hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内損傷乗り越え複製アッセイを用いたアクリルアミド誘発遺伝毒性の分子機構の研究

食品の加熱調理により生成する発がん性物質であるアクリルアミドは生体内でシトクロムP450 2E1によりグリシドアミドに代謝され、ゲノムDNA中のデオキシグアノシン(dG)のN7位に付加体(GA7dG)を形成する。dGのN7位のアルキル化体であるGA7dGは化学的に不安定で容易に脱塩基するため、GA7dGがアクリルアミドの遺伝毒性・突然変異原性にどのように寄与するかは明らかになっていない。そこで本研究では糖部を2′-デオキシ-2′-フルオロアラビノグアノシンに置換した安定化アナログ(GA7FdG)を作成し、シャトルベクターを用いた細胞内TLSアッセイ、および精製DNAポリメラーゼと基質DNAを用いたin vitro損傷DNA乗り越え合成(TLS)アッセイにより、ヒト細胞におけるアクリルアミド誘発遺伝毒性・突然変異原性の分子機構を解析した。細胞内TLSアッセイでは、XP4PASV細胞内におけるGA7FdG鎖の複製効率は損傷のないコントロールベクターと比べて半分程度であった。また、GA7FdGに対してT、dA、またはdCを重合した塩基置換変異および1塩基欠失が見られた。In vitro TLSアッセイでは、複製型DNAポリメラーゼであるPolε[イプシロン]のDNA合成活性は鋳型DNA上のGA7FdGにより著しく阻害された。さらに、本研究で用いたTLSポリメラーゼ(Polη[イータ]、Polι[イオタ]、Polκ[カッパ]、REV1、Polζ[ゼータ])のいずれもGA7FdGにより著しく阻害され、単独でGA7FdGを乗り越える活性を持つDNAポリメラーゼは見られなかった。これらの結果から、GA7dGによるDNA複製阻害がアクリルアミド誘発遺伝毒性と点突然変異の誘発に寄与することが示された。本研究では食品の加熱調理により生成する発がん性物質であるアクリルアミドにより引き起こされる突然変異の誘発または抑制に関わる分子機構を明らかにするため、アクリルアミドの活性代謝産物であるグリシドアミド(GA)付加体の損傷乗り越えDNA合成(TLS)に関わるDNAポリメラーゼを明らかにすることを目的としている。今年度は大阪大学大学院基礎工学研究科の岩井成憲教授との共同研究によりGA付加体を特定の部位に持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、マウス細胞内で複製可能なポリオーマウイルス複製起点を持つプラスミドに組み込んでシャトルベクターの作成を行った。GAは主にグアニンのN7位に付加体(N7-GA-dG)を形成するが、グアニンのN7位のアルキル化体は脱塩基しやすいため、糖部に2′-デオキシ-2′-フルオロアラビノグアノシンを持つdGアナログ(FdG)を用いた。FdGの前後をGAとの反応性を持たないdTのみとした9塩基のオリゴヌクレオチド(5′-dTTTTFTTTT-3′; F=FdG)にGAを反応させ、反応産物をHPLC精製した後、足場オリゴヌクレオチドを用いて5′および3′にベクターと相補的な配列をライゲーションし、30-merのオリゴDNA(Gca 30-mer)を作成した。同時にコントロールとして用いるGAと反応させていないFdGを持つオリゴDNA(Cont 30-mer)を作成した。このオリゴDNAの配列に合わせてpMTEXシャトルベクターのクローニングサイトを改変してpMTEX-GA1ベクターを作成し、VCSM13ヘルパーファージを用いて一本鎖ベクターを調製した。このベクターにリン酸化した30-merオリゴヌクレオチドをアニールさせ、T4 DNAポリメラーゼによる相補鎖合成とT4 DNAリガーゼによるライゲーションを行って閉環状二本鎖ベクターを作成した。糖部にFdGを用いた安定化アナログであるN7-GA-FdGを持つオリゴDNAの合成は、FdGの前後をGAとの反応性を持たないdTのみとした9塩基のオリゴヌクレオチド(5′-dTTTTFTTTT-3′; F=FdG)を化学合成し、このオリゴヌクレオチドにGAを反応させて作成した。反応産物にはN7位以外の付加体も含まれていたがHPLC精製により除去し、質量分析により目的産物が得られたことを確認している。足場オリゴヌクレオチドを用いて5′および3′にベクターと相補的な配列をライゲーションし、最終的に30-merのオリゴヌクレオチドを作成した。これに合わせてシャトルベクターの配列の改変を常法により行ってpMTEX-GA1ベクターを作成し、VCSM13ヘルパーファージを用いて一本鎖ベクターを調製した。通常の30-merオリゴヌクレオチドを用いて相補鎖合成とライゲーションによる閉環状二本鎖DNA(cccDNA)の合成を行ったところ、エチジウムブロマイドを添加したアガロースゲル電気泳動において想定される移動度のバンドが確認でき、制限酵素による切断で予定塩基長のバンドが得られたことから、この方法により計画通りシャトルベクターが作成できたと考えられる。引き続き、シークエンス解析によっても生成物の検証を行う予定である。ただしcccDNAの生成効率が想定よりも低く、得られた修飾オリゴヌクレオチドの量が微量であったことからベクター作成効率の向上が必要と考えられた。そこで非修飾の30-merオリゴヌクレオチドと一本鎖ベクターを用いてアニーリング条件の検討を行ったところ、おおむね良好な結果が得られた。引き続きシャトルベクターの作成をスケールアップして実施する。本研究は食品の加熱調理により生成する発がん性物質であるアクリルアミドの活性代謝産物であるグリシドアミド(GA)付加体の損傷乗り越え

