hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
偶蹄類における首の構造と機能の進化

事前に標本提供を依頼していた国内の研究機関から予想以上に好意的な協力を得たため、偶蹄類ウシ科ブラックバック族における頸部骨格形態のデータが十分に得られた。また、これまで取り組んできた研究内容を学術論文として出版し、自身の研究について世界中から反響を得ることができた。報告者は、偶蹄類における首の構造と機能の進化の解明をめざし、多数の種を対象として、頸部筋骨格構造の記載・比較を行っている。本年度は特に、キリン(Giraffa camelopardalis)、ヒトコブラクダ(Camelus dromedarius)、アルパカ(Vicugna pacos)、リャマ(Lama glama)の4種に注目し、首の伸長に伴う筋構造の派生的変化の特定を目指した。2014年度・2015年度に行ってきた肉眼解剖データを整理し、上記4種の頸部筋構造と詳細に記載した。また、シカ科のニホンジカ(Cervus nippon)の頸部構造と基準とし、比較解剖学的手法を用いて、頸部伸長に伴う筋構造の適応進化の解明を目指した。筋構造の比較の結果、長い首をもつ上記4種に共通する特異的筋構造は確認されなかったため、偶蹄類における頸部伸長に伴う筋構造の派生的変化を一般化することはできなかった。一方で、前肢と頸部をつなぐ複数の筋肉では、キリン、アルパカ、リャマの3種に共通した構造が確認された。さらに、頸部を拳上・側屈する役割をもつ筋肉において、キリン特有の構造が確認された。筋肉の走行方向の変化や付着位置の変化を踏まえ、これらの筋構造の変化は、首の姿勢や運動機能の進化に関連した適応進化であることが示唆された。また、本年度は、昨年度に調査・解析を行ったウシ科ブラックバック族の頸部骨格構造の進化に関する知見をまとめ、日本哺乳類学会にて発表し、優秀ポスター賞を受賞した。また、当該研究に関する論文を執筆し、国際誌に投稿した。事前に標本提供を依頼していた国内の研究機関から予想以上に好意的な協力を得たため、偶蹄類の中でも著しく頸部が特殊化しているキリン(キリン科)、ラクダ・アルパカ(ラクダ科)における詳細な筋構造のデータを得ることが出来た。キリン科・ウシ科に属するいくつかの種は、国内で標本を手にいれることが非常に困難であると予想されたが、アメリカ自然史博物館およびニューヨーク工科大学の協力を得る事で、頭骨・脊椎骨の形態データを多数取得することができた。2014年度、2015年度に収集したデータをもとに、「キリンの頸部筋肉構造と運動機能に関する研究」、「偶蹄類ウシ科ブラックバック族における頸椎の成長様式と首の長さの多様化に関する研究」の2点を論文としてまとめ、国際学術雑誌に投稿する。2015年度に学術論文として発表した「キリンの特殊な第一胸椎の機能とその進化的意義に関する研究」と合わせ、学位論文を執筆し、東京大学大学院農学生命科学研究科農学国際専攻に提出する。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度に収集したキリン、ラクダ・アルパカ、ゲレヌクの頸部筋骨格構造のデータを、近縁で頸部が長くない種と比較することで、頸部の伸張に伴う構造的変化を明らかにしていく。また、頸部が特殊化している種同士の筋骨格構造を比較することで、偶蹄類における頸部伸張の基本的なパターンの把握を試みると共に、それぞれの種の生態・行動と関連した頸部の機能と構造の変化の様子を明らかにしていく。
制御性Ｔ細胞サブセットによる皮膚免疫制御

アトピー性皮膚炎・乾癬・自己免疫疾患の病態はまだ完全に解明されていないが、その一因は免疫系の暴走が原因である。このような免疫系の過剰反応を抑える特殊なリンパ球が制御性T細胞である。本研究では、Helios発現細胞に蛍光タンパクを発現させたHeliosレポーターマウスを作製し、Heliosを発現する制御性T細胞を生きた状態で解析した。その結果、Heliosを発現する制御性T細胞は強い免疫抑制活性を有することがわかった。Heliosレポーターマウスは、過剰な免疫反応を効率的に抑制する方法の開発や、アレルギー疾患・自己免疫疾患の治療開発にも応用できる。Foxp3陽性制御性T細胞は、免疫寛容を維持するCD4陽性T細胞であり、胸腺型と末梢誘導型の二つのサブセットに分けられる。サブセットを識別する指標は現在のところ不明だが、胸腺型は転写因子Heliosを恒常的に発現する。ただしHeliosは、ある条件では末梢誘導型も発現するためサブセットの厳密なマーカーとはならない。しかしながら、抗原刺激によりHelios陽性制御性T細胞の数が増えることから、Heliosは制御性T細胞の機能と何らかの形で関わっていると想定される。本研究は、黄色蛍光タンパク「Venus」でHeliosの発現をモニターできるように作成したHeliosレポーターマウスを用いて、Helios陽性制御性T細胞の性質を解析することを目的とする。平成25年度はハプテンでCHS(contact hypersensitivity)を惹起した皮膚に集積した制御性T細胞を分取し、Helios陽性/陰性間の制御性T細胞の機能を比較した。その結果、Helios陽性分画には、抗原特異的で抑制活性が高い制御性T細胞が濃縮されていることが明らかになった。したがってHelios発現は、ある時点での制御性T細胞の抗原反応性を反映するものと推測できた。免疫寛容を維持する制御性T細胞(Treg)は皮膚免疫難病の治療標的としても有望視されている。Tregには胸腺型と誘導型の二つのサブセットが存在するが、炎症性皮膚疾患におけるこれらサブセットの意義は分かっていない。本研究は、独自のHeliosレポーターマウスを用いて皮膚免疫におけるTregサブセットの意義を明らかにし、新たな免疫制御薬の創出に発展させることを目的とする。平成24年度は、Helios発現を可視化しTregサブセットを生かした状態で解析できるマウスを作出した。また接触過敏性皮膚炎モデルにおいて出現するTregサブセットを解析した。概要は以下の通りである。(1)Foxp3/Heliosレポーターマウスの作出に成功した:Helios遺伝子を黄色蛍光タンパクVenus遺伝子で置換したHeliosレポーターマウスをFoxp3レポーターマウスと交配した。Foxp3はTregに特異的な転写因子である。Foxp3のレポーターマウスは、ヒトCD2遺伝子またはGFP(緑色蛍光タンパク)を発現する。その結果Foxp3を発現するTregを、Venus発現レベルにより分類することが可能になった。(2)接触過敏性皮膚炎におけるTregサブセットを解析した:CHS(contact hypersensitivity)は一般的な接触皮膚炎モデルであり、様々な化学物質やペプチドを用いて皮膚の免疫反応を解析できる。本年度は、野生型マウスの耳介皮膚にDNFBハプテンでCHSを惹起し、出現するTregのHelios発現をモノクローナル抗体を用いて解析した。その結果、抗原刺激により増加するTregサブセットの大部分はHelios陽性型であることが明らかになった。Foxp3陽性制御性T細胞(Treg)は免疫寛容を維持するT細胞である。胸腺内で分化する胸腺型Tregと、末梢リンパ組織で通常のT細胞から分化する末梢誘導型Tregの少なくとも二つのサブセットが認知されている。しかし各サブセットを識別できる細胞表面マーカーがなく、簡便な解析手段がなかった。そこで本研究では、胸腺型Tregが恒常的に発現する転写因子Heliosを蛍光タンパクで可視化したマウスを開発し、生きたHelios(+)Tregの性質を解析した。今年度も継続して、CHS(contact hypersensitivity)を惹起した皮膚・所属リンパ節のTregをFACSで分取し、抑制活性を解析した。その結果幾つかの興味深い知見をえられた。(1)Helios(+)Treg分画は、CHS感作抗原に特異的なT細胞が濃縮されていた。(2)Helios(+)Treg分画はHelios(-)分画よりも強い抑制活性を発揮した。(3)Helios(+)Tregは共存する通常T細胞のIL-17産生をより効率的に抑制したが、IFN-γ産生抑制能についてはサブセット間の違いはなかった。このようなTregサブセット間の違いが、実際の免疫疾患や癌免疫においてどのような働きをしているかは今後の課題である。

