hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
泡沫濃縮と次世代シーケンシングを利用した水環境中の病原細菌一斉検出法の開発

[代表者・鈴木,H30-31]:界面活性タンパク質を用いて,細菌の鉄凝集フロック(塊)が気泡の気液界面に付着・吸着する機能を高め,工学的手法によって泡沫に濃縮する方法を開発する。具体的には,病原微生物汚染水にタンパク質を添加し,分散気泡を送気供給して水面上に発生する安定泡沫に超高濃度で細菌を分離・回収する。その泡沫濃縮液から高効率にDNAを抽出し,標的とする病原細菌の遺伝子を濃厚に含むDNA濃縮原液を得る。目標設定値:原水10 Lに含まれる細菌DNAを100μLにする(10万倍濃縮)。進捗状況:計画通りに遂行し,5万倍の細菌DNA濃縮法を確立した。スケールアップは確認済。2100以上の標的遺伝子の一斉検出法[プライマー設定:分担者・真砂,H30-31;一斉検出:鈴木,H31-32]:WHOの飲用水質ガイドラインの病原細菌リストや感染症研究所の病原微生物検出情報ウェブサイトから候補となる病原細菌を選定する。さらに,文献検索システムのデータベースから,選定された病原細菌の標的遺伝子を検索し,PCRで増幅するためのプライマーを設定する。進捗状況:水系感染症で最重要な5種の病原大腸菌をリストアップし,独自のプライマーを設計した。3実河川における実証[鈴木・真砂,H32]:都市河川,畜産排水の流入する河川,および下水道未整備地区の河川を対象として,河川水からDNAを超高濃度に濃縮して,病原細菌に関連する標的遺伝子を一斉検出する。進捗状況:実河川において,病原性細菌属を網羅的に検出した。以上のことから,本研究は概ね順調に進展している。我々が開発した大容量の水試料からの高効率な病原細菌濃縮技術(泡沫分離法)と近年開発が進む次世代シーケンシング技術を組み合わせることによって,1水試料中から全ての細菌を超高濃度に濃縮し,2病原関連遺伝子を一斉検出する手法を開発する。当初,計画していた調査旅費を精査することによって大幅に削減できた。次年度の消耗品費に合わせて,遺伝子抽出キット,薬剤耐性試験試薬で使用する計画である。
半導体/磁性体複合構造における電気伝導の理論的研究

強磁性微小2重トンネル接合の磁気抵抗効果を、ドット内のスピン緩和時間とスピン蓄積の効果を取り入れて計算した。その結果、1)スピン緩和時間が長いほど磁気抵抗効果が大きくなること、2)印加電圧とともに磁気抵抗効果が振動すること、が示された。更に、強磁性1重トンネル接合の絶縁層内に磁性微粒子を配列させた、ハイブリッド系における電気抵抗を線形応答の範囲内で計算した。その結果、1)微粒子の静電ポテンシャルが分布している場合には、電気抵抗の温度依存性が弱くなること、2)微粒子内のエネルギー準位間隔より温度が十分低くなると磁気抵抗効果が増大すること、が示された。半導体中の磁性不純物とその再隣接原子の電子状態密度を、タイトバインディング模型に実空間のバンド計算の手法を適用して計算した。その結果、1)不純物電子状態には、ギャップ近傍に特異な混成状態が出現すること、2)再隣接半導体原子には、spボンドの切断によると思われる新しい準位が出現すること、3)上向きスピン状態と下向きスピン状態の混成の違いのため、最隣接原子のスピン分極は不純物のそれと逆向きとなること、が示された。これら以外にも、遷移金属を用いたトンネル接合、マンガン酸化物を用いたトンネル接合、に関する研究を行った。
光運動材料を用いたインテリジェントデバイスの開発

架橋アゾベンゼン液晶高分子(CLCP)フィルムは紫外光照射によりメソゲンの配向方向に沿って異方的に変形し,可視光照射または熱により初期の形状に復元する。このため,CLCPフィルムはアクチュエーターとしての応用が期待できる。これまでにわれわれは,CLCPフィルムの光屈伸挙動こつい検討し,前年度において,架橋部位の光応答性の有無が動作特性に大きな影響を及ぼすことを明らかにした。本年度はフィルム内部のアゾベンゼンの異性化率をFischer法により算出し,アゾベンゼンの導入位置および濃度の光異性化への影響と,力学的特性への寄与を評価した。その結果,アゾベンゼン濃度が低下するにつれて異性化率が増大することが明らかとなった。また,アゾベンゼン濃度が一定の系において異性化率および発生応力を測定したところ,異性化率では,アゾベンゼンを側鎖に多く含む系において高い値を示す一方,発生応力では,架橋部にアゾベンゼンを多く含む系で高い値を示すことが明らかとなつた。続いて,高い発生応力を示したフィルムを用いて応用性を検討した。その結果,フィルムは照射のみで自重の100倍以上の重量を有する物体をもちあげ,自重の1,000倍近くの重量を有する台車を移動できることが明らかとなった。さらに,太陽光よりフィルターを用いて紫外光と可視光を取り出し,CLCPフィルムに照射したところ,自然光のみで屈伸運動を誘起できることもらかとなった。以上の結果より,アゾベンゼンの濃度および導入位置を調節することにより,高効率な光運動材料を得られることが明らかとなった。架橋アゾベンゼン液晶高分子フィルムは紫外光を照射すると分子の配向方向に沿って異方的に変形し,可視光または熱により初期の形状に復元する。このため,架橋アゾベンゼン液晶高分子フィルムはアクチュエーターとしての応用が期待できる。しかしながら架橋アゾベンゼン液晶高分子は「動作特性の向上」と「応用範囲の広い運動モードの構築」という二つの課題を有する。筆者らは材料の最適化を図るため,フィルムの組成や光照射条件を変化させ,出力や変形量,エネルギー変換効率の向上する条件を検討した。まず,温度や光強度,初期荷重への依存性について検討するとともに,光変形の繰り返し耐久性についても評価した。変形量は温度,および光強度が増加すると増大した。また,架橋剤濃度依存性についても検討を行い,架橋剤濃度が増加すると出力が著しく増大することが明らかとなった。次に,フィルムの変形をより効率よく誘起するため,アゾベンゼンを含むモノマー・架橋剤,アゾベンゼンを含まないモノマー・架橋剤を合成し、それらを組み合わせて架橋部位の構造の異なるフィルムを作製し,動作特性への影響を検討した。その結果,アゾベンゼン濃度が低下するに伴って出力,収縮量はともに増大した。また,モノマー部位と比較して,架橋部位の光応答性の有無が動作特性に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。初期の動作特性と比較して収縮量にして4倍以上,出力にして7倍以上の特性向上に成功した。
サケ科魚類のMHC遺伝子の構造解析

