hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトの生理学的適応能力の計測技術の体系化

身体運動への適応能力を研究する上で必要な生理的計測肢術(有酸素運動能力,酸素運搬機能と筋肉の酸素利用機能の計測技術)を検討した。特に,超音波ドップラー法による心拍出量と活動筋の血流量,近赤外分光測定法による酸素利用機能の計測技術を検討した.結果:心拍出量と活動筋血流量の連続測定が可能となり、運動の開始時においては酸素摂取応答に比べて,中心および末梢循環の応答がより速いことが確認された。したがって、酸素摂取応答の規定要因は酸素運搬能力ではなく,運動筋自体の酸素利用能力と考えられる.さらに、運動筋微小循環の酸素分圧(動物実験)とヒトにおける酸素化状態の測定結果を比較し、運動開始時における運動筋の酸素利用能力が、運動筋内部の酸素能に依存すると推測された。また,呼吸変動が酸素摂取量の応答特性に与える影響を調べた。体温調節の動的特性を調べるために循環スーツ内温度を急激に変化させた場合、皮膚温や皮膚血流量も急激に変化した。特に,末梢部の変化が大きく,スーツ温下降の方が生体反応の追従性がより早い.本法により体温調節機構の動的特性を十分に評価できると考えられた.また、昨年度にヒトの皮膚血流量を準定量的に測定できることを認めたレーザードップラー式血流画像化装置で下肢温浴時の胸・人腿の皮膚血流量を高齢者と若年成人とで比較検討した。その結果は、老化が下肢から始まるという我々の先行研究結果を支持する。温熱負荷中にコリン作動性神経から放出されるアセチルコリンは、一酸化窒素(NO)メカニズムを介して能動的皮膚血管拡張に関係する可能性がある。マイクロダイアリシス法を用いた結果から、コリン作動性アセチルコリンは、初期の皮膚血管拡張には関連するが、皮膚血管が十分に拡張した後にはほとんど効果がないことが示された。A)身体運動能力計測技術の体系化本年度は,超音波ドップラー法による活動筋血流量の計測技術の体系化を実施した.特に、ステップ(一定強度)負荷運動テスト(膝伸展タイプのエルゴメーターによる,無酸素性作業閾値(AT)以下とAT以上の強度)を実施し,超音波ドップラー法による活動筋血流量の測定を行なった。運動の開始時における酸素摂取の変化(過渡的な応答)を測定し,その生理学的なメカニズムと制限因子を検討した(古賀、福場、塩尻).B)体温調節能力計測技術の体系化本研究では、新開発のレーザードップラー式血流画像化装置(LDI)での皮膚血流量とレーザードップラー式血流計(LDF)、プレチスモグラフィ(PL)での皮膚血流量を暑熱下運動時に比較し、LDIの妥当性を検討した。その結果、LDIは測定部位で皮膚血流量の定量性が異なるものの、中等度の運動時においてもヒトの皮膚血流量を準定量的に測定できることが示唆された(井上)。また、体温調節反応の動的特性を評価するために、スーツ内温度を20°C、35°C及び45°Cと8分ごとに変化させると、皮膚温と前腕部皮膚血流量は温度変化に遅れをとり追従するような反応を示した。この方法により動的特性の評価が可能であると考えられる(近藤)。さらに、汗腺機能を評価するための計測技術として、近年、ヒトの研究に応用されつつあるマイクロダイアリシス法と、発汗反応を測定する換気カプセル法を組み合わせた測定システムを構築した。本システムの有効性を検討するために、多濃度の発汗誘発剤であるアセチルコリン(ACh)を連続的にマイクロダイアリシスを介して、皮内に注入し、ACh濃度と発汗量の容量曲線を算出した。

さらに、汗腺周囲のメカニズムを検討するため、アセチルコリンエステラーゼ(AChE)拮抗薬であるネオスチグミンを用いて、汗腺周囲のAChEの役割について検討した。ネオスチグミン処置および非処置部における多濃度のACh投与に対する発汗量の容量曲線比較および水循環服を用いた体加温時の発汗反応比較から、AChEは発汗神経活動レベルの低い、すなわち少量のACh放出時には非常に高い影響力を示すが、発汗神経活動レベルが高くなるに伴い、その影響力は低下することが示された(芝崎).身体運動への適応能力を研究する上で必要な生理的計測技術(有酸素運動能力,酸素運搬機能と筋肉の酸素利用機能の計測技術)を検討した.特に,超音波ドップラー法による心拍出量と活動筋の血流量,近赤外分光測定法による酸素利用機能の計測技術を検討した.結果:心拍出量と活動筋血流量の連続測定が可能となり,運動の開始時においては酸素摂取応答に比べて,中心および末梢循環の応答がより速いことが確認された。したがって、酸素摂取応答の規定要因は酸素運搬能力ではなく,運動筋自体の酸素利用能力と考えられる.さらに、運動筋微小循環の酸素分圧(動物実験)とヒトにおける酸素化状態の測定結果を比較し、運動開始時における運動筋の酸素利用能力が、運動筋内部の酸素取込み機能に依存すると推測された。また,呼吸変動が酸素摂取量の応答特性に与える影響を調べた。体温調節の動的特性を調べるために循環スーツ内温度を急激に変化させた場合、皮膚温や皮膚血流量も急激に変化した。特に,末梢部の変化が大きく,スーツ温下降の方が生体反応の追従性がより早い.本法により体温調節機構の動的特性を十分に評価できると考えられた.また,昨年度にヒトの皮膚血流量を準定量的に測定できることを認めたレーザードップラー式血流画像化装置で下肢温浴時の胸・大腿の皮膚血流量を高齢者と若年成人とで比較検討した。その結果は、老化が下肢から始まるという我々の先行研究結果を支持する。温熱負荷中にコリン作動性神経から放出されるアセチルコリンは、一酸化窒素(NO)メカニズムを介して能動的皮膚血管拡張に関係する可能性がある。マイクロダイアリシス法を用いた結果から、コリン作動性アセチルコリンは、初期の皮膚血管拡張には関連するが、皮膚血管が十分に拡張した後にはほとんど効果がないことが示された。
高信頼ナノギャップメモリー素子の実用化基盤技術

