hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
睡眠不足・喫煙が引き起こす脂質の代謝異常とその検出マーカーの探索

本研究では、睡眠不足および喫煙による脂質代謝の変化および日中の生活機能への影響を検討した。短時間睡眠により、自然睡眠時に比し、認知課題中の脳血流反応が抑制されることが明らかとなった。また、若年者においても喫煙前に比し、喫煙後に動脈硬化指標の一つである血管内皮機能の低下が認められた。質量分析法を用いた脂質分子種の検討では、自然睡眠時と短時間睡眠時、喫煙者と非喫煙者および喫煙前後の比較で、いくつかの分子種が有意に変化していた。動脈硬化症は、幼少期から始まっており、若年期の生活習慣が将来の動脈硬化症の発症と関連している。近年開発された質量分析計による包括的な脂質メタボローム解析は、病態モデル動物において脂質代謝の変化から疾患発症のメカニズムを探索することを可能とした。本研究では、質量分析計を用いて脂質メタボロームを包括的に解析し、1睡眠の質・睡眠時間の脂質代謝への影響、2喫煙の脂質代謝への影響、3唾液中の脂質成分と血液中の脂質成分との比較により、唾液による検査法の確立を目指す。本研究では、大学生を対象に、生活習慣を調査し、血中の炎症マーカーの解析をおこなった。生活習慣の調査では、喫煙習慣(1日の喫煙本数および喫煙年数)、運動習慣(1回の運動時間と1月間の運動日数)、飲酒習慣(1回の飲酒量と1月間の飲酒日数)、毎日の起床・就床時刻および睡眠時間、不眠や過眠症状を調査した。不眠および過眠症状の調査には、それぞれピッツバーグ睡眠質問票およびエプワース眠気尺度を利用した。客観的な睡眠評価として24時間行動記録計を用いた。血中の炎症マーカーとして、TNFα、IL-1β、IL-6などを測定した。また、脂質解析用に血液および唾液採取をおこなった。さらに、脂質抽出法と膜表面抽出法による脂質メタボローム解析の手法を比較検討した。睡眠時間の不十分な学生では、十分な睡眠時間をとれている学生と比べ、血中の炎症マーカーが上昇しているものが認められた。また、喫煙者では非喫煙者に比べ、血中の炎症マーカーが上昇しているものが認められた。さらに、喫煙後に喫煙前に比し、血中の炎症マーカーが増大する症例があった。本研究では、大学生を対象に、生活習慣調査、血中の炎症マーカー測定、生理的動脈硬化指標を検討した。喫煙習慣(1日喫煙本数および喫煙年数)、睡眠時間、不眠・過眠症上、運動習慣(1回の運動時間と1か月間の運動日数)、飲酒習慣(1回の飲酒量と1か月間の飲酒日数)を調査した。睡眠時間は、調査紙による自覚的睡眠時間と24時間行動記録計を用いて評価した。脂質メタボローム解析手法を検討した結果、より簡便で大量検体の処理可能な膜表面抽出法を用い測定することとなった。非喫煙者と喫煙者、および喫煙前後の動脈硬化指標を検討した。若年者においては、非喫煙時、喫煙者と非喫煙者では動脈硬化指標に有意な差を認めなかった。しかし、喫煙後には動脈硬化指標が悪化し、若年者であっても喫煙により血管機能が障害されることを証明した。本研究では、大学生を対象に、アンケートおよび行動量記録から、睡眠の質・睡眠時間と脂質代謝の変化との関係、喫煙習慣の有無や喫煙量と脂質代謝の変化との関係、唾液脂質成分と血中脂質成分との相関について検討する。平成27年度には、大学生において非喫煙者と喫煙者との間で動脈硬化指標について検討し、非喫煙時には有意な差を認めなかったが、喫煙後に動脈硬化指標が悪化し、若年者であっても喫煙により血管機能が障害されていることを明らかにした。また、睡眠時間を4時間以下に制限した睡眠不足の状況では、認知機能が低下し、認知課題中の脳血流量が低下していることを認め、脳機能低下には睡眠不足による脳血流量の低下が関与している可能性を示した。前年度の質量分析計の故障および新しい機器による測定系を再構築のために、検体の測定開始が半年ほど遅れた。現在、検体の測定を進めており、平成28年度中に測定および解析を終わらせる予定である。動脈硬化症は、狭心症、心筋梗塞および脳梗塞など心血管系疾患の危険因子であり、生活習慣と強く結びついていることはよく知られている。

近年の研究では、動脈硬化は幼少期より始まり、成人と同様に運動不足や過食などの生活習慣の悪化により、動脈硬化が進展することが明らかにされている。近年、質量分析法を用いた脂質メタボロームの包括的解析により、正常あるいは疾患モデル動物のサンプルプロファイルを解析し、病態生理に関する因子を見つけようとする試みがなされている。肥満モデルマウスでは、肥満に先行するかたちで、リン脂質グループの質的・量的バランスの変動がみられ、特定の脂質分子種グループの代謝変動が肥満病態への移行に関与していることが示されている。本研究の目的は、質量分析計を用いて脂質メタボロームを包括的に解析し、1睡眠の質・睡眠時間と脂質代謝との関連、2喫煙の脂質代謝への影響を検討することである。本研究では、1健常成人を対象に、通常の睡眠時間と短時間睡眠時の脂質プロファイルを検討した、2非喫煙者と喫煙者および喫煙前後での脂質プロファイルを検討した。睡眠との関連では、睡眠時間を4時間未満にした短時間睡眠時と通常の睡眠時間(8時間以上)のときの、脂質メタボロームを比較し、リン脂質グループの分子種の検出率が異なることを明らかにした。喫煙との関連においても、喫煙前後の脂質分子種を包括解析することにより、脂質分子種により検出量が異なることを見出した。本研究では、睡眠不足および喫煙による脂質代謝の変化および日中の生活機能への影響を検討した。短時間睡眠により、自然睡眠時に比し、認知課題中の脳血流反応が抑制されることが明らかとなった。また、若年者においても喫煙前に比し、喫煙後に動脈硬化指標の一つである血管内皮機能の低下が認められた。質量分析法を用いた脂質分子種の検討では、自然睡眠時と短時間睡眠時、喫煙者と非喫煙者および喫煙前後の比較で、いくつかの分子種が有意に変化していた。平成26年度は、研究者の異動と研究体制の再構築、ならびに測定機器の故障で研究にやや遅れが生じた。しかし、年度後半には、機器の修理が終了し、検体の測定を開始することができ、これまでの遅れを取り戻せるよう努力している。質量分析計による血中脂質成分の包括的解析には、膜表面抽出法により実施している。喫煙者と非喫煙者の比較により、喫煙者のみに認められた脂質分子種や非喫煙者にだけ認められた脂質分子種があり、これらについて詳細に解析していく予定である。また、喫煙者と非喫煙者との間において、脂質分子種の相対的量に違いを認めたものもあり、定量分析も行えるように準備を進めている。さらに、睡眠不足時の血液検体の脂質質量分析も進めていく予定である。睡眠医学膜表面抽出法による脂質メタボローム解析を進めていく。同一被検者において、唾液と血液を脂質メタボローム解析することにより、より侵襲性の少ない唾液により脂質代謝変動を捉えることが可能かどうか検討していく。睡眠不足時と自然睡眠時とを比較することにより、睡眠時間の脂質代謝への影響を明らかにしていく。さらに、喫煙者における脂質メタボロームを非喫煙者および喫煙後のそれらと比較することにより、喫煙の脂質代謝への影響を明らかにする。当初の計画通り、研究参加者を集めることができ、解析に必要な試料・資料を得ることができ、検体の測定は順調に進んでいる。平成27年度に質量分析計が故障し、計画通りに検体測定を行えなかった。測定に使用する機器が故障したため、測定が中断し消耗品類を購入することができなかった。平成27年度に測定できなかった検体測定のために使用していく予定である。
無限生成の対象の研究(野性的空間の基本群)

