hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二酸化炭素とグリセロールを原料とする新規ポリカーボネート類の創製

二酸化炭素とグリセロールの両者を原料として利用し、鎖状のグリセロールトリカーボネート及び環状のグリセロールジカーボネートを選択的に合成するに成功した。得られたカーボネート類は、ポリ乳酸用の改質剤として、加工性を向上させることが示された。本法は、未利用資源から機能性材料へ変換する好例の1つとして考えられる。二酸化炭素の排出削減や有効利用は急務の課題である。そのため、安価で毒性がなく豊富に存在する二酸化炭素を理想的なC1源としてとらえ、利用する試みが活発に行われている。また、油脂業界において副生物として排出されてきたグリセロールも、近年のバイオディーゼル燃料の生産に伴い、その副産量が著しく増加し、有効利用が強く望まれている。そこで我々は、これら両者を原料として利用し、付加価値のある化学薬品への変換を検討した。その結果、本年度の研究において、有機強塩基を利用することにより、二酸化炭素とグリセロールと臭化ブチルから冷凍機油への利用が可能なトリブチルカーボネートを得ることに成功した。本研究の全体計画では、ポリカーボネート類の合成を目指すが、そのためには、低分子量のカーボネート類を効率良く合成する必要がある。そこで、トリブチルカーボネート合成をモデル反応として、反応条件の検討を行った結果、二酸化炭素加圧下、NMP溶媒中、グアニジン誘導体塩基を用いた場合に、最も高い収率で、目的物が得られることが明らかになった。ただし、現段階では、過剰の臭化ブチルと塩基を使用しなければならない。これらの知見は、次年度以降に行うポリカーボネート合成において、有益な指針となりうる。温暖化対策として二酸化炭素の有効利用は急務の課題である。また、バイオディーゼル燃料の生産に伴い、グリセロールの有効利用も強く望まれている。本年度の研究では、これらの原材料を有効に利用して、カーボネート類の重合体の合成を目指した。前年度は、二酸化炭素とアルコールと臭化ブチルから鎖状のグリセロールトリブチルカーボネートを合成することに成功している。しかし、環状のグリセロールジブチルカーボネートの副生を抑制するため、過剰の強塩基と臭化ブチルを使用する必要があった。本年度は、まず、臭化ブチルの代わりにヨウ化ブチルを用いることで、過剰の原料を用いることなく、比較的高い選択率で鎖状のトリブチルカーボネートが合成できることを明らかにした。次いで、その条件を基に、ヨウ化ブチルの代わりに1,4-ジヨードブタンを用いて、カーボネート重合体の合成を検討した。その結果、グリセロール/ジヨードブタンを1/3の量比で反応を行った場合に、鎖状のオリゴマーが主生成物として得られた。さらに、前年度に見出した合成法を利用し、異なるアルキル鎖長や官能基を有する種々のグリセロールトリアルキルカーボネート類の合成にも成功した。これらの生成物は、低分子量あるいは中程度の分子量でも使用できる樹脂添加剤として期待される。温室効果ガスの1つとして考えられている二酸化炭素の有効利用は急務の課題である。また、バイオディーゼル燃料の生産時に副生するグリセロールの有効利用も強く望まれている。本年度の研究では、これら両者の原料からカーボネート類を合成し、それらを機能性材料として利用することを目指した。前年度までに、二酸化炭素とグリセロールとハロゲン化アルキルから鎖状のグリセロールトリアルキルカーボネートを合成することに成功している。そこでまず、前年度の知見を基に、適切な反応条件を設定し、環状のグリセロールジアルキルカーボネートを効率よく合成できることを示した。本反応は、常圧・50°Cの温和な条件下で行うことができ、反応条件を変えるだけで、鎖状及び環状のカーボネート類を選択的に合成することができる。次に、合成した上記のカーボネート類を樹脂用改質剤として利用することを試みた。本法は、余剰工業原料を使用するグリーンな合成であるが、その特徴を活かすため、代表的なグリーンプラスチックスの1つであるポリ乳酸の改質剤として利用した。ポリ乳酸に対して、合成したカーボネート類を20部添加し、混練、成形を行ったところ、大きな可塑性が付与され、成形加工性が著しく向上することを確認した。従って、二酸化炭素とグリセロールを原料として直接使用し、ポリ乳酸用の添加剤へ変換することが可能になった。本合成法は、未利用資源を機能性材料へ変換する好例の一つとして考えられる。鎖状のグリセロールカーボネート類のオリゴマーや、異なるアルキル鎖長や官能基を有する種々のグリセロールトリアルキルカーボネート類の合成に成功した。これらの合成法及び得られた生成物は、次年度の研究課題である機能性カーボネート類の合成に利用できる。有機合成機能性カーボネート類の合成を目指し、本年度に合成した鎖状のグリセロールトリカーボネート類及び副生物として得られた環状のグリセロールジカーボネート類を樹脂添加剤として利用する。低分子量のトリブチルカーボネートの合成に成功した。

ポリカーボネート合成を行う際の反応条件に関する知見が得られた。次年度開始直後に、実験に必要な消耗品を購入するため。本年度の合成条件に関する結果を踏まえ、過剰のアルキル化剤の使用の回避あるいはポリマー前駆体となる低分子量のカーボネート類の合成を検討し、ポリカーボネート合成を試みる。ガラス器具、カラム等の消耗品を購入する。年度末の学会出張を1日短縮したため。次年度の初めに有機薬品の購入に使用する。
DNAらせん鎖の配向固定化フィルムの超構造

本研究では、DNA-脂質複合体を有機溶媒からキャストしてフィルムを作製し、一方向に延伸することにより、二重らせん鎖を配向固定化したフィルムを作製し、DNAの人工構造化による新機能を発現することを目的にして、研究を行い以下のような成果を得た。1)サケ精子由来のDNA(分子量200万以上)を超音波照射により分子量10万くらいの長さに切断し、DNA中のリン酸アニオンと等モルのカチオン性脂質を加えて、DNA-脂質複合体ポリイオンコンプレックスの沈殿を得た。これをクロロホルムなどの有機溶媒に溶解して、円偏光二色性CDスペクトルや500MHz-NMRスペクトルなどから有機溶媒中でもDNA-脂質複合体は水中と同じように二重らせん構造を形成していることを確認した。2)これをガラス板上にキャストしてDNAフィルムを作製した。このフィルムは水に不溶であり、基板からはがして一方向に延伸することにより、DNAらせん鎖が延伸方向に配向したフィルムを得た。X線回折によりフィルム中での塩基間距離、二重らせん鎖間の距離や配向方向などを決定した。二重らせん鎖の配向は偏光紫外吸収の二色性比からも求めることが出来た。
SOIデバイスのソフトエラー耐性強化

