hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトiPS細胞由来心筋細胞の特徴付けによる催不整脈性リスク指標の確立

Amiodarone、bepridilおよびE-4031の3薬物を用いて、ヒトiPS細胞由来心筋細胞における興奮伝導(FPDと伝導)、刺激電流の閾値、有効不応期と有効不応期からFPDを引いた差分(ms):post-repolarization refractorinessの変化を解析した。これらの指標によってマルチチャネル遮断薬の持つNa+チャネル遮断、Ca2+チャネル遮断およびK+チャネル遮断の動態および相対的バランスの概略を検出する方法を開発し、論文にて報告した:Izumi-Nakaseko H, et al. J Pharmacol Sci. 2018Aug;137(4):372-378.また、慢性骨髄腫の治療薬で、低分子チロシンキナーゼ阻害薬であるdasatinibを用いて同様の評価系を適用し、その特徴と催不整脈性の有無を明らかにした(現在リバイス中)。さらにMED64システムと高速度デジタルCMOSカメラ(KP-FM400WCL,セルモーションイメージングシステムSI8000シリーズ、SONY、東京)を組み合わせ、電気的ペーシング(刺激周期長500-1400 ms)で誘発した拍動の再分極時間、伝導速度と収縮のモーションベクトルの同時測定を行った。インキュベーター内のO2濃度を95%と20%(空気)の2種類で行い、心筋の伝導興奮と収縮に対する溶存酸素濃度の影響をコントロール、溶媒のみ、10 nM (-)-isoproterenol存在下で比較実験を行った。その結果は現在解析中である。また電気刺激位置を調整することによって収縮と弛緩の方向をコントロールし、収縮と弛緩ベクトルを分離することに成功した。H29年度計画した研究に関して、H30年度に原著論文で報告することが出来た。H30年度はH29年度の計画の一部とH30年度の計画を行い、現在解析中である。収縮ベクトルと電気生理学的変化の相関の解析結果を受けて、心臓への陰性変力作用をもつ薬物の収縮ベクトルにおける表現型の解釈方法を開発するかどうか決定する。また、陰性変時作用がヒトiPS細胞由来心筋細胞で再現できる場合は、Ca2+動態の変化やミトコンドリアの呼吸能の変化などを測定してその機序を検討する。ヒトiPS細胞由来心筋細胞シートの特徴づけをE-4031、bepridil、amiodaroneを用いて行い、催不整脈性の指標を模索した。心筋細胞シートの興奮伝導は多電極システムにて計測し、1 mm四方上の64電極上における細胞外電位変化を測定した。2電極から電流を注入して細胞シートのペーシングを行い、刺激周期長は6001,600 msとした。この条件下で細胞外電位幅(FPD)、刺激の電流閾値、伝導速度、有効不応期を薬物非存在下、薬物存在下で測定した。また有効不応期とFPDの差分から再分極後の不応期(PRR)、各刺激周期長に対するFPD変化の傾きを非線形式にフィッティングさせて求めた。E-4031、bepridil、amiodaroneにおけるそれぞれの指標の変化を比較した結果、ヒトiPS細胞由来心筋細胞シートにおいてPRR延長は伝導抑制と比例関係にあり、PRRの算出は薬物のNaチャネル遮断とそれに伴う伝導抑制作用の指標として有用であることが明らかになった。各刺激周期長に対するFPD変化の傾きは選択的IKr遮断薬であるE-4031では有意に増大したが、不複数のKチャネルを遮断するbepridilとamiodaroneでは有意に変化しなかったことから、この指標は複数のKチャネル遮断におけるIKr遮断作用の寄与を判定するのに有用であることが示された。FPD変化の解析により、マルチチャネル遮断薬において、Kチャネル遮断に対するCaチャネル遮断のバランスを判定するのに有用であることが示された。以上より、候補化合物による伝導抑制、IKr遮断作用の寄与およびCaチャネル遮断のバランスを示す指標としてPRR、刺激周期長に対するFPD変化の傾き、FPD変化がそれぞれ有用であることが示唆された。現在原著論文を執筆中である。H29年度はヒトiPS細胞由来心筋細胞シート、多電極システムおよびプログラム刺激の組み合わせを用いて、コントロール、選択的IKr遮断薬であるE-4031、マルチチャネル遮断薬で抗不整脈薬のbepridilとamiodarone存在下における細胞シートの興奮伝導における電気生理学的変化を多面的に解析した。その結果、マルチチャネル遮断作用を示す候補化合物を解析する上で、薬物の伝導抑制、IKr遮断作用の寄与およびCaチャネル遮断のバランスを示す指標として再分極後の不応期(PRR)、刺激周期長に対する細胞外電位幅(FPD)変化の傾き、FPD変化がそれぞれ有用であることを示すことができた。

さらにMED64システムと高速度デジタルCMOSカメラ(KP-FM400WCL,セルモーションイメージングシステムSI8000シリーズ、SONY、東京)を組み合わせ、電気的ペーシング(刺激周期長500-1400 ms)で誘発した拍動の再分極時間、伝導速度と収縮のモーションベクトルの同時測定を行った。インキュベーター内のO2濃度を95%と20%(空気)の2種類で行い、心筋の伝導興奮と収縮に対する溶存酸素濃度の影響をコントロール、溶媒のみ、10 nM (-)-isoproterenol存在下で比較実験を行った。その結果は現在解析中である。また電気刺激位置を調整することによって収縮と弛緩の方向をコントロールし、収縮と弛緩ベクトルを分離することに成功した。H29年度計画した研究に関して、H30年度に原著論文で報告することが出来た。H30年度はH29年度の計画の一部とH30年度の計画を行い、現在解析中である。H29年度の研究において、同時に自発活動の測定も行ったところ、薬物の濃度や時間経過によって自発活動を先導する細胞の位置や自発頻度が変動することが明らかになり、自発活動下における細胞外電位幅(FPD)変動の計測は最低これら二つの不確定要素を持つことが明らかになった。そこで、当初の予定通り、H30年度は66発の電気刺激下で51発におけるFPDの変動を測定することを計画している。薬物はE-4031と複数のマルチチャネル遮断薬を解析する予定である。また昨年度は初代のiCell cardiomyocyteで研究を行ったが、現在iCell cardiomyocyte2(スクエア)が多く研究に用いられているので、今後はiCell cardiomyocyte2を中心に用いる予定である。またセルモーションイメージングシステムSI8000シリーズと多電極システムMED64を組み合わせた実験の予備試験をおこなう予定である。収縮ベクトルと電気生理学的変化の相関の解析結果を受けて、心臓への陰性変力作用をもつ薬物の収縮ベクトルにおける表現型の解釈方法を開発するかどうか決定する。また、陰性変時作用がヒトiPS細胞由来心筋細胞で再現できる場合は、Ca2+動態の変化やミトコンドリアの呼吸能の変化などを測定してその機序を検討する。H29年度は既に購入済みであったiCell cardiomocyte、多電極プローブ、薬物などを用いて実験を行ったので、支出が予定より少なくなったことを報告する。H30年度はiCell cardiomocyte2(スクエア)の購入(1チューブ22万円)に加え、薬物、消耗品を購入する予定である。多電極プローブは電極部分が改良されたタイプが発売され、旧型の生産が終わる予定なので、30枚新型を購入する予定である(1枚当たり3万円)。また、東邦大学の総合研究部にセルモーションイメージングシステムSI8000シリーズに納入されたので、それに多電極システムMED64を組み合わせるためMED温度制御付コネクター(品番:MED-CP04H、価格:80万円)と灌流キャップ(品番:MED-KCAP01)の購入を計画している。
老人性白内障の発生成因に関する形態学的研究

