hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンパク質ダイナミクス解明のためのロバストなトラジェクトリ解析法の開発

タンパク質の静的構造の比較や動的変化(ダイナミクス)の研究には信頼のおける構造重ね合わせ法が必要である。本研究では、結晶構造の乱れに関係する占有率と共分散行列の非対角成分の両方を統一して扱える理論的枠組みを開発し、プログラムmmfitcとして実装した。分子動力学シミュレーション結果の解析など、対象構造が多数の場合に、特に有用であると思われる。また、構造が大きく異なる分子が紛れ込んでいる場合に、その影響を受けにくい構造重ね合わせ法も開発した。結晶構造の比較など、対象とする構造があまり多くない場合に有用であると思われる。受容体などタンパク質の機能はダイナミクスと深いつながりがある。分子動力学シミュレーションはその研究の主要な手法のひとつである。本研究は、シミュレーションにより得られるデータ(トラジェクトリ)の解析に利用する手法の開発に関するものであり、構造比較に用いられる構造の重ね合わせ法やダイナミクス解析の主力である主成分分析に改良を施し、外れ値の影響を受けにくい(ロバストな)手法を開発することを目指している。平成27年度から平成28年度にかけて、ロバストな立体構造同時重ね合わせ法の開発を予定している。平成27年度は、そのベースとなる異分散性を考慮した同時重ね合わせ法として、以前開発した混合効果モデルに基づく手法をもとに、一般化最小二乗法(反復重み付け最小二乗法)に類する手法のコードを作成した。分散の推定は、とりあえず、標本分散をLedoitとWolfの方法で縮小する方策をとっている。それにロバストな性質を付与するために、何らかのL1ノルムを利用する方法を検討しているが、実現には至っていない。当初は考慮していなかった正規ラプラス分布による方法に理論面からは期待を持っているが、すべてのズレをL1ノルムで測る手法と同様に、単純で有効な実装法がみつかっていない。検討の結果、計画調書でもふれたL2ノルムとL1ノルムの折衷型が、現実的と判断するに至った。前述のコードをベースにして、小規模な改造で実現できると考えている。なお、将来のソースコードの公開と利用の簡便さを考慮し、同時重ね合わせなどに不可欠である特異値分解と固有値分解の独自の実装を行った。当初は、外れ値について、原子単位のものを想定していたが、より必要なものは、分子単位で外れ値をあつかうものであると考え、それについて検討を続けた結果、正規ラプラス分布を利用する手法が利用できることがわかった。しかし、そのためには、これまで想定していなかった最適化用コードが必要であり、実現にはいたっていない。この検討に時間をとられてしまった。また、特異値分解コードの開発に、やや予定外の時間を要した。本研究は、X線回折や核磁気共鳴法などにより得られた立体構造の集まり、あるいは、分子動力学シミュレーションにより得られた立体構造の集まり(トラジェクトリ)の解析に利用し、ダイナミクスに関する知見を得るような手法に関するものである。具体的には、構造比較に用いられる同時構造重ね合わせ法やダイナミクス解析の主力である主成分分析に改良を施し、外れ値の影響を受けにくい(ロバストな)手法を開発することを目指している。平成28年度は、ロバストな立体構造同時重ね合わせ法の理論の再構築を行った。これまでは、シミュレーションによるデータ(トラジェクトリ)を中心に考えていたが、構造重ね合わせによる構造比較法は、一般には、むしろ、X線回折や核磁気共鳴法による立体構造データへの利用が多い。その場合、結晶構造におけるディスオーダーや占有率に対する効果的な扱いが必要となる。それらについての独自の新規手法を考案した。また、従来は、最尤法において、原子間相関を無視したものしか報告がなされていないが、非対角行列を考慮した推定方程式を導出した。その結果、前年度の一般化最小二乗法に基づくものから、むしろ、一般化推定方程式と一般化モーメント法を組み合わせた方法に類似したものになった。ロバスト性を付与するためのL1/L2折衷型の重み付けと併せて、現在、実装ならびに検証に取り組んでいる。この手法は、単に静的構造の同時重ね合わせにおいて必要というだけではなく、構造の多様性の観点からダイナミクスを検討する際に、有力な手法となると考えている。平成27年度から平成28年度にかけては、ロバストな立体構造同時重ね合わせ法を開発する計画であったが、当初、ディスオーダーや占有率への対応は、本研究で開発する解析法においては重要ではなく、単なる重みとして処理できるものと考えていたが、共分散項を無視しない推定方程式の導出に当たっては、すなわち、これまでの方法が無視している原子間相関を考慮するためには、占有率の扱いに新規の特別な手法が必要となった。その開発に時間が必要であったことが、遅れの第一の原因と考えている。多数のタンパク質立体構造の同時構造重ね合わせにおいて、構成尤度(composite likelihood)に基づく理論的枠組みを平成28年度までに完成させた。この手法は、(1)結晶構造での位置ディスオーダーや占有率を明示的に取り入れていること、(2)作業用分散行列の非対角成分も考慮していることが、従来法にはない特長である。平成30年度は、この理論に基づく同時多重構造重ね合わせ法を実装し、その有効性の検証のための数値実験を行った。その結果、(1)については、それが有効に働くことを確認した。一般に、膨大な数の結晶構造に、0超1未満の占有率の原子が含まれている。これらの多重性はタンパク質機能においても重要かもしれない。

