hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞分裂におけるMink1の機能解析

細胞分裂において、細胞は複製した二組の染色体を二つの娘細胞に正確に分配しなければならず、この分配異常は染色体の不安定化を引き起こし、細胞死または細胞の癌化などにつながる。この細胞分裂の過程は多くのタンパク質により複雑かつ精密に制御されており、近年細胞分裂に関する複数のプロテオーム解析が行われ、今まで知られているよりもさらに多くのタンパク質が関与する可能性が示唆された。しかしながら個々のタンパク質についての解析は解析が進んでおらず、いまだ細胞分裂の全貌の解明には至っていない。本研究では細胞分裂に関与する新規タンパク質を同定する目的で、siRNAを用いたスクリーニングを行った。細胞分裂期に発現亢進やリン酸化がおこるタンパク質のデータベースを利用しその中から解析の進んでいない遺伝子約300を選び、それぞれのsiRNAをHeLa細胞に取り込ませ培養し、核と微小管を染色して多核などの細胞分裂異常を呈するものを選び出した。本研究ではその中からMink1に注目し、細胞分裂における役割を解析することとした。Mink1はN末端にキナーゼ領域、C末端にCNH(Citron Homology Domain)領域を有する約140kDaのセリンスレオニンキナーゼである。はじめにMink1に対するポリクローナル抗体を作製した。この抗体を用いてウェスタンブロットを行ったところ分子量約140kDaのタンパク質が検出され、siRNAの導入によりその発現は顕著に抑制されていた。また細胞を間期と分裂期に同調させると分裂期にMink1の見かけ上の分子量が上昇し、分裂期にリン酸化を受けることが推測された。さらにMink1を免疫沈降し複合タンパク質を質量分析にかけMink1結合タンパク質を複数同定した。しかしながら個々のタンパク質についての解析は十分に進んでおらず、未だ細胞分裂の全貌解明には至っていない。本研究では細胞分裂に関与する新規タンパク質を同定する目的でデータベースを基にピックアップした遺伝子に対してsiRNAスクリーニングを行い、その中からsiRNAでノックダウンすると多核細胞が有意に増加したMink1というセリンスレオニンキナーゼに注目し詳細な解析を行っている。前年度のMink1は分裂期特異的にリン酸化を受けるという結果をもとに、本年度はMink1のリン酸化とMink1のキナーゼ活性の関係をin vitroキナーゼアッセイを用いて検討した。またMink1をリン酸化する酵素を検討した。その結果Mink1は分裂期にCDK1とPLK1によりリン酸化され、それに伴いキナーゼ活性が上昇することが明らかとなった。前年度にMink1に対する抗体を作成し、その抗体で免疫沈降を行いMink1の結合タンパク質を質量分析で同定した。複数のタンパク質が同定されてきたが、その中から脱リン酸化酵素のサブユニットの一つで基質特異的に結合するregulatory subunitであるSTRN4について詳細な解析を行った。STRN4をクローニングし過剰発現系でMink1との結合を確認するとともに、STRN4抗体を用いて内在性のSTRN4とMink1との結合も確認した。さらにMink1と相同性の高いMAP4K4とTNIKともSTRN4は結合することが確認された。MINK1はセリンスレオニンプロテインキナーゼであり、その詳細な生理的機能は不明である。我々はMINK1が細胞質分裂の最終段階である娘細胞の離断に必須であることをsiRNAをもちいたスクリーニングで見出した。MINK1は細胞分裂時にリン酸化され、そしてその酵素活性はリン酸化により亢進していた。MINK1の機能をさらに解析するため、質量分析装置を用いてMINK1の結合タンパク質を探索した。その結果、MINK1はSTRIPAKと呼ばれるタンパク質の複合体の因子であることが分かった。さらに解析を進めたところ、MINK1はSTRIPAKの因子であるSTRN4と直接結合することが明らかとなった。MINK1にはTNIK、MAP4K4と呼ばれるホモログ遺伝子が存在する。これらのホモログタンパク質もSTRN4と直接結合した。STRN4の発現をsiRNAを用いて抑制したところ、MINK1の発現抑制同様、細胞質分裂における離断が阻害された。STRN4はフォスファターゼと結合することが知られている。STRN4とフォスファターゼの複合体はMINK1の酵素活性を濃度依存的に阻害した。これらの結果は、STRIPAKの構成因子であるMINK1、STRN4が細胞質分裂の完了に必須あり、MINK1の酵素活性はSTRIPAKのフォスファターゼ活性により、細胞周期依存的に制御されていることを示唆する。ほぼ申請書に記載した予定とおり研究が進展しており、現在論文にまとめるべく最終的な実験に着手している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後はMink1とSTRN4との結合がどのように細胞分裂に関わっているのか検討し、今まで得られたデータとともに研究成果を論文にし発表する。
中国史における正統と異端

本研究によって、以下の事が明らかにされた。1広大な地域にわたる小農経済の上に皇帝が一元的な統治を行うには文人官僚の協力を必要としたが、そこで実際上の原理となりえたのは抽象的、形式的な、服従を至上とする道徳規範のほかにはなかった。この代償として、商業、技術の分化・発達が阻害された。2中国史上、一元的な皇帝権力に服従するものは正当化されるが、服従しないものはすべて異端として抑圧された。伝統中国では、正統性は中国文化の優越性に支えられていた。3現代中国において歴史上かって見られない、大規模な異端の抑圧がなされた。この異端抑圧のやり方は、伝統中国の方式とおなじで、最高権力に主張、政策からずれる、意見は抑圧され、その主張者は厳しく処罰された。現代中国では共産党主導の一元的支配が歴史上かって見られないほど徹底した。伝統社会で長期にわたり許容されていた宗教、風俗、習慣さえも抑圧・改造の対象となった。4現在、経済発展と民主化をめざして、市場経済と社会の多元化がはかられている。しかも、現代では、経済的にも、政治的にも、文化的にも、中国は世界の一構成部分となったことにより、伝統的な正統観も転換を迫られている。1「中国史における正統と異端」プロジェクトにかんする基本的な先行研究のリストを作成し配布し、このテ-マに関する先行研究の状況把握と参加者全員のこのテ-マに関する共通認識形成の資料を提供した。2「中国史における正統と異端」プロジェクトにかんする本年度の最も大きな成果は、10月に本大学においてこのプロジェクト参加者による研究集会を行ったことである。(1)「中国史における正統と異端」プロジェクトの目的とスケジュ-ルについて、(2)中国史における正統と異端、(3)儒教における正統と異端、(4)日本における正統と異端などの報告がおこなわれ、これをもとに参加者全員によって、討論がおこなわれ、このテ-マに関する概括的な共通の認識がえられ、これをもとに参加者一人一人の研究テ-マが決定された。3社会文化史研究会に参加し、本テ-マに関連する問題について討論を行った。4年度末には、各自の研究状況について簡単なレポ-トを集計した。第2年度は、伝統中国の正統・異端問題の処理と、現代中国における同問題の処理を比較し、以下のことが明らかにされた。1現代中国において歴史上かって見られない、大規模な異端の抑圧がなされた。2現在、経済発展と民主化をめざして、市場経済と社会の多元化がはかられている。
ラフトのコレステロールに結合するPFOタンパク質の構造遷移と相互作用様式の解明

