hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性有機ケイ素イオンによる気相イオン分子反応と合成設計へのアプローチ

有機ケイ素化合物の溶液反応では,カルボカチオンの空のp軌道とSi-Cのσ結合間の共役(σ-π共役)により,β位のカルボカチオンがケイ素原子により安定化を受ける.アルカンやシクロアルカンの炭素原子をケイ素原子で置換えたアルキルシランやシラシクロアルカンなどのEIMSには,溶液反応で見つかっている反応と同じあるいは似た分解からのイオンが存在することが分かっている.実験に先立ち,C_2H_4を無限遠からCH_3SiH_2^+イオンに近づけてたときの反応のポテンシャルエネルギー曲面を,計算プログラムGAUSSIAN 94,IBMワークステーションIBM-7006-41Tを用いて詳細に計算した.エチレンをどの方向から近づけても,Si-C結合とβ位の炭素原子の空のp軌道が平行になって共役が出来,C-C結合は短くなって二重結合性を帯びることが分かった.理論計算ではその生成が明らかになったので,イオン分子反応でこのm/z73イオンが生成するかどうかをFTMSによって検討した.FTMSは電通大井上研究室の装置を使用させてもらった.合成したメチルプロピルシランCH_3SiH_2C_3H_7を電子衝撃によりイオン化し,生成したイオンをイオンサイクロトロン室に導入してサキクロトロン共鳴により,CH_3SiH_2^+イオンのみを残してそこにエチレンを導入した.並進エネルギーが1.8eVのCH_3SiH_2^+イオンと3.3Torrのエチレン圧のときm/z73の生成を認めることができた.MS/MSの衝突室での実験では,両者の衝突がせいせい数回程度であったため,このイオンの生成が認められなかったが,十分な時間をかけることで,反応が進行することがわかった.有機ケイ素化合物の溶液反応では,カルボカチオンの空のp軌道とSi-Cのσ結合間の共役(σ-π共役)により,β位のカルボカチオンがケイ素原子により安定化を受ける.アルカンやシクロアルカンの炭素原子をケイ素原子で置換えたアルキルシランやシラシクロアルカンなどのEIMSには,溶液反応で見つかっている反応と同じあるいは似た分解からのイオンが存在することが分かっている.実験に先立ち,C_2H_4を無限遠からCH_3SiH_2^+イオンに近づけてたときの反応のポテンシャルエネルギー曲面を,計算プログラムGAUSSIAN 94,IBMワークステーションIBM-7006-41Tを用いて詳細に計算した.エチレンをどの方向から近づけても,Si-C結合とβ位の炭素原子の空のp軌道が平行になって共役が出来,C-C結合は短くなって二重結合性を帯びることが分かった.理論計算ではその生成が明らかになったので,イオン分子反応でこのm/z73イオンが生成するかどうかをFTMSによって検討した.FTMSは電通大井上研究室の装置を使用させてもらった.合成したメチルプロピルシランCH_3SiH_2C_3H_7を電子衝撃によりイオン化し,生成したイオンをイオンサイクロトロン室に導入してサキクロトロン共鳴により,CH_3SiH_2^+イオンのみを残してそこにエチレンを導入した.並進エネルギーが1.8eVのCH_3SiH_2^+イオンと3.3Torrのエチレン圧のときm/z73の生成を認めることができた.MS/MSの衝突室での実験では,両者の衝突がせいせい数回程度であったため,このイオンの生成が認められなかったが,十分な時間をかけることで,反応が進行することがわかった.
CNP/NPR-Bシグナルによる骨伸長促進作用のメカニズムの解明

申請者らはこれまでにC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の強力な骨伸長促進作用について報告し、その成長板軟骨に対する効果について示してきたが、その形態学的な本態や分子カスケードについては解明されていなかった。本研究ではマウス胎仔長管骨器官培養系を用いてイメージング技術によりその動態を解析し、一方ではシグナル伝達物質の網羅的解析をおこなってCNPとの関連性を解析し、最終的には候補シグナルの効果を器官培養における動態にフィードバックさせるものである。昨年度までの本研究において、CGA-EGFPマウス(グリーンマウス)の胎生16.5日胎仔より摘出した尺骨の器官培養を用いて二光子顕微鏡による4D (3D+時間軸)イメージング解析によりCNPの成長板軟骨に対する作用を検討し、CNPが成長板軟骨細胞の増殖よりむしろ細胞の増大や基質産生の増加を促進することにより成長板軟骨の伸長を促進することが明らかとなった。本年度は、分子カスケードの解明としておこなうシグネチャー解析の前段階として、主な成長板伸長調節系であるERKシグナル伝達系の阻害剤であるU0126の、同じくマウス胎仔長管骨器官培養系における巨視的な作用を確認した。その結果、U0126が長管骨培養体の成長板軟骨の伸長を強力に促進することを確認した。それを受けて、次年度のシグネチャー解析を行うための準備としてCNP、ERK阻害剤を添加したマウス胎仔長管骨器官培養系の成長板軟骨からRNA抽出をおこなった。研究は順調に進行している。計画通り研究を遂行する予定である。申請者らはこれまでにC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の強力な骨伸長促進作用について報告してきた。CNPは成長板軟骨を強く伸長させることにより骨伸長を促進するが、その形態学的な本態や分子カスケードについては解明されていない。本研究では、マウス長管骨の器官培養を用いて、まず二光子顕微鏡による4D(3D+時間軸)イメージング解析によりCNPの作用の本態を形態学的に解明する。さらに、器官培養を用いて、CNPの添加による発現遺伝子の変化と、様々な細胞内シグナル経路の阻害剤の添加による発現遺伝子の変化を比較することにより(シグネチャー解析)、CNPの成長板軟骨伸長促進作用のシグナル伝達経路(分子カスケード)を同定する。最後に、同定されたシグナル伝達経路の修飾による変化を先述の器官培養の4Dイメージング系で検討し、CNPによる変化と比較して、下流シグナルとしての整合性を検証する。平成29年度は、二光子蛍光顕微鏡を用いた4DイメージングによるCNPの成長板軟骨伸長促進作用の形態学的解析について、CGA-EGFPマウス(グリーンマウス)の胎生16.5日胎仔より尺骨を摘出し、骨幹部をゲルで固定した状態で器官培養(静置培養)をおこない、インキュベーター二光子蛍光顕微鏡(Olympus LCV110-MPE)を用いてタイムラプスイメージング(微速度撮影)により撮影する系を確立した。確立した4Dイメージング系においてCNP(10-7 M)を添加し、CNPの成長板軟骨伸長促進作用を確認したうえで、上述の1)軟骨細胞の動き、および2)細胞質・基質の変化に対するCNPの作用を解析した。研究の進捗に特に問題もなく、ほぼ順調に進展している。当初の計画に基づいて、CNPの成長板伸長促進作用に関するメカニズムについて解析を進め、そのシグナル解析に関する検討を開始する予定である。今年度計画ではマウス胎仔長菅骨器官培養のイメージング系の確立として、先端バイオイメージング支援プラットホーム(ABiS)の支援も受けられたため、次年度使用額が生じた。次年度以降DNAアレイ解析等での多額の出費が見込まれるため、そちらを充填する計画である。最終年度にアレイ解析等をおこなうことになったため、次年度への支出の増大に対して繰越をおこなった。
Runx1を標的とした治療抵抗性小児AMLに対する新たな治療戦略

