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アカウンティング・プロフェッションによる監査のガバナンス支援機能に関する研究

我が国においては、大企業のディスクロージャーとガバナンスは非常に重要な制度として厳しい統制の対象となっている。そのため、企業の「不正」が明るみに出るたびに、企業と監査法人の責任が厳しく追及されているのである。ところが、いわゆる「東芝事件」は、ディスクロージャーとガバナンスに関する責任の取りようが「一般企業」と「国策企業」とで大きく異なっていることを白日のもとに晒した。「国策企業」においては、「不正」が「不適切」に格下げされ、経営者は責任を問われなかったのである。戦後70年かけて構築されて来た我が国のディスクロージャー制度は根幹の部分で疑問符をつけられた。そして、この根幹の部分の疑問符は、パブリック・セクターの機能不全ともいうべきその後の国レベルでの様々な出来事と密接につながっていることを白日のもとに晒した。いわゆる「モリカケ問題」では、公文書の改竄及び破棄・証拠の隠蔽及び隠滅・偽証・記憶喪失等が国会の場で堂々とまかりとおり、刑事訴追の恐れがあるとして答弁を拒否した責任者は刑事訴追されなかった。厚生労働省の統計データ改竄問題は、国の政策の根底を揺るがす大問題であるにも関わらず、責任者が繰り返した答弁を指弾できないまま時間だけが経過している。さらには、会計検査院の的確な指摘を検査される側が曲解しても、それがまかり通ったのである。いつの間にか官邸や官庁にはディスクロージャーとガバナンスが存在しなくても構わないという雰囲気が当然のごとく醸し出されてしまっているのである。国政レベルにおいて「説明責任を果たさせることの難しさ」を目の当たりにさせられている現況は、私の研究の意義と重要性を再確認させた一方で、研究する術がないことを痛感させられることとなった。官尊民卑の根深さとプライベート・セクターの無力さが並のレベルでないことは、シンガポールでの聞取調査においても痛感させられた。公認会計士による民間企業の財務諸表監査は、2001年に発生したアメリカにおけるエンロン事件を契機とした多方面にわたる改革の結果、監査主体が厳格監査を行うための仕組みがブラッシュアップされ、一定の成果を生むようになってきていた。わが国においても、アメリカとほぼ同様だと思われていた。つまり、私が科研費に応募しようとした時点においては、大規模株式会社の財務諸表監査は一定の到達点に達していたと考えうる状況だったのである。そのために、科研費によって遂行したいと考えた研究テーマは、大規模株式会社の財務諸表監査の枠を超えたアカウンティング・プロフェッションによるパブリックセクターの監査およびガバナンス支援機能の理論的・実証的探求、および具体的政策提言であった。しかしながら、2015年2月に始まった東芝のいわゆる「不適切会計」問題は2016年に入っても一件落着とはならず、日本におけるアカウンティング・プロフェッションによる法定強制監査システムの屋台骨を揺るがしかねない極めて重大な問題であり続けた。(この問題は2017年度に入っても依然として継続中である。)そのため、2016年度においては、まず「東芝の不適切会計」が象徴しているわが国の財務諸表監査制度が内包する重大な問題点を明らかにするため、目の前の東芝事件の成り行きが示しているファクトとこれまでの私の研究成果とをリンクさせて論点をあぶり出した上で、上述した科研費での研究との連続性を明らかにする単著の執筆に費やした。その結果、2016年12月に単著を出版することができた。さらに、同様の視点に立った監査論の入門書の編著も同時並行的に行い、2017年3月に斬新なテキストを出版した。各出版物は次のとおりである。百合野正博著『会計監査本質論』森山書店、2016年12月。百合野正博共編著『はじめてまなぶ監査論』中央経済社、2017年3月。研究者の間での共通理解ではないけれども、2015年2月に始まった東芝のいわゆる「不適切会計問題」は、日本におけるアカウンティング・プロフェッションによる法定強制監査システムの屋台骨を揺るがしかねない極めて重大な問題である。その理由は次のとおりである。後にその第三者性に疑問符が付されることとなる第三者委員会の報告を根拠として「不適切」という用語を東芝が使用したことを根拠として日本経済新聞が一連の東芝をめぐる出来事を報道し続けたこと、および、決算発表を再三延期した上で監査法人を変更し、変更後の監査法人から適正意見をもらえないまま決算発表を行うものの、再度監査法人を変更しようとしている東芝の行動と、経営者の責任を追及せず、上場を廃止せず、ただただ成り行きに任せている監督官庁と証券取引所の態度を私は見過ごすことができなかった。その問題点を明らかにしないまま科研費の研究に取り掛かった場合、問題意識の希薄な研究になってしまうと強く感じたのである。そのため、2016年度においては、海外における聞取調査を翌年以降に延期することとし、まず東芝事件が象徴しているわが国の財務諸表監査制度が内包する重大な問題点を明らかにすることによって、科研費による研究テーマ、すなわちパブリックセクターの監査およびガバナンス支援機能の理論的・実証的探求の重要性を浮かび上がらせることに注力した。その成果である単著『会計監査本質論』は、江戸時代末から明治・大正・昭和・平成を通して考察できるわが国監査制度上の固有の論点を類書にはないユニークな切り口であぶり出すとともに、今回の科研費による研究の重要性を明らかにした、まさに私の意図を反映した内容になっている。

その反面、時間的余裕がなくなり、結果的には、科研費で行うべき研究の中核としての海外聞取調査を行うことができなかった。そのため、評価は、「遅れている」とした。私が科研費に応募した時点において、我が国における民間大規模株式会社の財務諸表監査は一定の到達点に達していたと考えうる状況であった。そのため、科研費の研究テーマは、民間大規模株式会社の財務諸表監査のフレームワークを超えたパブリックセクターの監査であり、その監査をアカウンティング・プロフェッションたる公認会計士が担うとともに、ガバナンス支援機能を発揮するための理論的・実証的探求を行なったうえで具体的な政策提言を行うことであった。しかしながら、2015年2月に東芝の「不適切会計」問題が発覚して2016年に入っても決着しなかったことの重要性は、上記の研究に取り掛かる前に明らかにしておかなければならないという問題意識を生じさせたため、2016年においては海外における調査研究よりも優先すべき課題であった我が国の財務諸表監査制度が内包する重大な問題点を明らかにすることを通して上述した科研費での研究との連続性を明らかにする単著の執筆に費やした。この単著は2017年度の日本監査研究学会「岩田・渡邊賞」に選定された。2017年度においては、アメリカにおける聞取調査を次のスケジュールで実施した。調査期間8月17日(木)23日(水)調査対象KPMG(大手国際会計事務所)ニューヨーク本部、AICPA(米国公認会計士協会)ニューヨーク本部、PwC Florham Park(大手国際会計事務所米国品質管理本部)、PCAOB(米国公開企業会計監視委員会)この調査において、アメリカの公認会計士が民間企業の財務諸表監査のみならず、パブリックセクターの情報公開にも深く関わるという意識を有していると感じることができた。ただ、それがどのような背景の下で形成されたのかについての手がかりを得るまでには至らなかった。2016年度に生じた研究の遅れが東芝の「不適切会計」問題によるものであったことについては上述したとおりである。一般企業では「粉飾決算」として扱われて来た「会計不正」が、東芝のような「国策企業」においては「不適切会計」という聞きなれない用語とともに正当化されるという現実は、戦後70年かけて構築されて来た我が国のディスクロージャー制度を根幹から揺るがせた。さらに、2017年度においては、当研究のターゲットであるパブリック・セクターにおいてちょっと信じられないような出来事が国会と各省庁において発生した。いわゆる「モリカケ問題」である。国有財産の払い下げと国家戦略特区をめぐり、公文書の改竄及び破棄・証拠の隠蔽及び隠滅・偽証・記憶喪失等が国会の場で堂々と繰り返されたのである。会計検査院の報告を巡っても検査される側の勝手な曲解がまかり通った。他の省庁においても同様の事例が複数発覚し、国政レベルにおいて「事実」を明らかにすることの難しさを我々は目の当たりにしているのである。東芝事件はいつの間にかうやむやになってしまった。そして、現在進行中の国政レベルの出来事の成り行きも予断を許さない。2年続きのこれらの出来事は、当研究の意義と重要性を再確認させるものであるといえよう。
不良気象下における蚕作安定方策の検索

