hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ソフトな金属中心とハードな塩基の協同によるC-H結合の活性化

[M【acac_2】](M:Pd【II】,Pt【II】,acac:アセチルアセトネート)と2倍モルのPPh3をMeOHに溶解してできる【[M(acac)(PPh_3)_2]^+】【acac^】は、外部試薬のC-H結合を活性化し、新物質を含む多くの錯体合成の良い出発物質となることを見出した。たとえばアルキルスルホニルアセトニトリルやアセチレン類との反応では[M(acac)(-CH(【SO_2】R)CN)(【PPh_3】)]および[M【-CΞCR_2】【(PPh_3)_2】]が生成した。acacHのpKaが89であるのに対し【RSO_2】【CH_2】CNとRCΞCHのpKaはそれぞれ12,2126と大きいにもかかわらず反応が進行するのは、(1)基質が金属と相互作用することによりそのpKaが低下し、かつプロトンアクセプター【acac^】がすぐそばにある。(2)プロトン引き抜きのエネルギー的不利を補って余りある生成錯体の熱力学的安定性,(3)生成錯体が溶媒に溶けず固体として析出して平衡系外にでる。の三点の理由によると考えられる。2-ヒドロキシアセトフェノン類(pKa【CH_3】:20,OH9)との反応ではができるが、この場合さらにキレート効果が反応進行の理由に加わる。他方[M【acac_2】]と2倍モルの1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)メタン,dppm(pKa29)との反応ではdppmのメチレンが活性化され、[M【dppm-H_2】]ができた。Ptの場合、【^(31)P】nmrで反応を追跡し、[Pt-(acac-O,O ́)(acac-O)(dppm-P)]と[Pt(dppm)(dppm-H)](acac)が反応中間体として存在することを見出した。一方Pdでは等モルのdppmとの反応で[Pd(acac)(dppm-H)]が単離され、これと【T_S】OHとの反応では[Pd(acac)(dppm)](O【T_S】)ができた。以上より反応全体は、[M【acac_2】]【(dppm)!→】[M(acac-O,O ́)(acac-O)(dppm)]→[M(acac)(dppm)](acac)【(-acacH)!→】[M(acac)(dppm-H)]【(dppm)!→】[M(dppm)(dppm-H)](acac)【(-acacH)!→】[M【dppm-H_2】]のように進むと推定される。PdとPtで反応の安定中間体が異なることは興味深い。以上のように、強アルカリ条件や、低酸化数の錯体への基質の酸化的付加が必要な合成でも、ありふれた錯体[M【acac_2】]を用いて容易にできることを見出し、その反応機構についても調べた。一方Pdでは等モルのdppmとの反応で[Pd(acac)(dppm-H)]が単離され、これと【T_S】

OHとの反応では[Pd(acac)(dppm)](O【T_S】)ができた。以上より反応全体は、[M【acac_2】]【(dppm)!→】[M(acac-O,O ́)(acac-O)(dppm)]→[M(acac)(dppm)](acac)【(-acacH)!→】[M(acac)(dppm-H)]【(dppm)!→】[M(dppm)(dppm-H)](acac)【(-acacH)!→】[M【dppm-H_2】]のように進むと推定される。PdとPtで反応の安定中間体が異なることは興味深い。以上のように、強アルカリ条件や、低酸化数の錯体への基質の酸化的付加が必要な合成でも、ありふれた錯体[M【acac_2】]を用いて容易にできることを見出し、その反応機構についても調べた。
cyclin Cによるヒト造血幹細胞の機能制御メカニズムの解析

ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞でサイクリンCをノックダウンすることにより静止期細胞が増え未分化マーカーであるCD34の発現を維持することを見いだした。またin vitroにおける増幅や免疫不全マウスへの生着を改善することを明らかにした。以上よりサイクリンCがヒト造血幹細胞・前駆細胞の静止期を制御する重要な役割を担っていることを明らかにし、造血幹細胞においてサイクリンCの量および活性を調整することで造血幹細胞の増幅や生着を改善しうることを示した。臍帯血より分離したCD34陽性において、cyclin Cに対するshort hairpin RNAを発現するレンチウィルスを感染させることにより、cyclin Cの発現を下げることに成功した。この細胞を用いて、様々なin vitroの実験を行った。cyclinはその多くが細胞周期の調節に関与しているので、まず最初にPI染色による細胞周期の検討を行った。しかしながらこれではサを認めなかった。次に静止期分画の検討を行ったところ、cyclin CをノックダウンしたCD34陽性細胞群ではより多くの静止期細胞を認めた。しかしながら週毎の増殖速度を検討したところ、初期ではcyclin Cノックダウン群で低く、3週以降では高かった。さらに累積増殖cyclin Cノックダウン群で優位に高かった。培養細胞でのコロニー系性能は培養後期cyclin Cノックダウン群で著しく高く、自己複製能が亢進していることが示唆された。しばし自己複製能の亢進は分化ブロックを伴うことが多いので、各種サイトカインを含んだメチルセルロース培地を用いたcolony forming unit assayで分化に与える影響を検討した。顆粒球系、赤芽球系とも著変なかった。これらはより未分化な細胞への作用かどうかを検討する為に、CD34陽性細胞をより未分化なCD38陰性細胞群と分化したprogenitorであるCD38陽性細胞とで比較を行った。CD38陰性細胞群では培養5週目のCD34陽性率やコロニー形成能が著しく高く、これはCD38陽性細胞では認められなかった。このことから、cyclin Cは造血幹細胞を含む未分化な分画で重要な役割を果たしていることが示唆された。これらの結果を論文で投稿するとともに、亢進した静止状態と自己複製能がin vivoにおいても認められるか、マウスへの移植モデルを用いて検討している。我々はヒト臍帯血より分離したCD34陽性において静止期より細胞周期に入る際に、early G1 cyclinであるcyclin Dではなくcyclin Cの発現が亢進する事を見いだした。そこでcyclin Cが造血幹細胞(HSC)の静止期から細胞周期への導入を制御しているかどうか検討した。まずcyclin Cに対するshort hairpin RNAをレトロウィルスでの感染効率の低いHSCを含むCD34陽性細胞にレンチウィルスにより導入し、cyclin Cの発現を下げることに成功した。G1/S/G2M期の割合には優位な差は認めなかったが、cyclin Cノックダウン群では静止期細胞の増加を認めた。週毎の増殖速度を検討したところ、初期ではcyclin Cノックダウン群でやや低く、3週以降では高かった。さらに累積増殖はノックダウン群で優位に高かった。培養細胞でのコロニー系性能は培養後期でノックダウン群で著しく高く、自己複製能が亢進していることが示唆された。CFCアッセイや表面マーカー解析では、顆粒球系・赤芽球系とも分化には著変なく、自己複製の亢進は分化ブロックを伴うものではなかった。CD34陽性細胞をより未分化なHSCを含むCD38陰性群と分化したprogenitorであるCD38陽性群とで比較を行った。CD38陰性群では培養5週目のCD34陽性率やコロニー形成能が著しく高く、これはCD38陽性群では認められなかった。以上より、cyclin CはHSCを含む未分化な分画で重要な役割を果たしていることが示唆された。また免疫不全マウスへの移植実験ではノックダウン群において移植6週後でのヒトキメリズムが優位であった。このことからcyclin Cをノックダウする事でHSCの生着を亢進させる事が明らかになり、cyclin Cを阻害する事で生着率を向上させられる可能性を示した。
ホルモン遺伝子を表皮細胞に導入することによるホルモンの全身への供給

