hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コラーゲン遺伝子異常による心臓刺激伝導障害の新たな分子病態の解明

家族性心臓伝導障害家系の全エクソン解析で、VI型コラーゲン(COL6A2)を同定した。Purkinje線維周囲のコラーゲンが、隣接する心室筋細胞との絶縁効果を高め、迅速な心室内伝導をもたらす可能性を検証するために、COL6A2の心筋内・細胞内局在を分析した。胎生時にはCOL6A2は心室筋細胞の全層にわたって発現していたが、年齢依存性に心内膜側に集族するようになり、生後1月ではほぼ刺激伝導系に強く発現していた。一方、CRISPR/Cas9ゲノム編集で作成したCOL6A2変異ノックインマウスは、予想に反して、年齢12カ月でも心電図異常を示さなかった。1. Purkinje線維標識マウス心筋におけるCOL6A2の局在・経年変化Purkinje線維に特異的に発現するContactin2-EGFP融合タンパクのトランスジェニックマウス(cntn2-EGFP)を、胎生12日から生後1か月まで左室横断切片を作成し、VI型コラーゲンを免疫組織染色した。胎生時にはVI型コラーゲンは心室筋細胞の全層にわたって発現していたが、年齢依存性に心内膜側に集族するようになり、生後1月ではcontactin2と同様、ほぼ刺激伝導系に強く発現していた。単離心筋細胞でもVI型コラーゲンは、細胞外的リックスとして心筋細胞周囲に発現していた。RNAレベルでも、COL6AのRNA発現量は心室筋細胞よりも伝導系細胞で強かった。2.進行性心臓伝導障害(PCCD)の網羅的遺伝子解析4世代にわたる日本人PCCD家系のうち罹患者3人・非罹患者2人の全エクソン解析を行った。各種公的バリエーションデータベースでフィルタリングしたところ、COL6A2, TTN(タイチン), NUPL2(ヌクレオポリン2)の変異が家系内で臨床像と合致していた。さらに、日本人PCCD 53家系に関して、上の3つの遺伝子を含む200遺伝子のターゲットエクソン解析を行ったところ、LMNA(ラミンA/C)16人、SCN5A(心筋Naチャネル)11人、COL6A2 2人、その他の遺伝子6人に変異が同定された。COL6A2はPCCDの新たな疾患遺伝子である可能性が高くなった。3.CRISPR/Casシステムを用いたCOL6A2ノックインマウスの作成CRISPR/Casシステムを用いて上記PCCD家系に同定されたCOL66A2-変異P402Aノックインマウスを作製した。21日後産仔のジェノタイピング行い、オフターゲット解析で配列異常がないものをファウンダー(F0)とし、さらに野生型個体との戻し交配を行って生殖系列伝達を確認する。現在F2世代のホモを繁殖中で、今後心電図を含め電気生理学的にPCCDとしての表現型がないかどうかを検討する。1. COL6A2が刺激伝導系細胞周囲の細胞外マトリックスとして発現分布していることを、刺激伝導系細胞を標識したトランスジェニックマウスを使い証明した。2.全エクソン解析、ターゲットエクソン解析によってPCCD患者の網羅的遺伝子解析を行い、COL6A2がPCCDの原因遺伝子であることを確実にした。3. COL6A2-P402Aのノックインマウスを樹立し、近々機能評価を行う。1. Purkinje線維標識マウス心筋におけるCOL6A2の局在・経年変化:Purkinje線維に特異的に発現するContactin2-EGFP融合タンパクのトランスジェニックマウスの左室をVI型コラーゲンで免疫組織染色した。胎生時にはVI型コラーゲンは心室筋細胞の全層にわたって発現していたが、年齢依存性に心内膜側に集簇するようになり、生後1月ではcontactin2と同様、ほぼ刺激伝導系に強く発現していた。2.進行性心臓伝導障害(PCCD)の網羅的遺伝子解析:4世代日本人PCCD家系の全エクソン解析でCOL6A2, TTN, NUPL2変異が候補遺伝子と考えられた、さらに日本人PCCD 53家系に関して、200遺伝子のターゲットエクソン解析を行ったところ、COL6A2変異キャリアが2人確認された。その他に、LMNA、SCN5A, GJC1などの遺伝子変異を確認した。COL6A2はPCCDの新たな疾患遺伝子の可能性が高くなった。3.Col6A2ノックアウトマウスおよびCRISPR/Cas Col6a2ノックインマウスの心電図計測:Col6a2 KOマウスを購入し、心電図を計測したがCRISPR/Casシステムを用いて上記PCCD家系に同定されたCOL66A2-変異P402Aノックインマウスを作製した。年齢6カ月のF2マウス(WT n=9,ヘテロn=17,ホモn=13)で心電図計測したが、心拍数、PR時間, QRS幅, QTc時間いずれも差がなかった。伝導障害が強いとされるSvjストレインと交配したマウスでもその傾向は変わらなかった。遺伝子解析(エクソーム)、組織染色、ノックインマウス作成およびin vivo解析を完了した。想定と異なりネガティブな結果となったが、可能な限りの手段を取って解析を行った。前年度までに作成したCol6A2ノックインマウスは、生後1年後まで経過を見たが、伝導異常を含めた心電図異常(心拍数、PR時間、QRS幅、QT時間)はみられなかった。そのため、別の心臓伝導障害家系の次世代シークエンスで見出したコネキシン45(Cx45)の遺伝子(GJC1)のミスセンス変異R75Hについて研究を継続した。

