hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超分子反応場による立体選択性制御法の開拓

酸塩基複合化学を基盤に超分子触媒を精密設計し、その触媒活性中心近傍に所望の反応遷移状態を安定化するための反応場を構築し、高難度分子変換を制御することを研究目的として実施した。2018年度の主な成果を以下に記す。(1)2,4-ビス(トリフルオロメチル)フェニルボロン酸がアミド脱水縮合触媒として有効であることを明らかにし報告した。この触媒の活性種は二量体無水物であることをESI-MS分析によって明らかにした。(2)キラルアミドリン酸エステルとハロ琥珀酸イミドをそれぞれ塩基触媒、酸として用いエナンチオ選択的ヨードエーテル環化反応及びヨードアザ環化反応を報告した。ヨウ素の酸塩基二重活性化が本反応の鍵である。(3)チオウレアを塩基触媒にin situでIClを発生させ、選択的なヨードクロロ化反応を開発し報告した。チオウレアとI2とNCSから生じる活性中間体のX線結晶構造解析に成功した。(4)ボロン酸、キラルビナフトール由来の配位子、トリス(ペンタフルオロフェニル)ボロンの3成分からキラル超分子触媒をin situで調製し、プロパルギルアルデヒドとシクロペンタジエンとのエナンチオ選択的かつ基質選択的Diles-Alder反応を開発し報告した。超分子触媒の活性中心近傍に深い反応空間を構築し、その中でマルチ選択的に反応を制御することに初めて成功した。これはいわば基質や生成物に応じたテーラーメイド型超分子触媒の創製である。(5)キラルビスリン酸触媒を設計し、その分子内水素結合ネットワークによって増強した酸性プロトンが活性中心となるアザ-Friedel-Crafts反応を開発し報告した。これは言わば酵素の水素結合ネットワークをモデル化した成果として注目される。当初の計画通り、順調に進展しており成果を論文として発表できた。最終年度に向けてさらなる成果につながるように推進していく。酸塩基複合化学を基盤にさらなる精密な触媒設計と高難度な反応制御にチャレンジして、インパクトの高い成果に繋げていけるように推進する。本研究では、酸塩基複合化学を基盤に、予め分子設計した酸と塩基を組み合わせて超分子触媒を創製し、基質選択性、反応選択性、立体選択性、官能基選択性、サイト選択性、レジオ選択性など、既存の単一分子触媒では制御困難な高次選択的触媒反応システムの開発を目的に研究を実施した。ナノサイズの精密キラルBroensted酸触媒の開発:反応性の低いケチミンを基質に選び、スチレン、インドール、2-メトキシフランなどを求核剤に用いてFriedel-Crafts型反応を検討した。触媒設計には、ビナフチルジスルホン酸やキラルビナフチルピロリン酸などの光学活性二塩基酸を用い、アルカリ金属イオンやアルカリ土類金属イオンなどを利用してそれらの金属塩を調製した。その際、モル比を調整することで、多種多様な金属塩を選択的に創ることができた。この方法を用いて触媒活性中心の酸塩基性の強さを調整し、触媒活性中心近傍に適切な不斉反応場を構築できるように検討を重ねた。その結果、幾つかの反応において、エナンチオ選択性のみならず、反応選択性やサイト選択性を制御することに成功した。水素結合ネットワークを利用したBroensted酸触媒の開発:酵素の働きをヒントに、触媒活性近傍の鍵穴を水素結合ネットワークで構築すると同時に、水素結合ネットワークによってBroensted酸性を強めることができれば、様々な選択的反応に利用できると期待し、検討した。光学活性ビナフトール由来のビスリン酸は分子内で互いに水素結合を作り、環状構造として安定化することを明らかにした。また、その際のBroensted酸性はビナフトールのモノリン酸よりも強いことを理論計算化学で確かめた。実験的にも、モノリン酸触媒では反応が進行しない場合にも、ビスリン酸を触媒に用いれば反応が進行することを実証した。光学活性ビナフチルジスルホン酸(BINSA)及びその3,3'-置換型BINSAをキラルBroensted酸ユニットとして用いて不斉超分子触媒を設計し、高難度な反応開発を行うことを目的に研究をスタートさせた。このBINSA誘導体は我々が世界に先駆けてその合成法を確立しており、これらの光学活性Broensted酸を利用した共同研究が国内外で幾つかスタートした(北海道大学、東京工業大学、大阪大学、University of California, Berkley)。この研究の波及効果は当初の計画以上の進展であり、大いに期待している。

その結果、幾つかの反応において、エナンチオ選択性のみならず、反応選択性やサイト選択性を制御することに成功した。水素結合ネットワークを利用したBroensted酸触媒の開発:酵素の働きをヒントに、触媒活性近傍の鍵穴を水素結合ネットワークで構築すると同時に、水素結合ネットワークによってBroensted酸性を強めることができれば、様々な選択的反応に利用できると期待し、検討した。光学活性ビナフトール由来のビスリン酸は分子内で互いに水素結合を作り、環状構造として安定化することを明らかにした。また、その際のBroensted酸性はビナフトールのモノリン酸よりも強いことを理論計算化学で確かめた。実験的にも、モノリン酸触媒では反応が進行しない場合にも、ビスリン酸を触媒に用いれば反応が進行することを実証した。光学活性ビナフチルジスルホン酸(BINSA)及びその3,3'-置換型BINSAをキラルBroensted酸ユニットとして用いて不斉超分子触媒を設計し、高難度な反応開発を行うことを目的に研究をスタートさせた。このBINSA誘導体は我々が世界に先駆けてその合成法を確立しており、これらの光学活性Broensted酸を利用した共同研究が国内外で幾つかスタートした(北海道大学、東京工業大学、大阪大学、University of California, Berkley)。この研究の波及効果は当初の計画以上の進展であり、大いに期待している。本研究では、酸塩基複合化学を基盤に、あらかじめ設計した酸と塩基を組み合わせて超分子触媒を創製し、基質選択性、反応選択性、立体選択性、官能基選択性、サイト選択性、レジオ選択性など、既存の単一分子触媒では制御困難な高次選択的触媒反応システムの開発を目的に研究を実施した。ナノサイズの精密キラルBroensted酸触媒の開発:前年度に引き続き、アルジミンやケチミンを基質に選び、スチレン、インドール、2-メトキシフラン、トリメチルシアニドなどを求核剤に用いて求核付加反応を検討した。触媒設計には、ビナフチルジスルホン酸やキラルビナフチルピロリン酸などの光学活性二塩基酸を用い、アルカリ金属イオンやアルカリ土類金属イオンなどを利用してそれらの金属塩を調製した。その際、モル比を調整することで、多種多様な金属塩を選択的に創ることができた。この方法を用いて触媒活性中心の酸塩基性の強さを調整し、触媒活性中心近傍に適切な不斉反応場を構築できるように検討を重ねた。その結果、幾つかの反応において、エナンチオ選択性や立体選択性を制御することに成功した。水素結合ネットワークを利用したキラルBroensted酸触媒の開発:前年度に引き続き、酵素の働きをヒントに、触媒活性近傍の鍵穴を水素結合ネットワークで構築すると同時に、水素結合ネットワークにとってBroensted酸性を強めることができれば、様々な選択的反応に利用できると期待し検討した。光学活性部ナフトール由来のC1対称型ビスリン酸を合成し、分子内のリン酸部位が互いに水素結合を作り、環状構造として安定化することを明らかにした。また、その際のBroensted酸性はビナフトールのモノリン酸よりも強いことを量子化学計算で確かめた。
アジアの洪水常襲地に適した持続的作物栽培体系の開発