前年度の研究において作成したinsulin-like growthfactor, growth hormone, erythropoietinの発現ベクターを、ヒロサキヘアレスラットの背部皮膚にnaked DNA法を用いて遺伝子導入し、血中に各遺伝子産物が検出されるかどうかをELISA法により検討した。遺伝子導入後、全ての生物活性物質について経時的な血中濃度の上昇が認められたが、24時間後を最高値とする一過性の発現にとどまった。次に、発現ベクターに用いるプロモーターの強さを検討するために、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子の上流に、サイトメガロウイルス、SV40ウイルス、ケラチン10遺伝子、I型コラーゲン遺伝子、あるいはエラスチン遺伝子のプロモーター領域を連結したレポーターコンストラクトをラット皮膚に導入し、24時間後に導入部組織を採取しCAT活性を行ったところ、サイトメガロウイルス、SV40ウイルスのプロモーターが最強の活性を有していた。次に遺伝子発現の細胞選択性を同様の実験系を用いて検討したところ、サイトメガロウイルスおよびSV40ウイルスでは表皮、真皮ともに強い発現が見られたが、表皮において約3倍強い発現が観察された。一方、表皮特異的発現遺伝子であるケラチン10のプロモーター活性は、表皮においてサイトメガロウイルスの約1/3であったが、真皮においてもプロモーター活性が認められた(表皮の1/20)。更に真皮特異的発現遺伝子であるI型コラーゲンおよびエラスチンプロモーターの活性は、真皮のみならず表皮においても認められ真皮と同等以上のプロモーター活性がみられた。遺伝子治療は,細胞に新たに遺伝子を導入したり細胞にある遺伝子を操作することにより治療効果を得る治療方法で,有効な治療方法がない疾患に対する新しい治療方法として期待されている。申請者らは,抗炎症性のサイトカインであるinterleukin(IL)-10の遺伝子を表皮細胞に導入し強発現させると,IL-10が血中に移行し全身に分配されることを見出した。そこで,表皮細胞にホルモン遺伝子を導入し,そこからホルモンを全身性に分配する可能性を検討した。種々のホルモンcDNAの翻訳領域をPCRにて増幅できるオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ホルモンとしては,insulin-like growthfactor (IGF),growth hormone,erythropoietinを選択した。この中でIGFなどは実際に表皮細胞で産生されている。次に,これらを産生するラットやヒトの細胞からRNAを抽出し,オリゴd(T)プライマーと逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。さらにそれらのcDNAを鋳型として,PCRを行いそれぞれのホルモンのcDNAをクローニングした。塩基配列を確かめた所,IGF,growth hormone,erythropoietinの配列に一致した。遺伝子治療は,細胞に新たに遺伝子を導入したり細胞にある遺伝子を操作することにより治療効果を得る治療法で,有効な治療法のない疾患に対する新しい治療法として期待されている。ホルモンとしては,insulin-like growthfactor (IGF),growth hormone, erythropoietinを選択した。塩基配列を確かめた所,IGF,growth hormone, erythropoietinの配列に一致した。その後,これらcDNAを発現ベクターにsubcloningし,おのおのをラットあるいはヒト表皮角化細胞由来培養細胞に導入した。それらの発現を免疫組織学的に検討したところ,対照に比較して,各ホルモンの有意な発現が観察された。
暗号、符号、擬似乱数への代数学の応用

暗号、符号、擬似乱数への代数学の応用研究を行った。具体的には、相互に関係の深い以下の3種類の研究を進めた。1.暗号と擬似乱数アルゴリズムの開発と評価、2.シミュレーションのためのグラフの分散彩色アルゴリズム及び分散彩色多項式、3.誤り訂正符号系列の存在性と電子署名への応用。1.暗号と擬似乱数アルゴリズムの開発と評価についてはブロック暗号とストリーム暗号の安全性の評価方法についての研究を進めた。特にAESのSubbyte変換部分の特徴を生かして効率的に乱数性の悪さを検出することができた。その評価結果などの具体的に暗号を評価した結果と合わせて発表するための準備を進めている。2.シミュレーションのためのグラフの分散彩色アルゴリズム及び分散彩色多項式、については、予定していた理論研究にとどまらず、その成果の応用可能性を探る研究を進めて2018年12月に応用数学合同研究集会で、「印象評価のためのグラフの重み更新アルゴリズムについて」(共著)を発表した。グラフの重み更新アルゴリズムを用いて順位を決めることと、よく使われるイロ・レーティングとの関係についても分析した。引き続き研究を進めて、より具体的で数学的に信頼できる印象評価方法を提案していきたいと考えている。3.誤り訂正符号系列の存在性と電子署名への応用についても存在条件についての研究を進め、2019年1月に東北大学で行われた研究集会「組合せ論的符号理論」で「有限体上の誤り訂正符号系列の存在条件について」を発表した。計画通り暗号、符号、擬似乱数への代数学の応用研究を行い、おおむね順調に進展している。具体的には、相互に関係の深い以下の3種類の研究を進め、それぞれに関連する期待していた研究成果が得られ、2と3については研究集会で新しい結果を発表することができた。引き続き、相互に関係の深い以下の3種類の研究を進める。特に1に関連して、AESのSboxの特殊性を利用した評価研究が進んでいるため、引き続き研究を進めていきたい。また、2に関連して、平成30年度までに印象評価へのグラフ彩色とブロックデザインの応用可能性を探り、良い成果が上がっている。今後は、これらの評価手法によって得られた部分的な評価を全体の評価に拡張する方法を組み合わせて実用的な印象評価手法を提案したいと考えている。1.暗号と擬似乱数アルゴリズムの開発と評価についてはAESの安全性の評価方法についての研究を進め、擬似乱数を追加することで安全性が高まることの統計的検定により評価し、2015年12月に応用数学合同研究集会で「AES暗号の安全性評価」(共著)を発表した。2.シミュレーションのためのグラフの分散彩色アルゴリズム及び分散彩色多項式、については、関係する応用研究を進めて2015年12月に応用数学合同研究集会で、n点の完全グラフのオイラー閉路の最小サイクルの長さの最大値に関する定理を証明した「オイラー閉路における同頂点間距離の最小値について」(共著)、組合せ構造の印象評価への応用を提案するとともに、部分的に得られた順序から妥当な全体の順序を決定するための重み付きグラフを利用した研究を紹介する「印象評価への組合せ構造の応用」(共著)、グラフを用いて作成した行きたい場所を入力するとおすすめの観光プランを出力してくれるアプリケーションを提案した「グラフ理論の分割問題を用いた旅行計画アプリケーションの提案」(共著)の3件の研究成果を発表した。3.誤り訂正符号系列の存在性と電子署名への応用については、これまでの研究成果を整理し、日本数学会の2015年度秋季総合分科会企画特別講演「誤り訂正符号系列の存在性について」を発表した。1については期待通りに進んでいる。2については、関連する研究で成果が上がっている。3については期待していた通りの状況になっていることが確認できたが、さらに研究を進めることを目指して準備中である。1.暗号と擬似乱数アルゴリズムの開発と評価についてはAESの安全性の評価方法についての研究を進め、擬似乱数を追加することで安全性が高まることの統計的検定により評価し、2016年12月に応用数学合同研究集会と2017年3月の応用数理学会研究部会連合発表会で「関数選択を用いた暗号化の乱数性の評価」(共著)を発表した。

