hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
嚢胞性肺疾患家系のリンケージ解析

現在まで、気胸の発症と遺伝子・染色体異常の関連に関する報告はほとんど見られていないが、複数の家系において、家族内気胸発症歴を有する気胸症例の存在を明らかにすることができた。これを踏まえ、気胸の発症と遺伝子・染色体異常の関連を明らかにする目的で、家族内気胸発症歴を有する家系のDNAを用いて本研究を行った。主として家族内気胸発症歴を有する家系からの採血およびDNA抽出と遺伝形式の解析を行った。現在まで、5家系に同意の上での採血が可能であった。これら症例については、さらにDNAの抽出を終了した。気胸の発症と遺伝形式の関係を検討する目的で行った5家系における遺伝様式の検討では、家系内の約半数の人間において気胸が発症していた。詳細な既往歴の聴取および遺伝形式の検討からは、本疾患は常染色体優性遺伝形式をとる単一遺伝子による疾患と推定された。また、本疾患の発症には、喫煙は関与していなかった。その一方で、切除肺の表面には、著明な炭粉沈着と気腫性変化がみられ、本疾患発症の一因となっていると思われた。これを踏まえ、気胸の発症と遺伝子・染色体異常の関連を明らかにする目的で、家族内気胸発症歴を有する家系のDNAを用いて本研究を行っている。研究の初年度にあたる本年度には、主として家族内気胸発症歴を有する家系からの採血およびDNA抽出と遺伝形式の解析を行った。気胸の発症と遺伝形式の関係を検討する目的で行った5家系における家系図の検討では、家系内の約半数の人間において気胸が発症していた。現在、さらに別家系の気胸発症家系の集積を行うとともに、本症の発生に関与する染色体部位を決定する目的でリンケージ解析による解析を行っている。同時に気管支および肺で発現・機能し、活性酸素の代謝に関与すると推定される複数の遺伝子における突然変異の有無についての解析を行っている。さらに、遺伝歴の明らかでない気胸発症症例からも採血を行い、非遺伝性で散発性に発症する気胸症例においても同様の検討を平行して行っている。
安定な芳香族置換ニトロキシド類を用いた高Tc磁性体や磁性導体の開発

本研究は、高い転移温度を有する分子性磁性体や、磁性と関連した複合材料の開発が主眼である。芳香族置換基を有するニトロキシドラジカルを、有機ラジカル系強磁性体の構築のために用いた。また、複素芳香族置換基を遷移金属錯体の配位子として用いた。純粋な有機化合物からなる磁性体の構築のために、ジフェニルニトロキシドラジカル類の磁性体への応用を検討したところ、分子間で強磁性的相互作用を与える系が比較的多いことがわかった。そのような背景からスピロビアクリジン-N,N'-ジオキシルを設計し、合成した。ピリミジン架橋(PM)を用いた錯体の分子性磁性体の開発を進めた。アニオンにも磁気カップラーとして機能させる目的で、π共役系1価アニオンであるN(CN)_2^-を導入した。PM・M[N(CN)_2]_2(M=Fe,Co,Ni)の結晶構造は同形であり、磁気測定によれば、転移温度はそれぞれ3.2,1.8,8.4Kであった。前の二者は弱強磁性挙動を示した。ラジカル置換基としてニトロニルニトロキシド(NN)を選び、それを4位あるいは5位に有するPM架橋の利用を検討した。[4PMNN・CuX_2]_6(X=Cl,Br)は、12スピン系大員環状の分子構造を有し、結晶中ではカラムを形成する。チューブ状空間にゲスト分子を取り込ませたところ、強磁性的相互作用が増大した。すなわち、分子磁性をホスト-ゲスト化学などにより超分子的に制御する可能性が示された。複素環としてピラジンを用いたもののなかにも、磁気的に興味深い物質が得られた。
RNA結合タンパク質による減数分裂制御機構

本研究では、生殖細胞の形成に不可欠なプロセスである減数分裂を制御する分子機構を明らかにすることを目標とし、分裂酵母の減数分裂制御において重要な役割を果たす三つのRNA結合タンパク質Mei2、Mmi1、Spo5の機能解析を進めている。Mei2は、減数分裂開始のスイッチとしての役割と、減数分裂の進行に欠かせない機能を有するタンパク質である。Mmi1は、減数分裂期に発現する転写産物の分解を誘導すると同時に、減数分裂遺伝子の条件的なヘテロクロマチン化に関与することなどが分かっている。Spo5についても、減数分裂の進行において重要な働きをしていることが示されている。しかし、三者の具体的な機能には、多くの謎が残されている。本研究では、これらRNA結合タンパク質の機能の詳細を明らかにし、減数分裂の制御系を分子レベルで理解することを目指す。これまでの研究から、Mmi1が核内で点状構造体を形成することが、減数分裂転写産物の分解に重要なことが示されていた。転写産物分解の担い手であるRNA分解複合体exosomeもまた、Mmi1点状構造体に局在することが示されていた。30年度の解析から、exosomeとMmi1の相互作用に必要な因子を、Mmi1関連因子の中から特定することができた。Mmi1はN末端側の領域で自己相互作用することで、点状構造体を形成することが示されていた。大腸菌を利用して野生型、自己相互作用領域を欠く変異型などのMmi1タンパク質の精製を行った。精製タンパク質を用いたin vitroでの解析を現在進めている。Mei2による減数分裂開始機構を明らかにするため、Mei2タンパク質を分裂酵母細胞より精製し、同時に精製されるRNAの特定を進めた。Mei2結合RNAの候補が複数得られ、現在それらの解析を進めている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、減数分裂を制御する分子機構を明らかにすることを目標とし、分裂酵母の減数分裂制御において重要な役割を果たす三つのRNA結合タンパク質Mei2、Mmi1、Spo5の機能解析を進めている。Mei2は、減数分裂開始のスイッチとしての役割と、減数分裂の進行に不可欠な役割を果たすタンパク質である。Mmi1は、減数分裂期に発現するRNAの分解を誘導すると同時に、減数分裂遺伝子の条件的なヘテロクロマチン化に関与することが示されている。しかし、三者の果たす役割については、多くの謎が残されている。本研究では、これらRNA結合タンパク質の機能の解明を通じて、減数分裂の制御系の詳細に迫る。Mei2と結合しているRNAを明らかにするための条件検討を進めた。Mei2を減数分裂期の分裂酵母より精製し、同時に得られるRNAを単離するため、非常に不安定なタンパク質であるMei2を効率よく精製する系の確立を進めた。Mmi1が、様々なレベルで遺伝子発現制御に関わるCcr4/Not複合体を呼び込むことで、標的遺伝子のヘテロクロマン形成を促進していることを明らかにした。また、Mmi1の標的因子の解析を進め、細胞質ダイニンの制御因子ダイナクチン複合体のサブユニットを複数同定し、それらがダイニンの局在制御、活性制御で果たす役割を明らかにした。Mmi1によるRNA分解誘導についてより詳細な解析を行うため、標的RNAの細胞内での挙動を観察する系を立ち上げた。一分子FISH法を導入し、標的RNAの局在観察を行った。同時に、蛍光タンパク質を用いて、生細胞内でMmi1標的RNAの局在を観察できる株の作製を進めた。これらの手法を応用し、Mmi1標的RNAの細胞内での挙動を観察していく予定である。Mei2と遺伝学的に関連する因子の解析に関しては、遺伝子破壊株の作製、発現解析などを行ったが、Mei2の発現制御に関わることが期待される因子が得られたのみで、Mei2の機能に迫る情報は今のところ得られていない状況にある。今後、Mei2の発現制御に関わる可能性がある因子の解析を行うとともに、その他の因子群について、解析を進めていく予定である。Mei2と相互作用するRNAの探索については、非常に不安定なタンパク質であるMei2を大量精製する系を見出すことができた。この系を用いてRNAの同定を進めたい。Mmi1については、標的RNAの局在を観察する系が構築できたので、今後各種関連変異体を用いて解析を進めることで、新たな知見が得られると期待される。また、Mmi1とCcr4/Not複合体との予期せぬつながりを示すことができた。さらに、Mmi1の標的を解析することで、減数分裂期の細胞骨格制御に関わる重要な因子を新たに同定することが出来た。本年度は、Mei2とMmi1の解析に重点を置いたため、Spo5の解析については来年度以降に繰り越した。本研究では、生殖細胞形成に欠かせない減数分裂を制御する分子機構を明らかにすることを目標とし、分裂酵母の減数分裂制御において重要な役割を果たす三つのRNA結合タンパク質Mei2、Mmi1、Spo5の機能解析を進めている。

