hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多量の都市型廃棄物を安全に有効利用する資源循環型CLSMの開発と実用化

制御型低強度材料(CLSM : Controlled Low Strength Material)は、近年米国で生まれた新しいセメント系埋め戻し材料の総称である。国内においても類似の材料が存在するが、未だ統一された材料基準や施工方法の確立は行われていない現状にある。本研究は、このCLSMに数種の産業廃棄物を活用し、国内で容易にかつ安全に使用できる環境を創造することを大きな目的としている。初年度である15年度から3年間でCLSMの物性試験、耐久性試験、および現場施工に関する取り纏めとデータの不足を補う追加実験を行った。物性試験では、都市ゴミ溶融スラグと砕石粉、および規格外フライアッシュを用いたCLSMの物性試験を行った。試験の結果、これらの産業廃棄物および産業副産物を用いたCLSMの物性は実際の施工材料として十分満足する性状を示した。耐久性試験においては、寒冷地におけるCLSMの施工と強度進展特性を把握し、低温下における養生の影響について検討を行った。さらに、繰返し掘削による材料の再利用に関する検討を行い、再利用による物性の低下があるものの、再利用が可能であることが確認された。溶出特性についても、CLSMが土壌環境基準に適合する材料であるかどうかの確認を行った。3年間の研究成果から、多量の都市型廃棄物を安全に有効利用する資源循環型CLSMの開発が実現され、具体的な実用化が果たされた。制御型低強度材料(CLSM)は、近年米国で生まれた新しいセメント系埋め戻し材料である。本研究は、このCLSMに数種の産業廃棄物を活用し、国内で容易に使用できる環境を創造することを大きな目的としている。初年度である今年度では、CLSMの物性試験、耐久性試験、および現場施工を案施した。物性試験では、都市ゴミ溶融スラグと規格外フライアッシュを用いたCLSMの物性試験を行った。さらに、繰り返し掘削による材料の再利用に関する検討を行い、再利用による物性の低下があるものの、再利用が可能であることが確認された。実際の現場施工が行われ、日本国内においても合理的かつ経済的なCLSMによる埋め戻し施工が可能であることが確認された。なお、現場施工に関しては、その詳細について添付の参考文献2編において取り急ぎ報告を行った。制御型低強度材料(CLSM : Controlled Low Strength Material)は、近年米国で生まれた新しいセメント系埋め戻し材料である。国内では類似の材料は存在するが未だ統一された材料基準や施工方法の確立は行われていない。今年度は、研究2年目の年度であり、初年度実施したCLSMの物性試験、耐久性試験、および現場施工に関する取り纏めとデータの不足を補う追加実験を行った。国内では類似の材料は存在するが未だ統一された材料基準や施工方法の確立は行われていない現状にある。

本研究は、このCLSMに数種の産業廃棄物を活用し、国内で容易に使用できる環境を創造することを大きな目的としている。今年度が本研究の最終年度である。初年度実施したCLSMの物性試験、耐久性試験、および現場施工に関する取り纏めとデータの不足を補う追加実験を行った。物性試験では、都市ゴミ溶融スラグと砕石粉、および規格外フライアッシュを用いたCLSMの物性試験を行った。試験の結果、これらの産業廃棄物および産業副産物を用いたCLSMの物性は実際の施工材料として十分満足する性状を示した。耐久性試験においては、寒冷地におけるCLSMの施工と強度進展特性を把握し、低温下における養生の影響について検討を行った。さらに、繰り返し掘削による材料の再利用に関する検討を行い、再利用による物性の低下があるものの、再利用が可能であることが確認された。溶出特性についても、CLSMが土壌環境基準に適合する材料であるかどうかの確認を行った。最終年度における総まとめとして、多量の都市型廃棄物を安全に有効利用する資源循環型CLSMの開発を本研究では実施し、その実用化が可能であることが確認された。
ヒトプレB細胞分化におけるコア2GlcNac転移酵素遺伝子の転写制御機構の解明

プレB細胞表面にはシアリルルイス-X(sLeX)糖鎖抗原が存在し、血管内皮細胞へのE-セレクチン依存性細胞接着に関与している。sLeX発現は糖転移酵素を通して糖鎖遺伝子の間接支配を受けるが、プレB細胞の場合、表面sLeX発現レベル調節の律速酵素は末端のフコース転移酵素FucT-VIIではなく、コア構造を作るコア2GlcNAc転移酵素(C2GnT)である。さらにsLeX糖鎖構造は分子量150kDaの特定糖蛋白質(gp150)上のO-グリコシド糖鎖末端に好んで生合成される。本研究で、我々はさらに次のことを明らかにした。1.C2GnTにょるsLeX発現レベル調節は、扁桃由来のB細胞活性化においても示された。2.プレB細胞分化におけるC2GnT転写調飾には、Spl family、GATA、NF-IL6などの転写因子群、とりわけSp2とGATA3が関与していることが示唆された。すなわち、(i)C2GnTのダウンレギュレーションに先だって、Sp2発現が一過性に増加する。さらにそのあとGATA3発現がアップレギュレーションする。(ii)ルシフェラーゼリポーター遺伝子を使った実験から、C2GnT遺伝子上流の転写調節領域に存在する、三つのTATAボックスのうち、転写開始点に一番近い-182のTATAを含む部分欠失ミュータントが、最も高い一過性転写活性を示した。(iii)TATA(-182)の近傍に存在する、Sp gene familyまたはGATA結合コンセンサス部位に、人工的変異を挿入することによって、一過性転写活性が1O倍以上になる。(iv)ゲルシフトアッセイでSp gene family及びGATA3の結合が示されている。これらからSpl gene family及びGATA3が負の調節因子となっていることが判明した。以上の結果は欧文誌に発表済みないし発表予定である。
物質循環計測を見据えた多次元NMRメタボノミクス法の開発