2.シミュレーションのためのグラフの分散彩色アルゴリズム及び分散彩色多項式、については、予定していた理論研究にとどまらず、その成果の応用可能性を探る研究を進めて2016年12月に応用数学合同研究集会で、「ペアの円順列での同要素の最短距離について」(共著)、組合せ構造の印象評価への応用を提案する「グラフ彩色を用いた写真選出手法」(共著)を、2017年3月の応用数理学会研究部会連合発表会で「印象評価における比較順序の提案」(共著)、「印象評価への組合せ構造の応用」(共著)を発表した。3.誤り訂正符号系列の存在性と電子署名への応用については、2017年3月の応用数理学会研究部会連合発表会で「有限体上の誤り訂正符号系列の存在条件について」(共著)を発表した。計画通り暗号、符号、擬似乱数への代数学の応用研究を行い、おおむね順調に進展している。具体的には、相互に関係の深い以下の3種類の研究を進め、それぞれに関連する期待していた研究成果が得られ、研究集会で新しい結果を発表することができた。1.暗号と擬似乱数アルゴリズムの開発と評価、2.シミュレーションのためのグラフの分散彩色アルゴリズム及び分散彩色多項式、3.誤り訂正符号系列の存在性と電子署名への応用。特に2については予定していた理論研究にとどまらず、その成果の応用可能性を探る研究に着手し、順調に成果を上げている。暗号、符号、擬似乱数への代数学の応用研究を行った。具体的には、相互に関係の深い以下の3種類の研究を進めた。1.暗号と擬似乱数アルゴリズムの開発と評価についてはブロック暗号とストリーム暗号の安全性の評価方法についての研究を進めた。具体的に暗号を評価した結果と合わせて発表するための準備を進めている。2.シミュレーションのためのグラフの分散彩色アルゴリズム及び分散彩色多項式、については、予定していた理論研究にとどまらず、その成果の応用可能性を探る研究を進めて2017年12月に応用数学合同研究集会で、「グラフ彩色を用いた写真選出の評価」(共著)を発表した。3.誤り訂正符号系列の存在性と電子署名への応用についても存在条件についての研究を進め、2017年8月に行われたJapanese Conference on Combinatorics and its Applications (JCCA- 2017)離散数学とその応用研究集会2017で「有限体上の誤り訂正符号系列の存在条件について」を発表した。具体的には、相互に関係の深い以下の3種類の研究を進め、それぞれに関連する期待していた研究成果が得られ、2と3については研究集会で新しい結果を発表することができた。1.暗号と擬似乱数
中枢神経系の局所神経回路を解析する

中枢神経系をニューロンレベルからボトムアップに理解しようとするときに、決定的にかけている情報は「局所神経回路」の詳細である。これを解析する戦略として、細胞内染色法と遺伝子技術等を組み合せた「From one to many」の研究戦略により、以下の成果を得た。(1)蛍光顕微鏡下に生きたままGABA作動性ニューロンを観察できる遺伝子改変動物を用いて、ホールセルクランプにより細胞内染色する。この際、アダルト動物でのホールセルクランプが困難であるという問題を、GAD67/GFP knock-in mouseを用いた実験系でほぼ解決し、論文として報告した。現在この技術を用いて、VGAT/GFP BAC transgenic ratと逆行性標識法との組み合わせにより、皮質GABA作動性インターニューロンから皮質脊髄投射ニューロンへの入力を解析している。(2)lentivirusをトランスジェニック動物での遺伝子発現・タンパク質局在に関して良いモデルとして使えると考え、これを用いて8種類のtagged GFPを試みた。その結果、ニューロンの樹上突起をGolgi染色様に標識できるtagged GFP([myristoylation/palmitoylation site of Fyn]-[GFP]-[LDL receptor C-terminus]; myrGFP-LDLRCT)を開発できた。Thyl promoterとGAD67 promoter下にこのtagged GFPを発現するtransgenic mouseを作製してGFPのdendritic membrane targetingに成功したので論文として発表した。現在、より発現特異性の高いparvalbumin(PV)promoter等を用いたBAC transgenic mouseを作成中であり、PV/myrGFP-LDLRCT BAC transgenic mouseの作製に成功したところである。(4)VGluT1およびVGluT2が皮質線条体入力と視床線条体入力に対応することを用いて、それぞれの線条体入力を電顕を用いて形態学的に解析した。この基礎データをもとに、Sindbis virusによるゴルジ染色様標識とVGluTの免疫染色を組み合わせて、1個の線条体ニューロンに対してどの程度の皮質入力(VGluT1)および視床入力(VGluT2)があるか、現在検討中である。局所回路網を解析する戦略として、細胞内染色法と遺伝子技術等を組み合せた「from one to many」の研究戦略により、以下の成果を得た。1.大脳皮質運動・体性感覚野の皮質脊髄路ニユーロンに、大脳皮質錐体細胞がどの様に入力するか検討した。皮質脊髄路ニューロンには全ての皮質層の錐体細胞からの入力が収束して入力していたが、大脳皮質IV層の星状錐体細胞からの入力が他の入力の23倍認められた。IV層星状錐体細胞は入力に対して一過性の応答を示す特徴があることから、小脳からの入力成分の内、タイミング情報を皮質脊髄路ニューロンに受け渡していると考えられた。2.Vesicular glutamatetransporter(VGluT)を認識する抗体を作成し、中枢神経系の局所神経回路の解析に応用した。VGluT1は主として大脳皮質の出力ニューロンが使用しており、VGluT2は視床のニューロンが用いているために、線条体・大脳皮質などの領域で、大脳皮質由来および視床由来の興奮性神経終末を区別して標識出来るようになった。これらの抗体を用いたpost-embedding免疫電顕法により、線条体の大脳皮質由来及び視床由来の興奮性神経終末にはAMPA受容体が発現していることを発見した。

