hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高性能偏極ヘリウム３生成技術の開発と応用の研究

スピン交換光ポンピング法による3He核偏極では、偏極の過程で利用しているRbの密度の低さが性能に対する制約の一つとなっている。そこで、ゼオライト中に分散させたRbを利用することで密度の問題を克服し、3Heガス核偏極の効率を高める方式を提案し、実証実験を実施した。また、偏極3Heの応用として、パルス中性子対応の、大立体角検出器をカバー可能な偏極中性子回折測定用中性子スピンアナライザーの開発を進めた。本研究で設計したOffline SEOP方式偏極3He NSFアナライザーは、J-PARCのパルス中性子小角散乱装置のアナライザーとして採用されることが決定し、現在実機の製作が進んでいる。今年度はヘリウム3ガスとアルカリ金属を円筒形状のガラスセルに封入した核偏極試験セルを製作した。また、実際にレーザーを照射して光ポンピング実験を行いヘリウム3ガスの核偏極を確認した。次に中性子スピンフィルターとして効率的に利用するためのガラスセルの開発を行った。核偏極ヘリウム3ガスを効率的に利用するには、セルに充填するガス圧を6気圧に高める必要がある。円筒形ガラスセルで高圧に耐えられるようにするには、ガラスを非常に厚くする必要がある。ガラスが厚くなれば中性子の透過度が低下し不都合である。この問題を解決するために、薄いガラスで高い充填圧力に耐えられる偏極ヘリウム3ガス用ガラスセルの設計を行った。有限要素法による応力計算で形状最適化を行い、従来の1/3の厚さのガラスで6気圧に耐えられるガラスセルの開発に成功した。これにより中性子透過度を高く保ちつつ、高い充填圧力のセルを作製する事が可能となった。これはin-situ方式偏極ヘリウム3ガス中性子スピンフィルター用としては世界初の成果でり、2014年に開催される国際会議「PNCMI2014(偏極中性子を用いた物性研究に関する国際会議)」にて発表を予定している。次いで、偏極ヘリウム3ガス用磁気シールドの設計を行った。中性子実験では、偏極ヘリウム3ガスは強磁場環境装置と組み合わせて使用されることが想定されている。しかし、偏極ヘリウム3ガスは不均一磁場に非常に弱く、強磁場試料環境装置の近くでは数分程度で核偏極が失われ実用的ではないという課題があった。この問題解決に取り組み、最終的に7Tの強磁場環境装置のそばでも偏極ヘリウム3ガス中性子スピンフィルターを使用可能とする、小型で高性能な磁気シールドの開発に成功した。この磁気シールドにより、従来は数分で核偏極が失われるところを、100時間以上にのばすことが可能となった。この成果については、2013年度の日本中性子科学会で報告を行った。本研究には大きく分けて高気密ヘリウム3ガス循環ラインの開発、アルカリ金属担持ゼオライト膜の開発、ヘリウム3ガス偏極度測定・極性制御用電子回路の3つの開発要素が存在する。高気密ヘリウム3ガス循環ラインの開発においては今年度はガス循環ラインおよびアルカリ金属担持ゼオライト膜設置容器に要求される性能を検討し、設計を進めた。その結果を受け、ガス回収が可能な気密性スクロールポンプなど実験に必要となる機材の発注を行った。また、実験に使用するヘリウム3ガスの発注を併せて行った。さらに、ゼオライト膜を用いないSEOP法により3Heガスの偏極実験も行い3Heガスの核偏極に成功した。これにより、問題となるアルカリ金属の密度と緩和について理解を進め、ゼオライト膜を用いたスピン交換実験に役立つ貴重な情報を得ることができた。アルカリ金属担持ゼオライト膜の開発においては必要とされる性能を詳細に検討し、アルカリ金属担持ゼオライト作製に必要となる試薬品、物品の購入を進めた。また、試験的にガラス管にアルカリ金属を導入し、真空封入・加熱することで蒸気圧の制御条件の調査を行った。また、アルカリ金属担持ゼオライトが正しく作製されたかを確認する手法を用意した。ヘリウム3ガス偏極度測定・極性制御用電子回路については、目標となる信号の電圧が100nVと小さい上にインピーダンスが大きいため測定の困難が予想されたため、24bitADCを用いた高性能データ収集システムの開発を進めた。将来J-PARCのビームラインでの応用実験を念頭にした、限られたスペースを有効活用するために小型システムとするとともに、ヘリウム3ガスの偏極方向を制御するための回路を組み込むことに成功した。これらの開発を進めたことで、高性能偏極ヘリウム3ガス生成装置の評価環境を整えることができた。2014年度は、2013年度に有限要素法計算を元に設計・製作した大口径・高耐圧・薄型GE180ガラスセルを用いて、カリウムとルビジウムを封入した予備実験用ヘリウム3ガスセルを作製した。光吸収測定により気相のカリウムとルビジウムの吸収を測定し、カリウムとルビジウムの混合セルが予定通り製作できていることを確認した。この高耐圧セルは、耐圧性能を高めるためにレーザー入射窓を湾曲させたが、これがレーザーの入射を妨げ、ヘリウム3ガスをきちんと偏極できない可能性が考えられる。そこで実際にセルにRbの吸収端に相当する波長の円偏光レーザーを照射し、ヘリウム3ガスの核スピンが偏極することを確認した。次に、2013年度に磁場計算を行った偏極ヘリウム3ガス用磁気シールドの性能評価を行った。実ビームライン上では様々な機器が設置されており環境磁場を乱すのでヘリウム3ガスが短時間で緩和してしまう。

