hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オプトジェネティクスを用いたＨｅｓ１の発現振動による細胞周期制御メカニズムの解明

昨年度は、光で人工的にHes1の発現動態(Hes1の発現なし、発現振動、持続発現)を誘導する系をHes1欠損型(KO)マウス由来のマウス胎児繊維芽細胞(MEF)に導入し、解析したが、適切な系ではなかったため、違う培養細胞の検討を行った。今年度はその培養細胞の検討から行った。昨年度CRISSPR-Cas9システムによるHes1 KOの誘導は高効率でできたので、その系を用いて10T1/2,及びC2C12にHes1KOを誘導したところ、増殖の減少は確認できなかった。次にCreによるHes1flox MEFのHes1 KO誘導に関して検討した。昨年度はCreによって効率よくHes1 KOを誘導できなかったため、条件の検討やCre発現系の改良を行い、高効率でのHes1 KOの誘導に成功した。そこで、Hes1 flox MEFにHes1 KOを誘導したところ、増殖の減少は確認できなかった。次に神経幹細胞の培養系の使用を検討した。Hes1 floxHes3/Hes5/Hey1トリプルノックアウトマウスから樹立した神経幹細胞にCreによるHes1の欠損を誘導したところ、増殖速度が減少することが分かった。そこでこの細胞を用いてHes1の発現振動による細胞周期制御メカニズムの解明を目指した。まず、Hes1の欠損による下流因子の発現の変化があるか調べたところ、神経分化関連因子であるascl1や細胞周期制御関連因子であるGadd45gなどの発現がHes1の欠損によって上昇していることが分かった。次に、光応答性転写因子GAVPOによって人工的にHes1の発現振動の誘導を試みたところ、2.5時間周期、3時間周期での発現振動の誘導に成功した。そこでHes1野生型の神経幹細胞にHes1の発現振動を2.5時間周期、3時間周期を誘導したところ増殖速度が促進された28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。人工的にHes1の発現動態(Hes1の発現なし、発現振動、持続発現)を誘導するため、光応答性転写因子GAVPOを使った光による転写因子誘導系をHes1欠損型(KO)マウス由来のマウス胎児繊維芽細胞(MEF)に導入し、安定発現株を作成した。その細胞株に2時間から3時間周期で青色光をあてたところHes1の発現振動(2から3時間周期)を誘導することに成功した。また、更に短時間周期(30分周期)で青色光をあてたところ、Hes1の持続発現を誘導することに成功した。次に、Hes1の発現振動の条件(発現レベル、周期等)が最適かどうか確かめるため、増殖速度が減少するHes1 KOマウス由来のMEFにHes1の発現振動を誘導したとき増殖速度が回復するかどうか調べたがHes1 KO MEFの増殖速度は回復しなかった。これはHes1 KO MEFが細胞株作成までの間に、Hes1がない状態で増殖できるように適応またはHes1がない状態でも増殖速度が高いクローンが選別されたためと考えられた。そこで、私たちは別の細胞株の使用を検討した。今までの結果より、Hes1 KOの状態で維持するのが不適切だと考えられるので、Hes1 floxマウス由来のMEFの使用、及びCRISPR-Cas9システムを使って有名な細胞株(10T1/2, C2C12等)のHes1 KOの誘導などを検討した。まず、Creリコンビネースを発現させることでHes1を欠損させることができるHes1 flox MEFの使用を検討した。様々な条件で、CreリコンビネースをHes1 flox MEFに誘導してHes1の欠損を目指したがHes1の欠損効率は高くなかった。次に10T1/2, C2C12の使用を検討した。Cas9はsynthetic guide RNA(sgRNA)が認識できるゲノムのDNA配列付近に結合し、NA二重鎖切断を起こさせる。そこで私たちはHes1遺伝子を欠損できるようなsgRNAとCas9を10T1/2とC2C12に誘導し、Hes1遺伝子の欠損を目指した。いくつかの条件を検討した結果、高効率でHes1を欠損させることができた。光による転写因子誘導系を用いて、光の照射条件の検討や光を周期的に照射する装置の作成や改良を行い、その結果様々な周期や発現レベルまたは持続発現でのHes1の発現に成功した。また、本研究の過程で使用していたHes1 KO MEFがHes1の発現振動で増殖速度が回復しなかったことより、「Hes1 KOの状態で維持するのが不適切」というこれからの実験計画に必要な知見を得られた。また、Hes1 KO MEFが使えなくなったので新しい細胞株やCRISPR-Cas9システムを新たにラボに導入し、CRISPR-Cas9システムによる遺伝子のノックアウト、ノックインに成功した。以上より、当初予定していた通りには進んでいないが後で必要になる知見の獲得や系の確立に成功しており、問題なく研究は進んでいると考えられる。

昨年度CRISSPR-Cas9システムによるHes1 KOの誘導は高効率でできたので、その系を用いて10T1/2,及びC2C12にHes1KOを誘導したところ、増殖の減少は確認できなかった。次にCreによるHes1flox MEFのHes1 KO誘導に関して検討した。昨年度はCreによって効率よくHes1 KOを誘導できなかったため、条件の検討やCre発現系の改良を行い、高効率でのHes1 KOの誘導に成功した。そこで、Hes1 flox MEFにHes1 KOを誘導したところ、増殖の減少は確認できなかった。次に神経幹細胞の培養系の使用を検討した。Hes1 floxHes3/Hes5/Hey1トリプルノックアウトマウスから樹立した神経幹細胞にCreによるHes1の欠損を誘導したところ、増殖速度が減少することが分かった。そこでこの細胞を用いてHes1の発現振動による細胞周期制御メカニズムの解明を目指した。まず、Hes1の欠損による下流因子の発現の変化があるか調べたところ、神経分化関連因子であるascl1や細胞周期制御関連因子であるGadd45gなどの発現がHes1の欠損によって上昇していることが分かった。次に、光応答性転写因子GAVPOによって人工的にHes1の発現振動の誘導を試みたところ、2.5時間周期、3時間周期での発現振動の誘導に成功した。そこでHes1野生型の神経幹細胞にHes1の発現振動を2.5時間周期、3時間周期を誘導したところ増殖速度が促進されたHes1 flox MEF及びC2C12, 10T1/2においてHes1の欠損による増殖速度が減少するか調べる。増殖速度の減少が確認できた細胞株を使って光によるHes1の発現振動の誘導によって増殖速度が回復するか調べる。増殖速度の回復する条件を見つけたら、その細胞で、Hes1の発現の三つの状態(発現なし、発現振動、持続発現)を誘導し、RNA-seqまたはmicroarrayにより網羅的な遺伝子発現量解析を行う。その結果より、Hes1の発現に伴って変化する細胞周期関連因子を同定する。次にHes1の発現に伴う下流因子のタンパク質量、活性の動態を明らかにする。最後にレスキュー実験として、Hes1、下流因子欠損細胞に明らかになった下流因子の発現動態を誘導した時、細胞周期の制御が正常に行われるかを確かめ、Hes1による細胞周期制御メカニズムの解明を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。
筋の分化と可塑性に関する分子細胞生物学的研究

