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チャマダラセセリの生息と人間の土地利用と共存のメカニズム解明

チャマダラセセリPyrgusmaculatusは,鱗翅目セセリチョウ科に属する草原性のチョウで,現在日本で最も絶滅が危惧されているチョウの1種である.長野県木曽町と岐阜県高山市の生息地において,採草地での野焼きと裸地率の関係や,産卵場所の選好性と草地管理の方法との関係などを調査し,2年に1回の火入れと採草が本種の生活様式に適した草原環境を生み出していたことがわかり,人間の伝統的な土地利用と本種の共存メカニズムを明らかにした.室内飼育実験から有効積算温度定数,発育零点および休眠の臨界日長条件を解明し,また生息域外保全に必要な交尾技術を確立した.さらに韓国での調査を行った。1年目はチャマダラセセリの生息地での密度調査と室内飼育実験を行うことを目的とした。長野県開田高原のチャマダラセセリは長野県指定希少野生動植物に指定されており、個体群は危機的な状況である。2014年の調査では、5月の1化目の成虫は10日間定点調査をしたが、オス1個体、メス2個体を確認したのみであった。メス2個体を確保したが、産卵せず未交尾であると考えられることから、ただちに生息地に還した。卵・幼虫の密度調査の結果は、春(1化目)は、ミツバツチグリ3629枚、キジムシロ2736枚、夏(2化目)は、ミツバツチグリ2607枚、キジムシロ446枚を探索したが、卵・幼虫を発見することはできなかった。以上のことから、開田高原では絶滅の危機に瀕していることが明らかとなった。そこで、室内飼育実験の材料としては同じ御嶽山麓の他地域の個体群を用いた。この実験においては今までチャマダラセセリにおいては人為的に行うことが困難であった交尾技術の確立を行うことができた。具体的には30回の交尾実験を行ったところ5ペア成功した。成功率は16.7%であった。成功例におけるオスの平均羽化後日数は4.8日、メスの平均羽化後日数は2.4日、交尾時の平均気温は30.7°Cであった。一方、失敗した場合はそれぞれ5.1日、2.6日、29.1°Cであった。成功例と失敗例のオスとメスの羽化後日数の間には有意差はなかった。成功例は失敗例より有意に気温が高かった。成功したペアにおける平均交尾時間は38.75分であった。さらに交尾が成功した5個体のメス成虫を使って、リシャール式採卵法で産卵させたところ、平均産卵数は35.4卵であった。この結果により、チャマダラセセリの累代飼育技術が確立され、チャマダラセセリ開田高原個体群の生息域外保全に関する科学的データを蓄積することができた。2年目はチャマダラセセリの生息環境を調査し、室内で生態的なデータを蓄積した。1.コドラート調査木曽町開田高原における本種の生息地を、春に野焼きを行う野焼き区、野焼きを行わない非野焼き区、春に野焼きを行わず夏に草刈りを行う草刈り区に区分した。各区画コドラートを設置し、コドラート内のミツバツチグリとキジムシロの葉数、葉の縦・横・草丈を測定した。また被度と裸地率を求めるために、全てのコドラートを調査毎にデジタルカメラで撮影した。2.非破壊での餌資源の測定方法の開発チャマダラセセリの幼虫は営巣することが知られている。そこで、野外で生息している幼虫4個体を1週間毎に観察し、営巣している食草のサイズを測定した。次にミツバツチグリの葉200枚を採集しスキャナーで取り込み画像解析ソフトImageJによって面積を算出した。これにより葉の縦または横の長さを測定するだけで面積を容易に算出することが可能となり、本種の産卵選好や幼虫の利用する葉の大きさを解析した。3.食草選択実験チャマダラセセリ27個体を用い、25°C、12L:12Dの条件で飼育した。異なる植物で個別飼育し、幼虫期間、蛹体重を測定した。その結果、平均幼虫期間はミツバツチグリで42.2日、キジムシロで37.0日、キンミズヒキで50.5日、オランダイチゴで45.5日となった。また平均蛹体重はミツバツチグリで0.1176g、キジムシロで0.1278g、キンミズヒキで0.0910g、オランダイチゴで0.1098gとなった。さらに生存率はミツバツチグリで71.43%、キジムシロで100%、キンミズヒキで60%、オランダイチゴで80%となった。4.海外調査韓国での野外調査を行った。その結果ソウル近郊の生息地として登録された場所では成虫を確認することができなかった。そこで、済州島で再度調査を行ったところ4ヶ所で生息を確認できた。2年目もチャマダラセセリの長野県開田高原個体群は危機的な状況であることから、開田高原個体群の研究を行うことができなかった。そこで、チャマダラセセリのデータだけではなく、生息環境の調査を行い、データを算出することができた。またチャマダラセセリが好む環境を測定する方法を開発したため、今後の調査で活用できると考えられる。

チャマダラセセリは飼育等の生態学的知見が乏しく、保全が進まないのが現状である。円滑な飼育方法を確立するための室内飼育実験を予定より多く行うことができた。海外調査でもチャマダラセセリを発見することができ、サンプルも確保することができた。本研究の対象種であるチャマダラセセリは長野県で危機的な状況にある。そのため、研究に必要なサンプル数が確保できない。そこで、3年目は長野県の生息地と隣接する岐阜県の生息地での野外調査と、室内飼育実験を行った。1.岐阜県での野外調査母蝶が好んで産卵する草地環境を明らかにするため,草丈の低いところに3プロット,草丈の高いところに2プロット合計5つの調査プロットを設定して,卵・幼虫数,裸地率,食草であるミツバツチグリの高さ,葉の大きさなどを調査した.裸地率は各プロットに設けた1m×1mのコドラートをデジタルカメラで撮影し,画像解析ソフトを使って算出した.その結果,合計909枚の葉を調査して,卵・幼虫合わせて11個体が確認された.卵・幼虫が発見されたのは,草丈が低く裸地率が20%以上の3つのプロットであった.そのうち2つのプロットで野焼きされていた.一方,卵・幼虫が見つからなかった2つのプロットは,草丈が高く裸地率が47%で,草刈りや野焼きもされず管理が放棄されたところであった.産卵されたミツバチチグリの3枚の小葉の平均サイズは,右小葉が14.3,左小葉が15.7,真ん中の小葉が16.4cmであった.以上の結果から,本種母蝶が好んで産卵する環境は,裸地率が高く,草丈が低くて地表に近い小さい食草がある草地であると考えられた.2.室内飼育実験日長を16L:8Dと一定にして温度を1530°Cと変化させて飼育を行い、各発育段階の発育期間を記録し、孵化率、生存率、羽化率を算出した。また、得られたデータを元に有効積算温度定数と発育零点を算出し、生息地における発生シミュレーションを行った。その結果、木曽馬の採草地管理として草刈りが行われていた時期と推定された2化成虫の発生時期が重なっており、木曽馬の採草地管理がチャマダラセセリにとって好適な産卵環境を提供していたと推察された。研究は3年目として、多くの項目について明らかにすることができた。しかし、チャマダラセセリ自体の生息数が激減してしまい、本来の調査地で野外調査をすることが困難となっている。そこで、隣接する他の生息地において調査をすることとした。また、本種の発生状況を確認する必要があると判断し、研究期間を延長することとした。4年目は累代飼育していたチャマダラセセリの飼育に関する研究を行った。1.交尾・産卵実験チャマダラセセリは人工での交尾成功事例がほとんどなく、そのことから累代飼育が進まないことが問題であった。そこで幼虫から羽化した成虫個体を用いて30回交尾実験を行い、交尾が成功した雌成虫はその後産卵実験を行った。その結果、5ペア成功し、交尾成功率は16.7%であった。オスの平均羽化後日数、メスの平均羽化後日数、平均気温はそれぞれ成功例で4.8日、2.4日、30.7°C、失敗例で5.1日、2.6日、29.1°Cであった。成功例と失敗例のオスとメスの羽化後日数の間には有意差はなかった。成功例は失敗例より有意に気温が高かった。成功したペアにおける平均交尾時間は38.75分であった。交尾が成功した♀成虫を順にABCDEとし、リシャール式採卵法で産卵させたところ、Aははじめて産卵した日から6日間生存し3回の実験で40卵、Bは3日間生存し2回の実験で14卵、Cは2日間生存し1回の実験で11卵、Dは10日間生存し4回の実験で72卵、Eは6日間生存し3回の実験で40卵産卵した。平均産卵数は35.4卵であった。2.部分2化の解明
急性心筋梗塞後の心臓修復を促進する革新的PPARγナノ医薬の研究開発