近年労働力不足に対する労力の合理的利用と装備の機械化に伴う投下資本の増大に対して、年間条桑による多回育が進められてきた。それに伴って今まで飼育の行われなかった梅雨期、初冬期にも飼育が行われるようになった。これらの時期は気象条件が不良であるばかりでなく、桑葉葉質も低下しているので、しばしば違作をみている例が少なくない。今回はこの不良環境下における蚕作を安定させる方策の一つとして主として葉質の向上策について研究を進めた。1.7月及び10月期の桑葉葉質の品種間差異について在来品種及び戦後登録された改良品種についてその葉質を人工飼料育法により検討した結果、現在広く栽培されている改良鼠返よりも葉質のすぐれているものが明らかとなった。2.葉面散布剤を散布することにより10月期の桑葉葉質の改善の可能性について検べた結果、何種類かの葉面散布剤が効果のあること、散布回数は1回よりもある間隔をおいて2回散布する方がより効果があることなどがわかった。3.施肥時期の相違については、春発芽時期並びに収穫時期を考えて、施肥時期を遅くするあるいは施肥回数を変える等の考慮をはらうことにより葉質を改善できることがわかった。蚕期により飼料である桑葉の葉質には相当の差があり,概して6月期及び10月期の桑葉葉質は他の時期に比較して劣悪である(その概要は東京農工大学農学部附属農場研究報告第12号,昭和61年5月発行に発表した).そこでそれらの時期の葉質を少しでも向上させて蚕作を安定させる方策についていくつかの試みを行なった.1)根の活動が衰えた10月期の桑葉に葉面散布剤を散布することにより葉質をある程度改善するコトが可能であることを確めるとともに,散布の時期,濃度,散布剤の種類等による差異を明らかにし,最も有効と思われる方法をみいだした.2)施肥時期を変えることにより6月期及び10月期の桑葉葉質の改善の可能性を確認した.3)桑の品種により葉質に相当の差がみられるので6月期及び10月期に適した桑品種の検索を行った.4)明年は引続き,施肥方法,桑品種との関係等について研究を進めたい.近年労働力不足に対する労力の合理的利用と装備の機械化に伴う投下資本の増大に対して、年間条桑による多回育が進められてきた。
Smadタンパクの細肪内導入による肺線維化の制御

本研究の目的は、TGF-βの主要シグナル系であるSmadタンパクを細胞内へ直接導入することにより線維芽細胞の機能の変化を解析し、肺線維症の治療への新たな臨床応用の可能性を探ることである。まず、マウス肺線維芽細胞株(MLg)を用い、TGF-β1刺激下にSmad系、I型コラーゲン、α-平滑筋アクチン(ASMA)の変化を検討した。TGF-β1刺激により、Smadシグナルが活性化し、I型コラーゲン発現が誘導されるのを確認した。これにより、I型コラーゲンがSmadタンパク導入細胞において、その機能を評価するマーカーとして適していると考えられた。一方、TGF-β1刺激によりASMAの発現量は変化せず、この細胞においてASMAはconstitutionalに存在していることがわかった。しかし形態学的には、ASMA陽性filamentがTGF-β1刺激後早期にみられ、細胞形態も筋線維芽細胞様に変化を示した。即ち、TGF-βにより、ASMA発現量の変化なしに筋線維芽細胞が誘導されたと考えられた。次に、ヒト胎児肺線維芽細胞株(HFL-1)を対象とし、ヒトSmadタンパクを導入の実験を行った。担体としてChariot^<TM>を用い、同細胞におけるタンパク導入の効率を陽性コントロールであるβ-galactosidaseにより検討し、実験条件の設定を行った。この条件下でヒト遺伝子組み換えSmad2を細胞内に導入した。導入細胞から抽出したタンパクを解析したところ、Smad2の著明な増加をみたが、リン酸化Smad2やI型コラーゲンの発現に変化はみられなかった。本研究により、Smadタンパクが比較的容易に細胞内に導入できることが明らかとなった。今後は、導入Smadタンパクが細胞内で機能し得るかを、実験条件の再検討や転写活性、mRNAレベルでの解析などを通じ、更に研究する予定である。本研究の目的は、TGF-βの主要シグナル系であるSmadタンパクを細胞内へ直接導入することによる線維芽細胞の機能の変化を解析することである。今年度は、まず培養線維芽細胞を用い、1)線維芽細胞のコラーゲン産生,筋線維芽細胞への分化などに対する作用,2)タンパク導入の効率をin vitroで観察した。培養線維芽細胞として、ヒト線維芽細胞株であるMRC-5、WI-26とマウス線維芽細胞株であるMLg、L929、3T3を用いた。1)Smadタンパク導入前の実験としてTGF-β1刺激による各種Smadの変化、およびその下流にあると考えられるコラーゲン、MMP-9、α-smooth muscle actinの発現について、mRNAレベルならびにタンパクレベルで経時的に検討を行った。2)各培養細胞におけるタンパク導入の効率を、コントロールタンパクであるβ-galactosidaseを用い、顕微鏡にて観察を行った。結果は、1)TGF-β1刺激後48時間内で、MRC-5、WI-26はいずれもコラーゲン産生に変化を示さなかった(ELISA)。また、L929、3T3においても、TGF-β1刺激によるI型コラーゲンのmRNA量は、2倍以内とわずかな変化のみであった。一方MLgにおいてはTGF-β1刺激1時間後にSmad7 mRNAが著明に増加し、3時間後にSmad7 mRNAは減少し、一方I型コラーゲン、MMP-9のmRNA、リン酸化-Smad2の有意な増加を認めた。このように、線維芽細胞においても細胞株によりTGF-βに対する反応は異なることがわかった。以上より、マウスの細胞ではMLgを本実験に使用することとした。