Heliosは、胸腺型Treg以外に、末梢誘導型Tregの一部・通常T細胞の一部・NK細胞・神経細胞の一部にも発現する。本研究で開発したHelios可視化マウスはこれらの細胞の機能を解析する上でも非常に有用である。皮膚科学・免疫学当初、分取したHelios陽性制御性T細胞をin vivoに養子移入し、生体内での抑制活性を評価する予定だった。しかし回収できる細胞数が予想外に少なく、生体内での機能を評価しきれなかった。より多くの細胞を分取する方法を工夫するか、少ない細胞で評価できるモデルを工夫する必要がある。その理由からプロジェクトに若干の遅れがあると判断した。平成24年度は、Heliosレポーターマウスの作出を行なった。さらにTregを生かした状態で検出できるFoxp3レポーターマウスと交配した。以下の達成度から、おおむね予定通りの進捗を得たと考える。(1)Heliosレポーターマウスの作出に成功した:最初のATGコドンが出現する第2エキソンに、読み枠をそろえてVenus遺伝子(黄色蛍光タンパク)を相同組換えで挿入したES細胞クローン(129/B6のF1)を、マウス胚に注入しキメラマウスを得た。このキメラマウスを野生型マウス(B6)に戻し交配した。その結果、ヘテロ接合体の生育は正常で、T細胞の一部にVenusの発現を確認した。(2)Foxp3/Heliosレポーターマウスの作出に成功した:Foxp3のレポーターマウスは、ヒトCD2遺伝子またはGFP(緑色蛍光タンパク)を発現するマウスである。その結果、Foxp3を発現するTregを、Venus発現レベルにより分類することが可能になった。養子移入実験を可能にするため、遺伝背景をB6に戻し交配を継続中である。(3)接触過敏性皮膚炎におけるTregサブセットを解析した:CHS(contact hypersensitivity)は一般的な接触皮膚炎モデルであり、様々な化学物質やペプチドを用いて皮膚の免疫反応を解析が可能である。本年度は、野生型マウスの耳介皮膚にDNFBハプテンでCHSを惹起し、出現するTregのHelios発現をモノクローナル抗体を用いて解析した。その結果、抗原刺激により増加するTregサブセットはHelios陽性型であることが明らかになった。今年度、Heliosの発現が、制御性T細胞が抗原を認識した状態と関係することが明らかになった。しかし通常のT細胞を抗CD3抗体で刺激してもHeliosは発現しない。したがって、Heliosの発現は(T細胞抗原受容体シグナルの活性化ではなく)制御性T細胞に特有の、ある状態を反映している可能性がある。今後は、他研究室との共同研究を通して、Helios陽性制御性T細胞の遺伝子発現プロファイルやクロマチン状態を解析する予定である。またHelios陽性制御性T細胞が誘導される条件、あるいは誘導が抑制される条件を、接触皮膚炎モデルを用いて探索する。
ヒトｉＰＳ細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導手法を応用した、肺癌幹細胞の同定の研究

本研究の主目的は、ヒト肺がん細胞における、癌幹細胞を同定・抽出しその性質の検討を行う研究であった。また、治療標的となる癌幹細胞の中心的な性質として腫瘍形成能、薬剤耐性を定義した。研究の手法において、臨床検体から細胞株を樹立し目的の因子を検討することが、本研究計画の特色であった。研究の第一に、臨床患者から採取したヒト肺がん細胞をCPMの発現によりフローサイトメトリーを用いてソーティングを行い、腫瘍形成能・薬剤耐性の性質を検討したが、当初の仮説と異なり、腫瘍形成能、薬剤耐性のフェノタイプを確認することができなかった。以下に修正された計画の研究状況を述べる。1肺がん細胞における、ほかの腫瘍形成能/薬剤感受性低下にかかわる因子を同定した。複数の患者検体、肺がん由来細胞株で当該因子をノックダウン・阻害することで、腫瘍形成能と薬剤感受性に変化があることを同定した。肺がんで、癌幹細胞性質/薬剤耐性に関係する新たな因子として、現在論文作成中である。2複数の樹立した患者検体由来の細胞株の中で、同一患者から薬剤投与前、治療が進み治療抵抗性のサンプルを得て、各々から細胞株を樹立した。これを用い、治療抵抗性となり病状が進んだ患者のがん細胞で癌幹細胞性質を検討した。結果、腫瘍形成能の差はみとめなかったが、治療薬剤感受性の低下をみとめた。その原因となる2因子の活性化・発現上昇・機能的であることを示し、現在論文リバイス中である。ほか、本研究の最終目標として設定していた、「腫瘍形成能あるいは薬剤耐性マーカーを探索し、臨床の患者で検討する」研究として、肝細胞増殖因子(HGF)を患者血清で測定し、肺がんの薬物治療効果(無増悪生存期間)の予測マーカーとなりうるかを検討した。結果、査読誌にAcceptされた。29年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定通り、ヒト臨床検体より肺癌細胞を複数株培養・株樹立を行う事ができた。また、治療抵抗性細胞モデルの樹立の実験系も、予定通り実験系を構築することができた。しかし、肺胞上皮細胞の分化誘導の手法をトレースしソーティングを行ったが、癌幹細胞性質のフェノタイプを確認することが難しく、以下の方向に若干軌道修正をおこなった。1肺胞上皮細胞の分化誘導に重要な因子の肺癌における役割は不明であるので、その機能解析を行う。2そのほかの癌幹細胞の抽出の因子を分化誘導の観点から考える。1については、CRISPR-Cas9を用いて複数の肺癌細胞株(H2228, HCC827)から主要な因子のノックアウト細胞を樹立、またノックアウト細胞にその因子を強制発現させ、レスキュー細胞を樹立した。現在幹細胞性質の変化やその他のフェノタイプを解析中である。現時点で、当該因子のノックアウト細胞ではin vitroでの腫瘍形成能が高まること、薬剤に対して治療抵抗性の性質を持つこと、が確認されている。In vivoでの検討はこれからであり、引き続きこれらについて継続研究の予定である。2についても、治療抵抗性細胞から得た癌幹細胞様のフェノタイプを持つ細胞株を複数樹立したため、これらのRNA、蛋白レベルの発現解析から、複数の細胞系統で共通して発現している因子がいくつか同定されたため、これらについても癌幹細胞との関連が想定されるという仮説のもと、引き続き解析の予定である。ヒト臨床検体より肺癌細胞を複数株培養・株樹立に成功し、肺胞上皮細胞の分化誘導の手法をトレースしソーティングを行ったが、癌幹細胞性質のフェノタイプを確認することが難しく、実験の計画を変更しているため。

