hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ATP放出性マキシアニオンチャネルの分子同定と心筋虚血・再灌流障害への役割解明

本研究において、1マキシアニオンチャネルMaxi-Clのポア構成分子実体がSLCO2A1であること、2C127細胞の浸透圧性細胞膨張時ATP放出にこのSCLO2A1が関与すること、3マウス摘出心臓において虚血・再灌流直後にピークを示すATP放出が観察され、これにもSLCO2A1が関与すること、4その際に放出されたATPは心保護効果を示し、アデノシンA1受容体シグナルによって仲介されることを明らかにした。多くの細胞は、種々のストレス下において細胞外にATPを放出するが、その経路としてはエキソサイトシス性のものとチャネル性のものがあることが知られている。私達は、後者チャネルとしてマキシアニオンチャネル(Maxi-Cl)が、心筋細胞を含めて多くの細胞系において、関与することを示して来た。更に最近、乳腺腫瘍由来株C127細胞におけるATP放出性Maxi-Cl分子として、♯4819.5遺伝子産物タンパク質を同定した。そこで本研究では、心臓の虚血・再灌流負荷時におけるATP放出についても同様にこの分子が関与することを明らかにすることを第1の目的とし、その放出ATPの病態生理学的役割を解明することを第2の目的とする。平成26年度においては、成熟マウスより摘出した心臓のランゲンドルフ標本において、脱酸素・脱グルコース液の灌流による「虚血」と、その後の酸素・グルコース再投与による「再灌流」のモデル実験を行い、「再灌流」時に限局してATP放出が、再現性よく見られることを確認した。また、この「虚血・再灌流」性ATP放出は、繰り返し行うと次第に減弱することを見出した。次に、マウスにあらかじめマウス尾静脈より、3日間連続して♯4819.5にたいするsiRNAを投与(テスト)、あるいはそのコントロールとしてスクランブルsiRNAを投与(コントロール)し、4日目にその摘出心臓に対してRT-PCRを行ったところ、テスト心臓におい♯4819.5遺伝子の発現が有意に減少していることを確認した。また、4日目にランゲンドルフ虚血・再灌流実験を行ったところ、4819.5遺伝子サイレンシングされたテスト心臓からのATP放出が有意に抑制されることを見出した。これらの結果を英文原著論文にまとめて、国際誌へ投稿した。多くの細胞は、種々のストレス下において細胞外にATPを放出するが、その経路としてはエキソサイトシス仲介のものとチャネル仲介のものがある。私たちは、後者チャネルとしてマキシアニオンチャネル(Maxi-Cl)が、心筋細胞を含めて多くの細胞系でこれに関与することを、これまで示してきた。また、最近私たちは、マウス乳腺由来C127細胞におけるATP放出を担うMaxi-Clの分子実体候補として、#4819.5遺伝子産物を特定することに成功した。そこで本研究では、心臓からの虚血・再灌流性ATP放出についても同様の分子が関与するかについて検討した。成熟マウスの摘出心ランゲンドルフ標本を用いての脱酸素・脱グルコース液灌流後の酸素・グルコース再投与による「虚血・再灌流」のモデル実験によって、虚血・再灌流性ATP放出が再灌流時に再現性よく見られることを明らかにした。次に、マウスにあらかじめ尾静脈より3日間連続して#4819.5に対するsiRNAをイン・ビボ投与したところ、コントロール実験に比べて有意に再灌流時ATP放出が抑制されることを見出した。これらの平成26年度における成果を踏まえ、平成27年度には次の実験を行った。まず第1に、この摘出心再灌流時ATP放出に対して、他細胞においてATP放出路を与えると報告されているパネキシン・ヘミチャネルの関与の可能性を、パネキシン特異的ブロッカーを用いて排除することに成功した。第2には、C127細胞におけるイン・ビトロ実験によって#4819.5遺伝子をCRISPR-Cas9法によってノックアウトし、Maxi-Cl活性の消失することを確認した。第3には、Maxi-Cl活性を欠失したマウスC1300細胞において、C127細胞に比べて著しく低い発現を示した細胞骨格系関連分子アネキシンA2 (Anxa2)が、Maxi-Clのレギュレータであることを明らかにした。平成26年度においては、イン・ビボ実験条件の設定に日数を要したために若干の遅れがあったが、平成27年度においては確立した実験条件のもとで数多くの実験を実施することができ、遅れを完全に取り戻すことができた。その結果、本研究の第1の目的である「心臓の虚血・再灌流性ATP放出における#4819.5遺伝子産物の関与の実証」を達成することができた。本研究の目的は、第1にマキシアニオンチャネルの分子同定を行い、この分子が細胞膨張時のATP放出路を与えることを証明すること、そして第2にこの分子が心臓からの虚血・再灌流時のATP放出の通路を与える事を証明すること、更に第3にこのATP放出が虚血・再灌流後の心機能障害に対して防御的に働くのか、それとも障害的に働くのかを評価することである。平成28年度における成果は、次の通りである。まず第1の点については、本分子を培養細胞に強制発現させた時に、マキシアニオンチャネル電流のみならず細胞膨張性ATP放出も高まること、そしてプロスタグランジンE2(PGE2)投与によって、マキシアニオンチャネル電流のみならず細胞膨張性ATP放出も抑制されることを明らかにした。次に、第2の点に関しては、心臓の虚血・再灌流性ATP放出がマキシアニオンチャネルのブロッカーで有意に抑制されることを明らかにした。

