hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウイルス感染症克服に向けた糖鎖機能改変による革新的感染制御

デング、日本脳炎ウイルスの細胞内増殖およびその病態形成には宿主側因子が必須である。両ウイルス感染に関わる機能糖鎖を探索・分子最適化して用いることで、ウイルスの感染細胞内におけるウイルス増殖機構および病態形成機構を解明およびウイルス感染症制御に有用な物質的基盤を構築することを目的として研究を実施した。本課題研究を通して、ウイルス粒子の成熟や細胞内取込に関与する糖鎖分子の同定、抗デングウイルス活性を示す食用キノコの同定、新規抗ウイルス剤の創出・最適化、遺伝子改変マウスを用いたウイルス組織指向性・病態形成機構の解明などの成果を挙げるとともに、抗デングウイルス剤リードとなる化合物を創出した。平成25年度において以下の成果を得た。1.糖鎖機能改変プローブの分子最適化デングウイルスEタンパク質との結合およびウイルス増殖阻害作用が明らかにされているオクチルグルコシドをリードとして糖鎖機能制御プローブ誘導体ライブラリーを新たに構築した。このライブラリーからデングウイルス感染阻害活性を指標に探索を行った結果、Octyl-2-O-sulfo β-D-glucuronic acidを機能改変候補化合物として同定した(IC50値=約0.1 mM)。さらにX-線結晶構造解析データ(PDB: 1OKE)を利用して、デングウイルスEタンパク質上の疎水性ポケットに対するこの化合物の相互作用について熱力学的シュミレーションをはじめとするコンピュータモデリング手法を行い、阻害化合物とEタンパク質上のアミノ酸との相互作用を分子レベルで明らかにするとともに、膜融合を標的とする新規抗デングウイルス剤リードであることを示した。2.受容体糖鎖改変マウスを用いたウイルス感染機構の解明CSEは哺乳動物の生体内に広く分布しており、脳内では神経細胞に特徴的に発現している。生体内でのCSEの日本脳炎ウイルス感染における機能を解明するため、CSE合成酵素遺伝子欠損(CSE-KO)マウスに対する日本脳炎ウイルス感染を行った。CSE-KOマウスはヘテロマウスを交配させることにより取得した。3週令のCSE-KOマウスおよびその野生型Balb/cマウスに対して、麻酔下、日本脳炎ウイルスを頭蓋内に接種した。マウスの感染後の体重変化のモニタリング、行動観察および生存率測定を行った。その結果、CSE-KOマウスでは有意差は得られなかったものの野生型マウスに比べて生存率の延長傾向が認められた。CSEは脳神経系へのウイルス指向性に関与するのではなく、ウイルス感染に対する防御的な因子として機能していることが示唆された。本研究は,デング・日本脳炎ウイルス病態発現の分子機構の解明および感染症制御に有用な物質的基盤を構築することを目的としている。平成24年度において以下の項目について研究を実施し、成果を得た。1.糖鎖機能改変プローブを用いたデング・日本脳炎ウイルス感染機構の解明:グルコース転移酵素阻害剤であるPDMPを用いてウイルス増殖阻害効果を検討した。PDMPは両ウイルスの増殖を阻害した。ウイルス感染後期の過程において作用していることが示唆された。糖脂質が両ウイルス感染にとって必須の分子であるかどうかを糖脂質欠損マウス胎児由来繊維芽細胞を用いて検討した。その結果、ウイルス侵入効率に違いは認められない一方で、細胞外へのウイルス粒子の放出に著しい低下を認めた。以上のことから、細胞内糖脂質が両ウイルスの増殖に必須であることが示されるとともに、ウイルス粒子の成熟、細胞外放出に重要な役割を担っていることが示唆された。2.新規糖鎖機能改変プローブの探索・性状解析:食用キノコの抽出液から抗DENV、抗JEV活性を有する化合物の探索をおこなった。その結果、オオヒラタケ熱水抽出物中にきわめて高い抗デングウイルス活性を検出した(IC50値=約0.01mg/ml)。当熱水抽出物の感染阻害効果はウイルス感染後の細胞を処理することによって認められたことから、ウイルスの複製過程を阻害していることが示唆された。3.ウイルスNS1タンパク質修飾糖鎖の構造と機能解析:感染個体においてDENVタンパク質の一つであるNS1が糖鎖修飾を受けた後、ウイルス血症に先行して血中濃度が上昇すること、その濃度と重症度(デング出血熱)が相関することが知られている。NS1タンパク質上の修飾糖鎖構造をレクチンブロット法により解析した。糖鎖のシアル酸残基が標的細胞への結合に関与していることが示唆された。デング(DENV)・日本脳炎(JEV)ウイルス感染に直接・間接的に関わる機能糖鎖を改変するプローブを化学合成あるいは天然資源から探索・分子最適化して用いることで、ウイルスの感染細胞内におけるウイルス増殖機構および病態形成機構を解明するとともに、両ウイルス感染症制御に有用な物質的基盤を構築することを目的として研究を実施した。最終年度では、計算科学的アプローチにより糖鎖機能制御プローブの更なる構造最適化を進め、プローブ分子によるウイルス表面タンパク質の構造変化が抑制される可能性を示した。

さらに、JEV神経弱毒性株と強毒性株のコンドロイチン硫酸E(CSE)に対する結合性の違いについて検討を行い、ウイルスEタンパク質上の123番のアミノ酸が、Ser(Mie-41株)→Arg(Beijing-1株)への1アミノ酸置換することにより脳神経系に存在するCSEとの結合性が上昇し、神経細胞への感染効率が上昇する可能性を示した。本課題研究を通して、(1)細胞内糖脂質がウイルス粒子の成熟に関与する新たなウイルス感染機構、(2)高い抗デングウイルス活性を示す食用キノコ同定、(3)NS1タンパク質糖鎖末端シアル酸構造の同定とシアル酸依存的細胞内ウイルス粒子取込機構、(4)糖合成化学およびコンピュータ科学連携による新規DENV細胞内侵入阻害剤創出、(5)遺伝子改変マウスを用いたウイルス感染に関わるCSE機能解明、(6)計算科学的アプローチによる侵入阻害剤構造最適化、(7)JEVの神経組織指向性・病原性へのCSEの関与などについて成果を挙げた。本研究による成果は、感染過程におけるウイルスー宿主因子間相互作用、特にウイルス膜ー宿主細胞膜間融合機構、ならびに病態形成機構の解明に貢献した。さらに抗デングウイルス剤リード化合物となることが期待される感染症制御プローブ分子が創出された。糖鎖生物学、ウイルス学本課題研究の目指すところは感染過程におけるウイルスー宿主因子間相互作用を介した病態形成機構を解明するとともに感染症制御に有用な物質的基盤を構築するものである。本年度の研究成果の達成度は以下のようにまとめられる。(1)糖合成化学およびコンピュータ科学の技術・知見を連携させることにより、デングウイルスの細胞内侵入阻害剤の創出を行った。独自に作成した糖誘導体ライブラリーから、ウイルスにより誘導される膜融合を制御することでウイルス感染を効率的に阻害できる新規ウイルス増殖阻害化合物を同定した。本化合物は、デングウイルスの流行を有効に阻止するための抗デングウイルス剤リード化合物になると考えている。さらに本化合物の作用機序解析から、未だ十分に解明されていないデングウイルス感染初期過程におけるウイルス膜ー宿主細胞膜間融合機構の分子レベルでの解明に貢献した。(2)遺伝子改変マウスを用いて、デングウイルスならびに日本脳炎ウイルス結合性糖鎖分子であるコンドロイチン硫酸E(CSE)のウイルス感染にかかわる機能解明を試みた。CSE欠失マウスにおける日本脳炎ウイルスの脳内感染は、野生型マウスに比べて感染が阻害される傾向が認められ、本糖鎖分子は生体内におけるウイルス感染防御に寄与していることが示唆された。生体内糖鎖分子のフラビウイルス感染における機能を動物レベルで理解することに貢献した。以上、本年度における研究達成度について、当初の目的に沿った成果が得られ、研究全体の目的に対して概ね予想通りの成果を上げることができたと言える。本課題研究の目指すところは感染過程におけるウイルスー宿主因子間相互作用を介した病態形成機構を解明するとともに感染症制御に有用な物質的基盤を構築するものである。
癌抗原発現ワクシニアウイルスを用いた腫瘍溶解免疫療法の開発

