hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
IPS細胞を用いた細胞ハイブリッド型人工骨による顎骨再建に関する基礎的研究

低侵襲な骨の再生方法の確立を目的として(1)骨髄由来の未分化間葉系細胞と人工骨を組み合わせた細胞ハイブリッド型人工骨による骨再生の可能性を検討した。次いで(2)脂肪幹細胞の分化誘導の可能性を検討した。そして(3)IPS細胞を用いた骨再生の基盤技術を確立することを目的としてiPS細胞の骨芽細胞への分化誘導に適した培養条件について検討し,骨芽細胞様細胞への分化誘導を確認した。インプラントの埋入を目的とした骨増生では自家骨移植が最も有用であるとされている。しかし,大量の移植骨が必要となる場合には骨採取部の侵襲が大きくなることから,低侵襲な骨増生法の開発が望まれている。本研究ではiPS細胞を用いた骨再生の基盤技術を確立することが目的である。平成22年度はiPS細胞の骨芽細胞への分化誘導法を確立するための予備実験として,イヌ由来の骨原性細胞(BMSC)を用い,ハニカム型β-TCP(以下37H)を組み合わせた細胞ハイブリッド型人工骨を作製した。そして,この人工骨の骨再生能について形態学的,分子生物学的に解析した。また,ヒト由来の脂肪幹細胞を用い,骨芽細胞への分化誘導法について検討した。実験に用いた人工骨は直径3mm,厚さ1mmの円板状に成型され,37か所に直径300μmの孔を有するハニカム構造のβTCPである。イヌ由来の未分化間葉系細胞の多分化能は,種々の分化促進培地で分化誘導し,骨芽細胞化,軟骨細胞化および脂肪細胞化すること,さらに各細胞からAPase, osteocalcinなどのmRNA発現を確認することで評価した。各イヌの細胞を個別に培養し、サブコンフルエントの状態の細胞を2x105個/mlの濃度で人工骨とともに遠心管内で培養し、rhBMP-2(100ng/ml)を添加して骨芽細胞へ分化誘導させ,細胞ハイブリッド型人工骨として実験に使用した。その結果,人工骨にBMSCを混合しただけでは効果的な骨芽細胞への分化誘導は認められず,rhBMP-2を添加することで人工骨内に骨芽細胞を分化・増殖させることがが可能となった。また,ヒト由来の脂肪幹細胞を28日間骨分化誘導培地で培養したところ,骨芽細胞に分化させることが可能であった。この結果は,口腔内から容易に採取できる脂肪組織を利用しての骨再生の可能性を示唆するものと考えられた。成熟脂肪組織由来の脂肪幹細胞から、骨芽細胞あるいは軟骨細胞を分化誘導することにより、骨再生医療に応用することが期待されている。本研究では、ADSCに化学的刺激や物理的刺激を与えることで、骨芽細胞あるいは軟骨細胞への分化誘導の可能性をin vitroで検討した。脂肪幹細胞にBMP2、BMP7、PPAR&#61543;の阻害剤であるGW9662を骨芽細胞誘導培地と共にそれぞれ、または、その全てを添加し化学的刺激とした。同時に200rpmの振動を毎日1時間与え、機械的刺激とした。培養7、14および21日目の細胞について、RT-PCR法および、Western Blotting法によって骨芽細胞および軟骨細胞のマーカー遺伝子および、タンパクの発現を解析した。さらに、細胞染色(クリスタルバイオレッド、トルイジンブルー、アリザリンレッドおよびALPase活性染色)および比色定量法によって、脂肪細胞、骨芽細胞、並びに軟骨細胞に関する分化形質発現を評価した。BMP2、7を添加した群では、マーカー発現および形質発現において、主に軟骨細胞様細胞への分化を認めた。一方、GW9662を添加した群では、主に骨芽細胞様細胞への分化を認めた。さらに、BMP2、7、GW9662を共に添加した群では、両者の形質を同時に具有する細胞への分化を認めた。また、機械的刺激を与えた群では、化学的刺激の有無にかかわらず、細胞増殖が顕著で、かつ、骨芽細胞および軟骨細胞への分化マーカー遺伝子の早期的・持続的発現を認め、両者の形質を同時に具有する細胞への分化を認めた。化学的・機械的刺激により、骨芽細胞または軟骨細胞、あるいはその両者の形質を具有する細胞に分化調節できることが明らかとなった。脂肪幹細胞に化学的刺激と機械的刺激の複合を与えることによって、遺伝子導入を伴わない自家骨再生療法の可能性が明らかとなった。顎堤の吸収や顎骨欠損に対する骨の再生治療は,歯科・口腔外科領域における重要な治療の一つである。従来、顎堤の形成あるいは顎骨の再建には遊離骨移植,あるいは海綿骨細片移植などによって行われてきた。これらの方法は有用性が高い反面,骨採取に伴う手術侵襲も小さくないことから,より低侵襲で確実な骨の再生法の確立が望まれてきた。申請者らは,これまで行ってきた実験で骨髄から採取した未分化間葉系細胞から分化誘導させた骨芽細胞と多孔質β-TCPを組み合わせた細胞ハイブリッド型人工骨の作製に成功している。そこで今回はiPS細胞(induced pluripotent stem cells)を用いた骨再生の基盤技術を確立することを目的として以下の実験を行った。

マウス(C57/BL6系統由来)の皮膚細胞から作製されたiPS細胞(iPS-MEF-Ng-20D-17)とマウス胎児線維芽細胞または種々の骨芽細胞(UAMS-32, 0P9, ST-2, RD-c6, POBなど)との共存培養下でiPSの骨芽細胞への分化誘導を試み,分化に最も適した支持細胞の種類について検討した。また,支持細胞と共存培養したiPS細胞ならびにESGRO Complete Basal Mediumの中で培養したiPS細胞に骨芽細胞への分化に必要な分化誘導因子(活性型ビタミンD3,デキサメタゾンなどを濃度別に添加し,骨芽細胞への分化誘導法について検討した。その結果,iPS細胞と骨芽細胞株(UAM-32細胞)との共存培養系で活性型ビタミンD3 10nMおよびデキサメタゾン100nMを添加して14間培養したところ,アルカリフォスファターゼ陽性細胞が出現し,さらに3週間目には石灰化物が形成され,骨芽細胞への分化誘導が確認できた。骨芽細胞への分化誘導が安定した結果が得られていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。このまま予定通り研究を遂行する。
山中馬車鉄道客車の復原に関する研究