【研究実績の概要】本研究は、急性心筋梗塞病態(心筋虚血再灌流傷害および梗塞後心臓組織修復)において、単球・マクロファージを介した炎症およびその収束・修復の役割を明らかにし、この過程を制御するPPARγナノ医薬を開発することを目的とした。(1)心筋梗塞後に組織障害性の炎症と組織修復性M2マクロファージの集簇が段階的に起こること、(2)PPARγナノ医薬が急性炎症を抑制するとともに、心臓組織におけるマクロファージM1/M2分化を組織修復性M2優位に制御すること、それとともに心筋梗塞後リモデリングを抑制すること、(3)PPARγナノ医薬による心筋梗塞後の生命予後改善効果を示し、結果をCardiovascular Research誌に報告した。この研究により、ナノ医薬のプラットフォームの有用性を示すとともに、急性炎症と組織修復の制御による新しい疾病治療コンセプトを示すことができた。【現在までの進捗状況】1)心筋虚血再灌流傷害および梗塞後左室リモデリングにおける炎症の役割の解明(平成29年度):虚血再灌流後、および心筋梗塞後の心臓において、Ly6Chigh炎症性単球/マクロファージの動員をフローサイトメトリーで検討した。2)PPARγナノ医薬による左室機能改善効果とメカニズムの解明(平成29年度):PPARγナノ医薬としてピオグリタゾン封入ナノ粒子(Pio-NP)を作成し、マウス心筋虚血再灌流モデルにおいて、Pio-NPが心臓組織に対するLy6Chigh炎症性単球の動員を抑制し、それに伴って心筋梗塞サイズを減少させることを示した。心筋梗塞モデルにおいて、心筋梗塞作成後3、7日目の心臓組織におけるフローサイトメトリー、蛍光分子トモグラフィーにより、Pio-NPが心臓組織におけるM1/M2分化をM2優位に誘導するとともに、心臓組織における炎症とMMP活性を抑制、梗塞瘢痕領域の縮小、菲薄化の抑制、残存心筋の繊維化の抑制、左室駆出率の改善することを示した。3)PPARγナノ医薬による生命予後改善効果の検討(平成30年度の成果):マウス心筋梗塞モデルにおいて、心筋梗塞作成手術から回復後に無作為化し、Pio-NPまたは溶媒を3日間連続で投与した。マウスを継続飼育・観察し、Pio-NP投与が総死亡および心破裂による死亡を抑制することを明らかとした。以上の結果をCardiovascular Research誌(Tokutome M, Matoba T, et al.Cardiovasc Res. 2019;115:419-431.)に報告した。【今後の研究の推進方策】平成30年度までに主要な研究目的を達成した。公表した研究結果について、発表、議論を行う。また、残る研究課題について検討を行う。具体的には心筋梗塞における炎症の機序における、PPARγと糖代謝、脂質代謝の関係について明らかにする。本研究は、急性心筋梗塞病態(心筋虚血再灌流傷害および梗塞後心臓組織修復)において、単球・マクロファージを介した炎症およびその収束・修復の役割を明らかにし、この過程を制御するPPARγナノ医薬を開発することを目的とした。具体的には(1)心筋虚血再灌流傷害および梗塞後左室リモデリングにおける炎症の役割の解明、(2)PPARγナノ医薬による左室機能改善効果とメカニズムの解明、(3)PPARγナノ医薬による生命予後改善効果の検討、の3段階に分けて計画し、平成29年度の研究により(1)心筋梗塞後に組織障害性の炎症と組織修復性M2マクロファージの集簇が段階的に起こること、(2)PPARγナノ医薬が急性炎症を抑制するとともに、心臓組織におけるマクロファージM1/M2分化を組織修復性M2優位に制御すること、それとともに心筋梗塞後リモデリングを抑制することを示しつつある。引き続き研究計画を進めPPARγナノ医薬の急性心筋梗塞後の生命予後に対するインパクトを検証し、最終的にはナノ医薬のプラットフォームを硬固とするとともに急性炎症と組織修復の制御による新しい疾病治療コンセプトを示したい。1)心筋虚血再灌流傷害および梗塞後左室リモデリングにおける炎症の役割の解明まず、虚血再灌流後の心臓に対してLy6Chigh炎症性単球が12時間後をピークに動員されることをフローサイトメトリーで示し、Ly6Chigh炎症性単球の主要なケモカインであるCCR2の欠損マウスでは、Ly6Chigh単球による急性炎症が抑制され虚血再灌流傷害による心筋梗塞サイズの拡大が約50%抑制されることを示した。冠動脈永久結紮心筋梗塞マウスモデルにおいても心筋梗塞後0, 3, 7日目の心臓組織においてフローサイトメトリーを行い、M1マクロファージは3日目から動員される一方、M2マクロファージが7日目から動員されることを示した。2)PPARγナノ医薬による左室機能改善効果とメカニズムの解明PPARγナノ医薬としてピオグリタゾン封入ナノ粒子(Pio-NP)を作成し、in vitroで骨髄由来単球をM2マクロファージへ分化させることを示した。マウス心筋虚血再灌流モデルにおいて、冠動脈再灌流時にPio-NPを静脈内投与し、再灌流24時間後の心臓組織におけるフローサイトメトリー、蛍光トモグラフィーにおける心臓の炎症のin vivoイメージング、および組織学的心筋梗塞サイズの検討を行った。Pio-NPは心臓組織に対するLy6Chigh炎症性単球の動員を抑制し、それに伴って心筋梗塞サイズを減少させることを示した。心筋梗塞モデルにおいて、心筋梗塞作成後3、7日目の心臓組織におけるフローサイトメトリーにより、Pio-

