hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス内耳の細胞内カルシウム動態観測による加齢性難聴の解析基盤構築

加齢進行性難聴モデルマウスとしての意義を検討するために、カルシウム動態異常をきたす変異体の難聴表現型、特に難聴進行速度の差異と変異部位との関係を解析し、有毛細胞欠失は加齢性難聴進展の大半を説明するが、欠失前の機能低下の寄与もある事が推測され、この機能低下と細胞欠失までの期間の間の相関が示唆された。更に発現系整備のための最適化を実施し、適用可能な全変異体に関する動力学的dataを収集するための条件を検討した。こうしたvitroの動力学的dataとvivoでの表現型の総合的解析を行う事により、細胞レベルでの老化につながる変化の明示的なマーカーを得る事が発症機構全体の理解のために必要と考えられた。加齢性・老人性難聴の増加に伴い、その詳細な発症機構解析のためにはマウスモデルの必要性が非常に高いにもかかわらず、加齢進行性難聴のマウスモデルの詳細な機構の解析は例が少ない。本研究では明瞭に進行性聴覚障害の表現型を示す変異体マウスを用い、(1)継時的な表現型記述と組織学的解析を実施する事により、加齢性・老人性難聴モデルとしての意義を検討するための基礎的知見を集積する事を目的とする。また、(2)細胞内カルシウム動態異常が加齢性聴覚障害における細胞変性の主要な原因一つであるという仮説を基に、変異有毛細胞のex vivoでの生理学的解析法によりカルシウム動態を観測するシステムを開発し、その動態異常と進行性難聴の関係を明らかにする事を目指す。本年度は、上記(1)の目的の為に主にPmca2変異体4系統の継時的な表現型解析、組織学的解析を実施した。これら4系統はPmca2遺伝子上のmissense変異による新しいalleleを伴い、何れも加齢性の聴覚閾値上昇を示した。各Pmca2遺伝子産物のアミノ酸置換に応じて表現型に差異が認められ、Early-Late phase (5-20w)の聴覚閾値上昇率の順序は、Late phaseの細胞障害進展速度の差異と一致した。Pmca2変異体のEarly phase(-5w)における閾値の上昇は細胞死に先行するが、引き続き起こる有毛細胞とラセン神経節細胞の細胞死の進行により、各系統の加齢性難聴が異なる速度で増悪すると考えられた。内有毛細胞、外有毛細胞、支持細胞、ラセン神経節細胞、神経繊維束の変性・死滅は、それらのコルチ器における局在個所(基底ー頂回転)に応じて、短時間の間に同期して起こる様に見え、各事象間の因果関係(細胞間相互作用)は細胞死の機構を明らかにする上で重要であると考えられた。そこで、本研究では明瞭に進行性聴覚障害の表現型を示す変異体マウスを用い、継時的な表現型記述と組織学的解析を実施する事により、加齢性・老人性難聴モデルとしての意義を検討するための基礎的知見を集積する。また、細胞内カルシウム動態異常が加齢性聴覚障害における細胞変性の主要な原因一つであるという仮説(1)を基に、変異体有毛細胞のex vivoでの生理学的解析法によりカルシウム動態を観測するシステムを構築し、その動態異常と進行性難聴の関係を明らかにするための基盤とする。本年度は、カルシウム動態異常をきたす変異体における、加齢進行性難聴表現型の解析を引き続き進め、難聴進行速度の差異と変異部位との関係、及び難聴表現型自体の進展と有毛細胞欠失の進行との関係を解析した。有毛細胞の欠失は、加齢性難聴進展の大半を説明するが、一部欠失によらない機能低下の寄与がある事が示唆される。発現系の整備の一環として、vitroにおける遺伝子変異導入、発現ベクター構築、培養細胞選定等の、システム最適化を継続実施中である。加齢性・老人性難聴の増加に伴い、その詳細な発症機構を解明することは、予防・治療を進展させるために不可欠と考えられる。この機構解明のためにマウスモデルの必要性は非常に高いにもかかわらず、加齢進行性難聴のマウスモデルにおける、十分に詳細な機構解析例は必ずしも多くない。そこで、本研究では明瞭に進行性難聴障害の表現型を示す変異体マウスを用い、継時的な表現型記述と組織学的解析を実施する事により、加齢性・老人性難聴モデルとしての意義を検討するための基礎的知見を集積する。また、細胞内カルシウム動態を観測するシステムを構築し、その動態異常と進行性難聴の関係を明らかにするための基礎とする。本年度は、カルシウム動態異常をきたす変異体における、加齢進行性難聴表現型の解析を進め、難聴進行速度の差異と変異部位との関係、及び難聴表現型自体の進展と有毛細胞欠失の進行との関係を引き続き解析した。有毛細胞の欠失は、加齢性難聴進展の大半を説明するが、一部欠失によらない機能低下の寄与もある事が推測され、この機能低下と細胞欠失発生までの期間との間に相関性の有る事が示唆された。更に、発現系の整備の一環として、vitroに於ける遺伝子変異導入、発現ベクター構築、培養細胞選定等の、システム最適化を継続実施し、適用可能な全ての変異体に関する動力学的dataを収集するための条件を検討した。

こうしたvitroの動力学的dataと、vivoでの表現型の総合的解析を行うことにより、カルシウム動態変化がもたらす細胞レベルでの老化につながる変化の明示的なマーカーを得る事が、発症機構全体の理解のために必要と考えられた。加齢進行性難聴モデルマウスとしての意義を検討するために、カルシウム動態異常をきたす変異体の難聴表現型、特に難聴進行速度の差異と変異部位との関係を解析し、有毛細胞欠失は加齢性難聴進展の大半を説明するが、欠失前の機能低下の寄与もある事が推測され、この機能低下と細胞欠失までの期間の間の相関が示唆された。更に発現系整備のための最適化を実施し、適用可能な全変異体に関する動力学的dataを収集するための条件を検討した。こうしたvitroの動力学的dataとvivoでの表現型の総合的解析を行う事により、細胞レベルでの老化につながる変化の明示的なマーカーを得る事が発症機構全体の理解のために必要と考えられた。理化学研究所の遺伝変異マウスのリソースの中で、進行性聴覚障害の表現型を示す複数の遺伝性マウスPmca2変異体を用い、内耳における基礎的な組織形態学的、生理学的解析を継時的に実施する事により、加齢性内耳障害の記述、機構推定を行うためのシステムを構築した。これを用いる事により、難聴進展過程において、聴覚機能低下のフェーズと細胞変性,細胞死のフェーズを識別する方法を開発し、加齢性・老人性難聴モデルとしての意義を更に詳細に検討する事が可能となる。発現システムの最適化を完了し、適用可能なすべての変異体に関する動力学的dataを収集する。これらとvivoでの表現型を総合的に解析することにより、カルシウム動態変化がもたらす細胞レベルでの老化につながる変化のマーカーを検討する。分子遺伝学理化学研究所の遺伝変異マウスのリソースの中の、その他の加齢性難聴表現型を示す系統について解析を進めると同時に、聴覚機能低下のフェーズと細胞変性,細胞死のフェーズを識別する方法を探索する。また、細胞内カルシウム動態異常が加齢性聴覚障害における細胞変性の主要な原因一つであるという仮説に基づき、変異体有毛細胞のex vivoでの生理学的解析法によりカルシウム動態を観測するシステムの構築を試みる。試薬価格の変動により、差額を生じた。物品の購入において、合見積りにより当初予定額より低価格での購入が可能となったため。必要な試薬の購入に適宜補填する。試薬の追加購入に充当する。
ラジカルカチオンプール法を用いた反応集積化

