hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミトコンドリア呼吸鎖複合体Iの構造と機能

ウシ心筋ミトコンドリアから精製した複合体Iを、カオトロピック試薬によって処理すると、フラビン蛋白質分画(FP)、および鉄硫黄蛋白質分画(IP)が得られる。これらの分画を構成するサブユニットの機能に関する知見を得るため、まず、各サブユニットをクロマトグラフィ-によって分離し、一次構造解析を行なった。次に、解析結果からの推定にもとづいて、鉄イオウ中心を保持したままでのサブユニットの単離を試みた。FPを還元カルボキシメチル化した後、高濃度の尿素存在下でのゲルろ過によって、51K、24K、9Kの3個のポリペプチドを分離した。このうち、9Kポリペプチドの全アミノ酸配列を、エドマン法などを用いて決定した。総残基数は75個、配列から計算した分子量は8437であった。決定した配列中には、システイン残基はなく、9Kサブユニットは鉄硫黄蛋白質ではないことが明らかとなった。デ-タベ-スでのホモロジ-検索では、類似の構造をもつ蛋白質は見つからなかった。現在のところ、細菌の複合体Iにも、9Kサブユニットに相当するものは見つかっていないことから、このサブユニットは真核生物にだけ存在する成分であると思われた。IPについても、構成サブユニットの分画を行なった。IPを還元カルボキシメチル化、さらにシトラコニル化した後、尿素存在下でゲルろ過を行なった。得られた画分を、さらに各種のクロマトグラフィ-によって細分画し、75K、49K、30K、20K、18K、15K、13KーA、13KーBの8個のポリペプチドを単離した。これらのうち、20Kポリペプチドは、本研究によって初めてサブユニットとして同定された。一次構造解析から、2つの13Kポリペプチドは互いに異なる蛋白質であることが判明した。13KーAポリペプチドは96残基からなり、分子量は10536と計算された。13KーBポリペプチドは114残基からなり、そのアミノ末端はブロックされていた。アシルアミノ酸遊離酵素による分析の結果、アミノ末端残基をアセチルアラニンと同定した。配列から求めた分子量は、アセチル基を含めて13130であった。ミトコンドリア電子伝達系で、アミノ末端がアセチル化されている蛋白質が見つかったのは、これが4例目である。また、13KーAポリペプチドには、鉄硫黄蛋白質に共通して見られるシステイン残基の配置があり、IPに含まれる鉄硫黄中心の1つが、13Kサブユニットに存在する可能性が示唆された。実際に、複合体Iの水溶性分画から、分子量約1万2千の茶色を呈する蛋白質が得られたが、詳しい解析を行なうまでには至らなかった。30Kおよび20Kポリペプチドの部分アミノ酸配列は、葉緑体ゲノムや藍色細菌ゲノムにコ-ドされるORF158とpsbG遺伝子の産物に、それぞれ高い類似性を示した。このことから、ORF158とpsbGは、葉緑体や藍色細菌に存在する複合体I様の酵素複合体の構成成分をコ-ドしていると推定された。一次構造を比較した結果、30Kポリペプチドには、保存されているシステイン残基はなかった。一方、20Kポリペプチドについては、さらに詳細なホモロジ-検索を行ない、細菌のニッケル鉄ヒドロゲナ-ゼの小サブユニットとの間にも有意な類似性を見いだした。比較したすべての配列において、2個のシステイン残基が保存されており、20Kサブユニットが、鉄硫黄クラスタ-の保持に関与している可能性を示唆した。また、49Kサブユニットとニッケル鉄ヒドロゲナ-ゼの大サブユニットの配列間にも、有意な構造類似性を見いだした。実際にIPを界面活性剤によって解体すると、49Kと20Kサブユニットから成る分画が得られた。この分画での鉄硫黄クラスタ-の存在を確かめることはできなかったが、49Kと20Kサブユニットが複合体I内において、1つの構造単位を形成していることは確かと思われた。細菌の酸化還元酵素の中には、ニッケル鉄とヒドロゲナ-ゼの他にも、複合体Iのサブユニットと類似性を示すものが存在する。これらの結果は、複合体Iが他の酸化還元酵素と進化的に関連のあることを示すものであり、複合体Iの構造と機能の関係を調べていく上で、多くの示唆を与えるものと考えられる。

現在のところ、細菌の複合体Iにも、9Kサブユニットに相当するものは見つかっていないことから、このサブユニットは真核生物にだけ存在する成分であると思われた。IPについても、構成サブユニットの分画を行なった。IPを還元カルボキシメチル化、さらにシトラコニル化した後、尿素存在下でゲルろ過を行なった。得られた画分を、さらに各種のクロマトグラフィ-によって細分画し、75K、49K、30K、20K、18K、15K、13KーA、13KーBの8個のポリペプチドを単離した。これらのうち、20Kポリペプチドは、本研究によって初めてサブユニットとして同定された。一次構造解析から、2つの13Kポリペプチドは互いに異なる蛋白質であることが判明した。13KーAポリペプチドは96残基からなり、分子量は10536と計算された。13KーBポリペプチドは114残基からなり、そのアミノ末端はブロックされていた。アシルアミノ酸遊離酵素による分析の結果、アミノ末端残基をアセチルアラニンと同定した。配列から求めた分子量は、アセチル基を含めて13130であった。ミトコンドリア電子伝達系で、アミノ末端がアセチル化されている蛋白質が見つかったのは、これが4例目である。また、13KーAポリペプチドには、鉄硫黄蛋白質に共通して見られるシステイン残基の配置があり、IPに含まれる鉄硫黄中心の1つが、13Kサブユニットに存在する可能性が示唆された。実際に、複合体Iの水溶性分画から、分子量約1万2千の茶色を呈する蛋白質が得られたが、詳しい解析を行なうまでには至らなかった。30Kおよび20Kポリペプチドの部分アミノ酸配列は、葉緑体ゲノムや藍色細菌ゲノムにコ-ドされるORF158とpsbG遺伝子の産物に、それぞれ高い類似性を示した。このことから、ORF158とpsbGは、葉緑体や藍色細菌に存在する複合体I様の酵素複合体の構成成分をコ-ドしていると推定された。一次構造を比較した結果、30Kポリペプチドには、保存されているシステイン残基はなかった。一方、20Kポリペプチドについては、さらに詳細なホモロジ-検索を行ない、細菌のニッケル鉄ヒドロゲナ-ゼの小サブユニットとの間にも有意な類似性を見いだした。比較したすべての配列において、2個のシステイン残基が保存されており、20Kサブユニットが、鉄硫黄クラスタ-の保持に関与している可能性を示唆した。また、49Kサブユニットとニッケル鉄ヒドロゲナ-ゼの大サブユニットの配列間にも、有意な構造類似性を見いだした。実際にIPを界面活性剤によって解体すると、49Kと20Kサブユニットから成る分画が得られた。この分画での鉄硫黄クラスタ-の存在を確かめることはできなかったが、49Kと20Kサブユニットが複合体I内において、1つの構造単位を形成していることは確かと思われた。細菌の酸化還元酵素の中には、ニッケル鉄とヒドロゲナ-ゼの他にも、複合体Iのサブユニットと類似性を示すものが存在する。これらの結果は、複合体Iが他の酸化還元酵素と進化的に関連のあることを示すものであり、複合体Iの構造と機能の関係を調べていく上で、多くの示唆を与えるものと考えられる。昨年度に引き続きカルボキシメチル化及びシトラコニル化した複合体Iの鉄イオウ蛋白質画分から10種のポリペプチドを単離し、それらの構造解析を行った。特に今年度は、そのシステイン含量から鉄イオウ活性中心をキレ-トしている可能性が高いと考えられる分子量30Kと20Kのポリペプチドについて解析を進めた。
楕円曲線暗号と超楕円曲線暗号のベィユデセント攻撃に対する安全性に関する研究