NPが心臓組織におけるM1/M2分化をM2優位に誘導するとともに、心臓組織における炎症とMMP活性を抑制、梗塞瘢痕領域の縮小、菲薄化の抑制、残存心筋の繊維化の抑制、左室駆出率の改善することを示した。【研究実績の概要】本研究は、急性心筋梗塞病態(心筋虚血再灌流傷害および梗塞後心臓組織修復)において、単球・マクロファージを介した炎症およびその収束・修復の役割を明らかにし、この過程を制御するPPARγナノ医薬を開発することを目的とした。(1)心筋梗塞後に組織障害性の炎症と組織修復性M2マクロファージの集簇が段階的に起こること、(2)PPARγナノ医薬が急性炎症を抑制するとともに、心臓組織におけるマクロファージM1/M2分化を組織修復性M2優位に制御すること、それとともに心筋梗塞後リモデリングを抑制すること、(3)PPARγナノ医薬による心筋梗塞後の生命予後改善効果を示し、結果をCardiovascular Research誌に報告した。この研究により、ナノ医薬のプラットフォームの有用性を示すとともに、急性炎症と組織修復の制御による新しい疾病治療コンセプトを示すことができた。【現在までの進捗状況】1)心筋虚血再灌流傷害および梗塞後左室リモデリングにおける炎症の役割の解明(平成29年度):虚血再灌流後、および心筋梗塞後の心臓において、Ly6Chigh炎症性単球/マクロファージの動員をフローサイトメトリーで検討した。2)PPARγナノ医薬による左室機能改善効果とメカニズムの解明(平成29年度):PPARγナノ医薬としてピオグリタゾン封入ナノ粒子(Pio-NP)を作成し、マウス心筋虚血再灌流モデルにおいて、Pio-NPが心臓組織に対するLy6Chigh炎症性単球の動員を抑制し、それに伴って心筋梗塞サイズを減少させることを示した。心筋梗塞モデルにおいて、心筋梗塞作成後3、7日目の心臓組織におけるフローサイトメトリー、蛍光分子トモグラフィーにより、Pio-NPが心臓組織におけるM1/M2分化をM2優位に誘導するとともに、心臓組織における炎症とMMP活性を抑制、梗塞瘢痕領域の縮小、菲薄化の抑制、残存心筋の繊維化の抑制、左室駆出率の改善することを示した。3)PPARγナノ医薬による生命予後改善効果の検討(平成30年度の成果):マウス心筋梗塞モデルにおいて、心筋梗塞作成手術から回復後に無作為化し、Pio-NPまたは溶媒を3日間連続で投与した。マウスを継続飼育・観察し、Pio-NP投与が総死亡および心破裂による死亡を抑制することを明らかとした。以上の結果をCardiovascular Research誌(Tokutome M, Matoba T, et al.Cardiovasc Res. 2019;115:419-431.)に報告した。
弓状核－室傍核軸の概日リズムによる摂食・エネルギー代謝調節とその破綻機序の解明

概日リズムは摂食・エネルギー代謝調節に重要であり、概日リズムの乱れが内分泌・代謝疾患を増悪する事が明らかになってきている。本研究では、摂食・エネルギー代謝調節の中枢である視床下部の弓状核ー室傍核軸の概日リズムによる摂食・エネルギー代謝調節機構の解明を目的とした。これまでに室傍核Nesfatin-1ニューロンの概日リズムが、室傍核オキシトシンニューロンの活性化を介して摂食の概日リズムを調節する事と明らかにした。室傍核Nesfatin-1ニューロンの概日リズム形成は、末梢代謝情報のインスリン、レプチン、血糖に加えてFGF21が重要である事を報告してきたが、網膜からの光刺激は視交叉上核バゾプレッシンニューロンから室傍核オキシトシンニューロンへの神経回路が重要である事、さらにインスリンは直接室傍核オキシトシンニューロンを活性化する事を明らかにした。一方、時計遺伝子BMAL1のオキシトシンニューロン特異的ノックアウトマウスでは摂食リズムの障害を認めなかった。これらの結果から、室傍核オキシトシンニューロンは代謝および光情報により複合的な受動的制御を受けて摂食リズムを調節する事が示唆された。弓状核AgRPニューロン特異的BMAL1ノックアウトマウスは摂食リズム異常を示したが、代謝リズムは正常であった。他施設からAgRPニューロンを介した代謝リズム調節の報告と相違しており、今後の検証が必要と考えられた。最終年度に研究室の異動があり、研究の完成の遅れを認めており期間後も研究を継続し完成を目指す。概日リズムの乱れが内分泌・代謝疾患を増悪させることが明らかとなってきており、概日リズムは摂食・エネルギー代謝調節に大きく係わっている。本研究は、摂食・エネルギー代謝調節の中枢である視床下部弓状核ー室傍核軸の概日リズムが摂食・エネルギー代謝制御に重要である、と仮説を立てこれを検証するものである。本年度は、当初の実験計画通りに、各種のコンデショナルノックアウトマウスを作成した。弓状核のAgRPニューロンを標的に時計遺伝子のBMALノックアウトマウスを作成し、摂食行動の概日リズムと糖代謝に関する解析を行った。室傍核を標的としたSIM1 cre/BMAL floxedマウスの解析では室傍核のNucleobindin2(NUCB2)と摂食リズムの関連が示唆され、これをもとに、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いたNUCB2 shRNA発現によるノックダウンにより、室傍核のオキシトシン発現が低下し、摂食の概日リズムが障害されることを明らかにし、論文報告を行った。また、NUCB2のfloxedマウスを用いた、コンデショナルノックアウトマウスを作成し、室傍核NUCB2の摂食・エネルギー代謝の概日リズム調節機構を解明する準備を行った。ノックアウトマウスの作成に関しては問題なく行っている。作成したマウスの解析に関しても、十分に行える状況である。近年、概日リズムの乱れが内分泌・代謝疾患を増悪することが明らかになってきている。このことは概日リズムが摂食・エネルギー代謝調節に重要であることを示している。そこで本研究では、摂食・エネルギー代謝調節の中枢である視床下部の弓状核ー室傍核軸に着目し、弓状核ー室傍核軸の概日リズムによる摂食・エネルギー代謝制御機構の解明を目的とする。昨年度までに、実験計画通りに、各種のコンデショナルノックアウトマウスを作成し、本年度はこれらマウスの摂食・エネルギー代謝に関して解析を行った。AAVベクターを用いた解析より室傍核NUCB2/Nesfatin-1ニューロンが摂食の概日リズムを形成する事を昨年度報告した。本年度はSIM1 CreマウスとNUCB2floxマウスの交配により室傍核特異的NUCB2/Nesfatin-1ノックアウトマウスを作成し、室傍核NUCB2/Nesfatin-1ニューロンの活性化調節因子を検討した。さらに、FGF21ノックアウトマウスは室傍核NUCB2/Nesfatin-1発現が低下している事、FGF21の血中濃度には概日リズムがある事、FGF21の摂食抑制作用にも概日リズムがある事を明らかにした。これらの結果より、FGF21による室傍核NUCB2/Nesfatin-1ニューロンの活性化が摂食行動の概日リズム形成に関与している可能性が示唆された。時計遺伝子であるBMAL1の室傍核特異的ノックアウトマウス、Oxytocinニューロン特異的ノックアウトマウス、AgRPニューロン特異的ノックアウトマウスは過食を呈した。この結果、AgRP,Nesfatin-1,Oxytocinニューロンによる弓状核ー室傍核軸の概日リズムが摂食行動の調節に重要であることが示唆された。Oxytocinニューロンに関連するノックアウトマウスでは、妊娠・出産の異常による繁殖の問題があり計画が少し遅れている。しかし、作成したノックアウトマウスの摂食・エネルギー代謝の表現型の解析は完了しており、遅れは改善できると考えられる。本研究では、摂食・エネルギー代謝調節の中枢である視床下部の弓状核-室傍核軸に着目し、弓状核ー室傍核軸の概日リズムによる摂食・エネルギー代謝調節機構の解明を目的としてきた。

