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レトロウイルス誘発抗原特異的CD8T細胞機能不全機構の解明

ウイルス等の持続感染個体では、ウイルス特異的メモリーCD8T細胞に対して特異抗原による継続的な刺激が繰り返されることにより種々の抑制性受容体の発現が持続し、結果T細胞機能が低下するいわゆる疲弊(exhaustion)が起こる。マウスに持続的なウイルス血症とそれに引き続く致死性の赤白血病を誘発するレトロウイルスであるフレンドウイルス(FV)感染個体ではウイルス特異的CD8T細胞の著しい機能低下が認められるが、その機構は不明であった。研究代表者、はこの機能不全の原因が他の持続感染ウイルス同様の疲弊に起因すること、しかも通常持続感染期にみられるウイルス特異的CD8T細胞疲弊の誘発が、FV感染個体の場合では感染初期より観察されることを見出した。この成果により、FV感染により増加した制御性T細胞(Treg)によりウイルス特異的CD8T細胞が機能不全に陥るというこれまでの説が根底から覆された。フレンド白血病ウイルス(Friend virus ; FV)は成体マウスに免疫抑制に伴う持続的なウイルス血症とそれに引き続く致死性の赤白血病を誘発するレトロウイルスである。FV感染による免疫抑制(抗原特異的CD8T細胞機能不全)の実態はこれまで感染後期に誘導される制御性T細胞(Treg)によるものと考えられてきた。しかしながら、申請者はFV感染初期における爆発的なウイルス感染細胞の増加とこれに伴う極度の刺激がウイルス特異的CD8T細胞の疲弊(ehxaustion)を誘発し、これが機能不全の原因であることを報告した(Takamura et al. J Imunol.2010)。更に、申請者はFV持続感染個体にて機能的メモリーCD8T細胞が全く検出されないことに不審を抱きFV感染形態を再検討したところ、これまで報告されていた骨髄、脾臓のみならず、胸腺もFVの感染・複製の標的臓器の一つであることを突き止めた。通常持続感染期に胸腺より供給された抗原特異的ナイーブCD8T細胞は、末梢で残存抗原により活性化され機能的メモリーCD8T細胞へと分化する。しかしながらFVの胸腺感染は、ウイルス抗原が自己抗原と見なされることでウイルス特異的免疫寛容を誘導し、持続感染期におけるウイルス特異的ナイーブCD8T細胞の供給(機能的メモリーCD8T細胞の源)が遮断され、これが持続感染期における機能的メモリーCD8Tの枯渇原因となっていることが示唆された。これに関して申請者は、FVが胸腺細胞、胸腺樹状細胞、胸腺ストローマ細胞等あらゆる細胞に感染性を示すことを明らかとした。更に、FV感染胸腺から供給されたCD8T細胞がインフルエンザ抗原には反応するものの、FV抗原刺激には反応出来ないことを突き止めた。一方、FV持続感染マウスがFV抗原発現腫瘍細胞を排除出来ないにもかかわらず、FV以外の抗原発現腫瘍細胞を排除する事が出来る事を見出し、免疫抑制がFV抗原特異的である事を証明した。これは先のTregによる免疫抑制を間接的に否定するものでもある。現在、FV感染マウスに正常マウス胸腺より供給されて間もない末梢T細胞(Recent Thymic Emigrant ; RTE)を移入し、FV特異的ナイーブT細胞の供給を補うことで、持続感染の結果誘発される白血病発症が抑制されるかを検討中である。フレンド白血病ウイルス(Friend virus; FV)は成体マウスに免疫抑制に伴う持続的なウイルス血症とそれに引き続く致死性の赤白血病を誘発するレトロウイルスである。しかしながら、申請者はFV感染初期における爆発的なウイルス感染細胞の増加とこれに伴う極度の刺激がウイルス特異的CD8T細胞の疲弊(ehxaustion)を誘発し、これが機能不全の原因であることを報告した(Takamura et al. J Imunol. 2010)。しかしながらFVの胸腺感染は、ウイルス抗原が自己抗原と見なされることでウイルス特異的免疫寛容を誘導し、持続感染期におけるウイルス特異的ナイーブCD8T細胞の供給(機能的メモリーCD8T細胞の源)が遮断され、これが持続感染期における機能的メモリーCD8Tの枯渇原因となっていることが申請者の研究により明らかとなった。

また、このウイルス特異的免疫寛容の誘導にはウイルスに感染した胸腺樹状細胞、胸腺上皮細胞が重要な役割りを果たしていることも明らかとなった(論文執筆中)。従って、FVは早期疲弊の誘導により末梢性のCD8T細胞免疫応答を、また免疫寛容により中枢性のCD8T細胞免疫応答を共に回避する術を備えていることが明らかとなった。
膜型混合バイオリアクターとビフィズス菌特異的増殖因子を利用した生菌製剤の生産

本研究では,膜型混合バイオリアクターシステムとブロピオン酸菌の生産するビフィズス菌特異的増殖促進物質(BGS)とを利用した,生菌製剤としてのビフィズス菌の効率的生産法を開発することについて検討した。本研究において得られた結果は,以下のようにまとめられる。1.プロピオン酸菌培養液が示す増殖促進作用を定量的に測定するために,Bifidobacterium longumを被検菌として高感度な寒天平板拡散法を用いたバイオアッセイ法を確立した。2.ビフィズス薗の増殖に対するプロピオン酸菌の培養液が示す促進作用を,A)誘導期の短縮,B)比増殖速度の向上,C)最終菌体濃度の増加,D)生菌率の増加,E)増殖収率の変動などを指標にして検討した。その結果,BGSを含む培養液の添加によってビフィズス菌の最終濁度および生菌率が増加することがわかった。3.プロピオン酸菌は,ラクトースやグルコースなどの糖質に比べて,乳酸の発酵速度が速いことがわかった。したがって,糖を炭素源としてビフィズス菌と混合培養することによってプロピオン酸菌の増殖が促進されると推定された。このように,ビフィズス菌とプロピオン酸菌の間には,増殖に関して相互に協調関係が成立することがわかった。4. 2台の発酵槽と2本のホローファイバー型精密濾過膜モジュールとを組み合わた膜型混合バイオリアクターシステムを開発した。このシステムを用いて,B.breveまたはB.adolescentisとPropionibacterium freudenreichiiとの膜型混合培養を行った結果,ビフィズス菌は単独培養に比べて約1.42倍濃度まで生育させることができた。本研究では、膜型混合バイオリアクターシステムとプロピオン酸菌の生産するビフィズス菌特異的増殖促進物質(BGS)とを利用した、生菌製剤としてのビフィズス菌の効率的生産法を開発することについて検討した。本研究において得られた結果は、以下のようにまとめられる。1)プロピオン酸菌培養液が示す増殖促進作用を定量的に測定するために、Bifidobacterium longumを被検菌として高感度な寒天平板拡散法を用いたバイオアッセイ法を確立した。このバイオアッセイ法を用いることによって、各プロピオン酸菌の回分培養による増殖因子の生産量を比較した結果、Propionibacterium shermaniiが乳酸を炭素源としたときに最も多くのBGSを生産することがわかった。2)ビフィズス菌の増殖に対するプロピオン酸菌の培養液が示す促進作用を、A)誘導期の短縮、B)比増殖速度の向上、C)最終菌体濃度の増加、D)生菌率の増加、E)増殖収率の変動などを指標にして検討した。その結果、BGSを含む培養液を添加することによってビフィズス菌の最終濁度および生菌率が増加することがわかった。しかし、酸素に対する耐性への影響については、培養工学的見地から検討する必要性があると考えられた。3)2台の発酵槽と2本のホローファイバー型精密濾過膜モジュールとを組み合わせた膜型混合バイオリアクターシステムを開発した。このシステムを用いて、B.breveとP.freudenreichiiとの膜型混合培養を行った結果、ビフィズス菌は単独培養に比べて約1.4倍濃度まで生育させることができた。本研究では,膜型混合バイオリアクターシステムとプロピオン酸菌の生産するビフィズス菌特異的増殖促進物質(BGS)とを利用した、生菌製剤としてのビフィズス菌の効率的生産法を開発することについて検討した。