ナノ空間を利用した新規不揮発性記憶素子の実用化基盤技術について研究を行った.白金,タングステンなどの高融点金属からなるナノギャップメモリーを作製し,抵抗スイッチ効果を確認し,特性を明らかにした.また,ナノギャップメモリー構造の結晶性制御にとりくみ,単結晶化ナノ電極の新規作製法を開発した.現在実用化されているメモリー素子は80°C以上で動作せず,夏の炎天下車内等,日常の過酷環境下でも安定に動作しない.そのため,消防用通信機器や航空機,救急医療器具等,過酷環境下で高信頼性が求められる製品に対応する事ができない.ナノギャップ型メモリーは,ナノサイズのギャップを挟んだ金属電極のみで構成され,原理的に高温動作が可能である.本研究課題では,ナノギャップ型メモリを各種金属により作製し,その高温動作安定性を調べることにより,高信頼動作メモリー素子実用化のための基盤技術を開発することを目的に研究を行った.電極材料や電極サイズ・形状の選択自由度が高い「平面型ナノギャップ型メモリ」を用いて各種金属・温度・構造を調査することで,ナノギャップメモリの高温動作安定性の系統立った知見の獲得を目指した.シリコン基板上に電子線リソグラフィーを用いて,金属ナノワイヤー構造をシリコン基板上に作製.その後,制御を伴った通電によって,ナノワイヤーを精度よく破断することで,ナノギャップ構造を形成.本研究を通じ,Ptなどの高融点各種金属でのナノギャップ構造の形成技術を確立した.高温素子測定用プローブステーション装置を用いて,メモリーの高温環境動作特性を調べ,On,Offに相当するそれぞれの抵抗値のばらつきが,ナノ領域で微細なナノ構造や多結晶構造の変形に起因していることを明らかにした.さらに,温度に対して堅牢な単結晶構造を備えたナノ電極の作製を試み,白金単結晶ナノ構造の作製手法を確立した.電子線結晶構造解析により形成した構造が単結晶であることを確認した.本研究によって創世された,単結晶ナノ電極は,ナノ空隙に対向する電極の仕事関数を結晶面方位で制御可能な空間制御技術であり,これまでに実現されていない.ナノギャップ型メモリーの基盤技術ばかりでなく,ナノ空間を利用するあらゆる技術の基盤技術となりうるものである.ナノ空間を利用した新規不揮発性記憶素子の実用化基盤技術について研究を行った.白金,タングステンなどの高融点金属からなるナノギャップメモリーを作製し,抵抗スイッチ効果を確認し,特性を明らかにした.また,ナノギャップメモリー構造の結晶性制御にとりくみ,単結晶化ナノ電極の新規作製法を開発した.電極材料や電極サイズ・形状の選択自由度が高い「平面型のメモリーセル」を用いて各種金属・温度・構造を調査することで,ナノギャップメモリの高温動作安定性の系統立った知見の獲得を目指した.平面型ナノギャップ型メモリーを各種金属により作製し,メモリーの動作安定性を高温度環境で調べた.シリコン基板上にEBリソグラフィーを用いて,ナノワイヤー形状のレジストパターンを形成.その後,各種金属を蒸着することで,金属ナノワイヤー構造をシリコン基板上に作製.その後,制御を伴った通電によって,ナノワイヤーを精度よく破断することで,ナノギャップ構造を形成.本研究を通じ,Pt, Ta,Wなどの高融点各種金属でのナノギャップ構造の形成技術を確立した.次に,高温素子測定用プローブステーション装置を用いて,メモリーの高温環境動作特性を調べた.メモリー動作を確認できたものの,On,Offに相当するそれぞれの抵抗値が大きくばらつく結果となった.電子顕微鏡による構造観察から,高温環境において,ナノ領域で微細なナノ構造や多結晶構造が変形していることが,抵抗値が変動の原因と考えられる.抵抗値のばらつきは素子間ばらつきとなり実用化の課題となることが懸念された.既存メモリーは,素子間ばらつきを1セルに1つの制御用トランジスタを配置することで抑制しているが,高温動作メモリーには,制御用トランジスタは使えず,記憶部自体に高温安定性が要求される.そこで,温度に対して堅牢な単結晶,もしくは良好な結晶性を持ったナノ電極を形成することが出来れば,抵抗ばらつきを抑えることができるのではないかと考え,ナノ構造を形成する金属部分の単結晶化形成を試みた.既存の方法と表面科学の古典的な手法を融合させ,新たな白金単結晶ナノ構造の形成手法を開発した.ワイヤーをジュール熱で単結晶成長させながら,ナノ空間を電子のエネルギーで破断する原理である.震災による影響を少なからず受けた.1つはサンプル素子作製である.サンプル作製装置,設備が震災の影響で破壊し,復旧ならびに安全管理のため,長期間にわたり利用することができなかった.そのため,研究を加速するためのサンプル数を確保できなかった.2つは装置納入である.震災による影響により,予算配分の時期が遅れたばかりでなく,選定業者側での実験装置の納入が大幅に遅れた事による.高温メモリーの駆動方法技術を確立する.ナノギャップメモリーに印加する電圧のパルス形状などを検討することにより,安定動作条件を探索することで,高温におけるナノ構造変化において支配的な現象が何であるかを追求する.また,高温動作メモリーの裏付けを計算科学の観点から行う.特に,高温条件下で起こる温度膨張とナノ構造の関連を追求する.高温動作安定性の系統だった知見,安定動作原理,温度限界,駆動方式などについて,得られた結果を取りまとめ,成果の発表を行う.メモリー作製のための材料費、測定器の保守用部品を消耗品として計上する。また,得られた研究成果は、国内学会と論文発表をしたいと考えており、それぞれ国内旅費、研究成果投稿料として計上する。高温素子測定用プローブステーション購入の際に端数として発生した端数を,次年度使用額として消耗品に充当する予定である
大学・短期大学の地域社会連携と社会貢献事例の実践構造に関する理論的実証的研究

