hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
北極氷床コア解析による気候変動研究

昨年度に引き続き、NGRIP/GRIPコアの物理解析および力学試験が行われた。1)静水圧加圧条件下で行った一軸圧縮試験の結果では、実験温度-18°Cで再結晶の発生が観察された。氷の再結晶は、通常-10°C以上の高温で観察されており、この実験結果は極めて大きな歪エネルギーの蓄積が起こったことを意味している。このことは、氷床深部の高静水圧状態から氷床表面の常圧下へとコア採取する際の圧力変化に伴う結晶組織(方位分布)の変化を議論する時に重要である。2)NGRIPのクラウディーバンド画像から得られたグレーバリュー曲線と電気伝導度曲線(DEP)を比較した結果、両曲線の間に正および負の相関が有ることが判った。DEP値は、氷に含まれる不純物により酸性度が高まると増加することが知られている(正の相関)。今回明らかになった負の相関の存在は、従来の考えでは解釈できないことであり、今後、化学分析を含めた詳細な解析が必要となった。3)採取直後のコアに含まれる気泡の内圧は、採取深さの静水圧とほぼ同じであるため、この試料を常圧下で変形実験する場合、気泡周辺部での局所的変形が同時進行することになる。この気泡変形がマクロな氷の硬さに及ぼす影響を調べるため人工的に差圧を持つ気泡入りの試料を作成して実験した。その結果、差圧が数200気圧程度では、氷の流動硬さに影響のないことが判った。本研究は、北半球の代表的な気候変動データを記録しているグリーンランド・サミットコアおよびノースグリップコアを試料として行う多点深層コアの総合比較解析である。低温解析室(北見工業大学、名古屋大学大気水圏研究所および国立極地研究所)内において、グリーンランド氷床深層コアの物理解析を行った。1)クラウディーバンドについて、コア採取後の時効効果に注目した測定結果では、以下の結果が得られた。・新しいクラウディーバンドの発生や厚さの増加は見られない。・顕微鏡下の変化では、気泡やクラックの発生・膨張が顕著である(温度依存)。2)クラスレート・ハイドレートから気泡への変態過程に注目した顕微鏡観察の結果によると、変態はハイドレート形状の複雑なものほど容易であり、残存するハイドレートは、ほぼ球形もしくは楕円形をしたものが多い。これは、複雑な形状のハイドレートほど、コア採取時の圧力変化によりハイドレート周辺に大きな歪場を発生させ、それが変態を促進させていると考えられる。3)直流電気伝導度測定については、顕微鏡下の精密測定法を開発中である。4)超音波速度測定の結果では、コア採取後数年を経た緩和コアについても、氷の結晶方位分布に対応して音速が変化することが判明した。従って音速測定は、結晶方位分布と気泡等の内部空洞の情報をもたらすことが確認された。5)コア試料の力学試験(3軸)については、本年度低温庫が新設され恒温性チェックも無事終了したのにともない、来年度には3軸試験機を設置して本格的な測定の開始が予定されている。本研究は、北半球の代表的な気候変動情報を記録しているグリーンランド・サミットコアおよびノースグリップコアを試料として行う多点深層コアの総合比較研究である。昨年度末に設置(北見工業大学)されたステップイン式の大型低温実験室内に、本年度は三軸圧縮試験機が導入され、本格的な「氷床コアの静水圧下における力学実験」が開始された。1)設置された三軸圧縮試験機は、シリコンオイルを圧力媒体として300気圧までの静水圧下、サンプルサイズ3x3x10cmの氷試料を一定の歪速度で一軸圧縮変形することができる。測定中のサンプルを光学観察できるように、圧力容器の四方には透明な窓が設けられている。2)クラウディーバンドを顕著に含むサミットコアから変形試片を切り出し、表面をミクロトームで仕上げたのちクラウディーアイスとクリアーアイスの硬さの違いが判るように、特殊針でマーキングしてから変形実験を行った。その結果、クラウディーアイスとクリアーアイスで硬さにほとんど差のないことが判った。3)氷の塑性硬さは、結晶方位分布と不純物濃度によって規制される。上記の実験結果は、クリアーアイスの結晶方位分布集中の効果と、クラウディーアイスの不純物濃度増加の効果が氷の軟化に対してほぼ同じ寄付をしているためと考えられる。これらの実験結果は、氷床底部付近のコア中に観察されている褶曲のような局所的氷床流動を理解するために、基礎的に重要な測定データを提供している。

今回明らかになった負の相関の存在は、従来の考えでは解釈できないことであり、今後、化学分析を含めた詳細な解析が必要となった。3)採取直後のコアに含まれる気泡の内圧は、採取深さの静水圧とほぼ同じであるため、この試料を常圧下で変形実験する場合、気泡周辺部での局所的変形が同時進行することになる。この気泡変形がマクロな氷の硬さに及ぼす影響を調べるため人工的に差圧を持つ気泡入りの試料を作成して実験した。その結果、差圧が数200気圧程度では、氷の流動硬さに影響のないことが判った。
関節軟骨片とmicroRNA・エクソソームを用いた新規関節軟骨治療の開発

