hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
結晶場を活用した新しいタイプの重合反応の開拓

3)1,4-ビス(ヒドロキシフェニルメチル)ベンゼン、4,4'-ビス(ヒドロキシフェニルメチル)ジフェニルエーテルと2,5-ビス[ヒドロキシ(4-メトキシフェニル)メチル〕チオフェンのメソ体、ラセミ体をそれぞれ単離し、無溶媒下における重合挙動を調べたところ、2)と同様にメソ体とラセミ体では重合挙動に大きな差が見られることが判った。さらにこれらの重合では、重合途中で生成したポリマーの分解が同時に起こっており、分解物の同定と分解のメカニズムを明らかにした。また、1)3)で得られた結果を総合的に見ると、融点の低いモノマー程、低い温度で重合することを明らかとなった。これは、結晶中の分子の運動性に起因していると考えられる。4)各種アミノ酸類をりん醸触媒下、無溶媒下で加熱することにより、ポリペプチドの合成を試みた。その結果、予想に反し、検討したほぼすべてのアミノ醸で環化反応が起こって2,5-ジケトピペラジン類を生成し、不斉中心の立体も保持されていないことが明らかとなった。1 1,4-ベンゼンジメタノール、2,6-ナフタレンジメタノール、あるいは、4,4-ビフェニルジメタノールの結晶に(1S)-10-カンファースルホン酸の粉末を触媒量(5mol%)加え、めのう乳鉢ですり合せた後に無溶媒下で加熱しすると、融点以下の温度(60.C-95°C)で粉末状態を保ったまま脱水重縮合が進行し、対応するポリエーテルが得られることを見出した。2天然の各種単糖(グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース)についても、1)と同様に、触媒量(5mol%)のりん酸を加え融点以下の温度(80.C-120°C)で加熱すると、粉末状態を保ったまま脱水重縮合が進行し、多分岐糖鎖高分子(分子量数千)が得られることを見出した。興味深いことに、各単糖のα体とβ体は、固体状態では異なる反応性(溶融状態では反応性は同じ)を示し、生成する糖鎖高分子の構造も異なっていた。3各種シランジオール、シロキサンジオールに酸触媒や塩基触媒を無溶媒で作用させると、環状オリゴシロキサンや鎖状のポリシロキサンが得られることを見出した。ジフェニルシランジオールの結晶に5mol%の炭酸カリウムを加え110°Cで24時間加熱すると、対応する環状4量体が選択的に生成した。一方、ケイ素上にメチル、シクロヘキシル、および、イソプロピルの各基を有するフェニルシランジオールからは、環状および鎖状のオリゴシロキサンが生成した。ところが、興味深いことに、これらのモノマーとジフェニルシランジオールを固体状態で混合し共重合させると、分子量数万のポリシロキサンが得られることが判った。また、1,1-ジメチル-3,3-ジフェニルジシロキサンジオールに5mol%の炭酸カリウムを加え65°Cで24時間加熱すると最大で重量平均分子量50万程度の高分子量ポリシロキサンが生成した。1)1,5-ビス(ヒドロギシアリールメチル)ナフタレン(アリール=フェニル(1)、4-メチルフェニル(2)、4-プロピルフェニル(3))の結晶に、ガンファースルホン酸(5mol%)を加えめのう乳鉢で擦り混ぜた後、窒素気流下で80170°Cの加熱すると、粉末状態を保ったまま脱水重縮合し、対応するポリエーテル(最大で重量平均分子量=15000)を生成した。また、モノマー2、3は、フェニル基上のアルキル置換基の電子供与性によって酸触媒なしでも、155185°Cで重合し、M_W=10000程度のポリマーを生成した。この場合、光学顕微鏡による重合過程の観察によって、モノマー結晶の粒子が溶融せずに重合が進行していることが分かった。2)2,6-ビス(ヒドロキシメチル)フェノール誘導体の固相重合では、フェノール残基の作用によって、酸性条件下だけでなく、塩基性条件下でも加熱によつて反応が進行した。
ナノメディシン分子科学

ナノメディシン分子科学では研究期間内に度々、国際シンポジウムを開催し、この領域の研究者と議論をしてきた。これを基盤として、「ナノメディシン国際シンポジウム」の開催・共催を実施し、グローバル化の観点から研究成果の社会還元を実施することは、我が国がこの研究分野、また将来的な産業分野にてイニシアティブをとるためにも重要であると考える。すでに、平成28年5月にモントリオールで開催された世界バイオマテリアル会議でシンポジウムを共催した。この会議は世界中から約4,000人の研究者が集まるために、この場におけるシンポジウムは、研究成果の公開にはまたとない機会となった。これに合わせて、国際雑誌Science and Technology of Advanced materialsに特集号"Nanomedicine MolecularScience in Japan"を出版した。この際に、論文へのアクセスの便宜を図るために、オープンアクセス論文として、情報の公開に便宜を図った。また、ナノメディシン分子科学の将来への展開、発展を担う若手研究者、学生を育成するために、教科書「ナノメディシンの分子科学」を出版することで、研究成果を一冊にまとめ市販することは、研究成果の社会還元と継承の点からも極めて重要である。すでに、原稿を収集し、現在編集段階に至っている。この教科書を利用して学部特別講義を行うこと、大学学部生、さらには大学院の学生に関心を持ってもらえるようにするとともに、研究所、企業の若手研究者がこの学術領域を理解することにつなげる。将来、これらの基礎知識を利用して次世代の新産業創成を期待している。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ベンゾジアゼピン系薬物の眠気および精神運動機能に対する影響

