hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規疼痛抑制ペプチドのラット神経系からの単離精製とそのバイオアッセイ法の確立

本研究の目的はAPGWamide様の抗アロディニア活性を有する新規神経ペプチドをラット神経系から単離精製することであり、2728年度で、効率よく単離精製するための精製法とバイオアッセイの法を確立することができた。予備実験としてマウス1000頭分の脳組織をホモジナイズし、遠心分離機で遠沈した後、上清を集め、ロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮液をセファデックスでゲル濾過し分子量で分画した後、活性のあった画分をセップパックC18で前処理し、逆相HPLCで分画した。それぞれの精製段階の画分から一部を取り出し、バイオアッセイに用いた。バイオアッセイはポリエチレン製のカテーテルを髄腔内に留置した糖尿病性神経因性疼痛モデルラットを用いた。von Freyフィラメントによる足底への機械刺激に対する回避行動の閾値を指標にしてカテーテルからマウス脳抽出液の各精製段階の画分を投与し、抗アロディニア活性を調べた。逆相HPLC、陽イオン交換HPLC数段階を経て、最終精製まで進めることができた。残念ながら最終精製物の量が非常に少なく、構造決定までは至らなかった。そこで、2930年度は大量に入手可能なニワトリの脳組織を材料に、確立した精製法とバイオアッセイ法を用いてAPGWamide様の抗アロディニア活性を有する新規神経ペプチドの単離を試みた。その結果マウスの場合と同様の方法で活性物質を単離精製することができた。構造解析の結果、非ペプチド性の化合物で、分子量と構造の一部は解析できたが、完全な構造決定には至っていない。本研究の成果として以下の3点を挙げる。1糖尿病性神経因性疼痛モデルラットの痛み行動を指標としたバイオアッセイ法の確立。2脳組織から抗アロディに活性を示す物質の単離精製法の確立。3脳組織中に非ペプチド性の強力な抗アロディニア活性を持つ新規生理活性物質の存在を確認。本研究の目的はAPGWamide様の抗アロディニア活性を有する新規神経ペプチドをラット神経系から単離精製することであり、27年度は、効率よく単離精製するための精製法の検討とバイオアッセイの法の確立を目指した。濃縮液をセファデックスでゲル濾過し分子量で分画した。活性のあった画分をセップパックC18で前処理し、逆相HPLCで分画した。それぞれの精製段階の画分から一部を取り出し、凍結乾燥し、生理食塩水に溶解してバイオアッセイに用いた。セファデックスのゲル濾過でペプチドと思われる分子量の画分に複数の強い抗アロディニア活性を認めた。それぞれの活性画分のセップパックC18によるのエタノール溶出液、またその活性画分を分画したHPLCの画分にも抗アロディニア活性を認めることができた。最終精製までは進めていないが、糖尿病性神経因性疼痛モデルラットを用いたバイオアッセイ法で各精製過程の抗アロディニア活性を判定することが可能であることが示された。またこの精製法で脳組織から抗アロディに活性を示す神経ペプチドが単離精製できることが示された。27年度は実験計画にしたがって、ラットの神経組織(脳・脊髄)からの抗アロディニア活性持ったAPGWamide様神経ペプチドの精製法の確立と抗アロディニア活性を検定するバイオアッセイ法の確立を目標に1糖尿病性神経因性疼痛モデルラットの作製。2ラット脳脊髄から神経ペプチドの抽出(精製法の確立)。3抗アロディニア活性の検定(バイオアッセイ法の確立)を行った。糖尿病性神経因性疼痛モデルラットの作製は体重約300gのSD系雄ラットを用い、ラット脳抽出物を髄腔内に投与するため、ポリエチレン製のチューブでカテーテルを作り、大槽)からクモ膜下腔に挿入し、先端を腰髄の髄腔内に留置した。続いて、ラットの尾静脈からストレプトゾトシン(STZ)を投与することによって膵臓のβ細胞を破壊し、糖尿病モデルを作製した。糖尿病性神経因性疼痛モデルラットは強いアロディニアを示し、von Freyフィラメントによる足底への機械刺激に対する回避行動の閾値を測定することによって、アロディニアの程度を数値化することが可能である。ラットの脳脊髄からのAPGWamide様神経ペプチド抽出の予備実験としてマウス1000頭分の脳組織からAPGWamide様神経ペプチドの単離精製を試みた。セファデックスによるゲル濾過で分画した画分の一部に抗アロディニア活性が見られた。髄腔内にカテーテルを留置した糖尿病性神経因性疼痛モデルラットを脳抽出物の抗アロディニア活性の検定に使用することができた。さらに、セップパック、HPLCを用いた数段階の精製過程で得られた画分の検定にも同モデルラットが有効に活用できることが分かった。本格的にラットの神経組織からAPGWamide様神経ペプチドを単離精製するための精製法とバイオアッセイ法を確立することができた。

本研究の目的はAPGWamide様の抗アロディニア活性を有する新規神経ペプチドをラット神経系から単離精製することであり、27年度は、効率よく単離精製するための精製法の検討とバイオアッセイ法の確立を目指した。予備実験としてマウス1000頭分の脳組織をホモジナイズし、遠心分離機で遠沈した後、上清を集め、ロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮液をセファデックスでゲル濾過し分子量で分画した。活性のあった画分をセップパックC18で前処理し、逆相HPLCで分画した。それぞれの精製段階の画分から一部を取り出し、凍結乾燥し、生理食塩水に溶解してバイオアッセイに用いた。バイオアッセイはポリエチレン製のカテーテルを髄腔内に留置した糖尿病性神経因性疼痛モデルラットを用いた。von Freyフィラメントによる足底への機械刺激に対する回避行動の閾値を指標にしてカテーテルからマウス脳抽出液の各精製段階の画分を投与し、抗アロディニア活性を調べた。セファデックスのゲル濾過でペプチドと思われる分子量の画分に複数の強い抗アロディニア活性を認めた。28年度は、さらにゲル濾過の活性画分に含まれる物質の精製を進めた。それぞれの活性画分のセップパックC18によるエタノール溶出液、またその活性画分を分画したHPLCの画分にも抗アロディニア活性を認めることができた。逆相HPLC、陽イオン交換HPLC数段階を経て、最終精製まで進めることができた。構造決定までは至らなかったが、1糖尿病性神経因性疼痛モデルラットを用いたバイオアッセイ法で各精製過程の抗アロディニア活性を判定することが可能であることが示された。また2この精製法で脳組織から抗アロディに活性を示す神経ペプチドが単離精製できることが示された。27年度は実験計画にしたがって、ラットの神経組織からの抗アロディニア活性を持ったAPGWamide様神経ペプチドの精製法の確立とバイオアッセイ法の確立を目標に1糖尿病性神経因性疼痛モデルラットの作製2ラット脳脊髄から神経ペプチドの抽出(精製法の確立)3抗アロディニア活性の検定(バイオアッセイ法の確立)を行った。糖尿病性神経因性疼痛モデルラットの作製は体重約300gのSD系雄ラットを用い、ラット脳抽出物を髄腔内に投与するため、ポリエチレン製のチューブでカテーテルを作り、大槽からクモ膜下腔に挿入し、先端を腰髄の髄腔内に留置した。続いて、ラットの尾静脈からストレプトゾトシン(STZ)を投与することによって膵臓のβ細胞を破壊し、糖尿病モデルを作製した。糖尿病性神経因性疼痛モデルラットは強いアロディニアを示し、von Freyフィラメントによる足底への機械刺激に対する回避行動の閾値を測定することによって、アロディニアの程度を数値化することが可能である。27年度から28年度にかけて、ラットの脳脊髄からのAPGWamide様神経ペプチド抽出の予備実験としてマウス1000頭分の脳組織からAPGWamide様神経ペプチドの単離精製を試みた。セファデックスによるゲル濾過で分画した画分の一部に抗アロディニア活性が見られた。さらにその活性画分に含まれる物質の精製を進めた。それぞれの活性画分を濃縮し、セップパックC18によるエタノール溶出、逆相HPLC、陽イオン交換HPLC数段階を経て、紫外線検出器で単一のピークを示す最終精製物を得ることができた。
溶融酸化物系フラックスと金属シリコン間のボロン分配