1.膜型混合バイオリアクターシステムを用いた透析培養によってビフィズス菌を生産した結果,使用した培地量に比例して多くの菌体を得ることができた。この時得られた菌体濃度は,通常の回分培養に比べて高くなった。2.ビフィズス菌培地にプロピオン酸菌培養上澄液を流加しながら,ビフィズス菌を培養した結果,上澄液を添加しない場合に比べてビフィズス菌を多く生産できた。したがって,ビフィズス菌の生産にとってプロピオン酸菌培養上澄液は有効であることがわかった。3.プロピオン酸菌は,ラクトースやグルコースなどの糖質に比べて,乳酸の発酵速度が速いことがわかった。したがって,糖を炭素源としてビフィズス菌と混合培養することによってプロピオン酸菌の増殖が促進されると推定された。4.模型混合バイオリアクターシステムを用いてビフィズス菌とプロピオン酸菌との混合培養を行った結果,同体積の培地を用いた場合にはビフィズス菌は単独培養に比べて約2倍濃度まで生育した。また,プロピオン酸菌は単独培養に比べて半分の時間で同じ菌体濃度に達した。
結膜EMZLにおけるRAS系の関与

組織レニン・アンジオテンシン系(組織renin-angiotensin system: RAS)および受容体結合プロレニン系(receptor-associated prorenin system: RAPS)は、糖尿病網膜症をはじめとする様々な眼疾患において血管新生などの病態に関与することを、我々はこれまでに報告してきた。本研究では、結膜節外辺縁帯B細胞性リンパ腫(EMZL)におけるRASおよびRAPSの病態への関与を検討した。その結果、組織RASおよびRAPSが結膜EMZLの病態形成に関与する分子であることが示唆された。結膜リンパ腫は眼付属器でみられる悪性腫瘍の中でも高い頻度でみられる疾患である。節外辺縁帯B細胞性リンパ腫(EMZL)は結膜リンパ腫では最も多くみられる組織型であるが、その病態における分子機構はよく知られていない。レニン・アンジオテンシン系(RAS)は、生物が海から陸へと進化する過程で塩分と水分を体内に保持するために発達した循環ホルモンシステム(循環RAS)であるが、臓器局所では細胞の分化・増殖など組織修復などの役割を担っている(組織RAS)。これまでに研究代表者のグループは、組織RASおよび組織RASの上流に位置する(プロ)レニン受容体が、眼組織におけるVEGFを介した炎症・血管新生の上流で網膜疾患の分子病態を制御していることを動物モデルで示し、受容体結合プロレニン系(RAPS)という新たな病態概念を提唱してきた。RASの抑制が腫瘍の増殖や効果的に抑制することが複数の実験モデルや臨床研究で示されており、悪性腫瘍に対する治療標的としてRASは良い候補であると言われていることから、EMZLにおいてもRASやRAPSが密接に関与していると考えられる。本研究では、外科的に切除された結膜EMZL組織を用いてRAS及びRAPS関連分子の発現を解析する。これまでに外科的に切除した結膜EMZL組織を採取する事が出来た。そして結膜EMZL組織とIM-9細胞においてRAS関連分子の発現を定性PCRで確認した。また(P)RRは、結膜EMZL組織においてB細胞マーカーCD20、血管内皮細胞マーカーCD31とさらにはB細胞においてはリガンドのプロレニンと共局在が認められた。AT1Rも同様にCD20およびCD31と、またリガンドのアンジオテンシノーゲンと共局在していた。外科的に切除した結膜EMZL組織をこれまでに5症例を採取する事が出来た。そして結膜EMZL組織5例とヒトBリンパ球細胞のIM-9細胞においてRAS関連分子の発現を定性PCRで確認した。これまでに申請者のグループは、組織RASおよび組織RASの上流に位置する(プロ)レニン受容体が、眼組織における血管内皮増殖因子(VEGF)を介した炎症・血管新生の上流で網膜疾患の分子病態を制御していることを動物モデルで示し、受容体結合プロレニン系(receptor-associated prorenin system: RAPS)という新たな病態概念を提唱してきた。RASの抑制が腫瘍の増殖や転移を効果的に抑制することが複数の実験モデルや臨床研究で示されており、悪性腫瘍に対する治療標的としてRASは良い候補であると言われていることから、EMZLにおいてもRASやRAPSが密接に関与していると考えられる。これまでに外科的に切除した結膜EMZL組織において、RAPS関連分子の発現・局在を確認した。そこで、培養ヒトBリンパ球を用いてRASおよびRAPSの病態形成への関与を明らかにした。これまでに申請者のグループは、組織RASおよび組織RASの上流に位置する(プロ)レニン受容体が、眼組織におけるVEGFを介した炎症・血管新生の上流で網膜疾患の分子病態を制御していることを動物モデルで示し、受容体結合プロレニン系(receptor-associated prorenin system: RAPS)という新たな病態概念を提唱してきた。RASの抑制が腫瘍の増殖や転移を効果的に抑制することが複数の実験モデルや臨床研究で示されており、悪性腫瘍に対する治療標的としてRASは良い候補であると言える。また組織RASの抑制は急性炎症モデルに効果を示したという報告がある。