受容体型チロシンキナーゼであるFLT3に生ずるFLT3/ITD変異は、10-15%の小児急性骨髄性白血病(AML)患者に見られ、予後不良因子となる。これまでにいくつものFLT3/ITDを標的とした治療薬が開発されてきたが、いずれも有効なものはこれまでのところない。その理由として、これら治療薬を長期に使用することで、FLT3/ITD陽性AML細胞が薬剤抵抗性となり、再発するからである。私たちは、FLT3/ITDが薬剤抵抗性となる機序と、その薬剤抵抗性に打ち勝つための新たな治療戦略となる基礎研究を行った。まず始めにマイクロアレイを用いてFLT3/ITDが、造血細胞の主に分化に関わる重要な転写因子であるRUNX1の発現を上昇させることを見出した。そこでFLT3/ITD下におけるRUNX1の機能解析を行った。まず、FLT3/ITD陽性細胞でRUNX1をknock downすると、その異常な細胞増殖が抑制され、分化が促進され、自己複製能を抑制することができた。これはつまり、FLT3/ITDはRUNX1の発現を上昇させることで、異常な細胞増殖を引き起こし、分化を抑制し、自己複製能を高めていると考えられる。更に、FLT3/ITD阻害剤に抵抗性となった細胞においても、RUNX1をknock downすると同様に細胞増殖が抑制され、分化が促進され、自己複製能を抑制することができた。そのため、RUNX1は、薬剤抵抗性となったFLT3/ITD陽性細胞においても治療標的となりうることが示唆された。当初目標としていたFLT3/ITDが薬剤抵抗性となる機序と、その薬剤抵抗性に打ち勝つための新たな治療戦略となる基礎研究を行うことができた。チロシンキナーゼ受容体FLT3遺伝子に生ずるFLT3/ITDは予後不良であり、治療抵抗性である。したがって、治療抵抗性となる分子機構を解明し、新たな治療戦略を考える必要がある。例えば、FLT3/ITD抑制剤に対する治療抵抗性は克服すべき課題の一つであり、これが解決すれば治療効果の改善が期待できる。これまでに私たちは、FLT3/ITDが造血幹細胞の増殖分化を制御する転写因子であるRunx1発現を上昇し、FLT3/ITD抑制剤AC220に対する抵抗性に関わることを報告した。したがって、Runx1の標的を行うことで、FLT3/ITD抑制剤に対する薬剤耐性を克服可能と考えるが、Runx1は造血幹細胞にも発現し、その阻害は造血不全に至る為、実際には用い難く、新たな治療標的が必要と考える。新たな標的分子として考えられるのは、転写因子Runx1の下流に存在する分子群である。昨年は動物実験を行うことを計画したが、このようにRunx1を実際に治療標的にすることは困難が予想されるので、それよりも下流の分子、あるいはRunx1とは独立した分子、かつ正常造血幹細胞に影響の少ない分子を同定することに計画を若干修正して行っている。具体的には以下のように行いつつある。これまでに、Runx1下流の分子群を同定する目的で、FLT3/ITD陽性細胞内でRunx1に対するshRNAをトランスフェクションすることでRunx1ノックダウン細胞を作製し、mRNAを抽出した。今後遺伝子発現をRNA-seqまたはマイクロアレイを用いて解析し、Runx1の標的と考えられる分子群を同定する。一方で、Runx1とは独立した新たな治療標的を同定するために、ゲノム編集スクリーニング(CRISPRーCas9システム)を用いてFLT3/ITD抑制剤に対する抵抗性をもたらす分子群を同定するために、FLT3/ITD陽性細胞にCas-9導入を行っている。当初の目標であるRunx1が薬剤抵抗性に関わることは証明できたので、更にその研究を発展させる段階である。動物実験を行うことを当初は計画したが、Runx1を実際に治療標的にすることは困難が予想されるので、それよりも下流の分子、あるいはRunx1とは独立した分子、かつ正常造血幹細胞に影響の少ない分子を同定することに計画を若干修正して行っている。FLT3遺伝子に生ずるFLT3/ITD+AMLは治療抵抗性である為、その分子機構を解明する必要がある。私達は、FLT3/ITDが転写因子Runx1の発現を上昇し、FLT3/ITD抑制剤AC220に対する抵抗性に関わることを報告した。今年度は、骨髄微小環境から分泌されるケモカインCXCL12がRunx1発現に及ぼす影響に注目して、治療抵抗に関する機構を解析した。FLT3/ITD+細胞では、FLT3/ITD陰性細胞と比較して増殖が亢進し、Runx1発現は有意に上昇した。FLT3/ITD抑制剤AC220を添加すると、細胞数とRunx1は減少したが、AC220抵抗細胞では細胞数は減少せず、Runx1が上昇した。次にAC220感受性FLT3/ITD+細胞にAC220存在下でCXCL12添加すると、CXCL12非存在下と比較して細胞数は有意に減少し、4時間後のRunx1mRNAは、非刺激細胞と比べ有意に低下した。CXCR4拮抗薬AMD3100は、CXCL12によってもたらされるRunx1と細胞数低下を部分的に抑制した。これらはFLT3/ITDによって発現上昇するRunx1を、CXCL12が減少させ、細胞減少をもたらすことを示唆する。一方、AC220抵抗細胞では、AC220存在下でCXCL12を加えても細胞増殖は抑制されなかった。現在、これら細胞でRunx

