hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
畜産環境における耐性菌出現防止のための抗生物質の磁気分離

ニューキノロン系抗菌剤レボフロキサシン(LVX)を模擬残留抗菌剤として用い,シーケンスバッチリアクター方式(SBR)の生物学的廃水処理過程における抗菌剤曝露の急性および再曝露における微生物群集の残留抗菌薬曝露に対する水処理機能への影響と回復を栄養塩類除去率の変動と微生物群集構造の動態解析から明らかにした。とくに亜硝酸酸化細菌がアンモニア酸化細菌よりも感受性が低く,アンモニア酸化細菌のNitrosomonas sp.と亜硝酸酸化細菌のNitrospira sp.の細胞密度が各機能の指標となることを示す結果を得た。加えて,急性曝露時のLVX濃度より低濃度LVXを再曝露した際、微生物群集は速やかに応答し,水処理機能に影響を示さないという知見を得た。抗生物質磁気分離技術の開発および耐性菌の出現リスク評価ともに,それぞれ実用的かつ環境浄化技術の応用に資する有益な知見を得ていると考えられる。当初予定と多少の変更をせざるを得ない点もあったが,それをカバーするデータを得ており,概ね順調に進展していると判断できる。薬剤耐性菌の環境への拡散を防止するため,畜産廃水に含有する抗生物質のオンサイト処理技術として,永久磁石を用いた磁気分離法の開発と,畜産廃水由来の耐性菌出現を避けるために耐性遺伝子変異と抗生物質濃度との関係を調べ,耐性菌の出現リスクについて明らかにすることを試みた。抗生物質の除去率向上のために,抗生物質の磁性付与(磁気シーディング)と磁性付与した抗生物質に作用する磁気力増大の2点について研究を行った。前者の改善法として,pH制御型電気化学磁気シーディングについて検討した。磁気シーディング時に特定のpHに溶液を制御することによって,酪農廃水からのオキシテトラサイクリンの除去率が大幅に改善されることを見出した。後者については,循環濃縮式による分離法を検討し,安定的な分離除去が可能であることを明らかにした。また,畜産業等で用いられる抗生物質等による耐性菌の出現リスクについて検討を重ねた。抗菌薬に曝露されるモデル系を作成し,抗菌薬レボフロキサシンを用いたモデル系では、曝露前のリアクター内微生物群全体を対象とした最小生育阻止濃度(MIC)が32 mg/L、最小殺菌濃度(MBC)が512 mg/Lであったことを基に、曝露濃度を4 mg/L, 16 mg/L, 128 mg/Lとして実験を行った。曝露濃度4 mg/Lにおいては、微生物群集構造に優位な変化は与えなかった。また、どの曝露濃度においても、曝露中に多剤耐性菌が生じていたと示される結果を得た。しかし、どの系においても抗菌薬を排除した環境に曝露し直すことにより、耐性菌の数が激減し、もとの感受性菌の分布に戻されることが明らかになり、本モデル系においては、抗菌薬の環境へのリスクは一過的であるものの、抗菌薬を適切に低減することで、そのリスクさえも除去できることが明らかになった。畜産廃水に残留する抗生物質を目標濃度まで低減するためには,磁気シーディングの改善と磁気分離装置の改良の両方が必要である。一方で,初年度の研究成果から永久磁石と磁気フィルタを組み合わせた磁気分離装置には技術的な制約もあることがわかってきた。抗生物質への磁気シーディング法については共存物質への対応をより一層強化するとともに,目標濃度まで抗生物質を確実に低減できるよう永久磁石由来の磁場空間を生かした分離フローについて研究を進める方針である。永久磁石を用いた抗生物質磁気分離技術の開発については,平成29年度に見通しを立てることができた改良技術を活用し,畜産施設に設置・展開を見据えた装置化の研究を推進する。
LAMP 法パネルを用いた小児重症肺炎の迅速診断系の確立とその臨床応用に関する研究

パンデミックインフルエンザウイルス感染をはじめとする小児重症ウイルス性肺炎において、迅速な診断の確定はその予後を左右しうる重要な要素であり、迅速・簡便な確定診断法の確立は非常に重要である。我々は小児重症ウイルス性肺炎の原因ウイルスに対するLAMP法のセット、すなわちLAMP法パネルを作成し、このパネルを用いて小児重症ウイルス性肺炎の迅速な鑑別診断がベッドサイドのレベルでも行えるシステムの構築を目指した。パンデミックインフルエンザウイルス感染をはじめとする小児重症ウイルス性肺炎において、迅速な診断の確定はその予後を左右しうる重要な要素であり、迅速・簡便な確定診断法の確立は急務と考えられる。我々は新型インフルエンザウイルス感染に対する迅速確定診断法であるLAMP法の開発に成功し、その臨床応用が可能であることも確認しているが、それに加え、他の小児重症ウイルス性肺炎の原因ウイルスに対するLAMP法のセット、すなわちLAMP法パネルを作成し、このパネルを用いて小児重症ウイルス性肺炎の迅速な鑑別診断がベッドサイドのレベルでも行えるシステムの構築を目指す。同時に、このシステムを用いてインフルエンザパンデミック期にどのような原因ウイルスが小児重症ウイルス性呼吸器感染症を引き起こしているのかを明らかにし、それらに対するウイルス学的解析も行っていく。平成22年度には、国立病院機構仙台医療センター臨床研究部ウイルスセンター長の西村秀一博士と共同で、新型ならびに季節性インフルエンザウイルスに対するLAMP法のパネルを完成させた。現在パラインフルエンザウイルスやRSウイルスなど他の小児重症肺炎の原因ウイルスに対するLAMP法の作成を継続中である。平成23年度からは、長崎大学病院小児科の森内浩幸教授と共同で、長崎大学小児科から臨床検体の提供をうけ、我々の作成したLAMP法の系と、平成22年度にセットアップの完了した既存のリアルタイムPCRの系の感度・特異度を比較し、我々のLAMP法の系の臨床応用の可能性を検証していく。パンデミックインフルエンザウイルス感染をはじめとする小児重症ウイルス性肺炎において、迅速な診断の確定はその予後を左右しうる重要な要素であり、迅速・簡便な確定診断法の確立は非常に重要であると考えられる。我々はパンデミックインフルエンザウイルス感染に対する迅速確定診断法であるLAMP法の開発に成功し、その臨床応用が可能であることも確認している。それに加え、他の小児重症ウイルス性肺炎の原因ウイルスに対するLAMP法のセット、すなわちLAMP法パネルを作成し、このパネルを用いて小児重症ウイルス性肺炎の迅速な鑑別診断がベッドサイドのレベルでも行えるシステムの構築を目指す。同時に、このシステムを用いて、インフルエンザパンデミック期とその後にどのような原因ウイルスが小児重症ウイルス性呼吸器感染症を引き起こしているのかを明らかにし、それらに対するウイルス学的解析も行っていく。平成22年度には、国立病院機構仙台医療センター臨床研究部ウイルスセンター長の西村秀一博士と共同で、A型(Pdm、H1、H3)、B型およびC型季節性インフルエンザウイルスに対するLAMP法のパネルを完成させ、平成23年度には、パラインフルエンザウイルス(1型-4型)やRSウイルスなど他の小児重症肺炎の原因ウイルスに対するLAMP法の作成を行い、平成23年9月の国際ウイルス学会に於いて発表を行った。現在これらに加えて、ヒトメタニューモウイルス、アデノウイルスなどその他のウイルスに対するLAMP法の作成も継続中である。我々は小児重症ウイルス性肺炎の原因ウイルスに対するLAMP法のセット、すなわちLAMP法パネルを作成し、このパネルを用いて小児重症ウイルス性肺炎の迅速な鑑別診断がベッドサイドのレベルでも行えるシステムの構築を目指してきた。平成23年度までに開発した、季節性インフルエンザウイルス(A型(Pdm、H1、H3)、B型およびC型)、パラインフルエンザウイルス(1型ー4型)、RSウイルスに対するLAMP法に加え、本年度はコロナウイルス、エンテロウイルスに対するLAMP法の作成を行った。エンテロウイルスは小児のいわゆる「夏かぜ」のウイルスであるが、重症例では致死的な髄膜炎や脳炎を引き起こし、インフルエンザウイルスやRSウイルスによる脳炎との鑑別が必要となる疾患である。この研究結果は平成24年4月の日本感染症学会と11月の日本ウイルス学会において発表を行った。ヒトメタニューモウイルス、アデノウイルスに対するLAMP法の作成は継続中である。同時に、この検査システムを用いて、インフルエンザパンデミック期とその後にどのような原因ウイルスが小児重症ウイルス性呼吸器感染症を引き起こしているのかを明らかにするためのウイルス学的解析も行ってきた。LAMP法パネルによるスクリーニングで原因ウイルスの特定ができなかった検体に関しては、マルチプレックス・リアルタイムPCR法による原因ウイルス・細菌の特定を行い、それでも原因微生物が不明な検体に関しては、次世代シーケンサーを用いて網羅的な検索のできる系の開発を進めている。これらの過程において、一般臨床にも応用が可能な重症肺炎の検査系を確立することができた。現在までにすべての季節性インフルエンザウイルス(A、B、C型)、パラインフルエンザウイルス(1型-4型)、RSウイルス、エンテロウイルス等小児感染症分野での主要なウイルスに対するLAMP法を作成し、それらはリアルタイムPCR法とほぼ同等の感度・特異度を示しており、今後の臨床応用が期待される。