健常成年男子8名を被験者とし、目的・方法・試験薬剤の特徴、起こりうる副作用について説明を行い、書面による参加の同意を得た。ジアゼパム10mg,ロラゼパム2mg、およびプラセボをそれぞれ2名ずつ1回服用してもらい、radiorecepter assay法により、血中濃度の測定を行いジアゼパムでは50分70分後に最高血中濃度に達し、ロラゼパムでは、2時間2時間30分後に最高血中濃度に達した。また血中濃度は漸減し、ジアゼパムでは、23時間後にほぼ半減し、ロラゼパムでは、12時間後に半減し、いずれも32時間後には、ほぼ消失した。長期記憶では、服用後の記憶がロラゼパムで有意により強く障害され、また短期記憶では、memory scanning taskによりジアゼパムは反応選択段階に作用し、またロラゼパムは記憶走査段階に作用するという結果が得られた。その他、注意機能の障害は血中濃度と相関し、眠気については、必ずしも血中濃度と相関せず、血中濃度が低下し体外に排出されたと考えられる時間でも、眠気は残存するという結果が確認された。以上のことにより、記憶の障害は、記憶の獲得と固定の過程で起こり、力価が強く半減期の短い薬剤がより障害が大きく、短期記憶障害に関しては結果の異なる報告もなされているので、今後数種のベンゾジアゼピン系薬剤を用量を変えて研究のデザインを組む必要がある。今年度は、健常成年男子6名を被験者とし、試験の目的・方法・試験薬剤の特徴、起こりうる副作用について説明を行い、書面による参加の同意を得た。ジアゼパム10mg,ロラゼパム2mg、およびプラセボをそれぞれ2名ずつ1回服用してもらい、radiorecepter assay法により、血中濃度の測定を行いジアゼパムでは50分後に最高血中濃度に達し、ロラゼパムでは、2時間後に最高血中濃度に達した。またいずれの薬剤にても漸減的に血中濃度は減少、ジアゼパムでは、23時間後にほぼ半減し、ロラゼパムでは、12時間後に半減し、いずれも32時間後には、ほぼ消失した。長期記憶に関しては、服用後の記憶がロラゼパムで有意により強く障害され、ジアゼパムでも記憶の障害がみられた。また短期記憶に関しては、有意な差が見られなかった。注意機能の障害は血中濃度と相関し、眠気については、必ずしも血中濃度と相関せず、血中濃度が低下し体外に排出されたと考えられる時間でも、眠気は残存するという結果が得られた。以上のことにより、記憶の障害は、記憶の獲得と固定の過程であること、力価が強く半減期の短い薬剤がより記憶の障害をもたらすことなどが得られた。次年度は再度試験を行い、短期記憶の障害について検討する予定である。
体性幹細胞ホーミング因子を用いた新規根管充填法の開発

1今年度は人工歯ではなく、ブタ抜去歯を用いて実験を行うことを計画した。具体的には、ブタ抜去歯を歯冠側よりタービンにてアクセスオープニングを行い、根管内を手用ステンレスファイルにて60号まで根管拡大・根管形成する。その後、3ウェイシリンジを用いて強圧で根管拡大後の根管内を洗浄乾燥後、顕微鏡にて根管内に切削片が残っていないか確認し、その後、根尖部及び歯根膜組織をメスにて除去し、70%エタノールにて消毒し、5%次亜塩素酸ナトリウムに浸漬して一晩消毒を行った。その後、オートクレーブをかけることで残った組織を無菌にする。その後増殖因子を含有させたコラーゲンゲルを30Gの洗浄針を用いて気泡が入らないように注入し、37°Cにて30分培養することでゲル化を誘導し、その後MTAセメントにて根管上部を封鎖し、CRにて歯冠修復を行った後にラット背部皮下へ移植し、3週間後に取り出し、組織学的解析を行うことを計画していた。しかし、ブタ抜去歯は根管模型とは異なり根管壁が透明でないため、シリンジの位置や注入しているところを目で確認しながらコラーゲンゲルの注入操作を行えず、コラーゲンゲルの注入操作が難しいためうまく実験が進まなかった。2今まで得られた結果をまとめたものが、2018年12月に査読付き英文学術誌に出版された。また、歯髄組織の再生の研究を行うにあたり、アクセスオープニングした歯冠部の修復材料に関して検討することが必要であるため、直接覆髄材のシステマティックレビューを行い、歯髄再生の際に用いるのに適した歯科材料を探索した。そして研究成果を査読付き英文学術誌にて論文発表した。【方法】歯内療法実習用模型歯(B22X-END,ニッシン)をタービンにつけたダイヤモンドラウンドバーを使って髄腔開拡し、手用ステンレスファイルにて#60まで根管拡大し、17%EDTA溶液に5分間浸漬後、3ウェイシリンジにてよく水洗し、エアーをかけ、切削片が残っていないことをマイクロスコープにて確認後、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液中に1日浸漬。その後、PBS(-)にて2回洗浄し、滅菌ペーパーポイントにて根管を乾燥後、気泡が入らないようにVEGF含有コラーゲンゲルを根管内へ注入し、37°Cで10分間培養した。その後、歯冠部をフジフィルLC(GC)にて仮封し、ペンキュアー(モリタ)にて10秒間光照射し、6週齢Wister雄ラット背部へ移植した。3週間飼育後、還流固定を行った。その後、人工歯を取り出し、凍結切片を作成してH-E染色を行った。【結果・考察】ラット背部への皮下移植後3週で、移植した根管模型内の根尖部2mmの部位に、ラット組織由来の繊維芽細胞様細胞が観察された。しかし、足場材であるコラーゲン注入時の気泡の混入などのエラーによって得られる結果が安定しないため、実験手法の再考察が必要である。また、根尖部へ動員された細胞の歯髄細胞への分化誘導には、根管模型でない本物の象牙質との接触が必要であると考えられるため、当初考えていた根管模型を用いた実験計画では、歯髄組織の再生は難しそうであろうことが考えられる。足場材であるコラーゲン注入時の気泡の混入などのエラーによって、得られる結果が安定しないため、実験手法の再考察が必要である。また、歯髄組織への分化には、人工歯でない本物の象牙質との接触が必要と考えられるため、当初考えていた実験計画では歯髄再生は難しそうであろうことが考えられる。1今年度は、今まで得られた結果をもとに、Journal of Oral Scienceに研究発表を行った。2また、タービンで髄腔開拡後、手用ステンレスファイルを用いて根管拡大・形成した根管模型内にコラーゲンゲルを注入する過程で、気泡が混入する問題があった。気泡が混入すると、その部分には細胞が侵入できず、歯髄組織も再生することが不可能であるため、気泡を入れずに、根管模型内へコラーゲンゲルを注入する必要があった。そのため、コラーゲンゲルを注入するのに使用するシリンジ、使用するコラーゲンゲルや根管模型の根管拡大号数の検討を行った。その結果、根管模型を手用ステンレスファイルの60号まで拡大し、30Gの洗浄針を用いてコラーゲンゲルを注入することで、気泡を入れずコラーゲンゲルを注入できるようになった。3単根管の天然歯を用いて、根管模型と同様の実験(天然歯をタービンにて髄腔開拡し、手用ステンレスファイルにて根管拡大・形成、次亜塩素酸ナトリウムにて根管洗浄して根管乾燥後、増殖因子を含有させたコラーゲンゲルを注入し、ラット背部皮下へ移植し、3週間後に取り出し、組織学的解析を行う)を計画しているが、根管模型と異なり根管壁は透明でないため、シリンジの位置や注入しているところを目で確認しながら注入操作を行えず、コラーゲンゲルの注入操作が難しいため、熟練を要する。そのため、天然歯の歯根を数ミリ単位で輪切りにして、それを実験に使用する系を検討中である。分野の統合など、研究以外の業務の増加のため。