本研究により、開発した同時多重構造重ね合わせはそれらの解析に有用と思われる。また、(2)についても、非対角成分を考慮することで、対象構造数が多数の場合(100程度以上の場合)は、重ね合わせの質が、程度は大きくはないが、改善することが確認できた。ただし、非ゼロ成分数は少数に限定することが有効であった。その手段として、今回は、相関行列上での閾値法と条件数による正則化を開発し、利用した。重ね合わせ後の平均構造や分散、相関行列の精度に改善がみられた。本手法は、特に、分子動力学計算のトラジェクトリーの解析など、対象構造が極めて多数の場合に、特に有用であると思われる。また、今回の数値実験により、一般に重ね合わせ法にはover-fittingに類似した分散要素のバイアスがみられることを明らかにした。その後の主成分分析などに影響が懸念される。以上の結果は投稿中である。さらに、本プログラムにはL21重みを導入した「外れ分子」に対してロバストな重ね合わせ法も実装し、有効性を確認した。タンパク質の静的構造の比較や動的変化(ダイナミクス)の研究には信頼のおける構造重ね合わせ法が必要である。本研究では、結晶構造の乱れに関係する占有率と共分散行列の非対角成分の両方を統一して扱える理論的枠組みを開発し、プログラムmmfitcとして実装した。分子動力学シミュレーション結果の解析など、対象構造が多数の場合に、特に有用であると思われる。また、構造が大きく異なる分子が紛れ込んでいる場合に、その影響を受けにくい構造重ね合わせ法も開発した。結晶構造の比較など、対象とする構造があまり多くない場合に有用であると思われる。立体構造同時重ね合わせについて、当初計画では、通常用いられる二乗和(L2)ノルムが、形式上、二階層であることに着目し、その一方を平方根和(ある種のL1ノルム)とする折衷型の手法も開発する予定であった。この手法も、分子単位の外れ値対策という性質をある程度備えている。平成28年度はそのコードの開発と性能評価を再優先で行う。既に大部分のコーディングは完了しているので、当初予定通り、平成28年度中には完了できるように取り組みたい。また、その際、L1ノルム型の分子間変動への対応だけでなく、分散行列(対角行列)の成分の縮小法についても、検討を行い、分子内異分散性への対応も、より効果的な手法を開発する。立体構造同時重ね合わせ法の実装を最優先する。そこには、ディスオーダー・占有率に相当する欠測値への対応、ならびに、予定通り、分子単位のL1/L2混合型ノルム重みによるロバスト性の付与を行う。また、主成分分析については、その前処理である同時重ね合わせを改良することにより、主成分分析の結果にどの程度の違いがみられるのかを中心に検討する。計算構造生物学進捗状況にやや遅れがあり、国内学会での成果発表を見送ったため、旅費を執行しなかった。代わりに、当初から購入予定であったワークステーションに、より高速な計算が可能となるようにGPUボードを装着した。これらが大きな変更点であったが、総計として、若干の次年度使用額が生じた。
「色音変換発音装置」を利用した視覚障害者用誘導システム

「色音変換発音装置」を利用した視覚障がい者のための「誘導システム」の開発を目的とする本研究については,内蔵予定であった部品の絶版等あり当該年度において開発の完成を延期していた基板制作が,年度後半に至るまでに解決策,代替案が見つからず開発に苦慮した.しかしながら年度後期において,当初より予定していた方式(色センサーによって走査取得したRGBデータを直接的に音階に変換する方法)の不調に対し,解決策として外部記憶装置に予め用意した音源(MP3等)を呼び出す方法が他の開発者より提案された.現在はその試作が成功した段階にあり,鋭意本機搭載用の基板開発をおこなっているところである.基板完成の目途は令和元年6月であり,その後にネットワーク上で検証済の3種のパラメタマッピング(1Analogc{即時的}モード,2Symbolic{恣意的}モード,3Emotional{情動的}モード)について変換プログラムを設定し研究基板の完成を達成する.その後,当該基板を搭載した白杖型装置を用いた本被験者(視覚障がい者)への検証に入る予定.とくに当該装置の方式変更(外部記憶装置に用意した音源を呼び出す方法)については,2Symbolic{恣意的}モード及び3Emotional{情動的}モードの有効利用の拡大につながるもので,相当の期待をもっている.このことの展開によっては,当初予定して本研究の有効性,多様性が,さらにより拡大できるものと考えている.研究全体のまとめについては,本年度(令和元年)中の達成を目指す.当初より予定していた方式の変更にともない,今年度中に完成を延期していた白杖型装置制作がさらに遅れた.しかしながら,解決策である新方式(外部記憶装置呼出し方式)が,それまでは補足的位置付けで構想していたパラメタマッピング(Symbolic{恣意的}モード,Emotional{情動的}モード)の有効性を拡大してくれるものとなり,当初に予定していた研究成果の拡大が見込めるものと考えている.色データの特徴的なパラメタ(変数)を,音のパラメタに対応づける方法である本研究の基幹技術であるパラメタマッピングについての体系化については,ネット環境等においてほぼ終えており,本研究における現行の課題は当該プログラムを搭載した装置の制作である.そのことについても,解決策となる試作機により新方式の目途が立っており(6月完成予定)現在,その制作に注力している.研究の今後については,当該新方式が,当初予定していた研究成果を大幅に拡大してくれるものと想定できることから,その目的についての変更(拡大)をおこないその研究全体の推進策としたい.「色音変換発音装置」を利用した視覚障がい者のための「誘導システム」の開発を目的とする本研究の当該年度(平成29年度)は,精度向上を目的とした色音変換発音装置のリニューアル制作と並行して,前年度(平成28年度)において設計したデータ可聴化技術のためのパラメタマッピング(1Analogic[即時的]モード,2Symbolic[恣意的]モード,3Emotional[情動的]モード)の妥当性を測るための実験用フレームワークの制作を行った.生憎,リニューアル装置の開発が遅延し,そのことによって,白杖装置を用いた当該パラメタマッピングの検証作業は,当該年度においては達成できなかったのであるが,代替の実験用フレームワークとして,ネット(サイト)上に,音階を違えた各種の発音用イベントを設定し,当該イベントをカーソルの操作によって発音できるシステムを制作した.それはすなわち,被験者が,画面を介して当該パラメタマッピングを検証できるフレームワークである(研究ワークサイト→http://hihara.pinoko.jp/index.html).当該研究ワークサイトの現在は,1Analogic[即時的]モードの実装を終え,3Emotional[情動的]モードの実装中であり,2Symbolic[恣意的]モードの具体的仕組みを企画している段階である.次年度(平成30年度)の中頃の完成を目指している.なお,当該研究ワークサイトが完成したならば,本研究が目的としているところの一つである「色音変換発音装置」を用いた「誘導システム」の全体像が,疑似的に体験できるものとなる.一方,色音変換発音装置のリニューアルに関しては,装置に内蔵予定であった小型MIDIハードウエアが(絶版のため)入手が困難となったことから,当該制作については,東北学院大学工学部情報基盤工学科研究室の協力を得,鋭意制作中である.前年度(平成28年度)に立てた推進方策の内,装置全体の精度向上のためのリニューアル制作作業が遅れ,そのことによって,予定していた,白杖型装置を利用したパラメタマッピング(1Analogic[即時的]モード,2Symbolic[恣意的]モード,3Emotional[情動的]モード)の検証作業を,ネット環境(HTML/CSS/JavaScript)を利用した,代替の実験用フレームワーク(研究ワークサイト)にて行うこととした.なお,リニューアル制作作業の遅れの理由は,装置に内蔵を予定していた小型MIDIハードウエアが絶版になってしまっていたことと,発注先の変更(予算内での対応が困難であり変更せざる得なかった)による見込み違いがあった(当該新規発注先のファーム開発力に見込み違いがあった.現在,当該課題解決のため,東北学院大学工学部情報基盤工学科研究室に支援を要請し,対策を急いでいる)