標記実験に先立ち実験手法の妥当性を確認するため、ボロンを含有していないアルミナ飽和カルシア+アルミナ+シリカ系フラックスと金属シリコン間の分配平衡実験を行った。アルミ、カルシウムの2液相間の分配反応は可逆的に進行し、おおむね3時間で平衡に到達した。実験後のフラックス組成は、従来、Muan et al.によって報告されているアルミナ飽和の液相線組成とほぼ一致すること確認した。また、次式の平衡定数、アルミ+シリコン合金中のアルミの活量から算出したフラックス中のシリカの活量は、CおよびCOガスの共存下で測定された従来の報告値より若干、低値を示すことがわかった。上記、実験方法の妥当性の確認を踏まえて、カルシア+アルミナ+シリカ系フラックスと溶融シリコン間のボロン分配を調査した。その結果、液相線組成や合金中のカルシウムとアルミの濃度の対応関係はボロンを含有しない場合とほとんど相違が無いこと、種々のカルシア/シリカ比に対するボロン分配比は滑らかな曲線関係で表されることがわかり、両相中でのボロンの濃度が1%程度以下の範囲内ではボロンの活量はヘンリー則に従うと見なし得ることがわかった。フラックス組成がアルミナ飽和の領域ではカルシア/シリカ比の上昇と伴にボロン分配比は上昇した。更に、より塩基度の高い酸化物を含有する場合のボロン除去の効果を把握する目的でアルミナ坩堝を用いてカルシウムアルミネート飽和の液体フラックスとの分配平衡実験を行った結果、フラックス組成が2CaO・A1203飽和組成に至るとカルシア/シリカ比の上昇と伴にゆるやかに低下する傾向が認められた。
希少放線菌の運動性胞子が示す高速遊走運動の分子基盤の解明

まず、本研究の対象であるActinoplanes missouriensisの遺伝子操作方法の改良に取り組んだ。様々な検討の結果、MS培地に終濃度40mMのMgCl2を添加した培地と、スターチを主成分とするISP4培地に0.05% Yeastextract, 0.1% Tryptone、終濃度40mMのMgCl2を添加した改変ISP4培地上で遺伝子組換えが極めて容易に行えるようになった。ブレーキタンパク質FtgAの機能解析では、栄養を感知した際のみにブレーキがかかる理由を解明するために、FtgAが存在するCheクラスター内の他の因子と、ブレーキの機能の発揮に関連があるのか検証するため、Cheクラスター1, 2, 3すべてを破壊した株に1コピーのFtgAを相補した株を作製した。この株で正常にブレーキがかかったことから、FtgAの機能とCheクラスター中の他の因子に関係はないと示された。FtgAの相互作用対象と示唆されているFliN, FliG, FliIの組換えタンパク質の取得は難航したが、最終的にGST融合タンパク質として取得に成功した。現在、プルダウン実験を行っている。べん毛形成に必須なチオレドキシンTrxAの機能解析では、CsrA-FliWシステム関係の遺伝子破壊株およびTrxAとの二重破壊株を作製した。その結果、FliWとCsrAは協働しており、おそらくCsrAはfliC mRNAのSD配列付近と、FliWの両者に結合できること、FliWはFliCに結合していることが示唆された。線毛の機能解析では、学習院大学中根助教との共同研究により大幅な進展が見られた。まず、遊走子線毛は平均5.6本、620nm、太さ5nmだった。また、線毛は水圧変化を受けると即座に引き込まれること、疎水性表面に付着すること、親水性表面には付着しないことが判明した。29年度が最終年度であるため、記入しない。トラッキング顕微鏡による遊走子の軌道解析では、軌道そのものの解析は行えたものの、走化性発揮時の詳細な軌道解析を行うことはできなかった。これは、濃度勾配の形成がうまくいっているかどうかの検証ができないために、遊走子の追跡を開始する点をどこにするか定められないことに起因すると考えられた。しかし、不完全な条件下ながら、野生株、Cheクラスター1,2の二重破壊株の遊走子は走化性誘引物質存在下であってもランダムに遊走していることが示唆された(危険率11%で誘引物質存在方向への有意な軌道の偏りあり)。Millicellを用いた実験系により、Cheクラスター1のみが走化性に必要だとほぼ特定できた。FtgAの機能解析では、UVによるランダム変異導入を行い、相互作用対象のタンパク質(以下、標的タンパク質)の探索を行った。そのために、標的タンパク質をコードする遺伝子に変異の入った株をスクリーニングする実験系の構築が完了した。現時点で、構築したスクリーニング系により偽陽性株は複数取得できている。スクリーニング継続中であり、遠からず標的タンパク質に変異の入った株が取得できると考えている。AMIS75470の機能解析では、S. griseusに存在するチオレドキシンホモログ(SGR_690)をAMIS75470破壊株に導入してもべん毛を形成しなかったことと、チオレドキシンの活性残基であるCXXCモチーフ内のシステインをセリンに置換してもべん毛形成能が維持されたため、AMIS75470のべん毛形成における活性は、チオレドキシンによるものではない、と判明した。AMIS75470とSGR690をそれぞれ4分割し、キメラタンパク質を発現するプラスミドを構築してAMIS75470破壊株に導入したところ、AMIS75470の3番目の領域までの領域がべん毛形成能に必須だと判明した。トラッキング顕微鏡による軌道の解析がうまくいっておらず、走化性発揮時の軌道解析が行えていない。また、Millicellをプレパラートの代わりにトラッキング顕微鏡と組み合わせることもうまくいっていない。べん毛回転を停止させるブレーキだと考えているFtgAがCheクラスター1の中に存在しており、Millicellの実験によってCheクラスター1が走化性に必須だと考えられた。そのため、A. missouriensisにおける走化性では遊走方向の能動的な変化ではなく、好ましい環境でのべん毛回転停止が重要かもしれない。その場合、最高速度の物体を追跡するトラッキング顕微鏡では現象の把握が困難である可能性がある。こうした現状を打開するためには、遊走子をシングル化できるようなマイクロデバイスを新しく作製して観察を行うか、高解像度のカメラを用いて広い視野で観察する必要があると考えている。FtgAの機能解析においては、標的タンパク質の決定には至っていないものの、実験系の構築は行うことができた。一方で、生化学的にFtgAの標的タンパク質を特定する試みも行ったが、FtgAの発現量が低く、検出できなかった。AMIS75470の機能解析では、作用部位の絞り込みができた。一方で、単独の活性残基の特定には至っておらず、手詰まり感もある。遊走状態の胞子(以下、遊走子)のブレーキだと考えているFtgAの機能解析では、作用対象特定のため3種類の実験を行った。(1)大腸菌内でのツーハイブリッド法(BACTH)により、べん毛

