hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アロステリズムを利用した非線形応答システムの創製

アロステリック相互作用を示すダブルデッカー型ポルフィリン化合物を用い、我々はルイス^Xfamilyなどの生理活性オリゴ糖類を認識することに昨年度(平成13年度)世界で初めて成功した。しかしながら、円二色性スペクトル以外の方法で糖質をセンシングすることは出来なかった。そこで本年度は前年度の化合物の基本設計指針を土台として蛍光応答性のホスト分子を設計した。この化合物を用いて、生理活性オリゴ糖の認識へと展開した。認識過程は、各種分光法(NMR, UV-Vis,蛍光,マススペクトル)を用い、生理活性オリゴ糖としては癌細胞の表層に発現されるルイス^Xfamilyについて検討した。しかしながら蛍光スペクトルによる糖質のアロステリックな読み出しには成功したものの、合成した化合物がオリゴ糖選択性ではなく単糖選択性を示し、オリゴ糖には有意のシグナルを与えなかった。そこで糖質認識部位としてボロン酸以外に金属配位を利用することとし検討を行った。基体となるポルフィリンの中心金属として亜鉛あるいはスズを選び検討したところ、第3の認識部位としての配位結合の優位性が確認された。ダブルデッカーポルフィリンの8つの置換基を適度な位置に導入すると、不斉を有することに着目し、アロステリックな不斉認識についても検討した。合成は終了しており、糖質認識に応用する。アロステリズムを分子認識系に組み込むための指針として、回転軸周りに論理的に認識部位を配置するという我々の作業仮説が正しいかを検討するために、ダブルデッカー型ポルフィリン錯体を基本骨格として選び、種々の分子認識系を構築してきた。本年度は、分子として、ガン関連糖鎖抗原であるルイス糖類を選ぴ、それぞれ対応する認識部位をダブルデッカー型ポルフィリン錯体に導入した。ボロン酸誘導体を導入した化合物においては、我々のグループで行ってきたボロン酸を用いた糖質認識化学に新たに正のアロステリズムという概念を加えたことになる。その結果、従来の手法では認識することが非常に困難であったマルトオリゴ糖、ラミナリオリゴ糖などのオリゴ糖鎖のセンシングが可能であることを世界に先駆けて示すことに成功した。さらにボロン酸を導入したダブルデッカー型ポルフィリン錯体は単糖よりもオリゴ糖に対して高い親和性を示し、アロステリズムを発現しない化合物に比べて、認識に伴うシグナル強度が増幅されることを明らかとした。細胞接着に重要でありかつガン関連糖鎖抗原であるルイスオリゴ糖類をターゲットとして検討したところ、世界で初めて「水中」かつ「人工合成分子」で認識することに成功した。以上の結果から、(1)弱い化学・物理シグナルの増幅、(2)ゲスト分子に対する選択性、感度の向上にアロステリズムが非常に有効であることが明瞭に示された。しかしながら、ダブルデッカー型ポルフィリン錯体は、水中での安定性が低いため、回転軸の利用を金属イオンからアセチレン軸に展開した分子を新たに設計し、合成した。この化合物は水中において単糖を認識することが可能であり、かつフコースに対しては蛍光スペクトル応答が確認された。
ゲノミック・インプリンティングの生物学的意義

哺乳類の個体発生、成長、行動には、父親、母親由来のゲノムは機能的に異なる役割を果たしている。このゲノムインプリンティングと呼ばれる現象の分子的原因はインプリンティング遺伝子と呼ばれる2種類の遺伝子群Paternally expressed genes(Peg)とMaternally expressed genes(Meg)の存在によっていることを、これらPeg、Meg遺伝子群の体系的な分離によって、ほぼ実証できた。人工的に作製した母親由来のゲノムのみをもつ雌性単為発生胚や、父親由来のゲノムのみをもつ雄性発生胚と、正常受精胚の間での遺伝子サブトラクションは、新しく開発したPCRを用いた極微量の生物材料からの遺伝子サブトラクション技術により可能になり、これまでに8つのPeg遺伝子(Peg1-8)と5つのMeg遺伝子(Meg1-5)の分離に成功した。これらの遺伝子はマウス染色体上の7ケ所のインプリンティング領域にマッピングされることから、ゲノムインプリンティング現象が、PegとMegの2群の遺伝子の発現の過剰または欠除によっておこると考えることができるようになった。このうち我々が新規に同定したインプリンティング領域は5ケ所にのぼり、この現象の全貌を解析するための多くの知見を得ることができた。また、これらの遺伝子群の発現様式、発現部位を体系的に解析することにより、インプリンティング遺伝子の母親の卵成熟過程における刷込みの実体の解明、インプリンティング遺伝子が胎盤で共通に発現することから、この現象の生物学的意義に関しての提唱している新胎盤仮説など多くの業績をあげることができた。この研究から、胎盤形成という問題を通して、ゲノムインプリンテイングと哺乳類の誕生という生物進化の問題解明の糸口が掴めたと考えている。われわれは、哺乳類に特徴的な遺伝子発現機構であり、哺乳類の個体発生、成長、行動に重要な役割を果たしているゲノミック・インプリンティング現象の全貌を明らかにし、その生物学的な意義を明らかにするために、この現象の支配下にある体系的にプリンティングの分離を行っている。父親由来のゲノムのみから発現する遺伝子群(Peg,Paternally expressed genes)の分離には母親由来のゲノムのみを持つ雌性単為発生胚と正常受精胚との間で、これとは逆に母親由来のゲノムのみから発現する遺伝子群(Meg,Maternally expressed genes)の分離には父親由来のゲノムのみを持つ雄性単為発生胚と正常受精胚との間でサブトラクションを行っている。われわれは極微量の生物材料から遺伝子のサブトラクションを行う新しい実験法を確立し、これまでにPeg遺伝子群として、Peg1-8の8個の遺伝子の分離に成功している。そして、実際にこれが父親由来のゲノムのみから発現することを証明した。また、この方法をさらに改良しMeg遺伝子のスクリーニングを行い、すでに候補として現在10以上の遺伝子を分離している。このようにインプリンティング遺伝子を多数分離することにより、インプリンティング遺伝子に共通する生化学的機能や、胎児における遺伝子発現の共通性等を直接検討できる基盤が整い、これまでゲノミック・インプリンティング現象の生物学的な意義に関して提出されている種々の説に対する正当な評価がなしうると考えている。また、これらの研究はゲノミック・インプリンティング遺伝子群の発現調節にかかわる分子機構の解明につながると考えている。哺乳類に特徴的な遺伝子発現機構であり、哺乳類の個体発生、成長、行動に重要な役割を果たしているゲノミック・インプリンティング現象の全貌を明らかにし、その生物学的な意義を明らかにするために、この現象の支配下にある遺伝子群の新規サブトラクション法による体系的にプリンティングの分離を行っている。これまでに父親由来のゲノムのみから発現する遺伝子群(Peg,Paternally expressed genes)を8個、母親由来のゲノムのみから発現する遺伝子群(Meg,Maternally expressed genes)を5個の分離に成功している。このうち9個が新規遺伝子であり、この方法が世界で最も効率的に稼働働していることを実証した。また、さらに幾つかの候補遺伝子についても解析中である。

