hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖鎖抗体遺伝子導入による自己免疫性神経疾患モデルマウスの作製

常法に従って、H鎖(IgG2a)とL鎖の遺伝子をマウス受精卵に注入しトランスジェニックマウスの作製を試みている。IgM型抗体は胎盤を通過しないが、IgG型は通過するので、個体形成への関与も考えられ、今後詳細な検討を加える予定である。糖鎖抗体遺伝子導入によるトランスジェニックマウスの作製に成功した。最初に、すべてのb系列ガングリオシド(GD3,GD2,GD1b,GT1b,GQ1b)と強く反応するが、その他の糖脂質(a系列やアシアロ系列など)とは反応しない抗体(43-20,lgM)を産生するハイブリドーマ株由来のmRNAよりRT-PCR法を用いて目的とするVH鎖とVL鎖のcDNAをクローニングした。このcDNAの情報を基にゲノム遺伝子の単離を行い、Fc部分の膜貫通ドメインを持つもの(Fu11 type)と持たないもの(Secretion type)の遺伝子組み換え体を作製した。これら抗体遺伝子を×63(lg非産生B細胞株)に導入して、抗体産生をELISAにて確認後、常法にしたがってトランスジェニックマウスを作製した。現在までに、樹立されたFounderの数は、Fu11 typeで7匹、Secretion typeで12匹である。Founderは全て外見的に病的所見が認められなかった。またFounderのGD3に対する血中抗体価はいずれも、GD3を免疫して得られた抗体価と同程度に高いタイターが認められた。F1は現在まで303匹生まれ、その内の53匹が遺伝子発現、抗体価共に陽性であった。次に、顕著な病的所見が認められなかった上記トランスジェニックマウスに対して炎症惹起薬剤投与による神経症状の誘発を試みた。これらトランスジェニックマウスおよび正常対照マウスに対しSalmone11a minnesota由来LPSを経口投与し、末梢神経症状の観察と血中のGD3に対する抗体価のモニタリングをおこなった。両群とも約2ケ月経過した現在に至るまで末梢神経障害症状などは観察されていない。また、GD3に対する抗体価の更なる上昇も認められでいない。昨年度までにb系列ガングリオシド(GD3,GD2,GD1b,GTlb,GQlb)と強く反応するが、その他の糖脂質(a系列やアシアロ系列等)とは全く反応しない抗体(#43-20,IgM)の遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作製した。生後ほぼ2年経過しているが、現在までのところ、顕著な神経症状は認められていない。ギラン・バレーやフィッシャー症候群の発症には病原体(C.jejuniやマイコプラズマなど)の先行感染がみられることが多く、その発症機序として感染後の炎症作用が重要な因子となる可能性が想定されている。そこで、顕著な病的所見が認められなかった上記トランスジェニックマウスに対してフィッシャー症候群患者より分離されたC.jejuni由来リポ多糖投与による神経症状の誘発を試みたが、末梢神経障害症状の惹起は観察されなかった。現在、炎症惹起薬物(種々のサイトカインなど)の投与による神経症状誘発の可能性を検討している。本年度は、上記IgM型に加えて、IgG型抗ジシアロガングリオシド抗体産生トランスジェニックマウスの作製を行った。方法は、#43-20のH鎖の定常部遺伝子を膜貫通ドメインをのぞいたG定常部遺伝子に置換した組み換えH鎖(IgG)遺伝子を構築した。
不妊疾患関連遺伝子プロタミン2変異マウスの作製と解析

不妊疾患関連遺伝子プロタミン2変異マウスの作製と解析ヒト雄性不妊において発現異常が多く見受けられる精細胞特異的発現タンパク質プロタミンに着眼し、マウスES細胞をもちいた遺伝子破壊法によってプロタミン2欠損マウスを作製してその解析を目的とした。プロタミン1欠損マウスでの解析により、プロタミン2欠損マウスにおいてもキメラマウスおよびヘテロマウスにおいて雄性不妊であることが予想された。その為Y染色体を脱落したES細胞でのジーンターゲティングをおこなうことで変異マウスを得て、生殖不全変異マウスの系統化を試みた不妊疾患関連遺伝子プロタミン2変異マウスの作製と解析ヒト雄性不妊において発現異常が多く見受けられる精細胞特異的発現タンパク質プロタミンに着眼し、マウスES細胞をもちいた遺伝子破壊法によってプロタミン2欠損マウスを作製してその解析を目的とした。その為Y染色体を脱落したES細胞でのジーンターゲティングをおこなうことで変異マウスを得て、生殖不全変異マウスの系統化を試みたヒトの不妊の原因は多岐にわたり、そのうち男性不妊の頻度は約半数とされているが、子孫を得られない特性から、その遺伝的要因については未だに不明な点が多い。また子孫が得られない為実験動物においても変異体が得られなかったり、維持できない為に解析が困難である。その様な中で精細胞に特異的に発現する極めて特徴的なDNA結合タンパク質であるプロタミン類の発現低下が不妊に関係しているという知見がヒト症例において数多く報告されている。そこでその1つであるProtamine2(Prm2)遺伝子を、ES細胞を用いた遺伝子相同組換え技術により破壊したノックアウトマウスを作製し解析をおこなう事を目的とする。プロタミン遺伝子群はPrm1、Prm2、Prm3、Tnp2から成るクラスターを成している。このgenome領域は精巣では非常に活発に発現しているが、それ以外の組織やES細胞内では不活化されているために相同組換えが極めて生じにくいと予想される。さらにPrm2遺伝子は2ニクソンから構成されるが、合計723bpと非常に短いため相同組換えに必要な特異的な配列が少ない事も相同組換え頻度低下の一因になると思われる。さらにハプロ不全の表現型を示す事から雄キメラマウスで不妊となる事が予想される。この様な状況を加味し、相同領域を約8kb程度に設定し、かつPCRスクリーニングを前提としたターゲティングベクターを構築し、ES細胞への導入をおこなった。ヒトの不妊の原因は多岐にわたり、そのうち男性不妊の頻度は約半数とされているが、子孫を得られない特性から、その遺伝的要因については未だに不明な点が多い。そこでその1つであるProtamine2 (Prm2)遺伝子を、ES細胞を用いた遺伝子相同組換え技術により破壊したノックアウトマウスを作製し解析をおこなう事を目的とする。さらにPrm2遺伝子は2エクソンから構成されるが、合計723bpと非常に短いため相同組換えに必要な特異的な配列が少ない事も相同組換え頻度低下の一因になると思われる。ヒトでの不妊疾患の原因は多岐に渡り、最近の研究によって加齢及び環境要因については多くの知見が得られている。しかし実験動物を用いた研究においても子孫が得られにくい特性により変異体を樹立が困難である事などから遺伝的要因については未だ不明な点が多い。この様な状況の中で不妊原因の半数を占めるとされる男性側の要因については、精細胞に特異的に発現する極めて特徴的なDNA結合タンパク質であるプロタミン類の発現低下が関係しているという知見がヒト症例において数多く報告されている。そこでその1つであるProtamine2(Prm2)遺伝子を、ES細胞を用いた遺伝子相同組換え技術により破壊したノックアウトマウスを作製し解析をおこなう事を目的とした。プロタミン遺伝子群はヒトおよびマウスではPrm1、Prm2、Prm3、Tnp2から成るクラスターを成すとされている。既に作製したPrm1 KOマウスではハプロ不全による雄性不妊が認められ、その解析からPrm1がPrm2と協調して機能していると考えられる。

