hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
前庭動眼反射と追跡眼球運動の適応における小脳片葉と傍片葉の機能の解明

猿の追跡性眼球運動の適応の動特性を解析するとともに、微小電極法を用いて、数頭の猿から追跡眼球運動に関係する神経活動を記録し、特徴を片葉と傍片葉で比較した。猿にステップ-ランプ状に動く視標を追跡させた時、視標が動き始めてから100m秒位でslow speedの眼球運動が生じ4°/秒位の定常状態の速度に達したのち、小さなサッケード眼球運動が生じた。このサッケード眼球運動終了後ただちに最大速度8°/秒位の一定速度の滑動性追跡眼球運動が起こった。サッケード眼球運動の開始直後に、視標の速度を短期間、増加ないし減少させると、追跡眼球運動の眼球運動の速度には、速やかに(10分程度の試行)適応が生じた。同時に、サッケード眼球運動にも適応が生じ、サッケードの振幅と、潜時がともに大きくなることが明らかになった。さらに、微小電極を用いて片葉と傍片葉のPurkinje細胞の発射活動を記録したが、追跡眼球運動の適応に関係した活動は確かに傍片葉には認められたが、片葉には見られなかった。これらの所見から、傍片葉が追跡眼球運動の適応に強く関与していることが示唆された。また小脳の神経伝達可塑性である長期抑圧(LTD)が、追跡眼球運動の適応時に見られる傍片葉の神経活動に関与するか、即ち追跡眼球運動の適応の原因となる可能性があるかを、長期抑圧を特異的に阻止することが知られている薬物(NO吸収剤やNOS阻害剤)を傍片葉に局所投与し検討した。これらの薬物投与により追跡眼球運動の適応に影響がでることを確認した。平成9年度まで、猿の追跡性眼球運動の適応の動特性を解析するとともに、微小電極法を用いて、数頭の猿から、追跡眼球運動に関係する神経活動を記録し、片葉と傍片葉で比較した。猿にステップ-ランプ状に動く視標を追跡させた時、視標が動き始めてから100m秒位でslow speedの眼球運動が立ち上がり4度/秒位の定常状態の速度に40m秒位に達したのち、小さなサッケード眼球運動が生じた。このサッケード眼球運動の終了後ただちに最大速度8度/秒位の一定速度のslow speedの眼球運動が生じ、視標が消えた後100m秒位まで持続した。サッケード眼球運動の開始直後に視標の速度に10m200m秒の間、視標の速度を増加ないし減少させると、追跡眼球運動に適応が生じ、サッケード眼球運動の終了後に生じる一定速度のslow speedの眼球運動の速度に10分程度の試行で適応が生じた。しかしながら、100m秒位の潜時で立ち上がり40m秒位での定常状態の速度に達する追跡眼球運動には適応は、全く見られなかった。さらに、サッケードの直後に生じる追跡眼球運動に適応が生じる際に、若干ではあるが有意な変化がサッケード眼球運動にも生じ、サッケードの振幅と、潜時がともに大きくなることが明らかになった。このことは、追跡眼球運動に早く出現するものと、遅く出現するものがあり、かつ、早い方がまず働いて、眼球を視標の速さに対して半分位の速度まで加速し、さらに遅い方が出現することにより、視標の速さにほぼ相当するまで加速することを示唆している。また適応が生じるのは遅い方の成分らしいということが明らかになった。微小電極を用いて片葉と傍片葉から500個位のPurkinje細胞の活動を記録したが、追跡眼球運動の適応に関係した活動は傍片葉に認められたが、片葉には見られなかった。

猿の追跡性眼球運動の適応の動特性を解析するとともに、微小電極法を用いて、数頭の猿から追跡眼球運動に関係する神経活動を記録し、特徴を片葉と傍片葉で比較した。猿にステップ-ランプ状に動く視標を追跡させた時、視標が動き始めてから100m秒位でslow speedの眼球運動が生じ4°/秒位の定常状態の速度に達したのち、小さなサッケード眼球運動が生じた。このサッケード眼球運動終了後ただちに最大速度8°/秒位の一定速度の滑動性追跡眼球運動が起こった。サッケード眼球運動の開始直後に、視標の速度を短期間、増加ないし減少させると、追跡眼球運動の眼球運動の速度には、速やかに(10分程度の試行)適応が生じた。同時に、サッケード眼球運動にも適応が生じ、サッケードの振幅と、潜時がともに大きくなることが明らかになった。さらに、微小電極を用いて片葉と傍片葉のPurkinje細胞の発射活動を記録したが、追跡眼球運動の適応に関係した活動は確かに傍片葉には認められたが、片葉には見られなかった。これらの所見から、傍片葉が追跡眼球運動の適応に強く関与していることが示唆された。また小脳の神経伝達可塑性である長期抑圧(LTD)が、追跡眼球運動の適応時に見られる傍片葉の神経活動に関与するか、即ち追跡眼球運動の適応の原因となる可能性があるかを、長期抑圧を特異的に阻止することが知られている薬物(NO吸収剤やNOS阻害剤)を傍片葉に局所投与し検討した。これらの薬物投与により追跡眼球運動の適応に影響がでることを確認した。
Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルを用いた前立腺癌予後予測血中マーカーの探索

