hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精緻かつ実用的な腎組織再構築のためのストローマ前駆細胞の誘導・維持・増殖法の開発

既報の腎臓オルガノイドは、腎臓以外の雑多な細胞も混入し、局所的かつ不完全な腎構造の再現に止まる。この原因の一つは、腎臓の3種類の前駆細胞のうち、ストローマ前駆細胞の分化誘導系、およびその維持・増殖培養系が未確立なことにある。本研究では、腎ストローマ前駆細胞で発現する遺伝子Foxd1に着目し、緑色蛍光タンパク(GFP)でその発現を標識できるよう遺伝子改変した幹細胞と、Foxd1-GFPトランスジェニックマウス由来の初代培養細胞とを併用することで、これらの課題を効率的に解決し、腎臓の再生・精緻で実用的なオルガノイドの構築といった工学的アプローチのために不可欠な基礎技術の確立を目指す。
すばる望遠鏡ＦＭＯＳによる大規模銀河分光サーベイで探る宇宙の加速膨張の起源

本研究の目的は、すばる望遠鏡の近赤外分光装置FMOSを用いて、赤方偏移z=1.4(宇宙誕生後約60億年後)の銀河の三次元分布を観測し、赤方偏移歪み効果を検出することで一般相対論の検証を行うことである(FastSoundプロジェクト)。昨年度までにこのサーベイについての詳細をまとめた論文と、一般相対論の検証結果を出版し、本研究の主目的は達成された。平成28年度は、サーベイで得られたデータを活用した新たな研究を行った。FastSoundで得られた銀河の3次元分布とCFHTLenS可視サーベイによる銀河形状の情報を用いて、大規模構造における銀河形状の指向性を調べた。これはintrinsic alignment (IA)と呼ばれ、銀河形成や進化の理論モデルに制限を与えると同時に、弱重力レンズサーベイに系統誤差を与える可能性がある。銀河位置と銀河形状の相関関数を測定することで、z=1.4の青い星形成銀河についてIAは統計的エラーの範囲でゼロであることがわかった。この結果は、これまでのz=0.6までの測定と同じであり、晩期型銀河については広い赤方偏移の範囲において、IAは存在しないままであることを示すものである。早期型銀河については低赤方偏移で明らかなIAのシグナルが発見されているため、本結果は、銀河の種類によって形成や進化の過程が異なることを直接示す重要なものである。同時に、晩期型銀河の割合が増える、今後の弱重力レンズサーベイでのIAによる系統誤差も一定以内であることが分かった。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、すばる望遠鏡FMOSによる銀河分光サーベイ(FastSoundプロジェクト)の観測データから、赤方偏移カタログを作成し、その成果を論文として発表した。この論文では、FastSoundプロジェクトの基礎デザイン、データ取得、第一段階解析、データの公開など、サーベイの基礎的かつ不可欠な部分について詳しくまとめた。この解析の段階で開発し、データ解析において重要な役割を果たした、「輝線自動検出ソフト」についても、そのアルゴリズムや性能評価をまとめた論文が受理された。この赤方偏移カタログは、2012年4月から2014年7月の35晩のすばる望遠鏡FMOSによる観測で得られた、赤方偏移1.21.6に位置する約5,000の銀河の位置や輝線の情報について詳細にまとめたもので、赤方偏移1を超えるものとしては、世界で初めてのデータである。このデータを用いて、FastSoundプロジェクトの第一目標である、銀河の二点相関関数に見られる非等方性である赤方偏移空間歪みの検出による宇宙の大規模構造の成長率測定が、赤方偏移1を超える領域で、初めて4σの有意性で行われた。現在標準的に用いられている宇宙モデルであるΛ-CDMモデルの予測と無矛盾な結果が得られ、同時に、今後のより大規模なサーベイで行われる大規模構造の成長率測定が、宇宙の加速膨張の起源の可能性である修正重力理論の制限に有用であることが分かった。平成27年度は、当初の予定通り、FastSoundプロジェクトの第一論文を筆頭著者として出版した。また、FastSoundデータのカタログ化も完了し、データリリースを行うこともできた。このデータを用いて、銀河クラスタリングの解析、赤方偏移空間歪み効果の検出に基づく大規模構造の形成スピード測定、修正重力への示唆も当初の予定通り進行し、共著論文として出版した。これらの結果についての発表も、国際会議と国内会議で1回ずつの口頭発表を行っており、これも予定通りである。以上の点から、本研究は予定通り進展していると言える。FastSoundデータ(赤方偏移1.4の星形成銀河のカタログ)を用いたサイエンスとしては、現在FastSound銀河のintrinsic alignment(IA)の測定を行っている。これは銀河が大規模構造の中で、特定の方向を向きやすいかを表す量で、銀河形成の物理に大きく関わるものである。

「銀河の形状はアンサンブル平均では真円である」ことを仮定する弱重力レンズサーベイにおける系統誤差の原因ともなりうる量であるため、IAの測定を、これまでにない赤方偏移でFastSoundデータを用いて行う意義は大きいと考えられる。また、FastSoundの銀河クラスタリング解析に携わった経験を活かし、他の測光や分光サーベイのデータを使った銀河クラスタリングによる宇宙論研究、例えばバリオン音響振動の検出による宇宙論パラメータの制限などを並行して行う予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
リアルタイム画像計測による画像ものさしシステムの研究