2)β-galactosidaseの導入効率はいずれの細胞株でも有意な差はなく、50%以上の細胞において細胞質内および核内に移行するのを確認することができた。本研究の目的は、TGF-βの主要シグナル系であるSmadタンパクを細胞内へ直接導入することによる線維芽細胞の機能の変化を解析することである。前年度の研究により、いくつかのマウス線維芽細胞の中でTGF-β1刺激下にSmad系、I型コラーゲンが反応を示すMLg細胞を対象とすることとした。また、ヒト肺線維芽細胞株として、胎児由来のHFL-1を対象とした。今年度は、1)Smadタンパク導入の際に観察対象となる候補分子の発現パターンについて、詳細な検討を行った。2)培養線維芽細胞における遺伝子組み換えヒトSmad2タンパク導入の効率を、コントロールタンパクであるβ-galactosidaseと比較観察した。結果は、1)TGF-β刺激下MLg細胞において、従来Smadシグナルの下流にあると考えられる分子のうち、I型コラーゲンとα-平滑筋アクチンの発現パターンが異なっていることを見出した。即ち、I型コラーゲンはSmad2のリン酸化と共に発現が亢進するのに対し、Smadシグナルはα-平滑筋アクチンmRNAやタンパク産生に直接の影響を示さなかった。また、シクロヘキサミドで処理した場合の発現の変化においても、この2分子の間で差がみられた。以上より、MLg細胞においてSmadタンパク導入による線維化への直接の影響をみる対象としては、I型コラーゲンが最も適切であると考えられた。2)MLg細胞およびHFL-1細胞においてSmad2の導入効率を検討する方法として、遺伝子組み換えSmad2にタグとしてついているGSTを標的とした。バックグラウンドのGSTレベルは比較的低く、GSTを導入の目安にすることが可能であると考えられた。現在、細胞内の分布について観察を行っている。今後、Smadリン酸化やI型コラーゲン発現を中心に、Smadタンパク導入の線維芽細胞への作用を解析する予定である。
中世の『伊勢物語』イメージ形成に関わる「伊勢物語絵」と文芸の総合的研究

今年度は通算7回の研究会を行い、昨年から引き続き中近世の伊勢物語の注釈書等の内容や特徴を各段ごとに把握した。今年度は特にメトロポリタン美術館蔵「伊勢物語図屏風」に描かれている段のうちの13段分について、様々な注釈書の内容を相互に比較し検討した。昨年も参照した様々な注釈書に加え、伊勢物語の内容を引用している謡曲の「井筒」や「雲林院」、伊勢物語の登場人物について言及する「花鳥風月」「雀さうし」や「女家訓」などの内容についても検討した。それにより、メトロポリタン本の絵が注釈書ごとの記述の違いを直接反映するような形とはなっていないことが判明し、様々な注釈書の記述を踏まえつつも、独自の伊勢物語観を見せるものであることが見えてきた。今年度は調査も順調に進めることができた。屏風の作品としては、出光美術館で「伊勢物語図屏風」2点、伝俵屋宗達筆「伊勢物語図屏風」を観覧し、図版では見えない細部の描写を確認し、各場面がどのような関係性をもって屏風に配置されるのかを考えることができた。サントリー美術館では「伊勢物語色紙貼交屏風」を観覧し、剥落などにより見えにくくなっている図様を確認することができた。海の見える杜美術館では「伊勢物語画帖」を観覧し、メトロポリタン本と同じ構成をとる段の絵の表現を見ることができた。本研究は、伊勢物語の本文の解釈や、各時代の伊勢物語の注釈書や関連資料の解釈と絡めて伊勢物語絵を捉え、その制作者や受容者がいかなる伊勢物語観を有していたかを考えることを目的としている。当初の研究対象として挙げていた小野家本、東京国立博物館本(異本伊勢物語絵巻)、中尾家本の絵については、注釈書との比較検討を試みてもその特徴がなかなか見えてこないのだが、選択された場面や絵の表現に特徴を有するメトロポリタン本については、本研究の目的に沿った方向での成果を上げつつある。今年度は上記のとおり研究や調査を進めることができた。今年度は、国外ではイギリスの大英博物館、大英図書館、アイルランドのチェスタービーティーライブラリー、国内では斎宮歴史博物館、東京国立博物館などで伊勢物語絵の調査を予定している。そして研究の成果をまとめ、年度の後半に学会例会や研究会などで成果を発表する予定である。本研究は、美術史と国文学の研究者が協同し、鎌倉・室町・桃山近世初期の各時代の伊勢物語絵の表現を、作品毎に、『伊勢物語』の本文や同時代の注釈書や御伽草紙等の内容と比較検討し、その時代の享受者が追及した『伊勢物語』世界がいかなるものであったのかを探求することを目的としている。研究の方法としては、1伊勢物語絵の図像を可能な限りデータ化し、章段ごとに比較検討すること、2様々な伊勢物語絵及び関連する作品の調査を行うこと、3『伊勢物語』本文や注釈書等の読解を行い、12を通して抽出された図像の特徴とあわせ考察することを行う。そして13を総合して検討し、各時代の伊勢物語絵がいかなる『伊勢物語』理解と結びつき、またどのように『伊勢物語』世界をイメージしているのかを探求することを目指す。平成28年度は2としては、アメリカの美術館で調査を行うことができた。伊勢物語絵としては、ハーヴァード大学美術館で「伊勢物語絵巻A本」、メトロポリタン美術館で「伊勢物語図屏風」と「伊勢物語図色紙宇津山」を、物語絵の参考作品としてフリア美術館で「源氏物語白描画帖」、「源氏物語図屏風(帚木・若菜上)」、メトロポリタン美術館で「源氏物語図屏風(関屋・行幸・浮舟)」等の調査を行った。1と3に関しては、各年度、章段を分けて取り組む計画としている。平成28年度は、初段「春日の里」、2段「西の京の女」、3段「ひじき藻」、4段「西の対」、5段「関守」、6段「芥川」、9段「東下り」について、『伊勢物語』本文、及び注釈書の『和歌知顕集』、『冷泉家流伊勢物語抄』、『伊勢物語愚見抄』、『伊勢物語肖聞抄』、『伊勢物語闕疑抄』、『伊勢物語拾穂抄』を読み、様々な伊勢物語絵の当該章段の絵と比較した。その結果、各伊勢物語絵の特徴が抽出でき、注釈書との対応関係についても考えることができた。計画していたアメリカでの調査を実施することができ、予定していた調査作品も概ね見ることができた。この調査における最大の収穫は、メトロポリタン美術館において「伊勢物語図屏風」(以下メトロポリタン本とする)を調査できたことであった。本図は、六曲一双の紙本着色の屏風で、これまでにもわずかに図録等で触れられてはいるが、本格的な紹介はいまだなされていないものである。本研究の計画段階においても、特に注目していなかった。しかしメトロポリタン美術館において実見し、大変優れた表現のなされた伊勢物語絵であることが確認できた。本屏風は近世初期の作とされるものの、その制作事情がわかるような文字資料はなく、絵師や制作に関わった者の名や制作時期などはわかっていない。しかし本図には他の伊勢物語絵には見いだせない特徴が様々にあり、それらにより、本図の制作者がこの絵に込めた意味や意図も推測できるのではないかと思われるものであった。本屏風は、伊勢物語絵と享受者の伊勢物語イメージを探求する本研究を遂行する上で、大変重要な意味を持つものと位置づけられる。1と3については、各章段の絵の図像比較、および本文と注釈書の検討を行い、たとえば以下のような成果が得られた。

