hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
H形鋼を用いたSRC長柱の弱軸回り曲げ座屈耐力に関する実験的研究

SRC梁-柱試験体の中心・偏心圧縮実験を行い、H形鋼を用いたSRC長柱の弱軸回り曲げ座屈耐力に関する実験資料を得るとともに、理論解析を行い実験結果と比較検討した。1実験(a)試験体試験体は12cm×12cmの断面内に溶接H形鋼H-62×60×6×6と4本の丸鋼主筋9φおよび丸鋼フ-プ3φを配し、弱軸まわり曲げ座屈を対象とした。中心圧縮と2種類の偏心量を与えた偏心圧縮実験を4種類の材長(材長とせいの比:L/D=4,8,12,18)について行った。(b)実験試験体をかまぼこ球座を介して長柱試験機に設置し、約30tの圧縮力をかけた状態で部材中央の横たわみが最小となるように上下端の材端移動装置を調整し、その状態を中心圧縮の状態とした。偏心圧縮実験では中心圧縮の状態から材端移動装置を操作して所定の偏心量を与えた。(c)実験結果中心圧縮実験で得られた耐力は接線係数理論値と良好な対応を示した。偏心圧縮実験結果は後述の理論解析結果と良好な対応を示した。解析結果との対応より考察すると、コンクリート外縁が露出した通常のSRC長柱ではコンクリートの圧壊・劣化が卓越し部材中央断面は全塑性状態に達することはない。2解析任意の構成法則に従う、任意形状の鉄骨を持つ単純支持されたSRC長柱が(a)一定軸力のもとで両端に等しい漸増座異端モーメントを受ける場合、(b)両端に等しい偏心量の偏心圧縮を受ける場合、の耐力を求める手法を導いた。解析結果は、今回の実験結果や松井他によるコンクリート充填鋼管の実験結果と良好な対応を示した。細長比が中程度以上であれば、コンクリートの圧壊・劣化が始まる以前に安定限界に達するので、最大耐力に関してはコンクリートの圧壊・劣化を考慮する必要はない。平成7年度は、長方形断面鉄骨を持つSRC梁-柱の耐力解析、鉄骨試験体の製作、コンクリートの打設および素材試験を行った。1解析一定軸力の元で両端に等しい曲げモーメントを受ける単純梁について、最大耐力に達するための条件を明示的に明らかにし、N-M相関曲線を求めた。成果は日本建築学会近畿支部研究報告集に投稿予定。2鉄骨試験体の製作鉄骨部分は、SS400の鋼板PL-6×60およびPL-6×50を溶接組立したH形鋼H-62×60×6×6とし、両端に20mm厚のエンドプレートを溶接した。RC部分の主筋は4-9φとし、端部をエンドプレートに溶接した。製作された試験体は焼鈍を施した。製作した試験体数は、材長48、96、144、216、288cmの各々について各4体、計20体とした。3コンクリート打設溶接加工したフ-プ筋3φを60mm間隔で配置した後、コンクリートを横打ちで打設した。コンクリートの配合は、水セメント比:64%、骨材重量比:C:S:G=1:2.67:2.29とし、細骨材については打設ごとに表面水量を測定して水分の補正を行った。コンクリート打設後2日で脱型し48週間の標準水中養生の後空中養生とした。4素材試験鉄骨試験体のフランジおよびウェブより採取したJISI号試験片による引張試験、およびコンクリートの4週強度試験を行った。コンクリートの4週強度は平均4週強度:344.3kg/cm^2、標準偏差16.35kg/cm^2であり、ほぼ当初の目的が達せられた。

細長比が中程度以上であれば、コンクリートの圧壊・劣化が始まる以前に安定限界に達するので、最大耐力に関してはコンクリートの圧壊・劣化を考慮する必要はない。
電位依存性Ca^<2+>チャネル遺伝子変異マウスを用いた痛覚情報伝達メカニズムの研究

平成1415年度に行ったマイクロアレイを用いた野生型およびN型Ca^<2+>チャネル遺伝子欠損マウス神経系の遺伝子発現解析により、中枢神経各部位および後根神経節より見出されてきている神経因性疼痛確立時に発現変動を示す遺伝子群の特徴づけを継続して行い、神経因性疼痛治療の新たな標的分子候補の検索をさらに行った。行動薬理学的アプローチが可能である一部の標的分子候補に関しては、組織学的検討としてNorthern blot法および免疫組織化学法により発現変動率や発現変動部位・細胞を検討した。行動薬理学的検討では、作用薬や阻害・拮抗薬を様々なルート(腹腔内、脳室内、髄腔内)から投与を行い、マウスの神経因性疼痛行動に対する効果を検討した。以上の検討結果から選別された有望な標的分子候補の内、特に脊髄において見出されたものに関しては、さらに成熟マウス脊髄スライス標本を用いた二次元多領域光学的膜電位測定法により、作用メカニズムの検討を行った。すなわち、一次知覚神経を様々な刺激強度で電気刺激したり、様々な薬物により誘発されるシナプス応答や薬物反応を解析し、標的分子候補に対する作用薬や阻害・拮抗薬の効果を検討した。これらの検討結果から神経因性疼痛治療の新たな標的分子候補を数種類絞りこんでおり、現在論文を投稿準備中である。また本年度は、N型およびR型Ca^<2+>チャネル欠損マウスのモルヒネ鎮痛効果・鎮痛耐性形成に関する実験結果をまとめ、英文論文を発表した。R型Ca^<2+>チャネル阻害薬はモルヒネの鎮痛効果を増強するが、鎮痛耐性形成は逆に抑制することを示し、疼痛管理に有用な薬物になりうる可能性を示唆した。N型電位依存性Ca^<2+>チャネル欠損マウスにおいては、末梢神経損傷に伴う神経因性疼痛の発症が著明に減弱していることを我々は最近見出している。そこで神経因性疼痛を誘発する脊髄神経結紮術(spinal nerve ligation : SNL)を野生型およびN型Ca^<2+>チャネル欠損マウスに適用し、後根神経節・脊髄・延髄・視床・中脳・大脳皮質において発現変動を受ける遺伝子産物をマイクロアレイ(クローンテックAtlas Glass Array)を用いて検索し、神経因性疼痛発症および維持に重要な遺伝子産物の同定を試みた。その結果、野生型マウスにおいてはSNLにより大きく発現変動を示すが、欠損マウスにおいては発現変動が抑制されている遺伝子が複数種見出された。現在マイクロアレイを用いて見出された遺伝子発現変動の再現性を他の手法(Northern blotなど)を用いて確認を行うとともに、薬理学的に活性化や抑制が可能な標的遺伝子産物に関しては薬物投与により神経因性疼痛行動に変化が生じるか否かを行動学的に検討している。また生理学的検討に備え、マウス脊髄スライス標本を用いたpatch clamp法や細胞内Ca^<2+>濃度変化測定法の条件検討、およびマウス脊髄in vivo patch clamp法の確立に着手している。設備備品費に計上した予算で購入したin vivoマイクロダイアライシスシステムを用い、薬物(コカインやモルヒネなど)投与により誘発されるドーパミンおよびセロトニン放出の検出を試み、マウス線条体よりこれらのアミンの検出が良好に行える条件を検討した。またこのシステムをR型Ca^<2+>チャネル欠損マウスに適用し、この欠損マウス線条体においてもコカインによるドーパミンおよびセロトニン放出が正常に誘発されることを見出した(Han et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299,299-304,2002)。末梢神経損傷に伴う神経因性疼痛の発症が著明に減弱しているN型電位依存性Ca^<2+>チャネル欠損マウスを用い、後根神経節・脊髄・延髄・視床・中脳・大脳皮質において発現変動を受ける遺伝子産物をマイクロアレイにより検索した結果、各部位において発現変動を生じる遺伝子が複数種見出された。現在発現変動の再現性を他の手法(Northern blot、免疫組織化学など)を用いて行っている。また薬理学的に抑制が可能な標的遺伝子産物に関しては、薬物投与により神経因性疼痛行動に変化が生じるか否かを検討し、髄腔内投与あるいは脳室内投与により、実際に疼痛行動の抑制が観察される薬物を現在数種見出している。脊髄レベルにおける生理学的検討として、マウス脊髄スライス標本を用いたpatch clamp法、膜電位感受性色素染色による二次元多領域膜電位変化測定法、細胞内Ca^<2+>濃度変化測定法などの条件検討を行い、これらの手法を用いて行動学的に神経因性疼痛を抑制する薬物の作用メカニズムの検討を平行して行っている。またマウス脊髄in vivo patch clamp法によりII層膠様質神経細胞からのシナプス応答の記録に成功しており、より生理学的な検討を行えるシステムを確立した。本年度は、内臓痛条件刺激により誘発される内因性長期疼痛抑制機構に関する実験結果と、急性炎症後のN型Ca^<2+>チャネル発現の可塑的変化が慢性疼痛発現に関与する実験結果に関して英文論文を発表した。