平成27年度は主に、これまで開発してきた有機電解反応の拡張に取り組んだ。これまで本研究者は芳香族化合物をピリジン存在下電解酸化し、得られたピリジニウムイオンをピペリジンと反応させ芳香族第一級アミンに変換する手法を開発している。一般的に、電解酸化で芳香族化合物をアミノ化する場合、生成物がさらに過剰酸化されることが問題になる。一方、本手法は電解参加で得られる生成物はカチオン性であり、過剰酸化に侵されることはない。今年度、本研究者は本反応設計を官能基を有するアルキルアミンと芳香族化合物のカップリング反応に拡張するために新しい反応設計を提案した。本反応設計のカギはアルキルアミンを事前にヘテロ環にしておくことである。このアプローチには次の3点の利点があげられる。1)酸化電位が元のアルキルアミンより高くなり芳香族化合物を選択的に酸化することができる。2)窒素上および官能基上のプロトンをなくすことで電解反応ではカチオン性の中間体を与える。カチオン性の中間体は酸化電位が上がるため過剰酸化にさらされることはない。3)芳香族化合物のラジカルカチオンと反応しうる高い求核性を維持できる。このようなヘテロ環存在下、芳香族化合物を電解酸化し、得られたカチオン性の中間体を化学反応で処理することで目的のカップリング生成物を効率良く得ることができる。また本手法を用いて日光川の変異原物質を従来法より効率よく合成できることを明らかにし、合成的有用性を示した。27年度が最終年度であるため、記入しない。芳香族化合物の芳香環上やベンジル位に窒素が導入された化合物は天然物、医薬、配位子など様々な用途がある。そのためそれらの化合物を効率よく合成する手法を開発することは有機合成化学の重要な課題といえる。この課題に対し本研究者は電解酸化による新規窒素官能基導入法の開発に取り組んでいる。電解酸化により発生させたラジカルカチオンを経由しカチオン性の化合物を得た後、化学反応を集積化することで従来では達成困難な分子変換が可能になると期待できる。まず本研究者は電解酸化を用いたC-H結合の官能基化による芳香族化合物への窒素官能基導入法の開発にとりくんだ。その結果、電子豊富な芳香族化合物をピリジン存在下に電解酸化することによりアリールピリジニウムイオン中間体を得、これをピペリジンと反応させることにより芳香族第一級アミンが効率よく生成することが分かった。芳香族化合物をアミノ化する代表的な手法であるニトロ化・還元法ではしばしば官能基許容性が問題となるが、本手法は極めて温和な条件で反応が進行するためア広範な官能基が許容であり対応する生成物を高収率で与えた。また本手法を用いてVLA-4阻害薬を従来法より短ステップ、高収率で合成し、本手法が有機合成における新しい合成ルートを与えることを明らかにした。さらに本研究者は電解酸化を用いたC-H結合の官能基化によるN置換イミダゾールの合成法の開発にとりくんだ。その結果、芳香族化合物をメシルイミダゾール存在下に電解酸化することによりイミダゾリウムイオン中間体を得、これをピペリジンと反応させることによりN-芳香族置換イミダゾールを合成できることを明らかにした。これらの手法は従来の手法では難しい合成ルートを可能にすることから有機合成における強力なツールとなり得る。本研究者はこれまで開発してきた窒素官能基導入反応を分子内反応へ展開し、ベンゾオキサゾールやベンゾチアゾール類の合成法を確立することに成功した。2-ピリミジルオキシベンゼンを電解酸化すると対応するカチオン性中間体の生成が1H NMRから確認できた。また通電後ピペリジンと反応させると2-アミノベンゾオキサゾールが85%で得られた。本反応は官能基許容性が高く、エステル、メチル、ハロゲントリフルオロメチル、ケトン、シアノ基など様々官能基が反応条件に耐えた。また原料に2-ピリミジルチオベンゼンを用いると2-アミノベンゾチアゾールが得られ、本反応も様々な官能基が許容であることが分かった。ベンゾオキサゾールやベンゾチアゾールは医薬によく見られる骨格であるが、合成するには一般的にアミノフェノールまたはアミノチオフェノールなど二置換ベンゼン類を基質に用いる必要があった。より効率のよい合成を可能にするためアニリン類の分子内C-Hアルコキシ化やC-Hチオール化等で合成する手法が開発された。一方、同骨格をフェノール類の分子内C-Hアミノ化で合成する例は一例しか報告されておらずチオフェノール類の分子内C-Hアミノ化で合成する例は報告されていなかった。そのため本手法は従来の分子内C-H官能基化によるベンゾオキサゾールやベンゾチアゾールの合成手法と相補的であり、幅広い応用が期待される。

今年度、本研究者は本反応設計を官能基を有するアルキルアミンと芳香族化合物のカップリング反応に拡張するために新しい反応設計を提案した。本反応設計のカギはアルキルアミンを事前にヘテロ環にしておくことである。このアプローチには次の3点の利点があげられる。1)酸化電位が元のアルキルアミンより高くなり芳香族化合物を選択的に酸化することができる。2)窒素上および官能基上のプロトンをなくすことで電解反応ではカチオン性の中間体を与える。カチオン性の中間体は酸化電位が上がるため過剰酸化にさらされることはない。3)芳香族化合物のラジカルカチオンと反応しうる高い求核性を維持できる。このようなヘテロ環存在下、芳香族化合物を電解酸化し、得られたカチオン性の中間体を化学反応で処理することで目的のカップリング生成物を効率良く得ることができる。また本手法を用いて日光川の変異原物質を従来法より効率よく合成できることを明らかにし、合成的有用性を示した。本特別研究員は常日頃より研究に対して熱心に取り組み、粘り強く研究テーマを進めております。本研究員が熱心に研究に取り組む姿勢は研究室全体に良い影響を与えております。研究成果は着実に表れており、論文は既に発表しているものをはじめ、現在執筆中のものもあり、近日に投稿する予定であります。また国内外の学会発表にも積極的に参加しております。さらに他分野との交流などにも積極的に取り組んでおり、将来有望な研究者として着実に成長しております27年度が最終年度であるため、記入しない。今後はより一般性の高い分子変換を確立する新たな原理を探索する予定です。具体的にはこれまでヘテロ環化合物と芳香族化合物のラジカルカチオン種が反応することを利用し、窒素官能基を導入する手法を開発してきましたが、アルキルアミンに拡張するため適切な分子設計を行う予定です。またこれまで開発してきた反応や現在開発中の反応を用いて生理活性物質の迅速合成に取り組み本研究の集大成としたいと思います。電解酸化により発生した芳香族ラジカルカチオン種を経てカチオン性中間体を得た後、化学反応により目的の生成物を得るという形式の反応を論文で二報発表した。また生理活性物質の合成にも応用しており、当初の計画以上の速さで進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題は炭素-炭素結合を出発として、本年度炭素-窒素結合形成へと拡張された。今後は本研究を炭素-酸素結合形成や炭素-硫黄結合形成に応用し、更なる合成ツールの確立を目指す。また、これまでは低分子の合成手法開発として本研究を進めてきたが、今回達成された素反応を高分子合成に応用していきたいと考えている。
ヒト歯根膜細胞のリソソーム酵素カテプシンB、L活性へのIL-6刺激伝達系の関与

