hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子標的薬に対して高感受性を示すがん微小環境の研究

2016年度、2017年度は、上記現象を引き起こすCD200分子発現CAFsの同定を行った。2018年度は、1)癌細胞側に引き起こされる分子機構の解明、2)CD200分子発現CAFsの病態解析、を行った。定常状態では、PC-9細胞にはCD200R mRNAの発現は認められない。そこでEGFR-TKI投与中に、CD200R分子の発現誘導が起こるかどうかを検討したが、CD200R発現の誘導を認めなかった。以上より、PC-9細胞には、CD200R以外のCD200に対する受容体が発現している可能性が示唆された。また、CD200発現CAFsは、肺腺癌18検体中5検体に認められた。しかしながら、これら肺腺癌に特徴的な臨床病理像を見出すことは出来なかった。1) CD200リコンビナントタンパクをPC-9細胞に添加し、EGFR-TKI感受性が増強するかを確認する。具体的にはapoptosisが増加するかを検討する。並行してPC-9細胞に発現している上記候補分子の受容体の同定を試みる。2)候補分子のリコンビナントタンパクを添加した際、受容体を介してPC-9細胞にどのようなシグナル変異が起こり、apoptosisが誘導されているのかを検討する。具体的にはリン酸化アレイを用いて関連シグナルの同定を行う。3)上記にて同定したシグナルの抑制薬+EGFR-TKIの併用により、PC-9細胞のapoptosisが減少するかを検討する。本年度は以下の実験を行う。1)使用したPC-9細胞にCD200R分子の発現誘導が引き起こされるかどうか?定常状態では、PC-9細胞にはCD200R膜蛋白の発現は認められなかった。そこでEGFR-TKI投与中に、CD200R分子の発現誘導が起こるかどうかを検討する。具体的にはEGFR-TKI投与後、day1, day2, day 3にPC-9細胞を回収し、FACSにより、CD200R発現を検討する。2)CD200分子の細胞外ドメイン欠損体を数種類作製する。これらをCAFsに過剰発現し、PC-9細胞と共培養、EGFR-TKI処理を行う。CD200のどの領域が、感受性亢進に重要な領域かを同定する。3)他のCAFsを用いて同様にPC-9細胞と共培養、抗がん剤処理を行う。全体で約10種類のCAFsを予定する。抗がん剤感受性を亢進するCAFsを今までのスクリーニング方法と同様の方法を用いて同定する。さらに、CFAsに発現している責任分子を同定する。同定された責任分子とCD200分子との分子相関、あるいはレセプターを介したシグナルの類似性の解明を行う。4)上記の研究を介して、薬剤感受性を亢進するCAFsそして、それらが形成する微小環境の特徴を明らかにする。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
FXR agonistを用いた肝切除後肝再生促進療法の臨床応用を見据えた基礎研究

マウス実験に関しては、70%肝切除モデルの確立を行った。B6マウスにおける肝切除の手技的な準備・プロトコール作成は可能であった。並行してヒトサンプル解析を行い、FXR抗体(PPMX社、Clone No. A9033A)を用いて肝切除例の背景肝組織の免疫染色を施行した。良好な染色の局在が得られたものの、染色切片における肝細胞のうち50%以上の核染色(核内移行)が見られる症例はほぼ全例(n > 50)であり、これの定量的な評価をFXR活性化群・不活性化群に分けることは困難であった。臨床的な意義を検証するためには他のFXR評価法を確立する必要があると考えられた。マウス実験に関しては、70%肝切除モデルの確立を行っている。当初死亡率が高く、腹腔内出血や麻酔に伴う呼吸抑制死亡が見られたため、手技の安定化に努めている。また血中胆汁酸の濃度を調べるため、肝切除前および術後採血を行うトレーニングも行っており、手技の安定化が得られてきた。Obeticholic acidを投与する実験準備は整ってきている。このように、肝再生が促進されても促進されなくても、FXR agonistで肝再生がどのように影響されるのかを確実にpublishできるような詳細なデータ採取の準備をすすめている。並行してヒトサンプル解析を行っている。まず、FXR抗体のうち、免疫染色でワークする抗体を探し、染色条件設定が終了した。ヒトサンプルのデータに関しては前向きに収集しているため、術後再生肝volumeデータを収集中である。術前肝切除率については、術前必須項目であり、これはすべての症例ですでにデータ蓄積されている。これらの症例のうち、切除率の均一な集団内での解析ができるよう右肝切除症例をピックアップし、術後の肝volumeを測定し、数を増やして検証中である。多変量解析を行う必要があり、左右肝切除症例100例程度を目標としている。2000年以降肝切除を施行した31例を対象にまずFXRの免疫染色を行った。背景肝と腫瘍部を別個に判定し、10%以上の肝細胞または肝細胞癌細胞においてFXRの核内移行を認める症例を陽性症例として評価を行った。背景肝にFXR核内移行を認めた症例は13例(42%)であった。これまで得られている結果として、組織学的線維化の上昇とともに胆汁酸濃度は上昇するということを認めていたため、この血中胆汁酸濃度上昇がFXR核内移行へ関与するかどうかを調べた。FXR核内移行群と核内非移行群との間には血中胆汁酸濃度の差は認めなかった。一方、FXR核内移行率は、肝の線維化が強くなるにつれて強くなる傾向を認めた(F0-1:20%, F2:25%, F3:38%, F4:42%)。FXRが核内へ移行するメカニズムについては血中胆汁酸が関与していない可能性が示され、予想される結果とは異なった。今年度はヒトサンプルの解析を中心に行った。FXRの免疫染色の条件決定に時間を要したが、テストサンプルでの解析を終了した。予想される結果とは異なったものの、FXRの核内移行には血中胆汁酸濃度は関与しない可能性が示された。マウス肝切除に関しては方法の確立は行えたものの、FXR agonist投与まで至らなかった。ヒト肝細胞癌サンプルの免疫染色結果については、100例の切除例の背景肝を評価すると、Hepatocyteはほぼ全例において核内のFXRが染色されており、また広範囲にその核内移行がみられた。従って、FXRの活性化例と非活性化例のグループ分けは困難であり、また定量化にも適さない染色結果であった。血中胆汁酸値との対比は難しく、FXRの活性化の程度を免疫組織学的に定量的に評価することが難しいことが考えられ、臨床的な意義を検証するためには他のFXR評価法を確立する必要があると考えられた。マウス解析はまだFXR agonist投与まで至っていないものの、肝切除の手技は安定化してきたため、これから統計学的にばらつきの少ないデータが得られると確信している。ヒトサンプル解析に関しては、2000年以降左右肝切除を施行した100例を対象に、背景肝のFXRの核内発現と血中胆汁酸濃度を対比する。FXR抗体を用いて、免疫染色の条件を決定した。現在症例を増やして検証中である。これまで我々は、血中胆汁酸濃度は肝切除後の肝再生と関連し、胆汁外ろうは肝再生を抑制する可能性があることを見出した(Br J Surg 2012)。