本研究は、課題「大学・短期大学の地域社会連携と社会貢献事例の実践構造に関する理論的実証的研究」に対して、事例調査をする上で、事前に4つの仮説的事例類型を設定した。すなわち、(1)北海道地域=「地域密着ないし地域貢献型」事例、(2)東北・福島地域=「職業人再研修型」事例、(3)京都地域=「コンソーシアム型」事例、(4)和歌山地域=「大学と地域生涯学習連携型」事例、という内容である。その上で、4類型のそれぞれに固有な諸特徴や機能、社会的ミッションについて相互に自由な意見交換を行った。そこでは、共同研究を行う上での必要な情報の交流、研究方法や調査研究の目標について具体的な討議を行った。(=研究うち合わせ会議を3回開催)そして、4類型の事例の実際について、平成16-17年度において、各事例についての共同調査を行った。(1)については、北海道の北端に位置するオホーツク地域の大学調査を行った。コミュニティに立脚しながら困難な条件を逆手にとって大学の新しいありかたを拓く社会貢献実践について光をあてた。(2)については、学部段階での社会人受け入れとその再研修型実践について福島大学の事例をとりあげた。大学院段階の社会人受け入れや専門職大学院の研究に比して、学部学生段階の事例の継続的な研究蓄積は弱く、その意味で貴重な研究になった。(3)については、コンソーシアム京都の事例調査を行った。自治体(京都市)の支援のもとに、京都地域の国・公・私立大学間の連携・協働の多様な試みと成果は、この分野でのパイオニアであり、多くの示唆を与えていることが明確になった。(4)については、国立大学附設の生涯学習教育研究センターの果たしている役割の典型の一つとして和歌山大学を取り上げた。例えば、粉川高校と和歌山大学生涯学習教育研究センターとのパートナーシップ事業の発展によって、地域共同学習とも言うべき新たな学びの共同体が形成され、大学の役割、地域高校の発展方向、学習者の学びの質的変容などが、共に確認できるものであった。以上、4つの事例を総合し比較する視点からは、大学の第三の機能たる、社会貢献や知識転移についての、一定の成果ある方向が確認できたといえる。なお、以上の実証として研究報告書を作成し刊行した。申請研究計画に基づき、2004年6月都立大学での第一回研究打ち合わせ(姉崎、光本、大串、細井、千葉、高橋)で調査計画を確認した。また、日本社会教育学会6月集会ラウンドテーブルで「大学改革と地域社会」を姉崎と大串で企画し、都立大と北海道の事例を検討した。7月日本高等教育学会第7回大会(駒澤大学)では、「大学と地域社会のパートナーシップに関する研究」を北海道の事例報告を姉崎、光本が行った。8月には、北海道オホーツク地域の大学調査(姉崎、光本と院生など)と、和歌山大学の事例調査(同前)を行った。9月には、北大と英国リーズ大学の共催シンポジウム(北大)で大学と社会貢献について、姉崎が報告を行った。11月にはオホーツク地域の大学の二次調査(同前)、同じく11月にはコンソーシアム京都の調査(姉崎、光本、細井、木村、山本)を行った。2005年1月には、第二回の研究打ち合わせを北大で行った。

(姉崎、木村、光本、千葉、山本、堀内、研究協力者の院生)2月には福島大学調査(姉崎、光本、大串、千葉)、同2月に、コンソーシアム京都の二次調査、和歌山大学の地域社会連携活動調査とシンポジウム報告(姉崎、光本、細井、山本、堀内、研究協力者の大学院生)、3月には、北大とヘルシンキ大学との共催シンポにおいて、大学と地域との連携の視点から姉崎がコメンテーターの役割を果たした。また同3月には、北海道教育学会(於、北海道教育大学釧路校)での高大連携シンポジウム報告(光本)、また、コンソーシアム京都追加調査(姉崎)、長野と愛知における大学と地域社会連携に関する調査(姉崎、研究協力者の院生)を行った。これらの成果の一部は、(季刊『人間と教育』43号04.9)、さらに近刊の北大教育学研究科『高等継続教育研究』等に掲載される予定である。2005年度は、調査を引き続き行い、報告書をまとめる予定である。本研究は、課題「大学・短期大学の地域社会連携と社会貢献事例の実践構造に関する理論的実証的研究」に対して、事例調査をする上で、事前に4つの仮説的事例類型を設定した。すなわち、(1)北海道地域=「地域密着ないし地域貢献型」事例、(2)東北・福島地域=「職業人再研修型」事例、(3)京都地域=「コンソーシアム型」事例、(4)和歌山地域=「大学と地域生涯学習連携型」事例、という内容である。その上で、4類型のそれぞれに固有な諸特徴や機能、社会的ミッションについて相互に自由な意見交換を行った。そこでは、共同研究を行う上での必要な情報の交流、研究方法や調査研究の目標について具体的な討議を行った。(=研究うち合わせ会議を3回開催)そして、4類型の事例の実際について、平成16-17年度において、各事例についての共同調査を行った。(1)については、北海道の北端に位置するオホーツク地域の大学調査を行った。コミュニティに立脚しながら困難な条件を逆手にとって大学の新しいありかたを拓く社会貢献実践について光をあてた。(2)については、学部段階での社会人受け入れとその再研修型実践について福島大学の事例をとりあげた。大学院段階の社会人受け入れや専門職大学院の研究に比して、学部学生段階の事例の継続的な研究蓄積は弱く、その意味で貴重な研究になった。(3)については、コンソーシアム京都の事例調査を行った。自治体(京都市)の支援のもとに、京都地域の国・公・私立大学間の連携・協働の多様な試みと成果は、この分野でのパイオニアであり、多くの示唆を与えていることが明確になった。(4)については、国立大学附設の生涯学習教育研究センターの果たしている役割の典型の一つとして和歌山大学を取り上げた。例えば、粉川高校と和歌山大学生涯学習教育研究センターとのパートナーシップ事業の発展によって、地域共同学習とも言うべき新たな学びの共同体が形成され、大学の役割、地域高校の発展方向、学習者の学びの質的変容などが、共に確認できるものであった。以上、4つの事例を総合し比較する視点からは、大学の第三の機能たる、社会貢献や知識転移についての、一定の成果ある方向が確認できたといえる。なお、以上の実証として研究報告書を作成し刊行した。
進化型計算アルゴリズムに基づく適応的スケジューリング・システムの開発

