hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重複及び頻回受診者の受療行動に関連する行動科学的要因に関する研究

地域における多・重複受診者の受療行動及び服薬状況などの実態把握を目的として、T県A市の老人医療受給対象者のうち、1997年68月又は1998年68月の期間で受診件数(診療報酬請求明細書の枚数)が上位1%の者(多受診者)、及び1月間に同一診療科を3か所以上受診したか、2月以上連続して同一診療科を2か所以上受診した者(重複受診者)を対象に保健婦による聞き取り調査を実施した。調査対象とされた317人中、241人(76.0%)から回答が得られた。薬剤服用状況については、処方された薬剤を全て服用すると回答した者が202人(83.8%)、一部のみ服用すると回答した者が39人(16.2%)であった。1日に処方されている薬剤数の合計は、平均11.8錠であった。最大値は37錠であり、「なし」と回答した者が5名認められた。1日平均5-9錠を処方されている者が全体で73人(30.3%)ともっとも多く、33人(13.7%)が1日20錠以上の薬剤を処方されていた。薬剤服用状況別に1日の平均処方薬剤数をみると、一部のみ服用すると回答した群が10.2錠、全て服用すると回答した群が12.2錠と、全て服用する者の方でより多くの薬剤を処方されている傾向が認められた。老人保健医療給付対象者中の多・重複受診者の大半が処方された薬剤を全て服用していたことが明らかになった。しかし、実際に受けている医療行為の全てが有効に利用されているわけではない事例も存在することが示された。高齢者に必要な医療サービスを提供しつつ、医療費の高騰を抑制するためには、多・重複受診者と判定されたものを一律に指導するのではなく、診療内容に関する情報を把握しておくことが重要と考えられた。老人保健医療における患者自己負担制度の変更と受療行動の関連を検討する目的で、T県A市における老人医療受給対象者のうち、1997年6月から8月の間の受診件数(診療報酬請求明細書の枚数)が上位1%にある者(多受診者)及び特定の一月間に同一診療科を3か所以上受診したもの、もしくは2か月以上連続して同一診療科を2か所以上受診していた者(重複受診者)の受療行動を検討した。1996年3月1998年2月の期間に死亡、転出、入院および入所の経験があるものを除外した87名を分析対象とした。対象者の診療報酬請求明細書を、各個人別及び月別に診療実日数、医療費総額を集計した。今回調査対象となった87名の性、年齢分布は28名(32.2%)が男、59名(67.8%)が女、最高齢者は91歳、もっとも若かった者は68歳であった。また、年齢の平均値は77.1歳であった。70歳未満を除く全ての年齢階級で女の方が多く、特に75-79歳では30人中23人(76.7%)が女であった。期間中の調査対象者の医療費総額の平均値は142万3千円(年間71万1500円)であった。一人あたり医療費、受診件数は1998年9月の自己負担制度改定前に一時的な上昇を示した後に、減少傾向に転じ、1996年の水準まで戻る形の推移を示した。1か月あたり日数、一日あたり費用は制度変更前後で比較しても、特徴的な変化が認められなかった。医療費総額を月別に見た場合、1997年3月より7月にかけて増加し9月以降一転して減少するという推移を示したのは、1件あたり日数及び一日あたり費用の推移には大きな変化がなっかたことから、一人あたり受診件数の変動によると考えられた。

高齢者に必要な医療サービスを提供しつつ、医療費の高騰を抑制するためには、多・重複受診者と判定されたものを一律に指導するのではなく、診療内容に関する情報を把握しておくことが重要と考えられた。
スクロール表示の読みの有効視野に及ぼす処理の深さの効果

本研究では,CRT上を右から左に移動する文章の読みに際して,読み手に求める処理のレベルを系統的に変化させ,それが有効視野に与える効果を検討した.読み手に求めた処理レベルは、文字の形態処理から文脈情報の処理までであり,それが有効視野の大きさに与える影響を分析することを通して,読みにおける有効視野を規定する要因について考察した.本研究では,CRT上で文章を提示する領域を制限(1文字30文字)し,それぞれの提示領域で,被験者に求める作業に最適な文字移動の速度を測定した後,それに基づいて有効視野を推定した.文章の提示及び移動速度の計測にはパーソナルコンピュータ(NEC製)を用いた.句読点位置の検出・・文字列の相対的な空白箇所の検出で,文字の形態処理のみで遂行可能特定助詞の検出・・・文字列から助詞相当の文字を検出し,それが助詞かどうか判断する処理助詞の誤用の検出・・名詞句,動詞句を検出し,句列が分を構成するかどうかを判断する処理普通の読み・・・・・総合的な処理(トップダウン的な文脈処理を含む)以上の課題毎に最適移動速度から有効視野を推定したところ,形態素処理以上の言語情報処理を必須とする課題(句読点位置の検出課題以外の課題)では10文字前後であり,言語情報処理を要しない課題(句読点位置の検出)では15文字前後であった.このことから,読みの有効視野は10文字前後であること.また,有効視野の大きさは文の構造解析処理やトップダウン的な文脈処理の影響を受けず,読みの初期的段階での形態素処理によってのみ規定されることが見いだされた.本研究では,CRT上を右から左に移動する文章の読みに際して,読み手に求める処理のレベルを系統的に変化させ,それが有効視野に与える効果を検討した.読み手に求めた処理レベルは、文字の形態処理から文脈情報の処理までであり,それが有効視野の大きさに与える影響を分析することを通して,読みにおける有効視野を規定する要因について考察した.本研究では,CRT上で文章を提示する領域を制限(1文字30文字)し,それぞれの提示領域で,被験者に求める作業に最適な文字移動の速度を測定した後,それに基づいて有効視野を推定した.文章の提示及び移動速度の計測にはパーソナルコンピュータ(NEC製)を用いた.句読点位置の検出・・文字列の相対的な空白箇所の検出で,文字の形態処理のみで遂行可能特定助詞の検出・・・文字列から助詞相当の文字を検出し,それが助詞かどうか判断する処理助詞の誤用の検出・・名詞句,動詞句を検出し,句列が分を構成するかどうかを判断する処理普通の読み・・・・・総合的な処理(トップダウン的な文脈処理を含む)以上の課題毎に最適移動速度から有効視野を推定したところ,形態素処理以上の言語情報処理を必須とする課題(句読点位置の検出課題以外の課題)では10文字前後であり,言語情報処理を要しない課題(句読点位置の検出)では15文字前後であった.このことから,読みの有効視野は10文字前後であること.また,有効視野の大きさは文の構造解析処理やトップダウン的な文脈処理の影響を受けず,読みの初期的段階での形態素処理によってのみ規定されることが見いだされた.
レ-ザラマン分光によるその場観察を用いた結晶成長の原子レベル制御

