hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルツハイマー病動物モデルを用いた痴呆の定量化と抗痴呆療法の研究

1.急激なCAT活性低下によるAChの減少に対し,AChE(ACh分解酵素)活性の低下と受容体結合能の増加という代償機構が働いた.2.アルツハイマー病モデルラットでXの脳内移植はCAT活性を高めコリン作動性の神経情報伝達を正常化した.正常のドンリュウ系フットに対し,2週間にわたり条件付けを行った。方法としては,条件刺激音に無作為に(出現率10%)混じた標的音に同期させて600msec後に光刺激または尾部電気刺激を加えるものである。これらの条件付ラットを用いて、イボテン酸処置群(定位脳的に一側腹側淡蒼球にイボテン酸を微量注入してアルツハイマ-型痴呆モデルとする)と未処置群に対して,上記条件付と同様の刺激時における,事像関連電位(ERP)を測定して来た。その結果,未処理群ではERPの潜時は310380msecであるのに対して,処置群では>400msecと著明な遅延を認めた。現在,処置群の数を増やすべく,処置群ラットのERPを測定中である。なお,ラットのERPはヒトのものと胎ど潜時は変わらず,条件何していないラットに対する光および尾部電気シゲキに対しても発生するが,条件付ラットにおけるものと比べ潜時は短く,今後,さらに検討をする予定である.平成4年度は,治療群におけるERPを検索してゆく。平成3年度は動物モデルの確立、痴呆の定量化を、4年度は抗痴呆療法の見当評価を行ってきた。i)動物モデル作成:雄Sprague-Dawleyラットの一側前脳基底核Meynert核にイボテン酸5μg,0.5μLを局所注入した。ii)抗痴呆療法:内科的治療ー病変作成3日後より塩酸Bifemeran(BH)15mg/kgの腹腔内投与を2週間行った。外科的治療ー作成1週後に自家迷走神経下神経節(X)を大脳皮質へ移植した。iii)動物の条件付け:後述する事象関連電位P300の記録のため、BH投与群では投与開始より2週間、移植群では移植手術後2週より(出現率90%の基準音(2kHz)に対し)10%でat randomに出現する標的音(1kHz)に同期して600msec遅れた尾への電気刺激を2週間与え続けた。破壊非治療群と非被壊群にも行った。iv)痴呆の評価:条件付けした動物のP300を記録した。尾へ電気刺激を与えずにP300を記録できた。非破壊群で349.7±22.3msec、破壊非治療群(痴呆モデル)で393.0±25.5msecと両者間に有意差(p<0.001)を認めた。BH治療群で342.4±17.7msecと短縮し、有意な(p<0.001)治療効果を認めた。X移植群でも339.4±25.5msecと有意な抗痴呆効果を認めた。v)脳内muscarine Ach受容体(mACh-R)、acetylcholinesterase(AChE)、choline acetyltransferase(CAT)測定:BH治療群でmAch-Rは破壊群より増加し、AChE、CATはあまり変化なかった。X移植群は現在測定中である。BH治療ではmAch-R結合能の増加によるAch系神経伝導の改善でのP300潜時の短縮が推測される。vi)組織化学的検索:P300測定後、各群の動物の一部に対し4%parafolmaldehydeによる灌流固定した脳をTagoらの方法にてAchE染色している。以上、実験は進行中であり、確実に成果が出て来ている。平成5年度はX移植方法を改良(Meynert核ー大脳皮質間を繋ぐX神経および神経節移植)したモデルを用いて上記の検索評価を行う。アルツハイマー病モデルとして前脳基底核(NBM)破壊ラットに対して自家頸部迷走神経節(以後,X)を脳内移植後,4週間
運動中の認知課題遂行における認知・運動・呼吸循環機能の相互関連性

今年度は、二重課題において認知課題を変化させた場合、すなわち認知課題の種類やその難易度を変化させた時に、二重課題実施時の認知や運動のパフォーマンスが、単一課題実施時と比べどのように変化するかについて、若年者を対象に明らかにしようとした。異なる認知課題として、短期記憶機能を見るメモリー課題、注意機能を見る視覚探索課題、注意機能と短期記憶および実行機能を見るTMT課題を用いた。難易度については、視覚探索課題およびメモリー課題の提示パターンや数を変えることで変化させた。運動パフォーマンスについては、1)認知課題の種類を変えた場合、単独運動時に比べ二重課題時の自転車の回転数の変動係数、つまり回転数のずれが全ての課題で有意に大きくなり、特にTMTで大きく、かつ平均値もTMTのみ有意に遅くなること、2)視覚探索課題およびメモリー課題の難易度を変えても、同様に変化すること、が明らかとなった。一方、認知パフォーマンスについては、1)易しい課題での二重課題は、安静時に比べメモリー課題の反応時間の短縮や、視覚探索課題の誤答率の低下が起こるなど、認知パフォーマンスが良くなる傾向にあること、2)視覚探索課題で課題を難しくした場合とTMT課題については、二重課題で反応時間・誤答率の両認知パフォーマンスが有意に低下し、その低下の大きさはTMTが最も大きいこと、が明らかとなった。以上のことから、二重課題により、1)運動パフォーマンスは認知課題の種類や難易度にかかわらず低下するが、特にTMTで大きいこと、2)認知パフォーマンスは認知課題の種類や難易度によって影響の仕方が異なるが、特にTMTは低下しやすいこと、が明らかとなった。これらことから、TMT課題で特異的な認知機能、すなわち実行機能は二重課題による干渉が最も大きいことが示唆された。倫理委員会で中高年の被験者を加えた申請が承認されるまで、3か月以上かかったこと、および、複数かつ難易度を変える認知課題の設定(提示時間や回答時間など)を決めるのに、かなり予備実験が必要であったことにより、本実験に入るまでに時間がかかった。また、1人の被験者に対し4回の測定があり、若年者20数名、中高年者30名近くの実験のスケジュール合わせが大変で、これも時間がかかる要因となった。若年者については測定が終了し、データ解析を進めているところであるが、中高年者は測定が3分の2が終わったところである。当初の予定では、2018年度中に中高年者の測定も終えることになっていたが、まだ終了していないので、やや遅れている状況である。現在、中高齢者の実験を実施中で、目標人数20人以上をリクルートにより確保している。次のステップとして、本年度は、認知能力の異なる対象者群での二重課題パフォーマンスへの影響の違いを検討することを目的とし、MCI(軽度認知障害者)の人の特徴を明かにすることを当初は予定していた。しかし、健常な中高年の参加者でさえも、実験室に来て課題に慣れるのに時間がかかるなど、実験実施がかなり大変であり、もともと外出したがらないMCIの人を、多人数集めて一人5日間も実験を実施するのは、かなり難しいことが予測された。そこで、中高年者内で認知能力に個人差が大きいことに着目し、今後は中高年の対象者数を増やすことによって、中高年者の中で認知が衰えてきた人(MCIを含む)と認知機能が優れている人の2群に分け、両群を比較することで、認知能力の違いによる影響を明らかにすることにした。歩きながら話をすると歩行速度が落ちるなど、運動と認知の二つの課題を同時に行うと、一方または両方の課題のパフォーマンスは低下する。この二重課題において、一方の課題の種類や難易度を変えると、各課題のパフォーマンスは影響を受けると考えられるが、詳細は明らかにされていない。平成29年度は、その基礎データを収集するため、若年者を用いて運動課題の難易度を変化させた時の、各課題への影響を明かにしようとした。若年男女20名を対象に、自転車エルゴメータで最大の40%強度で好みの回転数を決め、運動の難易度を変えるため、その±10回転/分の速さの3条件を設定した。認知課題は注意・遂行機能を見るTrail Making TestのBを用いた。安静で認知課題を3分間実施し、次に一つの回転数での2分間の運動のみの単一課題試行と3分間の二重課題試行を1セットとし、速さ条件をランダムに変えて3セット実施した。運動パンフォーマンスについては、3条件とも二重課題中に回転数の変動係数が有意に高値を示し、回転がブレやすくなった。さらに特に速い回転数では、設定回転数より遅くなる傾向があるが、3条件とも個人により変化の方向が一定ではなく、有意な変化ではなかった。認知パフォーマンスについては、二重課題中の誤答率が3条件とも有意に増加し、運動の難易度が上がると間違えやすくなった。反応時間は、回転数が速い場合に遅くなる傾向が認められたが、3条件とも個人により早くなる場合と遅くなる場合があり、一定の傾向は認められなかった。各個人の回転数の変化と反応時間の変化の関係を見ると、全体では一定の傾向はないが、各個人では、例えば二重課題ではいつも回転数が速くなって反応時間が遅くなるなど、個人により両課題の変化の仕方が3条件でほぼ同じ傾向が認められた。若年者では二重課題に対する個人のストラテジーが決まっていることが推察された。生命倫理審査委員会の承認が遅れ、それにともない予備実験の開始も遅れたため、本実験の開始が2017年11月からと少し出遅れた。

