hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
表情定量解析に基づくパーキンソン病の仮面様顔貌の病態解明

また,表情変動減少は注意・遂行機能を中心とした心理検査,抑うつ症状と関連を認め,安静時fMRI解析の結果,表情変動減少は前頭葉を中心とした機能的結合性の変化と関連していた.以上より,仮面様顔貌は認知情動障害と関連したより高次の症候である可能性が示唆された.神経内科、神経心理学、高次脳機能障害表情解析ソフトのアップデートが行われ,次年度でのアップデート版の購入が必要になった.また次年度より画像解析の詳細を行っていくため,画像解析ワークステーションの構築を予定している.アップデート版の表情解析ソフトの購入,およびデータの更新.画像解析ワークステーションの購入および,画像解析・糖型解析ソフトの購入を予定している.
α1-酸性糖タンパク質分子上における薬物結合部位のマッピング

血清タンパク質の一つであるα_1-酸性糖タンパク質(AGP)は、塩基性薬物の主要結合タンパク質として機能しているものの、リガンド結合部位の詳細な位置関係、いわゆるトポロジーは全くと言ってよい程明らかにされていない。本研究の目的は、光アフィニティラベル法、部位特異的変異法及びドッキングシミュレーションなど種々の方法によりその詳細を明らかにし、薬物結合部位のトポロジー解析を行うことである。1.F1*S体に選択的に結合することが知られているプラゾシンをアジド化することにより、光反応性を持った[^3H]アジドプラゾシンを得ることに成功した。その後、F1*S体を光ラベル化後、これまでと同様の手法でペプチドへ断片化し、エドマン分解によるアミノ酸配列解析及びマススペクトル法によりラベル化されたアミノ酸残基を同定した。その結果、^<64>Glu、^<92>Val、^<98>Phe、^<100>Hisが結合に関与している可能性が強く示唆された。さらにAGPの薬物結合部位における多型間の相違についてトポロジー解析を行い、化学修飾法や部位特異的変異法により^<97>His、^<122>Trp、^<160>TrpがAGPの薬物結合に重要な残基であることが明らかとなった。2.大腸菌により組換え型AGP(F1*S体とA体)の作製に成功した。その後、Crystal screenやWizardなどの結晶化キットを用いて組換え型AGPの結晶化に成功した。最適な結晶化条件は現在検討中であり、X線結晶構造解析により、それぞれの立体構造を解明できる秒読み段階である。また、得られたF1*S体とA体を用いてそれぞれに選択的に結合する薬物とのドッキングシミュレーションを行うことにより、化学修飾法や部位特異的変異法の結果を更に裏付けるものになると考えられる。本研究は、光アフィニティラベル法及び部位特異的変異法により、AGP分子上の薬物結合部位のマッピングを行うことを目的として実施された。以下に今年度得られた知見を要約する。1)[3H]Flunitrazepamのラベル化に対する各種バリアント選択的薬物の阻害効果についての検討を行った結果、F1*S体におけるラベル化は、F1*S体に結合選択性を有するワルファリン及びジピリダモールを加えることで有意に阻害された。一方、A体に対するラベル化は、選択的薬物であるジソピラミド、プロパフェノン及びイミプラミンで有意に阻害された。2)F1*S分子上の薬物結合に関与していると考えられるアミノ酸残基をアラニンに置換したH97A、H100A及びW122A変異体を作製し、限外ろ過法により薬物結合性の評価を行った結果、ワルファリンの関してはH97A及びW122Aにおいて、ジピリダモールに関しては、H100A及びW122Aにおいて有意な結合性の低下が観察された。これらの結果より、97位及び100位のHis残基及び122位のTrp残基がF1*S体の薬物結合に関与していることが示唆された。3)Cu(II)イオシはA体にのみ特異的に結合し、さらにE92Q、H100A及びC149A変異体で有意な結合性の低下が観察された。また、E92Q/H100A変異体では、E92Q及びH100A変異体と比較.して有意な結合性の低下が観察された。

さらにA体においてもW122A変異体で結合性が低下したため、122位のTrp残基の重要性が示唆された。;れらの結果より、A体の薬物結合においては92位のGlu残基、100位のHis残基及び122位のTrp残基が重要な役割を演じており、A体選択的結合性薬物の認識機構に関わっているものと考えられた。血清タンパク質の一つであるα_1-酸性糖タンパク質(AGP)は、塩基性薬物の主要結合タンパク質として機能しているものの、リガンド結合部位の詳細な位置関係、いわゆるトポロジーは全くと言ってよい程明らかにされていない。本研究の目的は、光アフィニティラベル法、部位特異的変異法及びドッキングシミュレ-ションなど種々の方法によりその詳細を明らかにし、薬物結合部位のトポロジー解析を行うことである。1、F1*S体に選択的に結合することが知られているプラゾシンをアジド化することにより、光反応性を持った[3^H]アジドプラゾシンを得ることに成功した。その後、F1*S体を光ラベル化後、これまでと同様の手法で酵素処理によりペプチドへ断片化し、放射活性を持ったペプチド断片を分離・精製し、エドマン分解によるアミノ酸配列解析及びマススペクトル法によりラベル化されたアミノ酸残基の同定を行った。その結果、<64>^Glu、<92>^Val、<98>^Phe、<100>^Hisが結合に関与している可能性が強く示唆された。現在、Kopecky博士らがホモロジーモデウシグにより、AGPの薬物結合部位における多型間の相違についてトポロジー解析を行っている。2、大腸菌で得られた組換え型AGP(F1*S体とA体)の作製に成功した。その後、Crystal screenやWizardなどの結晶化キットを用いて組換え型AGPの結晶化を行い、両者とも結晶化に成功した。現在、最適な結晶化条件を検討しており、近い将来、X線結晶構造解析により、それぞれの立体構造を解明できると考えている。また、得られたF1*S体とA体を用いてそれぞれに選択的に結合する薬物とのドッキングシミュレーションを行い、薬物結合サイトのトポロジー解析を行う予定である。
OCT3/4及びSOX2による癌幹細胞能力と癌転移能の誘導

