hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔マイコプラズマによるTならびにBリンパ球の活性化

1.エイズ関連マイコプラズマが細胞膜結合性のホスファチジルコリンならびにホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼCを有することを明らかにした。ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼCは免疫学的に重要な役割を果たしているCD14あるいはFcレセプターなどのGPIアンカー型の膜タンパク質を細胞膜から切り離すことが知られている。このような理由から、エイズ関連マイコプラズマは免疫抑制状態を誘導できるのではないかと考えられる。2.口腔ならびにエイズ関連マイコプラズマがコンカナバリンAによって誘導されるTリンパ球のアポトーシスを加速し、また、本活性にはTNF-αが重要な役割を果たしているを明らかにした。3.口腔マイコプラズマが歯肉線維芽細胞に炎症性サイトカインであるIL-6ならびにIL-8を誘導し、また、その誘導メカニズムはグラム陰性菌のLPSのそれとは異なることを明らかにした。本知見は口腔マイコプラズマの歯周疾患における病因的役割の一端を解明したものと思われる。我々は、Mycoplasma fermentans(Mf)ならびにM.salivarium(Ms)の細胞膜がコンカナバリンA(Con A)によるT細胞の活性化を阻害することを明かにした。本研究では、そのメカニズムを明かにすることを目的とした。Mf IID 812ならびにMs ATCC23064細胞を超音波処理することにより細胞膜画分を調製した。6-9週令の雄のddyマウスの脾臓細胞をナイロンウ-ルカラムにかけ、その素通した細胞をマウス脾臓T細胞(Tms)とした。5x10^5個のTmsをCon A添加RPMI1640培地(10%FBS含有)0.2mlで48時間培養した後、0.05μCiの^3H-thymidine(TT)でパルスした。さらに、18時間培養した後、細胞に取り込まれた放射能を液体シンチレーションカウンターで定量した。Con AによるTmsの活性化のCon A濃度依存性を詳細に調べたところ、TT取り込み活性(TT活性)は、5x10^5個のTmsに対して約1.0μgのCon A刺激で最大に達し、それ以上の濃度では急激に減少した。Tmsの死細胞の増加並びに染色体DNAの断片化により、この急激な減少はTmsのアポトーシスによることがわかった。さらに、この系にMsあるいはMf細胞膜を共存させると、Tmsのアポトーシスが加速されることがわかった。以上のことから、Con AによるT細胞の活性化は両マイコプラズマ(M)細胞膜により阻害されたのではなく、Con Aによって誘導されたTmsのアポトーシスが両M細胞膜によって加速されたものであることがわかった。両M細胞膜の有する本活性(アポトーシス促進活性)はTMFα抗体で有意に阻害された。さらに、TmsをM細胞膜で刺激することにより、TNFαが産生されることがELISA法で確認された。したがって、両M細胞膜の有するアポトーシス促進活性には、M細胞膜刺激によりTmsから産生されたTNFαが重要な役割を果たしているものと推測された。我々は下記のことを明らかにした。1.口腔ならびにエイズ関連マイコプラズマがマウス脾臓由来T細胞に対してmitogen活性を有していた。3.口腔マイコプラズマが歯肉線維芽細胞に炎症性サイトカインであるIL-6ならびにIL-8を誘導し、また、その誘導メカニズムはグラフ陰性菌のLPSのそれとは異なることを明らかにした。
分子生物学・構造生物学を基盤とした植物ネクローシスに関する研究

植物ネクローシスの誘導活性を有する低分子化合物として、アサから2種のカンナビノイドの同定に成功した。併せて、植物ネクローシスの誘導に関与することが推定されているシクロフィリンD(CYD)と電位依存性アニオンチャンネル(VDAC)の遺伝子クローニング及びその発現に成功した。VDACについては、VDAC抗体を作製にも成功した。動物のVDAC抗体は、動物ネクローシスを阻害することが報告されているが、上記の抗体は植物ネクローシスを阻害しないことが判明した。本年度は、植物ネクローシスを制御する因子であるCYDおよびVDACの同定を目的として、様々な検討を行った。まず、植物のネクローシスの性質に関して、詳細な検討を行った結果、THCAのみならずCBCA、CBDA、CBGAなどのカンナビノイドに強いネクローシス誘導活性があることを確認した。これに対してTHCAの脱炭酸体であるTHCやカンナビノイドの構成ユニットであるオリベトール酸などにはネクローシス誘導活性はきわめて弱いことから、酸性カンナビノイド骨格がネクローシス誘導因子として、重要であることを発見した(Plant Sinahng&Behaviorに発表)。これらの結果は、CYDやVDACなどに酸性カンナビノイド結合部位が存在するものと推察された。そこでCYDやVDACを同定するために、カンナビノイドをリガンドとするアフィニティ担体を調製し、CYDとVDACの精製を試みている。具体的には、タバコ培養細胞からミトコンドリアを単離し、粗タンパク液を調製した。これを上記の担体を充填したカラムに付し、吸着したタンパク質の解析を現在行っている。CYDとVDACが確認でき次第、本因子の抗体を調製する計画である。これらの実験とともに、また、タバコ培養細胞を用いて、CYDおよびVDACの遺伝子クローニングを検討した。この結果、いくつかの遺伝子のクローニングに成功したので、現在、これらの発現実験を試みている。現在発現系として、大腸菌を用いているが、発現量が少ないために、酵母や昆虫細胞を用いた:系の構築も併せて進めている。本年度は、ネクローシスを引き起こすのに重要な機能を有するCYD及びVDACのモノクローナル抗体の作成を検討した。前年度では、各種酸性カンナビノイドが、mitochondrial permeability transitionを経由して、植物ネクローシスを誘導することを明らかした。さらにこの結果を基に、CYDおよびVDACを精製するために、カンナビノイド結合アフィニティークロマトグラフィーを作成し、これを用いてタバコ培養細胞から上記の2因子の同定を検討したが、目的とするタンパクの検出には至らなかった。そこで、それぞれの因子をコードする遺伝子のクローニングを行い、それらの発現系の構築を検討した。まず、大腸菌を用いて両遺伝子の発現を試みた結果、不活性型のinclusionbodyとして大量に発現することが判明した。抗体を作成するためには、活性型のタンパクを用いなくてもよいケースが報告されているので、上記の不活性型タンパク質を抗原として、マウスに免疫を行っている。抗体価の上昇が確認でき次第、モノクローナル抗体の作成を行う計画である。また、CYD及びVDACの性質を詳細に解析するために、酵母や昆虫細胞を用いて、活性型の組み換え酵素の発現を行ったが、目的を達成するには至らなかった。そこで、現在カイコを用いて活性化組み換えタンパク質の発現を検討している。また、CYDおよびVDACと推察される遺伝子のクローニングに成功したことから、RNA干渉法を用いて両酵素を阻害する計画である。このために、形質転換植物の作成系の条件検討を現在行っている。CYD(cyclophilin D)やVDACはネクローシスに関与する重要な因子であり、ともにミトコンドリアにおいて発現していることが知られている。動物細胞においては、両タンパク質の性質は詳細に解析されているが、植物のCYDやVDACについては極めて研究が遅れているのが現状である。本年度は両因子の生化学的性質および植物生理学的機能の解明を検討した。前年度にクローニングしたタバコCYD及びVDACの性質を詳細に解析するために、本年度は、カイコを用いて、活性型の組み換えタンパク質の発現を行った。この結果、CYD及びVDACの発現には成功したが、大量調製法を確立するには至らなかった。そこで、大腸菌を用いた大量発現系の構築を再検討した。種々の条件を詳細に検討したところ、可能性画分に両タンパク質を大量に発現させることに成功した。CYDはプロイルイソメラーゼ活性を有することが知られているので、組換えタンパクの酵素活性を測定した結果、本酵素活性を確認することに成功した。タバコにおいてCYDの発現を抑えるために、現在RNA干渉法に使用するベクターの作成を行っている。また、本年度はVDACのモノクローナル抗体を作成するために、本タンパク質をマウスに対して免疫を行った。抗体価の上昇がみられたので、脾臓を取り出し、ミエローマとの融合を行った。現在、抗VDAC抗体を発現している株の選抜を行っている。また、CYDのについても、モノクロナール抗体を作成するために、免疫を検討している。
プロテアソームの形態制御によるユビキチン融合遺伝子導入樹状細胞癌ワクチンの新戦略

