hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
材料間の界面特性に着目したＲＣ構造物の耐久性と構造性能の統一的評価手法の開発

型枠近傍での再振動締固めによりコールドジョイントの発生を抑制できた.養生の影響では,塩分浸透では再水和によってその影響は小さくなるが,中性化ではその影響が著しかった.また,塩分混入コンクリートを再生骨材としても,置換率30%までは大きな影響は無い.テーマ2:コンクリート中に埋め込んだ鉄筋の引張試験を行い,鉄筋とコンクリートの付着特性を明らかにした.また,ひび割れた試験体に樹脂注入補修を施して再載荷を行い,補修後の付着性状についても併せて明らかにした.テーマ3:高塩分濃度ほど屈曲度が小さく,収斂度が大きくなり,結果として,実効拡散係数が大きく傾向にあった.塩分浸透は移流,拡散,固定・吸着,蒸気拡散等の相互作用であり,それぞれの現象が主として生じる細孔空隙範囲が異なっている可能性が示唆された.鋼材腐食については,各種要因が分極特性に及ぼす影響を検討した結果,塩分濃度が最も影響がある.なお,細骨材にシラスを用いた場合,初期ひび割れが発生しても自己治癒効果によってひび割れが閉塞して鋼材の腐食進行が停止した.テーマ4:けい酸塩系表面含浸材の改質機構には,コンクリート中の水酸化カルシウムと水分が重要な要因であることがわかった.市販の材料を複数用いた実験より,多くの材料で反応型と固化型の両方の効果があり,種類判定試験によって主となる改質機構とその程度を把握することが可能であった.改質後の物質透過性は,改質層と非改質層の積層構造として取り扱うことで評価可能であった.研究計画に示したとおりに概ね進んでいる.少し異なる点は,次の通りである.当初計画ではサブテーマ(4)(各種対策工法)については平成24年度から開始予定であったが,その一部を平成23年度から開始した.サブテーマ(1)については,平成24年度に実施予定であった分割練混ぜおよび最振動締固めの影響を平成23年度から開始したことにより,再生骨材等の影響については平成23年度から開始予定であったが,平成24年度から検討を開始することに変更した.25年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画に示したとおりに概ね予定通りに進んでいる.研究計画通りに概ね進んでいるため,当初計画を着実に実行していく予定である.なお,マクロセル腐食の検討については,平成23年度の結果より,その機構を定量的に理解することは難しい状況にあった。そのため平成24年度は,コンクリート中の鉄筋腐食について,配合や環境条件を実験要因として基礎的な分極特性を計測し,その結果を用いて,再度マクロセル腐食の検討を行うことが必要であると考えられた.さらに,当初計画では盛り込んでいなかった二次製品の塩化物イオン浸透性についても検討していく予定である.25年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画通りに概ね進んでいるため,当初計画を着実に実行していく予定である.なお,サブテーマ5について,研究計画では,実構造物を仮想したケーススタディを予定したが,実際に腐食させたRC試験体の疲労試験を実施し,この挙動をテーマ14でえられた知見に基づき分析することで,材料間の界面特性を考慮したRC構造物の耐久性と構造性能の統一的評価手法の構築を目指す.
日米金融市場の比較

交付申請書においてあげた4つの研究目標について以下の進展があった。(4).それらのデータを公開し、国内の研究者・実務家・政策担当者に資すること。この点についてはデータベースを上記の東京大学経済学部金融教育研究センターにおいて公開しており、さらにアクセスの詳細については日本経済新聞社と交渉を続けている。
長鎖脂肪酸による自然リンパ球３型の活性化を介したアトピー性皮膚炎発症機構の解明

小児のアトピー性皮膚炎(AD)と母乳中の脂肪酸の関係については、以前から報告があるが、「なぜ?」という発症機構に対する明確な説明はなされていない。母乳栄養母子の出生コホート研究(小児アレルギー)において、AD群母乳にのみ自然免疫系Dangerシグナル活性(DAMPs活性)を検出している。質量分析機を用いたnon-targeted metabolomics解析の結果、相関が見られた物質は母乳中の脂肪酸群であり、長鎖飽和脂肪酸群(LCSFA)に、in vitroで強いDAMPs活性を認目ている。マウスAD発症モデルを新たに確立し、自然免疫系に着目をし、特に自然リンパ球に焦点を当てて解析を行う。
インスリンシグナル伝達の分子機構とその病態の解析

インスリンは代謝調節、細胞増殖因子として生体必須ホルモンであり、それは細胞膜に存在するインスリンレセプターと結合することにより作用を発現する。インスリンがレセプターと結合することにより、そのシグナルがどのようにして細胞内に伝達され、最終的なターゲットに到達するか、またその病態によってどのような異常が生じるかを解析することは、医学・生物学上極めて重要な課題である。インスリンレセプターチロシンキナーゼを介するシグナル伝達機構を明らかにすることを目的とする。細胞をインスリン刺激した後、Cell Lysateを抗ホスホチロシンで反応させた沈降物中にPI3-キナーゼ活性が上昇していることが1990年2つの研究室より報告され、PI3-キナーゼがインスリンシグナル伝達のメディエーターの1つになっているのではないかと推測された。我々はインスリンレセプターチロシンキナーゼによりin vitroはおよびin vivoでPI3-キナーゼの85kサブユニットがチロシンリン酸化されることを報告した。そして368,580,607番目のチロシン残基がリン酸化されることを明らかにした。今後この3つのTyrをPheに変えたp85を大量に細胞内で発現させることにより、インスリンシグナル伝達のどこがblockされるかを検討し、PI3-キナーゼの役割を明らかにする。また、インスリンレセプター遺伝子異常が、インスリン非依存性(成人型)糖尿病の遺伝因子の一つとして考えられるとの立場から、この型の糠尿病患者の中にどれほどの頻度でその異常が存在するのかを検索しており、既に4例のアミノ酸置換を発見している。インスリンは代謝調節、細胞増殖因子として生体必須のホルモンであり、それは細胞膜に存在するインスリンレセプタ-と結合することにより作用を発現する。インスリンがレセプタ-と結合することにより、そのシグナルがどのようにして細胞内に伝達され、最終的はタ-ゲットに致達するか、またその病態によってどのような異常が生じるかを解析することは、医学・生物学上極めて重要な課題である。インスリンレセプタ-チロシンキナ-ゼを介するシグナル伝達機構を明らかにすることを目的とする。1)グルコ-スを細胞へ取り込むためにはグルコ-ストランスポ-タ-が必要である。細胞を血清やインスリンなどの細胞増殖因子で処理したり、またras、srcなどによる細胞癌化に伴い、矩時のうちに1型グルコ-ストランスポ-タ-(GLUTI)mRNAが増加する。我々は、細胞増殖因子やras.srcなどによるGLUTI遺伝子の発現調節機構を解明するためNIH3T3細胞を使ったCATassayにより転写開始部位2.7kb上流と第2イントロン中に、2つのエンハンサ-領域を同定した。転写開始部位上流のエンハンサ-は8倍、第2イントロンのエンハンサ-は14倍、転写活性を増大させた(論文リストNo.1)。2)In vitroの糸に於て精製したインスリンレセプタ-が精製したPIー3キナ-ゼの85kサブユニットをチロシンリン酸化することは作年報告したが(論文リストNo.2)In vivoに於てもPIー3キナ-ゼの85kサブユニットが、インスリン刺激によりリン酸化されていること(投稿準備中)、またPIー3キナ-ゼ85kサブユニットのインスリンレセプタ-により、In vitroでリン酸化されるチロシン残基を決定した(投稿準備中)。インスリンがレセプターと結合することにより、そのシグナルがどのようにして細胞内に伝達され、最終的なターゲットに到達するか、またその病態によってどのような異常が生じるかを解析することとは、医学・生物学上極めて重要な課題である。

