hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト膀胱平滑筋のカルシウム非依存性収縮

Ca^<2+>非依存性収縮における細胞内情報伝達の解析に主眼をおいた研究を行った.カルモジュリン阻害剤およびプロテインキナーゼ阻害剤を用いた収縮実験では,W-7(calmodulin inhibitor),ML-9(myosinlight chainekinase inhibitor)ともに、カルバコールによるCa^<2+>非依存性収縮を抑制しなかったのに対し,H-7(protein kinase C inhibitor)はこの収縮を強く抑制した.従ってCa^<2+>非依存性収縮はCa^<2+>依存性収縮におけるCa^<2+>/Calmodulin/MLCKsystemを介する反応ではなく,プロテインキナーゼCの活性化が関与した収縮であると考えられた.カルバコールによるムスカリン受容体刺激がホスフオリバーゼCを介してイノシトール三リン酸(IP_3)およびジアシルグリセロール(DG)を産生することが知られており,このDGが内因性にプロテインキナーゼCを活性化するとされていることからカルバコールによるCa^<2+>非依存性収縮もこの系によるのではないかと推察された.skinned fiber標本による検討ではヒト膀胱平滑筋のskinningに技術的問題があり実施し得ず,代わってcaffeineを用いた検討を行った.EGTAを含むCa^<2+>-free溶液中のヒト膀胱平滑筋筋切片にcaffeineを投与し細胞内Stored-Caを放出させた後でも,全く同一のカルバコールによるCa^<2+>非依存性収縮が認められた.すなわち,細胞内Stored-Caは本収縮には関与していないものと思われた.ヒト膀胱のCa^<2+>非依存性収縮の生理的意義は不明であるが,膀胱平滑筋固有の張力維持などに役立っている可能性があるかもしれない.また,病的膀胱の活動性抑制にカルシウム拮抗薬の効果が不十分であるという臨床からの所見は,この系路が病態整理と関係していることを示唆する.Ca^<2+>非依存性収縮における細胞内情報伝達の解析に主眼をおいた研究を行った.カルモジュリン阻害剤およびプロテインキナーゼ阻害剤を用いた収縮実験では,W-7(calmodulin inhibitor),ML-9(myosinlight chainekinase inhibitor)ともに、カルバコールによるCa^<2+>非依存性収縮を抑制しなかったのに対し,H-7(protein kinase C inhibitor)はこの収縮を強く抑制した.従ってCa^<2+>非依存性収縮はCa^<2+>依存性収縮におけるCa^<2+>/Calmodulin/MLCKsystemを介する反応ではなく,プロテインキナーゼCの活性化が関与した収縮であると考えられた.カルバコールによるムスカリン受容体刺激がホスフオリバーゼCを介してイノシトール三リン酸(IP_3)およびジアシルグリセロール(DG)を産生することが知られており,このDGが内因性にプロテインキナーゼCを活性化するとされていることからカルバコールによるCa^<2+>非依存性収縮もこの系によるのではないかと推察された.skinned fiber標本による検討ではヒト膀胱平滑筋のskinningに技術的問題があり実施し得ず,代わってcaffeineを用いた検討を行った.EGTAを含むCa^<2+>-free溶液中のヒト膀胱平滑筋筋切片にcaffeineを投与し細胞内Stored-Caを放出させた後でも,全く同一のカルバコールによるCa^<2+>非依存性収縮が認められた.すなわち,細胞内Stored-Caは本収縮には関与していないものと思われた.ヒト膀胱のCa^<2+>非依存性収縮の生理的意義は不明であるが,膀胱平滑筋固有の張力維持などに役立っている可能性があるかもしれない.また,病的膀胱の活動性抑制にカルシウム拮抗薬の効果が不十分であるという臨床からの所見は,この系路が病態整理と関係していることを示唆する.ウサギおよびヒトの膀胱平滑筋々切片を用いたorgan both studyでEGTAを含むCa-free溶液中でもカルバコールやプロスタグランディンE_2等の受容体作動薬による刺激で収縮することを確認し得た。また、同一の条件下でPKC活性化物質であるホルボールエステルで刺激しても収縮張力が得られた。収縮張力の大きさは、ウサギでは高カリウム収縮(Ca^<2+>を含む溶液中)の約37%であった。一方、ヒトでは2030%で、種差のあることが判った。さらに、ウサギ血管平滑筋ではCa非依存性収縮が高カルウム収縮の80230%と非常に大きく臓器差のあることも推定された。同時に行った細胞内Ca濃度促成(Fura-2)ではCa非依存性収縮の際、Ca濃度の変動はほとんど観察されず従来のCa^<2+>→CaM→MLCKを介した筋収縮とは異なった機序の関与が示唆された。ヒト膀胱で前立腺肥大による下部尿路閉塞のあったものや、二分脊椎で神経因性膀胱を呈していたものなどのいわゆる病的膀胱ではCa非依存性収縮が正常膀胱に比し大きい印象を持っている。この事は症例数がまだ少なく、統計学的処理もできない段階で断定できないが、今後興味のある検討課題であると考えている。膀胱拡大術や膀胱全摘出術などの際、患者の同意を得た上で、病的ヒト膀胱平滑筋のCa非依存性収縮をさらに詳しく評価していきたい。各種プロテインキナーゼ阻害剤を用いた実験ではCaM阻害剤W-7や、MLCK阻害剤ML-9は、Ca依存性収縮を著明に抑制するものの同じ用量のW-7はML-9はCa依存性収縮を全く抑制しなかった。

一方、PKC阻害剤であるH-7は530μMの範囲内でCa依存性収縮に影響を与えなかったのに対し、Ca非依存性収縮の方を著明に抑制した。以上より膀胱のCa非依存性収縮についても、PKCの活性化が関与しているものと考えられた。Ca^<2+>非依存性収縮における細胞内情報伝達の解析に主眼をおいた研究を行った.カルモジュリン阻害剤およびプロテインキナーゼ阻害剤を用いた収縮実験では,W-7(calmodulin inhibitor),ML-9(myosin light chainekinase inhibitor)ともにカルバコールによるCa^<2+>非依存性収縮を抑制しなかったのに対し,H-7(protein kinase C inhibitor)はこの収縮を強く抑制した.従ってCa^<2+>非依存性収縮はCa^<2+>依存性収縮におけるCa^<2+>/Calmodulin/MLCKsystemを介する反応ではなく,プロテインキナーゼCの活性化が関与した収縮であると考えられた.カルバコールによるムスカリン受容対刺激がホスフオリパーゼCを介してイノシトール三リン酸(IP_3)およびジアシルグリセロール(DG)を産生することが知られており,このDGが内因性にプロテインキナーゼCを活性化するとされていることからカルバコールによるCa^<2+>非依存性収縮もこの系によるのではないかと推察された.skinned fiber標本による検討ではヒト膀胱平滑筋のskinningに技術的問題があり実施し得ず,代わってcaffeineを用いた検討を行った.EGTAを含むCa^<2+>-free溶液中のヒト膀胱平滑筋筋切片にcaffeineを投与し細胞内Stored-Caを放出させた後でも,全く同一のカルバコールによるCa^<2+>非依存性収縮が認められた.すなわち,細胞内Stored-Caは本収縮には関与していないものと思われた.ヒト膀胱のCa^<2+>非依存性収縮の生理的意義は不明であるが,膀胱平滑筋固有の張力維持などに役立っている可能性があるかもしれない.また,病的膀胱の活動性抑制にカルシウム拮抗薬の効果が不十分であるという臨床からの所見は,この系路が病態整理と関係していることを示唆する.
遺伝的アルゴリズムによる電気探査逆問題の大域最適解探索と先験情報導入法の構築

