hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
動的バビネ反転可能な異方的メタ表面によるテラヘルツ波制御の新展開

当初、本デバイスに必要な大きさの導電率変化を実現する二酸化バナジウムの成膜ができなかったため、作製したデバイスで十分な特性を得ることができなかった。この問題を解決するため二酸化バナジウムの成膜法を最適化し、十分大きな導電率変化を引き起こすことができる二酸化バナジウムを成膜できるようになった。この結果、新しく作製したデバイスにおいて、予想していたものに比べても大きな変調幅でヘリシティの切替が実現できることがわかった。また、異方的バビネ反転の応用として、新たに平面カイラル応答の切替を目指し研究を進めた。その結果、平面カイラル応答の切替は比較的に実現しやすいことが判明した。このため、予定を変更し、平面カイラル切替の実現に向けた実験に注力した。この結果、実際に平面カイラル切替が可能であることを示唆する実験結果を得た。しかしながら、初期の実験では十分に温度が安定化されておらず、実験の再現性に課題があった。この問題を解決するため、温度安定化を進め、再現性よくデバイスの特性を評価できるようになりつつある。チェッカーボード構造は接点状態が接続か非接続かによってその応答が劇的に変化する。こうしたチェッカーボード構造の特異な応答について本研究課題ではデバイス応用可能性の追求、および、新たな物理的理解を目指して研究を進めている。以下、当該年度に得られた具体的な成果について説明する。まず、出射偏光の回転方向(ヘリシティ)を制御可能な動的λ/4波長板を実現するために必要とされる対称性を明確化し、設計の指導原理として新たにまとめた。この指導原理において、フォスターの定理と呼ばれる受動的な回路の一般的な性質が鍵となることも明らかになった。今回、定式化できた指導原理においてはデバイスの具体的な形状ではなく、対称性が重要な役割を果たす。このため、今回得られた指導原理はヘリシティ切り替えを実現するための普遍的な原理として様々な形状に応用でき、非常に有用性は高い。さらに、こうした動的λ/4波長板の性能を向上させるために、新たな構造を検討し、その動作周波数の広帯域化も検討した。その結果として構造を単純化させることで動作周波数のブロードバンド化が実現可能であることが明らかとなった。こうしたブロードバンド化は通信やセンシング応用にとって重要となる。また、上記の動的λ/4波長板とは別にチェッカーボード構造を利用した回折波の進行方向制御に関する数値計算も行なった。その結果として、チェッカーボード構造を用いてテラヘルツ波のビームステアリングが可能であるという知見も得られた。こうしたステアリング技術を用いると通信効率やセンシングの効率を上げることが可能になると期待される。(1)出射テラヘルツ波の偏光の回転方向(ヘリシティ)を制御可能な動的λ/4波長板に関して得られた成果をまとめた論文を執筆・投稿した。その後、査読者とのやり取りを通して原稿の改訂が必要となった。このためにデバイスの設計理論をさらに精緻化した。また、データの信頼性を上げるための実験も行なった。
ハンドボール競技におけるヨーロッパ強豪国のユース年代のトレーニング分析

本研究は、日本ハンドボール競技におけるシュート力向上に貢献できる知見を得るために、世界のトップレベルにあるクロアチア、セルビア、モンテネグロの国際競技力向上のためのトレーニング組織および環境について調査した。さらにクロアチアのチームが実際に行っているトレーニング、特にシュートに関するトレーニング内容と方法を調査した。その結果、クロアチアのトレーニング内容は、実践形式の中で防御者とGKをかわす技能を習得する個人戦術の向上、シュートとアシストパスを選択しながら行うグループ戦術および個人戦術の向上、そして反復によって技術・体力的な要素を強化する技術力の向上が循環的に行われていることが明らかになった。平成25年度は、世界のトップレベルにあるヨーロッパ強豪国同士の対戦によるゲーム様相を分析し、勝ちチームは、オフェンスにおいてゴールエリア際のシュート生起率が高いこと、そしてセットオフェンスにおいて、接触された状況におけるシュート成功率が高いことを明らかにした。さらに、世界女子トップレベルプレーヤーと日本女子トップレベルプレーヤーのシュートプレーを比較検討し、世界トップレベルプレーヤーはフェイント動作を利用する、上半身を左右に傾斜させる、形態的優位性を利用するなど、個性を活かしたシュートプレーを実践していることを明らかにした。これらの研究によって明らかになった勝ちチームと負けチームのゲーム様相の差異、およびトップレベルプレーヤーが実践していたシュートプレーは、トップレベルを目指しているユース年代にとって、重要なトレーニング課題であると考えられ、本研究においてトレーニング内容と方法を分析し、比較検討していくうえで重要な参考文献となる。実地調査に関して、スペイン在住のGerard Lasierra氏と話し合いを重ねたが、スペインにおいては、不安定なクラブ経営事情により指導者や選手の入れ替わりなどがあるため、本研究の調査に適したチームを決定することができなかった。そこで、スペインを調査対象国から外し、クロアチア、セルビア、モンテネグロのうちから2か国で調査を実施する計画に変更した。平成25年1月3月の間に、クロアチア、セルビア、モンテネグロの指導者と交渉し、本研究に対する理解を求めた。調査期間は試合期に統一する予定であり、各国における試合期の調査は済んでいる。平成26年度は、まず、5月2026日にクロアチアの女子ハンドボールの強豪クラブであるZametを訪問し、クロアチアにおける学校教育とスポーツ、スポーツ指導者ライセンス、国内リーグのシステム、クラブ運営、シニア以下のカテゴリー、そしてトレーニング環境についてインタビュー調査を実施した。そこでは、ユース年代のトレーニング映像の収集も行った。そして、調査期間中にクロアチア国内で開催されていたザグレブ大学主催の7th International scientific conference on kinesiologyに参加し、「Evaluation of attack-contribution in collegiate women's handball」というテーマでポスター発表を行った。次に、6月2329日にセルビアで開催されたHandball at schoolというハンドボールのトレーニングキャンプに参加し、セルビアにおけるスポーツ指導者ライセンス、国内リーグシステム、シニア以下のカテゴリーの強化システムについてインタビュー調査を実施した。また、キャンプに参加していたモンテネグロ、ルーマニア、イスラエル、ドイツ、スウェーデンの指導者と情報交換を行った。セルビアのユース年代の強化を担当しているSinisa Djukic Djuka氏から、セルビアでは男子中心に競技力の強化が行われているため、調査対象の国としてはセルビアよりもモンテネグロの方が適切であろうと言う助言をもらった。そこで、2014年の最優秀指導者に選出されているモンテネグロの指導者Adzicに本研究の目的を理解してもらい、彼のクラブチームでのトレーニング調査の許可を得ることができた。平成27年度は、まず、国内女子ユース年代のトレーニングに関するデータを補完するため、7月に高校トップレベルの女子ハンドボールチームであるH高校を訪問し、指導内容・強化システムに関するインタビュー調査および試合期に行われているトレーニング映像の収集を行った。次に、昨年度にクロアチアのZametで収集したトレーニング映像の分析およびインタビュー調査をまとめ、それと国内およびこれまでに蓄積した海外事例との比較を行った。さらに、モンテネグロ女子代表監督Adzic氏が指導するZRK Buducnostというクラブチームとの現地調査の日程調整を行った。Adzic氏は多忙なため、スケジュール調整に時間がかかることがか予測できたため、Adzic氏のアシスタントコーチをしているMilos Perovic氏に直接コンタクトがとれる状況にした。また、スポーツコーディネーターであるNikolaj氏に協力を要請し、モンテネグロのハンドボール界に精通しているPapachartofilis Stathis氏を紹介してもらうことで、スケジュール調整に努めた。しかしながら、11月までにAdzic氏との日程調整が進まなかったことから、12月初旬にデンマークで女子世界選手権大会に向けた事前合宿をしていたAdzic氏に直接会い、今後の研究に対する協力を得ると共に、モンテネグロのハンドボール環境および強化システムに関するインタビュー調査を行った。モンテネグロで行うZRK Buducnostという現地調査の日程調整が合わず、調査の実施を見送ったため分析に必要なデータの収集が揃っていないため。ハンドボールコーチング論ZRKBuducnost(モンテネグロ、ポドゴリツゥア)において実地調査を実施し、その映像資料を分析し、論文としてまとめる。実地調査期間は6月末または12月末1月で交渉中である。2016年3月日本ハンドボール学会にて研究成果を発表する予定である。