魚類の主要組織適合抗原複合体(MHC)を研究することは、数々の疾病に対する予防や育種および系群識別においてきわめて重要である。しかし魚類におけるMHCの研究はほとんど行われていない。そこで水産上重要魚種であるシロザケおよびカラフトマスのMHCの遺伝子のクローニングをPCR法を用いて行った。シロザケは岩手県、カラフトマスは北海道よりサンプリングを行い、それぞれ定法に従ってDNAを分離した。MHC遺伝子のクローニング方法としてタイセイヨウザケでクローニングされているMHCクラス1遺伝子の塩基配列をもとに6種類のプライマーを作成し、各ドメインのクローニングを試みた。その結果MHCクラス1遺伝子のalpha-1ドメイン(約260塩基)のクローニングを行うことができたが、その他のドメイン(alpha-2及びalpha-3)はできなかった。そこでクローニングできた部分の塩基配列の決定を試みた。その結果シロザケのMHCクラス1遺伝子は、タイセイヨウザケとくらべると222塩基中9塩基の違い(アミノ酸で74個中4個)が見いだされた。一方カラフトマスのMHCクラス1遺伝子はタイセイヨウザケと、222塩基中8塩基の違い(アミノ酸で74個中5個)が見いだされた。さらにシロサゲとカラフトマスでは、222塩基中10塩基の違い(アミノ酸で74個中7個)が認められた。さらに同一個体においての変異をシロザケで確かめた結果、6クローン中3クローンにそれぞれ1塩基の相違が見られ、これらの変異はすべてアミノ酸も変異を伴っていた。従ってほ乳類において見られるMHCの多様性は、魚類においても存在する可能性が示唆された。
コムギ老化葉におけるRubiscoの膜小胞を介した葉緑体化への排出と分解

RCBはRubiscoの分解が盛んな葉の老化初期に最も多く存在していることを先の研究において見出した。そしてRCBがリソソーム様のオルガネラに囲まれていること、およびRCBが液胞内に取り込まれていることを免疫電顕観察により見出した。この結果からRCBを介したRubiscoの葉緑体外への排出が葉の老化過程におけるRubisco分解において重要な役割を果たしていることが示唆されている。本年度は、コムギに加えて、モデル植物であるイネとアラビドプシスにおいてもRCBが見られるかどうか検討した。その結果、イネとアラビドプシスにおいてもRCBの存在が免疫電顕において確認された(Ishida et al.2005)。そこで葉緑体のストロマにターゲットされたGFPを発現するアラビドプシス形質転換体を用いて、RCBの生きた細胞内での可視化を試みた。その結果、液胞のATPase阻害剤であるコンカナマイシンAを加え、液胞内のpHを上昇させた葉の細胞において、RCBが液胞内に存在することを共焦点レーザー顕微鏡を用いて見出した。一方、コンカナマイシンA非存在下ではRCBは観察されなかった。共焦点レーザー顕微鏡において見出されたRCBは直径0.5-1.5マイクロメートルでありクロロフィル自家蛍光を有していなかった。この結果は電顕観察のものと一致した。以上の結果は、RCBが葉緑体外でのRubisco分解に関与していることを極めて強く示唆した(Ishida et al.投稿中)。(1)Rubiscoを含む小胞(RCB)が形成される老化のステージ、生育環境の特定コムギ第一葉を展開から成熟、老化そして枯死に至る過程で経時的にサンプリングし、葉の一生におけるRubisco量の変動とRCB形成の関係について定量的な解析を行った。その結果、RCBはRubiscoの分解が盛んな葉の老化初期に最も多く存在していた。この結果からRCBを介したRubiscoの葉緑体外への排出が葉の老化過程におけるRubisco分解の一端を担っている可能性が示唆された。またRubisco分解が大幅に促進される環境である暗処理下でのRCB形成について調べたところ、その出現頻度は自然老化の過程と同程度であった。暗処理下において、葉緑体のインタクトネスはRubiscoが処理開始前の20%に減少した時期まで保持されていた。このことより暗所下ではRCBを介した分解系に加えて、葉緑体内におけるRubisco分解系も盛んに働いていることが示唆された(Plant Cell Physiol.に投稿中)。(2)Rubiscoの分解を担う細胞内プロテアーゼの同定項目(1)の結果を受けて、暗所下でRubisco分解に関与する葉緑体プロテアーゼ活性の検索を行った。コムギ老化葉から葉緑体を単離しその破砕液を暗所下でインキュベートし、Rubiscoの分解活性の有無について調べた。その結果Rubisco大サブユニットをPhe-40とArg.-41の間で分解するプロテアーゼ活性の存在を見出した(Kokubun et al. 2002,Plant Cell Physiol.43:1390-1395)。(1)コムギ葉におけるRubiscoを含む小胞(RCB)の形成とそのRubisco分解における役割RCBはRubiscoの分解が盛んな葉の老化初期に最も多く存在していることを昨年の研究において見出した。この結果からRCBを介したRubiscoの葉緑体外への排出が葉の老化過程におけるRubisco分解において重要な役割を果たしていることが示唆された(Chiba et al.,2003,Plant Cell Physiol.44:914-921)。(2)Rubiscoの分解を担う細胞内プロテアーゼの同定昨年、Rubisco大サブユニット(LSU)をPhe-40とArg-41の間で分解するプロテアーゼ活性が単離葉緑体に存在することを見出した(Kokubun et al.2002,Plant Cell Physiol. 43:1390-1395)。そこでこのLSUの切断部位前後のアミノ酸配列をもとに蛍光ペプチド基質を合成し、これを用いてホウレンソウ葉からプロテアーゼの精製を行った。精製は硫安分画と、金属キレートアフィニティ、イオン交換、ならびにゲルろ過の各クロマトグライフィーにより行った。精製されたプロテアーゼはインシュリナーゼとの相同性を持つ分子量約100,000の単量体ポリペプチドからなる金属プロテアーゼであった。

そこで葉緑体のストロマにターゲットされたGFPを発現するアラビドプシス形質転換体を用いて、RCBの生きた細胞内での可視化を試みた。その結果、液胞のATPase阻害剤であるコンカナマイシンAを加え、液胞内のpHを上昇させた葉の細胞において、RCBが液胞内に存在することを共焦点レーザー顕微鏡を用いて見出した。一方、コンカナマイシンA非存在下ではRCBは観察されなかった。共焦点レーザー顕微鏡において見出されたRCBは直径0.5-1.5マイクロメートルでありクロロフィル自家蛍光を有していなかった。この結果は電顕観察のものと一致した。以上の結果は、RCBが葉緑体外でのRubisco分解に関与していることを極めて強く示唆した(Ishida et al.投稿中)。
ソーレ効果を用いた水素混合ガスの成分分離デバイスの開発に関する基礎研究

