hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん転移モデルとしての悪性褐色細胞腫の解析

悪性褐色細胞腫例について、同一症例内での原発巣と転移巣を用いた全ゲノムメチル化解析を行い、その結果から悪性化関連候補CpG領域28か所を決定した。さらに、全ゲノムメチル化解析、メチル化依存的制限酵素を用いた定量PCR、バイサルファイト処理後のダイレクトシークエンスの3つの解析方法を用い、良性悪性腫瘍間でメチル化を比較定量し、癌化に伴うエピゲノミックな変化が疑われる3つのCpG領域を絞り込んだ。候補CpG領域の下流には既知の蛋白としてACSBG1およびMAST1が確認され、同蛋白の発現が悪性化に伴い腫瘍内で変化する可能性が示唆された。これらについてさらに腫瘍内発現を検討する予定である。本研究は、良性・悪性褐色細胞腫組織を材料としたゲノム、エピゲノム、トランスクリプトーム、およびプロテオームの解析を通して、本症の癌抑制因子や転移関連遺伝子について分析し、それらを臨床像と照らし合わせることにより診断・予後予測・悪性化阻止等の治療に反映できる情報を得ることを目的としている。さらに、本症以外の腫瘍一般における潜在的がん転移能力のもつ意味やそれが顕性化するメカニズムの解明、早期診断法を確立することを目的としている。平成23年度から24年度にかけて、ホルマリン固定パラフィンブロックサンプルよりDNAを抽出した9症例・12サンプル(悪性褐色細胞腫3例{各症例につき原発巣転移巣2サンプル}+12年以上転移がみられない良性褐色細胞腫3例+経過観察中で良性か悪性か不明の腫瘍3例)につき全ゲノムメチル化解析を行った。全症例について書面でインフォームドコンセントを得ている。悪性褐色細胞腫2例の同一症例内での原発巣および転移巣の全ゲノムメチル化解析結果から、転移に関連してメチレーションに変化が生じる可能性のある候補CpG領域を7つに絞り込んだ。(メチル化:3 CpG領域脱メチル化:4 CpG領域)。絞り込む方法としては各症例のメチル化・脱メチル化変化率の高いCpG領域Top20と、2症例で共通してメチル化変化率0.45以上であったCpG領域を有意メチレーション変化CpG領域として取り上げた。現在この7つのCpG領域について良性腫瘍・および経過観察腫瘍(各7症例)を含めたより多くのサンプルについてMethylation specific PCR法を用いたメチル化解析を行っている。本研究では悪性・良性の褐色細胞腫の摘出腫瘍組織を試料に網羅的オミックス解析を通して、本症の悪性化関連遺伝子について分析し診断マーカーとなりうる蛋白ないし遺伝子を探索すること、さらに発展して固形腫瘍一般の潜在的がん転移能力のもつ意味やそれが顕性化するメカニズムを解明することを目的としている。1悪性例と良性例、2同一悪性腫瘍症例の原発巣と転移巣の比較解析を行っている。平成23年から24年にかけてエピジェネティックな解析からアプローチした。ホルマリン固定パラフィンブロックから抽出したDNA(9症例・12サンプル)【悪性例3例(原発・転移各2サンプル)、12年以上転移のない良性例3例、良悪性不明例3例】につき全ゲノムメチル化解析を行った。同一症例内での原発転移間の解析結果を比較しメチル化に変化が生じた候補CpG領域を28ヶ所に絞り込み(メチル化率上昇;12ヶ所、メチル化率低下;16ヶ所)、nを増やして(悪性例6例良性例10例)メチル化定量を行った。解析方法はDNAバイサルファイト処理によるメチル化定量、とメチル化配列切断酵素処理による定量。の2法を採用した。平成25年度は以下の実験を追加した。1メチル化定量の結果から上記28ヶ所をさらに候補CpG領域メチル化:2か所脱メチル化:2か所に絞り込んだ。4か所の候補CpG領域の下流には既知の蛋白ACSBG1 (Acyl-CoA Synthetase, Bubblegum Family, member 1)およびMAST1 (Microtubule Associated Serine/Threonine Kinase 1)が確認され、エピジェネティックな変化に伴い同蛋白の発現が腫瘍内で変化する可能性が示唆された。これらについて発現を検討する予定である。2ゲノム解析にも取り組んだ。DNA材料を用いた全ゲノムエクソンシークエンスでの検討を考えていたが、10年以上経過したパラフィンブロックからは数百bpのDNA片しか得られずゲノムワイドな全エクソン解析は断念し、Cancer Panelを用いたアンプリコンシークエンスを行った。現在解析結果待ちである。本研究は悪性褐色細胞腫の転移関与遺伝子、関与分子について分析し、潜在的がん転移能力のもつ意味やそれが顕性化する機序の解明を目的としている。[悪性化に伴うメチル化解析]

[タンパク発現量の面からのプロテオーム解析]の二つのアプローチを考え、このうち平成23年度は前者を中心に下記の研究を行った。(1)実験のデザインと研究対象褐色細胞腫患者のエントリー。臨床情報の収集。(2)組織からのtotal RNA抽出。(3)組織からのgenomic DNAの抽出とそれらを用いた全ゲノムのメチル化解析。【対象】褐色細胞腫症例38例(良性31例、悪性7例)。悪性7例のうち原発巣摘出後に長時間を経て転移巣が確認され悪性の診断に至った下記2例を全ゲノムメチル化解析の対象とした。症例1;男性1986年右副腎褐色細胞腫を摘出。1993年胸腹部・Virchowリンパ節に転移を診断。症例2;女性1992年膀胱褐色細胞腫を摘出。2003年左第8肋骨・右下肺に、2004年胸骨・脊椎に転移を診断。【研究経過・結果】(1)パラフィン包埋組織より約35 mgの切片を切り出しtotal RNAを抽出、38例のうち24例について解析に十分量のサンプルが得られた。(2)症例1. 2の原発巣、転移巣よりgenomic DNAを抽出した。得られたDNAは全ゲノム網羅的DNAメチル化解析に提出予定。(3)38例のうちMEN2型は6例(2例が多発病変)であった。Von Hippel-Lindau tumor suppressor gene (VHL)のmutationは2例、筑波大学大学院臨床医学系分子検査医学に依頼し検索したsuccinate dehydrogenase (SDHB, SDHD)gene mutationは3例に陽性であった。11症例に重複はなくいずれも悪性の診断はなされていない。平成24年度までに、解析を予定していた全サンプルについて全ゲノムメチレーション解析をおこなうことができた。しかし、次のステップであるメチレーション特異的PCR(MSP)については、特にそのプライマーの設計に多くの時間を費やしている。MSPではCGコンテントの多い部分を増幅する特殊なプライマーの設計が必要であり、さらに一つのCpG領域について非メチル化・メチル化の二つのプライマーを設計する必要がある。このプライマー設計実験が難航している理由の一つである。現在MSPを鋭意実験している最中であり、この結果を踏まえ候補CpG領域をさらに絞り込むことができれば、その結果を用いて、今後研究の展開が期待できると考えられる。さらに、今回悪性化に伴うメチレーションをテーマにしていることから、悪性化・転移形質獲得に伴い遺伝子レベルでの変化が生じていないことを確認する必要がある。凍結腫瘍組織(原発巣と転移巣)から抽出したRNAを用いた検討が有用であるが、手元にある凍結組織サンプル数が限られており、パラフィン組織を材料としたDNAエクソームシークエンスを用いて検証するしか方法がなく、さらに費用を充てる必要があり、今後の研究方法を検討中である。本年度は、本研究開始初年度として、まず実験のデザインおよび対象褐色細胞腫患者のエントリーと臨床情報収集、さらに材料収集を行った。
非線形シュレディンガー方程式の解の漸近挙動に関する研究