本研究は、インドネシア国内に広がる沼沢地(SWAMP)を対象に、イネとダイズの作物栽培体系の適応可能性を明らかにする目的で行った。まず、イネにおいては、鉄過剰耐性品種を選抜するとともに、QTL解析から鉄無毒化と吸収抑制に関わる機構を明らかにした。また、冠水障害回避に効果的な肥培管理方法を提案した。さらに、現地における、再生二期作の高生産テンシャルを実証した。次に、ダイズにおいて、塩障害を引き起こす生理的メカニズムを明らかにするとともに、耐塩性準同質遺伝子系統の有用性を現地で明らかにした。一方、酸性土壌におけるイネの枯死は低pHが原因と断定し、硫酸酸性土壌生成の原因の一部についても明らかにした。1.イネのストレス耐性の向上と適正栽培技術の開発にかかわる研究:イネ栽培の確立を目指した圃場(Sriwwijaya大学)およびポット(Bogor農大)試験については、種子の供給が十分でなかったために、試験開始時期が予定の6月から12月に半年遅れ、データの収集は平成25年度になる見込みとなった。一方で、鉄過剰耐性強のDadahupと鉄過剰耐性弱のCiherangよりDNAを抽出し、DadahupとCiherangの遺伝子型が識別可能なDNAマーカーの探索を行った。336マーカーのうち54マーカーについて多型を検出し、DNAマーカーとして利用可能であることを確認した。また、南スマトラのスワンプにおける水稲栽培の実情を調査し,海岸線からの距離が異なるスワンプ地域間の水稲栽培の作付時期の変異や収量構成要素が異なることを明らかにした。2.ダイズの塩害抵抗性の改善にかかわる研究:まず、現地塩害圃場の土壌を用いてダイズポット栽培試験を行った。耐塩性準同質遺伝子系統において耐塩性の対立遺伝子を有する系統(NILs18-T、NILs25-T、NILs72-T)の子実重は、いずれも耐塩性の対立遺伝子を持ってない系統(NILs18-S、NILs25-S、NILs72-S)よりも高い値を示すことを確認した。また、湿害耐性の遺伝解析をするために栽培ダイズ品種Jacksonと野生ダイズ系統JWS156-1間の交雑に由来するBC3F2世代を獲得した。一方で、国内において耐塩性の育種素材の基本的特性を解析した。塩処理の影響は3つのNILsのいずれも感受性(S)と耐性(T)系統間の差異は明瞭であり、S系統に比べT系統では、塩処理区における根粒形成、光合成速度および生育量の抑制が軽減された。3.酸性硫酸塩土壌の解析:南カリマンタン・バンジャルマシン2地点(3ヶ所)及び南スマトラ・パレンバン4地点の水田において土壌を採取し、一次鉱物組成、粘土鉱物組成及び化学組成を求めた。また、土壌pHの測定を行い、問題土壌に関する基盤的情報を収集した。1.大豆の耐塩性向上のための有望系統の育成と関連形質の評価インドネシアの海岸沿いのSWAMP地域において、ダイズの耐塩性準同質遺伝子系統の圃場栽培試験を行ったところ、感受性と耐塩性系統間に有意な差が認められなかった。次に、ダイズ湿害耐性の遺伝解析に必要な栽培ダイズ品種Jacksonと野生ダイズ系統JWS156-1間の交雑に由来するBC3F3世代の122系統を育成した。耐塩性に関するNILsを用い、耐塩性に関わる形質を比較した結果、耐塩性の大きい系統は小さい系統に比較して、塩処理条件下で、1)根粒形成を維持する能力が高く、2)NaとClを根に蓄積しながら地上部へのこれら元素の輸送を低減する性質を有していた。2.イネの冠水耐性向上および深水栽培技術の開発イネのコアコレクションに鉄過剰処理を行い、Ciherangと交配する鉄過剰耐性の3系統系統を選抜した。また、QTL解析に必要なDNAマーカーの探索を行い、336マーカー中54マーカーについて、CiherangとDadahupの間の多型を検出することができた。低湿地稲作の安定化に向け、異なる深水期間におけるイネの生育特性を比較した。その結果、主茎最上位完全展開葉の個葉光合成速度は1R Dadahupでは深水処理で高まっていたため、深水処理における乾物成長の差異は,分げつ数の消長が要因であると推察した。次に、深水条件下での窒素葉面散布の影響を調べた。その結果、深水前の葉面への積極的な窒素供給は,葉面の拡大には効果があるものの,成長速度に対する効果は安定して現れないことが明らかになった。加えて、水稲再生二期作の現地導入可能性を把握するために、異なるイネ35品種を供しして、収穫後に再生するヒコバエのポテンシャル評価をインドネシアと石垣島およびつくばで行い、基盤的知見を得た。1.硫酸塩鉱物の特定:異なる生育状況を示す土壌試料を用いて、蛍光X線分析による化学組成等元素の偏在性等のキャラクタリゼーションを行った。その結果、イネの枯死の原因は低pHのためであり、低pHは硫酸イオンの生成に起因していた。また、黄鉄鉱は土壌中には存在が確認できず、ジャロサイト(KFe3[SO4]2[OH]6)も同定されなかった。以上のことから、本地域の土壌には複数の硫酸塩鉱物が存在していると考えられた。2.耐塩性大豆育種:インドネシアダイズ遺伝資源51系統の幼苗期の耐湿性を温室で評価した。

