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染色体ＤＮＡ複製開始の制御機構とその高次制御

真核細胞における染色体DNA複製開始の詳細な分子メカニズムを理解するべく、出芽酵母を用いて新しい変異体取得方法を開発し、全ての複製開始因子について変異を単離した。それらの各変異体内で、各々の複製開始因子が染色体上の複製開始点に結合してくるモードを解析した結果、これまでにDNA複製開始直前に形成されると仮想されていた「複製開始前複合体」の実体とその形成様式を明らかにすることができた。複製開始前複合体の形成は複合体に含まれるそれぞれの因子に対し相互依存的であった。このような制御は複製開始反応の生物学的ロバストネスを高め、厳密な細胞増殖制御を可能にする仕組みの一端を担っていると考えられる。複製開始反応は、真核細胞においては2段階の制御を受けている。複製時にDNA2本鎖を巻き戻す複製時ヘリカーゼの染色体DNA上の複製開始点へのローディング(pre-RC形成、細胞周期のG1期)と、複製時ヘリカーゼの活性化と複製フォークの確立(S期)。この過程に関わる因子は以下の4種類に大別できる。1),pre_RCに含まれ、複製フォークには含まれないものこれまでの解析結果はグループ(3)の因子(Sld2,Sld3,Dpb11)の会合により促進される開始複合体の形成過程そのものが、複製開始・抑制のスイッチとなっており、それらの会合がCDKによるリン酸化で直接制御されていることを示している。開始複合体にはこれらの他、グループ(4)の因子も含まれているが、それらの開始複合体形成における役割は不明である。24年度にいくつか行った解析のうち、グループ(4)因子GINSが開始複合体形成に果たす役割についてまとまった成果が得られた。これまでの解析結果から、GINS-Dpb11の相互作用が開始複合体形成を促進することが示唆されていたが、この点を検証し、実際にそうであることを示すことができた。また、vertebrateのGINS-Dpb11オーソログが同様の機能を持つことも分かった。真核細胞においては、グループ(3)因子のアミノ酸保存度は非常に低いが、24年度に得られた成果は、真核細胞において共通の複製開始機構があることを示しており、今後の複製開始機構の理解に向けて、重要な貢献をなすものであると考えられる(論文投稿中)。これまでの解析結果はグループ(3)の因子(Sld2, Sld3, Dpb11)の会合により促進される開始複合体の形成過程そのものが、複製開始・抑制のスイッチとなっており、それらの会合がCDKによるリン酸化で直接制御されていることを示している。25年度までに得た結果:グループ(4)因子GINSが開始複合体形成に果たす役割についてを論文として発表した(Tanaka S*, KomedaY, Umemori T, Kubota Y, Takisawa H, Araki H. (2013).Efficient initiation of DNA replication in eukaryotes requires Dpb11/TopBP1ーGINS interaction. Mol Cell Biol. 33(13):2614-2622. )。また、従来の突然変異作製法を改良したことにより、ほぼ全ての複製因子についてタイトな変異体が得られたので、それらを用いて、各因子が複製開始反応において果たす役割の解明を進めている。複製開始反応は、真核細胞においては大きく2段階の反応である。即ち、DNA2本鎖を巻き戻す複製時ヘリカーゼの複製開始点への不活性型でのローディング(pre-RC形成、細胞周期のG1期)と、複製時ヘリカーゼの活性化と複製フォークの確立(S期)。今回、従来の突然変異体取得法を改良することで(論文投稿中)、グループ(3)(4)に含まれる全ての因子について、タイトな変異体を取得することができた。同時に、各因子特異的な抗体を作製し、ほぼ全ての因子について、特異的な抗体を得た。これらを組み合わせて解析に用いることにより、同一変異体より作製した、ひとつの細胞抽出液中において各因子の挙動を同時にかつ網羅的に解析することが可能となり、in vivo複製開始反応についての詳細な解析結果が得られつつある(論文投稿準備中)。この成果は、複製開始機構の理解に向けて重要な貢献となることが期待できる。グループ(3)(4)の因子がどのようにpre-RCを活性化し、複製フォークを確立するかについて、その詳細な機構は明らかではなかったが、グループ(3)(4)に含まれる全ての因子について、変異体を取得し、これらの因子について網羅的にクロマチン免疫沈降を行うことで、これらの因子のin vivoでの挙動を明らかにすることができた。

その過程において以前より仮想の複合体として提唱されていた複製前複合体(pre-IC)と言える複合体が実際に形成されること、pre-IC形成はスイッチのように起きることを見出した(論文投稿準備中)。また、多数の複製起点を高次に制御する機構として、クロマチン制御因子との関係性にフォーカスして解析を行ったところ、サイレンス化された部位や後期複製開始点において、その活性化に特定のクロマチン制御因子の関与を示す証拠を得た(論文投稿準備中)。これらの成果は、複製開始制御機構の総合的な理解に向けて重要な貢献となることが期待できる。真核細胞における染色体DNA複製開始の詳細な分子メカニズムを理解するべく、出芽酵母を用いて新しい変異体取得方法を開発し、全ての複製開始因子について変異を単離した。それらの各変異体内で、各々の複製開始因子が染色体上の複製開始点に結合してくるモードを解析した結果、これまでにDNA複製開始直前に形成されると仮想されていた「複製開始前複合体」の実体とその形成様式を明らかにすることができた。複製開始前複合体の形成は複合体に含まれるそれぞれの因子に対し相互依存的であった。このような制御は複製開始反応の生物学的ロバストネスを高め、厳密な細胞増殖制御を可能にする仕組みの一端を担っていると考えられる。ほぼ計画通りに成果を得られつつある。平成26年度の大きな成果としては、「研究実績の概要」欄に記したように、新たな変異体作製法の開発ならびに複製開始各因子特異的な抗体を揃え、これらを組み合わせて用いることにより、各変異体細胞内、「in vivo」での各複製因子の挙動を「網羅的」かつ「同時に」比較することが可能となり、その解析結果が出揃いつつある。このような成果は、近年他研究室から発表された「in vitro DNA複製再構成系」と相互補完的に働き、真核生物のDNA複製開始反応を詳細に理解するための重要な基礎データとなることが期待される。27年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学当初計画通り、複製開始反応のより良い理解を目指し、以下の解析を進める。1)平成26年度に得られた上記解析の完成・完了ならびに取り纏めと発表。2)複製起点活性化の高次制御の分子機構の解明。ほぼ計画通り、順調に成果が出ており、代表的な成果は国際的に認められている学術誌であるMolecular and Cellular Biology誌に投稿中。その他のプロジェクトについても、解析を進めている。ほぼ計画通り、順調に成果が出ており、代表的な成果は国際的に認められている学術誌であるMolecular and Cellular Biology誌に発表。他生物のオーソログについては、これまでに同定されていない分裂酵母Sld7と思われる因子を同定できたが、解析の結果、顕著な表現型を示さないことがわかった(negativeな結果であるが、それはそれで一歩前進)。この結果は他研究室より25年度に報告された哺乳動物細胞Sld7オーソログ候補因子の表現型とは顕著な違いを示す。
悪性黒色腫におけるアポトーシス誘導と細胞骨格・接着因子の変化の分子医学的解析

