hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
情動伝染に関わる遺伝子の同定とその進化的役割の解析

その結果、実験用マウス系統であるC57BL/6J (以下B6)よりも、野生由来系統であるMSM系統の方が、隣のマウスの恐怖刺激に対して、より強い情動伝染を受けることを見出した。この情動伝染がどのような刺激をもとに生じているか明らかにすることを目的として、刺激提示個体が恐怖刺激を受けている際の映像と音声を、その際の尿と共に提示すると、弱いながらも顕著な情動伝染を示すことを明らかにした。この結果は、刺激を個別に提示することで、情動伝染に関わる刺激情報の解明につながると期待された。そこで、刺激を個別に提示する実験を行った。映像、音声、匂いの刺激を個別に提示したところ、マウスは匂いと視覚刺激をもとに情動伝染を示すことが明らかになった。また、MSMとB6の情動伝染の違いに関わる遺伝子探索を行うことを目的として、遺伝子マッピングに有用なマウスリソースであるコンソミック系統を用いて情動伝染の系統差に関わる遺伝子座の特定を目指した解析を進めた。その結果、複数のコンソミック系統で情動伝染が確認された。コンソミック系統は同一系統の個体を繰り返し解析することが可能なため、これらの情動伝染の違いを示す系統について、さらなる遺伝子マッピングが可能になる。将来的には遺伝子同定を目指した解析に結び付けたいと考えている。これまでに、日本産野生マウス由来系統であるMSMに、刺激提示個体が恐怖刺激を受けている際の映像と音声を、その際の尿と共に提示することで、観察しているMSM個体に顕著な情動伝染を生じさせることに成功した。今後は、映像、音声、匂いの刺激を個別に提示することで、情動伝染にどのような刺激情報が関わっているのか解明していくまた、MSMとB6の情動伝染の違いに関わる遺伝子探索を行うことを目的として、遺伝子マッピングに有用なマウスリソースであるコンソミック系統を用いて情動伝染の系統差に関わる遺伝子座の特定を目指した解析を進めてていく。特に、これまでの解析で複数のコンソミック系統で情動伝染が確認されていることから、これらの染色体のさらに狭い領域を有するサブコンソミック系統を用いて解析を行うことで、情動伝染に関わる遺伝子座の解明を目指す。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
ネットワーク解析による金融市場の動的不安定性の解明

金融市場では銀行同士の取引などによって様々な「つながり」が形成され、そのネットワークを通じて複雑な波及現象が発生する。本研究では、従来の経済学的手法では分析が難しい金融市場に内在するネットワークの構造に焦点をあて、様々な金融危機現象をネットワーク現象としてモデル化し、動的な不安定性条件を導出することで、金融危機波及メカニズムの本質的な理解を目指す。例えば、金融機関のポートフォリオ相関をネットワークとして数理モデル化し、投げ売りの発生条件を解析的に示す。また、Hawkes過程をベースとした最新の統計的解析手法を用いて、理論・データの両面から金融危機の発生メカニズムに迫る。
肝癌幹細胞に対する癌免疫治療とその分子機構の解析

肝癌幹細胞の免疫学的解析を行った。癌幹細胞マーカーであるCD133陽性肝癌細胞は、MMP-2やADAM9の活性が高いために浸潤能やVEGF産生能が高くかつNK活性に抵抗性であった。また血清FGF-2の発現は慢性肝疾患の進展で低下傾向を示し、FGF-2により肝癌細胞のNK活性に対する感受性が増大した。さらにα-fetoproteinは樹状細胞のIL-12産生を制御することでNK細胞活性化を抑制することを示した。CD133分子は多くの癌腫において癌幹細胞のマーカーとして用いられている。肝細胞癌(HCC)においても癌幹細胞のマーカーとして同定されている。しかしながら、CD133を発現するHCC細胞の生物学的特徴は未だ不明である。我々は、ヒトHCC細胞のCD133分子の発現と各種metalloproteinaseの発現に注目し、HCCにおけるCD133分子発現の意義を検討した。PLC/PRF/5ヒト肝癌細胞(CD133強発現細胞)のCD133分子の発現をsiRNAにてノックダウン(CD133KD)すると、MMP-2発現の有意な低下をRNAレベル及び蛋白レベルで認めた。MMP-2関連の細胞浸潤能及びVEGF産生能を評価すると、CD133陽性PLC/PRF/5細胞の細胞浸潤能及びVEGF産生能は、CD133KD-PLC/PRF/5細胞及に比していずれも有意に高かった。またMMP-2蛋白の添加によりCD133KD-PLC/PRF/5細胞の細胞浸潤能及びVEGF産生能が増加した。一方Huh7肝癌細胞(CD133中等度発現細胞)を、CD133陽性細胞(CD133(+))と陰性細胞(CD133(-))をマイクロビーズ法にて分離した。CD133(+)Huh7細胞のMMP-2の発現は、CD133(-)Huh7細胞に比して有意に高かった。またCP133(+)Huh7細胞の細胞浸潤能及びVEGF産生能もCD133(-)Huh7細胞に比して有意に高く、PLC/PRF/5細胞と同様の結果であった。CD133陽性ヒトHCC細胞はMMP-2活性が高く、結果的にMMP-2関連の細胞浸潤能及びVEGF産生能が高かった。以上よりCD133陽性HCC細胞は、その生存に有利な生物学的特性があることが明らかとなり、HCCにおけるCD133分子発現の意義を明らかにできた。昨年CD133陽性ヒト肝癌細胞ではMMP-2発現が有意に高く、MMP-2関連である癌細胞浸潤能及びVEGF産生能も有意に高いことを報告した。本年は他のmetalloproteinaseも検討した結果、PLC/PRF/5ヒト肝癌細胞(CD133強発現細胞)のCD133分子の発現をsiRNAにてノックダウン(CD133KD)すると、ADAM9発現の有意な低下をRNAレベル及び蛋白レベルで認めた。ADAM9はNK活性化分子のMICA分子のsheddingに関与することを我々は以前報告している(Kohga K, et al Hepatology, 2010)。CD133KD細胞の膜結合型MICAは増加し、逆に可溶性MICAは減少した。このことはCD133KD細胞のNK細胞の細胞傷害活性に対する感受性が増大することが考えられるが、クロムリリース法によりCD133のノックダウンにてNK細胞に対する感受性の増大を確認した。Huh7肝癌細胞(CD133中等度発現細胞)をCD133陽性細胞(CD133(+))と陰性細胞(CD133(-))をマイクロビーズ法にて分離し同様に検討したところ、CD133(+)Huh7細胞のADAM9の発現は、CD133(-)Huh7細胞に比して有意に高く、CD133(+)Huh7細胞の膜結合型MICAの発現はCD133(-)Huh7細胞に比して有意に低く、逆に可溶性MICA産生は高かった。またCD133(+)Huh7細胞の方がCD133(-)Huh7細胞に比してNK細胞に対して抵抗性であることが明らかとなった。以上よりCD133陽性HCC細胞は、ADAM9の発現亢進によりNK細胞に対して抵抗性になることで、その生存に有利な生物学的特性があることが明らかとなった。