これまでに、室傍核NUCB2/Nesfatin-1ニューロンの概日リズムが、室傍核のオキシトシンニューロンの活性化を介して摂食の概日リズムを調節する事を明らかにしてきた。さらに、室傍核のNUCB2/Nesfatin-1ニューロンの概日リズム形成は、内分泌性FGFsのFGF21を含む代謝情報に依存する事も明らかにした。またオキシトシンは視交叉上核からの神経情報によっても制御されている事も明らかにした。これらの結果から、食事⇒代謝情報(FGF21,レプチン等)→NUCB2/Nesfatin-1ニューロン⇒オキシトシンニューロンの経路と光刺激→視交叉上核⇒オキシトシンニューロンの経路が摂食のリズム形成に重要である事が明らかになった。オキシトシンニューロン特異的に時計遺伝子BMAL1またはNUCB2をノックアウトしたマウスを作成し、解析を行なったが、摂食行動および代謝における著明な変化は観察されなかった。この事から、オキシトシンの概日リズム形成は、NUCB2陽性の非オキシトシンニューロンによる調節を受けている事、さらにオキシトシンの自発性概日リズムの寄与も少ない事が示された。一方、摂食亢進系ニューロンのAgRPニューロン特異的BMAL1ノックアウトマウスは摂食行動の異常が認められた事から、弓状核ー室傍核軸による摂食リズム調節系が存在する事が示唆された。また、室傍核特異的BMAL1ノックアウトマウスでも代謝異常が観察された。そこで、本研究を延長し、解析の完了を目指す。本研究では当初、視床下部弓状核ー室傍核軸による摂食・エネルギー代謝調節機構の解明を目指してきた。しかし、研究過程において弓状核ー室傍核軸は非常に多岐の生理活動調節に重要であることがあきらかになり、研究が広範になり、時間を費やした。今後は、研究を集約することで、完結を目指す。概日リズムは摂食・エネルギー代謝調節に重要であり、概日リズムの乱れが内分泌・代謝疾患を増悪する事が明らかになってきている。本研究では、摂食・エネルギー代謝調節の中枢である視床下部の弓状核ー室傍核軸の概日リズムによる摂食・エネルギー代謝調節機構の解明を目的とした。これまでに室傍核Nesfatin-1ニューロンの概日リズムが、室傍核オキシトシンニューロンの活性化を介して摂食の概日リズムを調節する事と明らかにした。室傍核Nesfatin-1ニューロンの概日リズム形成は、末梢代謝情報のインスリン、レプチン、血糖に加えてFGF21が重要である事を報告してきたが、網膜からの光刺激は視交叉上核バゾプレッシンニューロンから室傍核オキシトシンニューロンへの神経回路が重要である事、さらにインスリンは直接室傍核オキシトシンニューロンを活性化する事を明らかにした。一方、時計遺伝子BMAL1のオキシトシンニューロン特異的ノックアウトマウスでは摂食リズムの障害を認めなかった。これらの結果から、室傍核オキシトシンニューロンは代謝および光情報により複合的な受動的制御を受けて摂食リズムを調節する事が示唆された。弓状核AgRPニューロン特異的BMAL1ノックアウトマウスは摂食リズム異常を示したが、代謝リズムは正常であった。他施設からAgRPニューロンを介した代謝リズム調節の報告と相違しており、今後の検証が必要と考えられた。
多細胞生物における細胞個性の解析のための研究手法の開発

多細胞生物の発生過程では、個々の細胞で遺伝子発現パターンの差異が生じ、それにより細胞内分子ネットワークが細胞間で大きく異なってくる。この差異が個々の細胞種の機能の違いを生み出していると考えられ、その違いを包括的に理解するための方法が必要である。そこで、体の全細胞数が約1000個と少なく、個々の細胞がすべて同定されているモデル生物、線虫C.エレガンスを用い、全遺伝子発現パターンと細胞個性の連関を理解するための手法の確立を行った。PABP(ポリA結合蛋白質)を利用して特定の細胞からmRNAを抽出する技術、poly(A)pull-down法を開発、整備した。PABPを線虫の感覚神経に発現させ、これらの神経からmRNAを抽出し、cDNAマイクロアレイに適用することにより感覚神経特異的な遺伝子発現を解析した。コントロール細胞に比較して高い発現を示す遺伝子を順位付けし、これらの発現パターンをレポーターアッセイで調べたところ、発現の検出された15遺伝子のうち13遺伝子が感覚神経に発現していた。約30対の感覚神経のすべてに発現するもの、一部に発現するものなどさまざまな発現パターンを示す遺伝子が同定されていることがわかった。また、種々の細胞に特異的に遺伝子を発現させるために、細胞特異的プロモーターの収集を行った。Gatewayシステムをもとにしたベクターシステムを構築し、線虫ゲノム由来のプロモーター断片をpENTRベクターに挿入したものを揃えることにより、簡便に個々の解析対象の遺伝子をそれぞれのプロモーターの制御下に置くことができるようになった。感覚神経、介在神経を中心として、特定の少数の神経サブセットに発現するプロモーターを19種集め、pENTRベクターに挿入した。これらのシステムを応用することにより、今後さらに細胞個性の分子的理解が可能となるであろう。
抗体の糖鎖機能の修飾に及ぼす食品成分の役割