広範囲軟骨欠損に対し、自家培養軟骨細胞移植術が行われている。しかし、この治療法には、1正常軟骨組織を400mg採取しなければならない、2採取した軟骨組織から軟骨細胞を単離・培養しなければならない、3軟骨細胞によっては、増殖能、軟骨基質産生能が低いものがある、4軟骨採取と培養した軟骨様組織を移植する2段階手術が必要、54週間培養した軟骨様組織内に十分な軟骨基質が存在していない、6軟骨修復のメカニズムが不明といった問題点がある。このような問題点を解決するため、我々は、より軟骨基質を多く含有し、広範囲軟骨欠損に対応可能で、1回の手術で移植できる移植軟骨を作製することを目指し、以下の研究を行った。人工膝関節置換術の際に切除した軟骨からメスを用いて約2mmの軟骨片を作製しアテロコラーゲンと混合した。対照群として、軟骨細胞をコラゲナーゼ・トリプシン処理を行い単離し、アテロコラーゲンに包埋した。3週間培養した後、切片を作製し、サフラニンO染色、免疫染色を行った。軟骨片を培養した群では、単離した群と比較し、有意に多くの細胞をゲル内に認めた。この培地中に含まれるRNAを抽出し、分泌microRNAの発現解析を行った。軟骨片の群では、骨形成や軟骨分化に関与するmicroRNAが多く培地中に含まれていた。これらの結果から、従来の自家培養軟骨細胞移植術のように軟骨を酵素処理し、軟骨細胞を単離してアテロコラーゲンゲル内に包埋するより、軟骨片をゲルに包埋する方が、ゲル内での細胞増殖能は高く、また軟骨下骨・軟骨に有利に働くmicroRNAを分泌していることがわかった。日本白色家兎の大腿骨滑車部に骨軟骨欠損を作製し、アテロコラーゲンに包埋した軟骨片を移植したところ、良好な軟骨修復を認めた。これらの結果から培養の必要ない軟骨片の移植が有用であることがわかった。本研究では、広範囲軟骨欠損に対し、従来より行われている自家培養軟骨細胞移植術の欠点を克服した新たな軟骨修復術の確立を行うものである。つまり培養を必要とせず、一期的に完結する手術方法であるが、その有効性・妥当性をin vitro、in vivoの研究を行うことで実証していく。この軟骨修復術は、非荷重部の正常軟骨を採取し、細切した後、足場となるアテロコラーゲンに包埋して軟骨欠損部に移植するというものである。細切した軟骨片から軟骨細胞がアテロコラーゲン内に遊走・増殖し、軟骨基質を産生していくことで、広範囲軟骨欠損にも対応できる手術方法である。これまで、ヒト軟骨を用いて軟骨片と単離した軟骨細胞がアテロコラーゲン内での遊走・増殖能を検討し、細切した軟骨片の有効性を証明した(Tsuyuguchi Y, Adachi N et al. Cartilage 2018 in press)。また、日本白色家兎に骨軟骨欠損を作製し、アテロコラーゲンに軟骨片を包埋して移植した。この実験にて、広範囲軟骨欠損に対するアテロコラーゲン包埋細切軟骨片移植の有効性を示した(Matsushita R, Adachi N et al. American Journal of Sports Medicine 2019 in press)。この他、単離した軟骨細胞と細切した軟骨片を培養し、その培養液に分泌されたmicroRNAを解析し、骨形成や軟骨分化にも関与するmicroRNAが軟骨片を培養した方が多く分泌されている傾向があることがわかった。細切軟骨片を軟骨修復に使用する際、より大きな軟骨欠損部に移植することや、年齢等の影響により軟骨片からの細胞遊走が少ないことも考え、細切軟骨片からより多くの軟骨細胞が遊走し増殖できる因子を組み合わせることも検討する。具体的には、骨髄間葉系幹細胞(MSC)から分泌されるエクソソームを組み合わせることを考えており、今後は、細切軟骨片をアテロコラーゲンに包埋し、MSC由来のエクソソームを添加し細胞遊走・増殖を評価していく。また、in vivoでの有効性を証明するためエクソソームを添加した細切軟骨片を日本白色家兎の骨軟骨欠損に移植し、治療効果を評価する。さらに臨床応用へ向けて、ミニブタの大腿骨滑車部に軟骨欠損を作製し、アテロコラーゲン包埋細切軟骨片を移植してその有効性を示す。また、Ki67の免疫染色では、軟骨片の群が、Ki67陽性細胞数が有意に多かった。

軟骨特異的に発現するlect1は、軟骨片周囲に多く発現しており、TGFβも軟骨片の群で多く発現していた。この培地中に含まれるRNAを抽出し、分泌microRNAの発現解析を行った。軟骨片の群では、骨形成や軟骨分化に関与するmicroRNAが多く培地中に含まれていた。これらの結果から、従来の自家培養軟骨細胞移植術のように軟骨を酵素処理し、軟骨細胞を単離してアテロコラーゲンゲル内に包埋するより、軟骨片をゲルに包埋する方が、ゲル内での細胞増殖能は高く、また軟骨下骨・軟骨に有利に働くmicroRNAを分泌していることがわかった。平成29年度に予定していたことはおおむね順調に進展している。単離した軟骨細胞よりも軟骨片をアテロコラーゲンゲルに包埋し、軟骨欠損部に移植した方が、軟骨修復にはよい結果が得られると予想できるin vitroの実験結果が得られた。しかし、軟骨片、単離した軟骨細胞から分泌されているmicroRNAのデータが多く、これらのmicroRNAの機能解析が終わっていない。広範囲軟骨欠損に対し、自家培養軟骨細胞移植術が行われている。しかし、この治療法には、1正常軟骨組織を400mg採取しなければならない、2採取した軟骨組織から軟骨細胞を単離・培養しなければならない、3軟骨細胞によっては、増殖能、軟骨基質産生能が低いものがある、4軟骨採取と培養した軟骨様組織を移植する2段階手術が必要、54週間培養した軟骨様組織内に十分な軟骨基質が存在していない、6軟骨修復のメカニズムが不明といった問題点がある。このような問題点を解決するため、我々は、より軟骨基質を多く含有し、広範囲軟骨欠損に対応可能で、1回の手術で移植できる移植軟骨を作製することを目指し、以下の研究を行った。人工膝関節置換術の際に切除した軟骨からメスを用いて約2mmの軟骨片を作製しアテロコラーゲンと混合した。対照群として、軟骨細胞をコラゲナーゼ・トリプシン処理を行い単離し、アテロコラーゲンに包埋した。3週間培養した後、切片を作製し、サフラニンO染色、免疫染色を行った。軟骨片を培養した群では、単離した群と比較し、有意に多くの細胞をゲル内に認めた。日本白色家兎の大腿骨滑車部に骨軟骨欠損を作製し、アテロコラーゲンに包埋した軟骨片を移植したところ、良好な軟骨修復を認めた。これらの結果から培養の必要ない軟骨片の移植が有用であることがわかった。本研究では、広範囲軟骨欠損に対し、従来より行われている自家培養軟骨細胞移植術の欠点を克服した新たな軟骨修復術の確立を行うものである。つまり培養を必要とせず、一期的に完結する手術方法であるが、その有効性・妥当性をin vitro、in vivoの研究を行うことで実証していく。この軟骨修復術は、非荷重部の正常軟骨を採取し、細切した後、足場となるアテロコラーゲンに包埋して軟骨欠損部に移植するというものである。
各種疾患病態における新規遺伝子RB1CC1の関わりと臨床医学応用への試み

