hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ランタノイド錯体を触媒とする複素環化合物の合成

近年、有機合成反応において、ランタノイド化合物は従来の遷移金属錯体にない特有の触媒作用を示すことが報告されている。今回、ランタノイド化合物を触媒に用いたこれまでにない新しいタイプの合成反応をいくつか見い出した。触媒量のSm(O^iPr)_3存在下、脂肪族のイミンとニトロアルケンを反応させると、相当するプロール誘導体が生成することが明らかになった。例えば、N-ブチリデンブチルアミンと当量のtrans-β-ニトロスチレンをSm(O^iPr)_3を触媒に用い、THF中60°Cで3時間反応させたところ、N-ブチル-3-エチル-4-フェニルピロールが63%の収率で得られた。ピロール誘導体の触媒的な合成法はほとんど知られておらず、本反応は新規な方法として有用である。また、SmI_2を触媒に用い、イミンとエポキシドの反応によって、オキサゾリジン誘導体が合成できることを見い出した。一方、ランタノイド化合物を触媒に用いることによって、酢酸イソプロペニルをアシル化剤とする種々のアシル化合物の合成反応を開発した。Cp_2^*Sm(thf)_2錯体触媒存在下、アルデヒドとアセトンシアノヒドリンおよび酢酸イソプロペニルとの反応を行ったところ、対応するアセチルシアノ化物が良好な収率で得られることを見い出した。また、イソプロパノールと酢酸イソプロペニルを共存させ、Gd(O^iPr)_3を触媒に用いシクロヘキサノンの反応を行うと、Meerwein-Ponndorf-Verley型還元アシル化反応が生起し、シクロヘキシルアセテートがほぼ定量的に得られることが明らかになった。
学校全体で取り組むピア・メディエーション(2)-子どもの修復的対話と学級集団-

本研究では,小学4年生から6年生の子どもに対してピア・メディエーションの導入を行い、子どもたちの日頃の友人とのかかわりで生まれる対立問題の際、どのような方法を用いて解決されるかを観察することを目的とした。また、その中でも子どもの修復的対話による対立問題への介入がみられた場合には、どのような会話のもとで介入されたかを質的に検討することとした。これらの目的を達成するために,本研究ではおおむね以下のような手続きをとった。1)アメリカの学校視察と学会での研究者との交流, 2)研究会の開催による実践と研究の交流, 3)授業プログラムの実践, 5)観察データの収集と評価, 6)実践プログラムの改善と研究成果の報告。ピア・メディエーションの授業プログラムによって、友人との関わりにおいて説明や説得をする姿が見られる機会が増えた。その要因として、対話による修復をロールプレイによって経験することにより、話し合いという子どもにはやや抵抗を感じる方法に対して、ピア・メディエーションを通してスキルを習得し、抵抗感が減少していったのではないだろうかと推察している。実施前の子どもたちの生活場面では、対立が生じると暴力を振るったり、ののしったり、高学年女子の場合は無視をし合うなど非対話的対応が多く見られた。だが、授業を終えた子どもたちの様子を見ると、積極的に相手に対して行動の理由を聞いたり、気持ちを聞いたりするなど積極的に対話しようとする姿勢が見られ、対話を通した交流を行おうとする様子が見られた。5年生、6年生では低学年のいざこざ場面に介入することが、見られるようになった。以上より、ピア・メディエーションに学校全体で取り組むことで、学校における異学年ピア・サポートが促進されることが明らかとなった。
副腎髄質機能調節機構に関する研究ーmicrodialysisによる解析ー

本研究は副腎髄質レベルにおける副腎髄質機能調節機構を明らかにすることを目的として実験を行なった。最初に副腎における主要な神経伝達物質であるアセチルコリン(ACh)とカテコ-ルアミンとの関連性を調べた結果、副腎組織中のACh量とカテコ-ルアミン(エピネフリンおよびノルエピネフリン)量との間には有意の正相関が認められた。また、ストレス反応性の異常が報告されている脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)をyoung群(10週齢以下)、adult群(約20週齢)とold群(約40週齢)に分け、加齢による副腎ACh量の変化を同週齢の正常血圧ラットならびに高血圧自然発症ラット(SHR)と比較した結果、old群のSHRSPでは副腎ACh量の有意の増加が認められたことから、このSHRSPでの変化は悪性高血圧症への進展に関連したSHRSPの病態を反映しているものと考えられる。次に、microdialysis法を用いて安静時およびカリウム刺激時の副腎髄質レベルにおけるACh遊離量を測定した結果、adult群SHRSPの安静時の副腎ACh遊離量は、同週齢のWKYに比較し増加傾向を示した。さらに、100mMのカリウム刺激に対する副腎ACh遊離量変化の反応性はSHRSPでは有意に低下していた。これらの結果は、副腎組織中のACh量が副腎髄質機能を反映することを意味しており、SHRSPでは加齢に伴って副腎髄質機能が亢進していることを副腎ACh量の点から示すものである。さらに、microdialysis法を用いた副腎ACh遊離量の測定結果から、SHRSPでは副腎髄質レベルでの機能調節機構が変化している可能性が示唆された。今後、microdialysis法を副腎静脈血中モノアミン遊離量の測定に応用し、ACh遊離量との関連性(興奮ー分泌連関)の観点より実験を進め、副腎髄質レベルにおける調節機構について、さらに研究を進める予定である。以上の成績については、第41回日本薬理学会北部会(1990年)において発表し、第64回日本薬理学会総会(1991年)にて発表予定である。
変異ヒトγδ型T細胞受容体の立体構造解析による非ペプチド性抗原認識機構の解析