本研究のこれまでの3年間の成果をまとめなおした論文を再投稿をしたところ、査読者から更なる追加実験を求められ、これに対応するために多くの追加実験の実施が必要となった。そのかなりの部分は平成28年度中に実施したが、すべてを実施し終えることはできなかった。特に、第3点目に関する実験的検討がいまだ行えていない。心臓では虚血時にATPが心筋細胞自身から放出されることが古くから知られている。私達は単離心室筋細胞から虚血性ATP放出は、巨大コンダクタンスを示すマキシアニオンチャネル(Maxi-Cl)を通って行われることを示してきた。本研究課題の目的は、第1にマキシアニオンチャネルの分子同定を行い、この分子が細胞膨張時のATP放出路を与えることを証明すること、そして第2にこの分子が心臓からの虚血・再灌流時のATP放出の通路を与える事を証明すること、更に第3にこのATP放出が虚血・再灌流後の心機能障害に対して防御的に働くのか、それとも障害的に働くのかを評価することである。平成29年度における成果は、次の通りである。まず第1と第2の点については、平成28年度までに、薬理学的方法、遺伝子ノックダウン法、遺伝子ノックアウト法、遺伝子強制発現法、精製タンパク質人工膜再構成法などを駆使してSLCO2A1がこの分子であることを証明し、マウスにおけるSLCO2A1のインビボノックダウンによって心虚血・再灌流時ATP放出が抑制されることを示すことによって心臓においても虚血再灌流性ATP放出路を与えることを証明した。しかし、論文投稿時の査読において、SLCO2A1の人工膜再構成法実験に対して、ネガティブコントロール実験を行って裏を取るように依頼があり、他の膜貫通性のチャネルタンパク質LRRC8Aやトランスポータタンパク質SLC3A2を再構成してもMaxi-Cl活性は出現しないことを確認した。第3の点については、マウスのランゲンドルフ灌流心においてATP計測実験で用いた灌流プロトコールが、虚血再灌流傷害のモデルとして用いることができることを、バルーンカテーテル法による左心室機能計測実験から確認し、現在そのモデルを用いて、マキシクロライドチャネルから放出されたATPの機能的役割(心筋保護もしくは心筋傷害)について検討することを可能とした。本研究において、1マキシアニオンチャネルMaxi-Clのポア構成分子実体がSLCO2A1であること、2C127細胞の浸透圧性細胞膨張時ATP放出にこのSCLO2A1が関与すること、3マウス摘出心臓において虚血・再灌流直後にピークを示すATP放出が観察され、これにもSLCO2A1が関与すること、4その際に放出されたATPは心保護効果を示し、アデノシンA1受容体シグナルによって仲介されることを明らかにした。マウスのイン・ビボ遺伝子サイレンシングの実験条件の設定に、かなりの日数を要した上に、更にはランゲンドルフ摘出心「虚血・再灌流」実験とその灌流液ATP測定そのものに長時間を要し、1日23匹の実験しかできず、例数をかせぐためにもかなりの月日を要した。そのため、イン・ビトロの培養心筋細胞実験まで手がまわらず、それに関しては課題研究年度内の後半以降の実施となるものと思われる。論文投稿時に査読者によって求められたCRISPR-Cas9ノックアウト実験およびパネキシン関与排除の実験の追加を成功裡に終えたので、平成28年度においては、まず初めに論文の再投稿を行う。
専門看護実践者のための共同意思決定

本研究はがん看護スペシャリストによる意思決定の共同行為に対して、行為研究(action research)によりその促進をはかることから始められた。最終成果は、がん看護学での研究方法の一つとして、行為研究の可能性を得られたことである。第1に、がん看護での行為研究は、研究者と実践者が批判理論・行為科学へのパラダイムの転換をすることで適用される。第2に、がん看護で行為研究を適用できる対人関係での研究課題がある。それは異なる集団に生じる矛盾を自己内省を通じて改善していくような対人関係でのテーマである。第3に、研究過程では、研究者と実践者が相互作用によって生じたと思われる言葉の意味変化と思考の連鎖に着眼する。行為研究のデータは、コミュニケーションでの言葉の解釈である。研究者と実践者はお互いの言葉の意味を探求するので、そのことが同時に自分自身に影響し、自らの力で新しい視点へ変換させる状況を生み出す。これは認識や内面感覚の変化であると言われる。さらに、水面のうねりのように、参加者間に時間を経て進展させていく考えの共有が生まれる。これは思考の連鎖と表現される。データをまとめるには、研究者がテープレコーダを聞き、遂語録を繰り返し読む中で、以下の3つの内容が示される対話を抜粋する。・相互理解にいたる過程のなかで、言葉の意味が変化する対話・参加者間の思考の連鎖が促された対話第4には、行為研究は価値観を伴うため、妥当性、確証性を示す三角法(triangulation)が求められる。研究目的は、批判的内省研究(Critical reflective research)により、専門看護実践者に必要とされる共同意思決定を促進することであった。平成8年度は、以下の3つの内容について明らかにできた。・共同意思決定の困難な場面認識・共同意思決定についての自己内省・批判的内省研究の確証性対象は、K大学研究科修士課程癌看護学専攻の4名を対象とした。対象者は、研究者の1名によって行われる学習プログラムと共同意思決定の困難な場面に焦点を当てた事後学習会に参加した。学習プログラムは、自己内省を促すように構成され、1回90分として1カ月に8回行われた。学習会では、テープレコーダーが使用された。録音記録の書き起こしから、2人の研究者の意見が一致した内容が抜粋された。確証性を示すために、研究者と実践者が主観的な相互の了解に至った議論過程が分析された。結果として、看護婦と患者の共同意思決定の困難な場面として、「意識障害が急に進む場合」、「医療者と患者との疾病回復期がずれている場合」などであった。自己内省の内容では、「看護側からのアプローチがないと共同意思決定はすすまない」「常に、人権や倫理を含めて考える」などであった。批判的内省研究で、研究者と実践者は共同意思決定の困難な場面について、相互了解できた。研究者は事例から具体的的改善方法について示唆でき、一方、実践者は改善のために自ら実践できる見通しを持てた。確証性は逐語記録から意味内容を抽象化して、2名の研究者の意見が一致した内容を示すことで可能であった。平成9年度の研究目的は行動研究を内容とする代表的な7つの書籍を比較し、批判的内省研究の特性を検討することであった。しかし、すでに、DenzinとLincoln(1994)により精選された質的研究の解説の中に、批判的研究(critical research)の特性がまとめられていた。そのため、予定されていた書籍の比較からDenzinとLincolnによるHandbook of Qualitative researchの検討に変えた。質的研究はその中に価値観を伴うこと(value-laden nature of inquiry)を強調するので、信頼性、事実描写性、確実性、確証性をいかに示すかが求められる。これらについて、DenzinとLincolnによる文献では、triangulationという以下の5つの考え方が示された。・データ

