hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
毛状根からの再生植物におけるアグロバクテリウム属細菌に対する再感染阻害機構の解析

アグロバクテリウムの感染系において、すでにRiプラスミドのT-DNAが組み込まれた植物細胞組織には、アグロバクテリウムが再感染できないことがわかった。一方、薬剤耐性遺伝子で形質転換した植物にはAgrobacterium rhizogenesが感染でき、薬剤耐性の毛状根が単離できたので、これらの薬剤耐性毛状根の表現形質について検討した。RiプラスミドのT-DNAと薬剤耐性遺伝子のT-DNAが植物染色体上で共存できるかどうかを調べる目的で、薬剤耐性毛状根を薬剤を含まない培地で長期間(約8ヶ月間、20回)継代培養した後、薬剤を含む培地に移して培養した。その結果、生育可能であることから、組み込まれた2つのT-DNAは共存できることがわかった。感染の結果として形質転換体が得られるためには、アグロバクテリウムの植物細胞への接着、T-DNAの移行、T-DNAの組み込み、遺伝子発現の4つの過程が完遂されなければならない。そこで、感染過程のどの時期に阻害機構が働くのかを検討した。まず、RiプラスミドのT-DNAが組み込まれた植物細胞から細胞壁を除去してプロトプラストを調整した。アグロバクテリウムの細胞から薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドを抽出し、エレクトロポレーション法を用いて植物細胞内に遺伝子を導入した。その結果、野生型の植物細胞では、薬剤耐性を示す形質転換植物細胞が得られたのに対し、RiプラスミドのT-DNAが組み込まれた植物細胞からは得られなかった。以上の結果から、再感染阻害機構は、少なくともT-DNAが組み込み、あるいは遺伝子発現の段階で作動していることが明らかになった。
銀行経営者史の研究

戦前・戦後を通じた日本の経済発展において銀行の役割が重要であったことは、広く認知されているにもかかわらず、銀行家・銀行経営者に関する体系的な研究は乏しい。日本では明治初期に早くも銀行制度が導入されたが、それらは現代人が「銀行」と呼ぶものとはかなり異質である。制度・法規が整備されたからといって、それに適合的な銀行経営や経営者が直ちに現われるわけではない。銀行経営の主体である銀行経営者(家)に着目し、銀行がどのようにして「銀行」になってきたのかを考察したのが本研究である。本研究の目的は、1900年頃から1960年代を対象に日本における銀行家・銀行経営者の経営観(銀行観)と経営行動の歴史的変転について、多くのケーススタディに基づいた全体的構図を提示することにある。分析にあたっては次の3点を重視する。(1)経営環境としての法制・行政ならびに経済・金融構造に対する銀行家(経営者)の経営観の独自性。(2)銀行事業における銀行家自身の立身出世意欲(私益)。(3)東アジアにおける日本の銀行家の異同性。平成19年度においては、国会図書館憲政資料室(近代諸家文書)、全国地方銀行協会、早稲田大学図書館等々での文献・資料の閲覧を行い、伝記資料の収集に努めた。また次の海外出張を行い、各都市において関係研究者との意見交換や資料収集を行った。8月12日20日:中国・深セン、広州、香港。8月24日27日:韓国・ソウル。平成20年2月20日25日:中国・ハルビン、藩陽、大連。同時にこれら収集資料類の分析を進め、次年度における研究の展開を準備した。その分析成果の一部については、『日本金融史を生きた人々』(仮題)(共著、麗澤大学出版会)に吸収し、平成20年度に刊行を予定している。なお、麗澤大学公開講座(8月4日)での講演「立身出世と日本」のほか、静岡市「立身出世と日本の経済人」(8月2日)、奈良市「事業の継承と永続」(平成20年2月16日)大阪市「立身出世と日本の経済人」(2月18日)における講演においても研究成果の一部を取り入れ、社会的還元に務めた。平成20年度においては、国会図書館憲政資料室(近代諸家文書)、全国地方銀行協会、早稲田大学図書館、東京大学経済学部図書館、福井県立文書館等での文献・資料の閲覧を行い、伝記資料の収集に努めた。平成20年10月2日8日:中国・北京。10月18日20日:中華民国・台北。平成20年11月8日10日:中国・大連。同時にこれら収集資料類の分析を進め、研究成果のとりまとめに努めた。その分析成果の一部については、『日本金融史を生きた人々』(仮題)(共著、麗澤大学出版会)に吸収し、平成21年度に刊行を予定している。なお、地方金融史研究会報告「市橋保治郎と福井銀行」(平成20年12月26日)のほか、横浜市「立身出世と道経一体経営」(平成20年6月18日)、東京都「ファミリービジネス論の地平」(平成20年6月21日)名古屋市「立身出世と道経一体経営」(11月26日)における講演においても研究成果の一部を取り入れ、社会的還元に務めた。また日本金融学会2009年度春季大会(5月16日、東京大学)においてパネルディスカッション「危機と革新の金融史-1920年代、30年代の日本」を組織し、そこで「銀行経営の変容」を報告する予定である。
短期硬組織再生誘導を目指した三次元培養自己細胞移植システムの創製および臨床応用