樹状細胞(DC)成熟化に伴い「構成型」から「免疫型」へのプロテアソームが形態変化をおこす。プロテアソームは腫瘍抗原をペプチドに分解し、HLAとともに抗原提示する役割があるが、プロテアソームの違いによる成熟DCと腫瘍細胞の両者でのペプチド-HLA Class I複合体の不一致を解消することで, DCワクチンによって効率的な抗腫瘍免疫を誘導できる可能性がある。これらの事象を証明するため、膵癌の腫瘍抗原であるMesothelinと抗原のプロテアソームによる分解シグナルであるユビキチンの融合遺伝子導入したDCを用いた抗腫瘍免疫の基礎的研究を行った。腫瘍細胞が構成型プロテアソームによる腫瘍抗原のdegradationを行うのに対して、抗原提示細胞であるDCでは成熟化に伴い構成型から免疫型プロテアソームへ構造変化が生じるため、同一の腫瘍抗原でもdegradationの結果、異なったペプチド断片が作成され、ペプチドHLA-ClassI複合体の不一致が腫瘍細胞とDC間で生じる。腫瘍抗原遺伝子導入樹状細胞ワクチンの治療戦略において、この不一致を解消するため、成熟化に伴う樹状細胞内プロテアソームの構成型から免疫型への構造変化を阻害することで、抗腫瘍免疫を最適化することを目的とする。本年度は昨年度に作成した抗原の分解シグナルであるユビキチン遺伝子と膵癌の腫瘍関連抗原であるmesothelinの融合遺伝子導入樹状細胞により、mesothelinのdegradationと抗原提示が促進されるものの、膵癌細胞株を標的とした細胞傷害活性の増強には至らないことがわかった。そこで、今後の戦略として構成型プロテアソームのサブユニットX(β5),Y(β1),Z(β2)が免疫プロテアソームサブユニットLMP7(β5i),LMP2(β1i),MECL-1(β2i)へ構造変化することを抑制するsiRNAを作製し,未熟DCにtransfectionしたのち成熟化し、樹状細胞の免疫プロテアソームへの構造変化を阻害することで、Ub-mesothelin融合遺伝子導入樹状細胞がmesothlein抗原提示を促進するのみならず、膵癌細胞株に対する細胞傷害活性を増強することを証明する。昨年度は抗原の分解シグナルであるユビキチン遺伝子と膵癌の腫瘍関連抗原であるmesothelinの融合遺伝子導入樹状細胞を作成し、本年度は昨年度に作成した抗原の分解シグナルであるユビキチン遺伝子と膵癌の腫瘍関連抗原であるmesothelinの融合遺伝子導入樹状細胞により、mesothelinのdegradationと抗原提示が促進されるものの、膵癌細胞株を標的とした細胞傷害活性の増強には至らないことがわかった。次年度、構成型プロテアソームから免疫プロテアソームへの構造変化を抑制するsiRNAを用いて、Ub-mesothelin融合遺伝子導入樹状細胞がmesothlein抗原提示を促進するのみならず、膵癌細胞株に対する細胞傷害活性を増強することを証明するにあたって、概ね順調に進展していると考える。初年度及び次年度にかけて、アデノウイルスベクターを用いて膵癌腫瘍抗原であるmesothelinを遺伝子導入した樹状細胞を用いて、MSLN特異的CTLの誘導に成功した。また、抗原の分解シグナルであるユビキチン遺伝子(Ub)と膵癌の腫瘍関連抗原であるMSLNの融合遺伝子を作成した。本年度(最終年度)は、Ub-MSLN融合遺伝子導入樹状細胞により、MSLNのdegradationと抗原提示が促進されることを確認した。Ub-MSLN融合遺伝子導入樹状細胞を用いた、膵癌細胞株を標的にした細胞傷害活性解析では、MSLN単独の遺伝子導入樹状細胞を用いた場合と比較して、Ub-MSLN融合遺伝子導入樹状細胞による細胞傷害活性の増強効果は得られなかった。Ub修飾による抗腫瘍効果の増強が限定的であった理由としは、腫瘍細胞が構成型プロテアソームによる腫瘍抗原のdegradationを行うのに対して、抗原提示細胞である樹状細胞では成熟化に伴い構成型から免疫型プロテアソームへ構造変化が生じるため、同一の腫瘍抗原を用いてもdegradationの結果、異なったペプチド断片が作成され、ペプチドHLA-ClassI複合体の不一致が腫瘍細胞とDC間で生じることが挙げられる。したがって今後の腫瘍抗原遺伝子導入樹状細胞ワクチンの治療戦略において、この不一致を解消するため、成熟化に伴う樹状細胞内プロテアソームの構成型から免疫型への構造変化を阻害することで、抗腫瘍免疫を最適化する。具体的には構成型プロテアソームのサブユニットから免疫プロテアソームサブユニットへの構造変化を抑制するsiRNAを作成し、プロテアソームの構造変化を阻害することで、Ub-MSLN融合遺伝子導入樹状細胞がMSLN抗原提示を促進するのみならず、膵癌細胞株に対する細胞傷害活性を増強することを証明する。本研究ではユビキチン(Ub)と腫瘍関連抗原の融合遺伝子を作成し,その腫瘍抗原提示能力を最大限に発揮させるため,樹状細胞(DC)成熟化に伴うプロテアソームの形態変化の観点から,DC成熟化に伴う「構成型」

