hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高病原性鳥インフルエンザ疫学調査におけるDNAバーコーディング法の応用

本研究では、生体材料中のミトコンドリアDNA上にある特定領域の塩基配列を決定し、それを既存の生物の配列情報と照合することによって、生物種の同定を行う“DNAバーコーディング"という手法を用いて、ウイルス分離陽性の野鳥糞便サンプルや感染動物の消化管内容サンプルを解析することにより、高病原性鳥インフルエンザの疫学調査、すなわち国内発生時における感染ルートの究明や野鳥および野生ほ乳動物等の流行実態の把握が可能となった。本研究では、生体材料のミトコンドリアDNA上にある特定領域の塩基配列を決定し、それを既存の生物の配列情報と照合することによって、生物種の同定を行う“DNAバーコーディング"という手法を用いて、高病原性鳥インフルエンザウイルスの感染経路や野生動物の流行実態の解明等、様々な疫学情報を入手することにより、本病の国内発生予防対策確立のための一助とすることを目的としている。まず本年度は野鳥の糞便を用いたDNAバーコーディング法による種の同定について実施した。すなわち20062012年に申請者らが採取した野生水禽の糞便からDNAを抽出し、PCRによって特定領域を増幅した。増幅が認められない場合には二次増幅(Nested PCR)も検討した。その結果、最初のPCRでは、60検体中23検体に目的遺伝子の増幅が認められたが、残りの37検体で増幅は認められなかった。そこでNested PCRを行ったところ、58検体で増幅に成功した。これらの塩基配列を決定し、リファレンスライブラリおよびDNAバーコード同定ツールを用いて、それらの相同率からそれぞれの鳥種を決定した。さらに過去の発生養鶏場周辺で採取された糞便、骨、羽毛等についても同様にDNAバーコーディング法を用いて、本病発生時に養鶏場周辺に生息していた動物種の同定を試みた。その結果、ある発生農場の鶏舎周辺で採取された糞便が猫の糞便であることが特定された。防疫作業時にこの猫は行方不明となり、直接本ウイルス感染を証明することは出来なかったが、今回の成績からこの猫が本病発生当時も、鶏舎内外を移動していたことが明らかとなり、ウイルス侵入経路の可能性の一つと考えられた。次年度も引き続き各種疫学材料を精査し、本ウイルスの国内侵入経路ならびに農場内あるいは鶏舎内へのウイルス侵入ルートの推定を試みる計画である。本研究では、生体材料のミトコンドリアDNA上にある特定領域の塩基配列を決定し、それを既存の生物の配列情報と照合することによって、生物種の同定を行う“DNAバーコーディング"という手法を応用して、高病原性鳥インフルエンザの疫学調査、すなわち国内発生時における感染ルートの究明や野鳥および野生ほ乳動物等の流行実態の把握に努め、もって将来の高病原性鳥インフルエンザの国内発生予防対策確立のための一助とすることを目的としている。本年度は、前年度に引き続き、糞便によるウイルス保有状況調査を実施するとともに、ウイルス陽性糞便からDNAを抽出し、その感染宿主の同定を試みた。また、12月から1月にかけて、国内の養鶏場でH5N8亜型の高病原性鳥インフルエンザの発生が確認されたことから、発生農場で採取された材料(主に糞便)についても解析を試みた。また、2011年2月3月にかけて、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスに感染して死亡した野生猛禽類(ハヤブサおよびクマタカなど)の食道、そ嚢、腺胃、筋胃、十二指腸、空回腸、結直腸、総排泄腔から採取した内容物を用いて、被食動物の種の同定を試みた。その結果、2011年2月11日宮崎県西都市および2011年2月17日愛知県春日井市で発見されたH5N1亜型鳥インフルエンザウイルス感染ハヤブサ2羽のそ嚢内容物から、それぞれツグミおよびカワラバトとヒドリガモの遺伝子が検出され、ハヤブサが死亡前にこれらの鳥を捕食したことが明らかとなった。ツグミやハトはH5N1ウイルスに感受性があり、また養鶏場近辺で観察されることもあることから、これらの鳥種がハヤブサにウイルスを伝播した可能性が考えられた。以上の成績からDNAバーコーディングテクニックは種々の鳥インフルエンザ疫学調査において応用可能であることが実証された。本研究では生体材料のミトコンドリアDNA上にある特定領域の塩基配列を決定し、それを既存の生物の配列情報と照合することによって、生物種の同定を行う“DNAバーコーディング"という手法を応用して、高病原性鳥インフルエンザの感染経路や野生動物の流行実態の解明等、様々な疫学情報を入手することに努め、もって将来の高病原性鳥インフルエンザの国内発生予防対策確立のための一助とすることを目的としている。最終年度である本年度は、前年度に引き続き、糞便によるウイルス保有状況調査を実施するとともに、ウイルス陽性糞便からDNAを抽出し、その感染宿主の種の同定を試みた結果、昨年度とほぼ同程度の確率(97%)で、糞便の宿主を同定できた。また、本年度は猛禽類や哺乳動物の消化管内容物(被食動物)の同定の捕食者特異的ストッププライマーを用いることにより、猛禽類消化管内容物の同定の特異性向上を試みた。すなわち3'末端に1つのC3spacerを修飾したプライマーを用いたPCR反応を、高病原性ウイルスに感染して斃死した猛禽類の消化管内容物から抽出したDNAに対して用いることで、被食者の種の同定を試みた。その結果、2011年

