hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光捕集錯体とPOMから成る複合膜(iCHELL)を基盤とする水の完全分解系の構築

小さなカウンターカチオンをもつ、陰イオン種である多核金属オキソ酸クラスター、ポリ酸(POM)の高濃度の水溶液を、サイズの大きな有機化合物、もしくは錯体のカチオンの高濃度水溶液に注入することで、瞬時に液滴界面に不溶性の膜を形成し、内部がPOMの水溶液で満たされた小胞体(iCHELLs)が作成できる。iCHELLsは、膜の構成要素であるPOM自身が優れた酸化還元特性や電子貯蔵能を有することに加えて、有機化合物から金属錯体まで、幅広いカチオンを構成要素として選択できるため、膜そのものに様々な機能を付与することが可能である。また、膜の内外でプロトン勾配を容易に作り出せること、適切な膜の構成分子の選択によって分子の膜透過能を制御可能なことから、生体系で行われているような、高度な化学反応系を実現可能なプラットフォームと成り得る。しかし、実際にiCHELLsの化学反応場としての可能性を追求した報告はこれまでに無かった。そこで、本研究では、iCHELLsの触媒反応のプラットフォームとしての可能性を示すため、光駆動の水素発生反応に着目した。本研究ではiCHELLsを構成するアニオンとして[PW12O40]3-を、カチオンとしてMV2+を用いた光水素発生を検討した。内部に水素発生触媒の白金ナノ粒子とPOMを含み、外部に光増感剤、犠牲還元剤、電子伝達剤(MV2+)を含むiCHELLsを作成し、光照射したところ、水素の発生を確認した。また、注入するPOMの濃度が高くなるにつれて、水素発生量が向上し、顕著な水素発生が始まるまでの時間が長くなるという興味深い結果が得られた。以上、iCHELLsを基盤とした光駆動の異方的な電子移動系及び、光水素発生反応系の構築に成功し、iCHELLsの化学反応場としてのポテンシャルを証明した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
新規pericyte特異的マーカーMyosin 1Bの病理学への応用

次に、ヒト皮膚の血管周囲性腫瘍54例(血管平滑筋腫28例、グロームス腫瘍23例、筋周皮腫3例)における腫瘍細胞のpericyteへの分化を検討した。MYO1BとhCDの免疫染色を行い各々の成分を半定量的に評価した。その結果、血管平滑筋腫は血管平滑筋細胞の特徴を有していること(MYO1B-hCD+)、グロームス腫瘍はpericyteとvSMCsの中間の特徴を有する細胞(MYO1B+hCD+)から主に構成されていること、筋周皮腫の中には形態学的に血管平滑筋腫と鑑別が難しいものが存在するが、免疫組織化学的にも血管平滑筋腫に近い特徴を有するものが存在することを見出した。PericyteすなわちMYO1B+hCD-の細胞のみから構成される腫瘍は54例中には認められなかった。そこで、次の段階として、MYO1B+hCD-の細胞のみから構成される真のpericyte腫瘍が存在するのか検討を行うことにした。また、鼻領域にはperivascular myoid phenotypeを示すsinonasal glomangiopericytomaと呼ばれる腫瘍がある。この腫瘍に関しても、MYO1BとhCDを用いてpericyteへの分化を検討する予定である。MYO1B+hCD-の細胞のみから構成される真のpericyte腫瘍が存在するのか検討を行った。浜松医科大学医学部附属病院の皮下腫瘍および軟部腫瘍の手術材料をreviewし、HE染色の組織像のみでは病理診断が困難で、かつ免疫組織化学的にα-SMA陽性例を拾い上げ、それらに対しMYO1BおよびhCDの免疫染色を行ったところ、MYO1B+hCD-の細胞のみから構成される腫瘍が1例見つかった。MYO1B+hCD-のみから構成されているということは、すなわち真のpericyte腫瘍と解釈されたため、この例に関しては症例報告を行った(Meguro S, et al. Pathol Int. 2019;69:246-248. doi: 10.1111/pin.12777.)。鼻のsinonasal glomangiopericytomaに関しては、稀な腫瘍のため症例を収集している段階である。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。MYO1B+hCD-の細胞のみから構成される真のpericyte腫瘍の検討に関しては、現在1例のみであり、真のpericyte腫瘍の特徴を論じるにはより多数の症例が必要と考えている。また、鼻のsinonasal glomangiopericytomaに関しては、稀な腫瘍のため症例を収集している段階であるが、症例が集まればMYO1BやhCDなどの免疫染色を行い、sinonasal glomangiopericytomaの免疫組織化学的な特徴を明らかにする予定である。これまでの研究(平成26-28年度科研費)から、我々は、新規pericyteマーカーとして同定したmyosin1B(MYO1B)と平滑筋マーカーであるh-CDを組み合わせることで、ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト皮膚組織材料の血管壁細胞はMYO1B+h-CD-であるpericyte、MYO1B-h-CD+である血管平滑筋細胞、MYO1B+h-CD+である両者の中間的な血管壁細胞に分類できることを見出した。次に、ヒト皮膚の血管周囲性腫瘍54例(血管平滑筋腫28例、グロームス腫瘍23例、筋周皮腫3例)における腫瘍細胞の周皮細胞への分化を検討した。MYO1Bとh-CDの免疫染色を行い各々の成分を半定量的に評価した。その結果、血管平滑筋腫は血管平滑筋細胞の特徴を有していること(MYO1B-h-CD+)、グロームス腫瘍はpericyteとvSMCsの中間の特徴を有する細胞(MYO1B+h-CD+)から主に構成されていること、筋周皮腫の中には形態学的に血管平滑筋腫と鑑別が難しいものが存在するが、免疫組織化学的にも血管平滑筋腫に近い特徴を有するものが存在することを見出した。PericyteすなわちMYO1B+h-CD-の細胞のみから構成される腫瘍は54例中には認められなかった。浜松医科大学医学部附属病院の手術材料1例で免疫組織化学的検討を行ったところ、h-CDは全体的に陰性で、かつα-SMA陽性、MYO1B陽性の領域がみられ、この腫瘍がpericyteの特徴を有する可能性が考えられた。MYO1B+h-CD-の細胞のみから構成される真のpericyte腫瘍が存在するのか検討を行うことにした。浜松医科大学医学部附属病院の皮下腫瘍および軟部腫瘍の手術材料をreviewし、HE染色の組織像のみでは病理診断が困難である症例を抽出した。Pericyteを含む血管壁細胞はα-SMAを発現しているため、抽出した症例に対しα-SMAの免疫染色を行い、陽性例を拾い上げた。今後はこれらの症例に対しMYO1Bおよびh-CDの免疫染色を行い、MYO1B+h-CD-の細胞のみから構成される腫瘍が存在するのか検討する予定である。

