hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トレニアの花の放射対称化・大輪化・八重化による観賞性の改良とその分子機構の解明

「動く遺伝子」トランスポゾンの転移が活性化したトレニアの系統「雀斑(そばかす)」は、自家受粉によって生じた子孫に高確率で変異体を生じる。その中から、花の観賞性を向上させる変異として園芸用花き共通するもの、つまり、花が、1八重化、2大輪化、3放射相称に近い外観に変化した各種の変異体を得た。また、これらの変異体の原因遺伝子を特定し、変異の分子機構を明らかにした。さらに、これらの変異を交雑によって組合せ、八重、大輪、放射相称性を兼ね備えた花を咲かせる系統を育成した。本年度は、DNA型トランスポゾンTtf1の転移が活性化したトレニアの変異体「雀斑」の自殖後代に発生し、花の観賞性の改良にとって重要な変異である上下対称変異、全花弁着色変異、八重変異を増強する修飾変異を得るための自殖種子の採種を行った。また、交雑により、これら3つの変異のうち2つを組み合わせた系統の作製を目指した。その結果、F2世代で、2つの変異形質を併せ持つ個体、つまり、上下対称・全花弁着色個体、全花弁着色・八重個体、上下対称・八重個体を得ることができた。これらの個体では、花弁数、花冠の形態の相称性、花冠の着色パターンの相称性は独立に遺伝しており、変異形質の集積により、個々の形質の発現程度が変化することはなかった。現在、これらの個体を自殖し、形質の固定を確認中である。以上の成果は、来年度以降、これらの形質全てを増強し、集積するために必要なものである。以上の3つの変異形質のうち、八重変異の原因遺伝子が、クラスCホメオティック遺伝子TfFARINELLI (TfFAR)であることを解明した。つまり、八重変異体では、TfFARの第2イントロンにTtf1が挿入して発現量が著しく低下していた。このため、クラスAホメオティック遺伝子TfSQUAMOSAの発現領域がwhorl 3まで拡大して雄蕊が花弁に変換し、八重化していた。一方、全花弁着色変異、上下対称変異は、復帰変異花のS1分離集団を解析した結果、候補遺伝子をひとつに絞り込めなかったため、Ttf1の挿入パターンが異なる系統とのF2分離集団を作製することにより、候補遺伝子の同定を目指している。なお、全花弁着色変異は、向軸側花弁において、アントシアニン生合成を制御する転写因子であるTfMYB1の発現が誘導されることによって着色することを明らかにした。本年度は、DNA型トランスポゾンTtf1の転移が活性化したトレニアの変異体「雀斑」の自殖後代に発生し、花の観賞性の改良にとって重要な変異である上下対称変異、全花弁着色変異、八重変異との組み合わせによって観賞性を向上させる変異を得るため、これらの変異体の自殖第一代を栽培し、変異体のスクリーニングを行った。その結果、着色の放射相称化に影響を及ぼす変異体として、向軸側花弁がより濃い紫色に着色し、着色の放射相称化程度が高まった変異体、ならびに、着色の放射相称化を妨げるブロッチが形成されない変異体、ブロッチが淡色化する変異体を新たに得ることができた。また、交雑により、上下対称変異、全花弁着色変異、八重変異を組み合わせた系統の作製を目指した。その結果、昨年度までに、F2世代で、2つの変異形質を併せ持つ個体、つまり、上下対称・全花弁着色個体、全花弁着色・八重個体、上下対称・八重個体を得た。今年度は、これらの個体をさらに交雑し、これら3つの形質を全て集積した個体を得ることができた。現在、これらの個体の自殖後代における形質の固定を確認中である。以上の3つの変異形質のうち、上下対称変異体では、TCP転写因子遺伝子のCYCLOIDEAが、正常型では発現の認められない背軸側花弁で発現し、さらに、TfRADIALIS、TfDIVARICATAの発現部位を変化させることにより、背軸側花弁が向軸側花弁に転換することが明らかとなった。一方で、上下対称変異体および全花弁着色変異体について、原因遺伝子同定のため、Ttf1の挿入パターンが異なる系統とのF2分離集団を作製した。昨年度までに、DNA型トランスポゾンTtf1の転移が活性化したトレニアの変異体「雀斑」の自殖第一代、ならびに、上下対称変異、全花弁着色変異、八重変異の自殖第一代から得られた新たな変異体、つまり、向軸側花弁がより濃い紫色に着色し、着色の放射相称化程度が高まった変異体、ならびに、着色の放射相称化を妨げるブロッチが形成されない変異体、ブロッチが淡色化する変異体が得られたが、今年度は、これらの変異体から原因遺伝子を単離するため、自殖第一代、ならびに、他系統との交雑による自殖第2代の分離集団を育成した他、ブロッチが形成されない変異体、ブロッチが淡色化する変異体では、ブロッチのカロテノイド含量が低下していることを明らかにした。また、昨年度までに、交雑により、上下対称変異、全花弁着色変異、八重変異の3つの形質を全て集積した個体を得ることができた。本年度は、このような形質を持つ個体をさらに複数得ることができた他、これらの個体の自殖第一代ならびにさし芽増殖個体を得ることにより、形質が安定していて固定されていることを確認した。以上の3つの変異形質のうち、昨年度までに原因遺伝子単離のための分離集団を育成した全花弁着色変異体では、向軸側花弁における着色を制御する遺伝子TfMYB1の発現が高まっていることが明らかとなった。