宮崎県および鳥取県でそれぞれ発見された2羽のハヤブサおよび栃木県で発見されたオオタカの検体では、遺伝子増幅は認められたが、シークエンス結果はいずれも捕食者であるハヤブサもしくはオオタカのCO1遺伝子のみであった。以上の成績から、本研究で確立されたDNAバーコーディング法は猛禽類を対象とした場合、そ嚢の消化管内容物を用いて比較的高率に被食者の同定が可能であり、種々の鳥インフルエンザの疫学調査に応用できることが実証された。本法は研究代表者が所属する鳥取大学鳥由来人獣共通感染症疫学研究センターが毎年実施している、野生水禽を対象としたインフルエンザウイルス保有状況調査に既に応用している。本研究では、生体材料中のミトコンドリアDNA上にある特定領域の塩基配列を決定し、それを既存の生物の配列情報と照合することによって、生物種の同定を行う“DNAバーコーディング"という手法を用いて、ウイルス分離陽性の野鳥糞便サンプルや感染動物の消化管内容サンプルを解析することにより、高病原性鳥インフルエンザの疫学調査、すなわち国内発生時における感染ルートの究明や野鳥および野生ほ乳動物等の流行実態の把握が可能となった。本年度は昨年度に引き続き、比較的新鮮な野鳥の糞便等を用いて、DNAバーコーディング法による種の同定に成功し、本手法の有効性をさらに証明することができた。本年度はまた当初の計画に則って、猛禽類の消化管内容物の抽出DNAを用い、被食動物の種の同定にも成功した。以上の点から本研究は当初の計画に従っておおむね順調に進展しているものと考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。ウイルス学次年度は最終年度であることから、引き続き野鳥の糞便等を用いたDNAバーコーディング法による種の同定を継続する予定である。一方、猛禽類消化管内容物の同定に関しても、ストッププライマーを用いた、より検出感度および特異性の高い手法の改良を試みる。さらに、それまで得られた成績を総合し、わが国への高病原性鳥インフルエンザウイルスの感染経路ならびに農場内あるいは鶏舎内へのウイルス侵入ルートの推定を試みる。また、得られた成績は材料の提供を受けたそれぞれの機関等にフィードバックするとともに、生産者の方々にも積極的に情報公開する。以上のように今後の研究方針ついては現時点で特段変更の必要性はなく、概ね当初の計画通り推進できるものと考えられる。本年度はまず野鳥の糞便等を用いたDNAバーコーディング法による種の同定を実施し、20062012年の間に鳥インフルエンザウイルスが分離された国内野鳥の糞便60検体を調べることで、本手法の実用性を明らかにすることができた。ごく一部の検体で、シークエンスの波形が重複しており、同定が困難なものが認められたが、その原因については次年度以降でさらに分析を進める計画である。また、過去の発生養鶏場周辺で採取された糞便、骨、羽毛などの疫学材料について、同様にDNAバーコーディング法を応用し、本病発生時に養鶏場周辺に生息していた動物種を明らかにする点に関しては、1例ではあるが、限られた材料をもとにして、本病発生当時、鶏舎内外を移動していた動物種を特定することができた。以上の点から本研究は当初の計画に従って概ね順調に進展しているものと考えられる。ただし、レファレンスライブラリーに存在しない鳥種のDNAの塩基配列を決定し、登録することに関しては、年度内にそのような材料入手の機会がなかったため、引き続き次年度以降もその機会を待つこととなった。
ナノ空隙の吸着サイト改質とミクロ界面すべり制御による木材の超塑性加工法の開発

本研究では、産総研で見出した“木材の超塑性挙動"に着目し、微細構造変化の観点から変形メカニズムを解明するとともに、木材の超塑性現象を利用した変形加工技術の開発を目指した。超塑性挙動に及ぼす、木材の非結晶領域に存在するナノ空隙と吸着サイト、細胞間および細胞間層などの界面状態の影響を実験的に検討し、木材の超塑性的変形メカニズムの一部を明らかにした。そして、この現象を利用して、大変形と同時に寸法安定性や強度、難燃性能を付与する『木材の流動成形』の実用化研究を実施した。本研究では、"木材の超塑性挙動"に着目し、ナノマイクロレベルでの微細構造変化の観点から変形メカニズムを解明するとともに、木材の超塑性現象を利用した変形加工技術の開発を目指す。具体的には、木材の非結晶領域に多く分布するナノ空隙と吸着サイトを把握・制御して、種々の界面状態を変化させ、木材に超塑性的変形を生じさせる。また、吸着サイトや吸着剤のナノ表面処理によって、変形と同時に寸法安定性や強度、難燃性能を付与することを目的とする。当該年度は以下の3つの項目を検討した。1.ナノ空隙の把握と制御:超塑性現象発現に必要な材料内部における「すべり面」生成の起点となるナノ空隙の量や大きさが、主に温度や含有水分等の「履歴」によって変化することを見出した。160°Cまでの熱処理を行い、ガス吸着測定(物理吸着)により一定温度における空隙量を把握した。その結果、解析によって計算された空隙サイズでは、熱処理温度が高くなるにつれてサブナノメートルの空隙量が減少することが分かった。また、水銀圧入法による空隙測定においても、数ナノメートルの空隙の存在が確認され、木材調整条件と空隙構造の変化に関してガス吸着測定と水銀圧入法を併用して定量的データを得る準備が整った。2.吸着サイトの把握と制御:分子量を400程度に調整した低分子フェノール樹脂(水溶性)を木材に導入し、木材中に存在する空隙量の増加を試みた。熱流測定(DSC)の結果から、無処理木材に比較して、ガラス転移における比熱容量の変化が大きく現れること、FT-IRにおいてリグニンやヘミセルロースの波数域の変化が顕著に現れることなどから、非結晶領域の吸着サイトの改質が確認された。更に分子量の大きなポリエチレングリコール(分子量20000)までの導入を試み、より大きな空隙の導入を図るための実験方法が確立された。3.界面すべりの制御:数種の添加剤(グリコール類、フェノール樹脂)を導入した木材の熱軟化特性を動的粘弾性測定により評価した。また、細胞間すべり特性を評価する円柱試験の方法をほぼ確立した。SPMによって細胞実質と細胞間層の物性値に変化があることが確認された。これらの軟化挙動、すべり現象(降伏挙動)、組織構造における物性値の差を総合的に検討することによって、木材で生じる超塑性的変形挙動の発生についての検討を行った。本研究では、“木材の超塑性挙動"に着目し、ナノマイクロレベルでの微細構造変化の観点から変形メカニズムを解明するとともに、木材の超塑性現象を利用した変形加工技術の開発を目指す。1.ナノ空隙の把握と制御:木材中に存在する空隙半径r:10nm以下での空隙がすべり変形の起点になっていることを考慮し、種々の高分子の導入を図った。その結果、水系溶媒においてPEGで分子量20000の一部まで導入可能であり、木材細胞壁物性に影響を与えることが熱分析などにより明らかになった。2.吸着サイトの把握と制御:これまで実施してきた水溶媒を用いた熱硬化性樹脂の吸着サイトへの導入以外に、予め吸着サイトを疎水化することによって、疎水性樹脂の導入を図れることを確認し、細胞壁内吸着サイトへのポリメタクリル酸メチル(PMMA)の重合に成功した。3.界面すべりの制御:PMMA、メラミン系樹脂、アルコール溶性フェノール樹脂、ウレタン樹脂などを導入した木材の熱軟化特性、ならびに円柱圧縮試験によるすべり(流動)特性を評価した。走査プローブ顕微鏡によって細胞実質と細胞間層の物性値に変化があることが確認された。これらの軟化挙動、すべり現象(降伏挙動)、組織構造における物性値の差を総合的に検討することによって、木材で生じる超塑性的変形挙動の発生につい細胞間層が大きな影響を示していることがわかった。特に、PMMA樹脂では大幅に流動抵抗が低下することがわかった。