細胞をインスリン刺激した後、Cell Lysateを抗ホスホチロシンで反応させた沈降物中にPI3-キナーゼ活性が上昇していることが1990年2つの研究室より報告され、PI3-キナーゼがインスリンシグナル伝達のメディエーターの1つになっているのではないかと推測された。我々はインスリンレセプターチロシンキナーゼによりin vitroおよびin vivoでPI13-キナーゼの85kサブユニットがチロシンリン酸化されることを報告した。そして368,580,607番目のチロシン残基がリン酸化されることを明らかにした。今後この3つのTyrをPheに変えたp85を大量に細胞内で発現させることにより、インスリンシグナル伝達のどこがblockされるかを検討し、PI3-キナーゼの役割を明らかにする。また、インスリンレセプター遺伝子異常が、インスリン非依存性(成人型)糖尿病の遺伝因子の一つとして考えられるとの立場から、この型の糖尿病患者の中にどれほどの頻度でその異常が存在するのかを検索しており、既に4例のアミノ酸置換を発見している。
視床下核の神経細胞脱落に起因する運動・認知障害とその代償的回復機構の解明

運動制御における大脳基底核神経回路の間接路の役割を探るために、中継核の一つである視床下核(subthalamic nucleus,STN)に着目した。イムノトキシン細胞標的法を適用できるように、ヒトインターロイキン2受容体αサブユニット(IL-2Rα)タンパクをSTN細胞に発現する遺伝子変異マウス(NPIGマウス)を作製し、導入IL-2Rαを抗原として特異的に認識するanti-Tac-(Fv)PE38抗体(イムノトキシン、IT)をNPIGマウスの片側STNに微量注入したところ、STN細胞の特異的な脱落・破壊が認められた。NPIGマウス片側STNへのIT注入処理後、新奇環境に呈示すると、IT処理を受けた大脳半球の反対方向(破壊反対側方向)への自発的な回転運動が生じた。野生型マウスにIT処理を行っても、回転運動は生起しなかった。同一NPIGマウス群にドーパミン非選択的作動薬であるアポモルフィン(APO,2mg/kg)を皮下投与すると、回転方向が破壊同側方向(ipsiversive)へ逆転した回転運動を示した。片側STNにIT処理を行った同一NPIGマウス群を飼育室・ホームケージ環境で回復させ、IT注入操作の28日後以降に自発的な破壊反対側方向への回転量とAPO誘導性の破壊同側方向への回転量を測定すると、両者は有意に減弱することを認めた。また、自発的な定位運動・APO誘導性の定位運動も減少した。ドーパミンD1もしくはD2受容体の各選択的作動薬の単独投与では、APO投与時に認められた回転方向の逆転現象は認められなかった。STN選択破壊によるSTN機能不全は、ドーパミン刺激による運動亢進作用に対して障害が認められたことから、本研究は運動制御における大脳基底核の間接経路の独自機能の解明について示唆を与えると期待できる。
電子スピン分極プローブによる一重項酸素の蛋白質内挙動の研究

第2年度は、1スピン分極発生機構、2蛋白質構造変化測定法開発を目指したアミノ酸-ラジカル系のスピン分極発生、の2点について研究した。1一重項酸素-ラジカル系でのスピン分極発生効率は、測定感度を決める重要因子である。従って、様々なラジカルと一重項酸素の系でのスピン分極発生効率を、時間分解ESR法で測定した。ラジカルとして、TEMPO、Galvinoxyl、DPPH、Verydazyl、PTIOを用いたところ、TEMPOやPTIOのようなニトロキシドラジカルでは効率が良く、DPPHやVerdazylのような大きなπ電子系を持つラジカルでは効率が悪いことがわかった。スピン分極の理論的考察から、後者のラジカルでは酸素-ラジカル衝突対の電子交換相互作用が小さいために効率が小さくなり、前者では交換相互作用が大きいために発生効率が大きくなることが示唆された。またTEMPOやPTIOの一重項酸素消光速度定数を見積もったところ、その値は一重項酸素寿命に影響を与えない程度に小さかった。これらから、ニトロキシド系ラジカルがモニタ用ラジカルとして優れていることが結論された。2トリプトファンは蛋白質内のアミノ酸残基の中で比較的長い波長のUV光を吸収するため、UVレーザーによる励起が容易である。トリプトファンを励起してニトロキシドにスピン分担を発生させれば、蛋白質折れたたみ構造の変化によってトリプトファンの位畳が蛋白質表面や内部に移る過程をスピン分極強度変化でモニタできる。このような検出法の開発を目指し、水中でのトリプトファン-TEMPO系のスピン分極発生強度や発生時間スケールをFT-ESR法で調べた。スピン分極は十分測定可能な程度発生し、またその信号は数百ナノ秒で発生消失した。従って、この程度の時間分解能で蛋白質折れたたみ構造変化を検出可能であると結論した。初年度は以下の3つの柱で電子スピン分極の研究、ラジカルの選定や試薬合成を行った。1.電子スピン分極発生機構の検討。一重項酸素とラジカルの電子スピン分極発生について理解するため、様々なラジカル三重項分子衝突対(RTP)における四重項と二重項状態の分裂エネルギーJを、ラジカルに発生した電子スピン分極を観測して研究した。モデル系として、ラジカルにGalvinoxyl、三重項にNaphthaleneやChryseneを用いた場合、Jの符号は正となった。これは、CT状態とRTP状態の相互作用によるJ_<CT>の寄与によるものと解釈した。また溶媒の極性を高くした場合、Jの符号は負に転じた。これは、溶媒極性の効果でCT状態エネルギーが変化し、J_<CT>、の寄与が弱まったためと理解した。このように、励起分子-ラジカル衝突錯体内の電子スピンによる磁気モーメントは、錯体内分子間C一状態に依存することを示した。2.一重項酸素モニタ用ラジカルの選定。モニタ用ラジカルを選定するため、一重項酸素と様々なラジカルの相互作用による電子スピン分極の発生効率を測定した。ラジカルとして、TEMPO、GalvinoxylおよびDPPHを用いたところ、TEMPOでの電子スピン分極発生効率が極めて大きいことがわかった。また、TEMPOの電子スピン分極をプローブにした一重項酸素のポリフェノール類による消光速度定数測定を行った。決定した消光速度定数はポリフェノールの酸化琶位に依存し、CT相互作用による消光が重要であることを示した。3.試薬合成。本課題のタンパク質内一重項酸素挙動研究には、一重項酸素発生用にアントラセン酸素架橋試薬が必要である。この試薬合成では、光増感によるアントラセンへの溶存酸素付加反応を利用た。合成した試薬は、光増感剤等との混合物として得られたため、カラムクロマトグラフィーによる分離を検討中である。