本研究課題においては、ヒトγδ型T細胞受容体の細胞外領域をそれぞれ大腸菌で発現させ、リフォールディング後、結晶化し、その構造を2.2Åの解像度で決定した。具体的には、まず、γ鎖およびδ鎖の細胞外領域をそれぞれクローニングし、T7プロモーターを有する発現ベクターに組み入れた。原配列のままでは全く発現が見られなかったため、分子動力学的手法を用いてステムループの除去を行った。さらに、大腸菌コドンインデックスが0.65以上になるようにコドン置換を行い、また、プリファレンスインデックスにより大腸菌型コドン置換も行った。このようにして、γ鎖およびδ鎖を大腸菌1リットル培養で100mg以上の収率で発現させることが可能になった。ここで得られた封入体をグアニジン溶液に溶解し、DTT処理後、アルギニンベースの緩衝液に迅速希釈してリフォールディングを行った。透析後、タンパクの精製を行ったが、その際、pIから判断してpHを5.5に調製し陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。さらに、分子篩により最終的な精製を行い、結晶化用タンパク標品とした。結晶化のスクリーニングは、市販のキットと当研究室で作製したキットを用いて行った。その結果、PEG4000ベースの緩衝液でタンパク質が結晶化することが明らかになった。この結晶をインハウスのX線発生装置で解析した結果、3Å程度の回折点が得られたため、SPring8で高解像度のデータを採取した。データ解析はワークステーションで行い、次のような統計値を得た。空間群:P21、格子:60.82、77.35、100.12、90.00、95.00、90.00、回折点:314,713、独立回折点:65,401、解像度:1.90、完全性:91.4、重複性:4.8、リファインメント:15-1.90。以上のようにヒトγδ型T細胞受容体の構造を高解像度で決定することができた。ヒトγδ型T細胞は、結核菌、マラリア原虫、病原性大腸菌O157などの産生するピロリン酸モノエステル系化合物や、プロテウスなどの産生するアルキルアミン系化合物を認識し、感染免疫において重要な役割を果たしている。また、それら非ペプチド性抗原をパルスした腫瘍細胞を効率よく傷害することから腫瘍免疫においても重要な役割を担っていると考えられている。今年度は、ヒトγδ型T細胞による非ペプチド性抗原認識において最も重要な役割を果たすγδ型T細胞受容体の細胞外領域を大腸菌で封入体として産生し、リフォールドを行い、精製後、結晶化を行った。具体的には、γ鎖およびδ鎖として、γδ型T細胞の増加していた成人末梢血中において、最も高頻度に検出された配列をクローニングし、それらを組み合わせたγδ型T細胞受容体を野生型とした。さらに、γK108A、γK109A、δR51A、δL97Aの各アラニン点変異体を作製した。また、γ鎖において野生型のCDR3領域のVとQの間にアラニンを1つから5つ添加した変異体も作製し、野生型およびそれぞれの変異型γδ型T細胞受容体の細胞外領域タンパク質を調製した。

その際、もともとのヒト型遺伝子配列を大腸菌に組み込んだ場合において、全くタンパク質の発現がみられなかったため、リボソーム結合部位の改変、スペーサー領域の改変、コドンのサイレント変異などを行い、塩基配列をヒト型から大腸菌型に改変した。これらの塩基配列変換により、大腸菌培養1リットルあたり300mg程度の封入体の産生がみられるようになった。結晶化に関しては、野生型T細胞受容体に関しては、0.2mm程度の結晶が再現性よく得られた。来年度は、今年度得られた結晶に関して構造解析を行うとともに、その他の変異型T細胞受容体に関しても、結晶化と構造解析を進めていく予定である。本年度は、ヒトγδ型T細胞受容体の細胞外領域をそれぞれ大腸菌で発現させ、リフォールディング後、結晶化し、その構造を2.2≠フ解像度で決定した。具体的には、まず、γ鎖およびδ鎖の細胞外領域をそれぞれクローニングし、T7プロモーターを有する発現ベクターに組み入れた。原配列のままでは全く発現が見られなかったため、分子動力学的手法を用いてステムループの除去を行った。さらに、大腸菌コドンインデックスが0.65以上になるようにコドン置換を行い、また、プリファレンスインデックスにより大賜菌型コドン置換も行った。このようにして、γ鎖およびδ鎖を大腸菌1リットル培養で100mg以上の収率で発現させることが可能になった。ここで得られた封入体をグアニジン溶液に溶解し、DTT処理後、アルギニンベースの緩衝液に迅速希釈してリフォールディングを行った。透析後、タンパクの精製を行ったが、その際、pIから判断してpHを5.5に調製し陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。さらに、分子篩により最終的な精製を行い、結晶化用タンパク標品とした。結晶化のスクリーニングは、市販のキットと当研究室で作製したキットを用いて行った。その結果、PEG4000ベースの緩衝液でタンパク質が結晶化することが明らかになった。この結晶をインハウスのX線発生装置で解析した結果、3£□xの回折点が得られたため、SPring8で高解像度のデータを採取した。データ解析はワークステーションで行い、次のような統計値を得た。空間群:P21、格子:60.82、77.35、100.12、90.00、95.00、90.00、回折点:314,713、独立回折点:65,401、解像度:1.90、完全性:91.4、重複性:4.8、フィファインメント:15-1.90。以上のようにヒトγδ型T細胞受容体の構造が高解像度で決定できた。
GSO無機シンチレータを用いた低エネルギー太陽ニュートリノ実験の基礎研究

数年前ガドリニウムが低エネルギー太陽ニュートリノ実験を行うのに非常に適した原子核であることが指摘されたので、本研究ではガドリニウムを多く含む結晶シンチレータGSO(Gd_2SiO_5)を用いて、太陽ニュートリノ実験が可能であるか否かの基礎研究を行った。予想される太陽ニュートリノ信号は、まず電子の信号があり、その後約90ナノ秒遅れてガンマ線の信号があり、この2つの信号を同定することによりノイズと区別される。本研究の結果、GSOを用いた太陽ニュートリノ実験、特に太陽の核融合の内最も基本的な過程で生成されるppニュートリノを観測する実験を行うためには、現在製造しうる最もウランの不純物の少ないGSOより更に10^8倍不純物の少ない結晶を生成すること、また、結晶の発光過程が太陽ニュートリノ実験装置として使用するためには少し遅すぎることが判明し、現段階では、GSOを用いた太陽ニュートリノ実験の実現は非常に難しいと結論せざるを得なかった。同様に少しエネルギーの高い^7Be太陽ニュートリノの検出装置に関しても、GSOの発光過程が少し遅すぎ実現は困難であると結論した。なお、研究の1つの発展として、1970年代に提案されたが、非常な困難があるとしてあきらめられていたインジウムを用いた太陽ニュートリノ実験の可能性をもう一度精密なシミュレーション計算により検討した。その結果、インジウムを用いた太陽ニュートリノ実験は、やさしくはないが実現可能性があることが判明した。低エネルギー太陽ニュートリノ検出器に使用できる物質として、ガドリニウムが都合よいことが近年発見された。我々はガドリニウムを多く含むGSO無機シンチレータが太陽ニュートリノ実験に使え得るか否かの基礎的な研究を行った。まず、太陽ニュートリノ検出器として用いるためには、予想される太陽ニュートリノ信号がまず電子の信号があり、それから約90ナノ秒遅れてガンマ線の信号があるため、2つの時間的に数十ナノ秒離れた信号を分別する必要がある。このため、シンチレータの発光減衰時間も数十ナノ以下であることが求められる。このために我々はCeを通常より多く(3%)ドープしたGSOを特注し性能評価した。この結果、シンチレーション信号の時間は半値全幅で、約40ナノ秒と概ね満足のいくの値を得た。また、太陽ニュートリノ実験では、信号の頻度が非常に低いので、UやThといった放射線バックグラウンドを取り除く必要がある。要求される純度はおおよそ10^<-10>g/gのU,Th不純物濃度である。我々はこの条件を満たす材料をもとにGSO結晶の制作を行った。しかし結果として得られた結晶の不純物濃度は10^<-8>g/g程度であり、我々の仕様を満たすものではなかった。この原因は今後突き止める予定である。
アト秒軟X線パルスの発生と軟X線非線形過程の研究