近年の水素利用技術に関連し,水素ガスあるいはその混合気において例外的に顕在化する温度による濃度分布形成(ソーレ効果)に注目し,それを利用して省エネ型の新しいガス分離デバイスを開発することを目的として、基礎的実験を行った。可燃性で危険性のある水素を試験ガスとして用いるため、実験には細心の注意を要し、そのため装置の詳細な検討を繰り返して装置を完成し、試験、データを収集した。基礎実験の概要を記すと、水素と窒素の混合ガスの成分分離を念頭に,先ず,水素,窒素それぞれのガス単独における伝熱と成分分離(ソーレ効果)について基礎的に調べるため,高さ5mm,幅15mm,長さ20mmの微小な矩形チャンネルを流路として,そこに試験ガスを流入させた.そして、上面を加熱,下面を冷却して鉛直方向に温度勾配を作り,ガス成分の分離度合いをガスクロマトグラフィにより測定した.実験パラメタは混合ガスの成分比率(水素と窒素の混合割合)である。その結果、ガス分離は必ずしも明瞭には生じないが、ソーレ効果によって確かに分離される傾向にあることが確認された。ソーレ効果が強いと、対流にもそれに応じた乱れ(ゆらぎ)が生じると予想される。その状況や挙動を見るため、ガス中に熱容量の小さな感温シートを置き、その温度を放射温度計で計測すること、またソーレ効果の強さ程度の測定は、ソーレ効果が無いとしたときの伝熱量(理論)に対する実際の伝熱量の比の形で評価することを計画し、実験装置もそれが可能になるよう工夫しているが、現段階では未だ結果が得られておらず、継続実験中である。近年の水素利用技術に関連し,水素ガスあるいはその混合気において例外的に顕在化する温度による濃度分布形成(ソーレ効果)に注目し,それを利用して省エネ型の新しいガス分離デバイスを開発することを目的として、初年度は実験計画の策定、実験装置の設計・製作を行った。本実験は、可燃性で危険性のある水素を試験ガスとして用いるため、実験には細心の注意を要するため、その研究計画、装置の詳細な検討を繰り返したため、現在装置が完成し、試験の段階であり、データを収集するに至っていない。したがってまた、研究成果の公表実績もない。装置は次のような実験研究を行うものとして設計製作されている。つまり水素と窒素の混合ガスの成分分離を念頭に,先ず,水素,窒素それぞれのガス単独における伝熱と成分分離(ソーレ効果)について基礎的に調べるため,高さ5mm,幅15mm,長さ20mmの微小な矩形チャンネルを流路として,そこに試験ガスを流入させる.そして、上面を加熱,下面を冷却して鉛直方向に温度勾配を作り,上下面間の熱伝達を詳細に調べる.ここでの実験パラメタは系の圧力、及び混合ガスの成分比率(水素と窒素の混合割合)である.ソーレ効果が強いと、対流にもそれに応じた乱れ(ゆらぎ)が生じると予想される。その状況や挙動を見るため、ガス中に熱容量の小さな感温シートを置き、その温度を放射温度計で計測する。流れ場の詳細なデータが必要ならマッハツンダー法かホログラフィー法を用いる予定である。なお、ソーレ効果の強さ程度の測定は、ソーレ効果が無いとしたときの伝熱量(理論)に対する実際の伝熱量の比の形で評価するとしている。また、ソーレ効果によるガス分離に関しては下流部にサンプリングルームを設けてあり、ガスクロマトグラフィーで成分を測定することとしている。
栄養処理による食肉の呈味制御：遺伝子発現及びメタボローム解析による高品質化

食肉の高品質化の中で呈味向上に対する期待は大きいが、効率的かつ有効な手法は未だに模索されている。そこでリジン(Lys)および分枝アミノ酸(BCAA)にグルタミン酸量(Glu)の調節及び肉質向上の可能性を見出し、その効果並びに作用機序を検討した。結果からBCAA量の調製によるGlu増加条件が明らかとなり、TCA中間代謝物への影響が見られた。一方Lys0.5%飼料添加は筋肉遊離Lys及びGluを有意に増加させ、Lys代謝物のサッカロピンやαアミノアジピン酸も増加した。Lys異化の律速酵素の遺伝子発現が増加した。飼料に由来する筋肉のアミノ酸代謝が食肉の呈味成分の生合成に影響する可能性を明らかにした。食肉の高品質化の中で呈味の向上に対する期待は大きいが、熟成保存中の成分変化を除き、呈味成分量の調節に関する有効な情報は極めて不足している。本研究は、食肉高品質化のため、飼料栄養素の調節による食肉呈味向上を図ることを目的とし、そのモデル家畜のグルタミン酸(Glu)及び関連アミノ酸の代謝メカニズムを解析し、次いでメカニズムを考慮した食餌栄養調節による高品質食肉の作出を目的とする。この解析にメタボローム、遺伝子発現解析等を用いた。モデルとした飼料リジン(Lys)を0.5%添加した飼料を10日間給与することにより、筋肉遊離Glu量を有意に増加させたブロイラーのメタボローム解析の結果、肝臓のみでなく筋肉でもサッカロピンやピペコリン酸(PA)系によるLys異化が生じた。肝臓における知見から、サッカロピン系のLys異化では2モル、PA系では1モルのGluが生成され、筋肉でも遺伝子発現やメタボロームで異化が確認されたことから、両者またはいずれかがGlu産生に寄与したことが示された。飼料へのPAを添加した検討から、PA系の関与はサッカロピン系よりも小さい可能性が示された。また高Lys飼料給与で、筋肉でLysの構造類似物質が増加し、β-Ala-Lysも増加した。その一方でβ-Ala-His(カルノシン)が減少する可能性が示されたが、これは食餌性Hisレベルの調整で高レベルを維持できることが明らかとなった。また食餌性BCAAによる筋肉Glu増加では、低ロイシンによるGlu増加が、吸収時のBCAA拮抗の結果として血漿Valの増加を介して生じた可能性を得た。これらの成果の一部は日本畜産学会等での11件の学会発表、国際アミノ酸科学協会セミナー等での3回の招待講演で公開した。また特許を取得した。従来の高品質化手法は遺伝(育種)及び食肉加工が主であった。生産段階で育種よりも短期間に高品質化を図る方法の一つに飼養管理があるが、呈味成分は飼料では変わらないとされてきた。筆者の検討から一部の飼料成分が呈味成分に影響する可能性を見出した。当初は低エネルギーや食事制限による呈味成分量低下であったが、高タンパク質飼料で主要呈味成分の一つであるグルタミン酸(Glu)が増加する可能性を得た。しかし高タンパク質は飼料コストや環境負荷の点から実用化の可能性が低く、微量の調節因子の可能性を検討した。そこでリジン(Lys)および分枝アミノ酸(BCAA)にグルタミン酸量の調節及び肉質向上の可能性を見出し、本研究においてその効果並びに作用機序を検討した。その結果、BCAA量の調製によるGlu増加条件が明らかとなった。メタボローム解析からTCA回路の中間代謝物への影響が見られた。しかしmRNA遺伝子発現解析では律速酵素の発現には差がなく、リン酸化または他の要因が関与する可能性が示された。一方Lysの0.5%飼料添加は筋肉の遊離Lys濃度を有意に増加させ、遊離Gluも有意に増加した。血漿Glu濃度は変化しなかった。筋肉を試料とした遺伝子発現解析の結果、Lys異化の律速であるLys-αケトグルタル酸レダクターゼの発現は有意に増加した。メタボローム解析からLys代謝物であるサッカロピンやαアミノアジピン酸等も増加した。これらから筋肉でLys異化が生じる可能性が示された。このLys異化は鶏で2経路が存在するがピペコリン酸投与の検討からGlu合成に関してはサッカロピン系が主体と推察された。以上により、飼料に起因する筋肉のアミノ酸代謝が食肉の呈味成分の生合成に影響し、また呈味に影響する可能性が明らかとなった。