その結果、インドネシア由来のダイズ遺伝資源が高い耐塩性を持つことが分かった。また、栽培ダイズ品種Jacksonと野生ダイズ系統JWS156-1間の交雑集団(BC3F4世代)122系統を獲得した。さらに、耐塩性に関する準同質遺伝子系統については、塩濃度に関わらず、耐塩性系統の葉の塩素濃度は低いことが明らかになった。3.鉄過剰耐性稲育種:CiherangとDadahupの間で多型が検出可能なSSRマーカーを、既存のDNAマーカーから選抜した。さらに、Mi-Seqによって得られたDNAのシークエンスデータからSSRマーカーの作成を行った。その結果、各染色体上に均等に設計されたSSRマーカーは合計124個となった。これらのSSRマーカーを用いてCiherangとDadahupのF2集団のブロンジングスコアのQTL解析を行った結果、1番および11番染色体にQTL候補領域を検出した。4.稲安定生産技術の開発:再生二期作栽培の効果的な施肥技術を確立するために、本作収穫時の施肥が刈り取り後の新茎の発生に及ぼす影響を比較検討した。施肥によってSPAD値と葉面積が増加し、その結果地上部の乾物重が増大した。一方で、スリウィジャヤ大学において、窒素施肥法を比較した結果、IR64ではN-leaf処理とN-root処理で、CiherangではN-leaf処理で無窒素処理に比べてRGRが高まった。1.イネ鉄過剰耐性育種と稲作技術開発:鉄過剰障害の指標であるブロンジングスコアに関するQTLを1番染色体、6番染色体に検出した。また、1番染色体のQTLは地上部において吸収された鉄を無毒化し、ブロンジングの発生を抑制する機構に関わるQTLであり、6番染色体のQTLは過剰な鉄の吸収を抑制する機構、あるいは過剰に吸収した鉄の地上部への輸送を阻害する機構に関わるQTLであることが示唆された。また、パレンバンの圃場試験では、再生収量に施肥処理区間で、Kwanfu401に差異は認められなかったが、IR24では無施肥区に比較して施肥区の収量が有意に向上したことから、本作収穫後に分化する穂の成長に効果的な施肥体系を確立する必要があると結論付けた。さらに、普及品種(Ciherang)とswamp適正品種(1R Dadahap)を冠水処理した結果、冠水処理条件での成長の違いは純同化率に影響を受けており、深水下での光合成能力の違いが関係していることが明らかになった。2.大豆塩害耐性育種:耐塩性系統は感受性系統に比較して、塩処理下において根や根粒の生育を維持することによりN吸収能を維持すること、あるいはNa+、Cl-を根から葉へと移行するのを抑制して物質生産能低下を軽減する生理的特性を有すると推察された。さらに、昨年度の一次評価で得たインドネシア耐塩性遺伝資源の耐塩性が確認された。また、耐塩性系統と塩感受性品種Jacksonを交配し、F1世代の種子を獲得、Jacksonと野生ダイズ系統JWS156-1間の交雑集団BC3F5世代を獲得した。3.酸性硫酸塩土壌の発生要因の解明:2013年・2014年に採取した土壌試料を用いて、蛍光X線分析、X線回折分析、走査型分析電子顕微鏡による元素の偏在性等の解析を行った。その結果、作物生産の不安定化を助長する酸性土壌のpH低下をもたらす原因物質と存在状態の特定に成功した。本研究は、インドネシア国内に広がる沼沢地(SWAMP)を対象に、イネとダイズの作物栽培体系の適応可能性を明らかにする目的で行った。
恒常的活性化チロシンキナーゼを発現した造血器腫瘍に対する統合的分子標的療法の開発

急性骨髄性白血病や慢性骨髄性白血病等の骨髄増殖性腫瘍で高頻度に認められる恒常的活性化チロシンキナーゼ変異体であるFLT3-ITD, BCR/ABL, Jak2-V617Fが、抗癌剤や種々の分子標的薬に対して治療抵抗性を付与する分子機構を検討し、これらの変異体が抗癌剤処理時にChk1を介した細胞周期チェックポイント活性化を亢進したり、STAT5の高度の活性化を介してPI3K/Akt経路の阻害から下流のmTORC経路の抑制を阻止する機構を見出し、またこれらの機構を制御することにより相乗的な腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することで、極めて有効な治療効果が期待出来る事を示した。造血器腫瘍細胞の発症や進展に重要な恒常的活性化チロシンキナーゼ変異体であるBCR/ABL, Flt3-ITDおよびJak2-V617Fを発現した白血病細胞およびモデル造血細胞株を用いて検討を行い、それぞれの変異体に対する阻害薬で活性化を抑制することで、etoposideなどの化学療法薬によるChk1の活性化とChk1依存性のG2/M期での細胞周期arrestを抑制し、Bax活性化、ミトコンドリア膜電位障害、caspase活性化を介したapoptosisの誘導を相乗的に誘導しうることを見いだした。また、GDC-0941やMK-2206等のそれぞれPI3KやAktの阻害薬も、キナーゼ変異体の抑制とほぼ同様の効果をもたらすことを見いだした。特に、imatinibのみでなく第二世代のBCR/ABL陽性白血病治療薬であるdasatinibやnilotinibにも完全耐性を示すBCR/ABLのT315I変異体発現細胞に対しても、GDC-0941やMK-2206により抗癌剤との相乗的apoptosisが誘導される事を見いだした(PLoS One 8:e79478, 2013)。また、p53がp21などの標的遺伝子産物の発現誘導を介して抗癌剤誘導性のChk1活性化を抑制することを見出し、p53の発現誘導を亢進させるnutlin-3がチロシンキナーゼ阻害薬と同様に、G2/M期での細胞周期arrestを抑制しapoptosisの誘導を相乗的に誘導しうる事を示した(投稿準備中)。これらの結果はChk1を介したDNA損傷誘導性チェックポイント活性化調節の分子機構解明へ向けて重要な意義を有するのみでなく、BCR/ABLのT315I変異を含めた治療抵抗性造血器腫瘍に対する化学療法薬と併用した統合的分子標的療法の新規開発に直結しうる臨床的にも極めて重要な意義を有する。造血器腫瘍細胞の発症や進展に関与する代表的な恒常的活性化チロシンキナーゼ変異体であるBCR/ABL, Flt3-ITDおよびJak2-V617Fを発現した、白血病細胞およびモデル造血細胞株を用いて検討を行い、それぞれimatinib, sorafenibおよびJakI-1にてこれらの変異体の活性化を抑制することで、etoposideやdoxorubicinによるChk1の活性化とChk1依存性のG2/M期での細胞周期arrestを抑制し、Bax活性化、ミトコンドリア膜電位障害、caspase活性化を介したapoptosisの誘導を相乗的に誘導しうることを見いだした。また、この過程にはPI3K/Akt経路活性化の抑制によるGSK3活性化を介したChk1発現抑制が関与し、GDC-0941やMK-2206等のそれぞれPI3KやAktの阻害薬が、キナーゼ変異体の抑制とほぼ同様の効果をもたらすことを見いだした。さらに、imatinibのみでなく第二世代のBCR/ABL陽性白血病治療薬であるdasatinibやnilotinibにも完全耐性を示すBCR/ABLのT315I変異体発現細胞に対しても、依然に申請者らが抑制効果を示したsorafenibのみでなく、GDC-0941やMK-2206により抗癌剤との相乗的apoptosisが誘導される事を見いだした(論文投稿中)。これらの結果はChk1を介したDNA損傷誘導性チェックポイント活性化調節の分子機構解明へ向けて重要な意義を有するのみでなく、既に臨床応用されていたり開発中の阻害薬を用いた結果であることから、BCR/ABLのT315I変異を含めた治療抵抗性造血器腫瘍に対する化学療法薬と併用した統合的分子標的療法の新規開発に直結しうる臨床的にも極めて重要な意義を有する。マウス造血前駆細胞32D細胞に変異遺伝子、FLT3-ITDとFLT3-TKDを導入して32D/ITDおよび32D/TKD細胞を作製し以下の検討を行った。

