hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
社会的状況における抑制とその影響-反意図的な侵入思考に対する解釈の役割-

本研究は、日常生活の中における思考、感情、行動の抑制(メンタルコントロール)とその影響を明らかにするものである。抑制を行うとかえってその思考が増幅する逆説的効果が報告されている。本研究は、その逆説的効果に加えて、その効果に対する当事者の「解釈」に焦点を当てる。抑制者にとって、抑制の逆説的効果が生じることは予期されておらず、この意図せざる緊張感は、源泉不明の緊張(Mystery Tension)と言える。通常、このような緊張には、当事者の解釈が加わるが、この解釈が、以降の思考や行動、感情に様々な影響を与えると考えられた。本年度は、まず、侵入思考に対する解釈やメンタルコントロールに対する信念を把握するための質問紙調査とPC課題を用いた実験室実験を行った。調査は、日々の生活においてメンタルコントロールの種類や頻度.が異なると考えられる同年代の3つの集団、一般大学生(416名)、美術系専門大学生(255名)、および選抜アスリート(92名)に対して実施した。その結果、3つの集団においてメンタルコントロールに対する必要性や実行の程度が異なっており、それは、心的健康や社会生活での適応と関連が見られた。続いて、一般大学生(45名)とアスリート(25名)に対し、緊張状態を制御する必要のある実験課題を実施し、メンタルコントロール傾向とパフォーマシス、および心身の健康の関連を調べた。課題中の緊張感に対し、抑制的に対処しようとした者は、課題の失敗が続くとパフォーマンスの低下および、感情状態の悪化が見られた。これらの一連の結果より、心的なコントロールを行おうとすることによって生じる緊張感に加えて、その緊張感に対する解釈や対応が、長期的な心的健康やパフォーマンスに影響を及ぼす可能性が示唆された。
CD147による腎エネルギー代謝機構の解明と臓器相関に対する治療法の探究

膜貫通型糖蛋白質・CD147/Basiginは、細胞の生存や浸潤・転移に重要な役割を果たす。しかし、糖尿病や肝・腎機能障害を呈するメタボリック症候群についてCD147を含む分子機構は明確に解明されていない。CD147はMonocarboxylate transporterのシャペロンとして乳酸代謝に促進し、細胞内エネルギー代謝・ATP産生に大きな影響を及ぼす。今回の動物実験において、過剰な糖・脂質・尿酸の細胞内蓄積による酸化ストレスはCD147を誘導・負のサイクルを形成する事によって相乗的な臓器障害を惹起する事が示された。CD147を治療標的とする応用は肥満関連性腎・肝機能障害に広がる。慢性腎臓病(CKD)とその危険因子である肥満症は各々、慢性炎症と代謝障害を通じて動脈硬化症や心臓・肝臓等に臓器障害を惹起する。CD147はMonocarboxylate transporter(MCT)のシャペロンとして乳酸代謝に促進し、細胞内エネルギー代謝・ATP産生に大きな影響を及ぼす。我々は、1)腎尿細管に豊富に発現するCD147がATP産生亢進により糖・脂質・尿酸代謝の再吸収・輸送を促進する、2)酸化ストレスにより尿細管細胞のCD147発現は増加し、慢性炎症機構を活性化する、という知見を得ている。以上から過剰な糖・脂質・尿酸の細胞内蓄積による酸化ストレスはCD147を誘導・負のサイクルを形成する事によって相乗的な臓器障害を惹起する事が推測される。本研究では、腎エネルギー・代謝機構の網羅的解明を通じ、CKDから生じる臓器相関に対する治療法の探究を目的とする。本年度にエネルギー代謝におけるCD147の意義を解明するため、高脂肪・糖質負荷したCD147KOと野生型マウスを作製し、各臓器の採取採取を行った。血液・尿・心臓・腎臓検体をメタボローム解析にて主要な生化学反応経路やそれに付随する代謝産物について網羅的・動的解析をおこない、更に、アディポサイトカインの発現様式を比較検証した。その結果として、CD147欠損マウスでは野生型マウスに比して、随時血糖と尿酸値の抑制と中性脂肪の増加を認めた。さらに、CD147欠損マウスでは体重や摂食量に有意な差を認めないにもかかわらず、脂肪肝形成の程度は低かった。腎機能についてもCD147欠損マウスの腎機能の低下は抑止されていた。ATP産生能を含めて、腎尿細管における糖質・尿酸輸送機構や肝での尿酸・脂肪代謝機構とCD147の関係をIn vitro研究にて検証をおこなうため腎近位尿細管・肝細胞初代培養を施行している。慢性腎臓病(CKD)とその危険因子である肥満症はそれぞれ、慢性炎症と代謝障害を通じて動脈硬化症や心臓・肝臓等に臓器障害を惹起する。CD147は乳酸代謝を促進し細胞内エネルギー代謝・ATP賛成に大きな影響を示す。本年度は高脂肪・糖質を負荷した場合、CD147KOマウスでは野生型マウスと比して、遊離脂肪酸や尿酸・血糖・腎機能について有意に抑制もしくは改善を認めていたことが判明した。前年度報告の肝臓内の脂肪蓄積もまたCD147KOマウスにて有意に抑制されていたことを再確認し、その免疫学的解析を行った。結果として、M1 macrophageが野生型マウスに比してKOマウスでは有意に浸潤が抑止されていた。メタボローム解析などから、解糖系のG6Paseとその関連代謝物質や酵素の変化が認められた。腎臓についてもリポフスチン様物質の尿細管蓄積が尿細管間質障害を引き起こし、腎機能低下を引き起こすと考えられ、更に検索を進めている。既に、In vivoの検体採取・解析を終了し、その実験結果に沿って細胞培養を用いてそのシグナル経路の解明や分子生物学的・免疫学的意義について検証を開始した。特に、免疫学的なリンパ球やマクロファージに関するCD147の意義についてはIn vivoでの胴体解析を終了し、In vitroでの刺激実験によって詳細な誘導・分化経路の検証を行っている。膜貫通型糖蛋白質CD147/Basiginは、細胞の生存や浸潤・転移に重要な役割を果たす。しかし、糖尿病や自己免疫性疾患についてCD147を含む分子機構は明確に解明されていない。本研究において腎臓に豊富に存在するCD147は尿細管で糖質・脂質・タンパク質の再吸収・輸送機構に関与し、同時にATP depletionに伴う酸化ストレス亢進・尿細管間質細胞障害を引き起こす可能性を検証した。腎エネルギー・代謝機構の網羅的解明を通じ、CKDから生じる臓器創刊に対する治療法の探求を最終目的とした。