1.筋蛋白質のダイナミクス:マイクロインジェクション、フォトブリーチングおよび蛍光抗体法を用いることにより、筋原線維形成過程においてアクチン分子の取り込みや交換にネブリンは重要な役割を果しているが、コネクチンにはそのような働きはないことが示された。またアクチンとα-アクチニンのダイナミクスに相違のあることが判明し、この相違がI-Z-I構造の形成に何らかの役割を果していることが考えられた。2.筋蛋白質発生の相関関係:胚骨格筋を蛍光抗体法で観察し、ミオシンの集合から正しい配列に至る過程でミオメシン、コネクチン、C-蛋白質は重要な役割を演じていること、一過性に出現する蛋白質(非筋型アクチン、心筋型C-蛋白質)は何らかの役割を果たしたのちに、機能的構造から排除される機構のあることが示された。3.アクチン結合蛋白質、ミオシン結合蛋白質の役割の解析:筋特有のアクチン結合蛋白質(筋コフィリン)の、マウス胎児の筋形成過程での発現特性をin situハイブリダイゼーション法で解明した。ミオシン結合蛋白質(C-蛋白質)については、老齢マウス心房で発現上昇する新たな変異体を発見した。組み換え体蛋白質を用いた生化学実験から、これはミオシン・コネクチン結合が脆弱であることを見出した。4.出生後のマウス咬筋におけるミオシン重鎖(MHC)アイソフォームの構成変化:MHCアイソフォームのひとつであるMHC-2bの出現は離乳期に一致していた。この事から、MHCアイソフォームの変化と、吸啜から咀嚼への機能変化との間に関連があると考えられた。形成過程の筋原線維における筋蛋白質の動態とそれに対する細胞骨格の役割を調べた。培養胚骨格筋細胞に蛍光色素(ローダミン)で標識したアクチンをマイクロインジェクションし、48時間後にネブリンおよびコネクチンに対する抗体で染色した。またローダミン標識を取り込んだ細胞内構造をレーザ光でフォトブリーチし、蛍光の回復(FR)と細胞骨格の発達との関連を調べた。注入したアクチンは、ネブリンおよびコネクチンによる細胞骨格構造の存在する部位に取り込まれた。筋原線維が成熟するにつれ、アクチン、ネブリン、コネクチンはそれぞれ特有の横紋構造を形成した。注入したアクチンの横紋構造の形成過程は、ネブリンとは同調していたが、コネクチンはアクチンおよびネブリンより常に早く横紋を形成し、同調していなかった。またアクチンのFRはネブリンの発育パターンと密接な関係を持っていた。以上の結果より、幼若な筋原線維へのアクチン分子の取り込みや交換に、ネブリンは重要な役割を果たしていることが考えられ、コネクチンにはそのような働きはないことが想像された。次に抗ネブリンおよび抗コネクチン抗体をあらかじめ注入しておいた培養心筋細胞にローダミン・アクチンを注入することを行った。ネブリンの活性を押さえた細胞ではアクチンの筋原線維への取り込みは見られなかったが、コネクチンの場合には取り込みが見られ、上記の結論の正しいことが証明された。胚子の骨格筋組織内で筋原線維がいかに形成されるかを解明するため、ミオシンとミオシン関連蛋白質(ミオメシン、コネクチン、C-蛋白質)の発生上の相関を調べた。材料にはニワトリ胚を用い、発生が最も早く進む頚部体節の凍結縦断切片を抗体(筋型ミオシン〔ミオシン軽鎖MLC〕、非筋型ミオシン〔IIB〕、ミオメシン〔B4、BB78〕、コネクチン〔T51、9D10〕、C-蛋白質〔遅筋型ALD66、速筋型MF1、心筋型C315〕)による二重染色を施し、蛍光顕微鏡にて観察した。最初、ミオメシンとコネクチンは点状に、そしてその点上に筋型および非筋型ミオシンが桿状に出現した。

ミオシンは次に線維状に並び、この線維上にミオメシンとコネクチンは横紋を形成した。その頃には非筋型ミオシンは消失し、その後に筋型ミオシンは横紋(A帯)を形成した。コネクチンとミオメシンがミオシンより早く横紋を形成することは、これら蛋白質はミオシンの集合からその正しい配列に重要な役割を演じていることが考えられた。さらにC-蛋白質は遅筋型・心筋型・速筋型の順に出現してそれぞれ典型的な横紋("doublets")を形成し、心筋型はまもなく消失した。C-蛋白質の横紋はミオシンがA帯内にH帯を形成するより以前に形成されたので、C-蛋白質はA帯内でのミオシンフィラメントの正しい配列に関係していることが考えられた。非筋型ミオシンおよび心筋型C-蛋白質が一過的に出現することは、これらの幼若型筋蛋白質アイソフォームは発生過程で構造形成に何らかの重要な役割を果たした後、機能的構造からは排除される機構があることを示していると考えられた。
リキアにおける都市アイデンティティの形成と展開ー碑文習慣の展開からの考察

