hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
牛卵胞の発育培養による主席卵胞モデル作製と野生動物種卵子の体外生産への応用

その結果、IVG卵子の核成熟、体外受精成績はBMP-4無添加の場合と同等であったが、胚盤胞への発生率はBMP-4添加によって抑制された。顆粒層細胞のみの培養時にBMP-4を添加しても顆粒層細胞の増殖抑制は見られないことから、培養中の卵子と顆粒層細胞の相互作用がお互いの増殖・発生能に強く影響を与えていることが明らかとなった。次に卵巣内にもともと存在する胞状卵胞数(AFC)が卵子発生能に与える影響を体内および体外発育卵子を用いて比較した。その結果、体内発育卵子においては低AFC群の体外受精能が高AFC群より低く、IVGを行った場合は、培養期間中のOGC生存性に差は認められないものの、培養後の顆粒層細胞数は高AFC群の方が多かった。また、卵子ミトコンドリア活性は高AFC群の方が高く、核成熟率も高AFC群の方が高かった。以上の結果から、卵巣予備能の高い牛に由来する卵子の核成熟能および受精能は高いことが示唆された。牛卵巣中に存在する初期胞状卵胞から採取した発育途上にある卵子を、卵子-卵丘細胞-顆粒層細胞複合体(OGC)として体外発育培養(IVG)法の改善に取り組んだ。その結果、世界で3例目の産子を作出し、本IVG系により発育した卵子の正常性が確認された。また、骨形成タンパク質4は、培養中の顆粒層細胞の直径を小さくし、プロジェステロン分泌を抑制することから、顆粒層細胞の黄体化を抑制することが明らかになった。さらに、卵巣内胞状卵胞数(AFC)由来OGCのIVGを行った場合、OGCの生存性に差は認められないものの、高AFC群の方が顆粒層細胞数は多く、卵子ミトコンドリア活性と核成熟率は高いことが分かった。卵子の発育培養(IVG)中のミトコンドリア活性測定やステロイドホルモン産生能の検討など、平成26年度中の実験目的については予定通り進展している。体内発育卵子の発生能動態を検討するための超音波ガイド下での生体牛からの採卵を相当数繰り返し、体内発育卵子固有の発生能とそれに影響を与える要因をある程度確認できた。また、IVG卵子を体内発育卵子のモデルとして活用しより詳細な検討を開始している。現在、卵子内のミトコンドリア活性および活性酸素種産生量の確認を行うとともに、ミトコンドリア活性が低く発生能が低いと考えられる牛から採取した卵子の発生能改善に関する研究に着手した。野生動物種からの卵子採取は、個体死亡後に新鮮な卵巣を入手することが困難なため難航している。代わりに体外受精あるいは人工授精に必要な精子を安定的かつ安全に採取する方法の開発に取り組んでおり、クマ科動物からほぼ確実な採取方法を開発した。繁殖学1IVG実験:牛のOCGC培養に約2週間、体外受精を行うと更に1週間を要するため、1回の実験結果が出るまでに約1カ月を要する。その他の動物においては最適な培養期間すら不明である。そのため、本研究は複数年度に亘る研究を計画しており、平成25年度に実施した研究を継続して行う。2体内発育卵子の発生能に影響及ぼす要因に関する検討:体内で様々な発育段階にある卵胞から卵子を採取し、その発生能を確認する実験を継続する。同時にIVG卵子の様々な発育段階での性状を精査することによって、卵子の発生能獲得機序の解明を目指す。さらに、発生能が低いと考えられる卵子の発生能改善を目指した培養法の開発を行う。3内卵胞膜細胞が卵胞発育与える影響の解析:本IVG法では卵胞の構成細胞の一つである内卵胞膜細胞の機能解析を行うことは出来ない。そこで本研究では内卵胞膜細胞から分泌されるBMP-4の添加試験を行っている。BMP-4添加によって顆粒層細胞の黄体化が抑制されることが明らかになった。今後は、本IVG法で発育させた卵子の発生能について検討する予定である。4野生動物種への応用:
孤発性筋萎縮側索硬化症における運動ニューロン死へのRNA編集酵素と多因子の関与

代表的な神経変性疾患である筋萎縮性側索硬化症(ALS)におけるRNA編集酵素などの複合的に関与する因子を検討するために、細胞死発現のモデル系を構築した。in vitro系の検討を行うために、アデノウイルスベクターを開発し、in vivo実験系としてマウス胎仔脳への電気穿孔法遺伝子導入によるモデル系を開発した。本系は、複数の遺伝子を同時に簡便に導入できる系であり、複合的な要因の研究に多大なる貢献をすると考えられる。運動ニューロンが選択的に死滅する筋萎縮性側索硬化症(ALS)の原因として、運動ニューロンにおける、RNA編集酵素ADAR2の活性低下やTDP-43、Proglanulinの機能異常が関係していると考えられる。本課題では、細胞死発現のモデル系を構築することにより、これら様々な因子がADAR2を介した運動ニューロン死のカスケードにどのように複合的に関与するのかについて検討する。計画初年度に当たる平成21年度はin vitro系においてADAR2とTDP-43、Progranulinとの相互作用の検討を行うために、ウイルスベクターを開発した。まず、野生型および変異型のTDP-43遺伝子、Progranulin遺伝子、ADAR2遺伝子をクローニングし、ウイルスベクター(Adeno-X^<TM> Vira Trak DsRed/GFP-Express Expression System 2)に組み込み精製した。現在はこれらのベクターの発現効率などについて培養細胞を用いて検討中である。また本計画ではin vivo実験系の開発を目標としているが、対象となる遺伝子の選択に使用するためにin vitro系の開発も行う。そのためにはニューロン・グリア共培養系の確立が必要である。本年度にはマウス胎仔より大脳皮質を分離し、ニューロン培養系ならびにアストログリア培養系を開発を試みた。現在、細胞処理条件の検討、使用するマウス日齢の検討、培養液添加剤の検討を行っている。次年度では、これらのウイルスベクターならびに初代培養系を用いて、in vitroにおけるADAR2とTDP-43、Progranulinとの相互作用を検討する。筋萎縮性側索硬化症(ALS)における細胞死発現のモデル系を構築することにより、「TDP-43をはじめとする他の因子」が複合的にADAR2を介した運動ニューロン死に関与するのかについて検討する。平成21年度はin vitro系においてADAR2とTDP-43との相互作用の検討を行うために、アデノウイルスベクターを開発した。平成22年度においては、初代培養系を用い相互作用の検討を行う予定であったが、マウスin vivoにおける長期変化を観察する重要性を考え、胎仔脳への電気穿孔法による遺伝子導入法の開発を先行した。まずCAGプロモータを有するベクター(pCX-EGFP)を用い、FLAG、mycタグを付加した野生型TDP-43遺伝子と変異型TDP-43(M337V、A315T)遺伝子を組み込んだプラスミドを作成した。本プラスミドをE12.5ICRマウス胎仔側脳室に注入し、電気穿孔法により大脳皮質ニューロンにTDP-43遺伝子を導入することに成功した。遺伝子導入されたニューロンは、同時に注入されたEGFP遺伝子の発現、もしくはFLAG、mycタグの発現により同定した。変異型遺伝子の導入により、生後早期に皮質ニューロン死が起きている可能性があり、現在アポトーシスなどの各種マーカー、細胞数により定量的に検討中である。本法は遺伝子組換え動物作成などに比較しはるかに短い時間で簡便に行える。今年度の結果により、基本的な手技は確立されており、様々な遺伝子の作用を検討できる可能性が示された。今後は長期、生体内における変異遺伝子の効果を観察するため、遺伝子導入後3-6ヶ月程度において、脳組織の検討を行ない、封入体形成、グリア細胞の変化などの観察を行う予定である。本年度は、in vivo遺伝子導入法を用いて、様々なTDP-43遺伝子プラスミドを導入した。GFPタグ付き野生型全長、変異型全長(M337V、A315T)遺伝子を電気穿孔法を用いて、マウス胎仔(E13)大脳皮質に導入した。導入マウスでは、GFP遺伝子の発現は認められるものの、野生型、変異型のいずれにおいてもヒト病理を反映するようなTDP-43封入体は観察されなかった。そのため、患者脳で蓄積が確認されているTDP-43のC末断片を発現するプラスミドを作成し導入した。同様に、野生型C末断片、変異型(M337V)C末断片遺伝子を導入した。これにより、野生型、変異型のいずれにおいても、TDP-43陽性封入体が細胞質内に確認された。生後21日齢の変異型C末断片導入マウスにおいて、封入体は抗リン酸化TDP-43抗体、抗活性化カスパーゼ3抗体、抗ユビキチン抗体において標識されるものが認められた。これらは筋萎縮性側索硬化症組織において観察される病理像を再現したものであり、本系が疾患モデルとして利用可能であることが示された。