2本の原著論文が受理され、今後の研究を進める上で、有用な知見を得ることができた。また、実地調査に関して、平成26年度内にスペインで実地調査を行うのは不可能であるという結論に至ったため、スペインを調査対象国から外した。平成25年1月3月の間に、クロアチア、セルビア、モンテネグロの指導者と交渉し、本研究に対する理解を求めた。調査期間は試合期に統一する予定であるため、各国における試合期の調査は済んでいる。平成26年5月にクロアチア、6月にセルビア、モンテネグロを訪れて直接実地調査の打ち合わせをする予定である。平成26年度に実施する予定だった海外における実地調査が受け入れチームとの日程調整が順調にいかず、次年度に実施する予定になったため、旅費に未使用額が生じた。平成26年5月にクロアチア、6月にセルビア、モンテネグロを訪れて現状を視察し、その後、実地調査を実施する国、クラブおよび期間を決定する。期間は平成26年12月以降で予定している。その後、実地調査の結果をもとにトレーニング内容・方法などを分析していく。ZRK Buducnost(モンテネグロ、ポドゴリツァ)での実地調査の旅費として使用する。
トランスジェニックメダカを用いた魚類の温度適応分子機構に関する研究

広温域性のコイは季節的な環境水温に馴化し、ATPase活性の異なる骨格筋ミオシン重鎖アイソフォームを発現することが明らかとなっている。しかしながら、これらミオシン重鎖アイソフォーム遺伝子の発現調節機構は未だ不明である。一方、同じく広温域性であるメダカではトランスジェニック技術が確立されており、魚類の遺伝子解析には格好の対象と考えられる。そこで本研究では、これまでに近交系メダカHNIを用いて馴化温度依存的に発現する7種類のミオシン重鎖アイソフォームcDNAをクローン化し、さらにメダカBACゲノムライブラリーよりダンデムに配列した11種類の成体速筋型ミオシン重鎖遺伝子を単離した。これらのうち1種類は新規機能遺伝子、3種類は偽遺伝子であることが示唆された。今年度は、11種類のミオシン重鎖遺伝子の発現状況を調べるとともに、各発現遺伝子の転写開始点付近の詳細な解析を行い、レポータープラスミドの構築を試みた。新規および偽遺伝子と推定されたミオシン重鎖遺伝子に特異的なプライマーを作製し、10°Cおよび30°C馴化メダカ骨格筋から構築したcDNAライブラリーを対象にPCRを行った。その結果、新規機能遺伝子の転写産物は確認されたが、3種類の推定偽遺伝子については転写産物が得られなかった。次に5'RACEおよびRT-PCRを行い、これまでの結果とあわせて8種類のミオシン重鎖遺伝子のゲノム構造を決定した。いずれも41個のエキソンからなり、全長は約10.412.0kbp、1,9351,939アミノ酸をコードしていた。次に、5'上流域の機能解析を行うため、これら8種類のミオシン重鎖遺伝子のうち10°Cおよび30°C馴化メダカにおいてそれぞれ主成分として発現していたmMyHC-6およびmMyHC-7を用い、これらの5'側を欠失させた種々の長さのDNA断片をルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだレポーターアッセイ用プラスミドを構築した。すなわち、転写開始点より約2kb、1kb、500b、200bおよび20b上流域のDNA断片をルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入した。また、ルシフェラーゼ活性の値を標準化するため、メダカ・βアクチンのプロモーターを組み込んだプラスミドも構築した。現在、各レポータープラスミドを10°Cおよび30°C馴化メダカの骨格筋に注入し、その後5、10および15日目のルシフェラーゼ活性を測定中である。
1分子マススペクトロメトリー・イメージング法の開発

分子同定のできる質量分析法と細胞などの生きたものの形態変化がミクロで捉えられる顕微イメージング法の結合により、生命科学研究法の夢である生きたまま細胞応答と分子メカニズムが同時に追跡できる手法を極限的な1分子レベルで可能となる開発を目指した。1)高感度マススペクトロメーターの開発従来のマイクロチャンネルプレート(MCP)検出器による限界に挑戦し、細胞1ヶでの検出に成功し、その生体反応と連動した分子分泌を質量分析法で捉えた。しかし、この検出器では検出能に限界があるので、より高感度なトンネル結合型極低温検出器による飛行時間型質量分析計を構築した。本検出器はMCP検出器では感度が落ちた高分子量の分子でも同じ感度を持ち、抗原抗体蛋白複合体の検出にも成功し、イメージングに応用した。2)1分子イメージング法の開発超高感度ビデオカメラと結合して、レーザーのマイクロポイント照射を可能とする1本の光ファイバーを使った照明法(ピンファイバービデオスコープ法と命名)で1分子イメージングを可能とした。これによりDNA1分子の伸縮や切断、そして、STAT1という、細胞質からシグナル伝達により細胞膜へそして更に核移行する分子の追跡に成功し、膜結合の際には、1分子が順に2ヶあるいは2ヶの分子が同時に結合する様子を解明した。3)リアルタイムマススペクトロメトリー追跡法の開発更にこれらを結合して、ビデオイメージング法で細胞の形態変化を追跡し、ある生体反応が起こった瞬間その細胞が放出した分子を質量分析法で捉える"ビデオマススコープ法"(我々の命名)を開発した。本手法により始めてアレルギー細胞が微細顆粒を放出するときに、ヒスタミンやセロトニンを放出している事とその時間経過を明らかにすることに成功した。これらの手法はまだまだ未成熟であるが、今後さらに改善を続け、夢のライフサイエンス分析法として完成させる大きな基盤が形成できたと言える。1.超高感度マススペクトロメーターの開発高感度なマススペクトロメーターを開発するには、それぞれのイオン光学系の最適化が最も重要で、イオン光学シミュレーションにより、1年間に渡りシミュレーションを進めた。その結果、所定の感度と性能をもった質量分析計(イオンガイド、質量フィルター、TOF解析部)が完成できた。これから、更に全体的な視点から高感度分子解析部を完成させたい。その内容の部を来る日本薬学会第124回年会で報告する。2.1細胞内分子解析用トラップインターフェイスの完成とイメージング装置の設計1細胞にも対応する分子捕捉ナノスプレーチップの開発の可能性を検討し、前処理濃縮樹脂を充填したナノスプレーチップの開発に成功した。しかし未だ感度が1細胞レベルまでは行かず、今後、濃縮効率や選択効率を上昇させ、更なる高感度化が必要であることが分かった。その内容の一部を来る日本薬学会第124回年会で報告する。また細胞イメージング装置の為のイオン光学系をシミュレーション設計した。3.細胞間MSディファレンシャル分子比較法まずエレクトロスプレーTOF型質量分析法と2.とを結合させ、マスト細胞を刺激し、外部に放出されたヒスタミンとセロトニンの検出に成功し、その様々な時間での比較を行った。その成果を、来る日本薬学会第124回年会で初めて報告する。これらの結果を元に更に高感度化と、いよいよ細胞イメージング装置の開発の本格的な試作に入る事ができる基盤が出来た。1)超高感度マススペクトロメーターの開発高感度化の為の2つの3重極イオンガイドが完成した。細胞外液を捉えるには、イオン化のブルーレーザー(購入)を更に高出力に変えて、イオン化を増強しインラインレーザーイオン化法を完成させた。