食肉の高品質化の中で呈味の向上に対する期待は大きいが、保存熟成中の成分変化を除き、呈味成分量の調節に関する有効な情報は極めて不足している。本研究は、食肉高品質化のため、飼料栄養素の調節による食肉呈味向上を図り、そのモデル家畜のグルタミン酸(Glu)及び関連アミノ酸の代謝メカニズムを解析し、次いでメカニズムを考慮した食餌栄養調節による高品質食肉の作出を目的とする。この解析にメタボローム、遺伝子発現解析等を用いる。飼料リジン(Lys)量を調節し、5または10日間の給与により、筋肉遊離Glu量を増加させたモデルブロイラーのメタボローム解析の結果、肝臓のみでなく筋肉でもサッカロピンやピペコリン酸系によるLys異化が生じている可能性を得た。このとき両組織のLysine α-ketoglutarate reductase(LKR)遺伝子の発現上昇が見られた。筋肉では遊離Gluの増加が見られた一方、肝臓では遊離Gluの増加は見られなかった。血漿遊離Glu濃度は変化しなかった。このことから筋肉においてLys異化が生じ、Glu増加が生じる可能性が示された。一方、代謝経路は報告されていないが、Lysと構造が類似した複数の物質の増加が確認された。また暑熱環境下で飼養した場合にイミダゾールジペプチドのカルノシン量が筋肉で減少する可能性を得、これには塩基性アミノ酸の代謝が関与し、飼料での調節で対処できる可能性を得た。さらに飼料BCAAなどの給与による解析を進めた。これらの成果の一部は、57th International Congress of Meat Science and Technology等において6件の学会において研究発表を行った。また飼料に関する研究会にて招待講演を行った。概要で示した様に、Lys給与動物のメタボローム解析より、筋肉でサッカロピン及びPA系によるLys異化が生じている可能性を得たが、さらにPA系の関与の比率の検討に入り、その寄与は低い可能性を見出すことができた。またBCAAによる筋肉Glu量調節においては、吸収時のBCAA拮抗が関与する可能性を得ることができた。いずれもこれまでの知見と異なり、本研究課題の目的である飼料栄養素による筋肉でのGlu増加メカニズムの一端を明らかにすることができた。これらは当初の目的を十分に達成して展開している。またこれまでの成果から、新たな研究の展開が示された。概要で示した様に、Lys給与動物のメタボローム解析より、肝臓のみでなく筋肉でもサッカロピンやピペコリン酸系によるLys異化が生じている可能性を得た。このとき両組織のLKR遺伝子の発現上昇が見られ、筋肉では遊離Gluの増加が見られた。一方、肝臓では遊離Gluの増加は見られなかった。血漿Gluは変化しなかった。これまでの知見と異なり、筋肉でのLys異化を確認したことなど、本研究課題の目的である飼料栄養素によるGlu増加メカニズムの一端を明らかにした。この検討過程で、サッカロピン及びピペコリン酸系の中間代謝物の変動率には肝臓と筋肉での相違が見られ、またGluの応答は組織ごとに異なった。これらのことからGlu異化までを含む代謝を詳細に解析する必要が示された。前年度の成果を基盤に、メタボローム及び遺伝子発現解析、酵素活性の検討等を用いて飼料アミノ酸の給与に伴う筋肉Glu量の増加メカニズムの解明を進める。特にLysによる代謝のより詳細な解析、BCAA間で異なるGlu調節能についての代謝調節メカニズムの解析の検討を進め、食肉の効率的な食味向上のための条件を明らかにする。
DNA結合性タンパク質HMG1およびHMG2の機能とその作用機序の解明

[1] HMGタンパク質のDNA結合機構とそれに伴う構造変動の解析HMG1の2つのHMGボックスは単独でもDNA結合能を有すが、隣接塩基性領域の存在と2つのボックスの繋がりが結合安定性を増すこと、強いDNA結合は主にボックスB内の102Fのインターカレーションによることを解明した。また、2つのボックスがhead-to-headに繋がっており、DNAの17から18bpに結合、95から137度のDNA湾曲を与えるものと推定した。以上をもとに、HMG1とDNAと結合機構モデルを提唱した。HMG1/2は、負の超らせん型DNAに対する優先的認識、DNA巻き戻し活性、ヌクレアーゼS1消化からのDNA保護活性などの性質をもつが、その機能発現にはいずれもboxBが必須であるが、十分な活性発現には結合親和性を高める周辺領域を必要とすることを解明した。[2] HMG1、HMG2の機能、性質を解析し、以下の新知見を得た。(a) HMG1よる細胞内での転写促進がクロマチンの構造弛緩を伴うこと。(b) HMG1,2によるDNA bendingの機能領域はボックスBと隣接配列であること。(c) DNA依存性プロテインキナーゼの調節成分としてHMG1,2が機能すること。(d) DNAリガーゼIVの反応をHMG1,2が促進、制御因子と働く可能性があること。(e) HMG1,2が外来遺伝子の宿主ゲノムDNAへの組込みを促進する活性をもつこと。(f) HMG2が細胞増殖の制御に関わる因子であること。(g)HMG2の核移行シグナルが新規のシグナルであること(h)難病患者血清中に見いだしたHMGに対する自己抗体のエピトープを解明したこと。以上、HMG1、HMG2は転写、複製、組換え、修復、DNAインテグレーションなどに広く関与する多機能性の核タンパク質であることが、明らかにできた。1、HMG1による転写促進機構の解析:HMG1高発現細胞内でのレポータープラスミド由来のミニクロモソームの構造をHMG2高発現細胞中のそれと比較したところ、ヌクレオソームのH1ヒストンの量が減少しH1ヒストンの量が増加、併せて構造が弛緩していることが明らかとなった。2、細胞核内でHMG1と相互作用する因子の精製:培養細胞にHMG1、HMG2発現プラスミドを導入し、一定時間後、細胞核抽出液を調製し、抗HMG抗体をもちいた免疫沈降させた。ここで得られたタンパク質を二次元電気泳動法で解析した。その結果、HMG1、HMG2とそれぞれ特異的に結合して存在する複数種のタンパク質を同定できた。現在、抗HMG1、抗HMG2抗体をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーにより、これら因子の精製とクローン化を進めている。3、部位特異的変異を導入したHMG1のDNA結合機構の解析:HMG1内の単独のDNA結合領域、さらに2つのDNA結合領域が立体構造保持およびDNAとの結合に関与すると期待されるアミノ酸残基について各種部位特異的変異体を作製、高発現、精製した。これらとDNAとの結合を表面プラズモン共鳴(SPR)センサをもちいて定量的に測定、立体構造保持とDNAとの結合の機構を解析し、多くの知見を得た。4、HMG1のDNA結合ドメインのDNA認識機構の解析:HMG1タンパク質のDNA結合に主役的に働くBoxBの中で、DNAへのインターカレーションが予測される101F、102Fの結合における重要性を実験的に明らかにした。

