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ー破骨細胞による骨分解機構の解明ー　骨破壊性疾患の克服に向けて

ヒト末梢血単球およびヒト白血病細胞株HL60を分化誘導した破骨細胞モデルを用いて破骨細胞活性化の分子機構の解明に取り組んだ。標的分子として、1)PKCδ、2)KIF20A、3)Vimentin、4)snRNPタンパク質,SMNの関与について検討した。各分子のshRNAを導入し、ノックダウン型の破骨細胞モデルを作成した。PKCδおよびVimentinのノックダウンではF-アクチン再構築の抑制、KIF20AおよびSMNノックダウンでは多核化の亢進が認められた。SMNの場合にはリソソームの輸送に関わるα-チュブリンのアセチル化も亢進しており、破骨細胞活性化プロセスを制御している可能性が示唆された。ヒト末梢血由来の単球およびヒト白血病細胞株を分化誘導した破骨細胞モデルを用いて破骨細胞の活性化プロセスを追跡した。骨分解の開始刺激としてATPを利用し、刺激後の変化を、1環状の接着帯(シーリングゾーン)の形成に必須のF-アクチンの再構築、2リソソームの細胞内輸送とその輸送に関わる微小管のダイナミクス、3骨表面への放出機構という視点から経時的に解析した。とりわけ平成23年度の研究において注目した1)ATP/P2X7刺激で活性化するチロシンキナーゼSykの下流で働くシグナル伝達分子PKCδ、2)キネシンファミリータンパク質KIF20A、および3)細胞骨格タンパク質ビメンチンについては、各々のノックダウン型ヒト白血病細胞株HL60とcontrol-shRNAを導入したcontrolノックダウンHL60細胞を比較してその影響を検討した。1)PKCδノックダウン細胞では、分化により誘導される接着分子インテグリンの発現に抑制が認められたが、podosomeの形状や頻度に大きな差異は認められなかった。2)KIF20Aノックダウン細胞では、分化プロセスにおいて多核化が亢進して巨細胞化したが、podosome複合体についての顕著な違いは見いだせなかった。3)ビメンチンノックダウン細胞では、形態のいびつな細胞が多く、シーリングゾーンの環状形態が不明瞭であった。さらに細胞内分解に関わる分子として新たな視点で作成したSMNノックダウン細胞の作成と基礎検討を開始した。ヒト末梢血由来の単球およびヒト白血病細胞株HL60を分化誘導した破骨細胞モデルを用いて破骨細胞活性化プロセスの分子メカニズムの解明に取り組んだ。破骨細胞の活性化プロセスを、1F-アクチンの再構築、即ちドッド状のF-アクチン複合体であるpodosomeの集積による環状の接着帯(シーリングゾーン)の形成と、2リソソームの細胞内輸送とその輸送に関わる微小管のダイナミクス、3骨分解酵素の骨表面への放出の3段階に分けて解析した。標的分子として、1)ATP/P2X7刺激で活性化するSyk(すでに報告)の下流分子,PKCδ、2)細胞内輸送に関わるキネシンファミリータンパク質,KIF20A、3)podosomeの構築に関わる細胞骨格タンパク質として中間径フィラメントのビメンチンについて検討した(平成2324年度)。さらに、4)脊髄性筋萎縮症(SMA)の原因遺伝子産物であるsnRNPタンパク質,SMNの関与についても検討した(平成25年度)。各々の分子についてshRNAを導入し、ノックダウン型の破骨細胞モデルを作成してその影響を検討した。1)PKCδのノックダウンではpodosomeの集積がやや少なかった。2)KIF20Aのノックダウンでは多核化が亢進して巨細胞化したが、上記13の機能については差異を見出せなかった。3)ビメンチンのノックダウンでは、podosomeの形成が抑制された。4)SMNノックダウンでは、細胞融合にともなう多核化、環状の接着帯の形成が亢進しており、活性化型破骨細胞に近い半球状の構造も多く認められた。リソソームの輸送に関わる微小管構成成分,αチューブリンのアセチル化の亢進(脱アセチル化の遅延)も確認した。これらの結果より、SMNがF-アクチンの再構築から、リソソームの輸送に至る破骨細胞活性化プロセスを制御している可能性が示唆された。ヒト末梢血由来の単球およびヒト白血病細胞株を破骨細胞へと分化誘導し、象牙質切片や、骨基質を塗布したグラス上で骨分解過程をin vitroに再現する系を確立した。骨分解の開始刺激としてATPを利用し、刺激後の変化を、(1)シーリングゾーン(環状の接着帯)の形成に必須のF-アクチンの再構築、(2)骨分解酵素を含むリソソームの細胞内輸送とその輸送を支える微小管のダイナミクス、(3)骨表面への放出機構、という視点から経時的に解析した。とりわけ今年度は、(1)シーリングゾーンを構成するF-アクチンを中心としたドット状の複合体構造、podosomeの形成機構に注目した。

podosome形成に関わる標的分子を、ATP刺激後のプロセスにより1)ATP/P2X7刺激で活性化するチロシンキナーゼSykとその下流で働くシグナル伝達分子群、2) podosome複合体構成分子の輸送に関わる分子群、および3)アクチンとともにpodosomeの構成成分となる分子群に分けて検討した。1)Sykの下流分子として、破骨細胞様分化において発現量の増加が認められるセリン・スレオニンキナーゼ、PKCδ、2)輸送に関わる分子としてキネシンファミリー分子であるKIF20A、3)podosome成分として細胞骨格を構成する中間径フィラメント、ビメンチンに焦点をあて、podosome形成能を有するヒト白血病細胞株HL60について、これら分子の発現抑制変異型を作成した。引き続き、podosome形成能における影響を検討中である。F-アクチン複合体であるpodosomeの形成機構に注目して標的分子のノックダウン株を作成したが、破骨細胞の分化成熟に対する影響の確認に時間を要し、成熟後のpodosome形成に特化した検討への取り組み開始が遅くなった。F-アクチンを中心とした複合体であるpodosomeの形成機構に注目して研究を開始したが、個々の標的分子の変異株の作成に時間を要したため、詳細な機能の解析検討が遅れている。平成24年度の検討で、シーリングゾーンの環状形態に影響の認められたビメンチン変異株、および新たに作成したSMNノックダウン株の解析を通して、podosomeの形成、リソソームの細胞内輸送、輸送に関わる微小管のダイナミクスおよび骨表面への放出機構の解明に取り組む。平成23年度に作成した変異株を用いpodosome形成時における各標的分子の機能解明に取り組む。さらに、変異型-破骨細胞の機能をより生体内に近い環境で解析するため、骨髄微小環境を再現するin vitroモデルおよびその中でのバイオイメージングシステムの確立に取り組む。平成24年度の研究費の一部を新たに作成したSMNノックダウン細胞株の解析検討に活用する。平成23、24年度に引き続き、in vitroの細胞培養実験およびバイオイメージングシステムに必要な試薬および器具を購入する。平成23年度において、標的分子変異株の作成に時間を要したため、培養システムを駆使した解析検討に必要な研究費を次年度に活用する。上記、in vitroモデル、およびバイオイメージングシステムの確立のため、細胞培養装置(当初平成23年度購入予定)と培養器具、およびその際必要な試薬を購入する。
トリチウム理工学-計測・貯蔵および移送技術