即ち、PI3K阻害薬のGDC-0941 (GDC)およびAkt阻害薬のMK-2206 (MK)は内因性経路によるアポトーシスを誘導し、その効果は32D/ITDに比べ、32D/TKDで強かった。また、32D/TKDにSTAT5の活性化型変異体STAT5A1*6を導入した細胞(DY/STAT5*)では、阻害薬に抵抗性となり、32D/ITDにSTAT5阻害薬であるpimozide (PZD)を処理すると抵抗性が解除された。同様の効果をFLT3-ITD陽性ヒト白血病細胞株MV4-11で認めた。これらの薬剤は4EBP-1の脱リン酸化を32D/ITDに比して32D/TKDで強く誘導し、その効果はSTAT5A1*6導入で減弱し、PZD処理で増大した。これに伴って、翻訳開始複合体形成におけるeIF4E-eIF4G会合や抗アポトーシス因子Mcl-1の発現の抑制を認めた。このMcl-1の発現抑制は転写活性の抑制やタンパク質の不安定化とは独立した機構で生じ、外因性にMcl-1遺伝子を導入した32D/TKDではこれらの薬剤に抵抗性を示した。FLT3-ITD陽性のAML患者より得た初代培養細胞では、GDCによる4EBP-1の脱リン酸化とMcl-1の発現抑制、ひいては細胞死を、PZD処理でより強力に誘導することを確認した。本研究により、FLT3-ITDの強いSTAT5活性化がmTORC1/4EBP1経路を通じてeIF4E会合に影響を与え、PI3K/Akt阻害薬に対し、主にMcl-1 cap依存性の翻訳活性を維持することでアポトーシスを回避することが示された。血液内科学恒常的活性化チロシンキナーゼ変異体がGSK3ßの不活化を介してDNA損傷誘導性のChk1活性化を抑制恒常的活性化チロシンキナーゼ変異体がGSK3ßの不活化を介してDNA損傷誘導性のChk1活性化を亢進し治療抵抗性をもたらす分子機構の詳細を明らかにするとの目標に対して、これらの変異体がPI3K/Akt経路の活性化を介することでGSK3ßを不活化し、Chk1のubiquitin化を介したproteasome系での分解を抑制することで、その活性化とG2/M期での細胞周期arrestを維持させ、Bax活性化、ミトコンドリア膜電位障害、caspase活性化を介したapoptosisの誘導を阻害することを見出し、さらにはE3リガーゼMdm2の阻害によるp53の活性化を亢進させる事で、チロシンキナーゼ阻害薬と同様に、抗癌剤によるChk1活性化抑制により相乗的アポトーシスを恒常的チロシンキナーゼ変異体発現細胞に持たしうる事を見出す等のことで、その一部を達成すると供に、より詳細な分子機構解明の為の実験系を確立することが出来た。また、T315I変異を有するBCR/ABL発現細胞に対する新規治療法開発へ向けての取り組みにおいても、sorafenibとDNA損傷反応との相乗効果のみならず、臨床開発中のPI3K阻害薬GDC-0941やAkt阻害約MK-2206、さらにはp53の活性化促進薬nutlin-3がsorafenibと同様に、抗癌剤誘導性のapoptosisを相乗的に増強しうることを見いだすことにより、目標達成に向けて着実に研究を進展させることが出来た。恒常的活性化チロシンキナーゼ変異体がGSK3ßの不活化を介してDNA損傷誘導性のChk1活性化を抑制し治療抵抗性をもたらす分子機構の詳細を明らかにするとの目標に対して、これらの変異体またはPI3K/Akt経路の抑制により、Chk1の活性化とChk1依存性のG2/M期での細胞周期arrestを抑制し、Bax活性化、ミトコンドリア膜電位障害、caspase活性化を介したapoptosisの誘導をDNA損傷誘導性の抗癌剤と相乗的に誘導しうることを見いだすことにより、その一部を達成すると供に、より詳細な分子機構解明の為の実験系を確立することが出来た。
タンパク質量の均一化による微量タンパク質の網羅的解析

