hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
認知症の進行に伴う嚥下機能の経時的変化と並走する誤嚥リスク回避策に関する臨床研究

2017年度からデータ収集をしていた認知症治療病棟入所者群31名の、初回と3ヵ月後の経時的変化について統計解析を行なった。その結果、摂食嚥下機能には有意差は認められなかった。しかし介護認定調査員テキスト2009に従って、1寝たきり度、2認知機能、3精神・行動障害観察項目、4独自に作成した食行動問題観察項目と5食形態観察項目においては、精神・行動障害(P=0.007)、食行動問題(p=0.049)に有意差が認められた。さらに、重度認知症デイケア通所者群20名の、初回と6ヵ月後の経時的データの収集が終わって、現在はその解析中である。6ヶ月間の経過中に2名の者が他施設へ入所となった。また、毎週一回開催される軽度認知症のためのデイサービス参加者群20名の、初回データの収集が終わって、6ヵ月後に当たる2019年8月に経過データを取る計画である。認知症治療病棟入所群・重度認知症デイケア通所者群・軽度認知症デイサービス参加者群の3群に対しては、共通的に非侵襲的嚥下機能検査装置を使って反復唾液嚥下回数と反復唾液嚥下間の時間、さらにトリガスプーンを使った5回の水飲み検査による嚥下間の時間を比較して経時的変化を捉える事を研究手法の中心に置いていた。しかし、認知症治療病棟入所群は、非侵襲的嚥下機能検査装置による二つの検査に対する理解が困難であったことから、観察評価が中心となり唯一共通評価として比較できる手法が、80センチの吹き戻しを使った検査のみとなった。当初に計画していた認知症の摂食嚥下機能の経時的変化を捉えるための検査方法が、認知症治療病棟に入所している者には理解が困難で検査法の変更を余儀なくされたことと、認知障害や非認知障害による摂食行動の問題が予想に反して進行したために、経時期間を3ヶ月しか設けれなかった点が挙げられる。今後は、毎週一回開催される軽度認知症デイサービス参加者群グループ20名の初回データの収集は完了しているので、6ヶ月後の経過を2019年8月に取る予定である。さらに今年度は科研の最終年度であることから、健常高齢者群や認知症がない施設入所高齢者群さらには認知症の重症度による3群について、摂食嚥下機能に関する総合的な解析を行なって研究成果としてまとめる予定である。28年度の研究計画は、1スクーリニング検査のための評価装置の改良、2研究分担者による機械学習による自動解析の構築、3として1と2の検証試験の予定であった。1の評価装置の改良点は、嚥下性無呼吸を捉えるために鼻腔に取り付ける呼吸センサが被検者にとって違和感となっている事から、胸郭のどこかで嚥下性無呼吸を捉えることが可能かの実験を試行しているが、まだ適切な部位が特定出来ていない。2機械学習による自動解析の構築については、健常成人・健常高齢者・介護老人保健施設入所者のデータを解析してアルゴリズムの構築に向けた研究を実施しているが、捉えた波形は個別性が高いこと、捉えた波形は検査物によって異なること等の理由より構築までには至っていない。3については呼吸センサの従来型を使って、介護老人保健施設で機械学習のアルゴリズム構築用のデータを収集した。検査物として唾液・トリガスプーンですくえる10ccの水・10gのゼリーを用いた。唾液を用いた検査では、30秒間継続して唾液を嚥下するという指示に対して、一度しか嚥下を行なわない者が見られた。水とゼリーの摂取に対しては、切迫的に口腔に摂取する行為が見られた。平均年齢78歳の健常高齢者群20名と平均年齢88歳の介護老人保健施設群35名を比較した結果、介護老人保健施設群がゼリーを口腔に取り入れてから嚥下するまでの時間が約1分間短かった。この現象は年齢が高くなることによる認知機能の低下によって引き起こされている問題か、あるいは検査指示への理解不足やコミュニケーション等の問題によるものかについて今後検討する必要がある。嚥下性無呼吸の把握は、摂食嚥下中に空気の流入と流出がある箇所で捉える必要がある。その器官としては鼻腔と口腔のみである。しかし鼻腔と口腔に呼吸センサを取り付けると違和感や食事動作の支障になる。そのため胸郭のどこかで空気の流入と流出と一時的出入り停止を捉えるには、温度や流量の違いをセンサで捉える方法では不可能であることから、その捉える手法とセンサの取り付け部位の検証に時間がかかっているため、計画通りに進行していない。機械学習による自動解析のアルゴリズム構築については、異常波形のサンプルが少ないことから完全に計画通りには進行していない。29年度は、1誤嚥疑い群と無群の区別のためのスクーリニング検査の実施、2誤嚥疑い群に対する機能評価に基づいた誤嚥回避策の実施と効果検証を行なう計画であった。同一施設で実施する計画であったが、主研究協力施設の事情で1と2は、別々の施設で実施した。1については特別養護老人ホームで実施して、誤嚥の発生は呼気時間との相関が強いことが示唆された。嚥下のスクーリニング検査や非侵襲的嚥下検査装置を使った評価も重要であるが、特別養護老人ホームなどはリハビリ専門職の雇用が義務化されていないために、単発的評価と同時に養護老人ホームの職員による一定期間の食事観察データとの整合性から、誤嚥の分析をすることが重要であることが示された。

