hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腸管上皮幹細胞の幹細胞機能維持における亜鉛トランスポーターの役割解明

腸管上皮細胞は腸陰窩底部に位置する腸管上皮幹細胞の増殖と分化により常に新しい細胞に置き換わっている。本研究では、亜鉛恒常性を担う分子である亜鉛トランスポーターZip7の腸陰窩における役割について検討を行い、腸陰窩の細胞増殖及び腸管上皮幹細胞の維持に重要な役割を果たしていること、その機構には腸陰窩のERストレス応答制御が関連していることを明らかとした。亜鉛の欠乏は、免疫不全、成長障害、味覚障害をきたし、亜鉛の過剰摂取は神経系の以上をもたらすことが知られてきた。亜鉛は、生体において必要不可欠の必須微量元素であり、生体内において総亜鉛量を一定に保つことは重要な生命維持機構の一つである。そのため、亜鉛の恒常性を維持するために生体にはZip/Slc39などの亜鉛トランスポーターやメタロチオネインなどが発現している。亜鉛の恒常性を維持する亜鉛トランスポーターは2種のサブファミリー(Zip, Znt)からなり、哺乳類においては20種以上が同定されている。研究代表者は、Zipファミリーの中で、細胞内における亜鉛の主要な貯蔵場所の一つである小胞体に局在することが確認されているZip7に焦点をあてた。Zip7は腸管上皮組織において強く発現することを見いだした。さらには、Zip7の発現は腸管上皮細胞の代謝回転に沿って変動することを見いだした。その生物学的な役割の解析するため、Cre-LoxPシステムに準じたfloxedマウスを用いたノックアウトマウスを作成しその表現型解析を行い、Zip7が腸管上皮組織の恒常性維持に寄与していることを見いだした。亜鉛トランスポーターは、生体内において必須微量元素である亜鉛の恒常性の制御を担っている。亜鉛トランスポーターファミリーは哺乳類においては20数種類が同定されているが、これら亜鉛トランスポーターが生体内の組織、細胞レベルにおいてどのような生物学的役割を担っているのか、その意義については不明な点が多い。本研究では、腸管上皮細胞における亜鉛トランスポーターの機能解析を行った。前年度までに絨毛領域に比較して陰窩領域において亜鉛トランスポーターの一つであるZip7が高く発現していること、さらに、腸管上皮細胞特異的にZip7を欠損するマウスの作成を行い、Zip7の欠損は腸管構造に乱れを引き起こすことを示してきた。今年度は、腸陰窩におけるZip7の機能解析を行った。腸陰窩は腸管上皮細胞の活発な細胞増殖と系列細胞へと分化が行われていることから、Zip7の欠損により細胞増殖または分化が障害されている可能性が考えられた。増殖細胞マーカーであるKi67による免疫染色により腸陰窩の細胞増殖への影響を調べたところ、Zip7の欠損により腸陰窩での細胞増殖がほとんど消失していることがわかった。腸陰窩の増殖細胞は腸陰窩底部に存在する腸管上皮幹細胞から生み出されることから、Zip7の腸管上皮幹細胞への関与を調べた。腸管上皮幹細胞マーカーであるOlfm4のin situ hybridization解析によりZip7欠損腸陰窩ではOlfm4陽性の腸管上皮幹細胞が消失していることが明らかとなった。マイクロアレイ解析からZip7欠損により腸陰窩においては細胞内ストレス応答とアポトーシス遺伝子の発現が誘導されていることがわかった。以上のことから、腸陰窩においてZip7は、細胞内ストレス応答制御に関わり、腸管上皮幹細胞の維持を担い腸陰窩細胞の増殖を促すトランスポーターとして機能していることが明らかとなった医歯薬学本年度の研究は、概ね研究計画にそって進行した。研究計画に則り、ノックアウトマウスの表現型解析を引き続き実施するとともに、Zip7欠損によりどのような因子が影響をうけるのか、その解析を進める予定である。購入試薬の選定のため、各プロバイダーからの情報収集と検討を進めていたため。生じている次年度使用額については既に使用予定があり、翌年度早々に試薬購入にあてる予定である。このため、翌年度分の助成金と合わせて、翌年度に使用する予定である。
脳・神経系におけるホスホリパーゼC-δ1のストレス応答性とその意義に関する研究

申請者らはこれまでに、Phospholipase C(PLC)のisozymeの1つであるPLC-δ1がアルツハイマー病(AD)脳において、ADに特徴的な病理像に異常に蓄積していることを認め、酸化ストレスとPLC-δ1との関連性を示唆してきた。標記研究課題に関連して、ラットをhyperoxiaの環境下におくことにより、また、astrocytomaを誘発するとされるacrylonitril(ACN)をラットに経口摂取させることにより、脳内のPLC isozymeの変動を、心臓におけるそれと比較した。その結果、hyperoxia及びACN処置は心臓における過酸化脂質量を増大し、そのレベルは後者の方が大きかったが、いずれの場合も大脳皮質におけるレベルより小さく、脳における酸化ストレス抵抗性の低いことが確認できた。ACN処置により大脳皮質細胞質分画のPLC-β1及び-δ1並びに細胞質及び膜分画のPLC-γ1レベルは上昇した。また、hyperoxia処置大脳皮質のPLC-β1及び-δ1についてはACN処置の場合と同様の変動プロファイが認められたが、PLC-γ1については変動しなかった。一方、心臓においては、hyperoxiaにより総PLC-γ1及び-δ1レベルの変動は無いが、いずれも細胞質分画から膜分画への転移が起り、ACN処置ではPLC-δ1レベルのみが細胞質及び膜の両分画で上昇した。このように、酸化ストレスに際して3種のPLC isozymeが応容するものの、その応答性は画一でなく、またストレスの程度並びに組織間でそれらの応答性が異なることが示唆された。その他、神経細胞死とその保護へのPLC isozymeの関与に関する情報を得ることを目的として、ラット初代培養神経細胞を用い、グルタミン酸刺激による細胞死及びtheaninによる保護効果とPLC isozymeとの関係、血液脳関門のモデル細胞系におけるaluminumの輸送特性、並びに、ラットの発生と加齢に伴う大脳皮質中のcaspase familyの変動をも調べた。ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(Phospholipase C : PLC)は、イノシトールリン脂質の分解を伴う数々の細胞応答に関与する重要な酵素である。本酵素は大別して、β、γ、δ、ε型の4種のアイソザイムの存在が認められている。申請者らは、これまでに、PLC-δ1がアルツハイマー病(AD)脳において異常に蓄積していることを認め、ADの病態にイノシトールリン脂質代謝異常が絡んでいる可能性を示唆した。しかし、AD菌におけるPLC-δ1の異常蓄積の原因については不明である。本研究は、どのような環境下でPLC-δ1の異常蓄積が起るのかを追求し、PLC-δ1異常蓄積のもつ生理的意義を明らかにすることを目的としたものである。今回、100%酸素下で60時間飼育することにより酸化ストレスを負荷したラットの脳組織におけるPLCアイソザイムのタンパク質レベルを調べ、以下の結果を得た。高酸素負荷ラットの脳においては、過酸化脂質量に変動は認められないものの、酸化ストレスの指標の1つである低分子量チロシンホスファターゼ活性が低下していた。このような脳の大脳皮質および海馬におけるPLC-δ1のタンパク質レベルならびに大脳皮質におけるPLC-β1のタンパク質レベルは有意に上昇するが、PLC-γ1については、いずれの組織でも変動しなかった。なお、この際、PLC-β1画分のPLC活性は上昇するものの、PLC-δ1画分のそれには変化がなかった。