また、トランスポゾンディスプレイ解析の結果により、Ttf1がMYB転写因子遺伝子のTfRADIALISに挿入していることが明らかになった。これにより、TfRADIALISの発現が低下し、向軸側花弁が側方花弁に変換して着色することが明らかとなった。研究は、概ね順調に進展していると考えられる。しかし、変異の原因遺伝子の同定が、当初予定していた変異体の自殖第一代でうまくいかない場合もあった。また、昨年度、想定外の結果として、向軸側花弁が他の花弁と同程度に濃く着色し、着色の放射相称性が高まった変異体、着色の放射相称化の妨げとなるブロッチが消失した変異体、ならびに、ブロッチが淡色化した変異体を得ることができた。このため、本年度は、原因遺伝子同定のための分離集団の育成に重点を置いた実施状況となった。この観点からは、分離集団の育成が順調に進んだので、本年度の計画は概ね達成できたと考えられる。また、上下対称変異、全花弁着色変異、八重変異の3つの形質を全て組み合わせた個体が昨年度に得られたが、本年度さらに複数の個体を得、これらの個体を自殖して形質の安定が確認できたので、この面でも、ほぼ予定通りに進捗したと考えられる。上下対称変異、全花弁着色変異、八重変異の原因遺伝子の解明に関しては、これまでに、八重変異の原因遺伝子が、クラスC花器官ホメオティック遺伝子であるTfFARであること、ならびにその形質発現機構を明らかにすることができた。また、全花弁着色変異体の原因遺伝子がTfRADIALISであることを明らかにできたため、概ね計画を達成したと考えられる。昨年度までに、DNA型トランスポゾンTtf1の転移が活性化したトレニア「雀斑」、ならびに花形の変化した各種変異体の自殖後代から新たに得られた変異体、つまり、向軸側花弁がより濃い紫色に着色し、着色の放射相称化程度が高まった変異体、ならびに、着色の放射相称化を妨げるブロッチが形成されない変異体、ブロッチが淡色化する変異体について、自殖後代を得た。本年度は、この自殖後代を用いてトランスポゾンディスプレイ解析を行った。その結果、向軸側花弁が濃紫色に着色する変異体ではTfRADIALIS1(TfRAD1)にTtf1が挿入して発現が著しく低下し、向軸側花弁が側方または背軸側花弁に変換した結果、濃紫色に着色することが明らかとなった。なお、本研究計画の当初から得られていた、向軸側花弁がやや薄い紫色に着色する変異体においても、同様にTfRAD1にTtf1が挿入しているが、なぜ着色程度に差が生じるかについては調査中である。また、ブロッチが形成されない変異体では、TfCYCLOIDEA2(TfCYC2)にTtf1が挿入し、正常型では向軸側花弁を中心に発現するTfCYC2が背軸側花弁でも発現するようになった結果、背軸側花弁のアイデンティティーが失われてブロッチが形成されなくなることが明らかとなった。以上の遺伝子は、いずれも花の相称性の決定に関与する遺伝子であった。一方、ブロッチが淡色化する変異体では、今回用いた方法で原因遺伝子は同定できなかったものの、ブロッチ形成部において、カロテノイド生合成酵素遺伝子であるBHY(β-carotene 3,3'-hydroxylase遺伝子)の発現が正常型と比較して著しく低いことが明らかとなった。さらに、今年度は、「雀斑」自殖第一代のスクリーニングを引き続き行い、背軸側花弁が側方花弁に変換する変異体、ならびに花弁数が増加する変異体などを得た。「動く遺伝子」
ブリ類の初回成熟年齢を決定する遺伝要因とその機構の解明

1)ブリ類における血中の2種生殖腺刺激ホルモン(FSHおよびLH)測定系の開発カンパチの血中FSHおよびLH測定のための酵素免疫測定法(ELISA)に用いる、リコンビナントFSHおよびLHと、両GtHに特異的な抗体を作製した。ヒト腎臓293細胞に、カンパチFSHβまたはLHβにカンパチGPαを連結した組換えカンパチFSHまたはLHを発現させ、精製した。同様に、カンパチFSHβまたはLHβにウサギGPαを連結した、組換えキメラFSHまたはLHを発現させて精製し、これらのキメラGtHをそれぞれ家兎に免疫して抗血清を得た。IgG精製後、直接吸着法によるELISAにより、いずれのIgGもカンパチFSHまたはLHの検出に有効であった。本研究により、ブリ類の2種GtHの測定が可能となった。2)ブリ類の早熟マーカーの探索1魚体採集: 1歳の野生カンパチ個体を採捕し、約2年間飼育して初回成熟(3歳)に達した最初の産卵期(6月)に、卵巣組織の一部採取を実施し、卵径により性成熟の有無(初回成熟したか否か)を判定した。同時に、鰭の一部を採取した。2DNA抽出: 1で採集した全個体の鰭組織より、それぞれDNAを抽出し、凍結保存した。3メラノコルチン4型受容体(MC4R)の多型解析:カンパチのMC4Rの塩基配列を決定し、遺伝子多型を解析した。まず、カンパチMC4Rの全塩基配列を決定した。得られた塩基配列をもとに、カンパチMC4R特異的なプライマーを設計し、2で得た各個体のDNA試料を鋳型としてダイレクトシークエンスを行った。結果、多くの個体で変異が見られたが、ほとんどはアミノ酸置換を伴わなかった(サイレント変異)。またヘテロ接合型のミスセンス変異が3個体で生じていたが、成熟の有無との関連は見られなかった。(抄録なし)1)ブリ類における血中の2種生殖腺刺激ホルモン(FSHおよびLH)測定系の開発カンパチの血中FSHおよびLH測定のための酵素免疫測定法(ELISA)に用いる、リコンビナントFSHおよびLHと、両GtHに特異的な抗体を作製した。(抄録なし)
統合失調症に関わるニコチン受容体の遺伝子多型と機能異常の解析

1.統合失調症の発症にα7ニコチン受容体遺伝子CHRNA7の変異が関与するかどうかを明らかにするため、日本人統合失調症患者100名および健常者100名を対象に、一塩基多型の解析を行った。群間でアレル頻度に有意差のある多型は認められなかったが、統合失調症患者のみに新規のミスセンス変異(G423S:423番目のグリシンをセリンに置換させる変異)を見出した。その変異受容体を人工的にアフリカツメガエル卵母細胞に発現させ、機能変化を検討した結果、プロテインキナーゼC(PKC)活性化剤存在下でα7アゴニスト刺激を行うと変異受容体は特異的にリン酸化され、しかもその活性は異常に低下することを明らかにした。したがって、G423S変異に伴い、α7ニコチン受容体の脱感作がPKCを介して促進されると結論できた。2.機能の未知なヒトα7ニコチン受容体重複遺伝子CHRFAM7AのcDNAをクローニングし、発現および機能を解析した結果、培養細胞においてタンパクに翻訳され、α7ニコチン受容体と結合することにより、α7ニコチン受容体の活性を抑制することを明らかにした。3.統合失調症の治療および研究に有用な新規α7ニコチン受容体作用薬を開発するため、アフリカツメガエル卵母細胞にニコチン受容体の各サブタイプを発現させ、毒ガエルおよびホヤアルカロイドの薬効を解析し、α7受容体の選択的遮断薬としてアルカロイド205Bを見出した。4.α7ニコチン受容体刺激による遺伝子およびタンパク発現の変化を解析した結果、視床下部神経細胞における性腺刺激ホルモン放出ホルモンの発現や血管平滑筋細胞におけるα7ニコチン受容体数が増加することを明らかにした。以上のように、ヒトα7ニコチン受容体の機能低下を引き起こす遺伝子変異および重複遺伝子産物の存在を明らかにし、これらの異常が中枢神経疾患の発症を引き起こす可能性を示した。1.統合失調症の発症にα7ニコチン受容体系の異常が関与するかどうかを明らかにするため、同意を得た日本人統合失調症患者70名、健常者100名を対象に、α7ニコチン受容体遺伝子(CHRNA7)における一塩基多型(SNPs)の解析を行った。群間でアレル頻度に有意差のあるSNPsは認められなかったが、統合失調症患者のみに認められる変異として、exon10に新規のSNP11(EX10+277G→A)を見出した。2.SNP11はα7ニコチン受容体の423番目(細胞質側)のアミノ酸をグリシンからセリンへ置換させる変異であり、この変異受容体を人工的にアフリカツメガエル卵母細胞に発現させ、薬理学的特性を電気生理学的に検討した結果、プロテインキナーゼC(PKC)活性化剤phorbol-12-myristate-13-acetateが、変異受容体の活性を選択的に抑制することを明らかにした。このことから、SNP11によるアミノ酸置換に伴い、PKCを介する受容体の脱感作が促進され、統合失調症におけるα7ニコチン受容体の機能低下の一因となる可能性が示唆された。3.統合失調症の治療(および研究)に有用な新規α7ニコチン受容体作用薬を開発するため、アフリカツメガエル卵母細胞-遺伝子発現系を用いて、毒ガエルおよびホヤアルカロイドの薬効を解析し、α7受容体の選択的遮断薬としてアルカロイド205Bを見出した。4.培養ラット大脳皮質神経細胞において、脳由来神経栄養因子

