hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胎生期低栄養が小胞体ストレス応答を介して成人期の脂肪蓄積リスクとなる機序の解析

諸家の疫学研究から、胎生期に低栄養環境に曝されると、成長後に非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を発症するハイリスクとなることが報告されている。我々はその具体的なメカニズムの解明と、治療的介入戦略への探索を研究の目的とした。妊娠マウスに摂餌制限を行うことで、産生仔が成長後に肝脂肪変性が増悪する動物モデルを調整し、1)肝脂肪変性の増悪とともに肝臓マクロファージの浸潤による慢性炎症が進行すること、2)肝脂肪変性の増悪とともに小胞体ストレスの亢進によりおりたたみ不良たんぱく質が蓄積すること、3)産生仔の肝脂肪変性が増悪した後であっても、シャペロンの経口投与によって小胞体ストレスを軽減することで肝脂肪変性は劇的に改善することを明らかにた(Sci Rep. 5, 16867, 2015)。さらに、胎生期の低栄養による肝脂肪変性の増悪ならびにシャペロン投与による劇的改善は、クロマチン構造の変容による遺伝子発現の調節によって行われることを解明し、現在論文投稿準備中である。丸剤までの研究成果により、胎生期に低栄養環境に曝された場合に、NAFLDに罹患するハイリスク因子となる具体的否メカニズムの一端が解明するとともに、天然シャペロンを含んだ食生活の指導やサプリメントの開発など具体的な治療、介入戦略を探索する手がかりが明らかとなった。マウスを用いて、母獣の摂餌制限による体制低栄養環境により、成獣期に肝脂肪変性が著しく増悪する動物モデルを確立した。この動物生デルを用いて、胎生期の低栄養環境は、肝細胞に小胞体ストレスを惹起しておりたたみ不良タンパク質を蓄積し、肝臓マクロファージ浸潤による慢性炎症ならびに脂肪蓄積の増悪を来すことを明らかにした。さらに、小胞体ストレスを緩和するシャペロンを傾向投与しておりたたみ不良タンパク質の蓄積を軽減することで、肝臓の慢性炎症ならびに脂肪蓄積は劇的に改善することを示し、新たな先制医療の開発の可能性を明らかにした。平成28年3月4日、胎生期低栄養マウスモデルの肝脂肪変性の解析の治験から。平成28年度では。網羅的メタボローム解析ならびに網羅的遺伝子エピジェネティクス解析を行う予定である。Microarray-based Integrated Analysis of Methylation by Isoschizomers(MAIAMI)法により網羅的にDNAメチル化解析を行い、小胞体ストレス応答に関連する諸遺伝子プロモーターが胎生期低栄養によって如何なるメチル化の変化を受けているか、成獣期における小胞体ストレス応答亢進との関連の視点から解析する予定である。さらに、同定を目指す小胞体ストレス調節関連物質のプロモーターのメチル化された部分が当該遺伝子発現の制御に及ぼす影響について、ルシフェラーゼを用いたリポーター遺伝子アッセイを行い、胎生期低栄養に起因するメチル化の変化の病態生理学的意義の確認を行う予定である。これまでの研究期間において確立した胎生期低栄養により産生仔の脂肪肝が増悪するマウスモデルを用いて、マイクロアレイ法により遺伝子の網羅的発現変化を解析した。平成29年度ではさらに、次世代シークエンサーによるMBD法にて、この動物モデルの肝臓における遺伝子のメチル化を網羅的に解析する予定である。
日本企業におけるキャリア・ディベロップメント・プログラム(CDP)に関する研究

本研究の目的は日本の大企業のキャリア・ディベロップメント・プログラム(CDP)の実践における最近の傾向を検討することである。日本の大企業の人事がどのように変化してきたか、そしてどのように変化して行くかを検討した。各産業の大企業が人事面においてどこまでキャリア・デベロップメントを実践しているかを検討した。検討の結果として、日本の企業においてはキャリア・ディベロップメントに関するパラダイム転換を解明した。インタビューから新しいキャリア・ディベロップメント・パラダイムを説明するための枠組みを作成した。新しいキャリア・ディベロップメント・パラダイムは四つの特徴をもっている。現状の経済や国際的、また社会的な問題を考えると、これから先も、従来の日本の経営システムが存続するか否かは疑問でキャッチ・アップ型モデルで高度成長を遂げてきた日本の企業も大きな転換点にきて、組織と個人の関係をもう一度組み立て直さなければならない。実際、多くの企業がこのような経営環境の変化に適応するために、これまでの経営制度を変革に着手している。しかし、企業が形式的に新しい人事政策だけを導入しても、それを着実に機能させなければ経営革新を実現することはできない。もし企業が本当の経営革新を目指すならば、新しいキャリア・ディベロップメント・パラダイムを構築することが、現状を打破するための最善策の一つである。本年度は次の3点を実施した。1文献の情報収集と実態調査の準備:(1)アメリカと日本の経営学専門誌に過去5年に掲載された関連論文の調査を行った。(2)カナダでの情報収集を行った。日本であまり手に入らない当研究に関連の深い米国の専門誌(Human Resource Management等)と研究論文の調査を行った。(3)本研究についてMacMaster大学とYork大学の研究者に相談した。MacMaster大学の研究者からは本研究をもっと有意義にするため、現在の職場への進路を決定しようとしている日本の大学生のキャリア志向も検討するべきだという助言を受けた。(4)文献と助言に基づいて新しい研究フレームワークを作成した。(5)調査の対象大手企業のリストをつくった後、電話と手紙で人事担当に連絡して、調査の説明と依頼をした。2実態調査:(1)日本の大企業の実態調査を行った。各企業の人事部と従業員にインタビューをした。具体的な調査方法は、従業員と人事部門管理者への深層面接法を採用した。それぞれの面接内容をテープに録音し、面接の際にはメモもとった。(2)日本の大学生のキャリア志向についても調査を行った。主としてSchein(1990)のキャリア・アンカー質問票調査に基づく手法を経済学部の学生に対して用いた。3データの分析:面接内容のテープのコンピュータ入力・分析、収集した資料・文献の整理、残りのフィールドワークなどの作業は現在進行中である。本年度は次の2点を実施した。1.日本の大企業の人事がどのように変化してきたか、そしてどのように変化して行くかを検討した。各産業の大企業が人事面においてどこまでキャリア・デベロップメントを実践しているか検討した。インタビューから新キャリア・ディベロップメント・パラダイムを説明するための枠組みを作成した。2.日本の大学生のキャリア志向について調査を行った。この研究は、変容しつつある現在の職場への進路を決定しようとしている日本およびカナダの大学生のキャリア志向を比較検討した。主としてSchein(1990)のキャリア・アンカー質問票調査に基づく手法を両国の経済・経営学部の学生に用いた。調査の結果、日本の大学生は(雇用の)保証安定、地域への定着を志向しているのに対し、カナダの大学生は管理能力の志向の重視していることを示した。企業家精神の志向やライフスタイルの志向については二国間に特別な差異は存在しなかった。
新規白色腐朽菌によるダイオキシン類分解除去システムの開発

