hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
刺激一放出連関におけるカルシウムシグナリングの細胞内・細胞間伝播

遊離膵腺房標本を窒素ガスによる刺激物質のごく短時間噴出で局所刺激する方法を画像解析法と組み合わせて確立した。この方法は刺激物質投与量とCa^<2+>transientの定量的解析を可能にする。Ca^<2+>増加のホットスポット及び指揮細胞の存在の可能性は少なく、各々の細胞が独立して反応し得る。適当な濃度範囲の刺激物質で局所刺激した場合、Ca^<2+>が隣接する細胞に環状に伝播していく画像がしばしば見られた。細胞間ギャップ結合の透過性を減少させるheptanolを作用させると、CCK-8刺激によるCa^<2+>の細胞間伝播が抑制されたことから、細胞間伝播にギャップ結合が関与していると思われる。腺房細胞ヘの微小ガラスピペットの刺入は困難で、また高濃度Ca^<2+>をピペットに充填すると先端にCa^<2+>の結晶が生じ、細胞内のinjectionがますます困難となった。従って細胞膜可溶化物質のdigitoninを次に用いた。これを基底膜近傍に局所的投与して細胞外Ca^<2+>を流入させることで細胞内Ca^<2+>を上昇させ、隣接細胞への波及を見たが、高濃度でギャップ結合が閉じたためか隣接細胞への伝播は認められていない。Ca^<2+>測定に用いた細胞の電子顕微鏡観察を検討中であるが、現在エポン包埋まで可能となった。trimmingし、超薄切標本を得ることが次の課題である。他の細胞内signal transduction因子の役割についてはピペットの刺入が困難なため別の方法を模索中であるが、cyclic AMPについては直接的な関与は薄いと思われる。結論として、刺激物質によって各細胞のCa^<2+>濃度が上昇し、上昇したCa^<2+>はギャップ結合を通って隣接細胞に伝播し、腺房全体として同期したCa^<2+>濃度上昇が起こる。しかし、細胞膜破損などである特定の細胞のCa^<2+>濃度が生理的範囲を逸脱するほどに上昇した時は、ギャップ結合は閉鎖し、高まりすぎたCa^<2+>が隣接細胞に波及するのをむしろ防いでいるものと考えられる。Ca^<2+>の細胞内濃度はかなり厳密に調節されていると考えられる。
成人白質脳症の臨床・遺伝学的背景の解明と新規遺伝子同定

白質脳症は大脳白質を病変の主座とする疾患の総称である。原因疾患は多岐にわたり、遺伝性も含め全く病態の異なる疾患が混在する。我々は卓上型次世代シーケンサーを用いて特定の白質脳症関連55遺伝子について、微細構造異常を含めて検出可能な解析系を開発し、解析を行ってきた。その研究を通じて収集した白質脳症60例のうち、異常が検出されなかった52例および追加収集した白質脳症52例に対し、臨床病型・画像所見から分類を行い、遺伝子異常が疑われる群に対してはエクソーム解析を施行した。共通項が得られている例ごとにエクソーム解析の結果を検討することで、新規原因遺伝子の同定をめざす。本研究により成人白質脳症の全体像の把握、効率的な診断、治療方針の決定が可能となると考えられる。現在までの進捗状況に記載の通り、当該研究で収集した60検体の内、特定55種類の遺伝子に異常が認められなかった52症例、新たに追加収集した52症例についてエクソーム解析を進め、成人白質脳症の全体像を明らかにしていきたいと考えている。これまでに112症例のエキソーム解析を施行し、8症例に対して疾患原因遺伝子を同定することができた。引き続き、未同定の95症例に対する原因解明に努めていく。当該研究で収集した60検体の内、特定55種類の遺伝子に異常が認められなかった52症例、新たに追加収集した52症例についてエクソーム解析を進め、成人白質脳症の全体像を明らかにしていきたいと考えている。スクリーニング解析陰性の52症例においてエクソーム解析を行った結果、1症例においてL2HGDHホモ接合性変異を同定した。顕著な脳室拡大・脳萎縮を伴い、白質ジストロフィーが疑われた実際の症例であり、我々が選択した55遺伝子以外の遺伝子変異であった。L2HGDH遺伝子異常の症候は多彩であるため、表現型として「白質脳症」が必ずしも前景に立つわけではないが、主治医が白質脳症に着目したことから、我々の解析手法、臨床・画像分類からの遺伝子同定ストラテジーを用いることにつながり、診断へ結びついた例である。また、新たに収集した52症例に対しエクソーム解析を行った結果、これまでに6例でNOTCH3新規変異、1例でTUBB4A新規変異を検出するに至っている。合計112症例のエキソーム解析を終え、8症例に対して疾患原因遺伝子を同定することができた。引き続き未同定の95症例に対する原因解明に努めていく。112症例のエキソーム解析を施行し、8症例に対して疾患原因遺伝子を同定することができた。常にアップデートされた文献内容を把握し、既知遺伝子における新規変異の病的意義の検討を行う。

常にアップデートされた文献内容を把握し、既知遺伝子における新規変異の病的意義の検討を行う。エクソーム解析の検体数が予定数より少なかったため、来年度は追加検体のエクソームキャプチャー試薬代、エクソームシーケンス解析代として助成金を使用する予定である。
Runx2プロモーターにおける細胞系列及び分化段階特異的発現制御領域の特定