これまでの一連の研究による得られた大きな成果の一つは、新規遺伝子のヒト相同遺伝子の多くがヒト遺伝病に関係している可能性が高く、出生前後の生育遅滞を引き起こすSilver-Russell症候群をはじめ、脳腫瘍であるグリオーマ、胎児性のガンであるWilms'腫瘍などの原因遺伝子候補が分離されたことである。さらに、このような体系的な遺伝子の同定から、インプリンティング遺伝子に共通する発現場所が胎盤組織にあることを発見したことが挙げられる。これにより、インプリンティング現象の生物学的な意義に関して新しい仮説(新胎盤仮説)を提唱し、この現象が哺乳類の胎盤形成に重要な役割を果たしていることを示唆した。今後、この遺伝子発現の機構を明らかにすることによりこの仮説の妥当性を検討したいと考えている。哺乳類の個体発生、成長、行動には、父親、母親由来のゲノムは機能的に異なる役割を果たしている。このゲノムインプリンティングと呼ばれる現象の分子的原因はインプリンティング遺伝子と呼ばれる2種類の遺伝子群Paterma11y expressed genes(Peg)とMatema11y expressed genes(Meg)の存在によっていることを、これらPeg、Meg遺伝子群の体系的な分離によって、ほぼ実証できた。人工的に作製した母親由来のゲノムのみをもつ雌性単為発生胚や、父親由来のゲノムのみをもつ雄性発生胚と、正常受精胚の間での遺伝子サブトラクションは、新しく開発したPCRを用いた極微量の生物材料からの遺伝子サブトラクション技術により可能になり、これまでに8つのPeg遺伝子(Peg1-8)と5つのMeg遺伝子(Meg1-5)の分離に成功した。これらの遺伝子はマウス染色体上の7ケ所のインプリンティング領域にマッピングされることから、ゲノムインプリンティング現象が、PegとMegの2群の遺伝子の発現の過剰または欠除によっておこると考えることができるようになった。このうち我々が新規に同定したインプリンティング領域は5ケ所にのぼり、この現象の全貌を解析するための多くの知見を得ることができた。また、これらの遺伝子群の発現様式、発現部位を体系的に解析することにより、インプリンティング遺伝子の母親の卵成熟過程における刷込みの実体の解明、インプリンティング遺伝子が胎盤で共通に発現することから、この現象の生物学的意義に関しての提唱している新胎盤仮説など多くの業績をあげることができた。この研究から、胎盤形成という問題を通して、ゲノムインプリンテイングと哺乳類の誕生という生物進化の問題解明の糸口が掴めたと考えている。
染色体を単位としたゲノム輸送システムの構築

ミクロセル融合による染色体移入の効率を改善するため、膜融合活性を持つ麻疹ウイルスエンベロープタンパク質の利用を検討した。ポリエチレングリコール(PEG)による従来法と比較して、最大10倍の効率改善が認められた。移入効率は受容細胞におけるエンベロープタンパク質の受容体であるCD46の発現に依存することが明らかとなった。そこでCD46低発現である正常繊維芽細胞への染色体移入を目指して、受容体の指向性改変を試みた。エンベロープタンパク質に対しCD13ないしトランスフェリン受容体に対する一本鎖抗体を付加することにより、PEGでは困難であった正常繊維芽細胞への染色体移入が可能となった。動物細胞を対象とした「ミクロセル融合法」は、染色体を供与細胞から受容細胞に移すことを可能にした。これまで、ヒト染色体をマウスES細胞に移入する系がゲノム/エピゲノム研究に大きく貢献したのに対し、正常ヒト細胞への染色体移入はきわめて困難であって、懸案のまま残されている。染色体をipsなど幹細胞に移入できれば、ヒトの再生遺伝子医療をはじめ発生、分化、疾患研究に新たな方法論を提供できる。本研究は、マイクロセル融合法の素過程を改良し、受容細胞に対する指向性を持ち効率の高い「染色体を単位としたゲノム輸送システム」の確立を目指す。今年度は、細胞融合法の効率改善に対し、ウイルスエンベロープ由来の細胞膜融合タンパク質が利用可能かどうかを検討した。麻疹ウイルス(弱毒化Edmonstonワクチン株)由来のヘマグルチニン(H)およびフュージョン(F)タンパク質発現プラスミドをヒト染色体ベクター供与細胞(CHO)に導入したところ、該CHO細胞は麻疹ウイルス受容体であるCD46を発現するヒト細胞に対する融合能を獲得した。該CHO細胞より微小核細胞を調整し、ヒト受容細胞と共培養したところ、ヒト染色体ベクターは受容細胞に移入された。移入効率は、従来法(ポリエチレングリコール融合)と比較して最大2桁向上したことから、麻疹ウイルスタンパク質は、融合効率の改善に対し有効なことが明らかになった。さらに、移入効率は受容細胞のCD46表面発現量に依存するとの知見も得た。このことから、Hタンパク質を改変することで受容体に対する指向性が操作できれば、標的とするヒト細胞への染色体ベクター移入が可能になると予想される。今後は、一本鎖抗体を利用して反応指向性が操作できるかを検討し、ウイルスタンパク質による染色体ベクター移入法の適用範囲を拡げていく予定である。染色体をiPSなど幹細胞に移入できれば、ヒトの再生/遺伝子医療をはじめ発生、分化、疾患研究に新たな方法論を提供できる。本研究は、ミクロセル融合法の素過程を改良し、受容細胞に対する指向性を持ち効率の高い「染色体を単位としたゲノム輸送システム」確立を目指す。前年度までに、ミクロセル融合法の効率改善に対し、麻疹ウイルスエンベロープ由来の細胞膜融合タンパク質の利用が有効であることを明らかにした。これを受けて今年度は、ウイルスエンベロープタンパク質の改変により反応指向性が操作できるかを検討した。麻疹ウイルス(弱毒化Edmonstonワクチン株)由来のヘマグルチニン(H)タンパク質は、補体不活化因子であるCD46を特異的に認識して吸着する。CD46はヒト組織において広く発現するものの、発現量は低レベルである。実際ヒト正常線維芽細胞に対しHタンパク質を介したミクロセル融合を試みたところ、従来法であるポリエチレングリコールを用いた融合法と同程度の融合効率に止まった。そこで線維芽細胞で比較的発現量の高い表面受容体を検索し、候補としてCD13およびCD71を選定し、これらに対する一本鎖抗体を入手した。Hタンパク質のC末端細胞外ドメインに一本鎖抗体を付加した発現プラスミドとフュージョン(F)タンパク質発現プラスミドを、ヒト染色体ベクター供与細胞(CHO)に共導入したところ、該CHO細胞はCD13ないしCD71を発現するヒト細胞に対する融合能を獲得した。該CHO細胞よりミクロセルを調整しヒト受容細胞と共培養したところ、ヒト染色体ベクターは受容細胞に移入された。移入効率は従来法と比較して1桁以上向上したことから、一本鎖抗体の利用により受容体に対する反応指向性が操作できることが明らかになった。