今研究では肝硬変症例において胆汁酸が高いという事実に基づき、FXRの核内移行が血中胆汁酸濃度に影響をうけるかを調べ、関連がないことを確認した。従って、ベースとなるFXRの核内移行は他のメカニズムによる制御機構が存在し、術後の胆汁酸濃度の上昇とともにFXRシグナルの活性化がすべての症例に起こる可能性がある。我々はβCateninが肝再生の制御因子であることを報告したが(Yang J et al. Hepatology 2014)、FXRが肝細胞癌においてはβCatenin pathwayのNegative regulatorであるという報告が近年なされており(Xijun L et al. Oncotarget 2015)、ヒトにおいて肝再生におけるFXRの役割とそのメカニズムを調べるため、βCateninシグナルとFXR核内移行との関連性も調べる。消化器外科学(特に肝領域)臨床データはプロスペクティブに集積されており、肝再生についても術前の切除肝volumeは蓄積されている。術後7日目の肝volume情報について解析が未施行の最近の症例についてvolumetryで解析を行っており、2000年以降左右肝切除を施行した約100例を対象に、肝再生に関する臨床データを現在直近の症例までbrush up中である。このデータを土台として、慢性肝炎・肝硬変といった障害肝の症例で胆汁酸が術前高い症例は、FXRの活性化レベルが他の集団よりもともと高いのか、また、このような症例は肝再生が促進されないのか、これを免疫組織学的に証明するために、現在免疫染色の条件が得られ、症例を増やしており、十分な症例数を確保できたら統計学的に解析する。動物実験については、肝切除・採血といった基本的な手技の安定化が得られてきたため、実際薬剤投与し、FXR agonistであるobeticholic acid(OCR)の有効性を検証する。結果がNegativeであれば、マウスの数を増やして検証し、免疫組織学的な解析に加え、血液検査値の検証など詳細なデータも合わせて差がないことを確かなものとする。ヒトサンプルの解析において、FXRの免疫染色の条件決定に時間を要し、また得られた結果が予想される結果とは異なったため、当初の研究計画に見直しを行う必要があったため。また、医局内に保管している消耗品を使用したため、予定より消耗品を購入しなくてすんだため。当初想定より安価で試薬・消耗品費の購入が可能であったため。次年度はヒトにおいて肝再生におけるFXRの役割とそのメカニズムを調べるため、βCateninシグナルとFXR核内移行との関連性も調べる予定であり、サンプル、及び他消耗品費が必要になる。また、得られた結果をデータとしてまとめるため、事務補佐員を雇用したいと考える。本年度得られたデータを土台として、免疫染色の条件を設定、十分な症例数が確保でき次第、統計学的に解析する予定である。また、動物実験において、実際薬剤投与し、FXR agonistであるobeticholic acid(OCR)の有効性を検証する。そのため、研究費は免疫染色や動物実験など各実験に係る試薬消耗品及び実験動物購入・維持費に使用する予定である。
精密解析による多重ボソン生成を伴うヒッグス物理の研究

LHC実験によるヒッグス粒子の探索のバックグランドとなる、2光子及び2個の弱ゲージボソンの生成過程の散乱断面積の精密な計算を行った。さらに、これらの過程の生成粒子の分布を忠実に再願するシミュレーション・プログラムを作成し公開した。散乱断面積の計算には、摂動計算によるものばかりではなく非摂動的な効果が重要であるが、独自に開発したパートン・シャワー法と主対数項引き算法を組み合わせることにより、両効果を矛盾なくかつ高能率で計算することに成功した。(1)LHC実験の中心的な課題の一つである、ヒッグス粒子の探索において、バックグランドとなる2光子生成を伴うジェット生成反応について、その散乱断面積を高次補正を含めて精密な計算を行う。(2)上記計算について、実行するプログラムを公開し、LHC実験研究者に使用してもらい、実験の解析に貢献する、(3)さらに、軽いヒッグス粒子の存在を予言する超対称性模型について、高次補正を含む精密な計算を行い、超対称性粒子生成の詳細を明かにする。平成20年より、CERN(欧州合同原子核研究機構)において世界最高エネルギーの陽子・陽子衝突型加速器であるLHC(Large Hadron Collider)が運転を開始する予定であったが、事故のため約1年実験開始は延期となった。そのため、平成20年度は来るべきデータ解析のための準備の年となった。本研究においては、実験データの解析のための強い相互作用の高次補正を含む、イベント・ジェメレータの作成を行った。ターゲットの散乱過程を、ヒッグス粒子の探索の主なバックグランドとなる、2光子生成過程に決め、必要な散乱振幅・ループ補正計算ルーチン・整合性をもったジェット生成のための差し引き法の確立、等の研究を行った。その結果、2光子生成過程におけるイベント生成プログラムの主要な部分を完成させることができた。また、ヒッグス物理学とも密接に関連する超対称性理論に基づく散乱断面積、および粒子崩壊幅の輻射補正の自動計算のためのシステム開発を行い、電弱相互作用についてはほぼ自動化が完了した。引き続き、強い相互作用に関する高次補正を計算システムを開発している。これは、LHC実験におけるヒッグス物理ための輻射補正の計算にも利用可能であり、基本的なツールの開発をほぼ終えることができた。また、そのイベント生成プログラムをアトラス実験グループの解析に利用できる標準的なデータとして、イベントの情報を磁気ディスク上に保存する試験を行った。その結果、本研究で作成されたイベント生成プログラムが、アトラス実験において利用可能であることが、実証された。本研究の目的の一つは、LHC実験におけるヒッグス粒子探索のデータ解析に必要な、イベントジェネレータを作成することであるが、平成21年度においては、ヒッグス粒子探索の最大のバックグランドとなる2光子生成反応に対して、「フラグメント・効果」と呼ばれるものについて、研究を行った。従来の方法では、フラグメント効果は、実験データをフィッティングすることにより得られる、「破砕関数」をもちいて評価されていた。しかし、この方法では粒子のハドロン化との両立ができなかった。それに対して、パートンシャワー法にフラグメント効果をいれる新しい方法を開発した。これにより、ハドロン化に対応可能となった。これは、実験と直接比較できるイベントジェネレータの作成に対して、重要な進展となる。パートンシャワーに、フラグメント効果を入れる方法にはいくつかの可能性があるので、それらを比較し、破砕関数の方法と同等な結果が、より使いやすい形式で生成できる方法を調べた。結果として得られた、最良の方法を、GR@PPAと呼ばれる本研究グループにより開発中のイベントジェネレータ・システムに組み込む作業を行った。これにより、実験研究者に利用可能なシステムの構築が前進した。また、ヒッグス物理とも関連の深い超対称性粒子のさまざまな性質を研究するためのシステムの開発も行った。超対称性粒子の崩壊幅について、輻射補正を自動的に計算するシステムを開発し、多くの主要な崩壊過程について、崩壊幅の輻射補正を計算した。これにより、LHC実験におけるヒッグス物理と、それを超えるモデルの探索に重要な情報をお与えることができる。精密解析手法に基づいて作成された、イベント・ジェネレータ・プログラムである、GR@PPAの改良を行い、本研究の目的であるヒッグス生成のバックグランドとなる、ウィーク・ボソン+ジェット生成の過程について、パートン・シャワー法の改良、ダブルカウントを避けるための、主要対数項差し引き法を導入した。新しいGR@PPAプログラムは、実験研究者の公開されている。また、ジェットとエネルギーの高い光子を同時に生成する、新しいパートン・シャワー法を開発し、プログラムを作成した。一般に光子の生成確率は、ジェットの生成確率よりも非常に低く、通常の方法では必要な高エネルギー光子の生成は大変に効率が悪い。そこで、高エネルギー光子の生成を能率よく、また理論的に正しい結果を出すような、パートン・シャワー法を開発した。このプログラムは、今後GR@PPAに組み込む予定である。