ヒト老人性白内障を究明する1つの手段として、近年、自然発症モデルが注目を集めているが、従来の遺伝性白内障マウスはその混濁発現までの期間が生後約1ケ月と短かく、必ずしも良い材料と言えなかった。最近米国で見出されたエモリーマウスは遺伝性白内障の系統でありながら混濁発現が68ケ月と緩徐な症状進行を示し、ヒト老人性白内障に最も近似の動物モデルとして注目を集めていた。我々はこのマウス白内障の発生機序について病理学的な面から検討を試みた。方法として、生後1週齢から15ケ月齢までのエモリーマウスを4%グルタールアルデヒド液で固定し、光顕と電顕で調べた。試料の1部はCarn'ey液で固定し、水晶体上皮伸展標本を作製した。対照としてほぼ同齢のddy系マウスを用いた。エモリーマウス水晶体は、生後間もなく(2週齢)から水晶体上皮が絶えず欠落する遺伝性の欠陥を有することが見出された。しかし、この欠陥は比較的軽徴で、水晶体の発達も良く、長期間透明性を維持できたが、持続的に上皮欠落が生じるため水晶体の加齢性変化が早期に出現し、これらの変化が重篤となって混濁が発生することが判った。この実験モデルは水晶体の透明性維持には上皮のviabilityが重要な要因となっていることを暗示しており、ヒト老人性白内障の成因を考慮する上で示唆に富むモデルであるように思われた。
月隕石及びSELENE月探査衛星データに基づく、月の起源と進化の全貌解明

(1)月裏側高地起源の月隕石Dhofar489グループ隕石の鉱物研究結果とアポロで採集された月表側高地岩石データ及び月リモートセンシングデータを組み合わせることにより、月表裏地殻の組成相違が月の分化の二分性に起因するというモデルを発表した。(2)玄武岩質月隕石YAMM隕石(Yamato-793169,Asuka-881757,MET01210,MIL05035の総称)の鉱物研究結果と月リモートセンシングデータを組み合わせることにより、YAMM隕石が月表側南西縁のSchickardクレータ内の直径1.4kmのクレータから飛び出した可能性が高いことを突き止めた。また、放射性熱源元素に富むマグマオーシャン残渣との関係を推定する指標である^238U/^204Pb(=μ)値が、YAMM隕石の場合アポロ玄武岩より一桁低いことから、月の火山活動の熱源が放射壊変熱以外にもあるうることを指摘した。(3)かぐや衛星に搭載されたマルチバンドイメージャ(MI)及びスペクトルプロファイラ(SP)のデータを用いて、月全球の斜長岩質地殻の岩石種及びFe/Fe+Mg比を精度よく求めるためのアルゴリズム開発を、機器の主任研究者らとともに進めた。
CDISC標準対応症例データレポジトリーシステムの構築と運用・評価

個別症例生データをCDISC ODM形式で構築しXMLデータベースシステムに導入した。データはデータ表現にある程度の齟齬があっても取り込み可能であった。研究者がXQueryの技能を有せずとも簡単に検索可能なフロントエンドWebアプリケーションおよびフロントエンドアプリケーションを開発した。検索結果は抽出・保存し新たなデータとしてXMLデータベースシステムに再取込可能であった。これら成果を利活用することで研究者が特殊な技能を有せずとも簡単にメタアナリシスや再統計解析可能な環境を提供できる。本研究の目的は、各分野の異なった研究グループの異なった臨床・疫学研究の個別症例生データをデータベースとして集積して、逐次データ抽出、メタアナリシス、統計解析に利用可能なCDISC標準による臨床・疫学研究症例リポジトリーの構築・運用評価を行う事にある。本年度は本研究に必要なサーバーのハードウエアの導入・構築作業及びXMLデータベースソフトウエアBaseXのインストール作業を実施した。構築・導入した環境は次の通り。1)サーバー:omega.umin.ac.jp、2)オペレーティングシステム:レッドハットエンタープライズ6.1、3)外部公開用IPアドレス:130.69.94.141、4)BaseXサーバー:BseX 7.9-14.1臨床試験サンプルXMLデータとしてCDISC ODM形式(XML形式)のサンプル臨床試験データを作成して上記構築のサーバーシステム環境に試験取り込みを実施した。この作業のためにデータは4試験分作成した。日本語を含むサンプルデータを作成し上記システムに取り込んで様々な検索を実施したが今回の研究範囲内の環境では問題無く検索が実施できた。しかしながらXpath、XQuery等の技術者向けの検索方法を駆使しなければならず一般の非技術者が大部分を占める臨床試験関係者にこれら技術の習得・強要は難しく利用のための前提とすると大変使いにくいものに有ると思われた。これらXPathやXQuery言語を隠蔽化したフロントエンドアプリケーションが必要と再確認した。これら結果を踏まえてフロントエンドアプリケーションの仕様策定を実施した。XPathやXQueryの隠蔽と共にある程度利用頻度の高いと思われる検索に関しては予め項目ごとのボタン等を配置して簡単に利用可能なようにするなど簡単に使える配慮が必要と考えられた。個別症例生データを作成しそのデータをCDISC ODM形式で構築した。XMLデータベースサーバーシステムとしてBaseXを用いたステムを構築した。このシステムに前述の個別症例生データを蓄積した。BaseXが持っているGUIモードを使いXQuery等を用いて試験検索を実施した。その結果を用いてフロントエンドWebアプリケーションの仕様を策定した。その結果は、XQueryは強力で多様な検索ができ標準規格化済みではあるものの多様な検索を実施するにはXQueryの文法と記述を習得する必要がありメタアナリシスが目的の臨床研究者にその技能の習得を課すのは大きな負担になると思われた。そこで、フロントエンドWebアプリケーションの仕様設計方針としてXQueryの記述をアプリケーション内に隠蔽化しユーザーがXQueryを意識しなくても利用可能なものにした。アプリケーションを運用・評価したところ狙い通りにユーザーがXQueryを全く意識することなく検索キーワードを指定し検索ボタンを押下するだけの簡単な方法で複数の試験を跨った検索が実現できたことより目標は達せられたと考える。研究計画時点には無かった追加のフロントエンドアプリケーションも開発した。これはフロントエンドWebアプリケーションと同等以上の機能を提供するがWebアプリケーションではない通常の実行可能形式のアプリケーションとした。本研究で構築したシステムを利活用することで例えば各医療機関ごとにデータ表現形式にある程度の齟齬が含有されるようなデータであっても取り込み可能であって簡単な操作で検索が可能なことが確認された。検索結果は抽出可能でその抽出したデータを新たなデータベースのデータとして再利用可能であった。これら成果を踏まえるとXQuery等の技能を習得せずとも簡単にメタアナリシスや再統計解析が可能な環境が提供できた。本年度の作業範囲は環境構築、サンプル臨床試験データの導入、試験検索、フロントエンドアプリケーションの仕様策定であり、それら各項目の作業は計画通りの進捗であった。また追加の成果としてCDISCの年会である、CDISC International Interchange(2014年11月、米国North Bethesdaで開催)にて本研究の途中の成果の発表を実施した。これにより本研究に対する仕様策定側のCDISCの関心がより高まり、本研究分野におけるCDISC ODM形式の利用が促進され、より良い仕様改訂を推進することに繋がると期待する。同じく同カンファレンス参加者にもCDISC ODM形式を利用した臨床・疫学研究レポジトリの可能性を紹介できた。これにより本研究成果である同レポジトリへの参加や利用が促進される可能性が出て来たと考える。医歯薬学実際の臨床試験で収集したデータを用いて様々な検索を実施して、詳細なWebアプリケーションの仕様策定を行う。これに基づいてシステム開発を実施し、更にシステム検証、仕様再策定、システム再構築を行う。今期はシステム構築等は実施したが今後新たなバージョンのシステム提供がなされた場合は新バージョンの機能と現行との差を検討してアップデートするか慎重に判断したい。