PFOタンパク質を用いたラフトの細分化及び構造解析に向けた試料調製の改良従来「ラフト画分」として用いられてきた界面活性剤に不溶性の低密度膜画分から、コレステロール含有率の高い膜サブセットを分離する手法を確立した。この手法を用いてJurkat細胞から分離したBC-PFO結合性のラフト膜サブセットには、フロチリン、ガングリオシドGM1等のラフトマーカー分子の他に、Lck, LAT, PAG等のT細胞情報伝達を正・負に制御する分子群が検出された。一方、受容体刺激による活性化に伴って、BC-PFO結合性の膜領域に移行してくる分子の存在も明らかになった。PFOタンパク質の構造及びコレステロール・脂質との相互作用様式の解析を、ドメイン4(D4)を用いて進行させた。大腸菌の菌体破砕液の不溶性画分に存在するD4を、アルギニン法によってリフォールディングする事で、これまでに100FMの濃度のD4試料を安定して調製できるようになっていた。今回さらに試料調製法の改良(凝集防止剤(本領域の群馬大学・若松先生よりご提供)の添加、リフォールディング・濃縮工程の修正、サンプル管のシリコン加工等)を行った結果、500μMの濃度のD4試料を得る事に成功した。タンパク質の安定性に関しても、調製されたタンパク質はこれまで数時間程度しか良好なスペクトルを与えなかったが、今回それを1週間程度まで伸ばす事に成功した。現在この試料を用いて3次元スペクトルの測定を行い、主鎖の帰属を進行させている。細胞膜にはスフィンゴ脂質とコレステロールに富んだ機能的脂質ドメイン(ラフト)が存在している。Perfringolysin O(PFO)タンパク質は、ラフト中のコレステロールを選択的に認識して結合し、最終的には細胞に穴を開け破壊する毒素である。我々はこれまでに、PFOタンパク質を改変、無毒化することによってコレステロールに特異的なプローブ(BCθ)を作製し、BCθが脂質ミクロドメイン(ラフト)中のコレステロール密度の高い領域に選択的に結合することを見いだしている。今回BCθを用いた解析により、従来「ラフト画分」として用いられてきた画分が、コレステロール含有率の高い(BCθ結合性の)膜と低い(BCθ非結合性の)膜の混合物であることが明らかになった。そしてJurkat細胞から分離したBCθ結合性のラフト膜サブセットには、ラフトマーカー分子の他に、T細胞情報伝達を正・負に制御する分子群が検出された。一方、受容体刺激による活性化に伴って、BCθ結合性の膜領域に移行してくる分子の存在も明らかになった。我々はPFOタンパク質中の約110アミノ酸からなる部位(D4)が、ラフト中のコレステロールへの選択的な結合能を有する事を見出した。大腸菌の菌体破砕液の不溶性画分に存在するD4を、アルギニン法によってリフォールディングする事で、安定して調製できるようになった。この試料に3重共鳴法を適用する事により、主鎖の帰属をある程度行うことができた。また膜環境を模した状態における構造解析を行う為に、D4をミセルに取り込ませる事を試みた。この状態におけるCDスペクトルは、水中におけるものとは少し異なっていた。さらにより膜の環境に近づける為に、コレステロール含有のリポソームを調製し、そこにD4を取り込ませた。この状態のCDスペクトルも、水中におけるものとは少し異なっていた。
人体構造の防災用有限要素モデル化に関する研究

地震や津波などの自然災害や、車両・船舶の衝突、群集事故などの人為的な災害による被害軽減策を検討する上で、被災メカニズムの解明は重要な課題である。本研究は、バイオメカニクスや身体運動学の先端的な知見を応用して、災害で直接被害を受ける人体側からの視点による減災策の検討を試みるものである。3年間にわたる研究の成果として、防災用に特化したサイバー・ダミー(コンピュータでシミュレーション解析が可能な有限要素モデル)の開発を行い、日本人成人男性の平均身長を有する人体モデルを完成させた地震や津波などの自然災害や、車両・船舶の衝突、群集事故などの人為的な災害による被害軽減策を検討する上で、被災メカニズムの解明は重要な課題である。本研究は、バイオメカニクスやキネシオロジー(kinesiology:身体運動学)の先端的な知見を応用して、直接被害を受ける人体側からの視点による減災策の検討を試みるものである。既往の、いわゆるクラッシュ・ダミーよりも高精度で、防災用に特化したバーチャル・ダミー(コンピュータでシミュレーション解析が可能な有限要素モデル)の全身モデルの開発を最終的な研究目標としており、本研究課題はその一環として、胸郭部と大腿部の有限要素モデル化を行うものである。本年度(平成18年度)は当該研究の初年度に当たり、まず、1.研究の全体計画の策定、2.研環境の整備(デュアルコア型プロセッサ搭載中央処理装置の購入、汎用衝撃応答解析プログラムの使用許可の取得、解析補助員の手配と大腿部の有限要素モデル化に関する実験準備)を行い、次に、3.人体モデルの基本形状データの取得とJAVA言語を用いた一連のデータ変換手法の開発を行った。さらに、4.本研究において必要不可欠な技術である、「筋肉部分のソリッド要素分割方法」について検討を行い、汎用有限要素法解析ソフト(COSMOS WORKS)と汎用3次元設計ソフト(SOLID WORKS)を新たに導入して半自動的に行う手法を開発した。本年度の後半では、5.過去に実施した、CTスキャナーによる胸部圧迫試験結果の再検討と整理を行い、また、上記の方法を用いて生成した胸郭部モデルを用いたシミュレーション解析結果との比較・検討を行うことにより、胸郭部モデルの精緻化を行った。同時に、パラメータ解析を行い、筋肉・靭帯などの軟組織の物性値が胸腔内径の変化に及ぼす影響について明らかにした。既往の、いわゆるクラッシュ・ダミーよりも高精度で、防災用に特化したサイバー・ダミー(コンピュータでシミュレーション解析が可能な有限要素モデル)の全身モデルの開発を最終的な研究目標としており、本研究課題はその一環として、胸郭部と大腿部の有限要素モデル化を行うものである。本年度(平成19年度)は、1.昨年度の研究成果の発表(査読付論文2件:安全工学シンポジウム、土木学会地震工学論文集)を行うと伴に、2.昨年度構築した研究環境の維持(汎用衝撃応答解析プログラムの使用許可の取得、2年目)を行い、次に、3.昨年度開発した、汎用有限要素法解析ソフト(COSMOS WORKS)と汎用3次元設計ソフト(SOLID WORKS)を用いた「軟組織のソリッド要素の半自動分割手法」により、右半身の人体有限要素モデルを作成した。過去に入手していた市販の人体データ(臓器なども含む全身モデル:anatomy data)をベースとして、「平成15年度国民健康・栄養調査報告」における20歳代の日本人の身長の平均値となるように寸法を調整して、身長1716mmの成年男性の人体モデルを完成させた。本研究は、バイオメカニクスやキネシオロジー(kine-siology:身体運動学)の先端的な知見を応用して、直接被害を受ける人体側からの視点による減災策の検討を試みるものである。本年度(平成20年度)は、1.昨年度の研究成果の発表(査読付論文2件および査読無し論文2件、計4件:安全工学シンポジウム、地域安全学会論文集、14^<th> World Conference on Earthquake Engineering、地域安全学会研究発表会梗概集)を国内外で行うと伴に、2.研究環境の維持(汎用衝撃応答解析プログラムの使用許可の取得、3年目)を行い、次に、3.昨年度完成させた、身長1716mmの成年男性の人体モデルを用い、その軟組織の材料定数に関する検討を行った。