行動薬理学的検討では、作用薬や阻害・拮抗薬を様々なルート(腹腔内、脳室内、髄腔内)から投与を行い、マウスの神経因性疼痛行動に対する効果を検討した。以上の検討結果から選別された有望な標的分子候補の内、特に脊髄において見出されたものに関しては、さらに成熟マウス脊髄スライス標本を用いた二次元多領域光学的膜電位測定法により、作用メカニズムの検討を行った。すなわち、一次知覚神経を様々な刺激強度で電気刺激したり、様々な薬物により誘発されるシナプス応答や薬物反応を解析し、標的分子候補に対する作用薬や阻害・拮抗薬の効果を検討した。これらの検討結果から神経因性疼痛治療の新たな標的分子候補を数種類絞りこんでおり、現在論文を投稿準備中である。また本年度は、N型およびR型Ca^<2+>チャネル欠損マウスのモルヒネ鎮痛効果・鎮痛耐性形成に関する実験結果をまとめ、英文論文を発表した。R型Ca^<2+>チャネル阻害薬はモルヒネの鎮痛効果を増強するが、鎮痛耐性形成は逆に抑制することを示し、疼痛管理に有用な薬物になりうる可能性を示唆した。
東南アジアの病害動物による感染症の疫学とこれら動物の系統発生病原性の研究

環境保全のもとに、殺虫剤の使用を極度に制限し如何に効果的に疾病媒介者を防除するかの方法の開発と応用の研究をおこなっている。病害動物には非常に類縁的な種の間の分化や、或はいまだに別種であるかシノニムであるかさえ確認されていない分類群が存在している現状にある。このような系統学的ならびに、病原性に関する類以乃至相違性の検討の必要性が、東南アジア地域で現に流行が目立って取り残されている病害動物の関与する疾患についてクロ-ズアップされてきている。この研究はすでに1981年ごろから続けているが、我々研究グル-プは、このような現実的要請の下、基礎的並びに実用化のための応用実験をタイおよびマレイシアにおいておこなっている。今年度は、池庄司らはマレイシア・ペナン島を中心にヤブカ類の物理的、化学的刺激についての野外実験から、ヒトスジシマカの捕獲試験では、色彩は黒色、温度、音が雌雄に対し各々有為な誘引性をしめし、また防除の高効率化には黒色音響捕獲には長距離吸血誘引物質の高濃度薬剤処理の必要性をしった。ネッタイシマカは、温度、湿度、乳酸、黒色、炭酸ガス、動き、音は単独での誘引性がみられた。S.Leemingsawatを主にタイ・カンチャナブリ・タラムヤイ村マラリア流行地において、媒介者の密度の消長を、凝似羽音吸血炭酸ガス捕獲器を用い、密度のモニタリング法を開発するのに成功した。尚音響の波長応答に媒介種内分類群固有の周波数を持つことを知った。尚分布地域集団にも異なる周波数集団がみられ、遺伝的分化との関係が実証された。本捕獲法はマラリア作業員のヒト吸血作業を回避し、マラリア感染からの災害防止上からも役立つ。幼虫成長抑制剤(IGR)の山麓地帯マラリア流行地への応用により、0.5ppbの濃度bに渓流発生媒介種防除を年間を通し、雨期乾期に関し、必要な時期に応用する方法を開発した。尚媒介者の外流行地において天敵魚による防除法、IGRによる防除法、対照地域の三者の比較実験を行なっている(Vanida Kerdpibuleら)、さらに音響吸血ドライアイス捕獲器、IGRの応用の併用防除法の計画をカンチャナブリ省においてたてた。日本脳炎媒介蚊のバンコク周辺から各々離れた三地域(30,100,300km)に於ける媒介種の分布の相違を音響吸血ドライアイス捕獲器およびヒト吸血捕獲法によりしらベ、音響捕獲防除法、IGRの応用防除法の応用実験をおこない、実用化にむけての準備をすすめている(v.Kerdpibuleら)。ヌマカ類の防除にIGRの応用の準備に予察調査をクアラルンプウル郊外の錫廃抗においてヒト吸血捕獲法、音響吸血捕獲法、幼虫捕獲法の三者により行なっている(マレイシア国立医学研究所IMRとの共同研究)。トキソプラズマ症のラテックス凝集反応法によりバンコク市・スラム街、農村、市内産院の三者において調査し中枢神経系疾患殿関係を検索虫である(T.Chintana)。肺吸虫および肝吸虫について:日本及びタイの寄生蠕虫のうち、さし当り肝吸虫と肝吸虫の系統発生遺伝学的関係をしらべるため、病原性の相似性相違性に関係し、病原体の細胞遺伝、アイソザムの遺伝子頻度による変異乃至多型そしてDNA塩基対の組成構造の比較と諸種病原性との関係を明らかにする。とくに肝吸虫では、発癌性、病態生理とくに手始めに超音波診断法および臨床所見の解析をおこなっている(S.Pungpakら、C.Komalamisra)。Dirofilariaの系統発生についてB.B.Omarが今までの諸資料をもとに見解をまさめた。Angiostrongylus属のmtDNAを分離し制限酵素による分解断片の種間変異を解析し病原性の相違の因果関係の調査を進めている(飯田ら)。