癌ウイルス療法の標的疾患として多発性骨髄腫を選び、マウスVk*MYC細胞の同系移植マウスへの感染実験を行ったが、Vk*MYC細胞ではワクシニアウイルスの感染性が低く、腫瘍縮小効果が不十分であった。そのためin vitroでスクリーニングを行い、より評価に適したマウス肺癌細胞株3LL細胞の同系マウス皮下移植モデルを選択し、以後の研究を進めた。また、本邦で開発されたワクシニアウイルスLC16m8株に以下の様な改変を加え抗腫瘍効果の増強を図った。(1)腫瘍組織の免疫抑制細胞MDSCを抑制するHPGD遺伝子を挿入。(2)細胞障害T細胞を活性化するIL-12遺伝子を挿入。(3)代替癌抗原としてOVAの3LL細胞への導入。(4)マウスNKT細胞活性化作用を持つCD1dを強制発現させた人工アジュバント細胞の併用。(5)GM-CSF/OVA融合蛋白の人工アジュバント細胞からの分泌。これらの改変型ワクシニアウイルス、人工アジュバント細胞の作製を行い、抗腫瘍効果をin vivoで評価した。B6/3LL皮下腫瘍モデルに対し、改変型ワクシニアウイルスは腫瘍特異的に感染して腫瘍の増殖を阻害し生存期間を有意に延長した。また人工癌抗原OVAを発現したB6/3LL-OVAモデルに対し、人工アジュバント細胞を経静脈的に投与したところ、腫瘍増殖の有意な抑制を確認できた。過去のマウスを用いた先行研究では、異種移植モデル等、免疫不全マウスでワクシニアウイルスの抗腫瘍効果は報告されていたが、本研究のような正常免疫マウスでの有効性はWR株によるわずかな例を除いて報告がなかった。WR株は中枢神経毒性があり、弱毒化の改変を行わなければ人への臨床使用に危険性が残る一方、我々のLC16m8株はヒトでの安全性が強固に確認されており、将来の癌治療への応用に際し優位性がある。癌抗原発現ワクシニアウイルスによる抗腫瘍免疫誘導の基礎検討癌抗原に対する免疫応答を観察する初期検討として、まずルシフェラーゼ-2A-GFPを代用癌抗原としたマウス骨髄腫モデルの作製に取り組んだ。腫瘍細胞、ワクシニアウイルス共にルシフェラーゼ・GFPを発現するよう設計した。Vk*Myc細胞はB6マウス由来の骨髄腫細胞で、同系マウスに移植可能であるが、in vitroでは培養できないため、我々は当初骨髄移植にて継代を行っていた。レンチウイルスでルシフェラーゼ-2A-GFPを遺伝子導入したVk*Myc細胞を骨髄移植するとバイオイメージングには十分なルシフェラーゼシグナルを検出できたが、免疫能正常なB6マウス骨髄では遺伝子導入されていない細胞が共存すると増殖が遅く、消失はしなかったものの次のマウスへの継代に十分な数のルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞を回収できなかった。方法の改善が必要と考え、遺伝子導入後Vk*Myc細胞をSCIDマウスの皮下にMatrigelと共に移植してみたところ、2週間後には触知可能な腫瘤が形成されることがわかった。またこの皮下腫瘤より回収した腫瘍細胞は新たなマウスに移植して皮下腫瘤を形成することも確かめた。SCIDマウスの皮下腫瘤としてexpandするとルシフェラーゼ-2A-GFP導入Vk*Myc細胞をFACSで十分量回収できたため、今後はこの純化された遺伝子導入Vk*Myc細胞をB6マウスの骨髄(または皮下)に移植し、ルシフェラーゼ・GFP発現ワクシニアウイルスを感染させて抗腫瘍効果を観察する予定である。当初、ルシフェラーゼ・GFP導入Vk*Myc細胞をマウス体内で増幅させる事に難渋したが、SCIDマウスのVk*Myc皮下腫瘤モデルを利用することで解決の目途がつき、概ね計画通りに研究を進める事ができた。またVk*Myc骨髄腫モデルが当初の予定通りに進まない場合に備えて、マウスB6由来肺癌細胞株である3LL細胞の皮下腫瘤モデルも並行して作製した。B6由来の癌細胞株へワクシニアウイルス(VV)のin vitro感染実験を行ったところ3LL細胞は他のマウス癌細胞株(MC38大腸癌、B16メラノーマ)と比較して特にVVへの感受性が高かったため、感染実験に適したモデルになると考えられる。3LLを皮下移植したB6マウスに1x10^7 pfuのVVを経静脈的に感染させたところ、皮下腫瘤の有意に体積の増加を抑制し、生存期間も有意に延長させた。癌抗原に対する免疫応答観察のモデルとして、B6マウスに対する同系骨髄腫細胞であるVk*Myc細胞の移植モデルを作製した。このVk*Myc細胞にルシフェラーゼを遺伝子導入することで体内での腫瘍量や腫瘍分布を生体内バイオイメージング(in vivo imaging system, IVIS)で追跡可能となり、このVk*Myc/Luc骨髄腫に対し、ワクシニアウイルスを感染させることで抗腫瘍効果を確認する実験系も作製できた。しかしVk*Myc細胞はin vitro培養が不可能でマウス体内での継代できない扱いの難しい細胞株であり、ワクシニアウイルスによる抗腫瘍免疫誘導効果も腫瘍を完全に消失させるには不十分であった。この問題を解決するためin vitroで扱いやすく、腫瘍免疫の効果判定が容易なマウス肺癌細胞株である3LL細胞の同系マウス皮下移植モデルを用いて以後の研究を進める事とした。また、ワクシニアウイルスには以下の様な種々の改変を加え抗腫瘍効果の増強を図った。(1)腫瘍組織に存在する骨髄由来抑制細胞MDSCを抑制するHPGD