DNA合成(TLS)に関わるDNAポリメラーゼを明らかにすることを目的としている。GAは主にグアニンのN7位に付加体(N7-GA-dG)を形成するが、グアニンのN7位のアルキル化体は脱塩基しやすいため、糖部に2′-デオキシ-2′-フルオロアラビノグアノシンを持つdGアナログ(FdG)を用いて付加体合成を行った。具体的には、FdGの前後をGAとの反応性を持たないdTのみとした9塩基のオリゴヌクレオチド(5′-dTTTTFTTTT-3′; F=FdG)にGAを反応させ、反応産物をHPLC精製した後、足場オリゴヌクレオチドを用いて5′および3′にベクターと相補的な配列をライゲーションし、30-merのオリゴDNA(Gca 30-mer)を作成した。同時にコントロールとして用いるGAと反応させていないFdGを持つオリゴDNA(Cont 30-mer)を作成した。これらのオリゴDNAを特定の部位に持つシャトルベクターを作成し、マウス胚性線維芽細胞(MEF)にトランスフェクションして細胞内で複製させ、複製産物を回収して複製効率および変異スペクトラムを解析した。その結果、N7-GA-FdGの複製効率はコントロールと比べて約半分程度に低下しており、GA付加体によりDNA複製が強く阻害されることが示唆された。一方でN7-GA-FdGの複製において塩基置換・欠失変異体の頻度はそれぞれ1%程度であったことから、GA付加体による複製阻害を正確に乗り越える機構が存在すると考えられた。N7-GA-FdGを持つオリゴDNA、コントロールとしてFdGを持つオリゴDNA、及び無修飾のdGを持つオリゴをpMTEX-GA1ベクターに組み込み、MEFにトランスフェクションして細胞内で複製させた。複製産物を回収して解析した結果、無修飾のdGでは両側の鎖がほぼ半々の割合で複製されたのに対して、FdG鎖の場合は22%程度に低下した。さらに、N7-GA-FdG鎖の場合はわずか6%であった。このことから、N7-GA-FdGにより複製が強く阻害されることが示唆されたが、一方で付加体のないFdGでも複製効率が約半分に低下していたことから、FdGが複製を阻害してしまうか、あるいはDNA修復機構により除去されてしまう可能性が考えられた。そこでヌクレオチド除去修復機構を欠損したXpc-/-マウス由来MEFを用いて同様の実験を行ったところ、dGとFdGの複製効率はほぼ同等であり、一方でN7-GA-FdGの複製効率はコントロールと比べて約半分程度に低下していた。このことから、GA付加体によりDNA複製が強く阻害されると考えられた。N7-GA-FdG鎖の複製産物の変異頻度をシークエンス解析により調べたところ、塩基置換・欠失変異体の頻度はそれぞれ1%程度であったことから、GA付加体による複製阻害を正確に乗り越える機構が存在することが示唆された。また、FdGはヌクレオチド除去修復の基質として認識され除去されてしまうものの、複製は阻害しないと考えられたためヌクレオチド除去修復欠損細胞を用いることで複製効率の測定が可能であると考えられた。そこで、SV40でトランスフォームしたXPC欠損細胞で複製アッセイを行うために、pMTEX-GA1ベクターのポリオーマオリジンとポリオーマT抗原をSV40オリジンに置換したベクターを作成した。
軽構造船の主機剛性を考慮した振動応答推定法の研究

1.船体及び主機をテイモシエンコはりで近似し、二重底やマウントの剛性をウインクラ型のばねで近似したモデルについて計算及び実験を行い、次の結果を得た。(1)主機の剛性を考慮したときは、主機の内部モーメントが振動応答に及ぼす影響は無視できず、これは主機の起振力を1個の不平衡力とモーメントに置換える従来の計算法では推定できない。(2)不平衡モーメントのない着火順序に対して概略の応答を与える計算法を作成した。2.DW10000トンの貨物船を対象に、機関及び主機を板構造、それ以外の船体をテイモシエンコはりとして有限要素法による計算を行い、次の結果を得た。(1)前記1.で述べたテイモシエンコはりの計算は、本詳細計算と定性的に一致し、簡便法として役立つことがわかった。(2)実際の機関位置と着火順序の場合、内部モーメントによる振動応答は不平衡モーメントによる応答と同程度になる場合がある。3.今後、上記の理論を発展させて、前記2.で述べたモデルの場合について、主機剛性の変化や支持マウント剛性の変化の影響を調べ、最適な設計法を作成する。
ギラン・バレー症候群由来のモノクローナル抗ガングリオシド抗体の作成と遺伝子解析

Campylobacter jejuiリポオリゴ糖はヒト末梢神経GM1ガングリオシドと分子相同性を有し、IgG抗GM1抗体価が急性期のギラン・バレー症候群(GBS)患者血中に上昇する。軸索型GBSでは、抗GM1抗体だけでなく、IgG抗GM1b、抗GD1a、抗Ga1NAc-GD1a抗体が単独もしくは組み合わせで検出される。自己抗体は、高い親和性を獲得して病原性を発揮する。その分子基盤は、免疫グロブリン遺伝子の変異頻度が高いことにある。GBSとその亜型患者由来のモノクローナル抗ガングリオシド抗体を得て、その親和性を測定し、免疫グロブリン遺伝子の塩基配列を決定する。得られたモノクローナル抗体を用いて、標的分子(GM1、GM1b、GD1a、Ga1NAc-GD1a、GQ1b、GT1a)のヒト神経系における発現部位、細胞内局在をマッピングする。現在モノクローナル抗ガングリオシド抗体を精力的に作成している。ガングリオシドとアフィニティーが強く、pathogenicな抗ガングリオシドIgG抗体を産生するB細胞クローンを単離する。インフォームドコンセントの得られた、ギラン・バレー症候群患者の末梢血B細胞からRNAを単離し、cDNAを合成する。そのcDNAをpFABsG3-sacBベクター(scFv :イムノグロブリン可変部鎖域)に組み込み、PCRにてイムノグロブリンheavy chainおよびlight chain遺伝子を増幅する。次いで、シャペロンベクターpCDFDuet-1-Smに移し、大腸菌TOP10F'にトランスフォーメーションする。インサートを有する大腸菌をアンピシリン寒天培地上で選択しする。それをさらに大腸菌XL-1 Blueにトランスフォーメーションし、ファージコートタンパクとscFvの融合タンパクを表面に発現したファージを産生させる。ガングリオシドGM1、GDla、GQlbを因相化したファルコンボトルにファージ(大腸菌の培養上清)入れ、八二ングにてガングリオシドと親和性のあるファージをスクリーニングする。現在、DNAの合成中である。ギラン・バレー症候群(GBS)の先行感染病原体として、Campylobacter jejuniとの疫学的な関係が確立している。C.jejuniリポオリゴ糖はヒト末梢神経GM1ガングリオシドと分子相同性を有し、IgG抗GM1抗体価が急性期の患者血中に上昇することが既に報告されている。以前にわれわれは,GM1やC.jejuniリポオリゴ糖感作により軸索型GBSのモデル動物を樹立し、分子相同性仮説を立証した。軸索型GBSでは抗GM1抗体だけでなく、IgG抗GM1b、抗GD1a、抗Ga1NAc-GD1a抗体が、単独もしくは組み合わせで検出され、自己抗体は高い親和性を獲得して病原性を発揮する。GBSとその亜型患者由来のモノクローナル抗ガングリオシド抗体を得て、その親和性を測定し、免疫グロブリン遺伝子の塩基配列を決定することを第一の目的とした。本年度は、患者末梢血中のメモリーB細胞のうちIgGを特異的に産生する系の樹立を試みた。抗ガングリオシド抗体陽性GBS関連疾患患者の急性期の末梢血を用いて、メモリーB細胞を分離した。当院へ入院したGBS患者のうち、主治医および患者の同意を得た新鮮血が5例得られた。メモリーB細胞のうち、蛍光標示式細胞分離装置を用いて、IgM、IgD、IgAを発現しているB細胞を除去した。さらに、CD22ビーズを用いてIgGを特異的に産生するB細胞を分離した。B細胞を強力に活性化するオリゴデオキシヌクレオチドCpG 2006を加え、EBウイルスを感染させる途中である。