尚分布地域集団にも異なる周波数集団がみられ、遺伝的分化との関係が実証された。本捕獲法はマラリア作業員のヒト吸血作業を回避し、マラリア感染からの災害防止上からも役立つ。幼虫成長抑制剤(IGR)の山麓地帯マラリア流行地への応用により、0.5ppbの濃度bに渓流発生媒介種防除を年間を通し、雨期乾期に関し、必要な時期に応用する方法を開発した。尚媒介者の外流行地において天敵魚による防除法、IGRによる防除法、対照地域の三者の比較実験を行なっている(Vanida Kerdpibuleら)、さらに音響吸血ドライアイス捕獲器、IGRの応用の併用防除法の計画をカンチャナブリ省においてたてた。日本脳炎媒介蚊のバンコク周辺から各々離れた三地域(30,100,300km)に於ける媒介種の分布の相違を音響吸血ドライアイス捕獲器およびヒト吸血捕獲法によりしらベ、音響捕獲防除法、IGRの応用防除法の応用実験をおこない、実用化にむけての準備をすすめている(v.Kerdpibuleら)。ヌマカ類の防除にIGRの応用の準備に予察調査をクアラルンプウル郊外の錫廃抗においてヒト吸血捕獲法、音響吸血捕獲法、幼虫捕獲法の三者により行なっている(マレイシア国立医学研究所IMRとの共同研究)。トキソプラズマ症のラテックス凝集反応法によりバンコク市・スラム街、農村、市内産院の三者において調査し中枢神経系疾患殿関係を検索虫である(T.Chintana)。肺吸虫および肝吸虫について:日本及びタイの寄生蠕虫のうち、さし当り肝吸虫と肝吸虫の系統発生遺伝学的関係をしらべるため、病原性の相似性相違性に関係し、病原体の細胞遺伝、アイソザムの遺伝子頻度による変異乃至多型そしてDNA塩基対の組成構造の比較と諸種病原性との関係を明らかにする。とくに肝吸虫では、発癌性、病態生理とくに手始めに超音波診断法および臨床所見の解析をおこなっている(S.Pungpakら、C.Komalamisra)。Dirofilariaの系統発生についてB.B.Omarが今までの諸資料をもとに見解をまさめた。Angiostrongylus属のmtDNAを分離し制限酵素による分解断片の種間変異を解析し病原性の相違の因果関係の調査を進めている(飯田ら)。
東日本大震災が子どもの森林観・自然観に及ぼした影響

本研究は、東日本大震災で自然の脅威を体験した子どもたちに、森林と人間との関わりを如何に伝えるかという課題に応える基礎として、大震災が子どもたちの森林観に与えた影響を把握する目的で実施した。調査は、小中学生へのアンケート調査と子どもたちの作文のテキスト分析を中心に実施した。調査の結果、東日本大震災は子供たちの森林観に必ずしもネガティブな影響を与えたとはいえず、被災を体験した特定の学年(小学校入学前後等)への配慮はしつつも、極端に自制せず被災地の子どもたちにふさわしい森林環境教育を提供していくことが重要である。平成27年度は、岩手県沿岸部の市町村(久慈市以南、山田町以北)の教育委員会を通して、研究の趣旨と計画について説明し、調査対象となる小中学校の絞り込み、調査を依頼する活動を中心に行った。当初の計画では、各小中学校には、東日本大震災時の子供たちの避難の様子を関係者からヒアリングするにとどめ、アンケート調査は次年度以降に行う予定であったが、比較的条件が整ったところからアンケート調査も実施した。この他、被災後、児童・生徒の文集を作成しているところについては資料の提供を依頼し、文集の実物あるいはコピーを入手した。児童・生徒用のアンケート調査票は、自然や森に対するイメージや評価に関する内容とし、津波など震災の生々しい状況を想起し子供たちが混乱しないよう配慮して作成した。また、学校側でアンケート調査票を記名付き回収し、アンケート裏面に担任教師などが児童・生徒の被災状況をコメントできるようにし、調査者が回収する際は、記名欄の箇所を切り離して無記名アンケートして回収することとし、個人情報の保護に努めた。児童・生徒が作成した文集は、計10校から入手した。また、アンケート調査は計19校で、実施可能な学年について実施した。平成28年度の前半は、調査で得られた文集について、「森林」、「自然」等の単語がどのような文脈で使用されているかテキスト分析を行うとともに、アンケート結果を集計し、学校ごと、地域ごとの特徴を分析する作業を行い、後半は分析結果を踏まえた各地域(学区の集落等)の子供の生活環境としてのコミュニティの状況を把握するための調査を実施する予定である。平成27年度は、当初予定していなかった児童・生徒を対象としたアンケート調査について、一部の小中学校で実施が可能となり、データが収集できた。一方、児童・生徒が作成した文集のテキスト分析の作業は、今年度に持ち越すことになった。トータルとしては、平成28年度の取り組みの内容が明確化し、順調に調査を進めるための具体的な計画の作成が容易になったことから、概ね順調と評価した。研究2年目の平成28年度は、前年度の岩手県内での調査(児童・生徒へのアンケート調査等)の実施を踏まえて、1)宮城県内の調査地の全体概況調査、2)岩手県内の児童・生徒へのヒアリング調査、3)収集資料のテキスト分析、4)調査結果の総括および調査法の再検討、4)学会等での発表内容のとりまとめ、を課題とした。課題1については、前年度に教師への調査と資料調査もほぼ実施を終えたことから、岩手県内でのヒアリング調査(宮古市、山田町、田野畑村の被災地関連の自治会長等を通して、震災前の自治会活動、コミュニティーの現状、子どもたちの自然とのふれあい状況等の把握)を優先的に実施し、宮城県の全体調査は次年度に持ち越すこととした。課題2については、宮古市および田野畑村において、海岸沿いを訪れた高校生や中学生を対象に計10名程度、調査を実施した。その結果、子どもたちの中では、震災で体験した恐ろしい自然と、遊び場や癒しを提供してくれる自然とは明確に区別され、全体として自然保護教育や環境教育の推進上、震災の体験は大きな障害にはなっていないことがわかった。この点は、児童・生徒を対象としたアンケート調査結果とも合致した。課題3については、本格的なテキスト分析は未着手で次年度に持ち越したが、一部について検討した結果、子どもたちは震災後の「開発」の様子を自然破壊として捉えている面が確認された。課題4については、これまでの研究成果をもとに、平成29年3月、鹿児島大学で開催された日本森林学会大会で口頭発表を行った。平成28年度は、8月まで岩手県内の沿岸部を中心に、被災地関連の自治会長ほかへのヒアリング調査と現地における中高生へのヒアリング調査が一部実施できたが、9月の台風による未曽有の災害のため、岩手県沿岸部へのアクセスが困難となり、また新たな被害を受けた地域については継続調査を断念せざるを得なくなった。また、この台風被害の影響もあり、宮城県内での調査も次年度への持ち越しを余儀なくされた。研究最終年度である平成29年度は、1)宮城県内での児童を対象とした新たな調査(アンケート調査、授業実践、資料調査等)の実施、2)アンケート調査データのより詳しい解析、3)岩手県内の調査結果とあわせて研究全体の総括、4)学会誌への投稿を含む研究成果のとりまとめを順次進行させることとしていた。1)については、宮城県東松島市立宮野森小学校3年生児童を対象とした、総合的な学習の時間内で行われた「森の学校」活動の調査(児童が作成したポートフォリオの調査、参与観察による児童の行動調査、担任教諭へのヒアリング調査)を実施した。なお、3年生児童を対象としたことから、アンケート調査の実施は見送った。2)については、岩手県内で実施したアンケートデータを精査し、入力の修正追加等のデータの調整作業を行った。そのうえで新たな分析を行い、現在とりまとめ中である。

