hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
学力保障を基盤にした「持続可能な開発のための教育」の評価方法とカリキュラムの開発

具体的には、質の高いESDの実践を展開するうえで留意すべき諸点に関するオーストラリアでの理論的な議論などに注目して、検討を進めた。また、アデレード大学や西オーストラリア大学、グリフィス大学などにおいて資料収集を行い、現地の議論の検討を進めた。2つ目は、オーストラリアでの実践事例の調査および分析の進展である。具体的には、Tasmanian Centre for Global Learning(ホバート)やOne World Centre(パース)が実施している実践や教師教育プログラムの内容等に関する資料収集やスタッフへのインタビュー、学校現場での取り組みの視察などを行った。また、教育評価やカリキュラム編成などに関する資料収集やインタビュー調査と、得られた資料の検討などを行った。今年度は、交付申請書の「研究実施計画」に示した「教育評価を効果的に位置づけたカリキュラムの開発」に向けた理論と実践に関する調査と分析、および、「国外での実践事例の調査および分析」に取り組んできた。当初の計画では、国内での実践事例の調査、ならびにそれもふまえたカリキュラムの開発まで進める予定であったが、今年度は学内の助成金も用いて国外での調査を充実させる機会を得たため、当初は次年度以降に予定していた国外での調査も先に行うかたちに計画を修正した。そのため、「カリキュラムの開発」および「国内での実践事例の調査および分析」に、やや遅れが生じている。本研究は、学力保障を基盤に据えた「持続可能な開発のための教育(Education for Sustainable Development:以下、ESD)」の実践を日本の学校教育の場に広げるために、理論と実践の往還を重視した教育方法学的アプローチによって、教育目標の設定と教育評価の方法論の構築を行うとともに、それに基づくカリキュラムを開発することを目的としている。平成29年度の主な研究成果は、以下の3つにまとめられる。1つ目は、ESDに関する取り組みを充実させるための理論に関する研究の進展である。具体的には、主にオーストラリアにおける議論を参考にしながら、実践の質を保障し、より効果的な実践を展開するための評価の観点や評価方法についての検討を進めた。また、オーストラリアのアデレード大学等において資料収集を行い、得られた資料の検討も進めた。2つ目は、実践に関する調査および議論や分析の進展である。具体的には、国内の教師の実践づくりに関わったり、オーストラリアにおける「持続可能性のための教育(Education for Sustainability)」、ならびにニュージーランドにおけるESDやグローバル教育に関連する取り組みに関する資料収集やスタッフへのインタビュー、学校現場での取り組みの視察、ならびにその分析などを行ったりした。3つ目は、自身の研究成果の発信である。具体的には、まず、所属する国内の学会での研究発表を行った。
付着生物幼生の着底、変態を誘起する化学因子に関する研究

付着性の管棲多毛類エゾカサネカンザシHydroides ezoensis幼生をモデルとして、付着生物幼生の着底、変態を誘起する化学因子を種々検討した。その結果、同種の棲管塊のMeOH抽出物から、幼生の変態を誘起する物質として、ドコサヘキサエン酸のモノアシルグリセリドである1-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosahexaenoyl-glycerol(以下DHAMGと略記)を単離、同定した。このことは本種が天然において示す「群居性」が、この物質を根拠に成立していることを示すものと考えられる。関連物質として、各種の遊離脂肪酸、そのグリセリド等にも活性が認められたが、活性の発現はアシル基の不飽和結合の存在と数に依存し、グリセリドの方が活性が高かった。人為的な変態誘起因子として、神経伝達物質とその前駆体であるアドレナリンとL-3,4-dihydroxyphenylalanine(以下L-DOPAと略記)に変態誘起活性があることが判明した。哺乳類では活性がない光学異性体のD-DOPAでもやや低い活性が認められたことから、哺乳類のドーパミン受容体とは異なる受容体の関与の可能性も考えられた。またアドレナリン受容体の各種アゴニストについて検討した結果、哺乳類で知られているα_1、α_2、β各型の受容体に特異的な反応を示さなかったことから、やはり哺乳類とは異なったタイプのアドレナリン受容体が関与している可能性が推察された。人為的な変態誘起因子としては、海水中のK^+あるいはCa^<2+>イオン濃度の上昇も有効であった。逆にCa^<2+>イオン濃度を1/2に低下させるとL-DOPAによる変態誘起が阻止されたことから、Ca^<2+>イオン濃度の上昇による変態誘起はカスケード反応のより下流にあることが判明した。研究遂行上必要な基礎的知見である付着生物種の選定,幼生の飼育技術と着底・変態誘起活性のアッセイ法の確率を行うとともに,幼生の着底,変態誘起因子の探索を行った。付着生物種としては,目的にあう種類として,ムラサキイガイ,コウロエンカワヒバリガイ,ホトトギス,タテジマフジツボ,エゾカサネカンザシなどが適当であることが明らかになった。このうちエゾカサネカンザシは6月から11月にかけて成熟卵が入手でき,飼育時間も10日程度と短いことから,集中的な実験が可能である。タテジマフジツボについては,親個体にアルテミア・ノープリウス幼生を与えることで容易に幼生が得られるため,ほぼ周年にわたり実験が可能である。他の種類については成熟期に集中的に実験を行うこととした。飼育条件の内飼育水温については,ムラサキイガイ以外の種類については温度25゚Cで,幼生が良好に発育した。飼育塩分については,コウロエンカワヒバリガイ,ホトトギス,タテジマフジツボが2025psuの比較的低塩分で幼生の成長が良好であったが,他の種類では30psu程度で良好な結果が得られた。幼生に与える餌としては,珪藻のChaetoceros calcitransが全ての種類で使用できた。幼生の着底,変態を誘起する因子として,エゾカサネカンザシでは,新しく形成された同種の棲管が高い活性を示した。新棲管に対する幼生の反応は極めて速く,導入後数時間以内に棲管土で着底,変態した。新棲管の水抽出物には活性がなかったが,有効な抽出方法については,来年度に材料を十分量そろえた上で検討する予定である。この他,幼生自体のメタノール抽出物,天然の海中で形成された微生物フィルムが,活性を示した。人為的な変態誘起因子として,神経伝達物質のアドレナリンとその前駆体であるL-3,4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA)が活性を示した。これらの物質のアゴニスト,アンタゴニストの作用については来年度検討する予定である。