.なお,研究ワークサイトは,以下の研究報告サイトより視聴可能である.「色音変換発音装置」を利用した視覚障がい者のための「誘導システム」の開発を目的とする本研究については,内蔵予定であった部品の絶版等あり当該年度において開発の完成を延期していた基板制作が,年度後半に至るまでに解決策,代替案が見つからず開発に苦慮した.しかしながら年度後期において,当初より予定していた方式(色センサーによって走査取得したRGBデータを直接的に音階に変換する方法)の不調に対し,解決策として外部記憶装置に予め用意した音源(MP3等)を呼び出す方法が他の開発者より提案された.現在はその試作が成功した段階にあり,鋭意本機搭載用の基板開発をおこなっているところである.基板完成の目途は令和元年6月であり,その後にネットワーク上で検証済の3種のパラメタマッピング(1Analogc{即時的}モード,2Symbolic{恣意的}モード,3Emotional{情動的}モード)について変換プログラムを設定し研究基板の完成を達成する.その後,当該基板を搭載した白杖型装置を用いた本被験者(視覚障がい者)への検証に入る予定.とくに当該装置の方式変更(外部記憶装置に用意した音源を呼び出す方法)については,2Symbolic{恣意的}モード及び3Emotional{情動的}モードの有効利用の拡大につながるもので,相当の期待をもっている.このことの展開によっては,当初予定して本研究の有効性,多様性が,さらにより拡大できるものと考えている.研究全体のまとめについては,本年度(令和元年)中の達成を目指す.当初より予定していた方式の変更にともない,今年度中に完成を延期していた白杖型装置制作がさらに遅れた.しかしながら,解決策である新方式(外部記憶装置呼出し方式)が,それまでは補足的位置付けで構想していたパラメタマッピング(Symbolic{恣意的}モード,Emotional{情動的}モード)の有効性を拡大してくれるものとなり,当初に予定していた研究成果の拡大が見込めるものと考えている.「色音変換発音装置」を利用した,視覚障がい者のための「誘導システム」の開発を目的とする本研究は,初年度(平成28年度)に計画していた予備実験用装置(1色センサ,2白杖本体,3変換装置,4発音装置)の組立開発を実施した.一方,本研究の進路及び学術的位置づけを図ることを目的としたフィールド調査及び文献調査を実施し,本研究が聴覚ディスプレイ開発に関わるもので,その基盤技術が,パラメタマッピング方式のデータ可聴化技術であることを明らかにさせた.そのことから,入力データとなる色面のパラメタと可聴化される音のパラメタとの対応づけが,本研究において最も重要なコンテントであることが確認され,その体系化の課題発見を予備実験の主たる目的とした.予備実験用パラメタの体系化は,1Analogic(即時性),2Symbolic(意味性),3Emotional(情動性)の3系統を主軸に据え,1を誘導と注意・警告の標識.2を
人型癌転移抑制抗体によるエピトープの解析とその遺伝子群からの転移のプロセスの解明

転移抑制ヒト型モノクローナル抗体を作製し、そのエピトープの解析から転移のメカニズムを解析することは、実際のヒトの癌転移のモデルとして非常に意義深いものと考える。我々は肺小細胞癌株から高肺転移を起こす細胞株SBC-Hを作製することに成功しており、これも利用して、キリン麦酒より提供を受けたヒトのB細胞を持つKMマウスを用い、高肺転移細胞株SBC-Hでマウスを免疫し、SBC-Hの母細胞株に発現していないような転移に関係したエピトープを認識するヒト型モノクローナル抗体を作製してきた。現在のところ、すでにこれらの抗体を用い、この高肺転移株の肺転移を抑制できるものを11種類選別することができた。これらのうち7種類は蛋白質を認識しており、残りの4種類は糖鎖を認識していた。そこで、前者については遺伝子クローニングをすすめ、そのエピトープを明らかにし、後者についてはTLC immunostaining、NMR分析等でその糖鎖構造を明らかにしてきた。既にこれまでのところ、そのうち2種の抗体がAminopeptidase Nを認識しており、この内のMT95-4抗体はこれまでに作製したAminopeptidase N認識マウスモノクローナル抗体よりもはるかに高率にAminopeptidase Nの酵素活性を抑制した。そこで、動物実験を行うことにし、乳癌細胞の骨転移をヌードマウスを用いた実験でMT95-4抗体は、マウス抗体MH8-11などよりはるかに効率に骨転移を抑制することを証明した。我々が作製した、ヒト型抗APN抗体は転移を抑制する機能を持つ世界では類を見ないユニークな抗体であり、ヒト化抗体やキメラ抗体に比べ副作用は更に少ないと考えられ、直ちに臨床応用可能であると考える。我々は、キリン麦酒より提供を受けたヒトのB細胞を持つKMマウスを用い、高肺転移細胞株SBC-HやHT1080でマウスを免疫し、転移に関係したエピトープを認識するヒト型モノクローナル抗体を作製していった。現在、これらの抗体のうち、肺転移を抑制できるものを11種類選別することができた。そこで、前者については遺伝子クローニングをすすめ、そのエピトープを明らかにし、後者についてはTLC immunostaining、NMR分析等でその糖鎖構造を明らかにしていった。その結果、3種のモノクローナル抗体は1つのエピトープを認識していると考えられた。cDNAクローニングの結果、これはAminopeputidase Nを認識していた。これまで高転移株と低転移株を用いてDNAマイクロアレイなどにより転移関連遺伝子を探究する手法はよくなされてきた。しかしながら、実際に機能性モノクローナル抗体を作製し、しかもヒト型モノクローナル抗体を用いて、in vivoで転移を抑制するような抗体を選別し、そのエピトープから癌転移に関わる分子を探究しようという試みは未だ世界でも類を見ない。特に、ヒト型モノクロール抗体を用い、研究を進めて行くと、容易に臨床応用ができることから、その価値は充分重要である。更に、我々は実際に多数の遺伝子をクローニングすることによって、これらの分子の転移における役割を明らかにし、転移のプロセスを追及していく予定である。現在のところ、エピトープの判明したAminopeputidase Nを認識しているヒト型モノクローナル抗体M2-E95、M2-F19、M2-F80はいずれも、IgG抗体であり、強いADCC効果を要しており、APN陽性癌患者に対して強力な抗体治療の成果を期待できると思われる。

