hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
学習の臨界期を調節する分子の探索と、臨界期を制御可能なモデル動物の開発

幼若期における学習の臨界期に重要な遺伝子を探索し、臨界期の制御メカニズムの解明を目指すことが本研究の目的である。当該年度は、DNAマイクロアレイおよびリアルタイムPCR法を用いて昨年度に行った、臨界期中に発現量が高く、臨界期終了後に発現量が減少する遺伝子の網羅的な探索から選別されたいくつかの遺伝子について、より詳細な発現量変化や発現部位の特定、さらには機能解析を行った。その結果、刷込み行動の成立に重要であることが分かっている終脳のvisualWulst(VW)と呼ばれる領域(哺乳類の皮質視覚野に相当)に特異的に発現細胞が観察された遺伝子(遺伝子X)が見つかった。また、遺伝子Xのコードしているタンパク質(X)は細胞から放出され、その細胞のあるいは他の細胞が持つ受容体に結合することで、機能的に働くことが知られており、その受容体はこれまで3種類分かっている。受容体の発現分布を調べたところ、受容体1は脳における発現が観察されなかったのに対し、受容体2は終脳全体に、受容体3はVW領域のほか、刷込み記憶の保存に重要な領域であるIMMと呼ばれる部位に集中して発現していた。これらのことから、タンパク質Xは受容体2および3を介して機能し、刷込みの臨界期制御に関与していることが示唆された。次に、合成したタンパク質XをVW領域に注入し、刷込みの効率や臨界期に変化がみられるかを調べた。その結果、P1のVW領域にタンパク質Xを注入した群では、本来刷込みが起こらない短い時間のトレーニング(10分)で刷込みが成立するようになった。また、臨界期が終了しているP7においても、タンパク質Xを注入した群では刷込みが観察できるようになった。このことは、タンパク質Xの分泌量依存的に、刷込みの成立の効率や、刷込みの臨界期が制御されていることを示している。今回得られた結果をまとめた論文の投稿準備を行っている。27年度が最終年度であるため、記入しない。臨界期における学習に重要な分子を探索し、臨界期を制御可能なモデル動物の作成を目指すことが本研究の目的である。当該年度は、臨界期における学習時に特異的に活動する細胞の同定・可視化を行った。具体的には、最初期遺伝子であるArc/arg3.1のpromoterの下流に緑色蛍光タンパク質(GFP)をつないだ遺伝子配列を含むベクターを作成した。また、遺伝子導入された細胞が認識できるようにchickβ-actin promoterの下流に赤色蛍光タンパク質(mCherry)をつなげたベクターを作成した。それぞれの目的配列はトランスポゾン(Tol2)配列内に組み込んだ。Stage10 (1012体節胚)の前脳に上記2種のベクター及びトランスポザーゼ発現ベクターを注入し、electroporation法によって遺伝子導入を行った。遺伝子導入された胚は、孵化するまでインキュベーションを行った。孵化した個体に刷り込み学習を行わせて24時間後に終脳の視覚野での蛍光タンパク質の発現を観察すると、非学習個体に比べてmCherryの発現は差がなかったのに対し、EGFPの発現は有意に高くなっていた。このことから、学習によってEGFPの発現が誘導されていることが分かった。また、EGFPの発現していた細胞はArc/arg3.1を発現しており、神経活動依存的にEGFPの発現が見られることが分かった。刷り込み学習の臨界期前後で発現量が変化する遺伝子や、学習に伴い発現量が変化する遺伝子を網羅的に抽出し解析するために、DNAマイクロアレイ法を用いた解析を行った。臨界期中に発現が高く、さらに学習によって発現量に変化が見られる遺伝子を選び、いくつかの遺伝子に関してリアルタイムPCRによる遺伝子発現量変化の確認やin situ hybridizationによる発現細胞・領域の特定を行った。当該年度は、臨界期中の学習時に活動する神経細胞の特定に成功した。これにより、臨界期制御に関わる遺伝子の特定や詳細な解析が可能となると考えられる。当該年度は、DNAマイクロアレイを用いて刷込みの臨界期に重要な遺伝子の探索を行い、またリアルタイムPCR法やin situ hybridization法によって、遺伝子の発現量の発育に伴う変化や発現細胞・領域の特定を行った。その結果、刷込み学習の獲得の際に重要な働きを持つ脳領域に特異的に発現が観察できた遺伝子の幾つかは、刷込みの臨界期中での発現量が臨界期終了後における発現量よりも有意に高く、それらの遺伝子は臨界期の制御機構に重要な役割を持つ可能性が示唆された。脳神経系における重要な神経伝達物質であるグルタミン酸の受容体の1種であるNMDA受容体のサブタイプにNR2Bがあり、NR2Bは刷込みの臨界期中における発現量が臨界期終了以降よりも高い。阻害剤を脳に注入する方法でNR2B受容体の活動を阻害した場合、刷込みの成立が起こらなくなった。また、NR2Bの発現量を増加させると刷り込みの効率が上昇した。刷込みの成立の際には、脳の視覚野の興奮性神経細胞において長期増強現象(LTP)が起こり、このLTP発生にはシナプス後部の膜表面におけるNR2Bの増加が必要であることが分かった。また、NR2Bのシナプス膜表面における発現量は、NR2B自身の活動によって制御されていた。