本研究は、公開鍵暗号の中で最も安全とされている楕円と超楕円暗号系の、最近提案されたWeil descent GHS攻撃に対する安全性を解明することが目的である。楕円曲線と超楕円曲線のGHS攻撃に破れる可能性のある曲線をすべて割り出す弱い曲線の分類を行い、Weil descent GHS攻撃に破れる楕円・超楕円曲線の完全分類と曲線の同型類の数を厳密に評価した。特に3次拡大体上の楕円曲線は半数以上が攻撃されることを明らかにした。本研究は、楕円と超楕円暗号系のWeil descentを利用したGHS攻撃に対する安全性を完全に解明することを目的とするものである。具体的には、Weil descent攻撃に弱い楕円曲線と超楕円曲線のすべてのパターンを発見、分類する、そしてこのような曲線の数と形を解明し、その判別法を示す、さらにこれらの曲線の定義方程式を見つけ、攻撃を実装することによって、攻撃されるときの被害度を解明することを目指すものである。20年度は、今まで得られた結果を発展し、定義体が奇標数の有限体の場合について、GHS攻撃の適用条件と攻撃可能な曲線のクラスを完全に分類し、また密度解析を行うことにより、楕円・超楕円暗号の安全性を明らかにした。具体的には、まず以上の楕円曲線或いは超楕円曲線C0の被覆曲線のヤコビ多様体の様態は大変複雑であるが、GHS攻撃にとっては、最も有利な攻撃状況、つまり被覆曲線Cのヤコビ多様体が、C0のWeil restrictionに同種である場合を想定し、解析を行った。さらに、拡大体上に定義されている楕円曲線或いは種数2、3の超楕円曲線C0のGalois閉包を考え、それによって定義される被覆曲線は、射影曲線P^1の(2,2,...,2)被覆となるため、そのような型の被覆の完全分類を行った。そのためには、拡大体上定義される曲線C0の被覆Cの被覆群に対するGalois群の作用に注目し、Galois表現を分類する手法を用いた。具体的には、上記被覆の分岐点のパターンを解析し、リーマン-フルビツ不等式を利用して、上記被覆の存在条件を割り出して、分類した。GHSの攻撃に弱い曲線のクラスの方程式を示し、その同型類の密度を明らかにした。具体的には、Weil descent攻撃に弱い楕円曲線と超楕円曲線のすべてのパターンを発見、分類する。そしてこのような曲線の数と形を解明し、その判別法を示す。さらにこれらの曲線の定義方程式を見つけ、攻撃を実装することによって、攻撃されるときの被害度を解明することを目指すものである。20年度までは、定義体が奇標数の有限体のときの、GHS攻撃可能な曲線について考察してきたが、21年度では、まず、定義体が奇標数の3次拡大体に限定して、Weil descent攻撃に破れる楕円・超楕円曲線の完全分類と曲線の同型類の数を厳密に評価した。具体的に、奇標数の3次拡大体上で定義されているランダムなLegendre標準形で定義される楕円曲線の半分は攻撃されて、例えば、160ビットの鍵長で設計された楕円暗号は、107ビットの鍵長の安全性しか持たないことが分かった。さらに、このような弱い楕円曲線を判定するために、多項式時間のアルゴリズムも示している。次に、今までは同種条件というWeil descent攻撃によっては最も都合の良い条件、具体的には、被覆曲線Cのヤコビ多様体が、COのWeil restrictionに同種である場合を想定し解析を行った。本年度の二番目の課題は、この同種条件が満たさない場合の危険が曲線を分類することであった。さらに、定義体が偶標数の3次拡大体に限定したときの、Weil descent攻撃に弱い楕円曲線の完全分類を行い、その同型類の密度を厳密に評価した。具体的には、Weil descent攻撃に弱い楕円曲線と超楕円曲線のすべてのパターンを発見、分類すること、そしてこのような曲線の数と形を解明し、その判別法を示すこと、さらにこれらの曲線の被覆曲線の定義方程式を見つけ、GHS攻撃を実装することによって、攻撃されるときの被害度を解明することを目指すものである。具体的には、まず同種条件というWeil descent攻撃によっては最も都合の良い条件を想定し解析を行った。楕円曲線と超楕円曲線の定義体が奇標数の有限体のときの、GHS攻撃に破れる可能性のある曲線をすべて割り出す弱い曲線の分類を行った。そして定義体が奇標数の3次拡大体に限定したとき、Weil descent GHS攻撃に破れる楕円・超楕円曲線の完全分類と曲線の同型類の数を厳密に評価した。特に3次拡大体上の楕円曲線のルジャンドル標準形で書かれたものを半数以上が破れることを判明した。

さらに、定義体が偶標数の3次拡大体に限定したときの、Weil descent攻撃に弱い楕円曲線の完全分類を行った。その同型類の密度を厳密に評価した結果、奇標数の場合よりもさらに弱い曲線が数多く存在することが発見した。以上の結果を、同種条件が満たさない場合にも拡張し、Weil descent GHS攻撃に対して危険が曲線の完全分類が得られた。
高血圧症における心房細動の一次予防に関する研究