MYO1BとhCDの免疫染色を行い各々の成分を半定量的に評価した。その結果、血管平滑筋腫は血管平滑筋細胞の特徴を有していること(MYO1B-hCD+)、グロームス腫瘍はpericyteとvSMCsの中間の特徴を有する細胞(MYO1B+hCD+)から主に構成されていること、筋周皮腫の中には形態学的に血管平滑筋腫と鑑別が難しいものが存在するが、免疫組織化学的にも血管平滑筋腫に近い特徴を有するものが存在することを見出した。PericyteすなわちMYO1B+hCD-の細胞のみから構成される腫瘍は54例中には認められなかった。そこで、次の段階として、MYO1B+hCD-の細胞のみから構成される真のpericyte腫瘍が存在するのか検討を行うことにした。また、鼻領域にはperivascular myoid phenotypeを示すsinonasal glomangiopericytomaと呼ばれる腫瘍がある。この腫瘍に関しても、MYO1BとhCDを用いてpericyteへの分化を検討する予定である。MYO1B+hCD-の細胞のみから構成される真のpericyte腫瘍が存在するのか検討を行った。浜松医科大学医学部附属病院の皮下腫瘍および軟部腫瘍の手術材料をreviewし、HE染色の組織像のみでは病理診断が困難で、かつ免疫組織化学的にα-SMA陽性例を拾い上げ、それらに対しMYO1BおよびhCDの免疫染色を行ったところ、MYO1B+hCD-の細胞のみから構成される腫瘍が1例見つかった。MYO1B+hCD-のみから構成されているということは、すなわち真のpericyte腫瘍と解釈されたため、この例に関しては症例報告を行った(Meguro S, et al. Pathol Int. 2019;69:246-248. doi: 10.1111/pin.12777.)。鼻のsinonasal glomangiopericytomaに関しては、稀な腫瘍のため症例を収集している段階である。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。MYO1B+h-CD-の細胞のみから構成される真のpericyte腫瘍の検討に関しては、これまでに抽出した皮下腫瘍および軟部腫瘍の症例に対し、MYO1Bおよびh-CDの免疫染色を行い、MYO1B+h-CD-の細胞のみから構成される腫瘍が存在するのか検討する予定である。鼻のsinonasal glomangiopericytomaに関しては、稀な腫瘍のため症例を収集している段階であるが、症例が集まればMYO1Bやh-CDなどの免疫染色を行い、sinonasal glomangiopericytomaの免疫組織化学的な特徴を明らかにする予定である。MYO1B+hCD-の細胞のみから構成される真のpericyte腫瘍の検討に関しては、現在1例のみであり、真のpericyte腫瘍の特徴を論じるにはより多数の症例が必要と考えている。また、鼻のsinonasal glomangiopericytomaに関しては、稀な腫瘍のため症例を収集している段階であるが、症例が集まればMYO1BやhCDなどの免疫染色を行い、sinonasal glomangiopericytomaの免疫組織化学的な特徴を明らかにする予定である。現在までの進捗状況の関係で当該年度の実支出額が予定を下回ったが、次年度、抗体の購入や論文掲載料などに使用する予定である。
アクアポリン6のアニオン透過メカニズムの解明

アクアポリン(AQP)は細胞膜に存在し,ほとんどのものが水分子を選択的に透過させる水チャネルであるが,中には水分子以外の低分子を選択的に透過させるAQPが存在する.しかし,これら低分子を透過させる哺乳類のAQPについては実験による結晶構造が得られていないため,AQPの低分子透過メカニズムの分子レベルでの解明は行われていない.本研究では,タンパク質立体構造予測法と分子動力学シミュレーション法を用い,アミノ酸変位によってアニオン・水分子透過性が切り替わるAQP6のアニオン・水分子透過メカニズムの分子レベルでの解明を目指している.初年度の研究成果を下記に述べる.(1)立体構造予測法を用いて予測したアクアポリンの立体構造を用いて,アクアポリン/脂質膜/水/イオンの系に対して温度圧力一定条件において長時間(12マイクロ秒)の分子動力学シミュレーションを行った.野生型AQP6とアミノ酸変位型AQP6(N63G)を用い,それぞれ中性・酸性条件下において計4種類の計算を行った.(2)構造予測モデルの妥当性を検証するために,タンパク質の脂質膜内での構造安定性を解析し,シミュレーション時間内では脂質膜内においてAQPの立体構造が安定していることがわかった.さらに,野生型のAQP3とAQP8についてもシミュレーションを行い,AQPの立体構造モデルの妥当性を検証した.(3)AQPの細孔内を水分子が透過することがわかった.さらに,野生型AQP6に関して酸性条件において細孔内にアニオンが入ることを確認した.今年度計画していた研究項目について研究を実施し,概ね順調に進展している.立体構造予測したAQP3, AQP6, AQP8を用いた分子動力学シミュレーションでは,脂質膜内でのAQP立体構造が安定して存在していることに加え,水分子が細孔内を透過しているため,他のAQP結晶構造を用いた分子動力学シミュレーションで観測される現象と同様のものが観測されている.さらに,酸性条件において野生型AQP6の細孔内にアニオンが入ることを確認しており,次年度でのイオン濃度勾配下におけるアニオン透過の分子レベルでの観測に可能性を見出している.今後は,(1)平成30年度に引き続きアクアポリンの水・イオン透過性について解析する.(2)イオン濃度勾配下におけるAQP6のアニオン透過性について解析する.通常,分子シミュレーションでは周期境界条件を使用しているため,上下,左右の境界が繋がっている.計算系においてイオンの濃度勾配を生じさせるために,細胞膜を2枚設置し,イオン濃度が2枚の膜で挟まれた中心部分(溶液A)と外側部分(溶液B)で異なる系について分子動力学シミュレーションを行う.濃度勾配を一定に保つために,イオンが溶液AB間をAQPを透過して移動した場合,移動したイオンを確率的に別の溶液の水分子と入れ替え,イオンの濃度勾配を一定に保つ.(3)分子選択性に寄与しているサイトを明らかにするために,イオンがAQP6の細孔内を通過する際の平均力ポテンシャルを傘サンプル法を用いて計算する.アクアポリン(AQP)は細胞膜に存在し,ほとんどのものが水分子を選択的に透過させる水チャネルであるが,中には水分子以外の低分子を選択的に透過させるAQPが存在する.しかし,これら低分子を透過させる哺乳類のAQPについては実験による結晶構造が得られていないため,AQPの低分子透過メカニズムの分子レベルでの解明は行われていない.本研究では,タンパク質立体構造予測法と分子動力学シミュレーション法を用い,アミノ酸変位によってアニオン・水分子透過性が切り替わるAQP6のアニオン・水分子透過メカニズムの分子レベルでの解明を目指している.初年度の研究成果を下記に述べる.(1)立体構造予測法を用いて予測したアクアポリンの立体構造を用いて,アクアポリン/脂質膜/水/イオンの系に対して温度圧力一定条件において長時間(12マイクロ秒)の分子動力学シミュレーションを行った.野生型AQP6とアミノ酸変位型AQP6(N63G)を用い,それぞれ中性・酸性条件下において計4種類の計算を行った.(2)構造予測モデルの妥当性を検証するために,タンパク質の脂質膜内での構造安定性を解析し,シミュレーション時間内では脂質膜内においてAQPの立体構造が安定していることがわかった.さらに,野生型のAQP3とAQP8についてもシミュレーションを行い,AQPの立体構造モデルの妥当性を検証した.(3)AQPの細孔内を水分子が透過することがわかった.さらに,野生型AQP6に関して酸性条件において細孔内にアニオンが入ることを確認した.今年度計画していた研究項目について研究を実施し,概ね順調に進展している.立体構造予測したAQP3, AQP6, AQP8を用いた分子動力学シミュレーションでは,脂質膜内でのAQP立体構造が安定して存在していることに加え,水分子が細孔内を透過しているため,他のAQP結晶構造を用いた分子動力学シミュレーションで観測される現象と同様のものが観測されている.さらに,酸性条件において野生型AQP6の細孔内にアニオンが入ることを確認しており,次年度でのイオン濃度勾配下におけるアニオン透過の分子レベルでの観測に可能性を見出している.今後は,(1)平成30年度に引き続きアクアポリンの水・イオン透過性について解析する.(2)イオン濃度勾配下におけるAQP6のアニオン透過性について解析する.通常,分子シミュレーションでは周期境界条件を使用しているため,上下,左右の境界が繋がっている.計算系においてイオンの濃度勾配を生じさせるために,細胞膜を2枚設置し,イオン濃度が2枚の膜で挟まれた中心部分(溶液A)と外側部分(溶液B)で異なる系について分子動力学シミュレーションを行う.