しかし、三者の果たす役割については、多くの謎が残されている。本研究では、これらRNA結合タンパク質の機能の解明を通じて、減数分裂の制御系の詳細に迫る。Mmi1が誘導する減数分裂転写産物の選択的な分解について詳細に解析するため、一分子FISHと蛍光タンパク質を利用した生細胞観察を行って、Mmi1の標的RNAの細胞内局在を観察した。野生型株とMmi1関連因子の変異体を用いて実験を行った結果、Mmi1がRNA分解誘導とヘテロクロマチン形成促進に加えて、標的転写産物の核外排出を阻害して翻訳を抑制することで、減数分裂の遺伝子の発現を抑え込んでいることを示すデータを得た。また、Mmi1がN末端側の領域で自己相互作用しており、その領域がMmi1の機能に重要であることを明らかにした。Mmi1の自己相互作用と、RNA分解誘導や翻訳抑制との関係について、解析を継続している。異所的に減数分裂を開始してしまい増殖不能となる活性化型のMei2変異が、細胞周期制御因子の変異によって抑圧されるという予備的な結果が得られた。この結果を詳細に検討し、Mei2の減数分裂誘導活性と細胞周期制御の関係に着目して解析を行う予定である。当初予想していなかった新たな発見もあり、本年度は本研究課題の解析対象である三つのRNA結合タンパク質のうち、Mmi1の解析に重点を置いたため、Mei2とSpo5の解析については予定した研究計画を次年度以降に繰り越すことになった。しかしながら本年度は、Mmi1が標的RNAの局在制御を介して、翻訳のレベルで減数分裂遺伝子の発現を抑制しているという新たな知見を得ることができた。今後解析を進めることで、減数分裂遺伝子の発現制御についての理解が一層深まると期待される。また、Mmi1が誘導するRNA分解に関連する因子群についても、変異体を用いた解析等を行った。今回明らかとなった翻訳抑制との関わりを含め、これらの因子群の働きを明らかにしていく予定である。Mei2に関しては、本年度の遺伝学的な解析によって、減数分裂誘導活性と細胞周期制御因子との関わりが浮かび上がってきた。この結果を足がかりとして、次年度以降結合しているRNAの探索を中心とした解析を組み合わせていくことで、未だ実体の分からないMei2の減数分裂誘導活性を明らかにしていくことができると期待される。本研究では、生殖細胞の形成に必須のプロセスである減数分裂を制御する分子機構を明らかにすることを目標とし、分裂酵母の減数分裂制御において重要な役割を果たす三つのRNA結合タンパク質Mei2、Mmi1、Spo5の機能解析を進めている。Mei2は、減数分裂開始のスイッチとしての役割と、減数分裂の進行に不可欠な役割を果たすタンパク質である。Mmi1は、減数分裂期に発現するRNAの分解を誘導すると同時に、減数分裂遺伝子の条件的なヘテロクロマチン化に関与することが示されている。Spo5についても、減数分裂の進行において重要な働きをしていることが示されている。しかし、三者の具体的な機能には、多くの謎が残されている。本研究では、これらRNA結合タンパク質の機能の詳細を明らかにし、減数分裂の制御系を分子レベルで理解することを目指す。
磁場を利用した材料プロセス制御に関する研究

本研究では、磁場による、弱磁性物質を中心とした材料プロセスの制御に関して、物質流れの可視化や、組織形成のその場観察を行うことにより、基礎的な知見を集積し、体系化することを目的とする研究を実施した。平成18年度は、前年度に開発した高磁場中現象その場観察システムを用いた材料プロセスの可視化により。この検討を行なった。シャドウグラフ法による流体の流れの可視化では、水のベナール対流を対象として、印加する磁気力の方向に依存して、熱対流の開始が促進・抑制されることを確認した。また、水の磁化率の温度依存性により、熱対流の促進・抑制挙動が異なることを見出した。これらの結果から、広い温度領域で磁気力による水の熱対流制御を体系的に理解することに成功した。また、サブミクロンの分解能で強磁場中現象のその場観察を実現する強磁場中レーザースキャン顕微鏡システムは、現時点で、磁場中において光学的可視化により得られる最高の分解能である。これを用いて、いくつかのセラミックスファイバーの配向過程のその場観察から、磁気的異方性による磁場配向現象の解析を行なった。その結果、媒体粘度やファイバー長をパラメータとして、統一的に磁場配向現象の記述が可能であることを明らかにした。以上のように、本研究では、いくつかの方法で、磁場中現象の可視化を可能にし、弱磁性物質の物質流や材料プロセスの磁場制御に関する知見を得ることが出来た。これらの知見は、今後の材料プロセスへの磁場利用において有益な情報となると期待される。平成17年度は、高磁場中材料プロセス可視化システムの開発、それを用いた材料プロセスの高磁場中その場観察を実施した。流体の流れを可視化する方法として、シャドウグラフ法を採用し、水のベナール対流に対する磁場効果を可視化により評価することに成功した。印加する磁気力の方向に依存して、水の熱対流の開始が促進・抑制されることを見出した。また、共焦点レーザースキャン顕微鏡を10T程度の強磁場中で使用できるアタッチメントの使用により、磁場方向と平行な方向から、2次元の試料を観測することを可能にした。この観測系の分解能を評価するため、833nm幅のラインとブランクが交互に並ぶテストパターンの観測を行なったところ、明瞭に分解して観測することができた。これは、現時点で、磁場中において光学的可視化により得られる最高の分解能である。さらに、これを用いて、銀の無電解析出における析出結晶の形態に対する磁場効果の機構を評価した。銀の無電解析出では、通常、形成される樹枝状の結晶形態が、疎で長さの異なるパターンとなるが、磁場中では密で長さの揃った形態へ劇的に変化する。成長末端の直接その場観察の結果から、ある程度の長さまで樹枝が成長した後に、急激に樹枝のある長さが一体となって屈曲する様子が観測された。この結果から、銀が無電解析出する際の電子の授受に伴い、樹枝中を流れる電流によって、樹枝にローレンツ力が作用したことが原因となって、劇的な形態変化が観測されたことが明らかとなった。以上のように、2通りの方法で、磁場中現象の可視化を可能にし、材料プロセスへの磁場影響評価に利用することができた。この検討を行なった。
微生物を含むリキッドマーブルを気相中マイクロリアクターとする生体ファイバーの合成