1肺胞上皮細胞の分化誘導に重要な因子の肺癌における役割は不明であるので、それも検討する方向でも並行して行う。2そのほかの癌幹細胞の抽出の因子を分化誘導の観点から考える。1については、CRISPR-Cas9を用いて複数の肺癌細胞株から主要な因子のノックアウト細胞を樹立、またノックアウト細胞にその因子を強制発現させ、レスキュー細胞を樹立した。現在幹細胞性質の変化やその他のフェノタイプを解析中である。2についても、治療抵抗性細胞から得た癌幹細胞様のフェノタイプを持つ細胞株を複数樹立したため、これらの発現解析から、有望な因子がいくつか同定されており、引き続き解析の予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
血漿セレノプロテインPによるセレン運搬機構の解明

セレノプロテインP(SeP)は、必須微量元素セレンを含む血漿蛋白質である。SePは、細胞にセレンを運ぶトランスポーターとしての機能を有する。しかしながら、SePのセレン運搬メカニズムは未だ不明な点が多い。本研究では、骨格筋や膵臓、リンパ球など複数の細胞系でSeP受容体を同定した。さらに、親和性の異なる受容体を発見し、そのセレン運搬機構の違いを明らかにした。以上、SePのセレン運搬機構の分子メカニズムが明らかとなった。平成25年度において本研究では、SePのセレン運搬作用に必須のプロセスと考えられる細胞表面への結合およびSeP受容体の同定を目指して検討を行った。ヒトTリンパ球腫Jurkat細胞やヒト神経芽腫SH-SY5Y細胞、ヒト横紋筋由来RD細胞についてSePのセレン運搬作用を、GPx1やSePに対する抗体を用いたWestern blot法で解析した。その結果、SePのセレン運搬作用が細胞毎に大きく異なり、Jurkat細胞やSH-SY5Y細胞では低濃度で運搬するのに対し、RD細胞では高濃度のSePが必要であることが分かった。骨格筋由来C2C12細胞でも、SePによるセレン運搬作用は、高濃度の条件でしか認められなかった。これより、Jurkat細胞やSH-SY5Y細胞では、高親和性の受容体が発現し、RD細胞やC2C12細胞では、高親和性の受容体が発現していない可能性が考えられた。そこで、受容体の同定には、増殖能力が高いJurkat細胞を用いることとした。次に、細胞膜への特異的な結合や親和性を明らかにするために、75Se標識SePを作成した。SePを分泌するHepG2細胞を、75Se存在下で72時間培養し、培養上清を回収した。回収した上清から、Ni-NTAカラムにより75Se標識SePを調製した。SeP濃度は、ELISA法にて測定した。今後、クロスリンク実験を進め、複合体を免疫沈降できる抗体を選別する予定である。75Seを用いた実験と同時進行で、抗体を用いた実験系の確立を行った。SeP-受容体複合体をクロスリンクし、抗SeP抗体でWestern blot解析した結果、75Se標識SePを用いた場合と類似の複合体形成が観察された。また、フローサイトメーターを用いたSeP結合アッセイ系の構築もできた。次年度、複合体を免疫沈降できる抗体を選別し、質量分析法によるSeP受容体同定を目指す。平成26年度において本研究では、SePのセレン運搬作用に必須のプロセスである細胞表面への結合およびSeP受容体の同定を目指して検討を行った。前年度同定した高親和性の受容体の存在が示唆されたヒトTリンパ球腫Jurkat細胞と低親和性のヒト横紋筋由来RD細胞について、SePに由来するセレンの細胞内取り込み経路の詳細を比較した。SePが細胞内で分解されセレン源となっているかについて、リソソーム阻害剤の効果を検討した結果、RD細胞ではセレン供給が阻害されるのに対し、Jurkat細胞では阻害されなかった。これより、前者ではリソソームにおけるSePの分解を介してセレン供給されるのに対し、後者ではリソソームにおける分解を介していないと考えられた。細胞内局在について、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した結果、細胞内に取り込まれたSePは、RD細胞ではリソソームに局在するのに対し、Jurkat細胞では回収エンドソームに認められた。リソソーム依存性の違いと同様、RD細胞ではセレノシステイン分解酵素に依存的であるのに対し、Jurkat細胞では分解酵素非依存的であった。以上の解析から、SePのセレン運搬作用に分解経路と非分解経路があることが示唆された。今度受容体同定を進め、同経路の分子機構を明らかにする。受容体の同定については、前年度確立した75Se標識SePを用い、クロスリンカー処理後、SDS-PAGEで分離しSeP-結合タンパク質複合体を検出する解析系を立ち上げた。複合体を免疫沈降できる抗体のスクリーニングを行った結果、免疫沈降に使用可能な抗体を3種類同定した。複合体を大量調製し、免疫沈降法を用いて分離後、質量分析法による同定を目指す。平成27年度において本研究では、同定されてきたSeP受容体の発現パターンとその機能解析を進めた。高親和性受容体の存在が示唆されたヒトTリンパ球由来Jurkat細胞とヒト神経細胞由来SH-SY5Y細胞、また低親和性のヒト横紋筋由来RD細胞、マウス膵β細胞由来MIN6細胞およびマウス骨格筋由来C2C12細胞について、SeP受容体の発現をmRNAレベル及びタンパク質レベルで比較した。ヒトおよびマウスSeP受容体のsiRNA系を構築し、各細胞において機能しているSeP受容体を明らかにした。未知のSeP受容体の同定については、これまでに確立したSeP-受容体複合体を免疫沈降できる抗体を用い、複合体の大量調製後、免疫沈降法を用いて分離し質量分析法による同定を試みた。得られた解析結果から、受容体候補となる分子を見いだした。今後、siRNA系により詳細を明らかにする予定である。今年度はさらにin vivoでの検討を進めた。ヒトSePをマウスに投与し、各臓器におけるSePの取り込みおよびセレン運搬作用を評価する系を構築した。ヒトSeP投与マウスの臓器ホモジネートを作成し、得られた可溶性タンパク質画分をWestern blot法により解析した。各臓器由来タンパク質をSDS-PAGEにより分離後、SePおよび各セレノプロテイン