またアドレナリン受容体の各種アゴニストについて検討した結果、哺乳類で知られているα_1、α_2、β各型の受容体に特異的な反応を示さなかったことから、やはり哺乳類とは異なったタイプのアドレナリン受容体が関与している可能性が推察された。人為的な変態誘起因子としては、海水中のK^+あるいはCa^<2+>イオン濃度の上昇も有効であった。逆にCa^<2+>イオン濃度を1/2に低下させるとL-DOPAによる変態誘起が阻止されたことから、Ca^<2+>イオン濃度の上昇による変態誘起はカスケード反応のより下流にあることが判明した。昨年度の結果から、エゾカサネカンザシは成熟期が6月から11月にかけてと長く、飼育時間も10日程度と比較的短いことから、集中的な実験が可能であることが明らかになったため、主にこの種を用いて幼生の着底、変態現象の発現過程の解明にあたった。昨年度の結果から、幼生の着底、変態を誘起する人為的な変態誘起因子として、神経伝達物質のアドレナリンとその前駆体であるL-3,4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA)が活性を示すことが明らかになったが、今年度はこのうちアドレナリンのアゴニストについて検討した。検討したepinephrine(α,β)、norepinephrine(α,β)、L-phenylephrine(α_1)、clonidine(α_2)、isoproterenol(β)の活性は、epinephrine>norepinephrine【greater than or equal】isoproterenol>phenylephrine>clonidineであった。このことからエゾカサネカンザシ幼生の着底、変態現象には、アドレナリンβ受容体が関与していることがうかがわれたが、その濃度と現象の発現の関係はマガキなどで知られているものとは大きく異なっており、脊椎動物の受容体とは異なる可能性もある。したがって来年度は更に多くのアゴニスト、アンタゴニストについて検討する必要性がある。幼生の着底、変態を誘起する別の人為的な変態誘起因子として、海水中のイオン濃度についても検討した。その結果、海水中のK^+とCa^<2+>について、その濃度を上昇させることで、活性が認められた。すなわち、K^+では50mMを中心に20mM70mMで、Ca^<2+>では20mM30mMを中心に10mMから40mMの間で、濃度依存的に変態を誘起する活性があった。またCa^<2+>については、その濃度を通常の海水の1/2にすることで、L-DOPAによる変態の誘起が阻害された。付着性の管棲多毛類エゾカサネカンザシHydroides ezoensis幼生をモデルとして、付着生物幼生の着底、変態を誘起する化学因子を種々検討した。その結果、同種の棲管塊のMeOH抽出物から、幼生の変態を誘起する物質として、ドコサヘキサエン酸のモノアシルグリセリドである1-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosahexaenoyl-glycerol(以下DHAMGと略記)を単離、同定した。このことは本種が天然において示す「群居性」が、この物質を根拠に成立していることを示すものと考えられる。関連物質として、各種の遊離脂肪酸、そのグリセリド等にも活性が認められたが、活性の発現はアシル基の不飽和結合の存在と数に依存し、グリセリドの方が活性が高かった。人為的な変態誘起因子として、神経伝達物質とその前駆体であるアドレナリンとL-3,4-dihydroxyphenylalanine(以下L-DOPAと略記)に変態誘起活性があることが判明した。
ろう児への手話を支える身体のエクリチュール性－文化的環境としてのろう保育者の意義

本研究は、「音声言語」対「手話言語」の二項対立図式を越えて進む試みである。伝統的な言語学を方法論とする「手話言語学」は、「手話言語には文字がない」と判断した。しかし、デリダとメルロ=ポンティの思索によれば、空間的であるだけでなく時間的に、間ー身体的な表現である手話こそ、原エクリチュールとしてのパロールに他ならない。成人ろう者によるろう児の教育は、文字のある言語の世界に人間のおとなが子どもを導いていく原型である。この視座からの現象学的記述を通して、成人ろう者がろう児に必要不可欠な文化的環境であることの自明性を論じた。ろう・難聴の幼児をことばの世界に導くために、豊かな身体表現を伴う手話を日常言語とするろうの保育者たちが必要不可欠な文化的環境であることを、現象学的に考察中である。27年度は、Tろう学園幼稚部に3日間、Sろう学園幼稚部に18日間の参与観察に入った。Tろう学園で観察できた内容に関しては、拙稿「人間は自画像としての絵画に溢れた世界を生きる身体であるー後期メルロ=ポンティ絵画論の位相」(小熊正久他編「画像と知覚の哲学」2015年11月,東信堂、所収)に「付記」として言及した。Sろう学園に関しては、ふたりのろう者の保育を継続して参与観察し、当該保育者に送った毎回の考察文の総量が、400字詰め原稿用紙換算90枚ほどになる。本研究の「目的」に、ろう保育者がろう・難聴児との関係を築く保育環境構成に関して考察するための重要項目として、1手話による絵本読み聞かせ、2描画指導、3文字指導の3つを掲げていた。27年度に特に大きな成果があったのは、1である。ろう者が手話的な身体表現によって、絵としての「ことば」の意味と文字としての「ことば」の意味を同時に表現できることにおいて、「見えないもの」であるはずの論理を、一気に「見えるもの」にする、非常に知的な読み聞かせを行うようすを、具体的に観察できた。