hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞質分裂に必須な遺伝子であるSupervillin(SVIL)の機能解析

我々は今回の研究においてSupervillin (SVIL)が分裂時にCentral spindle (CS)と呼ばれる構造体に局在することを見出した。この局在はSVILの238番目のセリンのリン酸化により制御されていた。細胞に238番目のセリンをアラニン変えたS238Aを発現させた細胞では分裂の異常が観察された。さらに詳しく解析したところ、リン酸化したSVILは分裂期における細胞膜の収縮に関与していることが明らかとなった。以上より、SVILのリン酸化は細胞質分裂に重要な働きをしていると考えられる。細胞は複製したDNAを正確に娘細胞に分配しなけれはならず、その分配異常は細胞死、細胞の癌化などを引き起こす。そのため、細胞分裂の制御は多くの複雑なネットワークにより精密におこなわれている。細胞分裂制御因子は、抗癌剤の分子標的治療のターゲットとしても有用であり、新たな細胞分裂制御因子の同定は、癌治療の発展にもつながる。我々は新たな細胞分裂を制御するタンパク質を同定するため、siRNAのスクリーニングをおこない、Supervillin (SVIL)という遺伝子が細胞分裂の進行に必須であることを見出した。このタンパク質に対する抗体を作製し、その局在を観察したところ、細胞分裂時において、Central Spindle, Midbodyなどの特異的な部位に局在することが明らかとなった。SVIL発現抑制細胞では、細胞分裂が最終段階まで継続せず、途中で再び二つの娘細胞が融合してしまうことが観察された。SVILの局在に必須なタンパク質を探索したところ、SVILはモータータンパク質であるKIF14と結合し、この結合がSVILのCentral Spindleへの局在に必須であった。KIF14と結合できないSVILはMidbodyに局在することができなかった。さらに、Central Spindleに局在したSVILは、そこに局在する様々なタンパク質と複合体を形成し、アクチンとミオシンからなる収縮環の制御に関与していた。また、SVILは分裂期特異的にN末端がりん酸化されていることが判明した。このりん酸化部位に変異を導入することにより、SVILのアクチンへの結合に変化が観察された。現在Central SpindleにおけるSVILとKIF14の複合体がどのような役割を担っているのか検討中である。Supervillin(SVIL)は細胞骨格を制御するタンパク質として報告されている。我々はこのタンパク質が細胞分裂に関与することを見出し、研究を進めてきた。SVILは分裂期にはセントラルスピンドルという分離したクロモソームの中間点に局在し、そして中央体と呼ばれる領域に分裂の最終段階で局在する。この局在は抗体を用いた免疫染色、またGFP融合SVILを発現させた系で確認できた。SVILの発現を抑制した細胞をタイムラプス顕微鏡を用いて観察すると、分裂溝は形成され収縮は始まるが、収縮が完了せず途中で崩壊し、分裂中の細胞が再び融合してしまうことが見られた。このことより、SVILは収縮環の安定性に寄与していると考えられる。我々はさらにSVILがPLK1というプロテインキナーゼによりリン酸化されることを見出した。リン酸化部位を調べたところ、N末部分がリン酸化されることが確認できた。このリン酸化はSVILのセントラルスピンドルへの局在に重要であった。PLK1の活性を阻害するか、またはSVILのPLK1によるリン酸化部位に点変異を導入すると、SVILのセントラルスピンドルへの局在は顕著に減少した。PLK1にリン酸化されない変異型SVILを発現させた細胞ではスピンドル形成や染色体の分離に異常は見られなかった。しかしタイムラプス顕微鏡を用いて詳細に観察した結果、変異型SVILを発現した細胞では収縮環の幅が顕著に増加し、収縮が最後まで進行しないことが観察された。この結果、PLK1によるSVILのリン酸化はSVILの局在と収縮環の安定性に重要であると考えられる。細胞は複製したDNAを正確に二つの娘細胞に分配するため、多くの複雑なシステムを築き上げてきた。現在までに多くの精力的な研究がおこなわれてきたが、いまだ細胞分裂の詳細な制御機構は不明である。申請者はsiRNAを用いてスクリーニングにより、Supervillin(SVIL)という遺伝子が細胞分裂に必須であることを発見した。SVILの局在を調べたところ、Central spindleと呼ばれる分裂中の二つの細胞の中間にある特殊な構造に局在することが判明した。また、SVILはPLK1という細胞分裂に必須なタンパク質により、238番目のセリンがリン酸化されることが分かった。このリン酸化はSVILのCentral spindleへの局在に必須であった。PRC1はCentral spindleを形成するのに必須なタンパク質である。SVILはリン酸化依存的にPRC1の中央部分と結合していた。以上より、SVILはPLK1によりリン酸化され、そしてPRC1と結合することによりCentral spindleに局在すると考えられる。さらにSVILのリン酸化の役割を調べるため、リン酸化されない変異型SVILを細胞に導入した。

変異型SVILを発現する細胞では分裂時における収縮環の収縮が正常に進まないことが観察された。また、収縮環の収縮に必須なミオシンの活性化が阻害されることが分かった。SVILはミオシンと結合するタンパク質である。そこでミオシンと結合しない変異型SVILを細胞に発現させ、その影響を調べた。その結果、SVILとミオシンとの結合が分裂に必須であることが分かった。以上より、PLK1によりリン酸化されたSVILはCentral spindleに局在し、そしてミオシンと結合することでミオシンを活性化し、細胞分裂を促進すると推測される。当初の目的では、SVILをリン酸化するタンパク質とリン酸化部位の同定を助成3年度におこなう予定であったが、すでに終了している。また、目的に掲げていたSVIL結合タンパク質の探索もほぼ終了している。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初に掲げた目標を速やかに達成する。SVIL結合タンパク質を同定し、それがSVILの局在に必須であることを明らかにする。そしてPLK1によるリン酸化がSVILの局在をどのように制御し、SVILが収縮環の安定性に寄与する分子メカニズムを明らかにする。
植物器官の力学的特性を調節する遺伝子群の網羅的探索

植物器官の力学的特性を調節する分子メカニズム解明の糸口を掴むため、力学的特性の調節に関わる遺伝子群の網羅的な探索を行う。植物器官の力学的特性のうち、屈曲・引張・圧縮粘弾性をハイスループットに定量評価する技術の開発を行い、遺伝的多型を含むシロイヌナズナ集団を材料に力学的特性の網羅的な定量評価を実施する。本研究が完成した場合、植物器官の力学的特性を調節する分子メカニズムの解明に止まらず、生理的意義の理解や産業応用にもつながる可能性がある。
自家不和合性関連および細胞質内遺伝子群の多様性から見たバラ科植物の分子系統

