hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト胎児発育の制御に関わる胎児胎盤循環動態および細胞成長因子の意義に関する研究

子宮内発育遅延の胎児を対象に、微小循環として捉えた胎児胎盤循環動態について検討を加えた。invivoにおける子宮-胎盤-胎児系の循環動態の超音波学的ならびに生化学的解析から、1)本症胎児では脳血管抵抗の減少と胎盤血管抵抗の上昇が存在すること、2)この機序は、背景にある低酸素状態に対応した血流再分配機構の発動であるが明らかとなった。一方、本症胎児を対象とした血管内皮細胞の態様の観察から、1)妊娠中毒症に合併した症例には血管内皮細胞障害因子が、2)母胎合併症と胎児形態異常を伴わない症例には血管内皮細胞増殖抑制因子が存在することが明らかとなった。これらの成績から、1)ヒト胎児の発育には、要因のひとつとして胎盤の微小循環動態の破綻の存否が関与すること、2)この事象の発現には、血管内皮細胞障害因子あるいは細胞増殖抑制因子によって抑制される血管内皮細胞の機能が関与することが示唆された。本年度は子宮内発育遅延における胎児胎盤循環動態を、1)細胞生物学的:血管内皮細胞機能、2)超音波学的:in vivoにおける子宮一胎盤一胎児系の循環動態の2点から検討することにより、ヒト胎児発育に関わる胎児胎盤循環動態を明らかにすることを目的とした。対照には同一妊娠週数で正常発育の胎児を用いた。1)血管内皮細胞の機能の検討には、血管内皮細胞のプロスタサイクリン(PG12)およびエンドセリンの産生能を指標として用いた。血管内皮細胞は臍静脈から分離・培養した。その結果、子宮内発育遅延児では正常発育胎児に比し、臍動脈血管内皮細胞でのPG12およびエンドセリン産生能の低下を認めた。以上より、胎児胎盤循環動態には血管内皮細胞の産生する血管作動物質が関与する可能性が示唆された。2)in vivoにおける子宮一胎盤一胎児系の循環動態の検討には、超音波ドプラ法による臍動脈・中大脳動脈の血流計測を用いた。その結果、子宮内発育遅延児では正常発育胎児に比し、臍動脈のResistance Index(RI)値の上昇および中大脳動脈のRI値の低下を認めた。このことから、子宮内発育遅延児では胎盤血管抵抗の上昇と脳血管抵抗の減少が存在することが示唆された。.ヒト胎児における胎児胎盤循環の調節機構に関する検討子宮内発育遅延(IUGR)の胎児、新生児を対象として、微小循環として捉えた胎児胎盤循環動態を、1)細胞生物学的:血管内皮細胞機能および関連物質との相互作用、2)超音波学的:in vivoにおける子宮-胎盤-胎児系の循環動態の2点から検討を加えた。対照は同一妊娠週数で正常発育の胎児・新生児を用いた。1)血管内皮細胞機能および関連物質との相互作用に関する検討は、血管内皮細胞のPG12およびエンドセリンの産生能を指標として用いた。PG12およびエンドセリン産生量はELISA法を用いて測定した。その結果、IUGR胎児では正常発育胎児に比し、臍帯血管内皮細胞でのPG12およびエンドセリンの産生能の低下を認めた。このことから、IUGR胎児の胎児胎盤循環動態には血管内皮細胞の産生する血管作動性物質が関与する可能性が示唆された。2)in vivoにおける子宮-胎盤-胎児系の循環動態の検討は、超音波ドプラ法による臍動脈・中大脳動脈の血流計測を用いた。その結果、IUGR胎児では正常発育胎児に比し、臍動脈のResistance Index(RI)値の上昇および中大脳動脈のRI値の低下を認めた。このことから、IUGR胎児では胎盤血管抵抗の上昇と脳血管抵抗の減少が存在することが示唆された。.ヒト胎児における発育および成熟制御機構の細胞生物学的検討子宮内発育遅延(IUGR)の胎児・新生児を対象として、胎盤血管床の形成に関して細胞生物学的に検討を加えた。胎盤血管床の形成の検討には、胎児血清が血管内皮細胞に及ぼす増殖能および傷害性の二つの指標を用いた。細胞増殖能および細胞傷害性の尺度には、各々3H-チミジン取り込み能と51Cr解離能を用いた。血管内皮細胞は母児に合併症を認めない臍静脈から分離・培養した。その結果、IUGR胎児では正常発育胎児に比し、3H-チミジン取り込み能の低下を認めた。

一方、妊娠中毒症に伴うIUGR胎児では、母体合併症を伴わないIUGR胎児および正常発育胎児に比し、51Cr解離能の上昇を認めた。このことから、妊娠中毒症に伴うIUGR胎児には血管内皮細胞傷害因子、母体合併症を伴わないIUGR胎児には血管内皮細胞増殖抑制因子が存在することが示唆された。子宮内発育遅延の胎児を対象として、微小循環として捉えた胎児胎盤循環動態と個々の胎児が有する細胞増殖制御機構との関連について検討を加えた。対照に同一妊娠週数で正常発育の胎児を用いた。胎児胎盤循環動態の評価には、クロミウム乖離を指標として母体ならびに胎児血清の血管内皮細胞に対する傷害性および超音波ドプラ法で得られる臍動脈RI(resistanceindex)値を指標として胎盤血管抵抗を用いた。胎児が有する細胞増殖制御機構は、個々の胎児の臍帯静脈から血管内皮細胞を分離・培養し、tritiatedチミジンの取り込み能を指標として血管内皮細胞増殖能を評価した。その結果、1)子宮内発育遅延の胎児では胎盤血管抵抗の上昇が存在すること、そのうち、2)母体に妊娠中毒症を合併した症例では母体ならびに胎児血清に血管内皮細胞を傷害する因子が存在すること、3)母体に合併症が認められない症例では臍帯静脈血管内皮細胞の増殖能が低下していることが明らかになった。これらの成績から、子宮内発育遅延の胎児では、1)胎児胎盤循環動態の障害が存在すること、2)本事象の発現には血管内皮細胞の機能障害を介すること、3)母体妊娠中毒症の有無によって、互いに異なる病態が関与することが示唆された。
卵巣癌における癌幹細胞マーカーの検索と癌幹細胞分化誘導薬の開発