スピン分極は十分測定可能な程度発生し、またその信号は数百ナノ秒で発生消失した。従って、この程度の時間分解能で蛋白質折れたたみ構造変化を検出可能であると結論した。
希土類金属錯体の特性を利用した新規有機合成反応の開発

本研究により希土類金属及びその錯体が種々の有機合成反応の新しい触媒や反応剤として特異な反応性を有していることを初めて明らかにすることができ,希土類金属反応剤の開発に成功した.主な成果は次の通りである.1.三塩化ランタノイド(LnCl_3)触媒による新しいFriedel-Crafts反応の開発LnCl_3のうちPmを除く全てのランタノイド(La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu)塩化物は400゚Cで30分間N_2気流中で乾燥して活性化するとベンゼン、フラン等のアルキル及びアシルハロゲン化物によるアルキル化及びアシル化反応のよい触媒となり、しかもこれらの触媒は反応後回収され再使用が可能なことを見い出した。希土類の中でも特にYb、Tm等の重希土が触媒活性が高くAlCl_3/CH_<3_NO3>系の反応性と同定度であり今後の利用がまたれる。2.PhYbI錯体あるいはYb金属によるC-C不飽和結合の還元反応の開発PhYbI/MeOH又はYb/MeOH反応剤により芳香族置換オレフィン,アセチレン等が室温で容易に還元され相当するアルカンを与え,又MeODを用いると重水素化物を選択的に得ることができる.反応操作も簡単でかつ高収率が得られる.3.Yb金属による芳香属ケトンとアセトン等のアルキルケントとのクロスカップリングによる非対称ピナコールの合成反応の開発ベンゾフェノン等の芳香族ケントにYbを反応させD_2Oで処理すると重水素化されたアルコール(Ph_2C-D・9H)が定量的に生成することを明らかにしので次にこの中間体にアセトン等のケトンを反応させた結果,クロスカップリングが起こり非対称ピナコールが高収率で生成することを発見した.本反応はケトンの反応極性を逆転させて求核的に働かせることに成功した最初の例で,ケトンのみならづ,ニトリル, CO_2,エポキシド等の種々の求電子剤と容易にカップリングを起こすことも見い出しているので今後, Yb金属によるこの分野の合成反応の益々の発展が期待される.本研究により希土類金属及びその錯体が種々の有機合成反応の新しい触媒や反応剤として特異な反応性を有していることを初めて明らかにすることができ,希土類金属反応剤の開発に成功した.主な成果は次の通りである.1.三塩化ランタノイド(LnCl_3)触媒による新しいFriedel-Crafts反応の開発LnCl_3のうちPmを除く全てのランタノイド(La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu)塩化物は400゚Cで30分間N_2気流中で乾燥して活性化するとベンゼン、フラン等のアルキル及びアシルハロゲン化物によるアルキル化及びアシル化反応のよい触媒となり、しかもこれらの触媒は反応後回収され再使用が可能なことを見い出した。2.PhYbI錯体あるいはYb金属によるC-C不飽和結合の還元反応の開発PhYbI/MeOH又はYb/MeOH反応剤により芳香族置換オレフィン,アセチレン等が室温で容易に還元され相当するアルカンを与え,又MeODを用いると重水素化物を選択的に得ることができる.反応操作も簡単でかつ高収率が得られる.3.Yb金属による芳香属ケトンとアセトン等のアルキルケントとのクロスカップリングによる非対称ピナコールの合成反応の開発ベンゾフェノン等の芳香族ケントにYbを反応させD_2Oで処理すると重水素化されたアルコール(Ph_2C-D・9H)が定量的に生成することを明らかにしので次にこの中間体にアセトン等のケトンを反応させた結果,クロスカップリングが起こり非対称ピナコールが高収率で生成することを発見した.本反応はケトンの反応極性を逆転させて求核的に働かせることに成功した最初の例で,ケトンのみならづ,ニトリル, CO_2,エポキシド等の種々の求電子剤と容易にカップリングを起こすことも見い出しているので今後, Yb金属によるこの分野の合成反応の益々の発展が期待される.本年度は当初に計画した実施計画のうち、ランタノイド触媒によるFriedel-Crafts型反応の開発を目指して重点的に研究を進め、希土類塩化物(Ln【Cl_3】)がベンゼン等のアルキル化及びアシル化反応に対して高活性を有し、しかも塩化アルミニウム等の従来の触媒と異なり反応後の水処理によって分解しないので回収・再使用が可能という大きな特長を有することが明らかになり、新しい触媒の開発に成功した。本年度に得られた主な成果は次の通りである。2.三塩化ランタノイドの活性を塩化ベンジルのベンゼン及びトルエンに対する競爭反応から得られるkT/kB値から評価し、Ln【Cl_3】を充分乾燥した場合は、kT/kB=5.6となりAl【Cl_3】/【CH_3】【NO_2】系(kT/kB=5.4)と同程度の活性を有することが明らかになった。