本研究は、微小なリキッドマーブル集合体を好気性微生物用のマイクロリアクターとして利用した新規のバクテリアナノファイバー生産システムの構築を目指している。そこで、2018年度は以下の項目について研究を実施した。1)リキッドマーブル(LM)を形成するモデル固体粒子として、これまで申請者が固体粒子エマルションの形成で実績のあるステアリン酸塩マイクロ粒子を用い、リキッドマーブルの調製条件について実験的に検討した。モデル粒子としてステアリン酸カルシウムマイクロ粒子を用い、マイクロ粒子ベッドに水溶液を滴下することによりLMの調製に成功した。また、滴下コア液容量と形成されるLMのサイズの関係を調べたところ、滴下容量の増加とともにLM高さは増加するが、その後、一定となり最大高さが存在することを見出した。2)さらに調製したLM単体の物性について調べた。LMの機械的強度はそのままでは脆弱であるが、コア液に生体ポリマーを導入することによりその強度が高められることを明らかにした。また、定温定湿度条件下でLMの重量変化を測定し、LMの乾燥速度を算出した。本データからLMの乾燥速度曲線を求めたところ、典型的な湿潤粉体の乾燥速度曲線が得られ、LM表面の粉体層から水分が連続的に蒸発していることがわかった。さらに、コア液に含まれる成分(塩など)によって乾燥速度に違いが見られ、適切なコア液成分を選択することによってLMからの蒸発徐放制御が可能であることを明らかにした。これらはLMの乾燥挙動についての初めての報告例であり、LMをマイクロリアクターとして利用する際の重要な知見である。3)モデル好気性微生物として酢酸菌に着目し、既往の研究からバクテリアナノファイバーの産生能が高いと予想される複数の由来菌株の選定を行った。2018年度では、上述の概要に示すように、成果として1)ステアリン酸カルシウムマイクロ粒子を用い、マイクロ粒子ベッドに水溶液を滴下することによりリキッドマーブル(LM)の調製に成功した。また、滴下コア液容量と形成されるLMのサイズの関係を調べ、LMの最大高さが存在することを見出した。LMのコア液に生体ポリマーを導入することによりLMの機械的強度が高められることを明らかにした。LMの乾燥速度曲線は典型的な湿潤粉体の乾燥速度曲線となり、LM表面の粉体層から水分が連続的に蒸発していることがわかった。また、コア液に含まれる成分(塩など)によって乾燥速度に違いが見られ、適切なコア液成分を選択することによってLMからの蒸発徐放制御が可能であることを明らかにした。このようにほぼ当初計画通りの成果が得られており、おおむね順調に進展している。前年度に引き続き、微小なリキッドマーブル(LM)集合体を好気性微生物用のマイクロリアクターとして利用した新規のバクテリアナノファイバー生産システムの構築を目指す。具体的には、(1)前年度に引き続き生体ポリマー導入によるLMの機械的強度の向上について調べるとともに、LMからの蒸発徐放挙動についてより詳細な知見を得る。また、LMコア液の溶存酸素濃度の測定方法の確立を目指す。(2)バクテリアナノファイバーを産生するモデル好気性微生物として着目した酢酸菌について、選定した菌株を入手し、その培養条件、バクテリアナノファイバー産生条件の探索を行う。(3)バクテリアナノファイバー生産を目的とした気相中リキッドマーブルロータリー培養システムを作製する。これらの知見を基に、新規バクテリアナノファイバー生産システムの構築を目指す。

2018年度では、上述の概要に示すように、成果として1)ステアリン酸カルシウムマイクロ粒子を用い、マイクロ粒子ベッドに水溶液を滴下することによりリキッドマーブル(LM)の調製に成功した。また、滴下コア液容量と形成されるLMのサイズの関係を調べ、LMの最大高さが存在することを見出した。2)さらに調製したLM単体の物性について調べた。LMのコア液に生体ポリマーを導入することによりLMの機械的強度が高められることを明らかにした。また、定温定湿度条件下でLMの重量変化を測定し、LMの乾燥速度を算出した。LMの乾燥速度曲線は典型的な湿潤粉体の乾燥速度曲線となり、LM表面の粉体層から水分が連続的に蒸発していることがわかった。また、コア液に含まれる成分(塩など)によって乾燥速度に違いが見られ、適切なコア液成分を選択することによってLMからの蒸発徐放制御が可能であることを明らかにした。3)モデル好気性微生物として酢酸菌に着目し、既往の研究からバクテリアナノファイバーの産生能が高いと予想される複数の由来菌株の選定を行った。このようにほぼ当初計画通りの成果が得られており、おおむね順調に進展している。前年度に引き続き、微小なリキッドマーブル(LM)集合体を好気性微生物用のマイクロリアクターとして利用した新規のバクテリアナノファイバー生産システムの構築を目指す。具体的には、(1)前年度に引き続き生体ポリマー導入によるLMの機械的強度の向上について調べるとともに、LMからの蒸発徐放挙動についてより詳細な知見を得る。また、LMコア液の溶存酸素濃度の測定方法の確立を目指す。(2)バクテリアナノファイバーを産生するモデル好気性微生物として着目した酢酸菌について、選定した菌株を入手し、その培養条件、バクテリアナノファイバー産生条件の探索を行う。(3)バクテリアナノファイバー生産を目的とした気相中リキッドマーブルロータリー培養システムを作製する。これらの知見を基に、新規バクテリアナノファイバー生産システムの構築を目指す。
血管内皮・平滑筋細胞の相互作用による潜在型TGFーβ活性化の機序解明