我々は、現在までに臨床患者癌組織由来の前立腺癌xenograftモデルの樹立に成功してきた(KUCaP-1,-2,-3,-4)。本研究ではこれらの前立腺癌xenograftモデルを用いた新規バイオマーカーの同定を目指した。腫瘍の分泌蛋白が濃縮された嚢胞を形成するという特徴をもつKUCap-3に特に注目し、血中及び嚢胞液中の分泌蛋白の高感度質量分析を行い、数種類のバイオマーカー候補蛋白質を同定した。今後、候補蛋白の機能解析などを検討している。1)質量顕微鏡を用いたxenograft腫瘍組織内の蛋白発現とその局在解析申請書に記したように、当研究室では臨床検体由来のxenograftを数系統確立しており、現在までにARの発現やmutationなどのcharacterizationを行った4系統について、それらの腫瘍組織切片を質量顕微鏡を用いたImazing mass spectrometry(IMS)を行った。まず切片に蒸着させるマトリックスを数種類試したのちに選択し、同一の条件で比較検討できる設定を行った。その設定の元、4系統から採取した組織切片に上記のIMSを行い、それぞれの腫瘍組織で高発現しているタンパク質の中から、xenograftの悪性度と比例しているものを選出した。これらの候補タンパク質を順次RT-PCR, Western blotでvalidationを行っている段階である。2)腫瘍から血中に分泌される蛋白の高感度質量分析装置による解析上記1)と同時に、4系統のマウス血清を用いて、高感度質量分析装置によるプロテオーム解析を行っている。この解析によって得られた候補と1)の候補とを比較してさらなる絞り込みを行っている。1)質量顕微鏡を用いたXengraft腫瘍組織内の蛋白発現とその局在か伊関申請書に記したように、当研究室では臨床検体由来のXenograftを数系統樹立しており、現在までにARの発現やmutationなどのcharacterizationを行った4系統について、それらの腫瘍組織切片を質量顕微鏡を用いたImazing mass spectrometry(IMS)を行った。まず、切片時蒸着させるマトリックスを数種類試したのちに選択し、同一の条件で比較検討できる設定を行った。その設定のもと、4系統から採取した組織切片に上記のIMSを行い、それぞれの腫瘍組織で高発現している蛋白質の中からXenograftの悪性度と比例しているものの選出を試みた。これらの候補蛋白質を順次、RT-PCRやWestern blotでvalidationも試みた。しかしながら、腫瘍組織内で高発現している蛋白質のほとんどは、正常組織内でも高発現している細胞骨格などに関する蛋白質であると考えられた。2)腫瘍から血中にプンピツされる蛋白の高感度質量分析による解析上記1)と同時に、4系統のマウス血清を用いて、高感度質量分析装置によるプロテオーム解析を行った。同時に、腫瘍が嚢胞を形成するXenograftからは嚢胞液も同様のプロテオーム解析を行うことで、候補の絞り込みを行い、これらの候補蛋白質を順次、RT-PCRやWestern blotでvalidationを行った。上記のとおり、xenograftの組織を用いたIMSや血清を用いた質量分析は、概ね順調にworkすることが確認できている。候補蛋白のvalidationには時間がかかっているが、現在のmethodで当初の目的は達成できると考えている。25年度が最終年度であるため、記入しない。上記の方法で選出した候補蛋白について、臨床検体やTissue microarrayの免疫染色を行い、臨床的悪性度との相関も評価する。そののち、これらの候補蛋白のELISAの系を確立し、当科ですでに保存している前立腺癌患者の血清を用いてその臨床データとの相関をretrospectiveに確認する。
去勢抵抗性前立腺癌における機能性RNAネットワークの解明と革新的診断治療シーズ

前立腺癌臨床検体を用いたマイクロRNA発現プロファイルを独自に作成し、癌抑制型マイクロRNAの探索および機能解析を行なった。更に、癌抑制型マイクロRNAが制御する癌遺伝子の探索を行った。miR-221/222, miR-29s, miR-218, miR-224, miR-23b/27b/24, miR-26a/b, miR-205, miR-223が前立腺癌の癌抑制型マイクロRNAである事を証明し、それらが制御する遺伝子について明らかとした。前立腺癌臨床検体を用いたマイクロRNA発現プロファイルを独自に作成し、発現抑制が認められたものを指標にして、癌抑制型マイクロRNAの探索・解析を行なった。その他、前立腺癌に関する臨床・基礎データを解析し、学会発表や論文発表などを行った。発現抑制を認めたmiR-224をアンドロゲン非依存性癌細胞に核酸導入した結果、癌細胞の遊走・浸潤を顕著に抑制する事を見出した。この事から、miR-224は癌抑制機能を有する事が判明した。miR-224の標的遺伝子としてTPD52を同定した。TPD52の機能解析を進めた結果、癌細胞の浸潤・遊走を促進する癌遺伝子機能を有していた。これら結果について、FEBS Lettに論文発表した。同様に、ヒト染色体の同一部位(9q22.32)に存在するmiR-23b/27b/24-1クラスターの発現抑制を認めたため、機能解析を施行した。いずれのマイクロRNAも細胞の遊走・浸潤を抑制する癌抑制型マイクロRNAである事を証明した。また、miR-27bの発現は、去勢抵抗性前立腺癌に至るまでの期間を予測するマーカーとして有効である事を証明した。更に、miR-27bが制御する遺伝子として、これまでに機能が明らかとなっていないGOLM1を同定し、前立腺癌の新たな癌遺伝子である事を証明しOncotargetに論文発表した。転移抑制型マイクロRNAとして選択されたmiR-218は、LIM and SH3 protein (LASP1)を直接制御していた。LASP1は、臨床検体で高発現しており、癌細胞株でノックダウンすると浸潤・遊走を顕著に抑制し、前立腺癌の転移に関わる可能性を見出し、Cancer Sciに論文発表した。miRNA-29a/b/cについても転移抑制型マイクロRNAであること、標的分子のLaminin C2 (LAMC2)が癌細胞の浸潤・遊走に関わることを見出し、成果をInt J Oncol論文発表した。発現抑制を認めたmiR-205をアンドロゲン非依存性癌細胞に核酸導入した結果、癌細胞の遊走・浸潤を顕著に抑制する事を見出した。この事から、miR-205は癌抑制機能を有する事が判明した。miR-205の標的分子としてcentromere protein Fを同定した。この標的分子は癌細胞の浸潤・遊走を促進する癌遺伝子機能を有していた。これらの結果について、Int J Urolに論文発表した。同様に、miR-26a/26bの発現抑制を認めたため、機能解析を施行した。いずれも癌細胞の浸潤を抑制する癌抑制型マイクロRNAである事を示した。miR-26a/26bが制御する分子として、La-related protein 1を同定し、この分子が前立腺癌組織において過剰に発現していることも明らかにし、Int J Oncolに論文発表した。去勢抵抗性前立腺癌組織を用いたマイクロRNA発現プロファイルを新規に作成し、発現抑制されているものとしてmiR-221/222クラスターを同定し機能解析を施行した。いずれも癌細胞の遊走・浸潤を抑制する癌抑制型マイクロRNAである事を証明した。また、miR-221/222が制御する分子としてEcm29を同定し、Br J Cancerに論文発表した。miR-223についても癌抑制型マイクロRNAであること、標的分子のITGA3とITGB1が癌細胞の浸潤・遊走に関わることを見出し、成果をCancer Sciに論文発表した。その他、前立腺癌に関する臨床・基礎データを解析し、英文誌に論文発表した。研究実績の概要にも示したとおり、前立腺癌組織において発現が低下しているマイクロRNAの中から、miR-224、miR-23b/27b/24-1クラスター、miR-218、miRNA-29a/b/cクラスターを癌抑制型マイクロRNAとして同定した。さらに、それぞれのマイクロRNAの標的遺伝子を同定し、癌遺伝子機能を有する事を証明した。これらの新知見を、FEBS Lett、Oncotarget、Cancer Sci、Int J Oncolに論文発表することができた。

