hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
筋強直性ジストロフィーの病態機序に関する研究

1.DMPK遺伝子のハプロタイプ解析およびリピート数の動的変化の解析筋強直性ジストロフィーの家系構成員の高分子量DNAを2002年2月21日現在474個収集した。サザン法とPCR法を用いて、CTGリピート数の決定、リピート近傍のDNA多型マーカーの解析を行い、日本人の詳細なハプロタイプを作成した。本研究では、5種類の新規遺伝子多型が同定され、以前報告した8箇所の遺伝子多型と併せて、13箇所の多型で集団をハプロタイプ分類できた。その結果、患者集団における創始者染色体の存在、異常遺伝子の由来が従来言われてきた(CTG)5リピート由来ではなく、ある限られた(CTG)19リピート以上の集団の先祖由来であり、DMPK遺伝子下流のSIX5遺伝子第3エキソン領域の遺伝子再構成が示唆された。ホモ接合性DM患者、前変異の人のリピート周辺の塩基配列をシークエンスしたが、CTGリピート部分のとぎれや変化は見出さなかった。2.先天型DMの筋肉組織の解析2001年2月21日現在、1歳未満の先天型DM6症例の病理解剖より得られた組織32サンプルから高分子量DNAおよび蛋白を抽出し、サザン解析、DMPK蛋白のWestern解析を行い、リピートの均一性、若干の組織間の違い、筋組織の未熟性を示唆するデータを得た。DMPK蛋白の発現は低下していなかった。3.DMPK蛋白の機能解析酵母two hybrid systemを利用して、DMPKやSix5/DMAHP遺伝子と結合する蛋白を単離・同定するため、ヒト心筋および骨格筋のcDNAライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンとして筋収縮に閧係するミオシン結合蛋臼のファミリーとミオシン軽鎖蛋白、細胞骨格に関係するRac1とRhoAを検出した。さらに特異的に作用する蛋白を検索中である。1.DMPK遺伝子のハプロタイプ解析筋強直性ジストロフィーの家系構成員の高分子量DNAを2001年2月21日現在469個収集した。サザン法とPCR法を用いて、CTGリピート数の決定、リピート近傍のDNA多型マーカーの解析を行い、日本人のハプロタイプを作成中である。今のところ、5、17リピート以上と1kb挿入多型の連鎖、11-13リピートと1kb欠失多型の連鎖が99%以上に証明され、以前報告したハプロタイプAからKの11種類の内の4種類が90%以上を占める事を確認した。2.リピート数の動的変化の解析ホモ接合性DM患者、前変異の人のリピート周辺の塩基配列を検索中である。今のところCTGリピート部分のとぎれや変化は見出していない。遺伝子型と臨床型の詳しい検討を行いつつある。3.先天型DMの筋肉組織の解析2001年2月21日現在、1歳未満の先天型DM6症例の病理解剖より得られた組織32サンプルから高分子量DNAおよび蛋白を抽出し、サザン解析、DMPK蛋白のWestern解析を行い、リピートの均一性、若干の組織間の違い、筋組織の未熟性を示唆するデータを得た。4.DMPK蛋白の機能解析酵母two hybrid systemを利用して、DMPKやSix5/DMAHP遺伝子と結合する蛋白を単離・同定するため、ヒト心筋および骨格筋のcDNAライブラリーをスクリーニングしている。陽性クローンとして筋収縮に関係するミオシン結合蛋白のファミリーとミオシン軽鎖蛋白、細胞骨格に関係するRac1とRhoAを検出した。1.DMPK遺伝子のハプロタイプ解析およびリピート数の動的変化の解析筋

強直性ジストロフィーの家系構成員の高分子量DNAを2002年2月21日現在474個収集した。サザン法とPCR法を用いて、CTGリピート数の決定、リピート近傍のDNA多型マーカーの解析を行い、日本人の詳細なハプロタイプを作成した。本研究では、5種類の新規遺伝子多型が同定され、以前報告した8箇所の遺伝子多型と併せて、13箇所の多型で集団をハプロタイプ分類できた。その結果、患者集団における創始者染色体の存在、異常遺伝子の由来が従来言われてきた(CTG)5リピート由来ではなく、ある限られた(CTG)19リピート以上の集団の先祖由来であり、DMPK遺伝子下流のSIX5遺伝子第3エキソン領域の遺伝子再構成が示唆された。ホモ接合性DM患者、前変異の人のリピート周辺の塩基配列をシークエンスしたが、CTGリピート部分のとぎれや変化は見出さなかった。2.先天型DMの筋肉組織の解析2001年2月21日現在、1歳未満の先天型DM6症例の病理解剖より得られた組織32サンプルから高分子量DNAおよび蛋白を抽出し、サザン解析、DMPK蛋白のWestern解析を行い、リピートの均一性、若干の組織間の違い、筋組織の未熟性を示唆するデータを得た。DMPK蛋白の発現は低下していなかった。3.DMPK蛋白の機能解析酵母two hybrid systemを利用して、DMPKやSix5/DMAHP遺伝子と結合する蛋白を単離・同定するため、ヒト心筋および骨格筋のcDNAライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンとして筋収縮に関係するミオシン結合蛋白のファミリーとミオシン軽鎖蛋白、細胞骨格に関係するRac1とRhoAを検出した。さらに特異的に作用する蛋白を検索中である。
キャストクラスプ用Ti-Ni合金の疲労特性におよぼす熱処理の影響

キャストクラスプは、口腔内補綴物の一つである部分床義歯の維持装置であり、耐疲労特性が要求される。一方、Ti-Ni合金の変態温度は、熱処理や合金組成の影響をうけ、また合金の機械的性質とくに超弾性に大きな影響を与える。そこで我々は、Ti-Ni合金鋳造体を熱処理し、そのを講入した低温示差走査熱量計(L-DSC)にて測定し、その疲労特性を講入したクラスプ疲労試験機にて測定した。疲労試験は一本の試料の破断に200万回要する場合、約半月かかることもあり十分なデータは得られていないが、熱処理により耐疲労特性の向上の傾向が見られた。超弾性の引張試験による検討の結果、400°C30分の熱処理により試料の超弾性は飛躍的に向上した。またこの熱処理にともなって変態温度の上昇が認められた(別記上記2つの研究発表参照)。また鋳造のままの試料における繰り返し曲げ荷重と変形との関係についても有益な知見が得られた(別記最後の研究発表参照)。今後、疲労試験の継続により当初研究課題の充実を計るつもりである。一方、これまでの試料の鋳造は、リン酸塩系鋳型材によって行われてきたが合金酸化抑制を目的とした新しいカルシア系鋳型材を開発中であり、それを利用することにより鋳造体の機械的性質は向上することが考えられるので、その鋳造体試料の熱処理効果をさらに検討していきたい。
インスリン分泌システムの形成機構とその破綻