我々は肺小細胞癌株から高肺転移を起こす細胞株SBC-Hを作製することに成功しており、これも利用して、キリン麦酒より提供を受けたヒトのB細胞を持つKMマウスを用い、高肺転移細胞株SBC-Hでマウスを免疫し、SBC-Hの母細胞株に発現していないような転移に関係したエピトープを認識するヒト型モノクローナル抗体を作製してきた。現在のところ、すでにこれらの抗体を用い、この高肺転移株の肺転移を抑制できるものを11種類選別することができた。これらのうち7種類は蛋白質を認識しており、残りの4種類は糖鎖を認識していた。そこで、前者については遺伝子クローニングをすすめ、そのエピトープを明らかにし、後者についてはTLC immunostaining、NMR分析等でその糖鎖構造を明らかにしてきた。既にこれまでのところ、そのうち2種の抗体がAminopeptidase Nを認識しており、この内のMT95-4抗体はこれまでに作製したAminopeptidaseN認識マウスモノクローナル抗体よりもはるかに高率にAminopeptidase Nの酵素活性を抑制した。そこで、動物実験を行うことにし、乳癌細胞の骨転移をヌードマウスを用いた実験でMT95-4抗体は、マウス抗体MH8-11などよりはるかに効率に骨転移を抑制することを証明した。我々が作製した、ヒト型抗APN抗体は転移を抑制する機能を持つ世界では類を見ないユニークな抗体であり、ヒト化抗体やキメラ抗体に比べ副作用は更に少ないと考えられ、直ちに臨床応用可能であると考える。
ヘテロシス発現に寄与する遺伝子の分類基準と育種への応用に関する研究

バイオマス増加に関するヘテロシス(雑種強勢)は、農作物のハイブリッド品種に広く利用されている。しかしながら、分子メカニズムの詳細は不明である。本研究ではテンサイ初期生育におけるヘテロシスの発現機構について基礎的な知見を明らかにし、ハイブリッド育種の効率化に貢献することを目的とする。昨年度の研究では、テンサイ初期生育におけるF1のバイオマスの増加について、期間や時期などを詳細に明らかにすることができた。以下に本年度の研究結果を示す。1.表現型解析からヘテロシスの発現に高く寄与していると考えられる時期において葉と根からRNAを抽出し、RNA-seq解析に供試した。テンサイリファレンスゲノムにコードされる遺伝子についてF1と各親系統で比較したところ、発現変動遺伝子の数は、いずれの器官においても親系統間の方がF1と各親との間よりも多かった。2.F1が両親よりも発現が促進されている遺伝子の数は、全遺伝子数の0.2-0.3%であった。次にこれらの遺伝子群についてGOエンリッチメント解析を行ったところ、有意なGOタームは検出されなかった。3.データベース上で公開されているテンサイ6系統のゲノムについて、系統間で保存されている割合を遺伝子ごとに明らかにした。全系統で高く保存されている遺伝子は全体の約40%であった。また、発現解析において発現変動していない遺伝子群では、全系統で保存されている遺伝子の割合が高かった。RNA-seqによる遺伝子発現解析を計画通りに行い、新たな知見を得ることができた。ゲノム配列については供試系統の解析を進めている。計画通りに研究を行う。本年度は、F2集団を用いてヘテロシス発現に寄与する候補遺伝子を絞り込み、ヘテロシス発現の分子モデルを検証する。ヘテロシス(雑種強勢)は、生体量、成長速度および繁殖力などにおいて、種内あるいは種間の交雑によって得られた後代が両親を上回る現象であり、農作物ではハイブリッド品種として広く利用されている。しかし、その分子メカニズムの詳細は明らかにされていない。本研究では、テンサイの初期生育におけるヘテロシスの発現メカニズムについて基礎的知見を明らかにし、ハイブリッド育種の効率化に貢献することを目的に行われる。1.テンサイの屋内水耕栽培システムを構築した。圃場試験で収穫時の肥大根重の増加が確認されているF1とその両親を試験栽培し、本栽培システムを用いた初期生育において、ヘテロシスの発現を確認することができた。2.光環境が異なる二つの栽培環境条件で、親二系統およびそのF1を栽培し、31の形質について経時的に調査した。調査日は播種後4回設けた。その結果、いずれの栽培環境においても、特に栽培後期でほぼ全ての形質においてF1が両親を上回るヘテロシスを確認した。また、最も相対成長率が高い時期は播種後24ー27日であった。3.肥大根の内部組織を調査した。親二系統に比べてF1では、形成層間の細胞サイズが肥大しており、肥大根重のヘテロシス発現の要因として、細胞数の増加よりも急速な細胞サイズの増加の方が寄与していることが示唆された。4.次世代シーケンサーを用いて親二系統のゲノムシーケンスを行い、クオリティーが高い配列を得ることできた。得られた配列を、テンサイのリファレンスゲノムにマッピングした。表現型解析について、予定通り実験は順調に進んでおり、転写解析等に適した部位や播種後日数を選定することができた。ただし、注視すべき形態も散見されるため、F2集団を用いてさらに詳細に明らかにする必要がある。一方、ゲノム解析について、リファレンスゲノムへのマッピングは完了したが、最近になって新規のテンサイ系統の全ゲノム配列が公表されたため、それを解析対象に含めることとした。現在系統間で比較解析中である。転写解析によってヘテロシスに寄与する候補遺伝子群を明らかする。また、F2集団を用いて候補遺伝子群をさらに絞り込む。

これらの解析によって明らかにされた有力候補遺伝子群を、ゲノム解析の系統間比較結果と照合し、ヘテロシス発現の分子メカニズムの解明に取り組む。計画通りに研究を行う。本年度は、F2集団を用いてヘテロシス発現に寄与する候補遺伝子を絞り込み、ヘテロシス発現の分子モデルを検証する。被雇用者の都合により退職したため、人件費として計上していた予算分を使用しなかった。次年度は、本年度選定したサンプルを用いて、RNA-seqによって系統間の遺伝子発現を比較する。必要であれば、qRT-PCRで詳細に定量する。人件費削減によって差額が生じ、その分は物品費として利用した。翌年度の物品費として利用する。
クロライドホメオダイナミクス仮説で読み解く胎児・新生児脳障害の病態と新仮説の提案