更に、極低温トンネル結合イオン検出器によりMCPとは異なり高分子量の分子イオンまで検出できるようにし、飛行時間型質量分析部(フライトチューブ側)に飛ばし、デジタルオシロスコープ(購入)でそのピークを捉える様にした。その成果を第125年会日本薬学会で発表した。2)細胞内分子分布MSイメージング試験装置の開発対物レンズ4ヶの光学顕微鏡とビデオカメラ(現有)4ヶを一体化した新顕微鏡を作りその4カメラモニターパソコンシステム(開発品購入)により、比較の難しい細胞動態を同時に4画像を捉えながら比較することを可能にし、同時に変化の瞬間に細胞内、細胞表面などに焦点を合わせレーザーにて、ミクロ照射する方法を確立し、イメージングの基盤を構築した。その顕微法の成果を第125年会日本薬学会で発表した。3)細胞間MSディファレンシャル分子比較法の開発2次元ゲル電気泳動法で行われる状態の異なる細胞群間での蛋白質比較が、質量分析では、蛋白質のみでなく低分子も対象となり、その為に昨年確立した細胞内外分子のミクロ脱塩・前処理濃縮分離法(インテグレーター、グラディエント器(購入))を開発した。検出器や当開発質量分析器の真空チャンバーは昇温乾燥(乾燥器(2種購入))し表面発生イオンの低減により高感度化も図った。これらの結果を用い、血液、尿での分離分析法を併用した分子比較法で、神経芽細胞腫の癌マーカー探索の基盤を作り、一部の成果を、第125年会日本薬学会で発表した。1)超高感度マススペクトロメーターの開発従来のMCP検出器では高分子の感度が極端に低く、高分子に高感度な極低温トンネル結合イオン検出器をもつスイス製のmacromizerのハードウエアー一部のみを購入し、その検出能の向上のみでなく、細胞内分子のイオン化法も改善し、装置に組み込んだ。これにより、蛋白質の様に高分子でも高感度に検出できる質量分析機を完成させた。2)細胞イメージングと分子検出法の開発細胞がある変化を起こした瞬間に、その細胞の形態変化とその時に放出あるいは分泌した分子を同時に検出できる手法を開発し、アレルギーの発生する瞬間の形態変化とその時に放出された分子の同時検出を試み成功した。また、その時間的な形態変化と放出分子種およびその時間変化を追跡することに成功し、それらを論文発表した。3)MSディファレンシャル分子比較法によるキー分子発見と分子探索法の開発今までの蛋白質比較から、低分子も対象とし、小児ガンの一種である神経芽細胞腫のキー分子となりうるカテコールアミン類の一斉分析系を確立することに成功し、更に未知分子の構造解析法も確立した。その一部の成果を論文および第126年会日本薬学会で発表した。この解析基盤確立を元にMSディファレンシャル分子比較法により、正常児と疾患児の血液、尿の比較を行い、ガンマーカーを探索することとなり、現在全国からその検体が集められている。この様にして、超高感度な高分子、低分子に渡る質量分析法とイメージングを併用した新しい手法が確立でき、今後のバイオメディカル研究への本格的な応用を期待している。
低レニン性高血圧における腎臓内レニンアンジオテンシン系の遺伝子発現と役割

DOCA(15mg/日,皮下注)の投与及び食塩負荷によりDOCA食塩高血圧(低レニン性高血圧)モデル犬の作製を行った。2週間の投与で平均約30mmHgの昇圧を認め、血漿レニン活性は測定感度以下と低値であった。低レニン性高血圧モデル犬に対し、アンジオテンシンII受容体拮抗薬としてDup753(6mg/kg/hrdiv)を投与した。投与後3時間にわたり、血圧、脈拍、糸球体濾過率(イヌリンクリアランス)、有効腎血漿流量(パラアミノ馬尿酸クリアランス)に有意な変化は認めなかったが、尿量、尿中Na排泄量は有意に上昇した。低レニン性高血圧モデル犬においてもアンジオテンシンII受容体拮抗薬の投与により水Na利尿を認め、全身循環血中のアンジオテンシンIIと腎組織内のアンジオテンシンIIは異なる調整を受けている可能性が示唆された。次に、正常モデル犬、低レニン性高血圧モデル犬の各々の腎組織のアンジオテンシンI、アンジオテンシンII、アンジオテンシン変換酵素活性の測定、またアンジオテンシンIIタイプI受容体のmRNAの発言量をPCR法を用い比較した。その結果、両群において、アンジオテンシンI、アンジオテンシンII、アンジオテンシン変換酵素活性およびアンジオテンシンIIタイプI受容体のmRNAの発現量に有意差はなかった。このことは全身循環血中のアンジオテンシンIIと腎組織内のアンジオテンシンIIは異なる調整を受け、低レニン性高血圧において、受容体発現調節に変化はなく、アンジテンシンIIの腎組織内濃度も低下していないことが示された。
共感的態度のバイオマーカーの探索とカウンセリングにおける有効性評価