さらに、最近我々は糖尿病網膜症患者より採取した臨床検体を用いた解析の結果、(プロ)レニン受容体はVEGFと同様に糖尿病網膜症における血管新生、つまり疾患の進行に関与する重要な分子であることを示した。先に述べたように、我々は結膜EMZLには炎症が関与すること、VEGFが発現していることを示しており、EMZLにおいてもRASやRAPSが密接に関与していると考えられる。組織レニン・アンジオテンシン系(組織renin-angiotensin system: RAS)および受容体結合プロレニン系(receptor-associated prorenin system: RAPS)は、糖尿病網膜症をはじめとする様々な眼疾患において血管新生などの病態に関与することを、我々はこれまでに報告してきた。本研究では、結膜節外辺縁帯B細胞性リンパ腫(EMZL)におけるRASおよびRAPSの病態への関与を検討した。その結果、組織RASおよびRAPSが結膜EMZLの病態形成に関与する分子であることが示唆された。B細胞におけるRASおよびRAPSの詳細な病態形成への関与を明らかにするため、培養ヒトB細胞を用いてプロレニンおよびアンジオテンシンII刺激により、どのような分子の発現が変動するかを確認する。1.ヒトBリンパ芽球株の細胞増殖(増殖能力、生存能力)、細胞サイクル、細胞生存率、細胞形態、アポトーシスなどへの影響をフローサイトメトリーや免疫細胞染色等により解析する。2.両者による刺激は分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(ERK1/2)や転写因子NF-kBなど種々の細胞内シグナルを活性化し、細胞増殖因子のVEGFやFibroblast growthfactor(FGF)、基底膜分解酵素のマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP-2)などの発現上昇を誘導することが報告されている[Pons M, et al., Am J Pathol. 2011; Kanda A, et al., Diabetologia. 2012]。それら炎症関連分子や血管新生関連分子の遺伝子発現をreal-time PCR法、タンパク発現をELISA法またはウエスタンブロット法を用いて検討する。外科的に切除した結膜EMZL組織を用いて、RAPS関連分子と同定した分子との関連性を免疫組織染色やウエスタンブロット法などを用いて解析を行う。眼科学研究計画に沿って、研究費は順調に使用されている。予想より臨床検体の集まりが遅かったため、解析が一部行えていない。そのため少額の研究費が残存したが、次年度の研究費として繰越を行った。研究計画に沿って、研究費は順調に使用されている。予想よりターゲット遺伝子の選定などに時間を要したため、解析が行えていない。そのため、少額の研究費が残存したが、次年度の研究費として繰越を行った。27年度に施行予定であった実験計画や28年度行う予定の実験費用(細胞培養試薬、抗体、遺伝子発現解析試薬、プラスチック消耗品など)に使用する。28年度に施行予定であった実験計画や29年度に行う予定の実験費用(細胞培養試薬、抗体、遺伝子発現解析試薬、プラスチック消耗品など)に使用する。
社会的相互作用を支える無意識の対人間協調ダイナミクス

近年、二者が向かい合って立つと無意識的に姿勢動揺が同期することが報告され、この同期が社会相互作用を支える神経系の機能として注目され始めている。しかしながらこれらの先行研究は、姿勢動揺の時系列データの相互相関により同期を定量化するにとどまっており、その背後に潜むダイナミクスは検討していない。つまり二者の身体の潜在的な協調ダイナミクスと、顔がそれに与える影響は不明である。本研究の目的はこれらを明らかにすることである。初年度はまず、二者間の姿勢同期がどの程度の距離で生じるのか、またパーソナルスペースとどのように関連しているのかを調査した。二者が複数の距離(つま先間の距離が20、40、60、80、100cm)で向かいあって立つ(対面条件)、背中を向けて立つ(背面条件)という2つの条件を設定した。姿勢動揺は床反力計および動作解析装置を用いて計測した。パーソナルスペースは先行研究に習って計測した。パーソナルスペースは解析中なので、二者の姿勢同期について述べる。同期の指標として、相互相関解析、線形因果性解析を試みた。相互相関解析の結果は、先行研究と同様の結果であった。すなわち、対面条件のみにおいて、二者間の同期が確認された。さらに、足圧中心と頭部動揺に対して線形因果性解析を行った。その結果、二者間の影響量は頭部動揺においてより顕著に観察された。このことは、二者が互いに相手の頭部(顔)から影響を受け動揺しているが、その動揺は身体の各関節の協調により補償されていることを示唆する。二者間の姿勢同期の指標として、申請時に予定していた非線形因果性解析を試みたが、うまく影響量を検出できなかった。その理由としては、そもそも解析手法がこのデータに適していないか、もしくは応用方法に問題があるかのどちらかが考えらえる。この点については引き続き研究を進める。しかしながら、その他の結果(線形の因果性解析の結果)から、二者間の姿勢同期に顔が与える影響についての理解を深めることができた。現在解析中のパーソナルスペースとの関連を調べることで、さらなる研究の進展が期待される。以上の理由から、おおむね順調に進んでいると言える。今後の研究の推進方策として、まずは初年度の課題を論文化するための検討事項を2つ述べる。1つ目は、二者間の姿勢同期について申請時に予定していた非線形因果性解析の応用を試みることである。これによって、時系列データの背後に潜むダイナミクスについて明らかにできる可能性がある。2つ目は、パーソナルスペースと姿勢同期、因果性との関連を明らかにすることである。この2点を確認し、そこまでの知見を論文化する。次の実験としては以下の条件設定を考えている。まず、相手の背中を見る条件など、相手との位置関係に関する条件を増やすことである。初年度は、二者間距離を複数設定したために、実験時間内に床反力計を何度も動かす必要があり、対面と背面の2条件しか設定できなかった。次年度は初年度の知見をもとに、相手の影響が及ぶ距離、及ばない距離の2つの距離において、様々な二者の位置関係を検討する。さらにその際に、姿勢動揺の方向性についても検討する。

1つ目は、二者間の姿勢同期について申請時に予定していた非線形因果性解析の応用を試みることである。これによって、時系列データの背後に潜むダイナミクスについて明らかにできる可能性がある。2つ目は、パーソナルスペースと姿勢同期、因果性との関連を明らかにすることである。この2点を確認し、そこまでの知見を論文化する。次の実験としては以下の条件設定を考えている。まず、相手の背中を見る条件など、相手との位置関係に関する条件を増やすことである。初年度は、二者間距離を複数設定したために、実験時間内に床反力計を何度も動かす必要があり、対面と背面の2条件しか設定できなかった。次年度は初年度の知見をもとに、相手の影響が及ぶ距離、及ばない距離の2つの距離において、様々な二者の位置関係を検討する。さらにその際に、姿勢動揺の方向性についても検討する。
スフィンゴシン1リン酸輸送体を標的とした新規免疫抑制剤の開発