基部タンパク質のFliG, FliN, FliIとFtgAの相互作用を検出した。FliGとFliNはべん毛基部のCリング、FliIはCリング内側のATPaseである。現在、in vitro実験により更なる解析を行っている。(2)FtgAの作用点がべん毛基部であることの証拠を得るために、蛍光タンパク質融合FtgA発現株を作製したが、これらの株の遊走子はブレーキがかからず、蛍光タンパク質によるFtgAの機能阻害が示唆された。(3)標的タンパク質に変異が入ることを期待したUV照射によるランダム変異導入株作製を行った。FtgAとは無関係な経路の存在が示唆された。現在、詳細について解析中である。べん毛形成に必須なチオレドキシンの機能解析では、継続中だったキメラタンパク質発現株作製による、べん毛形成に必須な残基が"EKVEQ"と特定した。また、BACTH法により、FliWとAMIS75470の相互作用が検出された。FliWは細胞質内のFliC存在量の調節因子であり、現在詳細を解析中である。当初の計画には記載していなかったが、線毛をコードする遺伝子群の破壊により、遊走子の凝集性が極めて高くなることを発見した。遊走停止時の遊走子の様子との関連などを解析中である。さらに、遺伝子操作方法の改良に取り組んだ結果、ゲノム組込み型ベクターであれば確実に導入可能な接合用培地の処方を見出した。現在、遺伝子破壊株作製を容易にするために、CRISPR/Cas9システムの導入を目指している。FtgAの解析では、当初の予定通りFtgAの作用対象と考えられるタンパク質の絞り込みを行えた。また、UV変異導入により、ブレーキ関連タンパク質の制御が翻訳後の段階で行われているかもしれない示唆を得ることができた。AMIS75470の解析では、チオレドキシンとしての活性ではなく、表面に露出すると考えられるEKVEQの5アミノ酸残基がべん毛形成に必須と特定した。さらに、FliCの存在量制御に関わるFliW-CsrAシステムとの関連が示唆されたことにより、DC1申請時には全く手がかりのなかったAMIS75470の機能の解析について大きく進展した。さらに、線毛遺伝子群の興味深い性質を見出したこと、遺伝子操作が簡便(または確実)になりつつあることを考えると、当初の計画以上に進展していると判断する。まず、本研究の対象であるActinoplanes missouriensisの遺伝子操作方法の改良に取り組んだ。様々な検討の結果、MS培地に終濃度40mMのMgCl2を添加した培地と、スターチを主成分とするISP4培地に0.05% Yeastextract, 0.1% Tryptone、終濃度40mMのMgCl2を添加した改変ISP4培地上で遺伝子組換えが極めて容易に行えるようになった。ブレーキタンパク質FtgAの機能解析では、栄養を感知した際のみにブレーキがかかる理由を解明するために、FtgAが存在するCheクラスター内の他の因子と、ブレーキの機能の発揮に関連があるのか検証するため、Cheクラスター1, 2, 3すべてを破壊した株に1コピーのFtgAを相補した株を作製した。この株で正常にブレーキがかかったことから、FtgAの機能とCheクラスター中の他の因子に関係はないと示された。
口腔内湿潤度と睡眠中の呼吸および睡眠時ブラキシズムの関係

睡眠時無呼吸症候群や睡眠時ブラキシズムにおいて、違和感が少なく、簡便で安全性の高い治療は未だない。唾液分泌とそれらの病態との関係が推測される中、本研究は口腔内湿潤度とそれらの病態の関係性、および人工唾液による改善効果について、実際に睡眠測定を行い、被験者群と口腔乾燥症患者群とを比較して、検討していくものである。
昆虫視葉板における色覚初期過程の解剖学的・生理学的解析