共感的態度は、他者の感情を理解し受容的な態度を示す、カウンセリングにおける重要な技法の一つである。本研究では、dual-fMRIを用いて、20組の同性の初対面のペアを対象にして意見開示課題を実施した。結果として、共感的態度と関連して、右下前頭野と右側頭頭頂結合部の機能的結合性の増強が見られた。さらには、職業上、共感的態度を呈することを求められる医療労働者を対象に安静時fMRIを用いた実験的検討を実施した。結果として、右前頭極と線条体の結合性が対照群と有意に異なることを確認した。これらをまとめると、共感的態度のバイオマーカーとして前頭葉と他の領域の機能的結合性の評価が有用である可能性を示した。ヒトが他者に対して示す共感的態度は、他者とのスムーズな社会的交流を可能にすることを通じて、カウンセリングの有効性を高める、重要なカウンセリング技法の一つである。本研究では、自然な社会的行動を遂行中の二者の脳活動の同時計測が可能なdual-fMRIを活用して、共感的態度の有効性を示すバイオマーカーの探索を目的としている。本年度は、実験室環境下における共感的態度の惹起、および、その神経基盤の計測を目的とした実験を実施した。本年度の実験においては、dual-fMRIを用いて、20組の同性の初対面のペアを対象にして、自らの意見を開示する実験課題を開発し、実施した。結果として、聴き手側の行動データの変容から共感的態度の発露があることを確認した。さらには、SPM 12(Statistical Parametric Mapping)を用いた解析により、共感的態度の発露に関わる神経基盤(楔前部)についても明らかにした。一方で、共感的態度の発露が見られない時には、前帯状回などのpain matrixの活動が惹起されることも併せて確認した。さらには、二者間の脳活動の同調性評価するための解析についても取り組んだ。これらの知見は、カウンセリングにおいて重要な共感的態度の発露を表象する神経基盤を、dual-fMRIを用いた二者の社会的交流課題において確認したものである。そのため、共感的態度の有効性を示すバイオマーカーの探索において重要な成果となるものである。dual-fMRIを用いて、実験室環境下における共感的態度の発露とその神経基盤を確認することができた。よって、当初の計画通り進展している。カウンセリング場面においてカウンセラーとクライエントの間の社会的交流をスムーズなものにすることは、カウンセリングの有効性を上げるために重要である。そのような社会的交流をスムーズにする技法の主要なものの一つに、他者の感情を理解し受容的な態度を示す、共感的態度がある。本研究では、自然な社会的行動を遂行中の二者(ペア)の脳活動の同時計測が可能なdual-fMRIを活用して、20組の同性の初対面のペアを対象にした、自らの意見を開示する実験課題(意見開示課題)を実施した。意見開示課題においては、共感的態度の有効性を示すバイオマーカーの探索を目的とした。共感的態度の有効性の評価として、各々が感じる親密度(共感的態度を受けることで、相手に対する親密度をより感じる)を採用した。課題を通じて、右下前頭野と右側頭頭頂結合部の機能的結合性が増強することから前頭葉と他の領域の機能的結合性が共感的態度のバイオマーカーとなりうると考えた。さらには、医療的な面談場面で共感的態度を呈することを求められる医療労働者(職業上の要請として有効な共感的態度を取ることが求められる)を対象に安静時fMRIを用いた実験的検討を実施した。年齢、性別を統制した対照群と比較して、右前頭極と線条体の結合性が低下することを確認した。これは職業的訓練に伴う有効な共感的態度のバイオマーカーと考えられる。以上のように、機能的結合性の評価を中心として、共感的態度の有効性に関するバイオマーカーを明らかにした。計画通り進んでいるため、当初の計画通り進める。昨年度得られた実験結果に対して、二者間の同調性評価に関する解析を加速し、論文化につなげる。さらには、こうした共感的態度の有効性が与える影響についての評価が可能な実験系を構築し、追加実験を実施する。社会神経科学当初計画していた解析を実施したところ、論文化に向けて追加の解析の実施の必要性が判明した。そのため、論文化に関わる予算を昨年度使用しなかったことが理由である。追加解析完了後に、論文化を進め、その際の英文校正・投稿費用として使用する。
インプリント制御領域へのゲノムワイド的アプローチ

由来する親の性に依存して一方のアレルのみが発現するインプリント遺伝子の近傍には、アレル特異的にメチル化されるゲノム領域(DMR)が存在し、インプリンティングの成立維持への関与が示唆されている。これらDMRはCpGアイランド(CGI)様の配列でしかも縦列反復構造をとるという特徴がある。通常CGIは遺伝子のプロモーター近傍に存在しメチル化を免れているが、その例外がDMRと不活化X染色体上のCGIであり、これらはメチル化アレルと非メチル化アレルの混在型(CMI)を示す。したがって情報学的にCGIを網羅するための完全なゲノム配列とCMIを検出する簡便な方法があればインプリント遺伝子を効率的に同定できる可能性が高い。そこで、我々はこのアプローチの有効性を検証する目的で、配列情報が最も正確であるヒト21番染色体長腕部から情報学的に抽出したCGIに関して、独自に考案したHapll-McrBC PCR法を用いてそれらの末梢血細胞中でのメチル化状態を網羅的に検討した。一定基準で選択された同染色体上のCGIのほぼ全体にあたる149個を解析したところ、完全にメチル化されたものが31個、CMIが7個、どのアレルも部分的にメチル化されたものが8個で、残りはメチル化されていないことが分かった。更に、CMI7個のうちテロメア領域由来の3個については、多型を利用してメチル化のアレル特異性を検討した。その結果、2つは母親由来のアレルのみが選択的にメチル化を受けるが、残る1つに関しては「どちらか一方のアレルが必ずメチル化されるが、そのアレルが由来する親の性は個体によって異なる」という新奇なパターンを示すことが明らかになった。
音響鼻腔計測法を用いた鼻呼吸障害が睡眠に与える影響についての検討