本研究は内皮細胞と平滑筋細胞の混合培養系を用いて潜在型TGFーβ(LTGFーβ)の活性化におけるTGFーβ越合蛋白質(LAP:latency associated protein及びLTBP:latent TGF-βbinding protein)の役割を明かにすることを目標とした。LTGF-βの活性化の判定は以前報告した方法に準じて、平滑筋細胞による内皮細胞遊走阻害作用を指標にした。まずLTGFーβからTGFーβを除去し得られたLAPとLTBPとのcomplexに対するpolyclonal抗体(抗MP抗体)を作成し、平滑筋細胞の内皮細胞遊走阻害に対する効果を検討したところ、抗MP抗体は遊走阻害効果を中和することが確認された。そこで次にLAPとLTBPのcomplexに対するmonoclonal抗体を作成した。得られた10個のclone(KM698KM707)について今回購入したマイクロプレ-トリ-ダ-を用いて解析した結果、KM698、702、704、707はLAP部分を、またKM699、700、701、703、705、706はLTBP部分を認識することが明かとなっている。そこでこれらのmonoclonal抗体について平滑筋細胞の内皮細胞遊走阻害に対する効果を検討したところKM704のみで遊走阻害効果が中和されることが判明した。次にKM704がLTGFーβの活性化を阻害する機序について検討したところ以下の事が明かとなった。平滑筋細胞の細胞表面にはLTGFーβに対する選択的結合部位が存在しており、KM704はこのLTGFーβの細胞表面への結合を阻害する。LTGFーβの活性化は内皮細胞表面で蛋白分解酵素によって成されるが内皮細胞の表面にはLTGFーβに対する選択的結合部位が無いため内皮細胞単独ではLTGFーβは活性化されず、このため混合培養において平滑筋細胞表面へのLTGF-βの結合が必須であり、KM704はこのプロセスを阻害することによりLTGFーβの活性化を阻害する。今後はLAP分子中のKM704の認識部位と共にLTGFーβ選択的結合部位の同定が課題である。
絵図にみる禅院とその建築・儀礼・意味に関する研究

前年度にひきつづき本年度は、申請した研究テーマのもと、入手絵図および関連既往研究の整理とともに、関連絵図の新たな調査を行った。鎌倉国宝館蔵の「往古仏殿之図」のほか、名古屋工業大学所蔵の各種木割書にみる「人体相関図」を現地調査し、研究の基礎的情報を得た。平行して、昨年度実見した「大宋諸山図」もあわせて、絵図に書き込まれた各種情報を、文献史料や既往研究と照らし合わせながら、その意味を多角的に検討した。また、各種の研究会を組織することで、関連する学術情報を収集した。その結果、「往古仏殿之図」および「人体相関図」に関して以下のことが明らかとなった。1)宝暦期に修復された「往古仏殿之図」は、中世の頃に存在した仏殿を描いたものだが、写実的なものではなく、あくまで想像的に描かれたもので、建築の施工を目的に描かれたものではなかった可能性が高い。2)禅宗寺院の伽藍配置を人体に擬えた「人体相関図」は、加賀建仁寺流や四天王寺流の大工を中心に流布していた。また、北陸および東北地方を中心に、神社の建築や境内をもこの人体に擬えて表現する絵図が存在する。これらの検討結果は、禅院とその建築および絵図にさまざまな意味が込められていたことの証左として、建築情報の伝達プロセスをうかがえる事例の一つとして極めて興味深い。本年度は、申請した研究テーマのもと、入手絵図および関連既往研究の整理をおこなった。おもに東福寺蔵の「大宋諸山図」のほか、各種木割書とその絵図、鎌倉国宝館蔵「円覚寺仏殿建地割図」を調査し、研究の基礎的情報を得た。平行して、絵図に書き込まれた各種情報を、文献史料や既往研究と照らし合わせながら、その意味を多角的に検討した。幹事を務める「日本宗教建築研究会」を、東京をはじめ奈良や名古屋で定期に開催し、研究者を招聘して研究発表と討議を行った。くわえて、愛知県や岐阜県などの中部地方、愛媛県や高知県などの四国地方を中心に、関連する各種文化財建造物の実地調査を行った。各種学術論文なども執筆し、成果をのこした。禅院の建築とその文化の移入過程について東アジアの観点から考察した論考を提出したほか、文部科学省特定領域研究「東アジアの海域交流と日本伝統文化の形成」の協力研究者として、論考を執筆した。
省エネルギーを目指す水-アルコール系の膜分離

近年石油に替わるエネルギー源、化学原料として、再生可能な資源であるバイオマスからのアルコール製造が注目されており、醗酵液からの蒸留にかわる省エネルギー的なアルコールの分離法が模索されている。本研究では固体高分子膜を用いる浸透気化法を取り上げ、本年度は水を選択的に透過する膜と比較して開発の遅れているアルコール選択膜の開発を目的とした。この目的のために、昨年度に引き続いてシリコーンゴム膜を用いて透過機構の解明を行うと共に、水-アルコール分離では収着と拡散が同程度膜透過に寄与しているという昨年度の結果を踏まえて、収着挙動の向上を目指す膜修飾と、拡散挙動の向上を目指す研究を進めた。1.膜透過機構の解明:昨年度に引き続いてシリコーンゴム膜を用いて浸透気化実験を行った結果、水-メタノールおよび水-2プロパノール系の挙動は基本的に他の水-アルコール系と類似な挙動を示した。膜透過流束は透過側圧力の増加に対して直線的に減少した。透過流束の温度依存性はアレニウス型であり、収着拡散機構と矛盾しない。2.膜修飾:水に対するアルコールの収着性を向上させる目的で、フルオロプロピル基およびフェニル基を導入したシリコーンベースの膜を作成して、水-エタノール系での浸透気化実験を行った。フルオロプロピル基を導入したものは部分的に選択性が向上しているものもあるが、シリコーン膜と大差なく、透過流束は小さくなった。フェニル基を導入したものは選択性および透過流束共にシリコーン膜より悪かった。膜透過流束は膜の見掛け密度との相関がある。3.拡散挙動の向上:アルコールの膜中での拡散挙動の向上とアルコールによる水の同伴移動の防止を目的に、超音波エネルギーを付与した場合の効果を調べた。手持の超音波ホモジナイザー(20KHz、150W)を用いた結果では殆んど影響は認められなかった。
脳血管モヤモヤ病の地誌的、民族的分布の不均衡の原因の解明