また、ランタノイドの中では重希土のLuが最も活性が高くそれより原子番号の小さいGdに向うにつれて徐々に活性が低下する。3.反応の配向性を塩化ベンジルとトルエンの反応を中心に検討し、反応はO,P配向性を示すこと、更に原子番号が下がるにつれてP体が減少しO体が増加することが明らかになった。一方m体は全体を通じて生成割合に変化は認められなかった。また、Al【Cl_3】の場合と異なりm体への異性化は起こらない。4.触媒の回収法の検討の結果、反応後の水層を濃縮する方法の他に、濾過法やデカンテーション法も有効で、特にデカンテーションにより反応後Ln【Cl_3】を分離して再使用する方法がよいことが明らかになった。以上のようにLn【Cl_3】は回収・再使用が可能な新しいタイプのFriedel-Crafts触媒であることが明らかになり更にアシル化を検討中である。
ERから細胞膜へ:膜骨格裏打ちユニット小胞の細胞内トラフィックと疾患

細胞膜構造の機能的構築・形成メカニズムの解明と疾患分子病態解明への応用を目標に、「膜骨格はいかにして作られるのか」を具体的目的に据えた解析を行った。膜タンパク質AE1と先天性溶血性貧血の原因となるその変異体を利用した小胞体ERにおける足場タンパク質アンキリンとの相互作用、ERからの小胞輸送を規定する特定のアミノ酸配列の解明等により、小胞体における膜骨格ユニット形成の可能性を示した。小胞体(ER)における膜骨格基本構造の形成と細胞膜への輸送を、赤芽バンド3(AE1)/グライコフォリンC(GPC)の遺伝子改変マウスの赤芽球前駆細胞、あるいは赤芽球系培養細胞で実証することを目的とした基礎研究を行い以下の結果を得た。A. α-スペクトリン、アンキリン、ならびにGATA-1の各遣伝子プロモーター制御下に、細胞外第4ループにFLAGタグを組み込んだマウスAE1(AE1-L4FLAG)を発現するべクターを作製した。現在、これらの構築遺伝子を用いてAE1トランスジェニックマウスAE1tgの作成が進行中である。一方、GPCノックアウトについては、GPC遺伝子のターゲッティングベクターへの組み込みを終えた段階であり、今後GPC^<-/->マウス、ならびにGPC^<+/->とAE1^<+/->のダブルノックアウト系統の作出を試みる。B.上記組み換え遺伝子を、HEK293、MEL細胞に導入し、その発現レベルや発現部位等の解析を行った。いずれの構築もCMVプロモーターの場合と比べると基本発現レベルは低かった。CMV構築ではAE1-L4FLAGの良好な発現と細胞膜への分布が認められた。したがって、これらの赤芽球系特異的発現構築を用いてAE1tgマウスでのAE1の発現が生じれば、それは生理的な膜骨格形成を反映した動態を示すものと考えられた。C. AE1の分子シャペロンとされるGPAの遺伝子とポリペプチド、ならびに糖鎖付加の解析を行い、当該実験に用いる犬と牛のGPAの分子実態を明らかにした。A.前年度に続き、α-スペクトリンアンキリン、ならびにGATA-1の各遺伝子プロモーター制御下、細胞外第4ループにFLAGタグを組み込んだマウスAE1(AE1-L4FLAG)を発現する構築遺伝子を用いてAE1トランスジェニックマウスAE1tgの作成が進行中である。一方、GPCノックアウトについては、GPC遺伝子のターゲッティングベクターへの組み込みを終えた段階であり、今後GPCチマウス、ならびにGPC^<+/->とAE1^<+/->のダブルノックアウト系統の作出を試みる。B.各種変異AE1のHEK293、MEL細胞等における発現レベルやターンオーバー、発現部位等の解析を行い、1)AE1の膜輸送が、細胞質ドメインのN末端近傍領域の配列に規定されること、2)牛AE1の場合、GPの分子シャペロンとしての必要性が低いこと、3)N-結合型糖鎖をもつヒトAE1に比べ、もたない牛AE1のERADではカルネキシン以外のシャペロンの関与が考えられること、4)AE1のプロテアソーム系ERADは、相互作用する分子によって性状が変わることなどを明らかにした。本研究は体細胞に普遍的な細胞膜骨格の構築と構成タンパク質の膜輪送機構を明らかにし、その異常に基づく疾患の発症機序を理解することを目的とする。今年度は、赤血球の主要膜内在性タンパク質である牛のバンド3、グライコフォリン、ならびにそれらと相互作用する膜骨格タンパク質の小胞体(ER)から細胞膜への小胞輸送やER品質管理の制御メカニズムを検討した。その結果、1)バンド3とアンキリンがER膜上で複合体を形成すること、2)バンド3がERからERGICに移行する際は、そのN末端領域にある疎水性ΦXΦXΦという配列が認識されCOP II小胞によって輸送されること、3)バンド3のER関連分解はユビキチン化、糖鎖認識、細胞質への逆行輸送のいずれも受けない点で従来CFTRについて知られるものとは全く別の仕組みをもつこと、4)牛グライコフォリン分子群はCD58等とともに細胞膜表面で遺伝的多様性をもつ高分子複合体を形成することなどの新しい知見を得た。これらの知見は、従来の知見とあわせ、膜骨格を形成するタンパク質がERで既に相互作用し、ERの品質管理を受けながら小さな骨格ユニットしてGolgiを経て細胞膜に輸送されることを示すものであり、今後、その形態学的な検証、細胞膜におけるユニットから膜骨格への再構成のメカニズム解明という新しい展開を提示するものである。また、本研究により小胞輸送やER関連分解についても新しい機構や未知の分子間相互作用の存在が実証され、これらについての解析を続けているところである。
非結核性抗酸菌の比較ゲノム学的解析とその臨床応用