三角測量法(data triangulation):1つの研究に多様なデータを用いる方法本研究では、確証性だけが2人の研究者の意見一致により示されたので、これまでにまとめた研究内容をtriangulationの視点から見直すことが必要になった。[文献]質的研究(qualitative research)の文献検討から、行為科学をがん看護実践に応用するために、妥当性の検討と今後の研究テーマの精選を行った。行為研究での妥当性とは、一般化された法則性ではなく、状況にあわせた言語的な解釈であると考えられる。妥当性の検討は、これまで民族学的研究方法に依存してきた。しかし、行為研究では、現実を言葉で描くという避けられない問題が妥当性を示す困難さになる。Waterman(1998)は行為研究に関する妥当性について、弁証的・批判的・内省的の3つに分類して、検討する方法を示した。行為科学を適用できるテーマとして、がん患者が臨床試験へ積極的に参加し、さらに、安全な経過をたどるために、がん看護スペシャリストとの共同意思決定に焦点を絞った。1997年に改正された「医薬品の臨床試験の実施の基準に関する省令(新GCP)」第35条には治験実施医療機関の満たすべき要件として、看護婦もその必要な職員として位置づけられた。法的にも整備されてきており、インフォームド・コンセントの視点から、臨床試験での看護職者の役割開発をしていく予定である。
脳腫瘍における分子イメージングを併用した画像と病理・遺伝子解析との関連

本研究は、頭部MRI検査などの形態学を中心とした画像に、生理・生化学的情報を定量的に評価するPET検査、ASLやMRSなどの代謝・機能画像を併せて評価し、さらに画像と病理診断、画像と遺伝子診断を検討することにより、「画像検査のみで確定診断ができるのか」、さらに「画像検査より治療予後の予測ができるのか」、これらの課題を追及する研究である。
細菌由来の耐酸性因子を再構成して得られる酸防御機構を備えた生体模擬システム

中性pH域を至適とする生体反応を強酸性下で行うことが可能な「生体模擬システム」が構築できれば、低pHであるがゆえに不可能とされていた生体反応がpH調節を行うことなく可能になると考えられる。それを実現するためには、生体の耐酸性のメカニズムを理解する必要がある。本研究では、細菌の耐酸性に関与していると考えられる酵素H^+-ATPaseの性質を明らかにするために、Thiobacillus thiooxidans及び乳酸菌を材料として検討し、さらにATPase活性の強化を試みた。T.thiooxidans及び乳酸菌(Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus)のATPaseはいづれもF_1F_0タイプであった。T.thiooxidansのATPaseは反応最適pHが8.0で、その活性は亜硫酸イオン(SO_3^<2->)によって特異的に活性化された。乳酸菌のATPaseの反応最適pHは6.0で、SO_3^<2->の影響は認められなかった。L.acidophilusのATPase活性はL.bulgaricusよりも高く、このことは耐酸性の高さとも一致していた。細胞の耐酸性を高めるために、ATPase活性を人為的に強化することを試みた。乳酸菌をデカン酸存在下で培養すると、ATPaseの比活性が高まることが明らかになった。このとき細胞膜の脂質組成も変化していた。乳酸菌の膜画分を調製し、ここにオレイン酸やリノール酸などの不飽和脂肪酸を添加すると、ATPase活性が高くなることを見いだした。今後は、ATPase活性を強化した乳酸菌の耐酸性の評価を行い、さらにこのATPaseを利用した生体模擬システムの構築を目指した研究を行う。
新規分子ツール群の開発と応用による心筋イオンチャンネルの分子機能の解析

心疾患成因の解明と予知,発見と治療法確立の努力を行う上で,心筋興奮・伝導を担う分子レベルの解析と知見を得ることは不可欠である。本研究では心筋機能を担う分子のうち,心室筋形質膜のCa^<2+>チャンネルとNa^+チャンネル,さらにATP感受性K^+チャンネルを対象とし,生物有機化学的,免疫化学的,電気生理学的アプローチによって,この幅広い研究分野をつなぐ分子ツールを確立し,不整脈病因の解明に資しようとした。以下に2年間にわたる研究成果の概要を述べる。1.Ca^<2+>チャンネルの拮抗薬結合部位の同定:新規に合成したジヒドロピリジン誘導体,ジアジピンを用いた光アフィニテイラベル法によって,我々は既に骨格筋チャンネルの同薬物結合部位を同定しているが,この実験手法を心筋Ca^<2+>チャンネルにも適用して解析した。その結果,結合部位は骨格筋の場合同様,リピートIIIのS5-S6リンカー部と,リピートIVのS6を含む部分であるが,両チャンネルの間には数箇所アミノ酸置換が起っていることが判明した。これが同一薬物群に対しても両チャンネルでは10倍親和性がちがう大きな要因であると考察した。2.ATP-K^+チャンネル候補タンパクの単離:同チャンネルの特異的阻害剤グリベンクラミドの化学構造を有する新しい試薬を合成した。これを用いた光アフィニテイラベルを行い,それを手掛りにした精製を行った結果,分子量55をDaのタンパク質を単離し,その部分構造を明らかにした。蛍光抗体法で本タンパク質が心窒筋の細胞膜表面に局在することが確認できた。また本チャンネル開口剤の基本骨格を有するいくつかの化合物を合成し,その作用を電気生理学的に調べた。。3.Na^+チャンネルの抗不整脈薬結合部位解析をめざして:代表的クラスI抗不整脈薬メキシレチンをリード化合物とする光アフィニテイラベル用試薬とハプテン抗体産生用の誘導体を合成した。。1.L型Ca^<2+>チャンネルに対する代表的なブロッカーである1.4-ジヒドロピリジン化合物の結合部位を初めて同定した昨年度の骨格筋標品での成果をかまえ、本年度は心筋標品を用いてその検索を進めた。その結果、ビヒドロピリジン化合物の結合部位は心筋標品においても骨格筋同様、ドメインIIIとドメインIVの2ヶ所の特定部位であることを明らかにした。またこの2ヶ所のアミノ酸配列を心筋と骨格筋で比較したところ、数個所で、アミノ酸置換がみられることから、この置換が両組織におけるビヒドロピリジン化合物に対する親和性の差を決めていると推定された。2.心筋Na^+チャンネルをターゲットとする抗不整脈薬メキシレチンの結合部位を光アフィニティラベル法によって明らかにするため、そのラベル用試薬の調整を行った。またラベル部位同定のためのツールとして抗ペプチド抗体2種と抗リガンド抗体を作製した。3.ATP感受性K^+チャンネルの分子的同定をめざし、トリチウム標識したグリベンケラミド型光ラベル試薬を合成した。この試薬は心筋のATP感受性K^+チャンネル標品とナノモーラーオーダーの高い親和性を有することが確認できた。この試薬を用いて光ラベル反応を行ったところ、K^+チャンネルタンパク候補となる分子を特異的にラベルすることができたので、これを用いて現在このタンパク分子の同定を進めている。本研究は心疾患と密接な関連があると考えられるいくつかの心筋イオンチャンネル分子をとりあげ、それらを研究するのに最もふさわしい新しい分子ツールを作り上げ、これを用いてチャンネル分子群の構造と機能を明らかにすることを目的としている。