1フェムト秒(10^<-15>秒)の波束の広がりは0.3μmであり、0.3μmの波長の1サイクルに対応する。光のパルス幅は振動の包らく線の幅であるから、既に定義を越えている。1フェムト秒を切り、アト秒(10^<-18>秒)の領域に入るためには、短波長であることが絶対条件である。この研究では真空紫外から軟X線のコヒーレント光である高次高調波を用いてアト秒パルスに挑戦することが目的であった。平成9年度は極短紫外域(88nm)における新しいパルス幅の測定法を確立した。パルス幅測定のためには非線形光学過程が必要である。この研究で初めて高次高調波による多光子イオン化を観測し、自己相関法を用いて、パルス幅の測定を行った。パルス幅は88nmで27フェムト秒であった。繰り返し10Hzのレーザーを用いたため測定に20分程度かかり、その間のレーザーの安定性の問題があった。そのため繰り返し1kHzのテラワット級チタンサファイアレーザーを開発した。更なる短パルス化のためには高調波発生過程で起きるチャープを補償する必要がある。高調波に正の分数を与えることにより初めてパルス圧縮に成功し13フェムト秒を得た。この時用いた基本波のパルス幅は115フェムト秒であり、10フェムトの基本波を用いれば、アト秒パルスが得られる見通しを得た。最短光パルスのパルス幅は4.5フェムト秒で、近赤外では光のわずか2サイクルである。可視近赤外のパルスを用いるかぎり原理的限界に近い。更なる短パルス化のためには、短波長が必要であり、中でも高次高調波は有力候補である。ところがパルス幅の測定には非線形効果を必要とするが極端紫外域ではいまだ観測されていない。この研究ではまず、高次高調波の高出力化を試み、従来に比べ数ケタ改善を行った。例えばチタンサファイアレーザーの9次高調波(89nm)において、13nJであった。この光を用いてHeおよびArの2光子吸収を初めて観測した。2ビームに分けた9次高調波をパルスガスジェットに集光し、相互の遅延に変化させHe,Arイオンを測ることにより自己相関を測定した。この結果極端紫外では最短の27fsを得た。この結果は既にOptics Lettersに掲載され、高い評価を受け、今年のレーザーとエレクトロオプテックス国際会議(CLEO'98)に招待された。基本波のパルス幅34fsに対し9次高調波の27fsは予想より長過ぎるため、理論的解析を行った結果レーザーの集光強度に対するパルス幅依存性が明かになった。今後最適な強度での実験とあらたに開発中のkHz,TW級レーザー(パルス幅10fs)を用い、データの高速処理を行うことによりアト秒パルスをめざし準備している。平成9年度はチタンサファイアレーザーの9次高調波のパルス幅を2光子吸収を用いて初めて測定し、平成10年5月の国際会議(CLEO'98)に招待された。平成10年度は更なる短パルス化を目ざし、高調波のチャープ特性を調べ、パルス圧縮することにより13フェムト秒を得た。これは高次高調波の最短パルス幅である。一般に高次高調波はその発生メカニズムからして、負のチャープをしている。これを補償してパルス圧縮するためには正の分散を必要とする。5次と7次の高調波に対し、LiF、CaF_2の板を厚みを変え透過させることにより、最適な厚みがあることを実証し、100fsの励起光に対し、13fsの高調波を得た。また自己相関波形が5次高調波のHeによる4光子吸収によることを明らかにした。またチタンサファイアレーザー光にチャープを与えることにより特定の厚みのLiFに対し最短パルス化できることを実証した。

これらの結果は高次高調波において初めてパルス圧縮を行ったものであり、投稿準備中である。更に短パルス化してアト秒を目ざすためには、チタンサファイアレーザーの短パルス化と高速データ処理のため高繰り返し化が必要である。このため繰り返し周波数1kHzでTW級レーザーを開発した。パルス幅21fsで0.66TWを得た。このピーク出力はkHzレーザーでは最高である。
メラネシアに生起した新しいindigenous movementの人類学的研究

本年度は、9月18日から10月4日までの予定で、ヴァヌアツ第二の都市ルガンヴィルでのフィールドワークを実施した。帰路、ルガンヴィルから首都のポートヴィラまでの国内便が遅延したため、ポートヴィラでの国際線に接続できず、2日間余分な滞在を余儀なくされたが、その間、次年度でのフィールドワークのための手続き、予備調査を行った。ルガンヴィルでのフィールドワークの目的は、indigenous parliament運動の広がりを知ることであったが、以下の2点が明らかになった。1indigenous parliament運動は、ルガンヴィルでは2004年2005年頃に最盛期を迎えたが、近年はその活動は沈静化している、2ヴァヌアツの新しいindigenous movementは、伝統的な手続きによる各島のリーダー達を集めて伝統的な政治システムを復活させる目的をもったindigenous parliament運動よりも、伝統と近代の融合を目指す実験としてのTuraga Nation運動に、大きな比重をかけるようになってきた、という点である。ヴァヌアツで生起した新しいindigenous movementのポイントは、伝統と近代をいかに融合するか、近代から見た伝統の在り方を追求するという点である。その意味で、indigenous parliament運動は、西洋化しすぎた全国首長会議を批判するあまり、伝統への復帰を急ぐ提案をしたきらいがある。一方、Turaga Nation運動は、その本拠地であるペンテコスト島北部のラバトゥマンゲム村で伝統と近代の融合を目指した実験を繰り返しているという。この運動の実態を探ることが、本研究の中心活動となると考えられる。本年度のルガンヴィルの調査で、ルガンヴィルではindigenous parliament運動が下火となり、Turaga Nation運動に収れんされつつあることが分かったが、ヴァヌアツで生起した新しいindigenous movementの中核としてTurga Naton運動を位置付けることができるようになった。そして、本年度のフィールドワークのかたわら、来年度のTuraga Nation運動の本拠地であるラバトマンゲム村への入村許可を取ることができたことで、さらにindigenous movementの本質を追求することができることがわかったので、おおむね順調に進展していると考えられる。来年度は、ヴァヌアツで生起している新しいindigenous movementの本拠地でのフィールドワークを実施するとともに、運動のリーダー二人、つまり、ヒルダー・リニ氏とヴィラレオ氏を中心にインタビューを行い、運動の意味を探る。次年度は、ペンテコスト島北部の西海岸にあるラバトマンゲム村でのフィールドワークを含む調査を予定しているが、ペンテコスト島北部の飛行場からこの地に行くまでの間にトラック借り上げなどが必要になること、また船外機付きボートの借り上げなどが予想されることから、今年度の経費の一部を次年度に繰り越すこととした。
悪性脳腫瘍に対するNK細胞とIL-2による抗腫瘍に関する研究

