hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト内在性レトロウイルス抗原の同定と疾患

当核年度内にヒト内在性レトロウイルスを検出するために抗原や抗血清などの手段を作製し人体組織での発現を検討した。この目的を達成するためにヒト内在性レトロウイルス様遣伝子clone4-1を修飾しenV領域とgag領域遣伝子産物に相当する組み替え蛋白を作製し抗体を得た。enV遣伝子領域遣伝子産物は大腸菌内で産生した。この遣伝子産物に対する家兎の抗体を用いた組織学検索では正常の組織にはヒト内在性レトロウイルス関連抗原は検出できなかったが胎盤組織の栄養芽性合胞細胞や血管中膜平滑筋細胞や血管内皮細胞に発現していた。次に用いたcolne4-1のgag遣伝子領域はstop codonにより3つの翻訳可能領域に分断されていた。stop codonをPCRによるsite mutagenesisにより改変し連続した翻訳可能領域を含む遣伝子を得た。次にこのDNA断片をバキュロウイルスヴェクターに挿入した後にSpodoptera frugiperda細胞に移入し野生型のバキュロウイルスとの組み替え体を得た。次にこのような組み替え体を含む細胞を同定し、増殖させ組み替え蛋白を得た。この組み替え蛋白は分子量約29Kdであった。この蛋白はマウス白血病ウイルスのP30に相当する。Western hybridization法によりこの組み替え蛋白にはマウスあるいはネコの白血病ウスルスのP30に対する抗体に反応した。この結果はヒト内在性レトロウイルス遣伝子はマウスやネコの白血病ウイルスと起源が同じであることを示す。抗血清による組織分布は昨年度のenV領域遣伝子産物の組織分布と同様であった。種々の膠原病患者血清と、この組み替え蛋白を用いてWetern hybridizationを行なったところ多数例でこの組み替えgag蛋白に反応する抗体を検出した。これまで混合型結合織病患者血清中に認められるマウスあるいはネコのgag蛋白に対する自然抗体はヒト内在性レトロウイルス蛋白を検出している可能性が考えられる。ヒト内在性レトロウィルス様ゲノム(c1oneー1)のenv遺伝子領域のDNA断片を大腸菌での組替え蛋白発現ベクタ-であるpETに挿入した組替えDNAを得た。この組替えDNAで大腸菌を形質転換した後、培養を行い更にIPTGを加えて組替え蛋白の誘導を行った。その結果大量の組替え蛋白の発現が認められた。組替え蛋白の発現はSDSーPAGEで確認し分子量25,000であった。これは用いたDNA断片から推定された分子量とほぼ同じであった。我々が得た組替え蛋白は封入体の性状を持っていたので高速遠心分離により精製と超音波破砕を繰り返すことにより組替え蛋白からなる精製された封入体を得ることができた。この精製蛋白を家兎に免疫し特異的な抗血清を得ることができた。次にこの抗体を用いてヒトの正常組織を免疫染色したが有意の染色像は得られなかった。しかし胎盤組織を用いた場合に特異的な染色像が得られた。特に合胞栄養芽細胞に強く陽性所見が認められた。また血管の内皮細胞にも陽性所見が認められた。これらの結果はヒトの組織にも内在性レトロウィルス遺伝子産物が発現していることを示唆するものである。次に精製組替え蛋白を7Mの尿素を用いて可溶化した後に、0.5Mの尿素溶液に透析して可溶化蛋白を得た。この可溶化蛋白をELISA法に用いて組替え蛋白に対する自然抗体がヒトの血清中に存在するかを検討した。

その結果SLEの患者血清中には組替え蛋白に対する自然抗体が存在することが判明した。しかし同様の自然抗体は程度は低いものの健康人の血清中にも存在することがわかった。昨年度に引き続きヒト内在性レトロウイルスの染色体遺伝子を用いてgag領域遺伝子産物を遺伝子工学的に作製し、その性状を解析した。用いたヒト内在性レトロウイルス様ゲノム遺伝子(clone4-1)のgag遺伝子領域はstop codonにより3つの翻訳可能領域に分断されていた。このままでは目的とする遺伝子領域の組み替え蛋白を作製することが不可能なのでstop codonをPCRによるsite mutagenesisにより改変し連続した翻訳可能領域を含む遺伝子を得た。次にこのDNA断片をバキュロウイルスのヴェクターに挿入した後にSpodoptera frugiperda細胞にtransfectionし培養し野生型のバキュロウイルスとの組み替え体を得た。次にこのような組み替え体を含む細胞を同定し、増殖させ細胞内に蓄積する組み替え蛋白を得た。この組み替え蛋白は分子量約29kdであった。この蛋白はマウス白血病ウイルスgag遺伝子領域内に規定されるp30に相当する。Western hybridization法によりこの組み替え蛋白にはマウス白血病ウイルス(MuLV)やネコ白血病ウイルス(FeLV)のp30に対する坑体に反応した。この結果はヒト内在性レトロウイルス遺伝子はマウスやネコの白血病ウイルスと起源が同じであることを示している。坑血清による組織分布はenV領域遺伝子産物の組織分布と同様であった。種々の膠原病患者血清と、この組み替え蛋白を用いてWeterm hybridizationを行なったところ多数例でこの組み替えgag蛋白に反応する坑体を検出した。これまでMCTD患者血清中に認められるマウスあるいはネコのgag蛋白に対する自然坑体は実はヒト内在性レトロウイルス蛋白を検出している可能性が考えられる。現在これらの坑体の特異性を検討している。
ジシアノメチレン基を有する芳香族系電子受容体の研究

フルオレノン、アントロンおよびジベンゾスベレノンなど縮環性芳香族ケトン類とマロノニトリルのの縮合反応において、出発物の構造の差違と反応の難易の関係を考察した。また、得られたジシアノメチレン化化合物の赤外、電子線スペクトル、^<13>C-NMRおよび還元電位を測定し、それぞれの電子状態の計算と比較して論じた。上記の化合物のなかでジシアノジベンゾ-9-ヘプタフルベンは6π電子構造の寄与が大きい。これとの関連においてキサントン、チオキサントンとそのスルホオキシドおよびアクリドンとそのN-メチル化合物とマロノニトリルを一段階で縮合させ、相当するジシアノメチレン化合物を合成する方法を確立した。得られた縮合物について、赤外および電子線スペクトルを測定して複素還の相違による6π電子構造の寄与の程度を明らかにした。とくにカルボニル基をジシアノメチレン基に変換させることによる長波長シフトは、この種複素還系色素の設計に重要な知見となることを知った。また上の一連のジシアノメチレン化合物の酸、アルカリに対する反応性を検討した。とくに濃硫酸によって、條件の強弱によるが、相当するジ-およびモノカルバモイル化合物を収率よく導くことが出きた。かつ後者の脱水反応によって、三還性複素還のモノシアノメチレン化合物を得ることに成功した。ここに得られた三還性複素還の10位に、モノ-およびジシアノメチレン基のついた化合物について、スペクトル的性質を比較して、分子の平面性を論ずると共に、酸化還元電位を比較して、電子受容体としての性質を考察した上で、アニオンラジカル、カチオンラジカルの生成の容易さに対するヘテロ置換基の影響を解明した。
EPMA元素マッピングからみた多方向荷重における象牙質面内異方性の解明