本研究は、古代東地中海の歴史をギリシア史・ヘレニズム史・ローマ史と区分して見るのではなく、東地中海、とりわけ小アジアの文化を通時的に考察することを目的とした。小アジアにおける多様な土着の文化が、時代とともにどのように変容していったかについて、《ギリシア化》という現象に焦点をおいてその現象がどのような側面で展開されていったかについて考察をおこなった。とくにリキアにおけるギリシア由来の制度の受容とその解釈のあり方、それによる土着文化の変化と強化について検討した。最終年度に、この問題関心を中心テーマに据えて国際ワークショップを開催し、今後この研究を共同研究として進めていくための土台を築いた。今年度は、リキア諸都市間の条約、同盟等に関する碑文の内容の理解を深めるために、何よりも現地を訪問し、都市と都市との距離、地形を知ることを重点に置いた。その一環として、8月上旬から9月にかけて、代表者が研究分担者となっている[古代・中世地中海世界における宗教空間と社会変動ートロス遺跡聖堂遺構の発掘調査」(基盤研究(b)海外学術、研究代表者:浦野聡)とも関連して、リキア地方の都市トロス遺跡の発掘調査に参加するとともに、他のリキア都市の遺跡調査をおこなった。また、リキアの対岸に位置するロドスの遺跡調査におもむき、ここでは墓碑銘を中心にリキア諸都市出身者がどれほどいるかについて調査をおこなった。2月に再度リキアを訪れ、8月に訪れることのできなかった都市を中心に調査をおこなった。初年度となる今年度は、基礎史料を収集し、読み込むことに重点を置いた。とくにリキア諸都市間で同盟が締結されるときに語られることのある、当該諸都市が同じルーツをもつということが意識された「シュンゲネイア」という表現の出てくる碑文を中心に分析を含め、それがどのような文脈で使われているのかについての考察をすすめつつある。また、地方史あるいはより私的な歴史を刻んだ碑文についても収集し、上記の碑文とともにリキアというアイデンティティがどのように形成されてきているかについて考察した。史料の読み込みにはまだ時間を要するが、次年度までには新たな知見を得られる見通しが立てられるのではないかと考えている。2014年度もまた2013年度に引き続き、トロス遺跡発掘調査に参加して現地調査をおこなうために研究費が使われた。これに関して2014年度は土器を専門とする向井朋生氏を研究協力者として同地に派遣するためにも研究費は使われた。11月にはトロス遺跡聖堂遺構発掘調査報告会において、上述の発掘調査で得られた出土碑文についての報告をおこなった。その成果は2015年3月に発行された『史苑』75巻2号に掲載された。また、4月に在アテネ英国研究所で開催された第3回日欧コロキアムで“Transformation and Re-Creation of Memory through the Ages: Local Pride and the Rendering of the Persian Wars ーRe-reading the Themistocles Decreefrom Troizen"の報告をおこなうためにも研究費が使用された。本報告の中心テーマはヘレニズム時代初期のアテナイであったが、ヘレニズム時代に古典期の記憶がアテナイ以外、とりわけリキアを含む小アジアにおいてどのように展開されていったかについて研究を展開しつつある。これに関する報告は2015年度およびそれ以後となるが、最初の関連報告を2015年6月にオクスフォード大学のEpigraphy Workshopにておこなう予定である。そのほか2014年度は種々の学会報告と学会シンポジウムでの司会、コメンテータなどをつとめる中で、ヘレニズム・ローマ時代の東地中海世界の展開についての考察・研究を深めることに注力した。本年度は、2016年3月18ー21日に開催した小アジアワークショップ(Asia Minor Workshop: Understanding the process of Hellenization in Asia Minor: New perspectives - Culture and identity between the locality and the 'globalization')の組織と準備に注力した。これに先立ち、6月15日にオクスフォード大学のEpigraphy workshopにて'"Barbaroi" in Attic (and Greek) Inscriptions'というタイトルで、ギリシア人が異民族に対して敵対的な用語を用いる実態とその背景についての再点検をおこなった。またこの報告をもとにしつつ、さらに発展させて、10月23日に古代史の会例会(東京大学)において日本語で報告をおこなった。また6月21日の地中海学会大会(北海道大学)のシンポジウムにおいて「古代ギリシアにおける移住と移民」というタイトルで報告をおこない、移住地におけるアイデンティティの保持と変容にかんする考察をおこなった。冒頭に記した上記のワークショップは京都大学を会場として開催され、海外から4名、研究代表者および分担者をふくめて国内から10名の報告者をえた。小アジア各地における土着の文化の継続と変容について、それぞれの地域・時代を専門的に研究している研究者から多様な報告を得ることができた。小アジアにおける長時間をかけたさまざまなレベルでのギリシア文化の受容の実態について、ギリシア史研究者、ローマ史研究者の垣根をとりはらい、今後さらに共同研究をすすめていくための土台をつくることには成功したと言える。

最終年度に、この問題関心を中心テーマに据えて国際ワークショップを開催し、今後この研究を共同研究として進めていくための土台を築いた。(1) 4回に及ぶ学会および研究会報告に加えて、3回にわたるシンポジウムの司会とコメンテータをつとめることができた。この中で、東地中海の歴史を通時的に考察する機会を得た。(2)国内で同様の問題関心を共有する研究者との共同研究の下地をつくりつつあり、翌年度中にそれを実現できそうになっていること。あわせて海外研究者を含めた研究会を開催できる見通しが立ったこと。(3)直接的にリキアをキーワードとする論文の数は多くないものの、この1年にそれなりの数の論文を公にできたこと。あわせて、次年度以降に発表する論文の準備もおおむね順調に進んでいること。古代ギリシア史最終年度となる2015年度は、年度末に少数の招聘海外研究者も交えて、ワークショップを開催する計画を進めている。ギリシア史、あるいは古代東地中海の歴史を通時的に考察し、古代ギリシア史を孤立させるのではなく東地中海の「グローバル」な展開の中に位置づける試みを本科研終了後にも継続して共同研究することを可能にする素地をつくりたいと考えている。個人的には、上記ワークショップの準備に加えて、6月にオクスフォード大学のEpigraphy Workshopで"Barbaroi in Attic Inscriptions"というタイトルの報告をおこなう。アテナイにおける"異民族観"がヘレニズム時代の小アジアにどのように移植されているかについても論ずる予定である。あわせてロンドン大学で開催される国際学会Poetics of Warに参加する。そのほか、執筆中のいくつかの論文について仕上げていく。初年度は、研究代表者、研究分担者ともに個別の研究を進めることを優先した。まずは、個々が研究課題についての研究状況をより深く知る必要があったからである。代表者は、夏季(89月)と冬季(2月)の2度にわたりリキア各都市の現地調査をおこない、現地の地形と碑文建立の場の確認に努めた(冬季の調査の経費は本科研からは支出されていない)。こうした状況もあり、大きな成果のとりまとめは次年度以降になる。なお関連して基礎的資料の収集もおこなった。とくに代表者は、これまでほとんど所持していなかったリキア地方の碑文集の収集にも努めた。また、同研究課題について、共同研究をおこなう可能性のある研究者と接触し、共同研究会の開催の下地をつくることに努めた。
南アジアに分布するタイレリア原虫の分子系統進化