このように、脳内に酸化ストレスが生じることによりPLC-δ1のタンパク質レベルが上昇することを確認するとともに、酸化ストレスの程度によっては、PLC-δ1のみならず、PLC-β1のタンパク質レベルも上昇するが、これらPLC分子の触媒活性は、酸化ストレスの程度により影響を受けることが示唆された。ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(phospholipnse C : PLC)は、イノシトールリン脂質の分解を伴う数々の細胞応答に関与する重要な酵素である。本酵素は大別して、β、γ、δ、ε型の4種のisozymeの存在が認められている。申請者らは、これまでに、、isozymeの1つであるPLC-δlがアルツハイマー病(AD)脳において、ADに特徴的な病理像に異常に蓄積していることを認め、酸化ストレスとPLC-δlとの関連性を示唆してきた。標記研究課題に関連して、今年度は、ラットをhyperoxiaの環境下におくことにより、また、astrocytomaを誘発するとされるacrylonitril(ACN)をラットに経口摂収させることにより、脳内のPLC isozymeの変動を、心臓におけるそれと比較した。その結果、hyperoxia及びACN処置は心臓における過酸化脂質量を増大し、そのレベルは後者の方が大きかったが、いずれの場合も大脳皮質におけるレベルより小さく、脳における酸化ストレス抵抗性の低いことが碓認できた。ACN処置により大脳皮質細胞質分画のPLC-βl及び-δl並びに細胞質及び膜分画のPLC-γlレベルは上昇した。また、hyperoxia処置大脳皮質のPLC-βl及び-δlについてはACN処置の場合と同様の変動プロファイが認められたが、PLC-γlついては変動しなかった。一方、心臓においては、hyperoxiaにより総PLC-γl及び-δlレベルの変動は無いが、いずれも細胞質分画から膜分画への転移が起り、ACN処置ではPLC-δlレベルのみが細胞質及び膜の両分画で上昇した。このように、酸化ストレスに際して3種のPLC isozymeが応答するものの、その応答性は画一でなく、またストレスの程度並びに組織間でそれらの応答性が異なることが示唆された。
セロトニントランスポーター調節機構の解明

我々は、プロテインカイネースC(PKC)系を介した調節の検討を行うため、セトロニントランスポーターを異所性に常に発現している細胞を作製した。この細胞は、controlに比べて数十倍高いセロトニン取り込みを示した。PKCのactivatorである、phorbol esterによってセロトニンの細胞内への取り込みは、阻害されること、更にこの阻害は、主に、Vmaxの減少によることが明らかとなった。しかし、この阻害は、PKCによるリン酸化予想部位をミューテイションすることでは、回復されなかったため、間接的な調節機構が示唆された。今後このメカニズムについて更に検討を加えていく。また、セロトニントランスポーター結合蛋白の単離、同定を行うため、グルタチオンSトランスフェラーゼ配列をふくむ発現ベクターにセロトニントランスポーター蛋白のアミノ末端配列をサブクローニングし、このコンストラクトを用いて大腸菌(JM109)を形質転換し、IPTGにて導入することにより、多量のfusion proteinを得た。しかし、全配列をサブクローニングしてたコンストラクトは、可溶性に問題があり使用できなかった。グルタチオンセファロースを用いて、columnを作製し、そこにアミノ末端配列のfusion proteinを含む大腸菌可溶性分画を注入し、洗浄すると、fusion proteinはcolumn内に留まる。そこに、可溶化したラット脳の膜分画を投与し洗浄後、塩濃度勾配により結合蛋白を溶出した。その結果いくつかの結合蛋白を同定できた、今後、ペプチド分析を行い部分シイクエンスを決定する予定である。
バクテリアセルロースを用いたナノＣ／Ｃコンポジットの摩擦・摩耗特性

酢酸菌が生産するバクテリアセルロース(BC)を取り上げ,ナノ・オーダーの天然繊維の優れた機械的特性に注目して,独自に工夫した材料開発を行った。BC繊維は従来の炭素繊維強化炭素材料に使用される炭素繊維と比較して1000分の1の細かな構造を実現するとともに,その機械的特性に及ぼす成形条件の影響を明らかにし,第3成分添加による性能向上と,摩擦摩耗特性におけるBC繊維や第3成分添加の効果について考察を行った。従来の軸受けやボールベアリングなどが使用できないマイクロマシンや資材な部品における可動部分の摩擦特性を大きく向上させ,新たな用途を生み出す可能性を示した。本研究においては,開発された天然繊維バクテリアセルロースの三次元ナノ構造を利用した新規摺動材であるC/Cコンポジットについて,とくに摩擦摩耗特性をはじめとする材料特性を実験的に明らかにしながら,材料の添加物,炭化・焼結温度など最適な材料成型を明らかにした.(1)FRP材料の炭化・焼結工程の検討;焼成温度を7001100°Cまでの範囲で,昇温速度も変化させてC/Cコンポジットを成型して,摩擦・摩耗特性に及ぼす成形条件の影響を詳細に調べた.曲げ試験,ビッカース硬さ試験による評価を行い,焼結温度が上昇するにつれて硬さ値が上昇し,比摩耗量は減少して摩耗特性が向上すること,ホルムの関係式が成立することが明らかとなった.動摩擦係数においては,焼結温度及び昇温速度による影響は小さいことがわかった.摩耗粉の形成についてBCファイバーブリッジングの様子を観察して力学的モデル作成のための基礎的データを得た.(2)第3成分としての添加剤の検討;イネ科の植物である竹粉は,ケイ素が豊富であるため焼結時にSiCを形成して材料の硬度が向上するため,さらなる摩耗特性の向上が期待される.BCの前処理についても考慮して第3成分の添加によるハイブリッド化を検討し,動摩擦係数が低い材料SiC-C/Cコンポジットの開発に成功した.また,焼結温度1500°Cにおける成型についても予備実験を行い,基礎的データを得た.(3)特性評価のための弾性数理解析;解析においては,多孔質体の空孔と強化粒子について関して,周期的領域においてランダム分布とし,また,それらの大きさは擬似的なポアソン分布としてモデル化を行った.多孔質性複合材料の周期モデルについて,温度と変位場に関して,漸近展開を適用して均質化理論に基づいた微視的擾乱温度と変位に関する定式化を示し,多孔質性複合材料の有効熱伝導率や熱弾性特性を示した.酢酸菌が生産するバクテリアセルロース(BC)を取り上げ,ナノ・オーダーの天然繊維の優れた機械的特性に注目して,独自に工夫した材料開発を行った。申請者らは,酢酸菌が生成する繊維径10nmの天然繊維バクテリアセルロース(BC)を用いて,摩擦摩耗特性に優れた新規摺動材を開発した.水分を含んだBC繊維網へのフェノール樹脂を直接含浸する手法を用いてBC-FRPプリプレグを成型し,焼成してBC炭素繊維の三次元ナノ構造をもつC/Cコンポジット材料とした.平成24年度においては,次に述べるような成果を得た.(1)BCマイクロフィブリルの最適な分散状態の形成;BC-FRPプリプレグの直接含浸法及びその応用に関する出願「摺動部材の製造方法,2008年8月4日出願,国立大学法人福島大学・福島県,特願2008-200617」が特許として認められた.BCマイクロフィブリルの分散性とフェノール樹脂の含浸・充填性について改善を行い,摺動材料に適したBC分散状態の高次構造をもつFRPを得た.(2)FRP成型における材料中に生じるボイド欠陥の除去;フェノール樹脂は加熱による脱水縮合反応で硬化するため,重要な工程であるプレス成型時にガス抜き工程において施工回数の増加と真空装置を用いた脱気などにより製品性能向上を試みた.作製したFRP成型体を用いて焼成実験を行い,7001100°Cまでの範囲で成型温度と昇温速度の摩擦・摩耗特性に及ぼす影響を明らかにした.比摩耗量においては焼成温度が高いほうが小さく,動摩擦係数については焼結温度及び昇温速度による影響は小さいことがわかった.(3)接触面の弾性数理解析;