濃度勾配を一定に保つために,イオンが溶液AB間をAQPを透過して移動した場合,移動したイオンを確率的に別の溶液の水分子と入れ替え,イオンの濃度勾配を一定に保つ.(3)分子選択性に寄与しているサイトを明らかにするために,イオンがAQP6の細孔内を通過する際の平均力ポテンシャルを傘サンプル法を用いて計算する.
高分解能・高感度型乳腺用 PET による乳癌の診断

乳房専用に開発されたポジトロン放出断層撮像法装置は検出器の形状からC型とO型の2種類あり、乳癌に対する感度は、患者別でそれぞれ81%(92%), 84%(95%)、病変別で78%(89%), 81%(92%)であった(括弧内は撮像範囲外の病変を除いて算出)。比較的大きな病変を対象としたために全身用PET/CTに対する診断精度上の優位性は得られなかったが、描出された画像は病理組織をより的確に反映したものであった。この画像で得られる定量値や予後予測能は今後の課題である。2種類(O型およびC型)の乳腺専用PET装置のうち、スペックとしてより高い性能が期待されるO型装置についてNEMA NU 4-2008に基づき、物理的性能評価を行った。この装置の検出器は1個のサイズが1.45xl.45x4.5mm、4層のDOI(depth of interaction)検出器で、lutetium oxyorthosilicateの結晶体より構成される。FOV(field of view)は体軸方向に155.5mm、体軸に垂直な平面で直径185mmである。ファントム実験の結果、水平方向および体軸方向の空間分解能は1.34-1.72mmが得られ、100-800keVのエネルギーウィンドウにおける感度は11.2%、最高計数率は374kcpsであった。臨床現場における撮像はO型とC型のいずれかあるいは両者で施行した。はじめに至適条件の決定にむけて、女性患者27人の30病変に対し、1分間x10回のリストモードで撮像した。10分後に描出される病変はいずれも1分後より何らかの集積として描出されていることを確認した。また病変周囲のノイズレペルは4-6分以降でほぼ同程度であることから、診断精度は5分撮像の画像を用いることにした。58人の患者68病変(サイズは2-80mm、全身用PET/CTにおける平均SUVmaxは6.4)を解析対象として描出能を検討したところ、O型装置で撮像された66病変のうち、54病変は腫瘍の全体あるいは一部が描出され、4病変は同定されず、8病変は撮像範囲外となった。C型装置で撮像された67病変のうち、56病変は腫瘍の全体あるいは一部が描出され、6病変は同定されず、5病変は撮像範囲外となった。O型およびC型装置の感度は、すべての病変を対象にするとそれぞれ82%,84%、撮像範囲外の病変を除くとそれぞれ93%,90%であり、物理学的特性から推測されるように、病変が撮像範囲内にあればよりきれいに描出できるO型の描出能がC型を上回ったが、特に胸壁に近い小病変などが撮像範囲外となりやすいことが判明した。PET検査が依頼された乳癌患者に対し、全身用PET/CT装置による全身撮像を行った後に、2種類の乳房専用PET装置を用いて片側5分で乳房の撮像を行い、手術結果などの最終診断に基づいて診断精度を検討した。乳房専用PET装置(O型およびC型)、全身用PET/CT装置、乳腺MRI検査をすべて受けた69人(31-77歳、平均54歳)、80病変に絞って解析した。術後の最終診断として悪性76病変の内訳は、浸潤性乳管癌67病変、浸潤性小葉癌5病変、非浸潤性乳管癌4病変であり、境界型と考えられるadenomatous ductal hyperplasiaは1病変、良性3病変(線維腺腫1病変、線維嚢胞変性2病変)であった。乳房専用PET装置O型およびC型、全身用PET/CT、乳腺MRIの感度は、患者別解析でそれぞれ82%(55/67),85%(57/67),96%(64/67),100%(67/67)であり、病変別解析(ただし複数病変の場合は2個までとした)で、それぞれ82%(62/76),83%(63/76),92%(70/76),100%(76/76)、乳房専用PET装置の感度は全身用PET/CTよりもむしろ低かった。ただしこれはPET装置の撮像範囲外に病変が存在した症例を含んでおり、そのような症例を除くと病変別解析の感度はO型、C型それぞれ93%(62/67)、90%(63/70)であった。全身用PET/CTと比較してO型は高い感度を有したが、C型はほぼ同等であった。これは今回対照とした母集団が、乳癌が疑われて精査あるいは治療を目的に外来を受診し、PET/CT検査の依頼があった患者であり、もともと原発巣のサイズが大きく(平均27mm)、通常のPET/CTでも十分描出できる症例が多かったためではないかと推察される。