基礎的研究(1)マウス組織標本を用いた免疫組織化学的検討:sequential bioimmunochemotherapyを行ったマウスの悪性黒色腫病理標本を用いて、アポトーシスの誘導を確認した。(2)メラノーマ細胞を用いた薬剤感受性試験の検討:各種抗腫瘍剤による生存変化を検討した。タモキシフェン(TAM)でアポトーシスを誘導し、Annexin法で検出、FACScanで定量化を行った。時間・濃度依存性に増加した。(3)細胞骨格の変化の解析:TAMによるアポトーシスを誘導し、ビメンチンの発現・形態変化を蛍光抗体法で検出し、濃度・時間依存性に細胞骨格の変化を認めた。しかし、発現の定量的解析に技術的な問題があった。(4)マウスを用いた接着因子発現の検討:動物実験の環境を整えることができず、実施に至らなかった。(5)薬剤耐性遺伝子の検討:多剤耐性関連遺伝子の一つであるMRPの化学療法前後での発現について検討し、8例中6例において化学療法語に発生した腫瘍において増強を検出した。(6)薬剤耐性細胞株の樹立:シスプラチン(CDDP),TAMなどで培養メラノーマ細胞を処理し、耐性細胞株樹立を検討したが一定の性質を得るには至っていない。臨床的研究(1)悪性黒色腫患者病理組織標本を用いた免疫組織化学的検討:患者病理組織標本を用い、免疫組織学的にアポトーシス細胞、アポトーシス関連遺伝子・蛋白、細胞接着因子の発現について検索し、臨床経過・治療と比較検討した。日光角化症・ボーエン病でも検討しp16,RBの発現異常について報告した。(2)各種接着因子・特異蛋白の定量:手術・化学療法前後の患者血清中のMIA-1を測定中した。(3)化学療法の有用性の検討:悪性黒色腫に対するDAC-Tam療法について、有用性を検討・解析した。十分な成果を発表することはできませんでしたが、今後も引き続き研鑚を重ねたいと思います。今年度の計画に従って、以下を行ってきた。(1)悪性黒色腫患者病理組織標本を用いた免疫組織化学検討:現在当科で所持している患者病理組織標本を用い、免疫組織学的にTUNEL法によるアポトーシス細胞、p53,bcl-2などアポトーシス関連遺伝子・蛋白の検出、細胞接着因子の発現について検索し、それぞれの臨床経過・治療時期・治療内容と比較検討した。数例の検討では、有意差は検出されず、RT-PCR法は行っていない。(2)培養メラノーマ細胞を用いた薬剤感受性試験の検討:各種抗腫瘍剤による生存変化をMTT法で検討する。タモキシフェンでは同様にアポトーシスを誘導し、Annexin法で検出、FACScanで定量化を行った。時間・濃度依存性にアポトーシスが増加した。(3)細胞骨格の変化の検討:タモキシフェンによるアポトーシスを誘導し、細胞を固定、ビメンチンの発現・形態変化を蛍光抗体法で検出し、濃度・時間依存性に細胞骨格の変化を認めた。(4)各種接着因子・特異蛋白の定量:手術・化学療法前後の患者血清中のMIA-1,S-100を測定中である。(5)薬剤耐性細胞株の樹立:シスプラチン(CDDP),タモキシフェン(TAM)などで培養メラノーマ細胞を処理し、耐性細胞株を継代培養中である。引き続き継続していく予定である。

(1)悪性黒色腫患者病理組織標本を用いた免疫組織化学的検討:新たに入手できた患者病理組織標本を、免疫組織学的にTUNEL法によるアポトーシス細胞、p53、bcl-2などアポトーシス関連遺伝子・蛋白の検出、細胞接着因子の発現について検索した。症例数は数例増えたものの、臨床経過・治療時期・治療内容との比較検討では有意差は検出されなかった。(2)マウスを用いた接着因子発現の検討:マウスを飼育する環境を整えることができなかったため、今年度は施行できず次年度とした。(3)薬剤耐性細胞株の樹立とアポトーシス:シスプラチン(CDDP)、タモキシフェン(TAM)などで培養メラノーマ細胞を処理し、耐性培養株を継代培養中である。一定の株の樹立には至らず、アポトーシスの発現の検討を少しずつ行っているが、比較検討には至っていない。(4)抗腫瘍剤投与方法の工夫:エレクトロポレーションの条件を設定するための予備実験を繰り返している。(5)細胞骨格の変化:タモキシフェンによるアポトーシス誘導で見られたビメンチンの発現・形態変化を、他の抗腫瘍剤でも施行し強弱に差はあるが、濃度・時間依存的に細胞骨格の変化を認めた。(6)臨床研究:悪性黒色腫に対するDAC-Tam療法について、まとめて有用性などを検討した。引き続き継続していく予定である。
新規dNTPaseの複雑な制御機構の解明とその生理学的意義への洞察

高度好熱菌由dNTP triphosphohydrolase(Tt-dNrPase)は複雑な分子内制御機構と幅広い基質特異性を持ってdNTPの加水分解反応を触媒する。しかし、Tt-dNTPaseホモログの三次元構造は未だ明らかになっておらず、多様な分子機能に対する構造生物学的洞察は得られていなかった。本研究では、その分子機能を明らかにするために、Tt-dNTPaseのSe-Met置換体を作製し、SAD法を用いてX線結晶構造解析を行った。分解能2.2Åでの構造解析に成功し、Tt-dNTPaseは3回軸を持つ三量体リング2つが、境界面に2回軸を有して2つ連なった、ホモ六量体を形成していることが明らかになった。サブユニットは19個のαヘリックスから成り、その内部には活性部位のHDドメインと呼ばれる加水分解モチーフを含む6つのαヘリックスが存在した。高度に保存された残基に配位する金属イオンの位置と、HDドメインを持つ他のタンパク質の基質複合体構造との構造比較から、6つのαヘリックスの中心に活性部位が存在すると考えられる。その情報に基づいて活性部位にdNTPが結合したモデルを作成したところ、活性部位には核酸塩基を特異的に認識する残基はほとんど存在しなかったが、リン酸基を認識する残基は多数存在することが示唆された。一方、分子機能解析からはTt-dNTPaseは非天然dNTPを含む様々なdNTPを分解するが、dNDP, dNMPは分解しない結果が得られた。これらのことから、活性部位における基質認識には三リン酸の認識が重要であることが明らかになった。
癌抑制遺伝子p53の類似遺伝子p51、p73の解析およびこれら遺伝子の癌抑制への活用