高次補正については、GRACEをもちいて、自動的に高次補正プログラムを作成するユーティリティーについて開発をすすめ、各種のプロセスについて高次補正の自動計算ができるように整備した。また、超対称性模型についても自動計算のシステムの整備・超対称性粒子の崩壊の高次補正の計算等を行い、研究を進めた。平成23年度は、非摂動効果による硬光子の発生のプログラム開発を行った。従来の方法では、この効果は光子破砕関数を用いて実験データをもとに計算されていた。そのために、重要な力学変数(光子の放出角等)は積分されてしまい、データ解析に必要な一部の情報は失われてしまっていた。我々は、この光子発生を、改善されたパートン・シャワー法を用いることで計算し、従来の方法では失われていた硬光子とハドロン・シャワーを、完全な力学変数の情報を保ったままで計算することに成功した。この方法はイベント発生の効率が良く、測定器シミュレーションプログラムに直接接続することができるので、理論による計算に基づいてより精密に予言できるようになった。また、超対称性模型について研究を行った。LHC実験により発見が期待される超対称粒子に関して、その崩壊幅と分岐比の高次補正を系統的に計算した。超対称性粒子は、その実験的信号に明確な特徴があるため、もし存在するならばLHC実験んにおいて比較的容易に発見されるものと期待されている。しかし、その信号の詳細は、超対称性粒子粒子の質量・崩壊幅等に強く依存する。そこで、LHC実験における超対称性粒子の信号に対する高次補正の効果を確認するために、超対称性粒子の多段崩壊における崩壊幅の高次補正の精密な計算を行った。これにより、一部のパラメータ領域においては大きな補正が存在することが判明した。将来、超対称性粒子が発見された場合、その実験による測定値から超対称性模型のパラメータを決定するうえで、今回の高次補正の計算は重要な役割を果たすものと期待される。
動的クロマチン構造制御の機能複合体解析

出芽および分裂酵母において、FLAGI/HAエピトープタグを付加した各種ヒストン遺伝子株を構築し、各種ヒストンと相互作用する因子群を機能複合体として解析した。これまでに、可溶性画分から生理的条件下で免疫沈降することにより、クロマチンへの挿入装置だけでなく、修飾や局在、分解といった動的なヒストンメタポリズムについての関連因子をスクリーニングし、新規クロマチン関連因子も含めてヒストンダイナミクスの一端が明らかとなった。例えば、出芽酵母において、可溶性ヒストンはH3/H4がきわめて少ない。一方、比較的可溶化しやすいH2A-H2B複合体はヒストンシャペロンNap1以外にEACT(Spt16、Pob3)を含むことが明らかとなった。FACTはクロマチン転写を促進する因子として有名であるが、各種阻害剤、細胞固定法など様々な条件で解析することにより、FACTは転写や複製時のみならず、生体内でクロマチンからH2A/H2Bを解離させる働きを持ち、よりグローバルなH2AIH2Bダイナミクスを規定する基盤因子として働くことが示唆される。また、ヒストンH3-H4複合体は出芽酵母、分裂酵母、ヒトの間でかなり異なることが明らかとなり、クロマチン形成の共通の分子基盤と戦略のバリエーションが示唆される。分裂酵母ヒストンH3複合体の主要構成因子の1つとして同定した新規クロマチン因子は、大量発現により染色体分配異常を引き起こす。In vitroにおいてヒストンH3/H4と結合するが、結合領域も新規であり、如何にして特異的にヒストンと相互作用するのか興味深い。また、既知のヒストンシャペロンCIA1(=Asf1)とヒストンを介した相互作用することからも、クロマチン制御の新たな一面が明らかとなりつつある。本研究はヒストン複合体をはじめとするクロマチン制御複合体解析を通してクロマチン形成,維持,変換ダイナミクスの解明を目指したものである。申請者が独自に確立したエピトープタグを利用した各種ヒストン挿入装置複合体精製法を駆使することにより,クロマチン制御因子を網羅的に同定すると同時に複合体同士の機能的ネットワークとクロマチン形成のダイナミクスについて焦点を絞って以下の解析を行った。平成18年度までに,出芽酵母および分裂酵母からFLAG/HAエピトープタグを付加した各種ヒストンについて,生理的条件に近い低塩条件下でクロマチンに挿入されていない状態における複合体を精製することに成功している。さらに,細胞周期に依存したピストン複合体の動的変換について調べるために,cdc10温度感受性変異株にタグを付加したヒストンH3を導入し,同調培養条件でのヒストン複合体精製を行ったが,顕著な違いは見られなかったが,その過程でピストン遺伝子の3'UTR領域の新たな機能を見出した。また,大量発現による複合体形成異常などダイナミックな制御システムを理解する上での問題点を浮き彫りにした。細胞周期依存等の一過的な相互作用についても細胞固定によるヒストン複合体スナップショット系を確立することによりダイナミックなクロマチン構造形成とヒストンメタボリズム制御機構の解明を目指している。また,分裂酵母ヒストンH3複合体の主要構成因子の1つとして同定したMlo2は大量発現により染色体分配異常を引き起こす機能不明のタンパク質であったが,ピストンH3/H4を大量発現させた場合も顕著な増殖阻害を引き起こすことを見出している。これらの関連性について,Mlo2の細胞局在と複合体解析,欠失変異体解析を通してピストン結合の生理機能を現在解析している。
水で濡らしたアルミ棒積層体のせん断機構の微視的考察