H17年度には、自己細胞の移植による迅速な硬組織再生療法の臨床応用を目標として、まず骨芽細胞機能亢進に関与する遺伝子群の確認・評価を行った。すなわち、キトサン添加による培養骨芽細胞のALP活性上昇時に応答しているmRNA解析のため、cDNAマイクロアレイを利用した遺伝子クローニングの結果、細胞増殖・分化を誘導するといわれているMAPKカスケードやJak/Stat経路に関与する遺伝子、転写因子の発現増強が確認できた。次いで6週齢雄性Wistar系ラット下顎骨または大腿骨から骨髄液を穿刺・採取し、ラット血清を添加した培地で継代培養操作を行い、この際、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を誘導する目的で硬組織誘導培地(アスコルビン酸、β-グリセロリン酸およびデキサメサゾン含有DMEM)へ生理活性物質としてキトサン溶液を添加した。その結果、キトサン濃度0.002mMを添加することによって100mmの培養皿1×10^6cells播種すれば約14日後にコンフルエントとなることが確認できた。H18年度は間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導に関する検討のため、硬組織関連のターゲット遺伝子に特異的なプライマーを用いてリアルタイムPCRを行ったところ、osteocalcinおよびBMP-2において有為に遺伝子発現の増強が定量的に確認できた。培養細胞の形態変化(大型化)を確i認し、ALP免疫染色、von kossa染色およびアリザリンレッド染色にて石灰化様分泌物産生も確認できた。次いでキトサンScaffold(坦体)の作成の際に、後の生体内坦体移植の際に周囲脈管系組織由来のCa^<2+>の取り込みを促進させるためカルボキシメチル化キトサン(CM-C)の誘導体を用いた。また坦体内へ効率的に細胞や血管が侵入しやすいことが必要なことから多孔性材料、特に多孔体の気孔どうしがつながった連通構造を持つことが重要であると考え、ハニカム状トンネル型気孔を有する形状を作成した。現在、骨欠損部ヘキトサンscaffold上で3次元培養した骨芽細胞を移植し、骨様組織新生促進効果について細胞の組織内局在性、分化成熟度および硬組織基質形成度について、免疫組織化学的に検討中である。本年度は、自己細胞の移植による迅速な硬組織再生を目標として、骨芽細胞機能亢進に関与する遺伝子群の確認・評価を行った。すなわち、キトサン添加による培養骨芽細胞のALP活性上昇時に応答しているmRNA解析のため、cDNAマイクロアレイを利用した遺伝子クローニングの結果、発現増強が確認されたものに対して、リアルタイムPCR法によるcDNAの厳密な定量分析を実施した。まず6週齢雄性Wistar系ラット下顎骨または大腿骨から骨髄液を穿刺・採取し、ラット血清を添加した培地で継代培養操作を行い、この際、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を誘導する目的で、α-MEM培地にDexamethazonおよび生理活性物質としてキトサン溶液を添加した。

次いで、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化に関して、ALP, Type I collagen, osteocalcinおよびBMP-2をターゲットとして、それらのmRNAの発現増強について検討を行った。培養細胞の形態変化(大型化)を倒立培養顕微鏡下で確認後、RNAを回収し、これをもとに前述したターゲット遺伝子に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行ったところ、osteocalcinおよびBMP-2において有為に遺伝子発現の増強がみられた。また、形態学的にもALP免疫染色、von kossa染色およびアリザリンレッド染色にて石灰化様分泌物が確認できた。さらに、水溶性キトサンによる骨芽細胞における石灰化機能亢進に影響する遺伝子群の同定・評価を行うために培養細胞からtRNAを回収し、ルシフェラーゼRNAを添加した後、小型全自動核酸精製装置を利用し、蛍光ラベリングされたcDNAを回収した。これらmRNAに相当するcDNAを合成するために特異的プライマーを設計しPCR法にて増幅し、この増幅産物をリアルタイムPCR装置にて、現在、直接連続的に定量分析検討中である。H17年度には、自己細胞の移植による迅速な硬組織再生療法の臨床応用を目標として、まず骨芽細胞機能亢進に関与する遺伝子群の確認・評価を行った。すなわち、キトサン添加による培養骨芽細胞のALP活性上昇時に応答しているmRNA解析のため、cDNAマイクロアレイを利用した遺伝子クローニングの結果、細胞増殖・分化を誘導するといわれているMAPKカスケードやJak/Stat経路に関与する遺伝子、転写因子の発現増強が確認できた。次いで6週齢雄性Wistar系ラット下顎骨または大腿骨から骨髄液を穿刺・採取し、ラット血清を添加した培地で継代培養操作を行い、この際、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を誘導する目的で硬組織誘導培地(アスコルビン酸、β-グリセロリン酸およびデキサメサゾン含有DMEM)へ生理活性物質としてキトサン溶液を添加した。その結果、キトサン濃度0.002mMを添加することによって100mmの培養皿1×10^6cells播種すれば約14日後にコンフルエントとなることが確認できた。H18年度は間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導に関する検討のため、硬組織関連のターゲット遺伝子に特異的なプライマーを用いてリアルタイムPCRを行ったところ、osteocalcinおよびBMP-2において有為に遺伝子発現の増強が定量的に確認できた。培養細胞の形態変化(大型化)を確認し、ALP免疫染色、von kossa染色およびアリザリンレッド染色にて石灰化様分泌物産生も確認できた。次いでキトサンScaffold(坦体)の作成の際に、後の生体内坦体移植の際に周囲脈管系組織由来のCa^<2+>の取り込みを促進させるためカルボキシメチル化キトサン(CM-C)の誘導体を用いた。また坦体内へ効率的に細胞や血管が侵入しやすいことが必要なことから多孔性材料、特に多孔体の気孔どうしがつながった連通構造を持つことが重要であると考え、ハニカム状トンネル型気孔を有する形状を作成した。現在、骨欠損部ヘキトサンscaffold上で3次元培養した骨芽細胞を移植し、骨様組織新生促進効果について細胞の組織内局在性、分化成熟度および硬組織基質形成度について、免疫組織化学的に検討中である。
血栓症発症素因としてのビタミンK依存性プロテインSの病態検査学的研究

ビタミンK依存性血漿蛋白質の一つプロティンSは、別のビタミンK依存性セリンプロテアーゼの活性型プロテインC(APC)による血液凝固Va因子、【VIII】a因子の分解・失活化を促進するコファクターであり、血小板や血管内皮細胞などの細胞膜リン脂質上におけるAPCのレセプターとして機能する。本研究において、申請者は、反復性の重篤な血栓症を呈する先天性のプロテインS欠乏症2家系20症例を発見し、プロテインSがプロテインCと同様に重要な生理学的凝固制御因子であることを明らかにした。プロテインSは、血中ではその半分量が補体系の制御因子の1つ【C_4】b結合蛋白質(【C_4】bp)と可逆的に結合し複合体として存在するが、APCに対するコファクター活性は非複合体性(フリー)のプロテインSにのみ存在することを、精製プロテインS、【C_4】bpを用いたin vitro実験ならびに先天性プロテインS欠乏症の患者血漿中のプロテインSの存在状態を検索することによって明らかにした。以上の事実は、血中のプロテインSコファクター活性の低下に基づく血栓塞栓性疾患の発症要因には、血中のフリー型プロテインS濃度の低下、換言すれば、【C_4】bp濃度の増加やあるいは【C_4】bp濃度に影響を与える補体系因子の変動が示唆される。そこで、申請者は、先天性プロテインS欠乏症をはじめとする各種疾患患者血中のプロテインS、【C_4】bp、プロテインCならびに各種の凝固・線溶・補体系因子を測定し、フリー型プロテインSの濃度に影響を与える因子の検索を行った。しかし、これまでの検索では、フリー型のプロテインS濃度と高い正相関あるいは負相関を示す因子の発見には至っていない。今年度の研究実績に基づき、ひき続いてフリーのプロテインS濃度に影響を与える因子の検索を行うとともに、プロテインSと【C_4】bpの結合状態、【C_4】bpのプロテインSコファクター活性阻害機構を明らかにしたい。
一過性血管導入による革新的ヒト軟骨再構成法の開発