1発現を解析中である。AC220感受性FLT3/ITD+細胞では、CXCL12がRunx1を低下させ、AC220の細胞死誘導作用を増強すること、逆にAC220抵抗細胞ではRunx1が上昇していること、AC220抵抗細胞ではCXCL12によるAC220細胞死誘導作用の増強が見られないことは、Runx1がCXCL12による細胞減少に関わることと、骨髄微小環境におけるAC220抵抗性に関わることを示唆する。今後、これら仮説を証明する。上記の実験はマウスの細胞を用いた試験管内の研究であった。そこで、FLT3/ITD白血病マウスモデルを用いて、RUNX1のknock downが新たな治療標的となりうるかを確認する。また、ヒトAML白血病モデル細胞においても、同様にRUNX1のknock downが治療標的となりうるかを確認する。動物実験を行うことを当初は計画したが、Runx1を実際に治療標的にすることは困難が予想されるので、それよりも下流の分子、あるいはRunx1とは独立した分子、かつ正常造血幹細胞に影響の少ない分子を同定することに計画を若干修正して行う。小児科学必要とした物品が想定していたよりも少なく済んだため。本研究では、Runx1という転写因子を阻害することがFlt3/ITD陽性白血病細胞のFlt3/ITD阻害薬への治療耐性を克服する為に有用であることを示した。しかし、Runx1は正常造血幹細胞にも発現し、その阻害は造血不全に至る為、実際の患者には用い難い為、新たな治療標的を見出す、あるいは正常造血幹細胞でのRunx1が破壊されないような工夫が必要と考える。その為の追加実験を行う為の延長を申請したので、次年度使用の必要が生じた。実験物品の購入、情報収集のための学会参加。昨年度は、下流の分子群を同定する目的で、FLT3/ITD陽性細胞内でRunx1に対するshRNAをトランスフェクションすることでRunx1ノックダウン細胞を作製し、mRNAを抽出したので、今後遺伝子発現をRNA-seqまたはマイクロアレイを用いて解析し、Runx1の標的と考えられる分子群を同定する。また、Runx1とは独立した新たな治療標的を同定するために、ゲノム編集スクリーニング(CRISPRーCas9システム)を用いてFLT3/ITD抑制剤に対する抵抗性をもたらす分子群を同定する。次年度は、これらの解析費用として使用予定である。
磁気ディスク表面の潤滑液体超薄膜によって形成される液体架橋の動特性の測定

触針の大変位を測定する装置を改良して、実用されている2nm程度の磁気ディスク表面潤滑膜について、極性基の有無、分子量の違い、紫外線照射の影響に関して潤滑膜の凝着力と伸び量、ばね定数,減衰係数を測定した。極性基の存在や紫外線照射により、ディスク表面に吸着する分子が増大すると凝着力、伸び量ともに減少する傾向があること、伸び量が流動分子の量や性質に依存することを示し、超薄膜に対しても本装置が十分な測定精度があることを示した。本年度は,研究計画に基づいて研究を行い,以下のような結果を得た.1.実験装置全体の改良および補修実際の磁気ディスクの潤滑剤として使用されている2nm以下の膜における測定を実現するために,測定精度の向上を目指して実験装置の改良を行った.具体的には,旧機種よりも高速,高精細,軽量の超高速ビデオカメラを本格導入し,画像の高解像度化,装置の高剛性化を実現した.また,カンディレバーの変位検出に使用している反射面をアルミ蒸着ガラス鏡に変更した.従来のシリコン研磨面と比較して表面精度が約2倍向上し,反射光のコントラストも約43%向上した.これらの改良により,干渉縞の同定精度の標準偏差が21.4nmから14. 7nmに改善された.一方,実験データの処理,保存に使用していた装置が動作不良を起こしたため,計画段階では想定していなかった処理装置を新規に導入した.2.垂直方向の分離実験改修した実験装置を使用して, 2nm程度の極性潤滑剤(PFPE Zdol2000, Zdo14000)および無極性潤滑剤(Z03, Z25)の垂直方向の伸び量と凝着力を測定した.実験結果から,無極性潤滑剤では,分子量の大小は伸び量に影響しないこと,極性潤滑剤では分子量が大きいと伸び量が小さいことを確認した.これらの結果は,分子量の大きさの直接的な影響というよりも,流動分子の多寡が主要因であると考えられる.凝着力については,極性潤滑剤の方が無極性潤滑剤よりも小さく,極性潤滑剤ではZdo12000の方が小さいことを確認した.これは,Zdo12000の分子直径に近い約2nmの超薄膜では,単分子膜が整然と形成された状態となり,表面エネルギーの小さい主鎖が表面に露出するために,凝着力が最小になったと考えられる.このような層構造を持たない無極性潤滑剤の場合には,分子量による顕著な差がなく凝着力がほぼ一定であることも確認した.磁気ディスク装置の高記録密度化にともなって,ヘッドとディスク問のすきまが狭小化され,接触走行をも考慮した潤滑技術が必要となっている.そのため両表面を保護するための潤滑剤にも新たな機能が求められており,紫外線(UV)を用いてディスク表面への潤滑剤の固着(ボンド)状態を制御する方法が提案されている.そこで,本年度はこれまでに開発した装置を用いて市販の磁気ディスク装置と同等の2nm厚さの潤滑剤を対象として実験を行い,下記の成果を得た.1.ナノ薄膜潤滑剤におけるばね定数と減衰係数の測定膜厚2nmの潤滑剤に対して,触針とディスク表面の間に潤滑剤による架橋を形成した状態のまま階段状に架橋を引き延ばし,ばね定数と減衰係数を測定した.ばね定数は-0.01-0.3N/m,減衰係数は0.010.06N/mとなり,厚膜の場合よりも小さくなることを確認した.また, UV照射を施した潤滑膜に対しても測定し、UV照射がばね定数と減衰係数に影響を与えることを確認した.2.凝着力と伸び量に対する紫外線照射の影響の測定UV官能型のPFPE AM3001と非UV官能型の同Z03を用いて照射時間を変化させて測定を行った.AM3001の凝着力については,ボンド率の増加に対して約30nNでほぼ一定であったが, Z03では約70nNから約30nNまで徐々に減少した.また, AM3001の伸び量は、ボンド率の増加に対して50100nmの間で増減したが、Z03はボンド率0.4までの間は約210nmまで上昇し,その後は70nmまで減少するという結果を得た.3.紫外線照射を用いた化学的テクスチャ表面の測定くし状のマスクを介してのUV照射によたて形成した化学的テクスチャ表面について、凝着力と伸び量を測定した.ボンド状態と非ボンド状態のテクスチャの違いが測定でき,伸び量については全面照射の場合と異なる傾向があることを確認した.
サイトメガロウイルス母子感染における特異的免疫能とウイルス株の特性に関する研究

妊娠中のサイトロメガロウイルス(CMV)の初感染または再活性化による胎内感染は児に重篤な後遺症を残すこともある。周産期、特に胎内感染のスクリーニングおよび早期診断、および治療は胎児・新生児の予後判定と長期的管理において重要である。我々は妊娠中の活動性CMV感染の診断への応用の目的でCMV感染における特異的T細胞の活性化を細胞内サイトカインの産生を指標にして検討した。またCMV胎内感染の成立に関してはウイルス遺伝子に関する研究からある特殊な遺伝子を有する株による初感染および再感染の重要性も指摘されていることから胎内感染を引き起こし、胎児および新生児に障害を残すCMV株のウイルス学的特性に関しても検討した。妊娠中のサイトメガロウイルス(CMV)の初感染または再活性化による胎内感染は児に重篤な後遺症を残すこともある。またCMV胎内感染の成立に関してはウイルス遺伝子に関する研究からある特殊な遺伝子型を有する株による初感染および再感染の重要性も指摘されていることから胎内感染を引き起こし、胎児および新生児に障害を残すCMV株のウイルス学的特性に関しても検討した。
後脳分節に繰り返される形態学的相同ニューロンの機能分化と機能結合

