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新規Znフィンガータンパク質Smucの筋分化における役割の解析

これまでの研究から、新規Znフィンガータンパク質SmucはMyoDなどの筋分化調節因子の働きを抑制し、遺伝子発現制御を通して筋分化を調節していると予想した。本研究では、筋分化調節因子としてSmucがどのように機能するかの解明を目標とした。外見上および組織学的観察からは、Smucノックアウトマウス(昨年度作製)の表現型は見られなかった。遅い筋特異的なミオシン抗体で染色し、骨格筋における速筋と遅筋の比率を解析したが、異常はみられなかった。野生型およびノックアウトマウスの骨格筋内にカルディオトキシン注入し、筋分化調節因子が活発に機能する筋再生を誘導した。骨格筋が破壊されてから再生するまでの約2週間に渡り経時的に再生筋の組織像を観察し、野生型とノックアウトマウスとの比較を行ったが、有為な差は見つからなかった。これらの結果から、Smucの欠損による変化を骨格筋において見いだすには、特異的なマーカーが必要である。C2C12筋芽細胞を分化誘導するとMyogeninを発現するようになり、さらに分化が進むとTroponinTを発現し、細胞融合し筋管の形成がみられる。このin vitroでの筋分化の系においてSmucの影響を検討した。誘導的にSmucを強制発現する細胞の樹立を試みたが困難を極めた為、一過的にSmucを発現させる系を用いた。MyoD,Myogenin,Troponinを指標にして、経時的に分化の進行を調べた結果、Smucの発現量に関わらずほぼ同様に筋分化が進行することが明らかになった。C2C12の一部は既にMyoDを発現しており、より初期の筋分化について検討する為に他の細胞株を用いる。また、Smucにより直接転写制御を調節される遺伝子を検索し、Smucの関わる現象の抽出を目指す。新規Znフィンガータンパク質SmucがMyoDなどの筋分化調節因子の働きを抑制し、筋分化を調節しているという仮説を持っている。本年度は、1)機能解析の為のノツクアウトマウスの作製、2)Smucの生体内での発現時期などの挙動の解析を目標とした。1)ノックアウトマウスの作製。第一エクソンを失い、β-gal cDNAに置換したターゲティングベクターを用いて、ES細胞で相同組換え体を得た。これを用いてキメラマウスを作製し、変異を持ったヘテロ個体を得た。ヘテロ個体を用いて、X-gal染色を行い、Smuc遺伝子を発現する細胞の同定を試みたが、X-gal陽性細胞は見られなかった。β-galの発現量が非常に少ない為であると考えている。現在、このヘテロマウス同士を交配し、ホモ個体が生まれるかを検討中である。今後は、胚性致死の可能性も含めて検討を進める。2)抗Smuc抗体の作製及び、発現細胞の同定。大腸菌に発現させたGST-Smuc融合タンパク質を抗原として、ウサギに免疫し抗血清を得た。Smucを培養細胞に強制発現した後この抗血清で染色すると、発現細胞特異的に核が染色された。マウスの組織を用いたウエスタンブロットにおいては、多くの非特異的なバンドが検出され、現在精製を進めている。筋分化マーカーとの二重染色を念頭において、今後組織における発現細胞の同定を進める。Znフィンガータンパク質SmucがMyoDなどの筋分化調節因子の働きを抑制し、筋分化を調節しているという仮説のもとに研究を進めている。本年度は、1)ノックアウトマウスの表現型の解析、2)培養系での機能解析を始めた。1)ノックアウトマウスの表現型の解析昨年度作製したヘテロ個体どうしを交配した結果、ホモ接合体の個体が産まれた。それぞれの遺伝子型の個体がメンデルの法則に従った数得られている為、Smucをノックアウトマウスは胚性致死ではないことがわかった。ホモ接合体は、見かけ上何ら異常がみられ無かった。Smucが骨格筋の幹細胞であるサテライト細胞で発現がみられることから、筋再生に異常がみられることが予想される。そこで、現在カルディオトキシンを骨格筋内に注入し、筋再生を誘導する実験を開始した。HE染色した組織切片を観察したが、野生型とホモ接合体との間に明瞭な差は見えていない。今後再生の経時的観察、サテライト細胞や、筋芽細胞のマーカーを用いた詳細な解析をすすめる予定である。2)培養系での機能解析筋管細胞への分化には、MyoDなどの筋分化調節因子が機能するが、この段階にSmucがどのような影響を及ぼすかを検証するために、筋芽細胞C2C12に強制発現を試みた。CMVプロモーターによってSmucを発現させると、安定に発現するラインが得られなかった。経時的に発現細胞を数えたところ、Smuc強制発現の場合には、コントールとして用いたGFP発現に比べて優位に発現細胞が減少していた。この結果から、Smucは筋芽細胞の増殖を抑制するか、細胞死を誘導していること推察された。そこで、現在はテトラサイクリンによる発現誘導系を用いて、この現象を検証している。更に、筋芽細胞への分化段階について、Smucの機能解析する為に、他の細胞株を用いることを計画している。

外見上および組織学的観察からは、Smucノックアウトマウス(昨年度作製)の表現型は見られなかった。遅い筋特異的なミオシン抗体で染色し、骨格筋における速筋と遅筋の比率を解析したが、異常はみられなかった。野生型およびノックアウトマウスの骨格筋内にカルディオトキシン注入し、筋分化調節因子が活発に機能する筋再生を誘導した。骨格筋が破壊されてから再生するまでの約2週間に渡り経時的に再生筋の組織像を観察し、野生型とノックアウトマウスとの比較を行ったが、有為な差は見つからなかった。これらの結果から、Smucの欠損による変化を骨格筋において見いだすには、特異的なマーカーが必要である。C2C12筋芽細胞を分化誘導するとMyogeninを発現するようになり、さらに分化が進むとTroponinTを発現し、細胞融合し筋管の形成がみられる。このin vitroでの筋分化の系においてSmucの影響を検討した。誘導的にSmucを強制発現する細胞の樹立を試みたが困難を極めた為、一過的にSmucを発現させる系を用いた。MyoD,Myogenin,Troponinを指標にして、経時的に分化の進行を調べた結果、Smucの発現量に関わらずほぼ同様に筋分化が進行することが明らかになった。C2C12の一部は既にMyoDを発現しており、より初期の筋分化について検討する為に他の細胞株を用いる。また、Smucにより直接転写制御を調節される遺伝子を検索し、Smucの関わる現象の抽出を目指す。
移民「二世」から見るナショナリティの歴史と現在