【目的】癌幹細胞マーカーに関与する遺伝子の検索のために正常卵巣上皮(OSE)、封入嚢腫(IC)、樹立した正常卵巣上皮不死化細胞株(IOSEC)を用いてMenchymal to Epithelial Transition(MET)の関与を検討した。さらにIOSECとそのprimary culture(PC)細胞間で発現が異なる遺伝子を包括的ヒトゲノム発現解析によりスクリーニングし、卵巣癌発生に関する遺伝子の検索を試みた。【成績】1)種々の抗原発現よりOSEは中皮細胞の性格を示し、ICは中皮細胞の性格を失いつつ、単層円柱上皮細胞の性格を獲得しつつある染色結果となった。2)同様にIOSECにおいてもICに類似した染色結果が得られた。3)PCとIOSEC間で有意水準5%で発現差が認められた遺伝子は104種類であった。【結論】ICはMET過程にあることが示唆され、IOSECはICと類似したMET過程にあるモデルとなることが示唆された。このモデルを用いてスクリーニングされた104遺伝子の中に卵巣癌発生に関する遺伝子候補がある可能性が示唆された。現在卵巣癌組織よりCD133強陽性細胞株を樹立に成功しており、その細胞株も用い遺伝子を選択する予定である。
線維芽細胞による腫瘍選択的血管新生機構の解明

これまで本研究テーマにおいて、主要な血管新生因子として知られるVEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)が正常組織、がん組織いずれにおいても発現があるにも関わらず、血管新生はがん組織に特異的に起こる現象に注目し、実際の生体内ではVEGFを不活性化、活性化を調節する未知の機構があると仮説を立て研究を行ってきた。その際に、血管内皮細胞や線維芽細胞など、正常、がん組織に共通して存在する細胞はVEGFを不活性化する機構を持つこと、がん組織に特異的ながん細胞、炎症細胞などがVEGFを活性化する機構をもつと予想して研究した。その結果、線維芽細胞から分泌されるVEGFは、CTGF(connective tissue growth factor)が結合することにより不活性化すること、また血管内皮細胞はほとんどVEGFを産生しないがパラクラインによりVEGFが内皮細胞の近傍に集まると、内皮細胞が産生するsVEGFR-1(soluble VEGF Receptor-1)が結合することにより不活性化することをそれぞれ実験で確かめた。さらにこういった内因性のアンタゴニストにより不活性化されたVEGFは自身が産生するMMP-7(matrix metalloproteinase-7)により活性化されることを見出した。その分子機構としてMMP-7が、CTGF、sVEGFR-1を選択的に分解することで抑制性の複合体からVEGFが解放されていることを見出した。これらの分子機構はリコンビナントタンパクのみならず、内因性のタンパク、細胞レベル、ヒトがん移植腫瘍モデルで起こることを実験上確かめた。これまでの研究で、線維芽細胞から分泌される血管新生因子VEGFは不活性化された状態で産生されることを明らかにしてきた。このVEGFは正常組織では不活性化されたままであるが、がん組織内ではがん細胞の産生するプロテアーゼMMP-7の作用により再活性化されることを明らかにしてきた。この機構が、正常組織ではVEGFの発現が見られるにも関わらず血管新生が起こらず、がん組織のみで起こる現象に寄与していると考え、研究を続けてきた。VEGFが血管新生するにあたり、血管内皮細胞上のVEGF受容体に結合する必要がある。しかし血管内皮細胞はVEGFに結合しその機能を阻害するsoluble VEGF Receptor-1(sVEGFR-1)を大量に産生している。よって仮に線維芽細胞由来のVEGFがMMP-7により活性化されたとしても、血管内皮細胞周囲でsVEGFR-1の作用によりVEGFは再び不活性化されると考えられる。しかしこれまでの実験結果からがん環境下では線維芽細胞由来のVEGFは血管新生を亢進できることが分かっていた。本年度はこの間を埋める機構に取り組んだ。結果として、血管内皮細胞より分泌されたsVEGFR-1はMMP-7により分解されることが分かった。そしてsVEGFR-1が分解されることで、sVEGFR-1に活性が抑えられていたVEGFが再び血管新生を亢進できるようになることがわかった。今回の成果は、VEGFの翻訳後修飾に関わる分子機構の報告がこれまで非常に限られていることを加味すると、今後のVEGFの実際の生態における血管新生制御の機構を解明する上で重要な知見となる可能性を秘めている。
前期破水時の陣痛発来時間は予測できるか?

本研究は、妊娠37週以降の前期破水後の陣痛発来時間の予測に関連する要因の探索と、それらの要因が陣痛発来時間を予測するための指標となりうるのか検討することである。本年度は、過去2年間の研究を基盤に、妊娠37週以降の前期破水事例の入院から陣痛発来に至る経過について15例の臨床観察研究を実施した。前期破水後の経過について、研究協力者の入院時から陣痛発来および分娩経過に関して、観察シートを用いて経時的に観察した。また、前期破水後の睦内分泌物中の炎症性サイトカイン濃度変化の観察はELISA法を用いてサイトカイン濃度を測定し、前期破水後の分娩経過との関連を分析した。その結果、ペルビックスコアおよび高位破水と陣痛発来時間との関連可能性が示唆された。これは平成19年度に実施した、前期破水時の陣痛発来を予測するための関連要因について臨床経験知から抽出した結果を支持するものであった。また、腟内分泌物中のサイトカイン濃度変化については、前期破水後の陣痛発来時にサイトカイン濃度の上昇が確認された。さらに、妊娠期間中の腟分泌物量増加および腟内細菌叢状態との関連可能性もうかがわれた。今後の研究の方向性として、妊娠経過中から腟内細菌叢の状態と妊娠経過および破水との関連を詳細に分析する必要がある。つまり、前方視的に妊娠期から分娩期までを経過観察するものである。これは、pretermの前期破水との関連が明らかとなっている絨毛膜羊膜炎などの病的な状態や治療を必要とする細菌性腟症などの症例への進展との関連も分析する必要がある。また、さらに妊娠37週以降の前期破水時の陣痛発来に関して大規模記録調査を実施する必要性がある。本研究は、妊娠37週以降の前期破水後の陣痛発来時間の予測に関連する要因の探索と、それら要因が陣痛発来時間を予測するための指標となりうるのか検討することであり、段階的な3つの研究からなる。第1研究は、前期破水後の陣痛発来時間の予測に関連する要因を探索することである。第2研究は、前期破水時の陣痛発来の関連要因として抽出された要因について、臨床所見として評価しうる形で抽出し具体的評価基準を作成することを目的とする。第3研究は、抽出された前期破水時の陣痛発来の予測に関連する要因と炎症性サイトカインの測定データを分析し、前期破水時の陣痛発来時間予測指標として有用な要因を検討する。本年度は、第1研究を実施した。分娩介助に携わる臨床経験5年以上、分娩介助例数200以上の産科医師および助産師に対する面接調査によって、妊娠37週以降の前期破水後の陣痛発来時間の予測に関連する要因を探索した。その結果、陣痛発来と関連すると有用視されている要因は、軟産道内診所見、前駆陣痛、羊水流出状態に関する情報であった。さらに、前期破水時に陣痛誘発を考慮する臨床所見としては、母体・胎児の健康状態の中でも特に感染徴候、分娩開始徴候、分娩開始後の分娩進行状況と破水後経過時間であった。本研究結果は、臨床現場における経験知を明らかにしたものと解釈され、続く第2・3研究の基盤となる重要な知見である。平成19年度に実施した第1研究において、臨床経験知から陣痛発来の関連要因を探索した。今年度は第2研究として、平成19年度に得られた臨床経験知を観察研究の実施に向けて精選するとともに、陣痛発来の関連要因として最有力視している腔内分泌物中のサイトカインの測定方法を検討した。その結果、妊娠37週以降の前期破水症例を対象とした観察研究におけるデータシートを完成させた。データシートの特徴は、臨床経験知をフィジカルイグザミネーションによって得られる臨床所見と検査所見で得られるデータとして抽出したことである。(ペルビックスコア、超音波断層法による羊水量測定、母子の感染兆候、羊水性状、胎児心拍陣痛図による陣痛観察、妊娠中の腟分泌物培養など)また、腟内分泌物の試料採取方法においては、予備測定から、採取後にサイトカイン失活を防ぐためにプロテアーゼインヒビターを用いた速やかな一次処理が必要であることが判明したため、予備測定をもとに腟内分泌物の採取方法、処理方法および保存方法を決定した。第3研究は、37週以降の前期破水の産婦、3040症例を対象とし、観察研究によって得られたデータおよび試料を分析し前期破水後の陣痛発来時間の予測に関連する要因を特定することである。