本研究は、最先端で行われている数学研究(特に、非線形シュレディンガー方程式の相対論版である非線形クライン・ゴルドン方程式の解の漸近挙動に関する研究)を行い、そこから得られた生きた題材を高校生にも分かる形で還元し、高校生に数学に対する興味や関心を持たせることを目標としている。研究を以下の(1)(2)に分けて行った。(1)砂川秀明氏(大阪大学)と共同で、質量共鳴がある場合の非線形クライン・ゴルドン方程式(以下NLKGと略す)の解の長時間挙動について考察した。一般に、質量項の間にある意味での共鳴関係がある場合にはNLKGの解のエネルギーは時間とともに増大していくことが知られているが、一方で、非線形項の形状にある種の構造がある場合にはエネルギーの増大が起こらないことも知られている。今回の共同研究により、質量共鳴下でもエネルギー増幅が起こらないための非線形項の形状に関する新しい十分条件を得ることに成功した。この成果は"Global solutions for two-dimensional nonlinear Klein-Gordon systems in the presence of mass resonance"と題する論文にまとめて国際誌に投稿する予定であり、現在その準備中である。(2)最先端での数学の研究((1)の研究)と高校数学とをリンクするような教材を開発した。(1)の結果を得るのに非常に重要であった補題は、一見複雑そうに見えるが、複素数の知識と連立1次方程式の解の関係が分かっていれば証明できることなど、実際に授業を行った。最先端の数学研究の場で用いられている道具は現在高校生が学んでいる数学が基礎になっていることを実感させることができ、また数学を身近に感じさせることができた。
糖代謝異常の解明とそれに基づく抗糖尿病活性化合物の合成研究

抗糖尿病活性化合物を目指した高脂溶性2位置換AICAR誘導体合成とAICARの-リン酸化物(ZMP)の合成研究は,金属触媒を用いるカップリング反応を中心に進め,新規なアリール基置換プリン誘導体を創製してきた.この複素環合成研究はキサンテン骨格を有する新規ローダミン及びロサミン誘導体合成へと発展した.すなわちローダミンラベル剤に代わる新規二官能性蛍光ラベル剤の合成研究であり,具体的にはローダミンラベル剤で問題となる,ベンゼン環上のカルボキシ基がフェニル基とキサンテン環との間の単結合の自由回転を阻害して生じる軸性キラリティー,それに起因するジアステレオマー発生の問題を克服したロサミン骨格を有する二官能性蛍光ラベル剤を,新規に設計し,その合成についても実用的なレベルに高めること目指した.その結果,ローダミンラベル剤とロサミンラベル剤に共通する合成中間体を設定でき,従来法に比較して反応ステップ数と精製回数を大幅に減らし,簡便で高効率なルートを確立することができた.また,対象となる生体分子であるタンパク質との相互作用をモデルペプチドを用いてHPLC, NMR, CDによって検証したところ,モデルペプチドはそのα-ヘリックス構造(CD)を保持しながら,分子表面に存在する塩基性置換基との関係に明瞭な相違が見出され,それらが電子的性質(NMR)と疎水的性質(HPLC)に影響を及ぼしていることが分かった.これらの成果は,抗糖尿病活性化合物の細胞膜透過性の改善と細胞内での生体分子との相互作用解明,さらに,金属触媒を用いるカップリング反応における立体障害を克服するの分子変換手法開発に繋がるものである.エネルギー代謝制御にかかわる酵素であるAMP活性化タンパク質リン酸化酵素(AMPK)は運動による筋収縮により活性化されることから,運動療法がもつ抗糖尿病効果の発現要因として注目されている.酵素AMPKの活性化剤としてAICARが有望視されているが,AICARは入手困難でありその類縁体の合成研究も十分ではない.そのことが糖代謝活性化機構の解明の障害となっている現実がある。そこでこのAICARに着目し,糖代謝活性化機構の解明を展望して,AICAR自体及びその誘導体の系統的合成法の確立を目的とする研究を実施した.最初に,イノシンからアミナール型保護を経由するAICAR合成を考案した.そのものを水酸化ナトリウム水溶液中で加熱還流したところ,想定した保護されたAICARではなく,開環反応と同時にアミナール保護基も脱離して,最終目的化合物であるAICARを得た.反応機構を考察して,種々誘導体を用いて最適条件を検討した結果,メトキシエトキシメチル体で全4段階,総収率56%という実用的なAICAR合成法を確立することができた.AICARは細胞膜透過性が低く,また細胞内ですばやく代謝されるので,AMPKを活性化させるためには過剰量の投与を必要とする.脂溶性の高い2位置換AICAR誘導体はこの欠点を克服できると考え,先の方法を応用して,アデノシンを出発原料として,その臭素化,鈴木カップリング,トリオールの保護,酸化的脱アミノ化,アミナール保護基の導入,それに続く開環反応という合成経路を考案した.実際の反応の結果,最終的に目的とするフェニル基,置換フェニル基,複素環置換基,及び置換ビニル基を有する7種類の2-アリールAICAR誘導体の合成に成功した.AICARは細胞膜透過性が低く,また細胞内ですばやく代謝されるので,AMPKを活性化させるためには過剰量の投与を必要とする.脂溶性の高い2位置換AICAR誘導体はこの欠点を克服できると考え,既に開発した方法を応用してその合成を実施した.塩基部にアリール基を導入した核酸類縁体は抗ウイルス剤や抗腫瘍剤の候補化合物として盛んに合成されているので,置換基としてアリール基を選択した.また,その導入反応には安全性と環境負荷を考慮して,鈴木カップリングを用いることにした.まずAICAR自体を出発原料としてその臭素化を試みたが,望む反応は進行しなかった.そこでアデノシンを出発原料として,その臭素化,鈴木カップリング,トリオールの保護,酸化的脱アミノ化,アミナール保護基の導入,それに続く開環反応という合成経路を考案した.実際の反応の結果,最終的に目的とするフェニル基,置換フェニル基,複素環置換基,及び置換ビニル基を有する7種類の2-アリールAICAR誘導体の合成に成功した.今回合成した2-アリールAICAR誘導体はまったくの新規化合物であり,2位置換AICARの系統的合成法を確立することができた.次に,AMPK活性化の活性本体がAICARの一リン酸化物(ZMP)であることから,合成ターゲットをZMP類縁体に拡張した.実際には,細胞内で加水分解されやすい糖リン酸エステルを,分解されない糖ホスホン酸に置き換える分子設計をもとに以下の合成を実施した.