さらに、これらの成果を踏まえ、review論文をInt J Urolに発表した。その他、前立腺癌に関する臨床・基礎データを解析し、学会発表や論文発表などを行った。研究期間の2年目でこれらの成果を達成していることから、本研究課題はおおむね順調に進展していると自己評価した。27年度が最終年度であるため、記入しない。泌尿器科学1.前立腺癌組織において発現が低下しているマイクロRNA(miRNA)の中から新たに癌抑制型miRNAを探索する。解析方法は、miRNAを前立腺癌細胞に導入し、細胞増殖能、遊走能、浸潤能の抑制とアポトーシス誘導を指標とした機能スクリーニングを施行して、癌の悪性形質を抑制する事で確認する。in vitro解析で明らかとなった癌抑制型miRNAについて、in vivoにおける解析を施行し、前立腺癌の治療候補となるmiRNAの選択を行う。2.去勢抵抗性前立腺癌(CRPC) miRNA発現プロファイルを作成し、これまで我々が保有する前立腺癌miRNAプロファイルと比較を行い、CRPC特異的な発現を示すmiRNAを探索する。これらを順次機能解析し、癌遺伝子型・癌抑制型miRNAに分類する。以上の解析の中で、検証の進んだmiRNAについてさらに次の解析を進める。さらに、このシグナル伝達経路において、既存の治療薬でその経路を遮断することが可能なものがあるか検証する。遮断することが可能であり、かつ前立腺癌やCRPCで使用されていない既存の治療薬があれば、前立腺癌XenograftモデルマウスやCRPCモデルマウスを用いて抗腫瘍効果について検討する。研究実績の概要にも示したとおり、前立腺癌組織において発現が低下しているマイクロRNAの中から新たにmicroRNA-143/145 (miR-143/145)クラスターとmiR-23b/27b/24-1クラスターを同定した。これらの解析により、両者が共通して制御する新規癌遺伝子GOLM1 (Golgi membrane protein 1)を同定することができた。miR-143/145については既にJournal of Human Geneticsに受理されており、miR-23b/27b/24-1についてもBritish Journal of Cancerに投稿した。前立腺癌組織において発現が低下しているマイクロRNAの中から、さらにmiR-218も同定し、その解析によりLASP1 (LIM and SH3 protein1)を制御することを明らかとし、これについてもCancer Scienceに投稿した。また、microRNA-29a/b/cについては、その標的分子のLaminin C2 (LAMC2)が癌細胞の浸潤・遊走に関わることを見出し、International Journal of Cancerに投稿した。研究期間の1年目でこれらの成果を達成していることから、本研究課題はおおむね順調に進展していると自己評価した。
口腔内細菌による食物アレルギー抑制効果の解明

本年度はまず、食物アレルギー症状を増悪させる作用が示されたCitrobacter属細菌をマウスに経口投与し、腸管粘膜にどのような変化が起きるかを解析した。食物アレルギーモデルマウスにCitrobacter koseri標準株(JCM1658)を経口投与して腸管切片を顕微鏡で観察したところ、腸管粘膜固有層に集積する好酸球数が有意に増加していた。また、フローサイトメトリーにて腸管粘膜のT細胞サブセットを解析したところ、Th2(CD4陽性IL4陽性)の比率が有意に増加し、Th17 (CD4陽性IL17A陽性)の増加は抑制されていた。これらのことから、Citrobacter属細菌は腸管粘膜においてTh2応答を促進していることが示された。次に、食物アレルギーが口腔内細菌叢にどのような変化を及ぼすかを解析した。食物アレルギーマウスの口腔内を拭った綿棒をPBSに浸し、このPBSをプルシアンブループレートに塗布して過酸化水素産生菌数を比較したところ、対照群マウスと比較して過酸化水素産生菌のコロニー形成がほとんど見られなかった。また、食物アレルギーマウスでは唾液中のIgA量もIgA結合細菌も有意に増加していた。以上のことから、食物アレルギーでは、腸管粘膜でCitrobacter属細菌が増加し、腸管粘膜上皮細胞からIL-33の産生を誘導することで、Th2応答を促進しアレルギー症状を増悪していることが示された。また、このTh2応答の促進によりTh17応答が抑制され、Citrobacterが排除されにくくなっていることで、この作用は維持、増幅されていることが示唆された。さらに、食物アレルギーによるこのような腸内細菌叢の変化はIgA量を増加させ、唾液中のIgAが口腔内細菌に結合することで、腸管だけでなく口腔細菌叢においても病的な構成変化を誘導していることが示唆された。本年度は、食物アレルギーモデルマウスを作製し、その腸内細菌叢の構成を解析して、食物アレルギーで増加する腸内細菌の菌種を同定した。まず、卵白アルブミン(OVA)を抗原として、アジュバントの水酸化アルミニウムゲルと混合して、近交系マウス(BALB/c、7週齢雌、体重20g)に腹腔内投与することで食物アレルギーモデルマウスを作製した。この際、OVAを0.002mg/匹で腹腔内投与し、その一週間後に再び等量のOVAを同様に投与して感作した。そして、感作の一週間後から10mg/匹のOVAを1日おきに4回経口投与した後、さらに一週間おいて50mg/匹のOVAを経口投与して食物アレルギーを誘導した。食物アレルギーの成立は、血清中の抗OVA-IgE抗体価をELISA法により測定して評価し、食物アレルギー症状は、OVA経口投与直後の直腸温で評価した。次に、作製した食物アレルギーモデルマウスならびにコントロール群マウスの糞便を採取してリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、コロンビア5%ヒツジ血液寒天平板上で培養した。それらの寒天平板上に出来たコロニーをMALDI-ToF-MS法(バイテックMS使用)で解析したところ、食物アレルギーモデルマウスから採取したサンプルでCitrobacter amalonaticusが顕著に増加していた。上記の方法では糞便中の生きた細菌のみを解析することになるので、Citrobacter amalonaticusは食物アレルギーを発症したマウスの腸内で増殖したものと考えられる。現在我々は、上記サンプルのコロニーを単離して得た培養液でマウス細胞株(NIH-3T3、colon26)を刺激し、そのサイトカイン産生などを解析することで、Citrobacter amalonaticusの病原性を調べている。食物アレルギーにおいて顕著に増加する腸内細菌は同定できたが、口腔内細菌の同定には至っていない。実験は、滅菌綿棒を用いて食物アレルギーマウスならびにコントロール群マウスの口腔内を拭い、それを懸濁したリン酸緩衝生理食塩水をコロンビア5%ヒツジ血液寒天平板に播いて、それらの寒天平板上に出来たコロニーをMALDI-ToF-MS法(バイテックMS使用)で解析する方法で行ったが、データベースに該当する菌種が無く同定できなかった。今後はこれらの懸濁液をサンプルとして次世代シーケンサーを用いた解析も行う予定である。本年度は、食物アレルギーモデルマウスの糞便から単離、同定した菌種の病原性を、培養細胞を用いた実験で明らかにした。昨年度に作製した食物アレルギーモデルマウス群ならびにコントロールマウス群の糞便から単離したCitrobacter属、Enterococcus属およびLactobacillus属の生菌でマウス細胞株(NIH-3T3、colon26、RAW264.7)を刺激して、それらの細胞におけるサイトカインの発現をリアルタイムPCR法で評価した。その結果、いずれの細胞株においても、Citrobacter属で刺激すると他の菌種で刺激したときよりもIL-33の発現が有意に高かった。昨年度の本研究において、Citrobacter属は食物アレルギーモデルマウスの糞便中で顕著に増加していた菌種であるという結果が得られている。また、IL-33が食物アレルギーの発症に関与するサイトカインであることは既に報告されている(Int. Immunol. 26, 539-549,2014)。これらのことから、食物アレルギーによって腸内で増殖したCitrobacter属が、腸内でIL-33の産生を促進することで、食物アレルギーの症状を増悪させている可能性が示唆された。以上の結果は、2016年8月に開催された第58回歯科基礎医学会学術大会で発表した。