本研究では,非破壊試験方法のひとつである硬さによる評価を応用し,ヌープ硬さ試験法の変法ともいうべき新たな手法で,ヒト象牙質における力学的異方性について検索した.さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いた形態的観察,化学組成の組織内分布についてはElectron Probe Micro-Analyzer (EPMA)解析を行い,元素の検出,定量分析およびマッピングを行い,象牙質面内異方性と微細組織レベルでの元素分布との関係を検討するため,以下の実験を行った.上顎中切歯の矢状断を試料として用い(N=10),研磨および琢磨後,押込荷重25gf,負荷時間30秒,除荷後90秒後の測定条件のもと面内異方性の検索を行った.力学試験の結果,歯冠方向に50%相当部位では根尖方向と口蓋側方向に高い値を示し,強化されていることが示された.0%相当部位すなわちCEJでは唇側方向から切縁方向へ30度の部位で著しく低い値を示した.この部位を共焦点レーザー顕微鏡にて観察すると,象牙細管の走向と圧痕長径がほぼ並行であることが認められた.また,根尖方向に75%相当部位では根尖方向と口蓋側方向へ30度の部位で高い値を示した.これをEPMA元素分析およびマッピングにて観察すると,試験部位周辺にわずかに高いCaおよびPの分布が認められた.以上より,象牙質の面内異方性は微細組織構造と無機質成分組成の組織内分布に密接に関与する結果として表出することが示唆された.本研究では、非破壊試験方法のひとつである硬さによる評価を応用し、試験材料の構造体と力学的性質の関係を知ることができるヌープ硬さ試験法の変法ともいうべき新たな手法で、ヒト象牙質における力学的異方性および力学的挙動を調べ、面内異方性の主軸、方向依存性について検索している。加えて共焦点レーザー顕微鏡を用いた未脱灰標本における形態的観察を行う。また、組織内分布についてElectron Probe Micro-Analyzer(EPMA)解析を行い、元素の検出、定量分析およびマッピングを試み、力学的特性と微細組織レベルでの元素分布との関係を、バイオメカニクス、組織学および生化学的観点から統合的に検討し、明らかにすることを目的としている。本年度は、研究計画に示す(1)試料準備および加工、(2)多方向荷重における面内異方性の検索、(3)共焦点レーザー顕微鏡による検鏡まで順調にすすめているところである。(1)では、研究協力者からの技術支援のもと、早期の手技安定を目指し、迅速な実験遂行に努めているところである。また(2)では、ヌープ硬さ試験機に従来から用いられている2軸微動台に圧子角度設定機能を付与し、より正確な計測位置・角度が簡便に設定できるよう改良し、詳細なデータを速やかに得られるよう配慮している。加えて、測定部位に再現性を持たせるため、試験機上にて角度計測可能となる独自の測定器を開発し研究をすすめることによって、より精密なデータを得るため試料の個体差を最小限に留めるように工夫している。本研究では,非破壊試験方法のひとつである硬さによる評価を応用し,ヌープ硬さ試験法の変法ともいうべき新たな手法で,ヒト象牙質における力学的異方性について検索した.さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いた形態的観察,化学組成の組織内分布についてはElectron Probe Micro-Analyzer (EPMA)解析を行い,元素の検出,定量分析およびマッピングを行い,象牙質面内異方性と微細組織レベルでの元素分布との関係を検討するため,以下の実験を行った.上顎中切歯の矢状断を試料として用い(N=10),研磨および琢磨後,押込荷重25gf,負荷時間30秒,除荷後90秒後の測定条件のもと面内異方性の検索を行った.力学試験の結果,歯冠方向に50%相当部位では根尖方向と口蓋側方向に高い値を示し,強化されていることが示された.0%相当部位すなわちCEJでは唇側方向から切縁方向へ30度の部位で著しく低い値を示した.この部位を共焦点レーザー顕微鏡にて観察すると,象牙細管の走向と圧痕長径がほぼ並行であることが認められた.また,根尖方向に75%相当部位では根尖方向と口蓋側方向へ30度の部位で高い値を示した.これをEPMA元素分析およびマッピングにて観察すると,試験部位周辺にわずかに高いCaおよびPの分布が認められた.以上より,象牙質の面内異方性は微細組織構造と無機質成分組成の組織内分布に密接に関与する結果として表出することが示唆された.
理想的合意としての絶対知　－現代哲学に対するフィヒテ知識学のインパクト－

本研究はフィヒテ知識学の根本概念、特に中期フィヒテの「絶対知」概念を、現代のフィヒテ主義的哲学である超越論的語用論を通じて現代的に解釈することを目的とするものである。当概念は、難解さや抽象性から、現代の哲学的諸理論の興味の対象外となっている。しかし、現代のフィヒテ主義的哲学である超越論的語用論を経由すれば、現代の議論状況に即して解釈され得るというのが本研究の見通しである。当初の年次計画に従い、今年度は主として、(A)なお曖昧さが残っていたカントとフィヒテの差異を明確にすることを試みた上で、(B)フィヒテの「絶対知」を「理想的コミュニケーション共同体」の「理想的合意」として解釈することへの批判、(C)超越論的語用論が採用している真理の合意説への批判、という、本研究成果に対して想定される2つの批判への回答を試みた。(A)カントとフィヒテの差異を、以前の研究成果を発展させつつ、自我論と道徳論の両側面から改めて強調した。(B)「絶対知」を読み替えることは、取りも直さず、現代哲学に対するフィヒテ主義の可能性とインパクトを明らかにすることでもある。この観点から、現代哲学においては存在しないと考えられてきたフィヒテ主義が、実はカント解釈からの逸脱として水面下で萌芽しつつあったこと、そしてその結実として超越論的語用論が成立したことを論じた。(C)超越論的語用論による真理の合意説に対してはヴェルマーやパトナムからの有力な批判があり、本研究を完結させるためにはこれらに答える必要がある。そこで、対応説や整合説、デフレ理論といった諸理論の問題点を合意説が克服できること、また形而上学的実在論に基づいた真理観に対する、超越論的反実在論としての合意説の優位を論じた(前年度からの継続)。最後に、本研究からの発展的研究の一例としてフィクション論への応用を挙げ、今後の展望を示した。28年度が最終年度であるため、記入しない。フィヒテの言う「絶対我」「絶対知」「絶対者」といった根本概念は、その説明の難解さや抽象性から、現代の哲学的諸理論にとっては殆ど興味の対象外となっている。しかし、現代のフィヒテ主義的哲学である超越論的語用論を経由すれば、フィヒテの立場を現代の真理論や「知識の哲学」の議論状況に即して解釈することができるというのが本研究の見通しである。今年度は、主として、フィヒテと超越論的語用論を関連付けるための予備的な研究に取り組んだ。(A)フィヒテの『1801/1802年の知識学の叙述』の特に前半の叙述を検討対象の中心に据え、これを扱った二次文献をも参照しつつ、我々が現実的に持つあらゆる知は、その形式として「絶対知」を必要とする、ということを確認した。また(B)現代の真理論および「知識の哲学」についての資料を収集し、特にマイケル・ダメットの言う「実在論」と「反実在論」の対立や、知識についての内在主義と外在主義の対立をめぐる議論の現状把握を行った。これらの検討から、フィヒテの「絶対知」という思想は、真理に関しては反実在論的であり、また知識に関しては内在主義的である、という見通しを得た。しかし「絶対知」は個人が経験的に持つような知ではないため、現代の議論との間にはなおギャップがあることが改めて確認された。(C)そのギャップを埋めるものは、現代のフィヒテ主義的哲学である超越論的語用論が提唱する「真理の合意説」にあると予想される。そこで、アーペルとハーバーマスの合意説を比較検討し、両者は共に「理想的合意」を真理の十分条件ではなく必要条件と考えていることを確認した。今後は、「絶対知」を「理想的合意」と関連付けつつ研究を進めていく。今年度は、主として、フィヒテの「絶対知」を「理想的コミュニケーション共同体」の「理想的合意」として解釈することを軸として研究を遂行し、その文脈を視野に入れつつ、カントとフィヒテの共通性および差異の明確化をも行った。(A)超越論的語用論が採用している「真理の合意説」は、対応説、整合説、明証説といった既存の真理論を包括的に統合するが、真理の基準を物自体としての実在との対応ではなく「究極的合意」に求める点で反実在論的であり、カントやフィヒテの超越論的観念論と比較可能であることを明確にした。