民族進化の歴史と家族性モヤモヤ病の地誌的分布とに共通項があるか否がを明らかにすることを研究目的とした。民族の進化の跡を追跡する手段として、ミトコンドリアDNAの塩基変化を比較検討を行なった。これは、ミトコンドリアDNAが、主に母系遺伝をするがために、母系のルーツを探ることができるためである。また、Y染色体の染色体多型を用いて、父系系譜よりルーツを探った。家族性モヤモヤ病患者58名(男性16名、女性42名)と、モヤモヤ病がないと判断された健康人60名を対象とした。Y染色体の解析は、DYS287(YAP)locusと、DYS19locusとを行った。この解析結果から、父系には、大きく2つのルーツからの流れがあることが判明し、コントール集団と比べ、集積性があることが判明した。また、ミトコンドリアD-ループ領域のhypervariable region IIの(MT3)の検討を行った。ヌクレオチドは、Cambridge Reference Sequence(CRS)の93-110番及び、326-307番に相応している。家族性モヤモヤ病患者群では、MT3の塩基配列の違いがら見て10個のハプロタイプが存在したのみであったが、コントロール群では、30個のハプロタイプが見られた。また、平均塩基置換数を見ると、家族性モヤモヤ病群とコントロール群とでは、有意差が見られた(P<0.0001)。以上から、家族性モヤモヤ病には、ルーツがあり、モンゴロイドの移動進化とともに地球上に分布したと考えれた。<目的>家族性モヤモヤ病、及び、弧発性モヤモヤ病の発症が、特定の民族、集団と密接な関係があるのか、否かを、進化論的に検証した。<対象>家族性モヤモヤ病の58患者(男性16名,女性42名)26家系(ギリシャの1家系を含む)、及び、家族発生のない、弧発性モヤモヤ病51患者、及び、東日本域に居住する66名のモヤモヤ病に罹患していないと判断された対象例を用いて検討を行った。<方法>末梢血よりフェノール・クロロホルムにて型の如くDNAの抽出を行った。検討した染色体及びlocusは、我々が行ってきたLinkage analysisの結果、最も高いLOD scoreを呈した、3番染色体のD3S3706 locus,Y染色体のDYS19及び、YAP locus、mitchondria DNAのDloop領域にある2領域(MT-1,MT-3)5領域である。これらの、5領域につきそれぞれ、プライマーを設定し、反応緩衝液、アニーリング温度を最適化した後、PCRを施行した。<結果>D3S3706locusでは、家族性モヤモヤ病患者は58例がすべて同じalleleであったが、弧発性モヤモヤ病では、51例中49例で同じallele、コントロール例では、66例中63例で同じalleleであった。Y染色体のgenotypeを見ると、家族性モヤモヤ病患者では、2つのhaplotypeしか確認されなかったのに対し、弧発性モヤモヤ病では7つのhaplotypeが、コントロール例では5つのhaplotypeが存在した。mtDNAのgenotypeは現在検索中である。
コンピュータウイルスの可視化と検出に関する研究

コンピュータウイルスによる被害を抑制するには、既存のアンチウイルスソフトウェアでは検出できない未知のウイルスを検出可能とすることが重要である。そこで、既知のウイルスの特徴とウイルスらしきファイルの特徴を比較することで、未知ウイルスを検出するいくつかの手法を提案した。提案するにあたり機械的に特徴データを処理した結果だけでなく、特徴を可視化することで特徴の抽出と比較を分離して考えた点は本研究の特色である。本研究では過去のコンピュータウイルスの機能をベイズ学習アルゴリズムなどで学習し、その学習結果に基づいたウイルス検出を行うことで、現状では未解決な未知ウイルス検出手法の確立を目指す。ただし、学習情報として与える「コンピュータウイルスの機能」の抽出には研究の余地が多分に存在するため、本研究では情報抽出手法と学習手法の問題を切り分けることを目的に、コンピュータウイルスの機能を的確に表現し、ノンウイルスとウイルスを明確に識別可能なバイナリファイルの可視化を目標とする。本年度は過去の研究である程度のウイルス検出結果が得られることが確認されている、抽出するウイルスの機能としてバイナリファイル中の文字列を利用した場合の可視化を試みた。可視化した結果からウイルスの間にはある程度の類似性が見られ、特に亜種ウイルス同士ではその傾向が強いことがわかった。しかし、バイナリファイル中の文字列をすべて可視化するとウイルスと一般の実行ファイルの間にもかなりの共通部分があり、ウイルスをウイルスとして正しく認識するには全体の傾向ではなく突出した少数の特徴に着目する必要があることが明らかになった。このことは、ウイルス検出に少数の特徴に着目し判定するPaul Graham Bayesを使った過去の研究が有効であったことを示すが、逆に亜種のように少数の特徴が共通するウイルス以外では未知ウイルスの検出が難しく、一般の実行ファイルをウイルスと誤検出する可能性も高くなることがわかった。そこで、過去のウイルスを学習する段階で一般の実行ファイルと共通する部分を学習データから除外する手法を試みたところ、検出率が上がり誤検出率が低下することが確認されたが、この手法はまだ改善の余地が残されていると考えられ今後も研究を続けていく予定である。本研究では過去のコンピュータウイルスの情報を抽出しその情報に基づいたウイル検出を行うことで、現状では未解決な未知ウイルス検出手法の確立を目指す。ただし、情報として与える「コンピュータウイルスの機能」の抽出には研究の余地が多分に存在するため、本研究では情報抽出手法と検出手法の問題を切り分けることを目的に、コンピュータウイルスの機能を的確に表現し、ノンウイルスとウイルスを明確に識別可能なバイナリファイルの可視化を目標とする。本年度はバイナリファイルの構造にも着目し、昨年度までの可視化手法では利用していなかったプログラムコードやリソースに関する情報を用いた可視化を行った。まず、バイナリファイルの構造からプログラムの動作そのものが書かれたコードセクションを特定し、そこからWirdows APIコールを順に取り出すことでAPIのシーケンスを得た。ここでいうWirdows APIとはプログラムが動作する上で必須となるOS機能を呼び出すためのインターフェースのことであるため、今回取り出したAPIシーケンスはプログラムの動作そのものと密接に関係しており、亜種ウイルスをはじめとするウイルス同士では似通ったものとなる。そこで、既にウイルスとわかっているプログラムから取り出したAPIシーケンスと、未知のプログラムから取り出したそれとをr次元ベクトル空間上に表現し、そのベクトル間距離をとることで未知プログラムがウイルスかどうかを判定する手法を提案した。また、亜種ウイルス同士ではプログラムアイコン等のリソース情報が似通っていることに着目し、リソース情報を格納しているリソースセクションの構造を可視化し、その違いを元にウイルスを検出する手法も提案した。この手法ではリソース情報の内容ではなくあえてその構造を利用することで、亜種ウイルス間のわずかなリソースの差に影響を受けない検出が可能となっている。
1次元一般化拡散過程の到達時間分布