(課題1)膵β細胞発生・分化過程におけるインスリン分泌機能発現機構の解明(1)膵腺房細胞から分化転換によってインスリン分泌細胞が誘導できることを直接証明し、そのメカニズムとして、PI3キナーゼの活性化とカドヘリン依存性細胞間接着が重要であることを明らかにした。(2)Kir6.2G132Sトランスジェニックマウスがin vivo膵β細胞再生モデルとして有用であることを示し、ある種のレクチンに結合性を有する細胞が前駆細胞として機能する可能性を示唆した。(3)腸管特異的に発現する新規転写因子Mgx-1(Isx)が膵臓の発生に必須な転写因子Pdx1やインスリン遺伝子の発現を低下させ、膵β細胞への分化を抑制することを明らかにした。(課題2)成熟膵β細胞におけるインスリン分泌機能統合機構の解明(1)インスリン分泌顆粒動態の解析から、グルコース刺激によって惹起されるインスリン分泌は、第1相と第2相はともに細胞内から細胞膜にリクルートメントされたインスリン分泌顆粒が膜融合する(restless newcomerと呼ぶ)ことによって引き起こされることを発見した。(2)cAMPシグナルによって増強されるインスリン分泌の第1相と第2相ともrestless newcomerが担うことを示した。また、cAMPにより活性化されたEpac2/Rap1シグナルはPKA非依存的に細胞膜近傍に存在するインスリン分泌顆粒プールを増大させることで、インスリン分泌の第1相を増強することを解明した。(3)PKA非依存性インスリン分泌制御には、Epacを含むcAMPコンパートメントが関与するモデルを提唱した。(課題3)個体レベルにおけるインスリン分泌制御機構の解明(1)K_<ATP>チャネル欠損マウスにおいて、グルコースによるインスリン分泌は障害されているが、GLP-1やGIPなどの腸管内分泌ホルモンインクレチン存在下ではグルコース応答性インスリン分泌が惹起されることを見いだした。(2)膵β細胞で分泌に関与するNoc2の欠損マウスを解析し、Noc2がインスリン分泌抑制に作用するGi/oシグナルを抑制することでストレス下でのインスリン分泌を調節することを明らかにした。(課題4)インスリン分泌システムの破綻による病態解析(1)膵β細胞から同定された転写因子Dmbx1の欠損マウスの解析から、Dmbx1の機能抑制により糖尿病モデルマウスであるAy/aマウスの糖尿病の発症が抑制されること、インスリン分泌が明らかに低値であることを明らかにした。(2)1型糖尿病モデルKDPラットの解析から同定した2つの主要遺伝子(MHCとCblb)による糖尿病発症モデルを証明した。日本人2型糖尿病候補遺伝子の大規模関連解析により、K_<ATP>チャネルを構成するSUR1(ABCC8)遺伝子と強い関連を認めた。課題

1膵β細胞発生・分化過程におけるインスリン分泌システムの形成成体における膵内分泌前駆細胞を同定し成熟β細胞への分化メカニズムを解明する目的で、成体マウスの非内分泌細胞からin vitroでインスリン産生細胞を分化誘導する再現性の高い方法を確立した。この時、ある種のサイトカインと細胞外マトリクスが必須であることを見出した。また、前駆細胞同定に用いるトランスジェニックマウスとアデノウイルスを作製し、細胞マーキングと追跡法の予備検討を行っている。課題2成熟膵β細胞におけるインスリン分泌システムの形成インスリン開口放出において重要な役割を果たすATP, cAMP, Ca^<2+>センサー分子が膵β細胞の特定の領域で統合することを見出した。このようなセンサー分子の統合は種々の細胞内シグナルを開口放出装置へ効果的に伝達するのに役立っていると考えられる。統合されたセンサー分子は細胞膜とインスリン小胞に存在する開口分泌装置構成分子を繋ぐ重要な役割を果たすと推測されるが、その詳細は明らかではない。今後、インスリン小胞と細胞膜に局在する分子の同定から明らかにする予定である。課題3生体レベルでのインスリン分泌システムの形成平成15年度には、消化管内分泌細胞のグルコース感知の分子機構解明に用いられる消化管内分泌細胞株の樹立に用いる遺伝子改変マウスの作製に成功した。すなわちGIP遺伝子のプロモーターの制御下で発癌遺伝子を産生する遺伝子導入マウスが4家系作製された。今後、これらのマウスに生ずる消化管腫瘍からCIPを分泌する細胞株を樹立する予定である。課題4インスリン分泌システムの破綻による病態解析cAMPセンサー分子であるcAMP-GEF2を組織特異的に遺伝子破壊するためのノックインマウスの作製に成功した。今後、組織特異的Cre recomnibase発現マウスと交配し、膵β細胞、およびインスリン分泌を制御する脳におけるcAMP-GEF2機能解析を行う予定である。Ca^<2+>センサーおよびcAMPセンサー遺伝子についてヒトゲノム情報をもとにエクソン・イントロン構造を決定した。各エクソン領域を増幅するためのプライマーを設計し、糖尿病患者から得られたDNAを用いて変異および多型を検索した。その結果、複数のSNPsを同定したがアミノ酸置換を伴うものは認められなかった。現在、同定したSNPsについて対照者における頻度との比較解析を行い、糖尿病との関連を検討している。課題1)膵β細胞発生・分化過程におけるインスリン分泌機能発現機構の解明1.マウス膵島特異的cDNAライブラリーを作製し、これをもとに膵島特異的データベースの構築およびマイクロアレイの開発を行った。2.組織幹(前駆)細胞からインスリン分泌細胞への分化誘導法を確立した。課題2)成熟膵β細胞におけるインスリン分泌機能統合機構の解明
脱芳香化・再芳香化を活用した革新的有機合成法の開発と展開