1.ナノ空隙の把握と制御:低分子フェノール(PF)樹脂を含浸した木材の空隙構造は、空隙半径r:10nm以下での空隙量の増加ならびに無処理では認められるr:1042nm程度の空隙が消失することが水銀圧入法から明らかになった。PF樹脂によって流動特性が向上したことを考慮すると、細胞壁内に存在するナノレベルの空隙のうちr:10nm以下のものがすべりの起点となっている可能性が示唆された。2.吸着サイトの把握と制御:ポリエチレングリコール(PEG)のうち、r:1042nmの細孔へ浸入可能な分子量が3001540に存在することが明らかになった。すなわち、この細孔領域に吸着できる分子サイズがバインダ・添加剤には必要である。3.界面すべりの制御:数種の添加剤(グリコール類、フェノール樹脂、メラミン樹脂)を導入した木材の熱軟化特性、ならびに円柱圧縮試験によるすべり(流動)特性を評価した。走査プローブ顕微鏡によって細胞実質と細胞間層の物性値に変化があることが確認された。これらの軟化挙動、すべり現象(降伏挙動)、組織構造における物性値の差を総合的に検討することによって、木材で生じる超塑性的変形挙動の発生につい細胞間層が大きな影響を示していることがわかった。本研究では、近年我々が見出した“木材の超塑性挙動"に着目し、ナノマイクロレベルでの微細構造変化の観点から変形メカニズムを解明するとともに、木材の超塑性現象を利用した変形加工技術の開発を目指す。具体的には、木材の非結晶領域に多く分布するナノ空隙と吸着サイトを把握・制御して、種々の界面状態を変化させ、木材に超塑性的変形を生じさせる。また、吸着サイトや吸着剤のナノ表面処理によって、変形と同時に寸法安定性や強度、難燃性能を付与することを目的とする。これによって、木材および木質材料の材料・部材としての適用箇所が格段に拡大するうえ、高機能な木質製品を、金属材料や合成樹脂のような生産性の高い塑性加工の手段で得ることができると考えられる。本年度の主な成果として1超塑性的変形挙動の核となる細胞間でのすべり現象について、走査型プローブ顕微鏡により細胞界面に存在する一次壁や細胞間層が湿潤の加温状態で膨潤し軟化することを明らかにした。2熱可塑性樹脂の木材細胞壁への導入によって、押出し特性が向上し、より低荷重での成形が可能になった。また、成形時に重要な因子である摩擦挙動についても、添加剤の種類によって大きく変化することがわかった。3細胞壁を始めとする木質細胞へ低分子量の添加剤が浸入し吸着することで、外部寸法の膨潤と同時に線膨張係数に変化が現れることを見出すとともに、樹種によってその変化挙動に差があることを明らかにした。本研究では、木材の超塑性挙動に着目し、微細構造変化の観点から変形メカニズムを解明するとともに、木材の超塑性現象を利用した変形加工技術の開発を目指す。また、吸着サイトの改質により、変形と同時に寸法安定性や強度、難燃性能を付与することを目的とする。1ナノ空隙の把握と制御:平均分子量の異なるポリエチレングリコール(PEG)を含浸された木材について、ガス吸着測定によって解析されたナノ空隙(0.30.6nm)の累積空隙量が、無処理木材と比較して減少するPEGサイズが存在することを見出した。
集合動産譲渡担保の理論的・実証的研究

理論上、物の集合体の上には一個の物権は成立せず、また集合物概念は原則として物を有体物に限定する民法85条に反するとされてきた。しかし、実務では、在庫商品や原材料のような多数の動産の集合体を一括して譲渡担保に供する方法が広く利用されるようになり、最高裁昭和五四年判決を契機に、中小企業の担保手段として判例法上、認知されるにいたった。そこで、学説は、一方で、集合動産譲渡担保実行前であっても、動産の集合体上に一個の担保権としての効力を認めつつ、同時に、一定の範囲で集合物を構成する個別動産の浮動担保性を承認するという、一見相矛盾する法律効果を合理的に説明するために、数多くの試みを行ってきた。この問題はなおも論争中である。本研究の主な成果は、「集合物」概念の有用性を証明し、再構成した点である。集合物概念を認めるかどうかについては現在見解が激しく対立しているが、(1)爾後取得動産について新たな行為なくして担保の効力および対抗要件の具備の効果が及ぶこと、(2)爾後取得動産に対する対抗要件具備時期を、個別動産が集合物へ搬入された時点ではなく、担保権が設定され「集合物」に対抗要件が具備された時点まで遡及させること、(3)したがって、また、この点から、債務者の資産状態が悪化していない段階で担保権が設定されているかぎり原則として爾後取得動産についても破産法上の否認の対象からはずれること、以上の点を合理的に説明するためには、集合物を一個の物として取り扱う必要まではないが、実行前にも集合動産に対して一個の担保権の成立を認めるべきである。もっとも、動産の集合体を一個の「集合物」として捉えていくとしても、それは有体物とは異なり、観念的便宜的な存在である。そこで、このような「物」に対して対抗要件を認めていくためには、(a)動産の集合体に場所的一体性があること、(b)個別の物の集合体の価値を越える集合物としての価値の存在が最低必要であると解される。特に、前記(2)の効力を認めるためには、単に動産の集合体であるだけで「集合物」性を認めるべきではないと解される。集合動産譲渡担保権者が、継続的な取引関係にある事業者間で利用され、銀行取引ではあまり使われなくなっている現状からすると、集合動産譲渡担保の対象に絞りをかける見解が実務的にも妥当であると考える。現在研究はまとめの段階であり、早ければ来年度中に研究成果を単行本として出版する予定である。1.平成6年度の当初計画のうち集合動産譲渡担保の効力についての個別的検討については、(1)集合動産譲渡担保の成立を正面から肯定した初めての最高裁判決である最判昭和62.11.10の問題点を明らかにした上で、動産の売買の際に利用される所有権留保と集合動産譲渡担保の効力の関係について検討を加えた。所有権留保の法的性質を代金完済時までは当該不動産の所有権は設定者に移転しないものと解すると、所有権留保動産の場合、それが集合物内に存しても、個別動産には集合動産譲渡担保の効力が及ばないと解さざるをえない。もっとも、その場合にも、集合動産譲渡担保権の善意取得が認められないかどうかについて検討の余地はあるが、占有改定による善意取得を認めない判例理論のもとでは、所有権留保のほうが集合動産譲渡担保に優先することが多いことになる。そうすると、動産の売主が先取特権を取得しているにすぎない場合と所有権を留保して動産を売買した場合では、集合動産譲渡担保の対外的効力に極めて大きな違いがあることが判明した。効力について所有権留保>集合動産譲渡担保>動産売買先取特権という結論を肯定するのかどうか、肯定するとしてその実質的根拠をどこに求めるか、なお考察の余地はあり、この点については研究の継続を必要とする。(2)集合動産譲渡担保権の侵害についても、東京池判平成6・3・28の検討により研究成果をあげることができた。(3)設定者破産の場合において集合動産譲渡担保が否認の対象となるかどうかについても整理することができた。2.特定債権譲渡規制法における特別目的会社-特別目的会社は債権の集合性を人為的に作りだす「箱」-と集合物を対比する中で、集合動産譲渡担保の法的性質を解明するためのキ-概念となる「集合物」については、物概念との連関を考えざるをえないとする研究当初の予想が正しいのではないかという感触を得た。