本研究の成果については、以下のような項目の順に報告する。この研究は書籍5冊,19編の論文,49の学会発表をもってなされた。1脳腫瘍患者のT細胞サブセットとNK細胞,NK活性の動態脳腫瘍患者の臨床例について、術前,術後におけるT細胞サブセットとNK細胞をモノクロナール抗体を用いて、フローサイトメトリーにより測定し、これらが脳腫瘍患者の免疫能をみる上で新しい指標になることが判明した。更にNK活性についても重要な指標となっていることも解った。2フローサイトメトリーを用いた基礎的実験(螢光色素とsorting)螢光色素における基礎的実験で、FITC標識モノクロナール抗体の染色性について、Fluorescein diacetateを用いたviabilityの測定法の開発、Hoecnst3342による生体染色法等種々の螢光色素の至適条件を明らかにした。更に無菌的分取を施行するにあたり、機械のgatingとsortingも検索した3抗癌剤、インターフェロンによる抗腫瘍効果の判定in vitroでのフローサイトメトリーによる抗種瘍効果判定のための方法を開発し、手術材料より種々の抗癌剤の感受性検査する方法を開発した。又インターフェロンについても、FITC標識することによる判定も行った4NK細胞の照菌的分取と抗腫瘍効果モノクロナール抗体を(Leu7,leu11a)利用し、NK細胞を無菌的に分取する方法を開発、確立することができた。更にこの分取したNK細胞を用いて、株化細胞や脳腫瘍の手術材料からの培養細胞に対して、in vitro systemで殺細胞効果のあることが証明された5NK細胞とIL-2混合による抗腫瘍効果株化細胞では、両者混合による抗腫瘍効果が得られ、現在患者にも応用中である。
高機能性SiC粉末の合成と熱電変換効率の向上

本研究では機能性β-SiC粉末を製造する方法を通して熱電物性の向上を試みた。1.機能性粉末合成B添加により合成されたβ-SiCにはウイスカーが少なく、小さい粒径を持つ球状粒子が主に生成した。Nを添加した場合は、積層欠陥が多く存在し、結晶子が小さい粒子が合成された。Feを添加して合成した場合は、液相(Fe-Si系)を経由した溶解-析出反応によって欠陥が少なく、結晶子が大きいβ-SiC粒子が合成された。合成粉末のX線同定分析と格子定数の変化から、合成中に添加したBとNは各々β-SiC格子内に固溶する反面、Feは格子内に固溶せずにFe-Si系の第二相を形成したと考えられる。2.合成粉末の熱電物性N_2またはAr雰囲気中で合成した後、N_2中で焼結したβ-SiCはn型半導性を示した。したがって、Nは焼結中または合成中にドナーとして固溶したものと考えられる。N_2雰囲気中で合成したものの方がAr雰囲気中で合成したものより高い導電性を示したのは、合成中にNが固溶したためと考えられる。Bを添加して合成した粉末から作製した焼結体はp型半導性を示した。BはアクセプターとしてSiC中に固溶したため高い導電性が得られたと考えられる。機能性粉末から作製したβ-SiC焼結体のゼ-ベック係数を測定した場合、Nを添加したものは負のゼ-ベック係数を、Bを添加したものは正のゼ-ベック係数を示した。ゼ-ベック係数の絶対値はいずれの場合も温度上昇と共に増加した。Feを添加した場合の導電率とゼ-ベック係数はBまたはNを添加したものより両方高い値を示した。導電率の増加はβ-SiC内に金属系のFe-Siが形成されているためであり、ゼ-ベック係数の増加は欠陥が少ない粉末の生成のためと考えられる。Fe-Si系の熱処理によって金属相の半導体化することによってもっと優秀な熱電物性が期待される。
パーキンソン病に対する神経伝達物質及び神経栄養因子の遺伝子導入に関する研究

パーキンソン病は黒質線条体ドパミン神経系の進行性変性疾患であり、線条体に欠落したドパミンを供給したり、線条体にglialcell line-derived neurotrophic factor (GDNF)等を供給し、ドパミン神経系への保護修復効果を期待する方法がある。これらの因子の供給に遺伝子導入法は有用であると考えられる。遺伝子導入法として我々はプラスミドベクターとリポソームの複合体を1週間持続注入する方法で線条体の主にグリアに遺伝子を導入する手法を開発し、本研究ではこの方法を応用して、パーキンソン病の治療をめざした種々の検討を行った。パーキンソン病モデルとしては、1側の黒質線条体ドパミン神経系を6-hydroxydopamine(6-OHDA)で破壊した片側パーキンソン病モデルを用い、分析は、組織学的にはtyrosine hydroxylase (TH)に対する抗体を用いた免疫組織化学で黒質のドパミン細胞数、線条体のドパミン線維の密度を検討、生化学的には高速液体クロマトグラフィーで線条体のドパミン濃度を測定、行動学的には、アポモルフィンおよびアンフェタミン注入による薬物誘発回転運動を検討した。本研究期間に以下の点が明らかとなった。2.6-OHDA注入後遺伝子導入を行う時期は、早いほうがより機能的改善が得られた。3.GDNF遺伝子とTH遺伝子の両者を導入する方がより効果的であった。4.神経栄養因子に関しても、GDNF遺伝子とBDNF遺伝子の両者を導入する方が相乗効果があった。5.遺伝子発現は6カ月後にはかなり減少しており、今後長期発現の維持が重要であると考えられた。神経伝達物質、神経栄養因子の遺伝子を線条体に導入する方法は、パーキンソン病の治療法として有用と考えられた。組織学的には、線条体のグリアに、GDNFとTHの遺伝子の導入が確認された。黒質のドパミン細胞数と線条体のドパミン線維の密度が、遺伝子導入群で有意に増加していた。高速液体クロマトグラフィーの測定では、コントロール群に比べて、遺伝子導入群で有意に線条体のドパミン濃度の上昇がみられた。アポモルフィン誘発の回転運動についても、遺伝子導入群で有意な回転運動の減少効果が確認された。今回は、6-OHDA投与1週間後に遺伝子導入を行っているが、今後、2週間、4週間後に遺伝子導入を行い、これらの時期にも遺伝子導入効果がみられるかどうかを観察する必要がある。これまで、パーキンソン病に対する遺伝子導入では、神経伝達物質あるいは神経栄養因子の導入が単独で行われてきた。今回の研究では、これらを同時に導入することが可能であること、しかも、組織学的、生化学的、行動学的に有効であることが示された点が有意義である。パーキンソン病に対する治療法として、線条体へ神経伝達物質であるドパミンと、神経栄養因子であるglialcell line-derived neurotrophic factor (GDNF)の遺伝子を同時に導入する方法が期待されている。今回、この遺伝子導入がどのように宿主ドパミン系に対して修復効果を発揮するかを検討した。まず、ドパミン合成酵素であるtyrosine hydroxylase (TH)遺伝子を組み込んだプラスミドベクター、さらにGDNF遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを作製、これらの遺伝子をリポソームに混合して、複合体を形成した。パーキンソン病モデルラットは、6-hydroxydopamine (6-OHDA)を右側線条体に注入することによって作製した。本年は、このパーキンソン病モデル作成後、2週後と4週後に1週間のDNAリポソーム複合体の持続注入を浸透圧ポンプを用いて行い、宿主ドパミン系に対する影響を中心に分析した。