平成14・15年度までに矯正学的歯の移動時の歯肉溝滲出液中のカテプシンB(CAB)、L(CAL)の活性が実験歯において24hrで対照歯よりそれぞれ約2倍高い値を示したこと、また、培養歯根膜線維芽細胞に周期的伸展力を918%で5日間作用させた結果、CALの活性は周期的伸展力により経時的および伸展力依存的に増加しこと、また、in vivoの実験系において13週齢のWister系雄性ラットに実験的矯正力を加えて、7日までのCABおよびCALの局在を免疫組織学的に検討した結果、歯の移動開始後3日目に圧迫側および牽引側の両側において破骨細胞の出現を認め、その細胞はCABおよびCALの強度陽性を示したことを報告した。最終年度の平成16年度では培養歯根膜線維芽細胞に持続的圧縮力を03g/cm^2,持続的伸展力を02.5% increase in surface areaの加重でそれぞれ24時間作用させ、CAB、CALの活性を測定した。さらに、細胞に2g/cm^2のCompression Force、および2.5% elongationで12時間作用させ、RT-PCRにて遺伝子発現を検討したところ、持続的圧縮力,持続的伸展力によりCAB、CALの遺伝子発現が増強されたことが確認された。さらに、培養歯根膜線維芽細胞にinterleukin-6(IL-6)とp44/42MAPKの特異的阻害剤であるPD98059を添加し、IL-6によるCAB, CALの活性の上昇にMAPKが関与しているかを検討したところ、PD98059の添加によりCAB, CAL活性は有意に抑制された。以上の結果から、歯根膜線維芽細胞は機械的外力およびIL-6に対してCAB, CALの活性を上昇させることにより、矯正学的歯の移動時の骨コラーゲン分解に深く関与していることが示唆された。矯正学的歯の移動に伴う骨代謝にプロスタグランディン(PG)や各種サイトカインが深く関与していることが明らかにされている。近年、骨代謝におけるlysosomal cystein protcaseの関与が重要視され、骨コラーゲン分解に深く関与していると考えられている。矯正学的歯の移動時には歯周組織の細胞活性に変化が生じ、その変化は歯肉溝滲出液GCF(gingival crevicular fluid)に反映され、PGE、インターロイキン-1、6等が増加することが明らかになっている。しかしながら、矯正学的歯の移動時のGCF中のカテプシンに関しては十分に解明されていない。そこで、矯正学的歯の移動時の歯肉溝溶出液中のカテプシンB(CAB)、L(CAL)の活性について検討した。上下顎左右第一小臼歯抜歯症例10名を対象とし、遠心移動を行う犬歯を実験歯、反対側の犬歯ならびに実験歯と同側の反対顎の犬歯を対照歯とした。レベリング後、ステンレスワイヤーを装着し、エラスティックチェーンを用いて実験歯の遠心移動を行った。移動開始後、継時的(0,1hr、24hr、168hr)にGCFを採取した。タンパク抽出後、CAB、CALの測定は、ELISA kitにて行った。矯正学的歯の移動に伴い実験歯GCF中のCAB、CALの産生量は24hrで対照歯よりそれぞれ約2倍高い値を示した。さらに、Western-blot分析によりCABのタンパクを確認した。

また、矯正治療のため抜去した歯から採取した歯根膜を継代培養して得た歯根膜細胞に周期的伸展力を918%で5日間作用させた結果、CALの活性は周期的伸展力により経時的および伸展力依存的に増加した。以上の結果より、矯正学的歯の移動時の骨コラーゲン分解にCAB、CALが深く関与していることが示唆された。矯正学的歯の移動に伴う骨代謝におけるlysosomalcystein proteaseの菊について検討するために、矯正学的歯の移動時の歯肉溝滲出液中のカテプシンB(CAB)、L(CAL)の活性について測定した。上下顎左右第一小臼歯抜歯症例10名を対象とし、遠心移動を行う犬歯を実験歯、反対側の犬歯ならびに実験歯と同側の反対顎の犬歯を対照歯とし、ステンレスワイヤーを装着後、エラスティックチェーンを用いて実験歯の遠心移動を行った。移動開始後、継時的(0、1hr、24hr、168hr)にGCFを採取した。タンパク抽出後、CAB、CALの測定は、ELISA kitにて行った。矯正学的歯の移動に伴い実験歯GCF中のCAB、CALの産生量は24hrで対照歯よりそれぞれ約2倍高い値を示した。さらに、Western-blot分析によりCABのタンパクを確認した。さらに、in vivoの実験系において、Waldoの方法に基づき13週齢のWister系雄性ラットに実験的矯正力を加えて、7日までのCABおよびCALの局在を免疫組織学的に検討した。その結果、歯の移動開始後3日目に圧迫側および牽引側の両側において破骨細胞の出現を認め、その細胞はCABおよびCALの強度陽性を示していた。また、歯根膜線維芽細胞におけるCABおよびCALの染色態度の対照群に比較して陽性度が高かった。7日目も引き続き同様の所見が得られたが3日目に比較して、破骨細胞、歯根膜線維芽細胞における染色態度は若干減少していた。前年度までに矯正学的歯の移動時の歯肉溝滲出液中のカテプシンB(CAB)、L(CAL)の活性が実験歯において24hrで対照歯よりそれぞれ約2倍高い値を示したこと、また、培養歯根膜線維芽細胞に周期的伸展力を918%で5日間作用させた結果、CALの活性は周期的伸展力により経時的および伸展力依存的に増加したこと、また、in vivoの実験系において13週齢のWister系雄性ラットに実験的矯正力を加えて、7日までのCABおよびCALの局在を免疫組織学的に検討した結果、歯の移動開始後3日目に圧迫側および牽引側の両側において破骨細胞の出現を認め、その細胞はCABおよびCALの強度陽性を示したことを報告した。
Wntシグナルを活性化する新規DIX蛋白Ccd1の神経回路形成における役割の解析

