hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物オルガネラのRNA編集の分子機構解明に向けた編集酵素の探索と同定

植物のミトコンドリアと葉緑体でmRNAの特定のシチジン(C)がウリジン(U)に変換される「RNA編集」が頻繁に起こるが、その分子メカニズムは不明である。本研究ではモデル植物であるヒメツリガネゴケを用いて新規のRNA編集因子を3種同定した。さらに同定したRNA編集因子の機能ドメイン領域を解析した結果、RNA編集因子のC末端に存在するシチジンデアミナーゼ活性部位類似アミノ酸残基を含む39アミノ酸領域がRNA編集部位の認識に関与することを初めて明らかにした。植物のミトコンドリアと葉緑体でmRNAの特定のシチジン(C)がウリジン(U)に変換される「RNA編集」が頻繁に起こるが、RNA編集の分子機構は未だ不明である。本研究ではRNA編集酵素の探索と同定を行い、RNA編集の分子機構の解明を目指す。今年度の成果は以下の通りである。(1)RNA編集の生物学的意義の検証:葉緑体リボソームタンパク質S14をコードするrps14 mRNAの+2C部位と-1C部位の2カ所がRNA編集される。これらの編集部位に作用することが予想されたPpPPR_45の発現レベルをRNAi法により抑制することにより、2カ所のRNA編集部位のRNA編集効率が異なる多数のヒメツリガネゴケ変異株を取得することに成功した。(2)RNA編集酵素活性の検証:植物オルガネラのRNA編集酵素はシチジンデアミナーゼ活性を持つことが予想される。ヒメツリガネゴケのPPRタンパク質のDYWドメイン中にシチジンデアミナーゼ活性中心の保存アミノ酸残基が存在することから、RNA編集に働くPPRタンパク質が編集部位の配列認識とRNA編集酵素活性を併せ持つ可能性が考えられる。この可能性を検証するため、RNA編集欠損のPPR遺伝子破壊株にPPRタンパク質の全長、部分長、変異型などをコードする遺伝子を導入した多数の相補株を取得しRNA編集が回復するかどうかを調べた。その結果、RNA編集にはDYWドメイン中の特定のアミノ酸殘基が重要な役割を担っていることを明らかにした。植物のミトコンドリアと葉緑体でmRNAの特定のシチジン(C)がウリジン(U)に変換される「RNA編集」が起こるが、RNA編集の分子機構は未だ不明である。RNA編集の分子機構の解明を目指し研究を行い、以下の成果を得た。(2)ヒメツリガネゴケのRNA編集因子PPRタンパク質の編集機能領域を明らかにするため、様々なタンパク質領域をコードする遺伝子をミトコンドリアのRNA編集欠損変異株に導入し、RNA編集が回復するかどうかを詳細に検討した。その結果、RNA編集にはDYWドメインが必須であることを明らかにした。(3)DYWドメインに存在するシチジンデアミナーゼ活性部位の類似アミノ酸残基HxE(x)nCxxCにアミノ酸変異を導入すると、RNA編集機能が喪失することを明らかにした。また、DYWドメインのほぼ中央部の2361番目のアミノ酸領域がRNA編集部位の認識に関与することも明らかにした。論文作成中植物オルガネラ遺伝子発現制御(1)PpPPR_45遺伝子のノックアウト(KO)株を取得するため、これまでに様々なコンストラクトを作製して植物体に導入したがKO株を得ることができなかった。そこで今年度はKO株ではなく、PpPPR_45遺伝子の発現を抑制したノックダウン(KD)株の取得を試みたところ、期待通りPpPPR_45遺伝子KD株を得ることに成功した。KD株を解析した結果、PpPPR_45が葉緑体のrps14 mRNAのRNA編集に関与する因子であることをほぼ実証することができた。この成果を土台としてさらなる解析を進めることができる。(2) PPRタンパク質のDYWドメイン中にシチジンデアミナーゼ活性を有するという傍証を得ることができたのは大きな進展である。次年度予定の検証実験を進める準備も整いつつあり、研究は順調に進展している。(1)PpPPR_45遺伝子ノックダウン(KD)株についてRNA編集以外の影響を検討するためRNA-Seq解析を行う。(2)取得したPpPPR_45発現抑制株を用いてS14タンパク質の蓄積レベルと葉緑体におけるタンパク質合成能を調査する。このためS14タンパク質のペピチド抗体を用いたウェスタン解析を行う。S14タンパク質の蓄積レベルとrps14 mRNAのRNA編集効率を比較検討する。(4)PPRタンパク質全長、DYWドメインを除いた変異PPRタンパク質、PPRタンパク質の部分長や変異型などをコードする遺伝子を様々なRNA編集変異株に導入し、RNA編集が回復するかどうかを調べる。これにより、RNA編集に必須のアミノ酸殘基や領域を詳細に明らかにする。今年度取得したPpPPR_45遺伝子ノックダウン株を解析した結果、PpPPR_45が葉緑体のrps14 mRNAのRNA編集に関与する因子であることがほぼ確実になった。さらにrps14 mRNAのRNA編集以外のRNAプロセスへの影響も調べる予定であった。

しかし、そのためのRNA-Seq解析を今年度中に行うことができなかった。このためRNA-Seq解析を行うのに必要な物品費の一部を次年度に使用する。次年度の前半にRNA-Seq解析を行う。そのための次世代シーケンス用試薬等の購入に充てる計画である。
誘電法による植物体内水分計測と水分の物理化学的特性