明治32年(1899)から大正2年(1913)まで、加賀・山中温泉へ温泉客を誘致するために、馬車鉄道が利用されていた。馬車鉄道とは、レールの上を馬車が走る軌道のことである。加賀市内で発見された、その山中馬車鉄道の客車の二遺構の実測図を作成し、関係する資料・図面の収集を行った。馬車鉄道の設立経緯、運行状況、電化に転換する経緯などを明らかにし、遺構の実測図と資料の分析に基づいて、客車の復原案を作成した。本年度の研究目的である、遺構の復原的考察と周辺資料の所在調査を行った。5月から12月にかけては、石川県庁に残されていた、関係すると思われる明治期の公文書の情報公開請求を行い、資料の確認と複写を行った。その結果は以下の通りである。1.山中馬車鉄道に直接関係する資料として、「山中軌道一件、(明治31年度)、「山中軌道一件」(明治44年度)の簿冊二冊が、石川県庁内に保管されていることを確認した。2.石川県情報公開条例に基づく手続きに従い、公文書公開請求を行い、文書の閲覧と写しの交付を行った。明治31年度の簿冊は設立時認可、新たに線路を設けるための大聖寺駅の構内図、路線図、客車・貨車の略図面、線路の断面図、営業報告書、運賃改定に関する書類、動力変更願などからなり、設立時から数年後までの運営状態を知ることができる資料であった。一方、明治44年の簿冊は、主に馬車鉄道の電化への転換に関する書類であり、合併に伴う終業時に関する資料が多く含まれていた。一方、遺構に関する復原考察は、11月から2月にかけて、既往調査データの整理と再分析を行った。明治31年度の簿冊に略図面も含まれてにたことから、これらもあわせて復原考察を行い、図面の作成に着手した。なお、石川県庁の公文書調査において、石川県内の他の馬車鉄道の重資料も残されていることが判明した。車両に関する情報がこれらに含まれている可能性もあり、引き続き資料収集を進めたい。本年度の研究目的である、収集した資料と遺構調査の成果に基づく車両の復原考察を行った。5月から12月にかけては、石川県庁に残されていた、明治期の公文書の解読を行った。「山中軌道一件」(明治31年度)は設立認可に関する書類、大聖寺駅構内図、路線の計画図、客車の図面、線路の断面図など、山中馬車鉄道初期の書類群であった。客車の図面は簡略なものであるが、失われた庇やデッキ部分の形状、寸法など、復原考察において必要な情報が記されていた。また、設立後の営業報告書、運賃改定に関する書類など経営状況を示す書類、馬車から石油発動車への転換の計画があったことを示す動力変更願などにより、馬車鉄道からの脱却が早い時期から検討されていたことが明らかになった。「山中軌道一件」(明治44年度)は、主に馬車鉄道の電化への転換に関する書類であり、大聖寺水力発電所の設置が契機となったこと、車両を二車連結して輸送力の増強を図ることが目的であったこと、工事の計画や電気鉄道転換後の運賃や時刻表など、明治43年の株主総会資料と県への申請書を中心に、この時期自社のみでの事業転換が進められていた状況が明らかになった。一方で、遺構に関する復原考察については、比較対象となる他の馬車鉄道の車両の現存は確認できず、狭山市立博物館にある入間馬車鉄道の復原車両についても復原の根拠が不明であることから、参考とするのは困難であることが明らかになった。そのため、1月以降、実測図面と上述の客車図面をあわせて考察を行い、復原案を作成した。また、成果の公表として、昨年度発表した論文をPDFファイルとして、自らのホームページにおいて公開した。
アミロイド前駆体セクレターゼ活性をモジュレートする分子による治療薬の開発

アルツハイマー病は、脳内にアミロイドβタンパク質が蓄積することによって発症し、その治療法もβタンパク質分解促進やβタンパク質精製阻害など、いろいろな方向からチャレンジされているのが現状である。また最近では、ワクチン療法も試みられている。本研究では、(1)αセクレターゼの正体をADAMの一群であることを明らかにし、(2)in vitro並びにBACE1安定過剰発現細胞系において強くBACE1を阻害することが明らかになっているペプチド性阻害剤KMI429を、アルツハイマー病患者の変異を持つトランスジェニックマウスTg2576の海馬に直接注入し、脳内βタンパク質の蓄積変化を定量することによって、効果を調べた。その結果、KMI429は、BACE1を安定形質発現させた細胞で、外液に分泌されるsAPPβの量を抑えることがわかった。これをTg2576にインジェクトし3時間後の外液sAPPβを見ると、80%に低下していた。また海馬βタンパク質の量をELISAで定量すると、可溶性Aβ40の量が60.7%に低下していた。また、この阻害剤の注入は、BACE1の発現には影響を与えなかった。次に、KMI429が正常マウスのβタンパク質の蓄積にどのような影響を与えるかを検討した。その結果、可溶性並びに不溶性Aβ40もAβ42も約30-40%に低下していることがわかった。これらの事実は、BACE1阻害剤が生体内でβタンパク質の生成を抑えていることを示すものであり、酵素阻害剤でアルツハイマー病の治療が可能になることを示す初めての結果であった。本研究の目的は、アミロイド前駆体セクレターゼの同定とその生理的意義の解明である。まず、αセクレターゼの本体を明らかにするために、現在まで報告のあるADAM9,10,17の3種類のcDNAをCOS細胞に導入し、構成的αセクレターゼ活性を見たところ、9(meltrin γ)と10(MADM)に強いαセクレターゼ活性が認められた。また、TPAを加えて調節的αセクレターゼ活性を検討したところ、17(TACE)>9(meltrin γ)、10(MADM)の順に活性が認められた。これらの研究によって、数種類の酵素がαセクレターゼ活性を担っていることが判明した。次に、βセクレターゼとして報告のあるBACE1がγセクレターゼ複合体の一員であるnicastrinと相互作用することを発見した。また、nicastrinにはBACE1活性化作用が認められた。最後に、内因性αセクレターゼ活性が高い培養グリオブラストーマ細胞を用いて、α活性を上昇させる薬剤の探索を行ったところ、BACE1活性を阻害する新規アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤が逆にα活性を増強することを発見した。このことによって、αとβセクレターゼは相互に影響しあっており、アダプター分子を介して両酵素活性をモジュレートしていることが明らかになった。このアダプター分子の解明が直接治療の標的となる可能性も示唆された。本年度の研究により、アルツハイマー病の脳に蓄積するアミロイドβタンパク質(Aβ)を軽減させる理論的方法が明らかになった。まず、Aβを蓄積させない酵素であるαセクレターゼの本体が、ADAM 9,10,17,19の4種類の酵素であることが、cDNA導入実験とdsRNAによるRNAiの実験により明らかになった。このうち、ADAM9,10,17の3種で、αセクレターゼ活性の90%を説明できることがわかった。これによって、酵素特異的な活性化剤の探索が容易になった。次に、βセクレターゼとして報告されたBACE1の阻害剤を用いて、αセクレターゼ活性を上げることができないかを検討したところ、フェニルノルスタチン化合物であるKMI compoundsのいくつかに、その活性が認められた。