昨年度に引き続いて研究を続けた結果、以下のような新知見を得た。1.ATP感受性K^+チャンネルの単離とその局在:電気生理学的知見から、かなり高密度で存在するとみなされる本チャンネル分子を光アフィニテイラベル法で検索した。その結果、55kDaのタンパク質が特異的にラベルされ、これをマーカーに精製を行い、グリベンクラミド結合タンパクとしてその単離に成功した。また蛍光抗体法で調べた結果、このタンパク質は、心筋細胞膜表面に局在していることもわかった。2.カルシウム依存性Ca^<2+>放出チャンネルのリン酸化と機能制御:カルモジュリン依存性キナーゼ及びcAMP依存性キナーゼのどちらでリン酸化されても本チャンネル機能は上昇するが、その効果は相加的であり、また、上記キナーゼによる本チャンネル分子のリン酸化部位は異なっていることなどが明らかになった。
PACAP-PAC1誘発アストロサイトシグナル伝達を標的とする慢性疼痛治療戦略

下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドPACAPは一次感覚神経に発現し、末梢神経障害・炎症に伴い発現上昇するなど、脊髄痛覚伝達に重要な役割を持つことが示唆されていたが、関与する受容体やその下流の情報伝達系など、多くの不明な点が残されている。そこで我々は、マウスにPACAP等をくも膜下腔投与し、疼痛行動の薬理学的解析、およびウェスタンブロット・免疫組織化学的解析を行った。その結果、PACAPはPAC1受容体を介して脊髄後角神経細胞およびアストロサイトを活性化させ、機械的痛覚過敏を長期間誘発することが判明した。PAC1受容体情報伝達系は疼痛の慢性化に重要な役割を持つことが示唆された。申請者らはこれまでにPACAP(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide)をマウス脊髄くも膜下腔に投与すると、数時間を超える慢性痛を引き起こし、PAC1シグナリングによる脊髄アストロサイト早期活性化がその寄与する可能性を見いだした。本研究ではPACAP-PAC1シグナルによる脊髄アストロサイト早期活性化メカニズムを検証し、本シグナルで駆動される下流分子群の中から疼痛慢性化に重要なグリア-ニューロン・クロストーク分子について検討し、以下の知見を得た。まず慢性疼痛分子の疼痛行動学的、組織学的、生理学的検討に関して、マウスにPACAPを髄腔内単回投与すると、後肢の機械的閾値は顕著に低下(機械的アロディニア)し、少なくとも投与後12週まで持続し、この発症は、PAC1受容体アンタゴニストmax.d.4の前処置により寛解された。一方、PACAPは熱性痛覚過敏を誘発しなかった。アストロサイトマーカー(glial fibrillary acidic protein;GFAP)の免疫組織化学とウェスタンブロット解析を実施したところ、投与後1日目から脊髄内GFAPの有意な発現上昇が認められ、少なくとも12週後まで持続していた。また、アストロサイト活性化阻害薬アジピン酸の同時投与により、PACAP/MAX誘発機械的アロディニアの発症は、ほぼ完全に阻害された。PACAP投与後30分で発現が誘導される遺伝子群としてBambiなど6種類見いだした。PACAPによる脊髄のANLS(astrocyte-neuron lactate shuttle)と疼痛慢性化の関連性の検討に関してはグリコーゲンホスホリラーゼ阻害薬であるDABの同時投与によりPACAPにより誘導される疼痛様行動が抑制される知見を得て、さらに解析を進めている。申請者らはこれまでにPACAP(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide)をマウス脊髄くも膜下腔投与すると、数時間を超える慢性痛を引き起こし、PAC1シグナリングによる脊髄アストロサイト早期活性化が寄与する可能性を見出した。アストロサイトマーカー(glial fibrillary acidic protein;GFAP)の免疫組織化学とウェスタンブロット解析を実施したところ、投与後1日目から脊髄内GFAPの優位な発現上昇がみとめられ、少なくとも12週後まで持続していた。PACAP投与後30分で発現が誘導される遺伝子群としてBambiなど6種類見出した。PACAPによる脊髄のANLS(astrocyte-neuron lactate shuttle)と疼痛慢性化の関連性の検討に関してはグリコーゲンホスホリラーゼ阻害薬であるDABの同時投与によりPACAPにより誘導される疼痛様行動が抑制される知見が得られた。さらに、慢性痛に関与する脊髄でのアストロサイトを中心とした神経伝達メカニズムの解析を進めているところである。平成26年度、まず慢性疼痛の1つである機械的アロディニア現象について、その疼痛行動学的解析を通じて、そのメカニズムの解明に取り組み、アストロサイトの活性化の重要性が示唆された。そしてPACAPによって発現誘導される遺伝子群の中にPACAPによって引き起こされる疼痛に直接関係するであろうことが、特異的阻害剤の投与により明らかとなったことや、DABを投与することで同じくPACAPによって起こる疼痛が減弱するという興味ある知見が得られた。平成27年度は、PACAPのPAC1刺激による機械的アロディニアにみられるニューロン内ERK活性化は、JNK活性化を伴ったアストロサイトの早期活性化が関与していることを見出した。また、PACAP髄腔内投与による長期間継続する機械的アロディニアはDABで抑制されるが、培養アストロサイトを用いたグリコーゲン量を測定を行った結果、アストロサイト-ニューロン-乳酸シャトルの関与を明確にできた。PACAP(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide)をマウスにくも膜下投与すると、数時間を超える慢性痛を引き起こし、PAC1シグナリングによる脊髄アストロサイト早期活性化が寄与する可能性を見出した。