本研究は、ミクロセル融合法の素過程を改良し、受容細胞に対する指向性を持ち効率の高い「染色体を単位としたゲノム輸送システム」確立を目指す。前年度までに、ミクロセル融合法の効率改善に対し、1)麻疹ウイルスエンベロープ由来の細胞膜融合タンパク質の利用が有効であること、2)さらにウイルスエンベロープタンパク質の細胞外ドメイン末端に一本鎖抗体を付加することにより、受容細胞に対する反応指向性が操作できることを明らかにした。この成果は、麻疹ウイルス(弱毒化Edmonstonワクチン株)由来のヘマグルチニン(H)タンパク質およびフュージョン(F)タンパク質発現プラスミドを、ヒト染色体ベクター供与細胞(CHO)に共導入し安定発現株を取得することにより達成した。しかしながら染色体ベクターに搭載する目的遺伝子の発現ユニットは多種にわたる為、その都度安定発現株を取得し、なおかつ染色体ベクターのクオリティーを検定することは極めて煩雑な手順となる。そこでHおよびFタンパク質発現プラスミドのヒト染色体ベクター供与細胞への導入法を検討したところ、該プラスミドの一過性導入によっても安定株に匹敵する導入効率を確保できることが明らかとなった。当初計画では、1)ミクロセルの分取と2)細胞融合法の検討を提案した。2)については成果が出つつあるが、1)については染色体ベクターの標識法に関する予備実験に留まっている。25年度が最終年度であるため、記入しない。上述2項目のうち、先行している2)細胞融合法の検討については引き続き推進し成果をまとめる。検討が遅れている1)ミクロセルの分取については、当初計画で提案した染色体ベクターの標識法に関するいくつかのアプローチのうち、実現可能性の高いものを見極めることに注力する。
複合性局所疼痛症候群(CRPS)の病態と治療に関する基礎的・臨床的研究

複合性局所疼痛症候群(CRPS)患者における交感神経機能の関与特にα2アドレナリン受容体の関与について複合性局所疼痛症候群(CRPS)患者における交感神経機能の関与特にα2アドレナリン受容体の関与についてIASPの診断基準に沿った上肢および下肢の複合性局所症候群(CRPS)症例15人(上肢10人;下肢5人)に対して,同意を取得後,局所静脈内デクスメデトミジン(α2アドレナリン受容体作動薬)注入(IVRA-D)を施行した.4-5回を1クールとして施行した.IVRA-D施行後,すべての患者において,疼痛は軽減し,allodyniaの軽減が著明であった.特に患側の温度低下の認められた症例でかつ交感神経ブロックが有効であった症例では有効であった.また,低血圧,徐脈など治療を要するような有害な副作用は認めなかった.この治療の前後において,血中カテコラミン濃度の測定を行った.治療後,ノルエピネフリン濃度の有意な低下を認めた.血中乳酸値に関しては,健側と患側およびIVRA-D施行前後で有意な変化は認めなかった.これらの患者において,サーモグラフィーおよび皮膚温度計を使用して,温度変化を見た.14人では,治療前患側の温度は1度以上健側より低下していた.IVRA-D直後には,有意な温度上昇は認めなかったが,施行後1日目には健側の温度上昇が認められた.また,基礎研究においては,体重200-250gの雄性SDラットを使用し,坐骨神経部分損傷モデル(Seltzer model)を作製した.熱刺激性痛覚過敏および機械刺激性アロディニアについて調べた.また,モデル作成後14日目に潅流固定を行い,脊髄および脊髄後根神経節足底皮膚を摘出し,免疫組織学的手法を用いて検討した.NPY, tyrosine hydroxylase(TH), α2Aアドレナリン受容体(α2AAR), SP, CGRPの分布について調べた.Seltzer modelにおいては,脊髄後角で損傷側ではNPY免疫陽性線維が増加していた.α2AARに関しては,損傷側で免疫反応陽性瀬線維の減少を認めた.足底受容器では,今回明らかな差を認めなかった.臨床研究では,前年度に引き続き,IASPの診断基準に沿った上肢および下肢のCRPS患者に対し,同意取得後,局所静脈内デクスメデトミジン(α2アドレナリン受容体作動薬)注入(IVM-D)を施行した。症例の増加により、臨床症状で浮腫の著明な症例、患側肢の温度が健側肢より高い症例では、IVRA-Dより局所静脈内ステロイド注入のほうが有効であった。また、IVRA-Dはアロディニアが著明な症例で有効性が認められた。また,IVRA-D施行前後のカテコラミン血中濃度測定では,ノルアドレナリン濃度の低下が施行後に認められた症例では,臨床症状の改善が著明であった.基礎研究においては,体重200-250gの雄性SDラットを使用し,坐骨神経部分損傷モデル(Selzer model)を作成した.モデル作成前,作成後3,5,7,10,14日目に熱刺激性痛覚過敏および機械刺激性アロディニアについて調べた.1群では,さらに14日目実験後にネンブタールの過麻酔後灌流固定を行い,脊髄,後根神経節,足底皮膚を摘出し,免疫組織学的手法を用いて調べた.また,他の群の坐骨神経部分損傷モデルでは,14日目に痛覚過敏を調べた後,ネンブタール腹腔内投与し,患側足背に静脈路を確保後,患肢を駆血後,局所静脈内デクスメデトミジン注入施行後6時間後に熱刺激性痛覚過敏および機械刺激性アロディニアについて調べた後,過麻酔後灌流固定を行った.坐骨神経部分損傷モデルでは,熱刺激および機械刺激に対してモデル作成後7日目から変化が認められ,後肢の変形が認められた.これらは,局所静脈内デクスメデトミジン注入により鎮痛効果が認められた.免疫組織学的研究では,脊髄後角ではα2A受容体免疫陽性線維の減少を損傷側で認めた.受容野にはA2A受容体陽性線維は非常にすくなかった.また,CGRP陽性線維は患側肢で減少していた.神経因性疼痛患者の治療にα2アドレナリン受容体作動薬が有効であることがヒトや動物における研究で報告されている。、CRPS患者においてデクスメデトミジン(Dex)を局所静脈内投与し、良好な結果を得たことから、ラットにおける神経因性疼痛モデルでの局所静脈内Dex注入の有効性について検討した。(方法)雄性SDラットを用いてペントバルビタール麻酔下(腹腔内投与)に坐骨神経部分結紮(PSN)モデルを作製し、14日間経時的にpaw pressure test,plantar test、触刺激によるアロディニアテストを行った後、再度麻酔下に患側後肢を駆血し、静脈内にDex 5μg/kgを生理食塩液で希釈し0.5mlとして注入し、また、コントロール群として、生理食塩液0.5ml、さらにリドカイン(L)群ではリドカイン5mg/kgを全量0.5mlにした溶液を注入して約30分間駆血後解除した。4時間後完全覚醒下に、paw pressure test,plantartest、アロディニアテストを行った。さらに、行動学的研究終了後、ペントバルビタール深麻酔下に潅流固定を行い、免疫組織学的に観察した。統計処理には、分散分析法、student t-testを用いた。