最終年度(平成24年度)の研究成果活性層・支持基板が共にn形のSOI基板(n/n),および高不純物濃度の支持基板を有するSOI基板(n/n^+)上にp^+nダイオードを作製し逆バイアス印加状態において重イオン(15MeV,酸素イオン)照射誘起過渡電流の測定を行ったn/nデバイスでは、アノード領域に照射した場合に、アノードおよび基板電極で過渡電流が発生すること,また両者の収集電荷量は照射により活性層中で発生した電荷量の約2倍程度となることを確認した.これより,過渡電流の主成分は埋め込み酸化膜を介した変位電流であることを確認した.一方n/n^+デバイスでは,アノード領域照射時の過渡電流が測定限界以下に抑圧できることを確認した.また,アノード拡散層エッジ部に照射した場合でも収集電荷量は発生電荷量程度に抑制可能であることを確認した.以上より,支持墓板の高不純物濃度化により,SOIデバイスの更なるソフトエラー耐性強化が可能となることを示したまた.SOI-MOSFETに対し照射実験を行った結果,ドレイン部に照射した場合に大きな過渡電流がドレインおよび板電極において発生することがわかった.これより,SOI-M0SFETにおいても埋め込み酸化膜を介した電流成分が大きく,上記手法が有効であることを確認した.研究期間全体における研究成果3次元デバイスシミュレーションにより,SOI-pnダイオードの重イオン照射誘起電流の解析を行った結果,指示基板表面の空乏層幅制御により過渡電流の低減が可能との結果を得た.本結果検証のため、実デバイスを作製し照射実験を実施した結果,基板への電圧印加や高不純物濃度を有する支持基板を用いることにより支持基板表面の空乏層幅制御することにより変位電流が抑圧可能であり,SOIデバイスの更なるソフトエラー耐性向上技術として適用可能であることを実験的に立証した.Si基板上のデバイス作製技術を活用し,支持基板および活性層がn形のSOI基板上に,p+nダイオードおよびpチャネルMOSFETの試作を,大学内のマイクロ機能デバイス研究センターの設備を用いて行った.デバイス毎に活性層を分離した構造とすることにより,埋め込み酸化膜層(BOX層)を介したリーク電流低減を実現し,良好な電気的特性を確認した.作製したSOI-pnダイオード(逆バイアス印加)に対し,日本原子力研究開発機構の加速器を用い,加速エネルギー15MeVの酸素イオンを照射し,シングルイオン照射誘起過渡電流を測定した.その結果,アノード領域に照射した際に過渡電流が観測され,その時間積分値である収集電荷量は活性層での発生量以上となることを確認した.また,各端子の過渡電流およびシミュレーション結果との比較から,この超過分の電荷収集はBOX層を介した変位電流に起因することを明らかにした.この変位電流は,支持基板表面の空乏層電界による照射誘起発生電荷の収集により発生する.よって,収集電荷量は空乏層幅に大きく依存すると考えられる.そこで,デバイスシミュレータにより解析した結果,支持基板・活性層とで異なる不純物タイプのSOI基板,ないしは高不純物濃度の支持基板を有するSOI基板を用いて空乏層幅を減少することにより変位電流が抑制され, SOIデバイスの照射誘起電荷収集量の抑制が可能となることを明らかにした.また,Bulk Si基板上のMOSFETを用いて,酸化膜を介した電荷収集のトータルドーズ効果を評価した結果,吸収線量6.3 kGy(SiO2)のγ線照射後においても酸化膜のリーク電流の顕著な増加は観測されず,SOIデバイスのソフトエラー耐性強化のためには,BOX層を介した変位電流の抑制が重要であることを確認した(電子情報通信学会論文誌採録決定).最終年度(平成24年度)の研究成果活性層・支持基板が共にn形のSOI基板(n/n),および高不純物濃度の支持基板を有するSOI基板(n/n^+)上にp^+nダイオードを作製し逆バイアス印加状態において重イオン(15MeV,酸素イオン)照射誘起過渡電流の測定を行ったn/nデバイスでは、アノード領域に照射した場合に、アノードおよび基板電極で過渡電流が発生すること,また両者の収集電荷量は照射により活性層中で発生した電荷量の約2倍程度となることを確認した.これより,過渡電流の主成分は埋め込み酸化膜を介した変位電流であることを確認した.一方n/n^+デバイスでは,アノード領域照射時の過渡電流が測定限界以下に抑圧できることを確認した.また,アノード拡散層エッジ部に照射した場合でも収集電荷量は発生電荷量程度に抑制可能であることを確認した.以上より,支持墓板の高不純物濃度化により,SOIデバイスの更なるソフトエラー耐性強化が可能となることを示したまた.SOI-MOSFETに対し照射実験を行った結果,ドレイン部に照射した場合に大きな過渡電流がドレインおよび板電極において発生することがわかった.これより,SOI-M0SFETにおいても埋め込み酸化膜を介した電流成分が大きく,上記手法が有効であることを確認した.研究期間全体における研究成果

3次元デバイスシミュレーションにより,SOI-pnダイオードの重イオン照射誘起電流の解析を行った結果,指示基板表面の空乏層幅制御により過渡電流の低減が可能との結果を得た.本結果検証のため、実デバイスを作製し照射実験を実施した結果,基板への電圧印加や高不純物濃度を有する支持基板を用いることにより支持基板表面の空乏層幅制御することにより変位電流が抑圧可能であり,SOIデバイスの更なるソフトエラー耐性向上技術として適用可能であることを実験的に立証した.1) SOI-pnダイオードおよびSOI-MOSFETの試作:これまでに実施した作製プロセスを応用し,各種SOIデバイスの試作を行った.その結果,ICPエッチングによる活性層分離などのプロセス追加により,良好な電気的特性を有するデバイス作製プロセスを確立し,当初の目的を達成した.2) SOIデバイスに対する重イオン照射実験の実施:日本原子力研究開発機構において,作製したSOI-pnダイオードに対し,酸素イオンの照射実験を行い,各端子においてシングルイオン照射により誘起される過渡電流の測定を実施した.その結果,照射誘起電流および種集電荷量の照射中印加電圧依存性,イオン照射位置依存性を明らかにした.また,測定結果の解析より,異常電荷収集の原因がBOX層を介した変位電流であることも確認し,当初の目的をほぼ達成した.3)照射誘起電流抑制に関する検討:本予算にて購入したデバイスシミュレータを用いて,重イオン照射誘起過渡電流抑制について検討を行った.その結果,SOI構造の支持基板の不純物のタイプおよび濃度の制御により,BOX層を介した電荷収集が抑制できる可能性を示し当初の目的をほぼ達成した.4)トータルドーズ効果に関する検討:放射線吸収線量増加に対する,絶縁膜を介した電荷収集機構の変化を評価するため,Bulk Si上に作製したMOSFETを用いて照射実験を行った.その結果,吸収線量増大に伴うゲート絶縁膜中の捕獲電荷密度増加により絶縁膜電界が大きく変化するものの,基本的な電荷収集メカニズムは変化しないことを明らかにした.今年度の研究推進により,支持基板・活性層とで異なる不純物タイプのSOI基板,ないしは高不純物濃度の支持基板を有するSOI基板を用いてデバイスを作製することにより,重イオン照射誘起電流および収集電荷量が抑制可能であることを示唆する結果を,シミュレーションにより得た.そこで次年度は,上記の基板を用いたデバイスを試作し,照射実験によりソフトエラー耐性強化について確認を行う予定である.また,実験結果とシミュレーション結果との比較により,支持基板表面における空乏層電界分布を収集電荷量との関係を明らかにする.また,提案する照射誘起電流抑制手法を,各種デザインルールのデバイスに対し適用した場合のシミュレーションを行い,素子寸法縮小化が及ぼす影響について評価を行い,現行および次世代の集積回路への適用の可能性について検討を行う.主に,3次元デバイスシミュレータ年間使用契約費用,およびSOI基板や材料ガスなど,SOIデバイス作製用消耗品費として使用する予定である.また今年度後期に,支持基板の不純物のタイプおよび濃度が異なるSOI基板を購入し,平成24年度の試作に向けた準備を行う旨計画していたが,日々変化する少量数の購入市場において希望に合致する仕様の基板が見いだせなかったため,SOI基板の購入は平成24年度に実施することとした.
生体要因による薬物動態の変動：サイトカインシグナルを介した調節メカニズムの解明

