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中国における砂漠化防止と砂丘地利用に関する研究

本研究は,中国東部の湿潤,半湿潤および半乾燥型河岸砂地における砂漠化防止ならびに農業開発に関する問題点の探索を目的として,3カ年計画で行った大学間協力研究である。1.研究実施経過平成元年には湿潤型砂地として長江下流域の南昌地区,平成2年には半湿潤型砂地として黄河下流域の禹城・夏津地区,北京市郊外氷定河流域の大興地区,および半乾燥型砂地として東北部の奈曼地区を調査した。平成3年には蘭州沙漠研究所でセミナ-を開催し,また沙坡頭試験站を視察した。一方,中国側研究分担者を3年間に延べ4名日本に招いて鳥取県内砂丘地を調査すると共に,平成3年には鳥取大学でセミナ-を催した。2.現地調査結果(1)南昌地区南昌市郊外のガン江流域砂地面積は南昌市だけで8,300haに達する。北緯28゚25',年降水量1,600mmでその85%は17月に降る。年平均気温は17.3°Cで鳥取より約3°C高い。蘭州沙漠研究所南昌試験站を拠点に,砂丘地の植林や果樹,野菜など換金作物を中心とした農業利用が進められている。温度や降水量に恵まれ,立派な農園も散見されるが,砂地の農業開発はまだその緒についた段階である。(2)禹城・夏津地区山東省の黄河流域砂地は123万haもあり,風食被害耕地は74万haに達する。その代表地点の禹城市郊外に蘭州沙漠研究所禹城試験站がある。北緯37゚08',年平均気温は13.1°C,年降水量616mmで68月にその68%が降る。禹城県では海拔20m前後の沖積平原に1,098haの砂荒地がある。砂地利用計画は,自然条件に基づいて4区の分けて進められている。現在887haが開拓され150haの果樹園が完成している。夏津市は禹城の西約80kmにあり,夏津県内にある18,700haの砂地のうち8,670haが改良されている。しかし,春の風砂害と夏の水食によって作物生産は極めて不安定である。(3)北京地区北京は北緯約40゚,年平均気温12.5°C,年降水量641mmでその75%が68月に集中する。北京南部の氷定河その他の河岸に59,000haの砂地がある。氷定河沖積砂地に大興試験站が1987年に設置され,各専門の研究者を配置して園芸作物とくに果樹に重点を置いた近郊園芸地帯の開発を目指している。(4)奈曼地区北緯約43゚,降水量340450mm,海拔250570mの起伏に富んだ奈曼県は,総面積8,159km^2でそのうち62%は砂地である。春の強風,夏の集中降雨,秋の冷涼と快晴,冬の酷寒という厳しい地帯である。自然条件,社会経済状態によって3つの経済区に分けて農業開発を行っているが,砂漠化土地は県全体の60%に達し,現在も砂漠化が進行中である。3.日本の砂丘農業調査中国側研究分担者を招待して鳥取県における砂丘地の開発と農業利用の実態を調査すると共に,蘭州沙漠研究所において日本側分担研究者から「日本における砂丘とその農業利用」について詳しく紹介した。その結果,高度に発達した日本の砂丘農業が中国の研究者に強い感銘を与えた。4.まとめ中国東部の河岸砂地4地区の平均気温をみると,南昌は日本南部,禹城と北京は日本の東北地方,奈曼は北海道とそれぞれ大差がない。雨量は南昌を除くと日本の1/31/4に過ぎないが,夏雨型であるため植物生育に有利である。砂漠化は,ことの奈曼では深刻であり,他の地区でも風砂害や水食が絶えない。各地区とも砂地の農業開発が推進されており,果樹などの換金作物の生産が重視されている。しかし,砂防林の造成,潅・排水施設の整備,土地改良,作物の選択と栽培技術等のいずれも極めて不充分である。日本の海岸砂丘の砂防造林,砂丘地農業の発展経過は,中国の河岸砂地の砂漠化防止と農業開発にとって大いに参考になると考えられる。

北緯28゚25',年降水量1,600mmでその85%は17月に降る。年平均気温は17.3°Cで鳥取より約3°C高い。蘭州沙漠研究所南昌試験站を拠点に,砂丘地の植林や果樹,野菜など換金作物を中心とした農業利用が進められている。温度や降水量に恵まれ,立派な農園も散見されるが,砂地の農業開発はまだその緒についた段階である。(2)禹城・夏津地区山東省の黄河流域砂地は123万haもあり,風食被害耕地は74万haに達する。その代表地点の禹城市郊外に蘭州沙漠研究所禹城試験站がある。北緯37゚08',年平均気温は13.1°C,年降水量616mmで68月にその68%が降る。禹城県では海拔20m前後の沖積平原に1,098haの砂荒地がある。砂地利用計画は,自然条件に基づいて4区の分けて進められている。現在887haが開拓され150haの果樹園が完成している。夏津市は禹城の西約80kmにあり,夏津県内にある18,700haの砂地のうち8,670haが改良されている。しかし,春の風砂害と夏の水食によって作物生産は極めて不安定である。(3)北京地区北京は北緯約40゚,年平均気温12.5°C,年降水量641mmでその75%が68月に集中する。北京南部の氷定河その他の河岸に59,000haの砂地がある。氷定河沖積砂地に大興試験站が1987年に設置され,各専門の研究者を配置して園芸作物とくに果樹に重点を置いた近郊園芸地帯の開発を目指している。(4)奈曼地区北緯約43゚,降水量340450mm,海拔250570mの起伏に富んだ奈曼県は,総面積8,159km^2でそのうち62%は砂地である。春の強風,夏の集中降雨,秋の冷涼と快晴,冬の酷寒という厳しい地帯である。自然条件,社会経済状態によって3つの経済区に分けて農業開発を行っているが,砂漠化土地は県全体の60%に達し,現在も砂漠化が進行中である。3.日本の砂丘農業調査中国側研究分担者を招待して鳥取県における砂丘地の開発と農業利用の実態を調査すると共に,蘭州沙漠研究所において日本側分担研究者から「日本における砂丘とその農業利用」について詳しく紹介した。その結果,高度に発達した日本の砂丘農業が中国の研究者に強い感銘を与えた。4.まとめ中国東部の河岸砂地4地区の平均気温をみると,南昌は日本南部,禹城と北京は日本の東北地方,奈曼は北海道とそれぞれ大差がない。雨量は南昌を除くと日本の1/31/4に過ぎないが,夏雨型であるため植物生育に有利である。砂漠化は,ことの奈曼では深刻であり,他の地区でも風砂害や水食が絶えない。各地区とも砂地の農業開発が推進されており,果樹などの換金作物の生産が重視されている。しかし,砂防林の造成,潅・排水施設の整備,土地改良,作物の選択と栽培技術等のいずれも極めて不充分である。日本の海岸砂丘の砂防造林,砂丘地農業の発展経過は,中国の河岸砂地の砂漠化防止と農業開発にとって大いに参考になると考えられる。中国の大河流域に分布する河岸沙地について,前年度は亜熱帯湿潤型沙地に属する長江支流域の南昌市郊外を調査した。本年度は,8月下旬から9月上旬にかけて温暖帯半湿潤型沙地に属する黄河下流域の禹城・夏津地区,および亜寒帯半乾燥型沙地に属する西遼河上流域の奈曼旗(ナイマンチ-)において現地調査を行った。禹城・夏津地区は年平均降水量約600mmで,土壌は黄河の滞積物から成り,地形は傾斜がかなり緩やかで,畑面が平坦になるよう耕地が造成されている。水路は用排水兼用で,調査時期が雨季の末期であったため地下水が上り,排水が悪く,各地に滞水がみられた。禹城地区内には約1,100haの砂地があり,このうち887haが開拓され,150haは果樹園になっている。ブドウ,リンゴ,ナシなどの果樹のほか,落花生,コムギ,インゲンマメ,ゴマ等が栽培されているが,潅排水設備が不充分で高台は旱魃,低地は湿害をうけるため,作物の生産は不安定である。
TDR計測の応用の拡張とその機能特性