3)については、岩手県内のアンケート調査データと収集した文集のテキスト分析結果をあわせて検討し、一部を第129回日本森林学会大会(高知大学)で報告した。4)については、現在、学会誌の投稿に向けて作業を進行中である。以上、研究成果については、現在、成果公表のための準備段階にあるが、要約すると次のとおりである。1)東日本大震災の津波等を経験した子供たちは、4年以上を経過した時点で見る限り、ごく一部を除けば、人々に被害を及ぼす自然の恐ろしい面と、人々を癒してくれるポジティブな自然とは、気持ちの中で区別ができていること、2)むしろ復興に伴ってなくなっていく森に対して不安な気持ちを持つなど、今後の被災地の子供たちに対する自然体験が重要であり、被災した子供たちへの心のケアを行いつつ、今後、子供たちの自然体験を促進していく方策が重要であること、が確認された。本研究は、東日本大震災で自然の脅威を体験した子どもたちに、森林と人間との関わりを如何に伝えるかという課題に応える基礎として、大震災が子どもたちの森林観に与えた影響を把握する目的で実施した。調査は、小中学生へのアンケート調査と子どもたちの作文のテキスト分析を中心に実施した。調査の結果、東日本大震災は子供たちの森林観に必ずしもネガティブな影響を与えたとはいえず、被災を体験した特定の学年(小学校入学前後等)への配慮はしつつも、極端に自制せず被災地の子どもたちにふさわしい森林環境教育を提供していくことが重要である。平成28年度は、以下の調査・分析の作業を実施する。1.前年度得られた児童・生徒の震災に関わる文集について、テキスト分析を実施する。2.前年度得られた児童・生徒のアンケート調査結果を集計し、傾向を見出す。3.1および2の結果を踏まえて、震災前後の被災地における地域コミュニティの状況(集落内での子供たちのコミュニケーションの状況等)を把握するため、当時の自治会長や関係者からのヒアリングを実施する。一部、前年度積み残した課題はあるが、今年度前半で処理する目途が立っており、計画の大幅な変更の必要はない。平成29年度は、東松島市の宮野森小学校をはじめ、宮城県内での新たな調査地の目処がついたことから、28年度に実施できなかった宮城県内の全体調査は行わなくても支障がないと判断した。全体として平成29年度は、ほぼ当初計画通り、1)宮城県内での児童を対象とした新たな調査(アンケート調査、授業実践資料調査等)の実施、2)アンケート調査データのより詳しい解析、3)岩手県内の調査結果とあわせて研究全体の総括、4)学会誌への投稿を含め研究成果のとりまとめを、順次進行させる予定である。森林科学・環境教育次年度使用額(約8万円)は、主として平成27年度に予定していた児童・生徒の震災文集のテキスト分析が今年度の持ち越したため、分析に必要なスキャナーの購入費やデータを調整する作業の学生アルバイトの謝金の支出がなかったためである。平成28年度は8月まで順調に調査を実施していたが、9月に東北地方に上陸した台風による甚大な被害のため、調査地である三陸沿岸部へのアクセスが困難になったこと、また新たに被災した地域への継続調査が研究倫理面の理由から困難になったことにより、旅費やデータ収集のための謝金等の支出が大幅に減少したため。
レンサ球菌のニッチ拡大に伴う宿主-菌体相互作用の解析