日本・フランス2家系の進行性心房伝導障害に同一の変異Cx45-R75Hが同定された。4人のキャリアは共通の臨床症状として、(1)房室ブロック・心房静止などの進行性心房伝導障害と(2)短顔症・屈指症・永久歯無形性などの歯牙骨格異常を示した。この変異が心房の進行性伝導障害・心房静止と歯骨形成異常の病因であることを証明するために、変異Cx45のギャップ結合の生化学的・生理学的特性をin vitroで解析した。培養N2a細胞に強制発現させたCx45-R75Hは、ほぼ正常Cx45と同様、細胞・細胞間のギャップ結合プラークを形成した。しかし、Lucifer Yellowの隣接細胞へ移行する速度はCx45-R75Hで著しく遅延、ダブルホールセルパッチクランプ法測定した細胞間コンダクタンスも著しく低下していた。これらの結果は、Cx45-R45Hはギャップ結合に大きな構造異常をもたらすことはないが、その電気生理学的特性は著しく低下していることが判明した。Cx45変異がもたらす心房伝導障害をin vivoで確認するために、心臓特異的コンディショナルノックアウトマウスを作成した。タモキシフェン誘導によって心臓Cx45をノックアウトすると、マウスの心電図はP波消失、PR間隔延長、心房性不整脈を示し、経食道ペーシングでも洞結節回復時間の延長が確認された。以上の研究から、Cx45遺伝子は進行性心房伝導障害の新規の疾患遺伝子であることが証明された。家族性心臓伝導障害家系の全エクソン解析で、VI型コラーゲン(COL6A2)を同定した。Purkinje線維周囲のコラーゲンが、隣接する心室筋細胞との絶縁効果を高め、迅速な心室内伝導をもたらす可能性を検証するために、COL6A2の心筋内・細胞内局在を分析した。胎生時にはCOL6A2は心室筋細胞の全層にわたって発現していたが、年齢依存性に心内膜側に集族するようになり、生後1月ではほぼ刺激伝導系に強く発現していた。一方、CRISPR/Cas9ゲノム編集で作成したCOL6A2変異ノックインマウスは、予想に反して、年齢12カ月でも心電図異常を示さなかった。2. PCCD患者からiPS心筋細胞を樹立し、刺激伝導障害メカニズムをin vitroで解析する予定である。心臓伝導障害の網羅的遺伝子解析で、COL6A2と同時にギャップジャンクション遺伝子GJC1(コネキシン45)の変異を同定した。房室ブロックの3世代日本人家系とフランス人新規発症例に同一の変異R75Hを同定し、その結果をin vitro,in vino解析し、論文に投稿した(Seki, Makita et al JACC, in revision)。循環器内科学2. PCCD患者からiPS心筋細胞を樹立し、機能解析するため。H28年9月, iPS心筋細胞の機能解析に用いる予定の多電極細胞電気解析装置(MED64)が故障した。古いOSを使用していたため修理に時間を要し、その間のiPSの培養も中断しており、実験がおよそ3か月遅れた。H29年度にiPSの実験を行い、成果を年度内にまとめる。伝導障害の機能を見るために、すでに作成したiPS心筋細胞の培養に用いる試薬に充てる予定である。
高機能ハイドロゲル誘導癌幹細胞を制御するエピジェネティクス変異の解析

癌組織中に存在する癌幹細胞は治療抵抗性を有し、再発の原因となるため、癌幹細胞を標的とした治療法の開発が求められる。我々は北海道大学で開発された高機能ハイドロゲルを用いた癌細胞の培養による迅速な癌幹細胞誘導システムを開発し、長期間の培養で不可逆的に癌幹細胞の性質を誘導することを明らかにした。この現象には高機能ハイドロゲルからの刺激により生じた後天的な遺伝の仕組みの一つであるエピジェネティックな変化の関与が考えられる。本研究では、様々な癌腫における高機能ハイドロゲル上での癌幹細胞誘導に関与するエピジェネティクス変異を解析し、癌幹細胞の発生機序の解明や癌幹細胞を標的とした新たな治療法の開発を目指す。
一重項縮環共役開殻分子系の光学スペクトルの理論研究

一重項縮環共役開殻分子系の電子構造と(非)線形光学スペクトルの相関関係を解明するための計算・解析手法の開発と実在系への適用を行った。ab initio MO法に基づく量子マスター方程式を用いて動的二次非線形応答の計算・解析法の開発に成功し、第二高調波発生スペクトルの置換基効果や波長分散に対する構造特性相関を明らかにした。一重項縮環共役開殻分子系の多参照摂動論による励起状態計算を実行し、線形、二光子吸収スペクトルの実験値と比較することで構造特性相関を明らかにした。開殻分子系の派生として、キノイダルオリゴチオフェンやなど局在化ジラジカル系についても構造特性相関を明らかにした。本年度は、実在の開殻オリゴマー分子系であるキノイダルオリゴチオフェンに関して、開殻性と分子構造および光学スペクトルの形状の間の関係についての研究を行った。特に、キノイダルオリゴチオフェンのユニット数(n)と開殻性の指標であるジラジカル因子(y)および三次非線形光学(NLO)特性の指標である第二超分極率(γ)の間の相関関係を議論した。以下に簡単に結果をまとめる。これまでに芳香族炭化水素系などを中心に開殻NLO分子系の探索を行ってきたが、開殻PAH系は一般に合成が非常に難しく、開殻性の異なる実在系での系統的な研究は困難であった。一方、キノイダルオリゴチオフェンは、古くからキャリア輸送材料として検討から多くの誘導体が合成され、分光学および計算化学に基づく研究から、開殻性を有することが明らかになってきた。しかし、これらの系の開殻性の定量評価や三次NLO特性との関係は未解明であった。オリゴマー分子では、nを変えることで系統的に物性が変化するが、ここでは、それに伴う開殻性の変化に着目した。密度汎関数法に基づいて、これらのnとyとγの関係を検討した結果、本系はn=4-5で大きな三次NLO特性を示すこと、それが中間の開殻性に起因することを、理論計算に基づき明らかにした。一方、分子鎖長の効果も評価した結果、開殻性の変化するオリゴマー系では、中間の開殻性と分子鎖長との両方を指針とすることで、従来の閉殻オリゴマー材料を超えるような著しい三次NLO特性の増大を発現することが示された。本成果は物理化学(材料)系のトップジャーナルの一つである、J.Phys.Chem.Cに掲載された。本系は、実在分子系であり、本成果に基づいて、合成、測定を行っているグループとの共同研究を開始した。現在、前年度に検討した多参照理論に基づく計算法などにより、これらの線形および二光子吸収スペクトルの検討を開始している。本年度は、開殻多環芳香族炭化水素(PAH)系の光応答物性について、開殻性(ジラジカル因子)と分子構造および光学スペクトル(線形および二光子吸収スペクトル)の形状の間の関係についての研究を行った。また、非対称系の動的第一超分極率についての方法論開発も行った。開殻PAH系では、基底状態に開殻性を有するため、その電子スペクトルの予測や機構解明のために必要な量子化学計算法の選定が重要である。本年度は、開殻性を考慮可能な多参照理論に基づく電子状態計算法の適用性を検討した。実験により大きな二光子吸収特性を持つことが示された、ジラジカル因子の異なる2種類のジフェナレニルジラジカル化合物の二光子吸収スペクトルを、CASSCF/NEVPT2法に基づき計算した電子状態間の遷移特性から算出した。その結果、スペクトル形状のジラジカル因子依存性に関して、実験で得られた結果を定性的・半定量的に再現した。電子遷移を解析した結果、ジラジカル因子の大きな系では、励起状態間の遷移モーメントが大きくなることで二光子吸収特性が大きくなる機構が明らかになった。これらの結果は2サイトのモデルジラジカル系に対する解析解による結果とも一致し、理論に基づく設計指針の妥当性が示された。本研究の成果を分子科学討論会討論会2012東京にて口頭発表し、その内容が評価され分子科学会優秀講演賞を受賞した。また、量子マスター方程式動力学法をab initio MO CI法と組み合わせたMOQME法に基づき、閉殻非対称系の動的第一超分極率(第二高調波発生)を計算、解析する方法論を提案し、プログラムに実装した。本手法により、外部振動電場により誘起される電荷密度の非線形応答を可視化し、各原子や各軌道の寄与の解析が可能になった。現在は広範な分子系に適用可能なTDDFT法と組み合わせた手法への拡張を行っている。局在化ジラジカルであるシクロ