現在、データを整理中で30年度の投稿を目指している。2については療養病棟に入院中で、経管栄養などの代替栄養中で誤嚥の既往がある者を対象に、嚥下の機能訓練や姿勢などの誤嚥回避策を実施した結果、誤嚥の発生が認められず機能的にも改善したことについて、論文として発表した。長期間の代替栄養者でも、特に摂食嚥下に重要な頚部周囲の筋力、筋緊張、関節可動域の改善、さらには抗重力姿勢を一日の内でも一定時間実施することが呼吸機能の維持や改善につながり、訓練期間中からフォローアップの間は誤嚥が生じなかった理由と思われる。一度、代替栄養になるとリハビリの実施回数や実施内容も限定されてくることから、その症例にとって最も重要と思われる訓練プログラムを立案・実施することが重要である。29年度の研究計画は、おおむね実施できたと思っている。しかし、研究課題である認知症者を対象とした研究実施は、認知症のレベルが重症であったためにスクーリニング検査等の実施が理解困難であった。さらに主研究協力施設のマンパワー不足から、対象者の選定や同意取得が困難であった。2017年度からデータ収集をしていた認知症治療病棟入所者群31名の、初回と3ヵ月後の経時的変化について統計解析を行なった。その結果、摂食嚥下機能には有意差は認められなかった。しかし介護認定調査員テキスト2009に従って、1寝たきり度、2認知機能、3精神・行動障害観察項目、4独自に作成した食行動問題観察項目と5食形態観察項目においては、精神・行動障害(P=0.007)、食行動問題(p=0.049)に有意差が認められた。さらに、重度認知症デイケア通所者群20名の、初回と6ヵ月後の経時的データの収集が終わって、現在はその解析中である。6ヶ月間の経過中に2名の者が他施設へ入所となった。また、毎週一回開催される軽度認知症のためのデイサービス参加者群20名の、初回データの収集が終わって、6ヵ月後に当たる2019年8月に経過データを取る計画である。認知症治療病棟入所群・重度認知症デイケア通所者群・軽度認知症デイサービス参加者群の3群に対しては、共通的に非侵襲的嚥下機能検査装置を使って反復唾液嚥下回数と反復唾液嚥下間の時間、さらにトリガスプーンを使った5回の水飲み検査による嚥下間の時間を比較して経時的変化を捉える事を研究手法の中心に置いていた。しかし、認知症治療病棟入所群は、非侵襲的嚥下機能検査装置による二つの検査に対する理解が困難であったことから、観察評価が中心となり唯一共通評価として比較できる手法が、80センチの吹き戻しを使った検査のみとなった。当初に計画していた認知症の摂食嚥下機能の経時的変化を捉えるための検査方法が、認知症治療病棟に入所している者には理解が困難で検査法の変更を余儀なくされたことと、認知障害や非認知障害による摂食行動の問題が予想に反して進行したために、経時期間を3ヶ月しか設けれなかった点が挙げられる。今年度の前半までにスクーリニング検査のための評価装置を完成させる計画である。後半から認知症疾患治療病棟で現場のスタッフより抽出・選定された被検者を対象に、基礎情報、ミール観察情報、摂食嚥下の評価情報、評価装置による情報を収集する。そのデータをもとに機械学習による自動解析のアルゴリズムを完成させる。今後は、1研究対象者である認知症者を、入院者からデイケア利用者に変更する、2マンパワー不足に対処するために、月一回のペースでデータを収集する方針に変更したいと考えている。認知症の重症度レベルを下げることによって、各種検査の実施や検査データの信頼性も高まると思われる。
次世代シークエンシングデータを利用した機械学習によるRNA二次構造予測の高精度化

RNA二次構造予測は古くから研究されているにも関わらず,長鎖非コードRNAやRNAウィルスのような長いRNA配列に対する予測精度は未だに十分とは言えない.近年,次世代シークエンサーから二次構造プロファイルを取得することが可能となったが,二次構造プロファイルは完全な二次構造でないために,既存の機械学習に基づく手法をそのまま適用することはできない.本研究では,部分的な構造情報である二次構造プロファイルを弱レベル学習データとして利用可能とする機械学習アルゴリズムを開発し,既存手法よりも精密な二次構造モデルを大量の二次構造プロファイルから学習することによって,過学習を回避しつつRNA二次構造予測の精度向上を目指す.これにより,二次構造予測をベースにした機能性RNAの機能・構造解析の精度向上を実現する.RNA二次構造予測アルゴリズムmxfoldを開発した.本手法では,これまでRNA二次構造予測で用いられてきた自由エネルギー最小化に基づく手法と機械学習に基づく手法を組み合わせ,意味のある特徴量を選択するL1正則化を機械学習に組み込むことによって適切な複雑さを表現することができる二次構造予測モデルを学習する.ベンチマーク実験では,従来の手法と比べて極めて高い精度でRNA二次構造を予測可能であることを示した.さらに,構造化SVMと深層学習を組み合わせた機械学習アルゴリズムを用いて塩基対確率を直接推定し,その上で期待精度最大化に基づくRNA二次構造予測を行う手法の改良を行った.これによって,通常のRNA二次構造予測のみならず,シュードノット構造を考慮したRNA二次構造予測において既存手法を上回る精度を期待できる.当初の計画通り,過学習を回避する方法および深層学習を含む高度な機械学習アルゴリズムを導入することに成功したため,おおむね順調に進展していると言える.本年度開発した手法(熱力学モデルの融合および深層学習の導入)を,大量の次世代シークエンスデータから得られる弱ラベルからの機械学習アルゴリズムに適用し,さらに高精度なRNA二次構造予測を目指す.RNA二次構造予測は古くから研究されているにも関わらず,長鎖非コードRNAやRNAウィルスのような長いRNA配列に対する予測精度は未だに十分とは言えない.近年,次世代シークエンサーから二次構造プロファイルを取得することが可能となったが,二次構造プロファイルは完全な二次構造でないために,既存の機械学習に基づく手法をそのまま適用することはできない.本研究では,部分的な構造情報である二次構造プロファイルを弱レベル学習データとして利用可能とする機械学習アルゴリズムを開発し,既存手法よりも精密な二次構造モデルを大量の二次構造プロファイルから学習することによって,過学習を回避しつつRNA二次構造予測の精度向上を目指す.これにより,二次構造予測をベースにした機能性RNAの機能・構造解析の精度向上を実現する.本年度は,構造化SVMを元にした弱ラベルデータからの学習アルゴリズムの定式化を行い,次世代シークエンスデータを弱ラベル学習データとするRNA二次造予測モデルのプロトタイプ実装を行なった.計算機実験の結果,次世代シークエンスデータを加えることによるRNA二次構造予測の精度向上が確認された.また,遺伝アルゴリズムによる多目的最適化手法を用いることによって,RNA-RNA相互作用を引き起こす複合二次構造を形成する二本のRNA配列をデザインする手法の開発を行った.計算機実験の結果,本手法のプロトタイプ実装が設計通りに動作し,適切な複合二次構造を形成する配列をデザインしていることが確認された.当初の計画通り,弱ラベルデータからの学習アルゴリズムの定式化,およびそのRNA二次構造予測への適用を行うことができたので,おおむね順調に進展していると言える.RNA二次構造予測は古くから研究されているにも関わらず,長鎖非コードRNAやRNAウィルスのような長いRNA配列に対する予測精度は未だに十分とは言えない.近年,次世代シークエンサーから二次構造プロファイルを取得することが可能となったが,二次構造プロファイルは完全な二次構造でないために,既存の機械学習に基づく手法をそのまま適用することはできない.本研究では,部分的な構造情報である二次構造プロファイルを弱レベル学習データとして利用可能とする機械学習アルゴリズムを開発し,既存手法よりも精密な二次構造モデルを大量の二次構造プロファイルから学習することによって,過学習を回避しつつRNA二次構造予測の精度向上を目指す.これにより,二次構造予測をベースにした機能性RNAの機能・構造解析の精度向上を実現する.本年度は,既存のTurner熱力学モデルに基づく自由エネルギー最小化法と構造化SVMによるパラメータ学習法を融合することによってより頑健かつ高精度なRNA二次構造予測手法の開発を行った.計算機実験の結果,既存の手法に見られる過学習は観測されず,予測精度の向上が確認された.さらに,構造化SVMと深層学習を組み合わせた機械学習アルゴリズムを用いて塩基対確率を直接推定し,その上で期待精度最大化に基づくRNA二次構造予測を行う手法の開発を行った.これによって,通常のRNA二次構造予測のみならず,シュードノット構造を考慮したRNA二次構造予測において既存手法を上回る精度を達成した.当初の計画通り,過学習を回避する方法および深層学習を含む高度な機械学習アルゴリズムを導入することに成功したため,おおむね順調に進展していると言える.RNA二次構造予測は古くから研究されているにも関わらず,長鎖非コードRNAやRNAウィルスのような長いRNA配列に対する予測精度は未だに十分とは言えない.