今まで、遺伝子組換えマウスなどを含め、ヒト病理像を再現したモデルは極めて希であり、本系は重要性が高いものである。本系により、全長型TDP-43遺伝子導入のみでは、封入体形成はなされないが、C末断片型TDP-43遺伝子を導入すれば、封入体が形成されることが示された。現在まで、C末断片形成機構についてはその詳細が明らかになっていないが、本研究により、同機構が封入体形成に重要な役割を果たしていることが示唆された。
情報科教育推進のためのｅラーニング教材と教員支援システムの開発

高校の情報科教育を推進するために、次のようなeラーニング教材と教員支援システムを開発し一部を活用した。(1)情報科教員研修用のeラーニング教材(教育工学等)、(2)授業改善を行うための授業カテゴリー分析等、授業過程を可視化する授業評価システム、(3)情報科の学習到達度を測るための評価テスト、(4)プログラミング学習のための支援ツール等、新しい学習指導要領の学習内容に対応する情報科のディジタル教材。(1)情報科教員研修用のeラーニング教材:情報科の教育法に関係するeラーニング教材として、大学の教職課程の講義「教育工学」を録画(90分×15回)し、他の授業録画教材と合わせて公開する準備を進めた。(2)授業評価システムを用いた情報科教員の授業評価・改善:授業の動画にコメントを記述して評価するシステム(以下、「授業評価システム」)はすでに分担者の大倉が開発済である。この授業評価システムを大学の教員養成課程の授業科目「教科教育法(情報)」で活用した。授業で実施した学生の模擬授業を録画し、授業評価システムを利用して模擬授業動画に評価コメントを入力し、授業者は授業の振り返りを行った。実践で利用した後、システムの評価を行い、安定して動作するように授業評価システムを改善した。(3)Web情報科診断評価テストの開発と活用:高校情報科の学習終了時に身につけるべき基本的な学習内容を診断評価するための質問票を開発した。平成1820年度に実施した「情報科学習診断テスト」を情報科の新教育課程に適用できるように内容を全面的に改訂したものである。この新情報科学習診断テストを大学の新入生を対象に受検させ、その結果を分析した。(4)高校新教育課程での情報科教育用教材の開発:新教育課程での情報科の科目(「情報の科学」と「社会と情報」)の学習内容に沿って、学習内容に特徴的な教育用教材を開発した。H25年度は主として「情報の科学」の教材を開発した。また、開発した教材を情報科教員が授業で活用し、その教員からのフィードバックを得て教材を改善することができるように、教材共有のためのSNSサイトを構築した。構築した教材共有SNSサイトを用いて「情報の科学」用のプログラミング教材をSNSにアップロードし、教材を共有しながら質の向上を実現する方法について研究を行った。(1)情報科教員研修用のeラーニング教材:情報科の教育方法の開発や見直しに参考になるeラーニング教材として、平成25年度の授業で収録した「教育工学」の授業動画を編集し、その一部を試用した。また、他の授業録画教材(情報システム系科目)と合わせて公開する準備を進めた。(2)授業評価システムを用いた情報科教員の授業評価・改善:授業動画にコメントをリンクする授業相互評価機能(平成25年度までに開発済)に加えて、授業のカテゴリー分析、ST分析を半自動化する機能を付加し、授業での教員と受講者の行為を可視化して評価する機能を実現した。教職課程の授業科目「教科教育法(情報)」の模擬授業を評価する際に、開発した授業評価システムを試用した結果、授業動画にコメントを付与する機能とともに、授業行為を定量的に分析・可視化する機能を利用することによって、模擬授業実施者は、より分析的に授業を評価・改善することができるようになった。(3)Web情報科診断評価テストの開発と活用:平成25年度に新教育課程用に改訂した「情報科学習診断テスト」を大学の新入生を対象に受検させ、その結果を分析し、その後の情報教育に活用した。(4)高校新教育課程での情報科教育用教材の開発:情報科の科目「社会と情報」の教材では、教員の要望が高い情報モラルの学習教材を開発した。具体的には、高校生用のリーフレット教材「スマホと情報モラル」(簡易版:全10ページ、詳細版:全21ページ)を開発し、情報科教員が情報モラルの指導に利用できるようにした。「情報の科学」の教材としては、平成25年度に開発したプログラミング支援システム(FreeBee)について、高校の教員が多数参加する日本情報科教育学会の全国大会で発表し、利用の普及に努めた。また研究の一部で、情報科教員のための情報科教育法の図書や、情報メディア等4科目の教授用指導書の出版を行った。本研究の課題は、(1)情報科教員研修用のeラーニング教材の開発、(2)授業改善のための授業評価システムの開発、(3)情報科の到達度評価の問題及びeラーニング教材の開発、(4)新教育課程に対応する情報科のデジタル教材を開発することによって、情報科教員の総合的な支援環境を実現することである。(1)については、平成26年度には「教育工学」の講義を撮影してeラーニング教材にした。また、平成27年度には「情報ネットワーク」、「マルチメディア技術」、「教科教育法(情報)」の講義映像を収録するなど、情報科教員用のeラーニング教材を開発した。(2)については、平成26年度に授業中の学習者と教員の行為を分析するカテゴリー分析とS-T分析を半自動化するシステムを開発した。さらに、平成27年度にはカテゴリー分析結果を可視化するツール、および授業計画と実際の授業との差異をカテゴリーで可視化するツールを開発し、大学の教職課程の必修科目(教科教育法(情報))の模擬授業で活用した。(3)については、H25年度に情報科の知識・理解を確認する到達度テスト(質問数40問)を開発し、大学入学時の学生を対象に試行して到達度テストの評価を行った。関係する組織を通じて一部の大学でプレースメントテストとして活用している。