TDRの新しい応用を展開し,それらの機能特性を明らかにすることによって,新計測手法を確立することを目的とした.本報告では,行った研究のうち,3つのテーマの成果をまとめている.(1)地表付近の土壌水分分布を計測するために,幅3cmの電子基板に8個のプローブを備えた多点TDRプローブ(MWP)を開発し,その性能について調べた.砂とマサ土における蒸発過程について計測したところ,MWPの利用によってそれら土壌における水分変化の特徴をとらえられることが認められた.(2)水中の土砂の堆積をモニタリングするためのTDR計測法の適用性を調べた.計測において,水の電気伝導度の影響が小さいことを見出すとともに,誘電率と堆砂深との間で線形関係を得た.(3)TDRによる淡水と塩水との境界面の検出を試みた.TDR波形の分析から,境界面のレベルを高精度で推定することが可能であった.同時に淡水の電気伝導度も高精度で測定できることを認めた.TDRの新しい応用を展開し,それらの機能特性を明らかにすることによって,新計測手法を確立することを目的とした.本報告では,行った研究のうち,3つのテーマの成果をまとめている.(1)地表付近の土壌水分分布を計測するために,幅3cmの電子基板に8個のプローブを備えた多点TDRプローブ(MWP)を開発し,その性能について調べた.砂とマサ土における蒸発過程について計測したところ,MWPの利用によってそれら土壌における水分変化の特徴をとらえられることが認められた.(2)水中の土砂の堆積をモニタリングするためのTDR計測法の適用性を調べた.計測において,水の電気伝導度の影響が小さいことを見出すとともに,誘電率と堆砂深との間で線形関係を得た.(3)TDRによる淡水と塩水との境界面の検出を試みた.TDR波形の分析から,境界面のレベルを高精度で推定することが可能であった.同時に淡水の電気伝導度も高精度で測定できることを認めた.本年度は,地表水分計測用のTDRプローブの開発を中心に研究を進めた.地表付近の土壌水分は地上の条件や土壌の透水性と関係深く,土壌面蒸発や植物蒸散を推定する上で大きな影響を及ぼすことが知られている.しかし,地上付近の土壌水分分布の時空間的変化が大きいため,土壌水分の細かい間隔で時間的変化を捉えることが必要である.従来の土壌水分計は大きすぎて,その目的に合わなかったが,TDR水分計のプローブを開発することによってその要件を満たす可能性があった.そこで本研究では,プリント可能な電子基板を用いて,基板上に3mm間隔で9本の線を描いて,隣り合う3本で一つのプローブ,つまり合計で8つのプローブ,として配線を行った.すなわち,この基板は3mm間隔で8点の土壌水分を計測できる多点プローブである.TDRでは,ケーブルテスター,マルチプレクサー,コンピュータを接続し,波形解析や計測制御にはTDR用ソフトであるWinTDRを用いた.まず,多点プローブの個々のプローブについてエタノール,植物油を用いて比誘電率の校正を行った.その結果,個々のプローブ間には誘電率の計測値に多少のずれはあったが,個々の校正式を使えば問題ないことが分かった.次に,本多点プローブに対して砂土の体積含水率と誘電率との関係を調べた.計測したこの関係は,基板を使用しているためTDRの普遍校正式であるToppの式には合わず独自の校正式を作った.これらを準備したあと,砂土とマサ土について,蒸発実験を行い,多点プローブを用いて蒸発過程における体積含水率分布を調べた.その結果,蒸発に伴う地表付近の体積含水率分布が土壌によって大きく異なることが明らかになった.以上のことから,開発したプローブを用いると,これまで測定困難とされていた土壌のごく表層の鉛直水分分布をミリメータ間隔で計測できることを明らかにした.本年度は,TDRに基づく境界面の位置計測法の開発を中心に研究を進めた.実験用カラムに模擬的に水中の堆砂層を設定し,TDRプローブを設置して,パルスの伝播波形を調べた.その波形から堆砂表面位を算出するために,2種の評価法を考えた.すなわち,水中部の伝播波形から算出する部分伝播法と,水中と堆砂層の全伝播波形から算出する全伝播法である.これらの方法について精度を調べた結果,いずれの方法も有用であることが認められた.さらに,TDRによる堆砂表面位と電気伝導度の同時計測を試みた.水の電気伝導度は堆砂表面位とプローブ周囲の電気伝導度から推定した.結果として,堆砂表面位は全伝播法より部分伝播法の方が高い精度を示した.また,この方法を一般の河川に適用する際,エネルギー損失理論に基づけば,計測可能なロッド最大長は4mであることが明らかにした.以上に加えて次の研究も行った.すなわち,(1)静電容量式土壌水分センサーの校正に対する電気伝導度の影響について検討を行い,校正の精度を高めるため3点校正法を提案し,これが電気伝導度の影響の補正に有効かつ簡便な方法であることを認めた,(2)テフロン被覆