免疫グロブリン分子の軽鎖は単純ポリペプチド鎖であり、糖鎖は存在しないが、稀に可変領域にN-結合型糖鎖が結合していることが知られている。ヒト型ハイブリドーマHB4C5の産生する抗体の軽鎖にもN-結合型糖鎖が可変領域に結合しており、その糖鎖が抗原認識に関与していることを明らかにしてきた。そこで、この肺ガン特異的ヒト型モノクローナル抗体HB4C5の軽鎖に結合する糖鎖の機能を検討するために糖鎖構造の改変を試みた。その手段としてまず、糖鎖合成変異細胞による本抗体の産生を試みた。糖鎖合成変異細胞はこれまで数多く取得されているが、それらはほとんど細胞障害性レクチンに対する耐性を指標に選択されている。そこで、レクチンを糖鎖合成変異細胞の選択薬剤として用いた。糖鎖結合軽鎖を分泌するハイブリドーマの糖鎖合成変異株を数種、植物レクチンの一種であるコカンナバリンAに耐性な細胞の中からスクリーニングすることができた。さらにこうして得られた変異細胞は、本来の抗体の持つ結合活性とはことなる結合活性を有する抗体を分泌していることが明らかになった。続いて、細胞の培養条件検討において、グルコース濃度を低下させたり、グルコースの代わりに他の単糖類を同濃度添加した培地でこうしたハイブリドーマを培養することにより、軽鎖に結合する糖質に変化が観察された。さら軽鎖の糖鎖修飾における変化は、抗体の抗原認識に影響を及ぼしていた。こうした変化は元の培地成分に戻すことにより回復した。培地成分(糖組織)が細胞の抗体糖鎖合成に影響することが判明したが、グルコースを置換した培地では、細胞の生存率が悪く長期継代培養が困難であり、増殖阻害を起こさない様な培地組成の食品成分を含めた検討が今後の検討課題であった。(平成5年度)。そこで、培地の糖源として、グルコース以外にNアセチルグリコサミンを添加し、またその存在比を調節することにより、抗体産性能及び細胞生存率を低下させることなく抗体の抗原結合性を著しく増大させることができた。さらに、グルコース濃度の抗体軽鎖の糖鎖修飾に対する効果は、血清成分に影響を受けることが明らかとなった。一方、動物細胞による糖タンパク質の糖鎖修飾は以上のようにその培養環境の影響をうけるので、その糖タンパク質糖鎖の正真性、均一性を維持することは特に重要である。抗体軽鎖の糖鎖修飾において培地中のグルコースレベルの変動に寛容な細胞株をレクチン耐性変異細胞の中に見いだした。(平成6年度)免疫グロブリン分子の軽鎖は単純ポリペプチド鎖であり、糖鎖は存在しないが、稀に可変領域にN-結合型糖鎖が結合していることが知られている。(平成5年度)。(平成6年度)本来、イムノグロブリン分子の軽鎖は単純ポリペプチド鎖であり、糖鎖は存在しない。ところが、稀に可変領域にN-結合型糖鎖が結合しているが知られており、ヒト型ハイブリドーマHB4C5の生産する坑体の軽鎖にもN-結合型糖鎖が可変領域に結合しており、その糖鎖が坑原認識に関与していることを明らかにしてきた。

そこでこの肺ガン特異的ヒト型モノクローナル坑体HB4C5の軽鎖に結合する糖鎖構造を、購入したウエスタンブロッテイング装置を用いて推定した。その結果これまでヒトイムノグロブリンではIgDの重鎖にしか存在が知られていないハイブリッド型糖鎖であった。さらに、この軽鎖結合糖鎖の機能を検討するために糖鎖構造の改変を試みた。その手段として、坑体を糖鎖合成変異細胞に産生させることにより、坑体の糖鎖構造を改変することにした。糖鎖合成変異細胞はこれまで数多く取得されているが、それらはほとんど細胞障害性レクチンに対する耐性を指標に選択されている。そこで、レクチンを糖鎖合成変異細胞の選択薬剤として用いた。糖鎖結合軽鎖を分泌するハイブリドーマの糖鎖合成変異株を数種、植物レクチンの一種であるコンカナバリンAに耐性な細胞の中からスクリーニングすることができた。さらに、こうして得られた変異細胞は、本来の坑体の持つ結合活性とは異なる結合活性を有する坑体を分泌していることが明らかになった。一方、培地成分の検討において、グルコース濃度を低下させたり、グルコースの代わりに他の単糖類を同濃度添加した培地でこうしたハイブリドーマを培養することにより、軽鎖に結合する糖鎖に変化が観察された。さらにこうした糖鎖の変化は、坑体の坑原認識に影響を及ぼしていた。こうした変化は元の培地成分に戻すことにより回復した。免疫グロブリン分子の軽鎖は単純ポリペプチド鎖であり、糖鎖は存在しないが、稀に可変領域にN-結合型糖鎖が結合していることが知られている。ヒト型ハイブリドーマHB4C5の産生する抗体の軽鎖にもN-結合型糖鎖が可変領域に結合しており、その糖鎖が抗原認識に関与していることを明らかにしてきた。そこで、この肺ガン特異的ヒト型モノクローナル抗体HB4C5の軽鎖に結合する糖鎖の機能を検討するために糖鎖構造の改変を試みた。その手段としてまず、糖鎖合成変異細胞による本抗体の産生を試みた。さらに、こうして得られた変異細胞は、本来の抗体の持つ結合活性とは異なる結合活性を有する抗体を分泌していることが明らかになった。続いて、細胞の培養条件検討において、グルコース濃度を低下させたり、グルコースの代わりに他の単糖類を同濃度添加した培地でこうしたハイブリドーマを培養することにより、軽鎖に結合する糖鎖に変化が観察された。さら軽鎖の糖鎖修飾における変化は、抗体の抗原認識に影響を及ぼしていた。こうした変化は元の培地成分に戻すことにより回腹した。培地成分(糖組成)が細胞の抗体糖鎖合成に影響することが判明したが、グルコースを置換した培地では、細胞の存在率が悪く長期継代培養が困難であり、増殖阻害を起こさない様な培地組成の食品成分を含めた検討が今後の検討課題であった(平成5年度)。そこで、培地中の糖源として、グルコース以外にNアセチルグルコサミンを添加し、またその存在比を調節することにより、抗体産生能及び細胞生存率を低下させることなく抗体の抗原結合活性を著しく増大させることができた。
日本における「里親支援体制の近未来像」の構築～里親・施設・行政の有機的連携～