Runx2(runt-related transcription factor 2)/Cbfa1(core binding factor a1)は未分化間葉系細胞からの骨芽細胞系列への分化決定と軟骨細胞の成熟を担う転写因子であり、Runx2遺伝子自身の、時間的・空間的発現調節が、骨芽細胞・軟骨細胞分化および正常な骨格形成プログラムに必須である。Runx2プロモーターは、エクソン1とエクソン2の上流にそれぞれ存在するが、Runx2遺伝子の転写制御機構は未だ明らかになっていない。これを明らかにするため、Runx2遺伝子領域のBACクローンを用いて、GFPトランスジェニックマウスを作製し、Runx2遺伝子の発現制御に必要な領域を明らかにした。さらに、様々な部位を欠失させたコンストラクトを用いてGFPトランスジェニックマウスを作製することにより、骨芽細胞にのみ発現を認めるトランスジェニックマウスおよび軟骨細胞にのみ発現を認めるトランスジェニックマウスをそれぞれ得た。これらのマウスは、Runx2遺伝子の発現調節機構を解明するのに、非常に有用なツールである。Runx2プロモーターは、エクソン1とエクソン2の上流にそれぞれ存在する。これまでRunx2の骨芽細胞と軟骨細胞での発現を制御する領域を調べるために、エクソン1の上流20kbまでのコンストラクトを導入したマウスを作成したが、いずれも再現できなかった。これは、イントロン領域に重要な転写因子の結合配列が存在することを示唆している。そこでBACクローンを用い、エクソン1上流100kb、イントロン1、エクソン2を含む約230kbゲノムDNAの下流にinternal ribosome entry site(IRES)-enhanced green fluorescence protein(EGFP)を挿入したコンストラクトを構築した。このDNAをマウス受精卵に注入、トランスジェニックマウスを作製した。4週齢で尾の先端を採取し、皮膚および皮下組織を除いて、蛍光実体顕微鏡にてEGFPを観察した。尾椎にEGFFPの強い発現の観察された、3匹のFOマウスを選択、系統を樹立した。これら3系統のマウスで、胎生16.5日で凍結切片を作製、蛍光顕微鏡で観察するとともに、抗EGFP抗体を用いた免疫組織染色を行った。3系統ともに、同じ発現パターンを示し、骨芽細胞、軟骨細胞に発現を認めた。これは、in situ hybridizationおよび抗Runx2抗体を用いた免疫組織染色で得られたRunx2の発現パターンと完全に一致した。したがって、用いた230kbには、Runx2の転写調節領域が全て含まれていると考えられ、今後Runx2の転写調節機構を解明するうえで、貴重なマウスとなる。これまでRunx 2の骨芽細胞と軟骨細胞での発現を制御する領域を調べるために、エクソン1の上流20kbまでのコンストラクトを導入したマウスを作成したが、いずれも再現できなかった。そこでBACクローンを用い、エクソン1上流100kb、イントロン1、エクソン2を含む約230kbゲノムDNAの下流にinternal ribosome entry site(IRES)-enhanced green fluorescence protein(EGFP)を挿入したコンストラクトにより、トランスジェニックマウスを作製した。抗EGFP抗体を用いた免疫組織染色は、in situ hybridizationおよび抗Runx2抗体を用いた免疫組織染色で得られたRunx 2の発現パターンと完全に一致した。さらにゲノムを約40kbずつ欠失させた6コンストラクトを作製し、それぞれトランスジェニックマウスを作製した。抗EGFP抗体を用いた免疫組織染色により、骨芽細胞にのみ発現を認めるトランスジェニックマウスおよび軟骨細胞にのみ発現を認めるトランスジェニックマウスをそれぞれ特定することができた。したがって、それぞれの欠失領域に、軟骨細胞特異的および骨芽細胞特異的エンハンサーが存在すると考えられる。今後これらの領域をさらに限定し、Runx 2の軟骨細胞および骨芽細胞における発現を規定する転写因子を特定する。
難治性口腔粘膜疾患の病態解明と新規制御法を目指した基礎的研究

口腔扁平苔癬は、口腔粘膜の角化異常を伴う難治性の慢性炎症性疾患である。原因は不明だが、上皮下へのCD4およびCD8T細胞の浸潤が惹起され、基底細胞に対する細胞傷害と変性を生じることにより病態が形成されると考えられている。これらT細胞の免疫応答は、細胞表面に発現される共刺激分子の発現と産生されるサイトカインによって大きく左右される。口腔扁平苔癬において、上皮下に浸潤しているCD3陽性T細胞上にPD-1の発現および基底細胞上にPD-L1が発現していることを確認した。よって、口腔扁平苔癬における免疫応答にPD-1-PD-L1の相互作用が関与していることが示唆された。口腔扁平苔癬は、臨床診断と病理組織学的診断を合わせて診断される。そこで、先ず臨床診断と病理組織学的診断の相関について検討を行った。対象は、2001年から2010年の間に東京医科歯科大学顎口腔外科を受診し、臨床的に口腔扁平苔癬と診断された951例のうち病理組織学検査を施行した761例とした。761例のうち553例(73%)が病理組織学的に口腔扁平苔癬と診断されていた。口腔扁平苔癬と診断されなかった病変は、Licheniod dysplasiaが31例,Epithelial dysplasiaが48例,Hyperkeratosisが23例,SCCが3例であった。次に、553例のうち6か月以上の経過観察を行った416例836病変について臨床的検討を行った。臨床視診型は、網状型が430病変(51.4%),萎縮型が178病変(21.3%),びらん・潰瘍型が228病変(27.3%)であった。発生部位は、口唇が44病変(5.3%),頬粘膜が350病変(41.9%),歯肉が338病変(40.4%),口蓋が21病変(2.5%),舌が77病変(9.2%),口底が6病変(0.7%)であった。また、416例のうち236例に細菌検査が施行され、130例(55%)に口腔カンジダ菌が検出された。口腔扁平苔癬は、多彩な病態を示すため、病理組織検査を施行する際には検体として採取する部位を考慮する必要があると思われた。今後は、臨床および病理組織学的に口腔扁平苔癬と診断された症例について免疫組織学検討を進めていく予定である。口腔白板症の癌化に関与する臨床的因子について検討した.対象は2001年から2010年までに東京医科歯科大学歯学部附属病院顎口腔外科を受診し,臨床的および病理組織学的に口腔白板症と診断された512症例554病変とした.性別は男性278例,女性234例,年齢は11歳から84歳(中央値:61歳)であった.平均観察期間は36か月であった.発生部位は舌176病変,歯肉219病変,頬粘膜76病変,硬口蓋50病変,軟口蓋21病変,口唇7病変,口底5病変であった.512症例のうち13例が,観察期間中に癌化した.癌化までの期間は9か月から7年7か月,平均3年3か月であった.癌化部位は舌縁が10病変で,歯肉,頬粘膜,軟口蓋にそれぞれ1病変であった.臨床視診型が非均一型であったのは,13病変のうち9病変であった.上皮性異形成の程度はなし2病変,軽度5病変,中等度6病変であった.単変量解析において,発生部位,臨床視診型および治療法が癌化との間に有意な相関関係を認めた.多変量解析においても,これら3因子は,統計学的有意差を認め,すなわち発生部位が舌縁,臨床視診型が非均一型で経過観察のみを行った症例において,有意に癌化する危険が高くなることが判明した.なお累積癌化率は5年で5.6%,10年で8.7%であった.次にこの中で外科的切除を行わず経過観察のみを行った237病変についてさらに検討した.経過観察中に135病変(57.0%)は病態に変化は認めず,30病変(12.7%)は大きさが縮小し,44病変(18.6%)は消失した.しかし,17(7.2%)病変は大きさが増大し,11(4.6%)病変は経過観察中に癌化した.病変が縮小および消失した症例の要因として,禁煙(21.6%)が最も高く,次いで咬合調整等による機械的刺激の除去(12.2%)が高かった.癌化した病変においては,発生部位が舌,臨床視診型が非均一型,上皮性異形成が中等度以上が有意に癌化率が高かった.今後は、白板症症例においても免疫学的検討を行いたいと考えている.粘膜疾患は、病態が変化しやすく対象症例の組織採取の時期を決定するのが難しい。また、免疫組織学検討を行うにあたり、免疫染色に用いる抗体の至適濃度の決定が難しく調整中である。よって、研究課題の進行が遅れている。口腔扁平苔癬(OLP)は、臨床診断と病理組織学的診断を合わせて診断される。臨床的には、金属アレルギーによる口腔扁平苔癬様病変(OLL)とOLPとの鑑別が必要となる。今回、OLPと金属アレルギーとの関連について検討した。