がん検診として前向きに症例を蓄積した場合には、分解能と感度の高い乳房専用PET装置の優位性が示される可能性がある。また日本人は乳房の小さな人が多く、胸壁に近い場所に存在した小病変は撮像範囲外となることが多かった。高密度乳房で大きな体格を有する欧米人を対象とした場合には、通常のマンモグラフィでわからない小病変の検出に役立つかもしれない。なお、今回対照とした集団では乳房別解析によるO型およびC型の特異度は、98%(48/49),98%(56/57)であり、偽陽性は少なかった。平成24年度まで症例を蓄積し、手術後の病理結果をふくめた最終診断に基づく診断精度を算出した。O型装置では、病理学的に証明された170人198個の悪性病変のうち161病変を描出、14病変は描出できず、23病変は乳房専用PET装置の撮像範囲外であった。患者単位の感度は83%、病変単位の感度は81%であり、撮像範囲外となった病変を除外すると、感度はそれぞれ95%、92%と算出された。非浸潤性乳管癌(DCIS)に対する感度は71%(5/7)であった。C型では、159人185個の悪性病変のうち、145病変を描出、18病変は描出されず、22病変は撮像範囲外であった。この母集団における患者単位の感度は81%、病変単位の感度は78%であり、撮像範囲外となった病変を除外すると、感度はそれぞれ92%、89%と算出された。DCISに対する感度は57%(4/7)であった。乳房単位の特異度はO型が97%、C型が96%で、偽陽性は少なかった。乳房専用PET装置で得られたPET画像から、乳房の輪郭を抽出して吸収係数マップを作成、乳房の吸収係数を水(=0.0958/cm)と仮定してソフトウェア的に吸収補正を行った。吸収補正の有無により2種類の画像が作成され、30病変に対してPET uptake valueを計測したところ、おおむね良好な相関が得られた(R=0.96)。ただしクロスキャリブレーションで用いるファントムと乳房の形状が大きく異なる場合に値が異なる可能性が示唆された。術前化学療法を施行した患者8人の原発巣8病変に対して、全身用PET/CTと乳房専用PET装置を用いて評価した。8病変中5病変で集積の低下が見られたが、1病変はサイズ、集積とも増大、1病変はサイズ不変で集積低下、1病変はサイズ不変で集積増大が見られた。乳房専用PETの結果は全身用と乖離がなく、現時点で優位性は明らかでない。この装置による撮像の依頼が継続しており、解析できる症例数が順調に増加しているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。検査は施行されたが外科的切除がまだで最終診断が確定していない症例は、いずれ最終診断が確定すると考えられ、これらの症例を含めた診断精度を算出する予定である。また定量評価に必須と考えられた吸収補正が乳房専用PET装置における必要性を検討する。さらに、術前化学療法に対する早期治療効果の判定に乳房専用PET装置が有効かどうかを検証することを予定している。
カウンセラ-の法的責任に関する実証的研究

(1)文献を検討しながらカウンセリングならびにカウンセラ-の法的責任を論じる場合の法的論理構成に関する基礎的情報を収集した。(2)これまで収集したカウンセリング機関からの資料を検討・分析した。東京にある248機関を対象にして資料の請求をして110機関から回答を得た。これらの資料はパンフレットのような簡単なものから、カウンセリング機関の長もしくはカウンセラ-の著書が含まれており、その内容も提供されるカウンセリング・サービスの骨格だけというものからカウンセリングを受けるための詳細な手続や条件など詳しい説明を含むものまであった。分析の結果は次のようにまとめることが出来る。*カウンセリング機関が提供する情報には、カウンセリングを受けるための手続に関しては比較的詳細なものが含まれている。*カウンセリングの内容ならびにカウンセラ-に関しては、詳しい情報が提供されているとは言えない。*カウンセリングの結果については明かではなく、利用者の期待に反する可能性がある。*カウンセリングは有償のものが多いが、利用者が提供されるサービスに苦情を申し立てることについては触れられない。*カウンセリング機関は印刷資料の中では、カウンセリングに関して十分な情報を提供しているとは言いにくい。(3)カウンセリング機関の提供する情報と提供されるサービスが利用者が抱いている期待と食い違うと紛争が生じる可能性は高い。今回入手した資料を分析する限りでは、こうした紛争い対してカウンセリング機関は明確な認識ならびに対応を用意しているとは判断出来ないと考えられる。1.カウンセリングに代表される精神医学をもとにした様々な療法を提供している民間の機関が、(ア)どのような内容の援助を提供しているか、(イ)どのような条件を利用者に課しているのか、(ウ)提供された援助をめぐって紛争が生じることを措定しているか、などに関して調査を行った。東京地区にある営利・非営利の相談機関をリスト・アップして、それぞれの機関が出している利用者のための案内やパンフレットなどを収集して、その分析に当たった。調査は、約250の機関に資料の送付を依頼し、約200の機関から資料を集めることが出来た。2.資料の分析によると、(ア)機関の多くは有償で相談を受けていること、(イ)相談は「科学的」とされる西欧の精神医学を基礎とした技法で行われていること、(ウ)援助提供者は自らを「専門家」と考えていること、(エ)相談をめぐる紛争は措定されていないこと、(オ)短期間に閉鎖した機関がいくつか見られること、などが指摘出来る。「いい加減」な機関かどうか不明であるが、インフォームド・コンセントや利用者保護(消費者保護)の観点から言えば、法的に問題点をいくつか残していると思われる。現在、表面化しつつある利用者からの「苦情」へどのように対応するのかの体制は十分整備されていない。3.東京地区にある民間非営利の相談機関において数名のカウンセラ-から、カウンセリングの結果についてカウンセラ-が責任をどの程度実感しているかに関して情報を収集した。4.また、英国・フランスの相談機関の実態に関しての情報も収集した。5.資料の回収に時間を要したので、整理・分析・検討は終了していない。来年度、いっそう詳細な作業を進める予定である。1.文献ならびに現職のカウンセラ-からの聞き取り(英国のそれも含まれる)によって次のような結論に達した。2.カウンセリング機関が提供する援助は、法的観点から見ると曖昧な状況にあると言われる。第一に、カウンセリング行為は医師などによる通常の治療行為とは以下の点で異なっているので、その法的性格が明らかでない。(1)カウンセリングでは、「治癒」が利用者の主観的判断に多く依るため、目的達成が判断しにくい。従って、行為の目的が明確でない法的関係はありうるかと問われる、(2)カウンセリングの行為が、通常「話を聴く」というものであり投薬や手術など積極的に利用者へ働きかける性格をもたないことが多い。第二に、カウンセリングの行為と利用者が主張する「被害」との因果関係の立証は難しい。第三に、カウンセリングの利用者は囚われの状況には通常ない。常に自由意思でカウンセリングにかかわるので、その結果に対しても責任を自ら負うべきである。