年度初めに、近年移民第二世代に関する研究が増加している欧米の移民研究のレビューを進めた。5月に開催された公開研究会では、現代ヨーロッパにおけるグローバル生殖産業、国際養子縁組等の展開を通じた親族関係の変容について最新の研究動向の知見を得た。6月には日本ラテンアメリカ学会および日本文化人類学会各大会で研究成果報告を行なった。夏期・春期にそれぞれ約1ヶ月間、1970年代後半アルゼンチン軍事政権の圧政により「失踪者」となった日系人と当時の社会、コミュニティの状況、軍部の非合法行為に対するその後の各政府の政治的対応に関する調査(失踪者家族会メンバーへの聞き取り、会の活動の参与観察、関連資料の収集)を実施した(ブエノスアイレスにて)。調査成果は次年度に発表する。また2-3月の調査では次年度の学会発表に向けて(民政移行後の日系社会の紛争について)の補足調査と、現地の研究者との共著論文の準備を並行して進めた。9月には次の2つの研究成果報告(スペイン語)を行なった。(1)ブエノスアイレス大学、ジーノ・ジェルマーニ研究所(IIGG)所属の研究会での博士論文の紹介報告、(2)「第17回パンアメリカン日系大会」(南北米大陸各地の日系人の交流会)での主催者からの依頼による講演。10-12月にも学会地域支部、受入教員が主催する研究会などで研究発表(3件)を行なった。年度を通して、博士論文以降の主題となるアルゼンチン軍政期とそれ以降の「ナショナリティ」の位置づけに関する知見と議論の発展においては現地調査によって予測以上の成果と見通しを得たが、同テーマを現代人類学の問題として位置づけるという課題が残った。成果発表の点では口頭発表に偏ったが、招待講演の形で調査地に成果を還元した。9月に報告を行なったIIGGの研究会のメンバーとの間では今後の研究の発展につながる有意義な交流をもった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
現代日本語における統語的階層性についての研究－英語分詞構文との対照から－

本研究は、日本語における統語的階層性を新たな視点から模索することを目的とした。具体的な研究方法としては、英語の分詞構文を含んだ用例とその複数の日本語訳を相互に対照することによって、英語・日本語それぞれにおける統語的階層性の具現のしかたを観察・検討した。その結果、英語分詞構文に関して、主節事象と分詞句事象との間の意味関係は多岐にわたり、両者の間には「同じ状況の中で生起する」といった緩やかな関係性が存在することも明らかになった。他方、日本語には分詞構文ほど幅広い関係性を表現できる形式はない。先行研究で指摘されている通り、古典日本語においては連用形接続・テ形接続などがこれに相当する機能を担っていたと考えられる。階層性という観点からすれば、連用形接続やテ形接続によって事象を並列的に述べる古典日本語は階層的ではなく、構造の平坦さが際立つといえる。このように考えたとき、分詞構文は、統語的階層性が際立つ構造をもつ英語のなかにあって、あえてより平坦な構造を形成する手段として働いているといえる。実際、英語はSVOという基本語順が厳密に定まっているため、文の早い段階で述語を示す必要がある。つまり、文を開始して主語・述語を述べるとそのあとは目的語や補語を述べて文を打ち切らなければならない。補足や軌道修正が必要になっても、新たに文を立ち上げるほかない。しかし、分詞構文を用いれば、文を終止することなく補足的な情報を加えることができる。このように分詞構文は英語の中で統語的階層性を調整することによって伝達効率を高める機能をもっていると考えることができる。また、上述の通り本来日本語が好んでいた平坦な構造は場合によっては、文章に単調な印象を与える場合がある。そこで、日本語は連体修飾をはじめ階層的な構造を取り入れることによって構造的なメリハリをつけ、より読みやすい文章を志向するようになったと考えられる。以下の作業を進めた。(A)既存の日英対照データ(Scott Fitzgeraldの小説The Great Gatsbyの原文、5種の翻訳を表計算ソフトExcelのファイルに入力し、一覧できるようにしたもの)を利用し、分詞構文に対応する日本語訳文の表現を、以下の点に留意しつつ分析した。(1)各要素の訳出の順序(2)分詞句に相当する部分を別の分として訳出するか、あるいは一文とするか(3)一文とする場合、連体修飾節を用いるか、あるいは主文に相当する部分と分詞句に相当する部分とを接続助詞などでつないでいるか(4)接続助詞を用いる場合、どのような助詞を選択しているか分類・整理のために(1)(4)について指標を与えているが、現時点では暫定的なものであり、今後改善の必要がある。なお、ここで用いている翻訳は以下の通りである。大貫三郎訳(1957年)・野崎孝訳(1974年)・橋本福夫訳(1974年)・村上春樹訳(2006年)・小川高義訳(2009年)(B)Earnest Hemingwayの小説The Old Man and the Sea原文から、分詞構文等を含む文を抽出、入力作業を行なった。原文のテキスト・ファイルを入手し、(A)と同様の形式でExcelファイルを整形するための準備を行なった。(A)のデータは原文に関係節および分詞構文を含む文を選び、対応する訳文が入力されている。今回の研究では、分詞構文のほか、関係節や従位接続詞節を含むものも含めたほうが比較・対照のためには望ましいと判断し、これらを含む原文も抽出することとしている。原文を抽出する作業と平行して、対応する5種の訳文についても入力準備を進めている。ここで用いる予定の翻訳は以下の通りである。福田恒存訳(1966年)・中山善之訳(2013年)・小川高義訳(2014年)・宮永重良訳(2015年)Earnest Hemingwayの小説The Old Man and the Sea原文の電子ファイルから、分詞構文等を含む文を抽出し、Excelファイルを整形するための準備を行なった際、ファイル整形に予想外に時間を要したことによる。すでに入力計画を見直しつつあり、平成29年度の早い時期には作業の遅れを取り返すことができる見通しである。以下の作業を進めた。(A)既存の日英語対照データ(Scott Fitzgeraldの小説The Great Gatsbyの原文、5種の翻訳を表計算ソフトExcelのファイルに入力し、一覧できるようにしたもの)を利用し、分詞構文に対応する日本語訳文の表現を分析した。具体的には、特に訳出の順序に注目して観察・考察を行なった。すなわち、原文通りの語順で訳しているか(以下、「正順」と呼ぶ)、原文とは逆の語順で訳しているか(以下、「逆順」と呼ぶ)という点である。用例の約8割を占める逆順の用例については、主節と分詞句との意味的関係から下位分類を行なったうえで分析し、論文を執筆した。

