマンドによる教材(映像、テキストを用いた)の提供システムを用いた高大連携教育の方法・学習システムの構成を検討し、両方式を用いた授業コンテンツの作成と授業を実践した。前者については、9回の実践授業を、岐阜県情報通信ネットワークのブロードバンド回線による学校間ネットワークおよびインターネット回線を用いて、岐阜女子大学と岐阜県内高校およびオーストラリアを結び、岐阜女子大学の英語のネイティブスピーカー教員等によるコーディネートの元、英語教育プログラムを中心として高大連携授業を行った。(谷口、後藤、協力教員)後者については、岐阜女子大学e-Learning教育システムを用いたオンデマンド授業を作成し、高等学校の生徒に対しブロードバンドのインターネット環境による授業配信を行い、高等学校および自宅で連携授業を受講できるようにした。(谷口、橋詰、菊川、その他協力教員)(2)高校生や導入期教育にかかわる教育プログラムの開発と問題点の抽出大学教員と高校教員の協同による、主に教科情報にかかわる教育プログラム(デジタル・アーキビスト概論他)を開発しオンデマンド授業として高校生に配信した。(谷口、後藤、高等学校教員による研究協力者)あわせて当該授業配信の受講者による評価を行い、改善点等の抽出を行った。(1)ブロードバンドネットワークを用いた高大連携教育の方法および学習システムの研究高速通信ネットワーク(ブロードバンド)を用いた同期双方向通信および、オンデマンドによる教材(映像、印刷メディアを用いた)の提供システムを用いた高大連携教育の方法・学習システムの構成を検討し、両方式を用いた授業コンテンツの作成と授業を実践した。前者については6月22日、8月6日、2月25日の3回、岐阜県情報通信ネットワークのブロードバンド回線による学校間ネットワークおよびインターネット回線を用いて、岐阜女子大学と岐阜県内高校およびオーストラリアを結び、岐阜女子大学のネイティブスピーカー教員等によるコーディネートの元、岐阜県内高校生に、ナチュラルでオーセンティックな英語学習環境を提供するとともに授業の評価を行った。後者については、岐阜女子大学e-Learning教育システムを用いたオンデマンド授業(数学および理科合計4科目)を作成し、高等学校の生徒に対しインターネット環境による授業配信を行い、高等学校および自宅で連携授業を受講できるようにした。あわせて当該システムによる授業配信の評価を行った。(谷口、橋詰、菊川、その他協力教員)(2)高校生や導入期教育にかかわる教育プログラムの開発大学教員と高校教員の協同による、主に教科情報にかかわる教育プログラム(デジタル・アーキビスト養成を中心にして)の開発および運用に係るプロジェクトを構成し、基礎研究を行った。(谷口、後藤、高等学校教員による研究協力者)(1)ブロードバンドネットワークを用いた高大連携教育の方法および学習システムの研究昨年度に引き続き、高速通信ネットワーク(ブロードバンド)を用いた同期双方向通信および、オンデマンドによる教材(映像、テキストを用いた)の提供システムを用いた高大連携教育の方法・学習システムの構成を検討し、両方式を用いた授業コンテンツの作成と授業を実践した。前者については5月17日、6月20日21日、7月125日、10月21日、10月24日25日、11月9日、11月15日16日、3月16日17日に、岐阜県情報通信ネットワークのブロードバンド回線による学校間ネットワークおよびインターネット回線を用いて、岐阜女子大学と岐阜県内高校およびオーストラリアを結び、岐阜女子大学の英語のネイティブスピーカー教員等によるコーディネートの元、英語教育プログラムを中心として高大連携授業を行った。
TGF-β coated β-TCP 移植後の歯周組織再生に関する研究

近年種々のサイトカインが発見され、一部のサイトカインは歯周疾患の発症と進行、あるいは治癒に大きく関与しているとの報告がある。なかでも、transforming growthfactor-β(TGF-β)は創傷治癒に関わるサイトカインとしてその性格が様々な方面から検討され、in vitroにおいてTGF-βはフィブロネクチンなどの細胞外基質の発現を促進したり、I型コラーゲン、III型コラーゲン、オステオネクチンなどの骨における重要な基質タンパクの合成を促進することが報告されている。本研究では、実験動物に永久歯の完全に萌出した雑種成犬を用い、完全麻酔下で、下顎第3小臼歯、第4小臼歯間及び第4小臼歯、第1大臼歯間に粘膜弁を形成後、歯槽骨頂部にラウンドバ-を用いて直径約3mmの一壁性骨欠損を形成すると共に欠損部に相当するセメント質を削除した。欠損部にβ-TCP顆粒を移植した。その後、粘膜弁を復位し、縫合閉鎖した。処置後、2、4、および8週目に処置部位を含む、歯および歯周組織を全身麻酔下で一塊として採取した。採取した試料は、10%ホルマリンにて浸漬固定し、脱灰処理後、6μmの連続薄切切片を作成し、ヘマトキシリン-エオジン重染色して観察した。組織学的観察から、β-TCPは、骨移植材として生体親和性にすぐれ、組織学的に良好な結果が得られることがわかった。今後の研究の展開として、凍結吸引乾燥法にて、TGF-βをコーティングしたβ-TCPをイヌ下顎骨欠損部へ移植し、TGF-βの骨形成に対する作用を組織学的に観察し検討する計画である。