保護されたイノシンから出発して,アルデヒドへの酸化,ホスホン酸の導入,続く水素添加によってイノシンホスホン酸エステルを得た後,AICARへの変換反応を利用して目的物合成を達成した.また,ZMPの糖リン酸エステル結合の酸素原子を窒素原子で置換した類縁体は細胞内加水分解酵素の基質になりにくいと考え,その合成研究を実施した.抗糖尿病活性化合物を目指した高脂溶性2位置換AICAR誘導体合成とAICARの-リン酸化物(ZMP)の合成研究は,金属触媒を用いるカップリング反応を中心に進め,新規なアリール基置換プリン誘導体を創製してきた.この複素環合成研究はキサンテン骨格を有する新規ローダミン及びロサミン誘導体合成へと発展した.すなわちローダミンラベル剤に代わる新規二官能性蛍光ラベル剤の合成研究であり,具体的にはローダミンラベル剤で問題となる,ベンゼン環上のカルボキシ基がフェニル基とキサンテン環との間の単結合の自由回転を阻害して生じる軸性キラリティー,それに起因するジアステレオマー発生の問題を克服したロサミン骨格を有する二官能性蛍光ラベル剤を,新規に設計し,その合成についても実用的なレベルに高めること目指した.その結果,ローダミンラベル剤とロサミンラベル剤に共通する合成中間体を設定でき,従来法に比較して反応ステップ数と精製回数を大幅に減らし,簡便で高効率なルートを確立することができた.また,対象となる生体分子であるタンパク質との相互作用をモデルペプチドを用いてHPLC, NMR, CDによって検証したところ,モデルペプチドはそのα-ヘリックス構造(CD)を保持しながら,分子表面に存在する塩基性置換基との関係に明瞭な相違が見出され,それらが電子的性質(NMR)と疎水的性質(HPLC)に影響を及ぼしていることが分かった.これらの成果は,抗糖尿病活性化合物の細胞膜透過性の改善と細胞内での生体分子との相互作用解明,さらに,金属触媒を用いるカップリング反応における立体障害を克服するの分子変換手法開発に繋がるものである.
地震時における防災行政機関の災害情報集積に関する時系列解析

地震に代表されるような、広域が対象となる災害時には市町村を本部長とする災害対策本部が公的に組織される。本研究は、地震時における防災行政の最適対応決定の迅速化のために、情報集積のメカニズムを時系列的に明らかにし、情報集積速度・適切性等の情報特性を規定する要因を解析し、もって被災地域住民の安全性の確保と迅速な復旧に資することを目的として提案されたものである。災害情報集積には行政体の努力結果に依存する側面(制御可能)と、地震・地域の持つ特性により決まってしまう側面(制御不能)とが混在する。その識別を進め、災害情報を効果的に利用し災害直後の行政体対応の効率化が探れるよう防災活動需要時系列モデルの構築を試みた。各年度で実施された項目を列挙する。1.災害情報の収集:最近北海道およびその周辺で発生した被害地震を調査対象とし、災害情報の発信側(各市町村・北海道の関連機関)および災害情報の受信側(災害対策本部)の送受信結果をアンケート・ヒアリングを主な手段として時系列的に収集した。2.災害情報の分析:収集した災害情報を実体的に把握するために、災害情報の時系列集積に関わる要因を制御・非制御に分類し抽出した。3.防災行政における災害情報の利用に関するシナリオ構築:これに並行して、情報が災害時にどのように利用されるかの調査を、主要自治体の防災計画マニュアルより時系列整理を行い、災害時の各部局に要求される活動をシナリオ的にモデル構築した。以上のモデルにより、様々な地震条件や被災地防災組織の対応部局条件など異なる諸条件における災害情報集積・対応シミュレーションが可能となり、最適対応の根拠をモデルに求めることが可能となった。地震に代表されるような、広域が対象となる災害時には市町村長を本部長とする災害対策本部が公的に組織される。以上の研究目的を達成するため、初年度は以下に焦点を当て研究を実施した。1.災害情報の収集1993年釧路沖地震、1993年北海道南西沖地震、1994年北海道東方沖地震を調査対象とし、災害情報の発信側(各市町村・北海道の関連機関)および災害情報の受信側(災害対策本部)の送受信結果をアンケート・ヒアリングを主な手段として時系列的に収集した。2.災害情報の分析収集した災害情報を実体的に把握するために分類と時系列解析を以下の観点から行い、災害情報の時系列集積に関わる要因として、地域を襲う地震動の大きさ、被災地域の都市規模、災害襲来頻度と学習効果を抽出することができた。3.防災行政における災害情報の利用に関するシナリオ解析これに並行して、情報が災害時にどのように利用されるかの調査を、主要自治体の防災計画マニュアルより時系列整理を行い、災害時の部局対応と必要情報のシナリオを作成した。地震に代表されるような、広域が対象となる災害時には市長村長を本部長とする災害対策本部が公的に組織される。災害情報集積には行政体の努力結果に依存する側面(制御可能)と地震・地域の持つ特性により決まってしまう側面(制御不能)とが混在する。

1.災害情報の収集:最近北海道およびその周辺で発生した被害地震を調査対象とし、災害情報の発信側(各市町村・北海道の関連機関)および災害情報の受信側(災害対策本部)の送受信結果をアンケート・ヒアリングを主な手段として時系列的に収集した。2.災害情報の分析:収集した災害情報を実体的に把握するために、災害情報の時系列集積に関わる要因を制御・非制御に分類し抽出した。3.防災行政における災害情報の利用に関するシナリオ構築:これに並行して、情報が災害時にどのように利用されるかの調査を、主要自治体の防災計画マニュアルより時系列整理を行い、災害時の各部局に要求される活動をシナリオ的にモデル構築した。以上のモデルにより、様々な地震条件や被災地防災組織の対応部局条件など異なる諸条件における災害情報集積・対応シミュレーションが可能となり、最適対応の根拠をモデルに求めることが可能となった。
マルチボディモデルに基づく多自由度ロボットの動作計画