今後は研究計画に従って策定された仕様の見直しを実施し、実際にフロントエンドアプリケーションの開発を行う。アプリケーションを運用し、その評価を研究班内で実施する。本研究に使用したXMLデータベースソフトウエアのBaseXであるがバージョンアップがされる度にトークナイザー(一連の入力ストリームよりコマンドとアーギュメント等を切り分けるサブシステム)での日本語処理機能の処理に幾つか不具合が発生する現象が見受けられた。来期にフロントエンドアプリケーション部分の改良作業により作業工数が必要と見込まれたのでその対応分とする。フロントエンドアプリケーションの日本語処理部分の難易度増加に対応する作業工数とし開発のため追加技術者稼働費用とする。
放射線感受性を調節する転写因子遺伝子に関する研究

我々は、電離放射線曝露により発現上昇し、強制発現させた細胞において放射線誘導アポトーシスを増強させる作用を持つzinc finger型新規遺伝子ZK1をクローニングした(Katoh,O., et al BBRC,249:595-600,1998)。この放射線誘導アポトーシスを増強させる機能を持つZK1遺伝子、およびその遺伝子産物の機能について以下の点を明らかにした。1.ZK1遺伝子産物は、導入した全ての細胞株(ヒト上顎がん由来の扁平上皮がん細胞株SCC-TF,子宮がん由来細胞株HeLa、卵巣がん由来細胞株MCAS、白血病細胞株U937)において、その放射線感受性を数倍以上増加させた。2.ZK1遺伝子産物は、電離放射線のみならずH_2O_2や温熱刺激(42°C〉などのストレス、あるいは抗腫瘍剤であるVP-16やシスプラチンによる細胞死を増強させた。3.ZK1蛋白が結合しうるDNA配列を同定するために、ZK1遺伝子を原核細胞発現ベクターpGEX-4T-1に導入し、リコンビナントGST-ZK1融合蛋白を作製し、任意の配列を持った20塩基をSL,KSプライマーにて挟み込んだオリゴヌクレオチドと結合させ、EMSA法を繰り返し行った。その結果、CCCAC等のGCリッチな配列に特に結合しうることが明らかになった。ZK1遺伝子産物は、種々の刺激によるアポトーシスのシグナル伝達経路の共通する部分に働いている可能性が高い。また直接DNAと結合し、転写調節因子として働いている可能性が極めて高いので、今後は、アポトーシスのシグナル伝達経路に関与する標的遺伝子の同定を試みていく予定である。電離放射線などのストレスにより発現が誘導され、放射線誘導アポトーシスを増強する機能を持つZK1遺伝子産物のがん細胞における機能について以下の点を明らかにした。1.ZK1遺伝子産物は導入した全ての細胞株(ヒト上顎がん由来の扁平上皮がん細胞株SCC-TF、子宮頚がん細胞株HeLaや白血病細胞株U937)において、その放射線感受性を数倍増加させた。2.ZK1遺伝子産物は、放射線のみならずH_2O_2や温熱刺激などのストレスによる細胞死を増強させた。3.U937細胞に抗腫瘍剤であるVP-16を曝露することによりZK1mRNAの発現が著しく誘導されることが明らかとなった。さらに、ZK1蛋白強制発現細胞は親株よりもVP-16に対して高い感受性を示した。ZK1遺伝子は、電離放射線曝露だけでなく抗腫瘍剤であるVP-16曝露によっても発現が誘導され、さらに、電離放射線、温熱刺激、抗腫瘍剤という種々のストレスによる細胞死を増強させる働きがあることが明らかとなった。また、扁平上皮がんや白血病などがん細胞の種類を問わず同様の機能を持っていることが認められた。ZK1遺伝子産物はzincfinger型転写因子のモチーフを持ち、転写調節因子として働くことが推測される。U937細胞は種々のストレスに対してアポトーシスにより死に至ることが知られており、ZK1遺伝子産物の標的遺伝子はアポトーシスのシグナル伝達経路に働いている可能性がある。さらに、種々のストレスに対して同様の働きがあることから、アポトーシスのシグナル伝達経路より共通した部分に関与していることが推測された。今後、この標的遺伝子の同定を進めていく予定である。我々は、電離放射線曝露により発現上昇し、強制発現させた細胞において放射線誘導アポトーシスを増強させる作用を持つzinc finger型新規遺伝子ZK1をクローニングした(Katoh,O.,et al BBRC,249:595・600.1998)。