本研究は、癌細胞に対して体細胞初期化因子が癌幹細胞特性を誘導するか否かを明らかにすることを目標として遂行し、前年度作成したプロトコールによりその可能性が明らかと成った事から更に以下の解析を進めた。平成23年度は、(1)既報の癌幹細胞マーカーの解析(2)初期化因子導入株の薬剤耐性能の解析(3)初期化因子導入株のin-vivoでの腫瘍形成能の解析(4)誘導型癌幹細胞(初期化因子導入株)の更なる解析以上の解析を目標とした。(1)に関しては、定量的RT-PCRを用いて、既報の癌幹細胞マーカー:CD133,CD44,について解析した。これにより初期化因子導入株はMock株に比して、いずれのマーカーもその発現が有意に上昇することが示された。(2)に関しては、消化器癌治療に一般的な抗癌剤:5-FUを用いて、抗癌剤耐性能の比較実験を行った。初期化因子導入株はMock株に比して、生存率の有意な増加がみられた。(3)に関しては、異種異所性移植(ヌードマウス皮下)で、初期化因子導入株とMock株(コントロール)の腫瘍形成能を比較した。この際、1x10^6 cells, 3x10^5 cellsの希釈系列を用いて行った。この結果から、初期化因子導入株はMock株に比して、(1)腫瘍形成個数、(2)形成される腫瘍の大きさ共に有意に増大する事が示された。(1)(3)の結果から、体細胞初期化因子が癌細胞株に対して、既報の癌幹細胞マーカーの発現、治療抵抗性に通じる抗癌剤耐性能、vivoの環境下での腫瘍形成能力を高めることが示された。これらの能力は、既報の癌幹細胞研究において必須と考えられる能力であり、体細胞初期化因子を用いたプロトコールで人工的な癌幹細胞(iCSC)を作成できることが示唆された。(4)に関して現在、a)初期化因子導入株の更なる解析と、b)初期化因子導入株中の誘導型癌幹細胞の抽出方法を解析中である。計画に掲げた実験内容は概ね予定通りに進んでいる。一方、本研究の結果から誘導型癌幹細胞の抽出方法の発見というあらたな知見に到達したため、現在これを追加検討項目として遂行している。体細胞初期化因子を用いて誘導型癌幹細胞(iCSC)の作成が可能であることが示唆された。癌幹細胞研究の現時点での大きな問題は、その生物学的特性を維持するためのニッチおよびkey role geneが不明な点であり、今後このiCSCを用いてその絞り込みを行う予定である。これらを明らかにすることで表面マーカー探索によらない、新たな癌幹細胞ターゲット治療の開発を目指す。本研究は、体細胞初期化因子が癌細胞に対して癌幹細胞特性を誘導する(仮説)か否かを明らかにすることを目標として研究を遂行した。平成22年度は、主にin-vitroの系で以下(1)(2)の解析を行った。(1)本研究における被誘導細胞株の機能解析に基づくプロトコール作成(2)上記のプロトコールを用いて、これ迄に報告された癌幹細胞の特性が誘導されるかを評価する実際は、(1)と(2)を同時に行い、より再現性の高いプロトコールの確立を目指した。(1)に関しては、山中らによって報告されたiPS細胞誘導法(以下、山中法)をモチーフとして、これを大腸癌細胞株に適応できるように、修正を繰り返した。山中法でそのまま施行する場合、被誘導細胞自体が自律増殖能を有していることが、fibroblastからのiPS誘導方法と異なる点を考慮し、誘導遺伝子の組み合わせや培養環境、継代方法を工夫した。また、至適誘導法を探索するなかで、誘導遺伝子の組み合わせや培養環境・継代方法などによって遺伝子導入効率・形質転換パターン・誘導される癌幹細胞能の程度など、獲得する性質およびその表現型にばらつきがみられた。そこで、これらの条件検討をすすめ、より安定かつ高効率な誘導が行えるプロトコールを確立した。(2)に関しては、上記で条件検討を行いつつ、既に報告されてきた癌幹細胞特性が誘導されているか否かの評価を繰り返し行った。これにより、癌幹細胞特性を効率よく誘導する条件に至ったが、一方で、上述の如く誘導される性質やその程度にばらつきがみられるという知見を得ることができ、「獲得する性質のパターンの違い」とそれらの条件との相関についての知見も得ることができた。以上から、山中のiPS誘導法をmodifyすることで、癌細胞株に対して癌幹細胞能を誘導する事が可能であるという知見とともに、それらに貢献する条件の違いという興味深い知見にも到達する事ができた。

(2)に関しては、消化器癌治療に一般的な抗癌剤:5-FUを用いて、抗癌剤耐性能の比較実験を行った。初期化因子導入株はMock株に比して、生存率の有意な増加がみられた。(3)に関しては、異種異所性移植(ヌードマウス皮下)で、初期化因子導入株とMock株(コントロール)の腫瘍形成能を比較した。この際、1x10^6 cells, 3x10^5 cellsの希釈系列を用いて行った。この結果から、初期化因子導入株はMock株に比して、(1)腫瘍形成個数、(2)形成される腫瘍の大きさ共に有意に増大する事が示された。(1)(3)の結果から、体細胞初期化因子が癌細胞株に対して、既報の癌幹細胞マーカーの発現、治療抵抗性に通じる抗癌剤耐性能、vivoの環境下での腫瘍形成能力を高めることが示された。これらの能力は、既報の癌幹細胞研究において必須と考えられる能力であり、体細胞初期化因子を用いたプロトコールで人工的な癌幹細胞(iCSC)を作成できることが示唆された。(4)に関して現在、a)初期化因子導入株の更なる解析と、b)初期化因子導入株中の誘導型癌幹細胞の抽出方法を解析中である。計画に掲げた実験内容は概ね予定通りに進んでいる。一方、本研究の結果から誘導型癌幹細胞の抽出方法の発見というあらたな知見に到達したため、現在これを追加検討項目として遂行している。体細胞初期化因子を用いて誘導型癌幹細胞(iCSC)の作成が可能であることが示唆された。癌幹細胞研究の現時点での大きな問題は、その生物学的特性を維持するためのニッチおよびkey role geneが不明な点であり、今後このiCSCを用いてその絞り込みを行う予定である。これらを明らかにすることで表面マーカー探索によらない、新たな癌幹細胞ターゲット治療の開発を目指す。
植物の栄養応答のシステムバイオロジー