本研究では,電気探査データによる地下比抵抗推定逆問題に関して,遺伝的アルゴリズムを利用した大域的解探索法の構築を行ない,従来のFEMをベースとする線形化反復法ではその収束解に偽像の発生する地下構造モデルをとりあげて,シミュレーションを中心に検討を行なった。その結果,従来法における偽像は,初期推定解に大きく依存するものであり,遺伝的アルゴリズムでは,それらの偽解も真の解とともに,探索過程において解集団の中に発生し,データから推定される最適解の候補として残留するものであることが,例として確認された。しかしながら,遺伝的アルゴリズムでは,地下の比抵抗分布を有限長の遺伝子コードとして表現することが必要であるので,地下構造も比抵抗値も比較的簡単で離散的なものに限るしかなく,その意味で,現段階では,解探索の範囲が空間としては広いものの,密度的には必ずしも十分であったとはいえず,確認された偽の解が唯一のものであるか,あるいは探索空間の中に多数存在するものであるかなど,大域的な解空間の構造まで議論するには至らなかった。さらに,逆問題においては,最適性の評価基準が解空間の構造を大きく左右するものであって,初期推定解を必要としない遺伝的アルゴリズムのような大域最適化法においては,その解探索プロセス以上にその基準の適切な設定が重要となってくることが示され,その意味で,ファジー理論の導入など,地質学的先験情報をその評価基準に取り込む方法の検討がとくに重要であることが示された。研究期間内には,実際の観測データを用いた解析などを含め,十分な検討がなされたとは言い難い。しかし,本研究で提示した,遺伝的アルゴリズムを利用した大域最適解探索と地質情報の融合法は物理探査逆問題全体においても大きな可能性をもっているものであり,今後もさらに検討を進めてゆきたいと考えている。
軍事環境下の子どもの医療人類学的研究─沖縄戦から連なる暴力的状況に着目して

第一に、沖縄戦で子どもが置かれた状況に注目しながら、「子ども」という視点から戦争の証言を整理し、子どもの戦争体験の特質について検討する。第二に、沖縄戦中から米軍が沖縄各地に設置した孤児院ならびに米軍野戦病院の精神科に関する公文書などの分析に加え、戦争孤児への聞き取りによって、精神保健・福祉の観点から子どもやコミュニティに対する戦争の影響を検証する。第三に、沖縄において虐待の問題に直面した個人の生活史と家族史を詳細に聞き取り、数世代にわたる家族の歴史を丹念に読み解いていくことで、沖縄戦から連なる暴力的体験や軍事環境が人びとの心身に与えてきた影響について考察する。
水田の環境保全と水稲の超多収を実現させるための戦略

本研究では、水田の環境を保全しながら水稲の超多収を実現させる戦略について検討した。得られた結果の概要は以下の通りである。1)1992年に998kg/10aの超多収を示した長野県伊那市の農家水田で生育するコシヒカリを調査し解析した。伊那コシヒカリの超多収性は、総根重、土壌表層根重の多さ、根の生理活性の高さに支えられた高い光合成速度と蒸散速度が背景にある。また、低水温の農業用水と土壌中の気相割合の多さも関係している。2)有機資材の連用により土壌中の腐植含有量は増加し、超多収を示した伊那コシヒカリと類似した根系形態を示すようになった。また、根の生理活性も高いことから、土壌への有機物連用は地力維持と環境保全への近道であると考えられた。3)コスト削減と外部環境に及ぼす影響を軽減するには、不耕起直播栽培や土中打込み点播方式も効果的である。また、LP肥料を用いたF1水稲品種の乾田不耕起直播栽培も北陸では有効であると考えられた。4)慣行的に施用されてきたN,R,K施肥の意味について、三要素継続試験から検討すると、三要素区、無P区、無K区での収量、根重、根の活力に有意な差が認められないことから、慣行的な施肥法を再考する必要性があることが明確となった。5)水稲の無農薬有機栽培の可能性について、コシヒカリBLを用いて検討した。再生紙マルチを用いて水稲を有機栽培すると575kg/10aの収量を示した。根系生育および根の生理活性は、超多収を示した伊那市のコシヒカリに近似していたことから、有機資材を用いて多収を実現することの可能性が示唆された。なお、畦畔にはアジュカ、イワダレソウを埴栽した。また、植物資材を利用した除草効果を検討したところ、米糠の利用が現実的であると判断された。6)2002年の伊那市の超多収コシヒカリの収量は800kg/10a以上を示した。本研究では、水稲の安定多収を維持しながらも外部環境に及ぼす負荷を極力少なくする栽培技術の確立を目指した。24年間豚糞堆肥を連続施用している水田で栽培したコシヒカリでは、慣行栽培(化学肥料)と比較して根系生育が旺盛であった。有機資材の連用により、土壌の物理化学性が改善され根の生育が促進されたものと考えられる。根の生理活性を示す指標として根系からの溢泌液量、根からのRb吸収量および溢泌液中のサイトカイニン(t-ZR)含量をELIZA法で測定した。1株あたりの溢泌液量と茎数および地上部乾重との間には正の相関関係(r=0.75,r=0.79)が認められた。有機栽培コシヒカリ(豚糞堆肥、カルス菌を用いて発酵させたボカシ有機堆肥)の1株あたりのRb吸収量は、株間および株直下20cmの位置で稲ワラ施用区より大きかった。不耕起移植栽培コシヒカリでは、株直下20cmでのRb吸収量が耕起区より大きく、根系の発達と根の活性の高さが推定された。

