hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトへの感染力の強い高病原性鳥インフルエンザウイルスの監視デバイスの開発

高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)のヒト適応変異をウイルス受容体への結合性の変化として簡便且つ高精度に捉える新イムノクロマトデバイスを構築した。本デバイスは、ヒトおよび動物に対して非侵襲的であり、軽量(5グラム以下)、小型(最大長:15 cm以下)、高速(全ての反応が30分以内で終了)、高精度(従来のELISAを基盤とするアッセイの結果と変わらない)であり、実際にエジプト、ベトナム、インドネシアで分離された株での実用性が確認された。これにより、ヒト適応変異H5N1の発生を国際的に監視するシステムの基盤構築が可能となった。1)イムノクロマトを原理とする高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)のヒト適応変異診断デバイス(プロトタイプ)の開発に成功先ず、遺伝子解析のみでは感知できない、H5N1の鳥→ヒト宿主域の変異(変異のフェノタイプ:すなわち、新型インフルエンザの発生に伴うレセプター認識特異性変異)を高感度且つ簡便にサーベイする材料を構築した。次に被検ウイルスが、ヒト適応変異H5N1か鳥H5N1かを高速(15分以内)、安価(結果は簡便に検出可能な小型軽量デバイス(5グラム以下)のプロトタイプの作成に成功した。本デバイスによる結果は目視により判別できるため、高価な分析機器を必要としない。よって開発途上国でも使用可であり、世界規模で使用可能な実用的デバイスの作成に成功した。2)プロトタイプデバイスによる野外分離高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)への適応可能性の実証本デバイスおよびエジプトのニワトリから分離された高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)およびそのヒト型レセプター結合性獲得変異株を用いて、両者の識別能力、実用性を調べた(BSL3施設を持つ阪大微研およびエジプトアレキサンドリア大との共同研究)。その結果、鳥インフルエンザウイルスおよびそのヒト適応変異株を実際に明確に識別出来ることを実証した。昨年度までに達成したプロトタイプの試作デバイスをさらに改良して、最終的に下記のデバイスを作成した。すなわち、本デバイスは、ヒトおよび動物に対して非侵襲的であり、軽量(5グラム以下)、小型(最大長:15 cm以下)、高速(全ての反応が30分以内で終了)、高精度(従来のELISAを基盤とするアッセイの結果と変わらない)であった。さらに、本デバイスを、実際に高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)が発生しているエジプト、ベトナム、インドネシアで分離された株で実用性を確認したところ、上記の性能が確認された。また、この成果を、国際学術誌(Biosensors and Bioelectronics)に投稿し、採択された。以上、本研究により、高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)のヒト適応変異をウイルス受容体への結合性の変化として簡便且つ高精度に捉える新イムノクロマトデバイスが構築出来た。ウイルス学、生化学当初の計画では、平成25年度、26年度前半で、A)ヒト型レセプター適応変異診断プロトタイプデバイスの構築を行い、平成26年度で、B)試作デバイスの実用性評価(阪大・微研、エジプトアレキサンドリア大(阪大経由)、インドネシアアイルランガ大などと連携)、および、C)本診断・監視技術の評価を国際規模で行う基本システムの構築(感染症研究国際ネットワークと連携)を行うこととしていた。しかし、平成25年度までに、B)の項目の一部(阪大、エジプトアレキサンドリア大(阪大経由)との連携で、試作デバイスの実用性評価を達成し、高い実用性を見いだすことに成功したため、計画以上の進捗が達成できたと思われる。また、デバイスは、当初の計画通り、軽量(5グラム以下)、最大長さ15 cm以下であり、鳥インフルエンザH5N1ウイルス(赤血球凝集力価として16HAU以下の感度を目指す。)を含む被検液を50ul以下滴下することにより15分以内に特異的にヒト型受容体結合変異が高感度、安価に検出可能であり、グローバルな実用化が期待できるものである。本監視技術の評価を国内で行うシステムが構築出来たので、次年度(最終年度)では、実際に高病原性鳥インフルエンザ(H5N1)が発生し、ヒトへの伝播が起こっている国(インドネシア、ベトナム、可能であれば中国など)の国際的な高病原性鳥インフルエンザウイルス研究拠点と連携し、共同研究体制を構築する。これにより、先ず、アジア地域における、高病原性鳥インフルエンザウイルスのヒトへの適応性変異監視体制の基盤を構築していく。
腫瘍血管特異的なノンコーディングRNAを標的とした新規血管新生抑制治療の確立

マウス肝細胞癌同所移植モデルを用いた周囲肝臓の血管内皮細胞(LSEC)と腫瘍血管内皮細胞(TEC)の肉眼的、機能的、遺伝子学的違いを明らかにする実験を行った。3種類の肝細胞癌株を用いて肝細胞癌同所移植マウスモデル(Liver orthotopic model)を作製した。腫瘍形成を確認後、マウスを屠殺し、癌組織及び肝臓組織を回収した。Whole-mount staining免疫染色法を用いて癌血管と肝臓血管の形態的及び機能的違いを評価したところ、癌血管では明らかに無秩序な血管形態を取り、血管漏出性が高く低灌流性の低機能な血管である事が明らかになった。その結果、癌組織内は著明な低酸素環境が形成されていることを確認した。次に、磁気抗体細胞分離法を用いて癌血管及び肝臓血管それぞれの血管内皮細胞を単離した。単離されたそれぞれの血管内皮細胞をマイクロアレイを用いて網羅的なDNA遺伝子発現解析を行ったところ206の癌血管特異的な遺伝子を同定する事に成功した。加えて、単離されたそれぞれの血管内皮細胞のマイクロRNAの発現もアレイにより網羅的に解析したところ、106個の癌血管特異的なマイクロRNAが同定された。Gene ontology解析及びKEGG pathway解析を用いてTEC特異的遺伝子の役割解析を行ったところ、癌血管は肝臓血管と比べ著明に血管新生誘導遺伝子、増殖関連遺伝子などの発現が亢進している事が分かった。106個の癌血管特異的マイクロRNAは、いずれも予測される標的遺伝子は細胞周期、血管新生誘導などに関わる遺伝子である事がターゲットスキャンと呼ばれる標的予測が可能なソフトにより解析されている。次年度は、同定された遺伝子から、癌血管の制御に関わる遺伝子を発見し、それらの役割を評価していく。予定されていた実験は全て順調に終了している。予定通り癌血管特異的遺伝子の解析まで到達したため、次に癌血管化に関わる重要な遺伝子の同定を次に行う。抽出されたマイクロRNA群から発現が最も低下しているマイクロRNAの発現を薬理学的に変動させ癌血管化するかどうかを検証していく。おおむね予定通りの支出で研究が行えているが、18661円の残額が出た理由として、免疫染色法で用いる抗体試薬の量が今年度行うには十分量あったため、追加での購入が必要なくなったからである。これら抗体試薬は消耗品であり、次年度に繰り越しし使用する。
健康と長寿を指向したアミノ糖含有ヘテロ糖鎖による腸内環境改善技術の開発