本研究では,デジタルカメラによる画像計測技術の自動化および測量システム化により低コストかつ1人で測量を可能とする,「画像ものさしシステム」を開発することを目的に,システムの開発および精度検証実験を実施した.本システムは,カメラの制御および画像処理により,リアルタイムかつ自動に画像計測が可能であり,計測精度として1020mm程度の精度を実現した.本研究では,デジタルカメラによる画像計測技術の自動化および測量システム化により低コストかつ1人で測量を可能とする,「画像ものさしシステム」を開発することを目的に,システムの開発および精度検証実験を実施した.本システムは,カメラの制御および画像処理により,リアルタイムかつ自動に画像計測が可能であり,計測精度として1020mm程度の精度を実現した.本研究は,デジタルカメラによる画像計測技術の自動化および測量システム化により,低コストかつ1人で測量を可能とする,「画像ものさしシステム」を開発することを目的としている.本システムは,対象範囲を複数台のカメラで写し込み,作業員が指した場所の位置関係や長さを自動的かつリアルタイムに測量するものである.測量値(3次元座標)および測量時の画像は自動的に保存されるとともに,取得画像上にすべての測量値を重ねて表示することで,測量後の内業(後処理)も容易である.なお,本システムではcm単位の測量精度を実現することを目標としている.本年度は,(1)PCによるカメラの制御(画像取得)プログラムの開発,および(2)取得画像より自動的に基準体および測量点の画像上の位置を自動判別する画像処理プログラムの開発,を実施し,カメラの制御プログラムおよび画像処理により対象物の画像位置を自動的に取得するプログラムを開発した.上記開発成果を基に,200万画素ギガビットネットワークカメラ3台とモバイルノートパソコンによるシステムのプロトタイプを開発し,室内実験により本システムの計測精度の検証を実施した.本実験により室内のような狭い範囲であれば,cm単位の計測精度を有すること示した.また,(3)画像処理による自動判別が容易となる基準体・測量点指示器の検討,を実施し,色および形の工夫により自動認識における認識確率を向上できることが分かった.本研究は,デジタルカメラによる画像計測技術の自動化および測量システム化により低コストかつ1人で測量を可能とする,「画像ものさしシステム」を開発することを目的としている.本システムは,対象範囲を複数台のカメラで写し込み,作業員が指した場所の位置関係や長さを自動的かつリアルタイムに測量するものである.測量値(3次元座標)および測量時の画像は自動的に保存されるとともに,取得画像上にすべての測量値を重ねて表示することで,測量後の内業(後処理)も容易である.なお,本システムではcm単位の測量精度を実現することを目標としている.本年度は,昨年度の成果を基に,システムのプロトタイプを開発することを目的とした.また,本システムの実用性および精度の検証のための実験を行った.プロトタイプの開発として,複数台のカメラを配置する設置冶具,およびカメラの通信の集約およびカメラへの電源供給を行う通信・電源ボックスを製作した.また,画像計測用基準体を製作した.これらを組み合わせ,画像ものさしシステムのプロトタイプを開発した.開発したシステムプロトタイプを用いて実験を実施した.その結果,リアルタイム画像計測を実現した.また,計測は自動連続的に可能であった.さらに,計測精度はcm精度を実現した.以上のように,本年度は本研究の成果をとりまとめ,複数台のカメラと画像処理により,cm単位の精度でリアルタイムかつ自動に画像計測が可能な測量システムを開発した.
医療評価のための計量モデルの研究

我が国においては医療費の増加が大きな問題となっており,在院日数や治療成果の適正な評価は今後の医療政策を考える上で重要な課題となっている。本研究では,これらの観点を踏まえて次の4点についての研究を行った。第1は,大腿骨骨折における在院日数・治療成果データの分析である。ここでは平成14年4月の診療報酬改定の在院日数・治療成果への影響の評価を行うとともに,これらに影響する因子についての検討を行った。第2は,白内障における入院日数の分析である。白内障治療のための手術は標準化されたものであるにも係わらず,病院ごとに在院日数に大きな差がある。これを計量モデルによって分析し,在院日数に影響を与える要因についての分析を行った。第3は,医療データの計量分析に関する理論研究である。治療成果は質的データであり,在院日数は整数値を取る計数データである。また,治療成果と在院日数は退院という一つの行為で決定される。すなわち、在院日数と治療成果の間には同時決定性の問題が存在する。在院日数と治療成果の関係について個別に分析した研究はこれまでに存在するが,これらを統合的に扱った研究は存在しなかった。これまでにない分析方法が必要となるが,ここではこの問題に対応するため,データ(質的データ・離散データ・制限従属変数として)の理論的な分析を行い,新たな計量モデルを作成し,その推定方法に関する研究,推定プログラムの開発などを行った。第4は,上記の研究で,開発された手法・モデルを応用した企業の雇用調整行動の分析である。開発された分析手法を用いて検証し,1990年代半ば以降に,大企業の雇用行動について構造変化の有無を明らかにした。一連の研究を通して,モデルや推定方法の開発・理論分析を通した計量経済学・統計学への貢献,分析結果の医療経済学への貢献,さらに労働経済分析への応用などの面で大きな成果をあげたと考えられる。平成17年度における研究では、これらの観点を踏まえて次の3点についての研究を行った。第1は、大腿骨骨折における在院日数・治療成果データの分析を行い平成14年4月の診療報酬改定の在院日数・治療成果への影響の評価を行うとともに,これらに影響する因子についての検討を行った。治療費用と治療成果の間には同時決定性の問題が存在する。また、在院日数は左の整数値を取る離散データであり、治療成果は質的データである。治療費用と治療成果の関係について個別に分析した研究はこれまでに存在するが、これらを統合的に扱った研究は存在しなかった。平成17年度の研究ではこの問題に対応するため、新たに離散型の比例ハザード・モデルおよび同時方程式モデルを作成し、その最尤推定のために独自に開発したプログラムによって分析を行った。これらの研究成果のうち、平成17年度中に3編の研究論文がJournal of Health Economics他の学術雑誌に掲載済みまたは掲載が決定(雑誌に掲載されもの1編、採択が決定したもの2編)している。第2は、白内障における入院日数の分析である。白内障治療のための手術は標準化されたものであるにも係わらず、病院ごとに在院日数に大きな差がある。これを離散型の比例ハザード・モデルおよび順序プロビット・モデルによって分析し、在院日数に影響を与える要因についての分析を行った。

研究成果のうち、1編の研究論文が学術雑誌に掲載が決定している。第3は、これらのデータ(質的データ・離散データ・制限従属変数として)の分析手法に関する研究である。査読期間等の関係で、平成17年度中は掲載決定に至ったものはないが、数編の研究論文を学術雑誌に投稿中である。また、これらの手法と関連する分野の著書1点を平成17年度中に刊行している。前年度の研究成果に基づき,本年度は次のような研究を行った。第一は,白内障の在院日数に関する研究である。我が国においても人口の老齢化に伴い白内障患者が増加しており,眼科手術数が行われている。例えば,平成14年10月時点での白内障患者は約129万人(労働厚生省,2002)であり,また,「社会医療診療行為別調査」によれば,6月審査分の白内障手術の実施件数は平成7年には33,286件であったものが,平成14年には65,864件となっており,年間100万件近くの手術が行われている。このため,在院日数の短縮は大幅な医療費の減少につながる。本年度の研究では,26病院の白内障患者のデータを離散型の比例ハザードモデルにより分析し,患者の特性や処置・手術のタイプの違いをコントロールしても,病院ごとに在院日数に大きな差があることを示し,さらにその要因の分析を行った。第二は,大腿骨骨折の在院日数と治療成果に関する研究である。我が国では老齢化の進展に伴い大腿骨骨折の患者が増加しており,大腿骨骨折は高齢者が寝たきりとなる主要な原因となっている。本年度は,新たに開発した同時方程式タイプのモデルを使い5病院の患者のデータを分析し,術後感染症,術後合併症の防止や手術後のリハビリなどの重要性を定量的に示した。これらの研究成果は,診療報酬体系の決定等の政策上も大きな意義があると考えられる。第三は,医療データの計量分析に関する理論研究である。治療成果は質的データであり,在院日数は1,2,.の整数値を取る計数データである。また,治療成果と在院日数は退院という一つの行為で決定されるため,これまでにない分析方法が必要となるが,本年度は,これらの理論的な分析を行い,新たなモデルおよびその推定方法に関する研究を行った。これらの研究成果は,本年度6編の論文として学術雑誌に掲載されている。また,現在,数編の関連する研究論文を学術雑誌に投稿中である。本年度は、研究の最終年度であり、前年度までの研究成果に基づき次のような研究を行った。第一は、大腿骨骨折の在院日数および治成果に関する研究である。大腿骨骨折は老人が寝たきりになる主要な要因の1つであり、その解析は非常に重要になっている。本年度は離散型の比例ハザードモデルおよび順序プロビットモデルを用い、平成14年度の診療報酬改定および在院日数および治療成果に影響すると考えられる要因の分析を行った。第2は白内障における入院日数の分析である。我が国では人口の老齢化に伴い、白内障の手術数が増加している。白内障における在院日数の短縮は大幅な医療費の削減につながると考えられる。データの分析の結果、白内障手術は標準化されたものであり、手術・措置に関して病院ごとの差は小さいにもかかわらず、在院日数において、病院ごとに大きな差があることが認めれた。
戦後沖縄における教育実践史研究