材料の機械的特性の評価のために,粒子分散強化した多孔質性複合材料としてモデル化し,異方性を含めた機械的特性について検討した.多孔質体を一方向に加圧して成形した場合を想定し,扁平な楕円体の空孔と強化粒子を周期的領域においてランダムに分布させた.作成したモデルを用い,均質化理論に基づき材料の弾性特性に及ぼす空孔と粒子の扁平率と異方性の関係について調べた.本報告では,C/Cコンポジットの更なる性能の向上を目的に,BCとフェノール樹脂に第3成分として竹炭を添加し,焼結温度の異なるSiC-C/Cコンポジットを成型した.摺動材としての性能を評価した.SEM観察をもとに摩耗現象についてモデル化を行い,これを用いて弾性数理解析を実施して基礎的な知見を得た.また,大学イノベーションに出展して試作品展示と技術紹介を行っている.得られた主な知見は次の通りである.(1)BCを砕き,竹炭粉についてもミクロンオーダーにまで粉砕して材料中に有効に混合し,含浸の初期段階で脱気を行うことで均質性に優れた材料を成型する手法を開発し, SiC-C/Cコンポジットを得た.(2)SiC-C/Cコンポジットの摺動試験を行った結果,比摩耗量,動摩擦係数においてNano-C/Cコンポジットよりも優れた結果を得られることが分かった.これは炭素繊維と竹炭との相互作用による効果だと考えられる.ビッカース硬さ試験の結果からSiC-C/CコンポジットはNano-C/Cコンポジットよりも硬度が高くなる傾向にあることが分かった.これは竹炭粉が繊維間で作用し,圧子に押し広げられないように抵抗しているためと考えられる.(3)摺動試験後のSiC-C/CコンポジットのSEM観察の結果,焼結温度が低いほど表面の炭素が削られ繊維が露出してくるが,焼結温度が高いと繊維とフェノール樹脂がより一体化し繊維が露出してくることが少なくなった.また,クラックの隙間にBC由来の繊維が確認でき,ファイバーブリッジング効果によりクラックの伝播を抑制している様子が確認できた.摩耗粉や被摺動面のSEM観察の結果から,焼結温度が1173Kの時は相手材に対して試験片が硬すぎることから摺動面を削り取っていることが分かった.摺動材として実用的な使用をする場合は焼結温度の違いによって相手材を選択する必要がある.材料力学新規摺動材C/Cコンポジットがもつ優れた摩擦摩耗特性に及ぼす,FRP材料の炭化・焼結工程の確立,第3成分としての添加剤の可能性,BC炭素繊維のナノファイバー・ブリッジング効果について検討した.当該年度に実施を計画した項目において一定の成果を得ており,ほぼ順調に推移していると考えている.FRP材料の炭化・焼結工程の詳細な検討については,BC-FRPプリプレグのプレス成型時のガス抜き工程と真空装置を用いた脱気などさらなる性能向上を試み,摩擦・摩耗特性に及ぼす成形条件の影響を詳細に調べた.この温度範囲での安定な成型手法を確立するとともに,摩耗粉の形成についてSEM観察によりBCファイバーブリッジングの様子を観察してモデリングのための基礎的データを得ている.第3成分としての添加剤の影響については,木質セルロースは構造由来の微細な孔や特有の成分元素が存在することから,BC繊維のナノ構造との相互作用による摩擦性能の向上が期待できる.イネ科植物である竹を焼成した竹炭はケイ素が豊富であるため焼結時にSiCを形成し硬度が向上する.これを微細化して,ナノ構造を有するBC繊維網との混合を試み,ハイブリッド化したSiC-C/Cコンポジットの開発に成功し,動摩擦係数が著しく低いことを明らかにした.この過程において,焼結温度1500°Cにおける成型を目指した予備実験を行い,基礎的データを得ることができた.
「防根給水ひも」の水駆動力を利用したトマト簡易栽培法の開発

