hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規α1Bアドレナリン受容体拮抗薬の神経変性抑制作用

黒質線条体神経死のモデルとして、メタンフェタミンモデルを確立した。まず、メタンフェタミン投与中の室内温度に毒性が依存することを明らかにした。このモデルにおいて特異的α1B受容体拮抗薬が変性抑制作用を持つか否かを検討するため、まず陽性対照薬として非特異的α1受容体拮抗薬のプラゾシンの効果を形態学的方法および生化学的手法により検証した。プラゾシンはメタンフェタミンの各投与前30分に皮下投与(0.5mg/kg)した。プラゾシンの対象薬には生理食塩水を用いた。メタンフェタミン最終投与から5日後に軽度エーテル麻酔下にて、ラット脳を灌流後、脳を摘出して固定し、線条体切片(4μm)を作成し、免疫組織染色(検出抗原:チロシン水酸化酵素)を行った。切片の写真をデジタル画像として撮り、NIHイメージにより定量化した。1群4-5匹として、生理食塩水投与+生理食塩水投与、プラゾシン+生理食塩水、生理食塩水投与+メタンフェタミン、プラゾシン+メタンフェタミンの4群につき比較した。この実験を昨年度と合わせて4回行い、メタンフェタミンによる神経変性に対してプラゾシンが統計学的に有意な抑制作用を示した。さらに、別の固体を用いて上記と同様の処置を行い、ラットを断頭後、迅速に線条体を摘出してドパミン、DOPAC、HVAを高速液クロで分離後定量した。この方法でもプラゾシンの保護効果が確認された。つぎに、α1B受容体拮抗薬(3mg/kg)を上記と同様の方法にて処置し、免疫組織染色および生化学的手法にて評価した。α1B受容体拮抗薬は保護効果が見られなかった。したがって、プラゾシンによる保護効果はα1B受容体以外の作用であることが示唆され、α1B受容体ノックアウトマウスを用いた海外の過去の結果を再検討する必要が大いにあると結論される。黒質線条体神経死のモデルとして、メタンフェタミンモデルを使用した。メタンフェタミン(10mg/kg, s.c.,2時間毎に4回)をラット(8週齢)に投与することにより黒質線条体路を50%以上破壊できるか否かを検討した。対象薬には生理食塩水(5ml/kg)を用いた。変成作用が一定しないためその原因を究明したところ、ケージあたりの匹数および実験室の温度に左右されることが分かった。今後の実験条件としてメタンフェタミン投与時のラットは個別のケージに入れ、室温を21±1°Cに保つことが実験結果の再現性に重要であることがわかった。このモデルにおいて特異的α1B受容体拮抗薬が変性抑制作用を持つか否かを検討するため、まず陽性対照薬として非特異的α1受容体拮抗薬のプラゾシンの効果を形態学的方法により検証した。

この実験を3回行い、2回はメタンフェタミンによる神経変性に対してプラゾシンが抑制作用を示したが、1回はメタンフェタミンによる変性に検体間のばらつきが大きくなりわずかに有意差がなかった。黒質線条体神経死のモデルとして、前年度に実験条件を確立したメタンフェタミンモデルを使用した。このモデルにおいて特異的α1B受容体拮抗薬が変性抑制作用を持つか否かを検討するため、まず陽性対照薬として非特異的α1受容体拮抗薬のプラゾシンの効果を形態学的方法および生化学的手法により検証した。プラゾシンはメタンフェタミンの各投与前30分に皮下投与(0.5mg/kg)した。プラゾシンの対象薬には生理食塩水を用いた。メタンフェタミン最終投与から5日後に軽度エーテル麻酔下にて、ラット脳を灌流後、脳を摘出して固定し、線条体切片(4μm)を作成し、免疫組織染色(検出抗原:チロシン水酸化酵素)を行った。切片の写真をデジタル画像として撮り、NIHイメージにより定量化した。1群4-5匹として、生理食塩水投与+生理食塩水投与、プラゾシン+生理食塩水、生理食塩水投与+メタンフェタミン、プラゾシン+メタンフェタミンの4群につき比較した。この実験を昨年度と合わせて4回行い、メタンフェタミンによる神経変性に対してプラゾシンが統計学的に有意な抑制作用を示した。さらに、別の固体を用いて上記と同様の処置を行い、ラットを断頭後、迅速に線条体を摘出してドパミン、DOPAC、HVAを高速液クロで分離後定量した。この方法でもプラゾシンの保護効果が確認された。つぎに、α1B受容体拮抗薬(3mg/kg)を上記と同様の方法にて処置し、免疫組織染色および生化学的手法にて評価した。α1B受容体拮抗薬は保護効果が見られなかった。したがって、プラゾシンによる保護効果はα1B受容体以外の作用であることが示唆された。
抗原特異性と機能に関する遺伝子導入T細胞による抗原特異的免疫療法の確立

生体内で抗原特異的免疫応答が起こった場合、その特異的T細胞はクローナルに増殖する。そこで、この変化を解析することで、抗原特異的なT細胞抗原レセプター(TCR)の情報を得ることが出来る。TCR分子は2つの鎖から構成されるので、もし一つのT細胞で機能発現しているTCR遺伝子情報をペアリングすることが可能であれば、この2つの遺伝子と望ましい機能遺伝子の3つをリンパ球に遺伝子導入することで、免疫疾患を抗原特異的に治療するための細胞を試験管内で再構築することが可能となる。本研究はこれらの技術を確立する目的で行った。方法の概略は、自己免疫疾患の病変、移植臓器などに集積している抗原特異的T細胞クローンの状況を把握するために、そこから採取した少量のRNAからすでに確立しているT細胞クロノタイプ検出法(RT-PCR法とSSCP法を組み合わせたもの)を用いて検討する。次に重要と考えられるクローンについて、TCR遺伝子の全塩基配列の情報を獲得し、これらの遺伝子を自らのリンパ球に導入し抗原特異性を再構築し、さらに機能遺伝子を導入するステップが必要である。このために、一つの細胞内での複数のmRNA情報を取得するための基本的技術と、リンパ球に効率よく遺伝子を導入する技術の確立を目指した。具体的には自己免疫疾患のモデルマウス(NZB/WF1)の脾臓細胞を単一浮遊細胞とした後、この中からRT-PCR法にて2つのTCR遺伝子を増幅した。次にこれらの全長cDNAをクローニングしてレトロウイルスベクターに組み換えた。これらをNZB/WF1マウスの脾臓細胞に遺伝子移入して、抗原特異性を検討した。現在、さらに抑制性サイトカイン遺伝子も導入した改変T細胞を用いて、自己免疫疾患が抑制可能か否かを検討中である。我々は、T細胞レセプター遺伝子に注目し、生体のリンパ球集団の中で実際に活性化され集積しているクローンを検出するシステムを確立した。そこで一つの細胞で使われているレセプター遺伝子の二つの全長cDNAの情報を獲得し、抗原特異性以外の機能を有するリンパ球亜分画の細胞に遺伝子導入すれば、実際に生体内で活性化され集積しているリンパ球と同一抗原特異性と機能を持った細胞を、試験管内で再構築できることになる。本年度はまず、リンパ球内でのTCRの情報をペアリングする技術の確立として、浮遊単細胞を用いて、T細胞レセプターのCα、Cβに相当する部分に続いてお互いが相補性の部分を持つ二つのプライマーを作成し、試験管内でアニールさせた。逆転写酵素を加え、細胞内でα鎖、β鎖のTCRのcDNAを合成した。細胞からcDNAを回収した後、V領域プライマーとともに二本鎖目のcDNAを合成した。この方法で、少なくとも二つの情報をペアリング可能であることが判明した。次に高力価レトロウイルス産生細胞株として東大医科研の北村らによる新たに改変したPLAT-E細胞を使用したところ、マウス脾細胞に40%程度の高率に遺伝子が導入可能であることが判明した。我々は、T細胞レセプター(TCR)遺伝子に注目し、生体のリンパ球集団の中で実際に活性化され集積しているクローンを検出するシステムを確立した。