(B)しかしカントとフィヒテの超越論的観念論には差異も認められ、それは両者の体系全体の方向性の差異に起因するものであるということ、そして超越論的語用論による真理の合意説はフィヒテの方向性を踏襲するものであることを確認した。(C)フィヒテの「絶対知」は、その都度成立している個々の知を統括する作用であると同時に、唯一の知から個々の知へと量化する作用でもあることを確認した。これは経験的な知に超越論的かつ反実在論的な根拠を与えるものであり、現代の文脈に即して表現するなら「知識の超越論的内在主義」と呼ぶべきものになることが明らかとなった。本研究はフィヒテ知識学の根本概念、特に中期フィヒテの「絶対知」概念を、現代のフィヒテ主義的哲学である超越論的語用論を通じて現代的に解釈することを目的とするものである。当概念は、難解さや抽象性から、現代の哲学的諸理論の興味の対象外となっている。しかし、現代のフィヒテ主義的哲学である超越論的語用論を経由すれば、現代の議論状況に即して解釈され得るというのが本研究の見通しである。当初の年次計画に従い、今年度は主として、(A)なお曖昧さが残っていたカントとフィヒテの差異を明確にすることを試みた上で、(B)フィヒテの「絶対知」を「理想的コミュニケーション共同体」の「理想的合意」として解釈することへの批判、(C)超越論的語用論が採用している真理の合意説への批判、という、本研究成果に対して想定される2つの批判への回答を試みた。(A)カントとフィヒテの差異を、以前の研究成果を発展させつつ、自我論と道徳論の両側面から改めて強調した。(B)「絶対知」を読み替えることは、取りも直さず、現代哲学に対するフィヒテ主義の可能性とインパクトを明らかにすることでもある。この観点から、現代哲学においては存在しないと考えられてきたフィヒテ主義が、実はカント解釈からの逸脱として水面下で萌芽しつつあったこと、そしてその結実として超越論的語用論が成立したことを論じた。(C)超越論的語用論による真理の合意説に対してはヴェルマーやパトナムからの有力な批判があり、本研究を完結させるためにはこれらに答える必要がある。そこで、対応説や整合説、デフレ理論といった諸理論の問題点を合意説が克服できること、また形而上学的実在論に基づいた真理観に対する、超越論的反実在論としての合意説の優位を論じた(前年度からの継続)。最後に、本研究からの発展的研究の一例としてフィクション論への応用を挙げ、今後の展望を示した。現代の真理論および「知識の哲学」に関する検討は、当初の計画よりも順調に遂行することができ、9月に行った口頭発表において、当初は予定していなかった内容にまで論及することができた。他方、当初計画では、今年度前半中に「絶対知」概念についての検討を終了し、超越論的語用論における「理想的合意」および両者の関係についての研究に重心を移す予定であった。しかし上記口頭発表により、「絶対知」概念のさらなる検討が必要であることが明らかとなり、来年度以降も当初計画の遂行と並行して検討を継続することになった。以上を総合的に勘案すると、研究はおおむね順調に進展していると評価できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。フィヒテについての検討の遅れは、超越論的語用論の検討には影響を与えないが、両者の関係についての検討には大きく影響する。そこで、現代の真理論および「知識の哲学」についての検討を当初よりも早く完了し、フィヒテの検討をより重視することによって、研究全体が遅延することを防ぐ。これらの変更に合わせて、口頭発表や論文投稿等の予定も当初計画から適宜変更する。
ストカスティックモデルとLESによる鉛直円管内気泡流の数値モデルの構築

本年度の研究範囲は、固気二相流シミュレーションで頻繁に使用されているストカスティックモデル計算手法が気液二相流でどこまで適用可能かということを明らかにする点にあった。そこで、鉛直円管内気泡流を対象として、低レイノルズ数型k-ε乱流モデルによるストカスティックモデル計算コードを開発した。年度途中で申請者が所属を替えたこともあり、当初予定したよりも計画の遅れはあったもののとにかく計算コードのプロットタイプ版は完成した。現在Neti and Mohamed^<1)>による実験結果と比較検討中である。ソース項、乱流モデル定数の決定など詳細なモデル化を検討する予定である。科研費によるカラープリンタの購入は、これらの計算結果を可視化することを可能にした。次年度以降、当初の目的を遂行する予定である。
鉄系超伝導体におけるマルチオービタルを利用した新規高温超伝導体設計指針の提案