我々が新規に同定したRB1CC1分子と各種疾患との関わりを明らかにし、本分子を医学臨床に役立てることを意図して研究を行った。継続した研究の結果、アルツハイマー病のいくつかの症例では、RB1CC1発現が寡少となり、mTOR活性が抑制されることにより、十分な蛋白合成が行われないために、神経突起萎縮、細胞萎縮、細胞死を来し、病態が進行してしまうことが明らかとなった。また最近、RB1CC1の発現状態が乳癌症例の生存率に大きく関与していることを明らかにした。RB1CC1の細胞質での働きと細胞核内での機能を病理標本において簡便に判別することによって、臨床予後が早期に類推でき、治療選択の一指針にもなり得ることが明らかになった。RB1CC1機能消失と癌との関連について、これまでに50例以上の各種の癌細胞株において遺伝子変異を検索したが、新たな変異は見つからなかった。また、発現消失のメカニズムのひとつとしてRB1CC1のコアpromoter部のメチル化の程度をbisulfite PCR法にて検索したが、癌における過剰メチル化等、RB1CC1遺伝子silencingを示唆するものは見つからなかった。これらより、多くの癌ではRB1CC1自身よりも、これに続きRB1に至る経路上の分子を中心に機能消失が起こっており、現在この経路の詳細を明らかにしようとしている。RB1CC1機能と神経、筋等の各種変性疾患との関連については、これまでに神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病、等)の病理解剖検体よりの標本を中心にin situ hybridization法,免疫組織化学法を行い、解析を進めてきた。これにより神経変性とともにRB1CC1の発現低下、機能消失の起こっていることがわかってきた。また、PC12神経細胞培養系においては、RB1CC1 siRNAによりNGF添加時の突起形成が抑制されることも示唆された。現在この確認を行うのとともに、RB1CC1機能低下から神経突起形成不全を起こす細胞生物学的経路を明らかにしようとしている。神経変性とともにRB1CC1の発現低下、機能消失が著明に進行している症例のあることがわかってきた。また、Neuro2a神経細胞培養系において、RB1CC1 siRNAにより神経分化抑制(分化率、神経突起長の抑制)が起こることが明らかとなった。ここでみられる分化抑制は、RB1CC1発現低下により、mTOR活性が通常以上に抑制され、十分なtranslationが行われないために起こっていることも解ってきている。一方で、RB1CC1はp53,hSNF5/INI1と複合体を形成することによって、p21,p16の発現を促す転写調節因子複合体となっていることが解った。RB1CC1はこの機構を介してRB経路を総合的に増強する(投稿準備中)。また、Neuro2a神経細胞培養系において、RB1CC1 siRNAにより神経分化抑制(分化率、神経突起長の抑制)、神経細胞死が起こることを明らかにした。ここでみられる分化抑制は、RB1CC1の発現低下により、mTOR活性が過剰に抑制され、十分なtranslationが行われないために起こっており、これが起因となって神経突起の短縮、細胞萎縮、細胞死が起こることが明らかとなった(投稿中)。

RB1CC1はRBを介した細胞増殖抑制の系とTSC-mTORを介した蛋白合成,細胞成長の制御系をクロストークさせながら,組織,生体の恒常的システム維持に貢献する。RB経路への貢献は,RB1CC1分子が細胞核内でhSNF5,p53両分子と転写因子複合体を形成することによって,p16,p21,RB1すべての発現を亢進させるものであると明らかにできた。一方で,RB1CC1は細胞質においては,TSC-mTOR経路,mTOR活性化因子として働く。両系は,RB1CC1低発現の骨髄では効率的な細胞増殖継続のために,RB1CC1高発現の神経,筋では過剰な細胞増殖を来すことなく,細胞,組織を大型に維持するために機能している。アルツハイマー病のいくつかの症例では,RB1CC1発現が寡少となり,mTOR活性が抑制され,十分なtranslationが行われないために,神経突起萎縮,細胞萎縮,細胞死が起こり,病態が進行してしまうことを解明できた。更に最近,RB1CC1の発現状態が乳癌症例の生存率に大きく関与していることを明らかにできた。RB1CC1の細胞質での働きと細胞核内での機能を病理標本において簡便に判別することによって,臨床的予後が早期に類推でき,治療選択の一指針にもなり得る事実が明らかになった。
ＥＳＤの視座からクリティカルシンキングを深化させる統計教材の開発

1.研究の成果研究仮説(ESDの視点から「クリティカルシンキングの手段化」を行うことで,より実践的で深化したクリティカルシンキングを育成できるのではないか)に基づき,教材開発を行った。その際,クリティカルシンキングの学習指導に関する3つの知見(服部, 2013)に,新たにESD的な知見「明確な解(答え)が存在しないなど,多様な考えがうまれるような問題を有効に扱うこと」を組みこむことを提案した。教材は数学I「データの分析」において,ローデータ(加工前のデータ)を分析させる活動により,「他者の意見を鵜呑みにするのではなく妥当性を検証し,その意見を受け入れたり改善したりする態度」などのクリティカルシンキングを育むものであり,ローデータを扱う際の困難性(柳沢・西村, 2014)を教材作成に応用している点が特長である。あわせて,教材評価を行うための評価問題の開発も行い,実際に授業を実施した。また,本研究の基盤となり得る研究とし,研究指導者とクリティカルシンキングを育む授業開発に関する研究を行い,その成果を発信した。2.研究の外部発信としての成果(1)広島大学附属福山中・高等学校研究紀要(第55巻)授業提案という形態で,研究成果を発信した。(2)全国数学教育学会第40回研究発表会関連研究の発信(研究指導者との共同研究)(3)全国数学教育学会第41回研究発表会関連研究の発信(研究指導者との共同研究)1.研究の成果研究仮説(ESDの視点から「クリティカルシンキングの手段化」を行うことで,より実践的で深化したクリティカルシンキングを育成できるのではないか)に基づき,教材開発を行った。(2)全国数学教育学会第40回研究発表会関連研究の発信(研究指導者との共同研究)(3)全国数学教育学会第41回研究発表会関連研究の発信(研究指導者との共同研究)
プリオン病における赤芽球系因子AHSP/EDRF発現変動の分子基盤