すなわち、αとβセクレターゼは単一基質を奪い合っており、Aβの沈着を抑えたいならば、αセクレターゼを活性化することも可能性の一つであることがわかった。しかしながら、現在までに報告されたものはすべて、細胞では効果がない。そこで、疎水性アミノ酸の導入など、各種の阻害剤を検討したところ、KMI-370に細胞での効果が認められた。最後に、ワクチン療法を検討した。Aβ経口ワクチンの基礎実験のため、Tobamoウイルスベクターを用いてAβをGFP融合タンパク質として、タバコ、トマト、ピーマンの葉に発現させた。発現量は、1gの葉当たり100μgと免疫実験には十分量あると考えられ、現在、経口投与の効果をマウスを用いて検討中である。本研究は、アルツハイマー病に特徴的なアミロイドの沈着に関係するプロテアーゼの詳細な研究である。まず、アルツハイマー病アミロイドβタンパク質の沈着の第一段階を触媒するβセクレターゼ(BACE1)阻害剤の効果をin vivoで検討を行った。まず、BACE1過剰発現HEK細胞にヒドロキシエチレン・イソステア骨格を持つ阻害剤を添加し、sAPPβの分泌量を測定したところ、KMI358、KMI370という阻害剤によって濃度依存的に阻害できることを発見した。現在、家族性アルツハイマー病変異を持つトランスジェニックマウスTg2576の海馬に直接阻害剤を注入し効果を判定することを試みている。βタンパク質の沈着を抑えるために、食物ワクチンの作成も試みている。GFPにβタンパク質を融合させたものをピーマン葉に発現させた。これをホモジナイズし、マウスに経口投与した。対照として、皮下投与も行った。皮下投与によって抗体価が上昇したが、経口投与では上昇程度は低いことがわかった。また、アミロイドβタンパク質の沈着を阻止する方向に働くαセクレターゼとして新たにADAM19を同定した。活性のないADAM12と活性のあるADAM19のキメラコンストラクトを作成し、どの部分にαセクレターゼ活性があるかを調べたところ、N末端のプロテアーゼ活性部位がADAM19であるときにAPPを切断する活性を持つことが判明した。この研究と、以前の私たちの研究によって、ADAMファミリーメタロプロテアーゼのうち、9、10、17、19の4種類がαセクレターゼとして働いていることがわかった。アルツハイマー病は、脳内にアミロイドβタンパク質が蓄積することによって発症し、その治療法もβタンパク質分解促進やβタンパク質精製阻害など、いろいろな方向からチャレンジされているのが現状である。また最近では、ワクチン療法も試みられている。本研究では、in vitro並びにBACE1安定過剰発現細胞系において強くBACE1を阻害することが明らかになっているペプチド性阻害剤KMI429を、アルツハイマー病患者の変異を持つトランスジェニックマウスTg2576の海馬に直接注入し、脳内βタンパク質の蓄積変化を定量することによって、効果を調べた。その結果、KMI429は、BACE1を安定形質発現させた細胞で、外液に分泌されるsAPPβの量を抑えることがわかった。これをTg2576にインジェクトし3時間後の外液sAPPβを見ると、80%に低下していた。また海馬βタンパク質の量をELISAで定量すると、可溶性Aβ40の量が60.7%に低下していた。
ヒッポスポンジンの合成研究

特異な化学構造と興味深い生理活性を併せ持つ海産天然物の合成研究は、医薬品の開発という観点から大きな意義がある、著者は合成標的化合物として海綿に含まれるフラノセスタテルペン、ヒッポスポンジン1とその類縁天然物2を選び、その全合成と絶対構造の決定を目的に研究を行った。1の合成に際し分子を3つのセグメントA-Cに切断し、その各々を合成後、3者を結合する方法を採用した、セグメントAに関しては対応するアルデヒド3の合成をめざした。すなわち山本によって開発された不斉四級炭素形成法を用いて合成した化合物より著者が先に開発した融合フラン構築法を活用し両エナンチオマーを合成する手法を確立した、このようにして得た3は、2にも共通する構造単位であるため、まず2の全合成を検討した、3より誘導したアセチレン体と3-フルアルデヒドより合成した4をカップリング後、Birch還元に付すことにより簡便に2の全合成を達成し、その不斉中ぐの絶対配置をRと決定した。一方、セグメントBについては、ジチアン法を用いてゲラニオールより導びいた5と市販のキラルベンジルグリシドールを結合後、ホスホネート6へと誘導した、次にこれを3とEmmonsカップリングによりリジエンとし、ジチアンの加水分解の後、野崎法によりエキソメチレン化を行い7を合成した.テトロン酸部の構築に関しては、現在モデル化合物を用いて検討中であり、今後これらの知見をふまえ1の全合成を完結する予定である。
焼酎粕因子による中枢制御とそれに基づく地鶏肉高生産法の開発