本年度はまず、リンパ球内でのTCRの情報をペアリングする技術の確立として、浮遊単細胞を用いて、表面マーカーにより望ましい細胞をセルソーターにて分離し、その単一細胞からRNAを抽出し、注目しているTCRのα、β鎖を増幅し、さらにそれがリンパ球集団で集積しているクローンであることを確認する一連の技術的なステップが動きうることを見いだした。次に高力価レトロウイルス産生細胞株として東大医科研の北村らによる新たに改変したPLAT-E細胞を使用したところ、マウス脾細胞に40%程度の高率に遺伝子が導入可能であることが判明した。これを用いて、すでに抗原特異性の判明しているTCRのα、β鎖を,マウス脾細胞に導入したところ、内在性のTCRにうち勝って細胞表面に発現し、試験管内および生体内で、抗原特異的なT細胞機能を発揮することが判明した。以上のことから、本研究の最終目標である、抗原特異的免疫療法の確立に向けて技術的に大きく前進したと考える。研究代表者らがすでに確立しているT細胞クロノタイプ検出法を発展させ、改変T細胞作成技術を確立し、マウスモデルにおいて抗原特異的免疫療法を行うことを目標とした。まず、自己免疫疾患の病変、移植臓器などに集積している抗原特異的T細胞クローンの状況を、そこから採取した少量のRNAから把握した上で、重要と考えられるクローンについて、T細胞レセプターの全塩基配列の情報を獲得する技術を確立し、次にこれらの遺伝子を自らのリンパ球に導入し抗原特異性を再構築することを目標とした。具体的には自己免疫疾患モデルマウス(NZB/WF1)の脾臓細胞を単一浮遊細胞とした後、FICT標識の抗TCR-Vβモノクローナル抗体(クローナリティ分析にてドミナントに用いられたVβ)にて染色しFACSにて分析後、単一細胞への分別(ソート)を行い、96穴プレートの一つ一つに1つの陽性細胞を分離した。それぞれのウェルからRNAを抽出し、cDNAを合成ののち、既に決定している染色に用いた1種類のVβプライマーおよび通常のPCR用の20種類のVαプライマーとそれぞれのC領域プライマーで別々にPCR反応を行い増幅をおこなうことで、TCRのシグナルを増幅した。このようにクローニングされた2つのT細胞レセプター遺伝子cDNAの結合ペアの中から、別に既に解析しているリンパ球集団全体の中で集積しているクローンのペアを同定した。次にこれらの全長cDNAをクローニングしてレトロウイルスベクターに組み換えた。これらをNZB/WF1マウスの脾臓細胞に遺伝子移入したところ、ヌクレオソーム特異的であることが判明した。現在、さらに抑制性サイトカイン遺伝子も導入した改変T細胞を用いて、自己免疫疾患が抑制可能かを検討中である。
微生物の新規代謝系「環状イミド代謝系」の解析と応用

微生物に見出した新規な環状イミド代謝系の有用性を探ること、および、環状イミド代謝系を用いた有用物質生産プロセスを構築することを目的とし、その酵素系の解析、さらには、微生物界における有用環状イミド変換反応の探索を行い、以下の結果を得た。(1)芳香族環状イミドや、バルキーな置換基を有する環状イミドを変換する活性を探索した結果、フタルイミド、シクロヘキシミドを代謝変換する微生物を多数見いだした。また、フタルイミド変換微生物の一種をArthrobacter ureafaciensと同定した。(2)フタルイミド変換菌Arthrobacter ureafaciens o-86を用い、有用物質生産プロセスとして2,3-ピリジンジカルボキシイミドの部位選択的加水分解反応を検討した結果、基質分子内の等価な2つのアミド結合のうちの一方を特異的に加水分解し、有用な3-カルバミルピコリン酸を生産することを確認した。また、部位選択性を向上させる至適反応条件として、低pH(pH4.55.5)、水-有機溶媒二相系(水-シクロヘキサノン)が効果的であることを見いだした。(3)環状イミド代謝系の最終産物であり有用性の高い有機酸であるピルビン酸を、安価な環状イミド代謝中間体であるフマル酸から環状イミド代謝系酵素を利用して生産するプロセスの構築を検討した結果、グルタルイミド資化性菌Pseudomonas sp.g31が至適反応条件下、100mMのフマル酸から94mMのピルビン酸を生成することを見いだした。また、効率生産には、通気撹拌が必要であることを見いだした。微生物に見出した新規な環状イミド代謝系の有用性を探ることを目的とし、その酵素系の解析、さらには、微生物界における有用環状イミド変換反応の深索を行い、以下の結果を得た。(1)最初に環状イミド代謝経路が見出された土壌分離菌Blastobacter sp.A17p-4を材料にし、環状イミド代謝系酵素イミダーゼおよびハーフアミターゼの単離精製、諸性質の解明を試みた。精製酵素を用いた基質特異性の検討および誘導条件の検討から、これらの酵素が環状イミドあるいはハーフアミドに特異的に作用する新規酵素であること、また、その生理機能が環状イミド化合物の代謝分解にあることを明らかにした。(2)Blastobacter sp.によって利用されにくい芳香族環状イミドや、バルキーな置換基を有する環状イミドを変換するする活性を検索した。芳香族環状イミドのモデル化合物としてフタルイミドを、バルキーな置換基を有する環状イミドのモデル化合物としてシクロヘキシミドを用い、変換活性の検索を行った結果、Blastobacter sp.とは異なる属のバクテリアにフタルイミド変換活性を、また、放線菌類にシクロヘキシミド変換活性を見出した。現在、これらの菌の同定を行っている。(3)(2)において見いだされたフタルイミド変換微生物を部位選択的物質生産プロセスに応用することを試みた。2,3-ピリジンジカルボキシイミドをモデル化合物として部位選択的反応を検討した結果、基質分子内の等価な2つのアミド結合のうちの一方を特異的に加水分解する菌株を選抜することができた。現在、この菌の同定を行うとともに、本菌を用いた2,3-ピリジンジカルボキシイミドからの3-アミドピコリン酸の選択的生産について、反応条件の検討および反応に関与するイミダーゼの解析を試みている。
水平方向に細長い空間内での火炎および煙の流動性状