バラ科植物(バラ、リンゴ)のオルガネラDNA、自家不和合性関連遺伝子群を解析し、次のような成果を上げた。1.バラ、リンゴのオルガネラDNA(葉緑体およびミトコンドリアDNA)は母系遺伝様式で後代に伝わる。2.リンゴ野性種19品種のオルガネラDNAのRFLP解析から分子系統樹を作製した。系統群は既存の分類群とよく一致したが、同じ属に分類されている品種の中に、異なる分岐群に属する場合が見られた。3.バラ野性種17品種のオルガネラDNAのRFLP解析、ならびにmatK部位の塩基配列データから分子系統樹を作製した。種間雑種は種子親の分岐群に属しており、また形態的に大きく異なり、かつ、別の節に属する品種が同じ系統群に属する例が見られるなど、既存の分類群と大きく異なる場合が見られた。4. RAPD解析法が、複雑な系譜を持つバラ栽培種のみならず、栄養繁殖により得られたクローン植物の識別・同定にも有効であることを明らかにした。5.リンゴ自家不和合性関連遺伝子群と相同性を有するクローンをプローブとしたRFLP解析法を用いて、リンゴ野性種、栽培種を同定・識別する系を確立した。本クローンはリンゴ自家和合品種と不和合品種を早期選抜する分子マーカーとしても有用であった。6.リンゴ16栽培種のS遺伝子型をS-allele特異的PCR法によって同定した。リンゴ栽培種`恵'の自家和合性はS遺伝子群の変異によるものではないことを示唆するデータを得た。葉緑体およびミトコンドリアDNAをプローブとしたバラ、リンゴ野生種のRFLP解析を行い、オルガネラDNAの多様性を検出した。これらのバラ科植物では、オルガネラDNAは母系遺伝様式で後代に伝わっており、解析に基づく系統分類の結果から、従来の形態的特徴に基づく分類とは一致しない点があることが明らかとなった。リンゴでは本法による分類群に、従来の分類では見られない地理的分布との間の相関が見られた。この点に関して、現在さらに詳しい解析を行っている。また、新たに導入したRAPD解析法により、複雑な系譜を持つバラ栽培種を識別・同定する系を確立した。リンゴから単離された自家不和合性遺伝子群と相同性のあるクローンをプローブとしたリンゴ野生種のRFLP解析を進め、これらのクローンが、リンゴ自家和合品種と不和合品種を早期選抜する分子マーカーとして有用であることを確認した。また、リンゴ野生種(自家不和合品種)の識別・同定にも有用であることがしされたが、これらのクローンの存在するゲノム上のローカスがヘテロで組換えを起こしやすい為、系統関係を復元するには至っていない。現在、リンゴ自家不和合品種から新たなクローンの単離を試みるとともに、自家和合品種およびバラからも自家不和合性遺伝子群と相同性を持つクローンの単離を試みており、これらのクローンの構造を比較して自家和合から不和合に至る分子進化と系統関係について明らかにしていく予定である。1.バラ、リンゴのオルガネラDNA(葉緑体およびミトコンドリアDNA)は母体遺伝様式で後代に伝わる。

4.RAPD解析法が、複雑な系譜を持つバラ栽培種のみならず、栄養繁殖により得られたクローン植物の識別・同定にも有効であることを明らかにした。5.リンゴ自家不和合性関連遺伝子群と相同性を有するクローンをプローブとしたRFLP解析法を用いて、リンゴ野性種、栽培種を同定・識別する系を確立した。本クローンはリンゴ自家和合品種と不和合品種を早期選抜する分子マーカーとしても有用であった。6.リンゴ16栽培種のS遺伝子型をS-allele特異的PCR法によって同定した。リンゴ栽培種`恵'の自家和合性はS遺伝子群の変異によるものではないことを示唆するデータを得た。
高温・乾燥地域での生育を可能にする植物の新規な蒸散制御システムの解明

東アフリカを原産とするヒマ(Ricinus communis)は優れた高温・乾燥耐性を持つが、その機構はいまだ明らかでない。これまでの研究から、ヒマ葉は他の植物と比較して、蒸散を厳密に制御しており、水分ロスを防ぐ新規な仕組みを持つと考えられた。そこで、ヒマ葉の顕微鏡観察を行い、蒸散が行われる気孔周辺の構造を観察したところ、気孔を形成する孔辺細胞直下にある葉内の間隙に、他の植物では見られない特殊な細胞を発見した。この細胞は気孔直下の間隙においてのみ観察された。この特殊な細胞の機能や働いている遺伝子を明らかにし、優れた高温・乾燥耐性システムの解明を目指す。
胎児・新生児向けウェアラブルバイタルモニタ装置の開発とその臨床評価