近年,次世代シークエンサーから二次構造プロファイルを取得することが可能となったが,二次構造プロファイルは完全な二次構造でないために,既存の機械学習に基づく手法をそのまま適用することはできない.本研究では,部分的な構造情報である二次構造プロファイルを弱レベル学習データとして利用可能とする機械学習アルゴリズムを開発し,既存手法よりも精密な二次構造モデルを大量の二次構造プロファイルから学習することによって,過学習を回避しつつRNA二次構造予測の精度向上を目指す.これにより,二次構造予測をベースにした機能性RNAの機能・構造解析の精度向上を実現する.RNA二次構造予測アルゴリズムmxfoldを開発した.本手法では,これまでRNA二次構造予測で用いられてきた自由エネルギー最小化に基づく手法と機械学習に基づく手法を組み合わせ,意味のある特徴量を選択するL1正則化を機械学習に組み込むことによって適切な複雑さを表現することができる二次構造予測モデルを学習する.ベンチマーク実験では,従来の手法と比べて極めて高い精度でRNA二次構造を予測可能であることを示した.さらに,構造化SVMと深層学習を組み合わせた機械学習アルゴリズムを用いて塩基対確率を直接推定し,その上で期待精度最大化に基づくRNA二次構造予測を行う手法の改良を行った.これによって,通常のRNA二次構造予測のみならず,シュードノット構造を考慮したRNA二次構造予測において既存手法を上回る精度を期待できる.当初の計画通り,過学習を回避する方法および深層学習を含む高度な機械学習アルゴリズムを導入することに成功したため,おおむね順調に進展していると言える.大量の次世代シークエンスデータからの学習を実現するために,二次構造予測アルゴリズムの最適化および学習の並列化を実装する.本年度開発した手法(熱力学モデルの融合および深層学習の導入)を,大量の次世代シークエンスデータから得られる弱ラベルからの機械学習アルゴリズムに適用し,さらに高精度なRNA二次構造予測を目指す.本年度開発した手法(熱力学モデルの融合および深層学習の導入)を,大量の次世代シークエンスデータから得られる弱ラベルからの機械学習アルゴリズムに適用し,さらに高精度なRNA二次構造予測を目指す.論文投稿料および旅費が当初の予定よりも少なく済んだことによる.(理由)論文投稿料および旅費が当初の予定よりも少なく済んだことによる.(使用計画)次年度以降,研究成果を学会発表するための旅費および論文投稿料を当初の予定よりも当初の予定よりも増やす.(理由)物品費,論文投稿料が当初の予定よりも少なく済んだことによる.(使用計画)次年度以降,研究成果を学会発表するための旅費および論文投稿料を当初の予定よりも当初の予定よりも増やす.次年度以降,研究成果を学会発表するための旅費および論文投稿料を当初の予定よりも当初の予定よりも増やす.
組織工学的手法と増殖因子による唾液腺組織の再生

本研究期間中の第1の課題として、唾液腺組織の再生過程で発現する遺伝子を解析し、候補遺伝子を明らかにするとともに、可能性のある遺伝子について解析を行った。第2の課題として、細胞を用いた唾液腺組織の再生・機能回復の実験として、従来行なってきた唾液腺上皮由来の細胞ではなく、骨髄由来の単核球細胞を用いた再生実験を行なった。比較的安定したデータが得られたDNA microarrayの結果から、唾液腺の再生過程で最も高頻度で発現が見られた遺伝子としてclusterinに着目した.ラット唾液腺の導管を結紮後細胞療法1週間にて、唾液腺の萎縮が引き起こされる.この導管結紮を解除し、12時間から10日後までの腺組織を摘出して、抗clusterin抗体を用いて免疫染色を行った.Clusterinは正常組織では腺房の細胞質に分布し、萎縮唾液腺では萎縮した腺房の管腔側に強発現していた.この発現は、再生過程の進行とともに消失する傾向であり、6日後には細胞質に再び発現していた。再生時に分裂する細胞とクラステリン陽性細胞との関連を調べるために、抗PCNA抗体との2重染色を行った.PCNA陽性細胞は間質と上皮双方に認められ、結紮解除後12時間で解除直後の5倍まで上昇した。そして6日後までにはbasal levelにもどった。しかしながら、PCNA陽性細胞とclusterin陽性細胞の直接の相関は認められず、clusterin陽性細胞が直接再生を引き起こす幹細胞ではないと考えられた。次に、細胞移植による治療効果をみるためのモデルとして、マウス唾液腺への放射線照射モデルを作製した。骨髄由来の単核球を移植して、細胞の生着に関わる条件と、唾液量の変化を比較した。細胞は放射線照射後6日目までに移植することで、安定して4週後でも残存することが明らかになった。細胞移植群ではコントロール群と比較して、唾液量の増加が認められた。1.上皮-間葉相互作用による組織再生当初の課題である上皮系-間葉系の相互作用を確認するために、本年度は共培養と移植の手技を確立した。培養した間葉系細胞をコラーゲン中に混ぜてゲル化して培養後、その上に上皮系細胞を播種した。唾液腺上皮細胞は、一部ゲル上で、一部はゲル内に入り球状を示した.管腔様構造は、一部でのみ見られた.その他に唾液腺未完成期のマウス顎下腺単離細胞を用いて、上皮-間葉相互作用の再現の可能性について検討を行った.使用した担体はコラーゲンゲル、PGAメッシュ、および多孔体のβ-TCPである.すべての担体において、移植した組織の周辺部に上皮細胞の生存を認めたが、移植後4週までの期間で腺に特異的な構造は見られていない.現在移植条件や担体の素材、構造が与える影響について検討を行っている.2.唾液腺の再生過程で発現する遺伝子の解析唾液腺再生過程における特異的遺伝子発現を検索する目的で、唾液腺導管結紮モデルを作製した。ラット顎下腺および舌下腺の導管を結紮し、一週間後に結紮を除去した。唾液腺は1週間で完全に萎縮し、結紮除去後に徐々に回復し、1週後にはほぼ外見てきには正常唾液腺の大きさとなった。結紮除去12、24、72時間後、6日後に唾液腺を採取し、RNAの採取を行った。