高脂肪食を負荷した野生型マウスとCD147欠損マウスを比較検討したところ、CD147欠損マウスにおいて遊離脂肪酸・尿酸・血糖の上昇が有意に抑制されており、腎機能についても保護的に作用していることが判明した。病理組織学的にも同様な傾向を指摘し、炎症系細胞の組織浸潤も欠損マウスにおいて抑止されていた。電子顕微鏡にて尿細管細胞を精査したところ、リポフスチン様物質の蓄積を示すWheel-likeな物質が野生型マウスに有意に増加していた。これらは脂質・過酸化物質の再吸収によって生じたものであり、尿細管細胞障害を誘導する原因物質である可能性が示唆された。これらの原因は過度な尿細管への再吸収により生じたAutophagy機構の破綻が原因と考えられた。p62をはじめとしたAutophagy障害を示すマーカーの結果はいずれも野生型におけるAutophagy障害を指し示した。今後の検証において、CD147におけるAutophagy機構への関与を分子生物学的に詳細に網羅的解析を加える必要性があると考えられた。膜貫通型糖蛋白質・CD147/Basiginは、細胞の生存や浸潤・転移に重要な役割を果たす。しかし、糖尿病や肝・腎機能障害を呈するメタボリック症候群についてCD147を含む分子機構は明確に解明されていない。CD147はMonocarboxylate transporterのシャペロンとして乳酸代謝に促進し、細胞内エネルギー代謝・ATP産生に大きな影響を及ぼす。今回の動物実験において、過剰な糖・脂質・尿酸の細胞内蓄積による酸化ストレスはCD147を誘導・負のサイクルを形成する事によって相乗的な臓器障害を惹起する事が示された。CD147を治療標的とする応用は肥満関連性腎・肝機能障害に広がる。すでに、In vivo研究の検体採取を終了し、In vitro研究においても実験を開始している。今後、これらの検体を使用して、高脂肪・糖質負荷による臓器障害(心・肝・腎)に対するCD147の意義を上記の検体にて病理学・分子生物学的に検証する。また、上記の検体を使用し、酸化ストレス・細胞障害に対するCD147の役割を分子生物学的に検証する。慢性炎症機構にて、サイトカイン産生性T細胞や免疫恒常性維持に関与する制御性T細胞(Treg)におけるCD147の意義をTreg suppression assayなどの機能解析を通して免疫学的に解明する。今後も当初の計画通り3年目として最終年度の実験計画を遂行する。本年度はメカニズムの解析とともに肝細胞への脂肪蓄積や腎尿細管細胞障害を誘導するリポフスチン様物質の細胞内蓄積に関するCD147の役割をエンドサイトーシス機構を中心に検討する予定である。そのため、CD147に付随する糖鎖機能についても検討を広げる予定である。腎臓領域今後も当初の計画通り2年目の実験計画を遂行するが、次年度には分子メカニズムの解明をおこなうため、これまで以上に研究協力者の提言を受ける予定である。
CD5陽性びまん性大細胞型Bリンパ腫の腫瘍発生と病態の解明

CD5陽性びまん性大細胞型Bリンパ腫(CD5^+ DLBCL)はCD5^-DLBCLに比較して初発時臨床症状が明らかに異なり、(1)高年齢者に多い、(2)performance statusが2以上の症例が多い、(3)LDH高値の症例が多い、(4)臨床病期がIII/IV期の症例が多い、(5)節外性臓器浸潤が2ヶ所以上の症例が多い、(6)B症状を持つ症例が多い、(7)生存曲線率が下回り、5年生存率が低い特徴をもつ。病理組織学的にCD5^+ DLBCLのほとんどはcentroblastic variantを示す。CD5^+ DLBCLはCD27:2/13,CD38:7/14,CD148:7/13に陽性を示し、メモリ-B細胞もしくは活性化B細胞の陽性率は低い。免疫グロブリン遺伝子可変領域(VH遺伝子)解析からCD5^+DLBCLは2群に分かれたことがわかった。germlineもしくは低頻度のmutationを示す群(low群)とsomatic hypermutationを示す群(high群)である。bcl-6遺伝子promoter領域のsomatic mutationは6例でgemlineを示し、5例は1塩基のみmutationしていた。Low群は2例で1例にmutation、high群は6例中3例にmutation、(3)他3例(VH遺伝子未解析)は1例にmutationを認めた。一方、CD5^-DLBCL8例の結果は3例でgemline、4例でmutationを示し、mutationを示した塩基数はそれぞれ1、3、4、5塩基であった。他1例では1塩基の欠損(deletion)を認めた。DNA microarrayではCD5^+ DLBCLはCD5^-DLBCLと異なる発現パターンを示した。以上の結果から、CD5^+ DLBCLは一疾患単位として特徴が明らかである、通常の化学療法とは異なる治療が必要と考えられる。<目的>CD5陽性びまん性大細胞型リンパ腫(CD5^+ DLBCL)の組織発生、特にCD5^+ DLBCLはCD5^-DLBCLと同様に胚中心由来なのか否かを免疫グロブリン遺伝子可変領域(VH遺伝子)および免疫組織化学的に検討した。<結果>現在まで23症例についてVH遺伝子を解析できた。somatic mutationの頻度は0-17.2%、平均6.2%を示したが、5%を境界として(1)germlineもしくは低頻度のmutationを示すもの(Low群)と(2)高い頻度のmutation (somatic hypermutation)を示すもの(High群)に分けることが出来た。Low群は12例、somatic mutationの頻度は0-3.4%平均1.7%、VHfamily usageはVH1:1例,VH2:1例,VH3:8例,VH4:2例であった。これに対して(2)High群は13例、5.6-17.2%平均11.1%、VH family usageはVH3:5例,VH4:6例であった。R/S比はLow群はCDR領域3.5、FW領域1.5、High群はCDR領域1.96、FW領域1.34を示した。すなわち、Low群とHigh群ではVH遺伝子の性状は異なっており、約10%に平均値を示して一峰性分布を示すCD5^-DLBCLとは異なっていた。2)免疫組織学的検討CD27,CD38,CD148について検討した。