この放射線誘導アポトーシスを増強させる機能を持つZK1遺伝子、およびその遺伝子産物の機能について以下の点を明らかにした.1.ZK1遺伝子産物は、導入した全ての細胞株(とト上顎がん由来の扁平上皮がん細胞株SCC-TF,子宮がん由来細胞株HeLa、卵巣がん由来細胞株MCAS、白血病細胞株U937)において、その放射線感受性を数倍以上増加させた。2.ZK1遺伝子産物は、電離放射線のみならずH_2O_2や温熱刺激(42°C)などのストレス、あるいは抗腫瘍剤であるVP-16やシスプラチンによる細胞死を増強させた.3.ZK1蛋白が結合しうるDNA配列を同定するために、ZK1遺伝子を原核細胞発現ベクターpGEX-4T-1に導入し、リコンビナントGST-ZK1融合蛋白を作製し、任意の配列を持った20塩基をSK,KSプライマーにて挟み込んだオリゴヌクレオチドと結合させ、EMSA法を繰り返し行った。その結果、CCCAC等のGCリッチな配列に特に結合しうることが明らかになった。ZK1遺伝子産物は、種々の刺激によるアポトーシスのシグナル伝達経路の共通する部分に働いている可能性が高い。また直接DNAと結合し、転写調節因子として働いている可能性が極めて高いので、今後は、アポトーシスのシグナル伝達経路に関与する標的遺伝子の同定を試みていく予定である。
SLEの免疫学的分類による治療最適化に関する研究

本研究ではヒトSLEの病態解析と個別化医療のためのアルゴリズム確立を追求した。細胞表面分子の網羅的解析からMilk Fat Globule Epidermal growth factor 8 (MFG-E8)に着目した。末梢血中のMFG-E8陽性単球数は疾患活動性と相関した。皮膚、筋骨格病変、白血球減少を有する患者で高値であり、障害臓器での特徴を有する可能性を報告した。また、CD8T細胞亜分画は疾患活動性と相関し、各障害臓器との関連を示した。以上より、末梢血免疫細胞および血清蛋白を指標として、障害臓器および免疫学的アプローチから層別化することの実現可能性が示唆された。全身性エリテマトーデスは若年女性に好発する多彩な臓器病変を呈する自己免疫疾患である。本疾患の診断は臨床症状および検査所見の組み合わせによるため、多彩な表現系を呈する患者群を内包する症候群となっていることからも、個別化治療の必要性が次の重要な課題となっている。SLEの発症機序や免疫学的病態に関して、種々の免疫細胞やサイトカインの異常など様々な異常の存在が明らかとなっている。免疫学的異常をプロテオーム解析とエピゲノム解析で抽出し、臨床データと組み合わせることで新規病態関連バイオマーカーを抽出することが目的である。また、既存の病態関連マーカーに新規候補マーカーを加えてモニタリングすることで、個々の症例の免疫学的ステータスを見いだし、障害臓器や治療反応性、再燃の有無、予後との関連を解析する。本年度は、少数例の全身性エリテマトーデスおよび健常者の末梢血中の細胞表面蛋白発現を網羅的に解析し、幾つかの候補分子を見出した。さらに文献的考察から候補分子を絞り、対象者数を増やしながら経時的データを含めた解析を行っている。当初予定していたエントリー患者数が予想よりも下回っていること、また血清蛋白解析は症例が集積後に同時に測定することで測定誤差を最小限にするために、来年度以降、症例が一定に達するまで持ち越しとした。多彩な臓器病変を呈する全身性エリテマトーデスは、多彩な表現系を呈する患者群を内包する症候群と考えられている中で、個別化治療の必要性が重要な課題となっている。免疫学的異常をプロテオーム解析とエピゲノム解析で抽出し、臨床データと組み合わせることで新規関連バイオマーカーを抽出することを目的としている。個々の症例の免疫学的ステータスを見出し、生涯臓器や治療反応性、再燃の有無、予後との関連を解析する。昨年度に引き続き、新規発症、再燃および症状の安定した全身性エリテマトーデスおよび健常人の末梢血中細胞表面蛋白発現を網羅的に解析した。少数例のマルチ表面タンパクスクリーニングプレートを用いたマルチカラーフローサイトメトリーによる解析で得られた複数の候補分子を組込み、さらに症例数および経時的データを積み重ね検討した。一部の末梢血細胞表面蛋白発現パターンが臨床所見と関連することが中間解析から判明した。これらは複数の臓器障害を持つ患者群で一定の発現パターンを呈し、活動性全身性エリテマトーデスの病態との関連が示唆され、さらに腎障害の治療反応性と関連した。関連する解析結果の一部を関連学会で報告した。また、新規候補分子に関しては関連する試験管内での検討を行い、全身性エリテマトーデス診療における意義づけを行なっている最中である。血漿成分および尿検体について、アプタマーを用いたタンパク発現網羅的定量解析を測定した。現在複数のパラメータを用いた解析を行なっている。当初予定していたエントリー患者数が依然として下回っている。フローサイトメトリー解析における条件設定変更を余儀無くされたため、進行が予定よりも遅れた。また、特定の血清蛋白解析は症例集積後に同時に測定することで測定誤差を最小限にするため、来年度に症例数が一定に達した時点で測定する予定である。本研究ではヒトSLEの病態解析に加え、収集したデータを基にした個別化医療のためのアルゴリズムを新たに確立することを追求した。活動性および維持期SLE患者、健常人を対象とし、治療開始前後に末梢血を採取し、全血で網羅的フローサイトメトリーを施行し、細胞表面蛋白および関連する血清蛋白解析した。網羅的細胞表面マーカー測定および文献的に病態に関連する分子としてアポトーシス関連の分泌蛋白Milk Fat Globule Epidermal growth factor 8 (MFG-E8)に着目した。36例の活動性SLE、38例の非活動性SLE、24例の健常コントロールで検討した。末梢血中のMFG-E8陽性単球数は活動性SLEで高値であり、SLEDAI、抗dsDNA抗体価などと相関を示した。また皮膚、筋骨格病変、白血球減少を有する患者で高値であり、治療後に低下、再燃例では上昇傾向が認められた。これらの事象は血清MFG-E8では認めなかった。以上より、MFG-E8陽性単球は活動性SLEのバイオマーカーの一つとなること、および障害臓器での特徴を有する可能性が強く示唆された。活動性SLEでは活性化CD8T細胞割合が高値で、SLEDAIと相関した。ナイーブCD8T細胞は抗dsDNA抗体価などと相関した。腎炎、皮膚病変、白血球減少と活性化CD8T細胞割合が有意に相関した。寛解導入療法後のCD8T細胞亜分画でも有意な変動があり、ナイーブCD8T細胞割合はループス腎炎治療抵抗例で高値であった。以上より、障害臓器や活動性、治療反応性によって関与するCD8T細胞サブセットが異なる可能性が示された。

