hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＤＮＡ損傷修復異常による遺伝性小頭症発症の分子機構

放射線の子宮内被曝は精神遅滞を伴う重度小頭症を誘発することが知られている。しかし、小頭症発症の分子、細胞レベルでの発症機構は不明な点が多い。本研究では、遺伝性小頭症の原因遺伝子としてMRE11A遺伝子を同定して、ATM依存性アポトーシスの亢進が小頭症発症の一因になることを示した。また、セッケル症候群2家系2例が、中心体構成分子pericentrin遺伝子のヌルタイプ変異のコンパウンドへテロ接合体であることを明らかにした。患者細胞はp53-p21経路が活性化されG1期停止した細胞集団が増加していることを示した。以上のことから、本研究により遺伝性小頭症発症の新たな遺伝的基盤が明らかになった。放射線による子宮内被曝は精神遅滞を伴う重度小頭症を誘発する。しかし、小頭症発症の分子、細胞レベルでの発症機序は不明な点が多い。本研究では、遺伝性小頭症の原因遺伝子の同定と機能解析を通じて、小頭症発症の分子機構の解明を研究目的としている。本年度は、小頭症患者とその両親3家系分のエクソーム解析を行った。現在、劣性遺伝形式を示す新規SNPの抽出を行い、原因変異の絞り込みを行っているところである。一方、小頭症の候補遺伝子が真の原因遺伝子であるかを検証するために、本研究では人工ヌクレアーゼTALENを用いたヒト培養細胞株における効率的な標的遺伝子破壊のプロトコールを構築した。また、ゲノム安定性維持を担う分裂期チェックポイントの主要分子であるBUBR1が先天的に欠損して生じる染色分体早期解離(PCS)症候群は、高発癌性だけでなく重度小頭症も発症する。日本人PCS症候群患者では、片アリル性にBUBR1遺伝子のエクソン内に変異を認めるが、もう一方のアリルはBUBR1発現低下を認めるがエクソン内変異は検出されない。本研究では、Long-Range PCRと次世代シークエンサーを利用して、日本人PCS症候群家系に共通して検出されるBUBR1遺伝子を含む0.2Mbのハプロタイプを解析したところ、BUBR1遺伝子の転写開始点上流約40kb上流にPCS症候群発症に関連する新規SNPを同定した。TALENを用いて本SNPをヒト正常細胞に導入するとBUBR1遺伝子発現の低下とPCS症候群患者細胞と同様の分裂期異常を示したことから、新規SNPがPCS症候群発症の原因変異であると考えられた。放射線の子宮内被曝は精神遅滞を伴う重度小頭症を誘発することが動物実験や原爆被爆者の疫学調査から明らかになっている。本研究では、遺伝性小頭症の原因遺伝子探索とその機能解析を行い、小頭症発症の分子病理機構の解明を研究目的としている。最終年度は、小頭症患者2名(同胞例)とその両親のエクソーム解析を行った。劣性遺伝形式を示す新規SNPの抽出を行い、原因変異の絞り込みを試みた。しかし、原因変異の候補となる新規SNPは検出されず、既知の小頭症原因遺伝子53遺伝子のエクソンおよびエクソンーイントロン境界部にも変異は検出されなかった。これらのことから、原因変異はエクソン外領域に存在することが示唆され、全ゲノム塩基配列決定による変異探索を要することが考えられた。また、ゲノム安定性維持を担う分裂期チェックポイントの主要分子であるBUBR1の先天的欠損症である染色分体早期解離(PCS)症候群は、高発癌性だけでなく精神遅滞を伴う重度小頭症も高頻度に合併する。日本人PCS症候群患者では、片アリル性にBUBR1遺伝子のエクソン内に変異を検出するが、もう一方のアリルにはBUBR1遺伝子発現低下に強く相関する0.2Mbのハプロタイプを認めるがエクソン内変異は検出されない。次世代シークエンサーを用いて本ハプロタイプの全塩基配列を決定して、BUBR1遺伝子の転写開始点上流44kbに本疾患に関連する新規SNPを同定した。独自に開発した人工ヌクレアーゼTALENを用いた一塩基編集技術を用いて、本SNPをヒト正常細胞にノックインしたところ、BUBR1遺伝子発現の低下と本疾患を特徴づける染色体不安定性を示したことから、新規SNPがPCS症候群発症の遺伝子外変異であると結論づけた。本研究成果はPNAS誌に掲載され、掲載号の注目論文として取り上げられた。原爆小頭症で知られるとおり、放射線による子宮内被曝は精神遅滞を伴う重度小頭症を誘発する。しかしながら、小頭症の分子・細胞レベルでの発症機序は不明な点が多い。本研究では、遺伝性小頭症の原因遺伝子の同定と機能解析を通じて、小頭症発症の分子機構の解明を試みる。

研究初年度は、MRE11遺伝子のスプライシング異常を示す日本人重度小頭症2家系の細胞生物学的解析を行った。これまでにMRE11遺伝子変異はAT(毛細血管拡張性運動失調症)様疾患を引き起こすことが知られていたが、本研究におけるMRE11遺伝子変異をもつ重度小頭症患者由来細胞を用いた解析から、本患者では放射線感受性およびATMシグナル依存性アポトーシスの有意な亢進を認めた。これらの結果から、本患者は神経発生過程でATM依存性アポトーシスが亢進したために、DNA損傷を受けた細胞が排除されてしまい、神経前駆細胞数の減少を来して小頭症を発症したと考えられた。一方、AT様疾患では、ATM依存性アポトーシスの低下により、DNA損傷をもつ神経細胞が蓄積されてしまい、小頭症ではなく神経変性症を発症したと考えられた。また、ゲノム安定性維持を担う分裂期チェックポイントの主要分子であるBUBR1が先天的に欠損して生じる染色分体早期解離(PCS)症候群は、高発がん性に加えて重度小頭症を合併する。本研究では、PCS症候群の分子病理学的解析を行い、G0期BUBR1が細胞外情報のセンサーとして働く一次繊毛の形成に必要であることを明らかにした。BUBR1は一次繊毛形成を介して多様な細胞分化シグナルを調節することによって中枢神経系の発生に重要な役割を担うことが示唆された。研究初年度の重度小頭症遺伝子同定はDNA修復経路に関連する候補遺伝子に着目した方法であったが、本年度はスクリーニングできる遺伝子数を増加できるエクソーム解析を3家系分について実施した。現在、劣性遺伝形式を示す新規SNPの抽出を行い、原因変異であるかを評価しているところである。また、候補遺伝子が真の原因遺伝子であることを証明するために、人工ヌクレアーゼを用いた効率的な標的遺伝子破壊をヒト培養細胞株で行うプロトコールを広島大学理学部・山本卓教授との共同研究で作成した。この共同研究の過程で様々な動物種や培養細胞でのTALEN/ZFNによるゲノム編集技術の有用性をPNAS誌、Genes to Cells誌に共著で発表した。研究初年度は、これまで申請者が所属する研究室で収集してきた日本人重度小頭症患者11例のうち、MRE11遺伝子のスプライシング変異を持つ2例について細胞生物学的解析を行った。その結果、また、患者由来細胞を用いた細胞生物学的解析から、本患者における放射線感受性およびATM依存性アポトーシスの亢進を明らかにした。これらの研究成果をまとめて、DNA Repair誌に発表した。また、重度小頭症を合併する高発がん性遺伝病である染色分体早期解離症候群の新しい分子病理機構として、G0期BUBR1の一次繊毛形成能の破綻を患者細胞およびBUBR1欠損メダカを用いた解析から明らかにした。本研究成果はHuman Molecular Genetics誌に発表した。また、一部新聞報道もされ、ゲノム安定性と中枢神経の発生メカニズムを繋ぐ研究としても注目された。本年度までにエクソーム解析を行った小頭症患者は3例3家系と限定的であるので、今後は未解析の家系についてエクソーム解析を行い小頭症原因遺伝子の探索を継続する。また、本年度、人工ヌクレアーゼを用いた標的遺伝子破壊をヒト培養細胞でルーチンワークとして行える状態になったの。
実践型演習における受講生の行動評価に基づくITコンピテンシ育成環境