当該の研究期間で行われた研究成果は、以下の通りである。1.ダイオキシン分解菌と同等の酵素ペルオキシダーゼを産生するCoprinus属の菌を培養し、その粗酵素液を用いてノニルフェノールとビスフェノールAの除去に関する実験の最適化を行った。ノニルフェノール除去に関して、ノニルフェノールと酸化剤過酸化水素との最適モル比は1:7であり、最適pHおよび反応温度はそれぞれ7-8、25-40°Cであった。なお、この条件下において1mg/Lのノニルフェノールを除去するのに必要な酵素量は、0.5U/mLとなった。すなわち、1mgのノニルフェノールを除去するのに500Uのペルオキダーゼが必要であることを示している。この値は、ビスフェノールAを除去するのに必要な量の16.7倍であった。なお、ビスフェノールAとこの酵素との反応では、酸化重合による沈殿が生じたが、ノニルフェノールの場合には、沈殿は発生しないため、ビスフェノールAとは分解機構が異なることが示唆された。2.本研究の主題は、新規にスクリーニングした白色腐朽菌を用いてダイオキシン類のバイオレメディエーション技術を構築することにある。このような背景から、筆者らは製紙工場廃液等からダイオキシン分解菌のスクリーニングを試み、約1000株の中から高い分解性を持つ新種の白色腐朽菌L-25株の取得に成功した。この菌は、16rDNA-500配列解析よりPhanerochaete属と類縁関係にある新規株であることが確認され、種々の条件下で、培養を行ったところ、著量のマンガンペルオキシダーゼを分泌することが分かった。たとえば、多量のペプトン類を添加することにより、その生産性は増加し、14U/mLもの活性を有するマンガンペルダーゼを生産することが可能となった。さらに、ダイオキシン類を基質としてこの菌を培養したところ100ng/mLの1,3,7,8-テトラクロロダイオキシンおよび1,2,7,8-テトラクロロジベンゾフランを1週間の培養で、60%以上分解させることに成功した。これは、従来から報告されている菌株より分解速度が速く、また高塩素化ダイオキシンを容易に分解させることができることから、今後の研究が期待される。今年度に行った研究によって得られた知見は、以下の通りである。1.ダイオキシン分解菌のスクリーニングと並行して、フェノール系化合物の重合沈殿処理に有効なペルオキシダーゼ生産菌の培養を行い、その最適化を図るとともに誘導物質5-アミノレブリン酸の効果を調べた。その結果、対照の場合と比較して1.82倍程度の酵素活性の向上が認められた。さらに、この粗酵素液を用いてフェノール、ビスフェノールA、ノニルフェノールの処理を行ったところ、フェノール、ビスフェノールAは酵素によって酸化重合され沈殿物を生じたが、ノニルフェノールは重合されず酸化分解が起った。また、ビスフェノールA、ノニルフェノールに関しては、急性毒性及び環境ホルモンすなわちエストロゲン様作用を調べたが、いずれの場合も反応後その作用の低下が認められた。

このような背景から、筆者らは製紙工場廃液等からダイオキシン分解菌のスクリーニングを試み、約1000株の中から高い分解性を持つ新種の白色腐朽菌325株の取得に成功した。325菌の詳細な同定は困難であったが、16rDNA-500配列解析によりPhanerochaete属と類縁関係にある株であることが判明した、この株を用いて、ポテトデキストロース液体培地中にて回転振トウ培養を行ったところ、ダイオキシンの分解が可能な酵素マンガンペルオキシダーゼ及びリグニンペルオキシダーゼの分泌が認められた。さらに、ここで得られた培養液を濃縮し、ダイオキシン類の分解を行った結果、塩素の置換数が5以上のものについても分解性を確認することができた。3.上記菌株は、ストレスに弱く培養が困難であるため、効率よく培養できる回転円板型バイオリアクターの開発を行った。円板素材としては、織布とステンレスメッシュを組み合わせたものを使用し、現在、予備実験中ではあるが、比較的良好な結果が得られつつある。昨年度に続き、今年度行った研究によって得られた知見は、以下の通りである。1.ダイオキシン分解菌のスクリーニングと並行して行ったフェノール系化合物の重合沈澱処理に有効なペルオキダーゼの大量生産法に関する実験は、昨年度終了している。今年度は、その粗酵素液を用いてノニルフェノール除去に関する実験の最適化を行った。ノニルフェノール除去に関して、ノニルフェノールと酸化剤過酸化水素との最適モル比は1:7であり、最適pHおよび反応温度はそれぞれ7-8、25-40°Cであった。なお、この条件下において1mg/Lのノニルフェノールを除去するのに必要な酵素量は、0.5U/mLとなった。すなわち、1mgのノニルフェノールを除去するのに500Uのペルオキダーゼが必要であることを示している。この値は、ビスフェノールAを除去するのに必要な量の16.7倍であった。なお、ビスフェノールAとこの酵素との反応では、酸化重合による沈殿が生じたが、ノニルフェノールの場合には、沈殿は発生しないため、ビスフェノールAとは分解機構が異なることが示唆された。2.昨年度、スクリーニングした白色腐朽菌を用いてダイオキシン類の分解を試みた。この菌は、16rDNA-500配列解析よりPhanerochaete属と類縁関係にある新規株であることが確認され、種々の条件下で、培養を行ったところ、著量のマンガンペルオキシダーゼを分泌することが分かった。たとえば、多量のペプトン類を添加することにより、その生産性は増加し、14U/mLもの活性を有するマンガンペルダーゼを生産することが可能となった。さらに、ダイオキシン類を基質としてこの菌を培養したところ100ng/mLの1,3,7,8-テトラクロロダイオキシンおよび1,2,7,8-テトラクロロジベンゾフランを1週間の培養で、60%以上分解させることに成功した。これは、従来から報告されている菌株より分解速度が速く、また高塩素化ダイオキシンを容易に分解させることができることから、今後の研究が期待される。3.上記菌株は、ストレスに弱く培養が困難であるため、新たな大量培養法の確立が必要である。本研究では、効率的に培養できる方法として回転円板型バイオリアクターによる方法を検討中である。
抗酸化タンパクノックアウトがマラリア原虫の哺乳類及び蚊体内発育に及ぼす影響の解析