聴者による「聞かせることば」での読み聞かせが、時として、文字の単なる音声化に終始してしまうことに比較して、「見せることば」である手話を駆使するろう者による全身体的読み聞かせの方が、はるかに知的でありうる。もとより、それは、「理由の空間」に身体的に存在するわたしたち人間に共通の「身体のエクリチュール性」ゆえであろう。さらに、ろうの保育者がろう・難聴の子どもたちのために構成する保育環境が、その都度の身体性を豊かに反映する可塑性・流動性に富んでいるありさまについても、考察の糸口がつかめた。現象学的記述を中心とした考察のために、継続して参与観察できるろう保育の現場に恵まれたこと。ろう教育のスペシャリストであり、ネイティブなろう者の手話の読み取りにも堪能である研究者(筑波技術大学准教授新井孝昭氏)の協力を得ることができたこと。前年度に引き続き、埼玉県立特別支援学校大宮ろう学園幼稚部に勤務する、二人のろうの保育者、清水由紀江、戸田康之両氏が、同校のろう・難聴の子どもたちをことばの世界へと導くための貴重な文化的環境であることを参与観察し、現象学的に記述した。清水氏が9月中旬ー2月中旬間、産休であった。そのため、その期間は、戸田氏の保育を中心的に観察した。毎月、数日間にわたって、訪問し、その都度、現象学的記述による考察文を届け、その総量は、400字詰め原稿用紙換算で160枚あまりになる。(年度末は、当該年度の科研費を使い切って旅費が出ないために、「出張」ではなく、「研修」として、訪問したが、参観した内容についての考察文は送り続けた。)清水氏の保育に関しては、ろう・難聴児にとって最初の「ことば」である絵画制作を支援する優れた空間的環境構成、戸田氏に関しては、絵本の読み聞かせから発展させる劇ごっこ遊びによる、言語能力の育成に、焦点化して、考察した。その内容については、現在、執筆中の著書「メルロ=ポンティの教育の哲学」(仮題)に収録する。また、メルロ=ポンティ哲学に関して複数の著者で編集する入門書の原稿にも、反映させる。近年、人工内耳の手術を乳幼児期に受けるろう・難聴児が増加しており、それは、両氏が勤務する大宮ろう学園でも同様である。しかし、決して完璧な装置ではない人工内耳の使用を修得していく前提としても、全身体的なコミュニュケーション空間の体験は必須であり、そのための、ろうの保育者の手話能力の活用は必至であることを、両氏の保育実践に参与観察して、確信する次第である。ろう者である、清水由紀江、戸田康之、両氏の保育観察を計画していたが、清水由紀江氏が、6カ月間の産休をとった。その期間は、戸田康之氏の保育実践に集中して、参与観察した。手話に堪能な成人ろう者がろう学校幼稚部に勤務することは珍しくはないが、聴者の補佐役を期待されてであることが多い。近代学校教育の重点課題が音声言語の「表音文字」の教育であることを背景にろう教育も聴者が主導すべきだと考えられがちだからである。抗して「手話言語学」を論拠に「ろう文化」を主張する「手話言語条例」の制定が全国各地で推進されていくが、「ろう文化」の中核として示される手話はろう者集団内で生育しなければ体得できない繊細な言語であり、一般的な聴者には敷居が高い。

こうして「聴者」対「ろう者」、「音声言語」対「手話言語」、と二項対立する社会状況があり、学術的研究はどちらか一方の側に立ってなされるのが一般的であるが、本研究は、対立図式を越える第三の方途をデリダ的「エクリチュール」の発想から模索した。「手話言語学」は手話を言語と認めた功績を云々するが、依拠した言語学とは西欧形而上学が絶対的ロゴスを一方向的に伝達しうる媒体として音声的パロールを尊重した「音声中心主義」の学であることから、「手話には文字がない」と判断した。だが、ロゴス的パロールの只中にも時間的他者たちとの限りない意味生成を開く「エクリチュール」の胎動を見て西欧形而上学を脱構築したデリダ、さらに彼に先立つメルロ=ポンティの、「エクリチュール」の可能性の条件を間身体性に見いだす姿勢に依拠すれば、手話こそ、人間的パロールの「原エクリチュール」のありさまを集約的に開示している言語である。本研究はこの視座から複数のろうの保育者のふるまいの現象学的記述を行い、成人ろう者がろうの乳幼児に必要不可欠な文化的環境であることの自明性を論じた。その内容は同時に、聴者対ろう者の区分の手前の水準で、およそわたしたち人間のおとなが言語で分節化され常に新たに更新される世界に子どもを導いていく原型的ありさまの提示に他ならないのである。本研究は、「音声言語」対「手話言語」の二項対立図式を越えて進む試みである。伝統的な言語学を方法論とする「手話言語学」は、「手話言語には文字がない」と判断した。しかし、デリダとメルロ=ポンティの思索によれば、空間的であるだけでなく時間的に、間ー身体的な表現である手話こそ、原エクリチュールとしてのパロールに他ならない。成人ろう者によるろう児の教育は、文字のある言語の世界に人間のおとなが子どもを導いていく原型である。この視座からの現象学的記述を通して、成人ろう者がろう児に必要不可欠な文化的環境であることの自明性を論じた。本研究の「目的」に、ろう保育者がろう・難聴児との関係を築く保育環境について考察するための重要項目として掲げた3つの項目、1手話による絵本読み聞かせ、2描画指導、3文字指導、のうち、特に2と3について推進しつつ、さらに、ろう保育者による保育環境構成一般について、深く考察したい。最終年度である29年度には、研究成果を社会に還元することに重点をおく。29年6月25日(日)には、西岡の勤務校である香川大学内を会場として、ろう者の戸田康之氏、と聴者の新井孝昭氏(西岡の科研費研究の研究協力者)による、講演会+ワークショップ(ろう・難聴児の劇ごっこ遊びをはぐくむ絵本の手話語りをアクティブ・ラーニング)を企画している。さらに、西岡個人での学会発表を行い、執筆中の著書の完成をめざす。教育方法学
モデルマウスを用いたアトピー性皮膚炎発症に関与する因子の同定ならびにその機能解析