集合物概念を認めるかどうかについては現在見解が激しく対立しているが、(1)爾後取得動産について新たな行為なくして担保の効力および対抗要件の具備の効果が及ぶこと、(2)爾後取得動産に対する対抗要件具備時期を、個別動産が集合物へ搬入された時点ではなく、担保権が設定され「集合物」に対抗要件が具備された時点まで遡及させること、(3)したがって、また、この点から、債務者の資産状態が悪化していない段階で担保権が設定されているかぎり原則として爾後取得動産についても破産法上の否認の対象からはずれること、以上の点を合理的に説明するためには、集合物を一個の物として取り扱う必要まではないが、実行前にも集合動産に対して一個の担保権の成立を認めるべきである。もっとも、動産の集合体を一個の「集合物」として捉えていくとしても、それは有体物とは異なり、観念的便宜的な存在である。そこで、このような「物」に対して対抗要件を認めていくためには、(a)動産の集合体に場所的一体性があること、(b)個別の物の集合体の価値を越える集合物としての価値の存在が最低必要であると解される。特に、前記(2)の効力を認めるためには、単に動産の集合体であるだけで「集合物」性を認めるべきではないと解される。集合動産譲渡担保権者が、継続的な取引関係にある事業者間で利用され、銀行取引ではあまり使われなくなっている現状からすると、集合動産譲渡担保の対象に絞りをかける見解が実務的にも妥当であると考える。現在研究はまとめの段階であり、早ければ来年度中に研究成果を単行本として出版する予定である。本研究は、理論的には、一方で、集合動産譲渡担保実行前であっても、動産の集合体を目的物とする一個の担保権としての効力を認めつつ、同時に、一定の範囲で集合物を構成する個別動産の浮動担保性を承認し、第三者との関係で強すぎる集合動産担保権の効力を抑制するという、一見相矛盾する法律効果を合理的に説明することを目的としている。これに対して、最近、集合動産譲渡担保の実行前には担保権としての効力を認めない価値枠論に加えて、集合物概念を否定する考え方、さらには分析論に回帰する見解が有力に主張されている。しかし、(1)爾後取得動産について新たな行為なくしては担保の効力および対抗要件の具備の効果が及ぶこと、(2)爾後取得動産に対する対抗要件具備時期は、個別動産が集合物へ搬入された時点ではなく、担保権が設定され「集合物」に対抗要件が具備された時点まで遡及すること、(3)したがって、また、この点から、債務者の資産状態が悪化していない段階で担保権が設定されているかぎり、原則として爾後取得動産についても否認の対象からはずれること、以上の点を合理的に説明するためには、いわゆる「集合物」概念が肯定されるべきである、というのが本年度の研究成果である。ただ、動産の集合体を一個の「集合物」として物概念と関連させながら捉えていくとしても、それは概念的便宜的な存在にとどまるところから、このような「物」に対して対抗要件を認めていくことには問題が残されている。どのような場合に、「集合物」として特殊な効果を与えるべきか、この点がさらに検討されるべき課題となる。
汎用水中カメラを用いたリアルタイム・ターゲットサイズ計測手法の開発

本研究では,水中の対象物のサイズを計測できる簡便な画像計測手法の開発を目的として,汎用のデジタルカメラとレーザーユニットを用いて装置を構成するとともに,計測用にソフトウェアを作成し,水槽実験と海上実験により同計測手法及び装置の有効性を明らかにした。室内水槽において模型対象物および金魚を用いた実験による計測誤差は,最大約5%,平均で約4%であった。また,海上において船上から装置を水中に垂下して観測を行った。スケトウダラと判断される個体について計測を行い,計測値が同海域に分布するこの時期のスケトウダラの体長におよそ一致することを確認した。本年度は,前年度の結果をもとに耐圧水深200mの試作機を製作し,水槽における校正試験を行うとともに,試作機に対応したソフトウェアの製作ならびに実際の海洋での本装置の有効性を検討するために海上実験を行った。制作された試作機は,50cm x 36 cm x 19cmの金属フレーム内にカメラ筐体とレーザーユニットを装着したものであり,トロール漁具等への装着も考慮してフレーム強度に余裕をもたせた構造とした。校正実験は,北海道大学水産学部内の大型飼育水槽(直径3m,水深1m)において行った。水槽内においてサイズの既知である模型対象物(20×20 cmの平板)をレンズからの距離を変化させながらレーザー光軸上を移動させて撮影し,対象物のサイズ推定のための校正式の各パラメータを求めた。次に,スケトウダラ成魚を対象として計測試験を実施し,魚体の実サイズと計測されたサイズの比較を行った。その結果,計測誤差は約3%であった。なお,前年の金魚を対象とした結果よりも計測精度が向上した。これは,対象とした魚体サイズが大きいことに加えて,計測のアルゴリズムを修正したことによる。海上実験は,6/116/13の期間,鳥取県水産試験場の調査船「第一鳥取丸」により,隠岐島周辺において実施した。隠岐島沿岸域において,試作機を観測用ウインチのワイヤーにより海底付近となる水深3040mまで沈下させて,2時間の撮影を行った。同手順により撮影を3回実施した。しかしながら,同撮影においては計測対象として適切な画像を得ることができなかった。これは,実験海域において浮遊物が多く非常に濁度が高かったこととに加えて,機器に不調が生じたためであった。本年度は,屋内水槽を用いた実験により装置の構成を決定するとともに計測手法の妥当性の検証を行った。詳細は以下のとおりである。直径2.6 mの円形水槽内に1.8×1.2 mの長方形の実験区画を作成し,水深を0.45mとしてその中に装置を設置した。装置はデジタルカメラ(解像度3840×2160)とレーザーユニット(波長532nm)により構成された。次に,同装置によるサイズ計測の精度を確認するために,同水槽において実際の魚を用いた計測実験を行った,供試魚として金魚(平均体長13.6 cm)6尾を用意し,1尾ずつ水槽内に放流して各個体について20回レーザー光を通過するまで撮影を行った。撮影後に供試魚に麻酔を施し,体サイズ(体長・体高)を計測した。また,撮影画像より,供試魚がレーザーを通過した際の静止画を抽出した。その後,サイズ推定を半自動的に行うため,先に得られた校正式に基づく計測ソフトウェアをVisual Studio 2008 (Microsoft)により作成し,得られた画像から金魚の体サイズを計測した。同ソフトウェアによる体サイズの計測結果は,直接計測された値とよく一致していた。なお,カメラからの距離が遠くなると誤差は増加する傾向にあった。これは,1画素あたりの実距離がカメラからの距離にともない大きくなり,分解能が低下するためである。しかし,計測誤差は最大約5%,平均で約4%であったことから,十分実用的な範囲と判断された。本研究では,海洋調査等において撮影される水中画像中の対象物のサイズをリアルタイム計測できる簡便な水中画像計測計測手法の開発を目的とした。この計測手法は,CCDなどの受光素子式カメラとレーザー光照射装置を利用することで,レーザー光を遮蔽した対象物のサイズを画像から幾何学的に計測するものである。まず,室内飼育水槽(直径3m,水深1m)において,模型対象物(20x20cm平板)をレンズからの距離を変化させながらレーザー光軸上を移動させて撮影し,対象物のサイズ推定のための校正式の各パラメータを求め,次に,同装置によるサイズ計測の精度を確認するために実際の魚を用いて計測実験を行った。また,計測のために専用の画像計測ソフトウェアを作成した。