また、両群のマウス腸管の凍結切片を作製し、抗IL-33抗体で免疫染色した後、レーザー共焦点顕微鏡で観察したところ、食物アレルギーモデルマウスの腸管ではコントロールマウスの腸管と比べてIL-33が多く発現していた。現在は、Citrobacter属をマウスに感染させるとアレルギー症状にどのような影響が出るかを調べている。食物アレルギーの発症に関与する腸内細菌の病原性については検討が進んでいるが、口腔内細菌と食物アレルギーの関連については検討が遅れている。現在までの段階で、食物アレルギーにおいて口腔内で顕著に増加する菌種は同定できていない。しかし、食物アレルギーと腸内細菌との関連性については検討が進んでいるので、今後は口腔内細菌の経口投与が腸内細菌叢の構成に及ぼす影響を明らかにすることで、食物アレルギーに対する口腔内細菌の効果について検討していく予定である。本年度は、食物アレルギーモデルマウスの糞便中で顕著に増加していた菌種であるCitrobacter属を、マウスに経口感染させるとアレルギー症状にどのような影響が出るかを明らかにした。まず、昨年度に作製した食物アレルギーモデルマウス群にCitrobacter koseri標準株(JCM1658)を経口投与し、その後、アレルゲンである卵白アルブミン(OVA)を経口投与してアレルギー症状の変化を調べた。すると、Citrobacter koseri標準株を経口投与したマウスは、投与していないマウスよりもOVA経口投与後の直腸温が有意に低下していた。この結果から、Citrobacter属細菌は、腸内で食物アレルギー症状を増悪させる作用を持つことが示唆された。また、このCitrobacter koseri標準株を食物アレルギーモデルマウス群ならびにコントロールマウス群に経口投与し、この両群のマウスから採取した糞便中の細菌を解析したところ、アレルギー群マウスではCitrobacter koseriが腸内から排除されず長期間残留していた。以上の事から、食物アレルギーによって腸内に残留しやすくなったCitrobacter属細菌が、食物アレルギー症状を増悪させている可能性が示唆された。以上の結果は、2017年12月に開催された第46回日本免疫学会・学術集会で発表した。現在は、Citrobacter属をマウスに経口投与すると腸管粘膜のT細胞サブセットにどのような変化が出るか、それが食物アレルギー症状にどのような影響を及ぼすかを調べている。食物アレルギー症状の増悪に関与する腸内細菌を同定し、その病原性について検討が進んでいる。今後は口腔内細菌の経口投与が、腸内細菌叢の構成や腸管粘膜における免疫応答に及ぼす影響を調べて、食物アレルギーに対する口腔内細菌の効果について明らかにしていく予定である。本年度はまず、食物アレルギー症状を増悪させる作用が示されたCitrobacter属細菌をマウスに経口投与し、腸管粘膜にどのような変化が起きるかを解析した。食物アレルギーモデルマウスにCitrobacter koseri標準株(JCM1658)を経口投与して腸管切片を顕微鏡で観察したところ、腸管粘膜固有層に集積する好酸球数が有意に増加していた。
有機磁性体結晶における磁気的相互作用経路の研究

有機ラジカル結晶の強磁性体が1991年に発見されて以来、国内外で多くの有機強磁性体の開発が行われている。しかしながら、その強磁性発現機構をミクロな視点で解明する研究はほとんど進んでいなかった。本研究では、特に高速マジック角回転法を用いたH-,D-,13C-,19F-固体高分解能NMRを、有機磁性結晶(nitroxide,nitronylnitroxide,iminonitroxide)18種について測定した。これより等方的なフェルミコンタクトシフトを求め、磁性体結晶の構成分子の各原子上に現れる電子スピン密度を実験的に決定し、結晶内での磁気的相互作用のメカニズムを明らかにした。さらにこれらの磁性分子の孤立状態や2量体、3量体などのクラスターモデルの電子状態を密度汎関数法(UBLYP,UB3LYP)により計算し、実験結果との比較検討を行った。その結果、有機磁性結晶内での磁気的相互作用のメカニズムとその原子レベルでの経路について、以下の事柄が特に重要であることを示した。また、本研究を磁性金属を含む磁性結晶や、水素結合・電子(電荷)・格子相互作用系へと展開した。1おもにニトロキシド基にある不対電子軌道は、超共役によりニトロキシド基のラジカルサイトを保護しているメチル基の一部の水素原子にまで及び、この水素原子上にラジカルサイトと同じ符号のスピンが現れること、さらに同一のメチル基の他の水素原子上にはスピン分極効果により逆符号のスピンが現れることを、4-hydroxyimino-TEMPOの粉末結晶を例に取りD-MAS-NMR測定より実験で明らかにした。このため、メチル基を介した磁気的相互作用は強磁性的にも反強磁性的にもなりうる。メチル基の配向の制御が磁性制御には重要である。2水素結合を重水素化した6種類の異なる水素結合角を持つ水素結合性有機磁性結晶について高速マジック角回転D-NMRの測定を行い、水素結合を介して強磁性的相互作用が働くこと、さらにこの強磁性的相互作用は水素結合角度が90度に近いほど強く働くことを実験的に示した。3スピン分極による磁気的相互作用経路上に非共有電子対を持つヘテロ原子があると、スピン分極の伝達は抑えられ、強磁性的相互作用が弱くなる。4スピン分極を強く引き起こす共役電子系へのNなどのへテロ原子の導入効果は、分子の立体構造の変化と同程度の影響をスピン分極機構に引き起こす。有機磁性体結晶中のラジカル分子の各原子上の電子スピン密度分布を固体高分解能核磁気共鳴(NMR)法により実験的に決定し、分子間の原子レベルでの磁気的相互作用経路およびその機構を解明し、さらに有機強磁性の発現機構を解明することを目的として研究を行い、以下の成果を得た。1.固体高分解能1H,2H,13C,19F-NMRスペクトル測定から、磁性分子結晶における電子スピン密度分布を決定し、以下の点を明らかにした。