中枢神経系の最も主要な抑制性神経伝達物質であるGABA(γ-アミノ酪酸)の発達期の脳における作用はCl^-ホメオダイナミクスに代表されるように、実にマルチモーダルなものである。すなわち、(1)神経発生期と細胞移動期には非シナプス性の傍分泌的な脱分極作用で、細胞分裂の促進と抑制、ついで移動のブレーキあるいはアクセルとして移動速度を調節し、(2)回路形成期には興奮性伝達物質としてシナプスの形成・強化に関与する。そして(3)成熟後に初めて抑制性神経伝達物質として作用するのである。このように、GABAには発達段階に応じた3つの役割があり、発達初期における役割は古典的概念の抑制性伝達物質とは大きく異なっている。したがって、胎児・新生児期の疾患の病因や病態には、種々の外的要因がこれらマルチモーダルなGABAの作用に影響することで起こるものが含まれている可能性がある。そこで、種々のモデル動物を用いこの仮説の当否を検討した。1.モデル動物の作製:(1)Cl^-ホメオスタシス破綻モデル:マウス胎仔脳に、変異KCC2遺伝子をコードするcDNAをIUEP法で導入しCl^-を低下させた。皮質凍結損傷ではKCC2発現低下が惹起された。(2)母体タウリン欠乏モデル:D-システインスルフィン酸やタウリントランスポーター阻害剤を、妊娠マウス腹腔内に投与して母体のタウリン合成を阻害し、脳のタウリン含有量が半減した胎仔を得た。(3)インビボ(胎盤低環流)脳虚血モデル:妊娠14.5日に片側子宮動脈を結紮し体重が30%低下したIUGRモデルを確立した。(4)母体拘束ストレスモデル:GAD67-GFP knock-inマウスの妊娠15日目から3日間、45分の拘束・光刺激ストレスを一日3回野生型母マウスに与え、胎仔コルチコステロンが優位に増加するモデルを確立した。2.モデル脳細胞の発生・移動・生理機能・微細形態・アミノ酸分泌の解析:Cl^-ホメオスタシス破綻モデルでは[Cl^-]_iを強制的に低下させると放射状移動も接線移動も遅くなった。GABA_A受容体阻害で移動速度が変化しCa^<2+>振動頻度が減少した。イメージング法で、自己/傍分泌的に容積感受性陰イオンチャネルからGABAが放出されることを証明した。また、胎仔でのパラクリン的分泌はGABAがglutamateより優位であった。免疫組織化学とHPLCによるタウリンの細胞内外の分布を解析した結果、大脳皮質に多く存在しタウリントランスポーターで取り込み、容積感受性陰イオンチャネルから放出していた。母体D-システインスルフィン酸投与による胎仔脳タウリン欠乏モデルで放射状移動が速くなることが明らかになった。3.モデル動物のDNAメチル化解析:モデルマウス脳から、部位別に数マイクログラムのゲノムDNAを抽出し、MeDIP法により回収されたDNA断片を、DNAマイクロアレイを用いて解析する方法をほぼ確立できた。したがって、モデル脳で特異的にエピジェネティックな遺伝子発現制御を受けている候補遺伝子群を網羅的に同定する準備が出来た。
ハプロタイプ構造解析法による小型哺乳類の浸透交雑の解析

本研究は、小型哺乳類においては頻繁に観察される異なる地域系統間の二次的接触について、組換現象に直目し、その時空間動態を把握するための手法の開発をめざした。特定の染色体領域で一定の間隔でマーカーを設置し、10 kb、200 kb、1 Mb、5 Mbの長さで対象領域をセットした。例えば200 kbの場合は20-30 kb間隔で計8個のマーカーをセットした。この異なる長さのハプロタイプ解析において、組換えサイトの間隔を推定した。これにより、数千年から数百年といった異なる時間スケールに応じて二次的接触のイベントの状況把握ができることが示された。本年度はクマネズミにおける浸透交雑の状況把握を主目的として研究を行った。沖縄島産クマネズミは全身黒色個体が観察されていることから責任変異の特定も兼ねて毛色関連遺伝子Asipのコード領域を含む3つのexon領域を解析し、exon4のアグーチタンパク質の構造維持に重要とされるシトシンに置換が起き、黒色化が引き起こされたと推察された。また3つのexon領域の集団解析により、2つの系統の存在が認識できた。数kbという短い断片の中で組換が集団内に認められ数千年から数万年という時代に異系統間の浸透交雑が生じていることも示唆された。この2系統は、インド・ヨーロッパ起源のRattus rattusには由来せず、Rattus tanezumiと由来特定不能なアジア起源の系統との交雑によることが明らかとなった。また、コウベモグラ(Mogera wogura)の地域集団の遺伝的構造の把握をミトコンドリアDNAおよび核遺伝子をマーカーとして解析を行ったところ、列島内には近畿東海(I)、中国・四国(II)および九州(III)という3つの大きく異なる系統が存在し、大阪平野の北部辺縁部においてI, IIの交雑帯の存在が確認され、今後の核遺伝子のハプロタイプ構造解析の対象の特定とサンプル収集を行うことができた。北海道集団のクロテン(Martes zibellina)は毛色関連遺伝子Mc1rとそれに隣接する遺伝子Tcf25の変異において2つのハプロタイプ群が観察され、1つは北海道独自であり、もう1つは大陸産と共通するものであり、北海道において新旧の系統間で交雑が起きていることが示唆された。さらにハプロタイプの組換体の検出頻度から数万年前の事象であると推察された。クマネズミ(the Rattus rattus species complex)においては、毛色多型にも注目し、2つの毛色関連遺伝子領域の地理的変異の解析を行った。小樽および小笠原において観察される全身黒色性の責任遺伝子はMelanocrtin receptor 1 gene (Mc1r)であることが判明しているが、約200kbのハプロタイプ構造の解析を行ったところ責任変異周辺には明瞭な連鎖不平衡が観察された。当該責任変異は進化的に最近生じたことが示唆され、黒色性はヒトのヨーロッパへの展開に伴って生じたとするKambe et al.(2011)の仮説を支持した。一方、沖縄のクマネズミに観察された全身黒色性関しては、クマネズミ38個体における候補責任遺伝子Agoutisignalingprotein(Asip)の全アミノ酸コード領域の塩基配列の解析により、Asipがのエクソン4上に責任変異が存在することが明らかとなった。また、広範なアジア地域より収集したクマネズミについてエクソン2、エクソン3、エクソン4に関するハプロタイプ構造を調査した結果、6つの遺伝的に分化した系統の存在が示唆された。さらにこれらの系統間の組換えハプロタイプも観察され、ヒトのユーラシアへの歴史的展開以前に自然状態下で交雑していた可能性が示唆された。また、前述の全身黒色性の責任変異は東アジアにおいて生じた可能性も示唆された。ハツカネズミ8番染色体の1 Mb領域に11つのマーカーを設置し、日本産野生ハツカネズミのハプロタイプ構造を調べた。日本列島には主要な要素であるユーラシア北方系統(musculus型)以外にもインド・東南アジア型(castaneus型)や西ヨーロッパ型(domesticus型)も非主要な要素として含まれていた。北日本にcastaneus型が分布することも考慮し、これらの結果は、有史以前に人類とともに最初に移入した「南方系」と呼ばれるcastaneus型と、「北方系」と呼ばれる朝鮮半島経由で移入したmusculus型との間で浸透交雑が起きたことが強く示唆された。castaneus型由来断片長は平均200 kbほどであったことから、1000年ほど前に浸透交雑が起きたことが示唆された。一方,domesticus型のハプロタイプは釧路,共和(北海道),厚木でみられ,そのハプロタイプ長は1 Mb以上であった。5 Mbのウインドウで解析したところ,これらは2 Mb以上の長さに渡ることが判明した。