4年間の研究成果は以下の通りである。1.伊波常雄教育関係資料を保管するうるま市石川歴史民俗資料館と共同して資料を整理し、同資料の目録とCD-ROMを作成・発行した。2.戦後沖縄、とりわけ占領期の沖縄教育の実態と課題について研究を深め、研究メンバーがそれぞれ成果を発表した。また、各自の研究論文とシンポジウムの記録、聞き取り調査の内容などをまとめ、最終年度に研究成果報告書として刊行することができた。3.最終年度に、うるま市石川歴史民俗資料館とうるま市教育委員会の協力を得て資料展示会とシンポジウムを開催し、地元メディアにも大きく取り上げられた。4.伊波常雄教育関係資料リスト、検索用CD-ROM、研究成果報告書を国内外の主要な図書館や研究機関に送付し、一般にも研究成果を発信できた。以上、今後の占領期教育実践研究進展のための基盤づくりができたことを踏まえ、当初の計画通りの成果を上げられたものと考える。本研究の目的は、沖縄の一教師だった伊波常雄(1931-2007)が40年以上にわたる教員生活の中で蓄積してきた教育資料を中心に、他の教育史料の調査・整理の成果、聞き取り等を援用することによって戦後沖縄の教育実態を解明しようとするものである。4年間の研究計画は以下の通りである。(1)資料整理とリストの発行伊波常雄教育資料を整理し保存するだけでなく、詳細細目を含めた資料リストを発行することで、利用者の便宜を図る。さらに一部マイクロ化によって、貴重な資料の保存を図る。(2)戦後沖縄、とりわけ占領初期の教育実践の実態調査伊波資料を中心にしながら他の教育史料を調査し、さらには同時代を生きた同僚の証言等の聞き取りなどを通して、これまでの先行研究では不十分であった「実践」にフォーカスした占領初期の教育の事態を明らかにする。(3)教育実践と教師のライフサイクル研究当時の教師たちの教員養成、教員研修等のライフサイクル研究と史料の分析結果を総合し、「子ども」の教育、文化、生活にまで目配りすることによって、戦後沖縄教育実践史論を構築することを目指す。本研究の目的は、沖縄の一教師だった伊波常雄(1931-2007)が40年以上にわたる教員生活の中で蓄積してきた教育史料を中心に、公共図書館所蔵の教育史料を調査・整理の成果を援用することよって戦後沖縄の教育実態を解明しようとするものである。これまでの沖縄戦後教育史研究においては、占領を後背地とした教育運動論、社会教育、教育行政研究においては一定の到達点が見られた。しかし当時教育現場にいた教員や子どもたちの具体的な証言、日常の教育実践史料が乏しく、こうした教育実践史料の欠落は、この分野での研究の隘路ともなっていた。伊波教育史料には戦後初期のガリ版教科書や学習帳、学級日誌の綴りや文集、学級通信、授業指導案等が含まれており、それを有効活用すれば当時の沖縄の教育活動全体を浮き彫りにすることができる。そこに本研究の重要な意義がある。今年度は、まず史料整理と研究環境を整えることに集中的に取り組んだ。約100箱にも及ぶ伊波教育史料をジャンルごとに分類し、史料タイトル、中身の詳細細目も含めてリストを作成するとともに、劣化した資料の保全を図った。さらに重要な戦後初期の史料についてはマイクロ化を依頼し、今後の利用への道を開いたことが重要な成果としてあげられる。また戦後、とくに占領前期の教育実態を明らかにするため、基本文献の収集と精査を行い、当時の教育についての理解を深めるための研究会を実施した。とりわけ伊波教育資料以外にも散逸している戦後初期のガリ版教科書の調査と複写、新聞メディア等による占領期教育政策の関連資料収集、琉球民政府の「USCAR文書」マイクロフィルムの中から、伊波の勤めていた宮森小学校に関する未完の英文資料、および日本語資料の一部を発掘したことが成果としてあげられる。本研究の目的は、沖縄の一教師だった伊波常雄(1931-2007)が40年以上にわたる教員生活の中で蓄積してきた教育資料を中心に、公共図書館所蔵の教育資料を調査・整理の成果を援用することよって戦後沖縄の教育実態を解明しようとするものである。このように、一教師の日常の教育実践の記録を中心としつつ終戦後の沖縄教育実践のありようを解明しようとした研究テーマはかつてなく、そこに本研究の最大の意義がある。今年度は昨年度に引き続き、約100箱にも及ぶ伊波教育資料の詳細細目も含めたリストを作成する作業を実施するとともに、劣化した資料の保全を図った。