刷込み刺激によって、NR2Bの活動を介してNR2Bのシナプスでの発現を増加させ、特定の神経細胞においてLTPを発生させやすくなっていると見なすことができ、これが幼児期の高い神経可塑性や学習効率の重要な神経メカニズムの1つであると考えられた。以上の結果をまとめ、(Nakamori et al., 2015, J Neurochem.)において発表した。幼若期における学習の臨界期に重要な遺伝子を探索し、臨界期の制御メカニズムの解明を目指すことが本研究の目的である。当該年度は、DNAマイクロアレイおよびリアルタイムPCR法を用いて昨年度に行った、臨界期中に発現量が高く、臨界期終了後に発現量が減少する遺伝子の網羅的な探索から選別されたいくつかの遺伝子について、より詳細な発現量変化や発現部位の特定、さらには機能解析を行った。その結果、刷込み行動の成立に重要であることが分かっている終脳のvisualWulst(VW)と呼ばれる領域(哺乳類の皮質視覚野に相当)に特異的に発現細胞が観察された遺伝子(遺伝子X)が見つかった。また、遺伝子Xのコードしているタンパク質(X)は細胞から放出され、その細胞のあるいは他の細胞が持つ受容体に結合することで、機能的に働くことが知られており、その受容体はこれまで3種類分かっている。受容体の発現分布を調べたところ、受容体1は脳における発現が観察されなかったのに対し、受容体2は終脳全体に、受容体3はVW領域のほか、刷込み記憶の保存に重要な領域であるIMMと呼ばれる部位に集中して発現していた。これらのことから、タンパク質Xは受容体2および3を介して機能し、刷込みの臨界期制御に関与していることが示唆された。次に、合成したタンパク質XをVW領域に注入し、刷込みの効率や臨界期に変化がみられるかを調べた。その結果、P1のVW領域にタンパク質Xを注入した群では、本来刷込みが起こらない短い時間のトレーニング(10分)で刷込みが成立するようになった。また、臨界期が終了しているP7においても、タンパク質Xを注入した群では刷込みが観察できるようになった。このことは、タンパク質Xの分泌量依存的に、刷込みの成立の効率や、刷込みの臨界期が制御されていることを示している。今回得られた結果をまとめた論文の投稿準備を行っている。当初の研究計画では、幼児期における学習時に活動した神経細胞において、学習の成立に重要な働きを持つ遺伝子を探索すること、また幼児期学習の臨界期の発現に重要な遺伝子を探索することを目的をしていた。当該年度までに、DNAマイクロアレイやリアルタイムPCR法による遺伝子の発現量解析の他、in situ hybridization法を用いた遺伝子発現分布の解析を行い、刷込み学習の成立時に重要な働きを持つ視覚野の神経細胞において、発育依存的に発現量が変化し、かつ学習によっても発現量が変化するいくつかの遺伝子をピックアップした。また、グルタミン酸の受容体の1種であるNMDA受容体のサブタイプのNR2Bは、刷込みの臨界期中における発現量が臨界期終了以降よりも高い。阻害剤を脳に注入する方法でNR2B受容体の活動を阻害した場合、刷込みの成立が起こらなくなった。また、NR2Bの発現量を増加させると刷り込みの効率が上昇した。
南アジア天水田地帯における地域生態系構造の環境計画学的研究

低水準ながら高度な生態学的平衡が長期に亙って維持されていた地域生態系が、開発行為によって急変革を余儀なくされている典型例として南アジアの天水田地域の潅漑開発地の村落を選び、その(1)域生態系の構造、特にその自然・生産・生活構造の相互関係構造(2)潅漑開発に伴う地域生態系構造の変化と要素間不整合の発現状況(3)前項の不整合の解消過程。などを導入潅漑開発の仕様・機能と併せて調査し、地域生態系に発現した不整合の潅漑開発機能との関係づけを目的として昭和62年に第1次調査を実施し、平成元年度に第2次調査を実施した4か年に亘る研究の最終取りまとめである。第1次調査は主として試・資料収集、ヒアリング等により(1)、(2)を実施したが、(3)については現象のトレ-スに依るため観察集落を設定し、現地研究者の協力のもとに経過記録を続けて、第2回調査でその間の変化を把握した。調査地域はインドのタミルナドゥ州アランタンギ地区(エガプルマル-村)とネパ-ルのテライ地方チトワン地区(モハナ村)で、平成元年年8月1日9月20日に実施した。タミルナドゥ州調査は昭和62年が本調査で平成元年に補足調査としてGrandAnicut Canal(GAC)の第11支線水路系を選んで行政的なGAC管理と地域農民の水管理との補完関係とその結果としての用水供給実態を把握するとともに、その受益農村として同支線20番スル-ス受益地のEgaperumalur集落を選んでGAC受益区域に入る以前の50年前にさかのぼって集落の経済、社会構造の変化を調べた。用水管理実態調査の方法はおもに各関係行政部局からの資料、記録デ-タの収集と、システム各部位の操作・管理責任者からの現地でのヒヤリングによった。集落調査は集落に保管されている記録類の収集・解読が主で、集落の古老と現在の役員農民の協力の元に実施した。なお調査の全てにはコインバト-ル農科大学(Sivanappann教授他)の調査協力を受けた。テライ平野調査は昭和62年度が予備調査で、平成元年に本調査として約600haの受益水田面積を対象に5年前に完成しているPanchakania Irrigation Systemを選び、その全体の用水供給実態を把握するとともに、受益農村のサンプルとしてMohana村を選んで営農技術を含むその社会・経済構造の潅漑導入前後の変化を調べた。用水管理実態調査の方法はGACと同様であるが、地域用水状況の微視的な差異を生じているので、施設管理・操作技術者と同行してのシステム全体の踏査に時間をかけた。村落調査は112戸の全農家を対象の訪問アンケ-ト調査と農地1筆毎の農学的調査が主である。トリブヴァン大学農学部(Mallik教授他)の教官7名、学生5名の協力のもとに実施された。工学(農業土木)班による潅漑施設の仕様・機能状況、自然科学(作物学、土壌学)班によるサンプリング調査と社会科学(農業経営、地域経済学、社会学)班によるヒアリング調査とも、現地研究者の適切な協力により、それぞれ十分な成果を得ることができた。収集資料は土壌,水田湛水,水稲葉,種籾等の試料と、営農内容についての農家アンケ-ト調査回答・ヒアリング記録と、潅漑施設の仕様・機能及びその運用記録,地域自然構造・土地利用,地域経済・社会状況の文献資料・統計資料・地図資料などである。うち試料は現地研究者と折半し半分を持ち帰った。その整理はリストを作成した上で分担研究者の所属大学に保管した。農家アンケ-ト調査回答とヒアリング記録の整理は八木、佐藤が担当し、リストを作成した上で農業経済学関係のものは東京大学農学部、社会学関係は横浜市立大学商学部に保管した。文献資料・統計資料・地図資料は、リストを作成して研究組織全員での利用体制を作った上で、潅漑施設の仕様・機能及びその運用記録は広田、山路が整理に当り、おもに岩手大学農学部に保管した。その他は各々の分担研究者が整理保管し、共通的なもは宇都宮大学農学部で保管した。平成2年度には調査総括としてネパ-ル国トリブヴァン大学農学部のBhora Pokharel教授を招へいして総合考察討論を進めた。分析・考察結果は、総合考察討論の成果と合わせて報告書に取りまとめて印刷した。なお、相手国への成果の還元については、試料サンプル類の全分析結果、その他資料の全整理結果を関係現地大学の研究者へ回付し、相手国内での将来の研究資料に供した。