また、前期破水後の睦内分泌物中の炎症性サイトカイン濃度変化の観察はELISA法を用いてサイトカイン濃度を測定し、前期破水後の分娩経過との関連を分析した。その結果、ペルビックスコアおよび高位破水と陣痛発来時間との関連可能性が示唆された。これは平成19年度に実施した、前期破水時の陣痛発来を予測するための関連要因について臨床経験知から抽出した結果を支持するものであった。また、腟内分泌物中のサイトカイン濃度変化については、前期破水後の陣痛発来時にサイトカイン濃度の上昇が確認された。さらに、妊娠期間中の腟分泌物量増加および腟内細菌叢状態との関連可能性もうかがわれた。今後の研究の方向性として、妊娠経過中から腟内細菌叢の状態と妊娠経過および破水との関連を詳細に分析する必要がある。つまり、前方視的に妊娠期から分娩期までを経過観察するものである。これは、pretermの前期破水との関連が明らかとなっている絨毛膜羊膜炎などの病的な状態や治療を必要とする細菌性腟症などの症例への進展との関連も分析する必要がある。また、さらに妊娠37週以降の前期破水時の陣痛発来に関して大規模記録調査を実施する必要性がある。
量子カスケードレーザーを用いた赤外線サーモグラフィーにおけるその場較正手法の開発

極限環境下での高精度な赤外線サーモグラフィーの実現のために、観測面における放射率のその場較正手法の開発研究を赤外線カメラや量子カスケードレーザー等を用いて実験的に原子力機構及び核融合科学研究所において行った。その成果を以下に示す。初めに、タングステン試料の放射率特性を明らかにするために、表面粗さの異なる試料を真空容器内に設置し、炭素製ヒーターを用いて約1000 °Cまで加熱した。3 μmから5 μmの波長範囲における赤外光を分光計測し、さらに熱電対で測定した試料の表面温度から放射率を評価した。その結果、試料の放射率は表面粗さに対して強い依存性を有しているが、3.4 μmと4.7 μmの二波長における放射率の比の変化率は10 %程度以下であり、単一波長による温度導出に比べて有利であることを明らかにした。次に、その場較正手法の原理検証のために、タングステン試料に対して5°の角度で量子カスケードレーザーを照射して、試料の角度を変化させることで散乱光の角度分布を計測した。その結果、レーザーを試料に対して斜めに入射した場合でも、表面粗さが1.0 μm以上の試料について散乱光を測定することができることが分かり、極限環境下である国際熱核融合実験炉(ITER)においても放射率の変化の情報を得ることができる見通しを得た。さらに、核融合プラズマ実験装置におけるその場較正手法の適用性を明らかにするために、核融合科学研究所のLHD装置において、タングステン試料を下部ポートのダイバータレッグ近傍に設置して較正手法開発試験を行った。その結果、強磁場・プラズマ環境下において試料からの放射光及び量子カスケードレーザーの散乱光を観測した。今後データ解析を進めてその場較正手法の適用可能性を探る。
ブリルアン散乱による磁性体単結晶のスピン波分光研究

本研究では、様々な磁性体単結晶中に熱励起されたスピン波からのブリルアン散乱測定を行ない、磁性研究におけるブリルアン散乱の有用性の確立を目的とする。まず、装置の性能改善をはかるため、本年度は分光器の心臓部であるファブリ・ペロー干渉計用ミラー2組を購入した。加えて、レンズ、鏡等の光学部品を高性能化した結果、平成9年度の個体レーザー、新設計の分光器制御システムの導入と併せ、装置の性能が本研究開始時点に比べて、検出感度が10倍、分解能が約2倍に向上した。正方晶単結晶Fe/Au人工格子膜のスピン波測定を行なった。測定に用いたFe/Au単結晶人工格子膜は、東北大金研においてMBE法で作成された。この研究では、Au層を介在としてFe層間に働く層間交換相互作用定数の定量的決定を試みた。各金属層の厚さが25整数原子面を持つ4枚の試料について室温でスピン波散乱を測定し、全ての試料でスピン波散乱を測定することが出来た。スピン波振動数の磁場依存性の結果から、1)層間交換相互作用は強磁性的である、2)偶数原子面の試料に比べ奇数原子面の試料では層間交換相互作用の強さが著しく小さくなり、偶奇間で減衰振動的な振る舞いを示す、3)原子面数の低下に伴い、急激に一軸磁気異方性が増大することが見いだされた。とりわけ2)の結果は層間交換相互作用の新しい側面を端的に示したものであり、本研究で初めて見いだされた。その物理的起因の解明は、層間交換相互作用の微視的起因の理解に重要な役割を果たすことが期待される。インバー合金Fe_3Pt単結晶についてもスピン波測定を試みた。この試料は非常に硬く、表面の鏡面研磨を十分施すことが出来ず、極めて強い弾性散乱光のためにスピン波ピークを測定することが出来なかった。この課題はインバー効果の起因解明に重要であると考えられるので、今後も継続課題として研究を続けていく。本研究ではブリルアン散乱を用いて、様々な磁性体単結晶中に熱励起されたスピン波の分光測定を行ない、磁性研究におけるブリルアン散乱の有用性を確立することを目的とする。平成9年度は、強磁性EuS単結晶の磁気相転移研究への適用に加えて、Fe/Au単結晶人工格子膜のスピン波測定を行なった。EuS単結晶は16Kで常磁性相から強磁性相へ典型的な2次相転移を行なう。転移温度近傍におけるスピン波ピーク幅の異常増大と磁化の減少による振動数のソフト化を観測することにより、ブリルアン散乱による磁気相転移研究の突破口を開くことを目的とした。ブリッジマン法により育成された単結晶から劈開により得られた試料(1.32×0.84×0.15mm^3)を用いて、我々は7Kから300Kまでの温度範囲で磁気散乱を観測することに成功した。観測された磁気散乱は、強磁性相ではコヒーレントなスピン波励起からの散乱であるが、常磁性相では磁場誘起のインコヒーレントな常磁性散乱である。転移温度の約20倍付近の温度でも磁気散乱が観測されたことは、この物質では光と磁気の結合が極めて強いことを意味している。転移温度近傍でピーク幅の異常増大が観測されたものの、振動数にはソフト化が認められなかった。