これらの抗原はいずれもmemory B細胞やactivated B細胞との関連性を報告されているが、Low群とは異なりHigh群では3つの抗原のうち2種以上の抗原が陽性になる症例が認められた。一方、CD5^-DLBCLは2種以上の抗原が陽性になる症例が多かった。<これまでの結果からの考察>以上からCD5^+ DLBCLの約半数を占めるLow群は胚中心を経由していないCD5^+ nalve B細胞から腫瘍化した可能性があり、CD5^+ B細胞の独自性とCD5^+ DLBCLとCD5^+ B-CLLの類似性を示唆する所見と考えられる。High群に所属するCD5^+ DLBCLについては抗原刺激を受けたCD5^+ B細胞から発生する可能性がある。<目的><結果>腫瘍組織から高分子DNAを抽出し、bcl-6遺伝子promoter領域(およそ700bps)をPCR増幅し、塩基配列を解析した。CD5^+ DLBCLは11症例を検討した。6例はgermlineを示し、5例は1塩基のみmutationしていた。VH遺伝子somatic mutationとの関係は(1)Low frequency群は2例で1例にmutation(+)、(2)hypermutation群は6例中3例にmutation(+)、(3)他3例(VH遺伝子未解析)は1例にmutation(+)であった。一方、CD5^-DLBCLは8例について解析したところ、3例はgermline、4例でmutationを示したが、mutationを示した塩基数はそれぞれ1,3,4,5塩基であった。他1例では1塩基の欠損(deletion)を認めた。このうち5例でVH遺伝子のsomatic mutationを解析しているが、5.6-19.1%のmutation頻度を示した。2)bcl-6遺伝子異常(再構成もしくは染色体異常)Southern blottingによるbcl-6遺伝子の再構成、もしくは染色体分析による3q27異常を検索したが、CD5^+ DLBCL20例に異常は認められなかった。CD5^-DLBCLではおよそ20%にbcl-6遺伝子の異常を認めるとされる。腫瘍組織からRNAを抽出し、CD5^+ DLBCL 6例とCD5^-DLBCL6例についておよそ600の遺伝子についてmicroarray法による発現を検討したところ、CD5^+ DLBCL4例は、CD5^-DLBCLの他2例とCD5^-DLBCL 6例を合わせた群とは明らかに異なる発現パターンを示した。<これまでの結果からの考察>CD5^-DLBCLに比較してCD5^+ DLBCLはVH遺伝子の他、bcl-6遺伝子の変化および異常が少ないことが明らかにされた。さらにDNA microarrayにより遺伝子発現のパターンが異なることも示された。すなわちCD5^+ DLBCLとCD5^<+-> DLBCLでは遺伝子レベルで異なった腫瘍であることが示唆された。
象牙質・歯髄複合体培養系を用いた歯髄修復機構の解析

前年度の研究結果から,本実験系で用いた象牙質・歯髄複合体培養系は,象牙質と歯髄両者の特性を合わせ持った培養系であり、種々のサイトカインがin vitroの条件下でどのような動態を示すかを知るうえで極めて有用な実験系であることが明らかとなった.そこで本年度は,これらの成果をもとにおよそ下記のような実験を行った.1.分子病理学的解析:1)細胞増殖能の確認:前年度に続き一部の培養例(3,7,21日培養例)では,培地に5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU)を加えてさらに培養し,その後試料を取り出してパラフィン切片を作成し免疫組織学化学的解析を行い,試料中の各種歯髄細胞の増殖能を調べた.2)各種サイトカイン産生細胞の同定:培養3,7,14,21,30日後に培地から試料を回収してパラフィン切片を作成し,各サイトカインに対する抗体を用いた免疫組織化学的染色を行い,各成分の組織内局在を調べた.さらに各サイトカインのcDNAプローブを使用してin situ-PCR法を行い,各サイトカインmRNAの発現細胞を最終的に同定した.2.総括:現在,以上の実験成績を総合的に解析して,歯髄炎症過程におけるVEGFをはじめとするサイトカイン各成分の活性の変動と遺伝子発現の状態を骨子とした論文を作成中である.前年度の研究結果から,本実験系で用いた象牙質・歯髄複合体培養系は,象牙質と歯髄両者の特性を合わせ持った培養系であり、種々のサイトカインがin vitroの条件下でどのような動態を示すかを知るうえで極めて有用な実験系であることが明らかとなった.そこで本年度は,これらの成果をもとにおよそ下記のような実験を行った.1.分子病理学的解析:1)細胞増殖能の確認:前年度に続き一部の培養例(3,7,21日培養例)では,培地に5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU)を加えてさらに培養し,その後試料を取り出してパラフィン切片を作成し免疫組織学化学的解析を行い,試料中の各種歯髄細胞の増殖能を調べた.2)各種サイトカイン産生細胞の同定:培養3,7,14,21,30日後に培地から試料を回収してパラフィン切片を作成し,各サイトカインに対する抗体を用いた免疫組織化学的染色を行い,各成分の組織内局在を調べた.さらに各サイトカインのcDNAプローブを使用してin situ-PCR法を行い,各サイトカインmRNAの発現細胞を最終的に同定した.2.総括:現在,以上の実験成績を総合的に解析して,歯髄炎症過程におけるVEGFをはじめとするサイトカイン各成分の活性の変動と遺伝子発現の状態を骨子とした論文を作成中である.1.試料の作成:矯正学的理由で便宜抜歯したヒトの健全な幼若小臼歯(30歯,可能な限り多くの歯を同一個体から得る)を,自動精密切断機・アイソメットを用いて培地(後述)を滴下しながら無菌的に歯軸方向に割断し,象牙質と歯髄を含む500-700μmの厚さの試料(象牙質・歯髄複合体試料)を作成した.3.試料の培養:10%ウシ胎児血清(FBS)を含むイーグルMEM(EMEM)培地に,2.で得たLPSまたはPGを加え.これに1.で得た試料を入れて,37°C,CO25%,湿度100%の条件下で最長30日間まで培養した.4.培養上清中における各種サイトカイン濃度の測定:2日毎に培地を交換し,培養上清中のVEGF,VEGFレセプター,インターロイキン(IL)-1,IL-6およびIL-8タンパクの経時的変化をELISAで調べた.以上の研究結果から,本実験系で用いた象牙質・歯髄複合体培養系は,象牙質と歯髄両者の特性を合わせ持った培養系であり,種々のサイトカインがin vitroの条件下でどのような動態を示すかを知るうえで極めて有用な実験系であることが明らかとなった.現在,得られたデータを詳細に解析中である.前年度の研究結果から、本実験系で用いた象牙質・歯髄複合体培養系は、象牙質と歯髄両者の特性を合わせ持った培養系であり、種々のサイトカインがin vitroの条件下でどのような動態を示すかを知るうえで極めて有用な実験系であることが明らかとなった。そこで本年度は,これらの成果をもとにおよそ下記のような実験を行った。1.分子病理学的解析:1)細胞増殖能の確認:前年度に続き一部の培養例(3,7,21日培養例)では,培地に5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU)を加えてさらに培養し、その後試料を取り出してパラフィン切片を作成し免疫組織学化学的解析を行い,試料中の各種歯髄細胞の増殖能を調べた。2)各種サイトカイン産生細胞の同定:培養3・7・14・21・30日後に培地から試料を回収してパラフィン切片を作成し、各サイトカインに対する抗体を用いた免疫組織化学的染色を行い,各成分の組織内局在を調べた。さらに各サイトカインのcDNAプローブを使用してin situ-PCR法を行い,各サイトカインmRNAの発現細胞を最終的に同定した。2.総括:現在,以上の実験成績を総合的に解析して,歯髄炎症過程におけるVEGFをはじめとするサイトカイン各成分の活性の変動と遺伝子発現の状態を骨子とした論文を作成中である。
配列特異的な核酸分子の高精度定量技術の開発