昨年度レ-ザラマン分光法によるその場観察が可能な気相エピタキシャル装置の設計と製作を終了したので、本年度はその装置を用いてエピタキシャル成長の実験を本格的に開始した。基板温度700°C程度まではラマンスペクトルの測定が可能であることがわかった。また、このような系では成長反応により生じる各種物質がプロ-ブ光導入用の窓の部分に付着し、ラマンスペクトルの測定に支障をきたすことが懸念されかだ、反応開始後2時間程度までは、測定できることがわかった。したがって、結晶成長の初期においてその場観察を行うためには、測定手法上特に問題はない。本研究ではエピタキシ-に伴う応力の変化を測定し、その機構を明らかにすることが重要な目的である。ラマンスペクトルは試料の温度上昇だけでも変化するため、まず厚さが既知である各種絶縁膜を形成した半導体を加熱しながら、ラマンスペクトルの測定を行った。Siの場合、SiO_2およびSi_3N_4のいずれを形成しても低温では基板に圧縮応力が加わるが、約350°C以上では引張りの方向に変化すること、またGaAsの場合は、温度によらず引張り応力が加わり高温ほど大きくなることが明らかになった。ピ-クシフトの温度による変化とともに、半値幅の変化についても検討を行った。これらの結果から、半導体中の応力は非常に複雑な変化を示すことが明らかになるとともに、今後ヘテロ成長中のその場観察を行う際、注意すべき点が明らかになった。
定常的な外場負荷環境での組織形成過程の放射光によるその場観察

Al-Ag単結晶試料を用い、引張変形下でのGPゾーン形成及び成長のキネティクスを2次元放射光小角散乱強度のその場測定によって調べた。高分子材料の剪断変形下の相分離過程を比較した場合に以下のような特徴を持つ事が明らかとなった。(1)剪断歪は高分子の場合のように一様なもににはならない。(2)しかしながら、明確なゾーン成長の鈍化と非常に小さいながらも形状異方性の出現が認められた。成長則の変化に関してはゾーンの切断機構による破壊と、それに対する拡散律速成長の競合が支配的であるが、ゾーン破壊は本実験条件下では析出体積率の減少とは結びつかない。また剪断による撹乱的抵抗の第二相サイズ依存性が流体と異なる事が成長則の変化がポリマー程大きくない原図であると考えられる。本研究では補助金により作成したその場引張試験機を高エネルギー研放射光実験施設BL-ISAに設置して2次元その場観察(in-situSR-SAXS)いより構造変化を調べた。本成果は第11回小角散乱国際会議期待講演(99/5)である。外場による擾乱の影響下にある材料の相変態挙動はいわゆるDriven Systemsの相変態過程としての基礎的研究課題として魅力ある課題である。本研究では塑性変形下での拡散変態過程のその場観察を目的として時分割放射光小角散乱法による実時間測定のための実験システムを開発し、塑性流動下の相分離過程の動力学の解明の具体的ケーススタディーとして単結晶アルミニウム基合金試料を作成、引っ張り変形下でのGPゾーン形成・粗大化課程の解明を試みた。本年度は放射光実験施設の小角散乱ステーションへの組み込みによる実時間測定用のパルスモータ駆動小型荷重負荷装置を設計、制作し、その性能評価と外部制御による動作確認をおこなった。放射光実験施設の改修・再立ち上げ後のビームタイムが98年より利用可能となり、現在装置の実地での試験を開始したところである。これと平行して本実験での単結晶合金試料の成長のためにブリッジマン炉を作成し、Al-Ag合金等のアルミニウム基低濃度合金の単結晶を作成し、予備実験として110面で切り出した試料の2次元小角散乱強度の静的測定をおこなった。得られた散乱パターンの解析からGPゾーンのファセッティングによる強度異方性の評価が強度並びに散乱ベクトルレンジの点において放射光であれば実時間測定によって十分定量化が可能であることを確認できた。次年度の継続研究において、本年度に調整の完了したその場変形装置を放射光小角散乱装置内に組み込んで、相分解並びに粗大化初期における加工変形下の微細組織の発展が非晶質高分子系の剪断変形下の組織発展や塑性変形のない合金中の組織発展とどのように異なるかを時間的な指数則ならびに組織異方性の歪速度依存性との関係から定量化することをめざす。
多粒子系の非線形微分方程式の多重スケール解析

1.Boltzmann-Grad極限の一様評価の導出:多数の粒子からなる系のNewtonの運動方程式において粒子数Nと粒子半径rを積Nr^2(全粒子表面積)=一定という条件のもとで2種のスケール極限N→∞,r→0を取るとBoltzmannが得られる。この収束はO.Lanford(1975)によって数学的証明が与えられた。その証明ではNewton方程式の解のN, rに関する一様性が最も重要である。本研究で、この評価は、いわゆる抽象的Cauchy-Kovalevskayaの定理により、より精密な評価が得られること示した。2.Boltzraann方程式の境界層問題の可解性条件の研究:最も基本的な境界層解は半無限空間の境界値問題の解である。この問題は無限遠における境界条件が過剰決定系になり、無条件では解けない。領域境界での境界値がある制約条件を満たすときのみ解が存在することを初めて証明した。さらにその制約条件の個数は、無限遠におけるMach数Mに依存し、M>1ならば5個、0<M<1では4個、-1<M<0では1個、M<-1では0個であることを明らかにした。証明には解の強いa priori評価を用いた。この評価を導くために、ある重み関数とダンピング項を方程式に導入することを考案した。3.非線形境界層解の安定性の研究:M<-1の場合について、2で得た定常解が時間的に漸近安定であることを証明した。より詳しくは、定常解に近い任意の初期条件にたいして、時間的大域解が存在し、時間舞限大で定常解に指数関数的に収束することを証明した。証明には線形化方程式の解が時間無限大で指数関数的に減衰することをエネルギー評価法により導き、これより非線形発展方程式め積分方程式形式に縮小写像の原理より、漸近安定性を導くことができた。Newton方程式の半微視的極限の研究:多粒子系の基礎運動方程式であるNewton方程式系で、粒子数と粒子サイズをスケールパラメータとしたBoltzmann-Grad極限の存在を証明するための新しい手法を開発した.偏微分方程式論の最も基本的な定理であるCauchy-Kovalevskaya定理を一般化した手法で、無限元連立微分方程式系の解の評価が簡潔に得られることとなり,粒子数無限大でのNewton方程式系の極限の存在が示せる.さらに,同じ手法をBoltzmann Hierachyに用いてEuler極限の存在証明にも応用できることを示した.これは半微視的運動方程式と巨視的流体方程式との直接的な漸近関係についての初めての結果である.同じ手法がBBGKY HierachyのEuler極限に適用できれば,Newton方程式と巨視的方程式の直接の漸近関係が証明できるので、現在研究を続けている.Japan J. Industrial Appl. Math.に掲載境界層理論におけるMilne問題の研究:Milne問題は半無限空間における線形Boltzmann方程式の定常問題であり、境界層理論の中で最も基本的な問題である。この問題については、既に80年代にC.Bardos, F.Golseらにより、ある積分条件の下で一意的な解が存在することと、その解は無限遠ではある有限確定な極限値に収束することが証明されていたのであるが、その極限値の構造は明らかでなかった。筆者は香港市立大学のT.Yang教授およびS.Yu助教授との共同研究により、この極限値の特徴付けに成功した。まず、極限値0を持つ解が存在するための必要十分条件は、その内向き境界値がある有限次元空間と直交することを示し、この有限次元空間と積分条件から問題の極限値が一意的に表現できる公式を導いた。