本年度は,トマト果実内の成分が水ストレスや塩ストレスによってどのように影響を受けるかについて調べた.また,それによって両ストレス下において生じるトマト果実の生長や果実の浸透圧調整機能など,生理的反応についても調べた.供試品種として,生食用トマト品種`ハウス桃太郎'を用いた.ガラス室内の栽培ベッドに砂とバーミキュライトを混合した培地を入れ,トマト植物を栽培した.土壌水分はTDRを用いて計測し,潅水量はその値に基づき制御した.塩ストレスは,培養液濃度を調節して与えた.植物体のストレスを調べるため,葉の水ポテンシャルを調べた.収穫果実に対して,糖,有機酸,アミノ酸,及び浸透ポテンシャルの測定を行った.その結果,水ストレスと塩ストレスとを比較した結果,果実生長抑制は塩ストレスの方が大きいことが分かった.果実内成分は,全般的に塩ストレスを与えた場合の方が顕著に高い値を示した.この結果は,糖及び有機酸の場合果実内水分現象に基づく濃縮効果によるものだが,アミノ酸の場合,生成量の真の変化に起因することが明らかになった.また,この結果は浸透圧調節機能のメカニズムが水ストレスと塩ストレスで異なることを示唆している.本研究では,土壌の水分計測に有効で,電磁波の誘電特性を利用した非破壊的な水分計測法であるTDR (Time domain reflectometry)法を用いて,逐次的に青果物体内の水分変化を測定することを目的とした。供試材料には市販のナス果実を用いた。含水率の計測は,TDR法および,乾燥法によって行った。また,実験開始時および終了時に光学顕微鏡により,ナス果実の細胞を観察した。乾燥法,すなわち,重量変化のみから算出した含水率の経時変化をみると,経過時間と含水率には非常に高い負の相関が認められた。しかし,誘電率の経時変化をみると,誘電率と経過時間の間には相関がなく,2日目までは経過時間に伴い誘電率は減少したが,それ以降は増加に転じた後,ある一定の値で推移した。これらの結果から,収穫後のナス果実の生体内では蒸散による水分損失が起こる一方で,呼吸により水分の供給が常に行われることにより,体内水分があるレベルで維持されることが示唆された。これが明らかになれば,水収支からみる,呼吸と蒸散の関係なども明らかになる可能性があると思われる。また,光学顕微鏡の観察により,新鮮なナス果実では細胞間が非常に密接しており,細胞間隙がほとんど見られないのに対し,実験開始より5日経過した果実では,細胞間隙が大きく肥大しており,また,細胞自体も大きくなっていたことが確認された。現段階では,細胞間隙の有無と誘電率変化の関係は明らかではないが,今後検討する予定である。本年度は,植物体内水分の理化学性を調べる実験の一つとして,ランにエチレン暴露させた場合,ラン植物体内の水分の状態が物理的に影響を受けるか,花弁の色が変化するかを調べた.また,花の老化過程における^1H-NMR緩和時間を調べ,エチレン暴露を細胞水との関係を明らかにした.実験材料は,Dendrobium Phalaenopsis cvを用いた.50個の栽培ポットを2つのグループ(コントロールとエチレン処理)に分け,異なる2つのグロース・チャンバに置いた.毎日サンプルを取り,^1H-NMRスペクトロメータによって,緩和時間T_1(スピン-格子緩和時間)とT_2(スピン-スピン緩和時間)を測定した.その結果,エチレン暴露によって,緩和時間と水分量が共に減少し,それに伴って色相角の増加が認められた.エチレン処理したランの花弁における細胞水のT_1は減少し,水分の低下と対応した.花弁の液胞水が消失したものと思われた.一方,T_2値はエチレン暴露下の花弁でも維持された.このことから,T_1は液胞の水に対して,T_2は細胞質の水に対してモニターが可能であることが分かった.これらの実験から,エチレン感受性の植物の場合,NMRの緩和時間を測定することによって,花弁の老化過程に関する基礎的な情報が評価できることが示された.本年度は,トマト果実内の成分が水ストレスや塩ストレスによってどのように影響を受けるかについて調べた.また,それによって両ストレス下において生じるトマト果実の生長や果実の浸透圧調整機能など,生理的反応についても調べた.供試品種として,生食用トマト品種`ハウス桃太郎'を用いた.ガラス室内の栽培ベッドに砂とバーミキュライトを混合した培地を入れ,トマト植物を栽培した.土壌水分はTDRを用いて計測し,潅水量はその値に基づき制御した.塩ストレスは,培養液濃度を調節して与えた.植物体のストレスを調べるため,葉の水ポテンシャルを調べた.収穫果実に対して,糖,有機酸,アミノ酸,及び浸透ポテンシャルの測定を行った.その結果,水ストレスと塩ストレスとを比較した結果,果実生長抑制は塩ストレスの方が大きいことが分かった.果実内成分は,全般的に塩ストレスを与えた場合の方が顕著に高い値を示した.この結果は,糖及び有機酸の場合果実内水分現象に基づく濃縮効果によるものだが,アミノ酸の場合,生成量の真の変化に起因することが明らかになった.また,この結果は浸透圧調節機能のメカニズムが水ストレスと塩ストレスで異なることを示唆している.
主観的評価を取り入れた連想記憶CNNによるE-learningシステム