24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の最終年度である平成24年度は、今までに得られた成果の論文発表を行っていく。また、現在はまだLAMP法が未完成であるウイルス(ヒトメタニューモウイルスなど)に対するLAMP法の完成を目指す。今年度からは日本赤十字社長崎諫早原爆病院や長崎大学病院小児科の森内浩幸教授と共同で臨床検体の提供をうけ、我々の作成したLAMP法の系と、既存のリアルタイムPCRの系の感度・特異度を比較し、我々のLAMP法の系の臨床応用の可能性を検証していく。
抗ウイルス活性を指向したRNA修飾の人為的制御

近年、ウイルスの感染過程でRNAのメチル化が関わることが示唆されており、RNAの修飾の人為的な制御は、抗ウイルス薬開発における新しい標的となることが期待される。本研究では、RNAメチル化酵素や脱メチル化酵素への作用薬の探索および、ウイルスRNAを標的とした配列特異的メチル化調節酵素のデザインを行い、新たな抗ウイルス薬の創薬標的としての“RNAエピトランスクリプトミクス"の可能性を明らかにしたい。
数値シミュレーションによる熔岩の物性・噴出条件の推定およびハザードマップの精密化

本研究の目的である、任意の地形上を流れる、粘性率と降伏応力の温度依存性を入れたBingham流体の数値計算コードは、作ることができた。幅広い熔岩物性に対応し、傾斜が緩い場合も計算できるプログラムを開発した。すでに計算手法は、論文として雑誌に受理されている。また、以前の手法には、数値メッシュでの方向依存性があり、通常の地形メッシュを用いた場合、東西南北方向が、斜め方向に比較して3倍程度流れやすくなっている。そのため例えば、東北方向へ顕著な斜面があっても熔岩は流れにくい、というハザードマップ作成の上では大きな欠点があったが、この問題はセルラ-=オートマトンの理論を適用することで解決した。また、熔岩流の表面からの冷却効率をパラメータ化して、その効果を見積もることができるようになった。さらに、幅広い物性、地形パラメータの下での熔岩流・熔岩ドームの数値計算を行ない、熔岩物性・噴出率と、地形との関係を追求した。その結果、熔岩流では、その長さではなく幅が、熔岩の噴出率を決定する上で重要なものになることが明らかになった。金星のマゼランの合成開口レーダーの画像データからもとめた熔岩流地形と、数値計算を比較することで、熔岩の物性・噴出率をもとめた。火山だけではなく、金星のクレーターアウトフロウに計算を応用して、アウトフロウには、噴出率が高くて幅が広いもの、および低くて幅の狭いものの2つの形態があることを明らかにした。
1;9転座を有する小児急性巨核芽球性白血病細胞株からのキメラ遺伝子のクローニング

小児の悪性腫瘍性疾患に関する解析は近年長足の進歩を示し、一部の疾患では徐々に疾患の分子的な発症機構が明らかになりつつあるが、1;9転座を有する急性巨核芽球性白血病(AMKL、急性骨髄性白血病(AML)のM7)の芽球の性質は非常に多様であり、その基本病態はいまだ不明のままである。AMKLに関する遺伝子レベルでのより客観的な病因の解明は小児血液学の重要な課題の一つであることから、そのキメラ遺伝子のクローニングを計画した。これと相前後して我々は15;17転座を有するAMLの一男児例と2:2転座を有する滑膜肉腫の一男児例とを経験した。興味深いことに、前者の転座切断点は通常、急性前骨髄性白血病(APL、AMLのM3)に多数認められるPML/RARAとして知られるキメラ遺伝子が生じる部位とは異なり、15q13と17q11であったことである。実際、この症例の腫瘍細胞は形態学的にはM2の芽球の像を呈しており、診断にも苦慮した。また、先の自験例M7症例と同様に、複雑で予後不良の臨床経過をとった。すみやかに初回寛解導入に成功し、以後は順調に強化療法を重ねて一旦治療終了となったものの、その直後に再発し、再寛解導入は不能で、非寛解状態で同種骨髄移植を施行した。移植後、約1ヶ月で再々発した。後者の切断点の一方は2q35であり、これは胞巣型横紋筋肉腫に特有の2:13転座でみられるPAX3/FKHRキメラ遺伝子のPAX3の切断点と同一のものであった。我々はこれらの症例についても未知のキメラ遺伝子を同定し得ないか、と考え、患児らより得た腫瘍細胞からもゲノムDNAを抽出し、白血病細胞のゲノムライブラリーを作成した。さらに既知配列を用いて5'RACE法でキメラRNAと思われる産物が得られた。今回、クローニングの対象としていたのは当科で経験し、またその白血病細胞の細胞株を当科で保有する1;9転座を有する急性巨核芽球性白血病(AMKL、急性骨髄性白血病(AML)のM7)の児の腫瘍細胞であるが、最近我々はこれとは別に15;17転座を有するAMLの一男児例を経験した。非常に興味深いのは、この症例における転座切断点は通常、急性前骨髄性白血病(APL、AMLのM3)に多数認められるPML/RARAとして知られるキメラ遺伝子が生じる部位とは全く異なっており、15q13と17q11であったことである。我々はこの症例についても未知のキメラ遺伝子を同定し得ないか、と考え、本年度はこの患児より得た白血病細胞からもゲノムDNAを抽出し、白血病細胞のゲノムライブラリーを作成した。今後、これを基にした小児自血病の客観的な分子診断の方法や、治療の標的分子の発見、さらに何故このような治療抵抗性の性質を有したかを、先のM7症例の解析と併行して明らかにする予定である。