本研究では、(1)里親を対象としたアンケート調査、(2)里親を対象としたインタビュー調査、(3)カナダ・ブリティッシュコロンビア州における里親支援体制に関するヒアリング調査の大きく3本の調査を実施した。その結果、養育受託中の里親だけでなく未委託里親への支援が課題であること、里親養育を地域に開くことが鍵であるが、里親養育を受け入れる地域をどうつくるかが鍵であること、里親レベルシステム導入の必要性等が明らかとなった。研究1年目である2013年度は、近畿圏内で登録している里親を対象に、里親支援に関するアンケート調査およびインタビュー調査を実施した(回収数319件、回収率54.5%)。まず、アンケート調査結果から「里親が今後もっと必要だと考える里親支援」として(1)里親家庭への養育支援の充実(里子の学習支援、里親の専門性向上につながる研修、レスパイトケアを利用しやすくする工夫など)、(2)児童相談所の里親支援機能強化、(3)20歳までの措置延長やアフターケアの充実を中心とした支援、(4)養子縁組後の支援や里親登録手続きの簡素化・迅速化といった里親制度そのものの改善、の4点が挙げられた。アンケート調査協力者の中からインタビュー協力者を募り、インタビュー調査を実施し、質的分析を行った。その結果、里親の成熟プロセスに影響を与える要素として(1)児童相談所等の専門機関との関わり、(2)里親同士の関わり、(3)里親の家族との関わり、(4)地域との関わり、の4つがあることが確認されるとともに、今後の改善や充実が必要な点として、以下の3点が示唆された。(1)里親に対する受容・共感的な関わりと具体的な承認・評価、(2)里親にとって複数の理解者・支援者の存在、(3)里子の子育てにおける専門的かつ具体的な支援。以上の結果を踏まえ、来年度は、里親支援機関や児童相談所が実際に行っている里親支援の内容や実施の工夫等について明らかにするとともに、里親支援機関等が考える「里親に必要なコンピテンシー」とそれを育てたり支えたりするために必要な方策等について検証する予定である。平成26年度は、8月から産休・育休を取得したため、4月から7月までの4か月間のみ研究をおこなった。まず、平成25年度に実施した里親を対象としたアンケート調査研究の報告書を作成した。アンケート調査結果から、里親種別ごとに支援ニーズが異なること、里親支援機関ごとに求める役割が異なること等が明らかとなった。里親支援のあり方について検証するため、以下の2つのインタビュー調査を実施した。1)里親支援機関職員を対象とした「里親のコンピテンシー」に関するインタビュー調査この調査では、日頃里親支援を行っている機関職員を対象に「里親に求めるコンピテンシー(資質や能力など)は何か」について尋ねるインタビュー調査を実施した。その結果、里親として「子どもとしっかり向き合う力や動機づけ」のほか「困った時にsosを出せる力」「他の人からの助言や支援を受け入れることのできる力」が里親には必要だと考えられていることが明らかになった。里親は我が家でわが子として要養護児童を養育するため、里親だけで問題解決しようとするなど、里子の養育を抱え込みすぎる傾向にあるという。しかし、里親養育は「社会」的養護を担うものであり、里親家庭だけで個人的に抱え込むべきものではなく、里子を養育するプロセスにおける悩みや喜びを含め、広く地域社会と共有・協働していく必要があると考えられていた。2)里親を対象とした「必要とする里親支援」に関するインタビュー調査この調査では、里子を養育している里親を対象に、里子養育にあたっての支援ニーズや各支援機関に期待すること等についてインタビューを実施した。その結果、発達障害や知的障害などかなり養育が難しい子どもの委託が増えているため、専門的な助言指導を求める里親が多いことが明らかになった。また、里親の中には「相談しづらさ」を抱えている里親が多いため、相談しやすい環境づくりの必要性も指摘された。これらの調査結果を踏まえ、里親のニーズにあった支援のあり方について次年度以降、海外の動向も踏まえながら考究していきたいと考える。2014(平成26)年度に産休・育休を取得したため、当初の研究計画よりも若干遅れている。上記3つの調査結果から、主に以下の内容が明らかになった。(1)里親認定前研修の時間数は日本とBC州とでほとんど変わらないが、認定後、養育委託後の義務研修数については、カナダBC州は日本よりも倍以上多いこと、(2)里親レベルシステムが導入されている。里親自身の希望、里親としての経験等からレベル分けされており、レベルに応じた里子が委託されることになっている。これによって的確なマッチングや、不調ケースの回避を目指しているとのことである、(3)里親家庭で育った子どもは27歳くらいまで行政の支援を受けることができる。それ以降は、社会的養護のもとで暮らす子どもの支援者として活動することが期待されており、持続可能で息の長い「当事者支援ネットワーク」をカナダ全域で展開できるよう行政がバックアップしている。これらの結果を踏まえ、里親アセスメントツールの開発や里親レベルシステムの提案、委託解除後の支援ネットワーク構築等の提案を行っていきたいと考える。平成26年度に産休・育休を取得したため、前年度までの段階では当初の計画よりも遅れていたが、平成28年度、カナダ視察を予定通り実施できたことに加え、日本においても里親へのグループインタビュー等を実施することができ、最終年度である平成29年度に、日本における里親支援体制の構築のあり方や、里親ソーシャルワークの体系化に向けた一定の提言をするために必要な情報やデータを十分に入手することができたため。