さらに、4.情報通信研究機構の2mmの立方体を単位とした人体データベースから、滑らかな曲面を持つロフトを作成するためのデータ処理方法について検討した。輪郭追跡処理のアルゴリズムを開発し、各パーツの輪郭を成す要素のみを取り出すことができるようになった。
実践的な英語コミュニケーション能力の向上を目指すシラバスの研究開発

平成14年度は、TOEIC対策講座参加した国際関係学部学生約200名を対象に実施したTOEIC模擬試験の誤答を分析した結果、(1)基本的な語彙力不足、(2)概略・要点の理解が困難であること、(3)多くの学生にとって「読むこと」は「聞くこと」より容易であること、が分かった。平成15年度は、国際関係学部のTOEIC受講生の173名に対し実施したTOEICリスニング模擬テスト・TOEIC公開テスト・ACTFL Proficiency基準に沿ったインタビューテストの結果に基づき、(4)TOEICスコア既得者25名について平均が591点から617点に伸びたこと、(5)コミュニケーションの展開や方策に関する知識不足、(6)異文化社会の理解不足、が問題点として指摘された。さらに、短期英語研修に参加した5名について研修前後のTOEICスコアを比較分析してみると、1ヶ月程度の研修ではTOEIC形式のテストでは顕著なスコアの向上は観察できなかった。平成16年度は、講座終了時に受講生に課したリスニング模擬テストの結果を分析し、レベル別にスコアの伸びと向上を妨げる困難点について考察した。また、米国オハイオ州立大学夏期英語研修に参加した数人の学生について、TOEICスコアとミシガンテストスコアを比較した。さらに、講座終了者の中から希望学生に対して、ACTFLの評価方法に沿ってインタビューテストを実施し、TOEICスコアレベルとスピーキング力の相関性を調査した。その結果、特に(7)内容の展開・文脈が明らかでない場合、談話・対話の理解は中・上級者でも非常にむずかしいこと、(8)TOEICスコアとインタビューテスト・ミシガンテストの評価にある程度の相関性があったが、両者の間には重要なズレがあり、TOEICスコアからスピーキング力またライティング力は適切に予測し難いこと、が重要な観察点として指摘された。平成14年度は、静岡県立大学国際関係学部において週2回(1回=90分)5週間の期間で開講したTOEIC講座(前期3クラス・後期10クラス・1クラス=1020人)を軸に、クラス開始時に参加学生に課した実験テストの結果と終了後のTOEIC公開テストスコアを比較分析し、大学生が実践的なコミュニカティブな英語を学習する上で直面する問題の本質とTOEICスコアアップを目標とした授業の効率性について予備調査した。調査では誤答分析および習熟度と正答率のクロス集計を用いた。誤答分析の結果、1.リスニングの場合、(1)音の識別よりむしろ基本的な語彙力不足にあり、特に受験勉強では学習していないような生活に密着した単語が困難であること、(2)全体を把握して概略・要点を理解することができないこと、2.文法・語法について、(3)「高校学習指導要領」で指定されている基本的な項目は正答率が高いこと、(4)動詞の類似する用法や機能の区別が適切に理解してないこと、3.リーディングの場合、(5)全体的に正答率が非常に高く大学生が「読むこと」をあまり苦手としていないこと、が分かった。また、クロス集計の結果、習熟度と正答率の相関性はリーディングセクションよりもリスニングセクションの方がより顕著に見られた。さらに、参加学生の一部(約40名)のTOEIC公開テストスコアの結果を分析してみると、リーディングよりリスニングの方がスコアの伸びが大きく、授業の成果が見られた。(なお、詳細については「TOEICスコアの意味-科研プロジェクト中間報告」(中部言語学会研究会2002年12月16日静岡県立大学)参照)。平成15年度前半は、今年2月にTOEIC公開テストを受験した本講座参加学生も含めて、インタビューテストを実施し、リスニング・リーディングとスピーキングの相関性を調査する予定である。

平成15年度は、TOEIC対策講座(前期7クラス-初級2クラス・中級3クラス・上級2クラス、週1回・90分授業、10回、後期9クラス-初級2クラス・中級5クラス・2クラス、週1回:7クラス、週2回:2クラス、10回、学生173名参加)を軸に、講座終了時に実施した100問から成るリスニング模擬試験の結果と講座参加者のTOEIC公開テストスコアを分析した。また、模擬試験を受けた学生の中からレベル別に数名選び、ACTFL Proficiency基準に従ってインタビューテストを実施した。加えて、静岡県立大学国際関係学部がオハイオ州立大学(アメリカ)において15年度より開始した「静岡夏期英語研修プログラム」に参加した学生5名の研修前後のTOEICスコアを比較分析し、短期英語研修成果の有無についての予備調査をおこなった。上記の分析調査の結果は以下の4点にまとめることができる。1.TOEICスコア既得者(25名)について、講座修了後のTOEICテストスコアが平均で591点から617点に上昇した(26点アップ)。対策講座がスコアアップに役立つことが分かった。2.模擬試験の結果分析から、大学生のリスニング力向上を図る上で、(1)語彙や文法力不足・(2)コミュニケーションや談話の展開方法・方策に関する知識不足・(3)異文化社会への理解不足、の3点が大きな問題点であることが分かった。3.インタビューテストに参加した学生が本年度は少なかったため暫定的な分析であったが、リスニングのテスト結果はスピーキングスキルを的確に測定できるものではなかった。4.1ヶ月程度の短期海外英語研修の成果は、研修直後では、TOEIC形式のようなリスニングテストに顕著な結果として現れなかった。このような成果を踏まえて、平成16年度は、特に3と4の調査に重点を置き、研究を継続して行く。平成16年度は、15年度と同様に、課外授業として実施したTOEIC対策講座(前期7クラス-初級2クラス、中級3クラス、上級2クラス、週1回・90分授業10回、後期9クラス-初級2クラス、中級4クラス、上級3クラス、週1回・90分授業7回、スピーキング特訓5クラス、90分授業45回)を中心に、講座終了時に受講生に課したリスニング模擬テスト(100問、2回実施)の結果を分析し、特にレベル別にスコアの伸びと進度を妨げる困難点について考察した。また、前期TOEIC講座受講生の中、オハイオ州立大学(アメリカ)夏期英語研修に参加した数人の学生について、TOEICスコアとミシガンテストスコアを比較した。さらに、講座終了者の中から希望学生に対して、ACTFLの評価方法に沿ってネイティブスピーカーのインタビューアーがインタビューテストを実施し、TOEICスコアレベルとスピーキング力の相関性を調査した。1.大学生の英語理解を妨げる最大の要因は語彙不足にあること。2.知らない語彙がある場合、学習者は知っている語彙に引っ張られてしまい、内容理解を誤ってしまう傾向にある。3.異文化を背景にした語彙・表現は既習のものでない限り、非常に困難である。4.内容の展開・文脈が明らかでない場合、談話・対話の理解は上級者でも非常にむずかしい。
チョッパー分光器を用いた中性子非弾性散乱による分子磁性体の磁気相関解明