鉄系超伝導体LaFeAsO1-xHxは、二つの超伝導相(SC)と二つの反強磁性相(AFM)を持つ。申請者は輸送特性と第一原理計算による電子状態の評価から、電子ドーピングによってFeの3dxy軌道が半充填に近づくことを見出し、この軌道を占有する電子スピンが常伝導状態や、より高い臨界温度(Tc)をもつSC相近傍のAFM2相の出現に大きく寄与することを示した。これらの結果は、高Tcを持つ超伝導が3dxy軌道が半充填になる近傍で発現することを示しており、高温超伝導体の新規設計指針を提案することができた。鉄系超伝導体は、銅酸化物系に次ぐ高いTcを有する高温超伝導体物質群である。特に1111系と呼ばれるLnFeAsO系は鉄系超伝導体中で最も高いTcを示すため、その超伝導発現機構には大きな注目が集まっている。母物質と呼ばれるLnFeAsOは低温で反強磁性秩序を示す。これらをキャリアドーピングによって抑制することで超伝導が発現する。しかし、1111系は、その発見当初から有効なキャリアドーピング手法が無く、本系の注目度とは裏腹に、その物性はほとんど未解明のままであった。申請者らは、1111系の酸素サイトに水素陰イオンを置換することで多量の電子を注入しその物性の変化を追っている。これまでLn=Laの系において、電子ドーピングが誘起する高温超伝導相及び磁気秩序相を発見し、これらの電子ドーピング誘起相が1111系の高Tc超伝導と深い関係にあるのではないかと考えた。本研究では、二つの磁性相を持つ系を拡張し、それらと高温超伝導相との関係を明らかにすることを目的としている。1111型鉄系超伝導体LnFeAsO(Ln=ランタノイド)は低温で常磁性-反強磁性転移を示す。超伝導は電子をドーピングすることで生じ、その超伝導臨界温度(Tc)は鉄系超伝導体中で最も高い値(56K)を示す。初めに申請者はLa系に着目し、電子を高濃度に注入し超伝導が消失した試料において二つ目の常磁性-反強磁性転移(PM-AFM2)を発見した。また、最高Tcを示すSm系においても、サマリウムの同位体置換および中性子回折を用いることでLa系と同様にAFM2相を発見した。さらに第一原理計算から、鉄の3dxy軌道が電子ドーピングによって半充填に近づくことを見出した。これはAFM2の起源が半充填に近づくことによって増加する有効クーロン相互作用に有ることを示している。また輸送特性の評価から、高Tcを示す試料の常伝導状態はAFM2を担う局在スピンの影響を強く受けていることが分かった。これらの結果は、高いTcを持つ超伝導相は半充填した3dxy軌道をフィリング制御することによって生じることを示している。今後、これらの指針をもとに新規高温超伝導材料の開発が期待できる。平成26年度から一山超伝導相を示す鉄系化合物の合成および物性評価を行ってきた。La系と同様にSm、Tb系においても高ドーピング域に秩序相が存在することを電気抵抗、磁化率測定から確認することができた。現在はX線、中性子回折法を用いてその具体的な秩序構造の決定に取り組んでいる。これらの成果は平成26年度の日本物理学会で二度発表した。近々論文にまとめる予定である。固体化学、高圧合成、超伝導平成27年度は、La系と同様にSm、Tb系においても高ドーピング域試料の中性子回折を行い、より詳細な秩序構造を決定し、その論文化に注力する。また、La系の電子構造の解明にも取り組む。平成26年度にサマリウムの154同位体を購入予定であったが、所属研究室の余り分を用いて作製した試料量で今年度の中性子測定のビームタイムが終わってしまったため、その分の金額が余ってしまった。この次年度使用額は当初の予定から一年ずれ、今年度27年に同項目にて使用予定である。主要な用途はサマリウム154酸化物の購入であり、10gで200万円相当するため、容量は多少減らす可能性がある。残った予算は国際会議への旅費や計算機の購入を考えている。
チベット高原カンパラ山宇宙線に関する調査

中国チベット自治区カンパラ山宇宙線観測基地(5500m)に面積約100m^2のエマルション・チェンバーを中国と共同で設置し, 10^<15>ー10^<17>eVの一次宇宙線が大気中で起こす核相互作用現象ーファミリーと呼ばれるーを観測する.これら高エネルギー宇宙線現象の大気中での振舞いから,このエネルギー領域での核相互作用の変化の様相及び一次宇宙線の組成,エネルギー・スペクトルを調べることを目的している.今年度は61年4月に設置した面積59^2,厚さ9c.u.の鉄エマルション・チェンバー,及び面積60m^2,厚さ30c.u.の鉛チェンバーを62年5月に解体し,新たに同種のチェンバーを設置した.このチェンバーの解体作業は63年4月に行う予定である.解体されたフィルムは北京の高能物理研究所で現像され現在その解析を進めている.このチェンバーで1000TeV以上のファミリー現象を3例観測した.また約400TeVの2芯コア現象,100TeV位のハドロン3本からなるファミリー現象も観測されている.いままでのカンパラ山実験で200TeV以上のファミリー現象が約100例観測された.今年度はこれらの結果を4編の総合報告として纒め,学術雑誌に投稿した.得られた主な結果は, 1)核破砕領域でのファインマンのスケーリング側の大きな破れは認められない. 2)相互作用断面積は10^<16D1eV領域までエネルギーの略0.06乗に比例して増大している.3)発生する2次粒子の横向き運動量の大きさはエネルギーと共に緩やかに増大し, 10^<16>eVで略500ー550MeV/cの値になる.以上のような核相互作用の大局的様相は現在の加速器データのスムースな延長と矛盾しないという結論が得られている.他に, 2芯コア現象等特異と思われる現象も数例あるが,その頻度は小さく(2%以下)この結論を変えるものではない.一方一次宇宙線については陽子の一次宇宙線中に占める割合が10^<14>eV近辺から減少し, 10.ナD115>eVでは(15ー20)%程度になると結論されている.64年度以降の研究計画についても数年来研究者間で議論されている.今までのカンパラ山の実験の結果に基いて,今後は10^<15>ー10^<16>eV領域の一次宇宙線の組成とスペクトル,及びCyg.Xー3等宇宙天体からの高エネルギー・ガンマー線の観測が重要と考え,研究内容をさらに広げた新計画として推進することで意見が一致している.研究の物理目的はこれらの観測から,高エネルギー宇宙線の起源と加速の問題を総合的に追求することであり,そのためにはチベットの高度が最適であると結論されている.中国チベット自治区カンパラ山宇宙線観測基地(5500m)に面積約100m^2のエマルション・チェンバーを中国と共同で設置し, 10^<15>ー10^<17>eVの一次宇宙線が大気中で起こす核相互作用現象ーファミリーと呼ばれるーを観測する.これら高エネルギー宇宙線現象の大気中での振舞いから,このエネルギー領域での核相互作用の変化の様相及び一次宇宙線の組成,エネルギー・スペクトルを調べることを目的している.今年度は61年4月に設置した面積59^2,厚さ9c.u.の鉄エマルション・チェンバー,及び面積60m^2,厚さ30c.u.の鉛チェンバーを62年5月に解体し,新たに同種のチェンバーを設置した.このチェンバーの解体作業は63年4月に行う予定である.解体されたフィルムは北京の高能物理研究所で現像され現在その解析を進めている.このチェンバーで1000TeV以上のファミリー現象を3例観測した.また約400TeVの2芯コア現象,100TeV位のハドロン3本からなるファミリー現象も観測されている.いままでのカンパラ山実験で200TeV以上のファミリー現象が約100例観測された.今年度はこれらの結果を4編の総合報告として纒め,学術雑誌に投稿した.得られた主な結果は, 1)核破砕領域でのファインマンのスケーリング側の大きな破れは認められない. 2)相互作用断面積は10^<16D1eV領域までエネルギーの略0.06乗に比例して増大している.3)発生する2次粒子の横向き運動量の大きさはエネルギーと共に緩やかに増大し, 10^<16>eVで略500ー550MeV/cの値になる.以上のような核相互作用の大局的様相は現在の加速器データのスムースな延長と矛盾しないという結論が得られている.他に, 2芯コア現象等特異と思われる現象も数例あるが,その頻度は小さく(2%以下)この結論を変えるものではない.一方一次宇宙線については陽子の一次宇宙線中に占める割合が10^<14>eV近辺から減少し, 10.ナD115>eVでは(15ー20)%程度になると結論されている.64年度以降の研究計画についても数年来研究者間で議論されている.