Wntシグナルは、発生期の体軸形成、分化、誘導を担い、軸索ガイダンス、シナプス形成においても重要な役割を持つ。Wntシグナル伝達には、βカテニン経路、PCP経路、Ca2+経路など複数の経路が存在するが、下流の情報伝達系やその調節機構については不明な点が多い。我々は、Wnt/βカテニン経路の情報伝達に必須なDishevelled (Dvl)とAxinの両者に保存されたDIXドメインを持つ第三の分子としてゼブラフィッシュCcd1 (Coiled-coil-DIX1)を単離し、Ccd1がin vitro及びin vivoでWntシグナルを活性化し、神経パターン形成に重要な役割を持つことを報告した。マウスのCcd1遺伝子を単離したところ、プロモーターの使い分けにより、ゼブラフィッシュCcd1と相同な構造を持つCcd1Bタイプ以外に、CHドメインをN末端に持つCcd1Aタイプが存在することを見出した。ゼブラフィッシュから単離したCcd2はAタイプとBタイプをコードすることを明かにした。培養細胞に発現させると、Ccd1B蛋白は小胞として細胞全体に分布したが、Ccd1A蛋白はアクチン繊維と共局在した。更に、Dvl蛋白の局在がCcd1AまたはCcd1Bの発現により変化することから、細胞内でDvl蛋白とCcd1蛋白が相互作用することが示唆された。ノックアウトマウスは、完全な機能喪失型ではなく、partial loss of functionになっていると考えられ、大きな異常は見られなかった。ゼブラフィンシュ胚にCcd2遺伝子に対するモルフォリノオリゴヌクレオチドを微量注入したところ、体軸が腹側に屈曲する表現(curly tail-down phenotype)が観察された。この異常はNodal、ヘッジホッグ系の変異体でも観察されることから、Ccdを介したシグナルも正中部形成と関連する可能性が考えられた。Wntシグナルは、発生期の体軸形成や分化・誘導の中心的なシグナルであり、神経系でも、分化、軸索ガイダンス、シナプス形成において重要な役割を担っている。Wntの情報伝達にDishevelled (Dvl)とAxinが必須であることが示されているが、下流の情報伝達経路やその調節機構については不明な点が多い。我々は、最近、DvlとAxinで保存されたDIXドメインを持つ第三の分子としてCcd1 (Coiled-coil-DIX1)を単離し、Ccd1がin vitro及びin vivoでWntシグナルを活性化すること、ゼブラフイッシュ胚で神経パターン形成に重要な役割を持つことを報告した。更に、マウスの相同遺伝子を単離し、アクチン結合蛋白質で見られるcalponin homology (CH)ドメインを有する新しいサブタイプ(Ccd1A)が存在することを見出した。本研究では、マウスCcd1蛋白と相互作用する蛋白を解析するとともに、Ccd1サブタイプの発現パターンとその細胞内局在や役割を調べ、Ccd1のWntシグナル伝達における役割を明らかにすることを目指している。In situハイブリダイゼーションとノーザンブロットを用いてCcd1サブタイプの発現を調べた所、Ccd1Aは胎児、脳、精巣に多く、Ccd1Bは脳、肺などに多かった。また、培養細胞にcDNAをトランスフェクションし、発現した蛋白を免疫染色法によって調べた結果、Ccd1AとCcd1Bが細胞内で異なる局在を示すことが明らかになった。Ccd1Aサブタイプは、アクチン結合蛋白に見られるCHドメインを持ち、細胞内でアクチン繊維と共局在することが観察されたので、今後アクチン蛋白との直接的な相互作用を検討する必要がある。また、ゼブラフィッシュからCcd1と高い相同性を示すCcd2遺伝子を単離した。

Ccd2遺伝子には、転写開始部位の違うアイソフォームが存在し、マウスと同じCHドメインを持つAタイプが存在することが明らかになった。Ccd2のドミナントネガティブ型をゼブラフィッシュ胚に過剰発現させた場合にも、Ccd1を過剰発現させた時と同様の変化が認められたことから、Ccd2もWntシグナルの制御に関わると考えられる。Wntは、発生期に体軸形成や分化・誘導を担うシグナル分子であり、神経系では、分化、軸索ガイダンス、シナプス形成において重要な役割を持つ。Wntの情報伝達系は複数存在し、下流の情報伝達経路やその調節機構については不明な点が多い。我々は、Dishevelled(Dvl)とAxinで保存されたDIXドメインを持つ第三の分子としてCcd1(Coiled-coil-DIX1)を単離し、Ccd1がin vitro及びin vivoでWntシグナルを活性化すること、ゼブラフィッシュ胚で神経パターン形成に重要な役割を持つことを報告した。更に、マウスの相同遺伝子を単離し、アクチン結合蛋白質で見られるcalponin homology(CH)ドメインを有する新しいサブタイプ(Ccd1A)が存在することを見出した。本研究では、マウスCcd1蛋白と相互作用する蛋白を解析するとともに、Ccd1サブタイプの発現パターンとその細胞内局在や役割を調べ、Ccd1のWntシグナル伝達における役割を明らかにすることを目的としている。RT-PCRとノーザンプロットを用いてノックアウトマウスのCcd1を調べたところ、遺伝子破壊によって除去されたエキソンを除いた部分の転写産物が少量検出された。また、これとは別に異常な構造を持つ転写産物も作られていた。従って、遺伝子破壊により、完全な機能喪失型ではなく、partial loss of functionになると考えられた。培養細胞にCcd1AとCcd1B cDNAをトランスフェクションした結果、Ccd1A蛋白とCcd1B蛋白が細胞内で異なる局在を示し、Ccd1Aサブタイプは、アクチン繊維と共局在した。今後、サブタイプ間で異なる機能が存在するかどうかを検討する必要がある。また、ゼブラフィッシュから新たに単離したCcd2遺伝子には、CHドメインを持つAタイプが存在することが明らかになった。更にモルフォリノオリゴヌクレオチドを微量注入したところ、初期胚で特徴的な形態異常が観察された。今後は、機能阻害胚で各種マーカー遺伝子の発現パターンを精査し、Ccdの発生における役割を明らかにする予定である。Wntシグナルは、発生期の体軸形成、分化、誘導を担い、軸索ガイダンス、シナプス形成においても重要な役割を持つ。Wntシグナル伝達には、βカテニン経路、PCP経路、Ca2+経路など複数の経路が存在するが、下流の情報伝達系やその調節機構については不明な点が多い。我々は、Wnt/βカテニン経路の情報伝達に必須なDishevelled(Dvl)とAxinの両者に保存されたDIXドメインを持つ第三の分子としてゼブラフィッシュCcd1(Coiled-coil-DIX1)を単離し、Ccd1がin vitro及びin vivoでWntシグナルを活性化し、神経パターン形成に重要な役割を持つことを報告した。
農耕地負荷削減のための物質循環モデルの構築