平成19年度まで、睡眠呼吸障害疑いにて受診し、終夜睡眠ポリグラフ検査(n-PSG)、頭部規格写真撮影、およびAcoustic Rhinometer・Rhino Manometer検査を施行した805例(男性727例、女性78例、Body Mass Index (BMI)中央値26.1kg/m^2、Apnea Hypopnea Index (AHI)中央値25.2/hr)に対し検討を行った。睡眠呼吸障害の重症度であるAHIを目的変数に、患者背景としてとして年齢、BMI、頭部規格写真のパラメーター、鼻腔断面積値、鼻腔容積値を説明変数として重回帰分析(ステップワイズ法、SPSSver 11)を行った。その結果、重症度の予測式はAHI=3.054xBMI+0.201x年齢-5.347x鼻腔容積-51.781(R^2=0.329、BMI:p<0.001、年齢:p=0.001、鼻腔容積:p=0.023)であった。この予測式からBMIが高く、高年齢で、鼻腔容積が小さいほど睡眠呼吸障害の重症度が高いという結果が得られた。さらに、年齢が45歳未満でBMIが26.3kg/m^2未満かつFacial axis 81.5°以上の群に分け(年齢・BMI・Facialaxisの各中央値で2分)、AHIを目的変数に重回帰分析を施行したところ、重症度の予測式はAHI=0.296x年齢+0.265x鼻腔抵抗値+0.274x MP-H+0.254x PNS-P-77.613(R^2=0.422,年齢:p=0.004,鼻腔抵抗値:p=0.010,MP-H:p=0.011,PNS-P:p=0.014)となった。このことより、よりやせで年齢が若く小下顎がない群においては、鼻呼吸障害が強いものほど睡眠呼吸障害が重症であるという結果であった。睡眠呼吸障害疑いにて受診した患者のうち、終夜睡眠ポリグラフ検査(n-PSG)、頭部規格写真撮影、およびAcoustic Rhinometer (AR)・Rhino Manometer (RM)検査に同意が得られた患者に対して検査を施行した。そして、唾眠呼吸障害の重症度と、顎顔面形態・鼻腔抵抗・鼻腔形態の関係について検討した。n-PSGではApnea Hypopnea Index (AHI)を、頭部規格写真ではDowns-Northwestern法およびRicketts法を用い解析した各パラメーターを、AR検査では鼻入口部から2cm、4cm、6cmの個所の断面積値(それぞれCSA2、CSA4、CSA6)と、鼻入口部から2cm、4cm、6cmまでの鼻腔容積値(それぞれVOL2、VOL4、VOL6)を、RM検査からは鼻腔抵抗値を算出した。そしてAHIを目的変数に、患者背景としてとして年齢、Body Mass Index (BMI)、規格写真のパラメーター、各部位での鼻腔断面積値、鼻腔容積値を説明変数として重回帰分析(ステップワイズ法、SPSS ver 11)を行った。その結果、重症度の予測式で有意な因子であったものはBMI、年齢、鼻腔抵抗値であり、鼻腔抵抗が高いほど睡眠呼吸障害の重症度が高いという結果であった。また、BMIが低い,年齢が若い、顎顔面形態(Facial axis)が大きい群(それぞれの中央値で分けた)では、鼻腔抵抗値は顎顔面形態のパラメーターであるMP-H・PNS-P、年齢、BMIとともにAHIと相関を認める有意な要因であり、相対的に肥満が少なく、年齢が若く、下顎が大きい群では、鼻閉がよりAHIに大きく影響を及ぼすという結果であった。

さらに、年齢が45歳未満でBMIが26.3kg/m^2未満かつFacial axis 81.5°以上の群に分け(年齢・BMI・Facialaxisの各中央値で2分)、AHIを目的変数に重回帰分析を施行したところ、重症度の予測式はAHI=0.296x年齢+0.265x鼻腔抵抗値+0.274x MP-H+0.254x PNS-P-77.613(R^2=0.422,年齢:p=0.004,鼻腔抵抗値:p=0.010,MP-H:p=0.011,PNS-P:p=0.014)となった。このことより、よりやせで年齢が若く小下顎がない群においては、鼻呼吸障害が強いものほど睡眠呼吸障害が重症であるという結果であった。
トランスデューサ理論を駆使するソフトウェア検証

ソフトウェア検証の基盤となる理論として,これまで主に出力を持たないオートマトンなどの計算モデルが用いられてきたが,ソフトウェア検証において出力を持つ計算モデルすなわちトランスデューサの理論が重要になってきている.本研究はトランスデューサとその拡張のソフトウェア検証への応用を進め,検証精度の向上,検証で扱えるプログラムの性質の拡張などにおいてソフトウェア検証の深化を目指す.特に,以下の3つの課題に取り組む:トランスデューサを含む文字列制約の充足可能性判定手続き,木トランスデューサ理論に基づくプログラムの時間計算量解析,ウェブブラウザにおけるセキュリティ対策機構のトランスデューサを用いた検証.ソフトウェア検証の基盤となる理論として,これまで主に出力を持たないオートマトンなどの計算モデルが用いられてきたが,ソフトウェア検証において出力を持つ計算モデルすなわちトランスデューサの理論が重要になってきている.本研究はトランスデューサとその拡張のソフトウェア検証への応用を進め,検証精度の向上,検証で扱えるプログラムの性質の拡張などにおいてソフトウェア検証の深化を目指す.特に,以下の3つの課題に取り組む:トランスデューサを含む文字列制約の充足可能性判定手続き,木トランスデューサ理論に基づくプログラムの時間計算量解析,ウェブブラウザにおけるセキュリティ対策機構のトランスデューサを用いた検証.
メダカの個体間相互作用に関わる神経回路及び遺伝子の検索

メダカの個体間相互作用(群れ行動)を誘導する行動実験系を確立した。さらにメダカ脳において条件的遺伝子操作法を確立し、メダカの社会性行動に関わる候補遺伝子として神経ペプチドをコードする遺伝子群を同定した。本研究ではメダカの行動制御に関わる候補分子として神経ペプチドに注目した。神経ペプチドは脳内に数十種類以上存在して、神経細胞上の受容体に結合して神経細胞の活動を制御する働きがある(神経修飾因子)。神経ペプチドは無脊椎動物から脊椎動物に至るまで特定の神経回路で機能し、様々な行動様式(摂食行動、攻撃行動、配偶行動、社会性行動)に影響を与える。神経ペプチドは遺伝子にコードされているため、遺伝子操作によってメダカの神経ペプチド発現を制御できれば特定の神経回路を人工的に制御する良いツールになることが期待される。本研究ではMALDI-TOF/MS法を用いて、メダカの終脳、視床下部、脳下垂体に存在するペプチドを合計16種類同定した。終脳から同定されたペプチドの一つサブスタンスPをコードする遺伝子の発現様式をin situ hybridization法で解析したところ、終脳の一部の領域と視床下部に発現が検出された。終脳は様々な感覚情報を統合する高次中枢であり、社会性を持つ魚類で発達している傾向があることから、行動目的の設定などの高次な情報処理を担うモジュールに対応する可能性がある。今後、これらの神経ペプチドをコードする遺伝子を調節した遺伝子改変メダカを作成して終脳の機能を修飾することで、メダカの行動に異常が生じるか否かを検定することが可能になった。本研究成果は国際雑誌"General and Comparative Endocrinology"に掲載された。本年度の研究成果は以下の4項目である。(1)初期応答遺伝子(c-fos)を用いた神経興奮領域のマッピング手法の確立。メダカの脳においてc-fosが配偶行動依存に発現誘導されることを確認した。in situ hybridization法においてイントロンプローブを用いた結果、神経活動依存に新規合成された未成熟なmRNAだけを検出するため、高い時間解像度で行動依存の神経興奮を検出できた。これにより初期応答遺伝子を用いてメダカの社会性行動依存に活動する脳領域を検索することが可能になった。本研究成果は国際雑誌Biochem. Biophys. Res. Commun.に掲載された。(2)アデノウイルスを利用したメダカ脳の条件遺伝子操作法の確立。メダカを用いてアデノウイルスが硬骨魚類の脳に感染することを世界で初めて示し、アデノウイルス感染によってCre遺伝子を強制発現することで、Cre-LoxPシステムが動くことを確認した。本手法を用いることによって、メダカの社会性行動に関わる神経回路の候補を遺伝学的手法でラベルしたり、機能修飾することが可能になった。本研究成果は国際雑誌FEBS lettersに掲載された。(3)メダカの群れ様行動を誘導する新規行動実験系の確立。視運動反応によってメダカの群れ様行動(Schooling,行動)が誘導されることを示した。また当該行動は同種選択的な相互作用の結果であり、また成長に伴って発達することを示した。本研究成果は国際雑誌PLoSOneに掲載された。(4)メダカ成体脳における細胞増殖領域のマッピング。メダカは孵化後の成長に伴って、群れ様行動や配偶者選別などの社会性行動を示すようになる。本研究ではメダカの成長に伴う脳発達の一つの様式として神経新生の様式を記載した。本研究成果は国際雑誌Brain Researchに掲載された。
難治性がんの効果的治療を目指した革新的薬物送達技術の構築