特異的抗体を用いて各タンパク質を検出できる条件を検討した。その結果、肝臓や膵臓、筋肉、脳において、取り込まれたヒトSePを検出する条件を確立出来た。また、筋肉においては、GPx1の評価によりSeP投与に伴うセレノプロテインの増加が評価出来ることが分かった。今後、SeP受容体の役割について、in vivoでの検討を進める。本研究では、前年度までに明らかにした低親和性・高親和性の培養細胞のSeP受容体を詳細に比較し、各細胞における受容体の発現パターンを明らかにすることが出来た。さらに、複数の受容体についてsiRNA系を構築する事ができ、SePの細胞内取り込みおよびセレン運搬に寄与する受容体を同定することが出来た。生体のセレン動態を考察する上で、非常に重要な知見がえられ、セレン運搬機構の全容解明を目指す研究基盤を構築出来たと考える。また、未知のSeP受容体の同定については、SeP受容体複合体の免疫沈降から質量分析系での解析まで進めることができ、有力な候補分子を同定するまでに至った。今後、siRNA系などを用い、その役割について粘り強く検討を続けていきたいと考えている。さらに今年度は、培養細胞での知見を踏まえin vivoでの検討を行うための動物モデル系の構築も進めた。実験が首尾良く進み、各臓器におけるSeP取り込みを検出する系の構築に成功した。以上の達成状況から、本年度は当初の計画どおりに進展していると評価した。セレノプロテインP(SeP)は、必須微量元素セレンを含む血漿蛋白質である。SePは、細胞にセレンを運ぶトランスポーターとしての機能を有する。しかしながら、SePのセレン運搬メカニズムは未だ不明な点が多い。本研究では、骨格筋や膵臓、リンパ球など複数の細胞系でSeP受容体を同定した。さらに、親和性の異なる受容体を発見し、そのセレン運搬機構の違いを明らかにした。以上、SePのセレン運搬機構の分子メカニズムが明らかとなった。平成28年度において本研究では、高親和性受容体の存在が示唆されたヒトTリンパ球由来Jurkat細胞について、セレノプロテインP(SeP)-受容体複合体を免疫沈降し、質量分析法による解析結果から、受容体候補となる分子を見いだした。エピトープの異なる抗体によるWestern blot解析から、複数のバリアントの存在を同定した。さらに、異なる配列を持つsiRNAおよび抗体の組み合わせから、SePの取り込みに機能する受容体の同定に成功した。さらに今年度は、細胞内に取り込まれたSePの評価法として、免疫染色法を用いた方法を確立した。細胞内に取り込まれたSePが検出され、また中和抗体の共存により細胞内取り込みが低下する様子がin vitroおよびin vivoの実験から観察された。前年度Western blot解析によりSePの取り込みが見られた膵臓について、免疫染色法を実施し、膵臓における投与SePの取り込みおよび中和抗体による取り込み抑制が観察できた。同じ結果が、膵β細胞モデルMIN6でも観察された。抗インスリン抗体を用いた共染色により、SePが膵β細胞にも取り込まれていることや、中和抗体で抑制されることが示された。
炭素安定同位体比観測による可搬型生態系炭素動態評価システムの開発

二酸化炭素炭素安定同位体比を観測することにより炭素収支のみならず生態系の生理学的情報や環境応答に関する情報を得ることができる。大気二酸化炭素安定同位体比の連続測定を行うために、レーザー分析計を検証し、可搬型炭素安定同位体比測定システムを開発し、野外観測を行った。林内鉛直プロファイル観測からは二酸化炭素濃度上昇と共に炭素安定同位体比が減少する日変動を捉えることができた。一方で、土壌チャンバーによって測定した炭素安定同位体比のデータから、キーリングプロットによる土壌炭素ソースの同位体比推定は、特に、二酸化炭素フラックスの小さくなる冬季には非常に難しいことが分かった。本研究の目的は、生態系の「いつ」吸収された炭素が「どの部分に」「どれだけ」蓄えられているかについての知見を加えた炭素動態を、炭素安定同位体比を用いて明らかにする手法を確立することである。そのために、本年度は、大気サンプリング装置や呼吸量測定チャンバーなどのシステム開発を行った。土壌から放出される二酸化炭素の安定同位体比を測定するためのチャンバーは、空気圧を利用した自動開閉式とし、長期間連続的にかつなるべく自然条件下に近い環境で測定できる物とした。大気サンプリング装置は、容易に分解・組立が行えるようにし、様々な高度の観測タワーに対応できる物とした。これらの装置から吸引された大気はリレーコントローラによって制御された電磁弁によって、自動的に順次、キャビティリングダウン(CRDS)方式のレーザー二酸化炭素安定同位体分析装置に導入され、測定される。また、開発中の安定同位体微気象群落多層モデルの検証のため、独)森林総合研究所富士吉田試験地(冷温帯アカマツ林)において、名古屋大学や独)海洋研究開発機構の研究者らと共同し、名古屋大学所有の量子カスケードレーザーを用いた高精度レーザー二酸化炭素安定同位体比測定装置を利用して炭素・酸素・安定同位体比の連続観測を行った。その結果、樹冠上では日中には同位体比が高く、夜間に低い様子が観測され、樹冠内では林床に近づくにつれ同位体比が低い様子が観測された。微気象群落多層モデルによって、森林内の大気二酸化炭素の炭素安定同位体比を計算することができ、その再現計算結果は観測値とも一致していた。森林生態系は最も複雑な生態系であり、不確定性を減少させるには大気と生態系との炭素交換量を測定するだけでは不十分であり、同時に、生態系内部の炭素動態を把握することによって、より正確な陸上生態系炭素交換量を算定することができる。安定同位体を用いることによって、呼吸による放出起源の推定や水利用効率の推定など、通常の大気観測では得られない情報を得ることができる。従来の質量分析計では行えなかった野外での大気13CO2測定を行うために、CRDS(キャビティリングダウン方式)レーザー分析計の森林での観測可能性を検証した。はじめに、測定精度を確認するため、二酸化炭素が充填されたシリンダーを測定し、アラン分散を算出した。その結果、1520分程度の積算時間で最も精度がよく、その精度は1000秒積算で0.08‰(715ppm)0.18‰(389ppm)程度であった。富士吉田アカマツ林サイトにおいて、^<13>CO_2鉛直プロファイル観測、自動開閉チャンバーを用いた土壌および葉からの^<13>CO_2フラックス観測を2011年7月から12月まで行った。2011年11月1日から光合成による分別を測定するために、枝チャンバーを取り付けた。林内鉛直プロファイル観測からはCO_2の濃度上昇と共にδ^<13>Cが減少する日変動を捉えることができた。土壌チャンバーによって測定したδ^<13>Cのデータから、キーリングプロットによる土壌炭素ソースの同位体比推定を行った。クローズドチャンバーによるキーリングプロットによる解析は、(そもそも前提が成り立たない面もあり)精度的に難しく、特に、CO_2フラックスの小さくなる冬季には非常に難しいことが分かった。可搬型炭素安定同位体観測システムが昨年度に基本的な部分が完成し、屋外環境で長期連続的に森林における二酸化炭素安定同位体を観測することが可能となった。本年度は、本システムを応用的に利用し、炭素安定同位体ラベリング実験を季節ごとに行い、樹木内の炭素動態の季節変動を捉えるとともにその実効性を検証した。アカマツ樹体内の炭素動態を明らかにするために、樹高20mのアカマツ成木の樹冠部を覆うようにラベリングチャンバーをかぶせて13CO2ラベリングを行い、樹体内の炭素動態に関する測定を冬季と夏季に行った。冬季のアカマツラベリング実験によって、冬季(12月)に固定された炭素は樹冠上部で蓄えられ、春先、気温が上昇し、光合成・蒸散活動が活発になるにつれて、急激に下方に流下し、呼吸基質として使われることが観測された。この現象はアカマツ新芽の伸長・

