hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
受動的力学機序を活かしたヒト規範型歩行・走行ロボットの開発

そこで,3Dリムレスホイールの運動を2次元運動に分けてモデル化するのではなく,3次元運動としてモデル化し,脚運動および脚の切換え現象を確認した.また,3次元歩行機および平地歩行機を機構的にインテグレーションする道筋を付けた.走行では,まず,伸張反射を有する手動型の足部ワイヤ駆動機構により,効率的にスロープ面を蹴ることが可能となった[(3),(4)].また,ワイヤ拘束機構(受動的力学機序)により,上体鉛直保持,脚の振り出し抑制・着地時膝伸展保持,さらに両脚連動を同時に実現することで,極めてヒトに近いインパクトのある走行を達成した.以上のことから,将来の能動化に向けての基本的な設計指針が明確にできた.本研究では,受動的な力学機序を活かし,ヒトの歩容を規範とした歩行・走行ロボットを開発した.また,ヒト歩行の特徴を解析的に明らかにした.従来の受動ロボットでは実現が困難であるヒト固有の特徴を考慮し,格段にヒトに近い3次元受動歩行および平地歩行を実現した.また,時速14.5kmの滑らかでダイナミックな連続走行を実現した.若干のアシストを伴っているものがあるが,モータ,センサおよびコンピュータを用いず,過度の能動制御は避けて受動的な力学メカニズムを最大限活かすことができた.ヒト固有の特徴(1)(4)に関して,異なるロボットではあるが,3次元受動歩行および平地歩行の実現によりほぼ達成された.いずれも受動的な力学機序を最大限活かしており,結果的にこれまで以上によりヒトに近い歩行を実現した.また,走行に関しても,自然でなめらかな受動的な走行を実現した.以上のことから,おおむね順調に進展していると考えている.27年度が最終年度であるため、記入しない。ロボティクス今後は,3次元歩行機および平地歩行機をインテグレーションし,実機による3次元平地歩行において,より高い安定性を追求し,さらに現行の手動方式から制御方式に切り替える.なお,平地歩行機に搭載されている上体質量が,精密なヒト足機構に大きな負担となるために最大の注意を払う.また,基本原理の理解のために数値解析も進める.走行に関しては,力学的機序を活かした制御手法の最適化を図ると共に,歩行とも関連する伸張反射を模擬した蹴り動作にも注目し,自立性を高めていく.本研究では,一から独自開発する歩行・走行ロボットで研究を推進しており,本年度も,実機開発ならびに実機実験を積極的に行い,その有効性を実証した.たとえば,アシスト受動歩行・走行では,ロボットのダイナミクスを体感し,パフォーマンスレベルの評価を行った.また,スロープ上で100歩を超えるヒト足による連続歩行実験に成功した.さらに,ヒト歩行を熟知した理学療法士の方々にも,達成した歩容が歩行リハビリテーションで目指すべき一つの理想形態とのコメントを頂いた.また,実験スキルをもった複数の大学院生を中心に,数体のロボットを並行して運用し,開発スピードを上げた.なお,一貫して力技の能動制御は避け,受動的な力学メカニズムを最大限活かす試みを行っており,今後の統合化も視野に入っている.27年度が最終年度であるため、記入しない。3次元歩行機と平地歩行機の2体の試作機(ロボット)に対して,ラピッドプロトタイピングを活用し,機構改良を迅速かつ低予算で行った.より大規模な改造を伴う2体のインテグレーションを図る前に,各機の基本性能の向上を入念に行ったために,次年度使用額が生じた.27年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究の推進方策としては,試作検証レベルから意匠性も考慮した本格運用レベルの実機に昇華させることで,信頼度・安定度を格段に向上させ,より長時間での歩行を実現する.
miRNA制御による損傷脊髄の再生

マウス脊髄損傷モデルにて,PCR法による脊髄損傷後のmiR-223の発現を観察したところ,損傷12時間後,3日後で二峰性の発現のピークがみられ,損傷12時間後においては損傷部±2mmの範囲で有意に高発現しており,同部位での炎症性サイトカインの上昇を認めた.また組織学的評価では,miRNA-223陽性細胞の約60%がGr-1陽性の好中球であることが判明した.以上より損傷早期の12時間において,好中球の遊走と炎症性サイトカインの放出は損傷部±2mmの範囲に集中し,これら好中球の動態にmiR-223の関与が示唆された.マウス脊髄損傷モデルにて,PCR法による脊髄損傷後のmiR-223の発現を観察したところ,損傷12時間後,3日後で二峰性の発現のピークがみられ,損傷12時間後においては損傷部±2mmの範囲で有意に高発現しており,同部位での炎症性サイトカインの上昇を認めた.また組織学的評価では,miRNA-223陽性細胞の約60%がGr-1陽性の好中球であることが判明した.以上より損傷早期の12時間において,好中球の遊走と炎症性サイトカインの放出は損傷部±2mmの範囲に集中し,これら好中球の動態にmiR-223の関与が示唆された.マウスを用い,T11高位にて脊髄損傷モデルを作成し,real time PCR法を用いて脊髄損傷12時間後におけるmiR-223の発現を損傷部中心に2mmごとに全長12mmにわたって解析した.椎弓切除のみ施行したコントロール群と比較して,損傷部±2mmの範囲でmiR-223は有意に高発現していた.損傷12時間後,3日後におけるin situ hybridizationを施行し,損傷部を中心に灰白質部にmiR-223を発現する細胞を認めた.またGr-1,CD68,Iba-1の免疫染色による二重染色を施行し発現細胞の同定を試みたところ,miR-223はGr-1陽性細胞と同様の分布を示し,二重染色にてmiR-223とGr-1の両者が陽性となる細胞を認めた.現在,損傷脊髄に対する再生医療として主に再生誘導あるいは細胞の移植研究が行われており,一部ではすでに臨床試験も実施されている。しかし移植細胞の腫瘍化や倫理的な問題問題があり,いまだに有効な再生治療は確立されていない.miRNAは組織特異的,発生段階特異的に発現しており,細胞の増殖,分化,アポトーシスなどといった生命現象だけでなく,疾患にも重要な役割を果たしているといわれている.また培養等の作業が必要なく,比較的臨床応用しやすいといった利点があり新薬開発の期待される分野である.脊髄損傷後,発現の上昇するmiR-223は,損傷部を中心に集積し,Gr-1陽性の好中球と一致する細胞を認めた.脊髄損傷後,miR-223は好中球に関与し二次損傷の制御に関わっている可能性があり,今後さらに研究をすることにより,将来,脊髄損傷後の二次損傷を防ぐまったく新しい治療法のターゲットとなる可能性がある.マウスを用い,T11高位にて脊髄損傷モデルを作成し,リアルタイムPCR法を用いて脊髄損傷後のmiR-223の発現を観察したところ,損傷12時間後,3日後で二峰性の発現のピークがみられた.次に損傷12時間後におけるmiR-223の発現を損傷部中心に2mmごとに全長12mmにわたって解析したところ,損傷部±2mmの範囲でmiR-223は有意に高発現し,同部位での炎症性サイトカインの上昇を認めた.またin situハイブリダイゼーションと免疫染色による二重染色により,miRNA-223陽性細胞の約60%がGr-1陽性の好中球であることが判明した.さらにmicroRNA-223の発現制御因子であるC/EBPαの発現を免疫染色で確認した.以上より損傷早期の12時間において,好中球の遊走と炎症性サイトカインの放出は損傷部±2mmの範囲に集中し,これら好中球の動態にmiR-223の関与が示唆された.現在,損傷脊髄に対する再生医療として主に再生誘導あるいは細胞の移植研究が行われており,一部ではすでに臨床試験も実施されている.しかし移植細胞の腫瘍化や倫理的な問題問題があり,いまだに有効な再生治療は確立されていない.miRNAは組織特異的,発生段階特異的に発現しており,細胞の増殖,分化,アポトーシスなどといった生命現象だけでなく,疾患にも重要な役割を果たしているといわれている.また培養等の作業が必要なく,比較的臨床応用しやすいといった利点があり新薬開発の期待される分野である.miR-223は今後さらに研究をすすめることにより,脊髄損傷後の二次損傷を防ぐ新しい治療法のターゲットとなる可能性がある.
東アジアの金融発展・統合の課題と展望