本年度は,問題に含まれるパラメータが予めわかっている場合だけでなく,動的に変化する場合あるいは不確定な場合の(すなわち,ダイナミック性・リアルタイム性が要求される)スケジューリング問題を対象とし,解(スケジュール)そのものでなく,これを生成するルール(スケジューリング・ルール)を問題の解表現としたスケジューリング・システムの枠組みを構築するとともに,(a)スケジューリング・ルールの整理とその表現方法の決定,(b)スケジューリング・ルールの評価手法の実現,に関する研究を行った.具体的には,(a)に関して,従来のルールベース・スケジューリングにおけるディスパッチング規則の荷重和をとって優先的に割り付けられる作業を決めるものとし,このときの重み係数を後件部に持つルール(if-then型ルール)を考えた,なお,このルールの前件部には,スケジューリングの過程における状態を持たせた.さらに,(b)に関しては,一連のルールを適用した際に生成されるスケジュールの評価を個々のルールに還元することが必要であり,強化学習アルゴリズムの一つである遺伝的アルゴリズムに基づく学習方式(ピッツバーグ・アプローチおよびミシガン・アプローチ)を採用した.このスケジューリング・ルール評価システムのプロトタイプを計算機上に作成し,まず(a)について,ピッツバーグ・アプローチを用いた計算機実験より,・適用されるルールをスケジューリングの途中で動的に切り替えることによって,より有効なスケジューリングが可能となること,が確認された.次に(b)について,ミシガン・アプローチに基づいてスケジューリング・ルールを評価する方法を実現するとともに,種々の計算機実験を行った.これより,・現時点においては,あらゆる状況下で個々のスケジューリング・ルールを正当に評価できるシステムの完成には到っていないが,そこでの問題点および課題が具体化された,という結果を得た.本年度は,問題に含まれるパラメータが予めわかっている場合だけでなく,動的に変化する場合あるいは不確定な場合の(すなわち,ダイナミック性・リアルタイム性が要求される)スケジューリング問題を対象とし,解(スケジュール)そのものでなく,これを生成するルール(スケジューリング・ルール)を問題の解表現としたスケジューリング・システムの枠組みを構築するとともに,(a)スケジューリング・ルールの整理とその表現方法の決定,(b)スケジューリング・ルールの評価手法の実現,に関する研究を行った.具体的には,(a)に関して,従来のルールベース・スケジューリングにおけるディスパッチング規則の荷重和をとって優先的に割り付けられる作業を決めるものとし,このときの重み係数を後件部に持つルール(if-then型ルール)を考えた,なお,このルールの前件部には,スケジューリングの過程における状態を持たせた.さらに,(b)に関しては,一連のルールを適用した際に生成されるスケジュールの評価を個々のルールに還元することが必要であり,強化学習アルゴリズムの一つである遺伝的アルゴリズムに基づく学習方式(ピッツバーグ・アプローチおよびミシガン・アプローチ)を採用した.このスケジューリング・ルール評価システムのプロトタイプを計算機上に作成し,まず(a)について,ピッツバーグ・アプローチを用いた計算機実験より,・適用されるルールをスケジューリングの途中で動的に切り替えることによって,より有効なスケジューリングが可能となること,が確認された.次に(b)について,ミシガン・アプローチに基づいてスケジューリング・ルールを評価する方法を実現するとともに,種々の計算機実験を行った.これより,・現時点においては,あらゆる状況下で個々のスケジューリング・ルールを正当に評価できるシステムの完成には到っていないが,そこでの問題点および課題が具体化された,という結果を得た.
寄生虫システインプロテアーゼの遺伝子発現と細胞内輸送の分子機構

肝蛭カテブシンLの遺伝子発現機構や細胞内プロセッシング機構を解明する目的で肝蛭カテブシンLゲノム遺伝子の構造を解析するとともに、大腸菌で発現した組換え不活性型カテブシンL前駆体を用いて活性型カテブシンLへの活性(成熟)化の分子機構について解析した。(1)肝蛭カテブシンL前駆体の遺伝子構造:PCRによって2種類の肝蛭カテブシンL前駆体遺伝子が増幅され、サイズは1.8と1.9Kbであり、そのコード配列は4つのエキソン(I-IV)と3つのイントロンから構成されていた。エキソンIはカテブシンL前駆体のブレ部、ブロ部、成熟酵素の一部をコードし、触媒活性を担うCys-27はエキソンIIに、His-164とAsn-184はエキソンIVに含まれていた。両者の大きな違いは第3イントロンのサイズとその塩基配列に認められた。さらに肝蛭成虫ゲノムDNAライブラリーのクローニングによって得られた肝蛭カテブシンL前駆体遺伝子構造、ならびにジェノミックサザンブロットの結果から、肝蛭カテブシンL遺伝子は縦列反復(tandemly repeated)ではないが、multiple genesとして存在しており、肝蛭の発育段階別に異なる遺伝子が特異的に発現している可能性が示唆された。(2)肝蛭カテブシンL前駆体の大腸菌における発現と活性型カテブシンLへの変換機構:肝蛭カテブシンL前駆体(以下、プロカテブシンL)cDNA、ならびにプロペプチド部を欠損させたカテブシンLcDNAをpGEX-4T-Iに挿入した組換えプラスミドを含む大腸菌の形質転換体を得た。IPTG添加によって発現した組換えプロカテブシンL、ならびにカテブシンL融合タンパクは不溶性であったため、尿素で可溶化し、さらに立体構造の再構築(refolding)を行った。得られた組換えプロカテブシンL、ならびにカテブシンLを用いて活性型への変換機構を解析した結果、不活性型プロカテブシンLは弱酸性条件下(pH4.5-5.5)で活性型カテブシンLに変換し、この変換はカテブシンLの阻害剤であるE-64添加によって完全に抑制されたことから、活性型カテブシンLへの変換はpH依存的自己触媒的機構によることが示された。しかしながら、プロペプチド部を欠損させたカテブシンLの場合には酵素活性が認められず、このことは酵素活性を有する機能的カテブシンLのfoldingにプロペプチド部が必須なものであることを示唆している。今後、緑色蛍光タンパクを肝蛭カテブシンL前駆体に融合させ、肝蛭カテブシンL前駆体の細胞内輸送のプロセスをリアルタイムに観察し、活性化が行われる細胞内オルガネラはどこなのか、あるいは最終局在部位である分泌顆粒へはどのようなシグナルによって選別輸送されるのかという点を明らかにしていきたい。今後、緑色蛍光タンパクを肝蛭カテブシンL前駆体に融合させ、肝蛭カテブシン

L前駆体の細胞内輸送のプロセスをリアルタイムに観察し、活性化が行われる細胞内オルガネラはどこなのか、あるいは最終局在部位である分泌顆粒へはどのようなシグナルによって選別輸送されるのかという点を明らかにしていきたい。肝蛭カテプシンL前駆体をコードする2つの遺伝子をゲノムレベルで解析した。すでに得られたcDNAのORFの5'-、および3'-端の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドプライマーとゲノムDNAを鋳型にPCRを行ったところ、1.9kb(B22-2)と1.8kb(B7-3)のカテプシンL遺伝子が得られた。また、クローニングベクターとしてEMBL3を用いて作製した肝蛭ゲノムDNAライブラリーより得た肝蛭カテプシンL前駆体遺伝子クローン(B22-2に相当)の解析もあわせて行った。まず、PCRによって増幅された2つの遺伝子のコート配列は4つのエキソン(I-IV)と3個のイントロン(1-3)から構成されていた。エキソンのサイズは5'側のIよりそれぞれ378、222、158、220bpであった。エキソンIには肝蛭カテプシンL前駆体のプレ部、プロ部、ならびに成熟酵素のN末端21アミノ酸残基が含まれ、触媒残基を構成するシステインはエキソンIIに、またヒスチジンとアスパラギンはエキソンIVに含まれていた。両遺伝子のアミノ酸レベルにおけるホモロジーは79.8%であった。3箇所あるイントロンの挿入部位は全く同じであったが、第3イントロンの大きさに違いがあることが判った(B22-2:694bp,B7-3:582bp)。一方、肝蛭ゲノムDNAライブラリーより得た肝蛭カテプシンL遺伝子(B22-2に相当)のエキソン_0に隣接する5'上流の発現制御領域(約1900bp)を解析したところ、5'-RACEによって決定した転写開始点より35bp上流にTATAboxと考えられる配列の存在が認められたが、典型的なCAATやGCboxはこの領域には認められなかった。肝蛭のカテプシンLは不活性型酵素(前駆体)として生合成され、細胞内プロセッシングを受けた後、腸上皮細胞内の分泌顆粒に輸送される。しかしながら、本酵素の細胞内輸送機構、不活性型酵素から活性型酵素(成熟酵素、mCL)への変換の分子機構については不明な点が多い。そこで本研究では肝蛭虫体より分離精製が困難である肝蛭カテプシンL前駆体(プロカテプシンL、proCL)を大腸菌で発現させ、その性質やin vitroにおける活性化機構を検討した。proCLをコードするcDNAはproCLのN末端とC末端アミノ酸配列に対応したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたcDNA-PCRによって増幅した。このcDNAをglutathione-S-transferase(GST)との融合タンパクとして発現させるpGEX-4T-1plasmid vectorに挿入し、得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌の形質転換体を得た。融合タンパクの発現は大腸菌培養液にIPTGを添加することによって行った。発現した融合タンパクは尿素で可溶化し、次いで還元型と酸化型グルタチオンを含むリン酸カリウム緩衝液中でrefoldingを行った。
休職に至る就労者を取り巻く環境と就労者の特性について