昆虫における色覚情報処理の初期過程とその進化を解明するため、視覚第一次中枢(視葉板)に的を絞り、次の2項目について徹底的な実験研究を行うことを目的とした。第一に、昆虫視覚神経系の連続ブロック表面走査電顕(SBF-SEM)による観察法を確立、視葉板カートリッジの全シナプスを記載するコネクトーム解析を行うこと、第二に、視細胞と視覚二次ニューロン(lamina monopolar cell, LMC)の波長対比性反応の機構を、電気生理学と分子細胞生物学の手法で解明することである。第一点について、1個体のアゲハで6個眼分のコネクトーム解析を完成させた。各個眼ごと、9個の視細胞と4個のLMCが含まれている。個眼間の結合も解明した。また、モンシロチョウとモンキチョウの視葉板の連続切片像も獲得し、少なくとも視細胞9番がこれまで言われていたように視髄まで軸索を伸ばす長視細胞ではなく、視葉板で終末する短視細胞であることが分かった。第二点については、アゲハ視覚系で同定したヒスタミン駆動性Cl-チャネル2種(PxHCLAとB)について、培養細胞で強制発現されたチャネルがヒスタミンとGABAの双方に感受性を持つことを示した。また、特異的抗体を用いた免疫組織化学的実験で、Aは視細胞と二次ニューロンのシナプスに、Bは視細胞同士のシナプスに発現していることが分かった。さらに、視葉板における視細胞終末部、およびLMCの軸索からは、波長対比性の反応が多く記録されることも確認できた。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。昆虫における色覚情報処理の初期過程とその進化を解明するため、視覚第一次中枢(視葉板)に的を絞り、(1)ナミアゲハ視葉板カートリッジのコネクトーム解析、(2)視細胞と視覚二次ニューロンの波長対比性反応の解析、(3)視葉板における外界表現のシミュレーション、(4)視葉板細胞構成の種間比較を行う。初年度は(1)アゲハ視葉板のコネクトーム解析と(2)波長対比性反応解析の立ち上げに全力を傾注した。(1)アゲハ視葉板のコネクトーム解析:今年はSBF-SEM法に最適化した固定およびブロック染色法を開発した。アゲハ視葉板をアルデヒドで前固定した後、還元オスミウム、四酸化オスミウム、酢酸ウラニル、硝酸鉛の濃度、温度、処理時間を調整し、条件を最適化した。この段階での解析で、1つの視葉板カートリッジ(1個眼に対応するモジュール構造)を構成する全細胞の形態と位置関係を調べた。その結果、アゲハ視葉板カートリッジひとつには形態的に区別できる4種類のLMCが存在する可能性が示唆された。(2)波長対比性反応の解析:焦点を視細胞軸索末端に絞って解析する。視細胞間抑制性シナプスの実体を解明するため、ヒスタミン駆動性Cl-チャネルに対する抗体を作成、視葉板内での局在を免疫組織学的に調べた。同定された2つの分子PxHCLAとPxHCLBのうち、PxHCLBが視細胞末端に発現している可能性が示唆された。アゲハ視覚系に存在するヒスタミン駆動性クロライドチャネルの候補分子2種を同定、これらの分子の局在を光学顕微鏡レベルの免疫組織化学の手法で解明した。昆虫における色覚情報処理の初期過程とその進化を解明するため、視覚第一次中枢(視葉板)に的を絞り、(1)ナミアゲハ視葉板カートリッジのコネクトーム解析、(2)視細胞と視覚二次ニューロンの波長対比性反応の解析、(3)視葉板における外界表現のシミュレーション、(4)視葉板細胞構成の種間比較を行っている。初年度に立ち上げたシステムを使って、(1)アゲハ視葉板のコネクトーム解析と(2)波長対比性反応解析について以下の実験を行った。(1)アゲハ視葉板のコネクトーム解析:アゲハ2個体について複眼中央部につながる視葉板領域から連続切片像のデータを取得した。うち1個体から3タイプの個眼それぞれに由来する3つの視葉板カートリッジについて、視細胞と二次ニューロン(LMC)の形態を3次元再構築で明らかにした。これまでは、一個眼に含まれる9個の視細胞R1-9のうち、R1, 2と9が視葉板を経由して第二次視覚中枢まで軸索を伸ばしているとされていたが、R9は視葉板で終末していることがわかった。(2)波長対比性反応の解析:アゲハ視覚系で同定したヒスタミン駆動性Cl-チャネル候補分子PxHCLAとPxHCLBについて、これを培養細胞に発現させ、ホールセルパッチ法で生理学的特性を調べた。結果、実際にヒスタミンの投与によって内向きのCl-電流が生ずることが明らかになった。これらの分子に対する特異的抗体を用いて、視葉板内での局在を免疫組織学的に調べた。光学顕微鏡レベルでは、両分子ともに視覚中枢に分布していることが明らかとなった。さらに細かな分布を電子顕微鏡レベルの免疫組織化学で調べ、PxHCLAについてはその視細胞とLMCの間のシナプスに存在することが確かめられた。アゲハで同定した2種のヒスタミン駆動性クロライドチャネルの候補分子について、培養細胞での発現とホールセルパッチ法による生理特性の測定に成功したため。

昆虫における色覚情報処理の初期過程とその進化を解明するため、視覚第一次中枢(視葉板)に的を絞り、(1)ナミアゲハ視葉板カートリッジのコネクトーム解析、(2)視細胞と視覚二次ニューロンの波長対比性反応の解析を行った。(1)アゲハ視葉板のコネクトーム解析:前年度から解析を続けているアゲハ2個体のうち1個体について、3タイプの個眼それぞれに由来する合計5つのカートリッジについて、視細胞と二次ニューロン(LMC)の形態を3次元再構築で明らかにした。アゲハに近縁のメスアカモンキアゲハでは、古典的なゴルジ法により、4タイプのLMCが存在することは報告されていたが、個々のカートリッジに含まれるLMCの数と種類は明らかになっていなかった。本研究で初めて、いずれのカートリッジにもLMCは4つずつ含まれ、ひとつのカートリッジに含まれる4つのLMCはそれぞれ形態の違う4タイプであることがわかった。4タイプは、中央シャフトの太さおよびシャフトから伸びる側枝の密度と長さによって区別できた。ただし、アゲハとメスアカモンキアゲハではLMCの形態に違いがあった。これは視覚機能の種間差に関係しているものと思われる。(2)波長対比性反応の解析:アゲハ視覚系に発現するヒスタミン駆動性Cl-チャネル候補分子PxHCLAとPxHCLBを培養細胞に発現させ、ホールセルパッチ法で生理学的特性を調べた。本来の伝達物質であるヒスタミンの他、アゲハ視葉板で存在が確認されている他の伝達物質候補(GABA、Dグルタミン酸、Lグルタミン酸、セロトニン、チラミン)に対する反応性も調べた。GABAのみが、PxHCLAとPxHCLBにCl-電流が生じさせたが、他の物質は全く効果が無かった。またこれらのチャネルの分布を免疫電顕法で調べた結果、PxHCLBは視細胞間シナプスに存在する可能性が極めて高いことがわかった。ショウジョウバエでは全くその機能が知られていなかったHCLBチャネルが、我々がとくに注目している視細胞間シナプスに存在することが新たに分かった。またこのチャネルはショウジョウバエと異なり、ヒスタミンとGABAの両方に反応することが、パッチクランプ法で明らかになった。さらに、並行して行っていた研究で、アゲハにもCRISPR-Cas9法が有効であることがわかった。いずれの結果も全く予期していなかったことで、研究の新しい展開が強く期待できる状況になった。昆虫における色覚情報処理の初期過程とその進化を解明するため、視覚第一次中枢(視葉板)に的を絞り、次の2項目について徹底的な実験研究を行うことを目的とした。第一に、昆虫視覚神経系の連続ブロック表面走査電顕(SBF-SEM)による観察法を確立、視葉板カートリッジの全シナプスを記載するコネクトーム解析を行うこと、第二に、視細胞と視覚二次ニューロン(lamina monopolar cell, LMC)の波長対比性反応の機構を、電気生理学と分子細胞生物学の手法で解明することである。第一点について、1個体のアゲハで6個眼分のコネクトーム解析を完成させた。各個眼ごと、9個の視細胞と4個のLMCが含まれている。個眼間の結合も解明した。また、モンシロチョウとモンキチョウの視葉板の連続切片像も獲得し、少なくとも視細胞9番がこれまで言われていたように視髄まで軸索を伸ばす長視細胞ではなく、視葉板で終末する短視細胞であることが分かった。第二点については、アゲハ視覚系で同定したヒスタミン駆動性Cl-チャネル2種(PxHCLAとB)について、培養細胞で強制発現されたチャネルがヒスタミンとGABAの双方に感受性を持つことを示した。
環境負荷低減と耐久性の向上に着目した複合リサイクル材料の新展開