非可算特有の現象であるスペッカー現象の非可換化を中心に群論的、代数位相幾何的研究をした。とくに、一次元ペアノ空間の基本群がホモトピー型を決定すること、また基本群間の任意の準同型写像が本質的には連続写像によって導かれることを示した。一般にペアノ空間の基本群は野性的な部分で自由積に分解されないことを示した。2次元セルライクな単連結非可縮なペアノ空間の存在を示した。無限生成の対象のうちとくに野性的空間に関して代数的位相幾何に現れる群(基本群、ホモロジー群、コホモロジー群)を中心に研究を進めている。当初の項目をあげると:(1)非可換スペッカー現象、(2)無限語の研究(3)連続語の研究(4)非可算非可換群の研究(5)2次元連結コンパクトアーベル群の無限カバー(6)Grope群の問題、である。Snake Spaceは円周をベースとした場合、2次元の野性的空間で、Cell-likeで単連結で、2次元のホモトピー群が非自明となる顕著な空間である。この空間は、U. Karimovによって提案され、本研究代表者が単連結性を示したものであるが、その証明は複雑で長かった。今回Olumの定理を使うことにより、自然な短い証明を得た。証明は短くなったが、基本群を表すため、本研究代表者の開発した無限語が使われている。現在、共同論文をまとめている最中である。後半では、1次元ペアノ空間の基本群がそのホモトピー型を決定することを証明した。このことは、10年ほど前から予想されていたことであったが、研究代表者が既に得た結果でいたるところ野性的空間の場合、基本群が同相型を決定してしまう。一般の場合はホモトピー型を考察することになるが、野性的空間の場合の補題の援用によりこの問題を解決した。また1次元ペアノ空間の基本群から1次元空間の基本群への準同型写像が、その空間の間の連続写像による準同型写像の共役写像となることを証明した。これは、研究代表者が既に得ている結果を含むものとなっている。この結果は、2009年3月に本研究費によりユタの出張中ブリガムヤング大学において、講演しこの内容を発表した。また、単著論文として雑誌に投稿中である。1次元のペアノ空間は局所単連結ならば有限グラフとホモトピー同値であることが知られており、その証明も難しいものではない。その基本群は自由群となり生成元の数は穴の個数となり、ホモトピー型は穴の個数で決まる。しかし局所構造が複雑なペアノ空間、例えば、Sierpinski Carpot, Menger spongeなどのような空間の場合は全く様相が異なる。2002年に本研究者はこれらの空間のように全ての点の近傍に穴がある1次元ペアノ空間は基本群がホモトピー型ばかりでなく位相空間を決定していることを証明した。この頃から、一般の1次元ペアノ空間に対しては基本群がホモトピー型を決定するであろうという予想があった。2005年にG.Connerらがその事実に近い定理をBeldewoの会議で発表したが、本研究者がその定理が間違っていることを示した。しかし、その際の補題のなかには有用なものがあった。その補題は、M.Meilstrupによるもので証明は不完全であった。昨年、本研究者は、その補題を強化したものを証明し、2002年の論文の主要な手法を使うことにより、1次元ペアノ空間の基本群はそのホモトピー型を決定することを証明した。さらに、二つの1次元ペアノ空間の基本群の間の準同型写像は、それらの空間の間の連続写像によって導かれる準同型写像の共役となっていることを証明した。また、この系として、1次元ペァノ空間の間の連続写像によって導かれる準同型写像が、同型写像であるならば、この連続写像は空間の間のホモトピー同値を与えていることが導かれた。これらにより、1次元ペアノ空間では基本群が支配していることがわかった。これは、2次元ペアノ空間でホモトピー群がどの程度支配的かという今後の問題を投げかけている。2009年度に報告した1次元ペアノ空間の基本群とホモトピー型に関する論文[2]の改訂を行い、結果を精密化した。この結果1次元ペアノ空間のホモトトピー型が基本群で決定されるという、ほぼ最終的な結果に到達した。一方、2次元のペアノ空間は1次元に比べはるかに複雑であることが予想されるものの、非可縮性をホモトピー群の非自明性以外から導くことが困難であることが、ここ数年の、U.Karimov(タジキスタン)、D.Repovs(スロベニア)らとの共同研究でわかってきている。その結果、「すべてのホモトピー群が自明となる2次元のペアノ空間は可縮であるか」という問題の研究を始めた。

野性的1次元ペアノ空間は負曲率幾何の極限空間に現れる。極限空間の構成は色々なものがあるが、研究代表者は超準解析との関係の深いAsymptotic Coneを対象としており、その基礎的研究を図書「数理論理学(使い方と考え方)内田老鶴圃」のなかで行った。2009年度の研究の継続として、川村一宏(筑波大)と論文[1]の関連の共同研究をした。これらの研究と少し異なったものではあるが、非可算無限の関係する幾何学として、連結完備全順序空間の有限直積の研究を行った(これは研究代表者の研究室に属する大学院生(上條良介)との共同研究である)。Lを連結完備全順序空間で、共終数あるいは共始数が非可算となる点が稠密であるとする。このとき、Lの有限直積の空間の自己同相写像は一次元の同相写像の組合せだけである。つまり、座標軸は各々他の座標軸に写る(この結果は現在論文にまとめている)。
自由行動下、細胞レベルでのｉｎ　ｖｉｖｏイメージング装置の開発と場所細胞への適用