Prm2 KOマウスは、Prm1 KOマウスと同様に、雄性不妊となる事が予想される為雌型ES細胞へのTargetingをおこない相同組換え体を得る事や、またES細胞における相同組換え頻度が極めて低い事が予想されるため、相同組換え頻度を高くする為のVectorコンストラクション作製の工夫をおこなった。当初作製したベクターで相同組換え体が得られないことから、ベクターの再構築をおこなっているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。再構築したベクターで相同組換え体の単離作製を試みる。その後キメラマウスを作出して、系統化をおこなう。雌で系統を維持し、不妊と期待される雄で解析をおこなう。
尿細管―podocyte細胞連関とその糖尿病性腎症および肥満腎症における意義

尿細管ーpodocyte細胞連関の詳細を解明した。その結果db/dbマウスと近位尿細管特異的Sirt1欠損マウスの交配においてもアルブミン尿の発症は抑制され、この仲介物質としてのNMNが尿細管から糸球体へと伝達されることを証明した。また近位尿細管Sirt1はボーマン嚢壁側上皮の分化に関わること、iNAMPTの発現を介し、線維化に関わることを証明した。つぎに近位尿細管特異的dnRhoA過剰発現マウスは高脂肪食により引き起こされる腎組織のRhoキナーゼの活性化が抑制され、尿蛋白、アルブミン尿の正常化、尿細管障害のマーカーの正常化、細胞周期因子p27の発現調節を介する尿細管細胞増殖抑制が認められた。近位尿細管特異的Sirt1欠損マウス、インスリン受容体(IR)欠損マウス、dnRhoA過剰発現マウス用いた糖尿病性腎症、肥満腎症発症のメカニズムの解明を開始した。まず近位尿細管特異的Sirt1-CKOとdb/dbマウスとの交配により肥満型糖尿病による尿蛋白排泄、HFD負荷による尿蛋白排泄の増悪の有無を検証した。その結果肥満型の糖尿病においてもアルブミン尿の発症は抑制され、podocyteの足突起のeffacementは正常化していた。つぎにこの「尿細管-podocyte細胞連関」仲介物質としてのNMNの腎内動態を光学的手法を用いて検証した。ATP・GTP等のヌクレオチドの体内動態観察に使用される蛍光物質Mant-NMN合成を腎動脈からの投与を行いその腎臓内での検出部位の時間経過を追った。その結果より近位尿細管からpodocyteへのNMNの移行を証明された。Rho/Rhoキナーゼ経路の尿細管における意義の検討も行った。この経路の近尿細管における意義を明らかにする目的で申請者はすでに近尿細管特異的プロモーターであるNa/Pi Cotransporterのプロモーターの下流にヒトdominant-negative RhoA遺伝子を接続した遺伝子をマウスに導入した近位尿細管特異的dnRhoA過剰発現マウスを作成している。このマウスは高脂肪食により引き起こされる腎組織のRhoキナーゼの活性化が抑制されるか、糸球体病変が近位尿細管の遺伝子改変で改善するか否かを検証した結果、肥満により生じた尿細管におけるRhoキナーゼの活性が近位尿細管特異的dnRhoA過剰発現マウスでは抑制されていた。そのマウスは腎臓のサイズ、生化学データにおける糖代謝の異常に関しては改善は認められず、尿蛋白、アルブミン尿の正常化は認められなかったものの、尿細管障害のマーカーが正常化していることが明らかとなった。近位尿細管特異的Sirt1遺伝子改変マウスでの研究においては「尿細管-podocyte細胞連関」の液性メヂィエイターNMNをconditioned Mediumの実験より解明したMNMの重要性を明らかにするために、NMNの合成酵素であるiNAMPTの重要性に注目した。iNAMPTの尿細管特異的欠損マウスには血管周囲の線維化が著明であった。これがポドサイトの機能を介する作用かを現在検討中である。さらにiNAMPTの発現調節に関する検討を行いTGFbの重要性が明らかとなった。腎尿細管RhoAの機能解析を行った。近位尿細管dominat negativeRhoA過剰発現マウスの表現型の解析を行った。まず肥満においては近位尿細管のRhoAの活性化が認められた。これが肥満、早期糖尿病性腎症における腎障害に関与するか検討した。このdominant negative RhoA過剰発現マウスでは尿細管の細胞浸潤、尿細管肥大、腎臓におけるサイトカイン発現の低下が認められ、尿細管マーカーの尿中排泄が低下した。これは肥満、糖尿病性腎症早期では尿細管のRhoAの活性化がその病態の初期の進行に寄与していることが明らかとなった。尿細管ーpodocyte連関をもとにした糖尿病性腎症、肥満関連腎症の早期診断法の確立についたは現在この臨床研究プロトコールを作成中である。糖尿病の早期の患者や肥満が主体の腎不全患者に関しその早期病態の変化を検出する目的の生検をする予定である。近年糖尿病性腎症の病期分類が提唱され今後腎生検の需要が増加する可能性がある。腎性インスリン抵抗性症候群の解析については、脂肪萎縮の存在を明らかとし、CKDでは脂肪組織における尿毒素の蓄積が早期よりおこりその結果脂肪組織の萎縮が生じリポディストロフィー様の病態を呈していることを明らかにした。肥満関連腎症及び糖尿病性腎症の発症時期は従来よりアルブミン尿がその目安となっていたが、これらの疾患は代謝異常が基盤病態にある故代謝の活発な尿細管の病態が発症にかかわると考えた。高脂肪食マウス、STZ誘発糖尿病マウス、db/dbマウスの血糖上昇から、アルブミン尿出現までに生じる尿細管における異常として、Sirt1の発現低下、Rho/Rhoキナーゼ経路の活性化、尿細管虚血に伴うPHD2の活性低下、SGLT2の活性上昇、尿細管細胞の肥大、ミトコンドリアの機能低下などが生じることを明らかにした。それぞれの病態を近位尿細管特異的遺伝子改変マウスにより抑制させるとアルブミン尿の発症が抑制された。