本研究は知能ロボットの自律性の向上による人的コストの低減や利用可能分野の拡大を目指し,多自由度ロボットの動作計画手法の開発を行った.ロボットおよび作業環境をマルチボディモデルで表現し,異なる優先度を与えられた複数のタスクを達成するようなマルチボディの軌道計画問題を対象とし,その基本原理を明らかにするとともに有効な計画アルゴリズムを提案した.具体的な項目としては,干渉回避などの非凸制約の取り扱い,複数のタスクを順序的あるいは並列的に実行するスケジューリング,リアルタイム動作計画による実機の制御およびソフトウェアライブラリの整備に取り組んだ.研究計画に含まれていた取り組み項目の内,干渉回避などの非凸問題の大域的最適化については,干渉回避を拘束条件として含むロボットアームのリーチング動作計画を実現した.しかし問題の非凸性を考慮した大域的な最適化に関する有効な方策は時間内に見出すことが出来なかったため,今後の課題としたい.スケジューリングを要する複数タスクの計画については,ロボットが複数のタスクを順序的,るいは並列的に実行するための動作計画の記述方法とその解法をある程度明らかにした.しかしながら,現状では各タスクの実行順序は所与としているため,今後はタスクの実行順序の決定も動作計画の枠組みに含める方法を検討したい.実用化の観点からは,ロボットアームの実機に対して,所定の制御周期内で動作計画を行い,それをもとにロボットへ関節角度指令値を送信するリアルタイム制御系を構成し,実験により評価を行った.予定していた制御遅れの影響の考察や状態推定への応用には時間的理由により着手できなかった.最後に第三者利用への取り組みについては,動作計画手法のソフトウェアライブラリ化,ドキュメント整備は大幅な進捗があった.実際の公開は未完了であるため早急に進めたい.また,GUIなどの利用しやすいユーザインタフェースを備えた開発環境の用意は未着手であるため,今後の課題とする.本研究は多自由度ロボットの動作計画法の開発を目的とし,種々の未解決課題に取り組んだ.干渉回避などの非凸問題の大域的最適化については,干渉回避を拘束条件として含むロボットアームのリーチング動作計画を実現した.しかし問題の非凸性を考慮した大域的な最適化に関する有効な方策は時間内に見出すことが出来なかったため,今後の課題としたい.スケジューリングを要する複数タスクの計画については,ロボットが複数のタスクを順序的,あるいは並列的に実行するための動作計画の記述方法とその解法をある程度明らかにした.現状では各タスクの実行順序は所与としているため,今後はタスクの実行順序の決定も動作計画の枠組みに含める方法を検討したい.実用化の観点からは,ロボットアームの実機に対して,所定の制御周期内で動作計画を行い,それをもとにロボットへの関節角度指令値を送信するリアルタイム制御系を構成し,実機により評価を行った.最終年度においては,追加の実機評価を行うため,二足ロボットの作成し,開発した動作計画手法を用いて歩行軌道生成を行い,試験を行った.最後に第三者利用への取り組みについては,動作計画手法のソフトウェアライブラリ化,ドキュメント整備は大幅は進捗があった.実際の公開は未完了であるため早急に進めたい.また,GUIなどの利用しやすいユーザインタフェースを備えた開発環境の用意は未着手であるため,今後の課題とする.本研究は知能ロボットの自律性の向上による人的コストの低減や利用可能分野の拡大を目指し,多自由度ロボットの動作計画手法の開発を行った.ロボットおよび作業環境をマルチボディモデルで表現し,異なる優先度を与えられた複数のタスクを達成するようなマルチボディの軌道計画問題を対象とし,その基本原理を明らかにするとともに有効な計画アルゴリズムを提案した.具体的な項目としては,干渉回避などの非凸制約の取り扱い,複数のタスクを順序的あるいは並列的に実行するスケジューリング,リアルタイム動作計画による実機の制御およびソフトウェアライブラリの整備に取り組んだ.本年度は,マルチボディモデルの動作計画問題に対して,非凸性を有する問題への解法を検討した.動作計画問題が非凸性を持つ原因としては,ロボットの関節可動範囲の制約や,周辺物体との干渉回避がある.干渉回避には外部物体との衝突のみならずロボット自身との衝突(self-collision)も含まれる.非凸性を有する問題に本手法を適用した場合,最適化の初期値に依存して異なる局所最適解が得られ,これらは最悪の場合,計画仕様を満たさない.このため,最適解を得るには個々の動作計画問題に応じて適切な初期値を選ぶ必要がある.これに対し,最近傍学習にもとづいて初期値を自動的に選択する手法を検討した.その結果,初期値をランダムに選ぶ場合に比べて高い確率で計画仕様を満たす解を出力する動作計画器を構築することができた.第二に,スケジューリングを要する複数タスクの計画問題に取り組んだ.この問題ではロボットの有する自由度(=リソース)を,要求された複数のサブタスク(=ジョブ)に最適な順序で割り振る必要がある.そこで,各タスクの開始時刻と終了時刻を定数ではなく決定変数として扱うことで,軌道計画とタスクスケジューリングを同一の枠組みで実行可能とした.また,「タスクAとタスクBのいずれかを行う」といったタスクの論理演算を導入し,より複雑な仕様の動作計画問題を扱う手法を考案した.上述の枠組みを,双腕ロボットが複数の物体に向かって手先を移動させるリーチングタスクの計画に適用し,計算機環境上にてある程度の検証を行った.関連する対外発表:国内会議1件,査読付き国際会議1件当初計画していた実施項目の内,基礎的な部分である干渉回避問題,複数タスクの計画問題,実機適用,ソフトウェア整備についてはほぼ計画通りの成果を得ることができたと言える.

一方で,より発展的な課題である大域的最適化,スケジューリング,実機応用における制御遅れなどの検討については,期間内に具体的な成果につなげることが出来なかった.二年間という限られた期間を考えれば致し方ないとも言えるが,計画策定段階において実現可能性をより慎重に考慮すべきであった.H23年度研究実施計画に記載したテーマに取り組むことができたため,おおむね計画通りに進捗していると言える.研究の過程で当初の想定した方向性を若干修正した部分もあるが,許容範囲である.期間中に得られた研究成果の対外発表やソフトウェア公開を進めつつ,より詳細な実機評価を行う.また,計画には記載されていたが研究期間中に十分な検討を行えなかった項目に取り組む.理論面では大域的最適化とスケジューリング問題がある.これらについては,タスクの因果関係を表現したオートマトン上の探索と従来の拘束ベースの計画を組み合わせた手法を検討する.また,実機応用においてはロボットアーム以外の形態(例えば歩行ロボット等)への適用を試みる.提案手法の実用性をロボットの実機を用いて検証する.実験環境としては市販のロボット用サーボモータを用いて簡易実験用ロボットを製作し,実験の便を優先して電源や計算機はロボットの外部に設ける.実機実験を通じ,計算時間制約や状態の部分観測性などの現実的問題への対処方法を検討する.また,本手法の大きな利点の一つは高い汎用性である(マルチボディモデルで表現可能な任意のロボットに適用可能).これを活かし,第三者が利用できるソフトウェアライブラリとして整備/公開する.また,インタラクティブな動作計画を実現するユーザインタフェースを開発し,そのユーザビリティを検討する.これは,常時動作計画アルゴリズムを実行しながらその時々刻々の結果を可視化し,ユーザからのアクション(変数や拘束の追加・削除,マウスドラッグによる物体の移動など)をリアルタイムに反映するものである.このユーザインタフェースを活用することで,提案手法の目下の弱点である「局所的な軌道の最適化は得意であるが大域的最適化は苦手」という性質をユーザが補うことができ,高精度かつ大域的最適な軌道を効率的に計画することが可能となると期待される.最後に,本研究の成果を学術論文としてまとめ投稿する.成果発表に係る論文掲載料の支払い,および実機評価に必要な実験機材の製作費に充当する.平成24年度交付額と平成23年度からの繰越額をあわせ下記のとおり経費の執行を計画している。実機検証用ロボット開発費,その他周辺装置: 900,000円成果発表用旅費: 300,000円論文掲載料: 100,000円その他: 200,000円
真性粘菌変形体における創発的経路形成の解析