中山間地の典型である長野県千曲川・犀川流域を対象とし、行政統計資料を用いて、過去2030年間にわたる窒素負荷発生量の変遷を調べ、主要な汚染源を明らかにし、窒素負荷発生機構と河川水の水質との関係を検討した。1.対象流域内の最大の窒素負荷発生源は、家畜排泄物であり、次が家庭排水、農耕地からの流出の順であった。家畜飼養頭数・農耕地面積の減少にともない、家畜・農耕地由来の窒素負荷発生は減少している。2. 1980年以降、化学肥料流通量(≒使用量)は、農耕地での必要施肥量を大きく下回るようになり、その分、畜産排泄物の農地還元が進んでいるものと考えられる。1990年以降は、畜産排泄物の大部分は、農地に還元されている計算になった。3.流域での窒素負荷低減に対する家庭排水処理の寄与は小さい。ヒトの屎尿は、屎尿処理場で処理されていたので、下水道の普及による、家庭排水からの新たな窒素負荷削減(上乗せ)はわずかである。ただし、窒素除去効率の改善は技術的には可能となっており、その技術が普及すれば下水処理による大幅な削減が期待できる。4.流域内の窒素流出量は、過去30年間で23,000トンから13,000トンへ半減した。それには、畜産廃棄物の農耕地還元と化学肥料使用量の減少が大きく寄与している。ただし、この窒素流出量の減少は、河川の窒素流下量には必ずしも反映されていなかった。5.今後流域での窒素負荷をさらに削減するには、流域外から流入する窒素(飼料・食料・肥料)まで含めた削減計画が必要である。
アポ蛋白Mを用いた播種性血管内凝固症候群、多臓器不全の新規治療法の確立

マウスにHDL上に存在するアポ蛋白Mを過剰発現あるいは発現抑制させることにより、敗血症モデルマウスであるリポポリサッカライド誘導DIC・多臓器不全モデルマウスの予後を改善あるいは悪化させることが分かった。また、リコンビナントアポ蛋白Mを用いることにより、リポポリサッカライド誘導DIC・多臓器不全モデルマウスの臓器障害を改善させることができた。これらの研究成果はアポ蛋白Mの敗血症に続発するDIC・多臓器不全の治療に応用できる可能性を示唆する。本邦における感染症による死亡は、優れた抗生物質が開発されてきている現在においても死因統計において未だ上位に位置している。その1つの大きな原因として、感染症に続発する播種性血管内凝固症候群(DIC)そして、多臓器不全(MOF)により、抗生物質などによる原疾患の治療が効果を発揮する前に致死的状態に陥ってしまうことが挙げられる。したがって感染症による死亡率を下げるためには、抗生物質の開発とともに、DICそれに伴うMOFに対する治療薬を開発することが求められているが、現在のところ、有望な治療薬に乏しい。本研究では、細胞生存促進・抗アポトーシス作用があり、様々な臓器において臓器保護作用が報告されているスフィンゴシン1-リン酸を、その輸送体、分解抑制因子であるアポ蛋白M(ApoM)を用いることで、体内における総量および作用を増強し、播種性血管内凝固症候群、多臓器不全による生存率改善を試みることを目標とし、リポポリサッカライド誘導DIC・MOFマウスモデルを用いて検討をする。そして、最終的には、リコンビナントApoMの有用性についても検討し、将来の臨床応用への架け橋となる基盤を作ることを目的とする。平成27年度には、ApoM過剰発現により、LPS誘導DIC・MOFモデルの生存率向上を再確認し、その機序として、ApoMがS1P受容体1, S1P受容体3依存的に抗アポトーシス作用を発揮することを解明した。また、ApoMを発現抑制すると、LPS誘導DIC・MOFモデルの生存率を悪化させ、アポトーシスマーカーを増加させていたことを発見した。また、平成28年度に使用する予定であるApoMリコンビナントの精製を行った。平成27年度は、(1)アポリポ蛋白M(ApoM)過剰発現によるLPS誘導DIC・MOFモデルの生存率向上のメカニズムの検討、(2)ApoM発現抑制によるLPS誘導DIC・MOFモデルの生存率、臓器障害に与える影響の検討、(3)ApoM recombinantの作成を予定していたが、(1)については、ApoM過剰発現による生存率向上のメカニズムはスフィンゴシン1-リン酸(S1P)受容体1, 3による抗アポトーシス効果、細胞生存促進効果が大きいことが分かり、(2)については、ApoM発現抑制により、生存率が低下しており、(3)についてはApoMリコンビナントの作成が終了している。よって、当初の予定通りに研究が進んでいる。平成28年度には、平成27年度までに発見していた敗血症モデルマウスであるリポポリサッカライド(LPS)誘導DIC・多臓器不全(MOF)モデルマウスにおけるアポ蛋白M(ApoM)の生存率改善、臓器保護作用の機序についてまず検討した。その結果、ApoM過剰発現により、炎症性サイトカインの上昇は抑制されなかったが、PAI-1の上昇抑制および催アポトーシスマーカー(BAXやcaspase3のcleavage)の抑制がみられ、抗凝固作用、抗アポトーシス作用が関与すると考えられた。さらには、S1P受容体アンタゴニストであるVPC23019により、前述のApoMのLPS誘導DIC・MOFに対する保護作用が、少なくとも部分的に阻害されており、ApoMは抗アポトーシス作用や生存促進作用を持つ強力な生理活性脂質であるスフィンゴシン1-リン酸(S1P)を増やすことにより、S1P受容体1,3を活性化することにより、抗凝固作用、抗アポトーシス作用を発揮している可能性が考えられた。次に、平成27年度に確立したリコンビナントApoMを用いて、ApoMがDIC・MOFに対して治療医学的応用ができるか検討した。残念ながら、リコンビナントApoMを投与してもマウス血漿S1Pの増加は、有意差はあるものの、1.52倍ほどにしか増加しなかった。しかしながら、リコンビナントApoMは、少量のLPSを投与したマウスのクレアチニン、ALTの上昇を抑制することができ、リコンビナントApoMの代謝動態を研究し、改良すれば、DIC・MOFの治療へ応用することができると考えられた。平成28年度は、ApoMリコンビナントのin vitroおよびin vivoにおける機能評価、およびApoMリコンビナントのLPS誘導DIC・MOFモデルに対する有用性の検討を行う。ApoMリコンビナントの有用性が見られたら、in vitroの研究にてその機序について検討を行う予定である。脂質学予定の研究は遂行することができたが、予定数以下のマウスにて生存率に有意差がついたこと、S1P受容体アンタゴニストをまとめて購入することにより費用を節約できたため。

費用的に余裕があれば、平成28年度のin vitroにおけるApoMリコンビナントの作用の検討は、よりヒトに近いモデルで行うため、初代培養細胞やiPS細胞を分化させて作成した細胞などを用いることを検討する。研究内容および研究業績を掲載している。
軸不斉機能分子素子による不斉空間の構築と触媒的立体制御