(結果)PSNモデルでは。手術側に経時的に機械的痛覚過敏、熱性刺激に対する潜時の短縮が認められた。Dex群、L群では、機械的痛覚過敏閾値の上昇、熱刺激に対する潜時の延長が認められた。また、Dex群では機械的痛覚過敏に対する効果のほうがより大きかった。神経因性疼痛モデルにおいて、局所静脈内デクスメデトミジン注入は、リドカイン注入と同様に機械刺激、熱刺激による痛覚過敏に有効であることを示した。動物は雄性Sprague-Dawleyラットを用いた.ペントバルビタール(50mg/kg)i.p.麻酔下に骨神経部分結紮モデル(PSNL)を作製した.Neuropathic painを生じた動物において,術後14日目に局所静脈内薬液注入の効果を調べた.薬液を注入した.注入20分後駆血を解除した.薬液(Dexmedetomidine(D), Lidocaine(L), saline(S))注入後の疼痛評価は,注入4時間後完全覚醒下に行った.またPSNLモデルにおいて,薬液(D,L,DL,S)注入4時間後,注入1日後,注入2日後に疼痛評価を行った.その後潅流固定を行い,組織学的実験を行った, PSNLモデルでは,手術側に経時的に機械的痛覚過敏,熱刺激に対する潜時の短縮が認められた.熱刺激に対しては,処置後4時間ではL群はS群と比較して有意に潜時の延長が認められたが, D群とは,有意差は認めなかった.機械刺激に対しては,処置後4時間に,paw pressure testでは,D群とS群間に有意差を認めたが,L群とは有意差を認なかった.vonFreytestでは,処置後4時間後にD群, L群で変化が認められたが,D群とS群間に有意差を認めたが,D群とL群には有意差は認めなかった.機械刺激に対しては,処置後4時間では,S群に対してDL群,D群では,有意差を認め,2日目には,S群,L群に対してDL群,D群では,有意差を認めた,Von Frey testでは,処置後4時間では, S群とD群, DL群間に有意差を認めたが,処置後2日目には,DL群にのみ有意差が認められた.免疫組織学的研究においては,PSNLモデルでは,術側の脊髄後角第1,2層でSP-IR parvalbmin-IRの増加は認めたが,α2A受容体陽性反応は,両側とも認めなかった.条件を変えることでも検出することはできなかった.我々の臨床および基礎研究からα2アドレナリン受容体は,CRPSなどの神経障害性疼痛とくに機械的アロディニアの治療に有効性が認められたが,その機序が脊髄レベルでの受容体を介するもののみであるかどうかは不明である.
発光分子間のエネルギー移乗のスイッチングに関する研究

フェルスターエネルギー移譲(FET)とフォトクロミック分子を組み合わせたエネルギースイッチングは、最終的に目的に即したフォトクロミック分子がうまく合成できず、想定した実験結果を得ることができなかった。最大の問題はフォトクロミック分子の吸収バンドがスイッチして、ドナーからエネルギー移譲がONになった場合、ドナーから励起子を受け取ったPC分子が再びOFF状態に入ってしまい、励起子が蛍光を十分発生できるだけの量子収率が得られない問題が明らかになった。これにより、より蛍光収率の大きなPC分子を求める必要があることがわかったため、今後はこの点を改良できる様なPC分子をさらに探索し、分子が見つかれば研究に再度挑戦したい。並行して進めていたペリレン分子2量体を利用した、回転偏光依存の利得特性をもつレーザー媒質の研究であるが、一量体で良好なレーザー発振を確認できたものの二量体では蛍光帯域の狭帯域化を含む誘導放出現象の確認ができず、レーザー発振を得ることができなかった。前述の二点の研究で得られた知見をいかして、平行して試みていた新材料による有機導波型光励起レーザーでは二点のレーザー発振を確認できた。一つは自己形成型有機ナノ蛍光微粒子を利用した有機導波型レーザーであり、もう一つはペリレン骨格をもつEL用蛍光分子を利用した有機DFB導波型レーザーである。これらは波長430nm-500nm、波長540nm付近でそれぞれスペクトル幅0.1nmの良好な可変波長単色光源として動作し、同材料を用いての世界で初めての発振事例である。前者については従来のクマリン形レーザー色素に比べ耐久性も大きく向上しており、今後実用的なブルー・グリーンフィルムレーザーとして利用していく。●FET制御のシミュレーションコードをC言語とランダム分散モデルを使用して試作した。作成については、蛍光体→蛍光体や燐光体→蛍光体などのモデルを想定し、このモデルをもとにプログラムを作成している。次に、シミュレーションを用いて動作の検討を行った。このプログラムコードより、当初の予想通り、N_D^*>N_Aの領域でRは制御でき、R^R_0の領域では励起強度により大きくFETの効率が変化することが確認できた。●次にレーザー色素(LD)とフォトクロミック(PC)分子の共ドープサンプルの作製であるが、対象となる、PC分子が入手できなかったため、代用としてレーザー色素を用いた共ドープサンプルを作製した。ドナーLDにはフルオレン骨格の青色蛍光体を用い、ドナーにはクマリン540Aレーザー色素を利用した。両者の共ドープ薄膜は良好なレーザー発振を示し、波長帯域も500nmから540nmと非常に広いシングルモード発振を得ることが出来た。そのエネルギー移譲の効率やR0については現在測定をおこなっているところである。●PC分子の合成、提供については、PC分子が強度の光照射によってフォトクロミック状態が元に戻ってしまう問題が発見されたため、この問題の起きにくい分子を設計中である。現在、フォトクロミック分子の代わりにペリレン系骨格の分子を用いた円偏光利得に方よりのあるアモルファスレーザーの調査をおこなっている。現在、このペリレン系骨格分子の特性を明らかにするとともに、次年度の準備としてPCを想定した予備実験を行っている。
初年次教育プログラム構築に向けたデザイン実験による効果検証