これまで肝細胞癌(HCC)の癌幹細胞のマーカーであるCD133陽性細胞は、その生存に有利な生物学的特性があることを明らかにしてきた。本年度は、HCCのニッチに関する検討と、HCCの産生するα-fetoprotein (AFP)の先天免疫制御に関する検討を行った。HCC関連ニッチの中で、本研究ではFGF-2に注目した。FGF-2の発現は正常では認めなったが、慢性肝炎では強く認め、肝硬変、HCCと病態が進展するにつれてFGF-2の発現は低下した。FGF-2添加によりHepG2及びPLC/PRF/5細胞上のNK活性化分子MICAの発現は有意に増加し、FGF-2の添加によりNK細胞の細胞傷害活性が亢進した。HCC発癌前後の血清FGF-2濃度は有意に発癌後低下していた。肝硬変患者84例をFGF-2濃度高値群(>1.8pg/ml、40例)と低値群(≦1.8pg/ml、44例)に分けると、FGF-2低値群では高値群に比してHCC発癌率が有意に高かった。以上の結果よりFGF-2が新たなHCCに対するリスクを予想するマーカーとなる可能性が示唆された。HCCの腫瘍マーカーであるAFPは、慢性肝炎・肝硬変でもしばしば高値を認め、AFP高値の肝硬変患者群は、発癌率が高いとの報告もある。本研究ではAFPのNK細胞活性に対する影響を検討した。NK細胞はAFP添加のみでは、その細胞傷害活性に変化は認めなかったが、AFP存在下でDCとNK細胞を共培養した場合、NK細胞の細胞傷害活性は、有意に低下した。AFP添加DCにIL-12を加えてNK細胞と共培養すると、NK細胞の細胞傷害活性は回復した。HCC59症例をAFP高値群(AFP≧100ng/ml)とAFP低値(AFP<100ng/ml)に分けてNK細胞のNKG2D発現を比較すると、AFP高値群ではAFP低値群に比してNKG2Dの発現が有意に低下していた。以上の結果は慢性肝疾患におけるAFP産生がNK細胞活性を抑制することで、肝発癌に有利な環境を作る可能性が示唆された。
タンパク質間相互作用を制御する特殊環状ペプチド創薬

本研究の目的は、タンパク質間相互作用を制御する特殊環状ペプチド医薬をスクリーニングすることである。ペプチドは従来の有機低分子医薬に代わる新しい医薬品リード化合物として近年非常に注目されており、低分子医薬では不可能なタンパク質間相互作用の促進や阻害が可能であるため、機能的により優れた医薬品となり得る。しかしながら、そのようなタンパク質間相互作用を制御するペプチドを効率的にスクリーニングする方法がないのが現状の課題である。既存のペプチドスクリーニング法としてはRaPIDディスプレイ法などがあるが、本研究ではRaPIDディスプレイ法を基盤としつつも、標的に結合するか否かをスクリーニングの指標とするのではなく、標的のタンパク質間相互作用の変化を引き起こすか否かを指標としてペプチドをスクリーニングできるシステムを開発している。具体的には細胞表面にEGFPを連結した標的タンパク質1とmRuby3を連結した標的タンパク質2を人工的に発現させ、488nmのレーザー光を照射してFRETによる赤色光の変化を示した細胞のみをセルソーターで回収することでセレクションを実施できる。現在、そのような細胞株の構築を進めている段階である。並行して、2種類のタンパク質にそれぞれ結合する特殊環状ペプチドのセレクションをおこない、各ペプチドの標的タンパク質への結合を確認したのち、2つのペプチドをリンカーを介して連結し、2つの標的タンパク質に同時に結合させる戦略も進めている状況である。現在までに細胞表面にEGFPを連結した標的タンパク質1を発現させることに成功しており、mRuby3を連結した標的タンパク質2の発現についても進行中である。2種類のタンパク質にそれぞれ結合する特殊環状ペプチドのセレクションについても順調に推移しており、次年度も研究を継続することにより目的とするペプチド配列が十分に得られる見込みである。2018年度までに細胞表面にEGFPを連結した標的タンパク質1を発現させることに成功しており、2019年度においては同細胞株にmRuby3を連結した標的タンパク質2を発現させることを試みる。これが構築できた段階で、当該細胞株を用いた特殊環状ペプチドのスクリーニングを開始する。使用するペプチドライブラリとしてはN末端にクロロアセチルチロシンを導入し、下流にはシステインを配置することにより両者間で安定なチオエーテル結合を形成させ、ペプチド全体を大環状化させたものを使用する。これにより、ペプチドの構造の安定化・標的への結合力の向上・ペプチダーゼ耐性の獲得などが期待できる。並行して、2種類の標的タンパク質にそれぞれ結合する特殊環状ペプチドのセレクションをおこなうことも継続して進める。ペプチドライブラリとしては上記のものと同様のものを用いる。現在までに1つの標的タンパク質に結合するペプチドの取得は完了しているため、今後はもう一つの標的に結合するペプチドのスクリーニングを継続して進め、結合するペプチドが得られた段階で両者をリンカーで連結する試みを進める。

現在までに細胞表面にEGFPを連結した標的タンパク質を発現させることに成功しているが、もう一つの標的タンパク質にmRuby3を連結した細胞の発現までに至っていないため、関連する試薬等の購入費用が次年度に持ち越しとなった。当該実験は次年度も継続するため、持ち越した金額については次年度に使用する見込みである。
微生物由来界面活性物質の分子デザイン技術の高度化