今までのカンパラ山の実験の結果に基いて,今後は10^<15>ー10^<16>eV領域の一次宇宙線の組成とスペクトル,及びCyg.Xー3等宇宙天体からの高エネルギー・ガンマー線の観測が重要と考え,研究内容をさらに広げた新計画として推進することで意見が一致している.研究の物理目的はこれらの観測から,高エネルギー宇宙線の起源と加速の問題を総合的に追求することであり,そのためにはチベットの高度が最適であると結論されている.
段落流を応用したOD法の開発

62年度は、本方式による汚水処理は他の処理装置と遜色のないと結論を下した。63年度は、同じ装置による実験を継続し、次に述べる二点を明らかにした。一つは汚泥の発生しない処理方法の可能性である。実験中昭和63年6月頃より、汚泥濃度が急激に低下するという現象がみられた。当初は、流入する汚水の濃度が低いためではないかと予想された。しかし、ある日を境にして汚泥が全く消滅してしまった。水質分析を行うとそれでも十分排出基準を満足することが示されていた。その原因が何によるものか始め分からなかったが、良く観察した結果、無数の貝が側壁に付着していることが判明した。貝が汚泥を食べるため、その発生が見られないのかどうかを確かめるために、MLSS濃度が500mg/l程度になるよう、別の施設から活性汚泥を投入し観察を行った。その結果、一夜にして汚泥は食べ尽されてしまった。河川における浄化機構と同じことが起こっていたと見ることができる。水温の低い時においても貝が成長すれば、汚泥(沈殿槽の生汚泥は別)の発生しない浄化方式として注目できるものである。二つ目は、MLSS濃度の増加による曝気係数への影響がどのようになるかと言うことである。従来からMLSS濃度の増加による酸素の移動性能が低下することは指摘されていた。しかし、その測定はかなり困難であった。本装置は、酸素移動が行われる距離が短いので、この間での汚泥の呼吸による酸素の消費速度を無視できる。そこで、各MLSSの濃度別に曝気係数K_Laの値を測定した結果MLSSがK_Laに大きく影響することが判明した。清水の時のK_Laを1とすれば、MLSS濃度が3,000mg/lの時、その値は0.77となり、6,000mg/lの時の0.49となり、半分にまでその能力が低下することが判明した。これは他の活性汚泥法にも言えることで、ここで測定されたデータは重要な資料として生かされるだろう。
非同型な自己正則写像を持つコンパクト複素多様体の研究

小平次元が負の3次元射影代数多様体Xで自身への非同型エタール正則写像fを持つものの構造を研究した。Xの適当な不分岐被覆X'は6通りに分類される事を証明した。X'が単繊維曲面と楕円曲線の積に分解できない類が多く存在する。端射線Rの収縮写像が双有理型の場合は別の多様体Yの楕円曲線に沿った爆発により得られる。難点はRがfの如何なる反復合成についても保存されず、極小モデル理論が自己正則写像の範疇で機能しない事による。DESPなる素性の良い不分岐正則写像の無限列を考察する事で困難を克服した。副産物として或る楕円繊維曲面上のコニック束が非同型なエタール自己正則写像を持つための判定条件を与えた。一貫して小平次元が負の3次元射影代数多様体Xで,非同型なエタール自己正則写像fを許すものの双正則な分類を行なった.これらの多様体の候補の絞込みと大まかな分類に関してはほぼ成功した.先ず, Xの端射線Rの収縮写像が双有理射を与える場合, Xは楕円曲線を中心とする爆発(の逆)により得られることを森理論を用いて証明した.難点は因子型の端射線Rが無限個存在する例が存在する為,極小モデル理論を自己正則写像の範疇で適用することが不可能なことにある.非同型な自己正則写像を持つXに対し,因子型収縮写像を逐次続行すると, Xと双有理同値な3次元多様体達で因子型の端射線を持たないもの,及びその間の非同型なエタール有限射の無限列が得られる(XのDESPと略記する).そこでXのDESPの構造を端射線の収縮写像がコニック束,または楕円曲線上のDEl-Pezzoファイバー束を与える場合とに分けて解析した.適当な底変換と因子収縮写像を施すことによりDESPは射影束の場合に帰着される.幸いなことにAtiyahによる楕円曲線上のベクトル束の分類結果を適用することが可能であった. DESPの大まかな構造を調べた上で,然るべき楕円曲線を中心とする爆発により元来の多様体Xを調べるという一見して回り道ではあるが着実な方法を選択した。起こりうるDESPを全て分類しきった結果,大方の場合Xの端射線の個数は有限個であり,極小モデルプログラムは自己正則写像の範疇で機能することが判明した. Xの適当なエタール被覆をとると小平次元が負の曲面Sと楕円曲線Eとの直積に分解する場合と,分解できない場合が起こりうる.後者は小平次元が負の仮定の下で初めて現れる現象であり,そのDESPはAtiyahが構成した楕円曲線上の次数零の直既約なベクトル束と深く関っている.首尾一貫して小平次元が負の3次元射影代数多様体Xで,非同型なエタール自己正則写像を持つものの双正則分類を行なった.これらの多様体の候補の絞込みと大まかな分類に関してはほぼ完結し, Xの適当なエタール・ガロワ被覆X'が6通りに分類される事を示した.結果は小平次元が非負の場合ほど簡潔ではなく, X'が繊維曲面と楕円曲線の直積に分解する場合と分解しない場合とに分かれる.後者は小平次元が負の仮定の下で初めて出現する現象である.まずXの端射線Rの収縮写像が双有理射を与えるとき, Xは楕円曲線を中心とする爆発により得られる事を森理論を用いて証明した.難点の一つは,因子型端射線を無限個持つ多様体が存在しうる為,極小モデルプログラム(MMP)が自己正則写像の範疇で必ずしも機能するとは限らない事である.そこでXに対して因子型収縮写像を有限回施し, Xと双有理同値な3次元多様体の間の非同型なエタール有限射の無限列で因子型の端射線を持たないもの(DESP)を構成した.次にDESPの構造を端射線の型(C型,D型)に応じて解析した上で楕円曲線を中心とする爆発を遂行し,元の多様体Xの大まかな構造を調べた.結果,無限個の因子型端射線を持つ多様体は非常に特殊な場合に限定され,大方の場合にMMPは自己正則写像の範疇で機能する事が分かった.再度,MMPを走らせ, DESPを非同型自己正則写像の範疇で構成してXの構造を調べるという一見遠廻りの手法を採用したが, Atiyahによる楕円曲線上のベクトル束の分類結果が適用出来て精密な分類が得られた.最終年度にはXのDESPがD型の場合, X'は大抵,楕円曲線上のファイバー束となる事を示した.また楕円繊維曲面の上のP1ファイバー空間が非同型なエタール自己正則写像を持つ為の判定条件を見出した.現在論文を作成中である.小平次元が負の3次元射影代数多様体Xで自身への非同型エタール正則写像fを持つものの構造を研究した。コンパクト複素多様体Xからそれ自身への全射正則写像fが同型写像でないとき