ITS(Intelligent Tutoring System)において,理解度診断を適切に行うことは最も重要な課題の一つである.診断に必要な学習者データには正答率や解答時間などの測定可能なものの他,学習者自身がどれだけ自信を持って解答したかを示す主観的確信度も有用な情報であると本研究では考えている.そこで本研究では主観的確信度を理解度診断の指標に加えるとともに,主観的確信度のような曖昧な情報を分類可能な連想記憶セルラニューラルネットワークを用いたITSを構築する.理解度診断実験を行った結果,全ての学習者データを想定した理解状態に分類することができ,診断結果の妥当性についても確認できた.本研究では,e-learningシステムにおける自主学習環境下において,システムが自らの適切な判断により学習者の理解度を推定し,適切な学習メニューを提示するシステムの構築をめざすものである.その際,従来のテスト等で用いられる正答率等の客観的指標に加え,学習者の主観的な情報も理解度の推定に有用であると本研究では考えている.そこで,主観的確信度を含めた学習者の解答行動ならびに理解度推定を試みた.本実験における推定モデルには多次元のデータを低次元化して分類することができるSOMを用いた.実験では中学レベルの数学の問題を29名の被験者に課し,正答率,解答時間および確信度を各設問から採取した.またSOMは5×5の一般的な(特にパラメータの最適化などを考慮していない)ものを用いた.結果として,クラスタ数は5であり,クラスタごとの統計量を算出したところ,通常の指標(正答率・解答時間等)では同程度の理解度とされる学習者間においても主観的確信度の差によって異なるクラスタに分類することができた.このことは主観的確信度がより正確な学習者の理解度推定の尺度となりうることが示唆されたといえる.ただし,個人の性格等に左右される要素であるため,理解度推定の評価指標として用いるには詳細な検討と設計を加えなければならない.また,今後は連想記憶CNNを用いたシステムを用いる予定であるが,実用に耐えうるシステム構築のためには代表パターンの設計がきわめて重要となる.昨年度の成果を踏まえた検討を続け,設計に着手したいと考えている.本年は主として主観的指標を用いた理解度診断を行う方法について検討した.研究代表者の所属機関において数学のオンラインテストを行い,解答正誤,解答時間,主観的確信度,クリック回数を抽出した.またエントロピーを利用した定量化を経て,自己組織化マップを用いたクラスタリングを行った.その結果,5つのクラスタが形成され,客観的結果と主観的確信度がおおむね一致していたクラスタや客観的結果が高いにもかかわらず,主観的確信度が低いクラスタなどがみられ,これらを別の特徴を有する学習者と判定することでより効果的な学習者へのフィードバックができると考えられ,学習者の主観的確信度による理解度診断の有用性が示唆された.本研究は,E-learning環境下において,自律的に学習者の理解状態を推定し,フィードバックを行うシステムを構築する目的で行っている.理解状態を推定する指標にあいまいな情報を多く含む主観的確信度を考慮することで,学習者個人により適応したフィードバックを行えることが期待される.連想記憶セルラニューラルネットワーク(Cellular Neural Network:CNN)における学習者の理解度推定の精度を高めるため,マウスの移動距離を新たに導入した.これは主観的確信度のほかに学習者の解答行動を象徴する重要な指標となりうるからである.マウスの移動距離は縦方向と横方向のピクセル数をもとに算出し,他の指標(正答,解答時間,主観的確信度)と同様に正規化して学習者パターンを作成した.4種類の指標を組合せ,21種類の記憶パターンを設定し,それらを5種類の理解状態と対応させた.75の学習者パターンを用いて理解度推定実験を行ったところ,想定したいずれかの理解状態を出力した割合(診断率)は89.3%であった.次いで5つのクラスタについての統計量を求め,診断結果の妥当性を検証した.その結果,正答率が高いもののマウスの移動距離が多く,正答を導くまでに時間を要するクラスタなど,これまでの実験では得られなかった理解状態が得られた.今後は主観的・客観的指標の精査を行いつつ,診断率の向上と結果の妥当性評価について検討を行い,学会発表等で成果報告を行いたい.研究者の所属機関が平成27年度に地(知)の拠点整備事業の協力校に採択され,研究者はすでに就任していた役職に加え,当該事業における所属機関の代表を兼務することとなった.このことから学内外における調整やカリキュラムの整備等に忙殺され,当初想定していたエフォートを割り当てることができなかった.本研究では,ITS(Intelligent Tutoring System)の構築において,理解度診断機構に連想記憶セルラニューラルネットワーク(CNN)を用いてきた.先行研究において課題となっていた診断率(記憶パターンのいずれかを出力する割合)の向上のため,連想記憶CNNの設計を見直した.学習者パターン及び記憶パターンの作成では,事前知識や類型化ルールも参考にし,解答の正誤を表す正答セル(2種類),解答時間の長さを表す時間セル(3種類),マウスの移動距離の多さを表すマウルセル(3種類),学習者自身の解答に対する自信の度合いを表した確信度セル(3種類)を組み合わせることで設計を行う.今年度の研究では5種類の学習者の理解度状況(十分に理解している,おおむね理解している,ある程度理解している,理解できているか疑わしい,理解できているとはいえない)を象徴する記憶パターンを増やすとともに,パラメータの再設計も行った.

その有用性を確認するため,E-testingを用いた理解度診断実験を行った.実験では,学習者データから解答の正誤,マウスの移動距離,解答時間,主観的確信度を抽出し,合計で75種類の学習者パターンを作成した.実験の結果,診断率は100%となり,先行研究の89.3%と比較して大幅にその割合を向上させることができた.また最初に定義した5種類の理解度状況と分類された学習者データを比較検討したところ,診断結果の妥当性が確認された.これにより,本研究の有用性が示唆されたと考えている.ITS(Intelligent Tutoring System)において,理解度診断を適切に行うことは最も重要な課題の一つである.診断に必要な学習者データには正答率や解答時間などの測定可能なものの他,学習者自身がどれだけ自信を持って解答したかを示す主観的確信度も有用な情報であると本研究では考えている.そこで本研究では主観的確信度を理解度診断の指標に加えるとともに,主観的確信度のような曖昧な情報を分類可能な連想記憶セルラニューラルネットワークを用いたITSを構築する.理解度診断実験を行った結果,全ての学習者データを想定した理解状態に分類することができ,診断結果の妥当性についても確認できた.当該年度は研究代表者が所属機関の役職者となった関係で,当初計画にあったエフォートほどの時間を充てることが十分にできなかったためと考えている.研究期間の延長を承認していただいたとともに,地(知)の拠点整備事業がスタートしたことにより,担当者の変更等も行われた.このことにより,研究時間の確保の見通しがたったといえる.あらためて当初計画の最終年度に予定していた目標を達成するため,実験や学会等での報告に重点をおいて研究を遂行したいと考えている.知能情報学,教育工学本事業の最終年度にあたるため,これまでの遅れを取り戻したい.そのため,まずは研究時間の確保に努める.また学内外の研究者との議論や学会発表等の機会を通して意見をもらいながら,質的向上に努めていく.昨年度の目標は関連研究の調査とシステム設計における基礎的な検討であった.調査においては学会等に参加して最新の関連研究動向についての情報を得たほか,システム設計においては理解度推定における評価指標について検討を行い,今後の設計に必要となる成果を得ることができた.本年度の達成度が重要であると位置づけているので,引き続き検討を行っていきたい.研究者が所属機関の役職に就任したため,十分な研究時間を確保できず,当初の研究計画よりも遅れているため当初計画にあった当該事業へのエフォートを十分に確保できなかったことで,研究の進捗状況が遅れてしまったことによる.研究期間の延長を承認いただいたため,2016年度で研究を完遂し,配分額をすべて使用する予定である.本年度は連想記憶CNNによる理解度推定システムに主観的確信度を考慮した推定機構を導入するため,代表パターンの設計に着手する.ただしその前段階として,主観的確信度をどのような形で数値化して導入すれば,効果的な推定機構ができるかを検討する必要がある.
公共施設での利用を可能とする指静脈認証システムに関する研究