しかし被検者が順調に集まり、2018年3月までに目標数の20名分の実験ができた。分析もおおむね終了し、ほぼ予定通りのスケジュールとなった。さらに、年度末の3月からは次年度の予備実験も開始しており、おおむね順調であると言える。今年度は、二重課題において認知課題を変化させた場合、すなわち認知課題の種類やその難易度を変化させた時に、二重課題実施時の認知や運動のパフォーマンスが、単一課題実施時と比べどのように変化するかについて、若年者を対象に明らかにしようとした。異なる認知課題として、短期記憶機能を見るメモリー課題、注意機能を見る視覚探索課題、注意機能と短期記憶および実行機能を見るTMT課題を用いた。難易度については、視覚探索課題およびメモリー課題の提示パターンや数を変えることで変化させた。運動パフォーマンスについては、1)認知課題の種類を変えた場合、単独運動時に比べ二重課題時の自転車の回転数の変動係数、つまり回転数のずれが全ての課題で有意に大きくなり、特にTMTで大きく、かつ平均値もTMTのみ有意に遅くなること、2)視覚探索課題およびメモリー課題の難易度を変えても、同様に変化すること、が明らかとなった。一方、認知パフォーマンスについては、1)易しい課題での二重課題は、安静時に比べメモリー課題の反応時間の短縮や、視覚探索課題の誤答率の低下が起こるなど、認知パフォーマンスが良くなる傾向にあること、2)視覚探索課題で課題を難しくした場合とTMT課題については、二重課題で反応時間・誤答率の両認知パフォーマンスが有意に低下し、その低下の大きさはTMTが最も大きいこと、が明らかとなった。以上のことから、二重課題により、1)運動パフォーマンスは認知課題の種類や難易度にかかわらず低下するが、特にTMTで大きいこと、2)認知パフォーマンスは認知課題の種類や難易度によって影響の仕方が異なるが、特にTMTは低下しやすいこと、が明らかとなった。これらことから、TMT課題で特異的な認知機能、すなわち実行機能は二重課題による干渉が最も大きいことが示唆された。倫理委員会で中高年の被験者を加えた申請が承認されるまで、3か月以上かかったこと、および、複数かつ難易度を変える認知課題の設定(提示時間や回答時間など)を決めるのに、かなり予備実験が必要であったことにより、本実験に入るまでに時間がかかった。また、1人の被験者に対し4回の測定があり、若年者20数名、中高年者30名近くの実験のスケジュール合わせが大変で、これも時間がかかる要因となった。若年者については測定が終了し、データ解析を進めているところであるが、中高年者は測定が3分の2が終わったところである。当初の予定では、2018年度中に中高年者の測定も終えることになっていたが、まだ終了していないので、やや遅れている状況である。当初の予定通り、平成30年度前半は、二重課題で認知課題を変えた時の各課題のパフォーマンスに及ぼす影響を探る実験を、若年者を対象に実施する。3種類の異なる認知機能を見る認知テストを作成し、昨年度と同様のプロトコルで実験を実施する。認知課題のみ条件、運動課題のみ条件に対し、二重課題条件で、どの認知課題の時に最も影響を受けるかなどを検討することにより、認知課題の違いが二重課題のパフォーマンスに及ぼす影響を明らかにする。同時に呼吸循環応答も測定し、どの認知課題の影響を受けるかも検討する。
鎮痛薬の副作用発現におけるヒトに固有の遺伝子制御機構の解明

ヒトとげっ歯類では大半の相同遺伝子やDNA領域を有し、ヒト疾患のモデルとしてげっ歯類は有効な実験動物であるとされてきた。しかし近年、げっ歯類とヒトにおける脳機能や治療薬奏効の違いから、脳・神経系における分子動態についてげっ歯類とヒトとの違いを明らかにする必要性が高まっている。本研究では、スウェーデン研究機関との共同研究により、ヒト死後脳について脳領域別に全ゲノム遺伝子発現解析・DNAメチル化解析など多層的解析を行い、麻薬性鎮痛薬により引き起こされるヒトに固有の遺伝子制御機構を明らかにする。
口腔癌に対するサイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害剤の細胞増殖抑制効果