子宮内胎児死亡や新生児突然死を防ぐことを目的として,母体・胎児・新生児にストレスをかけずに胎児・新生児の心拍信号を長時間連続的にモニタリングできるウェアラブルバイタルモニタ装置の開発と評価を行った.母体を拘束せずに妊娠後期の胎児の常時心拍計測を可能とするために、妊婦用腹帯に電極を取り付けた母体腹壁電位信号取得用センサヘッドおよび小型の記録装置、胎児心拍信号分離アルゴリズムを開発した。また新生児を拘束せずに新生児の常時心拍計測を可能とするために、導電性布シート電極による体表面電位信号記録条件を明らかにするとともに、ウェーブレット解析により体表面電位信号から雑音を低減するアルゴリズムを開発した。【新生児心電計測システム】成人用の容量型非接触シート状心電計測システムの新生児への転用を試みた。本研究課題では、新生児用のシートセンサの試作を繰り返し、生後13日の新生児被験者数名の協力の下、心電図計測試験を行った。その結果、好条件が重なった場合に、明確にR波が確認可能な心電図の計測に成功し本システムの新生児への適用可能性が示された。一方これと並行して、心拍リズムに不調のある成人患者の心電図を対象に、突発性の血圧降下の予測をするための新しい心電図分析法の提案および試験解析を行った。一般的である自律神経バランス診断法によって得られる知見に近い診断結果に加えて、従来手法では観測不可能であった突発性血圧急降下の兆候を提案新手法によって観察した。【胎児心電計測システム】母体心電信号に比べて著しく微小な胎児心電信号を取得するために,ハムノイズ除去回路,高性能なアンチエイリアスフィルタ,対数増幅回路の設計・制作を行った.これらの回路により,雑音が小さく安定した心電信号を取得できることを確認した.また,取得した胎児および母体の心拍信号を離れた端末に無線伝送するシステムの試作を行った。試作したシステムは、センサから得られた信号を低雑音増幅し不要な雑音成分をフィルタリングにより抑圧した後にディジタル信号に変換し、Bluetoothを用いて無線伝送する。試作したシステムの基本動作を実験により確認した。今後のシステムを集積化に向け、小型かつ高効率な集積化電源回路の検討を行った。小型化に適する電源回路であるチャージポンプ回路において、出力電圧の制御を電力効率を犠牲にすることなく行う手法を提案し、シミュレーションにより原理の確認を行った。【臨床評価】研究初年度であるため臨床評価に向けた準備を進めただけで,臨床評価事態は行っていない.1.容量型非接触新生児心拍測定技術:これまでに開発された容量型非接触心電計測技術を新生児に適用し、成人用の測定方法に新生児特有の条件を加味した方法を検討した。その結果、心電図の主成分であるR波の検出は可能となった。加えて、計測した長時間R波を解析して新生児の体調変化予測をするソフトウェアの開発を進めている。2.ウェアラブル胎児心拍測定センサ:ウェアラブル胎児心拍測定用センサヘッドを用いた心拍測定技術を開発するとともに,母体心拍信号と胎児心拍信号を分離する信号処理技術について検討した.後者について多チャネルで測定した信号に独立成分分析を用いることでクリアに分離できることを確認したことから,最大6チャネルで測定可能なセンサヘッドおよび測定装置を作成し,本学医学部産婦人科学科の協力を得て妊婦の腹壁電位信号の実測実験を行った.3.心拍信号取得・伝送装置:胎児および母体の心拍信号を取得し,無線伝送するシステムを構築した。取得した心拍信号から独立成分分析により胎児と母体の心拍の信号の分離を可能とするため,センサ後段の低雑音増幅回路の多入力化・小型化を実現する構成を提案した。後段の独立成分分析によりチャネル間干渉の影響が除去可能であることを活用し,大幅な小型・省電力化を実現した増幅回路の構成を提案した。提案する多入力増幅回路の一部の試作を行った。導電性布電極を用いたウェアラブルな母体腹壁信号計測プロトタイプの開発を継続して行うとともに、計測された母体腹壁電位信号から母体心拍信号と胎児心拍信号を分離するアルゴリズムの開発を行った。平成27年6月に、それまで母体腹壁電位信号の計測に用いてきたプロトタイピングツールの電気的故障が生じたが、このツールの市場供給が停止していたため、全く新しい部品で一から装置開発をやり直す必要が生じ、Raspberry Piをベースにした新しい母体腹壁電位信号計測装置を開発した。また、母体腹壁電位信号の計測に用いる生体信号増幅器については、この段階で基礎としていた独立成分分析に適した方式の回路構成を見出し、通常の複数チャネルの増幅器を単純に並列化した場合に比べて小型に集積化できることを明らかにした。一方、胎児心拍信号の分離アルゴリズムについては、検討を行ってきた独立成分分析を基礎とした分離アルゴリズムの性能限界が明らかになったことから、他のアルゴリズムの検討に着手した。独立成分分析では、分析結果として得られるいずれの独立成分に胎児心拍成分を含むのか、が明確ではないことも問題となった。このため、ベースアルゴリズムを主成分分析に切り替え、第一主成分から生成した母体心拍テンプレート波形を第一主成分から減算することで、独立成分分析や他の適応アルゴリズムよりも高い分離精度を有するアルゴリズムを開発した。導電性布電極を用いた母体腹壁電位信号計測実験を繰り返し実施した結果、導電性布電極の位置・形状によって、計測される母体腹壁電位信号の強度や信号体雑音比が大きく変化することを確認した。このことから、最適な電極形状、配置の検討を開始した。

母体腹壁電位信号の計測に用いてきたプロトタイピングツールの電気的故障が生じたが、このツールの市場供給が停止したため。母体腹壁電位信号からの胎児心拍信号の分離方法の検討を継続して行った。前年度まで独自開発を行ってきた小型の生体信号計測装置については、より小型の市販品の存在が明らかになったことから、独自開発を中止し、これを購入することで信号計測および胎児心拍信号の分離アルゴリズムの開発に研究の重点を移した。前年度までに開発した主成分分析とテンプーレート減算を用いる胎児心拍信号分離アルゴリズム(PCA-TS法)によって人為的に合成した疑似母体腹壁電位信号に対する解析を行い、胎児心拍成分の分離に必要となる母体心拍信号と胎児心拍信号の振幅比(Pm/Pf)および信号対雑音比(SNR)を明らかにした。購入した小型生体信号計測装置を利用して臨床実験を複数回実施し、当該装置に寄って母体腹壁電位信号を取得できることを確認した。また、取得した母体腹壁電位信号に対してPCA-TS法を適用することで、テンプレート減算後の残差信号に胎児心拍成分が含まれることを確認した。また、母体腹壁電位信号計測の臨床実験を通じ、腹帯に導電性布電極を縫製したウェラブルセンサヘッドは、導電性布の柔軟性の不足が原因で、安定して母体腹壁電位信号を取得できないことが明らかになったことから、導電性布以外の電極についての検討を開始した。子宮内胎児死亡や新生児突然死を防ぐことを目的として,母体・胎児・新生児にストレスをかけずに胎児・新生児の心拍信号を長時間連続的にモニタリングできるウェアラブルバイタルモニタ装置の開発と評価を行った.母体を拘束せずに妊娠後期の胎児の常時心拍計測を可能とするために、妊婦用腹帯に電極を取り付けた母体腹壁電位信号取得用センサヘッドおよび小型の記録装置、胎児心拍信号分離アルゴリズムを開発した。また新生児を拘束せずに新生児の常時心拍計測を可能とするために、導電性布シート電極による体表面電位信号記録条件を明らかにするとともに、ウェーブレット解析により体表面電位信号から雑音を低減するアルゴリズムを開発した。1.センサ使用方法の改善により、新生児のR波が計測可能となった。加えて、心拍変動(Heart Rate Variability: HRV)の長時間データに対して、情報理論に基づいて「体調変調時(特に急な血圧の降下)」を特定するHRV解析手法の開発を行ってきた。新生児の異常HRVデータは十分な数が無いために主として成人患者データを利用し、評価関数の組み立てを実施した。本件担当者が入試実施責任者に任命されたことから,昨年度は研究の進捗がやや遅れた.2.母体/胎児の信号分離技術は確立できたが,それに必要な多チャネル信号測定装置の実装に問題があり,多チャネルでの臨床信号測定が難航していることから「(3)やや遅れている」とした.これまでの成果(装置構成と実測例・信号分離技術)を2回国内学会において発表した.3.個別部品を用いた胎児の心拍測定システムの試作機の開発と,提案する小型・省電力化に適した多入力化増幅回路の回路設計およびレイアウト設計が完了している。
身近な昆虫を利用した行動観察法の確立：ボウフラの捕食回避行動に着目して