今年度は,遡上阻止限界風速と発熱速度の関係,および遡上した熱気流の温度減衰性状に注目した実験を行った。なお使用した実験模型は昨年度と同様に,断面形状が馬蹄形(最大幅274mm,床面からアーチ頂点までの高さ244mm)および矩形(300(W)×300(H))の2種類で,全長は最大で10mである。また模擬火源として,プロパンを燃料とした一辺100mmの正方バーナーを模型中央に設置した。遡上阻止限界風速と発熱速度の関係は次のようにして求めた。換気流と熱気流それぞれが持つ運動量が均衡する位置で遡上が停止すると考え,さらに遡上した熱気流先端近傍の温度が天井近傍最高温度に比例すると仮定した上で導出した速度および上昇温度に対する関係式を変形することにより,遡上阻止限界風速と発熱速度の関係式を導いた。実測値との比較から,実験定数を決定した。また,遡上した熱気流の温度減衰については,実験結果からその遡上位置に係わらず,遡上距離と温度減衰には一定の関係が成り立っていることが明らかとなった。さらに遡上熱気流の温度減哀は大きく3領域,つまり火源極近傍領域(I領域),一律に温度減衰する領域(II領域)および換気流の影響を受け大きな温度減衰が生じる領域(III領域)に分割でき,しかも発熱速度が異なった条件でも同じ性状を示した。地下街、駅舎、地下駐車場などに代表される地下空間の利用が今後さらに活発になると予想されることから、これらの区画を互いに結ぶ連結部に代表されるトンネル状半閉鎖空間内で発生した火災を想定し、特に火源近傍の火災性状を工学的に表現しうるモデル構築を目的した。実験は断面形状が馬蹄形(最大幅274mm、床面からアーチ頂点までの高さ244mm)および矩形(300(W)×300(H))の2種類を用い、全長は最大で10mの模型トンネルを用いた。また模擬火源として、プロパンを燃料とした一辺100mmの正方バーナーを模型中央に設置した。まず、強制換気時の火炎長さおよび火炎の傾斜角度に関するデータを、測定した温度場の値を基にした等温度線図から収集した。特に火炎傾斜角度を2種類定義し、火炎の傾斜角度を決定する主変数となる熱気流を強制換気流の表現法として、質量流束および力(慣性力と浮力)を出発点とした。これに火源近傍性状(間欠火炎領域とプルーム領域)の関係を組み合せ、さらに傾斜した火炎の有効火炎高さの関係を代入することにより、火炎傾斜角度と発熱速度および換気速度の組み合せ変数との関係を導いた。導出したモデルと実測値との比較から実験定数を求め、モデル式を決定した。さらに、強制換気時の区画天井部に現れる最高温度上昇値と発熱速度および換気流速の組み合わせ変数との関係を導いた。今度、遡上阻止限界流速と発熱量の関係、到達距離、および遡上した熱気流の厚み、温度減衰性状などの諸性状と発熱速度および換気流速との関係を明らかにしていく予定である。
精神障害に対するライフステージに応じた普及啓発の効果的な方法の検討

本年度は、親や配偶者の介護を行うライフステージにある人々の精神保健という観点から、調査を実施した。具体的には、認知症患者の介護を行う介護者(家族)と地域一般住民とで健康関連QOLを比較し、介護者の生活の質の程度を検討した。また、介護負担感や感情表出(Expressed Emotion)、介護に起因すると考えられる抑うつ症状について質問紙調査を行った。調査結果については現在分析を進めているところであるが、認知症患者の介護者は一般地域住民と比較して健康関連QOLが低下傾向にあること、また抑うつ状態にあると考えられる者が少なくないこと、認知症患者の認知機能の低下よりも認知症に伴う問題行動(Behavioral and Psychological Symptoms of Dementia;BPSD)が介護者の抑うつに関連していること、などが明らかになっている。また、22年度および23年度に実施した研究についてもさらなる分析を進め、学会発表や論文執筆作業を行った。地域住民を対象の精神障害等についての認識に関する調査の結果では、おおよそ統合失調症、躁うつ病、うつ病、摂食障害の順にネガティブなイメージをもっていることが明らかになった。また、ひきこもりについても比較的強い偏見があることが明らかになった。現在この結果については海外の専門誌に投稿中である。また、思春期・青年期というライフステージにある人々の精神健康に関する調査の結果から、大学浪人生は、抑うつ状態にあると考えられる者の割合が比較的高いことが明らかとなった。性別(女性)や保護者が進路へ反対していること、悩みの相談相手がいないこと、成績の悪さが、抑うつと有意に関連していたが、Sense of coherenceというストレス対処能力が高い場合にはこれらの要因との関連が弱まることが明らかになった。この結果についても、現在海外の専門誌に投稿中である。本研究の目的は、一般地域住民における精神障害に対する知識・意識の現状を明らかにすることである。特に、ライフステージによる知識の程度や関心の内容の違いに焦点を当てながら、統合失調症やうつ病のみならず様々な精神疾患やこころの問題についての知識・意識を明らかにする。本年度は、以下の2点について研究を実施した。1.以前、研究代表者が参加した「精神障害に関する知識の普及啓発活動の評価に関する研究」において一般地域住民を対象として実施した意識調査の結果を再分析し、明らかにすべき課題を明確にした。因子分析により、精神障害に対するイメージとして3つの因子を抽出した。重回帰分析の結果、それぞれの因子について、年齢や性別、経験や知識などが関連していたが、3つの因子すべてに影響していた要因はなく、特定の属性や経験を持つ人が精神障害を有する人の全側面に対してネガティブなイメージを持つというよりは、特定の属性や経験を持つ人が精神障害者のある特定の側面についてはネガティブなイメージを持ちやすいことが示唆された。2.3つの自治体において、住民基本台帳を用いて無作為に選出された一般地域住民を対象として郵送調査を実施した。調査票は、先行研究や上述の1)の研究をもとに作成した。冒頭で統合失調症、大うつ病性障害、双極性障害、摂食障害、ひきこもりについての事例(ビネット)を提示し、それについてのイメージなどを尋ねた。1200人に調査票を郵送にて配布し、回収率は約3割であった。来年度に研究結果の分析と公表を行う予定である。23年度は、思春期・青年期における精神保健に関する実態調査および意識調査を行った。2つの大学受験予備校の浪人生および4つの大学の学生に調査を依頼した。大学浪人という制度が海外にほとんど存在しないことなどから、大学浪人生の精神保健に関する先行研究はほとんどない。しかし、受験への強いプレッシャーのなかで精神健康を悪化させるケースや、大学浪人生活を経てひきこもりなどに発展するケースも少なくないことから、これらの者の精神健康の維持増進は重要である。そこで、本研究では大学生と比較しながら大学浪人生の精神保健について明らかにするために質問紙調査を実施した。調査内容は、以下のとおりである。身体的愁訴の有無、睡眠、ストレス対処能力、抑うつ、その他個人背景データ。調査は無記名で実施し、調査票の回収をもって調査協力に同意することとした。調査協力者は、大学浪人生1075名、大学生285名であった。現在、結果を解析中である。また、初年度に実施した一般地域住民の精神障害・精神保健についての認識に関する調査の結果を公表した。特に、ひきこもりに対する一般住民の意識に着目して論文にまとめた。住民基本台帳から無作為に選出された地域住民のうち、ひきこもり者が地域で暮らすことが望ましいと考える人は64.7%であり、この値は統合失調症者に対するものと同程度であった。また、ひきこもりになったことに対して非難されるべきでないと思う人の割合は53.0%であり、他の精神疾患(統合失調症、うつ病、躁うつ病、摂食障害)と比較してもっとも低かった。