環境調和型次世代界面活性剤として、利活用が期待されている微生物由来界面活性物質のひとつであるマンノシルエリスリトールリピッド(MEL)の微生物工場として、Pseudozyma hubeiensisに着目し、遺伝子工学・代謝工学を駆使した、非天然型MELの選択的かつ効率的な培養生産ならびにその機能について研究した。ドラフトゲノムデータを基に設計した遺伝子破壊用DNAを用いて、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子破壊株を取得し、脱アセチル化MEL(MEL-D)を選択的に合成し、界面物性について評価した。同時に副生産した3つのアシル基を持つ3本鎖MEL-Dの合成にも成功した。糖脂質生産菌Pseudozymahubeiensis SY62株のマンノシルエリスリトールリピッド(MEL)関連遺伝子破壊株の取得を試みた。アシルトランスフェラーゼ遺伝子mac1の破壊を試みたところ、首尾よく破壊株がえられた。破壊株を用いたMEL生産実験を試みたところ、薄層クロマトグラフィー分析ではMELもしくはMEL派生体を検出することができなかった。そこでペーパークロマトグラフィーを用いて、糖アルコールを検出したところマンノシルエリスリトールと思われる糖アルコールが検出できた。MEL関連遺伝子の破壊方法の確立、破壊株の評価などを進めており、概ね順調に研究が進んでいると判断できるため。微生物由来界面活性物質マンノシルエリスリトールリピッド(MEL)生産菌Pseudozyma hubeiensis SY62株の遺伝子破壊系を確立し、アセチルトランスフェラーゼ(mat1)破壊株の構築に成功した。これにより、当該菌株の遺伝子破壊系を確立することができ、代謝工学的な手法により、中間代謝物質の生産が可能となった。得られた中間体について、核磁気共鳴スペクトル、脂肪酸分析、マトリックス支援レーザーイオン化質量分析法などを組み合わせて、元株の代謝産物に見られるアセチル基が付加しない代謝物(MEL-D)を選択的に生産していることを証明した。得られたmat1破壊株は元株が有する効率的なMEL生産能力を保持したまま、MEL-Dを量産することができた。これまで報告のあるMEL-D生産方法の中で最も効率的な生産方法を確立できた。さらに新規に微生物界面活性物質生産菌の探索を実施し、ソホロリピッド生産菌を取得し、その成果についてBioscience, Biotechnology, and Bioenngineering誌にて誌上発表した。計画に即し、遺伝子破壊系を確立し、代謝工学的手法により、微生物界面活性剤の分子構造を制御できるようになったため。これまで新しい環境調和型界面活性剤としての利活用を目指して、環境中から微生物由来界面活性物質生産菌(BS)の探索を続けてきた、新しい構造のBSを発見するに至っているが、必ずしも望ましい物性や機能を持たないため、用途が限定されることがBS利用拡大の障害となっている。これまで困難であった分子生物学的な育種がゲノム解析技術の発展により利用可能となりつつある。用途に応じた分子種のデザイン(分子デザイン技術)を可能とするため、ゲノム情報を基盤として、迅速かつ網羅的な遺伝子破壊法を組み合わせることで、BSの分子デザイン技術を高度化すること(次世代グリーンプロダクションの創生)を目的として研究を実施した。1本鎖MELの選択的生産株の構築を目指してアシルトランスフェラーゼ破壊株の作成も試みたが、破壊株はMELを生産しなかった。予定通り、他のMEL関連遺伝子についても破壊株を取得し、その機能を解析するとともに、破壊株の有効利用について、検討する。引き続きMEL代謝関連遺伝子の遺伝子破壊株の構築を進めるとともに、構造・機能解析を実施する。29年度が最終年度であるため、記入しない。生物化学工学29年度が最終年度であるため、記入しない。
高分子ブレンドの相溶性に及ぼす延伸配向の効果

鎖状高分子を含め、ほとんど全ての分子は分子形状またはセグメントレベルの形状に関し異方的であるため、排除体積効果(パッキングエントロピー効果)に異方性を生じ、これが高分子凝集系のセグメント配向や近距離秩序に重大な影響を及ぼすと考えられる。本研究では、この配向依存性排除体積効果が高分子ブレンドの相溶性に及ぼす影響を明らかにするために、下限臨界相溶(LCST)型部分相溶系であるポリスチレン(PS)とポリビニルメチルエーテル(PVME)ブレンド系を取り上げ、その相分離挙動に与える外部力場としての一軸延伸の影響を検討した。PVMEと架橋剤としてジビニルベンゼンを含むスチレンモノマーを重合した架橋ブレンドフィルムならびにキャスト法により作製した非架橋ブレンドフィルムを所定温度で延伸した後、偏光赤外分光法により高分子のセグメント配向度を、一定昇温速度下での光散乱測定により系の曇点を決定し、曇点曲線とセグメント配向度の関係を明らかにした。架橋、非架橋いずれの場合においても、延伸に伴う曇点の低下が観測された。昇温速度の増加に伴い曇点の高温側への著しいシフトが認められたが、延伸に伴う曇点の低下量は昇温速度によらずほぼ一定となり、有限の昇温速度(dT/dt=1°C/min)での結果はdT/dt=0における曇点の変化量を半定量的に表すものと考えられる。また、本系で観測された延伸誘起非相溶化は、配向依存性排除体積効果に基づく理論的予測すなわち柔軟度を異にする高分子が外力による配向を受けた時に脱混合しやすいことに対応している。
「トリアルキルアルミウム-水」系による高活性アルキル化剤の開発

トリアルキルアルミニウムはアルキル化剤として古くから使用されてきたが,高温を要したり,反応性が低いため他の金属錯体を共存させるなど合成上の大きな制約があった.これはトリアルキルアルミニウムの強いルイス酸性のため,本質的に"アルキルアニオン"を発生しにくいためである.これに対し申請者らは最近,トリメチルアルミニウムに当量の水を加えると,トリメチルアルミニウム自身より遥かに活性なメチル化剤が発生することを発見した.本研究は,このような「トリアルキルアルミニウム-水」系による高活性なアルキル化剤の化学的挙動を調べ,有機合成に新局面を拓くことを目的として行われたものである.本年度の成果の概要を以下に記す.(1)トリメチルアルミニウムと水から発生するメチル化剤の構造解明「トリメリルアルミニウム-水」の組み合わせにより生じる活性種の構造は,当初メタンが1分子発生してできるヒドロキシアランではないかと予想したが,実験の結果,トリメチルアルミニウムに水が配位した化合物が活性種である可能性が強く示唆された.現在,真の活性種の構造解明に向けてさらに検討を加えている.(2)末端エポキシドの内部からの位置および立体選択的アルキル化反応の開発一般にアルキルリチウムや有機銅試薬などの求核試剤による末端エポキシドへの攻撃は,末端側から位置選択的に起こり内部からは起こらないことが知られている.これに対し,末端のγ,δ-エポキシアクリル酸エステルを基質に用いトリアルキルアルミニウム-水で処理すると,反応は内部から位置および立体選択的に起こり何れも単一の生成物を与えることを見出した.また,これらの反応は完全な立体反転を伴って進行することが判明した.新たに開発した末端エポキシドの立体特異的アルキル化反応は,新しい炭素-炭素結合形成反応として有用であるばかりではなく,本反応によって得られる生成物は不斉炭素、1級水酸基,二重結合,エステル基など多くの官能基を備えており,天然物合成に極めて有用なキラルビルディングブロックを提供するものと考えられる.トリアルキルアルミニウムはアルキル化剤として古くから使用されてきたが,高温を要したり,反応性が低いため他の金属錯体を共存させるなど合成上の大きな制約があった.これはトリアルキルアルミニウムの強いルイス酸性のため,本質的に"アルキルアニオン"を発生しにくいためである.これに対し申請者らは最近,トリメチルアルミニウムに当量の水を加えると,トリメチルアルミニウム自身より遥かに活性なメチル化剤が発生することを発見した.本研究は,このような「トリアルキルアルミニウム-水」系による高活性なアルキル化剤の化学的挙動を調べ,有機合成に新局面を拓くことを目的として行われたものである.本年度の成果の概要を以下に記す.(1)トリメチルアルミニウムと水から発生するメチル化剤の構造解明「トリメリルアルミニウム-水」の組み合わせにより生じる活性種の構造は,当初メタンが1分子発生してできるヒドロキシアランではないかと予想したが,実験の結果,トリメチルアルミニウムに水が配位した化合物が活性種である可能性が強く示唆された.現在,真の活性種の構造解明に向けてさらに検討を加えている.(2)末端エポキシドの内部からの位置および立体選択的アルキル化反応の開発一般にアルキルリチウムや有機銅試薬などの求核試剤による末端エポキシドへの攻撃は,末端側から位置選択的に起こり内部からは起こらないことが知られている.これに対し,末端のγ,δ-エポキシアクリル酸エステルを基質に用いトリアルキルアルミニウム-水で処理すると,反応は内部から位置および立体選択的に起こり何れも単一の生成物を与えることを見出した.また,これらの反応は完全な立体反転を伴って進行することが判明した.新たに開発した末端エポキシドの立体特異的アルキル化反応は,新しい炭素-炭素結合形成反応として有用であるばかりではなく,本反応によって得られる生成物は不斉炭素、1級水酸基,二重結合,エステル基など多くの官能基を備えており,天然物合成に極めて有用なキラルビルディングブロックを提供するものと考えられる.
金属とリン酸塩基ユニットの共同作用を利用した多機能固体触媒の創製