今年度は当該グループのオリジナル技術である高等植物の安定同位体標識技術を高度化し、特にモデル樹木・ポプラにも適用化した。茎からの寒天培地へのルーティングで、1ヶ月程度で葉から光合成由来の13CO2、あるいは根圏からの13C6-glucoseの取り込みがプラトーに達する事が分かった。この安定同位体標識技術を活かし、木質系バイオマスに必要とされる、固体状態での物性、構造解析を固体多次元NMR法を用いて展開する事が可能となった。一方で木質系バイオマス分解系として、シロアリ・腸内微生物分解系についても順調に代謝データが得られ始めてきた。特に、このような非モデル生物系ではゲノム情報から要素還元的にアプローチする事が難しいので、着目酵素の発現を抑えるRNAi技術と安定同位体標識技術を組み合わせる事により、微生物から宿主への複合生物間相互作用の観測を可能とした。他方で消費者の系としてマウスについても、新規の代謝データが得られている。例えば、動脈硬化に感受性の高い系統とそれ以外の系統を比較すると、腸内細菌の発酵産物である酢酸、乳酸、プロピオンが顕著に異なる事がわかった。これは腸内細菌との生物間相互作用が、動脈硬化との何らかの因果性をもっている可能性を示唆している。一方で、別の実験として、植物繊維の割合が高いコムギフスマを飼料中に混ぜたものと、コントロールとして通常通りの餌を摂食させたマウスの尿、糞の代謝産物を計測すると、尿でも摂食効果が顕著に現れる事がわかった。上述のように、生態系における生産者(植物)、消費者(動物)、分解者(微生物)の三者の相互作用を多次元NMRメタボノミクス法により計測する事で、生物間における物質循環を解析する目処が立った。これらの成果については、既にJ.Biol.Chem.誌、Phytochem..誌への受理が決まりつつある他、5報の論文を執筆中である。生存圏における物質循環を計測しようと考えた場合、生態系における生産者(植物)、消費者(動物)、分解者(微生物)の三者を系として扱える事が望ましい。申請者はシロイヌナズナをはじめとする植物の代謝研究を高分解能NMR法で遂行する方法論を開発し、世界で初めて多次元NMRメタボロミクスを提唱した。その鍵となる技術は生物個体への均一安定同位体標識化であり、放射性同位体と異なり動植物でも安全な安定同位体の動向を追跡する事により、生物間を渡る代謝産物の物質循環計測が可能となる。今年度は従来のシロイヌナズナに加えて、イネ、小松菜、ニンジン、ツルムラサキ、大豆、金時豆といった幅広い植物の^<13>C均一標識化を可能とした。さらに、これらの中でも成長が早くバイオマスとして多く収穫可能な^<13>C-小松菜を用いたマウス餌を作成する事により、マウスへの安定同位体標識化も可能となった。マウス代謝ゲージを用いた尿や糞の^<13>C-HSQC計測からは、非標識時の10倍以上もの交差シグナル観測が可能となっており、狙い通り生産者から消費者への代謝動態が追跡できた。同様の^<13>C-植物摂食の試みは、オオシロアリを用いて行なった。これはセルロースをはじめとする難分解性高分子の分解者としての評価である。^<13>C-小松菜から作成した^<13>C-セルロースをオオシロアリに摂食させると、腸内原生微生物等の作用により、酢酸をはじめとする有機酸に分解代謝されていく事がわかった。一方、異種核多次元NMR計測のための均一安定同位体標識技術も高度化し、前述の高感度NMR装置を利用して1000以上もの^<13>C-HSQC相間シグナル(予想代謝物数300-400程度)観測が可能となった。これらを物質同定するJavaソフトウエア、SpinAssignの開発も進行している。これらの成果は次項以降の発表に加え、現在2報の原著論文、3報の総説として執筆中である。

上述のように、生態系における生産者(植物)、消費者(動物)、分解者(微生物)の三者の相互作用を多次元NMRメタボノミクス法により計測する事で、生物間における物質循環を解析する目処が立った。これらの成果については、既にJ.Biol.Chem.誌、Phytochem..誌への受理が決まりつつある他、5報の論文を執筆中である。
重症心身障害児・者の主観的満足度としてのQOLの評価法の開発に関する研究

重症心身障害児・者(重症児・者)の主観的満足度としてのQOLの評価に際し、言語の理解のわずかでも可能な重症児・者と不可能な重症児・者に分けて検討した。言語理解のわずかでも可能な、知的発達年齢1歳半以上の重症児・者に対して、言語による質問と本人からの自己表現によるQOLを評価した。方法は、WHOQOL-26を改変した6領域39の質間よりなる評価用紙を開発作成し、まずその信頼性と妥当性について検討した。次いで、運動機能障害を併せ持つ知的障害児90例を対象に、本人のQOLを評価した。回答の方法は「言語」によるもの、「表情」や「視線」によるもの、「身体の動作」や「緊張」によるものなどそれぞれの障害の状態に応じて様々な方法が認められた。総得点では知的障害重度群で、知的障害軽度群より有意に低い得点を示した。領域別に見ると「全般」、「自己表現」、「意思決定や選択」、「機会」で重度群は軽度群より得点が低かった。これらの結果より、関わり手の理解不足や選択や機会の提供の不十分さはQOLに影響を及ぼすことが明らかになり、よりよいサポートシステムの開発が必要と考えられた。言語による理解が不可能な重症児・者に対しては、微笑行動などの表現を評価項目としたQOLの測定が可能と考えられ、日常生活場面に参加観察しエピソード記録から認識や感情表現を解釈した。多くの場面で微笑行動が観察されいずれも様々な自己表現を行っていた。解釈をもとに行った発達的評価は通常の発達検査結果より高い段階のものが認められ、認識や人との関わりの分野において著明であった。ここで用いた微笑行動を手がかりとした本人の意思や満足度などの精神活動を推定する方法は、表現手段の限られた重症心身障害児の主体的表現を捉えることができ、コミュニケーションやQOLを豊かにする可能性が考えられた。今後、より正確で簡便な評価尺度の開発が必要と考えられた。重症心身障害児・者は重度の運動機能障害と知的障害を併せ持ち、自己の意思や要求を表現する方法や手段が極めて限られているため、主観的QOLを評価することは困難である。今年度は1)重症心身障害児・者に対する関わりと観察の中で彼らの自己表現の方法やその意味について調査し、QOLを評価するための指標について検討した。また、2)国際シンポジウム等に出席して、障害児のQOLとその評価方法等について資料を収集した。1)観察等により、自己表現の方法としては、言語、「アー」「フーン」等の発声、微笑等の表情、視線、四肢の動作による「yes」「no」、身体の緊張などが観察された。知的発達年齢1歳半以上の者は、解りやすい言語による質問と、本人からの上記のような自己表現による回答が可能であり、評価項目や評価基準の検討が必要と考えられた。そこで、言語による理解可能であった者に対し、WHOQOL-26に基づく質問を試み、分析した結果は第29回日本重症心身障害学会にて「学齢期における重症心身障害児のQOL評価に関する検討」として報告した。言語による理解が不可能な者に対しては、日常生活場面での微笑行動等を評価項目として、QOLを評価する方法が可能と考えられた。なお、その際には重度障害児のQLOの向上に1980年頃より欧米で試みられているスヌーズレンを用いた反応の評価が有効と思われ、来年度の検討事項とし、用具等を購入した。