対象は、2009年1月から2013年12月の5年間に当科を初診し、臨床的にOLPと診断し、生検を施行した366症例のうち、パッチテストによる金属アレルギー検査が陽性であった26症例とした。発生部位は、頬粘膜:21例、歯肉:20例、舌:7例、口底:3例、口蓋:2例、口唇:1例で、発生様式は、両側性:17例、片側性:9例であった。臨床視診型は、網状型:35例、萎縮型:9例、びらん/潰瘍型:5例、丘疹型:2例、斑状型:2例、水疱型:1例であった。病理組織診断は、OLP:14例、OLP Suspected:6例、Epithelial dysplasia:3例、その他:3例であった。アレルギー検査陽性金属元素は、Ni:10例、Pd:8例、Pt:6例、Co:5例、Cr:5例、Hg:4例、Au:4例、Ir:2例、In:2例、V:2例、Mo:1例、Fe:1例、Cu:1例、Be:1例、Sn:1例であった。口腔内の補綴金属を全てあるいは一部除去したのは13例で、病変が消失したのは4例、改善したのは6例、不変が3例であった。補綴金属を除去せずに経過観察したのは13例で、改善が9例、不変が4例であった。陽性であった金属元素は、歯科用金属として使用されているものが多く、補綴金属の除去によって病変の消失または改善を認めた。また、臨床的および病理組織学的にOLPと診断された症例を対象とし、免疫染色を施行した。これにより、上皮下および上皮内に浸潤しているCD3陽性T細胞上にPD-1およびPD-L1の発現および基底細胞(Keratinocytes)上にPD-L1が発現していることを確認した。免疫染色を施行するのに市販されている抗体のどれが免疫染色に適しているか、またその至適濃度がどれくらいかの予備実験に時間がかかり進行が遅れている。口腔扁平苔癬(OLP)は、口腔粘膜の角化異常を伴う難治性の慢性炎症性疾患である。原因は未だに不明で、発症のメカニズムとして遅延型アレルギーに類似した細胞性免疫応答の関与が指摘されている。未知の抗原を認識した樹状細胞によりT細胞が感作され、IL-6,IL-1,INF-γ,TNF-αなどのサイトカインやケモカインの産生が誘導される。そしてこれら液性因子により上皮下へのCD4およびCD8T細胞の浸潤が惹起され、上皮基底細胞に対する細胞傷害と変性を生じることにより病態が形成されると考えられている。よって、病理組織学所見として上皮下に帯状のT細胞の浸潤を認める。これらT細胞の免疫応答は、抗原と抗原提示細胞の性状、特に細胞表面に発現される共刺激分子の発現と産生されるサイトカインによって大きく左右される。口腔扁平苔癬において、上皮下および上皮内に浸潤しているCD3陽性T細胞上にPD-1およびPD-L1の発現および基底細胞(Keratinocytes)上にPD-L1が発現していることを確認した。よって、口腔扁平苔癬における免疫応答にPD-1-PD-L1の相互作用が関与していることが示唆された。口腔扁平苔癬は、その臨床像に基づいて網状型、丘疹型、斑状型、潰瘍型、萎縮型、水疱型の6つの臨床視診型に分類されるが、病態が混在する症例では6分類に細分するのが難しいため、現在は白色病変が主要な部分を占める白色型(white type)と紅色病変が主要な部分を占める紅色型(red type)の2分類が主流になりつつある。紅色型の方が、病理組織学的に上皮下のTリンパ球浸潤が強く、現在白色型と紅色型におけるPD-1およびPD-L1の発現量の違いについて検討を行っている。口腔扁平苔癬は、口腔粘膜の角化異常を伴う難治性の慢性炎症性疾患である。原因は不明だが、上皮下へのCD4およびCD8T細胞の浸潤が惹起され、基底細胞に対する細胞傷害と変性を生じることにより病態が形成されると考えられている。これらT細胞の免疫応答は、細胞表面に発現される共刺激分子の発現と産生されるサイトカインによって大きく左右される。
先進国間協調体制の形成と変容：主要国首脳会議における日本外交、1975-1983

本研究は、主要国首脳会議(サミット)について1975年の第1回(ランブイエ)から政治問題も含めて討議することが定例化する1983年(ウィリアムズバーグ)までを対象に検討し、先進国間協調体制というグローバルな国際政治経済秩序の問題に「経済大国」として取り組んだ日本外交を構造的に把握することを目的としている。日本に加えて、アメリカ・イギリス・カナダ等の史料館でも調査を行い、国際的な構図の中で日本外交の姿を立体的に描き出したい。
ミトコンドリアネットワークを制御するGTPase群の分子機構

ミトコンドリアは内部に自身のDNAを持っており、核ゲノム及びミトコンドリアゲノムの両方にコードされたミトコンドリア蛋白質が正しく輸送され複合体を形成してその機能を発揮することができる。2重膜構造のミトコンドリアの構造はダイナミックであり、融合によって均質なミトコンドリアネットワークが細胞内に張り巡らされ、逆に分裂により独立したミトコンドリアが細胞内に分散する。ミトコンドリア膜の融合及び分裂はそれぞれに機能するGTPase群によって制御されており、このバランスが変化することで個々のミトコンドリアの特性が変化する。申請者はこれまで哺乳動物ミトコンドリアの融合・分裂に機能するGTPase群とその関連因子を同定し、分子機構詳細及びその生理機能の解析を続けている。今回、ミトコンドリア分裂の分子機構を理解する目的で、細胞質に局在するGTPaseであるDrp1、及び外膜の膜タンパク質Fis1の機能解析を行った。外膜のFis1はこれまでDrp1のミトコンドリアへの局在化に機能すると考えられていたが、我々はFis1の発現を抑制してもDrp1のミトコンドリアへの局在化に大きな影響を観察することはできなかった。そこで次にFis1の機能を理解する目的でFis1に結合する因子の同定を行ったところ、rabのGTPaseの制御に機能すると考えられる因子を同定した。この因子はFis1の機能に依存してミトコンドリアに局在化すること、またその発現抑制によってミトコンドリアの形態に大きな変化を誘導することも明らかになった。この新しいFis1結合因子はDrp1とは独立にミトコンドリアの形態制御に機能していると考えられる。これらの結果から、Fis1の新しいミトコンドリアにおける機能を提唱することができた。
不斉カチオン性ケイ素ルイス酸触媒反応