第1次調査は主として試・資料収集、ヒアリング等により(1)、(2)を実施したが、(3)については現象のトレ-スに依るため観察集落を設定し、現地研究者の協力のもとに経過記録を続けて、第2回調査でその間の変化を把握した。調査地域はインドのタミルナドゥ州アランタンギ地区(エガプルマル-村)とネパ-ルのテライ地方チトワン地区(モハナ村)で、平成元年年8月1日9月20日に実施した。タミルナドゥ州調査は昭和62年が本調査で平成元年に補足調査としてGrandAnicut Canal(GAC)の第11支線水路系を選んで行政的なGAC管理と地域農民の水管理との補完関係とその結果としての用水供給実態を把握するとともに、その受益農村として同支線20番スル-ス受益地のEgaperumalur集落を選んでGAC受益区域に入る以前の50年前にさかのぼって集落の経済、社会構造の変化を調べた。用水管理実態調査の方法はおもに各関係行政部局からの資料、記録デ-タの収集と、システム各部位の操作・管理責任者からの現地でのヒヤリングによった。集落調査は集落に保管されている記録類の収集・解読が主で、集落の古老と現在の役員農民の協力の元に実施した。なお調査の全てにはコインバト-ル農科大学(Sivanappann教授他)の調査協力を受けた。テライ平野調査は昭和62年度が予備調査で、平成元年に本調査として約600haの受益水田面積を対象に5年前に完成しているPanchakania Irrigation Systemを選び、その全体の用水供給実態を把握するとともに、受益農村のサンプルとしてMohana村を選んで営農技術を含むその社会・経済構造の潅漑導入前後の変化を調べた。用水管理実態調査の方法はGACと同様であるが、地域用水状況の微視的な差異を生じているので、施設管理・操作技術者と同行してのシステム全体の踏査に時間をかけた。村落調査は112戸の全農家を対象の訪問アンケ-ト調査と農地1筆毎の農学的調査が主である。トリブヴァン大学農学部(Mallik教授他)の教官7名、学生5名の協力のもとに実施された。工学(農業土木)班による潅漑施設の仕様・機能状況、自然科学(作物学、土壌学)班によるサンプリング調査と社会科学(農業経営、地域経済学、社会学)班によるヒアリング調査とも、現地研究者の適切な協力により、それぞれ十分な成果を得ることができた。収集資料は土壌,水田湛水,水稲葉,種籾等の試料と、営農内容についての農家アンケ-ト調査回答・ヒアリング記録と、潅漑施設の仕様・機能及びその運用記録,地域自然構造・土地利用,地域経済・社会状況の文献資料・統計資料・地図資料などである。うち試料は現地研究者と折半し半分を持ち帰った。その整理はリストを作成した上で分担研究者の所属大学に保管した。農家アンケ-ト調査回答とヒアリング記録の整理は八木、佐藤が担当し、リストを作成した上で農業経済学関係のものは東京大学農学部、社会学関係は横浜市立大学商学部に保管した。文献資料・統計資料・地図資料は、リストを作成して研究組織全員での利用体制を作った上で、潅漑施設の仕様・機能及びその運用記録は広田、山路が整理に当り、おもに岩手大学農学部に保管した。その他は各々の分担研究者が整理保管し、共通的なもは宇都宮大学農学部で保管した。平成2年度には調査総括としてネパ-ル国トリブヴァン大学農学部のBhora Pokharel教授を招へいして総合考察討論を進めた。分析・考察結果は、総合考察討論の成果と合わせて報告書に取りまとめて印刷した。なお、相手国への成果の還元については、試料サンプル類の全分析結果、その他資料の全整理結果を関係現地大学の研究者へ回付し、相手国内での将来の研究資料に供した。
ミスマッチ修復機構がクロマチン複製と協調する機構の解明

ミスマッチ修復(MMR)機構はDNA合成エラーを修復し、突然変異を抑制する重要なDNA修復機構である。真核生物のDNAは複製直後からクロマチン構造をとるため、真核生物のMMRはクロマチン形成が起きている場で機能しなければならない。しかし、MMRがクロマチン上で達成される仕組みはまだ明らかになっていない。特にMMRに関わるクロマチンリモデリング因子やヒストンシャペロンなどのクロマチン動態の変動に関わる因子は全く明らかになっていない。本研究では前年度までに、ツメガエル卵核質抽出液をモデル系として用いることで、MMR因子依存的にミスマッチ塩基対の周辺でクロマチン構造の解消が起きることを見出し、この反応を促進するクロマチンリモデリング因子を明らかにしていた。さらに、出芽酵母において、該当因子がMMR効率を促進することも明らかにしていた。本年度は、クロマチン構造を解析する手法として、マイクロコッカルヌクレアーゼによる処理とリアルタイムPCRを組み合わせた解析手法を新たに確立した。この手法により、ミスマッチ塩基対周辺約1 kbpの領域でクロマチン構造の解消が起きていることを明らかにした。また、クロマチン形成反応はDNA合成反応と協調的に起きる経路と、DNA合成とは独立に起きる反応がある。MMRはDNA合成反応と協調的に機能する修復反応であるため、ミスマッチ塩基対周辺のクロマチン解消反応がMMR反応を促進するためには、DNA合成と協調したクロマチン形成と拮抗する必要がある。この点を明らかにするため、DNA合成と協調したクロマチン形成を解析できる実験系を確立し、実際に、ミスマッチ塩基対があると、DNA合成と協調したクロマチン形成反応の抑制が起きることを明らかにした。本研究からクロマチン上のMMRに関わる新たな因子が明らかになった。本研究はクロマチン上でMMRが達成される仕組みの理解を飛躍的に前進させると期待できる。29年度が最終年度であるため、記入しない。ミスマッチ修復(MMR)はDNA合成エラーを修復し突然変異を抑制している、遺伝情報の安定維持に重要な機構である。真核生物のDNAは複製の直後からクロマチン構造をとるため、様々なDNA上での反応にはクロマチン構造の動態を制御する因子が重要な機能を持つ。しかし、MMRに機能するクロマチン関連因子は全く分かっておらず、クロマチン上でMMRが機能する仕組みは明らかになっていない。本研究はクロマチン上でMMRが機能する仕組みの解明を目的に、ツメガエル卵核質抽出液(NPE)を用いて、ミスマッチ塩基対の周辺でヌクレオソームが排除されること、クロマチンリモデリング因子Smarcad1、ヒストンシャペロンFACTがこの反応を促進することを見出してきた。これらの因子が実際に生体内においてもクロマチン動態を制御することでMMRを促進しているのかを知るため、出芽酵母を用いて自然突然変異頻度の計測を行った。出芽酵母のSmarcad1ホモログであるFUN30を欠失させると、複数の遺伝子座で突然変異頻度の上昇が見られた。さらに、msh3Δやmsh6ΔといったMMRの活性が部分的に低下している株からFUN30を欠失させると特に顕著に突然変異頻度が上昇した。この結果はFun30がMMR機構と協調的に機能し、突然変異を抑制することを示唆する。このFUN30の欠失による突然変異頻度の上昇は、ヌクレオソーム形成活性が低下するcac1Δ株では抑えられた。これらの結果はFun30がヌクレオソーム排除を促進することで生体内のMMR効率を高めるということを強く示唆する。本研究により、生体内のMMRを促進するクロマチンリモデリング因子が初めて明らかになり、MMRがクロマチン動態を制御しながら進行することが示唆された。ツメガエル卵核質抽出液を用いることで、MMRが起きるときのクロマチン動態の変化とそこに関わる因子を明らかにした。さらに、この試験管内系で見出した発見を、出芽酵母を用いた生体内のモデル系に適用することで、生理学的意義を示すことができた。生化学的な解析を進め、反応の詳細な分子機構を明らかにすることが今後の課題である。真核生物のDNAは複製直後からクロマチン構造をとるため、真核生物のMMRはクロマチン上で起きているはずである。しかし、MMRがクロマチン上で達成される仕組みはまだあまり明らかになっていない。本研究では前年度までに、ツメガエル卵核質抽出液をクロマチン上のMMRのモデル系として用いることで、クロマチン上でのMMRを促進するであろう因子を同定していた。さらに、出芽酵母を用いることで、該当因子が実際に生体内で突然変異を抑制する働きをもつことを見出していた。本年度は、該当因子が突然変異を抑制する仕組みを明らかにするため、突然変異計測に用いた遺伝子座の変異をシーケンシング解析により同定した。興味深いことに、該当因子の欠失により蓄積する変異はMMR因子の欠失により蓄積する変異と類似しており、該当因子がMMRを促進することで突然変異を抑制することが強く示唆された。また、私は免疫染色法とリアルタイムPCRを組み合わせることによって、MMR因子やヒストンタンパク質のDNAへの結合を定量する方法を確立した。