タイレリアのうち病原性の比較的弱いT.sergenti/buffeli/orientalis群の原虫はアジア・オーストラリア・ヨーロッパに広く分布している。初年度は韓国南部と済州島でタイレリア原虫を採集し、そのDNA解析を行った。その結果、済州島では病原性の比較的強い、I型が主体を占めていた。南アジアについてはカンボジア、タイ、インド、パキスタンを訪問し、それぞれ現地の研究者の協力で原虫を採集し、そのDNA解析を行った。タイではI型とC型原虫が分布していることを明らかにした。インド、パキスタンではT.annulataが主体であるため、水牛より材料を得て、タイレリア原虫の検出を行っているが、今のところ陽性例は得られていない。カンボジアについてはKongpong speuより56サンプル、Ratanakiriより81サンプルを得た。Kongpong speuでは、22株でC型とThai型原虫が混在していた。また19株でThai型が、2株でC型のみが検出された。Ratanakiriの材料では8株からC型とThai型の混在が、15株にThai型が、4株にC型のみが検出された。この成績はタイでの成績とよく一致していた。11年度は、南アジアのうちベトナム・タイ・カンボジア・中国南部(雲南)について原虫の分離を行った。7月にタイの共同研究者がタイ分離のタイレリア原虫DNAを持参したため、このDNAを解析した。8月にはベトナムとカンボジアを訪問し、多くの原虫DNAと血清を採集した。帰国後、原虫DNAを解析しているが、カンボジア・ベトナムのタイレリア原虫はタイに分布している原虫(Thai型)と類似の原虫と、日本に分布しているC型原虫が分布している事が明らかとなった。11月に中国・雲南省に採材に行ったが毎日雨で計画のようには原虫が採集できなかった。これら2年の調査で、南アジアのうちタイ・ベトナム・カンボジアに分布するタイレリア原虫はThai型とC型が主であることが明らかとなった。タイレリアのうち病原性の比較的弱いT.sergenti/buffeli/orientalis群の原虫はアジア・豪州・ヨーロッパと広く分布している。南アジアのうちインド・パキスタンでは、これまでT.annulataの分布は知られているが、タイ・カンボジア等では不明であった。今年はまず、韓国南部と済州島でタイレリア原虫を採集し、DNA解析を行った。その結果、済州島では病原性の比較的強いI型原虫が主体を占めていた。この成績は今、韓国の共同研究者と一緒に論文にすべく準備をしている。南アジアについてはカンボジア・タイ・インド・パキスタンをそれぞれ訪問し原虫を採集した。カンボジアでは時期が遅く、また初めての訪問であり、原虫材料は採集できなかった。タイについては現地の協力者により、タイ南部で原虫を採集し、タイでもI型、C型原虫が分布していることを明らかにした(論文を投稿中)。インド・パキスタンはT.annulataが主体である。インドでは顕微鏡で原虫寄生を認めたウシより4つの材料を得ており現在、解析している。パキスタンではJICAの専門家の協力が得られ、400頭の余りのウシ、水牛から血液材料を得た。これについても現在、原虫DNA解析を行っている。家畜のタイレリア原虫による疾病は、全世界に認められる。

本原虫は宿主体内で巧みに免疫を回避する事や、感染がダニを介することなどにより制圧されていない。わが国においても本原虫による小型ピロプラズマ感染症は経済的被害は大きく本病の制御が強く望まれている。タイレリア属に分類される原虫は10種類以上知られているがT.ParvaやT.Annulataならびに日本を初め東アジアに分布するT.Sergentiはモノクローナル抗体を用いた抗原性状や原虫遺伝子の解析が進んでいる。しかし南アジア、豪州、北米に分布するT.BuffeliやT.Orientalisの解析はほとんどなされていない。本研究の目的はタイレリア原虫の分布が知られている南アジアの国々で原虫種を採集し遺伝子と蛋白質レベルの比較を通してT.Sergentiの分類学的位置付けを明らかにする。本年度5月にタイの研究者が共同研究ため北大を訪問した。そこであらかじめタイ各地での原虫の採集を依頼しておき、そのDNAを持参してもらった。北大でタイの研究者と一緒に解析したところ、タイに分布するタイレリア原虫はタイ型が多く、他にC型とB型がみられ、ごく一部にI型が検出された。8月にベトナムとカンボジアでは多くの材料が得られた。現在解析中であるが、カンボジア・ベトナムともにタイに分布する原虫に類似していた。中国の南部(雲南省)についてはどのような原虫が分布しているか不明である。そこで今年訪問して採集を試みたが、ほとんど毎日、雨であり材料の採集が十分にはできず、得られた材料からはタイレリア原虫は検出されなかった。
Helicobacter pylori感染迅速診断:胃内視鏡用ウレアーゼ固定化チップの臨床応用

Helicobacter pylori(H.pylori)感染は慢性萎縮性胃炎の主な原因と考えられ、さらに分化型胃癌の危険因子とされている。また、消化性潰瘍、特に十二指腸潰瘍の病態においてもH.pylori感染の強い関連が認められている。H.pylori感染と病態との関連が明らかにされるようになり、H.pylori感染診断は治療を考慮するうえにも臨床上重要となってきた。すなわち、H.pyloriを除菌することにより、胃粘膜の炎症所見の改善が認められ、H.pylori感染陽性の十二指腸潰瘍患者ではH.pyloriの除菌により潰瘍の再発がおさえられると報告されている。さらに、H.pyloriの若年期からの持続感染が慢性胃炎から萎縮性胃炎へと移行し、分化型胃癌の発生に関与していると考えられており、H.pyloriの除菌は分化型胃癌の発生の低下にも寄与すると考えられる。そのためには、H.pylori感染の迅速簡便安価な診断法の確立が必要である。我々はH.pyloriに対する抗体を作成し、これをウレアーゼ補足用チップ(内径1.2mm)に固相化したものを、内視鏡用に開発した。このチップをアダプターで内視鏡用チューブに装着し、胃粘液をチップ内に吸引後、チップをはずし吸引及び洗浄用のポンプ作動回路を設けている測定装置内pH測定セルに挿入する。チップが挿入されスタートボタンを押すと、自動的に基質希釈液でチップ内を洗浄し、抗ウレアーゼ抗体に結合したH.pyloriのウレアーゼ以外を洗浄で洗い流す。そして、尿素を含む基質をセル内に送りH.pyloriのウレアーゼに反応させ、産生されるアンモニアによるpHの変化を測定する。H.pylori感染診断はこれまで繁雑で時間がかかり、限られた施設でなされているだけである。しかし、H.pylori感染の病態との関係が明らかにされるにつれ、臨床上H.pylori感染診断は重要であり、一般病院に広く普及されることが望まれる。本研究における経胃内視鏡用ウレアーゼ活性測定装置のH.pylori感染診断能は、培養法との比較で感度92.3%、特異度89.7%と、市販の内視鏡生検ウレアーゼテストであるCLOテストの感度81.0%、特異度89.0%を上回る成績であった。迅速性も診断に約15分と簡便であった。Helicobacter pylori(H.pylori)と上部消化管疾患との関連が明らかになるにつれ、感度、特異度だけでなく、侵襲が少なく、簡便かつ迅速な、H.pylori感染診断法が望まれる。H.pylori感染診断はこれまで、胃粘膜生検組織における鏡検下同定、培養が特異度が高い方法として行われてきたが、簡便性、迅速性に欠け、特殊な設備を要することから、実施可能な施設が限られていた。我々は抗H.pyloriウレアーゼに対するモノクローナル抗体をウレアーゼ補足用チップ(内径1.2mm)に固相化したものを、内視鏡用に開発した。