アミノ糖を含有するヘテロ2糖であるガラクト-N-ビオース(Galβ1-3GalNAc)は、ヒト腸内の善玉菌の代表的菌種であるビフィズス菌によって特異的に利用されるため、きわめて有望なビフィズス菌増殖因子である。本研究課題では、食品加工中の余剰産物であるチーズホエイおよび胃ムチンを材料として、ビフィズス菌由来のさまざまな酵素を組み合わせて作用させることで、ムチン型糖鎖の基部に存在するガラクト-N-ビオースを切り出すことに成功した。24年度には、畜産廃棄物であるブタ胃ムチンから組換えエンド-α-N-アセチルガラクトサミニダーゼを用いてビフィズス菌増殖活性のあるヘテロ2糖Galβ1-3GalNAc(ガラクト-N-ビオース)を遊離・調製する方法を確立した。25年度には、ブタ胃ムチンにBifidobacterium bifidum由来の組換えラクト-N-ビオシダーゼを作用させたところ、同様の生理活性をもつヘテロ2糖Galβ1-3GlcNAc(ラクト-N-ビオース)が遊離することを見出した。Galβ1-3GlcNAcβ1-R構造は1型糖鎖と呼ばれ、ヒトミルクオリゴ糖や糖脂質糖鎖に存在が知られているが、胃ムチンのO-グリカンにもかなりの量が含まれていることが明らかになった。ラクト-N-ビオシダーゼについては、25年度に共同研究者らにより結晶構造解析が明らかにされ、J. Biol. Chem.に論文が掲載された。また、既知のラクト-N-ビオシダーゼ遺伝子をもたないB. longum subsp. longumから全く新奇のラクト-N-ビオシダーゼ遺伝子をクローニングし、共同研究者とともにJ. Biol. Chem.に論文を発表した。胃ムチンの糖鎖末端には、胃ムチンに特異的はGlcNAcα1-4Galβ1-R構造が存在する。この糖鎖構造はピロリ菌の増殖を阻害し、天然の抗菌成分であることがわかっている。ウェルシュ菌由来の組換えエンド-β-ガラクトシダーゼ(Endo-β-Gal-GnGa)を作用させてピロリ菌阻害活性が期待できるヘテロ2糖GlcNAcα1-4Galの調製も試みた。以上のとおり、ブタ胃ムチンから特異的な酵素を利用することで、Galβ1-3GalNAc、Galβ1-3GlcNAc、GlcNAcα1-4Galの3種の生理活性ヘテロ2糖を遊離・調製できることを明らかにした。ビフィズス菌増殖活性のあるヘテロ2糖Galβ1-3GalNAcの大量調製法を確立するために、ビフィズス菌由来のエンド-α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ(EngBF)とシアリダーゼ(SiaBb2)を、チーズホエイ由来のグリコマクロペプチド(GMP)に作用させた。その結果、1gのGMPより約40mgのGalβ1-3GalNAcを遊離させることができた。熱に安定なヘテロ3糖Galβ1-3GalNAcα1-Glcの形で回収する目的で、1M Glcの存在下でEngBFの野生型酵素と糖転移活性の向上した変異体酵素H835A/W836Fを作用させヘテロ3糖の収量を比較したところ、H835A/W836Fは野生型酵素に比較して約3倍の収量が得られた。しかしながら、合成基質であるGalβ1-3GalNAcα1-pNPを糖供与体とした場合に比較して収率は低く、さらなる変異体酵素のスクリーニングが必要であることが明らかになった。畜産廃棄物である胃ムチンからヘテロ2糖Galβ1-3GalNAcを調製する場合には、O-グリカン末端のシアル酸残基以外に血液型抗原の除去が必要である。ビフィズス菌ゲノム中にB型抗原に作用することが期待されるGlycoside hydrolasefamily 110に属する遺伝子agaBbが見出されたため、これをクローニングして酵素の諸性質を調べた。AgaBbはB型抗原に特異的に作用するα-ガラクトシダーゼであり、B型赤血球をO型に変換することができた。また、ユニークなCarbohydrate-binding module 51を含むが、このドメインはB型抗原に特異的に結合することを等温熱量滴定法(ITC)などにより示し、ムチン上でクラスター化したB型抗原の分解を促進することを明らかにした。この成果は本年度にGlycobiology誌に掲載された。グルコサミンやN-アセチルグルコサミンを含むヘテロ糖鎖は、細胞内の老廃物分解系であるオートファジーを促進する可能性があり、また腸内の善玉菌であるビフィズス菌の増殖を促進する作用を有するため、生体に良い影響を与え寿命の伸長効果が期待できる食品素材である。

本研究課題では、畜産廃棄物であるブタ胃ムチンやチーズ生産における余剰産物であるホエイを原料に用いて、各種ビフィズス菌の酵素を作用させることでムチン型糖鎖の基部に存在するガラクト-N-ビオース(Galβ1-3GalNAc)を調製することを試みた。検討の過程で、胃ムチン糖鎖の中にラクト-N-ビオース(Galβ1-3GlcNAc)も存在することを明らかにした。またクロストリジウム属細菌の酵素を用いることで、胃ムチンからピロリ菌の増殖抑制効果が期待できるヘテロ2糖GlcNAcα1-4Galを調製することも可能になった。糖鎖非還元末端には血液型抗原をはじめとしたさまざまな糖鎖抗原が存在するが、これらを分解・除去するために必要なGH110 α-ガラクトシダーゼAgaBb(B型血液型物質に特異的に作用)、GH89 α-N-アセチルグルコサミニダーゼAgnB、Sda抗原に作用するGH123ドメインとGH33ドメインの両方をもつバイファンクショナル酵素SiaBb3などをクローニングして酵素学的諸性質を明らかにした。応用微生物学研究分担者による、糖転移活性の向上したエンド-α-N-アセチルガラクトサミニダーゼの変異体酵素の作成については大きな進展が見られなかった。そこで本酵素を用いた方法の探索は中断し、26年度には研究分担者から外れていただくことにした。一方、ラクト-N-ビオシダーゼを胃ムチンに作用させたところ、Galβ1-3GlcNAc(ラクト-N-ビオース)が遊離することを見出した。これは当初計画にない結果であるが、胃ムチンがラクト-N-ビオースの供給源となることを明らかにした点で重要な進捗である。ラクト-N-ビオシダーゼについては25年度に結晶構造が明らかにされたため、変異導入により糖転移活性の上昇した変異体酵素の作成に取りかかっている。また、胃ムチン糖鎖に含まれる第3の生理活性ヘテロ2糖であるGlcNAcα1-4Galの調製方法を確立することができた。研究代表者が平成24年4月に京都大学から近畿大学へ異動したために、研究環境のセットアップに時間を要した。しかし、研究分担者および23年度まで指導していた大学院生が引き続き京都大学において研究を進め、EngBFを用いたヘテロ2糖の調製については目標を達成できた。糖転移反応を利用したヘテロ3糖の合成に関しては、従来見出していた転移活性の向上した変異体酵素が天然基質を供与体とした糖転移反応においては十分な転移活性を示さないことが明らかとなったため、当初の目標レベルには到達していない。結晶構造解析の結果からアグリコンの認識に関わることが予想される残基へのさらなる変異導入が必要である。25年度に成果発表を予定していた、B型血液型抗原に特異的に作用するビフィズス菌由来のαーガラクトシダーゼAgaBbについては前倒しで論文を投稿し、掲載された。還元末端がフリーのラクト-N-ビオースは熱に対して不安定であるため、ラクト-N-テトラオース(Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)、あるいはGalβ1-3GlcNAcβ1-3Galなどの3糖を合成できれば加工食品への添加も容易になる。そこで、結晶構造が明らかにされたラクト-N-ビオシダーゼの活性中心に点変異を導入して、胃ムチンから糖転移反応により4糖ないしは3糖の形で回収する方法を検討する。また、組換え酵素ではなく微生物菌体を用いて各種ヘテロ2糖を調製する方法を検討する。1)安価な単糖・二糖を出発材料としたヘテロオリゴ糖の酵素合成法の探索-----ラクトースやキチン2糖などの安価な材料から糖転移反応によりヘテロオリゴ糖を調製するためのβ-ガラクトシダーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼを探索する。
トランスジェニック技術を用いたインドメダカ性決定遺伝子の機能解析