本研究は、BSE感染スクリーニングの間接的手法開発を目指し、その基盤となるAHSP発現変化の分子機構解明を目的としている。1.赤芽球系細胞モデルとしてPrP^cとAHSPの両者を発現するMEL細胞を選定し、分化誘導により高率に赤芽球系分化を示すサブクローンMEL hide8を単離した。2.MEL hide8細胞を用いてマウスPrP^cを大量発現するMEL hide8-MoPrP細胞を作製し、プリオン感染マウス由来脳乳剤またはPrP^<sc>持続感染神経細胞株(ScN2a)存在下に培養し赤芽球系分化誘導を行ったところ、AHSPならびにGATA-1、EKLFなどの赤芽球系特異的転写因子の発現動態に影響は認められなかった。また、同細胞を用いて、未分化前駆細胞にPrP^<sc>が蓄積するかどうか長期的影響も検討した。その結果、対照として用いたN2a-MoPrP細胞にはPrP^<sc>の蓄積が観察されたが、MEL hide8-MoPrPにはPrP^<sc>の蓄積は認められなかった。3.マウスAHSP遺伝子の5'上流領域2.4kbを単離しMEL hide8細胞でのプロモーター活性を解析した。その結果、赤芽球系分化誘導時には、転写開始点の上流-120から-50bpの領域の存在がAHSPの転写活性化に最も重要なことが判明した。この領域にはウシ、マウス、ヒトで共通にGATA認識配列が存在することから、AHSPの発現にGATAによる転写制御が関連することが推定された。さらにプリオン病関連サイトカインIL-1β、IL-6存在下にMEL hide8細胞を用いて、AHSP遺伝子プロモーター活性を測定したところ、プロモーター活性は減少した。以上のことから、プリオン感染動物におけるAHSP発現低下には、異常型プリオンが直接に赤芽球細胞の分化に影響を与えるのではなく、サイトカインなどの間接的な因子の関与が示唆された。本研究は、TSEs一般で発症経過とともに発現が著しく低下するAHSP/EDRF発現動態に基づいた牛BSE感染スクリーニングの間接的手法開発を目指し、その基盤となるAHSP/EDRF発現変化の分子機構解明を目的としている。15年度は、初期の目標として挙げたAHSP/EDRFの発現変動がPrP^<Sc>の直接の作用によるものか否かを明らかにしていくため、必要となる予備実験ならびに材料作製に着手した。1.抗AHSP抗体の作製マウス脾臓からmouse AHSP (mAHSP)cDNAの単離を行い、得られたmAHSP cDNAをpGEX6P vectorに組み込んだ後、大腸菌BL21で発現させて、GST融合タンパク質(GST-mAHSP)の合成を行った。合成したGST-mAHSPを、GST融合タンパク質精製カラムを用いて精製した後、GSTを切断し、さらにゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行うことで、抗体作製に必要な量、純度のmAHSPを得ることができた。現在は、ウサギに接種して免疫を行い、抗体価の上昇を待つところである。加えて、bovine AHSP (bAHSP)についてもウシ胎子肝臓からbAHSP cDNAの単離を行い、マウスと同様に、抗体作製用bAHSPの精製を行っており、間もなくウサギへの免疫を行う予定である。2.マウス赤白血病(MEL)細胞におけるAHSPおよびPrP mRNAの発現マウス赤白血病(MEL)細胞においてRT-PCRにより、AHSP, PrPのmRNAレベルでの発現を確認した。今後は、作製した抗体を用いたイムノブロット法、免疫組織化学的手法により、MEL細胞におけるAHSP, PrPのタンパク質発現と細胞内局在を調べ、in vitroでのAHSP発現変化とPrP^<Sc>の関係を明らかにしていく予定である。3.末梢血の成熟赤血球におけるプリオンタンパク質(PrP)の発現ヒトおよびウシの末梢血から赤血球膜を調製し、市販の抗PrP抗体(6H4)を用いてイムノブロットを行った。その結果、過去に報告されているようにヒト赤血球膜からはPrPが検出されたが(Horada et al.(2000)Br.J.Haematol.110,472)、ウシ赤血球膜からは検出されなかった。今後は、スクリーニング検査への有効性を調べるために作製した抗AHSP抗体を用いて末梢血におけるAHSPの発現を検索する予定である。1)AHSP発現変化の分子機構を明らかにするため、赤芽球系細胞モデルとしてPrP^cとAHSPの両者を発現するMEL細胞から、高率に赤芽球系に分化するサブクローンMELhide28を単離した。次に、MELhide8細胞にマウスPrP^c遺伝子を導入し、PrP^cを高率に安定発現する細胞(MELhide8-MoPrP)を作製し、PrP^<sc>感染マウス由来脳乳剤またはPrP^<sc>持続感染神経細胞株(ScN2a)存在下で培養を行い、PrP^<sc>の直接的影響を調べた。その結果、mRNAおよびタンパク質におけるAHSPの発現動態に影響は認められなかった。また同細胞を用いて、PrP^<sc>の長期的影響を調べるためPrP^<sc>感染実験を行った。その結果、MELhide8-MoPrPにPrP^<sc>の蓄積は認められなかった。

このことから、AHSP発現の低下は、直接的なPrP^<sc>侵襲あるいはPrP^<sc>の赤芽球系前駆細胞への蓄積を原因として起こる現象ではないと考えられる。2)マウスAHSP遺伝子の5'上流領域2.4kbを単離し、MELhide8細胞におけるプロモーター活性を解析した。その結果、赤芽球系分化誘導時、転写開始点の上流-120から-50bpのGATA認識配列の存在がAHSPの転写活性化に重要なことが判明した。今後はAHSPの転写に影響を与える転写制御因子およびPrP^<sc>侵襲時に変動する液性因子(サイトカイン等)に注目して研究を進めるのに加えて、間もなく発症時期を迎える実験的に作製したPrP^<sc>感染マウスを用いて造血系への影響を詳細に調べる予定である。本研究は、BSE感染スクリーニングの間接的手法開発を目指し、その基盤となるAHSP発現変化の分子機構解明を目的としている。1.赤芽球系細胞モデルとしてPrP^cとAHSPの両者を発現するMEL細胞を選定し、分化誘導により高率に赤芽球系分化を示すサブクローンMEL hide8を単離した。2.MEL hide8細胞を用いてマウスPrP^cを大量発現するMEL hide8-MoPrP細胞を作製し、プリオン感染マウス由来脳乳剤またはPrP^<sc>持続感染神経細胞株(ScN2a)存在下に培養し赤芽球系分化誘導を行ったところ、AHSPならびにGATA-1、EKLFなどの赤芽球系特異的転写因子の発現動態に影響は認められなかった。また、同細胞を用いて、未分化前駆細胞にPrP^<sc>が蓄積するかどうか長期的影響も検討した。その結果、対照として用いたN2a-MoPrP細胞にはPrP^<sc>の蓄積が観察されたが、MEL hide8-MoPrPにはPrP^<sc>の蓄積は認められなかった。3.マウスAHSP遺伝子の5'上流領域2.4kbを単離しMEL hide8細胞でのプロモーター活性を解析した。その結果、赤芽球系分化誘導時には、転写開始点の上流-120から-50bpの領域の存在がAHSPの転写活性化に最も重要なことが判明した。この領域にはウシ、マウス、ヒトで共通にGATA認識配列が存在することから、AHSPの発現にGATAによる転写制御が関連することが推定された。さらにプリオン病関連サイトカインIL-1β、IL-6存在下にMEL hide8細胞を用いて、AHSP遺伝子プロモーター活性を測定したところ、プロモーター活性は減少した。以上のことから、プリオン感染動物におけるAHSP発現低下には、異常型プリオンが直接に赤芽球細胞の分化に影響を与えるのではなく、サイトカインなどの間接的な因子の関与が示唆された。
均一系ニッケル錯体を用いた不斉水素化反応の開発