この結果はこれらの興奮性終末にポジティブフィードバック機構が存在し、線条体ニューロンのup stateを作り出すメカニズムとしてシナプス前性AMPA受容体が使われているのではないかと推測された。3.VGluT3産生皮質ニューロンは、GABA作動性インターニューロンであり、特にneurokinin Bを産生することを発見した。さらに、このニューロンの出力先は、neurokinin Bを産生する同種のニューロンであり、相手ニューロンの細胞体周囲にaxon basketを形成していた。この結果はneurokinin B産生インターニューロン群内部に閉じた神経回路が存在する可能性を示唆している。4.局所神経回路網を研究するツールとして、Lentivirus vector、遺伝子改変マウスなどを作成中である。中枢神経系をニューロンレベルからボトムアップに理解しようとするときに、決定的にかけている情報は「局所神経回路」の詳細である。局所回路網を解析する戦略として、細胞内染色法と遺伝子技術等を組み合せた「From one to many」の研究戦略により、以下の成果を得た。1.大脳皮質運動・体性感覚野の皮質脊髄路ニューロンに、大脳皮質錐体細胞がどの様に入力するか検討した。皮質脊髄路ニューロンには全ての皮質層の錐体細胞からの入力が収束して入力していたが、大脳皮質IV層の星状錐体細胞からの入力が他の入力の23倍認められた。IV層星状錐体細胞は入力に対して一過性の応答を示す特徴があることから、小脳からの入力成分の内、タイミング情報を皮質脊髄路ニューロンに受け渡していると考えられた。
乳酸菌バクテリオシンの腸内動態解明に向けた基礎的検討

ヒト小腸内優勢乳酸桿菌であるLactobacillus gasseriの多くの株は、抗菌ペプチドであるバクテリオシン「ガセリシンT」を産生する。本研究では、ガセリシンTが産生株の染色体上に存在する9遺伝子によって生合成されることを明らかにした。また、ガセリシンTが2分子の単純ペプチドで構成され、溶液中で強固に会合していることを見出した。本結果は、腸内細菌由来のバクテリオシンが宿主の腸内細菌叢および健康に与える影響を解明する上で重要な知見となるだろう。【背景と目的】乳酸菌の生産する抗菌ペプチド「バクテリオシン」は、安全なバイオプリザバティブとして食品保蔵等に有用であることが広く知られている。また、プロバイオティック乳酸菌の生産するバクテリオシンは、宿主であるヒト等の高等動物の腸内細菌叢に影響を与える一因子として考えられている。本研究では、ヒトや家畜の腸内優勢乳酸菌種であるLactobacillus gasseriが生産する二成分性バクテリオシン「ガセリシンT」に着目し、その構造や生合成機構に関わる遺伝情報を解明することにより、ガセリシンTの腸内動態およびLb.gasseriの腸内生存戦略の一端を明らかにすることを目的とした。【研究成果】本年度は、研究協力者とともに、ガセリシンTの精製と生合成関連遺伝子群の解析を行った。過去の研究経過から、ガセリシンTの精製は乳酸桿菌用培地であるMRS培地からでは困難であると考えられていたため、本研究では研究代表者が以前開発した乳ホエイをベースにした培地を用いることとした。その結果、逆相HPLCを最終段階に用いることで、初めてガセリシンTを精製することに成功した。得られた精製物のMS分析から、ガセリシンTは化学的な修飾を受けていない単純ペプチドであると明らかになったが、HPLCの溶出ピーク形状から二成分が複雑に会合した存在形態をとっていると考えられた。また、ガセリシンTの構造遺伝子周辺の塩基配列解析から、ガセリシンTは染色体上の6-7kbpにわたる9遺伝子で生産制御、生合成および分泌を行い、自己耐性能を獲得していることが強く示唆された。【背景と目的】乳酸菌の産生する抗菌ペプチドであるバクテリオシンは、安全なバイオプリザバティブとして食品保蔵等に有用であるとされる。また、プロバイオティック乳酸菌の産生するバクテリオシンは、宿主であるヒトや家畜等の哺乳動物の腸内細菌叢に影響を与える一因子として考えられている。そこで本研究では、ヒト小腸内優勢乳酸桿菌種であるLactobacillus gasseriの多くの株が産生する二成分性バクテリオシンであるガセリシンTに着目し、その腸内動態を解明するための第一歩として、ガセリシンTの構造や生合成機構に関わる遺伝情報を明らかにすることとした。【研究経過と成果】昨年度、HPLCを用いてガセリシンTを精製したと報告した。しかし、本年度、HPLCで分離した抗菌活性画分をSDS-PAGEに供したところ、夾雑と思われるピークが微かに確認された。また、得られた抗菌活性画分を用いたN-末端アミノ酸配列分析では明確な結果を得られなかった。このことから、ガセリシンTは完全に精製されていないことが判明した。一方、昨年度得られたガセリシンT生合成関連遺伝子群を種々のプログラムやデータベースで解析したところ、本遺伝子群は他のLactobacillus gasseriや近縁のLactobacillus johnsoniiにも類似の配列が存在することが明らかとなった。このことは、ガセリシンT生合成関連遺伝子群およびその類似遺伝子群が小腸内優勢の乳酸桿菌に広く分布していることを示し、小腸内でガセリシンTおよびその類似バクテリオシンが分泌されている可能性を示唆するものであった。以上の結果は、腸内細菌由来のバクテリオシンによる宿主の腸内細菌叢および健康への影響を解明する上で今後重要な知見となると思われる。当初は、ガセリシンTの推定生合成関連遺伝子群をプラスミドベクターに導入して異種発現を行い、生合成関連遺伝子群の全長を決定する予定であった。しかし、目的とする全長のプラスミドベクターへの組み込みが上手くいかなかったため、当初の研究計画よりやや遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、ガセリシンT生合成関連遺伝子群の全長解明に向けた研究を行う。また、当初の研究計画に沿って、ガセリシンTの生産調節に関わる制御系遺伝子の発現解析を行う予定である。
メリステムの対称性維持機構の研究