最終年度である平成29年度は、里親を対象としたインタビュー調査、施設の里親支援専門相談員を対象としたインタビュー調査を実施するとともに、これまでの研究成果の総括を行った。里親を対象としたインタビュー調査からは、本来であれば専門里親に委託されるべきである発達障害や知的障害のある子どもが、専門里親不足によって養育里親に委託されているケースが少なからずある実態、共働きの里親世帯が増える中で、これまでとは異なる支援ニーズが発生している現状、里子の実親と直接交渉している里親が一定数いる実態等が明らかになった。これらの実態を踏まえ、里親養育マニュアルやガイドラインを見直すとともに、里親類型を見直す必要性があるといえよう。里親支援専門相談員へのインタビュー調査からは、訪問支援活動における困難、里親支援専門相談員としての業務内容の体系化・確立とそれにみあった専門性を習得できるような研修の必要性等が指摘された。また、里親支援専門相談員を専任配置していない施設も見受けられ、施設長など施設側の理解を促進するような取り組みも求められている。4年間の調査研究を通して、日本における里親支援体制を構築していくにあたって、適切な里親子マッチング・アセスメントを行うために、里親類型の細分化と視覚化(里親レベルシステムの導入を含む)、委託後の相談支援の頻度の標準化、里子からの相談を受け付けるシステムの確立等の必要性が示唆された。本研究では、(1)里親を対象としたアンケート調査、(2)里親を対象としたインタビュー調査、(3)カナダ・ブリティッシュコロンビア州における里親支援体制に関するヒアリング調査の大きく3本の調査を実施した。その結果、養育受託中の里親だけでなく未委託里親への支援が課題であること、里親養育を地域に開くことが鍵であるが、里親養育を受け入れる地域をどうつくるかが鍵であること、里親レベルシステム導入の必要性等が明らかとなった。里親を対象としたアンケート調査に加え、インタビュー調査も実施できている。1)まず、前年度までの日本国内での先行研究レビューおよび里親を対象としたアンケート調査・インタビュー調査、里親支援機関職員を対象としたインタビュー調査結果をまとめる形で、「日本における里親支援の現状と課題」について一定のまとめをしたい。2)その上で、里親支援の先進国ともいえるカナダにおける里親支援の実態について視察調査およびインタビュー調査を実施し、日本との共通点と相違点、カナダ方式の里親支援を日本に導入できる可能性等について検証したいと考える。平成29年度は以下の研究課題に取り組む予定である。(1)日本における里親ソーシャルワークの体系化に向けた論点整理(2)里親子マッチング時に活用できる「アセスメントシート」の開発(3)里親委託フェーズごとの支援ニーズやソーシャルワーク展開過程の考察社会福祉学平成27年度は、昨年度までに実施した里親を対象としたアンケート調査とインタビュー調査のさらなる分析・検証を行う。さらに、里親支援機関職員を対象に「里親に求めるコンピテンシー」に関するインタビュー調査を実施する。
白亜紀維管束植物と共生生物群の多様性に関する研究

平成14年度は北海道で野外採集調査をおこない、植物破片を含むノジュールを多数採集した。資料には、今回直ちに利用できるようなものは含まれていなかったので、既存の裸子植物結実器官とみられる標本の同定作業と、菌類や節足動物の探索をおこなった。その結果、菌類や節足動物は発見できなかったが、結実器官自体が裸子植物の新たな綱に同定できる特殊なものであるとわかった。裸子植物の新綱を設立し、新種として記載予定である。また、北海道の採集家が小平町で採集した、木生シダの根茎が、ヘゴ科のDicksonia属に近縁であることを明らかにした。新種として記載する予定である。前年度に引き続き、日本の白亜系鉱化化石産地のうち、熊本県御所浦層群、群馬県瀬林層群、岩手県久慈層群、種市層群、北海道蝦夷層群産の植物化石について、菌類の探索をおこなった。その結果、分解途中とみられる組織内に腐朽菌が広くみられ、白亜紀には腐朽菌が十分に生態系の中で働いていたことがわかった。さらに、VA菌根菌が白亜紀独特の木生シダTempskyaの根茎を覆う不定根の皮層に限って良く発達していることが明らかとなった。同じような生活形をとるヘゴ科の根茎化石についてもVA菌根菌の探索を行ったが、存在は確認できなかった。これは、Tempskyaが特異的にVA菌根菌を利用して栄養摂取していることを示唆しており、このシダ植物とVA菌根菌との密接な共生関係を示すといえる。Tempskyaは白亜紀で絶滅するが、その原因として共生関係の崩壊が推定できる。節足動物については北海道産の化石で探索を行い、裸子植物の結実器官内に1種、直径約2cmの針葉樹の枝に形成された中えいの組織内に2種の節足動物化石がみつかった。前者はチャタテムシとの類縁が、後者のうち一つはハネカクシ類との類似が明らかになった。昆虫による様々な植物組織の利用形態が明らかになった。2001年度は熊本県に分布する御所浦層群と岩手県種市町に分布する種市層群について白亜紀珪化植物化石の収集を行うとともに、既存の資料中から菌類および、動物の探索を行った。御所浦層群からは珪化樹幹を、種市層群からは珪化樹幹とシダ植物根茎とみられる化石を採集した。御所浦層群からは未発表の、種市層群からはすでに白亜紀独特の木生シダTempskyaの根茎がみつかっており、Tempskya根茎には世界的にarbuscular菌が知られているので、特にこの地域での調査を行った。種市層群産の既存のTempskya根茎は、新種とわかり、Tempskya uemurae H.Nishida(2001)として記載したが、この根茎中にも多量の菌類がみられた。これらの菌類について、属性、生活史などを明らかにしつつある。また、X線CTスキャナの有用性について2件の学会発表と短報(西田2001)で報告した。動物化石については、北海道産の炭酸塩ノジュール内植物化石について主に探索している。新しい試みとして、新開発のX線CTスキャナーによる動物本体及び生痕の発見を試みた。その結果、生痕、昆虫とみられる映像を得ることができたが、今後切片で確認する必要がある。

既存の裸子植物結実器官からは、切片内に節足動物化石を発見した。この動物は、長い触角を持ちながら5対の足と強靭な口器をもつ。このため既存の分類群にはあてはまらず、最も近縁と考えられる昆虫類と多足類の中間的形態を持った新分類群である可能性があり、検討を続けている。結実器官内に穴を掘って生息するが、体長より長い触角、長い脚を持つことから、結実器官内を移動する草食性動物とは考えられず、強靭な顎の構造からは、結実器官をすみかとして利用する肉食動物である可能性がある。2002年度は上記の資料についてさらに検討することで、白亜紀の植物組織を中心とした生態系の一部を動的に明らかにしたい。平成14年度は北海道で野外採集調査をおこない、植物破片を含むノジュールを多数採集した。資料には、今回直ちに利用できるようなものは含まれていなかったので、既存の裸子植物結実器官とみられる標本の同定作業と、菌類や節足動物の探索をおこなった。その結果、菌類や節足動物は発見できなかったが、結実器官自体が裸子植物の新たな綱に同定できる特殊なものであるとわかった。裸子植物の新綱を設立し、新種として記載予定である。また、北海道の採集家が小平町で採集した、木生シダの根茎が、ヘゴ科のDicksonia属に近縁であることを明らかにした。新種として記載する予定である。前年度に引き続き、日本の白亜系鉱化化石産地のうち、熊本県御所浦層群、群馬県瀬林層群、岩手県久慈層群、種市層群、北海道蝦夷層群産の植物化石について、菌類の探索をおこなった。その結果、分解途中とみられる組織内に腐朽菌が広くみられ、白亜紀には腐朽菌が十分に生態系の中で働いていたことがわかった。さらに、VA菌根菌が白亜紀独特の木生シダTempskyaの根茎を覆う不定根の皮層に限って良く発達していることが明らかとなった。同じような生活形をとるヘゴ科の根茎化石についてもVA菌根菌の探索を行ったが、存在は確認できなかった。これは、Tempskyaが特異的にVA菌根菌を利用して栄養摂取していることを示唆しており、このシダ植物とVA菌根菌との密接な共生関係を示すといえる。Tempskyaは白亜紀で絶滅するが、その原因として共生関係の崩壊が推定できる。節足動物については北海道産の化石で探索を行い、裸子植物の結実器官内に1種、直径約2cmの針葉樹の枝に形成された中えいの組織内に2種の節足動物化石がみつかった。前者はチャタテムシとの類縁が、後者のうち一つはハネカクシ類との類似が明らかになった。昆虫による様々な植物組織の利用形態が明らかになった。成果の一部は2002年8月の第4回日本進化学会シンポジウムで講演した。
RNAウイルスのゲノム複製に関与する宿主因子の同定