展葉前に起こっており、生長に先立ち転流が行われることが示唆された。炭素到達時間から求めた炭素移動速度は0.11m/hから0.23m/hであり、上部でやや速く、下部で遅い結果が得られた。冬季における実験では13CO2の放出パターンは大きく異なっていたが、炭素到達時間は上部ではそれほど大きな差異はないものの、下部に行くほど遅くなっていた。本実験により、これまで捉えられることのなかった常緑針葉樹成木の樹体内炭素移動の季節変動の詳細について非破壊的観測により明らかにすることができた。今後、本システムとラベリング実験を組み合わせ、他の樹種や生態系で複数回適用することにより、より高時間解像度の樹体内炭素動態について明らかにすることができるであろう。さまざまな生態系において観測をおこなうために、二酸化炭素安定同位体測定装置および電磁弁制御部をコンパクトなケースにおさめ、内部には温度制御装置を組み込んだ。呼吸量測定用の幹チャンバーおよび土壌チャンバーをあわせても数人で一日程度でシステムを組み上げられるよう、可搬型観測システムを完成させた。また、携帯電話回線を使用することにより、データを遠隔地からでもモニタリングできるシステムを構築した。これにより、屋外環境にて二酸化炭素安定同位体比の長期連続観測が可能となった。また、アカマツ樹体内の炭素動態を明らかにするために、13CO2を用いた2012年9月に山梨県富士吉田試験地にて炭素安定同位体を用いたラベリング実験を行った。樹高20mのアカマツ成木の樹冠部を覆うようにラベリングチャンバーをかぶせてラベリングを行い、幹部には閉鎖循環式呼吸量測定チャンバーを設置して、放出される二酸化炭素の炭素安定同位体比をモニタリングした。本研究で導入されたレーザー分光二酸化炭素安定同位体測定装置を二酸化炭素のモニタリングに用いることによって、ラベリングされた炭素が光合成によって取り込まれ、再び呼吸として大気に戻っていく様子を連続的に捉えることが可能となった。これらの観測により、大気と生態系との炭素交換量だけではなく、同時に、生態系内部の炭素動態を把握することにでき、より正確な陸上生態系炭素交換量を算定することが可能となった。初年度には分析機械の納入の遅れなどにより、やや研究が滞ったが、本年度前半には分析機械の精度検証を行い、当初の計画通り、観測システムを完成させ、冷温帯針葉樹林で7月から12月まで観測を行うことができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。今年度目標としていた他の生態系での観測は行えなかったが、これは他の研究との絡みもあり、ラベリング実験を先行させたためであり、研究全体を考えれば当該年度分は概ね達成できたと自己評価した。今後、別の生態系にて二酸化炭素安定同位体比の観測を行い、冷温帯針葉樹林での観測結果と比較解析を行う。また、当初の計画よりもレーザー分光計の精度の維持管理が手間がかかるため、キャリブレーションの方法や装置について深く検討する。引き続きレーザー分光二酸化炭素安定同位体測定装置を用いて、チャンバー測定を行い、土壌および樹体から放出される12/13CO2フラックスを測定し、炭素安定同位体動態モデルの構築を進める。
チェコ私立大学類型化のための質的指標の構築

チェコ私立大学の教育・研究、社会的機能の多様性を調査し、私立大学全事例の量的・質的分析を通して私立大学を類型化する指標を抽出した。それは、「国際性ー地域性」、「研究志向ー教育志向」指標である。その指標に基づき、チェコ私立大学を1教育と研究における国際競争力を追求する大学、2チェコにおける新規分野の教育・研究を担う大学、3チェコの得意分野を国際競争力とする教育志向大学、4欧州に位置付く地域としての地域再生に貢献する教育志向大学に類型化することが可能であると示した。チェコにおける多様な私立大学の教育・研究の質を可視化、類型化するために、23年度は首都圏の経済系私立大学に関する調査を進めたが、24年度は、首都圏外の経済系私立大学を中心として研究を進めた。また、公立大学との対比において私立大学を類型化し、私立大学の社会的機能を明らかにするために、チェコ大学の生成に関する歴史的分析を行い、その経緯から現チェコにおける大学の理念について明らかにしようと試みた。7月までは、それまでに収集した資料に基づき、チェコ大学の研究・教育の理念について分析した。市民革命後に制定された1990年高等教育法が大学の自治と学問の自由を謳いあげていること、またチェコ社会や産業界が大学に対して保守的な見解を抱いていることを背景とし、大学は、教育・青年・スポーツ省との関係性においても自治を保つことができる。公立大学の自治と自由は、学術的入試や研究の自由を守るという伝統的な大学のあり方に表れ、私立大学の自治と自由は、市場経済にアンテナを張り巡らせ、多様なカリキュラムやプログラムを模索する需要適応型運営に表れている。8月には、チェコ調査を実施し、ズノイモやクノビツェの経済大学について、カリキュラムやプログラムを調査した。9月以降は、23年度に検討した「国際志向性」及び「国際的受容度」指標の上にそれらの大学を位置づけ、首都圏経済系私立大学との比較検討を行った。首都圏外の経済系大学では、国境に近い大学であればあるほど、近隣の市が後援団体となる場合が多く、地方の特色を反映させたカリキュラムを提供する傾向にある。短期留学パートナーが隣接する国であったり、隣接国大学との共同プログラムを設けていたりすることもある。すなわち、国際的受容度、及び国際志向性は高くなく、地域の知的基盤(ハイパー地域生涯学習センター)となる場合が多いことを明らかにした。チェコにおいて1999年に設置が認可された私立大学を類型化し、その社会的機能を明らかにすることを目的として、私立大学のミッションやプログラムについて調査、分析を行った。私立大学は、チェコ社会の国際化及び資本主義化、特に第三次産業拡大を背景とし、経済系専攻や、サービスあるいはサービスの対象となる人間に関わる専攻を中心に学士課程を提供する非大学型高等教育機関として設置された。その設置認可における条件は、実践的プログラムを設けることであり、私立大学は実践志向の大学としてスタートした。しかし、チェコ大学の主流は修士課程であるので、私立大学の中には、社会的「認可」を得るため、修士課程、ひいては博士課程の設置に向かうものもある。すなわち、私立大学は、新しい社会的背景とチェコ大学の伝統との間で、実践志向と研究志向の両方向性に拡大している。学士課程は、欧州高等教育圏構想を背景として誕生した概念であり、私立大学の中には、欧州諸大学との人的交流を促す革新的な国際プログラムを設置する大学もある。一方で、地方都市は欧州という枠組みの中での再生が課題であり、地方人材育成のために私立大学を誘致している。すなわち、チェコ国際化は、私立大学の国際化と地域化という二方向性を生み出した。チェコ私立大学は1国際性・研究志向、2国際性・実践志向、3地域性・研究志向、4地域性・実践志向という指標を用いて類型化することができる。1は国際的プログラムと修士・博士課程を設け、教育と研究における競争力を追求する大学、2は特化した専門性を国際的競争力として欧州からの学生を集める大学や、国際市場で活躍する人材を育成する大学。3は第三次産業が生み出す新規分野である福祉、教育やマスコミュニケーション等において教育・研究を担う大学、4は地方産業や地方公共団体で活躍する人材を育成し、地域再生に貢献する大学である。チェコにおける多様な私立大学の教育・研究の質を可視化、類型化するために、私立大学の多くを占める首都圏(プラハ)の経済系私立大学を中心として、そのカリキュラムやプログラムを調査し、私立大学の質を測定するための指標を検討しようと試みた。7月までは、高等教育法、チェコ高等教育研究センターから取り寄せた資料を分析し、私立大学設置基準と公立大学との組織的相違を明らかにした。8月のチェコ調査における資料収集、大学訪問、高等教育研究センターでの議論を踏まえて、9月以降は公立大学との更なる比較分析、私立大学の基本的類型構築と首都圏経済系私立大学の分布分析に取り組んだ。急速に発展する私立大学の質的研究は、日本の私立大学のあり方にも示唆を与えるものである。