このチップをアダプターで内視鏡用チューブに装着し、胃粘液をチップ内に吸引後、チップをはずし吸引及び洗浄用のポンプ作動回路を設けている測定装置内pH測定セルに挿入する。チップが挿入されスタートボタンを押すと、自動的に基質希釈液でチップ内を洗浄し、抗ウレアーゼ抗体に結合したH.pyloriのウレアーゼ以外を洗浄で洗い流す。そして、尿素を含む基質をセル内に送りH.pyloriのウレアーゼに反応させ、産生されるアンモニアによるpHの変化を測定する。内視鏡用に作成したチップを、pH測定セルに挿入することでウレアーゼ活性が自動的に測定され、約20分でH.pylori感染の診断が行える。本システムにおいて、H.pylori菌自身で検討したところ、現在のところウレアーゼ活性とH.pyloriの菌体数との相関が認められ、菌体数10個以上で感知することが出来た。臨床検討において、培養検査との比較では感度92.3%、特異度89.7%であった。本法は低侵襲性かつ簡便迅速な検査法であり、臨床応用が有効な方法であると考えられた。H. pylori感染の内視鏡下診断法には、多くの方法が考案されているが、一般診療において汎用されるには、感度特異度に加え、迅速、安全性に優れた方法が要求される。H. pylori感染の迅速簡便安価な診断法の確立のため、我々はH. pyroriに対する抗体を作成し、これをウレアーゼ補足用チップ(内経1.2mm)に固相化したものを、内視鏡用に開発した。チップが挿入されスタートボタンを押すと、自動的に基質希釈液でチップ内を洗浄し、抗ウレアーゼ抗体に結合したH. pyloriのウレアーゼ以外を洗浄で洗い流す。そして、尿素を含む基質をセル内に送りH. pyloriのウレアーゼに反応させ、産生されるアンモニアによるpHの変化を測定する。内視鏡用に作成したチップを、pH測定セルに挿入することでウレアーゼ活性が自動的に測定され、約10分でH. pylori感染の診断が行える。本法は10^4cfu/mlより検出可能であり、市販されているウレアーゼテストであるCLOテストに比べ感度は2桁上昇していた。また、チップに広く粘液を採取することが可能であり、臨床的に有用な方法であると考えられた。71例の患者で使用した結果、カットオフ値を0.0933mV/sとすると、感度94.4%、特異度100%、陽性的中率は100%であった。これはCLOテストの感度88.9%、特異度94.4%、陽性的中率94.1%に比べ良好であった。
実シーンのライトフィールドと仮想物体とのCG画像合成に関する研究

ライトフィールド(光線空間)とは、実シーン中を飛び交う光線情報のことである。本研究では、様々なライトフィールドカメラで撮影された実シーンのライトフィールドとCGの仮想物体を合成するための研究を行った。本研究では、実シーンのライトフィールドを取得するために全方位カメラを使用した。まず、屋外の1地点で取得したライトフィールドを光源とみなしてフォトリアルなCG合成を行うイメージベーストライティングに関する研究を行った。晴天の屋外で撮影された画像は、太陽の輝度が非常に高く撮影時に輝度飽和を起こすため、太陽やその周辺の輝度を正確に取得することは難しい。そこで、太陽とその周辺の天空をそれぞれ放射基底関数で表現し、その関数に基づき輝度飽和のないHDR光源環境画像を作成する。そのHDR光源環境画像を用いてレンダリングし、実写画像中における太陽の影を忠実に再現できることを確認した。次に、実シーンのライトフィールドとCGの仮想物体を合成するため、効率的なライトフィールドの取得に関する研究を行った。全方位カメラの位置を変えて撮影した複数の全方位画像から球面状のライトフィールドを構築し、撮影されていない任意視点での全方位画像を生成する手法を提案した。全方位画像を撮影したカメラの位置は、Shape from Motionを用いて復元した。撮影した全方位画像の各画素に対して、球の中心から各画素の方向に向かう光線を考え、光線と球との2交点を記憶しておくことにより、すべての撮影画像から1つの球面状ライトフィールドを構築した。画像生成時には、構築したライトフィールドから各画素方向の光線を取り出すことによって、任意視点での全方位画像の生成を行うことができた。近年では、撮影後のピント合わせ(リフォーカス)を行うことができるライトフィールドカメラが一般消費者向けに発売されて注目を集めている。一方、研究段階では、多数のカメラをアレイ状に配置するものや、通常のレンズと撮像素子の間にマイクロレンズアレイを配置したもの、鏡面球を利用したものなど多数のライトフィールドカメラが提案されている。しかし、これらのライトフィールドを用いた画像生成の対象は実物体であり、CGとの合成についてはほとんど議論されていない。本研究では、実シーンのライトフィールドとCGの仮想物体との合成に関する研究を行う。平成28年度は、ライトフィールドの取得に関する研究と実シーンのライトフィールドを光源としてCG合成する研究を行った。ライトフィールドの取得に関しては、安価な全方位カメラを用いて複数の位置で撮影を行い、撮影画像からライトフィールドの構築、および取得したライトフィールドからの画像生成を行うことができた。このとき、通常のライトフィールドレンダリングでは2つの平面を用いた4パラメータ表現を行うが、今回は球面状のライトフィールドの表現を行うことで全方位画像に対応した。実シーンのライトフィールドを光源としてCG合成する研究においては、安価な全方位カメラで撮影した画像から太陽と太陽周辺の天空を放射基底関数の和で表現する手法を開発した。これまでに行ってきた太陽を1つの平行光源として近似する手法では、太陽の影の境界領域でのなだらかな明度変化が表現できていなかったが、提案した手法ではこのような現象が再現できている。当初計画においては、平成28年度に(1)実シーンのライトフィールドと仮想物体をCG合成するイメージベーストレンダリングに関する研究を行い、平成29年度以降に(2)実シーンのライトフィールドを光源と考えたフォトリアルなCG合成に関する研究、(3)実シーンのライトフィールドを効率的に取得するためのキャプチャリング手法の開発、を行う予定であった。平成28年度には、これまでに行っていた先行研究との関連から(2)をまず行い、同時に(3)を実施した。そのため、当初の計画とは異なっているが、おおむね順調に進展していると判断した。また、実用段階ではないが、様々な種類のライトフィールドカメラの研究も行われている。さらに、ライトフィールドを表示するためのディスプレイの研究も行われている。しかしながら、ライトフィールドの取得には、ライトフィールドカメラを使用することがほとんどであり、そのため対象シーンはカメラで撮影される実シーンの物体のみか全てCGで作成した画像のみとなっている。本研究では、様々なライトフィールドカメラで撮影された実シーンのライトフィールドとCGの仮想物体を合成する研究を行う。本研究は、大きく次の3つに分類することができる。(1)実シーンのライトフィールドと仮想物体をCG合成するイメージベーストレンダリングに関する研究、(2)実シーンのライトフィールドを光源と考えたフォトリアルなCG合成に関する研究、(3)実シーンのライトフィールドを効率的に取得するためのキャプチャリング手法の開発、である。平成29年度は、前年度に引き続き(2)実シーンのライトフィールドを光源と考えたフォトリアルなCG合成に関する研究と(3)実シーンのライトフィールドを効率的に取得するためのキャプチャリング手法の研究を行った。(2)に関しては、太陽とその周辺の天空をそれぞれ放射基底関数で表現し、太陽の影を忠実に再現するレンダリング手法を開発した。(3)に関しては、全方位カメラの位置を変えて撮影した複数の全方位画像から球面状のライトフィールドを構築し、任意視点での全方位画像を作成する手法を提案した。また、(1)に関しても、対象はCG画像のみではあるが、ライトフィールドディスプレイへの表示に関する検討を行った。