TDRプローブを用いた粘性土壌の水分と電気伝導度の同時計測を行い,このセンサーを用いるとカオリナイトのような高電気伝導度性の土壌でも誘電率と含水率との関係が得られることを明らかにした.淡塩水境界面の位置計測に対する時間領域反射法(TDR)の有効性を評価するために,48cm長プローブを用いて,その先端から境界面までの距離h_iの計測の可否と精度を調べた,実験では,約1.75GHz以下^<18)>の広帯域マイクロ波ステップパルスを発信できる1502C型ケーブルテスター(Tektronix)にロッドプローブを接続し,TDR波形の計測制御および記録にソフトウェアWinTDR^<19)>を用いた.海水の電気伝導度に相当するσ_<sw>=5.2Sm^<-1>のNaCl溶液を塩水の代替溶液とし,蒸留水(σ_<fw>=0.0005Sm^<-1>)およびσ_<fw>=0.013,0.1,0.2,0.3,0,4Sm^<-1>のNaCl溶液を水質の異なる淡水の代替溶液とした.実験における各々の溶液温度は約22°Cであった.h_iを評価するために,本法では,プローブに与えたマイクロ波ステップパルスのTDR波形が,塩水によるエネルギー吸収によって急変する特徴を利用した.水質変化を想定し,淡水の電気伝導度σ_<fw>が異なる条件でh_i、を評価した結果,淡水中を伝播するパルスのエネルギー損失が大きい場合,すなわちσ_<fw>が高く,淡水層が厚い場合に属計測が困難になった,しかし,高σ_<fw>条件でも,淡水層が薄くなりエネルギー損失が抑制されると,h_iは計測可能となり,測定誤差は概ね1cm未満となった.また,たとえ境界面が変動しても,計測時に静的な水理条件であれば同等の精度でh_iを評価できることを確認した
抗がん剤の脳腫瘍血管透過性に関する超微形態学的研究

1)ENU経胎盤誘発ラット脳腫瘍血管とヒトグリオーマ血管について超微形態学的に観察し、抗がん剤の脳腫瘍血管透過性に関する研究のモデルとしての有用性を検討した。ヒトグリオブラストーマ5例の超薄切片では、血管内皮細胞の肥厚、pinocytotic vesicle(PV)の増加、short & elongate tight junction(TJ)、irregular basal laminaの出現、peri-vascular spaceの拡大を認め、レプリカではPVは平均23/μ【m^2】に増加し、TJは26条のstrandsを認めた。アストロサイトーマ5例においては、TJは67条のstrandsからなり、PVは30/μ【m^2】と増加していた。一方、ENU経胎盤誘発ラット脳腫瘍の超薄切片では、ヒトグリオーマと同様の所見を示し、レプリカではPVが28/μ【m^2】に増加し、TJは26条のstrandsを認めた。両群の腫瘍血管においてfenestrationは認めなかった。従って両者の脳腫瘍血管の超微形態学的基本構造は類似しており、モデルとして有用であると考えられた。2)シスプラチン含有りポソームを作製し、ENU経胎盤誘発脳腫瘍ラットの内頚動脈より1ml注入した。原子吸光法にて測定した腫瘍側、非腫瘍側の白金濃度はそれぞれ3.31μg/g,0.82μg/gと腫瘍側は治療域に達しており、血液脳関門を通過できると考えられた。リポソーム注入後1時間で固定した脳腫瘍組織の超薄切片では、in vivoと同じ形態をした多重層リポソームが観察された。リポソームは毛細血管内皮細胞のpinocytotic vesicle内にまず取り込まれて、abluminal側へ移動し、不整なbasal lamiraを貫通して後、脳腫瘍細胞内に進入し、一部は細胞内小器管や核にも認められた。血管内皮細胞間のtight junctionにはりポソームは見られず、junctionは通過しないと考えられた。これらの所見は抗がん剤の腫瘍血管透過の増強法を考える上で重要な所見と考えられた。
自己抗体を介する炎症性筋疾患の臨床像・筋病理の解析と病態機序の解明

自己抗体と臨床像、筋病理の関連を明らかにすることで炎症性筋疾患の統合的診断を行い、自己抗体測定の意義を明らかにした。全国から送付された生検筋と血清をもとに、国立精神・神経センター(NCNP)では筋病理診断を、我々はRNA免疫沈降法により自己抗体測定を行った。その結果、抗signal recognition particle (SRP)抗体が従来考えられていたより、高頻度であることが明らかになった。抗SRP抗体陽性例、発症年齢が若く、筋症状は重篤で筋萎縮を伴う傾向にあった。筋病理診断ごとの陽性率は壊死性筋症において高頻度に検出された。抗HMGCR抗体陽性8例(M:F = 5:3)の平均年齢は66歳であり、スタチン内服例は3例であった。症状は2ヶ月以内に進行し、血清CK値はいずれも3000IU/L以上であり初期には横紋筋融解症が示唆された。近位筋優位、左右対称性の四肢筋力低下を全例で認めた。壊死性筋症の筋病理は筋線維の壊死と再生が中心で炎症性細胞浸潤が乏しく、血清中の自己抗体検出が免疫介在性を示唆する根拠となる。抗HMGCR抗体はスタチン内服の有無にかかわらず壊死性筋症で検出され疾患マーカーとしての有用性が示唆された。抗signal recognition particle (SRP)抗体が従来考えられていたより、高頻度であることが明らかになった。患者登録数が800例をこえる炎症性筋疾患の総合的診断プロジェクトは2016年3月で終了した。今後はさらにデータ解析を行っていく予定である。またHLA-DRB1遺伝子のDNAタイピングをPCR-SSOP法により行い,免疫介在性壊死性ミオパチーの免疫遺伝学的背景について検討した.結果はDRB1*08:03 (odds比2.3, p=0.000021)とDRB1*11:01 (odds比2.0, p=0.04)が日本人健常者群に比し患者群で有意に多いことが明らかになった.抗体ごとのサブ解析では抗SRP抗体陽性群におけるDRB1*08:03および抗HMGCR抗体陽性群におけるDRB1*11:01が統計学的に有意に多かった.白人IMNMで行われた先行研究の結果と合致する部分もあり,IMNMは日本人において特定のHLA-DRB1多型と関連することを証明した.研究課題に関する論文は2報発表でき、今後の研究発展に繋がる研究成果である。RNA免疫沈降法では検出できない自己抗体についても更なる検討をすすめる。膠原病内科や皮膚科領域から炎症性筋疾患の新規自己抗体の発見が相次いでいる。しかし、筋疾患を中心に診療にあたる神経内科領域において、これら新規自己抗体の測定意義についてはまだ検討されていない。またこれらの新規自己抗体の多くはRNA免疫沈降法で検出できないため、別の測定系が必要である。培養細胞をS-35で標識した抗原に用いる蛋白免疫沈降法を駆使することでこれら新規自己抗体の同定が可能である。蛋白免疫沈降法は研究代表者がMGの自己抗体を測定する上で実施している方法である。ただし特異的な抗原を用いたELISAの方が簡便であり、また抗体価の測定も可能である。神経内科学RNA免疫沈降法では検出できない自己抗体についても更なる検討をすすめる。炎症性筋疾患の一型で臨床的診断が困難で難治性の経過をとるanti-SRP myopathyに注目する。最適な免疫治療と長期的な神経学的予後を明らかにするため、全国の主治医に対して追跡臨床調査を実施する。診断から2年以上経過した症例に関して施行した免疫治療、その反応性、神経学的予後(modified Rankin scaleなど)について調査する。この結果からanti-SRP myopathyの最適な治療の提言を行う。最終的にはn = 100の臨床情報の解析を目標にしている。抗体測定が順調に進み、想定していよりも少ない測定回数で有意な結果が得られたため。プラスチック器具などの消耗品に使用する予定。我々の研究と臨床に関する最新情報を患者さんや研究者に提供する目的
ゲノム情報科学の新展開(総括班)