肺炎レンサ球菌や口腔内レンサ球菌であるStreptococcus sanguinisはミティス群レンサ球菌に属する.肺炎球菌は肺炎や髄膜炎等の主な起因菌であり,薬剤耐性が問題になっている.一方,S. sanguinisをはじめとする近縁種の口腔内細菌は口腔内で歯牙へ早期に定着し,プラーク形成に寄与する.しかし,感染性心内膜炎からの分離頻度が高いことから,口腔内を離れ血流に入ると病原性を発揮すると考えられる.S. sanguinisは,他の口腔内レンサ球菌と比較して,多様な細胞壁架橋型の表層タンパク質を産生するため,菌体表層タンパク質の機能が血流における菌体の生存や心組織定着に繋がると考えられる.本申請研究では,ミティス群レンサ球菌の全身伝播時における上皮細胞と免疫細胞の相互作用と免疫回避や組織定着に関与する細菌因子を探索し,新規の病原性発揮機構の解明を目的とした.本年度では,菌株の収集を継続すると共に,これまでに作製したS. sanguinisの変異株ライブラリーの表現型解析を行った.また,S. sanguinisが産生する線毛について,組換えタンパク質の作製と結晶化を行った.肺炎球菌については,培養温度の変化が菌体表層タンパク質の発現に及ぼす影響を検討するとともに,血中での生存能とヒト細胞への菌体付着率に関する解析を行った.また,マウス感染実験により,培養温度の変化が及ぼす病原性への影響を検討した.その結果,培養温度の違いにより,これらの表現型や病原性は変化することが明らかになった.口腔内レンサ球菌の新規病原因子候補の解析を行うとともに,肺炎球菌を用いた解析から環境温度が病原性に与える影響を明らかにし,概ね順調に研究は進展していると考えられる.口腔と血液由来の菌株の収集と,これまでに得られた変異株の表現型解析を継続するとともに,組換えタンパク質を用いた生化学解析を行う.肺炎レンサ球菌と口腔内レンサ球菌の解析を並行して行い,病原性に関わる新たな機構を探索する.口腔内レンサ球菌Streptococcus sanguinisや主要な肺炎起因菌である肺炎レンサ球菌はmitis群レンサ球菌に属する.本菌群は全身性疾患の病巣から頻繁に分離される.S. sanguinisは,他の口腔内レンサ球菌と比較して,多様な細胞壁架橋型の表層タンパク質を産生する.感染性心内膜炎の病巣から高頻度に分離されることから,様々な分泌タンパク質の機能が血流での菌体の生存や心組織への定着を可能にすると推察されている.口腔内において,常在細菌である本菌は歯牙表面へ早期に定着し,デンタルプラークの形成を促進する.しかし,口腔内を離れた際,S. sanguinisに存在する潜在性の病原性が病態発症に寄与すると考えられる.本申請研究では,mitis群レンサ球菌の全身伝播時における上皮細胞や免疫細胞との相互作用ならびに菌体の免疫回避や組織定着に関与する細菌因子を検索し,新規の病原性発揮機構を明らかにすることを目的とした.本年度では,トランスポゾンを含むDNA断片とコンピテンス刺激ペプチドを用いた形質転換によりランダム変異株ライブラリーを構築した.さらに,二成分制御系を含む転写因子群の変異株を作製し,集落形態の観察と表現型の解析を行った.国内から収集した臨床分離株について,付着因子である線毛の発現と線毛遺伝子の存在を検討するとともに,線毛形成機構の解析と機能検索を行った.そして,明らかにした線毛構成タンパク質の組換えタンパク質を作製し,結晶化条件の検討を行った.変異株のライブラリーを構築し,病原性に関わると考えられる表現型について解析を始めていることから概ね順調に研究は進展していると考えられる.肺炎レンサ球菌や口腔内レンサ球菌であるStreptococcus sanguinisはミティス群レンサ球菌に属する.肺炎球菌は肺炎や髄膜炎等の主な起因菌であり,薬剤耐性が問題になっている.一方,S. sanguinisをはじめとする近縁種の口腔内細菌は口腔内で歯牙へ早期に定着し,プラーク形成に寄与する.しかし,感染性心内膜炎からの分離頻度が高いことから,口腔内を離れ血流に入ると病原性を発揮すると考えられる.S. sanguinisは,他の口腔内レンサ球菌と比較して,多様な細胞壁架橋型の表層タンパク質を産生するため,菌体表層タンパク質の機能が血流における菌体の生存や心組織定着に繋がると考えられる.本申請研究では,ミティス群レンサ球菌の全身伝播時における上皮細胞と免疫細胞の相互作用と免疫回避や組織定着に関与する細菌因子を探索し,新規の病原性発揮機構の解明を目的とした.本年度では,菌株の収集を継続すると共に,これまでに作製したS. sanguinisの変異株ライブラリーの表現型解析を行った.また,S. sanguinisが産生する線毛について,組換えタンパク質の作製と結晶化を行った.肺炎球菌については,培養温度の変化が菌体表層タンパク質の発現に及ぼす影響を検討するとともに,血中での生存能とヒト細胞への菌体付着率に関する解析を行った.また,マウス感染実験により,培養温度の変化が及ぼす病原性への影響を検討した.その結果,培養温度の違いにより,これらの表現型や病原性は変化することが明らかになった.

口腔内レンサ球菌の新規病原因子候補の解析を行うとともに,肺炎球菌を用いた解析から環境温度が病原性に与える影響を明らかにし,概ね順調に研究は進展していると考えられる.変異株のライブラリーを用いて新規病原因子を探索するとともに,転写因子群の変異株を用いたトランスクリプトーム解析と分泌タンパク質群の機能解析および結晶解析を行う予定である.口腔と血液由来の菌株の収集と,これまでに得られた変異株の表現型解析を継続するとともに,組換えタンパク質を用いた生化学解析を行う.肺炎レンサ球菌と口腔内レンサ球菌の解析を並行して行い,病原性に関わる新たな機構を探索する.
医療応用のための非線形分光・イメージング技術を基盤とした顕微鏡システムの開発

細胞や組織に障害を与えることなく、生体分子や内部構造を可視化するバイオイメージング技術の実用化を目指して、本研究では特に無染色で生体分子を可視化できるラマン分光分析や高次高調波発生などの非線形光学効果を利用した計測システムの構築を行い、疾患モデルや臨床検体の網羅的解析を行った。本研究の最初の成果としては、細胞や組織などの生体計測に特化した、ラマン分光分析システムを独自に設計・構築し、高感度かつ再現性に優れたラマン分光分析装置が完成したことが挙げられる。続いて、独自に構築した顕微ラマン分光システムを用いて、培養細胞、実験動物より採取した組織標本等の計測を行い、整形外科・消化器小児外科・心臓血管外科と連携し、種々の疾患モデル動物の解析およびヒト臨床検体の解析に成功した。最終年度では、骨粗鬆症モデルにおける骨質計測への応用可能性や抗がん剤投与による血流動態の解析などの研究成果を論文発表するに至った。また、ヒトの手術検体や病理標本を用いた解析も同時に並行して進めることができた。ラマン分光分析およびケモメトリックス解析による細胞外マトリックスの分子組成に着目することで、様々な疾患の早期診断や予後予測に応用できる可能性を示すことができた。さらに、従来は大型かつ高価な多光子励起顕微鏡を用いた非線形光学イメージング技術の医療現場での実用化に向けた取り組みとして、レーザー光源を含むシステム全体の小型化にも着手することができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。がん、糖尿病や骨粗鬆症などの生活習慣病は依然として増加傾向にあり、新たな診断・治療法の開発が急務である。近年これらの疾患の多くにおいて、細胞のみならずその周辺の細胞外マトリクスや微小環境の異常が疾患の発症から悪性化まで広く影響を与えることがわかってきた。しかし、細胞と細胞外マトリクスの相互作用、細胞外マトリクスの量的・質的変化を検出・評価できる手法はほとんど見当たらない。これまでに第2高調波発生(SHG)などの非線形光学効果を利用したイメージング技術や生体分子の振動状態に基づくラマン分光分析技術の開発・応用を行ってきたが、これらをさらに開発・高度化することによって、生体組織深部の細胞観察や細胞外マトリックスを構成するコラーゲンの量的・質的変化の検出・評価が可能になり、将来の組織・病理学診断法としての応用が期待される。本研究では、ラマン分光分析を基盤とする最先端の光学技術を融合した革新的顕微鏡システムを開発し、細胞のみならずこれまで着目されてこなかった細胞外マトリックスの病的変化を解析できる新しいコンセプトの医学・医療応用ツールを提案することを目的とし、本年度においては無染色で細胞の形態や分子の局在、組成・構造変化などを可視化するラマン顕微鏡システムを構築し、がん転移モデルおよび骨軟骨疾患モデル動物の計測を実施した。その結果、細胞外マトリックスの分子組成変化に着目した解析によって、疾患特有のスペクトル変化を捉えることに成功した。これらの成果を踏まえて、ヒト検体の計測にも着手した。生体組織計測に特化した顕微ラマン分光システムを独自に構築し、かつ疾患モデルマウスを作製し、細胞外マトリックスを中心とした生体組織内の分子組成の量的・質的変化を統合的に解析し、既存の組織・病理学的所見と比較検討した結果、骨粗鬆症、変形性関節症およびがん転移巣において、これらの疾患の特徴を示すラマンピークの変化を見出すことに成功したため、想定よりも早く臨床応用のための第一歩であるヒト検体の計測まで実施するに至ったから。生体の光イメージング技術は、細胞や組織に対する侵襲性が少なく、光と分子の相互作用を利用して、生体機能や様々な疾患と関連が深い分子の動態を直接あるいは間接的に可視化するために非常に有効な分析ツールである。本研究では、無染色で生体分子を可視化できるラマン分光分析と高次高調波発生などの非線形光学効果に基づいた光イメージング技術を開発し、医療応用を目指すことを目的とした。目標達成のために、細胞や組織などの生体計測に特化した、ラマン分光分析システムを独自に設計・構築し、性能評価を実施した。その結果、高感度かつ再現性に優れたラマン分光分析装置が完成した。このようにして独自に構築した顕微ラマン分光システムを用いて、培養細胞、実験動物より採取した組織標本等の計測に成功した。続いて、医療応用を視野に入れて、整形外科や消化器腫瘍外科、病理医と連携し、種々の疾患モデル動物の作成と解析をを行った。これまでに、軟骨変性疾患モデル、骨粗鬆症モデル、がん転移モデルなどを用いた動物実験により、その有用性と実用可能性を明らかにしてきた。これらの研究成果に基づき、本年度はヒト検体を用いた解析を実施した。特に、細胞外マトリックスの分子組成の変化に着目し、ラマン分光法および多光子励起顕微鏡を用いた解析を中心に行った結果、変性軟骨や、がん組織において、細胞外マトリックスの分子組成変化を鋭敏に捉えることに成功し、実用化のための重要な知見を得ることができた。動物実験による検証が終了し、想定よりも早くヒト検体の計測に着手することができたため。さらに、細胞外マトリックスに着目した解析の結果、疾患との関連が深いと考えられる変化を捉えることに成功したため。