(1)ラジカル基を保護するメチル基上に誘起される電子スピンは、一般にニトロニルニトロキシド(NN)誘導体よりもTEMPO誘導体の方が大きい。(2)Phenyl-NNの芳香環に窒素原子を導入しPyrldyl-NNにすると、芳香環の電子スピン密度は減少する。(3)oxlmeTEMPONでは、超共役により不対電子が非局在化し、アキシャルメチル方向へSOMOが張り出していることを実験的に明らかにした。2.磁性結晶では重水素化した試料の2H-MAS(マジック角回転)-NMRは、1H-MAS-NMRよりも分解能を向上させることができ、磁性分子結晶の研究に極めて有効であることを示した。3.上記の2H-MAS-NMRを用いて、ラジカル分子が水素結合で結ばれている有機磁性結晶について以下の点を実験的に明らかにした。(1)NO基と水素結合している水素原子上の電子スピン密度が、不対電子軌道とNOH平面の間の二面角に依存して大きな負の値から正の値まで変化する。(2)(1)の結果をもとに、また密度汎関数法を用いた量子化学計算により、いくつかの水素結合性有機磁性結晶における分子間の磁気的相互作用のメカニズムを考察し、原子レベルでの磁気的相互作用経路を提案した。4.この方法をCuイオンを含む磁性作体系にも適用し、マクロな性質である磁気転移温度とミクロな局所的磁気構造の関係を明らかにした。有機ラジカル結晶の強磁性体が1991年に発見されて以来、国内外で多くの有機強磁性体の開発が行われている。しかしながら、その強磁性発現機構をミクロな視点で解明する研究はほとんど進んでぃなかった。本研究では、特に高速マジック角回転法を用いたH-,D-,13C-,19F-固体高分解能NMRを、有機磁性結晶(nitroxide,nitronyinitroxide,iminonitroxide)18種について測定した。これより等方的なフェルミコンタクトシフトを求め、磁性体結晶の構成分子の各原子上に現れる電子スピン密度を実験的に決定し、結晶内での磁気的相互作用のメカニズムを明らかにした。さらにこれらの磁性分子の孤立状態や2量体、3量体などのクラスターモデルの電子状態を密度汎関数法(UBLYP,UB3LYP)により計算し、不対電子軌道の形状や配向などの理論的解析を行った。その結果、有機磁性結晶内での磁気的相互作用のメカニズムとその原子レベルでの経路について、以下の事柄が特に重要であることを示した。1おもにニトロキシド基にある不対電子軌道は、超共役によりニトロキシド基のラジカルサイトを保護しているメチル基の一部の水素原子にまで及び、この水素原子上にラジカルサイトと同じ符号のスピンが現れること、さらに同一のメチル基の他の水素原子上にはスピン分極効果により逆符号のスピンが現れることを、4-hydroxyimino-TEMPOの粉末結晶を例に取りD-MAS-NMR測定より実験で明らかにした。このため、メチル基を介した磁気的相互作用は強磁性的にも反強磁性的にもなりうる。メチル基の配向の制御が磁性制御には重要である。2水素結合を重水素化した6種類の異なる水素結合角を持つ水素結合性有機磁性結晶について高速マジック角回転D-NMRの測定を行い、水素結合を介して強磁性的相互作用が働くこと、さらにこの強磁性的相互作用は水素結合角度が90度に近いほど強く働くことを実験的に示した。3スピン分極による磁気的相互作用経路上に非共有電子対を持つヘテロ原子があると、スピン分極の伝達は抑えられ,強磁性的相互作用が弱くなる。
赤外スペクトル解析に基づく新しい石英石器産地分析手法の開発

本研究は石英石器の産地分析手法を新たに開発するものであり,はじめに基礎研究として,甲府花崗岩体中の5つの鉱床の石英を対象として分析条件の検討を行った.次に検討した条件に基づいて,山梨県内の釈迦堂遺跡群I区,堰口遺跡,獅子之前遺跡,上コブケ遺跡の石英製遺物の赤外分光分析を行った.出土遺物のうち概ね5割の試料が分析でき,この資料の分析可能数は当初の想定を上回る結果となった.次に分析によって得られた赤外スペクトルを利用して原産地と遺物の石英の比較を行った.この成果は日本旧石器学会にて報告したが,その後の検討により石英の赤外スペクトルが流体包有物として存在する水の影響を大きく受けることが明らかになった.そのため,現在では水の影響を取り除いた産地推定指標の作成に取り組んでいる.予察的な結果ではあるが,釈迦堂遺跡群I区,獅子之前遺跡,上コブケ遺跡では竹森鉱床産の石英が半数以上を占めるという結果を得ている.堰口遺跡については半数以上の資料で比較に用いた5つの鉱床のどの石英とも一致しておらず,現在までの結果では主とする原産地がどこだったのか明らかにできていない.また遺物の観察中に一部の石英石器の中に電気石などの固相包有物が確認できた.電気石の化学組成は石英の産地ごとに異なる可能性があるため,当初の研究実施計画には含まれていないものの電気石の組成分析も行った.この結果,釈迦堂遺跡群I区,堰口遺跡,獅子之前遺跡,上コブケ遺跡のすべての遺跡で竹森鉱床産の石英が利用されていることが明らかとなった.加えて堰口遺跡においては松木尾根産の石英も利用されていることが明らかとなった.赤外分光分析を石器石材の分析に導入するための基礎研究を計画通り終了することができた.また,当初計画にはなかったものの石英に包有された電気石の化学組成データから赤外分光分析の結果を支持するデータを得ることができ,石英石器の産地分析手法を新たに開発するという研究目的は達成しつつある.産地分析用指標の作成については当初計画よりも遅れているものの,遺物の分析が計画以上に進展しており,研究全体としてはおおむね順調に進展していると判断できる.当該研究の最終年度にあたる2019年度は,赤外スペクトルを用いた産地分析用指標を確立し,原産地および遺物の石英の分析点数を増やすことに取り組む.これらの成果報告を行うとともに研究全体の成果を取りまとめ,新しい産地推定手法というツールを用いた石器研究の新たな研究展開の方向性を検討する.また,本研究は宝石学からも着想を得た研究であり,宝石学方面からも本研究の成果が活用できるよう環境整備に着手する.本研究は石英石器の産地分析手法を新たに開発するものであり,はじめに基礎研究として,甲府花崗岩体中の5つの鉱床の石英を対象として分析条件の検討を行った.次に検討した条件に基づいて,山梨県内の釈迦堂遺跡群I区,堰口遺跡,獅子之前遺跡,上コブケ遺跡の石英製遺物の赤外分光分析を行った.出土遺物のうち概ね5割の試料が分析でき,この資料の分析可能数は当初の想定を上回る結果となった.次に分析によって得られた赤外スペクトルを利用して原産地と遺物の石英の比較を行った.この成果は日本旧石器学会にて報告したが,その後の検討により石英の赤外スペクトルが流体包有物として存在する水の影響を大きく受けることが明らかになった.そのため,現在では水の影響を取り除いた産地推定指標の作成に取り組んでいる.予察的な結果ではあるが,釈迦堂遺跡群I区,獅子之前遺跡,上コブケ遺跡では竹森鉱床産の石英が半数以上を占めるという結果を得ている.堰口遺跡については半数以上の資料で比較に用いた5つの鉱床のどの石英とも一致しておらず,現在までの結果では主とする原産地がどこだったのか明らかにできていない.また遺物の観察中に一部の石英石器の中に電気石などの固相包有物が確認できた.電気石の化学組成は石英の産地ごとに異なる可能性があるため,当初の研究実施計画には含まれていないものの電気石の組成分析も行った.この結果,釈迦堂遺跡群I区,堰口遺跡,獅子之前遺跡,上コブケ遺跡のすべての遺跡で竹森鉱床産の石英が利用されていることが明らかとなった.加えて堰口遺跡においては松木尾根産の石英も利用されていることが明らかとなった.赤外分光分析を石器石材の分析に導入するための基礎研究を計画通り終了することができた.また,当初計画にはなかったものの石英に包有された電気石の化学組成データから赤外分光分析の結果を支持するデータを得ることができ,石英石器の産地分析手法を新たに開発するという研究目的は達成しつつある.産地分析用指標の作成については当初計画よりも遅れているものの,遺物の分析が計画以上に進展しており,研究全体としてはおおむね順調に進展していると判断できる.当該研究の最終年度にあたる2019年度は,赤外スペクトルを用いた産地分析用指標を確立し,原産地および遺物の石英の分析点数を増やすことに取り組む.これらの成果報告を行うとともに研究全体の成果を取りまとめ,新しい産地推定手法というツールを用いた石器研究の新たな研究展開の方向性を検討する.また,本研究は宝石学からも着想を得た研究であり,宝石学方面からも本研究の成果が活用できるよう環境整備に着手する.当初購入を予定していた統計解析用のコンピュータを今年度に購入しなかったため物品費使用が減少した.