心エコー検査時洞調律で器質的心疾患を有しない高血圧患者1118例を対象とし、その後の心房細動発症に関与する背景因子ならびに心エコー指標を縦断的に調査した結果、多変量解析で有意な独立規定因子となったのは、年齢、喫煙歴、および慢性腎臓病(CKD)の合併であった。また、各種降圧薬ならびにスタチンが心房細動発症におよぼす影響を検討した結果、種々の交絡因子で調整した場合、レニン・アンジオテンシン系(RAS)阻害薬のみが心房細動の新規発症を有意に抑制していた。すなわち、日本人高血圧患者においてCKDの合併は心房細動発症の強力なリスク因子となり、一方RAS阻害薬は心房細動の新規発症を抑制することが示された。心エコー検査を施行した外来および入院高血圧患者約1500例の既存のデータベースをもとに、本研究のためにデータの見直しおよび再収集を行った。収集した具体的なデータ項目は、1)年齢、性別、身長、体重、2)生活歴、既往歴、合併症、3)生化学、末梢血、内分泌、尿検査結果、4)経胸壁心エコー検査結果、5)投薬内容(観察開始時および終了時)、6)血圧値、脈拍数(観察開始時および終了時)、7)心電図所見、および8)観察期間中のイベント発生(主要アウトカム:心房細動の新規発生、副次的アウトカム:心筋梗塞、脳梗塞、脳出血、急性大動脈解離の発生および死亡)の有無および発生日である。このうち、臨床背景および臨床検査パラメーターと心房細動新規発症の関係についてCox比例ハザード解析を用いて検討した結果、年齢、現在の喫煙および過去の喫煙歴、血液総蛋白、アルブミン、尿酸、ヘモグロビン、クレアチニンクリアランス、推定糸球体濾過率、蛋白尿が心房細動発症に有意に関係し、加齢、喫煙および腎機能に関連する指標が心房細動の新規発症に関わることが明らかとなった。一方、心エコー検査での左室拡張能指標であるE/A(左室流入血流拡張早期波と心房収縮期波の速度比)が高齢者における発作性心房細動の有病を示す指標となるかを別の症例データを用いて調査した。2011年から2012年までの2年間に心エコーを施行した連続1934例のうち、60歳以上でE/A1.2以上の患者(左室収縮能の低下や肺高血圧を認める症例は除く)を対象として検討した結果、種々の除外例を除いた69例中21例(30.4%)に発作性心房細動を認め、心不全を認めない高齢者においてE/Aの測定は発作性心房細動の検出に有用である可能性が示唆された。心エコー検査を施行した外来および入院高血圧患者約1500例の既存のデータベースをもとに、本研究のために対象例を選定した。検査時洞調律であり、かつ発作性心房細動の既往、心不全、心筋梗塞、心筋・心膜疾患、弁膜症、左室壁運動異常ならびに透析合併例を除いた1118例(男性580例、女性535例、平均年齢63±11歳)を対象とし、心房細動新規発症と臨床背景因子ならびに心エコー指標との関連を調べた。Cox比例ハザード解析を用いて検討した結果、背景因子では年齢、喫煙歴、推定糸球体濾過率(eGFR)、蛋白尿、慢性腎臓病(eGFR<60ml/min/1.73m2かつ/または尿蛋白≧1+)の有無が、心エコー指標では、心室中隔壁厚、左室後壁厚、左室重量係数、相対壁肥厚度、左房径、下大静脈径が心房細動発症に有意に関連していた。収縮能、拡張能の各指標は心房細動新規発症と有意な関連性を示さなかった。以上のような心房細動の一次予防に関する研究をすすめる一方、日常診療で非常に重要となる心房細動の二次予防および合併症の予防(心原性脳塞栓の一次予防)に関する調査研究もあわせておこない、ワルファリンや新規抗凝固薬の使用実態や心房細動管理の実情についてさまざまな知見を得た。

Cox比例ハザード解析を用いて検討した結果、背景因子では年齢、喫煙歴、推定糸球体濾過率(eGFR)、蛋白尿、慢性腎臓病(eGFR<60ml/min/1.73m2かつ/または尿蛋白≧1+)の有無が、心エコー指標では、心室中隔壁厚、左室後壁厚、左室重量係数、相対壁肥厚度、左房径、下大静脈径が心房細動発症に有意に関連していた。収縮能、拡張能の各指標は心房細動新規発症と有意な関連性を示さなかった。次に、投薬内容が観察終了時まで確認できた1022例を対象に、レニン・アンジオテンシン(RA)系阻害薬が心房細動新規発症におよぼす影響を検討した。Kaplan-Meier分析による心房細動累積発生率はRA系阻害薬使用群で低下傾向にあったが、有意には達しなかった(P=0.057)。しかしながら、RA系阻害薬の使用にはバイアスがあり、その背景因子を調節するため、propensity score matching法を取り入れ、再度解析を行った。RA系阻害薬の使用に関連する因子を30項目選定し、多重ロジスティック回帰によりpropensity scoreを算出、1:1(各群N=326)で背景を完全にマッチさせた2群で検討したところ、心房細動の発生頻度はRA阻害薬非使用群に比べ使用群で有意に低く、Kaplan-Meier曲線での累積発生率もRA系阻害薬使用群で有意に減少していた(P=0.013)。この結果より、高血圧患者においてRA系阻害薬の使用は心房細動の新規発症を抑制することが明確に示された。心エコー検査時洞調律で器質的心疾患を有しない高血圧患者1118例を対象とし、その後の心房細動発症に関与する背景因子ならびに心エコー指標を縦断的に調査した結果、多変量解析で有意な独立規定因子となったのは、年齢、喫煙歴、および慢性腎臓病(CKD)の合併であった。また、各種降圧薬ならびにスタチンが心房細動発症におよぼす影響を検討した結果、種々の交絡因子で調整した場合、レニン・アンジオテンシン系(RAS)阻害薬のみが心房細動の新規発症を有意に抑制していた。すなわち、日本人高血圧患者においてCKDの合併は心房細動発症の強力なリスク因子となり、一方RAS阻害薬は心房細動の新規発症を抑制することが示された。縦断観察研究の結果、心エコーパラメーターの中で左室肥大、左房拡大が心房細動の新規発症に関連する因子として見出された。また別の症例データを用いた検討にて心エコーパラメーターの中で左室拡張能指標であるE/Aが発作性心房細動の有病を示唆するものとして新たに検出された。すなわち、交付申請書の「研究目的」に記載した平成26年度内の目標、「左房リモデリングに関係する心エコーパラメーターと心房細動発症との関連を検討し、心房細動発症を予知、予測し得る心エコー指標を見出す」に見合った成果が当該年度中に得られたと考える。循環器病学各種降圧薬(Ca拮抗薬、ACE阻害薬、ARB、β遮断薬、利尿薬)やスタチン、抗血小板薬等の使用と心房細動発症との関連を検討し、高血圧患者における心房細動新規発症を抑制する薬剤の同定を行う。本研究は観察研究のため、薬剤の投与には主治医の意向が反映され、それがバイアスになると考えられるため、背景因子に顕著な差異がみられるような薬剤があれば、propensity score matching法を用いた解析を追加する。さらに、平成2526年度内に見出した心房細動予知、予測因子と心房細動の一次予防に寄与しうる薬剤との関係性を明らかにする。縦断観察研究の結果、臨床背景では年齢や喫煙、臨床検査パラメーターでは腎機能に関する種々の因子が心房細動の新規発症に関連する因子として見出され、また別の症例データを用いた検討にて心エコーパラメーターの中で左室拡張能指標であるE/Aが発作性心房細動の有病を示唆するものとして新たに検出された。すなわち、交付申請書の「研究目的」に記載した平成25年度内の目標、「臨床背景や種々の臨床検査パラメーターと心房細動発症の関連を検討し、心房細動発症を予知、予防できる因子を見出す」に見合った成果が当該年度中に得られたと考える。当該年度に行った統計解析は比較的単純な種類のものに留まったため、新たな統計解析ソフトなどを購入する必要がなかった。
発癌物質によるDNA損傷と突然変異誘起の機序