今日の企業や組織においては,職員に期待する能力として,業務知識以上に,コミュニケーション力など汎用的な能力(コンピテンシー)が求められている。コンピテンシーの育成と評価に適した教育方法の一つとしてグループ演習があげられる。そこで著者らは,情報システム設計に関するグループ演習授業において,学生のレポートの記述内容からコンピテンシーを評価する方式を開発して,3年間にわたって評価の実施,結果の分析を行った。リーダー、実務エキスパートなどグループ内の役割ごとに分析したところ,それぞれの役割の特徴が分析され,演習運営の改善に生かすことができた。まず、前年度に先行して調査・実験した情報系実践演習における学生の行動特性(コンピテンシ)について再評価を行った。その結果、OECDが推進する協調学習フレームワークであるPISA CPSを用いればグループ演習における学生の行動パターンが捉えやすいことや、リーダー/実務エキスパート/調整役といった学生の役割タイプによって行動パターンやその変化が異なることが示された。そこで、評価を行う授業に先だって別の授業の中で学生のグループ活動における役割タイプを学生の相互評価によって分析し、役割タイプの分布がほぼ一定となるように学生グループを設定して再び演習を実施した。その結果、リーダーは出足不調であるが後半での伸び率が高い。問題の定義から解決への貢献度が高いが、検証・評価のポイントが低い。逆に実務エキスパートは出足好調で短期的な成果への貢献が高いが、問題の再発見と解決案の調整を繰り返すうちに活動が低調となることなどが分析された。また、この実験の過程において、コンピテンシ評価基準となる行動キーワード集(ルーブリック)およびその作成手順の第一版を開発することができた。上記の研究成果に関しては、研究会において報告した。そのほか、コンピテンシ向上を含めたプレゼンテーションのスキル向上の学習コンテンツについても研究発表を行った。また、先の科研費研究において開発した情報系学生のための高度ITスキルとコンピテンシ関連情報の共有サイトであるITPostについて、今後本研究成果を反映されるための準備を行った。高度なスキルとコンピテンシを持つ人材の情報を約300件拡張するなどの成果を含めて査読付き論文としてまとめた。またITコンピテンシ環境を構築するための技術基盤として、地理情報をタグとして付加した写真群より土地の被覆の経緯を分析する方法について研究し、査読付き論文をまとめた。前年度に調査・実験した情報系実践演習における学生の行動特性(コンピテンシー)とグループ活動の役割タイプの関係について再度実験・評価を行い、コンピテンシー・フレームワークであるPISA CPSの情報系行動評価への適合性や、リーダーや調整役等におけるコンピテンシー向上の傾向を検証した。そこで、同じ調整役でもリーダー不在で調整役が複数存在するグループよりもリーダーと調整役がそれぞれ存在している場合の方が、調整役のコンピテンシーの伸びが良いことなどが新たに分析された。またコンピテンシーの分析結果に基づいて、例えば、リーダー不在グループの調整役の学生には、問題の整理や対策の分担決めなど問題解決に関するコンピテンシーを向上させるタスクを担うように誘導するなど指導策を定義した。以上の実験で得られた成果は、前回の科研費研究において開発したIT人材像とスキル項目に関する知識ベースであるITPostを拡張することにより収納可能であることを机上設計により確認した。この実験では、学生のレポートからコンピテンシーを測定するための用語集(ルーブリック)の整備・拡張を進めた。昨年度までに収集した関連用語を増補するとともに、動詞との関係など構文規則を含めて定義を拡張したので、学生レポートからの測定の効率及び信頼性を高めることができた。これらの実験成果については、情報処理学会の研究会にて即座に報告を行った。IT人材育成を振興している情報処理推進機構(IPA)や社会人のIT人材教育企業である日立インフォメーションアカデミーとの研究交換会を設定し意見交換を行った。企業においてはITスキル以上にコンピテンシー向上への要求が強く、研究への期待が寄せられた。ITコンピテンシー環境を構築する技術基盤とその効果検証の研究として、言語分析機能と観光情報処理の関係について査読付き論文を発行した。「コンピテンシー知識ベース構築及びコンピテンシー育成マネジメント機能の開発」(おおむね順調)静岡大学情報学部の一つの演習授業において、グループ活動における学生の役割タイプとコンピテンシーの分析を繰り返すことにより、分析手順をさらに洗練化した。当初は複数の科目への展開を予定していたものを一つに絞った形となったが、その分考察を深めて分析結果を基にしてコンピテンシー向上のための学生指導施策を行うことができた。他大学(大学院連携)では学生に主観評価の質問紙を提示し回答を回収・集計する方式によるコンピテンシー評価の報告があるが、本研究では、学生の活動をルーブリックを用いて直接的客観的に測定するので、高い測定精度が期待できるとともに、当該の演習内容に即した学生指導を展開しやすい。また情報システムの要件定義過程あるいはサービス企画マネジメント過程におけるコンピテンシー発揮と支援について研究を進め論文投稿及び研究報告を行った。「構築・運用手順の汎用化」及び「利用拡大戦略の立案」(おおむね順調)学生レポートからコンピテンシーを判定するためのルーブリックの増補・改良手順を精緻化した。これによりルーブリック作成の負荷ならびにコンピテンシー判定の負荷を軽減し、一つの演習に対しTeaching Assistant 1名のサポートで授業期間内にコンピテンシー測定結果や演習指導をフィードバックさせる運用について見通しを得た。またデータ分析に基づく施策立案の応用として、消費者行動分析に基づく販売戦略立案について研究を行い国際会議報告を行った。