本総括班は、「ゲノム情報科学の新展開」(略称:ゲノム情報科学)を有機的かつ円滑に運営し、研究、を効率良く進めるとともに、バイオインフォマティクスの推進を図るために設けられた。また、国内の関連プロジェクトやセンターとの連絡調整機能も果たす。本特定領域の設置期間である平成12年度から平成16年度中に開催した班会議や公開シンポジウムの中で主なものを以下に示す。・国際オントロジーワークショップ(3回:日本2回、ドイツ1回)・ゲノム特定4領域合同班会議(5回:東京1回、神戸3回、福岡1回)・ゲノムひろば(8回:東京2回、福岡3回、京都3回)・ゲノム情報国際会議(5回:東京3回、横浜2回)・公開ワークショップGenProc(4回:東京)この他に、科学技術振興機構(JST)バイオインフォマティクス推進センターと共催で、ゲノムリテラシー講座(20回)を開催した。また、ゲノム研究を一般向けに紹介するDVDを教育関係者等に配布した。これらの活動と並行して、ゲノム情報科学の人材養成、人材発掘を目的としてバイオインフォマティクスプログラミングコンテストを計3回催した。また、ゲノム情報科学を始めとするゲノム特定4領域の成果であるデータベースや解析ソフトウェアの一覧をインターネット上で公開した。さらに、研究成果公開のためのサーバの整備を行った。研究の推進と関係者の情報交換を図るために総括班に設けている「オントロジー整備委員会」、「ソフトウェア高速化および共有化委員会」、「タンパク質高次構造に関する情報流通・予測評価委員会」では、それぞれ、情報抽出やオントロジー構築のためのリソース整備、バイオ研究のためのグリッドコンピューティングの環境整備と利用技術開発、タンパク質高次構造からのゲノム機能解明、などについて講演、討論、情報交換などを行った。ゲノム情報科学の推進を図るために班会議、シンポジウム、講習会等を開催した。平成12年度に催した中で主なものを以下に示す。・合同班会議&個別班会議(9月23日、静岡)・第5回バイオインフォマティクス講習会「ヒトゲノム計画とインターネット」(7月24日、東京)・「ゲノム生物学」と「ゲノム情報科学」交流会(12月8日、東京)・分子生物学会ワークショップ「ゲノム情報科学の新展開」(12月15日、神戸)・高次ゲノム情報国際シンポジウム(1月22日23日、東京)・「ゲノムリテラシー講座-アノテーションのインフォマティクス-」(3月8日(木)10日、東京)また、「オントロジー整備委員会」と「ソフトウェア高速化および共有化委員会」との2つの研究推進委員会を設けて、特定領域研究C「ゲノム情報科学」全体で必要と思われる作業やそのための体制作りを行った。具体的には、「オントロジー整備委員会」ではBio Term Bankと呼ぶ、ゲノムサイエンスを記述する用語の総カタログ作りに着手した。これはゲノム分野のデータ統合と知識発見のリソースとして欠かせないものである。また、「ソフトウェア高速化」委員会では、並列処理の専門家のこの分野への参入およびゲノム研究者との共同研究を促すための会合や勉強会を開催した。さらに、大規模な並列計算機を導入し、平成13年度以降展開する予定のゲノム解析用並列処理技術開発のための基盤を整備した。平成13年度中に催した中で、主なものを以下に示す。・第6回バイオインフォマティクス講習会「ヒトゲノム計画とインターネット」(7月20日から21日、東京)・情報系研究者、学生のための分子生物学実習(7月31日から8月2日、東京)・ゲノム4領域合同班会議(8月22日から25日、神戸)・ゲノム情報国際会議(12月17日から19日、東京)

・合同班会議、個別班会議、公開シンポジウム(1月11日から12日、東京)・公開ワークショツプ「構造ゲノム科学としての情報生物学(GenProC2002)」(1月13日、東京)・国際ワークショップ「生命科学のための自然言語処理とオントロジー構築」(2月18日から20日、東京)・公開シンポジウム「自然言語処理とゲノムオントロジー」(2月20日、東京)また、上記活動と並行して、大規模並列計算機を3台購入して、それぞれ、ホモロジーモデリングによるタンパク質立体構造の網羅的予測、高精度ヒト遺伝子地図作成と転写制御解析用アノテーション、遺伝子ネットワークの相互作用推定のための大次元数値最適化計算を支援した。このうち、最初の2つの研究成果はすでにデータベースとして公開され、多くの研究者から利用されている。さらに、現在世界的に競争になっている、あるいは、研究者の需要が高いソフトウェアやデータベースの開発の支援を行った。これらについてもその多くがすでに公開され、研究者の利用に供している。研究の推進と関係者の情報交換を図るために、総括班に設けている「オントロジー整備委員会」と「ソフトウェア高速化および共有化委員会」では、論文からの情報抽出のためのタグ付コーパスの作成と普及、XMLによるデータベース標準化、GRID GAによる超並列パラメタ最適化プラットホーム構築、などについて講演、議論、作業を行った。ゲノム情報科学の推進を図るために班会議、シンポジウム、講習会等を開催した。平成14年度中に催したものの中で主なものを以下に示す。・第7回バイオインフォマティクス講習会「ヒトゲノム計画とインターネット」(7月、東京)・情報系研究者・学生のためのゲノムシークエンス講習会(7月、横浜)・ゲノム4領域合同班会議(8月、神戸)・ゲノムひろば(11月、東京、福岡、京都)・ゲノム情報国際会議(12月、東京)・ゲノム情報科学成果公開シンポジウム(1月、東京)・公開ワークショップGenProc2003(1月、東京)この他に広報活動の一環として一般向けビデオとパンフレットの作成を行った。また、これと並行して、ゲノム情報科学の人材養成、人材発掘を目的として、バイオインフォマティクスプログラミングコンテストBIP2003を開催した。57件の応募があった。また、ゲノム情報科学の成果を国際的な普及を目指して、計画班で開発されたデータベースやソフトウェアの公開支援を行った。現在約50件のデータベースやソフトウェアがインターネット上で公開され利用されている。研究の推進と関係者の情報交換を図るために、総括班に設けている「オントロジー整備委員会」と「ソフトウェア高速化および共有化委員会」では、情報抽出やオントロジー構築のためのリソース整備と共有化、バイオ研究のためのグリッドコンピューティングの環境整備(2003年3月現在で25サイト、115ノード、203CPUがインターネットを介して結合している)、などについて講演、討論、情報交換、作業などを行った。
尿路癌浸潤における腫瘍関連マクロファージの機能解析と浸潤阻害への応用