小児の悪性腫瘍性疾患に関する解析は近年長足の進歩を示し、一部の疾患では徐々に疾患の分子的な発症機構が明らかになりつつあるが、1;9転座を有する急性巨核芽球性白血病(AMKL、急性骨髄性白血病(AML)のM7)の芽球の性質は非常に多様であり、その基本病態はいまだ不明のままである。AMKLに関する遺伝子レベルでのより客観的な病因の解明は小児血液学の重要な課題の一つであることから、そのキメラ遺伝子のクローニングを計画した。これと相前後して我々は15;17転座を有するAMLの一男児例と2:2転座を有する滑膜肉腫の一男児例とを経験した。興味深いことに、前者の転座切断点は通常、急性前骨髄性白血病(APL、AMLのM3)に多数認められるPML/RARAとして知られるキメラ遺伝子が生じる部位とは異なり、15q13と17q11であったことである。実際、この症例の腫瘍細胞は形態学的にはM2の芽球の像を呈しており、診断にも苦慮した。また、先の自験例M7症例と同様に、複雑で予後不良の臨床経過をとった。すみやかに初回寛解導入に成功し、以後は順調に強化療法を重ねて一旦治療終了となったものの、その直後に再発し、再寛解導入は不能で、非寛解状態で同種骨髄移植を施行した。移植後、約1ヶ月で再々発した。後者の切断点の一方は2q35であり、これは胞巣型横紋筋肉腫に特有の2:13転座でみられるPAX3/FKHRキメラ遺伝子のPAX3の切断点と同一のものであった。我々はこれらの症例についても未知のキメラ遺伝子を同定し得ないか、と考え、患児らより得た腫瘍細胞からもゲノムDNAを抽出し、白血病細胞のゲノムライブラリーを作成した。さらに既知配列を用いて5'RACE法でキメラRNAと思われる産物が得られた。
改変アデノウィルスベクターを用いた癌細胞の検出法の開発

アデノウィルスベクターの構造蛋白を改変した血清型5型/3型キメラアデノウィルスを癌細胞の検出用ツールとして用いた。同キメラウィルスは血清型5型アデノウィルスをベースとし、ファイバー部分のみを3型アデノウィルスに置き換えた組み換えアデノウィルスであり、これまでの研究から多種の癌細胞に対して5型アデノウィルスに比べて高い感染性を有することが知られている。今回の研究では胸水中の癌細胞を同キメラウィルスを用いて検出することにより細胞診検査の精度向上を目指した。癌細胞の検出は具体的には同キメラウィルスにCMVプロモーター下に接続したルシフェラーゼcDNAもしくはGFPcDNAの発現カセットを組み替え、感染細胞のルシフェラーゼ活性もしくはGFPの発色により確認した。希釈した血清に培養肺癌細胞を一定数混入して疑似癌性胸水を用いた検討では赤血球溶血処理を加えることで、最小10個の癌細胞があれば有意にルシフェラーゼ活性が増加し癌細胞の検出が可能であることを示した。実際に臨床検体として得られた良性胸水および悪性胸水を用いた検討では一部の良性胸水で高いルシフェラーゼ活性を示す検体があり、本法による癌性胸膜炎の診断精度は感度75%、特異度79%であった。細胞診検査結果と比較したところ、診断精度については全体に特に劣るものではないが、本法ではリンパ腫等の血液癌に対してはアデノウィルスの感染性が低いこともあり細胞診検査よりも偽陰性例が多くみられた。一方、上皮性悪性腫瘍に対しては良好な結果を示した。また、良性胸水におけるルシフェラーゼ活性高値の理由についてはGFP発現ベクターを用いた解析から、良性中皮細胞への感染がその主たる原因と考えられた。以上の結果より、癌の種類によっては癌性胸膜炎や腹膜炎の補助診断に有用であるが、腫瘍特異的プロモーターを使用する等の工夫により診断の特異度を向上させ、診断精度を改善できるものと考えられた。各種の改変アデノウィルス(Ad5/3CMVluci、Ad5/3CMVGFP)については大量調整およびタイター測定が完了した。また、肺がん細胞株(H1299、H460、H157)を用いた感染実験において上記のウィルスによる遺伝子導入によりそれぞれ導入遺伝子の活性を確認した。実際にはAd5/3CMVluciウィルスについては感染細胞の融解液中のルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイにより確認し、Ad5/3CMVGFPについては感染細胞におけるGFPの発現を蛍光顕微鏡により確認した。実際の臨床検体における癌細胞の検出についてはまず良性の胸水に培養癌細胞を定数混入した疑似癌性胸水を作成し、検出感度を測定した。血球成分が多数含まれる血性胸水の場合は、ルシフェラーゼ活性が非常に低く癌細胞の検出感度は1000個/mLであった。原因として赤血球によるウィルス感染の阻害が疑われたため、最初に赤血球融解処理を行った後にウィルス感染させることで検出感度の改善がみられた。最終的には癌細胞10個/mLまで感度を高めることができ、本法を用いて実際の臨床検体を用いた測定実験を行っている。実際に細胞診検査によって癌性胸水の確定診断を得ている7症例のうち、6症例でカットオフ値を超えるルシフェラーゼ活性を検出しており、有用性が示唆された。一方、細胞診検査で陰性の検体11例中6例において高値を示しているため、擬陽性所見であるかどうかについてはそれぞれの臨床例の経過とも合わせて今後検討を進める予定である。