スフィンゴシン1リン酸(S1P)は、赤血球から血液中に放出される物質であり、リンパ球が血液中で働くために必要不可欠である。私は、赤血球から血液中へS1Pを放出する働きを持つ“S1P輸送体"が新しい免疫抑制剤の標的として有望であると考えている。本研究では、蛍光物質を使ってS1P輸送体の働きを簡単に調べる方法を確立した。この方法は、赤血球のS1P輸送体の働きを抑制する薬を探すのに有用である。血漿中のS1Pは、リンパ球の細胞膜に存在するS1P受容体に結合し、リンパ球の遊走を促進することで、胸腺および二次リンパ組織からのリンパ球の移出に必須の働きをしている。S1P受容体の機能的アンタゴニスト、フィンゴリモド(FTY-720)は免疫抑制作用を持っており、多発性硬化症治療薬として使用されている。本研究では、多検体処理可能なS1P輸送活性測定系を構築し、S1P輸送体を阻害する化合物のスクリーニングを行うことで、新しい免疫抑制剤の開発を目指している。平成25年度は、赤血球を用いた簡便なS1P輸送活性測定系を構築するため、蛍光標識されたS1Pの赤血球からの放出について調べた。赤血球にスフィンゴシン-NBDを含むバッファーを添加し、37°Cでインキュベートした後、遠心分離し、赤血球と上清から脂質抽出を行い、TLCにより展開した。LAS-3000を用いて、460nmの励起光照射により観察されるスポットを撮影し、定量したところ、スフィンゴシン-NBDが赤血球に取り込まれ、リン酸化されたことにより、時間依存的に細胞内のS1P-NBD量が増加した。また、細胞内で合成されたS1P-NBDは時間依存的に細胞外へ放出された。赤血球からのS1P-NBDの放出は、細胞外からの刺激を必要とせず、時間依存的であるという点で、赤血球からのS1Pの放出と同様である。私たちは、これまでの研究において、赤血球のS1P輸送体がATP依存性であり、ABCA輸送体の阻害剤であるGlyburideにより阻害されることを見いだしている。そこで、赤血球からのS1P-NBD放出に対するGlyburideの影響を調べたところ、赤血球のS1P輸送体と同様、Glyburideにより阻害されることが分かった。以上の結果より、S1P-NBDは赤血球のS1P輸送体によって輸送されると考えられる。平成25年度の研究では、NBD-スフィンゴシンが赤血球に取り込まれてNBD-S1Pへ代謝され、細胞外に放出されることが明らかになった。また、この赤血球からのNBD-S1Pの放出は、赤血球のS1P輸送体と同様、ABCA輸送体の阻害剤であるGlyburideにより阻害された。そこで、平成26年度は赤血球のNBD-S1P輸送体が赤血球S1P輸送体と同一のものなのかどうかをさらに検証するため、赤血球からのNBD-S1PやS1Pの輸送がそれぞれ細胞内のS1PやNBD-S1Pにより競合阻害を受けるかどうかを解析した。実験を進めていく過程で、NBD-スフィンゴシンはスフィンゴシンに比べ、細胞内へ取り込まれる速度が非常に遅いことが分かった。したがって、NBD-スフィンゴシンとスフィンゴシンを同時に赤血球へ加えた場合、S1Pと比較して、NBD-S1Pの細胞内での合成量は非常に少なかった。そこで、始めにNBD-スフィンゴシンのみを赤血球とインキュベートし、細胞内でNBD-S1Pを合成させた後、バッファーを除き、スフィンゴシンを含むバッファーもしくは含まないバッファーと交換した。そうしたところ、スフィンゴシンを添加した場合には細胞内でS1Pが合成され、それとともにNBD-S1Pの細胞外への放出が阻害された。また、スフィンゴシンと、その5倍量のNBD-スフィンゴシンをバッファーに添加した場合には、細胞外へのS1P放出が阻害された。以上の結果より、赤血球からのNBD-S1PおよびS1Pの放出は同一の輸送体を介していると考えられる。本研究では、蛍光物質のNBDで標識されたスフィンゴシン1リン酸(NBD-S1P)を用いて、赤血球のS1P輸送体活性を簡便に測定する系の確立を目指している。平成27年度は、赤血球からのNBD-S1P放出測定において使用する試薬や溶媒の条件検討を行った。これまで、赤血球からのS1P放出を測定する場合には、1% BSAを含むバッファーを用いていたが、BSAはNBD-S1Pの蛍光を測定する際、バックグラウンドを上昇させてしまうことが分かった。そこで、0, 0.01, 0.1, 1% BSAを含むバッファーを用いて、赤血球からのNBD-S1P放出を測定した。0.01%以下のBSAを含むバッファーでは、赤血球が溶血してしまったが、0.1% BSAを含むバッファーでは、1% BSAを含むバッファーと比較して、NBD-S1Pの放出量は若干減少するものの、バックグラウンドはほとんど上昇しなかった。

また、脂質抽出においては、脂質の分離を促進するために添加していたKCl溶液の塩素イオンが蛍光を減弱する可能性が考えられたことから、替わりに蒸留水を添加したところ、NBD-S1Pの蛍光強度が上昇し、脂質の分離も問題ないことが分かった。また、脂質抽出における水層の容量を減らすことで、水層中のNBD-S1P濃度を高め、蛍光測定時の感度を上昇させられるかどうか検討した。その結果、蒸留水の添加を無くし、メタノールの添加量を0.43倍に減らすことで、脂質の分離には影響を与えずに蛍光強度を約2.3倍上昇させられることが分かった。また、ジメチルホルムアミド(DMF)は蛍光強度を増強させる作用があることから、脂質抽出時の水層とDMFを混合し蛍光強度を測定したところ、水層とDMFを4:1の割合で混合した場合に、同量の水層と比較して蛍光強度が約1.5倍増強されることが分かった。平成27年度より研究代表者の所属機関が摂南大学へ変更になり、研究に必要な遠心濃縮機を購入する必要があったが、手続きの関係上、2ヶ月程度科研費を使うことができず、平成27年4月1日から6月12日までは実験を行うことができなかった為。本研究では、蛍光標識されたスフィンゴシン1リン酸(S1P)であるNBD-S1Pを用いて、赤血球S1P輸送体阻害剤のスクリーニングに必要な簡便で多検体処理可能なS1P輸送体活性測定系の確立を試みた。赤血球からのNBD-S1Pの放出は、S1Pの放出と同様、時間依存的であり、Glyburideにより阻害された。また、赤血球からのNBD-S1PとS1Pの放出は、細胞内のS1PとNBD-S1Pによりそれぞれ阻害された。これらの結果から、赤血球からのNBD-S1Pの放出とS1Pの放出は同じ輸送体を介していることが明らかになった。私は、NBD-S1Pを用いたS1P輸送体活性測定法を簡便にするため、蛍光プレートリーダーを使用した方法を確立し、検出感度を上げるため、脂質抽出において添加する溶媒の添加量等を最適化した。蛍光プレートリーダーの使用により、HPLCやTLC等のクロマトグラフィーに要する時間を省くことができた。しかしながら、アッセイバッファー中に含まれるNBD-S1Pを定量するためには、脂質抽出を必要とすることがネックとして残っていたことから、脂質抽出を必要としないS1P輸送体活性検出法の確立を試みた。0.1% BSAを含むアッセイバッファーを用いた場合、赤血球とNBD-スフィンゴシンをインキュベーションしてから1時間後にはアッセイバッファー中のNBD-スフィンゴシンがほぼ細胞内へ取り込まれることに着目し、赤血球とNBD-スフィンゴシンをインキュベーションしてから1時間後と2時間後のアッセイバッファーの蛍光を脂質抽出をせずにそのまま測定したところ、S1P輸送体の活性を検出できることが分かった。本研究で確立した方法により、赤血球S1P輸送体の阻害剤が同定できれば、より副作用の少ない免疫抑制剤の開発が可能になると考えている。スフィンゴシン1リン酸(S1P)は、赤血球から血液中に放出される物質であり、リンパ球が血液中で働くために必要不可欠である。私は、赤血球から血液中へS1Pを放出する働きを持つ“S1P輸送体"が新しい免疫抑制剤の標的として有望であると考えている。本研究では、蛍光物質を使ってS1P輸送体の働きを簡単に調べる方法を確立した。この方法は、赤血球のS1P輸送体の働きを抑制する薬を探すのに有用である。赤血球のNBD-S1P輸送体は、赤血球S1P輸送体と同一であることが明らかになったため。細胞膜輸送体の機能と生理的役割赤血球から放出されるNBD-S1Pの蛍光をプレートリーダーにより簡便に高感度で測定する方法と条件を検討し、赤血球S1P輸送体の阻害剤スクリーニングにつなげる。赤血球からのS1P-NBDの放出が確認できたことから。
糖尿病性腎症の進展におけるFSP1陽性細胞の役割

