hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腫瘍壊死因子とアクアポリン5を分子標的としたシェーグレン症候群の新規治療法の開発

シェーグレン症候群(SS)患者の唾液腺においてはアクアポリン(AQP)5の発現低下や分布異常が生じており、これが唾液分泌低下の一因であると考えられているが、その詳細なメカニズムは不明である。本研究においては培養ヒト唾液腺腺房細胞を腫瘍壊死因子(TNF-にて処理するとAQP5の発現が低下することに着目し、そのメカニズムの解析をおこなった。アクアポリン(AQP)は水輸送に関与する膜蛋白であり、唾液腺からの唾液分泌にAQP5が重要な役割を果たしている。シェーグレン症候群(SS)患者の唾液腺組織においてはAQP5の発現低下が報告されている。また、SS患者の唾液腺組織においては、腺房構造周囲に炎症性細胞浸潤が認められ、唾液分泌低下に炎症性細胞から産生されるTNF-αなどのサイトカインが深く関与している可能性が示唆されている。そこで本研究においては、ヒト唾液腺腺房細胞を用いてTNF-αがAQP5の発現にどのような影響を及ぼすか解析した。腺房細胞をTNF-αにて処理すると、AQP5の発現は有意に低下した。既に我々は、AQP5の発現していない唾液腺導管細胞をDNA脱メチル化剤で処理するとAQP5が誘導されることを報告した。そこで、TNF-αによるAQP5の発現低下とDNAのメチル化による遺伝子の発現低下の関連性について解析した。DNAメチルトランスフェラーゼ1(Dnmt-1)はIL-6によって発現が誘導されることから、培養上清中のIL-6濃度をELISA法にて検索したところ、TNF-α処理によりNS-SV-ACからのIL-6の産生は著明に増強された。しかし、TNF-α単独あるいはTNF-αとIL-6中和抗体の併用処理によってDnmt-1の発現に明らかな変化は認められなかった。さらに、TNF-αによるAQP5の発現低下はIL-6中和抗体による影響を受けなかった。また、TNF-αと転写因子NF-κBの阻害剤の併用処理ではTNF-α単独処理と比較しAQP5の発現は著明に抑制されたことから、TNF-αによるAQP5の発現低下にはDNAメチル化やNF-κBを介した経路以外のメカニズムが関与している可能性が示唆された。昨年度はTNF-αによるAQP5の発現低下のメカニズムの解析を行ったが、DNAメチル化やNF-κBを介した経路以外のメカニズムが関与している可能性を示したが、詳細なメカニズムの解明には到達しなかった。本年度は、それ以外の経路について検討を行った。まず、TNF-αによって活性化されるMAPKを介したシグナル伝達経路の解析を行った。各種MAPK(p38, JNK, ERK)の阻害剤を用いて細胞を処理し、MAPKのシグナル伝達を阻害したが、TNF-αによるAQP5 mRNAおよび蛋白レベルでの発現低下は抑制できなかった。AQP5の発現は転写因子Sp1を介して調節されていることが明らかになっていることから、Sp1に関連した転写調節因子の解析を行った。DNAマイクロアレイによる解析の結果、Sp1の転写を促進するNCoAの発現抑制とSp1の転写を抑制するNCoRの発現上昇が確認された。以上の結果から、TNF-αによるAQP5の発現低下には、この2つの因子が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。腺房細胞をTNF-αにて処理すると、AQP5の発現は有意に低下し、腺房細胞の水の移送能も低下した。そこで、本研究ではTNF-αによるAQP5の発現低下のメカニズムについて解析した。既にDNAのメチル化やNF-κBを介した経路は関与していないことを明らかにしていることから、TNF-αと関連の深いMAPキナーゼの経路(p38MAPK,JNK,ERK)の関与について解析したが、いずれも直接的な関与は認められなかった。

次に、蛋白の発現に深く関与している転写調節因子であるNuclear fctor co-activator(NCOA)とNuclear factor co-repressor(NCOR)について解析したところ、NCORの発現上昇あるいは、NCOAの発現低下がTNF-αによるAQP5の発現低下に関与している可能性が示めされた。
心筋の筋長効果の分子メカニズムの解明

心筋の発生張力は伸展とともに増大し、この性質は「筋長効果」と呼ばれている。筋長効果は、心臓の拍出量が拡張期圧に依存するというStarlingの法則の基礎を成す。本研究課題の目的は、筋長効果の分子メカニズムを、収縮蛋白系レベルで解き明かすことである。我々は既に、巨大弾性タンパク質タイチン(コネクチン)の伸展に依存した静止張力が格子間隔を縮小させ、クロスブリッジの形成確率を上昇させることを報告している。今回、筋長効果の制御におけるトロポニン(Tn)の役割について検討した。骨格筋の筋長効果は、心筋のそれに比べて著しく小さい。したがって、Tnが筋長効果の制御に関与しているのであれば、心筋の内因性Tnを骨格筋型Tn(sTn)に置換することによって筋長効果が減弱すると予想される。我々は、従来のTn置換法を大きく発展させ、細胞膜を除去したスキンド心筋の内因性のTnを、外来性Tn(ウサギ骨格筋速筋由来)にほぼ完全に置換することのできる実験系を確立した。その結果、ブタ心室筋のCa感受性が増大し、筋長効果がウサギ骨格筋速筋で得られるものとほぼ同じレベルに減弱した。さらに、sTn置換によって、クロスブリッジの形成速度が上昇した。逆に、ウサギ骨格筋速筋にブタ心室筋由来のTn(cTn)を組み入れると、Ca感受性が低下し、筋長効果がブタ心室筋で得られるものとほぼ同じレベルに増大した。したがって、伸展時、格子間隔の縮小にともなって増加するクロスブリッジの数は、Tnの制御を介した細いフィラメントの状態に依存していると考えられる。すなわち、sTnはcTnに比べて細いフィラメントのon-off平衡を相対的にon側へシフトさせるため、クロスブリッジ形成が促進するが、これは細いフィラメントから乖離している(潜在的に発生することのできる)ミオシン分子の減少をもたらし、筋長効果が減弱すると考えられる。本研究課題の目的は、心筋の筋長効果、すなわちFrank-Starling機構の分子メカニズムを、収縮タンパク系レベルで解き明かすことである。既に我々は、巨大弾性タンパク質タイチン依存性の静止張力が格子間隔を縮小させ、クロスブリッジの形成確率を上昇させることを報告している。今回、制御タンパク質トロポニン(Tn)の役割に着目した。骨格筋の筋長効果は心筋のそれに比べて小さい。したがって、Tnが筋長効果の制御に関与しているのであれば、内因性のTnを骨格筋型Tn(sTn)に置換することによって筋長効果が減弱すると考えられる。我々は、細胞膜を除去したスキンド心筋のTnを、外来性のTnにほぼ完全に置換することのできる新たな実験系を開発した。標本はブタ心室筋を使用し、これにウサギ腸腰筋由来のTnを組み入れた。これまでに以下の結果を得た:(1)sTnは、Ca感受性を増大させ、筋長効果を減弱させた。(2)タイチンは粘弾性要素としての特性を有するため、筋の伸展後、静止張力は一過的に増大した後に低下する。この性質を利用して、異なる静止張力レベルで活性張力を測定すると、Tnの分子種によらず、筋長効果が静止張力とともに増大した。(3)無機リン酸(Pi)は、クロスブリッジの数を減少させる(Ca感受性の低下)。sTnを組み入れた心筋では、PiのCa感受性低下作用が抑制されていた。すなわち、sTnはクロスブリッジ形成を促進することが示唆された。