土中打ち込み点播(直播)コシヒカリでは、株間の表層および株直下でRb吸収が多く根の活力は高いと考えられた。7月8日におけるサイトカイニン含量は、豚糞堆肥区で0.52pM/mlであり化学肥料区(0.8pM/ml)より低く、有機栽培によるサイトカイニン含量の増加はなかった。伊那市の多収穫コシヒカリ(823kg/10a)では、株間の表層に分布する根量が極めて多く、他の調査区の2倍以上であった。多肥施用と土壌の通気性の良さ(気相は20%以上)が、根系生育に大きく影響していると考えられるが、溢泌液中のサイトカイニン含量が1.6pM/mlと高く、根の活性も高いと考えられた。三井化学(株)育成のF1多収品種(MH2001,MH2003)を材料に用いて、LP肥料を施用した乾田不耕起栽培を行い多収性と根系生育の関係を検討した。出穂期における押し倒し抵抗値は高く倒伏耐性に優れており、根系もよく発達していた。LP肥料の環境効果と収量への貢献が期待される。多収穫の実績を残している長野県伊那市で栽培されるコシヒカリの生育、光合成速度、蒸散速度、根の土壌中階層分布および出穂期における根の生理活性を測定した。対照として、石川県で25年間にわたり連続した同一施肥管理(無窒素、化学肥料のみ施用、豚ぷん堆肥の施用)条件下で栽培されたコシヒカリを調査した。また、品種間差異や低コスト環境保全型農業の実践例として、LP肥料を施用して乾田不耕起直播栽培を行ったF1品種(MH2003,MH2005)の特性を調査した。対照区と比較すると、多収コシヒカリの根量は多く、出穂期における光合成速度や蒸散速度は富山県の慣行栽培区の測定値の約2倍であった。出穂期における根系からのRb吸収量を指標として表示した根の生理的活力は、多収コシヒカリが対照区より有意に高かった。多収穫の背景には、根の生理的活性の高さと高い光合成速度および蒸散が関与していることが明らかとなった。乾田不耕起直播したF1品種の根系はコシヒカリより有意に高い生理活性をもつことも明かになった。多収穫と根の生理活性との間には密接な関係があると考えられた。低水温の農業用水を利用している伊那コシヒカリと富山県入善町コシヒカリを比較して、水温が水稲の生育および収量に及ぼす影響を検討した。入善の水稲の場合、水口部の水稲根生育量は水尻部より有意に小さく、低水温の影響が顕著に表われていた。伊那では、水口部と水尻部における根系生育の差は小さく、収穫期では水口の根系生育が大きい結果も示された。伊那で利用している三峯川水系の用水にはSiやCaが多く含まれていることから、生育に対しては水温よりも用水から供給される天然のSi量の影響を考える必要があると考えられた。長期間にわたる堆肥連用圃場で栽培したコシヒカリの根系生育は大きかった。表題に示されたテーマを達成させるためには、有機物の施用とLP肥料の併用およびSi供給量を考えるべきである。1)今日の水稲栽培では、慣行的にN, P, Kの三大肥料要素が施用されている。富山県農業試験場の三要素試験圃場(継続20年目)において、コシヒカリの根系生育、根の生理活性および収量構成要素を調査した。無K施用区および無P施用区の収量は三要素施用区と大きな差はなく、根重の階層分布および出液速度にも大きな差は認められなかった。水稲栽培におけるPまたはKの施用は再考する必要があることが示唆された。2)長野県伊那市および富山県入善町の多収穫水田でコシヒカリの栽培試験を実施した。Rb吸収量を指標とした根の活力は、株間5cm下よりも株直下20cmで高かった。しかし、登熟中期の根の活力は、必ずしも多収穫水田では高いとは言えなかった。伊那市で利用している三峯川水系の農業用水のSi含有量は出穂期および登熟中期でそれぞれ154ppmおよび111ppmと高い値を示した。
ナノ機能カプセル創製のプロセッシング体系化ならびに次世代型応用技術への新たな展開

材料合成と機能発現・制御とを繋ぐプロセス工学的アプローチが重要で、これまで行われてきたマクロな構造体やプロセスに対する化学工学的思考方法を、ミクロな構造体とプロセスの検討にダウンサイジングし材料調製における超ミクロな化学工学体系の構築に関する検討を行った。カプセル化技術は基本的には、物理的もしくは機械的、物理化学的、化学的方法に分類されるが、それらが複合された方法で調製されることもある。既往の方法を含めて、各々の研究者が現在展開中のカプセル化調製法とその用途をまずお互いに相互理解することがまず必要不可欠である。一連の既往の技術を踏まえ、メンバーを分野により、1)ナノレベルのカプセル調製技術(チーフ:河野)、2)ナノレベルのカプセル径分布制御およびカプセル径・膜圧制御技術(チーフ:東谷)、3)ナノレベルで制御されたカプセルの性能評価(チーフ:田中)、そして4)ナノレベルで制御されたカプセルの応用技術(チーフ:中野)の4つグループに分け、さらに主担当を専門分野に応じて決定した。本調査研究項目のチーフの下、分担を決め、まず文献・特許・会議資料等から、担当項目を調査・取り纏めをした。さらに、ナノテクノロジー分野における高分子関連技術に関し、国内外の技術動向についても幅広い角度から調査研究を行い機能性を有する高機能製材料全般に関する調査結果の整理を行った(幡手)。全体が集合した情報交換会を実施して、お互いの進展中の調査研究につき詳細に説明し、問題点を提示し討議を重ねた。以上の企画調査研究により得られた情報を基にして、今後の「ナノ機能カプセル創製のプロセッシング体系化ならびに次世代型応用技術」への新たな展開における重要事項をまとめた。
ASEAN共同体の研究：自然資源開発，一次産品貿易と海洋権益をめぐる政治経済学