課程、大学規模、教員等から公立大学と私立大学との比較分析を行った結果、私立大学の特殊性が、強みと弱点の二つの側面として機能していることが明らかになった。例えば、私立大学には学生数が少ないという特色がある。それは、十分な財源を確保できずに大学の学術創造活動への妨げとなるという弱点である一方で、学生に対する個人的ケアが行き届く、さらには時代と産業の需要に応じて教育内容をフレキシブルに修正できるという強みともなっている。首都圏経済系私立大学のカリキュラム、プログラム分析を通して、「国際志向性」と「国際的受容度」という指標の中に私立大学を位置づけ、類型化する手法を考案した。「国際志向性」は、教員、教授用語、学位、単位互換制度、インターンシップの5項目からなり、国際的受容度は、留学生の割合によって示される。首都圏経済系私立大学に関しては、両者の指標が高い大学よりも、国際志向性のみ高い私立大学の方が多いことが明らかになった。又、今後調査する予定である地方の経済系私立大学や非経済系私立大学に関しては両者の指標が低いことが予想される。私立大学の機能を解明するには、私立大学が公立大学と比較してどのような研究・教育の理念をもっているのかを明らかにする必要があるとの指摘を受け、8月チェコ調査までは、公立大学の研究・教育理念を分析することに専念した。その成果の一つは、日本比較教育学会第48回大会における口頭発表「チェコ大学が目指す教育と研究の理念民主化と民営化をめぐって」である。また、大学の自治と学問の自由を守ろうとする方向性は、単に社会主義への反動として生まれたのではなく、それ以前の虐げられたチェコ民族の歴史を背景として生じたことを明らかにし、「カレル大学の発展における社会主義期の位置づけーチェコ人のための大学という視点からの歴史の読み直しー」(『名古屋女子大学紀要』第59号)と題する論文として発表した。また、自治と自由は、公立大学と私立大学の方向性を分岐する理念であることを導き、公立大学との対比で私立大学を類型化する思考的基盤を確立することができた。8月には、チェコ調査を実施し、高等教育センターを訪問して首都圏外経済系私立大学についての資料収集を行い、研究への助言を受けた。8月以降は、首都圏外の経済系私立大学を「国際志向性」、「国際的受容度」指標の上に類型化した。この段階までは、研究計画に沿った進行であり、高い自己評価を付すことができる。しかし、私立大学の大半を占める経済系私立大学を公立大学と「実際に」対比させること、また、23年度に高等教育センター長シェブコバ氏により指摘された点である「学生の満足度」を含めた質的指標の構築には至らなかった。しかし、公立大学、私立大学の研究と教育の理念を明らかにしたことにより、表面的二次元分類から三次元分類へと可能性を伸ばしたことへの意義は大きい。したがって、現在までの達成度には「おおむね」という自己評価を与えた。私立大学の特色を公立大学との比較で把握し、公立大学分類と対比させて私立大学を位置づけることから研究に着手した。その内容は本研究の序章的位置づけであるが、日本比較教育学会第47回大会において「チェコ私立大学類型化のための指標の検討」として口頭発表を行った。
生体機能性単-分子の力学的検出の目指す極限空間/時間分解能プローブ顕微鏡の開発

本研究は、生体分子や固液界面の溶液環境での高分解能観察可能な原子間力顕微鏡(AFM)を実現することを目的としている。まず、溶液中でQ値が低下し周波数変調方式の検出が困難となる従来のカンチレバーセンサーに代わり、長辺振動型水晶振動子を溶液中で自励発振・自己検出可能なセンサーとして用いて、新しい方式のAFMを開発することを試みた。水晶振動子に対する粘性によるダンピングを減らし溶液中での電極の短絡を防止するため、ハウジング内に振動子部分を収納し、探針だけを液中に露出させる方式を採った。このセンサーのQ値は、大気中で6000程度であったのに対し、水中に導入するとおよそ4000程度となり、大気中で値の80パーセント程度の感度を達成可能なことがわかった。また、典型的な動作状態におけるセンサーの振動振幅は0.1nmのオーダーと、非常に小さいことが判明した。これは、従来式のカンチレバーに比べて、1-2桁小さい値であり、新方式センサーの利点であった。また、通常のカンチレバーセンサーによる高感度・高速化についても検討した結果、振動振幅の減少量を検出・制御するAM方式よりも、振動位相の変化量を検出・制御するPM方式の方が、より高感度な計測が可能であり、また、広帯域計測も実現しやすいことを理論的・実験的に確認した。さらに、液中環境での粘性抵抗力を電気的な帰還回路によって相殺するQ値制御法と呼ばれる手法との複合を試みたところ、実効Q値の増大に伴って、力に対する感度が向上することを確認した。また、走査機構の高速化についても研究を実施した。動作速度を制約する圧電素子の機械的な共振を抑圧するため、素子の変位速度に比例して圧電素子の極板に発生する電流を用いて負帰還をかける方法を提案した。さらに、この信号を積分して変位量として帰還をかけることにより、低域におけるヒシテリシスも抑制することができた。本研究は、生体分子や固液界面の溶液環境での高分解能観察可能な原子間力顕微鏡を実現することを目的としている。ここでは、溶液中でQ値が低下し周波数変調方式の検出が困難となる従来のカンチレバー式センサーに代わり、長辺振動型水晶振動子を溶液中で自励発振・自己検出可能なセンサーとして用いて、新しい方式のAFMを開発することを試みた。市販されている共振周波数457kHzの水晶振動子をベースとして用いて、センサーを開発しその特性を評価した。この水晶部分をAFMセンサー用の電極にマウントし、電界研磨した直径50ミクロンのAuの探針を取り付けた状態で大気中で計測したQ値は約8000であった。これを液中に導入するにあたり、粘性によるダンピングを最小限にしかつ極性溶媒中での電極の短絡を防止するため、ハウジング内に振動子部分を収納し、探針だけを液中に液中に露出させる方式を採り、結果としてQ値を約6000の値に保つことができた。さらに、水晶の弾性定数を低減させるために、特注サイズの水晶振動子を購入し、これを用いてセンサーを製作した。この振動子においては、付加した探針の質量による共振特性の低下や水中に露出する探針が受ける粘性力を可能な限り低減するため、直径10ミクロンのタングステン細線を探針とし、収束イオンビーム加工を施して、水中Q値4000程度の特性を達成した。100kHzの復調帯域を仮定した場合、液体分子のブラウン運動により決まる感度は、現状では約1nN程度と計算される。