本研究はクロマチン上でMMRが達成される仕組みの理解を飛躍的に前進させると期待できる。本研究は既にクロマチン上でMMRを達成するために重要であると思われる因子を同定しており、ツメガエル卵核質抽出液を用いた系と、出芽酵母を用いた系の両方の系において、該当因子がクロマチン上でのMMRを促進するであろうことを示唆する結果を得ている。また、これらの結果を公表するための論文の大部分を既に完成させており、当初の計画通りの成果を上げることが十分に期待できる。ミスマッチ修復(MMR)機構はDNA合成エラーを修復し、突然変異を抑制する重要なDNA修復機構である。真核生物のDNAは複製直後からクロマチン構造をとるため、真核生物のMMRはクロマチン形成が起きている場で機能しなければならない。しかし、MMRがクロマチン上で達成される仕組みはまだ明らかになっていない。特にMMRに関わるクロマチンリモデリング因子やヒストンシャペロンなどのクロマチン動態の変動に関わる因子は全く明らかになっていない。本研究では前年度までに、ツメガエル卵核質抽出液をモデル系として用いることで、MMR因子依存的にミスマッチ塩基対の周辺でクロマチン構造の解消が起きることを見出し、この反応を促進するクロマチンリモデリング因子を明らかにしていた。さらに、出芽酵母において、該当因子がMMR効率を促進することも明らかにしていた。本年度は、クロマチン構造を解析する手法として、マイクロコッカルヌクレアーゼによる処理とリアルタイムPCRを組み合わせた解析手法を新たに確立した。この手法により、ミスマッチ塩基対周辺約1 kbpの領域でクロマチン構造の解消が起きていることを明らかにした。また、クロマチン形成反応はDNA合成反応と協調的に起きる経路と、DNA合成とは独立に起きる反応がある。MMRはDNA合成反応と協調的に機能する修復反応であるため、ミスマッチ塩基対周辺のクロマチン解消反応がMMR反応を促進するためには、DNA合成と協調したクロマチン形成と拮抗する必要がある。この点を明らかにするため、DNA合成と協調したクロマチン形成を解析できる実験系を確立し、実際に、ミスマッチ塩基対があると、DNA合成と協調したクロマチン形成反応の抑制が起きることを明らかにした。本研究からクロマチン上のMMRに関わる新たな因子が明らかになった。出芽酵母を用いた解析により、ヌクレオソーム排除反応が、生体内のMMRに重要な役割をもつことが明らかにできた。今後は、精製タンパク質を用いてヌクレオソーム排除反応を試験管内再構成し、Smarcad1やFACTがどのようにMMR因子と協調的に機能し、ヌクレオソーム排除を起こしているのか、どのようにしてMMRの反応を促進しているのか、詳細な分子機構を明らかにしていく。さらに、この試験管内系で明らかにした結果をもとに、出芽酵母の各種変異体を作成し、生体内のMMRへの重要性も明らかにしていく。本研究において、真核生物のMMRはミスマッチ周辺のヌクレオソームを排除しながら進行することが示唆された。
遺伝性甲状腺髄様癌の遺伝子発症前診断と予防的手術

1)全国ネットワークで集積し、239症例を集積した。2)52家系においてその遺伝子異常を検出した。あらに、遺伝子異常が検出できない1家系においては、さらに新しい遺伝子異常があることを確信し、検索している。3)これらのデーターをもとに臨床症状、発現した病変の種類・手術方法・時期・病理組織所見・免疫化学的所見・予後)などと対比させ、コドン634は副甲状腺病変、褐色細胞腫を合併しやすく、コドン768はFMTCであることが分かった。4)遺伝性甲状腺髄様癌において、予後因子を検討した遺伝性甲状腺髄様癌症例を甲状腺外科研究会及び家族性腫瘍研究会を通して。RET癌遺伝子では予後良好な変異部位はコドン768,790,791,804,891であり、予後不良部位はコドン609,611,618,620,634であった。また、血中カルシトニン、CEA、CT/CGRP比、年齢(50歳以上)、切除の可否、カルシトニン染色性、CGRP染色性、アミロイド染色性、壊死、腫瘍径、リンパ節転移、遠隔転移、ステージ、術後カルシトニン値、などが予後に深く関与した。5)ET遺伝子により診断された発症前の甲状腺髄様癌症例に対し、予防的甲状腺全摘術を施行した。14症例(男性6、女性8)に行い、MEN2A8,FMTC6例であり、コドン634 6例、コドン620 2例、コドン768 6例であった。年齢は4歳から22歳の及ぶ。予後不良なコドン634は4歳から12歳と比較的若く、予後良好なコドン768は9歳から22歳と比較的年齢が高かった。頸部リンパ節郭清は施行した症例と施行しない症例がある。術後のさせい、上皮小体機能低下症などの手術合併症はなく、術後のカルシトニン値は基礎値、負荷後のともに正常域であった。1)遺伝性甲状腺髄様癌症例を甲状腺外科研究会及び家族性腫瘍研究会を通して全国ネットワークで集積している。すでに、218症例を集積しており、現在はさらに家系の検索を行い、そのネットワークを広げている。2)RET癌遺伝子のexon 10,11,13,14の検索をPCRを行っている。それぞれのPCR産物を制限酵素Ecoliで消化後、プラスミドベクターにクローニングした。シークエンス反応後、6%PAGで電気泳動し、異常バンドを確認した。その結果、現在48家系においてその遺伝子異常を検出した。あらに、遺伝子異常が検出できない3課型においては、さらに新しい遺伝子異常があることを確信し、検索している。4)これらのデーターをもとに臨床症状、発現した病変の種類・手術方法・時期・病理組織所見・免疫化学的所見・予後)などと対比させており、現在のところ、codon 634は予後が不良で、副甲状腺病変、褐色細胞腫を合併しやすいことが分かった。また、codon 768はFMTCであり、予後は良好、病変の発言も遅いことが分かった。1)遺伝性甲状腺髄様癌において、予後因子を検討した。