2)資料の収集として、国際ワークショップ・シンポジウム「痴呆性高齢者対策と地域ケア」に参加し、主にアメリカ合衆国における成人知的障害者対するQOLの評価について資料を収集した。次いで、日本スヌーズレン協会の主催する、ワークショップと施設見学に参加し、重度の障害児のQOLを評価する際に有用と思われる、評価項目や評価基準に関する資料を収集した。自己の意思や要求を表現する方法や手段が極めて限られている重症心身障害児・者の主観的QOLを評価するため、今年度は1)言語理解の可能な重症心身障害児・者のQOLの調査、2)言語理解の不可能な重症心身障害児・者のQOLの評価のための準備段階として、正常乳幼児の微笑行動と自己表現の関連についての検討、3)国際学会、国際シンポジウム等に出席して障害児のQOLについての資料収集等を行った。1)知的発達年齢1歳半以上で、言語による質問と本人からの自己表現による回答が可能な重症心身障害児に対して、昨年度の研究結果の延長として、WHOQOL-26に基づく質問紙を開発作成し、その信頼性と妥当性について検討した。結果は第29回日本重症心身障害学会にて「学齢期における重症心身障害児のQOL評価に関する検討2」として報告した。16年度は、対象数を増やしてQOLの評価を行う予定である。2)言語による理解が不可能な重症心身障害児・者に対しては、日常生活場面での微笑行動などの表現を評価項目としたQOLの測定が可能と考えられた。そこで、評価基準を作成するため、正常乳児の微笑行動の観察を行い微笑行動の発達を検討し、その中に見られる自己表現の意味について検討した。その結果は、現在論文作成中である。16年度は、作成した評価基準をもとに、言語理解の不可能な重症心身障害児・者のQOLの評価を試みる予定である。自己の意思や要求を表現する方法や手段が極めて限られている重症心身障害児・者の主観的QOLの評価方法を開発するため、今年度は1)言語理解の可能な重症心身障害児・者のQOLの調査、2)言語理解の不可能な重症心身障害児・者の微笑行動を手がかりしたQOLの評価、3)国際学会でのQOLについての資料収集等を行った。概要を下に示す1)運動機能障害を併せ持つ知的障害児90例を対象に、本人のQOLを評価した。方法はWHOのQOL-26を改変した6領域39の質問よりなる評価用紙を作成し3件法を用いて回答を求め得点化し分析した。回答の方法は「言語」によるもの、「表情」や「視線」によるもの、「身体の動作」や「緊張」によるものなどそれぞれの障害の状態に応じて様々な方法が認められた。総得点では知的障害重度群で、知的障害軽度群より有意に低い得点を示した。領域別に見ると「全般」、「自己表現」、「意思決定や選択」、「機会」で重度群は軽度群より得点が低かった。これらの結果より、関わり手の理解不足や選択や機会の提供の不十分さはQOLに影響を及ぼすことが明らかになり、よりよいサポートシステムの開発が必要と考えられた。本結果は現在論文作成中である。また、第1回アジア太平洋知的障害学会(平成17年6月台北)にて発表予定である。2)微笑行動を手がかりとして重症心身障害児・者の主体的活動や発達段階の評価を試みた。方法は日常生活場面に参加観察し、エピソード記録から認識や感情表現を解釈した。多くの場面で微笑行動が観察されいずれも様々な自己表現を行っていた。解釈をもとに行った発達的評価は通常の発達検査結果より高い段階のものが認められ、認識や人との関わりの分野において著明であった。
生活習慣病予防に向けた月経周期と血清脂質特性に関する基礎的検討

閉経後女性は女性ホルモンであるエストロゲンの欠乏により,動脈硬化や心疾患の発症率が高まると言われている。エストロゲン欠乏の諸症状に対して女性ホルモンの補充療法があるが,最近は経口投与による補充により,中性脂肪値の上昇や冠動脈疾患の発症を助長する小型化した低比重リポタンパク(LDL)が増加することが明らかとなった。しかしこれらは経口投与量を半量にすると回避された。以上から,エストロゲンの血中濃度や吸収・代謝経路の違いが,LDLの小型化に影響している可能性が示唆される。閉経前の女性も内因性エストラジオール(E_2)値は大きく変動しており,月経周期では排卵期に,妊娠期は妊娠週数に伴いE_2値は高値になる。LDLの小型化がE_2濃度依存的であるならば,月経周期や妊娠に伴うE_2濃度変動は脂質代謝に影響を及ぼす可能性が考えられる。また経口・経皮投与における代謝経路の違いに由来するならば,経皮投与および内因性E_2は経口投与と代謝経路が異なるため,月経周期や妊娠に伴うE_2濃度変動は脂質代謝に影響を与えないと考えられる。そこで本研究は,妊娠後期や正常月経周期の排卵期にある女性を対象に,E_2と血清リポタンパクの関係を明らかにすることを目的に実施した。平成18年度は妊娠後期の日本人女性30名(2041歳),本年度は正常月経周期をもつ日本人女性18名(2233歳)を対象とし,HPLC法によりリポタンパク質の解析を行った。妊娠後期のE_2値は著しく上昇しており,それに伴ってLDLの小型化が認められた。排卵期のE_2値は上昇したがLDLの小型化は認められなかった。妊娠後期のE_2値は排卵期のE_2値より数十倍数百倍高値になっており,E_2濃度の違いによりLDLの小型化が認められたと考える。以上をふまえ,今後は閉経前女性および閉経後女性への保健指導介入や,より効果的なヘルスプロモーションの展開方法を検討していく。閉経後女性は、動脈硬化や心疾患の割合が増加すると言われており、これらは女性ホルモンであるエストロゲンの欠乏によるものと考えられている。エストロゲン欠乏による諸症状に対して女性ホルモンの補充療法が行われてきたが、最近では、経口投与によるエストロゲンの補充により、中性脂肪値の上昇や、冠動脈疾患の発症を助長する小粒子化した低比重リポタンパク(LDL)が増加していることが報告されている。しかしこれらは経口投与量を半量にしたところ回避された。エストロゲンの血中濃度や、吸収・代謝経路の違いが、LDLの小粒子化に影響している可能性が示唆されている。閉経前の女性においても内因性エストラジオール(E_2)値は大きく変動しており、月経周期をもつ女性は排卵期に、妊婦は妊娠週数に伴いE_2値は高値になる。LDLの小粒子化がE_2濃度依存的であるならば、月経周期や妊娠に伴うE_2濃度変動は脂質代謝に影響を及ぼす可能性が考えられる。また経口・経皮投与の代謝経路の違いに由来するのであれば、経皮投与および内因性E_2は経口投与と代謝経路が異なるため、月経周期や妊娠に伴うE_2濃度変動は、脂質代謝に影響を与えないと考えられる。そこで本研究は、妊娠後期や正常月経周期をもつ女性を対象に、内因性エストラジオールと血清リポタンパクの関係を明らかにすることを目的とし実施した。本年度は、妊娠後期の20歳41歳の日本人女性30名を対象とし、研究への参加承諾を得て実施した。基礎情報を収集し、次に血清を用いてエストラジオール値と高感度CRP値、HPLC法によりリポタンパク質の解析を行った。現在、各測定結果の分析をすすめている。今後は、正常月経周期をもつ女性を対象としてデータ収集・分析を行い、閉経前女性および閉経後女性入の保健指導介入や、より効果的なヘルスプロモーションの展開方法を検討していく。