すでに求めた非線形境界値問題の可解性条件と合わせてCommunications Math.Phys.に掲載が決まっている。非線形境界層解の漸近安定性についての研究:前年度の研究で得た非線形Boltzmann方程式の境界層解のうち、特に無限遠でのMach数が-1より小さい場合にはこの解は時間的に漸近安定であることを証明した。まず、対応する時間発展方程式をこの定常解のまわりで線形化した方程式を考える。それに含まれている有限次元作用素が、今の条件の下では負定値になることを見出した。これを用いるとエネルギー不等式が得られ、これより線形化方程式の解の時間に関する指数的減衰評価が導ける。これはL^2評価である。これよりbootstrapping手法を用いてL^ω評価を導くことができる。これより非線形解の漸近安定性が不動点定理を用いて証明できる。この研究も上記のT.YangとS.Yuとの共同研究であり現在投稿中である。非線形境界層解の漸近安定性についての研究:半無限空間における非線形Boltzmann方程式の定常境界値問題は、境界層理論の中で最も基本的な問題である。既に80年代にC.Bardos, F.Golseらは、ある積分条件の下で一意的な解が存在することを示していた。しかし非線形問題は長らく未解決であったが、前年度に本研究代表者が香港市立大学数学科のT.Yang教授およびS.Yu助教授と行った共同研究により、初めて非線形可解性条件が明らかになった。すなわち、ある条件を満たす境界データに対してのみ解が存在すること、条件の個数は無限遠におけるMach数の大きさに依存すること、また、解を持つ巨魁データの全体は滑らかな多様体を成すこと、を証明した。本年度は、このように得られる定常解の安定性の研究を行った。まず、無限遠のMach数が-1より小さい場合にこの定常解は時間的に指数的漸近安定であることを証明した。そのために、対応する時間発展方程式をこの定常解のまわりで線形化した方程式を考える。これはL^N評価である。これよりbootstrapping手法を用いてL^2評価を導くことができる。これを用いて非線形解の漸近安定性を不動点定理を用いて証明した。この結果はCommunications Math.Phys.に受理された。さらに引き続き、Mach数が1より大きな場合の定常解の漸近安定性の研究を行った。この場合には、上記有限次元差要素が正定値となり、上記の証明法は適用できない。しかし、境界値は時間的に指数減数することの証明に成功し、これと全空間におけるGreen関数の性質を組合すことにより漸近安定性を証明できた。大きな違いは、収束は指数関数的ではなく多項式的である。この研究も上記のT.Yang教授とS.Yu助教授との共同研究であり現在投稿準備中である。
ナノ振動子の機械特性の解明・制御と極微物理量検出への応用

本研究で目的とする「ナノメカニカル振動子を用いた光の放射圧の高感度検出」の実現を目指し、微小荷重検出のためのナノメカニカル振動子および振動子センサの設計および作製を実施した。具体的には2本の梁を対向させて配置して直流電圧で結合した検出デバイスを設計し、電子線リソグラフィを用いたプロセスによりデバイス構造を作製した。本デバイスは一方の梁への光の放射圧印加によって生じるたわみを、梁間に生じるクーロン力の変化を介して他方の梁(ナノメカニカル振動子)の共振周波数変化として検出するものである。SOI基板上にクロムを材料として形成した試作デバイスにおいて、出力1mWのレーザー照射による振動子の共振周波数変化が観測された。ただし本結果はレーザー照射による熱の影響を受けたと推定されるものである。高感度放射圧検出実現のためには材料改質などによるデバイス構造の熱変形の排除が重要となる。一方、このような振動子センサによる微小物理量検出実現のためには、一般に振動子の高性能化が求められる。本研究では振動子センサ高性能化のため、振動子のエネルギー損失の小ささを表す指標であるQ値に着目し、ナノメカニカル振動子の高Q値化に関する実験についても実施した。具体的には高Q値化を実現する振動子構造のひとつとして音叉構造に着目し、音叉型ナノメカニカル振動子の作製および振動特性評価を行った。その結果、真空中ならびに大気中における音叉型ナノメカニカル振動子の高Q値化の効果が実証された。本結果は学会発表および論文発表が行われた。また、同様にリング型ナノメカニカル振動子についても高Q値化を目指した作製および振動特性評価を実施し、これらの結果の学会発表を行った。以上のように、本研究では光の放射圧検出デバイスの設計および作製が進められた。またナノメカニカル振動子の高0値化に関する新たか知見が鼠出された.本研究で目的とする「ナノメカニカル振動子を用いた光の放射圧の高感度検出」の実現を目指し、微小荷重検出のためのナノメカニカル振動子および振動子センサの設計および作製を実施した。またナノメカニカル振動子の高0値化に関する新たか知見が鼠出された.
ケラチノサイト三次元培養系を用いたヒトパピローマウイルス遺伝子機能の解析

1.ケラチノサイト三次元培養系の確立。ヒト角化細胞を用いて三次元培養型を構築した。切片像の観察により皮膚の分化像にかなり近いモデルの構築に成功した。いくつかの分化マーカーに関しては確認済であるが、更に各種の指標となる蛋白の発現を検討している。2.三次元培養系におけるウイルス複製機構の解析。三次元培養系を用いたウイルス複製機構の解析を進める前に、通常の培養細胞系において環状化したHPV・DNAの複製を観察した。ここでは分化に関わらず、低レベルのDNA複製が認められた。この実験系ではHPVのE1、E2が複製に関与しており、その他の遺伝子の機能は観察できなかった。この実験を三次元培養系に適応する予定である。3. E6/E7によるテロメラーゼ活性の調節。HeLa細胞中にはテロメラーゼ活性が高いレベルで検出されるが、E2の発現導入によってテロメラーゼ活性が低下することが明らかとなった。ここにもE6/E7の発現抑制が関与しており、p53やRBなど癌抑制因子を介した機構以外にもE6/E7が癌細胞の増殖能の維持に機能している可能性が示唆された。4. HeLa細胞増殖阻害におけるE2転写活性化能の意義について。HeLaなどHPV陽性癌細胞のE2発現による増殖阻害には、E2の持つ転写活性化能が重要である。この増殖阻害にはE2がE6/E7のプロモーター領域に結合することが必要と考えられており、このE2-DNA結合に転写活性化能が必要であることが示された。しかしこの必要性はDNA側のcontextに依存しており、プロモーター活性の低いDNA領域には転写活性化能を持たないE2でも効率よく結合できることが分かった。
成体脳神経幹細胞の活性化とニューロン新生:その制御機構の解明と可視化技術の開発