本研究では高効率な弾性軟骨創出法の開発を目指し、まず軟骨の生理分化プロセスに必要な細胞間相互作用の解明を試みた。発生初期の耳介軟骨を独自のライブ観察系に導入しin vivoにおいて追尾定点観察を行ったところ、一過的に血液灌流が生じ血管内皮細胞が侵入することを見出した。次に、近年我々が同定したヒト軟骨前駆細胞を用いて、血管内皮細胞との共培養を行った所、in vitroで自律的に三次元組織を構築した。この三次元組織は、生体内への移植により、従来法と比べ高効率に弾性軟骨を再構築した。本技術によれば成長因子や足場材料が不要であり、安全性やコスト面で極めて有益な弾性軟骨再構築技術になるものと期待される。頭頚部領域の組織変形に対し優れた弾性軟骨再生治療を開発することは、全世界で100万人以上の患者に待ち望まれている。申請者は再生医療の実現化を目指し、弾性軟骨であるヒト耳介軟骨膜に存在するヒト軟骨前駆細胞の分離・培養法などの細胞操作法を確立してきた(TakebeT, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011)。これらの前駆細胞を用いた再生治療を実現化するためには、in vitroにおいて成熟軟骨細胞へ終末分化誘導する方法論の開発が急務であった。本研究では高効率な弾性軟骨創出法の開発を目指し、まず軟骨の生理分化プロセスの解明を試みた。軟骨前駆細胞を含む発生初期の耳介軟骨を独自のライブ観察系に導入しin vivoにおいて追尾定点観察を行ったところ、一過性に血液灌流が生じ血管内皮細胞が侵入することを見出した。これにより軟骨前駆細胞の増殖活性が一時的に亢進し、続く血管の退行に伴って終末分化誘導が生じることが明らかとなった。そこで、近年我々が同定したヒト軟骨前駆細胞を用いて、このような発生過程における一過性血管侵入を再現する新規培養系の構築を試みた。驚くべきことに、血管内皮細胞との共培養により、軟骨前駆細胞はin vitroで自律的に三次元組織を構築することが明らかとなった。さらに、この三次元組織を移植に用いることで、従来のペレット移植法と比較して、高効率に弾性軟骨を再構築することが示された。本技術によれば、成長因子や足場材料を用いる必要がないことから、安全性やコストの面で極めて有益な弾性軟骨再構築技術になるものと期待される。将来的に、患者のHLA型と一致した血管内皮細胞と低侵襲で採取培養した軟骨前駆細胞と共培養させ、三次元組織化を誘導し移植することで、頭蓋・顎・顔面領域の先天奇形や外傷に起因する組織変形の新たな治療法を提供できると考えられる。これらの前駆細胞を用いた再生治療を実現化するためには、in vitroにおいて成熟軟骨細胞へ終末分化誘導する方法論の開発が急務である。申請者らは、まずマウスおよびヒト軟骨前駆細胞から軟骨組織構築の過程を目視下で経時的に追尾することにより、軟骨前駆細胞から成熟軟骨細胞への分化過程において血管系細胞との相互作用が必須となることを示した。そこで、生理分化プロセスおいて生じる血管系細胞との三次元的な相互作用を再現化することの可能な培養系を検討し、足場材料によることなく軟骨前駆細胞集団に血管系細胞を時空間的に配置する三次元培養系を確立することに成功した(武部貴則,他.「軟骨細胞の調製方法」特願2013-58534 (出願日2013.3.21))。このような、“一過性血管化"を再現することにより、従来達成されていなかった成熟軟骨細胞への効率な終末分化誘導が可能であることが示された(Takebe T, et al, Under review )。既成概念とは全く異なる新たな分化誘導戦略に基づき三次元ヒト軟骨組織を再構成することにより、将来的に莫大な疾患ニーズの存在する頭頚部領域の組織変形を有する患者を対象として、軟骨再生医療応用するための極めて有益な再生医療技術となることが期待される。当初計画の通り、軟骨前駆細胞の単離および特性解析、ならびに、軟骨細胞の終末分化プロセスにおける血管系細胞の三次元イメージングを実施することができた。

これに加え、H25年度において実施を予定していた、上記解析より解明された軟骨終末分化プロセスの再現を可能とする革新的な培養系も新規に確立し、特許出願も完了していることから当初計画を大幅に上回る進捗状況にあるといえる。また、これらの成果は権威ある国際学術誌にて、論文審査中である。これまでに、ヒト軟骨前駆細胞をから足場材料に頼ることなく細胞のみから、三次元的にヒト血管系細胞を組み込む培養技術を確立した(武部貴則,他.「軟骨細胞の調製方法」特願2013-58534 (出願日2013.3.21))。次年度においては、本培養系における軟骨前駆細胞の分化誘導を促進するメカニズムの解明を目指し、血管排除過程に集積する分子群を免疫学的手法により同定し、それらを培養系に導入することにより試験管内における血管排除効果・分化誘導効果の検証を行う。特に、申請者が発見した軟骨未分化マーカーであるCD44リガンドのヒアルロン酸およびその修飾たんぱく質(各種プロテオグリカン)に着目し解析を行う。なぜならば、1.高濃度ヒアルロン酸はプロテオグリカンの付加により血管新生阻害作用を有すること、2.軟骨幹細胞のTransient Amplificationを誘導する作用が示唆されているからである(未発表データ)。尚、in vitro解析系としては、マトリクス成分の乾燥試料を用いて、FACSによりクローナルに分取した軟骨幹細胞および血管内皮細胞に対する増殖・分化に対する作用の検証を行う。これにより、血管排除を誘導する最適な細胞外マトリクス環境を決定し、独自の三次元培養系へと導入することで至適環境を人為的に構成し、発生・再生過程で生じる一過性血管化を伴う生理分化プロセスの再現化を行う。作成された三次元構造体の優位性を定量的に評価するために、従来技術(ペレット培養)により培養された軟骨様組織との比較解析を実施する。力学的特性や乾燥重量の比較に加え、半定量および定量RT-PCRによる遺伝子発現解析、ELISA法により蛋白分泌定量解析、免疫組織化学を含む各種組織学的評価を行う。細胞培養用の試薬に使用し、得られた細胞はFACSによる定量的な解析を遂行するために利用する。したがって、このFACS解析のために、蛍光標識されたモノクローナル抗体の購入に利用する。また、メカニズム解析のために、各種シグナル伝達阻害剤やノックダウン用ベクター、関連消耗品費の購入にあてる。また、平成24年度においては、試薬代が想定よりも安価に入手できたため若干の繰越金が生じた。次年度において必要な試薬代へ当てる予定である。
PCR法により検出されるDNA多型のアジア系集団間における比較