本研究では、タバコモザイクウイルス(TMV)の1細胞内での増殖をサポートするシロイヌナズナTOM1およびTOM2遺伝子の同定と遺伝子産物の機能解析を行った。ポジショナルクローニングにより、TOM1は291アミノ酸からなる7回膜貫通蛋白質と予想されるポリペプチドをコードすることを明らかにした。また、tom2変異株の解析からTMVの増殖抑制形質の原因遺伝子として独立な2つの遺伝子、TOM2AおよびTOM2Bを同定した。TOM2A遺伝子は280アミノ酸からなる4回膜貫通蛋白質と予想されるポリペプチドを、TOM2B遺伝子は122アミノ酸からなるポリペプチドをコードをコードしていた。TOM1,TOM2A,TOM2B蛋白質がいかにしてTMVの増殖を正に制御するかを知る目的で、これらがTMVゲノムにコードされた蛋白質と相互作用するかをSos recruitment assayにより検討したところ、RNA複製に関与するTMV130k蛋白質のヘリカーゼドメインとTOM1が相互作用することが示唆された。TMVを含め、知られる限り全ての高等真核生物プラス鎖RNAウイルスは細胞内の膜に結合した複合体で複製するが、TMVにコードされた複製蛋白質が膜に局在する機構は明らかでなかった。上記の結果から、TOM1がTMVの複製複合体の一部をなし、単独では膜結合性を欠くTMVの複製蛋白質を膜に繋ぎ止める役割を担う可能性が考えられた。また、tom1変異が遺伝子産物の活性をほぼゼロにするような変異であったにもかかわらず、TMVの増殖はゼロにはならなかった。本研究では、tom1変異株においてTMV増殖をサポートする残存活性が、シロイヌナズナゲノム上に存在するTOM1類似遺伝子TOM3に起因すること、従って、TOM1/TOM3の機能がTMVの複製に必須であることも明らかにした。タバコモザイクウイルス(TMV)の増殖の分子機構を解明するために、TMVの増殖に関与する宿主因子の同定をシロイヌナズナを用いた宿主遺伝学により試みた。本年度は、TMVの1細胞内での増殖を低レベルに抑制するシロイヌナズナtom1あるいはtom2変異に対応する野生型遺伝子の同定を行った。TOM1遺伝子座のファインマッピングを約3800株のF2植物を用いて行い、TOM1遺伝子座の存在しうる範囲を約22kbpにまで狭めた。この領域をカバーするゲノミックDNA断片でtom1変異株を形質転換し、変異が相補されることを示した。さらに、最小相補領域に存在する転写単位をcDNAクローニングとシークエンシングにより同定した。結果としてTOM1は複数回膜貫通型内在性膜蛋白質をコードすることが明らかになった。TOM2遺伝子座については、変異が第1染色体上の約20kbpの欠失によることを見いだし、その領域に対応するゲノミックシークエンスを決定した。その中には複数の転写単位が存在したので、そのうちどれがTOM2に対応するかを明らかにするために欠失領域に対応する種々のゲノミックDNA断片でtom2変異株を形質転換し、約9kbpのDNA断片が変異の相補能をもつことを見いだした。来年度に予定している試験管内TMV RNA複製系の構築の準備として、TMV(Cg株)の複製に関与するウイルス側蛋白質に対する抗体を作製した。1、tom2変異を相補するDNA断片を同定する実験を行い、tom2変異がTOM2A,TOM2Bと命名した独立の2遺伝子の欠損によることを明らかにした。cDNAクローニングの結果、TOM2Aは4回膜貫通蛋白質と予想される産物をコードしていることが明らかになった。現在変異の相補を指標にTOM2B遺伝子の同定を急いでいる。

2、TOM1,TOM2A蛋白質の細胞内局在性を決定するため、あるいはそれらの機能を解明するために、それらに対する抗体を作製した。先ず、各蛋白質の全長を大腸菌内で発現させることを試みたが、不成功であった。そこで、各遺伝子の部分断片の発現を試み、TOM2AのC末端側約100アミノ酸に対応するポリペプチドの発現に成功した。さらに、これに対する抗体を作製し、現在植物におけるTOM2A遺伝子産物の検出を試みている。TOM1に関しては、そのC末端16アミノ酸に対応する合成ペプチドに対する抗体を作製した。合成ペプチドに対する抗体価はあがったが、植物においてTOM1の存在を示すことはできていない。3、植物におけるTOM1,TOM2Aの機能を明らかにすることを目的に、カリフラワーモザイクウイルス35SRNAプロモーター下流にTOM1,TOM2A遺伝子のコード領域を挿入した遺伝子カセットを野生型植物に導入した。現在、それぞれについて過剰発現が起きた植物、コサプレッションにより発現抑制が起きた植物を検索している。我々はウイルスの増殖に関与する宿主因子を同定するためにタバコモザイクウイルス(TMV)に耐性を示すシロイヌナズナ変異株tom1およびtom2を単離し、これらに対応する野生型遺伝子TOM1,TOM2Aの産物が1細胞内でのTMV RNA複製を担う因子である可能性が高いことを示した。さらに、去る2年間の本研究によりTOM1遺伝子とTOM2A遺伝子のクローン化と構造解明に成功し、それらが複数回膜貫通型内在性膜蛋白質をコードすることを明らかにした。本年度は、残るもう一つの遺伝子TOM2Bの同定と、これら宿主因子がTMV RNA複製において、あるいはシロイヌナズナ自身において果たす役割を解明することを目指した。tom2変異を相補するDNA領域の検索によりTOM2B遺伝子の大まかな位置は既にわかっていたので、その領域内に位置する転写単位をcDNAクローニングし、TOM2B遺伝子が123アミノ酸からなるポリペプチドをコードすることを明らかにした。本意電子産物のアミノ酸配列は他の機能既知蛋白質との類似性あるいは機能を推測できるような著しい特徴をもたなかった。また、TMV感染植物から抽出したTMVRNA-dependent RNA polymerase画分にTOM1およびTOM2A蛋白質とTMV130k蛋白質が共存するという予備的結果を得た。これは、TOM1およびTOM2A蛋白質がTMVの複製複合体に含まれる可能性を支持する。さらに、TOM1の出芽酵母における機能的ホモログ遺伝子を取得する目的で、その生育がTOM1の発現に依存的になった変異株を検索し、候補株を得た。