計測誤差は最大約5%,平均で約4%であり,十分実用範囲にあると判断された。次に,水槽実験での装置の仕様をもとに,耐圧水深300mの試作機を製作し,水槽においてスケトウダラ成魚を対象として校正試験を行った後,海上での実験を行った。試作機は,50 x 36 x 19cmの金属フレーム内にカメラ筐体とレーザーユニットを固定した構成である。校正実験の結果,計測誤差は3%であった。海上実験では,試作機を船の観測用ウインチのワイヤーにより海底付近まで沈下させて撮影を行ったが,実験海域の濁度の高さ等から適切な計測を行えなかった。このため,最終年度は,異なる海域において再度海上実験を実施してスケトウダラと判断される個体について計測を行うことができた。計測された体長はいずれも約30cmであった。これは,同海域に分布するこの時期のスケトウダラの体長におよそ一致していた。本装置による計測はレーザー光を用いるために低照度下でも可能であり,その利用範囲は広いものと考えられる。漁業解析学H25年度の計画は,H24年度の結果をもとにした実機の製作と海上実験,および実機に対応した計測ソフトウェアの製作着手であった。このうち,実機はすでに製作しており,対応ソフトウェアの製作についても着手している。しかしながら,海上実験については,実施したものの,解析に適切な画像データの取得ができなかった。実験海域において浮遊物が多く非常に濁度が高かったこととに加えて,機器に不調が生じたためである。なお,この不調については,すでに対策を講じた改善を行っており,今後の計画に支障はない。24年度の計画は,計測システムの完成を目的とした水槽実験による1計測手法の妥当性の確認と2構成機器の決定ならびに3試作機の設計への着手であった。1と2については,計画通りの結果を得ることができており,3についてもすでに設計を始めている。なお,レーザー出力の決定のための懸濁状態下での光量減衰に関する検討については,実験による確認は行えなかったものの,現状で入手可能な最大光力のレーザーユニットを利用することで,対応できている。当初の計画通り,海上実験を継続することにより,海中での計測画像の収集を進めるとともに,ソフトウェアの精度検証と改良を行い,最終的なシステムの完成を目指す。海上実験については,時期と海域の選定を慎重に行い,計測環境を十分考慮するとともに,大型地区用水槽,養殖施設等での計測も合わせて行い,解析に供するための適切な画像データの蓄積をはかる。24年度の結果をもとに耐圧100m以深対応の試作機を製作する。また,動画画像からの計測の自動化を行うためのソフトウェアの製作ならびに実際の海洋での本装置の有効性について検討する。海上試験:製作した試作機を現有のROV(Remotely Operated Vehicle)に装着し,北海道大学附属練習船により海中での画像撮影を行う。また,養殖生簀等における計測実験も実施し,実際の海中での計測データを取得する。海上実験では,計測対象となった魚類の採集も行い,画像データとの比較から計測精度を調べ,本方法によるサイズ推定の実用性について検証を行う。計測ソフトウェアの開発:撮影時の画像より,任意の物体のサイズをリアルタイムに計測・記録するためのインターフェース・ソフトウェアを完成させる。
動く神経細胞の蛍光観察におけるROI設定

本研究の目的は、動く線虫の神経活動を定量的に評価するために蛍光画像の動画から蛍光発光強度を調べる領域(ROI:Region Of Interest)を自動設定する手法の開発である。顕微鏡ステージのリアルタイム制御により観察対象の運動を追跡する顕微鏡装置を用いて、多様な刺激に対する生物の反応を多様な観察手法で高い時間・空間分解能で解析・記録する装置を作成した。とくに、多細胞生物で多くの研究にモデル生物として用いられている線虫(C. elegans)を明視野ならびに蛍光観察できるシステムを実現した。さらに、ROIの自動追跡ソフトウェアを開発し、その有効性を確認した。本研究の目的は、動く線虫の神経活動を定量的に評価するために、蛍光画像の動画から蛍光発光強度を調べる領域(ROI: Region of Interest)を自動設定する手法の開発である。基盤研究(A)ならびに新学術領域研究において、線虫の動きを追跡するトラッキング顕微鏡を開発している。これは明視野透過画像を高速カメラで撮像し、画像処理を行って、高倍率かつ高速にXYZステージを制御するもので、生物の運動と神経活動(と強い関連のあるカルシウムイオン濃度に反応する蛍光タンパク質の発光強度)の両方を同時に計測することが可能である。本研究では、このトラッキング顕微鏡を用いる際に問題となる神経細胞の変形やフォーカスのズレ、蛍光発光の確率的時系列処理について解析し、神経細胞活動を正確に定量評価するための画像処理手法を開発することを目的としている。具体的には、1.線虫自身の運動により神経細胞(細胞体と軸索)も変形し、移動するが、蛍光画像のどの領域が注目する神経細胞に相当するかを推定する。2.複数の神経活動を同時に計測するとき、蛍光画像中のどのピクセルがどの神経に対応するかを推定する。3.フォーカスのズレは原理的に必ず発生するので、それを補正しなければならない。などの課題が挙げられる。これらの課題に対し、(1)あいまいな輪郭を抽出するのに有効な動的輪郭モデルに基づいて細胞変形モデルとモデルに基づくROI設定手法を開発し、トラッキング蛍光画像のオフライン処理方法を提案した。(2)解剖学的に得られた神経接続地図(インターネットで公開されている:wormatlas)を利用して、地図パターンと画像パターンのマッチングを行った。(3)地図パターンの三次元情報を利用して、注目するスライスに適応的に合焦するアルゴリズムを考案し、ステージのZ軸制御を併用することでZ面トラッキングを実現した。本年度は、ビジュアルサーボの手法を適用し、線虫の運動と変形とを同時に推定する画像処理手法を開発した。具体的には1.線虫自身の変形により神経細胞(細胞体と軸策)も変形するが、どの領域を画像処理すればよいか。2.複数の神経活動を同時に計測するとき、蛍光画像中のどのピクセルがどの神経に対応するのか。3.複数の神経活動を同時に計測するとき、焦点ぼけを推定して補償する必要がある。これらの課題に対し、1.細胞変形モデルとモデルに基づくROI設定法を開発した。あいまいな輪郭を抽出するのに有効な動的輪郭モデルを開発した。2.解剖学により得られた神経地図を利用して、地図パターンと画像パターンのマッチングを行った。EMアルゴリズムの適用と解析を行った。3.顕微鏡において焦点が合うスライスは薄いので、すべての神経細胞に合焦することは原理的に不可能であり、注目するスライスに適切に合焦しなければならない。地図パターンのスライスを切り出し、パターンマッチングすることにより特定のz面をトラッキングすることを試みた。以上の成果を国際会議論文に発表し、過去のトラッキング、パターンマッチング、オートフォーカス手法などとあわせて雑誌論文で発表した。XY方向のトラッキングはロバストに実施できている。Z方向の位置合わせ、スライス推定はさらにアルゴリズムの改良が必要である。共焦点ユニットの導入によりクリアなZ蛍光像スライスが取得できることがわかったので、地図パターンとの照合が精度よく出来るようになると考えている。特定のスライスに注目することよりも、ある程度の深さをスキャンして3次元神経画像を構築する手法と並行して進め、ROI設定のロバスト性を高め、検出精度向上(カルシウム濃度変化の定量化)に取り組みたい。次年度使用額は本研究費により発表することを予定していた学会発表を次年度に延期することにより生じたものであり、平成24年度に複数の学会で発表することで平成24年度旅費とあわせて使用する予定である。
分子標的治療を受ける進行がん患者へのセルフマネジメント教育プログラムの構築と検証