In vito環境において、マラリア原虫新規抗酸化タンパク、ペルオキシレドキシン(Prx)の欠損が原虫生理に与える影響を観察する目的で、2-Cys型Prx遺伝子を欠損するローデントマラリア原虫(Plasmodium.berghei, ANKA strain)を作製し、その表現型を観察した。ノックアウトコンストラクトの導入、薬剤マーカー(ピリメタミン)によるスクリーニング後に、限界希釈で得られたクローンについて2-Cys型Prx遺伝子座での相同組換えをSouthern blotで確認した。この時、マーカー遺伝子座で組換えをおこしピリメタミンに対する耐性のみを獲得した原虫クローンも、薬剤耐性コントロール(Prx WT)として選択した。原虫細胞でのPrx欠損はmRNAおよびタンパクレベルで確認した。Prx欠損原虫(Prx KO)をBALB/c、C57BL/6NおよびDBA/2Jに感染させて赤血球内発育型(赤内型)での増殖を観察した。その結果、Prx KOの赤内型増殖率は、いずれのマウス系統においても、親株(WT)およびPrx WTのそれらと同等であった。しかしながら、Prx KOでは生殖母体(ガメトサイト)の形成率がPrx WTに比して有意に低かった。一方、蚊(Anopheles stephensi)体内での発育についても、中腸壁でのオオシスト形成を比較したところ、Prx Koでは成熟オオシストの形成率がWT/Prx WTに比して有意に低かった。この結果、PrxKOでは唾液腺に集積するスポロゾイト数も有意に減少した(WT/Prx WTの1/10-1/20)。感染蚊唾液腺からスポロゾイトを調整し、ドースを変えてマウス尾静脈に接種し、赤血球内に出現してくる原虫を観察したところ、Prx KOではではマウスへの感染性が野生型原虫の約1/10に低下していた。Prx KOスポロゾイトをマウス尾静脈に接種し、その1時間後に肝臓を摘出して肝細胞内に侵入した原虫の数をWTでのそれと比較したところ、両者には有意な差が認められなかった。以上の成績から、Prx KOではガメトサイトの形成、スポロゾイトの形成、またそのマウスへの感染性、更には肝内型原虫の発育も阻害され、蚊から哺乳類への伝搬が著しく障害されることが示唆された。In vivo環境において、マラリア原虫新規抗酸化タンパク、ペルオキシレドキシン(Prx)の欠損が原虫生理に与える影響を観察する目的で、2-Cys型Prx遺伝子を欠損するローデントマラリア原虫(Plasmodium.berghei,ANKA strain)を作製し、その表現型を観察した。

Prx欠損原虫(Prx KO)をBALB/c、C57BL/6NおよびDBA/2Jに感染させて赤血球内発育型(赤内型)での増殖を観察した。その結果、Prx KOの赤内型増殖率は、いずれのマウス系統においても、親株(WT)およびPrx WTのそれらと同等であった。しかしながら、Prx KOでは生殖母体(ガメトサイト)の形成率がPrx WTに比して有意に低かった。一方、蚊(Anopheles stephensi)体内での発育についても、中腸壁でのオオシスト形成を比較したところ、Prx KOでは成熟オオシストの形成率がWT/Prx WTに比して有意に低かった。In vivo環境において、マラリア原虫新規抗酸化タンパク、ペルオキシレドキシン(Prx)の欠損が原虫生理に与える影響を観察する目的で、2-Cys型Prx遺伝子を欠損するローデントマラリア原虫(Plasmodium.berghei, ANKA strain)を作製しその表現型を観察した。昨年度に引き続き、Prx欠損原虫(Prx KO)の媒介蚊(Anopheles stephensi)体内での発育を観察した。Prx KOに感染したマウスに蚊を吸血させ、その14日後に中腸でのオオシスト形成を比較したところ、Prx KOでは成熟オオシストの数が親株(WT)の約1/10に減少していた。この時、オオシストの数には有意な差は見られなかった。吸血20日後に、Prx KOでのスポロゾイト形成数を算定したところ、中腸ではWTの約1/10、唾液腺でも約1/101/20に減少していた。15日後にPrx KOの媒介蚊中腸内での発育阻害の様子を電子顕微鏡で観察した。その結果、少数観察されたスポロゾイト包含オオシストにおいても、スポロゾイトの出芽異常、スポロゾイト細胞での空胞形成等の器質的変化が観察された。これらの成績から、2-Cys型Prx欠損原虫では、媒介蚊中腸でのオオシストの成熟が障害され、原虫の蚊から哺乳類宿主への伝播が著しく阻害されることが示唆された。次に、感染蚊唾液腺からスポロゾイトを調整し、ドースを変えてマウス尾静脈に接種し、赤血球内に出現してくる原虫を観察した。その結果、Prxを欠損するスポロゾイトではマウスへの感染性が野生型原虫の約1/10に低下していた。スポロゾイトの感染性低下が肝臓への侵入前後どちらでの表現型に由来するのかを確認する目的で、Prx KOに感染した媒介蚊の唾液腺から回収したスポロゾイトをマウス尾静脈に接種し、その1時間後に肝臓を摘出して肝細胞内に侵入した原虫の数をWTでのそれと比較した。この結果、Prx欠損スポロゾイトで観察されたマウス感染性の低下は、肝臓での発育期以降の表現型に由来することが示唆された。
走査型レーザ顕微ラマン分光システムの製作

1.前年度開発した。シングルホトンカウンティングレベルの二次元検出器とラマン分光用レーザ顕微鏡装置をドッキングして、システム化を実行した。2.新たに購入したマルチャンネル検出システムを組み込み、実際に1ミクロン程度の微少領域のラマンスペクトルの測定を行なった。3.核酸モノヌクレオチド微結晶(5′CMP・Cd,5′dCMP・Cd,5′CMP・Zn,5′CMP・Mn,5′GMP,5′dGMP・Ni等)のスペクトルを測定したところ、針状微結晶の1ミクロン程度の領域から、約100秒程度の時間で良好なスペクトルを測定できた。過去には1mg程度の試料で測定時間が5時間程度で測定していたスペクトルより、S/N比、分解能ともにすぐれており、今回のシステムは全体として全く問題がない事が判明した。4.検出器の感度を最高にした状態では、レーザ光強度は約50μW(過去の測定では50200mW)でも、6分程度で良好なスペクトルが測定できる事が判った。システムとして従来のものより3ケタ程度感度の向上を図る事ができた。5.従来の顕微ラマン分光装置では、測定が非常に困難であった、イン石中のダイヤモンド薄膜のラマンスペクトルを100秒で全く問題なく測定でき、しかもその線形解析からイン石中のダイヤモンド生成に関して議論する事ができた。6.本システムで実際の1個の生細胞のラマンスペクトルの1ミクロン領域の測定を行なったところ、一部光学系(試料の散乱角度と対物レンズとの問題等)を改善した方がよい事が判り、改善を行なっているところである。1.前年度開発した。
CRISPITT法によるオーダーメイド型免疫系ヒト化NOGマウスの開発