その後、3ウェイシリンジを用いて強圧で根管拡大後の根管内を洗浄乾燥後、顕微鏡にて根管内に切削片が残っていないか確認し、その後、根尖部及び歯根膜組織をメスにて除去し、70%エタノールにて消毒し、5%次亜塩素酸ナトリウムに浸漬して一晩消毒を行った。その後、オートクレーブをかけることで残った組織を無菌にする。その後増殖因子を含有させたコラーゲンゲルを30Gの洗浄針を用いて気泡が入らないように注入し、37°Cにて30分培養することでゲル化を誘導し、その後MTAセメントにて根管上部を封鎖し、CRにて歯冠修復を行った後にラット背部皮下へ移植し、3週間後に取り出し、組織学的解析を行うことを計画していた。しかし、ブタ抜去歯は根管模型とは異なり根管壁が透明でないため、シリンジの位置や注入しているところを目で確認しながらコラーゲンゲルの注入操作を行えず、コラーゲンゲルの注入操作が難しいためうまく実験が進まなかった。2今まで得られた結果をまとめたものが、2018年12月に査読付き英文学術誌に出版された。また、歯髄組織の再生の研究を行うにあたり、アクセスオープニングした歯冠部の修復材料に関して検討することが必要であるため、直接覆髄材のシステマティックレビューを行い、歯髄再生の際に用いるのに適した歯科材料を探索した。そして研究成果を査読付き英文学術誌にて論文発表した。抜髄をすることが可能な別の動物を使用し、抜髄後根管内へ上記の処置を行って歯髄の再生を試みる計画を立案中である。当初の研究計画で、引き続き研究を進めていく。具体的には、根管拡大した歯に足場材を注入したものを、ラットに移植して、数週後に組織学的な解析を行う。実験計画の修正が必要となったため、今年度予定していた使用額より少ない額となった。実験が遅れているため次年度使用額が生じている。当初の研究計画に基づいて、天然歯を用いたラット背部皮下移植の実験の試薬等の購入費に使用していく予定である。物品費および学会講演などの旅費に使用予定である。
線虫C.elegansを用いたパーキンソン病発症機構の解明と治療薬開発

α-Synucleinは家族性パーキンソン病の病因遺伝子であり、その遺伝子産物は疾患脳内神経細胞においてSer129位のリン酸化を受けて蓄積する。線虫C.elegansは神経変性疾患の分子機構を解析するツールとして有用であることが示唆されている。我々はヒトα-synucleinを発現する線虫を用いて、α-synucleinのリン酸化がその神経毒性に与える影響について解析した。その結果、Ser129リン酸化はα-synucleinの膜結合性を低下させることにより、神経毒性および下流のストレス応答を軽減する役割を持つことを明らかにした。また、本研究で用いた線虫モデルは更なる遺伝子/薬剤スクリーニングにも有用であることを見出した。α-synucleinを全神経系に発現するトランスジェニック(Tg)線虫に対しエンドサイトーシス遺伝子AP-2のRNAiを施すと、α-synuclein発現依存的に顕著な運動機能障害が認められることから、まずその分子的背景について検討を行った。その結果、AP-2のRNAi時には膜結合型α-synucleinが顕著に増加していること、Ser129リン酸化α-synucleinの局在が神経突起から細胞体へど移行していることを見出した。同時に表現型を回復させる薬剤の網羅的スクリーニングを試みたが、そのような薬剤の同定には至っていない。続いてα-synucleinのSer129リン酸化が神経毒性に果たす役割を解明するため、Ser129をアラニンに置換したS129A型α-synuclein Tg線虫を作出した。興味深いことに、この線虫は重度の運動機能障害と成長遅延を示すことが分かった。この時、明らかな神経細胞脱落やシナプス脱落は認められなかったが、膜結合型α-synucleinがやはり増加していることを見出した。続いてこの神経障害の背景にある分子機構を明らかにするため、DNAマイクロアレイによる遺伝子発現変動解析を行い、寿命決定や酸化ストレス応答に重要な転写因子daf-16の下流遺伝子群がS129A型α-synuclein Tg線虫において強く活性化していることを見出した。さらに順遺伝学的手法により神経毒性の分子基盤を明らかにするため、S129A型α-synuclein Tg線虫に対して変異原であるEMS(ethyl methanesulfonate)を処理し、運動機能異常が回復したラインを複数取得することに成功した。これらのラインについて現在変異箇所の同定を進めている。ヒト疾患脳内において特徴的なα-synucleinのSer129リン酸化が発症に与える影響を解明する目的で、Ser129をアラニンに置換したS129A型(非リン酸化型)α-synuclein Tg線虫、及びアスパラギン酸に置換したS129D型(リン酸化模倣型)α-synuclein Tg線虫を作出した。その結果、S129A型Tg線虫は重度の運動機能障害や成長遅延を示すこと、一方S129D型Tg線虫は目立った異常を示さないことが分かった。興味深いことに、S129A型Tg線虫では神経細胞脱落やシナプス脱落は認められないものの、膜結合型α-synucleinの量が野生型α-synuclein Tg線虫やS129D型Tg線虫に比して顕著に増加していることを見出した。次に、膜結合性を低下させることが知られているA30P変異をS129A変異に加えて導入したA30P-S129A型α-synuclein Tg線虫を作出した。その結果、このTg線虫は目立った異常表現型を示さず、また膜結合型α-synucleinの量が大きく減少していることを確認した。以上より、膜結合型α-synucleinが神経毒性を発揮すること、Ser129のリン酸化はα-synucleinを膜から引き離すことにより神経毒性を軽減させることが示唆された。続いてα-synuclein神経障害の背景にある分子機構を明らかにするため、DNAマイクロアレイによる遺伝子発現変動解析を行い、寿命決定や酸化ストレス応答に重要な転写因子daf-16の下流遺伝子群がS129A型Tg線虫において強く活性化していることを見出した。さらに順遺伝学的手法による検討から、X染色体の約1cMの領域に含まれる遺伝子変異がS129A型Tg線虫の運動機能障害を改善させることを見出した。以上の結果は本年7月の東アジア線虫学会において報告した。
器官形成におけるホメオボックス遺伝子Msxファミリーの機能解析