日本人およびアジア系集団(モンゴル人,中国のエベンキ族,オロチョン族,アジア由来と考えられるコロンビア先住民)のDNA多型を,PCR法を応用して解析した。調べたのは,日本人(茨城県および徳島県の2集団),モンゴル人と中国のエベンキ族とオロチョン族である。さらにその由来を考慮するとアジア系といえるコロンビア先住民についても,DNAの変異を解析した。日本人以外の試料はすべて以前の海外学術調査により現地にて入手されたものであり,本研究の開始前には血液試料よりフェノール法により抽出済みであった。調べた形質は,4種のVNTR(variable number of tandem repeat)および2種のSTR(short tandem repeat-ここでは2塩基単位の反復)である。いずれの実験でもPCR法により変異のある核DNA部分を増幅し,ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により,個体間の変異を検出し,各個体の持つ2つの対立遺伝子(allele)の同定をおこなった。なおVNTRではゲルの染色は臭化エチジウムにより,STRでは銀染色法によった。VNTRでは,MCT118,YNZ24,DAT1,D4S95の4種とも日本人も含めたアジア系集団では集団間でalleleの分布には大きな差異はみられなかった。しかし,文献によるコーカシアンのalleleの分布とアジア系集団のalleleの分布には大きな差があった。肝型糖輸送担体遺伝子内およびアミロイド前駆体タンパク質遺伝子内のSTRでも,アジア系集団相互では,allele分布に大きな差はなかった。また,それぞれの形質において,各集団で特異的にしかみられないalleleの存在が認められた。今回の集団はみな基本的に北アジア系であり,日本人もこのグループを形成する一員であることが,DNA多型からも裏付けられたことになる。
人工知能及び心臓シミュレーションを用いた心電図自動解析技術と臨床有用性の研究

2018年度に、人工知能を用いた不整脈の自動検出アルゴリズム及び心臓モデルの開発を行いました。まず、畳み込みニューラルネットワークまたはリカレントニューラルネットワークを使い、心電図質アクセス、心房細動自動検出、心室性期外収縮自動検出のアルゴリズムを開発し、Physionet/Computing in Cardiology Challenge 2011/2017、MIT-BIH atrial fibrillation database、MIT-BIH arrhythmia databaseで学習し、評価しました。心電図質アクセスに対し、ノイズの検出感度、特異度、正確度は93.9%、93.1%、93.3%となり、心室性期外収縮自動検出の感度、特異度、正確度は100%、95.6%、97.8%となり、心房細動自動検出感度、特異度、正確度は99.0%、98.9%、99.0%となります。更に、Generative Anniversary Networksを用い、ノイズを自動的に生成し、心電図質アクセスの自動解析アルゴリズムに学習させ、ノイズの検出感度、特異度、正確度は96.3%、94.8%、95.6%に改善しました。そして、心臓モデルも積極的に開発し、イオンチャネルを含むdiffusion reactionの二次元モデルを実現し、現在は三次元の心臓モデルを実装しています。関連研究は国際、国内学会で発表し、高く評価されました。人工知能を用いた心電図自動解析アルゴリズムを開発し、ニューラルネットワークを用いたノイズ自動生成技術を実現し、従来の方法より高い感度、特異度、正確度を得られました。心臓モデルの研究も順調に進みます。まず、Generative Anniversary Networksを用いた不整脈心電図の自動生成アルゴリズムを開発し、心電図自動解析アルゴリズムに応用する予定です。そして、心臓モデルを用いたシミュレーションした心電図を用い、心電図自動解析アルゴリズムを改善する予定です。更に、臨床データを用い、自動解析アルゴリズムを評価する予定です。計画通りに助成金を使用する予定でしたが、旅費などのコントロールしにくい予算に対し、少額残金が残ってしまいました。残った助成金は来年度に打ち合わせのための出張に使用する予定です。
シクラメンの花色・花色素遺伝の解明と花色育種における遺伝資源の開発

まず,シクラメンの花色,四倍体レベルでの花色・花色素の遺伝について調査を行ったところ,シアニック系品種と黄色花品種の交雑の結果、F_2後代の黄色花および花弁での黄色色素発現は,メンデルの法則に適合し,二倍体と同様にカルコンからのフラバノン生合成を決定する.すなわちカルコン-フラバノンイソメラーゼの活性を左右する1遺伝子Chに支配されていると考えられた.これは,黄色花品種に二倍体の巨大花粉分離株を用いて,meioticpolyploidyzationを行い,四倍体の後代を得た場合も,mitoticpolyploidizationによって得られた四倍体黄色花個体を用いて交雑を行った場合のいずれにおいても共通であった.また,Ch遺伝子はA遺伝子やF遺伝子の条件遺伝子であり,ChchまたはChChの遺伝子型の個体でのみAおよびF遺伝子が発現することが明らかとなった.次に,シクラメン体細胞胚増殖系の確立のため,体細胞胚の形成および発芽に及ぼす温度と培地成分,特に窒素の形態と濃度の検討を行ったところ,体細胞胚の形成と発芽では最適条件が異なった.体細胞胚形成では25°C程度の温度と比較的高い濃度のアンモニア態窒素が要求され,アンモニア態窒素が培地中に存在しない場合には体細胞胚は形成されなかった.一方,体細胞胚の発芽と生育では15-20°C程度の温度が要求されるとともに,25°C以上の高温と培地中のアンモニア態窒素が阻害的に作用した.まず,シクラメンの花色,花色素の遺伝について調査を行ったところ,シアニック系品種と白色花品種の正逆交雑では,F_2後代は有色花と白色花に分離し,ロイコアントシアニジンからアントシアニジンの生合成がメンデル遺伝に適合する1遺伝子Aにより決定されていることが明らかとなった.また,フラボノール生合成も同様にメンデル遺伝に適合する1遺伝子Fにより左右されることも明らかとなった.さらに,A遺伝子とF遺伝子は互いに独立して遺伝すること,白色花形質はA遺伝子に支配されており,遺伝子型がaaとなった場合にのみ,F遺伝子と関係なく花弁が白色を呈することも示された.一方,シアニック系品種と黄色花品種の交雑の結果,F_2後代は有色花,黄色花および白色花に分離し,花色および花色素の発現は,カルコンからのフラバノン生合成を決定する1遺伝子Chの他にAおよびF遺伝子に支配されていると考えられた.また,Ch遺伝子はA遺伝子やF遺伝子の条件遺伝子であり,ChchまたはChChの遺伝子型の個体でのみAおよびF遺伝子が発現すること,およびこれら三つの遺伝子は互いに連鎖していないことが明らかとなった.次に,シクラメン近縁野生種の花色,花色素を調査したところ,その変異の幅は園芸種より小さかった.園芸品種との種間雑種を作出しその花色を調査したが,シクラメン花色の変異の拡大は認められなかった.まず,シクラメンの花色,四倍体レベルでの花色・花色素の遺伝について調査を行ったところ,シアニック系品種と黄色花品種の交雑の結果、F_2後代の黄色花および花弁での黄色色素発現は,メンデルの法則に適合し,二倍体と同様にカルコンからのフラバノン生合成を決定する.すなわちカルコン-フラバノンイソメラーゼの活性を左右する1遺伝子Chに支配されていると考えられた.これは,黄色花品種に二倍体の巨大花粉分離株を用いて,meioticpolyploidyzationを行い,四倍体の後代を得た場合も,mitoticpolyploidizationによって得られた四倍体黄色花個体を用いて交雑を行った場合のいずれにおいても共通であった.また,Ch遺伝子はA遺伝子やF遺伝子の条件遺伝子であり,ChchまたはChChの遺伝子型の個体でのみAおよびF遺伝子が発現することが明らかとなった.次に,シクラメン体細胞胚増殖系の確立のため,体細胞胚の形成および発芽に及ぼす温度と培地成分,特に窒素の形態と濃度の検討を行ったところ,体細胞胚の形成と発芽では最適条件が異なった.体細胞胚形成では25°C程度の温度と比較的高い濃度のアンモニア態窒素が要求され,アンモニア態窒素が培地中に存在しない場合には体細胞胚は形成されなかった.一方,体細胞胚の発芽と生育では15-20°C程度の温度が要求されるとともに,25°C以上の高温と培地中のアンモニア態窒素が阻害的に作用した.
GATA4を介した循環器疾患と運動器症候群の病態連関