力情報を活用した鍼治療教育訓練システムの開発

近年世界的に東洋医学への関心が高まってきている。その中、鍼治療の効果に特に期待が集まり、それに対応できるため鍼師の育成が急務となる。鍼治療は実践的な要素が多く、高度な技法を修得することは繰り返しの学習訓練が不可欠である。本研究では人工現実感を用いた鍼治療教育訓練システムを提案した。本システムではコンピュータ内の3D人体ツボモデルを用いて繰り返しの学習と練習ができると同時に、定量的な情報提示とリアルタイムの正誤判断によって、高臨場感の学習・訓練の環境を実現した。近年日本では医師と医学生を始め一般人特に高齢者は東洋医学および鍼診療への期待が高まりつつある。鍼師の育成が急務となり,これから鍼教育、訓練の必要性が年々増えていくと予想される。鍼治療は実践的な要素が多く,高度な技法を修得することは学習訓練に不可欠であり,繰り返し練習によって技術を身につけることが最も重要である。コンピュータを用いた学習訓練システムは繰り返し訓練することができるというメリットがある。更に鍼灸師の育成においては,単純に教材の学習でなく,高臨場感とリアルタイムの正誤判別を利用しながら実際の操作を練習できる学習、訓練の環境と方法が求められる。本研究では初年度において人主現実感を用いた鍼治療学習訓練システムの提案と構成を行い,コンピュータ内に3次元人体ツボモデルの腕のモデルを生成した。人体ツボモデルを用いてツボの位置,深さ,役割,刺鍼点などの情報提示を行い,学習者にリアルタイムの正誤判定の提示ができるようになった。これから来年度の研究計画を実行できるようにさらに人体ツボモデル化を充実させる必要がある。本研究で提案した教育訓練システムの特徴として視覚情報提示と同時に鍼の微細な操作法の提示も行う。しかし,今までの鍼師の養成には繰り返しの練習によって感覚で覚えるしかなかったため,操作法にあたる速度や力などの定量的な測定と解析のデータがほとんどない。そこで,本研究では定量的な操作情報の提示ができるために,まず鍼師の微細な操作要素を測定、解析を行い,力を含めた鍼治療時の操作動作を解明する必要がある。そして,訓練のための指標を確立し,直接操作できる鍼治療デジタル教育訓練システムの開発を進めていく。近年世界的に東洋医学や鍼灸治療への期待が高まってきて鍼師の育成が急務となる。それを用いて繰り返しの学習と練習ができると同時に、テキストや平面図の教材学習のかわりに、コンピュータ内の3次元モデルを用いて高臨場感の学習・訓練の環境を実現した。更にリアルタイムの正誤判別を利用することで、今まで確認しにくい学習訓練の結果を評価することができるようになった。本研究では初年度において人工現実感を用いた鍼治療学習訓練システムの提案と構成を行い、コンピュータ内に3次元人体ツボモデルの腕のモデルを生成した。人体ツボモデルを用いてツボの位置、深さ、役割、刺鍼点などの情報提示を行い、学習者にリアルタイムの正誤判定の提示ができるようになった。さらに本年度では人体ツボモデルを充実させ、頭部ツボモデルを用いて切皮(刺入)角度の学習訓練システムを構築し、提案手法の有効性を確かめた。実は今までの鍼師の養成には繰り返しの練習によって感覚で覚えるしかなかったため、操作法にあたる速度や力などの定量的な測定と解析のデータがほとんどない。そこで、本年度では鍼の微細な操作を定量的に提示できるように、まず鍼師の切皮操作を測定・解析を行い、鍼治療時の切皮動作を解明し定量化を行った。そして、リアルタイム正誤判断ができるように、切皮速度の指標を確立した。そこで、教育現場や臨床医師との検討を重ねながら、より臨場感と操作感の高い教育訓練システムの開発を図る。本研究は従来の工学と医学の枠を越え異分野の融合として研究開発を進んでいる。現状の鍼治療教育訓練の問題点を解決するために、本研究では鍼治療の医療分野に知能システム、メカトロニクスとコンピュータ情報技術を生かし、高臨場感のコンピュータ教育訓練システムの開発を目指している。本研究では下記の内容に絞って鍼治療教育訓練へ工学的な研究アブローチを行っている。1)コンピュータ内に人体ツボモデルを作成し、鍼治療と対応したツボや経絡の情報を提示する。2)人工現実感技術を用いた鍼治療教育訓練システムを構築し、教示情報の呈示を充実させる。3)鍼師の操作情報、入鍼速度、力情報の測定および学習訓練の指標をシステムに確立する。4)操作感覚を伴った訓練を実現するために力覚フィードバック装置の開発と構築を行う。今年度では、鍼治療は高度な操作性が要求されているため、鍼治療の力情報を含んだ微細な操作がリアルタイム正誤判断できるように、鍼師の操作情報の取得および学習訓練の指標をシステムに確立することを行った。