(4)については、「情報の科学」の教材として、プログラミング学習支援のために処理構造を可視するテキストエディタを開発して活用している。また、「社会と情報」については、情報モラル教育用教材を開発して活用している。研究成果に関しては、日本情報科教育学会、教育システム情報学会等の学会の論文や研究発表で公表するとともに、高校の情報科教員の研究組織を通じて、前述の教材や支援システム等の成果物を情報科担当教員に紹介して利用の促進を行った。高校の情報科教育を推進するために、次のようなeラーニング教材と教員支援システムを開発し一部を活用した。(1)情報科教員研修用のeラーニング教材(教育工学等)、(2)授業改善を行うための授業カテゴリー分析等、授業過程を可視化する授業評価システム、(3)情報科の学習到達度を測るための評価テスト、(4)プログラミング学習のための支援ツール等、新しい学習指導要領の学習内容に対応する情報科のディジタル教材。本科学研究費補助金での研究は、次の4つの研究内容から構成されている。(1)(4)の研究課題ごとに、それぞれ実施した内容を記し、達成度を検討すると次のようになる。(1)情報科教員研修用のeラーニング教材:現在、高校で情報科を担当する教員の多くは、大学での情報の教育方法を学んでいない教員が大半である。平成26年度は、当初の予定通り「教育工学」のビデオ教材を編集し視聴できるように準備した。(2)授業改善のための授業評価システム:授業動画にコメントをリンクする授業相互評価機能に加えて、授業のカテゴリー分析、ST分析を半自動化する機能を付加し、授業での教員と受講者の行為を可視化して評価する機能を実現した。当初計画した授業評価システムの機能強化を実現したものである。模擬授業で試用した結果、これまでの授業評価システムでは明らかにできなかった授業の課題を可視化することができ、想定以上の成果を挙げることができた。(3)情報科診断評価テストの開発と活用:この情報科診断評価テストについては、残念ながら、平成25年度に作成したテストを継続して活用したにとどまったが、安定した評価テストとして広く活用されるようになった。(4)高校新教育課程での情報科教育用教材の開発:平成26年度は、高校の情報科教育で大切な内容である「情報モラル」の教材開発を行った。利用する高校の実情に応じて選択することができるように、簡易版と詳細版の2種類を開発することができた。また、情報科教員のための情報科教育法の図書や、情報メディア等4科目の教授用指導書の出版を行った。以上、(1)(4)の研究課題に沿って平成26年度の研究成果を説明した。(1)と(3)については予定通り、(2)と(4)については予定をやや上回る成果を挙げることができたといえる。したがって、全体的には、おおむね順調に研究がすすんでいると判定した。
原子力災害における地域の中核病院看護師への防災教育システムの構築

福島原発事故後、、原子力規制委員会による原子力災害対策指針において、原子力災害に対する高度被ばく医療支援センター及び原子力災害医療・総合支援センターの役割が明確に定義づけされた。その役割の中で、地域の中核病院である原子力災害拠点病院に対する専門的助言を行うことが掲げられており、長崎大学を含む5施設がその役割を担うことになった。そこで、本研究の目的は、、長崎大学が管轄する九州の拠点病院看護師における原子力災害医療についての知識度を調査し、今後の事故時対応について強化すべき点を明確にすることとした。2018年度は、研究組織を明確にし、原子力災害拠点病院看護師の原子力災害に備えた知識の把握を行うことを目的とした。そのため、本研究テーマに関する研究計画を作成し、所属機関の倫理委員会の承諾を得た。その後原子力災害拠点病院5施設の看護師552名にアンケート調査を行った。その結果、408名の回答があり、放射線防護に関する知識が5割以下であることが明確になった。また、拠点病院であることの認知の有無が知識に影響していることが示唆された。この結果をまとめ、日本放射線看護学会で発表した。さらに、本調査結果を、UPZ内外の看護師で比較した。UPZ内の看護師は原子力災害医療への関心が高かった。しかし、放射線に関する知識は、UPZ内外で有意な差は見られなかった。この結果を、日本看護研究学会、九州・沖縄地方会で発表した。2019年度の課題である、「看護師防災マップ」作成の為の、GIS (Geographic Information System:地理情報システム)についての研修も、研究協力者とともに受講し、マップ作成の準備を行っている。2018年度の予定は、原子力拠点病院の看護師に調査を行い、結果の分析までとしていたため、予定通りである。今後は、調査結果を論文としてまとめ公表する。原子力災害拠点病院の看護師に対して、研修企画を立案し実践する。その際、長崎県の拠点病院の看護師に関しては、長崎県看護協会と連携し、研修を実践する。それ以外の佐賀県、鹿児島県の拠点病院については、長崎大学原子力災害対策本部と協力して実施する。「看護師防災マップ」作成の為の、地理的情報の整理を行い、マップ作成にとりかかる。次年度使用額が、3062円となっているのは、研究は概ね順調に進展しているが、少額の次年度使用が生じた。その分は、2019年度の交通費の一部として使用する。
子連れ利用可能なコワーキングスペースの実証研究

1、社会的課題の構造と国際的な動向の調査:日本建築学会において「子連れの空間学」というシンポジウムを企画し2019年度開催に向けて当該分野の関連研究者と議論を行い、国内で子連れ出勤を導入した先導的企業の参画を得た。これにより、仕事/子育ての社会課題を取り巻く社会制度、保育、家庭、職場、地域における社会的、物理的環境の総体としての構造を捉え直すための進展が得られた。また、制度および社会状況が異なる国際的な動向として予定通り女性就業率が高いスウェーデンの幼児教育施設の視察を行った。2、子連れでの仕事を可能にする空間的要件と運営上の課題の調査:子連れで仕事をする空間として、子どもと親の双方が遊びや勉強、仕事に集中でき、かつお互いに安心して過ごせる環境や、複数の親子が共存さらには交流可能な空間が求められる。こうした利用を可能にする空間的な要件について、空間と利用行動の関係、子どもの年齢との関係、利用者のライフスタイルに与えた効果の検証を行い、その成果の一部を日本建築学会計画系論文集に発表した。また当該研究成果を活用して岐阜県下呂市の子連れコワーキングスペースの設計を担い、2019年2月に開所した。これは、社会実装の実現として大きな成果である。3、現状のライフスタイルに与える効果と新しいライフスタイルの調査:新しいワークライフスタイルを試みる被験者実験として、当該研究の技術補佐員が子連れ出勤を行い、実証実験スペースとしての子連れコワーキングスペースを利用する体制を構築した。日本建築学会において「子連れの空間学」というシンポジウムによって研究連携や情報入手、関連研究者や実践者との重要な議論の場を企画できたこと。(開催は次年度)日本建築学会計画系論文集に研究成果の一部を掲載できたこと。社会実装として岐阜県下呂市の子連れコワーキングスペースが完成したこと。以上の具体的成果が得られているため。1、社会的課題の構造と国際的な動向の調査:「子連れの空間学」というシンポジウムを企画し2019年6月に開催し、当該分野の関連研究者や企業での実践者と議論を行い、仕事/子育ての社会課題を取り巻く社会制度、保育、家庭、職場、地域における社会的、物理的環境の総体としての構造を捉え直す。また、制度および社会状況が異なる国際的な動向として女性就業率が低いイタリアの調査を予定する。2、子連れでの仕事を可能にする空間的要件と運営上の課題の調査:子連れで仕事をする空間として、子どもと親の双方が遊びや勉強、仕事に集中でき、かつお互いに安心して過ごせる環境や、複数の親子が共存さらには交流可能な空間について、2018年度に日本建築学会計画系論文集に掲載した論文の続編を執筆する。また当該研究成果を活用した岐阜県下呂市の子連れコワーキングスペースの利用・運営調査を行う。3、現状のライフスタイルに与える効果と新しいライフスタイルの調査: 2018年に構築した新しいワークライフスタイルを試みる被験者実験の体制を活かして、新しいライフスタイルとその効果に関する研究を進める。