2018年度は、まず2017年度の残課題として、撮影に必要なカメラのスペックを算出し、波長帯やフレーム速度に関する条件を検討し、波長としては800nm900nm帯域に感度を有すること、フレーム速度としては、500fps程度の速度が適していることを明らかにした。この残課題に加えて、撮像システムの見直し、照合手法の再検討、安全性向上のための検討を行った。撮像システムの見直しについては、低フレームレートのカメラで撮影した場合,手を早く動かすと静脈画像がブレてしまい,正しく照合を行うことが困難であったが、指に照射する光源をパルス発光させることで、強い光による人体の悪影響を軽減しつつ、低フレームレートでもブレの無い画像を撮影する仕組みを開発した。この仕組みを実現する実験システムとして、ファンクションジェネレイターを利用したパルス発光型LED光源を利用し、低フレームレートのカメラでも、高速に動かした指の静脈画像をブレなく撮影できることを実験的に確認した。また、照合手法の再検討では、指領域の抽出を行う際の精度を向上させる手法として、深層学習の代表的なネットワーク構造であるU-Netを利用した指領域抽出手法を提案し、学習によって指領域の抽出を行う関数を生成した。この関数を利用した指領域抽出の実験により、簡便な実装でも高い精度で指領域抽出ができることを実験的に確認した。また安全性向上のための検討としては、暗号化センシングを取り入れることで、生体情報の漏洩を防止する仕組みについて検討した。2017年度の計画では、通常のカメラを用いて静脈動画像撮影の予備実験を行い、この予備実験結果から、本研究で使用する高速カメラの必要スペックを算出し、この必要スペックに見合う高速カメラを購入する予定であった。しかし、予備実験において、光源の波長など想定外の検討要素が発生したため、2017年度中に高速カメラの必要スペックを定めるに至らなかった。しかし、2018年度に引き続き予備実験を行い、必要スペックを定めることができたため、2018年度に高速カメラを購入することができた。このカメラを利用することで、2018年度中には2017年度実施する研究をすべて完了することができた。また、2018年度の研究内容については、撮像システムと照合手法を検討するにあたり、2019年度の実施予定の実時間照合システムの検討が必要であったため、2019年度実施予定の研究を一部前倒しして実施した。この前倒し検討により、最終的な研究目的をより高いレベルで達成することを目指す。2019年度は、まず実時間照合システムの構築を行う。具体的には、GPU(Graphics Processing Unit)やマルチコアCPUの並列処理を利用したシステムを設計し、実際に静脈認証を行う実験システムを構築する。その後、この実験システムを利用して、処理速度や照合精度を測定する。これらの結果から、提案する指静脈認証装置の実質的な性能を評価し、実用化へ向けての課題を明らかにする予定である。以上の進捗及び計画は、当初の計画通りである。

まず静脈画像を撮影するための光学系について検討を行い、撮影方法として、近赤外光を手の指に照射し、その反射光及び透過光を取得するシステムを構築した。この撮影方法について、動きのある静脈パターンを撮影するためにはどのような方式が適切であるかを検討し、光源の種類や偏光板等の光学素子の設置方法を定めた。上記で構築した撮像システムを用いて、静脈撮影を行った。静脈撮影には、高フレームレートの高感度カメラを用いた場合と通常のフレームレート(30fps)のカメラの両方で撮影を行った。高フレームレートの撮影については、手を動かすスピードや動かす向きなどを様々に変化させて撮影を行った結果、500fpsであれば、十分な品質の静脈画像を取得できることを確認した。また、波長については、760nm、850nm、910nmの3種類の波長帯域のLEDを試したところ、850nmのLEDがもっとも明確な静脈画像を取得できることを確認した。2017年度の計画では、通常のカメラを用いて静脈動画像撮影の予備実験を行い、この予備実験結果から、本研究で使用する高速カメラの必要スペックを算出し、この必要スペックに見合う高速カメラを購入する予定であった。しかし、予備実験において、光源の波長など想定外の検討要素が発生したため、2017年度中に高速カメラの必要スペックを定めるに至らなかった。しかし、2018年度に引き続き予備実験を行い、必要スペックを定めることができたため、2018年度に高速カメラを購入することができた。このカメラを利用することで、2018年度中には2017年度実施する研究をすべて完了することができた。2019年度は、まず実時間照合システムの構築を行う。具体的には、GPU(Graphics Processing Unit)やマルチコアCPUの並列処理を利用したシステムを設計し、実際に静脈認証を行う実験システムを構築する。その後、この実験システムを利用して、処理速度や照合精度を測定する。これらの結果から、提案する指静脈認証装置の実質的な性能を評価し、実用化へ向けての課題を明らかにする予定である。以上の進捗及び計画は、当初の計画通りである。2018年度は、2017年度の残課題に加えて、撮像システムの見直し、照合手法の再検討、安全性向上のための検討を行った。撮像システムの見直しでは、高速カメラではない一般のカメラでもブレの少ない静脈画像が得られる撮像システムを提案し、実験によってその有効性を確認している。また、照合手法の再検討では、指領域の抽出を行う際の精度を向上させる手法として、深層学習の適用を検討した。安全性向上のための検討としては、暗号化センシングを取り入れることで、生体情報の漏洩を防止する仕組みについて検討した。
「外国人留学生の帰国後の実態と将来的役割についての研究」

本研究は留学生にかかわる問題のなかで、長期的な波及効果としての留学生の帰国後に焦点をあてて行われた。その背景として、「留学生10万人政策」に由来する近年の留学生数の著しい増加がある。もちろん、現在わが国に滞在する留学生についての各種支援が必要とされていることは言うまでもない。しかし、こうした現状の延長上にある今後の問題点を考慮すると、帰国後の留学生の生活について研究を行っておくことが必要な時期となっている。その場合、帰国してからの国内的、国際的役割を継続的に把握していくことが必要である。留学生の帰国後に描くことのできる明るい展望がなければ、国内における留学生指導も実効性をもつことがなく、留学生も日本への期待をもつことができなくなり、将来的にわが国への留学そのものを希望しなくなるであろう。今後の健全な留学生政策のためにも帰国後の留学生についての研究が必要とされてきている。本研究では国立大学の留学生センターの留学生指導担当教官が中心となり、留学生の帰国後の社会的活動の動向の量的、質的に把握するための調査を行った。わが国への留学の意義を現地の視点でとらえなおし、さらに今後のわが国との関係をいかに維持していくかについて現時点で研究した。対象国はタイ、マレーシア、インドネシア、韓国であったが、初年度のみ台湾を加えた。研究の実施過程は1)現地での調査研究、2)国内での修了留学生の名簿作成のためのデータベース構築、3)研究ワークショップの開催とに分けることができる。初年度は主として現地での調査研究に焦点を絞った。研究分担者6名が共同研究者のいる対象国における実状を把握するために、アジア地域を中心に担当国を複数ずつ訪問し予備的調査を行った。現地では研究協力者との個別会議を開催し、必要に応じて帰国留学生との面接を行い、現状把握を行った。こうした一連のプロセスにより日本側研究者の現地事情に関する認識を極めて高いものとなった。また、現在では過去に多くの留学生が卒業あるいは修了しているにもかかわらず、なお多くの卒業生の現状が大学で把握できていないことが判明してきた。そのために第2年度には、国内での作業として卒業・修了留学生のデータベース構築のための研究会を開催した。個々の大学の事情に応じて若干の差はあるものの、共通のデータ形式を統一し、入力作業を開始した。すでにいくつかの国では帰国留学生会が設立されているが、そのメンバーは帰国したのちに自らの日本留学を是認し評価している人々が中心となって形成されている。こうした組織に日本留学に批判的な人々が加わっている可能性は小さい。したがって、本来的な母集団としての日本の卒業・修了留学生から出発して追跡することが評価のためのもっとも公平な方法である。現在のところ、データベースの構築は留学生センターの設置されている国立大学の一部から開始されているに過ぎないが、今後はその範囲を拡大していくことにより、留学生が大学から離れた後の動向を把握することが可能となる。今回の3年間の研究では主として帰国後の留学生を対象としたが、われわれのこうしたデータベースを利用することによって、母国に帰国しない人々についても追跡していくことができるという大きな意義が生まれることになる。さらに、第3年度である平成7年9月には、タイのマヒドン大学においてタイ、マレーシア、韓国からかつての日本留学生で現在は本国で活躍している人々を招待し、日本側研究者と合同でのセミナーを開催した。ここでは過去の留学生が日本でどのような経験をしたか、現在何をしているか、現在の日本との関係、さらに現地から日本をどのように見ているかなどについて一日半にわたって討議を続けることができた。3年間の研究期間に参加した留学生センターの日本側研究者ならびに現地の分担研究者にとっては相互理解の基盤を確立し、その上で帰国留学生に関する研究を行うことができたという点で充実した期間であった。また、タイ、マレーシア、インドネシア、韓国で研究協力者として多くの帰国留学生が参加することができた点も高く評価したい。本研究は単に限定された学術的研究にとどまらず、留学生を媒介とした共同研究の萌芽を各研究者レベルで作り出してきた。今後、この留学生問題に関する分野での多くの研究者によるさらなる研究に期待したい。