また,天候不順で鉱山調査を複数回中止したため調査補助者への謝金使用が減少した.次年度は産地分析用指標の作成に本格的に取り組むため,統計解析用にコンピュータを購入する計画である.
サルコペニアに着目した膵癌進展抑制

骨格筋量の低下を特徴とするサルコペニアが膵癌において予後不良因子であることが明らかとなりつつある。膵癌の発症に伴うサルコペニアの形成についてはその全体像が明らかになっていない。膵癌が発生すると生体内でどのような変化が起こり、サルコペニアに至るのかを明らかとするのが本研究の目的である。そこで我々はマウスモデルを用いることでサルコペニアの類似状態を再現し、担癌状態における骨格筋量や脂肪量の低下の程度を検討する。またマウスモデルから得られた膵癌細胞と筋芽細胞を共培養し、筋代謝マーカーの変化を確認する。この過程で変化のある液性因子を定量し、サルコペニアの形成に寄与する候補因子を同定する。
ニワトリ抗体を用いたプリオン病診断のたの基礎的研究

ヒトプリオンタンパクの合成ペプチド(ヒトプリオンタンパクのアミノ酸配列25-49に相当する25アミノ酸からなるペプチド)を作成し、これを門液原としてニワトリに免疫し細胞融合実験-1を実施した。最終的に1種類のモノクローナル抗体(HUC2-13)の樹立に成功した。本抗体は、ヒトをはじめとする哺乳動物のプリオンタンパクに共通の配列を認識する抗体で、ヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病患者やスクレーピー・ヒツジの脳組織のプリオンタンパクを特異的に検出できる優れた抗体であった。また、広く世界的に利用されている既知マウスモノクローナル抗体と比較した実験において、HUC2-13抗体の優位性を確認した。上とは異なる融合実験において、ヒツジおよびウシプリオンタンパクの共通領域を認識するニワトリモノクローナル抗体(HUC3-11)の作出にも成功した。以上本研究を通して、プリオン研究に有用なモノクローナル抗体をニワトリ型抗体として作出することの優位性を実証することができた。この成果は、プリオン病の研究・診断に大きく貢献するものと確信する。ウシプリオンタンパクの合成ペプチド(ウシプリオンタンパクのアミノ酸配列204220に相当する17アミノ酸からなるペプチド)を作成し、これを免疫原としてニワトリに免疫し細胞融合実験-1を実施した。最終的に19種類のウシ合成ペプチド特異的ニワトリモノクローナル抗体の作成に成功した。これらの抗体を阻害ELISA法で更なる特異性を調べたところ、これらの抗体は大きく5種類に分類できた。すなわち、哺乳動物共通領域を認識できる2グループ、ウシ・マウス・ヒト共通領域を認識する1グループ、ウシ・ヒツジ・ハムスター共通領域を認識する1グループ、およびウシ特異領域を認識する1グループである。上とは異なるアミノ酸配列領域(106)の合成ペプチドを作成して細胞融合実験-2を実施した。その結果、6種の合成ペプチド特異的ニワトリモノクローナル抗体が得られ、そのうちの1種はウシ脳から精製した膜フラクションを用いたウエスタンブロット解析で使用可能な抗体であった。
大規模分散システムにおける協調型並列メタヒューリスティックス計算手法の研究開発