本研究では、水熱法により合成したCePO4触媒が他の均一系および不均一系酸・塩基触媒とは大きく異なり、5-hydroxymethylfurfuralの官能基選択的アセタール化反応に高い触媒活性を示した。CePO4触媒の存在下、種々のカルボニル化合物とアルコールの組み合わせにより、対応するアセタール化合物を高収率で与えた。反応機構の検討から、CePO4触媒上の均質なLewis酸点と弱塩基点がそれぞれ5-hydroxymethylfurfuralとアルコール分子に相互作用し、二元機能触媒として機能することで高い触媒性能を示すことが示唆された。オルトリン酸ユニットを構造内に有する金属リン酸化合物は,酸性質を有する金属ユニットと塩基性質を有するオルトリン酸ユニットの酸塩基共同作用により,優れた触媒として機能する可能性がある.しかしながら,これら金属リン酸化合物の酸塩基共同作用に着目した研究はほとんど行われていない.本年度では,金属リン酸化合物であるリン酸ランタン触媒の合成とその酸塩基触媒作用について報告する.LaPO4は水熱法により合成した.硝酸ランタンとリン酸アンモニウム溶液をオートクレーブ容器に入れ水熱合成を行い、ろ過により回収した沈殿を純水で洗浄後,乾燥または焼成することによりリン酸ランタン触媒を合成した.水熱合成の反応時間を変化させたときのリン酸ランタン触媒のXRDパターンを測定したところ、反応時間増加と共にリン酸ランタン触媒の結晶構造が六方晶構造から単斜晶構造へと変化し,反応時間を長くすることで単一な単斜晶リン酸ランタン触媒が得られた.また,トリメチルシリルシアニドを用いたアセトフェノンのシアノシリル化反応を行った。焼成処理した単斜晶リン酸ランタン触媒を用いた場合に、生成物であるシアノヒドリン収率が>99%と最高活性を示した.この結果から,単斜晶リン酸ランタン触媒は強塩基である水酸化ランタンや酸化ランタン、リン酸カリウムやルイス酸であるランタントリフラート触媒と比較して高い活性を示すことが明らかとなった.本触媒は反応終了後にろ過により回収でき,活性の低下なく再利用可能であることが明らかになった.酸塩基触媒作用を示す金属リン酸化合物の合成に成功し、触媒反応への応用も可能であることが確認できたため。本申請研究では、孤立した単核ホスフェートのもつ塩基性に由来した特異的分子活性化能(求核剤、二酸化炭素など)に着目し、オルトリン酸を構成ユニットとする金属リン酸化合物触媒の合成とリン酸ユニットに隣接する金属(ルイス酸点、酸化還元、等)との共同触媒作用を利用した、金属やリン酸ユニットのみでは達成し得ない高難度、あるいは新しい触媒反応系の開発を目的としている。本年度は、水熱法により合成したリン酸セリウム触媒が他の均一系および不均一系酸・塩基触媒とは大きく異なり、5ーヒドロキシメチルフルフラールの官能基選択的アセタール化反応に高い触媒活性を示した。リン酸セリウム触媒の存在下、種々のカルボニル化合物とアルコールの組み合わせにより、対応するアセタール化合物を高収率で与えた。反応機構の検討から、リン酸セリウム触媒上の均質なルイス酸点と弱塩基点がそれぞれ5ーヒドロキシメチルフルフラールとアルコール分子に相互作用し、二元機能触媒として機能することで高い触媒性能を示すことが示唆された。本反応系は、(1)水酸基をもつカルボニル化合物に対しても高い収率・アセタール化合物への官能基選択性を示す、(2)広範な基質群の組み合わせ・ラージスケール合成への応用可能である、(3)不均一触媒系として再使用可能である、といった特長がある。金属リン酸塩および類縁化合物が5ーヒドロキシメチルフルフラールへの糖変換反応に対してよく研究されているが、リン酸セリウムの酸塩基触媒作用はこれまでに報告されていない。このような二元機能が酸の影響を受けやすい官能基を有するカルボニル化合物を含む広範な基質の官能基選択的アセタール化反応に有効であると考えられる。合成法の最適化や他の金属種のリン酸塩を作成しより高活性な触媒の開発すると共に、構造に特徴的な酸塩基触媒作用の発現を目指す。本研究成果の関連記事が、以下のメディアに掲載されています。日経産業新聞2月23日付朝刊8面、化学工業日報2月27日付朝刊6面、科学新聞3月10日付3面触媒
ヘパリン中の血小板膜タンパク質結合ドメインの解析