研究の実施過程は1)現地での調査研究、2)国内での修了留学生の名簿作成のためのデータベース構築、3)研究ワークショップの開催とに分けることができる。初年度は主として現地での調査研究に焦点を絞った。研究分担者6名が共同研究者のいる対象国における実状を把握するために、アジア地域を中心に担当国を複数ずつ訪問し予備的調査を行った。現地では研究協力者との個別会議を開催し、必要に応じて帰国留学生との面接を行い、現状把握を行った。こうした一連のプロセスにより日本側研究者の現地事情に関する認識を極めて高いものとなった。また、現在では過去に多くの留学生が卒業あるいは修了しているにもかかわらず、なお多くの卒業生の現状が大学で把握できていないことが判明してきた。そのために第2年度には、国内での作業として卒業・修了留学生のデータベース構築のための研究会を開催した。個々の大学の事情に応じて若干の差はあるものの、共通のデータ形式を統一し、入力作業を開始した。すでにいくつかの国では帰国留学生会が設立されているが、そのメンバーは帰国したのちに自らの日本留学を是認し評価している人々が中心となって形成されている。こうした組織に日本留学に批判的な人々が加わっている可能性は小さい。したがって、本来的な母集団としての日本の卒業・修了留学生から出発して追跡することが評価のためのもっとも公平な方法である。現在のところ、データベースの構築は留学生センターの設置されている国立大学の一部から開始されているに過ぎないが、今後はその範囲を拡大していくことにより、留学生が大学から離れた後の動向を把握することが可能となる。今回の3年間の研究では主として帰国後の留学生を対象としたが、われわれのこうしたデータベースを利用することによって、母国に帰国しない人々についても追跡していくことができるという大きな意義が生まれることになる。さらに、第3年度である平成7年9月には、タイのマヒドン大学においてタイ、マレーシア、韓国からかつての日本留学生で現在は本国で活躍している人々を招待し、日本側研究者と合同でのセミナーを開催した。ここでは過去の留学生が日本でどのような経験をしたか、現在何をしているか、現在の日本との関係、さらに現地から日本をどのように見ているかなどについて一日半にわたって討議を続けることができた。3年間の研究期間に参加した留学生センターの日本側研究者ならびに現地の分担研究者にとっては相互理解の基盤を確立し、その上で帰国留学生に関する研究を行うことができたという点で充実した期間であった。また、タイ、マレーシア、インドネシア、韓国で研究協力者として多くの帰国留学生が参加することができた点も高く評価したい。本研究は単に限定された学術的研究にとどまらず、留学生を媒介とした共同研究の萌芽を各研究者レベルで作り出してきた。今後、この留学生問題に関する分野での多くの研究者によるさらなる研究に期待したい。
陸上植物における螺旋形精子形成機構の研究