D-T燃焼実験等の核融合炉開発過程の初期段階で解決すべき研究を次の3つに分け進めてきた。1.大量トリチウムの計量・計測(1)高性能カロリーメータを作製し、0.5Ci以上のトリチウム水を十分な精度で測定する手法を確立した。(2)エレクレット素子がトリチウム線量計として有用なことを実証した。(3)トリチウムのβ崩壊による光量子を測定すると大量トリチウムが計測できることを明らかにした。(4)サンドイッチ型のメモリ効果補償電離箱の試作および交流駆動電離箱の基礎実験を行った。(5)ドリフトチューブ法によって移動度測定法等について実験を行い、極微量【H_2】Oの検出に有望で、Li同位体分離が可能なことを実証した。(6)赤外吸収スペクトルの測定から、高濃度トリチウム水の化学形ごとの定量ができることを明らかにした。2.高レベルトリチウムの貯蔵技術(1)性能向上のためのスポンジチタンの表面処理条件を確立し、4mciのトリチウムガスの貯蔵・放出を実証した。(2)ZrNi合金が水素同位体の吸蔵材として有用なことを明らかにした。3.トリチウムの分離回収を含むトリチウムの移送技術(1)液体および臨界流体クロマトグラフィを用いて、理論段数100万段のものが得られることを実証した。(2)Ni-Al粉末焼結合金が、高い水素透過性と秀れた同位体分離特性を有することを明らかにした。(3)液体Li中のトリチウムの分離に、窓膜材を吟味した水素窓法が有用であることを明らかにした。(4)トリチウムの氷ペレットの入射に関して空気銃方式と遠心方式について概念設計を行った。ガラスペレットについて充填装置の漏洩の抑制と、ドリフト充填量の非破壊計測に成功した。(5)Al-Mg-Li合金の水素同位体に対する吸蔵・放出を明らかにした。(6)シリカ中の水素同位体の微視的挙動を明らかにした。
Bruxismによる歯周組織破壊の研究-睡眠中の下顎運動方向と歯の動揺度の変化の関係について-

申請者は,平成2年度,3年度,および4年度文部省科学研究費(奨励A)の補助を受け,従来まで不可能であった睡眠中の下顎運動を記録できる装置を考案した。本装置は下顎運動の前方,および側方運動の移動量ををデータレコーダならびに記録紙に記録し,さらに,そのデータをアナログデジタル変換器(AD変換器)を介しパーソナルコンピュータ(PC)に入力,分析することにより,下顎運動を前後左右の二次元的運動としてPCの画面(CRT)上に再現できるようにした。本年度の研究は,本装置を用い,睡眠中に出現するbruxismによる側方運動の実態を調査した。また,bruxismと歯周組織破壊との関係を明らかにする目的で各種歯の動揺度測定法についてその精度および特徴について調べ,咬合性外傷による歯周組織の微細な変化を測定することが可能かどうかについて検討し,実験を行った。動揺度の測定法は,従来から考案されている静的動揺度測定法と動的動揺度測定法について歯周組織模型を作成し,検討した。なお,動的動揺度測定法についてはペリオテストと加速度形を用いて歯に加振したときの減衰波形を分析する方法について行った。その結果,8名の被験者におけるbruxism時の側方運動の出現は,grindingならびにclenchingの両タイプで観察された。また,偏心位で行うclenchingの咬合位は,grindingの運動軌跡上に位置することが多いことが観察された(第35回春季および秋季歯周病学会発表)。動揺度測定法については,いずれの方法も,歯周組織支持量の変化とは高い相関性有していたが(第36回秋季歯周病学会発表),歯周組織の粘性と弾性の2つの性質との関係についてはさらに模型を改良して測定しなければならない。以上の点を考慮し,本実験は,動揺度とbruxismとの関係を解明するために実験に適した方法を検索中である。
呼吸速度または一回換気量の制御が運動開始時の酸素摂取動態に及ぼす影響の解明

本研究の目的は、呼吸性アルカローシスを誘導する過呼吸を引き出す方法の違いが、呼吸性アルカローシス環境下における運動開始時の酸素摂取応答速度にどのような影響を及ぼすかを明らかにすることであった。結果として、呼吸性アルカローシスの誘導法の違いにより、運動開始時における酸素摂取量の時定数に違いが生じることが示された。この違いには、呼吸性アルカローシスによる血中のpH及び重炭酸イオン濃度の変化、及び運動開始時における乳酸の産生が関与している可能性が考えられた。本研究では、呼吸性アルカローシスを誘導する過呼吸を引き出す方法の違いが、呼吸性アルカローシスの状態下における運動開始時の酸素摂取応答速度にどのような影響を及ぼすかを明らかにすることを目的とした。被験者は非喫煙の健常男性(2224歳)であった。平成24年度は呼吸速度を20、30、または60回/分に制御したのに対し、最終年度では呼気終末二酸化炭素濃度を20 mmHgに維持した呼吸状態で、安静1分、10 Wでのベースライン運動4分、主運動6分、10 Wでの整理運動6分の自転車運動負荷試験を行ない、その際の呼吸・循環パラメータを測定して、特に主運動開始時の酸素摂取動態に関して解析を行なった。対照実験では自由な呼吸の下、運動負荷試験を行なった。主運動負荷強度は嫌気的代謝閾値における運動負荷を中強度として、低強度、中強度、または高強度の3種類を設定した。解析の結果、呼吸速度を調節した場合、呼吸速度が遅い場合に比べて、呼吸速度が速い方が運動開始時の酸素摂取応答が速くなることが示された。一方、呼吸速度及び一回換気量は任意にして呼吸終末二酸化炭素濃度を調節した場合、その濃度が低くなると対照実験に比べて運動開始時の酸素摂取応答が遅くなることが示された。これらの結果は、第37回国際生理学会大会他で発表された。本研究では更に、呼吸制御による循環血液ガス成分等の変化に関する研究が動物実験により開始されており、今後の進展が期待される。本研究の目的は、1.呼吸性アルカローシス誘発の要因である呼吸速度及び一回換気量の増大が、アルカローシス誘発に対して単独および相互的にどのように関わり合っているかを明らかにすること、及び2.アルカローシス誘発の原因が主に呼吸速度であるか一回換気量であるかで、運動開始時における酸素摂取動態の応答速度にどのような差異が生じるかを明らかにすることである。上記1を果たすため、平成24年度はまず初めに動物実験手技の確立を行なった。具体的には、ペントバルビタール麻酔下のラットに対して本助成金で入手したレスピレータを用いて人工呼吸を施して尾静脈より血液を採取、血中二酸化炭素分圧をはじめとする血液ガス成分を本助成金で入手した血液ガス分析装置により測定した。現在は、麻酔深度の安定化、実験手技の成熟、安定化を図り、血液ガス成分測定値の安定化を図っている。このことは、今後取得していくデータの信頼性のために重要である。また、上記2を果たすため、平成24年度は呼吸速度を20、30、または60回/分に制御して運動負荷試験を行ない、その際の呼吸・循環パラメータを測定して解析した。運動負荷強度は嫌気的代謝閾値における運動負荷を中強度として、低強度、中強度、または高強度の3種類を用いた。その結果を受けて、呼吸性アルカローシスの状態で強い運動を行なうと、始めはピルビン酸脱水素酵素活性の減少が生じ、その後、強い運動による血液の酸性化に伴い酸素解離曲線の右方シフトが生じる可能性が示された。この結果は、運動生理学的知見として学術的に貢献できるものである。本研究成果は、第27回生体・生理工学シンポジウムにて発表を行なった。ラットを用いた動物実験の手技確立に関して、特に麻酔深度の安定化が難しく、技術向上、手技確立に時間を要した。従って、平成24年度で計画していた呼吸速度及び一回換気量を制御した上での血液ガス成分分析は、引き続き平成25年度に行なう予定でいる。ヒトを用いた運動負荷試験は現在のところ問題なく順調に進行しており、平成25年度に予定していた研究に既に入っている。以上、ほぼ順調に進展しているが、動物実験が平成24年度内に終了しなかった点を考慮して、やや遅れていると評価した。今後は、ラットを用いた動物実験を加速していく予定である。まずは現在の実験手技の基、呼吸速度及び一回換気量を制御した上での血液ガス成分分析を行ない、データの確認、解析を行なう。麻酔深度に関して、ばらつきが収まらない様であれば、イソフルランまたは笑気ガスによる吸入麻酔の適用を試す。平成24年度と同様、ラットを用いた動物実験と平行してヒトを用いた運動負荷試験を行なっていく。今後は、一回換気量を一定に保つ条件下、及び呼気終末二酸化炭素分圧を一定に保つ条件下における運動負荷試験を行なう予定である。