IT人材像とスキル項目に関する知識ベースであるITPostについてもデータを増補させながら運用を続けており、本研究成果との連動に関する課題を整理している。以上の2点を綜合して「おおむね順調」と評価している。前年度に引き続き、情報システム設計に関するグループ演習授業において個々の学生の役割と行動特性(コンピテンシ)の伸びの関係を測定・分析した。協調学習の共通フレームワークであるPISA CPSの3つの軸のうちの(2)問題解決に対するコンピテンシが、(1)コミュニケーションや(3)チームワークに対するコンピテンシと比べて、3年連続してひときわ大きな伸びを示し、最も学習効果を上げていることが重ねて示された。一方学生の役割に関しては、一昨年度の演習では「リーダー」と見られている学生よりも「実務エキスパート」や「調整役」と見られている学生の方がグループ演習で活躍する場面が多かったのに対し、昨年度では、「リーダー」が一貫して高いコンピテンシーを示していた。この問題に関して、今年度では、グループ内での議論が活発に展開されている場合には「リーダー」が取りまとめのために行動特性を発揮する機会が多いということが分析された。こうしたクラス全体の雰囲気に合わせてコンピテンシの向上を誘導していく実践的な教育方法に関して知見を得た。さらに今年度においては、これまで使用・蓄積したフレームワークとコンピテンシのキーワード集を別の演習科目に適用した。コンピテンシの伸びは同様に計測することができた。これら研究の狙いや分析結果に関して論文を執筆し、査読を経て掲載された。情報処理学会の高度人材認定のフォーラムにて講演し、企業教育関係者への普及を推進した。また、コンピテンシの構造と値、コンピテンシを有する人材や設計成果との関係などを統一的に扱う知識基盤技術の研究を進め、宇宙情報、観光情報などの分野における応用法などについて論文投稿および国際学会発表を行った。その他、IT企業経営、プロジェクト提案、プレゼンテーション制作などの分野におけるコンピテンシ育成を含む学習やその進捗度評価について研究会発表を行った。今日の企業や組織においては,職員に期待する能力として,業務知識以上に,コミュニケーション力など汎用的な能力(コンピテンシー)が求められている。コンピテンシーの育成と評価に適した教育方法の一つとしてグループ演習があげられる。そこで著者らは,情報システム設計に関するグループ演習授業において,学生のレポートの記述内容からコンピテンシーを評価する方式を開発して,3年間にわたって評価の実施,結果の分析を行った。リーダー、実務エキスパートなどグループ内の役割ごとに分析したところ,それぞれの役割の特徴が分析され,演習運営の改善に生かすことができた。「コンピテンシ知識ベース構築」(おおむね順調をいくらか上回る)
伝統的専門職組織の人材育成と事業システム

今年度は、能楽の公演を企画し運営責任を負うことが多いシテ方の能楽師の人材育成と事業システムに焦点をあてて、研究を行った。江戸時代から継続する家系の能楽師、一門の重責を担う人間国宝の能楽師とその後継者など、組織運営に関して責任をもちかつ技能レベルの高い調査協力者を得て、技能発揮の場面である公演の参加観察調査やインビュー調査を行った。調査結果から、能楽師が高度なスキルを獲得するキャリア形成のプロセスにおいて、いつ・どこで・どのような「一皮むけた経験」を有するのか明らかにした。能楽師の一皮むけた経験は、3つの時期に4種類がある。1内弟子時代に技能育成環境の変化に直面すること、230代ごろからの自分なりの技能を磨く時代にオリジナリティをどのように獲得するのかの模索、3基礎技能を自分のものとして腑に落ちた会得した経験、4キャリア後期にさらに新しい境地を獲得する楽曲に挑戦すること、である。指導育成の責任者である師匠にキャリア形成のプロセスに応じた一皮むけた経験は意識され、それを促すような指導もなされている。さらに、入門時の師匠と弟子の関係性を核に、キャリア形成に応じて意図的にディベロップメンタル・ネットワークの広がりが形成されることを発見した。最初の師匠が弟子のキャリア形成に応じて、宗家や一門の核になる能楽師など業界で影響力を有する能楽師へ自らの弟子を内弟子として送りだすことがある。その結果、弟子は新たな師匠から指導を受けるだけでなく多様な舞台経験を踏むことができ、さらにこの新しい師匠のもとに形成される内弟子のネットワークを通じて同世代の若手能楽師と関係性を構築することができ、自主公演での連携など技能育成を磨く機会の充実につながっている。得られた研究成果や知見を発表し、専門家と意見交換を行い今後さらに研究を深めるために、学会発表3回(内1回は海外)と論文執筆(1本)を行った。おおむね順調に進展している。理由:平成30年度は平成28・29年度の調査協力者の能楽師との連携を強化して調査を進めることができた。具体的には、良好な関係にある調査協力者の協力を得て、人材育成のポイントの「一皮むけた経験」について、複数の能楽師から深い語りの聞き取りを得ることができた。技能の進捗にかかわるデリケートな質問に関して、自らのキャリア形成の歩みを振り返りつつ、真摯かつ率直に経験を聞かせていただくことができたことは、調査研究上大きな進展であった、また、継続的な協力関係を有する能楽師以外の他の能楽師に関しても、キャリア節目の公演の場での参加観察など調査研究を展開することができた。その結果、シテ方能楽師の一皮むけた経験とキャリア形成との関連性を明らかにすることができた。能楽師の師匠は自らの専門職としての技能育成の歩みの経験をもとに、弟子の今後のキャリア形成のために他の能楽師のもとへ弟子を送りこむ等、公表されている文献では明確に記されていない点について、明らかにすることができた。また、平成29年度に明らかにした明治時代以降の能楽師という専門職組織間の連携の変化「ヒエラルキーからネットワーク型へ事業システムが移行」している点と、能楽師の人材育成との関連性について、宗家など影響力の強い師匠へ内弟子として送る仕組みが能楽師間に新たな連携を生み出し公演で多様な企画が成立している点で関連性を有していることを明らかにすることができた。しかし、いつごろからどのように変化したか等詳細までは、探求できなかった。一方で、キャリア形成のポイントのである一皮むけた経験について、シテ方以外の能楽師(ワキ方、狂言方、囃子方)の実情はどのようなものであるのかについては、詳しく明らかにすることができなかった。このように平成30年度は研究計画に基づき、順調に研究を進めることができた。平成2830年度の調査研究で協力を得られたシテ方能楽師の調査協力者との良好な関係性をもとに、今後も継続的に調査を行う。まず、ディベロップメンタル・ネットワークの形成の実情、キャリア形成のプロセスに応じたその形状の変化とキャリア形成との関連性について探求し、伝統的文化専門職が技能をどのように獲得していくのか、専門的技能だけでなく組織運営や顧客マネジメントに関する点についても、専門職同士の連携やその連携の結果として成り立つ公演の実情も考慮して研究を進める。また、平成29・30年度の調査研究で明らかになった専門職間の連携という事業実施のための新しいネットワーク形成が生じたことと、旧来から存在する宗家という制度との関連性について宗家(家元)に関する先行研究を踏まえて研究を進める。調査協力者の能楽師の中に、宗家預かり(技能レベルの高い能楽師が血縁に関係なく事実上の宗家としての役割を果たしている状況)の流儀の方がおり、現在の宗家の在り方が変化している可能性があるため、先行研究で検討された宗家の有する人材育成や事業システム上の機能と現在の宗家とを比較検討する予定である。さらに、初期キャリアと中期以降のキャリア形成において一皮むけた経験に違いがあること(経験がどのように生じるのか、その経験が生み出す変化等)が平成30年度の調査研究から明らかになったため、課題の楽曲やその披露の場である公演の設定に注目して、中堅や重鎮のシテ方能楽師へのインタビュー調査や公演の参加観察調査を行い、能楽師が自らの技能育成上の課題をどのように意識し、それをどう乗り越え技能レベルの向上を果たしているのか、さらに、公演のチケットを購入する顧客との関係性構築や価値共創に関しても調査研究する予定である。