本研究では脳の高次機能解明のため、自由行動下において、行動と神経活動を同時に長期間記録するためのin vivoイメージングシステムの開発を試みた。緑色蛍光タンパク質(GFP)発現ウイルスベクターの作製し、マウスの海馬へ注入後、スライス標本により蛍光顕微鏡観察したところ、ウイルス感染に伴う電気生理学的特性を損なうことなく、GFPの明るい蛍光と持続的な発現が認められた。同標本に対し、屈折率分布型(GRIN)レンズを介して蛍光像を取得したところ、像が暗く不鮮明であったことから、システムの基本的な光学系には問題はないが、像の最適化のためには更なるシステム改良が必要であることが今後の課題として残った。本研究では、脳の高次機能解明のため、自由行動下において、行動と神経活動を同時に長期間記録するためのin vivoイメージングシステムの開発を試みた。初年度は、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するレンチウイルスベクターの作製と共に、シータ波を利用してこのベクターを海馬CA1領域へ効率的に注入するシステムを開発した。このシステムによる上記ベクターのマウスの海馬CA1領域への注入は、蛍光顕微鏡下、スライス標本において、ウイルス感染細胞の長期間(3週間以上)の生存と外来遺伝子の持続的発現、さらにパッチクランプ法により、ウイルス感染に伴うシナプス伝達などの電気生理学的特性に対する影響は認められないことが確認できた。最終年度は、初年度に作製したウイルスベクターを用いてイメージングシステムの評価及び改良を試みた。「研究実施計画」では軟性ファイバーを用いる予定であったが、蛍光シグナルのファイバー伝搬時における著しい減衰が予想されたため、ファイバーに代えて屈折率分布型(GRIN)レンズを使用した。初年度同様にベクターをマウス海馬に注入し、23週間後、麻酔下、頭部を固定した状態でGRINレンズを脳内に刺入し、蛍光顕微鏡による蛍光像の取得を試みたが、蛍光像は得られなかった。そこでスライス標本を作製し、GRINレンズを介して同様に蛍光像の取得を試みたところ、蛍光像は得られたが、その像は若干暗く、また最適な像を得るためには焦点の微調整などが必要であった。以上本研究において、生体脳における細胞レベルでのイメージングシステムの基本的な光学系には問題はないことが明らかとなったが、像の最適化のためには更なるシステム改良が必要であることが今後の課題として残った。これらの課題は、神経活動を数%の蛍光強度の変化で捉えるより、蛍光色の変化や蛍光の分布変化を利用することにより一部克服できるものと考えられる。脳神経活動を蛍光強度の変化として長期間(数週間数か月)モニターするためには、長期間安定して蛍光タンパク質を発現する必要がある。レンチウイルスベクターは比較的細胞毒性が少なく、長期間安定して外来遺伝子を発現できると報告されている。そこではじめに、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するレンチウイルスベクターを作製し、その検討を行った。我々は、海馬のCA1錐体細胞層に特異的に現れるシータ波をモニターすることにより、CA1錐体細胞層に効率的にウイルスベクターを注入するシステムを開発した。このシステムを用いて、上記ウイルスベクターをマウスの海馬CA1領域に注入し、23週間飼育したのち、脳を取り出し、海馬のスライスを作製し、蛍光顕微鏡を用いて観察したところ、錐体細胞層において強いGFPシグナルが観察された。この結果、このウイルスベクターの錐体細胞への感染と外来遺伝子の導入・発現が確認できた。さらに上記の海馬スライス標本において、ウイルス感染によりGFPを発現したCA1錐体細胞のシナプス伝達特性(興奮性後シナプス電流:EPSC)をホールセルパッチクランプ法を用いて検討したところ、非感染錐体細胞と比較して両者に相違は認められず、また、シェーファー側枝のシータ・バースト刺激による長期増強(LTP)作用の誘導は共に観察された。以上の結果から、ウイルス感染細胞の長期間(少なくとも3週間以上)の生存と外来遺伝子の持続的発現が確認できた。GFPを発現するレンチウイルスベクターを海馬CA1領域に注入し、急性スライス標本を作製して蛍光顕微鏡観察を行った結果、60倍対物レンズの使用下、視野内の2030%の錐体細胞にGFPの発現が認めれ、さらにその蛍光強度は非常に強いものであったことから、作製したウイルスベクターの感染効率及び発現効率は非常に高いものと考えられる。これまで、in vivoイメージング装置の開発においては、脳内への蛍光色素の注入やヘルペスウイルスベクターを注入してその性能を検討してきたが、拡散や細胞毒性のためその蛍光シグナルは非常に弱く、装置の性能を十分に評価することは困難であった。しかし、今回、感染効率及び発現効率の非常に高いウイルスベクターを作製できたことは、今後のイメージング装置の開発において、その性能の評価を効率良く遂行できるものと期待する。まずはじめに、現時点におけるイメージングシステムを評価するため、今回作成したウイルスベクターを今年度と同様にラットの海馬に注入し、23週間後、麻酔下、頭部を固定した状態でイメージングファイバーを脳内に刺入し、遺伝子導入した蛍光タンパク質の観察を試みる。

イメージングシステムの評価において、もっとも危惧される問題点は、ファイバー伝搬時における蛍光シグナルの減衰であると考える。従って、得られた蛍光像が余りに暗い、或いは確認できない時には、バンドルファイバーに代えて屈折率分布型(GRIN)レンズの使用も考慮する。神経活動をモニターする蛍光プローブについては、おそらく得られる蛍光は非常に微弱なものと考える。従って、蛍光強度の変化よりむしろ、蛍光タンパク質の分布の変化(例えば、神経活動の増加に伴い、細胞質から細胞膜へ移動するようなタンパク質)を利用することを考えている。現時点におけるその候補としては、プロテインキナーゼCα(PKCα)を考えている。PKCαにタグとしてGFPを連結したレンチウイルスベクターを作製し、まずは、in vitroの系を用いて刺激に伴うPKCαの動態変化を確認したのち、in vivoの系に適用する。ウイルスベクターを用いて、脳内の神経細胞に遺伝子導入された蛍光タンパク質のシグナル強度は、バンドルファイバーなどを介することによる減衰などにより、相当に微弱であると考える。従って、そのような微弱蛍光を観察するためには、高感度の蛍光カメラの使用は必須であると考える。故に、次年度においては、高感度カメラの購入を最優先に計画している。さらに、イメージングシステムの性能向上のため、より高伝達のバンドルファイバーや、或いはGRINレンズなどの光学部品の購入も検討している。試薬などのその他の消耗品については、今年度と比較して減少する予定だが、それでも必要不可欠のために計上している。
臼田64m鏡Lバンド帯を用いた分子雲形成の研究