【背景・目的】2018年3月より切除不能・TACE不応の進行肝細胞癌に対するレンバチニブが保険承認された。レンバチニブは抗腫瘍効果が高いが、有害事象(Adverse Events:以下、AE)も多様である。当院でレンバチニブを投与した切除不能進行肝細胞がん17症例につき、初期使用経験をまとめた。また、同症例において、安全性(AE発現状況)と有効性につき検討した。【結果】対象は2018年4月2019年1月に、東海大学病院消化器内科で、レンバチニブを投薬した17例で、男性14例、平均年齢74歳、原疾患HCVかHBV5例、TNMステージIV10例、BCLC-C10例であった。グレード3以上のAEは、食欲不振、甲状腺機能異常、高血圧の順に多かった。導入時からの看護師によるセルフマネジメント支援あり群(11例)は支援なし群に比べ、OSと投薬期間ともに有意に良好であった。【考察】レンバチニブによる肝細胞がんへの抗腫瘍効果は高いが、有害事象の頻度も高く、種類も多彩であるため、より慎重な副作用マネジメントが必要である。試作したセルフマネジメント支援プログラムを進行肝細胞がん患者を対象にソラフェニブ、レゴラフェニブ、レンバチニブによる治療開始時から全例に試行している段階にあるが、対象数を増やすことが難しく、今後は多施設共同研究の可能性も含めて計画の見直しが必要と考えている。今後は、現在実施している試作版セルフマネジメント支援プログラムの有効性に関する調査を完遂し、多変量解析においても本支援プログラムの有効性が示唆できるように調査計画を見直すとともに、研究環境の整備を進めていく。【目的】進行肝がん患者を対象にソラフェニブ治療開始時をBaseline(BL)として、全対象にセルフマネジメント支援を実施し、自己効力感、健康関連Quality of life(HRQOL)、身体活動及びBMIの4か月間の変化を縦断的に明らかにした。【方法】自己効力感はSEAC、HRQOLはEORTCQLQ-C30、身体活動はIPAQにより毎月評価し、統計学的に分析した。【結果】対象は18例で、男性14例、平均年齢73.7±5.0歳、原肝疾患はHCVかHBV10例、TNMステージはIV11例であった。Grade3以上の主な有害事象は、皮膚毒性3例、高血圧1例であった。自己効力感スコアの平均は、Total efficacyはBL 96.8、2M91、4M97で、ADL efficacyはBL98、2M92、4M86であり、この2項目だけBLに比べ2,4Mは有意に低い傾向を示した。HRQOLスコアは、全般的健康観、身体機能、役割機能、情緒機能、認知機能、社会機能、疲労感、食欲不振、下痢の項目でBLに比べ2,4Mが有意に悪い傾向を示した。自己効力感もHRQOLも全ての項目で2Mと4M時点でのスコア間に有意差は認めず、4Mの平均スコアは2Mに比べ概ね横ばいか改善傾向であった。身体活動として、1日あたりの3METs以上の運動時間hoursの平均はBL4、2M3、4M4で、いずれの時点間にも有意差は認めなかった。BMIの平均値はBL23、2M21、4M21で、BLに比べ4Mで優位な低下を認めた。【考察】ソラフェニブ治療を受けている肝がん患者において、自己効力感とHRQOLのいくつかの項目でBLに比べ2、4Mで有意に悪化し、2Mから4Mにかけては低下がない傾向が示された。主な有害事象でHFSR、疲労感、下痢を認めた患者でADLに影響をきたしADL efficacyとTotal efficacyやHRQOLが低下した可能性が考えられた。以上から、有害事象のでやすい導入から2カ月目の時期に密に支援する必要性があると言える。試作したセルフマネジメント支援プログラムを進行肝細胞がん患者を対象に実行可能性試験を行っている段階にあるが、対象数の確保が難しく、今後は多施設共同研究の可能性も含めて計画の見直しが必要と考えている。試作したセルフマネジメント支援プログラムを進行肝細胞がん

患者を対象にソラフェニブ、レゴラフェニブ、レンバチニブによる治療開始時から全例に試行している段階にあるが、対象数を増やすことが難しく、今後は多施設共同研究の可能性も含めて計画の見直しが必要と考えている。今後は現在施行している試作版セルフマネジメントプログラムの有効性に関する調査を完遂し、無作為化比較試験へ移行できるよう計画の見直しと、研究環境の整備を進めていく。今後は、現在実施している試作版セルフマネジメント支援プログラムの有効性に関する調査を完遂し、多変量解析においても本支援プログラムの有効性が示唆できるように調査計画を見直すとともに、研究環境の整備を進めていく。分子標的資料を受けている肝細胞癌患者へのセルフマネジメントプログラムの実行可能性研究の調査の進捗が遅れたために、その成果を発表予定であった国際学会や英文雑誌に提出できなかったため、海外渡航費・学会参加費・英文校正や掲載料などの計画していた予算を執行できなかった。2018年度に前年度執行できなかった英文校正や掲載料、学会参加費として残額を使用する計画である。また、可能であれば次年度使用額によりデータ入力の効率化のためフィールドに携帯できるノート型パソコンを一台購入する。対象数が思うように増やせず、研究の進捗が遅れているため、2018年度も成果発表予定の国際学会渡航費・参加費や英文雑誌への投稿に充てる予算が執行できなかった。2018年度末より、調査結果のデータ入力などの人件費を活用し、研究のより円滑な遂行を工夫しはじめたところである。
皮膚低周波刺激での身体図式改変によるビークル操作熟達支援