細胞の機能を調節している転写因子などの重要なタンパク質のおおくは、細胞内で微量にしか発現していないことが多く、これらを質量分析によって検出することは困難であった。そこで、無細胞翻訳系を用いた簡便な同位体標識標準ペプチドと、静電相互作用、疎水性相互作用を用いたクロマトグラフィーによる多次元の分離により、標的タンパク質フラグメントの純度を高めることで、微量タンパク質の高感度な絶対定量法であるMS-QBiC法を確立した。これにより1細胞内に数千分子しか存在しない概日時計の転写因子の増減を定量的に検出することに成功した。細胞内のタンパク質量はタンパク質間で10,000倍以上の差があり、その量的ダイナミックレンジの大きさが現在のプロテオーム解析にとって大きな壁になっている。転写因子など、分子数は少ないが細胞の機能に大きな影響を与えるタンパク質も多くあり、これらも網羅的に解析することが今後のプロテオームには必要である。これには、質量分析計の高感度化とサンプル調整の両面からアプローチする必要がある。そこで、タンパク質量のダイナミックレンジを小さくするための手法の開発を目指した。まず、タンパク質を分離する手法が必要であるため、最も分離能が高い手法のひとつである、2次元電気泳動法を使用した。1次元目の電気泳動には、多くのタンパク質量を分離することができるアガーゲル(pH 3-10)を使用した。2次元目には10 %のSDS-PAGEを使用し、HEK293T細胞の細胞溶解液を分離し、2次元電気泳動の条件の検討を行った。また、本研究で最も重要な転写メンブレンの検討を行った。転写によるタンパク質吸着量の検討、吸着タンパク質の回収の検討には1次元のSDS-PAGEを行ったサンプルを使用した。市販ガラスフィルターにシランカップリング剤でC4,C8,C18などの疎水基を反応させ、そのガラスフィルターにタンパク質を転写を行った。このとき、ガラスフィルターをCBB染色することでタンパク質の吸着を確認したが、ガラスフィルターには23mm以上の厚みがあるものしか市販されていなく、不透明であるためフィルター内部に固定されたタンパク質までを正確に定量することが不可能であった。そのため、より厚みの薄いガラス繊維フィルターの入手、または透明なゲル素材にタンパク質吸着分子を組みこんだ機能性ゲルの作成が必要である。HEK293T細胞の細胞溶解液を用い、2次元電気泳動による細胞内タンパク質の分離条件の検討を行った。1次元目の電気泳動には、多くのタンパク質量を分離することができるアガーゲル(pH 3-10)を使用し、2次元目には10 %のSDS-PAGEを使用した。さらに、グラジエントゲルを用いることで、より幅広いタンパク質を分離することも可能である。また、タンパク質吸着素材として、ガラス繊維フィルターを使用した条件検討を行った。ガラス繊維フィルターには、シランカップリング剤を用いて疎水基(C4,C8,C18)を修飾し、機能化を行った。この時、シランカップリング剤濃度を0.110 %(90%エタノール中)と変化させ疎水基密度を変化させたが、いずれの濃度であってもタンパク質転写後のCBB染色に大きな差は見られなかった。これは、ガラス繊維フィルターが不透明であるため、フィルター表面へ非特異的に結合したタンパク質のみが検出されているためだと考えられる。今年度、使用したガラス繊維フィルターは、入手可能な市販品の中で最も薄いまたは表面が均一であるGEヘルスケアのGLASS MICROFIBER FILTERS 934-AHとGF/Aを使用したが、タンパク質量の状態を正確に知ることができないため、当初予定していたガラス繊維フィルターではこれ以上の条件検討は困難であり、実際の使用にも適さないと判断をした。そこで、透明性の高い機能性ゲル作成が必要である。近年、質量分析器の高性能化にともないタンパク質・ペプチドの網羅的解析が広く行われるようになってきており、様々な疾患のマーカータンパク質やタンパク質のリン酸化状態の定量が試みられている。質量分析器は、多くのタンパク質をノンバイアスに検出・同定することが可能である点で優れているが、その性質上、試料中に微量しか存在しないタンパク質の感度が悪いことが問題であり、その解決策が求められてきた。これまでは、微量のタンパク質の濃縮にはその抗体を用いるか、リン酸化などを指標にアフィニティー精製による濃縮を行ってきたが、狙ったタンパク質、特定の修飾されたものしか見えないという制約があり、質量分析のノンバイアス性を活かしきれていなかった。本研究ではタンパク質の吸着能の比較的低い濾紙に電気泳動によって分離させたタンパク質を転写させ、存在量の多いタンパク質のメンブレンへの吸着量を制限することで、タンパク質量の分布をある程度均一化することに成功した。しかし、吸着させたタンパク質は微量であるため、下流の酵素消化から質量分析に用いるためには効率の良い回収条件の選定が必要であることがわかった。そこで、はじめにタンパク質をトリプシンなどのエンドプロテアーゼを用いて、ペプチド断片にしてから静電相互作用を用いたイオン交換クロマトグラフィーによる分画と、C18による疎水性相互作用による分画を行うことで、タンパク質の多様性の向上と分画による標的タンパク質フラグメント(ペプチド)の純度を高め、微量タンパク質の高感度な質量分析を達成した。これを絶対定量法であるMS-QBiC法と組み合わせることで、1細胞内に数千分子しか存在しない転写因子の増減を定量的に検出することに成功した。(Proc Natl Acad Sci U S A. 2016Jun 14;113(24):E3461

-7)細胞の機能を調節している転写因子などの重要なタンパク質のおおくは、細胞内で微量にしか発現していないことが多く、これらを質量分析によって検出することは困難であった。そこで、無細胞翻訳系を用いた簡便な同位体標識標準ペプチドと、静電相互作用、疎水性相互作用を用いたクロマトグラフィーによる多次元の分離により、標的タンパク質フラグメントの純度を高めることで、微量タンパク質の高感度な絶対定量法であるMS-QBiC法を確立した。これにより1細胞内に数千分子しか存在しない概日時計の転写因子の増減を定量的に検出することに成功した。始めにC4, C8, C18などのタンパク質と相互作用できる機能性分子を組みこんだアクリルアミドゲル、またはアガロースゲルを作成する。この時、これら疎水基をもつ試薬は水溶性が低いため、通常のアクリルアミドゲルやアガロースゲル作成方法では相分離してしまい、均一に機能化することは困難であることが予想される。このため、エタノールなどの水溶性の有機溶媒を一定量含む状態でゲル化を行い、その後、任意の転写バッファーに置き換えることが必要だと考えられる。そこで、この機能性ゲルの作成条件の検討を行う。その後、ゲルの厚みでタンパク質の吸着量をコントロールし、量の多いタンパク質の一部のみがゲル内に保持される条件を探索する。これらの条件が整った後、2次元電気泳動による高分離した細胞内タンパク質を機能性ゲルでタンパク質量の多いものを少なくし、nanoLC/Orbitrap質量分析計を用いて、同定できるタンパク質数を比較する。この時、SILACシステムを利用し、一方のタンパク質にはC13、N15同位体アミノ酸(Lys,Arg)でラベル化を行った細胞溶解液を使用し、同時に測定することで、測定間の誤差を補正する。しかし、タンパク質量の補正を行っていない場合、多量のタンパク質(ペプチド)でイオンサプレッションによる目的ペプチドのイオン化阻害をする可能性があるため、混合比率の最適化なども行う。化学昨年度は、SILACシステムを利用した細胞培養を行わず、通常の培地で培養したHEK293T細胞を使用した実験にとどまっているためである。また、当初導入を予定していたラージゲル2次元電気泳動システムの導入を断念し、ミニゲルサイズの2次元電気泳動装置を導入した2点である。昨年度、実験を行えなかったSILACシステムを利用したHEK293T細胞を用い、同位体アミノ酸を取り込んだ細胞を作成する。また、タンパク質吸着用の機能性ゲルを作成し、ゲル内に取り込まれたタンパク質をイメージングするためのゲル撮影装置などの機器購入を行う。
Liquid biopsy及びDigitalPCRを用いた高感度胃癌診断法の開発