以上、筋長効果のトリガー因子は、タイチン依存性の静止張力に基づく格子間隔の縮小であるが、それによって増加するクロスブリッジの数は細いフィラメントの状態に強く依存している。すなわち、細いフィラメントの活性が促進していると、格子間隔の縮小にともなってクロスブリッジになりうる、細いフィラメントから乖離しているミオシン分子の数が減少するため、筋長効果が減弱すると考えられる。心筋の発生張力は伸展とともに増大し、この性質は「筋長効果」と呼ばれている。筋長効果は、心臓の拍出量が拡張期圧に依存するというStarlingの法則の基礎を成す。本研究課題の目的は、筋長効果の分子メカニズムを、収縮蛋白系レベルで解き明かすことである。我々は既に、巨大弾性タンパク質タイチン(コネクチン)の伸展に依存した静止張力が格子間隔を縮小させ、クロスブリッジの形成確率を上昇させることを報告している。今回、筋長効果の制御におけるトロポニン(Tn)の役割について検討した。骨格筋の筋長効果は、心筋のそれに比べて著しく小さい。したがって、Tnが筋長効果の制御に関与しているのであれば、心筋の内因性Tnを骨格筋型Tn(sTn)に置換することによって筋長効果が減弱すると予想される。我々は、先ず、昨年度報告したTn置換法をさらに発展させ、細胞膜を除去したスキンド心筋の内因性のTnを、外来性Tn(ウサギ骨格筋速筋由来)にほぼ完全に置換することのできる実験系を確立した。その結果、ブタ心室筋のCa感受性が増大し、筋長効果がウサギ骨格筋速筋で得られるものとほぼ同じレベルに減弱した。さらに、sTn置換によって、クロスブリッジの形成速度が上昇した。逆に、ウサギ骨格筋速筋にブタ心室筋由来のTn(cTn)を組み入れると、Ca感受性が低下し、筋長効果がブタ心室筋で得られるものとほぼ同じレベルに増大した。したがって、伸展時、格子間隔の縮小にともなって増加するクロスブリッジの数は、Tnの制御を介した細いフィラメントの状態に依存していると考えられる。すなわち、sTnはcTnに比べて細いフィラメントのon-off平衡を相対的にon側へシフトさせるため、クロスブ.リッジ形成が促進するが、これは細いフィラメントから乖離している(潜在的に発生することのできる)ミオシン分子の減少をもたらし、筋長効果が減弱すると考えられる。
タンニン酸-PEG複合体の形状・サイズ制御法の確立とワクチンへの応用

抗原をナノ粒子に固定化することで、粒子サイズや形状に依存して抗原に対する免疫応答が向上することが明らかになってきた。本研究では、形状とサイズを制御したタンニン酸-PEG(ポリエチレングリコール)複合体粒子の合成方法を確立し、ワクチンへの応用を目指す。従来では形状やサイズが制御しやすい金属粒子の報告が多く、生体適合性の高い有機分子を使っての形状・サイズ効果の検証・応用には至っていない。これは有機分子の場合、形状やサイズをナノスケールで制御することが難しいためである。そこで、生体適合性の高いタンニン酸-PEG複合体の形状・サイズ制御法を確立し、それらの免疫応答への効果を明らかにする。
広範囲抗寄生虫薬の開発とその分子基盤の構築

N-89の住血吸虫に対する作用機構を解析した。(1)産卵能抑制に関連するタンパク質因子を網羅的に探索した結果、11種のタンパク質が変動していた。そのうち、paramyosinはN-89作用で処理24時間後に30%まで減少した。マラリア原虫の標的分子群と異なることから、両感染症におけるN-89の相違をさらに検証して行く必要がある。(2)N-89投与により中体が短く、且つ、ヘモゾインの産生量も減少した。3)Rhodamine-N-89付加体を作成して住血吸虫への局在を調べたところ、N-89は中体へ取り込まれて作用することが明らかになった。本研究はマラリアと住血吸虫症の2大寄生虫病に有効な広範囲治療薬を開発することを目的としている。我々が抗マラリア薬として開発している環状過酸化化合物N-89が住血吸虫に対して肺移行期(住血吸虫感染後2週目)投与で虫体殺滅効果を、肝臓寄生期、雌雄接合開始期(住血吸虫感染後5週目)投与で産卵能抑制効果を示し、いずれも内臓病変を抑制する事を見出し、特許出願した(特願2008-172663,国際公開番号WO2010/001824 Al)。平成22年度はN-89の住血吸虫に対する作用機序を明らかにする事を目的として研究を行った。産卵能抑制の作用機序の解明のため、マンソン住血吸虫感染後5週目のマウスにN-89を投与し、12時間後、及び2週間後の虫体を回収、雌雄別々にタンパク質可溶性画分を調製し、N-89投与時に変動したタンパク質をプロテオーム解析より同定した。N-89を投与したマウスの住血吸虫産卵能抑制は、投与後4週間以上持続している事を考え合わせると、両条件で共通して変動していたタンパク質がN-89の産卵能抑制効果に関与している可能性が高い。プロテオーム解析の結果、雄では構造タンパク質、chaperon等6種類のタンパク質が増加し、5種類のタンパク質が減少していた。雌では構造タンパク質、regulatory protein,chaperon等それぞれ3種類のタンパク質が増加、及び減少していた。このうち、雌で減少していたparamyosineを用いてwestern blot解析を行った結果、N-89投与後24時間でコントロールの1/3に減少していた。これらN-89投与によって住血吸虫にもたらされた変化はN-89の住血吸虫の産卵能抑制に関与していると思われる。平成22年度に引き続き、平成23年度もN-89の住血吸虫に対する作用機序を明らかにする事を目的として研究を行った。1マンソン住血吸虫感染後5週目のマウスにN-89を投与し、12時間後及び2週間後に行ったプロテオーム解析から、いずれの時期にも変動していたタンパク質(オス:増加6種類、減少5種類メス:増加6種類、減少6種類)についてウエスタンブロッティングにより発現量を解析した。住血吸虫タンパク質に対する抗体は市販されているものがないので、他の生物種と比較し、アミノ酸配列の相同性が高いタンパク質に対する抗体、あるいは目的とするタンパク質の一部に相同な部位に対する抗体を購入し、感染後5週目のマウスにN-89を投与し、12時間後にタンパク質画分を調製してウエスタンブロッティングを行ったが、抗体が反応せずタンパク質レベルでの解析が出来なかった。2抗体の反応性の問題でウエスタンブロッティングの解析が出来なかったので、マンソン住血吸虫感染後5週目のマウスにN-89を投与し、12時間後にmRNAを抽出し、cDNAを調製した。現在、プロテオーム解析から見出したタンパク質をコードする遺伝子に特異的なプライマーを設計しリアルタイムPCRを行っている。3N-89のマンソン住血吸虫における薬剤標的タンパク質を同定するため、N-89ビオチン付加体を作製した。現在、このN-89ビオチン付加体を用いて、N-89と親和性のあるマンソン住血吸虫タンパク質の同定を試みている。4マンソン住血吸虫内におけるN-89の局在を観察するためにN-89に蛍光物質ローダミンを標識したローダミン標識N-89を作製した。マンソン住血吸虫の凍結切片スライドをローダミン標識N-89で染色し、住血吸虫内の局在観察を行っている。本研究は、難治性感染症である住血吸虫症とマラリアの寄生虫感染症に有効な広範囲治療薬の開発と標的分子を見出すことを目的としている。平成24年度は以下の研究成果を得た。(1)マンソン住血吸虫の凍結切片にRhodamine付加体N-89を作用させ、局在の観察を行なった。