ゲノム編集技術は目的の変異をもつマウスを迅速かつ簡便に作製できる。特にCRISPR/Cas9システムは受精卵にsingle guide RNAとCas9を導入するだけで、目的遺伝子座に変異を導入することができるために、大きな注目を集めている。更に、single guide RNA、Cas9とともに切断部位近傍と相同な配列に間に導入したい遺伝子を配置したドナーDNAを導入するとノックインマウスが作製できる。このノックインマウスは、様々なヒト疾患の大変有用なモデル動物となり得る。本研究では、ノックインの導入効率を上げ、ヒト遺伝子を有する優れたモデルマウス等を作出することに成功した。ヒト組織やヒト遺伝子が導入されたマウス(ヒト化マウス)は、ヒト細胞やヒト遺伝子の機能をマウス個体内で詳細に解析できるだけでなく、重要なヒト疾患モデルマウスとなり得るため、多くの期待を集めている。なかでも重度複合免疫不全を呈するNOGマウスはヒトの組織を受け入れるため、ヒト化マウスの作製のために欠かすことのできない生物資源である。このNOGマウスに、ヒト造血幹細胞を移植したヒト化マウスはヒト免疫システムをマウス体内で再現できる免疫系ヒト化マウスとして有用である。しかしながら、ヒト-マウス間のMHCクラスIIの差異により、抗体を介した液性免疫反応をこの免疫系ヒト化マウスで起こすことは困難である。そこで、我々はCRISPR/Cas9システムを用いて、各個人のヒトMHCクラスII遺伝子をノックインしたNOGマウスの作製に挑戦する。本年は、CRISPR/Cas9システムによるノックインマウス作製方法の確立を行った。申請者らはまず、一般的に使用されているスタンダード系統であるC57BL/6マウスの受精卵を用いてCRISPR/Cas9システムによるノックインを試みた。その結果、2本鎖DNAをドナーとする際には、ゲノムとの相同領域部位およそ1500塩基対とすれば、約5000塩基対のDNA断片を目的の遺伝箇所にノックインできることが明らかとなった。次に申請者はNOGマウスと非常によく似た遺伝背景を有するNOD/SCIDマウスを用いて、体外受精による受精卵の獲得法の確立を行った。その結果、10匹のNOD/SCIDマウスより100個を超える受精卵を得る方法を確立した。この方法で得た受精卵を用いてCRISPR/Cas9によるノックインに挑戦したが、ノックインベクターのランダムなゲノムへの挿入は認められたが、目的部位にノックインした個体を得ることは出来なかった。目的遺伝座に2つのloxPを導入するための戦略として当初は2つのサイト上で1本鎖DNAドナーと各CRISPRを用いたノックインを導入する方法を試していた。しかしながら、2箇所が切断されたゲノムDNAは切断末端同士が非相同末端再結合の経路により結合してしまうことが多く、2箇所同時のノックインの効率は著しく低いことが判明した。更には、cisに2つのloxPが導入されるのではなく、transにloxPが導入されることもあり、この戦略によるfloxアレルの作製は困難であった。事実、6,000個以上の受精卵にインジェクションした結果、floxアレルを持つ個体は1匹であった。そこで、次にプラスミドDNAをドナーとしたfloxアレル作製に取り組んだ。すなわち、flox領域の両端をCRISPRで切断し、「flox領域の上流約1000から2000塩基対」と「2000から3000塩基対のfloxされたDNA断片」と「flox領域の下流1000から2000塩基対」が連結されたドナー2重鎖DNAを介した相同組換え修復によりfloxアレルを導入する系である。さらに相同領域の上流と下流にFRT配列を設置することで、floxを導入した染色体でランダムインテグレーションも生じた場合においてもFlp発現マウスとの交配によりランダムインテグレーションした外来遺伝子部位を除けるようなプラットフォームベクターを開発した。この結果、非相同末端結合による欠損変異も生じるものの、およそ5%程度の効率で目的のflox変異を誘導することに成功した。昨年度までの研究から目的とするNOGマウスの親系統であるNOD系統ではゲノムの改変が難しいことが判明していた。そこで、系統における受精卵ゲノム編集効率を解析するために、C57BL/6J系統をコントロールとして、BALB/c系統・ICR系統・C3H・NOD系統系統を用いて実験行った。C57BL/6J系統では目的部位切除型のノックアウト効率が平均で約31%、またノックイン効率が8%程度であることが判明した。BALB/c系統ではノックアウトもノックイン効率もC57BL/6系統とほとんど差がなかったが、排卵誘導効率が低いために遺伝子を導入する受精卵を取得するためには多数の動物を準備しなくてはいけないことが明らかとなった。これに対し、ICR系統は排卵効率がよいものの遺伝子編集効率がC57BL/6系統に比べ、三分の一程度であった。C3H系統は、排卵誘導効率も受精卵からの個体復元効率も問題なかった。更に目的部位切除型のノックアウト変異誘導効率が70%を超えるなど、受精卵ゲノム編集に適している系統でることを明らかにした。最後にNODマウスであるが、DNA導入後に約半数の胚で発生停止が観察された。個体復元効率に異常はなかったが、ノックイン・ノックアウトともにゲノム編集効率は著しく低かった。

また、標準系統であるC57BL/6においては、ヒト遺伝子ノックインのみならず点変異の誘導やメガベース単位の欠失の誘導更には7000塩基対をこえるノックインも成功させ、受精卵ゲノム編集が十分実用化に耐えうることが明らかとなった。いくつかの系統ではいまだに狙い通りの編集が起きにくいために、胚の培養液や遺伝子導入のタイミングを詳細に検討する必要があると考えられた。ゲノム編集技術は目的の変異をもつマウスを迅速かつ簡便に作製できる。特にCRISPR/Cas9システムは受精卵にsingle guide RNAとCas9を導入するだけで、目的遺伝子座に変異を導入することができるために、大きな注目を集めている。更に、single guide RNA、Cas9とともに切断部位近傍と相同な配列に間に導入したい遺伝子を配置したドナーDNAを導入するとノックインマウスが作製できる。このノックインマウスは、様々なヒト疾患の大変有用なモデル動物となり得る。本研究では、ノックインの導入効率を上げ、ヒト遺伝子を有する優れたモデルマウス等を作出することに成功した。C57BL/6においては、受精卵でのノックイン方法の確立に成功し、NOD/SCIDにおいは、マイクロインジェクションに利用可能な胚を体外受精で得る方法を確立することができたため。今後は、C57BL/6で開発した方法をNODの遺伝背景をもつをマウスにて実施していき、ヒト遺伝子を高効率にノックイン可能な免疫不全マウスを開発していく予定である。発生工学、実験動物ノックイン効率を上げることが可能な小分子等を利用することでNOD/SCIDやNOGマウスの受精卵でのノックイン方法を確立し、ヒトのMHCクラスII遺伝子を保持するマウスを作製する。
重症筋無力症と胸腺内アポトーシスとのかかわり:CAD,DNaseγおよびAIFの解析