細胞や組織に障害を与えることなく、生体分子や内部構造を可視化するバイオイメージング技術の実用化を目指して、本研究では特に無染色で生体分子を可視化できるラマン分光分析や高次高調波発生などの非線形光学効果を利用した計測システムの構築を行い、疾患モデルや臨床検体の網羅的解析を行った。本研究の最初の成果としては、細胞や組織などの生体計測に特化した、ラマン分光分析システムを独自に設計・構築し、高感度かつ再現性に優れたラマン分光分析装置が完成したことが挙げられる。続いて、独自に構築した顕微ラマン分光システムを用いて、培養細胞、実験動物より採取した組織標本等の計測を行い、整形外科・消化器小児外科・心臓血管外科と連携し、種々の疾患モデル動物の解析およびヒト臨床検体の解析に成功した。最終年度では、骨粗鬆症モデルにおける骨質計測への応用可能性や抗がん剤投与による血流動態の解析などの研究成果を論文発表するに至った。また、ヒトの手術検体や病理標本を用いた解析も同時に並行して進めることができた。ラマン分光分析およびケモメトリックス解析による細胞外マトリックスの分子組成に着目することで、様々な疾患の早期診断や予後予測に応用できる可能性を示すことができた。さらに、従来は大型かつ高価な多光子励起顕微鏡を用いた非線形光学イメージング技術の医療現場での実用化に向けた取り組みとして、レーザー光源を含むシステム全体の小型化にも着手することができた。新たに構築した顕微ラマン分光システムによって得られた結果を蓄積し、ラマンスペクトルデータベースを構築するとともに、生体試料のラマン分光計測に特化した仕様の検出光学系およびラマン分光器の改良を行う。細胞外マトリックスの主要な構成分子に帰属されるラマンスペクトルの形状およびピークに注目して,疾患特異的なピークの高感度検出を達成するため、励起波長の最適化、および計測手法の検討を行い、最終的にはヒトへの応用、低・無侵襲的な検査手法としての将来性を見込んで、病理診断や臨床現場での実用化につなげていく。これまでに構築したラマン分光分析システムを用いて、病理組織標本の網羅的な解析を行い、実際の臨床現場においてがん診断や鏡視下での診断に使える技術へと発展させるための検討を行う。また、ヒト検体を用いた解析結果をこれまでに蓄積したモデル動物を用いた解析結果とじゅうぶんな比較検討を行い、再現性や安全性といった実用上の問題点を洗い出し、解決策を模索していく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
「環境問題解決」能力を育てる系統的カリキュラムの実践的研究

ゴミの増加とゴミ処理による新たな環境問題が深刻化し、便利な生活を保障してきたこれまでの生産・消費や社会システムを見直す必要が指摘されている。また、ゴミ問題を生じない循環型社会にしていくためには、ゴミ問題を資源・エネルギー問題として包括的に扱うことが必要であり、問題の体系的な理解と実践能力を育成する教育が必要である。そこで、自然界の循環原理の理解、それに基づく社会システムつくりの一貫した方策、その実践参加能力の育成、までを包含する総合授業を、小・中・高等学校の各学校段階を通じて系統的・体系的に構想した。その構想の具体化を行い、問題に精通していない教師でも一定水準の教育効果が期待できる具体的な授業内容として提示してきた。分別回収しても資源化されない社会システムの問題から、循環システムの必要性をわからせる。循環システムをつくるためにはどのような政策が必要かについて、政策や企業の対応の実例として日本とEUを比較することにより、政策や企業の対応も3Rの原則に沿う必要があることを理解させている。これらをもとに、さらに、地域の違った複数校における「環境問題解決能力」を育てる系統的カリキュラムの実践を行った。解決策の見通しがついて具体的行動の優先順位がわかるチェックシートを使用し、また、授業方法の開発や理解度が測定できる評価テストを作成した。循環システムをつくるためにはどのような政策が必要かについて、ゴミ減量の3Rの原則に沿って、日本とドイツの廃棄物政策の内容とその効果を比較することにより、政策も3Rの原則に沿う必要があることを理解させている。これらをもとに、さらに、地域の違った複数校における「環境問題解決能力」を育てる系統的カリキュラムの実践により解決策の見通しがついて具体的行動の優先順位がわかるチェックシート・授業方法の開発・理解度が測定できる評価テストの作成を行った。これらをもとに、さらに、地域の違った複数校における「環境問題解決能力」を育てる系統的カリキュラムの実践を行ってきている。
老人性難聴の自覚意識の評価法の開発とリハビリテーションに関する研究