(R)-BINOL配位子と種々のアリルクロロシランを反応させることにより、触媒前駆体であるキラルなアリルシランを合成した。これらの光学活性アリルシランに超強酸であるトリフルオロメタンスルホニルアミド(HNTf_2)を作用させることで、強いルイス酸性を有するエナンチオ選択的ルイス酸触媒であるケイ素ルイス酸触媒を合成した。cyclopentadieneと3-acryloyloxazolidin-2-oneとのDiels-Alder反応において、生成物の絶対配置及び鏡像体過剰率体はBINOL配位子およびケイ素上の置換基に大きく影響されることが分かった。BINOL配位子の6,6'位の置換基効果、3,3'位の置換基効果、ケイ素上の置換基効果を明らかにした。さらに、(R)-BINOL配位子の3,3'位に置換基を導入すると、エナンチオ選択性が逆転するという興味深い現象を見出した。さらに、(R)-BINOLの3,3'位の置換基をより嵩高くするにつれてエナンチオ選択性が向上し、4-(2-naphthyl)phenyl基を導入した場合では、ケイ素触媒量が2.5mol%という微量触媒量にも関わらず、鏡像体過剰率94%ee、ジアステレオ選択性96/4、収率92%という極めて高い立体選択性でDiels-Alder付加体を与えることを見出した。また、鎖状ジエンのDiels-Alder反応において、塩基を添加せずに反応を行うと円滑に反応が進行することが分かった。すなわち、塩基を添加せずに、ケイ素触媒を5mol%もちいてトランス-1,3-ペンタジエンとアクリロイルオキサゾリジノンとの反応を行ったところ、88%eの高いエナンチオ選択性を伴って対応する環化付加体を得た。本研究は高配位構造をとるケイ素化合物が不斉ルイス酸触媒として、実用レベルに達する高いエナンチ選択性およびジアステレオ選択性を示すことを始めて明らかにしたものである。この結果を検証するにあたり、Diels-Alder反応をテスト反応とした。今後、より多様な不斉触媒反応にケイ素ルイス酸を適用し、ケイ素ルイス酸の実用性を立証する(R)-BINOL配位子と種々のアリルクロロシランを反応させることにより、触媒前駆体であるキラルなアリルシランを合成した。今後、より多様な不斉触媒反応にケイ素ルイス酸を適用し、ケイ素ルイス酸の実用性を立証するキラルなケイ素ルイス酸触媒の合成法を確立した。光学活性配位子としてBINOLで修飾したアリルシランにブレンステッド酸であるビス(トリフルオロメタンスルホン)イミド(HNTf_2)を反応させたところケイ素に結合したアリル基が脱離し、スルホンイミドアニオンがケイ素に結合したシリルアミドが生成した。このケイ素化合物はキラルルイス酸触媒として高い活性を示すことが分かった。すなわち、このように合成した光学活性配位子としてBINOLをもつケイ素ルイス酸を触媒量(5mol%)用いて、アルケノイルオキサゾリジノンとジエン類との触媒的不斉ディールス・アルダー反応をトルエン溶媒中、低温下で行ったところ、良好なジアステレオ選択性(endo:exo>92:2)および非常に高いエナンチオ選択性(98% ee以上)を伴って反応が進行することを明らかにした。また、生成物の化学収率も80%以上と良好であった。この反応の特筆すべき特徴として、無置換のBINOLを光学活性配位子として用いてもジアステレオ選択性・エナンチオ選択性・収率ともに良好な結果を与える点である。

すなわち、無置換のBINOL配位子を用いた場合、導入が容易なケイ素上の置換基により反応の立体選択性をコントロールできる。ケイ素上の置換基が嵩高くなるにつれ反応のエナンチオ選択性が向上することが分かった。安価な無置換の光学活性BINOLをキラル源として用いることができるので、工業的にも適用可能な触媒的不斉反応がケイ素ルイス酸触媒により実現できる可能性が高い。さらに、BINOL配位子の3位に置換基を導入するとエナンチオ選択性が逆転するという興味深い現象を認めた。光学活性なケイ素ルイス酸触媒の合成法を確立した。光学活性配位子としてBINOLで修飾したアリルシランにブレンステッド酸であるビス(トリフルオロメタンスルホン)イミド(HNTf_2)を反応させたところケイ素に結合したアリル基が脱離し、スルホンイミドアニオンがケイ素に結合したシリルアミドが生成した。このケイ素化合物はキラルルイス酸触媒として高い活性を示すことが分かった。すなわち、光学活性配位子としてBINOLをもつケイ素ルイス酸を触媒量(5mol%)用いて、アルケノイルオキサゾリジノンとジエン類との触媒的不斉ディールス・アルダー反応をトルエン溶媒中、低温下で行ったところ、良好なジアステレオ選択性(endo:exo>92:2)および非常に高いエナンチオ選択性(98%ee以上)を伴って反応が進行することを明らかにした。また、生成物の化学収率も80%以上と良好であった。さらに、触媒量の光学活性ケイ素ルイス酸およびアミン塩基を用いることで、ケトンとイミンの触媒的直接不斉マンニッヒ型反応に成功した。反応系を1H NMRで調べたところ、この反応はキラルなケイ素エノラートを経由して進行することが分かった。すなわち、キラルなケイ素エノラートの触媒的生成法を見出した。キラルなケイ素エノラートは不斉合成反応における有用な化学種であるが触媒的生成法はこれまで知られていなかった。ケイ素エノラートは、非常に多くの合成反応に利用されており、今回、われわれが開発したキラルケイ素エノラート生成法を適用することで、これらの反応の多くの不斉触媒反応化が可能である。ケイ素は資源的にも無尽蔵な汎用元素(ユビキタス元素)である上、毒性がない。本研究によって得られた成果は、理想的な環境調和型・省資源型不斉合成反応の確立を促進するものである。
「persister」がん細胞マウスモデルによる肺癌の根治的薬物療法の開発

EGFR変異を伴う肺癌は、日本人の非喫煙者に発生する肺癌の半数以上を占める重要な疾患である。EGFRチロシンキナーゼ阻害薬(TKI)は、高い効果を示すが、完全寛解、根治しないことが未解決の課題である。「persister」がん細胞(しつこく生き残る耐性細胞)と呼ばれる細胞集団が、完全寛解、根治に向けた新規の治療標的として注目されている。本研究は、EGFR遺伝子改変肺癌マウスモデルを用い、1)「persister」がん細胞およびその腫瘍微小環境を評価、検証し治療標的を同定、またマウスモデルで「persister」がん細胞の阻害効果を検証し、肺癌根絶を目標とした臨床試験を立案することを目的とする。
胃癌リンパ節内の免疫寛容とリンパ管内皮細胞との相関及び転移予測マーカーの同定