3.しかし、カウンセラ-は法的責任をまったく問われないかは疑問である。(1)自ら「専門家」であるとする以上、専門家としての関与とそれによることが濃厚な結果に対して第一に倫理的責任が考えられる、(2)カウンセラ-と利用者との関係は、利用者の状況を「良くする/軽くする」という合意のもとに成立している以上、程度の問題は残るが契約関係にあると考えられる、(3)通常、カウンセラ-は援助によって利用者の状況を良くするとしてカウンセリングを行うのであり、目標はあると見なければならない、(4)利用者の損害が主観的であったとしても、現行法は慰籍料の概念を認めるのであって、主観的であることが責任追及の決定的な阻害要因にはならない。このように考えると、現実にカウンセリングで精神的被害を受けたと主張する利用者に対して法的救済を提供する可能性はあると考えられる。
キチナーゼとその類縁酵素の立体構造に基づく理論pKa値の計算と共通機能構造の推定

本研究では、キチン質加水分解酵素の触媒反応に必須な機能構造を、酵素の立体構造に基づく理論的pKa値の計算および部位特異的変異導入法によって明らかにすることを試みている。本研究の第一段階として、オオムギ種子由来のキチナーゼのX線結晶構造(2BAA)を基にして、すべての解離性アミノ酸残基のpKa値の推定を試みた。その結果、多くの解離性側鎖において、ほぼ正常なpKa値が得られたが、いくつかのアミノ酸残基、とりわけ、Arg114(>20.0)、Arg215(>20.0)、Glu203(-2.6)では、異常なpKa値が算出された。これらの異常なpKa値は、これらのアミノ酸残基の側鎖が他の側鎖と強い相互作用を行っていることを示すものであり、また、これらのアミノ酸残基の側鎖が触媒残基に近接して存在していることから、触媒反応にも関与していることが示唆された。以上の結果に基づき、まずArg215を部位特異的変異によってアラニンに置換させた変異体(R215A)の作製を試みた。部位特異的変異PCR法によって得られた変異遺伝子をEscherichia coli BL21(DE)pLysSに導入し、変異キチナーゼ遺伝子を発現させた。R215Aの酵素活性は完全になくなっており、Arg215が酵素活性発現に必須であることがわかった。R215AのCDスペクトルおよび蛍光スペクトルを野生型のものと比較すると、それぞれの強度は大きく減少しており、この変異によって大きな構造変化がおこっているものと思われた。熱変性実験を行い熱安定性を調べてみると、熱変性の転移温度は野生型に比べ、ほぼ6°Cほど低下していた。次にGlu203をアラニンに置換させた変異体を作製し、上と同様の解析を行った。この変異によって、酵素活性は完全になくなり、R215Aの場合と同様の構造変化がみられた。さらに熱変性の転移温度もほぼ6°C低下した。以上より、Arg215は触媒残基の近傍において、Glu203と相互作用を行うことによって、触媒残基のミクロ環境を適正なものに保っているものと思われた。計算はJuufferらの方法によった。すなわち、境界要素法を用いた連続体近似によって溶媒効果を取り入れた静電ポテンシャルを計算し、得られた静電ポテンシャルの変化よりpKa値のシフト量を算出した。その後、解離性側鎖間の相互作用をモンテカルロ法によって推定し、最終的なpKa値を算出した。以上の結果に基づき、Arg114,Arg215,Glu203それぞれの残基の部位特異的変異導入を試みた。まず、部位特異的変異PCR法によって、Arg215がAlaに置換されたオオムギキチナーゼ遺伝子を得た。得られた変異遺伝子をEscherichia coli BL21(DE)pLysSに導入し、変異キチナーゼ遺伝子を発現させた。その結果、野生型および変異キチナーゼはともに封入体として発現されていることがわかった。その後、封入体として得られた野生型および変異キチナーゼを、巻き戻すことによってこれら二つのタンパク質を得ることができた。現在、それらのキチナーゼの活性や熱安定性を調べている段階である。

R215Aは封入体として発現されたので、この封入体を巻き戻すことによって、R215Aをタンパク質標品として得た。R215Aの酵素活性は完全になくなっており、Arg215が酵素活性発現に必須であることがわかった。R215AのCDスペクトルおよび蛍光スペクトルを野生型のものと比較すると、それぞれの強度は大きく減少しており、この変異によって大きな構造変化がおこっているものと思われた。以上より、Arg215は触媒残基の近傍において、他のアミノ酸残基と相互作用を行うことによって、触媒残基のミクロ環境を適正なものに保っているものと思われた。本研究では、キチン質加水分解酵素の触媒反応に必須な機能構造を、酵素の立体構造に基づく理論的pKa値の計算および部位特異的変異導入法によって明らかにすることを試みている。本研究の第一段階として、オオムギ種子由来のキチナーゼのX線結晶構造(2BAA)を基にして、すべての解離性アミノ酸残基のpKa値の推定を試みた。その結果、多くの解離性側鎖において、ほぼ正常なpKa値が得られたが、いくつかのアミノ酸残基、とりわけ、Arg114(>20.0)、Arg215(>20.0)、Glu203(-2.6)では、異常なpKa値が算出された。これらの異常なpKa値は、これらのアミノ酸残基の側鎖が他の側鎖と強い相互作用を行っていることを示すものであり、また、これらのアミノ酸残基の側鎖が触媒残基に近接して存在していることから、触媒反応にも関与していることが示唆された。以上の結果に基づき、まずArg215を部位特異的変異によってアラニンに置換させた変異体(R215A)の作製を試みた。部位特異的変異PCR法によって得られた変異遺伝子をEscherichia coli BL21(DE)pLysSに導入し、変異キチナーゼ遺伝子を発現させた。熱変性実験を行い熱安定性を調べてみると、熱変性の転移温度は野生型に比べ、ほぼ6°Cほど低下していた。次にGlu203をアラニンに置換させた変異体を作製し、上と同様の解析を行った。この変異によって、酵素活性は完全になくなり、R215Aの場合と同様の構造変化がみられた。さらに熱変性の転移温度もほぼ6°C低下した。以上より、Arg215は触媒残基の近傍において、Glu203と相互作用を行うことによって、触媒残基のミクロ環境を適正なものに保っているものと思われた。
腸管の粘膜表層に常在する細菌群のゲノム解析