ペンタン-1,3-ジラジカル構造を有する中間体の、化学・電子構造と寿命との相関についての実験的研究が行われており、C2位置換基Xの導入により、一重項ジラジカル中間体の速度論的安定性が増大することが明らかになっている。この結果は、この化合物の基底状態の開殻性が置換基により制御されることを示している。本年度は実験家との共同研究により、シクロペンタン-1,3-ジラジカル化合物の開殻性と光学応答特性との相関を理論計算により検討した。その結果、置換基XがOHやFといった、長寿命化を導く置換基の導入により開殻性が中程度となること、その結果として三次非線形光学(NLO)特性の著しい増大が得られることが明らかになった。一方で、線形な分極率にはそのような増大は見られなかった。以上の結果より、基本的なジラジカル骨格である1,3-ジラジカル化合物の構造-光学応答特性相関が見出された。また、このことは、中間的なの結合状態を示す反応中間体の検出などへの応用可能性が示唆された。以上の結果は、J. Phys. Chem. Aに掲載され、今後の開殻性化学種の電子構造を非線形光学スペクトルにより明らかにするための基礎研究となると期待される。また、モノラジカル種であるフェナレニルラジカルからなるπ-πスタック型一次元集合体についても高精度励起状態計算を実行し、分子間に中間的な結合を有する二量体の二光子吸収スペクトルの第一ピーク値が、縮環共役型のジフェナレニル化合物の第一ピーク値に匹敵する可能性を見出した。本結果については四量体でのさらなる増大の結果と合わせて、日本化学会春季年会にて発表した。理論化学前年度までは、PAH系を始めとする種々の実在分子系をターゲットとして、構造ー光学応答特性の相関を明らかにすることを試みてきたが、これらの系では、開殻性を変化させるためには、構造や電子数、原子数が異なる系を対象にする必要があった。これにより、開殻性との相関関係を明らかにするための系統的な研究が難しかった。本年度はキノイダルオリゴチオフェンという実在系のオリゴマー分子に着目し、静的な応答を検討したが、その結果、本系が上記の系統的な研究の目的に合致した系であることが明らかになった。また、静的応答の範囲では、閉殻オリゴマー系に比べて著しい増大が見られることが明らかになった。これらの成果を論文および国際会議で発表した結果、本系の合成、測定を行っている国内外の研究者との共同研究を開始することが出来た。この共同研究により、本課題の目的の一つである実在系の線形および非線形光学スペクトルの理論計算の結果に対する、実験サイドからの詳細な検討が可能となった。このことから、興味深い開殻系への展開のための整備について当初計画の通りの達成度が得られたと言える。多参照理論に基づく光学スペクトルの計算については本年度から本格的に取り組み始めた。概要で述べたとおり、実験のあるいくつかの系では良好にスペクトルの形状を再現することが出来た。2年目以降も引き続きこれらの手法の適用範囲を種々の実験値と比較する必要があるが、1年目に得られた結果により方法論の選択に関してはかなりの知見と経験が得られた。これにより、2年目以降に予定している新規開殻分子系の提案に関して今後の新たな進展が期待できると期待できる。
低投入栽培下でのイネ共生細菌群集の動態とその制御メカニズムの解明

複数の品種を化成肥料を投入しない圃場で栽培した。イネに共生する細菌は、イネの生育ステージ進むにつれて安定し、幼穂形成期、出穂期、完熟期では、プロファイルが安定し、収束していく傾向が認められた。また、それぞれのステージに置いて品種比較を行ったところ、品種の影響に比べて、生育ステージの影響が大きいことも明らかとなった。先進国では、農業からの環境負荷を軽減するために、肥料や農薬を使わない低投入持続型農業が提唱されている。しかし、これらの栽培方法では、単位面積当たりの穀物生産量を現在以上に増大させることは難しい。そこで、低投入持続型農業での増収の実現に向けて、植物共生微生物の力を利用する試みがなされている。すでに商品開発されている製品の中には、「イネファイター(前川製作所)」という、Azospirillum属細菌を含む微生物資材がある。イネファイターを施用した圃場の水稲は穂数が多くなり、多収となった例が報告されている。この穂数を増やす接種効果には、品種間差異も認められている。さらには、植物の免疫力も高め、いもち病等に対する抵抗性を向上させるという報告もある。一見するといいことずくめのように聞こえるが、微生物資材の効果は、化成肥料に比べて不安定であり、効果を発揮する条件(土壌や気象等)が限られる傾向にある。農業現場で、植物共生微生物の力を利用するには、植物を含めた環境と微生物の相互作用を解明していく必要がある。申請者は、イネの植物共生細菌に着目し、共生細菌群集に影響を与える要因を明らかにしてきた。イネ共生細菌群集は部位によって異なっており、根では、窒素施肥の影響が大きく、葉や茎では品種の違いが影響を及ぼしていることが分かった。次の課題は、葉や茎で影響を受けている共生細菌種を特定し、それを制御する宿主側の機構を明らかにすることである。無施肥圃場で栽培したイネ4品種(コシヒカリ、カサラス、タカナリ、IR64)から、移植期、分げつ期、幼穂形成期、出穂期、完熟期での上位葉から細菌細胞を分離した。遺伝解析を行うためには多検体を扱う必要があるので、細胞分離方法をより簡便な葉面から集菌する方法を試みた。ユニバーサルプライマーで使用する前に、優占している場合の多いMethylobacterium属細菌に着目して、プロファイルを解析した。共生細菌のプロファイルは、Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA)法により解析した。分げつ期のサンプルでは、検出されるピークが反復ごとに異なり、共生細菌群集が安定していないと推察された。その後、幼穂形成期、出穂期、完熟期では、プロファイルが安定し、収束していく傾向が認められた。移植期からはシグナルが検出されなかったため、比較には含めなかった。植物の生育ステージ及び部位により、共生細菌群集が変化することを明らかにすることができた。しかし、この細菌細胞収集法では品種間差異が検出できなかったため、方法を以前の破砕法に戻し、再度取り組む必要がある。