本研究はアトピー性皮膚炎(AD)発症の初期段階から関与する遺伝子群を単離、同定し、かつその生体内での動態を包括的に解析することを目的としている。平成16年度も引き続き、ADの疾病モデル動物であるNC/Ngaマウスを用いて、生後より皮膚炎発症における一連の過程で特異的に発現する遺伝子の同定をおこなうため、対象群ならびにコントロール群の皮膚炎発症の経過を追って、発現の変動する遺伝子の単離を試みた。その結果、脂質の合成に関与すると考えられているタンパク質をコードする遺伝子1種、接着因子であるインテグリンの1種、未知のタンパク質をコードする遺伝子1種について、正常個体と皮膚炎発症個体について発現に違いが存在することが示唆され、現在これらの遺伝子について解析を進めている。本年度研究実施計画にも記載したごとく、これら遺伝子のSNPについて詳細に解析し、Mouse Genome Sequencing Consortium(http://www.ensembl.org/Mus musculus/)のデータベース(Ensembl mouse assembly 32)上のC57BL/6系統と比較したところ、2つの遺伝子についてアミノ酸置換を伴うcSNPが観察された。さらに、このアミノ酸置換を伴う遺伝子と相互作用するタンパク質を同定するため、イーストツーハイブリッド法による解析を行い、一次スクリーニングにおいて、計24個の陽性クローンを得た。さらに二次スクリーニングにより計3種の遺伝子産物が高い確率で相互作用する可能性が示唆された。ADの候補遺伝子のSNPと標記疾患を関連づけるためには、遺伝子の発現解析ならびに、遺伝子産物の生化学的解析さらにはin vivoでの表現型の証明が必要であると考えられる。よって現在、表記遺伝子がコードするタンパク質を認識する抗体の作製をおこない、組織での発現部位さらには発現時期の特定、相互作用すると考えられる因子との関係について調査している。平成15年度は、ADの疾病モデル動物であるNC/Ngaマウスを用いて、生後より皮膚炎発症における一連の過程で特異的に発現する遺伝子の同定をおこなうため、対象群ならびにコントロール群について血中IgE濃度の差異ならびに皮膚炎発症の経過を追って、複数の組織における発現遺伝子の変化をディファレンシャルディスプレイ(DD)法を用いて解析し、網羅的な変動遺伝子の単離を試みた。ELISA法を用いて測定した血中IgE濃度ならびに、さまざまな程度の皮膚の炎症を指標とし、それぞれの個体からサンプルを収集、コントロール群との遺伝子発現について比較した。その結果、免疫機能に関与すると考えられるものをはじめとして、転写因子、代謝関連酵素など複数の遺伝子の発現がコントロール群と比較して変動していることが示唆された。現在これらの発現変動遺伝子について、マイクロダイセクションを用いたQuantitative-RT-PCRによる特定細胞での発現モニタリングなどの手法を用いた詳細な検討、ならびにこれら遺伝子量の変動に影響を受ける遺伝子群の検出を目的としたマイクロアレイの作製をおこなっている。さらに、炎症部位において観察され、かつ発現が変動していると考えられる遺伝子について、その塩基配列を決定したところ、BALB/cならびにC57BL/6J系統などの他系統との間にアミノ酸置換を伴う塩基置換が観察されたことから、この遺伝子の機能についても詳細に解析し、皮膚炎発症との関連についても検討している。
更年期インスリン抵抗性に対するエストロゲンの作用とiNOSの関与の解明

エストロゲンによる血糖値上昇抑制メカニズムにおけるiNOSの役割を明らかにすることを目標として、本年度は以下の内容の研究を実施した。1.膵臓ランゲルハンス島細胞におけるiNOSの働きとインスリン分泌の検討;iNOSが膵臓ランゲルハンス島においてどのようにインスリン分泌に関与しているか明らかにするため、ovxマウスから単離精製したランゲルハンス島培養細胞におけるiNOS発現およびインスリン分泌について検討した。2.メトホルミン投与による血糖値変化;糖尿病治療薬であるメトホルミンを卵巣摘出マウスに投与し、血糖値の変化を観察した。メトホルミンを3週間経口投与後に経口糖負荷試験(OGTT)を行なった。グルコース投与後にovx cont群はsham cont群と比較して有意な血糖値上昇が観察された。また、グルコース投与後にovx Met投与群はovx cont群と比較して有意な血糖値の低下が観察された。sham Met投与群はsham cont群と比較して有意に血糖値が低下した。メトホルミンの投与により、卵巣摘出マウスで観察された血糖値上昇が改善した。また、ovx cont群ではsham cont群に比較して肝臓においてpAMPKタンパク量発現の有意な減少が観察された。この結果より、AMPKの活性化が卵巣摘出マウスにおける血糖値上昇に関与していることが示唆された。3.肝臓、腎臓および脂肪細胞における遺伝子・タンパク質発現;卵巣摘出マウスの膵臓の単離と同時に、血糖値の変動に関係すると考えられる肝臓、腎臓および脂肪細胞からmRNAおよびタンパク質を採取し、解析した。検討した因子は、IRS-1、IRS-2、GLUT2、GLUT4、PDK4およびGSK-3β等である。しかしながら、現在のところ重大な差異は観察されていない。3やや遅れている。本年度は、単離した膵臓ランゲルハンス島細胞におけるiNOSの働きとインスリン分泌について解析する計画であったが、膵臓の単離培養を安定して行うことができず、十分な結果を得ることができなかった。ランゲルハンス島の単離・培養の経験を持つ本学研究者のアドバイスを得て現在実験を進行中である。前年度より見送っているエストロゲンタブレットによるエスロトゲン補充による血糖値上昇抑制の効果の検討は、メトホルミン投与の結果から、AMPKの活性化が卵巣摘出による血糖値の変化に関与している可能性が示唆されたため、AMPKの経路について検討を行なう。また、iNOSKOマウスにおけるAMPK活性化の関与についても検討する。計画とは異なる検討も行ったため、本年度の研究の達成度は計画よりやや遅れていると判断したが着実に進んでいると考えられる。今後は、以下の計画で研究を実施する。1.膵臓ランゲルハンス島細胞におけるiNOSの働きとインスリン分泌の検討;iNOSは膵臓ランゲルハンス島においてインスリン分泌に関与していることが知られているため、ovxマウスおよびiNOSKOマウスにおいては分泌機能に影響を及ぼすことが考えられる。そこで、今年度に引き続きovxマウスから単離精製したランゲルハンス島培養細胞におけるiNOS発現およびインスリン分泌の検討を実施する。2.