近年我々はMGの原因として胸腺内におけるnegative selecticmの異常が一因であるのではないかと考え、ヒト胸腺細胞を用い研究をすすめてきた。in vitroにおけるnegative Selectionのモデルとしてanti-CD3+CD28抗体でapoptosisを誘導し、caspase-3の活性を証明した。この結果はマウスなどの動物実験を用いた方法では既に報告されているがヒト胸腺細胞を用いた結果はこれが始めてである。しかしcaspase阻客剤であるzVAD, fmkの存在下では、caspase-3は完全に阻害されたが、アポトーシスは完全には阻害されなかった。また顕微鏡で核の形態を観察したところ、核クロマチンの凝集は部分的でapoptotic bodyは見られなかった。この核の形態変化はcaspase independent pathwayの一つであるAIFによる働きと一致していた。そこで我々はzVAD.fmkの存在下でapoptosisを誘導しAIFの発現をフローサイトメトリーを用い解析した。AIFの発現は刺激後3h後よりみられzVAD, fmkの存在により影響が見られなかった。これはT細胞のnegative selectionにはcaspase dependent and independent pathwayとしてAIFが関与していることを示している。しかし発現を確認しているが本当に核に移行し機能しているかどうかなどの機能的な解析は不明のままである.今後MG合併胸腺においてapoptosisの機構が正常とは異なることが証明されれば、MGに対する原因追及に大きなインパクトがありまたMGに対する遺伝子導入治療の可能性がひらけると期待できる.近年我々はMGの原因として胸腺内におけるnegative selecticmの異常が一因であるのではないかと考え、ヒト胸腺細胞を用い研究をすすめてきた。しかし発現を確認しているが本当に核に移行し機能しているかどうかなどの機能的な解析は不明のままである.今後MG合併胸腺においてapoptosisの機構が正常とは異なることが証明されれば、MGに対する原因追及に大きなインパクトがありまたMGに対する遺伝子導入治療の可能性がひらけると期待できる.当科では今まで多くの重症筋無力症患者に対し胸腺摘出術を行い、良好な成績をあげてきた。しかしこの疾患になぜ胸腺の摘出が有効であるかは分かっていない。胸腺は正常に機能するT細胞を作り出すための器官であり、自己に反応するT細胞は除去される場所であるため、胸腺における異常がMGの発症に関係している可能性が充分考えられる。本研究ではヒト胸腺でのアポトーシスにおけるDNAの断片化に関わる種々の蛋白(CAD,DNaseγ,AIF)について解析し、重症筋無力症での何らかの異常がないかを検討した。(1)RNAの抽出正常胸腺またはMG患者、胸腺腫患者胸腺よりAGPC法にてRNAを抽出した。各サンプルより十分なRNAが得られた。(2)ヒト胸腺組織でのCAD,DNaseγおよびAIFの発現RT-PCR法を用いてヒト胸腺でのCAD,DNaseγおよびAIFの発現を検討したが各々に発現に差は認められなかった。現在更にノーザンブロッティングを行い、正常とMG患者、胸腺腫患者での発現を定量的に解析している。(3)アポトーシス誘導時のCAD,DNaseγおよびAIFの発現の変化Dexamethasone,Etoposideで各々の患者から得られた胸腺細胞を刺激しアポトーシスに伴うCAD,DNaseγおよびAIFの発現を時間経過とともに、RT-PCR法、ノーザンブロッティングを用いて検討している。また蛋白レベルでの発現を検討するため、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティングを用いて検討している。重症筋無力症(MG)には胸腺腫等の胸腺異常が高率に認められ、胸腺摘出術が有効な治療法として確立している。しかし胸腺摘出術がなぜ有効であるのかは全くわかっていない。胸腺はT細胞の分化・成熟がおこなわれている臓器で、特に自己反応性のT細胞が除去される場所であるので、胸腺における自己反応性T細胞除去のメカニズムの異常がMGの発症に関係している可能性が十分に考えられる。自己反応性T細胞の除去、すなわちnegative selectionは胸腺細胞中のCD4+CD8+double positive(DP) thymocyteの段階で行なわれる。胸腺stroma cellが提示する自己MHC+self peptideに高いaffinityを持つT cell receptor(TCR)を獲得したクローンがnegative selectionの対象となる。すなわち、TCRから強いシグナルが伝達されると最終的にapoptosisが誘導され、そうしたDP cellは死滅、除去される。

このapoptosisのin vitroモデルとしてanti-CD3とCD28抗体を用いapoptosisを誘導することが可能であった。このapoptosisはcaspaseを介したpathwayが知られ、実際我々のヒト胸腺細胞を用いた実験でも証明された。しかしcaspasc阻害剤であるzVAD.fmkはapoptosisは抑制したが、不完全であった。このことよりcaspase independent pathwayの一つであるAIFに注目し発現を解析した。AIFは刺激後3hよりミトコンドリアからreleaseされ、核に移行したが、これはzVAD.fmkに影響をうけなかった。
家畜卵の発生工学への利用性向上を目指したタンパク質合成・分解制御機構の解析

本研究は、哺乳類卵の初期発生過程において胚の正常分裂増殖のためのタンパク質合成と分解を制御する分子機構を解明することを目的とした。特にブタ卵減数分裂過程を例にとり、タンパク質の合成関連因子としてAurora A、また分解関連因子としてユビキチン・プロテアソーム系に働くユビキチンリガーゼの分裂後期促進複合体(APC)を活性化する因子であるcdc20,cdh1に注目し、17年度にはこれらのブタ遺伝子のクローニングに成功しジーンバンクに登録した。17年度にはブタ卵内のAurora Aタンパク質量が体細胞の約100倍という高濃度であり、その機能の重要性を示唆したにもかかわらず、Aurora A mRNAのブタ卵細胞質注入による過剰発現では減数分裂に大きく影響しなかった。そこで本年度は構成的活性型変異体のCA-Anrora Aを作製し、そのmRNAを注入したところ、cyclin Bの著しい増加と減数分裂再開の促進が見られた。また昨年度はアンチセンスRNAの注入による発現抑制でも影響が無かったが、本年度は、あらかじめ卵内のタンパク質を枯渇させた条件でその機能を調べた結果、減数分裂再開の抑制が明らかとなり、ブタ卵のタンパク質合成に果たすAurora Aの役割の重要性を初めて示すことができた。Cdc20、cdh1についても本年度はアンチセンスRNA注入による発現抑制を行い、cdc20抑制では第一減数分裂中期(MI)以降で本来分解されるべきcyclin Bの分解が抑制され、MI期で停止すること、またcdh1抑制では早期にcyclin Bが蓄積され減数分裂の再開が早まることを示した。この結果はブタ卵の減数分裂過程ではcdh1が初期に働き早熟な減数分裂再開を抑制していること、またcdc20が第1分裂から第2分裂への移行時に働くことを明らかにした。またmRNAの注入による過剰発現により、cdh1の早熟な減数分裂再開抑制作用を再確認し、またcdc20がcdh1の基質となることを示唆するなど、タンパク質分解の制御機構への知見を深めることができた。本研究は、哺乳類卵の初期発生過程において、胚が正常に分裂増殖するためのタンパク質の合成と分解を制御する分子機構を解明することを目的とするものである。本研究では特に家畜卵の減数分裂過程を例にとり、タンパク質の合成に関与する因子としてAurora Aに、また分解に関与する因子としてユビキチン・プロテアソーム系に働くユビキチンリガーゼである分裂後期促進複合体(APC)活性化因子のcdc20,cdh1に注目した。その結果、Aurora A、cdc20、cdh1の3因子がブタ卵巣内の卵に存在することをRT-PCRにより確認し、さらに全長配列をクローニングすることに成功した。これらのシークエンスにより全配列を決定し、3遺伝子をジーンバンクに登録した。ブタ卵の減数分裂過程における発現動態を解析したところ、Aurora A、cdc20、cdhlのmRNAおよびAurora A、cdc20のタンパク質は減数分裂過程を通して存在しその量はほぼ一定であることが示された。ブタ卵内のAurora Aタンパク質は体細胞の約100倍という高濃度の発現が確認され、その機能の重要性が示唆された。しかし、Aurora A mRNAのブタ卵細胞質注入による過剰発現やアンチセンスRNAの注入による発現抑制をした結果、ブタ卵の減数分裂には大きく影響しないことが示された。これはAurora Aタンパク質がブタ卵巣内の卵に既に十分量存在するためと考えられる。次年度は、あらかじめ卵内のタンパク質を枯渇させた条件でその機能を調べる予定である。