それをさらに大腸菌XL-1 Blueにトランスフォーメーションし、ファージコートタンパクとscFvの融合タンパクを表面に発現したファージを産生させる。ガングリオシドGM1、GDla、GQlbを因相化したファルコンボトルにファージ(大腸菌の培養上清)入れ、八二ングにてガングリオシドと親和性のあるファージをスクリーニングする。現在、DNAの合成中である。
トロポノイド骨格を有する親規液晶性ポリマーの合成と物性に関する研究

結果5-ヒドロキシトロポロンの2位をピバロイル化、続いて5位を1,ω-ジブロモアルカンでアルキル化し、ピバロイル基の除去により得られたツイン型化合物と種々のアルカン二酸塩化物を、溶媒にN-メチル-2-ピロリドンを用いた溶液重合法によってメソゲン基が単環、二環、三環性のトロポノイドオリゴマーおよびポリマーを合成した。また比較のため対応する低分子化合物およびベンゼノイドポリマーを合成した。得られたトロポノイドオリゴマーとポリマーは、分子量分布(Mw/Mn)3.1-4.2、分子量(Mw)が1,500-4,000程度で、分子が平均的に一方向に配列したネマチック相を発現した。GPCにより分取してえられたトロポノイドオリゴマーおよびポリマー(Mw/Mn=1.02-2.00、Mw=500-13,000)は、分取前と比較して分子量分布が狭くなり、分子量の増加とともに液晶相の熱安定性が向上した。また、メソゲン基の環が増加するとともに、液晶性が向上した。また、単環性トロポノイドオリゴマーは、液晶状態で一方向にシェアリングした後、室温まで冷却しても結晶化は起きず、配向を保持することが可能であった。しかし、対応する低分子化合物およびベンゼノイドポリマーは、いずれも非液晶であった。以上、今回得られた単環性、二環性、三環性トロポノイドオリゴマーおよびポリマーはいずれも液晶相を発現した。トロポノイド液晶は高分子化することにより、分子量の低いオリゴマーでも、液晶相を形成し、対応する低分子やベンゼノイド化合物より高い熱安定性を示すことがわかった。今後、低分子量トロポノイドオリゴマーでも結晶化が起こりにくいことから、より高分子量化することにより、配向フィルムなどへの応用が考えられる。
細胞内ATP及び還元環境応答性siRNAデリバリーキャリアの創製

がん細胞選択的にsiRNAを送達するために、細胞内環境応答性siRNAを調製した。高分子ミセル表面にはがん細胞表面を特異的に認識する環状ペプチドを導入した。高分子ミセル内部には環境応答機能を持ち、かつ、高分子ミセルを安定化させることのできる機能性分子として、フェニルボロン酸分子、および、チオール基を導入した。その結果、フェニルボロン酸の導入率が20 %以上の範囲において、高分子ミセルの安定化が達成された。また、得られた高分子ミセルを細胞内環境を模倣した条件下においたところ、高分子ミセル内部からsiRNAの放出が確認され、環境応答能をもった高分子ミセルの調製が達成された。二本鎖RNAのsiRNAは次世代の治療用薬剤として期待されており、細胞質内では非常に選択性良く標的とするmRNAを分解し、標的遺伝子の発現抑制を誘起することができる。難治性疾患を惹起する遺伝子発現を抑制することで遺伝子発現を抑えることが可能となれば治療効果を得ることができる。一方で、siRNAを薬剤としてそのまま生体に投与した場合、siRNAは投与後すぐに、血流中に存在する酵素による分解や、臓器による代謝をを受けてしまい、血流中から速やかに消失してしまい、薬理活性を失ってしまう。そこで、生体内、特に血流中ではsiRNAを安定に保護し、細胞質内へと効率的に送達することのできる"デリバリーキャリア"の開発がsiRNAの医療応用には必要不可欠である。デリバリーキャリアには、血流中で安定的にsiRNAを分解・代謝から保護する機能とともに、細胞質内では一転して、細胞質内環境に自律的に応答して保護していたsiRNAを放出する機能を持った、細胞質内環境応答性高分子ミセルの開発が求められている。これまでに既に、細胞質内の還元環境や、ATP濃度に応答してsiRNAを放出する高分子ミセルの調製に成功しており、本研究では、従来の高分子ミセル技術を統合し、細胞質内ATP濃度及び還元環境に対して同時に応答する高分子ミセルを調製し、細胞質内外により鋭敏に応答する高分子ミセルの開発を行う。また、機能評価を細胞・モデル動物を用いて評価し、有用性を確かめる。目標の達成に向け、H27年度では高分子の合成及び高分子ミセル調整を行った。高分子ミセルの外層になるポリエチレングリコールを開始剤として、ポリアミノ酸を重合した。更に、ポリアミノ酸側鎖へとATP応答性基や還元環境応答性基を様々な導入率で導入した。予定していた、高分子の合成と、高分子ミセルんの調製は終了し、環境応答性の評価も行った。高分子とsiRNAとの混合では分散度の低い高分子ミセルの調製に成功し、環境応答性も確認したところ、細胞質内に応答してsiRNAを放出しうることが示唆される実験結果を得た。二本鎖RNAのsiRNAや一本鎖核酸のアンチセンスオリゴ(ASO)は次世代の治療用薬剤として期待されており、培養細胞に対しては優れた活性を示している。一方で、生体に投与した場合は速やかに分解・排泄されてしまうため、有効な活性を示すことができず、課題とされている。そこで、上記の核酸医薬を生体内で標的組織へと送達することのできるデリバリーキャリアが必要とされているが、本研究ではこれまで開発されてきたデリバリーキャリアの特性をさらに発展させ、標的細胞内特異的な核酸医薬の送達を目指した。デリバリーキャリアには、血流中で安定的に核酸医薬を酵素分解や腎臓からの排泄から保護する機能とともに、細胞質内へとたどり着いた後は一転して不安定化し、細胞質内へと核酸医薬を放出する機能が求められる。近年、細胞質内の環境に自律的に応答して機能変化し、核酸医薬を放出するデリバリーキャリアが開発されてきている。申請者もこれまでに、細胞質内の還元環境や、ATP濃度に応答して核酸医薬を放出するデリバリーキャリアの開発に成功している。他方、これら既存のデリバリーキャリアは血中(細胞外環境)に存在する還元剤やATPなどにも徐々に応答し、血中での安定性に乏しく、さらなる機能改善が求められている。本研究では、従来のデリバリーキャリア技術を統合することで、血中では従来以上に安定で、かつ、細胞質内でのみ応答して核酸医薬を放出するデリバリーキャリアを開発を行った。新たに作製したデリバリーキャリアは従来のデリバリーキャリアと比べ、高い安定性と細胞内選択的な放出性を達成し、培養細胞に対する遺伝子発現抑制効果を示し、研究は順調に進捗し、終了した。前年度に調製した高分子ミセルを更に詳細に検討し、細胞や動物に対して投与し、評価を行う。本研究では、siRNA内包高分子ミセルの生体外(血流中)での安定性向上も重要な検討課題の1つであり、調製した高分子ミセルの安定性の評価を行い、安定性の高い高分子ミセルの選定を行う。特に、負電荷を持ったポリアニオンやアニオン性脂質などに対する安定性評価を行う。