p51とp73はp53に特徴的な領域をすべて有し、転写誘導能、アポトーシス誘導能、増殖抑制能など機能的にもp53類似の活性を有する。これらの遺伝子について以下の解析結果を得た。(1)キメラ遺伝子を用いた解析-これらに特徴的な転写調節領域、DNA結合領域、複合体形成領域を連結した合成遺伝子(キメラ遺伝子)のプロモーターに対する指向性、活性の多様性を明らかにした。そこで、遺伝子治療、p53ファミリー遺伝子の機能解析に対する有効性を鑑み、多数のキメラ遺伝子のアテノウイルス組み換え体を作製した。(2)p51、p73のゲノム解析-両ゲノム配列のほぼ全長を決定した。イントロンの長さの保存性、alternative promoterの存在、alternative exonの存在、alternative terminationの存在、多数のexon skippingなど、両者はゲノム上も類似性が高いことが判明した。p51に関しては2つの独立したプロモーター領域を同定した。特にΔNプロモーターに関しては、10bP程度のエレメントに限定されたので、その転写因子のクローニングを行っている。(3)ΔNおよび新規アイソフォームの解析-両遺伝子の新規アイソフォームを同定した。中でも、上記解析からΔNp73を同定した。ΔNp73は相互作用を通してTAp73を、DNA結合配列に対する競合阻害からp53をドミナントネガティブに阻害することを見いだした。(4)p51、p73蛋白質の制御機構解析-p53の制御は、発がんに密接に関係している。その主たる制御蛋白質MDM2とp51の関係を検討し、p51はMDM2に制御されないことを明らかにした。しかし、p51の顕著なユビキチン化を検出したので、現在p51を制御していると考えられるMDM2様遺伝子のクローニングを進めている。そこで、遺伝子治療、p53ファミリー遺伝子の機能解析に対する有効性を鑑み、多数のキメラ遺伝子のアデノウイルス組み換え体を作製した。(2)p51,p73のゲノム解析-両ゲノム配列のほぼ全長を決定した。特にΔNプロモーターに関しては、10bp程度のエレメントに限定されたので、その転写因子のクローニングを行っている。
古典学の再構築・調整班研究B03「近現代社会と古典」

本研究は,古典の受容に関してもっとも重要なファクターであると考えられる古典教育について,現代,世界の各地域でどのように意義づけられ,どのように教えられ,かつそれぞれの文明圏にどのような効果を及ぼしているのかを,内外の研究者を招いて共同討義によって明らかにし,その上でさらに考察を深めようとしたものである。本年度は4名の研究者を講演に招いた。その結果,近代の古典学の源流の一つともいえるベルリン大学における古典教育の具体像,近現代を通じて200年以上も古典研究のエリート層育成に力があったフランスのコンクール・ジェネラルというシステム,が明らかとなった。また,ホメロス以来の光輝ある古典の伝統と現代ギリシア語による一般大衆教育との鋭い対立という問題を抱えるギリシアの実情報告は,古典教育の持つマイナス面に対する意識を新たにさせた。(これは今後の検討課題である。)以上のより詳細な内容は,特定領域研究「古典学の再構築」研究成果報告書第7分冊,B03調整班報告書において発表される。本調整班では、研究分担者それぞれの専門とする分野において、近現代社会への古典の継承がどのように行われているかを次のような形で検討してきた。ヨーロッパ中世--アリストテレス哲学が、中世ヨーロッパで、権威として受け入れられたのはいかなる理由によるかを検討中である。(中川純男)中世イラン--英雄叙事詩『シャーナーメ』の写本調査を実施し、英国図書館より挿絵の含まれた良質写本14点のマイクロフィルムをとり寄せ、その読解を進めている。(羽田正)中世ドイツ--ルターによる聖書のドイツ語訳を中心に研究を進めている。ルター自身の書き込みによる校訂作業のうち、引用の出典確認と、参照された諸版(古印刷本)の確定作業を進めた。同時に、当分野の研究状況の把握にも努めている。(松浦純)ルネサンス期フランス--ルネサンス期の大学学芸学部におけるアリストテレスの『オルガノン』講義を当面の対象として、スコラ学からの変容の過程を明らかにした。(月村辰雄)18世紀フランス--『百科全書』本巻(1751-1765年)の項目を手掛かりにして、ギリシャ・ラテンの古典に対するヨーロッパ知識人の意識の変容を検討した。古典(中・高等学校の生徒に対して教えるに値する、と判断されたギリシャ・ラテン作家の著作)は、17世紀以来、文体の卓越性によって権威をもつテクストとして扱われてきた。だが18世紀半ばになると知識人は、古典テクストを、テクストそのものとして重視する立場(古典文献学者)と、自らの問題意識のために利用する立場(批評家)とに分化してくる。その過程を明らかにした。(中川久定)「近現代社会と古典」調整班研究は、古代に成立した古典がどのような形で近現代社会に伝承され、また受け入れられたのか、その受容の問題の考察を第1期の研究課題とした。特に、調整班のメンバーの多くに関係するところの大きいアリストテレスの著作を取り上げ、中世から近現代に至る諸期間に古典がどのようにその役割を変化させたかという問題を、古典を受容した教育などの制度や、また古典と深い関わりのある諸思想との関連において考察した。その結論は、以下のようにまとめられる。1.ヨーロッパ中世の大学におけるスコラ学は、アリストテレス哲学に依拠していた。2.ルネサンス期から始まったスコラ学(特にアリストテレス学説)に対する批判は、それ以後18世紀まで続く。3.18世紀に、アリストテレスの自然学と哲学の失墜は決定的なものになった。4.他方、文学の領域では、アリストテレスの『詩学』に由来し、ボワローの『詩法』によってあまねくフランスとヨーロッパに広められていた「3単一」の規則が、17世紀以来演劇界を支配していた。しかし、演劇的関心の中心が、貴族社会に設定された架空の演劇的状況の「真実らしさ」から、市民社会の日常的生活における「現実感」へと移行し始めるに及んで、この分野でもまた、アリストテレスの権威の時代は、容全に終わってしまう。以上見てきたことは、18世紀まではアリストテレス哲学が生きた思想であったことを、逆説的に証明しているであろう。次の19世紀に入ると、アリストテレスを、その歴史的脈絡の中で研究する道が新たに開け始め、今日に至っている。今年度より本調整班研究は月村が研究代表者を引き継ぐと同時に、新しく中等教育における古典教育を研究テーマに据え、都合4回、古典教育研究会という名称で講演会を開催。現在の日本、およびヨーロッパの古典教育の現状の把握に努め、それをもとにした共同討議によって、日本の古典教育がどのような形であるべきか、またありうるかについて考察した。各講演会の内容は以下の通り。1)日本の中等教育における古典教育(講師:東京大学、藤原克己、長島弘明):古典の教科書に取り上げられる教材が近年、その数を減じ、かつ固定化されている。これは、教える教師の側の学力および研究心の低下に即した結果で、教科書に新しい教材を盛り込むことはほぼ不可能な現状にある。2)イギリスの大学教育における古典(講師:オックスフォード大学、オズイン・マレー;ウォリック大学・ペネロペ・マレー):エリート層のための伝統的な古典教育システムをいかに維持するか、またそのかたわらで、一般学生を対象とした新設校における古典教育がどのような理念と方法によってなされているか(近代文学研究の枠組の中での意義付け、近代語訳による読解)、という二つの対立する問題点を抱えた現代イギリスの姿について、討議を加えた。