主な研究成果は、1金融開放は長期的に金融発展を促進するが、短期的に負の効果を及ぼす可能性がある。短期的な負の効果は銀行セクターの競争環境と相関しており、競争が活発であると正の効果を及ぼす。2金融発展は長期的に所得格差を縮小させるが、短期的にはむしろ拡大。危機への脆弱性が高く、ガバナンスの質が低いと短期的に所得格差を拡大。3海外からの金融ストレス・ショックの銀行貸出への波及効果は、銀行間の競争が活発でないほど負の影響が増幅され、逆に財務面での安定性が高いほど負の影響が緩和。4アジア通貨の米ドルとの連動は世界金融危機後に弱まっており、人民元との連動が2015年の管理相場制改革以降に強まっている。本研究の主な目的は、東アジア新興国を対象として、金融開放や資源価格変動が短期的なマクロ金融安定と長期的な金融発展に及ぼす影響について実証的な分析を行うとともに、東アジアの金融発展・統合の推進に向けての政策提言の方向性を示すことである。研究全体は大きく3つの段階に分けて進める計画であり、それぞれ、1東アジアの金融発展及び金融統合の実態把握、2金融発展・金融開放及び資源価格変動の経済効果の実証分析、3東アジアの金融発展・統合の推進に向けての政策提言のとりまとめを目標としている。これらのうち本年度は、主に1と2に重点を置いた取り組みを行った。まず1に関しては、京都大学共同利用・共同研究拠点「東南アジアにおける商業銀行セクターの地域横断的大変容の実態把握」研究会(計4回開催)への参加を通じて、情報収集と有識者との意見交換を行った。2に関しては、途上国の金融開放が金融発展に及ぼす影響の実証分析、ならびに途上国の金融発展が所得分配に及ぼす影響の実証分析に関する論文がそれぞれ国際学術誌に掲載されるとともに、アジアの金融統合の実態や資源依存国における金融発展の特徴を分析した論文などで構成される英文研究書(共著)を刊行した。さらに、アジア開発銀行研究所主催の国際コンファレンスでASEAN銀行統合に関する報告を行い、アジアの政策当局者とも意見交換をすることで、次年度以降の3に関する取り組みへの足がかりとなる情報を得ることができた。以下の理由により、研究計画に従って、研究目的の達成がおおむね順調に進展していると考えられる。すなわち、1大学外部の研究会に参加し、資料収集や専門家との意見交換を通じて、研究計画の第1段階であるアジア金融発展と統合の実態把握を効果的に行うことができたこと、2第2段階に位置付けられる金融発展・金融開放及び資源価格変動の経済効果の実証分析に関して、研究成果の一部が国際学術誌の論文及び英文研究書として刊行されたこと、3国際コンファレンスの参加を通じて、政策当局者との意見交換の機会に恵まれ、アジア金融発展と統合に関する政策課題の理解を深めることができたこと。本研究の主な目的は、1東アジアの金融発展及び金融統合の実態把握、2金融発展・金融開放及び資源価格変動の経済効果の実証分析、3東アジアの金融発展・統合の推進に向けての政策提言の3つである。本年度は、1及び2に関連して、米国の金融ショックがアジア諸国を含む各国の銀行の貸出行動に与える影響を銀行レベルの財務諸表データを用いて検証する実証分析、ならびに銀行レベルの財務諸表データを用いて銀行の倒産確率の予測を行い、金融セクターの脆弱性を計測する実証分析など行い、それぞれ査読付き国際学術誌において論文を刊行した。また、データサイエンスの手法を経済分析に活用する可能性について、工学系研究者と共同研究を開始し、アジア諸国を含む全世界の銀行レベルのデータを用いた銀行倒産や企業倒産の予測と金融セクターの脆弱性の計測に関する実証分析を行い、現在論文を執筆している段階である。さらに、京都大学東南アジア研究所が主催する「東南アジアにおける商業銀行セクターの地域横断的大変容の実態把握」に共同研究者として参加し、ASEAN銀行セクターの現状と課題に関する調査分析を行った。その一環として、シンガポールにおいて主要な地場銀行を訪問し、聞き取り調査を行うとともに、上記3に関連して、ASEAN+3マクロ経済リサーチオフィスにおいて、アジア域内の金融セクター育成に関する地域協力の可能性について研究報告を行った。以下の理由により、研究計画に従って、研究目的の達成が概ね順調に進展していると考える。すなわち、1主な研究目的に関連した研究成果を2本の論文として、査読付き国際学術誌で刊行している、2学外研究会の参加や海外現地調査を通じて、アジア域内の銀行セクターの実態に関する理解が深まり、その成果が次年度以降の研究成果に反映される見通しである。最終年度である本年度は、2に関連して、日本企業に関して企業レベルの財務諸表データを用いて倒産確率の予測を行い、産業別・地域別の脆弱性を計測する実証分析を行い、査読付き国際学術誌において論文を刊行した。なお、この研究成果は、Western Economic Association International 14th. International Conferenceにおいて共著者とともに共同報告を行った。また、アジア域内の為替レートの連動の変化についての実証分析を行い、査読付き国際学術誌において論文を刊行した(採択され、印刷中)。さらに、米国の金融ショックがアジア諸国を含む各国の銀行の貸出行動に与える影響に関して銀行レベルの財務諸表データを用いた実証分析を行うとともに、機械学習の手法を活用して石油先物価格の予測に関する実証分析を行い、いずれも査読付き国際学術誌に投稿し、審査中である。