宿主の線条体のグリア細胞には、TH, GDNFの遺伝子が導入されていた。ニューロンへの導入は認められなかった。宿主黒質のドパミン細胞数と宿主線条体のドパミン線維の密度は、TH, GDNF遺伝子導入群で有意に増加していた。神経化学的分析では、宿主の線条体のドパミン濃度の有意な上昇が遺伝子導入群で観察された。機能的にもアポモルフィン誘発回転運動の有意な改善効果が、遺伝子導入群で認められた。これらの効果は、6-OHDA注入2週後の方が、4週後の場合よりも顕著であった。これまでの検討では、6-OHDA注入1週後での効果は認められていたが、今回2週後、4週後でも効果があることが判明し、パーキンソン病のドパミン神経系の修復を目指した治療として、これらの遺伝子導入が期待される。パーキンソン病は黒質線条体ドパミン神経系の慢性進行性変性疾患であり、再生医学からみた治療法としては、線条体に欠落したドパミンを供給する方法と、線条体にglialcell line-derived neurotrophic factor(GDNF)などの神経栄養因子を供給しドパミン神経系の保護修復効果を期待する方法とがある。今回は、ドパミン合成酵素であるtyrosine hydroxylase(TH)遺伝子を組み込んだプラスミドベクターと、GDNF遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを作製し、これらの遺伝子をリポソームに混合して複合体を形成した。6-hydroxydopamine(6-OHDA)というドパミン神経系に対する神経毒をラットの右側線条体に注入しパーキンソン病モデル動物を作製した。本年はこのパーキンソン病モデル動物に対するDNA-リポソーム複合体の持続注入の効果を長期にわたって検討することを目的とした。パーキンソン病モデル作成2週後にDNA-リポソーム複合体の持続注入を1週間浸透圧ポンプを用いて行った。分析は遺伝子導入後1カ月、3カ月、6カ月後に行った。宿主線条体のグリア細胞は、遺伝子導入1カ月後、3カ月後にTH染色、GDNF染色で陽性であったが、遺伝子導入6カ月後には染色が認められなかった。宿主ドパミン神経系の修復効果を黒質のドパミン細胞数と線条体のドパミン線維の密度で測定すると、遺伝子導入1カ月、3カ月後は有意な修復が認められたが、6カ月後にはその効果は減弱した。アポモルフイン誘発回転運動も1カ月、3カ月後は有意に回復したが、6カ月後には効果は減少した。本法はドパミンやGDNFの遺伝子導入法として有用であるが、導入した遺伝子の発現をより長期にするための工夫が今後の課題である。GDNF遺伝子あるいはBDNF遺伝子を組み込んだプラスミドベクターと陽性荷電リポソームを混合して複合体を形成させ、パーキンソン病モデルラットの線条体に1週間の持続注入を行った。組織学的には、線条体のグリアにGDNFとBDNFの遺伝子の導入が確認された。黒質のドパミン細胞数と線条体のドパミン線維の密度は、遺伝子導入群で有意に増加していたが、興味深いことにGDNFとBDNFの両遺伝子を導入した群でドパミン細胞数、ドパミン線維の密度ともより増加していた。
大空間トラス構造実現のためのFRP構造部材の開発

本研究では、比強度が高く軽量化が可能な繊維強化プラスチックを構造部材として使用することにより、大空間トラス構造物を実現することを目的とした。開発の目標としたトラス構造部材は、FRP材よりなるトラス部材の両端に接合用の金属部品を接着した構成となっており、現場で金属接合部品をボルト接合することにより、トラス構造物を構築するものである。さらに、このトラス部材には、接合部の信頼性を高めるため、接着部のFRP材に埋め込まれた光ファイバひずみセンサによりひずみモニタリングを行い、損傷を検出する機能を付加する。本研究では、まず、FRP材に光ファイバセンサを埋め込み、成形過程における内部ひずみ測定手法について検討した。また、成形後の運用時においても、ひずみモニタリングによる損傷検出が可能であるのかについても調べた。その結果、成形過程のひずみを測定することが可能であり、成形後の残留ひずみを含めた正確なひずみも検出できることを明らかにした。そして、繰り返し負荷においても正確にひずみを測定することが可能であり、ひずみモニタリングに基づき損傷を検出することもできることを示した。最後に、金属とFRP材よりなる接着継手について、FRP材に光ファイバセンサを埋め込み、本研究で開発した光ファイバひずみモニタリングシステムを使った、引張荷重下におけるひずみ測定実験を行った。そして、本ひずみモニタリング手法により接着継手の接着部におけるはく離の検出が可能であること、また、測定されたひずみ値からはく離長さを検出することもできることを示した。以上の本研究で得られた成果により、接着部に埋め込まれた光ファイバセンサを使用するひずみモニタリングシステムを備えた、FRPトラス構造部材を開発するための基礎的技術の確立が可能となり、大空間トラス構造物の実現に寄与することができた。本研究では、引抜FRP (Fiber Reinforced Plastics)材の両端に金属製接合部品を接着し、光ファイバセンサによる接合部のひずみモニタリングを可能とした大空間トラス構造実現のための構造部材を開発することを目的としている。本年度検討した内容およびその成果を以下に述べる。・トラス構造部材にはその強度特性から、引抜成形により製造される引抜FRPを用いる計画である。まず、引抜FRP円筒について、その金属材料との接着接合技術を確立する前に、ガラス繊維を強化材とする引抜GFRP平板についてアルミニウム合金平板との接着接合法について調べた。アルミニウム合金と引抜GFRP平板をエポキシ接着剤で接合した接着継手について、引張試験を行い、強度特性を調べた。そして、有限要素法による応力解析を行って、破壊基準を検討した。検討の結果得られた破壊基準を使用して、接着継手の予測を行ったところ、予測値と測定結果に比較的よい一致が得られ、本予測法の有効性を示すことができた。・トラス構造部材用FRP円筒の成形法としては、引抜成形法と並んで、FW (Filament Winding)法も成形法として有効であると考えられる。そこで、トラス構造用部材として、FW円筒についても検討することにした。FW成形GFRP円筒について、成形過程で光ファイバを埋め込む方法を検討した。実験には、ひずみ測定が可能な干渉型のFBG (fiber Bragg grating)光ファイバセンサを使用し、FBGセンサ埋め込み後、マトリックス樹脂の硬化過程における内部ひずみおよび硬化後の引張負荷に対するひずみや内部損傷の検出について調べた。その結果、本研究において考案した方法により成形時に埋め込んだFBGセンサがセンシング機能を低下させることなく、内部ひずみおよび損傷を検出できることがあきらかになった。本研究では、FRP(Fiber Reinforced Plastics)パイプ材の両端に金属製接合部品を接着し、光ファイバセンサによる接合部のひずみモニタリングを可能とした大空間トラス構造実現のための構造部材を開発することを目的としている。