本研究では,脊椎動物の基本構造の一つである分節に組み込まれたニューロンが如何に機能的に分化し,相互に関係して機能的な回路を構築しているかを理解することを目的とした.具体的には,ゼブラフィッシュの後脳に存在する網様体脊髄路(RS)ニューロンの特異的な興奮性を決定する因子,逃避運動中の活動,逃避運動の発現に必要な感覚入力の形成過程について調べ以下の知見を得た.(1)ゼブラフィッシュのRSニューロンのうち最大の大きさを持つマウスナー(M)細胞は,他のRSニューロンと異なり,単発の活動電位しか発生しない.この特異的な興奮性は受精後90時間以降で獲得される.(2)M細胞の単発発火特性の獲得に対応して,低閾値型カリウムチャネルKv1がM細胞の軸索初節部の膜に表出する.(3)M細胞は聴覚入力による逃避運動において活動し,またその活動がなければ最も早い逃避運動は起こらない.M細胞の隣の分節に存在し,M細胞と形態学的に相同なRSニューロンは,触覚入力による逃避運動で活動し,聴覚入力による逃避運動ではむしろ活動が抑圧される.すなわち,M細胞と相同ニューロンは逃避運動において,相補的な役割を果たしている.(4)M細胞の活動にとって,もっとも重要な入力である聴覚入力の発達について,M細胞や感覚神経にGFPを発現するトランスジェニック・ゼブラフィッシュを活用して,電気生理学的・形態学的に調べた結果,M細胞が音に応答するよりずっと前に,機能的な聴覚回路は形成されていて,内耳の有毛細胞が音による振動を電気信号に変換する過程が,M細胞の聴覚獲得の時期を決めることを見出した.本研究の成果は,J.Neurosci.等に発表した.本研究では,脊椎動物の基本構造の一つである分節に組み込まれたニューロンが如何に機能的に分化し,相互に関係して機能的な回路を構築しているかを理解することを目的とした.具体的には,ゼブラフィッシュの後脳に存在する網様体脊髄路(RS)ニューロンの特異的な興奮性を決定する因子,逃避運動中の活動,逃避運動の発現に必要な感覚入力の形成過程について調べ以下の知見を得た.(1)ゼブラフィッシュのRSニューロンのうち最大の大きさを持つマウスナー(M)細胞は,他のRSニューロンと異なり,単発の活動電位しか発生しない.この特異的な興奮性は受精後90時間以降で獲得される.(2)M細胞の単発発火特性の獲得に対応して,低閾値型カリウムチャネルKv1がM細胞の軸索初節部の膜に表出する.(3)M細胞は聴覚入力による逃避運動において活動し,またその活動がなければ最も早い逃避運動は起こらない.M細胞の隣の分節に存在し,M細胞と形態学的に相同なRSニューロンは,触覚入力による逃避運動で活動し,聴覚入力による逃避運動ではむしろ活動が抑圧される.すなわち,M細胞と相同ニューロンは逃避運動において,相補的な役割を果たしている.(4)M細胞の活動にとって,もっとも重要な入力である聴覚入力の発達について,M細胞や感覚神経にGFPを発現するトランスジェニック・ゼブラフィッシュを活用して,電気生理学的・形態学的に調べた結果,M細胞が音に応答するよりずっと前に,機能的な聴覚回路は形成されていて,内耳の有毛細胞が音による振動を電気信号に変換する過程が,M細胞の聴覚獲得の時期を決めることを見出した.本研究の成果は,J.Neurosci.等に発表した.本研究では,脊椎動物の後脳の分節構造に基づいたニューロンの機能的分化を理解することを目的とした.硬骨魚のゼブラフィッシュやキンギョでは,後脳は吻尾軸方向に連なる7つの分節に対応して網様体脊髄路(RS)ニューロン群が存在する.興味深いことの共通の形態学的特徴をもつ相同ニューロンが隣接する分節に繰り返された上で,互いに少しずつ異なる機能を持っており,ニューロンの機能的分化のモデルとして注目される.後脳RSニューロン群の中で最大で,逃避運動の発現に決定的な役割を果たすマウスナー(M)細胞は単発の活動電位しか発生しない.M細胞と形態学的に類似した相同ニューロンも逃避運動に寄与すると考えられているが,発火パターンが大きく違う.また,逃避運動中のM細胞と相同ニューロンの活動をカルシウムイメージングした結果,それぞれをもっとも有効に駆動する感覚入力も少しずつ異なることが示唆された.この機能的な分化が発達段階でどのように獲得されるかを,ゼブラフィッシュ胚および稚魚のM細胞からホールセル記録を行って調べた.受精後2日(2dpf)では脱分極に対してM細胞が相同ニューロンと同じようにバースト発火するのに対し,5dpfのM細胞は単発発火を示した.3dpf以降では耳胞(内耳の原器)からの聴神経が電気シナプスと化学シナプスを介してM細胞に結合することが示されたが,2dpf以前では聴覚入力による応答が記録されず,代わりに三叉神経から強い入力が見出された.以上から,発達に伴ってM細胞への感覚入力投射が再編成されることと,M細胞の興奮性が変化することが示唆された.本研究では,脊椎動物の分節に繰り返して発現するニューロンが如何に機能的に分化し,相互に関係して機能的な回路を構築しているかを理解することを目的とした.具体的には,ゼブラフィッシュの後脳に存在する網様体脊髄路(RS)ニューロンの特異的な興奮性を決定する因子,逃避運動中の活動,逃避運動の発現に必要な感覚入力の形成過程について調べ以下の知見を得た.

(1)ゼブラフィッシュのRSニューロンのうち最大の大きさを持つマウスナー(M)細胞は,他のRSニューロンと異なり,単発の活動電位しか発生しない.この特異的な興奮性は受精後90時間以降で獲得される.(2)M細胞の単発発火特性の獲得に対応して,低閾値型カリウムチャネルKv1がM細胞の軸索初節部の膜に表出する.(3)M細胞は聴覚入力による逃避運動において活動し,またその活動がなければ最も早い逃避運動は起こらない.M細胞の隣の分節に存在し,M細胞と形態学的に相同なRSニューロンは,触覚入力による逃避運動で活動し,聴覚入力による逃避運動ではむしろ活動が抑圧される.すなわち,M細胞と相同ニューロンは逃避運動において,相補的な役割を果たしている.(4)M細胞の活動にとって,もっとも重要な入力である聴覚人力の発達について,M細胞や感覚神経にGFPを発現するトランスジェニック・ゼブラフィッシュを活用して,電気生理学的・形態学的に調べた結果,M細胞が音に応答するよりずっと前に,機能的な聴覚回路は形成されていて,内耳の有毛細胞が音による振動を電気信号に変換する過程が,M細胞の聴覚獲得の時期を決めることを見出した.成果の(3)と(4)については2報のJ.Neurosci.に発表した.
神経症状を示す家兎モデルを用いた脳血管攣縮の病態・治療法の関する実験的研究 ー特にエラスタ-ゼ投与効果についてー