本研究の目的はこれまで部分的に得られていた,1次元拡散過程や出生死滅過程の到達時間の到達点を境界に近づけたときの極限分布について統一的な結果を得ることであった.我々は上記の二つの確率過程を含む1次元一般化拡散過程に対して極限分布を考察し,出発点が反射壁の場合には条件と結論が非常にわかりやすい命題として統一的に述べられることを示した.一般の場合には条件はやや強くなりいくつかの場合に場合分けした形で命題を述べなければならないがこれまで得られていた結果をすべて含み,しかもより深く,統一された形の結果を得る事が出来た.また,そのやや強い仮定の下では到達点を時間パラメータと思って確率過程とみた到達時間過程が有限次元分布の意味で独立増分自己相似過程に収束することがわかった.独立増分自己相似過程については佐藤健一氏が詳しい研究をしているが,我々が得た極限過程は独立増分自己相似過程の興味ある例になっていると思われる.極限過程の分布のラプラス変換は変形ベッセル関数を多少変形したものと密接に結びついている.得られた結果は"Limit theorems for hitting times of 1-dimensional generalized diffusions"という題の論文としてまとめられ,投稿中である.また,今回の研究およびこれまでの1次元一般化拡散過程の到達時間分布に関する研究の総合報告を台北で催された"Symposium on Analysis and Probability"と題する国際研究集会で行った.なお,正規分布に収束するための十分条件はもう少し深める余地があり,今後の課題である.本研究の目的はこれまで部分的に得られていた,1次元拡散過程や出生死滅過程の到達時間の到達点を境界に近づけたときの極限分布について統一的な結果を得ることであった.我々は上記の二つの確率過程を含む1次元一般化拡散過程に対して極限分布を考察し,出発点が反射壁の場合には条件と結論が非常にわかりやすい命題として統一的に述べられることを示した.一般の場合には条件はやや強くなりいくつかの場合に場合分けした形で命題を述べなければならないがこれまで得られていた結果をすべて含み,しかもより深く,統一された形の結果を得る事が出来た.また,そのやや強い仮定の下では到達点を時間パラメータと思って確率過程とみた到達時間過程が有限次元分布の意味で独立増分自己相似過程に収束することがわかった.独立増分自己相似過程については佐藤健一氏が詳しい研究をしているが,我々が得た極限過程は独立増分自己相似過程の興味ある例になっていると思われる.極限過程の分布のラプラス変換は変形ベッセル関数を多少変形したものと密接に結びついている.得られた結果は"Limit theorems for hitting times of 1-dimensional generalized diffusions"という題の論文としてまとめられ,投稿中である.また,今回の研究およびこれまでの1次元一般化拡散過程の到達時間分布に関する研究の総合報告を台北で催された"Symposium on Analysis and Probability"と題する国際研究集会で行った.なお,正規分布に収束するための十分条件はもう少し深める余地があり,今後の課題である.
情報伝達に関わる膜タンパク質(GPCRとイオンチャネル)の構造研究

情報伝達の分子機構を構造の視点から理解することを目的として研究を進め、主に以下の成果を得た。1、グリア細胞に存在する水チャネルアクアポリンー4の構造を解析するために、昆虫細胞Sf9を用いて大量発現し、精製した。Sf9細胞の6リッターカルチャーから10mgのアクアポリンー4が精製できるようになった。これを用いて2次元結晶を作製する条件を検討できるようになった。2、電気エイの発電器官から作製されたニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)のチューブ状結晶を極低温電子顕微鏡で撮影して、立体構造解析を行っているが、nAChRの4.5Å分解能の解析とX線結晶学により解析されたアセチルコリン結合蛋白質の分子構造の比較から、リガンド結合に伴い、この受容体の2つのαサブユニットの内側のβバレルが15度程度回転するという構造変化の機構が解明された。3、電圧感受性Na^+チャネルの単粒子解析の分解能を向上させるために、Ωフィルターを装備した極低温電子顕微鏡を用いて、薄い氷に包埋した電圧感受性Na^+チャネルの多くの像を撮影した。4、興奮性シナプス後肥厚に存在して、代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)を局在させる働きをするHomer分子の立体構造を解析した。この結果、mGluRが結合することによってHomer分子とそれと結合するmGluRが局在するスイッチ機構のモデルを提案した。5、ヒトエンドセリン受容体にmGluRのC末端側のプロリンリッチな部分を含む20残基を付加したキメラ受容体をHomerと昆虫細胞内で共発現することで、このキメラ受容体を局在させることが出来ることを確認した。これは、膜蛋白質を局在させて精製できる技術を開発できる可能性を示唆している。1)グリア細胞に存在する水チャネルアクアポリン-4の構造を解析するために、昆虫細胞Sf9を用いて大量発現し、精製した。Sf9細胞の6リッターカルチャーから10mgのアクアポリン-4が精製できるようになったので、これを用いて2次元結晶を作製する条件を検討できるようになった。その結果、3Åを超える分解能の電子線解説図形が撮影できるような2次元結晶が作製できた。2)電気エイの発電器官から作製されたニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)のチューブ状結晶を極低温電子顕微鏡で撮影して、立体構造解析を行って、nAChRの4.5Å分解能の解析とX線結晶学により解析されたアセチルコリン結合蛋白質の分子構造の比較から、リガンド結合に伴い、この受容体の2つのαサブユニットの内側のβバレルが15度程度回転するという構造変化の機構を解明したが、引き続き分解能を向上させて、4Å分解能での解析から、原子モデルを作製した。この結果はNatureに(Articleとして)投稿した。3)IP_3受容体の立体構造を、極低温電子顕微鏡と単粒子解析法を用いて解析した。4)ギャップジャンクションにおいて、聴覚障害の原因として知られるコネキシン26の変異体の解析を行い、J.Biol.Chem.に発表した。5)ヒトエンドセリン受容体B型とカベオリン1との相互作用を研究して、ヒトエンドセリン受容体B型におけるシグナル伝達の制御機構を解明して、EJBに発表した。G蛋白質共役型受容体(GPCR)やチャネルなど情報伝達に関わる膜タンパク質の構造研究を推進することによって、情報伝達の分子機構を構造の視点から理解することを目的として、研究を進めた。以下、研究課題ごとに簡単に報告する。1.アクアポリン-4等の水チャネルの大量発現系を確立し、結晶化して、構造解析を行った。水チャネル、アクアポリン-4(AQP4)の構造を解析するために、昆虫細胞Sf9を用いて大量発現・精製し、2次元結晶を作製した。しかし、この結晶はこれまで電子線結晶学が抱えていた深刻な問題を解決しなければ、構造解析は実現できなかった。新しい試料作製方法(J.Structural Biologyに掲載される)を開発することによって、3.2Å分解能で構造を解析することに成功した。この構造解析の結果は、発現系を用いて解析された哺乳動物由来の膜蛋白質では初めての例であり、脳における血流の制御や、温度、浸透圧やグルコースのセンサー等に深い関係があると考えられ、構造学的視点からこれらの機能を議論できる結果を得た。2.アセチルコリン受容体の4Åより高い分解能での構造解析を実施して、原子モデルを作製した。ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)のチューブ状結晶を極低温電子顕微鏡で撮影して、4Å分解能での解析に基づいて原子モデルを作製した。これらの結果に基づいて、nAChRのゲーティングモデルを提唱した。これはリガンド開閉型イオンチャネルのゲーティングの機構を解明した最初の例であり、この結果はNature誌に発表した(Nature,423,949-955(2003))。これらの成果をまとめて、DVDを作製した。3.電圧感受性チャネルやIP_3受容体の単粒子解析を行い、チャネルの構造と機能を解析した。極低温電子顕微鏡と単粒子解析法、さらには、粒子拾い上げプログラムの開発を行うことによって10万個の粒子を解析することが出来て、IP_3受容体の立体構造を15Å分解能で解析した。これは非常にコンフォメーション変化を起こしやすいIP_3受容体の、Ca^<2+>

freeの条件における立体構造を解析したもので、全体構造の中にIP_3結合ドメインを当てはめることができた(J.Mol.Biol.,336,155-164(2004))。本年を最終年度として、平成13年度から平成15年度までの3年間計画で進めた科学研究費特別推進研究は、本年度の成果をはじめとして、3年間の所期の研究目的と計画をおおむね達成することができた。
熱処理型マグネシウム合金の集合組織形成メカニズムの解明とその板成形性向上への展開