そこで、鍼師の操作力を取得するための実験装置を開発し、鍼治療の微細操作の動作(速度、刺入力)の測定と解析を行って、鍼治療の刺入速度と力の指標を定めた。教育訓練システムの提示情報として、視覚情報及び力触覚情報の同時提示が求められている。それを実現するため、システムに力覚提示と同時に視覚的な教示情報も充実させ、より実用的、有効な学習訓練システムの開発と構築を行った。そこで、教育現場や臨床鍼師との検討を重ねながら、より高臨場感と操作感の教育訓練システムの開発を図っている。
アジア域内における陸路輸送を中心とした国際物流ネットワークの最適化に関する研究

近年,アジア域内において物流インフラ整備に伴い陸路輸送の利活用が始まったものの,インフラの状態や輸送品質が不十分であることから問題が多く見られる.本研究では,アジア域内における物流ネットワークの現地調査及びデータ収集を行い,トラック実走による輸送品質データベース及び物流ネットワークデータベースを構築した.数理モデルとして,時系列統計解析による輸送品質の評価モデル,輸送品質を考慮した最適輸送ネットワーク解析モデル及び内陸部における物流ハブ施設配置モデルの開発を行なった上で,フィージビリティ・スタディにより計算時間や実行可能性などの評価を行った.本研究では,アジア域内を対象とした陸路輸送を中心とした国際物流ネットワークの現状把握,データベースを構築した上で,輸送品質を考慮した最適輸送ルート選択モデル,物流ハブ最適配置モデルを用いて国際物流ネットワークの最適化を行うことを目的とする.今年度は,下記のような研究を行った.・アジア域内における物流ネットワークの現地調査及びデータ収集:アジア域内における物流ネットワークを構成する主要な港湾,空港,道路について,関連機関を訪問し,国際・国内物流の現状と課題について現地ヒアリング調査及び物流ネットワークに関する統計データの入手を行った.・トラック実走による輸送品質データベースの構築:現地調査及びデータ収集を踏まえて,荷主企業及び損害保険会社の協力により,アジア域内の主要区間におけるトラック実走により,振動・衝撃・圧縮,温度・湿度といった輸送品質に関するデータを収集した.・物流ネットワークデータベースの構築:現地調査及びデータ収集を踏まえて,地理情報システムを用いて主要港湾,空港から主要都市間の陸路輸送ルートについてネットワークデータを構築する.道路については,国際連合により整備されているアジアハイウェイデータベースを元に,道路規格や路面状況といったデータ項目についてネットワークデータを構築した.・数理モデルのプロトタイプの構築:次年度に開発予定である時系列統計解析による輸送品質の評価モデル及び輸送品質を考慮した最適輸送ネットワーク解析モデルについて,プロトタイプを構築し,小規模データによる計算時間や実行可能性の評価を行なった.本研究では,アジア域内を対象とした陸路輸送を中心とした国際物流ネットワークの現状把握,データベースを構築した上で,輸送品質を考慮した最適輸送ルート選択モデル,物流ハブ最適配置モデルを用いて国際物流ネットワークの最適化を行うことを目的とする.今年度は,下記のような研究を行った.・時系列統計解析による輸送品質の評価モデル:前年度に構築したトラック実走による輸送品質データベースに対して,主に輸送中に貨物にかかる振動・衝撃について,時系列データと見なすことでファイナンス理論に基づく統計解析を行なうプロトタイプモデルについて検討を行った.・輸送品質を考慮した最適輸送ネットワーク解析モデルの開発:前年度に構築した物流ネットワークに対して,輸送中に貨物にかかる振動・衝撃・圧縮,温度・湿度といった輸送品質に関する変数により各ルートの輸送コストを数値化することで,最短経路問題を元に輸送コストを最小となる最適輸送ルートを求めるネットワーク解析モデルについて検討を行った.・数理モデルのプロトタイプの構築:次年度に開発予定である内陸部における物流ハブ施設配置モデルの開発について,プロトタイプの構築について検討を行った.研究計画の予定通りに進展しているため.本研究では,アジア域内を対象とした陸路輸送を中心とした国際物流ネットワークの現状把握,データベースを構築した上で,輸送品質を考慮した最適輸送ルート選択モデル,物流ハブ最適配置モデルを用いて国際物流ネットワークの最適化を行うことを目的とする.