また、培養細胞に対して高分子ミセルを接触させ、細胞内への取込量、細胞毒性、及び、標的配列の遺伝子発現抑制量の評価などを行う。上記と並行し、高分子ミセルを動物へ投与し、血流中での安定性や、皮下腫瘍モデルに対する集積性、更には、治療用siRNAを用いた皮下腫瘍モデルの治療効果の検討を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
鳥類精子の受精機構分子基盤における膜ラフトマイクロドメインの機能的役割

1膜ラフトの機能性を網羅的に調べるため、ショットガンベース相対定量プロテオミクスを行った結果、82分子が膜ラフトに特異的あるいは豊富に存在することが分かった。2膜ラフトの先体反応誘起機構における役割を検討した結果、膜ラフトは可溶性および膜貫通型AC活性を制御することでPKA経路を介し、先体反応誘起に関与することが分かった。さらに、グルコースは膜ラフト上のGLUTを介して取り込まれ、AMPKを活性化することで先体反応を促進することも分かった。3以上の知見を元に精子凍結保存法開発に着手し、ニワトリ精子に種々のステロールを充填すると、凍結融解後の受精能低下を阻止できることが分かった。精子は構造的のみならず機能的にも区画化された希な細胞である。遺伝子の転写・翻訳活性を欠く精子は、受精を達成するために予め自己に組み込まれた細胞内カスケードを効率的に利用しなければならない。しかしながら、どのようなメカニズムで特定の細胞内区画において最適時期に必要な機能を発揮するのか不明な点が多い。膜ラフトはステロールや膜タンパクを豊富に含む機能性生体膜ドメインで、様々な細胞において細胞現象の制御に関わっていることが明らかになってきた。最近我々は、この膜ラフトが哺乳類および鳥類の精子に存在することを明らかにした。そこで、膜ラフトのニワトリ精子における機能を解明するため、本年度は膜変化を起点とする細胞内シグナリング経路の探査を行った。その結果、ステロール流出による膜ラフトの変化は、ニワトリ精子のタンパク質チロシンリン酸化を促進するが、プロテインキナーゼA(PKA)によるタンパク質リン酸化を阻害することが分かった。この阻害効果には、プロテインホスファターゼが関与している可能性が示唆された。またニワトリ精子におけるPKAによるタンパク質リン酸化経路には、哺乳動物精子における先行研究と同様に、アデニル酸シクラーゼおよびSRCキナーゼが関与していることも分かった。さらに、ステロール流出はニワトリ精子の運動パターンおよび先体反応性に劇的な変化をもたらすことが明らかになった。以上の結果、膜ラフトはニワトリ精子において細胞内シグナリング経路を調節することで、運動性および先体反応性の制御に関わっている可能性が示唆された。哺乳類精子と比較して、鳥類精子における細胞機能制御機構の理解が著しく遅れている。本実験の成果は、鳥類の人工繁殖技術の確立と共に、精子機能構造の比較生物学的研究に有用であると考えられる。鳥類精子における膜ラフトの細胞内シグナリング経路へ及ぼす影響に関する実験は、当初の予定通り進み、新知見が得られている。ステロール流出によるタンパク質チロシンリン酸化が精子受精能に及ぼす影響については、哺乳類精子と同様に鳥類精子もステロール流出により先体反応性が促進される結果が得られており、概ね順調に進んでいる。昨年度までの結果から、ニワトリ精子において膜ラフトは運動性および先体反応性の制御において重要な役割を果たしてることが明らかになった。そこで、ニワトリ精子から生化学的に分離した膜ラフトおよび非ラフトをDimethylation 2 plexlabeling approachによる相対定量的ショットガンプロテオミクスに供した。その結果、計265のタンパク質同定に成功し、その内75分子種が膜ラフトに豊富に存在していること、また16分子種は膜ラフトのみに存在していることを突き止めた。その内特徴的ないくつかの分子に絞り、ポリクロナール抗体を作製し分析を進めている。グルコーストランスポーターは膜ラフトに豊富に存在することが分かった。そこでグルコースの精子機能に及ぼす影響とその作用機構を調べた。その結果、グルコースには先体反応促進効果があることが分かった。また運動性への影響は認められなかった。さらに種々の阻害剤を使った薬理学実験により、その作用機構について調べた。その結果、ニワトリ精子においてグルコースは膜ラフトに存在するグルコーストランスポーターを介して取り込まれること、またグルコースはAMP活性化プロテインキナーゼを介して先体反応を促進している可能性を明らかにした。膜ラフトの精子ー卵認識における役割を検討した。その結果、膜ラフトタンパクのIPVLへの結合親和性は非ラフトに比べ著しく高いことが分かった。さらに、ビオチンーアビジンシステムを使って、IPVLに結合する膜ラフトタンパクのプロファイリングを行った結果、75KDの単一タンパク質がIPVLに強い結合性を示すことが分かった。以上の実験から、膜ラフトはニワトリ精子ー卵認識において足場として機能していることが示唆された。当初の予定通り、ニワトリ精子膜ラフトのプロテオミクスを実施し、多くのタンパク質を同定できたことから、今後の研究を進める上での基盤が構築できている。また膜ラフトの機能解析では、様々な新知見が出てきており、概ね順調に進んでいる。本研究課題では、ニワトリ精子膜ラフトの受精機構分子基盤における機能的役割について検討し、以下のような成果が得られた。申請者は膜ラフトのニワトリ精子ー卵結合への関与を調べた結果、膜ラフト特異的に発現している60 KDaの新規分子が卵への結合能を有すことが分かった。さらに膜ラフトの機能を網羅的に同定するため、相対定量プロテオミクスを実施した結果、82分子が膜ラフトに特異的あるいは豊富に存在することが分かった。プロテオームデータを基盤とした鳥類精子受精機能のボトムアップ型解析を進めるため、まず膜ラフトの先体反応における役割を調べた。