われわれはまず、手術で摘出された膀胱癌組織63例(浸潤性膀胱癌23例、表在性膀胱癌40例)を用いて腫瘍関連マクロファージの腫瘍浸潤における機能的解析の初段階として、その分布をCD68/HRPモノクローナル抗体にて免疫組織学的に検討した。その結果、腫瘍組織内での単位面積(0.25mm^2)あたりの腫瘍関連マクロファージ数を測定すると浸潤癌では154.22±11.98、表在癌では49.05±7.76と有意に(p<0.0001)浸潤癌の方が腫瘍関連マクロファージ数が多いことを見出した。また浸潤癌と表在癌での微少血管数を計測すると浸潤癌では71.55±10.44、表在癌では47.02±5.57と有意に(p<0.05)浸潤癌の方が微少血管数が多いことが明らかとなり、これらの腫瘍関連マクロファージ数と微少血管数の間には正相関(r=0.30,p=0.02)がみられることがわかった。この相関の機序として腫瘍関連マクロファージから何らかの血管新生因子が産生分泌されている可能性があるが、詳細については現在検討中である。さらに、全63例において腫瘍関連マクロファージ数の中央値でもって腫瘍関連マクロファージ数の多い群と少ない群の2群に分け5年生存率を比較したところ、腫瘍関連マクロファージ数の多い群が有意に(p<0.0001)少ない群よりも予後が不良であることが明かとなった。したがって膀胱腫瘍において腫瘍関連マクロファージは血管新生に関連して腫瘍の増殖進展に関与していることが示唆された。また腫瘍組織内での単位面積あたりの腫瘍関連マクロファージ数を計測することにより、膀胱癌の予後を推測できることが明らかとなった。膀胱腫瘍摘除標本においてマクロファージの特異的抗体であるCD68モノクローナル抗体を用いて膀胱癌組織中に分布する腫瘍関連マクロファー(TAM)の組織内密度と分布状況を検討した。63例の標本(浸潤性膀胱癌23例、表在性膀胱癌40例)において検討した結果、腫瘍組織単位面積0.25mm2)あたりのTAM密度は浸潤性膀胱癌で154.22±11.98,表在性膀胱癌では49.05±7.76と有意に(p,0.0001)浸潤性膀胱癌でTAM密度が高いことがわかった。またその分布も表在性膀胱癌では希薄で局在的な分布であるが、浸潤性膀胱癌では高密度でしかも腫瘍深部まで浸潤性に分布していた。また、微少血管密度もCD32モノクローナル抗体を用いて検討したが、浸潤性膀胱癌で71.55±10.44,表在性膀胱癌では47.02±5.57と有意に(P<0.0001)浸潤性膀胱癌の方が微少血管密度が高いことがわかった。これらのTAM密度と微少血管密度の間には、正相関(r=0.30 p=0.02)がみられ、膀胱癌においてTAMが血管新生を促進させていることが示唆された。さらに、63例の患者をTAM密度の中央値で高い群と低い群とに分けたところ、5年生存率において有意にTAM密度高値群の方が低値群より予後不良であることがわかった。本研究の中には通常、遠隔転移を起こすことのないと考えられる4名の臨床病期口の表在性膀胱癌の患者ではい、肝臓、骨に転移が見られた患者が含まれていたが、これらの4人はいずれもTAM密度高値群であった。これらのことから、膀胱腫瘍の患者において腫瘍組織のTAM密度を測定することは治療計画や予後判定の上で有用と考えられた。また現在、強力な血管新生因子の一つであるThymidine Phophorylaseの酵素反応で生成される2-deoxy-D-riboseのマクロファージに及ぼす影響を検討しており、腫瘍組織に豊富なThymidine Phophorylaseによりどのような浸潤関連物質が誘導されるのかを培養系マクロファージモデル細胞THP-1を用いて検討している。その結果、preliminaryではあるが、MMP2および9あるいはTNF-alphaが2-deoxy-D-riboseで誘導発現を受けることが観察されている。さらに詳細に検討の予定である。われわれはこれまでの研究から、膀胱癌患者において腫瘍関連マクロファージの腫瘍組織内分布密度が高い症例ほど予後不良であることを報告した。また膀胱癌では血管新生因子であるチミジンホスホリラーゼ(TP)が浸潤性膀胱癌で表在性膀胱癌よりも有意に高発現しており浸潤と関連していることを見出した。そこで今回、定量的real time PCR法によりさらに詳細に膀胱がん浸潤の危険因子・交絡因子の探索、解析を行った。またこれらの因子とTPとの相関についても検討した。(方法)72名の膀胱がん患者より採取した浸潤性膀胱がん標本34検体と表在性膀胱がん標本38検体より抽出したtotal RNAよりcDNAを作製し、定量的real time PCR法(ABI PRISM 7900HT : Applied Biosystems Japan社製)により浸潤関連因子であるMMP-1,MMP-2,MMP-7,MMP-9,MMP-14,TIMP-2,uPA, PAI-1,TS, DPD, TP, VEGFの発現について定量比較した。それぞれの因子の発現量はGAPDHにより補正を行った。さらにTP発現と各因子発現の間の相関について検討し、その機序について検討した。

(結果)表在性膀胱癌と浸潤性膀胱癌におけるmRNA発現レベルを比較解析(logistic regression analysis)すると、MMP-2,MMP-9,TIMP-2,uPA, TPの各因子は表在癌に比べ浸潤癌の方が有意に発現が強かった。なかでもTPの発現によるadjusted Odd ratioは2.413と最も高い値を示した。さらにTP発現と各因子の発現における相関を検討(Spearman's rank test)するとTPとの有意な相関がみられたのはMMP-1,MMP-7,MMP-9,TIMP-2,uPA, PAI-1,DPD, VEGFの各因子であった。そこで、TPの代謝産物である2-deoxy-D-ribose(2DR)によりin vitroで各因子の発現誘導の有無を観察したところ、弱酸性(pH6.5)環境下においてMMP-2,MMP-9,uPAの発現誘導がみられた。従来、2DRによる活性酸素の発生が血管新生因子の誘導の機序と考えられていたが、活性酸素の阻害剤であるN-acetyl cystein(NAC)によるこれらの因子の発現抑制は認められなかった。(考察)これまで腫瘍浸潤に関与していると思われていた因子のうちMMP-2,MMP-9,TIMP-2,uPA, TPは膀胱癌において腫瘍浸潤に関連している可能性が示唆された。なかでもTPは今回検討した因子のうち、浸潤に対するリスクを上げる因子として、最も有力なものと考えられた。また血管新生因子のTPの代謝産物によって弱酸性条件下でMMP-2,MMP-9,uPAの発現が誘導されることは固形腫瘍内のpHが弱酸性(pH5.57.4)であることから考えて矛盾しない結果と思われた。
ホスホリパーゼＡ２を介するマクロファージの変性ＬＤＬ取込みにおける新たな機序解明