本研究では、植物の生育に必須の元素である硫黄とモリブデンに関して、その吸収や栄養環境の変化が、植物にどのような代謝と遺伝子発現の変化を引き起こすのかについて網羅的な解析を行い、基礎的な分子生物学的知見を得ることと、そこから発展して植物の栄養応答制御を通じた生産性の向上などへの応用に結びつけることを目的として研究を進めていった。多量必須元素である窒素と硫黄の比に応答してレポーター遺伝子の発現量が変化する形質転換シロイヌナズナを材料に、硫黄欠乏に対する遺伝子発現応答に異常が見られる変異株をこれまで複数単離し原因遺伝子を同定した。これらの変異株を用いて通常条件と硫黄欠乏条件での遺伝子発現や代謝産物の変化を解析した。その結果、硫黄欠乏応答にかかわる新たな代謝経路、制御経路を見出すことができた。微量必須元素であるモリブデンは、窒素同化に重要な硝酸還元酵素や、植物ホルモンの合成に関わる酵素などに補酵素として含まれる重要な元素だが、その欠乏応答についてはこれまでほとんど解析されていなかった。シロイヌナズナで最近同定されたモリブデン酸トランスポーターの欠損株は、野生型株と比べ、モリブデン欠乏に対して感受性であった。この変異株と野生型株のモリブデン欠乏応答を調べるために、理化学研究所と協力してトランスクリプトーム解析およびメタボローム解析を進めた。その結果、アミノ酸や有機酸など多数の代謝産物の蓄積がモリブデン欠乏によってどのようなパターンで変化するのかを知ることができ、また、モリブデン欠乏によって発現が顕著に変化する転写因子やシグナル伝達、代謝などに関わる遺伝子を多数見つけることができた。これらの成果を学会で発表したので、これから論文を投稿する予定である。本課題研究の目的は、植物の栄養応答の制御に関わる新たな因子の同定(1)と、植物の栄養応答メカニズムの全体像の解明(2)である。以下に一年目の本研究成果の概要を示す。(1)多量必須元素である窒素と硫黄の比に応答してレポーター遺伝子の発現量が変化する形質転換シロイヌナズナを材料に、硫黄欠乏に対する遺伝子発現応答に異常が見られる変異株をこれまで複数単離していた。本年度は、これらの変異株で原因遺伝子が分かっていなかった系統について遺伝的マッピングを行い、硫黄欠乏応答異常の原因遺伝子を同定することを目指し実験を進めた。その結果、これまでに我々が得た7つの遺伝子に加え、新たに3つの遺伝子をほぼ同定することができた。これでこれまで得たすべての変異株の原因遺伝子の同定がほぼ完了したので、今後は実験を補いつつ、変異株ごとに論文をまとめる予定である。(2)微量必須元素であるモリブデンは、窒素同化に重要な硝酸還元酵素や、植物ホルモンの合成に関わる酵素などに補酵素として含まれる重要な元素だが、その欠乏応答についてはこれまでほとんど解析されていなかった。この変異株と野生型株のモリブデン欠乏応答を調べるために、理化学研究所のメタボローム基盤研究グループと協力してトランスクリプトーム解析およびメタボローム解析を進めた。その結果、アミノ酸や有機酸など多数の代謝産物の蓄積がモリブデン欠乏によって大きく変化することがわかった。また、モリブデン欠乏によって発現が顕著に変化する転写因子やシグナル伝達、代謝などに関わる遺伝子を多数見つけることができた。これから引き続き解析を進めていく予定である。本研究の目的は、植物の栄養応答の制御に関わる新たな因子の同定と、植物の栄養応答メカニズムの全体像の解明である。以下に本年度の研究成果の概要を示す。(1)多量必須元素である窒素と硫黄の比に応答してレポーター遺伝子の発現量が変化する形質転換シロイヌナズナを材料に、硫黄欠乏に対する遺伝子発現応答に異常が見られる変異株を複数単離し、遺伝的マッピングにより原因遺伝子の同定を行ってきたが、本年度はそれぞれの変異株の生理学的解析を行った。UPLC装置を用いて植物体内の遊離アミノ酸濃度を測定し、キャピラリー電気泳動装置を用いて植物体中のイオン濃度を測定した。これにより硫黄欠乏によって起こる野生型株と変異株の代謝の変化についてより詳しい知見が得られた。また、マイクロアレイ実験により、硫黄欠乏によって野生型株と変異株でどのような遺伝子発現パターンの違いが見られるのかを解析した。(2)シロイヌナズナで最近同定されたモリブデン酸トランスポーターMOT1の欠損株は、野生型株と比べ微量必須元素であるモリブデンの欠乏に対して感受性であった。この変異株と野生型株のモリブデン欠乏応答を調べるために遺伝子発現と代謝変動を網羅的に解析した。トランスクリプトーム解析およびメタボローム解析は本年度も引き続き共同研究として理化学研究所のメタボローム基盤研究グループと行った。GC-TOF/MSおよびCE-TOF/MSを用いて多数のサンプルで代謝産物の変化を調べ、モリブデン欠乏が多くの代謝産物の蓄積の変化をもたらすことが明らかとなった。特定の遺伝子がモリブデン欠乏で変化することも確かめられた。また、モリブデン補酵素が生成に関与する植物ホルモンであるABAの内在量の測定を、理化学研究所の成長制御研究グループと共同で行い、モリブデン欠乏がABAの合成にもわずかに影響を与えることが示された。

多量必須元素である窒素と硫黄の比に応答してレポーター遺伝子の発現量が変化する形質転換シロイヌナズナを材料に、硫黄欠乏に対する遺伝子発現応答に異常が見られる変異株をこれまで複数単離し原因遺伝子を同定した。これらの変異株を用いて通常条件と硫黄欠乏条件での遺伝子発現や代謝産物の変化を解析した。その結果、硫黄欠乏応答にかかわる新たな代謝経路、制御経路を見出すことができた。微量必須元素であるモリブデンは、窒素同化に重要な硝酸還元酵素や、植物ホルモンの合成に関わる酵素などに補酵素として含まれる重要な元素だが、その欠乏応答についてはこれまでほとんど解析されていなかった。シロイヌナズナで最近同定されたモリブデン酸トランスポーターの欠損株は、野生型株と比べ、モリブデン欠乏に対して感受性であった。この変異株と野生型株のモリブデン欠乏応答を調べるために、理化学研究所と協力してトランスクリプトーム解析およびメタボローム解析を進めた。その結果、アミノ酸や有機酸など多数の代謝産物の蓄積がモリブデン欠乏によってどのようなパターンで変化するのかを知ることができ、また、モリブデン欠乏によって発現が顕著に変化する転写因子やシグナル伝達、代謝などに関わる遺伝子を多数見つけることができた。これらの成果を学会で発表したので、これから論文を投稿する予定である。
放射線被曝によるマウス催奇性障害におけるp53遺伝子の役割