(1)各自、調査研究の進捗に応じて学会報告、論文・図書の投稿と執筆、並びにその準備に励んだ。発表された論文は合計18本、関連テーマでの学会報告・招待講演が16件、出版された著書は単著・共著を合せて2冊、その他研究ノートや書評等6点であった。(2)本研究は、研究の対象地域が広域にわたり扱うテーマも幅広いため、メンバー各自の研究成果の主題も広範囲にわたる。それらのテーマは、対象地域を基準にとると大きく次の3つのカテゴリーに分けられる。1ASEAN加盟国及び域外主要国個別の問題、2ASEAN共同体の制度と実態に関連する問題、3ASEAN加盟国並びにASEAN共同体と域外国との関連の問題の3つである。上記の諸業績も、おおよそこれら3つのカテゴリーのいずれかに分類されるものであり、全体としてみると13にわたってバランスよく成果が公表されてきている。(3)本研究は、研究代表者の所属機関である同志社大学人文科学研究所に設置されている共同研究プロジェクトの一つとして研究活動を展開している。今年度も昨年度に引続き、当該プロジェクト主催のセミナーを計11回開催した。研究報告は、昨年度を2本上回る17本であった。(4)上記研究所機関誌の『社会科学』で特集を組むために昨年度末に同誌に投稿したメンバー7名の論考が、2018年8月に刊行された同誌第48巻第2号に掲載された。特集のテーマは、「ASEAN共同体の政治経済学ー固有性と対域外関係の視点からー」とした。(5)「ASEAN-日本間の利害関係と東アジアの将来ー資源・一次産品・領有権の視点からー」という全体テーマの下、同志社大学人文科学研究所第92回公開講演会を本研究で企画し、メンバー4名に1名のゲストを加えた5名の登壇者でこれを実施した。講演会後に、同タイトルで講演会の記録をまとめた『人文研ブックレットNo.62』を刊行した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。発表された論文は合計19本、関連テーマでの学会報告・招待講演が17件、出版された著書は、単著・共著を合せて13冊であった。(2)本研究は、研究の対象地域が広域にわたり扱うテーマも幅広い。メンバー各自の研究テーマ、したがって上記の研究成果の主題も広範囲にわたる。上記の諸業績も、おおよそこれら3つのカテゴリーのいずれかに分類されるものであり、全体としてみると13にわたってバランスよく成果が公表されてきていることがわかる。(3)しかし、ASEAN共同体における「自然資源開発」や「一次産品貿易」、あるいは「(南シナ海における)海洋権益」といった本研究が主要課題と位置づけるテーマでの研究成果はまだ多くはない。ただ、こうした主要課題での成果公表を目指す準備作業は、次の「現在までの進捗状況」欄に記すように着実に進展させてきている。(4)本研究は、研究代表者の所属機関である同志社大学人文科学研究所に設置されている共同研究プロジェクトの一つとして研究活動を展開している。今年度は、当該プロジェクト主催の研究会を計11回開催し、13名による研究報告を組織したのであるが、このうち1月13日に開催したセミナーの一部を一般にも公開するかたちで実施した。報告者はベトナムからのゲスト講師Do Tien Sam氏で、報告タイトルは「南シナ海をめぐる問題:その実情と解決」であった。これは、本研究初のアウトリーチの試みであった。(1)本研究は、「研究実績の概要」欄でも述べた通り、同志社大学人文科学研究所の共同研究プロジェクトの一つとして研究活動を展開しているが、研究の対象地域が広域にわたり扱うテーマも幅広いため組織も大きい。まず今年度は、こうした性質に照らし、可能な限り数多くの当該プロジェクト主催研究会を開催することを目指した。具体的には、メンバーの多くが現地調査に赴く長期休暇期間中を除いて、春学期と秋学期にそれぞれ4回ずつ計8回月例で研究会を開催し、調査研究結果を報告し合う計画を立てたのであるが、研究会の開催回数は結果として計画を上回る11回に達し、13名による研究報告を組織することができた。その結果、後述の通り多くの研究実績を上げることができた。(2) 13本の研究報告のうち、本研究のメンバーによるものは9件であった。本研究には、「自然資源開発」「一次産品貿易」などの本研究の主要課題と関連をもちながらも、直接には結びつかないテーマを研究してきたメンバーもいるが、今年度の報告者はみな、計画立案時に設定した各自の分担課題に沿うテーマで研究報告を行っており、代表者の予想以上に各自の研究が進展していることが窺われた。(3)本研究では、今年度、適切に外部との研究上の交流・共同を図ることも課題とした。研究会でのゲスト講師はSam氏を初めとする3氏であったが、いずれの報告も内部では得難い知見をもたらしてくれた。特にSam氏の回は同志社大学南シナ海研究センター(センター長:法学部・浅野亮教授)と共同で開催し、他組織との共同の契機となった。

また、8月にはインドネシア・ジャカルタにて、メンバー6名が当地のASEAN関連機関等を訪問して関係者から本研究の課題に関連する聞取りを行った。この試みからは、ASEAN共同体という制度が実施に移される現場とその周辺ならではの貴重な情報を得ることができた。(1)各自、調査研究の進捗に応じて学会報告、論文・図書の投稿と執筆、並びにその準備に励んだ。発表された論文は合計18本、関連テーマでの学会報告・招待講演が16件、出版された著書は単著・共著を合せて2冊、その他研究ノートや書評等6点であった。(2)本研究は、研究の対象地域が広域にわたり扱うテーマも幅広いため、メンバー各自の研究成果の主題も広範囲にわたる。それらのテーマは、対象地域を基準にとると大きく次の3つのカテゴリーに分けられる。1ASEAN加盟国及び域外主要国個別の問題、2ASEAN共同体の制度と実態に関連する問題、3ASEAN加盟国並びにASEAN共同体と域外国との関連の問題の3つである。上記の諸業績も、おおよそこれら3つのカテゴリーのいずれかに分類されるものであり、全体としてみると13にわたってバランスよく成果が公表されてきている。(3)本研究は、研究代表者の所属機関である同志社大学人文科学研究所に設置されている共同研究プロジェクトの一つとして研究活動を展開している。今年度も昨年度に引続き、当該プロジェクト主催のセミナーを計11回開催した。研究報告は、昨年度を2本上回る17本であった。(4)上記研究所機関誌の『社会科学』で特集を組むために昨年度末に同誌に投稿したメンバー7名の論考が、2018年8月に刊行された同誌第48巻第2号に掲載された。特集のテーマは、「ASEAN共同体の政治経済学ー固有性と対域外関係の視点からー」とした。(5)「ASEAN-日本間の利害関係と東アジアの将来ー資源・一次産品・領有権の視点からー」という全体テーマの下、同志社大学人文科学研究所第92回公開講演会を本研究で企画し、メンバー4名に1名のゲストを加えた5名の登壇者でこれを実施した。講演会後に、同タイトルで講演会の記録をまとめた『人文研ブックレットNo.62』を刊行した。発表された論文は合計10本、関連テーマでの学会報告・招待講演が17件、出版された著書は単著・共著を合せて3冊、その他分析レポートや書評等7点であった。(2)本研究は、研究の対象地域が広域にわたり扱うテーマも幅広い。メンバー各自の研究テーマ、したがって上記の研究成果の主題も広範囲にわたる。(3)また、ASEAN共同体における「自然資源開発」や「一次産品貿易」、あるいは「(南シナ海における)海洋権益」といった本研究が主要課題と位置づけるテーマでの研究成果も前年度に比して増加している。
本邦てんかん患者におけるPCDH19遺伝子異常と臨床的スペクトラムの解明