運動によるiNOS発現の変化と血糖値への影響;単離精製したランゲルハンス島培養細胞と並行して、運動負荷時におけるインスリン抵抗性およびiNOS発現の変化を検討する。Ovxマウスに対し適度な運動負荷を行ない、iNOS発現の低下や血糖値降下作用について解析を行なう。3.エストロゲンタブレットによるエスロトゲン補充による血糖値上昇抑制の効果の検討;エストロゲンタブレットを卵巣摘出後血糖値の上昇が観察された野生型およびiNOSKOマウスに埋め込み、エスロトゲン補充による血糖値上昇抑制の効果を検討する。また、AMPKシグナルの変化についても併せて検討する。1.エストロゲン欠乏モデルマウスにおけるiNOS発現の変化;卵巣摘出(ovx)マウスを用いた以前の解析から、我々はiNOSKOマウスにおいて野生型マウスと比較して血糖値上昇が抑制されていることを確認している。そこで、野生型マウスの肝臓から抽出したmRNA解析により、ovxマウスにおいて偽手術(sham)マウスに比較してiNOS遺伝子発現が増加していることを確認した。2.筋肉細胞におけるGLUT4発現量と膜移行性;同時に、骨格筋細胞の糖取り込みにおいて重要な働きをもつGLUT4遺伝子発現について検討した。その結果、酸素代謝型の筋肉であるヒラメ筋におけるGLUT4遺伝子発現は、ovxマウスではshamマウスに比較して低下していた。一方、免疫染色による筋肉細胞膜に局在するGLUT4発現の検討結果では、iNOSKO ovxマウスで、野生型ovxマウスと比較して増加していることが明らかになった。加えてiNOSKOマウスにおいてインスリンシグナルを担うIRS-1およびGSK-3βの発現の増加が観察されたことから、iNOS欠損により、インスリン感受性が向上することが示唆された。3.筋肉および肝臓におけるシグナル分子の変化;エストロゲンの作用はPI3-kinase/Akt/NF-κB経路およびAMPK活性化を介していると予測されるため、筋肉および肝臓における関連因子のタンパク質発現量を測定した。しかしながら、現段階ではovxマウスおよびiNOSKOマウスにおいてエストロゲンシグナル経路の因子発現に重大な差異は認められていない。本年度は、インスリン抵抗性に対するエストロゲンの作用とiNOS発現への関与ついて解析する計画であった。ovxマウスにおいてiNOS発現の上昇が確認された。

また、iNOSKOマウスでは野生型に比較してインスリンシグナル因子のIRS-1やGSK3βの上昇あるいはGLUT4膜移行の増加が観察された。一方、iNOSがGLUT4の発現および膜移行にどのようなシグナルで関与するかを明らかにするまでに至らなかったため、計画書に記載した、変化が観察された因子についてその阻害薬を用いての効果の確認を行うことができなかった。また、同じく計画書に記載したエストロゲンタブレットによるエスロトゲン補充による血糖値上昇抑制の効果の検討は、研究費の節約の観点からも、iNOSが関与する重要なシグナルが判明してから行なうこととした。以上の観点から、本年度の研究の達成度はおおむね順調に進展していると判断した。エストロゲンによる血糖値上昇抑制メカニズムにおけるiNOSの役割を明らかにすることを目標として、本年度は以下の内容の研究を実施した。1.膵臓ランゲルハンス島細胞におけるiNOSの働きとインスリン分泌の検討;iNOSが膵臓ランゲルハンス島においてどのようにインスリン分泌に関与しているか明らかにするため、ovxマウスから単離精製したランゲルハンス島培養細胞におけるiNOS発現およびインスリン分泌について検討した。2.メトホルミン投与による血糖値変化;糖尿病治療薬であるメトホルミンを卵巣摘出マウスに投与し、血糖値の変化を観察した。メトホルミンを3週間経口投与後に経口糖負荷試験(OGTT)を行なった。グルコース投与後にovx cont群はsham cont群と比較して有意な血糖値上昇が観察された。また、グルコース投与後にovx Met投与群はovx cont群と比較して有意な血糖値の低下が観察された。sham Met投与群はsham cont群と比較して有意に血糖値が低下した。メトホルミンの投与により、卵巣摘出マウスで観察された血糖値上昇が改善した。また、ovx cont群ではsham cont群に比較して肝臓においてpAMPKタンパク量発現の有意な減少が観察された。この結果より、AMPKの活性化が卵巣摘出マウスにおける血糖値上昇に関与していることが示唆された。3.肝臓、腎臓および脂肪細胞における遺伝子・タンパク質発現;卵巣摘出マウスの膵臓の単離と同時に、血糖値の変動に関係すると考えられる肝臓、腎臓および脂肪細胞からmRNAおよびタンパク質を採取し、解析した。検討した因子は、IRS-1、IRS-2、GLUT2、GLUT4、PDK4およびGSK-3β等である。しかしながら、現在のところ重大な差異は観察されていない。3やや遅れている。本年度は、単離した膵臓ランゲルハンス島細胞におけるiNOSの働きとインスリン分泌について解析する計画であったが、膵臓の単離培養を安定して行うことができず、十分な結果を得ることができなかった。ランゲルハンス島の単離・培養の経験を持つ本学研究者のアドバイスを得て現在実験を進行中である。
遺伝子に作用する医薬品の開発と安定同位体標識化DNAを用いた相互作用の解明

癌,ウイルス性疾患および遺伝子疾患の治療薬として期待できる遺伝子発現制御物質に着目し,現在までに報告のないポリアミドとヌクレオシドの両方の特性を備えたポリアミド-ヌクレオシド縮合体を考案し,合成の検討,DNAとの相互作用に関する研究を行い以下の研究実績を得た.1.遺伝子発現制御物質としてのポリアミトヌクレオシド縮合体の設計と合成:ピロールポリアミド-アデノシン縮合体(Apy),3-アミノプロピオニルリンカーを介したグアノシンとピロールポリアミド縮合体(GBP),および3-アミノプロピルリンカーを介したグアノシンとピロールポリアミド縮合体(GAP)を考案し合成を達成した.2.ピロールポリアミド-ヌクレオシド縮合体とDNAとの相互作用の検討:塩基配列の異なる3種のDNA二重鎖と合成したApy,GBPおよびGAPとの相互作用をTm値およびCDを用いて検討した結果.Apy,GBPおよびGAPは配列認識能を持っていることが明らかとなった.