また、血中カルシトニン、CEA、CT/CGRP比、年齢(50歳以上)、切除の可否、カルシトニン染色性、CGRP染色性、アミロイド染色性、壊死、腫瘍径、リンパ節転移、遠隔転移、ステージ、術後カルシトニン値、などが予後に深く関与した。2)RET遺伝子により診断された発症前の甲状腺髄様癌症例に対し、予防的甲状腺全摘術を施行した。14症例(男性6、女性8)に行い、MEN2A8,FMTC6例であり、コドン634 6例、コドン620 2例、コドン768 6例であった。年齢は4歳から22歳の及ぶ。予後不良なコドン634は4歳から12歳と比較的若く、予後良好なコドン768は9歳から22歳と比較的年齢が高かった。頸部リンパ節郭清は施行した症例と施行しない症例がある。術後のさせい、上皮小体機能低下症などの手術合併症はなく、術後のカルシトニン値は基礎値、負荷後のともに正常域であった。
光顕微操作を用いた核動態制御により位置情報と細胞個性決定の関係性に迫る

本研究では、細胞数が少なく単純な雌性配偶体形成過程をモデルとして、植物の細胞個性制御機構の解明に迫るために、核動態を直接制御することにより、核の位置情報と細胞個性決定の関係性の解明を目指した。光顕微操作による核動態制御として、光ピンセットにより直接雌性配偶体内の核を移動できないか試みた。タバコ培養細胞における予備実験では、細胞内の粒子状オルガネラや細胞質糸の制御には成功していた。しかしながら、シロイヌナズナの胚珠を用いて8核期の核を補足しようと試みたところ、光ピンセットで補足することはできなかった。シロイヌナズナでは雌性配偶体が胚珠の中に埋め込まれているため、光ピンセットを用いた核の移動制御が困難であったことも考えられたので、雌性配偶体が胚珠から裸出しているため光顕微操作が容易なトレニアを用いて、同様に核の補足を試みたが、こちらもシロイヌナズナ同様、補足することはできなかった。この要因として、タバコ培養細胞で動かせていた粒子状オルガネラや細胞質糸に比べ核が大きく、光ピンセットでは植物細胞内で核を動かすための力が足りないことが考えられた。そのため、別の顕微操作として、光ピンセットではなく、磁気ピンセットにより核を移動させることはできないかと考え、実験系のセットアップ・植物材料の準備を進めた。また、多核体である4核期において、各位置と遺伝子発現に特徴があるのか、遺伝子発現解析を行うために、光変換蛍光タンパク質mEos4をヒストンH2Bに融合させ、顕微鏡下で解析したい核だけUVを照射し、緑色から赤色に蛍光を変換させた後、核を回収できるよう、実験材料の準備を進めた。本年度の計画では、光ピンセットにより核動態を直接制御することを目標にしていたが、植物細胞において、光ピンセットを用いて直接制御を達成することは適わなかった。そのため、実験手法を切り替え、磁気ピンセットによる制御を行うために、磁気ピンセット装置のセットアップを完了した。また、磁気ビーズを核に集積できるよう、磁気ビーズに標識したタグを結合できる標識核タンパク質を発現する形質転換植物体を作出を行った。また、遺伝子発現解析のための光変換蛍光タンパク質発現植物体の作出も完了した。今後は、磁気ピンセットに注力し、核動態の直接制御を試みる。シロイヌナズナに加えて、タバコ培養細胞も用い、植物細胞で制御できる実験系の確立を目指す。また、雌性配偶体の多核体時期の核で遺伝子発現解析を行い、位置情報と細胞個性の関係性を明らかにすることを目指す。物品費として計上していた消耗品費に残額が生じたため、次年度、引き続き消耗品費として使用する。
マリンメタゲノム由来の生理活性ペプチチド探索およびシーズ遺伝子特異的濃縮法の開発

難培養性細菌の遺伝子資源を創薬に利用する手法の開発を行った。従来のメタゲノムライブラリーを用いたスクリーニング方法で、オーファンGPCRの代替リガンド探索を行い、リガンド候補とその遺伝子を同定することが出来た。このことは、難培養性細菌の遺伝子ソースが創薬ターゲットになり得る可能性を示唆している。さらに、重要創薬ターゲット遺伝子を持つ細菌のみを、夾雑細菌中から見分けて特異的に全ゲノム増幅する方法を確立した。本研究は難培養微生物が生産しているオリゴペプチドに着目し、創薬標的として注目を浴びているGPCR (Gタンパク質共役型受容体)リガンド活性に基づいたスクリーニングによる取得と、その生成に関わる遺伝子の特異的取得方法の確立を目的としている。具体的には、申請者らが構築したカイメン共生・共在バクテリアのメタゲノムライブラリーの部分配列に基づいて構築されたデータベース中から、モチーフ検索によってアミノ酸リガーゼモチーフを持つクローンを選択し、スクリーニング対象を10万クローンから数十百数十クローンに絞り、スクリーニングの効率化をはかっている。GPCR (MCHR1, BRS3)のリガンドアッセイは、ヒトBRS3をヒト胎児腎臓細胞由来HEK 293T細胞に導入した一過性発現株を用いている。またチャイニーズハムスター卵巣細胞由来CHO細胞はHEK 293Tと異なるリガンド感受性を示すことから、この細胞を用いた一過性発現系も用いた。これらを用いて、120クローンの培養上清と反応させ、顕著なシグナルが得られるクローンをスクリーニングする。また、本方法では、陽性クローンが保持する遺伝子の解析を行い、GPCRリガンド合成遺伝子を同定することが可能である。さらに、環状ペプチド合成酵素であるNRPS遺伝子の全長をメタゲノム中から特異的に増幅して、取得する方法も確立する。以上の研究によって、難培養性細菌のメタゲノムライブラリーを用いたペプチド性GPCRリガンドの同定と原遺伝子特定は、未利用遺伝子資源を有効活用する手法を提供し、メタゲノムソースを鋳型とするペプチド合成遺伝子の特異的遺伝子増幅と全遺伝子領域の取得法を確立することで、今後のメタゲノムからの創薬シーズ探索の発展を目指す。具体的には、申請者らが構築したカイメン共生・共在バクテリアのメタゲノムライブラリーから、モチーフ検索によってアミノ酸リガーゼモチーフを持つクローンを選択し、スクリーニング対象を10万クローンから数十百数十クローンに絞り、スクリーニングの効率化をはかっている。GPCR (MCHR1, BRS3)のリガンドアッセイは、ヒト胎児腎臓細胞由来HEK 293Tのゲノム内にBRS3を導入した安定発現株、およびプラスミドに挿入したBRS3をHEK 293T細胞に導入した一過性発現株を用いている。両者は発現量が異なり、リガンドに対する感受性が異なるので両株ともスクリーニングに使用する。またハムスター卵巣細胞由来CHO細胞はHEK 293Tと異なるリガンド感受性を示すことから、この細胞を用いた発現株も作出した。これらを用いて、120クローンの培養上清と反応させ、顕著なシグナルが得られたクローンをスクリーニングする。具体的には、申請者らが構築したカイメン共生・共在バクテリアのメタゲノムライブラリーの部分配列に基づいて構築されたデータベース中から、モチーフ検索によってアミノ酸リガーゼモチーフを持つクローンを選択し、スクリーニング対象を10万クローンから数十百数十クローンに絞り、スクリーニングの効率化をはかった。GPCR (MCHR1, BRS3)のリガンドアッセイは、ヒトBRS3をヒト胎児腎臓細胞由来HEK 293T細胞に導入した一過性発現株を用いた。その結果、従来のスクリーニング効率より100倍効率を引き上げ、BRS3と反応する因子を生産している陽性クローン2株を得た。2株のうち、より活性が明確な#42株のメタゲノム断片の全長シークエンスを決定した。