1.「ひも上置肥」手法の開発「防根給水ひも」栽培において土壌を繰り返し利用することを容易にするため、栽培後に残存肥料が取り除ける「ひも上置き肥(以下,置肥とする)」手法について検討した.置肥とは肥効調節型肥料を透水性の袋に詰め,栽培容器内の「ひも」上に置く手法である(第2図).本試験では,この方法(置肥区)と土壌混和(混肥区)を中玉トマトの第7段摘心栽培において比較した.生育・収量ともに置肥区は混肥区より若干劣った.これは置肥区の養分溶出が混肥区より遅く,養分吸収量が減少したことによると考えられた.定植約2か月後に行った摘心部の生育量は、すでに置肥区で劣っており,摘心時以前に養分溶出に差が生じていたものと考えられた.置肥区における袋中の養分収支から,T-N,P205,K2O,CaO,MgOはそれぞれ6,4,5,5,3割が溶出した.混肥区に比べて置肥区の土中の残存養分量はT-N,P205,K20とも2-3g少なかった.また、栽培後の土壌中養分量を栽培前と比較すると,T-Nは置肥区では同量となったが,混肥区では栽培後の方が3g多くなった.P205,K20は,置肥区では栽培後の方が2g少なくなったが混肥区では差がなかった.CaOは両区とも2.5g,MgOは両区とも1g栽培後の方が少なくなった.肥料養分が過剰に残存すると、次作に同じ肥料設計を適用することが困難となる。また残存した肥料の溶出速度も考慮しなければならず,次作での肥料設計はより複雑となる.本試験の結果より、置肥ではもう少し溶出速度の早いタイプをシグモイド型で設計するのがよいと推察された。大玉トマトの促成栽培では培地量30、大塚A処方1/2濃度培養液管理で安定生産が可能となるが、第5段花房以降に葉の縁に激しい黄変症状が現れる。培養液を2/3濃度に高めると黄変症状は抑制されるが収量が半減する。そこで、K濃度を硝酸カリで高め、高まった窒素を硝酸カルシウムで落とすことで窒素を1/2濃度標準とし16段摘心栽培を行ったところ、株当たりの収量が7.3Kgとなり標準区に比べて約1Kg低くはなったが、葉の黄変は強く抑制された.一方、果実糖度と酸度は、いずれも0.3程度上昇した.なお、砂培地でも土培地と同様に生育し、果実収量の確保できることが明らかとなった。培地の再利用を考えると、土よりも砂の方が簡便で、今後は砂を培地とした生産技術の構築が必要とした。『防根給水ひも』栽培手法の確立に向けて栽培試験に取り組んだ。栽培容器を1stBox (3リットル)、2ndBox (3リットル)に仕切り、生育途中での根域開放効果について試験した。大玉トマトの秋冬季の8段穫り栽培では、開放による6リットル培地で収量は若干、高まるものの有意差はなく1stBoxの培地量で問題ないことを明らかにした。また、水要求量が増す春夏季の雨よけハウス栽培において、(1)定植始めから栽培終了まで1stBox、「ひも」1本で給水するS(1)区、(2)4段花房ホルモン処理時に2ndBoxに培土を加え、1stBoxの「ひも」1本で給水をするS(1)+S(0)区、(3)S(1)+S(0)区と同様に培土を追加し、給水は両Boxの「ひも」2本で給水するS(1)+S(1)区を設けて試験したところ、根域開放(6リットル培地)により株当たりの収量は約1kg増加した。「ひも」適用の効果についてはS(1)+S(0)区に比べS(1)+S(1)区は株当たりの収量が増加したが、その差は0.4kg程度であった。根の乾物重は処理区間に有意差はなかったが、2ndBoxにおいては、「ひも」を配置したS(1)+S(1)区はS(1)+S(0)区よりも著しく増加した。以上の結果から、植物の水分要求量が増す春夏季にかけての栽培では1stBoxのみの栽培では収量が低下するため、保水のため培土を増やす必要があると考えられた。「ひも」適用の有無については生育、収量に大きな差はないため培地量6lに対し「ひも」1本でも植物の水分要求量は満たされていると考えられた。他方、養分はあらかじめ緩効性肥料で培地に混和しておき、「ひも」では水のみを送り込む方法が考えられる。11月15日(第8段花房開花時)に仕切りを外し土量を2倍にした。中玉トマト第18段果房上2葉を残して摘心した。摘心部茎葉重はひも2本区で1本区の2倍、株当たりの収量も約1kg高かった。果実糖度と酸度にはひも1、2本区間に大きな差はなかった。根乾物重とSap量にひも1、2本区で差は認められなかった。Sap分析はNO3-N濃度(610me/l)とMg濃度(23me/l)が低く、Ca濃度(80100me/l)が異常に高いことを示した。

以上の結果より、中玉トマトの長期促成栽培においては、仕切り開放に伴う「ひも」の適用は、生育の安定と収量の増大に有効であることが明らかとなったが、収穫終了時のSap分析においてNO3-N濃度が低すぎることから、窒素肥料のタイプと施与量の検討が必要があると考えられた。1.トマトの水要求に心えるには、生育途中で培地量を2倍(6l)に増やすと同に,もう1の「ひも」を配置して大塚A処方1/2濃度で終始管理すれば,尻腐れ果実はほとんど発生せず大玉トマトの安定生産が可能であることを明らかにした。また、培地量3リットルでも2本の「ひも」を使用すれば、高温・強日射下でも水要求に応えられる可能性は高いとした。2.砂培地では生育中、初夏の日射が厳しいときには時折、萎れる株が見られる。そこで、粒径と毛管水の移動速度ならびに栽培中の含水率変動を計測すると同時に生育と収量に関して調査したところ、砂の粒径が1mm以下では萎れ症状は観察されず生育も良好となることから粒径1mm以上の砂を除くことが重要であるとした。3.要水量を定植前に予測することは、果実の経済生産および水の確保手段を考える上で重要となる。「防根給水ひも」栽培では、水および養分は圏外に流出することがないため土耕での吸水量を正確に測定することができる。代表者が開発した栽培装置の根域制限栽培において中玉系品種'レッドオーレ'の各部位の乾物と果実収量を調査し水利用効率を求めたところ、水1l当たり全乾物重で6g、果実重で43gが生産された。促成作型において培地3リットルに定植すれば、若干の水ロスを考慮しても60リットルの水が確保できれば、少なくとも第7段果房まで問題なく収穫できることを明らかにした。このとき水利用率は97%(蒸発3%)となることを示した。4.「防根給水ひも」栽培では,肥料は肥効調節型で培地に混和しておき,「ひも」では水のみを供給する方法が考えられる.導入コストが抑えられる本法について大玉トマト促成15段栽培において検討を行ったところ、株当たり16.2gの窒素施肥量で十分であり,この量を基準とした窒素溶出量の平準化が必要であるとした.1.「ひも上置肥」手法の開発「防根給水ひも」栽培において土壌を繰り返し利用することを容易にするため、栽培後に残存肥料が取り除ける「ひも上置き肥(以下,置肥とする)」手法について検討した.置肥とは肥効調節型肥料を透水性の袋に詰め,栽培容器内の「ひも」上に置く手法である(第2図).本試験では,この方法(置肥区)と土壌混和(混肥区)を中玉トマトの第7段摘心栽培において比較した.生育・収量ともに置肥区は混肥区より若干劣った.これは置肥区の養分溶出が混肥区より遅く,養分吸収量が減少したことによると考えられた.定植約2か月後に行った摘心部の生育量は、すでに置肥区で劣っており,摘心時以前に養分溶出に差が生じていたものと考えられた.置肥区における袋中の養分収支から,T-N,P205,K2O,CaO,MgOはそれぞれ6,4,5,5,3割が溶出した.混肥区に比べて置肥区の土中の残存養分量はT-N,P205,K20とも2-3g少なかった.また、栽培後の土壌中養分量を栽培前と比較すると,T-Nは置肥区では同量となったが,混肥区では栽培後の方が3g多くなった.P205,K20は,置肥区では栽培後の方が2g少なくなったが混肥区では差がなかった.CaOは両区とも2.5g,MgOは両区とも1g栽培後の方が少なくなった.肥料養分が過剰に残存すると、次作に同じ肥料設計を適用することが困難となる。また残存した肥料の溶出速度も考慮しなければならず,次作での肥料設計はより複雑となる.本試験の結果より、置肥ではもう少し溶出速度の早いタイプをシグモイド型で設計するのがよいと推察された。大玉トマトの促成栽培では培地量30、大塚A処方1/2濃度培養液管理で安定生産が可能となるが、第5段花房以降に葉の縁に激しい黄変症状が現れる。培養液を2/3濃度に高めると黄変症状は抑制されるが収量が半減する。
超精密分子認識能を持つスーパー人工酵素創製のための基本戦略の探索