成体哺乳類の脳における神経新生の発見は、神経幹細胞の神経系の再生医療への応用の可能性を示した。本研究において私たちは、神経幹細胞の制御因子として同定した2つの蛋白、すなわち、RNA結合蛋白Musashi-1及び糖鎖結合性分泌蛋白Galectin-1の成体脳における生理機能を解析した。また、神経分化を蛍光によって可視化するための『ColorTimer』マウスシステムを構築した。1.神経幹細胞に強く発現するRNA結合蛋白質Musashi1がPABPに結合してPABP-eIF4G間の結合を阻害し、PABP・翻訳開始因子複合体によって促進される5'cap依存的な翻訳を低下させることを明らかにした。この翻訳阻害効果は、Musashi1認識配列を有するRNAでのみ観察された。従ってMusashi1はPABPとelF4Gの結合を競合阻害することにより翻訳を抑制していると考えられた。2.Galectin-1は、その糖鎖結合能によって、成体脳内の神経幹細胞の増殖を制御している事が、我々の研究により示唆された。そこで今回、糖鎖結合型Galectin-1変異体(CS-Galectin-1)固定化カラムを作成し、そこに神経幹細胞を含む細胞破砕溶液を反応させ、Galectin-1と結合する分子群を濃縮、精製した。それらの分子を質量分析計にて同定したところ、Atpla3,GLT-1等の分子群が見出された。また、同時にIntegrinBeta1についても、成体脳内でGalectin-1と結合している事を示唆する結果を得た。今後、これらの分子群の成体脳内での発現パターン、およびGalectin-1との結合が神経幹細胞の制御にどの様に関わっているかについて、詳細に解析する予定である。3.組織免疫染色によりNestin-d4Venusトランスジェニックマウスでは、従来のNestin-EGFPトランスジェニックマウスと比較して、発生期の神経幹細胞の局在が知られている脳室周囲においてより限局した発現パターンが確認された。これらの細胞は分化したニューロンのマーカーであるbeta-tubulinIII陰性であった。さらにFACSを利用した解析によりd4Venus陽性細胞画分には自己複製能と多分化能を有する神経幹細胞が濃縮されることが確認された。2)脳スライス標本を用いて蛍光蛋白質により可視化されたニューロンから、パッチクランプ法により機能解析を行った。トランスジェニックマウスやウイルスベクターを用いて蛍光蛋白質(VenusやYFP)を発現させたニューロンにおいても、細胞膜の性質や膜電位は正常であり、またシナプス刺激に対する応答やシナプス可塑性も影響を受けないことを確認した。3)「ある神経系細胞がどの分化ステージにあるのか」を可視化するためのツール、『Color Timer』システムを構築中である。これまでに、Nestin遺伝子プロモーター/エンハンサー領域を用いて、オレンジ色蛍光蛋白Kusabira-Orange(KO)遺伝子を発現させるトランスジェニックマウス(Nestin/KO)、神経細胞特異的に活性化すると期待されるSCG10プロモーターを用いて黄色蛍光蛋白Venus遺伝子を発現させるトランスジェニックマウス(SCG10/Venus)などを作成した。1)Tumor suppressorの性質を有するlet-7 miRNAにMusashi1が特異的に結合することをゲルシフト法により発見した。Musashi1がRISC複合体の一部であるArgonaute(Ago)と同一の複合体に存在するという知見と合わせると、let-7の生合成,processing,機能発現のいずれかにMusashi1が関わっている可能性が考えられる。let-7は、肺癌、乳癌の細胞でその機能体の発現が減弱されており、let-7とMusashi1の関与は癌発生とMusashi1を結ぶ可能性がある。2)iPS細胞およびES細胞から神経細胞に分化誘導をかけた単離細胞が、活動電位や膜電位依存性電流を発生することをパッチクランプ法により証明し、正常神経機能を獲得していることを明らかにした。一方、機能的なシナプスを成熟脳において形成・維持する因子としてCbln1分子の解析を進めた。4)脳の発達や機能維持のために重要な役割を果たしているとされるドコサヘキサエン酸やアラキドン酸などの多価不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid;PUFA)受容体の一つであるG-protein coupled receptor 40(GPR40)がサル海馬歯状回の顆粒細胞下層の新生ニューロンをはじめ、神経幹細胞および血管内皮細胞、アストロサイトにおいて発現していることを明らかにした。蛍光蛋白トランスジェニックマウスを用いた、神経新生の遺伝子制御メカニズムの解明神経幹細胞マーカーとして最も広く使われているNestinのエンハンサー及びプロモーターによってオレンジ色蛍光蛋白Kusabira-Orange(KO)の産生か制御されるトランスジェニックマウス(nestin/KO Tg)を作製し、それぞれのラインについて、KO蛍光の発現パターンが内在性nestin遺伝子の発現をどの程度正確に反映しているか検討した。その中でベストと思われるラインを、抗Nestin抗体を用いて免疫組織・細胞学的に更に詳細に調べた。

平行し、幼弱神経細胞特異的な発現をドライブするdoublecortin(DCX)遺伝子制御領域を用いて緑色蛍光蛋白EGFPの産生を制御するDCX-EGFPトランスジェニックマウスをアメリカGENSATプログラムより導入し、B6マウスとかけ合わせて戻し交配を行った。更に、これら2種類のマウスをかけ合わせてダブルトランスジェニックマウスを作製し、8週齢マウス脳におけるこれら2種類の蛍光の分有を調べた。Musashilターゲット・PABPの同定とその結合の解析、musashil遺伝子発現レポーターコンストラクトの作製Musashilのターゲットとして、我々は新たにPoly(A)Binding Protein(PABP)を同定し、また、その結合に関しては、MusashilがeIF4F複合体の構成因子の1つであるeIF4Gと競合することを示した。昨年度までに我々が作製した、神経幹・前駆細胞マーカーとして最も広く使われているNestinの遺伝子のエンハンサー及びプロモーターによりオレンジ色蛍光蛋白Kusabira-Orange(KOr)の産生が制御されるトランスジェニック(Tg;nestin/KOr Tg)マウスの複数のラインを免疫組織学的に解析し、オレンジ蛍光がNestin蛋白分子の存在を最も忠実に反映しているラインを同定した。そのラインの動物の神経系細胞を免疫組織細胞学的に処理し、セルソーターを用いて解析したところ、オレンジ色蛍光の強度と細胞内のNestin蛋白の量とは正の相関関係にあることが確認された。更に、Neurosphere Formation Assayにより、オレンジ色蛍光の強度は『stemness』の指標になることも示された。このマウスと、幼弱神経細胞特異的な発現をドライブするdoublecortin(DCX)遺伝子制御領域を用いて緑色蛍光蛋白EGFPの産生を制御するDCX-EGFP Tgマウスとをかけ合わせ、ダブルTgマウス(第1世代『Color Time』マウス)を作製し、胎児(E14.5)及び成体(8週齢)マウス脳における神経新生とこれら2種類の蛍光との関係を調べた。その結果、Nestin陽性の神経幹・前駆細胞がDCX陽性の幼弱神経細胞に分化するに伴い、その細胞が発する蛍光色が予想通りオレンジから緑に変化することが観察された。
川崎病の効果的治療法の開発と病因究明:分子遺伝学的基盤とプロテオーム解析