真性粘菌の変形体は単細胞単核のアメーバが多数融合して形成される単細胞多核の巨大アメーバであり,適切な環境下で培養すると数十センチメートルから数メートルにまで成長する.また,変形体の細胞体全体は一定の周期で同調的に振動している.局所的に受容された情報は振動の位相変化として細胞全体に伝播され,それにより走化性応答などの行動が引き起こされる.従って変形体細胞は,脳などと同じく,能動的な素子によって作られる複雑なシステムであるとみなすことができる。近年,変形体のこのような性質を利用して例えば迷路の最短経路解を求めることなどが可能であることが示されており,変形体は集合的知性のモデルとして注目を集めている.筆者は変形体に関する生化学的・細胞生物学的研究を経て,近年は変形体の行動に関する数理的研究を展開すると同時に,「生命であること」を利用した計算系の実装を試み,構成的に生命とは何かを理解することを目指している.筆者は,変形体細胞が形成するチューブネットワークをグラフ理論的に解析することにより,サブネットワーク同士がトポロジーを共有すること及び,新しいネットワークは過去の運動及びネットワーク形成の履歴に依存して形成されることを発見した.つまり,変形体は細胞体の局所間で交信すると同時に,過去の履歴を参照しつつネットワーク形成を行うことが明らかとなり,細胞システムの適応的行動に関する新たな知見が得られた.また,これらの知見を元に変形体の経路探索に関する数理モデルを構築し,変形体の運動を良く再現することに成功した.我々は細胞システムにおける創発現象を実験的に観察することを目的に、真性粘菌の変形体を用いたバイオコンピューティングに取り組んでいる。細胞にある問題状況を与えそれを解決させるという実験は、与えられた状況に対する最適化過程もしくは秩序形成を観察することにつながる。即ち、ある問題解決のアルゴリズムを細胞を用いた実験系に実装することにより、細胞を用いた計算機を構築すると同時に細胞システムの持つ創発性を観察することができると期待される。このような目論みの元、我々は真性粘菌変形体を用いたボロノイ図の計算を行った。真性粘菌変形体の細胞体は、細胞運動により移動するシート状の部分とそれらをつなぎ単細胞としての統一性を保つためのチューブの2種類の部分から成る。我々は変形体の運動に伴うチューブ形成を利用し、グラフの一種であるボロノイ図を計算させることに成功した。ボロノイ図とは、平面上に有限個の母点(平面上に存在するランドマーク)が存在する時、それぞれの母点に最近接する点の集合を与える分割を表す図のことである。我々は変形体にとっての忌避物質を母点に相当する位置に配置し、忌避物質の間でチューブ形成を行わせることによって、変形体のチューブを用いたグラフの計算を構成した。本研究の成果は国際的に高い評価を受け、International Journal of Unconventional Computing誌の、真性粘菌を用いたバイオコンピューティングの特集号に招待論文として掲載されることとなった。ボロノイ図の計算は局所的な最適化のみによっては実行できない。即ちこれは平面全体の情報が必要になる計算である。細胞を用いてボロノイ図の計算が可能になったことは、細胞が局所的にではなく、ある種の全体性を持ってして計算を行ったというごとを示唆する。今後は変形体によるチューブ形成のメカニズムをモデル化することを目指し、その全体性と創発性を明らかにすることを試みる。真性粘菌の変形体は単細胞多核の巨大アメーバである。変形体は大きく分けて、盛んに運動・探索を行うシート状のlocomotive frontと、細胞の各部位を結び、栄養の分配や情報伝達を担い、単細胞としての統一性を保つために用いられる細胞質でできたチューブの2種類に分化している。前年度までの研究で我々は、別々の箇所で構築される変形体のチューブネットワークの間に形態的な相同性が現れることを発見した("Emergence ofmorphological order in thenetwork formation of Physarum polycephalum",Biophys.Chem.128,253-260,2007)。即ち同時期に形成されるネットワーク間において、ある種の協同性が存在することが見出された。そこで今年度の研究では、過去の運動とそれに伴って形成される形態が、進行中の細胞運動にどのような影響をもたらすかが実験により観察された。それにより、過去の運動の結果として形成されるチューブの配置がその先の細胞運動に影響していることを示す結果が得られた。この結果は、変形体がその運動の履歴に従ってチューブを形成することにより、チューブの状態及び配置をテンポラリーな記憶媒体として用いていることを示唆する。今後は上記現象のメカニズムを理解することを目標に、チューブ内部における原形質流動や細胞骨格のダイナミクスが、locomotive frontにおける細胞運動にどのような影響をもたらすかを調べていく予定である。近年,変形体のこのような性質を利用して例えば迷路の最短経路解を求めることなどが可能であることが示されており,変形体は集合的知性のモデルとして注目を集めている.

筆者は変形体に関する生化学的・細胞生物学的研究を経て,近年は変形体の行動に関する数理的研究を展開すると同時に,「生命であること」を利用した計算系の実装を試み,構成的に生命とは何かを理解することを目指している.筆者は,変形体細胞が形成するチューブネットワークをグラフ理論的に解析することにより,サブネットワーク同士がトポロジーを共有すること及び,新しいネットワークは過去の運動及びネットワーク形成の履歴に依存して形成されることを発見した.つまり,変形体は細胞体の局所間で交信すると同時に,過去の履歴を参照しつつネットワーク形成を行うことが明らかとなり,細胞システムの適応的行動に関する新たな知見が得られた.また,これらの知見を元に変形体の経路探索に関する数理モデルを構築し,変形体の運動を良く再現することに成功した.
学士課程教育における個の変容を的確に示す成果評価のあり方に関する実証的研究