平成18年度は妊娠後期の日本人女性30名(2041歳),本年度は正常月経周期をもつ日本人女性18名(2233歳)を対象とし,HPLC法によりリポタンパク質の解析を行った。妊娠後期のE_2値は著しく上昇しており,それに伴ってLDLの小型化が認められた。排卵期のE_2値は上昇したがLDLの小型化は認められなかった。妊娠後期のE_2値は排卵期のE_2値より数十倍数百倍高値になっており,E_2濃度の違いによりLDLの小型化が認められたと考える。以上をふまえ,今後は閉経前女性および閉経後女性への保健指導介入や,より効果的なヘルスプロモーションの展開方法を検討していく。
生体内における高感度・小型力計測システム

本研究は圧電効果の原理に基づき、半導体微細加工技術を用いて生体内における応力を即時に計測するための高感度・高応答速度・小型力計測システムを作製し、評価するものである。力計測システムは水晶力センサ部、高周波共振回路、実装部から構成されている。1.水晶力センサ部マイクロファブリケーション技術を用いてATカット水晶を小型化に加工した。水晶振動子は、16.1MHzの狂信周波数および16,000のQ値を持ち、コンダクタンス特性とインピーダンス特性が観察され、振動子の共振値計測に十分な値を備えることを確認した。2.高周波共振回路ガラスエポキシ基板上を用いて高周波共振回路を設計し製作した。水晶振動子を共振回路に接続し、共振周波数が増幅させ、持続した発振を得ることが確認された。3.実装部剛性のある外装材料を使用し、間接の動作中に測定を行うにもかかわらずセンサが変形せずに高い安定性を保つことを構築した。微細パーツの組立、センサの固定方法、及びノイズを抑制することについて検討した。固定が必要となる骨をはじめ、筋肉など生体内のどこでも使用できるようにするため、測定部の形状を針状にし、生体内における多様な応用ができるように設計した。外力と水晶の狂信周波数変化関係を調査した。振動子の周波数安定性について、実験結果により、荷重付加または無付加に関わらず、荷重印加時間40minでのセンサ出力の変動は±0.4ppmであった。本センサは外力の計測が可能であり、時間に対する安定性を備えていることが解る。ここで、出力変動は力に換算して最大0.36Nであった。
子どもの工作機械使用の技能教授法開発における自己動作フィードバックの機能と役割-親の知識観・技能観に関する調査を前提として-

ポ-タブル・ビデオカメラを活用し、学習者にカメラを意識させないようにこころがけ、とりあえず二元的レベルで技能動作を収録した。各個人の技能精度(いわゆるできばえ)および経過時間を測定するとともに各個人の技能動作の諸特徴、全体的な傾向を動作解析機器を駆使し、分析し、後日、同学習者を対象に自らの動作を見せながら指導することによって、動作フィードバックの過程をつくる。その結果、技能動作の変化、不変化の諸点の分析と技能精度(いわゆるできばえ)および経過時間との関連を考察した。小学生であれば、3年生、5年生あたりで技能獲得の可能性と技能発揮のレベルに特徴がみられることが指摘されている。しかしながら、工作機械を使っている自分の動作をフィードバックしつつ、学習を積み重ねていく際の機械操作技能獲得の変化に着目した研究は管見の限りではみられない。具体的には、木工旋盤と電動糸鋸盤を対象とした。技能動作機器として、ストツプ・モーション機能に比較的優れたビデオデッキ(編集機能をもつもの)で、動作画像を写真状態で取り出すためのビデオ・プリンタを併用した。成果として、小学校低学年においても木材加工に関する工作機械への恐怖感はほとんどなく、木工機械のなかでは比較的低回転数の木工旋盤と上下運動による切削である電動糸鋸盤作業には積極的に取り組めることがわかった。また、小学校4年生あたりから自らの機械操作動作をビデオモニターによってフィードバックすることによって確実に技能水準が向上することが認められた。いわゆる口頭による技能教授と視聴覚機器を駆使した技能教授との役割分担の一端を明らかにできたといえる。道具使用のみならず機械操作技能においても動作を伴うため、動的分析の有効性を一定程度明らかにし得た。
ペスト菌エンドトキシンの化学構造および感染における役割

ヒトに極めて強い病原性を示すペスト菌(Yersinia pestis)の病原性発現機構を菌のエンドトキシン(LPS)の構造の特殊性から研究した。Y.pestis Yreka株を生育至適温度の27°Cと、感染時の温度である37°Cで培養し、LPSの構造を質量分析などにより比較した。その結果、リピドA中の脂肪酸が、リピドA-27°Cでは3-OH-C_<14:0>に加えてC_<12:0>やC_<16:1>が多く、1分子中脂肪酸が3分子から6分子結合していた。これに対してリピドA-37°CではC_<12:0>が少なくC_<16:1>は検出されなかった。また1分子中脂肪酸は3分子ないし4分子であった。糖鎖に関してもLPS-37°Cでは、より単純な糖鎖構造になることが明らかになった。次にこれらのLPSの、ヒトおよびマウス由来マクロファージ系細胞に対する活性化能をTNF産生活性を指標にして調べた。その結果、LPS-37°CはLPS-27°Cに比べてマクロファージ活性化能が低いことがわかり、その差はヒトの細胞でより顕著に見られた。これらの結果から、37°CにおいてはLPSが単純な構造に変化し、免疫活性化能が低下することで、ペスト菌の体内での増殖を容易にすると推定された。さらに、リピドAにおけるC_<12:0>とC_<16:1>の増減を遺伝子レベルで解明するため、これらの脂肪酸を転移する酵素遺伝子のクローニングを行った。大腸菌の遺伝子と相同性をもつ領域をY.pestisおよび近縁のY.pesudotuberculosisの公開されているゲノムデータから検索した結果、相同性の高い2カ所の領域が見いだされた。そこでY.pesudotuberculosisの遺伝子をPCRで増幅し、クローニングした。ゲノムデータによると2菌種の相応する遺伝子産物のアミノ酸配列は完全に一致するが、リピドA中の脂肪酸の種類と温度変化のパターンは異なっていた。従って、温度に伴うリピドAの変化は脂肪酸転移酵素の発現量と活性によるのではなく、基質となる脂肪酸の生合成系からの供給量の変化に依存するのではないかと推定された。ペスト菌(Yersinia pestis)Yreka株を用いて、エンドトキシン(LPS)中のリピドAの化学構造およびその培養温度による変化を調べた。LPSから弱酸加水分解によりリピドAを調製し、MALDI-TOF MSによる質量分析を行った。その結果、27°C培養菌のリピドAでは主要な脂肪酸である3-OH-C_<14:0>に加えてC_<12:0>やC_<16:1>が比較的多く、リピドA1分子中の脂肪酸の合計が3分子のものから6分子のものまでが検出された。これに対して37°C培養菌のリピドAではC_<12:0>が少なく、C_<16:1>は検出されなかった。リピドA1分子中の脂肪酸は3分子ないし4分子のものが大部分であった。