放射線や発癌物質によるDNA損傷の修復と突然変異の誘起に関与する遺伝子umuD、CおよびruvA、Bの機能を研究して、以下の成果を得た。1.ruvBはDNAの組換え修復に関与していることがしられていたが、それとオペロンを形成しているruvAもDNA修復に関与していることを証明した。3.大腸菌でRuvBタンパクの多量生産株を作成し、精製した。RuvBはATPとADPに結合する性質をもち、弱いATP分解活性をしめした。同様にRuvAタンパクも精製し、RuvAは単鎖および二重鎖DNAと結合する性質があることを明らかにした。DNAと結合したRuvAはRuvBのもつATPase活性を促進することを証明した。4.細胞がDNAに損傷を受けると、RecAタンパクが活性化されて、UmuDおよびMucAタンパクのproteolytic processingを促進して、突然変異誘起の反応に関与する活性型に変えることを証明した。5.T7ファージの系を利用して、UmuDとUmuCタンパクおよびこれらのアナログであるMucAとMucBタンパクを大腸菌で多量生産することに成功した。UmuDおよびMucAタンパクを精製することができた。現在UmuCとMucBタンパクの精製を試みている。
ES細胞由来ミエロイド細胞 (ES-ML)を用いた神経自己免疫疾患の細胞治療

マウス及びヒトのES, iPS細胞由来のミエロイド細胞(ES, iPS-ML)を利用して、自己免疫疾患モデルマウスの細胞治療について主に検討を行った。免疫抑制性分子TRAILを遺伝子導入したES-MLで自己免疫疾患モデルマウスの臨床症状の改善が見られたが、多くの投与細胞数が必要であった。一方、ES, iPS-MLはマクロファージに類似した細胞で、免疫抑制性マクロファージに属する細胞表面分子(CD206, CD163)を発現していた。ML細胞のヒトへの臨床応用として、自己免疫疾患よりは、マクロファージ機能が利用可能な疾患の方が適している可能性がある。我々は全身的な免疫抑制状態に陥らせることなく、免疫抑制を誘導する手法の開発に取り組んでおり、その手法としてES, iPS細胞から樹状細胞(ES-, iPS-DC)を分化誘導し利用する方法を開発している。ES-DCを複数の自己免疫疾患マウスモデルに投与したところ、発症抑制や治療効果、ES-DCのTh1細胞に対する抑制効果を確認した。その一方、一度の分化誘導で得られる細胞数には限界があることや、Th1細胞以外の細胞に与える影響も少なかった。そのため今回、大量培養可能なES細胞由来ミエロイド細胞(ES-ML)を利用した自己免疫疾患モデルの治療について検討を行った。ES-MLの自己免疫疾患モデルマウスに対する治療効果の確認として、臨床症状を発症した実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)に対して、ES-MLの投与を行った。具体的には、Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG)とComplete Freund's adjuvant (CFA)によりC57BL/6マウスにEAEを誘導後、尾部の麻痺が認められた誘導10日後から3.0×106/匹のES-MLを5日間連続で腹腔投与し、その後の臨床症状の確認を行った。その結果、ES-ML投与群はコントロールとしてPBSを投与したES-ML非投与群と比較し、臨床症状の改善が認められなかった。そのため、ES-MLの連続投与日数を7日、10日間連続に変更し臨床症状の改善の有無を確認したものの、これらの群でも治療効果を確認できなかった。さらにES-ML投与群と非投与群の脊髄浸潤細胞を確認したところ、両者に有意な差を認めなかった。以上のことから、通常のES-MLの場合、ES-DCとは異なり、ES-ML自体に免疫抑制効果は認められない可能性が高いことが判明した。当初、通常のES細胞由来ミエロイド細胞(ES-ML)でもES-DCと同様に、細胞自体に免疫抑制作用を有すると考えていたが、実験結果からはそのような可能性が否定された。この結果は予想外であったものの、ES-ML細胞自身が免疫抑制、あるいは制御効果を有さないことを確証するための検討については、実験計画書の予定通りに行い検証を行うことができた。我々は、マウス及びヒトのES, iPS細胞から大量のミエロイド系免疫細胞を作製する方法を開発し、これをES, iPS-MLと命名している。ES, iPS-MLは単純な浮遊培養系で長期間にわたり増殖する細胞であり、自動培養装置を用いることで大量生産培養が可能である。本研究はこの大量培養が可能なES-MLを利用して、自己免疫疾患モデルマウスの細胞治療について検討を行った。実験的自己免責性脳脊髄炎(EAE)マウスに対して、臨床症状の発症後(尾部の麻痺)にES-MLを投与し、臨床症状改善効果について確認したところ、通常のES-MLでは、コントロール群(無治療群)と比較して臨床症状の改善が殆ど認められず、免疫抑制効果は認められない可能性が示唆された。そこで、強力な免疫抑制作用を有する免疫抑制分子TRAILを遺伝子導入した遺伝子改変ES-ML-TRAILの投与を前述と同様の条件で行った。その結果、ES-ML-TRAIL群投与群では投与回数依存性に、臨床症状の改善効果が確認された。さらにES-ML-TRAIL群では、コントロール群及びES-ML群と比較し、CD11b陽性ミエロイド細胞の割合上昇、CD4陽性T細胞の割合低下が確認され、脊髄浸潤Th1細胞数の減少が認められた。以上の結果から、ES-MLそのものを自己免疫疾患に応用することは困難であることが予想されたものの、遺伝子導入を行うことで対応可能である可能性が示唆された。一方で、ES-, iPS-ML細胞はCD206の発現を有し、免疫抑制性マクロファージとして貪食細胞としての役割を有したことから、アルツハイマー病を代表とするような異常なタンパクが沈着するような疾患に対して有効である可能性が示唆された。ES-MLの免疫抑制あるいは免疫制御機能を高めるため、免疫抑制分子の遺伝子導入を行った遺伝子改変ES-MLでの、EAEの臨床症状の改善効果について検証を行う。また、遺伝子改変ES-

MLを用いて、遺伝子改変ES-MLを投与したEAEマウスに対して、Th1, Th17, Treg細胞を中心としたT細胞分画の解析、生体内での挙動の確認等を行っていく。ES-MLそのものに、免疫抑制・制御効果がないという知見が得られたため、in vitroでの実験をわずかではあるが行う必要性がなくなったため、次年度使用額が生じた。ES-MLそのものに免疫抑制・制御効果がないという知見が得られたため、今後は免疫抑制効果、あるいは制御効果を有する遺伝子改変ES-MLを使用した実験が主体となる。この抑制機構の解明に使用する。
神経幹細胞移植によるヒルシュスプルング病に対する機能再生医療の開発

Hirschsprung病(H病)は現状では有効な治療法のない原因不明の難病であるが、本研究は腸管神経堤幹細胞の移植による神経再生の誘導を実現させ、これによってH病の新たな治療法の確立を目指す。以前よりわれわれはマウスを使った腸管神経系の研究を細胞レベルで行ってきた。特にこれまで未踏であるマウスおよびヒト神経堤幹細胞の生体マウスへの細胞移植技術を確立し、かつ本技術の機能再生を評価するところまでを研究の射程にいれる。これによって神経堤幹細胞を用いた細胞移植治療による臨床研究への鏑矢となる基礎研究とする。
腫瘍特異的遺伝子の解析によるヒト腎芽腫およびヒト肝芽腫の新規腫瘍関連遺伝子の探索