1.まず、種々の含水比のもとでのアルミ棒積層体(直径1.6mmと3mm、混合重量比3:2のランダム配置のもの,長さはともに50mm)のための低拘束圧下(σ=0.510gf/cm2)の特殊なせん断試験装置を経費節減のために種々の部品を購入して組み立てた。低拘束圧で正確に力を測定できるように種々の工夫を凝らした。2.次に、高性能全自動カメラによって粒子間の水のメニスカスを接写し、粒子間の水の付着角を写真から計測して、計算に反映させた。撮影した写真から解析粒子接点を決め、測定した水の付着角より水の表面張力による粒子間付着力を計算して、マクロな粘着力cや内部摩擦角φを算定した。この計算したせん断強度と1.で説明した特殊なせん断試験装置によるせん断強度を比較したところ、両者が近いという結果が得られた。本研究は、粒子間に付着力を有する粒状体のせん断機構を根源的に解明したものである。
プラズマCVDによるダイヤモンド状薄膜被覆材の摩擦・摩耗特性の評価

プラズマCVDやイオンプレーティングを使って,機械部品の構成素材である各種の鉄鋼やチタン表面にTiNセラミック膜,ダイヤモンド膜,ダイヤモンド状炭素膜を被覆する条件を明らかにして,薄膜の密着強度,硬さ,摩擦係数,摩耗挙動を検討した。その結果,次のような結論を得た。1)TiN積層膜の密着強度及び摩擦・摩耗挙動はTiNの組織積層数,積層順序に強く依存した。2)純チタン表面にプラズマCVD法を用いてダイヤモンドが核生成する過程を明らかにし,基板形状がメタンガスと酸素の混合ガスの流れに影響を与えるためにダイヤモンドの核生成及び結晶成長が大きく変化した。3)高周波プラズマCVDによってステンレス鋼表面にケイ素膜を中間層としてDLC膜を被覆した。密着強度は中間膜の厚さの影響を強く受ける。密着強度の変化に伴って,DLC膜の摩耗挙動に大きな差異が生じた。4)イオンプレーティングによって高速度工具鋼の表面にDLC膜を直接被覆した。基板の摩耗はDLC膜被覆によって大きく改善されるが,相手材の硬度によって差異が生じた。ステンレス鋼表面に高周波プラズマCVDを用いて、まずケイ素膜を被覆した。その膜厚を400Å及び800Åの2種類に変えた。その後、ダイヤモンド状炭素膜を被覆した。その膜厚は、0.4μmであった。このダイヤモンド状炭素膜に対してベアリング鋼及び黄銅のボールを押しつけてすべり速度、44mm/sのもとで摩擦・摩耗試験を行った。ダイヤモンド状炭素膜の被覆によってステンレス鋼の摩耗を大幅に低減させることができた。しかし相手材がベアリング鋼か黄銅かによって、その摩耗挙動が異なった。ベアリング鋼の場合、摩耗の進行は遅く、DLC膜が引っかき傷を作りながらはく離するのに対し、黄銅の場合凝着とはく離を繰り返してDLC膜の摩耗が進行する。イオンプレーティング法を用いて,高速度工具鋼(SKH2)の表面に直接1μmのDLC(ダイヤモンド状炭素)膜を被覆した試験片について,被摩耗材としてベアリング鋼(SUJ2)と超硬合金を用いてボールオンディスク摩擦・摩耗試験機によりDLC膜の摩擦・摩耗挙動を調べた。試験条件はすべり速度25mm/s,垂直荷重1N及び5Nと変え,すべり距離を5kmとした。得られた結果は以下のとおりである。1)DLC膜の被覆が相手材の摩耗量と摩擦係数を低下させた。2)DLC膜被覆材に対して相手材の硬度が増加すると,相手材の摩耗量は減少したが,逆にDLC膜の摩耗量は増加する。3)負荷荷重が増加すると相手材及びDLC膜ともに摩耗量が増加した。4)相手材がベアリング鋼で,負荷荷重5Nのとき,すべり距離が3kmを越えると,マイルド摩耗形態に遷移した。5)相手材がベアリング鋼のとき,PLC膜が無ければ,摩擦係数はμ=0.350.4であるのに対し,DLC膜の被覆によってμ=0.1まですべり距離によらずに低下する。
抗菌性モノマー(MDPB)の配合が接着システムに及ぼす影響

MDPBを市販のセルフエッチングプライマーおよびアドヒーシブに配合し,最終濃度で1,2,5(w/w)%のMDPBを含有するプライマー3種と2.5%のMDPBを含有するアドヒーシブを調製した。まず,試作したプライマー/アドヒーシブの重合率をFTIRを用いて測定したところ,MDPB非配合のコントロールと有意差は認められず,試作接着システムが十分な硬化特性を備えていることが明らかとなった。MDPBを配合したプライマー/アドヒーシブは,硬化前の状態で,Streptococcus mutansをはじめとするう蝕細菌に対して抗菌性を示し,とくに5%MDPB含有プライマーは短時間のうちにS.mutansを死滅させる強い殺菌効果を有していた。また,試作プライマー/アドヒーシブは,固定化された抗菌剤により,硬化後にもその表面に接触したS.mutansの増殖を抑制した。さらに,MDPBのプライマーへの5%までの配合,アドヒーシブへの2.5%の配合では象牙質接着性には影響は認められず,むしろプライマーへの1-2%の配合で接着性が向上した。一方,dentine barrier testを用いてヒト歯髄細胞に対するMDPB配合プライマーの毒性を評価した結果,5%までの配合濃度では有意な影響が認められないことが明らかとなった。以上のin vitroでの結果より,抗菌性モノマーMDPBの接着システムへの配合は,接着性能や安全性に悪影響を与えることなく確実な抗菌性を付与できる方法であることが明らかとなり,今後その臨床応用に向けてin vivoでの有用性を検討していくに値する材料であると考えられた。平成9年度においては,提出した研究実施計画に基づき,抗菌性モノマーMDPBを含有するプライマーおよびアドヒ-シブを調製し,その重合性ならびに硬化前・後の抗菌効果をin vitroで評価した。まず,MDPBを市販のセルフエッチングプライマーおよびアドヒ-シブに配合し,最終濃度で1,2,5%のMDPBを含有するプライマー3種と2.5%のMDPBを含有するアドヒ-シブ1種を試作した。これらをKBr discに湿布し,FTIRを用いてプライマー・アドヒ-シブ複合体の重合率を測定したところ,MDPBを含有しないコントロールを含めていずれの組合せでも有意差は認められず,60-65%の高い重合率を示した。一方,寒天平板拡散法で硬化前のプライマーのStreptococcus mutans,Lactobacillus casei,Actinomyces viscosusに対する抗菌性を,また硬化前のアドヒ-シブのS.mutansに対する抗菌性を調べたところ,MDPBの配合により明らかに抗菌効果が増強されることがわかった。また,補助金により購入した多本架低速遠心機を用いてS.mutansのPBS懸濁液を調製し,これに試作プライマーを30秒間接触させた後の生菌数を測定した結果,MDPBの配合濃度の上昇に伴って殺菌性が増加し,5%含有試料では非常に強い殺菌効果が認められた。さらに,低速遠心機を用いて調製した菌液を硬化したプライマーまたはアドヒ-シブ表面に播種して培養した結果,硬化試作プライマー/アドヒ-シブが菌の増殖抑制効果とわずかな殺菌効果を有することが明らかとなった。なお,上記の抗菌効果の評価実験は,すべて補助金により購入したバイオクリーンベンチ内で行った。以上のように,本年度の研究より,抗菌性モノマーMDPBの配合によるプライマー/アドヒ-シブの重合性への影響は認められないこと,およびMDPB含有プライマー/アドヒ-シブがその硬化前・後にう蝕関連細菌に対して抗菌効果を発現することが確認された。平成10年度においては,提出した研究実施計画に基づき,抗菌性モノマーMDPBを含有する試作接着システムの象牙質接着性および細胞毒性を評価した。ヒト抜去歯牙より象牙質平坦面を露出し,0,1,2,5%のMDPBを含有するプライマー4種を用いて引張試験を行った。