インドメダカY染色体上の性決定領域内には近傍遺伝子Sox3の生殖巣特異的エンハンサーが存在し,この領域が性決定時期におけるSox3の一過的発現を誘導することによって,精巣分化が開始されることが判明した.さらに,Y染色体上のSox3を機能欠損させたXY個体は雌に性転換したころから,Y染色体上のSox3が本種の性決定遺伝子であることが確かめられた.このことは,魚類と哺乳類で進化的に独立に,同じ遺伝子が性決定遺伝子として使い回されてきたことを示しているインドメダカY染色体上の性決定領域内には近傍遺伝子Sox3の生殖巣特異的エンハンサーが存在し,この領域が性決定時期におけるSox3の一過的発現を誘導することによって,精巣分化が開始されることが判明した.さらに,Y染色体上のSox3を機能欠損させたXY個体は雌に性転換したころから,Y染色体上のSox3が本種の性決定遺伝子であることが確かめられた.このことは,魚類と哺乳類で進化的に独立に,同じ遺伝子が性決定遺伝子として使い回されてきたことを示しているこれまでの研究から,ポジショナルクローニング法によってインドメダカ性決定遺伝子の最有力候補を特定した.そこで本研究では,トランスジェニック技術を用いた機能獲得実験および機能喪失実験により,本遺伝子がインドメダカの性決定遺伝子であることを証明する.本年度は,1)機能獲得実験・機能喪失実験のためのコンストラクト作製と遺伝子導入,2)候補遺伝子の詳細な発現解析,および3)遺伝子導入系統における表現型解析と遺伝子発現解析を行うことを計画した.機能獲得実験については,本候補遺伝子およびエンハンサー・プロモーター領域を十分含むと考えられる240kbのBACクローン(BAC240),および本クローンの候補遺伝子領域をGFPに置換したBAC(BAC240GFP)を作製し,これらを導入したトランスジェニック系統をそれぞれ3系統および2系統得ることができた.前者のトランスジェニック系統すべてから性転換XXオス個体が得られ,後者からは全く得られなかったことから,本遺伝子が性決定機能を有することが示された.機能喪失実験については,本遺伝子をターゲットとしたZinc Finger Nuclease(ZFN)を設計し,このmRNAを1細胞期の胚に導入した.導入個体およびその子孫から機能欠損型の変異をもつ突然変異個体を得ることができ,本種でもZFNが利用できることが示された.次年度にこれらの変異体の表現型を解析する予定である.また,本候補遺伝子の発現パターンをin situハイブリダイゼーション法によって解析したところ,受精後5目胚の生殖巣体細胞で発現が認められた.上記のBAC240GFP系統においても生殖巣で同様のGFP蛍光を観察することができ,経時観察によって受精後5目が発現のピークであることが判明した.これらの結果から,本遺伝子の一過的な発現によって精巣分化が開始されることが判明した.これまでの研究から,ポジショナルクローニング法によってインドメダカの性決定遺伝子領域を特定した.そこで本研究では,機能獲得実験および機能喪失実験を行って,インドメダカ性決定遺伝子を同定し,その機能を実験的に証明することを計画した.トランスジェニック技術を用いた機能獲得実験を行った結果,Y染色体上の性決定領域内には近傍遺伝子Sox3の生殖巣特異的エンハンサーが存在し,この領域が性決定時期におけるSox3の一過的発現を誘導することによって,精巣分化が開始されることが明らかになった.さらに,ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた機能喪失実験を行ってSox3ノックアウト個体を作出したところ,Y染色体上のSox3を機能欠損したXY個体はメスへ性転換することが明らかになった.X染色体上のSox3変異は性転換を誘導しなかったことから,Y染色体上のSox3が本種の性決定遺伝子であることが確かめられた.これらの結果は,魚類と哺乳類で進化的に独立に,同じ遺伝子(Sox3)が性決定遺伝子として使い回されてきたことを示しており,性決定遺伝子の進化を理解する上で極めて貴重な知見である.また,他のメダカ近縁種では,これまでに2つのオス決定遺伝子が同定されている(メダカのDmyおよびルソンメダカのGsdf).インドメダカにDmyは存在しないが,GsdfはインドメダカでもXY特異的に高発現していることが今回確認された.ルシフェラーゼアッセイの結果,Sox3とSf1の同時トランスフェクションによってGsdfプロモータの活性が上昇することから,Sox3はGsdfの転写制御を介して精巣分化を誘導していることが示唆された.これらの研究成果は,メダカ属ではGsdfが精巣分化の中心的役割を担っており,その転写制御因子の多様化によって異なる性決定機構が進化してきたことを強く示唆している.本年度に計画した機能獲得実験をほぼ予定通りに行うことができ,性決定遺伝子の機能を証明するだけでなく,発現パターンを明らかにすることもできた.さらに,機能喪失実験では,ZFNの導入によって極めて効率的に突然変異体を得ることができた.この変異体の解析によって,本遺伝子の機能を確実に証明できると考えている.24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度得られた突然変異体の表現型を解析し,機能獲得・機能喪失の両面から性決定遺伝子の機能を証明する.また,本遺伝子は転写因子をコードするので,レポーターアッセイや強制発現の系を駆使して,ターゲット遺伝子を明らかにする予定である.さらに,本遺伝子が他のメダカ近縁種でも性決定遺伝子として機能するかどうかについても検討する.
癌特異的変異タンパクを標的とした甲状腺乳頭癌及び未分化癌に対する治療法の開発

