hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モジュール3Dキーノートを用いたゲノム機能予測法の開発

全ゲノム配列が発表されている生物種は、100種を越えた。生体で機能している高分子は大部分がタンパク質であるため、集積されたゲノム配列にどのような機能を持ったタンパク質があるかを知る必要がある。しかし、ゲノム配列からタンパク質の機能を推定する方法はまだ確立していない。ゲノムにあるORFの約半数は機能が推定できていない。申請者は立体構造が類似であり、機能部位の詳細な構造が類似のリン酸基結合モジュールを、まったく異なる転写因子およびDNA重合修復酵素に見いだしてきた(K.Yura, et al. 1999a)。これらのモジュールのアミノ酸配列には明らかな類似性はないが、立体構造および機能部位が類似していることより、何らかの類似性が配列にあることが期待され、立体構造形成および機能に重要な残基に注目することで、アミノ酸配列のパターンを見いだし3Dキーノートと命名した(Yura, et al. 1999b)。本研究課題では、ゲノム配列中のORFから各種の3Dキーノートと一致する部位を見つける方法を確立することで、ORFの機能推定を行う手法を開発した。平成13年度までに3Dキーノートの作成方法がほぼ確立したのを受けて、平成14年度では、3Dキーノート作成方法の自動化をほぼ確立し、ゲノム配列決定が終了している全ゲノム配列に対して、約200種類の3Dキーノートを適用することができた。それらの予測結果を容易に検索できるようにするためのデータベースを構築し、研究室内において試験運用を開始することができた。また3Dキーノートによる予測結果がどの程度正しいかを実験的に検証するために、シアノバクテリアの実験家に予測結果を提示し、実証実験を開始することができた。現在までに実験結果を予測方法に還元することまでは至っていないが、実験と理論のよい組み合わせを形成することはできた。全ゲノム配列が発表されている生物種はついに60を越えた。生体で機能している高分子は大部分がタンパク質であるため、集積された塩基配列にどのような機能を持ったタンパク質があるかを知る必要がある。申請者らはラン藻のゲノムにコードされているある一つのORFの機能予測を、モジュール3Dキーノートの方法と他の方法を組み合わせることで成功した。モジュール3Dキーノートとは、立体構造及び機能部位が類似であるモジュールから抽出したアミノ酸配列ペアーのパターンである。これを受けて本研究課題では、モジュール3Dキーノートの方法の一般化と自動化を目指している。本年度はProtein Date・Bank(PDB)からタンパク質と基質や補酵素などの相互作用部位を自動抽出し、各種の機能のモジュール3Dキーノートの自動作成方法の確立を試みた。その結果、約200種類のモジュール3Dキーノートを作成することに成功した。40%はATPなどの核酸関連のモジュール3Dキーノート、30%は金属イオンのモジュール3Dキーノート、10%はヘムのモジュール3Dキーノートであった。新規のモジュール3Dキーノートを作成すると同時に、それらの予測精度を評価した。機能が詳細にわかっているタンパク質に対してモジュール3Dキーノートを適用し、どの程度わかっている機能を予測できるかを調べることで、3Dキーノートの予測精度を評価することができる。その結果、新規にできたモジュール3Dキーノートは平均約85%の精度を持つことがわかった。これらのモジュール3Dキーノートをラン藻全ゲノムに適用したところ、機能未知ORFの約12%に機能を推定する手がかりを与えることができた。来年度はモジュール3Dキーノートのデータベース化を実行する。
『西遊記』の総合的研究ー朝鮮朝・琉球国の受容及び研究資料の蒐集を中心にー

朝鮮国において,『西遊記』の受容は高麗朝から明暸な足跡を辿ることができる。〈朴通事〉に見える元本「西遊記」はその好例であろう。朝鮮朝では,明国との交流から戯曲・小説が多数もたらされた。明末(光海君時代)の朝鮮文人・許〓は,明刊本西遊記を読み,娯楽に適すると述べた。しかし,いかなる版本かは明示されなかった。ところが,最近発見した瓢箪〓蔵李卓吾先生批評西遊記は,朝鮮朝の文人・朴淳益の旧蔵で,しかも清刊本西遊記の第九回を鈔補することから見て,明末には,朝鮮には明刻(清初印?)『李卓吾先生批評西遊記』が入り,ついで清初には『西遊真詮』等が将来されたことが判明する。明末から清代にかけて,朝鮮では中国小説の影響を受け,翻案小説・ハングル訳小説が陸統と編撰された。『西遊記』も一部ハングル訳を受け,「唐太宗伝」という名称で刊刻され,数種の版本が現在残る。朝鮮の人々には,当時の中国語が難解であるため,小説読書用に,〈水滸伝語録解〉〈西遊記語録解〉(ソウル大学校本)なども編集された。一方,『西遊記』の浸透によって,『青丘永言』・『歌曲源流』などの民間曲辞にも,孫悟空や唐三蔵を詠みこんだ歌辞が作られ,人口に膾炙した。朝鮮国とは別に,琉球国にも江戸後期ごろ『西遊記』が伝来したらしく,那覇などに〈三蔵取経〉の民間説話が口伝で伝えられている。しかし,つい最近の発見であって,今後,更に内容を検討する必要がある。中国では,南通市において僮子戯という地方劇の中に『西遊記』がとりこまれ,〈神書〉という名で巫術と結合した形で,その地の住人に受容されている。ロンドンの大英博物館にある年画〈五庄観〉も,清代の『西遊記』が民間で絵物語として広まっていた,一つの例証と言うことが出来よう。
金属ナノ粒子積層電極の電気化学的修飾とその(光)電極触媒活性