現代の医薬品製造において触媒的不斉水素化反応は欠くことのできない技術へと発展した。しかしながら本方法論は希少元素であるRuやRh, Ir錯体を用いるために,コスト面や省資源の観点から大きな問題を抱えている。私は地球上での埋蔵量が比較的豊富なNiに注目し, Ni-フェロセン系錯体が水素化反応を促進する触媒として機能することを見出すとともに,高い立体選択性で反応を進行させることに成功した。研究初年度はNiを中心金属とした水素ガスを用いる還元反応を検討した。その結果,リン配位子の選択が重要であり,二座型のフェロセン系リン配位子ニッケルアセテートからなる有機金属錯体を用いることで,今までに例のない触媒的不斉水素化反応を実現することに成功した。とりわけ動的速度論分割を伴うα-アミノ-β-ケテエステル系の不斉水素化反応において,アンチ体のみを立体選択的に最高95%eeで得ることに成功した。本反応はC4位に芳香環をもつものに対して有効であり,我々がすでに見出しているIr系の水素化反応において問題となっていた電子吸引基を芳香環上にもつものに対しても,90%ee以上の立体選択性で反応が進行することを確認している。また本反応は芳香環上のニトロ基やエステル基,ハロゲンが存在しても,それらを損なうことなくケトンのみを環元することが可能である。水素圧に関しては100気圧で行っているが,5気圧の低水素条件においても反応速度の大幅な低下がみられるものの,反応が進行することを確認している。また興味深いことに事前の触媒調製を必要とすることなく,ニッケルアセテートとリン配位子,反応基質を加え,水素加圧するのみで立体選択性や収率を低下させることなく,水素加反応を行うことが可能である。その他の反応系に対する検討も同時に行っており,α-アミノケトンやエミナド,β-ケトエステルに対しも触媒的水素化反応が進行することを確認できた。来年度は反応機構の解明とともに,さらに有用な反応系の開拓を行う。しかしながらこの方法論は希少元素であるRuやRh,Irを中心金属とした錯体を触媒として用いることから,コスト面や省資源という観点から大きな問題を抱えている。私は地球上の埋蔵量が比較的豊富なNiに注目し,ニッケル-フェロセン系錯体が水素化反応を促進する触媒として機能することを見出すとともに,高い立体選択性で反応を促進させることに成功した。とりわけニッケル-フェロセン錯体はα-アミノ-β-ケトエステルの塩酸塩を水素化反応の基質とした場合に,動的速度論分割を伴うアンチ選択的な還元反応が進行し,最大95%eeでα-アミノ-β-ヒドロキシアミノ酸が得られる。本系におけるニッケル錯体の反応の特徴は,C3位に芳香環が結合したものが,高い反応性およびエナンチオ選択性でアンチ体を与え,芳香環上に電子吸引基や電子供与基が置換したいずれの基質に対しても有効である。一方,C3位にアルキル基が結合したものでは収率ならびに立体選択性も大幅に低下することを明らかにすることができた。もうひとつの特徴としては,用いるニッケル錯体の配位子が極めて限定されていることである。すなわち,代表的な二座配位子であるBINAPやDIOP,単剤配位子であるMOPや9-PBNでは全く水素化反応が進行せず,唯一フェロセンを骨格にもつ2座型リン配位子であるJosiphos型のものが有効である。このことは,Ni原子に配位する2つのリン原子の空間的な位置と電子密度が本反応を進行させるうえで,極めて重要な因子であることを意味するものである。
血管内皮・平滑筋細胞機能を細胞分子レベルで生体連続観察できるシステムの開発

1.開発した「血管内皮・平滑筋細胞機能を細胞分子レベルで生体連続観察できるシステム」の特徴:(1)回折格子で得られる2つの励起光(340、380nm)の切替照射に、ステッピングモーターによるチョッパーミラーの回転方式を採用することによって、比較的高速(10Hz)の2波長切替と無振動測定が可能となった。(2)チョッパー切替装置の制御は画像処理装置を用いた。(3)画像取り込みにSITカメラを採用し、画像処理装置のフレームおよび拡張メモリーを用いることによって、640x400ドットの8ビット(256階調)画像フレームを得ることができた。(4)細胞内の〔Ca〕i濃度分布像について、256階調の〔Ca〕i濃度レベルを疑似カラーで表示可能となった。この画像は、5Hzで得ることができるようになった。(5)画像中の30局所の変化を連続記録できる。(6)廉価。2.本システム、およびこれまで開発してきたfront-surface fluorimetryを利用し、次のような研究成果を挙げた。(1)in situ豚大動脈弁の内皮細胞に光学的方法を応用し、〔Ca〕i(フラ-2蛍光)と一酸化窒素-NO(diaminonaphthalene蛍光)の同時測定法を完成した。(2)冠動脈および賢動脈において、エンドセリンやアドレノメジュリン(AM)の産生と機能について検討した。これらの標本にReverse transcription polymerase chain reaction法を応用し、これら活性物質の産生に関わる蛋白のmRNAの発現を証明した。冠動脈および賢動脈においては、これらの活性物質がオートクリン/パラクリン型の血管緊張調節機能を有することを明らかにした。(6)廉価。本年度は、血管内皮細胞や平滑筋細胞の〔Ca〕iや機能(EDRF産生、張力発生等)を、細胞・分子レベルで生体連続観察可能なシステムの開発に着手した。本システムでは、代謝要因(Ca Na,pH,NADH)の測定には指示蛍光色素および自然蛍光の2波長或は1波長蛍光測光を用いる。2次元蛍光情報の処理に使用するイメージプロセッサ(蛍光画像経時変化測定システム)は、フルサワラボより購入し、必要に応じて改良を加えた。基礎実験で、現有の光学系(日本分光:CAM230)の光量はこのイメージプロセッサのシグナルとして不足とわかったので、旭計器工業に新しい光学系の作製を依頼した。これらの変更によって、比較的遅いシグナル(秒単位)は計測可能となったが、これより速いシグナルは未だに計測出来ない。この件に関するプログラムを現在開発中である。本システムを利用し、血液凝固因子トロンビンの血管内皮および平滑筋細胞に対する作用を検討した。豚の(1)大動脈弁内皮細胞、(2)冠動脈中膜平滑筋細胞、(3)内皮付冠動脈中膜平滑筋細胞の〔Ca〕iを、フラ-2蛍光測光した。(1)内皮細胞の〔Ca〕iはトロンビンによって一過性、濃度依存性に上昇した。(2)U46619によって前収縮させた中膜平滑筋はトロンビンにより、更なる収縮と〔Ca〕i上昇をしめした。(3)内皮付平滑筋は、i)脱分極収縮の場合、トロンビンによって弛緩するが、これはnitro-L-arginineで完全に抑制されるため、EDRFが関与していると考えられる。ii)U46619収縮の場合、トロンビンは一過性、濃度依存性に〔Ca〕i低下と弛緩を引き起こすが、nitro-L-arginineはこの弛緩を部分的にしか抑制出来なかった。これは、EDRFのみならず、EDHFもトロンビンの弛緩作用に関与することを示す。トロンビンはこのように収縮・弛緩の両面から血管の緊張を制御している事が明らかとなった。