その結果,5%までのMDPBのプライマーへの配合は象牙質接着性には悪影響を及ぼさず,逆に2%の濃度で配合した場合には接着性が向上するということが判明した。一方,アドヒーシプにMDPBを2.5%配合した場合,MDPB非含有のものと有意差は認められないものの,若干接着強さが低下する傾向が認められた。MDPBをアドヒーシブに配合した場合は,粘性が高くなるため,脱灰象牙質への浸透性がいくぶん低下するのではないかと考えられた。一方,補助金により購入したクリーンベンチ内で,ヒト抜去大臼歯より歯髄を採取し,得られた歯髄細胞を用いて,dentine barrier testにてMDPB含有プライマーの細胞毒性を評価した結果,プライマーへの5%までのMDPBの配合では細胞毒性には有意な影響が認められないことが明らかとなった。ただし,barrierである象牙質円板を透過したモノマー濃度を測定したところ,5%MDPB配合プライマーからは比較的高い濃度の未重合MDPBが歯髄チャンバー内へ溶出しており,細胞毒性の点から考えると,5%以上の濃度でプライマーにMDPBを配合することはあまり好ましくないことがわかった。以上のように,本年度の研究より,抗菌性モノマーMDPBの配合によるプライマー/アドヒーシブの接着性への影響はほとんど認められないこと,および5%までの配合であればプライマーの細胞毒性にも影響は認められないことが確認された。
過不足のない効率的な海上輸送実現のための最適化・シミュレーションシステムの構築

燃料最小化航路計画拡張モデルと船舶スケジューリング拡張モデルの融合モデルの構築を行う.平成29年度に開発した2つの拡張モデルを1つのモデルとして融合することで,先行研究ではできなかった程度の燃料消費量の削減を実現するできるモデルを構築した.2つのモデルのうち,燃料最小化航路計画モデルは,2港間の航路を具体的に定めるものであった.これ自体は非線形な制約式と目的関数を持つ混合整数最適化問題となる.このクラスの問題を扱うことのできる数理最適化ソフトウェアは存在するが,問題例によっては長い計算時間が必要となる点が課題である.船舶スケジューリング拡張モデルは2港間の移動コストを船速によって変化するものとして扱うが,そのためには計算過程で燃料最小化航路計画拡張モデルを繰り返し(場合によっては数百回)解く必要がある.そこで,計算時間を短縮するために,数値実験と検証を通して機能的かつ効率的な融合モデルの構築を行い,全体の計算時間を数分程度に短縮することを目標としてアルゴリズムの開発に取り組んだ.燃料消費量を表す多項式のモデルとしては,2次式,3次式,4次式など,船型によってさまざまなものが用いられるが,理論的な解析の結果,燃料を表現する多項式の中から,多くのものは二次錐制約を用いた制約式で記述できることが明らかになった.二次錐制約は,一般の非線形制約よりも効率的な計算を行える可能性がある.そのため,この効率性を活用した比較的短時間で実行可能なアルゴリズムを開発した.今年度取り組んだ融合モデルでは,部分的な問題を高速に解くことが重要である.そのためには,問題の構造を活用した効率の良いアルゴリズムの開発が必要である.問題の構造としてネットワーク構造と二次錐構造を明らかにし,それらを活かしたアルゴリズムを開発した.このことから,おおむね順調に推移していると判断した.今後は,開発した融合モデルを計算機プログラムのチューニングを行い,様々な問題例に対して安定的に動作するように改善を実施する.また,航路計画・船舶スケジューリングモデルと補完的な位置付けにある,船隊構成決定,訪問港・航路ネットワークの選定を行うための数理モデルの解析を行う.これにより,過不足のない効率な海上輸送を実現するための最適化・シミュレーションモデルを構築する.近年,環境負荷が小さくかつ効率的な海上輸送を実現するための取り組みが進められている.環境負荷を低減するための方策は,大きくハードウェア(エンジンなど)の改良によるものとソフトウェアの改良によるものがある.ソフトウェアの改良によるもので有効なものとして,船舶スケジューリングと航路計画の改良か挙げられる.これらは従来別々に行われるものであったが,本研究では,これらを融合することによって,より大きな効果が得られるモデル・アルゴリズムを開発することを目的としている.減速運航は,燃料消費量の削減のために有効な方策として認識されているが,それを実現するには,貨物を積み日,おろす日,荷量の変化,気象海象の変化など計画に迅速・的確に反映する必要がある.ここで開発したモデルとアルゴリズムは,この目的を実現するための最適化計算を実現する重要なものである.このような運航計画を求めるために有効なモデルとして,運航計画の2港間の移動コストを船速の大きさによって変化する燃料消費量として定義した航路計画モデルを開発した.これにより,運航上の制約を満たしつつ減速運航が可能となる計画を得ることができる.このモデルから計画を求めるためには大量の計算が必要であるが,その計算を実用的な時間内に行うためのアルゴリズムを開発した.また,船舶スケジューリングと統合するための準備として,列生成過程のアルゴリズムの設計を行った.これにより,緩和問題を用いることで,収束までの計算を効果的に行うことが期待できる.さら,実際の航路ネットワークのうちで,どの地域や港湾に注目するべきかを明らかにするために,国内外の港湾の貨物取扱量や施設を調査し,経済的な観点からの分析を行った.今年度取り組んだ航路計画のモデルの拡張は,次年度以降の融合モデルの開発の基礎となるものであるが,効率的なアルゴリズムの開発により,現実的な計算時間で解が求まることが期待される.また,予備的な解析結果により,日本近海の海象データをうまく用いることで燃料消費量の削減が期待できる可能性を見出している.これらのことから,おおむね順調に進展していると判断した.燃料最小化航路計画拡張モデルと船舶スケジューリング拡張モデルの融合モデルの構築を行う.平成29年度に開発した2つの拡張モデルを1つのモデルとして融合することで,先行研究ではできなかった程度の燃料消費量の削減を実現するできるモデルを構築した.2つのモデルのうち,燃料最小化航路計画モデルは,2港間の航路を具体的に定めるものであった.これ自体は非線形な制約式と目的関数を持つ混合整数最適化問題となる.このクラスの問題を扱うことのできる数理最適化ソフトウェアは存在するが,問題例によっては長い計算時間が必要となる点が課題である.船舶スケジューリング拡張モデルは2港間の移動コストを船速によって変化するものとして扱うが,そのためには計算過程で燃料最小化航路計画拡張モデルを繰り返し(場合によっては数百回)解く必要がある.そこで,計算時間を短縮するために,数値実験と検証を通して機能的かつ効率的な融合モデルの構築を行い,全体の計算時間を数分程度に短縮することを目標としてアルゴリズムの開発に取り組んだ.燃料消費量を表す多項式のモデルとしては,2次式,3次式,4次式など,船型によってさまざまなものが用いられるが,理論的な解析の結果,燃料を表現する多項式の中から,多くのものは二次錐制約を用いた制約式で記述できることが明らかになった.二次錐制約は,一般の非線形制約よりも効率的な計算を行える可能性がある.