動物モデルにおいて、発生初期の胚は、催奇性傷害に対して強力な防御機構を備えていることが示されているが、その実体が解け始めた。DNA損傷修復に深く関与している癌抑制遺伝子p53は、概念的には、変異を持つ遺伝子を娘細胞へ伝達させないように、遺伝情報の損傷を見張る“番人"としての働きが考えられている。奇形発生の防御に、p53遺伝子がどの程度重要な役割を果たしているのかを知る有効な方法は、p53遺伝子を欠如したマウスを用いて解析することである。p53欠損マウス(p53^<-1->)の胚(胎齢3.5日)は、普通マウス(p53^<+1+>)胚に比し、放射線抵抗性である。しかし、2GyのX線被曝後、生まれてきたp53^<-1->マウスには、80%以上の高頻度で奇形が生じる。一方、p53^<+1+>マウスは放射線致死感受性であるが、生存胎仔には奇形はみられない。主要器官形成期(胎齢9.5日)に被曝した場合も同様の傾向を示し、p53遺伝子機能の有無により、放射線致死感受性と催奇感受性とは、相反関係を示す(但し、1Gyの被曝までは、胎仔死亡、奇形ともに増加しない)。普通マウスの初期胚には、正常に生まれるか、死かに弁別する、きわめて優れた傷つき細胞の除去機構が備わっている。事実、p53^<+1+>マウスの胎仔組織では、X線照射後にアポトーシス細胞の激増が観察されるが、p53^<-1->マウスでは、2GyのX線照射によってもアポトーシス細胞は増加しない。胎児は、重要な奇形抑制遺伝子でもあるp53がうまく機能する限り、放射線などに少し曝されたくらいでは、危険が及ばないように優れた防御機構を備えており、その主役は、p53依存的アポトーシスによって催奇性損傷細胞を除去し、その穴を正常な細胞が増えて埋める“細胞交代修復"によるものと考えられる。p53遺伝子を挿入突然変異で完全に壊したp53ノックアウトマウスを得ている(Y.Gondo et al.,1994,BBRC)。p53遺伝子欠失(z/z)、ヘテロ(z/+)、p53正常ホモ(+/+)マウスとなる2細胞期の人工受精卵を偽妊娠状態のfosterマウス卵管に移植し以下の実験に用いた。1.奇形の危険期である胎齢9.5日の主要器官形成期に250kVpX線を0、1、2Gy照射し、胎齢18.5日目に開腹して子宮内の死亡胚及び胎児を摘出し、胎児については蘇生判定後、外表奇形を検索しその頻度を調べた。これまでに得られた新たな知見として、p53ノックアウトマウス(z/z)は、p53正常(+/+)又はヘテロ(z/+)マウスに比し放射線被曝による奇形発生率が高く、2Gyの被曝でp53正常マウスの約2.4倍であった。一方、胎児死亡に関しては、p53ノックアウトマウスは著しい放射線抵抗性を示し、2Gyの被曝でも有意な死亡胎児の増加はみられなかった。2.胎齢3.5日の胚に2GyのX線を照射し、1と同様な検索を実施した。

正常マウス(+/+)では2Gyの照射で早期死亡胚は多発するものの、奇形の発生は認められなかったが、p53ノックアウトマウス(z/z)には奇形が高頻度に生じた。これらの結果は、“放射線による催奇性障害を受けた細胞では、p53遺伝子の活性化により放射線誘発アポトーシス(自爆死)が起こり、損傷細胞は積極的に除去されている(奇形誘発の回避)"ことを示唆している。動物モデルにおいて、発生初期の胚は、催奇性傷害に対して強力な防御機構を備えていることが示されているが、その実態が解け始めた。DNA損傷修復に深く関与している癌抑制遺伝子p53は、概念的には、変異を持つ遺伝子を娘細胞へ伝達させないように、遺伝情報の損傷を見張る“番人"としての働きが考えられている。奇形発生の防御に、p53遺伝子がどの程度重要な役割を果たしているのかを知る有効な方法は、p53遺伝子を欠如したマウスを用いて解析することである。p53欠損マウス(p53^<-/->)の胚(胎齢3.5日)は、普通マウス(p53^<+/+>)胚に比し、放射線抵抗性である。しかし、2GyのX線被曝後、生まれてきたp53^<-/->マウスには、80%以上の高頻度で奇形が生じる。一方、p53^<+/+>マウスは放射線致死感受性であるが、生存胎仔には奇形はみられない。主要器官形成期(胎齢9.5日)に被曝した場合も同様の傾向を示し、p53遺伝子機能の有無により、放射線致死感受性と催奇感受性とは、相反関係を示す(但し、1Gyの被曝までは、胎仔死亡、奇形ともに増加しない)。普通マウスの初期胚には、正常に生まれるか、死かに弁別する、きわめて優れた傷つき細胞の除去機構が備わっている。事実、p53^<+/+>マウスの胎仔組織では、X線照射後にアポトーシス細胞の激増が観察されるが、p53^<-/->マウスでは、2GyのX線照射によってもアポトーシス細胞は増加しない。胎児は、重要な奇形抑制遺伝子でもあるp53がうまく機能する限り、放射線などに少し曝されたくらいでは、危険が及ばないように優れた防御機構を備えており、その主役は、p53依存的アポトーシスによって催奇性損傷細胞を除去し、その穴を正常な細胞が増えて埋める“細胞交代修復"によるものと考えられる。
石油分解微生物の石油汚染環境下における局在性制御技術の開発と浄化への応用

Rhodococcus属細菌は、難分解性化合物に対する資化能力をもつことなどから産業的に有用な菌群であると位置付けられ、環境浄化等への応用が期待されている。そのためには有機溶媒と微生物細胞との相互作用を解析することが重要である。本研究では、R. erythropolis PR-4株がアルカンに対し極めて特徴的な相互作用を示すことを見出し、その相互作用の違いについて物理化学的、生化学的側面から検討を加えた。R. erythropolis PR-4は、培地/アルカンの二層培養系において、添加するアルカンの炭素数によって、アルカン粒子表面へ吸着する「吸着型」とアルカン粒子内へ転移する「転移型」の二つの異なる相互作用を示す株であり、バイオリメディエーションやバイオプロセスの宿主として期待されている。この場合、有機溶媒存在下での利用が想定されることから、有機溶媒と微生物細胞との相互作用を理解し、制御することが重要である。本研究ではこれらの相互作用について物理化学的側面から検討を加えた。吸着型の代表としてn-ドデカン(C12)を転移型の代表としてプリスタン(C19)を選び、これらの条件から全タンパク質を抽出し、SDSPAGEを行った後、その発現パターンの違いなどをLC/MS/MSで解析した。その結果、プリスタン添加条件では、シャペロニンの一種であるGroEL2の高発現が確認された。続いてウエスタンブロッティングにより確認したところ、同様の結果が得られた。同属の細菌は複数のGroELを有し、EL2は必須遺伝子と考えられていることから、同遺伝子をクローニングしPR-4株に導入し、二層培養下での細胞の局在性を検討した。同時に一部をデリーションさせた断片を作製し、同様に導入した。その結果、groEL2遺伝子の導入により二層培養下での細胞の局在性が変化し、転移して生育できるアルカンの種類が増えた。ここから、同遺伝子はアルカンに転移して生育するために重要であると考えられた。R.erythropolis PR-4は、培地/アルカンの二層培養系において、添加するアルカンの炭素数によって、アルカン粒子表面へ吸着する「吸着型」とアルカン粒子内へ転移する「転移型」の二つの異なる相互作用を示す株であり、バイオリメディエーションやバイオプロセスの宿主として期待されている。本研究ではこれらの相互作用について物理化学的、遺伝生化学的側面から検討を加えた。吸着型の代表としてn-ドデカン(C12)を転移型の代表としてプリスタン(C19)を選び、これらを添加した条件で培養し、菌体を回収した。これらの裁縫表面特性を検討したところ、C19の添加により、細胞表面の新油性が上昇し、界面ギブスエネルギーが変化し、アルカンに転移することが示された。続いて、ショットガンプロテオーム解析を行った結果、プリスタン添加条件では、シャペロニンの一種であるGroEL2の高発現が確認された。また、PR4株由来のgroEL2遺伝子を他のRhodococcus属細菌に導入したところ、PR4株と同様に、生育できるアルカンの種類が増加し、通常の条件では生育できなかったアルカン存在下でも生育できることが示された。昨年までの研究の結果、R.erythropolis PR4株由来のgroEL2遺伝子の導入は、各種アルカンを添加した二相培養環境下での生育の促進や親株が生育できない短鎖のn-アルカン存在下でも生育を可能とさせることなど、有機溶媒耐性能の上昇をもたらすことが示唆されている。本年度では、この機能がRhodococcus属細菌に一般的なものか否かを検討した。その結果、遺伝子操作の可能な菌株の80%において、細胞の局在性が変化し、生育できるアルカンの炭素鎖数の範囲が広がった。ここから、PR4株由来のgroEL2遺伝子は自身だけでなく、他の株にも溶媒耐性の上昇をもたらすことが示唆された。