1.ヒト血小板膜タンパク質を可溶化し、ゲル電気泳動により分子量に基づき分離し、さらにニトロセルロ-ス膜上にトランスファ-した。2.申請者がすでに確立した方法により、市販されている未分離の高分子量のヘパリンを蛍光物質、さらに放射性物質(125ーI)で標識した。3.標識されたヘパリンとニトロセルロ-ス膜にトランスファ-された血小板膜タンパク質との結合実験を行い、へパリンに結合したタンパク質の同定を行った。また、ゲルのまま標識化へパリン染色をおこないヘパリンと結合した親和性の高いタンパク質を同定した。そして既知のGPIB等のタンパク質と分子量的に比較検討し分子量80ー90kダルトンのヘパリン結合タンパク質の存在の証明に成功し、本研究の第一の目的を達成できた。現在、免疫学的検討を行なっている。4.ヘパリンを酵素を、または化学的に限定分解し、カラムクロマトグラフィ-を組み合わせて、分子量および電荷に基づいて分離し種々の分子量と電荷を有したヘパリン誘導体を得た。5.標識化ヘパリンを用いて、血小板とヘパリン及びヘパリン誘導体の結合を系統的に短時間で評価できるASSAY法(結合阻害実験法)を確立した。6.5で確立したASSAY法により得られるヘパリン画分の血小板に対する結合率を測定し、低分子化の方法と分子量の効果を検討することにより血小板(血小板膜上のヘパリン結合性タンパク質)に対するヘパリンの構造特異性を検討し、結合ドメイン中の特異的二糖シ-クエンスの存在を推定することができた。
原始惑星系降着円盤の運動構造に関する地球流体力学的考察

原始惑星系降着円盤ガスを記述する基礎方程式の定式化を検討し、そこへの地球流体力学的諸概念の適用可能性を検討すること、そして、基本場と擾乱の構造を地球流体力学的に見直すことを試みた。地球流体力学で知られている軸対称循環場が満足するべき条件は、原始惑星系降着円盤ガスにおいても満足されているべきことが確認されたが、擾乱の構造に関しては地球流体力学で知られる傾圧不安定擾乱の構造とは大きく異なっている可能性がある。原始惑星系降着円盤ガスを記述する基礎方程式の定式化を検討し、そこへの地球流体力学的諸概念の適用可能性を検討すること、そして、非軸対称擾乱の考察の基本となる軸対称場の性質を調べることを行うことが本研究課題の最終目標である。本年度は、まず原始惑星系円盤に関する流体力学的研究として、原始惑星系円盤の動径方向にエントロピー勾配があるときの、系の流体力学的安定性を、線形摂動の時間発展を数値的に積分することにより調べた。その結果、摂動の振幅が一時的に増幅される現象が確認され、動径方向のエントロピー勾配により系が不安定になる可能性が示唆された。また、関連するより基礎的流体力学的な研究として楕円渦領域の軸対象化過程についても解析的・数値的研究を行った。さらに、原始惑星系円盤中のダストの振る舞いに関して、基礎方程式のレベルから見直す研究も行った。従来の研究ではダストを流体(連続体)として取り扱っているが、付着成長によりダストの個数が減少すると流体としての取り扱いは不適切となり、離散粒子として扱わなければならないことを指摘し、ガス・ダスト系の基礎方程式系に加えるべき変更を明らかにした。原始惑星系円盤中のダストの振る舞いに関連する研究として、ダスト合体成長方程式を解いて円盤中のダスト成長・赤道面への沈殿過程の数値計算を行い、円盤内ダストのサイズ・空間分布を求めた。さらにこれをもとに幅射輸送計算を行い、円盤からのダスト放射のモデル計算を行なった。計算の結果、周囲の分子雲の密度がn>10^4cm^3である場合、10^6年程度の年齢の円盤から放射される、赤外線領域におけるダスト連続光のスペクトル・エネルギー分布が観測値を再現することが示された。原始惑星系降着円盤ガスを記述する基礎方程式の定式化を検討し、そこへ地球流体力学的諸概念の適用可能性を検討すること、そして、非軸対称擾乱の考察の基本となる軸対称場の性質を調べることを行うことが本研究課題の最終目標である。本年度は,研究代表者,分担者全員が8月16日に神戸大学惑星科学研究センターに集まり,軸対称循環の基本場について見当を行った.軸対称循環の基本場が満足するべき条件(遠心力,圧力傾度力,重力のバランス)や基本場の安定性の十分条件は,地球流体力学ではCharney(1973)で詳しく議論されており,先ずこのレビューを行った.そして,原始惑星系降着円盤ガスの研究では,地球流体力学で知られているバランスが満足されていることがわかった.次の研究の発展の方向として,傾圧不安定による渦の生成について検討することを確認し,原始惑星系降着円盤ガスの傾圧不安定問題を扱った論文の調査を始めた.そのほか,以下の研究を行い成果を公表した.原始惑星系円盤におけるガスの電離度に関する研究:原始惑星系円盤において,円盤ガスがどの程度電離し磁場と結合するかが,円盤ガスの磁気乱流の保持において重要である.円盤ガスの電離を阻害するのが,ダスト粒子表面での電荷再結合である.この効果を取り入れながら,ダスト粒子の合体成長を解くと,ダスト粒子は負に帯電しお互いに反発しあうことにより,その成長が著しく妨げられることが分かった.この結果から,ダスト表面での再結合の効率は減らないので,円盤の電離度も低いままに抑えられ,磁気乱流の成長も阻害される可能性が示された.これにより,ダストの成長が,円盤ガスの乱流状態,および乱流降着円盤としての進化に対して及ぼす多大な影響を議論できるようになった.また、純流体力学的な研究として非一様な渦度分布を持つ楕円渦が軸対称化する過程において,フィラメントが果たす役割を数値実験を通じて明らかにした.これまでの考察を継続して,原始惑星系降着円盤ガスを記述する基礎方程式の定式化を検討し,軸対称場の基本的性質,すなわち,定常流が満足するべき平衡状態や軸対称定常流の安定性の基準を中心に考察を行い,具体的な設定としてダスト層起源の乱流を題材にして流体理帰宅的な構造の探索を進めた.原始惑星系降着円盤ガスにおいては,降着円盤中心面(z=0,zは円盤面に対し垂直方向の座標)においては,その対称性からz方向のエントロピー勾配がゼロとなる特異点が存在する.