2、子連れでの仕事を可能にする空間的要件と運営上の課題の調査:子連れで仕事をする空間として、子どもと親の双方が遊びや勉強、仕事に集中でき、かつお互いに安心して過ごせる環境や、複数の親子が共存さらには交流可能な空間について、2018年度に日本建築学会計画系論文集に掲載した論文の続編を執筆する。また当該研究成果を活用した岐阜県下呂市の子連れコワーキングスペースの利用・運営調査を行う。3、現状のライフスタイルに与える効果と新しいライフスタイルの調査: 2018年に構築した新しいワークライフスタイルを試みる被験者実験の体制を活かして、新しいライフスタイルとその効果に関する研究を進める。
細胞起源の多様性に基づく心臓形成機構の解明と再生デザインの探究

心臓形成に寄与する新たな細胞起源として前耳胞神経堤と原羊膜壁側中胚葉を同定し、各細胞群における表現型の多様性を単一細胞トランスクリプトーム解析で明らかにするとともに、それぞれの分化あるいは遊走を制御すると考えられるシグナルを明らかにした。また、冠動脈形成に関しては、その入口部の起源となる細胞群とリンパ管形成の新たな連携とそこに関わる分子シグナルを明らかにするとともに、虚血による心筋傷害過程にその知見を敷衍することにより、新しい心筋梗塞治療の標的となる可能性を示した。本研究は、我々がこれまで同定した心臓細胞の新たな系譜である頭部(前耳胞)神経堤細胞と胚外に生じる原羊膜壁側中胚葉を中心に、心臓における起源細胞の多能性と多様性、時空間的な分布パターン、細胞運命を明らかにしつつ、鳥類胚のラベル実験などにより心臓形成に寄与する全細胞系譜マップの完成を目指すものである。脊索動物から脊椎動物、羊膜類と進化する過程で獲得されたと考えられるこれらの細胞系譜が他の細胞群とどのように相互作用し、心臓形態の複雑化にどのように寄与しているのかを明らかにし、さらにこれらの知見を基盤として、マウスー鳥類間のキメラ移植実験などを用いて組織再生に最適化された細胞移植による再生戦略を探究することを目的としている。平成27年度は、これまで頭頚部の骨格形成に寄与していると考えられてきた前耳胞領域の頭部神経堤細胞が心臓内に流入し、冠動脈平滑筋はじめ心臓内の構造に広く寄与することを鳥類胚のラベル実験やキメラ移植実験によって示すとともに、マウス胚組織の網羅的遺伝子発現解析からc-Kit陽性の幹細胞様細胞群を含む細胞集団を形成することを見出した。冠動脈形成においては、神経発生などで反発性シグナルとして働くセマフォリンシグナルの欠損によって著しい異常が生じることから、この分子が異なる細胞系譜間の相互作用シグナルの1つとして位置づけられる可能性が示された。また、これまで心臓や血管の形成に関与する中胚葉領域は臓側葉中胚葉と沿軸中胚葉と考えられてきたが、体壁や羊膜の起源となる壁側葉中胚葉からも鰓弓や心臓内に細胞が流入し、心筋細胞などに分化することを見出した。心大血管の新たな起源領域を探索する研究過程で、羊膜や体壁を形成する壁側葉領域から細胞が心臓内に遊走してくるという知見が生じ、そのために細胞動態をリアルタイムで観察し、その運命を追跡することでこの知見を裏付け、心臓形成に対する役割を明らかにする必要が生じ、繰り越し申請を行って平成28年度に研究を継続した。これにより、マウスと鳥類胚において細胞ラベリングと移植を組み合わせ、タイムラプスイメージングで観察することで、本知見を異なる視点と方法論で検証し、論文としてまとめる段階に達した。一方、頭部(前耳胞)神経堤細胞由来の細胞系譜に関しては、冠動脈近位部の平滑筋に加えて大動脈弁・肺動脈弁を形成する間葉系細胞などに分化するとともに、c-Kit陽性の未分化細胞として幹細胞の形質を保っている可能性のある細胞として存在することが明らかになった。また、マウスにおけるレチノイン酸投与実験により、これらの前耳胞神経堤細胞の心臓への遊走・分化にはレチノイン酸シグナルが関与している可能性が考えられた。さらに、派生的研究として、神経堤細胞関連で頭部骨格形成に関する倉谷滋博士(理研)らとの共同研究が進展し、哺乳類と単弓類(爬虫類、鳥類)の鼓膜は進化の過程でそれぞれ独立に獲得されたという進化生物学上の仮説を実験発生学的に証明することができた。本研究は、進化の論争的課題に対して実験発生学的に実証的解明が可能でいることを示したものでもあり、今後理論と実験の連携研究領域を広げていく意味でも意義の大きな新しい展開であると考えられる。平成28年度研究において、体壁や羊膜の起源となる壁側葉中胚葉からも鰓弓や心臓内に細胞が流入し、心筋細胞などに分化する知見について、羊膜形成における細胞動態との連動、血管系細胞への分化、それぞれ分化に関与するシグナル分子の役割なども含めて論文発表した(Asai R, et al. Sci. Rep. 7(1):8955, 2017.)。心臓内に遊走する神経堤細胞の分布やレチノイン酸シグナルの影響を示すとともに、単一細胞レベルのRNA-seqによる網羅的遺伝子発現解析から心臓内の神経堤細胞の多様性と分化特性を明らかにした。現在、病態との関連を含めてこれらの細胞の役割を検討中である。冠動脈形成に関しては、リンパ管形成に依存した入口部形成とセマフォリンシグナルの関与が明らかになり、29年度の重要テーマとなった。