3に関連して、平成29年度刊行の「現代アジア経済論」の分担執筆を行い、東アジア経済を取り巻く国際金融環境の変化や中国の一帯一路構想の影響、さらには地域金融協力の現状と課題について分析を行った。また、日本金融学会2017年度春季大会において、「中国・アセアン経済の行方とアジアの金融・通貨秩序」と題するパネルセッションで、アジア域内の為替レート連動や地域金融協力の今後の展望について討論を行った。主な研究成果は、1金融開放は長期的に金融発展を促進するが、短期的に負の効果を及ぼす可能性がある。短期的な負の効果は銀行セクターの競争環境と相関しており、競争が活発であると正の効果を及ぼす。2金融発展は長期的に所得格差を縮小させるが、短期的にはむしろ拡大。危機への脆弱性が高く、ガバナンスの質が低いと短期的に所得格差を拡大。3海外からの金融ストレス・ショックの銀行貸出への波及効果は、銀行間の競争が活発でないほど負の影響が増幅され、逆に財務面での安定性が高いほど負の影響が緩和。4アジア通貨の米ドルとの連動は世界金融危機後に弱まっており、人民元との連動が2015年の管理相場制改革以降に強まっている。第2年度以降も引き続き、研究計画に従って、金融開放や資源価格変動が新興国の短期的なマクロ金融安定と長期的な金融発展に及ぼす影響について実証的な分析を行うとともに、東アジアの金融発展・統合の推進に向けての政策提言の方向性について検討を進める。そのために必要なデータベース・計量分析ソフトウェアの購入や海外現地調査の実施を中心に研究費の支出を行う計画である。第3年度は、引き続き研究計画に従って、第2年度までに終了しなかった実証分析や現地調査を終え、その研究成果を学会・研究会で報告するとともに、学術誌で論文として刊行することを最終目標とする。また、政策当局者との意見交換を通じて、アジアの金融発展や地域協力の促進に関する政策形成に学術的見地からの貢献を目指す。旅費にかかわるコストが想定よりも安かったため旅費が当初の見込みを下回ったため、次年度使用額が生じた。第2年度の旅費の一部に充当の予定研究計画に従って、学会参加や海外調査のための旅費、論文の英文校閲、学術誌への投稿料、PC関連の消耗品の購入などに使用する予定。
統合失調症リスク遺伝子の確定：多発罹患家系エクソーム解析からの多段階解析

本研究では、統合失調症の発症に大きな影響力をもつリスク遺伝子を確定するため、以下のアプローチを組み合わせる。すなわち、1多発罹患家系15人のエクソーム解析による候補リスク遺伝子の同定、2候補リスク遺伝子のシーケンスによる稀な変異の網羅的な検索、3大規模関連解析によるリスク遺伝子の確定である。
授業における児童の関係認識の発展に関する実証的研究

本研究は、児童の関係認識がどのように成立し発展するかという観点から子どもの思考過程を把握するとともに、その認識を促す集団的な思考の場について考察したものである。本研究では、子どもの認識や論理の深化の過程に関する先行研究を参考にしつつ、小学校での研究授業を実施し、授業逐語記録やノート等の資料にもとづいて児童の関係認識の発展の過程を詳細に分析した。分析を通して、関係認識の発展過程を段階的に把握するとともに、認識の深化を支える集団的思考の場の役割と課題が明らかになった。本年度は以下の2点を中心とした研究を行った。第1は、子どもの関係認識とその発展過程に関する先行研究の検討と課題の整理である。この点の理論的検討として、上田薫の知識論に着目し、関係の動的変容としての個の認識の深化について考察した。また関係認識の発展過程を具体的に把握するにあたり、日比裕が提示している子どもの論理の形成過程の諸段階を関係認識の発展という観点から検討するとともに、小学校の算数の事例にもとづく詳細な考察を行った。その成果として、関係認識の発展過程を段階的に把握するとともに、対象のもつ諸関係が十分理解されず試行錯誤的に行われるにとどまった学習活動から見通しをもった活動への発展、言い換えれば関係認識の成立や発展には、やや不明瞭ながらも着目された関係の気づきや予測というものが介在していることが考察された。これらの研究成果については、論文としてまとめた。第2は、研究授業の計画・実施および記録化の作業である。具体的な授業にもとづいて児童の関係認識のあり方を把握するとともに、それを促す授業の構築に関する知見を得るため、授業者との協議の上で小学校での研究授業を計画・実施し、記録した。具体的には、島根県内の公立小学校(算数)および茨城県内の公立小学校(国語)において研究授業の実施、記録を行い、ノート・作文等の資料を収集した。研究授業実施後、授業記録の作成および関係資料の整理等を進めた。第1は、児童の関係認識の発展における集団思考の役割とそのあり方を探るための研究授業の実施および記録化である。昨年度の研究成果を踏まえ、児童の認識の深化を図るには、子ども相互が考えを働きかけ合う場が重要な役割をもつことから、集団思考の場における児童の認識の変容を明らかにするために、とくに児童の話し合いを心とした小学校・国語の授業に焦点化して授業の参観・記録を行った。実施した授業の授業逐語記録の作成およびノート等の資料整理を行うとともに、考察を進めている。第2は、具体的な授業実践の分析にする児童の関係認識の発展過程の考察とそうした認識の深化を支える授業論的課題の検討である。分析の対象として、本研究で昨年度実施した研究授業(小学校・国語)を取り上け、授業記録、ノート、作文等にもとづく考察を行い、研究成果を論文としてまとめた。本分析を通して、学習開始時には登場人物の行為とそれに対する児童の解釈が直線的・単純に結びつけられているのに対し、授業過程でそのとらえ方に問い直しが生じ、登場人物の行為の背景やその場面ないし物語全体との関連でとらえ直される過程を明らかにした。また児童相互の解釈の相違点等の立ち表れる場面が認識の変容の契機として重要であり、疑問点や対立点、共通点をはじめとして子どもが自己と他の考えを関連づけてとらえる学習の体制が子どもの関係認識を促す授業の基盤として重要であることが考察された。
血漿マイクロＲＮＡのバイオマーカーとしての有用性の検討