さらに分子動力学シミュレーションにより、これらの側鎖の配位と結合との関連を解析した。その結果、BoxBのDNAへの結合が102F側鎖のDNAへのインターカレーションにより高められること、この側鎖の方向性を101Fが規定していることが明らかとなった。5、ラットHMG2のcDNAおよび遺伝子のクローニング:ラットHMG2のcDNAおよび遺伝子をクローンニングした。ラット繊維芽細胞をもちいた細胞増殖、細胞周期におけるHMG2の機能解析を進めている。[1] HMGタンパク質のDNA結合機構とそれに伴う構造変動の解析HMG1の2つのHMGボックスは単独でもDNA結合能を有すが、隣接塩基性領域の存在と2つのボックスの繋がりが結合安定性を増すこと、強いDNA結合は主にボックスB内の102Fのインターカレーションによることを解明した。また、2つのボックスがhead-to-headに繋がっており、DNAの17から18bpに結合、95から137度のDNA湾曲を与えるものと推定した。以上をもとに、HMG1とDNAと結合機構モデルを提唱した。HMG1/2は、負の超らせん型DNAに対する優先的認識、DNA巻き戻し活性、ヌクレアーゼS1消化からのDNA保護活性などの性質をもつが、その機能発現にはいずれもbox Bが必須であるが、十分な活性発現には結合親和性を高める周辺領域を必要とすることを解明した。[2] HMG1、HMG2の機能、性質を解析し、以下の新知見を得た。(a) HMG1よる細胞内での転写促進がクロマチンの構造弛緩を伴うこと。(b) HMG1,2によるDNA bendingの機能領域はボックスBと隣接配列であること。(c) DNA依存性プロテインキナーゼの調節成分としてHMG1,2が機能すること。(d) DNAリガーゼIVの反応をHMG1,2が促進、制御因子と働く可能性があること。(e) HMG1,2が外来遺伝子の宿主ゲノムDNAへの組込みを促進する活性をもつこと。(f) HMG2が細胞増殖の制御に関わる因子であること。(g)HMG2の核移行シグナルが新規のシグナルであること(h)難病患者血清中に見いだしたHMGに対する自己抗体のエピトープを解明したこと。以上、HMG1、HMG2は転写、複製、組換え、修復、DNAインテグレーションなどに広く関与する多機能性の核タンパク質であることが、明らかにできた。
嗅覚の客観的検査法の確立と嗅覚障害の病態に関する臨床的研究

日本で従来施行されている嗅覚検査法には基準臭嗅覚検査(T&T法)と静脈性嗅覚検査があるが、いずれも客観性に乏しい。米国で施行されているPhenyl ethyl alcohol single staircase odordetection threshold test(PEA法)は客観性・再現性の高い検査法であるが、煩雑である。そこで申請者らはT&T法の閾値判定にPEA法の原理を応用する新しい嗅覚検査法(MPEA法)を考案し、嗅覚正常者及び障害者に施行してその有用性を検討した。20才から60才までの嗅覚正常者86名(男性48名、女性38名)と嗅覚障害者54名(男性18名、女性36名)に対して、MPEA法とT&T法及び嗅覚アンケートを施行した。また55名の嗅覚正常者(男性34名、女性21名)に対して、T&T法とMPEA法を一定期間をおいて2回施行し、再現性についても検討した。嗅覚正常者と嗅覚障害者のMPEA法の平均値はそれぞれ-1.8と2.9で両者の間に有意差を認めた(t検定,p<0.01)。同様に嗅覚正常者と嗅覚障害者のT&T法の平均値は検知閾値が-1.3と1.5、認知閾値は-0.1と3.1で、それぞれ有意差を認めた(t検定,p<0.01)。Spearmanの順位相関を用いてMPEA法とT&T法の検知閾値・検知閾値との相関を求めたところ相関係数はそれぞれ0.796、0.836であった。同様にMPEA法と嗅覚アンケートとの相関計数は0.763であった。MPEA法とT&T法の検知閾値・検知閾値の再現性についてSpearmanの順位相関を用いて検討したところ、MPEA法は0.871、T&T法の検知閾値・検知閾値はそれぞれ0.733、0.441であった。以上の結果より、MPEA法は嗅覚障害の程度判定に役立つ上に、従来用いていたT&T法や、嗅覚アンケートとよく相関し、またT&T法よりも高い再現性が得られ、有用な検査法であると考えられた。
点字使用者のためのプログラミング環境の整備に関する研究