本研究において,肺Mycobacterium avium症患者由来株であるM. avium TH135株のゲノムの全塩基配列を決定した.さらに,この菌株において新規プラスミド(pMAH135)の存在を明らかにした.pMAH135のサイズは194,711 bpであり,一部病原性や薬剤耐性に関わる遺伝子群がコードされていた.分離株を用いてpMAH135の存在を調べた結果,HIV陽性患者由来株に比べて肺M. avium症患者由来株に多く存在した.しかし,ブタ由来株にはほとんど存在しなかった.以上の結果から,pMAH135は肺M. avium症の発症に加えて,宿主特異性に関与していることが示唆された.わが国を含め、世界的に増加傾向にあるMycobacterium avium complex (MAC)症の感染様式は、経気道感染と経腸感染の大きく2つに分けられる。またMAC症の起因菌の一つであるM. aviumは、ヒトに加えてブタに感染する。このようなMAC症の増加の要因、感染様式の違い、さらに宿主の特異性は何に起因しているか不明である。平成24年度に、国内で分離された肺MAC症患者由来のM. avium TH135株(経気道感染由来)のゲノム解析を行い、全塩基配列の決定を行った。その際、ゲノムDNAとは独立して存在する環状プラスミドの存在が明らかとなった。今回、平成25年度の研究実施計画に基づいて、このプラスミド(pMAH135)の全塩基配列の決定およびその特徴を調べた。pMAH135のサイズは194,711 bpであり、coding sequencesは164、tRNA遺伝子は1、Insertion sequenceは6存在していた。GC%は66.5%であり、ゲノムDNAのGC%(69.3%)に比べて低く、これはpMAH135が進化の過程で外部から取り込まれたことを意味している。さらに、pMAH135はこれまで報告されたM. avium由来のプラスミドとは、その相同性において全く異なる新規のプラスミドであった。pMAH135にコードされている遺伝子の特徴を調べた結果、鉄の取り込みを行うmycobactinの合成に関わる因子、病原因子の分泌に関わるType VII分泌装置、さらに薬剤の排出ポンプをコードしている遺伝子の存在が明らかとなった。前者2つはMAC菌の病原性に関与、そして後者は抗菌薬を含む薬剤の耐性に関与することから、pMAH135の重要性が示唆され、今後、pMAH135の存在意義を調べる予定であるわが国において増加傾向にあるMycobacterium avium complex (MAC)症の感染様式は、経腸感染と経気道感染の大きく2つに分けられる。このような感染様式の違いが何に起因しているか不明である。この問題を解明するために、国内で分離された肺MAC症患者由来のM. avium TH135株(経気道感染由来)の全ゲノム解析を行い、すでに米国でゲノム解読されているHIV陽性患者由来のM. avium 104株(経腸感染由来株)と比較・検討することにより、感染様式の違いに起因している要因の検討を行った。平成24年度の研究実施計画に基づいて、これまで報告がない肺MAC症患者分離株であるM. avium TH135株のゲノム解析を行った結果、全ゲノム配列を決定することができた。ゲノムサイズは4,951,217 bpであり、ゲノム解析株であるM. avium 104株に比べて524,274 bp短かった。GC%は69.32%であり、CDSは4636、tRNA遺伝子は46、rRNA operonは1存在していた。両ゲノムの比較を行った結果、共通遺伝子は3855、TH135株に特異的な遺伝子は888、104株に特異的な遺伝子は1265であった。また、両ゲノムには特異的な領域が多く存在し、それらの領域のGC%は染色体全体のそれに比べて低かった。さらに、これらの領域の両端にはファージ由来のインテグラーゼあるいはトランスポゾン由来のトランスポザーゼなどのリコンビナーゼが存在していた。このような結果から、これらの領域は進化の過程でhorizontal transferによって染色体に組み込まれたと考えられた。以上の結果から、経気道感染と経腸感染を引き起こすM. aviumは遺伝学的に異なっていることが示され、この違いが感染様式に反映されている可能性が強く示唆された。平成24年度は、これまで報告が無かった肺MAC症患者由来株(M. avium TH135株)のゲノム解析を行い、全塩基配列の決定を行った。そして、HIV陽性患者由来のM. avium 104株(経腸感染由来)のゲノムと比較を行った結果、両ゲノムには大きな違いが見られ、それぞれに特異的な領域が存在し、それらの領域には病原性に関与している多くの遺伝子が存在していた。平成25年度は、M. avium TH135株に存在しているプラスミド(pMAH135)の解析を行った。全塩基配列の決定およびその特徴を調べた結果、pMAH135は194,711 bpの巨大プラスミドであり、これまで報告されたM. avium由来のプラスミドとは、その相同性において全くことなる新規のプラスミドであった。さらに、このプラスミド上にコードされている遺伝子の特徴を調べた結果、病原性や薬剤耐性に関与する重要な遺伝子が存在していた。

平成26年度は、M. aviumの分離株を用いて、pMAH135の存在を調べた。その結果、HIV陽性患者由来株に比べて、肺MAC症患者由来株に多く存在した。しかし、ブタ由来株にはほとんど存在しなかった。さらに、M. avium分離株のVNTR(variable number tandem repeats)解析を行った結果、pMAH135を保有している菌株は特定のクラスターを形成した。以上の結果から、pMAH135は肺MAC症の発症、さらに宿主特異性に関与していることが示唆された。さらに、pMAH135を保有する菌株は、特定のVNTR genotypeを示したことは興味深い結果である。本研究において,肺Mycobacterium avium症患者由来株であるM. avium TH135株のゲノムの全塩基配列を決定した.さらに,この菌株において新規プラスミド(pMAH135)の存在を明らかにした.pMAH135のサイズは194,711 bpであり,一部病原性や薬剤耐性に関わる遺伝子群がコードされていた.分離株を用いてpMAH135の存在を調べた結果,HIV陽性患者由来株に比べて肺M. avium症患者由来株に多く存在した.しかし,ブタ由来株にはほとんど存在しなかった.以上の結果から,pMAH135は肺M. avium症の発症に加えて,宿主特異性に関与していることが示唆された.医歯薬学平成25年度の研究目的は、M. aviumの経気道感染と経腸感染の違いに起因する候補遺伝子の検索および同定を行うことであった。平成24年度および25年度の研究実施計画に基づいて行った研究の進捗状況から、下記の理由により、当該年度における達成度については概ね達成できたと考える。1.本年度に行った新規プラスミドの遺伝学的な解析は、平成24年度の研究目的であった。しかし下記に述べるように、本来平成25年度に行う予定であった感染様式の違いに起因する候補遺伝子の検索を平成24年度に行ったため、当初行う予定であった新規プラスミドの遺伝学的な解析は本年度に行うことになった。2.平成24年度に行った肺MAC症患者由来のM. avium TH135株(経気道感染由来)の全ゲノム配列を決定した後、すでに報告されているHIV陽性患者由来のM. avium 104株(経腸感染由来)のゲノムと比較を行った。その結果、両ゲノムには特異的な領域が多く存在し、それらの領域には病原性に関与している多くの遺伝子の存在が見られた。そして、M. avium TH135株のゲノムに特異的な遺伝子の保有状況を臨床分離株を用いて調べた結果、HIV陽性患者由来株に比べて、肺MAC症患者由来株に多く存在していた。一方、M. avium 104株特異的領域に存在している遺伝子の保有状況を調べた結果、HIV陽性患者由来株に多く存在していた。以上の結果から、経気道感染と経腸感染を引き起こす要因となる遺伝子の検索を行うことができた。しかし、このような感染様式に影響を与えている遺伝子の同定については、今後の課題である。平成24年度の研究目的は、肺MAC症患者由来のM. avium TH135株(経気道感染由来)のゲノム解析を行い、すでにゲノム解読されているHIV陽性患者由来のM. avium 104株(経腸感染由来株)と比較・検討することにより、感染様式の違いに起因している要因を明らかにすることであった。
血管緊張亢進の成因と新しい血管拡張薬の開発に関する分子細胞生物学的研究