本研究の目的は星形成の母体となる水素分子雲の形成条件、および水素分子形成率を明らかにすること、また低密度分子雲の分布・性質を明らかにすることである。これを達成するために、金星探査機「あかつき」や小惑星探査機「はやぶさ2」と通信を行っている臼田64m鏡のLバンド(1-2GHz)帯の高感度化を通して、高銀緯領域でヒドロキシラジカル輝線の観測を実施する。取得されるデータ、及び既存の一酸化炭素分子輝線、中性水素原子、低温ダストのデータを比較し目的を達成する。本研究は日本のLバンド帯の研究を普及・促進させ、SKA等の次世代観測装置への架け橋、ガンマ線との比較研究、分子雲自体の研究の発展に寄与する。
太陽フレアの磁場エネルギー蓄積・解放過程の観測的解明

太陽フレアを引き起こすエネルギーの源である、太陽表面の磁場のひずみの蓄積過程とその解放機構を総合的にとらえることが本研究課題の目的である。このための観測装置である、「太陽フレア望遠鏡」を昭和63年度に建設し、その後順次、黒点の観測装置、Hα線による彩層観測装置、磁場・速度場観測装置を制作し、平成3年8月に打ち上げられた太陽観測衛星「ようこう」との共同観測を実施している。1.平成3年6月には、最近20年間のうちて最大級のフレア活動があり、幸いにも日本の昼の時間帯であったので、良質のデータを得ることができた。特に、黒点の暗部の中に極めて微少な輝点として白色光フレアが観測されたのは世界でも初めてのことである。2.フレアに伴う磁場の変化については、1992年2月に起こった中規模のフレアにおいて、コロナループのはっきりした形状の変化と、それに対応した磁場ベクトルの変化の検出に成功した。太陽表面の電流密度もフレアをはさんで減少を示しており、フレアに伴う磁場変化のこれまででもっとも明瞭な証処を捉えたといえる。さらに多くの例について検証を行う必要があり、現在系統的解析を続行している。3.1992年11月に太陽の縁で起こった大フレアについては、Hα線で見えるループプロミネンスと、X線ループが上下方向にずれて観測された。これは、X線を出す高温のループが冷えてHα線を放出するようになるというフレアモデルを指示する結果である。1.太陽フレアを引き起こすエネルギー源である太陽表面の磁場所の歪みの蓄積と解放を総合的にとらえることが、本研究課題の目的である。本年度はこの目的のための最も重要な観測装置である赤道儀スパーの設計製作を主に行なった。太陽フレアを多面的に観測するため、赤道儀スパーには4台の望遠鏡を同架し、(1)フレアのエネルギー源である磁場の観測、(2)磁場の歪みを発生させる太陽表面のガスの流れの観測、(3)Hαフィルターによる太陽フレア像の観測、(4)干渉フィルターによる黒点像の観測を同時に行なえる光学系を採用した。赤道儀架台部は時計追尾装置、光電追尾機構を備えた電動式で、計算機制御が可能なインターフェイスを持っている。各望遠鏡の検出器系、データ処理系、及び赤道儀架台の計算機制御系については、次年度以降順次設置する予定である。2.速度場測定用の磁気光学フィルターについては、国立天文台において開発及び基礎実験が行なわれた。ナトリウムのガスを封入するガラスセルの形状、加熱方法、セルを納める真空容器の窓材のコーティングについて実験が行なわれ、より良い特性を得るための条件が求められた。また高分散分光器を用いてフィルターの透過特性を測定し、セルの温度や加える磁場の強さに対する透過特性の変化が、理論的に予測されるものと一致することを確認した。次年度以降は、より口径の大きいセルの製作と、KDPモジュレータと組合せた速度場測定装置の製作を行なう。太陽フレアをひきおこすエネルギーの源である、太陽表面の磁場の歪みの蓄積と解放を総合的にとらえることが本研究課題の目的である。昨年度の望遠鏡架台部分の製作に引続き、今年度は望遠鏡制御部の製作と、望遠鏡に塔載する光学系の導入を行なった。1.望遠鏡制御部は、望遠鏡のポインラィングや太陽の自動追尾を制御する装置で、手動操作のためのパネルと、計算機制御用インターフェイスから成る。基本性能についてのチェックは終了し、現在、実際に太陽を観測して太陽追尾機構の精度検査を行っている。2.望遠鏡は対物レンズの後に、平行光束を作るためのコリメーターレンズ、適当な大きさの太陽像を得るためのカメラレンズ、平坦な画像を作るための較正光学系等を配置するが、これらの設計、製作を行なった。3.太陽の彩層構造を観測するための、Hα線用リオーフィルターを購入し、透過波長特性の検定を行なった。

また、黒点、白斑を観測するための干渉フィルターを購入し、得られる像の質について試験を行なった。4.太陽表面のガスの流れを測定する磁気光学フィルターについては、昨年に引続きガラスセルの試作を行なったほか、透過波長を移動させるためのKDP結晶を購入した。以上、観測装置の製作は順調に進んでおり、来年度はHα線と白色光による本観測をスタートさせるほか、磁場測定用のリオーフィルターを導入する計画である。太陽フレアをひきおこすエネルギ-の源である、太陽表面の磁場のひずみの蓄積過程とその解放機構を総合的にとらえることが本研究課題の目的である。このための観測装置である「太陽フレア望遠鏡」を昭和63年度に建設した。平成元年度には黒点観測用の干渉フィルタ-と、彩層観測用のHαリオ・フィルタ-を導入した。これらの観測装置は現在順調に動作しており、観測した太陽画像をレ-ザ-ビデオディスクに記録している。すでにいくつかのフレアやプロミネンス爆発の観測に成功し、興味深いデ-タが得られている。観測デ-タはすべてCCDカメラによって取得されるため、デ-タの精度を向上させるにはCCDの画素間の感度差を補正する必要がある。これには一様でむらのない光をCCDに照射して、そのデ-タを基準として観測デ-タを解析すればよい。その際、光線のCCDへの照射角が観測時と全く同一であることが望ましいが、光路内に特殊なレンズ系を挿入することによりこれが可能であることがわかった。この原理に基いて新たな装置(較正光学系)を設計し製作した。この装置により、観測デ-タの精度が格段に向上した。磁場測定装置の心臓部である、透過波長幅1/8A^^°の複屈折干渉フィルタ-は、中国・南京天文儀器厰で製作され搬入された。波長特性試験の結果は良好であり、またこれと組合わせて用いる長時間露光CCD制御系の製作も終了し、平成3年度初めには試験観測に入る予定である。もう一つの重要な装置である速度場測定装置は平成3年夏に導入の予定であり、その時点で本観測設備全体が完成し、本格的な観測に入る。太陽フレアをひきおこす磁場の歪みが、太陽表面のガスの流れによって作られるのか、それとも歪みを持った磁場が太陽内部から浮上するためであるのかを明らかにすることが、主たる目標である。このための観測装置である「太陽フレア望遠鏡」を昭和63年度に建設し、その後順次、黒点の観測装置、Hα線による彩層観測装置、磁場・速度場観測装置を製作し、今年度はこれらすべてを用いた本観測の体勢に入った。平成3年8月には太陽観測衛星「ようこう」が打上げられ、大気圏外からのX線観測と組み合わせた太陽フレアの研究が可能となった。平成3年6月には、最近20年間のうちで最大級のフレア活動があり、幸いにも日本の昼の時間帯であったので、良質のデ-タを得ることができた。特に黒点の暗部の中に、極めて微小な輝点として白色光フレアが観測されたのは世界でも初めてのことである。この結果は既に論文として発表した。「ようこう」が定常運用に入った平成3年10月からは、X線観測から知られるコロナル-プの形やそのフレア時の変化と、太陽フレア望遠鏡から得られる太陽表面の磁場のひずみとの関係に主眼を置いた研究を行なっている。
生命機能を制御する鍵反応タンパク質アセチル化に関する化学遺伝学的研究