他方、日本語には分詞構文ほど幅広い関係性を表現できる形式はない。先行研究で指摘されている通り、古典日本語においては連用形接続・テ形接続などがこれに相当する機能を担っていたと考えられる。階層性という観点からすれば、連用形接続やテ形接続によって事象を並列的に述べる古典日本語は階層的ではなく、構造の平坦さが際立つといえる。このように考えたとき、分詞構文は、統語的階層性が際立つ構造をもつ英語のなかにあって、あえてより平坦な構造を形成する手段として働いているといえる。実際、英語はSVOという基本語順が厳密に定まっているため、文の早い段階で述語を示す必要がある。つまり、文を開始して主語・述語を述べるとそのあとは目的語や補語を述べて文を打ち切らなければならない。補足や軌道修正が必要になっても、新たに文を立ち上げるほかない。しかし、分詞構文を用いれば、文を終止することなく補足的な情報を加えることができる。このように分詞構文は英語の中で統語的階層性を調整することによって伝達効率を高める機能をもっていると考えることができる。また、上述の通り本来日本語が好んでいた平坦な構造は場合によっては、文章に単調な印象を与える場合がある。そこで、日本語は連体修飾をはじめ階層的な構造を取り入れることによって構造的なメリハリをつけ、より読みやすい文章を志向するようになったと考えられる。以下の作業を中心に研究を進める予定である。引き続き、日本語訳文の表現を分析する。それと並行して新たなデータの抽出、入力作業を進める。また、日本語母語話者を対象として、訳文の構造を「並列的」「階層的」のいずれと評価するかについて調査を設計、予備調査・本調査を行なう。引き続き日本語訳文の表現の分析を行なう。また、日本語母語話者を対象として、訳文の構造を「並列的」「階層的」のいずれと評価するかについて本調査を設計、実施する。データ作成のためのファイル整形に予想外に時間を要し、入力作業が予定通りにできなかったため。平成29年度の早い段階に、本年度に使用する予定だった謝金を使用し、入力作業を行なう予定である。
ササゲにおける高光合成能維持のための情報伝達機構解明に関する基礎研究

ササゲは食用マメ科中、乾燥下で最も高い光合成能を有し、半乾燥地帯で栽培されている重要な穀物である。ササゲは初生葉と第一本葉節間の茎が発達し貯水組織として機能しているといわれているものの、まだ本組織の機能は不明である。本研究ではまず、耐乾性の高いササゲに4日間のかん水処理を行ったところ、インゲンと比較して光合成能は約2倍高い値を示した。また、ササゲの初葉節と第一本葉節間の茎は他の茎より柔組織が発達し多量の水分を保持していることが分かった。次に中性子線を用いた植物中の水分のイメージングを行った。X線フィルム法ならびにCT法による水イメージング系の組み立てを試み、特に、CT法では、コンバータの開発、ターゲット系および冷却型CCDカメラの撮影系を工夫した。植物試料台の回転ならびにカメラのシャッターの開閉時間の制御系のコンピュータソフトも開発した。現在、画像解析のためのソフトを検討中である。実験結果としてはX線フィルム法により乾燥処理を施したササゲの着目茎から選択的に水分が減少することが示されたことをJ.Plant Phys.に投稿した。ササゲによるリアルタイムでの水の動きを知るため、PET(Positron Emission Tomography)も行った。まず、サイクロトロン加速器を用いて水をヘリウムビームで照射し、ポジトロン放出核種(^<18>F)で標識した水を調製したところ、トレーサー実験可能な量のアイソトープが得られることが分かった。次に標識水をササゲに短時間吸収させ、本茎ならびに本葉の水分吸収動態を調べることを試みた。まだ、予備実験の段階ではあるが、トレーサー実験可能な標識水の調製ならびに、植物への吸収動態のリアルタイム解析が可能となった。乾燥処理を施したササゲはインゲンと比較して水分吸収活性が高く維持されることが示された(J.Plant Nutr.投稿中)。
自然風中における高層建物縮尺模型に加わる風圧力に関する研究

潮岬風力実験所における野外観測、京都大学防災研究所における風洞実験および強風による建物被害調査により、以下の点を明らかにした。1.風速データを距離座標とするデータに直すと、建物の大きさとの対応を調べるのに便利であり、流路変化率という概念を導入することにより、自然風中での現象が理解しやすく、風洞実験との相似性に関する問題点も指摘することができる。2.強風時の住宅における屋根瓦の飛散の様子やその時の風速との関係を、実際に起った台風による被害の一例について定量的に評価した。3.竜巻による強風時に、建物に加わる風力について理論的解析を行った。4.3次元角柱を用いた実験を行い、側面上に形成される逆円錐状の渦について調べ、流れのパターンと圧力変動の関係を明らかにした。5.自然風中で角柱側面上に形成される局所的な負圧現象は、風洞実験において再現される風圧分布と相似な形状をもつことを示した。6.風洞実験により、高層建物の空力不安定振動の発生機構を強制振動法に基づいて非定常空気力を測定することにより、正方形断面をもつ場合について明らかにした。(1)平成3年9月25日台風9119号に伴う強風(最大瞬間風速約30m/s,主風向S)、及び平成4年1月22日、季節風に伴う強風(同約15m/s,同W)について、観測デ-タを取得した。(2)マノメ-タは角柱の各側面に45点、合計180点測定点を配置し風圧力を測定した。マノメ-タの液面の動きをビデオに撮り、それを画像解析して風圧力を求めた。(3)台風観測時、マノメ-タは直立状態で使用しており、10mのビニ-ルチュ-ブを含めた圧力測定系の時定数は、0.180.25秒程度であった。(4)観測中の室内圧の変動は、外壁に加わる風圧の変動に比べると小さいが無視できない。従って、マノメ-タから求めた風圧力から室内圧の変動分を引いて補正した。(5)角柱の屋根面上1.6mの位置に超音波風速計を設置し、風圧力観測中の風向風速の変動を記録した。(6)台風時のマノメ-タのデ-タから、角柱側面に加わる風圧力の分布を1/30秒毎に求め、その時間変化を調べた。(7)その結果、角柱側面の風上側のエッジ付近に-90mmAg以下の局部的な負圧が発生することがわかった。この局部負圧は約1秒前後で消滅してしまい、またその発生の周期性もないがこの局部負圧が発生する場合、側面上に特有の圧力分布形状を示す。潮岬風力実験所において野外観測を実施し、台風および季節風に伴う強風時のデータを採集した。データは高層建物縮尺模型に加わる風圧力および基準点における風速と静圧の値を記録し、模型周りの流れ場および壁面圧力の時刻変動を求め、模型周りの流れのパターンと圧力変動の関係を解析した。その結果、風速データを距離座標とするデータに直すと、建物の大きさとの対応を調べるのに便利であり、流路変化率という概念を導入することにより、自然風中での現象が理解しやすく、風洞実験との相似性に関する問題点も指摘することができた。又、強風時における自然風の特性と構造物が受ける被害の特徴を明らかにするという観点から、台風時の強風被害調査を行い、消防署の風向風速の記録および高層ビルの上から撮影されたビデオ画像の記録を使った解析を行い、強風時の住宅における屋根瓦の飛散の様子やその時の風速との関係を、定量的に評価した。一方、風洞実験との対比に関しては、3次元角柱を用いた実験を行い、側面上に形成される逆円錐状の渦について調べ、流れのパターンと圧力変動の関係を明らかにした。さらに、竜巻による強風時に建物に加わる風力について理論的解析を行った。・潮岬風力実験所における野外観測を引き続き実施し、強風時のデータを採集した。・平成3,4年度に得られた結果とあわせ、以下の点を明らかにした。