特に試料用の電磁石を用いた磁場環境では、試料に印可する磁場が110Tに達することもあり、その漏れ磁場の影響は極めて大きい。そこで今回は、1Tの試料環境用電磁石を設置し、磁気シールドをその2m下流に設置した状態で、磁気シールド内の所定の位置に偏極済みのヘリウム3ガスセルを設置してその緩和時間を測定することで性能評価を実施した。今回の配置はビームラインで実験を行うことを想定したものであり、J-PARCの実際のビームライン上で実施している。この状態で緩和時間はおよそ70時間であることが確認された。同じ磁気シールドについてビームライン外でも同様の実験を行ったが、そのときの緩和時間も約70時間であり、磁気シールドが試料用電磁石の漏れ磁場をきちんと遮蔽し、実験上十分な性能が発揮できていることが確認できた。今年度は、有限要素法による安全性評価計算を行った大口径ヘリウム3ガスセルを製作した。製作したセルはφ100×L100mm、ガス量14.9atm・cm、安全係数は2程度である。偏極性能を高めるため光ポンピングに使用するアルカリ金属はカリウム(K)とルビジウム(Rb)の混合物とし、それぞれ別のアンプルから気相で導入した。しかし、この方法ではKとRbの比率の制御が困難であることが分かり、事前にKとRbを10:1で混合したアンプルでセルを製作する手法を開発、セルを追加製作した。追加製作したセルはφ69×L121mm、ガス量13.0atm・cm、安全係数は2程度である。今回の開発により、K/Rb混合型大口径ヘリウム3ガスセルの安定生産に目処をつけた。さらに、大口径ヘリウム3ガスセルを偏極デバイスとして実用化することを目指し、偏極中性子回折実験のスピンアナライザとして使用するための装置の設計・製作を行った。この装置は今後中性子小角散乱装置で用いる計画である。従来の偏極ヘリウム3ガスセルでは光ポンピングに気相のKとRbを用いるが、密度が低く性能を制限する要因となっていた。これを克服するためZeolite中にKとRbを分散させ飛躍的に密度を高めた新方式のヘリウム3ガスセルを製作した。円偏光レーザーを照射しヘリウム3ガスの核スピン偏極を試みたが、有意な偏極は観測されなかった。また、中性子ビームが不要なヘリウム3ガス核スピン偏極率測定手段として、電子常磁性共鳴法(EPR)による測定回路を製作した。従来のEPR測定装置はロックインアンプ、ファンクションジェネレータなどを組み合わせた大掛かりな装置であったが、12×12×3cmの箱に主要回路を収める設計に成功した。実際に回路を組み立て、RF信号送信回路および測定回路の動作確認試験まで行ったが、偏極率測定は技術的問題から実施できなかった。今後、試験を実施した後に偏極率測定に使用する計画である。スピン交換光ポンピング法による3He核偏極では、偏極の過程で利用しているRbの密度の低さが性能に対する制約の一つとなっている。そこで、ゼオライト中に分散させたRbを利用することで密度の問題を克服し、3Heガス核偏極の効率を高める方式を提案し、実証実験を実施した。また、偏極3Heの応用として、パルス中性子対応の、大立体角検出器をカバー可能な偏極中性子回折測定用中性子スピンアナライザーの開発を進めた。
細胞性粘菌の分岐構造の形成に関与する遺伝子のクローン化とその解析

細胞性粘菌Polysphondylium palliumの子実体は、主軸上に輪生した分枝をだして、枝分かれした構造を形成する。我々は、この分枝構造に注目し、この構造が、どのような分子的基礎のもとに、どのような遺伝子産物が、どのような機構で形成されるかについて明らかにすることを目的とした。まず、この生物で挿入突然変異作製法を確立した。次に、この方法を用いて、多数の形態異常の変異体を単離した。その中の1つに、分岐した枝の長さが長い変異株があり、この株の変異遺伝子のクローン化を試みた。挿入されたベクターDNAを目印にして、その付近のゲノムDNAをクローン化し、1個のORFを見つけた。この変異が、このORFをコードする遺伝子によって引き起こされたことを相同組換え法を用いて確認した。また、cDNAを解析することにより、この遺伝子は2個のイントロンを含むことを明らかにした。相同性検索やアミノ酸配列の比較、また膜貫通ドメインの存在とその位置により、この遺伝子にコードされたタンパク質は、分泌タンパク質の小胞輸送に関与しているp24タンパク質ファミリーに属することが分かった。また、ノーザンブロット解析から、この遺伝子は発生開始後8時間目に発現量が最大に達して、その後減少していくことと、変異株ではこのmRNAは全く発現しないことが明らかになった。また、この遺伝子はゲノム中に1コピー存在していた。細胞性粘菌Dicytostelium discoideumのEST中に、3個のホモログを見つけたので、それらの遺伝子のゲノムDNAの塩基配列とcDNAの塩基配列を決定した。Polysphondylium pallidumは、子実体が車軸上で枝分かれ構造を形成する細胞性粘菌である。最近、我々はこの生物でinsertional mutagenesis法を確立した。このgene tagging法を用いて、この生物で分枝構造の形成が異常になった突然変異体を作成し、その中で、形質が安定しており、かつ、挿入されたベクターDNA断片を容易に単離出来る株について、さらに詳しく調べた。PPL1と名付けた株では、枝分かれ構造を全く作らない子実体を形成した。この株では、挿入されたベクターDNA断片の近くに、575アミノ酸からなるORFが存在していた。このタンパク質は既知のタンパク質との相同性は見つからなかった。このORFの遺伝子の発現を、野生株と変異株で調べたところ、野生株では3kbのmRNAが発生開始後12時間目に増加するパターンを示したが、変異株では、このmRNAは全く発現していなかった。現在、このORFが変異の原因遺伝子であるかどうかを、この生物ではかなり容易に行える相同組換えを用いて調べつつある。また、枝の長さが野生株より長い変異体を得て、挿入されたベクターDNA断片の近傍を解析したところ、2つのイントロンを持つ、206個のアミノ酸からなる膜タンパク質が見つかった。現在相同組換えを用いて調べつつある。そのほか、子実体の主軸に細胞の一部が細胞塊として残ったままになる変異体2株や、主軸が太く、まっすぐ伸びない株や、枝の長さが野生株より短い変異体を得ており、現在詳しく解析中である。
頭足類の胚体形成機構に関する研究