今年度は,下記のような研究を行った.・内陸部における物流ハブ施設配置モデルの開発:アジア域内における港湾や空港,主要都市からの輸送に対応したハブアンドスポークシステムを構築するため,内陸部における物流ハブの最適な配置を検討する必要がある.昨年度に構築した最適輸送ネットワークを用いて,都市工学で研究の蓄積がある施設配置モデルを元に,輸送費用が最小となる最適なハブ施設配置を求める定式化を行った.・時系列統計解析による輸送品質の評価モデル:国際物流における輸送品質,輸送環境等のデータを用いた時系列解析モデルに関する基礎的検討を行った.また,本時系列解析モデルを組み込むためのサプライチェーン評価モデルを構築し,輸送時や供給元のリスク,輸送コスト等の経済性を含めた分析を行うためのモデルへの拡張を行った.・フィージビリティ・スタディ:上記の分析について,物流ネットワークデータベースにおいて対象とした地域をケーススタディとして,時系列統計解析による輸送品質の評価モデル,輸送品質を考慮した最適輸送ネットワーク解析モデル,内陸部における物流ハブ施設配置モデルのモデル分析を行った.そして,輸送品質評価,最適輸送ネットワーク,最適施設配置の結果に対して,フィージビリティ・スタディを行い,計算時間や実行可能性などの評価を行った.近年,アジア域内において物流インフラ整備に伴い陸路輸送の利活用が始まったものの,インフラの状態や輸送品質が不十分であることから問題が多く見られる.本研究では,アジア域内における物流ネットワークの現地調査及びデータ収集を行い,トラック実走による輸送品質データベース及び物流ネットワークデータベースを構築した.数理モデルとして,時系列統計解析による輸送品質の評価モデル,輸送品質を考慮した最適輸送ネットワーク解析モデル及び内陸部における物流ハブ施設配置モデルの開発を行なった上で,フィージビリティ・スタディにより計算時間や実行可能性などの評価を行った.研究計画の予定通りに進展しているため。・内陸部における物流ハブ施設配置モデルの開発

アジア域内における港湾や空港,主要都市からの輸送に対応したハブアンドスポークシステムを構築するため,内陸部における物流ハブの最適な配置を検討する必要がある.昨年度に構築した最適輸送ネットワークを用いて,都市工学で研究の蓄積がある施設配置モデルを元に,輸送費用が最小となる最適なハブ施設配置を求める定式化を行う.・フィージビリティ・スタディ上記の分析について,物流ネットワークデータベースにおいて対象とした地域をケーススタディとして,時系列統計解析による輸送品質の評価モデル,輸送品質を考慮した最適輸送ネットワーク解析モデル,内陸部における物流ハブ施設配置モデルのモデル分析を行う.そして,輸送品質評価,最適輸送ネットワーク,最適施設配置の結果に対して,フィージビリティ・スタディを行い,計算時間や実行可能性などの評価を行う.社会システム工学・時系列統計解析による輸送品質の評価モデル:平成26年度に構築したトラック実走による輸送品質データベースに対して,主に輸送中に貨物にかかる振動・衝撃について,時系列データと見なすことでファイナンス理論に基づく統計解析を行なうモデルを開発する.・輸送品質を考慮した最適輸送ネットワーク解析モデルの開発:平成26年度に構築した物流ネットワークに対して,輸送中に貨物にかかる振動・衝撃・圧縮,温度・湿度といった輸送品質に関する変数により各ルートの輸送コストを数値化することで,最短経路問題を元に輸送コストを最小となる最適輸送ルートを求めるネットワーク解析モデルを構築する.・数理モデルのプロトタイプの構築:次年度に開発予定である内陸部における物流ハブ施設配置モデルの開発について,プロトタイプを構築し,小規模データによる計算時間や実行可能性の評価を行なう.現地調査を行わなかったので,旅費を使用しなかったため.数理モデルのプロトタイプの構築において、既存の計算機環境を使用し、購入を必要としなかったため。現地調査を行い,旅費を使用する計画である.時系列統計解析による輸送品質の評価モデルにおいて、開発用の計算機を購入する予定である。
インスリン分泌過程におけるミオシンVaの機能解析