4-アミノアラビノース(Ara4N)の量にも変動がみられ、27°C培養菌のリピドA中に、より多くのAra4Nが検出された。さらに、LPSのコア糖鎖についても培養温度による構造変化を調べた。その結果、内部コアのKdo領域に存在するKdo類似糖であるKoが37°C培養時にはほとんど検出されなくなることがわかった。次に、これらのLPSおよびリピドAによる、ヒトおよびマウス由来クロファージ系細胞の活性化をTNF-α産生誘導能を指標にして調べた。その結果、37°C培養菌のLPSおよびリピドAは27°C培養菌のものに比べてTNF-α産生誘導能が低いことが明らかになった。しかもその差はヒトマクロファージ系細胞においてより顕著(約100分の1の活性)であった。これらの結果から、ペスト菌は宿主への感染温度である37°Cにおいて、より単純な構造のLPSを生合成し、その結果としてリピドA中の脂肪酸分子数が減少し、このためマクロファージ活性化能が低下することが明らかになった。このようなLPSの免疫活性化能の低下が、ペスト菌のヒトに対する強力な病原性と密接に関連しているのではないかと推定された。前年度の研究により、ペスト菌(Y.pestis)は37°Cの培養温度においてC_<12:0>およびC_<16:1>の量が減少したリピドAを生合成する。ことが明らかになった。このようなリピドAはマクロファージ活性化能が低いので、これらの脂肪酸転移酵素の培養温度による発現調節がペスト菌の病原性と深く関わっていると推定された。そこでこれらの酵素をクローニングしてその性質を調べるために、公表されているY.pestis C092株の染色体全塩基配列から遺伝子解析ソフトを用いて、大腸菌のC_<12:0>、あるいはC_<16:1>転移酵素遺伝子と相同性を有する領域を検索した。その結果これらの遺伝子と同様の長さ(約900bp)と高い相同性(約60パーセント)を有する領域2カ所が見いだされた。ペスト菌の染色体を鋳型としてPCRにより遺伝子を増幅したところ、これら2カ所の領域をそれぞれ含む2種類の約1.2kbの産物が得られた。実際の遺伝子発現に関する研究はペスト菌と最も近縁で低病原性のY.pseudotuberculosis血清型O1b株を用いて行うこととした。本菌のリピドAには非ヒドロキシ脂肪酸としてC_<12:0>とC_<16:1>が含まれるので、最初にこれらの脂肪酸の培養温度による変動を調べたところ、27°Cに比べて37°CではC_<16:1>は変動しないがC_<12:0>は減少することがわかった。従ってC_<12:0>のリピドAへの取り込みにはペスト菌と同様の発現調節機構が働いていると考えられた。Y.pseudotuverculosisの染色体DNAを鋳型としてペスト菌に用いたDNAプライマーを用いてPCRを行ったところ、ペスト菌の場合と同様の長さの2種類のフラグメントが増幅された。従って両菌は極めて類似した塩基配列を持った脂肪酸転移酵素遺伝子を有することが明らかになった。これらのフラグメントをpUC119に接続し、大腸菌を形質転換することによりクローニングした。これにより脂肪酸転移酵素遺伝子の培養温度による発現調節機構を調べるための材料を揃えることができた。前年度までの研究で、ペスト菌(Yersinia pestis)のリピドA生合成に働くと思われる2種類の脂肪酸転移酵素遺伝子と類似の遺伝子領域がYersiniapseudotuberculosisにも存在することがわかり、クローニングされた。
自己修復性能を有する接着システムの開発～修復物の長期耐久性向上への新しい展開～

現代の歯科治療において、“Minimal Intervention(MI)"コンセプトに基づく接着性レジンとコンポジットレジンを用いた接着歯科治療は、臨床的有効性と経済的効率性の観点から患者に大きな利益をもたらすことから世界中で幅広く普及している。また、近年の目覚ましい接着歯学の発展に伴い、高い接着強さを示す接着性レジンや強度の高いコンポジットレジンが開発され臨床応用されているが、その長期耐久性については未だ研究、改良が必要である。過去の報告によると、コンポジットレジンにフルオロアルミノシリケートガラスとポリアクリル酸を内部に含むシリカマイクロカプセルを含有させることで、コンポジットレジン内に微小な亀裂が生じた際に流入した水によりシリカマイクロカプセル内部に含まれていたポリアクリル酸が流出し、フルオロアルミノシリケートガラスと反応し、グラスアイオノマーセメント(GIC)を形成、そのイオン結合によりコンポジットレジン内のポリマーが自動修復することが可能だといことが明らかになっている。そこで本研究の目的はこのポリマーの自動修復システムを接着システムに応用することで接着性レジンの長期耐久性を向上させ、さらなる接着歯科治療の発展に寄与することである。前年度においては、接着性モノマーとポリアクリル酸含有のシリカマイクロカプセルを様々な濃度で配合し試作した接着性レジンについて抜去歯を用いた微小引っ張り試験を行い臨床応用が可能な適性濃度を検討した。今年度も検討を続け、機会的強度や特性、長期耐久性の検討も行う予定である。本研究の目的はポリマーにおける自己修復システムの接着システムへの応用という新しい試みであるため、接着性レジンの適性な成分、濃度の検討が最も重要である。そのため現在はまだ基礎研究の段階ではあるが、今後は具体的な機会的特性や長期耐久性なども検討を行うことで研究成果を発表していく予定である。本研究では、接着性レジンの長期耐久性向上のために、ポリマーの自己修復システムを応用するという新しい手法を試みており、現在はまだ基礎研究の段階であるが、将来的には長期耐久性に優れた新しい接着システムの開発へと展開していく予定である。

そのため現在はまだ基礎研究の段階ではあるが、今後は具体的な機会的特性や長期耐久性なども検討を行うことで研究成果を発表していく予定である。本研究では、接着性レジンの長期耐久性向上のために、ポリマーの自己修復システムを応用するという新しい手法を試みており、現在はまだ基礎研究の段階であるが、将来的には長期耐久性に優れた新しい接着システムの開発へと展開していく予定である。研究機器のレンタル期間等に変更があったため次年度使用額が生じたが、今年度さらに研究機器のレンタル、また購入機器のメンテナンスや消耗品にしようする予定。予定よりもやや計画が遅れているため、次段階に使用予定の機械や材料の購入が遅れているため
日本絵画の〈復元〉に関する基礎的研究