ビークル操作時の車両感覚と関係深い身体図式に着目し,経皮低周波刺激で操作者の身体図式改変を誘導する運転操作支援法の要素研究を2年間実施した.経皮的抹消神経電気刺激(TENS)に注目し,身体図式の改変程度を識別し得る脳計測部位を視覚-体性感覚不一致課題等と近赤外線脳血流計測で調査し,鳥口上腕靭帯付近へ刺激印可と下頭頂小葉での挙動検出の有効性(p<0.01)を確認した.そして車両感覚向上支援法の効果を運転シミュレータでの車線維持課題(被験者数約80名)で検証し,身体図式改変をTENSで誘導する運転支援法の有効性を確認した(p<0.001,N=640-790).ビークル操作時の車両感覚と関係深い身体図式に着目し,経皮低周波刺激で操作者の身体図式改変を誘導する運転操作支援法の要素研究を2年間実施した.経皮的抹消神経電気刺激(TENS)に注目し,身体図式の改変程度を識別し得る脳計測部位を視覚-体性感覚不一致課題等と近赤外線脳血流計測で調査し,鳥口上腕靭帯付近へ刺激印可と下頭頂小葉での挙動検出の有効性(p<0.01)を確認した.そして車両感覚向上支援法の効果を運転シミュレータでの車線維持課題(被験者数約80名)で検証し,身体図式改変をTENSで誘導する運転支援法の有効性を確認した(p<0.001,N=640-790).ビークル運転操作の熟達に重要な車両感覚と関係深い身体図式(body schema:身体の延長感覚)に着目し,経皮低周波刺激で操作者の身体図式に干渉してビークル運転操作支援を行うために必要な要素について研究を実施した.今年度は,低周波刺激発生機器と生体計測装置を連成したビークル運転シミュレータを構築し,(A).低周波刺激を用いた車両感覚簡易支援法による操作者運転性能への効果を見るためのパイロット実験(被験者19名)と,(B).脳機能計測による身体図式改変程度の客観的計測法の模索,の2つの項目に取り組んだ.項目Aについては,鳥口上腕靭帯付近への経皮微弱電気刺激により,操作者にその刺激を認知させずにビークル操作性能を向上できることが確認されたが,同時に同微弱電気刺激に対する知覚弁別度の個人差が大きいことも確認された.項目Bに関しては,最初に,経皮低周波刺激の候補の一つである低周波音振動刺激に関して,身体図式の改変効力を運動錯覚実験(ピノキオ錯覚と屈曲錯覚)を用い,既存研究の諸条件で追試した.しかし,その運動錯覚の誘発率は34割程度に留まり,十分な発現を見出せなかったため,低周波音振動刺激による方式を棄却し,経費微弱電気刺激による方式を採用することとした.次に,身体図式改変の要因の一つである視覚情報に着目し,ビデオカメラ/モニタで視覚情報提示を光学的に変えて被験者に与える,"視覚体性感覚不一致タスク"を用い,身体図式の改変の学習中の脳活動を近赤外光脳血流計測(NIRS)で調べた.身体図式に関係すると言われている幾つかの脳部位の賦活変化を分析したところ,下頭頂葉小葉の賦活変化が視覚体性感覚不一致の程度に応じて有意に変化する(p<0.01)ことを確認した.以上により,身体図式の拡張の獲得程度を定量的に計測する手段の目途も立てることができた.ビークル操作時の車両感覚と関係深い身体図式(body schema:BS)に着目し,経皮低周波刺激で操作者のBS改変を誘導する運転操作支援法の要素研究を2年間実施した.初年度で,1パイロット実験による経皮低周波刺激での車両感覚支援効果と,2脳機能計測によるBS改変の客観指標,を確認したのち,本年度で,3経皮低周波刺激の最適条件の探索,4視触覚情報に対する丁度可知差異調査,5車両感覚向上支援法を,研究した.1に関しては音振動刺激と経皮的抹消神経電気刺激(TENS)の2つの候補のうち,後者の妥当性を運転シミュレータでの簡易車両感覚支援実験(被験者約20名)で確認した.2に関しては近赤外線脳血流計測(NIRS)を用い,視触覚不一致課題等でBS改変程度を識別し得る脳部位を探索調査し,下頭頂小葉の脳血流量が有意(p<0.01)に変化すること[電気学会知覚情報研究会で奨励論文賞受賞]や,同部位の脳血流量の高周波成分振幅が後述5の運転支援適用時に減少すること[NCSP2015 Student Paper Award受賞]を確認できた.本年度は,4の触覚情報に関して,被験者毎にTENS刺激知覚閾値を測定し,電流刺激条件の個人調整(項目3に相当)を図った上で,3種のTENS強度(知覚可能刺激:AA,知覚不能刺激:IA,刺激無:NA)と,2種の運転視点(運転席:Seat,車上:Roof)の6通りで被験者実験(約80名)を行い,道路壁面から距離を維持して運転するレーンキープタスクを用いて5を実験的に検証した.その結果,IAによるBS改変効果の一つと思われる最大逸脱時間の減少効果は9割の被験者に確認された.続いて逸脱累積時間の長短に応じて初心者群と熟達者群に分けて精査したところ,運転不慣れな初心者の場合にはSeat-IA刺激で,Seatでは慣れているもののRoof視点には不慣れな上級者の場合はRoof-IA条件で,それぞれ運転支援効果が見られ,BS改変をTENS刺激で誘発する車両感覚向上支援の有効性を確認できた.

・学会発表"脳機能測定を用いた身体図式改変の客観的評価"は,電気学会知覚情報研究会にて奨励論文賞受賞システム科学研究項目A(ビークル運転シミュレータの統合開発とパイロット実験の実施)については,運転中に主観的知覚を与えない強度の経皮低周波刺激で,身体図式拡張に関わる運転支援が可能である見通しは得られ,その目標は達成された.研究項目Bについても,身体図式の拡張学習に伴う生体的反応現象を,脳機機能計測により客観的に判定する一手法を見出せた.従って本年度は概ね計画通りに進めることができた.しかし,項目Aに関しては,支援効果や経皮微弱刺激に対する知覚強度に個人差があったので,次年度実施予定である丁度可知差異(JND)解析実験を行う前に,前述のパイロット実験で得られたデータについても個人差を精査する必要性を再認識した.また,同パイロット実験で確認された運転支援効果が,身体図式の拡張のみに因るものなのかについては,現時点で十分に断言できている訳ではない.これらの事項については,次年度でNIRS計測を用いて解析する計画であるので,当初の計画案に沿って研究を進める.当初の計画に従い,次年度では,(1)経皮微弱電気刺激の最適条件の探索調査,(2)視覚的変化と低周波刺激変化とを相互/独立に変化させた時のJND同定のための被験者実験,(3)車両感覚向上支援の制御系設計法の確立,を進める.既にJND調査用のシミュレータ運転コースと実験プロトコルは,ハプティックアクセルペダルによる踏力計測を準備的解析対象とした操作者の弁別度解析実験(既に被験者数20名に対して実施し,弁別度特性の算出が可能である見通しを得ている)で大凡の部分が完成しているので,これを用いて項目(1)の探索調査と,項目(2)のJND計測実験を行う.その計測実験の際には操作者のNIRS計測も行い,車両感覚を必要とする運転操作の熟達度が,経皮微弱電流刺激による身体図式の改変促進によって向上し,さらにその習得変化が脳血流量の違いとして定量的に判定できるかを実験的に確認する.そして,車両感覚向上支援の制御系設計に反映させ,再度ビークル運転シミュレータに実装し,項目(3)に取り組む.そしてこれら被験者実験で蓄積したデータの分析・評価を行って,本研究を総括する.補助金使用残金の端数分少額の為,次年度と合算して使用
ハイパースペクトル画像解析による農業空間情報センシング技術の構築