スペンサーコレクション本「伊勢物語絵巻」の「春日の里」には、春日の姉妹の部屋に化粧道具が置いてある。これは他本にはない表現である。それは、本文中の「なまめいたる女はらから」の「なまめく」の解釈として、「まなめくは、けしやうする心なり。なまなましきふるまひする、心にかなへり」とする『愚見抄』の解釈と関係するのではないだろうか。このように、各伊勢物語絵の図像の特色を抽出する作業と、各注釈書の解釈を関連づけて考える作業を行い、いくつかの成果が出ているところである。今年度も、伊勢物語絵の作品毎の図様の特徴を導くために、小野家蔵「伊勢物語絵巻」、中尾家蔵「伊勢物語画帖」、チェスタービーティー図書館蔵「伊勢物語絵本」、東京国立博物館蔵「異本伊勢物語絵巻」などの各章段の絵について、『伊勢物語』の注釈書の内容と比較しながら検討を加えた。参照した注釈書は、『書陵部本和歌知顕集』『島原文庫本和歌知顕集』『冷泉家流伊勢物語抄』『愚見抄』『肖聞抄』『宗長聞書』『闕疑抄』『次第条々』『歌之注』『懐中抄』『陽成院伝』『十巻本伊勢物語注』『増纂伊勢物語注』『伊勢物語奥秘書』などである。また、この物語を屏風という画面形式に描く際にどのような注意が払われているのかを、出光美術館蔵「伊勢物語図屏風」3作品や、泉屋博古館蔵「伊勢物語図屏風」、メトロポリタン美術館蔵「伊勢物語図屏風」などを比較して検討した。また久保惣記念美術館蔵「伊勢物語絵巻」の調査を行った。金や銀による装飾、小動物の描きこみ、人物描写の繊細さは類例がなく、独自の伊勢物語世界を見せるものであることが理解された。研究代表者が2017年1月より肺の持病の悪化、慢性化により体調不良に陥り、2017年4月からの1年間においても体調が回復せず、強い倦怠感、息苦しさ、胸の圧迫感、咳、痰などに常に悩まされ回復しないままとなってしまったため、大学の職務を行うだけで精一杯となり、科研の研究はあまり進めることができなかった。今年度は通算7回の研究会を行い、昨年から引き続き中近世の伊勢物語の注釈書等の内容や特徴を各段ごとに把握した。今年度は特にメトロポリタン美術館蔵「伊勢物語図屏風」に描かれている段のうちの13段分について、様々な注釈書の内容を相互に比較し検討した。昨年も参照した様々な注釈書に加え、伊勢物語の内容を引用している謡曲の「井筒」や「雲林院」、伊勢物語の登場人物について言及する「花鳥風月」「雀さうし」や「女家訓」などの内容についても検討した。それにより、メトロポリタン本の絵が注釈書ごとの記述の違いを直接反映するような形とはなっていないことが判明し、様々な注釈書の記述を踏まえつつも、独自の伊勢物語観を見せるものであることが見えてきた。今年度は調査も順調に進めることができた。屏風の作品としては、出光美術館で「伊勢物語図屏風」2点、伝俵屋宗達筆「伊勢物語図屏風」を観覧し、図版では見えない細部の描写を確認し、各場面がどのような関係性をもって屏風に配置されるのかを考えることができた。サントリー美術館では「伊勢物語色紙貼交屏風」を観覧し、剥落などにより見えにくくなっている図様を確認することができた。海の見える杜美術館では「伊勢物語画帖」を観覧し、メトロポリタン本と同じ構成をとる段の絵の表現を見ることができた。本研究は、伊勢物語の本文の解釈や、各時代の伊勢物語の注釈書や関連資料の解釈と絡めて伊勢物語絵を捉え、その制作者や受容者がいかなる伊勢物語観を有していたかを考えることを目的としている。
食事構造の変遷と特質に関する研究

<目的・方法>日本の近世・近代における日常食と饗応食の構造的特徴を明らかにするためには、出来るだけ具体的な史料を数多く掘り起こし、これらを調査・分析する必要があると思われる。そこで、各地域の家に残された文書を調査し、その食事記録に関する史料を掘り起こし、その特徴を解明しようとした。各図書館・文書館の家文書の調査および未公開の家文書を調査し、その食事記録を収集して目録を作成し、一部史料についての分析をおこなった。<結果・考察>全国の各図書館の史料のうち、食に関する記録が比較的まとまった形で残されているものは、多くはなかった。比較的多くの史料がある家文書のなかで、下記に関する目録を作成した。(1)真田家文書、(2)八田家文書、(3)小川家文書、(4)佐藤家文書、(5)千秋家文書、(6)玉尾家文書、(7)土屋家文書、(8)大炊御門家文書、(9)美濃高木家文書、(10)古橋家文書、(11)その他これらの文書は、公家(8)、武家(1)(7)、商家(2)(3)、農家(4)(5)(6)に属するものであり、婚礼、葬儀などの人生儀礼に関する献立などの記述が中心となったが、(2)の文書にみられた「御膳日記」は、調査の結果、(1)の真田家の元藩主真田幸弘の食事記録と推察された。この日記は、毎日三食の記録があるため、日常食とハレ食の両方の関係がわかる貴重な史料といえる。しかし、献立のみの記述であるため、真田家の他の文書をあわせることで、どのような状況下で用意された食事であるかをさらに明確にする必要があろう。日本各地の家々における食事記録の収集とその特徴を明らかにするため、平成10年度は、各地域の図書館、資料館等に残された各家の文書を調査した結果、郷土資料として家の文書が残されている例は多いが、食事記録は多いとはいえない。その中で、収集した記録のうち、とくに特徴的な食事記録は下記のようなものであった。1.毎日の食事記録史料について信濃松代藩の御用商人をつとめた八田家文書のなかに、松代藩主真田家の御膳番に提供したとみられる食事の日記『御膳日記』が、寛政12、13年、享和元年について残されている。朝、夕、夜食の献立がほぼ毎日記述されている。飯、汁、平皿にさらに1品加わった構成が朝、夕食の典型的なもので、夜食はさらに1品少ない。この背景を明らかにするためにも、同時に真田家に残されている『御膳番による日記』を一部撮影した。2.婚礼の献立・葬儀などの献立婚礼については、断片的なものが多いとはいえ、文化・文政期以降の史料は、いくつか収集できた。いずれも本膳料理に式三献を組み合わせた形であるが、人の並び方、招待客などの違いによる料理内容、材料等に違いがある。今後精査する予定である。葬儀については献立が残されているところが少なく今後収集する予定である。3.生間流万亀楼文書の献立京都の生間流包丁人の残した献立は、二条行幸の献立記録で、上層の献立を知る上で貴重なものと思われる。現在これらを目録化し、複写および写真撮影を行ったので、次年度は引き続き新たな史料を発掘するとともに、これらの内容を調査し、順次発表を行う予定である。平成10年度に引き続き、家文書を調査し、その中の婚礼や葬儀・法事などの饗応の記録などの記録を調査する一方で、平成11年度は、それらを整理し、目録作成をおこなっている。また、その中で特筆すべき史料について、その内容を精査し、その一部を目本調理科学会において報告した。