唾液腺の回復が得られる6日後を対象として、24および72時間後の遺伝子発現の比較をDNA、マイクロアレイにて比較し、12,24,72時間および6日後をFDD(蛍光ディファレンシャルディスプレイ法)にて比較を行った。DNAマイクロアレイでは、6日後と比較して24および72時間後に2倍以上発現が亢進している遺伝子が約30抽出された.その中でもっとも亢進していた数種類の遺伝子の発現をRT-PCRおよび免疫組織化学にて解析しており、再生過程における役割について検討を行っている。組織工学的手法を用いた組織再生のなかで、腺組織に代表される実質臓器の再生はいまだ困難である。特に腺房部から導管系に至る複雑な構造を、培養上皮細胞と担体の組み合わせのみで再現することは現在までのところ不可能である。本研究期間中の第1の目的として、3次元培養およびin vivoの移植モデルを用いて、唾液腺上皮-間葉細胞の相互作用による腺組織再生の可能性を検証することである。次に、唾液腺組織の再生過程で発現する遺伝子を解析し、候補遺伝子を明らかにするとともに、可能性のある遺伝子について絞り込みを行うことである.始めに、上皮-間葉相互作用再構築の可能性について、幼若マウス由来唾液腺組織を用いた組織工学的研究を行った.出生後1週間以内の唾液腺未完成期のマウス顎下腺細胞を用いて上皮系、間葉系細胞を分離し、担体に播種した後ヌードマウス皮下に移植した。担体としては、コラーゲンゲルおよび多孔質のβ-TCPを用いた.得られた組織では、間葉系細胞および上皮系細胞の生存を確認することが可能であった.しかしながら間葉系細胞と比較して上皮系細胞の残存は僅かであり、移植したインプラントの周辺部に局在していた.上皮系細胞はクラスターを形成するものの、腺房様の構造は認められなかった.一方、再生過程で発現する遺伝子の絞込みを行った.比較的安定したデータが得られたDNA microarrayの結果から、唾液腺の再生過程で最も高頻度で発現が見られた遺伝子としてclusterinに着目した.clusterinは様々な臓器で発現が確認されているが、再生過程の膵臓中での発現が知られている.ラット唾液腺の導管を結紮後1週間にて、唾液腺の萎縮が引き起こされる.この導管結紮を解除し、12時間、24時間および36時間後の腺組織を摘出して、抗clusterin抗体を用いて免疫染色を行った.Clusterinは清浄組織では腺房の細胞質に分布し、萎縮唾液腺では萎縮した腺房の管腔側に強発現していた.この発現は、再生過程の進行とともに消失する傾向であった.本研究期間中の第1の課題として、唾液腺組織の再生過程で発現する遺伝子を解析し、候補遺伝子を明らかにするとともに、可能性のある遺伝子について解析を行った。第2の課題として、細胞を用いた唾液腺組織の再生・機能回復の実験として、従来行なってきた唾液腺上皮由来の細胞ではなく、骨髄由来の単核球細胞を用いた再生実験を行なった。比較的安定したデータが得られたDNA microarrayの結果から、唾液腺の再生過程で最も高頻度で発現が見られた遺伝子としてClusterinに着目した.ラット唾液腺の導管を結紮後1週間にて、唾液腺の萎縮が引き起こされる.この導管結紮を解除し、12時間から10日後までの腺組織を摘出して、抗clusterin抗体を用いて免疫染色を行った.Clusterinは正常組織では腺房の細胞質に分布し、萎縮唾液腺では萎縮した腺房の管腔側に強発現していた.この発現は、再生過程の進行とともに消失する傾向であり、6日後には細胞質に再び発現していた。
成体神経新生におけるオルガネラ間接触がPTSD発症に果たす役割

Post-traumatic stressdisorder (PTSD)は強烈なショックやストレスにより引き起こされる障害である。PTSDの原因として記憶想起メカニズムの異常が提唱されているが、その分子機構はほとんど不明なままである。本研究は申請者独自の結果とツールをもとに神経幹細胞の制御にオルガネラ接触の観点から初めて臨むものであり挑戦的なものであるが、非常に新規性が高く重要なマイルストーンとなる可能性を有する。Post-traumatic stress disorder (PTSD)は強烈なショックやストレスにより引き起こされる障害である。
ウイルスゲノムの解析による猫伝染性腹膜炎の遺伝子診断法の確立

本研究では猫の致死的な伝染病である猫伝染性腹膜炎(FIP)の原因となる猫コロナウイルスに着目して研究を行った。猫コロナウイルスにはFIPを起こすFIPウイルスと、軽い下痢程度でとどまる猫腸コロナウイルスの二種類がある。FIPウイルスと猫腸コロナウイルスの病原性の差異は、ウイルス自身が持つ蛋白質の設計図(遺伝子)がわずかに異なることによるとされているため、両ウイルスの遺伝子を比較した。猫コロナウイルスには猫に軽度の下痢を起こす病原性の弱い猫腸コロナウイルスと、血管炎に基づく致死的な全身性疾患である猫伝染性腹膜炎(FIP)を起こすFIPウイルスが存在する。過去の研究から病原性が高いFIPウイルスの発生機序の仮説として、猫腸コロナウイルスの猫体内におけるゲノム変異による病原性転換が提唱されている。本申請研究では動物病院および動物保護施設から得た猫の検体を使用し、猫腸コロナウイルスとFIPウイルスのゲノム塩基配列を比較することにより、病原性の転換にかかわるウイルスゲノム領域を発見することを目的の一つとしている。平成27年度は全国の動物病院の協力により、FIP症例の胸水や腹水などの臨床検体を収取した。また、動物保護施設の許可を得て臨床上健常あるいは下痢を示す猫の糞便を採取した。実際の解析では、病原性転換にかかわることが示唆されているウイルスのスパイク遺伝子、3c遺伝子、7遺伝子の塩基配列の決定を行った。3c遺伝子に着目した実験結果では、FIP症例の胸水および腹水の計12検体中のウイルスの3c遺伝子には、いずれも3c蛋白の短縮につながるフレームシフト変異が認められた。一方、健常猫の糞便および下痢便計5例のウイルスにはこのような変異は認められなかった。現在も胸水・腹水および糞便検体を収集中であり、症例数を増やして解析する。また、猫コロナウイルスは血清型I型およびII型の2種類に分けられ、どちらの血清型にも猫腸コロナウイルスおよびFIPウイルスが存在するが、約90%の感染はI型のウイルスによるものであり、II型ウイルスの感染は稀である。そのため、ほとんどのウイルスゲノムの解析研究はI型のものに偏っており、II型の研究は少ない。本申請研究では2例のII型ウイルスを得ることができたため、今後はII型に着目したウイルスゲノム研究も次世代シーケンサーを使用して進める予定である。FIPを疑う猫の臨床検体は全国の動物病院から得ている。平成28年度も継続して検体提供を得る予定であり、FIPウイルスを得ることができると考えている。また、健常猫の糞便収集も動物保護施設に収容されている猫から得る予定であり、検体数を着実に増加させることができる。解析内容も、「研究実績の概要」で述べた3c遺伝子のみでなく、スパイク遺伝子や7遺伝子の解析も進めている。特にスパイク遺伝子については、過去に海外の研究グループから報告されている特定部位のアミノ酸の置換につながる遺伝子変異を、本申請研究におけるFIP検体の実験でも確認できており、日本のFIP症例においてもスパイク遺伝子の解析によってFIPを遺伝学的な手法により診断することができる可能性があると考えられる。一部の民間検査機関においてはすでにスパイク遺伝子の解析に基づくFIPの診断サービス提供が始まっているが、遺伝子変異と病原性の変化の学術的関連は不明なままである。基礎研究によってその関係の基盤知見が得られれば、FIPの診断だけでなく病態の解明にも有益である。ところで、コロナウイルスの全RNAゲノムは約30万塩基であり、その解析には次世代シーケンサーが有用である。本申請研究でも次世代シーケンサーを利用した解析を行う予定であり、平成28年度からは次世代シーケンサーによる解析を行う予定である。申請者が所属する日本大学生物資源科学部には昨年度に次世代シーケンサーが導入された。そのため、外注するよりも低コストでウイルスゲノムの解析を進めることができると予想している。当面は外注と学内の機器を併用し、次世代シーケンサーによる解析系を確立する予定である。猫コロナウイルス(FCoV)には軽度の下痢を起こす病原性の低い猫腸コロナウイルスと、腹水や胸水などの滲出液が貯留し、致死的な経過を取る猫伝染性腹膜炎(FIP)を起こすFIPウイルスが存在する。FIPウイルスは猫腸コロナウイルスが猫体内でゲノムに変異を起こして病原性が転換して発生すると考えられており、本申請研究では腹水や糞便中のFCoVのゲノム塩基配列を比較することにより、病原性の転換にかかわる可能性のあるウイルス遺伝子の同定を進めている。そのうち、これまでにおこなったウイルスのS(スパイク)遺伝子の解析では、大部分の血清型I型のFIPウイルスにおいてアミノ酸の置換につながる変異が生じているとされるコドン1058およびコドン1060の塩基配列を決定した。その結果、既報のデータと同様に大部分の滲出液中のウイルスに変異が認められたが、糞便中のウイルスには認められなかった。したがって、これらの部位のアミノ酸の変化はウイルスの病原性の変化と密接に関連している可能性が考えられた。この成果の一部は平成28年9月に開催された第159回日本獣医学会学術集会にて口頭発表した。また、平成29年度中にまとめて学術雑誌に投稿予定である。3c遺伝子も約5070%のFIPウイルスにおいて蛋白の短縮につながる変異が報告されているため、本研究でその塩基配列の解析を進めている。これまでに解析した滲出液中ウイルスの87.5%に3c蛋白の短縮につながる変異が認められた。