初年度目の研究実績概要は以下の通りまとめることができる。銀カルベンを用いるフェノール脱芳香化反応に関しては、メカニズム解析を行った結果、添加剤として用いる安息香酸が、触媒の重合状態のコントロールに重要な働きを持つことを実験的に証明した。また、インドールの脱芳香化反応やナフタレン誘導体の脱芳香化反応にも展開している。ドラグマシジンEをはじめとした、3,4位中員環縮環インドール類の合成に関しては、ジエンへのHeck挿入により促進されるカスケード反応を用いる骨格合成法を開発するとともに、ラジカルカスケード反応を活用する新規合成法を開発した。後者の手法は、3,4位中員環縮環インドール類の酸素類縁体となる、ベンゾフラン型化合物の合成に特に効果的であることがわかった。基質一般性の検討も行い、様々な3,4位中員環縮環ベンゾフラン類の合成に展開可能であることを示した。ドラグマシジンEの合成研究に関しては。現在も不斉中心導入の検討を進めている。また、全合成に必要となる、4置換ヨードアニリン誘導体の合成検討も進めている。これらを組み合わせることで、ベンジル位メチル基、インドール7位水酸基ユニットを含む基盤骨格の合成に成功した。これらに加え、金触媒を用いるフリーデルークラフツ型反応を活用したナフトール類の位置選択的官能基化を経由するラクトン合成法の開発や、銀カルベンを用いるフェノール性水酸基への触媒的不斉挿入反応の開発、パラジウム触媒を用いるカスケード反応を利用した7員環型化合物の合成法開発にも成功している。脱芳香化関連の反応開発に関しては、銀カルベノイドを用いる反応開発を中心に、フェノール脱芳香化のメカニズム解析、インドール類を求核剤とする分子内不斉脱芳香化反応への展開に成功した。さらに、フェノール、インドール求核剤にとどまらず、単純なナフタレン誘導体などの脱芳香化にも本カルベン種が利用可能であることも見いだした。3,4位中員環縮環インドール類の合成に関しては、新たな合成手法としてパラジウム触媒を用いる手法と、ラジカルカスケード反応を用いる手法を新たに開発した。AIBNを用いるラジカル開始剤を用いる手法に加え、フォトレドックス触媒を用いる光化学反応による合成法にも展開している。ドラグマシジンEの合成研究に関しては、天然物様に官能基化した骨格合成の検討を進めつつ、不斉中心の導入に関しては酵素触媒による構築検討も開始している。そのほかにも、種々の金属カルベンや遷移金属触媒を利用した新しい合成反応開発を検討しており、4年間の研究期間の最初の年の進捗としては、概ね順調との自己評価ができると考える。2年度目は以下の検討を進める。脱芳香化反応に関しては、銀カルベンを用いる手法の検討を中心に進める。特に、インドール脱芳香化反応の基質一般性の検討と、実験、計算化学的な手法を活用したメカニズム解析を行う。また、銀触媒を用いるナフタレンの脱芳香化、ブシュナー環拡大反応の触媒的不斉反応化に関して、初年度に見いだした初期的データの展開研究を進める。3,4位中員環縮環インドール類の合成に関しては、ドラグマシジンEの合成研究を進める。特に、酵素反応や化学触媒による不斉中心の立体選択的構築を徹底的に検討し、すでに確立しつつある主骨格の合成法とを組み合わせることで、全合成研究を進展させる。新しい試みとしては、独自の脱芳香化反応系を利用した、トリスピラン型分子の合成研究を新たに開始する。

3,4位中員環縮環インドール類の合成に関しては、新たな合成手法としてパラジウム触媒を用いる手法と、ラジカルカスケード反応を用いる手法を新たに開発した。AIBNを用いるラジカル開始剤を用いる手法に加え、フォトレドックス触媒を用いる光化学反応による合成法にも展開している。ドラグマシジンEの合成研究に関しては、天然物様に官能基化した骨格合成の検討を進めつつ、不斉中心の導入に関しては酵素触媒による構築検討も開始している。そのほかにも、種々の金属カルベンや遷移金属触媒を利用した新しい合成反応開発を検討しており、4年間の研究期間の最初の年の進捗としては、概ね順調との自己評価ができると考える。2年度目は以下の検討を進める。脱芳香化反応に関しては、銀カルベンを用いる手法の検討を中心に進める。特に、インドール脱芳香化反応の基質一般性の検討と、実験、計算化学的な手法を活用したメカニズム解析を行う。また、銀触媒を用いるナフタレンの脱芳香化、ブシュナー環拡大反応の触媒的不斉反応化に関して、初年度に見いだした初期的データの展開研究を進める。3,4位中員環縮環インドール類の合成に関しては、ドラグマシジンEの合成研究を進める。特に、酵素反応や化学触媒による不斉中心の立体選択的構築を徹底的に検討し、すでに確立しつつある主骨格の合成法とを組み合わせることで、全合成研究を進展させる。新しい試みとしては、独自の脱芳香化反応系を利用した、トリスピラン型分子の合成研究を新たに開始する。
APOBEC2 によるオートファジー制御と生理的意義の解明

骨格筋におけるオートファジーの破綻は、筋疾患や筋量の減少を引き起こす。本研究では、筋特異的脱アミノ化酵素APOBEC2欠損マウスの骨格筋で観察されたオートファジーについて追求した。複数のオートファジーのマーカー分子の発現パターンおよび組織学的検討から、APOBEC2欠損マウスの骨格筋ではオートファジー(あるいはマイトファジー)が亢進していることがわかった。また、メタボローム解析の結果、APOBEC2欠損筋ではミトコンドリアの代謝産物の一部に変化がみられた。即ち、APOBEC2欠損マウス骨格筋で観察されたオートファジーは、ミトコンドリアの代謝異常に起因すると考えた。研究代表者はこれまでの研究から、脱アミノ化酵素APOBEC2を欠損すると筋疾患および骨格筋重量の減少を引き起こすことを明らかにしている。その原因がオートファジーの異常に起因すると予想し、初年度(平成25年度)の研究計画は、オートファジーの亢進(あるいは抑制)が起こっているか確認することであった。すでに、APOBEC2欠損マウスの骨格筋では、オートファジーマーカーであるLC3が活性化していることがわかっている。そこでまず、他のマーカータンパク質(p62, poly-Ub, PINK1, Parkin)および遺伝子(map1lc3b, gabarapl1, pink1, park2)の発現量を定量した結果、オートファジーが亢進している可能性が示唆された。APOBEC2欠損マウス骨格筋の電顕写真から、異常なミトコンドリアが多く観察されたことから、ミトコンドリアマーカー(pdk4, ucp3)の遺伝子発現を定量すると、顕著な増加がみられた。一方で、mtDNAコピー数に増加はみられなかったことから、APOBEC2欠損筋中のミトコンドリアで、何らかの異常が起こったと考えられる。また、ミトコンドリアのオートファジー(マイトファジー)のマーカータンパク質(PINK1, Parkin)の発現量が増加していたことから、APOBEC2欠損により発生した異常ミトコンドリアを分解するために、マイトファジーが亢進した可能性が考えられる。近年、マイトファジーの破綻が、骨格筋量の減少に繫がることが明らかになっている(Lokireddy, Cell Metabol., 2012)。即ち、APOBEC2欠損マウスでみられた骨格筋量の減少は、マイトファジーの異常が原因である可能性が考えられる。筋特異的脱アミノ化酵素APOBEC2を欠損すると、筋萎縮や筋疾患、筋線維型の変化が起こる。初年度(平成25年度)の研究計画では、APOBEC2欠損による表現型の変化がオートファジーの亢進によるものか追求した。その結果、APOBEC2欠損マウスの骨格筋でオートファジーまたはマイトファジー(ミトコンドリアのオートファジー)が亢進していることを、各種マーカー分子の測定から確認した。一方で、野生型とAPOBEC2欠損型でmtDNAコピー数に有意な差はみられなかったことから、最終年度(平成26年度)では、オートファジーのシグナル伝達経路、翻訳後修飾およびミトコンドリアの機能に着目して研究を進めることにした。まず、オートファジー制御の主要な経路であるmTORのリン酸化を定量したが、野生型とAPOBEC2欠損型で大きな変化は見られなかった。次に、APOBEC2欠損マウス骨格筋中の代謝産物を測定するためメタボローム解析を行い、約100種の代謝産物を定量した。その結果、TCA回路の一部の代謝産物のみ、野生型とAPOBEC2欠損型で有意な差が認められた。近年、ミトコンドリアの一部の代謝産物がオートファジーを制御することが報告されたことから(Mario, Mol Cell, 2014)、APOBEC2欠損筋で観察されたオートファジーの亢進は、TCA回路の代謝産物の異常に起因する可能性が考えられる。現在、APOBEC2によるミトコンドリアの代謝制御について、解析中である。農学本年度の「研究の目的」は、APOBEC2欠損マウスの骨格筋でオートファジーが亢進しているかどうか、確認することであった。当初予定していたGFP-LC3マウスは用いていないが、複数のオートファジーマーカーの定量及び組織学的検討から、オートファジーの中でもミトコンドリア選択的なマイトファジーが亢進している可能性が示唆された。電顕解析の結果、APOBEC2欠損筋ではミトコンドリアの異常が起こっていたため、それを排除するためにマイトファジーが亢進していると予想している。本年度の研究から、APOBEC2欠損マウスの骨格筋で、ミトコンドリアの異常及びそれに伴うマイトファジーの亢進が確認された。