生物界に広く見られる、食うもの(捕食者)と食われるもの(被食者)の関係や捕食回避行動を高校生や大学生に進化の視点で理解させるため、蚊の幼虫(ボウフラ)とその捕食者(ミナミメダカ)を用いた実験・観察系を確立することが本研究の目的である。この目的を達成させるため、以下のサブテーマに取り組んだ。1教材候補種の採集方法の確立:北海道、兵庫、長崎、沖縄の大学キャンパスや民家にトラップを仕掛け、採集されるボウフラを調べたところ、いずれの地域でもトラップLLサイズではアカイエカ種群(アカイエカ、ネッタイイエカ)、Sサイズではヤブカ類(北海道と兵庫:ヤマトヤブカ、長崎と沖縄:ヒトスジシマカ)が採集できることが分かった。これらはトラップのサイズを分けることで採集できることが判明した。2行動観察:アカイエカ種群とヤブカ類の行動観察を対照区とメダカがいた水(メダカ水)で比較したところ、アカイエカ種群は有意にメダカ水中で行動が抑制される一方で、ヤブカ類では行動の変化が観察されなかった。3年間の調査からヤブカ属2種およびイエカ属4種の合計6種で実験を行い、メダカ水で強く行動抑制が現れるのはイエカ属4種で不変であることが分かった。3高校、大学および教員免許更新講習での実験の実施:3年間で長崎市内の公立高校、長崎大学教育学部の学生(理科専攻2年生)および長崎県内で実施の教員免許更新講習でボウフラを用いた実験・観察を実施した。いずれの実験・観察においても、高校生、大学生および現職教員が実施しても、実験の再現性が確認され、受講者からの評価も高かった。また、教員にも実施することで、今後教材として普及していくことを期待したい。なお、ボウフラの採集から観察までを解説した実験マニュアルを現在作成中である。生物界に広く見られる、食うもの(捕食者)と食われるもの(被食者)の関係を生徒や学生に進化の視点で理解させるため、蚊の幼虫(ボウフラ)とその捕食者を用いた実験・観察系を確立することが本研究の目的である。平成28年度は以下のサブテーマに取り組んだ。1教材候補種の採集方法の確立:長崎と、長崎とは蚊相が異なる琉球列島で様々なサイズのトラップを設置し、採集されるボウフラを調べたところ、いずれの地域でもLLサイズのトラップではアカイエカ種群、Sサイズではヒトスジシマカが採集できることが分かった。2行動観察:トラップで採集され得るアカイエカ種群3種のアカイエカ、チカイエカ、ネッタイイエカに加え、ヒトスジシマカの行動観察を対照区と、身近な天敵であるメダカがいた水(メダカ水)で比較したところ、アカイエカ種群は有意にメダカ水中で行動が抑制される一方で、ヒトスジシマカでは行動の変化が観察されなかった。また、西表島で採集される蚊でも同様の行動観察を行い、行動変化が確認される種を選定した。3生活史形質への影響:捕食者の存在がボウフラの行動を変化させ、結果的にボウフラの成長にも影響することが考えられるため、実験室条件下で捕食者・メダカの有無が蚊の生活史形質に与える影響を検討した。その結果、アカイエカ種群3種では羽化率、発育日数、成虫サイズに処理区間で有意な違いが検出されたが、ヒトスジシマカでは処理区間で違いがなかった。しかし、今年度の実験ではアカイエカ種群の羽化率が低かったため、飼育条件の再考を含めて次年度に追試を行いたい。4野外の天敵:野外に設置したトラップでボウフラとともに採集される天敵を調べたところ、長崎及び沖縄ではカクイカの仲間が共に存在していた。また、長崎ではカタビロアメンボ類も確認され、これらの捕食から逃れられるような行動変化が、ボウフラに現れるのかもしれない。これは次年度の課題としたい。予算の関係で学外での調査が少なくなったものの、予定していたテーマの8割は実施できている。生物界に広く見られる、食うもの(捕食者)と食われるもの(被食者)の関係を生徒や学生に進化の視点で理解させるため、蚊の幼虫(ボウフラ)とその捕食者(ミナミメダカ)を用いた実験・観察系を確立することが本研究の目的である。平成29年度は以下のサブテーマに取り組んだ。1教材候補種の採集方法の確立:長崎と蚊相が異なる北海道帯広市にある帯広畜産大学構内に、平成28年度に長崎と沖縄で使用したトラップと同型のものを設置し、採集されるボウフラを調べたところ、トラップLLサイズではアカイエカ種群(アカイエカ)、Sサイズではヤマトヤブカが採集できることが分かった。この2種はトラップのサイズを分けることで採集できることが判明した。2行動観察:北海道帯広市に設置したトラップで採集されたアカイエカとヤマトヤブカの行動観察を対照区とメダカがいた水(メダカ水)で比較したところ、アカイエカは有意にメダカ水中で行動が抑制される一方で、ヤマトヤブカでは行動の変化が観察されなかった。このことから、北海道には、これまで教材候補と考えていたヒトスジシマカは分布していないが、ヤマトヤブカが同ニッチを占める種として教材化が可能なことが分かった。トラップの中には捕食性のボウフラも見られたが、種を確定できなかったので、今後の課題としたい。