昨年度、圧力下の試験測定として行った有機ラジカル磁性体「ガルビノキシル」の中性子非弾性散乱において、分子の局所的な運動を示す励起モードとその圧力変化(加圧によるハード化)は観測されたものの磁気励起シグナルが観測されなかったことを受け、その理由の解明と対策を検討した。磁気励起が観測されなかった理由として考えられるのは、(1)スピンが分子上に広く分布しているため磁気形状因子の急速な減衰、(2)重水素化していない試料を用いたため軽水素の非干渉性散乱による大きなバックグラウンド、(3)印加圧力の不足による磁気秩序相の体積分率の低下、以上の3つであった。このうち1は、物質で決まってしまう要因である。また2は、大量の試料合成が容易ではない。そこで、3を改選すべく、従来のメゾアライト製圧力セル(最大圧力0.5GPa)からベリリウム銅製圧力セル(最大圧力1.2GPa)を整備した。また、昨年度は、1次元強磁性相関の発達のみが期待できる1.8Kでの測定だったが、今年度はHe3冷凍機を用いて、長距離磁気秩序が期待される0.3Kまで圧力セルを冷却し、非弾性散乱測定を行った。しかしながら、磁気励起を観測することはできなかった。この結果を受け、当初計画していた分子スピンラダー系の非弾性散乱実験の課題申請は延期し、重水素化試料の量産を検討し始め、同時に、同物質のスピン状態解明のため、まずは軽水素体試料での実験が可能なミュオンスピン緩和測定を申請を行うことを決めた。また、圧力セルによるバックグラウンド低減のための小型ラジアルコリメーターの仕様検討を行い、設計に着手した。有機ラジカル磁性体ガルビノキシルのテスト実験により、申請時に計画していた分子スピンラダー系における磁気励起観測のための中性子非弾性散乱は、今のままではシグナルが弱く観測できないことが予想されたため、課題申請を見送ることにした。この対応として、重水素化の方法を模索しつつ、まず軽水素体試料を用いてミュオンスピン緩和測定による磁気秩序状態とダイナミクスの解明を行うことにした。また、小型ラジアルコリメーターの仕様検討と設計には予定どおり着手しているが、製作には至っていない。分子スピンラダー系については、来年度、軽水素体での測定が可能なミュオンスピン緩和測定により、中性子散乱に先立って重要なデータとなる磁気秩序状態とスピンダイナミクスの解明をおこなうため、課題申請を行う(採択されれば令和元年度後期に実施)。また、中性子実験のための重水素体試料は、合成の段階で重水素体を量産することは非常に困難であるため、J-PARC施設内にある重水素化ラボの装置を使用した重水素化の方法を模索する。また、圧力下中性子非弾性散乱のための小型ラジアルコリメーターの設計を進め、製作に着手する。本研究では、中性子非弾性散乱を用いた分子磁性体の磁気的性質解明を目指している。また、その中で、有機ラジカル磁性体の圧力効果まで研究を発展させるため、非弾性散乱実験における圧力下の測定手法の構築も目指している。平成29年度は、有機ラジカル磁性体ガルビノキシルに対し、常圧および圧力下での中性子非弾性散乱測定を試みた。ガルビノキシルは、擬1次元的な構造をもち、分子上にスピン1/2が分布する。常圧では85Kで構造相転移を起こし反磁性になるが、約0.7GPaの静水圧を印加すると構造相転移が抑制され、1次元強磁性鎖となる。この実験での最終目標は、圧力下において低温で発達する1次元鎖内の強磁性相関による磁気励起を観測することであったが、圧力下での磁気励起シグナルは観測されなかった。原因はいくつか考えられるが、重水素化しない試料を用いたことによる非干渉性散乱、スピンが分子上に広く分布していることによる磁気形状因子の急速な減衰、あるいは試料の量とスピンの空間密度による強度不足と考えている。一方で、磁気励起よりも非弾性散乱の強度が10100倍以上強いフォノンのシグナルは明瞭に観測され、構造相転移にともなうフォノンスペクトルの変化をとらえることに成功した。さらに今年度は、今後より高い圧力(0.51.5GPa程度)を印加できるよう、現在使っているメゾアライト製クランプセルに代わるベリリウム銅製の圧力セルの整備と試験測定の準備に着手した。申請当初計画していた有機ラジカルによるスピンラダー物質の中性子非弾性散乱測定について、試料の選定と準備が間に合わず課題申請ができなかったため、実施できていない。現在、平成30年度秋以降のビームタイムを申請予定である。有機ラジカル磁性体ガルビノキシルの圧力下の非弾性散乱測定については、予定どおり実施したが、磁気励起シグナルが観測されなかった。そのため、この測定を完遂するには圧力セルの材質や圧力媒体の種類を再検討する必要があり、平成30年度のビームタイムを使って行うことになる。磁気励起が観測されなかった理由として考えられるのは、(1)スピンが分子上に広く分布しているため磁気形状因子の急速な減衰、(2)重水素化していない試料を用いたため軽水素の非干渉性散乱による大きなバックグラウンド、