本研究課題では、塩基配列を保存した高分子の核酸分子を直接定量する手法として、分光学的手法や酵素的増幅法を用いない、質量分析手法を開発することを目的として行った。具体的には、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)やキャピラリー電気泳動などの分離手法と誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)を組み合わせて、核酸分子内リン元素を直接的に定量することで高分子核酸の直接的な定量を実現した。特にサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)を用いたSEC-ICP-MS法では、5001000塩基のRNA分子を定量することができ、本手法の有効性と実用性を示す結果となった。当該研究課題に関して、平成25年度は、初年度に設定した課題の成果に基づき、特に質量分析を用いた核酸の定量評価を実施した。具体的には、これまでに合成、評価を行った核酸および、定量評価が行われた認証標準物質等を用いて、対象となる高分子DNAの質量分析を行った。初期のモデル試料としてオリゴDNAを予定したが、さらなる範囲拡大を念頭に、600塩基対程度の長鎖DNAを対象としてその定量評価を行った。これらの試料は、同位体希釈質量分析法などの他手法で定量評価された核酸を用いており、測定に関する妥当性を評価した。測定における分離分析技術としては、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)やキャピラリーゲル電気泳動(CGE)法を適用した。HPLCについては、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)カラムを用いた分離系を検討し、特に、質量分析に適用するために、溶離液中に塩などの添加物を極力含まない分離系を構築し、こうした方法でも繰り返し再現性良く分離可能な手法を確立した。CGEについては、独自に開発した質量分析装置用の微少試料導入装置を使用することでゲルを含有する分離緩衝液を直接的に質量分析装置に導入可能な手法として確立した。両分離技術について、質量分析技術と融合した複合分析技術を確立し、長鎖核酸の定量分析を行い、既報と比較して高感度かつ、安定した分析を可能とした。これらの高分子核酸を対象とした質量分析技術について、学会発表と論文投稿を行った。当該研究課題に関して、平成24年度は、次の3つを課題として設定し、以下のように実施した。課題1として、内標準用核酸の分子量および配列評価による純度検定を行い、内標準核酸として用いるメチル化修飾オリゴヌクレオチドまたは1塩基脱離オリゴヌクレオチドの合成および安定同位体標識核酸の合成を検討した。純度検定方法としては、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)やキャピラリーゲル電気泳動(CGE)法を適用し、モノマー核酸を含め、本提案で対象とする数十塩基の核酸を十分に含む分子量範囲で分離分析を実現した。内標準核酸としては、メチル化修飾部位および修飾数を変化させたオリゴヌクレオチドを複数選定し、合成を検討した。また、安定同位体標識核酸の合成も検討し、モノマーについて分析を行った。これらについてもHPLCやCGEを用いた同様の分離分析を実現した。核酸の分離分析技術について、学会発表と論文投稿を行った。課題2として、限外濾過等の各種前処理法の実施による定量値への影響評価を実施した。核酸由来、非核酸由来の夾雑物について前処理による精製を検討し、前処理中に夾雑物として含む可能性のある物質についても確認した。適合する複数種の核酸精製手法を比較し、分光学的手法および質量分析法を用いて核酸定量および回収率を評価した。課題3として、質量分析装置による多価イオン解析による目的配列の定量に関する装置準備を行った。具体的には、低濃度の核酸分離装置としてナノフロー型高速液体クロマトグラフを用いるが、当該装置と質量分析装置を接続するマスステージを新たに構築し、両装置の接続を試みた。核酸の定量評価を行うために、既存の質量分析装置および分離装置を当該ステージで接続し、稼働条件検討を行った。当該研究課題に関して、平成26年度は最終年度として、これまでに構築した質量分析を用いた核酸の定量評価技術の対象範囲拡張と認証標準物質を用いたバリデーションの実施を行った。特に、前年度までに、高速液体クロマトグラフ(HPLC)を用いた高分子核酸の分離技術を検討したが、中でもサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)カラムを用いた分離系に関して評価を進めた。対象物質としては、モデル物質としてきたオリゴDNAから実用性を踏まえて分子種をRNAに変更し、鎖長についても500塩基から1000塩基程度と大幅な拡張を検討した。これらの分子鎖に対してSECを用いて有効に分離できたほか、分離に用いる緩衝溶液のpHを弱アルカリ側に調整することによって、カラム担体へのRNA分子の吸着を抑え、安定した分離を実現することを見出した。