1.種々のシクロデキストリン(以下CDと略)2分子を,その水酸基(2-OH,3-OH,6-OH)の選択的活性化を通して,その位置でジスルフィド連結し,二量体(17種類)を合成した.これらの二量体が,水中で細長い形状のゲスト分子メチルオレンジを包接する能力を求めた結果,平衡定数には大きな差(1,500606,000M^<-1>)があることが明らかとなり,最高の包接力を示すものは,α-CDのC3とβ-CDのC6を連結した二量体(606,000M^<-1>)及びβ-CDのC6同士を連結した二量体(583,000M^<-1>)であると判明した.この結果,触媒基を導入して人工酵素を創製する素材としては,合成の簡便さを考慮して,後者の二量体が最適と判断した.2.β-CDの6A,6B-6A,6D-ジヨード化体を原料にして,特定位置にIm基とSH基を持つβ-CDを合成した.これを酸化しジスルフィド結合で連結し人工酵素(ジIm-CD二量体,6種)を得た.さらに,二量体の一成分に無修飾CDを採用したモノIm-CD二量体6種,Im-CD(単量体)も比較のため合成した.3.2つの部分がCDに認識されるエステルを基質として,中性の水中で上記のImを持つCDの加水分解触媒作用を検討した.Im-CDとモノIm-CD二量体の触媒反応定数はほぼ同じだが,後者は基質捕捉能力において前者を10倍上回り,モノIm-CD二量体とジIm-CD二量体は基質捕捉能力はほぼ同じだが,触媒反応において後者は前者を4倍上回る.結果として,ジIm-CD二量体のAF異性体は,無触媒加水分解の約1,000倍の加水分解速度を示す.そして,触媒としてturn-overし,生成物阻害は無く,中性付近のpHでは,pHを変化させても活性は変化しない.4.以上のことから,本研究のスーパー人工酵素創製の基本戦略は正しく,天然酵素より優れた機能を持つ人工酵素創製が可能であるとの示唆を得た.1.種々のシクロデキストリン(以下CDと略)2分子を,その水酸基(2-OH,3-OH,6-OH)の選択的活性化を通して,その位置でジスルフィド連結し,二量体(17種類)を合成した.これらの二量体が,水中で細長い形状のゲスト分子メチルオレンジを包接する能力を求めた結果,平衡定数には大きな差(1,500606,000M^<-1>)があることが明らかとなり,最高の包接力を示すものは,α-CDのC3とβ-CDのC6を連結した二量体(606,000M^<-1>)及びβ-CDのC6同士を連結した二量体(583,000M^<-1>)であると判明した.この結果,触媒基を導入して人工酵素を創製する素材としては,合成の簡便さを考慮して,後者の二量体が最適と判断した.2.β-CDの6A,6B-6A,6D-ジヨード化体を原料にして,特定位置にIm基とSH基を持つβ-CDを合成した.これを酸化しジスルフィド結合で連結し人工酵素(ジIm-CD二量体,6種)を得た.

さらに,二量体の一成分に無修飾CDを採用したモノIm-CD二量体6種,Im-CD(単量体)も比較のため合成した.3.2つの部分がCDに認識されるエステルを基質として,中性の水中で上記のImを持つCDの加水分解触媒作用を検討した.Im-CDとモノIm-CD二量体の触媒反応定数はほぼ同じだが,後者は基質捕捉能力において前者を10倍上回り,モノIm-CD二量体とジIm-CD二量体は基質捕捉能力はほぼ同じだが,触媒反応において後者は前者を4倍上回る.結果として,ジIm-CD二量体のAF異性体は,無触媒加水分解の約1,000倍の加水分解速度を示す.そして,触媒としてturn-overし,生成物阻害は無く,中性付近のpHでは,pHを変化させても活性は変化しない.4.以上のことから,本研究のスーパー人工酵素創製の基本戦略は正しく,天然酵素より優れた機能を持つ人工酵素創製が可能であるとの示唆を得た.申請者らの発見した合成法でαおよびβ-シクロデキストリン(CDと略)の2,3-アロエポキシドを合成し,それぞれにベンジルメルカプタンを作用した後,それぞれのCDからの二種のベンジルチオ体を逆相カラムにて分離し,構造決定した.単離した生成物を還元し,生成するメルカプタンをDMSO酸化し,二級側でジスルフィド結合で連結したホモ二量体4種を合成した.α及びβ-CDの2,3-マンノエポキシドから同様の方法によってそれぞれ一種,二種の二級側で連結したホモ二量体を合成した.一方,β-CDの6-OH1個をスルホニル化し,チオ尿素と反応させてチオウロニウム塩とした後,アルカリ処理によってメルカプタンし,これををジピリジニウムジスルフィドと反応させ,混合ジスルフィドとする.こうして得た混合ジスルフィドを,上記の二級側で連結した二量体を還元して得たメルカプタンと反応させることによって,一級側と二級側がジスルフィド連結したヘテロCD二量体五種を合成した.さらに一級側でα,β及びγ-CDがジスルフィド結合で連結したホモ二量体三種,ヘテロ二量体三種を合成した.加えて,二級水酸基側の同じ位置を同じ様式でスルフィド連結したβ-CDホモ二量体三種を,異なった位置を連結したヘテロ二量体一種を合成した.合成してきた数多くの二量体のホストとしての分子認識能を,細長い基質分子のモデルとして採用したメチルオレンジをゲストとし,円二色性,UV・可視スペクトルによって会合定数を尺度として,目下,評価している.α-及びβ-CDの2,3-アロエポキシドを原料とし二級側でジスルフィド結合で連結したホモ二量体4種,α-及びβ-CDの2,3-マンノエポキシドからそれぞれ二級側で連結したホモ二量体(計3種),β-CD一級側と二級側をジスルフィド連結したヘテロCD二量体5種,さらに一級側でα,β及びγ-CDがジスルフィド結合で連結3たホモ二量体3種,ヘテロ二量体3種,加えて,二級水酸基側の同じ位置を同じ様式でスルフィド連結したβ-CDホモ二量体3種を,異なった位置を連結したヘテロ二量体1種について,分子認識能を検討した.即ち,これらの二量体のホストとしての分子認識能を,細長い基質分子メチルオレンジに対する会合定数によって評価した.最も大きな会合定数を示したのは,α-CDのC3とβ-CDのC6をジスルフィド連結した二量体(会合定数606,000/M),β-CDのC6同士をジスルフィド連結した二量体(会合定数583,000/M),及びβ-CDのC2(この部分の糖はアルトロシドに変換している)とβ-CDのC6をジスルフィド連結した二量体(会合定数119,000/M)であり,最も小さい会合定数を示したものは,β-CDのC3同士をジスルフィド連結した二量体(会合定数1,540/M)及びβ-CDのC2(この部分の糖はアルトロシドに変換している)同士をジスルフィド連結した二量体(会合定数2930/M)であった(因みに,β-CDの示す会合定数は,2970/M).同じゲストに対してCD二量体の結合部位を変化させるだけで394倍も会合定数は変化する.以上の結果と,合成の容易さを考慮して,官能化二量体の素材として,β-CDのC6同士をジスルフィド連結した二量体を選んだ.目下,この二量体の適当な位置に触媒基となりうるイミダゾール,カルボキシル基を導入することを検討している.α,β,γ-シクロデキストリン(CDと略)のC2,C3,C6同士をジスルフィド連結したホモ,ヘテロ二量体を合成し,メチルオレンジ包接の会合定数を測定した結果と,合成の容易さを考慮して,官能化二量体の素材として,β-CDのC6同士をジスルフィド連結した二量体を選び,触媒基となりうるイミダゾール(Imと略)をこの二量体の適当な位置に導入すること,そしてそのエステラーゼ活性を検討した.1.Imを特定位置に持つβ-CDジスルフィド二量体の合成既知の方法を用いて,β-CDの6A,6B,6A,6C,6A,6DのOHをヨードで置換し,一方のヨードをチオ尿素誘導体で置換してチオウロニウム塩とし,二種の位置異性体を分離した.その異性体の残存ヨードをImで置換し,さらにチオウロニウム塩をSHに変換した.