腎芽腫及び肝芽腫における新規腫瘍関連遺伝子の同定と、治療標的としての可能性の検討を目的とした。マウス皮膚がん組織においてゲノムメチル化状態および発現レベルが変異している遺伝子を網羅的に解析し、得られた候補のうち、ZAR-1が肝芽腫・腎芽腫両細胞株で、正常組織と比べ有意に低発現であることを確認した。しかしZAR-1の発現抑制では明確な形質の変化は見られなかった。次に、別の候補遺伝子NRP1について、肝芽腫における機能解析を行い、NRP1の発現抑制により肝芽腫細胞のコロニーが縮小し増殖率も低下することを確認した。この結果はNRP1が癌遺伝子として機能している可能性を示唆する。本年度は、ヒト小児肝腫瘍および腎腫瘍の新規腫瘍関連遺伝子の絞込みを行った。2段階発癌プロトコールによって作製したマウス皮膚腫瘍モデルの皮膚腫瘍組織および正常皮膚組織より抽出したgenomic DNAおよびRNAを用いた網羅的解析によってDNAメチル化および発現に変化を認めた新規腫瘍関連遺伝子55領域について、UCSC genome browserを用いてヒト相同領域を確認した。これらの候補遺伝子のうち、ヒト相同領域を認めるものについて、ヒト小児肝腫瘍につては正常ヒト小児肝組織3検体とヒト肝芽腫細胞株2株(HepG2、Huh6 clone5)を、ヒト小児腎腫瘍については正常ヒト小児腎組織3検体とヒト腎芽腫細胞株2株(G401、SK-NEP-1)を対象として、それぞれRNAを抽出した。Real-time PCRを行い、mRNAレベルでの定量的遺伝子発現解析を行った。その結果、ヒト小児肝腫瘍では4遺伝子(A、B、C、D)、ヒト小児腎腫瘍では2遺伝子(E、F)で発現に有意差を認めた。現在、この6遺伝子についてMassARRAY epityper法による定量的DNAメチル化解析を行っている。DNAメチル化状態に差を認めた遺伝子につき、随時siRNAによるknock downおよびfull length cDNAを用いたプラスミドベクター導入による強制発現株を作製し、機能解析を行っていく予定である。前年度までに、細胞および組織における発現レベルの解析から新規ヒト小児肝芽腫・腎芽腫関連遺伝子の候補を6遺伝子に絞り込んだが、本年度はゲノムメチル化レベルの変化を調べることにより、この6遺伝子から更に絞り込みを行った。肝芽腫候補遺伝子4つと(A,B,C,D)、腎芽腫関連候補遺伝子2つ(E,F)のゲノムメチル化レベルをMassArray epityper法による定量的DNAメチル化解析をしたところ、AおよびEが、それぞれ肝芽腫、腎芽腫の腫瘍細胞または組織において正常部と比べて異なったメチル化状態を示した。この結果より、我々は遺伝子A、Eをそれぞれ新規肝芽腫関連遺伝子、新規腎芽腫関連候補遺伝子とし、次の機能解析に進んだ。遺伝子Aの機能解析はヒト肝芽腫細胞株HepG2、Huh6を用いて、遺伝子Eの機能解析は腎芽腫細胞株G401、SK-NEP-1を用いて解析することとした。それぞれ遺伝子AおよびEに対するsiRNAを用意し、knock down効率をこれらの細胞株を用いて調べた。また、各細胞株にプラスミドベクターを導入し、遺伝子A、Eの安定発現株の作製を試みている。いずれも、プラスミドをLipofection法で導入後、抗生剤存在下で培養し、それぞれの遺伝子を導入した細胞株のシングルクローンを1530株ほど得た。その後、real-time PCRおよびウエスタンブロッティングにより導入遺伝子の発現量の定量を行っているが、作成現時点では、まだ安定発現株は樹立できていない。次年度は引き続き安定発現樹立を試み、それぞれの遺伝子高発現での腫瘍細胞の形態変化、機能の変化を解析する。MassArray epityper法を用いた定量的DNAメチル化解析により新規肝芽腫・腎芽腫関連遺伝子の絞り込みが完了し、肝芽腫、腎芽腫におけるそれぞれの遺伝子の機能解析を行う準備に入ることができた。次年度は2個の遺伝子について、それぞれ肝芽腫、腎芽腫細胞株を用いて、平行して機能解析を行うが、解析を行う上でのノウハウやツールはすでに研究室内に整備されているため、問題なく研究が進行できると考える。前年度までに、新規ヒト肝芽腫候補遺伝子の探索を目的として、各細胞における候補遺伝子のゲノムメチル化レベルを定量的に解析した。その結果、腫瘍細胞と正常細胞で異なったメチル化状態を示した遺伝子として、肝芽腫候補遺伝子(A)を絞り込んだ。今年度は、臨床検体における遺伝子Aの発現状態の検討を行った。当科に保存している肝芽腫臨床検体7症例を正常肝組織と腫瘍組織に分け、それぞれReal-time-PCRで遺伝子発現を解析した所、正常肝と比較し腫瘍組織で有意に遺伝子Aが低発現であった。以上の結果は、遺伝子Aががん抑制遺伝子として機能している可能性を示唆した。そこで、肝芽腫における遺伝子Aの役割を解明するために、肝芽腫細胞株HepG2、Huh6に対して、遺伝子AのsiRNAを導入し発現抑制を行い、その機能解析を行った。Real-time- PCRおよびWestern blottingにより遺伝子Aのknock downを確認し、顕微鏡下の観察を行ったが、siRNA導入における形態変化は認めなかった。一方、遺伝子A発現抑制状態における細胞増殖能をWST-8 assayで測定した所、有意な細胞増殖能の増加を認めた。Wound healing assayによる細胞遊走能の解析では、有意な遊走能の変化は認めなかった。さらに、細胞株にHepG2、Huh6に遺伝子Aのプラスミドベクターを導入し、一過性過剰発現状態での機能解析も同様に行った。