前年度までに得られた、骨格筋分化を著明に亢進するテロメア型の18塩基オリゴDNA「myoDN」について、その応用可能性をより臨床に近いモデルで検証した。糖尿病患者やがん患者はしばしば筋萎縮を併発するが、本年度の研究により、糖尿病患者から採取された筋芽細胞の分化が悪化していること、また、大腸がん細胞の分泌物が筋芽細胞の分化を抑制することを見出し、臨床的な筋疾患のin vitro培養細胞モデルを確立した。myoDNは、これらの筋萎縮モデル系において、悪化した筋芽細胞の分化を有意に改善したことから、代謝性疾患やがん悪液質によって生じる筋萎縮の予防や治療に有用な核酸分子であることが示された。また、myoDNの強力な筋分化誘導作用の再生医学的な応用可能性も検証した。myoDNをマウスES/iPS細胞に投与した結果、自発的に拍動する心筋細胞のコロニーが多数得られた。心筋マーカーの発現を解析した結果、分化誘導4日目以降にmyoDNを投与すると多能性幹細胞の心筋分化が顕著に促進されることがわかった。一方、分化誘導3日目にmyoDNを投与すると、対照群と比較して、心筋分化が完全に抑制された。以上の結果から、myoDNは、多能性幹細胞において心筋細胞への運命を決定する因子に作用し、筋分化を制御することがわかった。myoDNを投与するだけでiPS細胞の心筋分化が著明に誘導されることから、心臓再生療法や創薬スクリーニングに不可欠な心筋細胞の作成に貢献できると考えられる。本年度はまず、骨格筋の再生に影響する循環器疾患関連因子をスクリーニングするための実験系を構築した。B6/Jマウスの若齢マウスの骨格筋組織から採取した骨格筋幹細胞(衛星細胞)を初代培養して得られた筋芽細胞を、コラーゲンコートした96穴プレートに播種し、増殖培地もしくは分化培地で培養した。培養中に、スクリーニングに供する因子を添加し、48時間後に、骨格筋の最終分化マーカーであるミオシン重鎖の免疫染色を行った。イメージアナライザーにより、蛍光顕微鏡写真の撮影から、細胞数およびミオシン重鎖陽性細胞の割合の定量を自動的に行うシステムを確立した。このハイスループットスクリーニング系を用い、循環器疾患、加齢性筋疾患、メタボリック症候群等への関与が考えられる因子や、これらに予防・治療効果を有することが期待される分子・成分等を探索した結果、筋分化を促進ないし抑制する因子を複数同定することに成功した。そのうち、腸内細菌叢を構成する乳酸菌の一種のゲノム配列に由来する短鎖オリゴDNAが、極めて強力な骨格筋分化作用を示すことを見出した。myoDNと命名したこのオリゴDNAを未分化な筋芽細胞に投与すると、増殖培地中において、48時間後に最大40%の細胞がミオシン重鎖陽性の筋管へと分化する。myoDNを筋芽細胞に投与すると、筋分化の促進に伴い細胞分裂が抑制される。しかし、myoDNは線維芽細胞の増殖は抑制しないことから、myoDNは、骨格筋系の細胞に特異的に作用し、その分化を亢進することが示唆された。現在までに、myoDNの活性中心と予想されるコア配列を見出している。また、myoDNの活性にはその立体構造が重要な役割を果たしていることも明らかになりつつある。筋分化を強力に促進するmyoDNは、循環器疾患および加齢による筋委縮の予防や治療に有用な機能性分子となる可能性があると期待される。本年度のスクリーニング実験により、循環器疾患、加齢性筋疾患、メタボリック症候群等への関与が考えられる因子や、これらに予防・治療効果を有することが期待される分子・成分等から、筋芽細胞の増殖や分化に影響する因子を複数同定することに成功した。特に、腸内細菌叢の乳酸菌のゲノム配列に由来し、筋分化を強力に促進するmyoDNは、筋再生に影響する全く新しい分子である。これまで、骨格筋系に作用するオリゴDNA分子の例はなく、myoDNのような革新的な新規分子を見出せたのは、スクリーニングの成果によるものである。また、myoDNの強力な筋分化促進作用を活用した、横紋筋肉腫の増殖抑制や、iPS細胞の筋分化誘導の研究も別途に進んでいる。このような例から、本研究で探索・同定される因子群は、当初の対象とした疾患以外にも、多様な関連領域の研究にも新たな知見を提供し得ることが示された。myoDN以外にも、血中にも存在する遊離脂肪酸や、新規心不全薬として臨床実験も実施されているポリフェノール分子などが、筋芽細胞の増殖・分化に作用することを見出している。これらの分子の作用機序については順次解析を進めており、一部の分子では、標的となる因子やシグナル経路を明らかになりつつある。これらの成果は、本研究の着想および実験系が有効に機能した結果と考えられる。よって、現在までの進捗状況は「おおむね順調に進展している」と判断した。昨年度の研究で発見した、骨格筋芽細胞の分化を強力に誘導するオリゴDNA「myoDN」の詳細な機能解析を行った。myoDNはテロメア配列を含む短い一本鎖DNAだが、その活性には立体構造が関与することが示唆された。分子シミュレーションによる構造解析の結果、テロメア配列の一部が分子内でスタッキングしており、活性中心を構成していることが推測された。変異myoDNの解析から、myoDNの活性に必須の塩基を同定した。また、myoDNに結合し、その活性を顕著に増強するアルカロイド分子を同定することにも成功した。myoDN-