移植期からはシグナルが検出されなかったため、比較には含めなかった。植物の生育ステージ及び部位により、共生細菌群集が変化することを明らかにすることができた。本年度は、植物の生育ステージが共生細菌群種に与える影響を明らかにすることを目的とした。コシヒカリとコシヒカリを遺伝背景とした出穂期が約2および4週間遅くなる系統を栽培した。これにより、共生細菌に与える影響が、生育ステージなのか、生育環境なのかを明らかにすることができる。現在、シークエンス用に細胞を濃縮している。先進国では、農業からの環境負荷を軽減するために、肥料や農薬を使わない低投入持続型農業が提唱されている。しかし、これらの栽培方法では、単位面積当たりの穀物生産量を現在以上に増大させることは難しい。そこで、低投入持続型農業での増収の実現に向けて、植物共生微生物の力を利用する試みがなされている。すでに商品開発されている製品の中には、「イネファイター(前川製作所)」という、Azospirillum属細菌を含む微生物資材がある。イネファイターを施用した圃場の水稲は穂数が多くなり、多収となった例が報告されている。この穂数を増やす接種効果には、品種間差異も認められている。さらには、植物の免疫力も高め、いもち病等に対する抵抗性を向上させるという報告もある。一見するといいことずくめのように聞こえるが、微生物資材の効果は、化成肥料に比べて不安定であり、効果を発揮する条件(土壌や気象等)が限られる傾向にある。農業現場で、植物共生微生物の力を利用するには、植物を含めた環境と微生物の相互作用を解明していく必要がある。申請者は、イネの植物共生細菌に着目し、共生細菌群集に影響を与える要因を明らかにしてきた。イネ共生細菌群集は部位によって異なっており、根では、窒素施肥の影響が大きく、葉や茎では品種の違いが影響を及ぼしていることが分かった。次の課題は、葉や茎で影響を受けている共生細菌種を特定し、それを制御する宿主側の機構を明らかにすることである。複数の品種を化成肥料を投入しない圃場で栽培した。イネに共生する細菌は、イネの生育ステージ進むにつれて安定し、幼穂形成期、出穂期、完熟期では、プロファイルが安定し、収束していく傾向が認められた。また、それぞれのステージに置いて品種比較を行ったところ、品種の影響に比べて、生育ステージの影響が大きいことも明らかとなった。植物の生育ステージ及び部位により、共生細菌群集が変化することを明らかにすることができたので、各ステージで変動している共生細菌群集を特定する。次世代シークエンサー(Illumina MiSeqを用いた16sアンプリコンシークエンスを行う。細菌群集が安定している時期のコシヒカリとカサラスの細菌群集を比較する。最も品種間差異が認められる時期において、特定の部位を、遺伝解析集団からサンプリングする。16sアンプリコンシークエンスを行い、それぞれのOTUの存在比を表現型値とすることで、検出されている細菌種と関係する遺伝子座が検出できる。これにより、共生細菌の多様性を制御する遺伝子座を検出できる。共生細菌群集を制御する遺伝子座が明らかになると期待される。
NMR等用高温超伝導マグネットの磁束ポンプを活用した永久電流補償形電源

昨年度準備した,要素製作を完成させ,リニア形磁束ポンプの主要部分を構成した。また,負荷用コイルとして,6つの矩形コイルを組合せて0.5Hのトロイダル負荷コイルを構成した。1.5mHの小形超電導コイルと組合せた予備励磁試験では,60Hzでも1000sで100mAに達することが確認された。この結果は,第18階国際磁石技術会議において報告した。さらに試作した0.5Hのトロイダル負荷コイルと組合せ,直流バイアス電流,三相交流電流の振幅と周波数を変化させて,励磁試験を行った。得られた移動磁界の振幅は,有限要素法解析によったものと同等であった。交流振幅が大きくなると電流増加率は高くなるが,それよりも周波数依存性が高いことが明らかとなった。測定した5Hzから9Hzまでは,電流増加率は周波数に比例する(すなわち1周期あたりの磁束ポンプ量が一定である)が,10Hzから20Hzまでは電流増加率が増加すること,また,20Hzから60Hzでは電流増加率が減少することが確認された。これは,超電導シート上に形成される常電導磁束スポットの形状によるものと考えられ,詳細について,検討中である。これらの結果は,Cryogenics誌,IEEE Transactions on Applied Superconductivity誌に論文投稿した。さらに,負荷コイルの形成する磁束を計測し,磁束ポンプの動作制御を行うことによって,負荷コイルの電流を一定に保つ,フィードバック制御系を構築中であり,半年程度で,良好な試験結果を得られるものと予測している。平成14年度は初年度であるため、全部の資材購入と設計と一部製作に時間をかけた。主に実験装置設計・製作と、その主要部品の有限要素法解析を行い、設計した装置の理論的特性確認を進めた。リニア形磁束ポンプの磁気コア、DCバイアス用超伝導マグネット、三相超伝導電機子巻線の製作を行うと共に、リニア形磁束ポンプ内の要求磁束密度を予測して、設計の正しさを検証した。更に、負荷用超伝導コイルの設計とそのコア製作を進めた。そしてまた、3個の超伝導永久電流スイッチの仕様決定と、巻枠製作を行った。14年度中には、全ての部品製作が終了しなかったが、部材は全部購入し、かつ要素の巻枠のような部品製作は終了した。負荷用コイルの製作、永久電流スイッチの製作、Nbストリップを使った磁束ポンプの要素製作は未完のままであるが、継続して製作が可能な段階まで準備はできた。その結果、全システム製作は未完了のままであるものの、一方それら要素の制作上必要な治具類も製作中であり、近い内に全システムを完成できる手はずを整えている。なお、本年度の成果として、別紙の通り2件の論文発表を行ったが、これらは設計製作に関わる磁界の有限要素解析結果を紹介したもので、この解析結果は設計の妥当性を理論的に確認する材料として有効であった。平成15年度には、出来るだけ早い時期に全システム作りを完了し、特性試験に入る予定である。
心筋受容体を介する機能調節におけるGTP結合タンパクの意義