3)フランスの中等教育におけるフランス語教育(講師:ヴェロニック・ヴィェル):現職のコレージュ教師を招き、フランス語古典が前期中等教育においてどのような形で教えられているか、さまざまな伝統的方法と新しい工夫とを知見に加えた。4)日本のディベート教育の可能性(講師:宇都宮大学、香西秀信):問いのレトリック、をめぐる講師独自のディベート方法論についての講演を出発点とし、今後、高校のカリキュラムに組み入れられるべきディベート教育の理念と方法について、他調整班のメンバーも加えた上で多方面から検討を加えた。本研究は,古典の受容に関してもっとも重要なファクターであると考えられる古典教育について,現代,世界の各地域でどのように意義づけられ,どのように教えられ,かつそれぞれの文明圏にどのような効果を及ぼしているのかを,内外の研究者を招いて共同討義によって明らかにし,その上でさらに考察を深めようとしたものである。本年度は4名の研究者を講演に招いた。その結果,近代の古典学の源流の一つともいえるベルリン大学における古典教育の具体像,近現代を通じて200年以上も古典研究のエリート層育成に力があったフランスのコンクール・ジェネラルというシステム,が明らかとなった。また,ホメロス以来の光輝ある古典の伝統と現代ギリシア語による一般大衆教育との鋭い対立という問題を抱えるギリシアの実情報告は,古典教育の持つマイナス面に対する意識を新たにさせた。(これは今後の検討課題である。)以上のより詳細な内容は,特定領域研究「古典学の再構築」研究成果報告書第7分冊,B03調整班報告書において発表される。
Intolerance of Ambiguity and Second Language Listening Anxiety

本研究では、第二言語での聞き取りにおける不安感を高める要因として、曖昧さへの非寛容がどのように影響するかを調査した。第二言語場面での曖昧さへの非寛容に関わると仮定した1不確実さに対する非寛容、2対人関係場面での曖昧さへの非寛容、3異文化場面での曖昧さへの非寛容のうち、1不確実さに対する非寛容のみが有意に影響していた。これは第二言語場面での曖昧さを狭義に言語面のみに仮定した尺度の影響であると考えられる。また、第二言語での聞き取りにおける不安感は、認知的側面(英語の聞き取り技能)と対人関係的要因(社会不安)の影響と共に、曖昧さへの非寛容によっても有意に予測さらえることがわかった。本研究は、第二言語学習者において言語の持つ社会性がどのように学習者個人の認知的・情意的特性と関わるかを調査する。特に「曖昧さへの非寛容」という今まで第二言語習得分野ではあまり深く研究されてこなかった学習者個人の特性が、「外国語で聞くときの不安感」とどのように関係付けられるかに焦点を当てる。「曖昧さ」とは、十分な手がかりがないために、適切な構造化や分類化ができない状態であり、それに対して非寛容ということは、その状況を恐れの源泉として知覚する傾向を示すことであると広く定義される。第二言語で聞くときにこの傾向が認知面と情意面の両方でマイナスに影響すると考えられるからである。25年度は『曖昧さへの非寛容尺度』を開発し、その妥当性・信頼性を検証する事を主な目的とした。しかしながら、この特性は、社会心理学の分野でも定義が困難で測定し難い特性とされているので、本研究では、第二言語習得という場面に特に関わりの深い、狭義の定義(不確実さへの非寛容)を採用し、尺度の開発を試みた。開発した尺度の信頼性はα=.86とそれなりの信頼度を示したが、Raschモデルを用いての分析では「曖昧さへの非寛容」という特性が、一次元特性(unidimentional construct)であるという確かな証拠が得られなかった。また、言語プロトコル分析によっても、質問紙の項目によって同意する/同意しないに大きく揺れる調査協力者が少なからずいた。これらのことから、26年度はさらに言語プロトコルデータを収集・分析することによりこの特性を精査した上で尺度の改良を進める必要がある。第二言語習得の研究分野では、「社会的展開」という言葉に代表されるようなパラダイムの転換期を迎えており、言語の持つ社会性が学習者個人に内在する認知的・情意的特性と深く複雑に関わって言語技能の習得に影響を与えている事が示されてきている。本研究では、特に「曖昧さへの寛容」という学習者が内在的に持つ特性が、第二言語で聞く時の不安感にどのように関わるかを調査・研究する。25年度26年度の予備調査で得られたのデータは、「曖昧さへの悲寛容」には社会的側面と認知的側面があることを示した。因子分析およびRASCEモデルによる分析が、それら二つの側面は個別の心理的構成要素であることを裏付けたからである。一方、『聞き取りの社会性に注目した聞き取りの技能尺度』の開発は不調に終わった。一般的な『聞き取りの技能尺度』の値との相関が高すぎるため、個別の認知的構成概念と結論付けることができなかったためである。27年度は最終年度であるため、研究計画に挙げた「社会性に注目した聞き取りの技能」は一旦調査する変数から外し、その他の変数を用いて研究を進める。本研究を始めて以降、「曖昧さへの非寛容」と「第二言語使用に関わる不安感」の研究領域では新たな研究結果が出された。Dewaele and Ip (2013)は、「曖昧さへの非寛容」を「第二言語授業(クラス)に置ける不安感」と関係づける試みであり、曖昧さに寛容な学習者において第二言語授業に置ける不安感が低く、第二言語技能に対する自己評価が高いことを示した。本研究は、特に「聞き取りにおける不安感」と「聞き取りの技能」に焦点を当て調査するものであり、Dewaele and Ipが言語技能に関する変数として自己評価を用いたのに対し、本研究は聞き取りの技能尺度を変数としているため、より外国語技能の習得との関係を明確に示せるだろうと考えている。本研究は、第二言語での聞き取りにおける不安感を高める要因として、曖昧さへの非寛容がどのように影響するかを調査するものであり、認知的側面(英語の聞き取り技能)の測定(研究1)第二言語での曖昧さへの非寛容に関わる3要因の調査と測定(研究2)第二言語での聞き取りにおける不安感の社会的側面(社会不安)の調査(研究3)、曖昧さへの非寛容と社会不安がどの程度、またどのように第二言語での聞き取りにおける不安感を予測するかの調査(研究4)から成り立つ。研究1では、既に開発されていた英語の聞き取り技能の測定のためのDictation Testの精度を高める工夫を行った。研究2では、第二言語での曖昧さへの非寛容に関わると仮定した1不確実さに対する非寛容、2対人関係場面での曖昧さへの非寛容、3異文化場面での曖昧さへの非寛容のうち、1と3が有意に影響していることがわかった。また、第二言語での曖昧さへの非寛容と1は相関が高く、第二言語習得分野で広く使われている『第二言語での曖昧さへの非寛容尺度』が言語のもつ認知的曖昧さに限定されたものであることをも示した。