予後不良な胃癌に対して、リアルタイムに鋭敏に胃癌を検出できうる検査法が求められる。これまで申請者らは、糖鎖腫瘍抗原のSTn合成酵素であるST6GalNAc-Iが胃癌に高発現しその悪性化に関わることを報告してきた。そこで申請者らは、胃癌患者末梢血から抽出した核酸分画のST6GalNAc-ImRNAを高感度なdigital PCRを用い検出するLiquid Biopsyによりモニターし、そのコピー数と胃癌の治療経過が相関することを明らかにし胃癌に対する新たなbiomarkerの確立にむけての取り組みを進めている。胃癌治療は近年急速な進歩を遂げているが、依然としてその予後は不良であり、早期診断による根治的な治療、適切なタイミングでの抗癌剤の導入が予後の改善に重要となる。そのためには、癌細胞あるいはそれに由来する蛋白や核酸を高感度かつ迅速、簡便に測定できる方法により早期の段階での診断や治療経過のモニタリングができれば大変有用である。これまで、各種画像診断やCEAやCA19-9などの血清腫瘍マーカー、循環腫瘍細胞(CTC)の検出、末梢血遊離DNAやmiRNAの検出などが報告されているが、微小残存病変(MRD)の検出といった観点からは腫瘍特異性に乏しく、未だbiomarkerとして実用化されたものはない。これまで申請者らは、胃癌腫瘍マーカーとして汎用されているSTn糖鎖抗原のsynthaseであるST6GalNAc-Iが直接胃癌転移能亢進にも関与することを報告してきた。そこで、Liquid Biopsyとして末梢血から抽出した核酸分画のST6GalNAc-ImRNAもしくはこれを制御するmiRNAをdigital PCRにより極めて高感度に定量する新たな胃癌biomarkerを開発する。胃癌症例の末梢血収集を行い臨床検体の集積が順調に進められているため。そこで、Liquid Biopsyとして末梢血から抽出した核酸分画のST6GalNAc-ImRNAをdigital PCRにより極めて高感度に定量することで、より実効性のある胃癌患者の診断や治療効果の判定が可能となるかについて検討を進めており、少数の症例サンプルを用いた検討では腫瘍量をよく反映することが確認され期待のできる結果が得られている。そこで、今後症例数を増やし新たな胃癌biomarkerとしての有用性を検討していく予定である。新規胃癌患者、根治的切除術後患者による前向きの検証にて症例集積の開始がやや遅れている。このためには、リアルタイムに鋭敏に胃癌を検出できうる検査modalityの開発が求められる。これまで申請者らは、胃癌腫瘍マーカーとして汎用されているSTn糖鎖抗原のsynthaseであるST6GalNAc-Iが直接胃癌転移能亢進に関与することを報告し、癌の進行に深く関与することを明らかにして来た。そこで申請者らは、いわゆるliquid biopsyとして、胃癌患者の末梢血から抽出した核酸分画のST6GalNAc-ImRNAもしくはこれを制御するmiRNAをdigital PCR法を用いることで極めて高感度に定量することが可能かどうかを検討し、ST6GalNAc-Iを用いた新たな胃癌biomarkerの開発を計画した。平成27年度からpreliminaryな検討として末梢血ST6GalNAc-1mRNAの測定と解析を行った。具体的には、胃癌患者の血中ST6GalNAc-1mRNAを定量し診断能、治療効果、臨床病理学的因子、予後などとの相関性を検証したところ、そのコピー数と臨床的経過の相関が示唆された。さらに、ST6GalNAc-1の発現を制御するmiRNAについてmicroarrayによる同定を試み、その機能について検証を行なっている。最終年度からは、prospective studyとして胃癌症例の末梢血収集を行い、ST6GalNAc-1とmiRNAの臨床的有用性についての前向き試験を予定し胃癌に対する新たなbiomarkerの確立にむけての取り組みを進めている。

そこで申請者らは、胃癌患者末梢血から抽出した核酸分画のST6GalNAc-ImRNAを高感度なdigital PCRを用い検出するLiquid Biopsyによりモニターし、そのコピー数と胃癌の治療経過が相関することを明らかにし胃癌に対する新たなbiomarkerの確立にむけての取り組みを進めている。胃癌症例の末梢血収集を行い、ST6GalNAc-1とmiRNAの臨床的有用性についての検討を進めたい。新規胃癌患者、根治的切除術後患者において十分な検体の収集を行い胃癌の治療効果判定と予後に関する末梢血中ST6GalNAc-1mRNA/miRNAの血中バイオマーカーとしての臨床的有用性を検討したい。消化器病
真菌類由来アスコルビン酸類似体の動物における機能解明並びに生物学的利用

ビタミンC (アスコルビン酸、AA)は、抗酸化作用より食品の酸化防止剤、また多様な生理作用より食品、医薬品、化粧品として利用されている。ペニシリウム属が産生するAAの5位エピマーであるエリソルビン酸(EA)も食品の酸化防止剤としてよく利用されている。一方、真菌類の内キノコ類はAAより炭素数が1つ少ないエリスロアスコルビン酸と6-デオキAA、さらにそれらの配糖体を作ることが明らかとなっている。それぞれの化合物の生理作用と摂取量の相関を解析するためには、食品中含量を定量するHPLC分析系が必要であった。そこで、AA、AA-2-α-グルコシド(AA-2G)、AA-2-β-グルコシド、EAを用いて分離条件の検討を行った。これら化合物は高極性物質であるため同時分析は非常に困難であるが、ジオールカラムと溶離液としてアセトニトリルー66.7 mM酢酸アンモニウム(85:15, v/v)を用いることで食品中に存在するこれら化合物を定量分析することに成功した。これまでプロビタミンC剤は、代謝後のAAとしての作用を期待されてきたためか、それ自身の作用についてほとんど研究されていなかった。我々はAA-2Gを含む2-O-置換型AA誘導体自身がフリーラジカル誘導性赤血球溶血反応を阻害することを見いだした。その保護作用は、AAと同等もしくはそれ以上であった。しかし、電子スピン共鳴装置を用いてラジカルとの反応性を直接検討した結果、飴誘導体の反応性はAAと比較して極めて弱いものであった。反応速度は遅いが、AAと異なったラジカル捕捉メカニズムで量論的に多くのラジカルを捕捉できることがこれら誘導体の強い溶血抑制活性の原因ではないかと考えている。アスコルビン酸(AA)は、壊血病を治療するビタミンとして良く知られており、この効果はコラーゲン合成の促進によるものと言われている。イソアスコルビン酸(IA)は、ペニシリウム属においてグルコースから生合成されるAAの5位エピマーであり、抗酸化剤として食品添加物として一般に用いられている。しかし、IAの抗壊血病効果は、AAの1/20程度である。また、初代トリ腱細胞においてプロコラーゲン合成促進作用が1/5から1/3程度とAAより低く、細胞内への取り込みもAAの1/5程度であり、さらに培地中での分解速度がAAに比べ速いと言われている。一方、コラーゲン合成のキーエンザイムであるプロリン4-ハイドロキシラーゼには、AAに特異的な結合部位があり、IAもこの酵素に対してAAと同程度に結合する報告がある。これらの報告から、IAのin vivoとin vitroにおける低い生物活性は、プロリン水酸化反応における立体特異性が原因ではなく、細胞へ到達するまでの輸送ステップにおける立体特異性とIAの不安定さが原因であると考えられる。そこで、IAの安定性の向上のために2位のグルコシル化を、非特異的な細胞内への取り込みが可能となるように6位のアシル化を行った。得られた新規親油性安定型IA誘導体とそれに対応するAA誘導体を用いてヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン合成促進作用を検討した。IAは、AAに比べコラーゲン合成促進作用が低いのに対し、IA誘導体とAA誘導体は、全く同じ活性を示した。また、それら誘導体はAAよりも低濃度でコラーゲン合成促進作用を示した。イソアスコルビン酸(IA)は、ペニシリウム属においてグルコースから生合成されるAAの5位エピマーであり、抗酸化剤として食品添加物に用いられている。昨年度の研究でIAの2位をグルコシル化し、6位をアシル化した新規親油性安定型IA誘導体が、ヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン合成促進作用をAAよりも低濃度で示すことが明らかとなった。親油性安定型IA誘導体は、細胞において代謝を受けるとアシル化IA、グルコシル化IA、IAとなるはずである。親油性安定型IA誘導体のコラーゲン合成促進作用発揮には細胞内でどのような代謝物となる必要があるのか明らかにするため、細胞内代謝物の同定が必要である。親油性安定型IA誘導体は非常に貴重であるので、量も多く性質の類似した親油性安定型AA誘導体とその代謝物をモデルとしてHPLC分析系の確立を行った。このような脂溶性から高極性物質の同時分析は非常に困難であるが、シアノプロピルカラムと溶離液として20mg/LのDTTを含むMeOH-リン酸バッファー(pH2.1)(65:35,v/v)を用いることですべての化合物を一斉分析することに成功した。コラーゲン合成促進作用の他にAAの作用として抗酸化作用が非常に有名である。そこで、AA類似体の抗酸化作用評価をするにあたり各種モデルラジカルとAA誘導体を用いて評価条件の検討を行った。その過程でAA誘導体がAAとは異なる反応機構で持続的で穏やかなラジカル捕捉反応をすることを見いだした。