1.ヒメイカの発生段階表の作成. :ヒメイカは,小型で採集が容易で飼いやすく実験質内で卵を容易に得ることが出来るので,頭足類の発生生物学の材料として最適である.小容器内で飼育された雌は, 30-80個の卵を2-7日おきに産む.発生の研究には発生段階を性格に同定するための発生段階表が要求される.そこで,ヒメイカの発生過程を実体顕微鏡で観察し詳細なスケッチをえがくことにより,将来の研究の基準となる発生段階表を作成した.産卵されてから胚が孵化するまでの18日間(20゚C)にわたる発生過程を30のステージに分けるのが最も合理的であると思われる.2.シリヤケイカの発生過程における卵嚢の膨張. :シリヤケイカの卵嚢は,発生の最初の8日間は,ゼラチン層より水が失われることにより収縮する.しかし, 9日目に胚の周囲に囲卵腔が出現してから後は,そこへの吸水により次第に膨れ,孵化時には胚の回りに大きな空間を作り出す.この空間は胚の孵化運動のために必要である.囲卵腔液と海水間の浸透圧の差は,発生過程を通じてほぼ一定で,約135mmol/kgであった.囲卵腔液中のタンパク質濃度は発生の進行と共に増加した.このタンパク質が囲卵腔液の浸透圧を作り出していると思われる.3.シリヤケイカにおける網膜の発生. :頭足類の発生における器官形成の1例として,シリヤケイカ網膜の発生過程を電子顕微鏡,組織蛍光法および電気生理学的手法で,形態形成と機能発現の両面から追求した.網膜の形成過程は形態的に4期に分けることができた.ERP(早期受容器電位)の出現は,ロドプシンの蛍光が網膜に出現する時期にほぼ一致していた.ERP(網膜電図)の発達は,光受容部の構造的発達と一致していた.1.ヒメイカの発生段階表の作成.:ヒメイカは,小型で採集が容易で飼いやすく実験質内で卵を容易に得ることが出来るので,頭足類の発生生物学の材料として最適である.小容器内で飼育された雌は, 30-80個の卵を2-7日おきに産む.発生の研究には発生段階を性格に同定するための発生段階表が要求される.そこで,ヒメイカの発生過程を実体顕微鏡で観察し詳細なスケッチをえがくことにより,将来の研究の基準となる発生段階表を作成した.産卵されてから胚が孵化するまでの18日間(20゚C)にわたる発生過程を30のステージに分けるのが最も合理的であると思われる.2.シリヤケイカの発生過程における卵嚢の膨張. :シリヤケイカの卵嚢は,発生の最初の8日間は,ゼラチン層より水が失われることにより収縮する.しかし, 9日目に胚の周囲に囲卵腔が出現してから後は,そこへの吸水により次第に膨れ,孵化時には胚の回りに大きな空間を作り出す.この空間は胚の孵化運動のために必要である.囲卵腔液と海水間の浸透圧の差は,発生過程を通じてほぼ一定で,約135mmol/kgであった.囲卵腔液中のタンパク質濃度は発生の進行と共に増加した.このタンパク質が囲卵腔液の浸透圧を作り出していると思われる.3.シリヤケイカにおける網膜の発生. :頭足類の発生における器官形成の1例として,シリヤケイカ網膜の発生過程を電子顕微鏡,組織蛍光法および電気生理学的手法で,形態形成と機能発現の両面から追求した.網膜の形成過程は形態的に4期に分けることができた.ERP(早期受容器電位)の出現は,ロドプシンの蛍光が網膜に出現する時期にほぼ一致していた.ERP(網膜電図)の発達は,光受容部の構造的発達と一致していた.1.発生段階表の作成ヒメイカの発生を時間を追って詳細に観察することにより、前年度までに不明であった点を補って完全な発生段階表を作成することができた。2.生体染色法ヒメイカ胚は極めて透明であるため器官形成の初期過程は観察しにくい。ヒメイカ胚に適した染色剤を検索した結果ファーストグリーン、メチルグリーン、メチレンブルーが良好であることが判明した。3.卵膜除去実験ヒメイカの胚体形成機構を実験的に解析するためには、卵膜の除去が不可欠である。卵膜を機械的に除去することはどうしても出来なかった。各種薬剤を用いて除去を試みたところ、1%パパインと1%アクチナーゼの混合液中で約15分で除去出来ることがわかった。しかし、卵膜を除去された胚細胞はたちどころに異常をしめし、卵膜のない胚を飼育して正常な発生を行わせることは、いまのところどうしても成功しない。したがって、胚に手術的な処理を施して胚体形成機構を解析することは現在のところ不可能である。4.微量注射の試みヒメイカの細胞系譜を調べる目的で微量注射を試みた。卵膜を除去しないでなんとか注射出来ないものかと試みたが現在のところ、あらゆる試みは失敗している。5.結窄実験卵膜をつけたままで行える手術的実験として、卵膜の上から卵を結ることを試みた。卵は一部を結窄されても発生を続け、様々な異常形態を示す。次年度に詳しく解析する予定である。
電解生成ゲルミルアニオンおよびシリルアニオンの研究

四つのテーマについて研究を試みた結果、次の二つのテーマにおいて成果を得ることができた。1.一般に良く知られた炭素化合物の電解生成アニオンに関する研究。アントラセン、9,10-ジフェニルアントラセン、ペリレン、フルオレン、インデンの電解によりアニオンを生成することができたので、UVおよびNMRを用いた研究を行った。溶媒を変えた実験や温度を変化させた実験において、従来の金属を対カチオンとするアニオンとは異なる結果を得た。アニオンとカチオンとの対の作り方(contact ion pariなど)の観点からデータの解釈を試みているが、さらに詳細な実験を行う必要がある。蛍光を利用した実験や反応性を調べる実験を今後行うべきと考えられる。2.ポリシランや歩折りゲルマンの合成の過程において見られるバックバイティング現象に関する研究。電気化学的方法がこの現象の解明に適しているという着想に基づき研究を行った結果、多くが明らかとなった。(1)電気化学的なポリシランやポリゲルマンの合成法においてもバックバイティングが起こること、(2)バックバイティングの原因は、アニオンであること。(3)アニオンの攻撃を受けた高分子の分解は速やかであり、他の高分子に影響(電荷の移動など)を与えずにその分子の分子量が完全に低下すること、(4)ジアルキルの高分子よりもフェニル基を含む高分子において、反応が速いこと。(5)ポリゲルマンよりもポリシランにおいての方が遅いこと(当初の予測とは反対の結果となった。)(6)バックバイティテングの反応は、低温において遅くなるので合成の過程においてバックバイティングを抑制し、高分子量体を高収率で得るためには、比較的低い温度での合成が望ましいこと。
半導体レーザー周波数安定化に関する研究

半導体レーザーの光をこのフィルタ共振器を通じて,短期的な周波数安定な光を得ることが出来ました。約75mW(通過率70%)得た光を,もう一度半導体レーザーにフィードバックことで,レーザーの雑音抑圧が達成できまた。自作したホモダイン検出器を用いて、半導体レーザーの雑音の評価実験も行いました。半導体レーザーの強度雑音は2MHz以上ショットノイズレベルまで抑圧することができる。我々は半導体レーザーの位相雑音も調べました。もうひとつ分析共振器をもちいて、フィルタを通じた半導体レーザーの位相雑音10MHz以上ショットノイズレベルまで抑圧することもできました。外部共振器を用いて低雑音光によるSHGの実験を行い、入射光パワー40mWのとき、最大で10mW(変換効率25%)のSH光を得た。半導体レーザー雑音を抑圧ために、本研究ではフィルタ共振器と光をフィードバック用いる。本年度我々はフィルタ共振器と半導体レーザー雑音の測定するホモダイン検出器を完成しました。そして、半導体レーザーの雑音抑圧と雑音の評価実験を行いました。具体的には以下のように。1フィルタ共振器には、3枚のミラーで三角形に光ビームを反射させ、そのうち2枚の平面ミラーと他1枚の凹面ミラーを配置するリング型共振器である。安定性を考えるとこの3枚のミラーを同じアルミの基盤を使って固定し、分解能約1.4MHzのフィルタ共振器を得られました。そして、このフィルタを用いて1.4MHz以上の雑音はショットノイズレベルまでを抑圧することが出来ます。2オペアンプを用いてホモダイン検出器の製作を完成しまた。このホモダイン検出器を用いて、80MHzまでの雑音測定することが出来ます。3半導体レーザーの光をこのフィルタ共振器を通じて,短期的な周波数安定な光を得ることが出来ました。強度と位相雑音を抑圧した半導体レーザーを用いて周波数の安定度をさらに向上とも目指すること量子光学と量子情報処理などの分野の研究を開拓することが期待されている。本年度に、半導体レーザーの雑音抑圧と雑音の評価実験及び第二高調波の発生を行いました。1半導体レーザーの光をこのフィルタ共振器を通じて,短期的な周波数安定な光を得ることが出来ました。2外部共振器を用いて低雑音光によるSHGの実験を行い、入射光パワー40mWのとき、最大で9.8mW(変換効率24.5%)のSH光を得た。KTP結晶を温度位相整合により位相整合をとっているが、温度許容幅が約20mKと非常に狭く、最高出力を安定して長時間出力することは難しい。数十分のスパンで安定出力できる最大のパワーは、約9mWであった。
トリアゾール連結型アミノアシルtRNAによるアミノ酸導入技術革新