マグネシウム合金板材の室温プレス成形を可能とする最適組織設計指針の構築を目的として、室温プレス成形中の微視変形機構を調べた。また、室温プレス成形性に及ぼす微細組織因子の影響も評価した。マグネシウム合金板材の室温プレス成形(張出し成形)中には、底面すべりと柱面すべりが活動し、変形に寄与する。結晶粒径が微細になると、柱面すべりの活動が活発になるため、室温張出し成形性は向上することを明らかにした。例えば、商用Mg-Al-Mn合金圧延材でも、(0001)面が板面に配向する底面集合組織の形成を抑制し、結晶粒径を8um程度まで微細化することで、張出し成形性の指標であるエリクセン値(商用Mg合金では3mm程度)は8mmまで向上することがわかった。また、Znの添加によっても柱面すべりが生じやすくなり、Znを微量に添加した低濃度Mg-Al-Ca-Zn-Mn合金圧延材は、8.7mmの高いエリクセン値を示すことを明らかにした。一方、曲げ加工時には、底面すべりや柱面すべりの他に、引張双晶も生じる。商用Mg-Al-Mn合金圧延材は、20um程度の粗大な結晶粒径を持つ場合に良好な曲げ加工性を示すことから、引張双晶によって室温プレス成形性が改善する可能性も明らかにした。以上のような、微細組織-室温プレス成形性の関係解明に加えて、圧延加工および熱処理中の集合組織形成過程も検討した。圧延加工中に動的再結晶が生じると、その後の圧延加工中には動的再結晶粒の(0001)面が板面に平行に配向する。また、圧延加工後の熱処理中には、動的再結晶粒が優先して成長することから、動的再結晶の抑制が、(0001)面配向の弱化に有効である可能性を発見した。また、CaとZnの同時添加は、圧延加工中の動的再結晶粒の結晶回転を抑制し、底面集合組織の形成を抑制する効果があることも明らかにした。2018年度の実施項目であった、室温プレス成形中の変形機構、および微細組織-成形性の関係解明に加えて、今年度および次年度の実施予定項目である圧延加工・熱処理中の集合組織形成メカニズム解明にも取り組み、既に組織制御指針となる知見を得ている。また、次年度実施予定の結晶塑性解析プログラム開発やそれを利用した各種変形機構の臨界分解せん断応力の決定にも着手し、既に学術論文としても公表するに至っていることから、当初の計画以上に進展していると判断した。精緻な組織観察と結晶塑性解析を利用したマルチスケールな観点から、マグネシウム合金圧延材の微細組織因子と機械的性質の定量的な関係を構築する。特に、柱面すべりや双晶変形の活動によって室温プレス成形性が向上することを明らかにしていることから、その理由の解明と、柱面すべり・双晶変形を活発に生じさせるための微細組織因子の解明を進める。室温プレス成形性の向上と同時に、マグネシウム合金中の転位と析出物間の相互作用も微視的および巨視的視点から検討し、高強度の付与に必要な析出物の形状やサイズ・数密度を明らかにする。また、底面集合組織の形成抑制に必要な因子や手法も明らかにしつつあることから、(0001)面の一層の配向弱化を目的とした合金元素や加工熱処理条件の最適化を実施し、マグネシウム合金圧延板材のプロセス-微細組織の関係の構築を進める。一連の実験より、プロセス-微細組織-機械的性質の定量的な関係の解明、合金設計指針や組織制御技術の提案まで行い、優れた室温プレス成形性を持つ高強度・高延性マグネシウム合金圧延材の開発にまで発展させる。

また、圧延加工後の熱処理中には、動的再結晶粒が優先して成長することから、動的再結晶の抑制が、(0001)面配向の弱化に有効である可能性を発見した。また、CaとZnの同時添加は、圧延加工中の動的再結晶粒の結晶回転を抑制し、底面集合組織の形成を抑制する効果があることも明らかにした。2018年度の実施項目であった、室温プレス成形中の変形機構、および微細組織-成形性の関係解明に加えて、今年度および次年度の実施予定項目である圧延加工・熱処理中の集合組織形成メカニズム解明にも取り組み、既に組織制御指針となる知見を得ている。また、次年度実施予定の結晶塑性解析プログラム開発やそれを利用した各種変形機構の臨界分解せん断応力の決定にも着手し、既に学術論文としても公表するに至っていることから、当初の計画以上に進展していると判断した。精緻な組織観察と結晶塑性解析を利用したマルチスケールな観点から、マグネシウム合金圧延材の微細組織因子と機械的性質の定量的な関係を構築する。特に、柱面すべりや双晶変形の活動によって室温プレス成形性が向上することを明らかにしていることから、その理由の解明と、柱面すべり・双晶変形を活発に生じさせるための微細組織因子の解明を進める。室温プレス成形性の向上と同時に、マグネシウム合金中の転位と析出物間の相互作用も微視的および巨視的視点から検討し、高強度の付与に必要な析出物の形状やサイズ・数密度を明らかにする。また、底面集合組織の形成抑制に必要な因子や手法も明らかにしつつあることから、(0001)面の一層の配向弱化を目的とした合金元素や加工熱処理条件の最適化を実施し、マグネシウム合金圧延板材のプロセス-微細組織の関係の構築を進める。一連の実験より、プロセス-微細組織-機械的性質の定量的な関係の解明、合金設計指針や組織制御技術の提案まで行い、優れた室温プレス成形性を持つ高強度・高延性マグネシウム合金圧延材の開発にまで発展させる。
抗好中球抗体(抗MPOIII抗体)の血管炎における臨床および病因的意義

I:各疾患患者に於ける抗MPOIII抗体と病態との関連を検討した。順天堂大学膠原病内科外来受診中の膠原病患者107例を対象とし、内訳は慢性関節リウマチ(RA)20例、全身性エリテマトーデス(SLE)21例、強皮症(PSS)5例、多発性筋炎(PM)5例、シェ-グレン症候群(SjS)35例、その他21例であった。抗MPOIII抗体の平均値はRA0.127、SLE0.105、PSS0.142、SjS0.142、PM0.246とPMのみ差を認めた。II:活動性との相関をみるため、血管障害マーカーである血清トロンボモジュリン(sTM)、組織型ファイブロネクチン(EDA+FN)、遊離型ELAM1(sELAM1)と比較した。抗MPOIII抗体との相関は、sTMはPSSでr=0.806、EDA+FNはPSSでr=0.562、PMでr=0.641、sELAM1はPMでr=0.897の相関をみたが、例数が少なくいずれも有意でなかった。比較的高い値であり、他疾患よりもコントロール不良なケースが多い群で高い相関係数が出たことから、例数を増やす一方、活動性の高い例を加える事で高い相関がみられるのではないかと予想された。III:マウス(BALB/c)にMPOIII抗原を免疫しモノクローナル抗体の作製を試みた。皮下接種とivブ-ストを併用した。抗体の産生は認められたが、全ての個体で血管炎または血栓症は認められなかった。また、産生した2種類のMoAbを4匹のマウスに50μgづつ14日間に6回ivしたが血管炎、血栓症は発症しなかった。このことからこれらMoAbは病原性を示さないと判断されたため、それ以上の追及は行わなかった。モデルマウス確立の問題点として、1)病原性の発現には好中球の病的な活性化が必要。あるいは、2)病的作用の有る自己抗体の産生は正常マウスでは困難。等が予想された。以上の2点より実験系の再構築を企画し検討中である。等が予想された。
^3He(e,e′pπ^+)反応による^3He核内Δ成分の研究