当初計画においては、平成28年度に(1)実シーンのライトフィールドと仮想物体をCG合成するイメージベーストレンダリングに関する研究を行い、平成29年度以降に(2)実シーンのライトフィールドを光源と考えたフォトリアルなCG合成に関する研究、(3)実シーンのライトフィールドを効率的に取得するためのキャプチャリング手法の開発、を行う予定であったが、先行研究との関連から(2)と(3)を平成28年度に行った。平成29年度には、引き続き(2)と(3)の研究を行い、さらに並行して(1)についても事前準備を行った。これは、CGによって作成した複数画像からライトフィールドディスプレイに表示する研究である。引き続き、平成30年度はCGと実写の合成を行い、ライトフィールドディスプレイに表示する研究を行う予定である。ライトフィールド(光線空間)とは、実シーン中を飛び交う光線情報のことである。本研究では、様々なライトフィールドカメラで撮影された実シーンのライトフィールドとCGの仮想物体を合成するための研究を行った。本研究では、実シーンのライトフィールドを取得するために全方位カメラを使用した。まず、屋外の1地点で取得したライトフィールドを光源とみなしてフォトリアルなCG合成を行うイメージベーストライティングに関する研究を行った。晴天の屋外で撮影された画像は、太陽の輝度が非常に高く撮影時に輝度飽和を起こすため、太陽やその周辺の輝度を正確に取得することは難しい。そこで、太陽とその周辺の天空をそれぞれ放射基底関数で表現し、その関数に基づき輝度飽和のないHDR光源環境画像を作成する。そのHDR光源環境画像を用いてレンダリングし、実写画像中における太陽の影を忠実に再現できることを確認した。次に、実シーンのライトフィールドとCGの仮想物体を合成するため、効率的なライトフィールドの取得に関する研究を行った。全方位カメラの位置を変えて撮影した複数の全方位画像から球面状のライトフィールドを構築し、撮影されていない任意視点での全方位画像を生成する手法を提案した。全方位画像を撮影したカメラの位置は、Shape from Motionを用いて復元した。撮影した全方位画像の各画素に対して、球の中心から各画素の方向に向かう光線を考え、光線と球との2交点を記憶しておくことにより、すべての撮影画像から1つの球面状ライトフィールドを構築した。画像生成時には、構築したライトフィールドから各画素方向の光線を取り出すことによって、任意視点での全方位画像の生成を行うことができた。平成29年度には、引き続き(2)実シーンのライトフィールドを光源と考えたフォトリアルなCG合成に関する研究と(3)実シーンのライトフィールドを効率的に取得するためのキャプチャリング手法の開発を行い、これらに関しては成果を外部発表する予定である。
転写制御における協同性の網羅的解析

本年度は、以下のような項目について解析をすすめた。(1)転写因子のターゲットの網羅的予測:昨年度に引き続き、酵母ゲノムについて、蛋白質とDNAの相互作用データ、複合体の構造データや計算機シミュレーション、従来の配列情報に基づく方法などいくつかの予測方法を組み合わせることにより、網羅的な予測を行った。また、ChIP-chipやChIP-seqのデータと組み合わせて予測結果の評価を行った。これらの実験データと予測を組み合わせることにより、より精度良くターゲットを同定することができることがわかった。(2)転写制御領域のコンテクストの解析:ターゲット遺伝子のプロモータ上に結合する転写因子のコンテクストとターゲット遺伝子の発現や機能との関係を解析した。例として、Mafという転写因子について、ターゲット候補遺伝子群のプロモータに結合する転写因子を網羅的に予測し、Mafと他の転写因子との共起関係や転写因子間の距離などの情報をもとに、これらと遺伝子発現の実験データや機能を比較した。この結果、特定の転写因子との共起関係と遺伝子発現データや機能との間に相関を見いだすことができた。(3)転写制御ネットワークと協同性の解析:転写制御情報のデータベースを解析することにより、転写因子とターゲット遺伝子の産物からなるネットワークを構築しつつある。また、構造情報に基づいた転写因子複合体構造ネットワークを構築し、実験データに基づくネットワークを統合しつつある。この統合した転写制御ネットワーク用いて、いくつかの転写制御系について構造レベルでの協同性を調べた。これらの例について調べた結果、協同的なDNAへの結合により特異性が上がることがわかった。本年度は、以下のような項目について解析を行った。(1)転写因子のターゲットの網羅的予測:酵母ゲノムについて、これまでに開発してきた、蛋白質とDNAの相互作用データ、複合体の構造データや計算機シミュレーションなどに基づく予測方法を組み合わせ網羅的な予測を行った。(2)転写因子情報のデータベース化とコンテクスト・協同性の解析:予測された結合部位やターゲット遺伝子などの情報を酵母の転写制御情報の統合データベースに統合し、プロモーター上での転写因子の結合サイトのコンテクストの解析を行った。このためにまず、特定の転写因子について、実験的に知られているターゲット遺伝子の制御領域でのその転写因子と他の転写因子のコンテクストを結合する転写因子の組成、結合部位の距離、順序などによりクラスター化を行い、コントロール遺伝子の制御領域に対する結果と比較した。また、転写因子のコンテクストの解析をもとに、遺伝子機能などのアノテーションとの相関を調べた。これまでの特定の転写因子に対する試験的な解析では明確な結論は得られていないが、多くの転写因子を網羅的に調べることにより何らかの相関が見られると期待している。(3)転写制御ネットワークの協同性の解析:転写因子とターゲット遺伝子の産物からなるネットワークを可視化するインターフェイスを作成した。これを使って、転写制御ネットワークの階層性やモジュール構造などをゲノムスケールで解析している。(4)転写因子構造ネットワークの解析:転写因子とDNAの複合体の構造情報を解析することにより、分子間の相互作用ネットワークを解析するツール、PDBnet、を開発してきた。これを用いて、いくつかの例について転写制御ネットワークの協同性を構造レベルで解析した。これまでの解析から、転写制御の協同性が構造レベルで重要な役割を果たしていることが明らかになった。
ABO分泌型遺伝子FUT2多型の世界の諸集団における分布