また、変異の認められなかった症例の一部は滲出液および糞便の両検体が得られたため、これらから検出されたウイルスについて3c蛋白アミノ酸配列の変化を比較した結果、数箇所のアミノ酸に置換が認められた。したがって、これらのアミノ酸置換が3c蛋白の性状を変化させている可能性が考えられる。3c蛋白の変化も平成29年度中に論文として学術雑誌に発表する予定である。現在までに得た検体の内、約60症例では猫コロナウイルスが明瞭に検出され、それらについてS遺伝子や3c遺伝子の解析を進めている。過去の他グループの研究においても約20例30例のFIP症例のデータが論文としてまとめてられているため、本研究でこれまでに集めた症例数も発表できる水準に達していると考えている。また、平成29年度は当初の計画どおり次世代シーケンサーによる猫コロナウイルスのゲノム解析を行う予定である。猫コロナウイルスの1本鎖RNAゲノムサイズは約30キロ塩基であり、従来のキャピラリー方式のシーケンサーでは全長にわたる塩基配列の解析が困難である。対象となる検体としては、主に滲出液と糞便がセットで得られた症例と、比較的稀なS遺伝子に変異の無い猫コロナウイルスおよび、症例数の少ない血清型II型の猫コロナウイルスの滲出液の症例が中心となる予定である。本解析では猫腸コロナウイルスとFIPウイルスとのアミノ酸配列の比較を行って、アミノ酸の置換や蛋白の短縮につながるゲノム変異部位を同定する。猫コロナウイルスのウイルス蛋白の機能に関する報告は少ないため、それらの機能解析を進め、ウイルスの病原性転換を起こす可能性のある変異箇所を絞り込む予定である。既に一部のウイルス蛋白質については細胞内での機能解析に有用と考えられる実験結果を得ており、当該遺伝子を平成29年度以降の主要な解析対象とする予定である。また、分離が困難な血清型I型の猫コロナウイルスを効率よく分離する培養細胞の樹立を目的として、これまでに他グループから報告されているウイルスの受容体となる細胞蛋白を強制発現させた培養細胞は既に作出済みであり、平成29年度に実験を行う。本研究では病理学的な検査が診断に必要な猫伝染性腹膜炎(FIP)について、その遺伝子診断法確立のための知見を得ることを目的とした。これまでに動物病院に来院した約50頭の猫から猫コロナウイルスを含む検体を得られた。県動物保護施設の19頭の非FIP猫の糞便からも猫コロナウイルスを検出した。本申請研究で30例の滲出液(胸水・腹水)から検出された猫コロナウイルスを解析した結果、28例(93.3%)に当該変異が認められたが、動物保護施設の非FIP猫の糞便から検出されたウイルスには一切認められなかった。また、ウイルスの3c遺伝子は機能が不明であるが、60%以上のFIPウイルスは蛋白の短縮につながる変異を持つとされている。本研究でも滲出液中ウイルスの3c遺伝子を解析した結果、80%に変異が生じていた。以上の結果は既報の結果と一致している。滲出液中のウイルスの80%はSおよび3c遺伝子の両方に変異を持っていたため、両遺伝子の変異がウイルスの病原性に関与していると考察している。
ネット理論によるフレキシブル生産システムの階層的設計手法に関する研究