転移のないリンパ節と転移のあるリンパ節よりLECを分離し、それぞれNLEC、TLECと名付けた。TLECは繊維芽細胞のような紡錘形の形態であり、通常の内皮細胞と異なる形態を示しNLECと比較し高い増殖能・遊走能を有していた。TLECでは炎症性サイトカインや好中球遊走性因子の遺伝子発現が顕著に増加し、TLECの培養上清では血管・リンパ管新生因子であるVEGF-A,VEGF-Cの上昇がみられた。胃癌所属リンパ節内には正常のLECとは異なる性質をもった腫瘍関連LEC(TLEC)が存在する。TLECはリンパ節微小環境内で炎症性環境の形成やECMリモデリングにより腫瘍進展に関与することが示唆された。【背景】様々な癌種で原発巣周囲のリンパ管新生は予後不良因子であることが報告されており、腫瘍周囲のリンパ管新生は癌細胞転移における第一段階と考えられている。膵頭部癌や頭頚部癌ではリンパ行性転移の機序にリンパ節内のリンパ管新生が寄与することが報告されているが、胃癌についての報告はない。【目的】胃癌リンパ節内のリンパ管新生を同定しリンパ節転移やその他の臨床病理学的因子との関連について検討した。【方法】2011年に当科で切除したpT2以深の胃癌52例を対象にリンパ節のパラフィン包埋切片を抗D2-40抗体で免疫組織染色を行い、リンパ管を同定してリンパ管新生をLVD(lymphatic vessel density)により評価した。次に抗サイトケラチン抗体を用いて転移巣の大きさに基づきリンパ節を転移なし・ITC・微小転移・転移の4群に分類しLVDとの関連を検討した。【結果】1596個のリンパ節について検討した。転移リンパ節は225個で転移のないリンパ節は1371個だった。転移リンパ節内では転移のないリンパ節より有意にLVDが増加していた。リンパ節を転移巣の大きさで比較すると、転移巣の大きさに伴いLVDも増加した。さらに症例別では、pN1よりpN3で有意にLVDが増加していた。pN3症例ではdiffuse type、ly(+)症例でLVDが高値だった。pN(+)ではpN(-)と比較し転移のないリンパ節でもLVDが増加していた。【結語】胃癌において、リンパ節内のリンパ管新生は転移がなくても腫瘍の進行に伴い増強されることが示唆された。これよりリンパ管新生は胃癌転移の第一段階でリンパ節転移を介する遠隔転移に関与するかもしれないと考えられた。【背景】近年、炎症と癌との関連が報告されており、癌微小環境における炎症細胞の浸潤が癌進展や予後に関与することが報告されている。しかし、所属リンパ節への好中球浸潤を検討した報告例は少ない。また、我々はこれまでに転移形成前の初期段階から所属リンパ節内ではリンパ管新生がみられることを報告してきた。【目的】胃癌リンパ節内への好中球浸潤と臨床病理学的因子や予後との関連を検討するとともに、リンパ節内微小環境における好中球のリンパ管新生への関与を明らかにする。【対象と方法】2011年に当科で切除した胃癌52例のリンパ節パラフィン包埋切片を免疫組織染色した。好中球は抗CD15抗体を用いて同定した。リンパ管は抗D2-40抗体を用いて染色しリンパ管新生をLVD(lymphatic vessel density)により定量化した。リンパ節転移の大きさは抗サイトケラチン抗体を用いて測定した。微小転移を認めたリンパ節で浸潤好中球数とLVDなど臨床病理学的因子との関連を検討した。予後とのの関連は2006年から2007年の当科での胃癌切除症例96例につき検討した。【結果】検討したリンパ節数は1415個であった。全浸潤好中球数は平均49.6個で中央値は39であった。微小転移リンパ節内では転移のないリンパ節と比較し好中球数が増加していた。微小転移リンパ節内ではLVDが増加しており、リンパ節内LVDは好中球数と相関していた。症例別に比較するとdiffuse typeで好中球が増加していた。好中球数が39以上のhighグループでは39未満のlowグループと比較し有意に予後不良であった。【結語】リンパ節内の浸潤好中球数はリンパ節微小転移及びリンパ管新生と相関を認め、予後とも相関していた。以上より、リンパ管新生の増生とともに好中球が浸潤し、転移を促進する可能性が示唆された。リンパ管内皮細胞の分離、解析は順調に進ん出折、さらに今回は好中球とリンパ管新生との関連んについても検討したわれわれは、胃癌における代表的な転移形式であり最も重要な予後因子のひとつであるリンパ行性転移に着目し、リンパ節内での微小環境について検討してきた。腫瘍内への好中球、マクロファージの浸潤とリンパ管新生増強とが関連し、リンパ節内のリンパ管新生は、転移が形成する前から増加し予後との強い相関を認めた。続いて、外科切除を施行した標本のリンパ節から直接リンパ管内皮細胞(LEC)を分離し、その性質と転移の影響について検討した。

その結果、転移陽性のリンパ節から分離した“癌関連"LECは、非転移リンパ節から分離したLECと比べて、紡錘型であり、増殖能、遊走能が亢進しておりサイトカイン、ケモカイン、接着分子などの発現が著明に増加していた。さらに、癌細胞の浸潤を容易にするMMP発現の上昇も認めた。この反応は、非転移から分離したLECに癌細胞培養上清を添加することでも生じることから、癌によりLECの性質が変化し胃癌進展に強く関与することが示唆された。次に、われわれは、マクロファージとLECとを共培養しリンパ管管腔形成へ及ぼす影響について検討した。マクロファージと直接的にLECと培養した結果、敷石状のLECが紡錘形に変化し、管腔形成が促進された。さらに癌細胞培養上清を添加することにより管腔形成はさらに促進された。また、LECは癌細胞の影響によりPDL-1を発現しCD4T細胞の機能することがわかった。転移のないリンパ節と転移のあるリンパ節よりLECを分離し、それぞれNLEC、TLECと名付けた。TLECは繊維芽細胞のような紡錘形の形態であり、通常の内皮細胞と異なる形態を示しNLECと比較し高い増殖能・遊走能を有していた。TLECでは炎症性サイトカインや好中球遊走性因子の遺伝子発現が顕著に増加し、TLECの培養上清では血管・リンパ管新生因子であるVEGF-A,VEGF-Cの上昇がみられた。胃癌所属リンパ節内には正常のLECとは異なる性質をもった腫瘍関連LEC(TLEC)が存在する。TLECはリンパ節微小環境内で炎症性環境の形成やECMリモデリングにより腫瘍進展に関与することが示唆された。当初の計画していたリンパ管新生の胃癌組織内の意義については問題なく進んで予定通りの結果を得た。また、リンパ管内皮細胞の分離も順調に進んでおり、当初の計画通りに研究が遂行できていると考えられる。リンパ節転移におけるリンパ管内皮細胞の役割について明らかにする消化器外科今後、リンパ管新生と免疫細胞との関連について研究を進めるのに十分な試料があり、計画通りに遂行できると考えられる。試薬購入予定のため予定していた旅費をしようしなかったため。試薬購入予定研究に使用する物品費(抗体などの消耗品)に使用する予定
下咽頭・食道・気管におけるtelocyteの役割