本研究では、調節性分泌として知られる分泌顆粒の開口放出機構を解明するために、インスリン顆粒に局在し、その動態を制御すると考えられるミオシンVaの機能について研究している。これまでの解析では、ミオシンVaのドミナントネガティブ体発現あるいはノックダウンといった手法を用いていたため、詳細な機能は明らかとなっていなかった。そこでGriscelli症候群のモデルとして知られるミオシンVaのnull変異ラットから単離した膵β細胞を用いることで、インスリン分泌過程におけるミオシンVaの明確な機能を解明し、2型糖尿病におけるインスリン分泌不全機構の解明につなげる。まず、インスリン分泌過程へのミオシンVaの関与について検討するため、野生型と変異ラットについて耐糖能を比較・検討した。その結果、絶食時の血糖値が変異ラットでは野生型に比べて低いが、耐糖能そのものには差は見られなかった。次に、インスリン分泌への影響について検討するため、各ラットより単離した膵島を用いてペリフュージョン分泌実験を行った。その結果、野生型と比較して変異ラットの膵島では、インスリン分泌量が低下していることがわかった。さらに、電子顕微鏡により分泌顆粒の分布を解析したところ、変異ラットでは高グルコース刺激による分泌顆粒の局在変化が見られなかった。つまり、ミオシンVaがないことで、分泌が抑制されていることが示唆された。以上の結果から、ミオシンVaはインスリン分泌過程において正に制御する因子である可能性が示唆された。
ＱＴＯＦ質量分析装置を用いたベンゾジアゼピン系薬物分析法の新展開

多剤薬物中毒の分析には,飛行時間型質量分析計(QTOF)を用いた包括的手法が必要である.ベンゾジアゼピン系薬物と法医中毒薬毒物のトリガーMRMメソッドを作成,応用を試みた.前処理法は簡便なACN法で十分であることが判明し,対象薬物添加試料を用いて,定量用トランジションについて分析精度・イオン抑制などを検討,MS/MSスペクトルライブラリを構築して,剖検事例でも良好なスペクトル一致率が得られた.本研究では,QTOF測定後MFE法を用いてノイズ除去処理を行い,大規模精密質量データベースなどのライブラリ検索を行った.その結果,新たな代謝物も検出され,包括的QTOFスクリーニング法として有効であった.本研究は,ベンゾジアゼピン系薬物を含む剖検事例に対する包括的スクリーニング法として,LC/QTOFーMS(QTOF)質量分析装置を用いたベンゾジアゼピン系薬物ならびに代謝物の高感度・高選択的な分析法を開発することを目的とする.イオン抑制効果を含めたベンゾジアゼピン系薬物ならびに代謝物のLCーMSーMS質量データベース,QTOF精密質量データベースを作成し,ベンゾジアゼピン系薬物中毒患者試料や剖検資料へ応用する。H23年度は,ベンゾジアゼピン系薬物のプロダクトイオン理論値と実測値の標準的データをライブラリに集積,スペクトルライブラリを構築しベンゾジアゼピン系薬物トリガーMRM法を確立した.H24年度は精密質量データベースを使用するQTOFのMSMS構造相関(MSC)プログラムの包括的アプローチを検討した.QTOF分析は陽イオンモードと陰イオンモードで測定,ベンゾジアゼピン系薬物の保持時間と精密質量データベースを使用し,0.02daのマスウィンドウおよび1minの保持時間ウィンドウを備えた(M+H)+種の抽出するイオンを抽出,さらにMolecular Feature Extraction(MFE)を用いてイオンを絞り込んだ.生体試料を用いてのQTOF精密質量データベースの検出限界は10ng/ml,MFEでは5000カウント以上の化合物が識別されたが,多くの擬陽性イオンも観察された.対象薬物添加試料をQTOF測定後,MFE/6643薬物精密質量データベースによるスクリーニングを行い,MFEのパラメータを最適化することでエチゾラム、トリアゾラムの代謝物を除いた全薬物の検出が可能であった.剖検資料では,ACーRTで検出された薬物以外に新たな薬物が検出され,包括的スクリーニング法としてQTOF及びMFE/大規模精密質量データベーススクリーニング法が有効であることが確認された.飛行時間型質量分析計(QTOF)は分解能の高い包括的な測定が可能であることから,本研究では,精密質量-保持時間データベースを併用したベンゾジアゼピン系薬物ならびに代謝物の高感度・高選択的な分析法の開発を目的とした。今年度はベンゾジアゼピン系薬物を含む剖検薬物事例に対して,包括的QTOFスクリーニングを応用し,全化合物抽出イオンクロマトグラム(All ion MSMS法)及び精密質量データベースライブラリを用いて検索,ターゲットMSMS法による精密質量MSMSスペクトルライブラリ検索で確認を行い,さまざまな代謝物の検索を行った。試料は日本医科大学法医学教室で剖検した薬物が関与したと思われる事例の心臓血・心嚢液・胆汁・胃内容・尿などで,試料前処理法はをアセトニトリル除蛋白.尿はそのまま,あるいは0β-グルクロニダーゼ加水分解試料を用いた。All ionMSMS法で測定後,Find compound by formula (FCS)手法を用いることで高濃度のメタンフェタミン,プロメタジン,クロルプロマジン,低濃度のトラゾドン,トリアゾラム,フルニトラゼパムならびに各化合物の代謝物が検出され、いずれも相対質量誤差は3ppm以内と良好であった。