調査結果については現在分析を進めているところであるが、認知症患者の介護者は一般地域住民と比較して健康関連QOLが低下傾向にあること、また抑うつ状態にあると考えられる者が少なくないこと、認知症患者の認知機能の低下よりも認知症に伴う問題行動(Behavioral and Psychological Symptoms of Dementia;BPSD)が介護者の抑うつに関連していること、などが明らかになっている。また、22年度および23年度に実施した研究についてもさらなる分析を進め、学会発表や論文執筆作業を行った。地域住民を対象の精神障害等についての認識に関する調査の結果では、おおよそ統合失調症、躁うつ病、うつ病、摂食障害の順にネガティブなイメージをもっていることが明らかになった。また、ひきこもりについても比較的強い偏見があることが明らかになった。現在この結果については海外の専門誌に投稿中である。また、思春期・青年期というライフステージにある人々の精神健康に関する調査の結果から、大学浪人生は、抑うつ状態にあると考えられる者の割合が比較的高いことが明らかとなった。性別(女性)や保護者が進路へ反対していること、悩みの相談相手がいないこと、成績の悪さが、抑うつと有意に関連していたが、Sense of coherenceというストレス対処能力が高い場合にはこれらの要因との関連が弱まることが明らかになった。この結果についても、現在海外の専門誌に投稿中である。22年度の研究成果をまとめ、さらに思春期・青年期というライフステージにおける精神保健における実態調査・意識調査を実施することができ、今年度の計画目標はおおむね達成できていると考えられる。24年度は最終年度であり、22年度および23年度の研究成果についてより詳細な分析を行い、学会や専門誌などにて公表する。さらに、今年度は地域の高齢者、認知症高齢者およびその介護者の精神健康という観点から新たに調査も実施する。具体的には、認知症患者を抱える家族の家族機能の問題や、家族自身の精神健康の問題について、既存の尺度等を用いて調査を実施する。
中国南部に分布する洞窟棲淡水魚類の分子系統と適応進化

中国南部雲貴高原の石灰岩洞窟地帯に分布するコイ科魚類Sinocyclocheilus属は,さまざまな程度に洞窟適応した,種多様性の高い系統群である.本研究では,2度にわたって,貴州省,雲南省,広西壮族自治区で野外調査・標本採集を行ない,11地域の15地点から計18集団(種または下位分類群)を採集し,ミトコンドリアDNA (mtDNA)塩基配列分析とAFLP分析により,分子系統学および集団遺伝学的解析を行なった.採集された集団には,体色の白化したもの,目がさまざまな程度に退化したもの,背鰭前の背部が隆起し突起状になったものなど,さまざまな特化段階のものを含み,またいくつかの未記載種と判断されるものも含まれていた.mtDNAの部分塩基配列(約1600塩基対)に基づく分子系統樹から,本属には少なくとも6つの系統群が含まれ,その多くが,それぞれ洞窟周辺に棲息する好洞窟性の集団から,目の欠失などの典型的な洞窟適応を示す集団までを含んでいた.mtDNAの部分配列(約500塩基対)データやAFLP分析から,遺伝的多様性が低い集団が存在する一方,真洞窟性を含む多くの集団はある程度高い多様性を保持していることも明らかになり,広大な地下水系に比較的大きな集団として歴史的に存在してきたことが示唆された.系統地理パターンと洞窟への特化程度を合わせて考えると,古い時代に洞窟適応したグループと,比較的最近に好洞窟性の集団が広範に分散し,各地で真洞窟性集団として適応したグループが存在することが示唆された.本課題は,中国南部の洞窟地帯で大きく分化を遂げている洞窟棲淡水魚類Sinocyclocheilus属(コイ科)の系統進化と適応に関して分子系統学的にアプローチするものである.第1年度である本年は,まず実験施設の整備を進めた上で,11月に約1ヶ月間,中国貴州省,雲南省,広西壮族自治区において野外採集調査を行った.そして,得られた標本の分子系統解析の第1段階をとり行い,一定の成果を得た.野外調査は中国科学院動物研究所(北京)の全面的な協力のもとで行われ,数百kmスケールに含まれる14地域,計18カ所の洞窟を訪れ,9カ所でSinocyclocheilus属魚類を採集することができた.この中には,形態的に様々な程度に洞窟適応した,少なくとも10集団(種・亜種)が含まれていた.また同所的・同地的に3集団が生息する場所もあった.分子系統解析の第1段階として,まず,ミトゴンドリアDNAの非コード領域(調節領域)とシトクロームb遺伝子領域の部分塩基配列を1940個体について決定した.採集時に推察された生息地の環境容量や集団内の遺伝的多様性から,少なくともいくつかの集団(種)は大きな集団サイズを有していると考えられた.また,配列データから推定された集団間の系統類縁関係から,まず採集地と形態から区別された集団が単系統であること,いくつかの形態的に類似した各地の集団間に遺伝的な類縁関係が認められること,また同地域に系統的に離れた集団が生息することなどが明らかになった.次年度に追加標本の採集,形態的分化・特化の定量化および分子系統解析を進めることにより,本グループの洞窟への侵入,隔離,分散の過程をより明確にし,洞窟適応に際する形態・分子進化の関係についての考察を深める予定である.中国南部雲貴高原の石灰岩洞窟地帯に分布するコイ科魚類Sinocyclocheilus属は,さまざまな程度に洞窟適応した,種多様性の高い系統群である.本研究では,2度にわたって,貴州省,雲南省,広西壮族自治区で野外調査・標本採集を行ない,11地域の15地点から計18集団(種または下位分類群)を採集し,ミトコンドリアDNA (mtDNA)塩基配列分析とAFLP分析により,分子系統学および集団遺伝学的解析を行なった.採集された集団には,体色の白化したもの,目がさまざまな程度に退化したもの,背鰭前の背部が隆起し突起状になったものなど,さまざまな特化段階のものを含み,またいくつかの未記載種と判断されるものも含まれていた.mtDNAの部分塩基配列(約1600塩基対)に基づく分子系統樹から,本属には少なくとも6つの系統群が含まれ,その多くが,それぞれ洞窟周辺に棲息する好洞窟性の集団から,目の欠失などの典型的な洞窟適応を示す集団までを含んでいた.mtDNAの部分配列(約500塩基対)データやAFLP分析から,遺伝的多様性が低い集団が存在する一方,真洞窟性を含む多くの集団はある程度高い多様性を保持していることも明らかになり,広大な地下水系に比較的大きな集団として歴史的に存在してきたことが示唆された.系統地理パターンと洞窟への特化程度を合わせて考えると,古い時代に洞窟適応したグループと,比較的最近に好洞窟性の集団が広範に分散し,各地で真洞窟性集団として適応したグループが存在することが示唆された.
ＣＤ１１ｂｌｏｗＣＤ４５＋ｍｏｎｏｃｙｔｅの血管成熟化に関する機構解明