1.昨年作製した「血管内皮・平滑筋細胞機能を細胞分子レベルで生体連続観察できるシステム・第1号機」について、本年度は次の改良を行った。(1)回析格子で得られる2つの励起光(340、380nm)の切替照射法として、ステッピングモーターによるチョッパーミラーの回転方式を採用した。ことによって、比較的高速(10Hz)の切替が可能となった。(2)チョッパー切替装置の制御は画像処理装置のチョッパードライブを用いた。(3)画像取り込みはSITカメラを用いることにした。画像処理装置のフレームおよび拡張メモリーを用いて、640×400ドットの8ビット(256階調)画像フレームを得ることができた。(4)細胞内の[Ca]i濃度分布像について、256階調の[Ca]i濃度レベルを疑似カラーで表示可能となった。この画像は、5Hzで得ることができるようになった。2.本システムを利用し、次のような研究成果を挙げた。(1)in situ豚大動脈弁の内皮細胞に光学的方法を応用し、[Ca]i(フラ-2蛍光)と一酸化窒素-NO(diaminonaphthalene蛍光)の同時測定を試みた。内皮由来弛緩因子を産生するアゴニスト(ATP,Brady kinin,Thrombin)は、内皮細胞に用量依存性の[Ca]i上昇とNO産生を引き起こした。[Ca]i変化-NO産生量の関係は、アゴニストの種類によって異なることが明らかとなった。(2)冠動脈および腎動脈におけるアドレノメジュリン(AM)の産生と機能について検討した。K脱分極やエンドセリン1で前収縮させた冠動脈や腎動脈中膜標本の[Ca]iと張力を、AMは減少させた。これらの標本にReverse transcription polymerase chain reaction法を応用し、AM mRNAの発現を証明した。冠動脈および腎動脈において、AMはオートクリン/パラクリン型の血管緊張調節機能を有することが明らかとなった。(1)昨年完成した「血管内皮・平滑筋細胞機能を細胞分子レベルで生体連続観察できるシステム・第2号機」は細胞内の[Ca]i濃度分布画像について、256階調の[Ca]i濃度対応擬似カラーで表示出来る。この画像変化は、5Hzで観察可能である。現在、画像中の30局所の変化を連続記録可能なプログラムを開発し、その有効性を検定している。(2)本システムやfura-2-front-surface fluorimetryを利用し、次のような研究成果を挙げた。(3)冠動脈にはβ_3-adrenoceptor遺伝子が発現していることを、薬理学的方法およびRT-PCR法を用いて証明した。次に、正常者および虚血性心臓病患者白血球から得られたゲノムDNAとPCR-RFLP法を用いてβ_3-adrenoceptor遺伝子Tr64Arg変異を解析したところ、この変異は正常者に比べて、虚血性心臓病患者では優位に多いことが判った。この遺伝子変異は、冠動脈硬化症の危険因子の一つである可能性が示された。
自己校正型ロータリエンコーダを利用した大口径三次元絶対形状測定システムの開発

本研究では、これまでに参照鏡を用いない角度測定に基づく形状測定機(SDP: Scanning Deflectometry Profiler)を開発した。従来システムでは、ペンタゴンミラーを利用して角度測定ビームを垂直入射させていた為、透明材料を測定対象とする場合、裏面からの反射ビームが測定ビーム(試料表面からの反射ビーム)と重なってしまい、測定不能となる領域が存在する。そこで、ペンタゴンミラーを改良したDual mirror pair (DMP)を導入し、裏面反射ビームを空間的に分離する斜入射光学系システムを開発した。具体的には、ペンタゴンミラーの設置角度(45°)を変更した二組のミラー対を利用し、測定ビームを試料表面に斜めに入射させることで、裏面反射ビームの位置をずらすことにより、その影響を除去する。DMPを用いた光学システムは、レーザー光源と角度検出ユニットを分離することで平行平面基板の測定を実現する。これは、レーザービームを直接用いた独自の角度測定装置を適用した形状測定システムによって実現できる。一方、市販のオートコリメータを用いた多くの形状測定システムでは、平行平面基板を測定することは不可能である。開発したDMPを用いた光学システムの妥当性を検証するため、透明の平行平板(P-V値約300 nm)の測定を実施した。測定範囲90 mmの試料に対して、10回測定の繰り返し性は±0.7 nm以下であり、裏面反射が存在する対象に対しても高精度な測定が可能であることが確認できた。ペンタゴンミラーを改良したDual mirror pair (DMP)を導入し、裏面反射ビームを空間的に分離する斜入射光学系システムを開発した。実際に開発したDMPシステムを導入した形状測定システムを構築し、実測結果より、開発システムの妥当性も検証された。三次元平面度測定(平成29年度課題)、平行平板の測定(平成30年度課題)について、システムの構築を実施した。今後、より自由曲面(高傾斜試料)の測定に取り組む。また、異なる原理の測定装置との比較測定より、構築システムの妥当性検証も進める。本研究では,角度測定に基づく形状測定機を開発した。従来二次元(ライン)形状に限定された形状測定装置に試料回転ステージを搭載し、放射状に取得した各ライン形状から三次元形状を算出するシステムを構築した。ただし、各ライン形状測定結果は、最小二乗直線からの偏差量(真直度形状)であり、回転ステージのアンギュラ振れに伴い、各ライン形状の相対角度関係は不明である。そこで、円周測定に基づく各ライン接続法を構築した。円周形状の測定方法は、ペンタミラーを回転中心からある半径位置に移動し、ペンタミラーの走査軸(X軸)と直交したY軸方向の測定対象表面の局部傾斜角度を測定する。そして、ステージを回転し、円周接線方向の局部傾斜角度分布を測定する。ただし、円周測定の結果には、回転に伴うアンギュラ振れが加わる。そこで、試料台の裏面中央にミラーを設置し、もう一台のオートコリメータを用いて回転テーブルのアンギュラ振れを補正する。得られた局部傾斜角度分布を積分することにより、円周形状が得られる。放射状のライン形状は、円周測定結果との交差点データより相対角度関係が決定できる。新たな三次元形状測定システムの検証のため、実際に,低熱膨張セラミックス製オプチカルフラットのφ300 mmの範囲の平面度測定を実施した。平面度はPV値131.7 nm、RMS値で26.0 nmであった。提案接続手法の検証のため、産総研が保有する平面度フィゾー干渉計で同一のオプチカルフラットを測定した。平面度はPV値131.2 nm、RMS値で26.4 nmであった。