1.血管緊張亢進の成因に関する研究アンギオテンシンII(AT II)とエンドセリン(ET)は、強力な血管収縮性のペプチドである。本研究では、まず、AT IIやET受容体の発現調節機序について解析を試み、次いでETの血管緊張調節機序の解明に取組んだ。(1)CキナーゼとAキナーゼによる平滑筋AT II受容体mRNAの発現調節。ラット大動脈初代培養平滑筋細胞のAT IItype-1受容体mRNAの発現におよぼすAT IIおよびcAMPの効果をRT-PCR法を用いて検討した。フラ-2顕微鏡側光法を用いて[Ca]iを測定し、生理的反応性の尺度とした。i)AT II、C-キナーゼおよびA-キナーゼはAT II受容体mRNAの発現を調節していること、ii)受容体mRNAの増加は[Ca]iと良く相関するが、受容体mRNAの減少は必ずしも相関しないことが示唆された。(2)cAMPによるET_A受容体の制御。ラット大動脈初代培養平滑筋細胞に、forskolinとIBMXを併用し、cAMPを長時間上昇させるとET_A受容体はup-regulationを受けることが明らかとなった。(3)ET-1とET-3による冠状動脈収縮機序の相違を明らかにした。2.血管拡張薬の開発古典的な血管拡張薬であるパパベリン、現在使用されている血管拡張薬であるニコランジル、開発中の血管拡張薬LP-805について作用機序の解明を試みた。(1)パパベリンやニコランジルは主として[Ca]iを低下させ、収縮蛋白のCa感受性を低下させることによって、弛緩を引き起こすこと、(2)ニコランジルの[Ca]i低下の機序として、ATP感受性Kチャネルの開放も重要であることが明かとなった。(3)合成抗狭心症薬LP-805はATP感受性Kチャネルを開き、[Ca]iを低下させる一方、EDRFを産生する。この詳細な機序を解明した。本研究は、分子・細胞レベルにおいて、血管系の各種細胞情報伝達系と、その相互作用を明かにすること、情報伝達系の病的変化という観点から、血管緊張の病的亢進の機序を解明し、新しい血管拡張薬を開発するための理論的基礎を作ることを目的とした。本年度は、平滑筋細胞に対するCAMPの作用について、次の結果を得た。1.イソプロテレノールで一過性にcAMPを上昇させると、ブタ冠動脈基始部平滑筋は(Ca)iの低下を伴い弛緩した。(Ca)i低下に比べて、張力低下の程度は、K脱分極の際の(Ca)iー張力関係から予測される程度をはるかに越えるものであった。cAMPは、ヒスタミン感受性Ca貯蔵部のCaを減少させ、放出も阻害した。cAMPによる血管平滑筋弛緩の機序として、(Ca)iの低下作用に加えて、収縮蛋白のCa感受性低下も重要であろうと考えられた。2.cAMPによるエンドセリンーA受容体(ETA受容体)制御機序を検討した。ラット大動脈初代培養平滑筋細胞に、フォルスコリンとIBMXを併用し、cAMPを上昇させた。ETA受容体mRNAの増減を、時間経過に従って、RT-PCR法により測定した。フォルスコリン・IBMXの24時間処理群のETA受容体mRNA量は、未処理コントロール群の4.2倍に増え、フラー2で測定した(Ca)i上昇の程度も8.5倍に増加した。

cAMPの長時間作用によって、ラット大動脈初代培養細胞のETA受容体はupレギュレーションを受けることが明かとなった。これら1.2の研究から、cAMPは冠動脈血管平滑筋に短時間作用すると、(Ca)i低下を伴う弛緩の関わること、培養平滑筋細胞に比較的長時間作用すると、mRNAを介して受容体数を制御し、反応性を制御することが明かとなった。本研究は、分子・細胞レベルにおいて、血管系の各種細胞情報伝達系とその相互作用を明かにすること、情報伝達系の病的変化という観点から血管緊張の病的亢進の機序を解明し、新しい血管拡張薬を開発するための理論的基礎を作ることを目的とした。本年度は内皮細胞にエンドセリン(ET)ETA受容体が存在するか、否かについて、薬理学的および分子生物学的方法を用いて検討した。(1)内皮細胞細胞質Ca濃度、(Ca)i、測定実験:ET-1は、等濃度のET-3よりも、明かに大きな一過性の(Ca)i上昇を内皮細胞に引き起こした。ET-3投与に重ねてET-1を投与すると、さらなる(Ca)iの上昇が見られるが、ET-3をET-1に重ねて投与しても、(Ca)iの上昇は見られなかった。また、ET-1によって惹起される(Ca)iの上昇はETA受容体のアンタゴニストであるBQ123により部分的に抑制された。以上の薬理学的実験より、豚大動脈弁上の内皮細胞には機能的にETA受容体の存在することが示された。(2)分子生物学的実験:PCR法を用いて、豚ETA受容体cDNAの塩基配列を決定した。これは牛のETA受容体の塩基配列と92%の相同性を示し、アミノ酸レベルでは97%の相同性を示た。豚大動脈弁上の内皮細胞より得られた全RNAと豚ETA受容体cDNAの塩基配列よりデザインされたプライマーを用いてRT-PCRを行ったところ、特異的バンドが検出された。このPCR産物をゲルより切出し、塩基配列を決定したところ、豚ETA受容体cDNAの塩基配列と全く同一であった。薬理学的および分子生物学的方法の両者によって、豚大動脈弁上の内皮細胞にはETA受容体が存在し、機能していることを証明した。ラット大動脈初代培養平滑筋細胞のAT IItype-1受容体mRNAの発現におよぼすATIIおよびcAMPの効果を、逆転写ポリメラーゼ・チェイン・リアクション(RT-PCR)法を用いて検討した。一方、フラ-2顕微鏡測光法を用いて(Ca)iを測定し、この生理的反応性とATII受容体mANAレベルとの関係を検討した。ATIIの添加によりATII受容体mRNAレベルは時間および用量依存性に減少した。最大効果(対照の50±13%に減少)はATIIの添加後6時間で現れ、24時間後もとのレベルに復した。比較的選択的なC-キナーゼの阻害剤であるH-7(30μM)の添加によって、このATIIにより惹起される6時間後のATII受容体mRNAの減少は阻止された。またC-キナーゼの刺激剤であるphorbol12myristate13-acetate 0.3μMの添加により同様のATII受容体mRNAレベルの減少(対照の35±8%に減少)が見られた。
大強度粒子ビーム高精度可視化装置の開発