産前産後の休暇・育児休業(2018年2月2021年3月)の取得により本年度研究を中断している.産前産後の休暇・育児休業(2018年2月2021年3月)の取得により本年度研究を中断したため産前産後の休暇・育児休業終了後に予定していた研究計画を速やかに遂行する予定である.タンパク質・ポリペプチドへの非天然型アミノ酸導入法の開発は,医農薬をはじめ幅広い分野で注目されている.現在,非天然型アミノ酸をtRNAに人為的に連結させたアミノアシルtRNAをその運搬体として用いる手法が汎用されているが,アミノアシルtRNAの化学合成においては,効率の低さや導入可能なアミノ酸構造への制約などが克服すべき課題となっていた.本研究では,クリック化学の代表例である銅触媒アジドアルキン付加環化(CuAAC)反応をアミノ酸部とtRNA部の連結反応に活用することで,アミノアシルtRNAの高効率・簡便合成法を開発することを目的とする.これにより導入可能な非天然型アミノ酸を拡張し,タンパク質・ポリペプチドの自在な修飾・編集法の確立を目指す.研究初年度である本年度は,トリアゾール連結型tRNA合成における鍵となる二つの工程である「1. RNAの3'末端へのアジド基の導入」と「2.アジド化RNAとアルキンとのCuAAC反応による連結」の両者に取り組み,どちらも短鎖のモデル化合物を用いて効率的な合成法を開発するに至った.工程1の「RNAの3'末端へのアジド基の導入」においては,アジド基をもつヌクレオシドトリリン酸をポリメラーゼの基質として用いたが,その類縁体の既知の合成法では,一度に得られる量が一ミリグラム未満とごくわずかであった.本研究の遂行において,このトリリン酸の量的供給が必須であるとの認識のもと,報告者は精製方法を改良し,一度に数十ミリグラム得られる手法を実現した.以上により,当初の予定どおり本課題である長鎖のtRNAに適用する準備が整い,次年度以降の研究展開を迅速に進めるための知見を得ることができた.これらの研究成果なかで,関連するアジド化反応については,現在論文執筆中である.研究初年度である本年度は,本研究の遂行において最も困難が予想された2つの工程の開発に取り組み,モデル化合物を用いて高効率・高選択的な手法を確立することができた.1.RNA 3'末端へのアジド基の導入法の開発:アジド化ヌクレオシドトリリン酸の量的供給可能な合成法を確立し,これをRNAポリメラーゼの基質として用いることで,RNAの3'末端にアジド基の導入する手法を開発した.短鎖のモデルRNA分子へのアジド化ヌクレオシドトリリン酸の取り込み効率について,種々のポリメラーゼ酵素を用いたスクリーニングを行い,そのなかで大腸菌RNAポリメラーゼが最適であることを見出した.汎用されている反応条件では大腸菌RNAポリメラーゼでも取り込み効率が50%程度であったが,酵素量,オリゴヌクレオチド濃度,反応時間,事前の精製の有無などの複数のパラメーターをもとに反応条件を最適化し,その取り込み効率を97%と向上させることができた.これらの検討においては,数十サンプルを同時に解析することがきるウレア変性ポリアクリルアミドゲル解析を活用することで,迅速な条件検討を可能とすることができた.2.アジド化RNAとアルキンとのCuAAC連結:3'末端をアジド化したRNAとアルキンとが穏和な条件下,高選択的にCuAAC連結可能であることを明らかにした.連結するアルキンとして,エチニル修飾RNA 10量体を新たに設計・合成したのち,アジド化RNA 22量体とCuAAC連結反応を行い,得られる32量体の生成量をポリアクリルアミド解析により定量評価した.ここでも触媒の濃度,オリゴヌクレオチドの濃度,テンプレートの存在の有無などを含む条件のスクリーニングを行うことで,高選択的にCuAAC反応が進行する条件を見出すことができた.本年度に最も困難が予想された2つの工程に対して,モデル化合物を用いて高効率・高選択的な手法を確立することができた.タンパク質・ポリペプチドへの非天然型アミノ酸導入法の開発は,医農薬をはじめ幅広い分野で注目されている.現在,非天然型アミノ酸をtRNAに人為的に連結させたアミノアシルtRNAをその運搬体として用いる手法が汎用されているが,アミノアシルtRNAの化学合成においては,効率の低さや導入可能なアミノ酸構造への制約などが克服すべき課題となっていた.本研究では,銅触媒アジドアルキン付加環化(CuAAC)反応をアミノ酸部とtRNA部の連結反応に活用することで,アミノアシルtRNAの高効率・簡便合成法を開発することを目的とする.これにより導入可能な非天然型アミノ酸を拡張し,タンパク質・ポリペプチドの自在な修飾・編集法の確立を目指す.本研究課題を遂行するにあたり,昨年度は,鍵反応となるRNA末端のアジド化反応の開発とCuAAC連結法を開発した.本年度は,この酵素反応を用いたアジド化法の高い効率・簡便性に着目し,これをDNA末端のアジド化法へと適用した.まずDNA末端へのアジド化反応のための各種酵素をスクリーニングにより選定し,DNAの3'末端へのアジド化法を開発した.一方,アジド化オリゴヌクレオチドと連結するためのエチニル化オリゴヌクレオチドを固相合成法により新規に開発した.これまでに独自に開発してきたエチニル基をもつヌクレオシドを固相担持オリゴヌクレオチドの5'末端に伸長することでエチニル化オリゴヌクレオチドの高効率合成法を実現した.これらのアジド化