その結果、膜ラフトは可溶性および膜貫通型AC活性を制御することでPKA経路を介し、先体反応誘起に関与することが分かった。さらに、先体反応機構におけるグルコース代謝の役割を調べた結果、Glucose Transporter (GLUT) 3は先体部および尾部に局在し、膜ラフトと極めて強い親和性を示すことが分かった。また、グルコースは膜ラフト上のGLUTを介して取り込まれ、AMPKを活性化することで先体反応を促進することが分かった以上の基礎的知見を元に新たな鳥類精子凍結保存法の構築に取り組んだ。その結果申請者は、ニワトリ精子において凍結保存に伴う受精障害は、ステロール流出により膜ラフトが崩壊した結果、アポトーシスが促進されることに因ることを報告した。この結果に基づき、ニワトリ精子に種々のステロールを充填すると、凍結融解後の受精能低下を阻止できることを報告した。1膜ラフトの機能性を網羅的に調べるため、ショットガンベース相対定量プロテオミクスを行った結果、82分子が膜ラフトに特異的あるいは豊富に存在することが分かった。2膜ラフトの先体反応誘起機構における役割を検討した結果、膜ラフトは可溶性および膜貫通型AC活性を制御することでPKA経路を介し、先体反応誘起に関与することが分かった。さらに、グルコースは膜ラフト上のGLUTを介して取り込まれ、AMPKを活性化することで先体反応を促進することも分かった。3以上の知見を元に精子凍結保存法開発に着手し、ニワトリ精子に種々のステロールを充填すると、凍結融解後の受精能低下を阻止できることが分かった。今までの結果、ステロール流出によるタンパク質チロシンリン酸化が先体反応を促進することが示唆された。今後は現在までの知見の発展を目指し、タンパク質チロシンリン酸化に関わるシグナル分子の同定、およびステロール流出から先体反応性向上までのシグナル経路の全容解明を進める。今までの成果を基に、今後は以下の研究を予定している。ポリクロナール抗体を使ったプロテオミクスデータの堅実性確認、および膜ラフトタンパクの発現、細胞内局在の解析。グルコース取り込みによる先体反応促進効果に関与するシグナリング経路の全容解明。膜ラフトに存在するIPVL結合性タンパクの分子種同定。生殖生物学
塩基変異の引き起こすエクソンスキップを分子機構の解明と治療法の開発

対象遺伝子のイントロンに、エクソン配列の挿入変異により引き起こされるエクソンスキップが疾患に関わることを発見した。挿入変異の塩基を変化させることによりエクソンスキップをキャンセルさせることに成功したが、そのメカニズムは既存のスプライシング予測プログラム等では解決不能であった。これは、保存されている配列から予測されたシスエレメントが実際に選択性の制御に関わっているか否かの解析にはシミュレーションでは未解決であり、スプライシングに関わる部位のコンセンサス配列は高等生物ではかなり緩いものであるため、未だに何らかの実験的な解析手段が不可欠である。この挿入変異はエクソンスキップがオンオフと強力に作用しているため、機構を解明することは治療法の開発につながる。正常および変異の配列に特異的に結合するスプライシングタンパクを単離するために、ミニ遺伝子を作成し各種蛍光RNAプローブとHeLa細胞核蛋白を結合させてゲルシフト解析を行った。しかしながらこの実験によって、結合するタンパクとシス因子が同定できていない。このためHeLa細胞核抽出液を用いるin vitroスプライシング・アッセイ系の検討を開始している。今後、RNA結合タンパク質の側からの探索とは反対側の塩基配列側からのアプローチも行う。これらのスプライシング促進配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、エクソンスキッピングを解除し得ることを明らかにし、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療の適応を検討する。核酸とタンパク質が相互作用し、複合体を形成することにより、電気泳動時に核酸の移動度が低下する現象を利用した解析法である。RNAプローブをRNA-蛋白質複合体の形成を行い電気泳動で分離し、質量分析法を利用しLC-MS/MS解析しているが、正常DNA配列と変体DNA配列で差が認められていない。このため次のステップである制御因子のDNA結合配列の決定に進めていないため、やや遅れている。定量性の感度を上げるために夾雑物を減らす必要がある。このためHeLa細胞核抽出液をin vitroで反応させる系の条件検討を行っている。引き続きHeLa細胞核抽出液を用いるin vitroスプライシング・アッセイ系の確立を目指していき、RNAプローブに結合した蛋白がスプライシングに関与しているか否かを確認する。確認できた場合はプローブ特異的に結合したタンパクを分取し、質量分析法で分子種を同定する。またのミニ遺伝子を作成してスプライシング効率を測定する予定である。その後、スプライソソームはsnRNPが集合することで形成され、活性化時と反応終了後にこれらは解離して再利用される。このサイクルはスプライソソームサイクルと呼ばれ、スプライソソーム活性が変化すればこのサイクルが乱れて、各snRNPの細胞内遊離量も変動すると予想される。そこで、snRNP量の変動を検出するスプリットルシフェラーゼレポーターを用いたスクリーニングを実施する。しかしながらこれまでの経緯を踏まえ、スプライシング因子の同定には時間を要しそうなため、このスプライシング異常を制御因子の活性を低下させて修正できるかどうかを確認するため、阻害剤を用いる準備を行う。CRISPR-Cas9を用いて、対象遺伝子の特定部位に挿入し、変異RNAを恒常発現している細胞株を作成することを検討する。

その後、スプライソソームはsnRNPが集合することで形成され、活性化時と反応終了後にこれらは解離して再利用される。このサイクルはスプライソソームサイクルと呼ばれ、スプライソソーム活性が変化すればこのサイクルが乱れて、各snRNPの細胞内遊離量も変動すると予想される。そこで、snRNP量の変動を検出するスプリットルシフェラーゼレポーターを用いたスクリーニングを実施する。しかしながらこれまでの経緯を踏まえ、スプライシング因子の同定には時間を要しそうなため、このスプライシング異常を制御因子の活性を低下させて修正できるかどうかを確認するため、阻害剤を用いる準備を行う。CRISPR-Cas9を用いて、対象遺伝子の特定部位に挿入し、変異RNAを恒常発現している細胞株を作成することを検討する。質量分析法を利用しLC-MS/MS解析しているが、正常DNA配列と変体DNA配列で差が認められていない。このため次のステップである制御因子のDNA結合配列の決定に進めていないため、対応する試薬の購入がないため余剰が生じている。
脱リン酸化阻害によるＪＭＪＤ１Ａリン酸化維持によりベージュ化が誘導されるかの解明

リン酸化は一過性であり、リン酸化酵素と脱リン酸化酵素の拮抗する作用により可逆的に制御される。先の申請者の報告から、JMJD1A脱リン酸化を阻害する事で一過性のリン酸化が維持、ベージュ化が誘導される可能性が示唆され、JMJD1Aの脱リン酸化酵素阻害剤が、ベージュ化誘導によりエネルギー消費を増大させる肥満症治療薬になり得ると考えられた。そこで本研究では、プロテオーム解析でJMJD1Aの脱リン酸化酵素を同定、JMJD1Aと脱リン酸化酵素の相互作用部位を構造解析より解明の上、この部位を選択的に阻害する事で、副作用を最小限に抑えた脱リン酸化酵素阻害に基づきベージュ化を誘導する肥満症治療薬の創出を目指す。
国際結婚の子育て支援について