葉の向背軸形成に関わる遺伝子として,AUXIN RESPONSEFACTOR (ARF)遺伝子の発現をteb変異株について調べたところ,ETTIN (ETT)/ARF3やARF4は,teb変異株ではmRNA存在量が上昇し,tebatrの二重変異株では,さらにその量が上昇していた。ETT/ARF3やARF4の発現上昇はtsk変異株でも確認された。また,葉の向背軸形成に関連する他の遺伝子との関わりをみるために,tebと各遺伝子変異株との二重変異株の作製し,その影響を調べた。asymmetric leaves2(as2)teb二重変異株は,teb単独変異で見られる葉の向背軸形成に関わる表現型を元進し,as2,argonaute 7(ago7)の二重変異株について報告された(Xu, L.et al.2006),棒状やラッパ状の葉の形成が観察された。しかし,ago7,teb二重変異株は,葉の向背軸形成に関わる表現型を若干亢進するに留まった。これらのことから,TEBはAGO7,RDR6,SGS3経路によるtrans-acting siRNAとは別経路でETT, ARF4の発現制御に関与するのでは無いかと考えられた。しかし,葉の向背軸形成に関わる遺伝子でも,向軸側形成に関わる遺伝子であるphabulosaやrevoluta変異はteb変異株の形態に明白な影響を与えなかった。TONSOKUタンパク質はN末端近傍にLGNリピート、C末端近傍にロイシンリッチリピートという二つのモチーフを有している。そのうちLGNリピートをbaitとして酵母を用いてtwo-hybrid法スクリーニングを行った。シロイヌナズナ地上部から作製された6000万余のcDNAクローンの中から、11種の陽性クローンを得た。陽性クローンのうち名古屋大学大学院理学研究科町田泰則研究室で単離されたタバコNtSIP1と相同性が見られるPOT3とmyosin-like proteinとアノテーションが付けられているPOT1について主に解析を進めた。POT3については、Hisタグを付けたPOT3とT7タグを付けたTONSOKUを大腸菌に過剰発現して作らせたそれぞれの融合タンパク質を混ぜ合わせたとき、抗T7タグ抗体でPOT3が共沈することから、試験管内でもPOT3とTONOSKUが結合することが確認された。茎頂と根端両メリステムの構造に影響を及ぼす新規突然変異株の単離tsk変異株は、帯化形質を見せるだけでなく、若干浸透圧が高い培地上で生育させると野生株より根が短くなる性質を持っているので、自作のタギングラインからtskに似た性質をもつ変異株のスクリーニングを行った。そして、2000の独立したタギングラインの中から2系統を選抜した。その1系統はTONSOKU遺伝子内の新しい場所に挿入変異を持っていた。もう1系統は、挿入変異株では無かったので4番染色体の詳細なマッピングを進め、At4g32700遺伝子内に欠失を見つけた。この遺伝子はDrosohpillaのmus308というDNA修復系に関わる変異株の原因遺伝子と相同な遺伝子をコードしている。その遺伝子産物は、N末端側にDNAもしくはRNAヘリカーゼに共通に見られるモチーフがあり、C末端側には細菌型DNAポリメラーゼIと相同な領域を持っている。TONSOKUタンパク質の細胞内局在の解析タバコ培養細胞BY-2内でのTSK:GFP融合タンパク質は、その局在が細胞周期依存的に変化することが明らかになった。融合タンパク質は中間期には核構造内に存在するが、細胞分裂期には染色体に先んじて娘細胞に移行し、複数のスポット状構造を形成することが判明した。TSKタンパク質のN末端近傍にあるLGNリピートがこのような特異的なタンパク質の細胞内局在性に関与していると予想される。茎頂と根端両メリステムの構造に影響をおよぼすSS93株の解析野生株より根が短くかつ地上部が帯化するSS93株の原因遺伝子は、DNAヘリカーゼとDNAポリメラーゼのモチーフを一つのポリペプチドに持つタンパク質をコードすることから、DNA修復に関わると予測される。この変異株は、マイトマイシンC等のDNA鎖間架橋剤に対して高感受性を示すほか、恒常的にDNA鎖切断修復およびG2/M期チェックポイント機構に働く遺伝子群の発現量が上昇している。またサイクリンボックスを持つサイクリンB1::GUSをこの変異株に導入したところ、G2/M期にある細胞め数が、野生型株より多くなっていたことから、この変異株の根端分裂組織内では細胞分裂周期が変化していることが明らかになった。同じレポーター遺伝子の過剰発現は茎頂でも見られることから、この現象は茎頂および根端分裂組織の構造異常に関連すると推察される。また、変異株では野生型株に比べて、葉における核の倍数性が上がっていることも、変異と細胞分裂周期との関連を示している。tskおよびteb-1変異株においてはDNA切断修復およびG2/M期チェックポイント機構に関わる遺伝子群の発現量が恒常的に上昇していた。また、G2/M期にある細胞を検出するためcyclinB1::GUSを両変異株に導入したところ、いずれの変異株でもSAMとRAMの両方で、染色される細胞の数が野生型株より多くなっていた。これらの結果は、変異の影響により内在性のDNA障害を修復する能力が低下し、その結果生じた不完全なDNA複製が検出されてチェックポイント制御が働き、M期への進行が停止されたと解釈される。teb-1変異株より抽出したmRNAを用いたマイクロアレイで、M期

特異的に発現する遺伝子の発現量がどれも野生型株に比して低くなっていたことは、これに符合する。DNA複製のチェックポイント制御に関わると考えられているATMキナーゼ遺伝子もしくはATRキナーゼ遺伝子の変異株とteb-1変異株の二重変異株を作製したところ、atm変異の影響は見られなかったが、atr変異はteb-1変異に見られるcyclinB1::GUS発現細胞の数の増加を抑制した。teb-1変異によって起こるM期への進行停止はATRキナーゼ制御下にあると考えられる。2・細胞分裂周期制御と形態形成atr変異単独では形態異常が見られないが,atrとteb-1の二重変異株は、teb-1変異で見られた形態異常が顕著になり、針状の葉の形成や根の重度の伸長抑制が観察された。先に示したようにatr/teb-1二重変異株ではM期への進行停止は解除されているので、この結果は、細胞分裂周期の不調和以外の要素も加わり特に葉の形態異常が起こることを示すと考えられる。茎頂メリステムおよび根端メリステムの構造に異常が見られる帯化変異株tebichi(teb)の表現型と細胞周期チェックポイントとの関係を調べるため,tebとDNA複製チェックポイントに関わるATR(Ataxia Telangiectasia-mutated and Rad3-related)遺伝子の変異の二重変異株の解析を行い,ATRとTEBは遺伝学的な関係があることを明らかにした.teb変異株はやや細く周辺部の形が乱れた葉を持つが,tab atr二重変異株ではこの表現型が特に亢進され,棒状の葉が頻繁に生じた.そこで,teb変異株の葉の切片を観察したところ,背軸側の細胞の形態の特徴が向軸側に広がって見られたほか,葉原基のin situハイブリダイゼーションでは,背軸側遺伝子FILAMENTOUS FLOWER(FIL)が向軸側に広がって発現していることが明らかになった.これらの結果は,teb変異株における葉の形態異常の少なくとも一部は,葉の向背軸を決める遺伝子群の発現の局在性の異常によるものである事を示していると考えられる.これまで,DNA複製の進行と,発生段階における極性に関わる遺伝子発現や非対称細胞分裂との関係について得られている知見は少ないので,これらの解析から,葉の極性形成の分子機構に新たな知見をもたらすことが期待される.また,帯化変異株と向背軸形成との関わりから,メリステムの構造維持についても新たな知見が得られるのではないかと考られる葉の向背軸形成に関わる遺伝子として,AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF)遺伝子の発現をteb変異株について調べたところ,ETTIN (ETT)/ARF3やARF4は,teb変異株ではmRNA存在量が上昇し,tebatrの二重変異株では,さらにその量が上昇していた。ETT/ARF3やARF4の発現上昇はtsk変異株でも確認された。また,葉の向背軸形成に関連する他の遺伝子との関わりをみるために,tebと各遺伝子変異株との二重変異株の作製し,その影響を調べた。asymmetric leaves2(as2)
ミトコンドリア環境応答性核酸ナノ粒子の構築と細胞内微小環境の核酸科学