これまでの研究成果と今後の研究の成果を横断的に考察し、能楽師の人材育成と能楽の事業システムとの関連性を探究する。伝統文化専門職の事例として能楽師、特に能楽の主役であるシテ方能楽師を務める人材の育成に焦点をあてて調査研究を進めた。具体的には、若手のシテ方能楽師を育成する指導者(人間国宝など業界の重鎮)、江戸時代から能楽師として継続する家系の中堅人の能楽師、若手人材などキャリア形成のプロセスにかかわる多様な立場のシテ方能楽師へのインタビュー調査と技能発揮の場面である公演での参加観察調査を行った。平成28年度の調査結果から、シテ方能楽師のキャリア初期には技能育成の課題とされる節目の楽曲が3つあり、その能力発揮の演目が公演されるので、能楽師や関心の高い観客に若手能楽師のキャリアの節目が共有されることが明らかなった。また、キャリア形成が進んだ中堅能楽師にも技能育成のプロセスに応じた重習物と呼ばれる課題となる楽曲が複数あり、これらの楽曲を演じるためには、キャリア初期の節目の楽曲と同様に師匠や家元の許可が必要であることも分かった。さらに、中堅やベテランの能楽師は自らの技能育成だけではなく、一門や流儀、さらに能楽界全体の研修の場などで後継人材を育成する役割を担うことも分かった。また、京都花街における伝統文化専門職に関する研究と比較して、日本の伝統文化専門職のキャリア形成の特色を検討した。その結果、1技能の習熟に応じたキャリア形成の節目がありキャリア形成のプロセスが明確であること、2キャリア形成を円滑にするため指導育成責任者とキャリア形成支援の関係を結ぶ仕組みがあること、3同期や先輩・後輩等、能力発揮の場では多様な専門家と一緒に技能発揮をするため現場経験が評価や学びの機会として機能すること、という3つの共通点を明確にした。得られた研究成果や知見を発表し専門家と意見交換を行い今後さらに研究を深めるために、学会発表2回(内1回は海外)論文執筆1本、研究会での招待講演1回を行った。能楽とディベロップメンタル・ネットワークに関する先行研究のレビューを丹念に行い、本研究の学術的意義を確認し、分析枠組みや概念定義、調査方法を固めることができた。また、能楽師へのインタビュー調査と技能発揮の現場や育成指導の現場の参加観察調査を予定通りに行うことができた。平成28年度は特にキャリア初期の若手人材の獲得すべき技能について明確にすることを目的として調査研究を進める計画であり、この点については実践知の概念を用いて、キャリア初期の段階で獲得すべきテクニカルスキルを明確に表す楽曲が広く共有されていることと、技能獲得に応じた公演が指導育成責任者と家元等の流儀の重鎮によって認められて開催できることを明らかにできた。さらに、いつどのように獲得した技能を発揮しその結果を検証し技能獲得していくのかについて、技能発揮の場である実際の公演の場で参加観察を行い、実践知がキャリアのレベルに応じてどのように育成されるのか、キャリアの節目に応じた楽曲があることとその課題曲に挑戦するための機会が能楽師同士の連携によって実施されていることも明らかにすることができた。また、事業システムに関して、一門の責任者もしくは責任者を補佐する立場の専門職に、能楽の公演の形態や実施の実状についてインタビュー調査を実施した。
ヒト上気道モデルを用いた新規インフルエンザ複製機序の解明とその制御

ンフルエンザウイルスは宿主細胞に感染し細胞死を誘導する。また、宿主由来の蛋白分解酵素を利用して複製された仔ウイルスが感染性を獲得する。今回、感染細胞の細胞死とウイルス複製との関係を調べた。その結果、インフルエンザウイルスは感染した細胞にアポトーシス以外の細胞死を誘導し、この細胞死の経路で利用される蛋白分解酵素を利用して感染性を獲得するという新たな感染性ウイルス産生機序の存在が示唆された。1.インフルエンザウイルスH1N1とH3N2を、MDCK細胞を用いてウイルス量を増やし準備した。2.米国ダートマス大学Wright博士よりヒト線維芽細胞の分与を受けた。3.MDCK細胞を用いた基礎実験ウイルス表面蛋白であるヘマグルチニン(HA)が開裂したウイルスをMDCK細胞に接種し、段階希釈したプロテアーゼ阻害剤とともに72時間培養し、比色法によりプロテアーゼ阻害剤の細胞毒性を検討し、さらにリアルタイムPCR法でウイルス量を定量化することによりその抗ウイルス効果について検討した。(1)使用したプロテアーゼ阻害剤はMDCK細胞に対して細胞毒性は示さなかった。(2)約0.1μg/mlのプロテアーゼ阻害剤濃度でプロテアーゼ阻害剤未添加のコントロールと比較しウイルス産生量を半減させることができた。(3)トリプシン添加プロテアーゼ未添加条件下ではウイルス量は指数関数的に増加した。(4)トリプシン未添加プロテアーゼ未添加条件下でもウイルス量は増加したが、トリプシン添加条件下に比較してウイルス量は100分の1程度であった。(5)トリプシン未添加プロテアーゼ添加条件下ではウイルス量はさらに100分の1程度に減少させることができた。以上により、プロテアーゼ未添加でもインフルエンザはMDCK細胞感染後に増殖することが示された。これは複製された仔ウイルスのHAがプロテアーゼを産生しないとされていたMDCK細胞由来のプロテアーゼにより開裂することを示唆している。つまり、ウイルス感染によりMDCK細胞内部からHA開裂に関与するプロテアーゼが誘導されている可能性を示すものである。今後、この機序について研究を進める予定である。前年度の研究で求められたウイルス量を半減させることのできる濃度(EC50)の10倍の濃度のプロテーゼ阻害剤をもちいてウイルス増殖実験を行った。ウイルス感染72時間後まで経時的にウイルス量をリアルタイムPCR法で定量化し、さらにウイルスヘマグルチニン(HA)の開裂の様子をウェスタンブロット法にて確認した。1.ウイルス感染8時間後までは、トリプシン添加プロテアーゼ未添加条件、トリプシン未添加プロテアーゼ未添加条件、トリプシン未添加プロテアーゼ添加条件のいずれのウイルス量にも差はなかった。2.培養72時間後の培養上清中のウイルスHAの開裂について、トリプシン添加プロテアーゼ未添加条件ではすべてのHAは開裂、トリプシン未添加プロテアーゼ未添加条件では約半数のHAが開裂、トリプシン未添加プロテアーゼ添加条件ではほとんどのHAが未開裂であった。3.各条件下でウイルス感染細胞内の細胞質基質を回収しウイルスHAについて確認したところ、HAは非開裂状態であった。以上から、インフルエンザウイルスは感染8時間以内に第1世代のウイルス複製が完了することが示唆された。さらに、各条件下でのHA開裂状況からHAはMDCK細胞が細胞外へ産生・分泌しているプロテアーゼにより開裂を受けていることが示唆された。次に培養上清を用いて、ザイモグラムによりプロテーゼの検出を試みた。1.ザイモグラムにて、カゼインまたはゼラチンを分解するプロテアーゼが検出された。しかし、これらの活性はウイルス増殖を抑制するプロテアーゼによって抑制されなかった。これは、HA開裂は細胞から培養上清中に分泌されるプロテアーゼの作用によらない、またはザイモグラムでは検出できないプロテアーゼの作用によりHAが開裂をうける可能性を示唆するものである。インフルエンザウイルスは表面の膜蛋白の一つであるヘマグルチニンをセリンプロテアーゼの作用により開裂させることで、新たな感染性を獲得する。しかしながら、セリンプロテーゼを産生しないMDCK細胞にインフルエンザウイルスを感染させても外因性のプロテアーゼ添加なしに新しいウイルスの複製サイクルが認められる。そこでインフルエンザウイルスが感染細胞にアポトーシスを誘導し、その際に用いられるプロテアーゼを自己の複製・増殖のために利用しているとの仮説に基づきこれを検証した。まず、ウイルスを細胞に感染させる前後に全カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD FMKもしくはカスパーゼを介しないアポトーシス経路に重要な役割を担うセリンプロテーゼの一つであるHtrA2の阻害剤であるUcf-101を添加し実験を行った。さらに両者を併用し同様の実験を行ったが、いずれの条件でもウイルス増殖と細胞死を抑制することはできなかった。一方、セリンプロテーゼ阻害剤を添加すると、ウイルス増殖が効率よく抑制できた。