具体的には下記の通りである。1.主な収集史料(1)古橋家文書(愛知県古橋家):婚礼・葬儀に関する史科の整理、カ一ドを作成した。(2)真田藩史科(国立史料館):「江戸御目付日記」「江戸家老日記」の写真撮影し、整理した。(3)山梨県立図書館所蔵文書:「婚礼出費記載帳」「婚礼出費記載帳」などを写真撮影し整理した。(4)土屋家文書(史料館蔵):「御成日記」「御家事日記」を撮影し整理した。2.目録作成上記の古橋文書について目録作成をおこなっている。100点以上の文書についての目録のうち、8割を目録化している。3.食構造に関する内容の精査及び報告平成10年度収集・撮影した「御膳日記」の内容のうち日常の食構造、食材の特徴について精査し、平成11年9月、日本調理科学会大会において報告した。また、行事食等との比較について、12年度日本家政学会(6月)において報告する。平成11年に引き続き、家文書を調査し、食事記録に関する記事の目録を作成した。下記目録については、個別に各家の文書についての解題を記し、その他の文書については、その概要と特徴について「その他の文書」として示した。(1)古橋家文書(2)真田家文書(3)土屋家文書(4)八田家文書(5)佐藤家文書(6)小川家文書(7)美濃高木家文書(8)大炊御門家文書(9)千秋家文書(10)玉尾家文書また、真田家文書、八田家文書の食事記録の関連、その内容の特徴について、平成11年10月には、日本調理科学会に、また平成12年6月の日本家政学会において発表した。真田藩の御用商人であった八田家文書の食事記録は、真田家家老日記などの同年の記事から調査の結果、真田藩主真田幸弘の隠居後の食事記録であることが明らかになった。その食事は、通常、朝食、夕食、夜食ごとに食事内容が簡単に記されており、実質は一日3食であっても、1日2度食の名残がみられる。また、朝食、夕食とも一汁二菜、夜食が一汁一菜で、日常食は比較的簡素であった。
先天性胆道閉鎖症の早期診断マススクリーニング法の開発

先天性肝胆道疾患の早期診断法並びに治療法の確立が緊急の課題となっている。胆汁酸は肝機能の診断指標として古くより注目されている。本研究は、胎児-新生児期における胆汁酸の体内動態を解明したのち、胎児性胆汁酸の酵素免疫測定法による微量分析法を開発し、先天性胆道閉鎖症の病態解析法を検討して、早期診断法並びにマススクリーニング法の確立を目的とした。1.先天性胆道閉鎖症における胎児性胆汁酸の体内動態:早期診断法の確立を目的として、患児血液(浸染血液乾燥濾紙)及び尿中の胎児性胆汁酸をGC/MSにより検討し病態解析法を開発した。2.抱合型胎児性胆汁酸のHPLCによる微量分析法の開発:胎便中には、主にタウリンまたは硫酸抱合型胆汁酸が存在することが判明したので、抱合型胎児性胆汁酸をPHP-Shephadex LH-20により分画、アンスロイル誘導体として蛍光検出HPLCによる定量法を開発し、胆道閉鎖症患児の各種体液について検討した。3.胎児性胆汁酸の酵素免疫測定法の開発:タウロ-1β-水酸化コール酸-BSA蛋白結合体を用いてウサギより特異性の高い抗血清を得て、西洋ワサビペルキシダーゼ酵素標識抗原を用いる酵素免疫測定法を開発し、抱合型胎児性胆汁酸の体内動態について検討した。4.先天性胆道閉鎖症のマススクリーニング法の開発:開発した酵素免疫測定法に基づいて、ヤギ抗ウサギIgG抗体を第2抗体としてウエルに固定してELISA法を開発し、本症患児の生後5日検診時に得られた浸染血液乾燥濾紙を用いるマススクリーニング法の可能性を示した。近年、種々の先天性胆道疾患の早期における診断法ならびに治療法の確立が緊急の課題となっている。胆汁酸は肝機能の診断指標として古くより注目されてきた。本研究は、胎児-新生児期における胆汁酸の体内動態を解明したのち、胎児性胆汁酸の酵素免疫測定法による的確な微量分析法を開発して、先天性胆道閉鎖症の簡便かつ迅速なる病体解析法を検討することにより、早期診断法ならびに浸染血液乾燥濾紙を用いるマススクリーニング法を確立することを目的とした。1.先天性胆道閉鎖症における胎児性胆汁酸の体内動態の解析:本疾患の早期診断法の確立を目的として、患児血液および尿中の1β-水酸化コール酸の術前、術後における変動、浸染血液乾燥濾紙についてガスクロマトグラフィー質量分析により検討し、病態解析法を開発した。2.抱合型胎児性胆汁酸の高速液体クロマトグラフィーによる一斉微量分析法の開発:胎便中には成人の場合と異なり、タウリンまたは硫酸抱合型胆汁酸が存在することを見出し、これら抱合型胎児性胆汁酸をPHP-Shephadex LH-20により分画、アンスロイル誘導体として蛍光検出高速液体クロマトグラフィーによる定量法を開発し、胆道閉鎖症患児の各種体液について検討した。3.胎児性胆汁酸の酵素免疫測定法の開発:先天胆道閉鎖症のマススクリーニング法を確立するため胎児-新生児期における主成分のタウロ-1β-水酸化コール酸-BSA蛋白結合体を用いてウサギより特異性の高い抗血清を得て、酵素標識抗原を用いる2抗体法による酵素免疫測定法を開発し、抱合型胎児性胆汁酸の体内動態について検討した。近年、新生児の肝胆道疾患として新生児肝炎や多数の先天代謝異常症が見出され、これらの診断法および治療法の確立が緊急の課題となっている。本研究は、胎児-新生児期における胆汁酸の体内動態を解明したのち、胎児性胆汁酸の酵素免疫測定法による的確な微量分析法を開発して、先天性胆道閉鎖症の簡便かつ迅速なる病態解析法を検討することにより、早期診断法ならびに出生後5日検診時における浸染血液乾燥濾紙を用いるマススクリーニング法を確立して、新生児医療の進展に貢献することを目的とした。