心大血管の新たな起源領域を探索する研究過程で、羊膜や体壁を形成する壁側葉領域から細胞が心臓内に遊走してくるという知見が生じ、そのために細胞動態をリアルタイムで観察し、その運命を追跡することでこの知見を裏付るとともに、羊膜形成における細胞動態との連動、血管系細胞への分化、それぞれ分化に関与するシグナル分子の役割などもさらに明らかになり、繰り越し申請を行って解析を精緻に進めることにより平成29年度に研究を継続した、この成果を論文発表した(Asai R, et al. Sci. Rep. 7(1):8955, 2017)。一方、心臓内に遊走する神経堤細胞の分布やレチノイン酸シグナルの影響を示すとともに、単一細胞レベルのRNA-seqによる網羅的遺伝子発現解析から心臓内の神経堤細胞の多様性と分化特性が明らかになり、病態形成の基盤を理解する上でも新しい知見が得られている。また、マウスにおけるレチノイン酸投与実験により、これらの前耳胞神経堤細胞の心臓への遊走・分化にはレチノイン酸シグナルが関与している可能性が考えられた。冠動脈形成においては、セマフォリンシグナル冠動脈形成や病態形成における役割を明らかにしてきたが、リンパ管形成に依存した冠動脈入口部形成とセマフォリンシグナルの関与が明らかになり、29年度研究として検討を進めた。以上から、計画当初では予期していなかった知見も含め、研究は順調に進んでいると考えている。心臓形成に寄与する新たな細胞起源として前耳胞神経堤と原羊膜壁側中胚葉を同定し、各細胞群における表現型の多様性を単一細胞トランスクリプトーム解析で明らかにするとともに、それぞれの分化あるいは遊走を制御すると考えられるシグナルを明らかにした。また、冠動脈形成に関しては、その入口部の起源となる細胞群とリンパ管形成の新たな連携とそこに関わる分子シグナルを明らかにするとともに、虚血による心筋傷害過程にその知見を敷衍することにより、新しい心筋梗塞治療の標的となる可能性を示した。胚外に生じる原羊膜壁側中胚葉の心臓組織への寄与については、既に論文化して投稿準備に入っており、査読の過程でさらに検証や問題点の洗い出しとその解決を進める。セマフォリンシグナルによる冠動脈形成、レチノイン酸による前耳胞神経堤細胞の制御機構についてもほぼ同様のレベルに達しており、論文化を進める。また、神経堤細胞におけるc-Kit陽性の幹細胞様細胞群や壁側中胚葉における心筋分化能を保持した細胞については、単一細胞レベルの遺伝子発現解析やマーカー分子による細胞同定をさらに進めており、細胞系譜マップの完成とともに、マウスにおける心筋梗塞などの病態での細胞動態や心筋再生の可能性について、当初の予定どおり研究を進める。胚外に生じる原羊膜壁側中胚葉の心臓組織への寄与については、論文発表の内容を単一細胞レベルのRNA-seqなどによってさらに進展させる。セマフォリンシグナルによる冠動脈形成についてもリンパ管形成との関連をさらに解析し、論文化を進める。医歯薬学
高エネルギー物質の衝撃感度制御

高エネルギー物質の衝撃感度を測定し、その感度を制御するための実験装置として、レーザ衝撃波発生装置を製作した。この装置によりナノ秒の1GPa程度の超高圧パルスを発生させることができる。レーザ衝撃波の圧力は、レーザにより誘起されるアルミニウムフライアーの移動速度をドップラー干渉計により測定し、ウゴニオ関係式より計算により求めた。この装置により実際に分子結晶が圧縮されることを確かめるために硫黄結晶を衝撃圧縮し、時間分解ラマンスペクトルを測定して結晶構造の時間変化を観測した。α相の硫黄は衝撃圧縮により50ナノ秒以内に高速融解すること、またビブロンの温度はバルク結晶の温度より高速に励起されることを明らかにした。高エネルギー物質の衝撃感度を決める要因を明らかにするために、RDXやHMXなどの高性能爆薬をダイアモンドアンビルセル(DAC)を用いて1-50GPaに圧縮してFT-IRスペクトル及びUV-Visの吸収スペクトルを観測した。FT-IRスペクトル線の圧力シフトから、RDXは5GPa付近で相変化を起こすことを明らかにした。量子化学計算を行い、この新しい高圧相の構造を推定した。紫外スペクトルの吸収端波長の圧力依存を測定したが、この吸収端シフトはHMXやペンスリットなどの高感度爆薬ではほとんど見られず、NTOなどの低感度爆薬で大きいことを見出した。このことは、高エネルギー物質の衝撃感度はHOMOとLUMOのエネルギー幅の大きさに依存しているわけではないことを示している。
金属錯体ナノ空間内での高分子鎖拘束化学

多孔性金属錯体の細孔内に導入された高分子の特異な物性の測定を行った。例えば、細孔内に導入されたポリエチレングリコール(PEG)がたった数本鎖程度の集合体であるにも関わらず、熱転移挙動を示すことを発見した。また、柔軟な空間に導入された蛍光性オリゴマーがガス吸着時のホストの構造変化と同期してコンフォメーションを変化させ、ガスの種類や圧力に応答する蛍光センサーとして機能することがわかった。ナノサイズの空間に拘束された高分子がどのような物性を示すかということは、高分子ナノ材料の物性解明という観点から非常に重要である。一方で、多孔性金属錯体は、細孔のサイズや表面環境を様々に変化させることができるため、その細孔中に高分子を導入することで、高分子集合体の本数や環境を厳密に制御でき、その物性探索が可能となった。本研究では、細孔中に結晶性のポリエチレングリコール(PEG)を導入し、その相転移挙動を検討した。また、バルクでは相溶しないPEGと直鎖アルカンを同時に細孔中に導入することで、細孔中における相分離挙動についても検討を行った。多孔性金属錯体[Cu_2(L)_2(trietnylenediamine)]。のジカルボキシレート配位子Lを系統的に変化させ、一連の錯体を合成した。加熱により液体状態となったPEG(M_W=600)をそれぞれの錯体の細孔中に拡散させ、導入を行った。DSCにより、細孔サイズが異なる細孔中でのPEGの融点を測定したところ、バルク状態のPEGの融点より低くなり、更に細孔サイズに強く依存して変化することが分かった。一つまり、高分子数本程度の集合体の融点を初めて観測し、更に高分子の本数に依存した融点の変化を明らかにした。また、細孔サイズが同様で配位子Lの置換基の異なる系において、それぞれの錯体の細孔表面とPEGとの相互作用が強いほど、細孔表面に強くトラップされ、融点が上昇することが分かった。一方、PEG(M_W=600)と直鎖アルカンC_<40>H_<82>(重量比1:1)を多孔性錯体の細孔内へと導入したところ、DSCにおいてそれぞれの融点が観測され、片方のゲスト高分子のみを導入した場合よりも融点は低くなり、融解熱は小さくなった。この結果は、細孔中においてPEGとC_<40>H_<82>が、お互いのドメインを分断し合った相分離構造を形成していることを示唆している。導入するPEGとC_<40>H_<82>の重量比を変化させ検討を行うと、比に応じて、それぞれの融点が変化することがわかった。高密度記憶素子の構築に向け、強誘電性高分子のナノ構造体が形成され、その物性評価が盛んに行われている。しかし、基板上の高分子ナノ構造体やナノ細孔中の高分子を用いたこれまでの研究では、数nm以下の領域での物性は未だ明らかになっていない。一方、2nm以下の均一な細孔を有する多孔性金属錯体が近年注目を集めている。多孔性金属錯体の細孔のサイズや表面環境は様々に変化させることができるため、その細孔中に高分子を導入することで、細孔中における高分子の本数や環境を、自在にかつ厳密にコントロールすることが可能となる。本研究では、強誘電性を示すフッ化ビニリデンオリゴマー(o-VDF)を細孔中に導入することで、細孔中における誘電挙動について検討を行った。o-VDFをアセトンに溶解させ、そこに細孔径が1×1nm^2である多孔性金属錯体[Tb(benzene tribenzoate)]_n(1)を浸漬した後、窒素雰囲気下で140°Cに加熱することで、融解したo-VDFを細孔内へと導入した。粉末X線回折、窒素吸着測定などにより、多孔性骨格を保持したまま細孔内にo-VDFを導入できたことを確認した。得られた複合体の誘電分散測定を行ったところ、-120°Cおよび0°C付近に誘電緩和を観測した。バルクのo-VDFや錯体1ではこのような緩和挙動は観測されず、細孔中に閉じ込められたo-VDF由来の誘電緩和であると考えられる。複合体において観測された二つの緩和は、共にアレニウス型の周波数依存性を示し、それぞれo-VDFの局所的な運動(-120°C)、再配向に伴うセグメント運動(0°C)に由来することが示唆された。1の細孔中におけるo-VDFの強誘電性についても検討を行った。金属イオンと有機架橋配位子から形成される多孔性金属錯体の特徴の1つに、外部刺激による構造の柔軟な変化が挙げられる。このような柔軟性多孔性金属錯体に発光性分子を導入し、溶媒やガスの吸着によってホスト構造を変化させることができれば、そのホスト変化と同期して発光性分子のコンフォメーションやパッキングが変化し、発光をコントロールできると考えられる。