このSHを酸化することによって二つのImを特定位置に持つβ-CDジスルフィド連結ホモ二量体6種を合成した.また同様に,上記の方法で合成した特定位置にSHとImを持つβ-CDと,C6のOHをSHで置換したβ-CDとから一つのImを特定位置に持つβ-CDジスルフィド連結ヘテロ二量体6種を合成した.全てのジスルフィド二量体の位置異性決定は,我々が既に位置決定した標品を基礎として行った.2.エステラーゼ活性上記の一つあるいは二つのImを特定位置に持つβ-CDジスルフィド二量体計12種,Im,β-CDジスルフィド二量体,ImをC6に持つβ-CDそれぞれについてp-tert-butylphenyl p-nitrophenylcarbonateを基質とし,25度C,中性でのエステル加水分解を行った.触媒濃度0.25mM,エステル濃度0.03mMでの擬一次反応速度は,無触媒に比べて,β-CDジスルフィド二量体は2倍,Imは4倍,ImをC6に持つβ-CDは100倍,一つあるいは二つのImを特定位置に持つβ-CDジスルフィド二量体はそれぞれ約200倍,約1000倍であった.
運動時における骨格筋代謝の３次元的解析

被験者はMR装置のボア内で伏臥位姿勢となり,足首に巻き付けられたラバーバンドを引き延ばす膝伸展運動を6分間行った.運動頻度は,0.25, 0.5, 1Hzの3試行とし,運動時におけるPi/PCr比を計測した.得られたシグナルを浅層部(表層より3cm)と深層部(深さ3cm6cm)に分けて解析・評価した.その結果,深層部は運動頻度の増加に伴いPi/PCr比が増加し,1Hzの運動時では浅層部に比べて有意にPi/PCr比が増加した.一方,浅層部のPi/PCr比は運動頻度の増加に伴う顕著な変化は観察されなかった.我々は,一昨年度に,リン磁気共鳴分光法による化学シフトイメージング(CSI)を用いて,各ボクセル単位でリンスペクトルを同時計測し,膝伸展運動時における大腿部筋エネルギー代謝の深さ方向について検討した.その結果,深層部は運動頻度の増加に伴いPi/PCr比が増加し,最高頻度の運動時では浅層部に比べて有意にPi/PCr比が増加した.一方,浅層部のPi/PCr比は運動頻度の増加に伴う顕著な変化は観察されなかった.ヒト単一筋内においては浅層部に比べて深層部の方が遅筋線維の占める割合が大きいと報告されていることから,運動強度の増加に伴い浅層部の方がより顕著にPi/PCr比が増加するという仮説を持っていたが,それとは異なる結果が得られた.しかしながら,一昨年度に実施した運動負荷は運動頻度を増加させる形態だったので,速筋線維の多い浅層部の筋群が動員されにくくなったとも考えられるので,昨年度は10%MVCから運動負荷を次第に増加させるプロトコールで実験を行った.健康成人男性16名(28±5歳)を対象に,被験者は腹臥位で大腿四頭筋をベッドに固定され,ストレインゲージを用いて大腿四頭筋のMVCを測定した.同肢位でNMR装置内にて10%-30%MVCの等張性膝関節伸展運動を0.5Hzで6分20秒行った.その結果,運動負荷の増大に伴い浅層部,深層部ともにPi/PCr比が増大したが,最大運動時におけるPi/PCr比は深層部に比べて浅層部の方が有意に高かった.本研究の結果から,膝進展運動時における大腿筋エネルギー代謝の深さ方向にも部位差が生じている事が確認された.被験者はMR装置のボア内で伏臥位姿勢となり,足首に巻き付けられたラバーバンドを引き延ばす膝伸展運動を6分間行った.運動頻度は,0.25, 0.5, 1Hzの3試行とし,運動時におけるPi/PCr比を計測した.得られたシグナルを浅層部(表層より3cm)と深層部(深さ3cm6cm)に分けて解析・評価した.その結果,深層部は運動頻度の増加に伴いPi/PCr比が増加し,1Hzの運動時では浅層部に比べて有意にPi/PCr比が増加した.一方,浅層部のPi/PCr比は運動頻度の増加に伴う顕著な変化は観察されなかった.平成24年度の研究目的および研究実施計画:多チャンネル型近赤外線分光法装置(Multi-NIRS)を用いて平面的な酸素バランスの不均一性については検討されているが,深さ方向分析も加えて酸素バランスを3次元的に解析した研究はこれまでに殆ど行われていない.また,筋細胞内のPCr濃度はミトコンドリアの酸素需要レベルを反映しており,近年我々は筋内PCr濃度分布の3次元的計測に成功した事から,この筋内PCr濃度分布と筋組織酸素バランスの動態を併せて計測することで,酸素需要と酸素供給のマッチング・ミスマッチングについて3次元的に言及することが可能と考えられる.そこで,今年度の目的は,Multi-NIRSの開発およびMRボア内で行う膝伸展運動用エルゴメーターの製作に取りかかり.Multi-NIRS装置の開発後は,まず安静時mVO2の部位差について3次元的解析を行う.膝伸展運動用のエルゴメーターの製作終了後は,MRボア内での実用面の確認を行った後,被験者数名を対象としてMRシグナルの感度を調べる予備実験を行う.それと並行して,動的膝伸展運動時における筋酸素バランスの3次元的計測についても検討する.平成24年度の研究成果:MRボア内で実験を行うための膝伸展運動エルゴメーターの製作が終了し,当該年度末までに12名の被験者を対象として膝伸展運動時における筋内PCr分布の計測を行った.解析も同時に進めているが,解析に関しては現在までのところ6名しか終了していない.一方,深さ方向計測用の近赤外線分光装置(NIRS)に関しては,深部組織のシグナル感度が非常に弱いので,これまで殆どのNIRS装置用いられている散乱光よりも透過光の方がより安定したシグナルを検出できると考え,現在は透過光を用いた深部組織の筋酸素動態を計測する装置を作成中である.多チャンネル型近赤外線分光法装置(Multi-NIRS)を用いて平面的な酸素バランスの不均一性については検討されているが,ミトコンドリアの酸素需要レベルを反映する筋細胞内のPi濃度の分布も併せて検討した研究はみられない。そこで我々は、リン磁気共鳴分光法による化学シフトイメージングを用いて、動的膝伸展運動時における大腿筋群のPi濃度の分布について調べた。その結果、ミトコンドリアの呼吸刺激物質の一つであるPi濃度は、運動頻度の増加に深層部では有意に増加したが、浅層部では有意な変化は観察されなかった。ヒト