国際結婚児の子育て支援の研究調査を行った。日本国内保育所(園)23681園中無作為抽出2368園にアンケート調査を行った。回収率41.2%976園の回答で有効回答総園児数95807名で国際結婚児は1697名、園平均総園児数は98.1名1園の国際結婚児平均1.7名となった。結果・考察:1.現在困っている事では「コミュニケーションが問題」264園、2.対応に工夫や配慮している事では「伝達工夫・おたより帳活用」249園、3.子育て支援に望む事では「日本に適応するための教育」102園であった。今後は行政が担えない部分をNPO法人や地域国際交流・センター等を活用し外国籍の親相談機能の充実が必要である。平成24年度の研究目的は、全国保育所(園)の国際結婚の子どもと親に関する調査(子どもの利用している数、親への支援、困難な問題等)を知ることや専科的に行っている国内の国際結婚の子育て支援を行なっている保育所(園)の実態調査を行うことである。研究実施計画として、全国23680か所の保育所(園)から無作為抽出(法系統抽出法)を用い、2368か所の保育所(園)を抽出した。抽出した保育所(園)に勤務している保育士(1保育所(園)1枚を送付)、国際結婚の子どもとその親に関するアンケート調査を行った。アンケート調査票4項目1.園の特徴公立、私立総園児数、2.園において、国際結婚している子どもの人数3.子どもについての質問(1年齢、2性別、3家族構成)4.国際結婚の子どもについて自由記述による質問1困っていることは何か2どのような対応をとっているか。3国際結婚の子育て・家族支援に臨むことは何かその他アンケートに回答していただいた方への質問役職有資格性別年齢を送付した。平成24年6月高崎健康福祉大学疫学研究倫理委員会に提出同年7月24日高崎健康大倫第2403号許可同年8月アンケート調査票を全国保育所(園)2368か所に配布同年9月11月(3か月間回収期間)同年12月1012か所より回収修了平成25年1月現在アンケート調査票を分析(東京都、神奈川県に関しては修了)岩手県、宮城県、福島県では東日本大震災の影響を受けた保育所(園)が多く、所在所不明、移転、閉園等の返却されてくる状況が伺われた。また東京都江東区保育所(園)からのアンケート調査では、国際結婚の親子の受け入れが多いのと同様に福島県からの移住者を積極的に受け入れていることも調査で伺い知ることができた。2012年11月から12月の2ヶ月間、全国保育所(園)リストから系統的抽出(10おきに抽出)により2368園の保育所(園)を選出し、保育現場である保育所(園)にアンケート調査の依頼と発送をおこなった。アンケート調査内容は、1)園の特徴(保育所(園)・幼稚園、認定こども園・公立・私立、総園児数,2)国際結婚している子どもの人数、,3)その子どもについて年齢、性別、家族構成,4)1困っていることは何か,2どのような対応をとっているか,3国際結婚の子育て・家族支援に望むことは何かである。結果有効回答数は976園(41.2%)であり、公立保育園606、私立保育園253、公立民間委託20,未回答20であった。有効回答の園の総園児数は95807人、外国籍児と国際結婚児は1697人、割合は1.7%であった。「困っていること」について回答では「コミュニケーション」が264、「困っていない」が255、「生活習慣(文化、宗教を含む)」が122、その他が33であった。他の2つの回答については現在解析中である。考察外国籍児・国際結婚児の割合は1.7%であった。「困ったこと」では、「コミュニケーション」を上げている園が最も多かった。2番目に多かったことは「特に困っていることはない」という回答である。記述内容には、両親のどちらかが日本人である、日本語が堪能であるという記述が目立つなど、言語的な問題をクリアしていると、園での対応がしやすいことが推察できた。3番目に多かったことは「生活習慣の違い」である。記述回答では、宗教の違いによる食べ物の問題である。このような状況のある保育園では、除去食の提供に苦慮している記述が目立った。また、登降園の時間が守れないことや保育所(園)で依頼している大切な書類の提出期日を守れないなど、日本とは異なるおおらかな社会性も困難性を引き起こしていた。

今後は行政が担えない部分をNPO法人や地域国際交流・センター等を活用し外国籍の親相談機能の充実が必要である。大学近隣の市町村の保育所に出向き、国際結婚児と家族について調査し事例検討を行った。A町は工場の勤務する外国人女性が日本人男性と結婚することが多い。対象とした国際結婚児は5例であり、4例は母親がブラジル人、2例は母親がフィリピン人であった。子ども自身よりも母親の葛藤が大きく、母親を支援することの重要性を理解した。母親の葛藤内容はさまざまであり、日本語が使えない、文化的違いに戸惑う、家族関係の在り方が異なる、子どもがいじめにあっていると感じるなどであった。保育所における国際結婚児を観察する時のポイントとしては、日本語の習得度(これを理解していないと発達障害と間違われる)、子ども同士の交流、親子の交流などである。国際結婚児はそれを支える家族についての理解も重要であり、婚姻の成立過程、夫の両親との関係、夫婦のコミュニケーションなどについて「国際結婚家族」についての知識が保育士には必要だと理解した。全国の保育所を対象にした国際結婚児の現状調査であるが、調査表を作成した段階で東日本大震災が生じ、東北地方の保育所の状況を考慮し、平成24年度に行う予定にした。米国におけるCFHA(Collaborative Health Care Association)に参加し、研究者が行ってきた親子ふれあい教室の効果研究を発表すると同時に、国際結婚児支援の在り方について、参加者と意見交換を行った。またComminuty Practitoner Volume 84 Nomber 10(英国学術雑誌)においてChildcare support atnursery schools in Japan:current services and future needsを記述した。平成26年度においては、国際結婚を多く受け入れている保育所むけに、具体的支援を行っている浜松国際交流協会(静岡県浜松市)、横浜国際交流協会(鶴見国際交流センター)の2か所を訪問した。保育所への具体的な支援と移住してきた外国籍の人達のための通訳、公共団体への同行を行い、保育所入所の手続き、その他必要な手続き等様々な方法を取り支援していた。特に浜松国際交流協会の場合、外国籍の親支援にも力を入れており、異文化によるカルチャーショックを解消するために、同国の人達によるパーティから始まり、母国語で会話できるコーナーを設けるなど、精神的な支えとともに日本で、生活していくための具体的な支援を行う、きめ細かいサービスが整っていた。子どもの適応力と親のバランスのとり方などを考慮に入れたペアレントトレーニング講座は好評で、保育所で対応が難しい場合、この講座を受け、また精神疾患が疑われる場合は精神科クリニックに同行し、母親のメンタルへルスを行う支援をしていた。窓口業務には様々な言語、ポルトガル語、英語、韓国語、中国語等に対応できるスタッフと、日本の資格である精神保健福祉士、社会福祉士、保健師をもった語学に堪能である支援が外国籍の親子を支援していた。横浜国際交流協会(鶴見国際交流センター)では、中国人の母親が多く、特に保育所からの依頼で行われていたのが、お昼のお弁当作りを体験させ、子どもが喜ぶお弁当講座が中国人の母親を支援していた。訪問時この講座が開講されており、中国人の母親がお弁当作りに参加していた。安価な鶏肉、旬の野菜、ウインナーを利用してのたこ、かにつくりは、お弁当作りの習慣のない中国籍の母親たちは、新鮮な刺激となり、何度もボランテイアで参加している通訳者、料理指導者に確認しながら完成をさせていた。2つの交流協会による外国籍の母親支援は、保育所側としてもとても役立っていることが理解できた。
原腸形成運動を制御するWntシグナルの分子細胞生物学的解析