本研究では、発光性高分子であるPoly(p-phenylene vinylene)(PPV)のユニット構造であるdistyrylbenzene(DSB)を導入し、溶媒分子やガス分子の吸着や熱といった外部刺激を与えることで発光をスイッチングすることを試みた。粉末状のホスト錯体[Zn2(terephthalate)2(triethylenediamine)]n(1)(細孔径=7.5×7.5Å2)とDSBを固相混合後、真空下で加熱してDSBを昇華させてホストへの導入を行った。XRPD測定の結果より、ホスト骨格が元の構造(1)から変形した構造(1')に変化した複合体(1'⊃DSB)であることを確認した。また、その複合体(1'⊃DSB)にアセトニトリルを吸着させると、ホスト骨格が元の構造(1)へと変化した複合体(1⊃[DSB+CH3CN])が得られた。さらに、その複合体(1⊃[DSB+CH3CN])から真空引きによりアセトニトリルを除去するとホスト骨格の構造が保たれた複合体(1⊃DSB)へと変化することがわかった)。蛍光量子収率測定を行った所、1'⊃DSBでは0.02である一方、1⊃[DSB+CH3CN]や1⊃DSBでは0.61、0.54となり、発光強度に大きな差異が見られた。また、1⊃DSBを150°Cで加熱すると、1'⊃DSBの状態に戻り、熱や吸着といった外部刺激によってホスト骨格と共に発光挙動を変化させることができた。そこで、DSBのコンフォメーションを調べるために、IR測定を行った。DSBのC-H面外変角振動に着目すると、1⊃[DSB+CH3CN]や1⊃DSBはバルクと同様のスペクトルを示したが、1'⊃DSBは低波数側にシフトしており、1'の骨格中のDSBはバルクとは異なる状態であると示唆された。理論計算を行った所、DSBの二重結合周りの二面角を大きくするとC-H面外変角振動のピークが低波数側にシフトすることから、1'の骨格中ではDSBはねじれていることが示唆された。DSBのような・共役分子はねじれると無放射失活過程が支配的になるために発光強度が小さくなることが報告されており、これは本系における1'⊃DSBの消光の原因であると考えられる。すなわち、分子のコンフォメーション変化が発光挙動の変化に大きく寄与していることがわかった。
小学校音楽科におけるプログラミング教育のためのカリキュラム開発

本研究の目的は,小学校音楽科において,即興的表現活動をとおして児童の「プログラミング的思考」を育むためのカリキュラムを開発することである。初年度となる平成30年度は,プログラミング教育や即興的表現活動に関連する資料や先行研究,およびプログラミング教育の実践例を収集するとともに,プログラミング教育をテーマとしたシンポジウム等に参加して最新情報の収集につとめた。その他,デンマークの音楽家Carl Bergstrom-Nielsen氏を迎え,即興的表現活動のワークショップ「Creative Music Improvisation」を,また,イギリスで音楽と関わったSTEM教育活動を展開しているグループ「conductive music」のディレクターEnrico Bertelli氏を迎え,レクチャーとフリートーク「新しいテクノロジーを使った音楽教育の可能性」を開催した。実践的研究については,小学校音楽科(高学年)における授業を対象とし,授業者の長山弘とともにその教育的可能性を検討した。この授業の目的は,「元気の良い感じで歌おう」のようなアナログな思考が反映された言葉と,「ヴェロシティ」,「BPM」のようなボーカロイドで一般的に用いられるデジタルな思考が反映された言葉との違いに着目し,ボーカロイドによる歌唱表現を工夫する活動をとおして,児童のなかにある両方の思考を往還させることであった。授業観察をとおして得られた成果と課題は,日本音楽教育学会の大会で発表した(口頭発表,筆頭発表者は長山弘)。また,音楽祭「CMF,クリエイティヴ・ミュージック・フェスティバル2018」のワークショップ「音符を使わない作曲」では,講師として,プログラミングの基本処理をふまえた作曲方法に関する講演と指導を行い,受講生の創作過程および創作物から,今後の研究の示唆を得た。資料や先行研究の収集や,カリキュラム開発のための要点の整理がまだ不十分であることから,「(3)やや遅れている」とした。研究が遅れている理由は,病気療養や「平成30年7月豪雨」に伴う事情といった個人的なものである。今後の推進方策は次の3つである。1.カリキュラムを開発のための要点を整理する。2.カリキュラムの一部を成す授業を開発する。必要に応じて,応募者が勤務する大学の附属小学校のほか,公立・私立小学校にも研究協力を依頼し,実際の授業実践をとおしてカリキュラムとしての妥当性・有用性を検討する。3.研究代表者が平成29年に開発した,スマートフォンやタブレット端末の通信機能を使用して,聴衆の立場にある児童がステージ上の即興演奏に介入することのできる教材《サンカプレイ(Sanka Play)》を取り上げ,その教育的意義をプログラミング教育の視点で検討するとともに,現場の小学校教員にとってより使いやすくなるような改良を試みる。(理由)平成30年度は,物品費として425,000円,旅費として425,000円,謝金として100,000円,その他として50,000円,合計1,000,000円の使用を予定していた。物品費については,購入した書籍が予定よりも少なかったため,予定していた金額のおよそ2/3に留まった。