心筋細胞α_1受容体,アンジオテンシン(AT)およびエンドセリン(ET)受容体はともに三量体GTP結合蛋白質(G蛋白質)のG_qを介してPI代謝促進に共役されている。したがってこれら受容体は共通の情報伝達過程を介して心筋細胞機能調節を行う可能性が高い。これらの受容体刺激による種々のレベルにおける調節過程の異同から調節系におけるG_qタンパクの意義を追求することが本研究の目的である。α_1受容体刺激の心筋細胞機能調節における特徴は(1) Negativelusitripic effect(弛緩遅延効果)にともなわれた陽性変力作用,(2)軽度の細胞内Caトランジェント増強作用,(3)収縮蛋白Ca感受性増強作用,(4)哺乳類間における著しい種差などである。本年度の研究ではCa感受性蛍光色素indo-1/AMを負荷したウサギ単離心筋細胞をもちいて細胞短縮とindo-1蛍光シグナル(CaT)の同時測定が可能な実験系でこれら受容体刺激効果を比較検討した。α_1刺激はβ刺激とは対照的にほとんどCaT増強をともなわずに細胞短縮を増強した(収縮力増強効果)。α_1刺激効果はエクオリン負荷ウサギ乳頭筋標本において得られた結果と非常によい整合性を示した。ウサギ心室筋細胞におけるET受容体刺激のCaTに対する効果は検索されていなかったが,本研究においてET-1による収縮性調節はα_1刺激効果と非常に高い類似性を示すことが明らかにされた。すなわちET-1の陽性変力作用も(2)および(3)にともなわれて惹起された。一方,従来の研究においてATは(2)を示さず,(3)のみの効果により陽性変力作用を惹起することが報告されていたが,本研究においてATも同様に(2)および(3)の機序により収縮性増強作用を発揮することが明確に示された。したがってこれらPI代謝促進に共役されている受容体刺激による収縮性調節は共通の情報伝達過程を介して発揮され,収縮性調節におけるPI代謝促進の生理的意義を強く示唆する。
ゴルジ体の構造形成因子の同定と機能解析

1.GCP60のゴルジ体局在化シグナルの決定とGiantinとの結合様式:GCP60のゴルジ体への局在化にはC末端近くのTyr^<521>とTyr^<522>が必須であることがわかった。一方、N末端近くのPhe^<93>とPhe^<94>をAlaに置換するとGCP60は小胞体に停留しゴルジ体に局在しなくなった。この結果から、GCP60はまずN末端のPhe^<93>とPhe^<94>が小胞体からの輸送シグナルとして働き、さらに、C末端のTyr^<521>/Tyr^<522>がGiantinとの結合ならびにゴルジ体への局在に必須であることが示唆された。2.GCP16のゴルジ膜結合様式およびGCP170との結合様式:GCP16は膜貫通領域を持たないにもかかわらずゴルジ膜に強固に結合している。各種実験によって、GCP16はCys^<69>とCys^<72>がパルミチン酸でアシル化されることによってゴルジ膜に結合していること、およびこのアシル化はGCP170との結合にも必須であることが確認された。3.p115のCOG複合体との相互作用とゴルジ体形態維持への関与:小胞繋留因子p115はUso1pと相同性の高い領域(HR2)を介してCog-2に結合し、COG (conserved oligomeric Golgi)複合体と相互作用することがわかった。SiRNAでp115をノックダウンすると、ゴルジ体は断片化し解体された。この細胞に野生型p115を発現するとゴルジ体は正常構造を回復するが、HR2欠損p115の発現では不定形な構造しか形成できないことから、p115はCOG複合体と相互作用してゴルジ体の構造形成とその機能に密接に関与することが示唆された。4.ゴルジ体の形態維持におけるGCP170の役割:ゴルジ体の管状化と層板構造の解体を起こすsemi-intactcellでは、GCP170がゴルジ膜から遊離していることがわかった。GCP170非存在下ではゴルジ体の管状化が再現され、GCP170の添加でゴルジ体の構造が回復することから、GCP170がゴルジ体の形態維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。これまでの研究で、ゴルジ体の細胞質側に局在するタンパク質としてGiantinおよびGCP170を同定し、小胞体-ゴルジ体間のタンパク質輸送およびゴルジ体の構造形成に関与していることを明らかにした。今年度は、Giantinと特異的に結合する新規タンパク質としてGCP60を、また、GCP170と特異的に結合するタンパク質としてGCP16を同定し、それぞれのタンパク質同士の結合様式ならびにゴルジ膜との結合様式について検討した。1)GCP60のゴルジ体局在化シグナルの決定とGiantinとの結合様式。

GCP60のゴルジ体への局在化にはC末端側半分(373-528)の領域が必須である。各種の置換変異体および欠失変異体を作成し、HeLa細胞に導入・発現させ、ゴルジ体局在化シグナルを解析した。その結果、GCO60のゴルジ体局在化にはC末端近くのチロシン2残基(Tyr^<521>/Tyr^<522>)が必須であることがわかった。一方、N末端近くのフェニールアラニン2残基(Phe^<93>/Phe^<94>)をアラニンに置換するとGCP60は小胞体に停留し、ゴルジ体に局在しなくなった。これらの結果から、GCP60はまずN末端のPhe^<93>/Phe^<94>が小胞体からの輸送シグナルとして働き、さらにC末端のTyr^<521>/Tyr^<522>がGiantinとの結合ならびにゴルジ体への局在に必須であることが示唆された。2)GCP16のゴルジ膜結合様式およびGCP170との結合様式。GCP16は膜貫通領域を持たないにもかかわらずゴルジ膜に強固に結合している。まず、[^3H]パルミチン酸のラベル実験でGCP16が脂質を介してゴルジ膜に結合していることを確認した。本タンパク質にはシステインが4残基含まれているが、そのうち実際にアシル化されるのはCys^<69>とCys^<72>であることを明らかにした。この2残基をアラニンに置換すると、GCP16はアシル化されず可溶性タンパク質となり、ゴルジ体に局在しなくなることがわかった。さらに、免疫沈降反応の解析より、GCP16のアシル化はGCP170との結合にも必須であることが確認された。1.p115のCOG複合体との相互作用とゴルジ体形態維持への関与:p115は小胞輸送に関与する因子であるが、今回我々はp115がCOG(conserved oligomeric Golgi)複合体と相互作用することによってゴルジ体の形成に関与することを明らかにした。先ず、酵母のtwo-hybrid法を用いてヒト細胞から、Uso1pと相同性の高いp115の領域(HR2 domain)と特異的に結合するCog-2を分離・同定した。COG複合体は8種類のサブユニット(Cog-1Cog-8)から構成されるが、p115はHR2 domainを介してCog-2に結合しCOG複合体と相互作用することがわかった。siRNA導入によってp115をノックダウンすると、ゴルジ体の重槽構造は断片化し解体された。この細胞にwild-typeのp115を発現すると、ゴルジ体は正常な構造を回復するが、HR2 domainを欠如するp115を発現させるとゴルジ体は不定形な構造しか形成できず、小胞を介する細胞表面へのタンパク質輸送も著しく障害された。これらの結果は、p115はCOG複合体と相互作用してゴルジ体の構造形成とその機能に密接に関与することを示唆する。2.ゴルジ体の形態維持におけるGCP170の役割:細胞膜を半透過性にした培養細胞(semi-intact cells)をサイトゾールとともにインキュベートするとゴルジ体の管状化(tubulation)と層板構造の解体が起こる。ゴルジ体の管状化を起こした細胞では、GCP170がゴルジ膜から遊離していることがわかった。GCP170を含まないサイトゾールを調製し、上記条件下で細胞をインキュベートするとゴルジ体の管状化が再現され、GCP170添加でゴルジ体の構造が回復することがわかった。これらの結果は、semi-intactcellでは先ずGCP170のゴルジ膜への接着因子(GCP16など)が何らの機序で欠如あるいは失活し、GCP170がゴルジ膜から解離することがゴルジ体の形態変化に関係していることを示唆する。
アレクサンドロス大王伝の成立と初期ヘレニズム時代