APOBEC2の分子機能は不明であるが、ミトコンドリアの恒常性の維持に関与している可能性も考えられる。APOBEC2欠損マウスの骨格筋でみられた筋疾患や筋萎縮との関係を明らかにするため、次年度はオートファジーのみでなく、ミトコンドリアや代謝に着目して研究を進展させる必要がある。当初の研究計画では、GFP-LC3マウスを用いてオートファジーを詳細に評価する予定であった。しかし、他の様々なマーカー分子をタンパク質及び遺伝子レベルで多角的に検討したことで、オートファジーの亢進を十分に評価できたため、GFP-LC3マウスを使用する必要がなくなった。そのため、マウス購入費および維持費が不要になり、抗体やリアルタイムPCRのための消耗品のみを購入したため、次年度使用額が生じた。初年度の研究結果から、APOBEC2欠損マウス骨格筋ではオートファジーやマイトファジー(ミトコンドリアのオートファジー)の亢進が観察された。特に、肥大化したミトコンドリアが多く見られたことなどから、代謝の異常が起こっている可能性が考えられる。近年、様々な細胞内代謝物がオートファジーを制御することが明らかになってきた。そこで、メタボローム解析(受託解析)により、代謝物の網羅的解析を行い、APOBEC2欠損によるオートファジー亢進の原因を探る。
重力場レンズ現象に現れる特異点の研究

平成17年度における研究は15年度16年度の成果を踏まえて、重力場レンズ現象の焦線の研究を推進すると同時に、今後の研究目標とも言うべき、事象の地平線の特異点(ブラックホールの形状と関係する)の研究をすすめる為の、基礎的事実の整理を行った。そのために、は重力がない場合に対応する、ローレンツ・ミンコフスキー空間内の光的超曲面の特異点の研究を推進した。特に、一次元下がった場合の3次元ローレンツ・ミンコフスキー空間内の光的超曲面(光的可展面)が光的超平面、光錐、光的超曲面内の曲線の接線曲面、光的曲線の接線曲面かその張り合わせからなることを示し、そのうちでもっとも興味深い曲面である光的曲線の接線曲面の特異点の分類を実行した。その結果、生成的な光的曲線の接線曲面の特異点は局所的にカスプ曲面、ツバメの尾またはシェルバク曲面に微分同相となることがわかった。3次元ユークリッド空間内の接線曲面の特異点は生成的な曲線にたいしてカスプ曲面か折り畳み傘に局所微分同相であることが知られており、全く違う状況にあることが判明した。ちなみに、シェルバク曲面はロシアのシェルバクにより、H3型の複素鏡映群に対応する事が示されている。また、ローレンツ・ミンコフスキー空間内の3次元ド・シッター空間内の光的曲面の特異点についての研究も推進した。このド・シッター空間はアインシュタイン方程式の真空解の一つとして知られ、宇宙論における重要な概念である。この空間内の光的曲面の特異点を研究する事は、平坦でない重力めある場合の空間内の事象の地平線の形状を研究する上での第一歩となる。その結果、生成的な空間的曲線に沿った光的曲面の特異点は局所的にカスプ曲面またはツバメの尾に微分同相となることがわかった。重力場レンズ現象を記述する物理的意味や方程式はある程度整備されているが、正しい幾何学的枠組みはいまだに不確定であった。実際、従来の研究結果として、単レンズ(途中のレンズ天体が一個の場合)の場合には重力場レンズ現象の物理的モデルはアーノルドのラグランジュ特異点論の枠組みで記述されることが知られていたが、この枠組みでは、多重レンズ(途中のレンズ天体が複数個ある場合で、一般的状況では多くの場合はこうなっていると考えられる)の場合は記述できないことがわかった。そこで、当研究ではラグランジュ特異点論を含むシンプレクテイック関係の理論で記述すれば多重レンズ現象も含んだ形で枠組みが構成できるのではないかと考え、初年度としてはその理論的枠組みを構成することを主たる目的とした。その結果、シンプレクテイック関係の合成という概念を構成し、単純に複数個の天体が並んでいる場合には、この枠組みが多重重力場レンズ現象を記述するものであることがわかった。さらに、重力場レンズ現象において重要な概念として、焦線(倍率が無限大となり、そこを境として星の像の個数がかわる曲線)があるが、この枠組みにおいて、焦線の分類を行い、従来の枠組みでは得られない新しい形状の曲線が現れることを明らかにした。一方、これらの枠組みはロバートソン・ウオーカー時空などでは正しい近似理論であるが一般の場合にはより厳密な枠組みが必要とされる。当研究では、現在「厳密普遍重力場レンズ方程式」と呼ばれるFritteli, Newmanの枠組みのシンプレクテイック幾何学化を推進中であり、それは、次年度の重要な目標の一つである。重力場レンズを記述する、厳密重力場レンズ方程式のシンプレクテイック幾何学的またはローレンツ幾何学的枠組みを構成し、その枠組みの元で記述される焦線の特異点を分類する準備を行った。また、ブラックホールなどに現れる事象の地平線の形状を記述するためにミンコフスキー空間内の光錐的超曲面の特異点理論を構成した。さらに重要な場合のド・シッター空間内の光錐的超曲面の特異点を記述するための準備を行った。また、反ド・シッター空間内でも同様な考察を行うことの重要性を発見した。これらの結果を得るために、6月に中国で開催した日中特異点論研究集会において研究打ち合わせを実施した。また、日本国内においても研究打ち合わせを実施した。この他に関連する話題として、ミンコフスキー空間内の光錐内の空間的超曲面に対してルジャンドル特異点論を応用することにより、新たな不変量を構成した。この不変量は幾何学的に非常に奇妙な性質をもっており、ガウス曲率に対応した概念は外在的(法線に依存)であるが平均曲率に対応する概念は内在的であると言う通常の曲率とはまったく違う性質をもつことを発見した。さらに、空間的超曲面に対して平行超曲面の概念が定義できるが、それは通常のような性質とまったく違う性質を持つことを発見した。さらにこの平行超曲面は光錐以外の擬球面内の空間的超曲面の平行曲面を統一的に取り扱えることがわかった。ここにおける構成法は重力場レンズ方程式の特異点を研究するための基本的道具立てとなることが予想される。