異なる測定原理であるフィゾー干渉計と1 nm以下(PV値比較)で一致した。角度測定に基づく三次元形状測定システムを構築し、異なる原理の干渉計測との比較測定結果から、構築システムの妥当性も確認できた。三次元平面度測定(平成29年度課題)、平行平板の測定(平成30年度課題)について、システムの構築を実施した。今後、より自由曲面(高傾斜試料)の測定に取り組む。また、異なる原理の測定装置との比較測定より、構築システムの妥当性検証も進める。曲率を含めた開発装置による絶対形状測定精度の検証を実施し、開発装置による自由曲面の三次元形状測定測定の不確かさを求める。接触式三次元測定装置や球面干渉計、平面干渉計などとの比較測定を実施し、開発装置の妥当性を示す。
Pin1関連分子群を利用した加齢疾患の予防・診断・創薬

第一に、Pin1 -KOマウスでは野生型マウスに比べて巨核球数が減少していた。血液幹細胞から分化した巨核球細胞は、次に、いくつもの突起を形成するproplatelet(血小板前駆細胞)に分化し、1個の血小板前駆細胞から約1000個の血小板が産生する。巨核球が、突起を形成し血小板前駆細胞に分化するには微小管重合の促進が必要である。我々は、血小板前駆細胞ではタウが微小管重合を促進していることを解明した。さらにタウはリン酸化により活性を低下させるが、そのリン酸化タウの活性をPin1が回復させることで、Pin1は血小板前駆細胞の産生を制御し、最終的には血小板産生を制御していることを解明した(Shimizu (2017))。第二に、Pin1 -KOマウスでは野生型マウスに比べて精子数が早期に激減し不妊になるが、今回、Pin1が精子幹細胞の細胞周期M期の進行を促進することで、精子幹細胞の分化に必須であることを精子幹細胞特異的な抗GDNFfamily receptor α1抗体で免疫染色することで解明した(Kurita-Suzuki(2018))。第三に、Pin1の心臓疾患との関係の新たな分子機構を解明した。我々はこれまでに、Pin1が心臓疾患と関係していることを報告したが(Toko(2013))、今回、Pin1は、Ca2+のhandling proteinであるsarcoplasmic reticulum calcium ATPaseおよびNa2+/Ca2+ Exchanger 1 proteinの発現と機能を制御することで、心疾患の発症を制御していることを示した(Sacchi(2017))。Pin1の発現レベルが低下すると不妊になる理由が幹細胞の分化にPin1が関与してることがわかったので、発現レベルを上げることで不妊や再生医療に役立てられることが明らかになった。また、心疾患は、世界的に中高年の死亡に直接結びつく重要な疾患であるが、Pin1の発現レベルを測定することで、心疾患発症のリスクが分かることを明確にできた。最も驚くべき発見は、巨核球内にリン酸化タウが大量に存在することである。血小板と脳のリン酸化タウに相関があればアルツハイマー病の原因となるリン酸化タウを血液中の血小板で簡便に測定でき、アルツハイマー病の診断に役立てられる可能性を示すことができた。Ca2+ので活性化されるキナーゼCaMKII (calcium/calmodulin-dependent protein kinase II)は脳内で重要な機能を担う。Pin1によるCaMKII活性の調節機能とアルツハイマー病やタウオパチーの関連について検討する。Pin1の発現レベルを上げることで幹細胞の分化を促進し、組織再生を促進することで再生医療に役立てられないかを検討する。血小板のPin1の活性または発現量を測定することで、アルツハイマー病などの神経変性疾患の診断や防御に役立てられないかを研究する。Pin1による基質リン酸化タンパク質の構造変化について解析する目的で、FRETを応用した。Pin1自身の構造変化をみるPin1-FRETと代表的なPin1の基質であるc-mycの構造変化を見るMYC-FRETの作成を行った。どちらもin vitroでの相対的な測定は可能なものができたが、まだ測定の絶対値が低く細胞への応用は不可能である。Tauの構造変化を測定するTau-FRETはTauのリン酸化の制御が難しく再現性のある結果が得られていない。繰越金をお認めいたき研究を行ったのは本研究の過程でTauの凝集をPin1類似タンパク質が制御している可能性があるという結果を得たからである。本研究はアルツハイマー病治療にきたいできるものであり現在も詳細な検討を行っている。Tauには多くのリン酸化部位があるので実験は大変難しいが重要なテーマであるので着実に研究をおこなっている。一方、副産物であるが大きな成果もあげた。この研究の過程で加齢疾患に関与する。Pin1は、血管内皮細胞や神経細胞で、一酸化窒素産生酵素の分解や活性制御に関与していることが報告されている。広義の活性酸素であるNOは循環器や脳や神経の疾患と関連がある。この研究を進めるためにはNOをリアルタイムで想定する方法が必要であると考えた。我々は根粒菌の硝酸センサーシステムに関与するタンパク質が応用できることを見出した。根粒菌のシステムを応用した細胞内での測定系を構築し、現在詳細な検討を行っている。マウス各器官でのPin1関連分子群の発現をWestern blotで調べた。Pin1-KOマウスではPar14の発現が低下しており、Pin1の機能をPar14が相補している可能性が考えられた。Tauの微小管重合促進能および凝集とPin1、Gas7bがどのように関係しているのかについて検討を行っている。Crisper/Cas9システムを用いてPin1欠損、Par14欠損、両遺伝子ともに欠損の3種類の細胞を作成している。Pin1による基質リン酸化タンパク質の構造変化について解析する目的で、FRETを応用し、Pin1自身の構造変化をみるPin1-FRETはin vitroでの測定が可能となり、Pin1阻害剤とPin1の結合をPin1の構造変化でリアルタイムで検出することを可能にした。Tauの凝集をPin1および類似タンパク質のGas7bが変化させていることを見出した。現在詳細な検討を行っている。本研究はアルツハイマー病治療に応用が期待できるものであり詳細な検討を行っている。