アルカロイド複合体の強力な筋分化誘導作用は、循環器疾患および加齢による筋委縮の予防や治療に有用な、新規機能性核酸分子として応用が期待される。現在、モデル動物を用いてmyoDNの生体内での作用の実証実験を行っている。また、myoDNの新たな応用事例として、横紋筋肉腫の増殖抑制作用を見出した。横紋筋肉腫は小児で最も頻度の高い軟部悪性腫瘍であるが、治療法は確立されていない。横紋筋肉腫の一部は筋芽細胞が由来と考えられており、横紋筋肉腫の筋分化を誘導することで、増殖・転移を抑制する治療戦略が提唱されている。複数のヒト横紋筋肉腫細胞株にmyoDNを投与すると、骨格筋マーカー遺伝子の発現上昇とともに細胞分裂が抑制されることを見出した。今後も、抗横紋筋肉腫作用を有する核酸医薬としてのmyoDNの可能性を追求していく。また、骨格筋と発生学的に近縁であり、ロコモティブ症候群およびメタボリック症候群にも深く関与する一連の細胞腫、すなわち心筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞におけるmyoDNの作用の検証を開始した。これらの細胞におけるmyoDNの作用を明らかにすることで、本研究が対象とする循環器疾患と運動器症候群に対して有効な予防・治療法の開発への貢献が期待される。昨年度の研究で発見したmyoDNの詳細な機能解析、およびその作用を顕著に促進するアルカロイドの同定により、骨格筋分化を強力に促進する新規化合物の開発に成功した。myoDN-アルカロイド複合体は筋芽細胞だけではなく、横紋筋肉腫細胞などにも作用することを見出し、循環器疾患や運動器症候群以外の疾患への応用可能性を示すことができた。myoDN-アルカロイド複合体については国内特許および国際特許を出願しており、知的財産権の確保にも努めている。これらのin vitroの成果を踏まえ、myoDNの生体内作用を実証する動物実験を開始する環境を整えた。さらに、ロコモティブ症候群やメタボリック症候群に関連する複数の細胞腫(心筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞)におけるmyoDNの作用の実証を開始し、循環器-運動器の病態連関の立体的な解明に向けた実験系を確立しつつある。また、これらの細胞を用いた新たなスクリーニング系の構築にも着手した。本研究で開始した筋芽細胞のスクリーニング系によって有用な分子が同定されたこと、同定された分子の機能がin vitroで証明されたこと、スクリーニング系を多様な細胞腫に拡張できたことなどから、現在までの進捗状況は「おおむね順調に進展している」と判断した。前年度までに得られた、骨格筋分化を著明に亢進するテロメア型の18塩基オリゴDNA「myoDN」について、その応用可能性をより臨床に近いモデルで検証した。糖尿病患者やがん患者はしばしば筋萎縮を併発するが、本年度の研究により、糖尿病患者から採取された筋芽細胞の分化が悪化していること、また、大腸がん細胞の分泌物が筋芽細胞の分化を抑制することを見出し、臨床的な筋疾患のin vitro培養細胞モデルを確立した。myoDNは、これらの筋萎縮モデル系において、悪化した筋芽細胞の分化を有意に改善したことから、代謝性疾患やがん悪液質によって生じる筋萎縮の予防や治療に有用な核酸分子であることが示された。また、myoDNの強力な筋分化誘導作用の再生医学的な応用可能性も検証した。
南方モンゴロイド集団とオ-ストラロメラネシア集団の類縁性に関する遺伝子生態学的研究

パプアニュ-ギニアのオ-ストラロ・メラネシアンとオ-ストラリアに渡ったオ-ストラリア原住民(アボリジン)の起源や他の集団(含モンゴロイド)との遺伝形質の分化等を明らかにすることを目的として、パプアニュ-ギニアのオ-ストラロ・メラネシアンの一言語族(ギデラ族)を対象とした、ウイルス学的かつ遺伝血清学的調査を行った。その結果、1)ウイルスでは、ギデラ族にエイズ抗体陽性者はみられず、いわゆる近代的な汚染はないと考えられた。また、これまでHTLVー1の抗体陽性率はパプアニュ-ギニアの中でもギデラ族の居住する西州が最も低値(1/30=3.3%)を示すことが指摘されてきたが、本研究の結果の1.8%(13/723)はこれよりさらに低値であった。HBsAgとHCV抗体の陽性率(それぞれ11.9%と4.1%)は、これまでのパプアニュ-ギニアやオセアニア全体での報告と同様の高値を示した。一方、これらHTLVー1、HBsAgとHCV抗体の陽性率は、より町に近く近代化の影響を受けている村落で高値を示した。このように、ウイルスの伝幡は生活や行動様式といった文化的な要因に強く規定されることから、ウイルス学的見地から集団の類縁性を検討するには限界があると言える。2)血清蛋白質では、現在、比較すべき集団のデ-タが十分集まっていないので明確なことは言えないが、ほとんど全ての血清蛋白質の多型の頻度分布は日本人の場合と異なり、いくつかの項目ではニュ-ギニア高地人の場合とも異なっていた。現在、デ-タベ-スを作製し他の集団と比較検討中である。ギデラ族の主に成人以降の男女各727人から得た血液サンプルについて、ウイルス学的分析一成人T細胞白血病の原因ウイルス(HTLVー1)抗体、エイズウイルス(HIVー1)抗体、B型肝炎ウイルス抗原(HBsAg)およびC型肝炎ウイルス(HCV)抗体ーならびに血清蛋白質(Hp,Tf,GC,PI,ITI,C6,C7,C8,HF,AHSG,IF,BF,PLG)多型を電気泳動法で決定した。
組織培養及び細胞融合による寒天・カラゲナン資源海藻の選抜と品種育成に関する研究