本年度は、前年度までに解析モデルとして選定した4遺伝子(薬物代謝酵素と薬物応答性転写因子について、各々2つ)のプロモーター領域についての解析、1レポーター解析による炎症性サイトカインIL-6刺激に対する応答性に必要とされるプロモーター領域の絞り込み、2結合モチーフ探索ツール及び既報論文からの情報を利用したプロモーター領域に作用する候補転写因子の絞り込み、を進めた。ヒト肝癌由来HepG2細胞を用いたレポーター解析の結果に基づき、4つのモデル遺伝子のうち、3つについて、再現性を確保しながらIL-6応答性に必要とされるプロモーター領域をそれぞれ約300 bp、約400 bp及び約300 bpまで絞り込んだ。そこで、3つのモデル遺伝子の絞り込んだプロモーター領域に共通して存在する転写因子の予測結合配列と既知のIL-6応答性の報告を指標にして、モデル遺伝子のIL-6応答性に関与し得る候補転写因子を5つ選定した。HepG2細胞において、各々モデル遺伝子と候補転写因子のIL-6刺激下での経時的な発現変動を比較したところ、モデル遺伝子はそれぞれ刺激後2時間と6時間にmRNA発現レベルの有意な減弱が観察される2つのグループに分かれること、一方、既報の通り、5つの候補因子のうち、3つは刺激後2時間でmRNA発現レベルが有意に上昇すること、を確認した。並行して、5つの候補因子のうち、4つの発現プラスミドを新たに作製、または分与により取得し、それらを用いてモデル遺伝子のIL-6応答性領域を含む短いプロモーター領域のレポーター解析を実施した。その結果、4つの候補因子うち、2つはそれぞれ異なるモデル遺伝子のプロモーター領域の転写活性を抑制することを見出した。他方、IL-1b及びTNFa刺激下でのレポーター解析の実施条件(内部標準用レポータープラスミドの選定など)の最適化を実施した。炎症応答時の薬物動態関連因子の発現抑制メカニズムの体系的な理解を目指し、前年度までの成果に基づき、本年度はHepG2細胞を解析系の軸に据え、選定したモデル遺伝子のプロモーター領域の炎症性サイトカインIL-6に対する応答性に関わる領域の絞り込みと、その領域に作用してIL-6に応答した転写抑制を介在する転写因子の検討を進めた。これまでに、3つのモデル遺伝子についてIL-6応答性に必要とされるプロモーター領域をそれぞれ約300400 bpまで絞り込み、これらの領域に存在する共通した転写因子の予測結合配列とIL-6応答性の報告を基に候補転写因子を選定して解析を進めており、複数の候補因子について継続的な解析に向けて良好な結果を得た。これらの結果を基にして、各々候補因子の機能的変異体(構成的活性化型、DNA結合能欠失型など)を用いた解析実施の準備を進めている。他方、IL-6以外の炎症性サイトカインを用いたレポーター解析の実施条件も整った。今後は、これらを基盤として、モデル遺伝子のプロモーター領域の炎症性サイトカインに応答した調節メカニズムを明らかにしていく。実施期間第2年次に、所属研究機関の変更に伴う研究実施環境の整備などの理由から実施計画に多少変更点を生じたため、本研究の実施期間延長の承認を受けた。今後の解析項目は明確化されており、本研究課題の最終目的に向けて大きな支障はないと考える。基本的には、交付申請書に記した計画に従い研究を進める。本年度の実施成果を基に、HepG2細胞を解析系の軸に据え、選定したモデル遺伝子のIL-6に応答した発現抑制メカニズムの解析を進める。各々解析モデル遺伝子のIL-6応答性に必要とされるプロモーター領域において、共通に存在する転写因子の推定結合配列と既報のIL-6応答性を指標にして選定した候補転写因子のIL-6応答性への関与の検討を進め、2つの候補因子については継続的な解析に向けて良好な結果を得ている。そこで、これら2つを中心に解析を進める。機能的変異体の強制発現や特異的siRNAによる発現ノックダウンによって候補因子のHepG2細胞内での質的・量的発現を調節してレポーター解析や遺伝子発現解析、ChIP解析などを実施して、どのようにこれら候補転写因子がモデル遺伝子のIL-6応答性に関与するのかを明らかにする。並行して、IL-6以外の炎症性サイトカインについて、IL-6応答性の場合と同様の手法を用いてモデル遺伝子のプロモーター領域の解析を実施する。さらに、HepG2細胞で得られた結果について、ヒト初代培養肝細胞に近い特徴を有するHepaRG細胞を用いて細胞株間でのメカニズムの保存性に焦点を当てて検証する。これらの解析から得られた結果を基に、複数の解析モデル遺伝子のプロモーター領域の異同を明らかにし、肝臓における炎症性サイトカインに応答した薬物動態関連因子群の発現抑制メカニズムの体系的な理解を進める。本年度は、HepaRG細胞を用いて、ヒト肝臓でのサイトカイン応答性を高く保持・反映する薬物動態関連因子(薬物代謝酵素、薬物トランスポーター)の発現変動機序のインビトロ解析モデルの検討・選定を行った。薬物動態関連因子の肝細胞特異的な「構成的」発現及び薬物曝露に伴う「誘導的」発現におけるサイトカイン応答性の解析を目的とし、それぞれに適当な培養・処理条件を検討・選定した。次いで、それぞれの条件下、代表的なサイトカイン(IL-6、IL-1b、TNFa)の刺激に応答した主要な薬物動態関連因子及びこれらの転写制御に関わる転写因子群のmRNA発現変動を解析した。