浸透交雑の時期を推定すると数十年前となり、現代における遺伝伝子汚染の一例であることが示された。今回のハプロタイプ構造の解析においては中央付近のマーカーに,自然選択の影響を調査する目的で毛色関連遺伝子Mc1rを設置した。塩基多様度をマーカー間で比較した結果、castaneus型とdomesticus型の2つの亜種においてMc1r周辺領域で塩基多様度の低下が認められ、selective sweepの傾向の存在が示された。これにより、野生ハツカネズミの祖先集団において亜種分化の過程で毛色に関する方向性選択が起きた可能性が示唆された。以上にように今回用いたハプロタイプ構造解析は歴史的な浸透交雑、現代における遺伝子汚染、さらには、方向性選択の検出において有用な手法であることが示された。研究業績の概要に記したように、3種の哺乳類種を対象に、浸透交雑の把握とその手法の開発という点で、当初想定した成果が十分に得られているものと確信している。クロテンにおいては、Ishida et al. (2013)として北海道において大きく異なる2系統の存在を明らかにするとともに、ハプロタイプ構造解析により、その交雑の推定も行うことに成功した。ハプロタイプ構造解析に関する一般への紹介も、和文(公開済み)および英文(投稿中)でのレレビュー論文も作成することで、一定の成果をあげることができたと考えている。日本列島内で野生のモグラ類において地域系統間が進化的時間の中で対峙し、境界線領域においてのみ交雑しているという状況を明らかにしたことは大きな成果であると考えている。クロテンにおいても、Mc1rと隣接する遺伝子のTcf25を解析したのみであるが、この2つのマーカーの間で組換えを起こしたハプロタイプを発見することができた。過去1万年程度の時間の中で、元々北海道に生息していたクロテンと新規に移入したクロテンがもたらしたハプロタイプ間での交雑の結果をゲノムの中に見いだすことができた。北海道の動物の自然史を語る上で重要なエピソードでもある。また、全身黄色性のクロテンを3個体得ることができ、35番目のシステインが他のアミノ酸に置き換わるという変異を持っていた。機能的なMC1R受容体を作成できず、ユーメラニンの生産ができず、黄色の毛色をしているものと推察された。この変異が自然選択で集団中に展開しているかどうか、今後連鎖不平衡のレベルをみていくことで検証でき、その道を展開させることができたことは成果の1つであると考えている。当初計画した通り、1)野生ハツカネズミの自然史の解明、2)浸透交雑把握のための有効な手法の開発、3)自然選択検出とその解析手法の開発、といった3点において成果をあげることができた。自然史の解明においては、日本列島へのハツカネズミの複数系統の移入が歴史的経緯の中で起きたことを明瞭に示すことができたことが今回の研究の最大の意義である。今回の知見は日本列島に有史以前に農業を持ち込んだ人類の祖先系統の推察においても参照すべき情報を提供していると思われる。また、今回用いた手法はシンテニーがあることが一般的には期待されることを考慮すると、ゲノム構造が明らかになった近縁種が存在する場合は、どの生物種においても適応可能であると思われる。
高等植物液胞膜H+輸送性ピロフォスファターゼの発現制御機構の解明

シロイヌナズナH^+-PPaseの発現調節機構の解明前年度までに同定したシロイヌナズナH^+-PPaseの花粉特異的プロモーター領域0.4kbpを更に短くしていったGUSレポーターのコンストラクトを作製し、最終的に花粉での転写活性化に必要な領域を35bp以内までに絞り込んだ。この35bpの領域に結合する転写因子を単離するために出芽酵母のシロイヌナズナOne-Hybridライブラリーを作製し、35bpの領域に結合するタンパク質のスクリーニングを行った。その結果、この領域に結合すると思われる候補のクローンを4種類同定した。現在、これらのタンパク質を大腸菌の発現系を用いて発現させ、精製した後、ゲルシフト法を用いて精製タンパク質が35bpの領域に結合するか調べている。また、これらのタンパク質をコードしている遺伝子領域をT-DNAの挿入によって破壊したシロイヌナズナをスクリーニングし、その表現系を解析することでこれらの遺伝子が植物体の生長にどのような役割を果たしているかを調べている。これらのタンパク質は花粉(雄性配偶子)において総合的に遺伝子発現を調節している転写因子である可能性が高く。花粉発達に非常に重要な役割をしていると考えている。(1)シロイヌナズナH^+-PPaseの発現調節機構の解明シロイヌナズナゲノムよりインバースPCR法によりH^+-PPaseの上流非転写領域1.4kbを単離後、この全長1.4kbの配列と0.4kbの配列の二種類をpBI101のGUS遺伝子の上流に挿入し、それらを植物にアグロバクテリアを用いて形質転換し、二種類の形質転換シロイヌナズナを作製した。これらの形質転換シロイヌナズナを用いてGUS-reporter法でプロモーターの発現様式の解析をしたところ、全長1.4kbのコンストラクトではほぼ植物体全体で発現しているのに対し、0.4kbのコンストラクトでは花粉でのみ活性が観察された。また花粉特異的に遺伝子発現を誘導する0.4kbの領域の下流にH^+-PPase遺伝子をアンチセンス方向に結合したものを、植物体に発現させると花粉の成育が途中でい停止し、種子が出来ない雄性不稔の形質を示す植物体がある割合で現れた。このことからH^+-PPaseは花粉の発生段階で特異的に発現が調節され、H^+-PPaseの発現は花粉の発達に非常に重要な働きをしていることが示唆された。(2)新型H^+-PPaseの細胞内局在の同定近年シロイヌナズナゲノム解析により、従来の液胞型のH^+-PPase(AVP-1)のほかにAVP-1に30%程度の相同性を持ったH^+-PPase(AVP-2)が存在することがわかった。電気生理学的解析からこの酵素は、K^+イオンで活性がしないなどAVP-1とは違った性質を持っていることがわかった。液胞膜にはK^+イオンで活性化するH^+-PPase活性しか観察されないためAVP-2の局在は液胞以外であることが推定された。そこでAVP-2の局在を調べるため、AVP-2にGFPを結合した融合たんぱく質をシロイヌナズナ培養細胞に一過的に発現させ、その局在を調べたところ、ドット状のオルガネラに局在することがわかった。ブレフェルジンAを使った解析、各種オルガネラマーカーたんぱく質を使った解析からAVP-2/GFP融合たんぱく質はゴルジ体に局在することがわかった。これらのことから、AVP-2はゴルジ体に局在するH^+-PPaseで、ゴルジ体内腔の酸性化に重要な働きをしていることが示唆された。
ペルオキシソーム代謝異常と中枢神経系障害