本邦てんかん女児に対しPCDH19遺伝子解析を行い、点変異18例、血縁罹患者4例、遺伝子欠失2例、計24例を同定した。発症は4-25ヶ月齢で、しばしば、発熱に関連して短い発作の群発が出現した。発作型は部分発作か全身けいれんであった。4例は軽症例で、発症が遅い傾向にあり、幼児期に発作消失し、発達良好であった。長期経過を終えた5例では、発作は10歳台以降に消失した。知的障害を18例、自閉を7例、多動を3例に認めた。これまでの調査から明らかとなったPCDH19遺伝子異常でみられやすい症状をもつ女性患者や、表現型が類似する難治てんかんであるドラベ症候群とその辺縁群の女性患者を中心に収集した。平成22年度は新規に66例を解析し、病的変異を5例に同定した。これらの症例は、以前に同定した症例と同様、全例、乳児期から幼児期早期発症で、発熱感受性の強い群発発作を主症状とし、種々の程度の知的障害を合併し、これらはPCDH19遺伝子異常でみられる代表的症状と考えられた。さらに、臨床的スペクトラムを探索するため、これらの患者群とは別に、他研究で収集された精神遅滞症例のうちてんかんを合併する女児60例を解析した。このうち上記症例とは表現型を異にする1例に病的意義の不明な変異を認めた。これは保存性の高いアミノ酸残基に生じており、現在その病的意義を基礎的実験により検討している。さらに、シークエンス法で同定不可能な染色体微細欠失を持つ症例が海外から4例報告されているが、このような異常を同定するため、独自にプローブを設計しMLPA解析を開始した。現在131例を解析したが異常の同定された症例はなかった。現在、てんかんの責任遺伝子は種々明らかとなりつつあり、今後はその原因遺伝子からみたてんかん分類や、個々の分子病態に基づく治療法の開発が必要である。本研究では、本邦女性患者におけるPCDH19遺伝子変異の原因としての重要性や、さらにその表現型を明らかにし、今後のてんかん病型の診断的・遺伝学的意義の確立や、病態解明に向けた足がかりとするための重要な研究となる。(1)PCDH19遺伝子解析:早期発症難治てんかんや発熱関連発作などをもつ女児症例、特にこれまでに明らかにした臨床的特徴(乳幼児期発症、発熱関連性発作、短い発作の群発、しばしば知的障害、自閉症や多動などの発達・行動異常、女性の特徴的家族歴などを認める)をもつものを中心症例として提示し収集し、新規に70例のシークエンスを行った。変異のない症例のうち実施可能であった42例に対しMLPA解析を行った。結果、遺伝子変異8例(1例ではエクソン2)、PCDH19全欠失2例を新規に同定し、前年までと併せ、本邦症例は20家系、24例となり、女性の早期発症てんかんの原因として、その重要性を確認できた。高解像度融解曲線分析は準備を進めたが、正確性と煩雑性を勘案し現時点で実施に至っていない。(2)臨床的特徴:新規症例においても乳幼児期発症、発熱との強い関連性、持続数分以内に終了する短い部分発作や全身性けいれんが高率に群発して出現していた。様々な程度の知的障害を8例に、自閉傾向を5例に認めた。調査年齢が若く長期予後判定は出来なかった。欠失例は本邦初であったが、点変異例との有意な臨床的相違は認めなかった。このように、本遺伝子異常による中心的臨床特徴がより明らかとなり、これらを参考に解析対象症例を選定することにより、より効率的に本遺伝子異常を同定することが可能となった。しかし、家族性症例では発作が数回のみで幼児期に消失する例や、有熱時発作や群発のない例も存在し、臨床的多様性が明らかであった。上記特徴の明確でない特に軽症例の存在は、実態把握の面で今後の課題である。(3)遺伝子型-表現型相関:海外からの報告も併せ、明らかな相関は認めなかった。同じ変異でも軽症と重症が混在する一卵性双生児例が存在し、その臨床的多様性は、他の遺伝的、環境的修飾因子に大きく依存することが推測された。
ラン藻Microcystis aeruginosaに関する分子生物学的研究

1.ラン藻(シアノバクテリア)Microcystis aeruginosaより、その大プラスミドpMA2を純粋に単離し、クローン化後その制限酵素地図を完成した。さらにその全塩基配列の決定に成功した。pMA2は全塩基数4993bpであり、そのGC Contentは42.2%であった。(DDBJAccession No.D17448:登録済み)。また細胞内におけるpMA1とpMA2の量的比率はおよそ6:1と計測された。pMA2とpMA1の塩基配列間には高い相同性を示す領域は見いだされなかった。2.データーベースによる検索の結果から、pMA2には、その正鎖、逆鎖にそれぞれ1個のORFの存在が認められたが、それらの仮想タンパク質と高い相同性を示すタンパク質は見出されなかった。またpMA1に於て確認されたreplication proteinに相当する配列も存在していなかった。しかし複製に必須なnicking siteの塩基配列として、pMA1に共通する配列(CTTG(!)ATT)の存在が確かめられた。3.pMA1(2287bp)にはグラム陽性菌であるBacillus sp.Lactobacillus sp.のプラスミド類が有するreplication proteinと相同性の高い領域、Ori領域及び複製開始点が存在していた。この検索結果に基づいてpMA1の複製機構を調べた。pMA1を菌体より抽出後、S1 nuclease処理、Agarose gel電気泳動、Nylontransfer membrane移送及びそれぞれのプラスミドプローブによるHybridization実験の結果からpMA1は明らかにRolling Circle Replication機構に従って複製される事が証明された。現在このreplication proteinの証明を進めている。霞ヶ浦において発生し、採集された「アオコ」の優占種ラン藻(Cyanobacteria),Microcystis aeruginosa f.aeruginosa Kutzing(I)の生理・生態を分子生物学的に研究するために、今回は先ず(I)よりそのプラスミドDNAを単離しその塩基配列決定と機能解析を行った。1。上記M.aeruginosa(I)より2種のプラスミドを抽出単離することが出来た。小プラスミド(pMA1)は2.3kb,大プラスミド(pMA2)は5kbの大きさであり、両者の制限パターンはそれぞれに異なっていた。両者の細胞内でコピー数の比率はpMA1:pMA2=6:1と評価出来た。2。pMA1は興味あることに、Synechocystis PCC 6803株の有する小プラスミドpUS1-3とhybridizeし、両者が高い相同性を持つことが示された。4。この配列中には9個のORFが見い出され、そのうちの1個は253個のアミノ酸よりなり、例えばBacillus coagulansの有するプラスミドpBC1のreplication proteinと53%という高い相同性を示した。こま傾向は、Bacillus属のみならずLactobacillus属Staphyrococcus属のプラスミドとの間に於いても認められた。5。pMA1のori領域、dna box等に於いても幅広く且つ高い相同性が認められた。とりわけori領域に於いて、ローリングサークル複製機構のシグナルと高い相同性が認められたことは興味ある発見である。6。現在pMA2の配列決定を進めており、pMA1との相関性、M.aeruginosaの異常発生現象との関係等について研究を進めている。