本年度は、種々のポリマーを鋳型とする白金または金ナノ粒子を電極表面に固定するための最適な組み合わせを明らかにすることに注力した。具体的には、ポリアクリル酸(PAA)のようなポリアニオンを鋳型として調製した白金ナノ粒子、ポリエチレンイミン(PEI)のようなポリカチオンを鋳型として調製した白金ナノ粒子、ならびにポリビニルピロリドン(PVP)に代表される中性のポリマーを鋳型とする白金ナノ粒子および金ナノ粒子を、対応するポリマーとの交互積層を行った。白金ナノ粒子を交互積層した場合には、電気化学測定により、積層数に対する水素吸脱着波の変化から、担持できた白金量を見積もるとともに、酸素還元活性を評価した。一方、金ナノ粒子の場合には、透明基板を用いて、吸光度変化から積層量を評価した。いずれの場合も、10層目あたりから、積層回数と実際の積層量との相関が線形からずれ、表面が次第にラフネスを増大させていくことがわかった。ただし、その度合いには対ポリマーの分子量や構造、親・疎水性にかなり影響を受けることもわかった。また、基板の種類に応じて、前処理を行うことが、安定した積層を行う上で、有用であることもわかってきた。以上の結果については、より系統的な研究の必要性がある。一方、さらに実際の電極触媒研究と関連づけるために、白金ナノ粒子を担持した触媒粒子の表面をポリマーで処理し、その表面電荷を利用して、サブミクロンスケールの粒子も交互積層法により電極基板表面に固定できることも明らかにしつつある。今年度は、ポリビニルピロリドン(PVP)を鋳型として塩化金酸をアルコールによる化学的還元することにより金ナノ粒子を調製した。透過型電子顕微鏡(TEM)およびレーザー弾性散乱によりその平均粒径を評価したところ、約45nm程度であることがわかった。さらに、還元時間により粒子の形状が変化することも紫外-可視吸収スペクトル上に現れるピーク形状の変化から明らかになった。これについては現在、詳細なプロファイリングを行っている。このようにして調製したPVP被覆金ナノ粒子を以下の手順で電極基板上に積層した。まず、ポリアクリル酸(PAA)を含む水溶液に洗浄済みのITO電極を浸漬し、一定時間保持した後に引き上げてミリQ水で洗浄する。次にITO電極基板をPVP被覆金ナノ粒子水溶液に一定時間浸漬し、引き上げ後ミリQ水で洗浄を行う。この手法により、PAAと金ナノ粒子周囲のPVPとの間に水素結合が形成され、金ナノ粒子の単層修飾が行われることが報告されている。上記交互浸漬を繰り返すことにより金ナノ粒子の吸着層を積層することが可能であり、実際、積層回数とともにITO電極透過UV-VISスペクトル上の金プラズモンバンドの吸光度が増大することからも確認できた。しかし、プラズモンバンドの増大については5層積層で停止し、これ以上の積層は確認できなかった。現在、IRスペクトルからその原因を探っている。さらに、調製した金ナノ粒子被覆ITO電極に触媒活性を賦与するため、金ナノ粒子表面に異種金属を積層する試みを行った。従来、チオール修飾された金ナノ粒子は表面がチオールで被覆され、反応サイトがほとんど無いが、PVP被覆の場合は、ポリマーとの緩い相互作用のため、異種金属の析出も容易にできる。そこで、最初の段階として、積層電極の電位を硫酸銅溶液中で走査し、銅析出を試みた。その結果、銅のアンダーポテンシャル析出が、観測され、PVP被覆金電極の電気化学的修飾が非常に容易であり、新しいナノ構造を有する電極触媒への展開が期待できることが明らかになった。
子どもの虐待防止における非政府組織(NGO)の役割に関する国際比較調査研究

本研究の目的は児童虐待防止に関与する海外の非政府組織(NGOと)と、その行政機関(GO)との連携に関する実態を把握・分析し、その結果をもとに日本の現状と照らし合わせながら、日本の子どもの虐待防止関連NGOの今後の課題と方向性を検討することにあった。そのため3年間にわたる本研究では第1に資料収集ならびに文献研究を行い、第2に、児童虐待防止先進国である米国・英国、そして英国の影響を受けて早くから虐待防止に努めている香港で、第1次・第2次・第3次予防を担っている代表的組織(38件のNGO・22件のGO)を訪問し、その背景・活動状況・職員構成/財政・行政機関との連携・ボランティアリズムと専門性などについて聞き取りり調査を行った。また第3に、世界各国(N=54)におけるNGOによる児童虐待防止活動の一般的傾向を明らかにするため、質問調査を実施した。これらの調査の結果、(1)文化・歴史・地域性・法的背景の相違に関わらず、各NGOは第1・第2・第3予防のうち2つ以上の分野で自らの秀でた専門性を発揮し、それぞれの子どもと家族のニーズに合った個別のサービスを提供していること、(2)虐待防止先進国の場合、「NGOとGOのパートナーシップ」は我が国のそれとは異なり、NGOはGOから相当な額の補助金を受理した上で、その契約に基づいた委託事業を行っていること、(3)GOは、効果測定の結果でサービス提供の成果があったNGOのみと契約の更新をする傾向にあること、(4)例外はあるものの、概してどの国の児童保護システムをみても、措置権を持つGOが虐待ケースの調査/介入を担っており、NGOはGOによるケースマネジメントのもとに、調査/介入以外の分野でサービス提供を行っていること、などが明らかになった。本研究の最後に日本の児童虐待防止関連政策に関して、(1)国・都道府県・市町村レベルでの補金を伴ったNGOとのパートナーシップの再構築、(2)学校基盤型の第1次予防の強化、などを盛り込んだ提言を行った。3年間プロジェクトの1年目として、香港における虐待防止関連非政府組織(NGO)の役割に関する情報収集ならびに聞き取り調査(対象機関:防止虐待児童会、ユナイテッドクリスチャン、ホスピタル、カリタス、ファミリーサービス、社会福祉局/家庭児童保護サービスユニット、香港理工大学応用社会科学部、矯正サービス局)を実施した。香港は1997年に独自の自治権を持つ「中華人民共和国香港特別行政区」として中国に返還されたが、現在でも欧米型、特に英国のソーシャルワークを基盤とした児童保護サービスが提供されている。香港には多種多様の児童虐待防止関連民間団体があり、それらの多くは20年以上の長い歴史を持っている。香港の民間団体は児童虐待防止の4分野である予防・調査・介入・治療の全分野において行政と下請け契約を結び国の補助金を受理し、行政との連携を効果的にとりながら活躍している。香港の主な特色として第1に、1つ既存する民間団体が児童虐待通告の調査および軽度から中度の虐待ケースの介入を行なっている点があげられる。ただし民間団体は被虐待児を家庭外に措置する権限を持っていないため、あくまで通告対象家族の同意を得たうえでのサービス提供を実施している。第2の特色として、香港の各民間団体の専門性が高い評価を得ていることがあげられる。例えぱ「児童虐待予防」分野では、民間団体による家庭訪問、ドロップインサービスなど、「治療プログラム」では経験豊かなソーシャルワーカーによるカウンセリング、グループワーク実施などが実施されている。