研究には寒天藻のオゴノリ、ハリガネ、ナンブグサとカラゲナン藻のツノマタを用いた。プロトプラスト作成は、0.7Mマン二トールMES滅菌海水にアガラーゼ、セルラーゼ、マセロザイム、ペクチナーゼ添加、25°C、60-120分処理で、細胞融合に使用可能なプロトプラストをオゴノリ、ハリガネで得た。フィリピン産キリンサイのice-ice感染症部分から単離した細菌はカラゲナン分解を示した。これをツノマタ類に使用したが、完全なプロトプラストは未だ出来ていない。今後もこの点の検討を続ける。組織培養は、植物ホルモンのオーキシン系の2,4-D、IAA、IBA、IPA、pCA、α-NAA、β-NAA、サイトカイニン系のBAP、KIN、ZEA,ジベレリン系のGA3の11種類を添加したPES培地で行った。新芽の形成は、ハリガネは8、15°Cで藻体断面の先端方向の柔組織からのみ、オゴノリは8、15°Cで藻体断面の柔組織と側面でみられ、2,4-Dで高い効果をしめした。ナンブグサはすべての培養条件下で1週間以内に切片の断面と側面から新芽が形成され、2,4-D、IAAで高い効果がみられた。ツノマタは数は少なかったが、15°Cでは6ヶ月後に藻体断面の柔組織から新芽が形成され、2,4-Dで効果が高かった。これらの結果、組織培養は種苗生産や品種改良に有効であることがわかった。付着細胞の形成が十分ではなかったので、今後、この点に重点を置いた研究を続けて行く。食品、医薬、化粧品の原料やバイオテクノロジーの研究に用いられる寒天・カラゲナンに代表される海産多糖類は、これら製品や研究の高機能・多様化にともなって、多様で高品質のものが要求されている。これに対応するため、品種改良を目的とした寒天・カラゲナン海藻の品種作成過程への組織培養と細胞融合法の導入、その有効性について今年度は、1)胞子から単藻培養した藻体の作成、2)組織の無菌摘出と培養に必須の抗生物質・その他殺菌剤、培地組成の種類・、3)プロトプラスト作成と培養好適条件、4)カラゲナン溶解酵素が市販されていないため、カラゲナン藻の分解細菌からのカラゲナン溶解酵素の作製、等について検討を行った。実験には、寒天藻としてオゴノリ、エゴノリとハリガネ類を、カラゲナン藻としてツノマタ類を用いた。ツノマタの果胞子を用いた単藻培養からは、夾雑藻類のない本研究の試料として耐え得る藻体を作成することが出来た。寒天藻のオゴノリ、エゴノリ、ハリガネのプロトプラスト作成には0.7MマンニトールMES滅菌海水にアガラーゼ(4U/ml)、セルラーゼ(6%w/v)、マセロザイム(3%w/v)、ペクチナーゼ(3%w/v)、温度25C,処理時間60-120分でこれらの海藻のプロトプラストが得られた。特にハリガネではアガラーゼ(4U/ml)で848万個得られた。フィリピン産キリンサイのice-ice感染症部分から細菌を単離したところ、この細菌はカラゲーナンを分解しており、カラゲネース作成の可能性が確認できた。今年度は、組織培養に重点を置いて研究を行った。材料には寒天藻としてハリガネ、ナンブグサ、オゴノリを、カラゲーナン藻としてツノマタをそれぞれ用いた。組織培養用の培地には海藻類一般に使われているPES培地を基本に、これに植物ホルモンとしてオーキシン系の2,4-D、IAA、NAAを、サイトカイニン系のKinetinを添加した。

その濃度は0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/Lの3段階とした。藻体はそれぞれ約1mmの長さの切片にして培養に用いた。培養の温度条件は8°C、15°C、20°Cとし、日長条件は12時間:12時間の中日条件とした。ハリガネでは8°C、15°Cで藻体の断面の柔組織から新芽が形成され、6ヶ月後には新芽の先端は叉状または三叉状に生育した。このとき新芽形成は先端方向の切断面のみみられ、皮層部ではみられなかった。また植物ホルモンの影響はなかった。オゴノリでは3ヶ月後に8°C、15°Cで藻体の断面の柔組織からと側面から新芽の形成がみられた。植物ホルモンは、2,4-Dで効果がみられた。ナンブグサでは新芽形成は他の寒天藻に比べて速く、すべての培養条件下で1週間以内にみられた。また切片の断面と側面から新芽は形成された。植物ホルモンは2,4-D、IAAで効果がみられた。ツノマタでは藻体の切片の殆どが培養後、数日で変色して腐敗してしまった。しかし15°Cで培養したものでは、変色しても6ヶ月後に藻体断面の柔組織から新芽を形成した。植物ホルモンは2,4-Dで効果がみられた。今年度は、昨年度と同様に組織培養に重点を置いて研究を行った。材料には寒天藻としてハリガネ、ナンブグサ、オゴノリを、カラゲーナン藻としてクロハギンナンソウを用いた。培地はPES培地を基本にして、これに植物ホルモンのオーキシン系の2,4-D、IAA、IBA、IPA、pCA、α-NAA、β-NAAを、サイトカイニン系のBAP、KIN、ZEAを、その他としてジベレリン系のGA3の11種類を用いた。濃度(mg/L)は0.01、0.1、1.0、10の4段階とした。藻体は約1-3mmの切片にして、温度15°C、20°C、日長は中日条件で培養した。新芽の形成はナンブグサではオーキシン系、サイトカイニン系の用いた全ての植物ホルモンでみられた。オーキシン系の2,4-DとIAAの0.11.0mg/Lで良い効果が得られ、特にサイトカイニン系のZEAの0.1mg/Lで最も良い効果が得られた。オゴノリではオーキシン系の2,4-Dの1.0mg/Lの濃度で良い効果が得られた。ハリガネではオーキシン系はIAA、α-NAA、β-NAA、IPAで良い効果が得られたが、特にIPAの10mg/Lの濃度で最も良い効果が得られた。またサイトカイニン系はKINの0.11.0mg/Lの濃度で良い効果が得られた。ジベレリン系のGA3でも効果が認められた。クロハギンナンソウではオーキシン系の2,4-Dを除いた全ての種類で効果が認められた。これらの結果から、寒天藻・カラゲーナン藻の組織培養にはオーキシン系、サイトカイニン系、ジベレリン系ともに効果があるが、特にオーキシン系では2,4-DとIAA、サイトカイニン系ではKINとZEAの良い効果が認められた。また、ツノマタとハリガネではカルスの形成がサイトカイニン系の添加で得られた。このことは、クローン化が可能であることを示しており、将来、これらの海藻の品種改良と育種かの可能性を示唆している。ツノマタとクロハギンナンソウのプロトプラストの形成を試みたが、いずれも完全なものはできなかった。この原因はカラゲーナン分解酵素に起因しており、酵素の開発が重要である。
神経芽細胞腫の生物学的悪性度診断のための簡易マイクロアレイの開発と臨床応用