遺伝子をワクシニアウイルスB5R遺伝子下流に挿入。(2)細胞障害T細胞を活性化するIL-12遺伝子をワクシニアウイルスTK遺伝子部位との組換え。(3)3LL細胞に代替癌抗原としてOVAを発現させ、B6マウスのMHC (H-2Kb)でエピトープとなるSIINFEKLモチーフをワクシニアウイルスに挿入。(4)マウスNKT細胞を活性化する作用をもつCD1dを強制発現させた人工アジュバント細胞の併用。(5)GM-CSF/SIINFEKLモチーフ融合蛋白の人工アジュバント細胞からの分泌。これらの改変型ワクシニアウイルス、人工アジュバント細胞の作製が現在進行中であり、次年度はB6/3LL-OVAマウス皮下移植モデルを用いて治療実験を行う予定である。当初使用していたマウス由来骨髄腫細胞株Vk*Myc細胞はin vitro培養が不可能でマウス体内での継代できない扱いの難しい特性があり、ワクシニアウイルスによる抗腫瘍免疫誘導効果も腫瘍を完全に消失させるには不十分であった。したがってin vitroで培養が容易で、同系マウスの移植実験も可能なB6由来マウス肺癌細胞株である3LL細胞の皮下移植モデルを用いて以後の研究を進める事とした。以下のようにワクシニアウイルスには以下の様々な改変を加え抗腫瘍効果の増強を図った。(1)腫瘍組織に存在する骨髄由来抑制細胞MDSCを抑制するHPGD遺伝子をワクシニアウイルスB5R遺伝子下流に挿入。(2)細胞障害T細胞を活性化するIL12遺伝子をワクシニアウイルスTK遺伝子部位との組換え。(3)3LL細胞に代替癌抗原としてOVAを発現させ、B6マウスのMHC型(H-2Kb)でエピトープとなるSIINFEKLモチーフをワクシニアウイルスに挿入。5)GM-CSF/SIINFEKLモチーフ融合蛋白の人工アジュバント細胞からの分泌。遺伝子の改変はワクシニアウイルス親株であるLister株由来のLC16m8Δ株と改変型プラスミドのRK13細胞への共トランスフェクション、および3回以上のプラーク継代を用いた純化により行った。癌ウイルス療法の標的疾患として多発性骨髄腫を選び、マウスVk*MYC細胞の同系移植マウスへの感染実験を行ったが、Vk*MYC細胞ではワクシニアウイルスの感染性が低く、腫瘍縮小効果が不十分であった。そのためin vitroでスクリーニングを行い、より評価に適したマウス肺癌細胞株3LL細胞の同系マウス皮下移植モデルを選択し、以後の研究を進めた。また、本邦で開発されたワクシニアウイルスLC16m8株に以下の様な改変を加え抗腫瘍効果の増強を図った。(1)腫瘍組織の免疫抑制細胞MDSCを抑制するHPGD遺伝子を挿入。(2)細胞障害T細胞を活性化するIL-12遺伝子を挿入。(3)代替癌抗原としてOVAの3LL細胞への導入。(4)マウスNKT細胞活性化作用を持つCD1dを強制発現させた人工アジュバント細胞の併用。(5)GM-CSF/OVA融合蛋白の人工アジュバント細胞からの分泌。
ＤＣＩＲ遺伝子欠損マウスを利用した脊椎関節炎の新規動物モデルの開発

強直性脊椎炎は代表的な脊椎関節症で脊椎や仙腸関節などの関節部位の強直を引き起こす。強直性脊椎炎を含む脊椎関節症では腱付着部炎が見られるが、疾患発症に至るメカニズムは未だ不明で根本的な治療法も開発されていない。我々が独自に開発したC型レクチン受容体DCIR欠損マウスが腱付着部炎と強直を自然発症することから、脊椎関節炎の新規動物モデルを作出し、疾患発症メカニズムの理解を目指した。その結果、DCIR欠損マウスで発症する強直には炎症性サイトカインが重要であること、このサイトカインは骨新生を促すことが明らかになった。従って、DCIR欠損マウスは脊椎関節炎理解の有用な疾患モデルであることが示された。C型レクチン受容体の一つであるDCIR遺伝子欠損マウスが加齢に伴い自然発症する腱付着部炎の発症機序と病態形成の進行過程を明らかにし、ヒトにおける脊椎関節症の病態解明および新規治療法の開発に有用な動物モデルを樹立することを目的としている。当該年度はB6背景への戻し交配が終了したDCIR欠損マウスを用いて解析を進めつつ、前年度に樹立を行った各種炎症性サイトカインとの二重欠損マウスを用いて腱付着部炎および強直の発症と炎症性サイトカインとの関連を詳細に検討した。前年度において関節部位にサイトカイン陽性T細胞が加齢に従い集積することを検出していたがこのサイトカイン欠損をDCIR欠損マウスに導入したところ強直発症を完全に抑制することを見出した。従来、発症との関連が指摘されていた炎症性サイトカイン欠損においても強直発症を抑制することから複数の炎症性サイトカインが病態発症・増悪化に関与していることが示された。また今回新たに病態との関係を明らかにした炎症性サイトカインが骨系細胞に作用することを見出しつつある。その結果、この病原性炎症性サイトカインは免疫系細胞に作用し炎症を惹起するとともに骨代謝にも影響をおよぼすことが考えられた。このことからDCIRを介した制御機構の破綻により免疫システムの制御異常が引き起こされ、その結果骨格系細胞に作用を及ぼす可能性が示唆された。C型レクチン受容体の一つであるDCIR遺伝子欠損マウスが加齢に伴い自然発症する腱付着部炎の発症機序と病態形成の進行過程を明らかにし、ヒトの脊椎関節症の病態解明および新規治療法の開発に有用な動物モデルを樹立することを目的としている。当該年度は、前年度までに樹立解析したRag2-/-DCIR-/-マウスとDCIR欠損マウスと各種炎症性サイトカインとの二重欠損マウスを活用し、病態形成を誘導する病原性サイトカインの作用と免疫細胞の制御異常を引き起こすメカニズムの解明を実施した。病態への関与が示唆された病原性サイトカインが間葉系細胞に作用し増殖応答を亢進させることが明らかとなった。またDCIR欠損によりサイトカインバランスが変化し、病原性サイトカインが産生誘導されやすい状態になっていることが示された。その結果、DCIRを介した制御機構の破綻が、免疫細胞の異常活性化を誘導し、骨代謝に作用する炎症性サイトカインの産生が増加することが示唆された。当該年度はDCIR欠損マウスのB6背景への戻し交配を進めつつ、病理学的解析を実施することと次年度に向けて各種サイトカインとの二重欠損マウスの作成に取り組んだ。DCIR欠損マウスの戻し交配は計画通りに推移し平成23年度においてB6背景への戻し交配が完了した。戻し交配と並行しながら関節部局所の病理組織解析を実施し、各種染色方法により異常な細胞増殖を関節局所に認めた。またqPCR法により関節局所におけるサイトカイン産生を検討したところDCIR欠損マウスにおいて発現亢進するサイトカインを見出した。一方でDCIR欠損マウスからリンパ球系細胞を欠失させると関節部位の強直発症が完全に抑制されることから強直発症と免疫細胞との関係を検討した。その結果サイトカイン陽性T細胞の割合が加齢に伴いDCIR欠損マウスにおいて有意に増加してくることを見出し、DCIR欠損マウスにおいてT細胞制御が破綻している可能性が示された。DCIRの機能制御を理解するためにDCIR発現細胞をPCR法とフローサイトメトリー解析にて詳細に検討したところミエロイド系細胞に発現していることを確認した。このことからDCIRを介した制御機構の破綻により免疫システムの制御異常が、骨格系細胞に作用を及ぼす可能性が示唆された。