オリゴヌクレオチドとエチニル化オリゴヌクレオチドとをCuAAC連結することで,多様な塩基配列・鎖長をもつ長鎖DNA合成法を確立した.得られたトリアゾール連結DNAは,複製反応の鋳型基質として機能することを見出し,PCRにより長鎖DNAの大量供給可能とした.本手法はDNAライブラリの高効率な調整法として高い波及効果が期待できる.本年度は,(i)DNA末端のアジド化法を開発し,(ii)これと新規に設計・合成したエチニル基を5'末端もつオリゴヌクレオチドとをCuAAC連結した.さらに(iii)得られたトリアゾール連結DNAを鋳型とした複製反応を行うことで,長鎖DNAの大量供給を可能とした.(i) DNA 3'末端へのアジド化法:酵素反応を用いてDNAの3'末端へのアジド化法を開発した.酵素の種類や導入するヌクレオシドの塩基配列を精査し,高効率な手法を確立することができた.(ii)エチニル基をもつオリゴヌクレオチドの合成とCuAAC連結:報告者らがこれまでに開発したエチニル基をもつヌクレオシドを活用し,これをDNA上流部に連結すべく,3'位ヒドロキシ基をホスホアミダイト化した.続いてこれを固相担持DNAの5'末端にホスホアミダイト法により連結することで,エチニル基を5'末端にもつオリゴヌクレオチドを合成した.さらに(i)にて合成したアジド化DNAとCuAAC連結するための反応条件を最適化し,高効率な連結法を開発した.(iii)トリアゾール連結DNAを鋳型とした複製反応:モデル化合物としてトリアゾール連結部を一つ含む長鎖オリゴヌクレオチドを設計・合成した.報告者らが以前に報告した手法にならい,今回新たに設計・合成したトリアゾール連結型ジヌクレオチドを構成単位として,ホスホアミダイト法によりオリゴヌクレオチドを伸長した.これを鋳型として,非天然型連結部を乗り越え可能な酵素をスクリーニングし,最適な酵素・反応条件を決定した.本手法によりトリアゾール連結DNAを鋳型とした複製反応が可能となり,長鎖DNAの量的供給を実現できた.これらの研究成果は現在論文審査中である.産前産後の休暇・育児休業(2018年2月2021年3月)の取得により本年度研究を中断している.産前産後の休暇・育児休業(2018年2月2021年3月)の取得により本年度研究を中断したため来年度以降は,今年度に確立した手法を適用して,本課題の中心分子となるtRNA合成に挑む.開発した手法を74量体からなるtRNA前駆体に適用し,5'位エチニル基をもつアミノアシルtRNA合成法を開発する.5'位エチニル基をもつアミノアシル化ヌクレオシドは,申請者らの開発した5'位エチニル基をもつヌクレオシド類縁体から3工程により合成する.CuAAC反応による連結において反応効率が低い場合は,銅触媒や配位子,溶媒,濃度などを含む条件検討により反応条件の最適化を行う.続いて,トリアゾール連結型アミノアシルtRNAの三次元構造形成能の評価を行う.アミノアシルtRNAは特異的な三次元構造をとることで,アミノ酸運搬体としての機能を発現する.トリアゾール連結型アミノアシルtRNAの水中での最安定構造について,各種スペクトル解析(紫外可視吸収スペクトル・円二色性スペクトル・NMRスペクトルなど)により調べ,天然型アミノアシルtRNAとの比較・評価する.これにより,人工アミノアシルtRNAの構造に関する基礎的知見を得る.さらに,トリアゾール連結型アミノアシルtRNAの翻訳反応を開始し,そのアミノ酸運搬機能を評価する.
核内因子ＩκＢーζを介したエピジェネティクな転写調節

NF-κBは、微生物感染時の炎症性サイトカインや抗菌タンパク質の発現に必須な転写因子であり、IκB-ζは、一群のNF-κB標的遺伝子の発現に不可欠な核タンパク質である。本研究では、クロマチン存在下でのIκB-ζによる転写調節を明らかにすることを目指した。抗菌タンパク質をコードする二つのIκB-ζ依存性遺伝子に着目し、これらの発現がリポ多糖と糖質コルチコイドの刺激で相乗的に増大することを見出した。これらの転写誘導に関わるシスエレメントを決定し、さらにこのシスエレメントへのNF-κB、グルココルチコイド受容体およびクロマチンリモデリング因子の結合がIκB-ζ依存的に協調して起きることを示した。NF-κBは微生物感染に対する防御応答において中心的な役割を担う転写因子であり、リポ多糖(LPS)などの感染微生物由来分子の刺激によって活性化され、抗菌タンパク質や炎症メディエーターの産生を誘導する。研究代表者は以前、NF-κBと結合する核内因子IκBζをクローニングし、ノックアウトマウスの解析などを通じてこの新規分子のはたらきを明らかにしてきた。IκBζの欠損細胞では、一群のNF-κB標的遺伝子の発現が障害されているが、それらの発現制御領域にはNF-κBやクロマチンリモデリング因子が結合できないことから、IκBζは転写活性化因子に対するシスエレメントのaccessibilityを決定する重要因子であると考えられた。本年度研究代表者は、二つのIκBζ依存性遺伝子の発現が、LPSの刺激と、合成糖質コルチコイドであるデキサメサゾン(Dex)の刺激によって相乗的に増強されることを見出した。この二つの遺伝子はいずれも抗菌タンパク質をコードしていた。この発現増強効果は、炎症メディエーターなどの多くのLPS誘導性遺伝子の発現がDexによって抑制される事実と対照的である。また、この二つの抗菌タンパク質遺伝子の発現は、Dexの単独刺激ではまったく誘導されなかった。糖質コルチコイド受容体(GR)はDexの単独刺激時には発現制御領域に結合しないが、LPSとの共刺激時には結合していた。また、IκBζの欠損細胞では、NF-κBやクロマチンリモデリング因子ばかりでなく、GRの発現制御領域への結合も障害されていた。感染応答時にTNF-αやIL-1βなどの炎症性サイトカインレベルが上昇すると副腎から放出される糖質コルチコイドによって炎症応答が抑制されることが知られているので、本研究で見出した抗菌タンパク質の発現増強は、過度の炎症反応を抑えつつ感染防御能を維持する上で重要であると考えられる。転写因子NF-κBは、炎症性サイトカインや抗菌タンパク質などの宿主防御因子の発現に必須な役割を果たしている。炎症性サイトカインの発現は、糖質コルチコイドの存在下で抑制されるが、これは、NF-κBの転写活性が核内受容体であるグルココルチコイド受容体を介して阻害されるためであることが知られている。一方、抗菌タンパク質の発現に対する糖質コルチコイドの効果についてはこれまで不明であった。研究代表者は最近、リポ多糖などの微生物感染刺激によって誘導される抗菌タンパク質の発現が、合成糖質コルチコイドであるデキサメサゾン(Dexamethasone, Dex)の存在下で増強されることを見出した。このことは、炎症応答の進行に伴って放出される糖質コルチコイドが、過剰な炎症反応を抑制しつつ、抗菌タンパク質の産生を増大させることにより宿主の感染防御能を維持する作用を持つ可能性を示唆している。また、本研究で着目している抗菌タンパク質遺伝子は、いずれも研究代表者が以前に発見した核内因子「IκB-ζ」に依存して発現する遺伝子であった。本年度は、対象としている抗菌タンパク質遺伝子について、転写開始点を含む5'-上流領域のDNA断片を用いて転写活性化に関わるシスエレメントの解析をおこなった。今回新たに取得したDNA断片をルシフェラーゼ遺伝子の上流に融合したプラスミドを細胞に導入すると、リポ多糖刺激による強いレポーター活性の上昇およびDexによる増強効果が認められた。一連の欠失変異体および点変異体を解析し、Dexによる転写増強に必要なシスエレメントを同定した結果、グルココルチコイド応答エレメント非依存的に転写増強される機構の存在が明らかになった。微生物感染に伴う多くの宿主防御遺伝子の発現は、転写因子NF-κBに依存している。研究代表者が以前同定した核タンパク質IκB-ζは、一群のNF-κB標的遺伝子の発現に不可欠である。野生型マウスから調製したマクロファージをリポ多糖(LPS; lipopolysaccharide)などの微生物成分で刺激すると、標的エンハンサーにNF-κBのp65サブユニットやクロマチンリモデリング因子が結合するが、IκB-ζの欠損細胞ではこれらの結合が認められないので、IκB-