その結果、活性に必要な領域は少なくとも3つのORFがコードされており、そのうち2つはオペロンを形成しており、さらにオペロンのみでもGPCRを刺激することが出来るが、全長を保持していた方が高活性であることが分かった。以上の結果から、サロゲートリガンドになり得るペプチドをコードする遺伝子の分離に成功したといえる。さらに、環状ペプチド合成酵素であるNRPS遺伝子の特異的プライマーを用いて、夾雑細菌が存在する中、NRPS陽性細菌のみを特異的に、全ゲノム増幅に成功した。以上の研究によって、今後のメタゲノムからの創薬シーズ探索への発展が期待される。微生物ゲノム工学従来のスクリーニング効率より100倍効率を引き上げ、BRS3と反応する因子を生産している陽性クローン2株を得た。そして、精製度を上げていき、まだ、同定には至っていないが、特定のフラクションまで追い詰めている。また、25年度は、2株のうち、より活性が明確な#42株に絞って研究を進めた。#42株が持つプラスミド中にクローニングされたメタゲノム断片の全長シークエンスを決定した。その結果、活性に必要な領域には少なくとも3つのORFがコードされており、そのうち2つはオペロンを形成していることが分かった。これらのORFを個別にクローニングしたクローンを作製し、BRS3へ活性を示す生理活性物質生産に必須な遺伝子を特定することを目指している。「細菌1細胞分離法および全ゲノム増幅法の確立」はNRPS特異的プライマーを用いて、夾雑細菌が存在する中、NRPS陽性細菌のみを特異的に、全ゲノム増幅に成功した。これにより、目標は達せられたと結論した。今後は、細菌1細胞分離法1および00kbにおよぶ遺伝子全長をホストにクローニングする方法について検討していく予定である。平成24年度は、1ライブラリークローンの絞り込み、2GPCRのリガンドアッセイを目的としていた。1においては、120クローンに絞り込まれ、従来のスクリーニング効率より100倍効率を引き上げることが出来た。2においては、2株の陽性クローンを得た。これらはペプチド精製カラムによるHPLC分画後も活性が残存しており、確かにペプチドである可能性が高い。現在は、この2株に注目し、リガンドの精製に取り組んでいる。さらに、平成26年度で計画している「細菌1細胞分離法および全ゲノム増幅法の確立」について、先行して基礎的に実験を行った。そもそも本計画で使用するrolling cycle amplificationはφ29DNAポリメラーゼを使用するが、混合菌での使用が困難なため、1細胞分離技術が必要であった。特異的プライマーの使用はワンサイト・プライミングであるため、確実にワンサイトを認識できるか確認することから始めたところ、確かにサークルを数百から数千回転して増幅した1本鎖DNAが得られることを確かめた。
X線天文衛生「あすか」による近傍にある銀河団の空間構造の研究

「あすか」衛生に搭載されているX線望遠鏡のPoint Spread Function(PSF)は、現在も較正が行われている段階である。このため、詳細な銀河団の画像解析は行わず、PSFの不定性の影響をうけにくい低温度の銀河団と二重銀河団について、場所ごとのX線スペクトルの解析を行った。1低温度の銀河団我々の近傍にある5つの銀河団(A496、A1795、A3112、A2063、MKW3s)について、中心部(半径2.5分角以内)と周辺部(半径2.5分角から10分角)のスペクトルを作成した。スペクトル解析の結果、次のことがわかった。(1)大きなcoolingflowを持つ銀河団(A496、A1795、A3112)は中心部の温度が低い。これに対して、cooling flowの小さな銀河団(A2063、MKW3s)は等温である。(2)A3112、A2063、A496では重元素が中心部に集中しているが、A1795、MKW3sでは重元素が一様に分布している。重元素の中心集中とcooling flowの大きさには相関が見られなかった。2二重銀河団二重銀河団は銀河団の力学的な進化を研究する上で重要な天体であるが、これまでX線スペクトルの観測は行われていない。「あすか」でA1750とA2440の2つの二重銀河団を観測した。観測した銀河団は2つのピークを持つ構造をしており、それぞれのピークの温度、重元素量、赤方偏移を求めた。2つのピークの赤方偏移がほぼ等しいことから、2つのピーク構造が、2つの銀河団の見かけ上の重ね合わせではなく、1つの銀河団の2つのsubclusterであることが確かめられた。subclusterのX線光度と温度の関係は通常の銀河団とほぼ同じで、重元素の組成比も通常の銀河団と同程度であることがわかった。
動物個体における転写と共役したmRNAプロセシングの制御機構の解明

