hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス免疫複合体型糸球体腎炎モデルにおける半月体形成特異遺伝子のクローニング

(1)マウス免疫複合体型糸球体腎炎モデルにおいて半月体形成期に腎臓内で特異的に発現するLine-1レトロトランスポゾンの局在解析マウス免疫複合体型糸球体腎炎モデルの半月体形成期の腎(GN4W),半月体形成前の腎(GN3W),対照マウスでGN4W, GN3Wと同週齢のものの腎(それぞれCont4W, Cont3W)標本を作製した.Line-1レトロトランスポゾンの逆転写酵素の部位に対するRNAプローブにてin situ hybridization法による局在解析を行った.Cont4W, Cont3Wにおけるバックグラウンドの発現は腎髓質に強く認められた.GN3Wに比し,GN4Wでは,半月体を形成している細胞,半月体を形成した糸球体周囲の尿細管に強く発現していた.(2)薬剤による発現抑制介入実験文献上レトロトランスポゾンを抑制する薬剤が存在する.この薬剤を入手し,再度マウス免疫複合体型腎炎モデルの経過中に経口投与した.溶媒のみを投与した対照群では,当然ながらマウスは重篤な腎炎を惹起し,高死亡率を呈したが,薬剤投与を受けた群では死亡率の改善および半月体形成の抑制が認められた.現在,確認のため再実験の施行中である.(1),(2)より,Line-1レトロトランスポゾンはマウス免疫複合体型腎炎の半月体形成に関わる重要な因子であり,本因子の抑制薬は腎炎の新しい治療薬の可能性であることが示唆された.(1)マウス免疫複合体型糸球体腎炎モデルの作製と組織像の評価.B10-BRマウスおよびB10-D2マウスにウシ血清アルブミン(BSA)をFreund's completeアジュバントとともに免疫し,抗体価上昇確認後,連日BSAを腹腔内投与した.BSAを投与開始から3週後,4週後に全採血,腎摘出をおこなった.腎組織所見にて3週後のマウス腎には半月体が存在せず,4週後にはほぼ100%の糸球体に半月体が存在することおよび,免疫染色にて4週後のマウス腎にIgG,C3が沈着していることを確認し,サブトラクションに適当な状態であることが判明した.(2)本モデルにおけるマウス系統差の検討.B10-BR,B10-D2は比較的特殊な系統であり,最も汎用されているC57BL/6において半月体形成性腎炎モデルの作製可否を検討した.(1)と同条件では,マウス腎にはメサンギウム増殖性糸球体腎炎は惹起され,尿蚕白の増加,IgG,C3の沈着は認められたが,半月体の形成は全くみられなかった.BSA以外の異種蛋白を免疫することも検討し,卵白アルブミン(OVA)を用い,C57BL/6マウスにて同様の実験を行なったところ,尿蛋白の増加,IgG,C3の糸球体内沈着を伴うメサンギウム増殖性腎炎が惹起され,およそ5%以下の糸球体で小半月体が存在したが,本研究の目的であるサブトラクションによる半月体特異遺伝子のクローニングには使用不適であることが判明した.(3)糸球体単離プロトコールの作製.腎組織の構造を考慮すると,半月体が形成される糸球体以外の尿細管・間質の部位が大部分であり,本研究においてmRNAの抽出は単離糸球体から施行すべきと考えられた.ラット糸球体単離法を参考にマウス糸球体単離プロトコールを作製した.(1)(3)の予備実験が終了しており,RDA法によるサブトラクションを準備中である.(1)マウス免疫複合体腎炎モデルの糸球体単離.B10-BRマウスに対してウシアルブミン(BSA)を用いた腎炎モデルを作製した.本腎炎モデルはプロトコール第3週では,糸球体に半月体が認められなかったが,第4週では高度の半月体形成を認め,サブトラクションによる特異的に発現する遺伝子の単離に適していると考えられた.第3週,第4週の腎臓よりsieving(篩い分け)法にて糸球体を単離し,メッセンジャーRNA (mRNA)を抽出した.(1)で抽出したmRNAを鋳型にcDNAを合成し,cDNA-RDAを施行し,第3週糸球体-第4週糸球体,第4週-第3週の発現遺伝子のサブトラクションを行った.第3週-第4週では有意な遺伝子断片を得ることができなかったが,第4週-第3週では2つのcDNA断片を得た.このcDNA断片をプラスミドにクローニングし,両端よりシーケンスした.得られた遺伝子配列をデータベースで検索したところ,一方はLine-1レトロトランスポゾン,もう一方は未知遺伝子配列であった.(3)in situ hybridizationによるLine-1レトロトランスポゾンの発現部位解析.(2)で得られたLine-1レトロトランスポゾンのマウス腎における発現部位をin situ hybridizaionにより解析するため,クローニングしたプラスミドのプロモーター配列を生かし,Digoxigenin(DIG)標識RNAプローブを合成した.現在,このプローブを用いて,染色条件の最適化を施行中である.(1)マウス免疫複合体型糸球体腎炎モデルにおいて半月体形成期に腎臓内で特異的に発現するLine-1レトロトランスポゾンの局在解析マウス免疫複合体型

糸球体腎炎モデルの半月体形成期の腎(GN4W),半月体形成前の腎(GN3W),対照マウスでGN4W, GN3Wと同週齢のものの腎(それぞれCont4W, Cont3W)標本を作製した.Line-1レトロトランスポゾンの逆転写酵素の部位に対するRNAプローブにてin situ hybridization法による局在解析を行った.Cont4W, Cont3Wにおけるバックグラウンドの発現は腎髓質に強く認められた.GN3Wに比し,GN4Wでは,半月体を形成している細胞,半月体を形成した糸球体周囲の尿細管に強く発現していた.(2)薬剤による発現抑制介入実験文献上レトロトランスポゾンを抑制する薬剤が存在する.この薬剤を入手し,再度マウス免疫複合体型腎炎モデルの経過中に経口投与した.溶媒のみを投与した対照群では,当然ながらマウスは重篤な腎炎を惹起し,高死亡率を呈したが,薬剤投与を受けた群では死亡率の改善および半月体形成の抑制が認められた.現在,確認のため再実験の施行中である.(1),(2)より,Line-1レトロトランスポゾンはマウス免疫複合体型腎炎の半月体形成に関わる重要な因子であり,本因子の抑制薬は腎炎の新しい治療薬の可能性であることが示唆された.
チッソ-マグネシウム結合をもつ新反応剤の反応における一電子移動過程の研究