その結果db/dbマウスと近位尿細管特異的Sirt1欠損マウスの交配においてもアルブミン尿の発症は抑制され、この仲介物質としてのNMNが尿細管から糸球体へと伝達されることを証明した。また近位尿細管Sirt1はボーマン嚢壁側上皮の分化に関わること、iNAMPTの発現を介し、線維化に関わることを証明した。つぎに近位尿細管特異的dnRhoA過剰発現マウスは高脂肪食により引き起こされる腎組織のRhoキナーゼの活性化が抑制され、尿蛋白、アルブミン尿の正常化、尿細管障害のマーカーの正常化、細胞周期因子p27の発現調節を介する尿細管細胞増殖抑制が認められた。臨床研究は倫理審査に時間がかかっている。27年度が最終年度であるため、記入しない。腎臓病学、内分泌代謝病学近位尿細管特異的インスリン受容体欠損マウスの検討を行う。近位尿細管特異的IR欠損CKOにおいて高脂肪食、db/dbマウスとの交配を行い肥満、インスリン抵抗性に伴う腎障害マウスモデルにおいてその腎症進行に対する影響、尿蛋白排泄に対する影響、podocyte障害の有無を明らかとする。また近尿細管細胞、podocytesにおける遺伝子発現をLaser microdissection法で検討し、近位尿細管特異的IR欠損マウスのpodocytes、近尿細管細胞において変化する遺伝子群をmicroarrayで探索し、蛋白尿出現に影響する遺伝子を明らかにする。倫理審査を通過後速やかに臨床試験の遂行を早める。Sirt1/NMN経路の臨床応用として腎生検検体で証明するとともに、DN患者の尿中claudin-1およびNMNの測定を糖尿病性腎症の重症度の診断マーカーとして臨床応用させたい。倫理審査委員会における承認・患者への説明及び文書による同意を得て、既に8検体の糖尿病性腎症の予備検討を開始している。Sirt1、Claudin-1抗体によるヒト検体における免疫染色のプロトコールを確立し、施行する。染色陽性部位をImage-Pro Plus 3.0で定量し、臨床学的パラメータ(eGFR,S-Cr,HbA1c,蛋白尿等)との相関を統計学的に解析する。このような検討をIR、Rho/Rhoキナーゼ経路に関連する代謝産物に関しても検討する。近尿細管細胞におけるNMNの分泌、吸収についてレセプターを介す機序かどうかを明らかにする予定であり、具体的にはMant-NMNを用い、近位尿細管細胞からのexocytosis等の放出機序やendocytosis、P2X・P2Yヌクレオチド受容体を介する細胞内取り込みなどpodocyteへの取り込み機序の詳細を明らかにする予定であったが、in vivoの解析が主に行ってきたため、まだ結果は明らかとなっていない。また尿細管インスリンレセプターのCKD発症進展における意義についての検討が不十分である。すなわち我々は既に近位尿細管特異的Creマウス(NDRG-Creマウス、京都大学柳田素子教授より供与)とIR flox/flox(insulin receptor、Harvard大学Ronald Kahn教授より供与)との交配により近位尿細管特異的IR欠損マウスの作成に成功している。このマウスを用い、腎臓における近位尿細管のインスリン抵抗性の意義について明らかにする予定である。すなわち作成されている近位尿細管特異的IR欠損CKOにおいて高脂肪食、
部位選択的ＤＮＡ脱メチル化誘導による新規細胞機能改変法の検討

ヒドロキシメチルシトシン(hmC)は、DNAを構成するシトシン修飾の一つであり、近年DNAの脱メチル修飾の過程で重要な働きをしていると考えられている。そこでメチル化シトシンヒドロキシラーゼTET1をHEK293T細胞に過剰発現させ、液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計でヒドロキシメチル化デオキシシチジン量の増大を確認した。さらに、独自に開発したMoCEV法を用いて観察した結果、HEK293T細胞内に導入したhmCは細胞増殖を経ると、CpGの部位でメチルシトシンへと変化することを明らかにした。これらの結果は、TET1を活用した部位特異的DNA脱メチル化誘導を考える上で重要な知見となった。本研究は、細胞機能を改変する新規の方法を開発する為に、部位選択的DNA脱メチル化の誘導を行う事を目的にしている。昨年度に引き続き、本研究ではメチル化シトシンヒドロキシラーゼであるヒトTET1遺伝子に着目した。本年度において、pFN21A HaloTag Flexiベクターに組み込んだ全長ヒトTET1遺伝子を準備し、培養細胞である293T細胞を用いて導入を試みた。さらに遺伝子導入の効率を高めることの必要性から、高効率で低細胞毒性であると言われているクロンテック社のXfectトランスフェクション試薬の可能性についても検討した。一方、本研究課題において哺乳動物細胞発現用エピソーマルベクターを改変した解析手法MoCEV (modified cytosine in episomal vector)法を開発した。この方法は、任意の領域のシトシン修飾が近傍の遺伝子発現へ与える影響やTET1活性による脱メチル化機構を検証出来る新規の実験手法であると考えられる。研究代表者は、任意の配列上の全シトシンをPCR増幅時にヒドロキシメチルシトシンに置き換えた後、MoCEV法を用いて細胞内でのシトシンの修飾の変化を観察した。その結果、DNAの複製に伴ってnon-CpG部位のシトシンは修飾を持たないシトシンに、CpG部位のシトシンはメチルシトシンに変化することを明らかにした。この観察結果は、哺乳動物細胞におけるDNA脱メチル化がヒドロキシメチルシトシンを経たpassive demethylationであるという説明に疑問を呈する結果であった。この研究成果を筆頭著者の論文にまとめ、英文国際誌にて発表したところ、広く生命科学者から反響があり、現段階でNature Reviews Molecular Cell Biology誌やPLOS Genetics誌などの掲載論文に引用された。本研究の目的は、部位選択的DNA脱メチル化誘導による新規の細胞機能改変法の開発である。そこで、まず本研究で着目しているメチル化シトシンヒドロキシラーゼであるヒトTET1遺伝子の活性領域をクローニングし、培養細胞である293T細胞を用いて、その発現を試みた。その結果、293T細胞内でヒドロキシメチルシトシン量の増大が観察された。さらに、イルミナ社のInfiniumメチル化アッセイを行った結果、293T細胞内でメチル化されていたシトシンのうち、脱メチル化が誘導されている塩基を観察出来た。一方、研究代表者は、任意の領域のシトシン修飾が近傍の遺伝子発現へ与える影響やTET1活性による脱メチル化機構を検証出来る新規の実験手法が必要であると考え、哺乳動物細胞発現用エピソーマルベクターを用いた解析手法MoCEV (modified cytosine in episomal vector)法を開発した。強い発現誘導能を持つCAGプロモーターのCpG部位に酵素的にメチル化修飾を加え、哺乳動物細胞発現ベクターをin vitroで再構築し、293T細胞への導入実験を行った。その結果、細胞増殖を経てもシトシンのメチル化修飾が維持され、下流のレポーター遺伝子の発現が抑制されることが観察された。さらに、CAGプロモーターの全シトシンをヒドロキシメチルシトシンに置き換えた後、MoCEV法で293T細胞へ導入したところ、DNAの複製に伴ってnon-CpG部位のシトシンは修飾を持たないシトシンに、CpG部位のシトシンはメチルシトシンに変化することが明らかになった。この結果は、TET1の活性によって誘導されるヒドロキシメチルシトシンを経由した脱メチル化機構を考える上で重要な知見である。研究代表者は、これらの研究成果を筆頭著者の論文にまとめ、国際誌にて発表し、さらに国内学会および国際学会において報告した。本研究では、細胞機能を改変する新規の方法を開発する為に、部位選択的DNA脱メチル化の誘導後の状態を評価出来る分析法を準備した。具体的には、回収した精製DNAに含まれるシトシン、メチル修飾シトシン、ヒドロキシメチル化シトシンの比率を明らかにする為に、試料DNAを酵素処理によりnucleosideまで分解し、LC/MS/MSシステムで試料中に含まれる修飾塩基量を分析する方法である。