【研究目的】腫瘍血管新生抑制をより効率良くするために、単核球のpericyteへの分化誘導の詳細について解析を行った。さらにこの単核球が腫瘍構築・増殖にどの段階でどの程度影響を与えるか調査を行った。【研究内容】まず末梢血に存在する、pericyteに分化すると報告されている分画を蛍光標識を施した抗CD11b抗体と抗CD45抗体で染色し、FACSを用いて回収した。これにPDGFやVEGF等の血管内皮細胞・pericyte分化に関与する各成長因子を各濃度で組み合わせて添加し、ディッシュ上にて一定期間培養し、pericyteに発現するα-SMAにて染色しpericyteへの分化の有無の確認を行った。その結果、一部にはα-SMA陽性細胞が観察されたがその割合は低いことが明らかとなった。次に腫瘍内に単核球を移植することにより、腫瘍内におけるpericyte誘導が末梢血単核球の分化によるものか解析した。腫瘍内血管中にα-SMA陽性のものは観察されなかったがGFP陽性CD31(血管内皮細胞マーカー)陽性らしきものもごく一部に観察された。しかしその腫瘍を用いて再度FACS解析を行ってもGFP陽性CD31陽性の細胞は確認できず血管内皮細胞に分化しているかどうか同定できなかった。最後に上記の結果よりpericyteではなく血管内皮細胞に分化する可能性が示唆されたため、GFPマウスより回収した末梢血単核球と腫瘍細胞を混合しマウスへ皮下移植を行い免疫染色により血管内皮細胞への分化を調査した。その結果、先述した結果よりはわずかではあるが多くのGFP陽性CD31陽性細胞が観察された。しかし血管全体を構成しているわけではなく一部の血管のさらに部分的に存在していることが確認された。また血管密度や腫瘍の大きさが顕著に変化することもなかった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
血漿マイクロRNAを用いた大腸癌肝転移Precision Medicineの構築