表題のN-Mg反応剤であるアリールイミノジマグネシウムの反応機構の研究は、これがC-Mg反応剤であるアリールマグネシウムより穏やかな電子供与能をもち、種々の予想される反応支配因子が見出され興味深い。当面解明さるべき重要な反応として、ニトロベンゼンおよびベンジルとの反応があり、本研究課題の当初の目的として、前者との反応に焦点をあて、(1)生成物分布の精査、(2)反応熱測定、(3)電子スピン共鳴(ESR)測定による機構の前面的解明をあげた。(1)については、基質・反応剤側の長鎖アルキル置換基の効果、オルト位陰性置換基の効果、オルト位ヒドロキシ置換基の効果を精査し、反応剤分子の会合体の形成が一電子移動効率を大きく変動させる事実を見出し報告した。(2)については、すでに提案した基質・反応剤の還元・酸化電位の組合せを基礎とする相対的一電子移動効率によるマグネシウム反応剤の諸反応の性格づけと分類にもとづき、この分類から選んだ典型的な基質・反応の組合せ8種について反応熱測定を行い、分類と合致する相対発熱量の系列を見出し、有機反応化学討論会に報告した。(3)については、本学の旧型電子スピン共鳴装置(設置後15年経過)の検出器の性能低下のため、複雑な超微細構造をもつスペクトルを与えるニトロベンゼンとの反応の研究に活用できず、平成元年度に特越した。しかし、比較的単純なスペクトルがベンジルとの反応において観測され、上記(2)の分類のなかで特異な位置を占めるベンジルとの反応生成物分布を精査し、ESRの結果とあわせて二段階電子移動の第1および第2段階におけるキレート(またはシグマ錯体)形成効果の関与の程度の差異にもとづいて機構の解明をほぼ完了し、投稿準備中である。ESR装置の検出基部分の交換による性能回復を早急に実行し、(1)(2)の結果とあわせて、ニトロベンゼンとの反応機構の解明に着手する予定である。
ボルト締結部における疲労き裂の実時間超音波測定

機械類の安全性確保のために,ボルト締結部の疲労き裂を検出する必要があるが,ボルト頭などでき裂が覆われており,目視できない.本研究では,超音波測定によりボルト締結部に発生する疲労き裂を検出する方法について研究を実施した.その結果,表面弾性波を用いてボルト締結部に発生・伝播する長さ100μm以下の微小な疲労き裂を検出するとともに,疲労き裂の寸法(長さ及び深さ)を推定した.また,疲労サイクル1周期中の各応力段階におけるき裂の開閉口に伴う反射波強さの変化を検出した.機械類の安全性確保のために,ボルト締結部の疲労き裂を検出する必要があるが,ボルト頭などでき裂が覆われており,目視できない.本研究では,超音波測定によりボルト締結部に発生する疲労き裂を検出する方法について研究を実施した.その結果,表面弾性波を用いてボルト締結部に発生・伝播する長さ100μm以下の微小な疲労き裂を検出するとともに,疲労き裂の寸法(長さ及び深さ)を推定した.また,疲労サイクル1周期中の各応力段階におけるき裂の開閉口に伴う反射波強さの変化を検出した.ボルト締結した部材が繰り返しの負荷を受ける際にボルト穴近傍で発生・伝播する疲労き裂を非破壊的に検出する手法の開発を目的としている.そこで,アルミニウム合金(A2024-T3)平板より製作したボルト締結試験片について疲労試験を行うとともに,所定の疲労繰り返し回数ごとに試験機を停止し,表面弾性波(SAW)を用いた超音波測定を行った.また,荷重サイクルに同期させた超音波測定についても実施した.その結果,以下の成果を得た.1.ボルト締結力によって,疲労き裂の発生機構及び疲労寿命と締結力の関係が異なる.すなわち,ボルト締結力が小さい場合,疲労寿命は締結力の増大に従って増加していき,またボルト穴縁から疲労き裂が発生・伝播する(機械的疲労損傷).ボルト締結力が中程度になると,疲労寿命は締結力の増大に従って増加傾向を示すが,疲労き裂はボルト穴近傍に発生するようになる(フレッティング磨耗損傷).更に締結力が大きくなると,疲労寿命は締結力の増大に従って低下していき,また疲労き裂はボルト穴近傍に発生する(フレッティング疲労損傷).2.SAW測定により,ボルト穴近傍に発生する疲労き裂はその初期段階から検出された.また,疲労き裂長さの増大に従って疲労き裂からの反射波強さが一様に増大していき,SAW反射波強さより疲労き裂長さが定量的に評価可能であることを示した.3.同期測定において,疲労サイクル中の応力変化に対応してき裂からのSAW反射波強さは周期的に変化した.この結果は,反射波強さが疲労サイクル中の疲労き裂の開閉口と関係することを示唆する.ボルト締結した部材が繰り返しの負荷を受ける際にボルト穴近傍で発生・伝播する疲労き裂を非破壊的に検出する手法の開発を目的としている.本年度は,アルミニウム合金(A2024-T3)平板より製作したボルト締結試験片について周波数10Hzの疲労試験を行うとともに,荷重サイクルに同期させた表面弾性波(SAW)の測定を行った.また,0.001Hzの非常に低周波数の疲労試験を行い,実時間超音波測定及びき裂開閉口挙動の観察を行った.その結果,以下の成果を得た.1.疲労サイクルに同期させたSAW測定により,疲労サイクル中の応力の変化に対応して疲労き裂からの反射波強さが変化する現象を明らかにした.すなわち,応力が増加するに従って反射波強さは増大していき,応力の減少に伴って反射波強さは低下していった.反射波強さと応力との関係を反射波強さと応力拡大係数との関係に読み替え,反射波強さが疲労き裂の開口長さに比例すると仮定して解析し,各段階における疲労き裂長さを評価した.その結果,以前求めた疲労き裂長さと反射波強さとの関係とよく一致する結果を得た.2.0.001Hzの非常に低周波の疲労試験を実施しながらSAW測定を行い,疲労き裂からのSAW反射波強さが応力サイクル1周期中に変化すること,反射波の変化状況が周波数10Hzの疲労試験中に実施した同期測定とほぼ一致すること,を明らかにした.この結果より,周波数10Hzの疲労試験中に行った同期測定の結果は疲労試験の周波数に依存しないことが明らかとなった.3.周波数0.001Hzの疲労試験中に疲労き裂の観察を行い,疲労サイクル中の応力変化に対応して疲労き裂が開閉口することが確認された.ボルト締結部が繰り返し負荷を受けた際に,締結部近傍で発生・進展していく疲労き裂を超音波測定によって非破壊的に評価する技術の開発を目的として,本年度は,疲労サイクル中のき裂の開閉口挙動と超音波反射波強さとの関係を明らかにするため,以下に示す事項について研究を実施した.放電加工等により表面に小さな傷を付けた試験片の疲労試験を行い,長さ数mmの表面予き裂を導入した.次いで,周波数0.001Hz程度のごく低周波数で疲労試験を行いながら実時間で表面弾性波(SAW)測定を行った.平行して,試験片表面に存在する疲労き裂の成長過程を光学顕微鏡により観察した.次いで,圧延平板上に存在する自然きずを発生源として疲労き裂の発生・進展過程を観察するため,平板上を2次元的に表面弾性波測定を行うことにより,表面きずを検出することを試みた.また,浸透探傷によっても表面きずの検出を試みた.以上の測定により,以下の成果が得られた.