一過性過剰発現での形態変化は認めず、細胞増殖能は有意な低下を認め、細胞遊走能は有意差を認めなかった。以上の研究結果より、遺伝子Aが肝芽腫において細胞の増殖能を抑制し、がん抑制遺伝子として機能している可能性が示唆された。今後は、遺伝子Aが細胞増殖能を抑制する機序を検討するとともに、遺伝子Aの定常発現株の樹立、in vivoにおける検討などの追加実験を行う予定である。腎芽腫及び肝芽腫における新規腫瘍関連遺伝子の同定と、治療標的としての可能性の検討を目的とした。マウス皮膚がん組織においてゲノムメチル化状態および発現レベルが変異している遺伝子を網羅的に解析し、得られた候補のうち、ZAR-1が肝芽腫・腎芽腫両細胞株で、正常組織と比べ有意に低発現であることを確認した。しかしZAR-1の発現抑制では明確な形質の変化は見られなかった。次に、別の候補遺伝子NRP1について、肝芽腫における機能解析を行い、NRP1の発現抑制により肝芽腫細胞のコロニーが縮小し増殖率も低下することを確認した。この結果はNRP1が癌遺伝子として機能している可能性を示唆する。候補遺伝子に対するReal-time PCRによるmRNAレベルでの定量的発現解析により、候補遺伝子は6遺伝子に絞り込めている。定量的DNAメチル化解析が不十分ではあるが、現在解析を行っており、候補遺伝子の絞込みは比較的早期に可能であるため、今後の機能解析を進めるにあたり大きな支障はないと考えられる。肝芽腫細胞株においては遺伝子A、腎芽腫細胞株においては遺伝子Eの発現をsiRNAでknock downもしくは、ベクター導入により安定発現させ、細胞の増殖能や遊走・浸潤能などの変化を検討する。前年度までに安定強制発現株の樹立が出来ていないことから、本年度も引き続き、安定発現クローンのスクリーニングを行い、それでも樹立ができない場合は、ベクターの種類を変えるなどの検討を行う。次年度の半ば頃までに安定発現株が樹立できなかった場合は、一過性の発現による機能解析を行う。培養系において有意な機能変化が観察でき、さらに、その遺伝子の安定発現株も樹立できた場合は、その細胞株を免疫不全マウス皮下に注入し、in vivoにおける増殖能、転移能について検討する。小児外科DNAメチル化解析により有意差を認めた遺伝子につき、随時肝芽腫または腎芽腫細胞株を用いて機能解析を行う。候補遺伝子に対してsiRNAによるKnock downやfull length cDNAを導入したプラスミドベクターを用いた強制発現細胞を扱う実験系は当施設内で確立されており、候補遺伝子を選定次第解析可能である。
骨量維持を目的とした適正リン摂取量の解明-「多面的評価」をもとに-

日本人若年成人女性を対象とした観察疫学研究により,血清繊維芽細胞成長因子23 (FGF-23)濃度と,3日間の秤量目安量記録法による食事記録より算出した習慣的なリン摂取量,および24時間尿中リン排泄量とが有意な正の関係にあることを見出した。血清FGF-23濃度はリン摂取量およびリン吸収量の指標となる可能性が示唆された。本研究の目的は、骨量維持を目的とした適正なリン摂取量を、体内でのリンの動態に影響を及ぼすカルシウムとビタミンDの栄養状態を踏まえて多面的に解明することである。そこで、平成23年度中に日本人若年成人女性(大学1年生)約200名を対象に観察疫学調査を行い、(1)3日間の秤量記録法を用いた食事記録、(2)早朝空腹時採血による血清無機リン、カルシウム、副甲状腺ホルモン、活性型ビタミンD濃度、(3)24時間蓄尿による14時間尿中無機リン、カルシウム排泄量、(4)二重X線吸収法による全身骨密度、(5)身長、体重および体脂肪率、(6)自記式のアンケート調査票による初経年齢および運動習慣のデータを得た。(1)の食事記録は、対象者に事前に秤量記録法の訓練を行い、また、記録の回収時に管理栄養士による確認面接を行った。(2)は対象者に前日10時以降水以外の飲食を禁止させ、空腹の状態で採血を行った。採血後は血清を遠心分離にて回収し、検査会社((株)SRL、東京)に測定を依頼した。(3)は対象者に尿採取用の紙コップと回収用のボトルを配布し、24時間中に排泄された尿をすべて回収してもらった。回収した尿はよく混和し、一部を採取して検査会社((株)SRL、東京)に測定を依頼した。(4)は骨密度測定装置(Prodigy、(株)GEヘルスケアジャパン、東京)を用い、専門技師に測定を依頼した。(5)の身長は靴を脱いだ状態で0.1cm単位で測定した。体重および体脂肪率は8電極式多周波インピーダンス法による測定装置(InBody720、(株)バイオスペース、東京)を用いて測定した。(6)では、初経年齢より初経からの年齢を算出した。また、中学生時、高校生時また現在の運動習慣として授業を除いた週当たりの日数とその内容について記述してもらった。平成23年度に日本人若年成人女性(大学1年生)を対象に行った観察疫学調査を実施した。平成24年度は得られた血清から血清繊維芽細胞成長因子23(Fibroblast growth factor 23;FGRF-23)の測定、および3日間の秤量記録法を用いた食事記録の解析を行った。得られた全データを用いて解析し、以下の結果を得た。健康な若年成人女性(194名、19.5±0.3歳)を対象とし、身体測定、早朝空腹時採血、24時間蓄尿、DEXA法による骨密度測定、また秤量目安量記録法による3日間の食事調査を行った。血清FGF-23、無機リン(iP)、総カルシウム(Ca)、副甲状腺ホルモン(whole-PTH)、活性型ビタミンD (1,25(OH)2D)濃度、また、24時間尿中無機リン(iP)、総カルシウム(Ca)排泄量を測定した。食事調査より、エネルギーおよびリン、カルシウムを含む栄養素摂取量を算出した。その結果、対象者の身長は158.1±5.2 cm、体重は53.9±8.1 kg、血清FGF-23は30.6±11.6 pg/mL、血清iPは3.8±0.4 mg/dL、24時間尿中iP排泄量は648±149 mg、全身骨密度は1.138±0.074 g/cm2、リン摂取量は762±212 mg/日(512±106 mg/1000 kcal/日)であった。血清FGF-23と有意な正の相関のあった因子は、身長、体重、血清iP、血清Ca、24時間尿中iPおよびCa排泄量、全身骨密度、1000 kcalあたりのリンおよびカルシウム摂取量であった。血清FGF-23と有意な負の相関にあった因子は、血清1,25(OH)2Dであった。日本人若年成人女性において、血清FGF-23はリンの栄養状態を示す因子として有用である可能性が示唆された。研究実施計画通り、日本人若年成人女性約200名を対象とした観察疫学調査の実施ができたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、得られた食事記録の解析を行い、習慣的なエネルギーおよびリン、カルシウム、ビタミンDを含めた栄養素摂取量を算出する。また、血清中の繊維芽細胞成長因子FGF-23濃度の測定を行う。これらデータと平成23年度に得られたデータを用いて、(1)習慣的なリン摂取量と血清FGF-23濃度の関係の検討および(2)リン摂取量およびFGF-23濃度と全身骨密度との関係の検討を行う。

このとき、カルシウム、ビタミンDの摂取量および栄養状態がどのようにこれらの関係に影響するかについても併せて検討する。24年度が最終年度であるため、記入しない。
新しい位置検出型中性子計数管の作製とそれを用いた原子炉動特性解析等への応用