(3)印加圧力の不足による磁気秩序相の体積分率の低下、以上の3つであった。このうち1は、物質で決まってしまう要因である。また2は、大量の試料合成が容易ではない。そこで、3を改選すべく、従来のメゾアライト製圧力セル(最大圧力0.5GPa)からベリリウム銅製圧力セル(最大圧力1.2GPa)を整備した。また、昨年度は、1次元強磁性相関の発達のみが期待できる1.8Kでの測定だったが、今年度はHe3冷凍機を用いて、長距離磁気秩序が期待される0.3Kまで圧力セルを冷却し、非弾性散乱測定を行った。しかしながら、磁気励起を観測することはできなかった。この結果を受け、当初計画していた分子スピンラダー系の非弾性散乱実験の課題申請は延期し、重水素化試料の量産を検討し始め、同時に、同物質のスピン状態解明のため、まずは軽水素体試料での実験が可能なミュオンスピン緩和測定を申請を行うことを決めた。また、圧力セルによるバックグラウンド低減のための小型ラジアルコリメーターの仕様検討を行い、設計に着手した。有機ラジカル磁性体ガルビノキシルのテスト実験により、申請時に計画していた分子スピンラダー系における磁気励起観測のための中性子非弾性散乱は、今のままではシグナルが弱く観測できないことが予想されたため、課題申請を見送ることにした。この対応として、重水素化の方法を模索しつつ、まず軽水素体試料を用いてミュオンスピン緩和測定による磁気秩序状態とダイナミクスの解明を行うことにした。また、小型ラジアルコリメーターの仕様検討と設計には予定どおり着手しているが、製作には至っていない。平成30年度は、有機ラジカルによるスピンラダー物質について、中性子非弾性散乱実験による磁気励起の観測に挑戦する。有機磁性体は、スピンが分子上に広く分布しているため、磁気励起シグナルが非常に弱いかあるいは形状因子の減衰が非常に速い可能性がある。本測定では、対象物質の磁気的性質の解明を目指すとともに、分子磁性体への中性子非弾性散乱測定の適用の可能性を探る。中性子非弾性散乱測定を行っているJ-PARC物質・生命科学実験施設には、中性子のほかにミュオンビームラインも利用可能である。そこで、分子磁性体の磁性研究において必要があれば、中性子とミュオンを相補的に利用することも視野に入れる。高圧環境下での測定手法確立については、平成29年度に購入したベリリウム銅製圧力セルについてオンビーム試験を行い、圧力セルおよび圧力媒体によるバックグラウンドを評価する。その後、平成29年度に測定した有機ラジカル系・ガルビノキシルについて、圧力セルの材質を変えて再度、測定を行う。分子スピンラダー系については、来年度、軽水素体での測定が可能なミュオンスピン緩和測定により、中性子散乱に先立って重要なデータとなる磁気秩序状態とスピンダイナミクスの解明をおこなうため、課題申請を行う(採択されれば令和元年度後期に実施)。また、中性子実験のための重水素体試料は、合成の段階で重水素体を量産することは非常に困難であるため、J-PARC施設内にある重水素化ラボの装置を使用した重水素化の方法を模索する。また、圧力下中性子非弾性散乱のための小型ラジアルコリメーターの設計を進め、製作に着手する。次年度使用額が生じたのは、申請当時は今年度を予定していた、圧力実験用の小型ラジアルコリメーターの製作に着手していないためである。
鳥インフルエンザ制御を目指した新規ワクチン戦略基盤

H5N1亜型など鳥インフルエンザウイルスによるパンデミックの発生が危惧される。薬剤耐性ウイルスの出現からより効果的で安全なワクチンが求められている。本研究では、新しい非増殖型半生ワクチンを構築した。このワクチンは細胞に感染し防御免疫抗原を発現するがウイルス粒子は産生されず、高い安全性と防御効果が期待できる。非増殖型ウイルスとしてM2、NS2、NA、あるいはHA欠損ウイルスを構築した。それぞれの構築法やマウスでの免疫原性からHA膜融合能を欠損させた非増殖型ウイルスが半生ワクチンとして最も有望であった。この知見はワクチン戦略のブレイクスルーになると期待される。H5N1亜型を代表とする鳥インフルエンザウイルスに起因する新たなインフルエンザ世界的大流行(パンデミック)の発生が危惧される。今後予想される抗ウイルス薬耐性ウイルスの出現と拡がりは、予防ワクチンの重要性を強調するものの、不活化ワクチンの有効性に対する不安や、生ワクチンの安全性、使用時期の制限から、鳥インフルエンザの制御を目指したより効果的で安全なワクチン戦略が早急に求められている。本研究では、新しい戦略として非増殖型半生ワクチンの構築を目的とする。このワクチンウイルスは細胞に感染し、防御免疫抗原を感染細胞上に発現するが、感染性ウイルス粒子は産生されない。したがって、安全性は極めて高く、一方では、タンパク質性アジュバント分子を同時に搭載・発現させることも可能であり、不活化ワクチンや生ワクチンを凌ぐ防御効果が期待できる。得られる成果は、インフルエンザワクチン戦略のブレークスルーに発展する可能性がある。本年度は、非増殖性半生ワクチンウイルスの効率のよい作製方法を検討した。まず、M2欠損ウイルスについて検討したところ、その増殖性はかなり減少するものの、半生ウイルスとしては不完全である可能性が示された。そこで、次に、NS2欠損ウイルスについて検討を行った。そのため、変異ウイルスを増幅するために必要なNS2恒常発現細胞の作製を試みたものの、NS2タンパク質自体がもつ細胞毒性が強いため、通常のプラスミド法では樹立は困難であると判断した。そこで、発現性の弱いレトロウイルスベクターを用いてNS2発現細胞の作製を検討し、細胞の樹立に成功した。今後は、この細胞を用いて半生ウイルスが作製できるかを検討する予定である。H5N1亜型を代表とする鳥インフルエンザウイルスに起因する新たなインフルエンザパンデミックの発生が危惧される。本年度は、非増殖性半生ワクチンウイルスとしてHA開裂欠損変異体の効率のよい作製方法を検討した。HAの開裂はウイルスの感染性に必須であるため、開裂欠損によりウイルスの非増殖性が保証される。まず、HA開裂欠損変異体をレスキュー、増殖させるため野生型のHAを恒常的に発現するMDCK細胞を確立し、HA開裂欠損変異体を増幅することが可能になった。上清に得られたウイルスを正常細胞に感染させたところ、HAの発現が認められるとともに、もはや感染性のウイルスは産生されないことが確認できた。次に、このHA開裂欠損変異ウイルスをマウスに経鼻接種したところ、血中抗体の産生が認められた。マウスからは感染性ウイルスは回収されなかった。これらの成績は、このHA開裂欠損変異ウイルスが半生ワクチンとして応用できる可能性を示すものである。