ζは標的エンハンサーのアクセシビリティを調節していると考えられる。抗菌タンパク質Lipocalin-2をコードするLcn2の発現は、IκB-ζ依存的にLPSによって誘導される。研究代表者は昨年度までに、LPS刺激によるLcn2の発現が、合成グルココルチコイドの一種デキサメサゾン(Dex)によって強く増強されることを見出していた。本年度は主にクロマチン免疫沈降解析により、NF-κBやグルココルチコイド受容体(GR; glucocorticoid receptor)のエンハンサー結合を検討した。Dexの単独刺激時には、GRの核移行は認められたが、Lcn2エンハンサーへのGRの結合やLcn2の発現は観察されなかった。ところが、LPSとDexの両者で刺激すると、GRがIκB-ζ依存的にLcn2エンハンサーに結合するようになることが判明した。したがって、IκB-ζを介したエンハンサーアクセシビリティの増大は、Lcn2の相乗的な遺伝子発現に重要な役割を果たすことが明らかになった。二つのIκBζ依存性遺伝子についてリポ多糖刺激と糖質コルチコイド刺激による発現増強効果を認め、その効果に関わる分子機構を明らかにすることができた。複数の転写活性化因子による相乗的な転写誘導の機構を解明できたと同時に、標的遺伝子の機能に基づいた生物学的意義の考察ができた。これまでに、IκB-ζが標的エンハンサーへの転写調節因子の結合を制御することを明らかにしてきたが、今回、LPSとDexとの同時刺激によって相乗的に発現が増強される遺伝子に着目したことにより、エンハンサーアクセシビリティのレベルでシグナル伝達のクロストークが起きる新しい例を見出すことができた。今年度までの理解をさらに進めるべく、LPSとDexによる相乗的な転写誘導における、IκBζおよびその結合因子の役割を明らかにする。IκBζ自身はDNAに直接結合するアミノ酸配列を持たず、NF-κBのp50サブユニットを介して標的プロモーターに結合すると考えられるので、まず、p50の役割に着目して解析を進める。p50の欠損細胞を用いてこれまでと同様の解析を行なうほか、刺激前後のプロモーター上におけるp50の挙動を明らかにする。さらに転写活性化時における、IκBζとGRとの相互作用や、クロマチンリモデリング因子のはたらきについても解析を行なう。IκB-ζやその関連分子のノックアウトマウス由来細胞を用いて、クロマチン免疫沈降解析をおこなうことにより、着目している個々の因子が関わる転写活性化のステップを明らかにする。また、IκB-ζの結合により転写因子のエンハンサー結合能が変化する可能性を探るべく、in vitroのDNA結合実験などを実施する。さらに、IκB-ζとクロマチンリモデリング因子との相互作用についても、免疫共沈降法やpull-downによって検討し、直接相互作用が認められた場合には、その相互作用に関わるアミノ酸残基に変異を導入した分子の発現の効果を評価する。研究代表者はすでにクロマチンの再構成に必要なATPの加水分解活性を欠くリモデリング因子の変異体を取得しているので、この変異体を発現する細胞における転写調節因子のプロモーター結合と遺伝子発現を検討する。
高温き裂伝ぱにおけるクリ-プ・疲労重畳効果の基本支配則に関する研究

クリ-プ・疲労重畳下のき裂伝ぱは、「クリ-プ型の純時間依存き裂伝ぱか、疲労型の純繰返し数依存き裂伝ぱのいずれかになり、負荷条件に応じて両特性間を可逆的に遷移する」という基本則の実証を、種々の材料と条件の組み合わせに対する高温疲労き裂伝ぱ実験を実施するとともに、基本となるき裂伝ぱ特性の把握ならびに必要な実験技術に関する検討を行った。得られた主な結果は以下の通りである。1.SUS304鋼を用いて、高温き裂伝ぱ挙動における応力保持時間効果を調べた結果、保持時間効果は疲労にクリ-プが加算的に重畳される形で現れ保持時間の増加とともに疲労型よりクリ-プ型に遷移した。2.SUS304鋼の巨視表面き裂の繰返し数依存型および時間依存型き裂伝ぱ特性は、貫通き裂の両特性とよく一致した。表面き裂の破壊力学量の評価手法を開発した。3.SUS304鋼を用いて高温の繰返し数依存型き裂伝ぱにおける下限界の性質を調べた。過大荷重による下限界の消失と、それに続く低レベル荷重負荷中における下限界の回復過程を調べた。低レベル荷重によるき裂伝ぱ速度は、試験温度にあまり依存しないことが明らかとなった。4.Ni基超合金Rene80とCM247LCの一方向凝固材について、高温低サイクル疲労強度を調べ、微小き裂発生伝ぱ挙動との関連を調べた。微小き裂の伝ぱ特性は、これまでに報告されている巨視き裂の伝ぱ特性とほぼ一致した。5.クリ-プ・疲労における微小き裂の発生および成長に関するモデルを提案し、これを用いてモンテカルロ・シミュレ-ションを行った。き裂発生と伝ぱの駆動力の相対関係により、破壊が多数き裂発生型と少数き裂成長型に分離できることを明らかにした。6.高温におけるき裂開閉口の高精度測定のため、レ-ザ-干渉法を用いた微小変位測定法を開発・適用した。高温におけるクリープ・疲労重畳下のき裂伝ぱに関する基本支配則を明らかにするため、種々の材料と条件の組み合わせに対する高温疲労き裂伝ぱ実験を実施するとともに、実験技術に関する検討を行った。1.SUS304鋼を用いて、高温き裂伝ぱにおける応力保持時間効果を調べた結果、保持時間効果は疲労にクリープが加算的に重畳される形で現れ保持時間の増加とともに疲労型よりクリープ型に遷移した。2.SUS304鋼の巨視表面き裂の疲労およびクリープ・疲労き裂伝ぱ特性を調べた。表面き裂の繰返し数依存型および時間依存型き裂伝ぱ特性は、貫通き裂の両特性とよく一致した。荷重変動による下限界の消失と消失後の回復過程、および下限界の消失に及ぼす荷重周波数と温度の影響を明らかにした。4.SUS304鋼の平滑試験片の一方向引張りとクリープ・疲労における微小表面き裂の挙動を比較し、両者の相違を明らかにした。5.一方向凝固により作成したA1-Li合金の高温微小疲労き裂の伝ぱ挙動を調べ、結晶学的因子の影響を明らかにした。6.実機で長時間使用されたSUS316鋼の微小疲労き裂伝ぱ挙動を調べた。