さらに重要な戦後初期の資料についてはマイクロ化し、研究メンバーがいつでも閲覧できるようにしたことが、研究基盤整備の成果としてあげられる。またリストの最終的な点検を行い、漏れがないかどうかを確認したのちに紙媒体として発行した。リストの発行によって膨大な資料の分類と検索が可能となり、利用者が関心に応じて必要な資料を閲覧できる道を開いた。また、戦後とくに占領前期の教育実態を明らかにするため、基本文献の収集と精査を行い、当時の教育についての理解を深めるための研究会を開催した。研究会では、伊波の元同僚からの教育実践の聞き取り調査に関する報告、戦後国語教科書の先行研究についての報告、沖縄の戦後平和教育、社会教育の実態調査報告、宮森小学校ジェット機事故に関する報告などがなされた。研究メンバーのそれぞれの研究関心の成果を学び合う中で、戦後沖縄教育の抱える問題点、今後の研究の方向性を共通理解し、来年度の研究目標につなげていった。今年度の研究成果は、今後の研究を深化させるための条件整備、基盤作りとして位署づけられる。本研究の目的は、沖縄の一教師だった伊波常雄(1931-2007)が40年以上にわたる教員生活の中で蓄積してきた教育資料を中心に、公共図書館所蔵の教育資料を調査・整理の成果を援用することよって戦後沖縄の教育実態を解明しようとするものである。一教師の日常の教育実践の記録を中心としつつも、他の資料や証言などを通して終戦後の沖縄教育実践の実相に迫ろうとしているため、残存資料活用の方途を探るための基礎作業と、各自の問題関心に基づく内容研究とが並行して行われた。今年度は、昨年マイクロ化したとりわけ重要な戦後初期の資料について、紙媒体にプリントアウトし製本した。これにより研究メンバーの利用をより簡便化した。また引き続きリストの最終的な点検を行い、漏れがないかどうかの確認作業をうるま市歴史民俗資料館と協同して行った。また、戦後とくに占領前期の教育実態を明らかにするため、基本文献の収集と精査を行い、当時の教育についての理解を深めるための研究会を定期的に開催することができた。研究会では、伊波の元同僚からの教育実践の聞き取り調査に関する報告、1950年代を中心とした伊波教育実践のまとめ、沖縄の戦後平和教育実践、平和教育行政についての報告、1950年代における伊波の教員研修に関する報告、などがなされた。研究メンバーのそれぞれの研究関心の成果と学び合いをさらに深めるとともに、最終年度のまとめとして開催予定のシンポジウム、資料展示会、資料リストのCD化に向けての準備と打ち合わせを進めることができた。さらに関連成果として、研究代表者が地元発行の琉球新報紙にて「占領期沖縄児童文化の光と影」14、琉球新報朝刊(2010年10月7.8.9.14日)を連載し発信した。今年度は、本研究の最終年度に当たるため、研究成果のまとめと公開に集中的に取り組み、以下のような成果を上げた。1.研究資料の活用化戦後沖縄教育発祥の地と称されている沖縄県石川地区(現・うるま市石川)で、約40年間にわたって小学校教師を務めた伊波常雄(1931-2007)が残した教育関係の整理と資料リストを完成させ、紙媒体ですでに発行していたリストの活用をより簡便にするために、検索用のCD-ROMを作成した。
体外循環システムによる抗腫瘍性リンパ球の誘導と癌治療の試み

レクチンをリンパ球と培養することにより強い抗腫瘍活性を有するキラーリンパ球が得られることは広く知られている。我々はこのキラーリンパ球を体外循環システムにおいて誘導し癌治療に応用する目的で以下の検討を加えた。旭化成によって開発されたレクチンを表面に固定化したセファロース粒子とリンパ球を培養することにより、ヒト及びマウスにおいてキラーリンパ球を誘導することが可能であった。またマウスにおいてはこのリンパ球はinvivoにおける抗腫瘍効果も確認された。次にこのセファロース粒子をカラムに充満させ、ヒトのリンパ球浮遊液を通過させることによってもキラーリンパ球を誘導することが可能であった。しかしながら全血をカラムに通過させその後にリンパ球の活性を調べてみてもキラー活性の誘導は困難であった。この問題は赤血球やマクロファージ等がリンパ球とセファロース粒子の適切なコンタクトを防げている可能性が考えられ、セファロース粒子の更なる改善やカラムを通過させる条件の検討を行う必要があると考えられる。またレクチンで誘導されたキラーリンパ球はin vitroで腫瘍細胞等と刺激することによりTNFを放出することが確認された。このキラーリンパ球はキラー活性が低いものでも十分に強いTNF産生能を有していることもわかった。それ故全血をカラム通過させた時にリンパ球のキラー活性が弱くても、これを体内に帰して腫瘍細胞とコンタクトさせることにより体内でTNFが放出される可能性もでてきており、この方法は内因性のTNFを誘導する方法としても期待がもてるものと考えられる。今後は全血をカラム通過させてキラーリンパ球を誘導する至適条件を追求するとともに、内因性のTNF産生を誘導する条件についても検討を加える予定である。
腸管平滑筋における電位依存性カルシウムチャネルの受容体刺激による調節機構

本研究では、モルモット回腸平滑筋における電位依存性カルシウムチャネルに対し抑制作用を示すものとしてムスカリン受容体を、増大させるものとしてニューロテンシン受容体を取り上げ、これら受容体間の相互作用を知る初段階として上述の相反する効果の細胞内情報伝達機構を明らかにすることを目的とした。実験には回腸縦走筋から得た単離平滑筋細胞を用い、パッチクランプ法によりカルシウムチャネル電流を記録した。1、カルシウムチャネル電流はムスカリン受容体刺激により抑制された。この抑制効果は一過性成分とその後の持続性成分からなり、いずれも百日咳毒素非感受性のG蛋白質を介して発現する。2、一過性の抑制はイノシトールリン脂質代謝産物であるイノシトール三リン酸を介した細胞内ストアからのカルシウム放出に起因する。3、持続性の抑制効果は発現が緩徐であることから何らかのセカンドメッセンジャーを介するものと考えられるが、既知のメッセンジャーであるイノシトール三リン酸、プロテインキナーゼC、サイクリックAMP、サイクリックGMPおよびアラキドン酸ではない。4、プロテインキナーゼCを活性化するホルボールエステルはカルシウムチャネル電流を増大させた。5、ニューロテンシン受容体刺激により生じる効果は、百日咳毒素感受性のG蛋白質を介したイノシトールリン脂質代謝経路に連関しており、プロテインキナーゼCがメッセンジャーである可能性が示唆された。以上の成績のうち14については既発表論文一編、投稿中論文一編としてまとめた。また、5については現在投稿準備中である。なお、ムスカリン受容体刺激による持続性抑制のメッセンジャーの同定、ならびにムスカリン受容体とニューロテンシン受容体間における情報伝達経路の相互調節機構について今後詳細に検討する必要がある。
検証型エピジェネティック毒性研究実現のための特異的ＤＮＡメチル基導入技術の開発