日本絵画の復元について、関連機関や企業、技術者らへの取材を行うとともにこれまでの事例についての基礎調査を行い、現状と問題点の把握に努めた。また、復元事業で先行する他の文化財分野についても取材と調査を進め、比較検討を行った。並行して、今後復元研究に携わる可能性のある学生や若手の美術史研究者を対象に、絵画技法材料・分析科学・歴史学など多分野にまたがるテーマを取り上げたワークショップを開催し、人材育成とネットワーク作りを進めた。代表者・分担者・連携研究者による全体研究会を実施し、基本的な研究方針を決定した。現代における日本絵画の復元の実態を把握するため、初年度は文化庁、東京芸術大学、愛知県立芸術大学などの関係機関への取材を行った。日本絵画の復元については文化庁が事業としての取り組みをはじめて間もなく、報告書の形式や復元の判断基準も曖昧である等、現状の問題点を確認することができた。美術大学では、主に外部からの受託研究や博士研究として復元模写制作が行われており、文化財保存や個人の研究としての復元事例が蓄積されつつある。今後は目的に応じた復元手法や成果物の公開と活用手法にも意識を向ける必要性を確認した。取材先では本研究二年度以降の研究会やシンポジウムへの協力を要請し、関係機関との連携を強めることができた。今年度は文化財保存、教育研究、宗教的な目的による復元事例について概要を把握することができたため、次年度以降は商業や観光資源的な要素の強い復元事例、それらの制作に関わる企業等の取材を行い、復元に関して総合的な基礎調査を進める計画である。その他、実際に文化財の復元展示を公開している施設の見学、情報開示や一般の評価・理解についての調査を目的として、鶴林寺太子堂壁画、名古屋城障壁画、青蓮院青不動の復元展示を視察し、資料を収集した。具体的な作品の復元に関しては東京芸術大学による法隆寺金堂壁画の復元、琉球王朝御後絵復元プロジェクトと連携し、復元手法や公開方法の検討を行った。また、代表者および分担者の編著作『日本画名作から読み解く技法の謎』の中で、日本絵画の復元に関わる諸問題と意義について論述した。初年度に引き続き、復元事例に関する基礎調査と資料の収集を進めた。特に初年度に十分な調査を実施できなかった、商業や観光資源的な要素の強い復元事例およびデジタル復元の事例について概要と現状課題の把握に努めた。人の手による復元模写と、CGによるデジタル復元では制作目的や完成した復元の用途が異なる場合が多いが、精度については互いの長所・利点を組み合わせることでより原本の形態に忠実な復元が可能となることを再確認した。絵画材料の質感や量感、色彩の復元についてもアナログとデジタルの折衷手法は有効と考えられ、最先端の復元研究現場では着実に技術革新が進められていることが実感できた。デジタル復元に関しては技術者に取材を行い、特に線描のトレース方法について研究報告としてまとめた。また、今年度は実技系研究者が主導して日本絵画の材料に関するワークショップを開催し、復元に携わる研究者のネットワーク作り、教育普及に取り組んだ。美術史や文化財科学など学術系の若手研究者や学生を対象とし、特に色料と金属材料の特性および使用方法について実演を交えた解説を行った。ワークショップ参加者には印象に残っている復元事例や今後復元を望む絵画作品についてのアンケートを行ったが、源氏物語絵巻や紅白梅図屏風など、テレビ番組等で話題となった復元事例への注目度が高い結果となった。なお、ワークショップの内容と成果については2016年6月の文化財保存修復学会ポスター発表により報告する予定である。他分野の専門的技術を体験する機会としてこうしたワークショップはシリーズ化したいと考えており、最終年度には科学調査や史料の利用に関するワークショップ開催を計画している。今年度は代表者の出産・育児に関わる都合で遠方での取材・調査を行うことが難しく、資料収集と分析および東京でのワークショップ開催を軸に研究を進めた。ワークショップには復元制作に携わる機関や大学関係者の参加が多くあり、会場で交流を深めることができたため、改めて現地取材の申請やシンポジウムの共催提案を行うことができた。学会発表等で本研究の認知度も高まっており、研究全体はおおむね順調に進展したといえる。最終年度も引き続き、復元に関わる関連機関や技術者への取材および多分野にまたがるテーマを取り上げたワークショップの開催を継続した。研究期間中に行った基礎調査とワークショップの成果報告については、文化財保存修復学会全国大会にて発表を行った。28年度のワークショップとしては、12月に「資料調査の方法を知る」と題して科学調査に関する基礎講義および機材を用いた調査のデモンストレーション、またトレース図の作成と活用、文献資料の検索方法や活用方法についての演習を各分担者が講師を担当して開催した。前年度に開催したワークショップから継続して参加する学生・研究者も多く、他分野の基礎事項を学ぶ機会を提供しながら、復元に関わるネットワーク作りの一助としての成果もあげることができたと考えている。ワークショップを通じて復元事業を受注している企業や工房の関係者とも交流を深めることができた。また、1月には分担者が代表を務める若手研究(B)「『和様』をめぐる実証的研究ー模倣と変容の位相」との共催ワークショップ「絵画材料としての藍について」を開催した。絵画復元の際にも重要となる色料のひとつである藍の抽出法について、研究発表と実演を行い、多くの研究者の関心を集めた。本研究課題の後継研究として29年度から「日本絵画の復元研究における復元根拠の再検討」が採択されたが、今後も若手研究者や学生を対象とした基礎的な講義と、研究者を対象とした応用的・専門的なテーマのワークショップを並行して開催し、復元に関するネットワークを広げていく計画である。

本課題の研究期間を通じて、その土台作りができたと考えている。日本絵画の復元について、関連機関や企業、技術者らへの取材を行うとともにこれまでの事例についての基礎調査を行い、現状と問題点の把握に努めた。また、復元事業で先行する他の文化財分野についても取材と調査を進め、比較検討を行った。並行して、今後復元研究に携わる可能性のある学生や若手の美術史研究者を対象に、絵画技法材料・分析科学・歴史学など多分野にまたがるテーマを取り上げたワークショップを開催し、人材育成とネットワーク作りを進めた。復元に関わる機関への取材を行い、現状を把握することができた。特に現代の文化財復元に関わりの深い博物館・美術館・企業・工房などの情報を整理することができたため、二年度以降の調査対象を絞り込むことができた。東京芸術大学が行った法隆寺金堂壁画復元や、美ら島財団が進めている御後絵復元プロジェクトとも連携し、制作から公開まで手法の検討に携わるなど、具体的な復元プロジェクトの現場とも関わりながら研究を進めており、おおむね順調に進展したといえる。これまでの研究では、取材やワークショップ開催を通して絵画をはじめとする文化財の復元に関わる研究者との交流を広げることができた。最終年度にはこうした研究者に登壇を呼びかけ、新たな研究分野としての「文化財復元学」を提唱するシンポジウム開催を計画している。また、美術史研究者の協力を得て、ポジフィルムや紙焼きの画像資料、絵画作品調書等のデジタルアーカイブによる研究者間での共有を進め、復元研究への利活用を試みたいと考えている。三年間の研究成果は論文としてまとめ、所属学会誌等に投稿する予定である。文化財保存学、美術史復元に関しては理念や評価の土台が固まっておらず、報告書についても基準がないため、先行する復元事例の記録の調査は難しいことがわかった。そのため、二年度以降も引き続き関係機関や技術者への取材を中心に基礎調査を進めることとする。二年度は実技系の美術大学で復元に携わる若手研究者を中心に、ミニシンポジウムの開催を企画している。文化財の科学調査に関するワークショップ開催のため、企画を担当する予定だった研究分担者の分担金に予算を計上していたが、講師のスケジュール調整の都合により開催を次年度に順延した。そのため分担金を次年度に繰り越して使用する必要が生じた。初年度は比較的東京近郊の取材・調査が中心となったため、旅費等に余剰が生じた。また、研究会での招待講演を行わなかったため、講演者謝金として計上していた費用等に余剰が生じた。2016年12月頃に光学調査に関するワークショップ開催を予定している。その際の会場費、通信費、機材運搬費、教材作成費等として使用する計画である。二年次にシンポジウムを開催する計画があるため、会議費、運営費、および遠方の講演者の旅費・謝金に使用する計画である。
生体膜内におけるプラズマ活性種輸送の統合的分子動力学解析