本研究の目的は、現存するアレクサンドロス大王伝の史料批判を通して、古代マケドニア王国及びアレクサンドロス帝国の理解を深めることにある。しかしその対象は広大であるため、具体的には次の3点に焦点を絞って研究を進めた。第1に、フィリッポス2世の暗殺について、妻オリュンピアスと息子のアレクサンドロスが関与していたとする伝承がある。しかし関連史料の検討の結果、この伝承には根拠のないことが明らかになった。第2に、暗殺をめぐる状況や大王の死後の後継者戦争には、王家が実践していた一夫多妻制が深くかかわっている。しかるに古代ギリシア人の手になる史料は、その実態を歪めて伝えているため、その歪みを正すことによってはじめてマケドニア王家を正しく理解することができる。第3に、一夫多妻の行動と心理の具体例として、オリュンピアスと取り上げた。彼女は古代からすでに悪評に包まれていたが、伝承の批判をとおして、その生涯を一夫多妻制の検知から再検討することを試みた。アレクサンドロス大王の五つの伝記の中から、今年度はとくにプルタルコスとディオドロスの読解と研究にとり組んだ。これらの作品に用いられている原史料は、東方遠征に従軍した作家たちと、従軍しなかった作家の二つの系統に分けることができる。したがってアレクサンドロスの実像と遠征の実態に迫るためには、両者の記述の綿密な比較検討が必要である。今年度はまず、いくつかの重要な主題についてのケース・スタディを試みた。たとえばアレクサンドロスのエジプト遠征、リビアのアモン神殿訪問、ペルセポリス放火、アマゾン女王との会見などである。各エピソードに関するいくつもの伝承を比較することによって、歴史的事実の復元を目ざした。しかしながらプルタルコスとディオドロスの作品全体の原典研究までには到らず、来年度の課題として残ることになった。今年度は、現存する5種類のアレクサンドロス大王伝の中から、ディオドロスとプルタルコスの2篇に重点をおいて、各々の依拠する原典を特定しつつ、伝記作品としての比較研究を行った。とくに考察の対象とした項目は次の3点である。1.フィリッポス2世暗殺へのアレクサンドロスの関与の有無について.いくつかの伝承はアレクサンドロスを真犯人としているが、プルタルコスの記述の批判的検討により、彼の関与はなかったと結論することができた。2.アレクサンドロスの政敵とされるアケドニア貴族アッタロスの位置づけについて.プルタルコスとディオドロスの伝承を比較検討した結果、現存史料には両者の関係を誇張したり創作した部分が多く含まれており、アレクサンドロス即位当時のマケドニアの政情についてはかなりの見直が必要であることが明らかになった。3.マケドニア王家の一夫多妻制について.現存史料に数多くみられるギリシア人の偏見や王妃オリュンピアスに対する敵対的描写を取り去って、一夫多妻制の実態を冷静にとらえることを試みた。以上3点についてはいずれも独立の論文を執筆ないし準備中であり、今年度中には公表できなかったが、来年度には確実に公表できる見通しである。本年度はアレクサンドロス時代のマケドニア王国を解明するための一つの鍵として、一夫多妻制に着目した。前5-4世紀のマケドニア王は複数の妻をもつのがふつうであった。アミュンタス3世は2人の妻から6人の息子と1人の娘を得、フィリッポス2世は7人の妻から2人の息子と4人の娘をもち、アレクサンドロスも3人の妻をめとった。こうした婚姻慣行は、フィリッポス2世の暗殺や大王の即位、さらには大王死後の後継者戦争にも少なからぬ政治的影響を与えた。したがって一夫多妻における行動と心理を解明することは、古代マケドニア王家の理解のために不可欠といえる。しかるに厳格な一夫一婦制を実践していた古典期のギリシア人は、こうした実態を理解することができず、王の複数の妻のただ一人を正妻と呼び、他は妾などと称した。この歪みが近年に至るまで受けつがれてきた。したがって一夫多妻制の研究は、現存するギリシア語史料の徹底した批判と一体のものとして進めなければならない。こうした見地に立って、アレクサンドロスの母親オリュンピアスをとりあげ、悪評に包まれたその生涯を根本的に再検討することを試みた。
近世から現代にかけての平仮名字形の定着

研究を進めることが困難な状況が続いていたため、予定していたほどの成果を得ることができたとはいえない。具体的成果としては、明治時代中期の活字資料11種を集録し、当研究の構築するデータベースに組み入れた。対象とした資料は既存の調査資料の系統から外れるものではなく、当研究の抱える、系統・号数という情報をいかにデータベースに反映させるかという課題は依然として残される。また、完全に作業を完了している段階ではないが、手書き字と印刷字のあいだに位置するとも言える原稿資料(夏目漱石手稿)のデータ化に着手している。罫線のない書写資料とは異なって字形の間隔が揃えられるという環境は、データベースにおいても他書写資料と同列に扱うことはできない。書写資料という枠組みの中においても、この対立を明示できる仕様を整える必要があるということが分かったことも成果の一つと言える。25年度に得られた研究成果の意義および重要性は、当データベースの拡張にあると言える。本研究の目的は、江戸時代から現代に至るまで、平仮名の群の規模や体系がどのように変化・固定化してきたかを示し、印刷字(整版・活版)・手書き字というメディア的対立が平仮名字形にもたらした影響を明らかにすることにある。柔軟性の著しい平仮名字形が次第に収斂・固定化してゆく過程を明らかにすることは従来の文字研究に寄与するものであり、24年度の成果の中では特に「原稿資料」の調査が意義深いものと考えられる。印刷字から手書き字への影響は、印刷字を目にすることのみによって起こりえたものではない。当時の書写行為として非日常的であった「間隔を揃えて書く」ことを強制する環境が、少なからず以後の字形に影響を与えたものと考えられるからである。体調不良と教育活動の忙しさによって、体力的余裕と時間的余裕に乏しかったため、計画を達成することはできなかった。平成26年度は、平成25年度のまでの進展の遅れを取り戻すとともに、江戸時代の資料を調査対象として加え、江戸時代から明治時代にかけての「手書き字と印刷字の間の主従関係」がどのように変化したのかを明らかにする。明治時代とは異なり、江戸時代は整版が出版の主流である。そのため、明治時代と同様の資料区分で調査を行うことは不可能である。整版印刷物に関しては、滑稽本・草双紙・読本の調査を検討しているが、そのほかに、版面が特徴的なものとして浄瑠璃本が挙げられる。現行の平仮名体系との関連が明確でない資料であるが、研究に余裕が出次第、調査資料の種類を拡張することを考えている。また、明治時代の初等書写教育資料と対応するものとして往来物を扱う。書写資料に関しては、明治時代における手筆原稿と同様に、稿本を中心に据えてデータの蓄積を行う。整版と対応する稿本を複数扱うことができれば、これまでは単体の作品において比較されていた稿本・整版の対立を、時代別または地域別に比較することが可能となるであろう。平成25年度予算は、教育活動が繁忙だったことと体調不良により未使用額が発生した。平成26年度は、日本語学会秋季大会への参加のため、旅費の使用を計画している。また、調査の進行状況によっては画像処理作業を院生に任せ、その謝礼の支払いを計画している。