本研究は癌細胞に高い感染性を有する改変アデノウィルスベクターを用いて胸水中の癌細胞を検出し、癌性胸膜炎の診断精度を高めることである。各種の改変アデノウィルス(Ad5/3CMVluci、Ad5/3CMVGFP)については大量調整およびタイター測定については昨年度報告したとおりに実施した。具体的には各種ウィルスをそれぞれHEK293E1細胞に感染させ、感染細胞を回収後凍結、融解を繰り返すことで細胞を破砕して粗ウィルス溶液を調整した。その後、塩化セシウム溶液に粗ウィルス溶液を重層し超遠心によって高濃度のウィルス溶液を分離した。分離したウィルス溶液はグリセロール添加PBS溶液中で透析し、TCID50法によってウィルス力価を定量した後に感染実験に用いた。また、実際の臨床検体を用いた感染実験についても昨年度に確立した方法に従って行った。具体的には溶血によって赤血球を除去した後に遠心によって細胞成分を分離し、細胞培養液で新たに細胞浮遊液を調整してウィルス感染を実施した。今年度は臨床検体数を増やして実験を行った。また、昨年度の実施した検体についてその後の臨床経過を追跡し、最終的な臨床診断を確定した。その結果、ルシフェラーゼ活性値のカットオフポイントとして2471 Unitを用いたところ、感度は75%と比較的良好な値を得た。しかしながら、明らかな良性胸水においても極めて高値を示す検体が存在し、その主たる感染細胞についての検討が課題として残った。次年度は偽陽性例についての検討を行い、最終的に従来の形態学的な細胞診の方法との比較を行う予定である。前年度までの結果では、ルシフェラーゼ活性値のカットオフポイントとして2471 Unitを用いたところ、感度は75%と比較的良好な値を得たが明らかな良性胸水においても極めて高値を示す検体が存在し、その主たる感染細胞についての検討が課題として残った。上記のGFP発現アデノウィルスを用いて良性細胞の同定をはかったところ、血球細胞への感染性はほとんどみられなかったが、一部の中皮細胞に感染を認めた。同細胞におけるルシフェラーゼ活性の増加が感度を低下させる原因と考えられた。中皮細胞のみを効率的に除去することは困難であるため、癌細胞においてルシフェラーゼ活性をさらに増加させる方法について検討した。VEGFプロモーターで増殖が誘導される制限増殖型アデノウィルスを(Ad5/3VEGF-E1)をAd5/3CMVluciと混合して実験をおこなった。その結果、制限増殖型アデノウィルスとルシフェラーゼ発現ウィルスが共感染したがん細胞では制限増殖型アデノウィルスの増殖が生じ、それに伴ってルシフェラーゼ発現ウィルスゲノムも増幅された。共感染によって癌細胞におけるルシフェラーゼ活性は増加したが、時間が経過すると制限増殖型アデノウィルスの殺細胞効果のためむしろルシフェラーゼ活性は低下した。
空間経済学における空間異質性の影響分析と政策への反映

1.移動資本の存在を無視したモデルに基づき、経済厚生の計測式が広く知られている。本研究は移動資本の役割を解明し、その計測方法を修正した。そして、並行輸入にも着目し、国内市場の状況が並行輸入政策への影響を分析していた。2.東京都市圏および名古屋都市圏における立地外部性の定量分析を,TSRの企業間取引データを用いて行った。特に,東京都市圏における結果と名古屋都市圏の比較分析を行い、産業構成、企業立地の違いが立地外部性にどのような影響をもたらすかを検証した。3.災害による負の生産性ショックのリスクの下での、社会的最適な交通投資政策についての分析を行った。一般的な産業連関構造を考慮した複数地域の新経済地理モデルにおいて、生産性や交通の外生的ショックによる経済的波及効果を表現する計算式の導出した。4.企業間ネットワークを通じた集積効果について、特に知的交流の観点からの実証研究を行った。産業集積の形状、共集積の検出および、それにおける企業間ネットワークの役割についての実証研究を進めた。知的交流ネットワークの役割、また、産業集積における企業間ネットワークの役割についての検証も行われ、順調に進展している。理論も実証も順調に行っており、一部の研究成果は国内外の学会で発表し、国内外の学術誌に掲載・投稿している。ほぼ研究計画調書のとおり行いたい。課題1(労働・資本を生産要素とする2要素モデルによる空間経済学の拡張を行う)に関して消費者の選好記述をCES効用関数からより一般的な効用関数に拡張する研究と労働者の弾力的な労働供給の2つの角度から企業立地と貿易パターンの分析を行った。本研究の結果は空間経済学において広く知られている大国の優位性はなくなることを示唆している。課題2(取引ネットワークの視点による企業の異質性研究)に関して企業間の取引関係の集積、およびそれが企業立地にもたらす影響についての研究を進展させた。課題3(応用研究:法人税と交通ネットワーク)に関して名古屋都市圏立地企業141社を対象とした企業取引モデルを構築し分析を行った.本年度はいちぶの成果はすでに国際学術誌に掲載受・受理されている。予定していた調査も順調に行っており、次年度以後も計画の実行を期待できる。ほぼ研究計画調書の通り行いたい。
一方向ハッシュ関数の構成と応用に関する研究