大規模分散システムにおけるタブーサーチ、シミュレーティッドアニーリング、遺伝アルゴリズムの効率的な並列処理手法を研究開発した。タブーサーチ、シミュレーティッドアニーリングの並列処理では、複数の探索プロセスが協調する事によって有望な解空間を効果的に見つけ出すことにより効率良く探索を進められる。また、並列遺伝アルゴリズムでは、プロセッサ能力の不均一性および通信遅延が進化計算における解の改善に大きな影響を与えることが分かった。1.探索空間情報を考慮したメタヒューリスティックスの分散並列処理(1)並列タブーサーチにおけるタブーメモリ協調構成法の検討各プロセスの管理するタブーメモリの内容をコンパクトにまとめ、探索情報として定義した。そして複数のタブーサーチ・プロセス間で、ある一定間隔毎に探索情報と現在解を交換することにより相互に探索の概要を把握し、各プロセスの探索空間をよりポテンシャルの高い空間に動的に割り当て直すメカニズムを開発した。(2)マスタースレーブ方式による遺伝アルゴリズムの並列処理手法の開発局所探索と遺伝アルゴリズムを組合せたハイブリッド遺伝アルゴリズムの並列化を計った。この時、近傍構造の定義に基づいて探索情報を表し、プロセス間で交換することで協調を行う。ここでの(協調による)探索空間の再割り当ては、他ノードの探索情報を考慮した染色体集団の再生成を行うことである。2.大規模分散システムにおける自律分散髄化(1)並列遺伝アルゴリズムにおけるネットワークトポロジーと通信遅延の影響の調査分散システムにおける計算ノードの能力の不均一、膨大な通信遅延の存在、ネットワークトポロジーは並列遺伝アルゴリズムの実行過程に多大な影響を与える。そこで、これらの要因が実際にどのような影響をどの程度与えるかを計算機実験によって調査した。その結果、情報交換の方式(染色体マイグレーションの方式)、トポロジーの特徴(ノード間平均距離、最長距離等)によって影響の度合いが異なることが分かった。本研究は、組合せ最適化計算を分散環境で実行する際の計算技術を開発するものである。近年のネットワーク技術の急激な進展に伴い地理的に分散した計算資源を共有する計算GRIDの研究開発が活発に行われている。本研究では計算GRIDのような大規模分散システム上の地理的に離れた計算資源を活用して分散並列処理する際の問題点を洗い出し、効率の良い計算を行うための手法を研究開発することを目的としている。平成19年度の成果は以下の通りである。(1)探索空間情報を考慮したメタヒューリスティックスの分散並列処理非同期型の並列タブーサーチの協調処理手法を開発し、数種類の異なる形状を持つ解空間を用いて、評価実験を行った。これにより、提案手法は協調を行わない従来の手法と比較して優れた探索能力を持つことが示された。(2)大規模分散システムにおける自律分散最適化並列遺伝アルゴリズムにおけるネットワークトポロジーと通信遅延の影響の調査を行った。評価実験で分散システムにおける計算ノードの能力の不均一、膨大な通信遅延の存在、ネットワークトポロジーは並列遺伝アルゴリズムの実行過程に多大な影響を与えることが分かった。また、ライントポロジーにおいては、不均一な計算能力を持つノードの整列の仕方によって、解の改善速度、解の品質に影響を与えることが分かった。(3)応用農業生産システムにおけるスケジューリング問題、およびバイオインフォマティックスにおける配列解析問題に対するメタヒューリスティックス計算法を開発し、性能評価を行った。バイオインフォマティックスのマルチプルアラインメント問題においては、従来研究と比較して性能が顕著に改善できた。(1)並列シミュレーティッドアニーリングにおける協調並列処理平成19年度に開発した並列シミュレーティッドアニーリング(SA)を改良し、大規模な分散システムに対応できるようにした。複数のSAプロセスをグループ化し、グループ内で一点スタートによる多点探索を行う事で、探索の頑強性をより高める事ができた。また、グループ間協調では、グループ毎に探索空間の複雑さを計測し、それをもとに、グループ間でプロセス数の調整を行うメカニズムを導入した。探索の複雑さは、単位ステップあたりの解の改善度を探索負荷率として定義し、グループ毎に平均をとった。計算機実験により、提案手法の有効性が確認できた。(2)解の多様性を維持する遺伝アルゴリズムの並列処理手法の開発島モデルにおける解の多様性とマイグレーションの影響を調査し、並列処理手法の改善を図った。提案している並列処理手法では、木構造の階層に基づいたマイグレーションを用いている。そこで、木構造の一つであるライントポロジーの島モデルにおいて、解の多様性がどの程度維持されるのかを、計算機実験によって評価した。実験結果より、解の多様性の維持と探索の性能の間に強い相関があることが分かった。これにより、解の多様性を維持する提案並列処理手法の有効性を示した。(3)メタヒューリスティックスの応用メタヒューリスティックスの応用研究として、分散さとうきび圃場における資源配置と農作業計画のための計算手法を開発した。開発した手法は、農作業に必要な農業機械、作業員等の資源を配置するとともに作業計画をたてる必要があるため、提案手法では、二段階方式を採用した。まずシミュレーティッドアニーリングによって、資源を配置し、それをもとに遺伝アルゴリズムによって具体的な作業計画をたてるものである。
表皮角化細胞の分化およびバリア機能因子としてのsuprabasin

血清中のスプラバシン(SBSN)濃度はAD患者において健常人より有意に低く、アトピー性皮膚炎(AD)におけるSBSNの産生の減少を支持した。また、SBSN発現を抑制した三次元培養皮膚は、ケラトヒアリン顆粒の顕著な減少を示した。さらに、このモデルはフィラグリン、ロリクリン、デスモグレイン-1、デスモコリン-1、コルネオデスモシンおよびブレオマイシン加水分解酵素を含む分化関連分子をmRNAレベルで有意に抑制したが、インボルクリン、クローディン-1、カルパイン-1は影響を受けなかった。この事実はSBSN発現の低下が異常な表皮分化を誘導し、ADにおける表皮バリア機能障害に寄与し得ることを示唆している。suprabasin(SBSN)をshRNAを用いてノックダウンした三次元培養皮膚を作成し、ケラチノサイトの分化についてコントロールとの比較検討を行った。まず、最も適した三次元培養皮膚が形成される培養条件を明らかにするために予備実験を行った。結果、最適なレンチウイルスの種類や培養条件が明らかとなった。この条件下で三次元培養皮膚を作成したところ、SBSNをノックダウンしたshSBSNでは角層、表皮の菲薄化がみられ、免疫染色、ウェスタンブロット法でもSBSNの発現低下が確認された。次にRT-PCRによる解析を行った。相対的mRNA発現量は、SBSNは大きく低下していた。また、involucrinはほぼ変化がなかったのに対し、filaggrinは大きく低下した。その他、filaggrin-2、loricrin、desmoglein-1、desmocollin-1、corneodesmosin、bleomycin hydrolaseの発現は有意に低下した。この傾向は単層培養条件下(三次元化する前)のケラチノサイトでもみられた。以上より、SBSNは正常角化に必要な蛋白であり、その発現を抑制することでfilaggrin等の角化関連蛋白の発現が抑制されることが明らかとなった。予備実験の結果、最適なレンチウイルスの種類や三次元培養皮膚の培養条件が明らかとすることができた。この条件下で作成したsuprabasinノックダウン三次元培養皮膚を利用し、各種角化関連蛋白の発現を評価することができ、大きく研究を進めることができた。スブラバシン(SBSN)は、様々な上皮組織の基底層より表層に発現する。SBSNはトランスグルタミナーゼ2および3活性の基質であり、SBSNは表皮細胞の分化において重要な役割を果たしていると考えられる。我々はSBSNの発現が、健常人に比較しアトピー性皮膚炎(AD)患者の角質層において有意に減少することを明らかにした。また血清中のSBSNはAD患者において健常人より有意に低く、ADにおけるSBSNの産生の減少を支持することも見出した。これらの知見は、SBSN発現の低下がADにおける表皮バリア機能不全を誘導する可能性を提起した。表皮分化のためのSBSNの機能を調べるために、我々はレンチウイルスベクターを用い、shSBSNで形質導入することでSBSNをノックダウンした三次元表皮モデルにを作成した。shSBSNで処理した3次元モデルは、角質層には明らかな形態学的変化を示さなかったが、ケラチオリン顆粒の顕著な減少を示した。さらに、shSBSNはフィラグリン、フィラグリン-2、ロリクリン、デスモグレイン-1、デスモコリン-1、コルネオデスモシンおよびブレオマイシン加水分解酵素を含む分化関連分子のmRNAレベルで有意に抑制したが、インボルクリン、クローディン-1、カルパイン-1は影響を受けなかった。この事実は、SBSN発現の低下が異常な表皮分化を誘導し、ADにおける表皮バリア機能障害に寄与し得ることを示唆している。mRNAレベルだけでなく、ウェスタンブロット法を用いて蛋白レベルでの各種角化関連蛋白の発現を明らかとする。また、Th1やTh2サイトカインを三次元培養皮膚に添加し、suprabasinの発現の変化を評価する。さらに、suprabasin KOマウスを用いて、皮膚でのfilaggrin、involucrin、loricurin、E-cadherin、claudin-1等の発現が野生型マウスとどのように異なるかを調べる。さらにsuprabasin KOマウスで角層機能試験や皮膚色素浸透性試験を行い、suprabasinのバリア機能への影響を推論する。バリア機能を反映する2つの評価法を、suprabasin KOマウスと正常マウス両者で比較検討する。皮膚科人件費、謝金の支出が想定以下であった。ほぼ予定通りの支出を計画している。
ゲノム構造解析に基づいたE型ボツリヌス毒素遺伝子の由来と伝達機構に関する研究