ミトコンドリア(Mt)の機能不全(Mtのゲノム異常)は、Mt脳筋症、神経変性疾患、心筋梗塞、糖尿病などの様々な疾患と関連しており、Mtを標的とする核酸医薬(アンチセンスオリゴ核酸)が革新的治療法として注目されている。本研究では、Mt環境応答性核酸ナノ粒子搭載ドラッグデリバリーシステム(DDS)を構築し、細胞Mt内部における核酸放出過程および遺伝子発現制御およびMt・細胞機能を評価した。本研究は、核酸科学研究分野に多彩な機能を有するMtという新しい細胞内微小環境を創出し、Mtを標的としたナノメディシン創製に貢献する事が期待される。ミトコンドリア(Mt)のゲノム異常は、Mt脳筋症、神経変性疾患、心筋梗塞、糖尿病などの様々な疾患と関連しており、Mtを標的とする核酸医薬(アンチセンスオリゴ核酸)が革新的治療法として注目されている。本研究では、Mt環境応答性核酸ナノ粒子搭載ドラッグデリバリーシステム(DDS)を構築し、Mt遺伝子発現制御、Mt・細胞機能を評価する。27年度は、「Mt環境応答性核酸ナノ粒子搭載DDSの構築」に関する下記の項目を中心に研究を遂行した。1Mt環境応答性核酸ナノ粒子の構築: Mtが細胞内部で特殊環境領域(アルカリ性領域、特異的酵素反応など)を有していることに着目し、核酸ナノ粒子を形成するカチオンポリマーに環境応答性を付加したポリマーを設計した。核酸ナノ粒子はオリゴRNA核酸とMt環境応答性ポリマーを異なる比率で混合しナノ粒子の形成を試みた。粒子径と表面電位測定をベースに粒子形成を確認し、種々の検討を経てナノ粒子が形成できる条件を見出した。2Mt環境下における核酸放出評価:核酸ナノ粒子をMt環境模倣溶液(アルカリ性、負電荷分子含有)でインキュベーションした後に、ナノ粒子からの核酸放出能を評価した。本評価のために、FRET、クエンチングなどの蛍光分子イメージング法を利用したプロトコルを検討し、最適な評価方法を構築した。種々の検討を経てMt環境でオリゴ核酸を放出しやすいMt応答性核酸ナノ粒子を構築する事に成功した。3Mt環境応答性核酸ナノ粒子搭載MITO-Porterの構築: Mt環境応答性核酸ナノ粒子をMITO-Porterに搭載し、粒子径・表面電位を測定し、安定した粒子構造が形成されている事を確認した。一方で、オリゴ核酸の封入率が低かったため、次年度はこの点も重要な課題点と考え検討していく予定である。Mt環境応答性を付加したポリマーを設計し、本ポリマーを用いたオリゴRNA核酸のナノ粒子形成に成功した。また、独自の核酸放出評価プロトコルを確立しMt環境応答性核酸ナノ粒子を調整する事に成功し、MITO-Porterへの搭載も実施した。一方で、オリゴ核酸の封入率が低かったため次年度はこの点も重要な課題点である事が明らかとなったが、ここまでに示した内容はH27年度に計画した全ての研究内容が網羅されており、研究の目的を達成する多くの成果を得ることができた。以上より、現在までの達成度は『おおむね順調に進展している』と判断した。平成27年度は、『Mt環境応答性核酸ナノ粒子搭載DDSの構築』に関する「1.Mt環境応答性核酸ナノ粒子の構築」、「2.Mt環境下における核酸放出評価」、「3.Mt環境応答性核酸ナノ粒子搭載MITO-Porterの構築」の項目を中心に研究を遂行した。平成28年度は、『生細胞MtへのMt環境応答性核酸ナノ粒子の送達および遺伝子抑制検証』に関する下記に記載した研究を進めた。1. Mt環境応答性核酸ナノ粒子の細胞内動態の最適化:キャリアの細胞取り込み能をフローサイトメトリーを利用して評価、細胞内動態は共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて観察し、細胞取り込み能およびMt移行能を評価しMtへの核酸ナノ粒子導入を最適化した。2.生細胞を用いたMt遺伝子抑制の検証: Mt呼吸鎖タンパク質であるCOX2コードするMt内因性mRNAを標的とするアンチセンスオリゴ核酸のナノ粒子をMt内部に導入し、その遺伝子発現抑制を検証した。定量的RT-PCRによるmRNAの定量、免疫染色法を用いた標的タンパク質の発現量を評価し、ミトコンドリアRNAノックダウンを確認した。また、Mt内の膜電位を検出可能な蛍光色素JC-1を利用して評価し、Mt呼吸鎖機能を維持するCOX2がノックダウン時の膜電位が低下を評価し、ミトコンドリア膜電位が低下する機能制御に成功した。

本研究は、核酸科学研究分野に多彩な機能を有するMtという新しい細胞内微小環境を創出し、Mtを標的としたナノメディシン創製に貢献する事が期待される。平成28年度は、『生細胞MtへのMt環境応答性核酸ナノ粒子の送達および遺伝子抑制検証』に関する研究を中心に下記に記載した計画で研究を進める予定である。1Mt環境応答性核酸ナノ粒子の細胞内動態の最適化:キャリアの細胞取り込み能をフローサイトメトリーを利用して評価、細胞内動態は共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて観察し、細胞取り込み能およびエンドソーム脱出効率・Mt移行能を定量的に評価しMtへの核酸ナノ粒子導入を最適化する。また、生細胞Mt環境における核酸放出過程の最適化を図る。2生細胞を用いたMt遺伝子抑制の検証: Mt呼吸鎖タンパク質であるCOX2コードするMt内因性mRNAを標的とするアンチセンスオリゴ核酸のナノ粒子をMt内部に導入し、その遺伝子発現抑制を検証する。定量的RT-PCRによるmRNAの定量、免疫染色法を用いた標的タンパク質の発現量を評価する。また、Mt内の膜電位を検出可能な蛍光色素JC-1を利用して評価し、Mt呼吸鎖機能を維持するCOX2がノックダウン時の膜電位が低下を評価する。これらの結果を基に、Mt応答性核酸ナノ粒子のMt内部での核酸放出制御の有用性および核酸放出とMt機能変化の関連性を解析する。本研究を含む一連の成果が評価され、平成28年度北海道科学技術奨励賞(知事表彰)を受賞した。また、「ミトコンドリア病」の新しい治療法の研究開発を目指す創薬プロジェクト『7 SEAS PROJECT』の構成メンバーとなり、本研究成果を医薬品へと発展させ、医療・経済・社会への貢献を目指し、新たな研究を計画・推進中である。薬物送達学研究費を節約しながら検討を進めたため、未使用額が生じた。次年度は最終年度であるため、細胞を利用した評価を実施するため、これまで以上に細胞培養用試薬などの消耗品費が必要となる。これらの消耗品費のために本未使用額を有効に活用したい。
Cholecystokinin(CCK)トランスジェニックマウスの作製-その病態生理学的意義に関する分子行動学的解析