甲状腺癌の悪性化に関与するBRAFの変異を有するヒト未分化癌細胞株NPAおよび乳頭癌細胞株K1および変異を有さないTPC1において、BRAFの発現を抑制することにより、悪性化の指標である遺伝子群の発現が抑制された。またヒト甲状腺乳頭癌臨床検体を用い、BRAFが約9割で変異を有することを認めた。他のヒト癌細胞株において、BRAFを抑制することが予想されているHSP90阻害剤により、細胞増殖が抑制された。【培養細胞実験】BRAF変異を有するヒト癌培養細胞における各種遺伝子発現の検討。1.ヒト癌培養細胞株であるNPA細胞においてPCR-RFLP法によりBRAFの変異を確認した2.NPA細胞においてsiRNAを用いてBRAFのmRNA発現を抑制することにより、悪性化の指標である遺伝子群の発現が抑制された。3.NPA細胞以外のBRAF変異を持つヒト甲状腺乳頭癌細胞株としてK1細胞、変異を有さないヒト甲状腺乳頭癌細胞株としてTPC-1においてBRAFのmRNAの発現をreal-time RT-PCRで検討した。4.ヒートショック蛋白抑制剤である17-AAGの添加により変異BRAFが抑制され、細胞増殖が抑制されることが予想されている。乳がん細胞株で17-AAGの添加によりアポトーシスが誘導され、細胞増殖が抑制された。【臨床検体をもちいた実験】甲状腺乳頭癌臨床検体を用いてBRAF変異と悪性度の関連を検討した。1.ヒト甲状腺乳頭癌臨床検体を用いてダイレクトシークエンス法によりBRAFの変異を検討し、約9割で変異を認めた。2.ヒト甲状腺乳頭癌臨床検体での検討で、変異BRAF mRNAの発現と悪性度の関連する遺伝子のmRNAの発現に有意な正の相関を認めた。また、分化度を反映する遺伝子のmRNAの発現との間には負の相関傾向を認めた。培養細胞実験、臨床検体を用いた実験の結果は国際専門誌(査読あり)であるEndocrine Journalに掲載された。またアポトーシスの関連については日本乳癌学会総会にて口頭発表した。【培養細胞実験】1. 17-AAG添加時のアポトーシス関連遺伝子発現の検討17-AAG(HSP阻害剤)を加えた細胞と加えない細胞において、ウェスタンブロット法を用いてアポトーシス関連タンパク発現(p21, PARP-1)の比較を行った。17-AAGの添加により有意にp21の発現が増加し、PARP-1の分解産物の発現も上昇した。これらは17-AAGの添加により細胞周期の進行が停止し、アポトーシスが誘導されたことを示唆した。また抗アポトーシス作用のあるAktタンパクのリン酸化が17-AAGの添加により抑制され、アポトーシスの促進が示唆された。2.最適なHSP阻害剤の投与量、投与間隔、温熱療法の条件の検討17-AAGの濃度を変化させて加えた細胞において細胞増殖に対する効果を検討した。2.5nMという非常に低濃度においても細胞増殖抑制効果を確認できた。また濃度依存性の増殖抑制効果を認めた。投与間隔については温熱を加える24時間までに薬剤を添加することにより温熱効果の増強を確認できた。温熱条件については17-AAGを加えることにより低温(摂氏43度)においても、高温(摂氏47度)と同等の細胞増殖抑制効果を得ることが確認できた。【動物実験】担癌動物におけるHSP阻害剤のMCLを用いた温熱治療効果増強の検討。1.担癌動物モデルを作成し、MCLを局所投与し、交番磁場を照射し実際に温度が上昇することを確認した。また腫瘍縮小効果を確認した。【培養細胞実験】DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現の検討17-AAG(HSP阻害剤)を加えた細胞と加えない細胞において、アポトーシス関連タンパク発現(p21、PARP-1)の比較し、17-AAGの添加により有意にp21の発現が増加し、PARP-1の分解産物の発現も上昇することを確認した。DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイルの比較を行い、17-AAG添加により誘導される遺伝子群、抑制される遺伝子群を抽出し、HSP阻害剤の細胞増殖抑制効果におけるメカニズムの解明を試みようとしたが、十分な試料(RNAなど)が準備できず実施できなかった。【動物実験】HSP阻害剤を用いた温熱効果増強作用における免疫系の関与の検討1.2つ以上の皮下移植腫瘍をもつ担癌動物モデルを作成し、MCLを一部の腫瘍に局所投与し、交番磁場を照射した。実際にMCLが投与された腫瘍において温度上昇を確認した。さらに腫瘍縮小効果も確認した。

2.MCLが投与されず、交番磁場も照射されていない腫瘍も腫瘍免疫の活性化により縮小することが報告されているが、今回の計画に用いた腫瘍細胞ではBRAFの変異の有無を問わず、そのような現象は観察されなかった。腫瘍免疫が活性化されなかったことが示唆された。よって、17-AAGによる温熱効果増強作用を検討することはできなかった。
感染シナプスにおけるHIV蛋白の極性輸送と粒子形成の分子機構