1.くも膜下出血モデル家兎の病態に関する検討(1)両側頸動脈循紫2週間後の家兎に、大槽内自家血2回注入法によるくも膜下出血を作成、3ー4日後に脳底動脈を中心とした血管攣縮および片麻痺などの神経症状(約60%)を示す動物実験モデルを完成した。(Stroke 19巻に発表)(2)本モデルにおける脳血流量・EEG・SEPの変化につき検討した。脳血流量は症状出現時、コントロ-ル例に比し約30%の低下を認めた。SEPもほぼ同様の変化を示し、本病態が血管攣縮による虚血性変化に起因することが推察された。(Stroke投稿中)(3)病理組織変化に関する検討では、攣縮血管には内膜・中膜の器質的変化を認めたが、脳実質の梗塞病変の出現は約6%にとどまり有意の差は確認できなかった。(4)以上の結果より、本モデルは高頻度に神経症状の出現を認める注目すべき実験モデルではあるが、その変化は一過性で明らかな梗塞病変の形成は得られず、尚不十分の点が多い。そこで注入物質を自家血に加えOxy Homoglobinなどより強い収縮物質に改良し、さらに激症型の実験モデル作成を試みている。2.エラスタ-ゼ製剤投与効果について血管弾性板組織破綻の抑制による血管攣縮予防効果を期待して、エラスタ-ゼ製剤投与実験を本モデルを用いて行なった。しかしながら本剤投与により症状出現の頻度はやや抑制の傾向は認めるものの、脳血管写所見・脳血流量・病理所見には有意の変化は認められなかった。他剤併用など、再検討中である。1.くも膜下出血モデル家兎の病態に関する検討(1)両側頚動脈結〓2週後の家兎40羽に,大槽内自家血2回注入法により,くも膜下出血を作製し,約半数に脳血管攣縮が原因と考えられる,片麻痺などの神経症状が出現した.(2)未処置群・頚動脈結〓群・くも膜下出血群にわけ,大脳皮質領域の脳血流量を測定比較した.正常群に比し,頚動脈結〓群で1020%,くも膜下出血群で3050%の血流低下が観察された.特に脳血管攣縮によると考えられた一側性神経症状を有する例で,患側に一致した有意の差をもつ血流の低下を認めた.高血流測定には,当初レーザー血流計の利用を予定していたが,予備実験により同器の安定性・再現性に問題が多く,今回の測定は主として水素クリアランス法により行なわれた.(3)病理組織学的検討では,脳血管・脳実質の所見共に,著しい変化を示した例は少数にとどなった.しかし血流低下の著明な部位に一致して,大脳皮質に散在性の神経細胞変性所見を認め,また比較的高頻度に海馬CA1のいわゆるdelaged neuronel deathの所見を認めた.脳底動脈血流域の変化は一例も認められなかった.酵素抗体法なども加え,現在より詳細な検討を行なっている.(4)脳波所見も血流低下・病理組織変化にほぼ一致した変化を示したが,その変化は比較的軽度であった.2.エラスターゼ製剤投与効果に関する検討エラスターゼ製剤投与法に関する検討を行なってきた.しかし現在のとこ3報告すべき実績をあげるにはいたっていない.本年度は、実験モデルの病態研究の総括およびエラスターゼ製剤投与の意義につき検討を行なった。1)神経症状を示す家兎実験モデルについて我々が作製に成功した、クモ膜下出血家兎実験モデルは、出血45日後に四肢麻痺などの神経症状を示す、より臨床例に近いものである。本モデル作製法および症状・血管写変化に関する論文がStrokeに採用掲載された。また本モデルの病態、意義につき脳血流量・SEP・病理所見より検討を続け、その結果を第14回日本脳卒中学会で報告した。

特に神経症状に一致して患側大脳領域の血流低下が証明されており、本モデルの有用性を示す結果であったと考えている。病理所見では明らかな器質的病変を認める例は稀で、本モデルの神経症状が一過性である事実に良く一致した。より重症の病態モデル作製を課題とし、現在研究を継続中である。2)エラスターゼ製剤投与効果についてエラスターゼ製剤の血管攣縮予防効果、特に血管弾性板組織破綻の抑制を期待し、動物実験より検討を開始した。エラスターゼ製剤で現在一般的なものは経口薬に限られており、今回の検討では特注の注射薬を使用した。まず2mg/kgを実験一週間前より筋肉内投与の後、クモ膜下出血実験を行ない、誘発される脳血管攣縮の程度と病理所見につき薬剤非投与例との差異を比較した。結果は残念ながら、本剤投与の有意性を示すものではなかった。薬剤投与法の再検討を中心に研究を続けている。1.くも膜下出血モデル家兎の病態に関する検討(1)両側頚動脈結紮2週間後に大槽内自家血2回注入法によりくも膜下出血を作製した家兎の病態につき検討を継続した。本モデルは出血作製後3-4日目に明らかな脳血管攣縮(脳血管写所見)および神経症状の出現を認める。これらの変化は脳血流量の変化とも一致し、虚血性の変化に起因することを既に明確にしてきた。今年度は特に病理組織学的検討を中心に行なった結果、攣縮のおこった脳底動脈を中心に血管壁自身には、中膜筋細胞の壊死・中膜の変性肥厚・種々の細胞浸潤などの変化が顕著であった。しかし脳実質の梗塞性病変の出現頻度は6%の例に認められたのみであった。GFAP免疫染色法などの検討も行なったが、くも膜下出血群と非出血群の間に有意の差を認める結果は得られなかった。2.エラスタ-ゼ製剤投与効果に関する検討くも膜下出血作製家兎において、エラスタ-ゼ製剤投与による血管攣縮はおよびそれに伴う神経症状抑制効果につき検討した。種々の投与法投与量により検討を行なった結果、症状出現はやや抑制される傾向を認めたものの、明らかな有用性は確認できなかった。3.モデルの改良および薬剤投与効果の再検討以上の不十分な結果は、作成したモデル病態が脳の器質的病変をひきおこすまでには到らぬ一過性の変化のみであることが主因である。このためより強い変化出現を目的に、自家血に加え、Oxy Hemoglobin,PAFなどより強い収縮物質の注入を行い、モデルの改良を行ない、興味ある結果を得ている。薬剤効果の再検討を含め研究を継続している。
心筋細胞の再プログラミングによるバイオペースメーカーの作製