本研究では地方国立S大学の初年次教育をA)オリエンテーション拡大型, B)教養コンテンツ型, C)ジェネリックスキル型, D)専門分野導入型, E)プロジェクトワーク型の5つのタイプに分類し,それぞれの効果を質問紙調査とエスノグラフィ調査で検証した。その結果, D)専門分野導入型が,修学プロセスとの接続が効果的であり,学士課程教育としてあるべき初年次教育タイプということが明らかになった。また1年間の学生の修学プロセスを分析し,必要なサポートを明示化した。初年次教育を5つの類型に分け,その教育的な効果検証を行うことを目的に,21年度は専門分野導入型に関する調査を実施した。専門分野型初年次教育を導入している総合理工学部物質科学科物理分野と協働で,新1年生64名全員を対象に初年次教育そのものの効果と,初年次教育が学士課程教育にどのように位置づけられているかを明らかにするために,知識面(専門基礎基礎教育科目2科目)との関係についても検討を行った。扱ったデータは診断的評価として入学形態,センター試験結果,プレイスメント試験結果(力学・数IIIC),形成的評価として各授業の小テスト,授業観察,メンターによる活動報告書,初年次教育担当教員へのインタビュー,総括的評価としそ各授業の成績評価,初年次教育ポストアンケート,学生への半構造化インタビューを採用した。これらのデータは開発試行段階のブロファイルシートに挿入され,個々の学生の学びのプロセスが明示化する仕掛けにした。学生の学習プロセスを的確に表すデータセットを構築するため,さまざまなデータをクラスター分析し,研究者2名で自らの経験知に適しているデータセットを検討した結果,診断的評価はプレイスメントテスト,形成的評価は前:後期中間テスト,前期期末テスト,総括的評価は後期期末テストの5点法で学生の学びのプロセスを明示化できることが明らかになった。分析の結果,64名の学生がおおまかに7つの学習タイプに区分され,それぞれに初年次の学生の学習におけるつまづきが明確化した。22年度は初年次教育の5類型において特に「プロジェクトワーク型」と「専門分野導入型」に関する拡張調査を行った。本学の初年次教育タイプは,本研究で扱う5類型に限定されるわけではなく,5類型を複数取り入れた多くのバリエーションの存在を明らかにした。法文学部言語文化学科では適切な評価を行うためのルーブリックを開発した。さらに生物資源科学部農業生産学科においても同様に評価ルーブリックを開発した。専門分野導入型の初年次教育を採用している総合理工学部では,スキルや態度を中心に高校から学士課程教育への移行を考える狭義の初年次教育のみでは対応できない,基礎学力不足問題が新たに浮上した。本研究では学生の多様化および個別化に対応する包括的な理工学部初年次教育のモデル化を目指し,23年度は学士課程教育と連動する修学サポートプログラムの構築を行い,その効果を検討した。その結果,狭義の初年次教育においてスキルと態度に関しての配慮を行うこと,また基礎学力不足では入学前教育を含む修学サポートプログラムにおいて複数の教育プログラムを開発し,個々の学生の高校までの学習履歴や理解度に合わせて細やかにサポートすることで,学士課程教育への移行がスムーズになることが明らかになった。また修学サポートにおいては,教員によるサポートより学士課程教育の先輩である上回生のサポートが有効なことがわかった。これはピアサポート特有のスキャフォールディングと位置づけられ,その活用を今後さらに検討する。平成23年度は,地方国立S大学を対象に学生の多様化の現状をより詳しく調査した上でタイプ化し,どの学生がいずれの初年次教育タイプまたは複合タイプを受ければ,高校から大学へのスムーズな移行が確立できるのか,について取り組んだ。その結果,調査対象大学においては大きく分けて,1)基礎学力不足,2)コミュニケーション能力など技能不足,3)意欲・目的不足,4)高い学力を持つ浮きこぼれ現象,の4つのタイプがあることが明らかになった。いずれにせよ,単独で現れるものは少なく,特に1)3)にかけては,一人の学生が複数の多様化の要因を抱えている場合も多い。またこれまで大きくクローズアップされていないが,4)の浮きこぼれの問題は深刻であり,不本意入学者として不登校になるケースもいくつか見られた。そこで2009年度入学者のX学科の学生64名を3年間追跡調査し,その多様な学生の学習プロセスを分析した。このように初年次における学生の多様化には,1つの正課初年次教育授業で対応していくのみならず,多くの成果外学習や活動を複合的に組み合わせた包括的な初年次教育プログラムの構築が必要であることが明らかになった。また基礎学力不足には,同じ教科であっても高校と大学の認知的接続に問題があることもわかった。また他者が学習に大きな影響を与えており,その効果を方略的に用いる際には,学習コミュニティをどのように構築し,浮きこぼれや様々な能力の不足を抱える学生を構成員として取り込んでいくかが修学の大きなサポートになることが明らかになった。
光質に影響を受ける根粒菌の運動性と共生能の検証

根粒菌とマメ科植物は、化学物質の交換により相互認識をすることが知られている。しかし、化学物質の交換だけでなく、根粒菌は土壌中が暗黒であることを利用して、光る根に集まってくるのではないかと仮説を立てた。この仮説を証明するために、1.根粒菌は光に集まるか?2.根粒菌の増殖は光に影響を受けるか?3.根への補光により根粒着生がコントロールされるか?の課題に取り組んだ。本課題の成果は次の通りである。根粒菌に青、赤、遠赤色光を照射したところ、いずれの色でも根粒菌の運動性に有意差は見られなかった。一方で、根粒菌は遠赤色光照射により増殖が促進し、青色光照射により増殖が抑制ることを明らかにした。しかし、化学物質の交換だけではなく、根粒菌は土壌中が暗黒であることを利用して、光る根を探して集まってくるのではないかという仮説を立てた。この仮説を証明するために、1.根粒菌は光に集まるか?2.根粒菌の増殖は光に影響を受けるか?3.根に対する補光により根粒着生がコントロールされるか?の課題に取り組んでいる。今年度の研究成果は、次の通りである。初めに光質による根粒菌の運動性の違いを検討するため、半流動培地上のミヤコグサ根粒菌野生株にLEDライト(青,赤,遠赤色)を照射した。その結果、暗黒条件と比較して、青,赤,遠赤色光照射による根粒菌の運動性に有意な差はないことが明らかになった。このことから、根粒菌に存在する光受容体は運動性には影響を与えないという新しい知見が得られた。さらに光質による根粒菌の増殖が影響を検討するために、ミヤコグサ根粒菌野生株およびミヤコグサ根粒菌STM株の増殖をLEDライト(青,赤,遠赤色)照射下で調査した。その結果、暗黒条件と比較して遠赤色光照射下で最も根粒菌増殖が促進され、青色光照射下で最も根粒菌増殖が抑制された。さらに、青色光受容体遺伝子の変異した根粒菌STM株に青色光を照射した場合、根粒菌増殖は暗黒条件下と同等になることが明らかになった。このことから、遠赤色光は根粒菌の運動性には影響を及ぼさないが、根粒菌増殖には大きく影響を及ぼすことが示唆された。次に、ミヤコグサ根への光質制御による根粒着生の評価のため、角型シャーレに播種したミヤコグサに根粒菌を接種し、地上部は植物育成用蛍光灯を、地下部には遠赤色光を照射して根粒着生位置や根粒着生数を調査した。しかし、植物体によりばらつきも多いため、再現性の確認が必要であると考えられる。この仮説を証明するために、1.根粒菌は光に集まるか?2.根粒菌の増殖は光に影響を受けるか?3.根に対する補光により根粒着生がコントロールされるか?の課題に取り組んだ。本課題の研究成果は、次の通りである。