平成24年度において動物実験の手技確立に時間を要したため、実験動物経費、動物実験関連の消耗品代の一部が次年度に回ることになった。また、旅費は平成25年度に海外で研究発表を行なうため、基金助成金の性質を生かし、平成24年度分の一部を平成25年度分に回した。人件費・謝金に関しては、平成24年度における運動負荷試験に対してボランティアの助けを得ることが出来たため、一部をその他に回し、残りを平成25年度における動物実験に関する消耗品費、及び運動負荷試験に関する人件費・謝金に回した。次年度は計画通り運動負荷試験用の薬品、心電図測定用電極、呼吸マスク、ガルバニ電池、固定用テープを購入する他、引き続き動物実験を行なうため、動物実験用の実験用動物、注射針・シリンジなどの動物実験関連消耗品も購入する。また、計画通り国際学会大会参加のため、平成24年度から回した分も含めて旅費を使用する。さらに、運動負荷試験に対するアシスタント雇用、被験者謝金に対して人件費・謝金を使用する。英文校閲料、学術論文投稿・印刷費としてその他の経費を使用する計画でいる。
南方モンゴロイドのグルコース-6-リン酸脱水素酵素異常症の遺伝子解析

ラオス、ミャンマー、タイ、インドネシア、日本のG6PD異常症例について遺伝子解析を行った。1.ラオス人8例ではいずれもG6PDViangchan(以下"G6PD"は省略)が見出された。2.ミャンマーおよびタイのミャンマー人では、15例(ビルマ族11例、モン族3例、シャン族1例)にMahidol,1例(ビルマ族)にUnionが同定された。5.ハルマヘラ島・ブル島のインドネシア人では、8例にVanua Lava,1例にCombraを同定し、ジャワ島では2例にChathamを見出した。6.インドネシア在住の中国人および母親が中国(香港・台湾を含む)出身の日本人では、5例にKaiping,3例にCanton、各1例にGaohe、Mahidol-likeを同定し、更に1例では新規の変異1291G→A(G6PD Surabayaと命名)が同定された。モン族も含めミャンマーでMahidolの頻度が高いこと、ハルマヘラ島・ブル島ではメラネシア系の変異酵素であるVanua Lavaの頻度が高いことは新知見として重要ある。これまでのデータも含め考察すると、南方モンゴロイドのG6PDの変異を、(1)大陸群(中国、ラオス、タイ、ミャンマー)、(2)島嶼群(フィリピン、ジャワ島)、(3)メラネシア群(バヌアツ、ソロモン諸島、ハルマヘラ島)に分類し、各群を代表する変異酵素を、(1)Canton、Kaiping,Mahidol,(2)Viangchan,(3)Union,Vanua Lavaとするのが妥当と思われる。本年度は、ラオス、インドネシア、ミャンマー、日本からの検体についてグルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PD)異常症例の遺伝子解析を行った。1.ラオスのマラリア流行地に住む678名を対象として、研究代表者の開発した方法で赤血球G6PD活性をスクリーニングし、46例(男22、女24)のG6PD異常症例を見出した。うち変異を確定しえた9例(男3、女6)は、すべて871G→Aを有しておりG6PD Viangchanと同定された。3.プリマキンによる急性溶血性貧血の既往のあるミャンマー人1例では、東南アジアに頻度の高いG6PD Mahidolを同定した。1,4を含めこれまで研究代表者らが検索した東南アジア各地のG6PD Vlangchan症例は、いずれも1311C→T,IVS11,93T→Cのサイレント変異を有しており、共通の祖先に由来することが示唆された。本年度も前年度に引き続き、インドネシア、ミャンマー、タイ、日本人検体について遺伝子解析を行った。1.インドネシアのハルマヘラ島・ブル島でのスクリーニングにより、G6PD活性低下が認められた9例について遺伝子解析を行い、8例で383T→C;G6PD Vanua Lavaを、1例で592C→T;G6PD Coimbraを同定した。2.ミャンマー(モン州・シャン州)でのスクリーニングにより見出されたG6PD異常症例11例の解析では、10例で487G→A;G6PD Mahidol、1例で1360C→T;G6PD Unionを同定した。タイと同じくミャンマーでもG6PD Mahidolの頻度が高いこと、インドネシアでもメラネシア系の色彩が強いハルマヘラ島では、メラネシアに特徴的なG6PD Vanua Lavaが高頻度に認められることは新知見として重要である。
アッセンブリタイプペロブスカイト型酸化物の選択的酸化触媒への応用