〔目的〕原子炉や臨界装置の測定孔等の狭い空間への挿入および水中,地中への挿入が可能な細くて長い冷置検出型中性子計数管を作製し,それを用いた原子炉動性解析等への応用を試みる。〔原理〕従来の電荷分割方式位置検出型計数管においては,計数管の両端に前置増幅器が存在するために,上記のような狭い空間に計数管を挿入して位置の信号を得ることは不可能である。そこで抵抗陽極線の一端を耐高電圧コンデンサーで交流的に接地し,他端から位置の情報を含むパルス信号を得る。また,二重円筒の内側の円筒陰極から全電荷量の信号を得る。二つの信号から正しい位置情報が得られる。そして計数管の一端にのみ二つの前置増幅器を設置できるので狭い空間に容易に挿入できる。〔結果〕上記の原理に基づく計数管を作製し,コンデンサーの容量と位置の直線性および位置分解能との関係を実験的および理論的に検討した。容量は1000pF以上あれば良好な直線性を与え,相対位置分解能は0.24%と良好であった。位置分解能の位置依存性が若干見られた。上記の原理に基づく^3He+CF_4計数ガスを使った位置検出型中性子計数管を作製した。長さ1.3m,外側円筒25mm,内側円筒23mmで,コンデンサ容量2200pFである。γ線バッグラウンドとの分離は十分で,位置の分解能は7mm,位置の非直線性は0.5%であった。京都大学原子炉実験所臨界実験装置の測定孔に上記の位置検出型中性子計数管を挿入して,中性子束分布を測定した。金線の放射化法は数時間を必要とするのに対して,本方法は45分の測定時間でよい。測定結果は金線の放射代法と一致したが,本方法では計数管の中を通じての中性子のストリーミングの影響が若干あった。逆にストリーミングの測定そのものを効果的に行うことができることが分った。1.平成元年度の研究目的(1)原子炉や未臨界実験装置内の狭い空間への挿入および水中への挿入が可能な位置検出型中性子計数管を作製する。(2)(1)で作製した計数管を用い、未臨界実験装置等において熱中性子束密度をリアルタイムで測定する方法を開発する。2.研密目的に対応した成果(1)抵抗陽極線の一端を、耐高電圧コンデンサ-で交流的に接地し、且つ陰極を2重にすることによって計数管の一端にのみ2個の前置増幅器をつける方法を開発した。この方法に基づいて前記1の(1)の目的に沿った直径2.5cm、有効長さ120cmの^3He位置検出型中性子計数管を作製することができた。位置分解能は5mm、位置の直線性からのずれは全有効長さにわたって0.2%以下であった。(2)計数管からの信号を、1の(2)の目的に沿って処理する信号処理装置を開発した。これらの装置を用いて、1m×1m×1mの黒鉛プロックの中央に^<241>Am(1Ci)-Be線源を置いた体系の種々の位置に(1)で作製した計数管を挿入し熱中性子束密度の空間分布を測定した。動的測定に関しては線源が1cm/sec程度の速さで動くのに対応して測定可能であった。(3)(1)の方法と異なる方法で位置信号を得ることが可能であることを見出した。

3.今後の研究(1)京都大学原子炉実験所未臨界実験装置で計数管の有効性を調べるための実験を続ける。(2)強い中性子密度の測定のための核分裂型位置検出器を開発する。4.備品の使用状況2の(1)、2の(3)の研究において購入備品は極めて有効に使用された。1.平成2年度の研究目的(1),原子炉や未臨界実験装置内の狭い空間への挿入および水中への挿入が可能な位置検出型^3He中性子計数管を作製する。(2),(1)と同様な仕様を持つ位置検出型核分裂中性子計数管を作製する。(3),(1),(2)で作製した計数管を用い,未臨界実験装置等において熱中性子束密度分布をリアルタイムで測定する方法を開発する。2.研究目的に対応した成果(1),外径25mm,長さ120cmの(1)の計数管において,種々の強度を持つ中性子束密度分布の測定が可能なように^3Heの含有率が0.3%,1%,10%の3種類の計数管を作製した。(2),位置検出型核分裂計数管の作製においては当初は酸化ウランと導電性炭素塗料を混合し,陰極表面に塗布していたが,この方法では薄くて均一な厚さのものが得られなかった。そこでウランの電着法を行った。この方法では0.11μmの厚さにおいて希望する厚さのウラン被膜を均一な厚さで電着できることが分った。外径25mm,長さ200cmの計数管を作製したが,核分裂パルス波高はα線との分離もよく,十分に使用に耐えることを確認した。(3).(1)の計数管を用いて,京都大学原史炉実験所臨界実験装置で中性子束密度分布の測定をした。炉心の近くの分布測定では^3He含有率0.3%のものがよく,減速材周辺のストリ-ミング等の測定には1%,10%等含有率の高いのが使用に適することが分った。3,今後の研究2.の(2),の計数管を用いて極めて強い中性子束密度分布の測定を行う。4.予算の使用状況設備備品はない。計数管の作製に極めて有効に使用できた。1.平成3年度の研究目的(1)位置検出型^3He中性子計数管をロングカウンタ-内に挿入し、中性子の線量当量率の測定と中性子のエネルギ-分布の測定の可能性を検討する。(2)位置検出型中性子計数管を臨界実験装置の測定孔に挿入し、中性子分布をリアルタイムで測定する。またカドミウム比の室内分布測定への適用を試みる。2.研究目的に対応した成果(1)直径1.25cm、長さ70cmの^3He位置検出型中性子計数管( ^3He0.7気圧)を中央に挿入したロングカウンタ-に^<252>Cfからの核分裂中性子を入射させて中性子のエネルギ-分布の測定を試みた。この測定とは別に、モンテカルロ計算によって単色中性子に対する位置応答関数を求めた。種々の単色エネルギ-の中性子に対する応答関数によるアンフォ-ルディングによって^<252>Cfからの中性子のエネルギ-分布の概略を求めることが可能であることが分った。したがってまた線量当量率の測定の可能性も十分にある。(2)臨界実験装置における中性子束分布測定では、^3He位置検出器による結果は金線の放射化による結果と比較して計数管中のストリ-ミングの影響が若干見られた。カドミウム比の測定には至らなかった。3.今後の研究2の(1)および(2)の研究を今後一層進めねばならない。また2の(2)の計数管を用いて環境中性子束分布の測定を行うことは魅力のある研究である。予算は有効に使用できた。
ツリガネムシの協調動作制御による生物融合型MEMSデバイスの開発