本年度検討した内容およびその成果を以下に述べる。・本研究では、光ファイバひずみセンサをFRPトラス構造部材へ成形過程で埋め込み、接着部における部材のひずみを測定することを目的としている。FRPの成形においては、残留ひずみが発生するため、正確なひずみ測定を行うためには、成形過程で発生する残留ひずみを測定しておく必要がある。そこで、FRPに埋め込んだ光ファイバセンサによる、残留ひずみ測定について検討した。そして、残留ひずみの測定が可能であり、成形後のFRP被着材の正確なひずみが測定できることを示した。・本年度は、昨年度製作したFBG(fiber Bragg graling)光ファイバセンサによるひずみ測定システムに加えて、EFPI(Extrinsic Fabry-Perot Interferomeler)光ファイバセンサによるひずみ測定システムを構築した。そして、FRPとアルミニウムからなる接着継手において、FRPの接着端部にEFPIセンサを埋め込むことにより、接着端部のひずみ計測およびはく離検出が可能なヘルスモニタリング手法を考案した。実験で、FRPとアルミニウム平板からなる接着継手試験片について、本ヘルスモニタリング手法を適用し、本手法がひずみ計測およびはく離検出において有用であることを示した。以上の成果は主にFRP積層板について行ったものであるが、得られた成果はそのままFRPパイプ材に適用することが可能であり、大空間トラス構造実現のための構造部材を開発するための基礎的準備が整ったものといえる。
半導体電極の光電気化学エッチングによる表面加工と太陽光エネルギー変換への応用

従来の半導体ポーラス膜の作製法は450°C程度の温度での熱処理を要するため、透明基板材料を比較的高価な板ガラスに限定してしまうことも太陽電池の低コスト化を阻む要因となっている。本研究では、これを解決するために、酸化チタン微粒子とチタン塩の水性混合ペーストを基板に塗布し、これを水熱容器の気相中に設置して水蒸気による加水分解反応によってチタン塩を酸化チタンに結晶化して酸化チタン微粒子を連結するという手法を新たに考案し、それが色素増感太陽電池の新規光電極作成法として非常に有望であることを見出した。透明導電性ガラス基盤を用いた場合には、太陽光に対する変換効率は6%を越え、透明導電性PETフィルムを基盤として用いた場合にも3.6%と、フィルム型電池としては世界トップと思われる高効率を達成した。本法のいっそう大きな可能性を評価するために、透明導電性ガラス上に製膜したものを450°Cにて焼成したところ、太陽光照射下で8%近い変換効率が得られ、本法の有望性が確認された。この研究結果は、Chemistry Lettersに掲載され、また続報がAdvanced Materialsに掲載可となっている。上記の検討では色素としてポリピリジンRu金属錯体を用いたが、これも高コストになる原因となることを考えて、安全な食品添加物としても用いられる天然色素(植物、昆虫、細菌類などから抽出したもの)を安価で無害な増感剤として用いることを試みた。10数種の天然色素のほとんど全てが増感機能を示し、最良のものは代表的な合成有機色素を上回る1.6%程度の光電変換効率を達成した。この研究結果はTransactions of Materials Research Society of Japanに掲載された。
関節破壊を惹起する病原性破骨細胞の同定とその解析

破骨細胞の定義は「骨を壊す細胞」である。教科書的には、この細胞には「良い働き」と「悪い働き」があり、良い働きとしては、これが古い骨を吸収することで骨芽細胞による骨新生を促し、恒常的なリモデリングが維持されることが挙げられ、一方で関節リウマチなどではこの細胞が働きすぎることで骨が破壊されるという悪い働きがあるとされてきた。しかし、本研究者は両者が顕著に異なることに気がつき、より本質的に異なるものではないかという仮説を立てた。本研究ではこの仮説の下に、「悪玉」破骨細胞のみを特異的に同定し、これを徹底的に抑制する新しい治療法開発を行う。破骨細胞はマクロファージから分化し、骨を破壊・吸収する。生理的環境下では破骨細胞は傷んだ骨を吸収して骨芽細胞による骨新生を促す正常な骨の新陳代謝のために必須の細胞であるが、一方では関節リウマチなどではこの同じ細胞種が過剰に働くことで異常な骨破壊をきたすと考えられてきた。本研究では炎症性骨破壊における病的破骨細胞を特異的に同定し抑制することで、副作用がなく強力に骨破壊を抑制する方法を開発する。関節リュウマチなど骨破壊を伴う関節炎に関与する破骨細胞について、炎症性破骨細胞の存在を示し生体内で観察するイメージング技術の確立、炎症性破骨細胞活性化に関与する分子を標的とした治療手段の開発を目指しており、独創性は高い。また、生理的破骨細胞と病的破骨細胞が起源の異なる細胞であるという仮説は斬新である。
超低ドーズ観察を可能にするバイオ電子顕微鏡法の開発

本研究の目的は、振興調整費プロジェクトで開発した超コヒーレント・バイオ位相差電子顕微鏡を用いて、超低電子線ドーズ下で生体分子の分子レベル観察を可能にする条件を絞り込むと共に、新たに照明系、試料系、結像系に改良を加えて新しい低ドーズ低損傷結像システムを開発し、無染色単一バイオ分子の分子レベル構造観察を実現することである。平成19年度は、開発した新しい結像システムが、超低ドーズの電子線照射下において機能するように技術的改良を行い、以下のような成果を得た。(1)輪帯対物絞りを収束イオンビーム加工によりを作製した。この成果は、原著論文[1,2]で報告した。(2)電子ドーズを考慮した画像のシミュレーションプログラムの開発し、新しい概念に基づく試料ドリフト補正プログラムや、フォーカス位置の制限を受けない波動場再構成法を開発した。この成果は、国際会議で報告した。(3)超低ドーズ条件において3次元フーリエフィルタリング処理が理想的に機能するように、最適な撮影枚数、フォーカス幅、フーカス位置を理論と実験の両方の側面から決定し、これまでに一般的に用いられてきたSchiskeによるWiener Filtering法と比較し、我々の開発した手法が特に明らかに優位性を持っていることを証明した。この成果は原著論文(印刷中)と国際会議で報告した。(4)電子線を間欠的に照射する照明方法を開発し、電子線損傷を約1/2に低減させることに成功した。(5)動的ホローコーン照明とフーリエフィルタリング技術を組み合わることにより、低周波数成分から軸上照明の情報限界を超えた高周波数成分に至るまで像劣化や歪みのない振幅・位相成分の無収差分離再生に成功した(原著論文執筆中)。本研究の目的は、振興調整費プロジェクトで開発した超コヒーレント・バイオ位相差電子顕微鏡の照明系、試料系、結像系に改良を加えて新しい低ドーズ低損傷結像システムを開発し、無染色単一バイオ分子の分子レベル構造観察を実現することである。本年度は、生体分子の高分解能高コントラスト観察を実現するために、照明系に動的な照射角変調機能を有するホロコーン照明システムを開発した。色収差の影響を軽減することで、これまで以上の高い分解能で収差補正した位相・振幅成分の分離再生することに成功し、現在論文を執筆しているところである。更に、このシステムと対物絞りの効果を併用する高コントラスト結像法の検討を開始した。生体試料が電子線照射で損傷を受ける程度を軽減するために低振動低温試料ホルダーを開発した。このホルダーでは、試料冷却のための液体窒素タンクと試料ホルダー部を分離し、液体窒素のバブリングによる振動が試料に伝わりにくい構造をしている。冷却達成温度は約マイナス100度であったが、汎用性の高いサイドエントリー型冷却ホルダーであるにもかかわらず、これまで保証されていなかった0.235nmの結晶格子縞を低温時において観察できる高分解能化を達成することができた。また、観察に利用する総電子線電流量を低下させ、かつ電子線を間欠的に照射する照明方法を採用することで、冷却による低損傷効果に加えて、更に約2倍の低損傷化が実現できることを実証した。また、次年度に開発する静電型位相板が挿入可能な特殊対物絞りホルダーの設計を行った。この絞りには、電子ビーム誘起により発生する汚れを防止するための絞り板加熱機構と、静電型位相板に任意の電圧印可を加えることが可能な2対の電流・電圧導入端子が組み込まれており、低周波から高周波数成分に至るまで像劣化や歪みのない理想的な高コントラスト観察が実現できる予定である。研究の目的は、振興調整費プロジェクトで開発した超コヒーレント・バイオ位相差電子顕微鏡の照明系、試料系、結像系に改良を加えて新しい低ドーズ低損傷結像システムを開発し、無染色単一バイオ分子の分子レベル構造観察を実現することである。