テロサイトは、腸管におけるカハール介在細胞に類似しているといわれている。カハール介在細胞は以前からその存在は知られていたが、近年その機能が明らかになり、蠕動運動の局所コントロールに寄与しているという画期的発見がなされた。同様の細胞は子宮、心臓、乳腺といった全身の様々な臓器に発見され、長い突起を持つことからテロサイトと名付けられている。テロサイトの定義は「テロポッドを持つ細胞」とされ、上皮直下・血管・神経・分泌腺の傍の間質に見いだされることが多い。本研究では下咽頭・気管・食道におけるLgr5陽性細胞およびその子孫細胞がテロサイトの特徴を備えていることを見出した。Lgr5はWntシグナルの標的遺伝子であり、腸管上皮幹細胞に発現している。Lgr5-EGFP-ires-CreERノックインマウスとRosa-Creレポーターマウスを交配させたトランスジェニックマウスの咽喉頭・気管・食道を調べ、その上皮幹細胞をも標識されるかどうか解析したところ、上皮には標識細胞は見つからなかったが、粘膜固有層には多数の長い突起をもつ標識細胞が見つかった。これらのLgr5陽性細胞系譜の細胞は、神経マーカーTuj1、樹状細胞マーカーMHI classIIの発現が見られず、間葉系細胞Vimentinの発現は見られるものもあり、その特徴的な形態はテロサイトの定義に合致していた。さらにtelocyteの発現を詳細に観察したところ、telocyteは声帯には発現せず、主に下咽頭梨状陥凹と食道を中心に多くの細胞が存在することが明らかとなった。下咽頭・食道は上部消化管であり、通過する飲食物に対する何らかの知覚とそれに対する応答を行なっていると考えられるが、テロサイトがそれを媒介している可能性があり、咽喉頭異常感、嚥下障害、アレルギー等の疾患に関連する知見が得られる可能性が期待される。テロサイトは近年に偶然発見された特殊な間葉系細胞であり、テロサイト関連研究領域自体が大きな可能性を秘めた発展途上の研究領域である。爬虫類・鳥類・哺乳類の間質に見られることが報告されてきている(Cretoiu 2016)。最初の報告はPopescuらによるもので、ヒトとラットの膵臓に消化管のカハール介在細胞に類似した細胞が発見された(Popescu 2005)。同様の細胞は子宮、心臓、乳腺といった全身の様々な臓器に発見され、長い突起を持つことからテロサイトと名付けられた。テロサイトの定義は「テロポッドを持つ細胞」とされ、上皮直下・血管・神経・分泌腺の傍の間質に見いだされることが多い(図1)。その長い突起を介して局所環境のコントロールに寄与していることが推察されている。耳鼻咽喉科・頭頸部外科領域では、気管や食道にあるという報告があるが、電子顕微鏡観察のみで機能含め詳細は不明である(Rusu 2012, Chen 2013)。本研究は、下咽頭・食道・気管におけるテロサイトの特徴とその機能を明らかにすることを目的としている。Wntシグナルの標的遺伝子であり、腸管上皮幹細胞に発現しているLgr5に着目し、Lgr5-EGFP-ires-CreERノックインマウスとRosa-Creレポーターマウスを交配させたトランスジェニックマウスを作成した。その咽喉頭・気管・食道を解析したところ、上皮には標識細胞は見つからなかったが、粘膜固有層には多数の長い突起をもつ標識細胞が見つかった。また、これらのLgr5陽性細胞系譜の細胞における神経マーカーTuj1、樹状細胞マーカーMHI classIIの発現を調べたところ、発現は見られず、間葉系細胞Vimentinの発現は見られるものもあり、その特徴的な形態はテロサイトの定義に合致していた。Wntシグナルの標的遺伝子であり、腸管上皮幹細胞に発現しているLgr5に着目し、Lgr5-EGFP-ires-CreERノックインマウスとRosa-Creレポーターマウスを交配させたトランスジェニックマウスを作成し、咽喉頭・気管・食道の粘膜固有層には多数の長い突起をもつ標識細胞が見つかり、テロサイトの定義を有していることを確認した。

さらにtelocyteの発現を詳細に観察したところ、telocyteは声帯には発現せず、主に下咽頭梨状陥凹と食道を中心に多くの細胞が存在することが明らかとなった。下咽頭・食道は上部消化管であり、通過する飲食物に対する何らかの知覚とそれに対する応答を行なっていると考えられるが、テロサイトがそれを媒介している可能性があり、咽喉頭異常感、嚥下障害、アレルギー等の疾患に関連する知見が得られる可能性が期待される。咽喉頭・気管・食道の傷害モデルを作成し、テロサイトの発現変化を解析する。さらに細胞の機能を評価するために、アブレーションモデルを作成して表現型を解析する。当初は今年度から咽喉頭・気管・食道の傷害モデルを作成の予定であったが、次年度に繰り越すことになったため、2143円の次年度使用額が生じた。次年度は咽喉頭・気管・食道の傷害モデルを作成してテロサイトの発現変化を解析し、さらにLgr5陽性細胞アブレーションモデルを作成してその表現型を解析する予定であるが、次年度使用額は傷害モデル作成時に必要なカテラン針購入に充てる予定である。
核磁気共鳴法を応用した敗血症重症化早期診断の確立と新規治療ターゲットの開拓