生体の運動器官(バイオアクチュエータ)は,駆動回路を内蔵したアクチュエータであり, MEMSシステム全体の小型化に有効である.バイオアクチュエータを活用したシステムとして,ツリガネムシの収縮・伸張運動を利用したフローレギュレータを開発した.流路内に導入したツリガネムシにCa^<2+>濃度を変化し,数十μmの動作範囲で収縮・伸長させた.伸長時には流路の流れが変化し,流体制御の可能性を示した.生体の運動器官(バイオアクチュエータ)は,駆動回路を内蔵したアクチュエータであり, MEMSシステム全体の小型化に有効である.バイオアクチュエータを活用したシステムとして,ツリガネムシの収縮・伸張運動を利用したフローレギュレータを開発した.流路内に導入したツリガネムシにCa^<2+>濃度を変化し,数十μmの動作範囲で収縮・伸長させた.伸長時には流路の流れが変化し,流体制御の可能性を示した.1生物融合型MEMSデバイスには,ツリガネムシ柄を駆動源とするフローレギュレータ作製を目標にした.Ca^<2+>で収縮・伸長する柄により,圧力損失を発生させ,流量を制御する.本デバイス構築のため,ツリガネムシを格納するPDMS(Polydimethylsiloxane)製の微小流体デバイスを作製した.流体デバイスは,溶液流路と制御用流路の2層構造であり,溶液流路の流れのON/OFFは,外部空圧で制御できる.溶液流路中には幅50μmのボトルネック領域を18個直列で設けて,各ボトルネックで発生する圧力損失を加算させる.ボトルネック部には,容積300μm×100μm×28μm=0.84nLのチャンバーが接続し,ツリガネムシを格納する.溶液流路の型にはポジ型厚膜レジストAZP4903を用いて,流路高さを28μmとした.作製した溶液流路内に,ツリガネムシを注入すると,チャンバー中にツリガネムシの接着と柄の伸長が見られた.2デバイスを安定的に作製し,操作するために,以下4点の基礎検討を行った.(1)母型のポジ厚膜レジストは,昇降温時にひび割れが生じやすく,繰り返し使用性が低かった.そこで母型をひび割れがしにくいエポキシ樹脂のデブコンETに転写し,繰り返しPDMS流路の作製を可能にした.(2)流路制御用の電磁弁,圧力センサ,圧力調節器をパネル上に取り付け,操作性を高めた.(3)溶液を内径0.5mmのシリコンチューブ内に貯めた場合,連続利用できる溶液量は数十μLであった.これに容量1.5mLのネジ式遠沈管を経由させて,1mLの溶液の連続利用を可能にした.(4)PDMSの触媒量を変更し,PDMS層間を接着する方法は,2度の計量と時間調節が手間となる.硬化させたPDMSに対し,コロナ放電処理装置BD-20ACの処理後,すぐにPDMS層間を接着して,これらの手間を省いた.本研究では,MEMS (Micro Electro Mechahical Systems)技術で作製した人工物を生物アクチュエータ(ツリガネムシ)と融合し,生物融合型MEMSデバイスを開発することを目的として実施した.得られた結果は次のとおりである.1.流量制御素子として機能させるために,各要素を18連直列で接続する流路を作製し,安定的にツリガネムシを接着した.遊泳形態のツリガネムシを各要素(容積:約1nL)に導入した.つづいて空圧バルブで流路を閉鎖して,要素内にツリガネムシを強制的に留め,18要素に1細胞以上接着させた.2.透膜処理後のツリガネムシの虫体を保持したまま,柄を繰り返し動作させた.1kPa以下の低圧力で溶液を導入するために,溶液導入方式を圧縮空気から静水圧に変更した.さらに空圧バルブを半閉として流路抵抗を増大させて,流速の減少により虫体の脱離を防いだ.3.伸長液と収縮液を交互に導入し,柄を繰り返し収縮・伸長させたときの運動特性を計測した.ツリガネムシの柄は20-70μmの範囲で駆動した.要素内と要素外の領域で,柄の動作速度は変化した.ツリガネムシの収縮・伸長速さは,要素内で1μm/s,要素外で3μm/sであった.4.作製した流路において,ツリガネムシの有無による流量評価を行った.ツリガネムシ有の流路では,柄の伸長により要素内の流体抵抗が増加し,流路出口の流量が減少した.ツリガネムシをバイオアクチュエータとして利用した流量制御の可能性を示した.
複数遺跡関連性調査のための石器接合資料生成自動化と接合手順可視化手法の確立

平成30年度は,下記のサブテーマに関して研究を実施した.(1)石器表面を表す3次元座標点群に対して,曲率に基づくフィルターを新たに開発し,剥離面の境界線となる稜線近傍の点群を抽出した.抽出法は,学術雑誌に公表した.また,稜線近傍点群から稜線を推定し,剥離面の境界線を生成する方法を提案し,成果の一部はIWAIT2019にて発表した.同様に,提案手法により抽出された稜線近傍点を入力として,3次元座標点群に領域拡張法を適用し,点群を剥離面ごとに分類するアルゴリズムを開発中である.成果の一部は,IWAIT2019にて発表した.(2)3次元座標点群で表された石器モデルに関して,2つの接合資料を混在させた状況で,石器を接合していくインタラクティブシステムを開発している.今年度は,接合したい面を指定して,その候補となる面を持つ石器をコンピュータが抽出する部分を開発した.その成果の一部は,学術雑誌に公表した.また,考古学者に開発したシステムを利用してもらい,ユーザビリティを調査している.(3)空洞の抽出とマッチングについては,接合結果を解析して,石器ごとの接合面の関係と接合面に隣接する隣接剥離面間の関係をグラフ化するアルゴリズムを検討している.検討結果の一部は,芸術科学会東北支部研究会にて発表した.(4)(2)の処理を高速化するために,主成分分析を用いて主軸の方向を算出し,剥離面ごとの打点を検出する方法を検討している.その後,主軸方向で断面形状を解析し,,その形状がネガ(凹型)なのかポジ(凸型)なのかを判定するアルゴリズムを検討した.多少遅れ気味なサブテーマもあるが,おおむね予定通り進んでいる.いくつか成果が出始めているので,積極的に学術雑誌へ投稿し外部へ公表する.平成30年度は,下記のサブテーマに関して研究を実施した.(1)石器表面を表す3次元座標点群に対して,曲率に基づくフィルターを新たに開発し,剥離面の境界線となる稜線近傍の点群を抽出した.抽出法は,学術雑誌に公表した.また,稜線近傍点群から稜線を推定し,剥離面の境界線を生成する方法を提案し,成果の一部はIWAIT2019にて発表した.同様に,提案手法により抽出された稜線近傍点を入力として,3次元座標点群に領域拡張法を適用し,点群を剥離面ごとに分類するアルゴリズムを開発中である.成果の一部は,IWAIT2019にて発表した.(2)3次元座標点群で表された石器モデルに関して,2つの接合資料を混在させた状況で,石器を接合していくインタラクティブシステムを開発している.今年度は,接合したい面を指定して,その候補となる面を持つ石器をコンピュータが抽出する部分を開発した.その成果の一部は,学術雑誌に公表した.また,考古学者に開発したシステムを利用してもらい,ユーザビリティを調査している.(3)空洞の抽出とマッチングについては,接合結果を解析して,石器ごとの接合面の関係と接合面に隣接する隣接剥離面間の関係をグラフ化するアルゴリズムを検討している.検討結果の一部は,芸術科学会東北支部研究会にて発表した.(4)(2)の処理を高速化するために,主成分分析を用いて主軸の方向を算出し,剥離面ごとの打点を検出する方法を検討している.その後,主軸方向で断面形状を解析し,,その形状がネガ(凹型)なのかポジ(凸型)なのかを判定するアルゴリズムを検討した.多少遅れ気味なサブテーマもあるが,おおむね予定通り進んでいる.いくつか成果が出始めているので,積極的に学術雑誌へ投稿し外部へ公表する.