そのため,この効率性を活用した比較的短時間で実行可能なアルゴリズムを開発した.今年度取り組んだ融合モデルでは,部分的な問題を高速に解くことが重要である.そのためには,問題の構造を活用した効率の良いアルゴリズムの開発が必要である.問題の構造としてネットワーク構造と二次錐構造を明らかにし,それらを活かしたアルゴリズムを開発した.このことから,おおむね順調に推移していると判断した.今後は,航路計画モデルを解くためのアルゴリズムの改良に取り組み,計算時間をより短縮する方法を追求するとともに,このモデルを船舶スケジューリングモデルと融合するための具体的なモデルの開発に取り組む.また,開発モデルの性能を評価するために,当該分野で使用されているベンチマーク問題のフォーマットを拡張する.さらに,航路計画・船舶スケジューリングモデルと補完的な位置付けにある,船隊構成決定・航路ネットワーク選定手法と相互に及ぼす影響の解析も行う.今後は,開発した融合モデルを計算機プログラムのチューニングを行い,様々な問題例に対して安定的に動作するように改善を実施する.また,航路計画・船舶スケジューリングモデルと補完的な位置付けにある,船隊構成決定,訪問港・航路ネットワークの選定を行うための数理モデルの解析を行う.これにより,過不足のない効率な海上輸送を実現するための最適化・シミュレーションモデルを構築する.当初予定していた費用のうち,次年度使用額とする主なものは,物品費,旅費とその他である。物品費は数理最適化ソフトウェアの購入のために用いる予定であったが,今年度のアルゴリズムの改良結果により,購入するべきソフトウェアの種類を再検討することが妥当だと判断した.次年度以降,アルゴリズム改良の進捗状況をみつつ,適当なソフトウェアの選定を行いたい.また,旅費とその他の費用は,国内学会における研究成果発表旅費とその参加料を想定していたが,学会発表ではなく研究成果を学術論文として投稿することが妥当だと判断した.そのため,次年度以降にその投稿の準備のために使用する予定である.当初予定していた費用のうち,次年度使用額となる主なものは,旅費とその他費用である.旅費は,学会発表のための使用を想定していた.開発モデルを当該分野における関連研究と十分に比較した上で発表するために,学会での発表を次年度に持ち越したため,次年度に使用することとした.また,その他費用は,国内外の学会における学会参加費と論文投稿に関わる投稿料・校正費用を想定していたが,上記と同じ理由により,次年度に使用することとした.
19世紀イギリスにおける都市空間の再編と動物観の変容

本研究の目的は、主に19世紀ロンドンを舞台に、都市における人間と動物との関係の歴史的な変化を考察することである。人間が動物をどのように認識してきたか、社会のなかで動物がどのように扱われてきたかという問題を通して、動物についてよりよく理解すること以上に、動物を比較対象とした人間の自己認識や、動物がその重要な構成員だった社会のあり方を理解することを目指している。採用最終年度にあたる本年は、3年間の研究成果を公表するための準備に専念してきた。具体的には、単著London Zoo,1828-1859:Cultural Politics,Public Science and Animal Historyの原稿を書き進め、8割程度完成した。なお、最終的な史料の確認、分析等のため2010年2月と3月に、ロンドンのブリティッシュ・ライブラリとウェルカム・ライブラリにてリサーチを行った。原稿執筆以外には、2009年6月にロンドン歴史学研究所で行われたカンファレンスにおいて、'Animals in the Metropolitan Landscape:London,1820-1860'を発表した。この研究報告は、19世紀ロンドンの正負両方のイメージに動物の存在が大きな影響を与えたことを明らかにした。また、それに関連して、都市における人間と動物との関係が変化していたことも論じた。上記の通り研究を実施したこととあわせて、『史学雑誌』編集部の依頼により、「(書評)『チャリティとイギリス近代』」を執筆した。チャリティは広義には、社会的弱者の救済だけではなく、「公益」をなす理念、施設、実践を意味する。その意味で、これまで公共文化施設について研究してきた自分が、本書から得られたものは大きかった。2 19世紀イギリス議会資料を網羅的に調査し、科学的な知識の普及に貢献した英国博物館の発展過程を分析した。1753年に設立された英国博物館を運営したのは、それを目的に設置された理事会である。この理事会に公共文化財を信託するという制度がどのように確立されたのかに着目し、183070年代のイギリスの文化政策を分析した。具体的には、(1)積極的な文化政策を展開しなかったと評価されるイギリス政府が、実際には英国博物館の運営に関して重要な介入政策をとったことを明らかにした。(2)大陸諸国における国家主導の文化振興策を理想とする批判を、その歴史的な文脈に置き相対化したうえでイギリスの特殊性を理解することを目指した。(3)ヴィクトリア期の「自由主義国家」と「市民社会」の形成という観点から、政府の文芸科学支援策が果たした役割を考察した。3 19世紀ロンドンの「幸福な家族」と呼ばれる動物の見世物に焦点をあて、日記、書簡から雑誌記事まで多様な史料を用い、当時の人々の動物観を多角的に分析した。人間が動物をどのように認識してきたか、社会のなかで動物がどのように扱われてきたかという問題を通して、動物についてよりよく理解すること以上に、動物を比較対象とした人間の自己認識や、動物がその重要名構成員だった社会のおり方を理解することを目指している。採用2年度目にあたる本年は、昨年行った史料収集と分析に基づいて、以下の論文を発表した。まず、「『幸福な家族』の肖像-19世紀ロンドンの動物史」(『史学』)は、ロンドンを中心にイギリス各地を巡業した動物の見世物の分析を通じて、動物を比較対象とした人々の自己認識や社会観を考察した。次に、11月に行われた第3回韓日英国史フォーラムにおける報告をもとに、'Mechanisms and Meanings of Scientific Enterprise'(Korean Journal of British History)を発表した。この論文は、ロンドン動物学協会と東インド会社による、ヒマラヤ産野鳥のスコットランド高地への気候順化の試みを、その遂行に携わった多様な人物の視点から分析したものである。19世紀イギリスにおいて人々の動物観に影響をあたえたと思われるもののなかに、自然史の標本等を収集・展示した博物館の普及がある。このことに関連して、当時はまだ自然史部門が分離されていなかった英国博物館の管理・運営方法を考察した。具体的には、博物館の管理・運営を独立した理事会に委ねるという制度がどのように確立されたのかに着目し、183070年代のイギリスの文化政策を分析した。その成果は、「英国博物館の再編と『信託管理』の確立-183070年代のイギリスの文化政策」(『史学雑誌』)として発表された。