本研究の最終的な目的は、難培養細菌が多数を占める腸内常在菌叢における腸管部位による構成菌種の違いや特徴の解明である。これは糞便のメタゲノム解析では解明困難であり、ヒトでの解析は倫理的・技術的にも難しい。そこで、マウスを材料として、宿主との相互作用という点では最も重要と考えられる粘膜表層、特に離乳期回腸粘膜表層に焦点を絞り、その最優勢菌種であると予想される難培養性細菌Segmented filamentous bacterium(SFB)の全ゲノム解読に取り組んだ。(1)無菌マウスを用いたSFBの分離:まず、離乳期マウスからマイクロマニピュレーターを用いてSFBを回収し、rolling circle amplification法で増幅を行った後、ショットガンライブラリーを作成した。しかし、本法ではプラスミド配列が優先的に増幅され、全ゲノム解析への応用が難しいことが判明した。そこで、SFBが芽胞形成細菌でクロロホルムに耐性であることを利用し、離乳期マウスから採取した空・回腸部をクロロホルム処理した後、無菌マウスに投与し、その空・回腸部を回収してDNAを抽出した。16S rRNA配列解析の結果、本法によってSFBが分離できることが確認されたため、抽出したDNAを用いてライブラリーを作成した。(2)SFBのゲノム解析:5万リードのショットガンシーケンスを行った。SFB以外にXanthomonas由来と思われる配列が約半分を占めたが、SFB由来のATリッチな配列のみを用いてPCRによるギャップクローズを進め、約50のスーパーコンティグとなった。そこで、無菌マウスを用いてSFBを再度分離して、フィニッシングのためのBACライブラリーを作成した。今後、BACクローンの両端配列を決定し、この情報を基にフィニッシングを行う予定である。難培養細菌はクローン化できないため、今回の解析は一種のメタゲノム解析である。得られた配列の解析では、複数のクローンが混在していることが明らかになっており、本研究は難培養細菌のゲノム解析のための新しい方法論の開発につながると期待される。本研究の最終的な目的は、難培養性細菌が相当数を占める腸内常在細菌叢における腸管部位による細菌叢構成菌種の違いや特徴を明らかにすることである。このような特性を糞便のメタゲノム解析から明らかにすることは難しく、ヒトの場合には、倫理的・技術的な観点から、ほとんど不可能である。そこで、最も一般的な動物モデルであるマウスを材料として、宿主との相互作用という点では最も重要と考えられる粘膜表層、特に離乳期回腸粘膜表層の細菌叢にターゲットを絞り、その最優勢菌種であると予想される難培養性細菌Segmented filamentous bacterium(SFB)の全ゲノム解読に取り組んだ。(1)マイクロマニピュレーターを用いたSFBの分離:離乳期の仔マウスから空腸・回腸部を採取し、マイクロマニピュレーターを用いて、約10,000個のSFBを回収してDNAを抽出した後、rolling circleamplification法で増幅を行い、ショットガンライブラリーを作成した。試験的なシークエンシングを行ったところ、プラスミド由来の配列が多数を占め、本法では全ゲノム解析に利用できるライブラリーの作成は難しいことが判明した。(2)無菌マウスを用いたSFBの分離:SFBが芽胞形成細菌であり、クロロホルムに耐性であることが示唆されているため、離乳期の仔マウスから採取した空腸・回腸部をクロロホルム処理した後、無菌マウスに投与し、その空腸・回腸部を回収した。

DNAを抽出し、16SrRNA配列を解析した結果、SFBのみが検出されたことから、本法によって、難培養性細菌であるSFBが分離できることが確認された。(3)SFBのゲノム解析:抽出したDNAを用いてShort insert libraryを作成し、ランダムショットガンシークエンシングを行った。約20,000クローン分の画末端配列を決定したところ、SFB以外にXanthomonas由来配列が存在することが明らかとなった。しかし、GC含量から両者を区別できることが判明したため、SFB由来のATリッチな配列のみを用いてsuper-contigを作成し、現在フィニッシングが進行中である。(4)ヒト由来SFB株の分離:無菌マウスを用いたSFBの分離法を用いて、乳児糞便由来のSFBの分離を行った。最初の試みは失敗に終わったが、サンプルの選択および調整法についての検討を進めており、工夫次第では、成功する可能性が高いと考えている。本研究の最終的な目的は、難培養細菌が多数を占める腸内常在菌叢における腸管部位による構成菌種の違いや特徴の解明である。これは糞便のメタゲノム解析では解明困難であり、ヒトでの解析は倫理的・技術的にも難しい。そこで、マウスを材料として、宿主との相互作用という点では最も重要と考えられる粘膜表層、特に離乳期回腸粘膜表層に焦点を絞り、その最優勢菌種であると予想される難培養性細菌Segmented filamentous bacterium(SFB)の全ゲノム解読に取り組んだ。(1)無菌マウスを用いたSFBの分離:まず、離乳期マウスからマイクロマニピュレーターを用いてSFBを回収し、rolling circle amplification法で増幅を行った後、ショットガンライブラリーを作成した。しかし、本法ではプラスミド配列が優先的に増幅され、全ゲノム解析への応用が難しいことが判明した。そこで、SFBが芽胞形成細菌でクロロホルムに耐性であることを利用し、離乳期マウスから採取した空・回腸部をクロロホルム処理した後、無菌マウスに投与し、その空・回腸部を回収してDNAを抽出した。16SrRNA配列解析の結果、本法によってSFBが分離できることが確認されたため、抽出したDNAを用いてライブラリーを作成した。(2)SFBのゲノム解析:5万リードのショットガンシーケンスを行った。SFB以外にXanthomonas由来と思われる配列が約半分を占めたが、SFB由来のATリッチな配列のみを用いてPCRによるギャップクローズを進め、約50のスーパーコンティグとなった。そこで、無菌マウスを用いてSFBを再度分離して、フィニッシングのためのBACライブラリーを作成した。今後、BACクローンの両端配列を決定し、この情報を基にフィニッシングを行う予定である。難培養細菌はクローン化できないため、今回の解析は一種のメタゲノム解析である。得られた配列の解析では、複数のクローンが混在していることが明らかになっており、本研究は難培養細菌のゲノム解析のための新しい方法論の開発につながると期待される。
LET増加に伴うRBEの上昇はDNA二重鎖切断のエラー修復で説明できるか