金属シアノ錯体の熱分解によってペロブスカイト型酸化物を調製した.流通ガス中の酸素濃度はペロブスカイト型酸化物の形成に影響を与えた.また,複核シアノ錯体の配位子の酸化熱(燃焼熱)によりペロブスカイト相が形成されていることが明らかとなった.シアノシリル化反応活性はペロブスカイト型酸化物の焼成温度の増加とともに増加した.ペロブスカイト型酸化物の結晶成長がシアノシリル化反応活性に影響を与えると結論した.本年度はシアノ錯体熱分解法(CN法),逆均一沈殿法(RHP法),高分子前駆体法(PP法)といった種々の調製法を用いてペロブスカイト型酸化物であるSmFeO3を調製し,液相反応であるカルボニル化合物のシアノシリル化反応に対する触媒活性について検討を行った.種々の方法で調製したSmFeO3の比表面積当りのシアノシリル化反応活性の序列はCN法>PP法>RHP法となった.CN法はシアノシリル化反応に対して有効な調製法であることがわかった.各調製法におけるSmFeO3の結晶子径を比較すると,40 nm (CN法) > 37 nm (PP法) > 34 nm (RHP法)となり,CN法が最も結晶成長が進んでいた.シアノシリル化反応活性との比較から,ペロブスカイト型構造を形成する結晶成長が,触媒活性を向上させた原因であると推測している.また,種々のAサイト金属イオン(Ln = La, Pr, Sm, Gd, Dy)を用いてCN法で調製したペロブスカイト型酸化物LnFeO3のカルボニル化合物のシアノシリル化反応に対する触媒活性について検討を行った.LnFeO3の比表面積当りのシアノシリル化反応活性を比較したところ,Aサイトランタノイド種のイオン半径が小さくなるにつれて触媒活性が高くなった.活性とXPS測定との比較から,表面酸素濃度が高くなるにつれて,比表面積当りのシアノシリル化活性が高くなる傾向を示した.カルボニル化合物のシアノシリル化反応の活性点はブレンステッド酸点であり,表面酸素濃度が増加すると,ブレンステッド酸量が増加することが報告されている.従って,本系では表面酸素濃度が増加し,活性点であるブレンステッド酸点が増加したことによりシアノシリル化反応に対する触媒活性が向上したと考えられる.金属シアノ錯体の熱分解によってペロブスカイト型酸化物を調製した.流通ガス中の酸素濃度はペロブスカイト型酸化物の形成に影響を与えた.また,複核シアノ錯体の配位子の酸化熱(燃焼熱)によりペロブスカイト相が形成されていることが明らかとなった.シアノシリル化反応活性はペロブスカイト型酸化物の焼成温度の増加とともに増加した.ペロブスカイト型酸化物の結晶成長がシアノシリル化反応活性に影響を与えると結論した.本申請課題では,均質なペロブスカイト型酸化物触媒を得るために,シアノ錯体の熱分解による調製法を用いている.Bサイト複核のペロブスカイト型酸化物LnFe(x)Co(1-x)O(3) (Ln :ランタノイド)を本法により調製し,これら触媒のCO酸化活性について検討した.さらに, Bサイトの部分置換効果やAサイト金属種が活性に与える影響について検討した.シアノ錯体Ln[Fe(x)Co(1-x)(CN)(6)]・nH(2)O (Ln = La, Pr , Sm, Gd, Dy, Ho, Er; x = 01)を合成し,各焼成体のXRD測定したところ,YbFe(0.5)Co(0.5)O(3)以外の試料ではペロブスカイト型酸化物に帰属されるピークのみが観察された.また,ペロブスカイト型酸化物由来のピークはFe添加量(x)とともに低角度側にシフトすること,格子定数は(x)とともに直線的に増加し, Bサイトが精密に部分置換できていることが明らかになった.単一相が得られたLnFe(x)Co(1-x)O(3)のCO酸化活性において,Aサイトに関わらず, x = 0.5で最大活性を示し, FeとCoの共存による相乗効果が認められた.一方, Aサイト金属種によるCO酸化活性への影響は小さく, Aサイト金属種よりもBサイト金属種の方がCO酸化活性に影響を与えることがわかった.原料錯体をシアノ錯体からオキサラト錯体K(3)[M(ox)(3)](M = Fe, Co)へ変えたところ,水溶媒では目的の配位高分子前駆体は得られなかったが,メタノール溶媒で目的の前駆体Sm[M(ox)(3)]を調製することができた.Sm[Fe(ox)(3)]を前駆体として,焼成温度を上げていくと600 °C以上で目的のペロブスカイト型酸化物が生成し,その金属酸化物の表面積は小さくなることがわかった.本研究では,シアノ錯体熱分解法(CN法)を用いて様々な焼成条件で調製したペロブスカイト型酸化物の物性評価を行った.CN法を用いて大気中で焼成して得られたペロブスカイト型酸化物SmFeO3の比表面積と焼成温度・焼成時間の関係について調査した.その結果,焼成温度の増加とともに,比表面積は低下した.

さらに,焼成温度が同じときには,焼成時間の増加とともに比表面積は低下した.650 °C,5 hの大気中で焼成して得られた単一相のSmFeO3で比表面積が最も大きくなった.AサイトがLaの場合もSmと同様な傾向を示した.このように本研究を通じて得られた結果として,CN法では焼成温度を低く,焼成時間を短くした方が,より比表面積の大きなペロブスカイト型酸化物が得られることを明らかにした.次に,様々な雰囲気でシアノ錯体を焼成してペロブスカイト型酸化物を調製した.酸素を流通して焼成した場合,ペロブスカイト型酸化物に帰属されるXRDピークが認められ,LaFeO3の単一相の形成が確認された.空気,湿潤窒素,二酸化炭素雰囲気の場合,単一のペロブスカイト型酸化物は形成しなかった.また,焼成炉の温度を300 °Cに設定し,種々の酸素分圧下でシアノ錯体を焼成した試料のXRD測定を行った.酸素分圧が50 %以上で焼成した際,単一相のペロブスカイト型酸化物LaFeO3の形成が確認された.ペロブスカイト相が観測された試料において,より高い酸素分圧下で焼成した試料ほど,結晶子径は増加し,比表面積は小さくなった.このように本研究によって焼成時の酸素分圧は得られるペロブスカイト型酸化物の比表面積,形状(アッセンブリ性)に大きく影響することを明らかにした.三か年の研究でCN法によるペロブスカイト型酸化物最適形成条件が明らかとなり,当初の目標が達成できた.触媒化学平成25年度の主な計画の「3アッセンブリタイプペロブスカイト型酸化物触媒特性の評価」に関して、液ー固反応として,酸塩基反応であるシアノシリル化反応に対する種々の方法で調製したペロブスカイト型酸化物触媒のシアノシリル化反応活性評価を重点的に行った.3つの異なる触媒調製方法で調製したSmFeO3を用いたところ,シアノ錯体熱分解法で調製した触媒が最も表面積あたりの触媒活性が高いこと,Aサイトランタノイド金属種の異なるペロブスカイト型酸化物LnFeO3のシアノシリル化反応活性は,表面酸素濃度の変化に伴うブレンステッド酸点の量と関係があることを明らかにした.以上のように,本申請課題は,当初の目的通りに進展している.前々年度の研究方針である「1多核シアノ錯体などの前駆体の合成」と「2シアノ錯体の熱分解によるアッセンブリタイプペロブスカイト型酸化物の調製」について継続的しており,焼成雰囲気を制御したシアノ錯体の熱分解を検討したところ,窒素や二酸化炭素雰囲気下でシアノ錯体が分解する過程に生成する新しい相が確認できており,当初の目的通りに進展している.平成24年度の2つの大きな計画のうち、「1多核シアノ錯体などの前駆体の合成」に関して,配位高分子前駆体の代表例として,La[Fe(CN)(6)]・nH(2)Oを用いて種々の条件で検討を行った.その結果,生成する配位高分子前駆体の形状に対して,調製時の溶媒や溶液の濃度は大きな影響を与えるが,pH変化は大きな影響を与えないことが明らかとなった.また,シアノ錯体以外のオキサラト錯体を用いて,配位高分子前駆体を合成したところ,水溶媒では安定な前駆体が得られないが,メタノール溶媒を用いて合成することで,目的の配位高分子前駆体が合成可能であることが明らかとなっており,本申請課題は,当初の目的通りに進展している.また,「2シアノ錯体の熱分解によるアッセンブリタイプペロブスカイト型酸化物の調製」に関して,熱処理温度及び雰囲気が酸化物集合体の形成に与える影響について検討を行った.
ヨウ化物イオンによる塩化スズ(IV)の還元を経たアリルスズ新規発生法とその応用