非同型な自己正則写像(endomorphism)という.本研究の目的は,非同型な自己正写像を持つコンパクト複素多様体の構造を,複素多様体の分類論の視点から,出来る限り具体的に調べることである.それは楕円曲線,アーベル多様体,トーリック多様体を含むクラスであり非常に簡明な構造を持つと予想される.本年度も,小平次元が負の非特異3次元射影代数多様体で非同型なエタール自己正則写像を持つ類の研究を継続した.最大の難点は因子収縮型の端射線が無限個存在するような例が出現し,それらが写像の反復合成により保存されるとは限らないことである.特に極小モデルプログラムが自己正則写像の範疇で機能する保障がない.そこで極小モデルプログラムを非同型な不分岐被覆の無限降下列を持つ代数多様体の範疇で機能させ,その構造を大雑把に解析した上で,個別に個々の多様体Xの構造を調べるという方法を採用した.因子収縮型の端射線を無限個持つ多様体は非常に限定され,ほとんどの場合に極小モデルプログラムは自己同型写像との合成の下,自己正則写像の範疇で機能することが判明した.結果, Xの構造は相当解明された.大雑把に述べると, Xの適当な有限エタール被覆X'が繊維曲面とブローアップと楕円曲線との蓄積に分解する場合と,そうでない場合とに分かれる.後者は小平次元が負の場合に初めて出現し,楕円曲線を中心とするブローアップの記述が非常に複雑である.これらの成果について口頭発表し,論文にまとめている最中である.小平次元が負で,非同型なエタール自己正則写像を許す3次元代数多様体の大雑把な分類・絞込みにはほぼ成功した.その過程で分類の鍵となる次の重要な事実が得られた. 'DESPが繊維曲面上のコニック束の場合,底曲面は適当なエタール被覆をとれば,楕円曲線と射影直線との直積,又は楕円曲線上の階数2,次数0の直既約ベクトル束の射影束のいずれかになる`. DESPの可能性を全て調べ尽くす手法の為,確実ではあるが論文にまとめると長大(現在で150頁)になるという欠点も抱えている.困難の要因のひとつに, DESPから楕円曲線を中心とする爆発を施す際,爆発の中心となるべき楕円曲線の候補は分かっても,爆発を実行して回復させた元の多様体の大域的構造が複雑であり,一言では記述できないことが挙げられる.他方,研究目的に記載した非同型な自己正則写像により保存されるデータを探索することも大事であり,試みたが決定打は得られず仕舞いであった.非同型なエタール自己正則写像を持つ小平次元が負の多様体Xの手頃な実験台として,楕円曲線上の射影束の上での,楕円曲線に沿ってのブローアップの記述に大方,成功した.同様のアイデアが一般のXを調べる際にも適用できることが分かり, Xの大雑把な構造が浮かび上がってきた.現在,非同型なエタール自己正則写像を許す小平次元が負の3次元多様体の論文の執筆はまとめの段階に入っている.残された最後の課題は, DESPから楕円曲線を中心とする爆発によって回復された元の多様体の大域的構造を明快に記述することである.大方の場合,楕円曲線上のファイバー束になると予期されるが,これを解決して論文を完成させたい.自己正則写像により保存されるデータの研究については,近年大発展を遂げている極小モデル理論を手本としつつ考察する予定である.自己正則写像により保存される新型のデータを極小モデル理論を手がかりに探索したい.京大数理研や名大等のセミナーにも積極的に参加して,視野を広げ本研究にも役立てたいと思う.今年度は論文の成果を発表するより論文の執筆に比重を置いた所為で,研究集会に出かけて成果発表することはやや控えた.その為,使用予定の旅費が未使用となり,次年度に繰越となった.
シナプス構成蛋白質の欠損からとらえる育児放棄の分子メカニズム