一方で、培養条件による局在性の変化の検討では、Mgの存在がPR4株の局在性に非常に重要であることを見出し、水相か有機相を経由して水相に菌体を移動させるための条件を開発した。
超極細注射針と一酸化窒素(NO)の鎮痛作用を応用した新しい歯根膜麻酔法の開発

一般歯科治療、口腔外科処置を安全に行うためには、治療に付随する強い痛みを局所麻酔薬により取り除く必要があるが、現在使用されている局所麻酔薬ならびに浸潤・伝達麻酔法には、以下のような問題点を有し、さらなる改善が要求される。○局所麻酔そのものへの患者の恐怖感○注射針刺入時の患者が感ずる痛み○歯槽骨を浸潤するために必要な高濃度の局所麻酔薬○麻酔効果維持のための血管収縮薬の添加そこで、従来型の発想による局所麻酔法の改善では限界があり、超極細注射針とNitric Oxide (NO)の鎮痛作用・高拡散性の両者を組み合わせた、全く新しい概念の局所麻酔法の開発に取り組んでいる。現在、動物実験においては、ラットの各種疼痛モデルを用い、鎮痛作用があると示唆されているNOのほか、現在臨床にて頻用されているリドカインおよびNO・リドカイン混合剤における鎮痛効果について検索中である。また、超極細注射針の臨床応用の可能性についても検討しており、テルモ社製の、インシュリン注射用に開発されすでに臨床使用が承認されている超極細針(33G、直径0.2mm)の刺入時痛について、健康成人ボランティアに対象として行った.現在,研究結果の公表を目的にデータ処理を行っている.今後,さらに,インシュリン注射器を改造したペン型注射器で、人の歯根膜および口腔粘膜への浸潤麻酔(2%リドカイン1/20万エピネフリン含有、0.5ml)を行い、その麻酔効果および注射針の深達度・注入抵抗値について検討を行い,極細注射針の臨床応用への可能性について検索する予定である。また、超極細注射針の臨床応用の可能性についても検討しており、テルモ社製の、インシュリン注射用に開発されすでに臨床使用が承認されている超極細針(33G、直径0.2mm)を使用し、インシュリン注射器を改造したペン型注射器で、人の歯根膜および口腔粘膜への浸潤麻酔(2%リドカイン1/20万エピネフリン含有、0.5ml)を行い、その麻酔効果および注射針の深達度・注入抵抗値・刺入時痛について検討し、極細注射針の臨床応用への可能性について検索する予定である。
超高密度プラズマに対するイオン・クラスター模型

レーザー爆縮プラズマのような高密度プラズマ中の圧縮された単原子,2原子分子,さらにイオン・クラスター模型の最小単位と目される3原子分子内部の電子状態解析を,密度汎関数理論(DFT)に基づくThomas-Fermi-Dirac-Weizsacker(TFDW)統計模型の枠内で実行して来た。1.圧縮された2原子分子に対するDFT 2原子分子に対する2中心実効ポテンシャルを2次元Kohn-Sham方程式のポテンシャルエネルギー項に初期入力関数として代入し,Poisson方程式と連立させて,反復法により1電子状態を求めるDFTについては定式化のみを行った。研究成果報告書で詳説する。この問題の数値解析はコードの開発が遅れており,まだ実行に至っていない。2.イオンクラスター模型の定式化と数値解析本研究の主課題であるイオンクラスター模型に関してはその最小の模型と考えられる3原子分子(3中心問題)に対する定式化を行い,その概要を研究成果報告書で報告する。この模型の数値解析は,模型自体がすべての対称性を失うため,3次元(独立変数が3個)解析となる。有限差分法に基づくコードは2中心問題旧コードの形式的な拡張として作成できるものの,我々電子物理学研究室のワークステーションでは演算処理が不可能と判断した。大阪大学レーザー核融合研究センターのスーパーコンピュータ利用を計画している。3.単原子の2温度模型平成7年度の実績報告書で概説したように,2温度模型は閉殻をなす基底状態イオン芯とそれをとり巻く有限温度の束縛電子気体から成る非平衡模型である。平成7年4月の「第12回レーザー相互作用と関連プラズマ現象国際会議」で反響をえた後,平成8年8月号のJ.Phys.Soc.Jpn.(Vol.65,No.8,pp.2463-2471)に本論文として掲載された。4.強磁場中でのThomas-Fermi原子の内部構造解析パルサー表面では10^<12>10^<14>G,レーザー爆縮プラズマ中では爆縮の異方性のため10^610^8Gの磁場の存在が予見されている。このような超強磁場中の単原子の内部構造解析を,まず基底状態にある球対称Thomas-Fermi原子に対して実行中である。また交換・相関相互作用とWeizsacker型密度勾配補正を考慮した有限温度・TFDW模型への拡張と,磁化TFDW原子に対するKohn-Sham方程式の数値解析を計画中である。1.圧縮された2原子分子に対するDFTの完結2原子分子の内部構造解析でえられた実効ポテンシャルを,Kohn-Sham方程式のポテンシャル項に用いた数値解析は,波動関数に対する境界条件の考察が不十分なため,新コードの作成が遅れている.2.イオンクラスター模型の定式化イオンクラスターの最も小さい模型と考えられる3原子分子(3中心問題)に対する定式化は,長球座標を用いて理論解析を始めたばかりである。本年度の実施計画に盛り込んだ3中心問題の数値解析コードの開発は次年度に持ち越さざるをえない。上記の二つの課題とは別に次の問題を精力的に研究した。