1)感染シナプスにおけるHIV粒子放出: SNAP23(Qc-SNAREの1つ)はIL-2やIFN-γのサイトカイン小胞を免疫シナプスの細胞間接着部位へ極性輸送する宿主因子である。この因子がGag輸送へ関与するかを明らかにする目的で、CRISPR-Cas9系を用いてSNAP23 gRNAとCas9を発現するレンチウイルスベクターを作製し、Jurkat細胞に導入した。しかし、SNAP23ノックアウト細胞は得られなかった(後に、SNAP23は必須因子と判明した)。そこで、既に作製済みのSNAP23ノックダウン細胞を使用するか(HIV産生を顕著に抑制した)、あるいはSNAP23のQa-SNARE counterpartであるSyntaxin 4をノックアウトすることとした。一方、炎症性サイトカインTNFの小胞を輸送する宿主因子Syntaxinのノックアウト細胞は作製でき、HIV産生の抑制が確認された。2)感染シナプスにおけるミトコンドリア局在:ミトコンドリアcox2を免疫染色し、感染シナプス(の細胞接着側)へのミトコンドリア極性化を明らかにした。ATP合成酵素(ミトコンドリアに局在)も極性化を示した。感染細胞にATP合成酵素阻害薬oligomycin処理し、感染シナプスの形成が抑制されるか、解析中である。3)Gag蛋白輸送における責任宿主分子の交換反応:SyntaxinとGag蛋白の共発現細胞と、クラスリンアダプターAPμあるいはESCRT-I分子TSG101の発現細胞から、それぞれ膜画分を分離した。現在、これらの膜画分をin vitroで混合し、分子の交換反応を解析中である。1)感染シナプスにおける細胞骨格系の再構築:Strawberry-Tubulin恒常発現Jurkat細胞を樹立した。HIVを感染させ非感染細胞と共培養して感染シナプスを形成させた。固定細胞を観察したところ、MTOCはシナプス形成側(細胞間接着部位側)の細胞質だけでなく遠位側(反対側)にも認められ、生細胞イメージングによる観察が必要と思われた。EB1-mCherryの発現は弱かった。また、アクチン結合性のLifeact-Strawberry恒常発現Jurkat細胞を樹立し、HIVを感染させ非感染細胞と感染シナプスを形成させた。固定細胞では細胞間接着側に厚いアクチン繊維が認められた。3)感染シナプスにおけるサイトカイン分泌輸送経路を介したGag蛋白輸送:サイトカイン分泌輸送を制御する分子群のいくつか(Syntaxin, SNAP23, Rab27)に対するshRNAをJurkat細胞に導入し、ノックダウン細胞を樹立した。これらの細胞にHIVを感染させたところHIV粒子産生は遅延・抑制された。感染シナプスを形成させたところ、TNF分泌を制御するSyntaxinのノックダウンでは、HIV産生の抑制は感染シナプス形成部位には限定されていなかった。SNAP23及びRab27のノックダウンの場合については現在解析中である。2)感染シナプスにおけるGag蛋白の極性輸送:Strawberry-Tubulin恒常発現Jurkat細胞とGag-EGFP発現HIVが準備でき、それらを組み合わせることにより、生細胞イメージングでGag-EGFPの微小管系輸送が解析できた。現在、感染シナプスを形成させてMTOC局在を観察する実験とGag-EGFPの微小管系輸送を合わせて行っている。3)感染シナプスにおけるサイトカイン分泌輸送経路:サイトカイン分泌輸送を制御する分子群(Syntaxin, SNAP23, Rab27)のノックダウンJurkat細胞を樹立できた。ノックダウン効率は低かったが、これらの細胞でHIV粒子産生の遅延・抑制が確認できた。SyntaxinはTNF分泌(multi-directional secretion)を制御する分子であり、感染シナプスにおける細胞間接着部位への輸送と関連が少ないのは予想通りであった。SNAP23, Rab27は、免疫シナプスにおける細胞間接着部位へのサイトカイン極性輸送(one directional secretion)を制御する分子であり、次年度以降はこれら分子のノックダウンJurkat細胞におけるHIV感染シナプス形成成立を解析する。1)Gag蛋白輸送における責任宿主分子の動員:TSG101(ESCRT-I構成因子)、AP1, AP2, AP3(クラスリンアダプター)、Rab7, Rab9(後期エンドソームの輸送制御分子)がGag蛋白輸送やHIV粒子出芽の関連分子として報告されている。Gag蛋白とSyntaxin, APμ分子, TSG101をEGFP, Cherry, Strawberryで蛍光標識し、生細胞イメージングで観察したところ、Gag蛋白とSyntaxinの共輸送は認められたが、AP1μ, AP3μやTSG101は核近傍に局在したままでGagとの共輸送は認められなかった。Syntaxin KD細胞ではGag蛋白輸送は阻害され、Gag蛋白は細胞質にdiffuseに散在した。2)感染シナプスにおけるHIV粒子放出(エンドソームからのエクソサイトーシス):SNAP23(形質膜局在のSNARE分子)と、Rab7, Rab9に対するshRNAをJurkat細胞に導入し、ノックダウン(KD)細胞を樹立した。Rab7 KD, Rab9 KD細胞にHIVを感染させたところHIV粒子産生は遅延・抑制された。固定細胞で観察したところ、後期エンドソームCD63分子が細胞接着部位に局在する傾向が認められた。初期エンドソームEEA1分子とリサイクリングエンドソームRab11分子の局在については現在解析中である。3)感染細胞におけるサイトカイン

分泌:Jurkat細胞からのサイトカイン分泌量をELISAで定量した。未刺激Jurkat細胞ではIL-2, TNF-α(T細胞産生サイトカイン)はほとんど分泌されなかったが、PMAで刺激して活性化させると多量に分泌された。HIVを感染させるとその分泌量は減少した。その減少はSyntaxin KD細胞で顕著であった。1)Gag蛋白輸送における責任宿主分子群の細胞動態:既にSyntaxinとTSG101やAP1μ, AP3μとの相互作用を酵母Two-hybrid法により明らかにしている。本年はこれら分子を蛍光標識しGag-EGFPとともに生細胞イメージングで調べたところ、Syntaxinとは異なり、TSG101やAP1μ, AP3μは核近傍に局在したままでGag蛋白と共輸送されず、またSyntaxinとも共輸送されない知見が得られた。すなわち、Gag-Syntaxin複合体が輸送過程でAP1, AP3やTSG101と一時的に相互作用する、あるいはその一部だけが動員される可能性が示唆できた。生化学的解析は次年度に行う予定。2)感染シナプスにおけるエンドソーム:Rab7 KD, Rab9 KD細胞ではHIV粒子産生が遅延・抑制されることが確認できた。感染シナプスを形成させると後期エンドソームCD63分子が細胞接着部位に局在する傾向が認められたが、生細胞イメージングでの経時的な観察が必要であると思われた。蛍光標識LysoTrackerで後期エンドソームを標識して感染シナプスを生細胞イメージングで観察する予定。3)感染細胞におけるサイトカイン分泌:Jurkat細胞からのサイトカイン(IL-2, TNF-α)分泌にはPMA等の刺激が必要であることが確認できた。この刺激活性化細胞にHIVを感染させると分泌量は減少し、Syntaxin KDによりさらに減少したことから、HIV感染によるサイトカイン分泌抑制とSyntaxinの関与が示唆できた。一方、HIV感染細胞の培養上清にはサイトカインがほとんど分泌されなかったことから、HIV感染はJurkat細胞を活性化しないことが示唆された。4)ミトコンドリア局在:感染シナプスにおけるミトコンドリアの局在観察に着手できた。1)感染シナプスにおけるHIV粒子放出: SNAP23(Qc-SNAREの1つ)はIL-2やIFN-γのサイトカイン小胞を免疫シナプスの細胞間接着部位へ極性輸送する宿主因子である。この因子がGag輸送へ関与するかを明らかにする目的で、CRISPR-Cas9系を用いてSNAP23 gRNAとCas9を発現するレンチウイルスベクターを作製し、Jurkat細胞に導入した。しかし、SNAP23ノックアウト細胞は得られなかった(後に、SNAP
食道癌におけるｍＴＯＲを標的としたｍｉＲＮＡｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｈｅｒａｐｙ

【食道癌におけるmiRNA発現の解析Total RNA抽出と網羅的解析】食道癌切除症例約100症例のtotal RNAを抽出。miRNAの候補検索にmiRNA microarrayを用い、臨床検体にて発現量に差があるmiRNAを網羅的に同定。pick upしたmiRNAについて定量的RT-PCR法を用いてvalidationを行い、いくつかのmiRNAに関して妥当性を検討した。【mTORを標的とするmiRNAとの相互的な発現制御機能の解明】上記にて同定されたmiRNAに対してmTORを標的とするか検証を行うため細胞株による実験を行っている。本研究は、食道癌においてmiRNAとmTORの制御機能を解明し、miRNAを用いたがんに対する治療について研究する。具体的な研究項目は、1mTORを標的とするmiRNA発現の解析、2miRNAとmTORの相互的な制御機能の解析、3miRNAを標的とした治療に対する検討、の3つである。【計画1.食道癌におけるmicroRNA発現の解析Total RNA抽出と網羅的解析】【計画2.mTORを標的とするmicroRNAとの相互的な発現制御機能の解明】1にて同定されたmiRNAに対してmTORを標的とするか検証を行う、miRanda、TargetScanなどのコンピューターデータベースを用いて検索し、細胞株による実験を行っている。in vitroでの癌細胞浸潤能、増殖能、細胞サイクル、アポトーシス抑制能などとの関係を評価し、Pre-miRなどを導入することでその変化を確認している現状である。【食道癌におけるmicroRNA発現の解析Total RNA抽出と網羅的解析】【mTORを標的とするmicroRNAとの相互的な発現制御機能の解明】上記にて同定されたmiRNAに対してmTORを標的とするか検証を行う、miRanda、TargetScanなどのコンピューターデータベースを用いて検索し、細胞株による実験を行っている。消化器外科学細胞実験でのマイナートラブルにて実験が遅れている。細胞実験でのマイナートラブルにて実験が遅れている。Total RNAの抽出作業や細胞実験などに関しては共同研究者並びに当研究室の技術補佐員等と協力して継続してすすめていく。再現性のある確かな研究を遂行するために、細胞実験に関しては実験精度を上げる必要がある。共同研究者ならびに当院スタッフより指導を仰ぎ、H26年度以降の研究計画を実行するとともに、より新しい知見を得るために積極的に学会などに参加する。共同研究者ならびに当院スタッフより指導を仰ぎ、H25年度以降の研究計画を実行するとともに、より新しい知見を得るために積極的に学会などに参加する。細胞実験でのマイナートラブルにより実験が遅れたため。細胞実験に関しては実験精度を上げるため、共同研究者や医局所属の他の研究者らの助言を仰ぎながら、複数回行う。研究費は関連試薬等消耗品購入に充てたいと考える。該当なし
アトムプローブ質量分析器による金属-化合物半導体界面の超微視的解析

電圧パルスにより表面原子の電界蒸発を促進し、蒸発イオンを逐一分析するアトムプローブ(A-P)は、金属材料の極微領域の分析に広く用いられているが、GaAsやGaP等の化合物半導体の分析ではGaイオンの検出数がAsやPイオン数より著とく少なく、化学量論的組成が得られない場合が多い。そこで、本研究では、直線型、偏向型、映像型を組み合せた複合型A-Pを製作し、その原因が、AsやPの電界蒸発の直後、その近傍のGaがパルス電圧が降下した後の低いDC電圧でも優先的に蒸発し、これらのイオンが検出されないことにあることを明らかにするとともに、偏向型の偏向電極電圧と試料に印加するパルス電圧を最適化すると、化学量論から期待される組成が得られることを示した。この複合型の特長は、イオンの検出に有効入射面の広いシェブロン型電子増倍器を、そして、イオンの飛行時間を測定するタイマーに信号波高弁別型を用いてイオンの検出効率を高めたこと、32ビットのコンピュータによりデータ処理を迅速化したこと、映像型A-Pの制御にストーレジオッシロスコープを用いたことにある。複合型A-Pによらず化合物半導体を分析する今一つの手法として注目されているのは、パルスレーザー光を試料に照射して電界蒸発を促進する手法である。本研究では、レーザーとしては、幅が0.8ナノ秒、ピークパワー200KWのものが用いられたが、この手法においても、正しい組成を得るにはレーザーパワーと試料に印加する電圧を最適化する必要があることを見い出し、最適条件を明らかにした。この成果をもとにして、Al-GaAs界面が調べられ、パルスレーザーと電圧パルスによる分析結果の比較がなされた。予期せぬ知見としては、パルスレーザー法ではAl-GaAs界面でAl-Ga置換反応により形成されたAlAs層と下地のGaAsとの間に数原子層のGa層が見い出されたことである。現在、Ga層形成の原因が調べられている。
形状モデリングのスケマティックインタフェースと融合したバーチャル心臓シミュレータ

我々は心臓シミュレーションの将来の臨床応用を目指し、試行システムを開発した。試行システムは主に以下の3つの機能から構成される。1)複雑な心臓形状のためのボリュームあるいはサーフィスモデルを処理するモデリングインタフェース。2)シミュレーション結果の有効な可視化。モデリングインタフェースによって、比較的容易に立体的な心臓形状モデルの処理と電気生理学的パラメータの設定が可能である。シミュレーションは心臓の電気生理学的な挙動を記述する2種類の数学モデルを目的に応じて選択できる。迅速性・簡便性を重視する場合には、簡易型のFHN方程式を用いてパーソナルコンピュータでのシミュレーションが実行できる。例えば、医療従事者が簡潔にベッドサイドで不整脈の概要を説明するときに効果的である。一方、制度がより重要であるときは、スーパーコンピュータで複雑なLRモデルを使って大規模な計算を実行することも可能である。これは不整脈メカニズムの詳細な研究に適している。されに、我々はネットワークシステムを試行した。このシステムでは、最初にユーザは滋賀医科大学のWWWサーバにアクセスし、活動電位のパラメータ、心室性期外収縮の発生場所などを指定する。次に、指定されたパラメータは循環器病センターに送られ、スーパーコンピュータによってシミュレーションが実行される。計算結果は循環器病センターにの可視化サーバで可視化されてイメージデータに変換される。最終的にイメージデータは滋賀医科大学に戻され、WWWサーバに登録される。ユーザはシミュレーション結果を可視化データとして閲覧することができる。これらのシステム開発は、心臓モデルの電気生理学的を変えて反復実験を用意に行うことが出来るシミュレーション研究の特徴を活かすのに有効であると思われる。心臓電気現象シミュレーションの臨床応用を目標に、取り扱いの困難な3次元の心臓形状ボリュームデータあるいはサーフェスデータを構築するのためのモデリングインタフェースと、シミュレーションを実行して、その結果を可視化できるシステムを試作した。このインタフェースでは、まだまだ制限事項は多いものの、手書きスケッチ風に仮想心臓の形状変形やパラメータ設定を簡便に行うことができる。さらに、シミュレーションの実行に関しては、目的に応じて、心臓電気現象のための数学モデル(方程式)を2種類選択することが可能である。すなわち、迅速性・簡便性を重視する場合には、簡易型のFHN方程式を用いてパーソナルコンピュータでのシミュレーションがほぼリアルタイムで実行できる。したがって、患者に簡単な病態の説明をベッドサイドで行うような場合に都合がよい。一方、正確性を重視する場合には、イオンチャネルモデルであるLR方程式による大規模計算をスーパーコンピュータを用いて実行することも可能である。不整脈のメカニズムの詳細な検討などに適しているものと考える。このシステムの試作に際しては、スーパーコンピュータによる高度大規模計算の実行環境の機能アップを図り、従来の約2倍の高速化を可能にした。このシステムの試作により、目的に応じて簡単に心臓モデルの形状を変更し、パラメータを少しずつ変えながら繰り返し実験が行えるという、シミュレーション研究の最大の特性を活かすことができると思われる。平成17年度においては、当初の研究計画に基づき、1.WWWサーバによるネットワーク・シミュレーション(環境)の試験的サービス、2.患者固有の心臓形状データを取り込むための医用画像処理、さらに前年度からの課題である3.スケマティックな心臓モデリングインタフェースの改善について研究を行った。1.ネットワーク・シミュレーション(環境)の試験的サービス我々は滋賀医科大学にWWWサーバを設置することにより、試験的運用を行うシステムを稼働させた。このシステムでは、滋賀医科大学のWWWサーバに利用者が接続し、活動電位のパラメータや期外収縮の発生部位などを指定する。指定されたパラメータは国立循環器病センターに送信され、スーパーコンピュータよりシミュレーションが実行される。計算結果は可視化サーバにより画像化/映像化され、滋賀医科大学のWWWサーバに登録しておくことが可能である。利用者はWebブラウザを使用してシミュレーション結果を閲覧することができる。2.患者固有の心臓形状データを取り込むための医用画像処理