→「免疫型」へのプロテアソーム形態変化を阻害し,構成型プロテアソームを発現する成熟DCを誘導することで,プロテアソームの形態変化による成熟DCと腫瘍細胞の両者でのペプチド-HLA Class I複合体の不一致を解消することで,これまで研究を進めてきたUb-TAA融合遺伝子導入DCによる効率的な抗腫瘍免疫を誘導することを目的とする。本年度はユビキチン遺伝子のクローニングを行い,膵癌の腫瘍抗原関連遺伝子であるmesothelin遺伝子との融合遺伝子の作成にも成功し,DCにおける融合遺伝子の蛋白発現の特徴もつかめたことから,次年度以降のプロテアソームの形態変化の違いによるDCワクチンの抗腫瘍効果の増強について研究していくにあたって,おおむね順調に研究が進展しているといえる。本年度は昨年度に作成した抗原の分解シグナルであるユビキチン遺伝子と膵癌の腫瘍関連抗原であるmesothelinの融合遺伝子導入樹状細胞により、mesothelinのdegradationと抗原提示が促進されるものの、膵癌細胞株を標的とした細胞傷害活性の増強には至らないことがわかった。そこで、今後の戦略として構成型プロテアソームのサブユニットX(β5),Y(β1),Z(β2)が免疫プロテアソームサブユニットLMP7(β5i),LMP2(β1i),MECL-1(β2i)へ構造変化することを抑制するsiRNAを作製し,未熟DCにtransfectionしたのち成熟化し、樹状細胞の免疫プロテアソームへの構造変化を阻害することで、Ub-mesothelin融合遺伝子導入樹状細胞がmesothlein抗原提示を促進するのみならず、膵癌細胞株に対する細胞傷害活性を増強することを証明する。膵癌免疫療法Ub-プロテアソーム経路によるmesothelinのペプチドへの分解亢進及び構成型プロテアソーム発現成熟DCによる'適切'な抗原提示を実現することで,DCワクチンにおける最も効率的な抗腫瘍免疫の誘導方法を開発するため,今後の研究において明らかにする点は,次の仮説1及び仮説2である。(仮説1) DCの成熟化に伴う構成型から免疫型へのプロテアソームの形態変化をsiRNAを用いて阻害し,成熟DCにおいても腫瘍細胞と同じ構成型プロテアソームを発現させることで,成熟DCと腫瘍細胞で提示されるTAA由来ペプチドの不一致を解消できる。(仮説2)免疫型プロテアソームへの形態変化を阻害した成熟DCにUb-MSLN融合遺伝子を導入することで,MSLN単独の遺伝子導入DCを用いた場合と比較してより効率的にCTLが誘導可能であり,強い抗腫瘍免疫を発揮することができる。仮説1を証明するため,構成型プロテアソームのサブユニットX(β5),Y(β1),Z(β2)がLMP7(β5i),LMP2(β1i),MECL-1(β2i)にそれぞれ入れ替わり,免疫プロテアソームが形成されるため,個々のサブユニットのsiRNAを作製し,免疫プロテアソームへの形態変化を阻害することを確認する。
組合せ理論と群表現論に基づく大規模システムの構造解析手法の研究

1.大規模方程式(あるいはその係数行列)の分解に関して代表者が提案したマトロイド理論的構造解析手法(CCF分解)をプログラム化し,国際的に標準とされるテスト問題(約30組)に適用した.その結果,つぎのような知見が得られた.(1)化学プラントや経済モデルを記述する方程式系は,CCF分解によって細かな階層的部分問題に分解される.(2)連続場を記述する偏微分方程式の離散化から生じる方程式系は(非対称行列であってもほとんどの場合)CCF分解によって分解されない.(3)CCF分解の実際的な有効性を高めるためには,部分問題間の半順序構造を厳密に実現することを放棄して,変換行列の疎性を保つようにすべきである.2.ランダムな初期不整を含む材料や構造物の強度を解析するための統計理論を提案した.これは,群論的分岐理論の枠組みを不整ベクトルの項を付加することによって幾分拡張した理論であり,ランダム不整に起因する強度の確率分布を与えるものである.この理論を,対称性の群が,二面体群,2次直交群,2次直交群の直積,の各場合について考察し,それぞれの場合の確率分布を導いた.この手法を,砂,粘土,コンクリート,シェル,トラスなどに適用して実験値と比較した結果,実験で観察される強度分布をきわめてよく説明できることが確認された.1.大規模方程式(あるいはその係数行列)の分解に関して代表者が提案したマトロイド理論的構造解析手法(CCF分解)をプログラム化し,国際的に標準とされるテスト問題(約30組)に適用した.その結果,つぎのような知見が得られた.(1)化学プラントや経済モデルを記述する方程式系は,CCF分解によって細かな階層的部分問題に分解される.(2)連続場を記述する偏微分方程式の離散化から生じる方程式系は(非対称行列であってもほとんどの場合)CCF分解によって分解されない.(3)CCF分解の実際的な有効性を高めるためには,部分問題間の半順序構造を厳密に実現することを放棄して,変換行列の疎性を保つようにすべきである.2.ランダムな初期不整を含む材料や構造物の強度を解析するための統計理論を提案した.これは,群論的分岐理論の枠組みを不整ベクトルの項を付加することによって幾分拡張した理論であり,ランダム不整に起因する強度の確率分布を与えるものである.この理論を,対称性の群が,二面体群,2次直交群,2次直交群の直積,の各場合について考察し,それぞれの場合の確率分布を導いた.この手法を,砂,粘土,コンクリート,シェル,トラスなどに適用して実験値と比較した結果,実験で観察される強度分布をきわめてよく説明できることが確認された.
帯電液滴による高密度空間電荷形成と気中放電に関する研究