しかし、遠赤色光を照射した根領域に根粒着生数が多くみられる植物体も観察されたが、明確な違いは明らかに出来なかった。植物微生物相互作用交付申請書に記載した研究計画について、一部方法などを変更して実施したが、概ね計画通りに実施できたと考えている。本年度の研究では、根粒菌の運動性に影響を与えず、増殖を促進する光質を特定することが出来た。従って今後は、小課題1および2の再現性を確認するとともに、小課題3.根に対する補光により根粒着生がコントロールされるか?についての調査を早急に進める。さらに寒天培地上だけでなく、実際に土壌中で光質による根粒着生の制御が可能か調査する必要がある。当初の計画通り研究を遂行するため、さらに情報収集や成果発表のための予算として使用する。当初の計画通りの使用(物品費=700千円、旅費=500千円、人件費・謝金=200千円)を予定している。
哺乳類細胞の極性決定時におけるG蛋白質の役割とその制御機構

細胞の極性形成を制御する蛋白質複合体として、Par6、atypical protein kinase C(aPKC)、Par3からなる3者複合体(Par complex)が知られており、ほ乳類上皮細胞においてはPar complexは極性形成とそれに続くタイトジャンクション(TJ)の形成に必須である。Par complexに加え、低分子量G蛋白質であるRacおよびCdc42は、Par6に結合し、細胞極性形成に必須の役割を果たすと考えられているが、これら蛋白質がどのように働くのかはよく分っていなかった。
在宅においても実施可能である棒またぎ体操が歩幅、運動耐容能に与える効果の検証

一年目である2018年度は,実用歩行に必要な歩幅を明らかにするとともに,在宅でも実施可能なステップトレーニングの適切な運動強度を調査することを目的とした。まず我々は実用歩行に必要な歩幅について調査し,身長に対する歩幅(歩幅身長比)が31.0%以上の必要であることを明らかにした(Morio et al., 2019)。ステップトレーニングの運動強度については,調律的聴覚的合図(rhythmic auditory cueing; RAC)のテンポと,障害物の高さを変更することにより調節を試みた。課題は棒またぎ体操とした。対象者は11名の健常若年男性であった。100%RACは,快適歩行時のケイデンスと定義した。棒またぎのタスクは,5種類の速さRAC(80,100,120,140,160%)と,3種類の障害物の高さ(0,2.5,10cm)の運動強度を組み合わせた15通りとした。メインアウトカムは,障害物をまたぐ際の先行肢と後続肢のストライド,および障害物間距離(toe clearance: TC)とし,3次元動作解析装置を用いて計測した。また,サブアウトカムは課題遂行中の心拍数とした。分析の結果,TCを増幅させるためには,120%RAC以上のリズムが必要であることが確認できた。TCは,後続肢が低値を示すことが明らかとなり,つまずきの原因は,後続肢にあるのかもしれない。また,障害物の高さは,0cm負荷よりも,2.5cm,10cm負荷の方がTCを増大させることができる。次に,ストライドは0cm負荷,もしくは2.5cm負荷で120%RAC以上のテンポが望ましい。しかし,160%RACにおいては,疲労度が高く,とくに10cm負荷での160%RACは,若年者でも嫌気性代謝閾値を超えている可能性があった。以上のことから,棒またぎ運動の至適強度は,2.5cm高の障害物で120%RAC,もしくは140%RACが望ましいと考えられた。最終的な研究対象者は高齢者であるが,まだ健常成人での基礎研究の段階である。高齢者に応用するにせよ,まずは安全性を確保することを優先したためである。本年度の研究で至適運動強度が明らかになったため,高齢者への調査へと移行したい。本研究の目的は,在宅においても実施可能である棒またぎ体操をトレーニングとして継続した際の,歩行パラメーター(歩幅、運動耐容能)に対する効果を明らかにすることである。今後は,高齢者の観察研究,および介入研究を実施するとともに,RAC生成のためのアプリケーションソフトの再現性,および実行可能性の調査についても実施する予定である。

当該年度に購入予定であった高精度体構成分析器InBody570(1,550千円)の購入は,研究の遅延から次年度に移行することにした。代わりに当該年度では,成人データの分析に必要であった統計ソフトウェアIBM SPSS version 25の購入を優先した。SPSSは共分散分析を行うためにAmosを追加したこと,および少ない対象者数でも分析可能なExact Testsをオプションとして追加したために504千円に及んでしまった。次年度は,高精度体構成分析器の品質を一段階下げ,研究費の支出を抑える工夫を施すこととする。
科学技術計算に現れる超大規模線形方程式の数理的諸問題と高速解法の総合的開発