フレキシブル生産システムの階層的自律散制御機構を表現能力に優れたペトリネットを用いてモデル化、検証、シミュレ-ション,更には実時間制御のためのコントロ-ラ構築まで一貫してネット理論の枠組の中で行う体系的な設計手法確立のため本研究では、まず理論的基礎として階層表現における活性の保存性について検討を加えた。その結果、各層でのネットモデルにおけるwell-behavednessの条件が明らかとなり、活性検証の有力な手法が見出された。また並行事象間の独立性の尺度として公平性の概念を導入し、資源有効利用のための最適資源配置に指針を与える公平度算定法が提案された。事故復旧動作の時間的上限を与える離散事象システムでの過渡応答時間の見積もりや、ショップスケジュ-リングでの重み付時間最適化等の問題に対してもネット理論的アプロ-チを試み、その具体的アルゴリズムを提案している。また、ネット解析に重要な役割を果たすインバリアントの算定法についても、限られたクラスではあるが、色付ペトリネットも含めてその構造的決定手順を明らかにした。最後に制御問題の基本であるネットモデルにおける可到達性を検討し、応用上重要なサブクラスである自由選択ネットにおける可到達判定のための効率の良い必要十分条件が得られた。以上理論的知見は並行システムシュミレ-タPCSSの機能拡充にとり入れられ、現在。PCSSは階層ネット、色付ネットの動作解析を行う実用的なツ-ルとして強化されている。応用上の検討としては、OSIプロトコルの一部であるHOLCのネットモデルおよびその検証手法を提案することにより、将来の自律分散プロトコルの自動設計のための指針が与えられた。また、自動搬送車誘導のためのスケジュ-リングシステムや、FMSでの分散シ-ケンスコントロ-ルを実現するためのプログラム開発環境整備についてもその基盤が固められた。本研究の初年度に当り,まず複数トランジションの同時逐次詳細化によるシステムのトップダウン設計なちびにネットモジュールの複合によるボトムアップ設計の基礎研究を行い,各階層モデルでの有界性・活性の保存性についての条件を導出した.これらの知見はフレキシブル生産システムの階層表現における,解析・検証に対する新らしい手法を提供するものである.つぎに,並行システムでの各構成要素間の動作の並行性に対する定量的な尺度を定義し,これを評価する手法に関し従来の同期距離の概念との関係も含めて考察し基礎的知見を得た.この知見は有限資源の特定要素による独占排除や資源の有効配置問題に適用することができる.また,並行分散システムでの周期動作ならびに過渡状態に対する新しい概念を導入し,その評価方法を与えた.これはシステムの復旧動作・異常検出に適用することができる.最後に,既に開発済の並行システムシミュレータPCSSの機能を拡充するにめに解析ツールの開発・搭載を行うことを試み,システムの構造解析を行う際に不可欠のインバリアントの検出プログラムならびに有界性,活性判定アルブリスム,周期,過渡応答時間の見積り評価プログラム等を完成し搭載が行われた.また,生産システムの設備制約をネットモデル陽に表現し,その競合状態をタイムペトリネット上で検出し,最適スケジューリングを行う有効な方法を開発し, PCSSに搭載された.以上により,当初計画の大部分が予定通り達成され次年度への発展が期待される.フレキシブル生産システムのLANあるいはバス結合による通信を行う際の通信規約について、OSI参照モデルのデータリンク層プロトコルをペトリネットにより表現し、その検証手法を提案した。また、非同期システムでの動作依存性あるいは並行性の定量的尺度として公平度の概念を導入しその算定法を提案した。ペトリネットモデルを用いた生産システム階層設計のためのCADツールとして、ネットエディタやシミュレータを開発し、ユーザインタフェースの優れたネットアナライザをワークステーションNEWS上に搭載した。

以上の成果を踏まえ、理論的整理と実用的CADシステムの構築を最終年度完成を目ざし行う予定である。本研究の最終年度にあたり、過去2ケ年に渉る基礎研究で得られた成果を整理、公表するとともに実システムへの応用としてフレキシブル生産工場での自動搬送システムのスケジュ-リング制御、シ-ケンス制御プログラムの自動生成ソフトウェアの構築ツ-ル等を開発した。具体的には、非同期システムでの並行動作における資源専有の尺度として公平性の概念を定量化し、あるクラスについてその算定法を提案した。また、並行システムの制御における重要な基本問題である可到達性に関し、応用上主要なネットクラスである自由選択ネットについてその必要十分条件を多項式オ-ダで判定可能な形で導出することができた。これらの理論的成果は、並行システムシミュレ-タとして開発済のPCSSの機能拡張にとり入れられ、例えばネット分解手順によるネット構造の判定規則、活性判定のためのインバリアント計算アルゴリズム、階層表現とそのシミュレ-ション、ト-クン属性を付加した色付ペトリネットとそのシミュレ-ション等の機能がPCSSに追加され、応用範囲が拡げられた。また、いくつかの企業研究グル-プとの共同により、フレキシブル生産を目ざした自動化工場における自動搬送システムの設計・制御ソフトウェアやシ-ケンス制御プログラム(ラダ-ダイアグラム)を自動生成するシステムの試作を行い、実工場における運用テストを実施した。本研究で得られた知見は上記のように生産システムのフレキシブルな運用・保守・変更を可能とする制御プログラムの開発環境を構築するための基盤を与えるものであり、将来のCIM、FMS実現に大きく寄与するものと期待している。
腹部大動脈瘤におけるアドレノメデュリン・マスト細胞の意義と新たな治療法の開発

腹部大動脈瘤の病態・進展機序は不明である。我々はヒト大動脈瘤組織中のマスト細胞からアドレノメデュリン(AM)が産生されることを報告した。本研究は腹部大動脈瘤モデルマウスを作成し、AMの役割を明らかにすることであった。12週齢雄ApoE-/-マウス及びAM+/- ApoE-/-マウスにアンジオテンシンIIを投与した。更にApoE-/-マウスにAM製剤を投与し、死亡率、腹部大動脈瘤発生率や動脈径を観察した。しかし、いずれのモデルでも腹部大動脈瘤の発生率や死亡率は各群間で差はなく、本研究でAMの関与は認められなかった。腹部大動脈瘤は動脈硬化を基盤として60歳以上の高齢者に発症する難治性疾患であり、有効な内科的治療は存在しない。腹部大動脈瘤組織では、本研究代表者等が発見したアドレノメデュリン(AM)がマスト細胞に高濃度局在している。また、我々はマスト細胞の機能制御により動脈瘤の発症・進展を抑制できる可能性を明らかにした。本研究では、腹部大動脈瘤の血管壁、特に外膜に存在するマスト細胞由来AMの腹部大動脈瘤の発症・進展機序に関する病態生理学的役割を明確にする。さらに、AMによる外膜の炎症機転の制御を主眼にした腹部大動脈瘤の内科的治療法の基盤を確立するための基礎的・臨床的研究を推進する。腹部大動脈瘤の発症および進展における血管壁のAMが善玉であるのか悪玉であるのかを明確にするため、遺伝子改変AM欠損マウスとアポリポプロテインE遺伝子を欠損されたマウス(Apo EKO)マウスの交配を行い、両遺伝子の欠如したダブルノックアウトマウスの確立に成功した。本モデルを解析することで、AMの動脈瘤発症における病態生理学的意義が明らかになると思われる。また、手術時に得られた大動脈瘤組織標本に関して、炎症の程度を鏡検で評価するとともに、マスト細胞の分化や成熟に関わるstem cell factorやその受容体であるc-kitのリン酸化を検討した結果、マスト細胞の活性化が動脈瘤発症の引き金になって、マクロファージが活性化されることが動脈瘤の発症進展に重要であるが明らかとなった。現在マスト細胞とマクロファージの培養細胞を用いて、両細胞間の細胞間情報伝達に関して検討を進めている。さらに、既に拡大した動脈瘤に対してもマスト細胞制御により治療効果があるかどうかの検討を塩化カルシウム塗布によるモデル実験にマスト細胞膜安定化剤(トラニラスト)を投与して検討している。動脈硬化や動脈瘤の進展において、「血管外膜」は新生血管増生などを介して炎症の持続や血管リモデリングに積極的に関与している可能性が示唆される。また生理活性ペプチドであるAdrenomedullin(AM)は血管内皮細胞において抗炎症作用や抗酸化作用を有しており、動脈硬化や動脈瘤の進展制御も期待される。我々は加齢に伴う動脈硬化進展における血管外膜の炎症と血管壁の構造変化について、通常食で飼育したApolipoprotein(Apo)E-/-マウス(動脈硬化モデルマウス)、AM^<+/->マウスを用いて、週齢別(16、32、52週齢)及び大動脈部位別(弓部、下行、腹部大動脈)に検討した。野生型と比較するとAM^<+/->マウスは形態的な違いは明らかでなかった。ApoE-/-マウスは52週齢の腹部大動脈外膜側にマクロファージ、Tリンパ球、CD31陽性血管数が著増し、これらはプラーク/中膜面積比と正に相関した。また、52週齢のApoE-/-マウスの腹部大動脈中膜内エラスチン含量は有意に減少し、血管周囲径は他の部位に比べて拡大していた。ケモカインであるregulated on activation, normal T cell expressed and secreted(RANTES)はプラークのみならず外膜の炎症細胞に分布し、52週齢のApoE-/-マウスの腹部大動脈で特に増加した。これらの結果から、加齢に伴う血管外膜の部位特異的な炎症細胞浸潤は、組織中サイトカイン・ケモカイン産生を介して血管の構造変化に寄与している可能性があることが示唆された。また、腹部大動脈瘤モデルマウス(アンギオテンシンIIを皮下投与し作成)を用いて形態的な評価を行ったが、ApoE-/-マウスとAM^<+/->ApoE-/-ダブルノックアウトマウスにおいて、腹部大動脈瘤の発症頻度、腹部大動脈径、腹部大動脈外膜に集積する炎症細胞浸潤等、いずれも両群間で違いは明らかでなかった。アドレノメデュリン(AM)の腹部大動脈瘤発症・進展への関与を明らかにし、同疾患に対するバイオマーカーとしての有用性ならびに新規治療薬としての可能性を探ることを本研究の目的とした。