2.強風時の住宅における屋根瓦の飛散の様子やその時の風速との関係を、定量的に評価した。3.竜巻による強風時に建物に加わる風力について理論的解析を行った。4.3次元角柱を用いた実験を行い、側面上に形成される逆円錐状の渦について調べ、流れのパターンと圧力変動の関係を明らかにした。5.角柱側面上に形成される局所的な負圧現象は、風洞実験において再現される風圧分布と相似な形状を示す。6.風洞実験により高層建物の空力不安定振動の発生機構を強制振動法に基づいて非定常空気力を測定することにより、ある程度明らかにした。
近江商人の広域志向経営システムの研究

矢尾喜兵衛家について1.近江商人矢尾家の系譜を明らかにしたこと。2.162年間の矢尾家の資産蓄積過程を明らかにしたこと。3.着実に資産を増加させていること。4.矢尾家の営業が酒造部門・繊維部門・金融部門・食品部門・日用品部門をもち、多角的経営をおこないながら、錙鉄の利を積み重ねていること。5.通算16の出店を開いていること。6.出店は乗合商いという、合資形態で資本を持ち寄って開店している場合があること。7.乗合商いには、資本の危険分散、有能な従業員の出店支配人への抜擢が可能となる経営の合理性が貫いていること。シルコライナーについて8.第二次大戦までの日本からのカナダ移民は滋賀県が最多数であること。9.滋賀県移民がカナダに設立したシルコライナーという絹布会杜が存在したこと。10.シルコライナーは零細な資本を持ち寄ってパートナー方式で経営されていたこと。11.シルコライナーの経営は、顧客や従業員に現地人を求めて、地元に溶け込むことに成功したこと。12.シルコライナーの最盛期には18の支店を設け、地元重視の経営方針とともに、シルコライナーと近江商人の間には経営方針に類似性があること。滋賀県蒲生郡日野の矢尾喜兵衛家の文書については、帳簿類・一紙文書ともに整理し、整理番号を与える分類作業を続行中である。これはマイクロ撮影のための準備であるが、重要と思われる文書については便宜的に写真撮影をおこなった。埼玉県秩父の同家出店に保管されている史料は、その一部を借用しては返却する方法で整理作業を進めている。同家の乗合商いの実態を調査するため、東京都立中央図書館を中心に調査活動を行った。カナダへ渡航した滋賀県出身者によって設立された絹布会社シルコライナーについては、平成12年夏にカナダへ渡って調査を実施した。ブリティッシュ・コロンビア大学の日系カナダ人関係のスペシャルコレクションをはじめ、カナダ中西部の創業者の子孫からの聞取り調査をおこなった。シルコライナーの日系企業のなかで位置付けのために、目下ヴァンクーヴァー市内の日系人集住地の商業調査とその整理を実行中である。これらの調査と平行して、滋賀県神崎郡五個荘町の外村与左衛門家の史料を閲覧した。その結果、近江商人の広域志向経営システムの合理性を示す、複式簿記の形式で記入された決算勘定帳が保管されていることを発見し、175年間にわたって同家の純資産の蓄積過程を明らかにした。「商人資本の蓄積過程-近江商人外村与左衛門家の場合」(同志社大学『経済学論叢』52巻3号)滋賀県蒲生郡日野の矢尾喜兵衛家の文書については、帳簿類・一紙文書ともに整理し、整理番号を与える分類作業を続行中であるが、年度内に終えることはできなかった。あくまでもマイクロ撮影のための予備的作業であり、重要と思われる文書については便宜的に写真撮影をおこなった。埼玉県秩父の同家出店に保管されている史料は、同家の乗合商いの実態を調査するための貴重な文書であり、東京都立中央図書館を中心に同家の出店の調査活動を行った。これらの矢尾家に関する調査と整理を続行しながら、平成13年6月9日に第34回日本酒造史学会において、「近江商人史のなかの酒」と題して矢尾家の酒造業が、創業以来酒利と純資産を着実に増加したことについて発表した。カナダへ渡航した滋賀県出身者によって設立された絹布会社シルコライナーについては、平成13年夏にカナダへ渡って調査を実施した。目下、現地に溶け込むことに成功したシルコライナーの経営に関する英文論文を執筆中である。
慢性腎臓病における腎-腸管連関の解明

これまでに着目してきたトランスポーター:carnitine/organic cation transporter 1 (OCTN1)は,慢性腎不全状態では腸管での機能が低下し,食餌由来の抗酸化物質:ergothioneineの吸収が低下すること,それに伴い体内のergothioneineが減少し,酸化ストレスの増大により腎不全を悪化させることを,動物実験およびヒト慢性腎臓病例の血液サンプルを用いて検証し,結果を論文にまとめ投稿した.OCTN1-ergothioneineは障害臓器の酸化ストレスを軽減するための防御システムと推定される.腎不全による腸管トランスポーターの機能障害が,この防御システムに悪影響を及ぼすと考えがえられ,慢性腎臓病の臓器連関を考える上で興味深い結果であった.腎不全状態における腸管トランスポーターの変化のメカニズムを,腸上皮培養細胞を用いて検証した.腸管と関連する尿毒素であるインドキシル硫酸やp-クレシル硫酸による刺激実験ではOCTN1の発現は亢進し,これまでの結果とは合致しなかった.また腸内細菌や菌叢由来の物質がトランスポーターの発現に影響している可能性について,抗菌薬投与マウスや無菌マウスを用いた検討も行った.これらのマウスについてもOCTN1の発現の変化は有意な変化を認めなかった.先の実験ではOCTN1の機能低下にはアダプター蛋白であるPDZK1が重要な役割を果たしていると考えられた.そのため,トランスポーターそのものの変化だけではなく関連するアダプター蛋白の発現の変化を確認していく予定である.腎不全と関連する物質による腸管トランスポーターへの影響は十分に確認できていない.慢性腎臓病における腸管の変化はここ数年で複数の論文で報告がなされている.それらの新たな知見から随時ヒントを得ながら実験計画を進めていく.これまでに着目してきたトランスポーター:carnitine/organic cation transporter 1 (OCTN1)は,慢性腎不全状態では腸管での機能が低下し,食餌由来の抗酸化物質:ergothioneineの吸収が低下すること,それに伴い体内のergothioneineが減少し,酸化ストレスの増大により腎不全を悪化させることを,動物実験およびヒト慢性腎臓病例の血液サンプルを用いて検証し,結果を論文にまとめ投稿した.OCTN1-ergothioneineは障害臓器の酸化ストレスを軽減するための防御システムと推定される.腎不全による腸管トランスポーターの機能障害が,この防御システムに悪影響を及ぼすと考えがえられ,慢性腎臓病の臓器連関を考える上で興味深い結果であった.腎不全状態における腸管トランスポーターの変化のメカニズムを,腸上皮培養細胞を用いて検証した.腸管と関連する尿毒素であるインドキシル硫酸やp-クレシル硫酸による刺激実験ではOCTN1の発現は亢進し,これまでの結果とは合致しなかった.また腸内細菌や菌叢由来の物質がトランスポーターの発現に影響している可能性について,抗菌薬投与マウスや無菌マウスを用いた検討も行った.これらのマウスについてもOCTN1の発現の変化は有意な変化を認めなかった.先の実験ではOCTN1の機能低下にはアダプター蛋白であるPDZK1が重要な役割を果たしていると考えられた.そのため,トランスポーターそのものの変化だけではなく関連するアダプター蛋白の発現の変化を確認していく予定である.腎不全と関連する物質による腸管トランスポーターへの影響は十分に確認できていない.慢性腎臓病における腸管の変化はここ数年で複数の論文で報告がなされている.それらの新たな知見から随時ヒントを得ながら実験計画を進めていく.
機械学習による反応分子動力学ポテンシャル自動作成システムの構築