研究3では、対人関係的要因(社会不安)と英語の聞き取り技能の両面が第二言語での曖昧さへの非寛容と有意に関わることが示され、その理由について議論した。これら調査研究を基に、研究4では第二言語での曖昧さへの非寛容、異文化場面での曖昧さへの非寛容、対人関係的要因(社会不安)が、認知的側面(英語の聞き取り技能)の影響を取り除いても、第二言語での聞き取りにおける不安感を有意に予測することがわかった。今後は、第二言語での聞き取りにおける不安感と英語の聞き取り技能に関する学習者の自信との関係に対する洞察を深め、本研究では有意項目とならなかった対人関係場面での曖昧さへの非寛容について社会不安との関連で理解を進めることが重要である。本研究では、第二言語での聞き取りにおける不安感を高める要因として、曖昧さへの非寛容がどのように影響するかを調査した。第二言語場面での曖昧さへの非寛容に関わると仮定した1不確実さに対する非寛容、2対人関係場面での曖昧さへの非寛容、3異文化場面での曖昧さへの非寛容のうち、1不確実さに対する非寛容のみが有意に影響していた。これは第二言語場面での曖昧さを狭義に言語面のみに仮定した尺度の影響であると考えられる。また、第二言語での聞き取りにおける不安感は、認知的側面(英語の聞き取り技能)と対人関係的要因(社会不安)の影響と共に、曖昧さへの非寛容によっても有意に予測さらえることがわかった。『聞き取りの社会性に注目した聞き取りの技能尺度』開発が不調に終わった事を除き、おおむね計画通りに進んでいる。第二言語習得参加したアメリカ応用言語学会の年次大会で、Dr. Christina Gkonouが外国語学習(使用)に置ける不安感に関する質的研究の報告を行った。本研究は量的研究であるが、外国語の学びがその場の状況や学習環境に大きく左右される事を考えると、プロトコル分析をより広く活用して、量的データに基づいた議論で研究結果とその分析を補強することが望ましいと感じた。プロトコル分析のためのデータを計画より多く集め、その体系的分析を組み入れた報告としたい。当初の研究計画では25年度に『曖昧さへの非寛容尺度』をおおよそ完成させ、26年度には『対人関係における曖昧さへの非寛容尺度』を精査することとしていたが、前述のように『曖昧さへの非寛容尺度』の一次元性と妥当性に問題があると考え、今年度さらに精査して修正を加えなければならない。また、『対人場面を想定した英語の聞き取り技能尺度』(リスニングテスト)についても、実用性と信頼性・妥当性のバランスが取り難い。つまり、(1)短時間で実施可能な(2)信頼性も高いものの開発は困難を極める。26年度に再度開発を試み、信頼性が上がらなければ、当初の計画通り進まない場合の対応に記したように、完成済の「英語の聞き取り技能」のみを認知尺度の独立変数とし、「対人場面を想定した英語の聞き取り技能」は独立変数から外す対応を取らざるを得ない。購入予定図書が年度内に納品できない状況であることがわかった。本研究は、「曖昧さへの非寛容」という学習者が本質的に持つ特性の概念についての理解を深め、それを尺度の項目に生かすことができなければ先に進む事ができない。この一番基本的かつ研究遂行に不可欠な点を押さえるために、さらに言語プロトコルデータを収集し分析する。当初の計画では、概念の明確化で手間取ることは想定していなかった。
魚類の多精現象の再検討と育種応用

ドジョウ野生型を雌、アルビノ系統を雄として、接水で賦活した卵の卵膜を除去し、動物極の胚盤中心付近に約11000精子を顕微注射したところ、精子数1000で卵割率は対照と同様の87%まで向上し、6%程度の胚が孵化した。卵膜除去卵への授精による強制的多精を行った場合も2%程度の胚が孵化した。アルビノ形質発現とマイクロサテライトDNA父系アレルのみの出現から、大部分の半数体、半数体を含むモザイク、四倍体は雄性発生胚であることが判明した。野生型で母系、父系の両アレルをもつ卵核と精子核の融合に起因する二倍体、三倍体、異数体胚も少数出現した。同様に、ゼブラフィッシュにおいても発生胚を得ることができた。実験の成否を可視化するため、ドジョウ野生型系統を雌、ヒドジョウあるいはアルビノ(劣勢形質)系統を雄とした。接水2分後の囲卵腔がはっきりした時期の卵について、トリプシンと尿素を含むリンゲル液で卵膜を除去し、裸卵とした。対照群は通常の乾導法により受精し作成した。裸卵の動物極付近に、おおよそ精子が1、10、100、1000細胞となるように顕微注射を行った。また、裸卵に授精した強制多精群も作成した。顕微注射群の受精率(2細胞期胚出現率)は87%と対照群(88%)と同様であったが、それらの孵化胚出現率は対照の77%に対し、多数精子を顕微注射した群で高かった(6%)。強制多精群では2%の率で胚が出現した。フローサイトメトリーにより、これら胚の倍数性を調べたところ、半数体が最も多く出現した(対照群はすべて二倍体)。このほか、半数体ー異数体、半数体ー二倍体、半数体ー三倍体などのモザイク、二倍体、三倍体、四倍体、五倍体が見られた。観察した中で最高の倍数性は五倍体であった。顕微注射と多精から生じた胚はほとんどが異常であったが、中には正常な外見を有する胚も生じた。また、顕微授精と強制多精から生じた異常胚のなかに、劣勢のアルビノ形質を示す胚が生じたことから、雄性発生が生じたことが示唆された。そこで、マイクロサテライトDNAマーカー3座(Mac24、Mac345、Mac449)について分析したところ、ほとんどの半数体が父親由来のアレルのみを持つ雄性発生胚であった。しかし、両親由来のアレルを含む、異なる精子に由来する半数体細胞をもつモザイク胚も認められた。正常でかつアルビノ形質を示す四倍体胚は雄性発生胚であった。以上の結果から、多数精子の顕微授精あるいは強制多精により、雄性発生が生じることが判明した。前年度、多数精子を賦活した後に卵膜を除去したドジョウ卵動物極に顕微授精しなくても、精液を媒精するだけで、雄性発生胚、倍数体胚が生じることが判明したので、再度、ドジョウを用いて裸卵への強制的な多精を試みた。その結果、通常受精によるコントロールが89%の卵割率、75%の孵化率を示す時、強制多精群では4%が卵割し、2%が孵化することが判明した。しかし、卵割は異常でサイズの異なる割球の存在、胚盤の一部のみでの卵割が見られた。今回は孵化に至る胚が著しく少なかったが、フローサイトメトリーの結果、1n胚が見られたことから、強制的多精によって半数体雄性発生が生じた可能性が確認できた。また、3n胚が出現したことから、雌雄両前核の合核の可能性も示された。一方、ドジョウの卵膜除去卵胚盤への多数精子の顕微授精の卵割率は14%、孵化率は0.5%で、生じた胚は1n細胞を含むモザイクであった。今回は孵化に至る胚が少なかったが、ドジョウでは裸卵の多精、顕微授精により半数体、倍数体が生じることが再現できた。ドジョウ以外の魚種においても、強制的な多精あるいは多数精子の顕微授精により、半数体雄性発生が起こることを実証するため、ゼブラフィッシュにおいて、ドジョウと同様の実験を繰り返した。ゼブラフィッシュにおいて卵膜を除去した卵に媒精したところ、卵割率は対照(32%)の半分程度であったが(16%)、卵割が生じ、胞胚、嚢胚期まで発生が進行した。しかし、孵化胚は得られなかった。