本研究はエアレスノズルから噴出させた液滴を誘導帯電により帯電させ、帯電液滴で形成する空間電荷雲内で放電を起こさせることを目的としている。平成4年度は4本のエアレスノズルを用いて2.6μC/m^3の空間電荷密度を実現し、電荷雲の中心にエアシリンダにより接地針電極を挿入させて、針電極先端で5mm程度進展するコロナストリーマ放電を起こさせた。平成5年度はさらに大きな放電を実現するための基礎研究として、高い比電荷を有する帯電液滴を生成することおよび高密度に空間電荷雲を形成させるために噴出させた液滴の帯電法について検討を行った。エアレスノズルとしては4年度は噴出角90°の空円錐ノズルを使用したが、帯電液滴の誘導電極への回り込みを極力防ぐために、噴出角60°のノズルを採用し、噴出量も13g/sまでの特性を得られるように5種類のノズルについて特性を測定した。誘導リング電極の大きさを直径30mm、ノズル-リング間距離を3mmに設定して各ノズルから噴出する液滴の帯電量を測定した。噴出流量が大きくなるにしたがって液滴の全電荷量は増加するが、液滴の単位質量あたりの電荷量(比電荷量)は流電の増加に比例せず、帯電効率が悪くなる傾向を示す。この帯電効率は誘導リング電極と液滴分裂点の位置関係に大きく依存するので、ノズル近傍の粒度分布をレーザ粒度計で測定し、粒度の変化から分裂点位置を求めた。大きな流量のノズルでは分裂点距離は長くなり、誘導電極の位置を正確に分裂点位置に合わせることが重要であることが判明した。大流量ノズルを利用して空間電荷雲を形成し、その中に設置した気中ギャップの放電電圧と火花の遅れ時間を調べた結果、帯電液滴の極性によって火花電圧が大きく変化することが明らかになった。本研究の目的は帯電粒子雲と金属電極との間、あるいはそれぞれ逆極性に帯電した粒子雲間の放電を実現することであり、今年度はこのような放電を制御された状態で再現させる方法を検討した。まず第一に、高い電荷量を有する液滴からなる空間電荷雲を形成させる方法を検討した。液滴生成には取扱が容易なエアレスノズルを使用し、ノズル先端部に取り付けた誘導帯電電極により、液滴を帯電させる方法を採用した。電動ポンプを用いて13MPaまで加圧された水道水をノズルから噴出する。使用したノズルを用いて生成できる液滴の平均粒径は50μmである。液滴に分裂する位置の近傍にリング状の誘導帯電電極を配置して、電極への印加電圧およびその位置を変えることにより、液滴の持つ電荷量を適宜変えることができ、所定の電荷密度を有する空間電荷雲を形成できる。本研究では最大空間電荷密度を1μC/m^3まで達成できた。使用するノズルを選択することにより、さらに高い電荷密度の電荷雲を形成できることも明らかになった。4本のエアレスノズルを用いたとき、2.6μC/m^3の空間電荷密度が実現できた。空間電荷と電極との間の放電の形成を確認するために、噴出帯電液滴を直径1m、高さ2mの円筒電極内に閉じ込めた状態で、接地円筒の外から空間電荷雲中心に向けて接地針電極を1m/sの速度で挿入した。挿入時の電極先端部をイメージインテンシファイアで観察した結果、微弱な発光を伴うストリーマコロナ放電が起きていることがわかった。また、放電電流の測定からは金属電極針対平板間で生じるコロナ放電と、本研究の空間電荷と針電極で得られた放電とはその特性が異なることが明らかになった。今後、さらに電荷密度を大きくした空間電荷雲を用いて放電特性を調べることの有用性を証明した。本研究はエアレスノズルから噴出させた液滴を誘導帯電により帯電させ、帯適液滴で形成する空間電荷雲内で放電を起こさせることを目的としている。

平成4年度は4本のエアレスノズルを用いて2.6μC/m^3の空間電荷密度を実現し、電荷雲の中心にエアシリンダにより接地針電極を挿入させて、針電極先端を5mm程度進展するコロナストリーマ放電を起こさせた。今年度はさらに大きな放電を実現するための基礎研究として、高い比電荷を有する帯電液滴を生成することおよび高密度に空間電荷雲を形成させるために噴出させた液滴の帯電法について検討を行った。エアレスノズルとしては4年度は噴出角90°の空円錐ノズルを使用したが、帯電液滴の誘導電極への回り込みを極力防ぐために、噴出角60°のノズルを採用し、噴出量も13g/sまでの特性を得られるように5種類のノズルについて特性を測定した。誘導リング電極の大きさを直径30mm、ノズル-リング間距離を3mmに設定して各ノズルから噴出する液滴の帯電量を測定した。噴出流量が大きくなるにしたがって液滴の全電荷量は増加するが、液滴の単位質量あたりの電荷量(比電荷量)は流量の増加に比例せず、帯電効率が悪くなる傾向を示す。この帯電効率は誘導リング電極と液滴分裂点の位置関係に大きく依存するので、ノズル近傍の粒度分布をレーザ粒度計で測定し、粒度の変化から分裂点位置を求めた。大きな流量のノズルでは分裂点距離は長くなり、誘導電極の位置を正確に分裂点位置に合わせることが重要であることが判明した。大流量ノズルを利用して空間電荷雲を形成し、その中に設置した気中ギャップの放電電圧と火花の遅れ時間を調べた結果、帯電液滴の極性によって火花電圧が大きく変化することが明らかになった。
ヒドロキシアパタイトの組成と骨形成に関する研究

本研究は、より生体に適合し、かつ骨形成の場としての環境を維持しながら、骨形成ならびに生成された複合組織の安定性に優れたHAよりなる骨充填材の開発を目的に行われてきたが、今回、HAを構成する無機質ならびに微量元素の生体に与える影響を検討するとともに、有効な臨床応用の方法についても検討を行い、以下の結論を得た。1)培養液(α-MEM)中にHA顆粒を浸漬させ、HA表面のCa、Pの動態を観察したところ、培養液中のCa、Pの量は減少し、HA表面にCa、Pの析出が認められた。逆に、培養液中にMgの増加が認められたところから、生体内においても、HAに含まれる微量元素は絶えず溶出、析出を繰り返している可能性が示された。2)骨芽細胞様細胞MC3T3-E1を用いて、これら微量元素の与える影響を検討したところ、細胞の増殖能に促進的に作用することが示された。また、Mgについても同様の結果であった。3)家兎脛骨内移植実験においても、Mgを少量添加したHAは、添加しない群に比して良好な骨形成とHA-骨複合体の安定性を示した。この理由として、Mgを添加することによって、従来湿式法では困難であった、1200°C焼成のβ-TCPとHAの2相混合セラミックスが可能となり、このアパタイトに含まれるβ-TCPが骨形成に有利に働いたものと考えられた。4)顎口腔領域で、HAの最も使用頻度の高い軟組織が関与する臨床応用を考えて、HAと骨髄との混合移植、組織再生誘導法(GTR法)の併用を行ったところ、ともに良好な骨形成、安定性が得られ、臨床応用には有効な方法であることが確認された。これまでの材料学的な検討結果から、Mg添加によりβ-TCPを安定化させたHAPの特性把握を目的とし、焼成温度の異なる3種類のHAP顆粒を用いて、材料の溶液反応活動が生物学的に及ぼす影響について検討した。実験材料には同じ組成(Ca/P比1.65、Mg含有0.18%)を有するが、焼成温度を1100、1200、1300°Cと変化させて合成した3種類のHAP顆粒を用いた。培養細胞には、マウス新生仔頭蓋冠由来の骨芽細胞様細胞MC3T3-E1を用いた。これらのHAP顆粒を浸清させた培養液を添加した群では、添加した培養液の濃度に比例して、α-MENだけを用いて培養したコントロール群より、MC3T3-E1への^3H-TdRの取り込みが増加したこと、また、焼成温度の違いによるMC3T3-E1への^3H-TdRの取り込みに有意差が認められなかったことより、添加した培養液の濃度に依存して増殖の刺激が亢進されており、HAPの影響によるわずかな培養液内の無機成分の変化が、細胞に影響を与えることが示唆された。さらに培養液中のMg濃度に比例して、MC3T3-E1の^3H-TdRの取り込みが促進されたことより、MgはMC3T3-E1の増殖能を刺激し、その程度は濃度に依存することが判明した。また、これらの試料では、1100°Cでは顆粒表面に析出物は認められなかったが、1200°C1300°Cでは針状結晶が密に生成しており、これは、表面への析出が初期の骨形成に関することを示唆するもので、重要な所見と考えられた。昨年度までの骨原性細胞MC3T3-E1を用いた培養実験から、Mgを少量加えたヒドロキシアパタイト(HA)は、MC3T3-E1の増殖能を活性化することがわかった。