これらの結果から、ウイルスは細胞感染後にアポトーシス以外の細胞死を誘導し、その経路ではHtrA2以外のセリンプロテアーゼが関与していることが考えられ、これがウイルスヘマグルチニンの開裂に寄与していると考えられた。そこで、ウイルス感染細胞の細胞膜分画、細胞質分画、培養上清を回収し、ザイモグラム法で当該セリンプロテアーゼの検出を試みたが、同定には至らなかった。しかし、今回、ヒト上気道モデルで同様の実験を行ったところ、当該セリンプロテアーゼ阻害剤はヒトの気道上皮細胞には毒性を示さず、且つ効率よくウイルスの増殖を抑制することが示されたことから、セリンプロテアーゼ阻害剤が従来の抗インフルエンザ剤とは異なる作用機序を持った新規抗ウイルス剤の候補となることが予想された。プロテアーゼの作用によりHAが開裂することは明らかであるが、様々な方法により細胞分画におけるプロテーゼの同定を試みているが、同定までには至っていない。研究計画当初よりもMDCK細胞を用いた手法の確立に時間を要していることから、実際のヒトアデノイドから単離した上皮細胞を用いた研究まで至っていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。HAが開裂していないウイルスを作製し、これを細胞に感染させさまざまなタイミングでウイルスHAの開裂の状況をウェスタンブロッティングで詳細に検討することにより、細胞内外でのHA開裂のタイミングについてさらに検討を加える。また、細胞分画を感染前後、さらにウイルス感染を経時的に細かく単離することによりHA開裂に関与するプロテーゼの同定を試みる。プロテーゼの同定には質量分析による同定も検討する。
スピン検出走査トンネル顕微鏡を用いた表面ナノ磁性研究

化学的に安定な窒化物ナノ磁性体規則配列の磁性解明を目指して、Cu(001)表面上に窒化クロム(CrN)規則ナノ構造を作製する方法を研究した。バルクのCrNは、岩塩型の結晶構造をもち、低温で反強磁性となる化合物である。固体表面に形成したCrN超薄膜は、その基板の格子定数に応じてバルクのCrN結晶とは異なる磁性を持つことが理論的に予測されている。バルク結晶とは格子定数の異なる基板上に窒化クロム薄膜を形成すれば、歪緩和機構によって興味深い磁性をもつ規則ナノ構造ができると期待される。そこで、これまで単原子層窒化物ナノ構造が観察されているCu(001)表面を基板に用いた。実験では、超高真空中で清浄なCu(001)表面上に、まず、低エネルギーイオン注入の方法で表面に窒素原子を導入する。その上に金属クロムを蒸着し400500°C程度でアニールすることにより、単原子層の窒化マンガン薄膜を作製した。表面構造解析には走査トンネル顕微鏡および低速電子回折を用い、組成分析にはX線光電子分光を用いた。ナノ磁性体規則配列を実現するために、窒素吸着量、クロム蒸着量およびアニール温度を系統的に変化させて実験を行った。その結果、アニール温度が400430°Cとした場合にのみ、単原子層のCrNナノアイランド(4x4nm^2)規則配列ができることをみいだした。この規則配列は、既に報告のあるMnNナノアイランド配列と類似しており、その場合と同じように格子歪を解消するCrN島間の短距離力によって周期構造が形成されたと考えられる。一方、このCrNナノアイランド配列では、その高さに2種類あるなどMnNの場合とは異なる点もあり、MnN薄膜と比較して、CrN薄膜の格子歪が小さいことが原因で、新奇なナノ構造が形成されていると考えられる。この規則ナノ構造は熱的に不安定であり、アニール温度をさらに高くすると、Cr_2Nの組成をもつ島構造が不規則に作製され、磁性に興味がもたれるCrN単原子膜は、高温では次第に分解してしまうことが明らかとなった。本研究では、規則ナノ構造の磁性研究を最後に行う予定であったが、測定を始める前に外国人特別研究員の期間が終了した。これは、東日本大震災によって走査トンネル顕微鏡を用いた研究に遅れが生じ、規則ナノ構造の実現に時間がかかりすぎたことが原因である。遷移金属窒化物超薄膜ナノ構造は、格子定数に依存した局所磁性が多様で興味が持たれている。今後、スピン分解走査トンネル顕微鏡を用いて、この研究を新しい局所磁性の研究へと発展させていく予定である。ナノ磁性体規則配列の磁性解明を目指して、固体表面に磁性規則ナノ構造を作成する方法を開発している。まず、Cu(001)表面上の規則窒化マンガンナノ構造を作成した。この実験では、最初に、超高真空中でスパッターとアニールを繰り返すことにより、清浄なCu(001)表面を作成する。次に、窒素イオン注入の方法で表面に窒素原子を導入し、それを400°C程度でアニールすることにより、平坦な窒素飽和吸着表面を作成する。その上にマンガンを蒸着し400°C程度でアニールすることにより、1原子層の窒化マンガンナノ構造薄膜を作成した。表面構造は走査トンネル顕微鏡(STM)を用いて室温で観察した。次に、クロムを用いた場合に同様のナノ構造ができるかどうかを調べるために、平坦な窒素飽和吸着表面クロムを1原子層以下蒸着した後、400°C程度アニールしてSTM観察した。クロム蒸着量が0.1原子層以下の場合、アニール後には、窒素が一部脱離し、格子パターンが現れた。クロム蒸着量を増やしていくと、この規則ナノ構造は崩れていく。これは、表面にクロム原子混入したために、表面格子歪が緩和され、格子歪によって形成していた規則ナノパターンが崩れていくと解釈できる。1原子層のクロムを蒸着した表面に、窒素を補給しアニールすると、1原子層深さのナノトレンチが不規則に現れた。これは、窒化クロムが表面歪を導入したためであるが、銅だけの表面や窒化マンガンのように規則パターンができない原因は明らかではない。安定なナノ磁性体規則配列の磁性解明を目指して、Cu(001)表面に磁性窒化物規則ナノ構造を作製する方法を開発し、その組成、構造および形成過程を調べている。昨年度から始めている規則窒化クロムナノ構造の作製条件を探索した。この手法では、清浄なCu(001)表面に窒素イオン注入の方法で表面に窒素原子を導入した後に400°C程度でアニールして作製した窒素飽和吸着表面を利用する。その上にクロムを蒸着しアニールすることにより、窒化クロムナノ構造を作製する方法を確立し、その構造を走査トンネル顕微鏡(STM)で観察した。クロムの平均膜厚(d)が0.5原子層(ML)以下の場合には、500°Cアニール後、表面は銅清浄面と数nm-10nm四方の大きさをもつ1原子層の窒化物の島で構成される。島の表面には、原子サイズの規則格子が観察された。また、島内の原子の高さは完全には一様ではなく、60pm程度高い原子列が1nm程度ごとに観察できる。この窒化クロム島の組成を調べるために、同じ作製条件を用いて作製した試料のX線光電子測定を行った。