多数精子を顕微授精した場合では、対照(27%)と変わらない卵割率(31%)が得られたが、嚢胚期まで進行した胚はわずか6%のみであり、孵化に至った胚はなかった。フローサイトメトリー分析に至らなかったため、胚の倍数性は不明であり、ゼブラフィッシュにおいて、雄性発生、倍数体が誘起できるか否かは不明であった。水族遺伝育種学多数精子の顕微注射、裸卵への強制多精により、多くの胚が発生を開始するが、ほとんどの胚は孵化期以前に死亡する。しかし、最高で6%程度生じた胚の遺伝学的分析から、これらの一部は雄性発生胚であることを明らかにできた。これにより、多精より生じる胚が何者であるかを解明し、目的はおおむね達成できた。以上のことから、達成度を(2)と判断した。多数精子の顕微注射、裸卵への強制多精により、多様な倍数体胚、雄性発生胚が生じることを遺伝学的に確認できたが、顕微注射された精子の卵内での挙動の観察には至らなかった。今後は以上の発生のメカニズム解明にむけて、受精過程について、前核化の存否、中心体の位置と数、雌性核との位置関係等について細胞学的組織学的観察を行う必要がある。また、ドジョウ以外の魚種においても、同様の事象が起こるか否かについても、実験を進める必要がある。物品費特に薬品類の節約により生じた金額新年度からの魚類飼育のための飼料(物品費)に供する。
血管内皮細胞のアポトーシス誘導による抗血管新生療法の開発

昨年度はウシ黄体細胞由来血管内皮細胞においてFas mRNA発現が認められ、腫瘍壊死因子(TNFα)およびインターフェロン(IFN)-γがFasを介レたアポトーシス誘導機構に関与していることを明らかにした。本年度は、(1)成長因子のFasを介したアポトーシスにおよぼす影響、(2)アポトーシス誘導機構または抑制機構のメカニズム(bcl-2ファミリーのmRNA発現)、(3)血管内皮細胞にFas遺伝子導入を行うことによるアポトーシス誘導モデルの作出について検討した。1.TNFα、IFNγおよびFasリガンドの添加に加え、成長因子(VEGF,IGE,bFGE,EGF)を単独または組み合わせて添加し、血管内皮細胞の細胞死およびアポトーシスの指標となるアポトーシス小体ならびにDNAの断片化についてそれぞれ検討した。その結果、VEGF単独または、VEGFと他の成長因子の組み合わせ添加において、TNFα、IFNγおよびFasリガンドの誘導するアポトーシスが抑制された。さらに、これらの添加区においてアポトーシス小体ならびにDNAの断片化が減少した。2.1.の各添加区において、bcl-2およびbax mRNA発現について検討した。その結果、アポトーシスの抑制が認められたVEGF単独または、VEGFと他の成長因子を組み合わせた添加区において、baxに対するbcl-2発現の割合が高くなった。3.血管内皮細胞にFas遺伝子導入をしたアポトーシス誘導モデルマウスの作出を試みたが、生存能力が極めて低く、目的としている部位にFasリガンドを注入する実験には至らなかった。以上の結果から、ウシ黄体の血管内皮細胞において、VEGFなどの成長因子はFasを介したアポトーシスに対する抑制作用をもち、その作用はbaxに対するbcl-2発現を高めることによることが示唆された。今後は、アポトーシス誘導モデルマウスを改良し、生体におけるアポトーシス誘導機構の詳細について検討していく予定である。血管新生は、正常個体において個体の発生や発育にとって不可欠の生命現象である。しかし、悪性腫瘍において、血管新生は病態の進行と密接に関連しており、血管が腫瘍細胞への栄養供給路としてだけではなく、腫瘍の転移および浸潤などに重要な役割を果たしていることが明らかにされている。そのため、抗血管新生療法の開発が強く望まれている。本年度は、血管新生制御法の開発に血管新生が正常個体において定期的に行われる黄体から得た血管内皮細胞を血管新生のモデルとして用いることができるかどうかを検討するために、(1)Fas mRNA発現および、(2)サイトカインのFasを介したアポトーシスにおよぼす影響について検討した。1.RT-PCRによりウシ黄体由来血管内皮細胞にFas mRNA発現が証明された。2.血管内皮細胞を培養し、腫瘍壊死因子(TNFα)、インターフェロン(IFN)-γおよびFasリガンド(Fas L)を単独または組み合わせて添加した。その後、血管内皮細胞の細胞死およびアポトーシスの指標となるアポトーシス小体ならびにDNAの断片化についてそれぞれ検討した。その結果、TNFαとFas Lの組み合わせ添加は17%の細胞死を誘導し、IFN-γおよびTNFαとFas Lの組み合わせ添加では32%の細胞死を誘導した。さらに、これらの添加区においてアポトーシス小体ならびにDNAの断片化が顕著に認められた。以上の結果から、ウシ黄体の血管内皮細胞にはFasを介したアポトーシス制御機構が存在し、血管新生制御法を開発するための研究材料として有用であることが示唆された。今後、TNFα、IFN-γ以外のサイトカイン、成長因子などの生理活性物質についても検討する予定である。さらに、血管内皮細胞にFas遺伝子導入を行うことによるアポトーシス誘導モデルの作出を検討中である。
メダカを用いた環境要因による性分化機構の解明