ペルオキシソーム形成因子Pex14欠損マウスにおいて、神経栄養因子Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)が小脳プルキンエ細胞周辺で増加していることを見出した。小脳神経初代培養実験により、高濃度のBDNFがPex14欠損マウスプルキンエ細胞の形態異常を誘発することを見出した。BDNF受容体であるTrkBの発現を解析したところ、Pex14欠損マウス小脳において、不活性型受容体TrkB-T1の発現が増加していた。活性型受容体であるTrkB-TK+ TrkB-T1は活性型受容体TrkB-TK+の自己リン酸化活性に対して阻害的に作用することが知られており、TrkB-TK+リン酸化の低下および下流のシグナル伝達系の活性低下も認められた。以上の結果からBDNF-TrkBを介した細胞シグナル応答の障害がペルオキシソーム形成異常症における小脳形態異常の主たる原因であることを発見した。以上の結果をLife Science Alliance誌において公表した。一方、ペルキシソーム欠損性グリア細胞において発現量が増加しているBDNFが、何れのペルオキシソーム代謝機能障害が原因であるか検討した。カタラーゼ阻害剤3-amino-1,2-triazoleの添加により、ペルオキシソーム欠損グリア細胞におけるBDNFの発現量が低下した。ペルオキシソーム欠損性細胞では、カタラーゼは細胞質に局在することから、ペルオキシソーム局在シグナルを欠失させたカタラーゼを発現させたところ、BDNFの発現が増加した。細胞質局在のカタラーゼが還元化状態を導くことが知られていることから、細胞質の還元性を消失させたところBDNFの発現が低下した。以上のことから、ペルオキシソーム欠損細胞における細胞質の還元化がBDNF増加を誘導することが示唆された。ペルオキシソーム欠損性グリア細胞において神経栄養因子Xの発現異常を見出している。また、ペルオキシソーム欠損症モデルマウス小脳においては神経栄養因子Xの発現異常のみならず、その受容体因子Yの発現異常も認められ、これらが小脳形態異常を導くことも見出している。今年度は、ペルキシソーム欠損性グリア細胞において発現量が増加している神経栄養因子Xが、何れのペルオキシソーム代謝機能障害が原因であるか検討した。Hexadecylglycerol添加によるプラスマローゲンの回復やペルオキシソームβ酸化酵素Acyl-CoA oxidase 1のノックダウンを行っても、神経栄養因子Xの発現には影響が認められなかった。カタラーゼ阻害剤3-amino-1,2-triazoleの添加により、ペルオキシソーム欠損グリア細胞における神経栄養因子Xの発現量が低下した。ペルオキシソーム欠損性細胞では、カタラーゼは細胞質に局在し還元化状態を導くことが知られていることから、細胞質の還元性が神経栄養因子Xの発現調節に関与することが示唆された。また、遺伝子発現調節機構のより詳細な解析を可能とするルシフェラーゼレポーターアッセイ系を確立した。ペルオキシソーム欠損症モデルマウスの小脳において神経栄養因子Xのタンパク質発現量増加を見出しているが、mRNAには変化がなかった。小脳に投射する神経細胞においてそのmRNAの発現量が増加していることが明らかとなり、中枢神経系における細胞間の相互作用の異常が病態発症を導く可能性が示唆された。一方、小脳神経細胞の初代培養法を確立し、ペルオキシソーム欠損症モデルマウスにおける受容体因子Yの発現異常解明に向けた実験系を構築した。ペルオキシソーム欠損グリア細胞における神経栄養因子Xの発現解析を行い、細胞質の還元化が発現量増加に関与することが示唆された。ペルオキシソーム欠損細胞ではカタラーゼは細胞質に局在し、細胞質の還元状態に関与することが報告されている。したがって、細胞質カタラーゼによる還元化が神経栄養因子Xの発現異常を導いていることが示唆された。また、ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を確立したことから、さらに詳細な分子機構の全容解明が期待される。また、ペルオキシソーム欠損症モデルマウスの神経細胞初代培養系を確立した。初代培養細胞を用いることで受容体因子Yの発現異常の分子機構解明が期待される。以上のように、ペルオキシソーム機能障害と神経栄養因子Xの発現異常との関連性を明らかにしつつあり、病態発症メカニズムの分子基盤の全容解明を目的とした本研究課題はおおむね順調に進展しているといえる。カタラーゼ阻害剤3-amino-

1,2-triazoleの添加により、ペルオキシソーム欠損グリア細胞におけるBDNFの発現量が低下した。ペルオキシソーム欠損性細胞では、カタラーゼは細胞質に局在することから、ペルオキシソーム局在シグナルを欠失させたカタラーゼを発現させたところ、BDNFの発現が増加した。細胞質局在のカタラーゼが還元化状態を導くことが知られていることから、細胞質の還元性を消失させたところBDNFの発現が低下した。以上のことから、ペルオキシソーム欠損細胞における細胞質の還元化がBDNF増加を誘導することが示唆された。確立したルシフェラーゼレポーターアッセイ系を用いて、神経栄養因子Xの発現調節に関わる領域の同定を試みる。同定された領域の結合する転写因子に関して、クロマチン免疫沈降法により、結合解析を行う。これら転写活性因子による機能調節において、ペルオキシソーム欠損細胞における細胞質還元化の影響を明らかにする。受容体因子Yの発現異常解明に向けて、何れのペルオキシソーム代謝機能がその発現異常に関わるか明らかにするために、初代培養細胞に対して個別の代謝反応経路に関わる酵素のノックダウンや、ペルオキシソーム欠損マウス由来細胞への正常代謝産物の添加などにより受容体因子Yの発現への影響を検証するとともに、さらに詳細な解析を進める。上記で明らかにした異常代謝産物が及ぼす転写調節因子への影響を野生型マウスおよびペルオキシソーム欠損性マウスにおいて解析する。代謝産物の脳内への注入やその代謝に関わる酵素等のノックダウン、薬剤による阻害等を行うことで、転写調節因子の分子動態および中枢神経系形成への影響について詳細な解析を行う神経栄養因子Xおよび受容体因子Yの発現調節に関わる因子の分子動態を野生型マウスおよびペルオキシソーム欠損性マウスにおいて解析する。さらに発現調節に関わる因子に対してノックダウンや薬物阻害等を行うことで、脳形態異常との関連性を検証する。
微細な金属の量子効果