本期間での成果から、末梢血免疫細胞および血清蛋白を指標として、障害臓器および免疫学的アプローチから層別化することの実現可能性が示唆された。本研究ではヒトSLEの病態解析と個別化医療のためのアルゴリズム確立を追求した。細胞表面分子の網羅的解析からMilk Fat Globule Epidermal growth factor 8 (MFG-E8)に着目した。末梢血中のMFG-E8陽性単球数は疾患活動性と相関した。皮膚、筋骨格病変、白血球減少を有する患者で高値であり、障害臓器での特徴を有する可能性を報告した。また、CD8T細胞亜分画は疾患活動性と相関し、各障害臓器との関連を示した。以上より、末梢血免疫細胞および血清蛋白を指標として、障害臓器および免疫学的アプローチから層別化することの実現可能性が示唆された。症例患者数を増やし、引き続き新規候補分子を含めた細胞表面蛋白解析を進める。今年度中に中間解析を行い、細胞表面蛋白解析で得られた知見に基づいて、保存している血清および尿における蛋白解析を進めていく。また、エピゲノム解析における標的分子についても、中間解析の結果から測定項目を選定する予定である。同時に臨床情報を収集し、個々の症例の免疫学的ステータスを見出していく方針である。症例患者数を引き続き増やし、新規候補分子を含めた細胞表面蛋白発現解析を経時的に解析を進める。中間解析から得られた分子を中心に血清および尿の蛋白解析を開始し、継続する。エピゲノム解析における標的分子も可能な限り選定する予定である。同時に臨床情報を収集し、症例数が一定に達した時点で、個々の症例の免疫学的ステータスを解析する。リウマチ・膠原病本年度は患者のエントリー数が予定よりも少なく、検体処理や解析に使用した試薬が既存のもので賄えたため。また、購入予定であった抗体試薬や測定キットについては次年度に解析する際に購入する予定となったため。本年度は患者エントリー数が想定よりも少なく、検体処理や解析に使用した物品が少数で賄えたため。購入予定であった試薬や測定キットは次年度に解析する際に購入予定とした。次年度はエントリー患者数の増加に伴い解析に使用する試薬が増加し、さらに血清および尿での解析を行う予定のため、それらの解析に用いる試薬および測定キット代として使用する予定である。次年度は引き続き抗体試薬、測定キットを血清、尿での解析も含めて使用する予定である。
赤外線カメラを用いた表情筋運動の病的協同運動の定量的検討

顔面神経麻痺の後遺症として顔面表情筋の病的共同運動が知られている。この病的共同運動は顔面神経麻痺の予後、治療効果を判定するのに必須の項目であるが、これに関してこれまで種々の評価法が試みられているにもかかわらず、定量的かつ他覚的に詳細な研究はなかった。検者の主観によるスコア法は実地臨床においては簡便なよい方法ではあるが、顔面表情筋運動を詳細に研究するには十分なものとは言えなかった。本研究の目的は、顔面表情筋上にマーキングしたマーカーの動きを赤外線カメラで詳細に検討することによりこれまで十分な研究成果の得られていなかった顔面表情運動の様々なメカニズムを明らかにしようとするものである。方法は顔面上の数カ所の解剖学的指標となる部位に特殊コーティングしたマーカーを貼る。表情筋運動に伴うこれらのマーカーの動きを60コマ/秒の赤外線カメラで撮影しコンピューターに取り込む。そして、コンピューター上で画像解析の手法を用いて、マーカーの動きを数値化し、その軌跡、速度などを解析するというものである。その結果、正常者を用いた検討にて、正常の共同運動が解明され、また顔面神経麻痺における表情運動の改善過程が詳細に検討できた。さらに、非常に微細な動きである発声時の口唇周囲の表情筋の運動の変化が詳細に検討できた。異常共同運動の評価に関しても詳細な情報を得ることができ、異常共同運動の評価、さらには予後判定に利用できることがわかった。顔面神経麻痺の後遺症として顔面表情筋の病的共同運動がある。これまで、病的共同運動は顔面神経麻痺の予後、治療効果の判定を評価するのに必須の項目であるのに定量的かつ他覚的には殆ど検討されていなかった。ヒトの体内には様々な筋肉があり、表層に近い横紋肪は骨や関節と連携しあい身体全体の運動を行っている。電気生埋学的にこれら個々の筋肉の運動を検討することはできても、実際に皮膚の上から筋肉の動きを捉えることは難しい。この点、顔面表情筋は顔面という一定の面積の領域のなかで運動し、電気生埋学的検討の他に顔面上のマーキングの軌跡を検討することで皮膚の上から筋肉の運動を検討できる唯一の部位であるといえる。我々は、本年度中に顔面表情筋上にマーキングしたマーカーの動きを赤外線カメラで異常共同運動つまり顔面麻痺後の後遺症の検討を行った。まず、正常者を用いた検討にて、正常の共同運動も他覚的に確認され、そのメカニズムがある程度解明された。さらに、異常共同運動をおこした表情筋上のマーカーの移動距離、移動速度を検討することにより、異常共同運動の詳細かつ綿密な情報を得ることができ、上口唇点での患側の移動距離が有意に長いことがわかるなど異常共同運動の他覚的評価のあしがかりを得ることができた。また、異常共同運動の評価法である村川らの評点法による顔面神経後遺症の評価法があった。この評価法と本研究の結果(表情筋上のマーカーの移動距離や移動速度を検討した結果)との間に相関があることもわかった。評点法による評価法と本研究の結果から臨床的に有用な評価法の確立が可能となった。本研究の目的は、顔面表情筋上にマーキングしたマーカーの動きを赤外線カメラで詳細に検討することによりこれまで十分な研究成果は得られていなかった顔面表情運動の様々なメカニズムを明らかにしようとするものである。

その結果、正常者を用いた検討にて、正常の共同運動が解明され、また顔面神経麻痺における表情運動の改善過程が詳細に検討できた。さらに、非常に微細な動きである発声時の口唇周囲の表情筋の運動の変化が詳細に検討できた。異常共同運動の評価に関しても詳細な情報を得ることができ、異常共同運動の評価、さらには予後判定に利用できることがわかった。
マッピングによるヒヤリ・ハットおよび災害体験情報の共有化についての検討