第3に香港では、重度の身体的虐待や性的虐待対象の多職種チームによるケースカンファレンスに、行政機関(社会福祉局・警察)とともに、民間団体(病院も含む)のスタッフが必ず参加してケースの処遇判定を行なうシステムが完備されていることが特色である。これらの情報を元に今後の日本の民間団体の役割を検討した。3年にわたる本研究の第2年目の本年度は第1に、本年度実施のアメリカにおける児童虐待防止非政府組織(NGO)ならびにその関連政府組織(GO)等を対象とする聞き取り調査の準備として関連資料の収集にあたった。第2に、アメリカ聞き取り調査を実施した。NGOとGOの連携状況に関する聞き取り調査の実施地はワシントンDC、メリーランド州、ノースカロライナ州、フロリダ州、ニュージャージー州、ワシントン州、カリフォルニア州であった。アメリカの児童虐待防止活動におけるNGOの活動の最も大きな特徴として、児童虐待の調査・子どもの家庭外措置を含む要養護児童の処遇の計画ならびにその実施の任務を持つ全ての児童保護局は主に、子どものパーマネンシープランニングに関するケースマネジメントに携わり、児童虐待第一次・第二次・第3次予防活動の殆どを、契約を交わしたNGOの諸機関に任せていることがあげられる。これは日本の介護福祉分野のケアマネジメントのシステムと類似すると言っても過言ではない。このようにアメリカのNGOはGOの補助的役割をする立場とは程遠く、児童虐待予防の確固たる中枢専門機関としての責任を担っている。また、各NGO活動は毎年厳密に評価され、成果をあげているNGOのみが次年度のGOとの契約を交わすことが可能になる。ゆえに、その競争世界で生存するためにも、子どもと家族へ提供するサービスの質の向上を目標に、スタッフの研修・効果測定等に相当力を入れていることが聞き取り調査の結果に現れた。特に、今回の聞き取り調査の対象となったアニーケーシー財団、法人ペアレントアナニマス(匿名の親)、ナショナルエクスチェンジ財団等は、全国に支部を置いて児童虐待防止活動に貢献する大規模な事業を行っている。最後に本研究第2年目として、ISPCAN(世界児童虐待防止学術研究会)会員の中から抽出した全世界のNGOおよびGOを対象に質問紙調査を実施した。回収率が低かったこともあり、第3年度の研究では、今年度の質問紙調査のフォローアップが必要である。3年にわたる本研究の第3年目の本年度では第1に、イギリスにおける児童虐待防止非政府組織(NGO)ならびにその関連政府組織(GO)を対象とする聞き取り調査を実施した。その内訳は民間機関15件、行政機関8件であったが、3年間全聞き取り調査対象(米国・香港・イギリス)の総合計としては民間機関42件、行政機関21件に至った。聞き取り調査結果として、(1)イギリスでは現在、ビクトリア・クリンビエ虐待死亡事件をきっかけに法律・ガイドラインを改正することにより地域、特に教育機関との連携強化に努めていること、(2)米国と比べて、イギリスにおける虐待防止活動の民間委託の割合は低いものであり、行政中心の活動が中心であること、(3)米国・日本では見られない点として、イギリスでは香港と同様に、限られたケース対象ではあるが、一民間機関(NSPCC)に虐待調査の権限を与えていること、などがあげられる。第2に、平成14年度の質問紙調査結果を解析し、各国のNGOの活動状況を比較検討した。
抗HIVペプチド、アクチノヒビンの大腸菌による生産と抗HIV活性必須領域の解析

放線菌が生産する抗HIVペプチドactinohivin(AH)の構造と活性の関係を明らかにし、新しい低分子抗HIV薬創製の基盤を得ることを目的として本研究を実施し、以下の結果を得た。。AH生産菌よりクローン化されたAH遺伝子を大腸菌発現ベクターpET30Xa/LICとin frameで連結してAH発現プラスミドを構築した。このプラスミドで形質転換した大腸菌BL21(DE3)plysSは約20mg/Lの組換えAH融合蛋白質を生産した。次に、組換えAHの精製法を検討し、組換えAH融合蛋白質をNiキレートカラムおよび逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した後、プロテアーゼfactor Xaで消化して組換えAHを切り出し、これを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する方法を確立した。この方法で得られた組換えAHは放線菌由来AHと同等の合胞体形成阻害活性を示した。AHは分子内に互いにきわめて相同性の高い3つのセグメントで構成されている。そこで1ないしは2つのセグメントで構成される6種類の欠失変異体を作成して合胞体形成阻害活性を調べたところ、いずれの欠失体もAHに比べて著しく活性が低下した。この結果より、AHの合胞体形成阻害活性には3つのセグメントが必須であると考えられた。一方、セグメント2にある2ヶ所のシステイン残基をセリン残基に置換した変異体はAHと同等の阻害活性を示したことから、システイン残基はAHの活性には影響しないものと考えられた。AHはその構造の特徴からcarbohydrate binding modulefamily13に属すたんぱく質であると考えられる。また、AHはHIV表面蛋白質gp120の糖鎖を認識していることが明らかとなった(未発表)。今後、AHとgp120の相互作用に関与するアミノ酸残基を同定し、両分子の結合様式を明らかにされることが期待される。。放線菌が生産する抗HIV活性を有する蛋白質actinohivin(AH)の分子構造と活性の関係の解明とその成果に基づいた新しい低分子抗HIV薬創製の為の基盤研究を実施し、本年度下記の結果を得た。1.AH生産菌よりクローニングしたAH遺伝子を鋳型としてPCR法でAH構造遺伝子を増幅し、これを大腸菌発現ベクターpET30Xa/LICのクローニング部位とin frameで連結してAH発現プラスミドpET30Xa/LIC::AHを構築した。2.このプラスミドで大腸菌BL21plysS(DE3)を形質転換し、得られた組み換え体をIPTGで発現誘導したところ、約20mg/Lの組み換え融合AHが生産された。3.組み換えAHの精製法を検討し、大腸菌の粗抽出液をNiキレートカラムおよび逆相シリカゲルカラムを用いたクロマトグラフィーで組み換え融合AHを精製した後、プロテアーゼファクターXaで消化して組み換えAHを分離し、これを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する方法を確立した。4.この方法で得られた組み換えAHは放線菌より得られたAHと同等のシンシチウム形成阻害活性を示した。5.組み換えAHを簡便な方法で分離・精製するために大腸菌のシグナルペプチド配列を利用した組み換えAH分泌発現系を大腸菌分泌発現ベクターpET26を用いて構築した。組み換えAHの大腸菌による生産および精製方法が確立されたので、次にAHの種々の欠失変異体を大腸菌で作成しそれらの抗HIV活性を評価し、AHの抗HIV活性必須領域を明らかにする。

昨年度に引き続き、放線菌が生産する抗HIV蛋白質actinohivin(AH)の分子構造と活性との関係を解明し、新しい低分子抗HIV薬の創製のための基盤研究を実施し、本年度下記の成果を得た。昨年度確立した組換えAHの大腸菌による生産およびアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いた精製方法を改良し、大腸菌ペリプラズム画分にAHを蓄積させる方法を検討した。すなわち、AH遺伝子PelBシグナルペプチドの下流にin frameで連結したAH発現ベクターを構築した。大腸菌BL21で生産された組換えAHはペリプラズム画分に検出されたがその分子量は放線菌由来のAHより小さかった。今回構築した発現系で生産されたAH前駆体はシグナルペプチダーゼ認識部位とは異なったところでプロセッシングされているものと考えられた。AHは分子内に互いにきわめて相同性の高い3つのセグメントで構成されている。そこで1ないしは2つのセグメントで構成される6種類の欠失変異体を作成して合胞体形成阻害活性を調べたところ、いずれの欠失体もAHに比べて著しく活性が低下した。この結果より、AHの合胞体形成阻害活性には3つのセグメントが必須であると考えられた。一方、セグメント2にある2ヶ所のシステイン残基をセリン残基に置換した変異体はAHと同等の阻害活性を示したことから、システイン残基はAHの活性には影響しないものと考えられた。AHはその構造の特徴からcarbohydrate binding modulefamily13に属すたんぱく質であると考えられる。また、AHはHIV表面蛋白質gp120の糖鎖を認識していることが明らかとなった(未発表)。今後、AHとgp120の相互作用に関与するアミノ酸残基を同定し、両分子の結合様式を明らかにされることが期待される。
IL-6阻害物質マジンドリン類の合成及び受容体密度認識化合物への応用