この原因として、我々はレーザー光とスピン波の相互作用が生じる表皮層内における反磁場分布を考えている。この点を明らかにするため、試料内部で均一な反磁場分布が期待でき、かつ類似の磁気相転移を示すEuO単結晶薄膜について、測定を行なう準備を進めている。MBE法で作成されたFe/Au単結晶人工格子膜についても測定を行なった。この研究の目的は、Au層を介在としてFe層間に働く交換相互作用を定量的に決定することである。各金属層の厚さを夫々2,3,4,5原子面とする4枚の人工格子試料について室温でスピン波散乱を測定し、全ての試料でスピン波ピークを観測することが出来た。現在、磁性層間に働く交換相互作用を定量的に評価するための解析を進めている。本研究では、様々な磁性体単結晶中に熱励起されたスピン波からのブリルアン散乱測定を行ない、磁性研究におけるブリルアン散乱の右用性の確立を目的とする。まず、装置の性能改善をはかるため、本年度は分光器の心臓部であるファブリ・ペロー干渉計用ミラー2組を購入した加えて、レンズ、鏡等の光学部品を高性能化した結果、平成9年度の固体レーザー、新設計の分光器制御システムの導入と併せ、装置の性能が本研究開始時点に比べて、検出感度が10倍、分解能が約2倍に向上した。正方品単結晶Fe/Au人工格子膜のスピン波測定を行なった。測定に用いたFe/Au単結晶人工格子膜は、東北大金研においてMBE法で作成された。この研究では、Au層を介在としてFe層間に働く層間交換相互作用定数の定量的決定を試みた。各金属層の厚さが25整数原子面を持つ4枚の試料について室温でスピン波散乱を測定し、全ての試料でスピン波散乱を観測することが出来た。スピン波振動数の磁場依存性の結果から、1)層間交換相互作用は強磁性的である、2)偶数原子面の試料に比べ奇数原子面の試料では層間交換相互作用の強さが著しく小さくなり、偶奇間で減衰振動的な振る舞いを示す、3)原子紙面数の低下に一軸磁気異方性が増大することが見いだされた。とりわけ2)の結果は層間交喚相互作用の新しい側面を端的に示したものであり、本研究で初めて見いだされた。その物理的起因の解明は、層間交換相互作用の微視的起因の理解に重要な役割を果たすことが期待される。インバー合金Fe_3Pt単結晶についてもスピン波測定を試みた。この試料は非常に硬く、表面の鏡面研磨を十分施すことが出来ず、極めて強い弾性散乱光のためにスピン波ピークを観測することが出来なかった。この課題はインバー効果の起因解明に重要であると考えられるので、今後も継続課題として研究を続けていく。
RNAアプタマーによるHIV Tat認識機構の構造学的解明とドラッグデザイン

HIVのTatタンパク質を捕捉するRNAアプタマーと7残基からなるTatタンパク質のRNA結合モチーフの複合体の構造情報を13C,15N標識RNAアプタマー及び13C,15N標識RNA結合モチーフを用いた各種のNMR実験から得ることができた。その結果、RNA結合モチーフとRNAアプタマーの複合体の構造情報の新たな知見を得ることが出来た。それによると、RNAアプタマーとRNA結合モチーフは複数の結合モードを有するということが分かった。複数の結合モードにおいて、RNAアプタマーが結合モチーフのどの部位と結合しているかを解明することが出来た。HIVと同様に血液を媒介として感染する感染症にHCVがある。HCVの効果的な治療法は未だなく、早期の確立が期待されている。そこで、HCVのIRES部分に特異的に結合することでIRESの翻訳を抑制するRNAアプタマーの研究を行った。本RNAアプタマーを酵素合成及び精製を行い、RNAアプタマーとHCVのIRES部分との相互作用情報を得るためにNMR実験を行った。その結果、RNAアプタマーとIRESの相互作用情報を得ることが出来た。現在は、13C,15N標識RNAアプタマーを用いてRNA単体の詳細構造を調べているところである。アプタマーの基質認識能を上げる手段として、三者相互作用を考えた。基質を認識するためには基質の他にさらに異なるもう1分子が必要というものである。そこで、我々はあるペプチドと結合することによって初めて基質であるアデニン塩基を認識する事が出来るリボ核ペプチドアプタマーについて、その基質認識メカニズムを調べる研究を開始した。リボ核ペプチドアプタマーのうちのRNAユニットのみでNMR実験を行い、次にペプチドユニットを添加し二者で実験を行い、さらにアデノシンを添加し、三者で実験を行い、それぞれの過程で構造変化が生じていることを確認した。現在はNOEを調べて距離情報を集積し、リボ核ペプチドアプタマーの構造情報を得ようとしているところである。^<13>C,^<15>N標識ヌクレオチド(平成17年度・消耗品費で購入)を用いて^<13>C,^<15>N標識RNAアプタマー(34残基のヌクレオチド)のT7ポリメラーゼによる酵素合成を行い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)精製を行った。そして、^<13>C,^<15>N標識ペプチド(平成17年度・消耗品費で購入)を用いて^<13>C,^<15>N標識RNA結合モチーフ(7アミノ酸残基の部分ペプチド)の合成・精製を行った。なお、RNA結合モチーフに関しては特定のアルギニン残基のみを標識した異なる試料を3種類調製した。得られた標識RNAアプタマーとすでに所有している非標識RNA結合モチーフの複合体を用い、現有するNMR装置にて多核多次元NMRを測定し、RNA側から情報を得た。また非標識RNAアプタマーと得られた標識RNA結合モチーフを用い、多核多次元NMRを測定し、RNA結合モチーフ側から情報を得た。残基特異的に標識したRNA結合モチーフを用いることにより、NMRスペクトルをシンプルにし、より解析しやすい情報を得ることが出来た。また、^1H検出ではなく^<13>C検出による新たなNMR測定手法を用いることにより、非直接的にRNAアプタマーとRNA結合モチーフの水素結合情報を求めた。その結果、RNA結合モチーフのどの部位がRNAと相互作用しているのかということについて新たな知見を得る事が出来た。得られた情報を高性能コンピュータ(平成17年度・設備備品費で購入)で解析した。本年度に得られた知見はTatタンパク質のRNA結合モチーフとRNAアプタマーの複合体の3次元立体構造を、NMR法によって決定するために重要な情報である。昨年度までに、RNAアプタマーと7残基からなるTatタンパク質のRNA結合モチーフの複合体の構造情報を得た。より詳細な情報を得るために、13C, 15N標識RNAアプタマー及び13C, 15N標識RNA結合モチーフを用いて、新たなNMR測定手法等を用いて実験を行った。それによると、RNAアプタマーとRNA結合モチープは複数の結合モードを有するということが分かった。この事を確かめるために、実験情報を元にシミュレーテッドアニーリング法により構造計算を行い、RNA結合モチーフとRNAアプタマーの複合体の3次元立体構造を求めたところ、確かに複数の結合モードがあることを構造計算においても検証できた。HIVと同様に血液を媒介として感染する感染症にHCV(C型肝炎ウィルス)がある。HIV感染者の約20%がHCVとの重複感染であり、その患者の死因の多くがHCVによるものであるとの報告がある。HIV Tatアプタマーの研究の応用として、HCVのIRES部分に特異的に結合するRNAアプタマーの研究に着手した。本RNAアプタマーをT7ポリメラーゼによる酵素合成を行い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)精製を行い、NMRスペクトルを測定するのに、最も適した条件を見出した。現在、HCVのRNAアプタマーとHCVのIRES部分との相互作用情報を得ることを試みている。