本研究では、まず、焼酎粕由来の成長促進物質であるブトキシブチルアルコール(BBA)の成長促進効果(ブロイラー)が筋肉タンパク質分解速度の低下と関連することを明らかにした。次に、BBAによる筋肉タンパク質分解速度の低下が、主として、筋肉タンパク質の分解を司るカルパインおよびユビキチンプロテアソーム系の関連酵素の遺伝子発現抑制によるものであることを示した。本研究では、また、BBAによる下垂体前葉からの成長ホルモン(GH)の分泌促進および副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)の分泌抑制を示し、さらに、BBAが視床下部神経ペプチドの発現変動を介して視床下部におけるコルチコトロピン放出ホルモン(CRH)の発現を抑制し食欲を促進することを示した。林と大塚は、ブロイラーに焼酎粕を与えると筋肉量が増加することを明らかにした。また、ブロイラーに合成したブトキシブチルアルコール(焼酎粕因子の一つ)を与えた場合にも筋肉量が増加することを明らかにしており、同時に、培養筋肉細胞を用いて、ブトキシブチルアルコールが筋肉タンパク質の分解速度を低下させることを明らかにしている。現在、排泄物中への3-メチルヒスチジン排泄量を測定することによりブロイラーの筋肉タンパク質分解速度に及ぼすブトキシブチルアルコールの影響を調べている。長谷川は、焼酎粕による食欲増進の起因となる視床下部神経ペプチド(群)の同定の一環として、まず、鶏の中枢における食欲調節機構に関与する神経ペプチドを明らかにする目的で、主要なエネルギー代謝調節ホルモンであるグルカゴンの中枢投与が摂食量及び視床下部食欲調節関連ペプチド(群)の遺伝子発現に及ぼす影響について調べた。その結果、グルカゴンの脳室内投与により鶏の摂食量は減少すること、視床下部副腎皮質刺激ホルモン放出因子の遺伝子発現が促進すること、ならびに血中副腎皮質ホルモン濃度が上昇することが明らかになった。これらの結果から、鶏においても、哺乳動物と同様に、副腎皮質刺激ホルモン放出因子が中枢の摂食調節機構において仲介因子として働くことが示唆された。焼酎粕因子はグルカゴンを介して食欲に影響を及ぼすのではないかと予想される。加藤は、ニワトリの下垂体機能を他の動物種と比較する観点から、2種類の実験を実施した。第1の実験では、仔ウシ、ヤギ、ヒツジを用いて、バソプレッシン刺激時によるACTH分泌の種差について検討し、その結果、バソプレッシン刺激によるACTH分泌程度には種差が認められ、ヤギ、ヒツジ、ウシの順序であることを明らかにした。また、ヤギでは、CRH刺激はACTH分泌を刺激せず、ヒトやラットと異なることがわかった。第2の実験では、仔ウシ10頭を用いて、焼酎粕を2週間給与した時の、血中GH、ACTH、IGF-IおよびInsulin濃度の変化を測定中である。ブロイラーに焼酎粕あるいは合成ブトキシブチルアルコール(BBA、焼酎粕に含まれる成長促進物質)を与えると筋肉量が増加することより、昨年度は、BBAは筋肉タンパク質の分解速度を低下させると予想し、BBAを含む培地で筋肉細胞を培養したところ、タンパク質分解速度は低下、筋肉細胞成長は促進されることを明らかにした。また、脳室内にBBAを投与して、ブロイラーにおいては、BBAが食欲促進作用を有することを明らかにしている。本年度は、in vivoで焼酎粕(焼酎粕濃縮液)および合成BBAをブロイラーに与え成長および筋肉タンパク質分解速度に及ぼす影響を調べ、さらにそのメカニズムを調べる目的で筋肉タンパク質分解に関与する遺伝子発現に対する影響を調べた。また、BBAの食欲促進作用は食欲抑制ペプチドの減少による可能性が考えられるので食欲抑制機構の最上流調節因子であるβ-MSHの変動を調べた。さらに、培養下垂体前葉細胞からの成長ホルモン(GH)分泌に及ぼすBBAの影響を調べた。その結果、in vivoにおいても焼酎粕および合成BBAは筋肉タンパク質分解を抑制し、筋肉タンパク質分解に関与する酵素であるカルパイン、プロテアソームおよびユビキチンリガーゼの遺伝子発現を抑制することが明らかになった。この事実はプロイラーの成長に対する焼酎粕の効果をよく説明している。また、食欲抑制因子であるβ-MSHについては、鶏においても最上流の食欲抑制ペプチドとして機能していることを確認し、現在、BBAの影響を調べているところである。さらに、ヒツジ下垂体から前葉細胞を単離し、BBAを含む培地で培養したところGH分泌が促進された。したがって、BBAは筋肉に直接作用してタンパク質分解を抑制するだけでなく脳に作用してホルモンなどの分泌に影響を及ぼし、ひいては成長や食欲に影響する可能性を示している。焼酎粕の給与は、食欲を増進させるが、この食欲増進因子の一つとして、林らは新規の生理活性物質-ブトキシブチルアルコールを同定した(平成19年3月・日本畜産学会大会)。本研究では、まず、ブロイラーにおいて焼酎粕および焼酎粕ヘキサン抽出物(焼酎粕因子を含む)が成長促進効果を有することを確かめ、成長促進効果が筋肉タンパク質分解速度の低下と関連することを明らかにした。

次に、焼酎粕濃縮液からのブトキシブチルアルコールの大量抽出精製法ならびに合成法を確立し、培養筋肉細胞を用いて筋肉蛋白質の分解抑制に対するブトキシブチルアルコールの直接的な作用を確認した。さらに、合成ブトキシブチルアルコールおよび焼酎粕ヘキサン抽出物による筋肉蛋白質分解抑制のメカニズムを明らかにした。すなわち、本年度は、合成ブトキシブチルアルコールおよび焼酎粕ヘキサン抽出物をブロイラーに与えて筋肉タンパク質分解のメカニズムを調べた。その結果、合成ブトキシブチルアルコールおよび焼酎粕ヘキサン抽出物はいずれも筋肉タンパク質分解に関与する遺伝子(カルパイン、ユビキチン、アトロジン)の発現を低下させることが分かった。さらに、本年度は、焼酎粕にブトキシブチルアルコールと同様の生理作用を示すジブトキシブタンが含まれることを明らかにした。ブトキシブチルアルコールとジブトキシブタンは相互に変換する可能性が高く、現在、この二つの物質の複合的作用を追究しているところである。
脊髄くも膜下麻酔後の脳血流酸素代謝変化と心拍出量及び体血管抵抗の関係