ニューギニアとスリランカの集団についてFUT2多型解析をおこなった。ニューギニアに関してはIrianese90名Admixed Irianese101名、Papua New Guineans32名、スリランカではSinhalese54名、Tamil58名についてFUT2コーディングエクソンをPCR増幅しダイレクトシークエンスをおこなった。これまで解析した集団では非分泌型アレルの頻度は約50%であったがIrianeseでは1人が分泌型とのヘテロ接合体でAdmixed Irianeseでも1020%と非常に低かった。分泌型アレルではニューギニア人に特徴的なものが比較的高い頻度で存在し、そのうちSe^<375>はアフリカ人にのみ低頻度認められているものであった。他の人種との遺伝的な距離を調べた結果近隣のインドネシア、サモアの集団からも分化しておりニューギニア人が比較的早い時期にアフリカから移住し近隣の人種から隔離していた可能性が示された。スリランカでは二つの集団ともアレルの構成はバングラディッシュと似ていたがSinhaleseでは非分泌型アレルの割合が38%であるのに対しTamilでは53%であり主要な非分泌型アレルが異なっていた。またバングラディッシュ人で13%を占めたアジア人特異的なse^<385>は見出だされずイラン人に認めたSe^<278>が存在した。これらの結果からスリランカの2集団は遺伝的に同一ではなく、またアジア人の影響が少ないということが示唆された。さらにFUT2の3.8kb下流のSTR多型解析の結果、アフリカ人は最も多様性が高くヨーロッパ人、日本人とハプロタイプの一部を共有しアフリカ起源説を裏付ける結果となり、またコーディング多型と同様人種差が存在した。以上、本研究によりFUT2が人種特異的な多型パターンを有することがさらに示された。FUT2多型はアフリカ人やヨーロッパ人では、428番目の塩基がGからAへ置換するナンセンス変異による非分泌型アレルse^<428>が、東洋人では385番目の塩基がAからTへ置換するミスセンス変異による非分泌型アレルse^<385>が同定された。この他にもFUT2 locusは人種に特徴的な様々なinactivating mutationを持っていることが示された。今回我々はニューギニア人のFUT2多型を解析した。90人のIrianese、101人のadmixed Irianese及び32人のPapua New Guineansの末梢血白血球よりゲノムDNAを抽出し、FUT2遺伝子の全エクソンをPCR増幅しシークエンス解析をおこなった。これまで調べてきた多くの人種でFUT2の非分泌型アレルの頻度は約0.5であったが90人のIrianeseではわずかに1名が非分泌型アレルのヘテロ結合体であったのみでadmixed Irianeseでも非分泌型アレルの頻度は0.1-0.2と非常に低かった。Admixed Irianeseでは非分泌型アレルはアジアに特徴的なse^<385>とポリネシア人に認められたse^<de12>であった。一方分泌型アレルはニューギニア人に特徴的なもの(Se^<375> and Se^<400>)が0.11-0.37と比較的高頻度認められた。このうちSe^<375>はニューギニア人以外では今のところアフリカ人に低頻度(0.01-0.03)認められるのみである。またFUT2 locusではF_<ST>が近隣の人種(インドネシア人やサモア人)と比べても大きかった。これらの結果からニューギニア人は比較的早期にアフリカからの移住が行われ長期間近隣の人種から隔離していた可能性が示唆された。

これまでの研究により分泌型遺伝子FUT2のnull alleleである非分泌型アレル(se)は人種特異的であることが分かってきた。そこでさらにこの遺伝子の多型分布を調べるため今回我々は今年度の研究費補助を受けスリランカへ赴き国民の18%を占めるタミル人と74%を占めるシンハラ人2集団それぞれ58名と54名から採血をおこないFUT2の多型解析をおこなった。その結果タミル人では非分泌アレルの頻度が約50%を占めるのに対しシンハラ人では63%と高頻度であった。タミル人で最も頻度が高い非分泌アレルはサモア人に見出されたse^<del2>であり、タイ、バングラディッシュに見出されたse^<302>と、ヨーロッパ人の主要なnull alleleであるse^<428>が多く存在した。また低頻度ながらバングラディッシュに分布するse^<685>が存在した。一方シンハラ人集団においてはse^<302>が最も高頻度に認められ、se^<428>が次に多く、se^<del2>が3番目に優位なnull alleleであった。一方タミル人集団に認められたse^<685>は存在しなかった。またどちらの集団にもアジア人の主要な非分泌型アレルであるse^<385>は認められなかった。これらのことから宗教や歴史的な背景から集団間で自由な婚姻が無かったと考えられる2集団は分泌型遺伝子のアレル組成も同一ではなく、遺伝的なバックグラウンドが異なるということ、またアジアからの影響も少ないのではないかということが示唆された。
逆転頻度が低いほど地磁気強度は大きくなるか？－アイスランド溶岩からの検証

100万年を超える長期間をカバーできる準連続時系列の古地磁気強度絶対値(API)データ源は、世界でもアイスランドの溶岩層序群をおいて他はない。本研究では、異なる地磁気逆転頻度を示す2つの期間を中心としたAPI準連続変動の解明を目指す。さらに海底堆積物から明らかにされつつある同期間の古地磁気強度相対値の時系列データと統合することで、試料依存性のない古地磁気強度連続変動記録を確立する。
口内炎モデルを用いた創傷治癒過程促進のメカニズムの解析