その結果、「構成的」発現の解析条件下、1何れのサイトカインも薬物動態関連因子及び転写因子の発現を普遍的に強く抑制する、2各薬物動態関連因子及び転写因子はサイトカインそれぞれに対して異なる応答性(抑制強度、反応時間)を示す、ことを見出した。とりわけ、「誘導的」発現の解析条件下、各種サイトカイン前処理後に薬物応答性転写因子(PXR、CAR)のリガンドを処理し、両転写因子の共通の標的薬物動態関連因子の発現誘導を解析した結果、サイトカインによる抑制には、転写因子のmRNAレベルでの量的変化と共に、翻訳後修飾を介した機能調節が関わる可能性が示された。また、ヒト肝癌細胞株及び大腸癌細胞株を用いて検討した結果、HepaRG細胞と比較して、薬物動態関連因子及び転写因子のサイトカイン応答性は限定的であることが明らかとなった。これらの解析結果を受け、1インビトロ解析モデルとして適当な薬物動態関連因子及び転写因子の選定とそれらのプロモーター領域の単離及びレポーターアッセイ系の構築、2細胞内シグナル経路の阻害薬処理条件の検討、を行った。今後、これらの解析系の構築及び解析諸条件の最適化を行い、薬物動態関連因子の発現変動機構の解析を進める予定である。本年度は、申請計画に沿い、HepaRG細胞を用いたサイトカインに応答した薬物動態関連因子の発現変動機序のインビトロ解析モデルの検討と選定に重点を置いて研究を進めた。薬物動態関連因子の発現を肝細胞特異的な「構成的」発現と薬物曝露に伴う「誘導的」発現に大きく分けて捉え、それぞれの解析に適当な培養・処理条件(培地、培養日数、サイトカイン処理濃度、薬物処理濃度)を選定した。解析の結果、今回用いた代表的な3種のサイトカインに対して、何れの薬物動態関連因子も強く発現抑制を受けると共に、それぞれ異なる応答性を示すことを見出すことができた。また、薬物応答性転写因子は、サイトカインによってmRNA発現レベルでの量的変化と共に、翻訳後修飾を介した機能調節を受ける可能性が示された。HepaRG細胞に引き続き、ヒト肝癌細胞株HepG2及び大腸癌細胞株LS180を用いた解析条件の検討を進め、それぞれの細胞株における各種薬物動態関連因子及び転写因子群のサイトカイン応答性を確認した。これらの結果を踏まえ、インビトロ解析モデルとして適当な薬物動態関連因子及び転写因子を選定し、それらのプロモーター領域の単離及びレポーターアッセイ系の構築に着手すると共に、細胞内シグナル経路の阻害薬処理条件の検討を進めた。以上のことから、計画当初の解析項目に小さな実施変更があるが、最終的な目的に向けて順調に研究は進行していると考える。本年度は、初年度にヒト肝癌由来HepaRG細胞を用いて炎症性サイトカインに応答したmRNA発現変動を指標にして選定した薬物動態関連因子(薬物代謝酵素、薬物トランスポーター)と薬物応答性転写因子について、それらの肝細胞特異的な「構成的」発現の解析系としてヒト肝癌由来HepG2細胞の有用性を検討した。これまでにHepG2細胞におけるそれらのサイトカイン応答性はHepaRG細胞と比較して限定的であることを見出していた。そこで、再現性と抑制強度に基づき解析モデルとして薬物代謝酵素と薬物応答性転写因子をそれぞれ2遺伝子ずつ選定した。
子どもが利用できる教室用ソフトウェア・ツールの開発

目的:本研究は,授業の中で子どもたちが教材内容を深く理解し,納得するためのパソコンのソフトウェアを作成し,実際の授業実践でその妥当性を検証することを目的とした.研究の成果. NECPC-9801VM2の上での3D-LOGOによって,小学校低学年に数の概念,加法と減法の関係を理解させるツールとして「やぐらのぼり」とよぶソフトを開発した.基本的な概念は,タテに置かれた数直線(「やぐら」)をモグラが地上もしくは地下から上下することで, a+□=C,□+b=c,p-q=□, p-□=r, □-q=r(□は未知数,他は既知)の相互関係を納得させるものであった.同一のソフトで,低学年(3年生)と高学年(6年生)に授業実践で使用してみた.対象は,静岡県の公立小学校.低学年クラスでは数名,高学年クラスではほぼ全員が,加法と減法の意味,相互関係.未知数の位置のちがいが解法とどうかかわるかなどについての理解と納得をもたらした.その後,このソフトはマッキントッシュのハイパー・カードでのソフトに発展し,目下試作中である. (いずれも未発表).結論と今後の展望:算数を「答えを出す」ためだけの手続きだとする考え方は,予想以上に根強く,パソコン教材への興味の強さにもかかわらず,それほどの効果は得られなかった.ものごとの「意味」を発見し,問い直すという実践は,他の教科もふくめて,もっと本格的に研究され,開発されるべきであろう.ただし,子どもの学習のメカニズム,とくにその認知過程における「納得」という状態が,そもそもどのようなものか,どのようにしてつくり出せるかについての基礎研究がもっと進められるべきであろう.本研究はそのための手がかりをさぐる段階にとどまったものであるが,今後の方向は見出されたと考えられる.目的:本研究は,授業の中で子どもたちが教材内容を深く理解し,納得するためのパソコンのソフトウェアを作成し,実際の授業実践でその妥当性を検証することを目的とした.研究の成果. NECPC-9801VM2の上での3D-LOGOによって,小学校低学年に数の概念,加法と減法の関係を理解させるツールとして「やぐらのぼり」とよぶソフトを開発した.基本的な概念は,タテに置かれた数直線(「やぐら」)をモグラが地上もしくは地下から上下することで, a+□=C,□+b=c,p-q=□, p-□=r, □-q=r(□は未知数,他は既知)の相互関係を納得させるものであった.同一のソフトで,低学年(3年生)と高学年(6年生)に授業実践で使用してみた.対象は,静岡県の公立小学校.低学年クラスでは数名,高学年クラスではほぼ全員が,加法と減法の意味,相互関係.未知数の位置のちがいが解法とどうかかわるかなどについての理解と納得をもたらした.その後,このソフトはマッキントッシュのハイパー・カードでのソフトに発展し,目下試作中である. (いずれも未発表).結論と今後の展望:算数を「答えを出す」ためだけの手続きだとする考え方は,予想以上に根強く,パソコン教材への興味の強さにもかかわらず,それほどの効果は得られなかった.ものごとの「意味」を発見し,問い直すという実践は,他の教科もふくめて,もっと本格的に研究され,開発されるべきであろう.ただし,子どもの学習のメカニズム,とくにその認知過程における「納得」という状態が,そもそもどのようなものか,どのようにしてつくり出せるかについての基礎研究がもっと進められるべきであろう.本研究はそのための手がかりをさぐる段階にとどまったものであるが,今後の方向は見出されたと考えられる.
風速・風向予測モデルを用いた小型風力発電機の最大出力制御法の確立と検証