摘出した脳を抽出処理し、NMR測定を行った後、NMRデータの解析を行った。この解析によって、L P S(10 mg/kg、2 mg/kg)投与群と生食投与群の3群を投与6時間後において分離可能であった。また、この6時間で死亡したラットはいなかった。これは、この手法によって、敗血症早期の脳で敗血症やその重症度の識別が可能であることを示唆している。この知見はex vivoのものであるが、脳は動きも少なくin vivo MRS測定に非常に適した臓器であり、in vivo MRSによる敗血症重症化の早期診断につながる重要な知見が得られたと考えられる。平成24年度は、in vivo MRS測定の準備として、ターゲットとする臓器としてどの臓器が最も適切か調べるために、まず、ラットをLPS投与群と生食投与群に分けた上で投与6時間後に主要臓器を摘出し凍結保存した。現在はこれらの臓器に抽出処理を行い、NMR測定を行っている。測定が終了し次第、解析に入れるよう各種解析用ソフトの習熟に努めている。この結果、最もよく2群を識別できる臓器をターゲットとして、in vivo MRS測定を施行していく予定である。研究期間全体の成果としては、脳のNMRデータ解析によって、LPS(10 mg/kg、2 mg/kg)投与群と生食投与群の3群を投与6時間後において分離可能であった。平成23年度は、本実験に入るための予備実験などを中心に行った。本研究におけるラットへのLPS投与量は、生存例と死亡例をin vivo MRS測定などで、ごく早期に判別するという目的のため、投与後すぐに死亡したり、投与しても全例生存するような投与量では適切でなく、投与後しばらく生存した上で個体により生存したり死亡したりする程度の投与量が望ましい。この投与量を決定するために、文献などを参考にした上で、さまざまな投与量を数匹ずつのラットに投与し、48時間後まで生存するか否かを観察した。その結果、1ー2μg/kg体重が適切な投与量であることが判明した。また、実際に数匹のラットに対し肝臓を対象としたin vivo MRS測定を施行し、測定中の適切な麻酔管理や個体の固定法を、バイタルサインをモニタリングしながらセッティングした。さらにin vivo MRS測定の測定条件の適正化も行った。これらの予備実験により、本実験であるLPS投与後の生存例と死亡例を判別するためのin vivo MRS測定を行う準備がほぼ完了した。また、上記実験での生存例では、各臓器を摘出の上凍結保存しており、そのサンプルの抽出作業を行いつつ、NMR測定の準備を行っている。さらに、統計解析ソフトであるUnscramblarの習熟を進めており、in vivo MRSやNMRの測定開始後、迅速にデータ解析を行える体制を整えている。平成23年度において、当初の主な実験を行う予定であった日本医大で、予定していた研究員雇用資金の急なキャンセルがあり、京都大学で機器購入を予定していた資金を、日本医大での研究員雇用に充てなくてはならなくなり、京都大学で十分な実験が行えなかったことや、一部の研究員の退職により一時期実験が中断したこと、夏期の空調トラブルによりNMR機器が使用停止となる時期が生じたことなどの理由のため。当初の主な実験を行う予定であった日本医大で、予定していた研究員雇用資金の急なキャンセルがあり、京都大学で機器購入を予定していた資金を、日本医大での研究員雇用に充てなくてはならなくなり、京都大学で十分な実験が行えなかったことや、一部の研究員の退職により一時期実験が中断したこと、夏期の空調トラブルによりNMR機器が使用停止となる時期が生じたことなどの理由のため。現在、摘出臓器に抽出処理を行い、NMR測定を行っている。この解析の結果、最もよく2群を識別できる臓器をターゲットとして、in vivo MRS測定を施行していく予定である。また、京都大学で購入したPCR機器などを利用して、摘出臓器の分子生物学的解析も平行して行っていく予定である。本研究における主要な実験であるin vivo MRS測定は、ほぼ準備が整っており、すぐに本実験を開始することができる。また、次年度の研究費と今年度の繰り越し資金を合算すれば、京都大学での機器購入が可能であり、京都大学での動物実験や分子生物学的解析などを遂行していくことができると考えている。

京都大学や日本医大での人件費や消耗品の購入、日本医大との打ち合わせや共同解析のための旅費などに使用する予定である。遺伝子発現の解析のため、PCR機器を購入する。その他、京都大学や日本医大での人件費や消耗品の購入、日本医大との打ち合わせのための旅費などに使用する予定である。
生物ゆらぎ模倣超低消費電力デバイス創製

スピンゆらぎ情報の電気的読み出し原理の確立に注力した。スピン情報伝達において、ジュール熱発生の伴わないスピン角運動量伝搬(マグノン)を活用したデバイスの基礎確立を目指した。具体的には磁性絶縁体-金属電極界面の最適化を実施した。先行研究で得た成果(常温動作するクラスターグラス物質)をもとに、スピングラスという微小なエネルギーゆらぎ状態を電気的に検出する実験を実施した。また熱ゆらぎの効率利用と信号増幅を実施した。優れた確率共鳴素子(超電力素子)の実現には、環境に存在する熱を如何に効率よく利用出来るかが鍵となる。生体ゆらぎ機能を模倣したスピングラス材料を用いたスピンポンピング(マグノニクス)素子、スピン波デバイスなどの実用化デバイスの設計に向けて研究を行った。脳型記憶素子の実現に向けた取り組みとして、LFCSクラスターグラスのスピンポンピングと逆スピンホール効果による電圧検出により、シナプス模倣素子を実証した。強磁性共鳴(FMR)の測定結果において、ピーク間線幅;HppはPt薄膜堆積前後でに増加している。これはLFCS内部で発生したスピン歳差運動のスピン角運動量がPt薄膜内の伝導電子に散逸された結果を反映しており、正常にスピンポンピングが行われていることを示している。逆スピンホール効果によって得られた電圧VISHEは30μV程度であった。またクラスターグラス相においては、光の照射によりスピン間の凍結を溶解し、準安定状態間の遷移を制御することが可能である。これまでに報告したクラスターグラス相における準安定状態に起因する記憶現象を利用することで、脳のシナプスにおける長期増強(LTP)を模倣した電気特性を実現することができる。印加磁場を基底状態の共鳴磁場に固定し、10分毎の光照射/停止サイクルを繰り返したときのVISHEの時間発展を確認した。研究計画に沿って実験を進めており、順調に進展していると考えられるため。ゆらぎの効率利用と信号増幅に関する研究を進める。生体ゆらぎ機能を模倣したスピングラス材料を用いたスピンポンピング(マグノニクス)素子、スピン波デバイスなどの実用化デバイスの設計を目指す。また、共鳴現象を利用したより高効率変換に関する研究も進める。熱ゆらぎのエネルギー源として、環境中の熱エネルギーの主な起源である太陽輻射光の中・遠赤外線帯域の光の電気エネルギーへの高効率変換を、新規原理により実現を目指す。その新しいアプローチとして、共鳴効果を利用した熱エネルギー変換能の増強および積極的蓄積を実現するため、(a)表面プラズモンポラリトン共鳴効果と(b)物性ゆらぎによる確率共鳴効果によるエネルギー変換の2つのアプローチにより、熱エネルギーの効率的利用に挑戦する。具体的には、スピングラスを介したスピン波伝搬を計測することを目的として、2ポートのコプレーナ線路(CPWs)を用いたデバイスを作製する予定。これまでの研究においてY3Fe5O12 (YIG)薄膜はダンピング定数α6.7×10-5(典型的な値は10-310-4)と非常に小さいため、スピン波は数mmものマクロな距離を伝搬することが期待される。今後の研究では外部磁場を薄膜表面に対して垂直に印加してMSFVW (magnetostatic forward volume wave)モードの伝搬を評価する。デバイス形状としてコプレーナ導波路の電極線幅および間隔はそれぞれ10 μmとし、特性インピーダンスが約50 Ωとなるように設計しする。中心導体間の距離は60 μmである。Sパラメータの計測にはベクトルネットワークアナライザーによる特性評価を実施する予定である。