神経細胞において伝達物質の放出を制御するCASTの欠損(KO)マウスにおいて母性行動の解析を行った。養育中のCAST KOマウスは巣の中をせわしなく移動し、仔マウスを哺育する時間が有意に低下する。まずCASTが発現する下垂体後葉から放出されるオキシトシンに着目したが、血漿内オキシトシン濃度に有意な差はみられなかった。次に、出産や養育によるストレス耐性をショ糖嗜好性試験により評価した。その結果、CAST KOマウスでは養育期間の飲水量が低下し妊娠中のスクロース嗜好性が高まる傾向にあることが分かった。これらのことから、神経調節因子の放出制御異常が不適切な養育行動に関与することが示唆された。内容>神経細胞において伝達物質の放出を制御する蛋白質群の一つであるCASTの欠損(KO)マウスでは、離乳率が顕著に低下し不適切な養育傾向が示唆されていた。そのため本研究では、伝達物質の放出制御という観点から、育児放棄に関わる神経回路の特定およびその分子メカニズム解明を目指す。(行動解析)養育中の母マウスの行動解析から、CAST KOマウスでは巣の中をせわしなく移動し、その結果仔マウスを哺育する時間が有意に低下していることが分かった。(関連因子の探索)母性との関連が深いオキシトシン濃度を測定したところ、視床下部や下垂体組織に含まれるオキシトシン濃度に変化は見られなかったが、血清中に放出されたオキシトシン量に差を見出した。今後、他の神経因子との関連を模索するとともに、オキシトシン放出と養育行動との因果関係の解明を目指す。意義>本研究は伝達物質放出を制御する蛋白質に着目するという特色があり、得られる成果は育児放棄に関わる新たな神経機構の発見につながることが期待できる。また、モデルマウスを用いた基礎データは、今後育児放棄の対症療法や治療薬の開発が期待される点で極めて意義深い。重要性>現代社会の問題の一つであるネグレクトのうち、積極的型に大別されるネグレクトは、明確な理由が示されておらずその心境が十分に理解されているとは言い難い。本研究により神経調節因子の放出調節機構の異常が明確な理由がないと考えられていたネグレクトの原因の一つを明らかにすると期待される。その成果は、治療への応用だけでなく、周囲の正しい理解と認識につながり、様々な予防措置等の対策を講ずる基礎データの提供になることが期待される。(行動解析)哺育行動の解析から、CAST KOの母マウスは仔マウスへの興味や認識に問題はなく、また仔マウスを清潔にする・哺乳するといった行動も行うことが分かったが、哺育中も頻繁にケージ内を動き回り、結果として哺育時間が有意に低下することが分かった。また、経産マウスでは哺育時間の減少が軽減し、離乳率の低下が抑えられていることも分かった。また、未経産マウスの哺育行動を観察したところ、やはりCAST KOマウスでは仔マウスへの関心が低く、哺育時間も有意に低下するなど、養育行動に異常があることが認められた。(関連する神経因子の探索)一方、母性と関連が深いホルモンとして血清中に放出されたオキシトシン濃度を測定したところ、若干の差を見出したが、これが哺育行動の大きな差を見出す要因となりうるか、まだ十分な所見が得られていない。そのため、今後も関連が示唆される神経伝達物質を探索し、関連する神経回路網の解明につなげる必要がある。神経細胞において伝達物質の放出を制御する蛋白質群の一つであるCASTの欠損(KO)マウスでは、離乳率の低下が不適切な養育傾向によるものであることが示唆されていた。そこで本研究では、伝達物質の放出制御という観点から育児放棄に関わる神経回路およびその分子メカニズム解明を目指し、行動並びに生化学的解析を行った。(内容)養育中の母マウスの行動解析から、CAST KOマウスは巣の中をせわしなく移動し、その結果仔マウスを哺育する時間が有意に低下していた。母性との関連が強く示唆されているオキシトシンは、視床下部の室傍核と視索上核の神経分泌ニューロンで産生され、下垂体後葉から血液中へと放出される。CASTは下垂体後葉に発現し、オキシトシンの放出に関与していることが示唆されたが、養育行動中の雌マウスの血漿内オキシトシン濃度に有意な差はみられなかった。一方、養育行動は出産や仔マウスとの接触によるストレスへの耐性が重要視されていることから、ショ糖嗜好性試験を行った。これらのことから、CAST KOマウスではドーパミンやセロトニンなどの神経調節因子の放出制御異常によって不適切な養育行動を起こしていることが示唆された。(重要性)現代社会問題の一つである育児放棄は、明確な理由が示されておらずその理解が十分進んでいるとは言い難い。本研究では、妊娠および養育期のストレスと放出制御の異常との関連が示されたことで、今後育児放棄の原因を解明する一翼になると期待される。(意義)本研究では、育児放棄に関わる神経メカニズムとして伝達物質の放出制御という点に着目しており、そのメカニズムが解明されることは育児放棄の対症療法や治療薬の開発に大いに寄与するものである。

養育中のCAST KOマウスは巣の中をせわしなく移動し、仔マウスを哺育する時間が有意に低下する。まずCASTが発現する下垂体後葉から放出されるオキシトシンに着目したが、血漿内オキシトシン濃度に有意な差はみられなかった。次に、出産や養育によるストレス耐性をショ糖嗜好性試験により評価した。その結果、CAST KOマウスでは養育期間の飲水量が低下し妊娠中のスクロース嗜好性が高まる傾向にあることが分かった。これらのことから、神経調節因子の放出制御異常が不適切な養育行動に関与することが示唆された。母性行動の解析ではCAST KOマウスに異常があることが認められたため、今後は養育本能を司る神経機構の解析に焦点を当てていく。血清及び脳組織内に放出されたホルモンをはじめとする神経因子を各種計測し、KOマウスにおいて放出に異常が見られる因子を探索する。さらに、その増減を調節しうる神経回路網を推測し、養育行動の改善につながる分子メカニズムの探索を行う。神経科学本解析では計画的なマウスの交配と継続的な行動解析の必要があるため、実験補助員の人件費を計上していたが、本年度は別の予算で雇用された実験補助員にこれらの実験遂行を依頼することができた。また、本解析で使用したマウス系統は他の解析でも使用していたことから、本解析用に計上していた動物の飼育管理・維持費は次年度の研究費として繰り越すこととした。研究計画に大きな変更はなく、次年度に繰り越した予算も併せて、実験補助員の人件費並びに解析に必要な試薬類及びマウスの飼育・維持費として本年度も引き続き使用していく。
高温性ラン藻の炭酸固定能の強化と炭酸ガスの有機資源化への利用

光量:18Wx2から始め、OD=0.4付近で18Wx3にする培地:欠乏する成分について2倍の濃度で培養を始め、OD=0.7付近でその成分を添加して4倍にする。次に、確立された高濃度培養において、固定された炭酸ガスが菌体内でどの様な成分になっているのかを知ることを目的として実験を行った。得られた菌体を用いて、蛋白質・糖・脂質の各成分を分析した。蛋白質はアルカリ処理の後Lowry法により、糖はフェノール硫酸法により、脂質は凍結乾燥菌体からクロロホルムで抽出される成分量により定量した。その結果、蛋白質・糖・脂質は凍結乾燥菌体成分中それぞれ49%、37%、12%を占めていることが明らかとなった。上記研究遂行の途上、凍結乾燥菌体を緩衝液に懸濁した後、再び遠心分離に供し菌体だけを回収しようとした。その際、得られた遠心上清が濃青色を呈していたため、この成分に関してさらに詳細に分析した。本遠心上清の可視吸光スペクトル特性からフィコシアニンの存在が推定された。そこで、この遠心上清をFPLCシステムを用いたSuperose-6次いでMono-Qカラムクロマトグラフィーに供した。この操作により、青色を呈する蛋白性物質を電気泳動的に単一にまで精製することができた。培養液500mlから5.42mgの青色物質が精製された。SDS-PAGEによる分析から、本蛋白質は2つのサブユニットから成っていることが示された。さらに吸光・蛍光スペクトルの特性から、本蛋白質はフィコシアニンであろうと推定された。上記の2つのサブユニットそれぞれのN末端アミノ酸配列を20残基まで決定し、その配列と相同性を有する蛋白質をSwiss Data Bankで検索した所、本蛋白質の配列は他の菌株由来のフィコシアニンの配列と極めて高い相同性を示した。このことから青色蛋白質はフィコシアニンであることが明らかとなった。タイの温泉より採取した高温性ラン藻、Chroococcidiopsis strain TS-821の高濃度培養を試みた。まず、菌の生育および炭酸固定能に与える炭酸ガス濃度の影響を調べた後、その他の栄養素の添加濃度、添加時期を検討し、短時間でより高濃度の菌体を得る方法を確立した。また、光強度の培養に与える影響を検討し、これ以上の高濃度培養にはより強い光を照射できる光バイオリアクターの開発が不可欠であるとの結論に達した。また、培養条件により現実の廃棄ガスを使用する場合に近付けるために、NOxの混入させて合成したモデル廃棄ガスを用いての培養に着手した。Specificity factor(τ値)は炭酸固定酵素RubisCOの炭酸固定効率を決定する重要な因子である。特に構造の簡単なラン藻や細菌においては、このτ値を高めることにより炭酸固定能の上昇が期待される。本研究では我が国の温泉から取得した高温性ラン藻Synechococcus straina-1のRubisCOのτ値の遺伝子工学的手法による改変を目指している。本研究の遂行のため、まずラジオアイソトープを用いることなく、イオンクロマトグラフィーで反応生産物を定量することよりτ値を容易に測定することを可能とした。さらにこの方法によってSynechococcus a-1株のRubisCOのτ値を求めた。現在τ値の高い高等植物由来のRubisCOのシーケンス等を参考に、本菌株のRubisCOのτ値の改変を試みている。