陸上植物における螺旋形精子形成機構を解析するためにシダ植物カニクサの精子形成変異株を用いて鞭毛装置を単離し、次いで、鞭毛装置特異的タンパク質を同定するために、単離した鞭毛装置に対するモノクローナル抗体を作製し、鞭毛装置特異的タンパク質の同定とその造精器、精子細胞内での分布を間接蛍光抗体法、免疫電子顕微鏡法などにより解析した。単離鞭毛装置は多数の鞭毛軸糸や基底小体、スプラインの主成分であるチューブリンを主として多数のタンパク質から構成されているが、その中からチューブリン以外のタンパク質である分子量42、41,43KDの鞭毛装置特異的タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製し精子における分布を調べた。これらのタンパク質はいずれも精子の螺旋に沿って分布しそれ以外の場所には認められなかった。免疫電子顕微鏡法でさらに詳細に調べると42KDのタンパク質は多層構造体の最上層であるS1層の上に分布する電子密度の高い領域オスミオフィリッククレストに、41、43KDのタンパク質はスプライン上で基底小体の周囲を覆っているエンベッディングマテアリアルに分布した。さらに精子形成過程についてこれらのタンパク質の挙動を間接蛍光抗体法で解析したところ、42KDのタンパク質は精細胞が形成されると細胞質全体に出現したが、やがてスプラインが伸長し螺旋形成が始まる頃に、鞭毛装置先端部にあるオスミオフィリッククレストが形成される場所に出現した。そして、螺旋形の形成と共に螺旋に沿って分布するようになった。これに対して、41、43KDのタンパク質は、精子完成直前に、鞭毛装置に付属する電子密度の高い物質が凝縮した後に出現し、それ以前には認められなかった。このように3種の鞭毛装置特異的なタンパク質の挙動はそれぞれ異なっており、鞭毛装置が形成される過程が非常に複雑であることを反映しているように考えられる。陸上植物系列の精子はスプライン多層構造体の存在と螺旋形態を特徴としている。このような鞭毛装置について分子レベルでの解析の道を開くために、シダ植物カニクサ精子形成変異株an-1株を用いて鞭毛装置単離の条件を検討した。なお、この変異株は多量の精子を作り続けるために、これまで、陸上植物精子の研究をする上でネックになっていた、精子を多量に集めることができないという問題点を解決できた。精子を回収後、界面活性剤TritonX-100やDnase処理することで、鞭毛、膜系、細胞核などを除去し、ついでパーコール連続密度勾配遠心によって鞭毛装置を単離精製した。単離した鞭毛装置の形態が保持されていることを確認するために、電子顕微鏡観察したところ、精子鞭毛装置の主だった構成要素である多層構造体、スプライン、基底小体、オスミオフィッククレスト、電子密度の高い物質などが保持されていた。単離された鞭毛装置のタンパク組成を明らかにする第一歩として、SDS-PAGEで解析したところ、チューブリン以外に約10個の主要なポリペプチドが精製鞭毛装置において濃縮されていた。このほかに単離鞭毛装置は多数のポリペプチドより構成されていることが判明した。次いで、鞭毛装置特異的タンパク質を同定するために、鞭毛装置を抗原としてモノクローナル抗体を作製した。その結果、3個の鞭毛装置特異的抗体を得ることができた。陸上植物進化系列の精子はスプライン多層構造体の存在と螺旋形態を特徴としている。このような鞭毛装置について分子レベルでの解析の道を開くために、シダ植物カニクサ精子形成変異株an-1株を用いて鞭毛装置の単離と鞭毛装置特異的なタンパク質の同定を行った。なお、この変異株は多量の精子を作り続けるために、これまで、陸上植物精子を研究する上でネックになっていた、精子を多量に集めることができないという問題点を解決できた。今年度は、単離した鞭毛装置に対するモノクローナル抗体を作製し、鞭毛装置特異的タンパク質の造精器、精子細胞内での分布を間接蛍光抗体法、免疫電子顕微鏡法などにより解析した。単離鞭毛装置は多数の鞭毛軸糸や基底小体、スプラインの主成分であるチューブリンを主として多数のタンパク質から構成されているが、その中から42、41,43KDの鞭毛装置特異的タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製し精子における分布を調べた。免疫電子顕微鏡法でさらに詳細に調べると42KDのタンパク質は多層構造体の最上層であるS1層の上に分布する電子密度の高い領域オスミオフィリッククレストに、41、43KDのタンパク質はスプラインジョウで基底小体の周囲を覆っているエンベッディングマテアリアルに分布した。さらに精子形成過程についてこれらのタンパク質の挙動を間接蛍光抗体法で解析したところ、42KDのタンパク質は精細胞が形成されると細胞質全体に出現したが、やがてスプラインが伸長し螺旋形生が始まる頃に、鞭毛装置先端部にあるオスミオフィリッククレストが形成される場所に出現した。このように3種の鞭毛装置特異的なタンパク質の挙動はそれぞれ異なっており、鞍毛装置が形成される過程が非常に複雑であることを反映しているように考えられる。

陸上植物における螺旋形精子形成機構を解析するためにシダ植物カニクサの精子形成変異株を用いて鞭毛装置を単離し、次いで、鞭毛装置特異的タンパク質を同定するために、単離した鞭毛装置に対するモノクローナル抗体を作製し、鞭毛装置特異的タンパク質の同定とその造精器、精子細胞内での分布を間接蛍光抗体法、免疫電子顕微鏡法などにより解析した。単離鞭毛装置は多数の鞭毛軸糸や基底小体、スプラインの主成分であるチューブリンを主として多数のタンパク質から構成されているが、その中からチューブリン以外のタンパク質である分子量42、41,43KDの鞭毛装置特異的タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製し精子における分布を調べた。これらのタンパク質はいずれも精子の螺旋に沿って分布しそれ以外の場所には認められなかった。免疫電子顕微鏡法でさらに詳細に調べると42KDのタンパク質は多層構造体の最上層であるS1層の上に分布する電子密度の高い領域オスミオフィリッククレストに、41、43KDのタンパク質はスプライン上で基底小体の周囲を覆っているエンベッディングマテアリアルに分布した。さらに精子形成過程についてこれらのタンパク質の挙動を間接蛍光抗体法で解析したところ、42KDのタンパク質は精細胞が形成されると細胞質全体に出現したが、やがてスプラインが伸長し螺旋形成が始まる頃に、鞭毛装置先端部にあるオスミオフィリッククレストが形成される場所に出現した。そして、螺旋形の形成と共に螺旋に沿って分布するようになった。これに対して、41、43KDのタンパク質は、精子完成直前に、鞭毛装置に付属する電子密度の高い物質が凝縮した後に出現し、それ以前には認められなかった。このように3種の鞭毛装置特異的なタンパク質の挙動はそれぞれ異なっており、鞭毛装置が形成される過程が非常に複雑であることを反映しているように考えられる。
染色体の分断による最小ゲノム酵母の創製と応用

本基盤研究は、出芽酵母の染色体を効率良く多数のミニ染色体に分断する技術(ゲノムの大規模改変技術)の開発とそれを利用した最少ゲノム酵母の創製を目的としたものである。染色体が自律複製し、娘細胞に安定に分配されるためには、複製起点、セントロメアと両端にテロメアが必要である。そこで、まず、1本の天然染色体を2つに分断したときに生成する2つの分断染色体に、これら3つの要素が含まれるようにした分断ベクターを構築し、実際に染色体の分断ができることを示した。次に、染色体の分断をくり返し行えるように、形質転換体選択のための種々のマーカーを持つ分断ベクターを構築し、それらを用いて、野生型一倍体株が持つ16本の染色体を21本に分断できることを示した。次に、分断をさらに効率よく行うために、酵母染色体全域に200コピー以上存在するデルタ配列を標的とすることで、標的配列を分断ベクターに逐一クローニングする過程を省略する方法(反復配列ターゲット型)を考案した。この方法を用いて、従来法と比べて簡便に酵母染色体が分断できることを明らかにした。次に、染色体分断技術の応用として、ひとつの菌株の染色体の望みの領域を、別の菌株の相当する領域で置換する技術(シャフリング)を開発した。この染色体のシャフリング法は、特定の染色体領域が、着目する有用形質に関与しているか否かを検定する遺伝子機能解析技術として、あるいは特定の染色体領域を単離して、別の酵母菌株に移植することによる育種技術として有用である。染色体分断技術の本研究の最終的な目標は、最小ゲノム生物を作成すること、そしてそのことを通して、ゲノムの構築原理を明らかにすることである。この観点から言えば、研究は緒についたばかりであり、未だ道遠しとの感は否めないが、本研究によって、その基盤となるゲノム操作技術は開発できたものと思っている。生命科学が向かうひとつの方向は、ヒトを究極とする複雑な生命体を理解しようとする方向である。しかしその対極として、限りなく少ない遺伝子のセットを持つ"最小ゲノム生物"特に最小ゲノム真核生物とはどのようなものであるかを明らかにすることも、現存する多様な生命体を理解するための基盤的知見を得る上で重要な課題と考えられる。申請者らは、染色体の自在な操作による酵母の新しい育種法を開発するため、染色体を任意の位置で分断する新しい染色体工学技術を開発してきた。この染色体分断技術を繰り返し行い染色体を次々と分断すれば、望みの長さの多数のミニ染色体から成る出芽酵母を作出できる。出芽酵母では、150kb以下の大きさの染色体は、細胞分裂時に高頻度で脱落することが知られている。従って、出芽酵母の染色体を多数に分断し、特定の培養条件下で培養することにより、その培養条件下での生存に不要な遺伝子を担う分断ミニ染色体を次々と除去することが可能であろう。本研究は、このアイデアの基に、申請者らが開発した染色体分断技術を応用して、世界に先駆けて「最小ゲノム真核生物」を創造し、それを通じて真核生物における生命の最小単位とはどのようなものか、そして、様々な環境条件で生物が生きていくためのゲノム構成はどのようなものであるかを明らかにしようとするものである。染色体分断技術は基本的には確立しているが、分断ベクターを繰り返し用いるための形質転換体の選択符号の問題など、いくつかの技術的問題が解決されなければ、多数の分断を行うことは困難である。そこで、平成12年度は、繰り返し使用可能な分断ベクターを構築し、その有効性を検討した。