1.本研究課題は、線虫をモデルとしてmRNA前駆体のプロセシングが転写伸長と共役して進行していく過程を個体レベルでゲノムワイドに明らかにすることを目指している。そのために、同調した線虫個体から調製した核画分を用いて核run-on法で転写伸長途中の新生mRNA前駆体を標識してから全RNAを精製しさらに標識RNAを精製してライブラリを調製し、新学術領域研究「先進ゲノム支援」の支援を受けて全長RNAシーケンス解析を行った。得られた配列データの生物情報学的解析を行い、mRNA前駆体の3'末端=RNAポリメラーゼIIの転写位置とスプライシング完了率の関係性を全イントロンのデータを総計して解析した。その結果、酵母ではイントロンが転写されて数十塩基対転写が進んだ段階で50%のスプライシングが完了していると報告されたのに対し、線虫では1,000塩基以上でようやく50%に達することが明らかとなり、酵母と比べてスプライシングに時間を要することが示唆された。前年度には代謝標識による新生RNAの経時変化のRNAseq解析を行っていたが、情報解析方法を工夫した結果、各イントロンについて半減期を推定することができた。全長RNAシーケンス解析については、lst-3変異体についても同様の解析を行い、野生型との比較を進めている。2.米国Emory大学の斧正一郎博士と共に線虫のトロポミオシンをコードするlev-11遺伝子のスプライスバリアントを詳細に解析し、各選択的エクソンが選択される組織特異性を明らかにして論文として報告した。計画Bについては、遅れていたB1は野生型とlst-3変異体について、新学術領域研究「先進ゲノム支援」の支援を受けて全長RNAシーケンス解析データの返却を受けた。計画Cについては、野生型について、上記の全長RNAシーケンス解析データを元に転写と共役したスプライシングの動態を明らかにした。計画DのRT-PCRによる実験的検証について、全長RNAシーケンス解析と通常のRNAseq解析により予測されたプロセシング順序について解析を試みて概ね期待された結果を得ており、順調に進んでいる。計画Eについては、LST-3タンパク質と共沈降するタンパク質の精製法に関して、架橋剤で固定しない抽出液では共沈するタンパク質がほとんど見られず、架橋してからの共沈降では逆に100以上の多種類のタンパク質が共沈してしまうため、特異的に結合する因子の同定には至っておらず、当初の計画より遅れている。計画Gのlst-3変異体を用いた全長RNAシーケンス解析と20分間代謝標識の新生RNAseq解析については新学術領域研究「先進ゲノム支援」の支援を受けて計画どおりデータを得ており野生型と同様の解析を行っている。計画Hの組織特異的スプライシング制御因子変異体における新生RNAseq解析については、lst-3変異体と同様に既にデータを得ており、順次解析とRT-PCRによる検証を行っている。基本的には、当初の研究計画に沿って、前年度のまでの成果を受けて引き続き研究を進めていく。計画Eは、架橋剤で固定したクロマチンを出発材料にして、DNA/RNAの酵素的分解を組み合わせることでLST-3と共沈するタンパク質の種類を減らして特異性を上げることを目指す。計画G、Hでは、lst-3および各種スプライシング制御因子変異体の新生RNAシーケンス解析データを野生型と同様の方法で解析して、野生型との違いを見出し、RT-PCRやレポーターミニ遺伝子の作製によって実験的に検証することで、選択的スプライシングの制御モデルを明らかにする。そのために、計画Aとして、転写伸長途中の新生mRNA前駆体の精製を計画していたが、核run-on法で新生RNAを標識してから全RNAを精製しさらに標識RNAを精製する方法を確立した。計画B1として、精製した新生RNAの全長シーケンス解析を計画していたが、調製した新生RNA画分に対してまずポリA(+)RNAとリボソームRNAの除去を行い、3'末端にアダプターを付加してから逆転写を行ってライブラリを調製する方法を確立した。さらに、新学術領域研究「先進ゲノム支援」の支援を受けて全長RNAシーケンス解析を依頼し、現在は結果を待つ段階にある。計画B2として新生RNAのRNAseq解析を計画していたが、こちらも「先進ゲノム支援」の支援を受けて大規模シーケンス解析を行った。RNAseq解析については、計画Cのデータ解析で5'末端形成、3'末端形成とスプライシングの順序関係を予測し、計画Dとして、いくつかの遺伝子について転写と共役したスプライシングや5'末端形成、3'末端形成とスプライシングとの順序関係についてRT-PCRによる実験的な検証を行い、得られたデータからプロセシングの順序をある程度予測できていることを確認した。計画FのLST-3が結合するクロマチン領域の解析については、「先進ゲノム支援」の支援を受けてChIPseq解析を行い、データを得た。2.線虫のトロポミオシンをコードするlev-11遺伝子のスプライスバリアントを詳細に解析し、エクソン7aを含む新たなアイソフォームとしてLEV-11Oを同定し、頭部体壁筋でのみ発現することを報告した。3.線虫のmRNAプロセシング制御についての総説を発表した。計画Aについては、予定どおり方法を確立して新生mRNA前駆体を大量調製することができた。

計画Bについては、B1はライブラリ調製まで進みシーケンス解析を依頼するところまで年度内に終了したが、データを出していただくのを待っている段階にある。B2はRNAseqのライブラリを調製して依頼に出し、すでにデータの返却を受けてCのデータ解析を行っており、計画どおりである。DのRT-PCRによる検証も、RNAseqデータにより予測されたプロセシング順序については解析を試みて概ね期待された結果を得ており、順調に進んでいる。計画Eについては、LST-3タンパク質と共沈降するタンパク質の精製法に関して、架橋剤で固定しない抽出液では共沈するタンパク質がほとんど見られず、架橋してからの共沈降では逆に100以上の多種類のタンパク質が共沈してしまうため、特異的に結合する因子の同定には至っておらず、当初の計画より遅れている。計画FのLST-3のクロマチン免疫沈降、lst-3変異体のクロマチン免疫沈降は、すでにChIP-seqのデータを得ており、計画どおりと言える。1.本研究課題は、線虫をモデルとしてmRNA前駆体のプロセシングが転写伸長と共役して進行していく過程を個体レベルでゲノムワイドに明らかにすることを目指している。そのために、同調した線虫個体から調製した核画分を用いて核run-on法で転写伸長途中の新生mRNA前駆体を標識してから全RNAを精製しさらに標識RNAを精製してライブラリを調製し、新学術領域研究「先進ゲノム支援」の支援を受けて全長RNAシーケンス解析を行った。得られた配列データの生物情報学的解析を行い、mRNA前駆体の3'末端=RNAポリメラーゼIIの転写位置とスプライシング完了率の関係性を全イントロンのデータを総計して解析した。その結果、酵母ではイントロンが転写されて数十塩基対転写が進んだ段階で50%のスプライシングが完了していると報告されたのに対し、線虫では1,000塩基以上でようやく50%に達することが明らかとなり、酵母と比べてスプライシングに時間を要することが示唆された。前年度には代謝標識による新生RNAの経時変化のRNAseq解析を行っていたが、情報解析方法を工夫した結果、各イントロンについて半減期を推定することができた。全長RNAシーケンス解析については、lst-3変異体についても同様の解析を行い、野生型との比較を進めている。2.米国Emory大学の斧正一郎博士と共に線虫のトロポミオシンをコードするlev-11遺伝子のスプライスバリアントを詳細に解析し、各選択的エクソンが選択される組織特異性を明らかにして論文として報告した。計画Bについては、遅れていたB1は野生型とlst-3変異体について、新学術領域研究「先進ゲノム支援」の支援を受けて全長RNAシーケンス解析データの返却を受けた。計画Cについては、野生型について、上記の全長RNAシーケンス解析データを元に転写と共役したスプライシングの動態を明らかにした。計画DのRT-PCRによる実験的検証について、全長RNAシーケンス解析と通常のRNAseq解析により予測されたプロセシング順序について解析を試みて概ね期待された結果を得ており、順調に進んでいる。
細菌細胞壁構成成分の微量検出・定量試薬の開発