超高齢化社会を迎え、完全房室ブロックや洞機能不全症候群などの徐脈性不整脈に罹患する患者は増加の一途をたどっている。そこで新たな治療戦略として、心臓ペースメーカー細胞に特異的に発現する転写因子を固有心筋細胞に遺伝子導入し、固有心筋細胞をペースメーカー細胞へと直接再プログラミングし、人工的なバイオペースメーカー細胞を作成することを試みた。まず50匹のC57BL6マウスから洞房結節を切除し、total RNAを採取した。これをテンプレートとしてssDNAを作成し、アジレント社のマイクロアレイを使用して遺伝子の発現プロファイルを右心房筋と比較した。その結果、洞房結節で発現量の高い転写因子28種、低い転写因子16種を同定した。このうち特に発現量の高いもの5種類(X,shox2,Isl1,Tbx3,Tbx18)のC端に蛍光蛋白質を融合したcDNAを作成した。これをアデノウイルスベクターにより培養心筋に遺伝子導入し,洞房結節のマーカー遺伝子であるHcn4の発現量変化を測定した。逆に洞房結節で発現量の低いNkx2.5およびNRSFに関しては、siRNAの遺伝子導入により遺伝子ノックダウンを行った。その結果、NRSFのノックダウンに加えてShox2もしくは転写因子Xを過剰発現した場合のみ、Hcn4の発現量が増加した。遺伝子ノックダウンについてはoff-target効果を除外するために、NRSFコンディショナルノックアウトマウスを入手し、現在実験を継続中である。予備実験では上記の結果を支持するデータが得られている。さらに大規模かつ高効率のスクリーニングを実施するために、Hcn4遺伝子座へluciferase cDNAをノックインしたマウスを作成中である。このマウスを使って繊維芽細胞などからも再プログラミングを実施し、プレートリーダーを使ってHcn4発現細胞をスクリーニングする予定である。
金属酵素およびモデル錯体の動的構造研究への新しいパルスEPR法の応用

ブルー銅蛋白、チトクロームCとビピリジンルテニウム錯体間、および亜鉛置換ミオグロビンとそのモデル系としてのポルフィリンの亜鉛およびマグネシウム錯体とキノン系電子受容体の間のレーザ光誘起電子移動反応をパルスおよびCW-時間分解EPR法によって検討した。ブルー銅蛋白とチトクロームCの系ではEPR法で観測するための条件の設定で遭遇した困難の解決に時間を費やし、研究は今後も継続されるが、亜鉛置換ミオグロビンとZnTPP、ZnOEPの系で極めて有意義な結果がえられた。特に自作のパルスEPR分光器を更に改良しFT-EPRとして機能するようにした結果、予想を上回る貴重な情報がえられた。これらを要約すると1.CW一時間分解EPR法ではレーザー光誘起による電子移動反応により生ずるポルフィ0リンカチオン、キノンアニオンラジカルとその前駆体であるポルフィリンカチオンーキノンアニオンラジカル対がそれぞれ独立に観測され、それらの生成、消滅過程に対する温度、ポルフィリンの軸配位子に対応する窒素塩基、無機塩の効果、中心金属の効果などの解析をとおして反応過程の詳細を明かにすることが出来た。2.CW一時間分解法では、スペクトルの観測はスピンに異常分極が存在する間に限られる。これに対しFT-EPR法では常磁性分子種が存在する限りスペクトルの観測は可能で、CW法では観測が100nsから数10μsに限られたのに対し、FT-EPRでは約10nsから数100μsにわたり観測が可能でこれにより反応速度定数の決定が可能となりこれに影響する諸因子を検討することができた。3.亜鉛ミオグロビンの系では反応速度定数が遅く、CW法では反応の観測が極めて困難であったが、FT-EPR法での観測に成功し、反応過程を検討することができた。
顎変形症患者の顎口腔機能三次元統合解析システムの構築

外科矯正治療を必要とする患者に対しては、形態異常部位の特定やその程度を知ることを目的として通常の不正咬合者の検査と同じく頭部エックス線規格写真や歯列模型の検査が行われるが、それに加えて全身麻酔下での大掛かりな手術を受けることからComputed Tomography (CT)が撮影される。またこのような重症の顎顔面形態異常患者には種々の顎口腔機能異常が付随していることが考えられるため術前後の機能検査が必須となっているが、両者をまとめた形態と機能の総合的解析システムはまだ報告されてはいない。本研究は患者の顎顔面形態をコンピュータ画面上に三次元で表示し、それを機能検査データに基づいてアニメーションで動かす顎口腔機能の三次元解析システムを構築するとともに、その結果を患者へのインフォームドコンセントにおける分かり易いコミュニケーションツールとして利用することを目的として開始した。平成17年度は、まず正・側方頭部エックス線規格写真の二次元画像から頭部形態の三次元画像を構築する方法とその画像に歯列画像を合体させる方法を報告した(文献1)。一方、口腔内に設置したセラミック真球を媒体として、立体構築したCT(3D-CT)に歯列三次元画像と咀嚼筋MRI画像や顔表面画像を組み入れる方法と、それらの顎変形症患者への応用について報告した(文献1)。現在、三次元頭部画像に顎運動および顎関節動態を表示するシステムについて日本顎変形症学会雑誌とAmer J Orthod & Orthopに投稿中であり、前者は採択が決定している。論文のほかにもここまでの成果は平成17年度に開催された日本矯正歯科学会と日本顎変形症学会にそれぞれ2題ずつ発表しており、前者の学会発表「顎変形症における顎顔面骨格および咀嚼筋形態の三次元的評価」には優秀発表賞が授与されている。顎変形症患者においては、特に顎関節症状を有する割合の多いことが報告され、顎関節症状と顎顔面骨格、歯列咬合面、顎関節部および咀嚼筋の三次元形態や顎運動は、密接な関連があると推測されている。しかしその詳細はまだ明らかでない。本研究の目的は、1)総合的に顎口腔機能を三次元的な分析・診断を行うことができるシステムを確立し、2)顎変形症患者における顎関節症と顎顔面口腔領域の三次元的な形態および顎運動の相互関係を明らかにすることである。本年度においては、顎顔面骨格の3D-CT像に非接触三次元計測装置を用いて計測した歯列模型像を統合し、この統合像に顎運動計測装置(トライメット)によるデータを組み込むことで、形態および顎運動を四次元的に可視化するシステムを構築した。当初の計画通り、3D-CT像と歯列模型像の統合にはセラミック真球を用いた。研究成果は第14回顎変形症学会(於・福岡)、2004年顎関節学会総会(於・新潟)、2004年電子情報通信学会・医用画像研究会、第10回コンピュータ歯科医学会などで口頭発表し、その一部はOrthodontic Waves Japanese Edition、日本医用画像工学会誌、電子情報通信学会信学技報などに論文として発表した。今の段階では視覚的表示にとどまっているため、今後は定量評価法へと発展させて顎変形症と顎関節症との関係を明らかにする計画である。
ワイルド受容の系譜―日本と英語圏諸国との比較研究―