1.き裂からのSAW反射波強さはき裂の開閉口挙動に従って変化していったが,両者の間には良好な比例関係は得られなかった.これは,き裂の開口幅と超音波の透過/反射特性との間に関係があるためと思われた.2.圧延平板状の2次元SAW測定によって検出された反射波の位置を特定し,その場所を光学顕微鏡観察した結果,表面きずの存在が確認された.この結果より,自然きずを発生源とした表面き裂の発生・成長過程の光学顕微鏡観察,及びSAW測定の可能性が示唆された.
卵胞培養によるウシ卵母細胞の体外成熟, 受精および発育に関する研究

I.ウシ卵胞内卵子をより生体内に近い条件下で成熟させるために,卵胞培養法を確立した.まず,卵胞培養による体外成熟および体外受精に及ぼす培養時間の影響を検討した.実験1では056時間まで8時間間隔,および2838時間まで2時間間隔で培養し,体外成熟率を検討した.実験2では, 24, 32, 40および48時間培養した卵子を用いて体外受精を行い,受精率(精子侵入行う前核形成が認められた卵子数/検査卵子数)を検討した.得られた成績は次のとおりである.1)成熟卵子は培養24時間で出現し,培養32, 40, 48時間ではそれぞれ57, 48, 56%と他の培養時間と比べて有意に高い(P<0.05)成熟率であった. 2)培養2838時間を2時間間隔で検討した結果,各培養時間による成熟率の間に有意差は認められなかった.しかし,培養32時間以上において,培養時間が長くなる程成熟率も高くなる傾向が見られた.3)受精率は, 24, 32, 40, 48時間培養でそれぞれ20, 37, 25, 37%で,各培養時間の間に有意差は認められなかった.しかし,雌雄両前核の形成が認めれられた正常受精率は培養48時間で最高(37%)であった.II.卵胞培養法および卵胞より採取して後に卵子を培養する方法(卵子培養法)による体外成熟率,体外および体内(ウサギ卵管内)受精率,分割率を検討した.体外成熟率は卵胞培養法で58%,卵子培養法で53%と有意差は認められなかった.しかし,体外受精率(55%)およびウサギ卵管内での分割率(2-8細胞期)(35%)は卵胞培養法の方が有意に(P0.025)高かった(卵子培養ではそれぞれ37%, 21%).また,新鮮原精液を使用することにより凍結融解精液を使用した培養に比べて有意に高い分割率が得られた.以上の如く,卵胞培養により成熟した卵子は従来の卵子培養法に比べて,より生理的に成熟していると考えられ,高い受精率および分割率が得られることが明らかとなった.I.ウシ卵胞内卵子をより生体内に近い条件下で成熟させるために,卵胞培養法を確立した.まず,卵胞培養による体外成熟および体外受精に及ぼす培養時間の影響を検討した.実験1では056時間まで8時間間隔,および2838時間まで2時間間隔で培養し,体外成熟率を検討した.実験2では, 24, 32, 40および48時間培養した卵子を用いて体外受精を行い,受精率(精子侵入行う前核形成が認められた卵子数/検査卵子数)を検討した.得られた成績は次のとおりである.1)成熟卵子は培養24時間で出現し,培養32, 40, 48時間ではそれぞれ57, 48, 56%と他の培養時間と比べて有意に高い(P<0.05)成熟率であった. 2)培養2838時間を2時間間隔で検討した結果,各培養時間による成熟率の間に有意差は認められなかった.しかし,培養32時間以上において,培養時間が長くなる程成熟率も高くなる傾向が見られた.3)受精率は, 24, 32, 40, 48時間培養でそれぞれ20, 37, 25, 37%で,各培養時間の間に有意差は認められなかった.しかし,雌雄両前核の形成が認めれられた正常受精率は培養48時間で最高(37%)であった.II.卵胞培養法および卵胞より採取して後に卵子を培養する方法(卵子培養法)による体外成熟率,体外および体内(ウサギ卵管内)受精率,分割率を検討した.体外成熟率は卵胞培養法で58%,卵子培養法で53%と有意差は認められなかった.しかし,体外受精率(55%)およびウサギ卵管内での分割率(2-8細胞期)(35%)は卵胞培養法の方が有意に(P0.025)高かった(卵子培養ではそれぞれ37%, 21%).また,新鮮原精液を使用することにより凍結融解精液を使用した培養に比べて有意に高い分割率が得られた.以上の如く,卵胞培養により成熟した卵子は従来の卵子培養法に比べて,より生理的に成熟していると考えられ,高い受精率および分割率が得られることが明らかとなった.
X線結晶構造解析学的手法を用いたHomer1cによる受容体集積機構の解明

そこで次に、結合相手と複合体を形成することによるHomer1cの構造変化を明らかにすることで、提唱した集積制御機構を明らかにできると考え、結合相手にIP_3Rを選択し複合体の三次元構造解析を開始した。その結果、IP_3RのHomer1cの結合領域とIP_3の結合領域とを含む細胞内領域であるIP_3R_<1-604>の精製条件を検討し大量調製を可能にした。さらに、還元剤にトリス(2,-カルボキシエチル)フォスフィン(TCEP)、溶液中の塩に硫酸ナトリウムを用いることで、溶液中での均一性が増すことを明らかにした。複合体の形成による構造変化を比較することと、単体の構造解析によって得られる立体構造に基づくことでIP_3R細胞内領域のCRH1との複合体を形成する最適な領域を決定できるため、このタンパク質試料を用いてIP_3R_<1-604>単体の結晶化を行った。その結果、0.1M Hepes-NaOH(pH7.5),2.0Mギ酸アンモニウム,3%メタノールの結晶化条件で偏光を示す針状結晶が得られた。現在は、この針状結晶を回折実験が行える大きさにするために、結晶化条件の最適化を行っている。シナプス後部には,後シナプス肥厚部(PSD)と呼ばれシナプス伝達に関わる多くの機能分子が集積している領域が存在している。PSD-Zip45(Homer-1c)はPSDに局在するタンパク質の一つであり代謝型グルタミン酸受容体やIP3受容体などのPSDに局在するタンパク質のクラスター形成に関与しているタンパク質である。本研究の目的はPSDにおけるPSD-Zip45による膜タンパク質の局在・集積化機構を立体構造に基づいて明らかにすることである。これまでに、Homer1ファミリー保存領域(CRH1:Conserved Region of the Homer 1 families)の結晶化を行い1.8Å分解能で構造を決定した。この領域は結合相手への結合領域であるEVH1ドメインを含んでいる。この構造解析の結果からCRH1のループ領域のSPLTP配列がEVH1ドメインに結合していた。このことから結合相手に結合することで自己重合を開始するという制御機構の存在が示唆された。そこで今回、この領域の水溶液中での挙動を調べるために、X線小角散乱により水溶液中でのこの領域の形状を測定した。その結果、分子の最大長が80Å程度であり分子のRcが9Å程度であることがわかった。この形状はCRH1のループ領域が自由に運動しているときの単量体の大きさによく一致する。これは、結晶格子中で観察されたEVH1ドメインとSPLTP配列の相互作用が水溶液中では起きていないことを示している。そこで次に、PSD-Zip45の結合相手の一つであるIP3受容体(IP3R)と複合体の三次元構造解析を開始した。IP3Rはイオノトロピックな受容体であり活性化されるとセカンドメッセンジャーとしても重要なCa^<++>イオンを放出する。また、非常に大きなタンパク質であるため、電子顕微鏡を用いた単粒子解析をおこなうこともできる。以上の理由から結合相手にIP3Rを選び、現在精製条件を検討中である。シナプス後肥厚部には多くのタンパク質が存在しており、それらが機能性膜タンパク質の局在や集積に関与していることが最近の研究で明らかになってきた。Homer1は代謝型グルタミン酸受容体やイノシトール三リン酸受容体(IP_3R)のクラスター形成に関与しているタンパク質である。Homer1はC末端のロイシンジッパー構造を介して自己重合を行うことができる。また最近の研究でIP_3RやTRP (Transient Receptor Potential)チャネルと共同し細胞質内のCa^<+2>濃度の調節を行っている事がわかってきている。このことからHomer1はシナプス後膜において膜タンパク質の局在・集積だけでなく細胞の機能調節に関しても重要な役割を果たしていると考えられる。これまでの本研究でHomer1ファミリー保存領域の結晶化を行い1.8A分解能で構造を決定した。この構造解析の結果から結合相手が存在することで、自己重合を開始する制御機構の存在が示唆された。そこで今回、受容体の結合によるHomer1の構造変化と受容体へ与える影響を知るためにIP3RのN末側の細胞内領域とHomer1のEVH1ドメインとの複合体の構造解析を開始した。IP3Rのこの領域にはHomer1結合ドメインとIP3との結合ドメインを含んでいる。この領域はIP3Rの活性を制御している領域である。この領域とHomer1との複合体の構造を明らかにすることでHomer1の結合によるIP3RのIP3結合領域の構造への影響を知ることができる。これを明らかにすることでHomer1によるIP3Rの活性化の制御機構を知ることができると考えている。これまでに、IP3Rの細胞質領域の発現精製条件を検討し、精製条件を確立し大量に試料を得ることができるようになった。現在はHomer1とIP3Rの細胞質領域との複合体の結晶化条件を検索中である。