しかし実際には水晶振動子の金属電極部の振動モードの等価的弾性が水晶自体の弾性よりはるかに低いと考えられるので、より感度は高いと期待される。これらの成果については、2回の国内学会において発表している。本研究は、生体分子や固液界面の溶液環境での高分解能観察可能な原子間力顕微鏡を実現することを目的としている。昨年度、長辺振動型水晶振動子を防水ハウジング内に収納し、探針だけを液中に露出させた、溶液中で自励発振・自己検出可能なセンサーを提案した。さらに、感度を改善させるべく、弾性定数を以前のものの約25パーセントに抑えた水晶振動子を特注で製作していたいので、本年度は、これをセンサーに加工してその特性を調査した。ここでは、このタイプのセンサーのもう1つの大きな利点である小振幅動作の特性についても考慮して特性を解析した。このセンサーのQ値は、大気中で6000程度であったのに対し、水中に導入するとおよそ4000程度となり、Q値の平方根に反比例する感度は、大気中の80パーセント程度を達成可能なことがわかった。また、熱振動によるセンサーの振動を検出した電気信号の大きさから、典型的な動作状態におけるセンサーの振動振幅は0.1nmのオーダーと、非常に小さいことが判明した。これは、従来式のカンチレバーに比べて、1-2桁小さい振幅でセンサーを振動させうることを表わしている。一般に従来のカンチレバーセンサーは、大振幅振動の軌跡中で受ける力学的相互作用を積分しているため、探針-試料ポテンシャルの形を正確にトレースできず、力情報の正確な抽出が困難であったが、本研究のセンサーは、小振幅振動のため、理想的な変調が実現されていることがわかる。これらの成果については、2つの国際学会において発表している。来年度は、小振幅動作可能だが弾性定数が高いため高感度化が困難な長辺振動型に変わる、別のタイプの水晶振動子の使用も視野にいれ、更なる感度の向上を期する予定である。高速かつ高制御性の原子間力顕微鏡を実現することを目的に研究を行ってきた。当初着目したのは、圧電効果を利用した水晶振動子を用いて、液中環境でも高い制御性を維持でき、自己検出可能なAFMシステムを開発することであった。特に、500-1000kHz程度という非常に高い共振周波数を持つことが知られている長辺振動型のものを用いれば、高速の動作も可能となることを期待した。しかし、現状で入手可能な水晶振動子の種類は限られており、必然的に弾性定数が10^6N以上という、非常に固いものにならざるを得ず、その割に共振のQ値は水中で10^4以下であったため、その感度面での性能は従来型のカンチレバーセンサーに比して優れたものとはいえないことが分かった。これは、水晶振動子の固定方法の精度に由来すると考えられる。これを改善するには、水晶の微細加工技術のレベルからの改善および振動子のデザインそのものの最適化が必要であると考えられ、本研究の規模では対処できないレベルのものである。圧電効果を利用した自己検出型のセンサーというアイデアは、センサーの変形による応力が直接に信号を生み出すため、素子の加工精度さえ確保できれば理論感度を容易に達成できる性格のものであり、今後の課題として勝ちあるものといえる。.また、高速化のための要素技術として、走査機構の高速化たついても研究を実施した。通常、走査用の圧電素子は機械的な共振を持ち、これが動作速度を制約する。
飲酒行動関連遺伝子多型とその健康指標に及ぼす影響に関する研究

飲酒行動は、動脈硬化の予防など、適量であれば良い作用も有するが、一方生体内での代謝により、極めて反応性の高いアセトアルデヒドを生じる。このアセトアルデヒドは、容易にDNAおよび蛋白質等と反応し、様々な生体反応を生じる。日本人においてはアルデヒド脱水素酵素(ALDH2)に高頻度の多型が存在する。約半数にみられる変異型の遺伝子型においては、飲酒時に高濃度のアセトアルデヒドに曝露するため、発がん等の健康影響が懸念されている。従って、飲酒行動等の環境要因によるアセトアルデヒドへの生体内曝露指標の開発は重要な課題である。我々は、昨年度の本研究においてアセトアルデヒドへの生体内曝露指標の開発は重要な課題である。我々は、昨年度の本研究においてアセトアルデヒドのヘモグロビン付加体量(HbAA)の測定方法を検討し、HPLCと蛍光検出器の組み合わせにより、アセトアルデヒド由来の蛍光物質を極めて高感度に検出可能になった。ボランティアにおいて、一定量のエタノール飲酒後のHbAAの増加を測定したところ、アルコール感受性の高いヘテロ型では、通常型ホモにくらべて明らかに大きな増加が観察された。職域集団において検診時の付加体量を測定したところ、やはりヘテロ型は通常型ホモにくらべて、過去2日間の飲酒量と比例して、HbAAの増加がみられることが示された。さらに、日頃の習慣的な飲酒量を加えて、重回帰分析を行った所、ヘテロ型では、過去2日間の飲酒量に加えて、習慣的な飲酒量もHbAAに寄与していることが判明した。この遺伝子型においては、過度の飲酒を連日続けると、生体内にアセトアルデヒドが蓄積することが示唆された。本年度は、ヘテロ型のボランティアにおいて、7日間連続飲酒によるHbAAの蓄積を検討した。日本酒1合程度の量を連日飲酒することによりHbAAが7日間にわたって蓄積していくことが示された。このような蓄積は生体内の種々の臓器において実際におきていると考えられ、飲酒の健康影響を考える上で極めて興味深い。アセトアルデヒドは、エタノール中間代謝産物であるが、非常に活性が高く、容易にDNAおよび蛋白質等と反応し、様々な生体反応を生じる。我々は、本研究においてアセトアルデヒドのヘモグロビン付加体重(HbAA)の測定方法を検討し、日本人集団への応用を試みた。HPLCと蛍光検出器の組み合わせにより、アセトアルデヒド由来の蛍光物質を極めて高感度に検出可能になった。同様の方法を用いて、職域集団において検診時の付加体重を測定したところ、やはりヘテロ型は通常の型ホモにくらべて、過去2日間の飲酒量と比例して、HbAAの増加が見られることが示された。この遺伝子型においては、過度の飲酒を連日続けると、生体内にアセトアルデヒドが蓄積することを意味しており、ヘルスプロモーションを進めていく上で重要な示唆を与えるものと思われる。今後は、この付加体重と、問題飲酒行動や検診データ等の他の健康指標との相関を検討し、また飲酒関連性の健康破綻との関連を検討することにより、付加体重の健康指標としての意義を探っていく予定である。