このことは,z=0において平均的な渦位がゼロであることを意味し,z=0を境界面と見立てての地球流体力学的な意味での傾圧不安定波が形成できないことを示していた.状況は回転球面上の赤道域と類似しており,z=0面を挟んで,z>0で渦位の値は正、z<0では負となる.しかし,降着円盤では特異点は二次のゼロとなるため回転球面上で有効であったβ面近似の手法を使うことができない(β=0であることと等価である),降着円盤ガスのシアー不安定の地球流体力学的構造の解明には抜本的な再考察(波の構造の研究)が必要であることがわかった.角運動量あるいは熱の供給を受けた際の軸対称場の大域的な構造を行う系の設計に関しては,これも,回転球面上の赤道付近の扱いと同様,z方向に放物柱関数を用いたスペクトル変換法によって定式化することができた.円盤方向の無限領域を扱うには石岡の方法(無限平面の球面投影を用いる方法)を用いることにより,これもスペクトル変換法で計算できる.スペクトル変換法と座標変換を組み合わせることにより得られる簡便な形式の数値計算モデルの構築は期間内に研究実施期間内には完了しなかった.
甲状腺未分化癌に対する新規治療法および治療薬の開発

甲状腺がんはその組織型により大きく予後が異なる。そのうち、甲状腺未分化癌は予後不良で、既存治療にも不応である。本研究は、アンメットメディカルニーズの高い甲状腺未分化癌に対して新規治療法、治療薬を開発することを目標としている。H29年度、甲状腺未分化癌細胞株(8305CおよびHTC/C3)において、文部科学省先端モデル動物支援プラットフォーム分子プロファイリング支援の阻害剤ライブラリーとして、レンバチニブの作用を増強させる併用薬の探索を行ったが、研究代表者が開発中である新規HDAC/PI3K二重阻害剤FK-A11も強い細胞胞増殖抑制効果を示したため、FK-A11に効果に着目して研究を行った。FK-A11は8305C細胞において、HDAC阻害、PI3K-AKT経路の抑制の他、MYCの発現を抑制することがwestern blottingによる検討の結果明らかになった。つづいて、FK-A11のinvivo抗腫瘍効果の条件の設定において、あらゆる溶媒に難溶性であり、その溶解性の改善が課題となった。検討の結果FK-A11をナノ粒子化し、分散させるという方法に成功した。その安定性確認試験において、肉眼、HPLCおよびSEMにて懸濁の性状および粒子径を確認したところ、1週間の室温留置では凝集が見られたが、4°C1週間保存では分散を維持していた。このことから、4°C保存が必要なことおよび、安定性のさらなる検証が必要なことが示された。そのほか、阻害剤ライブラリーを用いた検討において、レンバチニブの効果を増強する候補薬がでており、その検証実験を施行中である。in vivo試験を行うにあたり、FK-A11の難溶性を克服するための検討に時間を要した。ナノ粒子化することでin vivo試験でFK-A11を投与することが可能になったため、甲状腺未分化癌に対する薬効評価を行う。また、レンバチニブとの併用で効果を発揮しうる併用薬剤についての検証実験及び作用機序解析を行う。H29年度、甲状腺未分化癌細胞株(8305CおよびHTC/C3)を用いて、以下の方法により有効性を示しうる新たな治療法および治療薬のスクリーニングを行った。阻害剤ライブラリーとして、文部科学省先端モデル動物支援プラットフォーム分子プロファイリング支援の化合物ライブラリーを用いた。1.阻害剤ライブラリーを用いた、既存治療薬レンバチニブの作用を増強させる併用薬の探索。2.阻害剤ライブラリーから新たな治療薬剤の候補を探索。3.研究代表者が開発中である新規HDAC/PI3K二重阻害剤FK-A11の効果を評価。その結果、1.2.からはプロテアソーム阻害剤、HDAC阻害剤などが候補として選別されたが、3.のFK-A11が最も強い細胞胞増殖抑制効果を示した。また、FK-A11は8305C細胞において、western blottingによる作用機序解析の結果、HDAC阻害、PI3KーAKT経路の抑制の他、MYCの発現を抑制することが明らかになった。つづいて、FK-A11のin vivo抗腫瘍効果の検証を行うための条件の設定を行った。FK-A11は難溶性であり、in vivo試験において、その溶解性の改善が必要であることが課題となった。あらゆる溶媒を用いても難溶性であったため、別の方法としてFK-A11をナノ粒子化し、分散させるという方法に取り組み、成功した。また、ヒト繊維肉腫細胞を用いたin vivo抗腫瘍効果の予備的な検討において、ナノ化FK-A11は通常のFK-A11よりも優れた抗腫瘍効果を示した。H29年度は、in vitroの甲状腺癌細胞を用いた実験を行った。残念ながらレンバチニブの効果を特異的に増強させうる薬剤は選別されなったが、甲状腺癌細胞株に対して単独で効果を有する薬剤としてHDAC阻害剤が選別され、さらにHDAC/PI3K2重阻害剤活性を有するFK-A11が優れた細胞増増殖抑制効果を示した。そのため、次年度以降FK-A11による抗腫瘍効果の評価を予定し、そのための動物実験の予備的な検証を開始しており、おおむね順調に進展していると判断できる。検討の結果

FK-A11をナノ粒子化し、分散させるという方法に成功した。その安定性確認試験において、肉眼、HPLCおよびSEMにて懸濁の性状および粒子径を確認したところ、1週間の室温留置では凝集が見られたが、4°C1週間保存では分散を維持していた。このことから、4°C保存が必要なことおよび、安定性のさらなる検証が必要なことが示された。そのほか、阻害剤ライブラリーを用いた検討において、レンバチニブの効果を増強する候補薬がでており、その検証実験を施行中である。in vivo試験を行うにあたり、FK-A11の難溶性を克服するための検討に時間を要した。動物実験については溶解性の問題があったが、ナノ粒子化したFK-A11を用いることでその問題を克服できると考えている。今後は、そのナノ化FK-A11を用いて、in vivoで甲状腺未分化癌に対する抗腫瘍効果を検証する。また、MYCがFK-A11が感受性のバイオマーカーになるかの検討を行う。ナノ粒子化することでin vivo試験でFK-A11を投与することが可能になったため、甲状腺未分化癌に対する薬効評価を行う。また、レンバチニブとの併用で効果を発揮しうる併用薬剤についての検証実験及び作用機序解析を行う。試薬を含めた消耗品として次年度に使用する。試験物の溶解性の検討のため、動物実験に進めなかったため、次年度へ繰り越しの上、動物実験を行う予定である。
植物根のアルミニウムイオンによる伸長阻害の初期プロセスの解明-根端細胞におけるアルミニウム結合サイトの決定