1.湖水域に於ける「アオコ」現象に関わる原核性生物種である、ラン藻(シアノバクテリア)Microcystis aeruginosaより、その大プラスミドpMA2を純粋に単離し、その全塩基配列の決定に成功した。pMA2は全塩基数4993bpであり、そのGC Contentは42.2%であった。(DDBJAccession No.D17448:登録済み)。また細胞内におけるpMA1とpMA2の量的比率はおよそ6:1と計測された。pMA2とpMA1の塩基配列間には高い相同性を示す領域は見いだされなかった。2.コンピューター検索の結果から,pMA2には、その正鎖、逆鎖にそれぞれ1個のORFの存在が認められたが、それらの仮想タンパク質と高い相同性を示すタンパク質は見出されなかった。またpMA1に於て確認されたreplication proteinに相当する配列も存在していなかった。しかし複製に必須なnicking siteの塩基配列として、pMA1に共通する配列(CTTG(↓)ATT)の存在が確かめられた。3.pMA1(2287bp)にはグラム陽性菌であるBacillus sp.Lactobacillus sp.のプラスミド類が有するreplication proteinと相同性の高い領域、Ori領域及び複製開始点が存在していた。この検索結果に基ずいてpMA1の複製機構を調べた。pMA1を菌体より抽出後、S1 nuclease処理、Agarose gel電気泳動、Nylon transfer membrane移送及びそれぞれのプラスミドプローブによるHybridization実験の結果からpMA1は明らかにRolling Circle Replication機構に従って複製される事が証明された。現在このreplication proteinの証明を進めている。M.aeruginosaのプラスミドpMA1のreplication proteinは同時にpMA2の複製にも関与している可能性が考察されている。
神経障害性疼痛時に発生する排尿異常の解明

プロスタグランジン(PG)合成阻害薬ロキソプロフェン(Lox)及びグリシン(Gly)の排尿機能抑制に着目し、本研究では、排尿機能における相互作用を検討した。覚醒条件下で膀胱内圧測定を行い、静脈内および脊髄髄腔内投与による検討では、Lox及びGlyは排尿間隔の延長を示し、併用投与によりさらに延長した。また、Gly受容体α3サブユニット(GlyRα3)のノックダウンによりGly髄腔内投与による排尿機能抑制が阻害された。したがって、Lox及びGlyの排尿機能抑制効果は脊髄求心路に寄与していることが示唆された。また、GlyはGlyRα3を介して排尿機能を抑制していることが明らかとなった。神経障害性疼痛時に惹起される排尿異常を反映するモデルラットを作製し、その病態メカニズムの解明を目的として検討を行った。片側のL5脊髄神経結紮モデルを作製し、von Frey testにより経日的に疼痛閾値を観察したところ、3日目以降から有意な疼痛閾値の低下が認められたが、代謝ケージを用いての排尿行動試験では7、14日で排尿回数が増加傾向になるものの有意な排尿回数の増加が認められなかった。炎症性疼痛や神経障害性疼痛時にはプロスタグランジン(PG)が脊髄内に遊離または生合成され、グルタミン酸を介して痛覚過敏反応を引き起こすことが知られている。排尿機能においても、PGによる排尿促進が報告されており、臨床研究において、PG合成阻害薬であるロキソプロフェンが夜間頻尿に効果があることが報告されている。そこで、動物実験において、ロキソプロフェンの排尿機能抑制効果について検討した。排尿行動試験では、ロキソプロフェンの経口投与により排尿回数の有意な低下が認められた。覚醒条件下での膀胱内圧測定では、ロキソプロフェンの静脈内および脊髄髄腔内投与により排尿間隔が有意に延長した。このことから、ロキソプロフェンは少なくとも脊髄内のPGの生合成を阻害することで、排尿機能を抑制することが示唆された。さらに本研究では、抑制性神経伝達物質であるグリシンの静脈内投与により排尿間隔が有意に延長し、ロキソプロフェンと併用投与することで、排尿機能において相乗的な抑制効果を示すことが明らかとなった。炎症性疼痛や神経障害性疼痛時において、脊髄内のプロスタグランジン(PG)の遊離や生合成が痛覚過敏反応の引き金となっている。排尿機能においてもPGによる排尿促進が報告され、臨床研究においてPG合成酵素阻害薬であるロキソプロフェンが夜間頻尿に効果があることが報告されている。また抑制性伝達物質であるグリシンは、脊髄の侵害受容過程や排尿機能を抑制することから、ロキソプロフェン及びグリシンの排尿機能抑制に着目し、排尿機能における相互作用を明らかにするため、以下の実験を行った。代謝ケージを用いた排尿行動実験では、低用量ロキソプロフェンの経口投与は、排尿量に影響なく排尿回数のみ減少したことから、排尿反射経路にも作用していると考え、覚醒条件下で膀胱内圧測定を行った。前年度の実験により、ロキソプロフェンの静脈内投与は排尿間隔を延長し、グリシンとの併用投与によって排尿間隔が著しく延長することを明らかにした。この結果から作用部位を探るため、脊髄髄腔内投与により同様に検討を行ったところ、ロキソプロフェン及びグリシンは髄腔内投与により排尿間隔を延長した。さらに、siRNAを用いてグリシン受容体α3サブユニットをノックダウンしたラットを作製し検討した。グリシン髄腔内投与による排尿機能抑制は、グリシン受容体α3サブユニットのノックダウンにより阻害された。以上のことから、ロキソプロフェン及びグリシンは排尿機能において抑制効果を示し、その抑制効果は脊髄求心路に寄与していることが示唆された。ロキソプロフェンは少なくとも脊髄内のPGの生合成を阻害することで排尿機能を抑制し、グリシンはグリシン受容体α3サブユニットに作用して排尿機能を抑制していることが明らかになった。神経生理片側のL5脊髄神経結紮モデルラットは、疼痛閾値の低下、すなわちアロディニアの発現が認められたが、代謝ケージを用いての排尿行動試験では排尿機能に影響がなかったため、この神経障害性疼痛モデルでの検討は進めることができなかった。しかし炎症時の疼痛に深く関与する脊髄PGが、排尿促進に関わることが明らかになるとともに、グリシンとのクロストークが存在する可能性も明らかとなった。次年度以降は、PGE2脊髄髄腔内投与によるPGE2誘発性の頻尿モデルあるいは膀胱内に酢酸0.1%を灌流して作製する酢酸誘発性頻尿モデルを用いて、脊髄PGとグリシンの排尿機能に対する役割を検討する。

今後の研究計画は、炎症疼痛時に惹起される排尿促進とその病態メカニズムの解明について検討するため計画を変更する。具体的な研究計画はまず、排尿機能における脊髄PGおよびグリシンの役割を検討するため、無麻酔拘束下で膀胱内圧を測定し、PGE2の脊髄髄腔内投与による膀胱内圧の変化を確認する。この結果をもとにPGE2の受容体であるEP1EP4受容体の拮抗薬を用いてPGE2誘発性頻尿に対する各受容体の役割を薬理学的に検討する。グリシンも同様に脊髄髄腔内投与による膀胱内圧の変化を測定し、グリシン受容体拮抗薬を用いて解析する。また、炎症性疼痛時には脊髄内に遊離または生合成されたPGE2がグルタミン酸を介して痛覚過敏反応を引き起こすことから、PGE2脊髄髄腔内投与によるグルタミン酸遊離機構を確認するため、マイクロダイアリシス法を用いて脊髄グルタミン酸遊離量を測定する予定である。さらに、PGE2は脊髄で特異的にグリシン神経伝達を抑制することから、グリシン受容体α3サブユニットがPGE2の標的分子として提唱されている。したがって、siRNAを用いてグリシン受容体α3サブユニットをノックダウンしたラットを用いて、PGE2脊髄髄腔内投与あるいは0.1%酢酸膀胱内灌流による排尿促進に対して効果を検討する予定である。当初予定よりも使用動物数が下回ったため、次年度に繰り越した研究費が出た。次年度は使用する動物数、薬品量が大幅に増加するので、研究費は繰り越し分と合わせて主に実験動物と各種薬剤に使用する予定である。国内学会と国際学会参加を各1回予定しているので、こちらにも研究費を使用する。
動摩擦エネルギー散逸顕微鏡の開発によるナノトライボロジー研究