自然災害では、大規模な風水害や地震がいったん発生すると、死亡情報や被害情報に注目が集まりがちだが、重篤な事故をたどると、「事故の予兆」としての怪我の無い同種体験(ヒヤリ・ハット)を見逃してきたケースもあり、犠牲がでた後に対策を立てるようでは遅いと言わざるを得ない。これらの点をふまえ、過去に大きな被害のあった地域を対象に災害体験調査を行なってきた。また、地図上に災害体験をプロットすることによる、災害体験情報の提供および共有方法についても試みてきた。今年度はこれまで調査した地域を再精査し、今後の防災活動に必要な情報の抽出方法及び提供方法を検討した。調査地域は大分県別府市、静岡県熱海市、神奈川県箱根町などである。再精査した結果、全地域に共通して、調査後の回収数および体験数は少なかった。これは、自由記述方式であったことと、災害に対する感情的な問題(行政に対する責任など)が考えられた。次に各調査地域の結果を見ると、地域ごとの地形特性に関係する災害体験が多く寄せられていることが分かった。別府市では強風が、熱海では土砂災害、箱根町では浸水被害を不安視する傾向が多く寄せられていた。参考までに、岩手県釜石市での調査では、強風や津波、土砂、雪害などの体験が多く、山口県宇部市では、高潮災害の体験が多く寄せられていることを付け加えておきたい(申・中根ら、2004)。また、地形条件にもよるが全体の傾向としては、災害時に避難途中や帰宅途中などの移動中に危険な目に遭った体験が多いようであった(例:冠水した道路を子供を抱えて移動中、側溝の位置が分からず、足を取られそうになった。)。最後に、体験情報を地図上にプロットした結果、見やすさが向上し、災害や危険に対するイメージを向上させるための一助となりうることが示唆された。自然災害発生時、地域住民と被災時に偶然居合わせた地理情報に乏しい旅行者や通行者(以降移動者)が、適切な避難手段・経路・行動の意思決定に必要なイメージ能力を向上させるための手法を検討することを目的に、静岡県熱海市及び神奈川県箱根町を対象に調査をおこなった。調査対象地域および対象:静岡県熱海市、神奈川県箱根町の一般世帯および旅館。訪問配布、訪問回収。約200世帯に配布し、133票回収した。調査票配布の際には、調査票と地図を用意し、地図には災害に関する怪我体験やヒヤリ・ハット体験の箇所を記入してもらった。調査票配布および回収期間:平成18年12月。調査の結果、全体としては、台風や集中豪雨による浸水被害・強風被害・土砂災害を心配する内容が多く、特に崖崩れなどの土砂災害を不安視する意見が多かったが、実際の避難体験は少なかった。特に熱海市は、海と山に囲まれているが、他の地域に比べて大きな災害の経験が比較的少なかったことが影響したようであった。しかしながら、熱海市の地形的特徴から考えられる災害と住民および旅館経営者が不安視している内容は一致していた。これは、体験情報提供者の居住年数が、比較的長かったことが要因と思われた。また、防災のために共有すべき体験として、移動中(避難中)に危ない思いをした体験が散見された(例:「国道13号線を車で通行中に前方2300mで崖崩れ発生。」)。旅館経営者を対象とした調査では、宿泊客の避難経験の有無によって災害時の備蓄状況が異なることがわかった。また、旅行者の避難に関わる体験は若干数ではあるが、その存在が確認された。これらの体験内容は熱海市の地図上にマッピングされた。その結果、地形特性とともに体験内容が提示されたため、災害時に気をつけるべきポイントが住民にとってイメージしやすいものとなった。本研究では、自然災害発生時、地域住民や地理情報に乏しい旅行者や通行者が、適切な避難手段・経路・行動の意思決定に必要なイメージ能力を向上させるための手法を検討することを目的とした。その第一段階として、18年度及び19年度は、過去に災害の起こった地域を対象に一連の調査を行ない、様々な災害体験を収集した。具体的には、18年度は関東地方(静岡県熱海市・神奈川県箱根町)を対象とし、19年度は九州地方(大分県別府市及び湯布院)を対象とした。調査対象地域および対象:大分県別府市、湯布院の一般世帯および旅館。郵送配布、郵送回収。約1000世帯に配布し、359票回収した。調査票配布の際には、調査票と地図を用意し、地図に災害およびヒヤリ・ハット体験の箇所を記入してもらった。調査票配布・回収期間:平成19年11月。調査の結果、台風や集中豪雨による浸水被害・強風被害・土砂災害を心配する内容が多く、昨年度と同様の傾向が見られたが、特に別府市においては、強風に関する体験が多く寄せられていた。また、防災に有効と思われた体験として、事前に危険を予測して予定を変更するといった良い判断事例もあった(例:「敬老会を予定していたが、台風のために中止した。会場前の広場の薬師堂が石の台座を残して吹き飛んだことを考えると、敬老会を中止にして良かったと思う。」)。また、これらの体験内容は別府市と湯布院の地図上にマッピングされた。

自然災害では、大規模な風水害や地震がいったん発生すると、死亡情報や被害情報に注目が集まりがちだが、重篤な事故をたどると、「事故の予兆」としての怪我の無い同種体験(ヒヤリ・ハット)を見逃してきたケースもあり、犠牲がでた後に対策を立てるようでは遅いと言わざるを得ない。これらの点をふまえ、過去に大きな被害のあった地域を対象に災害体験調査を行なってきた。また、地図上に災害体験をプロットすることによる、災害体験情報の提供および共有方法についても試みてきた。今年度はこれまで調査した地域を再精査し、今後の防災活動に必要な情報の抽出方法及び提供方法を検討した。調査地域は大分県別府市、静岡県熱海市、神奈川県箱根町などである。再精査した結果、全地域に共通して、調査後の回収数および体験数は少なかった。これは、自由記述方式であったことと、災害に対する感情的な問題(行政に対する責任など)が考えられた。次に各調査地域の結果を見ると、地域ごとの地形特性に関係する災害体験が多く寄せられていることが分かった。別府市では強風が、熱海では土砂災害、箱根町では浸水被害を不安視する傾向が多く寄せられていた。参考までに、岩手県釜石市での調査では、強風や津波、土砂、雪害などの体験が多く、山口県宇部市では、高潮災害の体験が多く寄せられていることを付け加えておきたい(申・中根ら、2004)。また、地形条件にもよるが全体の傾向としては、災害時に避難途中や帰宅途中などの移動中に危険な目に遭った体験が多いようであった(例:冠水した道路を子供を抱えて移動中、側溝の位置が分からず、足を取られそうになった。)。最後に、体験情報を地図上にプロットした結果、見やすさが向上し、災害や危険に対するイメージを向上させるための一助となりうることが示唆された。
画像処理技術と生物光学を融合した新型海洋一次生産者別基礎生産算出アルゴリズム