本研究では,ハイパースペクトル画像解析により多様な農業空間の情報を計測するための技術開発を目指し,汎用性に優れたマップ生成アルゴリズムを開発した。この技術は,農業空間の作物生育量や品質などの不均一性の把握へ応用でき,栽培管理のための処方箋作成への展開が期待できる。従って,本研究で開発した技術は効率的で最適化された栽培管理を実行するために有効といえる。マップ生成アルゴリズムの開発には,ハイパースペクトル画像の撮影および農業空間情報の推定が必要となる。そこで,高品質な画像を取得するための画像撮影システムと高精度で推定するための画像解析システムを開発した。画像撮影システムは,広域画像撮影サブシステムと局所画像撮影サブシステムから成り立つ。広域画像撮影サブシステムでは,車両走行を利用して効率的に空間情報マップ生成のための農地全体の画像を取得する。局所画像撮影サブシステムは携行性に優れた小型の撮影システムで,空間情報の推定モデル開発のための高い空間分解能の画像を容易に得ることが可能である。このシステムは,多目的に利用することができ,その構造は簡略である。以上のことから,汎用的で実用性の高いと考えられる。画像解析システムは,フィールドスケール画像生成サブシステム,画素推定サブシステム,空間処理サブシステムから成り立つ。フィールドスケール画像生成サブシステムでは,取得した画像から自動的に農業空間全体を表すフィールドスケールの画像を生成する。画素推定サブシステムでは,フィールドスケール画像の各画素の農業空間情報を推定し,推定値の配列を生成する。空間処理サブシステムでは,対象となる空間情報やマップの用途により空間処理手法が異なるため,ノイズ除去や個体認識など複数の処理が実行可能な仕様となっている。
汎発性強皮症皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン遺伝子転写制御・情報伝達の研究

正常線維芽細胞ではSmad3を強発現した場合、無刺激下およびTGF-β刺激下のコラーゲン遺伝子転写活性は有意に亢進したがSmad2、あるいはSmad4を強発現にて特に変化は認められず、強皮症線維芽細胞ではこれらSmad蛋白の強発現にて無刺激下およびTGF-β刺激下のコラーゲン遺伝子転写活性は特に変化は認められなかった。Sp1の強発現は、正常維芽細胞ではTGF-β刺激に対する反応性を亢進させたが、強皮症線維芽細胞では変化しなかった。Smad3とSp1の強発現は、正常皮膚線維芽細胞では無刺激下およびTGF-β刺激下のコラーゲン遺伝子転写活性は著明にに亢進したが、強皮症皮膚線維芽細胞では軽度亢進し、これらの結果は強皮症皮膚線維芽細胞ではautocrine TGF-βsignalingにて既に活性化しているためと考えられた。またこの考えに合致して、強皮症皮膚線維芽細胞ではSmad3のセリンリン酸化が亢進し、Smad3とp300およびSp1の結合が亢進していた。強皮症線維芽細胞ではSmad7発現が亢進しTGF-β受容体と恒常的に結合していることが示された。Smad7の発現は正常線維芽細胞ではコラーゲン遺伝子転写活性を抑制したが、強皮症線維芽細胞では変化がなく、Smad7によるnegatvie feed back機構に異常があると考えられた。強皮症線維芽細胞では恒常的にp38 MAPKが活性化し、P38 MAPキナーゼ特異的阻害剤(SB202190、SB203580)あるいはdominant negatvie p38 MAP kinase強発現にて強皮症繊維芽細胞における細胞外マトリックス産生亢進が抑制され、強皮症線維芽細胞における細胞外マトリックス過剰産生においてp38 MAPKが関与する可能性が示唆された。強皮症皮膚線維芽細胞ではコラーゲン遣伝子の発現が3倍程度亢進し、Smad3のリン酸化力亢進していた。Smad3の発現量は正常皮膚線維芽細胞と差がなかった。さらに免疫沈降法にてSmad3とSp1のinteractionを検討したところ、強皮症線維芽細胞ではSmad3とSp1のinteractionが亢進していた。また免疫沈降法にて強皮症線維芽細胞ではSmad3とco-activatorであるp300/CBPとのinteractionが亢進していることが確認された。Smad3の過剰発現にて、正常皮膚線維芽細胞ではコラーゲン遺伝子転写活性が亢進し、さらにTGF-βに対する反応性も亢進したが、強皮症線維芽細胞では変化しなかった。また転写因子Sp1の過剰発現にて正常皮膚線維芽細胞ではTGF-β刺激下におけるコラーゲン遺伝子転写活性が亢進したが、強皮症線維芽細胞では変化しなかった。さらに強皮症線維芽細胞ではSmad7が過剰発現し、過剰発現したSmad7がTGF-βI型およびII型受容体とcomplexを形成していた。Smad7の過乗発現にて、正常皮膚線維芽細胞ではコラーゲン遺伝子転写活性が低下し、さらにTGF-βに対する反応性も低下したが、強皮症線維芽細胞では変化しなかった。以上の結果は、強皮症皮膚線維芽細胞ではin vivoでTGF-β刺激を受け、Smad3がリン酸化し、Smad7が過剰発現しているものと考えられ、皮症皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン遺伝子発現亢進においてin vivoにおけるTGF-β刺激、Smad3のリン酸化が関与していると考えられた。強皮症皮膚線維芽細胞ではコラーゲン遺伝子の発現が3倍程度亢進し、Smad3のリン酸化が亢進していた。またCAGAmotifおよびコラーゲン遺伝子プロモーター領域のTGF-βresponse elementを用いたDNA affinityimmunoprecipitation assayにて強皮症皮膚線維芽細胞ではSmad3のDNA結合能が恒常的に亢進していることが示された。Smad3の過剰発現にて、正常皮膚線維細胞芽細胞ではコラーゲン遺伝子転写活性が亢進し、さらにTGF-βに対する反応性も亢進したが、強皮症線維芽細胞では変化しなかった。またSmad7のTGF-β受容体degradationに関与するSmurf1/2の発現は強皮症皮膚線維芽細胞と正常皮膚線維芽細胞では差が見られなかったが、強皮症皮膚線維芽細胞ではSmurf1/2の機能が低下していた。以上の結果は、強皮症皮膚線維芽細胞では、恒常的にSmad3がリン酸化しかつDNA結合能が亢進し、Smad7が過剰発現しているもののSmurf1/2の機能が低下しているためnegative feedbackが作用していないと考えられ、強皮症皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン遺伝子発現亢進においてautocrine TGF-βsignalingが関与していると考えられた。