1.大腸癌原発巣・肝転移サンプル解析、およびGenetic/Epigenetic解析:これまで岡山大学病院消化管外科・肝胆膵外科にて手術された進行大腸癌・転移性肝癌の切除標本より抽出したDNAサンプルのGenetic/Epigenetic解析を行った。2.循環miRNAの産生形態を証明するための実験アッセイ確立:ヒト大腸がん細胞株HT29を用いた実験で、Ago2-miR-21が癌細胞からの能動的な放出のみならず抗癌剤投与による細胞死に伴って細胞外に放出されることを実証した。EVsに内包されるmiRNAはAgo2-miR-21よりも微量であり、また能動的なEV-miR-31/200cの放出は認められなかった。さらに大腸癌患者の血漿サンプルよりAgo2-miRNAを回収し、miRNA PCRアレイ/マイクロアレイを用いて包括的発現を評価した。3. Liquid biopsy:大腸癌原発巣および肝転移の両切除標本においてmiR-21とmiR-200cが豊富に発現していた事からAgo2-miR-21, Ago2-miR-200cを測定した。その結果、Ago2-miR-21は原発および転移部位の両方で高度に発現され、能動的放出と受動的放出が行われているのに対して、Ago2-miR-200cは原発巣よりも転移部位に発現が高く主に細胞溶解により放出されていた。またmiR-451がAgo2複合体と結合して血漿中で安定して発現するmiRNAであることも示されたことから、循環miRNA発現を正規化する方法としてAgo2-miR-451をAgo2-miRNAの内部対照として選択した。進行大腸癌における化学療法・手術からなる集学的治療の経過中における血液サンプルを用いてAGO2-miRNAを測定し、臨床経過の中でのEventと併せ評価することで、精緻な腫瘍病勢評価が可能であることを証明した。1.大腸癌原発巣・肝転移巣サンプル収集およびGenetic/Epigenetic解析:これまでの蓄積サンプルに加えて、岡山大学病院消化管外科・肝胆膵外科にて行われた進行大腸癌・転移性肝癌切除症例より組織サンプルを収集・保存し、DNA抽出を行い、Genetic/Epigenetic解析を行った。更に臨床試験(UMIN ID 7236, 8377, 9698, 11954, 11955)への付随研究として、試験参加患者からの血液サンプルを収集している。2.循環miRNAの産生形態を証明するための基礎実験:“活性細胞"から能動的に放出されたExtracelullar vesicleと言われる膜小胞によるパッケージ(EV-miRNA)、抗癌剤による“腫瘍細胞死"に伴って受動的に放出されアルゴネイチャーファミリー(特にAGO2蛋白)と複合体を形成したAGO2-miRNAの産生形態を証明するために、大腸癌細胞株に対して抗癌剤(5FU)投与下でのCell viability評価を継続している。抗癌剤投与下で障害細胞から放出された乳酸脱水素酵素(LDH)を高感度に測定した(LDH assay)。更に培養液中のmiRNA測定を経時的に行うことで生存細胞代謝・死滅細胞との意義付けを証明するべく実験アッセイが確立されつつある。3. .Liquid Biopsyとして、経時的循環miRNAの測定、病勢評価の検討:研究対象は、肝転移に特異的なmiR-200cの他、KRAS/BRAF変異に相当するmRNAを対象とする。既存血液サンプル50例に加えて、新規の大腸癌肝転移発見時、肝切除術前、術後のFollow upにおいて経時的に末梢血を採集する。末梢血採血の収集サンプルのEV-miRNA/AGO2-miRNAを測定し、測定dataを集積している。サンプル集積・解析について、順調にDataは蓄積されつつあり、Liquid biopsyの候補となる循環miRNA候補と臨床経時的data(腫瘍マーカーなど血液検査、各種画像検査所見)との比較検討を将来的に行うべく準備は順調に進んでいる。更に治療方針確立に有意義となる腫瘍病勢評価としての循環血液中のmiRNAについて、細胞株を用いた基礎実験を併行しており、評価の裏付けを得るともに臨床応用可能なアッセイ確立に向けて、順調に実験は進んでいる。1.大腸癌原発巣・肝転移サンプル解析、およびGenetic/Epigenetic解析:これまで岡山大学病院消化管外科・肝胆膵外科にて手術された進行大腸癌・転移性肝癌の切除標本より収集された組織サンプルからのDNA抽出を全て完了しGenetic/Epigenetic解析を行った。3. Liquid biopsy:大腸癌集学的治療の経過中における採血サンプルを用いてEV-miRNA/AGO2-miRNAを測定し、臨床Eventと併せ評価することで、精緻な腫瘍病勢評価が可能であることを証明し、臨床応用への道筋をつけた。前年度から継続してきたサンプル集積と実験結果は蓄積されてきており、解析と考察も順調に進んでいる。論文投稿に向けて、総括を行っている段階であり、最終年度内の論文受領を目標に、順調に研究は進んでいる。2.循環miRNAの産生形態を証明するための実験

アッセイ確立:ヒト大腸がん細胞株HT29を用いた実験で、Ago2-miR-21が癌細胞からの能動的な放出のみならず抗癌剤投与による細胞死に伴って細胞外に放出されることを実証した。EVsに内包されるmiRNAはAgo2-miR-21よりも微量であり、また能動的なEV-miR-31/200cの放出は認められなかった。さらに大腸癌患者の血漿サンプルよりAgo2-miRNAを回収し、miRNA PCRアレイ/マイクロアレイを用いて包括的発現を評価した。3. Liquid biopsy:大腸癌原発巣および肝転移の両切除標本においてmiR-21とmiR-200cが豊富に発現していた事からAgo2-miR-21, Ago2-miR-200cを測定した。その結果、Ago2-miR-21は原発および転移部位の両方で高度に発現され、能動的放出と受動的放出が行われているのに対して、Ago2-miR-200cは原発巣よりも転移部位に発現が高く主に細胞溶解により放出されていた。またmiR-451がAgo2複合体と結合して血漿中で安定して発現するmiRNAであることも示されたことから、循環miRNA発現を正規化する方法としてAgo2-miR-451をAgo2-miRNAの内部対照として選択した。進行大腸癌における化学療法・手術からなる集学的治療の経過中における血液サンプルを用いてAGO2-miRNAを測定し、臨床経過の中でのEventと併せ評価することで、精緻な腫瘍病勢評価が可能であることを証明した。腫瘍病勢評価の指標となり得るLiquid Biopsyの検査手技を確立するために、蓄積された経時的循環miRNAの測定dataと、従来既存の腫瘍マーカー推移、CT画像変化とを比較検討していき、循環miRNAの意義を証明する。具体的には、1EV-miRNAと再発率との相関、2EV-miRNA/AGO-2-miRNAと化学療法奏功率との相関、3既存腫瘍マーカーとの精度の比較を予定している。前年度から継続してきたサンプル集積と実験結果は蓄積されてきており、解析と考察も順調に進んでいる。研究総括を踏まえ設立したPrecision medicineを臨床現場に応用すべく、学術論文に投稿し、情報発信を企図している。論文投稿については、査読後の追加実験に備え、予備実験も適宜進めていく予定である(具体例:抗ヒトAgo2抗体を用いて、血漿からAgo2蛋白を抽出し、Western blottingによるAgo2蛋白同定を予定)。大腸癌原発巣・肝転移サンプル収集、及びGenetic/Epigenetic解析を行う中で、リアルタイムPCR、細胞培養に用いる試薬・抗体購入を予定していたが、予定よりも少ない量で順調に結果が得られたために、次年度繰越研究費が発生した。大腸癌原発巣・肝転移サンプル収集・及びGenetic/Epigenetic解析を行う中で、リアルタイムPCR,細胞培養に用いる試薬・抗体購入を予定していたが、予定していたよりも少ない量で順調に実験結果が得られたために、次年度繰り越し金を生じた。(使用計画)今後、論文査読の中で生じる追加実験(基礎実験、in vivo実験)の実施にあたり費用がかかるために、繰り越し研究費を充てる予定である。今後、既存札細胞剤・分子標的薬併用についての基礎実験、及びin vivo実験実施にあたり費用がかかるために、繰越研究費を充てる予定である。
アデノウイルスを使ったEGF受容体遺伝子導入による造血幹細胞の増幅