旅費は,当初予定していた海外への取材を取りやめたため,予定していた金額のおよそ半分の使用に留まった。謝金については,資料の整理のための支出は予定よりも多かったが,「専門家からの専門的知識の提供」のための支出が予定より少なかったため,予定していた金額のおよそ半分の使用に留まった。その他については,論文のダウンロードがすべて無料のものだったため,予定よりも大幅に少ない支出に留まった。結果,合計571,795円の支出となり,計画よりも428,205円少ない金額となった。(使用計画)物品費としては,研究に関わる書籍の購入等に使用する予定である。旅費としては,情報収集,研究成果の発表等に使用する予定である。特に,令和1年度は,マカオで開催されるAPSMER(12th Asia Pacific Symposium for Music Education Research)への参加を予定しているため,旅費等で大きい支出になる見込みである。謝金としては,平成30年度と同様,資料の整理や授業開発・カリキュラム開発のための専門的知見の供与等に関わる謝金にあてる予定である。その他については,学会の大会参加費のための使用も予定している。
腫瘍血管のがん転移への関与の解明とがん転移の制御

腫瘍血管内皮細胞ががんの転移の過程において,がん細胞にどのように影響を与えるのかを検討した.血管内皮細胞のがん転移への関与についてin vivoで解析を進め,転移能が高いがん由来の血管内皮細胞によるがん転移促進の可能性が示唆された.高転移性腫瘍内の血管内皮に特異的に発現する分子について,いくつか候補を見つけた.候補分子をノックダウンすると,上記でみられたがん転移促進がキャンセルされた.さらに,がん患者臨床検体においても,腫瘍血管にそのマーカーの発現が確認された.悪性度の高いがんにおいて,血管内皮細胞由来の分子ががんの転移に関与する可能性が示唆された.腫瘍血管内皮細胞ががんの転移の過程において,がん細胞にどのように影響を与えるのかを検討した.血管内皮細胞のがん転移への関与についてin vivoで解析を進め,転移能が高いがん由来の血管内皮細胞によるがん転移促進の可能性が示唆された.高転移性腫瘍内の血管内皮に特異的に発現する分子について,いくつか候補を見つけた.候補分子をノックダウンすると,上記でみられたがん転移促進がキャンセルされた.さらに,がん患者臨床検体においても,腫瘍血管にそのマーカーの発現が確認された.悪性度の高いがんにおいて,血管内皮細胞由来の分子ががんの転移に関与する可能性が示唆された.がんの血行性転移の初期過程では,がん細胞が血管内皮に遊走,接着し,さらには血管内皮間を通り抜けて血管内に侵入する血管内侵入のステップが必須である.がん細胞と腫瘍血管内皮が接触することから,腫瘍血管内皮の特異性が転移の初期ステップに関与するのではないかと考えた.申請者が所属する研究グループでは,腫瘍血管内皮細胞の分離と培養を行い,それらが正常血管内皮と比較して様々な異常性があることを見出してきた.さらには,転移能が異なるがんの微小環境の違いにより,腫瘍血管内皮は遊走能や増殖能,サイトカインの発現量などさまざまな性質の違いがあることを見出し最近報告した.転移能の異なる腫瘍から血管内皮細胞を分離し,それらを用いてがん細胞との相互作用をin vitroおよびin vivoにおいて解析すること,さらに,腫瘍血管の特異性質のうち転移促進に関わる機構を明らかにして,それらを標的としたがん転移の制御を目指すことを目的とした.1)高転移性腫瘍由来血管内皮細胞(HM-TEC),低転移性腫瘍由来血管内皮細胞(LM-TEC),正常皮膚由来血管内皮細胞(NEC)を分離培養した.2)分離培養した各ECにそれぞれGFP遺伝子導入を行った.3)低転移能のがん細胞にLuciferaseおよびRFP遺伝子を導入した.4)2,3)で作成した細胞を用いて,血管内皮とがん細胞をマウスに皮下移植し,転移の違いを比較した.【2.高転移性腫瘍内の血管内皮に特異的に発現する分子の同定】1)これまで見出してきた腫瘍血管内皮細胞マーカーのうち,低転移性腫瘍由来血管内皮に比べ,高転移性腫瘍由来血管内皮に有意に高く発現している分子を複数同定した.2)着目した分子に対し,siRNAによりノックダウンを行い,in vitroで腫瘍細胞と血管内皮の相互作用を解析した.1.高転移性腫瘍由来血管内皮細胞が発現する分子のがん転移促進に関わるin vivo解析:高転移性腫瘍由来血管内皮に有意に高く発現している分子として遺伝子Xに着目した.遺伝子Xに対するshウィルスベクターの遺伝子組み換えを行い,高転移性腫瘍由来血管内皮に遺伝子導入した.RFPも同時に発現するようにベクターを設計したため,RFP蛍光を指標にフローサイトメトリーによりソーティングし,純度を上げた.ノックダウンを行った腫瘍血管内皮と,Luciferase遺伝子およびVenus遺伝子導入を行った低転移性がん細胞をマウスの皮下に共移植し,循環腫瘍細胞数および肺転移を評価した.その結果,我々が見出した遺伝子Xは,がんの転移に関与しうることが示唆された.2.臨床検体におけるマーカーの発現と転移の検討:臨床検体において,上記で同定した腫瘍血管内皮マーカーの発現を組織免疫染色により解析した.臨床検体として,腎癌,肝臓癌,大腸癌を数例ずつ用いた.今後,統計的に解析するために症例数を増やして検討する.【1.in vivoにおける血管内皮細胞のがん転移促進の解析】として,1)高転移性腫瘍由来血管内皮細胞(HM-TEC),低転移性腫瘍由来血管内皮細胞(LM-TEC),正常皮膚由来血管内皮細胞(NEC)の分離培養,2)分離培養した各ECへのGFP遺伝子導入,3)低転移能のがん細胞へのLuciferaseおよびRFP遺伝子導入,4)2,3)で作成した細胞を用いたマウス移植in vivo実験は順調に進捗した.【2.高転移性腫瘍内の血管内皮に特異的に発現する分子の同定】として,1)低転移性腫瘍由来血管内皮に比べ,高転移性腫瘍由来血管内皮に有意に高く発現している分子の同定において,高転移性腫瘍由来の血管内皮細胞で有意に発現が亢進している遺伝子の解析のためにリストアップされた遺伝子が想定以上に多く、すべての解析に更に2ヶ月を要したため、遅延が生じた.2)着目した分子に対するsiRNAノックダウンによるin vitro解析はその後順調に進んでいる.25年度が最終年度であるため、記入しない。【1.高転移性腫瘍由来血管内皮細胞が発現する分子のがん転移促進に関わるin vivo解析】高転移性腫瘍由来血管内皮に有意に高く発現している分子に対するsh