障害された細胞から遊出してくるmiRNAが血漿中で比較的安定であることより、細胞特異的miRNAを見出すことができれば、バイオマーカーとして利用可能となる。このコンセプトに基づき、心筋梗塞の診断マーカーとしてmiR-499、脳梗塞の診断マーカーとしてmiR-124、心不全の重症度診断マーカーとしてmiR-126及びmiR-210、膵炎の診断マーカーとしてmiR-216a及びmiR-216bが使えることを見出した。平滑筋、心筋、骨格筋(速筋及び遅筋)が、筋肉に特異的なmiR-1, 133a, 133b, 145, 499などの組み合わせで分類可能であることを見出した。レーザーマイクロダイセクション法などを援用し、細胞特異的miRNAの同定を更に進めた。膵臓外分泌腺部に特異的なものとしてmiR-216を見出し、血液中のmiR-216を膵炎の診断に使えることを明らかにした。膵臓ランゲルハンス氏島、下垂体前葉、松果体、網膜、前立腺などでも特異的なmiRNA候補を見出しており、順次臨床応用を考えていきたい。miRNAの発現パターンは、細胞特異的であり、miRNAの発現パターンから細胞の由来を同定できる。miR-1/133/143/145/208/499などの組み合わせで、血管平滑筋、消化管平滑筋、骨格筋、心筋など筋細胞各種の区別が可能であることを明らかとした。褐色脂肪細胞は、脂肪細胞由来と考えられてきたが、このmiRNAの発現パターンからは、極めて筋細胞に近いことも判明した。神経系に関しても、神経細胞、オリゴデンドロ細胞、アストロ細胞、マイクログリアなどを識別するmiRNAリストを作成した。この発現パターンから由来細胞を特定できる可能性は、ESやiPS細胞からの細胞分化の指標として使える可能性も示唆する。miR-210は幅広く種々の細胞で発現しているが、低酸素刺激で発現レベルが上昇する。生体内の低酸素バイオマーカーとして使える可能性があり、心不全患者で血漿及び末梢単核球中のmiR-210レベルを評価した。予測通り、心不全の重症度ともにmiR-210の発現レベルが増加することが判明し、新たな心不全バイオマーカーとして使える可能性を示すことができた。脂肪肝でmiRNA発現パターンが変化するか調べたが、大きな差異は見いだせなかった。血漿中に流出してくるmiRNAをバイオマーカーとして利用する試みを種々の病態を対象として行った。1)miR-210は低酸素で誘導されるmiRNAである。心不全患者の予後と血漿miR-210に相関関係があることを明らかとした。2)miR-216a, miR-216bは膵臓外分泌部で特異的に発現しているmiRNAである。膵炎モデルで血漿miR-216a及びmiR-216bは著明に上昇し、血清アミラーゼよりも鋭敏であった。3)筋肉細胞に特徴的なmiRNAとして、miR-1, miR-133a,miR-145, miR-133b, miR-208, miR-499などが知られている。心筋、骨格筋(遅筋・速筋)、平滑筋でこれらの発現パターンは異なることを明らかとした。血漿中の上昇パターンから、どのような筋細胞に障害があるのか特定が可能である。褐色脂肪細胞でのmiRNAの発現パターン解析から、褐色脂肪細胞が筋肉細胞に近いことを明らかとした。4)腎近位尿細管特異的に発現している尿酸トランスポーターSlc22a12のプロモーター領域は、近位尿細管特異的に脱メチル化されていることを確認した。近位尿細管障害で、近位尿細管由来ゲノムDNAが血漿中に流出することを検出するシステムを構築した。細胞特異的なマイクロRNAを見いだせば、その細胞の障害を特定することができる。細胞のマイクロRNAのプロファイルは、培養下と生体内で異なることが判明している。そこで、レーザーマイクロダイセクション法を用いて、特定の細胞のみを収集し、特定の細胞のマイクロRNAのプロファイリングを行っている。平成23年度は、生体内の各種筋肉細胞(骨格筋、心筋、血管平滑筋、消化管平滑筋など)と各種消化管粘膜細胞のプロファイリングを行った。これは、高齢化とともに増加しているが、良い診断バイオマーカーの存在しない虚血性腸梗塞を対象とするためである。消化管平滑筋に特異的なマイクロRNAは存在しなかったが、消化管平滑筋に比較的特異的なマイクロRNAと消化管粘膜に比較的特異的なマイクロRNAを見いだすことができ、両者を組み合わせることで、診断方法となり得ることを確定した。

今後、虚血性腸梗塞モデルを作成し、実用性を確認し、ヒトへの応用も企画する予定である。低酸素で誘導されるマイクロRNAにmiRー210があるが、血漿miRー210が新たな心不全マーカーとなり得る可能性を検討している。心不全のモデル動物であるダール食塩感受性高血圧ラットにおいては、心不全期には、骨格筋などでのmiRー210の発現が高まり、血漿miRー210が増加することが確認された。今後、ヒトサンプルで検討予定である。発現レベルの高いマイクロRNAは、予想よりは少ない、あるいは現在の測定系では正確に定量できないものが多い、などが判明してきた。ただ、いくつかの成功例は提示できつつある。スクリーニングにマクロアレーを用いるのでは、良い候補を見逃す可能性もあり、small RNA libraryを作成して、次世代シーケンサーでの網羅的プロファイリングを行うべきかもしれない(予算的に困難だが)。現在までのところ、予想通りに進んでいるが、発現レベルの高い細胞特異的マイクロRNAは、予想よりは少ないことが判明してきた。複数のマイクロRNAの組み合わせで、病態診断を試みることになる。神経系に関しては、詳しい解析はこれからであり、期待したい。引き続き、病態との絡みで興味深い細胞種に関して、特異的miRNAの発見に努める。特に神経系に焦点を絞り、神経変性疾患の髄液診断に応用できないか、検討したい。マイクロRNAの発現パターンに組織特異性があるのは、ゲノムDNAのエピジェネティックな違いに基づく可能性が高く、障害細胞から漏出してくるゲノムDNAのエピジェネティックな状態を調べることで、由来細胞が特定できる可能性もある。この可能性も探る予定である。より多種類の細胞種に関してマイクロRNAのプロファイルを作成し、診断に役立つ特異的マイクロRNAの発見に努力する。特に神経系の変性疾患を、髄液中のマイクロRNAのプロファイリングにより診断できないか、検討したい。病態に伴い、特定の細胞内でのマイクロRNAのプロファイルが変化し、その変化が血漿中のマイクロRNAのプロファイルに反映される可能性もあるかもしれない。モデルケースとして、患者数が予想以上に多いとされる、脂肪肝を調べてみる。心不全のバイオマーカーの候補として血漿miRー210を調べてきたが、末梢単核球でのmiRー210の発現レベルも調査したい。レーザーマイクロダイセクション関連の消耗品マイクロRNA測定関連試薬病態モデル作成のための動物購入研究の方向性は定まってきており、最終年度にかけて熟練した研究員を従事させ、成果として結実させる予定である。そのために人件費を確保しておく必要があり、予算の繰り越しを行った。レーザーマイクロダイセクションの種々の消耗品マイクロRNA測定のための測定試薬、RNA精製試薬などの消耗品病態モデルを作成するためのラットやマウスなどの動物購入、飼育費
ＤＮＡおよびＤＮＡ代謝酵素の１分子蛍光観測による動態解析