化学物質の遅発毒性のメカニズムとして注目される「エピジェネティック毒性」研究を発展させるために、狙ったDNA配列のDNAメチル化を操作する技術の開発に取り組んだ。ゲノム編集技術として実用化が進んだ「DNA結合タンパク質-ヌクレアーゼ」技術を応用した。その際、DNAメチル化操作がPCR技術並みに特異的に行われる工夫を施したアイディアを盛り込んだ。培養細胞を使って技術の検討を進め、予備的ながら開発に目処がつくデータを得た。化学物質のエピゲノム作用により遅発毒性が生じる「エピジェネティック毒性」が注目されているが、研究の進展は遅れている。その原因として、エピゲノムを配列特異的に操作する技術が無く、検査研究にとどまらざるを得ないことが上げられる。本研究では、エピゲノムのうちDNAメチル化を取り上げ、「ゲノム上の任意の配列に対し特異的にDNAメチル基を導入する技術」を開発し、エピジェネティック毒性研究を検証型へシフトさせることを目的とする。そのために、実用化が進んだ「DNA結合タンパク質-ヌクレアーゼ」技術を応用し、「特異的にDNAメチル基を導入する技術」を開発する。具体的には、「2ヶ所のDNA配列の同時認識による内在性DNAメチル化酵素の特異的リクルートとその2量体化による酵素活性の上昇」を狙い、内在性DNAメチル化酵素のノリとしてDNMT3L断片をDNA結合タンパク質TALEに付加した人工タンパク質を開発する。このアイディアの検証のために、神経幹細胞におけるGFAP遺伝子のDNAメチル化による発現制御系を用い、GFAPプロモーターの特異的高メチル化誘導を目指したTALE-DNMT3Lの設計と実用性検討を行う。本年度は、GFAPプロモーター特異的TALE融合DNMT3L発現ベクターの設計および作製を行い、マウス神経幹細胞へ導入し、目的標的配列への結合をFlagに対するChIPで確認した。次に、GFAP発現誘導因子LIFに対するGFAP発現上昇が抑制されるか調べたところ、実際に抑制されることが確認された。この結果は、TALE融合DNMT3Lにより、細胞内在性のDNMT3Aまたは3BがGFAPプロモーターにリクルートされ、DNAメチル化を亢進させた可能性を示唆するものである。本年度は、GFAPプロモーター特異的TALE融合DNMT3L発現ベクターの設計および作製に取り組んだ。マウスGFAP遺伝子は、転写開始点上流約1.5kbに存在するSTAT3結合配列中にCpG配列を持ち、そのCがメチル化されているとSTAT3が結合できず、転写されないことが明らかになっている。そこで、このSTAT3結合配列を挟み特異的に結合するTALEタンパクをコードするDNA配列を設計した。そのためのベクターの合成までを終了し、現在、マウス神経幹細胞への導入と、目的配列への結合検証を行っている。本研究では、「2ヶ所のDNA配列の同時認識による内在性DNAメチル化酵素の特異的リクルートとその2量体化による酵素活性の上昇」を狙い、内在性DNAメチル化酵素のノリとしてDNMT3L断片をDNA結合タンパク質TALEに付加した人工タンパク質を開発する。2年間で完成させる計画であり、初年度にGFAPプロモーター特異的TALE融合DNMT3L発現ベクターの設計および作製に取り組み、GFAP遺伝子の発現を制御するSTAT3結合配列を挟み特異的に結合するTALEタンパクをコードするDNA配列の設計、そのためのベクターの合成までを終了した。ここまで特に問題なく計画を遂行できており、おおむね順調に進展していると判断した。1 GFAPプロモーター特異的TALE融合DNMT3L発現ベクターの作製:初年度に実施した、GFAP遺伝子の発現を制御するSTAT3結合配列を挟み特異的に結合するTALEタンパクをコードするDNA配列の設計、そのためのベクターの合成を受け、その性能検討を行う。

GFAPプロモーターへの結合が確認されたら、最終発現ベクターの作製を行う。2神経幹細胞へのベクター導入によるGFAPプロモーター高メチル化誘導確認:GFAP遺伝子のDNAメチル化による発現制御が明確なマウス胎児神経幹細胞の培養系を用い、培養を経てメチル化率が0%になっている細胞にジンクフィンガーDNMT3L発現ベクターを導入する。導入した細胞におけるGFAPプロモーターのDNAメチル化程度を、バイサルファイトクローニングシークエンス法によりDNA配列レベルの解像度で定量する。3 GFAPプロモーター高メチル化誘導に伴うGFAP発現低下の確認:DNA高メチル化を誘導した発現ベクターについて、GFAP発現低下作用を定量する。mRNAレベルを定量RT-PCRで測定し、タンパクレベルをウェスタンブロッティング法によって測定する。GFAPタンパクに対する抗体を用いた免疫染色法による検討も併用する。4ゲノム全体のDNAメチル化状態の解析による特異性検討:GFAPプロモーター以外のゲノム領域におけるDNAメチル化への影響を調べるために、ゲノム全体のDNAメチル化状態を測定する。5 ZFもしくはTALE融合DNMT3Lのゲノム上の結合領域検索による特異性確認:付加したペプチドタグを用いたクロマチン免疫沈降を行い、高速シークエンサーを用いた網羅的解析により、GFAPプロモーター以外への結合状況を検討する。導入した2種類のジンクフィンガーDNMT3Lの単量体の結合状況、2量体の結合状況を比較する。本年度にDNMT3L断片をDNA結合タンパク質TALEに付加した人工タンパク質の発現ベクターの設計を終了し、予備発現ベクターの合成までを終えた。次年度は、予備発現ベクターの性能検証を経て、発現ベクターの設計調整、合成を行う。得た発現ベクターの性能検証を行い、本研究のアイディアの妥当性を検討する。よって、次年度は、マウス胎児終脳を材料にした胎児神経幹細胞の初代培養、発現ベクターの導入、分子生物学的手法を用いた検討が必要である。そのための研究費として、本年度の残予算を充てる。具体的には、実験動物としてマウスが必要となり、初代培養に必要な培地、試薬、器具等も必要である。また、ベクターを作製する為に合成DNAやDNA組み換え用の試薬、大腸菌の培養に必要な試薬一式、ベクターDNA精製に用いる試薬類が必要である。解析手法として、クロマチン免疫沈降法、定量PCR法、bisulfite sequencing法、高速シークエンサーを用いた全ゲノム解析法を主に用いる。それらに要する試薬類、PCR primer類、抗体類、高速シークエンサー解析用試薬類を消耗品として必要とする。
ピエゾフィルムを用いた接着構造物の破壊予測モニタリングに関する基礎的研究