1.研究計画に従い、2分子のアミノアルコールとのカップリング反応による不斉配位子の合成については、マロン酸より得られるイミデ-ト塩との反応によりビスオキサゾリン系触媒を構築することができ、その触媒能についてジエチル亜鉛によるアルキル化を中心に検討を加えた。その結果、40%程度の高い選択性が達成された。2.L-酒石酸より得られる対称性イミドの還元を行い、連続不斉中心を有するアミドアルコールを得た。このアミドアルコールを用いてジエチル亜鉛による触媒的不斉アルキル化について詳細に検討した。その結果、次の4項目が新たな知見として得られた。(1)N-上の置換基がよりかさ高いほど立体選択性は向上する。(2)最高で不斉触媒は18.8回回転している。(3)4位がSの立体配置を有している化合物を用いた方が、高い立体選択性が得られる。(4)エーテルを用いた方がトルエン溶媒とするよりも高い選択性が得られる。また、糖であるアラビノフラノースを用いて、環状のアミド系不斉配位子につても23の検討を加えた。これまでにキラル素子としての不斉触媒能に関しては、本研究におけるような鎖状、および環状アミド系の報告例はまったくなく、極めて興味深いと考えられる。3.さらに新たな試みとして、同一の出発物質であるアラビノフラノースを用い、立体選択的求核付加および脱酸素反応を利用することにより、抗生物質である(-)-anisomycinと(+)-preussinの不斉全合成も達成した。まとめとして、上記の研究経過において明らかにしたように、主として目的とした不斉有機配位構造の構築とその触媒能の検討を行った。また、今回新たに生理活性天然物2種類の合成が達成された。研究計画に従いL-酒石酸より得られる対称性イミドの還元を行い、連続不斉中心を有するアミドアルコール(3)を得た。新たな不斉配位素子Aを合成する前段階の研究として、直接(3)のキラル素子としての不斉触媒能について詳細に検討した。その結果、RおよびR′によってその触媒能が大きく変化することが明かなった。しかしながら高度の選択性は現在までのところ得られておらず、最終的にはAを合成する必要があると思われる。一方、2分子のアミノアルコールとのカップリング反応による不斉配位子Bの合成については、やはり前段階として比較的単純な構造であるマロン酸との反応によりビスオキサゾリン系触媒を構築することができ、その触媒能についてジエチル亜鉛によるアルキル化を中心に検討を加えた。その結果、40%程度の選択性が達成され今後の進展が大きく期待される。上記の研究経過において明らかにしたように、これまでは主として目的とした不斉配位構造の前段階として、各種中間体や誘導体を用いた基礎的な触媒能の検討を行ってきた。それらの反応によって得られた結果は、基礎研究としては十分満足のゆく結果が得られており、今後本申請において明らかにした新しい不斉配位子であるA、あるいはBを構築することによって触媒サイクルによる高度な不斉反応の展開が期待される。さらにこれらの研究に加えて、新たに糖から誘導される同じタイプの不斉配位子の合成と触媒能についても研究標的として検討している。

このアミドアルコールを用いてジエチル亜鉛による触媒的不斉アルキル化について詳細に検討した。その結果、次の4項目が新たな知見として得られた。(1)N-上の置換基がよりかさ高いほど立体選択性は向上する。(2)最高で不斉触媒は18.8回回転している。(3)4位がSの立体配置を有している化合物を用いた方が、高い立体選択性が得られる。(4)エーテルを用いた方がトルエン溶媒とするよりも高い選択性が得られる。また、糖であるアラビノフラノースを用いて、環状のアミド系不斉配位子につても23の検討を加えた。これまでにキラル素子としての不斉触媒能に関しては、本研究におけるような鎖状、および環状アミド系の報告例はまったくなく、極めて興味深いと考えられる。3.さらに新たな試みとして、同一の出発物資であるアラビノフラノースを用い、立体選択的求核付加および脱酸素反応を利用することにより、抗生物質である(-)-anisomycinと(+)-preussinの不斉全合成も達成した。まとめとして、上記の研究経過において明らかにしたように、主として目的とした不斉有機配位構造の構築とその触媒能の検討を行った。また、今回新たに生理活性天然物2種類の合成が達成された。
超高分解能近接場光学顕微鏡の開発と分子鎖像に基づく高分子ナノ構造の研究

本研究は共役高分子の励起状態における光物理素過程を高分子ナノ構造の観点から考察したものである。当該年度に得られた成果は以下のように要約される。(1)結晶性共役高分子regioregular poly (3-hexylthiophene) (P3HT)薄膜内での一重項励起子拡散ダイナミクスについて研究した結果、一重項励起子の拡散定数および拡散長がそれぞれ7.9×10^<-3>cm^2s^<-1>および20nmであることを明らかにした。また二分子失活速度の時間依存性を解析し、P3HT結晶相内では励起子は一次元的に拡散していることを明らかにした。(2)一つの一重項励起子から二つの三重項励起子が生成する多重励起子生成反応(singlet fission)について研究した。アモルファスなpoly(9,9'-di-n-octylfluorene) (PFO)薄膜では三重項生成効率は高いが、三重項解離効率が低いため、生成した励起子の約半分が消滅した。一方、PFO主鎖の平面性が高く、分子鎖が配列した構造をとるβ-PFO薄膜では、電荷分離が競合過程となるため三重項生成効率は低いものの、励起子の拡散定数が大きいため、高い解離効率が得られることを明らかにした。(3)PFOに構造の異なる芳香族アミンをそれぞれ導入した2種の高分子薄膜での三重項励起子ダイナミクスを調べた。その結果、平面性の低い芳香族アミンを有するF8-PDAでは、励起子は膜内を拡散できるのに対し、三重項エネルギーの低いF8-ADAの励起子は拡散できなかった。このような励起子ダイナミクスの違いは、フルオレン基と芳香族アミンの相対的な三重項エネルギー準位の違いによることを明らかにした。以上の成果は高分子光物理・光化学の学問上興味深いばかりでなく、有機薄膜太陽電池や有機LEDなどの応用分野においても寄与するものと期待される。本研究はナノレベルでの分子形態観察から進めて、高分子の集合構造と光・電子機能との相関に着目し、有機エレクトロニクスの分野での活躍が期待される共役高分子の機能をナノスケールの構造から解明しようとする試みである。これまでの研究により結晶相での励起子拡散やsinglet fissionによる多重励起子生成など、応用上重要ないくつかの光物理素過程について高分子ナノ構造との相関を明らかにすることができた。これまでの研究により共役高分子の形成するナノ構造場での励起状態ダイナミクスについては一定の成果をあげることに成功した。本研究の最終目標は有機薄膜太陽電池の高効率化にあるため、今後の研究方針としてはこれまで行ってきた基礎的な研究をさらに進めるとともに、本研究成果に基づく光電変換効率向上を目指す。とくに独創的・新規的な課題としてsinglet fissionによる多重励起子生成を応用した光電流増感に取り組みたいと考えている。また研究範囲を電荷のダイナミクスにまで拡大し、ナノ構造場における電荷再結合ダイナミクスについても研究したいと考えている。第1年度前半は、修士課程から引き続き光学顕微鏡による単一高分子鎖の研究に取り組み、100nm以下の空間分解能を持つ光学顕微鏡SNOMにより、単分子膜内で形成されたミクロ相分離構造中に束縛された高分子鎖の特異な形態特性を明らかにした。この課題は表面・界面などの二次元空間に束縛された高分子の特性を分子レベルから明らかにする試みであり、その研究成果は2010年度の高分子関連学会にて自らが発表している。また、本研究をさらに発展させるため、ナノレベルの分子形態観察から進めて、高分子の集合構造と光・電子機能との相関に着目し、有機エレクトロニクスの分野で活躍が期待されている共役高分子の機能を、顕微分光観察によりナノスケールの構造から解明しようと試みた。本研究では特に盛んに研究されている(1)P3HTと(2)PFOの二種の高分子を研究対象として選択した。(1)側鎖の向きが揃ったP3HTは薄膜中で主鎖がπスタックした結晶構造を形成することが知られており、本研究ではP3HTの結晶構造と結晶内での励起子拡散やホール輸送性などの光・電子物性との相関について研究している。フィブリルを顕微分光観察することでP3HT結晶内で生成した励起子のダイナミクスについて検討した。(2)これまでに共役高分子内において三重項励起子の超高速生成が確認されており、これは一重項励起子分裂(singlet fission)によるものであると考えられている。本研究ではPFO薄膜内でのSinglet fissionとモルフォロジーとの関係について分子レベルから検討している。今年度の研究では主鎖が平面的なβ-PFOはアモルファスPFOに比べ三重項励起子が生成しにくいことが明らかになった。今後は光吸収から三重項生成までの各素過程においてどのプロセスがsinglet fissionの効率に影響を与えているのかをより詳細に検討していく予定である。本研究では共役高分子の中でも特に盛んに研究されているpoly(3-hexylthiophene) (P3HT)とpoly(9,9-dioctylfluorenyl-2,7-diyl)(PFO)の二種の高分子を研究対象として選択した。当該年度における研究成果は主に以下の二点に要約される。