そこで、今年度はHAの種々の微量元素の含有量が細胞に与える影響を検討するため、培養液中の微量元素濃度を変化させ初期付着率により比較検討した。実験細胞は、骨原性細胞MC3T3-E1と線維芽細胞L929を用い、細胞培養法による生体適合性評価表に従い行った。Ca濃度についてはMC3T3-E1、L929ともに濃度の上昇により付着率が上昇した。P濃度においてはMC3T3-E1では濃度の上昇とともに付着率も上昇したが、L929では付着率は低下した。Mg濃度については、Ca濃度と同様にMC3T3-E1、L929ともに濃度の上昇により付着率が上昇した。これらのことより、HAより溶出する微量元素もこれらの細胞に対して活性的に作用するものと考えられた。次にHA周囲での骨形成因子の影響を調べるため、周囲因子の除外を目的として行われる組織再生誘導法を用い、骨形成状態を観察した。実験いは、コの字型の約2mmの空隙のあるHAを用い、実験群には、組織再生誘導法を用い、家兎脛骨内への移植時に人工膜(Gore-Tex)で覆い、対照群は覆わないものとし、経時的にHAの空隙内の骨形成状態を比較検討した。対照群では、コの字型空隙の皮質骨近接部では骨形成が認められたが、深部では骨形成を妨げるように線維性組織の侵入が認められた。実験群においては、対照群より早期にコの字型の空隙に骨形成が認められ、また3ケ月後には空隙の深部にまで骨形成が認められた。これらの結果より、HAの骨形成には周囲因子の影響が関与することが示唆された。HAの欠点を補って,軟組織でも効果的にHAー骨複合体を形成させるには,骨形成因子などとの併用が望ましいと考えられ,本年度は効果的な臨床応用を目的に,自家骨髄(BM)との併用移植と組織再生誘導法(GTR法)との併用を検討した。(1)HAとBMの混合移植における骨形成についてこれまでの検討から,最も骨伝導性と安定性に優れたCa/P 1.65で,数+μm以上の連続気孔を有するHA顆粒を用い,体積比が1:1となるように混合し,家兎腹部皮下に移植,混合移植における骨形成とHA-骨複合体の様相について検討を行った。その結果,この混合移植における骨形成は,最初にHA顆粒間にBMが誘導した類骨が形成され,それが成熟してHAに接するように骨組織が形成される過程を示し,その後は,HAと新生骨が環状に配列し,その内部に骨髄を有する,あたかも長管骨を輪切りにしたようなHA-骨複合体の形成を認めた。この長管骨類似の構造は,長期にわたって添加・吸収を繰り返す安定したHA-骨複合体を形成したものと考えられた。(2)HAの骨伝導性に与えるGTR法の効果Ca/P 1.65,Mg含有量0.16%のHAブロックを作製し、前年度で報告したように2×2.5mmの間隙をもつ「下駄」状の形態に形成した。GTR法の膜には,Gore-Tex社製延伸ポリフッ化エチレン,Cardiovascalar Pach Typeの厚さ0.55μm,フィビリル長30μm,平均気孔径5μmのものを用いた。家兎脛骨近心内側の平坦な面に,HAブロックを置き,その上に膜を被って固定し,経時的にHAの間隙および周囲の骨形成を観察した。その結果,HAブロックのみの対照群に比べ,GTR群では,HAブロックの間隙部のみならず,全周にわたって良好な骨形成を認めた。これは,膜によりHAへの結合織の介在を防ぎ,骨側からの骨形成因子を効率よくひき出し,HAの持つ骨伝導性の作用を増強させたものと考えられ,臨床応用には有効な方法の一つと考えられた。
電荷秩序する分子導体における光非線形現象の研究

我々は,電気伝導性の電荷移動錯体α-(BEDT-TTF)_2I_3の金属絶縁体転移が強誘電性転移であることを示し,その特異な分極機構に注目している。この研究では,同等機構で強誘電転移する試料群を拡大するために,強誘電転移を効率よく検知するための光第二高調波発生(SHG)測定装置を完成させ,それを用いた新規強誘電体の探索を行うことにある。前年度確立した樹脂包埋処理を利用して,新たに,α-(BEDT-TTF)_2I_2Brが強誘電転移することを明らかにした。さらに,α'-(BEDT-TTF)_2IBr_2において,不均一な分布の強誘電状態が形成されることを発見した。これは,この錯体が,相図上において強誘電相と反強誘電相が拮抗する領域に位置していることを示唆する。本研究では,電気伝導性の分子性導体において発生を確認した自発分極の基礎的性質を理解するために,分極発生が観測される物質群の拡大を目指している。研究の推進には,分極が予想される物質を探索・合成することと同時に,官発分極発生の様子を確認する手段の確立が不可欠である。これまでの研究により,自発分極した試料は非常に大きな光第二高調波発生(SHG)を示すことがあきらかになっており,この性質を利用して我々は,分極の確認手法の一つとしてSHGを利用した顕微分光測定による分極ドメインの可視化を検討している。この実験では入射光と信号光の偏光を別々に制御することが必要なため,それぞれの光偏光を自由に制御できる透過測定が好ましい光学配置となる。有機伝導体は測定を行う近赤外領域で弱い光吸収をもつために,この実現には10ミクロン程度以下の薄膜状結晶が必要とされる。ほとんどの有機伝導体では,光学測定が可能な面積を持つ単結晶は100ミクロン以上の厚みに成長してしまうが,既に分極発生の確認を行ったα-(BEDT-TTF)_2I_3の場合,限られた確率ではあるが3ミクロン程度と極めて薄い単結晶が得られることがある。本年度は,上記の分極ドメイン観測を試行するための試料を確保するためにα-(BEDT-TTF)_2I_3結晶の合成を行い,透過光学実験に適した良質な薄膜状単結晶を得た。我々は,電気伝導性の電荷移動錯体α-(BEDT-TTF)_2I_3の金属絶縁体転移が強誘電性転移であることを発見し,その特異な分極機構に注目している。その理解には,同様の強誘電転移を示す物質の系統的探索が欠かせない。本研究の目的は(あ)有機導体の強誘電転移を効率よく検出できる光第二高調波発生(SHG)の測定法を確立し,(い)それを用いて新規強誘電体の物質探索を行うことにある。今年度までに,樹脂包埋処理により補強した試料の透過SHG測定に成功した。この方法では,試料を高分子樹脂へ包埋し,高熱伝導基板に密着させることで,非線形光学測定で問題になる励起光による試料温度の上昇を抑えつつ,脆弱な単結晶試料の測定を簡便に実行できる。熱膨張率を考慮した素材選定により試料に加わる応力・ひずみの大幅な抑制を実現し,精度の高い測定を実現した。
強相関電子系の多極子秩序