Rhodamine付加体N-89は住血吸虫体内の核(DAPI)及びミトコンドリア(MitoTracker Red)とは共局在しないが、特異的に局在する部位があることを明らかにした。また、薬剤作用時間に依存してRhodamine付加体N-89が濃縮される結果を得た。現在、局在部位を明らかにするため、解析を行っている。(2)ビオチン付加体N-89を用いて、N-89の標的タンパク質を同定するためのプロテオミクスの研究基盤を検討した。現在までに住血吸虫におけるN-89の標的タンパク質は同定出来ていないが、今後明らかにしたい。(3)物理的破壊によるマンソン住血吸虫のシストソミューラ培養液にN-89、あるいはN-251を直接処理したところ、濃度依存的にセルカリアの成長阻害と運動性の低下が見られた。両化合物のうち、N-251の方がN-89より阻害能が強く、特に、シストソミューラの運動性に与える影響が大きいことが判った。現在、マンソン住血吸虫の運動性に関わる因子の網羅的な比較解析を行っている。(4)培養熱帯熱マラリア原虫の標的分子の探索研究では、大量の培養液とそれに付随する不純物(赤血球由来)の除去法がネックとなっている。これら問題点を解決するためにローデントマラリア原虫感染マウス実験系(P. chabaudi感染ICRマウス)で、高収率のリング、及びトロポゾイトステージの原虫を集められるモデル系を構築し、上記の化合物の標的分子の解析に応用できるかどうかを現在検討している。平成23年度は薬剤標的タンパク質の同定において強力なツールとなるN-89ビオチン付加体を作製することができた。また、住血吸虫内におけるN-89の局在観察が可能となるローダミン標識N-89の作製をしたことから、N-89のマラリア原虫とマンソン住血吸虫における標的タンパク質及び作用機序を明らかにできると考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。マラリア原虫とマンソン住血吸虫におけるN-89の局在及び標的タンパク質を明らかにし、マラリア原虫と住血吸虫とで共通の標的ポイントを見出す。
固定/モバイルネットワークの多様性を考慮したストリーミング配信システムの構築

モバイルネットワークの普及並びにブロードバンド化により、伝送速度や利用形態に関して利用者の多様性が見られるようになったが、利用者間の公平性を確保することが重要である。そこで、昨年度に引き続き、無線LANにおいて各ユーザの無線チャネル使用期間が不公平になる状況が存在するという問題に対して検討を行った。本研究は、ホットスポットのようにユーザが一定の利用料金を支払っている無線LANにおけるユーザの満足度の向上に寄与するものである。本研究では、各端末の無線チャネル使用期間に基づき上位層において達成可能なスループットを推定し、その送信レートを制御する機構を提案している。昨年度までに、上位層としてTCPを利用する場合に、提案手法は無線チャネル使用期間の公平性に関して有効であることを示している。本年度では、様々なネットワーク環境において先行研究との比較を行い、無線チャネル使用期間に関する公平性だけではなく、従来手法では困難であった通信遅延に関する公平性も実現できることを確認した。また、動画などのストリーミング通信で多く用いられるTFRC通信に対して提案手法を適用し、TCPの場合と同様の結果を得たため、その成果を国際学会において発表した。同時に、提案手法の性能向上のため、アルゴリズムの改良を行った。具体的には、無線LANにおいてパケットロスの主要因となるフレームの衝突やビットエラーを考慮することで、スループットの推定を高精度化した。結果として、利用者間公平性の向上やパケットロス率の低減を実現した。一方で、これまでの研究成果をまとめたものを論文誌に投稿中である。有線ネットワーク・モバイルネットワークを問わず、インターネットを介してマルチメディアコンテンツをリアルタイムでストリーミング配信するサービスへの需要が高まると予想される。そのような場合、QoS(サービス品質)制御、とりわけトラフィックの優先度に応じた制御やユーザ間の公平性が重要になってくると考えられる。そこで、本年度では、近年急速に普及が進んでいる無線LAN(IEEE802.11)に注目し、端末がTCP通信を行う際に無線チャネル使用期間がユーザ間で不公平になる状況が存在するという問題に対して検討を行った。本研究では、全端末が同一無線LAN内の各端末の無線チャネル使用期間をMAC層において観測可能であることに着目し、その観測情報に基づく新たなTCPレート制御アルゴリズムを提案した。すなわち、本手法はクロスレイヤアプローチの一種である。提案手法では、各端末の無線チャネル使用状況に基づき、ユーザ間の公平性や無線チャネル利用効率を考慮しつつ、各端末が無線チャネルを利用可能な割合を推定する。そして、その場合にTCPが達成可能な最大スループットを予測し、TCPの送信レートを適切に設定する。シミュレーションにより提案手法の性能評価を行った結果、標準的な無線LANおよびTCPを使用する場合に比べ、各端末の無線チャネル利用期間が公平になることを確認した。加えて、TCPにおけるスループットの向上およびパケットドロップの抑制が可能であることも示した。なお、本研究の成果については国際学会において発表した。さらに、提案アルゴリズムの改良版を次年度開催予定の国際学会に投稿中である。今後、有線ネットワーク・モバイルネットワークを問わず、インターネットを介して大容量コンテンツを送受信する需要が高まると予想される。そのような場合、ユーザ間の公平性が重要になると考えられる。本研究は、ホットスポットのようなユーザが一定の利用料金を支払っている無線LANにおけるユーザの満足度の向上に寄与するものである。本研究では、無線チャネル使用期間に基づく新たなTCPレート制御アルゴリズムを提案している。昨年度では、各端末のMAC層における伝送レートが異なる場合について提案手法の有効性を確認したが、本年度では主に、同一無線LAN内にデータをアップロードする端末とダウンロードする端末が同居する場合について検討を行った。このような状況において、標準的な無線LANではアップロードを行う端末がより多く無線チャネルを占有してしまう。シミュレーションにより提案手法の性能評価を行った結果、標準的な無線LANおよびTCPを使用する場合に比べ、各端末の無線チャネル利用期間あるいはスループットが公平になることを確認した。加えて、TCPにおけるパケット再送率の抑制が可能であることを示した。なお、昨年度の研究成果を含め、本研究の成果を国際学会および国内学会において発表した。さらに、動画などのストリーミング配信により適したTFRC通信に対して提案アルゴリズムを応用した結果について、次年度開催予定の国際学会に投稿中である。