その結果、IP_3RのHomer1cの結合領域とIP_3の結合領域とを含む細胞内領域であるIP_3R_<1-604>の精製条件を検討し大量調製を可能にした。さらに、還元剤にトリス(2,-カルボキシエチル)フォスフィン(TCEP)、溶液中の塩に硫酸ナトリウムを用いることで、溶液中での均一性が増すことを明らかにした。複合体の形成による構造変化を比較することと、単体の構造解析によって得られる立体構造に基づくことでIP_3R細胞内領域のCRH1との複合体を形成する最適な領域を決定できるため、このタンパク質試料を用いてIP_3R_<1-604>単体の結晶化を行った。その結果、0.1M Hepes-NaOH(pH7.5),2.0Mギ酸アンモニウム,3%メタノールの結晶化条件で偏光を示す針状結晶が得られた。現在は、この針状結晶を回折実験が行える大きさにするために、結晶化条件の最適化を行っている。
ナノＤＤＳ血管外移行の分子基盤解明

腫瘍血管の形質も腫瘍難治性の一因であることを代表者らは明らかにし、腫瘍血管の性質を制御してナノDDSの薬効を向上させることを試み、既に膵癌・胃癌の動物モデルにおいて治療効果増大が見られることを証明した。この分子メカニズムとして、本研究では新生血管においてのみ高い発現が見られ、内皮細胞ー壁細胞の安定化に重要であることが示唆されている分子に着目して解析を行い、この分子が重要な説明因子であることを示唆した。24年度は、V*(現段階で名称公表不可、以下同様)とナノ粒子漏出性に関する解析を引き続き行った。炎症環境下でV*の発現は増強しており、BxPC3ヒト膵癌皮下腫瘍モデルにおいてもV*陽性血管は多くみられる。23年度にはTGFβシグナルの抑制によりV*陽性血管が減少し、ナノ粒子分布性と相関することを見出し、さらにin vitroレベルでTGFβシグナル依存的にV*発現が制御されることを報告した。一方、V*細胞外ドメインの分解によっても説明されうるため、24年度はV*の分解について解析を行った。in vitroモデル細胞としてヒト内皮細胞HUVECおよびHMVEC、およびマウス内皮細胞bEnd3を用いた解析を行った結果、炎症性シグナル依存的にV*を発現上昇させた後のTGFβシグナル抑制により、V*細胞外ドメインの切断が増加することが明らかになった。さらに、切断を受けた結果細胞表面から産生される遊離型のV*細胞外ドメインにより、内皮細胞間の細胞間接着に重要であるClaudin5の発現が減少することが示唆された。FITC標識デキストランを用いた透過性解析の結果、V*細胞外ドメインにより処理された血管内皮細胞では透過性が亢進することも明らかになった。これらの知見から、TGFβ阻害による漏出性の増強はV*細胞外ドメインのmRNAレベルでの発現制御に加え、V*細胞外ドメインの分解亢進によっても説明される可能性が示唆されてきている。並行して、新規実験系の構築も試みた。漏出性の評価に用いるトランズウェルインサート上で、内皮細胞と壁細胞の3次元培養を行うことにより両者の直接接着を実現したin vitroモデルの構築を試みた。系を構成する細胞として、新規腫瘍モデルに用いたMS1と10T1/2を用いて詳細な条件検討を行った結果、これらを用いた積層培養法による3次元培養系の確立に成功した。代表者は腫瘍種類による血管構築の差に着目し、それによる難治性の解析を進めてきた。特に副作用の少ない抗腫瘍治療を提供できることが臨床治験の結果からも実証されつつあるナノ粒子を用いた薬剤が実際に奏効する腫瘍はまだ限られているところ、血管制御との併用によって薬効を発揮させられる可能性を膵癌などの動物モデルで示してきた。しかし、その基盤となる分子メカニズムについては詳細が明らかでないことから本研究では、ナノ粒子の血管透過性の増減を説明する分子メカニズムの解明を目的として進めてきた。本研究期間昨年度までに、P*の切除された断片が血管におけるナノ粒子の漏出性を直接制御しうることを見いだした。またこれまでの検討の結果、P*は内皮細胞と壁細胞の接触後に発現が低下する可能性を見いだしており、長期的な接着には関与しないと考えられた。そこで本年度はP*断片による平面培養内皮細胞シートからのナノ粒子漏出性の直接的な制御について検討をすすめた。その結果、すでに全長V*の結合分子として知られているP**の発現を抑制すると、P*断片による血管内皮細胞シート透過性への影響が逆になり、透過性の亢進が確認された。さらに、P**が発現しない内皮細胞シートでは、P*断片によりそのナノ粒子に対する透過性が亢進した。以上から、P*断片がP**発現細胞においてのみ、ナノ粒子に対する透過性を亢進する作用を有するという結果を得た。これらの結果から、ナノ薬剤の血管外移行を説明する分子機構として、P*断片及びその結合対象分子であるP**の内皮細胞における発現が、重要な因子である可能性が示唆された。23年度は、新生血管においてのみ高い発現が見られ、内皮細胞ー壁細胞の安定化に重要であることが示唆されている分子V*(現段階で名称公表不可、以下同様)に着目して解析を行った。その結果、BxPC3ヒト膵癌皮下腫瘍モデルにおいて、TGFβ阻害を行った個体ではV*陽性血管が減少し、さらに血管におけるV*染色性とナノ粒子の腫瘍内貯留が逆相関する可能性を見出した。これまで、内皮細胞間の細胞間接着にはClaudin5とVE-cadherinなどが、また血管内皮細胞ー壁細胞間の細胞間接着を担う分子としては、主にN-cadherinが注目されてきたが、本研究の結果から、これらに加えてV*分子がナノ粒子漏出性の機能的マーカーとなる可能性が示唆された。