1)先天性胆道閉鎖症のマススクリーニング法の開発:先に開発した酵素免疫測定法に基づき、第2抗体としてヤギ抗ウサギIgG抗体をウエル固定しELISA法を開発し、本症患児の生後5日検診時に得られた浸染血液乾燥濾紙によるマススクリーニング法を検討した。既に胆道閉鎖症の確定診断がされている患児及び健常児の浸染血液乾燥濾紙を用いて比較検討を行い、鑑別判断に適応できることが判明した。さらにデータを収集してマススクリーニング法としての有用性を検討する必要がある。2)先天性肝胆道疾患における胎児性胆汁酸の体内動態の解明と病態解析法の開発:その他の各種先天性肝胆道疾患患児の血液、尿について1)において開発したELISA法とGC/MS法の併用により胎児性胆汁酸を精査して体内動態および病態解析法を検討した。
ネズミチフス菌感染と宿主抵抗性ー特に非特異的防御系ネットワ-クを中心としてー

ネズミチフス菌感染に対する無菌マウスと普通マウスの末梢血顆粒球及び腹腔細胞のルミノ-ル依存性化学発光におけるピ-ク化学発光値の変動をみると、無菌マウス感染群は普通マウス感染群に比して有意に高く評価された。ここではネズミチフス菌感染に対する網内系システムの食細胞の反応性のパタ-ンとは逆の現象として観察された。一方ネズミチフス菌感染に対する無菌マウスと普通マウスの末梢血顆粒球及び腹腔細胞のルンフェリン依存性化学発光反応性において、感染初期では普通マウス感染群は、無菌マウス感染群に比して高く評価されたが、感染の進行に伴い無菌マウス感染群の方が高く評価された。これはルミノ-ル依存性化学発光反応とは異なったパタ-ンであったが、感染に対する網内系システムの反応性のパタ-ンと類似していた。又無菌マウス及び普通マウス感染群において、腹腔細胞のO^<n->_2の産生とルンフェリン依存性化学発光反応性はよく相関していた。食細胞のルミノ-ル依存性発光は、ミエロペルオキシダ-ゼが関与するOCl^-によるものが主体である。又ルンフェリン依存性化学発光は、ス-パ-オキサイド.ジスムタ-ゼにより強く阻害され、^1O_2消去剤、ミエロペルオキシダ-ゼ阻害剤,カタラ-ゼなどによって僅かしか阻害されないことから、食細胞の食殺菌時のルンフェリン依存性化学発光反応はO^<n->_2が主役を演じていることが考えられる。われわれの実験において得られた結果は、無菌マウス感投群における末梢血顆粒球及び腹腔細胞の食殺菌時の反応性には、ミエロペルオキシダ-ゼの関与するOcl^-によるものが主役を演じており、また普通マウス感染群における顆粒球及び腹腔細胞の食殺菌時における反応性には、O^<n->_2によるものが中心的役割を果していることが示唆された。ネズミチフス菌をICR系の無菌マウス及び普通マウスに皮下感染すると、無菌マウス感染群においては感染後57日目に血中からの菌の検出もみとめられ、肝、脾の菌数も普通マウス感染群に比し高く評価された。普通マウス感染群の血中からの菌の検出はみられなかった。カーボンクリアランス試験による網内系機能測定によって得られたK値、α値と肝、脾から回収された生菌数との間に相関性がみられ、その反応性は普通マウス感染群の方が無菌マウス感染群より高く評価された。又肉芽腫構成細胞種について、普通マウス感染群の場合クッペル細胞が主体であるのに対し、無菌マウス皮下感染群は前単球によって占められていた。普通マウス感染群では、感染初期において好中球数や単球数の軽度の増加がみられるが、無菌マウス感染群では感染初期の細胞数の応答は弱く、感染経過と共に増加傾向がみられ、この傾向は好中球数において著明であった。一方血中食細胞よりの活性酸素放出能をルミノール存在下でザイモザンを刺激剤として加え、化学発光の放出として測定した結果、細胞当りのピークCL値の感染経過を追っての経時的観察において、無菌マウス感染群は普通マウス感染群に比較して高く評価され、特にこの傾向は感染5日目において著明であった。

血中好中球数の感染経過に対応した変動パターンと、血中食細胞のピークCL値の経時的追跡の結果とを比較すると、無菌マウスにおける好中球数の量的変動と、活性酸素放出能を指標とした血中顆粒球系食細胞の機能との間には逆相関が成立するように思われる。このことは非特異的防御系の中でいとなまれる顆粒球系食細胞の中での量と質の補完反応及びマクロファージ系細胞と顆粒球系食細胞との間の機能的補完反応を表現しているように考えられ、食細胞系の間に繰り広げられる恒常性維持機構の側面をあらわしているものとして興味深い。無菌マウス,普通マウスにネズミチフス菌を皮下感染した場合において、肝における肉芽腫形成は普通マウス感染群では、無菌マウス感染群に比し著明に抑制された。そして我々は、肉芽腫構成細胞の細胞化学的立場からの電顕的解析の結果、無菌マウス感染群における肝の肉芽腫構成細胞は、内在性ペルオキシダ-ゼ(EPO)局在が核膜周囲、粗面小胞体(rER)、ゴルジ装置及びアヅ-ル顆粒にみられる前単球によって占められていた。普通マウス感染群の肉芽腫構成細胞の主体は、rERや核膜周囲にEPOの局在のみられるクツパ-(Kupffer)細胞であるという成績が示された。個内系組織を主舞台とするネズミチフス菌のマウスにおける全身感染病においては、クッパ-細胞の役割はその感染防御効果を論ずる上にきわめて重要であり、得られた成績は、腸内フロ-ラガクッパ-細胞の量的制御に関与していることを示唆している。一方無菌マウス感染群における末梢血顆粒球及び腹腔細胞の食殺菌時の反応性には、ミエロペルオキシタ-ゼの関与するOcl^ーによるものが主役を演じていた。また、普通マウス感染群における顆粒球及び腹腔細胞の食殺菌時における反応性には、O_2^ー(ス-パ-オキサイドアニオン)によるものが中心的役割を果していることが示唆された。このことは、腸内フロ-ラの存否による食細胞の反応性の量的、質的相違点を解析する上に、又O_2^ー産生と細胞性免疫活性という問題の相互関係を探求する上に、きわめて重要な研究の足掛りを提供するものである。
パルスレーザーによる高温超伝導薄膜生成とプラズマカソードの研究