BDNFの発現が電気刺激により増加するが、細胞内CaストアのCa遊離阻害剤dantrolene存在下ではその効果が消失することを見出し、神経活動度に依存した遺伝子発現調節機構にCaストアが関与することを明らかにした。1.日本人統合失調症患者(104名中1名)に見出したα7ニコチン受容体遺伝子CHRNA7のミスセンス変異が受容体の機能に及ぼす影響を明らかにするため、その変異受容体(423番目のグリシンをセリンに置換した受容体:G423S)をアフリカツメガエル卵母細胞に発現させ、薬理学的特性を電気生理学的に検討した。プロテインキナーゼC(PKC)活性化剤phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)存在下でアセチルコリンの高頻度刺激を行った結果、変異受容体においてのみ、脱感作の亢進が認められた。この現象はPKC阻害剤calphostin Cの前処置により消失した。さらに、PMA処置後にα7受容体のセリンリン酸化をWestern blot法で検出した結果、変異受容体においてのみ、リン酸化レベルの増大が認められた。このように、G423S変異受容体のPKCによるリン酸化は受容体の脱感作を引き起こし、統合失調症におけるα7ニコチン受容体の機能低下の一因となる可能性が示された。2.ヒト小脳cDNAライブラリーから、機能の未知なα7ニコチン受容体の重複遺伝子CHRFAM7AのcDNAをクローニングして発現ベクターに組み込み、COS細胞、ヒト神経芽腫細胞SH-SY5Yおよびツメガエル卵母細胞に導入した結果、タンパクに翻訳されることをWestern blot法で明らかにした。3.培養ラット大脳皮質神経細胞を電気刺激し、活動依存的な遺伝子発現機構を検討した結果、シナプスの可塑性に関わる脳由来神経栄養因子BDNFのmRNA発現がPI3キナーゼおよびMAPキナーゼを介して誘導されることを明らかにした。また、不死化視床下部神経細胞をニコチン刺激すると、視床下部ホルモンGnRHの遺伝子発現が誘導され、その機構にはα7ニコチン受容体が関与していることが示された。統合失調症患者に見出した変異型α7ニコチン受容体(423番目のGlyがSerに変異した受容体:G423S)の脱感作特性の変化を解明するため、アフリカツメガエル卵母細胞にα7-G423S受容体を発現させ、アセチルコリン誘発電流を解析した。その結果、プロテインキナーゼC(PKC)活性化剤存在下でα7アゴニストのコリンを持続的に投与すると、正常型α7ニコチン受容体に比し、変異型受容体では脱感作が亢進することを明らかにした。従って、G423S変異に伴いPKCによるリン酸化を受けると、脱感作が亢進し、脳機能障害の一因になると結論できた。一方、機能が未知のヒトα7ニコチン受容体重複遺伝子産物(dup-α7)をα7ニコチン受容体と共に卵母細胞およびヒト神経芽腫細胞SH-SY5Yに強発現させたところ、タンパク質複合体として免疫共沈降された。しかもdup-α7発現時には、α7ニコチン受容体の活性が有意に抑制された。従って、統合失調症などの神経疾患におけるα7ニコチン受容体の活性低下にdup-α7受容体が関与する可能性が考えられた。また神経細胞においては、α7ニコチン受容体を長時間アゴニストで刺激すると、脱感作だけでなく受容体数の増加が認められるが、同様の増加が非神経細胞の血管平滑筋細胞においても生じることを初めて実証した。
共振器ポラリトンによる量子ドット系の振動子強度制御とプローブ

応用物理学会中四国支部会に出席すると共に、先端物質科学研究質量子光学物性研究室を訪問し、発光素子・共振器およびTHz光、局在プラズモン等に関する最新の情報を収集した。THz光の発生に際するフェムト秒パルス波と半導体との相互作用では、物質中の電子の極短時間の状態変化が重要となると考えられ、その振る舞いの解析は光情報処理を高周波数で実現するために重要な役割を果たすと考えられ、その成果の高速動作や情報通信への応用が期待される。また、局在プラズモン共鳴を用いた光波に対する八木宇田アンテナの実現は、その指向性を利用することで光波を共振器へ効率的に導入する際に役立つと考えられる。更に、近接場光の発生を利用して微細構造との強共鳴状態を実現することで、特定の量子ドットとの相互作用を選別的に実現したり、その相互作用の強度を制御するなどの手段に応用することが期待できる。局在プラズモン共鳴を介した電磁波と微細構造中の電子の相互作用は強い非線形的増強特性を示すため、量子ドット系の集団的性質を引き出すのに有利であると考えられる。このため、共振器構造に金属ナノパターンを埋め込んだ構造の提案、およびプラズモンとポラリトンの共通性質などの理論的解析が期待される。量子ドット系の振動子強度の制御の実現には至らなかったが、今後量子ドット系における粒子の集団的性質を引き出すのに有利な構造に対する、一定の知見を得ることができた。本年度はまず、分子線エピタキシー(MBE)法を用いて自己形成InAlAs量子ドットとGaAs量子井戸が隣接する構造をAlGaAs半導体中に作製した。これを加工することにより、量子ドット中の電子のエネルギー状態を、導波路中を伝搬させる光との微弱な結合を用いて検出する構造を実現した。次に、この構造による発光・吸収スペクトルを測定するために、光学測定系の作製を行った。量子井戸、量子ドット中のエネルギー準位の尖鋭化のために、試料を液体窒素温度まで冷却するため、試料周りの外気を遮断する真空冷却装置を作製した。これにより、液体窒素温度における構造からの安定した発光スペクトルの観測が可能となった。また、自己形成的に成長されたInAlAs量子ドットの粒径を判断するため、量子ドット中に励起された電子-正孔対のエネルギー準位に対するサイズ依存性を数値計算により計算した。この結果により、試料断面をAFMなどの大掛かりな装置を用いて観察することなく、光学スペクトルを測定することにより非破壊でドットサイズや密度を算出することが可能となる。逆に、指定波長の光と選択的に相互作用を引き起こす量子ドットのサイズを算出することも可能となるため、構造設計のための重要な足がかりとなる。本年度作製された光導波路-量子ドット結合構造を光共振器構造中に作製することで、量子ドット中の電子と光との相互作用強度を変化させ、これにより光による信号制御を可能にする演算素子への応用に繋げていく予定である。本年度は、昨年度作製した光学測定系を用い、量子井戸光導波路-ドット結合構造を有する試料の測定を行った。この結果、光導波路中の伝搬光において、量子ドットの共鳴波長におよそ0.5%の透過率の減少が見られた。このことは光導波路中の伝搬光について、量子ドットのエネルギー準位に対応する波長の透過率を調べることにより、量子ドット内の電子状態に関する振動子強度を読み出すことができることを示している。しかしながら量子ドットの影響による透過率の減少が0.5%と非常に小さく、これは量子井戸による影響よりも小さく、理論的予測に反する。このような結果になった要因として、導波路のクラッド層の厚さと(コア層との)屈折率差が不十分であったことが考えられる。より明確な透過率の減少を測定することが今後の課題である。また、分子線エピタキシー(MBE)法を用いてAIAs層とA10. 4Ga0.6As層を交互に積そうしたDBR共振器を作製し、その反射率の波長および入射角度依存性を測定する装置を作製した。これらを用いて77KにおけるDBR共振器の反射率測定を行い、共振波長付近における高い反射率と、共振波長における反射率の減少を得た。また、同様の構造をモデル化し、FDTD法に基いた電磁波伝搬シミュレーションを実現するプログラムを作製し、入射光の波長および入射角度による反射率の変化を計算した。計算結果と実際の試料の測定結果の間によい一致が見られた。