3高校での講義:2017年10月に長崎市内のN高校において、出前オープンキャンパスの一環で高校1、2年生を対象に60分の講義を2回実施(合計82名)し、その中でアカイエカの行動観察を行った。高校生に実験の背景と観察のポイントを説明した後に、実験に取り組んでもらったが、皆、大学生と同じような結果が得られた。このことから、現在取り組んでいる研究課題・手法は高校の授業内でも実施でき、教材化が可能であることが確認できた。予定していた北海道での調査と教材化に向けた講義も実施できたことが収穫であり、結果もまずまずであったと思う。次年度は北海道のボウフラ捕食者に関するデータを取得する必要がある。生物界に広く見られる、食うもの(捕食者)と食われるもの(被食者)の関係や捕食回避行動を高校生や大学生に進化の視点で理解させるため、蚊の幼虫(ボウフラ)とその捕食者(ミナミメダカ)を用いた実験・観察系を確立することが本研究の目的である。この目的を達成させるため、以下のサブテーマに取り組んだ。1教材候補種の採集方法の確立:北海道、兵庫、長崎、沖縄の大学キャンパスや民家にトラップを仕掛け、採集されるボウフラを調べたところ、いずれの地域でもトラップLLサイズではアカイエカ種群(アカイエカ、ネッタイイエカ)、Sサイズではヤブカ類(北海道と兵庫:ヤマトヤブカ、長崎と沖縄:ヒトスジシマカ)が採集できることが分かった。これらはトラップのサイズを分けることで採集できることが判明した。2行動観察:アカイエカ種群とヤブカ類の行動観察を対照区とメダカがいた水(メダカ水)で比較したところ、アカイエカ種群は有意にメダカ水中で行動が抑制される一方で、ヤブカ類では行動の変化が観察されなかった。3年間の調査からヤブカ属2種およびイエカ属4種の合計6種で実験を行い、メダカ水で強く行動抑制が現れるのはイエカ属4種で不変であることが分かった。3高校、大学および教員免許更新講習での実験の実施:3年間で長崎市内の公立高校、長崎大学教育学部の学生(理科専攻2年生)および長崎県内で実施の教員免許更新講習でボウフラを用いた実験・観察を実施した。いずれの実験・観察においても、高校生、大学生および現職教員が実施しても、実験の再現性が確認され、受講者からの評価も高かった。また、教員にも実施することで、今後教材として普及していくことを期待したい。なお、ボウフラの採集から観察までを解説した実験マニュアルを現在作成中である。上記で掲げた『生活史形質への影響』の追試と『野外の天敵』が存在する際のボウフラの行動変化を調べたい。また、教材化に向けたマニュアル作りに着手するため、中学校の理科の授業内で、観察を実施する予定である。最終年度は長崎大学教育学部附属中学校において、中学生向けの講義に加え、長崎県内の離島において教員免許状更新講習の中で現職教員向けに観察を実施する。また、マニュアルの完成と取得したデータの論文化を進める予定である。
５才児、１年生、２年生における読解力の研究－アイムーブメントの分析を通して－

本研究はアイカメラとビデオカメラを連動させて、5才児、1年生、2年生が絵本を読んでいる時の眼球の動きと音読とを同時にとらえると共に、読後の読解力テストを行って、読みと読解力との関係を明らかにしたものである。その結果、読解力と読み間違い数、読みの速さとの間には有意な相関はなかったが、読解力の得点と読み戻り数との間に強い相関が見られ、読み戻り数が多かった子の読解力得点は高く、読み戻り数が少なかった子の得点は低かった。そこで、読み戻りのヶ所の質的分析を行った結果、読み戻りは単なる音読上の読み直しではなく、語や文の意味について考える行為の反映であり、それが読解の深さに関係していることが明らかとなった。福山市と岡山市の計4保育園で、就学前の5才児、1年生、2年生、合計40名ずつで本実験を行った。アイムーブメントの実験と読解力のインタビューによって得られたデータを、(1)音読分析1読み間違い2読了時間、(2)アイムーブメント分析1眼球(視線)はどのように移動したか(saccade)2眼球はどの文字及び単語に注視したか(fixation)3眼球はどれくらいの時間その文字または単語に停止したか(duration)4眼球はどの文字または単語に読み戻ったか(regression)、(3)読解力分析の3つの部分にまとめた。これらの結果を重ね合わせることによって、1)読解力のレベルとアイムーブメントの注視数との間にはどのような関係があるか?2)読解力のレベルとアイムーブメントの注視時間の長さとの間にはどのような関係があるか?3)読解力のレベルとアイムーブメントの読み戻りのパターン及び回数との間にはどのような関係があるか?4)読解力のレベルとテキストを読み終えるまでの時間との間には、どのような関係があるか?5)アイムーブメントのどの要素が読解力に関係しているかが明らかなると考えられる。次年度に、これらの関係を考察することによって、視線の動きとその音声化に併行する高次な情報処理(意味の理解)との関係、及び、読解力の要因が明らかにしたい。1.被験児の選定:実験施設の教師、保育士、保護者の協力を得て、被験児の選定を行う。実験施設は、福山市内と岡山市内の4つの保育所に通う5歳児30名と2つの学童保育所に通う1年生30名と2年生30名である。全員が文字カードによる調査で平仮名50音の読める子どもであり、今までにテキスト『ともだちや』を読んだことのない子どもたちである2.使用するテキストの決定:テキストは、まだ被験児に一度も読まれていない内田麟太郎(作)、降矢なな(絵)の絵本『ともだちや』(偕成社)を選んだ。本書は幼児、児童に大変人気のある絵本であり、又、小学校2年生の道徳科の副読本(主題は友情)として定評のあるものである。3.使用する機器の選定と購入:アイカメラ及びソフトウェアは、現在世界で最も多く使われているApplied Science LavatoryのET-PC, Eye-Track PC Processing Unitを購入した。4.パイロットリサーチ:5歳児20名で、以下の項目について、本実験のフォーマットが適切かどうかの予備実験を行い、いくつかの修正を行った。1実験の雰囲気、明るさ、被験児、実験者、機器の配置はよいか2アイカメラ及びソフトウェアはうまく作動するか3被験児の年齢、人数は適切か4選定した使用するテキストは適切か5実験者の導入、インタビューの方法とその内容は適切か6研究のねらいに即したデータを収集することができるかの4点について予備実験をして修正を行い、本実験の準備を整えた。“読み"の本質は、単に書かれていることを音声化することではなく、その「意味」を理解することである。人は書かれているものを読む時、文字を音声化する前に文字や単語に一定時間注視し、眼球を移動させながら書かれている文字を判読して読解するので、読んでいる時の眼球の注視の数、位置、時間、読み戻り数等のアイムーブメントデータを取得することによって、読解(力)に関する貴重な知見を得ることができる。そこで、本研究ではアイトラッカーとビデオカメラを連動させて、5才児、1年生、2年生が絵本を読んでいる時の眼球の動きと音読とを同時にとらえると共に、読後の読解テストを行い、これら3つのデータを重ね合わせた分析を行った。その結果、一般に文章を読み間違えずに速く読める子は読み能力が高く読解力がよい子だと思われているが、読解力と読みまちがい数、読みの速さ等の間には有意な相関はなかった。