ドイツ・マインツ大学850MeVマイクロトロンからの高エネルギー連続電子線を使って、世界で初めて3重同時計数電子散乱実験、^3He(e,e′pπ^+)実験を行い、^3He核基底状態にあると理論的に予想されているデルタ粒子成分の検索を行った。実験では30マイクロアンペア-という大電流の電子ビームを20Kに冷却された高圧^3Heガス標的に照射し、散乱電子を超前方(20度)で検出した。^3He核へのエネルギー及び運動量移行は、それぞれ400、450MeV/cであった。そして実験室系で180度の開き角をもった陽子及びパイ中間子対を同時計数した。これは実験室系で静止したデルタ粒子の崩壊をとらえるためである。すなわち我々の実験配置は、初期状態で電子からの運動量移行450MeV/cに対し反対向きに同じ運動量を持っているデルタ粒子が、仮想光子を吸収し、終状態で静止する運動学に対応している。この場合、実験配置がとりやすいだけでなく、反応断面積の縦・横干渉項も比較的容易に測定できる特徴があった。この実験に先立って、2重計数実験^3He(e,e′π^+)、(e,e′π)、を行い、我々は初めてパイ中間子光発生反応の縦・横成分を分離した。その結果、縦成分にはデルタ成分の寄与が大きく影響するはずだが、終状態相互作用の取り扱い方に影響されることを示した。私が中心になって実施した^3He(e,e′π^+)反応実験は、1核子によるパイ中間子発生過程はないので終状態相互作用の影響を大きく落とすことができる特徴があった。実験は約1カ月間、マインツ大学で5カ国の共同チームで実施して、実験は成功した。現在、科研費の補助で購入した計算機でデータを解析中であるが、きれいに3重同時計数事象、^3He(e,e′π^+)は見えており、解析終了後、理論解析に入る予定である。
炎症非惹起型プロディフェンシンの構造作用特性に注目した炎症性腸疾患の治療

ヒト消化管における抗菌ペプチドに依存する自然免疫機能の感染防御機構を解明し,炎症性腸疾患の消化管粘膜上皮における自然免疫の関与を検討してきた.ディフェンシンの分子異常と機能異常を検討することによって,炎症性腸疾患の病因・病態における自然免疫機構異常の関与を解明した.さらに,内因性抗菌ペプチドをターゲットとする新たな炎症制御の可能性を検討し,炎症性腸疾患に対する特異的な新規治療法の開発をめざす.ヒト消化管における抗菌ペプチドに依存する自然免疫機能の感染防御機構を解明し,炎症性腸疾患の消化管粘膜上皮における自然免疫の関与を検討してきた.ディフェンシンの分子異常と機能異常を検討することによって,炎症性腸疾患の病因・病態における自然免疫機構異常の関与を解明した.さらに,内因性抗菌ペプチドをターゲットとする新たな炎症制御の可能性を検討し,炎症性腸疾患に対する特異的な新規治療法の開発をめざす.1.(1)大腸菌をもちいた発現系で,プロディフェンシンのリコンビナント蛋白を発現させ,HPLCにて精製した.精製蛋白はAU-PAGEとMALDI-TOF MSにて確認した.(2)リコンビナント蛋白を培養上清に添加し,上皮細胞からのサイトカイン発現誘導能をサイトカインarrayにて確認した.IL-8,IL-10,GRO,PDGFについてはELISAにて定量化し,IL-8とGROは分泌が誘導されていた.(3)三次元構造解析のため,発現vectorの検討を加えた.pET32a vectorにトランスレートした結果,蛋白発現が増強し,回収量が数倍に改善した.この,リコンビナント蛋白を材料として解析を継続する.(4)プロディフェンシンはトリプシン処理にて4kDのディフェンシンとなる.しかし,ジスルフィド結合を破壊されたプロディフェンシンは分解されてその機能を失う.それらの過程に関与する蛋白分解酵素の1つがヒト小腸から分離精製された.In vitroでの蛋白分解阻害実験を行う.2.(1)ラット腸管から抽出した蛋白から低分子蛋白を精製し,抗菌活性を確認した.N末端アミノ酸解析の結果ではribosomal proteinであり,ディフェンシンとは異なるものであった.その抗菌活性の生理的意義については他の研究を予定している.ラット小腸のPaneth細胞の顆粒はマウス,ヒトに比較し少量で,顆粒からの蛋白精製は困難であると考えられた.(2)ラット小腸からRNAを抽出し,ディフェンシンに対する特異的プライマーを作成し,RT-PCRを施行した.アガロースゲル電気泳動ではいくつかのバンドが認められ,そのシークエンスは解析中である.3.マウスDSS腸炎モデルをもちいて,プロディフェンシンの投与が有用である可能性を認めた.1.マウス実験の導入とマウスディフェンシンの精製,分解過程の解析(1)マウス小腸粘膜からcDNAライブラリーを作製しクローニングを行った.特異的なプライマーを作製しPCR増幅とTAクローニング, DNAシークエンスを行った.C57Bl/6マウスに特異的なディフェンシンを発見しCryp4(B6b)と命名した.(2)マウスペプチド特異的なシークエンスをpET28ベクターにライゲーションし,大腸菌発現システムで発現誘導し, Hisタグを有する蛋白をニッケルレジンで部分精製し,タグを切断したリコンビナント蛋白をHPLCにて精製した.精製蛋白にアジュバントを付加し,ウサギに免疫後ポリクロナール抗体を作製した.精製IgGがCryp4(B6b)に特異的であることを確認した.2マウスDSS腸炎モデルの作成とディフェンシンの発現と有効性の解析(1) C57B1/6マウスにDSSを経口投与し,腸炎モデルを作製した.腸炎の発症によりPaneth細胞の内因性ディフェンシンの発現量の変化をポリクロナール抗体を用いた免疫組織染色にて確認した.(2)経口的にヒトディフェンシンをいくつかの経路から投与し腸炎発症の抑制効果を検討した.腹腔内投与にて,生存期間の延長をみとめ組織学的に炎症の鎮静を確認した.(3)上皮細胞の増殖はKi-67染色にてアポトーシスはTUNEL法にて検討し,ディフェンシンの投与でインデックスは低下しアポトーシスを阻害する可能性をみた.ヒトディフェンシンはマウスin vivoモデルに対して治療効果を示し,抗菌ペプチドによる炎症性腸疾患の臨床応用の可能性を示した.