3.単原子の2温度模型従来多くの研究の対象になって来た統計模型では,原子(又は分子)内部の電子気体と周囲媒質との熱平衡を仮定した,一様温度模型である。平成5年度に着手した2温度模型は基底状態イオン芯とこれを取り巻く有限温度のクラッド電子気体から成る非平衡模型である。数値解析はほぼ終了しており,平成7年4月に開催された「第12回レーザー相互作用と関連プラズマ現象国際会議」での発表には米国,欧州の慣性核融合実験の専門家らが強い関心を示した。4.超強磁場中でのThomas-Fermi原子の内部構造解析パルサー表面やれ-ざ-爆縮プラズマ中に誘起される超強磁場は原子内部の電子状態に,摂動をもたらす。交換相互作用と密度勾配補正を無視した,第0近似のThomas-Fermi(TF)模型に対する数値解析コードをほぼ完成した。TF模型を,これに交換・相関エネルギーと密度勾配補正を追加したTFDW模型に拡張し,磁場方向への原子の伸長を説明できる,理論解析と数値解析コード開発を次年度に予定している.巨大惑星内部のイオン系や慣性核融合プラズマ中のイオン・電子系のような超高密度物質中のイオン内部の電子状態解析を,前年度に引き続き,密度汎関数理論(DFT)に基づくThomas-Fermi-Dirac-Weizsacker(TFDW)統計模型の枠内で実行して来た。1.圧縮された2原子分子に対するDFT 2原子分子内部の2中心実効ポテンシャルをKohn-Sham方程式のポテンシャル項に用いる数値解析は,いくつかの問題点が未解決のため,実効できなかった。しかし,高Zイオンでは相対論的効果が大きくなることを考慮して,Dirac-Fock方程式コードを開発した小坂圭三氏(岡大・非常勤講師)と共同研究の形で次年度にこの問題の解決を意図している。2.イオンクラスター模型の定式化と数値解析本研究の主課題であるイオンクラスター模型に関してはその最少の模型と考えられる3原子分子(3中心問題)に対する定式化を行った。その概要は研究成果報告書に掲載の予定である。この模型の数値解析は,模型自体がすべての対称性を失うため,3次元(独立変数が3個)解析となる。有限差分法に基づくコードは2中心問題旧コードの形式的な拡張として作成できるものの,我々電子物理学研究室のワークステーションで演算処理が可能かどうか次年度にわたって検討を続けたい。上記の2課題の他,次の課題の研究に多くの時間を費やした。単原子の2温度模型平成7年度の実績報告書で概説したように,2温度模型は閉殻をなす基底状態イオン芯とそれをとり巻く有限温度の束縛電子気体から成る非平衡模型である。平成7年4月の「第12回レーザー相互作用と関連プラズマ現象国際会議」で反響をえた後,平成8年8月号のJ.Phys.Soc.Jpn.(Vol.65,No.8,pp.2463-2471)に本論文として掲載された。4.強磁場中でのThomas-Fermi原子の内部構造解析パルサー表面では10^<12>10^<14>G,レーザー爆縮プラズマ中では爆縮の異方性のため10^610^8Gの磁場の存在が予見されている。
Twin-tail形態と有対ヒレの進化発生学的関係の解明

顎口類の鍵革新である有対ヒレが進化上どのように獲得されたのかは、150年前から注目される重要なテーマである。現在有対ヒレ進化は、祖先形質である正中ヒレの発生メカニズムを、何らかの形で体側にリクルートすることで獲得したと考えられている。しかし、どのように正中に一つのものを有対の状態にしたのか、という問いは依然不明なままである。そこで本研究では、正中ヒレが有対化する変異形態(Twin-tail形態)を持つゼブラフィッシュ変異体ogonに着目し、その形成機構から付属肢有対化の進化機構を解明することを目指す。平成30年度は、主にトランスジェニックフィッシュを用いた機能解析実験を行った。実験は、主にゼブラフィッシュTwin-tail変異体(ogon)とトランスジェニック(TG)による異所的強制発現系を用いた。強制発現は局所的に熱ショック誘導可能なプロモーターを使って、異時的に加熱することで行った。その結果、初期発生時のbmpシグナルの熱誘導によってTwin-tail形態を誘導することができた。ただし、この誘導は発生後期では影響を及ぼさなかった。したがって、bmpシグナルは発生初期のヒレ形成領域の成立時に影響すること、形成領域の拡大がそのままヒレ有対化につながることが示唆された。一方、FGFシグナルの異時的誘導ではTwin-tail形態の誘導が出来なかった。しかし、FGFの強制発現により、ヒレマーカー遺伝子の発現が、正中ヒレ領域から胸ヒレの有対ヒレ領域にまで拡大した。これは、これら有対ヒレと正中ヒレの形成可能域がつながっている可能性を示唆する。強制発現実験のため、fgf、bmpシグナル制御を行うトランスジェニックの確立を行い、十分に使用可能な系統を確立できた。また、それらを用いた実験も、予定通り行えている。ただし、機能抑制系のトランスジェニックフィッシュに関し、予定よりもその抑制活性が限定的であったため、代替としてそれぞれのシグナルカスケードの機能抑制剤を用いた。また、拡大したヒレ形成領域の内部に異所的な体節形成系の遺伝子発現を発見した。この異所的発現が正中ヒレが有対に形成される可能性が考えられるため、その遺伝子の強制発現系を現在構築中である。体側と正中のヒレは同じ誘導可能域から出来てくる可能性がこれまでの研究成果から見出された。そこで正常胚で誘導可能域の範囲を解析し、正中と体側のヒレの発生学的関係を考察する。またTwin-tail形態胚で誘導可能域や有対ヒレ形成位置に変化が出ないか、特に成魚となる時期に発生してくる腹ヒレに注目し、同様の解析を行う。誘導可能域は、fgf10の強制発現により膜ヒレマーカーsp9を異所的に発現させることで可視化する。さらに、CIRSPR/Cas9システムを使ったノックインによりsp9:CreERT2を作成し、誘導可能域を長期に観察する。また、腹側正中ヒレの予定形成領域は、体幹部の卵黄上皮上に左右に広がっておりその発生過程自体に体幹で有対化する要因を内包している事が示唆されている。この発生メカニズムが系統進化上保存されているかどうかを、他の脊椎動物、とくに祖先的な脊椎動物で解析し、正中ヒレと有対ヒレの系統進化関係を考察する。

この異所的発現が正中ヒレが有対に形成される可能性が考えられるため、その遺伝子の強制発現系を現在構築中である。体側と正中のヒレは同じ誘導可能域から出来てくる可能性がこれまでの研究成果から見出された。そこで正常胚で誘導可能域の範囲を解析し、正中と体側のヒレの発生学的関係を考察する。またTwin-tail形態胚で誘導可能域や有対ヒレ形成位置に変化が出ないか、特に成魚となる時期に発生してくる腹ヒレに注目し、同様の解析を行う。誘導可能域は、fgf10の強制発現により膜ヒレマーカーsp9を異所的に発現させることで可視化する。さらに、CIRSPR/Cas9システムを使ったノックインによりsp9:CreERT2を作成し、誘導可能域を長期に観察する。また、腹側正中ヒレの予定形成領域は、体幹部の卵黄上皮上に左右に広がっておりその発生過程自体に体幹で有対化する要因を内包している事が示唆されている。この発生メカニズムが系統進化上保存されているかどうかを、他の脊椎動物、とくに祖先的な脊椎動物で解析し、正中ヒレと有対ヒレの系統進化関係を考察する。研究遂行にあたりトランスジェニックゼブラフィッシュ(TG)の作成を行う必要があったが、予定した系統の作成が順調に進み、予定より維持する必要がある数が減った一方、研究結果から予想していなかった新たにいくつかの遺伝子に関してトランスジェニックを作成する必要が生じた。そのため、今年度使用予定額の一部を繰り越し、来年度のトランスジェニックフィッシュの作成の遂行のためにあてる。
電位依存性チャネルタンパク質の温度センシング機構の解明