本年度予定していたDCIR欠損マウスと各種炎症性サイトカインとの二重欠損マウスの作出に成功し、骨代謝異常と病原性炎症性サイトカインとの関連を明らかにし計画予定に即した進捗を達成している。前年度に細胞移入実験により病態形成に関与する免疫細胞の同定を試みたがこの実験は成功しなかった。今年度、責任細胞を同定することも目指して炎症性サイトカインとの二重欠損マウスの解析を行い病原性炎症性サイトカインと責任細胞の同定に繋がった。これらの結果から最終年度において免疫系と骨代謝系との相互作用とその制御破綻から生じる病態メカニズムを解析する土台が構築され、順調に実験計画を実施できている。本年度予定していたDCIR欠損マウスのB6背景への戻し交配、DCIR欠損マウスの関節局所の病理組織解析、各種サイトカインの発現動態解析を実施し計画予定に即した進捗を達成している。また次年度に向けた解析のために本年度の解析から得られた結果を基に二重欠損マウスの作製に既に取り組んでおり平成24年度の解析に向けた準備も進行している。一方で移入実験により病態形成に関与する免疫細胞の同定は細胞移入により関節部位の強直発症が観察出来ず計画予定を達成出来なかったが、現在作製している二重欠損マウスの解析から責任細胞の同定が可能であると考えている。前年度までの結果を基に、病態形成を引き起こす免疫細胞の機能異常を引き起こすメカニズムの解明に挑む。また病原性炎症性サイトカインと骨代謝制御の関係を明らかにすることを目的とする。in vitroの解析を中心に行い、T細胞制御に関わる樹状細胞の抗原提示能やT細胞活性能を野生型と欠損型マウスで比較する。また病原性炎症性サイトカインの骨系細胞に対する作用をin vitroの培養系を用いて実施する予定にしている。23年度の結果を基に病態形成を引き起こす免疫細胞の機能異常を明らかにすることを目的とする。現在作製しているDCIRと各種サイトカインとの二重欠損マウスを利用して病態形成に関与する細胞群の同定、強直の発症とサイトカインとの関係を検討する。首尾よく強直の発症が抑制したマウスを見出した場合、該当サイトカインと骨代謝機構との関係を解析する。また免疫細胞と強直発症との関係を明らかにするためにT細胞とB細胞の機能解析をDCIR欠損マウスと野生型マウスを比較して解析を行う。試薬・消耗品を中心として研究費を使用する。今年度は研究計画の最終年度のため成果を公表するために論文作成費を計上する。またこれまでの研究成果を報告するために学会参加を予定しており学会参加のための旅費として研究費を使用する。試薬・消耗品を中心として研究費を使用するが、24年度で解析するためにDCIR欠損マウスとの二重欠損マウスを作製したのでマウス飼育費として必要に応じて研究費を使用する。また本年度の成果を報告するために学会参加を予定しており学会参加のための旅費として研究費を使用する。
日本語音声における韻律的特徴の実態とその教育に関する総合的研究

本領域研究においては次の課題について研究を推進し次年度で研究完了の見込みである。(1)日本語の韻律的特徴に関して全国の方言音声を収集し、音声デ-タベ-ス化してこの利用と保存を可能にする。(2)収集した音声の音響的分析、その生理学的裏付け、理論の検討等を行う。(3)上記の結果を用いて日本語教育及び国語教育における音声教育の方法を確立する。この目的達成のため、当総括班は各学問分野を異にする研究者(研究協力者を含めて現在総数262名)を統合して着実に研究を推進することができた。その研究成果は次に示すとおりである。研究成果(1)音声の収集:目標とする100地点の収録を完了,また主要都市(各約100名)の録音は12都市を完了し鹿児島市を残すのみとなった。これに基づく音声デ-タベ-スはCDーROM1枚、CD7枚(アイヌ語も含む)を作成、その他北海道から琉球列島までのDAT録音機による収録音声資料1000名分余りを得た。(2)音声の音響的、生理的、理論的研究も進展した。教育班においては30ヶ国の外国人学習者約200名の音声の収録と分析を行い、日本人話者との比較を行った。本領域研究の成果は今後の日本語音声の研究に多大の影響を及ぼすものと考えられる。(3)研究の成果:総括班刊行物9冊、各研究班の刊行物3冊、合計12冊に及ぶ。研究推進のために行った総括班の活動は次のとおりである。会合その他の活動(1)(1)研究成果発表会:中間発表会(10月)成果発表会(1月)(2)公開講演会及びシンポジウム(6月、10月)(3)研究サロン及び音声デ-タベ-ス委員会の会合(5回)(4)総括班会議(3回)班長会議(3回)評価委員会(3回)各班間会議数回、事務局会議(9回)国際シンポジウム委員会(6回)等を開催した。(2)ニュ-ズレタ-4回を刊行し、その他各研究者間の意志の疎通、研究者全体の統合をはかり研究の進展を促進した。
粒子線治療における中枢神経の新規RBE指標の開発