圧電高分子フィルムには、動的負荷に対する高出力電圧・出力電圧の線形性・寸法形状の柔軟性等の特長が挙げられ、電源および増幅アンプが不要なセンサとして利用できるメリットがある。そこで本研究では、接着接合部付近のひずみ分布をひずみゲージ及びPVDFフィルムで測定し、両者の比較を行った。また、PVDFフィルム貼付用の接着剤としてエポキシ系接着剤と導電性接着剤を取り上げ、測定精度に及ぼす影響を調べた。本研究では、ひずみゲージに替わるセンサとして圧電高分子材料(ピエゾフィルム)を利用し、接着接合体のひずみ測定およびモニタリング方法の構築を試みた。今年度は第一段階として、接着接合部付近にピエゾフィルムを貼り付け、市販のひずみゲージと比較しながら、ひずみ測定の可能性を検証した。これまでに得られた知見を以下に示す。(1)ピエゾフィルムの出力電圧とひずみゲージによるひずみ値との間には良好な線形性が見られ、この特性を用いることでピエゾフィルムによる出力電圧からひずみ値の換算が可能であることがわかった。(2)ピエゾフィルムの出力電圧の大小は、その面積に依存する傾向がある。本研究の第二段階において、非常に小さな領域である接着層にピエゾフィルムを貼り付けることを鑑みると、この結果は好ましいものではない。しかしながらこの点については、補正係数などを用いることで対処できると考えている。(3)ピエゾフィルムの貼り付け方法として、エポキシ系接着剤と導電性接着剤の二種類を試したところ、エポキシ系接着剤の場合では、ひずみゲージで測定したひずみ分布に対して追従性がなく、ひずみ値にばらつきが見られた。一方、導電性接着剤を用いた場合では、ひずみゲージによる場合に対して、ひずみ分布の傾向が一致し、測定値のばらつきも小さくなることがわかった。このことから、導電性接着剤によるピエゾフィルムの貼り付けは測定精度の向上を期待できる。本提案研究はピエゾフィルムを用いて、構造物の安全性保持のためのひずみモニタリング技術を開発することが目標である。本研究の大きな特徴として、ピエゾフィルムをセンサとして利用し、これを接着構造物に適用するところにある。圧電材料は自己発生電圧が高く、電源および増幅アンプを必要としない。そのため、安価で手軽なセンサとして多箇所に取り付け、安全性確保のための破壊予測モニタリングが可能になると考えられる。具体的方法として、突き合わせ接着継手試験片を製作し、これに周期的な荷重を作用させ、接着接合部付近のひずみ分布をひずみゲージで測定するとともに、貼付された両面電極付PVDFフィルムの出力電圧を測定する。その後、定式化されたPVDFフィルムのひずみ解析式より、出力電圧からひずみに換算し、ふたつの手法によるひずみ分布を比較することで、本手法の接合問題への適用可能性を検証する。くわえて、PVDFフィルム貼付用の接着剤としてエポキシ系接着剤と導電性接着剤を取り上げ、測定精度に及ぼす影響を調べた。その結果、応力勾配を有する接着接合界面近傍において、本手法による定性的なひずみ分布測定の可能性を確認した。また、PVDFフィルムの貼り付けに導電性接着剤を用いることで測定精度が向上することがわかった。現段階では、接着層近傍における被着体のひずみ測定に留まっているが、最終的にはPVDFフィルムの特性を活かし、そのサイズを可能な限り小さくすることで接着層内部のひずみ測定を実現できると考えられる。そのための方策として、アクリル系接着剤を用いて固形アクリル樹脂を被着体に接合することにより、ある程度の厚さをもつ擬似接着層を設定し、これを徐々に薄くしていくことで実用接着層厚さレベルでのひずみ測定に対応させたいと考えている。
水素化反応をグリーン化する有機・金属複合型ヒドリド錯体の創成

分子内での含金属環化反応は,補酵素NADHのような有機ヒドリド化学の発展に寄与する。本研究では,カルボニル及びナフチリジン誘導体(pynpまたはpaa)の両方を含むルテニウム錯体系を創成した。両錯体の酸化還元特性を検討した後,pynp錯体の化学的還元反応を行った。その結果,従来の金属ヒドリドに加え,含金属環化反応に基づく有機ヒドリドが形成した。一方,対応するpaa錯体では同一分子内に金属ヒドリドと有機ヒドリドを含む“ハイブリッド"ヒドリド化合物が生成した。このハイブリッド・ヒドリド錯体から有機基質へのヒドリド移動を確認した。金属カルボニルは結合様式が多様なため,有機金属化学分野で最も重要な化合物の一つである。金属カルボニル中の金属ー炭素結合は還元により開裂することが多い。それ故,金属錯体中の配位圏の制御により金属ーCO結合を安定化することは重要な研究課題である。これまでの研究に基づけば,錯体の還元に伴う分子内環化により結合開裂を防ぐことが期待できるが,環化反応を起こすには非結合性窒素原子を含む有機配位子およびカルボニル2分子を導入することが必要とされる。そこで本研究では,有機配位子として二座のナフチリジンを導入したルテニウム錯体を創成した。原料の塩化ルテニウムからカルボニルポリマーを経て,中性錯体の合成に成功した。しかし,溶解度や還元電位の問題から,さらにパイ電子受容性の中性補助配位子(トリフェニルホスフィンおよびピリジン)を導入し,新規に二種の錯体系を構築した。いずれも各種分光分析ならびにX線構造解析により,目的の構造をとることが確認できた。ホスフィン錯体は-0.93 V,ピリジン錯体は-1.18 Vで還元を受け,従前の錯体に比べて非常に還元されやすいことが明らかとなった。ホスフィン錯体の酸化還元挙動を詳細に検討するため,分光電気化学測定を行ったところ,錯体の1電子還元に伴って分子内環化反応が可逆的に起こることが分かった。一方,還元剤を用いて錯体を化学的に還元し,還元体を単離・同定したところ,2種類の還元生成物を確認した。1つは金属ヒドリド錯体,もう1つは有機配位子部位が水素化した有機ヒドリド錯体であった。現在,これら2種の還元生成種を選択的に合成する経路を探索中である。本研究では,金属環化反応に誘起された有機ヒドリド化合物の生成を見出した。このような金属環化反応を用いた有機ヒドリド合成戦略は,補酵素NADHのような有機ヒドリド化学の発展に寄与することが期待される。金属錯体上でのヒドリド部位の形成は,均一系水素化,ヒドロホルミル化などの反応で重要な役割を果たすだけでなく,生体反応系のモデル化合物としても有用である。生体反応において電子伝達等の機能を司る補酵素NADモデルにより近づけるには,配位子上のピリジン窒素と炭素原子との結合生成に伴う水素化反応を達成する必要がある。前年度までに,2つのカルボニル配位子を有するルテニウム錯体において,支持配位子として用いた酸化還元活性な二座ナフチリジンの1電子還元に伴う可逆的な分子内環化反応を達成した。しかし,単離目的でこの錯体を化学的に還元すると,一方のカルボニルが解離してしまい,有機ヒドリド部位をもつメタラサイクル化合物を得ることはできない。そこで今年度においては,所望の有機ヒドリド化合物を選択的に得るための合成経路を開拓することを目的として研究を実施した。最初に一方のカルボニル配位子をメトキシドイオンで保護し,その後,還元剤である水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元を行った。各種分光測定ならびに単結晶X線構造解析から,カルボニル基の保護,脱保護が有効に機能し,結果的に分子内環化反応に伴うメタラサイクル形成が確認された。得られたメタラサイクル化合物は,配位子の還元に駆動された窒素ー炭素結合形成に伴い,有機配位子中の炭素原子が水素化されることを確認した。しかし,形成された有機ヒドリドは化学的に安定であることが判明し,基質へのヒドリド供与能が低いことが実験的に明らかとなった。今後,NADモデル化合物として有用な化合物群を構築するため,今回得られた知見を基盤として,電子的ならびに立体的な変更を加えた化合物の創成を試みる。本研究では,目的とするヒドリド錯体系を構築するため,支持配位子に酸化還元活性な二座ナフチリジン誘導体,二量化を防ぐ嵩高い軸配位子としてトリフェニルホスフィン,さらに強いパイ電子受容性をもつカルボニルからなるルテニウム錯体を創成した。研究1年目には上記目的錯体系の合成法を確立し,所望の分子構造であることを各種分光分析やX線構造解析で確認した。さらに分光電気化学測定により,錯体の1電子還元及び再酸化に伴い分子内環化反応が可逆的に起こることが分かった。一方,還元剤を用いて錯体を化学的に還元すると,2種類の還元生成物(金属ヒドリド錯体及び有機ヒドリド錯体)が確認された。この成果を踏まえ,研究2年目にはより有用な有機ヒドリド錯体を選択的に合成するため,カルボニル配位子の保護・脱保護という有機化学的手法を導入した。その結果,分子内環化反応に伴い有機配位子ナフチリジン中の炭素原子が水素化された。