本年度は、IL-6活性阻害物質マジンドリンAのルートの短縮化を行うと共に、新たに新反応を開発した。まず、著者が開発した新規不斉4級炭素構築法、即ち不斉補助基を持つα,β-不飽和イミドに対して塩基を作用させてγ位のプロトンを引き抜き、求電子剤とα位で反応させて不斉4級炭素とする方法の最適化及び一般性を検証した。また、生成する不斉4級炭素の絶対立体配置を決定した。この途上、4級炭素を持つ抗てんかん薬エトスクシミドが高収率及び高立体選択的に合成できることを示した。次に著者は、前年度発見したケテンアミナールのルイス酸による1,3-転位反応について、更に条件検討を行った。その結果、溶媒としてトルエンを用いた場合は1,3-転位反応が主に進行するが、ジクロロメタンを用いた場合には1,5-転位反応が収率良く進行することを見出した。加えて著者は、不斉補助基を有するケトジエンN,O-シリルアセタールを用いたビニロガス向山アルドール反応により遠隔不斉誘導〈1,7-及び1,6,7-遠隔不斉誘導〉が高立体選択的に起こることを発見した。これにより、我々独自の方法でマジンドリン類のフロインドリン部分を高立体選択的に合成した。本年度は、IL-6活性阻害物質マジンドリンAの全合成研究の途上見つけた知見についてさらに検討を行うと共に、新たに新反応を開発した。加えてマジンドリンAの全合成ルートの効率化を行った。すでに申請者は、中間体であるエノラートイオンをシリル化により捕捉し、エノラートの立体化学が単一であることを解明しているが、本年度はこのα,β-不飽和イミド由来のエノラートに対して様々な求電子剤を反応させ、不斉4級炭素が高立体選択性かつ好収率で構築できることを示した。次に著者はこのエノラートが0-アルキル化されたケテンアミナールのルイス酸による1,3-転位反応を実現した。ケテンアミナールはその反応性がほとんど知られていないため、この反応は全く新しいタイプの反応であるのみならずケテンアミナールの官能基としての利用法開発の発端となるものである。この反応により、先の塩基によるアルキル化とは逆の立体化学を持つ不斉4級炭素を極めて高い選択性で構築した。加えて著者は、マジンドリンA全合成ルートの短縮化を行うとともに各ステップの収率を向上し、実用的なマジンドリンAの全合成ルートを確立した。
希土類金属分子を用いる新分子変換反応

本重点研究の最終年度にあたる本年度は希土類金属アリル及びアレニル錯体の新規合成及びその求電子剤との反応について研究し,次の成果を得ることができた。1.サマリウム(III)η^3-アリル錯体の合成及び反応サマロセン(C_5Me_5)_nSm(thf)n(n=0or2)を0.5当量のアリリックベンジルエーテルと室温で反応させると、C-O結合が切断され,π-アリルSm錯体(C_5Me_5)_2Sm(η^3-allyl)がアルコキシ錯体C^*_P_2SmOBnと共に高収率で生成することを見いだした。次に、このようにしてin situに合成したπ-アリル錯体にシクロヘキサノンを反応させるとanti体のホモアリルアルコールが優先して得られ,反応がジアステレオ選択的に進行することが明らかになった。また,トリメチルアセトアルデヒドの反応ではanti体のみが得られた。一方,ジメチルフェニルシリルクロリドとの反応では,π-アリルSm錯体の置換基の少ないアリル炭素で選択的に反応が起こり,相当するアリルシランを与えるという興味ある結果が得られた。2.サマリウム(III)η^3-アレニル錯体の合成及び反応さらに,サマロセンC^*_P_2Smをプロパルギルエーテルと反応させるとアレニル錯体C^*_P_2-Sm(η′^3-allenic)がC^*_P_2SmOBnと共に生成することを見いだした。次に,これらのアレニル錯体とシクロヘキサノン及びジメチルシリルクロリドの反応を検討した結果,1級エーテルより合成したアレニル錯体は,シクロヘキサノンの反応の場合はアレニルアルコールを主生成物として与えるが,2級及び3級エーテルより合成したアレニル錯体はともにプロパルギル体を与え,反応の位置選択性は,求電子剤の性質よりは,出発エーテルの種類によって決まることが明らかになった。
B中間子崩壊におけるCP非保存の研究

BELLE検出器のシリコンバーテックス検出器のセンサー部分を組み立て、実験装置に組み込んで実験を開始した。この検出器は予定通りの性能を発揮し、現在もBELLE実験の重要なデータを提供している。一方、現在使用している3層で多分割されたシリコン検出器による粒子検出において、低い運動量の粒子の検出効率の改善の余地があることが判明した。そこで、現在、シリコン検出器を5層の構造にし、低い運動量の粒子の検出効率を著しく向上するべく改善案を検討している。この改善案では、クラコウグループは他の研究グループと共同で、信号読み出し系統の抜本的改善案を担当し、平成13年中には試作器を作り、平成14年夏以前に新しい高速読み出しシステムを完成させる計画である。物理解析の面では、B中間子のφK崩壊過程を世界で最初に観測することに成功した。この崩壊は、ペンギングラフを通してのみ可能なプロセスであり、B中間子崩壊研究の新しいページを開く可能性のある研究である。近い将来物理専門誌に結果を投稿する予定である。平成10年度は、BELLE検出器のシリコンバーテックス検出器のセンサー部分の製作と組み立てに多くの時間を割かなければならなかったので、FADCの回路製作は、ほとんどクラカウ側に頼ることになった。前年度に始まったFADCの基本設計を全年度内に完了し、モジュールの部品を年度当初には、クラカウにすべて納めることができた。128枚のシリコン検出器を読み出すのに必要なすべてのモジュールの製作を6月中に完了し、調整の後に9月には、KEKにこれらが納品された。引き続き、組み上げられたシリコン検出器の信号線をKEK筑波実験室にてFADCモジュールに接合し、11月には、宇宙線の飛跡を読み出すことに成功した。12月に、シリコン検出器をBELLE測定装置に組み込み、平成11年1月には、中心飛跡検出器で観測された宇宙線の飛跡とのマッチングに成功した。一方、3層で多分割されたシリコン検出器板の間の相対位置を正確に求めるために、ソフトウエアーの開発が平行して行われた。これは、宇宙線がシリコン検出器に残した信号を使って行われた。現在までに、飛跡を約50ミクロンにの精度で決定できるまでに調整が進んでいる。平成11年度当初に予定されている、ビーム衝突によるB中間子崩壊実験が可能な状態になっている。平成11年度は、BELLE検出器のシリコンバーテックス検出器のセンサー部分を組み立て、実験装置に組み込んで実験を開始した。この検出器は予定通りの性能を発揮し、BELLE実験の最初のデータを提供した。ところが残念ながら、放射線によるシリコン検出器の信号増幅回路に損傷が発生し、一度測定装置の交換を余儀なくされた。この交換を実行した以降は順調にデータ収集を行っている。特に、今回、クラコウグループとKEKで共同研究で製作したDSPを利用した高速アナログデジタル変換モジュール(FACD)の回路は、期待通りに稼働し、現在もBELLE実験の重要な部分を構成している。また、現在使用しているFACDシステムの性能をさらに向上し、より高速なデータ収集を可能にすべく、新たな検討をクラカウとKEKで開始した。一方、3層で多分割されたシリコン検出器板の間の相対位置を正確に求めるために、ソフトウェアーを開発し、平行して、宇宙線及ビーム衝突で生ずる電荷を持った粒子の飛跡を使ってその更正が行われた。現在までに、飛跡を約50ミクロンの精度で決定できるまでに調整が進んでいる。この位置の調整を行い、現在、シリコンバーテックス検出器は、期待された性能通りに稼動し、B中間子の崩壊点を正確に観測し、B中間子崩壊における、CP保存則の破れを近い将来に観測できる見通しを得た。平成12年度は、BELLE検出器のシリコンバーテックス検出器のセンサー部分を組み立て、実験装置に組み込んで実験を開始した。この改善案では、クラコウグループは他の研究グループと共同で、信号読み出し系統の抜本的改善案を担当し、平静3年中には試作機を作り、平成4年夏以前に新しい高速読み出しシステム完成させる計画である。