本研究の目的は大強度下で粒子軌跡を測定し可視化する検出器システムを開発することにある。このため、(1)0.5mm多芯比例計数チェンバー(MWPC)を製作し、その性能を研究した。(2)MWPCのための32ch前置増幅器システムを設計製作した。(3)0.5ピッチのシリコンストリップ検出器を製作し、どの程度高い放射線環境下でシステムが動作するかを調べた。我々はこれまで2.5mmドリフトチャンバーを大強度のπ中間子やK中間子ビームによる様々な実験に用いてきた。しかしながら、今後さらに大強度の二次ビームが得られるようになるので、そのような条件のもとで動作する高位置分解能を持つ検出器が非常に重要となっている。0.5mmMWPCは2.5mmドリフトチェンバーに比較してワイヤーあたりの計数率が一桁低くなり10倍の強度のビームを扱えるようになる。しかも、位置分解能もさらによくなることが期待される。製作された0.5mmMWPCはAr-イソブタンを主成分とするガスでテストされマジックガスを用いると十分の性能が得られることが明らかとなった。また、これまで用いられてきた前置増幅器に比べ2倍の集積度を持つシステムが4chのアンプーシェーパーディスクリICを用いて開発され今後集積度の高いMWPC読み出し回路として使われることが明らかとされた。さらに、0.5mmピッチのシリコンストリップ検出器が48チャンネルのASIC読み出しシステムと一体化して製作され、電子スペクトロメータ用の高計数率焦点面検出器として利用できるコンパクトな粒子軌道可視化装置の実用化に成功した。本研究の目的はこれまでで最小のワイヤー間隔を持つ多芯型ワイヤー・プロポーショナル・チェンバー・システムを開発し、加速器等における大強度粒子ビームの位置情報を可視化する装置の実用化を図ることにある。大強度粒子ビーム位置検出器の性能としては(1)直径1cmに収束された5x10^8/secのビームを粒子毎に測定できる。(2)上記高計数率下で200μm以下の位置分解能で測定できる。(3)放射線に対して寿命が十分長い。(4)検出器としての物質量が少ない。ことが求められる。大強度ビーム下で長期間安定に動作する検出器としてはガス・カウンターの右にでるものはない。こうした要請に応える位置検出器として本研究では、これまでの当グループが開発した2.5mmドリフトチェンバーの実績に基づき、0.5mm多芯ワイヤー・チェンバー・システムの設計,製作を行った。0.5mmチェンバーの位置分解能は2.5mmドリフトチェンバーがもつ位置分解能を上回る。さらに、一ワイヤ当たりの計数率は1/10となるため一桁高いビーム強度に対しても高精度位置測定が可能となる。シリコンストリップ検出器に比べて物質量が遥かに少なく、上記要求を満たすものである。高い工作精度、高度の組立技術が要求されるが、本研究での設計にもとづき、テスト用チェンバーの製作を行った。特にアノード・カソード間隔を平行に保つための配慮が払われている。本チェンバーの動作特性について試験が進行中である。大強度粒子ビーム位置検出器の性能としては(1)直径1cmに収束された5x108/secのビームを粒子毎に測定できる。ことが求められる。

こうした要請に応える位置検出器として本研究では、これまでの当グループが開発した2.5mmドリフトチェンバーの実績に基づき、0.5mm多芯ワイヤー・チェンバー・システムの設計,製作を行った。0.5mmチェンバーの位置分解能は2.5mmドリフトチェンバーがもつ位置分解能を上回る。さらに、一ワイヤ当たりの計数率は1/10となるため一桁高いビーム強度に対しても高精度位置測定が可能となる。シリコンストリップ検出器に比べて物質量が遥かに少なく、上記要求を満たすものである。製作された0.5mmワイヤチェンバーの性能がAr-Isobutaneをベースとしたガスを用いて行われ、いわゆるMagic gasでは100%の検出効率を得た。十分実用に耐えるチェンバーが完成したことになるがさらに最適な動作条件を求めて、テストが進められている。同時に、0.5mmチャンバーに適合した高集積度前置増幅器の回路設計が進められそのプロトタイプが製作された。本研究の目的はこれまでで最小のワイヤー間隔を持つ多芯型ワイヤー・プロポーショナル・チェンバー・システムを開発し,加速器等における大強度粒子ビームの位置情報を可視化する装置の実用化を図ることにある。こうした要請に応える位置検出器として本研究では,これまでの当グループが開発した2.5mmドリフトチェンバーの実績に基づき,0.5mm多芯ワイヤー・チェンバー・システムの設計,製作を行った。さらに,一ワイヤ当たりの計数率は1/10となるため一桁高いビーム強度に対しても高精度位置測定が可能となる。製作された0.5mmワイヤチェンバーの性能がAr-Isobutaneをベースとしたガスを用いて行われ,いわゆるMagic gasでは100%の検出効率を得た。十分実用に耐えるチェンバーが完成したことになる。また,これまで使用されてきた16ch前置増幅器に対して2倍の集積度をもつ32ch前置増幅器の回路設計開発も同時に進め,その性能を調べ,十分に実用となる高集積度読み出し回路システムを完成した。これらの結果により今後コンパクトなガス検出器システムを構築することが可能となった。さらに,0.5mmシリコンストリップ検出器の開発も行い,物質量を許容できる条件下で使用できるさらにコンパクトな粒子ビーム可視化装置の実用化にも成功した。
シグナルクロストークによる神経系細胞系譜制御のエピジェネティックアプローチ