我々は酵素反応や免疫システムなどの生体反応に適した37°Cの体温を維持している。そして、火や氷雪を「熱い」「冷たい」侵害刺激として回避する。我々の体において温度をセンスする分子がイオンチャネルであると分かったのは最近の話である。本研究は、体温付近の環境で高い温度依存性を呈し、白血球の温度センサーとして知られる電位依存性H+チャネル(Hv)をターゲットとし、電位依存性チャネルタンパク質の温度センシング機構について明らかにすることを目的とする。Hvチャネルに対して、生理学、生物物理学、蛋白質分析化学、蛋白質計算科学の分野横断的な手法を先鋭的に用いて、タンパク質が、物理的な温度を受容し細胞の生物学的機能に変換出力していくメカニズムを解明することを目的とする。生体分子の温度センシング機構の解明に広く応用できる新しい方法論的アプローチの確立をめざす。本年度は、昨年度電気生理学的機能解析から同定した温度依存性を決める責任ドメインについて詳しく調べた。数多くの変異体を作成し、解析を行い、温度センサーのける構造基盤を見いだした。さらに電気生理学的に詳細な解析を行い、温度域値を決定する変異体の法則について考察した。電気生理学的に詳細な解析を行い、温度依存性を決定する変異体の法則について考察した。昨年度報告された他の温度感受性イオンチャネルの構造と比較検討し、Hvチャネルの温度感受性について考察した。膜貫通領域のHvチャネル2量体の分子動力学シミュレーションの結果と合わせて考えて、チャネルの開閉時の構造変化について検討を行った。開閉時の構造変化がどのように温度に影響されるかを検討した。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、網羅的に点変異体作成し、二本刺し膜電位固定法により電気生理学的機能解析を行い、温度依存性を決める責任ドメインの探索を行った。その結果、温度依存性が変わるHvチャネル変異体を数種類獲得し、温度依存性の強弱を決める構造基盤について考察した。Hvチャネルに対して分子動力学的解析を行うためのシステムの構築を行った。温度域値を決めるコイルドコイルドメインの熱安定性を分子動力学的手法にて行った。野生型コイルドコイルに対してシミュレーションを行い、熱に弱い部位を見いだすことに成功した。当初計画通りに、温度依存性の責任ドメインの探索を行い、温度依存性が変わるHvチャネル変異体を数種類獲得することに成功した。この結果を活かして次年度詳細な解析に進みたい。コイルドコイルドメインの熱安定性を分子動力学的手法にて解析を行う基盤ができあがり、熱に弱い部位を見いだすことに成功した。このシミュレーション基盤と知見を活かして次年度以降の発展的な解析に進みたい。また、領域内の他の研究者との共同研究をスタートするための打ち合わせを行なったり、「温度生物学」と銘打ったシンポジウムで講演を行い、研究の幅を広げることにも成功した。以上の理由から本研究プロジェクトはおおむね順調に進展している。分子構成が最も小さい電位依存性チャネルであるHvチャネルの温度特性を解析する。

その高い温度依存性を生み出す分子機構を明らかにし、電位依存性チャネルに普遍的に通用する温度センシング機構を解明することを目指し、タンパク質の構造ー機能ー物性を「温度という共通のパラメター」を基軸として解析を行なう。計算科学を用い理論と実験の両側面からチャネルタンパク質を解析し、各パラメターの有機的なつながりを検討する。1)電気生理学解析:前年度同定した温度感受性の変化する変異体をパッチクランプ法を用いて詳細に解析する。2)構造機能相関解析:電気生理学的に温度変化に伴い変化するチャネル活性を解析する。Hvチャネルの結晶構造を基に作成した変異体を解析し、二本刺し膜電位固定法により網羅的に解析を行い、温度依存性の責任ドメインを探索する。探索により得られた変異体は随時パッチクランプ法にて詳細な解析を行う。3)分子動力学解析:昨年度、解析を行ったコイルドコイルドメインの熱安定性のシミュレーションを発展させ、変異体コイルコイルおよびHvチャネル分子全体に対して温度を変えたシミュレーションを行い、熱安定性とチャネルゲーティングの関係を検討する。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
眼乾燥症(ドライアイ)の病因論に関する免疫学的、分子生物学的研究

ドライアイは涙液の減少により角結膜に障害を生じる疾患である。現在までドライアイの症状ははっきりとしていなかったが、「眼精疲労」という形で表現されることが多いことがわかった1。さらにコンピューターの使用で生じる眼精疲労も一部はドライアイを介して起きることを示し、眼精疲労のコントロールへのアプローチの路を開いた2。疾患メカニズムの解明のためシェーグレン症候群の涙腺浸潤リンパ球を検討したところ主にCD4陽性T細胞でありさまざまなadhesion moleculeの発現を認めた3。これら浸潤T細胞にgranzyme A、PerforinがタンパクおよびmRNAレベルで検出された4。これらは涙腺破壊の機序として働いている可能性がある。移植の際に用いるサイクロスポリンAはこれらgranzyme A、Perforinの発現を抑制することで知られている。今回シェーグレン症候群にサイクロスポリンAの点眼を行ったところ一部の患者で臨床症状が改善した5。この機序としてはサイクロスポリンAがgranzyme A、Perforinの発現を涙腺で抑制したことが考えられる。さらにシェーグレン症候群結膜へのリンパ球浸潤について臨床的に検討した。ドライアイ患者をシェーグレン症候群とシェーグレン症候群以外のドライアイに分けて調べたところ、シェーグレン症候群患者の結膜には有意にリンパ球の浸潤が起きていることがわかった6。これらのリンパ球もCD4陽性T細胞であり、唾液腺のリンパ球浸潤と相関関係があり、涙腺の破壊と同じ様な機序で結膜が障害を受けている可能性が示唆された。ドライアイは涙液の異常により起こるとされているが、その臨床的な病状についての検討はあまり成されていなかった。この度平成4年度の研究費の補助により結膜細胞中へのリンパ球浸潤の定量的方法や涙液の蒸発量を無侵襲で測定する方法が開発され、英文論文として採択された。原因論に関する研究は、ドライアイのうちシェーグレン症候群における涙腺に焦点を絞って行った。シェーグレン症候群における涙腺の浸潤リンパもないが、どのようにして涙腺を破壊しているかという機序につき、CTL(細胞障害性T細胞)がGranzyme,Perforinを産生し、これを放出することにより涙腺細胞を障害していると仮説を立てた。シェーグレン症候群6例においてGranzymeおよびPerforinのメッセンジャーRNAレベルでの亢進が認められたため、この仮説が裏付けられた。現在サイクロスポリンなどの免疫抑制剤によってこの細胞障害がどの程度コントロールができるか検討を行っているところである。また同時にシェーグレン症候群の病因論としてEBウイルスが関与しているとの見地からEBウイルスのDNAを涙腺と結膜からさらに検出を行った。またインターフェロンαをEBウイルスに対する感染抑制に使えるか否か検討するため、インビトロでの実験を行い治療への応用を考えている。本研究により現在ドライアイの機序の一部が明らかにされつつあり、その一部の機序に対して従来の対症療法的な人工涙液のみに留まらない新しいドライアイの治療が模索されつつある。
ショウジョウバエ分子生物学による生体高次機能解析