心臓形状全体を取り込むところまでには至っていないが、冠動脈造影像よりイメージモザイクを行い、全体を一覧できる手法を開発した。すなわち、冠動脈像の時空間投影像および断面像を用いて、位置合わせを元にイメージモザイクを行うことで目的の画像を得ることができるものである。3.スケマティックな心臓モデリングインタフェースの改善前年度から開発を行ってきたスケマティックな心臓モデリングインタフェースの改善およびその応用として、直観的な心臓カテーテル検査のためのインタフェースや手書きの特性を活かした電子カルテインタフェースの試作などを行った。
野生チンパンジーの行動の地域変異と文化的行動の獲得過程

チンパンジー調査地6カ所、マハレ、ゴンベ(タンザニア)、カニャワラ、ンゴゴ、ブドンゴ(ウガンダ)、ボッソウ(ギニア)を訪問し、地域間で行動パタンを比較した。マハレでは文化的行動の発達も調べた。「社会的スクラッチ」、毛づくろい時の発生など、地域間で多くの行動の相違を発見した。マハレの「枯葉引き」遊びは多数のコドモで見られ、少なくとも10年以上続いている伝統であるが、他の調査地では伝統としては存在していない。マハレでは、コドモが谷などで水を使った様々な遊びを展開する。顔を水面に向け、首を振り、自分の影の動きを楽しむ「水面首振り行動」は、少なくとも数頭の雄のコドモに見られる。また、「葉のスポンジ」の利用や、葉の中助を水につけてなめる行動も、数頭の個体で見られる。これらの様々な遊びのパタンは、コドモからコドモへ伝播している可能性が高く、流行、あるいは萌芽的な文化かもしれない。また、6年前に得た水遊びの撮影資料との間に差異も発見した。「水中岩投げ」などの示威行動、「葉の噛みちぎり」や「灌木曲げ」などの求愛誇示もマハレの伝統である可能性が高い。ボッソウで発見した「踵叩き」、「掌上寄生虫潰し」、「相互性皮触り」は、マハレでは見られたことがない。個体は、成長とともに、採食、毛づくろい、道具使用、求愛、示威の順に、伝統を身につけていく。離乳期までには、ほとんどの伝統を獲得する。対角毛づくろいの発達に母親による教示(モールディング)が関与している可能性があり、また一頭の雌は移籍前の集団のパタンを部分的に維持していたチンパンジーでは、個体による発明・発見は繰り返し起こるが、文化として固定することはまれであるようだ。チンパンジーで、行動の相違が多く見られるのは、集団間では行動の伝播が遅いためと考えられる。父子間の行動の類似を調べるため、M集団の全個体から、糞などのDNA資料を収集し、Y染色体上の遣伝子を解析している。本年度は、マハレのチンパンジーの文化的行動の発掘と、すでに文化的行動と判明しているものの発達の問題を中心に研究した。アカンボウ、コドモ、ワカモノを対象に、かれらの行動をシステマチックにビデオ撮影して、映像素材を収集した。新しいファッションとして発見された行動として、「口を尖らせて水をかき回したり飛ばしたりする」水遊び行動や「四足で枯葉のパイルを押したり、引いたりする」独り遊び行動がある。前者は今回3頭の若者に見られたが、かつて観察されなかった行動である。後者は、2歳から始まり、コドモ時代によく見られ、ワカモノ期のうちに消失するようである。これら2つのパターンが、今後どのように伝播、あるいは衰退するのか調べたい。文化行動である「リーフ・グルーミング」の機能は、これまでまったく知られていなかった。今回、系統的なデータ収集により、身体から採取したシラミを口唇から葉に移し、折り曲げた葉にシラミを挟んで押し潰す行動であることを発見した。