物理解析の面では、B中間子のφK崩壊過程を世界で最初に観測することに成功した。この崩壊は、ペンギングラフを通してのみ可能なプロセスであり、B中間子崩壊研究の新しいページを開く可能性のある研究である。近い将来物理専門誌に結果を投稿する予定である。
マイクログリアが分泌する神経細胞保護因子の分離精製と特性の決定

マイクログリア、アストロサイトの神経細胞保護機構の機序について以下の事項について明らかにした。1)マイクログリアの神経細胞保護作用我々は、一酸化窒素(NO)供与体であるニトロプルシッドナトリウム(SNP)を一次培養大脳皮質神経細胞に負荷することにより、アポトーシス様の神経細胞死を誘導できることを見い出した。この系を用いて、マイクログリアがNOにより惹起される神経細胞死にどのように関わっているのかを検討した。その結果、SNP負荷前にマイクログリアを共培養しておくと、SNPによる神経細胞死を完全に抑止できることを見い出した。また、SNP負荷後にマイクログリアの培養上清を添加しても神経細胞死を抑制できたことから、マイクログリアの培養上清はNO消去以外の方法で神経細胞保護効果を発揮すると考えられた。マイクログリアの培養上清には、神経細胞のアポトーシスを抑制する効果があり、マイクログリアの分泌する液性因子の神経細胞アポトーシス抑制効果を検索したところ、TNFαに神経細胞アポトーシス抑制効果があることが判明した。2)アストロサイトの神経細胞死抑止効果活性酸素を神経細胞に負荷したときのアストロサイトの反応を観察した。活性酸素類を負荷する目的で、SNP、SIN-1、または硫酸第一鉄を一過性に投与すると、神経細胞の単独培養では、20時間以内にアポトーシス様の細胞死をきたすが、アストロサイトと共培養しておくと活性酸素による神経細胞死はほぼ完全に阻止された。髄膜由来線維芽細胞にはこのような効果は認められなかった。アストロサイト由来の細胞外マトリックスは、培養上清より強力な神経細胞保護効果を示し、ラミニンとフィブロネクチンを含んでいた。精製した両蛋白質にも強い神経細胞保護効果が認められた。以上の結果は、アストロサイトが、主に細胞外マトリックス蛋白質分泌を介して神経細胞を保護することを示唆している。また、アストロサイトはアミノ酸のセリン、グリシンを細胞外に分泌することを見出した。この両アミノ酸は、神経細胞の生存を有意に促進することが判明しており、この単純なアミノ酸がアストロサイト由来の神経細胞生存促進因子であることが明らかになった。1)マイクログリアの神経細胞保護作用脳の発生期あるいは脳血管障害や神経変性疾患の際には、神経細胞のアポトーシスが起こり、マイクログリアの活性化がみられると報告されている。しかし活性化したマイクログリアが神経細胞死を誘導しているのか、阻止しているのかは、未だ明らかではない。我々は、一酸化窒素(NO)供与体であるニトロプルシッドナトリウム(SNP)を一次培養大脳皮質神経細胞に負荷することにより、アポトーシス様の神経細胞死を誘導できることを見い出した。

活性酸素類を負荷する目的で、SNP、SIN-1、または硫酸第一鉄を一過性に投与すると、神経細胞の単独培養では、20時間以内にアポトーシス様の細胞死をきたすが、アストロサイトと共培養しておくと活性酸素による神経細胞死はほぼ完全に阻止された。髄膜由来線維芽細胞にはこのような効果は認められなかった。アストロサイト由来の細胞外マトリックスは、培養上清より強力な神経細胞保護効果を示し、ラミニンとフィブロネクチンを含んでいた。精製した両蛋白質にも強い神経細胞保護効果が認められた。以上の結果は、アストロサイトが、主に細胞外マトリックス蛋白質分泌を介して神経細胞を保護することを示唆している。マイクログリア、アストロサイトの神経細胞保護機構の機序について以下の事項について明らかにした。1)マイクログリアの神経細胞保護作用我々は、一酸化窒素(NO)供与体であるニトロプルシッドナトリウム(SNP)を一次培養大脳皮質神経細胞に負荷することにより、アポトーシス様の神経細胞死を誘導できることを見い出した。この系を用いて、マイクログリアがNOにより惹起される神経細胞死にどのように関わっているのかを検討した。その結果、SNP負荷前にマイクログリアを共培養しておくと、SNPによる神経細胞死を完全に抑止できることを見い出した。また、SNP負荷後にマイクログリアの培養上清を添加しても神経細胞死を抑制できたことから、マイクログリアの培養上清はNO消去以外の方法で神経細胞保護効果を発揮すると考えられた。マイクログリアの培養上清には、神経細胞のアポトーシスを抑制する効果があり、マイクログリアの分泌する液性因子の神経細胞アポトーシス抑制効果を検索したところ、TNFαに神経細胞アポトーシス抑制効果があることが判明した。2)アストロサイトの神経細胞死抑止効果活性酸素を神経細胞に負荷したときのアストロサイトの反応を観察した。また、アストロサイトはアミノ酸のセリン、グリシンを細胞外に分泌することを見出した。この両アミノ酸は、神経細胞の生存を有意に促進することが判明しており、この単純なアミノ酸がアストロサイト由来の神経細胞生存促進因子であることが明らかになった。
日本絵画史における写実表現の再検討