本年度は、昨年度作成したHA開裂欠損変異体の非増殖性半生ワクチンウイルスとしての効率をマウスモデルを用いて詳細に検討した。このHA開裂欠損変異ウイルスをマウスに経鼻接種したところ、IgAを含む局所抗体および血中抗体の産生のみならず細胞性免疫も誘導することが明らかとなり、野生株による攻撃実験において、対照の不活化ワクチンより高いワクチン効果が認められた。さらに、別の非増殖性半生ワクチンウイルスの作成を目指し、NA恒常発現MDCK細胞の樹立にも成功し、今後の研究に活用する予定である。H5N1亜型を代表とする鳥インフルエンザウイルスに起因する新たなインフルエンザパンデミックの発生が危惧される。今後予想される抗ウイルス薬耐性ウイルスの出現と拡がりは、予防ワクチンの重要性を強調するものの、不活化ワクチンの有効性に対する不安や、生ワクチンの安全性、使用時期の制限から、鳥インフルエンザの制御を目指した、より効果的で安全なワクチン戦略が早急に求められている。本研究では、新しい戦略として非増殖型半生ワクチンの構築を目的とする。このワクチンウイルスは細胞に感染し、防御免疫抗原を感染細胞上に発現するが、感染性ウイルス粒子は産生されない。したがって、安全性は極めて高く、一方、不活化ワクチンを凌ぐ防御効果が期待できる。得られる成果は、インフルエンザワクチン戦略のブレークスルーに発展する可能性がある。本年度は、改変型HAをもつ非増殖型ウイルスを作製し、そのワクチン効果を検証した。ウイルスの感染性に必須であるHAの膜融合ペプチド領域を欠損させた改変型HA遺伝子を構築し、リバースジェネティクス法によりそれをもつウイルスをレスキューした。このウイルスは正常なHAをもたないため非増殖性であるが、他の遺伝子分節は正常であるため、細胞に感染して防御抗原を発現する。このウイルスをHA恒常発現細胞を用いて増幅した後、そのワクチン効果をマウスモデルにて調べたところ、複数回の経鼻接種により、攻撃試験のマウスに対するワクチン効果が認められた。これらの成績は、このタイプの非増殖型ウイルスがインフルエンザワクチンのオプションとして応用可能であることを示している。
FISH/CISHを用いたRET遺伝子関連異常検索

様々なEGFRチロシンキナーゼ阻害剤やALKチロシンキナーゼ阻害剤が認可され肺腺癌の診断治療体系が一変した。肺腺癌に対する新たな分子標的としてRET遺伝子の転座を共同研究の中で見出し、我々はその後当教室での転座例を確認してFISHプローブの開発を行ってきた。2013年には新たな分子標的としてNTRK転座を見出し、細胞実験での検証を行った。2014年には新たな分子標的としてFGFR3転座を見出した。最近注目されているBRAF遺伝子V600E変異についてPCRや免疫染色等での同定法を検討し、2015年にFISHでの遺伝子増幅の確認を行った。肺癌は、組織学的に小細胞癌と非小細胞癌に大別され、組織型に応じて薬剤を選択し化学療法が行われてきた。しかし2004年に我々とDana Farber癌研究所の共同研究からEGFR遺伝子変異が(Paez JG et al. Sasaki H. 12番目、Fujii Y.13番目Science 304: 1497-1500)、2007年に日本の間野博士のグループからALK転座が発見され、さらにEGFR-チロシンキナーゼ阻害剤やALKチロシンキナーゼ阻害剤が認可されたことにより肺癌とくに腺癌の診断、治療体系が一変した。肺腺癌に対する新たな分子標的として2012年にはRET遺伝子の転座を共同研究の中で見いだし(Lipson D et al. Nature Med 2012; 18(3): 382-384. Sasaki H 24人目)、FISHプローブの開発を行ってきた。RETは甲状腺随様癌において転座が報告されていた。2013年にはさらに新しい分子標的として肺癌におけるNTRK1転座を見いだしNature Medicine誌に報告した(Vaishnavi A et al. Nat Med 19(11): 1469-1472. Sasaki H 13人目)。この転座は1%程度の比較的まれな転座であり、当院での手術例の肺癌検体を用いて再解析を施行したが、追加では一例も検出されなかった。しかしNTRKの恒常的活性化を来すため、現在細胞実験での検証を進めている。一方肺癌におけるBRAF遺伝子変異も注目されており、当科でもその検出を試みてきた。この中で頻度が多いV600E遺伝子変異については変異特異的抗体を用いた免疫組織学的検討も行ってきたが、これらの症例においてのBRAF遺伝子増幅の有無を検討するために、GSP研究所のBRAFFISHプローブを用いて、FISHによる解析を進めている。肺癌は。組織学的に小細胞癌と非小細胞癌に大別され、組織型に応じて薬剤を選択し化学療法が行われてきた。しかし2004年に我々とDana Farber癌研究所の共同研究からEGFR遺伝子変異が(Paez JG et al. Sasaki H. 12番目、Fujii Y.13番目。Science304:1497-1500.)、2007年に日本の間野博士のグループからALK転座が発見され、さらにEGFRチロシンキナーゼ阻害剤やALKチロシンキナーゼ阻害剤が認可されたことにより肺癌特に腺癌の診断、治療体系が一変した。肺腺癌に対する新たな分子標的として2012年にはRET遺伝子の転座を共同研究の中で見いだし(Lipson D et al. Nature Med 2012; 18(3):382-384. Sasaki H 24人目)、FISHプローブの開発を行ってきた。2013年にはさらに新しい分子標的として肺癌におけるNTRK1転座を見いだしNature Medicine誌に報告した(VaishnaviA et al. Nat Med 19(11): 1469-1472. Sasaki H 13人目)。この転座は1%程度の比較的まれな転座であり、当院での手術例の肺癌検体を用いて再解析を施行したが、追加では1例も検出されなかった。しかしNTRKの恒常的活性化を来すため、大腸癌のNTRK1転座細胞株での検証を進めた。NTRK阻害剤は有意に細胞増殖を抑制した。免疫組織学的検索では肺大細胞癌での染色陽性例を認めた。この中で頻度が多いV600E遺伝子変異について、マイクロダイセクションを用いたintra tumor heterogenityの検索を進めた。2014年末には新たにFGFR3の転座を見いだし報告した(Clin Cancer Res 20:6551-6558)。最近注目されているBRAF