塩化メチレン中、室温で、ヨウ化物イオンを用いてハロゲン化スズ(IV)をペンタハロスタナート(IV)の形成を経てトリハロスタナート(II)へ還元し、これとアリルクロリドまたはアリルメシラートからアリルスズを発生させた。このアリルスズ発生法をアルデヒドへの求核付加によるホモアリルアルコールの合成に利用した。また、この方法をプロパルギルスズまたはアレニルスズ発生法へ発展させた。1.カルボニル-アリル化反応塩化スズ(IV)と3倍モルのヨウ化テトラブチルアンモニウム(TBAI)を用いて2-プロペニルトリクロロスズを発生させ、アルデヒドを高収率でアリル化することができた。1-クロロ-2-ブテンによるアリル化では低収率であった。ヨウ化スズ(IV)に替えたところ、TBAIを2倍モルに削減でき、1-クロロ-2-ブテンによるアリル化で収率を向上させることができた。また、溶媒を1,3-ジメチルイミダゾリジン-2-オンにすると、TBAIの替わりにNaIが利用できることもわかった。2.カルボニル-アレニル化またはプロパルギル化反応アリル化と同様に、2-プロピニルクロリドまたはメシラートからカルボニル-アレニル化およびプロパルギル化反応を行うことができた。1-メチル-2-プロピニルメシラートでは2-メチル-3-ブチン-1-オール誘導体を、2-ブチニルメシラートでは2-メチル-2,3-ブタジエン-1-オール誘導体をそれぞれ選択的に生成することができた。申請者らは、ハロゲン化スズ(II)によるアリルアルコール、アリルエステル、およびハロゲン化アリルからのアリルスズ化合物の生成法を開発し、カルボニル化合物への求核付加反応(カルボニル-アリル化反応)に利用してきた。そのアリル化法は簡便ではあるが、ハロゲン化スズ(II)を溶かすために、高沸点の水溶性極性溶媒であるジメチルイミダゾリジノンやDMFを必要とする。そのため、その方法は処理、精製の点から大量合成には向かない。本申請では、塩化メチレン中で、ヨウ化テトラブチルアンモニウム(TBAI)を用いた塩化スズ(IV)の還元によるトリクロロスタナート(II)の生成、およびそれとハロゲン化アリルまたはアリルメシラートとの反応によるアリルトリクロロスズの発生法を開発した。そのアリルトリクロロスズ発生法をアルデヒド類への求核付加によるホモアリルアルコールの合成(Barbier型カルボニル-アリル化反応)へ応用した。SnCl_4およびTBAIの使用量や生成物であるホモアリルアルコールの収率の点から、出発アリル化合物としては2-プロペニルメシラートが1-クロロまたは1-ブロモ-2-プロペンより優れていることを見出した。また、1-クロロ-2-ブテンを用いるカルボニル-アリル化反応において、γ-syn付加体である1-置換2(syn)-メチル-3-ブテン-1-オールを選択的に生成することを見出した。現在のところ、試薬の使用量や収率に問題はあるが、Barbier条件下でのγ-syn選択性の発現は特筆に値するものであり、試薬その他の反応条件の改良により有効なカルボニル-アリル化法になると考える。アリルトリハロスズによるカルボニル化合物のアリル化反応(カルボニル-アリル化反応)をより汎用性の高い方法とするために、高沸点極性溶媒中でハロゲン化スズ(II)を用いる方法から、ヨウ化物イオンによりハロゲン化スズ(IV)を還元してトリハロスタナート(II)を発生させ、アリルスズを生成する方法に転換することを考えた。この新規発生法でアリルクロリド類またはアリルメシラート類からアリルトリハロスズを生成し、種々のカルボニル-アリル化反応に応用した。昨年度は、低沸点非極性溶媒の塩化メチレン中で、塩化スズ(IV)と13倍モルのヨウ化テトラブチルアンモニウム(TBAI)を用いて、上記アリル化反応を開発した。

この方法は、塩化スズ(IV)が加水分解しやすいという欠点を持っているため、操作が厄介であった。本年度は、塩化スズ(IV)の替わりに、固体のため比較的安定で取り扱いやすいヨウ化スズ(IV)を用いたところ、2倍モルのTBAIでアリルトリヨードスズを生成し、高収率でアルデヒド類をアリル化することができた。また、溶媒を1,3-ジメチルイミダゾリジン-2-オンに替えると、TBAIをヨウ化ナトリウムに替えることができ、より効率的な反応となった。さらに、系内にヨードトリメチルシランを添加すると、触媒量のヨウ化スズ(IV)で効率よくカルボニル-アリル化反応が起こることがわかった。また、このハロゲン化スズ(IV)の還元法をプロパルギルクロリド類およびプロパルギルメシラート類の反応に利用し、選択的カルボニル-プロパルギル化、またはアレニル化反応を可能にした。
皮膚・リンパ節内の免疫細胞挙動の解析による経皮ワクチン免疫誘導機構の解明