shNRAにより、V型sPLA2をノックダウン(KD)したRaw264.7細胞株を確立した(マウスマクロファージ系細胞)。この細胞株では酸化LDLの細胞内への取り込み能と、その後の分解処理能が野生型と比較して遅延、低下しており、この現象を規定している細胞骨格であるアクチンの重合度、Rho GTPaseの活性もV型sPLA2 KD細胞株において低下していた。これらの現象を説明するためのシグナルをスクリーニングしたところ、V型sPLA2 KD細胞株において、Srcの発現と活性が低下しており、V型sPLA2蛋白がSrcのプロモーター領域と相互作用してSrcの発現を調整している可能性が示唆された。Raw264.7細胞に、レンチウイルスベクターによるV型sPLA2のshRNAを導入し、細胞株化した。この細胞で酸化LDL取り込み実験を行い経時変化を見たところ、V型sPLA2のKD細胞では野生型の細胞と比較して酸化LDLを取り込んで消化処理する速度が遅延していることが観察された。この機序を解明するために、酸化LDL取り込み時のアクチン重合度(細胞内輸送に密接に関与している)を各細胞群で比較したところ、V型sPLA2のKD細胞ではそれが低下していた。また細胞内に取り込まれてearly endosomeへと運搬された酸化LDLは、さらにlate endosomeへ転送されるが、V型sPLA2 KD細胞ではlate endosomeへの運搬が遅延していた。これらの現象を規定している細胞内シグナルをスクリーニングしたところ、V型sPLA2 KD細胞ではSrcの発現が恒常的に低下しており、酵素活性も低下していた。このSrcの発現を規定するプロモーター領域をルシフェラーゼ発現ベクターにクローニングし、野生型細胞とV型PLA2 KD細胞にトランスフェクションしてルシフェラーゼの発現を比較したところ、V型PLA2 KD細胞でルシフェラーゼの発現が低下していた。このプロモーター領域を用いてゲルシフトアッセイを行ったところ、V型PLA2の蛋白を添加した際にゲルシフトが観察された。これらの結果は、V型PLA2が何らかの形でSrcのプロモーター領域に作用し、Srcの発現調節に関与している可能性が考えられた。当初、野生型とV型sPLA2のノックアウトマウスから採取した腹腔内マクロファージを使用し、マクロファージによる酸化LDL取り込み実験を開始した。しかしながら当該細胞が初代培養細胞であり、採取できる細胞数が限られていたこと、また細胞の状態が安定せず毎回同様な状態の細胞が得られなかったことなどから、初代培養細胞の使用を断念し、マウスマクロファージの細胞株であるRaw264.7細胞を使用することとした。これにより、野生型の細胞とV型sPLA2のノックダウン(KD)細胞が比較可能である。これらの現象を規定している細胞内シグナルをスクリーニングしたところ、V型sPLA2 KD細胞ではSrcの発現が恒常的に低下しており、この活性が低下しているものと考えられた。以上が初年度の研究成果であるが、これらの事象は、V型sPLA2がマクロファージにおいて酸化LDLを取り込んで泡沫化する現象を正に調整していることを示している。このことは生体内でV型sPLA2を選択的に阻害することにより、動脈硬化が抑制される可能性があることを示唆するものである。shRNAにより、V型sPLA2をノックダウン(KD)したRaw264.7細胞株を確立した。この細胞株においては酸化LDLの結合能が野生型と同様であったにもかかわらず、細胞内へ取り込んでその後に分解処理する能力が野生型と比較して遅延、低下していることを観察した。また細胞内に取り込まれてearly endosomeを形成した酸化LDLは、さらにlate endosomeへと転送されるが、V型sPLA2 KD細胞株ではlate endosomeへの運搬が遅延していた。これらの機序解明のために、酸化LDL取り込み時のアクチン重合度(物質の細胞内輸送に密接に関与している)を各細胞株群で比較したところ、V型sPLA2のKD細胞株では低下していた。

またアクチン重合を規定しているファクターであるRhoGTPaseの活性をpull-down法により比較したところ、V型sPLA2のKD細胞株では野生株よりも低下していた。これらの現象を規定している細胞内シグナルをスクリーニングしたところ、V型sPLA2 KD細胞株ではSrcの発現が恒常的に低下しており、酵素活性も低下していることが判明した。Src遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼ発現ベクターにクローニングして野生型細胞株とV型sPLA2 KD細胞株にトランスフェクションしてルシフェラーゼの発現を比較したところ、V型sPLA2 KD細胞株でルシフェラーゼの発現が低下していた。このプロモーター領域を用いてゲルシフトアッセイを行ったところ、V型sPLA2の蛋白を添加した際にゲルシフトが観察された。また、GFPをプローブとして、細胞にV型sPLA2を発現させたところ、細胞核内での発現が確認された。これらの結果から、V型sPLA2は何らかの形でSrcのプロモーター領域に作用し、Srcの発現調整を行っている可能性があると結論付けた。基礎循環器病学当初の計画では野生型とV型sPLA2ノックアウトマウスマクロファージを使用して酸化LDLの取り込みを比較し、その違いの原因となっている事象とシグナルを同定することが初年度の計画であった。しかしながらマウスの腹腔内マクロファージの初代培養細胞では実験が安定しなかったため、細胞株であるRaw264.7細胞を使用することとした。そのためV型sPLA2をノックダウンする必要性から、細胞にshRNAを導入して細胞株化するところで4か月を要した。したがって、スタートが当初の予定よりも半年ほどずれ込み、現在までの達成度はやや遅れている。当初の計画では野生型とV型sPLA2ノックアウトマウスマクロファージを使用して酸化LDLの取り込みを比較し、その違いの原因となっている事象とシグナルを同定することが初年度の計画であった。研究実績の内容の項でも述べたように、マウスの腹腔内マクロファージの初代培養細胞では実験が安定しなかったため、細胞株であるRaw264.7細胞を使用することとした。これまでV型PLA2 KD細胞で示してきた事象は、Srcの発現低下によるものであることがおおむね説明できる。このデータをもとに最終年度は阻害薬による実験を推進させ、動脈硬化進展に対する新たな治療方法の開発を行ってゆく。初年度の計画で実行できなかった、アクチンの再構成を直接調整しているRho GTPaseの活性化を、作成した細胞株で比較検討する。その後、この事象に関わっているシグナル経路の同定を行う。中でもSrc-Syk-PI3K経路は可能性が高い。以上を同定することと同時進行で、V型sPLA2を過剰発現させたRaw264.7の細胞株を樹立し、酸化LDL取り込み能を評価する。
小胞体ストレスセンサータンパク質の時空間的イメージングによるストレス応答の解析