器官形成におけるホメオボックス遺伝子Msx1およびMsx2の機能を明らかにするため、in situ hybridizationなどによる関連因子との関係の解析およびdifferential displayによる系統的な下流遺伝子の探索を行った。その結果、歯の形成には歯上皮から分泌されるFGF8が歯間葉においてMsx1を誘導し、Msx1が歯間葉でのFGF3を誘導するという新しいシグナル経路を発見した。さらに、Msx1およびMsx2は、肢芽前部において間葉でのBMP4の発現を誘導し、肢芽におけるFGF4およびShhの発現をも調節していることを明らかにした。また、指間組織のアポトーシスは、BMP4→Msx2→アポトーシス関連遺伝子というシグナル経路により誘導されることを証明した。このシグナル経路は、歯および菱脳におけるアポトーシスにも共通に利用されていることを明らかにした。毛嚢の形成については、Msx1およびMsx2は、BMP4およびLef1と関係して重要な機能を担っており、結果的に毛周期の調節を行うことを明らかにした。胸腹壁の形成については、Msx1およびMsx2は、Pax3、Shh、WntとともにmyotomeにおけるmyoDの発現を調節していることを明らかにした。一方、Msx1およびMsx2欠損マウスの各組織を用いたdifferential displayにより、欠損マウスにおいて発現が減少あるいは増加する新規な下流遺伝子を数個クローニングした。
土壌伝染性青枯病菌の植物認識機構－走化性の徹底解明

細菌は常時周囲の化学物質濃度を感知し、好ましい環境に集まり、好ましくない環境から逃避する走化性と呼ばれる環境応答を示す。土壌感染性の青枯病菌は感染宿主の農作物が植えられるとその根に接近し感染する。この過程で走化性が重要な役割を果たしていると考えられている。本研究では、青枯病菌が走化性を用いどのように宿主植物に接近し感染を果たすのかを分子生物学的に解析し、成果を得た。これまで青枯病菌の駆除は臭化メチル(オゾン層破壊物質)による土壌殺菌で行われてきた。本研究の知見は、青枯病菌の走化性を標的にした臭化メチルに頼らない環境適合型の感染防除技術の開発に寄与する。1ゲノム情報からRalstonia solanacearum Ps29株は22の走化性センサー遺伝子を有していることが分かっている。それら走化性センサーの機能特性化のためにすべての走化性センサー遺伝子を破壊した多重破壊株の構築を行い、それに成功した。2発現量の高さから植物感染に関与する走化性センサーを推定するために、土中及び植物中のR. solanacearumからRNAを抽出する方法を確立した。その方法により、a)トマトが植えられていない土の中の菌、b)トマト根圏に存在する菌、c)トマトに感染した菌からRNAを抽出し、それぞれの走化性センサー遺伝子に特異的なプライマーを用いた定量的RT-PCRにより転写量を測定した。いずれの遺伝子も転写量はb)>a)>c)の順であった。転写量が高かったのは、mcp05、mcp07、mcp09およびmcp14であった。このうちmcp14はリンゴ酸走化性センサーであるMcpMをコードしており、また、植物感染に関与していることが分かっている。3転写量が高かったmcp05、mcp07、mcp09およびmcp14の単独破壊株を用いてトマト感染実験を行った結果、mcp09とmcp14の変異株は親株よりも植物感染能が有意に低下していることが分かった。一方、mcp05とmcp07の単独変異株は親株と同等の感染能を示した。この結果から、植物感染に関与する新たな走化性センサー遺伝子としてmcp09を見出した。4Mcp09の走化性リガンドを特定するために、14の走化性センサー遺伝子を破壊した変異株にmcp09遺伝子を導入して走化性応答を測定することでスクリーニングしたところ、アガロース関連物質(まだ特定はできていない)を認識することが分かった。5R. solanacearumにGFP遺伝子を導入して蛍光標識し植物根傷口への接近を蛍光顕微鏡でモニタリングした。当初計画の5項目の事項のうち4つは完遂した。このうち、発現量を指標にしての植物感染に関与する走化性センサーの推定は有効な手法であることが分かったことは、大きな成果である。まず、この手法ですでに植物感染への関与が判明していたMcp14(McpM)がスクリーニングされてきた。そして、このMcpMに加えて、新たに植物感染に関与する走化性センサーMcp09がスクリーニングできた。Mcp09の機能特性化は2016年度の重要な課題になる。また、R. solanacearumのすべての走化性センサー遺伝子を破壊した株が構築できたことも、今後の研究展開に寄与する成果である。構築した多重破壊株に単独の走化性センサー遺伝子を導入することで、他の走化性センサーの干渉なしに機能特性化ができる。実は、2015年度にその予備試験を行ったのであるが、意外な結果を得た。L-リンゴ酸走化性センサー遺伝子(mcpM)およびアミノ酸走化性センサー遺伝子(mcpA)を導入した場合、それぞれの走化性が復帰した。しかし、D-リンゴ酸走化性センサー(mcp03)を全破壊株に導入しても走化性応答は復帰しなかった。その一方、17の走化性センサー遺伝子を破壊した部分破壊株に導入したところ、D-リンゴ酸への応答が復帰した。2016年度ではこの理由を明らかにする計画である。GFP標識したR. solanacearumを用いることで、植物根の傷口に接近している菌体を可視化することができた。しかし、解像度が不足しており、2016年度ではより高解像度で観測できる技術を確立したい。この最後の項目以外の達成度は「(1)当初の計画以上に進展している」であるが、最後の項目は完遂されてはいないので(2)おおむね順調に進展している」と自己評価した。[走化性センサー機能の特性化]Ralstonia solanacearumは22種類の走化性センサーを有している。これまでアミノ酸(McpA)、L-リンゴ酸/コハク酸/フマル酸(McpM)、ホウ酸(McpB)の走化性センサーの特定に成功している。平成28年度の研究により、新たにL-酒石酸/D-リンゴ酸(McpT)の特定に成功した。さらにこの研究を通じ、R. solanacearumでは初めて負の走化性(エタノール、マレイン酸)を示すことを見出した。このうちマレイン酸は特定の走化性センサー(McpP)が関与していること、このMcpPはリン酸およびクエン酸を走化性誘引物質として認識することを明らかにした。マレイン酸の認識とは対照的に、エタノールは不特定多数の走化性センサーによって認識されていることが分かった。