マウスCCKcDNAの構造にもとづき、RT-PCRにてマウス脳RNAよりCCKcDNAを増幅した。これをpCAGGS(β-アクチンプリモーター:東大宮崎教授)に組み込み、COS細胞はトランスファクトし、分泌されるCCKの量を測定、確認し、トランスジェニックマウスを作製する予定であった。しかしながら、COS細胞に何度トランスフェクションを行なっても、培養液中CCK活性の上昇が、非抽出及びエーテル抽出の両サンプルを用い、CCK-8及びその大分子型に特異的なRIAで確認できなかった、そこで再度CCKcDNAのシークエンスを検討したところ、CCKのcoding resconにPCRの間違いが見出され、CCKのプロセシングがうまくゆかず、CCKが産生されない可能性が強いと考えられた。そこで再度RT-PCRを行ない、PCR産物のシークエンスを確認し、現在トランスフェクションを行なっているところである。震災の影響で、少くとも2か月実験の遅れを生じ、トランスジェニックマウスのインジェクターも破損、修理中である。更に、動物実験姿勢もウイルス汚染が広がり、トランスジェニックマウス作製は動物の汚染が一掃されてから行いたいと考えられている。予定では、平成7年6月頃にCCKトランスジーンの活入を行い、F^1(ヘテロマウス)の誕生を待って行動解析を行う。現行までのところ、少なくとも訳文上、CCKトランスジェニックマウスは未だ報告されていない。
聴覚神経回路・周波数依存性マップ形成に関わる神経細胞接着分子NB-2の機能解析

神経認識分子NB-2はコンタクチン5とも呼ばれ、聴覚系神経回路で特に顕著に発現している。本研究では、先ずNB-2が音の聞こえ始める直前に発現が強くなり、特に高周波数に反応する領域で発現していることを明らかにした。次に、遺伝子欠損型マウスと野生型マウスで聴覚系神経回路の発達と機能を比較し、遺伝子欠損型マウスでは特に興奮性の神経回路のシナプス部位に異常があり、その結果、一部の神経細胞が細胞死を起こしていること、音に対する脳幹の反応に遅れが出ることを明らかにした。本研究は聴覚系神経回路網発達過程における神経細胞接着分子NB-2(コンタクチン5)の機能解析を通して、聴覚系神経回路発達・成熟の分子機構を明らかにすることを目的としている。今年度は、Casprファミリーに対する抗体作製と培養細胞系でのNB-2とCasprファミリー分子との共発現系を確立し、NB-2との相互作用の可能性についての検討を行うことを計画した。Caspr2については、以前に作製したウサギポリクローナル抗体を精製して用いると共にマウスモノクローナル抗体を作製した。Caspr4については、以前に作製したウサギポリクローナル抗体を精製して用いた。抗体が未だ作製できていないCaspr1,3については、HAタグとの融合タンパク質を培養細胞にNB-2と共発現させて免疫沈降法を行うことによって相互作用の可能性を調べた。その結果、NB-2はCaspr1,2,3の何れとも免疫沈降されず、Caspr4は培養細胞では発現しなかった。そこで、抗NB-2抗体をカラムに固定し、脳膜画分を用いてアフィニティ・クロマトグラフィーを行ったところ、溶出分画中にCaspr4が検出された。更に膜画分から抗NB-2抗体を用いて免疫沈降したところ、Caspr4を検出することができ、逆に抗Caspr4抗体を用いて免疫沈降した場合にはNB-2を検出することができた。このことから、NB-2はCaspr4と結合している可能性が高く、現在、免疫染色による検討を行っている。一方、NB-2を発現している神経細胞と神経伝達物質との関係を明らかにするため、種々のマーカーとの蛍光二重染色を行った。その結果、NB-2は黒質ではGABA陽性ニューロンでの発現が認められたが、聴覚系ではGABA、又はグリシン陽性ニューロンとはオーバーラップせず、グルタミン酸トランスポーターvGluT1陽性ニューロンと共局在した。これらのことから、今後、聴覚系グルタミン酸作動性ニューロンにおけるNB-2とCaspr4の役割について解析を行うことが必要である。本年度は、抗NB-2抗体と抗vGluT1抗体を用いた蛍光二重染色を行い、聴覚系神経回路の各発達段階での発現を詳細に検討した。NB-2は聴覚系のすべての部位で発現し、特に脳幹(蝸牛神経核、上オリーブ核、下丘)で特に強く発現していた。聴覚系におけるNB-2の発現は生後7日頃に最大となり、その後急速に減少し生後14日にはICを除いて発現が見られなくなった。そこで、NB-2とvGluT1の発現時期を比較し、グルタミン酸陽性ニューロンの発達・成熟とNB-2の発現との関係について検討した。その結果、NB-2の発現が特に強い脳幹においてNB-2とVGLUT1の免疫蛍光シグナルが重なった。NB-2とVGLUT1の発現時期を上オリーブ核で比較した結果、生後直後ではNB-2のみが発現し、聴覚系の発達に従ってVGLUT1が次第に発現し始めた。生後7日になるとNB-2の発現が最大となり、その後NB-2の発現は急速に減少し、生後14日になるとVGLUT1の発現のみが見られた。また、聴性脳幹反応(ABR)は聴覚系の機能を測定する上で極めて有用である。今年度は、1ケ月齢、3ケ月齢、6ケ月齢のNB-2欠損マウスと野生型マウスをそれぞれ用いて、ABRのI波からV波までの波形解析を行った。刺激頻度を8kHz、12kHz、16、kHz、20kHzの4段階で変化させ、それぞれの周波数における閾値と、I波からV波までの波形出現時間を比較した。その結果、すべての月齢においてNB-2欠損マウスは、低周波数(8kHz、12kHz)におけるABRの4波の出現時間が有意に遅れていた。一方、NB-2欠損マウスと野生型マウスのABRの閾値に有意な差は見られなかった。