精神科通院患者73名、一般就労者は232名から基礎データ(職場内での心理的負荷、職場外での心理的負荷、GHQ-30[精神の健康度]、NEO-FFI[人格傾向]、MPS[完全主義傾向]、自尊感情評価尺度など)を収集することが出来た。休職の背景には、休職者の完全主義傾向、神経症的な性格が大きく影響していること、女性就労者では上司との関係が影響していることが明らかとなった。休職に至る就労者を取り巻く環境およびその就労者の特性,性格傾向などを明らかにすることが本研究の目的である.休職に至り精神科を受診した人の精神障害の種類、程度、罹病期間と、休職の回数、休職の期間や患者の背景因子、すなわち性別、年齢、学歴、収入、家族構成、性格特性(特に完全主義傾向)、家族のサポート、患者を取り巻く仕事場の環境(業種、勤務体系、勤務時間、残業時間、職場での人間関係など)との関連を明らかにするために、独自の37問にわたる質問項目を作成した。またそれとともに過去6ヶ月間の環境の変化に関する調査票、性格傾向を把握するためのNEO-FFI、健康状態のチェックリストGHQ30、完全主義傾向を調べるMPS(Multidimensional Perfectionism Scale)、Rosenberg自尊感情評価尺度を使用することとし、東京慈恵会医科大学の倫理委員会の審査を受け、承認を得た。東京慈恵会医科大学附属病院の精神神経科の外来を受診した対象者、すなわち休職に至った患者に対して、本研究の目的、方法、意義、および対象者への人権保護の配慮(守秘義務など)について十分に説明し、文書にて同意の得られた対象者に上記の質問紙を配布し、回答を得た。また対象者の外来主治医には診断名、休職に至った原因についての質問紙に回答をいただいた。その結果、本年度は67名が調査に協力していただき、回答を得ることが出来た。来年度も調査を継続していく予定であるが現在までの解析の結果では、やはり休職に至る患者では完全主義傾向が高く、まじめな就労者が業務や人間関係の中で疲弊し休職に至っている姿が浮かび上がっている。精神科外来に通院している休職者の方に施行した質問紙では、F2圏とF3圏の合計73名(男性55名、女性18名)の回答を得ることが出来、一般就労者に同様の質問紙を施行した結果、232名の回答を得ることが出来た。休職者は一般就労者に比べて、完全主義傾向が高く、自分のした行動に対して疑いを持ちやすい、すなわち自分に自信がなく自分のした仕事がうまく出来たかどうかを気にしすぎ疲れてしまっている傾向が見てとれた。また休職者の方が神経症的な傾向が高く、外交的な性格傾向は低いことも明らかとなった。男女で比べてみると、男性より女性の方が神経症傾向が高く、また同調性も女性の方が高い傾向にあり、女性の方が職場内での人間関係に気を遣い疲弊しているのではないかと推察された。さらには女性の休職者は職場内の人間関係において、男性より有意に上司との関係が悪く、このことが職場での不適応の一つの原因になっていることが分かった。以上の結果は以前からある職場の休職者に関するメンタルヘルス研究にはない視点からの研究であり、休職者自身の完全主義傾向や神経症傾向といった性格傾向が休職に大きく影響していることが分かったことは大きな成果であると思われる。また女性休職者の特有な問題として「上司との関係」は今後もキーワードとして重要なものであると考えられ、女性の就労者をサポートする上では大変意義のある結果であったと思われる。職場において不適応を起こした患者さんを診察する場面は増加の一途にあり、こういった研究は患者さんをサポートするときの焦点を明確にすることができ、我々精神科医の日常診療の中で大いに役立っものと思われる。
カゼイン由来オピオイドペプチドの構造と生理的意義

カゼインおよび乳清蛋白質に潜在的に含まれるオピオイドペプチドの単離,構造決定,化学合成ならびに生物学的活性に関する研究を行った。既知のオピオイドペプチド類似の配列としてTyr-X-Phe,およびTyr-X-Y-Pheという配列を乳蛋白質中に検索し、人乳および牛乳α-ラクトアルブミンに存在するTyr-Gly-Leu-Phe,ウシβラクトグロブリンに存在するTyr-Leu-Leu-Phe配列をもとに、相当するテトラペプチドアミドを化学合成したところ弱いオピオイドアゴニスト活性を示した。一方、牛乳K-カゼインのペプシン水解物から、オピオイドレセプターに対する結合能を指標にして単離したペプチドは、Ser-Arg-Tyr-Pro-Ser-Tyr-【OCH_3】という構造を持つオピオイドアンタゴニストであり、モルモット回腸縦走筋標本の測定系でオピオイドアゴニストの作用と拮抗した。本ペプチドはK-カゼインの第3338番目に相当するペプチドであり、C末端は抽出過程でエステル化されたものである。本ペプチドをCaSoxin6と命名した。C末端を短縮したペプチドArg-Tyr-Pro-Ser-Tyr-【OCH_3】およびTyr-Pro-Ser-Tyr-【OCH_3】もアンタゴニスト活性を有しており、これらをCaSoxin5および4と命名した。C末端のメチルエステルはアンタゴニスト活性に重要でありこれを除くと活性は著しく低下した。エステルをTyrolに還元した場合やエチルおよびn-プロピルエステルにした場合も活性を示した。人乳K-カゼインに存在する相当配列Tyr-Pro-Tyr-Tyrを化学合成したところC末端遊離の場合も200μMでアンタゴニスト作用を示した。本ペプチドをメチルエステル化したところ、モルモット回腸測定系では2μMで有効であり、牛乳CaSoxin4より約10倍強力なオピオイドアンタゴニストとなった。本ペプチドをマウス脳室内投与した際にはモルフィセプチンの鎮痛作用と拮抗し、in vivoでも有効なオピオイドアンタゴニストとなった。本ペプチドをヒトCaSoxin4と命名した。
音楽文化における機械の役割-その歴史・現状に関する多面的分析と展望