アルミニウムイオンによる根の伸長阻害は処理開始後,数時間で発生する。このときに特に強い阻害を受けるのは根端の伸長域細胞である。しかしその細胞群におけるアルミニウムイオンの伸長阻害機構は不明であった。そこで本研究では根端細胞群の個々の細胞がどのような過程でその伸長速度を低下させられるのか,またその時,アルミニウムイオンはどの細胞に分布するかを調べることとした。材料としてはアルミニウムイオンに感受性の高いアルファルファを用いた。まず,アルミニウム処理中の細胞の伸長を経時的に追跡したところ,伸長域の細胞それぞれの阻害の受け方は異なっていたが,長い時間の後にはほぼすべての細胞の伸長が停止した。同時に細胞の生理活性を蛍光色素FUN-1にて調べたところ,一時的な活性上昇の後,減衰していくこと,またそれは個々の細胞にばらつきがみられることがわかった。次に個々の細胞単位でのアルミニウムの分布と伸長阻害の関係を大気Micro-PIXEにて検討したが明確な分布像を得ることはできなかった。酸性土壌や酸性雨により汚染された土壌では植物根は高濃度に可溶化したアルミニウムイオンによる伸長阻害を受ける。しかしそのメカニズムはいまだ明らかとなっていない。本研究では、アルミニウムイオンによる細胞伸長の阻害メカニズムを明らかにすることを目的としている。今年度はまずアルミニウムイオンによる細胞傷害の可能性の一つとされている細胞膜の損傷と細胞伸長との関係を調べた。蛍光色素FDAとDAPIの組み合わせにより、アルミニウムストレス下での細胞のviability及び細胞膜透過性の変化を可視化したところ、数時間で変化が認められたが、それは細胞伸長が停止した以後に起こっていることが示された。同様にX線分析法の一つであるPIXE法により根の表面細胞の元素組成を調べたところ、アルミニウムストレス下で細胞膜の損傷を示唆するK/P ratioの低下が認められたが、これもやはり細胞伸長が停止した以後に起こることがわかった。したがって、アルミニウムイオンによる細胞伸長の阻害は、細胞膜の損傷という根本的な変化が起こる以前に、細胞内あるいは細胞壁において何らかの生理的・物理的変化が起こったためであることが示唆された。このことをより明らかにするために、まずアルミニウムストレスによる細胞内Kの濃度変化を非破壊でchaseすることとした。蛍光色素PBFI-AMを根の細胞にloadingし、その蛍光強度から細胞内Kの濃度を顕微測光により定量することを試みた。現在のところ、十分な蛍光強度を得るためのloading条件の検討などを行っている。また同時に細胞膜の透過性をより鋭敏に反映すると言われる新規蛍光色素を用いて細胞膜の損傷度合いと、細胞核に発生する変化を同時にモニターする手法を試みている。来年度はこれらの成果をまとめるとともに、細胞壁における変化をモニターする予定である。
食品安全措置の実施における食品事業者・国・地方自治体の役割に関する検討

食品事業者が食品安全確保のための第一義的な責任を果たすことができる仕組み作りが重要であるととの問題意識のもとに、1食品事業者における食品安全確保のためのシステムの導入状況と課題を明らかにする(GAPとHACCPを中心に検討した)、2食品安全措置の実施に果たす公の役割と国と地方自治体の役割分担に関する考察と提言を行う、ことを研究課題とした。食品事業者および国・地方自治体の食品安全担当者に対するヒアリング調査、および収集した文献・資料に基づいて実施した。日本の特徴や課題を明らかにするために、EU(加盟国の事例としてはドイツ)との比較検討を行った。平成26年度には課題(1)「食品事業者における食品安全確保のためのシステムの導入状況と課題」と課題(2)「食品安全措置の実施に果たす公の役割と国と地方自治体の役割分担」に関して、国内外の文献と資料の収集を行った。そのうえで平成26年度は、課題(1)を中心に実施した。農業生産者および食品製造業者を検討対象としているが、主に農業生産段階の現状と課題を明らかにした。まず、日本における農業生産段階における食品安全の公的な規制内容を、EUの法的要件やコーデックス委員会の原則と比較しながら整理した。地方自治体の行政担当者へのヒアリングも実施した。比較の結果、日本では法的要件とされている項目が少なく、ガイドラインで対象とされる項目が多いことが分かった。そして前年度までの科研費若手(B)の公的な監視制度の問題点と合わせて、9月の日本農業経営学会大会にて報告を行った(13の学会発表欄に記載)。さらに農業生産段階では、農業適正規範であるGAPが「農業生産工程管理」と訳され、生産者や産地での導入・普及が進められているが、GAPについては概念の混乱が見られる。そこで食品衛生管理の考え方や、コーデックス委員会、ISOの文書、EUの政策文書などを元に、GAPの概念を再整理し、日本における現状の理解の幅を明らかにしたうえで問題点を考察した。また地方自治体において都道府県版GAPが作成されており、入手できる情報に基づいて内容の比較を行った。さらに国内の2産地において、GAPに関するヒアリング調査を実施した。食品製造業者の安全確保・品質管理のための自発的なプログラムに関しては、主に欧州の先行研究を中心に整理した。平成27年度には、課題(1)「食品事業者における食品安全確保のためのシステムの導入状況と課題」と課題(2)「食品安全措置の実施に果たす公の役割と国と地方自治体の役割分担」に関して、国内外の文献と資料の収集・整理を行うとともに、ヒアリング調査を実施した。課題(1)に関しては、H26年度に引き続き、農業段階におけるGAP(適正衛生規範)に関する状況について情報を収集した。またこの点について課題(2)に関する考察(生産者団体の役割と、国として義務的に整えるべき措置の検討)を行った。また課題(1)の「食品事業者における食品安全確保のためのシステム」としてHACCPを対象とし、情報収集やヒアリング調査を実施した。HACCPは食品事業者レベルでの衛生管理措置であり、日本でも将来的に導入が義務付けられることが見込まれている。EUではすでに2016年から農業段階を除くすべての食品事業者にHACCPシステムの導入が義務付けられている。EU加盟国のドイツを対象としてヒアリングを実施し、現在の導入状況および課題、また中小企業への柔軟性ある適用の実態や、企業に対する公的な監視指導の現状と課題について明らかにした。事業者が問題なく衛生管理措置を実施できるようにするため、国や自治体として整えておくべきことを整理した(課題(2)として)。昨年度からの公的監視制度の日本/ドイツに関する比較研究成果を、香港理工大学でのワークショップで報告した。また成果を取りまとめて公表した(13の研究発表に記載)。課題(1)(2)に関してとりわけHACCPシステムを対象として、ドイツにおけるヒアリング調査を実施し、比較対象であるEUおよびドイツの実態について明らかにすることができた。この点については予定通り進めることができた。27年度には日本において食品事業者にアンケート調査を実施することとしていたが、業種や規模によって違いが大きいため個別の事例のヒアリング調査を積み上げることに意味があると考え、日本における実態調査を進めた。ただしさらに実態調査を進める必要がある。また27年度には日本の自治体に対する調査を進めることとしていたが、当初の計画より遅れている。最終年度には、課題(1)「食品事業者における食品安全確保のためのシステムの導入状況と課題」と、課題(2)「食品安全措置の実施に果たす公の役割と国と地方自治体の役割分担」に関して、公開講座を実施するとともに、両課題に関する成果を取りまとめて公表した。公開講座(食と農の安全・倫理国際シンポジウム:食品安全への取り組みの現状と課題ー地方自治体と食品事業者ー)は、基盤(A)「食品安全のためのリスクコミュニケーションモデルの開発とプロフェッションの要件」(新山陽子代表)との共催で2017年5月に実施し、当基盤研究からは、主にドイツからの講演者(地方自治体の食品衛生担当者)の旅費等を支出した。さらに公開講座の翌日にワークショップを開催し、ドイツ・イギリスの自治体の食品衛生担当者および関西圏の自治体の食品衛生担当者等の間で、HACCP等の衛生管理システム導入にあたっての自治体や事業者の役割に関する議論を深めた。また、日本において導入が義務付けられることになった衛生管理方式であるHACCPシステムに重点を置いて成果を取りまとめて公表した。