単一筋内においては浅層部に比べて深層部の方が遅筋線維の割合が高いと報告されていることから、運動強度の増加に伴い、浅層部の方がより顕著にPi濃度が増加するという仮説を持っていたが、それとは異なる結果が得られた。この理由としては、上記の実験で実施した運動負荷は運動頻度を上げる形式であり、しかも最高頻度が1秒に1回の収縮であったため、速筋線維の割合が高いと考えられる浅層部の筋群が動員されにくかったと考えられる。そこで次に、最大随意収縮力の10%の強度から徐々に発揮張力を上げていく等張性の膝伸展運動を行ってPi濃度分布を調べた。その結果、運動負荷の増大に伴い浅層部、深層部のPi濃度は安静時に比べて有意に増加したが、深さ方向の差は検出されなかった。以上の結果から、同じ膝伸展運動であっても、運動頻度を上げる場合と発揮張力を上げる場合では深さ方向で筋エネルギー代謝が異なることが示唆された。筋エネルギー代謝当初の予定通り、まずは1筋エネルギー代謝の不均一性の検出,2運動時における筋エネルギー代謝不均一性の検出,3NMR内で運動を実施する事から,漸増負荷運動装置を外注する必要があったので,まずは簡易的な運動負荷としてラバーバンドによる運動頻度の増加によりNMRスペクトルの導出を確認した後,NMR内で実施できる膝伸展運動用エルゴメータを制作し,実験を実施した.ここまでは当初の予定通りに遂行している.平成24年度の研究目的は,1Multi-NIRSの開発,2MRボア内で行う膝伸展運動用エルゴメーターの製作,3動的膝伸展運動時における筋酸素バランスの3次元的計測であった.上記の研究目的のうち,2に関しては平成24年度初頭に製作が終了し,平成24年度の夏頃からMRボア内での動的膝伸展運動を行えるようになった.それに伴い3の動的運動時における筋内エネルギー代謝の深さ方向解析も始まり,現在までに12名の被験が測定を終えており,そのうち6名に関してはデータ解析も終了している.1の深さ方向計測用の近赤外線分光装置(NIRS)の製作の件だが,深部のシグナル感度が想定していた以上に弱いので,これまで殆どのNIRS装置用いられている散乱光よりも透過光の方がより安定したシグナルを検出できると考え,現在は散乱光よりもより感度の高い透過光を用いて深部の筋酸素動態を検出できる装置を開発している最中である.こちらに関しては,平成25年度の夏頃に完成する予定となっている.今年度は,筋エネルギー代謝の深さ方向の違いと合わせて,筋酸素動態の深さ方向の違いも計測出来るように試みている.現在,静岡大学工学部の庭山雅嗣准教授と共同で,近赤外線分光法とNMRを用いて筋酸素動態の深さ方向の検出に取り組んでおり,今夏に実験を開始できる予定となっている.今後は,現在進行しているMR内での動的運動時における筋内エネルギー代謝の深さ方向解析を継続し,被験者の合計が15名程度になるまで実験を行う.それと同時に計測されたNMRデータの解析も随時進める.また,深さ方向計測用の近赤外線分光装置(NIRS)が平成25年度の夏頃には完成する予定となっているので,こちらに関しても動作確認および予備実験が終了次第,速やかに運動時における筋酸素動態の深さ方向解析に取りかかる.筋酸素動態の深さ方向解析終了後,当教室が担当している東京医科大学心臓リハビリテーションセンターに通院している心疾患患者を対象として,循環機能が低下している方を対象とした筋エネルギー代謝の深さ方向解析へと取りかかる.一昨年度、昨年度は主にNMRを用いた筋エネルギー代謝の深さ方向の違いについて検討してきたが、当初の予定では、それと同時に筋酸素動態の深さ方向の違いについても合わせて検討する予定であった。
高い電荷輸送特性を発現する超分子型共役分子の構造設計

軽量,フレキシブル,印刷可能など様々な特徴を有する共役分子半導体材料における最大の課題は,電荷輸送性能が無機材料と比較可能なレベルに達していないことである。その最善の解決策は,共役分子鎖の主要な電荷輸送経路であるホッピング伝導をより高速なバンド伝導型へと導くことであり,電荷輸送における格子振動に伴う散乱を支配・制御するための斬新な共役鎖の構造設計が不可欠である。そこで,本研究では分子鎖の熱統計物理化学理論として提案され,現在も深化し続ける下記のFlory-Huggins理論の支配方程式を今一度見直し,共役軸のコンフィグレーションエントロピー(熱的ゆらぎ)の抑制による電荷移動度の向上を目指す。
膵臓腺房細胞における遺伝子修復機構と転写制御機構