本研究では、PACAP-PAC1シグナルによる脊髄アストロサイト早期活性化メカニズムを検証し、本シグナルで駆動される下流分子群の中から疼痛慢性化に重要なグリア-ニューロン・クロストーク分子について検討し、以下の知見を得た。まず、慢性疼痛分子の疼痛行動学的、組織学的、生理学的検討に関して、マウスにPACAPを髄腔内単回投与すると、後肢の機械的閾値は顕著に低下(機械的アロディニア)し、少なくとも投与後12週まで持続し、この発症は、PAC1受容体アンタゴニストmax.d.4の前処置により寛解された。アストロサイトマーカー(GFAP:glial fibrillary acidic protein)の免疫組織化学とウェスタンブロット解析を実施したところ、投与後1日目から脊髄内GFAPの優位な発現上昇が認められ、少なくとも12週間後まで持続していた。また、アストロサイト活性化阻害薬アジピン酸の同時投与により、PACAP/MAX誘発機械的アロディニアの発症は、ほぼ完全に阻害された。PACAP投与後30分で発現が誘導される遺伝子群としてBambiなど6種類見出した。これら一連のPAC1刺激による早期の機械的アロディニア発生については、細胞内シグナル伝達としてERKからJNKに向かう活性化によるものであると確認できた。下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドPACAPは一次感覚神経に発現し、末梢神経障害・炎症に伴い発現上昇するなど、脊髄痛覚伝達に重要な役割を持つことが示唆されていたが、関与する受容体やその下流の情報伝達系など、多くの不明な点が残されている。そこで我々は、マウスにPACAP等をくも膜下腔投与し、疼痛行動の薬理学的解析、およびウェスタンブロット・免疫組織化学的解析を行った。その結果、PACAPはPAC1受容体を介して脊髄後角神経細胞およびアストロサイトを活性化させ、機械的痛覚過敏を長期間誘発することが判明した。PAC1受容体情報伝達系は疼痛の慢性化に重要な役割を持つことが示唆された。平成26年度、まず慢性疼痛の一つである機械的アロディニア現象について、その疼痛行動学的解析を通じて、そのメカニズムの解明に取り組み、アストロサイトの活性化の重要性が示唆された。そしてPACAPによって発現誘導される遺伝子群の中に、PACAPによって引き起こされる疼痛に直接関係するであろうということが、特異的阻害剤の投与により明らかとなったことや、DABを投与することで同じくPACAPによって起こる疼痛が減弱するという興味ある知見を得たことから、当初の研究実施計画に基づいて概ね順調に研究が進行していると判断される。
嚥下運動パターンの非侵襲的検査法の確立と胃電図との相関に関する研究

本研究の目的は、健常成人を対象として、嚥下運動パターンの非侵襲的検査法の確立と嚥下時における胃電図から推察される胃運動との関係を明らかにすることである。主な結果は以下の2点に要約される。(1)健常成人を対象に、赤ランプの合図により随意性嚥下を誘発し、嚥下量や頸部姿勢の違いが喉頭運動や呼吸機能に及ぼす影響について検討した。嚥下量の増加により喉頭運動持続時間と嚥下性無呼吸時間が有意に延長した。後屈位では前屈位に比べて、合図から喉頭運動及び嚥下性無呼吸が始まるまでの潜時が短縮し、さらに喉頭運動持続時間が延長した。これらの知見により、喉頭や軟口蓋の運動の開始時間を短縮すること、および喉頭挙上時間を延長することにより、後屈位で生じやすい誤嚥を回避する機構を有していることが示唆された。(2)健常成人において、随意性嚥下および咽頭喉頭領域への各種溶液の注入による反射性嚥下時の胃運動の変化が胃電図上にどのように反映されるかについて検討した。水20ccの随意性嚥下に伴う食道の伸展により、胃電図には嚥下直後から一過性の振幅の増大が見られた。さらに、咽頭・喉頭領域への蒸留水、濃度0.9%食塩水及び0.05%クエン酸溶液を注入して引き起こした反射性嚥下において、クエン酸>水>食塩水の順で胃電図の振幅は増大した。嚥下が始まるまでの潜時は、食塩水>水>クェン酸の順で長かった。今回の研究により、健常者において食道伸展による機械的刺激あるいは舌根部への各種溶液の注入による化学的刺激により、胃電図上に顕著な一過性の応答が認められることが明らかになった。嚥下障害患者の障害程度把握や訓練計画立案の基礎的資料として活用する目的で、健常成人の嚥下時における頸部肢位と呼吸運動・喉頭運動・嚥下音の相関を検討した。股関節90屈曲位、体幹0度伸展位になるように端座位を取らせ基本姿勢とし、頸部が20度前屈、あるいは10度後屈になるように頸部肢位を調整した。嚥下に伴って嚥下性無呼吸が現れることはよく知られている。前屈位と比較して、後屈位では、喉頭運動持続時間と無呼吸持続時間は有意に長く、喉頭潜時と無呼吸潜時は有意に短かった。従って、頸部を後屈することにより、嚥下物の咽頭流入が加速されるために誤嚥が誘発されやすいことが示唆された。上記の嚥下時の基礎データをもとに、胃の電気活動を経皮的に記録して、正常嚥下運動時に胃電図にどのような変化が見られるのかを検討した。対象は腹部愁訴がない健常者で行った。被験者にAg-AgCl電極を腹壁に装着し、時定数とフィルターを改造した生体電気用アンプを用いて増幅し、AD変換した後、コンピュータ上で解析した。安静臥位にてチューブを口腔内に挿入し一定の流量で水、あるいは0.9%NaClを口腔内に流入し、反射性嚥下を誘発した。両溶液とも嚥下に伴い胃電図は一時的に抑制された。随意性嚥下を行ったグループでも、両溶液の嚥下に伴い著明な胃電図上の抑制が見られた。