本年度は、超軟弱粘性土地盤を想定し、高含水比140%程度の粘性土に対して本研究で提案する新複合リサイクル材を異なる添加率で添加した安定処理土を作製し、複合リサイクル材の添加率の違いが強度変形特性に及ぼす短期養生(1日8日)の影響を明らかにした。得られた結果は、軟弱な地盤におけるトラフィカビィティーの改善や工期の短縮につながるものと考えられる。また、同試料に対して締固め土を作製し、締固め特性と強度の関係に及ぼす短期養生の影響も解明した。さらに、地盤環境工学観点から重金属類(フッ素、ホウ素、六価クロム、カドミウム、ヒ素等)の溶出量を最も厳しい条件である新材料単体としての溶出試験により確認し、その溶出量が環境基準値を満足するかについても確認した。一方、上記複合リサイクル材料を用いて開発したコンクリートの基礎性能を評価し、その適用性を検討するため、異なる量の複合リサイクル材料を添加したコンクリートの圧縮強度試験、曲げ強度試験、熱分析試験、水銀圧入試験、長さ変化率試験を行った。また、SEM観察、X線回折分析試験も並行することで、エトリンガイトの生成を確認・評価するとともに、エトリンガイトの生成、組成変化が細孔構造の変化へ及ぼす影響、組細孔構造の変化が強度特性へ及ぼす影響の考察へ展開した(図ー1参照)。これらの検討・評価を通じて、複合リサイクル材料を用いたコンクリートの強度発現機構を解明するとともに、エトリンガイトの生成とコンクリートの収縮・膨張の相関関係を抽出し、高強度・無収縮コンクリートへの最適配合を提案した。計画通り進行している。複合リサイクル材料からの重金属類の溶出抑制メカニズムの解明...本研究で提案している廃石膏から再生した半水石膏、石炭灰、高炉スラグ、高炉セメントB種を用いた複合リサイクル材料が、近年土壌の環境問題となっているフッ素に加え,ホウ素,六価クロム,カドミウム,ヒ素等の重金属類の溶出を抑制する効果およびそのメカニズムを明らかにする予定である。研究代表者は、これまでに行ってきた実験から廃石膏を添加したセメント安定処理土には、土構造に多量のエトリンガイトが生成されており、この生成量が重金属類の溶出量を大きく低下させていることを明らかにしている。そこで本年度では先述した新複合リサイクル材の添加率が重金属(例えばヒ素)を含有した土試料に及ぼす影響を詳細に実証するため、内部において化学反応によって生成された物質(例えば、エトリンガイト)を定量的に評価するために、溶出試験を実施する予定である。
自殺発芽誘導による根寄生雑草の防除

本研究は、半乾燥地を中心に農業に甚大な被害をもたらしている根寄生雑草の防除に資することを目的として、発芽刺激物質、発芽阻害物質の探索ならびに発芽調節機構の解明を行った。スーダンのソルガム畑で立ち枯れたストライガの個体から分離したFusarium solaniの代謝産物がストライガの発芽を阻害することを見いだし、活性成分として、neosolaniolおよびその3種のアセチル化物(acuminatin,8-acetylneosolaniol, diacetylneosolaniol)を同定した。これら一連のトリコテセン(trichothecenes)のストライガに対する発芽阻害活性はアセチル化に伴い上昇したが、完全にストライガの発芽を阻害する濃度で、宿主植物ソルガムの発芽および初期生育にも阻害を示した。スクリーニングの結果最も高い発芽刺激活性を示したコウモリカヅラの根の培養液から、活性成分として(+)-strigolを単離した。極めて生産性が高いことから、今後、この培養系を用いて、ストリゴラクトンの生合成の解明が期待される。エチレン生合成に関わる2種類のACC合成酵素(SHACS1,SHACS2)および1種類のACC酸化酵素(SHACO1)を単離し、発現を調べた。その結果、SHACS1は発芽処理に応答して、SHACO1はコンディショニングに応答して発現が高まることが明らかとなった。このことから、ストライガ種子はSHACS1およびSHACO1によってそれぞれ宿主と環境を認識しており、生育条件が満たされていることを確認してエチレン生合成を活性化し発芽すると考えられた。これまでに根寄生雑草の発芽刺激物質として、ストリゴラクトンと総称される構造のきわめて類似した4種の化合物が見出されている。本研究は自殺発芽の誘導を可能とする新規な発芽刺激物質の発見を目的の一つとしている。発芽刺激活性に基づいて各種植物と微生物の培養液、抽出物のスクリーニングを行うとともに、既知の刺激物質の簡易な同定法の確立を行った。その結果、HPLCによりストリゴールとソルゴラクトンが分離できること、および生物検定と組み合わせたLC-ESI-MSによりストリゴールが同定可能であることを確認した。検出限界は10ng程度であった。一方、コンディショニングおよび発芽刺激物質に対する種子の生理的応答を調べた結果、コンディショニングに伴い、種子による投与したACCのエチレンへの酸化が活性化されることを見出した。この場合に、エチレン生成量と発芽率には正の相関が認められた。さらに各種阻害剤と発芽刺激物質を組み合わせて種子のエチレン生成と発芽の関係を調べた結果、発芽刺激物質はエチレン生合成を活性化して発芽を誘導することを確認した。このことから、エチレン生合成系が代謝制御による自殺発芽誘導の有力な標的であると考えられた。本年度は、根寄生雑草の発芽刺激物質の精製と並行して、発芽阻害物質の精製に注力した。スーダンのソルガム畑で立ち枯れたストライガ(Striga hermonthica)の個体から分離したFusarium solaniの代謝産物がストライガの発芽を阻害することを見いだした。本菌のメタノール抽出物を水に懸濁し、ヘキサンで脱脂後、クロロホルムで活性成分を抽出した。これをシリカゲルカラムで分離し、4つの活性画分を得た。各種機器分析によりそれぞれに含まれる主成分を、neosolaniolおよびその3種のアセチル化物(acuminatin,8-acetylneosolaniol,diacetylneosolaniol)と同定した。これら一連のトリコテセン(trichothecenes)のストライガに対する発芽阻害活性はアセチル化に伴い上昇し、diacetylneosolaniolと8-acetylneosolaniolは10ppmで完全にストライガの発芽を阻害した。本菌が最も多量に生産する8-acetylneosolaniolについて、宿主植物のソルガムの初期生育に対する影響を調べた。本物質は10ppmではソルガムの発芽に全く影響を与えなかった。100ppmでも発芽率を10%ほど低下させたのみであった。一方、ソルガム幼植物の生育は発芽よりも大きな影響を受けた。10ppmで地上部の生育は20%、根の伸長は40%阻害された。