その結果、RNA結合モチーフとRNAアプタマーの複合体の構造情報の新たな知見を得ることが出来た。それによると、RNAアプタマーとRNA結合モチーフは複数の結合モードを有するということが分かった。複数の結合モードにおいて、RNAアプタマーが結合モチーフのどの部位と結合しているかを解明することが出来た。HIVと同様に血液を媒介として感染する感染症にHCVがある。HCVの効果的な治療法は未だなく、早期の確立が期待されている。そこで、HCVのIRES部分に特異的に結合することでIRESの翻訳を抑制するRNAアプタマーの研究を行った。本RNAアプタマーを酵素合成及び精製を行い、RNAアプタマーとHCVのIRES部分との相互作用情報を得るためにNMR実験を行った。その結果、RNAアプタマーとIRESの相互作用情報を得ることが出来た。現在は、13C,15N標識RNAアプタマーを用いてRNA単体の詳細構造を調べているところである。アプタマーの基質認識能を上げる手段として、三者相互作用を考えた。基質を認識するためには基質の他にさらに異なるもう1分子が必要というものである。そこで、我々はあるペプチドと結合することによって初めて基質であるアデニン塩基を認識する事が出来るリボ核ペプチドアプタマーについて、その基質認識メカニズムを調べる研究を開始した。リボ核ペプチドアプタマーのうちのRNAユニットのみでNMR実験を行い、次にペプチドユニットを添加し二者で実験を行い、さらにアデノシンを添加し、三者で実験を行い、それぞれの過程で構造変化が生じていることを確認した。現在はNOEを調べて距離情報を集積し、リボ核ペプチドアプタマーの構造情報を得ようとしているところである。
統語的プライミングを用いた抽象的統語知識の獲得メカニズムの探求

「統語的プライミング」の本質を探るべく、いくつかの実験研究が行われた。文産出実験では、プライミングの効果が統語構造を共有しない構文間でも観察されることが明らかになった。文理解実験では、語彙項目を共有しない文の間でのプライミング効果が確認できなかった。これらの結果は、「統語的プライミング」と呼ばれる効果が、抽象的統語的構造に対して起こるものであるという議論に疑問を投げかけるものである。平成22年度は研究の第一段階として、大人を対象とした文理解実験の準備を行った。まず最初に、様々な文献やデータベースを利用しながら、実験における刺激文として利用できる日本語の動詞のリストを作成した。このリストは本研究課題のみならず、今後の様々な研究において活用できる利用価値が高いものとなった。そしてそのリストを基に刺激文を作成する手順を整理し、目的に応じた様々な実験文のセットを少ない労力で生成できる環境を整えた。さらに、内外の研究者と情報交換を積み重ね、本研究の目的に適した実験のデザインについて検討を重ね、様々な観点から見て妥当と判断できる実験デザインを選定した。これらの作業により、信頼性の高い実験を効率よく行うための準備は十分に整ったといえる。しかし、実際のデータ収集に関しては、予想外の事態が生じたため、遅れが生じている。大きな影響があったのは、平成23年3月11日に発生した東日本大震災である。震災により研究機関内の建物への立ち入り禁止・交通機関の乱れ・停電などが生じ、三月中に予定されていた実験のほとんどをキャンセルせざるを得なかった。この結果、平成22年度末までの段階で、大人の統語的プライミングについて何らかの一般化を導くのに十分な結果はまだ得られていない。しかしながらこの遅れはこの研究課題の遂行について致命的な影響を与えるものではない。上で述べたように、実験を行うための準備は十分にできているため、震災の影響が収まった後で速やかに必要なデータ収集を行うことができると考えられる。本年度は、成人を対象とした文理解実験の手法に関する検討と、実験の開発に多くの時間を費やした。当初の計画においては、文理解実験の課題は「真偽値判断」であった。これは、日本語の文と、何らかのイベントを描写した画像を提示し、文がその画像に「当てはまるかどうか」、すなわち画像が描写する状況で真になるかどうかを被験者に判断させる課題である。この課題は、いくつかのプライミングに関する先行研究で実際に用いられているものである。ところが本研究でこの課題を用いたパイロット実験を行った際、様々な問題が浮上した。最も大きな問題は、被験者の反応時間のばらつきがあまりに大きく、プライミング効果に関して信頼度の高い結果が得られる見込みが持てなかった点である。これはこの実験が先行研究よりもやや複雑な意味内容を持つ文を用いるため、それに応じて画像の内容も複雑なものとなり、「画像の内容を処理・理解するための時間」が反応時間に影響を与えたものと考えられる。また別の問題としては、刺激文を画像に対応させなければならないため、刺激文で使うことのできる動詞が限定される点であった。これらの問題に対応するため、研究計画を変更し、文理解実験は真偽値判断ではない課題を用いる実験に作り直すことになった。新たな課題は「文判断」、すなわち画面に表示された文が自然な文かそうでないかを答える、というものである。これは過去の膨大なプライミング研究が用いている「語彙判断課題」に着想を得たもので、実験の構造は既に確立された語彙判断課題の実験と同じものになる。この新実験を行うプログラムを作成し、パイロット実験で有効性を確認した後、データの収集を行った。データの収集は現在も継続中である。これらの経緯を通して得られた実験手法に関する知見は、統語的プライミングに関する基礎研究として重要な意義を持つものである。本年度は、成人を対象とした文理解実験と文産出実験、そして幼児を対象とした文産出実験を行った。成人対象の文理解実験は、コンピューターの画面上に表示される日本語文が自然な文であるかそうでないかを答える、という課題を行う際に、各試行の直前に提示されていた文の性質が反応時間にどのような影響を与えるかを調べたものである。この実験の結果においては、ベースラインとなるべき最も基本的な条件間の比較(例:直前に通常語順の能動文か受身文を提示された場合の、受身文に対する判断)においてすらプライミング効果が確認できなかった。この結果を受け、同様の構文を用いた文産出実験を成人に対して実施した。すると文産出に関しては極めて頑健なプライミング効果が確認できた。すなわち、被験者は直前に受身文を処理していると、自分でも受身文を用いる確率が高くなったのである。さらに、成人と幼児の両方に、タイプの異なる受身文をプライムとして用いた文産出実験を実施した。利用したのはgapless passiveと呼ばれる、自動詞を元に形成される受身文である(例:XがYに泣かれた)。統語論の研究においては、この種の受身文は、他動詞受身文と異なる構造を持つと主張されている。