[ホウ酸走化性センサーの特性化]平成27年度に世界で初めてのホウ酸走化性を発見し、そのセンサーの特定にも成功した(McpB)。平成28年度には、McpBのリガンド結合部位(LBD)を高発現・精製した。そしてCDスペクトル、等温滴定微量熱量計を用いてホウ酸がMcpBのLBDに直接結合することを示した。[植物感染に関与する走化性センサーの特定]上記で特性化できた走化性センサーは対応する遺伝子の破壊株をトマト感染試験に供した。すでに植物感染への関与が明らかになっているMcpM以外の走化性センサーは、用いた試験系では植物感染に関与していないことが示唆された。[走化性センサーがヘテロダイマーで機能している可能性?]22の走化性センサー遺伝子をすべて破壊した変異株を用いた相補試験から、(少なくとも)McpTとMcp05はヘテロダイマーで機能している可能性を示唆する結果を得た。平成28年度開始時点での年度計画はすべて計画通りの成果を挙げている。22もの走化性センサー遺伝子を持つR. solanacearumの走化性センサーを個別に特性化できるよう、22の走化性遺伝子をすべて破壊した多重破壊株を作成している。この変異株に個々の走化性センサー遺伝子を導入して走化性測定を行ったところ、アミノ酸およびL-リンゴ酸の走化性センサー遺伝子(mcpA、McpM)は予想通り当該リガンドへの走化性が復帰した。しかし、L-酒石酸/D-リンゴ酸の走化性センサー遺伝子(mcpT)およびクエン酸の走化性センサー遺伝子(mcp05)を導入した場合、対応する走化性は復帰しなかった。ところが、mcpTおよびmcp05の両遺伝子を同時に導入すると対応する走化性が復帰した。これまで、細菌の走化性センサーはホモダイマーを形成して機能していると考えられている。しかし、mcpTとmcp05の知見は走化性センサーが「ヘテロダイマー」を形成して機能している可能性を示唆するものである。もしそれが事実であるならば、ヘテロダイマーを形成する走化性センサーの組み合わせによって、感知できるリガンドのレパートリーも変化するかもしれない。平成28年度にはこのように、これまでの常識を覆すような知見を得ることにも成功している。このことを鑑みると、本研究は「当初の計画以上に進展している」と言えよう。平成29年度は複数の走化性リガンドが相乗的な走化性を引き起こすか、相加的な応答につながるかを検討した。植物根浸出液の主要成分である走化性リガンドを試験物質として用いることにした。平成27及び28年度の研究から別個の走化性センサーに感知されることが分かったL-グルタミン酸(McpAが感知)、クエン酸(McpCとMcpPが感知)、L-リンゴ酸(McpMが感知)を選択した。あまりに高濃度であると応答が飽和してしまうので、Ralstonia solanacearum Ps29株のそれぞれの走化性リガンドの応答限界濃度を求めた。ついで、3通りの二成分系および三成分系での走化性応答をコンピュータ支援キャピラリー法で精緻に測定した。得られた結果から、いずれの複数成分の応答も相乗的な応答ではなく、加算的応答を示すという結果になった。
実験肺線維症の進展と抑制におけるサイトカインの役割-エンドセリン遺伝子の生体肺への導入と病態生理学的研究-

【目的】線維化肺の発症と進展機序におけるエンドセリン(ET)の関与を明らかにするため,ET遺伝子を肺内に導入し肺線維症動物モデルを作成する.【方法】ET遺伝子を導入する手段として遺伝子安定発現型肺線維芽細胞株を樹立した.8週齢,雄ゴールデンハムスターを,ET産生肺線維芽細胞移植群(ET群),TGF-β産生肺線維芽細胞移植群(TGF-β群),対照肺線維芽細胞移植群(対照群)の3群に分けた.肺線維芽細胞の肺内移入効率を検討するために,以下の2ルートを設定.I経気管的:カニューレを気管内に挿入して投与,II経静脈的:外頸静脈よりカテーテルを右心腔内に挿入して投与.【結果】経気管的ルートによってのみ肺内への遺伝子導入が可能であった.各遺伝子発現肺線維芽細胞(1x10^7/0.3ml DMEM)を投与後7日,14日目に,各群の気管支肺胞洗浄液(BALF)を検討した.ET群では7日,14日目ともBALF中総細胞数とET濃度の増加を認めたが,他の2群では正常動物と変化なかった.肺組織標本の検討ではET群は実験7日目にすでに肺組織内で広範に肉芽腫形成及びその周囲の肺胞隔壁の肥厚を認めたが,他の2群ではこれらの変化は見られなかった.抗ET抗体を用いた免疫組織学的検討では,ET群に観察された肉芽腫形成細胞に強い発現を認めた.【結論】生体肺内における肺線維芽細胞の増殖にETはTGF-βより優位に作用する.このことは線維化肺の進展にETが深く関与していることを示唆している.【目的】線維化肺の発症と進展機序におけるエンドセリン(ET)の関与を明らかにするため,ET遺伝子を肺内に導入し肺線維症動物モデルを作成する.【方法】ET遺伝子を導入する手段として遺伝子安定発現型肺線維芽細胞株を樹立した.8週齢,雄ゴールデンハムスターを,ET産生肺線維芽細胞移植群(ET群),TGF-β産生肺線維芽細胞移植群(TGF-β群),対照肺線維芽細胞移植群(対照群)の3群に分けた.肺線維芽細胞の肺内移入効率を検討するために,以下の2ルートを設定.I経気管的:カニューレを気管内に挿入して投与,II経静脈的:外頸静脈よりカテーテルを右心腔内に挿入して投与.【結果】経気管的ルートによってのみ肺内への遺伝子導入が可能であった.各遺伝子発現肺線維芽細胞(1x10^7/0.3ml DMEM)を投与後7日,14日目に,各群の気管支肺胞洗浄液(BALF)を検討した.ET群では7日,14日目ともBALF中総細胞数とET濃度の増加を認めたが,他の2群では正常動物と変化なかった.肺組織標本の検討ではET群は実験7日目にすでに肺組織内で広範に肉芽腫形成及びその周囲の肺胞隔壁の肥厚を認めたが,他の2群ではこれらの変化は見られなかった.抗ET抗体を用いた免疫組織学的検討では,ET群に観察された肉芽腫形成細胞に強い発現を認めた.【結論】生体肺内における肺線維芽細胞の増殖にETはTGF-βより優位に作用する.このことは線維化肺の進展にETが深く関与していることを示唆している.
家庭と仕事の両立と女性の健康：国際移住による社会環境の変化に注目して