その発現制御メカニズムを明らかにするために、in vitroモデル細胞としてマウス内皮細胞MS1を用いた解析の結果、TGFβシグナル依存的にV*のmRNA・タンパク質発現が上昇する結果を得た。この発現変化は、播種密度およびTGFβ刺激時間により差がみられ、V*発現制御は内皮細胞のおかれる局所環境により精密に制御されていると考えられる。これらの知見から、TGFβ阻害により増強する漏出性はV*の発現低下により説明され、すなわちV*が新生血管における漏出性を規定する接着分子である可能性が示唆されてきた。これらと並行し、ヒト腫瘍病理標本を用いて、膵癌、胃癌(通常・スキルス)、大腸癌、卵巣癌において壁細胞被覆程度を免疫染色によって解析し、膵癌・スキルス胃癌は壁細胞被覆が多く、他は少ないことが示された。この結果は、これら腫瘍の難治性の程度と相関しており、腫瘍難治性が薬剤送達性によっても影響されていることが示唆された。医歯薬学本研究では、新規解析系を用いつつ、血管の壁細胞被服と漏出性の相関について分子基盤を明らかにする計画である。これまでの検討で、漏出性制御を担う機構として、代表的な内皮細胞タイトジャンクション分子であるclaudin5の発現レベルが関与すると示唆される一方で、それらが単純な壁細胞被覆レベルはとは相関しないことを見出していた。したがって、内皮細胞と壁細胞との接着に関してより詳細な解析が必要であった。前年度の検討の結果、内皮ー壁細胞間の接着安定化に重要であると報告されているV*が、腫瘍血管における漏出性に関連する可能性が示唆され、壁細胞の内皮細胞への接着と漏出性制御に関してあらたな視点を得た。そこで今年度は、V*の内皮細胞における発現状態と、漏出性との関連についてさらなる知見を得るための解析を行った。その結果、TGFβシグナル抑制により、細胞外ドメインの切除が促進され、その切除された断片(V*細胞外ドメイン)が漏出性を直接制御しうる可能性を見出した。これらの知見より、V*陽性内皮細胞におけるTGFβシグナルの抑制が、(1)壁細胞接着の減少と、(2)内皮細胞での直接的な漏出性制御という両面から、ナノ粒子送達性の増強をもたらしていることが示唆された。さらに、内皮細胞と壁細胞の相互接着性について詳細な解析を可能にすると期待される3次元培養法確立に着手した。現時点で、培養プロトコルはほぼ完成に近い状態である。以上のように、内皮細胞ー壁細胞間の接着と漏出性を制御しうる分子基盤の手がかりを得たと同時に、次年度の解析に必要となる系も確立されたため、内皮細胞間のタイトジャンクション形成制御に関する次年度以降の研究推進に十分な結果を得たと考えている。本研究は新規実験系を用いることで、壁細胞被覆と関連した漏出性と血管構築との関連性についてその分子基盤を明らかにする計画で進行させている。予備的検討から漏出性を減少させることが知られるclaudin5の発現レベルが単純な壁細胞被覆程度とは相関しないことを見出している。従って、内皮細胞と壁細胞との接着に関してより詳細な解析・評価を行い、claudin5の発現レベルとの相関を見出すことが必要であると考えている。23年度の検討の結果、前述の通り内皮ー壁細胞間の接着安定化に重要であると報告されている分子V*が、腫瘍血管における漏出性に関連する可能性が示唆された。V*は、これまでに、安定化した既存血管では発現が低く、新生血管においてのみ壁細胞との接着に関与していることが報告されている。
挿入光源ビームラインで用いる高分解能パルス・モード計測型光ビーム位置モニタの開発

大型放射光施設SPring-8の光位置モニタにおいては、今まで不可能であった大強度放射光ビームのパルス毎の位置計測が求められている。この課題を克服するために、マイクロ・ストリップライン構造の光電面を用いたパルス・モード計測型検出素子の技術を発展させる。具体的には、次の3点について技術やアイデアの導入を検討した。1光電子放出の量子効率を高め、信号量の増大を図ることで分解能の向上が期待できる。従来のブレード型検出素子はビーム軸に平行に配置させており、X線を検出できる有効断面積はブレード型検出素子の膜厚(0.3 mm)に限定されていた。ビーム軸に対してブレード型検出素子を斜めに配置させることで、有効断面積が広くなるだけでなく、単位断面積当たりの量子効率も高くなることが期待できる。このアイデアを取り入れた検出部を設計・製作し、構造上の問題の無いことを確認した。2この配置では光電子収集電極は、受光面であるブレード検出素子側面に正対しており印加電圧により光電子の放出を制御しやすくなることが期待できる。光電子収集電極の印加電圧を変化させてブレード型検出素子の信号量を観測することによりこれを確かめた。3ブレード型検出素子の形状は、今まで直線的に成形していた。この形状では受光部の先端部での局所的な温度上昇を避けることが困難であった。これを克服するために、先端部をアーチ型とした検出素子を新しく設計した。また、試作機を製作し、問題の無いことを確認した。初年度にて実証機の設計だけでなく、実際に部品の製作を開始する予定であった。装置全体を設計するためには、検出器素子の形状(特にサイズ)を確定する必要がある。しかし、検出素子の母材となるダイヤモンド・ヒートシンクは大きくするほど高価となるので、仕様を定めるのが困難となった。今年度の検討結果から、アーチ状の検出素子を採用することにより、要求を満たす信号量が得られることに見通しがついた。挿入光源ビームラインで用いる高分解能パルス・モード計測型光ビーム位置モニタとして達成すべき性能を再設定した後に検出器素子の形状を確定し、その他の部品(光電子収集電極、冷却水路付検出素子ホルダー、伝送路付フランジ、真空容器)の設計・製作を進める。当該年度においては、本モニタ設計・製作の根幹となる検出器素子形状の決定が遅れたことにより、「次年度使用額(B-A)」が生じた。次年度においては、検出器素子、および、その他の部品(光電子収集電極、冷却水路付検出素子ホルダー、伝送路付フランジ、真空容器)の製作に使用する計画である。
生理活性物質の細胞内移行及び細胞・核内分布動態のナノイメージング解析