従って、統語的プライミングがプライム文とターゲット文の間の統語構造の共通性を必要条件とするのであれば、gapless passiveのプライム文は他動詞受身のターゲット文の産出を促進しないと予測される。しかし実験の結果、成人・幼児共に、gapless passiveが他動詞受身の産出にプライミング効果をもたらすことが明らかになった。これはすなわち、「統語的プライミング」が統語構造の共通性がない構文間でも起こりうるものであることを示唆し、従って統語的プライミングを利用した実験の結果は、直接的には抽象的統語知識についての証拠とならない可能性を示している。幼児を対象とした実験調査の実施に遅れが生じている。これは、研究代表者が平成23年度に研究機関を異動したことに原因がある。以前の研究機関で利用できた実験環境(特に、大学の附属幼稚園)が利用できなくなり、新たに協力をしてくれる初等教育機関を探したり、研究機関内で倫理規定を策定するなどの作業に多くの時間が取られてしまった。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は本年度が完成年度であるので、本年度中に可能な限り多くのデータを収集することが非常に重要である。当初研究計画の時点では考慮されていなかった様々な問題により、データ収集の効率がこれまでのところ高かったとは言えないが、様々な作業や試行錯誤を経てここに至り十分な準備が整った、と言える。本年度はこれまでに築いた「土台」を利用し、効率よく数多くのデータを収集することとする。
リボフラビンを用いた光学活性高分子・超分子群の合成と機能性キラル材料への応用

天然由来のリボフラビン(ビタミンB2)を出発物質として用い、様々な低分子誘導体や高分子・超分子化合物を合成することに成功した。例えば、リボフラビン誘導体のカップリング反応により、共役系を拡張したリボフラビン二量体を得るとともに、それらを単位ユニットとして主鎖に導入した光学活性高分子を合成した。本研究で得られた種々の化合物はフラビン由来のπ共役構造に由来する特異な光学特性、酸化還元特性、触媒活性などを発現し、ユニークな機能性材料として応用できることを明らかにした。天然由来のリボフラビン(ビタミンB2)誘導体を側鎖に導入したペリレンビスイミド誘導体を合成することに成功した。様々な溶媒中で吸収スペクトル測定を行った結果、貧溶媒の割合が増えるにつれて大きな淡色効果が見られ、ペリレンビスイミドが疎溶媒効果により自己集合したことが明らかとなった。円二色性(CD)スペクトル測定の結果、会合体が大きなコットン効果を示すことが分かり、一方向巻きに片寄ったらせん状積層構造をとる超分子集合体を形成していることが示唆された。また、リボフラビン誘導体のカップリング反応により、共役系を拡張したリボフラビン二量体を合成するとともに、それらを単位ユニットとして主鎖に導入した光学活性高分子の合成にも成功した。本研究で得られた超分子集合体や高分子は、フラビンの規則的集積構造に由来するユニークな機能が発現すると考えられ、今後キラル材料への応用が期待される。種々の天然由来のリボフラビン(ビタミンB2)誘導体を酸化的カップリングさせることにより、フラビン環の8位がエテニレン架橋で連結した光学活性ビスフラビン誘導体を合成した。得られたビスフラビン誘導体は拡張されたπ電子系を有し、単量体のフラビン誘導体とくらべて吸収波長が長波長シフトするとともに、紫外光照射下で鮮やかな黄色の蛍光を呈することが明らかとなった。さらに、得られたビスフラビンの3位をアルキレン架橋することにより、ビスフラビン部位を有する新規高分子の合成に成功するとともに、環状オリゴマーがあわせて生成することも明らかとした。また、リボフラビンのOH基をカルバメートで保護することにより、種々のリボフラビンテトラカルバメート誘導体を合成し、得られた誘導体がクロロホルム中でゲル化を形成することを見出した。メタノールの添加によりゲル化が阻害されることから、テトラカルバメート誘導体は分子間水素結合を形成して集合体を形成していることが示唆された。さらに、リボフラビン誘導体を側鎖に導入したペリレンビスイミド誘導体を合成した。これらの研究で得られた光学活性な高分子や超分子集合体は、キラルなフラビンの集積構造に由来する特異な不斉触媒能や不斉センシング能などが発現すると考えられ、新しいキラル材料として応用が期待できる。本年度は、天然由来のリボフラビンを出発原料として用い、様々な合成手法によりリボフラビン誘導体を導入した超分子・高分子の合成を目的として研究を行った。その結果、フラビン誘導体の二量化反応などを駆使することにより、新しいリボフラビン含有超分子・高分子群を合成することに成功した。当初目標は十分達成できたと考えられる。高分子化学策定した研究計画に従い、27年度はこれまでに合成したリボフラビン含有超分子・高分子の応用に焦点をあてて検討を行う。なかでもフラビン化合物の光学特性を利用したセンシング材料の開発と、キラル構造を利用した不斉識別能の開拓を重点的に遂行する。商品の在庫状況の影響や実験の優先順位の変更などにより、3月末までに納品を予定していた物品類の納入が次年度にずれ込んだため。次年度使用額分はH27年度はじめに消費される予定である。研究計画に影響はない。
発育期の低強度運動が増進するメンタルヘルス：統合失調症予防効果の分子基盤解明