この抑制は嚥下に伴う筋肉運動による可能性を検討するため、空嚥下時の胃電図を検討したが、胃電図上には有意な変化は見られなかった。従って、この反射の求心路は嚥下に伴う喉頭及び食道への機械的伸展刺激による上喉頭神経である可能性が考えられた。現在、嚥下物の量と質が嚥下や胃電図のパワースペクトラムや振幅の変化にどのような影響を及ぼすのかについて検討している。今後、老人あるいは嚥下障害者にできうる範囲でこの実験を施行し、嚥下障害の原因探求のためのデータを収集していく予定である。嚥下に伴う食道の伸展により、反射性に胃は弛緩することが知られている(受け入れ弛緩)。この反射の中枢は延髄にあると考えられており、嚥下障害患者の障害程度の把握や訓練計画立案の基礎的資料として活用する目的で、健常成人の嚥下に伴う胃運動の変化が胃電図上にどのように反映されるかについて検討した。まず、予備実験としてラットを用い、胃電図上の変化と胃の内圧との間の相関について観察した。喉頭部への水刺激に対して、胃運動は持続的に抑制されたが、胃電図上では一過性の振幅の増大が認められた。健常人35名を対象に、随意性嚥下と反射性嚥下時の胃電図の変化について検討した。随意性嚥下に伴う食道の伸展により、胃電図には嚥下直後から一過性の振幅の増大が見られた。さらに、咽頭・喉頭領域への蒸留水、濃度0.9%食塩水及び0.05%クエン酸溶液を30秒間注入して引き起こした反射性嚥下において、クエン酸>水>食塩水の順で胃電図の振幅は増大した。嚥下が始まるまでの潜時は、食塩水>水>クエン酸の順で長く、また嚥下回数はクエン酸>水>食塩水の順に多かった。従って、咽頭及び喉頭への酸味による刺激は強い嚥下誘発効果を持つことが示唆された。今回の研究により、健常者において食道伸展刺激あるいは舌根部への各種溶液の注入による化学的刺激により、胃電図上に顕著な一過性の応答が認められることが明らかになった。これらの反射の求心路は上喉頭神経及び食道支配の迷走神経である可能性が高い。したがって、もしこの実験が嚥下障害者に適応すれば、胃電図上の振幅の変化を検討することにより、臨床上の診断の一助になり得るのではないかと考えられる。
迷走神経刺激療法のトランスレーショナル研究

迷走神経刺激療法(Vagus nerve stimulation; VNS)は,難治性てんかん発作に対する緩和的治療の一つで,体内に電気刺激装置を埋植し,左迷走神経を間歇的かつ慢性的に刺激する.VNSによる臨床的てんかん発作抑制効果が広く認められる一方で,その作用機序は未だ解明されていない.本研究では,動物実験と臨床研究により,VNSが大脳皮質の神経活動に与える影響を調べ,てんかん病態,知覚・認知,記憶・学習など脳の諸機能において,VNSの影響を考察した.迷走神経刺激療法(VNS)による脳活動の調整機能を明らかにし,さらに新たな利用方法を探索することを目指し,具体的には,(i)大脳皮質内の神経活動や皮質・視床・海馬の相互作用に対して,VNSが及ぼす影響を調べ,てんかん発作の発生と抑制のメカニズムを明らかにすること,(ii) VNSによる神経活動の調整が,知覚・認知と記憶・学習機能に及ぼす影響を調べて,VNSと音学習を併用した耳鳴治療(TRT)の可能性を探索することを目的とする.本年度,臨床研究では,VNSの治療成績を蓄積する研究体制を整えた.動物実験では,頭部拘束下で聴知覚を確認するための行動実験を行いながら,電気生理計測を可能とする実験系を構築した.頭部を実験系に固定した動物は,液体の射出口を備えたレバーを引くことによって行動する。あらかじめ断水したラットにレバー経由で与える水を報酬とする.動物には外界からの刺激として,前方に設置したスピーカからの音刺激及びLEDライトからの光刺激を提示することが可能である.実験系に動物の頭部を固定するために,本研究では別途作成したヘッドアタッチメントを,外科手術によって,あらかじめラットの頭骨に固定した上で,そのアタッチメントを把持する方式を採用した.ヘッドアタッチメントは,動物の聴覚野が位置する側頭から電極がアプローチできるスペースを備えるように,ABS樹脂の3Dプリンタで設計した.実験では,音提示条件に応じてレバーを引かせるタスクを学習させたところ,5日間の訓練により提示音の判定能力を示す指標が有意に上昇した.また,100計測点を有する微小電極アレイでの覚醒計測にも成功した.これらのことから,動物の主観的な知覚を把握し,そのVNSによる影響を調べるための実験系の基盤を用意できたと考える.本年度は,参画研究者との有機的な連携を通じて,臨床研究と動物実験とを両輪とした研究体制を整えた.特に,開発した動物実験系は,臨床的な知見を生理実験により検証できる点で有意義であると考える.本研究の目的は,迷走神経刺激療法(VNS)による脳活動の調整機能を明らかにし,さらに新たな利用方法を探索することである.具体的には,(i)大脳皮質内の神経活動や皮質・視床・海馬の相互作用に対して,VNSが及ぼす影響を調べ,てんかん発作の発生と抑制のメカニズムを明らかにすること,(ii) VNSによる神経活動の調整が,知覚・認知と記憶・学習機能に及ぼす影響を調べて,VNSと音学習を併用した耳鳴治療(TRT)の可能性を探索することである.本年度は,VNSが知覚情報処理に及ぼす影響を調べた.具体的には,ラットの聴覚系を対象として,視床(内側膝状体; MGB)と大脳皮質各層から神経活動を多点同時計測し,神経細胞の受容野,誘発反応の振幅,繰り返される音刺激への順応の強さを定量化し,VNS前とVNS中で比較した.その結果,視床では,VNSにより,受容野の特徴,誘発反応・順応の強さは,いずれも変化しなかった.一方,聴覚野では,層ごとに異なる変化が認められた.入力層である4層は,反応閾値は変わらないが,反応選択性が拡がった.中間層である2/3層は,反応閾値が低下し,反応選択性も拡がった.出力層である5/6層は,反応閾値が上昇した.また,聴覚野での誘発反応・順応の強さは,VNSにより低下した.これらの結果は,VNSが,視床レベルではなく,大脳皮質レベルで影響を及ぼすこと,また,その影響は層ごとに異なることを示しており,VNSの作用メカニズムの解明に資すると考える.本年度,動物実験で得られた結果は,VNSが及ぼす影響が脳の部位ごとに異なることを示している.臨床的に,VNSには,てんかん発作の低減,記憶力向上,抗うつ効果など,さまざまな効果が報告されており,その作用メカニズムを解明するために大きな一歩となった.本研究の目的は,迷走神経刺激療法(VNS)による脳活動の調整機能を明らかにし,さらに新たな利用方法を探索することである.具体的には, (i)大脳皮質内の神経活動や皮質・視床の相互作用に対して,VNSが及ぼす影響を調べ,てんかん発作の発生と抑制のメカニズムを明らかにすること,(ii) VNSによる神経活動の調整が,知覚・認知と記憶・学習機能に及ぼす影響を調べて,VNSと音学習を併用した耳鳴治療(TRT)の可能性を探索することである.これまでに,VNSが神経活動に及ぼす影響は,大脳皮質の層ごとに異なることを明らかにした.入力層の4層では反応閾値が広がり,中間層の2/3層は活性化し,出力層の5/6層は不活性化する.本年度は,まず,移動エントロピーにより,各層間の情報の流れを定量化し,それらが解剖学的な特徴と合致することを確かめた.また,4 mm角に100計測点を有する電極を用いて,層ごとに神経活動パターンを調べた.