本研究では、仕事と家庭の両立が女性の健康に与える影響を国際比較の観点から検討することが目的である。パネル調査を含む欧米の先行研究では、無配偶者よりも有配偶者のほうが、健康状態が良好であることが示されてきた。しかしながら、その男女差に関する議論には未だ決着がついていない。例えば、女性は妻・母・労働者としての役割葛藤が男性より大きいことから、仕事を持つ女性にとって結婚はあまり有益でない可能性も指摘されている。本研究では特に、日本おける日本人女性と米国における日系人女性の健康度を比較することで、女性に期待される社会的役割の違いが、どのように女性の健康に影響を及ぼすかを考察する。今年度は、前年度に行った米国に在住する日系人への健康調査の分析を行った。成人男女1,166名のサンプルを分析した結果、以下の知見が得られた。つまり、未婚者よりも既婚者において主観的健康度が高く、その関連は年齢や収入、学歴、などの社会経済的要因や喫煙、BMIなどの行動要因を考慮しても残ることが分かった。さらに、男性においてはある一定程度の就労時間が高い主観的健康度と関連しているのに対し、女性においては就労時間と主観的健康度のあいだには関連が見出せなかった。さらに、日本とのつながりが高い主観的健康度と関連していることも分かった。今年度は日系人調査の分析および日本人データの分析を行ったが、詳細な比較分析を次年度の持ち越したため、やや遅れていると判断した。次年度は日系人調査と日本人調査の比較を行う。特に、仕事が健康度に与える影響を有配偶女性と独身女性との比較から考察する。また、経済社会的変数がどのように健康度の差に影響を与えているかも比較検討する。さらに日系人調査において日本とのつながりがどのように健康に影響を与えるかも詳細に分析する予定である。本研究では、仕事と家庭の両立が女性の健康に与える影響を検討することが目的である。特に、日本と米国・ハワイ州における日本人および日系人女性の健康度を比較することで、女性に期待される社会的役割の違いが、どのように働く女性の健康に影響を及ぼすかを考察する。初年度前半は先行研究を広く集め、課題を検討した。特に、結婚が健康に与える影響、働き方やライフスタイルが健康におよぼす影響、そして、日系人研究をサーベイした。初年度後半は、産前・産後休業のため研究を中断した。産前・産後休業のため日系人調査の準備・実施は次年度以降に延期した。今年度は、米国に在住する日系人への健康調査の概要および調査項目をまとめ、調査会社の選定を開始した。具体的にはインターネットを使い、日系人モニターへ以下の質問項目を含む調査を行うことを予定している。年齢、学歴、など社会的属性に加えて、主観的健康感、健康行動、婚姻状態、就労時間、移民世代、日本とのつながり、アメリカ社会への適応度、などを質問項目とした。なお質問項目は、可能な限り日本人データとの比較が可能になるように設定した。また、日本に在住する日本人女性の健康データを使い、結婚・仕事・健康の関連について予備分析を行った。その結果、有配偶女性は無配偶女性よりも健康度が高く、パートタイム就労者は健康度が高いことが示唆された。今後より詳細な分析を行う予定である。今年度は米国における日系人健康調査の概要・質問項目をまとめたが、費用の不足から調査の実施は次年度に行うことにした。しかし、調査を行うかわりに、日本人データの予備分析を開始したため、やや遅れていると判断した。今年度は、米国に在住する日系人への健康調査を行った。具体的にはインターネットを使い、日系人モニターへ以下の質問項目を含む調査を行った。なお質問項目は、可能な限り日本人データとの比較が可能になるように設定し、比較対象として男性サンプルへも調査を行った。男女それぞれ600人程度のサンプルを得た。予備分析では、未婚者よりも既婚者において主観的健康度が高いことが分かった。

また、男性に比べて女性のほうが平均的な主観的健康度が高いことも分かった。今後はより詳細な分析を行う予定である。今年度は日系人調査を行い、予備分析を行ったが、当初予定していた日系人調査と日本人調査の比較分析を次年度の持ち越したため、やや遅れていると判断した。本研究では、仕事と家庭の両立が女性の健康に与える影響を国際比較の観点から検討することが目的である。パネル調査を含む欧米の先行研究では、無配偶者よりも有配偶者のほうが、健康状態が良好であることが示されてきた。しかしながら、その男女差に関する議論には未だ決着がついていない。例えば、女性は妻・母・労働者としての役割葛藤が男性より大きいことから、仕事を持つ女性にとって結婚はあまり有益でない可能性も指摘されている。本研究では特に、日本おける日本人女性と米国における日系人女性の健康度を比較することで、女性に期待される社会的役割の違いが、どのように女性の健康に影響を及ぼすかを考察する。今年度は、前年度に行った米国に在住する日系人への健康調査の分析を行った。成人男女1,166名のサンプルを分析した結果、以下の知見が得られた。つまり、未婚者よりも既婚者において主観的健康度が高く、その関連は年齢や収入、学歴、などの社会経済的要因や喫煙、BMIなどの行動要因を考慮しても残ることが分かった。さらに、男性においてはある一定程度の就労時間が高い主観的健康度と関連しているのに対し、女性においては就労時間と主観的健康度のあいだには関連が見出せなかった。さらに、日本とのつながりが高い主観的健康度と関連していることも分かった。今年度は日系人調査の分析および日本人データの分析を行ったが、詳細な比較分析を次年度の持ち越したため、やや遅れていると判断した。次年度以降はインターネットによる日系人調査を実施し、日本人データとの比較を行なう。特に、仕事を持つ有配偶女性に注目し、独身女性との比較においてどの程度、健康度に違いがあるか検討する。日系人調査の質問票には、既存の日本人データと比較可能な項目を中心に入れ、アメリカ社会への適応度合いや、日本とのつながりを測る項目も入れる予定である。次年度はインターネットによる在米日系人調査を実施し、分析を行う。特に、仕事を持つ有配偶女性と独身女性の健康度の比較を行う。また、既存の日本人データと比較を行い、健康度の差にどのような違いがあるか、検討する。さらに、日系人データから、アメリカ社会への適応度合いや、日本とのつながりが、どのように結婚と健康の関係に影響を与えるかも検証する予定である。次年度は日系人調査と日本人調査の比較分析を行う。また、各調査における経済社会的変数がどのように健康度の差に影響を与えているかも検討する。さらに、日系人データから、日本との社会的・経済的・文化的つながりが、どのように結婚と健康の関係に影響を与えるかも検証する予定である。次年度は日系人調査と日本人調査の比較を行う。特に、仕事が健康度に与える影響を有配偶女性と独身女性との比較から考察する。
ＢＺマイクロゲルを用いた生成と崩壊を内包するアメーバ様ロボットの開発