窒素1sの光電子スペクトルから、1)窒素は銅原子ではなくクロム原子と結合している、2)dが0.5ML以下の場合にはCrNができる、3)dが0.5ML以上の場合にはCr_2Nができる、ことがわかった。STMで観察された格子は、単層CrNのCr原子またはN原子と考えられる。その格子定数は、基板の銅結晶よりも8%程度大きく、バルクCrNよりは7%程度小さい。このCrN膜がバルク結晶に比べて圧縮されていることが、結晶格子が規則的な正方格子を維持できず、STMで観察された60pm高い原子列が形成される原因であると結論した。化学的に安定な窒化物ナノ磁性体規則配列の磁性解明を目指して、Cu(001)表面上に窒化クロム(CrN)規則ナノ構造を作製する方法を研究した。バルクのCrNは、岩塩型の結晶構造をもち、低温で反強磁性となる化合物である。固体表面に形成したCrN超薄膜は、その基板の格子定数に応じてバルクのCrN結晶とは異なる磁性を持つことが理論的に予測されている。バルク結晶とは格子定数の異なる基板上に窒化クロム薄膜を形成すれば、歪緩和機構によって興味深い磁性をもつ規則ナノ構造ができると期待される。そこで、これまで単原子層窒化物ナノ構造が観察されているCu(001)表面を基板に用いた。実験では、超高真空中で清浄なCu(001)表面上に、まず、低エネルギーイオン注入の方法で表面に窒素原子を導入する。その上に金属クロムを蒸着し400500°C程度でアニールすることにより、単原子層の窒化マンガン薄膜を作製した。表面構造解析には走査トンネル顕微鏡および低速電子回折を用い、組成分析にはX線光電子分光を用いた。ナノ磁性体規則配列を実現するために、窒素吸着量、クロム蒸着量およびアニール温度を系統的に変化させて実験を行った。その結果、アニール温度が400430°Cとした場合にのみ、単原子層のCrNナノアイランド(4x4nm^2)規則配列ができることをみいだした。この規則配列は、既に報告のあるMnNナノアイランド配列と類似しており、その場合と同じように格子歪を解消するCrN島間の短距離力によって周期構造が形成されたと考えられる。一方、このCrNナノアイランド配列では、その高さに2種類あるなどMnNの場合とは異なる点もあり、MnN薄膜と比較して、CrN薄膜の格子歪が小さいことが原因で、新奇なナノ構造が形成されていると考えられる。この規則ナノ構造は熱的に不安定であり、アニール温度をさらに高くすると、Cr_2Nの組成をもつ島構造が不規則に作製され、磁性に興味がもたれるCrN単原子膜は、高温では次第に分解してしまうことが明らかとなった。興味深いナノ磁性が期待できる安定なCrN膜を作製する方法を開発できたので、従来からの実験手法を用いてその物性を調べる研究をほぼ順調に行ってきた。本研究では、規則ナノ構造の磁性研究を最後に行う予定であったが、測定を始める前に外国人特別研究員の期間が終了した。これは、東日本大震災によって走査トンネル顕微鏡を用いた研究に遅れが生じ、規則ナノ構造の実現に時間がかかりすぎたことが原因である。当初の計画では、作製した磁性体の磁性を走査トンネル顕微鏡にスピン検出機能を持たせて測定する計画であった。しかし、開発を進めるうちに、その手法には汎用性が乏しく一般的なスピン計測は困難であることが判明したため、開発を中断している。今後は、窒化物磁性体ナノ構造の物性を研究の中心とし、磁性を調べるためには電子分光手法を用いる計画である。
高階な言語の概普遍性判定問題の決定可能性の解析

高階言語はプログラムの正しさを検証する「モデル検査」と呼ばれる技術を中心に近年注目を集めている言語クラスであるが,未解明な基本的性質が多く残されている重要な研究対象である.本研究では高階言語に対する概普遍性判定問題と呼ばれる決定問題の決定可能性に着目し研究を進め,高階言語の母関数的・組合せ的性質の解明のへ新たな道を拓くことを目指す.高階言語はプログラムの正しさを検証する「モデル検査」と呼ばれる技術を中心に近年注目を集めている言語クラスであるが,未解明な基本的性質が多く残されている重要な研究対象である.本研究では高階言語に対する概普遍性判定問題と呼ばれる決定問題の決定可能性に着目し研究を進め,高階言語の母関数的・組合せ的性質の解明のへ新たな道を拓くことを目指す.
行為の社会的意味