研究計画に沿って実験を進めており、順調に進展していると考えられるため。ゆらぎの効率利用と信号増幅に関する研究を進める。優れた確率共鳴素子(超電力素子)の実現には、環境に存在する熱を如何に効率よく利用出来るかが鍵となる。生体ゆらぎ機能を模倣したスピングラス材料を用いたスピンポンピング(マグノニクス)素子、スピン波デバイスなどの実用化デバイスの設計を目指す。また、共鳴現象を利用したより高効率変換に関する研究も進める。熱ゆらぎのエネルギー源として、環境中の熱エネルギーの主な起源である太陽輻射光の中・遠赤外線帯域の光の電気エネルギーへの高効率変換を、新規原理により実現を目指す。その新しいアプローチとして、共鳴効果を利用した熱エネルギー変換能の増強および積極的蓄積を実現するため、(a)表面プラズモンポラリトン共鳴効果と(b)物性ゆらぎによる確率共鳴効果によるエネルギー変換の2つのアプローチにより、熱エネルギーの効率的利用に挑戦する。具体的には、スピングラスを介したスピン波伝搬を計測することを目的として、2ポートのコプレーナ線路(CPWs)を用いたデバイスを作製する予定。これまでの研究においてY3Fe5O12 (YIG)薄膜はダンピング定数α6.7×10-5(典型的な値は10-310-4)と非常に小さいため、スピン波は数mmものマクロな距離を伝搬することが期待される。今後の研究では外部磁場を薄膜表面に対して垂直に印加してMSFVW (magnetostatic forward volume wave)モードの伝搬を評価する。デバイス形状としてコプレーナ導波路の電極線幅および間隔はそれぞれ10 μmとし、特性インピーダンスが約50 Ωとなるように設計しする。中心導体間の距離は60 μmである。Sパラメータの計測にはベクトルネットワークアナライザーによる特性評価を実施する予定である。
ペプチドによる胃癌標的治療薬開発に関する研究

我々は様々な癌細胞に特異的に発現するLIX1L遺伝子・蛋白質を同定し、LIX1Lは癌細胞増殖促進に働く機能を持っていることを明らかにしました。LIX1LはROS1キナーゼによりリン酸化を受け、様々なmiRNAを含むRNAに結合し、癌細胞増殖を促進することが明らかになりました。また、LIX1Lの136番目のチロシンを含む10アミノ酸の相同性ペプチドに、LIX1Lのリン酸化を抑制し、その結果、抗腫瘍効果が誘導されることも明らかにしました。これらのことから、LIX1Lは様々な癌に発現する共通の蛋白質であり、それを標的としたペプチドにより、新しい治療薬開発に発展できる可能性が示されました。平成25年度の研究計画・方法については下記の予定に従い研究を行いました。(1)胃癌細胞株におけるLIX1L発現解析:胃癌細胞株KATO-IIIとOCUM-1におけるLIX1L遺伝子・蛋白質の発現解析に加えて、胃癌細胞株MKN45とNUGC-4細胞を加えて解析を行いました。遺伝子発現はRT-PCRと半定量的PCRにて発現量の評価を行い、NUGC-4を除く胃癌細胞株において発現が亢進していることを明らかにしました。また、ペプチド2130はLIX1L発現しているKATO-III,OCUM-1,MKN45細胞にのみ抗腫瘍効果を示し、LIX1Lを発現していないNUGC-4細胞では抗腫瘍効果が認められませんでした。(2)胃癌臨床検体におけるLIX1L発現解析:胃癌手術標本約600症例を対象にLIX1L蛋白質の発現を免疫染色にて検討したところ分化度には関わらず5565%にLIX1L蛋白質の陽性症例を認めました。(3)胃癌細胞におけるLIX1Lの機能解析:胃癌細胞株を用いて、胃癌細胞増殖にLIX1Lが関与していることを明らかにするために、LIX1Lが影響を及ぼすシグナル経路を同定する。LIX1Lは336アミノ酸から構成されている。シュミレーションにて予想リン酸化サイト(セリン、スレオニン、チロシン)を検索するとセリンでは11か所、スレオニンでは3か所、チロシンでは2か所見つかりました。各リン酸化抗体でウェスタンブロットを行い、チロシンのみにリン酸化が認められることが明らかとなりました。また、LIX1LにFLAGを融合させた蛋白質を抗FLAG抗体で免疫沈降してくることにより、核分画ではNucleolin, DHX9, hnRNPLと細胞質分画ではRIOK1, Nucleolin, PABPC4, PABPC1と関連していることが明らかになりました。以上の結果から、ペプチド2130の胃癌細胞での抗腫瘍効果をもたらす標的分子があきらかとなり、分子標的治療薬開発の基礎的データが得られました。(1)in vivoでのペプチド2130の抗腫瘍効果について明らかにする:胃癌細胞株MKN45細胞をNOD/SCIDヌードマウスに移植した担癌マウスを作成し、ペプチド2130を担癌マウス(n=3)の腫瘍部位に直接投与することにより、有意に腫瘍形成を抑制しました。(2)LIX1L蛋白質の各種癌組織における発現解析と増殖への関与:免疫染色では胃癌(n=540);61.9%,膵臓癌(n=43);58.1%,大腸癌(n=50);56%,卵巣癌(n=50);52%,腎細胞癌(n=58);50%,乳癌(n=50);46%,肺癌(n=64);45.3%,肝細胞癌(n=47);38.3%,食道癌(n=51);29.4%,前立腺癌(n=53);24.5%,甲状腺癌(n=50);24%でLIX1Lの発現亢進が認められた。また、Western blot法においても各種癌組織における発現亢進が確認された。(3)LIX1L蛋白質の生理活性部位の同定:LIX1Lの136番目のチロシンが特異的にリン酸化されていることが確認された。LIX1L蛋白質のTyr136を標的とし、キナーゼアッセイによるチロシンキナーゼの同定を行い、6種類の候補チロシンキナーゼを同定した。(4)LIX1Lの標的RNAを同定:LIX1L抗体を用いた免疫沈降(RIP)により結合RNAを回収し、次世代シークエンサーを用いて結合RNAを同定した。mRNA以外に多数のsmall RNA(miRNAを含む)を検出し、データベースから10種類のmiRNAがLIX1Lに結合することが明らかにされた。以上の結果から、ペプチド2130のin vivoでの抗腫瘍効果を確認し、LIX1Lを標的とするチロシンキナーゼとLIX1Lが標的とするmiRNAを同定し、標的分子候補として分子標的治療薬開発の基礎的データが得られました。(1)LIX1L蛋白質のリン酸化酵素の同定を行いました。