また、この分離の際には、通常、分子吸着を抑制するために用いられる塩化ナトリウムなどの塩を添加しなくても吸着を抑えて安定に分離可能なカラムと分析条件を見出すことができた。この結果により、質量分析を用いた検出系においても良好に測定することができ、特に誘導結合プラズマ質量分析装置(ICP-MS)を用いた核酸分子内りん元素の質量分析を可能とした。SEC-ICP-MSにより、高分子のRNA分子を分離する系を確立したが、この手法の妥当性評価を行うために、RNA認証標準物質(NMIJ CRM6204-a)を用いた分析評価を行った。その結果、高分子性を保存した核酸分子においても安定して定量分析が可能であることが示され、本分析手法の有効性と実用性を示す結果となった。結果として本研究課題において、DNAとRNAの両分子を対象として、低分子から高分子までの範囲で高分子配列を有した試料を定量的に分析することを可能とした。分析化学当該研究課題について、平成25年度においては、研究計画に従って前年度の研究成果を基にした応用的研究を実施した。平成25年度実施の課題については、研究計画に記した内容と実施内容とは想定した結果と評価結果が概ね符合するものであり、順調に研究が進展していると判断する。特に、測定対象については、従来想定していた低分子化合物よりも範囲を拡げ、高分子の核酸において実証できた点については、予想以上の進展といえる。また、これらの結果については、学会発表と論文投稿を行っており、対外的にも高く評価されていると判断する。当該研究課題に関しては、研究実施初年度である平成24年度において3つの課題を目標として設定し、その計画に従って研究を実施した。平成24年度実施予定の各課題において、計画に示した内容は想定した結果と評価結果が概ね符合するものであり、順調に進展していると判断する。特に、核酸分離分析技術については、学会発表と関係専門誌への論文投稿を行い、投稿論文については内容が評価されて表紙への掲載も決定しており、対外的にも高い評価を得ていると考える。今後の研究については、平成25年度の実施状況が概ね順調であったことから、交付申請時に計画した研究実施計画に従って推進する。平成26年度については、前年度までに構築した核酸定量評価技術の適用範囲を拡大すると共に、認証標準物質を用いたバリデーションを実施することによって、定量評価手法の妥当性評価を行い、研究全体を総括する。平成25年度までに、モデル評価系として、オリゴDNAを測定対象範囲とするが、最終年度では実用性を評価する上でも適用範囲をより高分子範囲かつRNAなどの他の分子種に拡張する。本研究で開発する核酸定量評価技術の妥当性評価について、認証標準物質等の原理の異なる他の定量評価手法で定量された核酸を対象としてバリデーションを実施する。今後の研究については、研究初年度の実施状況が概ね順調であったことから、交付申請時に計画した研究実施計画に従って推進する。特に平成25年度については、初年度に設定した課題の成果に基づき、特に平成24年度設定課題3で準備検討を行った質量分析を用いた核酸の定量評価を実施する。具体的には、合成、評価を行った内標準核酸を用いて、対象となるDNA配列の質量分析を行う。初期のモデル試料としては20-mer程度のオリゴDNAを用い、同位体希釈質量分析法などの他手法で定量評価した核酸を定量することで、その妥当性を評価可能なように準備を行う。
大動脈モデル流れ場における乱流遷移構造の解明

大型哺乳類(ヒトや大型犬など)の大動脈内の血流では、心拍周期毎に乱流が発生・発達・減衰・消滅を繰り返す特異的な乱流遷移が生じていることが知られている。乱流遷移が発生すると流れ場の物理的性質が変化し、動脈壁を構成している血管内皮細胞や血液中の血球成分に対するずり応力の増大、血液中の酸素・二酸化炭素などのガス交換や脂質(コレステロール)等物質の拡散や混合が発生する。病態生理学的にも大動脈内の乱流は、溶血・血栓・粥状動脈硬化等、様々な病変の主因とされている。更に大動脈内の血流の時間変化は単純な正弦波変動でなく、心拍動に伴う周期内に停止期間を持つ間欠的な流れであり、こうした流れ場に発生する乱流の性質を明らかにするため、振動流及び周期的間欠流での実験計測・数値実験・実験データの統計的解析手法の開発を行ってきた。これまでに開発したアンサンブル平均に基づき乱流遷移を瞬時スペクトルを用い、統計的に実験計測した乱流遷移の解析を行った。その結果乱流渦の伸張が顕著に生じるのは管断面の中央領域であることが判明した。また乱流の消失は壁面近傍から早く生じることも判った。これは壁面の存在のよる粘性の影響のためであると考えられる。管中央領域での消失に着目すると、スペクトル解析上は極僅ながら次の周期にも小さな渦が残存し、これが次の周期の遷移に大きく影響していると考えられる。これは、昨年度報告したように、周期毎にほぼ同位相で遷移が発生するが、僅かな揺らぎが遷移位相には存在している。この管中央部に残存する小さな擾乱が揺らぎの1つの原因となっていると考えられる。さらに詳細な遷移の把握のために数値実験も行ってきたが、現在のところ類似した現象はみられるものの、周期数を増加させると発散してしまい現在までのところその原因が計算機能力や計算条件(2次元メッシュやメッシュサイズ)に起因しているのかは究明できていない。人やイヌなどの大型哺乳類の大動脈内血流においては、乱流遷移が観察されている。ここで観察される乱流は,心拍周期毎に乱流が発生・発達・減衰・消滅を繰り返す特異的な現象がみられる。乱流遷移が発生すると流れ場の物理的性質が大きく変化し、動脈壁を構成する内皮細胞や血液中の血球成分に対するずり応力の増大、血液中の酸素・二酸化炭素やコレステロール等物質の拡散や混合が起きる。病態生理学的にも大動脈内の乱流は、溶血・血栓・粥状動脈硬化等、血管・血液病変の要因の一つとされている。しかし大動脈内の血流の時間変化は単純な正弦波の繰り返し変動ではなく、心拍動に伴う周期内に停止期間を持つ間欠流である。こうした流れ場に発生する乱流の性質を明らかにするため、振動流及び周期的間欠流での実験計測・数値実験・実験データの統計的解析手法の開発を行ってきた。これまでの実験計測結果の示すところによると、乱流への遷移は通常の定常的な流れ場に発生する乱流遷移とは異なり、周期のある特定の位相において、管断面全体で乱流への遷移が発生している。これは、上流での乱流遷移が下流へと移流してくるのと同時に、局所でのストークス層領域(壁面近傍)からの遷移がほぼ同時に発生し互いに影響するために、断面全体での遷移が引き起こされるものと考えられる。またこの断面同時に乱流遷移が発生する周期内における位相にも着目し、前述のように周期毎にほぼ同位相で遷移が発生するが、僅かに揺らぎが存在する。これに着目し振動流における乱流遷移の安定性と揺らぎの概念を検討している。これには実験以外に数値実験の結果が不可欠であるが、現状での数値実験結果は似た現象はみられるものの、その原因が計算機能力や計算条件(2次元メッシュやメッシュサイズによる発散)に起因しているのか実際に対応する現象が計算でも捕らえられているのかの検証を行っている。

この管中央部に残存する小さな擾乱が揺らぎの1つの原因となっていると考えられる。さらに詳細な遷移の把握のために数値実験も行ってきたが、現在のところ類似した現象はみられるものの、周期数を増加させると発散してしまい現在までのところその原因が計算機能力や計算条件(2次元メッシュやメッシュサイズ)に起因しているのかは究明できていない。
アンチセンスRNAによるエピジェネティックな修飾の構築機構