本研究は,小型風力発電機の最大出力制御における高効率化を目的として,風速予測値を用いた制御手法の提案とその有用性の検討を行った.良好な制御性能を得るためには風速・風向の予測精度を向上させる必要があり,統計的手法に基づく種々の風速・風向予測モデル(複素ニューラルネットワーク,サポートベクターマシン,1次元畳み込みニューラルネットワーク)を提案し,予測精度の向上を図った.また,チョッパ回路を用いた最大出力制御システムのシミュレーションモデルを構築し,風速予測値に基づく高効率化の検討を行ったが,風速予測値の依存度が高く,さらなる予測精度の向上が必要であることが明らかとなった.平成27年度は研究実施の初年度ということで,研究環境の構築が第一目的でり,当初の研究計画通り,風速・風向同時予測システムの構築を行った.具体的には,1.メソ数値予報モデル格子点値(MSM-GPV)自動取得システムの構築,2.風速・風向観測システムおよび気象観測データサーバーの構築,3.素NNを用いた風速・風向同時予測システムの構築を行った.まず,大域的な気象情報として気象庁が提供するMSM-GPVを定期的に自動取得可能なソフトウェアを開発した.次に,数秒間隔で風速・風向を同時観測可能な風速・風向計(設備備品費として計上)を本学電気電子棟屋上に設置し,気象観測データサーバー(設備備品費として計上)にMSM-GPVとともに管理・運用可能なシステムを構築した.さらに,階層型複素ニューラルネットワークを用いて,風速・風向の同時予測システムについて検討した.風を複素ベクトルとして表現することで,風速と風向を1つのまとまった情報として扱うことを可能とし,複素情報の処理能力に優れた階層型複素ニューラルネットワークを用いて予測精度の向上について検討した.しかしながら,一定の予測精度向上は得られたものの,最大出力制御への応用を考えた場合,十分な精度ではなかった.そこで,アメダスを用いて風速データを複数のクラスに分類し,クラス毎に階層型ニューラルネットワークを用いた風速予測システムを構築した.そして,各クラスの風速予測システムをファジィ推論に倣った手法で加重平均することで,最終的な風速予測値を得るシステムを構築した.その結果,予測精度の向上効果があることが確認でき,また,複数地点においてもアメダスデータを用いて検証したところ,予測精度向上の傾向が確認でき,多くの知見を得ることができた.以上の研究成果は,国際会議1件,国内会議で2件,論文発表を行った.当初の計画通り,風速・風向計の設置および観測データ収集ソフトウェアの開発ができ,観測データの収集をスタートさせることができた.また,気象観測データを用いて,階層型複素ニューラルネットワークを用いて風速・風向予測システムを構築し,予測精度向上効果があることも確認できた.しかしながら,計画当初以上の予測精度を得ることはできなかった.そこで計画を若干変更し,予測システムの再検討を行った.具体的には,風速を幾つかのクラスに分類し,そのクラス毎に階層型ニューラルネットワークを用いて予測システムを構築した.さらに,各予測システムの予測結果をファジィ推論に倣って加重平均し,予測精度の更なる向上を実現した.以上のことから,本研究は概ね順調に進展していると判断した.平成28年度は,平成27年度に構築したメソ数値予報モデル格子点値(MSM-GPV)自動取得システムにより得られる各種気象予報データ,および,風速・風向観測システムにより得られた観測データを用いて,風速予測システムの予測精度向上を試みた。特に,風速の増減予測のタイミングにズレを生じていることが,思うように予測精度が向上しない原因であることを明らかにし,その上で,風速の増減予測に特化した予測システムの構築を試みた。具体的には,パターン認識手法の一つであるサポートベクターマシンを用いて風速の増減識別を試みた。その結果,6割強の確率で風速の増減予測が可能となった。また,風速・風向予測値を用いた最大出力制御法の構築を目的として,風力発電機のシミュレーションモデル(数学モデル)を導出するために風車シミュレータを試作した。試作した風車シミュレータは,購入した風力発電機とDCモータを直接カップリングしたもので,DCモータを制御することで任意の風速を模擬し,そのとき風力発電機の出力が計測できるようになっている。さらに,導出したシミュレーションモデルを用いて,予測風速を用いた風力発電システムの最大出力制御システムのシミュレーション解析を行った。シミュレーション環境にはPSIMを用い,降圧チョッパ回路を用いた制御システムを構築して提案する最大出力制御アルゴリズムの基礎的な検討を行った。その結果,100%の風速予測精度が得られると仮定した場合では,ある程度の制御性能の向上は確認できた。しかし,100%の風速予測精度を得ることは実際には不可能であるため,現実的な予測精度の場合について,制御性能の向上効果を検討することが課題として残った。平成27年度では,概ね当初の計画通り研究を進めることができた。しかし,計画当初以上の風速予測精度を得ることができなかったため,研究計画を若干変更して研究を進めた。その結果,風速予測精度が最大出力制御で必要とするレベルまで達成できていない理由が,風速の増減タイミングのズレにあることが明らかとなった。そこで,平成28年度ではさらに研究計画を変更し,サポートベクターマシンを用いて風速の増減予測を試みた。その結果,一定の成果を得ることができた。さらに,当初の研究計画通り,風速・風向予測値を用いた最大出力制御法の構築に着手し,風車シミュレータの試作および提案する制御アルゴリズムの有用性を検証するためのシミュレーション環境を構築した。以上のことから,本研究は概ね順調に進展していると判断する。