先行研究により、帝王切開術における脊髄くも膜下麻酔中には、血圧低下に依存して母体局所脳組織の血液量や酸素飽和度が低下することを明らかにした。その局所脳組織の血液量および酸素飽和度の低下が心拍出量あるいは体血管抵抗の減少に関連すると予測されたため、本研究では近赤外分光法と動脈圧心拍出量測定にてこの関連性について調べた。その結果、局所脳組織の血液量と酸素飽和度の低下はいずれも体血管抵抗の低下に相関関係が認められた。心拍出量の関与は認められなかった。脊髄くも膜下麻酔中に生じる低血圧に伴う局所脳組織の血液量と酸素飽和度の低下は、脊髄くも膜下麻酔による体血管抵抗の低下に依存している可能性が示唆された。帝王切開術における脊髄くも膜下麻酔導入後には、血圧低下に伴い母体局所脳組織の血液量や酸素飽和度が低下する。脊髄くも膜下麻酔導入後の血圧低下は、妊娠子宮による下大静脈圧迫に伴う心拍出量の低下と脊髄くも膜下麻酔による体血管抵抗の低下により生じる。本研究では、脊髄くも膜下麻酔中の母体局所脳組織の血液量および酸素飽和度の変化と体循環(心拍出量、体血管抵抗)変動との関係を検討する目的で、近赤外分光法(Niro-200NX:浜松ホトニクス社製)と低侵襲血行動態モニター(フロートラック・ビジレオモニター:エドワーズライフサイエンス社製)による測定を同時に行った。平成27年度では、研究開始前に本研究のUMIN-CTRへの登録および院内倫理委員会の承認を得た。その後は計画通り、術中の大量出血に備え観血的動脈圧測定をおこなう予定の脊髄くも膜下麻酔下帝王切開術を受ける症例を対象に本研究への参加募集をおこない、本研究内容に同意が得られた症例に対して研究をおこなった。現在までに目標症例数の約半数のデータ取得が完了した。その結果では、脊髄くも膜下麻酔導入後には血圧の低下に伴って母体局所脳組織の血液量や酸素飽和度が低下すること、また体循環変動については、心拍出量は維持されるが体血管抵抗は著明に低下することが確認された。これらの結果はいずれも先行研究を踏襲するものであった。さらに、脊髄くも膜下麻酔導入後に生じる母体局所脳組織の血液量と酸素飽和度の低下は、心拍出量の変化に比較し、体血管抵抗の変化に依存する傾向が認められた。平成27年度では目標症例数の約半数のデータ取得が完了した。申請した計画通りに研究をおこない、予定通りに研究の遂行およびデータの取得が安全におこなえることが確認できた。また、研究遂行中の近赤外分光法プローブの脱落や動脈圧測定ラインの一時的な不具合など、研究手法上の問題点も明らかとなった。問題点の対応策としては、プローブの脱落予防のためにヘアーバンドの装着と動脈圧ライン挿入部のシーネ固定が必要であることが分かった。平成28年度では、平成27年度に引き続きデータ所得を計画通りに行った。ただし、臨床症状発現時における脳循環および体循環変化の特異性や、作用の異なる昇圧剤(エフェドリンやフェニレフリン)投与後における脳循環および体循環指標の変化の差異についても検討を行う予定であったが、臨床症状が発現した症例がいなかったため、比較検討を行うことができなかった。結果では、脊髄くも膜下麻酔導入後には血圧の低下に伴って母体局所脳組織の血液量や酸素飽和度が低下すること、また体循環変動については、心拍出量は維持されるが体血管抵抗は著明に低下することが確認された。これらの結果は、脊髄くも膜下麻酔導入後に生じる母体局所脳組織の血液量と酸素飽和度の低下は、心拍出量の変化に比較し、体血管抵抗の変化に依存することが示された。申請した計画通りに28年度も同様の研究をおこない、目標症例数である20症例のデータ取得を目指す。

データ取得終了後は、各測定項目の経時変化について一元配置分散分析にて解析し、局所脳組織の血液量ならびに酸素飽和度の変化と体循環変動との関係については、20秒毎の総ヘモグロビン濃度ならびに組織酸素化指数の変化値と心拍出量および体血管抵抗の変化値とについて、それぞれの相関係数を求めて評価する。麻酔科学平成27年度では目標症例数の約半数のデータ取得が完了した。しかし、目標症例数の半数のため、必要物品の購入が遅れた。申請した計画通りに28年度も同様の研究をおこない、目標症例数である20症例のデータ取得を目指し、必要物品の購入を行う。
糖尿病関連歯周炎のIL-6動態に着目したマクロファージ・線維芽細胞クロストーク

本研究は,歯周炎病巣に浸潤するMφと歯肉線維芽細胞のクロストークに焦点を当て,高血糖(グルコース)やCPTによって惹起されるIL-6関連分子の動態によって制御される一連の細胞カスケードを解明することを目的とする。得られた結果は以下のとおりである。1糖尿病患者群と非糖尿病患者群との間におけるSkin AF値に有意差はなかった(P=0.34)。2最深ポケット部位におけるGCF中のIL-1βとsIL-6Rレベルは,糖尿病患者のHbA1c値と有意な相関が見られた(IL-1β: P=0.035,sIL-6R: P=0.040)。3HGとCPTは,THP-1 MφのsIL-6R産生を有意に誘導した。4HGは,歯肉線維芽細胞のIL-1βおよびIL-6+sIL-6RによるMMP-1の産生誘導を有意に促進した。このMMP-1産生の誘導はMAPKおよびNF-κB系を阻害することで有意に抑制された。なお,TIMP-1の産生性に変化は認めなかった。5HGは,歯肉線維芽細胞のIL-1βおよびIL-6+sIL-6RによるIκBα,p44/42 MAPKのリン酸化を著しく増強した。6HG下で培養したTHP-1 Mφの培養上清によって,歯肉線維芽細胞のMMP-1産生は有意に誘導された。このMMP-1産生はIL-1raによって有意に抑制された。以上の研究結果から,好中球などから産生されるCPTは,Mφに作用してIL-1βやsIL-6Rの産生を誘導し,それらの炎症関連分子の相互作用によって歯肉線維芽細胞のMMP-1産生が誘導され,歯周組織の破壊が起こること,そしてこの線維芽細胞とMφのクロストークは,高グルコース状態にある歯周組織では一層増強され,結果的に糖尿病患者において歯周病の重症化が生じる可能性が示唆された。カルプロテクチンがTLR4/NF-kB経路を介して歯肉線維芽細胞のIL-6産生を誘導することを明らかにした。このことは,主に好中球が産生するカルプロテクチンが歯肉線維芽細胞を中心としたIL-6ネットワークの基点となる可能性を示唆する。一方,高グルコース条件で培養した歯肉線維芽細胞はIL-6誘導性のMMP-1産生をさらに促進することを見出した。同じく高グルコース条件で培養したTHP-1マクロファージにおいてsIL-6R産生がさらに誘導されることも示した。また,このsIL-6R産生はTaceによって制御されることも確認した。以上のことから,糖尿病関連歯周炎の重症化機序におけるマクロファージー歯肉線維芽細胞クロストークの一端をカルプロテクチンとIL-6のサイトカインネットワークの面から解明することができた。カルプロテクチンによる歯肉線維芽細胞のIL-6産生機序について執筆した内容が評価され,当該英文誌への掲載が決まった。高血糖条件において,マクロファージが予想以上の反応性を示すことが明らかになった。歯周病細菌P.gingivalis由来リポポリサッカライド(LPS)が高血糖条件下で培養したTHP-1単球の炎症性サイトカインIL-6およびMCP-1産生を有意に亢進することを見出し,糖尿病患者における歯周病組織由来のマイクロインフラメーション(微弱炎症)の細胞学的機序の一端を明らかにした。さらに,この微弱炎症はカロテノイドの一種であるベータカロテンによって有意に抑制されることも示した。望ましい栄養摂取のあり方については,今後の研究発展のために重要なキーワードであると考えている。次に,糖尿病患者における歯周病の重症化機序を想定して,THP-1単球をマクロファージに分化させた後,高血糖条件下で培養するとIL-6アゴニストである可溶性IL-6レセプター(sIL-6R)の産生が有意に誘導されることを明らかにした。また,このsIL-6R産生はTaceの作用によるものであることも示すことが出来た(論文作成中)。一方,高血糖条件下で培養した歯肉線維芽細胞をIL-1やIL-6で刺激すると,NF-kB系あるいはMAPK系を介してタンパク分解酵素MMP-1の産生が有意に亢進することも見出した。MMP-1レベルの上昇は直接的な歯周組織破壊につながる。またIL-1は歯肉線維芽細胞のIL-6産生を劇的に誘導することも見出した。上記で得られた知見をまとめると,IL-6ネットワークを中心としたマクロファージと線維芽細胞のクロストークはIL-1の存在が重要であることが示唆され,このことによって糖尿病患者における歯周病の重症化機序の一端が説明できると考えている。本研究の目的は,糖尿病患者に見られる歯周病の重症化機序を探索するため,歯肉線維芽細胞とマクロファージの細胞間クロストークを検討するものである。また研究の前提をクリアするために必須であったマクロファージの前駆細胞である単球を高血糖条件下で培養した時の細胞反応を検討すると,様々な炎症性サイトカインの産生を誘導することが分かった。