本研究の目的は科学技術計算に現れるさまざまな超大規模線形方程式の数理的諸問題を研究し,高速解法を総合的に開発するものであり,その最終目標は,解きにくい問題を簡単に,計算時間のかかる問題を高速に,計算精度の不十分な問題を高精度に解けることである.そのため,まずは科学技術計算に詳しい分担者5名(小柳,藤野,速水,長谷川,阿部)が線形方程式に帰着される応用問題の現状について調査した.その調査結果をもとに全員は線形方程式の係数行列を規模と構造と代数性質の観点から分類を行った.張,小柳,速見,阿部は正則と特異な行列に対して収束性の研究を,張,藤野,長谷川,阿部は前処理手法の研究を行った.張,藤野は所属した研究機関の高速計算機環境(スーパーコンピュータと並列コンピュータ)において,クリロフ部分空間法の実装を行った.全員は計算結果に対して検証を行い,新しい問題点と課題に取り込んでいた.国内から計算科学,計算機科学,クリロフ部分空間法,前処理手法,ライブラリー開発などに携わっている専門家を招き,専門知識の提供を求めた.最終年度の現時点ではライブラリーを提供する計算サーバーの構築を行った.全研究期間においての研究実施計画の実施状況は下記の通りである.1.線形方程式に帰着される科学技術計算の応用問題の現状について調査した.2.線形方程式の係数行列を規模と構造と代数性質の観点から分類を行う.4.正則と特異な行列に対して収束性に関する研究を行った.5.前処理手法の研究を行った.6.4台のプロセスからなる並列システムを構築し,その上での前処理の並列技術に関する研究を行った.7.高速計算機(スーパーコンピュータと並列コンピュータ)においてクリロフ部分空間法の実装を行った.8.計算結果の検証を行い,新しい問題点と課題に取り込んでいた.9.国内から計算科学,計算機科学,クリロフ部分空間法,前処理手法,ライブラリー開発などに携わっている専門家を招き,専門知識の提供を求めた.10.最終成果として,ライブラリーを提供する計算サーバーの構築をほぼ完成した.これらの成果を国内外の同分野の研究者に紹介し,学術交流を通してその位置づけ・意義を明確にするため,学術論文誌に投稿するとともに,国内外学術会議にて出席して,発表を行った.本研究の目的は科学技術計算に現れるさまざまな超大規模線形方程式の数理的諸問題を研究し,高速解法を総合的に開発するものであり,その最終目標は,解きにくい問題を簡単に,計算時間のかかる問題を高速に,計算精度の不十分な問題を高精度に解けることである.そのため,まずは科学技術計算に詳しい分担者5名(小柳,藤野,速水,長谷川,阿部)が線形方程式に帰着される応用問題の現状について調査した.その調査結果をもとに全員は線形方程式の係数行列を規模と構造と代数性質の観点から分類を行った.張,小柳,速見,阿部は正則と特異な行列に対して収束性の研究を,張,藤野,長谷川,阿部は前処理手法の研究を行った.張,藤野は所属した研究機関の高速計算機環境(スーパーコンピュータと並列コンピュータ)において,クリロフ部分空間法の実装を行った.全員は計算結果に対して検証を行い,新しい問題点と課題に取り込んでいた.国内から計算科学,計算機科学,クリロフ部分空間法,前処理手法,ライブラリー開発などに携わっている専門家を招き,専門知識の提供を求めた.最終年度の現時点ではライブラリーを提供する計算サーバーの構築を行った.全研究期間においての研究実施計画の実施状況は下記の通りである.1.線形方程式に帰着される科学技術計算の応用問題の現状について調査した.2.線形方程式の係数行列を規模と構造と代数性質の観点から分類を行う.4.正則と特異な行列に対して収束性に関する研究を行った.5.前処理手法の研究を行った.6.4台のプロセスからなる並列システムを構築し,その上での前処理の並列技術に関する研究を行った.7.高速計算機(スーパーコンピュータと並列コンピュータ)においてクリロフ部分空間法の実装を行った.8.計算結果の検証を行い,新しい問題点と課題に取り込んでいた.9.国内から計算科学,計算機科学,クリロフ部分空間法,前処理手法,ライブラリー開発などに携わっている専門家を招き,専門知識の提供を求めた.10.最終成果として,ライブラリーを提供する計算サーバーの構築をほぼ完成した.これらの成果を国内外の同分野の研究者に紹介し,学術交流を通してその位置づけ・意義を明確にするため,学術論文誌に投稿するとともに,国内外学術会議にて出席して,発表を行った.本研究の目的は科学技術計算に現れるさまざまな超大規模線形方程式の数理的諸問題を研究し,高速解法を総合的に開発するものであり,その最終目標は,解きにくい問題を簡単に,計算時間のかかる問題を高速に,計算精度の不十分な問題を高精度に解けることである.そのため,まずは科学技術計算に詳しい分担者5名(小柳,藤野,速水,長谷川,橋本)が線形方程式に帰着される応用問題の現状について調査した.そして,全員で線形方程式の係数行列を規模と構造と代数性質の観点から分類を行った.張,小柳,速見,阿部は正則と特異な行列に対して収束性の研究を,張,藤野,長谷川,阿部は前処理手法の研究を行った.藤野,阿部は所属した研究機関の高速計算機環境(スーパーコンピュータと並列コンピュータ)において,クリロフ部分空間法の実装を行った.全員で計算結果の検証を行い,新しい問題点と課題に取り込む,国内外から計算科学,計算機科学,クリロフ部分空間法,前処理手法,ライブラリー開発などに携わっている専門家を招き,専門知識の提供を求めた.

1.線形方程式に帰着される科学技術計算の応用問題の現状について調査した.(小柳,藤野,速水,長谷川,橋本.調査・研究旅費,専門知識の提供,資料提供)2.線形方程式の係数行列を規模と構造と代数性質の観点から分類を行った.(全員.調査・研究旅費,専門知識の提供,資料提供)3.新しく提案された解法,GPBi-CG(ω)法,GPBi-CG法の収束特性をテスト問題を通じて具体的に評価する.(張.計算機,計算機使用料)4.正則と特異な行列に対して収束性を研究した.(張,小柳,速見,阿部.専門知識の提供,資料提供)5.前処理手法の研究を行った.(張,藤野,長谷川,阿部,橋本.専門知識の提供,資料提供)6.4台のプロセスからなる並列システムを構築し,その上での前処理の並列技術を研究した.(張,橋本.計算機)7.高速計算機環境(スーパーコンピュータと並列コンピュータ)において,クリロフ部分空間法の実装を行った.(藤野が所属した研究機関のものを利用.計算機,計算機使用料)9.国内外から計算科学,計算機科学,クリロフ部分空間法,前処理手法,ライブラリー開発などに携わっている専門家を招き,専門知識の提供を求めた.(旅費,専門知識の提供,資料提供)これらの成果を国内外の同分野の研究者に紹介し,学術交流を通してその位置づけ・意義を明確にするため,学術論文誌に投稿したとともに,国内学術会議(日本応用数理学会,情報処理学会,日本オペレーションズ・リサーチ学会)と国外学術会議(国際応用数理学会・IFFF学会・HPC学会)にて出席し、発表を行った.本研究の目的は科学技術計算に現れるさまざまな超大規模線形方程式の数理的諸問題を研究し,高速解法を総合的に開発するものであり,その最終目標は,解きにくい問題を簡単に,計算時間のかかる問題を高速に,計算精度の不十分な問題を高精度に解けることである.そのため,昨年度に引き続き,まずは科学技術計算に詳しい分担者5名(小柳,藤野,速水,長谷川,橋本)が線形方程式に帰着される応用問題の現状について調査した.そして,全員で線形方程式の係数行列を規模と構造と代数性質の観点から分類を行った.張,阿部は幾つかの国際会議に出席し,応用分野の専門家のニーズを調査した.張,長谷川,阿部は米国のスーパーコンピュータの国際会議で前処理の研究成果を展示した.また,張は東京大学にて,計算ライブラリーを提供する計算サーバの基本設計を完成し,公開を目標に開発している.ライブラリー開発などに携わっている国内外の専門家を招き,専門知識の提供を求めた.1.線形方程式に帰着される科学技術計算の応用問題の現状について調査した.(小柳,藤野,速水,長谷川,橋本,調査・研究旅費,専門知識の提供,資料提供)2.線形方程式の係数行列を規模と構造と代数性質の観点から分類を行った.(全員.調査・研究旅費,専門知識の提供,資料提供)3.前処理手法の研究を行った.(張,藤野,長谷川,阿部,橋本専門知識の提供,資料提供)4.第一年度の並列システムに,さらに4台のプロセスを追加し,その上での前処理の並列技術を研究した.(張,橋本.計算機)
マウスES細胞および発生過程における反復配列様遺伝子ECAT11の機能解析