生体内では繰返し配列間の相同組み換えによって、その間に挟まれた介在配列が容易に除去される。また、S.cerevisiaeにおいては、薬剤5FOA耐性選択によって、Ura3^+からUra3^-株を容易に選択できる。これらの知見に基づきURA3選択符号がサルモネラ菌由来のhisG配列に挟まれたhisG::URA3::hisGカセットを分断ベクターに組み込み、これを利用して繰返し使用可能な染色体分断ベクターを構築した。これを用いて第8番染色体(590kbp)のYHR087w遺伝子座で分断を行ったところ、期待通り282kbpと295kbpに分断された。この株から5FOA処理によりUra^-クローンを取得し、次に第2番染色体のHSP26遺伝子座での分断を試みた。現在、Ura^+候補株について、実際に第2番染色体が分断されていることを確認している途上である。申請者らは、染色体の自在な操作によるゲノムの大規模改変技術を開発し、酵母の育種や最小ゲノム酵母の創製、ゲノムの構築原理の解明などに応用するため、染色体を任意の位置で分断する新しい染色体工学技術を開発してきた。従来の分断ベクターは、1つのセントロメア、2対の逆向きに配置したテロメア、酵母形質転換体の選択符号からなる1断片型分断ベクターであり、分断部位が異なるごとに、標的配列をPCRで増幅し、分断ベクターにクローン化する必要があった。こうした方法は、多数の分断を効率良く行うためには不適である。そこで、1種の分断ベクターで多数の部位を分断できるように、酵母の染色体上に約200コピー散在するデルタ配列(343bp)を標的とする分断ベクターを構築した。デルタ配列内で一ケ所切断される制限酵素XhoIで切断後、形質転換を行った。13個の形質転換体について核型を分析したところ、少なくとも10箇所の異なる部位で分断されていることがわかった。これらの緒果より、デルタ配列は1種の分断ベクターで多数の部位を分断するための標的として有効であることがわかった。次に、分断をさらに効率良く行うため、分断に使用する断片をPCRにより調製できるような分断ベクターを構築した。すなわち、大腸菌ベクターであるpBluescriptSK+を基に、1つのセントロメア、テロメア、及びデルタ配列の左半分をクローンしたベクター(セントロメアカセット)、および1つのテロメア、酵母形質転換体の選択符号、デルタ配列の右半分をクローンしたベクター(選択符号カセット)の2種のベクターを構築した。これらの2種のベクターより、制限酵素切断によりセントロメアカセット、選択符号カセットを調製し、これらを混合して形質転換を行った。10個の形質転換体の核型を、パルスフィールドゲル電気泳動法により分析したところ、5個において複数の部位で分断が起こっている事がわかった。さらに、分断を効率よく行うため、分断に使用する断片をPCRで調製することを試みた。このため、セントロメアカセットの両端に位置するテロメアとデルタ配列にアニールするプライマーペアー、および選択符号カセットの両端のテロメアとデルタ配列にアニールするプライマーペアを設計してPCRを行ったが、増幅断片は得られなかった。そこで、フォワードプライマーとして、テロメアの外側の領域にアニールするプライマーを設計して、PCRを行ったところ、期待される大きさのPCR増幅産物が得られた。これらの増幅断片を用いて、どの程度効率良く分断が起こるを検討中である。
実験的歯の移動における至適矯正力の達成