機械、言い換えれば決まった行動を繰り返して行うために作られた装置は古代から自然的事象(たとえば宇宙の移り変わり)のモデルとして使われ、象徴性の高いものだった。一方、音楽も宇宙調和の象徴と見なされてきた。従って音楽を規制する規則や約束が機械のメカニズムと同一視することができ、実際にこの比喩が古代から現代まで多くの文献に見られるものである。古代から近代までの音楽機械-より一般的に言えば「音を発する機械」-のデザインには宇宙調和を暗示する部分、または機械全体が宇宙調和を象徴することが常に見られるものである。逆に中世の機械時計-これらは昼と夜という自然の移り変わりのモデルとして考えられた-にも常に規定された時間にメロディーを奏でる音楽機械(自動カリヨン)が付けられた。しかし音楽を「人間的な」、「命のある」行動とし、つまり「死んでいる」素材から作られた機械からは発生しえないものと定義し、機械による音楽の模倣を否定する考えもある。また、人間による「機械的な練習」の結果である「機械的な演奏」も「非音楽的な」、つまり音楽の本質と相容れない行動として批判されるのである。特に機械装置が日常生活で徐々に重要な役割を果たすようになった18・19世紀にはこのような批判が多くなる。しかし20世紀には生産機械のリズムが現代の本来の響きであると主張する美学的運動も起こった。けれども、最近二三十年には音楽のデジタル化によって音楽における物理的な機械の意義が根本的に変わったと考えられる。この研究では、音楽思想において自動装置が果たしてきた役割を歴史を通して検討した。この研究のもう一つの重点として複数の歴史的音楽機械のコンピューター・シミュレーションを作り、さらに機械アーティストと作曲家による共同作品の創作も行われた。研究成果を2つの展覧会と複数の演奏会やシンポジウムで発表した。秋(10月20日12月2日)に駒場博物館で「Musica ex Machina-機械じかけの音楽」特別展を開催した。その準備において研究代表者はヨーロッパで調査し,手に入れた一部の資料も展覧された。展覧会は「機械音楽の歴史」「マーティン,リッチズの世界」「自動ピアノのための作品と研究の最前線」に分けられ,各部門の解説パネルおよび参考資料が作成された。また,第二部門のために三輪眞弘とM,リッチズの協同作「Thinking Machine」が制作された。「Thinking Machine」ではjaikenzanというアルゴリズムが始めて機械でエミュレートされた。展覧会に伴ってさらに作品制作(主にM,リッチズの音楽機会のための作曲作品)が行われた。展覧会では作品発表なども多く行われたが,会期最終の二日間は,国際シンポジウム(主に研究代表者,分担者,外国人協力者とスペシャルゲストによる発表)が行われた。研究分担者別に研究内容をまとめると,代表者は古代からの機械音楽の歴史と思想および自動ピアノのための作品研究,長木誠司は日本における機械音楽のための作品,渡辺裕は20世紀前半ヨーロッパにおける音楽機械の発展と社会的な意義,岡田暁生は19世紀の音楽教育における機械化とそれに伴う身体と精神の関係論,安田寛は19世紀のピアノ教育に使われた訓練機械との関連でドイツで調査,高橋雄造は自動楽器と再生音楽/音楽再生の関係で消費者の立場を研究し,それらは12月のシンポジウムで発表が行われた。また,三輪眞弘はM,リッチズの新作「Thinking Machine」の発表に合わせ,正倉院に収蔵されている古代中国の竪琴,箜篌(復元)のための作品を創作(作曲)し,「Thinking Machine」と競演する形で発表した。2008年3月に「限りなき声」のシンポジウムでは特に岡田暁生が三輪眞弘の作品について研究発表を行った。

これらのシンポジウムと別に研究打ち合わせを二度行い,一回目は2007年度の研究方法,二回目はこれからの研究方法について相談した。平成20年度には一部のメンバーでドイツ・ライプツィヒに行われた国際会議『音楽・都市』において「非精神性の美学:歴史と現在の機械音楽」というシンポジウムとポースター・プレゼンテーション(http://fusehime.c.u-tokyo.ac.jp/gottschewski/leipzig/leipzlg01.html)を行った。研究代表者は古代から中世に渡って近代まで変化して来た機械論とそれに伴う世界観を概観した後、機械と精神との関係を美学的に考慮した。研究分担者岡田は19世紀のピアノ教育などに使われた機械的な練習の意義を明らかにし、その非精神的な性格こそが精神を自由にするーつの道であったことを明らかにした。演奏の技術的な面を完全に自動化することによって精神が初めて自由に音楽を支配することができるという考えである。また、自動化で行われる繰り返しと強化がワーグナーを始めとして19世紀の作曲家の作曲技法にも無関係ではないと示された。研究分担者長木は日本の未来派(20世紀前半)における機械の見方、外国人協力者呉は戦後の韓国音楽における機械アートの特徴を明らかにした。外国人協力者リッチズは自作の音楽機械、特に19年度の展覧会「機械じかけの音楽」の為に当時の研究分担者三輪と共同作品として作ったTHINKING MACHINEについて発表した。ディスカッションでは特にこのプロジェクトの外国人協力者でもあるクロッツや現代音楽の権威者であるヒーケルが発言し、THINKINGとMACHINEの矛盾や現代アートにおける精神の概念やそれについてアジアの独特な考え方について盛んに意見交換があった。他の研究分担者の活動としては特に高橋が行ったスイス、ドイツやフランスの博物館における自動楽器との関連資料調査が特記すべきである。また研究分担者の佐近田が歌声をリアルタイムに生成する機械歌唱ソフトウェア研究をすすめ、「こぶし」「かすれ」等の歌唱技法のアルゴリズム実装をはじめ、歴史上実在した特定の歌手の声紋的特徴および歌唱技法の特徴をパラメータ化し、リアルタイムに制御する発声エンジンを開発。それを用いた音楽作品「Le Tombeau de Freddie/L'Internationale」(2009)を三輪眞弘とともに制作/発表。他には研究プロジェクトのホームページを作って、それを徐々に充実させた。代表者は2007年に発表された作曲作品の電子ピアノのためのアレンジメントを作り、それをさらにフライブルク音楽大学でChristoph Sischkaの協力を得てヤマハのディスクラヴィアのための新しいアレンジメントを作った。2007年のヴァージョンを含めて三つのヴァージョンに詳しい説明を付けて(ドイツ語)聴覚資料としてホームページにアップロードした(http://fusehime.c.u-tokyo.ac.jp/gottschewski/musica/2F/gottschewski-de.htm)。
非食菌類より生理活性成分の検索