当研究室では、人工多能性幹(iPS)細胞の再生医療・各種細胞生物子研究の資源としての応用基盤を築くべく、体細胞からの初期化過程・iPS細胞の分化能や安全性などの質評価に関わる研究を行っている。iPS細胞株はそれぞれ分化能に違いがあり、iPS細胞由来キメラマウスにしばしば異常がみられ、ES細胞と比較して分化能と安全性に問題がある。また、樹立効率が4%以下と低く、応用の障害となる。これらを解決するためには初期化の中枢経路を知ることが必須である。報告者は平成21年度よりECAT11ノックインマーカーを応用したiPS細胞樹立過程の詳細解析を行っている。平成22年度の解析結果を発展させ、初期化誘導過程にある細胞集団をECAT11-EGFPおよび幹細胞表面抗原マーカーSSEA-1との二次元FACS解析で初期化段階別に4つのサブ集団に分類し、それぞれの集団の発現をシングルセルマルチプレックスPCRで解析し、段階別に特徴的なES細胞関連因子群の発現開始時期を特定した。また、この解析の中で新規にDppa4が初期化マーカーとして有用であることを発見した。このマーカーは従来のOct4・Nanogとは異なり多能性幹細胞の中でホモジナスに発現する因子であり、特にシングルセルマルチプレックスPCRによる系で初期化完遂までの細胞の発現変動を追う上で最適なマーカーと言える。さらに、シングルセルマルチプレックスPCRによって得られる細胞株における単一細胞ごとの発現分散度の安定化が従来の初期化完了と捉えられていた時期とは異なる時期に起こり、また長期培養によってこの安定が失われることも見出した。本研究成果はiPS細胞の質を評価する上で極めて重要な知見であり、今後この解析系を用いて、新たに樹立したiPS細胞株の安定性をはかる評価基準を作ることが可能である。●ECAT11欠失ES細胞に対するマイクロアレイ解析および変動因子に対するバイサルファイトシークエンシング法による解析およびChIP法によるヒストン修飾解析:樹立したECAT11欠失ES細胞3クローンのうち、マイクロアレイ解析ではすべてにおいてRhox遺伝子群の発現上昇が認められていたが、うちの2クローンでRhox遺伝子群プロモーター領域のメチル化異常を認めた。メチル化以外の発現変動原因があることも示唆されたため、ヒストンH3K9のメチル化およびアセチル化についてChIP法によって解析したが、この2つの修飾については変異型と野生型で差異がみられなかった。●ECAT11レスキュー実験:ECAT11領域を含むBACを用いて行った。ECATI1のレスキュー率と上記マイクロアレイ解析で変動した因子群の回復率の間に明確な相関性は確認できなかった。また、レスキュー株ではMILIの発現が上昇していることが確認された。●ECAT11ホモ変異マウスおよびヘテロ変異マウスのうち表現型異常のマウスについての解剖および透明骨格標本の観察:解剖所見としては、るいそう・脊椎の湾曲などが挙げられたが、それ以外に特徴的な異常は見られなかった。また、骨格標本でも、目立つ異常は確認できなかった。●ECAT11生体内局在の追跡:ECAT11遺伝子座にノックインしたEGFPの発現を追跡した。卵および受精直後は発現が見られず、胞胚期直前から頭部襞期頃まで全体で発現し続け、E10.5日頃に一度発現が消え、E12.5日目でEGFP光が前後肢および下顎と思われる部分で観察された。前後肢では指間にEGFPが局在していた。●RNA免疫沈降によるターゲットの探索:Myo5b、colllalおよびGdf6などの因子において濃縮がみられた。●ECAT11をマーカーとしたiPS細胞の作製:ECAT11は完全欠失の状態においてもES細胞マウスでほとんど異常が見られない。そこで、ECAT11自体が人工多能性幹細胞(iPSCs)識別マーカーとして利用できないかを検討するためECAT11ホモ変異MEFを用いてiPSCsの誘導および樹立を開始した。当研究室では、ES細胞をモデルとして創られたiPS細胞の再生医療・各種細胞生物学研究の資源としての応用基盤を築くべく、体細胞からの初期化過程・iPS細胞の分化能や安全性などの質評価に関わる研究を行っている。平成21年度はこれまでの解析の結果に基づく新しい発展研究としてEcAT11-EGFPノックインマーカーをレポーターとしたiPS細胞樹立過程の詳細解析を開始した。平成21年度の解析結果から、ECAT11-EGFPおよび幹細胞表面抗原マーカーSSEA-1との二次元FACS解析で、iPS細胞は少なくとも2つの発現ステータスを経由してできることがわかった。また各経路におけるマイクロアレイ解析の結果からES細胞・その他幹細胞マーカーの発現に特徴がみられることがわかった。このことから、樹立されたiPS細胞の株間の違いが誘導中に通る経路の違いによって生み出され、最終的に質の異なるiPS細胞ができると考えられた。さらに、各分画からの単細胞解析で、それぞれにES細胞との発現における類似度を測定することが可能になった。また、iPS細胞の初期化誘導に用いる四因子(Oct4・Sox2・Klf4・c-Myc)の割合を変えることで、それぞれの経路をを通る細胞集団の割合を変えられることもわかった。

この評価系を用いることで、最終的にもっともES細胞に近いiPS細胞を見出すことが可能となるだけでなく、iPS細胞がどのような発現の変遷を経て生成するか、最終的な初期化の完成を決定づける因子が何であるかも検出できるようになった。当研究室では、人工多能性幹(iPS)細胞の再生医療・各種細胞生物子研究の資源としての応用基盤を築くべく、体細胞からの初期化過程・iPS細胞の分化能や安全性などの質評価に関わる研究を行っている。iPS細胞株はそれぞれ分化能に違いがあり、iPS細胞由来キメラマウスにしばしば異常がみられ、ES細胞と比較して分化能と安全性に問題がある。また、樹立効率が4%以下と低く、応用の障害となる。これらを解決するためには初期化の中枢経路を知ることが必須である。報告者は平成21年度よりECAT11ノックインマーカーを応用したiPS細胞樹立過程の詳細解析を行っている。平成22年度の解析結果を発展させ、初期化誘導過程にある細胞集団をECAT11-EGFPおよび幹細胞表面抗原マーカーSSEA-1との二次元FACS解析で初期化段階別に4つのサブ集団に分類し、それぞれの集団の発現をシングルセルマルチプレックスPCRで解析し、段階別に特徴的なES細胞関連因子群の発現開始時期を特定した。また、この解析の中で新規にDppa4が初期化マーカーとして有用であることを発見した。このマーカーは従来のOct4・Nanogとは異なり多能性幹細胞の中でホモジナスに発現する因子であり、特にシングルセルマルチプレックスPCRによる系で初期化完遂までの細胞の発現変動を追う上で最適なマーカーと言える。さらに、シングルセルマルチプレックスPCRによって得られる細胞株における単一細胞ごとの発現分散度の安定化が従来の初期化完了と捉えられていた時期とは異なる時期に起こり、また長期培養によってこの安定が失われることも見出した。本研究成果はiPS細胞の質を評価する上で極めて重要な知見であり、今後この解析系を用いて、新たに樹立したiPS細胞株の安定性をはかる評価基準を作ることが可能である。