本研究は、光増感剤含有ナノ粒子投与後に、固形がん選択的な光照射により血管内で局所的に発生する一重項酸素などの活性酸素種により、難治性がん組織内血管の低い透過性を一時的に亢進させ、その後に別途投与する抗がん剤等含有ナノ粒子製剤の腫瘍組織集積性を改善し、高い抗腫瘍効果を達成する「光誘発型の腫瘍組織選択的な血管透過性亢進技術(photo-triggered tumor vascular treatment, PVT)」の構築ならびにその治療への多面的な応用を目指ものである。本研究で構築を目指す治療戦略の成否の鍵となるのは、PVT処置によりナノ粒子の腫瘍組織移行性が「どの程度」「どのくらいの期間」増大するのかという点に関する定量的な情報である。そこで本年度は、様々な条件においてPVT処置を施した際のナノ粒子の腫瘍組織移行動態を定量的に評価した。検討を加えた種々の処置条件の中で、処置後に別途投与したナノ粒子の腫瘍組織への送達効率が最も増大した、「光増感剤含有ナノ粒子を光増感剤として0.1 mg/kgの投与量にて静脈内投与した15分後に、腫瘍組織に3分間に亘って光照射を施す一連の処置」を、光誘発型の腫瘍内血管への処置(PVT)と名付け、今後すべての検討で用いることとした。現時点での研究の進捗状況が、当初申請書に記載していた研究計画と量・質ともに、概ね同程度であるため。初年度の研究の進展が順調であったため、特に予定を変更するつもりはなく、当初計画していた通りに進めていくつもりである。(理由)初年度の研究遂行に必要な消耗品費の累計が当初の予想を若干下回ったため。(使用計画)次年度使用額については、次年度に実施予定の動物実験などに繰り越すこととする。
金属ポルフィリン自己組織化分子層の構造制御積層化による新規機能性界面構造の構築

今年度は前年度に構築条件を確立したAu(111)基板上の鉄およびコバルトポルフィリン(FeTPP、CoTPP)分子層の酸素還元触媒能を評価するとともに、新たに亜鉛ポルフィリン(ZnTPP)のSi(111)基板上への構築条件を確立し、その可視光誘起電子移動について評価した。金属ポルフィリンとの結合性官能基としてのチオール基を有する、1,4-Benzene-dithiol(1,4-BDT)の自己組織化単分子層(SAM)をAu(111)単結晶基板上に構築し、そのSAM修飾Au(111)基板をFeTPPおよびCoTPP溶液に浸漬して、FeTPP分子層修飾Au(111)基板およびCoTPP分子層修飾Au(111)基板を作製した。両分子層修飾Au(111)電極の酸素飽和0.05 M硫酸電解質溶液中で測定したリニアスイープボルタモグラムにより、下地の1,4-BDT SAM修飾Au(111)電極ではほとんど観測されなかった酸素還元電流が、両修飾電極では大きく観測された。また、回転リングディスク電極を用いて、四電子還元はバルクと同様CoTPPの方がFeTPPより大きいことを明らかとした。金属ポルフィリンとの結合性官能基としてのカルボキシ基を有するMethyl acrylate(MA)およびEthyl undecylenate(EU)のSAMをSi(111)単結晶基板上に構築し、そのSAM修飾Si(111)基板をZnTPP溶液に浸漬して、ZnTPP分子層修飾Si(111)基板を作製した。作製した修飾Si(111)電極の可視光誘起電子移動による光電流測定によって、その効率を評価するとともに、偏光変調反射赤外分光やX線光電子分光によって、高効率な修飾電極構築条件を確立した。27年度が最終年度であるため、記入しない。平面型の金属ポルフィリン分子は、光感応性、電気化学活性、触媒活性など、多くの機能を有する機能性分子であるが、その機能はポルフィリン環の面内で起こる。そのため、金属ポルフィリンを利用し、多機能・高効率な分子素子を実現するためには、金属ポルフィリン環を固体基板表面に平行に配列させた分子組織体構造を構築する必要がある。我々は、ポルフィリン環に基板との結合性官能基を導入した新規分子の平面配列吸着を達成しているが[1]、この方法では分子合成に多大な時間を要することから、本研究は2段階の積層で金属ポルフィリン環を平面吸着させる新たな手法により、種々の機能を有する平面吸着型金属ポルフィリン分子層を構築することを目的としている。当該年度は平面吸着型の鉄およびコバルトポルフィリン(FeTPP、CoTPP)分子層の構築条件を確立し、またその酸素還元触媒能を評価した。金属ポルフィリンとの結合性官能基としてのチオール基を末端に有する、1-4-Benzene-dithiol(1,4-BDT)の自己組織化単分子層(Self-Assembled Monolayer; SAM)をAuディスク基板上に構築し、そのSAM修飾基板をFeTPP、CoTPP溶液に浸漬して、FeTPP、CoTPP分子層修飾金基板を作製した。両分子層修飾基板のX線光電子スペクトルより、金属ポルフィリンが平面吸着していること、および飽和吸着していることを確認した。両修飾電極の、酸素飽和0.05 M H2SO4溶液中で測定したリニアスイープボルタモグラム(LSV)を図1に示す。1,4-BDT SAMのみではほとんど観測されなかった酸素還元電流が、両修飾電極では大きく観測された。また、バルクと同様、CoTPPの方がFeTPPよりも酸素還元触媒能が大きいことがわかった。

平面吸着型金属ポルフィリン単分子層の構築に成功し、その構築法をほぼ確立した。その金属ポルフィリン分子層の触媒活性評価により、触媒効率の高さを立証した。また、領域内の共同研究により、単分子層における電気電導度計測も開始した。27年度が最終年度であるため、記入しない。有機金属錯体を利用して、構造・配向を制御した金属ポルフィリン多分子層を構築し、より高機能な分子デバイスを構築していく。また、領域内の共同研究の実施によって、金属ポルフィリンの配向と電気伝導性との関係を評価する。
肝臓標的遺伝子治療のための基礎技術の開発