All ion MSMS法及びMSMSスペクトルを用いることで偽陽性を低減することができ,標準品を入手しなければ検出することが困難であった代謝物類を検索することが可能となった。剖検資料の薬物分析では,高濃度に存在する薬物が微量成分に定量に影響を及ぼすことが多いが,All ionMSMS法ならびにFCS手法を中心とした包括的QTOFスクリーニング法を用いることによって,体内では低濃度を示すベンゾジアゼピン系薬物分析に有効であることが確認された。多剤薬物中毒の分析には,飛行時間型質量分析計(QTOF)を用いた包括的手法が必要である.ベンゾジアゼピン系薬物と法医中毒薬毒物のトリガーMRMメソッドを作成,応用を試みた.前処理法は簡便なACN法で十分であることが判明し,対象薬物添加試料を用いて,定量用トランジションについて分析精度・イオン抑制などを検討,MS/MSスペクトルライブラリを構築して,剖検事例でも良好なスペクトル一致率が得られた.本研究では,QTOF測定後MFE法を用いてノイズ除去処理を行い,大規模精密質量データベースなどのライブラリ検索を行った.その結果,新たな代謝物も検出され,包括的QTOFスクリーニング法として有効であった.本研究は,QTOF質量分析装置を用いてベンゾジアゼピン系薬物ならびに代謝物の高感度・高選択的な分析法を開発することを目的とする.イオン抑制効果を含めたベンゾジアゼピン系薬物ならびに代謝物のLC-MS-MS質量データベース,QTOF精密質量データベースを作成し,ベンゾジアゼピン系薬物中毒患者試料や剖検資料へ応用する。H23年度は,基盤研究(C)課題番号19590682

「質量分析の新技法を用いたベンゾジアゼピン系薬物分析法の再構築(H19-H22)」で作成した精密質量データベースに加えて,ベンゾジアゼピン系薬物のプロダクトイオン理論値と実測値の標準的データをライブラリに集積,スペクトルライブラリを構築しベンゾジアゼピン系薬物トリガーMRM法を確立した.トリガーMRM法は各薬物の主要8イオンで再構成されたスペクトルをデータベース検索できるもので,強度の高いプリカーサーイオンとプロダクトイオン1種類の組み合わせで測定していた従来のターゲットMRM分析の弱点を補う方法であり,ベンゾジアゼピン系薬物の確認には有効であった.一方,精密質量データベースを使用するLC/QTOF-MS(QTOF)を用いて,MSMS構造相関(MSC)プログラムの包括的アプローチを検討した.QTOF分析は陽イオンモードと陰イオンモードで測定,ベンゾジアゼピン系薬物の保持時間と精密質量データベースを使用し,0.02daのマスウィンドウおよび1minの保持時間ウィンドウを備えた(M+H)+種の抽出するイオンを抽出,さらにMolecular Feature Extraction (MFE)を用いてイオンを絞り込んだ.生体試料を用いてのQTOF精密質量データベースの検出限界は10ng/ml,MFEでは5000カウント以上の化合物が識別されたが,多くの擬陽性イオンも観察された.トリガーMRM法は各薬物の主要8イオンで再構成されたスペクトルをデータベース検索できるもので,強度の高いプリカーサーイオンとプロダクトイオン1種類の組み合わせで測定していた従来のターゲットMRM分析の弱点を補う方法である.ベンゾジアゼピン系薬物ならびに代謝物とメタンフェタミン,MDMA,モルヒネなど法医中毒学的に重要な薬物を含むトリガーMRMメソッドを作成し,剖検事例への応用を試みた.対象とする薬物についてトリガーMRM法における定量用トランジションについて対象薬物添加試料を用いて,検出限界・直線性・再現性・イオン抑制などを検討,疑似MS/MSスペクトルライブラリを構築した.今回検討した剖検事例では良好なスペクトル一致率が得られ,トリガーMRM法を確立することができた.QTOF精密質量データベース、MSMSライブラリおよびMSCプログラムを使用する包括的アプローチにトリガーMRM法を加えることにより,非常に有効であることが明確となったことから,当初の計画以上の進展が見込まれる.ベンゾジアゼピン系薬物トリガーMRM法を確立,ベンゾジアゼピン系薬物の確認に確実性が増したこと,QTOF精密質量データベース、MSMSライブラリおよびMSCプログラムを使用する包括的アプローチは非常に有用であることが明確となったことから,当初の計画以上の進展が見込まれる.平成23,24年度に得られた結果を基にして,QTOF精密質量データベース、MSMSライブラリおよびMSCプログラムを使用する包括的アプローチにトリガーMRM法を加えてベンゾジアゼピン系薬物を含む剖検事例に対する包括的スクリーニング法を最適化する.H25年度は最終年度となるため,生体試料を用いた検証を重点的に行う.すなわち,救命救急センター収容のベンゾジアゼピン系薬物中毒患者試料あるいはベンゾジアゼピン系薬物が関連した剖検資料について,LCーMSーMS質量データベースを用いたQTOFターゲット分析を行う.ベンゾジアゼピン系薬物を含む