矢代幸雄以来、日本美術は写実的であるよりも装飾的であると規定されてきた。本研究では、似絵を中心とした鎌倉時代の肖像画研究、および江戸時代中期の写実派である円山応挙、伊藤若冲の作品研究を二つの軸として、日本美術の写実性の観点から美術史を再構成することを試みた。似絵研究では、鎌倉時代における展開を、似絵の形式と内容面から初期・中期・後期の三期に時期区分し、初めて似絵研究に体系的な軸を構築した。円山応挙および伊藤若冲に関しては金刀比羅宮所蔵の障壁画群を主たるテーマとし、特に応挙の障壁画において、写実が単なる二次元上での再現だけでなく、現実空間への現前までを意識した魔術性を持つことを論じた。平成22年度の研究活動は、主として鎌倉時代に新たに発達した肖像画形式である似絵の研究を中心に行った。中でも、徳川美術館所蔵の「天皇摂関御影」の調査を行ったことは大きな成果であった。この似絵画巻は、全図は徳川美術館発行の『絵巻』(一九九三年四月)に掲載されているものの、写真が小さく細部を確認することは困難であった。しかし、今回徳川美術館のご厚意により、全巻の熟覧を許された。その結果として、甲巻では、天皇の描き方が四手に分かれることが確認できた。すなわち、冒頭の鳥羽院から四条院までが画風上一グループを成し、続く後嵯峨院が独特の精緻な筆致で描かれ、さらにそれにつづく後深草院と亀山院はスケッチ風の筆致で描かれるが、後深草と亀山では手が異なるということが分かった。細線重ね描きの画風が基本となる似絵において、後嵯峨院だけが、細密に描かれ、また彼だけが一回り丈高く描かれていることは、この画巻の制作主体が後嵯峨院であったことを暗示すると思われる。こうして画巻の視点人物が定められたことは、研究史上の独自の成果であると考えられる。これらの成果は平成23年度に発行する予定の自著の一章として発表する予定である。2011年度は『肖像画の時代-中世形成期における絵画の思想的深層』を上梓し、研究の中間まとめを行った。本書において、筆者は、日本の写実表現の重要な一翼を担う鎌倉時代俗人肖像画の展開過程を跡付けた。鎌倉時代俗人肖像画は、似絵を軸に展開するが、この似絵は初期・中期・後期の三期に区分できる。初期の似絵は、行事絵と親しく、行事絵的な特定性を持っていることが特色として挙げられる。中期の似絵は、芸能の主題が浮上してくる点に特色があり、芸能の興隆を通じた、宮廷の盛儀を描くことを主題としていると言える。後期の似絵になると、それまで像主と観者はともに同時代の人物であったところから変化し、通時的に人物を連ねる列影図形式が登場する。こうした三期に分かれる一方で、似絵制作の動機として一貫するのは、徳治を表象するという意図であることも明らかにした。また似絵研究の一環として2012年2月に国立歴史民俗博物館(千葉県佐倉市)を訪問し、架蔵の歴史資料「広橋家旧蔵記録文書典籍類」のうち、「題未詳」一軸(H-63-993)の調査を行った。調査は、まず全巻の写真撮影を行うとともに、細部の撮影も行った。さらに、同巻に含まれる「似絵詞」について既翻刻の文書(米倉迪夫「似絵詞について」『国華』960号掲載)と厳密に対照し、異同を確認した。また、虫食いなどで難読になっている部分の筆跡も確認し、米倉氏による翻刻の妥当性について検討を加えた。「似絵詞」は似絵を享受した貴族が、似絵を絵画史的に自ら位置づけた、似絵の思想を知る上での第一級の同時代史料であり、文言の確認によって、思想を読み解く基礎を築くことが出来た。平成25年度は研究の最終年前年であることから、これまでの研究成果をまとめることを中心に活動を行った。本研究の主たるターゲットである中世の美術における先行研究は、古いものに関しては研究開始前より収集を行っていたが、近年のものに関しては手薄になっていたので、そこを中心に文献の収集に注力した。本研究は日本美術の写実性を論ずるものであるが、その重要な論点に中世の肖像画の問題が存在する。近年は特に京都・神護寺が蔵する「(伝)源頼朝像・(伝)平重盛像・(伝)藤原光能像」の像主や制作時期をめぐる議論がめざましい発展を見せるとともに複雑化しており、論点の整理が必要な時期に来ている。

この点について整理を行い見通しを立てた。さらに、周辺的な成果として、写実性が特徴とされる鎌倉時代の慶派の彫刻についても近年の議論に目を通し、鎌倉時代全体として写実的な動向が何故生まれ、何故発展したのか、絵画・彫刻というジャンルを超えた時代の動向として考察する方向に視野を広げることに努めた。また、本研究の主軸となる似絵の本質的性格についての規定について考察を深め、端的な短い文章としてまとめを行い、今後の議論の基盤を作ることも行った。既に平成23年に拙著の中で長文の議論を行っているが、細かい留保条件等を排除して、一般にも分かりやすく定義することを目指したつもりである。近世に関しては、円山派の画家である長澤芦雪の作品数点について実地調査を行った。本来応挙を中心に近世の写実の問題を考察するべきであるが、奇想や遊びと言われがちな芦雪作品にも意外にきまじめな要素が存在することに興味を持ち、こちらの方面から円山派における写実表現の意味が明らかに出来るのではないかと考え、調査を実施した。本年度は、主として鎌倉・南北朝時代に宮廷において流行した似絵について調査をすすめ、またその問題点について考察を行った。とりわけ似絵の起源を解き明かすのに重要な位置を占める「承安五節絵」(東北大学図書館蔵)の調査を行ったことが大きな成果である。「承安五節絵」は現在模本しか伝わっておらず、その模本の出来にも格差があるが、東北大学図書館本はその中でも良質な模本として知られている。この模本についてはすでに山本陽子氏により詳細な紹介が成されている。山本氏の問題設定は、「承安五節絵」が似絵であるかどうかと言う点に力点があり、東北大学図書館本は、個別の顔をかき分けが意識されている点で、「承安五節絵」が似絵であることを証明する直接の証拠とされている。筆者が実見したところ、確かに個別の顔のかき分けが認められたが、技法的には似絵を特徴付ける細線重ね描きが見られず、顔つきも例えば鎌倉末期の古模本とされる「中殿御会図」のような鎌倉風の独特のくせが見あたらず、むしろ江戸期の癖というか色合いが濃く出ているように思われた。この点は、感覚的な問題になるけれども、良質な模本とされる東北大学図書館本といえども鎌倉風の癖が消えてしまった、近世の重模本と位置づけざるを得ないと考えられる。「承安五節絵」は承安元年の五節か承安二年の五節か曖昧な描写である点も早く指摘されており、現状では写し崩れや構成の再編集の手が多く加わったものと見ざるを得ない。もちろん、上記二つの年度のどちらの五節にしても、承安三年に描かれた最勝光院御所障子絵に先立つ行事絵としての意義は持つ。「承安五節絵」が似絵であるかどうかという問題設定を超えて、行事絵が先行して描かれる中で似絵的なものが醸成されてくる過程において、この作品がどのような意義を持ちうるのかを考えることが必要であろうと考える。本年度は研究期間の最終年に当たるため、これまでの研究の総括を中心に行った。特に、鎌倉時代肖像画の柱となる似絵を考察する際のネックとなっていたのが、似絵の発生状況が不明であると言うことであった。この点については、平安時代における奢侈観の研究などを踏まえて、色彩や金銀を用いた豪華な美意識に対して、白黒を中心としたモノクロームの美に対する関心が後白河院政期に発生したことを指摘し、これが似絵を背後から支える美の原理であることを指摘した。また、豪華な美意識とモノクロームの美意識の対立の背後には、過剰に飾り立てる「風流過差」の精神と、これを秩序紊乱につながる危険性の高い態度と見なして取り締まろうとする「過差禁制」の思想があることを発見した。
ラット脊髄運動ニュ-ロン抑制性シナプス伝達機構のパッチクランプ解析