これまでの多くの生化学的な研究により、DNAに作用するタンパク質群が網羅され、これらのタンパク質間相互作用を中心とするタンパク質機能解析が精力的に行われた結果、DNA代謝反応の分子モデルが提唱されるに至っている。これらの研究の多くは、試験管内反応産物をゲル電気泳動法により解析することに依っている。試験管内の反応溶液には数百万以上のDNA及びタンパク質の分子が含まれているため、そこから得られた結果は多分子の挙動の平均値の情報しか反映しておらず、個々の分子の揺らぎの影響を解析することは困難である。また、試験管内実験ではDNA代謝反応の中間過程の素反応の実態を明らかにすることが難しい。そのため、DNA代謝反応の分子機構には未だ不明な部分が多く残されてる。上記の問題点の解決には、微小反応場の制御が可能な微細流路装置、DNAの1分子操作が可能な磁気ピンセット装置、高感度カメラを装備した蛍光顕微鏡装置の組合せから構成された1分子蛍光観察装置を用い、DNAの形態を制御すること、DNA及びタンパク質を蛍光標識することが有効である。そこで、本研究では上記の1分子蛍光観察に必要な装置及び技術を駆使し、1分子レベルにてDNAポリメラーゼによるDNA合成反応、負の超らせんがDNA複製反応の開始に与える影響を直接観察により評価した。28年度が最終年度であるため、記入しない。DNAポリメラーゼの機能は試験管内実験の測定法であるゲル電気泳動法により解析されている。この解析法により得られる結果は数百万分子以上の鋳型DNAを合成するDNAポリメラーゼの平均挙動の応答のみの情報であるため、DNAポリメラーゼ1分子の揺らぎの影響の解析は困難である。一方で、1分子研究は個々のDNAポリメラーゼ分子の挙動の応答を捉えることができるため、DNA合成反応の過程のDNAポリメラーゼ同士の入れ替わり・DNAポリメラーゼのDNA合成反応の停止、DNAへ結合・解離するDNAポリメラーゼの動的挙動などのDNAポリメラーゼの機能を明白にすることができる。本研究では1分子レベルにてDNA合成反応をリアルタイム観察することで、DNAポリメラーゼの動態挙動や機能分担を明らかにすることを目的としている。本年度の研究実績として、DNAポリメラーゼによるDNA合成反応を1分子蛍光観察するために、DNA複製・修復反応に関与する大腸菌やマウス、ヒトなどの哺乳動物のDNAポリメラーゼの準備とそれらの蛍光標識法を開発した。また、DNA合成反応の直接観察には大腸菌及び哺乳動物の1本鎖DNA (ssDNA)結合タンパク質へ蛍光タンパク質を融合した蛍光1本鎖結合タンパク質を用いた。蛍光1本鎖DNA結合タンパク質により標識したssDNA領域を含む直鎖状DNAを鋳型として用いることで、大腸菌及び哺乳動物DNAポリメラーゼによるDNA合成反応は直接観察した。DNA合成反応の観察の間、DNA合成酵素の進行に伴い鋳型直鎖状DNAのssDNA領域が徐々に短くなった。DNA合成反応の進行により蛍光1本鎖DNA結合タンパク質がDNAのssDNA領域から解離する様子を捉えることができた。その後、合成したDNAの2本鎖領域はインターカレーター型蛍光色素(SYTOX Orange)により蛍光染色することで可視化した。この結果、本研究では1分子レベルでのDNA合成反応のリアルタイム観察に成功した。これまでにDNA合成酵素によるDNA合成反応の直接観察や任意の超らせん密度を任意のタイミングで直鎖状DNAへ超らせんを導入可能な実験系の構築に成功した。これらの得られた研究成果は論文や複数の学会にて精力的に発表した。また、学会にて賞など受賞した。本研究では大腸菌1本鎖DNA結合タンパク質(SSB)に赤色蛍光タンパク質(DsRed)を融合した蛍光1本鎖結合タンパク質であるSSB-DsRedと1本鎖DNA結合能を持つ1本鎖DNA結合タンパク質RPA70 kDaサブユニットに黄色蛍光タンパク質(YFP)を融合した蛍光1本鎖結合タンパク質であるRPA-YFPを作製した。SSB-DsRedやRPA-YFPにより標識したssDNA領域を含む鋳型直鎖状DNAを用いることで、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片やDNAポリメラーゼβによるDNA合成反応を直接観察した。DNA合成反応の観察の間、クレノウ断片やDNAポリメラーゼβの進行に伴い鋳型直鎖状DNAのssDNA領域が徐々に短くなった。この観察により、SSB-DsRedやRPA-YFPが鋳型直鎖状DNAのssDNA領域から解離する様子を観察することができた。その後、インターカレーター型蛍光色素により2本鎖DNAを蛍光染色することで、合成したDNAの2本鎖DNA領域を観察した。これらの結果から、本研究ではクレノウ断片やDNAポリメラーゼβによるDNA合成反応の可視化に成功した。これらのDNA合成反応の解析の結果、クレノウ断片によるDNA合成反応のDNA合成速度は33塩基/秒であった。本研究の結果とゲル電気泳動法による解析結果とほぼ同じDNA合成速度が得られたことから、実験の整合性がとれた。一方、DNAポリメラーゼβによるDNA合成反応の直接観察により得られたDNA合成速度はゲル電気泳動法による解析結果と異なる結果となった。試験管内の反応

溶液には数百万以上のDNA及びタンパク質の分子が含まれているため、そこから得られた結果は多分子の挙動の平均値の情報しか反映しておらず、個々の分子の揺らぎの影響を解析することは困難である。また、試験管内実験ではDNA代謝反応の中間過程の素反応の実態を明らかにすることが難しい。そのため、DNA代謝反応の分子機構には未だ不明な部分が多く残されてる。上記の問題点の解決には、微小反応場の制御が可能な微細流路装置、DNAの1分子操作が可能な磁気ピンセット装置、高感度カメラを装備した蛍光顕微鏡装置の組合せから構成された1分子蛍光観察装置を用い、DNAの形態を制御すること、DNA及びタンパク質を蛍光標識することが有効である。そこで、本研究では上記の1分子蛍光観察に必要な装置及び技術を駆使し、1分子レベルにてDNAポリメラーゼによるDNA合成反応、負の超らせんがDNA複製反応の開始に与える影響を直接観察により評価した。今後も本研究では1分子レベルにて大腸菌および哺乳動物DNAポリメラーゼによるDNA合成反応をリアルタイムにて観察を進めていく。DNA合成反応のリアルタイム観察から得られた結果をもとに、DNAポリメラーゼの動態挙動や機能分担を解析していく予定である。そのため、現段階では大腸菌DNAポリメラーゼII、III、IV、Vや哺乳動物のDNAポリメラーゼλ、δ、α、εやクランプ及びクランプローダーである細胞増殖核抗原(PCNA)、5量体Replication Factor C (RFC 1、2、3、4、5)などのタンパク質の準備を進めている。細胞周期的に核マトリクスに固定されている染色体DNAは超らせんをはじめとする高次構造をとっている。一方、水溶液内での閉環状DNAの場合には、熱擾乱による局所的な超らせんが導入されているため、試験管内では閉環状DNAの超らせん状態を制御できない。そのため、超らせん歪みが果たしている生理学的役割は極めて限られた知見しかない。そこで、DNAの超らせんがDNA複製反応にどのような影響を与えるのかを解析するために、微細流路装置、磁気ピンセット装置、蛍光顕微鏡装置の組合せである1分子蛍光観察装置を用いて、直鎖状DNAへの超らせんが導入可能な実験系を構築した。今後、Hurwitz、Stillmanら多くの研究者により確立された複製モデルであるSV40 in vitro複製系を開発した1分子実験系に適応することで、複製DNAポリメラーゼの機能など、負の超らせんがDNA複製反応に与える影響を解析していく。そのため、SV40複製因子である複製開始とヘリカーゼ活性の機能を持つSV40ラージT抗原、哺乳動物複製DNAポリメラーゼα、δ、ε及びその他の複製関連因子の準備も平行して進めていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。
血小板因子による肝再生の開始と停止機構の研究