まず、酵素分解後産物の標準品として、2'-Deoxy-5-hydroxymethyl cytidine、2'-Deoxy-5-methylcytidine、2'-Deoxycytidine(東京化成)を入手し、API3200 Qtrap LC/MS/MSシステム(AB SCIEX社)を分析に用いることで期待した十分な検出感度が得られることを確認した。次に、メチル修飾シトシンだけではなくヒドロキシメチル化シトシンを含んでいることが知られているヒト胚性癌細胞株NCCIT細胞を解析モデル細胞として、解析試料の準備条件を検討した。400万500万個のNCCIT細胞よりNucleoSpin Tissue(タカラバイオ)を用いてゲノムDNAを回収し、RNase処理後、DNA Clean & Concentrator kit(Zymo research社)で再度精製した。準備出来た純度の高いゲノムDNAをDNA Degradase Plus(Zymo research社)で処理し、nucleosideまで分解した。酵素処理が十分であったことは、アガロースゲル電気泳動で確認出来た。酵素処理後の試料をLC/MS/MSシステムで解析した結果、細胞から回収したDNAに含まれる修飾シトシンを高感度に観察出来ることが明らかになった。システムゲノム科学本研究課題において得られた研究成果は、国内外の学会において発表された。DNAの脱メチル化のメカニズムは、エピジェネティクス研究分野だけでは無く、iPS細胞やES細胞などを含む幹細胞研究など広く生命科学者の関心を集めるようになってきている。さらに、DNAのメチル化とガンなどの疾患との関連が指摘されるようになり、本研究の目的である部位選択的DNA脱メチル化の誘導法の重要性が高まってきている。そのため本研究課題の研究成果として、研究代表者が筆頭著者として執筆し英文国際誌上で発表した論文は、すでにNature Reviews Molecular Cell Biology誌などに掲載の論文に引用されるなど、大きな反響を得ている。さらに本研究で着目しているメチル化シトシンヒドロキシラーゼであるヒトTET1が、部位選択的DNAの脱メチル化誘導に有用である事を示唆する予備的な結果が得られていることから、本研究課題は、おおむね順調に進展していると考えられる。一方、研究代表者は、平成25年2月末日まで勤務した理化学研究所を離れ、平成25年3月1日より国立医薬品食品衛生研究所に研究活動の場所を移した。そのため、本年度において本研究課題に必要な実験システムの構築に時間を使う必要があった。平成26年度は、本研究課題の最終年度である事から、国立医薬品食品衛生研究所の所属研究室の優位性を生かして、期限内に有用性の高い細胞機能改変法の開発を試みることにする。本年度に実施した研究によって取得した成果は、研究代表者が筆頭著者として論文を執筆し英文国際誌上で発表することが出来た。さらに、MBSJ2012およびKeystone Symposiaという国内外の学会において、これらの成果を発表した。
生体硬組織に含まれるタンパク質の機能と起源の研究

本年度は,軟体動物(ホタテガイ)の殻内タンパク質,腕足動物(ホウズキチョウチンガイ)の殻結晶内タンパク質ICP-1,および脊椎動物(ネズミザメ)のエナメロイドタンパク質についての研究を行った.ホタデガイの殻内タンパク質については,殻から抽出した水溶性画分を電気泳動により精製し,エドマン法によりアミノ末端のアミノ酸部分配列を決定した.その結果,ホタデガイの殻には数種類のサイズの異なる水溶性タンパク質が含まれるが,それらは,いずれも共通のアミノ末端配列を持ち,しかもそれぞれが2種類のペプチドが結合してできている,という意外な事実を示唆する結果を得た.決定された配列には予想通り酸性アミノ酸が多く含まれていたが,その配列はこれまでに知られたものとは異なることも分かった.さらに,これらのタンパク質,および腕足動物のICP-1について,それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を決定すべく,外套膜より抽出したmRNAからcDNAを合成し,PCR法により目的とする断片の増幅を試みた.その結果,いずれも予想されるサイズのDNAが得られた.現在これらのDNA断片のクローニングを行い,構造の解析を行っている.ネズミザメのエナメロイドタンパク質については,その粗調製物および電気泳動による精製物のそれぞれに対する抗体を作製し,エナメロイドタンパク質の硬組織内での発現パターンを解析した.その結果,エナメロイドタンパク質は,歯のエナメロイド中の層状構造の発達と関連して発現すること,また象牙質の形成を行う間充織から分泌されている可能性が高いことなどが明らかになった.また,このエナメロイドタンパク質はアミノ末端がブロックされていることも明らかとなり,今後クリーブランド法によりこのタンパク質の酵素消化断片を精製し,アミノ酸配列を決定する方針である.本年度は,軟体動物(ホタテガイ)の殻内タンパク質,腕足動物(ホウズキチョウチンガイ)の殻結晶内タンパク質ICP-1,および脊椎動物(ネズミザメ)のエナメロイドタンパク質についての研究を行った.ホタデガイの殻内タンパク質については,殻から抽出した水溶性画分を電気泳動により精製し,エドマン法によりアミノ末端のアミノ酸部分配列を決定した.その結果,ホタデガイの殻には数種類のサイズの異なる水溶性タンパク質が含まれるが,それらは,いずれも共通のアミノ末端配列を持ち,しかもそれぞれが2種類のペプチドが結合してできている,という意外な事実を示唆する結果を得た.決定された配列には予想通り酸性アミノ酸が多く含まれていたが,その配列はこれまでに知られたものとは異なることも分かった.さらに,これらのタンパク質,および腕足動物のICP-1について,それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を決定すべく,外套膜より抽出したmRNAからcDNAを合成し,PCR法により目的とする断片の増幅を試みた.その結果,いずれも予想されるサイズのDNAが得られた.現在これらのDNA断片のクローニングを行い,構造の解析を行っている.ネズミザメのエナメロイドタンパク質については,その粗調製物および電気泳動による精製物のそれぞれに対する抗体を作製し,エナメロイドタンパク質の硬組織内での発現パターンを解析した.その結果,エナメロイドタンパク質は,歯のエナメロイド中の層状構造の発達と関連して発現すること,また象牙質の形成を行う間充織から分泌されている可能性が高いことなどが明らかになった.また,このエナメロイドタンパク質はアミノ末端がブロックされていることも明らかとなり,今後クリーブランド法によりこのタンパク質の酵素消化断片を精製し,アミノ酸配列を決定する方針である.
若年の抑うつ早期発見を目指した多角的アプローチによる症例対照研究