本年度は、NB-2遺伝子欠損型マウスと野生型マウスを用いて、腹側蝸牛核(VCN)、上オリーブ核群(SOC)におけるシナプス形成、及びアポトーシスについて比較した。台形体核(MNTB)のcalyx of HeldはVCNのbushy neuronからの終末であり、主要細胞の周囲を包み込むように動物細胞最大のシナプスを形成し、bushy neuronと主要細胞がほぼ1:1に対応している。このため、NB-2のシナプスでの役割を明らかにするためには、NB-2遺伝子欠損型マウスと野生型マウスでcalyx of Heldを比較することが重要であると考えた。出生後6日の野生型マウスでは、ほぼ全ての主要細胞でグルタミン酸作動性シナプスのマーカーであるVGLUT1陽性のcalyx of Heldが認められたが、NB-2欠損型マウスではVGLUT1のシグナルで囲まれていない主要細胞が見られた。次に、MNTBの主要細胞の数を野生型とNB-2欠損型マウスで比較したところ、出生後6日では有意な差は認められなかったが、出生後1か月では、NB-2欠損マウスで有意に主要細胞の数が減少していた。このことから、VCNからMNTBへの神経回路の発達にNB-2が重要な働きをしていることが明らかになった。更に、外側状オリーブ核(LSO)においてもNB-2欠損型マウスの方がVGLUT1陽性のシナプス数が少なかった。このことから、MNTB及びVCNにおいてアポトーシス細胞をCaspase 3による免疫染色を用いてNB-2欠損マウスと野生型マウスで比較したところ、欠損マウスのVCNおよびMNTBでアポトーシス細胞が有意に増加していた。これらのことから、NB-2の欠損によってLSO,MNTBへの神経回路の発達に重大な影響が現れることが明らかになり、LSOへの興奮性入力と抑制性入力のバランスに異常が生じ、周波数依存性にも影響が現れることが考えられた。
大脳皮質アデノシン系による局所睡眠の制御

徐波は睡眠欲求の指標と考えられているが、その発生メカニズムは不明である。本研究では自由行動下のマウスを用いて、覚醒・睡眠時の大脳皮質の細胞外電位の測定を行い、徐波発生時とそれ以外(覚醒)の状態において神経活動が単一細胞レベルおよびネットワークレベルでどのような様態を示すのかを調べた。徐波睡眠では神経細胞は同期したリズミックな活動を示すこと、興奮性細胞ではバースト発火率の増加が見られたが抑制性細胞では変化がなかった。しかし神経ネットワークレベルでは、覚醒時と比べ徐波睡眠ではネットワークが弱くなっており、逆に細胞内カルシウム流入量は大きく、覚醒時とノンレム睡眠時で大脳皮質の活動様態が大きく異なる。本研究はノンレム睡眠時の大脳皮質の神経発火の同期のメカニズムを明らかにするために、細胞外アデノシンの神経細胞への影響を調べることを目的としている。具体的にはマウスにおいて、in vivoでの多点細胞外電位記録・分子遺伝学・行動実験を組み合わせ、(1)局所OFFピリオドの発生における大脳皮質のアデノシン系の役割、また、(2)局所OFFピリオドの発生と大脳皮質アデノシン系に依存的な作業記憶との関係を解析する。平成26年度は自由行動下のマウスにおける多点同時記録を行い、異なる2か所の脳領域から同時にノンレム睡眠時のOFFピリオドの記録を行った。手術時に両半球の一次運動野にそれぞれ3本のテトロード電極を挿入した。また、睡眠判定を行うための表面脳波を記録するために頭蓋骨にネジ電極を取り付けた。筋電図は首の筋肉にワイヤを取り付けて記録した。テトロード電極、表面脳波、筋電のシグナルはオムネティクス社の32チャネルのインターフェースボード、フレキシブルテザーを介してNeuralynx社のDigital Lynx SXのA/Dコンバータへ同時に入力する。ホームケージで比較的自然な状態で覚醒・睡眠できるマウスから記録を行えるようにした。両側の大脳皮質からそれぞれ約10個の単一神経細胞の細胞外電位を同時に記録できることを確認した。ノンレム睡眠時のOFFピリオドのメカニズムは全く分かっておらず、マウスを用いた実験系を確立することで、分子遺伝学的な手法を用いた研究が可能になる。今年度はin vivoでの多点細胞外電位記録を睡眠時のマウスで行う系を確立した。今年度はマウス一次運動野からの両側記録を行い、データの数を増やした。平成26年度の研究目的である、「野生型マウスを用いた断眠、ノンレム睡眠時の局所OFFピリオドの解析」を行った。具体的には、テトロード電極から記録した複数の細胞外電位について、スパイクの相関を計算した。この相関が、覚醒・ノンレム睡眠・レム睡眠の3つのステージにおいて変化するかどうかを検証している。両半球の運動野から記録したデータを用いて、半球間のconnectivityが睡眠ステージによってどのように変化するのかを調べる。同側の運動野と感覚野から記録したデータを用いて、異なる大脳皮質間のconnectivityが睡眠ステージによりどのように変化するのかを調べる。Localfield potentialとsingle unitの相関について、睡眠欲求の増減との関連を調べるために断眠および回復実験を行った。こちらについても解析を行っている最中である。神経活動の解析について、当初予定していた相互相関解析では思ったような結果が得られず、解析方法について検討していた。相関解析が上手く行かない理由としては、event-relatedな細胞外記録ではなく、覚醒・睡眠時の活動を連続的に記録しているために時間あたりのスパイクの数が少ないことが原因と考えられる。Adenosine A1R-floxマウスのgenotypingの方法について、非特異遺伝子が出てしまうため、さらにプロトコルを精査する必要がある。先方とも相談し、PCRの方法やプライマーの設計について検討する必要がある。睡眠・覚醒時の記録実験は長時間にわたるため、記録中にマイクロドライブとテザーが外れてしまったり、記録装置が重くマウスにストレスを与えることがあった。記録がマウスにストレスとならず、かつ実験者が効率的に作業を行えるよう長期的な記録実験に適した実験環境を整える必要があった。1.自由行動下のマウスを用いた多チャンネル電気生理学実験を行い、睡眠/覚醒時の多点同時記録を遂行し、局所OFFピリオドを記録する、について現在得られた研究成果を学術論文に投稿するための準備を行っている。(1)概要:これまで睡眠・覚醒時の自由行動下のマウスの第一次運動野から細胞外記録および細胞外電場を記録してきた。睡眠のステージは、脳波と筋電により判定を行った。本年度はデータの解析を行い国際学術論文に投稿するため原稿の作成を行った。(2)改善点:改善点記録時間は任意のタイミングで最大でも連続一時間のデータ記録をこれまで行っていた。その理由は長時間の記録を行うことで、単一細胞外電位は容易に変化するため、記録したスパイクからクラスターを作成し単一細胞外電位を単離することが困難になるためであった。しかし、睡眠による長期間、少なくとも24時間から48時間の連続した記録実験の必要性が指摘されたために、長時間の記録実験と大容量のデータを解析するための環境を整えた。また、クラスタリングについては、長時間にわたって記録した細胞外電位の同定を行うためのアルゴリズムを開発するために、筑波大学の数理系の研究室と共同研究を行い、現在開発中である。