今年度は,主として,ハッシュ関数の安全性の強化可能性および共通鍵暗号に基づくハッシュ関数の安全性について検討を進めた.具体的な研究成果は以下の通りである.(1)暗号に利用されるハッシュ関数の満たすべき性質として,preimage resistance (PR), second-preimage resistance (2ndPR),無衝突性(collision resistance ; CR)が定義されている.このうち,PRは一方向性と同義であり,これについては,弱いPRと強いPRが定義され,弱いPRを満たすハッシュ関数から強いPRを満たすハッシュ関数が構成できることが証明されている.本研究では,2ndPR (CR)について弱い2ndPR (CR)と強い2ndPR (CR)を定義し,ある性質を満たす弱い2ndPR (CR)を満たすハッシュ関数から強い2ndPR (CR)を満たすハッシュ関数を構成できることを証明した.また,良く知られている暗号用途のハッシュ関数が上の結果で仮定した性質を満たすことを示し,この結果が有効であることを示した.(2)ハッシュ関数は通常,圧縮関数と呼ばれる関数の縦続接続により構成される.本研究では,ブロック暗号の暗号化関数を2回利用して計算される圧縮関数の無衝突性を検討し,これらの圧縮関数は,暗号化関数を1回しか利用しない圧縮関数と同程度の無衝突性しか有しないことを証明した.(3)1対多通信のメッセージ認証では,通常,ディジタル署名が利用されるが,より効率を重視した方式として,時間同期を仮定して共通鍵方式であるメッセージ認証を利用する方式が提案されている.本研究では,ハッシュ関数の無衝突性を利用した方式を考案した.今年度は,主として,共通鍵暗号に基づくハッシュ関数の構成法について検討を進めた.具体的な研究成果は以下の通りである.(1)一方向ハッシュ関数の構成法で,共通鍵暗号の暗号化関数を利用した構成法の内,共通鍵暗号の出力ビット数と等しいビット数のハッシュ値を出力し,かつレート1と呼ばれる方式のすべて(高々64種類)について,計算複雑さの理論の観点から,暗号化関数の安全性が一方向ハッシュ関数の十分条件ではないことを明らかにした.(2)一方向ハッシュ関数の構成法で,共通鍵暗号の暗号化関数を利用した構成法の内,共通鍵暗号の出力ビット数の2倍のビット数のハッシュ値を出力し,かつレート1と呼ばれる方式について検討した.この結果,従来得られていた安全性に関する定理の誤りを発見し,修正した.更に,これらのハッシュ関数の構成要素である圧縮関数の安全性について検討を進めた.(4)MD4と呼ばれる一方向ハッシュ関数がcollision-resistantでないことを示したDobbertinの攻撃と同様の攻撃が,MD4と同様の設計方針に基づくHAVALに有効であるかどうかの検討を進めた.これまでのところでは,3段のHAVALに対する有効性は確認できていない.今年度は,主として,ハッシュ関数の安全性の強化可能性および共通鍵暗号に基づくハッシュ関数の安全性について検討を進めた.具体的な研究成果は以下の通りである.(1)暗号に利用されるハッシュ関数の満たすべき性質として,preimage resistance (PR), second-preimage resistance (2ndPR),無衝突性(collision resistance ; CR)が定義されている.このうち,PRは一方向性と同義であり,これについては,弱いPRと強いPRが定義され,弱いPRを満たすハッシュ関数から強いPRを満たすハッシュ関数が構成できることが証明されている.本研究では,2ndPR (CR)について弱い2ndPR (CR)と強い2ndPR (CR)を定義し,ある性質を満たす弱い2ndPR (CR)を満たすハッシュ関数から強い2ndPR (CR)を満たすハッシュ関数を構成できることを証明した.また,良く知られている暗号用途のハッシュ関数が上の結果で仮定した性質を満たすことを示し,この結果が有効であることを示した.(2)ハッシュ関数は通常,圧縮関数と呼ばれる関数の縦続接続により構成される.本研究では,ブロック暗号の暗号化関数を2回利用して計算される圧縮関数の無衝突性を検討し,これらの圧縮関数は,暗号化関数を1回しか利用しない圧縮関数と同程度の無衝突性しか有しないことを証明した.(3)1対多通信のメッセージ認証では,通常,ディジタル署名が利用されるが,より効率を重視した方式として,時間同期を仮定して共通鍵方式であるメッセージ認証を利用する方式が提案されている.本研究では,ハッシュ関数の無衝突性を利用した方式を考案した.
バチルス属菌由来の環状リポペプチドによるシロイヌナズナの病害抵抗性制御機構の解明

環状リポペプチドiturin A及びsurfactinの精製物について、各種植物に対する病害抵抗性誘導能を病害抑制効果並びに遺伝子発現解析により評価した。シロイヌナズナを対象とした実験では、逆転写定量PCR法により、環状リポペプチド処理後の抵抗性誘導関連遺伝子群の発現量を経日的に測定したところ、環状リポペプチド処理後6日目まで全対象遺伝子は若干の変動はあるものの処理区間で有意差は認められなかった。環状リポペプチド処理がシロイヌナズナの病害抵抗性に依存した病害抑制効果を示すことは実験的に証明していることから、環状リポペプチドの処理は、宿主植物が病原菌の感染に対して早急に病害抵抗性を誘導する状態となるプライミング効果をもたらすものと予想された。レタス根腐れ病を対象病害として土耕栽培の実験系により環状リポペプチド精製物の病害抑制効果を評価したところ、iturin Aでは、以前に報告したタアサイを宿主としたものと同様に、過剰な処理濃度において、薬害ではない、病害抑制効果の消失が認められた。一方でsurfactinでは、過剰処理による病害抑制効果の消失は認められず、環状リポペプチド処理による病害抑制効果を示す適正濃度域は、植物種と環状リポペプチド分子種間での組合せにより、多様であることを明らかにした。キャベツを宿主植物とした水耕栽培における葉面細菌病に対する病害抑制効果の評価系においては、両環状リポペプチドはともに、ほぼ同等の処理濃度において根部へ処理することで、無処理に対して有意な病害抑制効果が認められた。この結果は環状リポペプチド処理による病害抵抗性の誘導では病害抑制効果を示す適正な処理濃度が環状リポペプチド間で差異がなく、科レベルで同じ傾向を示すことが強く示唆された。Bacillus属細菌が生産分泌する環状リポペプチドは、本菌を利用した植物病害の生物防除において重要であることが報告されている。環状リポペプチドは植物病原菌を含む真菌及び細菌類に対して広範な抗菌活性を示すことから、環状リポペプチド生産性Bacillus属細菌の植物病害抑制メカニズムは、環状リポペプチドの植物病原菌に対する抗菌活性に依存するものと予想されてきた。しかし、Fusarium属を病原菌とする土壌病害に対して、精製した環状リポペプチドの土壌処理では、顕著な病害抑制効果は確認できるものの、土壌中の病原性糸状菌密度は低下させることはなかった。この事は、環状リポペプチドが宿主植物の病害抵抗性を誘導することを強く示唆した。さらに、環状リポペプチドの土壌処理濃度を高めると、宿主植物の生育量に変化をもたらすことなく、病害抑制効果が消失する現象を見出し、環状リポペプチドによる宿主植物の病害抵抗性誘導では、既知の病害抵抗性誘導剤とは異なる応答機構が植物に潜在していることが予想された。そこで本年度は、シロイヌナズナを宿主植物として、環状リポペプチドの抗菌活性非依存的な病害抑制効果を検証した。シロイヌナズナを水耕栽培し、水耕液へ精製した環状リポペプチドを添加して根部処理した。一方、本葉にアブラナ科野菜黒斑細菌病病原性細菌を接種することで、環状リポペプチドの根部処理による抗菌活性非依存的な葉面細菌病の抑制効果を評価した。その結果、surfactinでは416mμM、iturinでは0.52μMの処理濃度において、顕著な病害抑制効果が認められた。また、surfactinでは32μM、iturinでは4μM以上の処理濃度で病害抑制効果が消失した。これらの結果は両環状リポペプチドはシロイヌナズナの病害抵抗性を誘導し、さらに一定以上の処理濃度では、その病害抑制効果が消失することを明らかにした。申請時に記載した研究計画通りに成果を挙げることができ、その成果を国際学会で発表した。Bacillus属細菌が生産する環状リポペプチドは、広範な微生物種に対する抗菌活性の他に、植物病害抑制において宿主植物の病害抵抗性誘導を誘引することが報告されている。しかし、環状リポペプチドの精製物を用いて病害抑制効果を評価した研究事例は極めて少ない。これまでに、タアサイを宿主植物として、精製した環状リポペプチドiturin A及びsurfactinについて、土壌へ混和することで、土壌糸状菌病害を抑制することを報告した。そして、両環状リポペプチドは過剰な濃度を処理すると、薬害ではなく、病害を抑制する効果が消失する奇異な減少を見出した。そこで、モデル植物であるシロイヌナズナを用いて、抵抗性誘導に依存した病害抑制効果、並びに過剰処理濃度における病害抑制効果の消失を評価することとした。アブラナ科黒斑細菌病菌を病原菌としたシロイヌナズナの葉面病害の実験系により、精製した環状リポペプチドを水耕栽培したシロイヌナズナの根部へ処理し、病害抑制効果を評価したところ、iturin Aでは0.52μMで、surfactinでは416μMの濃度範囲で有意な病害抑制効果が認められ、各々、4及び32μM以上の濃度では、病害抑制効果が消失し、タアサイを宿主とした土耕栽培と同様の現象が認められた。さらに、病害抵抗性誘導の関連遺伝子に関連するシロイヌナズナの欠損変異株を用いた解析から、本細菌病に対しては、イソコリスミ酸生合成経路によるサリチル酸をシグナル伝達物質としたSAR経路に依存して病害抑制効果を示し、そして、過剰処理による病害抑制効果の消失はISR経路の発現による拮抗作用が関与しないことを明らかにした。