(1)結晶性のregioregular-P3HT (RR-P3HT)とアモルファスなregiorandom-P3HT (RRa-P3HT)とを用いて、これらの薄膜内で生成した励起子の拡散ダイナミクスについて膜の結晶性が及ぼす影響について検討した。その結果、アモルファスなRRa-P3HTでは励起子は三次元的にランダムな拡散をするのに対し、結晶性のRR-P3HTは一次元的な拡散挙動を示し、またRRa-P3HTに比べ拡散定数が一桁程度大きいことを明らかにした。これはP3HT薄膜内での励起子拡散の次元性およびその起源について深く追求した初の研究であり、近日論文を投稿する予定である。(2)ベンタセンなどの低分子結晶中においては古くから三重項励起子の高速生成が知られており、これは一重項励起子分裂(singlet fission)によるものとされている。Singlet fissionの効率は薄膜内のモルフォロジーに依存すると予想されているが、その詳細は明らかになっていない。本研究ではPFO薄膜内でのsinglet fissionとモルフォロジーとの関係について分子レベルから検討している。PFOもまた薄膜作成法を変えることにより、アモルファスな薄膜とβ-相と呼ばれる主鎖が平面状にパッキングした構造を形成する。当該年度の研究によりアモルファスな薄膜の方がsingletfissionによる三重項対の生成量が多いことがわかった。これはβ-PFO薄膜では電荷生成反応がsinglet fissionと競合するためであることがわかった。共役高分子系におけるsinglet fissionの研究例は極めて少なく、フルオレン系共役高分子でのsinglet fissionは本研究ではじめて確認された。今後細部の検討をした後、論文を投稿する予定である。本研究は共役高分子の励起状態における光物理素過程を高分子ナノ構造の観点から考察したものである。当該年度に得られた成果は以下のように要約される。(1)結晶性共役高分子regioregular poly (3-hexylthiophene) (P3HT)薄膜内での一重項励起子拡散ダイナミクスについて研究した結果、一重項励起子の拡散定数および拡散長がそれぞれ7.9×10^<-3>cm^2s^<-1>および20nmであることを明らかにした。また二分子失活速度の時間依存性を解析し、P3HT結晶相内では励起子は一次元的に拡散していることを明らかにした。(2)一つの一重項励起子から二つの三重項励起子が生成する多重励起子生成反応(singlet fission)について研究した。アモルファスなpoly(9,9'-di-n-octylfluorene) (PFO)薄膜では三重項生成効率は高いが、三重項解離効率が低いため、生成した励起子の約半分が消滅した。一方、PFO主鎖の平面性が高く、分子鎖が配列した構造をとるβ-PFO薄膜では、電荷分離が競合過程となるため三重項生成効率は低いものの、励起子の拡散定数が大きいため、高い解離効率が得られることを明らかにした。(3)PFOに構造の異なる芳香族アミンをそれぞれ導入した2種の高分子薄膜での三重項励起子ダイナミクスを調べた。その結果、平面性の低い芳香族アミンを有するF8-
標的絶対定量プロテオミクスに基づく血液脳関門可塑性の分子機構解明