これによって,歯周病によるマイクロインフラメーションの機序の一端を明らかにできたと考える(Cell Biol Int. 42(1):105-111, 2018.に掲載)。さらに,マクロファージは高血糖条件下で培養するとIL-6アゴニストであるsIL-6Rの産生を誘導することから,糖尿病患者の歯周組織ではIL-6ネットワークが増強し得る環境に変貌している可能性が示唆された。このことは,全くの新規の知見・病態概念であり,今後の研究進捗によって非常にインパクトの大きい内容に発展することが期待されると考えている。したがって,現在までの研究の進捗は概ね順調であると考えている。本研究は,歯周炎病巣に浸潤するMφと歯肉線維芽細胞のクロストークに焦点を当て,高血糖(グルコース)やCPTによって惹起されるIL-6関連分子の動態によって制御される一連の細胞カスケードを解明することを目的とする。得られた結果は以下のとおりである。1糖尿病患者群と非糖尿病患者群との間におけるSkin AF値に有意差はなかった(P=0.34)。2最深ポケット部位におけるGCF中のIL-1βとsIL-6Rレベルは,糖尿病患者のHbA1c値と有意な相関が見られた(IL-1β: P=0.035,sIL-6R: P=0.040)。3HGとCPTは,THP-1 MφのsIL-6R産生を有意に誘導した。4HGは,歯肉線維芽細胞のIL-1βおよびIL-6+sIL-6RによるMMP-1の産生誘導を有意に促進した。このMMP-1産生の誘導はMAPKおよびNF-κB系を阻害することで有意に抑制された。なお,TIMP-1の産生性に変化は認めなかった。5HGは,歯肉線維芽細胞のIL-1βおよびIL-6+sIL-6RによるIκBα,p44/42 MAPKのリン酸化を著しく増強した。6HG下で培養したTHP-1 Mφの培養上清によって,歯肉線維芽細胞のMMP-1産生は有意に誘導された。このMMP-1産生はIL-1raによって有意に抑制された。以上の研究結果から,好中球などから産生されるCPTは,Mφに作用してIL-1βやsIL-6Rの産生を誘導し,それらの炎症関連分子の相互作用によって歯肉線維芽細胞のMMP-1産生が誘導され,歯周組織の破壊が起こること,そしてこの線維芽細胞とMφのクロストークは,高グルコース状態にある歯周組織では一層増強され,結果的に糖尿病患者において歯周病の重症化が生じる可能性が示唆された。現在まで順調に成果を挙げているので,大学院生ら研究協力者の士気も上がっている。これまでの研究成果を参考(対照)にして,高グルコース条件下で培養した細胞の反応性を調べる。これまでに実施してきた研究の流れに沿って,さらに継続して研究をすすめる。IL-6ネットワークに着目した細胞間のクロストークについて,種々の細胞実験を丁寧に行うことで,その信憑性をさらに高じる必要があると考えている。したがって,これまでの研究成果によって得られた知見を念頭に,タンパクレベルあるいは遺伝子レベルなど,あらゆる角度から,今回得られつつある新規知見の妥当性を検証していく。一方で,今回の新規細胞生物学的知見が糖尿病を併発した歯周病患者の歯周組織の炎症反応と合致するかどうかは非常に重要な視点であるので,臨床面から実際の患者試料を用いて研究成果の整合性を検討することが欠かせないと考えている。
well-being向上を目的とした行動活性化プログラムの開発