葉面細菌病を対象とした、病害抵抗性誘導に依存した、環状リポペプチドの病害抑制効果については、iturin A及びsurfactinの両環状リポペプチドは病害抵抗性誘導に依存した病害抑制効果を示し、さらに両環状リポペプチドは共に過剰処理濃度において病害抑制効果を消失するという特徴を明らかにすることができた。両環状リポペプチドのシロイヌナズナに対する抵抗性誘導メカニズムを明らかにするため、NGS解析によるRNA seqを実施するため、顕著な病害抑制効果を示す処理濃度及び病害抑制効果が消失する処理濃度において、定量PCR法により既知の病害抵抗性誘導関連遺伝子の発現量解析を実施したが、再現性を確認することができなかった。また、今回の葉面細菌病は主にSAR経路の発現により病害抑制がなされるため、ISR経路に依存して病害抑制効果を評価することが可能となる実験系を確立し、評価することも必要である。環状リポペプチドiturin A及びsurfactinの精製物について、各種植物に対する病害抵抗性誘導能を病害抑制効果並びに遺伝子発現解析により評価した。シロイヌナズナを対象とした実験では、逆転写定量PCR法により、環状リポペプチド処理後の抵抗性誘導関連遺伝子群の発現量を経日的に測定したところ、環状リポペプチド処理後6日目まで全対象遺伝子は若干の変動はあるものの処理区間で有意差は認められなかった。環状リポペプチド処理がシロイヌナズナの病害抵抗性に依存した病害抑制効果を示すことは実験的に証明していることから、環状リポペプチドの処理は、宿主植物が病原菌の感染に対して早急に病害抵抗性を誘導する状態となるプライミング効果をもたらすものと予想された。レタス根腐れ病を対象病害として土耕栽培の実験系により環状リポペプチド精製物の病害抑制効果を評価したところ、iturin Aでは、以前に報告したタアサイを宿主としたものと同様に、過剰な処理濃度において、薬害ではない、病害抑制効果の消失が認められた。一方でsurfactinでは、過剰処理による病害抑制効果の消失は認められず、環状リポペプチド処理による病害抑制効果を示す適正濃度域は、植物種と環状リポペプチド分子種間での組合せにより、多様であることを明らかにした。キャベツを宿主植物とした水耕栽培における葉面細菌病に対する病害抑制効果の評価系においては、両環状リポペプチドはともに、ほぼ同等の処理濃度において根部へ処理することで、無処理に対して有意な病害抑制効果が認められた。この結果は環状リポペプチド処理による病害抵抗性の誘導では病害抑制効果を示す適正な処理濃度が環状リポペプチド間で差異がなく、科レベルで同じ傾向を示すことが強く示唆された。申請書の記載内容に準じ、surfactin及びiturinの両環状リポペプチドの処理に対するシロイヌナズナの応答反応を精査する。両環状リポペプチドの処理は、病害抑制効果における適正濃度及び病害抑制効果が消失する過剰処理濃度と設定し、次世代シーケンサを利用したRNA seqにより、mRNAの転写量を比較することで、候補遺伝子を特定する。そして、候補遺伝子を対象にリアルタイムPCRによるmRNA転写量を精査し、併せてシロイヌナズナの変異株を購入して、病害抑制効果を指標としたシロイヌナズナの応答メカニズムを明らかにする。引き続き、iturin A並びにsurfactinの環状リポペプチドについて、シロイヌナズナを宿主とした病害抵抗性誘導機構の解明を行う。
染色体異常に対する新たな非侵襲的出生前スクリーニング法の開発

1)母体中胎児由来有核赤血球細胞(FNRBC)のenrichmentに関する検討:比重遠心法+フローサイトメトリー(FACS)により4.2倍、比重遠心法+磁気細胞分離装置(MACS)により2.9倍の分離濃縮が可能であった。ただしFACSによる方法では胎児細胞sortingに要する手間と細胞喪失などの欠点があった。2)MACSおよびnested-PCRを用いたFNRBC検出法による胎児性別判定試験:第1三半期(17例):男児と判定した9例のうち、実際の性別が男児であったのは9例であり偽陽性例は1例も認めなかった。女児と判定した8例のうち、実際女児であったのは6例であり、実際の性別が男児であった偽陰性例を2例認めた。特異性(Specificity)は100%,感度(Sensitivity)は81.8%,陽性的中率(PPV)は100%,陰性的中率(NPV)は75%であった。第2三半期(13例):男児と判定した5例のうち、実際の性別が男児であったのは4例であり、偽陽性例を1例認めた。女児と判定した8例のうち実際女児であったのは4例であり、実際の性別が男児であった偽陰性例を4例認めた。特異性は80%,感度は50%,PPVは80%,NPVは50%であった。第3三半期(19例):男児と判定した13例のうち、実際の性別が男児であったのは7例であり偽陽性例を6例認めた。女児と判定した例のうち、実際女児であったのは2例であり、実際の性別が男児であった偽陰性例を4例認めた。特異性は25%,感度は63.6%,PPVは53.8%,NPVは33.3%であった。全妊娠経過のうち1^<st>trimesterにおいて一番高率にFNRBCを検出する事が可能であった。充分なるインフォームド・コンセントにより同意を得られた、過去に妊娠歴のない男児を分娩した正常妊婦24例(A群:妊娠513週[n=10]、B群:妊娠14週27週[n=6]、C群:妊娠28週38週[n=8])および切迫早産例(D群[n=5])の末梢血10ml中のY染色体を蛍光標識し、その陽性細胞数を肉眼およびLSCにて測定して比較検討した。LSCによる測定値と手動検鏡測定値との間には強い相関(r=0.955)を認めた。母体末梢血10ml中のY染色体陽性細胞数はA群(手動:12.9±4.5個、LSC:16.1±5.5個)、B群(手動12.3±6.5個、LSC12.3±6.9個)、C群(手動4.00±1.5個、LCS4.38±2.9個)であり、A群でのLSCによるFNRBC検出数が一番多かった。切迫早産例のD群(手動:20.4±4.3個、LSC:20.6±4.4個)では正常例全体(手動:9.79±2.6個、LSC:11.25±3.1個)と比較してFNRBC数は増加していた。