具体的には、無線LANにおいてパケットロスの主要因となるフレームの衝突やビットエラーを考慮することで、スループットの推定を高精度化した。結果として、利用者間公平性の向上やパケットロス率の低減を実現した。一方で、これまでの研究成果をまとめたものを論文誌に投稿中である。
福島県内の木造仮設住宅の撤去・集約化と利活用に関する研究

東日本大震災並びにその後の原発事故(3.11)の影響によって、福島県内に建設された仮設住宅16,800戸に関して、福島県庁・被災自治体等からのマクロな統計データ収集やヒアリング調査を通し、その状況を把握した。2018年10月末時点において、6,046戸が撤去・10,754戸が現存している。そのうち、避難者が入居している694戸において1,102人の方が未だに仮設住宅での生活を送っている状況であった。なお、特に研究代表者・研究協力者が建設にかかった丸太組(ログハウス)工法の仮設住宅に一部が避難している、南相馬市・浪江町・大熊町・飯館村を中心に、仮設住宅団地ごとの入居率・空き家数と合わせて撤去・集約化の実態について時系列で詳細に把握した。また、福島県内に建設された仮設住宅のうち、供与期間終了後の再利用の対象とされた、県による買取りで整備した13,408戸(プレハブ協会住宅部会6,589戸・地元公募6,819戸)について、2019年1月末時点での移設再利用の実績を把握した。それと並行して、福島県が定めている再利用システム(譲与・移住促進仮設住宅提供事業・解体入札)について整理すると共に、再利用の現状について福島県庁・被災自治体等に随時ヒアリングを行い、状況を把握した。さらに、移設再利用を実施した施主(譲与契約者)・設計者・施工者へのヒアリングや現地調査を行うと共に、関係者から実態把握に必要な資料を得た。特に、2019年1月末時点で実際に行われた木造仮設住宅の移設の再利用の事例については、先ず、譲与か否かなど実行された制度にはじまり、移設再利用前後の現地調査や関係者へのヒアリングを通して、その実態を把握した。前年度に引き続き、特に丸太組(ログハウス)工法の仮設住宅に一部が避難している複数の自治体、具体的には、南相馬市・浪江町・大熊町・飯館村に焦点を当て、時系列で、仮設住宅の撤去・集約について時系列で整理して傾向を見た。また、福島県が定めている再利用システム(譲与・移住促進仮設住宅提供事業・解体入札)を利用しての移設の再利用については、譲与・移住促進仮設住宅提供事業を中心に2019年1月末時点までの取り組み事例とその実態を把握した。また、特に、丸太組(ログハウス)工法の仮設住宅については、実行した関係者へのヒアリングや現地調査も含め、実態を詳細に把握したことを踏まえ、今後もそれらを中心に調査分析が出来ると考え、上記の様に判断した。2019年度末で基本的には仮設住宅の供与期間が終了すること(大熊町と双葉町に関しては、不確定要素あり)、かつ2018年10月時点で仮設住宅の入居者が1000人強にまで減少していることを踏まえ、昨年度までと同様に、今年度も木造仮設住宅の物理的な移設再利用に焦点を当てた研究を進めることとする。木造仮設住宅の移設再利用の中でも、特に研究代表者・研究協力者が建設にかかった丸太組(ログハウス)工法の仮設住宅が事例としても多いことから、それらを中心に詳細を把握することとする。その比較対象として、板倉構法やパネル工法などの木造仮設住宅の移設再利用についても、それを実行する関係者へのヒアリングを調査も含め可能な限り実態を把握することとする。即ち、2019年末時点までの仮設住宅の撤去・集約の状況と上述した丸太組(ログハウス)工法の仮設住宅を中心とした移設再利用の実態を整理して、仮設住宅の撤去・集約の実態や移設再利用の可能性を明らかにすることとする。東日本大震災並びにその後の原発事故(3.11)の影響によって、福島県内に建設された応急仮設住宅(仮設住宅)16,800戸に関する福島県庁・被災自治体等からのマクロな統計データ収集やヒアリング調査を通して、2017年末2018年初頭における、それらの状況を把握した。2018年1月末時点では、3,074戸が撤去・13,726戸が現存しており、そのうち入居している2,252戸において3,865人の方が仮設住宅での避難生活を送っている状況であった。また、特に、研究代表者・研究協力者が建設にかかった丸太組(ログハウス)工法の仮設住宅に住民の一部が避難している、南相馬市・浪江町・大熊町・飯館村を中心に、仮設住宅団地ごとの入居率・空き家数と合わせて撤去・集約化の実態について時系列で詳細に把握した。例えば、仮設住宅の閉鎖の主な理由は、入居者の自然減だけでなく、立地自治体からの土地返還要請などもあることや、解体が動き出してから終了までに約1年(設計6ヶ月と解体6ヶ月)の時間を要することから、自治体の職員は、解体終了の1年前から入居者への調整を行うのが一般的な流れであること、などである。また、3.11後に福島県内に建設された仮設住宅のうち、福島県による買取りで整備した13,408戸(プレハブ協会住宅部会6,589戸・地元公募6,819戸)が、供与期間終了後の再利用の対象とされたが、その内、2017年末時点で実際に再利用が行われた木造仮設住宅の事例については、先ず、無償譲渡か解体入札後の再利用か否かなど実行された制度にはじまり、再利用前後の現地調査や関係者へのヒアリングを通して、その実態を把握した。福島県内の被災した全自治体・仮設団地への詳細な調査は難しいと判断し、仮設住宅の全数調査としては、仮設団地ごとの配置計画・建設戸数・構造・建設前の敷地用途として、それらを把握した。