本研究では、原子間力顕微鏡のカンチレバーによる荷重測定と水晶マイクロバランスによるエネルギー散逸測定を組み合わせてナノスケール領域での固体-固体間の動摩擦のエネルギー散逸を測定できるシステムを開発した。さらに開発した測定システムを利用して、グラファイト基板およびC60蒸着膜と探針間の動摩擦力を測定し、動摩擦力はすべり距離が基板の格子間隔より長いときは一定になるのに対して、格子間隔以下ではすべり距離に比例することを明らかにした。現在、ミクロスケールの視点から摩擦現象のメカニズムの解明を目指すナノトライボロジーが発展し、新しい知見に基づく摩擦の軽減・潤滑の開発に大きな貢献をすると期待されている。固体-固体間のエネルギー散逸は、見かけの接触面で一様に起こることはなく、ナノスケール領域での固体間距離(または荷重)と物性に依存し、どこで、どのように起こるかを答えなければならない。そのためには、面間にも面内方向にもナノスケールの分解能を持って直接にエネルギー散逸を測定することが必要となる。しかし技術的な困難さもあり、ほとんど行われていなかった。本研究の目的は、動摩擦によるエネルギー散逸を直接測定できるエネルギー散逸顕微鏡を開発することにあり、原子間力顕微鏡(AFM)と水晶マイクロバランス(QCM)を組み合わせることで実現できる。AFMでは探針をナノスケールの位置分解能とnNの荷重分解能を持って制御し、一方、QCMではpWのエネルギー散逸を測定する。平成21年度は、水晶振動子上にマイカ基板を用意して、AFM探針で荷重を制御し、同時にQCMのエネルギー散逸を測定できるシステムを構築した。また、室温・大気圧下で動作させ、水晶振動子の振動振幅を数10nm数nmの条件で、QCMのエネルギー散逸のAFM探針荷重依存生の予備実験を行った。予備実験の結果、探針の接触による水晶エネルギー散逸が観測された。測定の高精度化が今後の課題である。固体・固体間のエネルギー散逸は、見かけの接触面で一様に起こることはなく、ナノスケール領域での固体間距離(または荷重)と物性に依存し、どこで、どのように起こるかを答えなければならない。そのためには、面間にも1面内方向にもナノスケールの分解能を持って直接にエネルギー散逸を測定することが必要となる。本研究の目的は、動摩擦によるエネルギー散逸を直接測定できるエネルギー散逸顕微鏡を開発することにあり、原子間力顕微鏡(AFM)と水晶マイクロバランス(QCM)を組み合わせること実現できる。平成22年度はグラファイト基板について水晶振動子の振動振幅とAFM探針の荷重を制御して、室温・大気圧下においてQCMの共振振動数とエネルギー散逸の測定を行った。振動振幅が0.0550nmの範囲の測定結果によると、エネルギー散逸は振動振幅がおよそ0.5nmにおいて最大となる。また、この性質は荷重が数10数100nNの範囲で変わらない。エネルギー散逸が最大となる振動振幅はグラファイト基板の格子間隔と近く、そのメカニズムは興味深い。今後は探針先端の性質を制御してエネルギー散逸の測定を行うことが課題である。そのためにはナノスケールの分解能を持って直接にエネルギー散逸を測定することが必要となる。本研究の目的は、動摩擦によるエネルギー散逸を直接測定できるエネルギー散逸顕微鏡を開発し、ナノスケール領域での摩擦の性質を明らかにすることである。前年度までに原子間力顕微鏡(AFM)と水晶マイクロバランス(QCM)を組み合わせることで、ナノスケール領域ですべり距離を制御しながら動摩擦力のエネルギー散逸を測定できるシステムが完成した。平成23年度は、AFM探針の荷重とすべり距離を制御して、室温・大気圧下においてグラファイト基板とC60蒸着膜とAFM探針間の動摩擦力を測定した。動摩擦力はグラファイト基板とC60蒸着膜の両方ともに、すべり距離が格子定数より小さいときはすべり距離に比例し、大きいときは一定となる振舞いをすることが明らかになった。この振舞は、すべり距離が小さいときには探針が基板のポテンシャル障壁を越えないこと、一方、大きいときにはエネルギー散逸は探針が乗り越える基板のポテンシャル障壁の数に比例することから説明される。
超音波を応用した熱電変換性能を有する物質の合成

周波数10kHzから20kHz程度以上の力学的振動は空気をはじめとする気体中では超音波と呼ばれる疎密波を発生させる。この疎密波が物質に照射されると物質も、その力を受けて振動するが振幅や力を受けた際の変位は超音波の強度および照射を受ける物質の密度、代表的大きさ(粒子径等)および相状態に依存する。2種類以上の異種金属混合粉に超音波を照射すると金属粉間の高頻度での衝突が繰り返し起こり、そのときに発生する熱は金属混合粉全体に拡散し内部発熱を誘起する。この効果を利用し新物質合成を液体中での反応ではなく固相反応のみによって実現させることを主たる目的とする。
CRISPR/CAS9 ゲノム編集システムを使った新規大腸癌動物モデルの作製