作用点の異なる様々な小分子化合物によるUPR関連遺伝子群の発現パターンを比較解析した結果,ストレスセンサーの活性とUPR関連遺伝子の発現が化合物の作用点の違いによって少なくとも3パターン存在することが示唆された.UPR(Unfolded Protein Response)は小胞体内の恒常性維持機構である。UPRは3つの小胞体ストレスセンサーの活性化を介して制御されているが、近年、これらセンサーの活性化の強度や速度がさまざまな生理的・薬理的条件で異なることが示唆されている。よって、これら差異を解析することはUPR機構のさらなる理解に繋がると期待される。我々は、3つのセンサーの活性化を3色の蛍光でイメージングする系の構築に取り組んでいる。本年度は、IRE1αの活性化に必要十分なステップ二量体化を分断された蛍光蛋白質の再構成によりタンパク質間相互作用を検出するBiFC法を用いて検出する系の構築を行った。IRE1αのC末端欠損体に青色蛍光タンパク質ceruleanのN末端もしくはC末端断片を結合させた融合タンパク質を設計し、その両方を安定発現する細胞を作製した。通常培養条件下では青色蛍光はほとんど観察されなかったが、小胞体ストレス誘導剤DTTを処理すると青色蛍光が観察された。また小胞体に局在しているIRE1αは二量体化するとドット状の局在に変化するとの報告と同様に、DTT添加による青色蛍光の局在もドット状であった。さらに他の小胞体ストレス誘導剤(tunicamycin、thapsigargin)の添加によっても青色蛍光が観察され、さらにその蛍光はドット状の局在だった。これらより、青色蛍光は融合タンパク質の二量体化を反映していると示唆された。また、青色蛍光を経時的に観察したところ、DTTやthapsigarginは添加1時間後から、tunicamycinは4時間後から顕著に観察され、これらの時系列変化は内在性IRE1α活性化の時系列変化と概ね一致した。以上、本検出系は内在性IRE1αの活性を反映しており、また様々な化合物が誘導するIRE1α活性化速度の差異解析にも有用であると示唆された。小胞体の恒常性維持機構UPR (Unfolded Protein Response)は,小胞体膜上の3つのセンサータンパク質(ATF6, IRE1, PERK)が小胞体内に蓄積した不良タンパク質を認識することで活性化し,様々なUPR関連遺伝子群の発現によって制御されている.これまで,糖鎖修飾阻害剤tunicamycinや小胞体Ca2+ ATPase阻害剤thapsigarginなど作用点の異なる様々な化合物がUPRを誘導することが報告されているが,これら作用点が異なる化合物によるUPR関連遺伝子の発現挙動の違いについて解析した例はなかった.そこで本研究は,作用点が異なるUPR誘導剤7種によるUPR関連遺伝子9種のmRNA量を化合物添加24時間後まで経時的発現挙動を測定した.その結果,それぞれ化合物による9種のUPR関連遺伝子の発現プロファイルはそれぞれ特徴的なパターンを示し,それぞれの化合物の濃度を変えた時の発現プロファイル同士が最も類似していた.よって,UPR関連遺伝子発現プロファイルの違いは化合物の作用点の違いに依存していると示唆された.さらに,化合物毎の遺伝子発現プロファイルを階層的クラスタリングにより比較解析した結果,7種のUPR誘導剤のUPR関連遺伝子発現プロファイルは3つに分類された(グループA,B,C).UPR関連遺伝子の発現は3つのストレスセンサーの活性で制御されているため,次にグループA,B,Cそれぞれに属する化合物群によるセンサーの活性を検討したところ,グループAの化合物は3つのセンサー全てを活性化させていたのに対し,グループBの化合物はPERKとATF6を,さらにグループCの化合物はPERKのみを活性化させていた.よって,ストレスセンサーの活性とUPR関連遺伝子の発現が化合物の作用点の違いによって少なくとも3パターン存在することが示唆された.作用点の異なる様々な小分子化合物によるUPR関連遺伝子群の発現パターンを比較解析した結果,ストレスセンサーの活性とUPR関連遺伝子の発現が化合物の作用点の違いによって少なくとも3パターン存在することが示唆された.我々は,異なる作用点を持つUPR (unfolded protein response)誘導剤7種による9種のUPR関連遺伝子の計時的発現パターンが異なるという実験結果に基づき,UPR関連遺伝子の発現が小胞体膜上に局在する3つの小胞体ストレス・センサータンパク質(ATF6, IRE1, PERK)の活性化に起因するため,「UPR誘導剤によりセンサータンパク質の活性化パターンが異なるのでは?」と仮説を立てた.そこで3つのセンサータンパク質の活性化を3色の蛍光タンパク質(venus, cerulean, mCherry)を用いて検出する系をそれぞれ構築し,仮説を検証するのが目的である.本年度は,ATF6とIRE1の活性化評価系の構築を行った.ATF6は活性化するとそのN末端が小胞体から核内に移行するため,ATF6のN末端に黄色蛍光タンパク質venusを連結させたコンストラクトを作成,核内のvenusの輝度を指標に評価する系を構築した.そしてUPR誘導剤DTTにより核内venus輝度が増加した.今後,他のUPR誘導化合物によるATF6の応答を解析する.IRE1の活性化はBiFC法で評価する系の構築を行った.IRE1は二量体化すると活性化するため,IRE1のC末端に青色蛍光タンパク質ceruleanのN末端(cerN)もしくはC末端(cerC)を連結させたコンストラクトを作成,IRE1二量体化によるcerNとcerCの再構成(輝度)で評価する.

これまで,様々なC末端欠損変異体,IRE1とceruleanを連結させるリンカー,2つのコンストラクトが等量発現するよう2Aペプチドによる連結などを検討し,IRE1のRNaseドメインとKinaseドメインを欠損させた変異体でceruleanの再構成が起きた.今後,この評価系でUPR誘導化合物によるIRE1の応答を解析する.UPRは小胞体内に不良タンパク質が蓄積した時に活性化する小胞体内の恒常性維持機構である。UPRは小胞体膜上に局在する3つの小胞体ストレスセンサー(ATF6, IRE1α, PERK)の活性化を介して制御されているが、近年、これら小胞体ストレスセンサーの活性化の強度や速度が、さまざまな生理的・薬理的条件で異なることが示唆されている。したがって、これらの差異を解析することはUPR制御機構のさらなる理解に繋がると期待される。そこで本研究の目的は、3つのセンサータンパク質の活性化を3色の蛍光でイメージングする系の構築である。これまでにATF6のイメージング及び本年度はIRE1αの活性をイメージングする系の構築に成功した。したがって、残り1年でATF6の活性化をイメージングする系の構築に取り組む。したがって、概ね順調に研究は達成できていると考えている。初年度は3つのセンサータンパク質の活性化を3色の蛍光タンパク質(venus, cerulean, mCherry)を用いて検出する系をそれぞれ構築することであった.本年度は3つのセンサータンパク質のうち,2つのセンサータンパク質についてvenusとceruleanを用いて検出する系を構築できた.しかしPERKの活性化検出系の構築は遅れているため,「やや遅れている」と判断した.ただし,PERKはIRE1と同じく二量体化することで活性化するため,IRE1の活性化検出系の構築で得たノウハウが生かされると考えられる.したがって,この遅れは直ぐに挽回できると期待できる.PERKの活性化をBiFC法によってイメージングする系を構築する。PERKはN末端が二量体化すると活性化することが知られているため、PERKのN末端にmCherryのN末端もしくはC末端断片を融合させ、そのコンストラクトを安定的に発現する細胞系を取得する。そして様々な小胞体ストレス誘導剤を添加した時のセンサーの活性化パターンを測定する。3つのセンサータンパク質のうち,PERKの活性化検出系の構築をおこなう.PERKもIRE1と同じく二量体化することで活性化するため,BiFC法により検出する系の構築を行う.また,すでに構築済みのATF6とIRE1活性化検出については,それぞれのコンストラクトを安定的に発現するHeLa細胞を作成し,でき次第,様々なUPR誘導剤による活性化について測定する.PERKの活性化評価法も構築でき次第,細胞を作成し,様々なUPR誘導剤による活性化について測定する.そして本研究の仮説「UPR誘導剤によりセンサータンパク質の活性化パターンが異なるのでは?」を検証する.PERKの活性化をBiFC法によってイメージングするためのコンストラクトを作るため、遺伝子クローニングや遺伝子改変をする必要がある。
家族性パーキンソン病発症メカニズムを規範とした孤発性パーキンソン病発症機構解析