本研究では、Nbに続く超伝導加速空洞材料としてMgB2が期待できると考え、高い加速電界と低い電力損失という高周波加速空洞に必要な性能を評価する事を目的としている。6GHz帯の全面MgB2成膜用の空洞を、切断面等の異なる複数の空洞を製作し、空洞内全体の均一なMgB2成膜を行い、超伝導空洞としての性能の評価を行った。超伝導転移する成膜条件の精度を向上させるための試験を行った。また高電界測定を行うサンプルの準備をおこなった。これらの結果についてイタリアで行われた超伝導薄膜のワークショップで現状報告をおこなった。MgB_2は、酸化物高温超伝導体と比較して臨界温度、臨界磁場共に低いため、高温超伝導体発見時ほどには注目を浴びていないようであるが、酸化物高温超電導体にないいくつかの優れた特性を有し、超伝導加速空洞の素材として有望であることが明らかになってきた。我々はNbに続く超伝導加速空洞材料としてMgB_2が期待できると考え、加速空洞への応用に焦点を絞り、により、そのマイクロ波特性、特に表面抵抗の温度依存性、および電力(マイクロ波磁場)依存性を測定解析し応用可能性を評価しようとするものである。PLD法については我々は、酸化物高温超伝導体,特にYBaCuOにおける経験を基礎として、直径36φ円盤上に臨界温度が39K,16GHzにおける高周波表面抵抗が4.2Kで少なくとも0.1mΩ以下の、MgB_2薄膜を製作しその高周波電力依存性を測定し、高い加速電界達成の可能性を探っている。TMモード空洞に薄膜を付ける実験として長て方向に4分割した空洞を用いた実験をおこない銅空洞の内面にMgB2薄膜を形成し超伝導転移を高周波抵抗の急激な変化を20K付近で観測した。更に特性の改善に取組中である。本研究では、パルスレーザーを用いた高温超伝導薄膜生成とプラズマカソードの研究を目的としている。Nbによる超伝導加速空洞は50MV/mと理論値の限界に達しており、またNb空洞はBCS抵抗による高周波損失のため液体Heに減圧冷却を行っても、実用周波数はせいぜい1.5GHz止まりという限界がある。MgB2は、酸化物高温超伝導体と比較して臨界温度、臨界磁場共に低いが、酸化物高温超電導体にないいくつかの優れた特性を有し、超伝導加速空洞の素材として有望であることが明らかになってきた。そこでNbに続く超伝導加速空洞材料としてMgB2が期待できると考え、高い加速電界と低い電力損失という高周波加速空洞に要求される最も重要な二つの特性を、MgB2が極めて高いレベルで充足していることを、実験レベルで証明することを目的としている。昨年度は、前年度の空洞端板のみのMgB2成膜の結果に基づいて、6GHz帯の全面MgB2成膜用の空洞を複数製作し、空洞内全体の均一なMgB2成膜を行い、超伝導空洞としての性能の評価を行った。当初、加速電界方向に2分割した空洞にて成膜し、評価を行ったが、高周波電流の流れる接合面での成膜が難しかった。そこで2分割の空洞を切削後接合し、さらに4分割して個々に成膜を行う事で、接合面に高周波電流の流れない構造にして評価を行っている。成膜条件によって超伝導転移が確認できた物と、そうでない物があり、条件出しの精度を向上させるための試験を行っている。

成膜条件によって超伝導転移が確認できた物と、そうでない物があり、条件出しの精度を向上させるための試験を行っている。また高電界測定を行うサンプルの準備をおこなった。イタリアで行われた超伝導薄膜のワークショップで現状報告をおこなった。
大腸がんに対する新規抗体医薬の開発を目指す標的分子の同定と立体構造基盤の構築

本研究では、「大腸がん」をモデルとして、抗体医薬等を開発するために、革新的な戦略システムを構築する。マウス腸管オルガノイドは、ヒト大腸がんで高頻度に変異が認められる4種類のドライバー遺伝子(Apc, Kras, Tgfbr2, Trp53)を組み合わせて変異を導入することで発生する腸管腫瘍である。樹立したオルガノイドを同系マウスやNOGマウス(完全免疫不全マウス)の腸管あるいは脾臓に移植することで、ヒト大腸がんの原発巣および肝転移に極めて近い病態を再現することができる。このマウス由来オルガノイドシステムを用いて、構造解析にも使用できる立体構造認識抗体を取得する。創薬のターゲットの7割が膜タンパク質であるということに注目し、腫瘍組織(原発巣、転移巣)を摘出して、膜画分を調整した後、界面活性剤で可溶化する。摘出した腫瘍組織は、研究協力者の大島正伸(金沢大)が提供する。超遠心機で不溶性画分を除いた後、ホスファチジルコリンとSalmonella菌由来のlipid Aと共に再構成したプロテオリポソームを抗原としてマウス腹腔内に複数回投与する。リポソーム抗原を用いた場合、lipid Aが強い免疫刺激を与えて抗原性を増強するとともに、特にB細胞抗原受容体に対して未変性の膜タンパク質表面の立体構造を有効に提示できるため、所望の抗体が産生されやすい。自己免疫疾患マウスに免疫し、免疫寛容を回避する。スクリーニング工程では、可溶化した腫瘍組織をビオチン化脂質含有リポソーム中に再構成した上で、安定かつ強固にストレプトアビジンーマイクロプレートのウェルに固定化した抗原を用いてELISA(リポソームELISA)を行う。リポソームELISA法では陽性、ドットブロット法では陰性となるクローンを選抜することにより、膜タンパク質の部分ペプチド配列ではなく、立体構造を認識する抗体を20種類以上選抜する。1.大腸がん発生と悪性化に関与する既知ドライバー遺伝子数種類を組み合わせて導入したマウスモデルを作製し、大腸がん細胞の悪性化形質や転移能獲得にはApc、Kras、Tgfbr2変異の組み合わせが重要であることを明らかにした(Cancer Res, 2018)。これらのドライバー遺伝子すべてに変異が蓄積した大腸がんオルガノイドではテトラスパニンTM4SF1、Na+依存性L-アスコルビン酸トランスポーターSLC23A2等の膜タンパク質の発現亢進が顕著で、shRNAによる発現抑制実験等から大腸がん悪性化進展機構に特定の膜タンパク質の機能・相互作用が必須であることが証明された。2.上記の1.で大腸がん転移抑制のための創薬標的候補として挙げられた膜タンパク質を対象として、機能性抗体作製およびX線結晶構造解析を実施するための基盤として、昆虫細胞Sf9発現系を用いた膜タンパク質の大量発現・精製法を確立した。一例としてヒト・テトラスパニンTM4SF1に関する実験結果を図1に示した(精製収量2.5 mg/L Sf9培養)。精製の最終段階でのゲル濾過クロマトグラフィーでのピーク形状は良好、精製品のSDS-PAGE泳動像も単一バンドである。3.上記の2.で得られたTM4SF1の高品質精製標品および当グループが独自に開発した抗体スクリーニング技術(リポソーム免疫、リポソームELISA、蛍光ゲル濾過分析等)を用いて、ヒトTM4SF1に対する立体構造認識抗体(膜タンパク質の部分ペプチド配列ではなく、膜タンパク質の親水性表面の立体構造を特異的に認識し結合するモノクローナル抗体)を5株取得した。さらに、当該抗体が膜タンパク質の細胞外ドメイン/細胞外ドメインのいずれに結合しているかを識別する新技術を確立し、それを用いて少なくとも3株が細胞外ドメインの立体構造に結合することを明らかにした。取得した抗体を大量生産し、Fab抗体フラグメントを調製する。TM4SF1/Fabフラグメント複合体の精製品を調製し、この試料を用いて脂質キュービック相結晶化法により結晶化条件のスクリーニングを実施する。結晶化実験と並行して、TM4SF1/Fabフラグメント複合体を脂質ナノディスクに再構成し、クライオ電子顕微鏡単粒子解析のための試料調製を進める。さらに、取得した抗体の薬理活性評価に必要な大腸がんオルガノイドを用いた実験系を確立する。in vitro薬理活性評価(高転移性オルガノイドの培地に抗体を添加することによる増殖阻害効果、形態変化、浸潤能の変化を観察)とin vivo薬理活性評価(高転移性オルガノイドをマウス脾臓に移植後に抗体投与による治療実験)を実施する。転移抑制が観察される場合、どこに効いているのか(colonization、expansion、間質形成能など)を組織学的に見極める。取得した抗体IgGの精製品を用いて、大腸がん転移抑制の薬理効果の有無を解析する予定である。