膜透過性ペプチド核酸を利用したリアルタイム細胞内微小環境pHセンサーの開発

細胞膜不透過性であるペプチド核酸(PNA)に膜透過性ペプチドを付加することにより、膜透過型ペプチド核酸の開発に成功した。本研究では、このペプチド核酸を利用して以下の細胞内蛋白機能解析方法の開発を目的とした研究を実施した。1.遺伝子発現制御・・・哺乳細胞発現用プラスミドDNAとハイブリダイズする最適膜透過性PNAの決定と合成を行った。同PNAとプラスミドを反応させ、その後細胞培養液中に添加することで、培養細胞に遺伝子を導入する技術開発に成功した。さらに、導入効率を良くするための技術開発を行った。2.蛋白発現制御・・・膜透過性PNA-p53アンチセンスを癌細胞に導入することにより、同細胞内の変異p53蛋白・mRNAの発現抑制に成功した。また、本技術と我々が開発していたp53蛋白導入法を組みあわせることにより、癌細胞に発現しているp53を変異型から正常型に置換する蛋白置換法の開発に成功した。3.In situ細胞内環境測定・・・シトシンの位置を変化させた10個のDNAを作製し,pH7付近を測定するのに最も適したアンチパラレルDNA配列を探索した。そして、AGAAAGAGAAGAの塩基配列が最もpHの低下に伴って,Cy3由来の564nm付近蛍光強度が減少し,最も効率よくFRET効果を示すことが判明した。さらに、この配列を有するPNAを作製し、細胞内に導入することに成功した。本研究により以下のことを明らかにした。1.膜透過型ペプチドPNAの細胞内への導入効率の検討。最も効率よくペプチド核酸(PNA)を細胞内に導入するためのPNAに付加するペプチド配列の決定を行った。リジン、アルギニンを中心として様々なペプチドを作製し、ペプチド核酸に付加した。同ペプチドPNAにさらにFITCを付加し、293細胞の培養液中に1μMの濃度で添加した。細胞内への導入効率について、共焦点顕微鏡を使用したリアルタイムイメージング法にて検討した。その結果、RRPKKKRKVRKRRおよびPKKKRKVRRRRの配列のペプチドとPNAを合成したペプチドPNAが効率よく細胞内に導入されることが明らかになった。2.pH78でパラレル型からアンチパラレル型に移行するPNA配列の決定。パラレル型からアンチパラレル型に移行するためにはシトシンの位置、数が重要な決定事項であることが判明した。そこで、シトシンの位置、数を変えた様々なPNAを作製した。それぞれのPNA鎖の5'側にCy3およびCy5の蛍光団を付加し、蛍光団の距離の差を,in vitroでfluorescence resonance energy transfer (FRET)にて測定し、pHの変化に伴う各波長における蛍光強度を計測した。その結果、3'-AGAAAGAGAAGA-5'、5'-TCTTTCTCTTCT-3'の相補的PNAが最もフレット効果が大きかった。1,2で開発した細胞導入ペプチド、PNAを合成したペプチドPNAを作製した。同ペプチドPNAを293細胞内に導入し様々な刺激を細胞に与え、そのFRET効果について検討した。細胞内のpHが7.4から8に変化すると100ms以内にFRET効果が現れ、細胞内のpH変化を測定できることが明らかになった。本研究では、細胞膜不透過性であるペプチド核酸(PNA)に膜透過性ペプチドを付加することにより、膜透過型ペプチド核酸の開発研究を実施した。SV40核移行シグナルの両端にアルギニン残基を2個づつ付加したペプチドをペプチド核酸に付加することにより、ペプチド核酸を細胞内に効率よく導入させることに成功した。さらにpH78でパラレル型からアンチパラレル型に移行するペプチド核酸配列の決定を行った。シトシンの位置を変化させた10個のPNAを作製し、pH7付近を測定するのに最も適したアンチパラレルPNA配列を探索した。その結果、AGAAAgAGAAGAのPNA配列が、最もpHの低下に伴ってCy3由来の564nm付近蛍光強度が減少し、最も効率よくFRET効果を示すことを明らかにした。

さらにこのPNAに本研究で開発した細胞導入ペプチドを付加することにより細胞内に導入することができた。本研究成果により、膜透過性PNAを利用したリアルタイム細胞内pHセンサー開発が可能であることが示された。
胆嚢・胆管の形態形成・再生能と先天性疾患の分子機構の解明