局在プラズモン共鳴を介した電磁波と微細構造中の電子の相互作用は強い非線形的増強特性を示すため、量子ドット系の集団的性質を引き出すのに有利であると考えられる。このため、共振器構造に金属ナノパターンを埋め込んだ構造の提案、およびプラズモンとポラリトンの共通性質などの理論的解析が期待される。量子ドット系の振動子強度の制御の実現には至らなかったが、今後量子ドット系における粒子の集団的性質を引き出すのに有利な構造に対する、一定の知見を得ることができた。
生体成分を組織化吸着するポリマ-の合成と細胞機能制御に関する研究

生体膜のようにリン脂質分子が組織化した構造を形成している表面では極めて良好な血液適合性が発現している。人工的にこのような表面を実現すると優れた血液適合性高分子材料が得られる。本研究では、リン脂質に対して親和性を有する2ーメタリクロイルオキシエチルホスホリルコン(MPC)共重合体の表面が優れた血液適合性を示す機構を明らかにするために、リン脂質分子を吸着させた高分子表面に対する血小板の粘着挙動をミクロスフィア-カラム法により検討した。MPC共重合体を被覆した場合には血小板流出率が高い値となり、特にMPCモル組成32%の重合体では全く血小板の粘着は認められなかった。MPC共重合体表面をリン脂質リポソ-ムで予め処理することにより、粘着した血小板の活性化が抑制されることがわかった。特にリン脂質極性基を有する高分子表面では血小貼粘着も効果的抑制した。高分子表面に吸着したリン脂質分子の配向性をX線光電子分光計及び示差走査熱量計により調べた結果、リン脂質極性基を有する高分子表面では、リン脂質分子が組織化吸着し、極性基が集合した表面となっていることがわかった。このことより、リン脂質極性基を有する高分子が血液と接触した場合、表面に生体由来のリン脂質分子の組織化吸着層が形成され、生体膜類似構造が構築されるため優れた血液適合性が発現すると結論した。
ハンセン病療養所入所者の口腔管理および摂食・嚥下リハビリテーションシステムの確立

【研究目的】当園の入所者の平均年齢は約81.5歳と高齢である。そのほとんどが手指や眼の障害,顔面神経麻痺や知覚障害等のハンセン病後遺症を有しているため,通常の高齢者と比べて口腔衛生や喫食の自立が難しく,また,誤嚥のリスクが高い。本申請研究では,当園の入所者の口腔状態と摂食・嚥下機能の現状を把握・分析し,その評価に応じて口腔ケアと摂食・嚥下リハビリテーションをシステマティックに実施して評価し,それによって,ハンセン病療養所における入所者の口腔管理および摂食・嚥下リハビリテーションシステムを確立することを目的とした。【研究方法】摂食・嚥下障害対策委員会を組織し,委員の協力を得て口腔管理状態を調べ,摂食・嚥下に関しては全入所者にアンケート調査を実施した。その結果を分析し,個々の状態に応じた管理を検討するとともに,摂食・嚥下障害のリスクのある者を抽出して,摂食機能に関するアセスメント:口腔機能のテスト(口唇閉鎖,舌運動,頬膨らましの可否,発音機能検査(パ・タ・カ)等)およびスクリーニングテスト(反復唾液嚥下テスト,改訂水飲みテスト,フードテスト,頸部聴診,摂食・嚥下状態)を実施した。その結果に基づいて,個々に応じた摂食・嚥下訓練や食支援を行ってその評価を行った。【研究成果】口腔衛生管理に関しては,定期的な歯科診療室における歯科治療や専門的口腔ケアとともに,各部署における看護師や介護員による日常的口腔ケアを実施するシステムを確立した。また,個々の口腔状態に応じて,病棟,老人センター,不自由者棟には,週1度の歯科医師と歯科衛生士による往診システムを併せて実施している。ただ,口腔衛生管理について現状を調査して評価したところ,歯科を中心とした医療スタッフ数に対して全介助や一部介助を必要とする入所者が多く,口腔ケアをより能率的・効率的に行い,口腔管理システムをさらに整備する必要があることがわかった。摂食・嚥下管理に関しては,入所者全員に対するアンケート調査を分析して,そのうち誤嚥リスクの高い33名についてスクリーニングテストを実施した結果,口唇閉鎖できない人や分割嚥下を行っている人が多いことがわかった。さらに,嚥下造影検査も一部に実施したところ,誤嚥のリスクが高い入所者には,食形態の工夫,摂食方法の指導,喫食支援が必要であり,専門的スタッフによる定期的な回診が不可欠であることがわかった。
腎疾患に対する抗接着分子療法の臨床応用に関する基礎的検討-硫酸化オリゴ糖の抗セレクチン剤としての有用性-