文化的行動である「対角毛づくろい」は、5歳から見られ、コドモ時代を通じて母との間でのみ見られるが、ワカモノになると、母親以外のメスとも見られるようになる。しかし、オトナの雄との間では、本人がオトナになるまで見られない。他に、水中石投げ誇示、ワイピング行動、「シュラッブ・ベンド」求愛誇示や「リーフ・クリッピング」求愛誇示など多くの文化的行動について、各発育段階の個体のデータを集めたが、各行動の発達のプロセスを十分説明するにはまだだ不十分で今後のデータ蓄積を待つ。マハレ以外のサイトとの行動比較としては、ウガンダのキバレ森林のチンパンジーを観察した。その結果、キバレの対角毛づくろいは持続時間が長いこと、掌同士を握りあう形式の対角毛づくろいがカニャワラには存在することがわかった。第一に、タンザニアのマハレのチンパンジーの行動パターンを他の地域と比較するため、ウガンダのキバレ森林(ンゴゴ地域)とブドンゴ森林を選んだ。至近距離で観察できる場合は、行動をすべてビデオ・カメラで撮影した。その結果、(1)Social scratchとGrooming-hand-claspは、ンゴゴで見られるがブドンゴにはないこと、(2)しかし、Social scratchのやり方がマハレとンゴゴでは異なること、(3)Leaf-groomingは、ンゴゴでもブドンゴでも見られること、(4)しかし、ブドンゴでは明らかにどこよりも頻度が高いこと、(5)ンゴゴのチンパンジーでは、毛づくろいのさいに、マハレで知られるLip SmackやTeeth Chatterが聞かれず、そのかわりに、舌で歯と歯の間に空気を押しこめば出るような音を発すること、などがわかった。これらの多くは新発見である。第二に、マハレにおいて文化的行動パターンの発達過程について横断的・縦断的に調査をおこなった。その結果、採食行動、毛づくろい行動、遊び、求愛誇示、道具使用、攻撃的誇示、の順に行動の個体発達が早く見られること、多くの行動が離乳期(4-5歳)に一応の完成を見ることが明らかになった。文化的情報の伝達方法については、Grooming-band-claspが母親による子供へのmouldingの結果であることを示唆するデータが得られた。もし、この点が証明できれば、野生チンパンジーによる「積極的な教育」として、初めての例となる。今後、母子間の毛づくろいの観察例数を増やすことによって、解決できよう。他に、大人の社会関係の性差、仲直り行動、Self-scratch行動、子供の遊びとLaughter、雌の発情とホルモン分泌、DNA資料の収集、などの研究もおこなった。五百部は、1ヵ月間、マハレM集団の遊動域内の哺乳類密度を調べた。1995年と同じ手法で三つのルートを各6回センサスし、チンパンジーの狩猟対象となっている哺乳類8種について資料を集めた。島田(博士1年)は、2001年度から引き続き滞在し、チンパンジーの音声伝達のうちパントフートの発達と性差を調べた。西江(修士2年)は、2002年8月3日から3ヵ月強、オオアリ釣り行動の獲得過程について調べた。M集団54頭のうち、43頭のアリ釣りを確認した。これは、最年少の3歳4ヶ月のメスや2001年の移入メスを含む。さらに、釣り場所となった木の樹種と位置、食べられたアリの種の同定・栄養価,アリ釣り場面での母子間交渉を、現在分析中である。中井は、マハレに2ヵ月滞在し、チンパンジー5個体の骨格標本を計測し、疾病を調査した。ゴンベとは異なり、マハレには関節疾患が多かった。外傷はゴンベ同様マハレでも多く、他者からの攻撃と高所からの転落の両方が原因だと推定された。中村は、西アフリカのボッソウのチンパンジーを調査した。
ボンベシン様ペプチド系の機能の解明

1.NMB-R及びGRP-R両遺伝子を欠損したマウスの作製と解析:NMB-RとGRP-R遺伝子の両方がヘテロ型(+/-)である雌マウスと、NMB-Rがヘテロ型(+/-)である雄マウスを交配することにより、雄のダブルノックアウトマウスと、雄の野生型マウスを得た。ノックアウトマウスの表現型は野生型マウスと比較して際だった変化は見られず、また変化があってもGRP-RまたはNMB-Rの単独欠損マウスに見られるものと変わらなかった。2.NMB-R, GRP-R, BRS-3過剰発現鳥胚の開発:各マウス型cDNAのC末端に発現のモニターを可能にするEGFP(クラゲ蛍光色素)遺伝子を結合して、増殖型のレトロウイルスをベクターとしたコンストラクトを作製した。ウイルス粒子を調整しウイルス感受性ニワトリ胚脳原基に感染させた結果、広範に強い発現が見られた。遺伝子導入したトリ胚は胚発生後期に灌流固定を行い、凍結切片を作製して表現型を解析中である。3.鳥類におけるボンベシン系の解析:鳥類における類似のペプチド系の存在を明らかにする日的で、デジェネレートプライマーを用いたRT-PCRによって、ニワトリ脳からGRP-Rと、別にBRS-3とBB4にホモロジーの高い2種類の受容体をクローニングし、それぞれchGRP-RとchBRS-3.5と名付けた。in situハイブリダイゼーションを行ったところ、chGRP-Rは視床下部などの前脳の限られたところに発現しているのに対しchBRS3.5は前脳の線条体を中心とした広範囲で発現しているものの、小脳や脳幹には発現が見られなかった。この結果より、ボシベシンペプチド系は種を越えて存在し、鳥類においても哺乳類と同様の重要な機能を担っている可能性が示唆された。哺乳類におけるボンベシン様ペプチドには、ガストリン放出ペプチド(GRP)とニューロメジンB(NMB)があり、脳神経系や消化管に存在し、生体の機能調節に重要であることが示唆されている。受容体としては、GRP受容体(GRP-R)、NMB受容体(NMB-R)、そして第3の受容体であるBRS-3が明らかとなっている。本研究では、ボンベシン様ペプチドの個体における機能の全貌と、その作用機序を解明することを目的として、これらの受容体を過剰発現するモデル動物を作成することにより、過剰発現時の病態生理を把握することをめざしている。今年度は、これらの受容体を鳥類胚で過剰発現させることにより、特に脳神経系の発生における受容体の役割について検討を行った。そのために、まずニワトリ脳のcDNAからデジェネラティブプライマーを用いたPCR、そして3'-,5'-RACEをくみあわせることにより、GRP-RとBRS-3.5のクローニングに成功した。それぞれ、哺乳類のGRP-R、また、哺乳類のBRS-3あるいは両生類のBB4と呼ばれるボンベシン様ペプチド受容体に相同性が高く、鳥類においてもボンベシン様ペプチド系が存在することが確認できた。そして、マウスの3種類の受容体を、強制発現ベクターを用いて一過性に、あるいはレトロウィルスを用いて長期的に発現させるようなベクターを構築し、孵卵1.5日目のニワトリ胚脳原基への発現を試みた。これらの胚は孵卵開始後12日まで発生させて固定し、現在、どのようなフェノタイプが見られるかについて解析中である。

ノックアウトマウスの表現型は野生型マウスと比較して際だった変化は見られず、また変化があってもGRP-RまたはNMB-Rの単独欠損マウスに見られるものと変わらなかった。2.NMB-R, GRP-R. BRS-3過剰発現鳥胚の開発:各マウス型cDNAのC末端に発現のモニターを可能にするEGFP(クラゲ蛍光色素)遺伝子を結合して、増殖型のレトロウイルスをベクターとしたコンストラクトを作製した。ウイルス粒子を調整しウイルス感受性ニワトリ胚脳原基に感染させたところ、広範に強い発現が見られた。遺伝子導入したトリ胚は胚発生後期に灌流固定を行い、凍結切片を作製して表現型を解析中である。3.鳥類におけるボンベシン系の解析:鳥類における類似のペプチド系の存在を明らかにする目的で、デジニネレートプライマーを用いたRT-PCRによって、ニワトリ脳からGRP-Rと、別にBRS-3とBB4にホモロジーの高い2種類の受容体をクローニングし、それぞれchGRP-RとchBRS-3.5と名付けた。in situハイブリダイゼーションを行ったところ、chGRP-Rは視床下部などの前脳の限られたところに発現しているのに対しchBRS3.5は前脳の線条体を中心とした広範囲で発現しているものの、小脳や脳幹には発現が見られなかった。この結果より、ボンベシンペプチド系は種を越えて存在し、鳥類においても哺乳類と同様の重要な機能を担っている可能性が示唆された。