これまで、種々のサイトカインの組み合わせにより血液幹細胞を体外で培養し増幅させる試みが行われてきた.しかし,血液細胞に増殖作用を有するサイトカインは,同時に分化誘導作用を持つため,これらを用いて多分化能血液幹細胞を効率良く増幅させることは困難であった.遺伝子導入のベクター系としては,アデノウィルスを用いている.アデノウィルスを用いる理由は、1)アデノウィルスは,増殖能の低い細胞に効率良く感染する.このため,dormantな多分化能血液幹細胞への遺伝子導入に都合がよい.2)アデノウィルスは,感染した細胞のgenomeに組み込まれることがなく,細胞内に一過性に存在する.従って,体外増幅の後に細胞を患者に移植しても,ウィルスが細胞内に長期に存在することはなく,アデノウィウス感染による副作用の危険性が低い.すでに我々は,ヒトEGF受容体遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクターの開発を行い,モデル実験として,血液細胞株への感染実験を開始した.作成した、ヒトEGF受容体遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクターをヒト血液細胞株へ感染させた後、ヒトEGF受容体の発現を確認したところ、細胞表面におけるヒトEGF受容体の発現が確認された。更に、ヒトEGF受容体を発現したヒト血液細胞株をヒトEGFで処理し、細胞が反応するか否かを解析したところ、細胞増殖という点から反応が認められた。この実験結果はヒト血液細胞株に発現させたEGF受容体がEGF刺激に反応して増殖シグナルを伝えたことを示すものである。このように遺伝子操作を用いて血液細胞の増幅を試みた研究は,今までにほとんど例を見ない。この方法は,基礎検討が成功すれば,臨床にも比較的容易に応用できると期待される。
チタニウムインプラント被包化過程におけるマトリックスと蛋白と分解酵素の発現動態解明

チタニウムインプラントは顎顔面領域において、口腔癌切除後の再建術や下顎骨骨折治療の骨接合術に際して、広く用いられている.これらのインプラント周囲の線維組織は活性化した線維芽細胞が多く認められるfibrogenicな組織であり、tissue remodellingの場である.Tissue remodellingは細胞外マトリックス合成系と分解系のバランスにより構築されている.fibrogenicな組織におけるMMPとTIMPの発現は,線維芽細胞やマクロファージなどの紡錘形細胞と血管内皮細胞・平滑筋細胞において以下の通りであった.MMP-1,MMP-3,MMP-8およびMMP-9は陰性,MMP-2が陽性,TIMP-1およびTIMP-3が陽性,TIMP-2が強陽性であった.Scar like tissueでは線維芽細胞はMMP群,TIMP群のどれも陰性であった.続いて、口腔癌切除後の再建術において、チタニウムインプラント周囲組織をさらに被うようにして用いられる皮弁の反応について検討した。多くの症例で著名な炎症像が観察された。これらの症例では皮弁の表皮に真菌要素Candidaalbicansが存在した。真皮へ浸潤した主な炎症細胞はCD4^+/CD45RO^+のメモリ-リンパ球であった。これらのリンパ球は真皮においてCD1a陽性ランゲルハンス細胞(LC)とクラスター形成していた。真皮LCの多くはB7-2^+,CD83^+でメモリ-リンパ球と密接に接触していた。CD4^+リンパ球のKi-67labelingindexは4.2%で、CD8^+リンパ球の0.8%と比較し高率であった。リンパ管内にも多くの成熟LCが観察された。これらのLCはB7-2^+,B7-1^+,CD83^+であった。ランゲルハンス細胞がインプラント被包化においても重要な役割を果たしているのではないかと推察された。チタニウムインプラントは顎顔面領域の骨接合術や骨再建術で広く用いられている.これらのインプラント周囲の線維組織はtype1 procollagen陽性の線維芽細胞が多く認められるfibrogenicな組織であり、tissue remodellingの場であると考えられる.Tissue remodellingは細胞外マトリックス合成系と分解系のバランスにより構築されているとされている.Matrix metalloproteinase(MMP)は細胞外マトリックスを分解する酵素群であり、Tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP)はその酵素阻害タンパクである.これらの分解酵素と酵素阻害タンパクは、インプラント被包化の成熟および維持に強く関与していると考えられる.Type1 procollagenとの二重染色によりMMP-2およびTIMP-2を発現する細胞は活性化された線維芽細胞であることが確認された.また免疫電顕法にてもMMP-2およびTIMP-2を線維芽細胞であることが確認された.CD68との二重染色にてマクロファージの一部も発現していることが観察された.また免疫電顕法にてもこのことが確認された.これらの発現パターンは線維化進展に関連するパターンだと考えられた。平成11年度はMMP-2とTIMP-2のプローブを用いInsitu hybridization法により,mRNAの発現の確認および発現細胞の同定を実施する予定である.チタニウムインプラントは顎顔面領域において、口腔癌切除後の再建術や下顎骨骨折治療の骨接合術に際して、広く用いられている.これらのインプラント周囲の線維組織は活性化した線維芽細胞が多く認められるfibrogenicな組織であり、tissue remodellingの場である.

Tissue remodellingは細胞外マトリックス合成系と分解系のバランスにより構築されている.Fibrogenicな組織におけるMMPとTIMPの発現は、線維芽細胞やマクロファージなどの紡錘形細胞と血管内皮細胞・平滑筋細胞において以下の通りであった.MMP-1,MMP-3,MMP-8およびMMP-9は陰性、MMP-2が陽性、TIMP-1およびTIMP-3が陽性、TIMP-2が強陽性であった.Scarlike tissueでは線維芽細胞はMMP群、TIMP群のどれも陰性であった.続いて、口腔癌切除後の再建術において、チタニウムインプラント周囲組織をさらに被うようにして用いられる皮弁の反応について検討した。多くの症例で著明な炎症像が観察された。これらの症例では皮弁の表皮に真菌要素Candidaalbicansが存在した。真皮へ浸潤した主な炎症細胞はCD4^+/CD45RO^+のメモリーリンパ球であった。これらのリンパ球は真皮においてCD1a陽性ランゲルハンス細胞(LC)とクラスターを形成していた。真皮LCの多くはB7-2^+、CD83^+でメモリーリンパ球と密接に接触していた。CD4^+リンパ球のKi-67labelingindexは4.2%で、CD8^+リンパ球の0.8%と比較し高率であった。リンパ管内にも多くの成熟LCが観察された。これらのLCはB7-2^+、B7-1^+、CD83^+であった。ランゲルハンス細胞がインプラント被包化においても重要な役割を果たしてるのではないかと推察された。
小児看護における熟練技術を創造する組織のモデル化