特に、一次元下がった場合の3次元ローレンツ・ミンコフスキー空間内の光的超曲面(光的可展面)が光的超平面、光錐、光的超曲面内の曲線の接線曲面、光的曲線の接線曲面かその張り合わせからなることを示し、そのうちでもっとも興味深い曲面である光的曲線の接線曲面の特異点の分類を実行した。その結果、生成的な光的曲線の接線曲面の特異点は局所的にカスプ曲面、ツバメの尾またはシェルバク曲面に微分同相となることがわかった。3次元ユークリッド空間内の接線曲面の特異点は生成的な曲線にたいしてカスプ曲面か折り畳み傘に局所微分同相であることが知られており、全く違う状況にあることが判明した。ちなみに、シェルバク曲面はロシアのシェルバクにより、H3型の複素鏡映群に対応する事が示されている。また、ローレンツ・ミンコフスキー空間内の3次元ド・シッター空間内の光的曲面の特異点についての研究も推進した。このド・シッター空間はアインシュタイン方程式の真空解の一つとして知られ、宇宙論における重要な概念である。この空間内の光的曲面の特異点を研究する事は、平坦でない重力めある場合の空間内の事象の地平線の形状を研究する上での第一歩となる。その結果、生成的な空間的曲線に沿った光的曲面の特異点は局所的にカスプ曲面またはツバメの尾に微分同相となることがわかった。
小胞体膜蛋白質の小胞体への残留機構

P-450のER残留シグナル:分泌型カルボキシエステラーゼをレポーター蛋白質として用いP-450部分との色々な融合蛋白をCOS細胞内で発現させそれらのN-糖付加の挙動と間接蛍光抗体法による局在化挙動を解析した。その結果P-450の膜結合領域(TM)にER残留シグナルがあることを明らかにした。さらにこの残留は、一旦ERを出てゴルジ装置に到達した後に回帰するのではなく、恒常的にERに留まるという今まで報告のない新たな様式によっていることも明らかとなった。またTM部分の近傍にはP-450の構造形成に重要な領域が存在することも明らかにした。膜蛋白質のER膜残留機構:ダブルリジンモチーフを介してER膜残留の機構を酵母を用いて解析した。酵母ER膜蛋白質WBP1のTM部分を含むC末端領域をインベルターゼのC末端に繋ぎ酵母で発現するとインベルターゼは細胞内に留まった。酵母に変異を惹起しインベルターゼを細胞表層に発現する温度感受性変異株を6株分離することに成功した。このうちの1株はER-ゴルジ装置間の輸送が温度依存的に障害をうけることから、ER残留に関わる遺伝子の変異であることが明らかとなった。P-450のER残留シグナルに関しては生化学的にP-450の残留シグナルを特定しかつ間接蛍光法によってこれを確認するという当初の研究目的は完全に達成された。これによって蛋白質の膜結合領域がER残留シグナルとして働いているという新規な知見を得た。酵母を用いてのER膜残留機構の遺伝学的解析に関しては分離した温度感受性変異株に残留機構に障害を持つ株が存在したことから計画のかなりが達成され、分子機構解析に向けての重要な成果を得ることが出来た。真核細胞の分泌経路への入り口にあたるオルガネラとして小胞体(ER)は蛋白質の膜透過のみならず膜蛋白質のトポロジー形成と仕分けにも重要な機能を果たしている。ER膜を構成する膜蛋白質がどのようにして他のオルガネラへの輸送を免れてERに留まるのかという問題を生化学、細胞生物学および分子生物学的手法によって明らかにすることが本研究の目的であり、本年度は以下の事柄を明らかにした。(1)P-450のER残留シグナルと残留様式の解析我々は分泌型カルボキシエステラーゼ(Esec)をレポーターとして用いP-450との融合蛋白質のCOS細胞内での挙動を解析することによってP-450の膜結合領域(SA)にER残留シグナルがあることを証明した。またカテプシンDをレポーターとしてP-450は恒常的にERに留まっていることを示した。さらに、用いたすべてのコンストラクトについてそれらの細胞内局在を蛍光抗体法によって解析し、生化学手法で得られた結果を形態観察によって裏ずけることができた(投稿済み)。(2)膜蛋白質のER残留にかかわる遺伝子の解析ERに局在する膜蛋白質のいくつかはC末端の配列KKXX又はKXKXX(ダブルリジンモチーフ)がER残留のシグナルとして働いていることが知られている。我々は酵母を用いてこのモチーフを持つ膜蛋白質のER残留に関わる遺伝子を検索するために、インベルターゼのC末端に膜貫通領域とダブルリジンモチーフを持つ融合膜蛋白質を作成した。細胞表面に輸送されたインベルターゼのみを検出できる発色法を用いて、変異剤処理後ER膜結合型インベルターゼをERに保持できずに細胞膜にまで輸送する酵母の変異株を選択した。現在、ts性を示す5株について表現型の解析、テトラッド解析および遺伝子のクローニングを行なっている。

ER膜を構成する膜蛋白質がどのようにして膜に挿入され、また他のオルガネラへの輸送を免れてERに留まるのかという問題を生化学、細胞生物学および分子生物学的手法を用いて明らかにすることが本研究であり、本年度は次の事柄を明らかにした。(1)P-450のER膜上での構造形成と残留機構P-450のN-末端に存在するER膜結合領域はER残留シグナルとして機能する。この膜結合領域周辺に様々な変異を導入したP-450をCOS細胞内で発現させ酵素活性と細胞内局在を解析した。その結果、膜結合領域の近傍のプロリンに富む保存された領域(プロリンボックス)が構造形成に重要であることを見いだした。さらに構造形成不全のP-450を含むERは凝集した構造体を形成することを見いだした。(投稿中)(2)膜蛋白質のER残留に関わる遺伝子の解析C末端の配列KKXX又はKXKXX(ダブルリジンモチーフ)がいくつかの膜蛋白質のER残留シグナルとして機能している。この残留に関わる酵母の遺伝子を解析するため、酵母ER膜蛋白質WBP1のER残留シグナルを含む領域をレポーター蛋白質である酵母インベルターゼに繋いだキメラ蛋白質を酵母内で発現させた。細胞膜の表面に輸送するようになった6種類のts性酵母変異株を分離することに成功した。このうちの1つは蛋白質のER-ゴルジ間輸送に明らかな障害が観察された。
二酸化炭素の海水への溶存状態精密解析とオンサイト計測システム構築