本研究課題では、従来の注射投与型ワクチンと比較して高い有効性を発揮しうる経皮ワクチンの免疫誘導機構の解明を目指した。独自に開発した2種類の経皮ワクチンデバイス(ハイドロゲルパッチと皮膚内溶解型マイクロニードル)を用いた経皮ワクチンと注射投与(皮下および皮内)における免疫応答を比較検討した。その結果、皮膚を標的とした経皮ワクチンでは、皮膚組織内での遺伝子発現変化、所属リンパ節内での細胞ポピュレーション変化やT・B細胞の活性化など、注射投与ワクチンとは異なる反応が生じていることが判明し、これらの反応の違いが経皮ワクチンの優れた抗体産生誘導能に寄与していることが示唆された。針長が300 μmのマイクロニードルを用いた経皮投与、ならびに一般的な注射投与(筋肉内、皮下、皮内)によって、モデル抗原であるオボアルブミン(OVA)をマウスに投与し、OVA特異的抗体価測定したところ、経皮投与では他の注射投与と比較して高い抗体産生が認められた。従来の主なワクチン投与法である筋肉内注射や皮下注射よりも、皮膚表層を抗原の送達部位とする経皮免疫が優れていることが示された。そこで、皮膚に常在する組織特有の抗原提示細胞である樹状細胞に着目し、マイクロニードルを用いた経皮免疫におけるこれら細胞の関与を検討した。ジフテリアトキシンを投与することで皮膚に常在する3種類の樹状細胞を枯渇させた遺伝子改変マウスに経皮免疫を行ったところ、抗体産生が有意に低下した。したがって、皮膚に存在する抗原提示細胞が高い抗体産生を誘導する皮膚免疫において重要な役割を担っているものと考えられた。一方で、経皮投与により皮膚内へ送達された抗原の体内動態を観察したところ、抗原が皮膚の細胞に取り込まれることなくリンパ節へと流れ込み、マクロファージに数多く取り込まれていることが確認された。また、抗原を含有していないマイクロニードルを貼付すると、その穿刺に伴い、皮膚組織にマクロファージが集積することを見出した。このことから、樹状細胞と同じく抗原提示細胞であり、サイトカインやケモカインの分泌能に優れる免疫担当細胞でもあるマクロファージが、経皮免疫に寄与している可能性が示唆された。本研究課題では、従来の注射投与型ワクチンと比較して高い有効性を発揮しうる経皮ワクチンの免疫誘導機構の解明を目指している。まず、独自に開発した2種類の経皮ワクチンデバイス(親水性ゲルパッチと皮膚内溶解型マイクロニードル)を用いた経皮ワクチンと皮下注射投与における免疫応答誘導能を比較検討し、経皮ワクチンの有効性に関する基礎情報の収集を試みた。また、経皮ワクチン製剤の貼付部位である皮膚ならびにその所属リンパ節内の免疫細胞の挙動を解析し、生体内での免疫学的反応を可視化することに取り組んでいる。その中で本年度は、1.経皮ワクチンの抗体産生誘導能の評価、2.抗体産生に寄与する抗原提示細胞サブセットの同定、3.皮膚組織における免疫細胞の挙動、4.所属リンパ節における免疫細胞の挙動、について以下の成果を得た。1.経皮ワクチンが皮下注射投与ワクチンと同等、あるいはそれを上回る抗体産生を誘導可能であることを明らかにした。2.強力な抗原提示細胞である樹状細胞サブセットを枯渇した遺伝子改変マウスを用いることで、皮膚常在性の樹状細胞が抗体産生に寄与することを示した。3.経皮ワクチンデバイスを貼付することで皮膚内に免疫細胞が一時的に集積することを明らかにした。4.経皮ワクチンデバイスの貼付により、所属リンパ節における抗原提示細胞サブセットのポピュレーションが変化することを見出した。今後、皮膚組織あるいは所属リンパ節にて増加した免疫細胞の免疫応答誘導への寄与を詳細に解析していく予定である。独自に開発した2種類の経皮ワクチンデバイス(親水性ゲルパッチと皮膚内溶解型マイクロニードル)を用いた経皮ワクチンと注射投与(皮下および皮内)における免疫応答誘導能を比較検討した。その中で本年度は、経皮ワクチンの有効性に関する基礎情報として、以下のような成果を得た。1.経皮ワクチンデバイスである皮膚内溶解型マイクロニードルの貼付により、皮膚組織内での遺伝子発現が変化することが見出された。近年、免疫応答の誘導に深く関わるとして注目を集めている分子について発現変化が認められた。2.経皮ワクチンデバイスの貼付により、所属リンパ節における抗原提示細胞サブセットのポピュレーションが変化することを明らかにした。一方、経皮ワクチンデバイスの貼付により皮膚内に免疫細胞が集積することが判明した。3.経皮ワクチンでは注射投与ワクチンと比較して、T細胞ならびにB細胞の応答に違いがあることを明らかにした。特に、T細胞の抗原特異的な分裂については、経皮ワクチンと皮下注射投与ワクチンで大きな差が認められた。また、T細胞やB細胞の表面マーカーの解析から、経皮ワクチンと皮下注射投与ワクチンでは、T細胞やB細胞の活性化あるいは分化状態が異なることが判明した。以上の結果から、皮膚を標的とした経皮ワクチンでは、免疫応答の誘導における各ポイントにおいて、注射投与ワクチンとは異なる反応が生じていることが示唆され、これらの反応の違いが経皮ワクチンの優れた抗体産生誘導能に寄与していると推察される。

その結果、皮膚を標的とした経皮ワクチンでは、皮膚組織内での遺伝子発現変化、所属リンパ節内での細胞ポピュレーション変化やT・B細胞の活性化など、注射投与ワクチンとは異なる反応が生じていることが判明し、これらの反応の違いが経皮ワクチンの優れた抗体産生誘導能に寄与していることが示唆された。経皮ワクチンによる免疫応答の従来皮下注射との比較検討ならびに皮膚・所属リンパ節における免疫細胞の挙動の解析は順調に進んでいる。これらの成果をもとに、最終年度では、生体内における免疫細胞の挙動を二光子顕微鏡にて可視化する予定である。ドラッグデリバリーシステム二光子顕微鏡を用いた免疫細胞の挙動を可視化を実施するために、蛍光標識抗原ならびに蛍光発現樹状細胞を有する遺伝子改変動物の繁殖を現在進めている。免疫反応の時間推移は各時点でしか未だ解析できていないことから、二光子顕微鏡により時間を追って免疫細胞の生体内挙動を観察することで経皮ワクチンの免疫応答誘導機構の解明を目指していく予定である。マイクロニードルを用いた経皮免疫に大きく関与する細胞を少しずつではあるが明らかにしている。また、経皮免疫機構を詳細に解析する手法や多光子顕微鏡を用いて抗原取り込み細胞を生体レベルで追跡する手法の予備検討がおおよそ終了し、更なる機能解析を進めていける体制が整いつつあるといえる。マイクロニードルだけでなく、我々が独自に開発した親水性ゲルパッチについても経皮免疫機構の解明を進めていく予定である。マイクロニードルより皮膚の表層に抗原を送達する親水性ゲルパッチは、免疫応答のバランスが注射免疫と異なることが示されており、本デバイスについても詳細な解析が必要である。また、皮膚に常在する樹状細胞だけでなく、マクロファージが皮膚免疫に関わる可能性が示唆されたことから、クロドロン酸内包リポソームを用いたマクロファージ枯渇マウスを用いた検討を行う。さらに、多光子顕微鏡を用いた皮膚細胞の動態を観察する条件設定や予備検討を進めており、経皮投与された抗原ならびに抗原を取り込んだ細胞の挙動を生体レベルで追跡する。経皮免疫応答にマクロファージが関与することを見出したことから、新たに試薬をそろえる必要性が出たため。マクロファージを枯渇するクロドロン酸内包リポソームやマクロファージのサブセットを染め分ける抗体を購入する予定である。
交通渋滞を考慮した高速道路の混雑料金に関する研究