脊椎動物をはじめとする多くの動物の発生において、内、中、外胚葉からなる3層構造は、体を形作るための基本構造である。原腸形成は、この3胚葉構造を作るために重要な形態形成運動である。この過程では中胚葉として運命づけられた細胞群が外胚葉と内胚葉の間に入り込み移動する。両生類胚、魚類胚などの原腸形成運動においては、背側中胚葉の収束伸長と呼ばれる細胞運動が重要であると考えられている。我々は、アフリカツメガエルを用い、収束伸長運動における細胞のダイナミックな形態変化と運動の制御機構の解明を目指して研究を行った。これまでの研究から、この過程にWntシグナルが重要であることがわかっている。我々は、収束伸長運動の過程で、Wntシグナルの細胞内伝達因子であるDishevelledタンパク質や、その下流で働くRac1、さらにアクチンやアクチン細胞骨格制御因子などが細胞膜上に特異的な局在を示すことを明らかにした。この部分は細胞突起伸長が盛んにおこることが知られており、我々は、Wntシグナルを阻害することで細胞突起伸長が抑制されることを見いだした。これらのことからWntシグナルが細胞突起伸長などアクチン細胞骨格の制御を通じて、収束伸長運動を制御していることがわかった。我々は、新たなユビキチン化酵素を同定し、それがWntシグナルに必須の役割を果たしていることを明らかにした。この経路は、Dishevelledタンパク質の細胞内局在を制御し、さらに、下流のシグナル活性化にも必須であった。脊椎動物の体は内側に内胚葉由来の組織、外側には表皮など外胚葉由来の組織、そしてその間に筋肉など中胚葉由来の組織が配置している。この基本構造は初期胚発生において、中胚葉組織が外胚葉と内胚葉の間に入り込む原腸形成運動によって形成される。本研究ではアフリカツメガエル胚をモデルとして、原腸形成運動がどのようなメカニズムで制御されているかを明らかにすることを目的としている。近年、この過程にWntシグナルが重要な役割を果たしていることが明らかにされた。しかし、このシグナルによる組織運動制御の分子メカニズムは不明であった。本研究では、Wntシグナルがアクチン細胞骨格の再編成を促進し、細胞運動に必要な細胞突起形成を活性化することを見い出した。さらに原腸形成においてダイナミックな移動を行う中胚葉組織で細胞突起形成が盛んに行われていること、Wntシグナルを阻害することによりその細胞突起形成の活性が著しく阻害され、その結果胚全体の原腸形成運動が阻害されることがわかった。すなわち、内在のWntシグナルがアクチン細胞骨格の再編成をすることで組織の運動を制御していることを明らかにした。本研究では、Wntシグナルの細胞内シグナル伝達機構の解析も行った。細胞質タンパク質DishevelledはWntシグナル伝達に重要な役割を果たしていることが分かっている。このタンパク質に結合するRho GTP結合タンパク質活性化因子(RhoGEF)を同定し、Wntシグナルによるアクチン細胞骨格制御への関与を示唆した。また、Dishevelledの細胞内局在を制御するGプロテインを同定し、現在そのメカニズムの詳細を解析中である。

我々は、収束伸長運動の過程で、Wntシグナルの細胞内伝達因子であるDishevelledタンパク質や、その下流で働くRac1、さらにアクチンやアクチン細胞骨格制御因子などが細胞膜上に特異的な局在を示すことを明らかにした。この部分は細胞突起伸長が盛んにおこることが知られており、我々は、Wntシグナルを阻害することで細胞突起伸長が抑制されることを見いだした。これらのことからWntシグナルが細胞突起伸長などアクチン細胞骨格の制御を通じて、収束伸長運動を制御していることがわかった。我々は、さらにアクチン細胞骨格制御因子であるパキシリンが、アフリカツメガエルの収束伸長運動に必須の役割を果たしていることを明らかにした。パキシリンは収束伸長運動を行う細胞の表層で特異的な局在を示し、その局在がWntシグナルによって制御されていることも明らかにした。
新しいCa^<2+>結合蛋白質レギュスルチンの細胞機能調節に関する研究

1.レギュカルチンの臓器分布についてレギュカルチン(RC)抗体を用いたRCの臓器分布の検討の結果、RCは各種臓器の中で、肝に特異的に局在することが見出された。このことは、酵素免疫測定法ならびにノ-ザンブロッティング法のmRNAの分布からも確認された。2.レギュカルチンによる肝細胞機能の調節について1).肝細胞質のCa^<2+>/calmodulin依存性のCAMPホスホジエステラ-ゼ活性は、Ca^<2+>ーcalmodulinにより活性化されるがRCにより抑制的に制御された。また、デオキシウリジントリホスファタ-ゼ活性のCa^<2+>による活性低下はRCにより抑制されることが明らかにされた。2).肝細胞核の機能に及ぼすCa^<2+>の作用とRCによるその制御について調べたところ、単離細胞核において、2価金属イオンの中で、Ca^<2+>はDNAのfragmentationを特異的に促進した。RCは、Ca^<2+>によるDNA分解をほぼ完全に抑制することが見出され、核におけるCa^<2+>の作用を、RCは制御することが明らかとなった。また、肝細胞核へのCa^<2+>の取り込みについてCa^<2+>電極計を用いて調べた結果、核においてCa^<2+>の取り込とその放出機構が依存することが明らかにされ、RCはCa^<2+>取り込みに影響しなかったが、Ca^<2+>放出を刺激することが見出された。この知見は、RCによる肝細胞核機能の調節において、核内Ca^<2+>の放出を促進することが、RCによるCa^<2+>作用制御の機作の1つとして重要であるものと考えられた。本研究により、Ca^<2+>結合蛋白質レギュカルチン(RC)は、肝細胞に特異的に局在し、肝細胞機能のCa^<2+>に関連した調節において、その制御因子としての役割を果していることが更に解明された。1.レギュカルチンの臓器分布についてラット肝ホモジネ-トの上清画分から分離したレギュカルチンを用いて、ラビットからの抗血清を作製した。これを用いて、レギュカルチンのラット臓器におけるその分布を免疫組織化学的に調べた。その結果、レギュカルチンは、肝と脳に著しく分布していたが、他の臓器(腎、心、肺、脾、十二指腸)には明らかな分布は認められず、肝と脳におけるレギュカルチンの役割が示唆された。2.レギュカルチンの肝細胞質c・AMPホスホジエステラ-ゼ活性の制御ラット肝ホモジネ-トの上清画分におけるCa^<2+>/calmodulin依存性のc・AMPホスホジエステラ-ゼ活性は、レギュカルチン(1μM)によって、ほぼ完全に抑制することが見だされた。これは、レギュカルチンが本酵素の活性化に必要なCa^<2+>を結合するためにひき起こされることが判明した。この知見は、c・AMPに関連した細胞内情報伝達系におけるレギュカルチンの制御機構の一端を示すものである。3.レギュカルチンの肝細胞核機能における役割単離した肝細胞核を用いて、そのDNAのfragmentationがCa^<2+>によって活性化されるが、このようなことは他の2価金属イオンによっては認められず、Ca^<2+>に特異的なものであった。Ca^<2+>による細胞核DNAのfragmentationの活性化は、レギュカルチン(1μM)によってほぼ完全に抑制された。この機作として、レギュカルチンがCa^<2+>を結合することによっていることを明らかにした。本蛋白質が肝細胞核機能の調節においても重要な役割を果していることが判明した。