D-グルコサミンの細胞への取り込み状況を可視化するためカルボキシル化量子ドットとD-グルコサミンをアミド結合させ、培養骨芽細胞へ取り込ませた。3時間程度で細胞膜への付着及び細胞質内への移行が観察された。その後、核内への移行はなく7日程度で細胞外への排出によると考えられる細胞内量子ドットの減少が観察された。カルボキシル化した量子ドットとD-グルコサミンのアミノ基を結合させる。サンプル調整手順は以下のとおりである。1.1日目1)サンプル(D-グルコサミン)を1g秤量し、1mLPBSに溶解する(3本分)。2)4°Cにて一晩静置する。2.2日目1)0.1M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC-HCl)溶液を調整する。2)一本目サンプルにカルボキシル化量子ドット565(nm)を50μL加えて撹拌後、さらに0.1M EDC溶液(100μL)を加えて、静かに混和する。3)二本目ンプルにカルボキシル化量子ドット525(nm)を50μL加えて撹拌後、さらに0.1M EDC溶液(100μL)を加えて、静かに混和する。4)三本目ンプルにカルボキシル化量子ドット625(nm)を5μL加えて撹拌後、さらに0.1M EDC溶液100μL)を加えて、静かに混和する。5)2-4の反応溶液は4°Cにて24時間静かに撹拌した。上記の量子ドットは励起波長は385nm、最大蛍光波長はそれぞれ565.525.625nmである。525nmはFITCの波長にほぼ等しい。株化ヒト骨芽細胞であるNOS-1細胞への上記グルコサミン結合量子ドットの取り込みは、PBSで1%に希釈後、2倍濃縮培養液を用いて0.5%グルコサミンに調整した。培養1日目の細胞内への取り込み状態は共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。その結果、ほぼ分散された量子ドット粒子が数個細胞内へ取り込まれていることを初めて確認できた。量子ドットの細胞への取り込みは、D-グルコサミン濃度が0.2%となるよう調整した培地で継代直後から培養した。培地は3日目に交換した。また、細胞小器官の染色はOrganelle-ID^<TM>RGB reagent (EMZ-53007)にてリソゾーム、ミトコンドリアを生体染色した。量子ドットは輝度の極めて輝度の強い黄緑色の蛍光(FITCに近似)として細胞内に明瞭に観察できた。量子ドットのNOS-1細胞内での残留は、培養7日目においても頻度は少ないが認められた。同一視野内の細胞で、量子ドットを取り込んでいる細胞と、取り込んでいない細胞がみられた。また、培養5日、7日後においても、核内への移行は観察できなかった。量子ドットと細胞小器官と関係は、ほぼリソゾームの分布と一致していた今回、初めて量子ドットに結合したD-グルコサミンの培養骨芽細胞への長時間にわたる取り込み状況と細胞小器官への分布状況をイメージングできた。量子ドット単体では細胞への取り込みはないことはすでに確認されている。また、量子ドットとの結合は、カルボキシル基とアミノ基との結合であり細胞内へ入っても解離することはないと考えられるので、今回の観察はD-グルコサミンの細胞膜内及び細胞小器官への移行を示していることとなる。今後は、共焦点レーザー顕微鏡の特性を生かし、細胞への取り込み状況の3D的解析と同時に、細胞膜内通過時間、さらには細胞外への排出状況(細胞への為害性を含めて)などを検討する必要がある。さらに、細胞内での単糖の代謝による変化を観察するために、細胞が培養皿上で増殖ののち量子ドシトを取り込ませるなど実験系の工夫も必要である。細胞内へめ取り込みの実証ならびに細胞内小器官への移行状況も明らかとなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。細胞内への移行状況ならびに細胞外への排出状況の解明を検討する。特にレーザー共焦点顕微鏡を使い、3D観察を予定している。
運動文化の伝承を支えるキネステーゼアナロゴン抽出の試み

人類が育んできた運動文化を伝承するためには、我々人間の感覚運動を意味するキネステーゼ世界の出来事を整理、統合、体系化することが必要である。本研究は、運動の発生を促すため、当該の運動に動感的に類似しているキネステーゼアナロゴンを抽出して、提供し、運動文化の伝承を支えようとするものである。以上の観点から、様々な運動のアナロゴンの抽出とその移植を試みてきた。その成果として、身体を回転加速するためのキネステーゼアナロゴンを抽出し、移植した試みは明らかに運動者の動感に訴えて感覚的共鳴を起こしていることが認められた。また後方への回転加速と上方への移動を伴う運動におけるキネステーゼアナロゴン抽出の試みは、それらのアナロゴンが、運動を行う者とその環界との積極的な対峙関係の中で生み出されていくことが確認された。本研究は、文化として、その価値が認められてきた運動財について、より系統的、段階的に伝承するための方法を構築することが大きな目的である。この運動文化の伝承を支えるのはキネステーゼ世界の出来事であり、これをできるだけ表の世界に出しながら、整理していくことが重要になる。また新たな動きを体得する際には、今持っている自分のキネステーゼ体系の中でその新たな運動と「感じが似た動き」を見つけ出すことが必要になる。その自分が今対応できる「感じが似た動き」が「キネステーゼアナロゴン」であり、それを抽出し、用意することにより、動きの移しが可能になっていくのである。このような観点から、平成18年度は比較的運動経験の少ない小学校児童を対象とし、日常的な動きにはないような逆さを経過するような運動を取り上げ、運動が発生するまでの道程を分析することに努めた。その際、当該の運動に関する技術・構造情報をまず明らかにし、その情報を学習者自身の「私のコツ」として理解されるためには、どのような動きの感じとしてのキネステーゼアナロゴンが抽出できるのか、このアナロゴンはどのような学習者には向いているのか等について考察を加えた。その後実践の場面で、実験的に運動発生まで持ち込む試みをした。その結果、ここで抽出された運動例はキネステーゼアナロゴンとして、実践例での出来事を成立させるためのものとして定立するものと考えられた。ここに抽出されたアナロゴンを、さらに他の学習者に提供していくことにより、いっそう確かなものとなり得るであろう。これら一連のキネステーゼ世界の出来事や運動発生に関わる現場での出来事は、平成18年度日本スポーツ教育学会において発表した。本研究は、文化としての価値ある運動財を、より合理的に伝承するための方法を呈示することが目的である。その文化の伝承を支えるのはキネステーゼ体系における感覚世界の出来事であり、これらを表に出しながら、整理していくことが本研究の目的である。そして、それぞれの運動財を享受するためには、より善い動きや新たな動きを獲得するための営みが合理的に行われていくことが重要であり、そのためには運動する本人のキネステーゼ体系の中で、その新たな運動と「感じが似た動き」を見つけ出すことが必要となる。このような、自分が今対応できる「感じが似た動き」が「キネステーゼアナロゴン」であり、それを抽出し、用意することにより、新たな動き獲得のために必要な動きの移しが可能になっていくのである。このような観点から、平成19年度については特に学校現場での、特に低学年児童を中心に、運動がまだ未分化である状態から分化しつつある道程を観察し、資料として収集してきた。投の運動に関する実践例は一部論文としてまとめ発表してきたが、自分で動く世界や周界と自分との関係で動く世界での動きを理解するためには、もう少し運動する本人の世界に潜入する必要があり、今後更にこの問題を解決するための検証を進める必要がある。またこれまで様々な運動を伝承するためには、ある程度共通の「動きの素」を体系化できないかという問題意識を抱いてきたが、カンやコツ或いは感覚構造、図式技術と本研究の骨子であるキネステーゼアナロゴンの抽出とが、運動伝承を巡り具体的な運動に関し体系化できたときに、現場への還元ができるであろうということを、これまでの成果としてまとめつつあるところである。本研究は、人間の、より人間らしい営みの中で生まれ、育み、さらに発展してきた運動文化について、その伝承理論とその方法論を支える我々のキネステーゼ世界に潜入することを試みるものである。運動が生々流転する道筋を理解するためには、我々人間の感覚世界の出来事を明らかにし、それを整理、統合、体系化することが必要になる。