サイズが1μm程度の導体では、たとえ原子尺度や平均自由行程に比べると大きいとしても、極低温では試料内で電子が非弾性散乱を受ける確率は小さく、従って電子波のコヒーレンスが「試料」全体に亘って保たれる。このような微細な系は、最近メゾスコピックな系と呼ばれ、従来の固体物理の常識とは異なった新しい現象がこの系で見つかっている。本研究では電子線リソグラフィー法を用い、1μm程度以下の微細な構造をもつ種々の形状の金属試料を作り、その電気的・磁気的性質を極低温で測定することによって、メゾスコピックな金属に特有な量子効果を調べることを目的としている。本年度は、昨年度行った試料作製技術の習得、予備的実験の結果をうけ、電気伝導度のゆらぎに対する電界効果及び無電極リングの抵抗測定を行った。銀及びアンチモンを用い一辺1μmの角型リングを作り、さらに絶縁用ワニスをはさんで対向電極を付けた。リングの磁気抵抗を測定したとこと、弱局在による磁気抵抗に重疊して不規則なゆらぎ抵抗が観測された。さらに対向電極とリング間にDC電圧を加えたところ、アンチモン試料ではゆらぎのパタンがバイアス電圧と共に変化するのを観測した。この原因は印加電圧及びそれにより誘起された電荷により伝導電子の運動が変化したためであると考えている。メゾスコピック系の物理にはマクロな電極の存在が本質的である場合がある。例えば局在に起因するAB効果の振巾は、無電極の場合、有電極の時と比べて大きく増大することが予想されている。これを調べるために直径1μmのアンチモンリングを多数製作し、その電磁的性質を無電極的方法で測った。磁場の関数としてリング系の交流損失を測ったが、現在の所有意なリングによる損失を見るには至っていない。今後感度の増大を図る必要がある。1979年のアンダーソン局在についてのスケーリング理論に端を発した研究の結果, 1μm程度の微細な寸法をした導体の極低温での伝導には伝導電子の波動性が直接反映されることがわかってきた.本研究は,電子線リソグラファー法を使って1μm以下の微細な構造をもつ種々の形状の金属試料を実際に作り,その電気的・磁気的性質を極低温度で測定することによって微細な金属に特有なこの量子効果を調べることを目的としている.本年度は第1年度であり,試料作成法の習得・改良から始めた.その結果ポジ型レジストとスパッタエッチングによる加工方法に加え,より細かな加工に適したネガ型レジストを用いたリフトオフ法が使えるようになり,約0.1μm幅のパタンを作成できるようになった.一方,測定については,銀の金網状試料(各網の寸法は1μm×1μm)においてアンダーソン局在に起因するh/2eの磁束周期をもつ磁気抵抗変化(アハラノフーボーム効果),アンチモンの単一リングとビスマスの細線試料の磁気抵抗に量子ゆらぎと考えられる再現性のあるランダムな変化を観測するなど,一連の予備的な結果を得ている.来年度は,ゆらぎの原因を調べるために試料の特性をバイアス電圧を印加して変える実験を試みるとともに,微細リングの磁気的性質・金属微粒子を介した微細トンネル接合の特性を調べる予定である.サイズが1μm程度の導体では、たとえ原子尺度や平均自由行程に比べると大きいとしても、極低温では試料内で電子が非弾性散乱を受ける確率は小さく、従って電子波のコヒーレンスが「試料」全体に亘って保たれる。
蝸牛有毛細胞・らせん神経節細胞の遅発性脱落メカニズムの解明

マウスにおいて3-nitropropionic acid(3-NP)による急性内耳エネルギー不全モデルを作成し、蝸牛内電位の低下が蝸牛有毛細胞、らせん神経節細胞に与える影響を検討した。3-NP投与によりマウス聴性脳幹誘発反応(ABR)閾値上昇が認められ、蝸牛内電位(endocochlear potential)を測定したところ、3-NP投与によって低下していることが明らかとなった。3-NP投与後2週間を超えると徐々に内有毛細胞、外有毛細胞およびらせん神経節細胞に細胞脱落が生じ、投与後3ヶ月となると高度の脱落が生じ、高音域の難聴を固定化させる要因となっていることが明らかとなった。ミトコンドリアの電子伝達系の不可逆的阻害剤である3-nitoropropionic acid(3-NP)を内耳に局所投与し作成した急性内耳エネルギー不全モデルを用いて、蝸牛内電位の低下が内耳有毛細胞およびらせん神経節細胞に与える影響を明らかにすることを目的とする。本研究ではまずCBA/CaJマウスを用いた3-NPモデルを作成することから開始した。方法は全身麻酔下に耳後部切開をおき、中耳骨胞を露出する。続いて中耳骨胞にマイクロドリルで小開窓を行い手術顕微鏡下に正円窓窩を明視下に置く。500mMの3-NPを正円窓窩にマイクロポンプと微小チューブを用いて局所投与する。3-NP投与後、正円窓窩からの薬液脱落を防ぐため、正円窓窩にコラーゲンスポンジを留置し閉創する。その後経時的に聴性脳幹誘発反応(ABR)を全身麻酔下に行い、ABR閾値変化を生じるか確認した。その後3-NP投与後、経時的に深麻酔下で解剖し蝸牛を摘出、組織学的な検討を行った。組織学的検討はプラスティック(Epon812)包埋による薄切切片を用いた内有毛細胞、外有毛細胞、およびらせん神経節の微細構造の観察を光学顕微鏡にて行った。その結果、3-NP投与後2週間を超えると徐々に細胞脱落が生じ、投与後3ヶ月となると、基底回転の内有毛細胞、外有毛細胞およびらせん神経節細胞の高度の脱落が生じ、高音域の難聴を固定化させる要因となっていることが明らかとなった。これらの細胞脱落は、時間経過とともに徐々に進行し、最終的には基底回転から徐々に頂回転へと進行する事も明らかとなった。また免疫組織学的手法を用いて経時的に有毛細胞、らせん神経節細胞脱落の定量的に評価を行い、有毛細胞の脱落が3-NP投与直後に起こり、らせん神経節は2次的に脱落していることが明らかとなった。当初の予定通り、CBA/CaJマウスを用いて3-nitropropionic acid(3-NP)による急性内耳エネルギー不全モデルを作成し、経時的に組織学的手法を用いて経時的に有毛細胞、らせん神経節細胞脱落の定量的に評価が可能となったため。方法は全身麻酔下に500mMの3-NPを正円窓窩にマイクロポンプと微小チューブを用いて局所投与した。