まず、前年度において確立された高濃度培養において、固定された炭酸ガスが菌体内でどの様な成分になっているのかを知ることを目的として実験を行った。得られた菌体を用いて、蛋白質・糖・脂質の各成分を分析した。蛋白質はアルカリ処理の後Lowry法により、糖はフェノール硫酸法により、脂質は凍結乾燥菌体からクロロホルムで抽出される成分量により定量した。その結果、蛋白質・糖・脂質は凍結乾燥菌体成分中それぞれ49%、37%、12%を占めていることが明らかとなった。上記研究遂行の途上、凍結乾燥菌体を緩衝液に懸濁した後、再び遠心分離に供し菌体だけを回収しようとした。その際、得られた遠心上清が濃青色を呈していたため、この成分に関してさらに詳細に分析した。本遠心上清の可視吸光スペクトル特性からフィコシアニンの存在が推定された。そこで、この遠心上清をFPLCシステムを用いたSuperose-6次いでMono-Qカラムクロマトグラフィーに供した。この操作により、青色を呈する蛋白性物資を電気泳動的に単一にまで精製することができた。培養液500mlから5.42mgの青色物質が精製された。SDS-PAGEによる分析から、本蛋白質は2つのサブユニットから成っていることが示された。さらに吸光・蛍光スペクトルの特性から、本蛋白質はフィコシアニンであろうと推定された。上記の2つのサブユニットそれぞれのN末端アミノ酸配列を20残基まで決定し、その配列と相同性を有する蛋白質をSwiss Data Bankで検索した所、本蛋白質の配列は他の菌株由来のフィコシアニンの配列と極めて高い相同性を示した。このことから青色蛋白質はフィコシアニンであることが明らかとなった。
ZFP-LEDGF融合タンパクを用いたLVベクターの配列特異的挿入法の確立

レンチウイルス(LV)ベクターによる培養細胞への遺伝子導入は、細胞染色体へのLVベクターの挿入が必要だが、これにより宿主遺伝子への変異導入を伴うことがある。そこでLVベクターの宿主染色体DNA配列特異的な挿入法の開発を試みた。LVベクターの挿入に必須のタンパクに特異的DNA配列に結合可能なタンパクを融合させ、培養細胞において検討をおこなったが、標的部位付近への挿入を検出できなかった。レンチウイルスベクター(LVベクター)は、分裂細胞および非分裂細胞に高効率に遺伝子導入することが可能であるが、その遺伝子発現には宿主細胞の染色体への挿入が不可欠である。しかし、LVベクターの挿入サイトはランダムであるため、導入遺伝子のサイレンシングなど問題も多い。そこで本研究では、宿主染色体の配列特異的に一般的なLVベクターを挿入可能な手法を開発する。この技術によって、遺伝子ノックアウトをより容易におこなうことが可能になることが期待され、このような手法を開発することは重要であり、遺伝子疾患の原因解明など様々な研究発展に寄与すると考えられる。本研究では、ターゲット遺伝子をCCR5ケモカインレセプター遺伝子とした。LVベクターの宿主染色体への挿入に必須の宿主因子であるLEDGFのインテグラーゼ結合ドメイン(lBD)にCCR5塩基配列結合能を付与するため、CCR5遺伝子に結合能を有する亜鉛フィンガー(ZFP)をLEDGFlBDに融合させたタンパクZFP-lBDを構築した。lBD-ZFP融合タンパクの標的CCR5オリゴDNAに対する結合能を測定するため、コムギ胚芽無細胞タンパク合成系を用いて合成したlBD-ZFPタンパクと、高感度分子間結合解析システムであるアルファスクリーンを使用した解析系を新規に構築した。その結果、標的配列でsignal/background(S/B)比約50と強い結合がみられたが、-塩基置換したオリゴDNAにおいてはバックグラウンドと同程度で、顕著な結合抑制がみられた。また、核移行シグナルを付与したlBD-ZFPを培養細胞で発現させ、インテグラーゼとの核内での共局在を蛍光抗体染色で確認した。しかし、LVベクターの挿入部位はランダムであるため、導入遺伝子のサイレンシングなど未解決の問題もある。そこで本研究では、一般に使用されているLVベクターの宿主染色体配列特異的な挿入を可能とする手法を開発する。この技術によって、遺伝子ノックアウトをより容易におこなうことが可能になることが期待される。また、このような手法を開発することは重要であり、遺伝子疾患の原因解明など様々な研究発展に寄与すると考えられる。本研究では、ターゲット遺伝子をCCR5遺伝子とした。LVベクターの宿主染色体への挿入に必須の宿主因子であるLEDGFIBDにCCR5塩基配列結合能を付与するため、CCR5遺伝子に結合能を有する亜鉛フィンガードメインをLEDGF IBDに融合させたタンパクを発現するプラスミドを構築し、それらを発現する複製能欠損型アデノウイルスベクター(Ad-ZFP-IBD)を作製した。また、レポーター細胞として、ルシフェラーゼ遺伝子の開始コドン直下にZFN結合領域を染色体上に導入したHCT116-CCR5-L2細胞を構築した。また、本研究の過程で、LEDGFタンパクはユビキタスに発現していることが判明し、endogenousなLEDGFのみの発現をノックアウトするため、non-coding region RNAに対するLEDGFshRNAを発現するプラスミドを構築した。HCT116-CCR5-L2細胞にLEDGFshRNA発現プラスミドおよびAdZFP-IBDを作用後、ピューロマイシン発現LVベクターを作用させ、ピューロマイシン耐性となったクローンに関して、ルシフェラーゼアッセイや、LVベクター挿入箇所について解析をおこなったが、配列特異的なLVの挿入を検出することはできなかった。