その上で運動者自身の感覚世界に共鳴できるような、感覚運動知能としての情報であるキネステーゼアナロゴンを呈示、提供することにより、運動の合理的発生を促すことが容易となる。この様な観点から、平成20年度においてはキネステーゼアナロゴンの抽出を行うと共に、実践現場におけるアナロゴンの移植も試みてきた。日常的にはあまり経験していない、後方への回転と逆さ世界の出来事を小学校期の児童を対象として実施し、加速のために抽出したアナロゴンを運動者に移植することが可能であることを実験的に確かめ、その一部は論文として発表した。また同様なアナロゴンを持つであろう運動について取り上げ、そのアナロゴンが運動者と周界との積極的な対峙により生み出され、また変成していくことが確かめられた。その際には、運動者自身の動きの感覚世界から捉えた運動者をとりまく世界を理解することが必要不可欠であり、運動者にとってより良い周界をつくり出すことによって、アナロゴンの理解がよりいっそう明確になることが確認された。これらのアナロゴンは、さらに様々な運動者に対して移植可能かどうかを検討しており、より実践現場への還元を目指している。それらの成果は論文として、現在まとめつつある。
緑茶カテキンと運動負荷が更年期の骨粗鬆症を緩和するか?

本邦において、女性の平均寿命が83歳を越え、閉経後女性人口が急増しているため、閉経後女性のquahty of life(QOL)の改善と更年期の諸症状を緩和させるかどうかを本研究の目的とした。平成16年度は、雌Zuckerラットの卵巣を摘出し、高脂肪食を摂取させることにより、更年期モデルラットの作成を試み、卵巣を摘出したラットの血清エストロゲン量の低下を経時的に確認して、更年期モデルラット作成法を確立した。平成17年度は、確立した更年期モデルラットを使用し、脂肪蓄積を促進させる緑茶カテキンを投与することで、更年期モデルラットの脂肪組織重量が増加するかどうかを確かめた結果、コントロール群と緑茶カテキン投与群の間に、摂食量、飲水量の有意な差がみられなかった。また、体重増加量をコントロール群と比較しても、ほぼ同様の傾向を示したが、コントロール群と緑茶カテキン投与群の子宮周囲脂肪組織重量に有意な差がみられたことから、緑茶カテキンの投与が、子宮周囲の脂肪組織重量に影響を及ぼす可能性が明らかとなった。そこで、平成18年度は、卵巣を摘出し更年期となったSD更年期モデルラットを、緑茶カテキン投与群、緑茶カテキン投与+運動群、非投与+運動群の3群に分け、運動負荷を与えた際の、骨代謝への効果を明らかにすることを目的とした。ランニングトレーニングは、実験動物用トレッドミルを用いて持久走的運動を行わせ、更年期を考慮し、傾斜6度、30m/m,1h/d,5d/wから速度と時間を徐々に増加させ行い、血清エストロゲン量をELISA法により経時的に測定し、大腿骨を破断して骨強度を測定した。以上の結果を総合すると、緑茶カテキンの投与と運動負荷が骨形成に有効であることが示唆され(論文執筆中)、本研究の結果を若手研究(B)に発展させ、更年期モデルニットを用いたトレーニング効果を詳細に明らかにしていく予定である。更年期障害は、加齢による卵巣機能が衰えた結果、卵巣から分泌されるエストロゲン量が急激に減少するため生じ、この時期の女性にとって、通常見られる症状である。自覚症状には個人差があるものの、日本人女性の60%から70%は何らかの症状を訴えている。しかしながら、更年期障害と診断する明確な診断基準が確立されておらず、老化現象の一つとして放置されたままである。また、更年期障害の具体的な治療方法は、ホルモン補充療法(HRT)、心理療法、漢方薬等があるが、ホルモン補充療法(HRT)には副作用も多く、長期的に行なうと乳がんの発症率を増加させることが明らかとなっている。本邦において平均寿命が80歳を越え、閉経後の女性人口が増加していることから、更年期症状の緩和は、急速な高齢化社会の抱える問題の一つと言える。一方、緑茶の機能性について様々な報告がなされているが、緑茶成分が更年期症状に及ぼす影響を総合的に明らかにした研究はいまだない。そこで、本研究は、日本人にとってなじみの深い食品である緑茶が、閉経後の更年期症状を緩和させるかどうかを確かめるために行われた。雌Zuckerラットに、1週間の予備飼育の後、エーテル麻酔下にて卵巣を摘出した。摘出後、15%バターを含む50%蔗糖からなる高脂肪食を摂取させ、血清エストロゲン量をELISA法により測定し、体重増加量、摂食量、飲水量を測定した。その結果、血清エストロゲン濃度は、術後21日目以降有意な低下が認められた。また、成長の程度を調べた結果、摂食量・飲水量に手術前後の有意な差は見られなかったものの、体重増加量は、術前と比べて、術後21日目以降増加がみられた。以上の結果より、更年期モデルラット作成法を確立させた。本邦において、女性の平均寿命が83歳を越え、閉経後女性人口が急増している。更年期の女性は、卵巣から分泌されるエストロゲン量の急激な減少の結果、更年期症状を示す。そこで、このような閉経後女性のquality of life (QOL)の改善と更年期の諸症状を緩和させるかどうかを本研究の目的とした。平成16年度は、雌Zuckerラットの卵巣を摘出し、高脂肪食を摂取させることにより、更年期のモデルラットを作成することを試み、卵巣を摘出したラットの血清エストロゲン量の低下を経時的に確認して、更年期モデルラット作成法を確立することができた。一方、申請者は、これまでに、前脂肪細胞である3T3-L1細胞をインスリンにて脂肪細胞へと分化させる際に、緑茶含有カテキンの種類によって、脂肪細胞への分化と細胞内脂肪粒の合成を促進するカテキンと、脂肪細胞への分化と細胞内脂肪粒の合成を抑制するカテキンが存在することを明らかにしている。そこで、平成17年度は、確立した更年期モデルラットを使用し、脂肪蓄積を促進させる緑茶カテキンを投与することで、更年期モデルラットの脂肪組織重量が増加するかどうかを確かめた。その結果、コントロール群と緑茶カテキン投与群との間に、摂食量、飲水量の有意な差はみられなかった。また、体重増加量をコントロール群と比較しても、ほぼ同様の傾向を示した。しかしながら、コントロール群と緑茶カテキン投与群の子宮周囲脂肪組織重量に有意な差がみられたことから、緑茶カテキンの投与が、子宮周囲の脂肪組織重量に影響を及ぼす可能性が示唆された。以上の結果を総合すると、緑茶カテキンの投与は、体重に反映するほどの増加ではないが、脂質代謝を変化させていることが明らかとなった。