これまでの研究で、性分化時のメダカを孵化後0-5日の間、栄養源飢餓で処理することでII型生殖細胞の減少と雌(XX)から雄への性転換体が認められた。そこで、処理直後における生殖腺体細胞の性の状態を、既知のマーカー遺伝子のRT-qPCRによる発現解析で検証した。その結果、栄養源飢餓処理により雌マーカーの発現減少と雄マーカーの発現上昇が認められた。この結果は、栄養源処理直後の生殖腺体細胞の性の状態が雌から雄様へと変化したことを示唆する。前年度に山形大学及川准教授との共同研究でCE-TOFMSを用いて分析したところ、栄養源飢餓処理後のメダカ幼魚内代謝物を再度網羅的に解析した。その結果、栄養源飢餓処理によって減少した代謝物でのEnrichment解析で、一般的に栄養源飢餓で代謝が下がるタンパク質生合成やアミノ酸代謝、主要なエネルギー産生系の経路が認められた。これより、得られたメタボロームデータは栄養源飢餓処理で得られたデータとして適切であると判断し、さらに詳しい解析を行った。その結果、9種類の栄養源飢餓によって量が増加する代謝物が同定され、中でも、もっとも量が増加した代謝物がパントテン酸であった。予備的ではあるが、XXとXYの孵化後5日目でのメタボロームの比較においてもXXよりXYの方が多いと言う性差が認められており、このことはパントテン酸やその代謝が性分化と関連していることを想像させる。パントテン酸代謝経路の代謝物を詳しくみると、パントテン酸量が栄養源飢餓処理で増加した一方で、最終産物のCoAの量に変化は認められなかった。この結果はパントテン酸代謝がどこかの段階で栄養源飢餓処理によって負に制御されることを示唆した。実際に、栄養源飢餓処理直後の幼魚内での、パントテン酸代謝の律速酵素の遺伝子発現をRT-qPCRで検証したところ、栄養源飢餓処理サンプルで有意な発現減少が認められた。28年度が最終年度であるため、記入しない。生殖細胞の特性(幹細胞性、減数分裂、代謝調節、生殖細胞の性)の栄養制限による変化をマーカー遺伝子の遺伝子発現で検証した。幹細胞性と減数分裂のマーカー遺伝子の発現は栄養制限により減少し、代謝調節と生殖細胞の性のマーカー遺伝子は栄養制限下においても、通常飼育と同程度の発現が認められた。栄養制限の影響を網羅的に明らかにするため、1マイクロアレイ2CE-TOFMSによるメタボローム解析を計画した。1生殖細胞でEGFPが発現するメダカから、FACSにより2種の生殖細胞の単離を試みた。しかし2種の生殖細胞の完全な分取には至らず、マイクロアレイは行っていない。2栄養制限未処理・処理群のメダカ全体のメタボロームを、山形大学及川准教授の研究室と共同で解析した。その結果、主要なエネルギー産生系経路(解糖系、TCA回路)の代謝物は栄養制限により減少していた。一方で、パントテン酸等幾つかの代謝経路の代謝物で栄養制限による上昇が認められた。代謝制御やストレス応答に関わる8種の遺伝子をCRISPR/Cas9を用いて破壊した。現在までに5種の遺伝子について変異系統を樹立し、その表現型を解析した。その結果5種の遺伝子破壊メダカの内、FoxO3b変異体は野生型と異なる表現型を示した。以下に表現型をまとめる。栄養制限期間における生存率;野生型との間に大きな変化は認められなかった。栄養制限期間での体長;野生型で栄養制限により認められた体長の伸長抑制が、FoxO3b変異体ではより強くなり、孵化後2日目以降の体長の伸長は認められなかった。生殖細胞数;野生型では栄養制限によりII型生殖細胞数が減少していた。FoxO3b変異体では、通常飼育でもII型生殖細胞数が減少していた。成魚の性;通常飼育したFoxO3b変異体からメスからオスへの性転換体が観察された。以上から、FoxO3bが性分化に重要な役割を持つことが示唆される。生殖細胞の特性やメダカ幼魚全体のメタボロームの解析については、当初の計画通りに進展した。特にメタボローム解析では、栄養制限によりエネルギー産生系経路が低下する一方で、逆に亢進が認められる経路や代謝物を発見することができ、次年度につながる結果を得られた。代謝制御やストレス応答に関与する遺伝子の遺伝子破壊については、8遺伝子の破壊に成功し、その内5種類について変異系統の樹立と表現型解析が行えた。5種類の内、2種類はふ化後5日目までに致死、他の2種類では野生型と比べて目立った表現型の差は認められなかった。その一方でFoxO3b変異体は、性分化時期の生殖細胞数の減少やメスからオスへの性転換が認められるなど、興味深い表現型を示した。次年度もFoxO3b変異体でのメタボロームなどの解析を進める。致死の表現型を示す遺伝子破壊メダカを救済するために、CRISPR/Cas9を用いた遺伝子導入によるレスキュー系統の作製を試みた。しかし、これまでに挿入予定領域に導入遺伝子が確認されたものはなく、難航している。マイクロアレイに関して、FACSによる2種の生殖細胞の分取が難しく、完全な分取を行うためには、細胞表面マーカー等による細胞標識が必要である。しかし、メダカの2種類の生殖細胞のそれぞれに特異的なマーカーはまだ見つかっていないため、実験の継続を断念した。

またゼブラフィッシュに関して、系統維持にとどまり生殖腺形成の観察は行えなかったが、次年度行う予定である。以上より、おおむね順調に進展にしていると判断した。これまでの研究で、性分化時のメダカを孵化後0-5日の間、栄養源飢餓で処理することでII型生殖細胞の減少と雌(XX)から雄への性転換体が認められた。そこで、処理直後における生殖腺体細胞の性の状態を、既知のマーカー遺伝子のRT-qPCRによる発現解析で検証した。その結果、栄養源飢餓処理により雌マーカーの発現減少と雄マーカーの発現上昇が認められた。この結果は、栄養源処理直後の生殖腺体細胞の性の状態が雌から雄様へと変化したことを示唆する。前年度に山形大学及川准教授との共同研究でCE-TOFMSを用いて分析したところ、栄養源飢餓処理後のメダカ幼魚内代謝物を再度網羅的に解析した。その結果、栄養源飢餓処理によって減少した代謝物でのEnrichment解析で、一般的に栄養源飢餓で代謝が下がるタンパク質生合成やアミノ酸代謝、主要なエネルギー産生系の経路が認められた。これより、得られたメタボロームデータは栄養源飢餓処理で得られたデータとして適切であると判断し、さらに詳しい解析を行った。その結果、9種類の栄養源飢餓によって量が増加する代謝物が同定され、中でも、もっとも量が増加した代謝物がパントテン酸であった。予備的ではあるが、XXとXYの孵化後5日目でのメタボロームの比較においてもXXよりXYの方が多いと言う性差が認められており、このことはパントテン酸やその代謝が性分化と関連していることを想像させる。パントテン酸代謝経路の代謝物を詳しくみると、パントテン酸量が栄養源飢餓処理で増加した一方で、最終産物のCoAの量に変化は認められなかった。この結果はパントテン酸代謝がどこかの段階で栄養源飢餓処理によって負に制御されることを示唆した。実際に、栄養源飢餓処理直後の幼魚内での、パントテン酸代謝の律速酵素の遺伝子発現をRT-qPCRで検証したところ、栄養源飢餓処理サンプルで有意な発現減少が認められた。昨年度作製し、まだ表現型解析の終わっていない代謝制御やストレス応答に関与する遺伝子の遺伝子破壊メダカについて、通常・栄養制限条件下における性分化時期の体長や生殖細胞数と成魚の性等の表現型を評価する。また、生殖細胞の特性(代謝調節、幹細胞性、減数分裂、生殖細胞の性)についてもマーカー遺伝子を用いた発現解析で検証する。昨年度の解析から代謝制御遺伝子FoxO3bの遺伝子破壊メダカでは、栄養制限の有無にかかわらずII型(性分化時期ではメスに特有)生殖細胞の減少とメスからオスへの性転換が認められた。そこで転写因子であるFoxO3bタンパク質が生殖細胞内や生殖腺体細胞内でどのような局在を示すかを、FoxO3b抗体による免疫組織化学で検証する。昨年度行ったCE-TOFMSによるメタボローム解析の結果から、栄養制限により主なエネルギー産生系経路(解糖系、TCA回路)が低下し、その一方でパントテン酸代謝経路やグアニジン代謝経路の亢進そしてカルニチンの上昇が認められた。これらの代謝経路に関わる遺伝子の発現が、栄養制限により変化しうるのかをqRT-PCRまたはin-situ hybridization法を用いて解析する。またこの代謝変化がFoxO3b変異体メダカで起きているか否かを、メタボローム解析を通して検証する。
否定極性表現における構成的意味