充分なるインフォームド・コンセントにより同意を得られた、過去に妊娠歴のない男児を分娩した正常妊婦24例(A群:妊娠513週[n=10]、B群:妊娠14週27週[n=6]、C群:妊娠28週38週[n=8])および切迫早産例(D群[n=5])の末梢血10ml中のY染色体を蛍光標識し、その陽性細胞数を肉眼およびLSCにて測定して比較検討した。LSCによる測定値と手動検鏡測定値との間には強い相関(r=0.955)を認めた。母体末梢血10ml中のY染色体陽性細胞数はA群(手動:12.9±4.5個、LSC:16.1±5.5個)、B群(手動12.3±6.5個、LSC12.3±6.9個)、C群(手動4.00±1.5個、LCS4.38±2.9個)であり、A群でのLSCによるFNRBC検出数が一番多かった。切迫早産例のD群(手動:20.4±4.3個、LSC:20.6±4.4個)では正常例全体(手動:9.79±2.6個、LSC:11.25±3.1個)と比較してFNRBC数は増加していた。【磁気細胞分離装置に関する基礎的研究】採血された血液を比重遠心法にて有核細胞成分を分離し、その後magnetic cell sorterによるCD45モノクローナル抗体およびGlycophorin Aモノクローナル抗体を使用した二段階選別により目標とする胎児由来細胞成分を濃縮した。比重遠心法とMACSを用いて全血から有核細胞成分の分離を行ったところ、MACSの第一段階でnegative selectionされた細胞は全有核細胞中の41.56%であり、第二段階でpositive selcctionされた細胞は全有核細胞中の1.69%であった。【染色体数自動検出システムに関する基礎的研究】LSCによる解析は、肉眼でも明らかにFITC陽性と認識した細胞を陽性細胞とし、LSCがFITCを認識しても肉眼では確認されない細胞を判定不能細胞に分類した。その結果全妊娠経過中におけるFNRBC出現の頻度は、各個体差が認められたが約10^7個中1個から10^6個中5個の割合の範囲であることが明らかになった。【目的】極微量な妊婦母体血中胎児由来細胞を臨床応用する試みが近年行われている。本研究は胎児由来有核赤血球(FNRBC)のenrichment簡素化や検出分析自動化の検討を行った。【方法】enrichmentの検討:FACSおよびMACSによる分離濃縮方法を男児由来胎盤絨毛間腔血液にて比較検討した。比重遠心分離法にて有核細胞成分を分取した後、FACSではGlycophorin Aモノクローナル抗体(GA)および抗CD71モノクローナル抗体(CD71)による二重蛍光標識を行い、FNRBCの濃縮分離を試みた。MACSでは抗CD45モノクローナル抗体(CD45)でnegative selection(CD45-)した後、再度GAによるpositive selection(GA+)を行うことでFNRBCの分離濃縮を試みた。これら分離濃縮法前後の細胞集団にFISHを行いY染色体陽性細胞数の割合を算定した。Laser Scanning Cytometry(LSC)によるFNRBC分析:FISH施行後、我々はLSCによるFNRBCの自動的定量測定を試みた。【成績】比重遠心分離法後のY染色体陽性細胞数は9%であったが、FACS後では37.5%と4.2倍、MACS後では26.0%と2.9倍にenrichmentが可能。FACSではsortingに要する手間と細胞喪失などの欠点があった。
高等専門学校の学生に特化した英語教材の開発研究

高等専門学校(以下高専)の学生に焦点を当て、学生が求められる英語力を習得するのに適した英語学習教材の開発のあり方を研究しそれに基づく教材を開発する目的の下、以下の調査研究を行った。1.本研究担当者が過去に開発した教材、及びその開発過程を再検討した。また、先行文献の成果を参考に教材開発のあり方を再検討した。海外協同研究者と意見交換を行った。2.高専の学生に求められる英語力を把握するために、JABEE(日本技術者教育認定機構)認定プログラムや編入先大学等が求める英語力の内容を調査した。そして、学生の生涯学習に必須である情報収集の能力や、専門分野に関する情報を発信する能力の基礎となる英語力の習得が必要であると考えた。そこで、研究担当者の高専専攻科において、学生が自らの問題意識に沿って英文素材の選定、内容の調査、資料の作成を行い、英語でプレゼンテーションをする授業を展開し、その過程を検討した。3.教材開発の過程を点検しつつ、高専低学年の学生が使用できる教材、および高学年の学生を主たる対象とした教材を開発した。後者には大学理工系学部の教養課程の学生も利用できる教材や、広く大学教養課程の学生を対象とした教材が含まれる。これらの特徴は、(1)学習者の意見が反映された教材を開発することを目指し、素材選定や解説執筆の段階から学生の意見を参考にした、(2)執筆のみならず、編集のすべての段階で本研究担当者が関与し、教員と学生の双方にとっての使いやすい教材を目指した、などである。また、学生の在学中および卒業・修了後の自主学習の支援を考えると辞書が重要であることから、辞書の活用を考察した。技術者の素養として欠かせない技術者倫理や、新技術を活用した起業について学べる教材も手掛けた。高等専門学校(以下高専)の学生に焦点を当てて、学生が求められる英語力を習得するのに適した英語学習教材の開発のあり方を研究し、それに基づいて教材を開発する目的で、本年度は以下の調査研究を行った。(1)本研究担当者が過去に開発した教材、及びその開発過程を再検討した。また、先行文献の成果や海外の事例を参考に教材開発のあり方をシステム化する準備を行った。そのために、国際学会を含む諸学会等において、また、海外協同研究者との意見交換を通じて、アジア、特に韓国の教材の現状や開発のあり方を調査し、韓国の英語教科書の収集を行った。(2)高専の学生に求められる英語力を把握するために、JABEE(日本技術者教育認定機構)や編入先大学等が求める英語力の内容を調査した。そして、これらに対応するだけでは高専の授業や学生の自学のための教材は十分ではなく、学生の生涯学習に必須の情報収集の能力や、仕事の上で必要となる、専門分野に関するプレゼンテーションの能力を養うのに資するものでなければならないと考えた。そこで、研究担当者の高専専攻科において、学生が読解用素材を自ら選定し、内容を調査し、英語のレジュメ集を作成し、英語でプレゼンテーションをするという授業を展開し、並行してこのようなプロセスを実現できるESP教材の開発を検討した。(3)高校生と高専低学年学生のための教材を開発し、3冊シリーズの英語総合問題集をまとめた。学習者の意見が反映された教材を開発することを目指し、開発の段階から学生の意見を取り入れる試みを行った。具体的には、1)読解用素材の選定や解説の執筆に際して、その素材を読んだ学生の意見を参考にした、2)通常は編集者が専門業者に委託する表紙等のデザインを、本研究担当者所属高専の学生から募集して選定し、編集者との意見調整を経て完成させた、などである。