肝臓標的遺伝子治療によって利する疾患を少なくない。そのうち、LDLレセプター欠損症である家族性高コレステロール血症をモデルとして、以下の2つの目標を達成した。第一は、遺伝子導入の際、外来性タンパクに対する免疫反応の惹起が推測される。そこで、LDLレセプター以外のタンパクの遺伝子操作によるLDL欠損症の代謝異常の是正の可否を検証した。リポタンパクリパーゼ(LPL)とアポリポタンパクE(アポE)に注目した。なぜなら、いずれも非LDLレセプター代謝経路における重要なリガンドとして注目されているからである。ヒトLPLをCAGのプロモーターによって過剰発現するトランスジェニックマウス(LPLTg)をLDLレセプターノックアウトマウス(LDLRKO)に交配して、LPLを過剰発現するLDLRKOを作成した。LPLTgはLDLRKOにおいても血清トリグリセリド(TG)のみならずコレステロール(TC)に対しても低下作用を有し、食事誘発性アテローム形成も著明に抑制することが示された。同様に、ラットアポEをマウスメタロチオネインプロモーターによって過剰発現するトランスジェニックマウス(ETg)をLDLRKOに交配してアポEを過剰発現するLDLRKOを作成して、そのリポタンパク代謝をLDLRKOと比較した。ETg;LDLKOの血清コレステロールは抑制され、食事誘発性アテローム形成の有意に抑制された。更に、ex vivoでのLDLレセプター遺伝子導入療法の効果が不十分であるのは、移植肝の生着率が低い点に問題がある。非移植肝の選択的破壊と、移植肝の再生を促す方法の可否を検討するモデル系として、アシアロ糖タンパクレセプターのノックアウトマウス(MHL1-/-)を作成した。ホモ接合体では、MHL1とともにMHL2も完全に欠損し、アシアロ糖タンパクの除去も消失した。肝幹細胞の樹立のための基礎検討:129/Sv純系マウスのコロニーを樹立した。肝細胞を不死化するための手段のひとつとして、Bcl2の発現ベクターを構築し、CHO細胞に対してトランスフェクションを行い、Bcl2の発現を確認した。これに対して、たとえば、アポートシス誘導物しつである酸化脂質を作用させ、その効果がBcl2の発現によって相殺されることを確認した。これを用いて、導入新生児からコラゲナーゼを用いて肝実質細胞を採取し、in vitroで検討する。初代肝細胞培養は通常の培養設備を用い、分裂能を調べ、繼代培養の可能性について検討する。一方、各種遺伝子を肝臓において発現させる方法として、現在最も有力視されているアデノウイルスの方法を検討するため、種々の組み換えアデノウイルスを作製して目下検討している。現時点では、Bcl2発現ウイルスの肝再生に対する作用について検討中である。肝細胞分化の指標としてのコレステロール7α-ヒドロキシラーゼの有用性について検討:コレステロール7α-ヒドロキシラーゼの発現ベクターを構築し、CHO細胞に対してトランスフェクションを行っている。アシアロ糖蛋白受容体を利用した被移植肝のみを選択的に破壊と移植肝の再構築については、まず、アシアロ糖蛋白としアシアロソムコウドまたはそのアナログであるガラクトシル-ポリリジンにライシンかチミヂンキナーゼ遺伝子の発現ベクターを直接結合させる方法を検討中である。肝幹細胞を移植した場合の分化指標として何を用いたらよいかを調べるために、肝臓特異的に発現する遺伝子の遺伝子操作によりその機能を探った。また、遺伝子導入の方法として、実験動物レベルトランスジーンを導入することが可能である。そこで、トランスジェニックマウスを機能欠損マウスに交配した場合、欠損機能を改善しうるか否かについて検討した。肝臓に特異的に発現する遺伝子として、アシアロ糖蛋白受容体2型の欠損マウスの受容体機能を検討した。

2型受容体は1型受容体とポリマーを形成して、受容体としての機能を全うしているが、2型受容体が欠損によって、1型受容体も完全に機能不全になるか否かを検討した。2型受容体ノックアウトマウスの肝臓におけるアシアロ糖蛋白の結合と取り込みは著明に低下した。1型受容体数の著明に減少していたが、残存した1型受容体のみでも部分的ではあるがアシアロ糖蛋白の除去を行いうることが明らかになった。従って、遺伝子操作しない肝臓を識別して、それに選択的に細胞死を惹起するためには、2型受容体ノックアウトマウス由来の肝臓を用いるのでは不完全で、当初の目的を遂行するには1型受容体ノックアウトマウスの樹立も不可欠と考えて、現在、キメラを作製中である。もうひとつの肝臓特異発現を示す遺伝子として、胆汁酸合成酵素のひとつであるコレステロール7α水酸化酵素のノックアウトマウスを作出した。このマウスは新生児死亡率が高く、その原因として、胆汁酸の欠乏とビタミンの吸収障害が考えられた。しかし、成長後はこれらの表現形は消失し、正常マウスと変わらない体重増加を示した。リポタンパクリパーゼ(LPL)を過剰に発現するLDLレセプターノックアウトマウス(LPL/LDLRKO)を樹立した。LPL/LDLRKOのリポタンパク代謝をLDLRKOと比較したところ、血中の中性脂肪値と総コレステロール値の低下が観察された。機能欠失を示す遺伝子以外の遺伝子操作によって、異常が是正される可能性が示された。本年度はアシアロ藤蛋白レセプタータイプ1のノックアウトマウスを樹立した。相同的組換えによつて変異を導入したES細胞を卵にマイクロインジェクションして、キメラマウスを作成した。いくつかのキメラマウスからヘテロ接合体が生まれた。ヘテロ接合体同士の交配によってホモ接合体(MHL1KO)を樹立した。MHL1KOの外見は正常で、繁殖力も変化は認められなかった。肝臓の膜分画に対してイムノブロットを行ったところ、MHL1とMHL2の両方のサブユニットが完全に欠損していた。これは、MHL2KOの場合、MHL2は完全欠損していたが、MHL1は数%残存していたことを考えると興味深い現象である。放射性ヨードで標識したアシアロオロソムコイドとアシアロフェチュインの血中からの消失速度を比較して、アシアロ藤蛋白の除去能を検討した。アシアロオロソムコイドの異化はMHL1KOにおいてほとんど欠損しており、アロフェチュインの異化も遅延していた。特に、アシアロフェチュインの異化障害はMHL2KOの場合よりも強く、MHL1とMHL2の両方のサブユニットの欠損が確認されたイムノブロットの所見と合致していた。現在、血中のタンパクの糖鎖を解析中である。
共焦点レーザー顕微鏡による交感神経のカルシウム動態に対する麻酔薬の作用の画像解析