本研究では、まず、癌で生じている細胞周期関連因子の異常を口腔癌臨床材料において検索した。その結果、口腔癌でCDK2の発現異常が認められ、その過剰発現がN分類(p=0.025),腫瘍分化度(p=0.032)および腫瘍浸潤度(p=0.017)関連し、予後とも相関することがわかった(Jpn. J. Cancer Res,2001,Oral Oncol. In press,2002)。この結果から、CDK2に対する阻害剤が細胞周期を制御することによる新しい抗腫瘍剤として応用できるのではないかと考え、口腔扁平上皮癌細胞株におけるCDK阻害剤(RoscovitineならびにFlavopiridol)の抗腫瘍効果について検討した。その結果、11種類の口腔癌細胞株(HSC2,HSC3,HSC4,Ca9-22,SCC15,SCC25,SCC66,SCC105L, SCC111,BSC, NAN2)において,CDK阻害剤を添加することで濃度ならびに時間依存的にその細胞増殖を抑制することがわかった。また、正常上皮培養細胞株であるHaCaTにおいては、増殖抑制効果は認められなかった。CDK阻害剤により、各癌細胞にはサイクリンA,サイクリンB、CAK, CDC25Cの発現低下が見られ、CDK1およびCDK2活性は減弱を認めた。細胞周期の解析では、G1期ならびにG2/M期への細胞の集積が認められるとともに、subG1期への細胞集積を認めた。このSubG1期の細胞集積はDNA断片化、PARPのcleavageより、アポトーシスの誘導によるものであると考えられた。また、CDK阻害剤による口腔扁平上皮癌のアポトーシス誘導にはBCL-2,Baxは関与せず、Bcl-Xが関与していた。以上の結果から、CDK阻害剤は口腔癌の細胞周期制御を介した新しい治療法になる可能性が示唆された(日本癌学会総会2001)。1.各種口腔扁平上皮癌細胞株におけるin vitroでのCDK阻害剤による増殖抑制効果各種口腔扁平上皮癌細胞株(HSC2,3,4,SCC15,25,66,105L,111,Ca9-22,BSCC,NAN2)にCDK阻害剤Roscovitineを濃度依存性,時間依存性に作用させ,細胞増殖能に与える影響をトリパンブルー色素排除法を用いて検討した。濃度依存的検討の結果,いずれの細胞株においても30-50nMで最大の増殖抑制効果を認めた。次に、Roscovitineの濃度を30nMとし時間依存的な抑制効果について検討したところ,細胞死の誘導の発現時期に相違を認めた。2.細胞周期に対する影響とそのメカニズムの解析(1)CDC2,CDK2,CDK4およびCDK6の活性抑制効果の検討:CDK活性の抑制効果は,Roscovitineを時間依存性に作用させ各抗体で免疫沈降後,そのリン酸化活性を計測した。CDC2およびCDK2活性は時間依存的に減少したが,CDK4およびCDK6活性に関しては減少は認められなかった。(2)細胞周期の解析:細胞周期の解析にはPI染色法を用いたDNAヒストグラムの解析により行った。その結果,いずれの細胞においても核の断片化を示すsub-G1期の細胞数の上昇を認めたが,その発現時期は明確な細胞周期の停止を認めず速やかに生じたものと,まずG2/M期停止後に誘導された細胞があった。

(2)アポトーシス誘導に関する検討:DNA fragmentation及びウェスタンブロット法によるPARP cleavageの検討にて上記のsubG1期の細胞がアポトーシスを誘導していることを確認した。また、これらの細胞で,アポトーシスの発現時期の違いによりbcl-x,bcl-2の発現様式に違いを認めた。本年度は、11種類の口腔癌細胞株(HSC2,HSC3,HSC4,Ca9-22,SCC15,SCC25,SCC66,SCC105l,SCC111,BSC,NAN2)において,CDK阻害剤Flavopiridolの影響を検討した。各細胞に、Flavopiridolを添加することで濃度依存性細胞増殖抑制効果を認め,そのIC_<50>値は100300nMであったまた,Flavopiridolの抑制効果は300nMで有効であっため,この濃度で時間依存性増殖抑制効果を検討した。その結果、すべての細胞株において時間依存性効果を認め、24時間以内に細胞死と思われる細胞数の減少が認められた。しかしながら正常上皮培養細胞株であるHaCaTにおいては、増殖抑制効果が認められなかった。CDK阻害剤は、各細胞にCDK1およびCDK2活性の減弱を生じさせた。細胞周期解析により認められたsub-G1期細胞がアポトーシス細胞であることを確認するために,Flavopiridolを作用させた細胞にアガロースゲル電気泳動法によるDNA断片化およびウェスタンブロット法によるPARPの検出を行った。アガロースゲル電気泳動法による検討においては,sub-G1期細胞の出現時期に一致してDNAの断片化を認め,PARPの活性化による85kDaの活性型の出現も同様の時期に認めた。また、アポトーシスの誘導のみならず、各細胞においてサイタリンA,サイタリンB、CAK, CDC25Cの発現低下が見られた。また、CDK阻害剤による口腔扁平上皮癌のアポトーシス誘導にはBCL-2,Baxは関与せず、Bcl-Xが関与していた。以上の結果から、CDK阻害剤は口腔癌の細胞周期制御を介した新しい治療法になる可能性が示唆された(日本癌学会総会,2001)。
Steroid Sulfatase活性の局在と発現およびその異常

Steroid sulfatase(STS)は、ステロイドホルモン合成に作用する酵素である。STSにより合成されるステロイドホルモンの細胞増殖、分化、発生に及ぼす影響が報告されているが、本酵素の器官内分布、細胞レベルでの活性や機能については明らかでない。われわれは、電顕レベルでの組織化学的検出法、免疫化学的方法で、局在と機能について研究を進めてきた。一昨年度は、STS cDNA(exon 10)をprobeとしたin situ hybridization法を導入し、STSの局在をmRNAで観察することを可能にし、昨年度は、ヒトSTS cDNA cloneから酵素活性をもつ2.4Kbの一部分のSTS peptideを合成し、STS peptide抗体を作成した。本年度は、作成した抗ヒトSTS抗体を生かして、ヒト腎組織の広範囲な局在について検討可能であったため、腎組織内STS活性が高いことがわかってきた女性の腎癌に焦点をあて研究を進めた。女性の腎癌周囲組織に、強い陽性所見が認められた。STS活性は、近位尿細管のendoplasmic reticulumに広範囲に認められた。電顕では、ミトコンドリアの間、一部粗面少胞体に、mRNAが観察された。In situ hybridization法で、mRNAの発現が見られることから、近位尿細管で、STSが産生されていることが明らかであり、腎での細胞増殖に関与すると考えられた。STS-geneの存在部位は、LyonらのX inactivationをescapeすることなどが解かっており、現在、腎癌部分、周囲組織、健常組織のgenomic DNAを分離し、STS転写調節領域とgenomic omprintingに焦点をあて、なぜ、女性のみが強く発現するかについて検討を進めている。Steroid sulfatase (STS)は、ステロイドホルモン合成に作用する。近年、STSの遺伝子レベルでの解明が急速に進み、また、ステロイドホルモンの細胞増殖、分化、発生に及ぼす影響が明らかになりつつあるが、本酵素の器官内分布、細胞レベルでの局在や機能については明らかでない。われわれは、電顕レベルでの組織化学的検出法、モノクロナール抗体による免疫化学的方法で、STS活性局在、機能について明らかにすることを目的としてきた。本年度は、新たに、in situ hybridization法を導入し、STSの局在をmRNAで観察することを可能にした。lambdagtllにSTScDNAを組み込んだプラスミド(p422)をEcoRlで処理して2.7Kbの部分を精製してdigoxygeninをラベルし、プローブとして用いた。切片は、4%glutalaldehyde-30%sucroseで固定し、前処理した後、hybridizationし、5nm金コロイド標識-抗digoxygenin抗体でラベルし、silber enhansingした。光顕所見は、epipolarised light下で観察した。腎では、皮髄境界に強い局在を認め、proximaltubule、proximal convoluted tubule、糸状体のepithelialcell、Bowman′s capsuleの一部にSTSmRNAの発現が見られた。電顕では、proximal tubuleのmitochondriaに接近するendoplasmic reticulumにparticleが観察された。産生されるSTSが、活性型であることを確かめるため、4-methylumbelliferyl sulfateを基質としたenzyme-histochemistryを行なった結果、mRNAが存在する部位に一致して活性が見られ、腎で産生される本酵素は活性型であることが明らかであった。本研究の一部は、ISICR Annual meeting(1993年)で発表した。子宮においては、健常組織では観察されず、子宮筋腫で活性がみられた。子宮内膜のfibroblast、筋層の結合組織、子宮腺上皮に認められた。副腎網状体、肝細胞でもmRNAが発現しており、活性化されたSTSにより、性ステロイドホルモンが産生されて、細胞増殖などの機構に作用する可能性があり、分子生物学的なswitchのon and offについて研究を進めている。