本研究は,大気中の二酸化炭素及び海水中に存在する全二酸化炭素(総炭酸)に関するオンサイト精密測定装置を開発し,(大気-海洋)間の二酸化炭素の交換速度,交換量の正確な計測を測定現場で迅速・正確に行なうことが目的である。それに必要な携帯型の精密測定装置の開発及び測定法を新たに開発した。これら装置及び方法を用いて,二酸化炭素フリーの超純水,アルカリ溶液の調製,海水中の総炭酸及びそれと接する大気中の二酸化炭素の精密測定等が可能になった。更に,平衡論的解析法を用いて海水中の二酸化炭素の溶存状態を明確にし,(大気-海洋)間の分配平衡・分配平衡速度を求めることが可能となった。主な成果は次の通りである。1.FIA方式ガス拡散/吸光検出法に基づく大気中及び海水中の総炭酸定量用可搬型精密測定装置の開発:測定現場に持ち運び,その場計測が可能な可搬型フローインジェクション方式総炭酸測定装置を開発した。この装置は,新開発の小型高効率ガス拡散ユニットを内臓し,重さ約8kg,12Vバッテリー駆動方式である。海水等の水溶液試料は直接注入し,短時間(約3分)で測定できる。大気試料は,2mlの吸収液を入れたプラスチック製シリンジに採取し,吸収液を装置に注入し,測定する。接触している海洋,大気の濃度測定が同時に可能で,平衡・非平衡等のオンサイト情報を初めて求めることに成功した。2.高感度検出試薬の合成:二酸化炭素の高感度測定を可能とする検出試薬を合成した。アゾ系酸塩基指示薬誘導体を合成し,発光ダイオード(LED)の450nmでの高感度測定に使用できる試薬を発見した。本発色系を備えたLED/FIAでは,安定性,信頼性,省電力等オンサイト計測における大きなメリットが生れた。3.海水中の二酸化炭素の平衡反応解析,溶存種解明,全溶存種の濃度解析システム構築:海水中の平衡定数と総炭酸濃度を用いて,化学種濃度の予測を可能とした。これにより,(大気-海洋)間の二酸化炭素の分配平衡及び分配速度の解析に初めて成功した。二酸化炭素のオンサイト精密測定装置の試作,高感度検出試薬の合成そして(大気-海洋)間の二酸化炭素の分配平衡・溶解速度の精密解析に成功した.1.二酸化炭素のポータブル型精密測定装置の試作(1)高効率ガス拡散装置の開発に成功し,装置の長期間,安定な稼働のための流路切り替えバルブ付き恒温システムを開発した.本システムはガス化しやすい化学物質の分離システムとしても極めて有用であることを実証した.ガス拡散装置のミニチュア化(長さ5cm,径2cm)にも成功した.(2)FIA方式ポータブル測定装置の開発に成功した.開発したミニチュア型拡散透過装置を組み込んだ測定装置を構築した.これは,バッテリー駆動,オンサイトFIA測定,携帯型を基本に設計・製作した.プランジャーポンプ,試料サンプリング,検出器・光源等の改良・開発により,重さ7.5Kg,縦・横・奥行き(16cmx16cmx32cm),12Vバッテリー駆動,省電力光源(LED使用),PCカードメモリー・ノート型パソコンとの接続可能な携帯型オンサイト測定装置の開発に成功した.2.二酸化炭素の高感度検出試薬の合成・開発(1)高感度測定用吸光検出試薬の合成・開発に成功した.

LED光源に対応でき,二酸化炭素検出の条件(酸解離,溶解度,化学的安定性など)を満足する試薬を設計し,25種のニトロフェニルアゾフェノール誘導体を新規に合成した.最適の試薬は,4-(2,4-ジニトロフェニルアゾ)-1-ナフトール-5-スルホン酸であることを見いだし,二酸化炭素の高感度定量法開発に成功した.(2)蛍光検出試薬の合成・開発を行い,二酸化炭素測定に利用できる蛍光検出試薬及び反応の開発に成功した.3. (大気-海水)間の二酸化炭素の溶解速度,溶解平衡の精密解析(1)精密測定装置を用いて,大気からの二酸化炭素の水への溶解速度,溶解平衡の解析に成功した.(2)高濃度塩溶液中の炭酸の酸解離反応の精密解析をキャピラリー電気泳動法(CE)により行い,信頼できる平衡定数の決定に成功した.大気中のCO_2および海水中に存在する全CO_2のオンサイト精密測定装置を開発し,(大気-海洋)間のCO_2の交換速度・量の正確な計測を現場で迅速に行うことを目的とした研究を進め,CO_2の小型オンサイト精密測定装置の試作に成功した.更に,二酸化炭素の高感度検出のために新規検出試薬を合成し,新しい検出反応の確立に成功した.これらの装置,試薬を用いて水溶液への二酸化炭素の溶解平衡の詳細な検討が可能となった.1.二酸化炭素のオンサイト計測装置の小型化とポータブル化の実現高効率ガス透過装置の開発を目的とし,透過率の効率化・長時間の安定化を達成するガス透過装置を設計・製作し,目的の性能を有することを確認した.小型ポータブル型FIA装置に組み込み可能なミニチュア化(長さ3cm,径2cm)にも成功した.後者を用いて,FIA方式小型ポータブル二酸化炭素測定装置の開発に成功した.この装置は,縦・横各16cm,奥行き32cmのワンボックス,重さ7.5kg,12Vバッテリー駆動方式,ノート型パーソナルコンピュータにデータ保存・処理可能な装置であり,世界で初めての本格的ボータブルCO_2測定装置である.2.二酸化炭素の高感度検出試薬の合成・開発と反応系の開発高感度吸光検出試薬の合成・開発として,ポータブル装置のLED光源(450nm,530nm,650nm)に対応できる試薬の合成・開発に成功した.酸解離定数が89付近にあるニトロフェニルアゾナフトールスルホン酸類を中心に15種の誘導体を合成した、合成した検出試薬を用いる高感度検出反応系を構築し,水中の10^<-6>MのCO_2精密測定に初めて成功した.3.水中の二酸化炭素の溶存状態精密解析海水中の炭酸イオンの錯形成平衡の精密解析をキャピラリー電気泳動法(CE)により解析することに成功した.更に,Na^+,Mg^<2+>,Ca^<2+>等と炭酸イオン(HCO_3^-,CO_3^<2->)の錯平衡解析にも成功した.これらを基に海水中の二酸化炭素の溶存種解析が可能となり,(大気-海洋)間のCO_2の平衡を解析することを可能とした.大気中に存在する二酸化炭素(CO_2)および海水中に存在する全二酸化炭素(TCO_2)の精密測定装置・方法を開発し,(大気-海洋)間のCO_2の交換速度・量の正確な計測を行うことを目的として研究を進めた.更に,CO_2,TCO_2測定を現場で行うための小型オンサイト精密測定装置を開発した.これらの装置・方法に適用できる新規検出試薬の合成に成功したことにより,CO_2,TCO_2の高感度・精密定量のための新しい定量法の確立に成功した.
発達初期における情動の学習・記憶への作用の脳内メカニズムの解明