難治性川崎病に対する初期治療として免疫グロブリン療法とステロイドパルス療法の併用が臨床的に効果的であることが無作為前方視的比較試験により証明された。同時に、この効果的治療法のメカニズムを分子遺伝学的手法により検証した。また、難治性川崎病の層別化スコアの有効性が分子遺伝学的研究で検証された。治療開始が遅れた例に対する治療法の開発を行った。病因に関しては何らかのウイルス感染が関わっている事が示唆され、継続的に研究中である。川崎病における効果的治療法の開発の為、我々が開発したスコアリングシステムを用いて患者を層別化し、重症と予測される症例に対して初期治療として免疫グロブリンとステロイドパルス療法を行った。ランダマイズスタディを12例に対して行い、免疫グロブリン単独療法に比し、ステロイド併用療法が有効であることを証明した。また、同時に分子遺伝学的解析を行い、スコアにて層別化した群において、ハイリスク群において炎症性の遺伝子発現が異なることを証明した。また、ステロイドを加えることにより、広い範囲で炎症性関連遺伝子の発現が抑制されることを証明した。これらの事により、初期治療として、免疫グロブリンとステロイドを供用することが、より効果的に炎症を抑制することを分子遺伝学的に検討した。これらの結果は2009年のPediatric Research誌に発表した。現在、引き続き臨床的効果について検討中である。川崎病の効果的治療法の開発として初期の重症度の層別化および初期治療としてステロイドパルス療法を免疫グロブリン療法に加える強化療法の評価を行った。既にRNA発現を用いた層別化の妥当性および強化療法がRNA発現の面から効果的な事は分子生物学的手法を用いて説明している(Pediatr Res 2009)。今回は前視方的無作為試験を用いて臨床統計的に評価を行った。川崎病児262例に対して、代々から開発した重症度層別化スコアシステム(江上スコアJ.Pediatr 2006)を用いて重症例44例を抽出した。これらをランダムに割り付け、ステロイドパルス療法と免疫グロブリン療法併用群と免疫グロブリン単独療法群で比較をおこなった。エンドポイントは解熱とした。また、冠動脈合併症はZスコアを用いた標準化を行い評価した。エンドポイントの解熱を得られた者は、ステロイドパルス療法と免疫グロブリン併用療法群で有意に多かった。また、Zスコアによる冠動脈評価は、有意にステロイドパルス併用群において冠動脈への悪影響が少ない結果となった。この結果は、現在Pediatrics誌に投稿中である。しかし、これらの療法ににおいても不応例は存在する。それらの例に対して、インフリシキマブの投与を行っている。インフリシキマブはサイトカインを制御する事はよく知られているが、その他の作用は不明である。現在RNA発現解析および核着分子、血管増殖因子の解析中である。細菌層に関しては、川崎病児の頸部リンパ節穿刺液より、ブドウ球菌の培養に成功した。しかし、原因菌かどうか現在プロテオーム解析を用いて検索中である。難治性川崎病に対する効果的治療法の開発川崎病は、自己完結型の疾患であるため、重症度の層別化を行い難治性川崎病を識別し、それぞれの患者の重症度に適した治療を行う必要がある。我々は256人の川崎病児を用いて重症度の層別化スコア江上スコアを作成した(J Pediatr 2006)。Egami score1点,診断病日4日以内,年齢6ヶ月未満,血小板数30万以下,CRP 8mg/dl以上2点,ALT 80IU以上とし3点以上を特異度78%鋭敏度76%で難治性川崎病と予測した。Egami scoreを用いて難治性川崎病と診断した患者を初期治療として免疫グロブリン療法を単独におこなった群とステロイドパルス療法を併用した群にて無作為前方視的比較試験を行った。治療効果は治療終了後36時間の時点での解熱とした。結果はステロイドパルス療法併用群で治療効果が有意差を持って優れていた。また、冠動脈における影響はステロイドパルス療法併用群で有意差を持って少なかった。この結果は2012年のPediatrics誌に掲載された。診断が遅延した症例に対する治療法の開発米国心臓病学会の川崎病に関するガイドラインでは第9病日以内に治療を開始することが望ましいと推奨されている。現実には、11病日を過ぎて初診となる患者も存在する。それらの患者について第20回川崎病の全国調査にて得られた23337名を対象に検討した。初回免疫グロブリン治療が11病日から20病日に行われた164例に二次調査を行った。治療開始が遅い群では不全型川崎病が有意差を持って多かった。治療前後において炎症反応の改善は同等であった。1病日以降に開始のIVIGは、持続する炎症の改善には9病日以内に開始された例と同様に有効であったが、当然のことながら冠動脈障害の予防には不十分であった。

そのため、川崎病が強く疑われる症例では、できるだけ早期にIVIGを開始すべきと考えられた。この結果は2012年のPediatrics誌に掲載された。
緑色を呈する天然型色素の生産技術開発