我々はこれまでの研究で、SUMO-1およびSUMO-2が膵臓には他の臓器に比べ多量に存在することを見いだしその意義について検討をおこなってきた。SUMO-2をbaitとしてTwo-hybridスクリーニングを行い相互作用する蛋白質としてTTRAPを同定した。TTRAPはAPエンドヌクレアーゼ様の構造を持ち、精製した蛋白質は弱いAPエンドヌクレアーゼ様酵素活性を示した。さらに様々な相互作用の研究からFOXP2がTTRAPおよびUBC9と相互作用することを見いだした。FOXP2は転写調節因子で各種臓器において発現することが知られ、我々も膵臓において発現することをウェスタンブロットで確認した。今回このFOX蛋白質をSUMO化のモデル蛋白質として大腸菌内SUMO化システムを利用してSUMO化サイトを同定し、SUMO化が転写活性能に与える影響について検討した。マウスFOXP2内には3カ所のSUMO化サイトが予想され、各サイト(K74、K274、K673)のリジンをアルギニンに置換しSUMO化蛋白質の生成を調べたところ、K673Rに置換したときにのみSUMO化が起こらなかったことからこの部位が標的であることがわかった。また、FOXP2が結合することが知られているCC10遺伝子発現調節領域を組み込んだレポーター遺伝子を使って、野生型とK673R型FOXP2の転写抑制能を比較したところK673R型は野生型よりも強く転写活性を抑制し、FOXP2のSUMO化はDNA結合能に影響することが示唆された。ユビキチン様蛋白質SUMOによる蛋白質翻訳後修飾は、標的蛋白質の構造的変化や細胞内の特定部位への局在化に寄与し、蛋白質間の相互作用および蛋白質-DNA間の相互作用に働いている。また、蛋白質分解システムのユビキチンに拮抗して蛋白質を安定化して細胞周期の調節やDNA修復に関与する。このようなSUMOの基本的な働きは、発癌、炎症、ウィルス感染、先天性疾患などの病態を理解するために重要である。SUMOファミリーには、SUMO-1,-2,-3,-4がゲノムに存在し、SUMO-2/3はそのアミノ酸構造は酷似し、細胞に対する物理的、科学的ストレスに応答して高分子量化することが観察されている。私たちは、これまでにSUMO-1およびSUMO-2/3が膵臓に遊離型として多量に存在し、腺房細胞に局在することを見い出しその意義について検討し、以下の知見を得た。(1)ユビキチン様蛋白質SUMOと相互作用する蛋白質としてTTRAPを同定された。(2)TTRAPは弱いAPエンドヌクレアーゼ様活性を持つことを明らかとなった。(3)TTRAPによる転写制御における役割としてTTRAPとSUMOとの相互作用が重要であることが示唆された。(4)TTRAPはTDGを介してDNAと結合することが明らかになった。(5)TTRAPはTDG,PCNA,p53等を介してSUMOと相互作用する可能性が示唆された。(6)現在、マウス胎児および膵癌試料を用いた免疫組織化学的解析によって様々な知見を得つつある。今後の展開として、(1)各種膵臓疾患におけるSUMOの免疫組織化学的解析をさらに行う。(2)腺房細胞を用いてSUMOおよびSUMO関連蛋白質のノックダウンによる体系的解析を行う。(3)膵臓疾患におけるSMAD4のSUMO修飾の状態を解析する。(4)転写抑制機構における非共有結合型のSUMO結合モチーフ(SBM)と病態との関連について解明したい。SUMO-2をbaitとしてTwo-hybridスクリーニングを行い相互作用する蛋白質としてTTRAPを同定した.TTRAPはAPエンドヌクレアーゼ様の構造を持ち、精製した蛋白質は弱いAPエンドヌクレアーゼ様酵素活性を示した。

さらに様々な相互作用の研究からFOXP2がTTRAPおよびUBC9と相互作用することを見いだした。FOXP2は転写調節因子で各種臓器において発現することが知られ、我々も膵臓において発現することをウェスタンブロットで確認した。今回このFOX蛋白質をSUMO化のモデル蛋白質として大腸菌内SUMO化システムを利用してSUMO化サイトを同定し、SUMO化が転写活性能に与える影響について検討した。マウスFOXP2内には3カ所のSUMO化サイトが予想され、各サイト(K74、K274、K673)のリジンをアルギニンに置換しSUMO化蛋白質の生成を調べたところ、K673Rに置換したときにのみSUMO化が起こらなかったことからこの部位が標的であることがわかった。また、FOXP2が結合することが知られているCC10遺伝子発現調節領域を組み込んだレポーター遺伝子を使って、野生型とK673R型FOXP2の転写抑制能を比較したところK673R型は野生型よりも強く転写活性を抑制し、FOXP2のSUMO化はDNA結合能に影響することが示唆された。
毛状根からの再生植物におけるアグロバクテリウム属細菌に対する再感染阻害機構の解析

RiプラスミドのT-DNAで形質転換した植物細胞組織には、Agrobacterium属細菌が再感染できないことがわかった。一方、薬剤耐性遺伝子で形質転換した植物細胞組織には、Riプラスミドを持つAgrobacteriumが感染でき、薬剤耐性の毛状根が単離できた。この結果から、RiプラスミドのT-DNA上に、Agrobacterium属細菌の再感染を阻害する遺伝情報が存在することが示唆された。Agrobacteriumの感染によって、形質転換植物細胞を得る過程は、次の4つの段階に分けられる;(1)アグロバクテリウムの植物細胞への接着、(2)T-DNAの植物細胞への移行、(3)植物染色体へのT-DNAの組み込み、(4)組み込まれたT-DNAからの遺伝子発現。そこで、感染過程のどの時期に再感染阻害反応が起こるのかを検討した。まず、薬剤耐性毛状根の表現形質について検討した。薬剤耐性毛状根を薬剤を含まない培地で長時間(約8ヶ月間、20回)継代培養した後、薬剤を含む培地に移して培養した。その結果、いったん組み込まれた薬剤耐性遺伝子とRiプラスミドからの2つのT-DNAは共存でき、安定に保持されて形質発現できることがわかった。この結果から、再感染阻害反応はT-DNAの組み込み段階以前に起こることが示された。次に、RiプラスミドのT-DNAが組み込まれた植物細胞から細胞壁を除去して、プロトプラストを調製した。エレクトロポレーション法を用いて、薬剤耐性遺伝子を植物細胞内に直接導入した。その結果、野生型の植物細胞では、薬剤耐性を示す形質転換植物細胞が得られたのに対し、RiプラスミドのT-DNAが組み込まれた植物細胞からは得られなかった。以上の結果から、植物細胞にRiプラスミドのT-DNAが存在すると、少なくとも、外来性遺伝子が植物染色体に組み込まれる過程が阻害されることがわかった。タバコの培養細胞や葉切片にAgrobacterium rhizogenesを感染させて、RiプラスミドのT-DNAを導入し、植物ホルモン無添加培地で生育できる細胞(毛状根細胞)や毛状根を選抜した。遺伝的に均一な細胞から構成される毛状根細胞やその組織を用いることが、本実験においては特に重要であるので、十分な時間をかけて、それぞれのクローンを樹立した。また、毛状根から植物体を再生した。各々のクローンを野生株と同じ生理的培養状態に整えるために、数カ月間継代培養した。次に、薬剤耐性等のマーカー遺伝子を持ったプラスミドを有するAgrobacterium tunefaciensをそれらのクローンに接種し、形質転換体が得られるかどうかを検討した。その結果、野生型の植物組織では、薬剤耐性を示す形質転換細胞や組織が得られたのに対し、毛状根細胞やその組織においては、薬剤耐性の形質転換体が得られないことを確認した。この現象から、Ri T-DNAを導入した植物細胞には、アグロバクテリウムの再感染を阻害する機構が存在することが示唆された。次いで、逆の感染系、すなわち、薬剤耐性遺伝子で形質転換した植物細胞や再生植物体に、RiプラスミドのT-DNAを導入することが可能かどうかを検討した。薬剤耐性の植物細胞組織を作出し、クローンを樹立したのち、それらの細胞組織を数カ月間継代培養した。再生植物体の葉切片にA.rhizogenesを感染させたところ、毛状根が得られ、また、それらは薬剤耐性遺伝子を保有していることがわかった。以上の結果から、アグロバクテリウムの再感染を阻害する機能が、RiプラスミドのT-DNA中に存在する可能性が示された。