本研究では、地球海洋に生息する植物プランクトンの光合成速度を、地球観測衛星を用いて推定する新たな技術を開発した。この技術は、生物学と光学と画像処理技術を組み合わせた、これまでにない新たな技術である。この技術を利用して、実際の地球観測衛星のデータを10年間分解析すると、光合成速度やその変動の要因は植物プランクトンの分類群ごとに異っていた。特に、珪藻と呼ばれる植物プランクトンでは、その生物量の変化が光合成速度の変動に重要であるが、藍藻では光生理が重要であると考えられた。ハプト藻は、いわばその中間で、生物量と光生理の両方の影響が見られる結果を得た。このような知見は今までになく、本研究の成果である。人工衛星から地球海洋の海色を観測する遠隔探査(衛星海色リモートセンシング)は、海洋の生物量を観測できる唯一の遠隔探査手法として、海洋内の浮遊植物(植物プランクトン)の生物量指標の観測を可能にしてきた。近年では海洋内部の生態学的又は生物地球化学的機能をより詳細に明らかにするため、植物プランクトン群集別に光合成速度を衛星観測しようとする試みが、世界の第一線の研究者達により挑戦されている。本研究では、これら群集別光合成速度を、画像解析と生物光学を融合させた今までにない斬新な手法を用いて推定することを目的とする。本研究は研究開発段階を3つに分けている:(1)手法自体の開発,(2)手法の改良・最適化,(3)新たしい手法を用いたデータ解析による海洋生態学における新たな知見の探索。本年度は(1)を行った。具体的には、生物光学的な理論や法則を発展させ、複数のグループの光合成速度が衛星観測可能な物理量とどのように関係しているかを数学的に導きだし、複数グループの光合成速度を対象とする統計学的問題へ変換した。また、衛星画像内における空間的に近傍の画素複数を利用することで、上記統計の履行を可能にし、それを画像内で繰り返し連続して画像処理をすることで、複数グループの光合成速度を、同時に且つ画像内の全領域に対して、推定する手法を開発した。本研究では、植物プランクトン群集別光合成速度を推定する手法を開発するために、いくつかの副研究項目課題があった。具体的には、生物光学モデル内に現れる植物プランクトン光合成以外の変数の衛星からの推定や、それをもちいた中間変数(最終的には利用されないが、植物プランクトン群集別光合成を推定する上で、必須の変数)の導出であった。今年度は、これら副課題を早期に達成し、結果として、今年度課題であった植物プランクトン群集別光合成自体の推定を行うだけでなく、10年以上分の衛星データをすでに前処理することで、来年度行う予定であった群集別光合成の推定手法の改良・最適化にむけたデータの作成の一部をすでに進めることができたため、当初の計画以上に進展していると結論する。本年度は、昨年度開発した海色リモートセンシング技術(人工衛星によって測定された海色観測値より、海洋の複数グループの植物プランクトンの光吸収係数、光合成量子収率、光合成速度を求めるアルゴリズム)の最適化を行い、開発したアルゴリズムの安定化を試みた。また、開発および最適化したアルゴリズムを用いて、海洋植物プランクトンの群集別光合成速度の衛星データセットを作成した。最適化においては、具体的には、異なる2つの最小二乗法アルゴリズムを適用した(ひとつは通常標準的に利用される評価関数の微分値を0として解析的に計算する方法で、もうひとつは評価関数の微分値を評価することで評価関数の最小値を逐次的に探索する数値計算法)。結果、標準的最小二乗法がよりアルゴリズムが安定する傾向を得た。また、開発したアルゴリズム自体の特性から、アルゴリズムへ入力するデータの数により結果の信頼性が異なることから、どの数のデータを入力するのが良いかを調べた。これは、入力データ数を変えて反復的にアルゴリズムを実行し、結果を統計量で評価しアルゴリズムの安定度などを決定した。必要なデータ数はその後の解析の目的にもよるが、本研究ではある一定のデータ数(12個)を使うのがよいと判定した。衛星データセットの再作成については、今後の解析のために全球データセットおよび日本近海用データセットを作成した。また、上記研究成果について、学会発表を行い、投稿論文用原稿を執筆した。提案書にある予定では、本年度は開発したアルゴリズムを最適化し、衛星データセットを作成することが目標として掲げられていた。本年度は、これらを実施した上で、学会発表や論文執筆も行ったので、順調に進展していると言える。本年度は、本研究で新規に開発したアルゴリズムを用いて作成した10年間分(1998-2007)の衛星観測データの解析を行なった。データ解析とは、生理生態学的視点で、異なる植物プランクトングループによる一次生産が、どのような要因により影響を受けているかについての統計学的解析である。解析の結果、日本近海において、植物プランクトンの一次生産の変動は、異なるグループでは異なる要因に強く影響を受けていることが示された。特に、珪藻類の一次生産の変動はその生物量の変動に強く依存しているのに対し、藍藻ではその生物量の変動は光生理(光合成量子収率)の変動に強く依存していた。これらの結果は、季節性が多少みられたものの、総じて年間を通して見られるものであった。一方で、ハプト藻の一次生産量の変動は複雑であり、季節によりその変動要因が異なることが示された。

つまり、冬季(11月以降、翌年3月まで)には、パプト藻の一次生産の変動はその光生理の変動に強く影響を受けている一方、春季から秋季(4月から10月まで)では生物量の変動と光生理の変動が共に同等程度に一次生産の変動へ寄与していると示された。生物量の変動は動物プランクトンによる捕食などの効果も考えられる一方、光生理には海洋環境(日射など)の影響が含まれると考えられるので、結果として、海洋の一次生産変動機構の解明には、植物プランクトンをグループ別に分けて考える必要がある可能性が示唆された。本研究では、地球海洋に生息する植物プランクトンの光合成速度を、地球観測衛星を用いて推定する新たな技術を開発した。この技術は、生物学と光学と画像処理技術を組み合わせた、これまでにない新たな技術である。この技術を利用して、実際の地球観測衛星のデータを10年間分解析すると、光合成速度やその変動の要因は植物プランクトンの分類群ごとに異っていた。特に、珪藻と呼ばれる植物プランクトンでは、その生物量の変化が光合成速度の変動に重要であるが、藍藻では光生理が重要であると考えられた。ハプト藻は、いわばその中間で、生物量と光生理の両方の影響が見られる結果を得た。このような知見は今までになく、本研究の成果である。当初予定していた来年度計画(今年度開発した衛星観測手法の最適化と、それを用いた衛星データの整備)を早期に実施し、海洋生態学的な解析の早期着手を目指す。次年度も提案書の予定通りに研究を進め、作成したデータセットを用いて解析を行い海洋学的知見を得る予定である。リモートセンシング海外学会での発表より、投稿論文執筆を重視し、海外旅費の利用を控えたため。当初計画していたが中止となった当該会議が今年度再開されるのであればそれに参加する旅費に使用し、そうでなければ、当初研究計画より実際の研究が進んでいることを考慮して、さらなる研究解析に必要な物品購入などに使用する予定である。投稿予定の論文の出版代、および人件費(補助員or補佐員)に利用予定である。
リポソームのがん組織集積を促進する生体内分子応答性ＮＯ放出剤修飾脂質の開発