燃料電池の電極反応プロセスなどのように、界面における化学反応プロセスは微細構造の影響を強く受けることが指摘されている。このような化学反応現象を分子・原子レベルから明らかにするための、第一原理計算のような極めて高コストな解析手法に替わるアプローチが求められている。原子モデリングの枠組みで化学反応を記述する反応分子動力学法を実行するために必須となる、反応力場(原子間ポテンシャル関数)の構築を機械学習技術を取り入れることによって格段に効率化・簡単化することが本研究の目的であり、ポテンシャルフィッティング自動化アルゴリズムを構築している。フィッティングアルゴリズム自体はポテンシャル関数形に依存しないことから、本年度は比較的単純な非反応型ポテンシャル関数(EAM, SW, Tersoff型等)を用い、フィッティングアルゴリズムの改良を行った。具体的には、フィッティングのターゲットとなるリファレンス構造群を設定し、フィッティングしたポテンシャル性能スコアを評価することでリファレンス構造群を更新していくアルゴリズムを作成した。将来的な拡張性を確保するためにはリファレンス構造の種類や数を容易に変更できることが必要であり、そのため既存の原子モデル解析コードの構造を大幅に変更して改良を加えた。本年度は非反応型ポテンシャル関数を用いてフィッティングアルゴリズムの骨格部分を構築する計画となっており、予定通りコード整備および実装テストが進んでいる。初年度に開発したアルゴリズムを反応力場(ReaxFF)に対して拡張し実装する。これまでに構築した系(Ni-OH系、YSZ等)について、従来法と比較することで開発したアルゴリズムの性能を評価する。その他の系についてもフィッティングのテストを行い、アルゴリズムの安定性・拡張性について検討する。物品費については数値計算サーバ新規導入のため計上していたが、機種選定時において当初想定していた計算能力と同等のものが予定より安価で購入できた。また、現在遂行中のソフト改変途中での学会等での発表を見送り、より完成度を高めてから次年度以降に発表を行うこととしたため旅費およびその他支出がなかった。次年度は力場構築ツール開発を加速させるため研究員を雇用することとし、当初予定より人件費に多く充てる。
インクジェット法を用いた完全塗布型ナノチューブ薄膜トランジスタの作製

本研究の目的は、イオン液体・イオンゲルおよびインクジェット法を用いた完全塗布型高性能SWCNT-TFTの実現である。応募者は既にインクジェット法を用いたSWCM-TFT作製技術を確立しているため、本研究提案実現のより具体的な研究項目としては以下が挙げられる。(1)イオン液体・イオンゲルのインクジェット法による滴下技術の構築(2)イオン液体・イオンゲルを用いた電気二重層SWCNT-TFTの作製(3)完全塗布型TFTの高性能化平成22年度は、(1)イオン液体・イオンゲルのインクジェット法による滴下技術の構築および(2)イオン液体・イオンゲルを用いた電気二重層TFTの作製を目標としていた。第一段階としては、イオン液体を所有するインクジェット装置を用いて滴下に試みた。通常の液体とは特性が異なるイオン液体ではあったが、インクジェットヘッドへのヒーター導入等によって滴下に成功した。次に、イオンゲルの滴下方法を検討した。イオンゲルは、そのままではインクジェット法への適応が不可なため、イオン液体およびゲル化高分子の両方の両溶媒となる有機溶剤を探索し、イオンゲル溶液と呼べるインクを用いる事によって滴下に成功した。このように、イオン液体・イオンゲルのインクジェット法による滴下技術の構築を行った。最終段階として、イオン液体・イオンゲルを用いた電気二重層TFTの作製を行った。具体的には、インクジェット法を用いて半導体的なカーボンナノチューブ薄膜を作製し、その上にイオン液体やイオンゲルを滴下する事によって完全塗布型SWCN-TFT作製を試みた。結果、明確なトランジスタ特性が観測され、しかも大幅なヒステリシスの低減など今後の高性能化につながる重要な結果を得た。以上のように、平成22年度は、当初の目標を超える成果をあげることが出来た。
国民皆保険制度が富の再配分に与える影響:動学的ライフサイクルモデルによる分析