タンパク質脱アセチル化に関与するHDAC酵素のうち、核内の特定の構造体(HDAC4/Bach2 body)に存在するHDAC4と細胞質に局在し、微小管の脱アセチル化に関与するHDAC6の機能解析を行った。その結果、HDAC4はBach2とともに酸化ストレスに応答して核移行し、核内で点状構造に局在すること、この点状構造はPML bodyを取り囲むものであること、HDAC4/Bach2がPML body周辺に集合することにより、PML bodyにおける転写活性が著しく阻害されることなどを明らかにした。また、HDAC6がエンドサイトーシスを抑制することを見出した。HDAC6の安定なノックダウン肺癌細胞作製したところ、EGF刺激に応答したEGF受容体のダウンレギュレーションが亢進し、EGF受容体の量が低下するとともに、下流のERKが高発現してEGFシグナルの低下を補償することが明らかになった。このことはHDAC6がエンドサイトーシスの制御を通じて受容体シグナル伝達系を調節することを示している。さらにHDAC阻害剤を用いて新たなアセチル化タンパク質を探索した結果、動物細胞からHsp90、SV40 large T抗原、ポリAポリメラーゼ(PAP)など多数のタンパク質を同定した。同様に分裂酵母から10数個のタンパク質を同定した。その機能解析により、Hsp90はアセチル化により機能が低下し、T抗原は分解が促進され、PAPは核移行が低下することを見いだした。以上の結果からタンパク質アセチル化は予想以上に広く分布し、タンパク質の基本的な機能に大きく影響することが明らかになった。その結果、HDAC4はBach2とともに酸化ストレスに応答して核移行し、核内で点状構造に局在すること、この点状構造はPML bodyを取り囲むものであること、HDAC4/Bach22がPML body周辺に集合することにより、PML bodyにおける転写活性が著しく阻害されること、酸化ストレスによってBach2がSUMO化されること、Bach2のSUMO化を阻害すると、PML bodyへの局在化が起こらないことなどを明らかにした。Bach2はMARE配列を有するDNAに結合して転写を抑制することから、HDAC4はBach2と共同してこの転写抑制に関与すること、酸化ストレスによる複合体の局在変化の結果、特定の核内領域の転写を制御する可能性が示唆された。一方、HDAC6に関しては、自身がポリユビキチン化とSUMO化を受けることを見出した。HDAC6はポリユビキチン化されても分解は誘導されず、安定なままであった。HDAC6を過剰発現すると微小管のアセチル化が低下するだけでなく、EGFやトランスフェリンの細胞内取り込みが抑制されることを見出した。この活性には、HDAC6の脱アセチル化酵素活性、カルボキシ末端側にあるユビキチン結合ドメイン(UBP-Zn finger)及び自身のユビキチン化が必要であった。このことからHDAC6は自身の翻訳後修飾を通じて細胞内での物質輸送に関与することが示唆された。昨年に引き続きタンパク質脱アセチル化に関与するHDAC酵素のうち、核内の特定の構造体(HDAC4/Bach2body)に存在するHDAC4と細胞質に局在し、微小管の脱アセチル化に関与するHDAC6の機能解析を行った。昨年度HDAC4はBach2とともに酸化ストレスに応答して核移行し、核内で点状構造に局在することを見出したが、今年度はHDAC4のその核移行がPKCによって阻害されること、この阻害はHDAC4のリン酸化とそれによる14-3-3の結合によることを明らかにした。14-3-3の結合により、NLSがマスクされ、核移行が阻害されることが示された。

さらに活性型PKCアイソフォームを用いた研究から、HDAC4の核移行を制御するPKCはcPKCではなく、nPKCであることがわかった。一方、我々がチューブリン脱アセチル化酵素であることを同定したHDAC6は、EGFやトランスフェリンの細胞内取り込みを抑制するが、これは初期エンドソームの細胞内輸送を抑制するためであることがわかった。HDAC6をノックダウンした細胞では、逆にエンドサイトーシスが促進し、増殖因子受容体のリガンド依存的な分解が促進されることが明らかになった。このことはHDAC6がシグナル伝達の制御にも関わることを示唆する。さらにタンパク質アセチル化の包括的な役割を解析するため、HDAC阻害剤Trichostatin Aで処理したCOS細胞からアセチル化タンパク質を免疫沈降後、それぞれのアセチル化タンパク質を質量分析によって同定したところ、SV40のlargeT抗原がアセチル化されることが明らかになった。T抗原のアセチル化はCBPによって行われ、脱アセチル化はHDAC1およびSIRT1が関与する。アセチル化されたT抗原は、分解速度が速くなることから、T抗原のアセチル化はタンパク賞の安定性を制御する新しい機能であることが示唆された。昨年度に引き続き、動物細胞からのアセチル化タンパク質の同定と機能解析を行った。まず、近年報告のあった分子シャペロンHsp90のアセチル化について解析し、主なHsp90の脱アセチル化酵素がHDAC6であること、Hsp90はアセチル化によって機能が低下し、グルココルチコイドホルモン受容体の活性化と核移行が抑制されることがわかった。また、NAD依存的な脱アセチル化酵素であるSIRTによって脱アセチル化されるタンパク質も併せて取得するため、COS7細胞に亜鉛依存的なHDACを阻害するトリコスタチンA(TSA)とともにSIRT活性を抑制するニコチンアミドを同時に処理することで検出される新たなアセチル化タンパク質の解析を行った。その結果、いくつかの新規アセチルかタンパク質を同定した。その中でもCFIm25とポリAポリメラーゼ(PAP)はともに転写の終結に関わる因子であった。CFIm25はmRNAの3'側の予定切断部位に結合し、ポリA合成酵素であるPAPをリクルートすると考えられ、両者は長いポリA鎖の合成に関与する。その際、両者のアセチル化はCFIm25とPAPの結合低下をもたらした。両者のアセチル化酵素はともにCBPであり、脱アセチル化酵素はいずれもHDAC1,3,10およびSIRT1,2であった。すなわち、この転写終結複合体は、転写進行に伴って転写活性を正に制御するCBPによってアセチル化され、その結果解離し、mRNAの切断部位が露出することにより、PAPによるポリA付加を促進していることが示唆される。これは転写開始だけでなく、転写終結にもアセチル化が関与することを示す初めての発見である。さらに分裂酵母のSIRTであるHst2を破壊した株では、eIF5Aが特異的にアセチル化されることを見いだした。このことは、翻訳にもアセチル化が関与することを示唆する。
次世代育成支援策としての「孫育児をする祖父母の支援」に関する比較法研究