本研究の最終年度である平成29年度は,当初,試作機の設計・製作と実験による最大出力制御法の研究を目的として,(1)バッテリーを用いた昇圧チョッパ型パワーコンディショナの設計・試作と提案する最大出力制御法の有用性を実験により検証,(2)研究成果のまとめと報告を計画していた.しかし,(1)については,計画を前倒しして平成28年度にから着手していたため,平成28年度の研究により得られた成果を踏まえ,本年度は最大出力制御の制御性能に大きく依存する風速予測精度のさらなる向上を目指すこととして風速予測モデルの検討を行った.特に,本研究で用いているニューラルネットワーク(NN)のブレークスルーとなった深層学習に着目し,一次元畳み込みNN(1D-CNN)と時系列データの解析に有効であるLong Short-term Memory(LSTM)を用いた風速予測モデルを提案した.そして,初年度(平成27年度)に構築した風速・風向観測データ収集システムを用いて2010年2015年までのデータ収集し,それを用いて学習させた.予測モデルの評価は2016年のデータを用いて行った.提案予測モデルの優位性の比較対象としては,典型的な5層のディープニューラルネットワーク(DNN)を用いた.その結果,1D-CNNとLSTMを適切に組み合わせることで,予測精度が向上できることを確認し,最大出力制御の制御性能向上が確認できた.(2)の研究成果のまとめと報告については,学術雑誌レター1件,国際会議1件,国内会議1件を行い,研究室のホームページを通じて論文題目や雑誌名等の詳細を公開している.本研究は,小型風力発電機の最大出力制御における高効率化を目的として,風速予測値を用いた制御手法の提案とその有用性の検討を行った.良好な制御性能を得るためには風速・風向の予測精度を向上させる必要があり,統計的手法に基づく種々の風速・風向予測モデル(複素ニューラルネットワーク,サポートベクターマシン,1次元畳み込みニューラルネットワーク)を提案し,予測精度の向上を図った.また,チョッパ回路を用いた最大出力制御システムのシミュレーションモデルを構築し,風速予測値に基づく高効率化の検討を行ったが,風速予測値の依存度が高く,さらなる予測精度の向上が必要であることが明らかとなった.平成27年度の研究によって,風速予測システムの構築を行ったが,風力発電機の最大出力制御に有効な予測時間が決定できておらず,今後は,最大出力制御に最適な予測時間の推定と,それに基づく予測精度の検証を継続して行う.また,当初の計画通り,風速および風向変化を考慮した小型風力発電機の動的非線形モデルの構築と,予測風速に基づく最大出力制御アルゴリズムの構築を行う.さらに,実際の風力発電機を用いた実証実験を行う必要があり,実験システムの構築を行う.最終年度は,試作システムを用いて実験により提案する予測風速に基づく最大出力制御アルゴリズムの検証をすることが最大の目標となる。良い成果を得るためには,風速・風向予測精度の更なる向上に加え,制御アルゴリズムの再検討が必要となる。
基本周波数情報を手がかりとした声調の言語間対照研究

本年度は、昨年度の成果とあわせて検討する形で、さらに以下の研究を行った。1)中国語とタイ語について、分析結果に基づいて対照し、この2つの声調言語のあいだでの声調の類似点と相違点について検討した。1音節語と2音節語について分析を行ったことで、声調の実現形でのピッチカーブの一貫性を観察することができた。2)取り上げる予定であった3つ目の声調言語であるビルマ語について、タイ語、中国語と同様の手順で実験を行い、1音節語と2音節語についてピッチカーブを抽出した。3)声調の聞き分けに基本周波数情報がどのように関わるかを確認するために、ピッチカーブに手を加えた合成音声を作成し、タイ語について聴取実験を行った。その結果、タイ語の声調の聞き分けには基本周波数情報が最も関与しており、そのピッチカーブの形の中にcritical pointがある可能性が示唆された。上記の1)2)までで、当初予定していた3つの声調言語(中国語、タイ語、ビルマ語)についての基本周波数のパタンを抽出することができた。引き続いてこれら3つの声調言語について比較対照を行い、声調言語の声調の類似点と相違点について検討を行う予定である。そして、3)で行った合成音声による聴取実験を行う方法で、さらに、中国語とビルマ語について、声調の弁別に関与するピッチカーブのcritical pointについて今後検討を進める予定である。
「皆川家旧蔵資料」の研究

本研究の主たる作業である「皆川家旧蔵資料」の撮影については、7月と12月の2度にわたって行ない、資料点数70点、約4300コマの撮影をすることができた。これにより、以前に撮影したものと合わせて、同「資料」の総点数約450点の点数で3割強が撮影を終えたことになる。撮影したものの整理では、皆川家が陰陽寮内で造暦の実務を執っていたこともあって、造暦の理論書や数学書および暦の計算表がその対象となった。また、「若杉家文書」については、7月の調査に合わせて陰陽寮関係の記録を中心に調査を行ない、幕末期の記録である『天文暦方御日記』と『家茂公御上洛御記録』の中に寮官としての皆川家についての記述を検出した。『天文暦方御日記』では、幕末期の皆川家の当主である亀年(ながとし)が造暦の中心的作業者であったことが窺え、また『家茂公御上洛御記録』では、将軍徳川家茂の上洛に際し、亀年が寮官として祓などの宗教的行事にかかわっていたことが記されている。「皆川家旧蔵資料」中にも陰陽道祭祀関係の資料が出てきており、これらのことから幕末期の陰陽寮が、寮官を造暦など科学技術的なものと陰陽道祭祀など宗教的なものとにはっきりと系列を分けていたのではなかったことが推定される。また、同「資料」中に『天文要抄』という天文道書があるが、これと天文密奏などに多用される『天文要録』との比較を行ない、その結果、『天文要抄』が『天文要録』の抄出にオリジナルなものを加えたものであることが明らかとなった。これについては、日本宗教学会第55回学術大会において口頭発表を行ない、また『宗教研究』311にその要旨を発表した。これらの結果、本「資料」の撮影・整理、幕末期の陰陽寮の機構解明、本「資料」中の陰陽道書の系統化、という研究の3つの柱はそれぞれ成果を収めたが、残念ながら最終的な成果は、本「資料」のすべての調査が終わることを待たなければならない。
マイクロ電極を用いる細胞接着の誘導と細胞チップの構築

細胞培養環境下で細胞の接着箇所を書き込むバイオリソグラフィー,「電気化学バイオリソグラフィー」を開発した。異なる細胞種を順次配列してネットワーク化することが原理的には可能であるということを,明らかにした。この技術を用いて,細胞遊走の電気化学的なナビゲーションに初めて成功した。すなわち,電気化学バイオリソグラフィーにより,予め細胞のマイクロパターンを作成しておき,その細胞周辺に2回目のリソグラフィーを行うと,その改質パターンに沿って細胞が増殖し遊走することを実証できた。この方法をさらに改良して,細胞の遊走性を指標とする遊走アッセイの新しい方法への展開を試みた。しかし,このような実験は,比較的長時間の培養と観察を必要とし,ヘパリンによるブロッキングの耐久性が不十分であった。そこで,予めMPCポリマーなどで一次パターンを作成しておき,そこにヘパリンによるブロッキングと電気化学リソグラフィーを適用する方法に切り替えた。MPCポリマーのパターニングは,シリコーンで作製したマイクロ流路を用いて,行った。このMPCポリマーのパターニングは,他種の細胞工学研究にも有効な技術である。MPCポリマーのパターンは比較的長期の耐久性を有し,次亜臭素酸による電気化学リソグラフィーで改質されないことが分かった。これらの改良によって,パターンサイズに依存した細胞遊走速度を評価することができた。細胞骨格にダメージを与える薬剤によって,遊走活性が大幅に低減することも確かめた。電気化学反応を利用して細胞の接着箇所を書き込む技術「電気化学バイオリソグラフィー」を開発して,細胞ネットワークチップの構築に取り組んだ。この技術は,細胞培養環境下で行うバイオリソグラフィーであり,異なる細胞種を順次配列してネットワーク化することが原理的には可能という点で他に類を見ない。電極と基板との距離および次亜臭素酸を生成するための電解時間などが,得られる細胞パターンのサイズに与える影響を系統的に調べ,パターンサイズが拡散層のサイズに対応していることを明らかにした。すなわち,表面反応の速度は非常に速く,次亜臭素酸の供給律速で改質反応が起こっていると分かった。次亜臭素酸の細胞障害性をPI染色で調べた結果,事前に培養されているHeLa細胞を傷つけることなくその周辺を改質できることが明らかとなった。この技術を用いて,「細胞増殖パターンのその場誘導」に初めて成功した。この方法をさらに改良して,細胞の遊走性を指標とする遊走アッセイの新しい方法論に展開したい。また,異なる細胞(筋細胞と神経細胞)を配列して"連結"することが可能と思われるので,そのような細胞結合チップの開発も将来の目標に据えて,その基盤技術である本リソグラフィーを研ぎ澄まして行きたい。
ナノ超格子水素貯蔵デバイスの機能発現メカニズムの解明と耐久性向上