27年度に実施したドイツでのヒアリング調査に基づき、ドイツではHACCPシステムの導入と実施に関してどのような工夫がされているか、公的な衛生監視指導がどのように実施されているか、事業者・事業者団体と公的な監視指導の関係に重点を置いて明らかにし、研究業績として公表した(業績欄に記載)。食品事業者が食品安全確保のための第一義的な責任を果たすことができる仕組み作りが重要であるととの問題意識のもとに、1食品事業者における食品安全確保のためのシステムの導入状況と課題を明らかにする(GAPとHACCPを中心に検討した)、2食品安全措置の実施に果たす公の役割と国と地方自治体の役割分担に関する考察と提言を行う、ことを研究課題とした。食品事業者および国・地方自治体の食品安全担当者に対するヒアリング調査、および収集した文献・資料に基づいて実施した。日本の特徴や課題を明らかにするために、EU(加盟国の事例としてはドイツ)との比較検討を行った。平成26年度には、課題(1)(2)に関する先行研究や資料の収集については予定通り進めることができた。また課題(1)について、日本の農業生産段階に関して、行政および産地でのヒアリング調査を実施することができた。しかし、GAP(農業適正規範)概念の混乱が見られたことからその整理に時間を要した。そのため26年度には、農業生産段階に加えて、食品製造段階における安全・品質確保のためのプログラムの導入状況や現状と課題の検討のため食品製造業者に対してアンケート調査を実施する予定であったが、その実施にまで至らなかった。最終年度となる28年度には、H27年度に残された課題を引き続き実施したうえで、交付申請書の計画通り、成果のとりまとめを行う予定である。なお、H28年5月に公開シンポジウムを実施し、課題(1)(2)に関する成果を公表し、関係者との議論を深める予定としている。農業経済学27年度には、26年度に残された課題を引き続き実施したうえで、27年度以降については交付申請書の計画通りに研究を実施する予定である。具体的には課題(1)に関する食品製造業者へのアンケート調査を実施する。また課題(1)(2)に関する内外でのヒアリング調査を進める。国外ワークショップでの成果報告を行う予定としている。H28年度にはH27年度より、163,911円の予算が繰り越されている。H27年度の香港での国際ワークショップにおける研究成果報告に旅費予算を計上していたが、招待となったため、その分の旅費の支出が不要となり、予算が残された。平成27年度には、26年度から296,241円の予算が繰り越されている。申請時の計画では、食品事業者へのアンケート調査のための予算を計上していたが、26年度に実施できなかったため、その予算が残された。また物品費として書籍代を20万円計上していたが、当初想定していたより少ない額で入手できたものがあったため、その予算が一部残された。27年度に実施できなかった食品事業者および自治体・国への調査を実施するのに使用する。
2本鎖RNAによる遺伝子発現抑制機構の研究

RNAiとは、生物に2本鎖RNA (dsRNA)を投与した場合に相同な配列を持つmRNAの分解が生じる現象であり、基礎研究のための遺伝子発現抑制の新しい手法としてのみならず将来の医療分野への応用も期待されている。RNAi現象の分子機序の実体を解明するために、筆者はモデル生物として線虫C. elegansを用いて研究を行ってきている。筆者はこれまでに、dsRNAの導入に伴うRNAi反応に関与する因子を幾つか同定してきており、その因子の1つであるrde-1に着目して本年度の研究を行った。まずRDE-1のN末領域に対応するリコンビナント蛋白を作製し、ラットとウサギに対して免疫して抗体を作製した。次に、精製した抗RDE-1抗体を用いた免疫沈降実験によって、RDE-1がin vivoで相互作用している蛋白の候補を4種得た。質量分析による解析の結果、相互作用を示す蛋白の1つであるp40がII番染色体上の遺伝子に由来することがわかった。又、筆者は、RNAi反応に関与する因子を同定するためにRNAi活性を欠損した変異体rdeを単離してきた。これまでのスクリーニングにおいてはrde-1遺伝子に対する変異が多く出現し、その他のRNAi関与遺伝子に対する変異が得られる確率が低いことが問題点であった。そこで、新しいタイプのrde変異体を効率良く単離するために、rde-1遺伝子を多コピー導入したトランスジェニック線虫を作製することにより、rde-1変異体を避けて遺伝学的スクリーニングを行うシステムを開発した。
咬合高径の低下に伴う咀嚼筋筋線維におけるミオシン重鎖遺伝子発現パターンの解析

本研究は、開咬症の治療による咬合高径の低下に伴う咀嚼筋筋線維組成変化のメカニズムを解明するために、本年度は以下の項目について検索した。1、顎位変化モデルラットの作成と顎位変化の評価生後14週齢Wister系雄性ラットを麻酔下で、上下顎両側第13臼歯咬合面と下顎切歯を削合することにより、顎位を変化させた(顎位変化群)。顎位変化量は、1.0±0.5mmであった。2、顎位変化後の安定性についての組織学的検索実験1週後、および終了4日前にそれぞれテトラサイクリン、ドータイトカルセインの皮下投与により生体染色を行い、屠殺後、非脱灰標本を作製し、根尖部における骨形成について観祭した。根尖部、根分岐部に著明な骨形成は観察されず、臼歯部挺出移動による後戻りは認められず、減少した咬合高径は維持されていることが確認された。3、咀嚼筋における組成の変化削合後3日後、1週間後、2週間後のそれぞれにおいて、咬筋を採取し、ATPase染色とNADH-TR染色を行い、筋線維タイプを分別しその比率を測定した。遅筋型であるタイプIIAの割合は、対照群では実験期間中ほぼ一定であったが、3日群では有意に増加していた。また、筋線維の最短幅径を計測した結果は、3日群において有意に減少していた。さらに、顎位変化後3日において、タイプIIAとIIBの最短幅径を比較してみると、どちらのタイプも対照群と比較して減少していることが認められた。以上の結果から、人為的に咬合高径を減少させると、咀嚼筋の筋線維タイプは一時的に遅筋化(タイプIIb→IIa)するが、その後元の筋線維タイプに戻ることが確認された。顎位に後戻りがみられないことから、この筋線維の変化は新しい顎位に適応する際に一時的に生じた変化であることが考えられる。来年度以降は、生化学的検索なども行い、筋線維タイプ変化のメカニズムについてさらに解析を進める。