Steroid sulfatase(STS)は、ステロイドホルモン合成に作用する酵素である。近年、STSの遺伝子レベルでの解明が急速に進み、STS-geneの存在部位は、LyonらのX inactivationをescapeすることなどが解かってきた。また、STSにより合成されるestradiolなどステロイドホルモンの、細胞増殖、分化、発生に及ぼす影響が報告されつつあるが、本酵素の器官内分布、細胞レベルでの活性や機能については明らかでない。われわれは、電顕レベルでの組織化学的検出法、免疫化学的方法で、STS活性局在と機能について明らかにすることを目的とし、昨年度は、STS cDNA(exon 10)をprobeとしたin situ hybridization法を導入し、STSの局在をmRNAで観察することを可能にした。本年度は、STSのcentral dogmaの解明に向けて、ヒトSTS cDNA cloneから酵素活性をもつ2.4Kbの一部分のSTS peptideをMAP法にて合成し、STS peptide抗体を作成した。この結果、腎では、皮髄境界に強い局在を認め、ステロイドホルモンの産生、標的組織として注目されているproxymal tubule、proxymal convoluted tubule、あるいは、糸球体のepithelialcell、Bowman's capsuleの一部にSTSが関与することが明らかとなった。本研究の一部は、US-Japan Histochemistry(1994年)で発表した。子宮においては、子宮内膜のfibroblast、子宮腺上皮にSTS活性が認められた。副腎網状体、肝細胞でもmRNAが発現している。STS cDNA(exon 10)をprobeとして用いたnortherntechnicによる結果では、9.2-2.7Kbの間に5つのbandが認められ、splicingの差により,各組織のSTSの活性が規定される可能性があり,これについても研究を進めている。Steroid sulfatase(以下STS)は、strage typeのestrone sulfateをactive formのestroneに変換する酵素である。STSは、ヒト胎盤の合胞体栄養細胞に存在し、母児間のestrogenの調節をつかさどる。Xp22.3に遺伝子座をもち、胎盤の酵素活性が欠損した場合は、伴性遺伝性魚鱗癬を生ずる。胎盤以外にも子宮筋腫や乳癌組織に存在する。近年、性steroid hormoneは、細胞増殖やcancer inductionに関与することがわかってきた。
繊毛局在キナーゼによる繊毛形成機構とその生理学的意義の解明

内耳において聴覚を司る蝸牛にはコルチ器と呼ばれる感覚装置があり、外有毛細胞、内有毛細胞、支持細胞より構成される。有毛細胞頂面には1本の動毛とV字型もしくは弧状に配列した不動毛が構築されており、平面内細胞極性(planar cell polarity; PCP)を形成している。今回私たちは繊毛局在キナーゼICKが欠損したマウスと内耳特異的ICK欠損マウスの解析を行った結果、ICKは蝸牛有毛細胞の動毛や支持細胞の繊毛において蛋白質輸送を制御し、有毛細胞のPCP形成や支持細胞の繊毛形成に関与することが明らかとなった。さらにPCP障害が聴覚障害の一次的な原因となり得ることが示唆された。蛋白質リン酸化による繊毛形成制御の生理学的意義を明らかにするために、以前私たちが繊毛内輸送を制御することを明らかにしたセリン・スレオニンキナーゼICKが欠損したマウスを用いてICKの内耳有毛細胞での機能解析を行った。まず免疫組織化学染色により内耳有毛細胞においてICKの欠損による平面内細胞極性因子Vangl2やDvl2などの細胞内局在を調べたところ、コントロールマウスと比較してこれらの因子の局在に明らかな変化は認められなかった。ICK欠損マウスは新生児致死となり成体マウスでの解析ができないため、ICK floxマウスと内耳有毛細胞でCreを発現するPax2-Creトランスジェニックマウスを掛け合わせた。このマウスにおいてもICK欠損マウスと同様に免疫組織化学的解析や走査型電子顕微鏡を用いた解析により、有毛細胞において動毛の根本と不動毛の位置関係がずれているものが存在し、不動毛の配置も乱れていることを見出した。このコンディショナルノックアウトマウスを用いて聴性脳幹反応(ABR)を測定したところ聴力の低下が認められた。これらの結果から蛋白質リン酸化による繊毛内輸送が内耳有毛細胞の不動毛の形成と正常な聴覚機能獲得に必要である可能性が示唆された。今後は、ICKコンディショナルノックアウトマウスにおいて歪成分耳音響放射(DPOAE)を測定することによりICKの欠損が聴力に与える影響をより詳細に検討する。また、ICKの欠損による内耳有毛細胞での繊毛内輸送への影響を免疫組織化学染色、電子顕微鏡を用いて解析する予定である。本研究により、繊毛の形成や機能異常による難聴の発症メカニズムが明らかになり、治療法の開発へと繋がることが期待される。平成27年度は、免疫組織化学染色を行って内耳有毛細胞においてICKの欠損による平面内細胞極性因子Vangl2やDvl2などの細胞内局在を調べた。また、内耳においてICKを欠損したマウスを作製し聴性脳幹反応(ABR)を測定したところ聴力の低下が認められた。これらの解析により、蛋白質リン酸化による繊毛形成制御の生理学的意義の解明が進んだ。階段状に配列した不動毛が一定方向に倒れることにより聴覚が受容されることから、有毛細胞のPCPは聴覚機能の成立に重要であると考えられている。以前私たちは、セリン・スレオニンキナーゼICKが繊毛内蛋白質輸送を制御することを明らかにした。今回私たちはICKに着目して、繊毛蛋白のPCP形成への関与、PCP障害が聴覚機能に及ぼす影響を調べた。胎生期においてICK欠損マウスでは蝸牛管の長さが短縮し、外有毛細胞の列の数が増加していた。また、ICK欠損マウスでは動毛の位置異常や不動毛の配列異常が見られ、動毛と不動毛の位置が有意に解離していた。コントロールマウスでは繊毛の軸糸と基部に繊毛内輸送を担う蛋白質IFT88が局在していたのに対し、ICK欠損マウスでは繊毛の先端と基部に局在し軸糸への局在は減少していた。さらにICK欠損マウスでは、支持細胞の繊毛が有意に伸長していた。内耳特異的ICK欠損マウスを用いて聴覚機能を評価したところ、低音域に難聴を認め、頂回転から中回転にかけて基底小体の位置異常および不動毛の配列異常が見られた。蝸牛の周波数特性よりPCP障害の部位と聴覚の障害される周波数が一致していた。以上より、ICKは蝸牛有毛細胞の動毛や支持細胞の繊毛において蛋白質輸送を制御し、有毛細胞のPCP形成や支持細胞の繊毛形成に関与することが明らかとなった。今後、内耳有毛細胞のPCP形成における詳細な分子機構が解明されることが期待される。今回私たちは繊毛局在