しかし,形成した有機ヒドリド錯体中のヒドリド部位は化学的に安定であり,基質への水素供与能に乏しいことが明らかになった。そこで研究最終年度(本年度)は,上記の欠点を克服するために支持配位子(ナフチリジン誘導体)の電子的・立体的な見直しを行った。新規の錯体系は従来の錯体系と同様の分子構造であること,及び錯体の1電子酸化還元に伴う可逆的分子内環化反応が起こることを確認した。さらに,錯体の化学的還元反応生成物は,同一分子内に金属ヒドリド部位と有機ヒドリド部位の両方を含む“ハイブリッド"ヒドリド錯体であった。得られたハイブリッド錯体から基質(アクリジニウム)への水素供与実験を行い,基質への水素移動が起こることを明らかにした。以上の研究を通じて,金属錯体上から有機基質への水素移動反応が確認できた。本研究成果は,真に“グリーン"な水素化反応に発展する可能性をもつものと期待できる。分子内での含金属環化反応は,補酵素NADHのような有機ヒドリド化学の発展に寄与する。本研究では,カルボニル及びナフチリジン誘導体(pynpまたはpaa)の両方を含むルテニウム錯体系を創成した。両錯体の酸化還元特性を検討した後,pynp錯体の化学的還元反応を行った。その結果,従来の金属ヒドリドに加え,含金属環化反応に基づく有機ヒドリドが形成した。一方,対応するpaa錯体では同一分子内に金属ヒドリドと有機ヒドリドを含む“ハイブリッド"ヒドリド化合物が生成した。このハイブリッド・ヒドリド錯体から有機基質へのヒドリド移動を確認した。当初の計画に比べて達成度がやや遅れている原因として,以下の点が挙げられる。1.酸化還元反応を測定する際,分光電気化学的手法を用いることを予定していたが,分光測定用の光学セルが年度内に納品されず,結果的に実験が実施できなかった。2.構造解析用の単結晶の作製および解析に時間を要した。3.反応生成物の単離が予想以上に難しかった。無機化学これまでの研究において,反応の最適条件がほぼ見出されたことから,次年度はこの条件を用いることで,研究の効率化が図られると考えられる。当初の計画に比べて達成度がやや遅れた要因としては,以下の点が挙げられる。1.原料の輸入に想定以上の時間を要したため,支持配位子の合成が遅れた。2.本研究で用いる支持配位子が非対称構造であるため,錯体として組み上げた際に立体異性体が多く存在し,異性体の分離や精製を含めた合成経路の確立に時間を要した。3.構造解析に適した単結晶の作製が困難を極めた。当該年度に使用する計画で分光電気化学測定用光学セルを発注したが,年度内に納品されなかったため残額が生じた。加えて,当初計画で計上していた学会参加旅費の一部が所属大学の校費から支出されたため,次年度使用額が生じることとなった。これまでに創成した金属錯体の問題点(安定性および異性体数)を改善するため,従来用いてきた単座配位子に代えて,より安定かつ対称的な構造を有する二座配位子を新たに導入する。これにより,反応効率の向上ならびに合成経路の短縮を図ることが可能となり,より一層の進展が期待できる。生じた次年度使用額は,納品されなかった分光電気化学測定用光学セルの購入に充てることで,本研究のより一層の推進を図る。当初計画では学会発表に係る旅費を計上していたが,旅費について所属大学から支出されたことにより,次年度使用額が生じる結果となった。生じた次年度使用額は,物品費(消耗品費)に充当することにより,当該研究の推進を図る。
免疫チェックポイント分子に着目した薬剤性肺傷害発症機序の解析

上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤や免疫チェックポイント阻害剤は、時に致死的な薬剤性肺傷害を発症するが、その機序は不明である。以前我々は薬剤性肺傷害症例の気管支肺胞洗浄液をフローサイトメトリー解析し、免役チェックポイント分子を高発現したリンパ球が増加していることを報告した。肺傷害の重要な責任細胞である可能性があり、動物モデルを用いた解析を計画した。マウスナフタレン肺傷害モデルに上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を併用する薬剤性肺傷害モデルを用いて、気管支肺胞洗浄液や肺組織について免役チェックポイント分子に着目した解析を行い、薬剤性肺傷害発症機序の一端について解明を目指す。
多元的構造生物学アプローチによるプロテアソーム形成機構の解明と創薬への展開