本研究では、祖父母による孫育児の問題について、わが国ではまだほとんどなされていない、政策や法律の観点からの分析と検討を行なった。今回の研究期間内に、日本・英国・アイルランド・オーストラリアの諸国における研究動向と、孫育児をめぐる国内外の制度政策の現状と今後の課題を明らかにした。研究初年度である平成19年度は,当初の研究計画に修正を加えつつ研究を進めた。また,今年度は文献調査を行い,聞き取り調査等については実施しなかった。具体的には,収集した文献・政策文書・統計資料等に基づいて以下に関する検討を行った。初めに,わが国における祖父母と孫をめぐる諸制度の体系を検討した。また「保育者としての祖父母」が,わが国においてどのような形で議論されてきたのかを明らかにするため,孫育児に関するわが国の先行研究を収集し分析した。次いで,諸外国の孫育児の状況について資料等の収集と分析を行った。その際、当初の研究計画にしたがって,英国・アイルランド・オーストラリアを対象国に設定した。あわせて,これらの諸国における祖父母と孫を取り巻く文化・社会的状況の検討を試みた。英国については,インフォーマル・ケアの(ブレア政権以降の)社会政策上の位置づけを明らかにするとともに,特にひとり親家庭への重要な就労支援であるワーキング・タックス・クレジットのあり方について検討した。オーストラリアとアイルランドについては,資料収集と分析の過程において,両国では近年いわゆるキンシップ・ケアの重要性が認識され,孫を監護養育する祖父母の問題が議論されていることが判明した。この問題は,育児と就労の両立支援とは違った視点から,次世代育成支援策のひとつと位置づけることが可能であると考えた。また,わが国においても現在進行しつつある家族関係の変容に伴い,今後,この問題が浮上する可能性があると判断した。そこで当初の研究計画に修正を加え,当初は盛り込まなかった「養育者として孫育児を行う祖父母に対する支援策」についても研究対象とすることにした。なお,研究計画に修正を加えたこともあり,研究課題に関する体系的な考察はまだ十全とはいえない。そのため,研究成果については平成20年度に順次,発表することにした。今年度は昨年度に引き続き、国内外の文献・政策文書・統計資料等の収集と分析を行った。また、研究の取りまとめに向けての作業や情報発信(学会等での報告、川崎市教育委員会・大学等高等教育機関連携事業による公開講座)を行なった。本研究の意義は、祖父母による孫育児の問題について、わが国ではまだほとんどなされていない、政策や法律の観点からの分析や検討を行った点にある。研究の成果の具体的内容は次の通りである。(1)研究動向:英国・アイルランド・オーストラリアの諸国では、1990年代後半以降、公的機関等が祖父母によるインフォーマル・ケアについての調査・研究が行われてきた。孫の保育の問題とともに、孫の監護教育の問題も多く取り上げられている。わが国でもこの数年、孫の保育の問題を中心に関心が高まりつつある。(2)わが国の状況:保育所の利用申請の場面で祖父母による保育ニーズの充足を前提としつつ、具体的な保育の提供については子の親と祖父母との準委任契約に委ねている。孫の保育それ自体を対象とするとする社会保障給付や税制上の優遇措置、育児休業の取得等は法定されていない。公平の観点から何らかの公的支援が提供されても良い。(3)諸外国の状況:この点について諸外国の事例が参考となる。英国では祖父母がチャイルド・マインダーとして公的機関に登録されることにより、就労タックス・クレジットの対象となる制度がある。シンガポールでは2005課税年度より祖父母による孫の保育に対する税制上の優遇措置(祖父母控除)が導入されている。オーストラリアでは2007年11月に自由党・国民党連立政権の下、祖父母休業制度のプランが示された。ただし、実現には至っていない。今後の検討課題として、孫の監護教育についての検討と、これまで曖昧にされてきがちであった子-親-祖父母の権利義務関係を可視化することの意義と限界についての検討をあげることができる。
非リボソームペプチド合成酵素の触媒機能の精密解析