広く生物界の中でみられる再生現象の中でも肝再生は大変ドラマチックな生物現象であり、発見以来1世紀にもさかのぼる歴史を有する。この間、多くの研究者の関心を引きつけてきたが、肝再生の開始機構については長らく不明であった。私達は、1982年に世界に先駆けて成熟ラット初代培養肝細胞の増殖に成功し、このin vitroの肝再生系とも言えるアッセイ法を用いて、30数年来その実体が不明であった肝再生因子(hepatotrophic factor)の本体を70%肝部分切除後肝再生を活発に始めているラット血清中に見い出し、部分精製後、既知増殖因子のいずれとも異なる新しい因子であることが示唆されたので肝細胞増殖因子(hepatocyte growth factor;HGF)と名づけた。1986年にHGFを約3000匹のラット血小板から均一なタンパク質として単離することに成功した。HGFは分子量82-85kDaの熱に不安定なタンパク質であり、分子量69kDaのα鎖と34kDaのβ鎖からなるヘテロダイマーである。HGFの研究中、血小板には2種類の肝細胞増殖抑制因子が存在することに気づき、血小板由来にちなみPDGI-α及びβと名づけた。1つは精製後そのアミノ酸配列からTGF-β1と同一物質であり、他の1つはTGF-β1に類似しているが、化学的、生物学性質の異なる新しいgrowth inhibitorであることが示唆された。さらに血小板中にはTGF-βと特異的に結合してその活性をマスクする調節タンパク質(TGF-βmasking proteinと命名))が存在することが明らかになり、このタンパク質をラット及びヒト血小板から単離した。本研究課題では、血小板から新たに発見され単離された肝再生の開始と停止を担う生理活性タンパク質の構造を明らかにすると共に、肝再生の分子機構を分子細胞生物学的研究により解明する。肝再生因子の本体、HGFは分子量69kD(α鎖)と34kD(β鎖)の2種類のサブユニットから成るヘテロダイマ-である。最近、ラット及びヒトHGFのcDNAクロ-ニングに成功し,その全一次構造を明らかにした。ヒトHGFは728アミノ酸残基のプレプロ前駆体として合成される。この前駆体がプロセッシングを経て、440アミノ酸残基のα鎖と234残基のβ鎖に分離され、S-S結合を介したヘテロダイマ-構造を取って成熟型となる。α鎖には4個のkringle構造があり、プラスミンと相同性を持っている。またヒトHGF cDNAを組み込んだ発現プラスミドをCOS1及びCHO細胞に導入した結果、recombinant HGF合成にも成功した。また、肝炎ラットにおけるHGFmRNAの発現を検討したところ、肝傷害の程度に応じてHGFmRNA量が顕著に増加し、しかも非実質細胞によってHGFが合成されることが明かとなった。従って、肝臓内に傷害を認識し肝再生因子であるHGFの合成を誘導する機構が存在すると考えられる。即ち肝細胞の増殖を非実質細胞が調節するparacrine systemによって肝再生が起こることを示している。更に、TGF-βは肝細胞の増殖を抑制する因子であるが、その活性をマスクする調節蛋白質(TGF-βmasking protein)のHeavy chain(MP-h)のクロ-ニングにも成功し、その全アミノ酸配列を決定した。MP-hはその部分アミノ酸から未知の蛋白質であることを既に明らかにしていたが、今回の全一次構造決定で大変ユニ-クな構造を持つ蛋白質であることがわかった。

110kDのMP-hは全長6kbのmRNAにコ-ドされており、約1700残基のプレプロ前駆体として合成される。成熟型MP-hは841残基からなり、分子中に13個のEGF-like domainを持つ。MP-h分子中の多数のEGF-like domainが、TGF-βの可溶性レセプタ-とも考えられるMPの結合活性に重要な役割を担っていることが予想された。HGFとMP-hのクロ-ニングに成功した現在、肝実質細胞の増殖制御の研究は新しい局面をむかえている。1)HGFレセプタ-の解析:成熟ラット初代培養肝細胞のHGFレセプタ-はHGFに対し高い親和性を示すが、肝細胞一個当りのレセプタ-数は非常に少ない。またHGFレセプタ-の分子量は230kDaと推定された。更にHGFレセプタ-は上皮系細胞に広く認められるが、中胚葉由来の細胞には認められなかった。2)HGF mRNAの発現及びHGF産生細胞の同定:HGF mRNAは肝臓毒を投与したラットのKupffer cellで顕著に増加した。更に肺及び腎臓でもHGF mRNAの誘導が認められた。これらの結果は肝傷害を伝えるメジエ-タ-がKupffer cellばかりでなく、肺や腎臓でもHGF合成を誘導し、分泌されたHGFがparacrine機構及びendocrine機構によって肝再生を促すことを示唆している。3)ヒトHGF遺伝子の構造解析:ヒトHGF遺伝子の構造は全体としてはplasminogenなど血液凝固系、線溶系のセリンプロテア-ゼの遺伝子に類似していた。HGFはこれらの蛋白質を含む創傷治癒系の重要な一員である事を伺わせる。4)HGFの新しい生物活性:HGFはヒト正常表皮ケラチノサイトに対して、その増殖のみならず細胞のmigrationを強く促進した。更にHGFは幾つかの癌細胞に対して強い増殖抑制活性を持つことがわかった。この新しい活性も、HGFが組織の修復、再生において発揮する重要な活性であり、HGFは肝再生のみならず他の器官組織の再生にも関与していると考えられる。5)増殖抑制因子:TGFーβの増殖抑制作用をマスクするmasking proteinのlarge subunitをクロ-ニングし、全一次構造を決定した。このcDNAを用いて組織分布を調べたところ、TGFーβの発現分布と一致した。従ってTGFーβは不活性型で分泌され、活性化機構によって活性の発現が調節されると考えられる。またILー1が肝細胞の増殖抑制因子であることを見い出した。この作用はβ型に特異的であり、肝細胞にはILー1βに特異的なレセプタ-が存在することを確かめた。ヒトおよびラットのHGFcDNAやヒト組み換えHGFを利用して、HGFの働きや傷害によるHGFの誘導機構について詳細な検討を行なった。1.HGFは肝臓の再生因子として働くばかりでなく、腎臓やケラチノサイトの再生因子として働く。他方種々の肝障害に伴って肝臓のみならず肺、腎、脾などの正常遠隔臓器に於ても速やかにHGFが発現誘導を受ける。HGFの発現誘導は片腎摘出によっても認められ、HGFの発現誘導が広い臓器傷害によって起こる事を示した。2.HGFは一部の上皮系細胞に対しては運動を高める因子として働く。更に、腎再生時には尿細管の形成にHGFがmorphogenとして働く事も明かとなった。
局所尤度によるセミパラメトリック推測