この研究は行為の社会的意味に照準を当て、行為と志向性、行為の他者による了解可能性、行為と記述、とくに行為の複層的被規定性の根拠を行為が為される社会的文脈から明らかにすることをめざすものである。そのため、増永は主として、M・ブロンデルの行為論を中心に、全体としての人間的生を構成する行為の諸相の展開と、それによっていかにして共同体的倫理的世界が確立されるかを考察し、63年9月に九州大学哲学会で発表し、九州大学の菅ならびに他の教官と意見を交換した。また菅は後期ウィトゲンシュタインの言語ゲームを手がかりに、行為と記述の関係を分析し、社会的規範や価値評価による行為規定の構造を問題にし、従来からの研究結果を刊行し、増永、松永からの批判をうけ、その問題をさらに追求しようとしている。松永は、彼の従来からの行為研究をまとめ、63年12月、九州大学に10日間滞在し、行為の志向性、行為と因果性、行為規定の社会的文脈に関する研究発表を行い、増永、菅と多くの意見交換をおこなった。三者の共同研究を通して、共通の認識に達したものも多々あるが、相互の間に大きな見解の相異を残しているものが、いくつかあり、しかもそれらはすべて行為の哲学の基本問題であり、今後の共通の課題として、相互の研究成果を交換しつつ、明らかにしていかなければならない。その二三を挙げれば、まず、志向性をどう把握するかに関して増永、菅と松永との間に大きな見解の相異があることである。第2に因果性をめぐる松永の考察はとくに菅に大きな影響を与えたが、松永の因果性の考えが首尾一貫したものでありうるかどうかに関して、松永と菅はさらに検討を加える必要がある。第3に増永が主題としている、社会的規定を超越する行為の創造的契機の解明は松永や菅にとってはこれからの課題であり、増永の仕事を参照しつつ、考察を進めていく必要がある。
肺線維化に対する気道上皮細胞の機能的役割の解明と治療法の研究開発

1)気道上皮細胞BCL6強発現マウスの作製と解析:肺胞上皮細胞でBCL6が特異的に発現する目的でサーファクタントプロテインC(SPC)遺伝子のプロモーターを使用してSPC-BCL6-トランスジェニック(Tg)マウスを作製中した。LPSやブレオマイシン経気道投与による肺炎症および線維化の解析を行ったが、野生型マウスと比べて明らかな異常を認めなかった。また、いずれのTgマウスも外因性BCL6の発現が弱く、強発現マウスが得られなかった。また、BCL6強発現安定細胞株の作製を試みたが、細胞死を誘発するため、BCL6強発現による解析は困難であった。一方、BCL6の機能抑制を目的とし、ヒト肺胞上皮細胞であるA549にBCL6のDNA結合ドメインを欠損させたBCL6-ドミナントネガティブ(DN)遺伝子を強発現させたヒト肺胞上皮細胞機能安定株(SPC-DN-BCL6-A549)の確立に成功した。本研究では、おもに、この細胞を用いて解析した。また、現在、SPC-DN-BCL6-Tgマウスを作製し、.解析中である。2)SPC-DN-BCL6-A549の解析:BBCL6は気道上皮細胞でも発現している。また、気道上皮細胞は様々なケモカインやナイトカインの産生による気道炎症の制御や、上皮細胞のアポトーシスが肺線維症の原因になる可能性があることから、このような肺胞上皮細胞の機能に対するBCL6の役割をSPC-DN-BCL6-A549を用いて解析した。SPC-DN-BCL6-A549は継代可能であったが、無刺激で増殖能がA549に比べて明らかに低下し、さらに、ブレオマイシン添加による細胞傷害によるアポトーシスに対して一時的に抵抗性を示すが、その後、急速に細胞死を示した。以上の結果より、BCL6が細胞の生存や恒常性の維持に関与することを明らかにした3)BCL6のケモカイン遺伝子クラスターの制御機構:MCP-1を含む一連のケモカイン遺伝子群がBCL6によって統合的制御されることを見出した。この遺伝子クラスターには、多くの炎症性疾患で重要な役割を果すケモカインが存在していることから、BCL6は細胞恒常性維持機能と共に、ケモカイン産生の制御に深く関与することが考えられる。このようなBCL6の機能の破綻は間質性肺炎および肺線維症の発症に影響する可能性があると考えられる。肺線維症は肺胞領域に組織再構築(リモデリング)の結果、線維化による重度の呼吸不全をきたし、難治性で根治的治療法が存在しない予後不良の疾患である。その本態として肺上皮細胞の繰り返す傷害・損傷が線維化の発症および進行に重要な役割を果たす可能性が考えられている。すなわち、高度な上皮傷害とそれに続く線維芽細胞に代表される間葉系細胞の増殖をともなう異常な治癒過程により線維化の促進に進むと考えられる。

BCL6は主にリンパ球、心臓、脾臓そして気道上皮細胞を含む肺に強く発現しており、これら臓器・細胞に対して重要な転写抑制因子として働いていると考えられる。また、BCL6は細胞の終末分化に関与することが知られており、細胞の恒常性の維持に関与すると考えられるがその詳細な機構は不明である。そこで、本研究は、肺上皮細胞の形態的・機能的な恒常的維持機構についてBCL6の役割を分子レベルで解析し、明らかすることを目的としている。1)サーファクタントプロテイン(SP)C遺伝子プロモーターを利用した気道上皮細胞に選択的にBCL6を強発現するマウス(4系統)の作製が完了した。予備実験として肺組織でのBCL6蛋白の発現を免疫組織化学法によって解析している。2)細胞の維持機構に対するBCL6の役割を解析するために、T細胞,B細胞および肥満細胞で解析した。その結果、BCL6(ノックアウト)KOのT細胞では抗CD3抗体の繰り返し刺激により、増殖の低下および細胞死の増加を認めた。B細胞ではLPS+IL-21の刺激によって細胞死の増加を同様に認めた。また、肥満細胞では野生型に比べ、増殖の低下を認めた。以上の結果はBCL6が細胞の恒常性の維持に深く関与することを示すものであり、気道上皮系細胞についても現在、解析中である。肺線椎症は肺胞領域に組織再構築(リモデリング)の結果、線維化による重度の呼吸不全をきたし、難治性で根治的治療法が存在しない予後不良の疾患である。その本態として肺上皮細胞の繰り返す傷害・損傷が線維化の発症および進行に重要な役割を果たす可能性が考えられている。すなわち、高度な上皮傷害とそれに続く線維芽細胞に代表される間葉系細胞の増殖をともなう異常な治癒過程により線推化の促進に進むと考えられる。1)サーファクタントプロティン(SP)C遺伝子プロモーターを利用した気道上皮細胞に選択的にBCL6を強発現するTgマウス(4系統)をH16年度に作製がしたが、いずれも外因性のBCL6の発現が弱くH17年度に新たに6系統のTgマウスを作製し、現在、肺組織でのBCL6蛋白の発現を免疫組織化学法によって解析している。2)細胞の維持機構に対するBCL6の役割を解析するために、ヒト肺上皮細胞株に対し内因性BCL6の機能を抑制する目的でBCL6のドミナントネガティブ(A549-BCL6-DN)変異体を導入した機能安定株を作製した。解析の結果、A549と比べてA549-BCL6-DNでは増殖の低下および細胞死の増加を認め、癌抑制遺伝子であるp53遺伝子の発現が増加していた。また、ケモカインであるMCP-1やMCP-3遺伝子の発現の増加も認めた。以上の結果はBCL6が細胞周期の調節によって気道上皮細胞の恒常性の維持に深く関与することや、遊走性サイトカインの産生を調節することによって、気道炎症の制御に関わることを見出した。1)気道上皮細胞BCL6強発現マウスの作製と解析:肺胞上皮細胞でBCL6が特異的に発現する目的でサーファクタントプロテインC(SPC)遺伝子のプロモーターを使用してSPC-BCL6-トランスジェニック(Tg)マウスを作製中した。
破骨細胞におけるカテプシンEの役割と創薬にむけた基質分子の探究