高等専門学校(以下高専)の学生に焦点を当て、学生が求められる英語力を習得するのに適した英語学習教材の開発のあり方を研究してそれに基づく教材を開発するという目的の下、2年目となる本年度は以下の調査研究を行った。1本研究担当者が過去に開発した教材、及びその開発過程を再検討した。また、先行文献の成果や海外の事例を参考に教材開発のあり方をシステム化する準備を行った。そのために海外協同研究者との意見交換を通じて、アジア、特に韓国の教材の現状や開発のあり方を調査し、韓国の英語教科書の収集を行った。2高専の学生に求められる英語力を把握するために、JABEE(日本技術者教育認定機構)や編入先大学等が求める英語力の内容を調査した。そして、これらへの対応にとどまることなく、学生の生涯学習に必須である情報収集の能力や、仕事の上で必要となる、専門分野に関するプレゼンテーションの能力を養うのに資する英語力の習得が必要であると考えた。そこで、研究担当者の高専専攻科において、学生が読解用素材を自ら選定し、内容を調査し、英語のレジュメ集を作成し、英語でプレゼンテーションをするという授業を展開し、並行してこのようなプロセスを実現できるESP教材の開発を検討した。3大学教養課程および高専高学年学生のための教材Nature and Scienceを開発した。この教材の特筆すべき点は1)読解用素材の選定や解説の執筆に際し、学生の意見を参考にした、2)執筆のみならず、書籍の形をとるまでのすべての段階の編集で本研究担当者が関与し、教員と学生の双方にとっての使いやすさの向上を図った、などである。高等専門学校(以下高専)の学生に焦点を当て、学生に求められる英語力を習得するのに適した英語学習教材の開発のあり方を研究しそれに基づく教材を開発するという目的の下、本年度は以下の調査研究を行った。また、先行文献の成果や海外の事例を参考に教材開発のあり方を再検討した。海外協同研究者と意見交換を行った。2高専の学生に求められる英語力を把握するために、JABEE(日本技術者教育認定機構1)や編入先大学等が求める英語力の内容を調査した。そして指導ではこれらへの対応に加えて、学生の生涯学習に必須である情報収集の能力や、専門分野に関するプレゼンテーション能力を支える英語力の習得が必要であると考えられた。そこで、研究担当者所属校の専攻科において、学生が自らの問題意識に沿って素材を選定・調査・資料作成し、英語でプレゼンテーションをする授業を展開し、その過程を検討した。また、学生の在学中・卒業修了後の自主学習を支援する必要があると考えられた。そこで、教材開発の過程で辞書の活用を考慮し、従来型の辞書及び電子辞書双方について調査・検討を行った。3教材開発の過程を点検しつつ、高専高学年の学生を主たる対象とする教材Science and Cultureを開発した。また、高専高学年及び大学教養課程の学生を対象とするReading Focus of the Worldを開発した。これらの特徴は1)学習者の意見が反映された教材を開発することを目指し、開発の段階から学生の意見を取り入れる試みを行った。素材の選定や解説の執筆に際し、学生の意見を参考にした、2)執筆のみならず、書籍の形をとるまでの編集の全段階で本研究担当者が関与し、教員・学生双方に使いやすいことを意図した、などである。
眼窩および上下顎の骨格成長における涙腺神経切断の影響に関する研究

これまでに開瞼で誘発される三叉神経固有感覚神経(涙腺神経の枝)が、脳幹の中でどこにあり、どのような役割をしているかの解剖学的研究報告は皆無であった。本研究ではラットを用いて、涙腺神経を鋭敏な逆行性神経トレーサーであるフルオロゴールドで涙腺神経の断端を標識し、脳幹の観察をおこない、涙腺神経から固有感覚を司る三叉神経中脳路核への投射を確認した。当初、出生直後の新生児ラット(生後1日: P1)の涙腺神経を剖出し、両側あるいは片側の涙腺神経の神経切除(約1.5mm)を行う計画であったが、新生児ラットの涙腺神経は無髄神経であり、剖出が手技的に不可能であった。当初の目的として、涙腺神経の神経支配を明らかにする目的があったが、ラットの涙腺神経の神経支配がいまだに明確にされていないことに着目し、この涙腺神経における逆行性トレーサーによる神経支配領域に関する研究を行うこととした。200gのwistar系ラットを使用した。麻酔薬の腹腔内投与により麻酔を行い、眼瞼挙筋の外側に存在する涙腺神経を切断した。切断端に鋭敏な逆行性トレーサーであるフルオロゴールド(FG)2%希釈したものに神経断端を浸漬し、48時間後にパラフォルムアルデヒドで灌流を行う。凍結切片でFGの標識について確認すると、三叉神経中脳路核に標識された細胞を確認した。現在この結果を検証中であるが、三叉神経第三枝からFGが侵入した可能性を否定しきれておらず、今後は対照実験を行う予定である。出生直後の新生児ラット(生後1日:P1)の涙腺神経を剖出し、両側あるいは片側の涙腺神経の神経切除(約1.5mm)を行Iい、その後の顎骨、顔面骨の成長を観察する計画であったが、新生児ラットの涙腺神経は無髄神経であり、剖出が手技的に不可能であったため、その実験系を断念した。そこで、ラットの涙腺神経の神経支配がいまだに明確にされていないことに着目し、この涙腺神経におけるトレーサーによる神経支配領域に関する研究を行うこととした。方法Wistar系ラットにおいて、片側涙腺神経の最内側枝を切断して、そこから神経トレーサーであるフルオロゴールドを導入し、48時間の生存期間の後、脳を摘出し、顕微鏡で脳幹を観察した。側頭筋へのトレーサー流出を防ぐために、同側の側頭筋は上半分を完全切除した。凍結切片を脳の水平断で40μmで作成し蛍光顕微鏡を用いて観察した。さらにthyrosine hydroxylase染色を行い、青斑核との位置関係を観察した。結果涙腺神経最内側枝から注入されたフルオロゴールドで標識された細胞が、ラット脳幹の中脳、橋において観察された。これは三叉神経中脳路核であると考えられた。また橋においては青斑核と隣接した部分に標識された細胞がみられた。考察涙腺神経から固有感覚を司る三叉神経中脳路核への連続性が確認された。過去の報告では涙腺分泌にかかわるとされているものがあるが、我々は開瞼、閉瞼における固有感覚枝が涙腺神経ないに存在すると考えている。覚醒の中枢である青斑核近傍に認められたことから、開瞼と覚醒の関連性を示唆していると考えられた。