八極子以上の高次多極子が現実の系で秩序化することは,最近の様々な実験とその理論的解釈から疑いのないものになっている。しかし,その結果現れる物性については未知の点が多い。我々は多極子物理の現状と展望について,J.Phys.Soc.Jpn.からレビューを依頼され,招待論文として出版した。本論文は7月に刊行後,半年以上にわたってJPSJのダウンロードランキングの2位(1位は鉄超伝導のレビュー論文)という好評を得,現在でも依然として高い順位にある。オリジナルな主要研究成果としては,スクッテルダイトSmRu4P12の奇妙な相図を理論的に説明したことが挙げられる。SmRu4P12の磁気相図は,時間反転対称性を破る秩序状態に由来する特徴ある構造があり,その実態解明が待たれていた。我々は,4重縮退した結晶場基底状態だけでなく,近接している2重縮退した励起状態が本質的に重要であることを見出した。この擬6重項を用いて主な秩序変数である八極子の成長にともなって,電荷分布の変形をともなう四極子と,さらに高次の十六極子が誘起されことを示した。後者は結晶場の基底状態と励起状態を結ぶ行列要素を持つ。様々な多極子が絡み合った結果生ずる平衡状態は,外部磁場によって興味ある影響を受ける。本研究では,分子場理論で6個の結晶場状態から構成される可能な多極子をすべて取り入れ,この結果に基づいて,SmRu4P12の磁場中の相図を半定量的に再現した。また,観測されている磁気モーメントを立方対称性からのはずれによって八極子から派生すると解釈し,その大きさを見積もった。この結果,全角運動量J=5/2のフント則基底状態だけではなく,励起状態であるJ=7/2の多重項が定量的には無視できない役割を果たしていることを指摘した。本研究において、磁性における多極自由度の役割をはっきりさせるために、強い電子相関を持つ典型的システムを研究した。まず,ともに結晶場4重縮退状態をとるCeB6とSmRu4P12の波動関数を求め,CeB6の局所的立方対称性(Oh)とSmRu4P12の局所的正方対称性(Th)の違いがもたらす効果を分析した。フント則基底状態がJ=5/2の状態だけからできていると,両者の差は表面化しないが,J=7/2の励起状態の混合を考えると差が出てくる。すなわちTh対称性では,磁気双極子と磁気八極子が混合する。スピン・軌道相互作用はリガンドとf電子の典型的な混成エネルギーよりも小さいので,この混合効果の考慮が必要である。これによりSmRu4P12での不思議な相転移の解明がなされつつある。まず外部磁場中の金属-絶縁体転移温度の異方性から結晶場4重縮退状態を舞台とする相互作用はSU(4)極限の近くにあることがわかった。すなわち,双極子から八極子までのすべての多極子がほとんど等しく重要であることを意味する。その際,磁気双極子と磁気八極子の混合効果で,第2の相転移は滑らかになり,クロスオーバーをもたらすと考えている。一方,別のスクッテルダイト系PrFe4P12では,相転移の秩序変数が同定されていない。我々は,ランダウの現象論を用いて,(i)相転移付近での帯磁率と弾性率の異常,(ii)弾性定数の磁場効果,(iii)一軸性圧力下での帯磁率の異方性をすべて説明する新しいスカラー秩序モデルを提出した。
鼻におけるMucosal Immunityの研究

MUCOSAL IMMUNITYの立場から鼻粘膜上皮層浸潤細胞の分布を、アレルギ-、感染、正常鼻粘膜を対象に、電顕的、光顕的、免疫組織学的に分析した。アレルギ-鼻粘膜上皮層にはリンパ球、肥満細胞、好酸球、globule Leukocyte、感染性上皮層にはリンパ球と好中球、正常にはリンパ球が特徴的にみられた。リンパ球は鼻汁、固有層と異なりCD8+細胞がCD4+より優位で、B細胞はなかった。上皮層リンパ球を培養増殖させてFACSでさらに亜型を検査すると、活性化Ts/Tc、活性型Th/Ti、サプレッサ-インデュサ-T、ヘルパ-インデュサ-T、NK細胞が分類された。上皮層リンパ球の機能として、上皮層肥満細胞の分化増殖を仮定し、鼻アレルギ-鼻粘膜にILー2、3、4、CSFで誘発を行い、ILー2、ー4で肥満細胞の上皮層増加がわずかにみられた。肥満細胞は固有層のそれと異なり粘膜型肥満細胞に属し、抗原と反応してヒスタミン、ロイコトリエンを遊離した。各種ケミカルメジェタ-のうち、ヒスタミン、ロイコトリエンのみが明らかな鼻アレルギ-症状を誘発し、粘膜表面異物を除去した。好酸球も上皮層で脱顆粒像を示した。脱顆粒で遊離されるEPO、MBPはin vitroで、緩徐に上皮線毛運動を抑制した。上皮層肥満細胞と反応させたが、脱顆粒はみられなかった。無生物無毒の可溶性蛋白に対するMucosal Immunityを鼻アレルギ-上皮層浸潤細胞の立場から検討した。これら細胞の機能解析の端緒を得た。鼻粘膜上皮層における浸潤細胞の分布とその機能を光顕的、電顕的免疫組織学的な手法を用いて解明した。鼻汁は〓鼻により鼻アレルギー患者より採取し、塗抹標本を作製し、May-grunwald法、OKT8.4、OKNK、OKB7、モノクロナール抗体を用いた酵素抗体法により染色した。鼻粘膜上皮層は同じく鼻アレルギー患者より掻過により採取し、細切、Guy-grandの方法で細胞を分離し、鼻汁と同様に処理した。PLP固定後、Leu2a、3aと反応させ、その後電顕標本を作製した。鼻汁中細胞は好中球、好酸球、ついでリンパ球、好塩基性細胞の順で多く、後二者は前二者に比しきわめて少く、従ってOK4.8、BT、NK陽性細胞はほとんどみられなかった。一方上皮層細胞はリンパ球、好酸球好塩基性細胞、好中球の順で光顕的に観察されたが、電顕的には、光顕に比しGlobule Leukocyteがみられた。リンパ球のサブセットは、OKT8、OKNK、OKT4陽性細胞の順でOKB7、陽性細胞は少なかった。またリンパ球は核原形質比が小で、比較的細胞内小器官に富み、顆粒を含む大きさ7μのものと、核原形質比が大で小器官に乏しい、大きさ5μのものに分けられた。以上の結果から上皮層に滞在して機能する主な細胞はアレルギーではリンパ球と好塩基性細胞と推定された。リンパ球の約1/4はCD8陽性、原形質内顆粒をもち、NK細胞に類似しKiller activityを発揮すると推定された。好塩基性細胞は粘膜型肥満細胞に属し、抗原と反応して、抗原の粘膜内侵入を阻止すると考えられた。OK4陽性細胞、Globule Leukocyteの機能、好酸球の上皮層における役割を今後検討する。