若年女性を対象に抑うつ症状と細胞内の酸化ストレスに伴うDNA損傷との関連を明らかにすることを目的として、月経周期別に質問紙調査による抑うつ症状の判定と尿中酸化ストレスマーカー8-OHdG量の測定を行った。調査対象は若年女性57名(21.6±0.8)とし、月経期間を卵胞期、排卵期、黄体期の3期間に分けた。尿中8-OHdGの月経周期調整平均は「抑うつ群」で高値となり月経周期に独立して抑うつ症状と統計学的に有意な関連を示した。尿中8-OHdGによる抑うつの有無の弁別能を調べたROC曲線では、AUCは月経周期によらず統計学的に有意であった。本研究はSDSと尿中8-OHdGが月経周期に独立して関連した。メンタルヘルスの中でうつ病が最も多く、ついで、不安障害が多い。これらの男女比は1:2とも示されており、女性におけるうつ病が多いともいえる。また、我が国では20年程前から若年のうつ病が少しずつ増加しており、最近ではその話題が取り上げられることもある。若年者のうつ病の増加は、特に現代社会の協調意識の低下と競争社会が要因とも考えられている。したがって、若年女性においてうつ病の前段階である抑うつ症状を早期発見することが大切である。そこで、抑うつ症状の早期発見を目的として、若年女性を対象に抑うつ症状群(症例群)と健常者(対照群)との比較を行う症例対照研究である。また、同一対象者に、均一ストレス(国家試験)を曝露として考える追跡調査を行う。1.抑うつ症状における特徴的なストレス反応物質、生活習慣、身体精神的健康への影響の解明2.均一ストレス(国家試験)における抑うつ症状特有の性格およびストレス反応物質の分析。以上を栄養摂取調査、骨密度測定、ストレス反応物質測定、運動調査など身体・精神的健康面より多角的に解明を目指している。若年女性57名を対象として、月経周期を月経期(月経開始から3日以内)、増殖期(1315日)、分泌期(2325日)の3期間に分けた。各期に質問紙調査・ストレス反応物質採取(採血・採尿・唾液)を行った。質問紙は、不安尺度STAI、抑うつ尺度SDS、性格検査NEO-FFI・TCIを用いた。抑うつ尺度より「抑うつ群」、それ未満を「正群常」と判定した。ストレス反応物質は尿中Biopyrrin・8-OH-dG、総エストロゲン・セロトニン・TRAP-5b、コルチゾールを測定した。今後、統計解析により、抑うつ症状とストレス反応物質との関連をより明確にする。若年女性を対象に抑うつ症状と細胞内の酸化ストレスに伴うDNA損傷との関連を明らかにする。しかし、女性においては、月経周期が抑うつ症状と酸化ストレスの関連に交絡しているかもしれない。そこで、月経周期別に質問紙調査による抑うつ症状の判定と尿中8-hydroxy-2'deoxyguanosine (8-OHdG)量の測定を行った。調査対象は、58名(21.6±0.8歳)とし、月経期間を卵胞期(月経開始から3日以内)、排卵期(1315日)、黄体期(2426日)の3期間に分けた。各期に質問紙調査と採尿を行った。質問紙には、self-rating depression scale (SDS)を用いた。SDSより正常と抑うつ症状の判定を行い、SDSが40点以上の状態が2期間続いたものを「抑うつ症状要因あり」、それ未満のものを「抑うつ症状要因なし」とした。抑うつ症状と月経周期を要因として8-OH-dGに対する影響の検討では、抑うつ症状要因は抑うつ症状のあり・なしの2水準、月経周期要因は月経期、増殖期、分泌期の3水準とし、検定には対応のない因子と対応のある因子による二元配置分散分析を用いた(SPSS21.0J)。月経周期は尿中8-OHdGに統計学的有意な関連を示さなかった。一方、「抑うつあり」で5.5ng/mL、「なし」で3.4ng/mLと、「抑うつあり」で高値となり、月経周期に独立して抑うつ症状と統計学的に有意な関連を示した。さらに、8-OHdGによる抑うつの有無の弁別能を調べたROC解析では、AUCが月経期、増殖期でそれぞれ0.73、0.77と統計学的にも有意であったが、分泌期では0.67とやや低く、統計学的有意性も消失した(p=0.067)。横断的研究ではあるが、抑うつ症状のある者では、何らかのストレスにより体内の活性酸素が増加した酸化ストレス状態にある可能性が示唆された。

本研究はSDSと尿中8-OHdGが月経周期に独立して関連した。メンタルヘルスの中でうつ病が最も多く、ついで、不安障害が多い。これらの男女比は1:2とも示されており、女性におけるうつ病が多いともいえる。また、我が国では20年程前から若年のうつ病が少しずつ増加しており、最近ではその話題が取り上げられることもある。若年者のうつ病の増加は、特に現代社会の協調意識の低下と競争社会が要因とも考えられている。したがって、若年女性においてうつ病の前段階である抑うつ症状を早期発見することが大切である。そこで、抑うつ症状の早期発見を目的として、若年女性を対象に抑うつ症状群(症例群)と健常者(対照群)との比較を行う症例対照研究である。また、同一対象者に、均一ストレス(国家試験)を曝露として考える追跡調査を行う。1.抑うつ症状における特徴的なストレス反応物質、生活習慣、身体精神的健康への影響の解明2.均一ストレス(国家試験)における抑うつ症状特有の性格およびストレス反応物質の分析。以上を栄養摂取調査、骨密度測定、ストレス反応物質測定、運動調査など身体・精神的健康面より多角的に解明を目指している。若年女性28名を対象として、月経周期を月経期(月経開始から3日以内)、増殖期(1315日)、分泌期(2325日)の3期間に分けた。各期に質問紙調査・ストレス反応物質採取(採血・採尿・唾液)を行った。質問紙は、不安尺度STAI、抑うつ尺度SDS、性格検査NEO-FFI・TCIを用いた。不安・抑うつ尺度および精神科医師の診断のもと「抑うつ症状」、それ未満を「正常」と判定した。ストレス反応物質は尿中Biopyrrin・8-OH-dG、総エストロゲン・セロトニン・TRAP-5b、コルチゾールを測定した。今後、統計解析により、抑うつ症状と性格・ストレス反応物質との関連、抑うつ症状が生活習慣や身体精神的健康に及ぼす影響を解明する。藤田保健衛生大学臨床検査学科に在学する学生に対し、事前に研究内容と方法について十分な説明を行い,文書により同意を得た。説明会に参加した60名のうち58名が同意したが、月経周期が26日以上38日未満の範囲内になかった1名を除く57名を解析対象とした。予算の関係上、ストレス反応物質測定の件数を少なくしたが、国家試験受験前の3年生57名を測定することができた。月経周期を月経期(月経開始から3日以内)、増殖期(1315日)、分泌期(2325日)の3期間に分けた。月経周期3期間のストレス反応物質採取も順調に進み測定も順調に実施している。正常と抑うつの判定は、SDSスコアが53点以上を抑うつの可能性ありとし、DSM-IVにおける大うつ病エピソードの基準が2週間以上の症状持続とされていることから、2つの異なる月経周期で抑うつが認められた場合「抑うつ群」10名、それ以外を「not抑うつ群」47名と判定した。総エストロゲン・セロトニン・TRAP-5bは、外注先にて測定を行った。また、尿中Biopyrrin・8-OH-dGの測定は本学医療科学部にて行った。これらのデータを統計解析により、抑うつ症状と性格・ストレス反応物質との関連を成果として示していく。藤田保健衛生大学臨床検査学科に在学する学生に対し、本研究の説明を行い、同意を得た28名を対象者とした。予算の関係上、ストレス反応物質測定の件数を少なくしたが、国家試験受験前の3年生28名を測定することができた。
脂肪細胞が産生する新規生理活性ペプチド,アペリンの医薬品開発に関する基礎研究