ボツリヌス菌は産生する神経毒素の抗原性から、AG型に分類される。今回、E型ボツリヌス毒素遺伝子の由来と伝達機構を明らかにする手がかりとして、C型菌においてC2毒素遺伝子をコードするプラスミド(pC2C203U28)の解析を行った。本毒素はC2IとC2IIからなる2成分毒素で、両者の共存下で生物活性を示す。本プラスミドの解析を進めることで、伝達機構の解明につながる可能性があると考え、C2遺伝子の由来を明らかにすることを目的として、pC2C203U28の全塩基配列を決定し、様々な特徴を明らかとした。最近、E型ボツリヌス菌の全ゲノム塩基配列の決定が進められている。E型ボツリヌス毒素遺伝子の由来と伝達機構を明らかにする手がかりとして、今回、C型とD型ボツリヌス菌が産生するC2毒素(C2)をコードする遺伝子がプラスミドに局在している可能性を示唆する結果を得た。本プラスミドの解析を進めることで、伝達機構の解明につながる可能性があると考え、C2遺伝子の由来を明らかにすることを目的として、C型菌プラスミドの全塩基配列を決定し、ゲノム解析を行った。C型とD型有毒株とその無毒株について、制限酵素未処理でパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)を行い、C2Iをプローブにしてサザンプロット解析した結果、100110kbの位置に強いシグナルが検出された。種々のC型とD型菌からプラスミドの抽出を試みたが、完全なプラスミドを精製することが非常に困難であった。そこで、既知のC2遺伝子配列を基に、インバースPCRとPCRウォーキングにより全ゲノム塩基配列の決定を行った。本プラスミドの全塩基配列は106,981bpの環状2本鎖DNAで、Gc含量は26.7%であった。本プラスミド上には、C2を含む125個のタンパク質をコードする領域(ORF)が同定された。また、核酸代謝に関与する遺伝子が多数存在し、その並びもよく保存されていた。一方、本プラスミド上には新しいタイプのinsertion sequence (IS)とその残骸が存在し、ISとしての構造守確定することができた。他のC型およびD型菌C2プラスミドゲノム上の各遺伝子のPCRスキャニング解析を行ったところ,核酸代謝に関わる遺伝子の並びがよく保存されていた。また、C型とD型菌のC2遺伝子およびその上流と下流の5kbの塩基配列を決定し比較したところ、小さい遺伝子が欠損していたが、配列レベルではC型とD型は各遺伝子が非常に良く保存されていた。これらの研究結果から、昨年度の研究目的が達成でき、現在、論文の作製に取りかかっている。ボツリヌス菌は産生する神経毒素の抗原性からAG型に、A型とB型はA1A4, B1B3, bivalent B, bivalent(Ab, Ba, Bf型)に分類されている。近年、G型菌の性状は他の菌とは異なるため、Clostridium argentinenseという新種に独立された。最近、A, B, F型菌の全ゲノム塩基配列が報告された。現在、C, D, E型菌のゲノム配列の決定が進められている。これらの中で、A3, B1, Ba4型菌はプラスミド上に毒素遺伝子がコードされている。E型ボツリヌス毒素遺伝子の由来と伝達機構を明らかにする手がかりとして、今回、C型菌においてC2毒素(C2)遺伝子をコードするプラスミド(pC2C203U28)の全塩基配列の決定を行った。本プラスミドの解析を進めることで、伝達機構の解明につながる可能性があると考え、C2遺伝子の由来を明らかにすることを目的として、C型菌プラスミドの全塩基配列を決定し、様々な特徴を明らかとした。pC2C203U28の全塩基配列は、106, 981bpの環状2本鎖DNAで、GC含量は26.7%であった。本プラスミド上には、C2を含む123個のタンパク質をコードする領域(ORF)が同定されたが、tRNA遺伝子は存在していなかった。また、核酸代謝に関与する多数の遺伝子が存在し、その並びが保存されていた。さらに、3つのRNA polymerase σ因子が存在し、いずれもσ70ファミリーのextracytoplasmic function(ECF)σ因子のグループに属していた。-方、本プラスミド上には、新しいタイプのinsertion sequence(IS)とその残骸が存在し、ISとしての構造を確定することができた。

他のC型(C-Stockholm株とC-468株)とD型菌(D-1873株)について、プラスミド上の各遺伝子が保存されているかを調べるため、PCRスキャニング解析を行った。C型とD型菌ともC2遺伝子を含む下流領域(70kb)においては、ほとんどの遺伝子が保存されていたが、C2遺伝子の上流領域(35kb)では、C型菌のみ保存されていない遺伝子が多かった。そこで、C型とD型菌のプラスミド構造の比較するため、その上流領域の塩基配列の決定を行なったところ、C型とD型菌とも、非常にゲノム構造のバリエーションが認められた。最近、G型毒素遺伝子をコードするプラスミドの全塩基配列の決定も進めている。本プラスミドのサイズは、PFGE(パルスフィールド電気泳動)と毒素遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼイションから、約140kbであった。既知の毒素遺伝子を基に、インバースPCRにより配列決定を進め、約100kbの配列が決定できている。今後、残りのギャップ領域の配列決定を行い、本プラスミドの種々の特徴を明らかとし、毒素遺伝子の伝達機構(ファージ変換や接合伝達を含む)の解明に大いに貢献したいと考えている。