一方、読解力の得点と読み戻り数との間には強い相関が見られ、読み戻り数が多かった子は読解力の得点が高く、読み戻り数が少なかった子は低かった。しかし、数量的分析だけでは、読み戻りがどのような理由で読解に関係しているかはわからないので、さらに読解力質問に対応する個所の読み戻りのグラフィックデータを分析した。その結果、読み戻りは単なる音読上の読み直しや読み間違いを訂正する行為ではなく、語と語、文と文との間の意味について考える行為の反映であり、それが読解力(高得点)と関係していることが明らかとなった。一般に、読み戻りは読み能力や年齢が大きくなれば無くなるという消極的な意義しか与えられていないが、本研究で明らかとなったことは、読み戻りは単に読みを修正するためのものではなく、文に書かれている意味をより正しく、より深く理解するための知的な関係づけを反映するアイムーブメントであり、読解力の重要な要因をなすもののひとつであるということである。社会科学教育学1予備実験の結果の修正を行ったことによって、本実験でのデータの精度が上がり、予測したデータが順調にとれた。2データ処理に当初想定した以上の時間がかかっているが、データの編集とまとめの作業は順調に仕上がりつつある。1.機器の購入が送れたことと、関連機器の調整のためASL社とのやり取りに時間がかかった。2.協力者が機器の操作に習熟し、データの精度が上がるまでに時間がかかった。3.当初予定していた被験児のカリブレーションのフォーマットに若干のズレが生じ、その修正と再フォーマットに時間を要した。26年度は、1.研究のまとめと報告書の作成、2.研究成果の学会発表及び論文投稿を行うことにしている。1.アイムーブメントの実験と読解力のインタビューによるデータの収集を就学前の5歳児・1年生・2年生で行う。2.収集されたデータ(結果)のまとめ3.結果の考察前年度繰越金5,639円のうち4,640円が残ったので、それを次年度使用額として繰り越したため。1当初予算には、協力者への謝礼金が計上されていなかったが、膨大なデータの整理と編集に協力者の作業が必要になったため、その必要経費200,000円を計上した。2当初の26年度予算には、International Reading Association (セントルイス)とInternational Reading Association in Asia(インドネシア)、日本教育学会で発表するための予算269,000円を計上していたが、この予算額では発表者3名分の費用を賄うことが出来ないことがわかったので、2014年8月22日(月)からの日本教育学会第73回大会(九州大学)のみで発表することとし、その予算130,000円(3名分)を計上した。3学会参加費・研究成果冊子印刷代70,000円(当初予算通り)データ収集に対する実施施設への謝礼200,000円実験時の機器の操作とデータ整理等の協力者への謝礼135,000円
1細胞PCRを用いたミトコンドリアDNA分類によるがん早期診断

従来ミトコンドリアゲノム異常は、神経・筋異常を来たす稀な先天的疾患であると考えられてきた。申請者はこの10年いち早くその酸化障害修復と維持機構研究に取り組んできた。最近は、老化、糖尿病、心不全、癌などのより一般的な疾患においてミトコンドリアゲノム異常がその病態に深く関わっていることが次々と明らかになり、体細胞性の変異蓄積の重要性が再認識されている。今回癌細胞におけるミトコンドリアゲノムの変異についてその診断的価値について検討を始めた。ミトコンドリアゲノムは環状DNAで1細胞当たり数百から数千コピー存在する。このように多コピーで存在するため、一部ミトコンドリアDNAに変異が生じても正常DNAと変異DNAが1細胞内に混在することになり、この状態をヘテロプラスミーと呼ぶ。一方正常型か変異型かのどちらかのみが存在する状態をホモプラスミーと呼ぶ。近年様々ながん細胞ミトコンドリアDNAで同一個体の周辺非がん部組織に見られないホモプラスミー変異が高頻度(70-80%)で見られるという報告がある。少なくとも、このホモプラスミー性の変異は細胞のクローナルな増殖を反映し腫瘍性変化のよい指標となる可能性が指摘されている。今回まず1細胞PCRでミトコンドリア遺伝子の全塩基配列決定できる検査システムを構築することを目的とし、1細胞からのミトコンドリアゲノム全領域のPCR増幅と全塩基配列決定系を確立した。一方、癌細胞におけるヘテロプラスミー性変異の頻度とその臨床的意義を明らかにすることおよび臨床応用を考えた配列決定の迅速化のため、現在Affymetrix社のMitoChipと言うDNAチップを用いたヘテロプラスミーの検出測定系を検討中した。実際の患者サンプルと2種のDNAを混合した人工的なヘテロプラスミーサンプルを用いた。まず、配列の同定能力が95%程度で、実用的検査には使えないレベルであった。またヘテロプラスミーの検出も10%程度で通常のシークエンサーに勝るのもではなかった。現時点では上記のDNAチップは臨床現場に使える段階にはなかった。ミトコンドリアゲノムは核に比べはるかに酸化障害を受けやすい。今回癌細胞におけるミトコンドリアゲノの変異についてその診断的価値について検討を始めた。このようにコピーで存在するため、一部ミトコンドリアDNAに変異が生じても正常DNAと変異DNAが1細胞内に混在することになり、この状態をヘテロプラスミーと呼ぶ。一方、癌細胞におけるヘテロプラスミー性変異の頻度とその臨床的意義を明らかにすることおよび臨床応用を考えた配列決定の迅速化のため、現在DNAチップを用いた1%までのヘテロプラスミーの検出可能な測定系を検討中である。

まず、配列の同定能力が95%程度で、実用的検査には使えないレベルであった。またヘテロプラスミーの検出も10%程度で通常のシークエンサーに勝るのもではなかった。現時点では上記のDNAチップは臨床現場に使える段階にはなかった。
骨髄抑制剤併用G-CSF療法は心筋梗塞組織の再生を促進し、心機能を著名に改善する

骨髄抑制剤(MS:5-FU+CP)+G-CSF(顆粒球コロニー刺激因子)併用療法による梗塞後心機能改善効果とメカニズムの検討を以下の4群のウサギで検討した。(1)骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群:梗塞後1、2日目にMSを静注、梗塞後3日目より5日間G-CSFを皮下注射、(2)G-CSF単独療法群:梗塞後1、2日目に生理食塩水を静注、3日目より5日間G-CSFを皮下注射、(3)MS単独療法群;梗塞後1、2日目にMSを静注、3日目より5日間生理食塩水を投与、(4)非治療梗塞群:梗塞後7日間生理食塩水を投与。結果および考察A)梗塞前および28日後左室駆出率・左室壁厚・左室径は、骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群で、改善が最も良好であった。B)CD^<34>陽性単核球は骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群およびG-CSF単独療法群で高度に増加した。C)共焦点レーザー顕微鏡では、骨髄由来(赤色の蛍光色素DiI陽性)の心筋細胞は骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群でもっとも多かった。しかし、その頻度は骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群でも1-2%程度で、心機能改善効果を説明するには少なすぎた。D)梗塞7日目に摘出した心筋組織のVEGFおよびMMP-1のウエスターンブロット解析では骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群がもっとも多かった。E)梗塞28日目に摘出したモデルウサギ心では左室重量および心筋細胞のサイズに4群間で差がなかった。しかし、陳旧性梗塞領域は非治療梗塞群で最大で、骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群で最小であった。また、CD31陽性毛細血管およびα-平滑筋アクチン陽性筋線維芽細胞数は骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群で最も多かった。以上より、骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群での高度の心機能改善効果の成因は骨髄由来の心筋細胞再生よりはMMP等のサイトカインの関与が重要と思われる。骨髄抑制剤+G-CSF併用療法による心機能・リモデリング改善効果および梗塞縮小効果・分子メカニズムの検討対象および方法日本産白色種オスのウサギ60羽を以下の4群に分け、(1)骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群は、梗塞後1、2日目に5-FU+CPを静注、梗塞後3日目より5日間G-CSFを皮下注射、(2)G-CSF単独療法群は、梗塞後1、2日目に生理食塩水を静注、3日目より5日間G-CSFを皮下注射、(3)5-FU+CP単独療法群は、骨髄抑制剤併用療法群と同様に梗塞後1、2日目に5-FU+CPを静注、3日目より5日間生理食塩水を投与、(4)非治療梗塞群は梗塞後7日間生理食塩水を投与した。