本研究では、糸球体腎炎の新しい治療法として抗接着分子療法を開発することを目的して、セレクチン阻害薬の腎炎抑制効果を基礎的に検討した。最初に、セレクチン阻害薬として硫酸化ヒアルロン酸(SHA)を用いた。モデルとしてWKYラットに抗糸球体基底膜抗体を投与して作成される半月体形成性糸球体腎炎モデルとThy.1抗体を投与することによるメサンギウム増殖性糸球体腎炎モデルを用いた。まず、抗P-セレクチン抗体と抗L-セレクチン抗体を用いた阻害実験を行い、腎組織へのマクロファージの浸潤にP-セレクチンが関与していることを明らかにするとともに、in vitroにおける検討により、SHAがセレクチン阻害活性をもつことを確認した。次に、両モデルにSHAを投与して腎炎抑制効果を検討した。両モデルにおいて、SHAの投与により蛋白尿減少効果と組織学的に半月体形成の減少が認められた。さらに、SHAと同じく硫酸化オリゴ糖の一種である硫酸化コロミン酸(SCA)の半月体形成性糸球体腎炎ラットに投与したところ、SHAよりもさらに強い腎炎抑制効果が確認された。これらの結果から、セレクチン阻害活性をもつ硫酸化オリゴ糖は、糸球体腎炎の治療薬として臨床応用できる可能性があると考えられる。また、マクロファージから産生される組織傷害因子であるNOを阻害する化合物である選択的iNOS阻害薬が、半月体形成性糸球体腎炎に対して治療効果を示すことが明らかとなり、硫酸化オリゴ糖とともに新しい腎炎治療薬として有望な薬剤であると考えられた。糸球体腎炎の新しい治療法として抗接着分子療法を開発するために、セレクチン阻害薬の腎炎抑制効果を基礎的に検討した。セレクチン阻害薬として硫酸化ヒアルロン酸(SHA)を用いた。モデルとしてWKYラットに抗糸球体基底膜抗体を投与することによる半月体形成性糸球体腎炎モデルとThy1抗体を投与することによるメサンギウム増殖性糸球体腎炎モデルを用いた。まず、基礎的検討として、両モデルにおける抗P-セレクチン抗体、抗L-セレクチン抗体の腎炎抑制効果を検討したところ抗P-セレクチン抗体によって腎組織へのマクロファージ浸潤の抑制効果と蛋白尿減少効果が認められ、腎組織へのマクロファージの浸潤にP-セレクチンが関与していることが明らかになった。SHAのP-及びL-セレクチンのリガンドに対する結合に対する阻害効果をin vitroで検討したところ、SHAが両者を阻害することが明らかになった。そこで、両モデルラットにSHAを投与して腎炎抑制効果を検討した。その結果、両モデルにおいて、SHAの投与により蛋白尿の減少効果が認められ、さらに組織学的に、腎組織へのマクロファージの浸潤の減少と半月体形成の減少が認められた。以上の結果から、糸球体腎炎の進展にマクロファージの浸潤が重要な役割を果たしていること、糸球体へのマクロファージの浸潤にP-セレクチンが関与していること、硫酸化ヒアルロン酸がP-セレクチンの結合を阻害することによって腎組織へのマクロファージの浸潤を抑制して糸球体腎炎の進展を抑制する効果を示すことが明らかになった。今後、投与経路や副作用に関する検討を行う予定であるが、SHAは糸球体腎炎の治療薬として有用であると考えられる。モデルとしてWKYラットに抗糸球体基底膜抗体を投与することによる半月体形成性糸球体腎炎モデルとThy.1抗体を投与することによるメサンギウム増殖性糸球体腎炎モデルを用いた。基礎的検討として、両モデルにおける抗P-セレクチン抗体、抗L-セレクチン抗体の腎炎抑制効果を検討したところ抗P-セレクチン抗体によって腎組織へのマクロファージ浸潤の抑制効果と蛋白尿減少効果が認められ、腎組織へのマクロファージの浸潤にP-セレクチンが関与していることが明らかになった。

SHAのP-及びL-セレクチンのリガンドに対する結合に対する阻害効果をin vitroで検討したところ、SHAが両者を阻害することが明らかになった。そこで、両モデルラットにSHAを投与して腎炎抑制効果を検討した。その結果、両モデルにおいて、SHAの投与により蛋白尿の減少効果が認められ、さらに組織学的に、腎組織へのマクロファージの浸潤の減少と半月体形成の減少が認められた。さらに、硫酸化オリゴ糖のひとつである硫酸化コロミン酸(SCA)を半月体形成性糸球体腎炎ラットに投与したところ、SHAよりも高い腎炎抑制効果を示すことが明らかとなった。以上の結果から、糸球体腎炎の進展にマクロファージの浸潤が重要な役割を果たしていること、糸球体へのマクロファージの浸潤にP-セレクチンが関与していること、SHAおよびSCAがP-セレクチンの結合を阻害することによって腎組織へのマクロファージの浸潤を抑制して糸球体腎炎の進展を抑制する効果を示すことが明らかになった。硫酸化オリゴ糖はセレクチン阻害薬として糸球体腎炎の治療に応用できる可能性がある。
分子進化学的解析システムを用いた水稲根圏窒素固定の分子生態学的研究

水田は畑と比べ地力維持能が著しく高いが、生物窒素固定はその主要要因と推定されている。本研究は水稲根に共生している窒素固定菌群の遺伝的多様性を窒素固定遺伝子の配列解析から解析することを目的としている。nifDおよびnifHの配列データをDNAデータベースから抽出し多重アラインメントを行った。得られたアラインメントデータから保存領域を検索しPCRプライマーのデザイン、作製を行った。次に九州大学農学部付属農場で栽培した水稲根を採取し蒸留水で洗浄した。根をホモジナイズした後、DNAを抽出した。抽出したDNAには植物DNAの他に根の表面や内部に生息している微生物のDNAが混合しているものと考えられる。この混在DNAからPCRを用いて窒素固定菌群のみが有するnifD, nifH遺伝子断片を増幅した。得られた増幅DNA断片をpT7BlueTvectorにつなぎ大腸菌に形質転換することによって窒素固定遺伝子ライブラリーを作成した。ライブラリーから無作為にクローン群を選択し、両鎖から遺伝子構造を決定した。ODENおよびMEGAを用いて得られた遺伝情報を分子進化学的に解析した。その結果、水稲根には主にα-プロテオバクテリア、γ-プロテオバクテリアに属する多様な窒素固定菌群が生息していることが明らかとなった。今後、コロニーハイブリダイゼーション法を用いて、これらの窒素固定菌を分離培養する必要性が考えられる。
超音波ケフレンシ解析による複合材料の構造評価

強靭性・軽量性を生かして航空機、宇宙機器などの先端技術産業を始め、非常に多くの分野で用いられているCFRP(炭素繊維強化プラスチック)の構造評価にパワースペクトルをフーリエ変換したケフレンシー領域での解析を応用し、高分解能化が可能でることが分かった。詳細には、以下の通りである。右図上段にCFRP試料(テフロンシートは疑似層間剥離である)と超音波トランスデューサの配置と超音波パルスの反射の様子を、同図中段には反射波の波形(時系列データ)を、同図下段にケフレンシ解析でも最も単純な自己相関を示した。中段では、CFRP底面とテフロンシート表面からの反射が両方観測され、その振幅は同じ程度であった。下段の自己相関では、あるケフレンシーで特徴的ピークを示している。中央の2つのピークは「CFRP試料の底面とテフロンシート上の表面」と「CFRP試料の底面とテフロンシートの下の表面」の間隔に対応しており、音速を考慮してテフロンシートの位置および厚さを計算することが出来る。更に自己相関の2次元イメージングを行って、ある深さに対応する欠陥像を複数得ることにより、3次元的構造評価が可能であった。また、パワースペクトルを測定系の特性関数で規格化することによって、より高いS/N比および高精度のデータを得ることができることも判明した。
表皮細胞の抗張力反応の解析