また、完全に作業を完了している段階ではないが、手書き字と印刷字のあいだに位置するとも言える原稿資料(夏目漱石手稿)のデータ化に着手している。罫線のない書写資料とは異なって字形の間隔が揃えられるという環境は、データベースにおいても他書写資料と同列に扱うことはできない。書写資料という枠組みの中においても、この対立を明示できる仕様を整える必要があるということが分かったことも成果の一つと言える。24年度に得られた研究成果の意義および重要性は、当データベースの拡張にあると言える。本研究の目的は、江戸時代から現代に至るまで、平仮名の群の規模や体系がどのように変化・固定化してきたかを示し、印刷字(整版・活版)・手書き字というメディア的対立が平仮名字形にもたらした影響を明らかにすることにある。柔軟性の著しい平仮名字形が次第に収斂・固定化してゆく過程を明らかにすることは従来の文字研究に寄与するものであり、24年度の成果の中では特に「原稿資料」の調査が意義深いものと考えられる。印刷字から手書き字への影響は、印刷字を目にすることのみによって起こりえたものではない。当時の書写行為として非日常的であった「間隔を揃えて書く」ことを強制する環境が、少なからず以後の字形に影響を与えたものと考えられるからである。体調不良と教育活動の忙しさによって、体力的余裕と時間的余裕に乏しかったため、計画を達成することはできなかった。平成26年度は、平成25年度のまでの進展の遅れを取り戻すとともに、江戸時代の資料を調査対象として加え、江戸時代から明治時代にかけての「手書き字と印刷字の間の主従関係」がどのように変化したのかを明らかにする。明治時代とは異なり、江戸時代は整版が出版の主流である。そのため、明治時代と同様の資料区分で調査を行うことは不可能である。整版印刷物に関しては、滑稽本・草双紙・読本の調査を検討しているが、そのほかに、版面が特徴的なものとして浄瑠璃本が挙げられる。現行の平仮名体系との関連が明確でない資料であるが、研究に余裕が出次第、調査資料の種類を拡張することを考えている。また、明治時代の初等書写教育資料と対応するものとして往来物を扱う。書写資料に関しては、明治時代における手筆原稿と同様に、稿本を中心に据えてデータの蓄積を行う。整版と対応する稿本を複数扱うことができれば、これまでは単体の作品において比較されていた稿本・整版の対立を、時代別または地域別に比較することが可能となるであろう。平成25年度は、平成24年度の進展の遅れを取り戻すとともに、江戸時代の資料を調査対象として加え、江戸時代から明治時代にかけての「手書き字と印刷字の間の主従関係」がどのように変化したのかを明らかにする。
データベース・マーケティングに基づく病院経営における戦略モデルの構築

本研究では、DPC対象病院について、特定の主要診断群ないし疾患に専門特化する集中化戦略の有効性を検証し、病院経営の戦略モデルの構築を目指す。研究の方法として、医療の効率性については厚生労働省「DPC導入の影響評価に関する調査」、経営の効率性については「医療法人決算届」をそれぞれ分析し関連づけて検証する。本研究を通じて、医療におけるデータベース・マーケティングの方法論を確立し、エビデンスに基づいた病院経営の戦略モデルの今後の病院経営への応用が期待される。
チタンを溶融状態で採取する溶融塩電解プロセスに関する基礎研究

塩化物溶融塩電解により電析したチタンを溶融亜鉛に吸収させて溶融状態で採取するプロセスを想定し、このプロセスの確立に必要な次の2種類の基礎研究を行った。(1)亜鉛ーチタン系合金からの亜鉛の蒸発分離:溶融塩電解で陰極亜鉛に吸収されたチタンを分離するための基礎研究である。亜鉛ーチタン系には種々の金属間化合物が存在する。亜鉛ーチタン合金から亜鉛を分離し、清浄なチタンを得るためには、できるだけ低温で上記金属間化合物を熱分解することが望ましい。そこで、約7.5%のチタンを含む亜鉛ーチタン合金のアルゴン雰囲気中における蒸発過程を、種々の一定温度にて調べた。その結果、600°C以下ではTiZn_3は分解せずそのまま残留するが、620°C以上になると分解して金属チタンを生成することがわかった。また、蒸発速度は気相側物質移動により律速されることが明かにされた。(2)3価のチタンの還元過程の解明:溶融塩電解槽の設計に必要な基礎研究である。TiCl_3を含む16.4mol%BaCl_2ー46.9mol%CaCl_2ー36.7mol%NaClフラックスのサイクリックボルタメトリー、MgーZn合金および金属チタンによる還元過程について実験を行い、さらにTiーCl系化学ポテンシャル状態図について熱力学的検討を加えた結果、塩化物溶融塩中で3価のチタンイオンは2価の状態を経由して金属チタンに還元されることがわかった。このことから、電解槽に仕切りを設けるかあるいは多段式電解槽にする必要のあることが示唆された。チタンを溶融状態で採取する溶融塩電解プロセスを確立するためには、今後さらに、(i)四塩化チタンのフラックス中への供給方法と溶解速度、(ii)四塩化チタンの溶解速度とチタンの電析速度とのバランスを支配する因子の究明、(iii)電析チタンの溶融亜鉛への吸収速度、などについて検討する必要がある。交付申請書に記載した研究計画に基づき,下記の三種類の研究を行った.1.亜鉛ーチタン合金の作製法の検討:粒状亜鉛と粉末チタンあるいは線状,チタンを高純度アルミナルツボに入れ,石英管内に真空封入して800°Cで4時間保持して合金化を試みた.粉末チタンの場合には,その表面に酸化膜が存在するため,亜鉛中へのチタンの溶解がほとんど認められなかった.線状チタンを用いた場合には,合金化ガスムースに進行し,合金中のチタン濃度もEPMAおよび化学分析により目標値に達していることが確認された.2.亜鉛ーチタン系合金からの亜鉛の蒸発過程:溶融塩電解で陰極亜鉛に吸収されたチタンを分離するための基礎研究である.亜鉛ーチタン系には種々の金属間化合物が存在する.亜鉛ーチタン合金から亜鉛を分離し,清浄なチタンを得るためには,できるだけ低温で上記金属間化合物が熱分解することが望ましい.そこで,約7.5%のチタンを含む亜鉛ーチタン合金のアルゴン雰囲気中における蒸発過程を,種々の一定温度にて,熱天秤を用いて調べた.その結果,600°C以下ではTiZn_3は分解せずそのまま残留するが,620°C以上になると分解して金属チタンを生成することがわかった.また,蒸発速度は気相側物質移動により律速されることが明らかにされた.3.三塩化チタンの亜鉛ーマグネシウム溶融合金による還元に関する予備実験:マグネシアルツボに入れた2.6%MgーZn合金と10%MgCl_2ー35%NaClー55%