ウィルスベクターの遺伝子組み換えを行い,高転移性腫瘍由来血管内皮に遺伝子導入する.それにより,安定してその分子の発現をノックダウンする.ノックダウンを行った腫瘍血管内皮と,Luciferase遺伝子およびRFP遺伝子導入を行った低転移性がん細胞をマウスに共移植し,転移の違いを比較する.解析方法は,Circulating Tumor Cell (CTC)としてRFP陽性細胞をフローサイトメトリーで検出し,CTC数を比較する.また,in vivo imaging装置(IVIS Spectrum)を用いてLuciferase陽性細胞を検出し,肺転移を評価する.【2.臨床検体におけるマーカーの発現と転移の検討】臨床検体において,上記1で転移の違いが認められた腫瘍血管内皮マーカーの発現と転移,患者の予後との関連について病理学的な検索を行う.25年度が最終年度であるため、記入しない。
トレハロース蓄積による植物への耐凍性付与に関する研究

まず,タバコ由来のトレハロース分解酵素(トレハラーゼ)遺伝子のクローニングならびに大腸菌での発現を試みた。発現した蛋白質はインクルージョンボディを形成していたため,酵素活性を保持した状態では得られなかったものの,ポリクローナル抗体の抗原として用いることができた.これを用い,野生株のタバコにおけるトレハラーゼの発現を見たところ,その発現量は非常に低いことが確認された.同時に,トレハラーゼアンチセンス遺伝子を導入したトランスジェニック植物(22個体)を作製した.しかしながら,これらのトランスジェニック植物体中でのトレハロース蓄積量を測定した結果,トレハロースの蓄積は確認できなかった.続いて,トレハロース合成系酵素群(TPS;トレハロース6-リン酸合成酵素,TPP;トレハロース6-リン酸フォスファターゼ)の遺伝子のクローニングを試みた.まず,他の植物のDNA配列を基に,TPSおよびTPPコード遺伝子の保存領域からプライマーを作製し,PCRを行い,それぞれ約650bp,約450bp増幅断片を得た.次に,Clontech PCR Select cDNA library作製キットを用い,cDNAライブラリーを作製し,TPSおよびTPPをコードするcDNAクローンのスクリーニングを行った.それぞれの遺伝子についてスクリーニングをした結果,TPPに関しては1クローンのポジティブクローンが得られた.そのクローンは1,854bpからなり,384アミノ酸をコードしていることが明らかになった.TPSについてはcDNAライブラリーのスクリーニングによりポジティブクローンを得ることができなかったため,5'-RACE法および3'-RACE法を行い,2,177bpの塩基配列ならびに676残基の推定アミノ酸配列が決定された.今後は二つの遺伝子の導入によるトレハロースの蓄積を目指していく予定である.まず,タバコ由来のトレハロース分解酵素(トレハラーゼ)遺伝子のクローニングならびに大腸菌での発現を試みた。発現した蛋白質はインクルージョンボディを形成していたため,酵素活性を保持した状態では得られなかったものの,ポリクローナル抗体の抗原として用いることができた.これを用い,野生株のタバコにおけるトレハラーゼの発現を見たところ,その発現量は非常に低いことが確認された.同時に,トレハラーゼアンチセンス遺伝子を導入したトランスジェニック植物(22個体)を作製した.しかしながら,これらのトランスジェニック植物体中でのトレハロース蓄積量を測定した結果,トレハロースの蓄積は確認できなかった.続いて,トレハロース合成系酵素群(TPS;トレハロース6-リン酸合成酵素,TPP;トレハロース6-リン酸フォスファターゼ)の遺伝子のクローニングを試みた.まず,他の植物のDNA配列を基に,TPSおよびTPPコード遺伝子の保存領域からプライマーを作製し,PCRを行い,それぞれ約650bp,約450bp増幅断片を得た.次に,Clontech PCR Select cDNA library作製キットを用い,cDNAライブラリーを作製し,TPSおよびTPPをコードするcDNAクローンのスクリーニングを行った.それぞれの遺伝子についてスクリーニングをした結果,TPPに関しては1クローンのポジティブクローンが得られた.そのクローンは1,854bpからなり,384アミノ酸をコードしていることが明らかになった.TPSについてはcDNAライブラリーのスクリーニングによりポジティブクローンを得ることができなかったため,5'-RACE法および3'-RACE法を行い,2,177bpの塩基配列ならびに676残基の推定アミノ酸配列が決定された.今後は二つの遺伝子の導入によるトレハロースの蓄積を目指していく予定である.本年度はまず,タバコ由来のトレハロース分解酵素(トレハラーゼ)遺伝子のクローニングを完了し,大腸菌での発現を試みた.発現した蛋白質はインクルージョンボディを形成していたため,酵素活性を保持した状態では得られなかったものの,ポリクローナル抗体の抗原として用いることができた.これを用い,野生株のタバコにおけるトレハラーゼの発現を見たところ,その発現量は非常に低いことが確認された.同時に,トレハラーゼアンチセンス遺伝子を導入したトランスジェニック植物(22個体)を作成した.しかしながら,これらのトランスジェニック植物体中でのトレハロース蓄積量を測定した結果,トレハロースの蓄積は確認できなかった.分解系を抑えるためにはRNA干渉法を用いたトランスジェニック植物体の作出を考慮に入れ,来年度も引き続き,分解系を抑えたトレハロースの蓄積を試みる.また,同時にトレハロース合成系酵素群(TPS;トレハロース6-リン酸合成酵素,TPP;トレハロース6-リン酸フォスファターゼ)の遺伝子のクローニングも行っている.これまでに,他の植物のゲノム配列およびESTデータベースを基に,TPSおよびTPPコード遺伝子の保存領域からプライマーを作製し,PCRを行い,それぞれ増幅断片を得た.塩基配列の決定を行ったところ,得られた断片はそれぞれの遺伝子の一部であることが確認された.現在,λZAPIIベクターを用い,cDNAライブラリーを作製し,TPSおよびTPPをコードするcDNAクローンのスクリーニング中である.クローニングしたcDNAが取れ次第,次の段階であるトレハロースを蓄積したトランスジェニック植物体の作出に移る予定である.本年度はトレハロース合成系酵素群(TPS;トレハロース6-リン酸合成酵素,TPP;トレハロース6-リン酸フォスファターゼ)の遺伝子のクローニングを試みた.まず,他の植物のゲノム配列およびESTデータベースを基に,TPSおよびTPPコード遺伝子の保存領域からプライマーを作製し,PCRを行い,それぞれ約650bp,約450bp増幅断片を得た.塩基配列の決定を行ったところ,得られた断片はそれぞれの遺伝子の一部であることが確認された.次に,Clontech PCR Select cDNA library作製キットを用い,cDNAライブラリーを作製し,TPSおよびTPPをコードするcDNAクローンのスクリーニングを行った.