巨視き裂の下限界以下の領域でも、微小き裂は伝ぱした。7.クリープ・疲労における微小き裂成長のモデルを提案し、計算機シミュレーションによりき裂の密度、長さ分布、伝ぱ速度を調べた。8.レーザー干渉法を用いて微小変位を測定する手法を開発した。室温下で測定を行った結果、短い標点間の高精度変位測定が可能であり、き裂開閉口が十分の精度で検出できることがあきらかとなった。平成元年度には、昭和63年度に得られた結果を参照しながら、「クリ-プ・疲労重畳下のき裂伝ぱは、クリ-プ型の純時間依存き裂伝ぱか、疲労型の純繰返し数依存き裂伝ぱのいずれかになり、負荷条件に応じて両特性間を可逆的に遷移する」という基本則の実証を、種々の材料と条件の組み合わせに対する高温疲労き裂伝ぱ実験を実施するとともに、必要な実験技術に関する検討を行った。得られた主な結果は以下の通りである。1.SUS304鋼を用いて、高温き裂伝ぱ挙動における応力保持時間効果を調べ、損傷域およびき裂伝ぱ形態との関連を明らかにした。2.SUS304鋼を用いて高温の繰返し数依存型き裂伝ぱにおける下限界の性質を調べた。過大荷重による下限界の消失と、それに続く低レベル荷重負荷中における下限界の回復過程を調べた。低レベル荷重によるき裂伝ぱ速度は、試験温度にはあまり依存しないことが明らかとなった。3.Ni基超合金Rene80とCM247LCの一方向凝固材について、高温低サイクル疲労強度を調べ、微小き裂発生伝ぱ挙動との関係を調べた。微小き裂の伝ぱ特性は、これまでに報告されている巨視き裂の伝ぱ特性とほぼ一致したが、巨視き裂の伝ぱ下限界以下においても微小き裂は伝ぱする傾向があった。4.クリ-プ・疲労における微小き裂の発生および成長に関する擬3次元モデルを提案し、これを用いてモンテカルロ・シミュレ-ションを行った。き裂発生とき裂の駆動力の相対関係により、破壊が多数き裂発生型と少数き裂成長型に分離できることを明らかにした。5.高温におけるき裂開閉口の高精度測定のため、レ-ザ-干渉法を用いた微小変位測定法を開発・適用した。荷重を段階的に変更する方法を採用することにより、17Hzまでの繰返し荷重に対する変位計測が可能となった。6.表面き裂の破壊力学量の評価のため、境界要素法を用いた手法を開発した。
分子標的薬アキシチニブの血中濃度測定法の確立と投与支援

〈研究目的〉根治切除不能又は転移性の腎細胞がんの治療に用いられるアキシチニブは、AUC_<0→12>が150ng・h/mL以上になると抗腫瘍効果が認められ、無増悪生存期間の延長および部分奏効例が多いことが報告されている。一方、下痢、血圧上昇および手足症候群などの副作用が高頻度に発現し、減量や中止を余儀なくされることも多く、それらの血中濃度との関連は明確ではない。以上のことから、安全かつ有効な化学療法を実施するため、アキシチニブの血中濃度モニタリングが必要であると考えられる。そこで本研究では、カラムスイッチングLC/ESI-MS/MSによるアキシチニブの測定法を確立し、アキシチニブ服用患者において、副作用化現との関連を精査しつつ、抗腫瘍効果の期待できる至適血中濃度維持のための投与支援を実践することを目的とする。<研究方法>1.カラムスイッチングLC/ESI-MS/MSを用いたアキシチニブの測定法を確立する。2.アキシチニブ服用患者において、血中濃度測定を実施する。3.アキシチニブ服用患者において、ABCG2の遺伝子多型(421C/A)解析を実施し、血中濃度との関連を精査する。〈研究成果>1.カラムスイッチングLC/ESI-MS/MSを用いた測定法を構築することができた。2. 5名のアキシチニブ服用患者について、服用直前および服用4時間後の2点採血にて血中濃度測定を実施した。抗腫瘍効果の期待できる血中濃度を維持しながら、血中濃度と副作用発現との関連を精査したところ、血中濃度依存的に発現する副作用の発現は認められなかった。3. 5名のアキシチニブ服用患者について、ABCG2の遺伝子多型解析を実施した。421C/C患者と比較して、421C/AおよびA/A患者においては、低用量服用でAUC_<0→12>150ng・h/mLが担保される可能性が示唆された。
ペプチドミルクによる低アレルゲン経口免疫療法の確立