この知見は、RCによる肝細胞核機能の調節において、核内Ca^<2+>の放出を促進することが、RCによるCa^<2+>作用制御の機作の1つとして重要であるものと考えられた。本研究により、Ca^<2+>結合蛋白質レギュカルチン(RC)は、肝細胞に特異的に局在し、肝細胞機能のCa^<2+>に関連した調節において、その制御因子としての役割を果していることが更に解明された。I.ホルモンによる細胞内レギュカルチンの変動についてレギュカルチン(RC)の抗体を作製し,酵素免疫測定法を開発し,RCの各臓器中の濃度を測定した。その結果,RCは,肝に多量に存在し,腎にわずかに存在していたが,脳,肺,ひ臓,心臓,平滑節,骨格節,十二指腸ではほとんど存在していなかった。また一方,RCのcDNAをプロ-ブとして,ノ-ガンブロッティング法によりRCのmRNAの変動を調べると,RCのmRNAは肝に著明に発現され,腎でわずかであり,他の臓器では認められなかった。Ca^<2+>を腹腔内(ラット)投与すると,ホルモン(カルチトニン)分泌を介して,肝細胞内にCa^<2+>が増量するが,この場合において,肝mRNAの増量(約2倍)が見出された。II.レギュカルチンによる肝細胞機能の調節について肝細胞機能のCa^<2+>による調節については,ほとんど知られておらず,最近,この面における知見が報告されつつある。Ca^<2+>結合蛋白質レギュカルチンがどのような調節効果を有するのかを明らかにした。DNA合成に使用されるウソジン代謝に関与する酵素デオキシウリジントソホスファタ-ゼ活性がCa^<2+>(110μM)により低下したが,その低下はRC(12μM)の存在による発現されないことを明らかにし,RCのCa^<2+>作用の制御因子としての役割を示す結果を得た。Ca^<2+>による肝細胞核機能の調節とRCによる制御について明らかにするために,まず,肝細胞核へのCa^<2+>の取り込みについてCa^<2+>電極計を用いて調べた。その結果,細胞核においてCa^<2+>の取り込みとその放出機構が存在することが明らかにされ,RCはCa取り込みに影響しなかったが,Ca放出を刺激することが見出された。この結果は,RCによる肝細胞核機能の調節において,核内Ca^<2+>の放出を促進することが,RCによるCa^<2+>作用制御の機作の1つとして重要であるものと考えられた。
生涯学習の構造化に関する比較共同研究

第1年次の研究活動は、国立教育研究所(国研)とユネスコ国際教育計画研究所(IIEP)が生涯学習セミナー(パリ・セミナー)を共催したことを中核とする。具体的な研究活動は(1)セミナーにおける討議資料として提出する英文報告書6点の作成、(2)パリ・セミナーへの参加、(3)セミナー報告書の作成、及び(4)第2年次の国研側が主催する生涯学習セミナー(東京セミナー)の準備作業の四つからなる。1.英文報告書の作成国研が行った生涯学習に関する5点の全国調査結果((1)市町村の生涯学習事業、(2)一般市民の学習需要、(3)大学・短大の開放講座、(4)企業の学習需要、(5)企業従業員の学習需要)及び我が国を含め先進7ヶ国の生涯学習に関する比較研究を、それぞれ英文に翻訳し、セミナーのワーキング・ペーパーとして提出・使用した。2.生涯学習パリ・セミナーへの参加研究代表者・同分担者が標記セミナーに参加した。IIEP側はその研究分担者だけでなく、各国専門家もセミナーに招へいして国研が提出した前記報告書に基づいて研究討議を深めた。3.セミナー報告書の作成4.生涯学習東京セミナーの準備作業パリ・セミナーでは特に、(1)第2年次の東京セミナーでは本共同研究の最終報告書の構成、内容等について協議する、(2)オーストラリアも比較研究の対象国に加える、の2点が合意された。第2年次の研究活動は大きく二つに分かれる。一つは、東京セミナーの開催と研究課題についての研究討議であり、もう一つは、研究期間終了後の今後の継続研究である。1.東京セミナーの成果セミナーにおける討議を通じて、生涯学習の展開において対象先進工業諸国を通じて次のような共通の特徴が浮き彫りにされた。(1)主として中高年層に対する教養、趣味、生きがいの学習(2)主として若年・中年層にたいして、公正の原理から、失われた教育機会の回復を図る学習(特にアメリカ合衆国の「成人基礎教育」、ドイツの「第2の教育の道」、スウェーデンの「第2のチャンス」など、基本的人権を擁護するとともに、正規教育への接続を保証する。)(3)主として若年・中年層を対象とするリカレント教育このなかで(3)は何らかの形で雇用及び資格と結び付いており、従って職業教育及び職業再教育と関連している。具体的方策としては、当該国の社会・経済状況を背景として、さまざまな学習方策が講じられていて、一様ではない。高い失業率に悩むヨーロッパ諸国では、生涯学習の主たる対象分野をここにおいている。一般学生と比べて、成人学生の進学にさいしては、何らかの優遇措置(雇用経験、年齢等への配慮ほか)を講じている。対象各国が、(1)、(2)及び(3)を、どのように構造化しているかについては、引き続き今後の課題となった。2.継続研究東京セミナーにおいて、IIEP側は本研究活動の成果を取り入れて、国研が日本の生涯教育の現状と動向についてペーパーを作成するよう要請した。日本の生涯学習の経験がユネスコ加盟諸国の教育改善に資することが十分期待できるからとしている。この要請に応えて、国研は目下、英文ペーパーの執筆作業を進めている。