糖尿病性腎症のバイオマーカーとしての尿中FSP1の臨床的意義を検討するために、20092010年に当科で腎生検を実施した糖尿病性腎症患者の中でインフォームド・コンセントを取得した24例の尿中FSP1値を測定した。尿検体には、治療開始前、腎生検実施日の早朝第1尿を用い、測定値はクレアチニン値で補正した。尿中FSP1は、24例中20例で測定感度以下であった。測定した4例においても、臨床所見や病理所見との関連は認められず、尿中FSP1は糖尿病性腎症の有用なバイオマーカーでないと考えられた。つぎに、ポドサイトにおけるEMT誘導因子を検討する目的で、ポドサイト細胞株を高糖濃度、アンジオテンシンII刺激下、およびTGF-beta1刺激下で培養し、EMT関連因子の発現誘導をreal time PCR法で検討した。ポドサイト細胞株をTGF-beta1 (10ng/ml)存在下に24時間培養することで、EMT誘導因子であるSnail1とLOXの有意な発現亢進が認められた。また、線維芽細胞マーカーであるcollagen type 1およびfibronectinの発現亢進も認められた。一方、高糖濃度およびアンジオテンシンII刺激下では、有意なEMT誘導因子の発現はなかった。最後に、糖尿病性腎症の進展におけるFSP1の役割をin vivoで検討する目的で、ポドサイト特異的にFSP1を過剰発現するトランスジェニックマウス(FSP1.TG)とFSP1ノックアウトマウス(FSP1.KO)に、ストレプトゾトシン(STZ)投与による糖尿病モデルを作製した。しかし、これらの遺伝子改変マウスであるコントロールマウスにおいても、有意な腎病変の出現は認められなかった。STZモデルは腎症解析には有用なモデルとはいえないため、今後モデルを変更して、FSP1のin vivoにおける役割を検討する。
新たな早産予防戦略を指向した、子宮頸管における無菌性炎症とその制御機構の解明

子宮頸管における無菌性炎症応答とプロゲステロンによる制御系の破綻により誘導される早産病態メカニズムの検証を目指して以下の検討を行った。1無菌性炎症応答に関与する内因性リガンドの探索:頸管組織にも存在する代表的なAlarminであるHMGB1を各種濃度で子宮頸部線維芽細胞(UCFs)培養系に添加したところ、推定される生理的濃度では炎症応答は惹起されず、他の内因性リガンドの探索が必要と考えられた。Alarminの細胞外放出は、組織損傷などによる受動的な漏出以外に、炎症刺激による能動的な産生が報告されている。UCFs培養におけるLPS誘導性の炎症誘導性分子のうち、プロゲステロンによって発現が抑制されるリガンドをRNAシークエンス法を用いてグローバルに解析すると、先行研究で報告した分子群(IL-6, IL-8, PTGS2, CXCL11等)に加え、Alarminとして報告されている炎症メディエーターが新規に同定された。この分子の発現は頸管組織においてプロゲステロン作用で制御されている可能性が示唆され、無菌性炎症応答に関与する内因性リガンド候補と位置付けた。2無菌性炎症と拮抗するプロゲステロン標的分子の探索:頸管熟化機構において、炎症応答と呼応したプロゲステロン作用の減弱が推定される。そこで、RNAシークエンス法のデータより、プロゲステロン単独投与で著明に発現誘導され、LPS添加によって抑制される分子群を抽出した。さらにハンドサーチにより、炎症応答カスケードに抑制的に作用するシグナル分子を同定した。この分子はプロゲステロンシグナルの標的として頸管組織における潜在性無菌性炎症と拮抗している可能性が示唆される。RNAseqを用いたゲノムワイドな探索により、無菌性炎症応答の内因性リガンドと、プロゲステロンシグナルで誘導される制御系分子の候補を絞り込み、今後の研究展開の具体的な方向性が定まった。無菌性炎症への関与が示唆された内因性リガンドおよびその受容体のヒト頸管組織における発現・局在を免疫組織化学染色で明らかにする。さらにUCFs培養系を用いて以下の検討を行う。1リガンド添加によって誘導される炎症応答の特徴、プロゲステロン作用の影響、および外因性リガンドとの相乗作用について解析する。2発現誘導や機能変化に対するメカノストレスの影響について検証する。3制御因子と推定されるプロゲステロン標的分子の役割について、特異的阻害剤やsiRNAを用いて検証する。4炎症応答性の転写因子ならびにプロゲステロン受容体の標的遺伝子へのリクルートメント、転写活性化と相関する修飾ヒストンの局在についてChIPシークエンス法を用いて全ゲノムスケールで評価し、無菌性炎症応答に拮抗するプロゲステロンの作用機構を明らかにする子宮頸管における無菌性炎症応答とプロゲステロンによる制御系の破綻により誘導される早産病態メカニズムの検証を目指して以下の検討を行った。4炎症応答性の転写因子ならびにプロゲステロン受容体の標的遺伝子へのリクルートメント、転写活性化と相関する修飾ヒストンの局在についてChIPシークエンス法を用いて全ゲノムスケールで評価し、無菌性炎症応答に拮抗するプロゲステロンの作用機構を明らかにする研究の効率化を企図し、当該年度はRNAシーケンス解析による標的分子の絞り込みを行った。
リン酸親和性電気泳動に基づく蛋白質二重翻訳後修飾の同時検出法の開発とその応用