本研究では日本と英語圏諸国に於けるワイルドの受容状況の比較研究を行うことによって、日本に於けるワイルド受容の複数の特徴を明らかにすることができた。また、従来日本で注目度が低かった喜劇作品の受容にも重点を置いた研究を行うことで、より均衡の取れた受容研究を進めることができた。その際、演劇に焦点を当てながらも、ワイルドの戯曲以外の作品受容にまで視野を広げてこそワイルド劇自体の受容の全貌が明らかになるため、作品の幅を広げた多角的な研究を行い、多岐に渡るワイルド受容の諸相について具体例と共に考察を深めた。本研究の「研究の目的」を達成するための本年度の「研究実施計画」に則して、平成24年度は以下のような研究実績を挙げることができた。第一に、国内外のワイルド研究や演劇研究の動向の把握に努めると共に、日本のみならずカナダやアイルランドにおける劇場等での現地取材を含め、研究課題の関連資料の収集・分析を行うことができた。また、ワイルド劇の受容の場として、19世紀後半から現代に至るまでの日本の演劇事情の調査研究を進め、その際、特に島村抱月が日本におけるワイルド受容の初期に如何なる貢献を果たしたのかを追究した。このような研究の一方で、ワイルドによる原作の研究も進め、多角的な研究に努めた。本研究「ワイルド受容の系譜ー日本と英語圏諸国との比較研究ー」の主たる目的は次の二点であった。第一の目的は、オスカー・ワイルドの受容について、日本と英語圏諸国(特にイギリス、アイルランド、アメリカ、オーストラリア)に於ける受容状況の比較研究を行うことであった。第二の目的は、特に日本に於けるワイルド劇の受容史を明らかにすることであった。最終年度には、ワイルドが小説、演劇、映画、舞踊等多分野の作品に与えてきた影響関係について調査を進め、関連資料の収集と分析も随時行った。その際、19世紀末以降一世紀以上に渡る日本でのワイルド受容の変容についても研究を進めた。また、受容のみならずワイルドによる原作についても作品研究を深めた。その研究成果については複数の国際学会で発表を行い、海外の学術誌上でも研究論文を公表した。研究期間全体を通して、日本と英語圏諸国に於けるワイルドの受容状況の比較研究を行うことによって、日本に於けるワイルド受容の複数の特徴を明らかにすることができた。本研究の「研究の目的」を達成するための本年度の「研究実施計画」に則して、平成23年度は以下のような研究実績を挙げることができた。第一に、国内外のワイルド研究や演劇研究の動向の把握に努めると共に、日本のみならずオーストラリアやアイルランドにおける劇場等での現地取材を含め、研究課題の関連資料の収集・分析を行うことができた。以上の研究成果の一端は、共著『比較文化の響宴』(英光社、2011年)において、単著論文「肖像画からバンベリズムへーワイルド作品に於ける「二重生活」の変容ー」(PP.122-133)として発表した。また、平成23年8月7日から12日まで大阪大学で開催されたInternational Federation for Theatre Research (FIRT/IFTR)の国際大会において"WhenJapanese Tradition Meetsa Western "Wit and Dramatist": Early Japanese Reception of Oscar Wilde"と題する研究発表を行った。前者はワイルドの作品研究であり、ワイルドが異なるジャンルの作品を通して「二重生活」のテーマを如何に多角的に展開させたかについて分析した。後者は日本におけるワイルド受容に関する研究であり、特に演劇に焦点を当てて考察を深めた。いずれも本研究の骨子に関わる研究成果と言え、次年度以降の研究活動の礎としても意義深い。三年計画による本研究の主たる目的は次の二点である。第一の目的は、日本と英語圏諸国におけるワイルドの受容状況の比較研究を行うことである。その比較対照により、日本におけるワイルド受容の特徴をも浮き彫りにする。第二の目的は、日本におけるワイルド劇の受容史を構築することである。その際、従来日本で注目度が低かった喜劇作品の受容にも重点を置き、より均衡の取れた受容史の構築を目指す。また、演劇に焦点を当てながらも、ワイルドの戯曲以外の作品受容にまで視野を広げてこそ、ワイルド劇自体の受容の全貌が明らかになるため、ジャンルを超えた多角的な研究を行うこととする。

以上のような研究の目的について、本年度は、第一の目的にあるアイルランド及び北米(カナダ)におけるワイルドの受容状況について、歴史的な劇場等における現地取材及び主要な図書館における資料収集を行うことができ、非常に有意義であった。第二の目的にあるワイルド受容の特徴に関する考察やワイルドによる複数のジャンルの作品の研究についても、具体的に研究を進め、今後の研究についての展望も得ることができた。日本でのワイルド受容については、特に、島村抱月について具体的な調査研究を促進することができた。研究成果は、国際学会における研究発表や研究論文の出版を通して広く公表してきた。それにより、国際的なワイルド研究者や演劇研究者との議論も深めることもでき、国内外での研究活動を通して今後の発展に繋がる新たな知見を得ることができた。以上のことから、当初の計画通り順調に研究が進展していると判断できる。三年計画による本研究の主たる目的は次の二点である。第一の目的は、日本と英語圏諸国(特にイギリス、アイルランド、オーストラリア、アメリカ)におけるワイルドの受容状況の比較研究を行うことである。その比較対照により、日本におけるワイルド受容の特徴をも浮き彫りにする。第二の目的は、日本におけるワイルド劇の受容史を構築することである。その際、従来日本で注目度が低かった喜劇作品の受容にも重点を置き、より均衡の取れた受容史の構築を目指す。また、演劇に焦点を当てながらも、ワイルドの戯曲以外の作品受容にまで視野を広げてこそ、ワイルド劇自体の受容の全貌が明らかになるため、ジャンルを超えた多角的な研究を行うこととする。以上のような研究の目的について、本年度は、第一の目的にあるオーストラリアにおけるワイルドの受容状況について、歴史的な劇場等における現地取材及びオーストラリア国内の主要な図書館における資料収集を行うことができ、非常に有意義であった。また、アイルランドでの受容についても、今後の研究の方向性を確認すると共に、資料収集を行うことができた。第二の目的にある喜劇作品の受容の特徴に関する考察やワイルドによる複数のジャンルの作品の研究についても、具体的に研究を進め、今後の研究についての展望も得ることができた。特に、日本でのワイルド受容について、島村抱月について具体的な調査研究が進められた点も有意義であった。研究成果は、国際学会における研究発表や研究論文の出版を通して広く公表しており、更に、それらを通して今後の発展に繋がる新たな知見を得ることもできた。平成25年度は、平成23年度及び平成24年度に得られた成果を基にして、日本におけるワイルド劇の受容に関する研究総括を行う予定である。それと同時に、受容研究と連動させた形でワイルドの作品研究も行うこととする。特に、従来日本で注目度が低かった喜劇作品の受容にも重点を置き、より均衡の取れた受容史の構築を目指す。
位置・形状の曖昧さを含んだベクトルデータの表現・処理手法に関する研究