われわれは、AMが心血管の構築や機能に影響を及ぼすことを報告してきた。正常血管壁におけるAMの主要な産生部位は中膜の平滑筋層であった。しかし、腹部大動脈瘤では菲薄化した平滑筋層におけるAMの染色性は低下し、一方、中外膜に分布するマスト細胞からの産生が顕著だった。AMとアポリポプロテインE(apoE)の両遺伝子を改変させたマウス(apoE-/-AM+/-マウス)を作成して動脈瘤モデルの作成を試みたが、apoE-/-マウスとapoE-/-AM+/-マウスにおいて、マウスの瘤破裂による死亡率、瘤の発生率・最大径について両者間、有意な差を認めなかった。更に組織像を比較した。大動脈外膜へ集積するマクロファージ、Tリンパ球や微小血管数に有意な差はみられなかった(apoE-/- n=15 vs. apoE-/-AM+/- n=27;マクロファージ:33.3±10.9 /mm2 vs. 16.2±5.5 /mm2, p=0.1253、Tリンパ球:11.0±4.4 /mm2 vs. 14.66±3.2 /mm2, p=0.5038、微小血管数:14.8±4.1 /mm2 vs. 10.33±1.9 /mm2, p=0.2639)。各群間で差が見いだせなかった理由として、1)比較的若年のマウスを用いた(16週齢)、2)高脂肪食ではなく普通食で飼育した、3) AM-/-マウスは胎生期死亡するためAM+/-マウスを用いたため、AMの生理学的活性を充分に観察できなかった、4)観察期間が短かった可能性が考えられた。アドレノメデュリン(AM)の腹部大動脈瘤発症・進展への関与を明らかにし、同疾患に対するバイオマーカーとしての有用性ならびに新規治療薬としての可能性を探ることを本研究の目的とする。我々は、AMが心血管の構築や機能変化に影響を及ぼすことをこれまでに報告してきた。正常血管壁におけるAMの主産生部位は中膜の平滑筋層であるが、腹部大動脈瘤においては菲薄化した平滑筋層におけるAMの染色性は低下し、一方、中外膜に分布するマスト細胞からの産生が顕著となる。本研究では(1)ヒト腹部大動脈瘤患者の血中・組織中AM濃度の測定とPET-CTデータとの関連性を調査、(2)AMとアポリポプロテインEの両者を遺伝子改変させたマウスを作成して動脈瘤モデルの作成を試みることにより、動脈瘤形成におけるAM遺伝子の役割について引き続き模索する。アポEノックアウトマウス、AMノックアウトマウスの産出を継続的に行い、解析を進める。25年度が最終年度であるため、記入しない。われわれは、アンジオテンシンII(1000 ng/kg/min)を負荷して作成されるマウスに腹部大動脈瘤モデルを用いた。AMとアポリポプロテインEの両者を遺伝子改変させたマウス(AM+/- apoE-/-マウス)(n=29)と、アポリポプロテインE遺伝子のみの欠損マウス(apoE-/-マウス)(n=18)の死亡率、大動脈瘤発生率、瘤最大径について比較検討したが、統計学的に有意差は認められなかった(AM+/- apoE-/-マウスvs. apoE-/-マウス;死亡率: 6.8% vs. 5.2%, p = 0.7959、大動脈瘤発生率: 34.6% vs. 44.4%, p=0.5103、瘤最大径: 1.17±0.1 mm vs. 1.39±0.2 mm,中央値±標準誤差, p = 0.612)。
清帝国と法多元主義―中国東北地方の法の実態をめぐって

本年度は、(1)学会での研究報告、(2)アメリカでの在外研究、(3)資料収集とその事実関係の整理を主に行った。(2)在外研究。アメリカのプリンストン大学に留学し、Benjamin Elman教授をはじめ、アメリカの優れた研究者との交流を深め、それにより、アメリカにおけるQing Historyに関する最新の研究動向も詳しく把握でき、自分の研究分野である東北地方の法制史の分析・理解することにもつながった。(3)資料収集・整理。アメリカで本研究の基盤史料である「黒図档」を閲覧・収集し、上海や内モンゴルで本研究に関連する公文書や資料を収集した。また、『清実録』から東北地方の司法制度を整理し、研究課題に関わるNew Qing History・モンゴル法制史・八旗の土地制度などの様々な分野の先行研究をまとめ、これからの研究基礎を固めた。上述のように、Global Historyに関連する欧米の方々との交流などにより、博論の全体構想もまとまりつつあり、中国やアメリカにおける資料収集も進んでおり、清朝東北地方の司法制度の変容もまとめた。これらの研究交流・資料収集などを通じて、これからの研究の基礎を築いた。本研究全体として、おおむね順調に進展していると言える。最終年度である31年度は収集した資料を分析し、博論の主体を完成し、東北地方の法の実態及び変容を解明した上で、成果を学会報告や論文の形で発表することを予定している。(2)在外研究。
高速二酸化炭素分離用ゼオライト膜の後処理技術の確立