炭素線を脳局所に照射した際における認知機能低下と脳内毛細血管密度を指標とした解析を実施した。晩発性に神経細胞壊死を生じさせる線量(単回30Gy)をマウス全脳に照射したところ、照射16週間後に記憶に重要な役割を持つ海馬内の選択的な細胞壊死が生じていた。毛細血管密度を指標とした新しい画像分析手法を用いたところ、照射12週間後まで線量及び時間依存的な毛細血管密度の低下が生じており、その変化は認知機能障害が認めれる照射1週間後から検出が可能であることを、世界で初めて見出した。また毛細血管密度の低下は、晩発性に生じる選択的な海馬内神経細胞壊死の領域と関連性があることを明らかにした。脳局所照射領域の毛細血管密度の変化を計測するため,認知機能の低下を生じさせる線量(30Gy)を半脳に照射し,新たな測定法の定性および定量評価能力の検討を実施した。これまで炭素線10-30Gy照射により,照射1週間後から注意力の低下が生じることを明らかにしてきたが,脳内毛細血管密度への影響を解析したところ,照射1週間後から,記憶に重要な海馬領域(Hippocampas)および大脳皮質(Cortex)の毛細血管密度が低下し始めることを、光学的に確認した。また照射12週間後では,非照射側の海馬領域の毛細血管密度の低下が生じており,照射影響が,脳全域に広がることが示唆された。照射1週間後において定量が可能ということが判明したことから,この評価法によって,線量依存性を示すことができるかについて検討するため,10 ー60 Gy照射を行なった。その結果,照射1週間後において,10-30Gyでは線量依存性が認められるものの,60Gy照射では血液脳関門の破綻および血管透過性亢進によるものと考えられる要因によって,バックグラウンドの増加が生じ,定量性が確保できないことが判った。また脳内毛細血管密度を指標に検討したことにより,炭素線により脆弱性を示す脳内部位があることが判明した。これらの結果は、3th International Society of Radiation Neurobiology(2013年・第3回国際放射線神経生物学会)において、招待講演【Early and late impairments of spatial cognition after local brain irradiation with carbon ions】を行なった。注意力の欠如を含む認知機能の障害は、頭蓋内に発生した腫瘍体積の増大によって引き起される高次脳機能障害のひとつであるが、脳腫瘍の外科的手術、放射線や抗がん剤治療を実施した長期生存者において、脳壊死に附随して頻繁に出現する副作用のひとつでもある。そのため、脳壊死や高次脳機能障害をいかにして低く抑え、治療後のQOLの低下を防ぐことが今後の脳腫瘍治療の課題とされている。脳の毛細血管密度を指標とした新しい画像分析法を用いることで、従来数ヶ月から数年かからなければ判らなかったことが、1週間程度の短い時期に診断が可能になったこと、またそれを用いることで、放射線に脆弱な部位とそのメカニズムを明らかにしたことが高く評価され、9月14日からギリシャ・ロドス島で行なわれた41st Annual Meeting of the European Radiation Research Society(ERR2014)において「放射線による脳腫瘍治療時に生じる高次脳機能障害のメカニズム:The effects on the cognitive function and astrocytic activation in the hippocampusafter localbrain irradiation with carbon ions using mice」について発表し、国際学会賞(Best Poster Award賞)を受賞した。この研究成果は、治療後のQOLの低下を防ぐための薬剤開発や、放射線照射による脳壊死のメカニズムを探る新しいツールとなると考えられる。平成26年度までに、脳の放射線影響による認知機能障害に関わる生物学的指標を様々な手法を使って明らかにすることを第一目標としていたが、脳毛細血管密度を指標とした画像解析を用いることで、脳腫瘍放射線治療に伴う壊死のメカニズムについて明らかにすることができた。平成27年度においては、脳毛細血管密度の生物学的指標が、認知機能障害と関連性が認められない場合に、PETおよびSPECTに応用可能な脳内神経受容体の結合動態解析を行うことを当初予定していたが、平成27年度は脳内毛細血管密度を主たる解析法として、その定量性の確認を行い新たな診断法の樹立に向けた研究を実施することになった。放射線生物学新たに確立した脳毛細血管密度の画像診断法を用いることで、脳腫瘍放射線治療に伴う認知機能障害のメカニズムの解析が、1週間以内に解析できることを明らかにした(従来数ヶ月から数年を要していた)。脳腫瘍は、最新の陽子や炭素線などによる重粒子線治療によっても、正常組織の壊死および認知機能障害が治療の妨げとなっており、5年生存率の向上が認められていない。そのため、化学療法との併用も行われることが示唆されている。

化学療法はそれ自身によっても認知機能障害を引き起こすことが報告されており、放射線療法と化学療法の併用は、さらなる困難が推測される。これまでの研究成果を用いることで、放射線療法と化学療法との併用時の解析が可能になる。今年度でこの研究課題は終了するが、新たな研究課題として、脳腫瘍における放射線療法と化学療法の併用時における認知機能の低下を防ぐ研究を実施する予定である。初年度に予定された炭素線照射後の認知機能の解析は終了し、認知機能に関わる脳領域の毛細血管密度、局所血流量および糖代謝などの要因の中で、毛細血管密度の指標が最も認知機能と関連性があることを示した。また次年度(26年度)に予定されていた脆弱性を示す脳領域の傷害に起因する発現タンパク物質(TNF, HSP, Bcl, NGF, etc)などの解析も一部実施しており、脆弱性を誘起する因子の絞り込みを行なうことができた。毛細血管密度の指標とした解析法の定量性の確保が最優先であり、それに平衡して、炭素線に脆弱性を示した海馬の障害機序を明らかにする必要がある。またその解析次第では、障害を防護することのできる薬の開発につながると考えている。
障害者の平等権としての合理的配慮

障害者権利条約は非障害者を標準とした社会において、障害者は非障害者と同等の待遇を受けただけでは不利な状況に置かれるので、障害者に便宜供与する「合理的配慮」を命じ、その不履行を差別とする。条約批准に伴い、合理的配慮を規定する障害者差別解消法・改正障害者雇用促進法が施行されたが、行政解釈・有力学説は両法の合理的配慮に私法上の効力はなく、行政に行政指導権限を与えるだけと解している。条約適合的に解すれば、障害者は合理的配慮の請求権を有する。本研究は、条約の母法であるアメリカ法の学説・判例を細分化し、合理的配慮が障害者の請求権として適用可能になるよう、合理的配慮の権利性について新たな根拠論を提示する。
微生物酵素を用いた未利用多糖類からの有用オリゴ糖の生産