心エコー検査および血液検査を行った後、摘出した心は、ホルマリン固定後、パラフィン包埋し、ミクロトームで4μの薄切切片を作成して、ヘマトキシリン・エオジン、マッソントリクローム、シリウス・レッド染色を行い、定量的に梗塞サイズ、左室サイズ、左室壁厚等を測定した。また、免疫組織学的検討を行った。結果A)梗塞前および28日後に全身麻酔下で心エコーにて左室駆出率・左室壁厚・左室径を測定したが、非治療群に比べ、骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群で、左室駆出率、左室壁厚、左室径ともに改善が最も良好であった。B)同一個体のウサギから連続的に梗塞前、2日目、7日目、14日目、21日目および28日目に採血して、白血球数および分画を測定したが、骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群およびG-CSF単独療法群で7日目にCD^<34>陽性単核球が増加していた。考察骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群で、骨髄より多分化能を有する細胞が末梢血に動員され、最も良好な結果が得られたと示唆された。研究II:骨髄抑制剤+G-CSF併用療法効果の分子メカニズム昨年度の研究で骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群で心機能改善効果ならびに抹消血のCD34陽性細胞数が著しく高いことを報告した。本年度はそのメカニズムを解明するために以下のことを行った。対象および方法日本産日本白色種オスのウサギを昨年度と同様に4群に分ける(骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群;G-CSF単独療法群;骨髄抑制剤単独療法群;非治療梗塞群、各群n=10)。結果および考察1.骨髄細胞をDiI(赤色の蛍光色素)でマーカーした後、梗塞7日目に摘出したモデルウサギ心の共焦点レーザー顕微鏡の観察において、骨髄由来(DiI陽性)の心筋細胞および血管内皮細胞は非治療梗塞群でもっとも少なく、G-CSF単独療法群および骨髄抑制剤単独療法群で次に多く、骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群でもっとも多かった。しかし、その頻度は骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群でも1-2%程度で、心機能改善効果を説明するには少なすぎると思われる。2.梗塞7日目に摘出した心筋組織のVEGFおよびMMP-1のウエスターンブロット解析では非治療梗塞群がもっとも少なく、骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群がもっとも多かった。3.梗塞28日目に摘出したモデルウサギ心では左室重量および心筋細胞のサイズに4群間で差がなかった。しかし、陳旧性梗塞領域は非治療梗塞群で最大で、骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群で最小であった。また、CD31陽性毛細血管およびα-平滑筋アクチン陽性筋線維芽細胞数は非治療梗塞群でもっとも少なく、骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群でもっとも多かった。以上より、骨髄抑制剤+G-CSF併用療法群での高度の心機能改善効果の成因には骨髄由来の心筋細胞再生と共に、MMP等のサイトカインの関与が考えられる。
獣医療におけるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の保菌と予防に関する疫学研究

民間動物病院や大学付属動物病院の獣医師のMRSA保菌率は高かったが(23%または12%)、彼らに接触した犬のMRSA保菌率は1% (3/292)と低かった。しかし、犬由来MRSAの遺伝子型は、同じ動物病院の獣医療スタッフ由来MRSAの遺伝子型と共通で、動物病院内での伝播が推察された。獣医療由来MRSAの遺伝子型は、ST5-spa t002-SCCmec IIが最も多く、日本の院内感染型と同じであった。獣医師らの衛生対策とMRSA保菌の関連を解析したが、MRSAの予防因子は特定できなかった。診療時の1頭ごとの手洗い等の実施率自体が低く、獣医療における衛生対策の改善が必要と考えられた。獣医師らからメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)を分離する過程で、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(MRCNS)が多数分離された。MRCNSは、耐性遺伝子であるmecAの起源と考えられているため、72株のMRCNSの解析を行った。54株(75%)がStaphylococcus epidermidis (MRSE)と同定され、大半を占めた。MRSAとは異なり、MRCNSの26株(36.1%)はβ-ラクタム系のみに耐性を示したが、それ以外の3剤以上に耐性を示す多剤耐性株も22株(30.6%)認められた。また、日本の院内感染型および獣医師らから分離される大半のMRSAのSCCmec型はII型であるが、MRCNSのSCCmec型は48株(66.7%)がIV型で、II型は3株と少なかった。これらMRCNSの病原性は低いと考えられるものの、多剤耐性株も多く、獣医療における院内感染対策を強化する必要がある。研究目的:獣医療を介したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染拡大の防止を目的に、獣医師等の職業上のMRSA感染リスク因子と予防因子を特定するため、疫学解析および分子疫学解析を行った。研究方法:犬や猫の診療に従事する獣医師および動物看護師(VT)の鼻腔スワブからMRSAを分離し、SCCmec type、spa typeおよびMLSTによるSTを決定した。また、獣医師らの診療頭数など診療内容(6項目)、MRSA症例との接触歴(2項目)、手指消毒など衛生管理(7項目)、その他18項目について調査し、MRSA保菌との関連を調べた。考察:診療時のマスク着用や症例ごとの手指消毒の実施率は低く、獣医療におけるMRSA予防因子は特定できなかった。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)は、人の医療現場における院内感染の原因菌である。近年は、手術や入院歴のない人から市中感染型MRSAが分離され、新たな問題になっている。さらに、臨床獣医師らにおいて、高いMRSA保菌率が認められ、獣医療や伴侶動物を介したMRSAの感染拡大を防ぐ必要がある。獣医師等の職業上のMRSA感染リスク因子と予防因子を特定するため、調査を行った。MRSAの分離材料として獣医師らの鼻腔スワブを収集し、診療頭数など診療内容6項目、MRSA症例との接触歴2項目、手指消毒などの衛生管理7項目、その他18項目について調査した。獣医師50名のうち、6名(12%)からMRSAが分離された。MRSA保菌者と陰性者の疫学情報を解析すると、保菌者の診療頭数は平均83頭で、陰性者(平均40頭)より有意に多かった(P<0.05)。一方、臨床経験年数、手術頭数、抗生物質投与頭数などに有意な差は認められなかった。今後、分離されたMRSAの遺伝子型と疫学情報のより詳細な解析を進める予定である。また、先行して実施した獣医療における調査で分離したMRSA(獣医師由来22株、動物看護師由来7株および犬由来3株)の遺伝子型を調べた。その結果、獣医療において分離されるMRSAは、日本の医療現場でよく検出される遺伝子型(spa t002-SCCmec II)が大半(20/32)を占めた。また、犬から分離されたMRSAの遺伝子型(ST5-spa t002-SCCmec IIまたはST30-spa t021-SCCmec IV)は、その犬が飼育または診療を受けた動物病院に勤務する獣医師らから分離されたMRSAの遺伝子型と一致し、動物病院内で獣医師から犬へMRSAが伝播したと推測された。MRSA調査の中で先行研究と比べ高率に分離されたMRCNSの解析を概ね終わらせることが出来た。