皮膚損傷時や皮膚欠損縫縮時、損傷部位の離開を防ぐ結果として必ず瘢痕が生じる。このメカニズムを解明すべく、骨延長術のデバイスをマウス背部に装着しマウス皮膚持続的張力負荷モデルを用いた検討をおこなった。その結果これまでは真皮細胞だけでなく表皮細胞にも抗張力反応を示すことが明らかとなった。真皮細胞は進展収縮に並行して配列するが、表皮細胞の場合には進展収縮の方向と垂直に配列した。こうした細胞ではSMAの発現が認められた。そしてPlatelet-Derived Growth FactorがSMA発現を予防し、さらには瘢痕をおさせる因子の一つであることが示唆された。これまでマウス皮膚持続的張力負荷モデルをもちいた検討を行っていたが、培養したマウス線維芽細胞をin vitroにて一定方向へ伸展刺激を加える検討を行った。結果、細胞は伸展収縮の方向と垂直方向に配列した。また遺伝子発現の検討を行ったところ、同様にsmooth muscle actin(SMA)の発現を認め、in vivoと同様の結果を示した。しかしながらkeratin5陰性の終末分化に近い表皮細胞において同様の検討を行ったところ、SMAの発現をin vivoほどではないにしても認めらた。すなわち、in vivoの表皮細胞にて発現していたSMAは伸展刺激により表皮細胞が独自に発現するだけでなく、なんらかのシグナル伝達においても発現が促進されている可能性が示唆された。これまでケロイド・肥厚性瘢痕においては線維芽細胞に着目された研究がメインであったが、表皮細胞からもSMAが発現することから同部にも着目した検討が新たに必要であることが示唆された。そこで、血管内皮前駆細胞において張力によるSMA発現を抑制するPDGF受容体キナーゼ阻害剤であるAG1296をin vitroにおいて用いて、伸展刺激を加える検討を行った。その結果、表皮細胞、線維芽細胞いずれにおいても、伸展収縮の方向と垂直方向に配列するものの、SMAの発現は抑えられる形となり、コラーゲンI型の発現量も低下する形となった。これは線維化が抑制され、scarless wound healingへの糸口と期待される。当初の予定通り、in vitroの実験により、経時的に表皮細胞の挙動を観察し、PDGF受容体キナーゼ阻害剤であるAG1296によりSMA発現を阻害したときの表皮構造につき詳細に観察し、その意義について検討した。培養したマウス線維芽細胞をin vitroにて一定方向へ進展刺激を加える検討を行った結果、細胞は進展収縮の方向と垂直方向に配列した。また遺伝子発現において、smooth muscle actio(SMA)の発現を認め、in vivoと同様の結果を示した。そこで、SMA発現を抑制するPlatelet-Derived Growth Factor(PDGF)受容体阻害剤であるAG1296をin vitroで用いて、進展刺激を加える検討を行った。その結果、表皮細胞、線維芽細胞いずれにおいても、進展収縮の方向と垂直方向に配列するものの、SMAの発現は抑えられる形となり、コラーゲンI型の発現量も低下する形となった。PDGFRにはαとβの2つが存在するが、このAG1296はそのいずれもを阻害してしまう。そこで、どちらがより関与していることを調べるためにPDGFRa lox/loxマウスならびにPDGFRb lox/loxマウスとKeratin 5-Creマウスとの交配により表皮細胞特異的にPDGFR遺伝子を欠損させたマウスを作製して背部の創傷を作成し進展刺激を加えた。結果、PDGFRa欠損においてはSMAの発現が抑えられなかったのに対して、PDGFRb欠損においてはSMAの発現を抑えることができた。請者の研究グループの所有する表皮細胞特異的CreマウスであるKeratin5-Creマウス、またはKeratin14-CreERT2マウスとの交配により表皮細胞特異的ノックアウトマウスを作成し、皮膚持続的張力負荷時の表皮における該当遺伝子の機能をより特異的に解析する。形成外科マウスを用いたin vivoではなく、in vitroによる実験であったため、マウス購入、飼育費が削減できたため表皮細胞特異的ノックアウトマウスを用いた検討を行うため、その飼育費等に充当する。
バイオディーゼル燃料製造における副生グリセリンの革新的分離技術開発

活性炭あるいは活性炭に親水性コーティング剤で表面処理を施した粒子を分離促進剤としてエステル交換反応混合物に投入することにより、グリセリンが選択的に泡沫状となって瞬間的に液面に浮上するという新しい知見を得た。液面に泡沫として浮上したグリセリンは、泡沫分離法により反応混合物液相から分離することが可能なことから、エネルギー投入を伴わない安価な分離技術とすることが期待できる結果を得た。バイオディーゼル燃料(BDF)中に混在する副生グリセリン(GL)を、化学的特性の違いを利用し、可能な限りエネルギーを使わず分離し、短時間でBDFの主成分である脂肪酸メチルエステル(FAME)を精製する技術開発を行った。24年度は、GLとFAMEの化学的特性の違いである分子内-OH基数の相違に基づく親水性の差を利用して、多孔性材料(活性炭)に親水性物質をコーティングし、エステル反応混合物の分離容器に導入し、親水性表面上でGLの凝集を促すことにより、GLの相分離をより効率的に促進する技法の探索と分離条件の検討を行った。検討の結果、投入した活性炭が内包する気体により、細孔内に入り込んだBDF中のGLが泡沫状となって瞬間的に水面に浮上するという新しい知見を得た。さらに、活性炭をチタン系、メチルシリケート系超親水コーティング剤に含浸させ表面処理すると、この泡沫状のGL量が増加する傾向が見られた。この新技法は、泡沫の重量分析及び、Cadenza CD-C18カラム、アセトンーアセトニトリル(7:3)混合液を移動相としたHPLCシステムにより評価することにも成功した。また、親水性コーティングした活性炭はグリセリンと親和性のある溶媒で洗浄すれば再利用できると推察されることから、エステル交換反応で使用するメタノールで洗浄、乾燥させれば再利用できると考えられる。同様に、超親水性被膜材料によるコーティングも容易である。また、泡沫状で水面に浮上すれば、浮上分離あるいは泡沫分離法で容易にGLをBDFから分離し、FAMEを精製することが可能となることから、エネルギー投入を伴わない安価な分離技術とすることが期待できる結果を得た。植物油とメタノールのエステル交換反応から製造される脂肪酸メチルエステル(以下FAME)はディーゼル燃料の代替品となることからバイオディーゼル燃料(BDF)と呼ばれる。その反応で副生するグリセリン(GL)はFAME中に残留してBDFの燃料としての品質を左右するため、GLの分離によるFAMEの精製は重要であるが、製造コストの観点からその分離は費用のかからない重力沈降により行われるのが一般的であり、BDF製造過程中で最も時間を要する。本研究課題では、GLとFAMEの化学的特性の違いを利用して、可能な限りエネルギーを使わず、短時間でFAMEからのGL分離を達成するための技術開発を目的としている。具体的には、GLとFAMEの化学的特性の違いである分子内-OH基数の相違に基づく親水性の差を利用して、親水性の表面をもつ物質をエステル反応混合物の分離容器に導入し、親水性表面上でGLの凝集を促すことにより、GLの相分離をより効率的に促進する物質の探索と分離条件の検討を行う。親水性の高い表面構造を持つ吸着剤(分離促進剤)を反応混合物に加えることによりこの分離の速度を向上させられると考え、化学的に安定でかつ親水性を示すガラスビーズを吸着剤のプロトタイプとする予備的な試験を行った。ガラスビーズの添加でGL分離の促進効果が見られたことから、更に半定量的な検討を行った。検討の結果、ビーズ添加量の増加に対して分離速度が向上することが確認され、この促進効果が吸着剤の存在であることが確認できた。また、ビーズ粒径が小さいほどグリセリンの分離が早くなることが明らかになった。ビーズ粒径が大きすぎる場合、何も加えない場合よりも分離速度が遅くなる傾向も得られたことから、ビーズの密度、比表面積の大きさ、粗BDFの粘度が関係すると考えられるので、今後これらの要素を詳細に検討する必要があると考えている。平成23年度当初の交付申請書に記載の予定である、1)親水性ポリマーや超親水性薄膜材料を塗布したビーズを充填剤とするカラム法試験(担当:坂東、徳本)、2)非希釈FAME・GL混合物を試料とする円筒試験管分離実験(担当:坂東、徳本)、3)相分離能に対する充填ビーズのサイズ効果の確認実験(担当:坂東、徳本)、4)パイロットプラントスケール対応の相分離促進システムの予備設計とそれを使ったハンドリング予備試験(担当:坂東)に照らして、実験室系で実施する基礎的な検討(項目1)3))を定量的に評価するためのFAME(BDF主成分)、GL(副生成物)、MG・DG(エステル交換反応の中間生成物)の分離定量の為の装置再立ち上げと分析条件の確定までに予定より時間を要した。その結果この基礎検討部分については、最も基本と考えていたガラスビーズについてGLの分離促進効果を確認した(項目2))。またその効果の粒径依存性についても一定の評価を行うことができた(項目3))。