飲酒行動は、動脈硬化の予防など、適量であれば良い作用も有するが、一方生体内での代謝により、極めて反応性の高いアセトアルデヒドを生じる。このアセトアルデヒドは、容易にDNAおよび蛋白質等と反応し、様々な生体反応を生じる。日本人においてはアルデヒド脱水素酵素(ALDH2)に高頻度の多型が存在する。約半数にみられる変異型の遺伝子型においては、飲酒時に高濃度のアセトアルデヒドに曝露するため、発がん等の健康影響が懸念されている。従って、飲酒行動等の環境要因によるアセトアルデヒドへの生体内曝露指標の開発は重要な課題である。我々は、昨年度の本研究においてアセトアルデヒドのヘモグロビン付加体量(HbAA)の測定方法を検討し、HPLCと蛍光検出器の組み合わせにより、アセトアルデヒド由来の蛍光物質を極めて高感度に検出可能になった。ボランティアにおいて、一定量のエタノール飲酒後のHbAAの増加を測定したところ、アルコール感受性の高いヘテロ型では、通常型ホモにくらべて明らかに大きな増加が観察された。職域集団において検診時の付加体量を測定したところ、やはりへテロ型は通常型ホモにくらべて、過去2日間の飲酒量と比例して、HbAAの増加がみられることが示された。さらに、日頃の習慣的な飲酒量を加えて、重回帰分析を行った所、ヘテロ型では、過去2日間の飲酒量に加えて、習慣的な飲酒量もHbAAに寄与していることが判明した。この遺伝子型においては、過度の飲酒を連日続けると、生体内にアセトアルデヒドが蓄積することが示唆された。本年度は、ヘテロ型のボランティアにおいて、7日間連続飲酒によるHbAAの蓄積を検討した。日本酒1合程度の量を連日飲酒することによりHbAAが7日間にわたって蓄積していくことが示された。このような蓄積は生体内の種々の臓器において実際におきていると考えられ、飲酒の健康影響を考える上で極めて興味深い。
脊椎動物のCa調節機構に関与するホルモンとしてのプロラクチンの役割の検討

高等動物のCa調節機構に関与するホルモンとしてPTH・1α,25(OH)_2D_3・カルシトニンが知られているが、他のホルモンもその役割を荷っている可能性が考えられる。その1つとして下垂体前葉ホルモンであるプロラクチン(LTH)が哺乳類や魚類に対しCa調節ホルモンとしての可能性が示唆されている。申請者は、LTHがラットの血清Ca値上昇・骨細胞のCa取り込み促進・骨細胞形態変化(活性化)を誘起することを見出し、Ca調節へのLTHの役割を支持すると共に、その機構解明を目的に研究を続行してきた。本研究は、骨吸収に主役を演ずる破骨細胞に対しLTHの作用を形態的・機能的両面より検索した62年度の実績をより詳細に分析することが出来た。材料:破骨細胞はラット(1920日目胎児)及びマウス(新生児)の頭蓋冠または長幹骨より採取し、通法に従い培養(168時間)を行い、その間LTH(200μg/ml培養液)を添加し破骨細胞様多核細胞の出現数の変動を調べ、さらに酒石産抵抗性産ホスファターゼ染色・象牙質切片による骨吸収能詮索を施し多核細胞の性状を調べ、破骨細胞の形成に対するLTHの影響を詮索した。猶、LTH無添加を対照群とした。結果・考察:ラット・マウス各細胞に対するLTHの作用は同効果を示した。1.破骨細胞様多核細胞数:対照群では経時的に激滅するが、LTH群では著しい出現率の増大が認められた。添加時期を変えることによりこの細胞は新生された細胞と考えられた。2.破骨細胞のマーカ酵素TRACP検出:LTH群で増加出現した多核細胞はすべて陽性であった。更に陽性の単核三核の細胞が著明に出現した。3.骨吸収能の有無:LTH群でクジラ象牙質切片上の吸収窩は対照群と同様多核細胞により形成されることが認められ、また小さな吸収窩が多く観察された。特記すべきは二核細胞も吸収能を有していたことである。以上によりLTHが破骨細胞形成に対し分化誘導能を有することが初めて明白となり、Ca調節ホルモンとしての役割が強められた。近年,哺乳類のCa調節機構に対し下垂体ホルモンのプロラクチン(LTH)の関与が示唆されたが,その多くは未解決である.LTHが骨細胞のCa取込み促進・血清Ca値上昇・骨細胞の形能変化を起すことが申請者により見出され,他のホルモン(PTH・活性型V-D3)同様, Ca調節へのLTHの役割が強められた.当研究は破骨細胞に対するLTHの作用について形態と機能の両面より光顕及び電顕的観察を行い次の結果を得, LTHのCa調節機構への役割を提起した.材料:骨及び破骨細胞はラット及びマウス新生児の頭頂骨又は長幹骨から採取し,通法に従いα-MEM中で144h培養してその間LTHを添加し観察した.結果:ラット・マウス各々の細胞に対し, LTHの効果は同傾向を示した.1.多核細胞の出現:破骨細胞は,対照群では経時的に数が減少したが,一方LTH(200Mg/ml)添加群では破骨細胞若しくは破骨細胞類似性の多核巨大細胞の出現が著明に増加した.それらは,対照群では認め難い培養96h以後でも多く認められた.更に,破骨細胞の核の形態に類似した単核或は二核を有する小型細胞が顕著に出現し,それらは骨細胞層に囲まれた空間内に互に近接して認められた.2.破骨細胞のマーカー酵素酒石酸抵抗性酸フォスファターゼが検出:LTH添加群で増加出現した多核並びに単核細胞には破骨細胞のマーカ酵素が検出.3.硬組織吸収能の有無:クジラの象牙室切片上で細胞培養を行い吸収能を光顕及び走査型電顕で調べた.吸収窩は,対照群では4872hに大型のが認められたが以後減少し,一方LTH添加群ではその数は経時的に増加し96h以後も著明に認められた.又,吸収窩は対照群と比較し添加群では小型化した.63年度は,吸収窩に隣接し存在する吸収能を有すると推定される細胞の形態について透過型電顕を用い検索する.高等動物のCa調節機構に関与するホルモンとしてPTH・1α,25(OH)_2D_3・カルシトニンが知られているが、他のホルモンもその役割を荷っている可能性が考えられる。