我々は、アペリンmRNAが肺、心臓、脳、卵巣、脂肪、乳腺などに広く発現していることを見いだした。また、アペリン受容体も脳、脾臓、卵巣、小腸、大腸、白血球などに広く存在していることを明らかにした。さらに我々は、アペリンmRNAが脂肪細胞、動脈平滑筋細胞、胃粘膜細胞、T細胞などに発現していることを見いだした。アペリンレセプターAPJの遺伝子も脂肪細胞および動脈平滑筋細胞などに顕著に発現していた。アペリンは各種組織の動脈内皮に局在し、また、アペリン受容体も動脈平滑筋細胞などに発現していることから、アペリンの血圧調節に関する作用を測定したところ、アペリンがラットに対して強力な血圧降下作用を有することを見いだした。さらに種々のアペリンフラグメントを合成して血圧降下作用を検討し、アペリンー12が最も高い活性を示すことを明らかにした。しかし、アペリンー11やアペリンー10には血圧降下作用は認められなかったことから、アペリンー12が受容体結合に必要な最小構造であることが明らかになった。アペリンは動脈内皮に存在し血圧降下作用を有することから、アペリンがeNOSを活性化し一酸化窒素(NO)を産生する可能性が考えられた.そこで、NO合成阻害剤のアペリン血圧降下作用に及ぼす影響を調べたところ、アペリンによる血圧降下作用はNO合成阻害剤の存在下でほぼ完全に消失することを見いだした。これらの研究により、アペリンが動脈内皮から分泌されてを活性化し、血圧を降下する新規生理活性物質であることが明らかになった。アペリンは脂肪細胞および血管内皮の両方で産生され、NOを介して血圧を降下させることから、アペリンと肥満高血圧症、動脈硬化症との関連がクローズアップされてきた。本研究では、アペリンmRNAが肺、心臓、脳、卵巣、脂肪、乳腺などに広く発現していることを見いだした。また、APJ受容体も脳、脾臓、卵巣、小腸、大腸、白血球などにも広く存在していることを明らかにした。そこで、アペリンは広範囲な組織に分布し生体内で多様な生理作用を有することが推測された。また、我々は各種細胞におけるアペリンおよびそのレセプターであるAPJの遺伝子発現をRT-PCR法により検討したところ、アペリンmRNAが脂肪細胞3T3L-1、動脈平滑筋A7r5細胞、胃粘膜RGM-1細胞、T細胞Molt-4などに発現していることを見いだした。アペリンのレセプターAPJの遺伝子も3T3L-1細胞およびA7r5細胞などに著名に発現していた。3T3L-1細胞やA7r5細胞にはアペリンおよびそのレセプターであるAPJの両方の遺伝子発現が認められることから、これらの細胞ではオートクリンあるいはパラクリン機構を介して細胞情報伝達が行われているものと考えられた。また我々は、アペリンがAPJ受容体の内因性リガンドであり、APJ受容体がエイズ感染におけるコレセプターの一つであることから、アペリンの抗エイズウイルス作用について検討した。その結果、アペリンがCD4とAPJを発現させたヒト脳由来神経膠腫細胞に対するエイズウイルスの感染を阻止することを見いだした。エイズウイルス感染阻止作用は、アペリン36が最も強く、アペリン12より低濃度で感染を阻止した。また我々は、アペリンがマウスBALB/c脾臓細胞のインターフェロンおよびインターロイキンの産生を抑制することも明らかにした。すでに我々は、アペリンが肝臓のKupffer細胞にも存在することを観察しているので、アペリンが生体防御機構において何らかの役割を演じていることが推測された。

我々は、免疫組織学的研究によってアペリンが各種組織の動脈内皮や脂肪組織などに局在していることを見いだしている。また、我々は、アペリンmRNAが脂肪、乳腺などの組織に発現していること、また、アペリンmRNAは脂肪細胞や動脈平滑筋細胞などに発現し、アペリンの受容体mRNAも脂肪細胞および動脈平滑筋細胞などに顕著に発現していることを見いだしている。そこで、アペリンの生理作用について検討したところ、ラットを用いた実験でアペリンが強力な血圧降下作用を有することを見いだした。また、アペリン12がアペリン36より強力な血圧降下作用を有することなども観察した。さらに、NO合成阻害剤の存在下でアペリンの血圧降下作用がほぼ完全に阻害されること、アペリンが血中のNOx濃度を著しく増加させることを見いだし、アペリンが血管内皮においてeNOSを介してNOの合成を促進して血管を弛緩させ血圧を降下することを示唆した。これらのことからアペリンと肥満高血圧症との関連がクローズアップされてきた。そこで、アペリンのエンザイムアッセイ法を開発して、ヒトやラットの血中アペリン濃度を測定したところ、アペリンが血中に高濃度で存在することを見いだした。今後は、アペリンと肥満高血圧症との関連を検討するために、肥満高血圧症患者等の血中アペリン濃度を測定する予定である。さらに我々は、脳におけるアペリンの生理的役割を検討した。脳室内にガイドステンレスチューブを挿入固定した雄性ラットを用い、自由運動下のもとでアペリンを投与して摂食量を測定したところ、アペリンによる摂食促進効果が見られた。また、免疫染色実験では、食欲中枢近傍にアペリン染色が観察された。本研究の結果から食欲中枢などに対するアペリンおよびAPJレセプターの関与が示唆された。
マクロなスピン不斉の分子キラリティーへの変換