近年,うつ病の心理療法である行動活性化療法が健常者のwell-being向上に役立つ可能性が指摘されている。しかし,健常者を対象とした行動活性化プログラムを実施する場合,活性化すべき活動の候補が無数にある。したがって,個人にとって活性化するのが望ましい活動を明らかにする必要が生じるが,その際に個人の持つ価値(value)が重要な指針となる。本年度の研究では大学生を対象に1ヶ月の期間を空けた2時点からなる質問紙調査を行ない,価値とストレッサーがwell-beingに与える影響を検討した。その結果,価値に沿った生活の崩れが大きい場合ストレッサーの増大に伴ってwell-beingの低下がみられるが,価値に沿った生活の崩れが小さい場合ストレッサーの増大がwell-beingに影響を与えないことが明らかになった。一方,価値の自覚や価値に向かっての忍耐力の程度は将来のwell-beingに影響を及ぼさなかった。したがって価値を明確にするだけではなく,価値に沿った生活を継続することがwell-being向上を目的とする場合に重要であり,ストレッサーに曝露された場合にwell-beingの低下を予防する因子になると考えられる。本研究の結果は,ストレッサーが将来のwell-beingに与える影響を価値が調整するプロセスを示唆した。したがって,ストレッサーに対するwell-being低下を予防しつつ増進するためには,価値に沿った生活を継続するための支援が必要であると言える。本研究の結果を通して,well-being向上を目的とした行動活性化プログラム内容を構成する予定である。本年度はwell-being向上を目的とした行動活性化プログラム作成のための調査研究及び文献調査を実施し,調査結果をもとにプログラムを構成することを目標としていた。平成30年7月豪雨災害のため調査時期が大幅にずれ込んだが,現在までに遅れを取り戻しつつある。実施プログラムの最終調整段階にある。また調査時期変更のため公表が遅れているが,次年度以降に遅れを取り戻す予定である。平成30年度に作成したプログラムを予備的に実施し,感想や意見を求めることで調整する。その後,介入群に個別実施し,統制群と比較することで効果を確認する。また,得られた成果については学会発表等を通して公表していく予定である。
生体中の長寿命ラジカルによるガン誘発機構の解明

放射線による発ガンの引き金は、短寿命の活性酸素ラジカルによるものとこれまで考えられてきた。筆者等は半減期が20時間の長寿命ラジカルが細胞中に生成し、これが引き金になり突然変異やガンを誘発することを発表してきた。活性酸素ラジカルの存在しない照射後にビタミンCを添加すると、長寿命ラジカルを反応によって消去し、突然変異やガンの誘発を抑制する。本年度、ビタミンCとは化学構造が全く違うエピガロカテキンガレートを用いて検討し、長寿命ラジカルモデルをさらに実証するデータを得た。また、アメリカのWaldren教授によってこのモデルの追試がなされ、モデルの正当性が裏付けられた。彼の言葉によれば、長寿命ラジカルによる突然変異やガンの誘発機構は、これまで誰も考えていなかった新しいモデルであり、放射線生物学や発ガンにおいて極めて重要である。またESRスペクトルの解析から、長寿命ラジカルは蛋白質中のCH_2-SO・ラジカルである事を同定した。放射線により生成した長寿命蛋白質ラジカルから損傷シグナルがDNAに伝達され、突然変異やガンが誘発される。これはバイスタンダー効果の分子レベルでの機構と言える。長寿命ラジカルモデルによれば、ラジカル反応からDNA損傷に至る過程でも十分に制御出来る。特に長寿命ラジカルを直接観測しつつ対処出来るので、ガン抑制の新しい方向となろう。長寿命蛋白質ラジカルは紫外線照射によっても生成する事を見出し、紫外線発ガンの誘発に関与すると思われる。さらに、長寿命ラジカルとの反応性を利用して、抗ガン剤を評価する方法を検討した。
ハドロン物質の相転移のダイナミクスと、環境下でのハドロンの性質

申請者はこれまで「スクイーズ状態に基づく量子多体系の記述」法を時間俵存変分法に基づき開発してきたが、当初の計画通りこれを異方カイラル凝縮(DCC)の問題に適用できるように拡張を行った。すなわち、揺らぎの成長するようなDCCの問題では、カイラル凝縮とパイ中間子場を自己無撞着に扱うことが必要であるので、平均場である凝縮と、必ずしも小さくないそのまわりの揺らぎのモードを同時に取り込んで、両者を自己無撞着に決定する運動方程式が必要とされるが、我々のスクイーズ状態を用いる方法によりこの運動方程式を構成することに成功した。この方程式を数値的に解く必要があるが、予備的な数値計算の結果から、φ^4-modelの範囲内ではあるが、凝縮の成長と、そのまわりの揺らぎのモードヘのエネルギーの散逸の様相等が見られることがわかった。すなわち、初期に平均場が持っていたエネルギーは揺らぎのモードに分散していき、平均場自身は減衰振動的な振動を行いながら有限の凝縮値に緩和していくような数値結果が、予備的ではあるが得られている.さらに有限温度系での過程を扱うため、我々のスクイーズ状態による記述法の有限温度系への拡張を行った。そして凝縮とそのまわりの揺らぎのダイナミクスを記述する基礎方程式を、有限温度のスクイーズ状態による方法で導出したこのとき我々の方法と、R.Jackiw達の「密度行列のガウシアン近似の方法」との関係をあわせて明らかにすることができた。以上の研究と平行して、温度場の理論の考察として、su(2)の代数構造を持つハドロン多体系が外界である調和振動子と相互作用するモデルを取り上げ、温度場の理論の持つ理論構造を、量子論的にはボソン写像の方法を用いることにより、また半古典的には一種のスクイーズ状態である"mixed-mode coherent state"を用いることにより明らかにし、この成果を学術論文として公表した。
ミニチュア人工言語の学習によるメタ言語意識および脳活動の変化