非食菌類に含まれる生理活性成分の検索の一環として、ほとんど研究が行われていない5種の子嚢菌類(チャコブタケ、ツボミタケ、ホウズキタケ、クロコブタケおよびクチキトサカタケ)の成分検索を行った。クロサイワイタケ科チャコブタケ(Daldinia concentrica)からは植物成長阻害作用を示す1種の新規ビスナフチル化合物、3種の新規ベンゾフェノン誘導体、3種の新規アザフィロン関連化合物が単離された。クロサイワタケ科ツボミタケ(Daldinia vernicosa)からはKB cellに対し強力な細胞毒性を示す16種の新規サイトカラシン関連化合物を得た。クロコブタケ(Hypoxylon truncatum)からは1種の新規ナフトキノン化合物、ホウズキタケ(Entonaemasplendes)より3種の新規アザフィロン関連化合物、クチキトサカタケ(Ascoclavulina sakaii)より、1種の新規デプシド、1種の新規デプシドンおよび1種の新規ニトロソ化合物を単離し、構造を明らかにした.その個体が小さいことおよび組織培養が困難なことからいままでほとんど研究が行われていなかった粘菌類(変形菌類)の真性粘菌マメホコリ(Lycogala epidendrum)の化学成分の検索を行い、植物成長阻害活性を示す12種の新規ポリアセチレントリグリセリドおよび単純ヘルペスウイルスI型(HSV-1)に対する抗ウイルス作用および抗酸化作用を有する3種の新規ビスインドール誘導体を単離し、構造を明らかにした。
看護教育における模擬患者養成プログラムの検証と模擬患者を支援するシステム構築

SPがスキルアップし継続的に活動するためには、教員はOSCEや授業時においてSPの心身にかかる負担に配慮すること、SPが自己の技術を振り返るための定期的な学習会を開催すること、他機関のSPとの交流および教員との交流の機会を設けることが効果的であることが示唆された。これまで、担当教員が中心となりSPを支援してきた。今後にむけて、大学の組織である教務委員会によって支援されるシステムを構築した。本研究の目的は、「看護教育における模擬患者養成プログラムの検証と支援するシステムの構築」であり、平成22年度は、1.看護教育と医学教育におけるSP体験の共通点および相違点から、看護教員における模擬患者の特徴を明確にすること、2.模擬患者のスキルアップと継続した活動を支援するためのプログラムを検討することを中心に研究をすすめてきた。1については、看護教育と医学教育で模擬患者の体験があるSP6名に半構成的質問紙を用いて、インタビューを実施した。現在、インタビューデータを分析しているところである。分析結果をもとに平成23年度は質問紙を作成し、看護教育と医学教育における模擬患者の体験の相違についてさらに明らかにしていく。これにより、看護教育においてSP活動を行う上での特徴を模擬患者に示すことができるとともに、教員にとっても模擬患者への協力を依頼する際の指針を示すことができる。2.については、現在本学の模擬患者として活動をしている25名を対象とした定例学習会を開催した。学習会の回数は1回/2か月であり、実施時間は1回2時間であった。5月・7月・9月のプログラムの内容は、実際の授業やOSCE場面を録画した映像を視聴し、演技やフィードバックについて評価することである。11月は学部講師を招いて特別学習会を開催し、効果的なフィードバックに向けた演習を行った。12月以降は、OSCEに向けた練習を行った。学習会終了後のアンケートの結果、実施回数については全員が良いと答えており、8割のものが学習会は模擬患者としてのスキルアップに役立ったと答えていた。また、活動を継続するうえで、模擬患者同士の横のつながりや模擬患者の活動が新たな自分の発見につながるなど模擬患者自身のためになっていくことが、模擬患者が活動を継続するうえで重要な支援の視点であることが明らかになった。本研究の目的は、「看護教育における模擬患者養成プログラムの検証と支援するシステムの構築」であり、平成23年度は、1.看護教育と医学教育におけるSP体験の共通点および相違点から、看護教員における模擬患者の特徴を明確にすること、2,模擬患者のスキルアップと継続した活動を支援するためのプログラムを検討することを中心に研究をすすめてきた。1については、看護教育と医学教育で模擬患者の体験があるSP6名へのインタビュー内容を分析し、その結果に基づき質問紙を作成中である。今後プレテストを実施し、看護教育と医学教育における模擬患者の体験の相違についてさらに明らかにしていく。2については、現在本学の模擬患者として活動をしている23名を対象とした定例学習会を開催した。11月は現在SPとして活動をしている学部講師を招いて特別学習会を開催し、効果的な演技とフィードバックに向けた演習を行った。また、11月の学習会の開催時には他大学のSPとの交流会を開催した。学習会終了後のアンケートの結果、実施回数については全員が良いと答えており、9割のものが学習会は模擬患者としてのスキルアップに役立ったと答えていた。また、活動を継続するうえで、模擬患者同士の横のつながりや他大学のSPとの交流が有効であることが明らかになった。さらに、SPから大学で開催する学習会以外に自主的な学習会を開催したいとの申し出があったことからもSPへの支援が効果的に行われたものと推察する。一方、SP参加型授業を実施している科目が固定化しており、SPの中にはマンネリ化しモチベーションの維持が課題となっていると感じているものもいた。これらの結果に基づきプログラムの検討を進めていく。今年度は1.看護教育と医学教育における模擬患者の体験の共通点と相違点を明らかにすることを目的に、看護学部と医学部で活動している模擬患者の2機関8名のインタビューデータの分析を行った。その結果、異なる点は「看護師への期待の強さ」、「シナリオの違い」、「身体接触」、「演じやすさ」であった。医学教育においてはコミュニケーションが中心となり、一方看護においては看護技術の提供など身体接触を伴う技術の実施も含まれている場合がある。そのため、これらの違いを踏まえて模擬患者の養成を行っていくことが必要である。