KCLフラックスをパイレックスガラスルツボに装入し,温度660°C,アルゴン雰囲気中でTiCl_3を添加した時のフラックス中の酸化環元電位を,Ag/1%AgCl参照電極を用いて測定した.電位は,TiCl_3添加後上昇して最大値をとった後低下して次第に一定値に近づく.この結果から,チタンの陰極還元はTi^<3+>→Ti^<2+>→Tiの二段階で進行することが推定された.交付申請書に記載した研究計画に基づき、塩化物フラックス中における3価のチタンイオンの還元過程を明らかにするため、下記の2種類の実験を行った。(i)サイクリックボルタメトリー:TiCl_3を含む16.4mol%BaCl_2ー46.9mol%CaCl_2ー36.7mol%NaClをパイレックスルツボに入れてアルゴン気流中で溶解し、500、550および600°Cの温度で、陽極に炭素棒、陰極にタンタル線、参照極にAgー1%AgCl電極を用いて、タンタル線をカソーディックに分極した時のサイクリックボルタメトリーを求めた。その結果、3価のチタンイオンは2段にわたって還元されることがわかった。(ii)3価のチタンイオンの金属チタンにより還元:種々の量のTiCl_3を含む上記モル比のBaCl_2ーCaCl_2ーNaClをパイレックスルツボに入れて550°C、アルゴン気流中で溶解した。重量既知のチタン板を浸漬し、一定回転速度のインペラーで溶融フラックスを攪拌しながら、pt電極とAgー1%AgCl参照電極を用いて、フラックス中の酸化還元電位の経時変化を測定するとともに、Ti板の重量減少量を求めた。フラックス中に、3価と2価のチタンイオンのみが存在する場合と3価と1価のチタンイオンのみが存在する場合について、酸化還元電位の変化量とチタン板の重量減少量の関係を表わす理論式を求め、実験値と比較検討した。この結果と、昨年度行った3価のチタンイオンのMgーZn合金による還元実験の結果から、塩化物フラックス中では、3価のチタンイオンは2価を経由して金属チタンに還元されることが明らかになった。既存の熱力学データを用いて作成したTiーCl系化学ポテンシャル状態図も上記の結論を支持した。
RNA結合タンパクのノックダウンによる口腔がん治療のための基礎研究

H21年度にHuRをノックダウンした細胞のがんに関わる形質を様々な角度から検討した。その結果、HuRをノックダウンした細胞は、1.ARE-mRNAの安定化が阻害されること、2.足場非依存性増殖能、細胞運動能、ならびに浸潤能が抑制されること、3.細胞周期関連タンパクの発現量が低下し、さらにCDK1 mRNAの安定化が阻害されることを明らかにした。これらの研究結果は、Molecular Cancer Research ; 8(4), April, 2010に受理された。これらの研究成果を踏まえて、がんの悪性形質の一つである浸潤活性に対するHuRの影響について詳細に検討した。浸潤能に関わるMMP1遺伝子の転写活性化をluciferase reporter assayで検討し、さらにMMP1の転写因子のmRNAの発現についても確認した。次に、浸潤活性の高い口腔扁平上皮癌(SCC)と浸潤活性の低い口腔疣贅癌(VC)を用いて、HuRを免疫染色し、HuRの局在を検索した。HuRノックダウンにより、1.口腔がん細胞の浸潤能ならびにMMP1遺伝子の転写活性が低下し、同時にMMP1の転写を活性化するAP-1 (c-fos, c-jun)ならびにEts family (ets-1, E1AF)のmRNA量も低下しており、2.免疫染色の結果、VCではHuRが核のみに発現が認められたのに対し、SCCでは核ならびに細胞質に発現が認められ、細胞質のHuR発現亢進が浸潤活性に関与していることが示唆された。1.2.の結果は、口腔がん細胞の浸潤能の亢進はHuRの発現を介しており、HuRノックダウンにより口腔がん細胞の悪性形質を抑制できる可能性を示唆している。これらの結果は、現在Am J Patholに論文投稿中である。研究目的である、「口腔がん細胞でHuRの発現をRNAi法でノックダウンし、その手法を口腔がんの治療に利用するための基礎的研究を行うこと」を実践するため、HuRをノックダウンした細胞の性質、特にがんに関わる形質を様々な角度から検討した。HuRがノックダウンされた細胞の性質の検討(1)ARE-mRNAの輸送・安定化の確認:HuRをノックダウンした細胞と、していない細胞を核と細胞質に分離し、細胞質のARE-mRNA(c-fos,c-myc,cox2)を定量性Real-time RT-PCR法で測定し、細胞質に局在しているARE-mRNAを比較した。HuRをノックダウンした細胞では、ARE-mRNAの細胞質の蓄積が低下していた。さらに口腔がん細胞では、口腔正常細胞に比べて、HuRノックダウン効率が良く、口腔がん治療に応用する際の有用なデータが得られた。これらの細胞のARE-mRNAの半減期を求め、その安定化を検討したところ、HuRをノックダウンした細胞ではARE-mRNAの安定化が阻害されていることがわかった。(2)細胞増殖活性の検討:HuRをノックダウンしたがん細胞では、足場非依存性増殖能、細胞の移動度や浸潤度が抑制され、今後の口腔がん治療の応用に有用であることが示された。(3)細胞周期関連タンパクの検討:HuRをノックダウンしたがん細胞は、細胞周期関連タンパクの発現量が低下しており、さらにCDK1 mRNAの安定化が阻害されていることが明らかになった。