初年度は、照明系に動的な照射角変調機能を有するホローコーン照明システムを開発し、色収差の影響を軽減することでこれまで以上の高い分解能で位相・振幅成分を分離再生することに成功した。また、生体試料の電子線照射損傷を軽減するために低振動低温試料ホルダーを開発した。冷却達成温度は約マイナス100度であったが、液体窒素のバブリングによる振動が試料に伝わりにくい構造を採用したため、0.204nmの結晶格子縞を低温時において観察できる高分解能化を達成した。本年度は、上記の開発したシステムが超低ドーズの電子線照射下における新しい結像システムとして機能するように以下のような技術的改良を行い、無染色単一バイオ分子の分子レベル観察を実施した。(1)電子線を間欠的に照射する照明方法を開発し、電子線損傷を約1/2に低減させることに成功した。(2)超低ドーズ条件において3次元フーリエフィルタリング処理が理想的に機能するように、最適な撮影枚数、フォーカス幅、フーカス位置を決定した。(3)電子ドーズを考慮した画像のシミュレーションプログラムの開発、新しい概念に基づく試料ドリフト補正プログラムや画像取得のためのフォーカス位置の制限を受けない波動場再構成法を開発し、DNAの無染色分子レベル観察に成功した。(4)静電型位相板が挿入可能な特殊対物絞りホルダーを製作し、この絞りホルダーに装着する輪帯対物絞りを収束イオンビーム加工によりを作製した。動的ホローコーン照明とフーリエフィルタリング技術を組み合わることにより、軸上照明の情報限界を超えた振幅・位相成分の無収差分離再生に成功した。
Q5癌抗原発現調節機構を利用した癌の遺伝子治療モデルの研究

我々はマウス第17番染色体Qa/Tla領域に存在する多数の非古典的組織適合クラス1抗原遺伝子の一つであるQ5遺伝子が細胞の癌化に伴って発現され、その遺伝子産物である細胞表面物質(Q5抗原)が癌抗原として機能すること、またその癌細胞特異的発現が遺伝子転写のレベルで調節されていることを既に明らかにした。この機構を癌に対する遺伝子治療モデルに応用するために、この癌細胞特異的転写調節の機構について検討した。Q5遺伝子上流域DNAの支配下に置かれたルシフェラーゼ遺伝子の、SV40largeT抗原温度感受性変異遺伝子によって形質転換されたマウス繊維芽細胞に於ける発現を観察する実験系を作製して、癌細胞特異的転写に関与するエンハンサー/プロモーターの構造と機能に関する研究を進めた。Q5遺伝子上流3.5KbpのDNA全塩基配列を決定し、その色々な断片のエンハンサー活性を測定してエンハンサー構造の概略を明らかにした。更に詳細について検討中である。またこれを遺伝子治療モデル実験に用いるために、この調節領域の支配下に同種異系の主要組織適合遺伝子をおいたものを作製してその癌細胞特異的発現を試験管内実験系で確認し、更に現在この発現系を非増殖型アデノウイルスベクターに組み込んだものを作成中である。
強震時における都市域斜面の進行性崩壊の解析手法の開発

本研究では,画像処理システムを導入することによって精度の高い斜面崩壊の解析の可能性を探り,一方において,応力状態によって有限要素網を再分割する自動メッシュニング機構を備えたすべりやクラックの発展を表現し得る計算機プログラムの開発を試みた.まず,画像処理システムには以下の特長がある.(i)点ではなく面,すなわち2次元情報を時間,空間ともに連続的にサンプリングでき,面的変化を定量的に評価することができる.(ii)供試体に一切センサーを設置する必要がないので,センサーの影響を受けない斜面の挙動に対して解析を行うことができる.(iii) 1つの画像で種々の処理ができ,しかも何度も解析できる.また,必要であれば,画像データはディジタル量として保存することができる.本研究では,アルミニウム棒を使った斜面モデルの解析を行ったが,斜面の崩壊初期の様子,進行性破壊の様子を精度良く解析することができ,この種の解析には画像処理システムが極めて有効であることがわかった.次に,解析プログラムに関しては,静的な外力下(水平震度)において,引張り応力が生じる場所に修正ジョイント要素が自動的に配列されるソフトを開発した.これによってクラックの進展の様子を実験結果と比較したところ,定性的に良く一致することが分かった.以上の成果については,学会に発表の準備を進めている最中である.今後の問題としては,土材料,すなわち,さらに細い材料を使った実証が必要であり,プログラムに関しては,動的荷重下においても自動メッシュニング可能となる様にバージョンアップを計る必要がある.本研究では,画像処理システムを導入することによって精度の高い斜面崩壊の解析の可能性を探り,一方において,応力状態によって有限要素網を再分割する自動メッシュニング機構を備えたすべりやクラックの発展を表現し得る計算機プログラムの開発を試みた.まず,画像処理システムには以下の特長がある.(i)点ではなく面,すなわち2次元情報を時間,空間ともに連続的にサンプリングでき,面的変化を定量的に評価することができる.(ii)供試体に一切センサーを設置する必要がないので,センサーの影響を受けない斜面の挙動に対して解析を行うことができる.(iii) 1つの画像で種々の処理ができ,しかも何度も解析できる.また,必要であれば,画像データはディジタル量として保存することができる.本研究では,アルミニウム棒を使った斜面モデルの解析を行ったが,斜面の崩壊初期の様子,進行性破壊の様子を精度良く解析することができ,この種の解析には画像処理システムが極めて有効であることがわかった.次に,解析プログラムに関しては,静的な外力下(水平震度)において,引張り応力が生じる場所に修正ジョイント要素が自動的に配列されるソフトを開発した.これによってクラックの進展の様子を実験結果と比較したところ,定性的に良く一致することが分かった.以上の成果については,学会に発表の準備を進めている最中である.今後の問題としては,土材料,すなわち,さらに細い材料を使った実証が必要であり,プログラムに関しては,動的荷重下においても自動メッシュニング可能となる様にバージョンアップを計る必要がある.
ES細胞から栄養膜幹細胞へのエピジェネティック制御