乳児は生後3ヶ月ごろから、外界のイベント間の関係性を学習し、それに伴い予期的な反応を示すようになることが行動研究により報告されている。しかし、そのような学習やイベントの予期に関わる乳児期初期の神経メカニズムは明らかではなかった。これまで我々の研究チームは、乳児期初期の連合皮質領域が睡眠中にも関わらず聴覚刺激の弁別や新奇性の検出に関与していることを発見してきた。そこでこれらの知見に基づき、キュー(ビープ音)が聴覚イベント(女性の音声)の到来を予告する場合、睡眠中の乳児の連合野を含む特定の領域においてイベントの提示前に予期的な賦活がみられるのではないかと仮説をたて、その検証を行った。生後3ヶ月の乳児28名に2種類の短いビープ音(400Hz・700Hz、1.75秒)をランダムに提示し、一方のビープ音(CE)の後、3.25秒間の遅延期間をおいで絵本を朗読している女性の音声(4.5秒)を提示したが、もう一方のビープ音(CNE)の後は何も提示しなかった。25秒からなる試行を計16回繰り返し行い、遅延期間における脳活動を比較した。また、対照群として同月齢の乳児28名には1種類のビープ音に続いて音声イベントの有無をランダムに生じさせることでイベントの到来を予測できない状況を設定し、そのときの脳活動も調べた。その結果、生後3ヶ月の乳児の睡眠時にイベントを予告するキューに対してのみ前頭と側頭頭頂領域で脳活動がみられたことから、時間的に離れたイベント間の関係性を潜在的に学習し、予測可能なイベントに対して事前に脳活動を高めていることが示唆される。更に、前頭と側頭頭頂領域間で異なる時間展開の賦活パターンを示していたことから、これらの領域が学習やイベントの予測などにおいて異なる関与の仕方をしていることが示唆される。睡眠時に聴覚イベントの時間的連合を潜在的に学習していたという今回得られた知見により、乳児期初期の睡眠時における脳の機能的活動か成人のそれとは異なる可能性も示唆される。上記の結果を第31回日本神経科学学会にてポスター形式で発表を行い、また論文としてまとめて投稿し、PloS One誌に掲載された。また、前年度まで行っていた乳児の馴化・脱馴化に関わる脳活動を計測・解析した結果を論文としてまとめて投稿した結果、Cerebral Cortex誌に掲載された。生後数ケ月の乳児の大脳皮質の高次な領域(連合野)が、音声イベントの予期における内発的な注意活動に関与しているのかを明らかにすることを目的に研究を行った。具体的な活動は、大学内の実験室にて生後3ケ月の乳児80名を対象に実験を実施した。乳児の睡眠中にスピーカーから手がかり刺激のあと数秒の遅延期間を置いて音声イベントを提示するという課題を提示し、そのときの乳児の大脳皮質の活動を94チャンネルという多数の部位の同時計測が可能な光トポグラフィー(NIRS)という脳活動の測定機器を用いて計測を行った。そこで得られたデータを解析したところ、両半球の側頭葉の連合野や前頭葉連合野などの高次な皮質領域において、イベントの予期に関わる特異的な脳活動の賦活が認められた。この結果により、生後3ケ月の段階において既に内発的注意活動に脳の高次な領域が関与していることが示された。これまで生後1年経過しないと前頭葉といった高次な大脳皮質領域は機能的な活動を示さないというのが一般的な考え方であったが、一方で早期から高次な領域を含むさまざまな領域が相互作用することで脳機能が発達するという新しい脳機能の発達モデルが近年提唱されている。乳児の脳活動を計測することの難しさからそのモデルを裏付ける研究が限られていたが、本研究により前頭葉を含む高次な脳領域の機能的活動が明らかになったことは、後者の新しい脳機能の発達モデルを実証する重要な発見である。

更に、前頭と側頭頭頂領域間で異なる時間展開の賦活パターンを示していたことから、これらの領域が学習やイベントの予測などにおいて異なる関与の仕方をしていることが示唆される。睡眠時に聴覚イベントの時間的連合を潜在的に学習していたという今回得られた知見により、乳児期初期の睡眠時における脳の機能的活動か成人のそれとは異なる可能性も示唆される。上記の結果を第31回日本神経科学学会にてポスター形式で発表を行い、また論文としてまとめて投稿し、PloS One誌に掲載された。また、前年度まで行っていた乳児の馴化・脱馴化に関わる脳活動を計測・解析した結果を論文としてまとめて投稿した結果、Cerebral Cortex誌に掲載された。
戦略的人的資源管理とキャリア形成・人材育成に関する研究

人的資源管理とキャリア形成・人材育成との関連について考察するために、事例調査を試みた結果、(a)内部労働市場的対応と(b)職業別労働市場(もしくは外部労働市場)的対応の二つのパタンが見出された。ここから、後者(b)の性格の強い中小企業の場合、仕事能力を明確化し、技能形成のための環境整備をはかることが重要であり、加えて社会的に職業能力を評価し、能力形成をはかるためのしくみの整備が必要となる、という政策的含意を得た。本研究の目的は、人事管理の多元化と従業員のキャリア志向の多様化が一進展する中で、両者のニーズのマッティングを支える環境条件の在り方を考察するための理論的な枠組みを開発すると同時にそれを実証的に検証することにある。従来まで主流であった内部労働市場型のキャリア(つまり特定の会社で長期にわたってフルタイムで就労するタイプのキャリア)は、今でも従業員の生活と雇用を保障し人材育成に寄与するキャリアとして重要ではあるが、今後予想される様々な環境変化の下では、それに加えて職業別労働市場をベースにしたキャリア(つまり職業能力が特定企業の外側で定義・評価され、勤務先は変わっても労働条件や仕事を変えずに、場合によってはより向上させていけるようなタイプのキャリア)の普及によって補完される必要がある。本研究はそのための環境条件の整備の在り方を考える上で貴重な含意を有するものである。平成22年度は、研究目的の達成にむけて欠くことのできない作業である「人事管理とキャリア形成との関係」を統一的に考察するための枠組み構築にむけて、重要な研究鉱脈である戦略的人的資源管理論及びキャリア研究に注目しつつ主要な研究のレビューを行った。同時に国内外の文献を広く収集し、また体系的にレビューを行うことで、実証的な調査研究の仮説設定に寄与しうる主要変数の析出とその関係について精査し、より洗練された理論的な枠組みと仮説の構成をはかった。さらに以上から得られた理論的枠組み及び仮説の経験的妥当性の検証のために、首都圏を中心に関西圏も視野に入れつつ、企業レベルでの人事管理の動向及びキャリア管理・支援、人材育成の取り組みについてヒアリング調査を行い、その成果の一部を学会で報告し、また一部を著作に収録した。本研究の目的は、人事管理の多元化と従業員のキャリア志向の多様化が進展する中で、両者のニーズのマッティングを支える環境条件の在り方を考察するための理論的な枠組みを開発すると同時にそれを実証的に検証することにある。平成23年度は、平成22年度に引き続き、研究目的の達成にむけて欠くことのできない作業である「人事管理とキャリア形成との関係」を統一的に考察するための枠組み構築にむけて、重要な研究鉱脈である戦略的人的資源管理論及びキャリア研究に注目しつつ主要な研究のレビューを行った。また国内外の文献を広く収集し、また体系的にレビューを行うことで、実証的な調査研究の仮説設定に寄与しうる主要変数の析出とその関係について精査し、より洗練された理論的な枠組みと仮説の構成をはかった。その上で、平成23年度は理論的枠組み及び仮説の経験的妥当性の検証のために、首都圏及び関西圏に立地する中小製造業等を中心にヒアリング調査を行い、企業レベルでの人事管理の動向及びキャリア管理・支援、人材育成の取り組みについて明らかにした。同時にその成果の一部を学会で報告し、また論文として発表した。