特にGAPは高い選択性を持ち,対照物質のDistamycin AおよびApyおよびGBPより優れた配列認識能を有することを見いだした.これら合成物は遺伝子発現制御効果を期待できることから,さらなる新規抗ウイルス薬,抗がん剤,遺伝子疾患治療薬として今後の発展に期待が抱けるものと思われる.3.高立体選択的あるいは特定部位を標識した安定同位体標識化ヌクレオシドの効率的合成法の開発:{D-(5R)-[5-^2H_1;5-^<13>c]リボシル}チミンの合成を達成した.この標識化リボヌクレオシド誘導体を構成単位としたオリゴマーを合成すれば,医薬品等との相互作用時のNMR測定により詳細な構造解析が可能となると期待できる.癌,ウイルス性疾患および遺伝子疾患の治療薬として期待できる遺伝子発現制御物質に着目し,現在までに報告のないポリアミドとヌクレオシドの両方の特性を備えたポリアミド-ヌクレオシド縮合体を考案し,合成の検討,DNAとの相互作用に関する研究を行い以下の研究実績を得た.1.遺伝子発現制御物質としてのポリアミトヌクレオシド縮合体の設計と合成:ピロールポリアミド-アデノシン縮合体(Apy),3-アミノプロピオニルリンカーを介したグアノシンとピロールポリアミド縮合体(GBP),および3-アミノプロピルリンカーを介したグアノシンとピロールポリアミド縮合体(GAP)を考案し合成を達成した.2.ピロールポリアミド-ヌクレオシド縮合体とDNAとの相互作用の検討:塩基配列の異なる3種のDNA二重鎖と合成したApy,GBPおよびGAPとの相互作用をTm値およびCDを用いて検討した結果.Apy,GBPおよびGAPは配列認識能を持っていることが明らかとなった.特にGAPは高い選択性を持ち,対照物質のDistamycin AおよびApyおよびGBPより優れた配列認識能を有することを見いだした.これら合成物は遺伝子発現制御効果を期待できることから,さらなる新規抗ウイルス薬,抗がん剤,遺伝子疾患治療薬として今後の発展に期待が抱けるものと思われる.3.高立体選択的あるいは特定部位を標識した安定同位体標識化ヌクレオシドの効率的合成法の開発:{D-(5R)-[5-^2H_1;5-^<13>c]リボシル}チミンの合成を達成した.この標識化リボヌクレオシド誘導体を構成単位としたオリゴマーを合成すれば,医薬品等との相互作用時のNMR測定により詳細な構造解析が可能となると期待できる.DNAあるいはRNAに作用し遺伝子の発現を制御できる化学物質は,癌,遺伝子治療薬として期待できる.申請者は,現在までに報告のないポリアミドとヌクレオシドの両方の利点を兼ね備えた遺伝子発現制御物質を創製し,さらにこれらの相互作用を確認することを目的とした.(1)ポリアミド化合物とヌクレオシドより成る化合物を医薬品のリード化合物として合成:種々の検討を行いN-メチルピロールを出発原料とし,末端アミノ基のホルミル化されたピロールアミド3量体(ピロールポリアミド)を合成し,このピロールポリアミドを2'位水酸基とエステル結合させたウリジン,および2'位水酸基を3-アミノプロピル基をリンカーとしたピロールポリアミドで修飾したアデノシンの合成を達成した.(2)ピロールポリアミドで修飾したアデノシンとDNAとの相互作用の検討:この化合物とDNAとの複合体のCDスペクトルおよびTm値を測定し,DNAとの相互作用の解明を行った.ピロールポリアミドで修飾されたアデノシンではCD曲線が大きく変化し,DNAとの複合体が形成されることを明らかにした.(3)高立体選択的或いは特定部位を標識した安定同位体標識化ヌクレオシドの効率的合成法の開発:薬物と遺伝子DNAとの相互認識機構をNMR法を用いて解明する際に有用な高立体選択的[5'-^2H_1][5'-^<13>C]ヌクレオシド誘導体の効率的合成法の開発を検討した.立体構造を考慮し,D-アロースを原料とし,D-[5-^<13>C]リボフラノース誘導体の合成法の改良,続いてその5位の高立体選択的重水素化によるD-(5R)-[5-^2H_1;5-^<13>C]リボフラノース誘導体の合成法を開発し,それを用いた{D-(5R)-[5-^2H_1;5-^<13>C]リボシル}チミンの合成を達成した.

このように標識化されたリボヌクレオシド誘導体を用いオリゴマー合成をし医薬品等との相互作用時のNMR測定により詳細な構造解析が可能となると期待できる.癌,遺伝子治療薬の一種である遺伝子発現制御物質に着目し,現在までに報告のないポリアミドとヌクレオシドの両方の特性を備えたポリアミド-ヌクレオシドハイブリッド化合物を創製し,さらにこれらとDNAとの相互作用の調査・検討を行い以下の研究実績を得た.1.遺伝子発現制御物としてのポリアミド-ヌクレオシドハイブリッド化合物の合成:末端アミノ基がホルミル化されたピロールアミド3量体(ピロールポリアミド)とグアノシン(2位アミノ基),ウリジン(2'位水酸基)と,および2'-O-(3-アミノプロピル)アデノシン(アミノプロピル基のアミノ基)と縮合させ,ピロールポリアミドで修飾したヌクレオシド"ポリアミド-ヌクレオシドハイブリッド化合物"の合成を達成した.2.ピロールポリアミド-ヌクレオシドハイブリッド化合物とDNAとの相互作用の検討:これらの化合物とDNAとの複合体のCDスペクトルおよびTm値を測定し,相互作用の解明を行った.塩基配列の異なる3種のDNA二重鎖とこれらのハイブリッド化合物との相互作用をCDを用いて検討した結果,ピロールポリアミド-グアノシンハイブリッドおよび-アデノシンハイブリッド化合物では特定塩基配列を有するDNAとCD曲線が大きく変化し,DNAとの複合体が形成されることを明らかにし,これらのハイブリッド化合物はDNAの選択的な塩基配列認識能を有することが判明した.3.高立体選択的あるいは特定部位を標識した安定同位体標識化ヌクレオシドの効率的合成法の開発:D-[5-^<13>C]リボフラノース誘導体の合成法の改良,続いてその5位の高立体選択的重水素化によるD-(5R)-[5-^2H_1;5-^<13>C]リボフラノース誘導体の合成法を開発し,それを用いた{D-(5R)-[5-^2H_1;5-^<13>C]リボシル}チミンの合成を達成した.この標識化リボヌクレオシド誘導体を構成単位としたオリゴマーを合成すれば,医薬品等との相互作用時のNMR測定により詳細な構造解析が可能となると期待できる.