チロシナーゼは分子状酸素を用いてチロシンを2段階で酸化する。生成したキノンは反応性が高いため、種々の求核性基と非酵素的に結合することが知られている。我々は、ペプチド中のチロシン残基をチロシナーゼ触媒によりキノン化しアミノ酸と反応させ凍結すると、黄、緑、青などの種々の呈色反応が起こることを見出した。凍結下で進行するこの呈色反応は、新しい天然系色素の生産技術開発につながると期待できる。ペプチド結合中のチロシン残基への反応性が高いチロシナーゼをナメコ子実体から精製し、基質ペプチドN-acethyl-Tyr-Val-Glyとアミノ酸と反応させた。限外ろ過膜を用いて反応液からチロシナーゼを除去した後、pHを調整し凍結保存することで呈色させた。反応液をHPLCで分離し吸収スペクトルを測定した結果、緑色の呈色は黄色と青色の混合によることがわかった。黄色の天然色素は多いが青色は少ないことから、青色呈色に着目し、その構造解析を行った。NMRによる解析を試みたが、構造決定には至らなかった。そこで,種々のアミノ酸との反応液についてLC/MS/MS測定による構造解析を行って比較したところ、青色呈色物質を構成している基本構造が明らかになった.次に、反応中間体の検出を検討した。反応液をグリセリン存在下で凍結すると呈色反応速度が遅くなり、反応中間体が検出可能であった。HPLC、LC/MS、LCMS/MSによる解析を行った結果、反応中間体はキノン化した基質ペプチドにアミノ基が結合した構造をもっていた。すなわち本呈色反応において、チロシナーゼによりTyr残基が酸化されて生成したo-キノンに、アミノ酸のアミノ基が求核攻撃して中間体が生成する。凍結下ではo-キノンや中間体が安定化することで、さらにアミノ酸分子が反応して複素環が形成され、青色呈色物質が生成する反応機構が提唱できる。申請者らは、チロシナーゼとチロシン残基を含むペプチドとの反応を研究する過程で、アミノ酸共存下で反応を行ったのち凍結保存すると、反応液は様々な色を呈するようになることを見出した。しかし、本反応の詳細は不明である。一方、緑色は食品を美しく彩り、その魅力を増して食欲をそそる色合いとして好まれ、多くの食品に利用されている。消費者の安全性志向から天然系色素の使用が求められている中で、緑色に関しては不安定なクロロフィル以外の天然型色素は無いのが現状である。本研究では、メラニンのように赤や茶といった色しか知られていなかったチロシナーゼの酵素化学反応を利用し、緑を中心とした、食品に使える様々な色素を作り出す技術を開発することを目的としている。初年度の平成27年度では、モデルペプチドとして、チロシン残基を1つ含みN末端がアセチル化されたトリペプチド(Ac-YVG)とチロシナーゼを、グリシン共存下で反応させて生じた青色反応溶液から呈色物質を精製し、構造解析を実施した。1.反応に必要なチロシナーゼの精製:タンパク質中のチロシン残基に対して活性が高いチロシナーゼを、研究代表者の方法(Biosci. Biotechnol. Biochem. 71 (2007) 1752-1760)を用いてナメコ子実体から精製した。2.呈色物質の分離精製: 4種類のHPLC分析用カラムを用いて、反応液から呈色物質の分離精製を検討した。最も分離が良かったC18カラムでスケールアップ化を図り、4つの溶出ピーク(14)を得た。メインピークの1は青色、2は薄い赤色、3と4はごく薄い赤または青色であった。3.青色呈色物質の構造解析:1を分取し、吸収スペクトル、蛍光スペクトル、質量分析、NMR測定を行った。本呈色反応では、Ac-YVGペプチド中のチロシン残基がチロシナーゼにより酸化されて生成した反応性の高いドーパキノンに、グリシンのアミノ基が結合して青色色素が形成されたと考えている。そこで、溶媒に0.1 %のTFAを加えてペプチド中のカルボキシ基を非解離の状態にし、色素をC18カラムに吸着させて精製を行った。得られた青色物質は、600 nm付近に強い吸収と赤色蛍光を呈すことから、複素環構造をもつと考えられる。MS分析の結果、質量840と898が検出された。MS/MS分析では、質量840と質量898の分解物はほとんど同じであり、また質量898の分解物の中に質量841が検出された。質量840は、Ac-YVGペプチド2つとグリシンが1つ架橋した構造をもち、質量898はAc-YVGペプチド2つにグリシンが2つ架橋した構造をもつと予想される。NMR測定では、1H一次元スペクトルにおいて、CH3基とCH基に相当する化学シフト値に鋭く大きいシグナルが観察された。HMBC法による1H/13C二次元スペクトルにおいては、CH3基、CH基、COO基がそれぞれに結合しているシグナルが検出され、他の官能基との結合は観察されなかった。1H一次元スペクトルのシグナル強度から判断して、低分子不純物の存在が示唆された。そこで、青色呈色物質をゲルろ過クロマトグラフィーにかけたところ、青色の溶出前に緑色が溶出された。

緑色、青色、青色溶出後の無色溶出液について1H-NMR分析を行ったところ、緑色と青色にはアセチル基と芳香環のシグナルがなく、一方、無色の溶出液には芳香環のシグナルが検出された。以上の結果から、青色呈色物質の分離精製にはC18カラムとゲルろ過による精製が有効であり、本法を用いて精製を進めることで青色呈色物質の構造解析が可能であることがわかった。申請者らは、チロシナーゼとチロシン残基を含むペプチドとの反応を研究する過程で、アミノ酸共存下で反応を行ったのち凍結保存すると、反応液は様々な色を呈するようになることを見出した。しかし、本反応の詳細は不明である。一方、緑色は食品を美しく彩り、その魅力を増して食欲をそそる色合いとして好まれ、多くの食品に利用されている。消費者の安全性志向から天然系色素の使用が求められている中で、緑色に関しては不安定なクロロフィル以外の天然型色素は無いのが現状である。本研究では、メラニンのように赤や茶といった色しか知られていなかったチロシナーゼの酵素化学反応を利用し、緑を中心とした、食品に使える様々な色素を作り出す技術を開発することを目的としている。平成27年度では、モデルペプチドとして、チロシン残基を1つ含みN末端がアセチル化されたトリペプチド(Ac-YVG)とチロシナーゼを、グリシン共存下で反応させて生じた青色反応溶液から呈色物質を精製してH-NMR解析を行ったが、構造を特定することができなかった。平成28年度は、新たな知見を得るために、アミノ酸20種類とAc-YVGペプチドをpH条件を変えて反応させたところ、種々の呈色反応液が得られた。その中では、pH 8.7で脂肪族系アミノ酸(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン)を用いた場合に、安定した青色反応液が得られた。C18カラムを用いてピークをそれぞれ13つずつ分離精製したところ、赤色蛍光を示すものと蛍光がないものがあることが分かった。高性能質量分析により構造解析を行った結果、脂肪族系アミノ酸5種類を用いて調製した青色呈色物質は、アミノ酸の部分は違うが基本構造は同じであることがわかった。また、赤色蛍光を示す構造と、蛍光がない構造の基本構造の違いも明らかにすることができた。本呈色反応では、Ac-YVGペプチド中のチロシン残基がチロシナーゼにより酸化されて生成した反応性の高いドーパキノンに、アミノ酸のアミノ基が結合して色素が形成されると考えていたが、その構造は不明であった。初年度はアミノ酸としてグリシンを用いて青色色素の形成を行っていたが、構造決定には至らなかったことから、次年度の平成28年度では20種類のアミノ酸で同様の反応が起こるかどうかを検索して新たな情報を得ることにした。pHによって反応液の色調は異なるが、C18カラムで分離される基本ピークは同じであったことから、形成される物質の種類は同じであり、その比率が異なるだけであることがわかった。たとえば緑色の反応液は、青色と黄色の呈色物質の混合により緑色に見えるということである。そこで、一連の脂肪族系アミノ酸(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン)を用いて生成した青色反応液から青色呈色物質を精製し、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定し、精密質量分析を実施して比較検討を行った。その結果、これらの青色呈色物質の基本構造は、一連の脂肪族アミノ酸の側鎖は異なるが、アミノ酸3つとペプチド1つが複素環を形成している同じ構造であることが分かった。また、強い赤色蛍光の有無についても、構造の違いを明らかにすることができた。本研究の目的の1つである、ペプチドとアミノ酸から酵素反応を利用して作り出した新しい呈色物質の構造を提示することができた。
液中プラズマの放電特性に関する研究