オリゴ糖は抗う蝕作用、便秘改善、血清脂質改善などの生理作用や、低カロリー甘味物質として注目を集めている。またオリゴ糖は植物や微生物の健康に対しても有効であることが示されてきた。このようにオリゴ糖の重要性が認識されるにつれて、その効率的な生産手段が求められるようになってきた。そこで我々はイヌリンやレバンなどの未利用多糖類から微生物によってオリゴ糖を生産することとし、土壌サンプルからこれらの多糖分解菌を分離し、オリゴ糖生産菌をスクリーニングした。1.イヌリンからのオリゴ糖生産:イヌリンからDFAIIIを生産するArthrobacter sp.H65-7は菌体内DFAIII分解酵素によってDFAIIIをイヌロビオースに変換することが分かった。菌体反応をにより、DFAIIIからイヌロビオース生産が可能であることを示した。StreptomycesrocheiE87はイヌリンからイヌロトリオースを生産するエキソ型酵素を生産することが分かった。本酵素の精製を行い、酵素化学的性質を解明した。2.レバンからのオリゴ糖生産:土壌から分離されたレバン分解菌Streptomyces exfoliatus F3-2とArthrobacter nicotinovoransSG9は、レバンからレバンビオースとDFAIVをそれぞれ効率よく生産することが分かった。レバンビオース生成酵素を精製し、性質を解明した。3.糖転移反応を用いるオリゴ糖生産:Arthrobacter sp.MS9と同定された土壌分離菌のレバンビオース生成酵素を高濃度のイヌロビオースに作用させたところ、糖転移生成物と思われる3糖が生成された。構造解析の結果、このオリゴ糖はイヌロビオースの還元末端側のフラクトース残基にβ2-6結合でフラクトースが1残基結合した新規3糖であった。1.イヌリンからのオリゴ糖生産(1)イヌリンから環状二糖であるダイフラクトースアンハイドライドIII(DFAIII)を生産するArthrobacter sp.H65-7株について、菌体内酵素によるDFAIIIの分解経路について検討した。その結果、本菌はDFAIIIをイヌロビオースを経てフラクトースに代謝することが明らかになった。従ってDFAIIIからのイヌロビオース生産の可能性が示された。イヌロビオースを機器分析によって同定した。(2)土壌サンプルから多数のイヌリン資化性菌株を分離し、オリゴ糖生産菌株をスクリーニングした。その結果、新たにイヌリンからイヌロトリオース(F3)およびイヌロテトラオース(F4)のみを生産する菌体外酵素を分泌する放線菌を分離した。F3,F4については、機器分析により、構造決定を行った。また、サイクロイヌロヘキサオース、サイクロイヌロヘプタースなどを生産する菌体外酵素を分泌するBacillus属細菌も分離した。2.レバンからのオリゴ糖生産土壌から多数のレバン資化性菌を分離し、レバンオリゴ糖生産菌をスクリーニングした結果、レバンビオースをほぼ特異的に生成するレバン分解酵素生産菌を分離した。本菌はStreptomyces exfoliatus F3-2と同定された。またレバンビオースを機器分析により同定した。本菌の酵素生産のための培養条件を検討し、生産性を約10倍に高めた。粗酵素液を用いてレバンからのレバンビオース生産について試験したところ、50g/1のレバンから42g/1のレバンビオースが生成された。この結果は、これまでの報告の中で最も効率のよいものである。1.イヌリンからのオリゴ糖生産(1)DFAIII分解酵素の精製は継続中である。

この酵素はイヌロビオースからフラクトースを生成する酵素とは別の酵素であることが分かった。(2)イヌリンからイヌロトリオース(F3)とイヌロテトラオース(F4)を生産する放線菌はStreptomyces rochei E87株と同定された。本菌の培養条件を検討して酵素活性を高め、F3、F4の大量調製について検討し、イヌリン50g/lから約70%の重量収率でF3のみが生産されることを明かにした。これはF3の生産としては初めてのものである。本酵素を培養液から電気泳動的に均一に精製し、酵素化学的、およびタンパク化学的性質を明らかにした。(3)新規オリゴ糖生産菌のスクリーニングについては、耐熱性のサイクロイヌロオリゴ糖生成酵素を生産する菌株は得られなかった。2.レバンからのオリゴ糖生産(1)レバンビオース生成酵素生産菌Streptomyces exfoliatus F3-2の当該酵素を培養液から電気泳動的に均一に精製し、酵素化学的、およびタンパク化学的性質を明らかにした。本酵素は2,6-β-D-fructan 6-levanbiohydrolase(EC 3.2.1.64)であることが判明し、この酵素はこれまでタンパク的に精製されておらず、今回初めて精製された。(2)レバンからの新規オリゴ糖生産菌のスクリーニングでは目的の株は見つからなかったが、DFAIV生産菌として効率の良い菌株を見いだした。3.転移反応を用いるオリゴ糖生産については継続中である。1.イヌリンからオリゴ糖生産:イヌロトリオース生成酵素の精製を行い、酵素化学的性質を解明した。本酵素はオリゴ糖生成型のエキソ型のイヌリナーゼで、イヌリンからイヌロテトラオース単位で分解を行い、イヌロテトラオースは本酵素によってさらにイヌロトリオースとフラクトースに分解されてゆく。その結果、最終的には、イヌリンはほとんどがイヌロトリオースに変換されて、高純度のイヌロトリオースの生産が達成されることがあきらかになった。このタイプのイヌリナーゼの精製は今回がはじめての報告例である。2.DFAIII分解酵素は完全に精製することはできなかったが、菌体反応を利用して、DFAIIIからイヌロビオース生産が可能であることを示した。3.レバンからのオリゴ糖生産:レバンからダイフラクトースアンハイドライドIV(DFAIV)を効率よく生産する菌のスクリーニングを行い、DFAIVと少量のフラクトースのみを生成するレバン分解酵素を生産する細菌を得た。本菌は16SrRNAの塩基配列などの結果からArthrobacter nicotinovorans SG9と同定された。レバン分解酵素の生産条件を検討し、DFAIV生産のための諸条件を検討した。4.糖転移反応を用いるオリゴ糖生産:レバンビオース生成酵素を高濃度のイヌロビオースに作用させところ、糖転移生成物と思われる三糖が生成された。構造解析の結果、このオリゴ糖はイヌロビオースの還元末端側のフラクトース残基にβ2-6結合でフラクトースが1残基結合した新規三糖であることが分かった。このレバンビオース生成酵素生産菌はArthrobacter sp.MS12-12と同定された。
ラングランズ対応の枠組みをモチビックホモトピー論を用いて拡大する研究