次にスキルアップとモチベーションの維持を目的に定例学習会1回/2か月(5月・7月・9月)に開催し、10月以降は12月および2月に開催するOSCEの準備期間とした。今年度はさらに模擬患者と教員を対象としたFDおよび近郊で活動している模擬患者・教員を含めた学習交流会を開催した。現在22名が活動しており、アンケートの結果、定例の3回の学習会について、開催回数はちょうど良い90.5%、時間(2時間)丁度良い95.0%であった。学習会の内容について、技術を高めるうえで役に立った80.0%、活動を継続するうえで役に立った80.0%であった。教員と模擬患者を対象としたFD(テーマ:教員と模擬患者によるOSCEシナリオの振り返り」を実施した結果、SP・教員へのアンケートより、授業・OSCEに役立つ内容であった100%、今後の活動に活かせる内容であった100%であった。自由記述から「お互いの気持ちの理解」、「今後も教員とSPの合同の学習会を希望している」という記述が多くあった。以上より、学習会を定期的に開催すること、さらに大学の教員と合同で学習する機会をもつことが模擬患者としてのスキルアップやモチベーションの維持とって効果があることがわかった。インタビューの分析に時間を要し、質問紙の作成が遅れた。その結果、質問紙の配布に至らなかった。その理由は連携研究者の学内における役割が増えたことが一因である。24年度が最終年度であるため、記入しない。SPへの支援システムの構築に関する調査は順詣であることから、この調査を担当している連携研究者を研究遂行が遅れている看護教育における模擬患者の特徴の明確化に関する調査の役割に変更する。
ナノ構造体内部への選択的タンパク質取り込み機構の解明

エンカプスリンは、分子量30-40 kDaの単一のタンパク質が自己集合することにより形成される直径25-55 nmの中空の球状ナノ構造体である。特定の酵素を内包することにより、効率的な反応場や細胞にとって毒性のある基質や生産物を隔離する場を提供する細胞内微小区画であると考えられており、構造体のサイズ、安定性、内包するタンパク質の種類を制御することが可能となれば、マイクロリアクターやマイクロセンサー等としての活用が期待できる。そこで本研究では、ナノ構造体への外来タンパク質の取り込み機構を明らかにし効率的な内包手法の基盤を確立することを目的として研究を行った。申請者らが放線菌Rhodococcous erythropolis N771株から獲得したエンカプスリンについて、エンカプスリン遺伝子のすぐ上流にコードされた38残基のペプチドを外来タンパク質のC末端に付加しエンカプスリンと共発現させることにより外来タンパク質をエンカプスリンに内包可能であることは既に明らかにしていた。そこで、内包に関わると推定したペプチドを部分的に欠損させた外来タンパク質を用いて内包実験を行ったところ、C末端近傍のGSLXIGSLK配列が内包に重要であることを示唆する結果を得た。この配列はエンカプスリンを持つ菌種間で保存性の高い領域であることから、内包制御に必須のターゲットペプチドとして機能している可能性が高いことが予想された。また、エンカプスリン内部のターゲットペプチド認識部位について検討するため、エンカプスリンの結晶化を行い分解能3.3オングストロームでの構造解析に成功した。これまでに構造が明らかとなっている二種のエンカプスリンとの構造比較をもとに認識部位を推定し部位特異的変異体を用いた内包実験を行った。その結果、エンカプスリンのN末端ドメインの構造保存性の高い領域が認識に関わることが示唆された。特定の酵素を内包することにより、効率的な反応場や細胞にとって毒性のある基質や生産物を隔離する場を提供する細胞内微小区画であると考えられており、構造体のサイズ、安定性、内包するタンパク質の種類を制御することが可能となれば、マイクロリアクターやマイクロセンサー等としての活用が期待される。本研究では、内包するタンパク質の認識に関わる相互作用を特定することによりタンパク質の取り込み機構を明らかにし、ナノ構造体への外来タンパク質の効率的な内包手法の基盤を確立することを目的として研究を進めている。これまでに、エンカプスリン内部へのタンパク質の内包に関わる37アミノ酸残基からなる認識配列を推定し、この配列全体を外来タンパク質のC末端に付加することによりエンカプスリンへ外来タンパクが内包可能なことを明らかにした。平成28年度は、エンカプスリンへの内包に必須となる認識配列中の部位を特定するために、外来タンパク質に付加する認識配列の一部を削除し内包実験を行った。エンカプスリンとの内包の可否や効率の検討には、これまでに確立した緑色蛍光タンパク質やルシフェラーゼとの共発現系を用いた。その結果、認識配列のC末端側から15残基程度を削除すると外来タンパク質がエンカプスリンにほとんど内包されなくなった。他方、認識配列のN末端側を削除した場合、これまでのところ、内包に大きな影響を与えないという結果を得ている。したがって、認識配列の中でもC末端側に内包に必須となる部位が存在すると考えられた。平成28年度の研究により、エンカプスリンへの内包に関わる認識配列と推定したアミノ酸配列の中でC末端側の15残基の中に内包に必須な領域が存在することが示唆される結果を得た。この領域のアミノ酸残基がエンカプスリン内壁の特定の領域と相互作用することにより内包が制御されていると予想されることから、引き続きアミノ酸残基の特定を進めるとともに、結晶構造解析、タンパク質間生物物理学的相互作用解析、質量分析等の手法で実験を進めることにより、内包機構の解明につながることが期待できる。また、認識配列のN末端側を削除した場合について、予備的な結果ではあるが、内包効率に影響を与える可能性が示す結果を得ていることから、ナノ構造体への外来タンパク質の効率的な内包手法の基盤に結びつく結果も得られつつある。以上より,研究全体として,概ね計画通りに進行していると判断した。申請者らが放線菌Rhodococcous erythropolis N771株から獲得したエンカプスリンについて、これまでに、エンカプスリン遺伝子のすぐ上流にコードされた38アミノ酸残基を外来タンパク質のC末端に付加しエンカプスリンと共発現させることにより、外来タンパク質のエンカプスリンへの内包に成功している。そこで、内包に関わるシグナルタグと推定したアミノ酸配列を部分的に欠損させた外来タンパク質の内包実験を行ったところ、平成28年度までにC末端側の15残基の中に内包に必須な領域が存在することを明らかにした。詳細について平成29年度も引き続き検討を進めたところ、C末端近傍のGSLXIGSLK配列が内包に重要であることを示唆する結果を得た。この配列はエンカプスリンを持つ菌種間で保存性の高い領域であることから、内包制御に必須のシグナルタグとして機能している可能性が高いことが予想される。また、エンカプスリン内部のシグナルタグ認識部位を同定するため、エンカプスリンサブユニット(264アミノ酸残基)の予想構造をもとに70残基程度ずつに四分割したエンカプスリンを作製し、シグナル配列を付加した外来タンパク質との表面プラズモン共鳴法による相互作用解析を行った。