その中で、特に、研究代表者・研究協力者が建設にかかった丸太組(ログハウス)工法の仮設住宅に住民の一部が避難している自治体、具体的には、南相馬市・浪江町・大熊町・飯館村に焦点を当て、より詳細な調査研究を実行することとした。それらの自治体に関しては、現在までの所、撤去・集約化や再利用に関する情報が得られ分析も出来ていることから、今後もそれらを中心に調査分析が出来ると考え、上記の様に判断した。東日本大震災並びにその後の原発事故(3.11)の影響によって、福島県内に建設された仮設住宅16,800戸に関して、福島県庁・被災自治体等からのマクロな統計データ収集やヒアリング調査を通し、その状況を把握した。2018年10月末時点において、6,046戸が撤去・10,754戸が現存している。そのうち、避難者が入居している694戸において1,102人の方が未だに仮設住宅での生活を送っている状況であった。なお、特に研究代表者・研究協力者が建設にかかった丸太組(ログハウス)工法の仮設住宅に一部が避難している、南相馬市・浪江町・大熊町・飯館村を中心に、仮設住宅団地ごとの入居率・空き家数と合わせて撤去・集約化の実態について時系列で詳細に把握した。また、福島県内に建設された仮設住宅のうち、供与期間終了後の再利用の対象とされた、県による買取りで整備した13,408戸(プレハブ協会住宅部会6,589戸・地元公募6,819戸)について、2019年1月末時点での移設再利用の実績を把握した。それと並行して、福島県が定めている再利用システム(譲与・移住促進仮設住宅提供事業・解体入札)について整理すると共に、再利用の現状について福島県庁・被災自治体等に随時ヒアリングを行い、状況を把握した。さらに、移設再利用を実施した施主(譲与契約者)・設計者・施工者へのヒアリングや現地調査を行うと共に、関係者から実態把握に必要な資料を得た。特に、2019年1月末時点で実際に行われた木造仮設住宅の移設の再利用の事例については、先ず、譲与か否かなど実行された制度にはじまり、移設再利用前後の現地調査や関係者へのヒアリングを通して、その実態を把握した。前年度に引き続き、特に丸太組(ログハウス)工法の仮設住宅に一部が避難している複数の自治体、具体的には、南相馬市・浪江町・大熊町・飯館村に焦点を当て、時系列で、仮設住宅の撤去・集約について時系列で整理して傾向を見た。また、福島県が定めている再利用システム(譲与・移住促進仮設住宅提供事業・解体入札)を利用しての移設の再利用については、譲与・移住促進仮設住宅提供事業を中心に2019年1月末時点までの取り組み事例とその実態を把握した。また、特に、丸太組(ログハウス)工法の仮設住宅については、実行した関係者へのヒアリングや現地調査も含め、実態を詳細に把握したことを踏まえ、今後もそれらを中心に調査分析が出来ると考え、上記の様に判断した。研究計画立案当初の予想よりも早く、福島県内の仮設住宅の空き家が増加しその撤去が行われており、今後は仮設住宅団地の入居者への住まい選択や暮らしに関してのヒアリング調査を実行できる可能性が低いために、より木造仮設住宅の解体や再利用といった物理的な側面に重点を置いて研究を進めることとする。特に、木造仮設住宅の再利用に関しては、研究代表者・研究協力者が建設に関わった丸太組(ログハウス)工法の仮設住宅が事例としても多いことから、先ずはそれらを中心に詳細を把握することとする。
脂肪組織から分離した間葉系幹細胞と低結晶性炭酸アパタイトを用いた歯再生医療の開発

本研究では,ヒト脂肪組織由来幹細胞と低結晶性炭酸アパタイトを用いた歯再生医療の開発を試みた,脂肪組織由来幹細胞は骨,軟骨,脂肪への分化が可能であり,多分化能を有していた,焼結操作なしに作製した低結晶性炭酸アパタイトは生体内で吸収し,骨髄細胞の骨芽細胞への分化を促進した.われわれが樹立したマウスエナメル芽細胞株は生体内でエナメル器・様組織,骨様組織を形成し,マウス象牙芽細胞株は封GFにより分化が促進され,生体内で石灰化した歯胚様組織を形成した.本研究では,ヒト脂肪組織由来幹細胞と低結晶性炭酸アパタイトを用いた歯再生医療の開発を試みた,脂肪組織由来幹細胞は骨,軟骨,脂肪への分化が可能であり,多分化能を有していた,焼結操作なしに作製した低結晶性炭酸アパタイトは生体内で吸収し,骨髄細胞の骨芽細胞への分化を促進した.われわれが樹立したマウスエナメル芽細胞株は生体内でエナメル器・様組織,骨様組織を形成し,マウス象牙芽細胞株は封GFにより分化が促進され,生体内で石灰化した歯胚様組織を形成した.平成19年度は,脂肪組織由来の間葉系幹細胞を用いた歯の再生医療を目指し,その細胞源となるヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の特性およびその多分化能について,当教室で樹立したヒト骨髄由来の間葉系幹細胞との比較検討を行った.ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の形態および増殖能ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞は,骨髄由来間葉系幹細胞と同様に紡錘形で線維芽細胞様の形態をしていた.細胞の増殖能も骨髄由来間葉系幹細胞とほぼ同程度であった.ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の多分化能の検証a.骨芽細胞への分化能:細胞を骨分化誘導培地で21日間培養すると,石灰化したnoduleが形成され,アリザリンレッドで強く染色された.また,骨芽細胞分化マーカー遺伝子(I型コラーゲン,アルカリフォスファターゼ,オステオポンチン,オステオカルシン)の発現も上昇しており,骨芽細胞への分化が示唆された.骨芽細胞への分化能は骨髄由来間葉系幹細胞と同等であった.b.軟骨細胞への分化能:細胞を軟骨分化誘導培地で10日間培養すると,アルシアンブルーで軟骨基質が強く染色された.また,軟骨細胞分化マーカー遺伝子(II型コラーゲン,X型コラーゲン,アグリカン,シンデカン)の発現も上昇しており,軟骨細胞への分化が示唆された.軟骨細胞への分化能は骨髄由来間葉系幹細胞と同等であった.c.脂肪細胞への分化能:細胞を脂肪分化誘導培地で72時間培養後,脂肪維持培地で24時間培養した.このサイクルを3回繰り返し,最後に脂肪維持培地で7日間培養すると,脂肪滴が形成され,この脂肪滴はオイルレッドO染色で強く染色された.また,脂肪細胞分化マーカー遺伝子(C/EBPα,PPARγ,aP2など)の発現も上昇しており,脂肪細胞への分化が示唆された.脂肪細胞への分化能は骨髄由来間葉系幹細胞と同等であった.以上から,ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の多分化能が示された.平成20年度は,脂肪組織由来の間葉系幹細胞を用いた歯の再生医療を目指し,当教室で樹立したエナメル芽細胞株の生体内の挙動についての検討と歯再生用のスキャッフォールドとしての炭酸アパタイトの有用性の検討を行った.エナメル芽細胞株の生体内の挙動基底膜成分由来のマトリゲル^[○!R]に懸濁したエナメル芽細胞をヌードマウス背部皮下に移植し,6,20,40週後に試料を摘出して組織学評価および軟X線評価を行った.移植4週後から皮下に小さな結節が形成され,そのサイズは6週,20週,40週と増大していった.移植20週では小さな硬固物が触れ,軟X線写真で散在したレントゲン不透過像が観察された.移植40週では大きな固い組織塊が形成され,レントゲン不透過像が増大し,不透過性は亢進した.移植6週後ではエナメル器に類似した組織が形成され,この組織はアメロジェニン陽性,サイトケラチン14陽性であり,歯由来上皮細胞であることが示唆された.移植20週,40週後の標本では,エナメル器に類似した組織は消失し,無機質が観察された.歯再生用Scaffoldとしての炭酸アパタイトの有用性高温での焼結過程なしに結晶性の低い炭酸アパタイト(CAP)を作製し,低結晶性CAPがヒト骨髄細胞の接着,増殖および骨芽細胞への分化に与える影響について検討した.X線回折解析およびフーリエ変換赤外分光光度計分析から,作製したCAPは低結晶性B型CAPであることが明らかとなった.細胞接着はCAPとハイドロキシアパタイト(HAP)の間に有意差はなかった.CAP上での細胞増殖は,7日目まではHAPより遅かったが,10日目では有意差はなかった.骨芽細胞の分化マーカーの発現は,CAPおよびHAP上で培養した細胞は,培養皿と比べて,オステオポンチン,オステオカルシンの発現が510倍上昇していた.以上の結果より,低結晶性CAPはヒト骨髄細胞の骨芽細胞への分化を促進することが明らかとなり,骨再建材料としての有用性が示唆された.
亜鉛イオン依存性チロシンホスファターゼの生体内機能の解明