申請者は、胎生期の胆嚢上皮前駆細胞でのSOX17の発現量の半量低下により、細胞自律的に胆管上皮が管腔内への脱落(上皮破綻)し、妊娠後期で胆道閉鎖症(BA)を引き起こす疾患モデルマウスを世界で初めて開発しました。このSox17ハプロ不全により、胆嚢上皮は、1)肝内胆管に類似したSOX9+/SOX4+細胞へ脱分化し、細胞自律的に上皮細胞の脱落が生じ、胆嚢炎を引き起こすこと、さらに、2)Shhシグナルの発現低下により胆嚢周囲の平滑筋層の形成異常と収縮能の低下を招き、胆汁鬱滞が引き起こされることが判明しました。以上のBA発症の初期動態の解明は、新しい診断技術・予防法・治療法の開発に貢献します。本研究課題は、胆管系の発生・形態形成過程でのSOX17陽性の胆管細胞の動態・機能を明らかにすることにより、哺乳類の胆管系の構築の分子機序とその形成異常による肝・膵・胆管系の先天性疾患の分子基盤の解明を目的としている。Sox17 +/- (ヘテロ)マウス(B6系統)では、SOX17陽性の胆管前駆細胞の増殖能が低下し、13.5 dpc頃から異所性の肝外胆管の形成、さらに胆嚢の低形成、胆嚢・胆管上皮細胞の管腔内への剥離による胆管閉塞が誘導されることを見出している。初年度は、胎生期の肝炎マーカーの発現上昇のタイミングを詳細に解析した結果,胆汁の十二指腸への分泌開始後すぐに、肝炎マーカーの発現上昇することが判明し、肝臓からの胆汁の胆道への分泌後に肝炎が発症する証拠を得た。さらに、肝炎発症でのマウス系統差を解析した結果,肝炎を発症するB6系統で、肝炎を発症しない系統(ICR, 129)と比べ、(1)顕著にSOX17蛋白の発現レベルが低下していること、(2)異所性の肝管の形成率が有意に高いことが判明し、新生子肝炎の発症と異所性肝管の有無は、胎子のSox17 +/-胆管領域でのSox17発現量に依存していることが明らかとなった。これは、SOX17陽性の胆管細胞が、細胞自律的な異常により胆道閉鎖/肝炎を発症していることが示唆された。また、一部のヒトの先天性胆管閉鎖症に認められる左右軸の側性の異常、胆管上皮の線毛(シリア)の分布には、Sox17へテロ胆管では異常を示さなかった。最後に、従来から提唱されていた胆管形成に関わるNotch, Nodalシグナル関連遺伝子の発現レベルに関しても,ヘテロ、野生型において有意な差異は認められなかった。以上の結果から、Sox17 +/- (ヘテロ)マウス(B6系統)は、新しいタイプの胆管閉鎖症の病態モデルであることが証明された。本研究課題は、SOX17陽性の胆管細胞の動態・機能を明らかにすることにより、哺乳類の胆管系の構築の分子機序とその形成異常による肝・膵・胆管系の先天性疾患の分子基盤の解明を目的としている。Sox17+/-マウスにおけるSOX17+胆管前駆細胞を含む胆嚢原基と胆嚢管の領域に分けて発現解析行った。Sox17 +/-胆嚢では、胆嚢特異的な遺伝子発現の低下、胆嚢管に特異的な遺伝子の発現が上昇しており、「Sox17+/-胆嚢は、胆嚢管化している」ことが判明した。これは、Sox17 +/-胆嚢上皮細胞で、肝内胆管,膵管の上皮細胞に特異的なSOX9発現レベルが有意に上昇していることでも確認できた。さらに、E15.5のSox17 +/-胆嚢原基では、野生型と比べ急性炎症,創傷治癒関連の遺伝子群の発現が上昇していることから、胆管炎も発症していることも判明した。さらに、E15.5のSox17+/-胆嚢で特定のシグナル経路が有意に減少していることを見出した。発現解析,器官培養下におけるrescue実験の結果、従来考えられていたNotch, Nodalシグナル以外のシグナル因子がSOX17により胆嚢上皮から発現上昇により分泌され,胆嚢上皮周囲に位置する間葉系細胞(その受容体の発現細胞)に作用している可能性が判明した。上皮周囲の間葉系組織から、positive feedbackにより胆嚢上皮に逆に作用し、胆嚢上皮でのSOX17発現を上昇,維持するシグナル経路の存在も強く示唆された。これらの結果は,1)胆嚢,胆管の形態形成は、従来の考えられていたメカニズムとは異なり,2種類の異なったシグナル経路を介して誘導されること、2)このシグナルにより胆嚢,胆管前駆細胞が維持されていることが強く推測された。今後,Sox17の上流下流のこれらのシグナル経路に着目して機能解析を行い、胆管上皮の破綻の原因、胆嚢炎,胆管炎,胆道閉鎖に至る病態メカニズムの全貌が解明できるものと期待される。本研究課題は、胆管系の発生・形態形成過程でのSOX17陽性の胆管細胞の動態・機能を明らかにすることにより、胆管系の構築の分子機序とその形成異常による先天性疾患の分子基盤の解明を目的としている。本年度は、下記の成果を得た。