項目4)については交付申請段階で予定していたGL分離試験槽(内容積50L)を製作した。エステル交換反応の反応混合物(粗BDF)を使って、一定量のガラスビーズを加えよく撹拌した混合物を静置した後、一定時間ごとに表層から少量の試料粗BDFを分注し、そこに含まれるグリセリン量の時間変化を見ることにより、分離効率の大きさを精度よく評価できる。平成23年度に使用した粗BDF試料は、製造の実証試験用パイロットプラント(学外に設置されているプラント)で反応を行った試料であったため、合成から時間が経過し一度グリセリンが分離したものを再度攪拌することで実験に供していた。この場合、合成直後に比べ分離速度として評価される値が速くなることが明らかになった。これでは実際のプラントにおける製造段階で実分離速度を正しく反映できていないという問題がある。これを解消するために、BDFの小規模合成から実験室で行い、分離までの時間をコントロールする必要がある。この点は既に予備試験を行なっており、ビーズによる分離速度の向上がより顕著に確認できるという結果を得ている。以上のべたように、ここまでの試験結果の検討は半定量的な手法に基づくものであったことから、9.の研究実績の概要の最後で述べた分離速度を支配する要素を詳細に検討するために、実験手法の高度化と一般化を検討する。また、植物油から生成する粗BDF中にはGLの他、類縁化合物としてGL中の-OH基のうち1個が脂肪酸とのエステル結合を残したままのモノグリセリド(MG)や2個がエステル結合のまま残ったジグリセリド(DG)が存在し、またそれぞれのエステル基が56種類の脂肪酸基とその組み合わせから出来上がっていることから、HPLCあるいはGPLCによる分離分析条件の確立が必要であり、早急にこの確立を図る。定量分析手法を確立した上で、当初計画に述べた各種の吸着剤を実験に供し、最適分離条件の確立を図る。主には、交付申請書段階で平成23年度から実施できる予定であった精度の良い定量分析手法を確立する目的で、植物油(トリグリセリド:平均分子量が一般的に900前後)から、DG(同ca.600)、MG・FAME(同ca.300)、GL(同92)を分離するためのHPLCカラム、GPLCカラム、それら用のガードカラムを中心に、分析の高度化のための物品購入に研究費を使用する予定である。また、当初の計画で平成24年度に予定していた項目5)パイロットプラントスケール対応の相分離促進システムの設計とそれを使った実証試験用に、実験室試験で好成績を収めた吸着剤(予想では、表面修飾ガラスビーズやポリビニルアルコールビーズ、表面修飾酸化チタンなど)を購入するために研究費を充てる。
重複波浪場における漂砂移動に関する研究

本研究では、Dibajnia・Watanabe(1992)の漂砂量公式を重複波浪場に適用し、構造物周辺の地形変化のシミュレーションを行い、その有効性を検討した。流れ場の計算は、3次のストークス波を用いて重複波浪場における軌道流速を計算し、さらに質量輸送速度を足し合わせることによって、全流速を計算した。次に、この全流速の底面付近における流体粒子の一周期間のオイラー流速とラグランジュ流速を計算した。この様にして得られた二つの流速波形を、上記の漂砂量公式に適用し、鉛直壁前面における漂砂量を推定した。その際に実験レベルでは移動限界流速の影響が大きいためそれを考慮して漂砂量公式を改良した。さらに、底面の砂の連続式を用いて鉛直壁前面での地形変化を計算した。入江ら(1984)は鉛直壁前面における底面地形変化を様々な入射波と底質条件に対して、室内実験により計測し分類している。この実験結果と上述の数値モデルによる計算結果とを比較した。その結果、波高分布は実測値と計算値とでよく一致していた。また地形変化についても、15分後、225分後ともよく再現されていた。なお、オイラー的流速とラグランジュ的流速による計算結果では、あまり違いは見られなかった。全ケースについて見ると、ストークス波の適用範囲を大きく越えるケース(ア-セル数>25)については実験結果との一致度が悪かったものの、それ以外ではほぼ実験結果と一致した。今後は、ア-セル数が25より大きい場合の重複波浪場と質量輸送速度について研究を進める必要がある。
近世期私塾の人間形成-僧月性と時習館の人びとを中心に