亜鉛イオン依存性チロシンホスファターゼ(Zn^<2+>-PTPase)は、その触媒活性が完全に亜鉛イオン依存的である点が従来のPTPaseと大きく異なるところである。この酵素には主として肝臓に含まれる分子量約10万の高分子量型と、脳に含まれる分子量約6万の2種類のタイプの存在が確認されている。このうち脳型の酵素は、生理的条件下でマグネシウムイオン依存的にイノシトールモノホスファターゼ(Mg^<2+>-IMPase)活性を示すなど、特異な酵素であることが明らかになってきた。しかし、主として肝臓に含まれる高分子量型酵素の場合と同様、生理機能を初めとして、不明な点が多く残されている。今回、本酵素を含むPTPaseに関連して新たに以下の知見を得た。(1)肝臓中には、高分子量型酵素の他に、低分子量型酵素も少量含まれることを認め、生理条件下においては、後者については脳型酵素と同様に、Mg^<2+>-IMPase活性が認められたが、前者には全く認められなかった。なお、脳型酵素に関する特異抗体は肝の低分子量酵素を認識するものの、高分子量型酵素を全く認識しなかった。以上の結果、低分子量の脳型酵素と高分子量の肝型酵素とは酸性条件下でのZn^<2+>-PTPaseとしての性質は共通性があるものの、生理的な条件下における性質においては両者の間に明らかな違いが認められた。(Biol. Pharm. Bull., 21, 1218-1221(1998)(2)牛脳からMg^<2+>-IMPaseを既報に従って単離精製し、本酵素が酸性条件下で亜鉛イオン依存的にPTPase活性を示すことを確認した。(Gen. Pharmac. 31, 469-475 (1998)(3)アルツハイマー病(AD)脳におけるMg^<2+>-IMPaseのタンパク質レベルならびに酵素活性が対照脳に比べて有意に高いことを認めAD脳においては、イノシトールリン脂質代謝に代償機構が働いて、IMPaseがアップレギュレーションされている可能性を示唆した。(Neurosci. Lett., 245, 159-162 (1998)(4)脳における低分子量型PTPaseは、細胞質のみならず、神経終末画分にも多量含まれていることを初めて確認した。(Biol. Pharm. Bull., 22, 794-798 (1999)亜鉛イオン依存性チロシンホスファターゼ(Zn^<2+>-PTPase)は、その触媒活性が完全に亜鉛イオン依存的である点が従来のPTPaseと大きく異なるところである。(Biol. Pharm. Bull., 22, 794-798 (1999)亜鉛イオン依存性チロシンホスファターゼは、その触媒活性が完全に亜鉛イオン依存的である点が従来のチロシンホスファターゼと大きく異なるところである。このうち脳型の酵素は、生理的条件下でマグネシウムイオン依存的にイノシトールモノホスファターゼ(Mg^<2+>-IMP)活性を示すなど、特異な酵素であることが明らかになってきた。

しかし、主として肝臓に含まれる高分子量型酵素の場合と同様、生理機能を初めてとして、不明な点が多く残されている。今回、脳型および肝臓型チロシンホスファターゼに関して新たに以下の知見を得た。(1)肝臓中の亜鉛イオン依存性チロシンホスファターゼについては高分子量型酵素が主であるが、低分子量型酵素も少量含まれることを認めた。両酵素を電気泳動的に単一に精製し、酵素化学的諸性質を脳型酵素のそれと比較した。高分子量ならびに低分子量酵素とも、酸性条件下においては金属要求性や基質特異性は類似しており、脳型酵素と同様の性質を示した。しかし、生理条件下においては、低分子量型酵素には脳型酵素と同様に、Mg^<2+>-IMP活性が認められたが、高分子量型酵素には全く認められなかった。なお、脳型酵素に対する特異抗体は肝臓中の低分子量酵素を認識するものの、高分子量型酵素を全く認識しなかった。以上の結果、低分子量の脳型酵素と高分子量の肝型酵素とは酸性条件下での亜鉛依存性チロシンホスファターゼとしての性質は共通性があるものの、生理的な条件下における性質においては両者の間に明らかな違いが認められた。(Biol.Pharm.Bull.,21,1218-1221(1998)(2)牛脳からイノシトールモノホスファターゼを既報に従って単離精製し、本酵素が酸性条件下で亜鉛イオン依存的にチロシンホスファターゼ活性を示すことを確認した。(Gen.Pharmac.31,469-475(1998)亜鉛イオン依存性チロシンホスファターゼ(Zn^<2+>-PTPase)は、その触媒活性が完全に亜鉛イオン依存的である点が従来のPTPaseと大きく異なるところである。この酵素には主として肝臓に含まれる分子量約10万の高分子型と、脳に含まれる分子量約6万の2種類のタイプが存在し、脳型の酵素は、生理的条件下でマグネシウムイオン依存的にイノシトールモノホスファターゼ(Mg^<2+>-IMPase)活性を示すなど、特異な酵素であることを明らかにしてきた。昨年度、牛脳から精製したlMPaseが酸性条件下で亜鉛イオン依存的にPTPase活性を示すことを確認し(Gen.Pharmac.31,469-475(1998)、また、肝臓の高分子量型Zn^<2+>-PTPaseはMg^<2+>-lMPase活性を全く示さず、脳型の低分子量Zn^<2+>-PTPaseと肝臓型の高分子量Zn^<2+>-PTPaseとは酸性条件下でのZn^<2+>-PTPaseとしての性質は共通性があるものの、生理的な条件下における性質においては両者の間に明らかに違いのあることを認めた(Biol.Pharm.Bull.,21,1218-1221(1998)。さらに、アルツハイマー病脳におけるlMPaseのタンパク質レベルならびに酵素活性が対照脳に比べて有意に高いことを認めた(Neurosci.Lett.,245,159-162(1998)。今年度、Zn^<2+>-PTPaseの生体内基質の検素ならびに、脳内の低分子量チロシンホスファターゼに関して新たに次の知見を得た。(l)脳における低分子量型PTPaseは、従来、細胞質にのみ存在する酵素であるとされてきたが、今回、細胞質のみならず、神経終末画分にも多量含まれていることを初めて確認した(Biol.Pharm.Bull.,22,794-798(1999)。(2)ウシ脳Mg^
糖鎖構造解析による人工化学物質の生体影響評価法の開発