二酸化炭素分離技術のため、FAUやMORなど大きな細孔をもつゼオライト膜の開発を進める。そのため、カゴ状シルセスキオキサン(POSS)などの合成技術をベースとした高度な後処理を開発する。POSSは、合成条件を最適化することで、ゼオライトの4員環、5員環と類似しているSi-O-Si結合の4員環や5員環などを選択的に形成することができる。そのため、4員環をもつ合成途中のPOSS構造の場合、ゼオライトの4員環部分のみに有機置換基を導入可能となると思われる。さらに、有機置換基をもつ4員環、5員環中間体はFAUやMORの細孔より大きく、ゼオライト膜表面のみの処理が行える。
RNA干渉を用いたドナー臓器修復・免疫寛容誘導戦略の前臨床大動物実験による開発

ドナー不足に対するマージナル脳死・心停止ドナーへ適応拡大の際は、虚血再灌流障害(IRI)に伴う急性臓器不全や、免疫活性化による急性・慢性拒絶反応誘発が懸念され,本研究ではsmall interfering RNA(siRNA)を用いた保存臓器の保護・修復から、移植医療の向上を目的としている。主要組織適合性抗原MHC確立ミニブタ脳死ドナー腎臓に対し、独自開発のsiRNAを直接投与し、ドナー臓器内の炎症・拒絶惹起因子HMGB1、IL-6、CD40を中心とする発現制御を図る。修復ドナー臓器移植による1移植後急性期IRI抑制効果、2拒絶反応の制御から長期予後の改善、3より臨床応用性の高いドナー臓器保存の際の投与効果、の3点に焦点をあて、系統立てた前臨床実験から効果と移植免疫学的機序を解明する。平成30年度は、実験計画の平成29年度-平成30年度上半期に実施した目的1.脳死ドナーに対するsiRNA導入( HMGB1、IL-6)によるIRI抑制効果の実験・検証に引き続き、平成30年度下半期平成31年度実験計画に沿って目的2.脳死ドナーsiRNA導入(HMGB1、IL-6、副刺激分子CD40)によるIRI・拒絶抑制効果の評価(MHC不適合腎移植)リンパ球活性化には、抗原提示細胞・リンパ球間の副刺激シグナルが重要であり、副刺激経路遮断による免疫制御に期待がもたれる。目的2では、臨床移植医療に準じたMHC不適合腎臓モデルでの強い免疫反応下で、目的1の炎症制御に副刺激分子CD40の制御を加えることにより短期IRI・拒絶制御および免疫寛容誘導を評価した。平成30年度は、当初研究実施計画に記載した内容について、研究実績の概要に記載したように計画通りの実験を遂行したが、十分な結果を得ることができなかった。やや遅れているが、平成31年度以降も計画書に従い、研究を進めることが可能と考えらる。研究課題の継続として、平成30年度下半期平成31年度実験計画に沿って、平成30年度の結果を基に、平成31年度は、目的2.脳死ドナーsiRNA導入(HMGB1、IL-6、副刺激分子CD40)によるIRI・拒絶抑制効果の評価(MHC不適合腎移植)を行い、臨床移植医療に準じたMHC不適合腎臓モデルでの強い免疫反応下で、目的1の炎症制御に副刺激分子CD40の制御を加えることにより短期IRI・拒絶制御および免疫寛容誘導の可能性を検討・評価する。平成29年度は目的1.脳死ドナーに対するsiRNA導入( HMGB1、IL-6)によるIRI抑制効果の検証を行った。主要組織適合性抗原MHC確立ミニブタ脳死ドナー腎臓に対し、12日間低濃度FK506持続投与(血中濃度:10-15ng/ml)によりマイナー抗原応答を制御。既報のin vivo実験に基づき、ボナック核酸siRNA(抗HMGB1およびIL-6)1-5 mg/kgを、経腎動脈投与し、HMGB1、IL-6の各々の治療効果を非導入例と比較。移植臓器の3か月以上の生着もしくは機能不全をもってend pointとした。血清ELISA法や生検検体RT-PCRによるmRNA定量、炎症(TNF-α, IL-1β,IFN-γ)/抗炎症性(IL-10/IL-1ra/TGF-β)サイトカイン等を評価する。siRNA導入群と非導入群を比較し、結果、本目的のHMGB1、IL-6導入またその併用によるIRI抑制効果をみ認めた。IL-6とHMGB1併用あるいは追加標的を同定し、siRNAを生成し、同様のプロトコールで効果を検証する必要があると考えられる。平成29年度は、当初研究実施計画に記載した内容について、研究実績の概要に記載したように計画通りの実験を遂行し、また結果を得ることができた。平成30年度以降も、計画書に従い、円滑な研究を進めることが可能と考えられるため、おおむね順調に研究が進んでいるものと判断した。平成30年度は、実験計画の平成29年度-平成30年度上半期に実施した目的1.脳死ドナーに対するsiRNA導入( HMGB1、IL-6)によるIRI抑制効果の実験・検証に引き続き、平成30年度下半期平成31年度実験計画に沿って目的2.脳死ドナーsiRNA導入(HMGB1、IL-

6、副刺激分子CD40)によるIRI・拒絶抑制効果の評価(MHC不適合腎移植)リンパ球活性化には、抗原提示細胞・リンパ球間の副刺激シグナルが重要であり、副刺激経路遮断による免疫制御に期待がもたれる。目的2では、臨床移植医療に準じたMHC不適合腎臓モデルでの強い免疫反応下で、目的1の炎症制御に副刺激分子CD40の制御を加えることにより短期IRI・拒絶制御および免疫寛容誘導を評価した。平成30年度は、当初研究実施計画に記載した内容について、研究実績の概要に記載したように計画通りの実験を遂行したが、十分な結果を得ることができなかった。やや遅れているが、平成31年度以降も計画書に従い、研究を進めることが可能と考えらる。研究課題の継続として、平成29年度の結果を基に、平成30年度は、目的2.脳死ドナーsiRNA導入(HMGB1、IL-6、副刺激分子CD40)によるIRI・拒絶抑制効果の評価(MHC不適合腎移植)を行い、臨床移植医療に準じたMHC不適合腎臓モデルでの強い免疫反応下で、目的1の炎症制御に副刺激分子CD40の制御を加えることにより短期IRI・拒絶制御および免疫寛容誘導の可能性を評価する。研究課題の継続として、平成30年度下半期平成31年度実験計画に沿って、平成30年度の結果を基に、平成31年度は、目的2.脳死ドナーsiRNA導入(HMGB1、IL-6、副刺激分子CD40)によるIRI・拒絶抑制効果の評価(MHC不適合腎移植)を行い、臨床移植医療に準じたMHC不適合腎臓モデルでの強い免疫反応下で、目的1の炎症制御に副刺激分子CD40の制御を加えることにより短期IRI・拒絶制御および免疫寛容誘導の可能性を検討・評価する。アッセイのための試薬・材料の費用が当初の見込みよりも少ない結果となり、次年度使用額が生じました。もし可能ならば、同様の目的で平成30年度予定している実験の物品費として使用する計画です。不可ならば返還します。もし可能ならば、同様の目的で平成31年度予定している実験の物品費として使用する計画ですが、不可ならば返還します。