キナーゼICKが欠損したマウスと内耳特異的ICK欠損マウスの解析を行った結果、ICKは蝸牛有毛細胞の動毛や支持細胞の繊毛において蛋白質輸送を制御し、有毛細胞のPCP形成や支持細胞の繊毛形成に関与することが明らかとなった。さらにPCP障害が聴覚障害の一次的な原因となり得ることが示唆された。今後は、内耳においてICKが欠損したマウスの歪成分耳音響放射(DPOAE)を測定することによりICKの欠損が聴力に与える影響をより詳細に検討し、ICKの欠損による内耳有毛細胞での繊毛内輸送への影響を免疫組織化学染色、電子顕微鏡を用いて解析する予定である。神経科学
走査トンネル顕微鏡を用いた圧縮センシングによるマグノン分散関係計測

スパイラルスピン構造を示すMn/W(110)磁性薄膜上において、スピン分極した非弾性トンネル過程により、同薄膜中のマグノンに由来すると思われる信号を検出することに成功した。スピン方向を反転させることによる信号強度がスピン励起と考えることでうまく説明できることから、マグノン励起によるものと結論している。しかもその信号強度の面内分布測定から、散乱体近傍における定在波を観測しており、その波数測定からマグノンのエネルギー分散測定が走査トンネル顕微鏡(STM)により局所的に観測できる可能性を示すことができた。これまでのSTMでは、電子状態の定在波観測により局所領域における電子状態の分散関係が観測され、物質科学の発展に大いに貢献してきたが、今回の研究で、励起プロセスであるマグノンやフォノンの分散関係測定にも展開される可能性が示唆され、更なる展開が期待される。さらに観測されたマグノン波数から、その定在波生成にはマグノンのカイラリティが関与していることが明らかとなった。マグノンのカイラリティは、同薄膜のスピンスパイラル構造や基板由来のジャロシンスキー・守谷相互作用を反映したものであり、これらがマグノンにおいても、重要な役割を担っている可能性を示すことができた。今後、実験結果の解釈を更に推進させ、その成果を公開していく。さらには、測定方法にも工夫を凝らすことによって、測定の迅速化・高効率化を実現し、局所マグノン分散計測手法として確立させていく計画である。得られた実験結果の解析にしばらくの時間を要したが、年度末にかけて国内外の研究者との共同研究を通じて、その解釈を大いに進展させることができた。さらには、測定方法にも工夫を凝らすことによって、測定の迅速化・高効率化を実現していく予定である。当初の予定では、実験装置の使用状況のタイミングを計り適宜装置の改良を進める計画であったが、測定の都合上継続して測定を続けたほうが良いと判断し、改良を次年度に廻すこととした。このため装置改良等に係る費用に関しては次年度に使用することとなった。
癌化関連遺伝子の特異的発現機構

本研究グループは細胞の癌化に伴って発現性の著しく変化する遺伝子の発現変化の機構を明らかにすることによって癌細胞の遺伝子発現の異常性の本質にアプローチすることを目的として編成された。本年の研究成果は次の通りである。渡辺はIgHのエンハンサーの1つHE_2に結合する核内因子の精製に成功し、その部分アミノ酸の決定より、DNAプローブを合成しcDNAクローニングの実験を始めた。鈴木はフィブロインとセリシンのエンハンサーに働く核内因子の同定を行い、セリシンのエンハンサーの1つに働く因子のクローニングに成功し、構造解析を行っている。酒井はGST-P遺伝子上流にTPAに応答して働くTREの存在することを明らかにし、この要素に働くことの知られているc-JunのcDNAクローンを分離してTREとの相互作用と転写との関係を調べる実験を始めつつある。長田はG-CSF遺伝子の発現調節にかかわる3つの領域のあることを明らかにし、これらの領域に特異的に働く核内因子の存在を確認した。藤井はPー450c遺伝子に性質の異なる2つの制御領域が存在することを明らかにし、各々の領域に働く因子の性質を検討し、構成的発現に働く核内因子の精製とクローニングを行っている。堤はアルドラーゼβ遺伝子の発現に必要な2つの領域を決定し、1つの領域に働く因子の制御領域への結合がその部分のメチル化によって阻害されること、この因子の結合と転写の活性化とが密接に関係していることを示した。遠藤は癌特異的に発現するレトロウィルス様構造の遺伝子クローンを分離して、プロモーター活性を検討している。岡田(典)はint遺伝子の分離を行い、西郷は転移性因子tomの挿入により惹き起されるアナナスショウジョウバエの複眼形成異常の機作を分子レベルで検討している。岡田(典)は活性化rasによる癌化細胞のアザチロシンによる正常復帰現象の機作の検討を行っている。
脳卒中患者における蛋白同化ホルモンの筋力に及ぼす効果の検討