色素分子であるポルフィリン分子にヘテロな相互作用を形成させるために、一分子に複数個の官能基を導入することによる分子プログラミングを行い、規則的な自己集合化による超分子ポリマーの構築を謀った。色素分子であるポルフィリンに一次元の超分子ネットワークを構築させるためにカルボン酸フェニル基を導入し、一方、分子の溶解性の向上とポルフィリンの集合化の安定化を狙いデンドリマーユニットを持つポルフィリン亜鉛錯体1を設計・合成した。ベンゼン中での吸収スペクトルにおいて、1は、J-会合体に特徴的な分裂型Soret band(413 and 452nm)を与えた。さらに原子間力顕微鏡(AFM)や透過型電子顕微鏡(TEM)によって、一次元超分子ポリマーの形成を確認することができた。このデンドリマーボルフィリン1の超分子ポリマー溶液(3mL,6.0×10-6M)を200°Cにおいて、1.0×1.0×4,0cm石英セル中、無撹搾条件下、CDスペクトルを測定したところ、CDは検出されなかった。ところが、撹拌条件下(φ0,2×1.0cm撹拌子)で測定を行ったところ、非常に強いCD(Δε=200-300M-1cm-1)が得られることがわかった。CDの誘起および符号は、撹拌のON/OFFそして撹拌の向きに即座に応答して可逆的に変化した。また直線二色性スペクトルによって、ナノファイバーの溶液中での挙動を調査したところ、撹拌によってファイバーが主として縦に配向していることが明らかになった。2枚のディップコートフィルムを用いて疑似的に撹拌溶液中のファイバーの配向状態を作りだしたところ、驚いたことにこのフィルムに光学活性が現れた。したがって、得られたCDは1の集合化形態の大きな変化によるものではなく、ポリマーの渦に対するマクロな配向およびコイリングなどが原因と考えられる。色素分子であるポルフィリンは、可視領域に非常に強い光吸収(Soret band)および発光を持ち、様々な分光学的実験に対して極めて有用な化合物である。そのようなポルフィリン分子間にヘテロな相互作用を形成させるために、一分子に複数個の官能基を導入することによる分子プログラミングを行い、規則的な自己集合化による超分子ポリマーの構築を謀った。ベンゼン中での吸収スペクトルにおいて、1は、J-会合体に特徴的な分裂型Soret band(413 and 452 nm)を与えた。このデンドリマーボルフィリン1の超分子ポリマー溶液(3mL,6.0×10^<-6>M)を20°Cにおいて、1.0×1.0×4.0cm石英セル中、無撹拌条件下、CDスペクトルを測定したところ、CDは検出されなかった。ところが、撹拌条件下(φ02×1.0cm撹拌子)で測定を行ったところ、非常に強いCD(Δε=200-300M^<-1>cm^<-1>)が得られることがわかった。一方、同様の操作において、吸収スペクトルや蛍光スペクトルにほとんど変化が見られなかったことから、このCDの誘起は1の集合化形態の大きな変化によるものではなく、ポリマーの渦に対するマクロな配向およびコイリングなどが原因と考えられる。CDの強度は溶液の温度と濃度、撹拌の速度と位置に大きく依存することがわかった。低温条件下、高濃度の1を用い、撹拌の回転速度を上げ、そして撹拌位置をスペクトロメーターの光路に近づけることで大きなCD強度を得ることができた。また、非常に面白いことに、CDの符号は、撹拌の向きだけでなく撹拌位置(光路の上下)で反転することがわかった。

CDの誘起および符号は、撹拌のON/OFFそして撹拌の向きに即座に応答して可逆的に変化した。また直線二色性スペクトルによって、ナノファイバーの溶液中での挙動を調査したところ、撹拌によってファイバーが主として縦に配向していることが明らかになった。2枚のディップコートフィルムを用いて疑似的に撹拌溶液中のファイバーの配向状態を作りだしたところ、驚いたことにこのフィルムに光学活性が現れた。したがって、得られたCDは1の集合化形態の大きな変化によるものではなく、ポリマーの渦に対するマクロな配向およびコイリングなどが原因と考えられる。
コムギ耐病性物質環状ヒドロキサム酸類の発現機構の分子遺伝学的解明

6倍性植物であるパンコムギ(genome ; AABBDD)は耐病性に関与する二次代謝化合物である環状ヒドロキサム酸類(Hx)を生成、蓄積する。5種のHx生合成遺伝子(TaBx1-TaBx5)の発現レベルはパンコムギの3ゲノム間で異なる。しかし、プロモーター活性にはゲノム間で大きな差がないことをTaBx3およびTaBx4遺伝子についてこれまで明らかにしている。プロモーターの活性評価に用いたトランジェント発現系では導入された発現ベクターが染色体に組み込まれないため、種々のクロマチン修飾が発現調節に関わる遺伝子の場合、本来の発現調節を再現することができない。このことから、遺伝子発現のゲノム間差異はクロマチン修飾のゲノム間差異に起因する可能性が考えられた。そこでまず、TaBx4遺伝子のプロモーター領域約300bpについてbisulfite genomic sequencingを行い、シトシンのメチル化レベルを解析した。しかし、解析領域におけるメチル化は極めて低レベルでしか起こっておらず、発現レベルが低いAおよびDゲノム上の遺伝子と高レベルに発現しているBゲノム上の遺伝子の間で、メチル化頻度に差異は認められなかった。このことから、パンコムギゲノム間の遺伝子発現差異は少なくともシトシンのメチル化が原因ではないことが示唆された。近年、ヒストンH3およびH4タンパク質のN末端領域のリジン残基のメチル化やアセチル化が遺伝子発現制御に深く関わっていることが明らかにされている。今後はクロマチン免疫沈降法によって、パンコムギゲノム間の遺伝子発現差異にこれらの修飾が関与している可能性を検証していく必要があると考えられる。6倍性植物であるパンコムギ(genomes AABBDD)は耐病性に関与する二次代謝化合物である環状ヒドロキサム酸(Hx)類を生成、蓄積する。これまでにHx生合成の5段階の反応を担う生合成遺伝子(TaBx1-TaBx5)をパンコムギから単離し、5種の遺伝子はパンコムギのA,B,Dの全ゲノムに座乗することを明らかにしている。本年度は、パンコムギのHx生合成にA,B,Dの各ゲノムがどのように寄与しているのかを明らかにすることを目的とした。まず、これまでに得られているTaBx1-TaBx5 cDNAをプローブとしたパンコムギcDNAライブラリーのスクリーニングによって、TaBx1-TaBx5全てについてA,B,Dゲノムに由来する同祖遺伝子cDNAを3種ずつ単離した。同祖遺伝子間SNPsを利用することでゲノム(同祖遺伝子)特異的な定量RT-PCR系を確立し、遺伝子発現量のゲノム間差異を調べた。その結果、5種の生合成遺伝子の発現レベルはゲノム間で異なっており、その発現様式は植物の部位や生育時期によって異なることが明らかになった。次に、TaBx1を大腸菌で、TaBx2-TaBx5を酵母でそれぞれ発現させ、TaBx1精製酵素およびTaBx2-TaBx5を発現しているミクロソーム画分を用いたカイネティクス分析によって酵素の触媒能をゲノム間で比較した。K_<cat>/K_m値に基づいた比較から、酵素の触媒能はゲノム間で異なることが分かった。また、酵素触媒能のゲノム間差異は遺伝子発現量のゲノム間差異と対応しておらず、遺伝子発現量が必ずしも各ゲノムのHx生合成への寄与度を表していないことが示唆された。遺伝子発現量と酵素触媒能のゲノム間差異を総合すると、パンコムギの茎葉部ではBゲノムがHx生合成に最も寄与していることが示唆された。6倍性植物であるパンコムギ(genome;AABBDD)は耐病性に関与する二次代謝化合物である環状ヒドロキサム酸類(Hx)を生成、蓄積する。これまでの研究で、Hx生合成の5段階の反応を担う生合成遺伝子(TaBx1-TaBx5)はパンコムギのA,B,Dの3ゲノム全てに座乗しており、その発現レベルはゲノム間で累なることを明らかにしている。本年度は、生合成遺伝子の発現レベルがゲノム間差異を示す原因を明らかにすることを目的とした。パンコムギTACゲノムライブラリーのスクリーニングによって、5種の遺伝子のうちTaBx3およびたTaBx4遺伝子を含むTACクローンをA,B,Dの全ゲノムについて単離し、ショットガンシークエンシングによってTACクローンの全塩基配列を明らかにした。得られた配列からTaBx3およびTaBx4遺伝子のプロモーター領域(約1-2kb)を抽出し、ルシフェラーゼをレポーターとするトランジェントアッセイ用ベクターコンストラクトを作成した。次に、A,B,Dゲノム間で遺伝子発現レベルに明確な差異が見られる播種後5日のコムギ茎葉部から調製したプロトプラストを用いて、TaBx遺伝子のプロモーター活性を測定するトランジェントアッセイ系を確立した。ルシフェラーゼレポーターの酵素活性を指標として、TaBx3およびTaBx4遺伝子のプロモーター活性をA,B,Dゲノム間で比較した。その結果、それら遺伝子のプロモーター活性はゲノム間でわずかに差異を示したものの、プロモーター活性の強さと転写産物量の間に相関が認められなかったことから、転写産物量のゲノム間差異はプロモーター活性のゲノム間差異以外の要因によって生じていることが示唆された。