本プロジェクトでは、公的な国民皆保険制度(UHI)の影響についての調査を行った。再配分の効果は、富(wealth)ではなく福祉(welfare)において認められる。すなわち、若者よりは高齢者が、また富裕層よりは貧困層が多くを得るという構図である。我々は、国庫支出割合の上昇に伴って福祉の享受状況が逆U字型のパターンを描くこと、また税の歪みを考慮に入れた場合、大部分のOECD(経済協力開発機構)諸国の国庫支出割合(平均約70%)が高すぎる可能性があることを突き止めた。1.世帯の不均一性、金融市場の不完全性及び任意健康保険(PHI)の内生的需要を取り入れた動学的一般均衡型世代重複モデルを開発。世帯の不均一性は、所得、医療費、退職等の不確定要素に対する異なる認識に起因し、労働能率変化による所得のショックの完全な補償は得られない。医療費は国民皆保険(UHI)がない場合、PHI購入により一部補償可能であるが、万人がPHI購入の意思・経済力を有するわけではなく、民間保険会社には価格差別化インセンティブがあり、リスク共有及び分散の効果が低い。2.UHI提供がもたらす影響について定量的調査を実施。UHI不採用を基準にUHI提供の経済状態を比較すると、クラウディングアウト効果が認められ、UHI提供の場合には貯蓄額が減少、資産保有が大幅に低下、また、PHI契約率も著しく低下し、この傾向は高所得世帯で顕著であった。高所得世帯と低所得世帯では極めて異なる傾向(高所得世帯はPHIより資産維持を好み、低所得世帯は貯蓄維持より民間及び社会保険に依存)が認められた。給与税で賄われるUHIは富の再配分効果を有するが、公的UHI提供は社会福祉の再配分に影響している点が認められた。富の再配分効果は不明瞭で、UHI提供によって高所得世帯より低所得世帯で資産が押し出されることから、富の不平等が悪化する可能性がある。これに対し、社会福祉の再配分効果は明らかで、若年者より高齢者、高所得世帯より低所得世帯に、大きな利益が認められた。3.本研究は不完備市場環境における公的保険提供の影響に関する調査文献に沿ったものである。既存文献では、医療費ショックは各世帯の支出及び貯蓄に関する判断に重要な要素であると広く認められているが、健康保険に関する判断は調査モデルに含まれていない。Jeske & Kitao (2009)では、米国健康保険に対する税制度のもたらす社会福祉効果の研究に類似のモデルが適用され、これは個々の世帯が健康保険を任意購入できるモデルである。本研究ではUHIの義務加入及びPHIの購入判断との相互関係の分析に焦点を合わせた。さらに、Jeske & Kitaoでは非弾力的労働供給を仮定しているため、歪みのある税政策が消費と余暇に関する判断に及ぼす影響については触れていない。本研究では労働供給の内生的選択を取り入れ、社会福祉の研究におけるその重要性を確認した。本研究では、家計不均質と金融市場の不完全性を併せ持つ環境において国民皆保険制度の公的供給が及ぼす影響を調査する。各種の国民皆保険政策について、資金調達方法の歪みが有るもの及び歪みが無いものなど、各種とりあげて比較し、リスク軽減と税制の歪みの二律背反と、それに対応する福祉の意義に取り組む。また、内因的な保険選択と労働力供給の決定を含む動学的均衡モデルを用いて定量的分析を行う。分析の結果、歪みの効果を考慮すると、国民皆保険制度関連支出の占める割合は、ほとんどのOECD諸国において非常に高くなっていることがわかる。資産保有においても、明らかな押し出し効果が見受けられる。国民皆保険制度が導入されると、任意健康保険の購入に関する事柄は、価格と補償範囲の設定により左右される。富裕層は任意健康保険の価格に敏感で、国民皆保険制度導入に当たっては、補足的プランを求めることがわかる。本プロジェクトでは、世帯の不均一性と金融市場の不完全性をあわせ持つ環境での、国民皆保険の公的供給がもたらす影響を調査した。標準的な国民皆保険制度を未導入の経済と、導入済みの経済とを比較した。資産と民間保険の購入の両方で、明らかなクラウディングアウト効果が認められた。また再分配効果は、若年層より高齢者層により多く、富裕層より貧困層により多く、というように、富よりむしろ社会保障において見受けられた。一括税による(歪みのない)資金調達と比較することによって、労働供給、さらに民間保険の購入、資産保有を減少させる国民皆保険の給与税による資金調達で起きる歪みを明らかにした。給与税の歪みによる損失は、国民皆保険の供給において、給与税からの資金調達方法と一括税からの資金調達方法との間で福祉ギャップを生む。より高い保証率の国民皆保険政策はリスク・シェアリングの面では優れているが、その費用を賄うためにより厳しい税率を課すことが必要になる。つまり、リスク・シェアリングと税との間でトレードオフの関係が存在する。高い保証率では逆U字型の福祉パターンが確認された。

国民皆保険による支出保証率が50%を超えると、歪みによる損失の増加が、福祉による利益の増加を様々な想定ケースで上回ることがわかった。このことは、税の歪みを考慮するとOECD加盟国の多くの国では、保証率(平均約70%)が高すぎるのかもしれないということを示している。これまでに研究成果を論文としてまとめることができ、またすでに採択決定済みであるため。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後ほ、国民皆保険制度のもとでの補完的補償を提供する民間保険の設定について研究する予定である。
脳神経病変を標的とした異染性白質ジストロフィーの新規治療法(遺伝子治療)の開発

リソゾーム酵素欠損症では、一般的に酵素補充療法の有効性が期待できるが神経変性を伴う疾患に対しては血液脳関門(BBB)の存在が大きな障害となり有効な治療戦略が立てられていない。本研究では脳全体の広範な神経変性を伴う、異染性白質ジストロフィー(MLD)の非侵襲的かつ安全で脳神経組織に対する長期の酵素補充療法が出来る革新的な治療法の開発を目的としている。本研究では成体マウスにおいても治療が可能となるように、既存のAAVベクターの改良及び治療タンパクの改変を行い、脳神経組織治療に最良のベクターの選択を行う。(1)治療用AAVベクターの改良:BBBを通過可能な血清型の検索、scAAVベクターの使用。本年度は治療用AAVベクターの改良として、BBB通過可能な血清型1,8,9型のGFP発現scAAVベクターを作製し、メンブレンフィルター式培養カップを用いてin vitro BBBモデルを使用しBBBを通過するかどうか検討を行った。それぞれのscAAVベクターがBBBを通過し、遺伝子導入がされているかどうかをフリーサイトメトリーにてGFP発現を確認するとともに、導入されたAAVゲノムコピーをqPCRにて測定した。結果どのタイプのAAVもBBBを通過する事が示唆された。今後、in vitro BBBモデル及びマウスを用いたin vivoの実験を行い、脳神経組織治療に最良のベクターの選択を行っていく。(2)治療蛋白の改変:ASA-Tatキメラ蛋白質の作製。治療蛋白であるASAの改変としては、中枢神経系への移行を良くするために、細胞移行性のあるTatペプチドをASAcDNAのC末端に挿入しASA-Tatキメラ蛋白質を発現するAAVベクタープラスミドの作製をおこなった。今後ASA-Tatキメラ蛋白質を発現するAAVベクターを作成し、ASA-Tatキメラ蛋白質がBBBを通過するかどうか検討していく。血清型1,8,9型のGFP発現scAAVベクターはGFP発現強度の違いはあるものの、どのベクターもBBBを通過することを確認した。今後はin vivoにおいて血清型比較検討ならびに、成体MLDモデルマウスに静脈内投与と合わせて髄腔内投与を行い成体マウスでも治療可能な方法を確立する。また、これらの有効性を大型動物(サル)で検証し、安全性の評価も行い臨床応用を目指す。