この研究報告は、19世紀ロンドンの正負両方のイメージに動物の存在が大きな影響を与えたことを明らかにした。また、それに関連して、都市における人間と動物との関係が変化していたことも論じた。上記の通り研究を実施したこととあわせて、『史学雑誌』編集部の依頼により、「(書評)『チャリティとイギリス近代』」を執筆した。チャリティは広義には、社会的弱者の救済だけではなく、「公益」をなす理念、施設、実践を意味する。その意味で、これまで公共文化施設について研究してきた自分が、本書から得られたものは大きかった。
複製開始因子ORC1と細胞周期制御とのクロストーク異常と細胞のがん化

ヒト細胞において、G1/S期に特異的なORC1の発現によるORC複合体の形成と染色体複製、細胞増殖と間に密接な関係があるという以下の知見を得た。(1)ヒトORC1は増殖中の細胞のG1後期からS初期にかけて発現し、クロマチンと核構造の両方に相互作用すること、ORC1のS期の分解にプロテアソーム分解系が関与していることを明らかにした。(2)ORC2,-3,-4,-5からなる複合体(ORC2-5複合体)は細胞周期をとおして存在し、G1/S期にORC1が発現するとORC1,-2,-3,-4,-5からなるORC1-5複合体が形成されることを明らかにした。(3)ORC2-5複合体は、細胞周期をとおしてクロマチンと相互作用すること、ORC1との複合体形成によりG1/S期に一過的に特殊な核内の構造と相互作用することを明らかにした。(4)G1/S期におけるORC1-5複合体の形成が、複製ヘリケースであるMCMのクロマチンおよび核構造へのローディングに関与することを明らかにした。本年度の助成により、ORC複合体とそれを基点とする複製因子の集合、ひいてはクロマチン・核構造との相互作用のダイナミクスと、細胞周期制御とのクロストークの一端がを明らかになった。その意味で、この複製複合体の特性の変動がチェックポイント、細胞分化に異常を引き起こすというシナリオに歩近づけたものと考えている。現在、実際のがん組織におけるORCの発現、制御の検討を共同研究として始めており、細胞の異常増殖におけるORCの関与が明らかになるものと思われる。さらに、LC/MS/MSによる微量蛋白質同定技術を安定して運用できるまで確立したので、ORCサブユニットと相互作用する因子の同定、解析を行うことにより、複製開始因子ORCが基点となる細胞周期およびチェックポイント機構のネットワークを構成する分子の実体が明らかとなり、そのクロストーク異常として細胞のがん化を捉えることが可能となると思われる。
遺伝子治療への利用を目的とする普遍的プロモーターの開発

今日、多数のマイクロサテライトマーカーを用いた連鎖解析などを含むゲノム解析技術の進歩にともない、遺伝性疾患における原因遺伝子の同定が次々となされつつある。さらには、遺伝子工学、その他の技術の発展により、正常な遺伝子を成体に導入し、機能回復させる遺伝子治療も実際に行なわれ始めている。そこで、外来性遺伝子を導入する場合、その発現量や発現の場所が重要であり、導入遺伝子の効果を効率良く発揮させるため、細胞や組織で高い発現を示す適当なプロモーターを選ぶことが必要である。これまでに、我々の作製したpCAGGSベクターが様々な細胞で高いレベルで発現することを明らかにしている。そこで、このpCAGGSベクターが生体内でどのような発現を示すかを検討するため、このベクターを用いてトランスジェニックマウスを作製し、発現レベルおよび細胞を検索した。主要組織適合抗原複合体(MHC)クラスIのβ2-ミクログロブリン(BMG)遺伝子をこのベクターに組み込んだDNAを導入したトランスジェニックマウスを作製し、各組織におけるBMGの発現をノーザン法により解析した。その結果、検討したすべての組織で高い発現が認められた。さらに、同様なプロモーターにつないだクラスIL^d遺伝子を導入したトランスジェニックマウスと交配し、ダブルトランスジェニックマウスを作製した。その発生過程における発現を免疫組織化学的手法により解析した結果、胎生15日胚においてクラスIが強く発現していることがわかった。以上、このpCAGGSベクターは、ほぼすべての細胞で強く発現し、また、発現する時期もほぼ恒常的であることが示唆され、遺伝子治療に用いるベクターとして非常に有効であると考えられる。
同位体置換法中性子回折およびX線回折による生体関連分子の水和構造解析