ラングランズ対応をモチビックホモトピー論を用いて理解を深めることが目的だった。位相幾何学的な動機からは、点つき曲線の埋め込みのモジュライに、モジュラーオペラッドと呼ばれる、結合則に関する性質構造があることを示した。保型側の表現論に関しては、その圏をトポスとしてもつサイトのとある特徴づけを行った。これらふたつの動機はモチビックホモトピー論と関係するが、技術的にはまったく関係がないままとなった。ベイリンソン予想への応用は得られなかった。本年度の11月5日から11月8日までの4日間、カブリ数物連携宇宙研究機構所属のジーゲル氏による連続講演「マドセンワイスの定理のミニコース」を開催した。氏は代数曲線論の専門であって位相幾何の専門ではないが、実際にその定理の証明にかかわったガラティアス氏の講演をもとにしたもので、証明の概略を追うことが可能となるものであった。以降、二人の協力者を得て3人で共同研究を行っている。本年度は、主に、糊付け写像と呼ばれる位相幾何における写像の代数幾何における類似の構成に費やされた。参考にしたのは、モチーフ的(代数幾何的)な管状近傍を定義したレビーンの論文における糊付け写像の構成である。(参考文献:Levine, Marc "Motivic tubular neighborhoods" Doc. Math.,J. DMV 12, 71-146 (2007))情報収集のため、Winter School and Workshop "Higher Structures in Algebraic Analysis" (パドヴァ、イタリア)に2014年2月10日から21日まで参加した。無限圏をテーマとする集会であったので、本研究のテーマと直接の関係をみるのは難しいが、協力者の研究テーマに近く、共同研究をスムーズに行うために必要な知識となる。また、日本国内ではまだあまり盛んでないテーマであり、海外へ行く必要があった。今年度は、昨年度に引き続き、Jesse Wolfson氏(シカゴ大学)とCharles Siegel氏(東京大学カブリ数物連携宇宙研究機構)と共同研究を行った。代数曲線のモジュライの持つ代数的な構造として、モジュラーオペラッドという構造がある。これを、代数曲線の埋め込みのモジュライの場合に考察した。具体的には、代数曲線の対数標準埋め込みのモジュライを考え、それらについて糊付け射を構成し、それによりモジュラーオペラッドの構造を持つことを示した。また、これは代数曲線のモジュライの構造と互換性を持つ。この結果をプレプリント"Modular operads of embedded curves"arXiv:1407.6558にまとめた。今年度は主にプレプリント「Modular operads of embedded curves」の修正に費やされた。このプレプリントは2014年7月にアーカイブに投稿したもので、Charles Siegel氏およびJesse Wolfson氏との共同研究である。この論文においては、曲線のその曲線の埋め込みのモジュライを、従来とは異なる形で定義を行った。ふたつの曲線の糊付けという操作はよく知られているが、それを拡張する形で、ふたつの埋め込まれた曲線の糊付けを定義した。主結果は、この糊付けの誘導する写像により、埋め込みのモジュライ空間がオペラッド構造を持つ、というものである。このプレプリントでは、曲線の埋め込みのモジュライの定義に誤りがあり、プレプリントの形のままではうまくいかない部分が出てくることが今回わかった。そのため、その修正に時間が費やされ、従来のものとはことなる、新しいモジュライの定義を考えるに至った。これが今年度の主な研究実績となる。ラングランズの枠組みの改変を研究のゴールとして掲げているが、それについては、当初の予定とは異なる形での結果しか得られていない。(2回の講演)今年度は、発表してあったプレプリントに間違いが見つかったため、その修正に時間が費やされた。しかし、曲線のモジュライの埋め込みがオペラッドをなすというプレプリントについて、講演を行うなど、他の研究者からのフィードバックを得られるように動いた。プレプリントについてのコメントが専門家からあり、それを反映させるよう、プレプリントを改良しており、これらは必要なステップであったと考えられる。ガロア圏は副有限群の表現の圏の特徴づけを行うが、それを一般化して、局所副有限群の表現の圏を扱えるようにした。これは、モチビックホモトピー論とは関係しないが、サイトを用いた特徴づけであるので、群を扱うよりは層の一般論という意味で近づいているといえる。リヒテンバウム予想の関数体における類似に関して研究を行った。これは、研究目的に現れるベイリンソン予想と似ている予想で、L関数の特殊値に関するものである。L関数の特殊値を幾何的にどれくらい記述できるか、というテーマで、特に簡単な場合にのみ結果が得られた。ノートパソコンやデジタルカメラを情報収集および整理のために購入した。今年度は、交付申請書に記載した「研究の目的」とは無関係ではないが、当初は予想されなかったことについて研究を行っていたため、記載された通りの「研究の目的」の進展は少なかった。

今回、埋め込みのモジュライの新しい定義を得たことにより、これまでは考えられなかった具体的な問題が提示されるようになった。研究計画においてはすべてが抽象的であったが、これらの具体的な問題には、計算機などで計算が可能な問題が含まれており、このような計算を行うことが今後の方針を立てる上で役に立つのではないかと思われる。上の曲線の埋め込みのモジュライにまつわる問題に取り組むほか、より直接に最終年度の予定にも取り組む。スタンダード予想などを仮定することで、ベイリンソン予想を導くという目標があるが、これのより簡単な場合というものが考えられることが最近わかったので、そのより簡単な問題に取り組む。これは他の整数論の研究者の協力を必要とするものになると思われる。数論幾何学今回得られたモジュラーオペラッドは新しいもので、また代数幾何的である。既存のモジュラーオペラッドは位相幾何的かあるいは微分幾何的なものが多い。このモジュラーオペラッドを位相幾何的にみたときに、既存のものと比較し、違いがどのような点にあるか、明確にしていきたい。共同研究者の一人であるJesseWolfson氏は今年度中にコペンハーゲンに拠点を移す。そのため、研究打ち合わせのために訪問するかまたは招聘することになる。他の仕事のために長期の招聘、訪問が難しいときには、普段からの連絡をスムースに行うため、ネットワークの整備を行う。たとえば、通信ようのソフトウェアなどのパソコンの周辺機器を準備しておく。数論幾何学を専門とする研究者で代数曲線のモジュライを扱う研究者は日本に多く、彼らの意見を伺いたい。代数幾何的あるいは位相幾何的な観点からモジュライを扱う研究者は日本には多くなく、ヨーロッパに多い。専門家の意見は貴重なので、情報交換を行っていきたい。専門外の知識を必要とする部分は、経験が乏しいため情報収集などの部分で困難を伴うと予想されたが、4日間に及ぶ連続講演があったため、その困難な部分がクリアされた。当該年度はパソコンなど物品の購入が少なかったため、次年度使用額が生じた。本年度は予定したよりも研究集会が少なく、また、旅費のサポートやデスクトップパソコンを他から得ることができた。また、ノートパソコンやタブレットなどは買い換えたばかりで、まだ新しいものを必要としていなかった。ノートパソコンなど持っているもので古くなってきているものがあるため、それらを購入する予定である。また、書籍などにも使用する。計画当初はホモトピー論の知識のみが重要であろうと予想していたが、それに反して代数幾何学の代数曲線論の知識が必要であることがわかってきた。その道の専門家を研究協力者に加えて研究を進めていく予定である。長期の出張を予定しており、その旅費などで科研費を使う予定である。また、ノートパソコンなどの買い替えが必要となってきているので、それらを購入する。
動的に酸性点が発現する固体酸触媒の開発