人工言語はごく少数の文法規則と単語から成る。自然言語の習得には何年もかかるが、人工言語なら数分から数十分で学習できる。本研究課題は、人工言語の学習を通して、人間の言語学習能力を調べた。特に、中央埋め込みという自然言語の重要な特性を備えた人工言語に焦点を当てた。このタイプの人工言語は、人間の大人であっても、種々の条件が満たされない限り習得できないことが分かった。子どもは言語の天才と言われることもあるが、大人に比べて習得の失敗が多く、スピードが遅いことが分かった。本研究課題は、自然言語に基づき、人工の文法を作り出し、それを健康な子供や大人に学ばせた場合に、学習に伴い、脳の活動やメタ言語意識がどのように変化するのかを研究するというものである。今年度は、5年の研究期間の2年目であり、初年度の成果に基づきながら、実際に研究者独自の人工文法をデザインし、被験者に学習をさせることを目指した。デザインした人工文法を、日本人の子供(小学生・未就学児)に学ばせて、その結果を受けて、人工文法・提示方法・学習手続きなどを改善するというサイクルを繰り返した。その過程で必要になったソフトウェアなどを購入し、また、被験者や研究アシスタントに謝金を支払った。学会やシンポジウムなどを通して、他の研究者と活発に意見を交換し、研究の発展に生かした。人工文法に関する過去の研究をレビューし学会で発表した。その内容を元にレビュー論文の執筆を進めた。子供でも取り組める「人工言語」学習タスクを開発した。大人を対象に実施されていた、過去の実験を参考にしながら、以前から子供向けに開発に取り組んだが、子供の認知能力・学習能力を正しく把握できず、なかなか子供なら誰でも無理なく取り組める課題にはならなかった。実際に子供に試しながら、見つかった問題を改善していくサイクルを繰り返した。その結果、どんな子供でも比較的容易に取り組める課題が出来たので、本格的に実験に移行した。実験で被験者は、提示される音声を聞きながら、学習課題に取り組んだ。学習を明示的に要求するのではなく、課題を進めるには、自然に学習に取り組まなければならない状況を作り出した。被験者は子供と、比較の対象として、大学生を選んだ。男女比はだいたい同じになるように配慮した。実験は、一人ずつ防音室の中で行った。小さい部屋に子供を独りで入らせるのは不安を生じる可能性があるので、研究者が付き添った。子供でも数十分から1時間取り組めるように、課題の取り組みに応じて達成感が感じられるゲームのような仕組みを導入した。本実験では数十人の子供が参加したが、おおむねスムーズに実験を行うことが出来た。大学生に対しては、課題が子供向けであることを説明しておくと、特に疑問もなく取り組んでくれた。データが得られた後、その分析を進めた。また、学会やシンポジウムに参加し、研究課題に関して意見交換を行った。過去の人工文法学習研究のレビュー論文を投稿した。研究者の異動に向けて、実験環境の整備を行った。今年度は、5年の研究期間の最初の年度であり、既に実施されている人工文法研究を調査し、どのような人工文法を本研究に用いるのが良いかと言う、文法のデザインの問題について考察した。人工文法を用いた研究は、複数の学問領域に渡って展開されてきており、領域間でそのデザインが大きく異なることが分かった。人工言語の学習には被験者専用のコンピュータなどが必要なので、そういった機材を購入し、実験に備えた。また、本研究課題は人において人工文法の学習に伴う脳活動の変化を計測することが大きな目標なので、その土台となるように、脳波計測実験のパラダイム作りを進めて、一般の被験者から実際に脳波を計測しながら、実験時の刺激提示方法、脳波の取得方法、脳波の解析方法などを洗練していった。さらに、研究課題のもう一つの柱が、メタ言語意識の変化を捉えることなので、メタ言語意識を測るための行動実験の開発、質問紙の開発、などを進めて、実際の一般の被験者より得たデータを分析した。幾つか試したもののなかで、問題なく使えそうなものと、改善の余地があるもの、本研究に目的には使えそうにないものが明らかになった。研究代表者も人工文法研究は初めてであるので、学会やシンポジウムなどを通して、他の研究者と活発に意見を交換し、研究の発展に生かした。研究代表者が4月1日付けで別の研究機関に赴任した。新しい研究機関でも、本研究課題の研究が継続して行えるように、実験室や研究機器類を整えた。既に実施していた実験を補強するために、新たな実験室で、追加の実験を実施した。追加実験は、本研究課題の人工文法学習で、ある学習条件を除去した場合に、学習が成功するのか、失敗するのかを確認するために実施した。この学習条件は、過去の研究により、学習に必須であることが予測されていた。必要なデータを取得し分析を行った結果、予測の通り、本研究においても、この学習条件を取り除くと、学習が成立しないことが確認された。これまでの実験結果をまとめて、学会で人工文法学習実験について発表し、国内外の多くの研究者から意見や助言を得た。それらも踏まえて、また、新たなデータ分析結果も入れ込みながら、論文を執筆し、専門誌に投稿した。

論文審査の中で3回のリビジョンを求められたので全て真摯に対応し、新たな分析結果も盛り込んだが、最終的には受理されなかった。この論文は必要な修正を施し、今後、別の専門誌に投稿する予定である。また、この論文の実験をさらに発展させた内容の実験を計画している。実験準備が整い次第、実験参加者を集めて実験を実施したい。昨年度から投稿していた人工文法学習研究のレビュー論文については、審査で修正を求められたので、要求に応じて原稿に修正を行い再投稿したところ、受理されて専門誌に掲載された。研究代表者が前年度に異動し、実験室などの環境をゼロから構築することになったが、単年の予算では、必要な実験環境の整備を完了できなかったので、今年度も引き続き実験室の構築に努めた。本研究では、以前からの実験結果から、被験者の学習行動には大きな個人差があることが明らかになってきた。特に小学生などの子どもでこの傾向が顕著だが、大学生などの大人でも見られる。今回用いている人工文法に関しては、全体としては大人のほうが子どもよりも学習のスピードが速いようであるが、個人レベルで見ると、学習効率のいい子どもは学習効率の悪い大人に遥かに勝っているケースも見受けられる。こうした個人差に関してさらに追究するために、言語学習能力(ここでは外国語としての英語の学習能力)の特に高い子どもに関する研究を進めた。また、本研究は人間の言語習得に関する基礎研究であるが、外国語教育への応用を目指しており、この目標に従って、研究成果の一部、特に大人と子ども比較研究などについて、外国語教育・外国語学習の視点から、招待講演などで成果報告を行った。小学校英語の教育に貢献するために、海外の児童向け英語教材・外国の小学校英語教科の分析を、子どもの言語学習能力の観点から進めた。小学校で英語が正式な教科として導入されることが現実的になったため、小学生の言語・認知特性からどのような教育システムが妥当なのか、小学校英語教員養成はどうあるべきなのか、といった応用的な側面に関しても研究した。研究代表者の異動もあり、それまでに生じていた遅れを取り戻すに至らないうちに、小学校英語の教科化計画に関連して所属学部の組織改編があり、基礎研究に回せるエフォートが大幅に減ったため。このプロジェクトでは、人間の言語学習を実験室内の統制された条件下で調べるため、短期間で学習できるミニチュア人工文法を用いた研究を行った。日本国内において人工文法を用いた研究は盛んでなく、また、研究代表者自身も未経験だったので、研究期間の初期には、まず、人工文法学習パラダイムを用いた過去の重要な研究を網羅的に調査した。その成果として、国際的な学術誌に最近の人工文法学習パラダイムに関するレビュー論文を掲載した。次に、日本人の大人(大学生)と子ども(未就学児、小学生、中学生)を、同じ人工文法の学習において比較する実験を実施した。自然言語の獲得では、学習者の年齢が違えば学習方法や学習環境も違ってくるが、この実験では異なる年齢の被験者が同じ学習方法・環境で、同じ人工文法を学習した。この実験をまとめた論文を海外の学術誌に投稿したところ受理されなかったが、最終年度にこの論文の大幅な修正を行い、海外の別の学術誌に再投稿した。その結果、リビジョンとなったので現在、改訂に取り組んでいる。