本研究では,申請者らが開発したリン酸親和性電気泳動法(Phos-tag SDS-PAGE)を用いた2次元電気泳動法を基盤とした蛋白質翻訳後修飾の同時検出法の開発を行った.すなわち,蛋白質を1次元目としてSDS-PAGEなどの電気泳動法で分離し,次に2次元目としてPhos-tag SDS-PAGEで分離することによって,「リン酸化とユビキチン化」など,複数の翻訳後修飾に関する解析を1枚のゲルで同時に検出する方法である.本研究では,申請者らが開発したリン酸親和性電気泳動法(Phos-tag SDS-PAGE)を用いた2次元電気泳動法を基盤とした蛋白質翻訳後修飾の同時検出法の開発を行った.すなわち,蛋白質を1次元目としてSDS-PAGEなどの電気泳動法で分離し,次に2次元目としてPhos-tag SDS-PAGEで分離することによって,「リン酸化とユビキチン化」など,複数の翻訳後修飾に関する解析を1枚のゲルで同時に検出する方法である.ある蛋白質の1種類の翻訳後修飾が分子スイッチとして機能することで別の翻訳後修飾が稼働し,さらにそれらの修飾が複数の蛋白質群との複合体形成のために必須であるといった細胞内シグナリングが多くの研究成果より明らかになってきている。このような知見を得るためには,従来法では,それぞれの翻訳後修飾を検出するための抗体を用いてウェスタン解析を繰り返し行う必要があった。しかし,この方法では,過剰な化学反応修飾やその経時的な修飾ステップなど,蛋白質の詳細な翻訳後修飾反応をモニタリングすることは困難である。そこで本研究では,蛋白質のリン酸化修飾を軸とした複雑で多様なネットワークを理解するための高性能な分析技法を開発することを目的とする。当該年度では,フォスタグを用いたリン酸親和性2次元電気泳動法の原理を基盤とした蛋白質ダブル翻訳後修飾の同時検出法の開発を試みた。以下に研究の成果を列記する。1)フォスタグを用いたリン酸親和性電気泳動にBis-Tris-HClの中性pH緩衝液系を適用させることでリン酸化蛋白質の分離能が著しく改善した。2)通常のSDS-PAGE法と上記の中性pH環境下でのリン酸親和性電気泳動法を組み合わせた2次元電気泳動を行うことで,βカテニンのユビキチン化とリン酸化の同時検出,並びに,これら修飾反応の経時的ステップのモニタリングに成功した。上記したような著しく分離能の改善したリン酸親和性電気泳動法を開発したことにより,より幅広いリン酸化蛋白質の解析に応用できるものと期待している。来年度は,より感度の高い蛋白質ダブル翻訳後修飾の同時解析のためにディファレンシャル検出のコンビネーションに展開していく。なお,これまでの成果は2010年12月9日に神戸で開催の第33回日本分子生物学会・第83回日本生化学学会年会等で発表した。本研究では,申請者らが開発したリン酸親和性電気泳動法(Phos-tag SDS-PAGE)を用いた2次元電気泳動法を基盤とした蛋白質翻訳後修飾の同時検出法の開発を行った.すなわち,1次元目としてSDS-PAGEなどの電気泳動法で分離した蛋白質を,2次元目としてのPhos-tag SDS-PAGEで分離し,リシ酸化とユビキチン化など,複数の翻訳後修飾を受けたタンパク質に関する情報を同時に得られる方法である.まず,2次元目のPhos-tag SDS-PAGEの改良を行なった.本研究以前に開発したPhos-tag SDS-PAGEはアルカリ性の泳動条件であり,Phos-tagとリン酸基の親和性において至適条件ではなかった.これを中性の泳動条件で行うシステムを開発,適用したところ,劇的な分離・分解能の向上が見られた.この改良型のリン酸親和性2次元電気泳動法を用いて,以前の方法ではできなかった,以下のような成果を得た.1.Wntシグナルの構成分子であるβ-カテニンは,プロテアソーム阻害剤存在下のHEK293細胞において,ポリユビキチン化され,1次元目のSDS-PAGEで分子量の増加を検出できた.2次元目のPhos-tag SDS-PAGEでは,細胞内で恒常的に10種類のβ-カテニンのリン酸化状態が存在すること,さらにそのうち2つのリン酸化状態がポリユビキチン化とプロテアソームによる分解へと導かれることがわかった.2.1次元目の電気泳動法として多種の手技を適用し,等電点電気泳動法,ネイティブ電気泳動法,ブルーネイティブ電気泳動法を組み合わせる事を試みた.これらは,リン酸基によるものを含めタンパク質の電荷の違いを分離する方法であるのに対し,Phos-tag SDS-PAGEはリン酸基による状態の違いのみを分離する特徴がある.この組み合わせの2次元電気泳動により,ニワトリの卵白アルブミンには遺伝的なアミノ酸変異による電荷の違いがあること,またそれらのそれぞれに4種類のリン酸化状態が存在することがわかった3.蛍光ディファレンシャル電気泳動法でも高い分解能を示し,フォスファターゼ阻害剤存在下で高度にリン酸化される細胞内タンパク質を多数同定した.
土壌回復力(Soil Resilience)に関する基礎的研究

現在、砂漠化は半乾燥地を中心に世界的規模で進行しており、大きな地球問題となってきている。土壌を修復し、植生を定着させることを図るためには、土壌中の水分動態を把握することが大きな鍵である。本研究では、これまで実際の実験が困難なことから理論的な解析に留まっている、植物根近傍の水分動態を、直接、非破壊状態で像として得ることを試み、合わせてその解析も行った。植物試料としてダイズを用い、アルミニウムの薄箱中(120×160×3mm)で育成しながら、経時的に根及び根近傍の土壌中の水分動態を中性子ラジオグラフィ法で像として得た。中性子照射は日本原子力研究所の原子炉JRR3で行い、試料を通過する中性子をガドリウムのコンバータでγ線に変換し、X線フィルムを感光させた。X線フィルムには、土壌より水分量が多い根の形態が側根を含め、はっきりとした像が写し出された。本法による像の分解能は100μm以下であった。土壌中の水分量の変化は、フィルム上の黒化度として得られ、特に根の近傍1mm以下の地点まで解析可能であった。これら根及び根近傍の水分動態を解析するため、X線フィルム上に得られた水分像の画像解析を試みた。まず、土壌中の水分量を4-16分割することにより等水分線を求めたところ、根の上部が最も等水分線の密度が高いことが判った。次に、像を根の上部から下部にかけて、数箇所、根の垂直に切った水分像の断面図を求めた。根の近傍数mmの地点での水分吸収は、根の上部が最も多くまた下部からの吸収も示された。また、根より数cm離れた地点での水分吸収は根の下部から上部にかけて次第に増大することが示された。本研究で示された、1本の根からの水分吸収の根の部位による差異は初めて実験的に見いだされた結果であり、今までの理論解析における一様な根のモデルは見直しが必要になると思われる。
交代符号行列・平面分割の数え上げ組合せ論と行列式・パフィアンの研究