アレルギ-反応におけるメジエタ-のソ-スを研究するため、鼻アレルギ-患者の一側鼻を抗原で誘発し、各側から鼻汁を採取して誘発側と非誘発側の鼻汁成分の比較を行った。誘発側鼻汁は分泌腺、血管、湿潤細胞起源物質を含み、非誘発側鼻汁は分泌腺由来物質のみを含む。その結果水分、アルブミン、キニン、SP、分泌型IgAは腺由来が主なものと推定された。但し腺由来でも分泌殻IgAは腺分泌、他は腺透過であり、passive glandular secretionという新しい概念を提唱できた。ヒスタミン、ロイコトリエンは粘膜表面肥満細胞分泌物と推定された。ケミカルメジエタ-のうちアレルギ-反応で強く抗原排除に働くのはヒスタミンであった。リンパ球から分泌されるインタ-ロイキン2、3、4、コロニ-刺激因子(ヒト、リコビナント)で鼻アレルギ-鼻粘膜を刺激後24時間、刺激前後の上皮層肥満細胞数を、含まれているヒスタミン量の定量により検討した。その結果インタ-ロイキン2、4で肥満細胞増加の傾向がみられた。これらが肥満細胞の分化増殖に働くか否かは検討中である。鼻アレルギ-と対比し正常鼻粘膜上皮細胞間細胞のポピュレ-ションを検討した。正常ではリンパ球のみがみられ他の白血球はみられなかった。好酸球顆粒成分から主要塩基性蛋白MBPを精製し鼻アレルギ-粘膜上皮層肥満細胞とin vitroで反応させ、ヒスタミン遊離作用を検討中であるが、陽性結果が得られていない。
統合失調症圏障害者の生活の再構築とリカバリー像定立に向けての支援

作業所を利用する統合失調症圏障害者が、地域からの分離と非包括(anti-inclusion)に固定化されることなく、労働を含む生活世界を拡大し希望をもって社会生活を送ることを作業所が如何にプロモート出来るか、その手立てを明らかにするために、2002年5月から2004年2月までの20ヶ月間S市中作業所の職員及び利用者の協力を得てミューチュアルタイプアクションリサーチを実施した。作業所利用者は一日平均16名強、その殆どが統合失調症、他にアスペルガー症候群、境界人格障害等多様であった。研究開始前の処遇は「利用者に負担を負わせない昼間の居場所」と位置付け、再発を怖れ病状の安定にのみ気を配り専ら庇護的に利用者に対していた。従って利用者は職員に過度に依存し且つ無為の状態で滞留し、作業所は変化の乏しい空間であり職員はその事に疑問を感じていた。研究組織は、研究者2名、施設長、直接処遇職員2名の5名で構成した。研究方法は、アクションリサーチに参与観察、ケースカンファランスによるスーパーヴィジョン、研修会、文献学習を併用し、処遇の方法理念として「リカヴァリー」を位置付けた。20ヶ月間のaction-reflection spiralは、(1)再発予防を意図した危機介入、(2)利用者一人ひとりの回復像を職員が共有することとケース記録や処遇日誌等の整備、(3)利用者のナラティブから見えたリカヴァリー形成過程の共有、(4)ソーシャルワーカーの生活的視点に基づく支援手法の定立、(5)社会規範との関連で利用者の努力目標を設定する意味の共有、(6)職員の職業倫理的高次化、(7)グループワーク導入、(8)長期的対応を要する事例の同定という8つの実践的成果をもたらした。その帰結として、利用者は現実的主体的自己像を語り始め、職員は低い給与や不当な社会的評価に起因する福祉職員の内的差別意識に目覚め、権利主体としてエンパワリングされた。平成14年度は、職員のエンパワーメントを目的に、アクションリサーチに(1)ケースカンファランス、(2)グループスーパーヴィジョン、(3)グループワークや薬物療法、心理社会的治療のスペシャリストを招聘し、職員研修会を導入した支援のあり方を検討した。検討結果を基に計画を立て、実践・評価した。本年度の成果は、職員が(1)作業所利用の目的/目標や意味を利用者と共に考え共有すること、(2)面接技術を向上すること、(3)利用者の病像や障害像を専門的な立場から分析する視点を獲得すること、(4)利用者集団の力を信頼すること、(5)利用者の回復する力を信頼すること、(6)個人相談記録を整備すること、(7)学会発表すること等の面で、職員はエンパワーし、ソーシャルワーカーとして自分を信じられるようになった。また、そのことが現場を変え、利用者は一見小さなことから希望を見出し回復の歩みを始めた。即ち、利用者はリカバリーイメージ形成とリカバリーへの緒についた。上記の研究成果を以下の学会で発表した。1.精神障害者の回復像形成と小規模作業所