生物では代謝があるため,物質の流入出がある.そのため,身体の定義がはっきりしておらず,身体と環境の境界が曖昧である.そのような曖昧な中で運動が実現されている.そこで本研究では,その特徴を組み込んだロボットをソフトマターを用いて開発することで,生物にみられるような「身体と環境が曖昧な中での運動の実現」が見られるか調べた.そこで,チューブ内にマイクロサイズのコロイドゲルを満たし,実験を行ったところ,特定の条件下で一方向の移動が観察された.この結果のキモグラフを作成した結果,この移動は化学反応の伝播に依存して実現されていることが分かった.加えて,DLVO理論を用いてシミュレーションを行った結果,この移動にはチューブからの静電的相互作用が影響していることが明らかになった.移動と這行運動時のアンカーリングとの関係を調べるために,チューブの中心にのみコロイドゲルが存在する条件で実験を行った.実験結果からキモグラフを作成したところ,酸化状態から還元状態に戻るときにアンカーリングしていた.これらの実験結果より,上記のロボットは自身と環境の境界が曖昧なことを利用して運動を実現している.このロボットを自律分散ロボットとみなすと,各モジュール間をつなぐバネが分子間力に置き換わっていると考えられる.この分子間力を利用することで,身体を明確に定義する必要がなくなり,環境と身体の境界が曖昧な中での運動を実現することができた.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。生物の大きな特徴として、破壊と生成が両義的に成り立っていることにより、柔軟な環境適応性を見せることが挙げられる。そこで本研究では、マイクロサイズの自励振動ゲル(以下、マイクロゲル)を用いる。このマイクロゲルは、BZ反応の酸化-還元振動に合わせて拡散-凝集を繰り返す。その凝集と分散によって生成と破壊を両義的に成立するアメーバ様化学知能ロボットの開発を目指す。この各マイクロゲルの振る舞いとロボットの振る舞いを調整することができれば、アメーバの様にゲル-ゾル転移で移動するソフトマターロボットを実現できると考える。そこで、石英セルまたはガラス製のシャーレにBZ反応基質混合溶液を入れた。そこにマイクロゲルでチューブ内を満たした、長さ1.5[cm]のチューブを静かに入れた。フルHD対応USB小型カメラを用いてその様子を動画として撮影し、PCを通し外付けHDDに記録した。溶液温度は温度コントローラを用いて18.5°Cに保った。その結果、チューブ内での一方向の移動が観察された。また、実験開始直後には両端で発生していた酸化波が、実験開始からしばらくすると、後端から先端(移動方向側の端)へ伝播していることが分かった。また、一方向の移動と化学反応の関係を調べるために、マロン酸を除いたBZ反応基質混合溶液を用いて同様の実験を行った。マロン酸を除いたため、BZ反応は発生しなかった。その他の実験条件は、上記の実験条件と同様であった。その結果、化学反応が発生しないときには、マイクロゲルは一方向に移動しなかった。同様に時空間プロットにおいても、時間経過に伴って移動している様子を見ることはできなかった。以上の結果より、自律分散ロボットのように複数のマイクロゲルの集合体として、アクチュエーターの様な働きを実現できた。当初は、空間的な制限を設けず、マイクロゲルの静電的相互作用のみで溶液中に凝集させることを予定していた。しかし、実験を進めるうちに、マイクロゲル間の凝集力が弱く、そのまま液中に滴下させただけでは、拡散してしまうことが分かった。そこで、細いチューブを使用し、その中にマイクロゲルを封入することで溶液中への拡散を防ぐことにした。また、このチューブの素材と内径を工夫することで、チューブ内での化学反応に応じた一方向の移動を実現できることが分かった。この結果より、自律分散ロボットのように複数のマイクロゲルの集合体として、アクチュエーターの様な働きを実現できた。申請時の1年目の予定は、重合環境と実験環境の整備が主であり、それらが整備された後、実験に適したBZ反応基質の濃度の調査やマイクロゲルの構成を調べ、自律的なゲル-ゾル転移を実現することを予定していた。そして、上記のような自律的な重心移動を2年目に予定した。しかし、この自律的な重心移動を予定よりも早く、1年目に実現できたことから、進捗状況はおおむね順調であると言える。生物では代謝があるため,物質の流入出がある.そのため,身体の定義がはっきりしておらず,身体と環境の境界が曖昧である.そのような曖昧な中で運動が実現されている.そこで本研究では,その特徴を組み込んだロボットをソフトマターを用いて開発することで,生物にみられるような「身体と環境が曖昧な中での運動の実現」が見られるか調べた.そこで,チューブ内にマイクロサイズのコロイドゲルを満たし,実験を行ったところ,特定の条件下で一方向の移動が観察された.この結果のキモグラフを作成した結果,この移動は化学反応の伝播に依存して実現されていることが分かった.加えて,DLVO理論を用いてシミュレーションを行った結果,この移動にはチューブからの静電的相互作用が影響していることが明らかになった.移動と這行運動時のアンカーリングとの関係を調べるために,チューブの中心にのみコロイドゲルが存在する条件で実験を行った.実験結果からキモグラフを作成したところ,酸化状態から還元状態に戻るときにアンカーリングしていた.