ハンケル型のパフィアンとセルバーグ型の積分についてJiang Zeng氏と共同研究を行った。また、Mehta-Wangの行列式の拡張について、J. Zeng氏、田川氏、V. Guo氏と共同研究を行い、Askey-Wilson多項式を使った証明を得た。また,穴あきのアステカ長方形のドミノタイリングの個数について、ガウス超幾何級数の行列式を使って表す方法を研究した。ガウスの超幾何級数の隣接関係式と、それを応用して母関数を変形する方法を考察した。また、直交多項式と数え上げの行列式についても研究した。これらの研究成果は論文やいろいろな研究集会で公表した。2013年度は、Mehta-Wang型の行列式の拡張とパフィアン版について和歌山大学の田川裕之氏、フランスのJiang Zeng氏、中華人民共和国のVictor Guo氏と共同研究を行った。また、2013年7月2428日にパリのパリ第7大学で開催された形式的冪級数と代数的組合せ論に関する第25回国際会議に参加し、それについての研究発表を行った。結果はA Quadratic formula for basic hypergeometric seriesrelated toAskey-Wilson polynomialsという論文にまとめられ、Proceedings of the AMSに掲載予定である。その他にも名古屋大学の岡田聡一氏によって提唱されたd-complete posetsの(q,t)-hook formulaの予想についてBirdsの場合とBannersの場合について、very well-poisedな12W11に関するGasperの公式を使って証明できることを示した。この結果は(q; t)-hook formula for Birds and Bannersにまとめられ、現在投稿準備中である、この他にもLyon大学のJing Zeng氏とHankel型のパフィアンの評価について、Selberg積分や多変数直交多項式の結果を利用した方法を共同研究し、過去の論文に書いた予想の大部分を証明した。特に、Al-Salam-Carlitz多項式のモーメントを成分にするパフィアンを考えると、Baker-Forresterの結果を使って、非常に美しいパフィアンの公式を証明できる。これについては、予想以外の公式も証明できることがわかった。しかし、まだ証明できない予想があり、それはGessel-Xinが考察したHankel行列式のパフィアン版である。このパフィアンも、以前の論文に書いた以上に多くの予想が作れることがわかり、そのパフィアンの値はきれいな積になるが、評価の方法は未だにわからない。それはassociated Jacobi polynomialsとの関係があると、思われるからである。また、これらのパフィアンの数え上げ問題や数理物理への応用がないか研究を進めている。今年度の前半は主に交代行列や平面分割の数え上げに関連して現れるハンケル行列に関連して、ハンケルパフィアンとセルバーグ積分の関係についてJiang Zeng氏と共同研究を行った。Catalan数のハンケル行列式は経路の数え上げ問題から生じ、直交多項式との関連が深い。今回の研究では、これに類したハンケル型のパフィアンというものを定義し、それの評価がDe Bruijnの公式を通して、Selberg型の積分と関連付けられることがわかった。ここで、問題になるのは、ハンケル型の行列式に対して、どのような重み関数を見つければSelberg型の積分に帰着するかということである。これについては、前の論文に書いたほとんどの予想は解決を見たが、一方で1つだけGessel-Xinのタイプのハンケル型の行列式のパフィアン化に対しては解決できないでいる。これらの結果については2014年6月にアメリカ合衆国シカゴのDe Paul Universityで開催されたFPSAC'15において,ポスターとして発表した。また、引き続き、2014年8月にソウルでICM'14のサテライトとして開かれたThe 19th International Linear Algebra Society Conference及び2014年9月にオーストリアで開催されたThe 73rd Seminaire Lotharingien de Combinatoireにおいても口頭発表を行った。年度の後半は、学習院大学の中野氏及び津田塾大学の貞廣氏とともにAztec rectangleのrhombus tilingについて研究を行った。特に連続したholeがある場合にtilingの総数が超幾何級数で書けるという予想に取り組んでいる。平成27年度は大韓民国大田市のKAISTやNIMSで開催された代数的組合せ論のプログラムに参加し、Richard Stanley氏を含め、この分野の多くの研究者と情報交換を行った。7月には千葉大の萩原氏が主催したAlgebraic Combinatoricsの輪講会に参加し、Robinson-Schensted-Knuth対応について解説した。また、8月にマサチューセッツ工科大学を訪問し、Richard Stanley氏、Tom Roby氏と会い、また、1年間マサチューセッツ工科大学に滞在中の貞廣氏や中野氏と共同研究を行った。特に、穴あきのアステカ長方形のドミノタイリングの個数について、その行列式表示を簡単化する手法について研究した。この行列式表示はSchroder pathの個数を成分とする行列式であるが、Riordan arrayになっており、成分の母関数を用いて巧く変形をすることが重要である。また、ガウスの超幾何級数の隣接関係式が重要な役割を果たすが、それを母関数を使った変形と組み合せる。c=0の場合は証明できることがわかったが、一般のcでの予想式はLU-分解に似た行列式の分解に帰着させようと努力している。また、9月には、リヨン大学のJiang Zeng氏を訪問すると共にFrederic Jouhet氏やPhilippe Nadeau氏などの研究者と情報交換を行った。