本研究を進めるためには、学生たちが主体的に参加する授業を作り出すことが必要であるとの認識を持ち、ミニッツペーパーやディスカッションを活用した授業実践を行った。そして、授業中や授業後に収集したデータを分析することから、本テーマに迫った。その結果、ミニッツペーパーへの教員の書き込みや授業中のパフォーマンスは学生たちの主体性の向上に寄与していることが明らかになった。また、授業中に教員が収集したデータと大学が持つデータを関連させることによって、個の変容がかなり詳しく示せることも明らかになった。IT化、国際化等によって急速に変化する社会は、大学に対して生涯学び続け主体的に考える人材の育成を要請するとともに、その教育成果を見える形で示すように求めている。これに応えようと各大学は様々な努力を行ってきている。しかし、その手法は確立されておらず、社会の要請に応えきれていないのが、現状である。従来から、4年間の変容に関しては、個が積み重ねた履修科目の成果、いわゆる成績評価がその任を担ってきた。しかし、それは各担当教員が想定する知識・技能の修得レベルに対しての、彼、彼女の学期末の到達度を示すもの、つまり専門知識の獲得の程度を指し示すものであり、現在の社会が求めるそれらを使っての課題解決力等の評価にはなっていない。この要求に応えるとすれば、知識・技能という単一視点からの評価ではなく、その活用等の態度や行動特性などを見極めた評価が必要になる。本研究に於いては、大学で積み重ねられてきた評価手法の他に、民間企業が開発した社会人基礎力測定法や、米国の大学で普及し日本でも用いられている社会が求める能力を間接的に聞き取る方法を用い、経年的なそれらの結果を組み合わせれば、個の変容を可視化できるのではないかと考え、その実践を行うことになっている。本年度は、個を理解し、的確に把握する授業方法の確立に力を注いできた。このために、従来から行ってきている毎時間のコミュニケーションカードの活用だけではなく、彼らと一緒になって授業空間を作ってきた。これは、教員と学生の距離を非常に近くすることによって、紙面では計れない彼らの能力・態度を見極めたいと考えたからである。コミュニケーションカードやクリッカーによる調査及び成績とを比較分析することによって彼、彼女らの行動特性が明らかになってきている。来年度は、直接測定結果や関節測定結果とも関連させて、個の変容を明らかにしていきたい。社会は、大学に生涯を通して学び続け、主体的に課題に取り組む人材の育成を求めている。また、質保証や教育成果を見える形で示すように要請している。その動きはせかいてきであり、多くの大学でそれに真摯に対応しようという姿勢が広がっている。ただ、4年間という短い期間での成果が何に現れるのか、また、それをどのような形で示すのかを考えたとき、要請に応じる適切な手法を見つけることができずに試行が続いているのが現状である。従来は、大学の提供する授業科目の単位が取得できた、或いは、どの程度の取得状況であったかを大学が示してきた。しかし、それが学生の活用能力等にどのように結びつくかなどという疑問が出され、大学はそれを明確に示すことができずにいる。この手法の開発が本研究の目的になる。本研究では、教員と学生の距離感をできるだけ短くし、学生の多面的な理解が進むような手立ての確立に力を入れている。この一つの方法としてコミュニケーションカードを採用し、その内容と成績評価との関係を調べたが、密接な関係を示すデータは見つからなかった。そこで、学生たちの気質を探るために、クリッカー等を用いて授業中に時間をかけてのデータを収集した。この結果、大学選択や将来のキャリアなどの対する彼らの意識が授業に向かう態度形成に影響を与えているのではないかとの感触を得た。さらに、様々なデータをとり、それらを繋ぎ合わせることによってより深い学生理解につながるのではないかと考えている。この考えを深めるために米国の大学調査も行った。ここでは、各大学ともに社会が求めるものに対応する工夫をしながら、特色を模索していた。これらを参考にして、来年度はデータを繋ぐことによって更なる学生理解を深め、成果の可視化へつなげたい筆頭者が対象とした授業は、専門分野が異なる学生が存在している。そこで、授業評価やクリッカーを用いてデータを収集した。これを分析することによって、各学科の特性が出てきている。この状況を分担者と検討し、その原因を探っている。このデータによる学生気質の解明は、従来の教員の勘による手法とは異なり、授業展開を客観的に考えることができる。そして、これを続けることによって、学生の納得も得られ、距離感の改善につながるものと考えられる。さらに、平成28年2月の米国大学調査では、各大学の特色を出そうという試みを知ることができた。これらを参考に本年度の研究を進めたい。目標に向けての個の変容は、教育そのものである。従来は、その変容結果を科目ごとの評点として一人ひとりの学生に示されてきた。しかし、それは受講した科目における知識・技能の獲得に主眼が置かれており、それらを足し合わせても学生一人ひとりの変容を示すものとはなりえず、学習成果の可視化には不十分と言わざるを得ない。そこで、本研究においては様々なデータを用いて個の変容に迫りたいと考えた。ただ、個の変容を3年間通して追跡することは不可能であり、まずは一つ一つの授業の中での個の変容をデータで示していくことにした。

具体的には、(1)形成的評価や総括的評価から授業改善を考える研究、(2)アクティブラーニングに代表される授業法を用いての授業改善に関する研究、(3)大学全体で十周するデータと教員個人で収集するデータの組み合わせから授業改善を考える研究、そして、(4)米国の大学に於ける初年次教育の調査研究となる。本研究の結果、教員と受講生、受講生と受講生のコミュニケーションを密にし、教員と学生が一体感を持って展開する授業を行い、その過程を文字などを通して記録する事ができれば、学生一人ひとりの変容がかなり的確に示すことができることが明らかになった。もちろん、授業前の準備や授業後の分析などに教員は時間と労力を費やす必要があり、従来のような授業時間内だけの実践というわけにはいかないことも明らかになった。つまり、学生たちに行う単位制の説明(90分の事前学修と90分の受講、そして、90分の事後学修)ではないが、教員がそれ以上の時間を使って授業に取り組む必要性も示された。さらに、学士課程での変容を意識すれば、初年次からの真剣な授業への取り組みがなければ変容は生まれないことも暗示されている。このような授業改善を積み重ねることによってのみ、大学教育の質保証ができる。本研究を進めるためには、学生たちが主体的に参加する授業を作り出すことが必要であるとの認識を持ち、ミニッツペーパーやディスカッションを活用した授業実践を行った。そして、授業中や授業後に収集したデータを分析することから、本テーマに迫った。その結果、ミニッツペーパーへの教員の書き込みや授業中のパフォーマンスは学生たちの主体性の向上に寄与していることが明らかになった。また、授業中に教員が収集したデータと大学が持つデータを関連させることによって、個の変容がかなり詳しく示せることも明らかになった。研究対象とした授業は、本年度から研究筆頭者が担当したものであるが、専門分野の異なる学生が存在することから、本研究の目的に即した分析が可能となっている。そして、分析によって各専門分野ごとの特性が表れて来ている。さらに、年度末には、米国のコミュニテイカレッジを訪問し、その教育を直接見ることができ、学生たちとも話し合うことができた。これによって、可視化に不可欠な授業改善のヒントを得ることができた。大学教育の改善の一歩は、教員と学生の距離を縮め、彼らの考え方や行動特性を的確に把握することである。次年度に於いては、それを可能にする授業の在り方を、学生たちと一緒になってさらに追究したい。これは、授業の展開を教員独自の判断で決めてきた従来の方法からの脱却である。このためには、様々なデータを収集するとともにそれらを繋ぎ合わせて一人一人がデータで語れるようにしなければならない。今年度は最後の年になるので、目標達成に向けて分担者ともども知恵を出したいと考えている。直接評価と関節評価をどのように結びつけ、それを客観性のあるものにするかが勝負どころと思う。高等教育大学教育の可視化は、単に講義を行い、その知識・技能の獲得状況を測定することだけでは不可能である。教員と学生の距離を縮め、彼らの考え方や行動特性を的確に把握することが非常に大切になる。次年度に於いては、それを可能にする授業のあり方を彼らと一緒に模索することにしている。
顕微内視鏡を使った小脳顆粒細胞層のＩｎ　ＶＩＶＯでの情報処理の解明