蛋白質・核酸・糖は生体を構成する基本的な有機分子である。生体の状態(環境)が変化した時、蛋白質と核酸に量的変化は見られることがあるものの質的変化(構造の変化)は決して無い。ところが、糖は量的にも質的にも敏感に変化することが明らかにされつつある。そこで私は人工化学物質による環境汚染に対しても糖鎖構造に変化が現れるのではないかと考えた。本研究は、人工化学物質が糖蛋白質糖鎖構造に及ぼす影響を調べ、糖鎖構造解析による環境リスク初期評価が可能かどうか検討を行うことを目的とした。まず、飼育水を満たしたガラス容器中へ受精直後のヒメダカの卵を移し、26°Cに保った。飼育水は、コントロールの他、10mg/lと100mg/lのビスフェノールAを含むものを用意した。受精後72時間が経過しても成長が確認できない(眼が形成されない)卵は、未受精卵として除去した。発眼期および孵化直前・孵化直後に一定数ずつ取り出し、それぞれを凍結乾燥した。粉砕した後、ヒドラジン分解によってN-配糖体糖鎖を切り出し、還元末端を2-アミノピリジンで蛍光標識した。得られた蛍光標識化糖鎖は、サイズ分画高速液体クロマトグラフィーで分画した後、逆相高速液体クロマトグラフィーで分析した。その結果、発生の過程で溶出パターンに変化が見られたものの、ビスフェノールAを加えたことによる溶出パターンの有意義な変化は見られなかった。実験で用いたビスフェノールAの濃度は海水や河川水で検出されている濃度の10100倍であるが、この程度の濃度では発生段階のヒメダカの糖鎖構造に有意義な変化は見られないことがわかった。糖鎖の構造解析を高感度に行うには、ピリジルアミノ(PA)化のように還元末端を蛍光標識する手法がよく用いられる。以前に、PA-二糖のスミス分解生成物をHPLCで分析することによって、二糖の結合位置を50500pmolで決定することが可能とされていた。今回、私はfmolレベルでの結合位置分析を目指して、より強い蛍光性を有する7-(1,3-ジスルホナフチル)アミノ(DSNA)化した二糖を用いた結合位置分析法の開発に取り組んだ。還元末端がヘキソース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミンであるDSNA-二糖をスミス分解し、逆層HPLCで分析したところ、各々のDSNA-二糖から蛍光性の生成物が一種類ずつ検出された。これらを分取してFAB-MSで分析した結果、DSNA残基はスミス分解の条件下でも安定で、PA-二糖をスミス分解した場合と同様の結合位置に特異的な蛍光性生成物が得られることが確認された。また、これらの蛍光性生成物は逆層HPLCで互いに分離することが可能で、標準物質の溶出位置と比較することによって簡便に構造を明らかにすることができた。この一連の操作を、α-キシロシダーゼ(Bacillus sp.)の糖転移作用によって生成したXyl-Glc-DSNAの結合位置の解析に用い、その有用性を確認した。今回開発した手法は200fmolでの結合位置の決定が可能であり、従来の100分の1以下への微量化に成功した。現在は、各種の人工化学物質の存在下で魚を飼育するとともに、その糖鎖の構造解析を行っているところである。
おなかエンリッチメント‐希少動物の福祉と増殖管理のためのプロバイオ開発

種特異的腸内細菌を用いた新規な採食エンリッチメント法の確立をめざし、ゴリラ特異的乳酸菌の機能解析を行なった。飼育・野生ニシローランドゴリラおよび野生マウンテンゴリラ由来Lactobacillus gorillae株では、野生マウンテンゴリラ由来株が最も多様な炭素源を分解し、かつ病原性細菌に対する抗菌活性も最も高いということが明らかとなった。本研究によって希少種であるゴリラの飼育現場で安全に採食エンリッチメントを行うためのプロバイオティクスとしての、野生マウンテンゴリラ由来L. gorillae株の有用性が示唆された。採食エンリッチメント技術に、野生下の採食物の給与を取り入れる場合、飼育下で消失してしまった野生の腸内細菌をプロバイオとして給与することが対応策として有効であると考えられる。これまでの研究の中で、ゴリラに特徴的であると考えられるLactobacillus gorillaeを野生と飼育下のニシローランドゴリラのそれぞれから分離していたが、ニシローランドゴリラとは別種であるマウンテンゴリラからも分離できるかどうかをウガンダ共和国のブウィンディ国立公園の野生マウンテンゴリラで調査した。野生マウンテンゴリラの新鮮糞便から乳酸菌を分離することに成功し、16S rRNA遺伝子を用いた系統解析の結果、L. gorillaeであることが確認できた。マウンテンゴリラ分離株の生理性状試験を実施したところ野生ニシローランドゴリラ分離株と同様に、アルブチンなど植物のもつ反栄養物質の分解能が飼育下ニシローランドゴリラ由来株と比べて高いこと明らかとなった。野生ゴリラから分離されたこれらの株は、野生の食物に依存したゴリラの採食エンリッチメントを行う際のプロバイオとして有力な候補菌株である可能性が示唆された。また、菌株の表現形質のみにとどまらず、遺伝形質を明らかにするために、既に単離しているニシローランドゴリラから分離したL. gorillaeの全ゲノム解析を実施した。これらのデータを比較解析し、遺伝的にどのような差異があり、プロバイオとしてもっとも有用な菌株を選抜していく必要がある。すでに、一部の分離株についてゲノムの解析を実施することができたため。採食エンリッチメント技術に、野生下の採食物の給与を取り入れる場合、飼育下で消失してしまった野生の腸内細菌を、プロバイオティクスとして給与することが対応策として有効であると考えられる。本研究で、野生と飼育下のニシローランドゴリラ及び、野生マウンテンゴリラから共通して分離される、ゴリラに特徴的な乳酸菌Lactobacillus gorillaeが存在することが明らかとなった。これらのゴリラ由来株について、さらに詳細な生理性状試験を実施したところ、ニシローランドゴリラ由来株とマウンテンゴリラ由来株の持つ酵素活性に違いがあり、野生マウンテンゴリラ由来株が、最も多様な基質に対して酵素活性を有することが確認された。そこでさらに詳細な系統解析を行うために、Multilocus Sequence Typingを行なった結果、飼育及び野生ニシローランドゴリラ由来株と、野生マウンテンゴリラ由来株は、異なったクラスターに分かれることが明らかとなった。この結果により、L. gorillaeは宿主であるゴリラと同様に、亜種レベルで異なる可能性が示唆された。遺伝形質解析に関しては、昨年度行なったニシローランドゴリラ由来株の全ゲノム解析に加え、マウンテンゴリラ由来株の全ゲノム解析を実施した。現在、MG-RASTサーバーを利用して、アノテーション解析を行なっている。それぞれの由来株の遺伝的差異を明らかにし、ゴリラ用プロバイオティクスとして有用な菌株を選抜していく必要がある。当初計画通り、候補菌の表現形質及びゲノム構造の解析を進めており、概ね順調に進展している。また、本研究が評価され、2017年3月15日に朝日新聞社「朝日21関西スクエア賞」を受賞した。本研究で、野生と飼育下のニシローランドゴリラ及び、野生マウンテンゴリラから共通して分離される、ゴリラに特徴的な乳酸菌Lactobacillus gorillaeが存在することが明らかとなり、野生マウンテンゴリラ由来株が、最も多様な基質に対して分解活性を有することが確認された。これら多様な基質を詳細に解析したところ、野生由来L. gorillaeは飼育由来L. gorillae株に比べ、植物に含まれる難消化性の糖質に対する分解能が高いというとこが明らかとなった。また、プロバイオティクス株を選抜する上で重要な、病原菌に対する抗菌活性を測定した。病原性出血性大腸菌に対する抗菌活性を確認したところ、野生由来L. gorillae株のほうが飼育由来L. gorillae株よりも強い抗菌活性を示すことが明らかとなった。また、野生由来L. gorillae株の抗菌活性をさらに詳細に検討した結果、野生マウンテンゴリラ由来株が最も高い抗菌活性を示すことが明らかとなった。これらの結果から、採食エンリッチメントの一環として飼育ゴリラにプロバイオティクスとして給与する上で有用な菌株は、野生マウンテンゴリラ由来L. gorillae株と選抜された。本研究によって希少種であるゴリラの飼育現場で安全に採食エンリッチメントを行うためのプロバイオティクスとしての、野生マウンテンゴリラ由来L. gorillae