また、Cdc20についてもアンチセンスRNAの注入による発現抑制を行っており、未だ予備的なデータではあるが、第一減数分裂中期(MI)以降で本来分解されるべきcyclin B1の分解が抑制され、MI期で停止することが示唆されている。cdc20でさらにデータを追加し確実な結果を得るとともに、残りのcdhlについても同様の実験をする予定である。本研究は、哺乳類卵の初期発生過程において胚の正常分裂増殖のためのタンパク質合成と分解を制御する分子機構を解明することを目的とした。特にブタ卵減数分裂過程を例にとり、タンパク質の合成関連因子としてAurora A、また分解関連因子としてユビキチン・プロテアソーム系に働くユビキチンリガーゼの分裂後期促進複合体(APC)を活性化する因子であるcdc20,cdh1に注目し、17年度にはこれらのブタ遺伝子のクローニングに成功しジーンバンクに登録した。17年度にはブタ卵内のAurora Aタンパク質量が体細胞の約100倍という高濃度であり、その機能の重要性を示唆したにもかかわらず、Aurora A mRNAのブタ卵細胞質注入による過剰発現では減数分裂に大きく影響しなかった。そこで本年度は構成的活性型変異体のCA-Anrora Aを作製し、そのmRNAを注入したところ、cyclin Bの著しい増加と減数分裂再開の促進が見られた。また昨年度はアンチセンスRNAの注入による発現抑制でも影響が無かったが、本年度は、あらかじめ卵内のタンパク質を枯渇させた条件でその機能を調べた結果、減数分裂再開の抑制が明らかとなり、ブタ卵のタンパク質合成に果たすAurora Aの役割の重要性を初めて示すことができた。Cdc20、cdh1についても本年度はアンチセンスRNA注入による発現抑制を行い、cdc20抑制では第一減数分裂中期(MI)以降で本来分解されるべきcyclin Bの分解が抑制され、MI期で停止すること、またcdh1抑制では早期にcyclin Bが蓄積され減数分裂の再開が早まることを示した。この結果はブタ卵の減数分裂過程ではcdhlが初期に働き早熟な減数分裂再開を抑制していること、またcdc20が第1分裂から第2分裂への移行時に働くことを明らかにした。またmRNAの注入による過剰発現により、cdhlの早熟な減数分裂再開抑制作用を再確認し、またcdc20がcdh1の基質となることを示唆するなど、タンパク質分解の制御機構への知見を深めることができた。
ナノギャプにおける近接場光の波長選択性と光起電力発電への展開

本研究は、様々な熱源によって加熱された赤外線放射体表面近傍に生ずる近接場光領域に、真空ナノスケール隙間(ナノギャップ)を隔てて熱光起電力電池(Thermophotovoltaic Ce11;TPV Cell)を向かい合わせ設置し、その領域の高電界強度を利用することで高い発電密度を得ようとするものである娘まず、既存のTPV電池(フラウンホーファー研究所製)を用いて実験した。その表面には高ざ4μm、幅20岬の金電極が60μmのピッチで配置されている。そこで、接触を避けるためにタングステン放射体表面には溝が設けてある。長さ8mm、幅2mmの放射体表面を、高精度マイクロメーターにより近づけた場合、50μm以下の隙間では形態係数がほぼ1となり、それ以下に近づけても伝播成分の範囲では出力は増大しない。しかし、隙間が.1μm以下となると、短絡電流が4倍、開放電圧が1.4倍増大した。すなわち近接場効果により出力は56倍に増大することが明確となった。さらに、この電極間隔を拡げる、あるいは、P型半導体内部に電極を埋め込んだ独自のGaSb系のTPV電池を、ロードロックチャンバーを接続した簡易薄膜装置により製作を試みた。n型GaSb系基盤上にp.型GaSb半導体をエピタキシャル成長させることに成功し、アンドープでありながら、p-n接合であることが確認でき、キャリア密度5.73×10^<17>cm^<-3>と.モビリティ1.35×10^2cm^2/Vsを得た。一方、GaSb系のTPV電池は、波長1.8μm以下の電磁波を電力に変換できるが、それより長い波長の電磁波を電力に変換できない。そこで、金属放射体表面にナノスケールのキャビテーを多数設け、光導波管の原理により放射光の波長選択を試みた。表面研磨されたNi表面の2mm×2mm'の領域に、縦横500nm四方、深さ500nmのキャビテーが幅250nmの壁を隔てて周期的的に作製されている表面を用意した。このサンプルを真空容器内に入れて裏面から炭酸ガスレーザーにより1052Kまで加熱した。分光測定の結果、波長が2μm以上ではNiの鏡面の放射率にほぼ等しく、それより波長が短くなると徐々に増大し、キャビテー幅が半波長に等しい波長1μmよりやや短い波長の放射率が0.95と極めて高くなることが明らかとなった。これらの組合せにより、選択波長近接場光を用いた新たなエネルギー変換が構築できることの手がかりを掴むことができた。本研究は、様々な熱源によって加熱された赤外線放射体表面近傍に生ずる近接場光領域に、真空ナノスケール隙間(ナノギャップ)を隔てて熱光起電力電池(Thermophotovoltaic Cell ; TPV Cell)を向かい合わせ設置し、その領域の高電界強度を利用することで高い発電密度を得ようとするものである。