我々は細胞レベルの解像度で脳深部回路の神経活動をモニターできる顕微内視鏡を開発し、そのシステムを用いて小脳顆粒細胞層の情報処理機構について解析した。実験には小脳顆粒細胞特異的にCaセンサー蛋白(GCaMP2)を発現させた遺伝子操作マウス(Knopfel研より供与)を用いた。まず予備実験として、小脳顆粒細胞からの神経伝達を可逆的に遮断する事のできる遺伝子操作マウス(Wada et al, 2014,)で、、小脳顆粒細胞が関与する眼球運動を同定した。そして、その眼球運動時の小脳片葉での顆粒細胞の活動を顕微内視鏡を用いて観察し、in vivoでの生理刺激により小脳顆粒細胞の活動を可視化した。小脳顆粒細胞の機能をin vivoで明らかにするために、理化学研究所Thomas Knopfel博士より、小脳顆粒細胞特異的にGCaMP2というCaセンサー蛋白を発現させた遺伝子操作マウスの供与を受けた。このマウスはalbinoマウスであったので、C57B6マウスと交配させ、pigmentedのhomoマウスを作成した。このマウスを用いて、反射性眼球運動の一種である前庭眼反射(VOR)、視運動性眼球運動(OKR)の測定と同時に顕微内視鏡を用いた顆粒細胞の活動の観察を開始しているところである。記録部位は水平方向の反射性眼球運動に関与する小脳片葉H-zoneで、この記録同定は現在光学記録に用いている顕微内視鏡先端部からの通電刺激に対して、同側の眼球がnaso-temporal「鼻から耳の方向」へ動くことで行っている。GCaMP2は神経の興奮による蛍光上昇は大きいが、ベースの蛍光強度はあまり高くない。このため、顕微内視鏡からの画像のみでは記録部位の同定が困難であるので、現在syto64などB励起蛍光とoverlapの少ない赤色蛍光による各種細胞の染色を同時に試みている。また同時に細胞特異的なラベリングを目指して、アデノ随伴ウィルス(AAV)により特定のプロモータを持つ細胞だけをラベルする方法も同時並行的に行い、結果を調べているところである。今後、上記の様な方法によるこの赤色蛍光の信号よりmoving artifactのチェックを行った上で、前庭刺激、視刺激に対する顆粒細胞の活動の時空間的パターンを明らかにしていきたい。このマウスを用いて、反射性眼球運動の一種である前庭眼反射(VOR)、視運動性眼球運動(OKR)の測定と同時に顕微内視鏡を用いた顆粒細胞の活動の観察を開始した。並行して、所属研究室で行われている顆粒細胞からの可逆的シナプス伝達阻害マウスでの眼球運動解析で、顆粒細胞-ブルキンエ細胞のシナプス伝達阻害により高速度OKRの反応とOKRの適応性変化に影響がみられた。このため顕微内視鏡での顆粒細胞の反応もこれら眼球運動にfocusして観察しているところである。現時点でわかっていることは、一定速度OKR刺激に対して、顆粒細胞の軸索でCa signalのゆっくりとした上昇が観察される例が散見され始めたということである。この軸索でのCa signalのゆっくりとした上昇は、内視鏡先端からのtrain pulse電気刺激によっても引き起こすことができた。今後、軸索でのCa蓄積に関して、データの蓄積を行なって行きたい。頭部固定した覚醒マウスからの前庭刺激・視刺激に伴う眼球運動を記録すると同時に眼球運動を制御している小脳片葉からのCaイメージングを独自に開発した顕微内視鏡システムで行った。使用したマウスは小脳顆粒細胞特異的にGCaMP2を発現させた遺伝子操作マウス(Thomas Knopfel博士より供与)を用いた。視運動性刺激に対して、小脳顆粒細胞軸索でCa応答が観察された。また、小脳顆粒細胞からのシナプス伝達を遮断できるマウス(Yamamoto et al, 2003, J.Neurosci)を用いて視運動性眼振の適応性変化に対する小脳顆粒細胞の役割を検討した。結果、小脳顆粒細胞からのシナプス伝達を遮断した状態では視運動性眼振の適応性変化は起こらなかった。