本研究は、半乾燥地を中心に農業に甚大な被害をもたらしている根寄生雑草の防除に資することを目的として、発芽刺激物質、発芽阻害物質の探索ならびに発芽調節機構の解明を行った。スーダンのソルガム畑で立ち枯れたストライガの個体から分離したFusarium solaniの代謝産物がストライガの発芽を阻害することを見いだし、活性成分として、neosolaniolおよびその3種のアセチル化物(acuminatin,8-acetylneosolaniol, diacetylneosolaniol)を同定した。これら一連のトリコテセン(trichothecenes)のストライガに対する発芽阻害活性はアセチル化に伴い上昇したが、完全にストライガの発芽を阻害する濃度で、宿主植物ソルガムの発芽および初期生育にも阻害を示した。スクリーニングの結果最も高い発芽刺激活性を示したコウモリカヅラの根の培養液から、活性成分をとして(+)-strigolを単離した。極めて生産性が高いことから、今後、この培養系を用いて、ストリゴラクトンの生合成の解明が期待される。エチレン生合成に関わる2種類のACC合成酵素(SHACS1,SHACS2)および1種類のACC酸化酵素(SHACO1)を単離し、発現を調べた。その結果、SHACS1は発芽処理に応答して、SHACS1はコンディショニングに応答して発現が高まることが明らかとなった。このことから、ストライガ種子はSHACS1およびSHACO1によってそれぞれ宿主と環境を認識しており、生育条件が満たされていることを確認してエチレン生合成を活性化し発芽すると考えられた。
高等植物葉緑体ストロマ空間に存在する分子シャペロンHsp93の機能及び構造解析

研究代表者は、これまでに高等植物葉緑体ストロマ空間に存在するCタイプHSP100の一つであるHsp93が細胞質で合成された後、葉緑体へ輸送される蛋白質の葉緑体包膜に存在する蛋白質輸送装置の一因子であることを明らかにし、葉緑体においては、Hsp93がミトコンドリアマトリクスに存在するHSP70と同じ役割を果たしているのではないか、と考えている。研究代表者は、Hsp93の葉緑体蛋白質輸送における機能を解析する第一歩として、Hsp93のもつ2つのATP結合ドメインを部位特異的変異法によって改変した変異型リコンビナントHsp93を解析することによって、各々のATP結合ドメインの役割の解明を試みた。これまでのところ、他のHSP100に無い特徴、すなわち、C末端側のATP結合ドメインが、Hsp93が葉緑体内包膜と結合するために重要であることが判明した。現在、変異型Hsp93の個々のATP結合ドメインの機能をATP分解活性、多量体形成等の生化学的な見地から研究を進めている。N末端にヒスチジンタグを持つHsp93を大腸菌でリコンビナント蛋白質の生産には成功し、精製を試みたが、かなりの量の夾雑蛋白質が観察され、更にATP分解活性が極めて低い蛋白質しか得られなかった。これは、リコンビナント蛋白質が、正しい構造をとっていないことに起因すると考えられ、現在、無細胞蛋白質合成系によって、Hsp93の取得を試みている.一方、Hsp93の機能解析の上で重要なHsp93と相互作用する葉緑体蛋白質を検索しており、抗Hsp93抗体を用いたイムノアフィニティーカラムを用いることにより、いくつかの蛋白質が検出されている。そこで、現在それらの蛋白質の同定もあわせて試みている。
シリカ細孔内におけるRNA3塩基認識の熱力学

本研究では,リボソームなどで見られる3塩基認識の詳細解明を目的として,メソポーラスシリカが持つ均一メソ細孔空間を反応場とする実験系を構築し,以下の研究課題を遂行した。(1)細孔内過冷却水を利用した短鎖DNA二重鎖の構造安定性評価:シリカメソ細孔内では3塩基認識が効率的に進行することを見いだした。(2)ループ構造を持つヘアピンループ構造の細孔内安定性:ループ部位のわずかな構造変化によって構造安定性が細孔内で低下することを見いだした。(3)短鎖DNA二重鎖の安定性におよぼす空隙サイズの影響:サイズマッチングによる飛躍的な構造安定化を定量的に評価した。3塩基認識は,リボソームでのタンパク質合成において重要な役割を担っている。しかし,in-vitro系での実験的困難さから,その熱力学的安定性に関する知見は得られていない。本研究では,無機ナノ空間内におけるRNAの3塩基認識に関する一連の(塩基配列やミスマッチの有無)熱力学的パラメーターの算出を目指している。本研究では,以下の3課題について研究を進めた。1)トリプレットリピートDNAを用いた検証:CCGトリプレットリピートの熱安定性について計測する蛍光プローブの検討を行った。その結果,一般的な蛍光プローブであるフルオレセイン,ローダミン系のプローブ色素はグアニンによる蛍光消光の影響が大きく,本系において適用できないことが分かった。一方,チアゾールオレンジを蛍光プローブとした構造安定性の検証が可能であることを見いだした。2)細孔サイズの検証:チアゾールオレンジを用いて(CCG)4トリプレットピーとの構造安定性を検証した。実験においては,チアゾールオレンジ吸着(CCG)4をメソポーラスシリカ粒子の細孔空間(細孔サイズ:3.4,5.3 nm)に吸着させて,蛍光桜桃の温度依存性から構造変性の観測を行った。その結果,細孔径の大小にかかわらずバルク溶液系と比べて構造が不安定化されていることが示唆される結果を得た。これは,当初予定していた構造安定化とは逆の結果であることから,構造不安定化の要因について検討を現在進めている。本研究では,無機ナノ細孔空間内におけるRNAの3塩基認識に関する一連の(塩基配列やミスマッチの有無など)熱力学的パラメーターの算出を目指している。平成27年度は,以下の課題について研究を進めた。【トリプレットリピートDNAを用いた検証】(CCG)4トリプレットリピートは,3塩基の塩基対で形成されるステム部位を有するヘアピンループ(HL)構造を形成するため,HL構造をモデルとしたアミン修飾シリカ細孔内における熱力学的パラメーター算出を検討した。その結果,バルク溶液中に比べて細孔内ではHL構造が若干不安定化すること(融解温度が約10°C低下,エンタルピー変化の差が0.8 kcal/mol)を見いだした。この結果は,ループ部位と細孔内壁との相互作用によってHL構造が変化することを示唆するものであり,当初予定していたHL構造を利用したRNA3塩基認識の検証が困難であることが分かった。【細孔サイズの検証】不凍水(水/エタノール混合溶液)を利用した短鎖DNA断片の二重鎖形成エンタルピーを決定する実験系を構築した。この実験系を利用して3塩基DNA断片の二重鎖形成エンタルピーと細孔サイズの相関を検証した。その結果,二重鎖形成エンタルピーがバルク溶液系での推定値に比べて低下すること,また,エンタルピーが細孔サイズによって変化することを見いだした。これは,空間サイズも考慮した3塩基認識過程の検証が今後可能であることを示すものである。また,本年度においては,RNA3塩基認識のためのシリカ細孔内壁の修飾についても検討を行った。研究計画段階で予定していたヘアピンループ構造を用いた検証が,ループ部位の存在によって妨害を受けることをこれまでに確認した。そこで,検証のために適切なDNA構造を模索するために,やや達成度が遅れている。申請者らは,無機ナノ空間内において3塩基DNA鎖間での二本鎖形成反応がほぼ定量的(90%以上)に進行することを,これまでに見いだしてきた。本研究では,無機ナノ空間内におけるRNAの3塩基認識に関する一連の(塩基配列やミスマッチの有無)熱力学的パラメーターの算出を目指した。【トリプレットリピートDNAを用いた検証】(CCG)4トリプレットリピートは,3塩基の塩基対で形成されるステム部位を有するヘアピンループ構造を形成する。このトリプレットリピートについては前年度までにアミン修飾シリカナノ細孔内で若干不安定化することを見いだしている。本年度は,細孔径が3.513 nmの範囲でトリプレットリピートの構造安定性が変化しないことを確認した。これは,細孔内壁とループ部位との強い静電相互作用による構造変性と不安定化を意味する。【細孔サイズの検証】これまでに,ループ部位が存在しないDNA二重鎖は細孔内で安定化し,ループ部位を有するヘアピンループ構造では逆に不安定化することを見いだしてきた。そこで,34塩基DNA二重鎖について,構造安定性・平衡定数と細孔サイズの関係を精査した。