さらに、Pin1は、血管内皮細胞や神経細胞で、一酸化窒素(NO)産生酵素の分解や活性制御に関与していることが報告されている。広義の活性酸素であるNOは循環器や脳や神経の疾患と関連がある。この研究を進めるためにはNOをリアルタイムで想定する方法が必要であると考え、根粒菌の硝酸センサーシステムをまず明らかにした。このセンサータンパク質でFRET系を作成し細胞内の硝酸を測定できる可能性を見出した。硝酸はNOの代謝産物でありNOの半減期が短いことからほどNOと同一のものとみなされているので実質的なNOのリアルタイムイメージングを可能にする方法になると期待できる。マウス各器官でのPin1関連分子群の発現を調べ、Pin1の機能をPar14が相補している可能性を示した。Par14は申請者が発見した分子でありその機能の解明は独創性が高い。Crisper/Cas9システムをいち早く取り入れ速やかに研究を進めている。プロリン異性化酵素Pin1の機能の検討に我々はタンパク質の構造変化をリアルタイムで観察できるFRETの作成を検討してきた。c-mycペプチド(Pin1の結合部位であるSer58,62を含む)を基質としてPin1による構造変化を観察できるようになった。Pin1自身も構造変化を起こすのでその測定も可能にした。1,2年でPin1による構造変化の機構を解明できると思う。この研究の過程でNOセンサーの作成を試みた。生体内ではNOそのものはすぐに硝酸に酸化されるので、大豆根粒菌の硝酸センサーシステム(NasS/T)を利用し、細胞内で硝酸濃度をFRETとして観察できる方法を構築した。この方法をsNOOOpy法と命名し論文発表した(J BIol Chem 2016)。Journal of Biological Chemistry誌のpaper of theweekに選ばれ、プレスレリースもされ、国内外で話題になった。この他、抗癌剤などに対する耐性や脳血管バリアに関与しているMDR(p-glycoprotein)遺伝子の発現制御を転写因子であるFOXO3が行っていること、また、Pin1がリン酸化されたFOXO3の分解を促進することでMDR1の発現を抑制していることを解明した(Biochem Biophy Res Commun 2016)。このほかPin1がAMP-activated protein kinase (AMPK)のリン酸化されたガンマサブユニットに結合しキナーゼ活性を抑制することで糖尿病を発症または悪化させることを明らかにしPin1が糖尿病の薬剤標的になりうる根拠をこれまでの一連の研究に加える形で示した(J BIol Chem 2015)。この研究の過程でNOセンサーの作成を試み、大豆根粒菌の硝酸センサーシステム(NasS/T)を利用し、細胞内で硝酸濃度をFRETとして観察できる方法、sNOOOpy法を構築した。
アブラナ科伝統野菜の機能性有機硫黄物質の代謝に関する解析

本研究では、アブラナ科植物、その中でも優良形質が高度に保存されていると考えられる伝統野菜を対象とし、植物のイオウ吸収と代謝制御に関する基礎的な知見を得ることを目的としている。まず、水耕液中のイオウ濃度が植物体イオウ含有量に及ぼす影響について調べた。第4本葉展開まで1/10 str.Hoagland(0.1 mMイオウ)水耕液で育てた伝統野菜の実生に「水耕液イオウ欠如処理(0 mM)」と「水耕液イオウ濃度増加処理(0.2 mM、0.4 mM、0.8 mMイオウ処理)」を施し本葉10枚まで栽培した。その結果、イオウ欠如処理によりすべての供試植物において、地上部乾物重、イオウ含有率およびイオウ含有量が減少した。また、地上部の高親和性硫酸イオントランスポーター遺伝子SULTR1グループ(SULTR1;1、1;2、1;3)の発現量は増加することが確かめられたが、その程度には大きな差があった。さらに、欠如処理によりSULTR1グループの発現が著しく増大する品種は、植物体イオウ含有率の減少割合も大きくなる品種である傾向にあった。これらの結果から、根外部環境のイオウ欠乏状態に敏感に応答する植物と、比較的鈍感な品種が存在すると考えられた。また、水耕液中のイオウ濃度増加に応じて生育および体内イオウ含有率が上昇する植物と、ほとんど変化しない品種があり、前者はイオウ欠如処理にて著しくイオウ含有率が下がる品種でもある傾向が見られた。しかし、植物体のイオウ含有率および生育量の増加と、SULTR1グループ発現量との相関はあまり見られなかった。これらのことから、伝統野菜にはイオウへの要求性の高い品種が存在すると考えられたが、その取り込み機構はSULTR1グループの発現だけでは説明ができないことが確かめられた。平成30年度は、24品種の伝統野菜について、水耕液イオウ濃度を変化させた時の植物体の地上部・根部生育量(新鮮重、乾物重、葉数)およびイオウ含有率を調べ、根外部環境のイオウ濃度の変化に対しての伝統野菜の応答をグループ化し、さらに特徴的な応答を示す伝統野菜を選抜することができた。また14品種については高親和性硫酸イオントランスポーターであるSULTR1グループの遺伝子発現解析を行いデータの蓄積ができた。さらに、低親和性トランスポーターであるSULTR2;1の発現を検出するためのアブラナ科共通プライマーを設計し、解析する準備が整った。本年度は、平成30年度に引き続き、水耕液イオウ濃度(硫酸イオン供給量)に比例して体内の硫黄含有量が顕著に増大するアブラナ科伝統野菜の選抜と、硫酸イオントランスポーター遺伝子SULTR1グループおよびSULTR2;1の発現量の測定を行う。さらに水耕液イオウ濃度増加処理にて顕著なイオウ含有率の顕著な増加が観察された品種に対しては、O-Acetylserine (thyol)lyaseなどの有機態イオウ合成の分岐点であり鍵となる酵素活性を測定する予定である。

本年度は、平成30年度に引き続き、水耕液イオウ濃度(硫酸イオン供給量)に比例して体内の硫黄含有量が顕著に増大するアブラナ科伝統野菜の選抜と、硫酸イオントランスポーター遺伝子SULTR1グループおよびSULTR2;1の発現量の測定を行う。さらに水耕液イオウ濃度増加処理にて顕著なイオウ含有率の顕著な増加が観察された品種に対しては、O-Acetylserine (thyol)lyaseなどの有機態イオウ合成の分岐点であり鍵となる酵素活性を測定する予定である。次年度使用額があるが、これは植物体からのmRNA抽出およびqRT-PCRのための試薬代であったが、平成30年度では栽培品種の数を増やし、植物体イオウ濃度の測定を優先したため、遺伝子発現解析が全て終了せず、次年度に持ち越すこととなった。平成31年度に購入して、解析を継続する。