地理情報システム(GIS)は地方自治体をはじめとしてさまざまなようとに利用され始めている。しかしさまざまなデータ源からの地図データを総合的に利用しはじめるにつれ、信頼性や精度がまちまちなデータが一緒に解析・利用されるケースが多くなり、分析結果や検索結果の信頼性が影響を受ける例が増えてきている。従来のGISでは、データの曖昧さという概念は全くなく、丸め誤差の範囲の中でデータは正しいと考えられ、その過程をベースとしてデータ構造から検索・分析手法まで構築されていたのが実状であった。本研究ではまず図形的・幾何学的なデータの誤差・曖昧さに着目した。まず幾何学的な曖昧さのある図形(点、線、画)に存在可能性のある範囲を付与することにより、有限な大きさのある点、幅のある線分、にじんだ面といった形で表現した。すると、図形間の位相関係にも曖昧さが生じるので、その曖昧さの程度を判定する手法を開発した。さらに判定された位相関係を基に図形データをデータベースとして構築する手法を開発した。さらに、曖昧さのある図形データを利用した検索や解析機能を実現するために、「位置に曖昧さのある2点間の距離の平均・分散の推定手法」などさまざまな図形要素の組み合わせ間の演算手法を1セットとして開発した。これにより空間的な曖昧さのある図形データを表現し、蓄積・管理し、処理する一連の手法が構築された。、実際の地図データではこれらに加えて、時間経過に伴う対象物の変化による精度の劣化という減少が見られる。これについては、位置的な曖昧さが時間変化するというだけでなく、その対象物自体が存在しなくなるという変化もある。そこで上記のフレームワークに対象物(図形)の存在する確率という曖昧さも導入し、空間的な曖昧さの処理・管理手法を時間的なデータ精度の変化にも対応できるよう拡張した。
エンドリセン変換酵素の精製及び薬理学的研究

平成3年度1.ET-1測定条件の検討。変換酵素の性質を調べたり、精製を試みるには変換酵素活性を測定することが必須である。逆相の高速液体クロマトグラフィーと、ラジオイムノアッセイを組み合せることにより、ET-1を感度良く測定する系を確立した。又、肺、腎、大動脈の順であった。2.ECEの機能的薬理学的研究上述のように、腎臓にもET-1が存在することから、ECEが腎臓に分布する可能性が考えられた。そこで、痲酔下の犬の左側腹切開露出腎動脈にbigET-1を注入し、ET-1と比較しながら腎機能に対する影響を検討した。ET-1を投与すると(0.4pmol/kg/min)、腎血流量、糸球体濾過量、尿量は有意に減少した。ところがbigET-1を腎動注(ET-1と同量)しても腎機能は全く影響を受けななった。また、このときの腎静脈血中のET-1を測定すると、全く変化が認められなかった。これらのことから、bigET-1は腎臓において、活性をもたずET-1に変換されない可能性が示唆された。平成4年度ECEの精製と酵素化学的な検討肺、腎、大動脈にECE活性は認められ、肺が最も高い値を示した。しかし、肺については、すでに報告されているので、大動脈を実験材料に選んだ。大動脈の膜分画にもET-1産生酵素は存在した。至適pHは酸性側と中性付近に認められた。酸性側の活性はpepstatin Aで抑制され、中性付近で観られる活性はphosphoramidon、EDTA等で抑制された。膜分画について、Triton x-100で可溶化することが出来た.しかし、ECE活性は其れほど高くなかった。ECEを精製するには、さらに変換活性が高く且つ精製が容易な臓器・組織(血液を含めて)を検索するか、または、より大型の動物の大動脈からの精製を考慮する必要があると考える。1.各臓器・組織におけるエンドセリン(ETー1)含量の検討ETー1変換酵素(ECE)の臓器分布を知る手がかりとして、各組織におけるETー1の含量を測定した。肺に最も多くのETー1が存在し、次いで腎、大動脈であった。2.エンドセリン変換酵素の機能的薬理学的研究上述のように、腎臓にもETー1が存在することから、ECEが腎臓に分布する可能性が考えられた。そこで、痲酔下の犬の左側腹切開露出腎動脈にbigETー1を注入し、ETー1と比較しながら腎機能に対する影響を検討した。ETー1を投与すると(0.4pmol/kg/min)、腎血流量、糸球体濾過量、尿量は有意に減少した。ところがbigETー1を腎動注(ETー1と同量)しても腎機能は全く影響を受けなかった。また、このときの腎静脈血中のETー1を測定すると、全く変化が認められなっかた。また、培養内皮細胞系においてECEの阻害作用を有するphosphoramidoneを腎動注しても腎機能は有意に変化しなかった。これらのことから、bigETー1は腎臓において、活性をもたずETー1に変換されない可能性が示唆された。3.ECEの精製と酵素化学的な検討

肺、腎、大動脈のホモジェネイトとbigETー1をインキュベ-トし、ETー1への変換を測定すると、その活性は肺が最も高い値を示した。至適pHは酸性側と中性付近に認められた。酸性側の活性はpepstatinで抑制され、中性付近で観られる活性はphosphoramidoneで抑制された。膜分画について、可溶化後同様の活性を測定すると、失活した。今後可溶化剤の選択、使用条件等をさらに検討する必要がある。また、現在さらに、変換活性が高く且つ精製が容易な臓器・組織(血液を含めて)を検索している。ECEの精製と酵素化学的な検討ラット肺、腎、大動脈をhomogenizeしbigET-1を基質にしてET-1がされるかどうか調べると、肺に最も高いエンドセリン変換酵素活性は認めらた。しかし、肺については、すでに報告されているので、大動脈を実験材料に選んで。ラットの大動脈をhomogenizeし遠心分離法で得られるの膜分画にもET-1産生活性は認められた。そこでエンドセリン変換酵素活性に対する種々の阻害剤の影響を調べた。金属キレーターであるEDTA、EGTA、O-phenanthrolinを添加するとその活性は、強く抑制された。又、enkephalinaseの阻害剤であるphosphoramidonを添加しても、抑制された。次ぎに、この酵素のpH依存性を検討した。至適pHは酸性側と中性付近の2つに認められた。酸性側の活性はpepstatin Aで抑制されたことから、この活性はカテプシンD様の酵素であることが示唆された。また中性付近で観られる活性はphosphoramidon、EDTAにより抑制された。これは培養内皮細胞の膜分画ですでに報告されている酵素と良く一致した。さらに、酵素を精製するために、膜分画をTriton x-100で可溶化した。しかし、変換酵素活性は其れほど高くなかった。この酵素を精製するには、さらに変換活性が高く且つ精製が容易な臓器・組織(血液を含めて)を検索するか又は、ラットより大型の動物の大動脈からの精製を考える必要があると思われる。