神経発生過程には細胞内外の種々の因子が関与していることが分かってきている。本研究では、ニューロンおよびアストロサイト分化に深く関わる複数の因子の関わりあい(シグナルクロストーク)の解明に取り組んだ。1)Notch信号伝達系と骨形成因子(bone morphogenetic protein:BMP)信号伝達系のシグナルクロストークNotchおよびBMP2は全く異なるシステムを利用しでいるが、双方とも神経発生に重要な役割を果たしている。申請者らは、マウス未分化神経上皮細胞において、Notch標的遺伝子Hes-5、Hesr-1の転写がBMP2刺激が加わることで、相乗的に活性化されることを見いだした。これら遺伝子はBMP2単独刺激では発現せず、Notch信号伝達系を同時に刺激した際にNotch細胞内ドメインとBMP2の下流で活性化される転写因子Smadが、転写共役因子に介在される複合体を形成することで相乗的に転写活性化されることが分かった。2)核内因子c-ski発現による神経分化制御TGF-β転写活性の抑制因子c-skiは、発生段階の脳内において未分化伸経細胞およびニューロンに強発現している。マウス神経上皮紳胞にc-skiを強制発現すると、アストロサイト分化を抑制する一方でニューロン分化を促進した。c-skiは、サイトカインによる転写因子STAT3とSmad活性化を介したアストロサイト特異的遺伝子の発現を、両転写因子と直接会合することで抑制した。さらにc-skiはニューロン分化抑卸機能を有する抑制性basic helix-loop-helix(bHLH)の発現誘導を抑制し、ニューロン特異的bHLHの蛋白分解を阻害することでニューロン分化を促進した。c-skiは胎生期脳内においてアストロサイト分化を抑制する一方でニューロン分化を促進している可能性が示唆された。中枢神経系の発生過程では胎生中期前後はニューロン分化のみで、終期になりアストロサイト分化がおこる経時的な細胞分化の転換がみられるが、その制御機構は不明である。今回、我々はその制御機構にDNAメチル化が重要な働きをしていることを明らかにした。胎生14.5日(E14.5)マウス神経上皮細胞(E14.5NECs)をサイトカインLIFで刺激すると、アストロサイト特異的蛋白glial fibrillary acidic protein(GFAP)陽性アストロサイトの出現が見られた。一方、E11.5NECs、あるいは分化したニューロンではLIFによりGFAPの発現は誘導されなかったが、LIFの下流の転写因子STAT3は活性化されていた。GFAP遺伝子のプロモーター領域における遺伝子発現誘導に必須なSTAT3結合配列(TTCCGAGAA)中に存在するDNAメチル化の標的配列(CpG)は、GFAPを発現しない細胞ではメチル化の頻度が高く、E14.5NECsおよびアストロサイトでは低く、メチル化の程度とGFAP発現に逆相関を認めた。また、E11.5NECsでは高頻度にメチル化されており、経時的培養でその頻度は低下した。さらに、種々の検討により、GFAP遺伝子プロモーター上のCpGがメチル化されることで、STAT3のプロモーター結合能が抑制され、GFAPの発現抑制が惹起されることを明かにした。また、神経前駆細胞の分化における転写抑制因子c-skiの役割についても検討した。c-skiは未分化神経細胞と分化したニューロンに発現していた。c-skiを強発現すると、その細胞はLIF刺激でもアストロサイトに分化しなかった。この分子機構として、c-skiとSTAT3との複合体形成がSTAT3の転写活性を抑制することが分かった。今後、さらにc-skiに神経分化における役割について検討する予定である。
自然水中の未同定有機ヒ素化合物のスペシエーションとヒ素循環過程における役割

外洋におけるヒ素を含めた微量成分の定量法として、高分解能誘導結合プラズマ質量分析装置(HR-ICP-MS)を用いた手法を確立した。この方法では、妨害元素である海水中の主要塩類を除くために、8-ヒドロキシキノリンを修飾した担体に海水試料を導入して目的元素を捕集濃縮する。溶離液には海水中の主要塩類は含まれないので、HR-ICP-MSを用いて微量成分をより高感度に定量することが可能となった。この方法により、海水中のppqレベルの微量成分を定量できた。前年度に引き続き、琵琶湖、浦ノ内湾において"hiddenarsenicspecies"、3価及び5価の無機ヒ素、メチルヒ素分布の時・空間変動を観測した。本年度は、水域の生物活動が特に活発で生物相が急激に変遷する夏季(68月)に集中観測を実施した。観測では、水圏の生物相を決定する主な環境要因である溶存酸素、硫化水素、栄養塩類濃度温度、塩分環境、動・植物プランクトン群集の連続観測も合わせて行った。浦ノ内湾における観測データを6ボックスモデルを作成して解析した結果、浦ノ内湾において、メチルヒ素は植物プランクトンの異常発生によって短期間(数日)で急激に増加するものではなく、長期間(1-2カ月)にわたる蓄積の結果水層カラム中の濃度が高くなっていくことが分かった。また、メチルヒ素の生成速度に関して地域的・季節的な規則性が観測されたが、クロロフィル量や動・植物プランクトンの生物相との相関を見い出すことができなかった。一方、前年度の成果より、浦ノ内湾においては水温が高くなる夏季に有機物の分解生成物と考えられる"hiddenarsenicspecies"が著しく増加することが分かっている。以上の結果より、水圏におけるメチルヒ素の成因には、バクテリアなどの微生物の影響が深く関与していることが推察された。自然水中における未知なる有機ヒ素フラクション“hidden arsenic species"の存在を明らかにするために、一次生産性の高い琵琶湖、高知県浦ノ内湾におけるヒ素化学種の濃度分布と季節変化を観測した。本研究では、自然水試料にも適用できる全ヒ素測定法としてマイクロウェーブ法を新たに開発し、従来法である紫外線照射法、還元気化原子吸収法と組み合わせて、“hidden arsenic species"の分画法を開発した。同法をフィールド観測に適用したところ、自然水中の有機ヒ素は各種紫外線に対する安定性によって分画できることが分かった。また、試料水中のヒ素を高分解能-高周波アルゴンプラズマ質量分析計(HR-ICP-MS)によって直接定量した値は全ヒ素濃度と一致したことから、液体クロマトグラフィーによって自然水中の有機ヒ素を分離定量する際には検出器としてICP-MSが使用できることが分かった。フィールド観測では、琵琶湖及び浦ノ内湾表層水における全ヒ素濃度は、これまで主溶存種とされてきた無機ヒ素。メチルヒ素濃度の和よりも1.12.5倍大きく、自然水中に“hidden arsenic species"が高い割合で存在していることを見いだした。また、海水、淡水試料ともに“hidden arsenic species"の画分は未ろ過水の方がろ過水よりも大きく、自然水中の有機ヒ素の循環において粒子態-溶存態間の物質移動を特に考慮する必要があることが分かった。ヒ素化学種の季節推移では、“hidden arsenic species"の割合は生物生産が活発になる6月に特に高くなったことから、“hidden arsenic species"は生物中で見いだされている高分子有機ヒ素化合物が自然水中の溶存メチルヒ素に変換される際の中間化合物であると考えられる。