本年度は発足第1年度であるため、各分担研究者が自己の従来の研究を、ショウジョウバエ分子生物学技術を応用して発展させるための基礎づくりを行った。東京大学の研究代表者の研究室および東京大学遺伝子実験施設をセンターとして、(1)ショウジョウバエの核手突然変異株の領布と、その利用法の指導、(2)ショウジョウバエ凍結標品の供与、(3)各種のプロブDNAの配布、(4)ショウジョウバエ関連で開催された国際会議(EMBO主催のワークショップ、コールドスプリングハーバー研究所シンポジウム、国際遺伝学会など)の情報の普及のための体制を確立した。また、たまたま来日したショウジョウバエ分子生物学の活発な研究者を招いた国際シンポジウムを、拡大班会議の形式でおこなった。これらの努力により、従来ともすると個人レベルで死蔵されていた貴重な情報が日本全国の関連する研究者に広く普及することとなったのは、偏えにこの重点領域研究のおかげといえる。化学研究の側面でも、ショウジョウバエ研究の方法を他のシステムに応用するという本研究の目標にそって、いくつもの新しい成果を得た。それらの中には、劣性ガン遺伝子のショウジョウバエでの研究のように突然変異を多数得て、個体レベルでの遺伝子機能にすすみつつあるもの(西田)、細胞接着分子カドヘリンの分子遺伝学をショウジョウバエでとる研究(竹市)、ホメオボックス遺伝子をカイコやニワトリで分離して研究する(黒岩・鈴木)、細胞内セカンドメッセンジャーIP_3とその関連酵素フォスフォリパーゼCの突然変異の解析(堀田、井上、鈴木)などが重要である。また技術面でも、単一胚培養法(堀田)、P因子挿入突然変異誘発法(堀田)、新しい突然変異誘発トランスポゾン(西郷)、なども国際的にも大きな貢献となる研究がはじめられた。
CCL8 KOマウスにおけるGVHD消失の分子機構解明に向けた基礎的研究

前年度の研究結果を踏まえ、KOマウスのGVHD発症機構と関連の予想される主要組織適合抗原複合体(MHC)の発現等を含めたphenotype解析の追加実験および、in vitroでのallo recognitionにおけるサイトカイン産生などをWTとKOマウスで比較検証することでKOマウスを用いたGVHDマウスモデル解析におけるGVHD病態変化の要因を探索した。前年度からの本研究成果をまとめ現在論文投稿準備中である。移植片対宿主病(GVHD)は、造血幹細胞移植の成否を左右する重大な合併症の一つでありながら、その診断は依然として医師による主観的診断であり、早期に客観的に診断する方法が切望されている。我々はこれまでにヒト臨床サンプルおよびGVHDマウスモデルを用いた血漿プロテオミクス解析によりGVHDの早期診断マーカーとしてCCケモカインの一つであるCCL8を同定し、CCL8がGVHDの病態にかかわる可能性のある因子であることを示唆してきた。本研究ではGVHDにおけるCCL8の因果関係解明へ向けた移植マウスモデルに適した近交系(C57BL/6)のCCL8遺伝子欠損(KO)マウス作製を作成し、それを用いたGVHDモデル解析を行った。本マウスはZinc-finger nucleaseを用いることで近交系マウスを直接用いた標的部位特異的かつ限局的な欠損を可能としており、染色体上で近位に存在する他のCCケモカインジーンクラスター中のCCケモカインの発現には影響をおよぼさず、血液学、発生学、生殖学的な側面からも野生型近交系マウス(WT)と同等な、GVHDマウスモデルに用いてWTとの比較解析が可能なマウスであり、本KOマウスをrecipientとして用いたアロGVHDマウスモデルでの生存解析を行った結果、recipientにおけるCCL8の欠損はWTと比較して早期のGVHD由来の死亡を有意に減少させることが示され、CCL8がGVHDの一因である可能性が示唆された。現在までにZFNを用いることでexon内にNHEJを生じさせたKOマウス作製に成功しており、このことから血液学、発生学、生殖学的な側面からWTと同等条件下での、GVHDマウスモデル比較解析が可能である。現在までに本KOマウスを用いたアロGVHDマウスモデル解析の結果からrecipientにおけるCCL8の欠損はWTと比較して早期のGVHD由来の死亡を有意に減少させることが確認されている。今後は、上述のKOマウスを用いたGVHDマウスモデルにおける臨床学的、病理学的、生化学的な側面からの評価を行う。また、ZFNを用いてBALB/c由来CCL8 KOマウスも作製しdonor, recipient共にCCL8発現を欠損した系でのGVHDマウスモデル解析、およびWTとKOマウスを用いてキメラマウスを作製することで造血系、非造血系由来細胞各々のCCL8発現コントロールした系でのGVHDマウスモデル解析の検討も行う。
極小基線長光共振器を用いた動波検出器のための超高感度トランデュ-サ-の開発

まず、はじめに光源の評価を行った。半導体レ-ザ-励起Nd:YAGレ-ザ-を購入し、その強度雑音を測定した。その結果、測定周波数帯域であるkHz付近では強度雑音が散射雑音の約100倍でかなり大きいことが判明した。そこで、この雑音を取り除く方法としてのホモダイン検出法をテストするため、マイケルソン干渉計を組み立て雑音を測定したところほぼ散射雑音が観測され、高周波変調をかけなくても信号を取り出せるめどがついた。さらに、この装置を改造して、強度変調のかかった光の散射雑音の特性を測定し、最近議論されている非定常散射雑音の影響を確認した。この結果は既にPhysics Letters A誌に投稿されており、編集者から“acceptable"であるという返事が届いている。また、振動検出系を構成するFabry-Perot干渉計に関してはプロトタイプとして、He-Neレ-ザを用いたシステムをほぼ完成させ、真空中で動作させて3.5×10^<ー17>m/√Hzという感度を実現しており、原理的には問題がないことが示された。この感度は常温で作動するトランデュ-サ-としては世界でも有数のもので、現在、Review of Scientific Instrumets誌に投稿すべく準備中である。さらに、光源をHe-Neレ-ザ-からNd:YAGレ-ザ-に切り替えるために、新しい鏡を購入しその評価を行った。そのために変調を利用した高精度の測定系を作って鏡の透過率を測定したところ、最初に納入されたものはこちらの仕様を満たしてしなかったので交換し、現在評価中である。