大気圧以上の圧力環境下で高周波液中プラズマを発生させ,その気泡挙動と放電特性を調べた液中プラズマの電離度は0. 4MPaのとき約0. 1%であるが,気泡内の電子は,高周波による荷電粒子の激しい運動によって気泡内に数千Kの化学反応場を提供する。液中プラズマはプラズマ自身を熱源とした沸騰現象であるので高過熱度の沸騰現象を液体中に維持することができる。液中プラズマ内に金属棒を導入すると金属ナノ粒子を合成することができる。液体は気体と比べて分子密度が高く,液体自身の冷却効果が期待できるので,液体中をプラズマ反応場として利用すると,熱に弱い材料への高速成膜が可能となる,本研究の目的は液中プラズマの放電特性を明らかにすることである.このため,液体中でプラズマ発生させ,電流-電圧特性から放電形態を考察し,次に,電子温度,電子密度などのプラズマパラメーターを実測し,基本的な物理現象を把握,最後に,成膜実験,分解実験を実施しプラズマの放電特性工学的応用の可能性を探る大気圧以上の圧力環境下で高周波液中プラズマを発生させ,その気泡挙動と放電特性を調べた液中プラズマの電離度は0. 4MPaのとき約0. 1%であるが,気泡内の電子は,高周波による荷電粒子の激しい運動によって気泡内に数千Kの化学反応場を提供する。本研究では,27MHzの高周波,2.45GHzのマイクロ波を使った針電極からの液中放電実験を施し,プラズマ内部の基本特性と調べた.装置内圧力10kpa大気圧,出力10W440Wの範囲内で実験を行った.まず,プラズマ発生直後の様子を高速度カメラで観察を実施した.その結果,プラズマや気泡が大きく成長し,プラズマや気泡の変化の周期は長くなること,また,容器内圧力が小さいほど気泡の膨張が起こる周が長くなることが明らかになった.気泡内部の圧力はプラズマ発生直後に急激に上昇し,その後,圧力が低下し容器内圧力になる,このときの気泡内部の圧力の最大値は3001000hpaとなる.温度分布は投入電力により変化するが,測定される最も高い温度は投入電力に関わらず,容器内圧力での飽和温度に近い温度であることが,熱電対を用いたプラズマ周辺の温度測定から明らかになった.次に,プラズマの放電特性を調べる目的で,27.12MHzの高周波電源を用いて液中および気相中でプラズマを発生させ,プラズマ発生前後の電流-電圧波形をオシロスコープで測定した。液中プラズマは,気泡中でプラズマが発生しているので,気泡内ではコンデンサと抵抗の並列回路,液体の部分では,純水が誘電体の役割を果たしたコンデンサからなり,これらが直列につながった等価回路であると仮定すると,電流電圧波形を定性的に説明できる.最後に,水の流れの中の液中プラズマの分光測定を行い,電子温度,OH温度を求め,流れと圧力による影響を調べた,液中プラズマの電子温度やOH温度は流れによる影響をほとんどうけないことが明らかになった.系圧力の増加につれて電子温度は減少し,OH温度は増加する.これは従来の気相プラズマと同様の傾向である.水中に27.12MHzの高周波を照射した場合の液中プラズマの多点分光測定を実施した.水中プラズマの発光はHα,Hβ,O(777nm),O(845nm),OH(309nm)が強く発光するが,OHの発光分布のみが他の分布と比べて上側にシフトし,シフト量は圧力の増加によって減少する.電子温度の分布とOHラジカルの回転温度分布が得られた.圧力の増加にしたがい,電子温度は4800K3300Kに減少し,逆に,OHラジカルの回転温度は15003700Kに増加する.電子温度の空間分布は約50kPaでその傾向が大きく変わる.その理由は,電極からの電子の支配的な供給形態が二次電子放出から熱電子放出に変化するためであることが,電極の自己バイアスの測定結果から明らかになった.また,OHラジカルの最大発光強度点の約1mm上側であることが明らかになった.次に,液中プラズマの気泡の発生様式が調べられた.水中プラズマにおける気泡の発生様式は4つに分類することができ,水の沸騰と比較すると共通点が認められるが,fd値(気泡の離脱周波数f,気泡径d)が大きく異なる.これは,水中プラズマが通常の固体面の加熱による沸騰では実現困難な高熱流束領域での沸騰であるからである.また,サブクール状態で電極から離脱した気泡はプラズマを含まなくなるため急激に凝縮するが消滅せずに小さな気泡が残存する.これは水の化学変化によるもので,気体分析から約95%という高濃度の水素であることが判明した.最後に電子レンジを使った有機溶媒の分解実験を実施した.750Wの電子レンジを用いた場合は,発生ガスの74%が水素であり,気体1mol当たりの生成エンタルピは73.9kJ/mol,水素1molを生成させるために必要なエネルギーは640kJ/molであることが明らかになった.