活動パターンから音情報をデコーディングしたところ,2/3層のデコーディングは,4層や5層よりも難しかった.これらの集団的な情報表現に対するVNSの影響は現在調査中である.VNSが聴知覚に与える影響を調べるために,ラットの聴力検査を実現できる実験系を構築した.この系ではラットの頭部を固定した状態でレバーを引かせる.音に対してレバーを引くようにラットを訓練することで,ラットの聴知覚を報告させられる.強大音に暴露してラットを難聴にしたところ,予想通り,レバー引き行動の頻度の低下を認めた.また,耳鳴様行動を示す個体も認められた.これらの実験により,VNSが聴知覚に与える影響を調べる目途がついた.VNSの影響を調べるための実験が着実に進められている.本研究の目的は,迷走神経刺激療法(VNS)による脳活動の調整機能を明らかにし,さらに新たな利用方法を探索することである.具体的には, (i)大脳皮質内の神経活動や皮質・視床の相互作用に対して,VNSが及ぼす影響を調べ,てんかん発作の発生と抑制のメカニズムを明らかにすること,(ii) VNSによる神経活動の調整が,知覚・認知と記憶・学習機能に及ぼす影響を調べて,VNSと音学習を併用した耳鳴治療(TRT)の可能性を探索することである.動物実験では,ラットに強大音を曝露することで,耳鳴様行動を示す個体を作り,その聴覚野の活動を調べた.その結果,聴覚野の特定部位の同期が,耳鳴様行動の指標と相関することがわかった.また,VNSによる聴覚野の同期の調整も調べたところ,音刺激に対して,表層の同期が亢進し,深層の同期が低下することがわかった.さらに,これらの音の聞こえを定量化するために,ラットの音嗜好性を調べられる行動実験系を確立した.臨床研究では,VNS刺激の即時的効果について,頭蓋内電極およびNIRS(近赤外線分光法)を用いて調べた.頭蓋内電極抜去時にVNS植込を行った難治性てんかんの患者の術中脳波計測においては,VNS刺激の有無による皮質脳波および単一ニューロン活動の変化を確認した.VNS植込後慢性期の患者におけるNIRS計測では,VNS刺激による血流上昇は観察されなかったが,認知課題中にVNS刺激を行うことにより有意な血流上昇が得られることが確認された.またこの血流変化はVNS治療反応群でのみ有意であり,VNSの治療効果との関連が示唆された.さらに本邦における薬剤抵抗性てんかんに対する迷走神経刺激療法の使用成績をまとめて報告するとともに,診療ガイドラインを作成した.迷走神経刺激療法(Vagus nerve stimulation; VNS)は,難治性てんかん発作に対する緩和的治療の一つで,体内に電気刺激装置を埋植し,左迷走神経を間歇的かつ慢性的に刺激する.VNSによる臨床的てんかん発作抑制効果が広く認められる一方で,その作用機序は未だ解明されていない.本研究では,動物実験と臨床研究により,VNSが大脳皮質の神経活動に与える影響を調べ,てんかん病態,知覚・認知,記憶・学習など脳の諸機能において,VNSの影響を考察した.今後も臨床研究と動物実験の有機的な連携を図り,臨床上の意義と基礎研究としての意義の両面を追求していく.動物実験では,可塑性への影響を調べ,てんかん発作の低減や耳鳴緩和のメカニズムに迫る.さらに,これらの動物実験での知見は,臨床研究で裏付けるべく,参画研究者の有機的な連携を深める.
ラプラス作用素の幾何学

ノン・コンパクト・リーマン多様体あるいは境界付多様体上の解析的不等式とその多様体の幾何学的情報についての間の関係の解明を行った。具体的には、必ずしも凸とは限らない境界を持つコンパクト・リーマン多様体に対する解析的不等式であるintrinsic ultracontractive boundをDavies-Simonの手法を使い、その多様体の幾何的な量(リッチ曲率の下限、直径、境界の第二基本形式の上限、内部R-ball条件)により評価を与えた。また,そのためには、Hardy及びL^P Sobolev不等式をその準備として証明する必要があり、それも実行した。これらの解析的不等式は大変重要である。実際それらから、例えば、必ずしも凸とは限らない境界を持つ多様体のノイマン熱核の上限やディリクレ熱核とグリーン核の境界挙動、また、ディリクレ固有値問題の最初の固有値のギャップの下限等が分かるからである。ノンコンパクト多様体についての成果としては、以下のことが分かった:一般に、完備リーマン多様体の上にはラプラシアンと呼ばれる微分作用素が定義され、そのスペクトルと多様体の持つ幾何的性質との間には密接な関係があり、多くの研究者により様々な角度から研究されている。特に、考える多様体がノンコンパクト、完備のとき、ラプラシアンの本質的スペクトラムはその多様体の無限遠の幾何のみに依存する。そこで、多様体の無限遠の近傍においてある測度に関して曲率の平均を考え、その平均量の無限遠での収束と本質的スペクトラムとの間の関係について考察を試み、Donnelly、及び、自らの結果を一般化した。研究分担者の加須栄氏は、多様体収束とディリクレ形式の収束の関係を、佐藤氏はヨルゲンセン群の研究を、芥川氏は山辺不変量の研究を、また、奥村氏は、タイヒミュラー空間の大域解析的研究を行った。本年度は、研究目的・研究実施計画の(b)すなわち,ノン・コンパクト・リーマン多様体あるいは境界付多様体上の解析的不等式とその多様体の幾何学的情報についての間の関係の解明を中心に行った。また,そのためには、Hardy及びL^p Sobolev不等式をその準備として証明する必要があり、それも実行した。実際、それらから、例えば、必ずしも凸とは限らない境界を持つ多様体のノイマン熱核の上限やディリクレ熱核とグリーン核の境界挙動、また、ディリクレ固有値問題の最初の固有値のギャップの下限等が分かるからである。以上は(境界付)コンパクト多様体についてであるが、ノンコンパクト多様体についての成果としては、以下のことが分かった:ラプラシアンの本質的スペクトラムはその多様体の無限遠の幾何のみに依存ことが知られているが、それと無限遠における曲率の平均との関係について考察を行い、Donnelly及び自らの結果の一般化を得た。すなわち、極を持つ多様体の非正なるradial curvatureが無限遠において、積分による平均の意味で定数-K(K【greater than or equal】0)に近づくとき、区間[(n-1)^2K/4,∞]がラプラシアンの本質的スペクトラムに含まれることを示した。研究分担者の加須栄氏は、多様体収束とディリクレ形式の収束の関係を、佐藤氏はヨルゲンセン群の研究を、また、奥村氏は、タイヒミュラー空間の大域解析的研究を行い、これらの研究とラプラス作用素との間の関係解明が待たれる。