一方、真菌類の内キノコ類はAAより炭素数が1つ少ないエリスロアスコルビン酸と6-デオキAA、さらにそれらの配糖体を作ることが明らかとなっている。それぞれの化合物の生理作用と摂取量の相関を解析するためには、食品中含量を定量するHPLC分析系が必要であった。そこで、AA、AA-2-α-グルコシド(AA-2G)、AA-2-β-グルコシド、EAを用いて分離条件の検討を行った。これら化合物は高極性物質であるため同時分析は非常に困難であるが、ジオールカラムと溶離液としてアセトニトリルー66.7 mM酢酸アンモニウム(85:15, v/v)を用いることで食品中に存在するこれら化合物を定量分析することに成功した。これまでプロビタミンC剤は、代謝後のAAとしての作用を期待されてきたためか、それ自身の作用についてほとんど研究されていなかった。我々はAA-2Gを含む2-O-置換型AA誘導体自身がフリーラジカル誘導性赤血球溶血反応を阻害することを見いだした。その保護作用は、AAと同等もしくはそれ以上であった。しかし、電子スピン共鳴装置を用いてラジカルとの反応性を直接検討した結果、飴誘導体の反応性はAAと比較して極めて弱いものであった。反応速度は遅いが、AAと異なったラジカル捕捉メカニズムで量論的に多くのラジカルを捕捉できることがこれら誘導体の強い溶血抑制活性の原因ではないかと考えている。
腫瘍抗原遺伝子・サイトカイン遺伝子導入樹状細胞を用いた癌ワクチン療法の基礎研究

(平成15年度)1.アデノウイルスベクターの作製.CEA発現ベクター(AxCACEA)をCOS-TPC法にて作製し,マウスDCへ感染させ,導入効率を検討した.またGMCSF発現ベクター(AxCAGM-CSF),IL-12発現ベクター(AxCAIL-12)を調整した.2.CEA transenic miceの調整. CEA transgenic miceの繁殖を行い,産駒DNAよりCEA発現を確認.(平成17年度)1.CEA transgenic miceにおける抗腫瘍効果と免疫組織染. MC38-CEA(5×10^6個)をマウスの背部皮下に移植し,14日後に次の3つの治療法を行い,7日目に儀死後皮下腫瘍を取り出し,一部をホルマリン固定後HE染色し,組織の病理学的診断をした.さらに一部の腫瘍組織は凍結切片にし,CEA,CD4,CD8,NKの蛍光免疫染色を行い腫瘍組織中の細胞表面マーカーを確認した.DC-AxCACEA/GM-CSF/IL-12接種群はコントロール群と比較して著明な腫瘍縮小を認め,さらに治療グループは腫瘍組織のHE染色にて著明なリンパ球浸潤や腫瘍壊死像を認めた.またこの腫瘍組織は蛍光免疫染色にてCD8細胞NK細胞の浸潤を認めた. 2.CEA transgenic miceにおけるDCワクチン後の副作用に関する検討.治療群の血漕AST ALTCrはコントロール群と差を認めず,また自己免疫応答は認めなかった.現在上記内容の諭文を投稿中である.(平成15年度)1.アデノウイルスベクターの作製.CEA発現ベクター(AxCACEA)をCOS-TPC法にて作製し,マウスDCへ感染させ,導入効率を検討した.またGMCSF発現ベクター(AxCAGM-CSF),IL-12発現ベクター(AxCAIL-12)を調整した.2.CEA transenic miceの調整. CEA transgenic miceの繁殖を行い,産駒DNAよりCEA発現を確認.(平成17年度)1.CEA transgenic miceにおける抗腫瘍効果と免疫組織染. MC38-CEA(5×10^6個)をマウスの背部皮下に移植し,14日後に次の3つの治療法を行い,7日目に儀死後皮下腫瘍を取り出し,一部をホルマリン固定後HE染色し,組織の病理学的診断をした.さらに一部の腫瘍組織は凍結切片にし,CEA,CD4,CD8,NKの蛍光免疫染色を行い腫瘍組織中の細胞表面マーカーを確認した.DC-AxCACEA/GM-CSF/IL-12接種群はコントロール群と比較して著明な腫瘍縮小を認め,さらに治療グループは腫瘍組織のHE染色にて著明なリンパ球浸潤や腫瘍壊死像を認めた.またこの腫瘍組織は蛍光免疫染色にてCD8細胞NK細胞の浸潤を認めた. 2.CEA transgenic miceにおけるDCワクチン後の副作用に関する検討.治療群の血漕AST ALTCrはコントロール群と差を認めず,また自己免疫応答は認めなかった.現在上記内容の諭文を投稿中である.本年度はCEAcDNAをcarryするplasmid pL107.1よりCOS-TPC法にてヒトCEA発現adenovirus vector AxCACEAを作製した.マウスGM-CSF発現Ad vector AxCAGM-CSFとマウスIL-12発現Ad vector AxCAIL-12を増殖再調整した.これらを用いてマウス樹状細胞(DC)に関する基礎研究を行った.CEAtransgenic mouse C57BL/6(TgCEA)の大腿骨,脛骨より骨髄細胞を採取しDCを誘導し,DCの細胞表面マーカーをflow cytometryにて確認した.またTgCEAの各臓器別のCEA発現をRT-PCRにて確認した.続いて,誘導したDCにAxCACEA,AxCAGM-CSF,AxCAIL-12を遠心法にて感染させ,導入効率を確認した.またマウスDCのLPSによる成熟度とAd vector感染によるDCの機能解析を行った.TgCEAは大腸にのみCEAmRNA発現がみられ,小腸,肝,脳等の臓器には発現していなかった.DCの細胞表面抗原をFACSにて検討すると,CD11c(+),CD40(-),CD80(+),CD86(-),MHCclassI(+),MHCclassII(+)と未熟樹状細胞が誘導された.CEAのDCへの導入効率はFACSにて100MOIで十分でありoptimum doseとした.GM-CSFおよびIL-12はELISAにてMOI依存性に導入効率が上昇した.LPSにて未熟DCは成熟化し,それはAd-vector感染で増強されることがIFN-γとIL-12のELISAから考えられた.またFACSにてAd vector感染後にDCのCD40やCD80,CD86の発現増強が認められやはり成熟化が考えられた.現在CEA遺伝子+サイトカイン遺伝子導入DCを用いたCEA特異的CTLを誘導中である.本年度後半はCEA遺伝子導入ヒト末梢血由来DC用いたin vitroでのCEA特異的CTLの誘導実験を行った.CEA感染DCをstimulator,自己PBMCをresponderとして刺激し,3回刺激にてCTLを誘導.自己LCLにAxCACEAを感染させたLCL-CEA, LCL-LacZをTargetにした^<51>Cr-release-assayにて細胞傷害活性を検討した.DC-AxCACEAはLCL-CEAを強く傷害するのに対し,LCL-LacZを認識せずCEA特異的なCTLが誘導された.