局所尤度の概念を統計学へ展開した。これはパラメトリック推測とノンパラメトリック推測を結合させる新しい方法論と云える。今年度は密度推測について、カーネルと尤度関数を合体させた局所尤度関数に基づく推定の詳細な研究を行った。これは各点で推定したい密度を局所尤度法で構成するものである。問題となるのは「バンド幅をどのように決定するか?」である。これに対してリスク関数を交差検証法によって推定することによって、最適なバンド幅を決める方法を考察した。この方法と、従来のパラメトリックな方法とノンパラメトリックなカーネル型推定の密度推定量について比較検討した。局所尤度法はパラメトリックな方法の長所と、ノンパラメトリックな方法の長所を同時に引き出すことに成功した。この研究は、多次元ランダム変数の場合に拡張するように試みられている。特に判別分析の問題について研究された。これはニューラルネットワークスで盛んに研究されている、パタン認識の分野と密接な関連がある。トレーニングデータを学習させ、判別超曲面を構成する方法論である。これを局所尤度法に基づいて構成する研究を展開中である。具体的な方法は、ロジスティック回帰分析を援用した方法を拡張することから開始された。これによって初めに判別超平面が得られ、次に超平面上にトレーニングデータが貢献する尤度が局所的に計算される。この局所尤度関数によって各点の判別超曲面の法ベクトルを求める。この方法によって、線型判別関数を第1近似に持つ非線形判別関数が提案された。次に生存解析の標準的尤度解析について局所化について考察している。これはCox比例ハザードモデルに情報のあるドロップアウトやエントリーバイアスが無視出来ない状況の観測のために有効に働く。まだ完全な形は得られていないが、松浦正明博士(広島大学原医研)と共同研究の中で被爆者データの解析から局所化のモデル化を討論している。局所尤度の概念を統計学へ展開した.これはパラメトリック推測とノンパラメトリック推測を結合させる新しい方法論と云える.今年度は密度推定について,カーネルと尤度関数を合体させた局所尤度関数に基づく推定の詳細な研究を行った.これは各点で推定したい密度を局所最尤法で構成するものである.問題となるのは「バンド幅をどのように決定するか?」である.これに対してリスク関数を交差検証法によって推定することによって,最適なバンド幅を決める方法を考察した.この方法と,従来のパラメトリックな方法とノンパラメトリックなカーネル型推定の密度推定量について比較検討した.局所尤度法はパラメトリックな方法の長所と,ノンパラメトリックな方法の長所を同時に引き出すことに成功した.この研究は,多次元ランダム変数の場合に拡張するよう試みられている.特に判別分析の問題について研究された.これはニューラルネットワークスで盛んに研究されている,パタン認識の分野と密接な関連がある.トレーニングデータを学習させ,判別超曲面を構成する方法論である.これを局所尤度法に基づいて構成する研究を展開中である.具体的な方法は,ロジスティック回帰分析を援用した方法を拡張することから開始された.これによって初めに判別超平面が得られ,次に超平面上にトレーニングデータが貢献する尤度が局所的に計算される.この局所尤度関数によって各点の判別超曲面の法ベクトルを求める.この方法によって,線型判別関数を第1近似に持つ非線形判別関数が提案された.局所尤度の概念を統計学へ展開した.

これはパラメトリック推測とノンパラメトリック推測を結合させる新しい方法論と云える.今年度は密度推定について,カーネルと尤度関数を合体させた局所尤度関数に基づく推定の詳細な研究を行った.これは各点で推定したい密度を局所最尤法で構成するものである.問題となるのは「バンド幅をどのように決定するか?」である.これに対してリスク関数を交差検証法によって推定することによって,最適なバンド幅を決める方法を考察した.この方法と,従来のパラメトリックな方法とノンパラメトリックなカーネル型推定の密度推定量について比較検討した.局所尤度法はパラメトリックな方法の長所と,ノンパラメトリックな方法の長所を同時に引き出すことに成功した.この研究は,多次元ランダム変数の場合に拡張するよう試みられている.特に判別分析の問題について研究された.これはニューラルネットワークスで盛んに研究されている,パタン認識の分野と密接な関連がある.トレーニングデータを学習させ,判別超曲面を構成する方法論である.これを局所尤度法に基づいて構成する研究を展開中である.具体的な方法は,ロジスティック回帰分析を援用した方法を拡張することから開始された.これによって初めに判別超平面が得られ,次に超平面上にトレーニングデータが貢献する尤度が局所的に計算される.この局所尤度関数によって各点の判別超曲面の法ベクトルを求める.この方法によって,線型判別関数を第1近似に持つ非線形判別関数が提案された.次に生存解析の標準的尤度解析について局所化について考察している.これはC_<ox>比例ハザードモデルに情報のあるドロップアウトやエントリーバイアスが無視できない状況の観測のために有効に働く.まだ完全な形は得られていないが,松浦正明博士(広島大学原医研)との共同研究の中で被爆者データの解析から局所化のモデル化を討論している.
新規インターフェロンLimitinを中心としたがん治療戦略の確立

IFN-αやIFN-βと相同性を有する事実、IFN-α/β受容体と結合する事実、抗ウイルス活性を有する事実に基づき、我々が同定したlimitinは新種のI型IFNと認められIFN-ζと命名された。我々は、リコンビナントIFN-ζ/limitinを作製したうえで、IFN-ζ/limitinとIFN-αの生理活性を同一実験系にて直接比較した。IFN-ζ/limitinは、腫瘍細胞増殖抑制作用・MHC class I発現増強作用・CTLキラー活性増強作用に関しIFN-αと同等の生理活性を示した。一方、正常骨髄球・Bリンパ球・巨核球前駆細胞に対し、IFN-αと同等の増殖抑制作用を示すためには、より大量のIFN-ζ/limitinが必要であった。さらに、培養巨核球をIFN-ζ/limitinやIFN-αで刺激した時のシグナル伝達分子を解析した。IFN-ζ/limitinは、IFN-αと同定度のStat1リン酸化やSOCS-1遺伝子発現を誘導した。しかし、IFN-ζ/limitinは、IFN-αと比較してTyk2活性化およびTyk2下流のイベントであるDaxx遺伝子発現やCrkリン酸化誘導が減弱していた。アンチセンスオリゴを用いた実験系で、DaxxとCrkともにIFN-ζ/limitinやIFN-αによる巨核球前駆細胞増殖抑制に重要であることも明らかにした。Daxx分子に関して、Daxx蛋白をBa/F3細胞に過剰発現させるとFasを介するアポトーシス誘導が増強されることを明らかした。さらに、Daxx蛋白との新しい結合蛋白として,DMAP1やTSG101を同定し、これらが細胞内で複合体を形成することを示した。残念ながら、ヒト型IFN-ζ/limitin遺伝子を同定できなかった。稀なケースではあるが、IFN-ζ/limitinは、マウスでは存在するが、ヒトでは存在しない遺伝子であると考えられた。そこで我々は、IFN-ζ/limitin様生理活性特徴を保存した人工ヒトIFNの開発を目的として、IFN-ζ/limitinとIFN-αの塩基配列の違いをもとにした変異IFNを作製した。
有機ケイ素及び典型金属化合物から発生するラジカルイオン種の物性と反応性