本研究は、標的絶対定量プロテオミクス(Quantitative targeted absolute proteomics)を基盤として、「動的インターフェースとしての血液脳関門(BBB)輸送機能の可塑性(plasticity)」の分子機構を解明することを目的とした。具体的には、てんかんや炎症脳病態マウスモデルにおけるBBB輸送タンパク質の発現とP-糖蛋白を介した輸送機能の変動を解明した。さらに、ヒト脳毛細血管内皮細胞における酸化ストレスや炎症性サイトカイン暴露時のP-糖蛋白の輸送機能の変動と、その制御タンパク質のリン酸化による輸送活性調節機構を解明した。「動的インターフェースとしての血液脳関門(BBB)可塑性の分子機構解明」を目的として、本年度は、アトモルレベルの高感度標的リン酸化定量プロテオミクスを確立して、脳毛細血管内皮細胞の輸送機能を変動させる細胞膜上や細胞内で情報伝達に関与するリン酸化タンパク質を同定した。具体的には、ストレス病態モデルとして過酸化水素を曝露したヒト脳毛細血管内皮細胞株(hCMEC/D3細胞)を用い、P-glycoprotein(P-gp)/MDR1単分子輸送活性の制御機構を解明した。hCMEC/D3細胞におけるP-gpを介したvinblastineの排出輸送活性は過酸化水素の暴露濃度依存的に低下する一方、P-gp絶対発現量は有意に変動しなかった。リン酸化定量プロテオミクス解析の結果、過酸化水素によるP-gp輸送活性低下に伴って、リン酸化量が変動するタンパク質を同定した。特に、細胞膜結合タンパク質カベオリン-1についてTyr14のリン酸化絶対量とP-gpの単分子輸送機能が相関することを見出した。さらに、細胞内伝達に関与するtyrosine-protein kinase Srcの顕著なリン酸化変動が検出された。以上の結果から、ヒトBBBのP-gp輸送機能の制御機構としてカベオリン-1のTyr14リン酸化が関与することを解明した。本研究成果によって、脳毛細血管内皮細胞における細胞情報伝達経路の活性化によるトランスポーター機能の制御機構の定量的解明に突破口が開かれた。「血液脳関門の可塑性の分子機構解明」を目的として、本年度は標的絶対定量プロテオミクス(QTAP)の手法を用いて、病態モデルマウス脳組織の毛細血管におけるトランスポーターを含む薬物動態に関与する機能性タンパク質の絶対発現量を解明し、正常と比べて発現が変動する分子を同定した。ペンチレンテトラゾール(PTZ)を腹腔内に5週間反復投与することよって、てんかん様症状を示すマウスを作成した。また抗てんかん薬であるフェニトインを5週間反復投与し薬物治療モデルを、3 mg/kg LPSを腹腔内投与することによって炎症モデルを作成した。これら3種のモデルと自然てんかんモデルであるELマウスから脳毛細血管を単離し、QTAPによって31種の機能性分子の絶対発現量を測定した。その結果、PTZてんかんモデル、ELマウス及び薬物治療モデルにおいて、異物排出トランスポーターの発現量が正常マウスに比べて有意に増加していた。対照的に炎症モデルでは、そのトランスポーターの発現量は変化せず、有機アニオントランスポーターの発現量が有意に低下していた。脳疾患の中で脳関門機能が最も劇的に変化すると考えられる脳腫瘍について、ヒト脳腫瘍組織から毛細血管を単離する方法を最適化した。以上の研究結果は、ボトムネックとなっていた病態時の血液脳関門の解析手法の限界を克服するとともに、脳疾患に対する薬物治療において薬剤感受性の低下の原因の一つが、病巣部位の血液脳関門における薬物輸送機能の変動であることを支持している。本研究は、定量プロテオミクス、in vivo病態モデルマウス、及びヒト血液脳関門(BBB)モデル細胞(hCMEC/D3細胞)を用いて、病態時におけるBBB輸送機能の定量的変化と、細胞情報伝達経路の変動機構を解明することを目的とした。BBBにおいて薬物の脳移行性を制御するP-糖蛋白は、てんかんや炎症などの病態時において排出輸送活性を変動させることが報告されている。てんかん病態モデルとして用いたpentylenetetrazole投与マウス及び自然発症マウスにおいて、脳血管におけるP-糖蛋白の発現量が増加することを示した。P-糖蛋白の発現量増加と単分子輸送活性を組み入れた数理モデルを用いて、基質となるベラパミルのBBB透過性の低下を再構築することに成功した。さらに、炎症病態モデルとして、tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha)で処理したhCMEC/D3細胞では、P-糖蛋白の発現量は変化しなかったが、基質であるビンブラスチンの排出輸送活性が有意に低下することを示した。リン酸化定量プロテオミクスによって、TNF-alpha処理によってリン酸化量が変動するタンパク質を同定した。siRNAを用いた発現抑制実験の結果、ビンブラスチン排出輸送活性の低下は消失した。以上の結果から、hCMEC/D3細胞のTNF-alpha処理炎症モデルにおいて、P-糖蛋白の単分子あたりの輸送活性が低下することが示唆された。さらに、同モデルにおけるP-糖蛋白の単分子輸送活性の低下には、細胞内タンパク質のリン酸化量の増加が関与している可能性が示された。本研究は、定量プロテオミクス(Quantitative proteomics)を基盤として、ヒト病態時の血液脳関門(Blood-brain barrier, BBB)における輸送機能の変動とその制御機構を定量的に解明することを目的とした。具体的には、ヒト脳血管内皮細胞株hCMEC/D3細胞を用い、神経変性疾患や虚血病態の脳内環境モデルとして、酸化ストレス(過酸化水素)や炎症性サイトカイン(TNF-α)を暴露した場合の、P-糖タンパク(P-gp)の輸送機能の変動とその制御に関わる分子の同定を行った。

過酸化水素の存在下ではP-gp輸送活性が低下し、その機構にはP-gpの内在化が関与していた。リン酸化網羅的定量プロテオミクス解析から、酸化ストレス下におけるP-gpの輸送活性の主要な制御因子としてcaveolin-1(Cav1)のリン酸化シグナル伝達系が同定された。一方で、炎症病態における齧歯類のBBBでは、Cav1シグナルと異なる情報伝達経路が報告されている。hCMEC/D3細胞のTNF-αの曝露条件ではP-gp基質の排出活性は濃度依存的に低下したが、細胞膜上のP-gpは内在化しなかったことから、P-gpの単分子活性が変動することが示唆された。リン酸化網羅的定量プロテオミクス及びsiRNAノックダウン解析によって、TNF-α曝露によるP-gp輸送活性の低下に関与するCav1シグナルと異なる新たなシグナル伝達分子を同定した。以上の結果から、酸化ストレス及び炎症病態のBBBにおけるP-gp輸送機能の低下は、異なる情報伝達機構を介して制御されることが示唆された。これらの知見は、本研究において解明を目標とした「動的インターフェースとしてのBBBの可塑性」を説明する分子機構として、明確に位置づけられる。本研究は、標的絶対定量プロテオミクス(Quantitative targeted absolute proteomics)を基盤として、「動的インターフェースとしての血液脳関門(BBB)輸送機能の可塑性(plasticity)」の分子機構を解明することを目的とした。具体的には、てんかんや炎症脳病態マウスモデルにおけるBBB輸送タンパク質の発現とP-糖蛋白を介した輸送機能の変動を解明した。さらに、ヒト脳毛細血管内皮細胞における酸化ストレスや炎症性サイトカイン暴露時のP-糖蛋白の輸送機能の変動と、その制御タンパク質のリン酸化による輸送活性調節機構を解明した。本年度は、当初計画に従い病態モデルにおける輸送活性の変動機構の解明を進めた。さらに、リン酸化定量プロテオミクスを構築し、輸送活性制御タンパク質のリン酸化量の変動と輸送活性の変化の解明を進めた。27年度が最終年度であるため、記入しない。薬物動態学、定量プロテオミクス血液脳関門機能の可塑性解明の次段階として、病態モデル及びヒトin vitro血液脳関門モデルを用いて得られた知見をもとに、ヒト病態における脳毛細血管を用いた標的絶対定量プロテオミクス解析へ発展させる予定である。本年度は、平成26年度に計画していた「炎症病態モデルにおける輸送活性変動機構」の解析を前倒しで進めた。さらに、リン酸化定量プロテオミクス解析によって、当初計画では想定していなかった分子群が見い出だされた。当初計画が平成24年度の早期に完了し、血液脳関門で重要な役割を果たす密着結合分子や受容体など、当初は定量解析を計画していなかった分子群まで解析を進めることができ、それら分子群の発現量が顕著に変動していることを解明できた。