遺伝子V600E変異についてPCRや免疫染色等での同定法を検討し、2015年にFISHでの遺伝子増幅の確認を行った。日本では遺伝子診断ネットワーク(LC-SCRUM-Japan)が構築されRET転座のような1-2%の頻度の希少肺癌であっても実際にスクリーニングが可能であることが証明された意義は大きい。RET転座はこれまで希少と考えられていたALK肺癌の約5分の1の頻度である。しかしRET阻害剤が有望と思われるRET肺癌をどのようにスクリーニングして治療薬の有効性をいかなる方法で示し、臨床応用していけばよいかの考案の過程でFISHプローブの検討を試みてきた。RET遺伝子の切断点を隔てて2つのプローブをおいておき、これらが切断されていればほかの遺伝子と融合することを検出する方法(Break-apart assay)を主に用いてきた。NTRK1転座は日本人検体から検出されずFISHの検討に進めなかった。BRAF遺伝子増幅に関してはFISH法による同定を試み条件を設定、変異例で有意な増幅シグナルを得た。BRAF遺伝子変異や増幅の同定が進めば新たな分子標的としての可能性、臨床応用につながると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。呼吸器外科学NTRKについては大腸癌で転座が既に証明された細胞株での実験を進め、さらにNTRK発現増幅がみられる肺大細胞癌株の感受性実験を進めている。BRAF遺伝子増幅についてはキアゲン社のキットを用いたリアルタイムPCR法を用いたコピー数の同定も行い、FISH法との比較検討を行っていく予定である。現在BRAF遺伝子変異について、腫瘍内でのheterogeneityを認めたため、パラフィン切片を用いてレーザーマイクロダイセクションによって肺癌の様々な部位、コンポーネントの腫瘍部分からgenomic DNAを抽出し、CASR-PCRという方法を用いてそれぞれの部分のBRAF V600E遺伝子変異率計算を進めている。FISHの結果との比較検討も行う予定である。現在年間7万5千人が肺癌で死亡している。遺伝子解析技術の進歩に伴い、RET融合、BRAF遺伝子変異などの希少肺癌が近い将来いとも簡単に同定されることが目標である。今後、効果予測や副作用予測のバイオマーカーが確立され、安全でより効率的な分子標的治療が行われることが期待されている。また現在、肺癌EGFRチロシンキナーゼ阻害剤耐性変異であるT790M変異をCAST-PCR法で同定する試みを検討している。日本では遺伝子診断ネットワーク(LC-SCRUM-Japan)が構築されRET転座のような、12%の頻度の希少肺癌であっても実際にスクリーニングが可能であることが証明された意義は大きい。RET遺伝子の切断点を隔てて2つのプローブをおいておき、これらが切断されてほかの遺伝子と融合することを検出する方法(break-apart assay)を主に用いてきた。NTRK1転座はアメリカ、韓国、日本の共同研究にて同定したが、今のところ日本人検体からの転座は検出されておらず、ポジティブコントロールが存在しないため、FISHによる検討に進めなかった。BRAF
グラフ近似アルゴリズムの実装と評価

本プロジェクトでは、我々は主に以下に示すの3つの近似アルゴリズムの実装および評価を行い,以下の結論を得た:・U.Feigeにより発案されたvolume respecting embeddings(VRE)法を用いた,バンド幅縮小化問題に対する近似アルゴリズムを実装し,その実験的評価を行った.その結果,一般的なグラフに関してはVRE法はGPSアルゴリズム(Cuthill-Mckee法)より劣るが、伸長完全二部グラフなどのいくつかの特別なグラフクラスに対しては、VRE法の方がかなり良い結果を出力した.・幾つかのマトロイド被覆問題に対し,我々が提案した近似および発見的アルゴリズムを実装した.cographicマトロイドに関しては,我々の提案したアルゴリズムは自然な貪欲アルゴリズムとほぼ同程度かそれより若干良い精度を実現している。しかしながら,graphicとtransversalマトロイド被覆問題に関しては,解の精度の点で我々のアルゴリズムは貪欲アルゴリズムよりも劣っている。しかし我々のアルゴリズムは,厳密アルゴリズムと比べ,実装が容易と言える.・入力グラフをd-claw freeグラフに制限した重み付最大独立点集合問題に対して,幾つかの貪欲アルゴリズムおよびV.Bafna等によるSizeTwoImp, B.Chandrat等によるBestImp, P.BermanによるSquareImpを実装し評価を行った.実験により、SizeTwoImp, BestImp,およびSquareImpが妥当な時間で貪欲アルゴリズムより良い解を出力することが確認できた。本研究による副産物として幾つかの理論上の結果も得られた:"vertex boundary-width"と"path distance-width"と呼ばれるグラフパラメータに対する下界を得た.vertex boundary-widthは常にバンド幅の下界を与え,path distance-widthはバンド幅に深く関連するグラフパラメータである.さらに我々は単位格子交差グラフ,k-chordalグラフに対する最長誘導パスやtree-lengthに関する理論上の結果も得た.これらの結果は間接的に本研究プロジェクトに関係している.本プロジェクトでは、我々は主に以下に示すの3つの近似アルゴリズムの実装および評価を行い,以下の結論を得た:・U.Feigeにより発案されたvolume respecting embeddings(VRE)法を用いた,バンド幅縮小化問題に対する近似アルゴリズムを実装し,その実験的評価を行った.その結果,一般的なグラフに関してはVRE法はGPSアルゴリズム(Cuthill-Mckee法)より劣るが、伸長完全二部グラフなどのいくつかの特別なグラフクラスに対しては、VRE法の方がかなり良い結果を出力した.・幾つかのマトロイド被覆問題に対し,我々が提案した近似および発見的アルゴリズムを実装した.cographicマトロイドに関しては,我々の提案したアルゴリズムは自然な貪欲アルゴリズムとほぼ同程度かそれより若干良い精度を実現している。本研究による副産物として幾つかの理論上の結果も得られた:"vertex boundary-width"と"path distance-width"と呼ばれるグラフパラメータに対する下界を得た.vertex boundary-widthは常にバンド幅の下界を与え,path distance-widthはバンド幅に深く関連するグラフパラメータである.さらに我々は単位格子交差グラフ,k-chordalグラフに対する最長誘導パスやtree-lengthに関する理論上の結果も得た.これらの結果は間接的に本研究プロジェクトに関係している.本年度の研究によって得られた成果VRE法とは、グラフを一度高次元空間に埋め込み、その後低次元空間にランダムに射影するという方法で、バンド幅縮小化問題、VLSIレイアウト問題などへの応用が期待できる。特に、VRE法を用いることでバンド幅縮小化問題に対する確率的な近似アルゴリズムが設計できる。本研究では、既に実装したVRE法によるバンド幅縮小化問題に対する近似アルゴリズムを用いて、様々なグラフクラスに対し実験を行い、その有用性の検証を行っている。特に本年度では、高次元空間に埋め込む際のその次元数についての検証を行った。処理時間の短縮にはなるべく低い次元数が望ましいことが今までの実験結果からわかっていたが、適切なその設定基準についてはわかっていない。本研究を通じて得られた成果は以下の3点である:(1)次元が必要以上に高すぎると解の精度が落ちる(2)次元数の設定はグラフのサイズのみに依存するのではなく、グラフの構造(複雑度)にも(おそらく強く)依存すると予想される(3)適切に次元数を設定すれば、従来あるアルゴリズムと比較して、解の精度はやや劣るものの処理速度はやや勝り、グラフのサイズが大きくなるにつれ、解の精度の差は縮まり処理時間の差は開くと予想される今後は次元数のチューニングに関する研究も必要と考える。2.行列マトロイド被覆問題に対する近似アルゴリズムについてマトロイド被覆問題は様々な応用を持ち、(理論的には)多項式時間で処理できることが知られている。しかしながら、実用的な意味では処理時間が高速であるとはいえない。本研究では、行列マトロイドでの被覆問題に対し、最適解の出力を犠牲にし処理の高速化を図った近似アルゴリズムを提案した。本年度の研究によって得られた成果1.マトロイド被覆問題に対する近似アルゴリズムについてマトロイド被覆問題は多項式時間で解けることが知られているが、実用上処理時間が短いとはいえない。また対象とするマトロイドによっては、実装も容易ではない。このため、最適解であることの保障を犠牲にする替わりに、実用的な意味での短い処理時間及び容易な実装が可能となるアルゴリズムを開発することは重要である。