この事実は、前述した我々の脂肪細胞での結果(Mochizuki et al., 2004)を裏づけるものであった。本邦において、女性の平均寿命が83歳を越え、閉経後女性人口が急増しているため、閉経後女性のquahty of life(QOL)の改善と更年期の諸症状を緩和させるかどうかを本研究の目的とした。平成16年度は、雌Zuckerラットの卵巣を摘出し、高脂肪食を摂取させることにより、更年期モデルラットの作成を試み、卵巣を摘出したラットの血清エストロゲン量の低下を経時的に確認して、更年期モデルラット作成法を確立した。平成17年度は、確立した更年期モデルラットを使用し、脂肪蓄積を促進させる緑茶カテキンを投与することで、更年期モデルラットの脂肪組織重量が増加するかどうかを確かめた結果、コントロール群と緑茶カテキン投与群の間に、摂食量、飲水量の有意な差がみられなかった。また、体重増加量をコントロール群と比較しても、ほぼ同様の傾向を示したが、コントロール群と緑茶カテキン投与群の子宮周囲脂肪組織重量に有意な差がみられたことから、緑茶カテキンの投与が、子宮周囲の脂肪組織重量に影響を及ぼす可能性が明らかとなった。そこで、平成18年度は、卵巣を摘出し更年期となったSD更年期モデルラットを、緑茶カテキン投与群、緑茶カテキン投与+運動群、非投与+運動群の3群に分け、運動負荷を与えた際の、骨代謝への効果を明らかにすることを目的とした。ランニングトレーニングは、実験動物用トレッドミルを用いて持久走的運動を行わせ、更年期を考慮し、傾斜6度、30m/m,1h/d,5d/wから速度と時間を徐々に増加させ行い、血清エストロゲン量をELISA法により経時的に測定し、大腿骨を破断して骨強度を測定した。以上の結果を総合すると、緑茶カテキンの投与と運動負荷が骨形成に有効であることが示唆され(論文執筆中)、本研究の結果を若手研究(B)に発展させ、更年期モデルニットを用いたトレーニング効果を詳細に明らかにしていく予定である。
イネの低投入型多収品種開発に向けた高窒素利用機構の解明

「コシヒカリ」(日本型普通品種)と「タカナリ」(インド型多収品種)の正逆染色体断片置換系統群を用いて、根系からの窒素吸収量と乾物生産量を評価し、高吸収および高生産性に関わる量的形質遺伝子座を検討した。その結果、コシヒカリ背景において、窒素吸収量と乾物生産量では第11染色体短腕側が候補領域と考えらえた。一方、候補領域を狭めた系統群では、これらの形質に差が認められなかったことから、窒素吸収量と乾物生産量には複数の遺伝子座が関与する可能性が推察された。低投入栽培下において生産性を向上させる為には、「根系からの窒素吸収能」と「窒素利用効率(吸収した窒素当たりの収量)」の向上が重要となる。そこで本年度は、日本型普通品種「コシヒカリ」と根系からの窒素吸収能や吸収した窒素の利用効率が高いと考えられるインド型多収品種「タカナリ」の正逆の染色体置換系統群CSSLs(コシヒカリ背景41系統、タカナリ背景39系統)を用いて、水田圃場で「根系からの窒素吸収能」と「窒素利用効率」を検討した。タカナリは、コシヒカリに比較して、収穫期乾物重、穂重、全窒素吸収量および全窒素吸収量当たりの穂窒素含有量が高かった。コシヒカリ、タカナリ背景系統群共に、不稔及び弱勢系統を除いて、収穫期の乾物重が大きいほど全窒素吸収量が大きくなる傾向があった。このことから吸収した窒素当たりの乾物生産量は、系統間差が小さいことが分かった。一方、コシヒカリ背景の全窒素吸収量と穂重が、コシヒカリよりそれぞれ高い傾向のある系統は、3系統だったが、全窒素吸収量と全窒素吸収量当たりの穂窒素含有量がそれぞれ高い傾向のある系統は無かった。一方、タカナリ背景の全窒素吸収量と穂重、全窒素吸収量と全窒素吸収量当たりの穂窒素含有量では、それぞれ、3系統、2系統で、これらが両方タカナリより高い傾向のある系統は、2系統だった。今後は、全ての系統の年次間差異と、選抜系統の領域を狭めた組換え固定系統について窒素吸収と窒素利用効率について検討する予定である。そこで本年度は、日本型普通品種「コシヒカリ」と根系からの窒素吸収能が高いインド型多収品種「タカナリ」の正逆の染色体置換系統群CSSLs、および有望な1系統の染色体領域を狭めた系統群(コシヒカリ背景6系統)を用いて、水田圃場にて収穫期の乾物生産量と根系からの窒素吸収能に関わる染色体領域を検討した。タカナリは、コシヒカリに比較して、収穫期乾物重、全窒素含量が高かった。コシヒカリ背景の収穫時乾物重と全窒素吸収量では、2ヵ年でコシヒカリよりそれぞれ有意(以下10%有意水準)に高かった系統は、1系統のみだった。一方、タカナリ背景の収穫時乾物重と全窒素含量では、タカナリより有意に高い系統は無く、またコシヒカリ背景で有意だった領域を含むタカナリ背景側の系統は、登熟不良のため乾物重が有意に小さかった。コシヒカリ背景で収穫時乾物重と全窒素吸収量が有望だった系統の染色体領域を狭めた6系統群では、これら2形質がコシヒカリより有意に高くなる系統は無かった。以上のことから、収穫時乾物重と全窒素含量には、複数の遺伝子座の相互作用があると推察される。そこで本年度は、日本型普通品種「コシヒカリ」と根系からの窒素吸収能が高いインド型多収品種「タカナリ」の正逆の染色体置換系統群CSSLsのうち、有望な1系統の染色体領域を狭めた系統群(コシヒカリ背景6系統)を用いて、水田圃場にて収穫期の乾物生産量と根系からの窒素吸収能に関わる形質を検討した。その結果、有望系統ではこれまでの2か年間と同様に、乾物生産及び窒素吸収量が「コシヒカリ」よりもやや増加したものの、領域を狭めた系統群では効果が認められなかった。次いで、有望系統の根量と下層根割合を、「コシヒカリ」と比較したところ、「コシヒカリ」よりもやや根量が多く、下層根割合がやや高い傾向があったが有意ではなかった。また領域を狭めた系統群では、根量、下層根割合において、「コシヒカリ」との違いは認められなかった。以上のことから、収穫時乾物重と全窒素含量には、複数の遺伝子座の相互作用があると推察された。当初の予定通り、染色体置換系統群の有望な1系統及びその領域を狭めた系統群の圃場試験の年次反復を行い、窒素吸収に関わる根系の発達程度と活性を評価することが出来た。1つの土壌窒素条件下では、これらが高まる有望系統が1系統認められたが、土壌窒素量が異なる場合には、その効果が異なってくる可能性がある。そこで本年度は、日本型普通品種「コシヒカリ」と根系からの窒素吸収能が高いインド型多収品種「タカナリ」の正逆の染色体置換系統群