【目的】蛋白同化ホルモン(AS)投与により筋力が増加したという報告がある。昨年の研究では,AS投与前のFIMM点数が高ければ,投与後の筋力増加割合が高い傾向があり,日常活動量によりASの効果が異なることが示唆された。しかし,脳卒中患者の場合は麻痺側筋力が測れないことが多い。今回我々は,AS投与を行った脳卒中片麻痺患者において筋断面積と筋力を測定し,データの互換性を検討した。【対象】2005年2月から10月に当院回復期リハビリ病棟に入院した脳卒中片麻痺患者中,同意を得られた男性8例(平均年齢60.1±15.0歳,脳梗塞2例,脳出血6例)。重度の感覚障害,失語,糖尿病,肝障害症例はあらかじめ除外した。【方法】全例FIT (Full-time Integrated Treatment)プログラムに加え,エナント酸メテロノン100mgを週1回計6週筋肉注射した。バイオデックスで膝伸展筋力(角速度60°/秒,以下体重あたりの%としてKM)を毎週測定した。同時に大腿長中点における筋断面積をCTにて2週毎に計測し,筋力との相関,経時的変化率を分析した。【結果】筋力とそれに対応する筋断面積の相関はR^2=0.588であった。断面積の経時的変化では,平均増加量は麻痺側703mm^2,非麻痺側1560mm^2と麻痺側非麻痺側ともに有意に増加したが,増加率は非麻痺側のほうが有意に高かった。【考察】今回の結果より,下肢筋断面積はASの効果判定に有用であることが示唆された。麻痺側筋断面積の増加率が低かったことは,下肢使用量の差による可能性がある。【目的】蛋白同化ホルモン(AS)投与と筋力増強訓練の併用で筋力が増加したという報告がある。今回我々は,脳卒中患者の通常訓練にAS投与を併用し,筋力増強と活動性との関係を検討した。【対象】2004年10月から2005年1月に当院回復期リハビリ病棟に入院した脳卒中片麻痺患者7例(男性4例,女性3例,平均年齢65.7±11.2歳,脳梗塞3例,脳出血4例)。【方法】全例FIT(Full-time Integrated Treatment)プログラムに加え,エナント酸メテロノン100mgを週1回計6週筋肉注射した。バイオデックスで非麻痺側膝の伸展筋力(角速度60°/秒,以下体重あたりの%としてKM)を毎週測定した。活動性としてFIM運動項目(FIMM)を2週毎に計測し,KMとFIMの改善度の関係を分析した。【結果】症例をAS投与前のKMおよびFIMMの点数で,I群(KM<100かつFIMM<50),II群(KM<100かつFIMM≧50),III群(KM≧100かつFIMM<50),IV群(KM≧100かつFIMM≧50)に分類した。I群2例,II群0例,III群1例,IV群4例だった。KMの変化は,I群平均+11.1±12.6%,II群-6.8%,IV群平均+653±42.0%で,IV群で筋力増加の割合が高い傾向があった。FIM1点あたりの筋力増加量には,明らかな傾向はみられなかった。【考察】今回の結果より,AS投与前のFIMM点数が高ければ,投与後のKM増加割合が高い傾向があり,日常活動量によりASの効果が異なることが示唆された。
官能基を考慮したナノカーボン強化複合材料の機械特性の多次元的相関性の解明

カーボンナノファイバー強化複合材料は、ファイバーを添加するによりファイバー未添加のマトリックス材料よりも比摩耗量が小さくなること、並びに、ファイバー添加量に対する比摩耗量の依存性を明らかにした。このとき、比摩耗量の変化は、動摩擦係数の変化と相関関係があった。また、ファイバーへ酸化性溶液による表面処理を施すことにより、カーボンナノファイバー強化炭素複合材料の比摩耗量がさらに小さくなることを明らかにした。ナノカーボンの実用部材への適用をするために、官能基を導入したカーボンナノファイバー(以下、CNFとする)を用いたCNF強化複合材料を作製し、ナノ領域からマクロ領域での摩擦摩耗特性における相関性の知見を得ることを目指している。昨年度の結果から、CNFを用いて作製したCNF強化複合材料の力学試験により、CNFの複合化が材料の機械強度の向上に有効であることが分かった。また、溶液処理により複数の異なった官能基がCNF表面に導入できることも分かった。これらの結果を合わせ、溶液処理により官能基を導入したCNFを用いて作製したCNF強化複合材料に対して、摩擦摩耗試験を行うことによりCNFの複合化ならびに官能基導入の効果について検討した。硫酸、硝酸、過酸化水素水で処理をしたCNFをマトリックスであるガラス状炭素の前駆体の重量に対し、1 wt.%添加することによりCNF強化複合材料の供試体を準備した。摩擦摩耗試験は、ピンオンドラム式摩擦摩耗試験機で計測し、動摩擦係数および比摩耗量を算出した。その結果、官能基を導入したCNFを用いて作製したCNF強化複合材料の初期の動摩擦係数は、単味およびマトリックスであるガラス状炭素のそれらよりも低下した。特に、硫酸処理したCNFで用いて作製したそれに対して、顕著であった。SEM観察より、初期のCNFの引き抜けの量が潤滑に関係していることが示唆された。さらに、官能基を導入したCNFを用いて作製したCNF強化複合材料の比摩耗量も、単味およびマトリックスであるガラス状炭素のそれらよりも低下した。SEM観察より、引き抜けたCNFの保護効果ならびにマトリックス中のCNFが残存することにより、供試体自体の摩耗を防いだためであると推測される。繊維質のナノカーボンであるカーボンナノファイバー(以下、CNFとする)を実用部材へ適用をするために、必要となる主な機械的特性に摩擦摩耗特性がある。CNFの添加量そしてCNFの表面処理が摩擦摩耗特性に与える影響の知見を得ることを目指している。さらに、ナノからマイクロ領域の摩擦特性が、マクロ領域の摩擦摩耗特性に与える影響も合わせて検討している。昨年度までの結果から、0.15.0 wt.%CNF添加したCNF強化炭素複合材料の摩擦摩耗特性は、比較的ランダム配向の状態で、添加量が少量のときに比摩耗量が低く、嵩高くなるにつれ比摩耗量が大きくなったが、どの添加量の試料ともマトリックスであるガラス状炭素の比摩耗量より低くなった。比摩耗量の変化と相関するように、動摩擦係数も変化した。SEM観察より低CNF添加量の複合材料は、摺動後でも表面が滑らかであることが分かった。また、複数の溶液処理により炭素の表面状態を変化させたCNFを使用して作製したCNF強化炭素複合材料の摩擦摩耗特性は、未処理のCNFで作製した複合材料よりも比摩耗量が低くなった。しかし、動摩擦係数の変化と比摩耗量の変化との相関性は見られなかった。SEM観察より、比摩耗量が低くなった原因は、それぞれの溶液処理によりメカニズムが異なることが推測された。つまり、CNFの表面処理の方法により、CNFの引き抜けが起こりにくくなることで比摩耗量が減少することや、CNFが積極的に引き抜け摺動面と試験機の間での潤滑したため比摩耗量が減少することなどが考えられ、それらが動摩擦係数の変化を反映していると推測される。さらに、FFMによりナノからマイクロ領域の摩擦試験を行った結果、その摩擦係数は比摩耗量の変化に対応していた。そして、マトリックス上とCNFとの界面の摩擦係数を比較したところ、全体として界面の摩擦係数が低くなることが分かった。ナノカーボンを強化材として用いた複合材料は、将来、産業基盤となる構造材料として有望視されている。このナノカーボン強化複合材料を作製する上で、ナノカーボンの分散性・配向性・添加量が問題となっている。これらの問題を解決せずに材料評価を行っている研究が散見される。そこで、本研究では、これら問題点を解決し、官能基を考慮したナノカーボン強化複合材料を作製し、ナノからマクロの材料評価に対し多次元的相関性を解明し、実用化への指針を示すことを目的としている。平成23年度は、カーボンナノファイバーを用いて強化プラスチックを作製し、基本的な機械測定を行った。また、各種酸処理により炭素材料表面に結合する官能基について調査した。3wt.%のカーボンナノファイバーを複合化したプラスチックは、三点曲げ試験によるヤング率において単味のプラスチックよりも約1.5倍強度を示した。これによりカーボンナノファイバーが強化材として有効であることが分かった。一方、分散性を考慮するためには、より低添加量で試験を行う必要があることが分かった。