本研究の目的は、病棟組織において技術の熟練化を促進するための具体的な方策を提示することである。研究は、(1)文献検討、(2)質的研究、(3)米国の小児病棟視察、を通して遂行された。研究成果として、小児病棟組織は技術の知識や情報が共有されにくい特性を持っていたこと、しかし、組織メンバーのダイナミクスな相互作用が起こると技術の熟練化が促進されることを明らかにした。その促進のための具体的な5つの要件と今後の課題について提示した。平成18年度は、文献検討を行い調査のための基本的指針を立案した。また、調査の具体的な方針を検討するため、協力が得られる施設で勤務している看護師らとの勉強会を数回もち、施設の看護体制、教育体制についての確認を行った。1.看護の技術の共有と創造が行われる場に関する国内外の研究論文レビューを行った。知識創造理論は本研究への応用可能な理論であると考えられた。臨床現場の現状を記述していくなかで看護における組織学習の様相を概観できる可能性がある。2.基本的指針としてのリサーチクエスションを立案した。初期のリサーチクエスションとして、調査対象施設の看護師の探求する熟練技能とは何か、なぜ看護師らがそれを熟練技能とみなすのかを社会学的な観点から探求していくことに決定した。3.調査の協力について施設との調整を行った。調査に協力が得られる可能性のある施設の内諾を得た。さらに、看護師らとの勉強会を持ち調査に関する理解と、看護教育状況についての情報を得た。施設内、特に小児病棟では看護師の研究・教育に関するモチベーションが高く、組織的に指導者育成にも力を入れていた。日本の臨床教育に関する先行研究では中堅看護師層への教育の手薄さが指摘されているが、そうした中、意図的に中堅看護師層への指導を強化しているという点で大変興味深い組織であると考えられた。参与観察の時期はH19年度8月開始予定とし、研究計画書を作成した。今後、次年度調査実施に向け、本大学および対象施設の倫理委員会にかける。審査を経て、研究計画書に従い予備的フィールドワークの後、本研究に入る。平成19年度は、前年度に引き続き協力が得られる施設で勤務している看護師らとの勉強会を数回持ち、リサーチクエスションの洗練を行った。さらに予備調査を行い、本調査に向けた課題を明らかにした。1.勉強会の継続により得られた知見勉強会を重ねる中で、看護師間の相互作用が浮き彫りになってきた。自由参加である勉強会であったが、そこでは看護師間の上下関係や時間的拘束、業務遂行などのさまざまな組織体制の影響を受けて相互行為が展開されていた。また、そこでは単に知識のあるものが無いものへ一方向的に教えるといった一般的な教授関係とは異なる相互行為が展開されていた。これらは、本研究のテーマと関連する興味深い結果であると考えられた。2.予備調査予備調査として看護師へのインタビューの協力を得て実施した。その結果、まず、看護師らの習得を望む熟練技能というものは、確固たる実在するものではなく個々のもつ表象であることがわかった。しかしながら、OJTとしての技術教育で望むものは、実在するものとして議論されることが多かった。OJTは看護の現場教育において注目されている教育方法であるが、実践の中の教授関係における教育方法との差異についてさらに探求することが課題であると考えられた。平成20年度は、研究計画に基づき(1)本調査、(2)米国の小児病院・病棟視察を実施し、最終年度としてのまとめを行った。【本調査】日本赤十字看護大学倫理委員会の承認を得て、本調査を実施した(テーマ「小児看護における実践知を共有する組織」)。その結果、(1)病棟組織内において目的が共有される、(2)個人レベルで自由な行動が認められる、(3)病棟組織と外部との相互作用が自由に起きる、(4)知識や情報が繰り返し伝達される、(5)自由に知識や情報を得ることができる、ことによって実践知の共有・創造が促進されることが明らかになった。この研究成果については日本看護科学学会(平成20年12月)において発表した。【視察】米国(デンバー/コロラド州)の(1)The Children's Hospital、(2)St.Luke's MedicalHospitalの視察を行った。(1)ではDr.Fosterとのミーティングの後、主に「ナイチンゲール病棟」の見学を行った。(2)ではDr.Magilvyとのミーティングの後、小児病棟の見学を行った。技術教育体制として病院の理念を教育プログラムへ反映させることや、その教育効果の評価として看護師自身の職場満足感に着目している現状を知ることができた。また、その際の課題も明らかになった。
ポルトガルのEC(欧州共同体)加盟プロセス―アイデンティティの変容に注目して

本研究では、南欧の一国ポルトガルにおける民主化とヨーロッパ統合の関係について、民主化過程において重要な役割を果たしたポルトガル国内の主要主体のアイデンティティの変化に注目しながら分析を行った。申請者はすでに過去の研究において、権威主義政権主要閣僚と民主主義諸政党執行部のアイデンティティについての考察を行っている。また平成20年度には、それらとならび対象時期のポルトガル政治において重要な役割を果たした主体である軍部の有力者の行為や発言について、現地資料調査も交えつつ考察した。そしてその内容を、京都大学地域研究統合情報センターが発行する一冊の論文集のなかにまとめた。本年度は、これまでに行ったすべての分析結果を、博士論文としてまとめる作業を行った。そして平成21年10月、博士学位申請論文を所属大学に提出した。同論文の内容については、同年11月に開催された日本EU学会研究大会で発表した。さらに平成22年1月に実施され博士論文公開口述試験においても報告した。そして同試験に合格し、同年3月末、博士号(国際関係論)を正式に取得した。試験の際、いくつかの課題を指摘された。そのため同年2月末から一週間程度、リスボンに出張し、それらに関する調査を実施した。今後は、同調査内容を論文に反映させたうえで、一冊の書籍として刊行する予定である。同書は、ポルトガルとEC加盟プロセスに関する国内初の研究書となるであろう。本研究は、ポルトガルの権威主義体制後期からEC(欧州共同体)加盟に至るまでの過程について同国の政治主体のアイデンティティの変容に注目しながら考察し、同国のEC加盟の要因を明らかにすることを目的としている。過去の研究において私は、権威主義政権主要閣僚と民主主義諸政党執行部についての考察を行っているため、本年度の研究では、それらとならび対象時期において重要な役割を果たした主体である軍部の有力者の行為や発言について、現地資料調査も交えつつ考察を行った。具体的には、まずポルトガルの軍部とECの関係について知ることのできる二次文献を読み込み、対象時期の軍部の行動や軍部とECの関係の概要についての理解を深めた。そしてそこから得た情報を手がかりに、8月に40日間程度リスボンに滞在し、国立図書館や国立公文書資料館所蔵で史料調査を実施し、軍部の主要人物のアイデンティティの変化、およびそれがポルトガル政治に与えた重要性を示す一次資料を収集した。帰国後、調査結果をもとに、京都大学地域研究統合情報センター等主催のシンポジウム(10月4日開催)およびその成果報告としての同センター編の論文集『Kyoto Discussion Paper』第7号において発表を行った。今後は、軍部を除く権威主義体制崩壊後のポルトガルの主要主体についての調査を行ったうえで(すでに部分的には過去に実施済み)、その調査内容を本年度のものを含む過去の研究と合わせ、一つの成果としてまとめる予定である。