1.平成12年度中高年者の聴こえの実態について調べるため、50歳から79歳までの男女119名を対象にアンケート調査、純音聴力検査を実施した。その結果、男女とも加齢に伴い純音聴力は悪化し、その傾向は高音域において著しかった。また、加齢に伴い難聴9自覚も高くなる傾向がみられ、特に70歳代群で顕著であった。アンケートで難聴の自覚意識を最も反映していたのは、雑音下での聞き取りに関する項目であった。2.平成13年度1)老人性難聴の自覚意識の評価法の開発:高齢者用アンケートを作成し、60歳以上の高齢者とその家族116名について実施した。その結果は(1)高齢者およびその家族において、60歳代群では2割、70歳代群では3割、80歳代群では67割が聴こえにくさを自覚/予測していた。(2)高齢者58名中、2名が耳穴型の補聴器を装用しており、両者の難聴の自覚率は910割であった。(3)アンケート項目を分析し、老人性難聴についての自覚意識の評価表を作成した。コミュニケーションの際には、雑音を抑え、聴取し易い環境を作り、補聴器の活用も考慮し、ややゆっくりと区切って、明瞭に話し掛けることが重要と考える。2)老人性難聴者の単語レベルでの語音聴取の特徴:60歳以上の軽中等度レベルの老人性難聴者21名に、有意味語4語・無意味語4語を、話速とノイズの有無の4条件による組み合わせで聴取してもらった。その結果、(1)老人性難聴者は健聴者に比べ、話速と雑音の影響を受け易く、(2)老人性難聴者でも有意味語の単語レベルの理解は比較的保たれていることが分かった。難聴の高齢者とのコミュニケーションへの留意点は(1)話速は抑える。(2)雑音は極力排除する。(3)声は大き目にする。補聴器の効果も期待できる。(4)単語レベルでの認知・理解能力は保たれているので、(1)(3)を考慮して話し掛ければ、会話の理解度は向上すると思われる。本年度は,「老人性難聴の自覚意識の評価法の開発」に関するパイロット・スタディとして.次のような研究を行った。1.研究目的:老人性難聴の自覚意識と聴力について実態を調査する。2.研究方法:1)老人性難聴の自覚意識調査のためのアンケートを作成:文献および自検例を参照し,高齢者の聴こえに関するアンンケート項目を考え,アンケートを作成する。2)アンケートおよび聴力検査の実施:50歳79歳の男女119名を対象に,アンケート(聴こえにくい方にはトランペット型補聴器を使用して話しかける)および純音聴力検査(リオンオージオメータAA-56および室内の騒音を測るためにリオン普通騒音計NL-04を使用)を実施し,老人性難聴の実態を把握する。3.研究結果:1)アンケートの作成:10項目からなるアンケートを作成し,老人性難聴の自覚度や自覚率が算出できるように配慮した。2)アンケート結果:自覚率は50歳代群および60歳代群では30%前後であったのに比べ,70歳代群では60%と顕著に高かった。

難聴の自覚意識を最も反映していたのは,雑音下での聞き取りに関する項目であった。3)純音聴力検査結果:男女ともに,加齢とともに聴力閾値の上昇がみられ,特に高周波数域で顕著であった。4.考察:アンケート結果については,生活環境や難聴を認めたくないという心理,主観に基づく自己評価などの要因が関与していると思われた。聴力検査については,聴力の男女差は先行研究による結果程は認められなかった。今回の結果を基にして,13年度は評価法およびリハビリテーションについて取り組んで行きたい。本年度は、昨年に引き続き、次の研究を行った。1.「老人性難聴の自覚意識調査」の実施および評価法の作成1)研究目的:平成12年度の実績をもとに老人性難聴の自覚意識調査を実施し、評価法を作成する。2)研究方法:(1)老人性難聴の自覚意識調査アンケート〈60歳以上の高齢者用とその家族用)を作成する。(2)60歳以上の高齢者およびその家族の方に上記のアンケートを実施する。(3)アンケート結果を分析・整理し、老人性難聴の自覚意識評価法を作成する。(4)アンケート結果をもとに、老人生難聴への配慮について提案する。3〉研究結果:(1)22項目からなる老人性難聴の自覚意識調査アンケート〈60歳以上の高齢者用とその家族用)を作成し、60歳以上の高齢者58名(60歳台22名、70歳台26名、80歳10名;男性24名、女性34名)、それぞれの家族58名、計116名に実施した。(2)年代別の聴こえについては、60歳台〈約2割)、70歳台(約3割)と比較して80歳台〈約7割)の高齢者の難聴の自覚意識が高かった。(3)アンケート項目では、「早口で話されると分からない〈59%)」、「周囲がうるさいと内容が聞き取れない(53%)」、「体温計の音など小さな音に気づきにくい〈49%)」、「二人以上の人が話していると聞き取れない〈48%)」、「人に話し掛けられると聞きなおす(48%)」などの項目の自覚意識が高かった。4〉考察:高齢者および家族の方による「高齢者の日常の聞こえ方」の調査により、話し手の側の要因として、発話速度、音量、発音の明瞭さ、雑音環境など、聞き手の側では年齢の要因などが、高齢者の聴き取りに関与していることが示唆された。高齢者の聴き取りにくい要因をできるだけ除去したコミュニケーションへの配慮が不可欠と思われる。
始原生殖細胞における不活性X染色体再活性化メカニズムの解明