平成24年度は、平成23年度に引き続き、研究目的の達成にむけて欠くことのできない作業である「人事管理とキャリア形成との関係」を統一的に考察するための枠組み構築にむけて、重要な研究鉱脈である戦略的人的資源管理論及びキャリア研究、さらには海外文献による人的資源開発及びマネージャー・リーダー人材の役割と育成に関する研究動向に注目しつつ、主要な研究のレビューを行うと同時に、最終とりまとめに向けて、これまでの研究を踏まえた、理論的枠組み及び仮説の経験的妥当性の吟味、及び企業レベルでの人事管理の動向及びキャリア管理・支援、人材育成の取り組みについての一定の結論と含意について明らかにした。同時にその成果を論文にて公表した。当初の計画であった枠組みの構築及び研究のレビューを終了し、その上で企業調査を実施することができたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究目的及び計画に照らしておおむね順調に進展していることから、今後も引き続き計画通りに研究を実施してくことにしたい。
酵母フェロモン応答シグナルを用いたタンパク質間相互作用解析法の開発

酵母一倍体はフェロモンを感知すると二倍体を形成(接合)する。この接合を誘導するシグナルは細胞内のGα、Gβ、Gγから構成されるGタンパク質を介して下流へと伝達されていくが、Gνの膜局在性が不可欠である。そこで遺伝子工学的にGγの膜結合部位を削除することでシグナルを欠失させたのち、タンパク質間相互作用を用いてこれを回復させる手法を考案した。本年度は微弱な相互作用の検出をも可能とするために野生型Gνをエンハンサーとしたシグナル増幅技術の確立を試みた。本研究では微弱なタンパク質間相互作用のモデルとして、ヒトIgGのFc部位およびStaphylococcus aureusプロテインA由来のZ_<131A>(結合定数8.0×10^3M^<-1>)を選択した。従来技術とエンハンサーを用いた新技術のシグナル応答レベルを比較した結果、Fc-Z_<131A>の相互作用に対して約20,000倍のシグナル増幅が可能であることが示された。またエンハンサーをGβに変更することで新たな応用を考案した。シグナル伝達を誘導する物質(アゴニスト)は創薬リード化合物となるが、酵母での検出技術ではシグナル応答レベルが低いことが課題とされている。本技術の導入によりアゴニスト存在下では初期には微弱ながらもシグナル応答としてGβの過剰発現がフィードバック的に促進され、非常に大きなシグナル応答レベルが得られる。本研究ではソマトスタチンをアゴニストのモデルとして選択した。従来技術と比較した結果、検出下限濃度は10分の1に改善され、最大シグナル応答レベルは約3倍に上昇した。以上の結果より、本シグナル増幅技術は微弱な相互作用の検出およびアゴニストの高感度検出に有効であることが示された。酵母細胞は接合の際に活性化されるフェロモン応答シグナル経路を有しており、これは酵母内在性のGタンパク質共役型受容体にリガンドが結合するとGタンパク質を介してシグナルが伝達される。Gタンパク質は3つのサブユニットα、β、γから構成されており、γサブユニットの膜局在性がシグナル伝達に不可欠であることが知られている。そこで本研究では遺伝子工学的にγサブユニットの膜結合部位を削除した変異体を作成しシグナルを欠失させたのち、タンパク質問相互作用を用いてこれを回復させる手法を考案した。一方のタンパク質AをGγ変異体に融合させ、他方のタンパク質Bを細胞膜に固定することで、タンパク質間に相互作用が存在する場合にのみシグナルが回復し、そのシグナル応答により相互作用検出が可能となる。そこでシグナルのレポーターとしてEGFPを利用し、蛍光強度を指標とした相互作用の検出を試みた。本研究では相互作用のモデルとしてStaphylococcus aureusプロテインA由来のZZドメインおよびヒトIgGのFc部位を選択し、これらを導入した酵母株を創製した結果、上述のようにZZ-Fc間の相互作用によるフェロモン応答シグナルの回復が観測された。ここで相互作用検出を試験したモデルペア、ZZドメインとFc部位は非常に強く結合することが知られており(結合定数6.8×10^8M^<-1>)、相互作用検出システムとしての汎用性を評価するために、Fc部位との結合定数がZZドメインよりも小さい結合パートナーとして単量体のZドメイン、およびそれぞれ結合定数の異なるZ変異体2種を用意して酵母細胞に導入して試験を行ったところ、最も結合定数小さい(8.0×10^3M^<-1>)結合ペアの相互作用まで検出が可能であり、さらにそれぞれの結合強度に応じたシグナル応答レベルが観測された。これらの結果により、本システムを用いることで相互作用検出と同時に相互作用の強度についての定量的な情報を獲得できることが示唆される。酵母の一倍体細胞であるa細胞、α細胞は互いにフェロモンを分泌し、これを感知すると二倍体a/α細胞を形成(接合)する。この接合を誘導するシグナルは細胞内のα、β、γから構成されるGタンパク質を介して下流へと伝達されていくが、γサブユニット(Gγ)の膜局在性が不可欠である。本年度は接合を利用した相互作用のスクリーニング手法の確立を試みた。本研究ではa細胞およびα細胞として、それぞれリジン合成細胞およびメチオニン合成細胞を選択し、a細胞に相互作用をフェロモン応答シグナルに変換するための遺伝子改変を加えた。ここでα細胞との共培養を行うと、タンパク質間の相互作用により接合能が回復したa細胞のみが二倍体を生成する。生成した二倍体は両アミノ酸を含まない選択培地により選別が可能であり、相互作用をスクリーニングすることができる。本研究では相互作用のモデルとしてprotein A由来のZドメインおよびヒトIgGのFc部位を選択し、これらを導入した酵母株を創製した結果、上述のように接合能の回復が確認された。さらに本年度はタンパク質間の相互作用に対して競合タンパク質を導入することによって、結合強度の高い相互作用を選択的にスクリーニングするためのシステムの開発を行った。Fcとの結合定数がZよりも大きなZZを用意し、Zを競合タンパク質としてZZ-Fc間の相互作用を人工ライブラリからスクリーニングしたところ、ライブラリ中に0.01%しか存在しない微量の標的相互作用を効率的に選別できることが示された。本年度の研究により、接合を利用したタンパク質間相互作用のスクリーニング手法が確立され、さらに結合強度の高い相互作用を選択的に獲得することが可能となった。