水素ガスの生成効率に関しては,マイクロ波や高周波などの放電形態による大きな差異はなかった.本研究では,減圧状態から4気圧の圧力範囲で液中プラズマを水中で発生させ,その分光測定から,電子温度,電子密度,ガス温度を求めた.本圧力範囲では,電子温度は43003200K,OHの回転温度は,18005000Kとなる.電子密度は1.9×10^<20>から5.8×10^<21>個/m^3であることが明らかになった.液中プラズマの電離度は約0.1%であるが,液中プラズマはこの荷電粒子の運動によって気泡内に数千Kの化学反応場を液中に提供できる,従来の沸騰現象は加熱壁から発生するが,本実験では沸騰現象は,液体中のプラズマを熱源として沸騰が発生する.液中プラズマは通常の加熱壁からの沸騰では実現困難な,数千Kの過熱度を持つ沸騰現象を発生できることを明らかにした.次に,水中に発生するマイクロ波液中プラズマを高速度ビデオカメラで撮影し,プラズマの発生位置を調べた.FDTD法によって数値計算された電界分布と,その電界値から予測される水のエネルギー吸収量を考慮に入れた熱伝導方程式を解き,プラズマ発生部周辺の液体の温度を計算した.その結果,電界が高い地点が最も温度の高い地点になるとは限らないことが明らかになった.高速度カメラによって測定されたプラズマの発生場所と,数値計算から得られた最も温度が高い地点が一致した.通常プラズマは最も電界が強い場所から放電が発生するが,マイクロ波液中プラズマは最も温度が高い地点から放電が開始することが明らかになった.最後に,マイクロ波液中プラズマを利用したナノ粒子の合成実験を実施した.亜鉛電極を利用することで,エタノール中でプラズマを発生させると亜鉛ナノ粒子,水中で発生させると酸化亜鉛ナノ粒子が合成できることを明らかにした.電極上部にプレートを設置することによって,合成速度を制御することが可能となる.本研究の最終目的は液体中でプラズマを発生させる新しいプラズマ技術を利用した製造技術を確立することである.本研究では,高周波水中プラズマを模擬した数値シミュレーションを実施し,電流・電圧波形を解析的に求めた.ボアソン方程式を解いて空間電場を計算し,電子衝突による電離と解離再結合を考慮した.解析で得られた電流・電圧波形には特徴的なピーク及び電流波形の傾きが小さくなる箇所が見られた.これらの特性は電子の移動による空間電位の変化と電極からの二次電子放出が原因の一つであることが明らかになった.次に,プラズマCVDで均一な膜を生成するために,ダイヤモンド状膜の成膜実験とプラズマの分光実験を実施し,プラズマの特性が成膜に及ぼす影響を調べた.液中プラズマでは気泡の影響などにより,膜質を均一にすることが難しいという問題が露呈したため,本研究では気液界面上で高周波プラズマを発生させることで,気液界面の特性は維持したまま気泡運動による影響を排除した.基板に負のバイアス電圧を印加することにより生成される膜の硬度は増加する.分光測定から得られた電子温度,ガス温度はバイアスを印加した基板付近で増加し,この温度の増加が膜質に大きな影響を及ぼすことが明らかになった.マイクロ波液中プラズマを利用したナノ粒子の合成実験を実施した.プラズマの放電形態を制御することで,Mg(OH)_2,Zn/ZnO,Ag,WO_3のナノ粒子の合成速度が制御できることを明らかにした.最後に,発生ガスの分析を実施し,化学平衡計算結果とガスクロマトグラフによる実験結果においてH_2,CO,CO_2のモル分率によい一致を得た.
中国ナシの成熟特性と流通・貯蔵特性

1.チュウゴクナシ果実の成熟特性と貯蔵特性(1)日本産チュウゴクナシ:日本産チュウゴクナシ13品種について,エチレン生成の面から基本的成熟特性を比較検討した。さらに,中国側で研究対象とした中国産チュウゴクナシ品種を持ち帰り(輸入特別許可農林水産省指令5神植第1288号及び6神植第1270号),比較のため供試材料に加えた。その結果,チュウゴクナシは傷害型エチレン生成はすべての品種でみられるが,成熟型エチレン生成は品種によって認められるものと,認められないものがあることが明らかになった。そこで,エチレン生成系について比較検討した所,成熟型エチレン生成が認められない品種は,ACC合成酵素活性が制限要因になっていることが推察された。(2)中国吉林省産チュウゴクナシ:吉林省の主要品種である苹果梨を主体とし,その他大梨,苹博梨,香水梨を加えた4品種について,呼吸活性,エチレン生成及び内容成分含量の変化から樹上成熟特性と追熟特性を比較検討した。その結果,苹果梨の呼吸活性とエチレン生成が樹上及び収穫後のいずれでも他の品種に比べて低いことが明らかになり,貯蔵性が良好であると推察された。そこで,実際に種々の形態での貯蔵試験を穴蔵貯蔵庫で実施し,現在なお調査中である。現時点での判断では4月下旬まで十分貯蔵可能と思われる。(3)中国黒竜江省産チュウゴクナシ:黒竜江省産北方系チュウゴクナシ伏香梨,秋香梨,竜香梨及び晩香梨の4品種について,呼吸活性,エチレン生成及び内容成分含量の変化から樹上成熟特性と追熟特性を比較検討した。その結果,晩香梨の呼吸活性及びエチレン生成が樹上及び収穫後のいずれでも他の品種に比べて特異的に低いことが明らかになり,この品種が貯蔵性に秀れていることが推察された。そこで,実際に穴蔵貯蔵庫で種々の形態での貯蔵試験を実施し,現在なお調査中である。現時点での判断では4月下旬まで十分に貯蔵可能の見通しである。(4)低温耐性:日本産チュウゴクナシ13品種の全果及び果実から誘導したカルスについて,5°C下での低温障害発生状況を調査した。その結果,果肉褐変及び果肉電解質漏出度からみて,4品種では明らかに低温障害の発生が認められたが,その他の品種では障害発生は認められなかった。このような低温感受性の品種間差異の原因を探るため,膜リン脂質脂肪酸組成,トノプラストATPase活性,アブシジン酸含量,プロソン含量等の変化を比較検討したが,この調査の範囲では品種間差異を説明することはできなかった。2.チュウゴクナシ果実のエチレン生成系の遺伝子レベルでの解析チュウゴクナシは品種によって成熟型エチレン生成がみられるものと,みられないものがあることが明らかになった。そこで,エチレン生成系の二つの律速酵素であるACC合成酵素とACC酸化酵素をコードする遺伝子について品種間比較を行った。果実より改良SDS-フェノール法で全RNAを抽出し,これから合成したcDNAをテンプレートとしてPCR増幅を行った。増幅遺伝子断片を大腸菌プラスミドに導入,クローニングを行い,ACC合成酵素遺伝子について6種類,ACC酸化酵素遺伝子については3種類の遺伝子断片を得ることに成功した。これら遺伝子断片の塩基配列及び推定アミノ酸配列を調査した上,既報の他の果実より得られている遺伝子断片との相同性を検討し,得られた遺伝子断片はACC合成酵素遺伝断片及びACC酸化酵素遺伝子断片であることを確認した。現在,ノーザン分析による個々の遺伝子断片の発現特性調査に鋭意取り組み中であるが,成熟ナシ果実から分析に十分量のRNAを抽出することが予想外に困難であったため、研究に若干の遅れが生じている。しかし,RNA抽出法も苦心を重ねて改良法を見い出し,研究進展にも見通しが立つ状況に至っている。3.今後の研究の展開:今回の共同研究で,限定された品種ではあるがチュウゴクナシ果実の成熟特性と流通・貯蔵特性が明らかになり,実際の流通・貯蔵技術改善の指針を得ることができたことは大きい成果であった。今後は,別な研究プロジェクトによって,調査品種の拡大をはかる一方,エチレン生成系遺伝子の発現特性調査を急ぎ,さらにサザン分析によるゲノム内機能特性へと研究を深化させてゆく予定である。