5種のHx生合成遺伝子(TaBx1-TaBx5)の発現レベルはパンコムギの3ゲノム間で異なる。しかし、プロモーター活性にはゲノム間で大きな差がないことをTaBx3およびTaBx4遺伝子についてこれまで明らかにしている。プロモーターの活性評価に用いたトランジェント発現系では導入された発現ベクターが染色体に組み込まれないため、種々のクロマチン修飾が発現調節に関わる遺伝子の場合、本来の発現調節を再現することができない。このことから、遺伝子発現のゲノム間差異はクロマチン修飾のゲノム間差異に起因する可能性が考えられた。そこでまず、TaBx4遺伝子のプロモーター領域約300bpについてbisulfite genomic sequencingを行い、シトシンのメチル化レベルを解析した。しかし、解析領域におけるメチル化は極めて低レベルでしか起こっておらず、発現レベルが低いAおよびDゲノム上の遺伝子と高レベルに発現しているBゲノム上の遺伝子の間で、メチル化頻度に差異は認められなかった。このことから、パンコムギゲノム間の遺伝子発現差異は少なくともシトシンのメチル化が原因ではないことが示唆された。近年、ヒストンH3およびH4タンパク質のN末端領域のリジン残基のメチル化やアセチル化が遺伝子発現制御に深く関わっていることが明らかにされている。今後はクロマチン免疫沈降法によって、パンコムギゲノム間の遺伝子発現差異にこれらの修飾が関与している可能性を検証していく必要があると考えられる。
細径内視鏡による中耳腔内病態の観察

従来の双眼顕微鏡や鼓膜ファイバーでは詳細な観察が不可能であった中耳腔内を、汎用細径内視鏡FVS-3000のミニスコープ(外径0.75mm)により観察した。対象は各種の中耳炎症性疾患、中耳耳小骨奇形、耳硬化症などである。観察経路は鼓膜穿孔部、鼓膜切開部、あるいは経耳管とした。本研究の目的は非侵襲的な鼓室内の術前観察により、中耳疾患の病態解明の一助とすること、手術適応がある疾患では術式選択の資料とすることである。さらに、術後経過の観察に用いた。鼓膜穿孔のある症例、既手術耳で乳突腔が外耳洞に開放されている症例では経外耳道的に観察を行った。耳小骨の保存状態、粘膜病変、開放乳突腔では深部残存蜂巣が観察できることがわかった。ただし、中耳腔内や外耳道の分泌物がミニスコープ先端に付着すると、たとえ微量でも観察不能となった。また、ミニスコープ先端に可動性がないため、依然、観察不能な部位もあった。鼓膜穿孔のない中耳奇形や耳硬化症では前鼻孔から鼻腔、さらに耳管を経由で鼓室内にミニスコープを挿入して観察を行った。ここでも分泌物付着の問題が認められた。また、耳管形態に個体差があり、かつミニスコープの柔軟性にも限界があって、症例によってはミニスコープを中耳腔内に挿入できないこともあった。購入した機種の画像解像力については、操作中のビデオモニターによる観察、理解は可能でも、写真や記録としての鮮明度には多少問題があり、今後の検討を要すると思われた。
圧電結晶板のエッジ(端部)振動を利用した超小形且つ高安定の圧電振動子の実現

本研究の目的は、有限幅の薄い圧電結晶板に存在するエッジ振動という特殊な振動モードを利用して、高Q、高安定で且つ超小形の圧電振動子を開発することにある。本研究では、近年、周波数温度特性の良好な圧電結晶基板として注目されているタンタル酸リチウム(LiTa【O_3】)板の場合についてエッジ振動の理論解析を行い、その機械的及び電気的諸特性を明らかにすると共に、実際にエッジ振動子の試作実験を行い、その高Q、高安定化及び超小形化を追求した。本年度は下記の如き研究成果を得た。1.LiTa【O_3】板は、弾性的に異方性を有する結晶基板であるため、切断方位によって振動モードが変化し、伝搬モードとの結合による振動エネルギーの損失即ち共振尖鋭度Qの低下を招く。LiTa【O_3】板についてエッジ振動の理論解析を行った結果、モードの対称性、共振尖鋭度及び周波数温度特性に関してYZ(-50゚,90゚)板が振動子基板として最適であることが分った。2.X軸(電気軸)に長辺を持つYZ基板では、エッジ振動以外に板幅に基づく幅縦振動が強勢に励振されスプリアスとなる。これを抑圧するため、振動子の励振電極形状を工夫し、新たに7種類の電極形状を考案した。実験の結果、これらの電極形状の中でリード電極の引出方法を改良した電極形状Gが最も良好なスプリアス特性を示すことが分った。3.YZ基板を用いて上記電極形状Gのエッジ振動子を試作し、その電気的諸特性を測定した。その結果、共振周波数【f_0】≒1.5MHZに対して共振尖鋭度Q≒15000,容量比γ≒110,共振周波数の一次温度係数α≒16ppm/°Cの特性が得られた。4.振動子基板は、板幅2H≒1.6mm,板厚2t=0.2mm,長さl=18mmストリップ状となり、1.5MHZの振動子としては従来のものに比し大幅な小形化が実現された。