株の有用性が示唆された。ひきつづきゴリラの共生腸内細菌の分離をすすめるとともに、系統解析を実施し、同定作業を行う。得られた単離菌について、全ゲノム解析をおこなう。引き続き、表現形質及びゲノム構造の解析を行い、ゴリラ用プロバイオティクスとしての有用性を検定する。特に、病原細菌に対する抗菌性を中心とした検定を実施する。腸内細菌学昨年度、もう一度アフリカ渡航を予定していたが、現地カウンターパートの事情により、本年度に延期になったため。ゲノム解析を外注する予定であったが、研究協力者の協力を得て、無償で実施が可能となったため。今年度の旅費に充当する。初年度に引き続き、アフリカ渡航を予定していたが、前年度も現地カウンターパートの事情により延期になっている。今年度はウガンダではなく、ガボンのカウンターパートと調整をし、渡航する。
Na‐Ca交換電流と細胞内調節因子

最近、カリフォルニア大学のPhilipson等はNa-Ca交換担体蛋白の一次構造を明らかにし、その中にカルモジュリン結合部位に相当する部分があることを報告した。そこで本年度は、細胞内調節因子としてカルモジュリンが心筋のNa-Ca交換に関与しているかどうかを、カルモジュリン抑制薬を用いて調べた。抑制薬として知られるW-7とTrifluoperazineは濃度依存性に交換電流を抑制し,1/2最大抑制値はそれぞれ、13μm,7μmであった。しかしこれらは、カルモジュリンに特異的でないことが知られているので、より特異性の高いcalmidazoliumと、CGS9343Bを試した。細胞外から与えると、2つの薬物は、Na電流を減少させたが、Na-Ca交換電流には変化を与えなかった。電極内液に溶かして細胞内に与えても20分間では電流は変化しなかった。カルモジュリン結合ペプチドとして知られるマストパラン13.5μmを電極内に入れ、細胞内に潅流すると、8分目で電流は、77%に減少したが、その後、17分、28分目で測定した電流に更なる減少はなかった。これらの結果は、カルモジュリンはNa-Ca交換に直接関与していない事を示唆する。W-7とTrifluoperazineの抑制効果は、非特異的なものと思われる。
翻訳のレドックス制御を介する光合成の環境応答の分子メカニズム

活性酸素によるタンパク質合成(翻訳)の阻害機構、および翻訳のレドックス制御と光合成の環境応答との関係を、原核光合成生物ラン藻を用いて研究した。タンパク質合成の阻害が、活性酸素による翻訳因子EF-Gの特定のシステイン残基の酸化と、ジスルフィド結合の形成によることが明らかになった。また、このジスルフィド結合が光合成電子伝達体チオレドキシンによって還元され、EF-Gが活性化することもわかり、翻訳と光合成がレドックス制御によってリンクしていることが示唆された。光合成は酸化ストレスに対してきわめて感受性が高い。これまで研究代表者は、活性酸素が光化学系IIの修復を阻害し、修復に必要なタンパク質の新規合成を翻訳レベルで抑制することを明らかにした。さらに、活性酸素による翻訳阻害は、翻訳因子エロンゲーションファクターG(EF-G)の酸化によることを明らかにした。平成19年度の研究では、EF-Gの酸化的傷害のメカニズムを解明することに焦点を絞った。ラン藻Synechocystis sp。PCCのEF-G(Slr1463)では、活性酸素によって特定のCys残基が酸化されることがわかった。5つのCys残基を順次Serに置換したところ、Cys105とCys242が酸化を受けて、ジスルフィド結合を形成することがわかった。C105S改変体では、過酸化水素によるCys残基の酸化がまったく起こらず、この改変タンパク質を無細胞タンパク質合成系に加えたところ、翻訳活性が過酸化ストレスに対して耐性を示した。したがって、Cys105が活性酸素のターゲットとなり、このCysを改変することによって翻訳装置の酸化ストレス耐性が増大することが示唆された。Cys105をSerに改変したEF-GをSynechocystisで過剰発現させた。その結果、タンパク質合成能の酸化ストレス耐性が増大し、光化学系IIの光阻害が緩和することが観察された。したがって、EF-Gの酸化が翻訳系の酸化ストレス感受性を主要因となり、光合成の光阻害に大きく影響することがわかった。環境ストレスにより生じる活性酸素は、光合成の修復に必要なタンパク質の新規合成を阻害して光合成の機能を低下させる。これまでの研究により、活性酸素の主要なターゲットが翻訳因子エロンゲーションファクターG(EF-G)であることが明らかになっている。本研究では、EF-Gに焦点を絞り、EF-Gの酸化ストレス傷害の機構、酸化還元に関わるシステイン残基の改変、および電子伝達体チオレドキシンとの相互作用の解析を行い、EF-Gのレドックス制御と光合成の環境応答の関係をラン藻を用いて明らかにすることを目的とした。平成20年度の研究によって、EF-Gのレドックス制御に関与する2つのシステイン残基を同定することができた。さらにin vivoにおいて、これらのシステイン残基のレドックス状態がチオレドキシンによって制御されていることがわかった。これらのシステイン残基をセリンに置換したラン藻の変異株では、タンパク質合成が酸化ストレスに対して強くなり、光化学系IIの光阻害が緩和されることが観察された。以上のことから、光合成電子伝達から生じるレドックスシグナルがEF-Gを介して翻訳系に到達し、翻訳装置を活性化するメカニズムが示唆された。また、酸化ストレス状況下では、活性酸素がEF-Gを酸化型にしてその活性を失わせ、翻訳活性が低下することによって光合成の修復が阻害されることが示唆された。