パッチクランプ電極によるwholeーcell記録法を用いて、新生ラット脊髄運動ニュ-ロンから抑制性シナプス電流(IPSC)を記録した。IPSCは、運動ニュ-ロン近傍の介在ニュ-ロンを細胞外電極により刺激することにより誘発した。刺激のア-チファクトからIPSCの立ち上がりまでの潜時は、0.2ー50Hzの刺激頻度に対して、ほぼ一定値をとった。IPSCの潜時は、37Cでは0.6ー0.8msecであり、単シナプス性IPSCの性質を示した。細胞外Ca濃度を減少させると、IPSCのfailureが増加し、IPSCの平均振幅が減少した。Ca濃度とIPSCの平均振幅とは、両対数目盛りにおいて、直線関係を示し、平均傾斜は3.1であった(0.35ー1.4mMのCa濃度範囲)。Ca濃度を減少させるとIPSCの振幅は減少したが、0.7mM以下のCa濃度で観察されるIPSCの振幅(failureを除く)は、一定の最小値に達した。0.5mMCa濃度で記録された最小IPSCの平均コンダクタンスは650psであった。この値は、テトロドトキシン下に運動ニュ-ロンから記録された自発性微小IPSCの平均コンダクタンスとほぼ一致した。従って、Ca低濃度において観察される最小IPSCは、素量IPSCに相当すると考えられる。素量IPSCの平均振幅は、運動ニュ-ロンごとに、約3倍異なった。単一介在ニュ-ロン刺激により誘発された素量IPSCの分散係数は、平均0.50であった。IPSCの立ち上がり時間と、振幅との間には、相関が認められないことから、素量IPSCのばらつきは、伝達物質放出部位の位置的相違によるものではないと推測される。IPSCの統計的性質を検討した結果、IPSCの振幅は、二項分布には、適合しないことが明かになった。新生ラット脊髄運動ニュ-ロンのIPSCは、不均一なサイズの伝達物質素量子により構成されていると結論される。(1)抑制性シナプス電流(IPSC)の記録:新生ラット脊髄から厚さ120μmのスライスを作製し、運動ニュ-ロンをノマルスキ-顕微鏡で直視のもとに、パッチ電極による膜電流のwhole-cell記録を行った。近傍の介在ニュ-ロンに先端約2μmの電極を密着させて、通電刺激してIPSCを誘発した。刺激強度の変化に対して、IPSCが全か無かの応答を示すことから、一個の介在ニュ-ロンのみが興奮することを確認のうえ、IPSCの素量解析を行った。(2)素量解析:灌流液のCaを減少、Mg濃度増加させると、IPSCの平均振幅は、減少し、刺激に対するfailureの頻度が増加した。灌流液にテトロドトキシンを加えて活動電位を遮断すると、介在ニュ-ロン刺激によるIPSCは誘発されなくなったが、自発性微小IPSC(mIPSC)が記録された。このmIPSCの振幅は、Ca濃度を著しく低下させた際のIPSCの平均振幅とほぼ一致した。

先ず、IPSCがmIPSCを素量とする二項分布に従うと仮定して、IPSCの振幅ヒストグラムのfittingを行ったところ、外液Caを1/2、Mgを2倍にした条件下では、平均放出素量m=1.24、放出確率p=0.56で二項分布によく適合する結果が得られた。従ってこの条件下での放出可能部位はn=m/p=2.2となり、2-3箇所の放出部位から、高い確率で伝達物質が放出される状況が推察された。しかし、一方正常二価イオン濃度において、IPSCの平均振幅はmIPSCの振幅の5-10倍に及び、素量仮設に従えば最小限、5-10個の放出部位が必要とされる。また、正常液中では、IPSCの分布を二項分布に一致させることは困難であった。これらの結果は、中枢抑制性シナプスにおいては、伝達物質放出部位ごとの放出確率が異なることを示唆する。低Ca高Mg液中では、放出確率の低い部位は、脱落して、高確率放出部位のみが残存し、見かけ上二項分布に従ったものと推論される。ラット脊髄より厚さ120μmの横断スライスを作製(,)マルスキ-顕微鏡下に、運動ニュ-ロンを直視同定して,パッチ電極によるwholeーcell記録を行なった。近傍の介在ニュ-ロンを細胞外刺激して,抑制性シナプス電流(IPSC)は,ストリキニ-ネによりブロックされた。刺激強度を徐々に上昇させると,ある強度で,IPSCがallーorーnoneに発生する事から,単一介在ニュ-ロンが単一である事を確定した。次に頻回刺激により,シナプス潜時がほぼ一定値をとる事から,単シナプス性のIPSCである事を確認した。この条件下で,細胞外のCa^<2+>濃度を系統的に減少させた。細胞外Ca^<2+>濃度([Ca]o)の減少に伴ない,IPSCのfuilureが増加した。又,IPSCの振幅も減少し,その結果,平均振幅は[Ca]oの約3.1乗に比例して減少した。即ち34分子のCa^<2+>の結合により,シナプス伝達物質の放出が行われている事が示唆される。観察されるIPSCの振幅(failureを除く)は,一方,0.7mM[Ca]o以下では,一定の値に収束した。この最小IPSC振幅は約50PSで,チャネル数としては,約14個に相当する。最小IPSCは,シナプス伝達物質の最小単位(伝達物質量子)に匹適すると結論される。量子(quantum)サイズは,分散係数が0.52であった。この値は,神経筋接合部で従来報告されている値(0.3)よりかなり大きい。量子サイズの大きなバラツキが,シナプスの位置の相違によるものである可能性を検討するために、riseーtime,と振幅の相関を検討したが,相関は得られなかった。従って,量子サイズのバラツキは,シナプスの位置によるものでなく,伝達物質素量のバラツキ,又は受容体密度のバラツキを反映するものと結論される。ここに観察された量子サイズをもとに,IPSCの量子解析を行なったところ,IPSCの振幅は,二項分布,ポアソン分布のいずれにも適合しない事が明らかとなった。不均一量子サイズによるIPSCの構成がその根底にあると思われる。
血栓標的ドメインとヘビ毒由来フィブリン分解酵素融合体による血栓溶解剤の開発