LET(linear energy transfer:線エネルギー付与)と生物的効果比(RBE:relative biological effectiveness)の関係は、低LETのγやX線を基準にした場合1keV/μmからRBEはしだいに大きくなり、LET200keV/μm付近で極大となり、その後減少することが知られている。これは、LETが低いとγ線ではDNA二重鎖切断(DSB)を作る効率が悪いが、LET増加と共にDSBを作る効率が良くなり、200keV/μmが最適であり、それ以上では無駄玉となるという解釈であるが、DSB修復系が明らかになり、1個のDSBが致死になることが明らかになった現在、この解釈は正しいのであろうか。そこで4種のニワトリBリンパ細胞株{親株(DT40)、DNA二重鎖切断修復の相同組換(HR)修復系に関与するRad54遺伝子をノックアウトした細胞株(RAD54^<-/->)、非相同的末端連結(NHEJ)修復系のKu70遺伝子をノックアウトした細胞株(KU70^<-/->)と、この両遺伝子をダブルノックアウトした細胞株(KU70^<-/->/RAD54^<-/->)}を用いて、LETとRBEの関係を検討した。線源は150kVp X-線発生装置を基準線源として用い、高LET線源として原子炉からでてくる熱中性子と、熱中性子とボロンを組み合わせての^<10>B(n,α)^7Li反応により生成されるα線を用いた。細胞死は、コロニー形成法を用いて生存率曲線を描き、10%生存率からRBEを計算した。結果は、親のDT40細胞はX線と熱中性子及びα線の3曲線は異なり、X線の基準にしてRBEは熱中性子は1.8、α線は3.9であったが、ダブルノックアウトした細胞株(KU70^<-/->/RAD54^<-/->)では、X線と熱中性子とα線の3つの生存率曲線が一致し、RBEは1であった。低LET放射線でもDSBが出来るが、LETが高くなるにつれて、微小空間に2つ以上のDSBが出来る確率が増え、この2つ以上のDSBがエラー修復修復を誘導するという可能性が考えられ、修復がなければ、RBEの増加はないと解釈された。これまでの仮説と異なり、更なる検討が必要である。
retプロトオンコジーンの腸管神経系形成における役割

retプロトオンコジーンは細胞外ドメインにカドヘリン様構造を有するユニークな受容体型チロジンキナーゼをコードし、神経堤細胞の増殖・分化、特に腸管神経叢の形成に重要な役割を果たしていることが推定されている。われわれはまずRet蛋白のC末端に対するペプチド抗体を作製し、ラット胎生期におけるRet蛋白の発現を蛍光抗体法にて経時的に検索した。その結果、Ret蛋白陽性の細胞は胎生11.5日頃より腸管周囲、大動脈周囲に検出されるようになり、その後それぞれ腸管神経系、交感神経幹を形成することが判明した。腸管神経系では胎生14.5日までにほぼ全腸管周囲にRet陽性細胞が出現し、胎生16.5日頃になると筋層間神経叢を形成するようになった。これらの結果より、Ret蛋白は末梢神経系の分化に重要な役割を果たしていることが推定された。つぎに腸管神経細胞の分化異常によって生じるHirschsprung病の患者にて検出されたret遺伝子の変異をそれぞれret cDNAに導入後、マウス線維芽細胞NIH3T3に発現させ、Ret蛋白の生化学的解析を行った。われわれはすでにRet蛋白が細胞表面に存在する170kDaの成熟型の糖蛋白と小胞体に存在する150kDaの未成熟型の糖蛋白として発現することを証明している。今回、Hirschsprung病型変異を導入すると150kDaのRet蛋白の発現は変化しないものの、170kDaのRet蛋白の発現が著しく低下することが判明した。この結果は、Hirschsprung病型変異がRet蛋白の小胞体から細胞表面への輸送を障害したことを示唆した。即ち、Hirschpsrung病ではRet蛋白が細胞表面へ移行できなくなることにより、リガンドとの結合が起きず、腸管神経細胞が正常に分化できなくなるものと推定された。本年度はRet蛋白C末端に対するペプチド抗体を作製し、ラット胎生期におけるRet蛋白の発現を経時的に探索した。胎生10.5日から18.5日までの胎児の凍結切片を蛍光抗体法で染色し、発現細胞を同定した。また胎生12-14日にかけて顔面、舌咽、迷走神経の末梢の神経核に陽性を示すようになる。胎生16.5日になると三叉神経の末梢核の神経細胞も陽性になった。これらの結果より、Ret蛋白は末梢神経系の分化に重要な役割を果たしていることが推定される。神経系以外ではやはり胎生11.5日頃より泌尿器系の中腎管に陽性細胞が認められるようになり、13.5日になると中腎管が後腎組織に陥入して生じる尿管芽、さらに発生が進むと腎臓内の集合管に陽性所見を示すようになる。以上のようなRet蛋白の胎生期における発現様式は、ret遺伝子のノックアウトマウスにおいて腸管神経細胞と腎臓の欠損が生じるという事実とよく一致している。またHirschsprung病類似の病態をしめすラットにおけるRet蛋白の発現を検索した結果、正常部から病変部へ移行する腸管に残存している神経細胞に強い発現が認められた。これは移行部の神経細胞が病変部における神経細胞の欠損を代償しようとする働きを反映しているかもしれない。Ret蛋白のリガンドを検索する研究については、現在のところリガンドを発現する培養細胞を同定できておらず、さらにスクリーニングする培養細胞株の数を増やす予定でいる。