発育期の低強度運動が統合失調症モデル動物の行動異常を抑制するメカニズムの解明を目的とし、3つの研究課題を通じて検証する。課題1では、統合失調症の神経基盤と想定されるNMDA受容体の機能低下に対し、発育期の低強度運動がこれを改善するかどうか検討する。課題2では、運動が病態の神経基盤を改善するメカニズムとして脳由来神経栄養因子が関与するかどうかを検証する。課題3では、網羅的遺伝子発現解析を行い、運動効果の中核を担う遺伝子群を同定する。本研究により発育期の低強度運動の有用性とその神経基盤が明らかとなれば、運動処方確立に向けた臨床研究への発展が期待される。
レドックスメディエーターを用いる新規非酸素酸化型光触媒有機合成反応の開発

本研究は、徒来の光触媒有機合成反応の問題点を解決するために"レドックスメディエーターを用いる新規非酸素酸化型光触媒有機合成反応"を提案し、光触媒による有機合成反応に新たな可能性を開拓することを目的としている.本年度は、酸化タングステン多孔質電極を用いたベンゼンの直接水酸化反応を中心に検討を行った.様々な条件においてベンゼンの水酸化を検討したところ、完全な水系では反応収率、選択率ともに低かった.これに対して、アセトニトリルと水の混合溶媒を使用し、可視光のみの照射を行うと、水酸基が1つ導入されたフェノール、および水酸基が2つ導入されたヒドロキノンが効率良く生成することを見出した.特に、反応前に溶液中の酸素分子を除去すると、ベンゼン環の解裂が効果的に抑制され、ヒドロキノンが電流効率95%以上と極めて高い効率で生成することを見出した.様々な検討を進めた結果、本系におけるヒドロキノンの生成は通常の逐次的酸化反応ではなく、1電子酸化によるラジカル的な反応メカニズムによって進行していることが強く示唆された.また、酸化チタン電極を用い、紫外光を含む光を照射した場合には、他の生成物、特にベンゼンの解裂化合物、および過酸化による二酸化炭素の生成が進行した.したがって、酸化タングステン電極を用いて、可視光照射のみという穏和な条件でベンゼンの水酸化を行うことによって、従来にはない新規な有機合成系を構築できたと考えられる.本研究は、従来の光触媒有機合成反応の問題点を解決するために、"レドックスメディエーターを用いる新規非酸素酸化型光触媒有機合成反応"を提案し、光触媒による有機合成反応に新たな可能性を開拓することを目的としている.平成18年度は、各種光触媒薄膜電極の作成と、これらを用いて主にベンゼンの酸化反応を検討した.光触媒薄膜電極として、酸化チタン(TiO_2)、酸化タングステン(WO_3)、タンタルオキシナイトライド(TaON)の作成と特性評価を行った.TiO_2は市販品の微粒子を、WO_3はタングステン酸の加水分解によって得たコロイドを、それぞれペースト化し,導電性ガラス基板に塗布・焼成することによって高い光電流を得ることが出来た.またTaONに関しては、TaON粒子をペースト化し、これを導電性ガラス基板上に塗布・焼成後、さらに塩化タンタル水溶液を塗布・焼成することにより高い光電流が得られることが分かった.しかし、安定性に問題があったため、これに酸化助触媒として酸化イリジウムを適量担持することにより、高い安定した光電流が得られた.これらを用いて、ベンゼンの水酸化反応を検討した.その結果、酸素を含まない系において、ベンゼンの水酸化に伴う生成物が確認された.水酸基が1つ導入されたフェノール以外に、複数導入されたカテコール等の生成も比較的高い選択性で得られた.特に、酸化タングステンを用いて、紫外光をカットした可視光のみの照射を行うと、ベンゼン自身の光化学反応が抑制され、高い収率で水酸化生成物が得られることを見出した.比較例として、酸素雰囲気下において同様の反応を行うと、ベンゼンの芳香環の解裂や、過酸化による二酸化炭素の生成が確認された.また、TaON電極においては、他の2つの電極と異なる反応生成物が得られた.本研究は、徒来の光触媒有機合成反応の問題点を解決するために"レドックスメディエーターを用いる新規非酸素酸化型光触媒有機合成反応"を提案し、光触媒による有機合成反応に新たな可能性を開拓することを目的としている.本年度は、酸化タングステン多孔質電極を用いたベンゼンの直接水酸化反応を中心に検討を行った.様々な条件においてベンゼンの水酸化を検討したところ、完全な水系では反応収率、選択率ともに低かった.これに対して、アセトニトリルと水の混合溶媒を使用し、可視光のみの照射を行うと、水酸基が1つ導入されたフェノール、および水酸基が2つ導入されたヒドロキノンが効率良く生成することを見出した.特に、反応前に溶液中の酸素分子を除去すると、ベンゼン環の解裂が効果的に抑制され、ヒドロキノンが電流効率95%以上と極めて高い効率で生成することを見出した.様々な検討を進めた結果、本系におけるヒドロキノンの生成は通常の逐次的酸化反応ではなく、1電子酸化によるラジカル的な反応メカニズムによって進行していることが強く示唆された.また、酸化チタン電極を用い、紫外光を含む光を照射した場合には、他の生成物、特にベンゼンの解裂化合物、および過酸化による二酸化炭素の生成が進行した.したがって、酸化タングステン電極を用いて、可視光照射のみという穏和な条件でベンゼンの水酸化を行うことによって、従来にはない新規な有機合成系を構築できたと考えられる.
トルクセンサ内蔵小型無段変速機の開発と評価