機能:第54回北海道公衆衛生学会(札幌市),2002.112.精神障害者小規模作業所職員と利用者の主治医との連携:第23回日本社会精神衛生学会(盛岡市),2003.33.精神障害者小規模作業所におけるグループスーパービジョン:第23回日本社会精神衛生学会(盛岡市),2003.3前年度に引き続き、精神障害者小規模作業所を利用する統合失調症圏障害者の生活の再構築とリカヴァリー像定立に向けた職員の支援可能性とその方法を明らかにすることを意図し、アクション・リサーチを展開した。本年度は、(1)人間関係対処能力の未熟な複数の利用者間のトラブル解決を当事者のリカヴァリーと社会的規範のdilemmaを越えてどのように支援すべきか、(2)利用者に投与されている薬物のミスマッチに対するソーシャルワーカーの支援のあり方、(3)利用者の日常の具体的な言動や人間関係の結び方などの事実から利用者の社会像をどのように理解するかというソーシャルワーカーの基本的技能の検討がなされた。月1回のケースカンファランスでスーパーヴィジョンを受けた職員は、利用者のリカヴァリーを支援できる職員としての力と、自分の意見や実践内容を自分の言葉で人に説明する力を獲得したと自己省察した。上記の研究成果を以下の学会で発表した。(1)加藤欣子,加藤春樹,中村恵見,木下巌,向寛:精神障害者小規模作業所の処遇理念にリカバリー概念を導入する意義.第44回日本社会医学会,2003年7月,京都,(2)加藤春樹,加藤欣子:地域精神障害者支援資源におけるグループスーパーヴィジョン枠組み形成の試み-大学教員の社会的役割-.第44回日本社会医学会,2003年7月,京都,(3)加藤欣子,加藤春樹,中村恵見,木下巌,向寛:精神障害者小規模作業所の理念の明確化と説明責任の意義.第11回日本精神障害者リハビリテーション学会,2003年9月,諌早,(4)木下巌,中村恵見,向寛,加藤春樹,加藤欣子:小規模共同作業所における職員のエンパワメントとリカヴァリー支援の取り組み.第11回日本精神障害者リハビリテーション学会,2003年9月,諌早また、「精神障害とリハビリテーション」に「精神障害者小規模作業所の理念に『リカヴァリー』を導入する意義」を投稿し受理された。
移動通信システムにおける非対称トラヒックを考慮した高効率無線リソース管理法の研究

IPベースセルラ移動通信システムを考慮し、チャネルアクセス時に回線設定を行わないコネクションレス(共通チャネル)型のパケット通信を行う移動パケット通信システムを研究対象として、CDMA/Shared-TDD方式による非対称トラヒックの高効率収容に関して研究を進めた。非対称トラヒックの高効率収容においては、上下リンクへの適切な無線リソース割当てが重要な課題となっている。通常、基地局において観測される上下トラヒック量を測定し、その測定量に基づき各リンクへの無線リソール割当が行なわれるが、コネクションレス通信時には基地局で土りトラヒック量を把握することが困難となる。そこで、本研究では、基地局において上りトラヒック量を推定し、無線リソース割当を実施する手法を検討した。上りリンクトラヒック量推定法として、基地局において上りパケットに含まれる送信に関連する情報を統計処理することによりトラヒック量を推定する方式を提案した。また、CDMA/Shared-TDD方式において、推定トラヒック量に基づく上下リンクへの無線リソース割当方式についての検討を実施し、上下リンク無線リソース割当法を考案した。その後、これら提案手法の特性評価を計算機シミュレーションにより実施し、提案手法を用いることにより上りトラヒック量の把握が困難なコネクションレス通信時でも適切な上下リンクへの無線リソース割当が可能となり、その結果、システムのスループット特性が向上することを示した。本調査研究による上記成果を、電子情報通信学会英文論文誌(1件)、国際学会(2件)、電子情報通信学会総合大会(1件)にて発表した。
場と動きの共鳴から出現する多細胞ダイナミクスの解析

粘菌細胞の集合は、静的なcAMP勾配ではなく、cAMPの動的な進行波への誘引によって引き起こされている。細胞が受ける空間的な勾配は常に一定ではなく、波が細胞を通過するごとに勾配の方向が反転してしまう。空間勾配を検知するだけでは、繰り返し反転する場に対して細胞は行ったり来たりしてしまい、一方向に進むことが難しいはずと考えられている。昨年度までの解析により、我々は、微小流路を用いて進行波刺激を再現する系を構築し、3分から10分で通過するcAMP波に対してのみ、波がやってくる方向へ一方向移動し、このことが濃度の時間変化が減少である際がフィルターアウトされる特性に由来していることを明らかにした。今年度は、この問題を引き継ぐかたちで、粘菌の集合ステージの後期における運動に注目し、これまでに明らかにしてきたフィルター特性では説明つかないことを明らかにした。とくに、細胞間接着の様式の重要性に着目し、微小流路系の勾配チャンバーの改良を進め、細胞の極性形成とその維持に関わる動態について詳しく解析した。26年度が最終年度であるため、記入しない。微小流路技術を利用して作成した刺激を時空間的に変動できるチャンバを用いて、本来細胞集団が形成するcAMP進行波を人工的に生成し、場と運動の相互依存関係を切り離して解析した。進行波刺激を与えたときの細胞運動の様子を解析し、細胞運動効率の周期依存性を調べる。その結果、5ー6分で通過する波に対してのみ選択的に進行波とは逆の方向への細胞移動がみられることがわかった。そのときのFアクチン、およびRasの細胞膜状への局在の様子を観察し、これらの特徴が空間勾配検出の標準モデルの性質からただちに説明できないことを示した。モデルを再検討した結果、想定される大局的な抑制因子による出力シグナルの生成がミカエルメンテン型の酵素反応に従い、かつこれがゼロ次でVmaxに近い生成速度で抑制をかけている場合に、波の前面への選択性が説明できることがわかった。この性質は、自発的なRas活性が高い細胞については満たされず、実際にそうした細胞が、一様刺激にたいして、誘引物質から開放されたときに、強い負の応答を示してしまうこともよく説明する。進行波に対する走化性運動と分子動態との関係を解析したところ、その結果、進行波が繰り返されることで、細胞の移動速度が変化すること、またその応答も特徴的な形なることが明らかになった。FRETプローブによる細胞外cAMPの可視化は、膜の外側にFRETプローブを提示する系を作成、検討を進めている。また、集団効果による運動特性の解析のために細胞選別現象の可視化を進めた。モデル解析による理解は予想を上回る進展がみられた。論文投稿としてまとめるために、この点を優先したため、予定していた周期刺激やcAMPリレー応答との関係の解析がやや遅れている。研究計画全体で平均するとおおむね順調に推移している。cAMP波の周期性の起源を1細胞のcAMP応答の性質から明らかにすべく、走化性運動中の細胞質cAMPレベルの変動をFRET計測から特徴づける。このことから、周期性の起源である不応期と脱適応の時間スケールと運動状態との関係を明らかにする。細胞骨格系の適応の時定数との関連が示唆されるため、アクチン重合の阻害剤処理した細胞や、逆にFアクチン重合が異常に活発であるSCAR/WAVE関連の変位株などのcAMP産生を野生株細胞と同様に特徴づける。また、微小チャンバ内で発生させた細胞集団が形成するcAMP振動と走化性シグナル因子の動態を詳細に測定することより、細胞間接着による近接相互作用の有無や細胞密度に依存して振動周期の切り替わり(遷移)が起こるかを調べる。