神経芽細胞腫検体のうち予後が明らかな322例を対象に検討した。アレイCGH解析では、MYCN増幅や1・3・4・11・14・17番染色体に変化を認め、これらで簡易アレイCGHを作製し検討した結果11qの部分欠失は独立した予後不良因子であった。胎児脳cDNA library由来cDNAアレイ、全ゲノムのオリゴアレイ及びマイクロソート解析で抽出した182遺伝子を対象に、発現解析簡易アレイを作製し解析すると、予後不良例が95%の確率で層別化できた。また、また、hTERTおよびCaspase 8,9のプロモーターのCpG領域のメチル化を識別する簡易アレイを作製し120例で検討したところ、Caspase 8の2箇所のメチル化が予後と有意に相関し、hTERT及びCaspase 9は各々6、5箇所に変動が見られたが、予後と相関はなかった。腫瘍内にheterogeneityのある9例、化学療法後摘出の30例、多発11例,再発例8例、退縮,分化が確認された6例中で、腫瘍部位をマイクロダイセクションし、初回原発巣と比較したところ、遺伝子異常が加わった12例は全て予後不良であったが、多発例、再発例、分化・退縮例は遺伝子変化やメチル化の変動はなく予後良好であった。神経芽腫細胞株12株に、テロメラーゼ阻害剤GRN163やhTERTに対するsiRNAを投与で、5株、7株に活性抑制と細胞死、増殖抑制がみられ、細胞増殖シグナルの発現低下とアポトーシス関連遺伝子の発現上昇を認めた。また、レチノイドにて分化誘導する3株ではMYCN発現の低下とテロメラーゼ活性の消失、アポトーシスと神経分化の関連遺伝子の発現上昇が見られた。以上から、神経芽細胞腫の腫瘍特性は、簡易発現解析アレイとCGHアレイにて把握可能となった。また、治療への反応性、分化誘導療法の適応などの判別も可能で、有用なツールと考えられた。予後が判明している約300の神経芽細胞腫の凍結組織を対象に検討を行った。染色体全領域をカバーする大腸菌人工染色体(BAC)を用いたアレイCGH解析では、既に増幅が確認されているMYCN領域や1p欠損に加え、3・11・14・17番染色体にも変化を認め、これらを網羅的に解析できる簡易アレイCGH作製を計画中である。正常胎児脳組織由来のcDNAアレイ及びマイクロソートテクノロジーにて選別した本腫瘍で特異的に発現が増減する遺伝子約200を用いて100枚の簡易アレイを作製し、解析を行ったところ、予後不良な神経芽腫と予後良好な神経芽腫は100%の確率で層別化できた。また、予後と相関するhTERTおよびCaspase 8,9発現の検討として、これらの遺伝子のプロモーターのCpG領域に特異的にメチル化される部位を識別する簡易アレイを作製した。Caspase8においては4箇所の部位が予後と相関し、同時にメチル化されることがほとんどで、hTERTおよびCaspase9についても検索中であるが、これらの同時に予後と相関するメチル化部位が見出され、これらを網羅的に検出するアレイを作成準備中である。一方、腫瘍内にheterogeneityの存在する5例、化学療法後摘出腫瘍15例で、腫瘍細胞の部位をマイクロダイセクションし、抽出したDNAあるいはRNAを増幅し、アレイCGH、cDNA簡易アレイの検索を行った。他部位あるいは化学療法前の腫瘍との比較で明らかに悪性度を増していることが明らかになった4例存在はいずれも予後不良で、このように個々の腫瘍細胞の検討も必要であると考えられた。

また、多発例11例中3例,再発例8例中4例,再手術で退縮分化が確認された6例中0例でもとの腫瘍と有意な遺伝子量変化、遺伝子発現変化、メチル化の変化を認め、悪性度の変化を検討するのに適した簡易アレイと考えられた。予後の明らかな322例の神経芽細胞腫を対象に検討した。アレイCGH解析では、MYCN領域の増幅や1p欠失に加え、3・4・11・14・17番染色体にも変化を認め、11qの部分欠失は予後木良で、独立の特性を示した。正常胎児悩cDNA libraryから作成したcDNAアレイ、全ゲノムのオリゴアレイ及びマイクロソートによる解析で抽出した182遺伝子にて簡易アレイを作製し、遺伝子発現を解析すると、予後不良例が95%の確率で層別化できた。また、hTERT、Caspase 8,9のプロモーターのCpG領域のメチル化を識別する簡易アレイ検索では、Caspase 8の2箇所のメチル化が予後と有意に相関し、hTERT及びCaspase 9は各々6、5箇所に変動が見られたが、予後と相関はなかった。腫瘍内にheterogeneityのある9例、生検後化学療法し摘出した30例、多発11例,再発例8例で、腫瘍部位をマイクロダイセクションし、初回摘出巣と比較したところ、遺伝子異常が加わった12例は全て予後不良であったが、多発例、再発例でDNA量の差があっても、遺伝子量が均等に増減した症例(3n、4nから2n)は予後良好で、分化との関連が示唆された。神経芽腫細胞株12株に、テロメラーゼ阻害剤GRN163やhTERTに対するsiRNAを投与で、5株に活性抑制と細胞死、増殖抑制がみられ、発現解析では細胞増殖シグナル低下とアポトーシス関連遺伝子の発現上昇を認めた。また、レチノイドにて分化誘導する3株ではMYCN発現の低下とテロメラーゼ活性の消失、アポトーシスと神経分化の関連遺伝子の発現上昇が見られた。以上から、神経芽細胞腫の腫瘍特性は、簡易cDNAアレイとCGHアレイにて把握可能となった。また、治療への反応性、分化誘導療法の適応などの判別も可能となることが期待され、有用なツールと考えられた。