「有機ケイ素および典型有機金属化合物から発生するラジカルイオン種の物性と反応性」,および「有機ケイ素および典型有機金属化合物から発生するラジカルイオン種の合成化学的利用と機能開発」の2課題を中心に研究を進め、以下の成果を得た。1.アリルトリメチルシラン[1]またはベンジルトリメチルシランと1,4-ジシアノベンゼン(DCB)との光反応において、DCBのCN基の一方がアリル基またはベンジル基によって置換された生成物を高選択的に得た。2.[1]と1,4-ジシアノナフタレン(DCN)との光反応では、DCNの1位のCN基がアリル基によって置換された生成物,DCNの1,2位にアリル基と水素が付加した生成物,およびこの付加生成物が分子内でさらにシクロ付加した生成物を得た。これらの生成物は反応条件の選定によりそれぞれ高選択的に得られた。3.[1]と9,10-ジシアノアントラセン(DCA)との光反応では、DCAの9,10位にアリル基と水素が付加した化合物を高選択的に得た。4.[1]と1-アリール-2,2-ジシアノエテン[2]との光反応では、アリル基が[2]のCN基のβ位に付加した生成物を高選択的に得た。5.[1]とシクロヘキシリデンマロノニトリル[3]との光反応では、アリル基が[3]のCN基のα位に付加した生成物を得た。6.ヨウ化アルキル存在下でのアリルトリブチルスズと[2]との光反応では、[2]のα位にアリル基,β位にアルキル基が付加した生成物を高選択的に得た。7.1-5の光反応では、有機ケイ素化合物から光励起されたシアノ化合物への電子移動によって発生するラジカルイオン種が活性種となって反応が進行することが明らかになった。8.以上の光反応について、反応活性種の化学的特性,反応選択性を支配する因子,合成化学的利用などに関する多数の新知見を得た。
胃癌における上皮間葉移行（ＥＭＴ）制御によるリンパ管浸潤抑制の治療応用

本研究は、胃癌における上皮間葉移行(EMT)を制御することでリンパ管浸潤を抑制し、治療的応用を検討することを目的とした。先行研究で着目してきたHOXB9と胃癌の悪性度の関係を調べた。臨床検体を用いたHOXB9免疫染色の臨床病理学的検討で、HOXB9発現とリンパ節転移、リンパ管・血管浸潤との関連が認められた。また生存予後との関連も認められた。HOXB9を遺伝子導入した胃癌株TMK-1でリンパ管新生因子の発現亢進が認められた。胃癌ではHOXB9がリンパ管新生を誘導することで進展する可能性が示唆された。HOXB9分子に着目した胃癌の進展抑制の治療的応用は新たな治療戦略の一つとなる可能性が期待された。当初の仮説通り、HOXB9とリンパ節転移、リンパ管浸潤に関する新たな知見が得られた。これは胃癌が早期からリンパ節転移をきたすことを説明しうる1つの現象と考えられた。EMT誘導因子のHOXB9発現とリンパ管浸潤の関連を示すデータも得られ、HOXB9の発現調節による治療的応用が期待される結果が得られた。それとともに、研究結果から癌細胞のstemnessとの関連を示唆する所見が得られたため、26年度以降、この面での検討を進める予定である。本研究では、胃癌の上皮間葉移行(EMT)を制御することで、リンパ行性転移を抑制することで胃癌の新たな治療戦略を開拓することを目指した。本研究はHOXB9に着目した。HOXB9発現は、69症例の切除検体の免疫染色の臨床病理学的検討から、壁深達度(T)、リンパ節転移(N)、リンパ管浸潤(ly)、血管浸潤(v)と統計学的に有意な相関を認めた。またHOXB9の発現を認めた患者の予後(全生存)は不良の傾向を認めた(P=0.076)。胃癌細胞株のTMK-1を用いた検討では、HOXB9を遺伝子導入した株でVGEF-Dが高発現が認められた。我々のこれまでの大腸癌、乳癌での検討では、血管新生関連の因子の発現が亢進していたが、胃癌ではリンパ管新生関連因子が亢進しており、胃癌がリンパ行性に転移しやすい臨床的特徴と一致する結果であった。HOXB9の発現調節による治療的応用の可能性が示唆された。現在、研究結果を英文原著として投稿中である。また、現在、幹細胞性(stemness)との関連を検討しており、EMTの制御とともに胃癌の分化誘導が胃癌の悪性度を低下させる可能性がある結果を得ており、この方面で研究を進める予定である。一般・消化器外科臨床検体の検討では、当院における胃癌手術検体で、免疫染色によりHOXB9の発現と、癌細胞の浸潤形態とを比較検討し、EMTとの関連を検討し、さらに臨床病理学的因子(T, N, M, ly, v,予後など)との相関をみた。リンパ管新生に関して、D2-40の免疫染色により組織学的評価を行った。In vitroでは、上図のごとくqRT-PCRにてHOXB9の発現が低くepithelialな形質を有する胃癌細胞株TMK-1にHOXB9遺伝子(コントロールはLacZ遺伝子)を導入した。HOXB9を恒常的に高発現するTMK-1/HOXB9と、テトラサイクリン発現誘導システム(Tet-On®3G発現誘導システム、タカラバイオ(株))によりHOXB9発現を調節可能なTMK-1/TR/HOXB9の2種類の細胞を作成した。In vivoでは、免疫不全マウス(SCID)のxenograftモデルを作成したが、腫瘍の発育が遅く評価に堪えないものであった。それとともに、研究結果から癌細胞のstemnessとの関連を示唆する所見が得られたため、26年度以降、この面での検討も合わせて進める予定である。直接経費130万円のうち、4万数千円を残し、適切に研究のために使用した。未使用額は効率的な物品調達を行った結果として発生したものである。繰り越された数万円は、次年度の研究費と合わせて実験のための消耗品に使用する予定である。