Tsixの転写によって産生されるスプライシングを受けたRNAが,Tsixを介したXistの発現制御機構にどのようなインパクトを持つかについては,前年度の解析から,胚発生においてはTsixのスプライシング欠損アリル(Tsix^<ΔSA>)を持つX染色体上でもXistのエピジェネティック制御は適切に確立されることから,Tsixスプライシング産物はTsixによるXist遺伝子のアンチセンス制御を担うものではないという結論に達していた.そこで,平成18年度開始当初は,その投稿準備を進めるとともに,新たにTsixはRNAポリメラーゼII(polII)によって転写されることが必要なのか検討する計画であった.ところが,論文投稿にあたって,いくつかの追加実験を行ったところ,未分化なオスES細胞においてはTsixのスプライシング欠損を持つX染色体からのXistの発現量が野生型のそれに比べ有意に高いことがわかった.これは胚における前年度からの解析結果と一見矛盾するが,Tsix^<ΔSA>アリルを持つこのES細胞を分化させるとXistの発現は野生型同様消失することから,やはりTsixを介したXistの発現制御機構に大きな影響はないことが改めて示された.さらに以前作製したTsix^<ΔSA>とよく似た構造を持つもののTsixによるアンチセンス転写は正常に認められる改変アリル(Xist^<1lox>)を持つES細胞を用いて同様の解析を行った結果,この場合も未分化なES細胞においてのみXistの発現上昇が認められ,分化誘導後のXistの発現は適切に抑えられることがわかった.これらの結果から,Tsix^<ΔSA>とXist^<1lox>で共通に欠失している領域に未分化状態特異的にXistの発現制御に効果を持つ配列が存在すると考えた.一連の成果はDevelopment誌に掲載された.現在は,新たにその存在が示唆された未分化状態特異的に効果を持つXistの発現制御配列について解析を進めている.polIIによる転写の意義に関しては,現在中断している.X染色体不活性化の鍵遺伝子Xistの発現はそのアンチセンス非コード遺伝子Tsixによってクロマチンレベルで負の制御をシスに受ける.これまで,Tsixの効果を担うのがRNA産物なのかアンチセンス転写自体なのかは不明なままであった.当該研究の目的は,遺伝子改変マウスを作製することでRNA産物の重要性を確かめる一方,Tsix RNAと相互作用する因子を同定し,Xist遺伝子座のクロマチンの修飾におけるその役割を検討することである.本年度はTsixによるTsix遺伝子座クロマチン制御における成熟型Tsix RNA産生の意義について検討するため,Tsixのスプライシングを妨げ成熟型のRNAが産制されなくなるような新たなTsix^<ΔSA>アリルをマウスに導入し,胚発生におけるその影響を解析した.私たちは,Xist遺伝子座のCpGメチル化,DNaseI高感受性部位の有無,クロマチン免疫沈降を行うことでTsixを介したクロマチン制御機能が損なわれているかどうか評価する系をこれまでの研究で確立している.この系を利用して,E13.5のマウス胚より調製したクロマチンの解析を行った結果,Tsix^<ΔSA>を持つX染色体上のXist遺伝子座のクロマチン修飾や構造は,野生型のそれと比べ変化がないことがわかった,このことから,Tsixを介したXist遺伝子座のクロマチン制御は,たとえスプライシングを受けた成熟型のTsix RNAが産生されなくても,正常に機能することが示唆された.しかしながら,Tsix^<ΔSA>アリルからはその転写によってスプライシングを受けない長大なRNAが作られているので,今回の結果からはTsixの機能を担うのがRNA分子なのかアンチセンス転写自体なのかについては,更なる解析が必要である.現在,これまでに得られた結果について投稿準備を進めている.Tsixの転写によって産生されるスプライシングを受けたRNAが,Tsixを介したXistの発現制御機構にどのようなインパクトを持つかについては,前年度の解析から,胚発生においてはTsixのスプライシング欠損アリル(Tsix^<ΔSA>)を持つX染色体上でもXistのエピジェネティック制御は適切に確立されることから,Tsixスプライシング産物はTsixによるXist遺伝子のアンチセンス制御を担うものではないという結論に達していた.そこで,平成18年度開始当初は,その投稿準備を進めるとともに,新たにTsixはRNAポリメラーゼII(polII)によって転写されることが必要なのか検討する計画であった.ところが,論文投稿にあたって,いくつかの追加実験を行ったところ,未分化なオスES細胞においてはTsixのスプライシング欠損を持つX染色体からのXistの発現量が野生型のそれに比べ有意に高いことがわかった.これは胚における前年度からの解析結果と一見矛盾するが,Tsix^<ΔSA>アリルを持つこのES細胞を分化させるとXistの発現は野生型同様消失することから,やはりTsixを介したXistの発現制御機構に大きな影響はないことが改めて示された.さらに以前作製したTsix^<ΔSA>とよく似た構造を持つもののTsixによるアンチセンス転写は正常に認められる改変アリル(Xist^<1lox>)を持つES細胞を用いて同様の解析を行った結果,この場合も未分化なES細胞においてのみXistの発現上昇が認められ,分化誘導後のXistの発現は適切に抑えられることがわかった.これらの結果から,Tsix^<ΔSA>とXist^<1lox>で共通に欠失している領域に未分化状態

特異的にXistの発現制御に効果を持つ配列が存在すると考えた.一連の成果はDevelopment誌に掲載された.現在は,新たにその存在が示唆された未分化状態特異的に効果を持つXistの発現制御配列について解析を進めている.polIIによる転写の意義に関しては,現在中断している.
胃酸分泌にかかわる2種のCl^-チャネルの機能・構造・制御の解明

1)ほとんどすべての細胞の膜電位は細胞内外のK^+平衡電位で規定されているが、本研究においてウサギ胃腺の壁細胞では細胞内外のCl^-平衡電位で規定されていることを発見した。この膜電位形成にあずかる側基底膜中のCl^-チヤネルは0.3pSという小さなコンダクタンスを有し、アラキドン酸(AA)やプロスタグランヂンE_2(PG)によってオ-プンすることがわかった(J.Physiol.1992).胃腺において、内因性外因性のAA,PGはストレス等によって誘因される粘膜障害に対して防御作用を有することは知られている。しかし、これらの物質が細胞レベルでいかなる作用を引き出しているかこれまで不明であった。本研究では細胞防御に関係するこのチヤネルの生理学的意義、その制御機構を明らかにした。このCl^-チヤネルは細胞内GTP〓Sにより不活性化されることを発見した(酒井ら。投稿中)。更に、細胞内フリ-ラヂカルとの関連も明確になった。AAは他の細胞では、頂端膜中のCl^-チヤネルを不活性する例が報告されている。Cl^-チヤネルを活性化する例は始めてである。GTP〓Sは肥満細胞、クロマフィン細胞、腎CCD細胞、ヒト大腸がん細胞等のCl^-チヤネルを活性化すると報告されている。本研究のCl^-チヤネルがGTP Sにより不活性化される例は新しい発見である。このように、AAとGTP〓Sの効果が他の例とあべこべな現象は、apicalとbasolateralの極性の違いによる一般的現象なのか、壁細胞特有の鏡世界現象なのか是非調べる必要がある。2)アカハライモリの胃酸分泌細胞を単離した状態では、細胞表面に頂端膜と側基底膜が混在することをプロトンポンプ阻害剤E3810を使うことにより示した。(竹口ら、Jan.J.Physiol.1992).更に頂端膜中のCl^-チヤネルを捕らえることに成功した。投稿中)。(1)漿膜側Cl^-チャネルについて。全細胞パッチクランプ法を使って,Cl^-電流を捕えた。このCl^-チャネルについてはこれまで知られていないものであった。哺乳動物の胃酸分泌細胞の細胞膜電位を獲得するのに非常に重要なチャネルであることがわかった。このチャネルは,Cl^-チャネル阻害剤であるNPPB阻害された。単一チャネル電流は非常に小さく,ノイズアナリスより単一電流は,約0.35pSであることが判明した。細胞内のいかなるメッセンジャ-によって,このCl^-チャネルが制御されているかを調べたところ,アラキドン酸によって活性化を受けることがわかった。最近アラキドン酸によって不活性化を受けるCl^-チャネルが報告されているが,活性化を受けるCl^-チャネルはこれが初めてである。このCl^-チャネルは,細胞膜電位を形成するとともに,外部より障害が加わったりすると,アラキドン酸生成を介して,細胞膜電位を深くして,細胞を防御する機能を有すると考えられる。現在インタ-ロイキンとの関連について調べている。(2)分泌側Cl^-チャネルについて。哺乳動物の単離した胃酸分泌細胞では、頂端膜がメディウムに露出していなく,パッチクランプ法によって,頂端膜側Cl^-チャネルの研究を行うことは不可能である。