その結果,DNA二重鎖の幅(直径)と細孔空間サイズが一致すると2桁以上平衡定数が増大することを明かとし,サイズマッチング効果によるDNAの構造安定性の定量的評価を初めて達成した。本研究では,リボソームなどで見られる3塩基認識の詳細解明を目的として,メソポーラスシリカが持つ均一メソ細孔空間を反応場とする実験系を構築し,以下の研究課題を遂行した。(1)細孔内過冷却水を利用した短鎖DNA二重鎖の構造安定性評価:シリカメソ細孔内では3塩基認識が効率的に進行することを見いだした。(2)ループ構造を持つヘアピンループ構造の細孔内安定性:ループ部位のわずかな構造変化によって構造安定性が細孔内で低下することを見いだした。(3)短鎖DNA二重鎖の安定性におよぼす空隙サイズの影響:サイズマッチングによる飛躍的な構造安定化を定量的に評価した。ひも状の二重らせん構造についてはシリカ細孔内で安定化されていた一方で,ヘアピンループ構造では逆に不安定化されることが平成26年度内の研究で判明した。ヘアピンループ構造の構造不安定化の要因を検証するために,やや達成度が遅れている。検証のための適切なDNA構造を模索した。その結果,短鎖DNA断片の二重鎖形成を利用した検証を行ったところ,3塩基認識に関わるエンタルピーの決定,およびエンタルピーの細孔サイズ依存性に関する新しい知見が得られた。今後は,短鎖DNA断片の二重鎖形成を利用した実験系の改良(現在はCG塩基対を含むDNAに適用できない)を行うことで,一連の塩基配列での熱力学的パラメーター算出を目指す。分析化学当初は,ヘアピンループ構造をモチーフとして3塩基認識の熱力学的エネルギーを系統的に精査する予定であった。現在進めているヘアピンループ構造の構造不安定化の要因を検証後,目的達成に必要な二次構造を再設計など適切な実験系の構築を行っていく予定である。なお,構造変化を観測する蛍光プローブとしてはチアゾールオレンジが適切であることは,これまでの研究で確認している。従って,適切な実験系の構築後,チアゾールオレンジを用いた3塩基認識の検証を進める。研究計画段階で予定していたヘアピンループ構造を用いた検証が,ループ部位の存在によって妨害を受けることをこれまでに確認した。そこで,検証のために適切なDNA構造を模索するために,やや達成度が遅れている。このように研究進行が若干遅れているために,繰越金が生じた。当初は,ヘアピンループ構造をモチーフとして3塩基認識の熱力学的エネルギーを系統的に精査する予定であったが,ヘアピンループ構造は予想に反してシリカ細孔内で不安定化することが分かった。その原因を解明するために研究がやや遅れており,次年度使用額が生じることとなった。本研究を遂行するために必要不可欠な,DNAや試薬の購入のために使用する。今後は,ヘアピンループ構造の構造不安定化の要因を検証後,目的達成に必要な二次構造を再設計など適切な実験系の構築を行っていく予定である。構造不安定化要因の検証に必要な試薬,溶媒,合成DNAなど消耗品として使用する。
細胞接着分子誘導阻害に基づく抗動脈硬化薬の開発研究

2年間にわたり、細胞接着分子誘導阻害活性を持つ2種の海洋産天然物、ハリクロリンおよびラソノリドAの合成研究ならびにハリクロリン合成中間体の生物活性評価を行い以下1-3の成果を得た。1、ハリクロリンの合成研究:前年度に確立した三環性コア部分の合成法を基盤に、全合成に向けて研究を展開した。その結果、全合成には至らなかったものの、重要鍵中間体までの大量合成ルートを確立することができ、数種の化合物を3で述べる生物活性試験に供することができた。また、光学活性体の合成をめざして検討を行い、鍵となるアザスピロ環部のエナンチオ選択的合成を達成した。この方法も短工程で収率も高く効率的なものである。今後、光学活性体としての全合成に大きく寄与できる結果である。2、ラソノリドAの合成研究:全合成において鍵となる2種のヒドロピラン環部のうち、C1-C16セグメントの高立体選択的合成法を確立することができた。また、C18-C25セグメントの合成も行ったが、予期に反し、C21位でのエピ化が起こり、目的物のジアステレオマーが得られた。今後、この点の解決と全合成の完結に向けて検討を加えたい。3、ハリクロリン合成中間体の細胞接着・浸潤を制御する新規医薬品リード化合物の探索:ハリクロリンを範とし、動脈硬化や難治性炎症疾患治療に有効な薬物の開発につながるリード化合物の創製を目的に、今回合成した中間体を用いて、その生物活性評価を行った。正常およびガン由来細胞株を用いてスクリーニングを行った結果、一つの化合物にアポトーシス様の現象が観測された。このものは、最もハリクロリンに類似した骨格構造と官能基を有しており、天然物そのものもアポトーシスを誘導する可能性が期待され、全合成の意義がますます大きくなった。今後、本来のVCAM-1誘導阻害活性のみならず、アポトーシスの誘導に関する生物活性についても詳細な検討を加え、分子機構の解明と新規リード化合物の創製をめざしたい。動脈硬化や種々の難治性炎症疾患に対する治療薬の開発を最終目的に、細胞接着分子誘導阻害活性を有する2種の海洋産天然物、ハリクロリンおよびラソノリドAの効率的な全合成を目指し検討を行い、以下のような成果を得た。1、ハリクロリンに関しては、薬理活性評価と合成ルートの確立のため、まずラセミ体で合成を検討した。簡便で高立体選択的な連続的Michael付加-[3+2]付加環化反応を用い、スピロ環部を合成後、立体化学の反転、増炭を経てラクタム環化を行いキノリチジン環を構築した。これに対し、位置選択的に2重結合を導入し、全合成において鍵となる三環性キノリチジンコア骨格の合成法を確率した。また、全く別のルートで、光学活性体の合成についても検討を行った。市販の安価な原料をパン酵母を用いて還元し、高いエナンチオ選択性で四級炭素を含むシクロペンタン部を構築した。次いで、増炭、パラジウム触媒を用いる環化を経て、光学活性アザスピロ化合物の合成に成功した。2、ラソノリドAの合成については、鍵となる四級不斉中心を含むヒドロピラン環部の合成をめざした。