昨年度に引き続きFmoA3のX線結晶構造解析に取り組んだ。昨年度、apo型、AMP-PNP結合型、alpha-mehtylseryl-AMP結合型、3つの状態の構造解析に成功していたため、次に中間体である、ジペプチドが結合したFmoA3のX線結晶構造解析を試みることにした。昨年度合成したジペプチド中間体アナログが結合したFmoA3の合成を酵素方により試みた。その結果、この反応の過程で、FmoA3の安定性が低下し、凝集することがわかった。反応条件を複数検討したが、現在のところ、安定なジペプチド中間体アナログが結合したFmoA3の生産条件を見つけることができなかった。今後さらなる条件検討を行う予定である。次にJBIR-126の生合成酵素であるPgpA2, A3とJBIR-34, -35の生合成酵素であるFmoA2, A3間の相互作用に関する解析を行った。ビアコアを用いてPgpA2-PgpA3間とPgpA2-FmoA3間の相互作用の強さを比較したところ、これらのKDはそれぞれ26 μM, 52 μM程度であり、期待したほど大きな違いがないことがわかった。次にPgpA2-FmoA3間、FmoA2-PgpA3間では反応が進行しない原因を探るためにドメイン置換実験を行った。その結果、CPドメインがこれらの反応が進行しない原因の一つであることが明らかになった。おそらくCPドメインと触媒(Cy)ドメイン間の相互作用の差が反応性に重要であることが示唆された。一方、CPドメイン自体は2酵素間の相互作用には重要ではないことがビアコアを用いた解析によりわかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。非リボソームペプチドの一つであるJBIR-34,-35の生合成を担う非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)FmoA3のX線結晶構造解析に取り組んだ。FmoA3はヘテロ環化(Cy)ドメイン、アデニル化(A)ドメイン、輸送タンパク質(CP)、3つのドメインからなるNRPSである。FmoA3単独の構造、AMP-PNPとの複合体の構造、alpha-mehtylseryl-AMPとの複合体の構造、3つの状態の構造を明らかにすることに成功した。NRPSはペプチド結合を形成する反応を触媒する過程において、ダイナミックに構造を変えることが明らかとなっている。そのため、複数の状態のタンパク質の構造解析に成功したことは極めて重要である。この構造解析の結果から、ヘテロ環化ドメインとAドメインのN末端側は強固な構造を取っているが、AドメインのC末端側からCPドメインにかけては柔軟な構造を取っていることが示唆された。また、このX線結晶構造解析と部位特異的変異導入の解析結果から、FmoA3がalpha-methylserineという特異なアミノ酸を認識する機構の一端が明らかとなった。また、非リボソームペプチド合成酵素のさらなる解析には中間体との複合体のX線結晶構造解析が必要になると考えられる。そこで、FmoA3に結合すべき中間体(ジペプチド)の合成を試みた。その結果、ジペプチドの合成に成功した。また、ビアコアを用いてNRPS間の相互作用の検出を試みた結果、ビアコアを用いてNRPS間の相互作用を定量的に評価できる可能性が示唆された。これらの結果は次年度の研究において極めて重要である。FmoA3のX線結晶構造解析を試みた。3つのドメインを持つFmoA3のN末にヘキサヒスチジンタグを、C末端にStrepタグをつけた組換えタンパク質を大腸菌を用いて調製し、Niアフィニティーとストレプトタクチンアフィニティーを用いて精製した。これを結晶化スクリーニングにかけたところ、良質な結晶が得られた。さらにX線回折実験を行ったところ3.2オングストローム程度の分解能のデータが得られた。このデータを元に構造解析および分子置換を行なった結果、FmoA3の全体構造を明らかにすることに成功した。その後、さらに結晶化条件を最適化した結果、最大2.4オングストロームの分解能の解析データを得ることに成功した。ついで、ATPのアナログである、AMP-PNPとの共結晶の構造をソーキングにより明らかにすることを試みた。その結果、AMP-PNPとの複合体の構造を約3.1オングストロームの分解能でとくことに成功した。次にalpha-methylseryl-AMPとの複合体の構造解析を試みた。精製したFmoA3をalpha-methylserineとATPと反応させ、得られた反応液を用いて結晶化スクリーニングを行なった。その結果、一つの条件で良質な結晶が得られた。次にこの結晶を用いてX線回折実験を行なった結果、alpha-methylserineとの複合体の構造を役3.3オングストロームの分解能でとくことに成功した。得られた情報を元に部位特異的変異導入を行い、alpha-methylserine認識機構を明らかとした。また、同時にFmoA3の生合成するペプチドの中間体の合成を東北大学との共同研究により行なった。その結果、中間体の合成に成功した。ビアコアやiTCを利用してNRPSの間の相互作用を検出できるか調べた結果、ビアコアを用いることでNRPS間の相互作用の評価が可能であることを示唆した。

昨年度、apo型、AMP-PNP結合型、alpha-mehtylseryl-AMP結合型、3つの状態の構造解析に成功していたため、次に中間体である、ジペプチドが結合したFmoA3のX線結晶構造解析を試みることにした。昨年度合成したジペプチド中間体アナログが結合したFmoA3の合成を酵素方により試みた。その結果、この反応の過程で、FmoA3の安定性が低下し、凝集することがわかった。反応条件を複数検討したが、現在のところ、安定なジペプチド中間体アナログが結合したFmoA3の生産条件を見つけることができなかった。今後さらなる条件検討を行う予定である。次にJBIR-126の生合成酵素であるPgpA2, A3とJBIR-34, -35の生合成酵素であるFmoA2, A3間の相互作用に関する解析を行った。ビアコアを用いてPgpA2-PgpA3間とPgpA2-FmoA3間の相互作用の強さを比較したところ、これらのKDはそれぞれ26 μM, 52 μM程度であり、期待したほど大きな違いがないことがわかった。次にPgpA2-FmoA3間、FmoA2-PgpA3間では反応が進行しない原因を探るためにドメイン置換実験を行った。その結果、CPドメインがこれらの反応が進行しない原因の一つであることが明らかになった。おそらくCPドメインと触媒(Cy)ドメイン間の相互作用の差が反応性に重要であることが示唆された。一方、CPドメイン自体は2酵素間の相互作用には重要ではないことがビアコアを用いた解析によりわかった。合成した基質をFmoA3に共有結合させ、タンパク質をまず調製する。酵素濃度や基質濃度などを検討し、最適な条件を見つける。ついで、これらのタンパク質を精製し、さらに結晶化スクリーニングにかける。得られた結晶を用いて、X線結晶構造解析を行い、その構造を明らかにする。また、さらに部位特異的変異導入を行い、NRPSの触媒メカニズムに関する知見をえる。また、同時にNRPS間の相互作用の定量化を試みる。FmoA2, FmoA3, PgpA2, PgpA3間の相互作用をまず、ビアコアにより評価する。ついで、これらのキメラタンパク質を調製し同様に相互作用を評価する。これにより、NRPS間の相互作用にNRPSのどの部位が特に重要かを明らかとする。平衡してFmoA3のN末端とC末端にそれぞれ、CFPもしくはYFPを融合した組換えタンパク質の取得を試みる。このタンパク質を用い、FLETによる解析を行い、これらのタンパク質ないのN末端とC末端の位置関係を解析する。また、これらに基質を投与した場合、上流と下流の反応を担うNRPSを添加した場合FLET強度がどのように変化をするか観察し、NRPSの構造変化と触媒反応の関係性を調べる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
デバッグ手法とツールの評価のためのベンチマーク環境の構築