本研究では、矯正力を加えた際に生じる歯の移動に関して、歯周組織の反応と歯の移動様相の組織学的観察、および、歯周組織に生じる応力の分布を解析することで至適矯正力についての検討を行い以下の結果を得た。1.初期荷重時に残存していた歯頚部の変性組織とこれに面する歯槽骨に再荷重が加わることで、この部位の修復機転は遅延し、同部を回転中心とする傾斜移動が生じた。同部の変性組織と歯槽骨は、再荷重後、経時的に縮小する傾向を示したが、再荷重4週間後にも残存していた。これらより、再荷重時には荷重の減少や歯体移動を考慮する必要性が示唆された。2.歯槽骨の吸収と血管分布の変化を墨汁注入標本と血管鋳型標本で観察した結果、変性組織に面する歯槽骨では、2週間後で活発な背部吸収が観察され、これは骨髄腔から連絡する貫通管の開口部付近に生じていた。この開口部には歯根膜の変性組織が押し込められるように分布しており、その周囲には豊富な新生血管がみられ、さらに破骨細胞が多数観察された。3.背部骨吸収の出現に際しては、歯から歯根膜に伝達された圧の分布と貫通管内の血管の分布ならびに形態とが密接に関連していることが示唆された。4.組織切片と対応した有限要素モデルによる応力解析の結果から、変性組織はある一定の大きさ以上の圧縮応力のピークの存在下で出現し、その大きさは少なくとも最小主応力値が-35kPaを越えたところにあることが示唆された。組織学的な観点からは、矯正力として再荷重を与えることが、歯の移動様相にどのような影響を与えるかを初期荷重の条件と比較した。荷重は100gとし、実験期間を初期荷重、再荷重後ともに最長4週間に設定した。この結果から、初期荷重4週間を経てもなお、圧迫側歯根膜のうち歯頚部付近のみに変性組織と歯槽骨が残存しており、再荷重に際してこの部位では移動はみられず、同部を中心にした回転移動を生じることがわかった。生体力学的な観点からは、上記のように変性組織は部位により出現や修復に差があり、歯の移動様相にも影響をおよぼすことがわかったことから、圧迫側歯根膜に生じる変性組織と応力分布との関連について検討を行った。ネコの上顎犬歯に100g4日間の矯正力を加え、セロイジンによる組織切片を得た。ここから、歯、歯根膜、歯槽骨よりなる力学モデルを作成し、有限要素法による計算シミュレーションを行った。この結果から、変性組織はある一定の大きさ以上の圧縮応力のピーク下で出現し、少なくとも35kPaより大きいことがわかった。また、変性組織の分布は部位により異なり、歯頚部付近では力の作用線上に広く分布していたのに対し、根尖部付近では歯と歯槽骨の近接した部位に生じていた。これらのことから、変性組織の出現には、力の大きさや性質の違いのみならず、歯根や歯槽骨の解剖学的な条件の違いがあることが示唆された。前年度の研究実績より、歯の傾斜移動に際して圧迫側歯根膜の歯頚部付近には変性組織と歯槽骨が残存し、この部位が再荷重の際に新たな回転中心となり歯は移動することが組織学的検討から示唆された。また、生体力学的な観点から、変性組織は少なくとも-35kPaより大きいある一定以上の圧縮応力のピーク下で出現しこと、出現にあたっては力の大きさや性質の違いのみならず、歯根や歯槽骨の解剖学的な条件の違いが重要な要件であることが示唆された。このような結果から至適矯正力を考えると、解剖学的な要件は固体差や個々の歯さらには歯周組織の様相の差があり均質ではないことから、歯の移動に際しては直接性骨吸収を基本としつつも、変性組織が出現した際の歯の移動様式を検討することが重要と考えられた。

これに基づき、本年度の研究では生じた変性組織の周囲の歯槽骨がどのように吸収していくかを検討項目とした。実験には成ネコの上顎犬歯を用い、100gの初期荷重を加え実験期間を7日間と14日間に設定した。これから墨汁注入標本ならびに血管鋳型標本を作製し、おもに、変性組織に面した歯槽骨に生じる背部骨吸収の様相について組織学的検討を行った。この結果、背部骨吸収は歯根膜の圧迫によって生じた変性組織に対応する歯槽骨骨壁内の貫通管内で生じ、この開始には貫通管の太さや貫通管内の血管の走行や分布、ならびに変性組織が押し込まれた結果として貫通管内に生じる応力分布が重要な要素を担っていることが示唆された。
遺伝性脳変性疾患の動物モデルを用いた治療に関する細胞工学的研究

1)Krabbe病の動物モデルをもちいての脳障害の病因、治療の可能性に関する研究:Krabbe病の動物モデルであるtwitcher mouseを用いて、オリゴデンドログリア細胞を培養して形態変化を検討すると培養後、日数を追うに従い細胞数の減少、形態異常などを明らかにした。またサイコシンの高速液体クロマトを用いてその定量法を確立した。サイコシンは、Krabbe病マウスの組織で著明に著積しており約正常の100倍以上である。サイコシンの蓄積が脳障害の重要な病因と考えられる。2)NimannーPick病モデルマウスを用いて細胞内コレステロ-ルの代謝:NiemannーPick病マウスは、ヒトニ-マンピック病のモデルとして明らかにされているが我々は本モデルがヒトニ-マンピック病のモデルであることを明らかにした。即ち、コレステロ-ルのエステル化の障害が、認められると共に著明な遊離コレステロ-ルの組織への蓄積が認められる。また我々は、コレステロ-ル以外に種々の糖脂質が脳、肝、腎等全身の組織に蓄積している。又、コレステロ-ルの蓄積がgolgiーlysosomal complexにあることを明らかにした。ヒトNGFRcDNAを機能的に内因性NGF/NGFRカスケ-ドを発現しない神経芽細胞腫株(HTLA280)中へトランスフェクションした。樹立されたトラントフェクタントはNGF処置に引き続いて、機能的高親和性受容体を示唆するー過性のcーfos発現を示し、NGFに応答し、DNA合成の停止を伴う形態学的分化を引き起こした。この結果、神経系細胞の特性を持つ細胞内でのNGFRcDNAの発現が適切な細胞外環境において、機能的NGF/NGFRシグナルカスケ-ドを構成することを示唆した。遺伝性脳変性疾患動物モデルとしてKrabbe病動物であるtwitcherマウスを用いて脳血液関門並びに神経細胞へのリポゾ-ムを用いてのTargetingの機序を検討すると同時にNiemann-Pich病の動物モデルであるNiemann-Pich病マウスを用いてスフィンゴミエリナ-ゼのCDNAをレトロウィルスベクタ-に組込んで治療の可能性を検討した。又同時にアリルサルファタ-ゼA・B・C欠損培養皮膚線維芽細胞を用いて遺伝子治療の試みを行ったので報告する。1)リポゾ-ムを用いての脳血液関門並びに神経細胞へのtargetingの機序=リポゾ-ムをレシチン-コレステロ-ルーサルファチド又はpーアミノフェニ-ルマンノシド或いはその他の糖鎖誘導体を添加しこれに^3Hーガラクトセレブロシドを添加し脳へのとり込みを検討した。マンノ-ス含有リポゾ-ムは著明な脳内へのとり込みを認めたことがマンノ-スがBlood Brain Barrier細胞を認識していることが示された。本リポゾ-ムを用いて現在twitcherマウスの治療を試みている。2)Niemann-Pich病の動物モデルマウスを用いてスフィンゴミエリナ-ゼのc-DANをレトロウイルスベクタ-に組込み組織内でのスフインゴミエリナ-ゼの発現を検討した。スフィンゴミエリナ-ゼベクタ-に組込んだマウスでは肝に於て、1015%の活性の上昇が認められ蓄積物質のスフィンゴミエリンの蓄積の軽減を認めた。この事から本マウスモデルではスフィンゴミエリナ-ゼの低下を遺伝子レベルで治療した事となる。3)マルチプルサルファタ-ゼ欠損細胞での酵素補充療法:アリルサルファタ-ゼA遺伝子並びにステロイドサルファタ-ゼc-DNAで培養細胞をレトロウィルスベクタ-に組込んで検討した。MSD細胞への治療は現在そのExpressionの効率を上げる為に検討中である。