血清型1,8,9型のGFP発現scAAVベクターはGFP発現強度の違いはあるものの、どのベクターもBBBを通過することを確認した。今後はin vivoにおいて血清型比較検討ならびに、成体MLDモデルマウスに静脈内投与と合わせて髄腔内投与を行い成体マウスでも治療可能な方法を確立する。また、これらの有効性を大型動物(サル)で検証し、安全性の評価も行い臨床応用を目指す。当該年度は大型予算の必要がなく、次年度に繰り越すとなった。
RAS抑制変異体を用いた口腔癌に対する遺伝子治療の前臨床研究

舌癌に対する遺伝子治療法の基礎研究として、強力なサイトメガロウイルス(CMV)・プロモーターあるいは遺伝子をテロメラーゼ陽性癌細胞において特異的に作用させるためのテロメラーゼ触媒サブユニット(hTERT)プロモーターと共に、ヒトRAS癌遺伝子に対する抑制変異体遺伝子N116Yを搭載したアデノウイルス・ベクターを、ヒト舌癌細胞株(HSC-3、HSC-4、SAS)に感染させて、細胞増殖抑制効果を検討した。CMVプロモーターを用いた場合、N116Yアデノウイルス・ベクターはRAS蛋白質の発現が増加しているHSC-3、HSC-4、SASに強い増殖抑制効果および形態変化あるいはアポトーシスの指標である核凝縮を示した。しかし、ヒト口唇正常線維芽細胞株KDに対しても一定の増殖抑制効果を示した。この腫瘍形質抑制効果は、ERK活性化に関わるシグナル伝達経路の抑制によることが証明された。これに対してhTERTプロモーターを用いた場合には、hTERTプロモーター活性の高いHSC-3、SASに対して増殖抑制効果を示したが、hTERTプロモーター活性のほとんどないKDに対しては増殖を抑えなかった。これらの所見により、RAS癌遺伝子抑制変異体N116Yアデノウイルス・ベクターの舌癌遺伝子治療法における有用性と、hTERTプロモーターにより発現を制御されるN116Y遺伝子による舌癌特異的遺伝子治療法の可能性が示された。舌癌の治療実験に用いるRAS癌遺伝子抑制変異体N116Yの癌特異的プロモータ選別のために、ヒト舌癌細胞株(HSC-3、HSC-4、SAS)のin vitroおよびin vivoの増殖性とヒトテロメラーゼ触媒サブユニット(hTERT)プロモーター活性間の相関について検討した.HSC-3、HSC-4、SASのin vitroにおける増殖能は、口唇由来線維芽細胞株KDを1とした場合、HSC-3、HSC-4、SASは、それぞれ4倍、4倍、8倍であった.また、ヌードマウスin vivoにおける造腫瘍性の比較では、HSC-4を1とした場合、HSC-3とSASはそれぞれ4倍、370倍であった.一方、リポフェクション法を用いてhTERTプロモーターを含むルシフェラーゼ遺伝子(金沢大・京博士より供与)を、CMVプロモーターを持つβガラクトシダーゼ遺伝子と共に導入し、各細胞株間での遺伝子導入効率及びルシフェラーゼの発現によるプロモーター活性を比較検討した.KDを1とした場合、HSC-3、HSC-4,SASはそれぞれ、2800倍、1100倍、8700倍であった.以上の結果から、hTERTプロモーター活性は腫瘍細胞株に特異的で、in vitroおよびin vivoでの増殖能と相関があることがわかった.続いて、hTERTプロモーターを持つ治療遺伝子N116Y搭載アデノウイルスベクター、対照遺伝子LacZ搭載アデノウイルスベクターを構築した.ヒト舌癌細胞株におけるhTERT(ヒトテロメラーゼ触媒サブユニット)プロモーター活性を利用しRas癌遺伝子の抑制変異体であるN116Yをヒト舌癌細胞で発現させることにより、in vitroにおける増殖が癌特異的に抑制されるかどうかを検討した。hTERTプロモーターとN116Yの遺伝子を接続し、非増殖性アデノウイルス(AdMaX, Microbix)に組み込んだベクター(Ad.hTERT-N116Y)とhTERTプロモーターのみを組み込んだコントロールベクター(Ad.hTERT)を作製した。その後、ヒト舌癌細胞株(HSC-3)およびヒト正常口唇線維芽細胞株(KD)に各ウイルスを感染させて、MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)assayにより細胞増殖抑制効果を経時的に測定した。hTERTプロモーター活性陽性のHSC3細胞では、Ad.hTERT-N116Yウイルスを感染させた場合、非感染細胞およびAd.hTERTウイルスを感染させた場合と比較して増殖が有意に抑制された。これに対し、KD細胞ではこのような増殖抑制効果は認められなかった。hTERTプロモーターとN116Yを搭載したアデノウイルスベクターは、癌細胞特異的に細胞増殖抑制作用を示し、hTERTプロモーター活性陽性の舌癌に対する遺伝子治療に用いられる可能性が示された。本年度は、RAS癌遺伝子に対する抑制変異体N116Yを腫瘍

特異的かつ強力にヒト舌癌に作用させるための基礎実験として、舌癌において発現し正常細胞では発現していないテロメラーゼ触媒サブユニットhTERTプロモーターを用いるために、バクテリオファージP1由来の配列特異的組換え酵素Creとその特異的組換え配列loxPから成るCre/loxPシステムによりベクターに存在する2つのloxP配列間での特異的組換えをおこすアデノウイルスベクター二重感染法の樹立を試みた。そして、hTERTプロモーターの制御下にCre組換え酵素を発現するアデノウイルスAd.hTERT-Cre、Cre組換え酵素の存在下でCAG(cytomegalo virus enhancer、chicken beta-actin promoter、rabbit beta-globin polyA)プロモーターの制御下にレポーター遺伝子としてのLacZを発現するアデノウイルスAd.CALNLZを作製した。hTERTプロモーター活性陽性ヒト舌癌細胞株(HSC3、HSC4およびSAS)に、Ad.hTERT-LacZを単独感染あるいはAd.hTERT-CreとAd.CALNLZを二重感染させ、LacZ活性を化学発光アッセイにより遺伝子発現を検討した。3種のヒト舌癌細胞株において、hTERTプロモーター活性特異的アデノウイルスベクターの二重感染法において、単独感染法に比べ約20-40倍のLacZ発現増強が観察された。以上の成績からhTERTプロモーターとCre/loxPシステムを用いたアデノウイルスベクター二重感染法は、舌癌に対して遺伝子発現を増強させ、N116Yを用いた遺伝子治療法への応用の可能性が示された。
植物におけるエピジェネティクス機構を介した栄養ストレス応答メカニズムの解明