がん治療の副作用の一つである口腔粘膜炎を軽減、または抑制する効果が期待出来る薬剤の効果とその作用機序に関する検索を行った。臨床的に口内炎に効果がある事がわかり、保健収載もされている半夏瀉心湯の効果について検討を行ったところ、投与群で有意に症状の軽減が認められた。また、細胞培養によるスクラッチテストでは、投与によって上皮細胞の細胞増殖能が亢進している事が認められた。一方でスクラッチテストによる細胞遊走能は、添加によって抑制されている事が示された。この事から、半夏瀉心湯は、口腔粘膜の強度を挙げ、潰瘍形成を抑制する働きを有しているが、創傷治癒そのものを亢進する可能性は低い事が考えられた。本年度は引き続き、細胞培養モデルの確立と細胞培養の結果からの遺伝子解析を含めた分子生物学的アプローチの為の条件設定を行った。(細胞培養モデル確立の意義について)本研究では、現在臨床において使用されている薬剤の効果とその作用機序の解析を目的としている。作用機序を分子生物学的に明らかにする事によって、がん治療の完遂率に悪影響を与えている口腔粘膜炎による摂食障害に対する新しい局所応用による治療法や予防法の確立、ならびに、増殖因子等を用いた新薬にたいする、口腔粘膜への副作用の確認に用いる事が出来ると考えられる。平成24年度の研究では、細胞培養モデルにおいてHEK293細胞を用いて、スクラッチテスト並びに、試薬の添加実験によるタンパク質の発現と細胞分裂能について検索を行った。試薬としてプロマックの原末をゼリヤ新薬工業株式会社から、また半夏瀉心湯の原末を株式会社ツムラから無償提供を受けた。現在行っている条件下の実験において添加群とコントロール群で差を示したのは、ポラプレジンクであった。スクラッチテストでは、添加群にいてスクラッチ周辺の細胞の密集度が増加し、スクラッチ部がコントロールグンと比べると早く細胞で満たされた。この、細胞密度が上がる機序として細胞増殖能をBrdUの免疫染色で確認したところ、添加群において細胞増殖が盛んになっている事が示された。また、アクチンフィラメントの免疫染色において添加群とコントロール群を比較すると、細胞膜周囲の発現が、コントロール群では鮮明であるのに対して、添加群では不鮮明となっており、発現様式の変化が認められた。頭頚部領域のがんに対する放射線療法では、深刻な口腔粘膜炎によって、治療が中断される事が、一つの大きな問題であり、口腔粘膜炎の軽減のための治療法の確立が求められている。そこで、我々のグループでは、2012年より患者に対して半夏瀉心湯の臨床応用を行ったところ、口腔粘膜炎のグレードが投与群のグレードの平均が1.6、日投与群のゲレードの平均が2.8と有意に口腔粘膜炎の改善効果を確認した。そこで、株式会社ツムラより半夏瀉心湯原末の提供を受け、In vitroの実験系において、半夏瀉心湯における口腔粘膜炎の改善のメカニズムについて検索をおこなった。細胞培養系において上皮系の細胞の細胞増殖能について検索を行った。使用した細胞は口腔粘膜上皮がん細胞由来TR146細胞とヒト胎児腎細胞HEK293細胞である。ともに、上皮系細胞であるが、臓器が異なっており、半夏瀉心湯の効果が、消化器系上皮細胞に特異的に作用するかについて検討を行った。前年度に効果を検証したポラプレジンクは腎細胞ゆらいのHEK293に対し薬理作用を示したが、半夏瀉心湯は、HEK293には細胞増殖、細胞遊走、細胞外マトリックスの分泌に対して薬理作用を示さなかった。一方、口腔上皮由来のTR146に対して、細胞増殖を誘導する事が観察された。半夏瀉心湯を培養液中に添加したところ、BrdU陽性細胞率は、0 ug/ml 7.66%、1 ug/ml 8.4%、10 ug/ml 8.4%、100 ug/ml 9.6%となり、0ugと100ugの間に有為な差(p<0.05)を認めた。しかしながら、細胞遊走能と細胞外マトリックスの分泌については有為な差を添加群で示さなかった。これらの事より、半夏瀉心湯は上皮細胞特異的に作用し、創傷治癒における上皮細胞の細胞増殖を誘導する事で治癒の促進や潰瘍形成の予防に関与しているがん治療の副作用の一つである口腔粘膜炎を軽減、または抑制する効果が期待出来る薬剤の効果とその作用機序に関する検索を行った。本研究の目的は、亜鉛製剤であるポラプレジンク(商品名プロマック)ならびに半夏瀉心湯による口内炎創傷治癒の促進過程の機序を明らかにすることである。本年の研究では特に上皮系の細胞に対して亜鉛製剤がどのように作用するかについて検索を行った。

現在は腎上皮細胞であるHEK293細胞を用いて培養実験を開始した。現在行っている実験は、亜鉛製剤を加えた場合の細胞動態について、細胞遊走能をスクラッチテストにて、細胞増殖能をBrdUテストにて、また細胞骨格についてアクチンフィラメントの免疫染色を行っている。先ず、スクラッチテストでは亜鉛製剤添加群において細胞間のギャップを埋める速度が速い傾向が認められた。速度にばらつきがあり、まだ、有意差を認めるまでには至っておらず今後サンプル数を増やし検討する必要がある。また、その際、細胞増殖能が亜鉛添加群で活性になっていることも考えられる為、BrdUテストを行って細胞増殖能の比較を行ったが、亜鉛製添加群における細胞増殖能の増加は、有意差、傾向ともに認められなかったが、N数が少ないため今後、更なる実験が必要である。スクラッチテストにて添加群と非点か軍においてスクラッチの先端の細胞の形態が異なるように見えたため、アクチンフィラメントの走行を免疫染色的手法にて確認を行った。現時点ではまだN数が少ないが、アクチンフィラメントの発現パターンに変化が認められた。添加群では、アクチンフィラメントの発現が細胞質内に均質に発現しており、発現の局在等の変化は認められなかった。今後、発現量についての解析が必要である。臨床的に創傷治癒においていは、上皮化の促進は疼痛の軽減という側面から重要な項目である。現在まで、亜鉛製剤による上皮化促進のメカニズムは解明されておらず、本研究は臨床的に重要な意味を持つ。東日本大震災の影響で、実験室の引っ越しが2度あり、その為に実験条件の確認を行わなければならず、実験の再現性の確保の為に時間を要してしまった。平成23年に発生した東日本大震災の影響で、実験施設が被災し実験環境を再構築する為に時間を要してしまった。また、現在も震災の影響で、我々の使用しているビルの耐震工事の関係で、実験室の引っ越し等を余儀なくされており、集中して実験出来る環境を整えるまで、しばらく時間を要してしまう。主に環境要因によって実験の進捗状況が遅れているが、本年度は環境整備も整うため本来の実験計画に移行出来ると思われる。現在のスクラッチテストでは、再現性に問題があるため、本年度からマイグレーションアッセイキットを用いて再現性の良い研究を進め、効率化を図る。今後は、実験環境の整備をしつつ当初の目標に到達出来るよう実験計画を再検討する。特に本年行うことが出来なかった動物実験の開始を念頭に環境を整備していく。また、細胞培養の環境はほぼ整ったため、培養系の実験を優先的に行いIn vitroの実験結果の解析を押し進め、亜鉛製剤の上皮細胞への作用について明らかにしてくい。培養系では特に現在進めている細胞遊走能試験キットを用いて厳密に定量化を行う。また、漢方薬である半夏瀉心湯についても同様に実験を行いその効果と薬理作用について細胞動態を中心に検索を行う。動物実験においては、エタノールによる人工的口内炎発症モデルを用いて、亜鉛製剤並びに半夏瀉心湯の作用効果が最大である至適濃度について検討を行い、実際の創傷治癒過程について検索を行う。マイグレーションアッセイキットを新たに購入する予算として使用する昨年は、実験関連物品の購入も少なかった為、本年は先ず、培養系の材料について購入を勧めていく。特に、細胞遊走能テスト、BrdUテスト関連の試薬、並びにタンパク質の発現量を検索するためにウェスタンブロット関連の試薬を購入する予定である。また、動物実験関連の物品ならびに抗がん剤などの製剤と動物の購入と飼育について研究費を使用する物と考えられる。