1.交通流と渋滞現象のモデル開発交通流を圧縮性流体として扱い、渋滞列の延伸や縮小を衝撃波の伝播としてモデル化した。このモデルにもとづいて道路の走行費用を定式化した。2.混雑料金の導出に関する理論分析上のモデルにもとづいて、社会的便益を最大化するような交通量を求める問題を解くことによって混雑料金の計算式を導出した。本モデルは渋滞現象を考慮しているので、動学的な最適化問題を解いている。最適化の条件について分析した結果、渋滞が発生している場合には動学的外部効果があることを明らかにした。3.コンピュータシュミレ-ショウによる分析交通需要や道路に関する種々の条件のもとで交通流や渋滞長をシュミレートし、最適な混雑料金の額を計算した。その結果、最適な混雑料金を徴収することにより、渋滞を大きく軽減することができるが、動物学的外部効果のため料金はかなり高額になることが示された。4.混雑料金と交通量配分の関する分析上の分析は、一本の道路における交通流を対象としていたが、実際の都市では複数の道路がネットワークを形成している。ここでは交通量配分を効率化するための混雑料金の役割に注目する。社会的費用を最小化する問題を解くことにより、最適な経路別混雑料金を計算する式を導出した。さらに全ての道路で料金徴収が困難な現状を考慮した、次善の料金の導出を行い、その性質について検討した。
神経伝達物質遊離に関わるフクティブゾーン複合体の生理機能

神経伝達物質遊離に関わるアクティブゾーン複合体の生理機能を明らかにするため、まず、シンタキシン、VAMP、SNAP-25などと共にアクティブゾーン複合体を形成するシナプトタグミン(SYT)を欠失したPC12細胞を用い分泌能の検討を行った。刺激は神経伝達物質の異常分泌を引き起こすαラトロトキシン(αLTX)を用い予め細胞に取り込ませた[^3H]ノルエピネフリンの遊離を測定した。外液にCaが存在する条件でαLTXを作用させると、欠損株も正常株と同様の神経伝達物質の遊離を示した。一方、細胞外にCaが存在しない条件では、正常PC12細胞で見られる神経伝達物質の遊離が欠損株ではほとんど観察されなかった。この欠損株にラットのSYT1遺伝子を導入し、SYTの発現レベルが異なる細胞株を4クローン作成した。このSYT発現回復株では、Ca非依存的なαLTX誘発性伝達物質遊離能の回復が見られた。以上の結果からSYT1がαLTXにより引き起こされる神経伝達物質遊離に関わることが明らかとなった。次に、SYT1のCa/CaM kinase IIによるリン酸化部位の検討を行った。精製したSYTをCa/CaM kinase IIによりリン酸化した後、2Dペプチドマッピングを行ったところ、主にリン酸化されているペプチドは一断片のみであった。大腸菌で発現させたSYT1のC末端領域(αLTX受容体との結合部位)融合蛋白質は、Ca/CaM kinase IIによりリン酸化された。以上の結果からSYTはニューレキシンとの相互作用に関わるC末端領域がCa/CaM kinase IIによりリン酸化されることが示唆された。本研究によりアクティブゾーン複合体を形成しているタンパク質の分泌への関与が明らかとなり、また、その結合がタンパク質リン酸化酵素により調節される可能性が示唆された。
セラミドを介するアポトーシスシグナル伝達経路の分子生物学的解析析-自己免疫疾患病因解析の試み

アポトーシスに関連した細胞内シグナル伝達系は部分的に明らかになりつつある。私達は既にアポトーシスのセカンドメッセンジャーであるセラミドは、ICEファミリープロテアーゼの一員であるCPP32を活性化することによって核の形態変化を誘導していることを見出した。本研究ではセラミドを介したアポトーシスシグナル伝達機構をさらに解析した。抗Fas抗体によるアポトーシスに抵抗性の変異株であるJurkatFRはセラミドによるアポトーシスにも耐性であった。ウェスタンブロットではCPP32の発現量は野生型と同程度であったが、抗Fas抗体、セラミド処理後のCPP32の限定分解、および蛍光色素を基質とした酵素活性は有意に低下していた。さらにアポトーシス調節因子であるbcl-2、bcl-x、baxの発現を検討したところ、JurkatFRでは明らかなbcl-xLの高発現を認めた。よってJurkatFRの異常はセラミド-ICE様プロテアーゼ系にあり、かつbcl-xLがこの系を抑制する可能性が示唆された。次に、アポトーシスの初期マーカーとして特徴的であるホスファチジルセリン(PS)の細胞表面への表出にセラミドが関与するかを検討した。抗Fas抗体によるPSの表出はCPP32阻害剤であるAcDEVD-CHOで抑制されたため、PS表出にはCPP32が必要であると考えられた。しかし、セラミドによるアポトーシスではPS表出はわずかであったため、PS表出にはCPP32の活性化のみでは不十分であり、スフィンゴミエリン-セラミド系以外の経路が重要であると考えられた。
静磁場暴露による低周波脳律動の誘導と関連領野との相互結合性の変化

近年,頭皮上にネオジム永久磁石を置くことにより,その静磁場が皮質の興奮性を抑制性に変化させる効果が認められようになった.この脳刺激法は,経頭蓋静磁場刺激(tSMS)と呼ばれ,新たなる非侵襲的脳刺激法として注目されている.本研究では健常被験者を対象とし,従来型の脳刺激法と比較して経済性,安全性,操作性において圧倒的に優れたtSMSの介入効果の安定性,及び刺激部位と関連のある領野との相互結合性(コネクティビティ)の変化の特性を明らかにする.近年,頭皮上にネオジム永久磁石を置くことにより,その静磁場が皮質の興奮性を抑制性に変化させる効果が認められようになった.この脳刺激法は,経頭蓋静磁場刺激(tSMS)と呼ばれ,新たなる非侵襲的脳刺激法として注目されている.本研究では健常被験者を対象とし,従来型の脳刺激法と比較して経済性,安全性,操作性において圧倒的に優れたtSMSの介入効果の安定性,及び刺激部位と関連のある領野との相互結合性(コネクティビティ)の変化の特性を明らかにする.
小胞体カルシウムチャネルのアロステリック制御異常による認知症の発症機序