本年度は、過去2年間解析していた高浸透圧ストレス、例えば塩害・干害下における根の形態変化を司る新規の低分子RNA-mRNAのペア、miR167とIAR3に関する論文の投稿及び追加実験を主に行った。IAR3は植物の形態形成、とくに根の発達において中心的な役割を担う植物ホルモンであるオーキシンに関し、不活性型を加水分解して活性型をリリースする酵素をコードしている。しかしmiR167は窒素栄養条件下でARF6とARF8をターゲットとし、ARF6とARF8はこの栄養条件下で側根形成に関わっていることが報告されている(Gifford et al.,2008)。昨年の結果から高浸透圧ストレス下でARF6とARF8のmRNA蓄積量に変化がないことを示していたが、誘導型miR167ノックダウン株では通常条件下でmiR167をノックダウンするとIAR3だけでなくARF6とARF8のmRNAが上昇していた。ARF6とARF8はmiR167と完璧な相補性を有しているため予測通りの結果である。よって本年度はARF6とARF8が高浸透圧ストレス下での側根形成にも関与しているかどうか、2重変異体の表現型を解析した。その結果、二重変異体は野生型と同様の表現型を示したことから、ARF6とARF8は高浸透圧ストレス下の側根形成に直接的には関与していないことを示すことができた。さらに昨年度の解析では、miR167がIAR3をターゲットしていることを示す際にターゲット部位に変異を導入したIAR3を恒常型強発現プロモーター下で発現させていた。今年度はこれを改良しIAR3従来のプロモーターで発現させた。バックグラウンドにはIAR3ノックダウン系統を使用した。この実験系でも恒常型強発現系統と同様の結果が得られ、我々の主張がより強固になった。論文は無事受理されPlant Cellに掲載された(Kinoshita et al.,2012)。本年度は、植物が栄養ストレス下におかれると根の形態が変化することに注目し、解析を進めた。同様の形態変化は植物が塩・乾燥などの高浸透圧ストレスを受けた場合にも観察される。本研究では高浸透圧ストレス下での根の形態変化の分子メカニズム、より具体的にはエピジェネティックな分子機構を解明することで、それを栄養ストレスでの根の形態変化に応用するべく解析を進めた。次世代シーケンサとマイクロアレイを用いた解析からは新規な低分子RNAとそれによって制御される遺伝子のペアを見出し、それを実験的に証明することに成功した。また、この低分子RNA直下の遺伝子は浸透圧ストレス経路・栄養ストレス栄養経路両方において現在未知の因子であるため、これが浸透圧ストレスにおいて根の形態変化に直接関連があるのか、変異体を用いて解析を行った。その結果、この因子が浸透圧ストレス下での根の形態変化に重要な機能を持っていることが示された。この結果を得て同新規因子が乾燥ストレス下における耐性に寄与しているかどうか解析を進めた結果、本因子がストレス耐性に貢献しているデータが得られた。また、低分子RNAと新規ストレス因子の相互作用が進化的に保存されているかどうか、解析を進めた。その結果、この二者の相互作用が双子葉類と単子葉類で保存されていることが示唆された。これは本因子の乾燥耐性付与機能とも合致している。ストレス耐性に関する重要な知見が得られた。昨年度に引き続き、シロイヌナズナを用いて高浸透圧ストレス下で、側根形成において、進化的に保存されている新規小分子RNA-mRNAペア(miR167-IAR3)に関して、機能解析を行った。機能解析を進めるためにまず、miR167に関してエストラジオール誘導型のノックダウン系統を作出した。これを用いて、ストレス時における負の相関のみでなく、miR167が直接IAR3を制御していることが示した。さらに、この系統においてエストラジオール依存的に側根が形成されることも観察できた。ところがアラビドプシスのゲノム上にはIAR3と酷似したILLSという遺伝子がIAR3と隣接して存在する。ILL5とIAR3は塩基配列レベルで85%以上の相同性を有する。しかし、ILL5はIAR3と異なりストレス時でもmRNAのレベルが変化しないことがわかった。また、miR167相同部位に関してIAR3とILL5が異なるのは一塩基のみで、G・Uの違いであったが、ILL5がmiR167量の減少に応答して上昇してはいなかった。したがって、これらの結果は昨年の作業仮説(miR167によるIAR3制御)をより強固にしたと言える。さらにシロイヌナズナゲノム上にはmiR167と完全に相補し、オーキシンに正に応答する2つの遺伝子(ARF6・ARF8)がある。つまりARF6とARF8は窒素応答・生殖機構においてmiR167によって制御されている(Wu et al.,2006;Gifford et al.,2008)。よってこれらの因子の発現量を誘導型miR167ノックダウン系で解析した結果、完全な相補配列があることからも予想できる通り、IAR3同様にmRNA量が上昇していた。このシステムのポジテイブコントロールとも言える。現在arf6 arf8変異体がストレス下でどのような表現型を示すのか解析中である。

本年度は、過去2年間解析していた高浸透圧ストレス、例えば塩害・干害下における根の形態変化を司る新規の低分子RNA-mRNAのペア、miR167とIAR3に関する論文の投稿及び追加実験を主に行った。IAR3は植物の形態形成、とくに根の発達において中心的な役割を担う植物ホルモンであるオーキシンに関し、不活性型を加水分解して活性型をリリースする酵素をコードしている。しかしmiR167は窒素栄養条件下でARF6とARF8をターゲットとし、ARF6とARF8はこの栄養条件下で側根形成に関わっていることが報告されている(Gifford et al.,2008)。昨年の結果から高浸透圧ストレス下でARF6とARF8のmRNA蓄積量に変化がないことを示していたが、誘導型miR167ノックダウン株では通常条件下でmiR167をノックダウンするとIAR3だけでなくARF6とARF8のmRNAが上昇していた。ARF6とARF8はmiR167と完璧な相補性を有しているため予測通りの結果である。よって本年度はARF6とARF8が高浸透圧ストレス下での側根形成にも関与しているかどうか、2重変異体の表現型を解析した。その結果、二重変異体は野生型と同様の表現型を示したことから、ARF6とARF8は高浸透圧ストレス下の側根形成に直接的には関与していないことを示すことができた。さらに昨年度の解析では、miR167がIAR3をターゲットしていることを示す際にターゲット部位に変異を導入したIAR3を恒常型強発現プロモーター下で発現させていた。今年度はこれを改良しIAR3従来のプロモーターで発現させた。バックグラウンドにはIAR3ノックダウン系統を使用した。この実験系でも恒常型強発現系統と同様の結果が得られ、我々の主張がより強固になった。論文は無事受理されPlant Cellに掲載された(Kinoshita et al.,2012)。交付申請書の計画通り、miR167がLAR3を標的としていることを実証した。論文としてまとめるためには、miR167の既知の標的であるARF6,ARF8ではなく、上記した新奇の標的が、側根形成における標的分子であることを証明する必要がある。すでに、研究はスタートしているので、結果が待たれる。今後は、計画通りに進めれば良いであろう。