硫酸イオン含有ジルコニア担持白金触媒を調整し,ブタンの骨格異性化およびシクロプロパンの開環異性化に対する触媒特性を調べ,IR法により表面性質のキャラクタリゼ-ションを行った。ブタンは水素存在下では酸触媒である骨格異性化が進行するが,水素の供給を止めると反応が完全に停止する。硫酸イオンを添加しないと,金属触媒に特徴的な水素化分解が進行するが,硫酸イオンの添加により金属触媒の特徴が消失する。シクロプロパンを重水素存在下で反応させると、酸触媒反応である開環異性化によって生成するプロピレンのみが生成し,重水素を1個含有した同位体が多かった。金属触媒に特有な水素化は進行しなかった。吸着ピリジンのIR測定により表面酸性質を調べると,水素が存在しないときにはほとんどの酸点はルイス型の酸点であるが,水素存在下で,150°C以上に加熱すると,ルイス酸点が減少し,プロトン酸点が増加した。同時に,ルイス酸点の強度も減少した。これらの結果は,水素分子を起源とするプロトン酸点の発現を示している。即ち,水素分子は白金上で原子状に解離し,担体のジルコニア上にスピルオ-バ-し,強いルイス酸点で電子放出し,自身はプロトンとなる。この様にして生成したプロトンが触媒活性点として作用し,種々の酸触媒反応を促進する。水素分子を除去すると,逆スピルオ-バ-の過程を経て,プロトン酸点が消失する。担体のジルコニアをチタニアやアルミナに替えると,この様な酸点の動的な発現は見られなかったが,白金をニッケルに替えても同様な現象が観測できた。
集束超音波による血液脳関門解放下での遺伝子導入による新たなグリオーマ治療の開発

悪性グリオーマの治療において、血液脳関門(BBB)の存在は薬剤移行を阻害し、治療の障壁となっている。近年、集束超音波により非侵襲的に特定の部位のBBBを一時的に破綻させ、薬剤の移行性を高める方法が開発されてきた。我々の最終的な目標は、MBに結合させた核酸医薬の新規drug deliverysystem (DDS)を確立し、臨床応用を目指した悪性グリオーマに対する効果的治療法の開発を目的とした。平成27年度は初年度で、集束超音波によるBBB開放に関する条件検討と、実験に用いる、脳腫瘍モデルマウスの作成を行う計画であった。BBBの開放条件検討の為に、4週齢のICRマウスに対して、エバンスブルー(20mg/ml)を尾静脈より投与し、集束超音波の照射を行った。エバンスブルーの定量評価はホルムアミドで抽出し、吸光度計にて行った。また組織学的に安全性を評価した。開放の程度は集束超音波のIntensity(照射超音波強度)の強さ、Duty(実照射時間の割合)の大きさ、Burst rate(1回照射時間)の長さと正の相関を認めたが、1.0kW/cm2;以上の照射強度では脳組織損傷が認められた為、0.8kw/cm2以下でDDSの開発を進めることとした。また、脳腫瘍モデルマウスに関しては、U87ヒトグリオーマ細胞とOct3/4強制発現したU251ヒトグリオーマ細胞を6週齢のヌードマウスに、ナリシゲの頭蓋固定器とハミルトンシリンジを用いて1×10 5/3μl移植することで成功した。造影MRIと、固定した組織標本にて確認している。固定器を用いて移植することで、部位・大きさが安定して作成可能であった。以上が最終年度におこなった研究結果であり、当初の研究実施計画通りに進行していた。集束超音波で安全にBBBを開放出来ることを確認したこと、また安定した脳腫瘍モデルマウスが作成可能になったことは有用であった。
T細胞分化におけるIL-7レセプターによる細胞周期と細胞死の制御

本研究の目的は、胸腺T細胞がプレTCRからの刺激を受けた後にIL-7Rの発現が低下する分子機構を解明することにある。リンパ系前駆細胞の生成過程におけるIL-7Rの機能を明らかにするために、IL-7R遺伝子の発現制御機構を解析した。まず、胸腺におけるIL-7Rの発現を解析すると、CD4(-)CD8(-)DN分画とSP分画で発現していたが、DP分画ではまったく発現が見られなかった。次に、各分画のIL-7Rα鎖mRNAを解析したところ、DP分画で顕著に低下していた。以上の結果から、IL-7Rの発現が転写レベルで制御されることが明らかとなった。次に、マウスIL-7Rα鎖遺伝子のプロモーター領域を解析した。まず、転写が翻訳開始点の上流51bpと126bpの2ヵ所から開始することを確認した。マウスとヒトを比較すると、転写開始点の上流200bpの領域が高度に保存されており、Ikaros、PU.1、Runxの結合モチーフが存在した。また、マウスにはグルココルチコイド受容体(GR)の結合モチーフも存在した。次に、これらの領域をプロB細胞株38B9に導入し、レポーター法により解析すると、特異的な転写活性化能が検出された。この時、PU.1モチーフを破壊すると10%、GRモチーフを破壊すると44%減少し、両者を変異すると活性が完全に失われた。さらに、ゲルシフト法にて、38B9細胞の核抽出物の中にGRモチーフに結合する活性が検出され、この活性は抗GR抗体により消失した。一方、プロT細胞株KKFでは、グルココルチコイド処理によりIL-7Rの発現が増強した。まず、胸腺細胞におけるIL-7Rの発現の動態を調べた。胸腺細胞の各分画におけるIL-7Rの発現を解析すると、IL-7RはCD4(-)CD8(-)DN分画とSP分画で発現していたが、DP分画ではまったく発現が見られなかった。さらに、RAG2ノックアウトに抗CD3抗体を投与すると、4日後に胸腺細胞がDN分画からDP分画へと進むにつれ、IL-7Rの発現も消失した。同様の結果は、末梢のT細胞においても認められた。正常マウスの脾臓T細胞を抗CD4・抗CD8・抗IL-7R抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーにて解析した。その結果、CD4T細胞およびCD8T細胞のいずれの分画においても大部分の細胞がIL-7Rを発現していた。次に、TCR刺激後のIL-7Rの発現の変化を調べた。脾臓T細胞を固相化抗CD3抗体で刺激し、16時間後に細胞を回収し解析した。その結果、刺激しない細胞ではIL-7Rが高いレベルで発現していたが、抗CD3抗体で刺激した細胞ではIL-7Rの発現がほとんど見られなかった。以上のことから、プレTCR/TCRシグナルによってIL-7Rの発現が低下することが示された。次に、このIL-7Rの発現の低下がどのレベルで起こっているかを明らかにする目的で、IL-7Rα鎖の転写を調べた。胸腺細胞の各分画を磁気ビーズとセルソーターを用いて単離し、半定量的RT-PCR法にてmRNAのレベルを解析した。その結果、IL-7Rα鎖のmRNAがDP分画で顕著に低下していることが明らかになった。以上の結果から、プレTCR/TCRシグナルによってIL-7Rの発現が低下し、それが転写のレベルで誘導されることが明らかとなった。現在、IL-7Rα鎖遺伝子のプロモーター領域の機能解析を進めている。