創薬のターゲットの7割が膜タンパク質であるということに注目し、腫瘍組織(原発巣、転移巣)を摘出して、膜画分を調整した後、界面活性剤で可溶化する。摘出した腫瘍組織は、研究協力者の大島正伸(金沢大)が提供する。超遠心機で不溶性画分を除いた後、ホスファチジルコリンとSalmonella菌由来のlipid Aと共に再構成したプロテオリポソームを抗原としてマウス腹腔内に複数回投与する。リポソーム抗原を用いた場合、lipid Aが強い免疫刺激を与えて抗原性を増強するとともに、特にB細胞抗原受容体に対して未変性の膜タンパク質表面の立体構造を有効に提示できるため、所望の抗体が産生されやすい。自己免疫疾患マウスに免疫し、免疫寛容を回避する。スクリーニング工程では、可溶化した腫瘍組織をビオチン化脂質含有リポソーム中に再構成した上で、安定かつ強固にストレプトアビジンーマイクロプレートのウェルに固定化した抗原を用いてELISA(リポソームELISA)を行う。リポソームELISA法では陽性、ドットブロット法では陰性となるクローンを選抜することにより、膜タンパク質の部分ペプチド配列ではなく、立体構造を認識する抗体を20種類以上選抜する。1.大腸がん発生と悪性化に関与する既知ドライバー遺伝子数種類を組み合わせて導入したマウスモデルを作製し、大腸がん細胞の悪性化形質や転移能獲得にはApc、Kras、Tgfbr2変異の組み合わせが重要であることを明らかにした(Cancer Res, 2018)。これらのドライバー遺伝子すべてに変異が蓄積した大腸がんオルガノイドではテトラスパニンTM4SF1、Na+依存性L-アスコルビン酸トランスポーターSLC23A2等の膜タンパク質の発現亢進が顕著で、shRNAによる発現抑制実験等から大腸がん悪性化進展機構に特定の膜タンパク質の機能・相互作用が必須であることが証明された。2.上記の1.で大腸がん転移抑制のための創薬標的候補として挙げられた膜タンパク質を対象として、機能性抗体作製およびX線結晶構造解析を実施するための基盤として、昆虫細胞Sf9発現系を用いた膜タンパク質の大量発現・精製法を確立した。一例としてヒト・テトラスパニンTM4SF1に関する実験結果を図1に示した(精製収量2.5 mg/L Sf9培養)。精製の最終段階でのゲル濾過クロマトグラフィーでのピーク形状は良好、精製品のSDS-PAGE泳動像も単一バンドである。3.上記の2.で得られたTM4SF1の高品質精製標品および当グループが独自に開発した抗体スクリーニング技術(リポソーム免疫、リポソームELISA、蛍光ゲル濾過分析等)を用いて、ヒトTM4SF1に対する立体構造認識抗体(膜タンパク質の部分ペプチド配列ではなく、膜タンパク質の親水性表面の立体構造を特異的に認識し結合するモノクローナル抗体)を5株取得した。さらに、当該抗体が膜タンパク質の細胞外ドメイン/細胞外ドメインのいずれに結合しているかを識別する新技術を確立し、それを用いて少なくとも3株が細胞外ドメインの立体構造に結合することを明らかにした。
造血器腫瘍における骨髄間質細胞のレチノイン酸レセプターの分子異常

本研究によりall-trans retinoic acid (ATRA)およびその立体異性体9-cis RAともにヒト骨髄間質細胞株KM101細胞のM-CSF,GM-CSFの産生を濃度依存性に増強することが明らかになった。これらは転写レベルで産生調節が行なわれており、retinoid X receptor (RXR)のリガンドである9-cis RAがより強力な作用を有していた。9-cis RAはATRAと協調的にレチノイド耐性HL-60細胞に対する分化誘導能を有し、また極めて低い濃度では白血病細胞をむしろ増殖させることも判明した。次に骨髄間質細胞においては、retinoic acid receptor (RAR)はATRA,9-cis RAにてその発現が変化しなかったが、RXRの発現は9-cis RAにより濃度依存性に増強した。これらの事実は正常ヒト骨髄間質細胞初代長期培養細胞においても確認された。以上より、レチノイン酸が骨髄間質細胞からのサイトカイン産生を調節しており、RXRを介しての転写活性経路が重要であると考えられた。急性前骨髄球性白血病(ARL)に対するATRAによる分化誘導療法の治療初期に認められる白血球増多やそれに伴う致死的な呼吸不全の病態の一部は本研究によりレチノイドによる骨髄間質細胞からのサイトカイン産生、および極めて低濃度のATRAが白血病細胞をむしろ増殖させた結果と考えられた。骨髄性白血病細胞の分化においては、9-cis RAがATRAに比しより効果的であった。さらに,各レセプターの転写活性を選択的に増強し得る合成レチノイドを種々作製し検討したところ、RXR選択的レチノイドは白血病細胞の分化を誘導しなかったが、RAR選択的レチノイドは白血病細胞の増殖を抑制し、分化を誘導した。また、この過程でレチノイン酸耐性白血病細胞ではRXR遺伝子には全く異常を認めなかったが、RAR遺伝子のコドン411のCからTへの点突然変異を認めた。これらの結果より骨髄性白血病細胞の分化誘導やレチノイド耐性獲得に関してはRARを介するpathwayがより重要であると考えられた。当該年度は、ヒト骨髄間質細胞株KN101に対するレチノイン酸化合物の影響を検討した。All-trans retinoic acid(ATRA)およびその立体異性体である9-cis retinoic acid(9-cisRA)はKM101細胞のM-CSF,GM-CSF産生能を濃度依存性に増強した。これらはtranscriptionalなレベルで産生調節が行われていた。G-CSF,IL-6については恒常的に産生されているものの、レチノイドによる影響は受けなかった。さらに、9-cisRAはより強力なサイトカイン産生能を有しており、レチノイン酸抵抗性HL-60細胞に対する分化能や、極めて低濃度でHL-60細胞をむしろ増殖させることも明らかになった。間質細胞におけるレセプターの解析では、retinoic acid receptor(RAT)-alphaはATRA,9-cisRAにて発現が変化しなかったが、retinoid X receptor(RXR)-alphaは9-cisRAにてその発現が濃度依存的に増強した。さらに、正常ヒト骨髄間質細胞初代長期培養細胞においても同様の結果が得られた。これらの事実は、レチノイン酸がレセプターを介して骨髄間質細胞からのサイトカイン産生を調節しており、特に、RXRを介しての転写活性経路が重要な意義を持つと考えられる。