これまでの研究結果より1.細胞外のATPによって神経細胞および衛星細胞の両者で[Ca^<2+>]_iの上昇が認められた.神経細胞ではP2Y受容体を介する細胞内カルシウム貯蔵場からのCa^<2+>の動員,衛星細胞ではP2X受容体を介する細胞外からのCa^<2+>流入が関与することがわかった.2.神経細胞と衛星細胞でATP刺激後の[Ca^<2+>]_iの上昇に時間差が見られた.これは,衛星細胞でのすばやい[Ca^<2+>]_iの上昇は細胞外からのCa^<2+>流入であり,その後の神経細胞でのゆっくりとした[Ca^<2+>]_iの上昇は細胞内カルシウム貯蔵場からのCa^<2+>の動員によるためと考えられた.3.神経周膜細胞がP2X受容体を有し,この受容体を介してCa^<2+>流入による[Ca^<2+>]_iの上昇反応が誘発されることが示唆された.以上より,ATPが交感神経系の細胞の機能調節に関与している可能性が示唆された.さらに神経節を構成する神経細胞と衛星細胞のATP応答は独立しておきていることが明らかになった.神経周膜は,形態的にbarrier機能の存在が報告されてきたが,今回の結果はATPに対して機能的にもbarrier機能が存在することを証明した.神経周膜細胞の持続した[Ca^<2+>]_iの上昇は,神経周膜細胞のintercellular communicationsを抑制し,結果としてbarrier機能の低下をもたらす可能性が示唆された.臨床的に神経周膜の透過性の変化は,neuropathiesやedemaと関係あることが報告されていることから,本研究において神経周膜細胞におけるATPが誘発する[Ca^<2+>]_iの増加を抑制したLidocaineの様な薬剤は,その膜の透過性が亢進するのを防ぐことで神経線維に対して保護作用があるのではないかと考えられた.これまでの研究結果より1.細胞外のATPによって神経細胞および衛星細胞の両者で[Ca^<2+>]_iの上昇が認められた.神経細胞ではP2Y受容体を介する細胞内カルシウム貯蔵場からのCa^<2+>の動員,衛星細胞ではP2X受容体を介する細胞外からのCa^<2+>流入が関与することがわかった.2.神経細胞と衛星細胞でATP刺激後の[Ca^<2+>]_iの上昇に時間差が見られた.これは,衛星細胞でのすばやい[Ca^<2+>]_iの上昇は細胞外からのCa^<2+>流入であり,その後の神経細胞でのゆっくりとした[Ca^<2+>]_iの上昇は細胞内カルシウム貯蔵場からのCa^<2+>の動員によるためと考えられた.3.神経周膜細胞がP2X受容体を有し,この受容体を介してCa^<2+>流入による[Ca^<2+>]_iの上昇反応が誘発されることが示唆された.以上より,ATPが交感神経系の細胞の機能調節に関与している可能性が示唆された.さらに神経節を構成する神経細胞と衛星細胞のATP応答は独立しておきていることが明らかになった.神経周膜は,形態的にbarrier機能の存在が報告されてきたが,今回の結果はATPに対して機能的にもbarrier機能が存在することを証明した.神経周膜細胞の持続した[Ca^<2+>]_iの上昇は,神経周膜細胞のintercellular communicationsを抑制し,結果としてbarrier機能の低下をもたらす可能性が示唆された.臨床的に神経周膜の透過性の変化は,neuropathiesやedemaと関係あることが報告されていることから,本研究において神経周膜細胞におけるATPが誘発する[Ca^<2+>]_iの増加を抑制したLidocaineの様な薬剤は,その膜の透過性が亢進するのを防ぐことで神経線維に対して保護作用があるのではないかと考えられた.生後8週齢、雄性ウィスター系ラット(250-400g)から上頸神経節を摘出し、コラゲナーゼによる結合組織の消化後、Ca^<2+>憾受性色素Indo-1/AMを4°Cで12時間負荷した。その後に神経節標本を、カバーグラスが底面に張られた灌流チャンバーに固着した。標本周囲をHEPES緩衝リンゲル液で灌流し、ATPおよび各種の試薬を加えた際の[Ca^<2+>]iの変化を、リアルタイム共焦点レーザー顕微鏡(Nikon RCM/Ab)を用いて解析した。今後は局所麻酔薬を作用させた時の反応を明らかにしていく予定である。今回新たに神経細胞、衛星細胞が興奮性の細胞であるか非興奮性の細胞であるかを調べるために細胞外液に高カリウムイオンを添加して細胞膜を脱分極させた。神経細胞では細胞内カルシウムイオン濃度([Ca^<2+>]_i)の上昇が引き起こされたが、衛星細胞では認められなかった。そしてこの神経細胞での[Ca^<2+>]_iの上昇は、lidocaine(局所麻酔剤)で抑制された。このことより神経細胞は、興奮性であり衛星細胞は非興奮性であることが分かった。さらに末梢神経でのATPの作用を明らかにするために、生後8週齢、雄性ウィスター系ラット(250400g)の大腿から坐骨神経を摘出し、コラゲナーゼによる結合組織の消化後、Ca^<2+>感受性色素Indo-1/AMを4°Cで3時間負荷した。

その後灌流チャンバーに固着し、各種の試薬を加えた際の[Ca^<2+>]_iの変化を、リアルタイム共焦点レーザー顕微鏡(Nikon RCM/Ab)を用いて解析した。ATPは、神経周膜細胞の[Ca^<2+>]_iを上昇させた。細胞外カルシウムイオンの流入を抑えることでATPに対するこの反応は抑制された。またP2X agonistsにより[Ca^<2+>]、は上昇したが、P2Y agonistsによる反応は認められなかった。以上のことより神経周膜細胞がP2X受容体を有していることが分かった。前回の研究に引き続き生後8週齢、雄性ウィスター系ラット(250400g)の大腿から坐骨神経を摘出し、コラゲナーゼによる結合組織の消化後、Ca^<2+>感受性色素Indo-1/AMを4°Cで3時間負荷した。その後灌流チャンバーに固着し、各種の試薬を加えた際の細胞内カルシウムイオン濃度([Ca^<2+>]_i)の変化を、リアルタイム共焦点レーザー顕微鏡(Nikon RCM/Ab)を用いて解析した。神経周膜に覆われていない末梢神経では、Schwann cellはATPに対して[Ca^<2+>]_iの増加を示した。一方、神経周膜細胞に覆われた状態では、その反応は認められなかった。Lidocaineによって神経周膜細胞のATPが誘発する[Ca^<2+>]_iの増加は抑制された。興奮性の細胞であるか非興奮性の細胞であるかを調べるために細胞外液に高カリウムイオンを添加して細胞膜を脱分極させた。膜の脱分極によって、神経周膜細胞の[Ca^<2+>]_iは上昇しなかった。神経周膜細胞の持続した[Ca^<2+>]_iの上昇は、神経周膜細胞のintercellular communicationsを抑制し、結果としてbarrier機能の低下をもたらす可能性が示唆された。また神経周膜細胞におけるATPが誘発する[Ca^<2+>]_iの増加を抑制したLidocaineのような薬剤は、神経周膜の透過性の亢進を防ぎ神経周膜のbarrier機能を維持することで、神経周膜に対し保護作用があると示唆された。