本研究は、点字使用者のプログラミング環境を整備することを目的に、問題点を把握するための実態調査と、その結果に基づくソフトウェア開発とを行った。1.重度視覚障害を持つ情報処理技術者の職務遂行環境に関する実態調査点字を使用しなければならない程度の重い視覚障害を持つ情報処理技術者を対象に、プログラミングなどの情報処理業務を遂行する環境の実態を調査した。その結果、*コンピュータ・アクセスの手段が十分に整備されていないこと、*マニュアルなどの資料調べが難しいこと、*周囲との文字によるコミュニケーションが円滑にできないこと、*図形的な情報の処理が難しいこと、*思考を助けるための有効な手段がないこと、*新しい技術や知識の習得が難しいこと、などの問題があることが明らかになった。2.点字出力機能を備えたテキスト処理システムの開発とその有効性の評価重度視覚障害者のプログラミング作業では、点字を用いるシステムが未整備なことなどから、プログラムの入力・編集やマニュアルの検索などのテキスト処理は、音声出力を利用して行われている。しかし、この方法は、処理の確実さや心的負担などの点から必ずしも満足できるものではない。そこで、タッチ・カ-ソル・スイッチ式の点字ディスプレイ装置に出力される点字を介してテキスト処理を行えるソフトウェアを開発し、点字出力を用いるテキスト処理と音声出力によるテキスト処理を比較する実験を行った。その結果、*処理速度は平均的には点字出力を用いた方がやや速いこと、*処理をするテキストの内容によって能率の良否がそれぞれに異なること、*心的負担は点字出力の方がはるかに小さいこと、などが明らかになった。これらのことから、重度視覚障害者のプログラミング環境には、従来からの音声出力に加えて点字出力も導入することが望ましいとの結論を得た。平成7年度は、重度視覚障害者のプログラミング環境を整備するための基礎的研究として、以下のことを行った。1.実態調査研究の方向性をより明確するために、情報処理分野で現在就労している重度視覚障害者を対象に、その就労環境、職務内容、プログラミングの方法と問題点などに関するアンケート調査を実施した。その結果、プログラミング環境の整備のために、*確実なコンピュータ・アクセス手段の開発、*マニュアル類の整備などが必要であることが明らかになった。2.プログラミング用点字エディタに関する基礎的研究プログラミングの過程ではテキスト・エディタの果たす役割が重要であることから、点字で確実に操作できるエディタの開発を目指し、その準備段階として、*ユーザ・ニーズ、*点字と普通文字との変換*点字ディスプレイ装置の機能、などについて研究した。その結果、エディタが点字使用者のために具備すべき機能や、それを実現する方法などが明らかになった。3.オンライン点字マニュアルに関する研究プログラミングの過程で必要な各種の情報を重度視覚障害者が迅速かつ正確に得られるようにするためのオンライン点字エディタの実現を目的に、*検索用点字データの構造*点字ディスプレイ装置の活用法、などについて研究した。その結果に基づいて、実験用の点字データを作成し、点字情報検索システムを試作した。平成7年度に実施した実態調査により、重度視覚障害者のプログラミング環境が満足できるものではないことが明らかになった。その一因として、これまでオプタコンや音声出力装置など、点字が介在しない手段が専ら用いられてきたことがある。そこで、平成8年度は、点字を活用してプログラミングを行うシステムをパソコン上に構築し、その使用効果を検討した。1.パソコン用テキストエディタの開発テキストデータを点字ディスプレイ上にリアルタイムで表示する機能を備えたエディタソフトを開発した。これにより、プログラムの入力・編集やマニュアルの検索など普通文字のテキストデータ処理を、点字環境で行えるようになった。同エディタの特色は、以下のような点である。*点字出力に情報処理用点字を用いることにより、JIS X0201の1バイトキャラクタからなるテキストデータを点字で完全に読み取ることができる。

*点字ディスプレイ装置のキ-操作でテキストデータを能率良く閲覧することができる。*点字ディスプレイ装置のタッチ・カ-ソル・スイッチにより極めて迅速なカ-ソル移動ができる。2.点字ディスプレイの有効性に関する研究テキストデータの処理における点字ディスプレイの使用効果を調べるために、上記1.のエディタを用いて、重度視覚障害者を被験者とする実験を行った。同実験では、音声出力を使用する環境と点字ディスプレイを使用する環境のそれぞれで等価なテキストデータ処理を行わせ、比較した。その結果、以下のことが明らかになった。*処理速度は、平均的には点字ディスプレイの場合がやや速いが、テキストの内容により能率の良否が異なる。*処理の精度については顕著な相違はない。*処理作業中の心的負担は、点字ディスプレイの方がはるかに小さい。このことから、重度視覚障害者のプログラミング環境には、従来からの音声出力に加えて点字ディスプレイも導入することが望ましいと結論できる。
発熱分布を制御した触媒燃焼の利用によるジメチルエーテルのマイクロ改質

近年,燃料としての水素利用に注目が集まっており,その供給方法として可搬性に優れる液体の燃料の改質による水素生成が候補の1つとして考えられている.本研究は小領域にてジメチルエーテル(DME)を改質して水素を生成することを目的とし実験を行った.DMEの水蒸気改質反応を進行させるために外部から熱を投入する必要があり,その熱源として触媒燃焼を用いる.その結果,一酸化炭素といった望ましくない物質の生成を抑えつつ,DMEをほぼ完全に改質することができた.近年,燃料としての水素利用に注目が集まっており,その供給方法として可搬性に優れる液体の燃料の改質による水素生成が候補の1つとして考えられている.本研究は小領域にてジメチルエーテル(DME)を改質して水素を生成することを目的とし実験を行った.DMEの水蒸気改質反応を進行させるために外部から熱を投入する必要があり,その熱源として触媒燃焼を用いる.その結果,一酸化炭素といった望ましくない物質の生成を抑えつつ,DMEをほぼ完全に改質することができた.本研究ではジメチルエーテル(dimethyl ether, DME)の改質による水素生成に関する実験を行った.DMEは無毒性で可搬性に優れており,改質器の小型化・軽量化に成功すれば,携帯機器用の電源として小型の燃料電池システムへの燃料供給への応用も考えられる.試作した改質器は外管8mm,内管4mm,長さ100mmからなる二重管型の構造をしている.外側流路においてDMEの水蒸気改質を行う.改質の効率を高めるためにCu-Feスピネル酸化物とγアルミナの混合触媒を充填している. DME水蒸気改質は吸熱反応であるため熱源を要する。内側流路はその熱源の役割を担うよう,微小容積でも反応が保持できる白金触媒による水素の触媒燃焼を行った.また,触媒燃焼は気相燃焼と比較すると温度制御が容易であるという利点も有する.その結果,触媒燃焼側の条件を変えることにより,温度が高くなるにつれDME転化率を向上させることができた.一方で,過度に高温になる場合においては一酸化炭素やメタンが生じるため,適度な温度領域を作るべく触媒燃焼の制御が必要であるという知見を得た.内外側流路における温度分布は山型であり,流路入口からまもなく触媒燃焼は完了していると推察される.つまり,本年度の実験装置の長さ100mmはいささか過剰であった.また,外側触媒における最高温度と最低温度(出口付近)の差が250°C程度と想定していた値よりも大きかった.熱損失を減らす,そして,温度制御を容易とする観点から次年度における装置はより短くする予定である.また,触媒燃焼用の触媒担持分布を変えることで温度制御が可能となるよう擬似三重管構造にすることを考えている.本研究ではジメチルエーテル(dimethyl ether, DME)の改質による水素生成に関する実験を行った.DMEは無毒性で可搬性に優れており,改質器の小型化・軽量化に成功すれば,携帯機器用の電源として小型の燃料電池システムへの燃料供給への応用も考えられる.本研究で実験を行う改質器は二重管型の構造をしており,外側流路においてDMEの水蒸気改質を,内側流路でその熱源となる触媒燃焼を行う.改質の効率を高めるために外側流路にはCu-Feスピネル酸化物とγアルミナの混合触媒を充填している.これまでは,改質用触媒・触媒燃焼用触媒とも100mmの長さで行ってきたが,温度分布から流路の後半部分は反応に寄与していないと推測される.流路が過剰に長いことは熱損失の増大を招き,触媒燃焼を維持するために最高温度を高くせざるをえない原因となるため,できるだけ短くすることが望ましい.そこで,有効な反応長さを求めるべく,改質用触媒を充填する量を変化させて実験を行った.その結果、50mmが最適であるという結果を得た.次に温度分布の制御ができるように改質器の構造を変更した.これまでは内側流路の内管に触媒燃焼を担持していたがその方法では担持領域に濃淡を付けることが困難であるため,温度分布を変えることができるパラメータは混合気の流量と濃度のみであった.今回は外側に触媒が担持された棒を挿入する構造にした.4パターンの触媒担持棒を交換して挿入し実験を行うことにより異なる発熱分布を試すことができる.その結果,適度な温度分布を実現し一酸化炭素やメタンの生成を抑制しながらも高いDME転化率を達成した.
組織培養法を用いる乳腺発癌実験の代替