MRCNSは、MRSAの持つSCCmecの起源と考えられているが、分離されたMRCNSの一部に、MRSAが持つ非典型mec複合体と相同性の高い構造を持つ株が存在することを明らかにできた。計画通り、獣医師らから分離材料と疫学情報を収集し、MRSAの分離を行った。また、これに加え、疫学情報と分離結果の単変量解析を終了した。さらに、先行して行った調査の中で分離していたMRSAの遺伝子型別から、動物病院内でのMRSA伝播を明らかにすることが出来た。しかし、倫理審査により、当初計画していた調査対象の一部を除外したため、調査規模が縮小した。今年度は、MRCNSの解析を中心に行ったため、初年度に分離したMRSAの遺伝子解析を進める。また、MRSA保菌にかかる疫学情報の多変量解析等を行い、危険因子と予防因子を検索する。本研究課題の最終年度となるため、論文の執筆等にも着手する。新たな調査の中で分離されたMRSAについて遺伝子型別を進め、疫学情報の多変量解析等を行う。今回の調査では、先行した調査と比べ、MRSAの分離率が低下した一方で、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(MRCNS)の分離率が上昇した。MRCNSは、耐性遺伝子であるmecAの起源とも考えられているため、MRCNSの遺伝学的解析もあわせて行う予定である。遺伝子解析を中心とした消耗品の購入の他、論文執筆の際の英文校閲、投稿料、印刷代等を計画している。当初調査対象として計画していた獣医学生については、倫理審査の過程で調査対象から除外したため、予算の一部を次年度に繰り越した。しかしながら、上述した通りmecAの起源とも考えられているMRCNSの分離率が急増したため、次年度はこれらの遺伝子型別もあわせて行う予定である。
脳腫瘍幹細胞抗原および微小環境を標的とした複合的免疫療法の開発

本研究では、グリオーマ細胞、脳腫瘍幹細胞、およびグリオーマ組織において、免疫抑制性のVEGF/VEGFR系が高発現していることを明らかにした。また、再発悪性神経膠腫8症例に対してVEGFR1/2ペプチドワクチン療法を施行し、重篤な有害事象なく2例の不変(stable disease: SD)が得られた。投与前後のVEGFR特異的T細胞(CTL)の解析(6症例)を行った結果、ワクチン後にVEGFR1特異的CTLが6例中6例、VEGFR2特異的CTLが6例中2例で誘導された。以上からVEGF阻害(腫瘍免疫抑制の制御および腫瘍血管新生抑制)による新たな免疫療法の有効性が示唆された。癌幹細胞は様々な免疫抑制分子を産生し、腫瘍局所における免疫抑制環境を構築すると考えられているが、その詳細は明らかでない。本研究では、第一に脳腫瘍幹細胞(brain cancer stem cell; BCSC)が産生し、強力な腫瘍免疫抑制作用を有するVEGFに着目して、グリオーマの免疫学的微小環境およびBCSCによる腫瘍免疫抑制・抵抗性の解析を行う。さらにVEGFは腫瘍血管新生作用を有する機能分子である。そこで本研究では、極めて難治性のBCSCに対する治療法を開発するため、VEGF阻害(腫瘍免疫抑制の制御作用および腫瘍増殖・腫瘍血管新生の抑制作用)による、新たな免疫療法の有効性を検討する。これまで本研究では、グリオーマ細胞、BCSC、およびグリオーマ組織において、免疫抑制性のVEGF/VEGFR系が高頻度に発現していること、グリオーマ、BCSCが産生するVEGFが、血管内皮細胞にシグナル伝達するパラクライン機構のみならず、腫瘍細胞自身にもシグナル伝達するオートクライン機構が存在する可能性を明らかにした。また、悪性グリオーマ組織においてVEGFRは、腫瘍辺縁部と比較して腫瘍内で高発現していることから、低酸素状態によるVEGF/VEGFR系の発現誘導が示唆された。さらにVEGFR1/VEGFR2ペプチドワクチンが施行された患者血液を用いて、ワクチン投与前後のVEGFR特異的細胞傷害性T細胞の誘導に関する解析を行ったところ、ワクチン後にVEGFR1特異的細胞傷害性T細胞がほぼ全例で誘導されていること、一方、VEGFR2特異的細胞傷害性T細胞の誘導は一部の患者で認められた。本年度はグリオーマ細胞、BCSC、およびグリオーマ組織における免疫抑制性因子であるVEGF/VEGFRに着目して発現解析を行った。はじめに悪性グリオーマ組織におけるVEGFおよびVEGFRの発現と、血管内皮細胞抗原であるとCD34との発現を比較解析したところ、CD34は腫瘍内と腫瘍辺縁部において同等な発現を示したのに対して、VEGFRは腫瘍内での発現が高く腫瘍辺縁部での発現は低かった。また、VEGFはグリオーマ細胞の4/5、BCSCにおいて4/6の細胞で高発現しており、さらにVEGFRに関してもグリオーマ細胞の3/5、BCSCの3/6の細胞において発現が認められた。以上の結果から、グリオーマおよびBCSCは免疫抑制因子であるVEGFを産生し、腫瘍辺縁部と比較してとくに腫瘍内血管内皮細胞にシグナル伝達するパラクライン機構が存在すること、さらに腫瘍細胞自身にもシグナル伝達するオートクライン機構を有する可能性が明らかになった。これまで本研究では、グリオーマ細胞、BCSC、およびグリオーマ組織において、免疫抑制性のVEGF/VEGFR系が高頻度に発現していることを明らかにした。