既存のTPV電池(フラウンホーファー研究所製)の表面には高さ4μm、幅20μmの金電極が60μmのピッチで配置されている。そこで、接触を避けるためにタングステン放射体表面には溝が設けてある。長さ8mm、幅2mmの放射体表面を、高精度マイクロメーターにより15μm程度まで近づけると形態係数が1に近くなり、それ以下に近づけても出力は増大しない。しかし、隙間4μmまで近づけたとき、出力が低下した。その後、出力は得られなかったので、電極に接触し電池が破損したものと推察された。この電極がないTPV電池を独自に製作するため、ロードロックチャンバーを接続した簡易薄膜装置を導入した。基板のGaおよびSb、さらにp型半導体作製用のドープ材としてBeを選定し、それらの坩堝を装着した。本年度はその真空度を確認し、2.7×10^<-7>Paと、電池作製にはまずまずの真空度を達成した。さらに、GaSb系のTPV電池は、波長1.8μm以下の電磁波を電力に変換できるが、それより長い波長の電磁波は変換できない。そこで、金属放射体表面にナノスケールのキャビテーを多数設け、光導波管の原理により放射光の波長選択を試みた。表面研磨されたNi表面の2mm×2mmの領域に、縦横500nm四方、深さ500nmのキャビテーが幅250nmの壁を隔てて周期的に作製されている表面を用意した。このサンプルを真空容器内に入れて裏面から炭酸ガスレーザーにより1000Kまで加熱した。分光測定の結果、Niの鏡面の放射率に比べて、キャビテー幅が半波長に等しい波長1μmより短い波長の放射率が高くなることが明らかとなった。本研究は、様々な熱源によって加熱された赤外線放射体表面近傍に生ずる近接場光領域に、頁空ナノスケール隙間(ナノギャップ)を隔てて熱光起電力電池(Thermophotovoltaic Cell ; TPV Cell)を向かい合わせ設置し、その領域の高電界強度を利用することで高い発電密度を得ようとするものである。まず、既存のTPV電池(フラウンホーファー研究所製)を用いて実験した。その表面には高さ4μm、幅20μmの金電極が60μmのピッチで配置されている。長さ8mm、幅2mmの放射体表面を、高精度マイクロメーターにより近づけた場合、50μm以下の隙間では形態係数がほぼ1となり、それ以下に近づけても伝播成分の範囲では出力は増大しない。しかし、隙間が1μm以下となると、短絡電流が4倍、開放電圧が1.4倍増大した。すなわち近接場効果により出力は56倍に増大することが明確となった。さらに、この電極間隔を拡げる、あるいは、p型半導体内部に電極を埋め込んだ独自のGaSb系のTPV電池を、ロードロックチャンバーを接続した簡易薄膜装置により製作を試みた。n型GaSb系基盤上にp型GaSb半導体をエピタキシャル成長させることに成功し、アンドープでありながら、p-n接合であることが確認でき、キャリア密度5.73×10^<17>cm^<-3>とモビリティ1.35×10^2cm^2/Vsを得た。一方、GaSb系のTPV電池は、波長1.8μm以下の電磁波を電力に変換できるが、それより長い波長の電磁波を電力に変換できない。
フォトニックネットワークにおける伝送限界の追究

本研究は,光ファイバネットワークの伝送距離および容量の限界を追究し,大容量且つ長距離な次世代ネットワーク構築の基礎とするものである.光ファイバ通信の距離および容量は光ファイバの持つ非線形な伝送特性によって制限されている.このため,非線形な信号歪みを補償する必要がある.機械学習は信号判別器として有効であるが,レーザ位相の不安定性に起因するサイクルスリップ現象がその導入を妨げていた.機械学習による信号判別法にサイクルスリップ訂正技術を導入した新たな信号判別法を提案し,その有効性を計算機シミュレーションによって確認した.本研究は,光ファイバネットワークの伝送距離および容量の限界を明らかにし,次世代ネットワーク構築の基礎とするものである.光ノードで生じる信号劣化要因として,クロストークおよびフィルタ狭窄が挙げられる.仮に光ノード内に置かれた波長分割多重信号の合分波器が矩形の波長通過特性を持っていれば,クロストーク及びフィルタ狭窄は生じない.しかし,合分波器として用いられる波長選択スイッチの通過特性は4次程度の超ガウシアンフィルタに相当するため光ノードにおける信号劣化は避けられず,結果として伝送距離あるいは伝送容量が減少する.今年度は,クロストークとフィルタ狭窄化の関係を数式によって示した.また,その結果を複数の変調方式に関して適用し,その影響を定量的に示した.本研究結果は,将来の大規模光ネットワークを構築する上での基盤となる.高精細な動画配信サービスや移動体通信の普及などにより,ネットワークを流れるトラフィック量は急速に増加を続けている.このようなトラフィック需要に対応可能な大容量光ネットワークの構築に向け,光多値変調方式の導入が進められている.しかしながら,多値変調方式は本質的に伝送システムの信号劣化要因に対して脆弱であり,結果として伝送可能な距離が著しく制限されることとなる.このため,伝送距離を延伸するために,信号劣化要因を考慮した信号復調法が必要不可欠となる.本研究では,伝送距離および伝送容量の限界を追究するために,機械学習による信号復調法を提案し,その効果を検証した.レーザ位相雑音および光ファイバ非線形効果がある状況であっても,極めて高精度な信号復調が可能となることを示した.機械学習手法を用いた複素振幅ラベル判定は,実際に伝送によって歪んだ複素振幅を用いてラベル境界を構築するため,信号が現実に受ける歪みを考慮しながら複素振幅ラベルの判定を行うことができる.よって,識別精度の高い実用的な複素振幅ラベル判定境界を構築するためには,学習データを誤りなく収集することが必要不可欠である.しかしながら,主にレーザの位相不安定性に起因する,サイクルスリップと呼ばれる本来の受信複素振幅の位相にオフセットが加わった状態で複素振幅値を検出してしまう現象が確率的かつ不可避に発生する.その結果,誤った学習データを含んだ学習データセットに基づいて複素振幅ラベル判定境界が構築されてしまう.このような不安定動作を除去するために,サイクルスリップを検出し,それを補正する方式を考案し,機械学習による復調法に取り入れることで,安定した復調を行うことが可能となった.本方式は,光ファイバ通信に機械学習を取り入れるうえで必須の機能である.本研究は,光ファイバネットワークの伝送距離および容量の限界を追究し,大容量且つ長距離な次世代ネットワーク構築の基礎とするものである.光ファイバ通信の距離および容量は光ファイバの持つ非線形な伝送特性によって制限されている.このため,非線形な信号歪みを補償する必要がある.機械学習は信号判別器として有効であるが,レーザ位相の不安定性に起因するサイクルスリップ現象がその導入を妨げていた.機械学習による信号判別法にサイクルスリップ訂正技術を導入した新たな信号判別法を提案し,その有効性を計算機シミュレーションによって確認した.これまでは計画通りに進んでいる.ただし,昨年度の結果に関して,波長合分波器波長選択スイッチのポート数および消光比が僅かに影響することが判明した.このため,これらの影響を考慮した評価を再度行う必要が生じた.通信工学,ネットワーク,ディジタル信号処理当初の計画通り,今年度はより現実に近いネットワーク状況を想定して評価する.まず,レーザ周波数が不安定である場合のクロストーク及びフィルタ狭窄の影響を評価する予定である.さらに,昨年度の研究によって新たに明らかとなった波長選択スイッチのポート数および消光比の影響も併せて評価する予定である.続いてディジタル信号処理による信号劣化要因の補償技術を検討に着手する.ここでは,クロストーク低減,フィルタ狭窄等化,ノイズ低減などを実現する.最後に,これまでの結果を包括した総合的な評価を実験的に確認する.本研究によって,これまで示されていないフォトニックネットワークの伝送距離および伝送容量の物理限界javascript:onSave();を明らかにすると共に,将来のフォトニックネットワークの設計や光フィルタの設計の基礎となる.
河川底質中の硫酸還元菌により生成した硫化鉄化合物の非破壊状態分析と生成過程の推定