筑波大学研究基盤総合センター応用加速器部門の1 MVタンデトロン加速器のDコースに高分解能反跳原子検出法(HERDA: High-resolution Elastic Recoil Detection Analysis)ビームラインを構築した。入射イオン種を模索し、電流量や反跳断面積の大きさから、500 keVの16O+ビームを用いることとした。直径1 mmのビームにおいて試料上で300 nAの電流が取れることが分かった。入射イオンにより前方30°に反跳された水素イオンをエネルギー分析する。軌道半径200mmの90°マグネットとキネマティック・ブロードニングを補正するための静電4重極レンズを作製した。マグネットの磁場は1 Tを定格とした。偏向された水素イオンはMCP(Micro Channel Plate)と抵抗アレイを組み合わせた位置敏感検出器で検出する。位置敏感検出器の前には迷い粒子や前方散乱した入射イオンを除去するためのマイラ膜(2 μm厚)を設置した。2 μm厚のマイラ膜は手元にあった最も薄い膜であり、実際には0.5 μm厚まで薄い方が高分解能測定には適している。今回はテストとして2 μm厚を用いた。フッ酸処理した水素終端Si(100)ウエハを試料とし、セットアップしたHERDA装置の基本動作確認を行った。水素を新エネルギー源として利用する際に、安全かつ高効率の水素貯蔵方法の開発が必須である。これまでに様々な合金が水素を吸収させるキャリアとして開発・検討されてきたが、高い貯蔵量と低い水素放出温度を両立するものはまだ見つかっていない。そこで近年異なった特徴を持つ2つの金属をナノレベルで超格子化し、それら両方の特徴を併せ持つ材料の開発が行われている。本研究ではイオンビーム分析の一種であるラザフォード後方散乱分析(RBS)を高分解能化し、ナノ超格子の界面で起きる原子移動を精密に解析することで、材料の劣化原因の解明を試みることとした。研究期間中に高分解能RBS装置の開発、基礎データの取得までを行った。試料としてスパッタ成膜したナノスケールの厚さを持つMgとPd膜を想定し、入射イオンビームはHeを採用した。入射エネルギーは500 keVとし、金属原子により前方60°に散乱されたHeイオン(1価)を90°マグネットで分析し、マイクロチャンネルプレート(MCP)方式の位置敏感検出器で散乱イオンのエネルギーを決定する。分析マグネットの軌道半径は200 mmとして設計し、マグネットの入り口には取り込み角が有限であることに起因する運動エネルギーの分散を補償するための4重極静電レンズを設計、挿入し、そのための2チャンネル高電圧源を作製した。MCPの2つのアウトプットからの信号を独立に増幅し、コインシデンスをとりながら2chのアナログ-デジタル変換機(ADC)に入力し、信号強度の比から検出器上の位置を決定するプログラムを作成した。開発した高分解能RBSシステムのテストとしてSiウエハからの散乱を観察し、試料表面に対応する信号の立ち上がりを確認した。今後はナノ超格子への応用を行っていく。筑波大学1 MVタンデトロンに専用ビームラインを整備し、高分解能RBS-ERDAの装置開発を行った。また、共用スパッタ成膜装置を用いてPd/Mg/Ti/Mg/Ti/Siナノ超格子作成の条件出しを行った。高分解能RBS-ERDA装置の開発としては90度偏向マグネットの設計・製作、安定電流源の準備を行った。粒子検出部として検出器チェンバー一式を整備し、位置敏感検出器の設置および高圧電源、プリアンプ、ADコンバーターの準備を行った。また、キネマティック・ブロードニングを補正するための4重極静電レンズおよびそれに用いる500 V電源も2つ作製した。これにより高分解能RBSに必要な部品の製作、機器の準備は終了した。試料への入射ビームのエネルギーとして、1 MVタンデトロンで簡便に使える1.6 MeVを用いてシグナル検出のテストを行った。その結果、MCPを用いた位置敏感検出器ではバックグラウンド・ノイズが大きく、アンプによる増幅がうまくできなかった。そのため通常のRBS測定で実績のあるシリコン表面障壁型検出器に置き換えてテストを行った。

その結果90度偏向マグネットにかける電流値に対応したエネルギーの粒子が到達していることが確認できた。よってMCPの電気系のノイズを改善すれば装置の分解能を議論できるようになる。一方、試料作製においては2つのMg層の間のTi層の厚みを定量的に検討した。各層の水素濃度を窒素ビームを用いた共鳴核反応法で調べることを想定し、ビームのストラグリングによる深さ分解能をシミュレーションにより決定した。その結果、2つのMg層を分離して観察するためには間のTi層が少なくとも30 nm必要であることが分かり、その成膜のためのパラメータ出しを行った。Mg系ナノ超格子に対する高分解能RBSに向けて、予定通り装置開発を行ったほか、試料の作製にもめどがたった。震災の影響によりビームライン開発は遅れ気味であったが、年度の後半は想定していたよりも開発がスムーズに進み、初年度内にシグナル検出のテストを行うところまで到達した。試料の作製も条件出しが終わり、申請者により開発された実環境下共鳴核反応法により水素雰囲気中での水素化観察のテスト実験も行うことができた。高分解能RBSにおいて90度偏向マグネットはおおむね設計通りに機能していることが確認できた。現時点での問題点として位置敏感検出器のバックグラウンドノイズが挙げられる。製作した電気回路系を細かくチェックし、通常のパフォーマンスが出るように改善する。その後、Siウエハの表面端スペクトルを用いて所定の分解能が出るように4重極静電レンズのパラメータ出しを行っていく。その後、Mg系ナノ超格子の劣化原因を高分解能RBSによる界面探査により行っていく。並行して実環境下共鳴核反応法によりMg系ナノ超格子の水素化における弾性応力依存性を調べていく。試料作製のためのスパッタ成膜装置の消耗品、真空消耗品、電気回路などの購入の他、成果発表、共用加速器使用のための旅費として用いる。次年度に繰り越しとなった約46万円は当初上に挙げたような試料作製および測定に用いる予定だったが、震災による偏向マグネットの破損等で開発が半年程度遅れたため使用することができなかった。24年度に実験成果を出して成果報告を行っていく。
ヒト歯周病原細菌の同定とその免疫学的性状の解析(口腔Eubacterium属細菌を中心に)