本研究は、生体膜内における放電活性種の力学的挙動および膜構成分子間の解離反応について、古典および量子分子動力学法を併用して解析することにより、細胞膜中における放電活性種の輸送特性および構造変位を理論的かつ定量的に解明していくものである。期間内において、(1)放電活性種を内在する単一および複合生体膜の数値モデルを構築する、(2)生体膜中における酸素活性種の輸送係数を古典分子動力学法により導出する、(3)酸素活性種の投入量に対する損傷膜の密度変化及び残存分布を推定する、(4)リン脂質の解離による上記パラメータへの影響を量子計算的に解明する、(5)各膜部位における活性種輸送の相違を解析して、膜浸透率を導出する、(6)膜構成分子間の相互作用を構造変位から定量化し、膜安定度としてデータベース化する、といった各目標を達成するとともに、成果の有機的連携により研究全体を推進する計画であった。本年度は、平成27年度の結果を利用して、複合脂質二重膜の分子モデリングおよび膜分子間の相互作用の定量評価と膜安定度の導出を行うことを主目的として、【課題1】複合脂質二重膜モデルへの拡張、【課題2】各膜部位における活性種輸送の変位解析および膜浸透率の導出、【課題3】膜構成分子間における相互作用の定量化および膜安定度のデータベース化、を行った。【課題1】に関しては、膜構成ソフトウエアを用いて、コレステロールを含むリン脂質で構成された二重膜をモデル化し、定常状態を導出した。【課題2】では、古典的分子動力学法を用いて膜内の時系列解析を行い、複数の酸素活性種に対する空間的輸送特性を検証した。【課題3】に関しては、活性種の拡散係数や膜変位状態をデータに整理して大容量サーバに保管した。28年度が最終年度であるため、記入しない。期間内において、(1)放電活性種を内在する単一および複合生体膜の数値モデルを構築する、(2)生体膜中における酸素活性種の輸送係数を古典分子動力学法により導出する、(3)酸素活性種の投入量に対する損傷膜の密度変化及び残存分布を推定する、(4)リン脂質の解離による上記パラメータへの影響を量子計算的に解明する、(5)各膜部位における活性種輸送の相違を解析して、膜浸透率を導出する、(6)膜構成分子間の相互作用を構造変位から定量化し、膜安定度としてデータベース化する、といった各目標を達成するとともに、成果の有機的連携により研究全体を推進する計画である。本年度(平成27年度)は、膜内輸送の基本構成である単一膜中の活性種の輸送・分布特性および膜損傷状態における輸送への影響を理論的に精査することを主目的として、【課題1】放電活性種を内在する単一生体膜モデルの構築、【課題2】酸素活性種の輸送係数の導出、【課題3】酸素活性種の投入量に対する損傷膜密度の変化と残存分布の推定、【課題4】リン脂質の解離による輸送パラメータへの影響評価、を行った。【課題1】に関しては、膜構成ソフトウエアを用いて、単一リン脂質で構成された二重膜をモデル化した。【課題2】では、古典的分子動力学法による変位計算を行い、酸素活性種の拡散係数を導出した。【課題3】に関しては、活性種挙動の時間積算から得た残存分布を比較検討した。【課題4】においては、リン脂質分子に対する活性種の射突を量子分子動力学法により模擬し、入射エネルギーおよび活性種別に対する解離過程の変化を精査した。【課題1】において、人体細胞膜の主成分であるフォスファジチルコリンを対象とし、膜分子構成ソフトウエア(CHARMM Membrane Builder)を用いて、単一二重膜構造をモデル化した。さらに、O,O2,OH,HO2,H2O2といった酸素活性種を膜内外に配置し,初期安定構造が得られた。【課題2】に関しては、上記で作成したモデルに対して、常温常圧下における古典分子動力学計算(分子動力学ソフトウエアAmber14を使用)を10-100 ns程度の時間スケールで行った。ここで、生体膜内における各酸素活性種の自乗平均変位から、拡散係数を導出した。水中に比べて値が減少するとともに、分子量や親水または疎水性により違いが生じることを定量的に示した。本結果の詳細は国内会議(第76回応用物理学会秋季学術講演会)にて発表している。なお、長時間解析への対応は、次年度も引き続き検討を進めて行く予定である。【課題3】については、上記計算と同様にして活性種の挙動軌跡を計算した結果を時間積分することによって、活性種毎の残存分布を得た。これらは、膜内における活性種の自由エネルギーと強い相関を持っており、実験結果との比較から本計算の妥当性を示している(第25回日本MRS学会年次大会にて報告)。【課題4】においては、リン脂質分子に対するO,O2,H2O2の射突について、半経験的分子軌道法(PM3)を用いた量子分子動力学法により、それらの反応工程を模擬した。入射エネルギー、初期位置および活性種別に対する解離過程の変化を精査した結果、結合手の多いOにおける反応が著しいことを定量的に示した。