MOS構造を有する単一電子デバイスの作製とそのCMOSチップへの集積化の研究

本研究の目的は,Si単一電子デバイスを将来の超低消費電力デバイスととらえ,従来のVLSI MOSデバイスと単一電子デバイスが将来同一チップ上に集積する技術を確立することである.単一電子デバイスは,電子1個で動作する究極のデバイスであり,従来,金属や化合物半導体で研究が行われてきた.本研究では,既存のVLSIとの融合と共存を考慮して,Siで単一電子デバイスの試作評価を行った.本年度の成果は以下の通りである.(1)VLSIプロセスと互換性のあるプロセスを用いて,リソグラフィ限界を越えたSi極細量子細線を作製する技術を開発した.最小線幅は10nm以下である.(2)このプロセスを用いて極微細MOSFETを作製し,室温において単一電子トンネルによるクーロンブロッケード振動を観測すること成功した.(3)本デバイスを詳細に評価した結果,チャネルが複数のドットに分裂していることを明らかにした.ドット間の量子効果カップリングを考慮することにより,低温における電気伝導が,共鳴トンネル的伝導と熱励起型ホッピング伝導に区別できることを明らかにした.(4)上記のリソグラフィ限界を越えた細線作製プロセスを用い,T字構造や十字構造の作製に成功した.これらの構造をデバイスに応用すると,端子数が多いのでより多くの機能をもったデバイスが期待できる.また,これらの構造は集積化に適していることを明らかにし,単一電子デバイスをVLSIチップに集積するための基礎検討を行った.本研究の目的は,Si単一電子デバイスを将来の超低消費電力デバイスととらえ,従来のVLSI MOSデバイスと単一電子デバイスが将来同一チップ上に集積する技術を確立することである.単一電子デバイスは,電子1個で動作する究極のデバイスであり,従来,金属や化合物半導体で研究が行われてきた.本研究では,既存のVLSIとの融合と共存を考慮して,Siで単一電子デバイスの試作評価を行った.本年度の成果は以下の通りである.(1)VLSIプロセスと互換性のあるプロセスを用いて,リソグラフィ限界を越えたSi極細量子細線を作製する技術を開発した.最小線幅は10nm以下である.(2)このプロセスを用いて極微細MOSFETを作製し,室温において単一電子トンネルによるクーロンブロッケード振動を観測すること成功した.(3)本デバイスを詳細に評価した結果,チャネルが複数のドットに分裂していることを明らかにした.ドット間の量子効果カップリングを考慮することにより,低温における電気伝導が,共鳴トンネル的伝導と熱励起型ホッピング伝導に区別できることを明らかにした.(4)上記のリソグラフィ限界を越えた細線作製プロセスを用い,T字構造や十字構造の作製に成功した.これらの構造をデバイスに応用すると,端子数が多いのでより多くの機能をもったデバイスが期待できる.また,これらの構造は集積化に適していることを明らかにし,単一電子デバイスをVLSIチップに集積するための基礎検討を行った.
生体神経組織のマイトファジーイメージング法の樹立とその応用

神経変性疾患パーキンソン病(PD)の原因遺伝子PINK1, Parkinの神経における機能をショウジョウバエモデルにより解析した。組織染色、生体イメージングにより神経細胞におけるミトコンドリア形態や神経活動におけるPINK1, Parkinの機能を解析したところ、Parkinの過剰な活性によりミトコンドリアの形態異常が生じ、Parkinの活性化異常によりドーパミン神経の神経活動が低下し、細胞死が誘導された。この結果から、神経機能・生存におけるPINK1, Parkinを介したミトコンドリア機能制御の重要性が示された。本研究は、家族性パーキンソン病の原因遺伝子に着目し、神経細胞における機能・病態解析を行い、パーキンソン病発症機序の解明を試みている。本年度は、PINK1-Parkin経路の異常が、ハエのドーパミン神経のミトコンドリアに与える異常を解析した。PINK1-Parkin経路では、異常ミトコンドリア上のPINK1の蓄積がParkinのリン酸化を引き起こし、異常ミトコンドリア除去機構が働く。そこで、Parkinのリン酸化を修飾した変異体をショウジョウバエドーパミン神経で発現させた。ミトコンドリアの形態を分子遺伝学的手法を用いて観察したところ、リン酸化体や野生型Parkinの過剰発現は、ミトコンドリアの形態異常を誘導したが、非リン酸化体の過剰発現は、ミトコンドリア形態に影響しなかった。また、PINK1欠失系統では、Parkinリン酸化体の過剰発現は、ミトコンドリアに異常を誘導したが、野生型の過剰発現では影響が見られなかった。これらの結果から、ショウジョウバエドーパミン神経のミトコンドリアの機能維持は、PINK1を介したParkinのリン酸化により制御されるが、過剰なリン酸化は、ミトコンドリア異常を誘導することが明らかになった。さらに、生体イメージングにより、シナプス小胞分泌を観察したところ、Parkinリン酸化体・非リン酸化体の過剰発現は、ドーパミン神経のシナプス小胞分泌を低下させることが明らかになった。非リン酸化体の過剰発現でも小胞分泌に異常が生じたことから、Parkinは、ミトコンドリア機能維持とは独立した神経機能制御機構に関わることが示唆された。こうした、神経特有の機能におけるパーキンソン病原因遺伝子の機能解析は、あまり進んでいないことから、今後は、神経機能の着目し、研究を進めていく予定である。パーキンソン病原因遺伝子の機能解析を目的とし、ミトコンドリア機能維持に関わる遺伝子の機能解析を生体イメージングを含む解析手法で進めている。Vps35は、生体内小胞輸送に関わる遺伝子であり、パーキンソン病の原因遺伝子の一つである。最近の報告で、Vps35がミトコンドリアの機能維持に関わることが報告され、さらに神経の機能にも関わる可能性が推察されている。神経活動においてはミトコンドリアの働きが大きくかかわることから、Vps35の神経における機能解析を進めた。Vps35の発現量を減少させたショウジョウバエを用い、成虫脳のドーパミン神経の分泌能や幼虫運動神経のシナプス小胞量、リサイクリング効率を解析したところ、シナプス小胞動態全般の機能に異常が生じていた。そこで、生体イメージングや電気生理学的手法、電子顕微鏡を用いた超微細構造の観察を行い、詳細な解析を進めた結果、Vps35は、シナプス小胞のリサイクリングに関わることが示された。Vps35が直接シナプス小胞のリサイクリングを制御していることから、Vps35の発現量減少により生じる異常をシナプス小胞リサイクリングに関わる遺伝子の発現調節により回復させることができる可能性が推測できたため、既報のLRRK2やRab GTPaseを過剰発現させ、回復効果を解析したところ、シナプス小胞リサイクリングの亢進により、Vps35発現減少による異常を低減させることができた。