研究代表者らは、パーキンソン病患者(PD)脳脊髄液で増加傾向にある1BnTIQがβチューブリンに結合し、parkinによるユビキチン化を阻害することを明らかにしてきた。本研究では、PD関連神経毒MPP+を用いて、βチューブリンのユビキチン化に与える影響を調べたところ、これまでに毒性に関する報告が殆どない10μM MPP^+がβチューブリンのユビキチン化を阻害した。また、これに伴ってNonidet P-40不溶性画分におけるβチューブリンも増加した。このようなチューブリンのユビキチン化阻害とそれに伴う蓄積は、PDにおけるドパミン神経細胞死に関与している可能性が考えられる研究代表者らは、パーキンソン病患者(PD)脳脊髄液で増加傾向にある1BnTIQがβチューブリンに結合し、parkinによるユビキチン化を阻害することを明らかにしてきた。このようなチューブリンのユビキチン化阻害とそれに伴う蓄積は、PDにおけるドパミン神経細胞死に関与している可能性が考えられる家族性パーキンソン病の原因として、チューブリンをユビキチン化する酵素の遺伝的機能不全が報告されている。本研究の目的は、孤発性パーキンソン病患者脳脊髄液で増加する1BnTIQによるチューブリンのユビキチン化阻害現象を明らかにし、1BnTIQのような環境因子によるチューブリンのユビキチン化阻害がドパミン神経に及ぼす影響と、パーキンソン病発症との関連について調べることである。平成20年度においては、光親和性標識プローブを用いて1BIQ結合タンパクの検索を行った。得られたタンパク質群をSDS-PAGEにて泳動しPVDF膜に転写させ蛍光検出を行ったところ、50kDa付近に強い蛍光バンドが確認された。またこのシグナルは1BnTIQを蛍光プローブと同時にインキュベートすることにより消失し、タンパク質に結合していないバンドが検出された。したがって、本結合タンク質は1BnTIQを認識することが示唆された。さらに2次元電気泳動で分離同定を行い、検出されたスポットのうち最も強い蛍光スポットをMALDl-TOF massで解析したところβ-tubulinであった。近年、ユビキチン連結酵素の一種であるparkinが脳内でβ-tubulinに結合していることが知られている。1BnTIQがβ-tubulinに結合することでparkin変異と同じ現象であるユビキチン化異常がおこるのではないかと予想し、ユビキチン化されたβ-tubulinの検出を行った。ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Yにおいて1BnTIQを48時間で暴露後、モノクロナール抗β-tubulin抗体で免疫沈降し、抗ユビキチン抗体でウエスタンブロットを行うことでポリユビキチン化されたβ-tubulinの検出を行った。その結果、1BnTIQ暴露によるポリユビキチン化されたβ-tubulinの減少も10μM 1BnTIQ48時間暴露で確認された。パーキンソン病(PD)は、特定の遺伝子異常に起因する家族性PDと、遺伝子異常だけでは説明できず、神経毒のような環境因子の重要な関与が考えられている孤発性PDからなる。ある種の家族性PDでは、parkinという遺伝子に変異が存在し、その遺伝子がコードするParkinタンパク質のユビキチンE3リガーゼの機能が減弱することが発症原因であると考えられている。本年度は、孤発性PDにもParkinの不活性化が関係している可能性を考え、PD関連神経毒によるParkinの不活性化および発現量の変動について検討した。ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞に、孤発性PD患者脳脊髄液で増加している物質である1-benzyl-1, 2, 3, 4-tetrahydroisoquinoline(1BnTIQ)を曝露した後、細胞を回収した。TNE bufferに可溶化したものを可溶性画分、さらに不溶性のものを2%SDS含有Tris-HCI bufferに溶解させたものを不溶性画分とし、各画分のParkinタンパク量をウエスタンブロッティングにより検討した。また、Parkin活性について、細胞系では、抗tubulin抗体で免疫沈降したサンプルを抗ユビキチン抗体でwestern blottingを行うことにより、またin vitro系では、必要な因子を加えたユビキチン化アッセイにより基質であるtubulinのユビキチン化をwestern blottingにより検討した。tubulinのユビキチン化に対する1BnTIQの影響を調べたところ、in vitro系、細胞系ともにユビキチン化の阻害が認められた。また、1BnTIQを細胞に48時間曝露すると、可溶性画分、不溶性画分ともにParkinの発現が誘導された。これらの結果から、1BnTIQによりParkinの不活性化が起こり、その代償機構としてParkin発現が誘導される可能性が示された。

本年度は、昨年度に引き続き孤発性PD患者脳脊髄液で増加している脳内在性物質1-benzyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline(1BnTIQ)によるparkinの基質であるtubulinのユビキチン化阻害を調べるとともに、PDモデル作製に汎用されるMPP+についても同様の作用があるかについて調べた。抗tubulin抗体により免疫沈降し、抗ユビキチン化抗体でウェスタンブロットを行った結果、MPP+は1BnTIQと同様にSH-SY5Y細胞においてtubulinのユビキチン化阻害を引き起こし、その結果1%Nonidet P-40不溶性tubulin量は時間依存的に増加した。またparkinタンパク質自身もparkinの基質となるためparkinタンパク質の蓄積についても調べたところ、1%Nonidet P-40不溶性parkin量はtubulinと同様に時間依存的に増加した。以上の結果より、parkinおよびparkinの基質であるtubulinの蓄積は1BnTIQおよびMPP+といったPD関連物質に共通に認められる現象であり、これらタンパク質の蓄積が孤発性PD発症に関与している可能性が考えられる。