また、種別によっては初期位置に対して反応変化が生じることもわかった(第63回応用物理学会春季学術講演会にて報告)。以上より、本年度の研究においては当補助金を有効に活用し、到達目標を概ね達成できていると言える。本研究は、生体膜内における放電活性種の力学的挙動および膜構成分子間の解離反応について、古典および量子分子動力学法を併用して解析することにより、細胞膜中における放電活性種の輸送特性および構造変位を理論的かつ定量的に解明していくものである。期間内において、(1)放電活性種を内在する単一および複合生体膜の数値モデルを構築する、(2)生体膜中における酸素活性種の輸送係数を古典分子動力学法により導出する、(3)酸素活性種の投入量に対する損傷膜の密度変化及び残存分布を推定する、(4)リン脂質の解離による上記パラメータへの影響を量子計算的に解明する、(5)各膜部位における活性種輸送の相違を解析して、膜浸透率を導出する、(6)膜構成分子間の相互作用を構造変位から定量化し、膜安定度としてデータベース化する、といった各目標を達成するとともに、成果の有機的連携により研究全体を推進する計画であった。本年度は、平成27年度の結果を利用して、複合脂質二重膜の分子モデリングおよび膜分子間の相互作用の定量評価と膜安定度の導出を行うことを主目的として、【課題1】複合脂質二重膜モデルへの拡張、【課題2】各膜部位における活性種輸送の変位解析および膜浸透率の導出、【課題3】膜構成分子間における相互作用の定量化および膜安定度のデータベース化、を行った。【課題1】に関しては、膜構成ソフトウエアを用いて、コレステロールを含むリン脂質で構成された二重膜をモデル化し、定常状態を導出した。【課題2】では、古典的分子動力学法を用いて膜内の時系列解析を行い、複数の酸素活性種に対する空間的輸送特性を検証した。【課題3】に関しては、活性種の拡散係数や膜変位状態をデータに整理して大容量サーバに保管した。平成28年度は、前年度の結果を用いて複合脂質二重膜の分子モデリングおよび膜分子間の相互作用の定量評価と膜安定度の導出を行う。(1)たんぱく質を含む複合脂質二重膜モデルへの拡張:蛋白質構造データバンク(PDB)に登録されている関連分子から膜由来たんぱく質およびコレステロールの立体構造を選定する。前年度【課題1】と同様にして、たんぱく質とコレステロールを含めた複合脂質二重膜モデルを形成し、平衡状態を計算する。なお、以後の平衡計算における高速化を図るため、平衡状態のデータ保存ならびに初期入力値化を自動で行う補助プログラムを作成する。(2)各膜部位における活性種輸送の変位解析および膜浸透率の導出:複合膜の各膜部位における活性種の輸送パラメータを古典MD計算にて導出する。この時、複合膜部位における混合割合の違いによる輸送パラメータへの影響を検証する。また、入射レートを基にした活性種の初期配置数から部位毎の膜浸透率を導出する。活性種の反応により断片化した分子要素を含む脂質二重膜中の挙動については上記項目(1)で作成した補助プログラムを用いて活性種を再配置し、量子/古典併用MD計算にて挙動を模擬する。(3)膜構成分子間における相互作用の定量化および膜安定度のデータベース化:上記項目に基づく構成分子間の時空間偏差から膜変位量を概算して定量化する。
血管系腫瘍の悪性増殖機構に関するシグナル伝達経路の解明

犬血管肉腫(HSA)は、血管内皮細胞由来の悪性腫瘍であるが、有効な治療法は確立されていない。近年、腫瘍で特異的に発現している分子をターゲットとした、分子標的阻害薬を用いた治療が大きな成果をあげている。そこで本研究では、犬血管系腫瘍の悪性増殖に関与するシグナル伝達経路と分子を解明し、新たな治療法を確立することを目的とした。昨年度までの研究で、HSA細胞株を7株作成したところ、Aktの473位Ser(Akt Ser473)とその下流のeIF4E-binding protein1(4E-BP1)は、6株で血清に依存せず、恒常的にリン酸化していた。これより、HSA細胞株ではmTORC2/Akt Ser473/4E・BP1経路が恒常的に活性化しており、HSAの治療のターゲットとして有用であると考えられた。そこで本年度は、この経路に対する分子標的阻害剤の細胞増殖に対する効果を、WST-1法とウエスタンブロット法で検索した。HSA細胞株に,PI3K阻害剤のLY294002を加えたところ、全ての細胞株で容量依存性に細胞増殖が抑制され、PI3K/Akt/mTOR経路のタンパクのリン酸化も低下した。一方、mTORC1阻害剤のrapamycinでは全株でmTORC1のリン酸化が低下したが、細胞増殖は3株のみで抑制された。これらの細胞株では、4E-BP1のリン酸化が低下しており、そのうち2株ではAkt Ser473のリン酸化も低下していた。これらの結果より、HSA細胞株の細胞増殖は、mTORC1に依存しない、mTORC2/Akt/4E-BP1経路によって制御されている可能性が示唆された。また、自然発生HSAにおける同経路の活性を免疫染色で検討したところ、外科的切除されたHSA37例中、約80%のHSAで、p-Akt Ser473、p-4E-BP1 Thr37/46、eIF4Eの中等度から高度の発現が認められた。この結果から,自然発生HSAではmTORC1とは別に制御された、mTORC2/Akt/4E-BP1経路が活性化していることが示唆された。以上の結果から、本研究で樹立したHSA細胞株と自然発生のHSAでは、mTORC1に依存しない、mTORC2/Akt/4E-BP1経路が活性化しており、治療のターゲットとして有用である可能性が示唆された。当初の目的であった、mTORC2/Akt/4E-BP1経路の増殖抑制効果を明らかにすることができ、更に自然発生腫瘍における同経路の活性を検索することができたため、おおむね目標を達成できたと考えている。本研究で樹立した細胞株をヌードマウスに接種すると、犬血管肉腫の腫瘍組織が形成されることが分かっている。そこで、この腫瘍組織を用いることによって、実際の生体での分子標的阻害剤の効果を検討することができると考えている。血管肉腫は、血管内皮細胞由来の悪性腫瘍である。犬の血管肉腫は非常に悪性度が高く、容易に転移するが、有効な治療法は確立されていない。これは腫瘍細胞のみをターゲットとするため、副作用が少なく有効な治療法である。まず、犬血管肉腫細胞株を7株作成し、この細胞株における増殖因子/受容体の発現を調べた。その結果、増殖因子と増殖因子とその受容体のmRNAの発現は、細胞株によって様々であった。VEGF-A、bFGF、HGF、IGF-I、およびPDGF-Bは増殖因子と共に受容体のmRNAも発現していたことから、これらの増殖因子はオートクリン/パラクリン機構で働く可能性が示唆された。次に、様々な増殖因子、あるいは血清を細胞株に加え、WST-1法で増殖促進効果を検討した。その結果、1株では、ほとんどの増殖因子と血清下で増殖促進が認められた。3株では血清下で増殖促進が認められたが、増殖因子下はいずれも促進されなかった。その他の3株では、増殖因子と血清のいずれにも増殖促進を示さなかった。続いて、血清刺激によって活性化される経路をウエスタンブロット法で検討した。その結果、血清による増殖促進には、Erk経路が関与していることが示唆された。一方、Aktの473位Ser(AktSer473)とその下流のelF4E-binding protein 1(4E-BP1)は、6株で血清に依存せず、恒常的にリン酸化していた。以上の結果から、犬血管肉腫細胞株ではmTORC2/Akt Ser473/4E-BP1経路が恒常的に活性化しており、犬血管肉腫の治療のターゲットとして有用であると考えられた。