破骨細胞への分化・活性化においてRANK(Receptor Activator of NF-κB)/ RANKL(RANK Ligand), OPG(Osteoprotegerin)の系とMacrophage colony stimulating factor(M-CSF)/ c-fmsの系は重要なシグナル伝達経路である。カテプシンE(CE)の欠損マウスは破骨細胞の形成において、野生型マウスと比較して有意な破骨細胞数の減少が認められたため、これらの経路を含めた解析を進めてきた。破骨細胞数の減少と一致して、リアルタイムPCRでは、M-CSFおよびRANKLの膜表面受容体c-fms、RANK、シグナル経路のc-fos、破骨細胞特異的マーカーであるカテプシンK、酒石酸耐性アルカリホスファターゼ、等には発現の減少傾向にはあるものの、統計学的に有意な差は認められなかった。また、破骨細胞前駆細胞の融合に関係しているといわれているDC-STAMPとOC-STAMPについても同様の結果であった。そこで、包括的に細胞内のmRNAの発現を調べるために、Microarray解析を行った。すると、いくつかの因子の上昇あるいは下降が認められたが、その中で、酸化ストレスに関する因子の上昇が認められた。そこで、RANKL添加前と添加後の過酸化水素水を測定したところ、CE欠損マウスにおいて過酸化水素水産生量の上昇が認められた。つまり、CE欠損マウスは何かの原因で酸化ストレスを受けている可能性が示唆される結果となった。また、オートファジー関連分子について解析を行ったところ、p62、LC3、ユビキチンが、細胞可溶画分から不溶画分へと移動した。この結果と、破骨細胞数の減少に酸化ストレスが関与している、という結果と考えあわせると、CE欠損マウスにおける破骨細胞数の減少はオートファジーが亢進し、破骨細胞のミトコンドリアにダメージが生じ、破骨細胞の形成に抑制が生じたことが示唆された。破骨細胞への分化・活性化においてRANK(Receptor Activator of NF-κB)/RANKL(RANK Ligalld),OPG(Osteoprotegerin)の系とMacrophage colony stimulating factor(M-CSF)/c-fmsの系は重要なシグナル伝達経路である。カテプシンE(CE)の欠損マウスは破骨細胞の形成において、野生型マウスと比較して有意な破骨細胞数の減少が認められたため、これらの経路を含めたの解析を進めてきた。リアルタイムPCRでは、M-CSFおよびRANKLの膜表面受容体c-fms、RANK、シグナル経路のc-fos、破骨細胞特異的マーカーであるカテプシンK、酒石酸耐性アルカリホスファターゼ、等には発現に有意な差は認められなかった。そこで、包括的に細胞内のmRNAの発現を調べるために、RANKL添加後24時間での細胞を回収し、mRNAを採取、Microarray解析を行った。すると、いくつかの因子の上昇あるいは下降が認められたが、その中で、酸化ストレスに関する因子(peroxiredoxinl)の上昇が認められた。そこで、RANKL添加前と添加後の過酸化水素水を測定したたところ、CE欠損マウスにおいて過酸化水素水産生量の上昇が認められた。今後は酸化ストレスのもととなるミトコンドリアの機能について解析を行う予定である。カテプシンE(CE)の欠損マウスは破骨細胞の形成において、野生型マウスと比較して有意な破骨細胞数の減少が認められたため、その破骨細胞形成機構についての解析を進めてきた。

22年度はまず、破骨細胞数の減少は細胞死が原因ではないことを確認するため、細胞増殖能を調べたところ、これについては、野生型と欠損型で差は認められなかった。我々は最近、CE欠損マウスからの腹腔マクロファージでオートファジーが亢進している結果を得ており、オートファジー関連分子のp62やLC3-I,-IIの発現が上昇していることなどを明らかとしてきた。そこで、これらをもとに破骨細胞におけるオートファジー関連分子の挙動について解析を行った。腹腔マクロファージと同様に、破骨細胞前駆細胞においても、p62の発現の上昇を認めた。LC3についてもLC3-Iと-IIの発現が上昇し-IIの比率が上昇していることが明らかとなった。また、細胞質におけるタンパク質の分解系であるユビキチンの発現の上昇も認められた。この結果と、21年度の破骨細胞数の減少に酸化ストレスが関与している、という結果と考えあわせると、CE欠損マウスにおける破骨細胞数の減少はオートファジーが亢進し、破骨細胞のミトコンドリアにダメージが生じ、破骨細胞の形成に抑制が生じたことが示唆された。23年度は、さらにミトコンドリアのATP産生能や膜ポテンシャルにおける解析を行う予定にしている。カテプシンE(CE)の欠損マウスは破骨細胞の形成において、野生型マウスと比較して有意な破骨細胞数の減少が認められたため、その破骨細胞形成機構についての解析を進めてきた。本年度は、野生型マウスとCE欠損マウスの骨髄から破骨細胞形成因子であるmacrophage-colony stimulatingfactorとReceptor Activator of NF-κB Ligandを添加することで、破骨細胞を作製し、両者間でMicroarray解析を行った。以前から解析されていたマクロファージからの解析と昨年までの結果と同様に、酸化ストレスに関する分子が多く発現していた。一方、酵母のYeast Two Hybrid Systemを用いて、新たな基質の探索も同時に試みた。手始めに、すでに作製してあった胎児のマウスからライブラリーを作製し、これと成熟型CEや活性中心に変異を入れたベイトとの結合を調べた。CEと結合するいくつかの分子が見つかり、塩基配列を決定することで、既知か未知の分子であるか明らかにされた。しかしながら、破骨細胞でのみ発現しているような分子は認められなかった。また、先に明らかとされた酸化ストレスに関する分子は、このYeast Two Hybrid Systemでは見つからなかった。現在、破骨細胞からライブラリーを作製中であり、でき次第すでに作製されているCEのベイトとの結合を調べることにしている。