認知症のメカニズムは充分に理解されておらず、新たな分子メカニズムの探索が必要である。本研究は小胞体カルシウムチャネルのアロステリック制御異常と脳機能低下の関連について研究し、認知症メカニズムに関する新しい手掛かりを得ることを目的とする。小胞体の膜上に存在するアロステリックタンパク質であるIP3受容体はカルシウムチャネルとして働き、個体発生やシナプス可塑性を担い、脳の記憶や学習に関与することが明らかにされている。IP3受容体の遺伝子変異はヒト家族性脳疾患である脊髄小脳失調症やGillespie症候群の原因となり、認知症の主な原因である神経変性に関与し、IP3受容体の動作原理の解明はこれらの疾病の理解と治療薬の開発に役立つと考えられる。しかし、IP3受容体のIP3結合部位は、カルシウムイオン透過孔から90オングストロームも離れていることが最近明らかとなり、IP3が物理的にどのようにチャネルを開けるのか謎であった。本研究課題により、世界で初めて2217アミノ酸残基からなる巨大な細胞質ドメインのX線結晶構造解析に成功し原著論文及び総説に成果を発表し(PNAS, 2017)、これらの成果は日刊工業新聞と科学新聞そして化学工業日報に掲載された。また、この研究成果は二つの異なるゴードン会議に認められ口頭とポスター発表を行った(GRC,2017; GRC,2018)。更にX線結晶構造解析で示唆された「リーフレット」部位の変異体を作成し機能解析を行った(PNAS, 2017)。結果、IP3結合による構造変化は競争相手がNature誌に発表したクライオ電顕構造で示されたC末端ではなく、寧ろ巨大な調節・カップリング領域のグローバルな構造がリーフレット領域によりチャネルに伝達されることが必須であることを証明した。これらの成果と最近の研究を総説としてまとめた(Messenger, 2018;実験医学,2018; BBA, 2018)。研究計画では5年間の実験結果をまとめ国際誌に発表する計画であった。しかし、競争相手の研究がNature誌に掲載されたこともあり、実験を加速して行った結果、当初の予定より早い3年間で本研究課題の内容をまとめPNASに論文(PNAS, 2017)を発表することができた。更にこの成果の解説を含めた総説を投稿し出版できた(Messenger, 2018;実験医学,2018; BBA, 2018)。今回新しいゲート機構(PNAS,2017)が初めて明らかとなったので、認知症で生じる脳機能低下とこれがどの様に関連するのか研究することが可能となった。既に我々は認知症患者の脳で活性化されるトランスグルタミナーゼがIP3受容体の構造変化をロックし機能低下を引き起こすことを明らかにしている。トランスグルタミナーゼがIP3受容体のどの部位に作用し構造変化を阻害するのか詳細に解析を進める。さらに、この部位がIP3受容体の立体構造においてどのような位置にあるのか解析し脳の機能低下との関連を考察する。認知症に有効な治療法は未だ無く新たな分子メカニズムの探索が必要である。本研究では小胞体カルシウムチャネルのアロステリック制御異常が認知症の機能障害や毒性機序に関与するという新しい仮説について研究を行っている。脳の神経細胞に信号が伝わると細胞膜から遊離するIP3が小胞体に局在するIP3受容体に結合しチャネル構造のアロステリック変化を起こす。その際IP3受容体からカルシウムイオン(Ca2+)が放出され記憶や学習に必要な細胞過程を引き起こす。本研究ではこのIP3受容体のアロステリック変化がオートファジーの制御異常に関わることが示唆され、この成果は共著で総説に紹介された(Autophagy, 2016)。更にこれを認知症の予防法や創薬に役立てるにはアロステリック変化の詳細なメカニズムを理解する必要がある。昨年末クライオ電子顕微鏡で解析されたIP3受容体の四量体構造が報告されたが、機能的に重要な調節領域の分解能は低くCαモデルのみで、IP3による構造変化の知見は断片構造に限られており(全体の20%)、アロステリック変化のメカニズムは未解明である。本研究ではアロステリック変化の動作原理を解明するため、全体の80%を占める巨大な細胞質ドメインの負染色やクライオ電子顕微鏡、そしてX線結晶構造解析を行い解析可能なサンプル調製法を独自に開発し結晶化の初期条件を見出した。IP3受容体の動作原理は同じく小胞体Ca2+チャネルであるリアノジン受容体と共通であり、これまで細胞生物学的な手法により四量体サブユニット間の協同的相互作用を介したアロステリック変化の重要性を見出しその機能的な意義を明らかにした。本研究では物理化学的手法によりIP3受容体のアロステリック変化を分析可能な実験系の開発を目指す。バキュロウイルスを用いた昆虫細胞発現系により細胞質ドメインに変異を持つIP3受容体の様々な組み換え蛋白質を作成し大量発現・精製を行った。クライオ電子顕微鏡と負染色によるタンパク質の単粒子観察と動的光散乱測定により溶液中で単分散を示す細胞質ドメインを得た。初期スクリーニングによりこの細胞質ドメインの結晶化条件を見出した。並行してアロステリック変化に重要な部位を同定するため新しい機能解析法を企画し開発した。IP3受容体は小胞体の膜上に局在するタンパク質で、個体の発生や神経のシナプス可塑性を担う。

IP3受容体は四つ組み合わさって中心部にカルシウムイオン(Ca2+)を一つだけ通す小さなイオン透過口を形成しカルシウムチャネルとして働く。IP3受容体の遺伝子変異は、家族性脊髄小脳失調症やGillespie(ガレスピー)症候群の原因となり、認知症の主な原因である神経変性にも関与していることが知られている。そのため、IP3受容体の動作原理の解明はこれらの病気の治療薬の開発につながると期待されています。しかし、既知のリガンド作動型イオンチャネルに比べて、IP3受容体のIP3結合部位はチャネル部位から大きく離れているため、リガンドのIP3が物理的にどのようにチャネルを開けるのか不明であった。本研究では小胞体カルシウムチャネルのアロステリック制御異常が認知症の機能障害や毒性機序に関与するという新しい仮説について研究を行っている。IP3受容体のアロステリック変化がオートファジーの制御異常に関わることが示唆され、この成果は共著で総説に紹介された(Autophagy, 2016)。更にこれを認知症の予防法や創薬に役立てるにはアロステリック変化の詳細なメカニズムを理解する必要がある。本研究ではアロステリック変化の動作原理を解明するため、全体の80%を占める巨大な細胞質ドメインの負染色やクライオ電子顕微鏡、そしてX線結晶構造解析を行った(PNAS, 2017)。本研究課題の内容をまとめPNASに論文を発表することができた。認知症のメカニズムは未だ充分に理解されておらず新たな分子メカニズムの探索が必要である。本研究は小胞体カルシウムチャネルのアロステリック制御異常と脳機能低下の関連について研究し、認知症メカニズムに関する新たな手掛かり得ることを目的とする。小胞体の膜上に存在するアロステリックタンパク質であるIP3受容体はサブユニットが四つ組み合わさってカルシウムチャネルとして働き、個体発生やシナプス可塑性を担う。IP3受容体の遺伝子変異は、脊髄小脳失調症やGillespie症候群の原因となり、認知症の主な原因である神経変性にも関与し、IP3受容体の動作原理の解明はこれらの治療薬に役立つと考えられている。しかし、IP3受容体のIP3結合部位はチャネル部位から80オングストロームも離れておりIP3が物理的にどのようにチャネルを開けるのか謎であった。本研究により世界で初めて2217アミノ酸残基からなる巨大な細胞質ドメインのX線結晶構造解析に成功し原著論文及び総説に成果を発表した(PNAS, 2017)。この研究成果は二つの異なるゴードン会議で認められ口頭とポスター発表を行った(GRC,2017; GRC,2018)。更にX線結晶構造解析で示唆された「リーフレット」部位の変異体を作成し機能解析を行った(PNAS, 2017)。結果、IP3結合による構造変化は競争相手がNature誌に発表したクライオ電顕構造で示されたC末端ではなく、寧ろ巨大な調節・カップリング領域のグローバルな構造に反映されリーフレットが中心回転軸から外側に移動しチャネルを開口するゲート機構が明らかとなった(Messenger, 2017;実験医学,2018)。これらの成果は日刊工業新聞と科学新聞そして化学工業日報に掲載された。研究計画では5年間の実験結果をまとめ国際誌に発表する計画であった。