水溶液中における生体関連分子の挙動を明らかにするためには、生体関連分子が有する官能基毎の水和構造を部分構造レベルで解明する必要がある。しかし、溶液中では様々な分子間構造が互いに重なり合うため、単一の回折実験では複雑な生体分子の水和構造を明らかにする事は困難であった。本研究では、代表的な生体関連分子に対して同位体置換法中性子回折実験を行い、生体関連分子の官能基毎の水和構造を実験から明らかにした。本研究で構造解析を行った溶液系は以下のとおりである。・4mol%安息香酸リチウム重水溶液に対して、^6Li/^7LiおよびH/D(ベンゼン環水素)同位体置換法中性子回折実験により、溶液内のLi^+の水和構造を求め、およびベンゼン環水素原子周囲の水和構造をはじめて明らかにした。・10mol%炭酸カリウム重水溶液に対して^<12>C/^<13>C同位体置換法中性子回折実験を行い、炭酸イオン周囲には約9個の水分子が水素結合を形成している事を見出した。・18mol%アラニン酸リチウム重水溶液に対して^6Li/^7Li、^<14>N/^<15>NおよびH/D同位体置換法中性子回折実験を行い、溶液中のアラニン酸イオンのアミノ基N原子、メチル基H原子、メチン基H原子周囲の水和構造の詳細を明らかにするとともに、Li^+...アラニン酸イオン間構造に関する知見を得た。・15mol%ギ酸ナトリウム重水溶液に対して^<12>C/^<13>CおよびH/D同位体置換法中性子回折実験を行い、カルボキシル基周囲の水和構造を明らかにした。・15mol%尿素重水溶液に対して^<12>C/^<13>C同位体置換法中性子回折実験を実施し、尿素分子のカルボニル基周囲の水和構造をはじめて明らかにした。・5mol%グルタミン酸ナトリウム重水溶液に対して^<14>N/^<15>N同位体置換法中性子回折実験を行い、グルタミン酸分子のアミノ基周囲の水和構造に関する詳細な知見を得た。水溶液中における生体分子の挙動を明らかにするには、生体分子そのものの水和構造、特に生体分子を取り巻く最近接水分子との相互作用を解明する必要がある。生体分子は複数の官能基を有し、各々の官能基毎に特徴のある水和構造をとる。本研究では、同位体置換法中性子回折実験およびX線回折実験等の実験手段を用いて、水溶液中における生体関連分子の官能基毎の水和構造について研究を行い以下の成果を得た。1.生体分子に普遍的に存在するカルボキシル基周囲の水和構造を明らかにする目的で、8mol%酢酸ナトリウム重水溶液に対して^<12>C/^<13>C同位体置換法中性子回折実験を実施し、カルボキシル炭素周囲における水分子の構造情報を含む干渉項の差Δ_C(Q)および分布関数G_C(r)を得ることができた。カルボキシル基周囲には4.0(1)個の水分子が各々1つの水素原子をカルボキシル基の酸素に向ける配向を取っており、最近接C【triple bond】D_W距離は2.63(1)Åである事が明らかになった。2.アミノ酸分子の光学活性の違いが溶液中の分子間水素結合構造に及ぼす影響を検討するために、2.5mol%DL-アラニンおよびL-アラニン水溶液に対してH/D同位体置換法中性子回折実験を行った。その結果、DおよびL体分子の等量混合物であるDL-アラニン水溶液中に比較して、L-アラニン分子のみを含む重水溶液中の方が、分子間水素結合が約2%弱いことを初めて見出した。3.水溶液中におけるフォルミル基水素周囲の水和構造を調べる目的で、12mol%ギ酸リチウム水溶液に対してH/D同位体置換法中性子回折実験を行った。実験から得られたフォルミル水素周囲の構造情報を含む干渉項の差Δ_H(Q)の最小二乗法解析より、溶液中におけるギ酸分子内構造およびフォルミル水素周囲の水和構造に関する詳しい知見を得た。・18mol%アラニン酸リチウム重水溶液に対して^6Li/^7Li、^<14>N/^<15>N

およびH/D同位体置換法中性子回折実験を行い、溶液中のアラニン酸イオンのアミノ基N原子、メチル基H原子、メチン基H原子周囲の水和構造の詳細を明らかにするとともに、Li^+...アラニン酸イオン間構造に関する知見を得た。・15mol%ギ酸ナトリウム重水溶液に対して^<12>C/^<13>CおよびH/D同位体置換法中性子回折実験を行い、カルボキシル基周囲の水和構造を明らかにした。・15mol%尿素重水溶液に対して^<12>C/^<13>C同位体置換法中性子回折実験を実施し、尿素分子のカルボニル基周囲の水和構造をはじめて明らかにした。・5mol%グルタミン酸ナトリウム重水溶液に対して^<14>N/^<15>N同位体置換法中性子回折実験を行い、グルタミン酸分子のアミノ基周囲の水和構造に関する詳細な知見を得た。
糸球体上皮細胞傷害に起因する腎臓病の研究

慢性腎不全の特徴である糸球体硬化症とpodocyteの傷害の間の因果関係を明確にするために、我々は、イムノトキシン(LMB2)の投与によりpodocyte特異的な傷害を誘導できるトランスジェニック(TG)マウス(NEP25)を作成した。LMB2投与後にNEP25マウスは、podocyte、および二次的に他の糸球体細胞を傷害し、急速に糸球体硬化へと進展した。Cre-loxPを利用したpodocyte系譜の標識により、podocyteは分化マーカーの消失のみならず、欠落し、他の細胞に変換しない事が示された。キメラマウスを用いた研究から、podocyteの傷害は、隣接するpodocyteの二次的傷害をもたらす事が明らかになり、podocyte傷害が自動拡大する悪循環の存在が示唆された。また、podocyte病であるHIV-1関連腎症の研究のため、podocyteにHIV-1の遺伝子を発現するTGマウスを作製した。その結果、FVB/Nの遺伝的背景と、vprとnefの相乗作用によって、特徴的な腎症が発症する事が示された。NEP25、HIV-1 TG両モデルにおいて、尿管を閉塞させると、podocyteおよび糸球体の病変は劇的に予防され、podocyte傷害の拡大には、糸球体濾過が関与する事が示された。また、Angiotensin II受容体阻害剤によっても、NEP25、HIV-1 TGの糸球体病変が軽減した。常染色体優性FSGSの原因である変異α-Actinin-4をpodocyteで発現するTGマウスは、緩やかな経過でFSGSを発症した。NEP25マウスとのダブルTGを用い、変異α-Actinin-4はLMB2による糸球体病変を軽減する事を明らかにした。以上のように、様々な原因に起因するpodocyteの傷害が、濾過に依存して糸球体内に自動拡大し、糸球体硬化症が成立する事が示された。1.NEP25マウスの糸球体上皮細胞のみならず他の糸球体細胞が傷害され、急速に糸球体硬化症に陥る事を示した。詳細な経時変化の定量解析を進めている。2.NEP25マウスにおいて、片側尿管閉塞により、糸球体傷害が劇的に軽減する事が判明した。3.NEP25マウスに、SCIDの遺伝形質を導入したが、血中immunoglobulinは変わらず、またimmunotxin投与後の腎傷害も変化なかった。またBSA投与では、糸球体傷害には影響を与えなかった。4.NEP25マウスの腎傷害が、アンジオテンシン受容体(AT1)拮抗薬により、若干軽減される傾向を見出した。レチノイン酸には、治療効果が認められなかった。5.NEP25マウスにStreptozotocinを投与して糖尿病にした。一部の糖尿NEP25マウスは、immunotoxin投与後早期に死亡した。結果的に生き残ったマウスを比較したが、糖尿と非糖尿NEP25マウスの腎障害に差はなかった。高血糖が、糸球体上皮細胞の傷害を増悪するという仮説の検定には至らなかった。6.傷害された糸球体上皮細胞のたどる運命を解析するべく、交配により、NEP25とNephrin-Cre遺伝子を持ち、かつROSA26に関してホモであるトランスジェニックマウスを作製した。7.NEP25マウスとROSA26トランスジェニックマウスから構成されるキメラマウスを作製し、トキシンを投与した。ROSA26由来細胞にも傷害が認められた。