しかし、5日間にわたり視運動性刺激トレーニングを繰り返した後に顆粒細胞からのシナプス伝達を回復させると、視運動性眼振の適応性変化が引き起こされ、5日間のトレーニングで形成された学習記憶が表出にいたったものと考えられた。さらに一旦表出まで至った学習記憶は、その後再び小脳顆粒細胞からのシナプス伝達を遮断しても影響を受けなかった。また、5日間の視運動性トレーニングのあと小脳片葉を電気刺激すると、トレーニング前に比べて大きく眼球が動くことより何らかの可塑的変化が脳幹部前庭神経核で生じていることが示唆された。以上より、小脳依存的な運動学習では、小脳顆粒細胞からのシナプス伝達は、学習の獲得には必須ではなく、表出に必須であること。また、小脳皮質以外に脳幹部でも何らかの可塑的変化が生じ、視運動性眼球運動の適応性変化では少なくとも、一旦表出にまで至ると顆粒細胞からのシナプス伝達はもはや必要なくなることなどが明らかになった(Wada et al, 2014, 111, p5357, Proc Natl Acad Sci USA)。小脳顆粒細胞の機能をin vivoで明らかにするために、理化学研究所Thomas Knopfel博士より、小脳顆粒細胞特異的にGCaMP2というCaセンサー蛋白を発現させた遺伝子操作マウスの供与を受けた。このマウスはalbinoマウスであったので、C57B6マウスと交配させ、pigmentedのhomoマウスを作成した。このマウスを用いて、反射性眼球運動の一種である前庭眼反射(VOR)、視運動性眼球運動(OKR)の測定と同時に顕微内視鏡を用いた顆粒細胞の活動の観察を開始した。並行して行った顆粒細胞からの可逆的シナプス伝達阻害マウスでの眼球運動解析で、顆粒細胞ープルキンエ細胞のシナプス伝達阻害により定速度OKRの反応とOKRの適応性変化に影響がみられた。このため顕微内視鏡での顆粒細胞の反応もこれら眼球運動にfocusして観察した。記録部位は水平方向の反射性眼球運動に関与する小脳片葉H-zoneで、この記録同定は現在光学記録に用いている顕微内視鏡先端部からの通電刺激に対して、同側の眼球がnaso-temporal「鼻から耳の方向」へ動くことで行っている。一定速度OKR刺激に対しては、Ca signalのゆっくりとした上昇が観察される例が散見され、これはおもに分子層、すなわち顆粒細胞軸索で起こっている現象と思われた。さらにこのCa蓄積は右小脳ではスクリーンを時計回りに回転させた時のみに生じる方向依存性が見られた。in vivoで、顆粒細胞特異的にCa信号が観察できるマウスを使って、生理刺激・電気刺激に対する反応が観察されてきているので、新規性の高いデータが出つつあるから。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後、OKRの適応性変化時におこる顆粒細胞での反応変化を観察することで、小脳皮質での学習・記憶の神経機構を明らかにしていきたい。現在問題となっているのは、観察している行動に関与している神経回路をちゃんと観察できているかというところであるが、これに関しては、マウスの数が十分に確保されているので、実験の回数を増やすことで、対応していきたい。
パルスフィード電気泳動法による動物病原ブドウ球菌の分子疫学

動物に病原性を示すS. hyicusとS. intermediusは健康な動物にも広く分布するため、これらの感染症の疫学解析には病原株と非病原株の識別が必要である。本研究は、パルスフィード電気泳動法(PFEG)によるDNA解析が2菌種の病原株と非病原株の識別に応用できるか否かを検討した。はじめにPFGEの最適条件を設定し、各種動物由来S. hyicusについて解析を行ったことろ,由来動物種によって特異的なパターンがみられ、本菌種におけるecovarの存在が示唆された。S. hyicusでは豚の感染症が最重要であるが、豚由来病原株は90%が特定のパターンを示し、比較的多型性の非病原株との識別は可能であった。しかし、病原性を規定する遺伝子断片を特定することはできなかった。また、病原株のパターンは一部非病原株でもみられ、発病要因は菌側のみではなく宿主側にも存在することが示唆された。菌体外発現タンパクの解析を行ったところ病原株では特定のタンパクの発現量が著明であり、非病原株のそれは検出率も低く発現量は少なかった。本タンパクの同定、構造遺伝子ならびに調節機構が新たに課題となった。一方、S. intermediusでは菌種内において病原株、非病原株とも遺伝子型がきわめて多様であり、PFGEによる病原株の識別は困難であった。本菌種が遺伝的にheterogeneousであることが初めて明らかとなった。マウス感染モデル系を用いた両菌種の病原性解析では病原株と非病原株の識別は困難であった。この結果は両菌種感染症の発病機構における宿主側の重要性を強く提示することとなった。以上の結果からPFGEによるDNA解析は両菌種特にS. hyicusの生態、疫学マーカーとして有用であることが明らかとなり、PFGEレベルにおける病原性解析は本研究をもって十分と結論される。動物に病原性を示すS. hyicusとS. intermediusは健康な動物にも広く分布するため該菌による感染症の疫学解析には病原株と非病原株の識別が必要である。本研究ではパルスフィールド電気泳動法(PFGE)によるDNA解析が2菌種の病原株と非病原株の識別に応用することを目的とした。平成7年度ではS. hyicusとS. intermediusのPFGE解析における制限酵素、パルスタイム、泳動条件について検討を行ったところ、最適な設定条件が得られた。豚、鶏、牛、山羊由来S. hyicus 138株についてPFGE解析を行い、泳動パターンを比較検討したところ、由来動物種によって特異的と思われるバンドが観察され、本菌種におけるecovarの存在が示唆された。また、豚由来の泳動パターンは国、地域によって多少の違いが見られた。PFGEによる染色体DNAタイピングはS. hyicusの生態、疫学マーカーとして有用であることが明らかとなった。これらの成績は現在Journal of Clinical Microbiologyに投稿中である。また、滲出性表皮炎罹患豚、健康豚および健康鶏由来のS. hyicus 65株についてプラスミドDNA解析を行ったところ、病豚由来株には特定のプラスミドDNAの保有率が高いことが明らかとなった(第120回日本獣医学会にて公表、投稿準備中)。外耳炎をはじめとする犬の各種感染症および健康犬由来S. intermedius 52株についてPFGE解析を行ったところ泳動パターンは区々であり、区分することは困難であった。本菌種は遺伝的にきわめてheterogeneousである可能性が示唆された。その成績についてAmerican Journal of Veterinary Medicineに投稿中である。

動物に病原性を示すS.hyicusとS.intermediusは健康な動物にも広く分布するため、これらの感染症の疫学解析には病原株と非病原株の識別が必要である。本研究は、パルスフィールド電気泳動法(PFGE)によるDNA解析が2菌種の病原株と非病原株を識別するのに応用できるか否かを検討した。平成8年度は平成7年度に引続きパルスフィールド電気泳動法(PFGE)によって得られた菌株間の泳動パターンについて病原株と非病原株の詳細な比較検討を行った結果、豚由来S.hyicusでは病原株について90%の菌株が特定の泳動パターン示したのに対し非病原株では比較的多型性であった。病原性を規定する特定の遺伝子断片を特定することはできなかったが、PFGEによるDNA解析によってS.hyicus病原株の遺伝子型の識別は可能となった。しかし、非病原株からも一部病原株の遺伝子型が見いだされ本菌感染症の発病には菌側のみではなく、宿主側の要因も関連することが明らかとなった。菌体外発現タンパクの解析を行ったところ、病原株では特定のタンパクの発現量が著明であったのに対し、非病原株のそれは検出率も低く発現量も少なかった。本タンパクは分子量からS.hyicusの病原因子の一つと考えられているshETと推定されるが、同定は今後の課題となった。本タンパクは発現量が病原性に関与するものとも推察され、その構造遺伝子を特定することのほか調節機構が重要と思われた。一方、S.intermediusでは菌種内において遺伝子型がきわめて多様であり、PFGEによる病原性識別はできないと結論される。マウス感染モデル系を用いた両菌種各株の病原性解析では病原株と非病原株の識別すわなち疾病および健康の由来に基づく区別は困難であった。この結果は両菌種感染症の発病機構における宿主側の要因の重要性を強く提示することとなった。PFGEレベルにおける両菌種の病原性解析は本研究をもって十分と結論される。