昆虫血液の血漿部分にフェノール酸化酵素前駆体を活性化するカスケード(proPOカスケード)が発見されたのが1981年である。その後、このカスケードはごく微量のペプチドグリカン(PG)とベータ-1、3-グルカン(βG)により活性化されることが判明し、昆虫血液の血漿部分がグラム陽性菌による医療機器などの汚染検査に適用できるかも知れないことが示された。1996年末に和光純薬工業株式会社より家蚕血漿がSLP試薬の名の下に細菌汚染検査試薬として発売され、この可能性は実証された。SLP試薬は発売以来、使用上の問題点が多々指摘されたが、それらは次の2点に纏めることが出来る。1つはSLP試薬がPGのいかなる構造を認識しているか明らかでないことと、SLP試薬がペプチドグリカンに特異的でないことであった。また、もう1点はproPOカスケードの全貌が明らかにされておらず、PGやβGをproPOカスケードを用いて定量する時の理論的根拠がはっきりしないことであった。我々はCS-plasmaをカードランとインキュベートする条件を種々検討し、ProPOカスケードが活性化される危険がほとんどない条件下でCS-plasmaをカードランとインキュベートする方法を見いだした。この方法でカードラン処理されたCS-plasma(plasma-PG)はザイモサンとペプチドグリカンをエリシターとして検討したところ、ペプチドグリカンにたいする感度がザイモサンに対するそれよりも1万倍程高いことが観察された。今後、この方法をさらに改良すれば、ペプチドグリカンとだけ特異的に反応するCS-plasmaの製品化に道がひらけると思われる。また、CS-plasmaを分画することにより、ProPOカスケードはPG認識タンパク、βG認識タンパク、proPO活性化酵素前駆体、proPO以外に少なくとも4つの構成要素が関与するかなり複雑な系であることが明らかになった。上記の研究以外に本年度はproPOを活性化する酵素前駆体(proPPAE)のcDNAクローニングを行った。研究計画書調書・交付申請書に記した計画にしたがって順調に進展している。本年度購入した全自動タンパク質一次構造決定装置は本研究課題遂行に威力を発揮している。本年度はフェノール酸化酵素前駆体のcDNAの調製とその塩基配列の決定/塩基配列からアミノ酸配列の推定/フェノール酸化酵素前駆体のリジルエドペプチダーゼ消化産物のペプチドマッピング/得られたペプチドのアミノ酸配列の決定/フェノール酸化酵素前駆体が活性化されるときに切断されるペプチド結合の同定/フェノール酸化酵素前駆体のN末端構造解析を行った。cDNAの塩基配列より推定されたフェノール酸化酵素前駆体の一次構造は、今まで知られていたカビ、哺乳類、バクテリアのフェノール酸化酵素と、銅を配置するドメインの構造において大きく異なることが明らかになった。カビなどのフェノール酸化酵素は一分子中に二原子の銅を持っていることが示されている。この二原子の銅の内、一つの銅の結合部位はヘモシアニンのCu(B)サイト一次構造と相同性が高いが、他方の銅の結合部位はヘモシアニンのCu(A)サイトとの一次構造と相同性を示さない。ところが家蚕のフェノール酸化酵素前駆体はその一分子中に二原子の銅を持ち、二つの銅を結合する部位の一次構造はそれぞれヘモシアニンのCu(A)、Cu(B)と非常に高い相同性を示した。

この事実は家蚕フェノール酸化酵素前駆体はいままで知られていたカビ、哺乳類、バクテリアのものと異なり、新しいタイプのフェノール酸化酵素であることを示している。フェノール酸化酵素前駆体が活性化されるとき切断されるペプチド結合は-Asn-Arg-Phe-Gly-のArgのカルボキシル側で、ArgはN末端から50番目のアミノ酸であった。また、フェノール酸化酵素前駆体のN末端アミノ酸はアセチル化されていることが証明された。フェノール酸化酵素前駆体活性化系(フェノール酸化酵素前駆体カスケード、proPOカスケード)の再構成へむけての構成要素の単離・精製はゆっくりであるが確実に進展している。proPOカスケードの活性化においてβ-1,3-グルカン認識タンパク(βGRP)から我々がproBAEEaseとよんでいるセリンタイププロテアーゼ前駆体までの間には少なくとも2つの因子が関与していることを示す結果が得られている。現在、この因子を精製中である。ペプチドグリカンによるカスケードの活性化についても研究を進め、ペプチドグリカン認識タンパク(PGRP)はペプチドグリカン構成要素の内でグルカン部分に親和性を示し、グルカン部分の繰り返し構造単位の2つか2つ以上の大きさの構造をもつグルカンに結合することが明らかにされた。PGRPとペプチドグリカン複合体により活性化されるセリンタイププロテアーゼ前駆体である可能性のあるポリペプチドを精製することができた。現在このポリペプチドのリジルエンドペプチダーゼ消化断片のシークエンスを行い、このポリペプチドがセリンタイププロテアーゼ前駆体であるか否か検証することを計画している。フェノール酸化酵素前駆体活性化系はペプチドグリカンとβ-1,3-グルカンにより活性化される。従って、カビあるいはバクテリアを特異的に検出する試薬としてproPOカスケードを用いることはできない。カブトガニ血球細胞破砕液を用いるリムルステストでは血液凝固系がβ-1,3-グルカンとリポポリサッカライド(LPS)で活性化される。カブトガニ血球細胞破砕液に多量のβ-1,3-グルカンを加えることでカブトガニ血球細胞破砕液をLPSに特異的に反応する試薬にする事ができる。カブトガニ血球細胞破砕液で用いられている方法でproPOカスケードをペプチドグリカンに特異的に反応する試薬にすることを試みたが成功しなかった。1996年末に和光純薬工業株式会社より家蚕血漿がSLP試薬の名の下に細菌汚染検査試薬として発売された。発売以来、SLP試薬使用上の問題点が多々指摘されたが、その1つはSLP試薬がペプチドグリカンのいかなる構造を認識しているか明らかでないことと、SLP試薬がペプチドグリカンに特異的でないことであった。SLP試薬からproPOカスケード構成要素のうちbGRP(ベータ-1、3-グルカン認識タンパク)だけを除くことで、SLP試薬がペプチドグリカンによってだけ引き金がひかれるようにする方法はすでに報告している(Biochem. Biophys. Res. Commun. 141,1177-1184(1986)。しかし、1986年に報告した方法では、CS-plasmaの操作途中でProPOカスケードが活性化してしまうことが頻繁におこり、安定してペプチドグリカンだけに反応するカイコ血漿を試薬として供給することが困難であった。