哺乳類の雌(XX)は、雄(XY)との間のX染色体遺伝子量を補正する為に、発生初期に2本のX染色体のうちの1本上の遺伝子発現を協調的に不活性化する。この不活性化はXist RNAによって開始される。しかし、内部細胞塊及び始原生殖細胞形成過程で不活性化X染色体は再活性化される。本研究では、試験管内再構成されたマウス始原生殖細胞様細胞における不活性X染色体の再活性化ダイナミクスを明らかにした。前年度は1. in vivo由来の始原生殖細胞発生過程における再活性化ダイナミクスの解析を行った。2.多能性幹細胞(ESCs)より試験管内再構成法を用いて始原生殖細胞を誘導して再活性化を再現し、in vitro由来の始原生殖細胞における再活性化ダイナミクスの再現性の解析を行った。1ではE7.5からE12.5まで24時間ごとにin vivo由来の始原生殖細胞を回収し、再活性化ダイナミクス(Xistと不活性X染色体特異的ヒストン修飾であるH3K27me3の消失とX連鎖遺伝子の両アレルからの発現)を時系列で解析を行った。その結果、XistはE7.5から消失開始し、E10.5でほぼ全ての始原生殖細胞で消失が観察された。不活性X染色体特異的ヒストン修飾であるH3K27me3の消失はXistより24時間遅れて、E8.5から消失開始し、E11.5でほぼ全ての始原生殖細胞で消失が観察された。X連鎖遺伝子の両アレルからの発現は一部の遺伝子でE7.5以降に開始する事が認められた。2では試験管内再構成法で始原生殖細胞様細胞を誘導し、誘導開始後から3日後、72時間で、再活性化の解析を1と同様に行った。その結果、90%以上の細胞で誘導開始後72時間後で不活性化に必要な遺伝子であるXist遺伝子の発現とH3K27me3の局在が消失しており、両X染色体から一部のX連鎖遺伝子の発現が認められた。これらの結果から、試験管内再構成した始原生殖細胞における不活性X染色体再活性化が誘導されている事を多面的に確認出来た。また、誘導開始後から3日後、72時間における試験管内再構成した始原生殖細胞はin vivoのE11.5の始原生殖細胞に相当すると考えられた。前年度は前々年度に引き続き、1. In vivo由来の始原生殖細胞発生過程における不活性X染色体再活性化ダイナミクスの解析を行った。2.多能性幹細胞(ESCs)より試験管内再構成法を用いて始原生殖細胞様細胞を誘導して、in vitro由来の始原生殖細胞様細胞における不活性X染色体の再活性化ダイナミクスの解析を行った。1ではRNA FISHを用いて、E10.5及びE12.5胚由来始原生殖細胞におけるX染色体上遺伝子の両アレルからの発現解析を行った。その結果、E10.5では解析した一部の遺伝子、特にテロメア側に位置する遺伝子で両アレルからの発現が30%未満の細胞で観察された。一方、E12.5胚由来の始原生殖細胞では50%以上の細胞で解析した半数以上のX染色体上遺伝子で両アレルからの発現が観察された。これらの結果から不活性X染色体の再活性化はこの発生ステージではまだ完了していないと考えられる。また、2では1と同様にRNA FISHを用いて、試験管内再構成法で誘導培養開始後、6日間培養した始原生殖細胞様細胞(遺伝子の発現パターンからE9.5胚相当)におけるX染色体上遺伝子の両アレルからの発現解析を行った。その結果、解析した一部の遺伝子で両アレルからの発現が5%未満の細胞で観察された。同発生時期(E9.5)相当のin vivo胚由来の細胞における発現パターンも早急に解析し、それらと比較する事により、再活性化の進行を検証する必要がある。前年度は引き続き、1. In vivo由来の始原生殖細胞発生過程における不活性X染色体再活性化ダイナミクスの解析を行った。2.多能性幹細胞(ESCs)より始原生殖細胞様細胞を誘導して、in vitro由来の始原生殖細胞様細胞における不活性X染色体の再活性化ダイナミクスの解析を行った。1ではRNA FISHを用いて、E9.5及びE14.5胚由来始原生殖細胞におけるX染色体上遺伝子の両アレルからの発現解析を行った。その結果、E9.5では解析した一部の遺伝子、特にテロメア側に位置する遺伝子で両アレルからの発現が15%未満の細胞で観察された。一方、E14.5胚由来の始原生殖細胞では80%以上の細胞で解析した10種類のX染色体上遺伝子で両アレルからの発現が観察された。この結果から再活性化はこの発生ステージで完了していると考えられる。また、2では1と同様にRNA FISHを用いて、誘導開始後、6日目の始原生殖細胞様細胞(遺伝子の発現パターンからE9.5胚相当)におけるX染色体上遺伝子の両アレルからの発現解析を行った。in vivo胚の細胞における発現パターンと比較した場合、低い事が確認された。この結果から誘導過程において、片方のX染色体を消失している可能性が考えられるため、RNA FISHに続いてDNA FISHを行い、誘導過程におけるX染色体の本数を確認した。

その結果、誘導開始前のES細胞ではほとんどの細胞が2本保持していたが、誘導が進むに連れて5060%の細胞が片方のX染色体を消失している事が判明した。このため始原生殖細胞様細胞における不活性X染色体の再活性化ダイナミクスをDNA FISHとRNA FISHをあわせて2本X染色体を持つ細胞でのみ再解析中である。In vivo由来の始原生殖細胞(E11.5から14.5まで)の解析は完了した。E9.5-10.5胚由来の始原生殖細胞は非常に少量しか回収出来ない為に、解析が遅れている。一方、In vitro由来の始原生殖細胞様細胞の解析は上記したように再解析中である。また、前年度までの問題であった細胞のカバーガラスからの剥離はコーティング剤をPoly-L-Lysineを用いる事により防ぐ事が出来るようになった。1.多能性幹細胞(ESCs)より始原生殖細胞様細胞(PGCLCs)を誘導し、誘導開始後6日目のDay6 PGCLCs(RNA FISH解析後にDNA FISHでX染色体を2本保持する事を確認)における不活性X染色体の再活性化状態の解析をRNA FISHを用いて行った。その結果、Day6 PGCLCsではXistの発現は解析したほとんどの細胞で消失していたが、解析した10種類のX染色体上遺伝子の両アリルからの発現はほとんどの細胞で認められなかった。この事からDay6 PGCLCsでは、まだX染色体上遺伝子の再発現は開始していないと考えられる。2.単一細胞RNA-Seqを用いたIn vivo由来の始原生殖細胞(PGCs)発生過程(E9.5E14.5)における不活性X染色体再活性化の変動解析を公表されている結果とも比較しながら行った。その結果、RNA FISHで得られた結果と同様にXistはE9.5からE10.5にかけて発現がほぼ消失し、X染色体上の遺伝子はE10.5以降に両アリルからの発現を再開する遺伝子が多い事を確認した。3.2で得られた結果からPGCsの不活性X染色体再活性化におけるXistの発現抑制に関与すると推定される因子をXistの発現が消失するE9.5からE10.5で特異的に発現上昇する遺伝子を既報の多能性因子郡から選定した。その結果Rex1 (Zfp42)が特異的に上昇している事を見いだした。この事からRex1がPGCsでもXistの発現抑制に関与している事が推定される。哺乳類の雌(XX)は、雄(XY)との間のX染色体遺伝子量を補正する為に、発生初期に2本のX染色体のうちの1本上の遺伝子発現を協調的に不活性化する。この不活性化はXist RNAによって開始される。しかし、内部細胞塊及び始原生殖細胞形成過程で不活性化X染色体は再活性化される。本研究では、試験管内再構成されたマウス始原生殖細胞様細胞における不活性X染色体の再活性化ダイナミクスを明らかにした。RNA FISHを行う際に始原生殖細胞をスライドガラスもしくはカバーグラスに接着させているが、処理を進めて行く間にほとんどの細胞が剥がれて失われてしまう為に一回の実験で解析出来る細胞数が非常に少ない。この為に計画全体の進行が遅れている。また、In vivo由来の始原生殖細胞は非常に少量しか回収出来ない為に、再活性化の解析が遅れている。E9.5-10.5胚由来のIn vivo始原生殖細胞は非常に少量しか回収出来ないので、生殖隆起から凍結切片を作成し、始原生殖細胞マーカーを用いた蛍光免疫染色とRNA FISHを組み合わせる事で解析出来る細胞数を増やす。