本年度は、昨年度考案したマトロイド被覆問題に対するアルゴリズムを実際に実装し、実験的評価を行った。具体的には、graphic、cographic、gammoidの3つのマトロイドに対し、処理時間が短く実装も容易なアルゴリズム(graphicマトロイドに対しては近似アルゴリズム)を実装し、実験的評価を行った。今回我々が提案したcographicマトロイドに対するアルゴリズムは、入力が平面グラフならば2倍の近似率を保障するが、一般のグラフに対しては保障されない。実験から得られた結果として、我々の提案するアルゴリズムは、単に最大独立集合を貪欲的に被覆していく方法と比べると、若干ではあるが良い値を出すことが判明した。今回提案したgammoidに対するアルゴリズムに関しては、実装は容易ではあるものの、解の精度はあまり良くないことが明らかになった。d-claw freeグラフ上の重み付き最大独立点集合問題に対する近似アルゴリズムとして、V.Bafna等によるSizeTwoImp、Chandra等によるBestImp、BermanによるSquareImpなどが知られている。今回我々は上記3つの近似アルゴリズムの実装及び実験的評価を行った。実験では特に上記3つのアルゴリズムと幾つかの貪欲的アルゴリズムとの比較を試みた。結果として上記3つのアルゴリズムとも、予想通り処理時間では貪欲的アルゴリズムには到底及ばなかったものの、実用的な時間内で貪欲アルゴリズムよりも良い解を出力することがわかった。テストデータとしては、ランダムに生成したUnit SquareグラフやUnit diskグラフ等を用いた。本年度の研究によって得られた成果1.Tree-lengthとBranch-lengthの関係Tree-lengthとはtree-widthと呼ばれる良く知られたグラフパラメータと関係するグラフパラメータで、グラフのchordalityやspannerと関係することが知られている。Tree-lengthとtree-widthはともにtree-decompositionと呼ばれるグラフの構造に着目することで定義されるパラメータである。
イメージング・プレートX線回折計を活用した迅速な蛋白質立体構造決定システム

イメージングプレートを利用したX線回折計として、本研究の申請書に記載した実験室内の系(理学電機(株)製のR-AXISIIcを使用)と、高エネルギー研フォトン・ファクトリーのワイセンベルグ・カメラを使用した系の双方に関し、迅速な蛋白質立体構造決定システムの確立に努めた。その結果、二つの系のいずれかについても、極めて高性能のシステムを開発することに成功し、いくつかの蛋白質の構造の解明、又は精密化に成功した。以下項目に分けて述べる。1)実験室内のイメージング・プレートX線回折計の整備。平成3年度購入の『イメージング・プレートX線回折計用ゴニオメーター部』と、平成4年度購入の『イメージング・プレートX線回折計用マイコンシステム』を既有の部分と組み合せ、Ethernet網で既有のコンピューター・グラフィックス装置と接続した。2)高エネルギー研のワイセンベルグ・カメラで収集したX線回折データを、当研究室の既有のコンピューター・グラフィックス装置に入力して、構造解析を行うルートを確立した。3)上記の1)及び2)の設備により以下の蛋白質の結晶構造解析に成功した(かっこ内は適用した方法論を示す):インターフェロン-β及びリボヌクレアーゼRh(重原子同型置換法による新規の構造解析);SSI-トリプシン複合体(分子置換法による構造解析);人工変異SSIとサブチリシンとの複合体(差フーリエ法による構造解析);SSI-サブチリシン複合体(高分解能での構造精密化)。1)システムの構築1-1)今回申請のイメ-ジング・プレ-トX線回析計ゴニオメ-タ-を購入し、これをメ-カ-よりの借用による制御部と接続した。1-2)2-1)で調製したSSI結晶を使って、上記のシステムのハ-ドウェアの試験を行った。具体的には、今回のシステムで収集したX線回析強度デ-タと、従来の回析計によるデ-タとを比較検討した。1-3)分子置換法の根幹をなす回転関数法および並進関数法のソフトウェア-を原著者より導入し、これらを東大・大型センタ-のス-パ-コンピュ-タ-に適応させた。1-4)研究分担者(味の素、中研)の所有するダブル・ミラ-入射光学系について、共同で調整、試運転を行った。2)生化学的準備2-1)分子量2万の蛋白性プロテア-ゼ・インヒビタ-SSIについて種々の遺伝子工学的改変を施した試料を調製し、これらを結晶化した(SSI結晶)。次にSSIの標的プロテア-ゼであるSubtilisnと種々のSSIとの複合体を作り結晶化した。2-2)更に純然たる装置試験用の結晶として、新たに市販のサ-モライシンを購入し、その結晶化を行った。六方晶系の極めて分解能の高い結晶を得、これが従来報告されたものと同一であることを確認した。本年度購入の『イメージング・プレートX線回折計用マイコンシステム』を、既有の部分と組み合せ、Ethernet方式で既有のコンピューター・グラフィックス装置と接続した。2)イメージング・プレートX線回折計の性能評価。上記の1)のシステムにより、リボヌクレアーゼAの新型三方晶からのX線回折データを収集し、分子置換法による構造精密化を行ったところ、十分に高精度の結果が得られた。次に、レ-アスパラギナーゼの結晶を用い、データ収集を行った後、これを、約10年前に4軸自動回折計で集めたデータと比較したところ、両者の間の相対誤差が5%以下となり、驚くべき一致を示した。これらの事実より、上記の1)で開発したシステムから得られるデータは、a)十分に低いランダム・エラーのレベルを持ち、かつ6)何らの深刻な系統誤差をも含まないことが証明されたことになる。3)上記の1)のシステムにより、以下の蛋白質の結晶構造解析に成功した(かっこ内は、適用した方法論を示す):インターフェロン-β(重原子同型置換法による新規の構造解析);SSI-