牛乳アレルギー患者に対して、牛乳を摂取して寛解を獲得する免疫療法の有用性が数多く報告されてきた。しかし、牛乳を用いた経口免疫治療中は皮膚症状、消化器症状、呼吸症状が頻繁に誘発される。本研究では、ペプチドミルクを使った免疫療法の安全性と効果を検討した。重症の牛乳アレルギー患者での検討では、血液中の末梢血好塩基球活性化はペプチドミルクが普通ミルクで低く、二重盲検食物負荷試験では、普通ミルクよりペプチドミルクの方が摂取可能量は多かった。ペプチドミルクを用いた経口免疫療法を行い、8割の患者で摂取可能量が増加したことを確認した。初年度で行ったオープン法による食物負荷試験の結果をふまえて、症状が誘発されやすい量を確認し、20mlを総負荷量とする食物負荷試験が適当と判断した。今年度はさらに厳密に食物アレルギーを診断するために、二重盲検食物負荷試験をおこなった。まず、3例の牛乳アレルギー患者に対してペプチドミルク(森永乳業E赤ちゃん)、普通ミルク(森永乳業はぐくみ)、加水分解ミルク(森永乳業MA-mi)を用いた二重盲検食物負荷試験を行った。いずれの症例でも加水分解ミルクでは症状が誘発されず、少量の普通ミルクで症状が誘発されたため、牛乳アレルギーと正確に確定診断できた。ペプチドミルク摂取可能量と普通ミルク摂取可能量を比較したところ、ペプチドミルクで摂取可能量が多いか、同一量を摂取した場合でも誘発症状が軽微であったため、牛乳アレルギー患者に対するペプチドミルクの安全性を確認することができた。森永乳業でブラインド化した食品(ペプチドミルク、加水分解ミルク)を作成し、二重盲検食物負荷試験で牛乳アレルギーと診断された患者に連日ブラインド化した食品の摂取を開始した。末梢血の好塩基球活性化の表面マーカーであるCD203cでスキムミルク、カゼイン、ホエイ、E赤ちゃん抗原に対する活性化を確認し、50%以上陽性から20%以下陽性までの評価に値する希釈系列を定めることができた。【研究成果】<患者血液を使ったペプチドミルクの安全性の評価>極少量でアレルギー症状が誘発される重症牛乳アレルギー患児末梢血を用いて、スキムミルク、ペプチドミルク10μg/mLに対する好塩基球活性化を測定した。ペプチドミルクの方がアレルゲンに対する末梢血好塩基球活性化が低下していることを確認した。<ペプチドミルクの安全性の確認>まず、アレルギー患者5名に対して、牛乳とペプチドミルクの摂取量を食物負荷試験(オープン法)で評価した。牛乳の摂取可能閾値に比べ、ペプチドミルクの摂取可能閾値は多かった。次に、重症のミルクアレルギー児10名に対して、普通ミルク、ペプチドミルク、加水分解ミルクを用いて、二重盲検食物負荷試験を施行した。普通ミルクよりペプチドミルクの方が摂取可能量安全積算量は多かった。<ペプチドミルク免疫療法>ペプチドミルクを連日摂取する低アレルゲンペプチドミルク免疫療法を6例に施行し、4例で摂取可能量が増加した。連日の摂取でも治療中に全施行中1回咳嗽を認めただけであり、安全に摂取量が増加することを確認した。【研究の意義】牛乳アレルギーは、近年、原因食物そのものを積極的に摂取して、寛解を獲得する免疫療法の有用性が数多く報告されてきた。これまで、対応がなかった食物アレルギー患者にとっては、非常に有益な治療法であるが、原因アレルゲン自体を経口摂取するため、経口免疫治療中は皮膚症状、消化器症状、呼吸症状が頻繁に誘発される。本研究ではペプチドミルクを用いることで、アレルゲン摂取症状誘発がほとんどなく、安全積算量の増加することができたため、新たなる食物アレルギーに対する安全に治癒を誘導できる治療として確立できる可能性がある。牛乳特異的IgE高値(10 UA/mL以上)あるいは、明らかに牛乳による症状誘発の既往があるアレルギー患者5名(3歳から9歳:全て男児)に対して、まず牛乳摂取可能量(閾値)を食物負荷試験(オープン法)で評価した。すべての症例で症状が誘発された。誘発された時の牛乳負荷摂取量を閾値とした(0.05ml-30ml)。その5名に対して、ペプチドミルク(森永乳業E赤ちゃん)を用いた食物負荷試験(オープン法)を施行した。牛乳の摂取可能閾値に比べ、ペプチドミルクの摂取可能閾値は3倍から150倍量以上であった。摂取可能であったペプチドミルク量を連日同量自宅にて摂取を続けた。一部患者では摂取可能量を2ー3週間毎に徐々に増量した。継続摂取中、1例で軽度の蕁麻疹が出現したが、呼吸症状などの重篤なアレルギー症状は誘発されなかった。3例で治療後の牛乳の摂取可能閾値を負荷試験をおこない評価し、2-20倍の摂取可能量の増加を認めた。免疫学的な反応の変化を検討するために、牛乳特異的IgE(3例)、カゼイン特異的IgG4(2例)

末梢血の好塩基球の反応(2例)を摂取開始前、摂取開始後で測定した。牛乳特異的IgEは2例で軽度上昇し、1例で低下した。これまで報告されている牛乳そのものを摂取し続ける経口免疫療法に比べると上昇率は低かった。カゼイン特異的IgG4は1例で上昇し、1例で低下した。末梢血好塩基球は治療前後で用意した希釈系列すべても強い反応を示した。二重盲検食物負荷試験でペプチドミルクが牛乳に比べて遥に多量の摂取が可能であることがわかった。現在、森永乳業よりブラインドされた食品(ペプチドミルク、加水分解ミルク)を供給していただき、現在毎日自宅にて摂取を続けている。現在4例エントリーしているが、症例数を今後も増やしていくことが必要である。実際の患者でペプチドミルクが牛乳に比べて遥に多量の摂取が可能であることがわかった。自宅で継続する問題点、ペプチドミルクの供給必要量を確認した。低アレルゲンミルクを摂取することでの副作用がほとんどなく、安全に治療が行えることを5例で確認できた。年少者での摂取継続も可能であることがわかったため、適応年齢を1,2歳からとして、研究を行うこととした。免疫学的にも牛乳特異的IgEの上昇が軽度であり、特に年少例で遮断抗体とされるカゼイン特異的IgG4の上昇が確認できたことより、アレルギーを悪化させることなく、安全に寛解に導くという手応えが得られた。好塩基球の活性化を表面マーカーであるCD203c,CD63で確認しようとしたが、設定した希釈系列で全て反応したため、更に希釈系列を増やして検査を行うこととした。当初はペプチドミルク20mlを毎日自宅で摂取していく計画だったが、摂取可能量が20ml以下の被験者もいるため、摂取量を調節した。今後は、インターネットを利用した研究の告知を行い、より多くの患者エントリーを目指していく。今年度より、ペプチドミルクと加水分解乳でのダブルブラインドのプラセボ・コントロールスタディをおこなうこととした。プラセボを大豆乳から加水分解乳(MA-mi)に変更したのは、ブラインド化した食品を一括して森永乳業に委託することにしたためである。情報収集のための、アレルギー関連の学会出張、森永乳業との打ち合わせのための旅費200,000円。データの統計処理に必要なコンピュータ部品、ソフトウェアで200,000円。好塩基球の活性化を評価するためにCD203c測定キット;1キット100,000円として、4キット、400,000円。特異的IgE、特異的IgG、IgG4、IgA<カゼイン,αラクトアルブミン,βラクトグロブリン>(外注); 400,000円。情報収集のための、アレルギー関連の学会出張、森永乳業との打ち合わせのための旅費100,000円。好塩基球の活性化を評価するためにCD203c測定キット;1キット100,000円として、6キット、600,000円。