乳癌の発生は近年日本において急増しており,その発癌因子および発癌過程の究明が急がれている.この研究はマウスの乳腺上皮細胞の無血清培養法を用いて,化学発癌物質と乳腺分化ホルモンを組み合せ投与して前癌状態および癌化の過程を再現し,動物を用いる乳腺発癌実験の代替と乳腺発癌物質の特異的検索法を確立することを目的とした.初年度は,乳癌イニシエ-タ-の特異的検索法の開発を行い,マウス乳腺の初代培養細胞に乳腺を標的とする化学発癌物質を添加すると小核が用量反応的に出現することを明らかにした.平成2年度は,乳腺発癌物質および非乳腺発癌物質の種類をそれぞれ増やして小核出現の特異性を調べ,乳癌イニシエ-タ-の特異的検出のためのin vitro小核試験の確立を試みた.マウス乳腺の初代培養細胞における小核の出現は,乳腺発癌物質のNーmethylーNーnitrosourea(MNU),7,12ーdimethylbenz[a]anthracene(DMBA),2ーacetaminofluorene,20ーmethylーcholanthreneおよびNーbutylーNーnitrosoureaはいずれも用量反応的に陽性を示した.これに反して,非乳腺発癌物質のbenzo[a]pyrene1,2ーdimethylhydeazine,Nーnitrosodimethylamineおよび4ーnitroquinoline1ーOxideは陰性または弱陽性を示し,比較的特異性がみられた.以上の結果は,無血清培養システムを用いたマウス乳腺上皮細胞の小核の出現を定重することによってヒト乳癌のイニシエ-タ-の検索が可能であることを示している.一方,培養細胞における癌化の過程を調べるため,プロラクチンを加えた培地にマウス乳腺細胞を培養し,乳腺発癌物質のDMBAおよびMNUを3週間感作し,その後8週間培養を続けたがトランスフォ-ムした細胞の出現はみられなかった.この発癌物質でイニシエ-ションされた細胞のマウス乳腺の脂肪組織内における分化と癌化の有無を調べるため,現在移植実験を準備中である.乳癌の発生は近年日本において急増しており,その発癌因子および発癌過程の究明が急がれている.この研究はマウスの乳腺上皮細胞の無血清培養法を用いて,化学発癌物質と乳腺分化ホルモンを組み合せ投与して前癌状態および癌化の過程を再現し,動物を用いる乳腺発癌実験の代替と乳腺癌物質の特異的検索法を確立することを目的とした.初年度は,乳癌イニシエ-タ-の特異的検索法の開発を行い,マウス乳腺の初代培養細胞に乳腺を標的とする化学発癌物質を添加すると小核が用量反応的に出現することを明らかにした.平成2年度は,乳腺発癌物質および非乳腺発癌物質の種類をそれぞれ増やして小核出現の特異性を調べ,乳癌イニシエ-タ-の特異的検出のためのin vitro小核試験の確立を試みた.マウス乳腺の初代培養細胞における小核の出現は,乳腺発癌物質のN__ーmethylーN__ーnitrosourea(MNU),7,12ーdimethylbenz[a]antihracene(DMBA), 2ーacetaminofluorene, 20ーmethylーcholanthreneおよびN__ーbutylーN__ーnitrosoureaはいずれも用量反応的に陽性を示した.これに反して,非乳腺発癌物質のbenzo[a]pyrene1,2ーdimethylhydrazine, N__ーnitrosodimethylamineおよび4ーnitroquinoline1ーoxideは陰性または弱陽性を示し,比較的特異性をみられた.以上の結果は,無血清培養システムを用いたマウス乳腺上皮細胞の小核の出現を定量することによってヒト乳癌のイニシエ-タ-の検索が可能であることを示している.一方,培養細胞における癌化の過程を調べるため,プロラクチンを加えた培地にマウス乳腺細胞を培養し,乳腺発癌物質のDMBAおよびMNUを3週間感作し,その後8週間培養を続けたがトランスフォ-ムした細胞の出現はみられなかった.この発癌物質でイニシエ-ションサれた細胞のマウス乳腺の脂肪組織内における分化と癌化の有無を調べるため,現在移植実験を準備中である.乳癌の発生は近年日本において急増しており,その発癌因子および発癌過程の究明が急がれている.この研究はマウスの乳腺上皮細胞の無血清培養法を用いて,化学発癌物質と乳腺分化ホルモンを組み合せ投与して前癌状態および癌化の過程を再現し,動物を用いる乳腺発癌実験の代替と乳腺発癌物質の特異的検索法を確立することを目的とした.初年度は,乳癌イニシエ-タ-の特異的検索法の開発を行い,マウス乳腺の初代培養細胞に乳腺を標的とする化学発癌物質を添加すると小核が用量反応的に出現することを明らかにした.平成2年度は,乳腺発癌物質および非乳腺発癌物質の種類をそれぞれ増やして小核出現の特異性を調べ,乳癌イニシエ-タ-の特異的検出のためのin vitro小核試験の確立を試みた.マウス乳腺の初代培養細胞における小核の出現は,乳腺発癌物質のNーmethylーNーnitrosourea(MNU),7,12ーdimethylbenz[a]anthracene(DMBA),2ーacetaminofluorene,20ーmethylーcholanthreneおよびNーbutylーNーnitrosoureaはいずれも用量反応的に陽性を示した.