Alfimeprase(A)は血中のα-2マクログロブリン(α-2M)と速やかに複合体を形成して活性が阻害されるため、臨床第2相でドロップした。Aにハブ毒HRlaのC末ドメインを結合させた融合体(AH)遺伝子に、フィブリンへの標的化ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン1を融合させたAHP遺伝子を化学合成して大腸菌ベクター(pE-SUMO)で発現させた。これによって、Aのフィブリノゲン切断活性、ヒト血餅溶解活性のα-2Mによる阻害を回避することはできなかった。それはN末のSUMOペプチドの有無とは関係なかった。私たちは、ガラガラヘビ毒由来Alfimeprase、ハブ毒由来HR1のC末ドメイン、ヒトフィブリン特異的に結合するプラスミノーゲンのフィブリン結合ドメインであるfirst kringle domain(FKD)との融合体タンパク質を発現させ、そのフィブリン分解活性、血清中での安定性、血栓へのターゲッティング活性を調べることを計画している。当初計画していたブレビバチルス菌での分泌発現は不成功に終わり、平成24年度は大腸菌による菌体内発現・精製を試みた。Alfimeprase(A)遺伝子を挿入したpET大腸菌発現ベクターを使って発現・精製法を検討した。A遺伝子のN末にSUMOペプチド(約100aa)を付加することで、菌体内に大量に発現されることを確認したが、Aタンパク質は不溶性沈殿として回収された。他のタンパク質発現実験で検討・確立した不溶性沈殿から可溶化、HisTrapカラム精製、段階的透析によるリフォールディングする方法を使って、200ml菌培養液から8mg以上の全長を含むAを精製することに成功した。次にAlfimepraseとHR1C末ドメインを融合させた(AH)遺伝子、AlfimepraseとHR1C末ドメインの融合遺伝子のC末にFKD遺伝子を融合させた(AHP)遺伝子を同様に大腸菌菌体内で発現させ、不溶性沈殿から精製することに成功した(200ml菌培養液から約3mgのAH、約2.5mgのAHPタンパク質)。しかしながら、A、AH、AHPタンパク質のFibrin, Fibrinogen分解活性を未だ明確に確認できていない。臨床試験でドロップした血栓溶解剤(Alfimeprase=A)をリバイバルさせる技術を開発することを目標とした。Aは直接フィブリンを分解する活性を持ち、tPA(Activase)と異なりプラスミン産生がないため、2次的な補体系活性化が起きない。Aは血中のα-2マクログロブリン(α-2M)と速やかに複合体を形成して、活性が阻害されるため、臨床第2相でドロップした。【方法】ガラガラ蛇由来A、ハブ毒由来HR2aはα-2Mと複合体を形成するが、構造が似ているHR1aのN末ドメインは複合体を形成しないことから、HR1aのC末ドメイン(コラーゲン結合領域)がα-2Mとの結合を阻止できる可能性を考え、AにHR1aのC末ドメインを結合させた融合体(AH)を作製した。フィブリンへの標的化を考慮して、更にヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン1を融合させたAHP遺伝子を化学合成した。上記遺伝子を大腸菌発現系(pE-SUMO)に挿入して、発現・生産を行い、HisTrapカラムで精製した。精製タンパク質の生物活性はフィブリノゲンの切断活性とヒト血餅溶解活性で見た。【結果と考察】フィブリン分解活性を持つ遺伝子組換えA、AH、AHPタンパク質の生産に成功した。N末端にSUMOペプチドを付加したSUMO-AHPは特に血栓溶解活性が強かった。AHPはフィブリンに結合するためと考えられた。ハブ毒由来HR1aのC末タンパク質を融合させたSUMO-AHPにおいても、フィブリノゲン切断活性、ヒト血餅溶解活性のα-2Mによる阻害を回避することはできなかった。ハブ毒のHR1aのAlfimeprase相同部分はα-2Mと結合しないのであって、C末部分HR1Cのコラーゲン結合ドメインを持っているためではないと結論された。Fibrin消化活性があってかつα-2Mに結合しないヘビ毒由来タンパク質を見出すことが必要である。Alfimeprase(A)、AlfimepraseとHR1C末ドメインを融合させた遺伝子(AH)、AlfimepraseとHR1C末ドメインの融合遺伝子のC末にFKD遺伝子を融合させた遺伝子(AHP)、AH遺伝子のN末にFKD遺伝子を融合した遺伝子(PAH)を合成した(C末にHis6付加)。A、AH、AHP、PAH遺伝子をブレビバチルス発現ベクターpNCOM2のBamH1とXho1部位に挿入した。ブレビバチルス菌培養上清中の分泌タンパク質の抗His-Tag抗体によるウエスタンブロットによる検出を試みた。残念ながら、A遺伝子産物が微量に検出されたが、他の融合体タンパク質は全く検出されなかった。

次に、A、AH、AHP、PAH遺伝子をpET-22b(+)大腸菌発現ベクターDNAのNdeIとNotI部に挿入した。A遺伝子の大腸菌(BL21(DE3)Star株)菌体内発現について調べたところ、菌体内で大量に発現されることを見出した。A遺伝子を発現誘導させた大腸菌をEDTA-freeプロテアーゼインヒビターカクテルを含む抽出バッファー中で超音波処理して、可溶性画分と沈殿画分に分けてSDS-PAGEにかけ、抗HisTag抗体を用いたウエスタンブロットでA遺伝子産物を検出した。A遺伝子産物は、ほぼ100%沈殿画分に来ていた。沈殿画分を8M Ureaで可溶化して、段階的な透析によって可溶性画分に残存するかどうか調べたところ、50%程度がリフォールディングして可溶性画分に来ることが分かった。リフォールディングしたA遺伝子産物は、HisTrapカラムによって精製できることが分かった。平成24年度には、AH、AHP、PAH遺伝子についても大腸菌菌体内発現、可溶化、リフォールディング、HisTrap精製を試み、Alfimeprase活性の有無、α2Mによるトラップの有無を調べることを計画している。当初の計画では、平成23年度末にはA、AH、AHP遺伝子の分泌発現を行い、各組換えタンパク質の精製が終了しているはずであった。現状では、平成24年度末時点でA、AH、AHP組換えタンパク質の発現・精製に成功したところ。未だA、AH、AHPタンパク質のFibrin, Fibrinogen分解活性が明確になっていない。この点は大変重要な点であるが、改善方法は考えてある。今後の研究の推進方策で述べる。平成23年度計画では、A、AH、AHP、PAH遺伝子の分泌発現を行い、各組換えタンパク質の精製が終了している計画であったが、A遺伝子産物が精製できたのみであり、計画からは遅れている。Alfimeprase(A)タンパク質はZnを含むメタロプロテアーゼであり、リフォールディング時にEDTA存在下Znイオン不含で行ったために活性が見られなかったと考えている。本タンパク質のリフォールディング時には、EDTAを加えずにZnCl2を添加して透析するべきと思われる。Fibrin、Fibrinogen分解活性を見るアッセイ系への数十μMのZnCl2の混入は活性を阻害すると考えられるため、リフォールディングした後には精製サンプルを再度ZnCl2不含バッファーで透析する必要がある。大腸菌菌体内発現で、A遺伝子産物の生産が可能となったことから、AH、AHP、PAH遺伝子産物についても、同様に生産が可能かどうか追求する。もしも、可溶化・リフォールディングが難しい場合には、可溶化状態で発現しやすいSUMO融合体での発現を試みる予定。遺伝子組換え実験、遺伝子組換えタンパク質の抽出・精製、Fibrin分解活性測定、血栓分解活性測定(インビトロ、インビボ)のために、遺伝子免疫実験試薬、培養器具、培養試薬、アッセイ試薬、人血、ウサギなどを購入するための消耗品費・動物購入費を計上する。遺伝子組み換え実験、遺伝子組み換えタンパク質の抽出、精製のために、遺伝子免疫実験試薬、培養器具、培養試薬など消耗品費として使用する予定。