これらの実験結果より,上記のロボットは自身と環境の境界が曖昧なことを利用して運動を実現している.このロボットを自律分散ロボットとみなすと,各モジュール間をつなぐバネが分子間力に置き換わっていると考えられる.この分子間力を利用することで,身体を明確に定義する必要がなくなり,環境と身体の境界が曖昧な中での運動を実現することができた.昨年度の成果として、自律分散ロボットのように複数のマイクロゲルの集合体として、アクチュエーターの様な働きを実現できた。具体的には、細いチューブのなかに封入することによって、化学反応の伝播方向に応じた一方向の移動を実現することに成功した。また、粒子運動のシミュレーションを行い、その移動には化学反応に対応した凝集ー拡散振動が重要であることが分かった。しかし、上記の結果では、マイクロゲルは周囲の環境に応じてその振る舞いを自律的に変化させてはいない。マイクロゲルは、主鎖として温度応答性高分子を使用しているため、溶液の温度に応じてBZ反応の酸化-還元の速度が変化する。これは、温度センサを内蔵していると考えることができ、この特徴と上記のアクチュエーターとしての働きを利用し、周囲の環境に応じて振る舞いを自律的に変化させる化学ロボットの実現を目指す。具体的には、温度勾配のある状況では、BZ反応の酸化-還元の速度が変化し、その移動方向を自律的に変化させると考えられる。また、上記の実験が成功し、ソフトマターを用いて自律分散ロボットが実現されれば、よりウェットな環境下で環境適応的な問題を解決できる。このロボットの設計指針に沿って実現されたロボットはアクチュエーター及びセンサを化学反応が担うため、生体内でもそこに元々存在している基質や分散状態のタンパク質を用いて自律的な運動を見せると考えられる。そのためそのタンパク質を用いて、周囲の環境に応じて適応的に振る舞いを変化させるロボットの開発を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。
生体触媒の誤作動を利用した不斉酸化反応の制御

巨大菌に由来するP450BM3は、天然基質である脂肪酸に対する極めて高い水酸化活性を有すことから、実用的なバイオ触媒としての応用が期待される。しかし、P450BM3の脂肪酸に対する基質特異性は非常に高く、幅広い基質に対応する汎用的な酸化触媒としての利用が難しいことが応用面への課題となっていた。これに対し、我々の研究室は、脂肪酸の構造によく似た化合物「疑似基質」を開発し、これによりP450BM3を誤作動させることで、ベンゼンやプロパンといった非天然基質の水酸化反応に成功した。本申請課題では、この「疑似基質」の化学構造を利用して不斉酸化反応の立体選択性を制御し、単一の触媒から複数のエナンチオマーを「作り分け」できるような反応系を開発することを目標とする。当該年度に実施した研究では、P450BM3の変異体と「疑似基質」を組み合わせることで、より厳密な選択性制御を目指した。P450BM3のV78F変異体は、エチルベンゼンの水酸化反応において、エナンチオ過剰率が「疑似基質」によって110%変化した。これは、野生型P450BM3のときの89%よりも大きく、変異導入と「疑似基質」を併用することによる反応場制御が有効であることを示唆した。また、野生型P450BM3によるスチレンのエポキシ化反応では、「疑似基質」を利用したときの反応のエナンチオ過剰率の変化は36%にとどまったが、F87A、F87V変異体はそれぞれ114%、73%と大幅に上昇した。さらに、ジアゾ酢酸エステルをカルベン源としたスチレンのシクロプロパン化反応では、「疑似基質」を反応系内に共存させておくことで、熱力学的に不安定なシス体生成物の生成比が2%から22%まで上昇し、またシス体に対するエナンチオ過剰率も6%から63%に改善した。以下の通り、「疑似基質」で制御する非天然基質のエナンチオ選択的な変換について多くの知見と結果が得られていることから、当該研究は当初の計画以上に進展していると考えている。当該年度の研究により、特にスチレン酸化において、エナンチオ選択性変化の「疑似基質」応答が大きくなるような変異導入箇所を特定できた。今後、これらの変異体を鋳型とした指向的進化等の手法により、「疑似基質」によってさらに選択性を大きく変化させる触媒系の開発が見込まれる。一方で、疑似基質の濃度や、系内に共存させるイオンの種類を変更したことによる選択性の変化は確認されなかった。しかし、溶液のイオン強度を上昇させると、ベンジル位水酸化の選択性がSに偏る傾向を見出しており、「第二の外部添加因子」による選択性制御が可能であることが示唆された。また、「疑似基質」を利用した立体選択性制御の手法は、酸化反応に限らず、カルベン転移反応等の非生物学的な反応にも応用可能であることを確認することもできた。計算機シミュレーションによる実験では、「疑似基質」がP450BM3の構造変化に関与している可能性が示唆されており、これと選択性変化の相関が得られれば、コンピュータ上による「疑似基質」設計の可能性が見えてくると考える。当該年度で特定した、エナンチオ選択性の「疑似基質」応答が大きな変異体を鋳型とし、さらに選択性を大きく変化させる触媒系の開発に着手する。これに「第二の外部添加因子」を共存させ、複数の因子による共同的な選択性制御に挑戦する。計算機シミュレーションにより、選択性変化の要因を特定し、次代の系の設計指針とする。

以下の通り、「疑似基質」で制御する非天然基質のエナンチオ選択的な変換について多くの知見と結果が得られていることから、当該研究は当初の計画以上に進展していると考えている。当該年度の研究により、特にスチレン酸化において、エナンチオ選択性変化の「疑似基質」応答が大きくなるような変異導入箇所を特定できた。今後、これらの変異体を鋳型とした指向的進化等の手法により、「疑似基質」によってさらに選択性を大きく変化させる触媒系の開発が見込まれる。一方で、疑似基質の濃度や、系内に共存させるイオンの種類を変更したことによる選択性の変化は確認されなかった。しかし、溶液のイオン強度を上昇させると、ベンジル位水酸化の選択性がSに偏る傾向を見出しており、「第二の外部添加因子」による選択性制御が可能であることが示唆された。また、「疑似基質」を利用した立体選択性制御の手法は、酸化反応に限らず、カルベン転移反応等の非生物学的な反応にも応用可能であることを確認することもできた。計算機シミュレーションによる実験では、「疑似基質」がP450BM3の構造変化に関与している可能性が示唆されており、これと選択性変化の相関が得られれば、コンピュータ上による「疑似基質」設計の可能性が見えてくると考える。当該年度で特定した、エナンチオ選択性の「疑似基質」応答が大きな変異体を鋳型とし、さらに選択性を大きく変化させる触媒系の開発に着手する。これに「第二の外部添加因子」を共存させ、複数の因子による共同的な選択性制御に挑戦する。計算機シミュレーションにより、選択性変化の要因を特定し、次代の系の設計指針とする。