本年度テーマに関して得られた知見は以下のとおりである。1. 16年余続いた月性の遊学は、その期間の長さ、行動半径の広さからみて同時代人の中でも希有のものであり、とくに九州各地で得た政治的教養が後の革命的アジテターとしての素地を創ったことは間違いない。2.萩城下の士分と早くから往来があった理由はなお不分明であるが、こうした人間関係をフルに利用した彼は、塾の門人や知友の子弟を積極的に紹介し、また自らの主宰する時習館や克己堂に萩城下の人びとを意欲的に迎え入れ、しだいに学塾相互間の交流を活発に進めた。3.時習館の教育は平均的な漢学塾のそれと異なり、眼前の時事問題に対処できる人材養成をめざした政治教育としてカリキュラム化されていた。4.教師や塾生たちの人的交流が契機となり、これがしだいに藩内各地にあった政治結社的私塾の同盟関係に発展した。5.藩内全域に対して行われた巡回講談は、内憂外患を訴える政治的アジテーションであり、やがて奇兵隊に代表される前期的国民軍の結成や挙藩一致体制の確立に役立つことになる。6.時習館グループが世に出なかった理由は、中心的人物の早世や戦死などのせいもあるが、一番大きかったのは、彼らの出自が陪臣や神官、僧侶、農民などであり、萩城下の直臣たちとの権力闘争に敗れたことである。挙藩一致体制のリーダーシップの掌握、さらには維新革命の美果の獲得をめぐる角逐や抗争から、彼らはしだいに排除されていった。その出自ゆえに、海外留学生に選ばれず、新しい時代潮流の圏外に置かれたことも、無関係ではなかろう。7.幕末期の活躍、知名度が維新後に世俗的な出世に結びつかず、ほとんどの人びとはせいぜい地方名望家の境遇に甘んじた。
モノADPリボシル化毒素と基質蛋白質複合体の結晶構造および反応機構の基盤解析

ウェルシュ菌ADPリボシル化Iota毒素(Ia)とアクチン複合体の構造と機能を明らかにする目的で、apo-Ia-actin複合体, apo-Iaの結晶構造を明らかにした。これにより、一連のADPリボシル化反応に伴う構造変化を明らかにした。ボツリヌス菌C3毒素は、低分子量GタンパクであるRhoAのAsn41をADPリボシル化する。C3毒素とその標的のタンパクであるRhoAの複合体の結晶構造解析を目的としてそれぞれタンパクの大量発現を行い、複合体での安定する結晶化条件の探索を行っている。ADPリボシルトランスフェラーゼすなわちNADのADPリボシル基を基質タンパク質に転移する酵素とその基質タンパク質の複合体の相互作用を知るため、その複合体の結晶構造解析を目的とする。2008年、我々はウェルシュ菌Iota毒素酵素サブユニット(Ia)-actin-βTADの高次複合体解析に成功した。この研究をさらに発展させるため、異なる基質を認識するボツリヌスC3毒素を標的としてその研究を進めている。C3毒素でRhoAのAsnがADP-リボシル化されると、その下流のシグナル伝達系が不活化、アクチンの重合化が阻止され細胞死が誘導される。C3毒素とその標的タンパクであるRho複合体の構造は明らかでなく、その分子認識機構は依然として不明である。ADPリボシル化毒素の研究をさらに進めるために、このC3毒素とRhoA複合体の結晶構造解析を目的とする。平成21年度、その複合体の鍵と成る基質タンパク質の発現に取り組んできた。RhoAの安定化した発現系の構築のため、RhoAの末端10アミノ酸を欠損させ、さらにF25Nの変異を入れる事によりRhoAの安定化をした。この結果、GSTとの共発現で安定な十分な量のGST-RhoAが可能と成った。またトロンビンカットでGSTを外しても安定なRhoAが得られる事がわかった。このRhoA179F25Nは質量分析を用いたmascot解析により、RhoAである事を確認した。これらの研究により精製のための方法は確立したために、今後、結晶解析のための大量精製を行い、そのC3毒素との複合体の結晶化をめざす。ボツリヌス菌C3毒素は低分子量GタンパクであるRhoAのAsn41をADPリボシル化する。C3毒素でRhoAのAsnがADPリボシル化されると、その下流のシグナル伝達系が不活化され、アクチンの重合化が阻止され細胞死が誘導される。C3毒素とその標的のタンパクであるRhoAの複合体の結晶構造解析を目的として基質RhoAの大量発現を試みた。この結果、RhoAの安定化したF25Nの大量発現に成功し、C3毒素による活性化が見られた。しかしながら蛋白を混ぜた時点で沈殿をする事から、複合体での安定条件の探索を行っている。枯草菌で得られているC3酵素にわずかなプロテアーゼの混入がありRhoAを不安定化させていると考えられ、この問題を検討し、さらに複合体結晶化に進もうとしている。一方、我々はウェルシュ菌ADPリボシル化毒素Iaとアクチン複合体の結晶構造を既に明らかにしている。かねてからIaはαアクチン、βアクチンともに、ボツリヌス菌C2IはβアクチンのみADPリボシル化する事が知られている。この特異性がなぜ生ずるかについては不明であった。この特異性の解明を目的にアクチンの変異体の発現を検討している。アクチンを粘菌発現系は既に産総研の上田等により確立されており、この系を用いたアクチンの変異体の取得を検討している。また、粘菌アクチンに対するIaおよびC2IによるADPリボシル化により、新たな知見が得られた。さらに構造情報と合わせて検討を進める事により、モノADPリボシル化の特異性がなぜ生じるのか検討を進めている。多くの病原性細菌はモノADPリボシル化毒素(ADPRT)を持ち、ヒトの重要な蛋白質を標的にモノADPリボシル化することで,その機能を不全にする。これら修飾酵素と基質蛋白質の構造と機能は複合体構造解析なしには理解できない。我々はウェルシュ菌ADPリボシル化毒素Iaとアクチン複合体の結晶構造(βTAD-Ia-actin)を2008年に明らかにした。アクチンおよびRhoAを修飾する毒素では、基質は全く違うが酵素の構造は非常に似ている。結晶が得られるIa-アクチンの系でADPリボシル化に伴う様々な状態での構造を解析する事から一般的なADPリボシル化の構造変化および反応を考察できる。この系で新たにNADやβTADを含まない、apo-Ia-actin複合体で結晶が得られ結晶構造を明らかにした。またapo-Iaの結晶構造が得られた。

既に我々が構造を得ているNADH-Ia,βTAD-Ia-actinと合わせて詳細に構造変化検討することにより、一連のADPリボシル化反応に伴う構造変化を明らかにした。ボツリヌス菌C3毒素は低分子量GタンパクであるRhoAのAsn41をADPリボシル化する。C3毒素でRhoAのAsn41がADPリボシル化されると、その下流のシグナル伝達系が不活化され、アクチンの重合化が阻止され細胞死が誘導される。C3毒素とその標的のタンパクであるRhoAの複合体の結晶構造解析を目的として基質RhoAの大量発現を試みた。この結果、RhoAの安定化したF25Nの大量発現に成功し、C3毒素による活性化が見られた。HisタグおよびGSTタグでの発現し、精製をそれぞれ行い、複合体での安定する結晶化条件の探索を行っている。いくつかの条件で微結晶が得られた。今後より精密化して回折データを取れるように大きくする必要があり、さらに複合体結晶かどうかを見極めていく。