また、酸処理により炭素材料表面に結合する官能基については、硫酸処理では、表面には硫黄原子を含む官能基が検出され、それらが主たる官能基となった。硝酸処理では、表面に窒素を含む官能基は検出されず、各含酸素官能基では炭素ー酸素単結合が徐々に二重結合に変わっていき、主たる官能基となった。過酸化水素水処理では、炭素ー酸素単結合が主たる官能基となった。これらの酸処理による官能基の種類や量は、処理温度70°Cにおいて処理日数2日間でほぼ飽和するため、酸処理は70°Cで2日間が妥当であることが分かった。昨年度のCNFを用いて作製したCNF強化複合材料の機械強度の向上とCNFの添加量および表面処理の各条件の検討した結果を踏まえることで、円滑にCNF強化複合材料の摩擦摩耗試験が行えた。また、昨年度のCNFの溶液処理に対する知見を基に、学会発表も行った。特に、各条件を固定しCNF強化複合材料の摩擦摩耗試験を行うことで、CNF表面への官能基導入の効果を適切に調査することができた。これらの結果を踏まえ、官能基を導入したCNFの添加量を変化させ、昨年度末より実験を行っている。これらの結果は、学会発表に堪える知見が得られており、それを基に今年度中に論文誌に投稿できる可能性も高い。さらに、CNFの溶液処理に関しても、今年度中に論文誌に投稿する予定である。その上で、同時並行で行っているナノ領域の摩擦試験の準備も整っており、供試体ができ次第、実験を行う予定である。これらにより、CNF強化複合材料のナノ領域からマクロ領域までの摩擦摩耗特性のおける相関性の知見を得るための見通しがついてきた。ナノカーボン強化プラスチックやナノカーボン強化炭素の作製において、問題となっているのが、ナノカーボンの分散性・配向性・最適な添加量である。まず、カーボンナノファイバーを添加することにより力学特性が増加することが分かった。カーボンナノファイバーの分散性については、カーボンナノファイバーは超音波照射によりマトリックス前駆体の液体に対しマクロ的に分散させることができた。しかし、カーボンナノファイバーがマトリックスに対し嵩高くなってしまったためナノレベルの分散性や均一性は確認できなかった。したがって、カーボンナノファイバーの添加量は、3wt.%以下で、1wt.%程度がより妥当であることが分かった。配向性についてはドクターブレード法による有効性を現在確認している。カーボンナノファイバーの表面処理による官能基の導入に関して、種類と量も精査できたので、その条件(70°Cで2日間)で処理することにより、特定の種類と量の官能基を導入でき、次年度の官能基を考慮したカーボンナノファイバー強化複合材料の作製ができる見通しがついた。CNF強化複合材料は、産業利用を見据えているにもかかわらず、その摩擦摩耗特性が十分理解されておらず、その特性向上の試みが十分とは言えない。また、CNF強化複合材料のナノ領域の摩擦特性が、マクロ領域に対してどのような影響を与えるかの相関性に関する知見が得られていない。
Co基ホイスラー合金を用いたSi中への高効率スピン注入

半導体Siへの高効率スピン注入を実現するためには,高スピン分極材料の利用が有効である。本研究ではCo_2FeAl_<0.5>Si_<0.5>(CFAS)ホイスラー合金薄膜に注目して,その作製方法を検討した。その結果,CFAS層を含む積層膜の伝導特性の解析により,作製したCFAS薄膜は実際に非常に高いスピン分極率を有することが示された。また,同時に,CFASと格子整合がよいMgAl_2O_4極薄膜が作製可能であることも明らかにした。MgAl_2O_4はバリア層として高い特性を示し,Si上への作製技術が確立できればスピン注入に利用できると考えられる。本研究課題では,スピントロニクスを既存の半導体デバイス技術に応用し,新規不揮発性高集積ロジック回路(スピンMOSFET)への展開のために「室温で高いスピン分極率を待つことが期待されるCFAS合金を用いたSi半導体への高いスピン注入効率の実現」を目指す。具体的には完全スピン偏極した材料:「ハーフメタル」を用い,不揮発性を持つシリコントランジスタの実現に必要な要素技術の開発を行う。ハーフメタル材料の候補として,現在までにL2_1構造を有するCo基フルホイスラー合金,特にCo_2Fe(Al_<0.5>Si_<0.5>)合金(以下CFAS)を開発してきた。CFAS合金は高いキュリー点を持ち,フェルミ準位がマイノリティスピンバンドギャップのほぼ中央に位置するため,熱による影響を受けにくく室温以上でも高スピン分極率を保持できる。初年度の研究内容として,CFAS合金における高スピン分極率を得るためには,CFAS層中のD03的不規則性を,組成制御などを通して低減する方策が必要であることが示された。また,いままで高いスピン分極率を得るためには単結晶MgO基板上にCFAS層をはじめとする多層膜構造をエピタキシャル成長させていたが,これは下部層を選ぶということで本課題を進める上で大きな制限となっている。そこで,本年度はアモルファスSiO_2基板上に(001)配向したCFAS薄膜を成長させる技術も確立した。SiO_2基板上に構造最適化した強磁性トンネル接合を作製したところ,室温130%,7Kで225%の大きなTMR比が実現された。これは(001)配向が実現されればCFAS薄膜は高スピン偏極電流源として用いることが可能であることを示している。本研究課題では,スピントロニクスを既存の半導体デバイス技術に応用し,新規不揮発性高集積ロジック回路への展開のために「室温で高いスピン分極率を持つことが期待されるCFAS合金を用いたSi半導体への高いスピン注入効率の実現」を目指す。具体的には完全スピン偏極したハーフメタルを用い,不揮発性を持つシリコントランジスタの実現に必要な要素技術の開発を行う。ハーフメタルの候補として,L2_1構造を有するCo基フルホイスラー合金,特にCo_2Fe(Al_<0.5>Si<0.5>)合金(以下CFAS)に注目する。平成21年度の研究内容として,まず,MgO単結晶基板上に成長したCFAS/MgAlOx/CoFe接合を用いてCFAS合金のハーフメタル性を実証した。室温で102%,低温で162%の大きなTMR比に加え,コンダクタンスのバイアス依存性からマイノリティーバンドギャップの存在が明らかになりCFASがスピン注入に有効な材料であることがわかった。次に,CFASを用いたスピン注入デバイスを実現するため,Si(001)基板とCFAS層のミキシングを押え,接合抵抗を制御するために挿入するトンネルバリアの開発を行なった。まずMgOはSi(001)と大きな格子不整合(9%)のため高品質な接合の実現が極めて難しいことがわかった。そこで,上記のCFAS/MgAlOx/CoFeで発見されたMgAlOxバリアを発展させて,新規にエピタキシャルMgAl_2O_4(スピネル)バリアの開発を行なった。MgAl_2O_4はSi(001)との格子不整合が5%以下と小さく,またMgOに代る新規結晶性バリアとして使用できる。Fe/MgAl_2O_4/Fe(001)構造の作製を通して,室温で117%の大きなTMR比を実現し,非常に良好なバイアス電圧特性を得ることに成功した。したがって,Si上への高品質MgAl_2O_4バリア作製技術の確立がなされれば高効率スピン注入デバイスの実現に期待が持たれる。
侵害性機械刺激受容体の同定とトランスジェニックフライを用いた機能解析