(本年度の成果)ランダム変異を用いたバグ生成の対象として、Linked List処理を対象にくわえ実験を行った。生成したバグ入りプログラムを人間が分析評価し、その特徴をしらべた。さらに最終年度のまとめとして、プログラミングに関するシンポジウムで発表を行った。(研究期間全体の成果)バグ生成を自動的に行なう手法として、正しいプログラムコードにランダムに変異を加える手法を提案した。手法としてはソフトウェアテスティングにおけるFuzz Testingと同じであるが、それをバグ生成を目的とすることが新しい。生成した変異コードに対して多数の、あるいは網羅的なテストデータに対して実行し、全てではないができるだけ多数のテスト入力に正解できるものを「よいバグ入りプログラム」と定義した。この操作を多数回繰り返すことで、きわめて少数のテストだけに誤答する(ほとんど正しい)プログラムを生成できる。本研究ではソーティング(heapsort, quicksort)、リスト操作(linked list)、再帰的なプログラム(n-queen)を対象とし、いずれに対してもバグ入りプログラムを生成することができた。一方、よりよい結果を得るために一度作成したバグ入りプログラムにさらに変異を適用する遺伝的アルゴリズムの手法を行ってみたが、個々の変異が相関しあうためによい結果は得られなかった。得られたバグ入りプログラムをデバッグのベンチマークとして利用する可能性を見るために人間が分析分類を行ってみたところ、人間の目には全くの誤りに見えるにもかかわらず多数のテストに合格するプログラムが発見できた。これは非常に難しいデバッグ課題として利用が可能ではないかと考えている。1.研究費で購入したデバッグ用サーバの環境構築を行った。その上で、過去に作成してあったJavaプログラム実行可視化システムETVを動作させた。ETVは実行トレースにもとづく可視化システムで、プログラムの特定の実行過程を対象として、時間軸上を自由に移動して変数値などを吟味できる。このETVに対して、Java言語の最新版で導入された言語機能(ラムダ式など)に対応するための修正を実施した。以上によって、64GBという大容量のメモリを備えたサーバ上で、大規模なプログラムに対して実行状況の解析が可能になった。2. Quick Sortプログラムを対象として、人工的に誤りを導入したプログラムを複数用意した。導入する誤りとしては、比較演算における「以下」と「未満」の誤りのように、プログラミングにおいて発生しやすいものを選んだ。これらのプログラムをそれぞれ実行してみることで、誤動作の発生形態の違いを観察した。発生形態には、実行時エラー、無限ループ、誤った結果の出力などがふくまれ、また特定のテストデータに依存した誤動作発生もある。さらに、誤りの原因箇所を特定するための手法(変数値の出力、ステップ実行など)の有効性をプログラムごとに確認してみた。必要とする仕様(メモリ64GB、プロセッサ数2)を持つデバッグ用サーバを選定し購入した。そのサーバ上で、実行トレースを利用するプログラム実行可視化システムETVを動作させた。比較的単純なプログラムとしてQuick Sortを選び、誤りを人工的に導入したプログラム複数を作成して、その振舞いと古典的なデバッグ手法の有効性を調べることができた。以上を平成27年度の研究実施計画とてらしあわせて、おおむね順調に進展していると判断する。1. Quick Sortプログラムに含まれるpartition処理に着目し、そのうちの数ヶ所を候補として人手で選出し、テキスト処理によってそれらの箇所にあらかじめ用意した変異をランダムに加える「バグ自動生成プログラム」を作成した。変更内容としては、使用する変数の取り替え、比較演算子の取り替えなどである。生成されたプログラムにテストデータセットを与えてバグを確認できた。さらに、正解と異なった結果をもたらしたテスト件数を手がかりにすれば、どれだけ「正解に近いが誤っているか」を評価でき、これはデバッグの難しさの尺度として利用可能なのではないかとの着想を得た。これは自動生成したバグの評価に利用することが可能であると考えられる。2. Javaのマルチスレッドプログラムを対象として、スレッド間の同期を行う処理に人手で変更を加えることによりさまざまな並列処理のバグを作成する実験を行った。たとえばsynchronized構文によりガードする範囲の変更や、ガードそのものの省略などである。生成したプログラムを実行してバグの発生を確認できた。さらに、生成したバグに対して利用可能なデバッグ手法がどれくらいあるかを基準として、生成したバグの評価を試みた。たとえば、再現性がないバグの場合、バグ発生時のトレースくらいしか有効な手段はなくなるなどである。また、自動バグ検出ツールであるJava Path Finderの適用による評価も行なった。デバッグ手法の評価のための手段として、バグの難易度を利用する着想を得た。これは、難易度の高いバグとは、テストデータセットに対する出力を正しいプログラムの出力と比較したときに、不一致項目の件数が(1件以上であって)最小のものであるという仮説に基づくもので、これは機械的に判定可能である。また、機械的なプログラムの変異のために、Eclipse上のJavaプログラムのAbstract Syntax Treeの処理を習得した。前年はテキスト処理で変異を行っていたが、これにより構文的に正しい変異結果をプログラムの任意の箇所で行うことが可能になった。さらに、並行動作プログラムに対しては、人手でのバグ導入を試み、ある程度の結果を出すことができた。以上を平成28年度の研究実施計画とてらしあわせて、おおむね順調に進展していると判断する。1.Quicksort, heapsortのプログラムを対象として、ランダム変異によるバグ生成の処理を多数回(総計300万回程度)繰り返した。その結果、一部のテストのみを失敗する(バグ入り)プログラムが多数生成できたこと、いずれのプログラムについても「通過テスト数-生成度数」について似た傾向があることが確認できた。

またheapsortについては、自作のコードに加えて別の作者によるより最適化されたコードについても処理を行った。その結果から、コードの最適化の程度によって生成されるバグのテスト通過数に違いがあることがわかった。以上の結果について、国内学会で口頭発表を一件行った。その後、N-queensプログラムを対象として同様の処理を加え、こちらは入力を持たないため得られる解総数の正解との近さを指標として評価した。また、生成したバグ入りプログラムの人間による理解とデバッグについては、申請者自身を被験者として取りかかったところである。2.関連研究調査の過程で、ソフトウェアテスティングの文脈においてコードや入力に変異を与えて観察する手法Fuzz Testingが存在することを知った。この手法は近年ネットワークアプリケーションの脆弱性の検査などにも利用されている。本研究の「バグ生成」とは目的が異なるが変異を与える手法などには共通点も多く、今後有益な情報を得ることが期待できる一方、本研究のアプローチである「正しいプログラムに変異を与える」ことの新規性について再考が必要となった。プログラムにランダムな変異を与え、網羅的なテストデータを入力してテスト通過数を測定するシステムを実装した。コードの変異においては、コンパイルエラーを発生させるような無意味な変異を回避するため、ソーステキストレベルではなく構文木レベルでの変異とし、部分木の変異、複製、交換などを実装した。変異の発生については構文木の対象節点(文、変数参照、算術演算子)ごとに一定確率で変異の発生を決め、さらに可能な変異候補からランダムに選択するようにした。また、変数の可視性の破壊によるエラーを除外するため、構文木の変異の際には局所変数の管理を行うことにした。上記のシステムを購入した計算機システム上で継続的に稼働させ、テスト通過数ごとの発生度数を計測した。また、高いテスト通過数を示したいくつかのバグプログラムについて、人間による理解を試みた。その結果、たとえば同一変数が比較式の両辺に出現するなどあきらかに不自然なものが存在することが分かり、単純なテスト通過数だけではなくより人間的な尺度の必要性が示唆された。本来は29年度が最終年度であったが、研究実績の概要で記述したFuzz Testingとの関連から得られるものを活用して研究をさらに進めるため、研究計画の一年延長を申請した。(本年度の成果)ランダム変異を用いたバグ生成の対象として、Linked List処理を対象にくわえ実験を行った。