これに反して,非乳腺発癌物質のbenzo[a]pyrene1,2ーdimethylhydeazine,Nーnitrosodimethylamineおよび4ーnitroquinoline1ーOxideは陰性または弱陽性を示し,比較的特異性がみられた.以上の結果は,無血清培養システムを用いたマウス乳腺上皮細胞の小核の出現を定重することによってヒト乳癌のイニシエ-タ-の検索が可能であることを示している.一方,培養細胞における癌化の過程を調べるため,プロラクチンを加えた培地にマウス乳腺細胞を培養し,乳腺発癌物質のDMBAおよびMNUを3週間感作し,その後8週間培養を続けたがトランスフォ-ムした細胞の出現はみられなかった.この発癌物質でイニシエ-ションされた細胞のマウス乳腺の脂肪組織内における分化と癌化の有無を調べるため,現在移植実験を準備中である.乳癌は近年日本において急増しており、その発癌因子の究明が急がれている。この研究は、最近開発されたマウス乳腺細胞のコラ-ゲンゲル内無血清培養法を用いて、化学発癌物質と乳腺分化ホルモンを組合せ投与して前癌状態および癌化の過程を再現し、動物を用いる乳腺発癌実験の代替と、乳腺発癌物質の特異的検索法を確立することを目的とする。初年度はまず、乳癌イニシエ-タ-の特異的検索法の開発を行った。ICRマウスの乳腺上皮細胞を外科的およびコラゲナ-ゼ処理により分離し、無血清変法イ-グル培地でコラ-ゲンゲル上培養を行った。一定時間培養後、培養液に化学発癌物質を添加し、24時間後細胞を固定しメイ・ギムザ染色を行って生じた小核を顕微鏡下で計数した。2種の乳腺発癌物質メチルニトロソウレアおよびジメチルベンズアントラセンおよび直接発癌物質N-メチル-N-ニトロ-ニトロソグアニジンは小核の出現を増加させたが、非乳腺発癌物質はペンツピレンが弱い反応を示したほかは、ジメチルニトロソアミン、ジメチルヒドラジン、4-ニトロキノリン-N-オキシドはいずれも陰性を示した。また、ジメチルベンズアントラセンは近似発癌物質であるが、この系では代謝活性化されて陽性を示すことが明らかとなった。以上の結果は、コラ-ゲンゲル無血清培養システムを用いたマウス乳腺上皮細胞の小核の出現を定量することによって、ヒト乳癌のイニシエ-タ-のスクリ-ニングが可能であることを示している。これらの成績は第5回国際環境変異原学会および第3回日本動物実験代替法学会で発表した。乳癌の発生は近年日本において急増しており,その発癌因子および発癌過程の究明が急がれている.この研究はマウスの乳腺上皮細胞の無血清培養法を用いて,化学発癌物質と乳腺分化ホルモンを組み合せ投与して前癌状態および癌化の過程を再現し,動物を用いる乳腺発癌実験の代替と乳腺発癌物質の特異的検索法を確立することを目的とした.初年度は,乳癌イニシエ-タ-の特異的検索法の開発を行い,マウス乳腺の初代培養細胞に乳腺を標的とする化学発癌物質を添加すると小核が用量反応的に出現することを明らかにした.平成2年度は,乳腺発癌物質および非乳腺発癌物質の種類をそれぞれ増やして小核出現の特異性を調べ,乳癌イニシエ-タ-の特異的検出のためのin vitro小核試験の確立を試みた.マウス乳腺の初代培養細胞における小核の出現は,乳腺発癌物質のN__ーmethylーN__ーnitrosourea(MNU),7,12ーdimethylbenz
ペプチドライブラリを用いたタンパク質架橋酵素ファミリーの至適基質配列の解明と展開

トランスグルタミナーゼ(TGase)は、タンパク質中のグルタミン残基とリジン残基(もしくは一級アミン)との間に共有結合を形成する反応を触媒する一群の酵素である。ヒトなど高等動物では8つのアイソザイムが組織特異的に発現して多彩な生命現象に関与している。昨年度までに申請者は、ファージディスプレイ法を応用して、本酵素反応における高反応性基質配列をランダムペプチドライブラリから探索する手法を確立し、主要なアイソザイムであるTGase 2、TGase 1、Factor XIII(血液凝固第XIII因子)の、それぞれに対して特異的に高い反応性を示す、ダルクミン残基側の基質配列(12アミノ酸残基)を同定することに成功してきた。今年度は同様のアプローチを皮膚表皮に存在するTGase 3についても行った。TGase 3はTGase 1とともに、皮膚表皮形成に必須のアイソザイムである。昆虫細胞系を用いて大量にTGase 3を発現精製した後、これを用いて基質となる配列の候補を、ランダムペプチドライブラリから数十種同定することに成功した。なお、上述の実験と並行して、より基質タンパク質としての探索に特化した系を確立する試みとして、T7ファージ提示型のヒト脳cDNAに由来するポリペプチドライブラリから、TGaseに対する高反応性ポリペプチド基質配列の探索を行った。その結果、これまでにいくつかのタンパク質の部分配列(40-50アミノ酸残基)をTGase 2に対する高反応性基質ポリペプチドとして同定することに成功している。トランスグルタミナーゼ(TGase)は、タンパク質中のグルタミン残基とリジン残基(若しくは一級アミン)との間に共有結合を形成する反応を触媒する一群の酵素である。申請者はファージディスプレイ法を応用することで、本酵素に対する高反応性基質配列をランダムペプチドライブラリから探索する手法を確立し、主要なアイソザイムであるTGase2、Factor XIII(血液凝固第XIII因子)、それぞれに対して特異的に高い反応性を示すグルタミン残基側の基質配列T26(HQSYVDPWMLDH)、F11(DQMMLPWPAVKL)を取得することに成功した。その反応性は既知の基質配列に比べ非常に高いものであった。更にアラニン置換実験から、その反応性の高さに必要な配列上の要素を同定することに成功した。これらの実験により得られた知見はTGaseの基質認識機構の解明、ひいては本酵素に対する阻害剤の開発等において大きな意味を持つものと考える。なお上記配列の応用事例として、T26をN末端若しくはC末端に付与した融合組換えタンパク質と、標識一級アミンないし一級アミノ基を有する固相担体とを反応させることで、標的タンパク質の部位特異的標識・部位特異的固定化が可能であることを示した。更に、健全な皮膚の形成・角質化に必須であるTGase 1についても、バキュロウィルス-昆虫細胞系を用いることで組換え体として多量の酵素標品を取得し、同様の探索手法を展開した。現在までに、複数の高反応性基質配列を取得することに成功しており、その詳細な解析を進めているところである。本年度は、まずこれら高反応性基質配列の有用性の一端を示す目的で、TGase 2に対する高反応性基質配列を「糊しろ」として用いる事で、タンパク質の部位特異的標識・固定化が可能であることを報告した域(Sugimura, et. al.,Journal of Biotechnology,2007)。