胚性幹(ES)細胞から栄養膜細胞への分化転換に伴うエピゲノムの形成機序を解析するために、BMP4処理による分化転換における遺伝子発現動態の解析を行い、また、そこからの栄養膜幹(TS)細胞株の樹立を目指した。分化転換過程にはTS様細胞が存在することを明らかにしたが、得られた新規細胞株はむしろ胚体外胚葉由来幹細胞(EpiSC)に似た性質を有した。すなわち、本条件下での分化転換過程には、EpiSC様細胞とTS様細胞の両者が混在することが示唆される。栄養膜細胞はほ乳類に特徴的な細胞で、胚体には寄与せず胎盤を構築する。マウス胚性幹(ES)細胞は、栄養膜細胞系列が出現した後の胚の胚体細胞系列から樹立される細胞株で、通常、分化誘導しても栄養膜細胞には分化しない。しかし近年、無血清培養条件で維持したマウスES細胞をBMP4で処理することにより、効率的に栄養膜細胞への分化転換が誘導されることが発見されている。本研究は、この系を用いることで8日間のBMP4処理が用いられていた。そこで本年度は、まず、栄養膜細胞への分化転換に必要なBMP4処理時間の検討を行った。BMP4処理開始後、24時間おきにBMP4非添加培地に交換し、8日目に栄養膜細胞マーカー遺伝子の発現を解析した。その結果、最初の24時間の処理だけでも栄養膜細胞の分化が見られることが分かった。これは、少なくとも一部の細胞では、24時間のBMP4処理の間に胚体細胞系列から栄養膜細胞系列への分化運命の転換が起こっていることを示す。未分化栄養膜細胞は、FGF4とActivin Aの存在化で栄養膜幹細胞(TS細胞)として継代培養することが可能である。そこで、BMP4処理24時間後にTS細胞培養条件に移して、ES細胞由来TS細胞の樹立を試みた。ライン化の過程で、ドーム状に盛りあがる特徴的な形態を示す細胞集団がBMP4処理群特異的に出現したが、数回の継代を重ねるうちにそれらの細胞は徐々に消滅し、最終的にはBMP4処理の有無にかかわらず同様の形質を持つ細胞集団が得られた。この細胞ではOct4やNanogといったES細胞のマーカー遺伝子の発現が認められたが、その維持にUFやその他のサイトカインは必要とせず、TS細胞やES細胞とは異なる性質を有することが明らかとなった。DNAマイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析により、これらの細胞は、ES細胞よりも、エピブラストに由来する幹細胞株(EpiSC)により近い性質を有する存在であることが判明した。マウス胚性幹細胞(ESC)は、栄養膜細胞系列が出現した後の胚の胚体細胞系列から樹立される細胞株で、分化誘導しても栄養膜細胞には分化しない。本研究は、この系による分化転換の機序の解明、および、栄養膜細胞分化におけるエピゲノム変化とその制御に関する知見を得ることを目的とする。本年度は、昨年度の研究でBMP4処理後得られた細胞集団の性状解析を主に行った。この細胞は、幹細胞の簡易的な判別方法であるアルカリホスファターゼ活性が陽性で、マウス原始外胚葉由来幹細胞(EpiSC)のマーカー遺伝子であるOct4、Eomes、Tなどの遺伝子を発現していた。さらに網羅的な遺伝子発現解析によっても、その遺伝子発現パターンがESCよりもEpiSCに類似していることが判明した。EpiSCはBMP4処理によって栄養膜細胞へ分化誘導できることを踏まえ、得られた細胞集団をBMP4処理したところ、栄養膜細胞様の遺伝子発現と形態を示す細胞に分化した。これは、ESCから栄養膜細胞への分化転換過程に、EpiSC様の状態を経る経路が存在することを示している。また、免疫染色法により、分化転換誘導後の細胞集団におけるマーカータンパク質の発現解析を行ったところ、BMP4依存的にEpiSC様細胞が確認されたのに加え、混在する細胞の中に栄養膜幹細胞(TSC)様の細胞集団も認められた。すなわち、BMP4処理による分化転換の初期には、EpiSC様細胞と同時にTSC様細胞も存在していることが明らかとなった。ほ乳類初期胚で起きる最初の分化運命の分岐は、内部細胞塊(ICM)と栄養膜外胚葉(TE)への分化である。ICMは栄養膜細胞(TC)へは分化せず、TEは三胚葉へ分化しない。この分化運命の制限は、ICM由来の胚性幹細胞(ESC)とTE由来の栄養膜幹細胞(TSC)の分化能に反映されている。しかし近年、培地へのBMP4の添加によってマウスESCがTCへ分化することが明らかにされた。本研究ではこれを分化転換と称し、分化転換メカニズムの研究から、分化運命決定機構を解明することを目的とした。

昨年度までの研究で、分化転換過程にTSC様細胞と原始外胚葉由来幹細胞(EpiSC)様細胞が存在することを明らかにしている。そこで本年度はエピゲノム情報解析に用いる目的でこれらの細胞の株化を目指した。すでにEpiSC様細胞株を獲得していたが、TSC様細胞株は樹立できていないため、まずはTSC様細胞株の樹立を行い、その後エピゲノム情報を解析することとした。しかし、TSC様細胞はdish全体を継代するだけでは株化できず、また、単離培養や様々な接着因子上での培養によっても株化を試みたが樹立には至らなかった。樹立できない理由の1つとして、これまでの分化転換条件ではTSC様細胞株の誘導効率が10%前後と低いことが関係していると考え、TSC様細胞の誘導効率を向上させる方法を検討した。その結果、BMP4で24時間処理後、Activinシグナルを阻害する薬剤とBMP4の共存下に置くことで、出現したコロニーの80%近くがTSC様細胞となる条件を確立した。さらに、ここで誘導した細胞は分化誘導によってTC特異的なマーカー遺伝子を強く発現することも確認した。これらの成果を、国際学会で発表した。