またこのCTLはHLAA24陽性癌細胞株のうちCEA産生株のみを選択的に傷害し,CEA特異性はヒト癌細胞株でも証明された.現在はヒトGM-CSF遺伝子発現アデノウイルスベクターを作製中であり,来年度はCEA遺伝子GM-CSF遺伝子同時導入による抗腫瘍効果の増強効果を検討する予定である.本年度前半は昨年度に検討を行ったCEA transgenic miceを用いた抗腫瘍効果について,皮下腫瘍を用いた免疫組織化学染色や,その他詳細な副作用の検討を行った.本年度後半は昨年度施行したCEA遺伝子導入ヒト末梢血由来DCを用いたin vitroでの検討をさらに発展させるべくヒトGM-CSF遺伝子発現アデノウイルスベクターを作製しCEA遺伝子GM-CSF遺伝子同時導入による抗腫瘍効果の増強効果を検討した.CEA遺伝子単独導入DC群と比較してCEA GM-CSF遺伝子同時導入DC群は強い細胞傷害活性を示すCTLが誘導された.
独自なFISH法によるヒト癌発生母地のテロメア機能不全と染色体の不安定化の証明

癌の発生母地のテロメア機能不全とアルコール多飲がテロメアを短縮することを証明した。Werner症候群患者の表皮における加速したテロメア短縮を初めて証明した.ヒト下垂体テロメアの年間短縮率を報告した癌の発生母地のテロメア機能不全とアルコール多飲がテロメアを短縮することを証明した。Werner症候群患者の表皮における加速したテロメア短縮を初めて証明した.ヒト下垂体テロメアの年間短縮率を報告した「癌の発生母地のテロメアは非担癌正常組織より短い」という仮説を多臓器・組織で証明し、さらに、癌の発生母地におけるテロメア短縮(テロメア機能不全を惹起)による染色体の不安定性(発癌の入り口)の存在を証明するために組織FISH法によるテロメア長解析、サザンブロット法によるテロメア長測定、Q-FISH法による分裂中期細胞のテロメア長測定を行ないました。平成21年度は、FISH法によるテロメア長解析において標準化のために用いるTIG-1培養線維芽細胞のセルブロックを作製しました。(a)Barrett食道粘膜(b)食道粘膜(c)胃粘膜(d)皮膚(e)早老症組織(f)肝臓(g)副甲状腺(h)甲状腺(i)大腸の対象となる病変組織を収集、また対照群となる正常組織を収集し、FISH法によるテロメア解析を開始しています。従来通りのサザンブロット法によるテロメア長の測定も行なっています。また、食道上皮についてはQ-FISH法による分裂中期細胞のテロメア長測定および染色体の不安定性指標の検討も行ないました。以上の結果、Barrett食道と食道扁平上皮についてはテロメア解析および染色体不安定性の検討が終了し、癌の発生母地のテロメアは非担癌正常組織より短いという仮説と、癌の発生母地におけるテロメア短縮による染色体不安定性を証明しました。食道上皮については英文論文を投稿し、採択となりました(研究発表の項を参照下さい)。皮膚、副甲状腺、大腸についても、検討が進行しています。これらの結果の一部については日本病理学会、日本癌学会において発表し食道については英語論文の発表を行ないました。ヒト癌の発生母地のテロメア短縮に基づくテロメア機能不全と染色体の不安定化を証明するために、以下の研究を行い論文発表を行った。1.癌の発生母地のテロメア機能不全を証明した。2.線維芽細胞の老化と染色体異常の解明した。線維芽細胞(TIG-7細胞系)を細胞老化まで培養しテロメア長と染色体異常との関係を明らかにした(カナダBCがんセンター、癌研癌ゲノム解析センター、鳥取大医学部生命工学科との共同研究)。本研究所で作られたヒトの線維芽細胞7株を細胞分裂が停止するまで培養し、テロメア長を経時的に染色体別に計測した。測定には定量的蛍光インサイチューハイブリダイゼイション法を用いた。分裂が止まる直前に出現した癒合した染色体(染色体不安定性の指標)のテロメアは有意に短縮していた。また、染色体不分離像である細胞分裂の後期-終期ブリッジの頻度はテロメア短縮と相関し、特に架橋中にテロメアが過度に短縮した染色体があることを証明した。染色体の癒合は、テロメアの短い染色体から始まり分裂後の娘細胞の不分離の原因となることがわかった(Takubo et al.Mech Age Dev 2010)。3.その他下記の臓器で研究が進行中である。肺癌(粘膜内扁平上皮癌)、膀胱癌細胞の異型度(G1、G2、G3、10例程度)、早老症(ワーナー症候群、18・21トリソミー、各10例)、皮膚の日光被曝部、口腔内前癌病変、副甲状腺など多数。ヒト癌の発生母地のテロメア短縮に基づくテロメア機能不全と染色体の不安定性を証明するために、以下の研究を行い、論文発表を行った。1.癌の発生母地のテロメア機能不全とアルコール多飲がテロメアを短縮することを証明した。アルコール症患者は食道、口腔の扁平上皮癌の頻度は対照より4-10倍の頻度である。アルコール症患者の食道上皮のテロメアは短く染色体の不安定性のあることを証明し、アルコール多飲がテロメアの短縮因子であり、癌の発生に役割を果たしていることを報告した(Aida J et al.J Pathol 2011)(カナダBCがんセンター、癌研癌ゲノム解析センター、鳥取大医学部生命工学科との共同研究)。4.その他下記の臓器でテロメア研究が進行中である。肺癌(粘膜内扁平上皮癌)、食道癌とアルコール、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の有無(英文校正中)、膀胱癌細胞の異型度別(G1、G2、G3、10例程度)、早老症(18・21トリソミー、各10例、投稿中)、皮膚腫瘍の有無と日光被曝部の皮膚、口腔内前癌病変(leukoplakia、論文採択済み)、肝移植組織片(論文採択済みと投稿中各1報)。副甲状腺主細胞と好酸性細胞(投稿中)、膵(外分泌、導管、内分泌、線維芽細胞など)など多数。(文字数677文字)