また、イタリアのBertinoroで開催されたSeminaire Lotharingien de Combinatoireに参加し、Coxeter群や対称群の表現に関する興味深い話を聞いた。10月には京大数理研で開催された研究集会「組合せ論的表現論とその周辺」に参加し、研究成果を発表した。ハンケル型のパフィアンとセルバーグ型の積分についてJiang Zeng氏と共同研究を行った。また、Mehta-Wangの行列式の拡張について、J. Zeng氏、田川氏、V. Guo氏と共同研究を行い、Askey-Wilson多項式を使った証明を得た。また,穴あきのアステカ長方形のドミノタイリングの個数について、ガウス超幾何級数の行列式を使って表す方法を研究した。ガウスの超幾何級数の隣接関係式と、それを応用して母関数を変形する方法を考察した。また、直交多項式と数え上げの行列式についても研究した。これらの研究成果は論文やいろいろな研究集会で公表した。ハンケル型パフィアンの予想に関しては、リヨン大学のJiang Zeng氏との共同研究により、多くの進展があった。Gessel-Xin型の予想に関しては、さらに多くの、このタイプのパフィアンについて、予想ができることがわかった。最大の問題はハンケル型のパフィアンが現れる数え上げ問題を見つけることである。一方で、Aztec rectangle with consecutive holesのrhombus tilingの問題に関しては、まず、穴の数が偶数のときはGessel-Viennotの公式に帰着させてハンケル行列式にできることがわかった。この方法は極めて技巧的で穴を避けない経路も数えることにより、成分はSchroder経路の個数になる。このハンケル行列式を上岡氏の論文のようにLaurent biorthogonal polynomialsのモーメントの関連を使って拡張することによって、さらに一般的なハンケル行列式に拡張できる。この拡張によってDesnanot-Jacobi adjoint matrix theoremが使えることになり、タイリングの総数が2の冪と1次式の因子の積以外に、ある漸化式をみたす多項式で記述されることがわかる。また、最近では、この不思議な多項式がガウス超幾何級数を成分とする行列式(サイズは穴の個数)になることが、わかり、いろいろ不思議な予想ができ、その解決に向かって進んでいる。代数的組合せ論Aztec rectangle withconsecutive holesの研究は、まだ始めたばかりで、ガウス超幾何関数との関連を見つけた論文は見たことがない。
センサとプログラミングから子どもの自動化の世界を拓く技術の未来の学力養成

本研究は中学3年生生徒を対象として、「センサとプログラムから子どもの自動化の世界を拓く技術の未来の学力養成」という題の実践研究である。私たちの生活する社会は日々、進化し、利便さを追い求め様々な製品が開発されているが、子どもたちの認識としては「使いやすい」「便利になった」という認識がほとんどである。実際にセンサとプログラムがどれだけ身の回りで役にたっているか、身近になっているかを実感する生徒は少なく、それらの働きによって今の生活が成り立つことを理解させるために、さらには今後も発展していくであろう自動化の世界を意識させるためにこの実践研究に取り組んだ。実践研究の第一の方策としては、授業の中で「ビュートレーサー」「ミューロボ」を扱うことで、赤外線による物との距離の認識やセンサが読み取る数値の時間変化を学習し、センサが周りの環境を常に読み取り、その変化によって動作を変える(プログラムが組み込まれている)ことを体感させることであった。第二の方策としては、タブレットを用いて「加速度センサ」「ジャイロセンサ」に触れ、センサが切り開く未来を体感させることであった。実践研究の結果、中学生3年生は授業を通してセンサを身近に感じ、それが生活をより良くしていることを認識することができた。加えて、今後の自動化技術の発展方向に対する意見を豊かにもつことができた。本研究の成果及び検証の機会としては、まず2017年8月に研究の中間発表を愛知教育大学で開催の研究会で発表した。その後、2018年2月静岡市で開催の研究会に集まった全国各地の技術科教員のうち本研究に関心をもった教員に内容を詳しく説明した所、「限られた時間の中でセンサとプログラムの関係を深める教材であり、追実践したい」との評価を得た。今後は、そういった要望の方々へのケアを含めて、各地の研究会で報告し、研究および実践を広めていきたい。
FBP/SBPase導入形質転換植物によるソース/シンク器官の炭素代謝調節の解析

高等植物ソース器官のカルビン(光合成炭素還元:PCR)サイクルのチオール酵素に着目し、光合成を含めた炭素代謝におけるこれら酵素の位置づけと調節機構の生理的意義の解明を目的とする。本研究ではラン藻(Synechococcus PCC7942)のチオール酵素FBP/SBPaseを葉緑体または細胞質に導入したタバコ形質転換植物を作製し、ソース/シンク器官にける光合成能および炭素代謝に及ぼす影響を検討した。葉緑体にFBP/SBPascを導入した形質転換タバコでは、光強度の異なる培養条件下(水耕栽培、400μE/m2/sまたは800μE/m2/s、相対湿度,60%、25°C)において光合成能の上昇、カルビンサイクル代謝中間体の増加、さらに成育の促進、ソース器官でのシヨ糖含量、シンク器官でのデンプン含量の著しい増加が認められた。これら一連の現象はFBP/SBPase発現レベルに対応していた。一方、細胞質にFBP/SBPaseを導入した形質転換植物は、T1世代において野生株との間に生育の差は認められなかったが、上葉のヘキソース量が野生株と比較して顕著に増加していた。以上の結果より、FBPaseおよびSBPaseはカルビンサイクルの律速因子の一つであり、葉緑体内でのFBPaseおよびSBPase活性の増加に伴って、光合成炭素固定をソース/シンク器官での炭素代謝が大きく変化することが明らかになった。現在、明期/暗期において転流関連酵素への影響を検討している。細胞質にFBP/SBPaseを導入した形質転換体では、野生株との間に成育の差はなかったが、糖代謝への影響が認められた。
酵母液胞型プロトン輸送性ATP分解酵素複合体の分子構築に関する研究

酵母液胞膜V-ATPaseの17-kDaプロテオリピドサブユニットは、VMA3遺伝子にコードされているが、VMA3遺伝子には相同的な遺伝子VMA11とPPA1が存在する。これらVMA3相同遺伝子産物の機能に関する解析を行った。プロテオリピドサブユニットには、プロトンの輸送に直接機能していると考えられている保存性グルタミン酸残基がある。Vma11pとPpa1p上の保存性グルタミン酸残基の変異株を構築して解析した。その結果、これらの遺伝子産物でもこの位置に酸性残基があることが活性に重要であり、Vma11とPpa1pもVma3pと同様にプロトン輸送に機能している可能性が示唆された。次に、それぞれの遺伝子産物のC末端に910アミノ酸のエピトープを融合した融合タンパク質を発現する組換え体を構築した。融合タンパク質はいずれも機能的であり、ウエスタン法および間接蛍光抗体法によってそのいずれもが液胞に局在し、なおかつ液胞膜V-ATPase複合体に含まれることを認めた。すなわち、酵母液胞膜V-ATPaseの活性には、構造的、機能的に相同的な3種のプロテオリピドサブユニットが必要であることが示された。現在、これらサブユニットの機能分担に関する解析を継続している。液胞型ATPaseは、膜内在性のプロトン輸送路部分(V_0)と、膜表在性の触媒頭部(V_1)から構成されている。野生株では、液胞膜にあるV_0の約50%はV_1と結合せずにV_0部分複合体として存在する。一方、細胞質にはV_1部分複合体のプールが存在する。Vma11pおよびPpa1pの部位特異的変異体では、液胞膜上に野生株と同じサブユニット構成を持つV_0V_1複合体が形成されたが、液胞膜上のV_0のほとんどすべてがV_1を結合していた。この現象は、不活性型の変異株ではどの置換変異の場合にも観察された。変異株に共通の性質は液胞内酸性化の欠損であり、一つの可能性として液胞内酸性化の程度が酵素複合体のアセンブリに影響して活性調節に機能することが考えられた。