次世代ロボットの開発において,小出力のモータを効率的に使用する無段変速機は,ロボットの性能と安全性向上に極めて有効である.そこで本研究では,クランク式無段変速機をベースとした「星型クランク式無段変速機」を改良し,1)トルク計測機能付き無段変速機の開発,2)無限回転可能な改良機の開発,3)直交2軸型無段変速機の開発の3点を行った.これにより,負荷に応じて自動的に減速比を調整可能な,ロボット用無段変速機が実現可能であることを示した.本研究では,星形クランク式無段変速機と呼ぶ,複数のボールねじを利用したロボット用の無段変速機の試作・検討を行った.具体的には,(1)生物型ロボットの足やロボットアームの関節を想定した,無限回転可能でバックラッシュの小さい高出力の無段変速機と,(2)ロボットアームの手首を想定した2自由度の小型無段変速機の開発を行った.(1)の無段変速機では,無段変速機の軸受けにクロスローラーベアリングを用いて片持ち構造とすることで,出力軸の可動範囲を無限とすることに成功した.また,与圧式ボールスクリューを用い,軸受にも与圧をかけることで,従来よりもバックラッシュを低減した.また,旧試作機と比べて出力を40%増加させながらも,重量と体積はほぼ従来通りとし,特に横幅を約60mmと薄型とすることで,ロボットへの応用に適した形状とした.(2)の2自由度無段変速機では,新たに空間リンク機構を用いた構造を考案し,3台のボールねじで2自由度と減速比を制御する機構を実現した.これにより,2自由度で4台のボールねじが必要だった従来の機構ではに対し,ボールねじの台数の低減により小型・軽量化が可能となった.この機構は軸受が多く耐荷重性に不安があるものの,ロボットの手首や足首など,比較的トルクの小さい関節に適していると考えている.以上のように本研究では,出力と機能の大きく異なる2種類の無段変速機を新たに開発し,ロボットに応用可能な無段変速機の実現性を示した.次世代ロボットの開発において,小出力のモータを効率的に使用する無段変速機は,ロボットの性能と安全性向上に極めて有効である.そこで本研究では,クランク式無段変速機をベースとした「星型クランク式無段変速機」を改良し,1)トルク計測機能付き無段変速機の開発,2)無限回転可能な改良機の開発,3)直交2軸型無段変速機の開発の3点を行った.これにより,負荷に応じて自動的に減速比を調整可能な,ロボット用無段変速機が実現可能であることを示した.本研究は,ロボットに利用可能な,小型のクランク式無段変速機の開発と評価を目的としている.平成24年度には,(1)無限回転可能な新しい試作機の開発,(2)小型のトルク検出機構の開発とトルク制御,(3)無段変速機を持ちいたマニピュレータの開発,の3点を行った.(1)については,従来の試作機において出力軸の回転角度に限界があった点を改良し,出力軸を無限回転できる新しい無段変速機を試作した.また,従来機で問題であったバックラッシュを防ぐ工夫も図った.現在までに,試作機とその制御系を開発し,従来よりバックラッシュが減少したこと,また無限回転が可能であることを確認した.新しい試作機は,最大速度360度毎秒,最大連続トルク35Nmを実現しており,小型ロボット用関節として十分な性能を示している.また無限回転が可能となったことで,例えば車輪などにも応用の範囲が広がった.(2)については,金型用の小型強力バネと磁気式リニアエンコーダにより,殆ど構造に変更を加えことなく無段変速機に適用できる装置を開発した.これによりトルクの検出が可能となった.さらにトルク制御による出力軸の柔らかい制御も実現し,柔らかい制御時には指一本で押し返すことも可能となった.(3)については,新しい無段変速機を3個用いた3自由度マニピュレータを設計し,組立を行った.現在,制御プログラムを開発中であり,今後,速度や最大荷重,位置決め精度などの性能の評価を行う予定である.研究計画に挙げていた4つの研究課題(トルク検出機構の開発,2種類の試作機の開発,マニピュレータの開発,4足歩行ロボットの開発)のうち,1つは達成,2つは半分まで達成された.よって研究の進捗率は50%であり,おおむね順調に進展している.平成25年度も,計画に沿って以下の3つの課題について研究を進める.第一の課題は,現在開発中のマニピュレータの完成と,その性能の評価である.2つ目は,現在より小型で体積当たりの出力を向上した無段変速機の開発である.3つ目は,無段変速機を利用した4足歩行ロボットの開発とその性能の評価である.平成24年度は,基礎的な設計検討に時間をかけたこと,またマニピュレータの設計で比較的安価な部品を使用したことにより,予定よりも機械加工費が少額となった結果,次年度使用額が発生した.この研究費は,平成25年度の請求額と合わせ,主に4足歩行ロボットの機械要素購入費と機械加工費に使用する予定である.
DIDSによるアポトーシス抑制作用の分子機構の解明

当研究課題では、新規細胞死抑制物質DIDSについて、1)その細胞死抑制の分子機構を明らかにし,2)神経脱落を伴う疾患モデルに有効であるかを検討した。1) DIDSの細胞死抑制の作用点は,すでにcaspase活性化の前段階に存在することが示されていたので、特にミトコンドリアに対する影響に注目して検討した。細胞死誘導には以下の様々な刺激を用いた。高カリウム下、あるいは、インシュリン共存下培養し、通常の培養液に移行ミトコンドリア脱共役剤CCCPスタウロスポリン、過酸化水素、グルタミン酸による刺激細胞死の進行に伴って、ミトコンドリア膜電位の低下が観察された。DIDSの共存によって細胞死もミトコンドリア膜電位の低下も、ともに抑制された。しかしながら、ミトコンドリア膜電位の低下はcaspase活性化に先行しないこと、ならびに、CCCPによって誘導される細胞死では、ミトコンドリア膜電位が平衡化しても、数時間を経ないとcaspases活性化が観察されないこと、この間に細胞を培養液で洗うと、細胞死に至らないことなどから、ミトコンドリア膜電位の低下はこれらの刺激による細胞死の進行において寄与が小さいと結論づけた。さらに、CCCPによってミトコンドリア膜電位が平衡化した後であっても、DIDSは、細胞死を抑制した。したがって、DIDSはミトコンドリア膜電位の維持によって細胞死進行を抑制するのではなく、DIDSによって細胞死が抑制された結果、ミトコンドリア膜電位が維持されたのである。2)スナネズミを用いた一過性脳虚血モデルに対するDIDSの神経細胞保護効果を検討した。虚血負荷に先立って、DIDSの全身投与を行ったが、海馬CAl野の脱落には影響がみられなかった。DIDSの中枢移行性等の問題が考えられるので、DIDSの投与経路や虚血モデルについて、当研究課題終了後も引き続き検討を行っている。神経細胞にアポトーシス誘導刺激が加わってからcaspasesが活性化されるまでの過程において、ミトコンドリアの膜電位の平衡化とミトコンドリアからのチトクロームCの遊離のどちらがcaspases活性化に必須であるかを明らかにするために、小脳顆粒細胞の培養系を用いて、アポトーシス誘導刺激を加えた細胞のミトコンドリアの膜電位の変化を共焦点顕微鏡下、経時的にロ-ダミン123を用いて測定した。このとき、caspases活性化の前段階でアポトーシスの進行を抑制すると考えられるDIDSの作用を検討した.スタウロスポリン処理によって低下する膜電位は,DIDSの共存によって正常の電位に維持され、同様に、培養液中のカリウム濃度を減少させて細胞死を誘導した場合にも、DIDS非共存下では数時間でミトコンドリアの膜電位が平衡化したのに対し、DIDS共存下では膜電位が維持された。以上の事実より,DIDSはミトコンドリア膜の安定化によってアポトーシスの進行を抑制したと考えられた.ところが、ミトコンドリアの膜電位を平衡化するCCCP(アンカップラー)、あるいは、ミトコンドリアの電子伝達系酵素を阻害することによってミトコンドリアの膜電位を平衡化する作用を示す青酸イオンによって誘導される細胞死もDIDSの共存によって抑制されることを見いだした。現在、このとき、ミトコンドリアの膜電位が維持されているかどうかの確認を行っている。