しかし,我々の研究からは,下等なアカハライモリの胃酸分泌細胞を,ヒスタミンH_2アンタゴニスト存在下で調整すると,漿膜側膜と頂端膜との極性を維持した状態で,また頂端膜がメディウムに露出した状態で標本として得ることができた。このことを,頂端膜中に存在するH^+,K^+ーATPaseの細胞外に面している部分のペプタイドを抗原としてポリクロナ-ル抗体を作製し,その抗体が細胞外表面の一部を蛍光抗体染色できることから示した。今後,セルアタッチパッチで,このCl^-チャネルの同定を進める予定である。1)ほとんどすべての細胞の膜電位は細胞内外のK+平衡電位で規定されているが、我々の最近の知見ではウサギ胃腺の壁細胞では細胞内外のCl-平衡電位で規定されている。この膜電位形成にあずかる側基底膜中のCl-チヤネルは0.3pSという小さなコンダクタンスを有し、アラキドン酸(AA)やプロスタダランヂンE2(PG)によってオ-プンすることがわかった(J.Physiol.1992).胃腺において、内因性外因性のAA,PGはストレス等によって誘因される粘膜障害に対して防御作用を有することは知られている。しかし、これらの物質が細胞レベルでいかなる作用を引き出しているかこれまで不明であった。本研究では細胞防御に関係するこのチヤネルの生理学的意義、その制御機構を明らかにした。このCl-チヤネルは細胞内GTP Sにより不活性化されることを発見した(酒井ら。投稿中)。更に、細胞内フリ-ラヂカルとの関連も明確になった。AAは他の細胞では、頂端膜中のCl-チヤネルを不活性する例が報告されている。Cl-チヤネルを活性化する例は始めてである。GTP Sは肥満細胞、クロマフィン細胞、腎CCD細胞、ヒト大腸がん細胞等のCl-チヤネルを活性化すると報告されている。本研究のCl-チヤネルがGTP Sにより不活性化される例は新しい発見である。このように、AAとGTP Sの効果が他の例とあべこべな現象は、apicalとbasolateralの極性の違いによる一般的現象なのか、壁細胞特有の鏡世界現象なのか是非調べる必要がある。2)アカハライモリの胃酸分泌細胞を単離した状態では、細胞表面に頂端膜と側基底膜が混在することをプロトンポンプ阻害剤E3810を使うことにより示した。(竹口ら、Jan.J.Physiol.1992).
ラクトソームを用いた新しいアレルギー疾患治療法の探索

I型アレルギー反応はIgEによって誘導される有害な生体反応である。抗原に結合することによって、IgEは好塩基球やマスト細胞を刺激して、様々な炎症媒介物質を分泌させアレルギー反応を誘導する。アレルギーを抑えるための一つの方法としてステロイドを用いた免疫抑制があるが、この方法は他の有益な免疫反応も抑制してしまうといった負の側面を持つ。この研究では、私たちはラクトソームと呼ばれるナノ粒子を、薬剤を運搬するキャリアーとして使用することによって、生体内でのIgEを減らすことでアレルギーの治療を目指し、限定的ではあるが治療への可能性を示唆するデータが得られた。レチノイン酸を内包したラクトソームと、TGF-betaを架橋したラクトソームを別々に作製した。当初は、ラクトソームの内側に位置する疎水性部分にレチノイン酸を内包させ、外側に位置する親水性部分にTGF-betaを架橋したラクトソームを作成する事を計画していた(一つのラクトソームにレチノイン酸とTGF-beta両方を持つ分子を作成する事を計画していた。)しかし、レチノイン酸内包ラクトソームと、TGF-beta架橋ラクトソームを別々に調製して、それらの活性を確認する事から行った。まず、ラクトソームに内包されたレチノイン酸と、ラクトソームに架橋されたTGF-betaの活性をin vitroのクラススイッチ誘導実験にて確認した。ラクトソームに結合したレチノイン酸とTGF-betaは、それぞれ一定の活性を持つことが確認された。レチノイン酸を内包するラクトソームは、内包するレチノイン酸量を変化させる事によって、ナノ粒子の直径が変化する事が分かってきた。そのため、実際に生体内に投与した際、血管透過性の亢進した炎症部位にレチノイン酸を届ける担体として適した大きさを探る実験を行って、次のステップに進めるための足がかりとなるdataを収集する予定である。粒子に関する情報を収集し、実際の生体内で使用する粒子が決定した後、これらの粒子を用いて生体内でのアレルギー治療への影響を調べる。レチノイン酸を内包したラクトソームと、TGFーB1を表面に架橋したラクトソームに結合した因子の生理活性を調べた。脾臓B細胞を用いて、リポポリサッカライド(LPS)、TGF-b1、レチノイン酸によるIgAへのスイッチ誘導系で評価した。TGF-b1やレチノイン酸を様々な濃度で誘導し、レチノイン酸を内包したラクトソームや、TGFーB1を表面に架橋したラクトソームに結合しているレチノイン酸やTGF-b1の実際の量を生理的活性で補正した。ラクトソームに結合したレチノイン酸を結合したラクトソーム、TGF-b1を結合したラクトソームの生理活性の評価まで終了したが、生体内に投与するレチノイン酸、TGF-B1の量を考える予備実験を行った上で本番の実験に入る必要がある。この予備実験にもう少し時間が必要である。レチノイン酸を内包したラクトソームと、TGF-beta1を架橋したラクトソームを別々に作成し、それぞれの活性をin vitroでのクラススイッチ誘導系にて評価した。それぞれある程度の生理活性を確認できたが、その活性は期待していた値よりもかなり低かった。まずこれらの試薬を、マウスアレルギー性鼻炎を誘導する時期に同時に投与することによって、アレルギー性鼻炎発症の抑制効果を調べた。この段階での投与によって、アレルギー性鼻炎の発症に対するある程度の抑制効果が観察されたが、その効果は限定的であった。この解析から、IgAへのクラススイッチを促進する因子を、ラクトソームによって提供するDDSは、アレルギー性鼻炎を抑制する上で有効である可能性が示唆された。しかし効果はまだまだ不十分であることから、今後はラクトソームへのレチノイン酸の内包と、TGF-b1のラクトソームへの架橋の仕方を工夫することによって、より高い活性を持つ試薬を作成することが必要となる。ラクトソーム粒子を合成した後、様々な試薬を内包するラクトソームを作るには経験が必要である。一年でこの試薬を作成できたので、ほぼ順調に進んでいると考えられる。上述のように、もう少しの予備実験を終了した時点で本番のアッセイに入る予定である。分子生物学予定通り、アレルギーモデルマウスにこの試薬を投与して影響を調べていく。in vitroでのクラススイッチ誘導の実験が安定して行えなくなってしまったことが主な原因である。今まで使用していたLPSのロットが変わってしまったことから、今までのようにIgAへのクラススイッチを効率よく誘導することが難しくなった。このために培地など様々な条件を検討して、今入手可能なLPSを用いて効率よく誘導できる系を何とか立ち上げることに成功した。マウスを用いた実験で作成したラクトソームの影響を調べる予定である。マウスや免疫試薬などで30万円程度必要である。
C型肝炎の新規薬剤に対する耐性変異ウイルスの存在頻度と治療効果との関連について