本研究課題では、英語、日本語、ドイツ語の否定極性表現(「誰も/anyone」などのように主に否定文でのみ用いられる表現)及び意外性と累加の表現(「も/even, also」などの表現)を用いて、「ある言語表現の全体の意味がその表現を構成する部分の意味とどのように関わっているのか」を解明した。具体的には、いくつかの語の組み合わせから成る否定極性表現(「誰」+「も」など)と、それ以上小さな語に分けることが出来ない否定極性表現(anyoneなど)を比較し、語の意味が文全体の意味に与える影響を検討した。その際、上記3言語を比較することで、部分の意味と全体の意味の関係の普遍的性質を明確にした。本研究課題では、英語、日本語、ドイツ語の否定極性表現及び意外性と累加の表現の研究を3年間の計画で行うものである。これらの表現を用いて、「ある言語表現の全体の意味がその表現を構成する部分の意味とどのように関わっているのか」という構成性の問題を解明することを目的としている。また、3言語の比較を行うことで、構成性の普遍的性質をより明確にすることにも重点を置く。2年目にあたる24年度は、前年度に得られたデータに基づいて理論的考察を行うことに重点を置いた。夏期には、カナダのブリティッシュコロンビア大学及びカルガリー大学を訪れ、1年目に収集したデータの確認、及び研究者(Hotze Rullmann教授、Elizabeth Ritter教授)との意見交換を行った。この意見交換を通じて、理論的考察を深めることができた。具体的には、3言語のデータ比較を通じて人間が意味を理解する仕組みの精緻化を試みた。構成性に関して重要な違いを持つ英語、日本語、ドイツ語のデータを比較することで、形態的に構成部分を持つことと意味的に構成部分を持つことの関連性、さらに構成性の原理における言語表現の「部分」とはどういう性質のものを指すのかを詳細に検討することができた。最終年の3年目は、これまでに得られた成果をより広い理論的視野から検討し本研究課題を総括する。この際、国際学会での発表、学術論文への投稿を行う予定でいる。最終年の25年度は、前年度に引き続き理論的研究を重点的に行った。前2年間で得られた成果をより広い理論的視野から検討し、3言語のデータ比較を通じて人間が意味を理解する仕組みの精緻化を試みた。夏期には、アメリカのシカゴ大学を訪れ、これまでに収集したデータの確認、及び研究者(Christopher Kennedy教授)との意見交換を行った。この意見交換を通じて、これまでに得られた成果をより広い理論的視野から検討し、本研究課題を総括することができた。具体的には、日英後の詳細な比較を行うことで、「否定極性表現に存在する部分の意味の普遍性」及び「否定極性表現に存在する部分の意味と形態的構成部分の関係」が明らかになった。この研究成果を学術論文としてまとめ、国際的に権威のある学術雑誌に投稿することができた(現在審査中)。論文執筆を通じ、3年間の総括を行うと共に、今後の課題についても検討することができた。否定極性表現という一言語現象の研究に留まらず、否定極性表現を介して構成性の原理の普遍的性質の解明を行うことができた。1年目は基礎研究期間と位置付け、上述3言語のデータの記述的研究を中心に行った。前出の3言語の表現に関しては多数の先行研究がある。文献に出てくるデータを包括的に収集及び整理し、さらに提示されている分析を検討する作業を行った。この際、先行研究におけるデータの整合性を見極め、データの欠落や矛盾が見られた点に関しては、対象言語の話者から聞き取り調査を行うことで、新しいデータを補った。

以上の記述的研究を通して、前出の3言語の表現は、構成性に関して他言語とは異なる特徴を持っており、「構成性の普遍的性質を解明する」という本研究の目的を遂行する上で重要な役割を果たすことが明らかになった。以上の基礎研究の成果を、日本語のデータに焦点を当てて国内の2つの研究会で発表を行い、有意義な意見をもらうことができた。英語、ドイツ語に関しては、平成24年度9月の学会での招待講演において発表する予定でいる。以上、本年度は、2年目に行う予定である理論的考察の土台を築くことができたと言える。最終年の目標である学会発表及び論文執筆の土台を築くことができた。2年目以降の理論的分析に必要なデータをおおむね収集することが出来た。最終年の25年度は、前年度に引き続き理論的研究を重点的に行う。前2年間で得られた成果をより広い理論的視野から検討し、3言語のデータ比較を通じて人間が意味を理解する仕組みの精緻化を目指す。3年間の総括を行うと共に、今後の課題についても検討することで、本研究課題の将来的展望を明らかにする。2年目にあたる24年度は、前年度に得られたデータに基づいて理論的考察を行うことに重点を置く。3言語の包括的比較研究を行うことで、言語の普遍性に関する新しい発見につなげる。3年間の研究期間の中間地点にあたる24年度夏期には、カナダのカルガリー大学及びブリティッシュコロンビア大学、ドイツの言語研究所を訪れて、1年目に収集したデータの確認、及び研究者との意見交換を行う予定でいる。アメリカのシカゴ大学でChristphor Kennedy教授と意見交換を行う予定があり、その際の旅費として使用する。また、国際学会での発表の旅費として使用する。カナダのカルガリー大学及びブリティッシュコロンビア大学、ドイツの言語研究所を訪れる際の旅費として使用する予定である。