本年度はノンコンパクト多様体の持つ解析的性質と幾何的性質の間の関係についての昨年度の研究をさらに推し進め、改良を加えた。一般に、完備リーマン多様体の上にはラプラシアンと呼ばれる微分作用素が定義され、そのスペクトルと多様体の持つ幾何的性質との間には密接な関係があり、多くの研究者により様々な角度から研究されている。特に、考える多様体がノンコンパクト、完備のとき、ラプラシアンの本質的スペクトラムはその多様体の無限遠の幾何のみに依存する。そこで、多様体の無限遠の近傍においてある測度に関して曲率の平均を考え、その平均量の無限遠での収束と本質的スペクトラムとの間の関係について考察を試み、Donnelly、及び、自らの結果を一般化した。すなわち、極を持つリーマン多様体において、極からの距離関数rを用いて、重みexp(-cr)の測度exp(-cr)dv_Mを考える。ここで、cは正の定数、また、dv_Mはリーマン測度である。radial方向のリッチ曲率の負の定数-c^2/(n-1)を下回る部分のp乗の、この重み付き測度に関する平均が無限遠でゼロに収束するとき、ラプラシアンの本質的スペクトラムが区間[c^2,∞)を含むことが新たに分かった。ここで、nは多様体の次元である。この結果の系として、特に、極を持つリーマン多様体の体積が無限で、radial方向のリッチ曲率の負の部分のp乗の、リーマン測度に関する平均が無限遠でゼロに収束するとき、ラプラシアンの本質的スペクトラムが区問[0,∞)に一致することが分かる。研究分担者の加須栄氏は、多様体の収束とディリクレ形式の収束の間の関係について、佐藤氏は、コルゲンセン群について、芥川氏は、山辺不変量について、それぞれ研究を行った。
熱帯多雨林生態系の人と自然

合宿形式の研究会が計4回開催され、各担当者から以下の話題提供があり、活発な討議が進められた。(1).「熱帯林修復のための極相陽樹のスクリーニング」(山倉);熱帯177種と日本15種を取り上げ、成長データーを解析した結果、先駆種の性質と極相種の性質を合わせ持つ樹種が理想的な造林候補種であるとした。(2).「スラウェシの森と海の生業」(遅沢);スラウェシ周辺の伝統的生業と生活原理を森と海との関連の中でとらえ、同地域の森林を保持する上で海を如何に使うかが重要課題になることが指摘された。(3).「森林資源と慣習法-熱帯林保護の枠組みを求めて-」(増田);熱帯地域の森林利用に関する法規制の歴史的変遷を概観し、慣習法のはたしてきた役割が検討された。議論は欧米や日本の事例との法社会学的比較検討へと展開した。(4).「ボルネオの生態環境-人と森-」(山田);ボルネオの各種の森林の生態構造を明らかにし、それぞれの小地域において人と森の関係は重層構造をなし、少々の撹乱は受容する調和空間をなしている。この生態空間の持つ意味が検討された。(5).「ドイツを主体とする欧州の森林観・森林利用の歴史的変遷」(村尾);欧州における森林利用の変遷を概観すると「近代」こそが保続的な森林利用を可能にしたことが明かである。熱帯地域においても多目的林業を導入することが、調和のとれた森林の保全と多用な利用に通ずることが検討された。これらの研究会の成果としては人と森の関連を視座に入れた東南アジア熱帯多雨林生態系の構造が地域間比較を通じて明らかになったこと、熱帯多雨林生態系把握の際に地域間比較とともに歴史的な視点を考慮する必要性が確認されたこと、また、より具体的、実践的議論が進められわが国の山村問題の解決策の熱帯地域への適用可能性が検討されたなどがあげられる。来年度は以上の成果を踏まえて、分担者の調査経験を、歴史的にかつ比較地域的に肉づけする。
西部太平洋における炭酸塩と二酸化炭素に関する研究

1.海水中に溶存する炭酸物質および二酸化炭素分圧、カルサイトとアラゴナイトに対する飽和度の値を計算するための簡単なプログラムを作成して、KH-88-1次航海のデータ(水深、水温、塩分、pH、アルカリ度)を使つて、西部太平洋のポテンシャル二酸化炭素分圧およびカルサイトに対する飽和度を計算した。北緯8度東経150度)付近ではポテンシヤル二酸化炭素分圧が1800uatmの等圧線として、赤道湧昇によって、水深300メートル付近まで湧き上がつているが、海表面まで達していなかった。25°N、145°Eの観測点において、カルサイトに対する飽和水深は約1000メートルであった。2.沖縄県糸満市ルカン礁および本部町瀬底島のサンゴ礁調査を行った。海水中のカルシウムおよびアルカリ度の精密分析法を確立した後、ルカン礁において、CaCO_3生産量を測定した。その結果、1993年7月は0.74gCaCO_3/m^2/h、8月は1.0gCaCO.m^2/h、9月は0.91gCaCO_3/m^2/h、そして10月は0.55gCaCO_3/m^2/hとなった(昼間:13-15時の測定)。夜間、13時の測定ではCaCO_3生産は行われないことも明らかになった。下図にそれぞれの無機炭素および有機炭素生産速度を示す。さらに、海水の二酸化炭素分圧をNDIRおよびガスクロ(島津製作所)を用いて測定した結果、上記の調査時間帯(13-15時)のCO_2分圧はそれぞれ、7月は107-223ppm、9月は171-313ppm、10月は151-243ppmであった。また、琉球大学において測定した昼間(12-15時)の大気中の二酸化炭素濃度はそれぞれ、7月は365-370ppm、10月は360-365ppmであった。よって、サンゴ礁は昼間はCaCO_3を生産するとともに、二酸化炭素を吸収していると結論できる。