我々が独自に開発、確立したシリルメチルラジカルの[5-exo-tig]型の付加による不斉四級炭素構築法を活用し、ピラン環上に存在する四個の不斉炭素の構築を試みた。その結果、アノメリック炭素の立体化学が天然物とは全く逆の化合物が選択的且つ高収率で得られた。現在、その立体化学の反転を検討しており、重要鍵パートの合成に接近中である。本年度は、細胞接着分子誘導阻害活性を持つ海洋産アルカロイド、ハリクロリンの誘導体合成と生物活性評価を中心に検討した。また、同活性ならびに肺ガン抑制活性を持つ海洋産マクロリド、ラソノリドAにおけるピラン環部の合成研究を行った。1、ハリクロリン誘導体の合成:前年度に確立した三環性コア部分の合成法を基盤に、活性発現に必須と考えられる2環性スピロ化合物や三環性スピロキノリチジン骨格構造を有する数種の化合物を合成した。バイオアベイラビリティーを考慮して官能基変換も行った。また、光学活性体の合成をめざして検討を行い、パン酵母還元を活用する方法で、鍵となるアザスピロ環部の効率的且つエナンチオ選択的合成を達成した。2、ハリクロリン合成中間体の細胞接着・浸潤を制御する新規医薬品リード化合物の探索:ハリクロリンを範とし、動脈硬化や難治性炎症疾患治療に有効な薬物の開発につながるリード化合物の創製を目的に、今回合成した中間体を用いて、その生物活性評価を行った。正常およびガン由来細胞株を用いてスクリーニングを行った結果、一つの化合物にアポトーシス様の現象が観測された。このものは、最もハリクロリンに類似した骨格構造と官能基を有しており、天然物そのものもアポトーシスを誘導する可能性が期待され、全合成の意義がますます大きくなった。3、ラソノリドAの合成研究:全合成において鍵となる2種のヒドロピラン環部のうち、C1-C16セグメントの合成を検討し、高ジアステレオ選択的アルドール反応を基盤とする効率的な合成法を確立することができ、全合成達成に大きく貢献する知見をた。
シナプスの可塑性

テンジクネズミの海馬体から作製した薄切片について、興奮性シナプス後電位(EPSP)の素量解析を行う新しい方法を開発した。この方法によって、ホルボルエステルによるシナプス伝達の長期増強が主にシナプスボタンからの伝達物質放出促進によることを証明した(山本)。幼若ラットの脊髄と筋神経の標本では、外液のCaイオンとMgイオン濃度を増しても求心線維末端近傍でのインパルス伝導遮断は起らない。したがって、振動数増強や振動数減弱はインパルス伝導遮断部位の移動によるものではなく、伝達物質素量の放出促進や抑制によって生ずると考えられる(久野)。ウシガエルの摘出した交感神経節に3種の長期増強を分類した。つまり、Caイオンによるシナプス前性の長期増強、シナプス後細胞のシナプス下膜上の伝達物質受容体の感受性増大による長期増強、およびサイクリックAMPを介するアドレナリン性のシナプス前性長期増強である(久場)。ラットの前視床下部の小片を他のラットの第3脳室内に移植して生存せしむることに成功した。エストロゲンは、移植片の体積の増大とシナプス密度の増加を意起した。エストロゲンはシナプスの増植を起すことによって長期のシナプス可塑性を調節しているらしい(新井)。サイクリックAMP依存性蛋白質リン酸化酵素【II】は広い基質特異性を有し、チロシン水酸化酵素のリン酸化を通じてアドレナリン作動性シナプスの活動を調節する外に、微小管の重合を変調することによってシナプスの可塑性の発現に寄与していると考えられる(藤沢)。ネコについて前肢の電気刺激と大脳脚の電気刺激を組合せて、屈曲条件反射を形成した。このようなネコでは、大脳皮質の運動感覚野からの遠心線維は、赤核脊髄路核細胞の樹状突起基部や細胞体上に多くのシナプスを作るようになった(村上)。
中性子ビーム実験のための試料核偏極の基礎研究

本研究の目的は、入射中性子スピンと散乱試料中の原子核スピンのスピンを制御することによって、核スピンに依存した新たな中性子実験の開拓に必要となる試料中原子核の核スピン制御技術確立のための、核スピン偏極の移行・拡散に関する基礎研究であり、マイクロ波誘導型光核偏極法で得られたホスト結晶中の原子核偏極について、試料中の原子核への核スピン偏極の移行・拡散(伝播)を調べることにある。核スピン偏極の拡散の計測方法として、印加する磁場に勾配磁場を加え、試料位置とNMRの共鳴周波数との間に依存性を持たせることにより、試料位置中でのNMR信号の強度から偏極の度合いを観測するものである。本年度は主に昨年度に引き続き既存の試料陽子偏極装置を本測定に使用できるようにするための幾つかの改良を行った。その1点目は昨年度、設計を行ったESRのためのマイクロ波系の改善である。昨年度実施した発信系の改良に引き続き、検波系の改良を行い、ESR信号検出の効率化を図った。これによりキャビティの改良に伴い厳しくなっていたESR信号の観測条件が改善された。2点目は試料及びその周辺における環境測定の強化である。偏極状態は緩和時間に関わる試料温度に大きく依存するため、その変化をより正確に記録できるように、温度計測系の強化を図った。これらに加えてMR計測の高速化を行うための計測システムの見直しを行った。偏極の生成はESRにより行われ、偏極の確認はNMR計測によって行うが核スピン偏極の移行・拡散の測定のためには同一条件で行う必要があるが、マイクロ波キャビティなどの改良に伴い従来システムでは効率よく行えなくなったため、その解消を目指して行った。これら一連の改良により本測定の効率的な実施が行えるものと期待される。そのために今年度は既存の試料陽子偏極装置を本測定に使用できるように以下の改良を行った。(1)磁場勾配発生用の電磁石の追本加を行った。これはまず既存の電磁石の磁場測定を実施し、磁場勾配発生用コイルの磁場計算を行った。次に磁場計算結果検証のために試作コイルを作成し、これによる磁場測定により、設計値との違いを補正する為の再計算と再測定を行い、これらをもとに最終的な磁場勾配発生用コイル設計及び製作を行いその磁場特性を計測評価した。またこれと並行してESR用キャビティの改良を検討していたところ、ESR用マイクロ波系の安定性の問題が明らかになったので、(2)マイクロ波系の改良を行うこととした。マイクロ波誘導型光核偏極法では核偏極を生成する為にマイクロ波ESRを用いているが、今回の計測に必要な安定的な核偏極を維持し続けるためにはESRの安定性、すなわちマイクロ波系の安定性が欠かせない。これまではGUNダイオード式のマイクロ波発振器を用いてきたが、現在の発振器では本測定に関わる長時間の安定性が保てないことが判明したため、YIG方式による発振器の評価を行い、これを導入した。合わせて印加周波数をモニターしフィードバック回路を構成することによってマイクロ波系の安定性の改善を計った。