新規ゲノム編集システム(CRISPR/CAS9)を使って(1)大腸上皮特異的Apcノックアウトマウス(CPC-APCマウス)に大腸腫瘍で特異的な転写活性をもつレポーター遺伝子を組み込んでリアルタイムで腫瘍サイズの測定が可能なマウスの作製、ならびに(2)CPC-APCマウスと同じ遺伝子変異を持つ大腸上皮特異的Apcノックアウトラットを作製し、治療効果判定が容易な動物モデルの作製をめざした。CPC-APCマウスで利用したCDX2プロモーター配列(9.5kb)の組み込みが困難であり、同時にラットでの遺伝子改変のためのモデルが十分に確立できずこれらのモデルの作製に難渋した。遺伝子改変に使われるCre-loxPシステムは、マウス以外の動物種に応用が困難である。近年、ゲノム編集技術が飛躍的に進歩し、2014年に報告されたCRISPR/CAS9系ではDNA2重鎖切断(ノックアウト)とターゲティングベクターによる変異挿入(ノックイン)が簡便にできるようになった。また遺伝子組み換えを導入する際、ES細胞を必要としないためラットなど他種の動物疾患モデルの作製を容易とした。本研究では大腸癌マウスモデルでの技術と経験を生かし、CRISPR-Cas9システムを使って、従来の方法では作製が困難であった2種類の新規の大腸癌マウスモデルの作製を試みる。i) in vivoイメージが可能なCPC-APCモデルの作製: CPC-APCマウスにゲノム編集により、luciferaseやGFPなどのレポーター遺伝子を腫瘍内で発現するモデルを作製する。ii)新規ラット大腸癌モデルの作製:CPC-APCマウスと同じ遺伝子変異をもつ遺伝子改変ラットを作製する。進捗状況が遅れている最も大きな原因は、研究代表者が平成27年度の10月に広島大学から呉医療センターに異動となり、実験系の再構築などを要していることが挙げられる。私共は、これまで腸上皮特異的転写因子CDX2のプロモーター領域にマウスの大腸上皮細胞に転写活性をもつ9.5kbの遺伝子配列を発見し、それを応用して2種類の大腸上皮特異的Apcノックアウトマウス(左側結腸モデルであるCPC-APCマウスおよび右側結腸モデルであるCDX2-polyG-Cre-APCマウス)を作製した。また、これら2種類のノックアウトマウスをさらに応用して、大腸癌の発生に関与するもう1種類のドライバー遺伝子に欠損や変異をもつ複合的遺伝子改変マウスを作製に成功し、高度浸潤癌や粘液癌など、通常の大腸癌と異なるphenotypeをもつ大腸癌が自然発生した。本研究では、私共のこれまでの技術と経験を生かし、これまで作製したマウスモデルをCRISPR/Cas9システムを用いて、さらに使いやすいモデルの作製に応用する。現在、Cre/loxPシステムを使ったマウスモデルの解析を並行して行っているが(基盤B)、そちらの研究で得られているマウスのPhenotypeの解析に時間を要しており、どのような遺伝子を改変したマウスを作製するのか、現在検討中であり、Cre遺伝子を発現誘導できるもマウスモデルであるCDX2P-Cre-ERT2モデルでの実験を行っている。また、本研究ではin vivoイメージを可能とするGFRやluciferaseを遺伝子挿入することで、リアルタイムで腫瘍の変化をモニタリングできるモデルの確立をめざしている。ただし、CRISPR/Cas9システムを用いてもGFRやluciferase, Creなどの遺伝子を導入する事は、いまだにチャレンジ性が高く解析までを含めるともうしばらく時間がかかることが予想される。癌研究には免疫系や微小環境の影響を検討できる動物モデルが必須である。大腸癌において私共が確立した自然発生によるマウス大腸上皮細胞特異的コンディショナルApcノックアウト(CPC-APC)マウスに、Kras, TGFβIIR,Ptenなどの別の大腸癌発癌ドライバー遺伝子の変異を1つ追加した複合的遺伝子改変マウスを作製し、高度浸潤癌や粘液癌のモデルを作製した。本研究では、ゲノム編集システムCRISPR-CAS9を使って(1)CPC-APCモデルに腫瘍特異的な転写活性を持つTOP/FOP Flashーluciferase(GFP)を組み込んだレポーター遺伝子マウスを作製し、リアルタイムで腫瘍サイズの測定が可能なマウスモデルの作製をめざした。(2)CRISPR-CAS9は他の動物種においてもゲノム編集が可能であり、CPC-APCマウスと同じ遺伝子変異を持つラットを作製し大腸上皮特異的Apcノックアウトを行い、ラット大腸癌モデルの作製をめざしてきた。本研究では、CRISPR/Cas9に必要なCas9の発現ベクターや配列特異性のガイドRNA発現ベクターが必要となるが、CPC-APCモデルに使用したトランスジーンの配列をもとにガイドRNA発現ベクターの作製を試みたが(1)リアルタイムで腫瘍サイズの測定が可能なマウス(in vivoイメージマウスモデル)では、CPC-APCマウスの受精卵に遺伝子導入してGRPやluciferaseのcDNAをレポーター遺伝子の作製を試みたが、完成することが困難であった。(2)ラット大腸癌モデルの作製については、まずCDX2のプロモーター領域9.5kbが大腸上皮特異的転写活性をもつかどうかを確認し、その下流にCre reconbinaseを結合した遺伝子改変ラットを作製する必要があるが、ラット大腸上皮細胞に特異的なプロモーター領域の同定が困難であった。新規ゲノム編集システム(CRISPR/CAS9)を使って(1)大腸上皮特異的Apcノックアウトマウス(CPC-APCマウス)に大腸腫瘍で特異的な転写活性をもつレポーター遺伝子を組み込んでリアルタイムで腫瘍サイズの測定が可能なマウスの作製、ならびに(2)CPC-APCマウスと同じ遺伝子変異を持つ大腸

上皮特異的Apcノックアウトラットを作製し、治療効果判定が容易な動物モデルの作製をめざした。CPC-APCマウスで利用したCDX2プロモーター配列(9.5kb)の組み込みが困難であり、同時にラットでの遺伝子改変のためのモデルが十分に確立できずこれらのモデルの作製に難渋した。Cre遺伝子を発現誘導できるもマウスモデルであるCDX2P-Cre-ERT2モデルを使って大腸癌の有望なdriver geneであるApc, Kras, Braf, tgfbr2, ptenなどの複合的遺伝子欠損マウスの解析を行っている。これらのモデルに発生する腫瘍の特徴から、新規にCRISPR/Cas9システムを用いて作製するマウスの遺伝子型やデザインを早急に行う。GFPやCreのマウスのゲノムへの組み込みについては、既にプロトコールが報告されているので、それを用いてGFP, luciferase, Cre reconbinaseのcDNAを含み、遺伝子導入部位にhomology armをもつ環状のベクターを遺伝子組み換え実験によって作製する。私共はすでに9.5kbのCDX2 promoterをトランスジーン用のベクターに数回の組換えを行い挿入する技術を持っているので、それを応用すれば短期間で作製が可能と思われる。消化器外科試薬の発注が年度内にできず、翌年に持ち越しとなったため。本年度早々、試薬の購入を行った。
細胞間コミュニケーション解明のための超高分解能電気化学バイオイメージング法の開発

細胞間コミュニケーションの解明には、細胞近傍の局所領域で動的に変化を続ける化学情報を定量的に観察できる手段が必要である。細胞本来の活動を乱さずに観察するためには非染色・低侵襲に計測できる技術が必要であり、微小電極を用いる電気化学イメージング技術が期待されているが、必要な解像度と速度を併せ持つ技術の完成には未だ至っていない。そこで本研究では各電極への導線を必要としない「微細バイポーラ電極アレイ」を利用することで、高解像度かつ高速の電気化学イメージングを実現し、神経細胞からのドパミン放出のような単一細胞レベルの生体機能イメージングを行える革新的な観察プラットフォームの構築を行う。