本研究では、河口域底質中において、硫酸還元菌が鉄-硫黄系の反応機構にどのように関与しているかを解明するために種々の検討を行った。まず第一に、多摩川河口域を中心に各地で採取した底質中の硫酸還元菌とパイライト(FeS_2)の垂直分布の検討を行った。パイライトの検出には、非破壊で鉄の化学状態の分析ができるメスバウアー分光法を用い、硫酸還元菌の生菌数の測定には、寒天培地を利用した間接計数法を用いた。多摩川に比べて人為起源物質の汚染負荷が高いと考えられる東京都墨田区の北十間川や、ラムサール条約登録地で、東京湾内でも自然が保護されている谷津干潟においても、同様の検討を行った。その結果、底質中の一定深さごとの生菌数と、パイライト量の分布がよく一致することがわかった。また、多摩川河口域底質中から単離した硫酸還元菌(Desulfovibrio sp.)を、硫化鉄生成に必要なFe^<2+>イオン(40ppm,80ppm,200ppmの3種類の濃度を設定)とSO_4^<2->イオンを含む培地中で嫌気的条件下、30°Cにて培養実験を行った。培養期間がそれぞれ数日420日間の各段階で、培養液中に生成した沈澱を遠心分離後、凍結して生物活性を止めた。この固体試料を、空気を通さないパウチ袋に密封し、液体窒素温度における^<57>Feメスバウアースペクトルを測定した。その結果、培養する際の鉄濃度が生成物の状態変化に影響することが分かり、単に還元の過程で生成される硫黄化学種とFe^<2+>が反応する以上の、複雑な反応が起こっていることが推測された。また、XAFS(X線吸収微細構造)法により鉄の第1配位原子の特定を行った結果、反応の初期には酸素配位であった鉄が、反応の進行ともに硫黄配位(硫化物)になったことが明らかとなった。一方、無菌的に生成した硫化鉄は、これらの生成物とは異なるスペクトルを示し、底質中のパイライト生成反応に硫酸還元菌が関与していることが確認された。河口域底質中では嫌気性の硫酸還元菌の働きにより、硫酸イオンが還元されて発生した中間酸化状態の硫黄化学種が底質中の鉄化合物や水中の鉄イオンと反応し、硫化鉄(FeS)やパイライト(FeS_2)が生成されると考えられる。しかし、パイライトは一般に高温・高圧下で生成されるとされており、河口域のような穏和な条件下での生成メカニズムは、まだよく分かっていない。そこで本研究では、河口域底質中において、硫酸還元菌が鉄-硫黄系の反応機構にどのように関与しているかを解明するために種々の検討を行った。まず第一に、多摩川河口域の一定深さごとの底質中の生菌数を、間接計数法により計数し、メスバウアー分光法で定量したパイライト量の分布と比較したところ、その分布がよく一致した。

次に、多摩川河口域底質中から単離した硫酸還元菌(Desulfovibrio sp.)を、硫化鉄生成に必要なFe^<2+>イオン(40ppm,80ppm,200ppmの3種類の濃度を設定)とSO_4^<2->イオンを含む培地中で嫌気的条件下、30°Cで一定期間培養し、生成物を遠心分離してメスバウアー測定を行った。その結果、通常の硫酸還元菌培養に用いられる鉄濃度40ppmで培養したものは、培養12日目で黒沈を生じ、メスバウアースペクトルはピロータイト(Fe_<1-x>S)に似たセクステットを示した。3日目にはダブレットが現れて、培養日数が進むに連れて次第に突出してきた。2倍の鉄濃度80ppmでは23日目に初めて黒沈を生成し、ダブレットが現れるにも30日を要した。5倍の鉄濃度200ppmでは最初に白沈が見られるが3日目以降に黒沈を生成し、30日目でもピロータイト様のセクステットの重なりしか観測されなかった。このことから、培養する際の鉄濃度が生成物の状態変化に影響することが分かり、単に還元の過程で生成される硫黄化学種と鉄(II)が反応する以上の、複雑な反応が起っていることが推測された。本研究では、河口域底質中において、硫酸還元菌が鉄-硫黄系の反応機構にどのように関与しているかを解明するために種々の検討を行った。昨年度に引き続き、本年度も多摩川河口域を中心に各地で採取した底質中の硫酸還元菌とパイライト(FeS_2)の垂直分布の検討を行った。パイライトの検出には、非破壊で鉄の化学状態の分析ができるメスバウアー分光法を用い、硫酸還元菌の生菌数の測定には、寒天培地を利用した間接計数法を用いた。多摩川に比べて人為起源物質の汚染負荷が高いと考えられる東京都墨田区の内部河川や、ラムサール条約登録地で、東京湾内でも自然が保護されている谷津干潟においても、同様の検討を行った。その結果、底質中の一定深さごとの生菌数と、パイライト量の分布がよく一致することがわかった。また、多摩川河口域底質中から単離した硫酸還元菌(Desulfovibrio sp.)を、硫化鉄生成に必要なFe^<2+>イオン(40PPm,80ppm,200ppmの3種類の濃度を設定)とSO_4^<2->イオンを含む培地中で嫌気的条件下、30°Cにて培養実験を行った。培養期間がそれぞれ数日420日間の各段階で、培養液中に生成した沈澱を遠心分離後、凍結して生物活性を止めた。この固体試料を、空気を通さないパウチ袋に密封し、液体窒素温度における^<57>Feメスバウアースペクトルを測定した。その結果、培養する際の鉄濃度が生成物の状態変化に影響することが分かり、単に還元の過程で生成される硫黄化学種とFe^<2+>が反応する以上の、複雑な反応が起こっていることが推測された。また、XAFS(X線吸収微細構造)法により鉄の第1配位原子の特定を行った結果、反応の初期には酸素配位であった鉄が、反応の進行ともに硫黄配位(硫化物)になったことが明らかとなった。一方、無菌的に生成した硫化鉄は、これらの生成物とは異なるスペクトルを示し、底質中の鉄-硫黄系の反応に硫酸還元菌が関与していることが確認された。