本年度は、プロテアソームの触媒コア粒子を構成するαリング形成中間体に着目した。これまでのプロテアソームの形成中間体の構造研究は、主に酵母を中心に行われてきたが、本研究では創薬への展開を目的として、ヒト由来のものを対象とした。その結果、ヒトプロテアソームのαリングを構成するαサブユニットのうち、α1-α6は単量体と2量体の平衡で存在するのに対して、α7のみがホモ7量体のリング構造が2つ重なったホモ14量体構造を形成することを見出した。また、α7ホモ14量体構造の立体構造情報に基づいた分子設計を通じて、単量体およびシングルリングの構造を安定化させたα7形成中間体を創成した。これにより、αリング形成中間体の精密な構造機能解析が可能となった。次に、上記のプロセスを通じて創出したα1-α7のプロテアソーム形成中間体とアッセンブリーシャペロンのin vitro相互作用解析を行なった。その結果、ヒトPAC3/PAC4ヘテロ2量体は隣り合うα4-α5-α6の相互作用を介助することが明らかとなり、それら3つのサブユニットが正しく配置することを促すマッチメーカーとして働いているものと考察された。さらに、構造情報を活用したin silico創薬研究を行うことを目的として、ヒトPAC3の結晶構造解析およびNMR解析を行った。その結果、0.96オングストロームの超高分解能でその結晶構造を決定することに成功した。またNMR解析により、α6サブユニットの結合部位と予想されるループ構造が柔軟な構造をとることを明らかにした。これにより、in silicoドラッグスクリーニングを行ううえで、シャペロン分子の構造ダイナミクスを十分に考慮する必要があることが明らかとなった。以上の研究を通じて、プロテアソームアッセンブリー系を標的とする阻害剤設計に重要な知見を得ることが出来た。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。初年度前半は、真核生物のプロテアソームアッセンブリーシャペロンの古細菌ホモログ分子をモデル系として、分子集合の計測手法の方法論を磨き上げた。超分子質量分析により、古細菌ホモログPbaAはホモ5量体を形成しているが、その結合パートナータンパク質PF0014との相互作用することにより10:10のヘテロ20量体を形成することを見出した。さらに、電子顕微鏡解析により本複合体の立体構造を明らかにした。一方、金沢大学との共同研究を通じて、古細菌のアッセンブリーシャペロンホモログPbaBと古細菌プロテアソームの高速原子間力顕微鏡(AFM)解析を行い、分子集合過程のダイナミクスを追跡するための基盤を整えることができた。次に、ヒトプロテアソームの中核的な構成要素であるαリングをターゲットとしてその形成過程を探査した。αリングはα1α7の7種類の異なるサブユニットから成るヘテロ7量体であり、アッセンブリーシャペロンPAC1PAC4がその集合過程に関与している。そこで、これら構成コンポーネントとシャペロンを組換えタンパク質として調製することを試み、全コンポーネントの発現・精製法を確立することに成功した。次に、これらを用いて、超分子質量分析によりサブユニット形成中間体の同定と構造解析を試みた。その結果、α7単独ではホモ14量体の二重リング構造を形成するが、これにα6を加えることによって二重リング構造が解体され、7つのα7と1つのα6からなるヘテロ8量体が形成されることが明らかとなった。すなわち、プロテアソームの形成は、非天然型のサブユニット集合体の生成と、これが他のサブユニットとの相互作用を通じて崩壊するスクラップ・アンド・ビルドの過程を含むことが示唆された。真核生物のプロテアソームは33種類66個ものサブユニットから構成されており、その形成はアッセンブリーシャペロンが一過的に関与するダイナミックなプロセスである。初年度にαリングを構成する全サブユニットと関連シャペロンの発現・精製条件を完備するとともに、超分子質量分析、結晶構造解析、電顕解析などの構造解析手法を統合したことにより、活性中心を担うコア粒子の形成初期過程を探査する基盤を整えることができた。特に、金沢大学・内橋貴之博士のグループとの共同研究を通じて、当初の計画になかった高速AFM解析を用いた分子集合ダイナミクスの計測にも着手することができている。本年度に達成した重要な成果(プロテアソームの形成にスクラップ・アンド・ビルドの過程が存在し得ること)は、2015年末に論文公表している[Ishii et al. (2015)Sci. Rep. 5, 18167]。以上の成果を総合的に判断して極めて順調に研究は進展しているものと判断している。本年度は、αリングの形成過程の解明に向けてα7を起点としたαリング形成中間体の同定と構造解析を行った。本解析では、αリングの形成過程においてα7が他のサブユニットとどの様な複合体を形成し得るのかを明らかにするため、ホモ14量体形成能を欠失したα7変異体(α7*)を用いた。その結果、α7*はα1, 4, 6それぞれと複合体を形成すること、さらにはそれらをすべて含むα1-4-6-7*複合体を形成することを見出した。興味深いことに、ゲルろ過クロマトグラフィーや電子顕微鏡解析によってこれらの複合体はα7と同様の14量体構造を有することを示唆するに至った。

一方、古細菌のプロテアソーム集合シャペロンのホモログタンパク質に関しては、前年度までに明らかにしているX線結晶構造情報に基づく分子設計および改変を行うことにより、本タンパク質に新たにプロテアソーム結合能を賦与することに成功した。また、溶液散乱および高速AFMにより得られた改変体の構造のキャラクタライズを行った。さらに、アッセンブリーシャペロンを介したプロテアソーム形成中間体の相互作用メカニズムを明らかにすることを目的として、ヒトPAC4の結晶構造解析およびNMR解析を行った。その結果、1.90オングストロームの高分解能でその立体構造を決定することに成功し、PAC4を介したαリング形成中間体の複合体モデルを精度よく構築することが可能になった。これにより、プロテアソームアッセンブリー系を標的とする阻害剤設計に重要な手掛かりを与えることが出来た。本年度に達成した重要な成果(ヒトアッセンブリーシャペロンPAC4の結晶構造)は、2017年の5月に論文公表している[Kurimoto et al. (2017) Protein Sci. Rep. 5, 18167]。また、α7サブユニットを起点としたプロテアソーム形成中間体の同定に成功し、電子顕微鏡解析を実施することができた。以上の成果を総合的に判断して順調に研究は進展しているものと判断している。α7サブユニットを起点としたプロテアソーム形成中間体を対象として、X線結晶構造解析、電子顕微鏡解析、高速AFM解析を用いた多元的構造生物学的アプローチによる立体構造解析を行った。これにより、α6/α7およびα4/α7から形成される複合体はいずれも7量体のリングが2つ重なったヘテロ14量体構造を形成していることを見出した。また、高速AFMを用いたα7サブユニットのアッセンブリー過程の追跡観察により、αリングの形成中間体だと推測される複合体構造を捉えることに成功した。さらに、高速AFM解析によってα7ホモ14量体のα6サブユニットによる解体過程の可視化を試みた。その結果、α6によるα7の2重リングの解体は、2段階のプロセスを経ていることが明らかになった。また、超分子質量装置を用いた一連の相互作用解析を実施し、α6以外のサブユニットに関しても、α6と同様にα7ホモ14量体を解体する能力を有しているか否か検証した。その結果興味深いことに、α2、α4およびホモ14量体形成能を欠失したα7変異体もα7の2重リング構造を解体することが判明した。一方、アッセンブリーシャペロンの一つであるPAC3を対象として、その立体構造情報に基づくin silicoスクリーニングを行い、結合する低分子化合物を探索した。さらに、実際にその化合物がシャペロンとPAC3の複合体形成を阻害することを確認するとともに、NMRを用いてPAC3との相互作用解析に着手した。真核生物のプロテアソーム形成中間体のキャラクタライズに加えて、古細菌のプロテアソーム集合シャペロンのホモログタンパク質の機能改変を試みた。その結果、プロテアソーム活性能を賦与した人工タンパク質を創成することに成功した。また、クライオ電子顕微鏡解析によって、本シャペロン様タンパク質はパートナータンパク質との複合体形成に伴い、特徴的なカゴ状構造を形成することを見出した。以上の結果を総合的に判断して、順調に研究は進展していると考えている。