小分子型の抗がん剤が、がん組織のみならず正常組織に広く分布する一方で、粒子径が100 nm程度であるリポソームを始めとするナノメディシンは、がん組織に集積することが知られている。これは、がん新生血管の透過性の亢進と、組織に漏出した物質を回収するリンパ管が未発達である事に基づく、Enhanced Permeability and Retention (EPR)効果によるものである。一方でEPR効果による集積が限定的であること、がん患者の臓器で起こるEPR効果に個人差があることが新たな問題になっている。そこで我々はこのEPR効果を促進するため、がん組織の血流量を増加させることを考え、血管拡張剤の一つである一酸化窒素(NO)に注目している。このNOをがん組織に送達させ機能させるため、NO放出剤をリポソームに内包もしくはその膜に担持させた新たなナノメディシンの開発を行っている。また、ナノメディシン同様に集積の向上が望まれている、タンパク質医薬薬に注目し、NOを修飾する技術の創生を行なっている。平成30年度は、可逆的付加開裂連鎖移動重合を用いた、新たなNO放出剤担持型ポリマーの開発を行なった。本ポリマーについては、保存安定性が高くがん細胞特異的な放出が期待できる材料となった。またこれまで開発してきたNO放出剤内包リポソームの、がんへの集積過程について詳細な解析を行った。その結果、本リポソームは投与1時間後から48時間まで集積の促進を続けた。いくつかのNO放出剤は、生体内が耐性を獲得してしまい機能しなくなる一方、本研究で用いた放出剤はそのような耐性を獲得させないため、集積の促進を続けたと考えられる。また、ナノメディシン同様にがん組織への集積量向上が望まれているタンパク質医薬にも注目し、NO放出剤を修飾する技術の創成も行い、細胞、動物の両方を用いた評価を行なっている。我々は、NOを放出するナノメディシンを開発し、がんや炎症部位での血流を制御しその集積性を向上させ、現状のEPR効果による集積率の限界を打破することを目的としている。今年度は、これまでのNO放出剤内包リポソームについて、そのがん組織への集積についての挙動を詳細に評価した。その結果、本リポソームが投与1時間後からエンドポイントである48時間後まで集積を促進し続けた事が明らかになった。また、がん組織を破砕し集積したリポソームを定量した所、未内包のリポソームより2.7倍も多く集積している事が明らかになった。また、タンパク質医薬にNO放出剤を修飾する技術の創成にも成功しており、細胞との相互作用により、NOが放出される事が確認されている。これらの技術の早出は、関連分野に大きなインパクトを与える成果と考えている。またその成果を2件の国際学会で発表し、高い評価を得ている。以上のように我々は、NO放出剤内包リポソームの詳細か解析と、NO放出型タンパク質医薬の開発に成功しており、これらの成果は、本テーマの推進と関連分野に与える効果を考える時、当初の計画以上に進展していると判断しうる。現在、NO放出剤を担持したタンパク質医薬について、細胞、動物を用いた評価を行なっている。今後の研究の推進方策としては、まず放出剤の修飾率によって、その医薬が本来発揮する薬理作用について影響を与えるかどうか評価を行う。また、本NO放出剤は、主として細胞との相互作用によりNOが放出されるため、種々のがん細胞に添加する事で、その放出挙動を評価する。併せて、その細胞毒性についても評価を行う。次に、動物実験として担がんマウスを数種用い、本材料を投与しその集積量を評価する。この際、投与量やその毒性、治療効果についても詳細に評価することで、本材料の有効性を示す。これまでの小分子型の抗がん剤が、投与後がん組織のみならず正常組織にまで広く分布する一方、100 nm程度の粒子径を有するリポソームを始めとするナノメディシンは、がん組織に集積することが知られている。一方、EPR効果による集積は未だに限定的であるとも言われており、その改善が求められている。そこで申請者は、このEPR効果の促進のため、がん組織への血流量を増加させることを考え、血管拡張剤の一つである一酸化窒素(NO)に注目し、NO放出剤をリポソームの構成脂質に結合させた新たなNO放出剤修飾脂質の開発を行っている。平成29年度、グルタチオン応答型のNO放出剤を合成し、種々の脂質を検討後、リポソームの構成分子であるPEG脂質に結合させた分子の合成に成功した。一方、申請者は6月から翌年3月までワシントン大学Stayton研究室に留学し、可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)重合の技術と、関連する評価法等の習得を主として行った。また、NO修飾ポリマーの開発を共同研究として行い、親水的なポリマーにNO放出能を付加する事を試みた。更に、ナノメディシン同様にがんへの集積の向上が望まれている、タンパク質医薬に修飾可能なRAFTポリマーを合成し、共同研究として今後の研究を展開できることとなった。

本研究で開発された分子は、EPR効果に基づくがん組織への集積を根本的に向上させ得る材料であり、本研究課題の実現は、EPR効果を促進するという学術的な重要性だけでなく、これまで開発されてきたナノメディシンやタンパク質医薬に広く応用しうる汎用性の高い医療材料になり得るという点で意義が大きい。申請者は、一酸化窒素(NO)を放出するナノメディシンを開発し、がんや炎症局所での血流を制御してその集積性を向上させ、現状のEPR効果によるナノメディシンの集積率の限界を打破することを目的としている。今年度は、これまでリポソーム内にNO放出剤を内包していたことによる薬剤内包の制限をなくすため、NO放出能を有する脂質の開発に成功し、さらに米国ワシントン大学に留学して、新規な材料開発手法を導入し、種々の検討の後、NOを徐放する能力を有しうる新規高分子材料の設計に成功している。このように申請者は、本テーマを大きく展開し、しかも適用できるナノメディシンに普遍性を持たせるための新規なアイデアを創出、これを実現しており、これは関連分野に大きなインパクトを与える成果と考えている。また、その成果を2件の国内学会と、1件の国際学会で発表し、国内外で高い評価を得ている。以上のように申請者は、NO放出型ナノメディシン開発のための新規手法を留学において獲得し、共同研究の形で非常に有効な高分子材料の開発に成功しており、これらの成果は、本テーマの推進と関連分野に与える効果を考えるとき、当初の計画以上に進展していると判断しうる。小分子型の抗がん剤が、がん組織のみならず正常組織に広く分布する一方で、粒子径が100 nm程度であるリポソームを始めとするナノメディシンは、がん組織に集積することが知られている。これは、がん新生血管の透過性の亢進と、組織に漏出した物質を回収するリンパ管が未発達である事に基づく、Enhanced Permeability and Retention (EPR)効果によるものである。一方でEPR効果による集積が限定的であること、がん患者の臓器で起こるEPR効果に個人差があることが新たな問題になっている。そこで我々はこのEPR効果を促進するため、がん組織の血流量を増加させることを考え、血管拡張剤の一つである一酸化窒素(NO)に注目している。このNOをがん組織に送達させ機能させるため、NO放出剤をリポソームに内包もしくはその膜に担持させた新たなナノメディシンの開発を行っている。また、ナノメディシン同様に集積の向上が望まれている、タンパク質医薬薬に注目し、NOを修飾する技術の創生を行なっている。平成30年度は、可逆的付加開裂連鎖移動重合を用いた、新たなNO放出剤担持型ポリマーの開発を行なった。本ポリマーについては、保存安定性が高くがん細胞特異的な放出が期待できる材料となった。またこれまで開発してきたNO放出剤内包リポソームの、がんへの集積過程について詳細な解析を行った。その結果、本リポソームは投与1時間後から48時間まで集積の促進を続けた。いくつかのNO放出剤は、生体内が耐性を獲得してしまい機能しなくなる一方、本研究で用いた放出剤はそのような耐性を獲得させないため、集積の促進を続けたと考えられる。また、ナノメディシン同様にがん組織への集積量向上が望まれているタンパク質医薬にも注目し、NO放出剤を修飾する技術の創成も行い、細胞、動物の両方を用いた評価を行なっている。我々は、NOを放出するナノメディシンを開発し、がんや炎症部位での血流を制御しその集積性を向上させ、現状のEPR効果による集積率の限界を打破することを目的としている。