テラプレビル併用療法の非著効例に対して、シメプレビル併用療法を施行したC型肝炎21例を対象とし、有用性と著効に寄与する因子ならびにUltra-deep sequenceを用いて薬剤耐性変異について検討した。著効率は50%であった。著効に寄与する因子は、前治療ペグインターフェロン・リバビリン療法の再燃例のみであった。シメプレビル療法開始時にテラプレビル関連変異を認めた症例は29%であったが、両者の交叉耐性変異を認めたのは1例のみであり、この症例は著効となった。以上より、テラプレビルの交叉耐性変異はシメプレビルの治療効果に影響を与えず、耐性変異の影響は軽微であることが示唆された。C型肝炎に対するテラプレビル(TVR)3剤併用療法の非著効例の大半で検出される薬剤耐性ウイルスが,第二世代プロテアーゼ阻害薬であるシメプレビル(SMV) 3剤併用療法に与える影響を検討した。TVR併用療法非著効例に対してSMV併用療法を開始したGenotype 1型のC型慢性肝疾患7例(男性/女性:4例/3例、平均年齢62.4歳、TVR併用療法:再燃3例/無効2例/中止2例)を対象とし、NS3領域(36, 43, 54, 55, 80, 122, 155, 156, 168, 170)のアミノ酸変異の解析をDirect sequence法ならびにDeep sequence法を用いて行っている.この結果、SMV療法前のNS3遺伝子多型は7例中4例(V36G/L: 2例/1例、Q80L :1例、S122G: 1例、V170I 2例)に認めた。SMV療法開始後4週以上経過した4例中2例は、4週時HCV RNA陰性化(再燃例,治療前V36L)、感度以下陽性(再燃例,治療前変異なし)と抗ウイルス効果良好であったが、他の2例は、4週時HCV RNA 3.6 Log IU/mL(再燃例,治療前V36G/Q80L/V170I)、4.6 Log IU/mL(無効例,治療前V170I)と抗ウイルス効果不良であった。最後の症例では、TVR療法前よりV36G/V170Iの変異を認め, SMV療法前(TVR治療中止72週後)にもV170Iの変異を認め,SMV療法4週時点には, V170Iに加えてS122G, D168Vの新たなSMV耐性変異の出現を認めた.次世代シークエンサーを用いて、シメプレビル(SMV)に対する耐性変異部位の治療前遺伝子多型の存在と治療効果との関連について検討した。対象は,当院においてSMV3剤併用治療国内第3相臨床試験に参加したGenotype 1C型慢性肝炎20例(初回治療6例/前治療再燃7例/前治療無効7例)である。治療前の遺伝子多型(NS3領域: 43, 80, 122, 155, 156, 168)について、direct sequence法ならびにdeep sequence法にて検討し、さらに治療効果との関連について解析した。Deep sequence法は、Ion PGM (Life Technologies)を用いた。治療前遺伝子多型の検出頻度は、direct sequence法では、S122G (55%)、S122T (5%)、S122N (5%)であり、deep sequence法では、F43S(15%)、Q80R/K(60%/25%)、S122G/T/N/V/A/K(100%/80%/30%/15%/15%/5%)、R155Q (5%)、A156S(10%)、D168E/T(10%/5%)であった。SMV3剤併用治療の治療効果は、初回治療と前治療再燃では全例SVRとなり、前治療無効はSVR 3例、再燃2例、無効1例であった。治療前にSMV耐性遺伝子多型を認めた症例のうちSVRを達成したのは、F43は2/3例、Q80は11/13例、S122は17/20例、R155は1/1例、A156は1/1例、D168は3/3例であった。無効となった1症例における12週時の耐性変異の頻度は、Q80R/K(72/0%/0/5%)、S122N/I/T/G(42.3%/24.7%/20.5%/7.0%)、R155K(0.6%)、D168E/V(70.8%/2.3%)であったが、S122T/G以外は治療前とは異なり新たに出現した耐性変異であった。次世代シークエンサーを用いた解析により、SMV3剤併用治療において治療前から多くの症例にSMV耐性遺伝子多型を認めたが、その多くの症例でSVRが達成された。また無効例では、治療前とは異なる新たな変異の出現を認めた。治療前耐性変異と治療効果との関連については更なる検討を要する。今回、当院および関連施設にて2015年9月までにDCV/ASV療法を考慮したC型肝炎607例について薬剤耐性変異を測定した(Invader法).変異結果をもとに治療が開始された前治療SMV