本研究では、カエルではカプサイシンによって機械性痛覚過敏のみが誘導され、熱刺激に対しては痛覚過敏が誘導されないことを明らかにした。P2X受容体拮抗阻害剤の皮下投与により、カプサイシン誘導性の機械性異所痛が抑制されたことから、ATP-P2X受容体システムがカエル機械性痛覚過敏誘導において重要な役割を果たすことが示唆された。ハエ味覚ニューロンに微小機械刺激を加えるためのナノ振動刺激装置を作成した。1.カエル侵害性機械刺激受容体蛋白質の同定について:capsaicinの皮下投与が機械刺激に対する防御反射閾値を低下させる分子メカニズムについて検討した。カエル皮下へのcapsaicin投与時に、suraminによってP2X受容体をブロックすると、機械刺激に対する反応閾値は変化しない事を見いだした。このことから、capsaicin単独ではなく、ATP分泌とP2X受容体が関与して閾値変化をひきおこす可能性が示唆される。TRPV1受容体の活性化が皮膚組織におけるATPの分泌を促し、機械刺激受容器の感度を調節する分子メカニズムの存在が推測されたため、第54回基礎歯科医学会学術大会で発表した。2.ショウジョウバエ味覚神経への機械刺激受容体候補蛋白質の発現:ショウジョウバエ味覚遺伝子Gr5aのプロモーターを用いて、機械刺激受容体であることが示唆されているマウスTRPV4蛋白質のショウジョウバエ味覚神経への発現誘導を試みた。マウスTRPV4のmRNAの生成はRT-PCRにより確認できたが、受容体蛋白質の機能的強制発現は確認できなかった。そのため、Gr5aだけではなく、より早い発生段階から味覚器に広く発現するpoxn遺伝子プロモーターを併用すると、TRPV4発現を誘導したショウジョウバエはTRPV4アゴニストを摂食するようになり、マウスTRPV4の機能的発現に成功した。3.ショウジョウバエ味覚器の機械刺激装置の開発:ショウジョウバエ味覚器に機械刺激を加えるための、piezo素子を用いた弾性ヒンジ型ナノ振動印加装置に改良を加え、刺激周波数と刺激強度の調節機能を持たせることを検討した。その結果、0.1-500Hzの振動周波数では共振は生じず、安定した振動振幅を得られるようになった。この振動印加装置の開発について、日本機械学会第25回バイオエンジニアリング講演会にて発表した。マウスTRPV4をショウジョウバエ味覚器(味覚受容体Gr5a発現味覚ニューロン)および脳ニューロン(転写調節因子poxn発現ニューロン)に強制発現させた系統で、TRPV4の特異的アゴニストGSK1016790Aに対する吻伸展応答や、強制的にアゴニストを摂取させた場合の行動変化を詳細に観察した。その結果、アゴニストに対する吻伸展応答は野生型と同じであり、強制的にアゴニストを摂取させ体内に取り込ませた場合も、摂食行動に有意な変化は見いだせなかった。TRPV4発現の効果が確認できなかった原因を検討するために、ショウジョウバエ味覚器および脳(poxn発現ニューロン)に常時開口型Kチャンネル(kir2.1)を強制発現させて神経の興奮性を抑制し、その効果を検討した。Gr5a発現ニューロンにkir2.1-GFPキメラタンパク質を強制発現させ、味覚ニューロンに蛍光シグナルが認められた系統においても、ショ糖に対する吻伸展応答はコントロールと比較しても有意差が認められなかった。しかし、脳のニューロンにKir2.1を強制発現させると、成虫の発生率がコントロールの10%程度に低下し、摂食行動も濃度識別能力などに有意な低下が見られた。以上の結果から、ショウジョウバエ味覚器(Gr5a発現味覚ニューロン)は外来チャネルタンパク質を発現しうるが、チャネルは機能していないことが示唆された。一方、脳ニューロンにおいてはkir2.1は正常に機能していたが、TRPV4の機能は確認できなかった。TRPV4アゴニストが脳ニューロンに到達していない可能性があり、脳にアゴニストを直接注入するなどの方法を用いて、より詳細な検討が必要である。本研究では味覚ニューロンに種々のTRPチャネルを強制発現させ、その機械刺激に対する応答特性を網羅的に調べることを試みたが、脳のニューロンとは異なり、末梢味覚ニューロンでは外来チャネルタンパクが発現したとしても機能しないことが示された。1.カプサイシン皮下注射による機械刺激閾値の低下を、ウシガエルだけでなくアフリカツメガエル、ネッタイメガエルでも確認した。2.エンハンサートラップ系統Tre-gal4を用いたGal4-UAS法により、味覚器(糖受容器)に任意の遺伝子を発現させる方法が確立され、味覚情報伝達機構の研究が進められている。本研究ではこの手法を応用し、糖受容器に機械刺激受容体を発現させ、このニューロンを機械的に刺激することにより機械刺激受容体の活性化に必要な刺激強度、周波数などを詳細に検討することを目的とする。そのために、まず分子特性の究明が進められつつあるマウスTRPV4受容体をショウジョウバエ味覚神経に発現させ、RT-PCRにより、導入されたマウスTRPV4遺伝子が転写されていることを確認した。