ヒトの歯肉辺縁部歯垢や歯周疾患の病巣部位から高頻度分離される、口腔Eubacterium属細菌10菌種の各標準株を含む13株を用い、そのhetrogenicityを明かにすることを目的として、電気泳動パターン(SDS-PAGE)、免疫学的血清反応、DNAのGC含量および相同性を総合的に検討した。1.SDS-PAGEパターン:各菌体を超音波処理し透析後10%ゲルを用いSDS-PAGEを行い、クマシーブリリアントブルーで検出した構成ペプチドバンド分布パターンを比較した。その結果、subspecies間ではやや類似していたが、10species相互のそれは著しく異なっていた。また全菌種に共通する主要バンドは認められなかった。2.血清反応:前記のSDS-PAGE後Western Transferした各菌体抗原を、immuno-blotting法を用い、ウサギより得た抗血清に対する免疫反応性を検討した。その結果、幾つかの異菌種間で非常に弱い反応が見られたが、全菌種共通の抗原バンドは認められず、それらの免疫学的血清反応は、強い種特異性を示すことが判明した。3.DNA解析:検討した10菌種のDNAのGC含量は、3862%と広範囲に分布していた。同一species間に於けるDNAホモロジー%は、高い値(6999%)を示したが、異なるspecies間では著しく低い値(数%)を示した。また各菌種のDNAのGC含量と相同性の間に、類似性は認められなかった。以上の結果から、ヒトの口腔から分離されるEubacterium属の10菌種は、相互に強いhetrogenicityを示した。また、成人性歯周炎患者の血清に対するこれら各抗原の反応を検討した結果、幾つか抗原において強い陽性反応が検出され、これらの細菌が歯周疾患における免疫反応に深く関与している可能性が強く示唆された。
重層上皮のみに発現する新規の細胞・細胞間接着タンパク質ANKRD35の解析

中間径線維が結合する接着装置であるヘミデスモソームやデスモソームには、重層上皮の接着装置には存在するが単層上皮には含まれない構成タンパク質が存在する。本研究計画では、これまで知られていなかった重層上皮特異的な細胞間接着タンパク質であるANKRD35について、まず特異的なモノクローナル抗体を作製し、その特徴的な組織分布を明らかにした。さらに、ANKRD35が細胞間接着部に局在するメカニズムを分子生物学的手法を用いて解明した。平成26年度に、私たちは主に以下の3つの研究成果をあげた。1)初代培養ケラチノサイトは、通常培養条件下では単層の上皮シートを形成する。このような状態のケラチノサイトはANKRD35タンパク質をほとんど産生していない。しかし、初代培養ケラチノサイトをある特殊な条件下で重層化させると、ANKRD35タンパク質の産生が誘導されるようになり表皮と同様に細胞・細胞間接着部位に局在することを見出した。今後、この実験系を利用して、ANKRD35の表皮における機能をin vitroで調べる事を計画している。2)エピソーマルベクターを用いて、ANKRD35を安定的に発現するHaCaT細胞株の作製に成功した。本来、ANKRD35タンパク質をまったく産生しないHaCaT細胞においても、ANKRD35はHaCaT細胞の細胞・細胞間接着部位に局在した。ANKRD35安定発現細胞は親株に比べて、より扁平な形態を示した。このことは、機序は不明ながら、ANKRD35の発現が表皮細胞の動態に影響を及ぼし得る事を示している。3)ANKRD35のN末端部分のみから成る変異体、およびC末端部分のみから成る変異体をそれぞれHaCaT細胞に一過性発現した。その結果、C末端部分は細胞質ゾルに拡散したが、N末端部分は、細胞・細胞間接着部位に局在した。さらに、ANKRD35の全長配列のN末端またはC末端のいずれかにmycタグ配列を付加したリコンビナントタンパク質を発現した所、N末端にタグをつけたタンパク質は細胞質ゾルに拡散し、細胞・細胞間接着部位に局在できなくなっていた。このことから、ANKRD35の細胞内局在は主にN末端側のアミノ酸配列に依存していることが明らかとなった。平成27年度に、私たちは以下の研究結果を得た。1)正常表皮由来の培養細胞であるHaCaT細胞は、通常培養条件下では重層化せず、また発達したTJも形成しない。しかし、JNK阻害剤を加えると2-3層程度に分化/重層化し、TJも形成するようになることが報告されている。このような条件下でANKRD35の発現が誘導されるのかを検討したが、蛍光染色およびウェスタンブロットの結果、ANKRD35タンパク質は発現されないことがわかった。しかし、外因性のANKRD35を安定発現しているHaCaT細胞では、JNK阻害剤の添加によるTJ形成が阻害されることがあきらかとなった。2)昨年度の研究結果から、ANKRD35の細胞内局在は主にN末端側のアミノ酸配列に依存していることが明らかとなった。今年度の研究により、N末端での脂質付加がANKRD35タンパク質の細胞膜への局在に必要であることが明らかとなった。さらに脂質が付加されるアミノ酸も同定し、アラニン置換によりANKRD35が膜に局在しなくなることも示した。結合タンパク質の同定には至っていないが、脂質付加によるANKRD35タンパク質の細胞膜への局在機構を解明することができた。また、ANKRD35の機能を解析するための実験として、JNK阻害剤の添加によるHaCaT細胞の分化/重層化誘導が有効である可能性を示すことができた。平成26年度および27年度に得られた研究結果から、ANKRD35が分化にともない発現する重層上皮特異的な細胞間接着タンパク質であること、細胞間接着部への局在にはANKRD35のN末端部分のアミノ酸配列が重要で、なかでも脂質の付加が必須であることが明らかとなった。平成28年度に、私たちはさらに以下の研究結果を得た。1)これまで機能が未知だったN末端側のアンキリピート構造を一部欠失したANKRD35の変異体を作製し、HaCaT細胞に遺伝子導入したところ、細胞間接着部への局在能が失われることがわかった。2)外因性のANKRD35を安定発現しているHaCaT細胞のアドヘレンスジャンクション構成分子のsiRNAノックダウンをおこなった。その結果、αカテニン、βカテニン、プラコグロビンのノックダウンではANKRD35の細胞間接着部への局在にほとんど影響は認められなかった。しかし、βカテニンとプラコグロビンのダブルノックダウンでは、Pan-カドヘリン抗体による染色が陰性となった細胞ではANKRD35も陰性となっていた。