同時にスクリーニングの方法等、技術面の改善も検討している。retプロトオンコジーンは細胞外ドメインにカドヘリン様構造を有するユニークな受容体型チロシンキナーゼをコードし、腸管の神経節細胞の分化異常によって生じるHirschsprung病において、そのgerm-line mutationが存在することが明らかになっている。本年度の研究においてはHirschsprung病に検出された変異をret cDNAに導入し、培養細胞に発現させることにより、変異型Ret蛋白によるHirschsprung病の発症機構の解析を行った。まずHirschsprung病の患者にてret遺伝子の細胞外ドメインに検出された5種の変異をそれぞれ導入後、マウス線維芽細胞NIH3T3にトランスフェクトし、変異型Ret蛋白の発現を調べた。われわれはすでにRet蛋白が細胞表面に存在する170kDaの成熟型の糖蛋白と小胞体に存在する150kDaの未成熟型の糖蛋白として発現することを証明している。今回、Hirschsprung病型変異を導入すると150kDaのRet蛋白の発現は変化しないものの、170kDaのRet蛋白の発現が著しく低下することが判明した。この結果は、Hirschsprung病型変異がRet蛋白の小胞体から細胞表面への輸送を障害したことを示唆した。Hirschsprung病は障害をうける腸管の長さの違いによりlong segmentタイプとshort segmentタイプに分類される。long segmentタイプを生じる変異とshort segmentタイプを生じる変異を比較すると、前者で170kDaの蛋白の発現がより強く抑制された。よってHirschpsrung病ではRet蛋白が細胞表面へ移行できなくなることにより、リガンドとの結合が起きず、腸管神経細胞が正常に分化できなくなるものと推定された。
DNA認識能を有する蛋白質超分子機能の金属イオンによる制御機構に関する研究

本研究では、大腸菌中に含まれる転写調節因子SoxR蛋白質の活性点を構成している金属サイトの構造と機能を明らかにするため、以下に述べるような研究を行った。まず、組換え型SoxR蛋白質発現系の構築を行った。発現ベクターには、tacプロモーターを有する原核細胞発現用ベクターであるpKK223-3を用いた。pKK223-3に組み込むsoxR遺伝子は、大腸菌JM109株のクロモソームDNAを鋳型とするPCR法により合成した。組換え型SoxR蛋白質発現用の宿主には、大腸菌JM109株を用いた。組換え型SoxR蛋白質発現は、以下のようにして行った。発現ベクターを有する大腸菌JM109株を、30度で培養し、培養液の600nmにおける吸光度が0.4に達した時点で、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加する。IPTG添加後、培養温度を20度とし、一晩培養を続ける。組換え型SoxR蛋白質の精製は、以下のようにして行った。培養終了後の菌体を集め、リン酸緩衝溶液に懸濁する。超音波処理により菌体を破壊し、遠心分離により可溶性画分を得る。これを、陽イオン交換カラムであるCM-Sepharoseに添加し、吸着蛋白質を溶出させる。組換え型SoxR蛋白質は、赤茶色の画分として溶出してくる。このようにして得られた組換え型SoxR蛋白質は、ほぼ均一な状態であることを、SDS-PAGEにより確認した。精製した組換え型SoxR蛋白質の吸収スペクトルを測定したところ、2核の鉄硫黄クラスターに特徴的な吸収ピークが観測された。このことから、SoxR蛋白質には、植物型フェレドキシンと類似した、2核の鉄硫黄クラスターが含まれていることが分かった。
開口分泌促進および阻害活性を持つマストパラン関連ペプチドの開発

本研究では主にクロム親和性細胞からカテコールアミン(CA)分泌活性を指標として新規に分子デザインしたマストパラン(MP)関連ペプチドのうち開口分泌を促進あるいは阻害する活性を持つペプチドを開発することを目指した。先ず、MPのN末端側およびC末端側の47残基から成るフラグメントおよびアナログ7種を固相合成し、ウシ副腎髄質クロム親和細胞からのCA分泌活性に及ぼす影響をMP及びアゴニストの共存、非共存で検討し、併せてMPの持つGTPase活性促進効果を検討した。クロム親和細胞からのCA分泌活性測定法としては、測定感度上からバッチ法を採用した。このうち4残基のN末端フラグメントINLK-NH2 (N-4)とC末端フラグメントKKIL-NH2 (C-4)について興味深い結果が得られた。すなわち、(1)フラグメントはいずれもそれ自身ではCA分泌活性、GTPase活性作用、リシス作用を持たない。(2)両フラグメントは共にニコチン性アセチルコリン・レセプター(nAChR)に選択的に作用し強い阻害活性(IC_<50>はμMオーダー)を示す。(3)MPのGTPase活性促進効果はC-4のみにより特異的に阻害される事が示された。次に、N-4アナログ13種を新規に合成した。このうち最も強い分泌阻害活性を持つペプチドのIC_<50>は130μMであった。また、ペプチドの構造と阻害活性との相関および阻害様式の検討結果から、N-4の結合部位はAChとは異なる部位であり、疎水性および酸性アミノ酸を多く含む領域である可能性が示唆された。本研究により、当初予想されたように強い開口分泌阻害活性を持つ新規ペプチドが開発されたが、今後クロム親和細胞などから対象となる細胞群を広げ、種々の疾患への治療薬あるいは医薬品としての実用化の可能性を検討したい。本研究では、マストパラン(MP、14アミノ酸残基)のN末端側およびC末端側の47残基から成るMP断片フラグメントおよびアナログ7種を固相合成し、ウシ副腎髄質クロム親和細胞からのカテコールアミン(CA)分泌活性に及ぼす影響をMPおよびアゴニストの共存、非共存下で検討し、併せてMPのもつGTPase活性促進効果に及ぼす影響をも検討した。これらのうち、N末端フラグメントINLK-NH_2(I)とC末端フラグメントKKIL-NH_2(II)について詳細に追跡し、興味深い結果が得られた。クロム親和細胞からのCA分泌活性はバッチ法(bath-application system)により測定した。【結果】(1)フラグメント(I)、(II)はいずれもCA分泌活性およびリシス活性を持たない。(3)アセチルコリン(ACh)によるCA分泌をより強く抑制した(IC_<50>=300400μM)。(4)高濃度K^+刺激によるCA分泌は抑制しない。(5)カルバミルコリンおよびニコチンによるCA分泌も同様に両者ともμMオーダーで抑制した。(6)ヒスタミンおよびアンギオテンシンIIによるCA分泌(Gタンパク質共役型レセプター)に対しては両者とも明確な抑制は見られなかった。(7)DOC可溶化Gタンパク質(GTPase活性)に対しては(II)のみが活性化を阻害した。以上の結果から、両フラグメントは異なる二つの作用点を持つこと、両フラグメントはnAChレセプターの機能をμMオーダーで抑制し、CA分泌を阻害すること、MPのGTPase活性促進効果はC末端フラグメントによって特異的に抑制されることが推定される。