本研究は、パーキンソン病原因遺伝子のVps35の神経活動に関わる機能を解明し、さらに、Vps35と関連する遺伝子を特定し、それらの発現調節による回復効果を示した。当初の目的であるミトコンドリア機能との関連は明確にできなかったが、本研究で得られた知見は、パーキンソン病病態理解と治療標的特定に大きく寄与すると考えられる。Vps35の機能に着目して研究を進めてきたが、当初想定していたミトコンドリア機能との関連より、小胞動態における機能に関する結果が多く得られている。電気生理や超微細構造の観察、生体イメージング、行動レベルでの異常を見出し、それを回復する分子の特定も進んでいることから、パーキンソン病原因遺伝子の機能解析と治療法樹立のための基礎研究としては、十分な貢献が期待できる。現在、論文投稿のための最後の実験を進めており、成果報告を予定している。また、他のパーキンソン病関連遺伝子との遺伝的相関についても研究を行える状況にあり、さらなる研究を行うことで、パーキンソン病関連遺伝子のネットワークの一部を明らかにできると考えている。神経変性疾患パーキンソン病(PD)の原因遺伝子PINK1, Parkinの神経における機能をショウジョウバエモデルを利用し解析した。中脳黒質のドーパミン神経変性・脱落を主徴とするPDの原因遺伝子には、ミトコンドリア機能維持にかかわる遺伝子が含まれる。PINK1, Parkinは、ミトコンドリア機能維持にかかわるが、神経における働きの詳細は明らかにされていない。そこでハエモデルを用い、神経におけるPINK1, Parkinの機能を調べ、ミトコンドリアの機能制御機構を解析した。分子遺伝学的手法と組織染色、生体イメージングにより神経細胞におけるミトコンドリア形態や神経活動におけるPINK1, Parkinの機能を解析したところ、Parkinの過剰な活性によりミトコンドリアの形態異常が生じていた。

また、Parkinの活性化異常によりドーパミン神経の神経活動が低下し、細胞死が誘導された。この結果から、神経機能・生存におけるPINK1, Parkinを介したミトコンドリア機能制御の重要性が示された。さらに、神経活動におけるPINK1, Parkinの働きの詳細を解析するため、幼虫神経金接合部からの電気生理学的記録を行ったところ、神経機能の異常は検出できなかったが、受容側である筋肉の異常により、神経活動に異常が生じている可能性が示唆された。これらの結果から、PINK1, Parkinの異常は、ミトコンドリア機能に異常を生じさせ、ミトコンドリア機能の異常は、神経活動の分泌、受容両方に影響を与え、神経活動異常を生じていると考えられる。神経変性疾患パーキンソン病(PD)の原因遺伝子PINK1, Parkinの神経における機能をショウジョウバエモデルにより解析した。組織染色、生体イメージングにより神経細胞におけるミトコンドリア形態や神経活動におけるPINK1, Parkinの機能を解析したところ、Parkinの過剰な活性によりミトコンドリアの形態異常が生じ、Parkinの活性化異常によりドーパミン神経の神経活動が低下し、細胞死が誘導された。当初計画していたPINK1-Parkin経路を介した神経細胞におけるミトコンドリア機能維持機構の解明においては、Parkinリン酸化とミトコンドリア形態の関連を示すことができた。また、シナプス小胞分泌を生体イメージングにより解析する手法を確立でき、Parkinがシナプス小胞分泌に与える影響の解析も行うことができ、他の研究と合わせて論文として報告した。ミトコンドリアの維持機構とは独立した神経機能への寄与を確認できた点は、当該分野の研究に大きく貢献すると考えられる。しかし、マイトファジーに関しては、計画していた実験手法では確認できず、別の手法を確立する必要がある。既に、実験のほとんどは終了しており成果報告に向けた残りの実験と論文作成の段階にある。また、本研究で用いた手法、得られた知見をもとに研究をより発展させることができるため、今後は、他のパーキンソン病関連遺伝子との相関に注目し、研究を進める。神経科学パーキンソン病の病態解明においては、マイトファジー機構の解明も重要であるが、神経機能の異常を解明することも重要であり、現在、解析手法が確立できているシナプス小胞分泌機能の解析を主軸に、他のパーキンソン病原因遺伝子の機能解析を進めていく。シナプス小胞分泌に関わるパーキンソン病の原因遺伝子として、LRRK2が報告されているが、LRRK2と関連する遺伝子Vps35もパーキンソン病の原因遺伝子である。そこで、本研究で確立できた手法を更に拡張し、Vps35やLRRK2の病原性変異体の発現が神経機能に与える影響の解析を進める計画である。
単相性活動電位解析による再潅流不整脈および至適再潅流法の検討

本研究を行い、以下の問題点に遭遇した。1)単相性活動電位(MAP)測定電極の問題点ラット摘出灌流心用MAP測定電極として心外膜側からの吸引電極を作製したが、吸引電極は組織障害が強くまた経時的測定が困難であった。そこで心内膜側から市販の電極カテーテルを用いてMAP測定を試みたが、カテーテルサイズが6Frまでしかなくラットにはやや大きすぎた。インターノバ(株)社に依頼して4FrのMAP測定用電極カテーテルを新たに開発し、ようやくMAP測定が可能となった。2)ラットの問題点ラットのMAPを測定したが、ラットの活動電位接続時間(MAPD)は他の哺乳動物と比較して著しく短くMAPDの変化を評価するには不適当であった。これは活動電位第1相にみられるI_<TO>が極端に大きいため再分極が早くなるためであった。したがって実験動物をモルモットに変更し、幅の広い活動電位を得ることができた。3)再灌流不整脈解析の問題点当初は双極誘導心電図ならびにMAPをデータレコーダに記録し、あとで解析することとしていたが、非常に手間暇がかかるため、HolterECGのレコーダーに記録し、自動解析機を用いて解析することを試みた。しかしラットおよびモルモットの心拍数は非常に多いため従来のレコーダでは記録が不可能であった。記録速度を倍にしたレコーダーを東機貿(株)と共同開発し、ようやく記録可能となり自動解析機にのせることが可能となった。4)臨床研究の問題点1)3)の理由のため、動物実験が大幅に遅れ、動物実験にてMAP測定を確立したのち臨床応用をはかることとしていたため、今年度中は開心術でMAP測定は行えなかった。しかし再灌流不整脈の現況を把握するため、準備段階として術直前よりHolterECG(24時間)を既に50例以上記録し、現在解析中である。以上さまざまな問題に直面したが、すでに解決済みとなり来年度に引き続いて研究を行う予定である。