hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経・免疫・内分泌スーパーシステム間のクロストークと免疫病発症における役割

本研究で、神経系の調節に重要な因子が免疫バランスの制御にも重要であることを示唆する知見を得ることができた。すなわち、ovalbumin(OVA)特異的DO11.10マウスのnaive T cellからOVA特異的なTh1細胞とTh2細胞を誘導し、それらにおける神経ペプチド、神経栄養因子、あるいは神経栄養因子に対するレセプターの発現を調べたところ、ナイーブTh細胞には存在しないpreproenkephalin(PPE)、NGFおよびそのレセプターであるTrkA、さらに、NT-3のレセプターであるTrKCがTh2細胞特異的に発現していることが見いだされた。これらの分子はTh1細胞には発現せず、ナイーブThからIL-4依存的にTh2細胞にのみ誘導された。また、免疫系と内分泌系のクロストークについて検討を加えた結果、免疫担当細胞あるいはストロマ細胞との相互作用によって免疫システムにおいて産生される免疫ホルモンが存在し、免疫バランスの調節に関与していることを以下の研究によって初めて明確にした。すなわち、Th2細胞にのみP450sccが存在し、22R-hydroxycholesterolを加えて18hr後の細胞上清中にはpregnenoloneへの代謝が認められた。このpregnenoloneは繊維芽細胞などによりprogesteroneに代謝された。さらに、progesteroneによりTh2免疫の活性化が起こることが示された。以上のことから、Th2細胞自身およびストロマ細胞との相互作用により産生される免疫ステロイドが、Th1/Th2バランスを制御していることが初めて示された。平成12年度は、神経-内分泌系間のクロストークを分子レベルで明らかとする第一段階として、神経系の調節に重要な因子が、Th1/Th2細胞においても発現しているか否かについて検討した。RDA法を用いたサブトラクション法により、抗原特異的なTh2細胞にのみエンケファリンの前駆体であるプレプロエンケファリン(PPE)が発現することを明らかにした。Th2細胞におけるPPEmRNAの発現はIL-4依存的に誘導された。Th2細胞の抽出液にはメチオニンエンケファリンが存在することも確認されたことより、Th2細胞は神経細胞と同様に、生理活性を有したエンケファリンを産生することが証明された。神経成長因子(NGF)ファミリーとその受容体のOVA特異的Th1/Th2細胞における遺伝子発現についても検討した。その結果、NGFとその高親和性受容体TrkAの遺伝子発現が抗CD3抗体により刺激したTh2細胞で強く誘導されること、さらにニューロトロフィン-3(NT-3)の高親和性受容体であるTrkC遺伝子がTh2細胞選択的に発現することを明らかとした。TrkC遺伝子のTh2細胞選択的な発現について、さらに詳細な検討を行った結果、TrkC遺伝子はナイーブT細胞では発現しておらず、Th2サイトカインであるIL-4によりその発現が誘導される一方、Th1サイトカインであるIFN-γによりその発現が顕著に抑制されることを明らかとした。以上の結果から、NT-3は神経系の構築に必須であるだけでなく、免疫系、特にTh1/Th2バランスにも影響を及ぼしうる、神経-内分泌系間のクロストークに関与する分子であることが強く示唆された。今後さらに神経、免疫、内分泌のクロストークと疾病との関連性について追求して行きたいと考えている。これまでの研究で,神経系の調節に重要な因子が免疫バランスの制御にも重要であることを示してきた。本年度は,免疫系と内分泌系のクロストークについて検討を加えて,免疫担当細胞あるいはストロマ細胞との相互作用によって免疫システムにおいて産生される免疫ホルモンが存在し,免疫バランスの調節に関与していることを以下の研究によって初めて明確にした。DO11.10マウスのnaive T cellからOVA特異的なTh1細胞とTh2細胞を誘導し,P450sccの発現を調べたところ,Th2細胞でのみ発現が認められた。この酵素の発現はanti-IL-4の抗体を加えて培養することにより抑制された。

また,Th1およびTh2細胞に22R-hydroxycholesterolを加えて18hr後の細胞上清中のpregnenolone産生量を調べたところ,Th2細胞でのみpregnenoloneへの代謝が認められた。このpregnenoloneは繊維芽細胞などによりprogesteroneに代謝された。さらに,naive T cellをIL-2と抗原刺激のみで誘導する際にprogesteroneを添加すると,添加しない細胞に比べてIL-4の産生が上昇しIFN-γの産生が抑制されており,Th2型への移行が見られた。これらのことからTh2細胞自身およびストロマ細胞との相互作用により産生される免疫ステロイドが,Th1/Th2バランスを制御していることが初めて示された。今後,本研究によって世界に先駆け提唱された免疫ステロイドの免疫病発症との関連性を遺伝子改変マウスを用いて検討して行く予定である。
アレルギー性皮膚炎の増悪化機構の解明

アレルゲンによって発現誘導されるThymic StromalLymphoPoietin(以下TSLP)は、ヒトアレルギー性皮膚疾患と強い相関関係にあることが知られている。これまでの解析からTSLPはアレルギー性皮膚疾患の発症開始に重要であると考えられている。一方で炎症発症後から重症化していく過程におけるTSLPの役割は十分に解明されていない。本課題では、皮膚炎症の増悪化におけるTSLPの役割を明らかにするために、前年度までに既存の皮膚炎モデルを新規改変したTSLP依存的皮膚炎が増悪化するマウスモデルと条件付きTSLP受容体欠損マウスを用いて解析をおこなった。その結果、炎症の重症化にはTSLPによるCD4T細胞の活性化が重要である可能性が高いと考えられた。本年度はとくにTSLPによるCD4T細胞の活性化を介した炎症重症化への関与を検討する研究をおこなった。免疫したマウスから回収した野生型もしくはTSLP受容体欠損CD4T細胞をTSLP受容体欠損マウスに移入後に皮膚炎を重症化させた。その結果TSLP受容体欠損CD4T細胞移入マウスよりも、野生型CD4T細胞を移入したマウスでは皮膚の肥厚や浸潤するCD4T細胞などの増加、組織内Th2サイトカイン量の増加など確認された。さらにそれらのCD4T細胞を用いた競合実験では、炎症組織浸潤CD4T細胞の約7割が野生型CD4T細胞であり、TSLP受容体欠損CD4T細胞は細胞死をおこしている細胞が増加していた。これらの結果は、炎症の重症化にはTSLPが直接CD4T細胞に作用することが炎症の重症化に重要であり、TSLPがCD4T細胞の死を抑制することがその作用の一端を担っていると考えられた。今後TSLPによって活性化されたCD4T細胞の機能をさらに解析することで、炎症の重症化過程が明らかになることが期待される。前年度までに申請者が新規改変した皮膚炎症重症化モデルマウスとCD4特異的TSLP受容体欠損マウスを用いて、TSLPがCD4T細胞に直接作用することが炎症の重症化に関与する結果をえた。本年度はさらにCD4T細胞移入実験、CD4T細胞競合実験によって、皮膚の肥厚や炎症性細胞の浸潤、組織内Th2サイトカインIL-4とIL-5量の増加などを指標した炎症重症化には、CD4T細胞が直接TSLPを受け取ることが重要であることが確認できた。CD4T細胞上のTSLP受容体に依存して増加したIL-4は、炎症誘導に加えTSLPやTSLP受容体の発現にも関与することも報告されており、この皮膚炎においても重要な役割を果たしている可能性がある。またTSLPの作用の一端として、CD4T細胞の細胞死を抑制していることが示唆された。これまでに申請者が新規改変した抗原の繰り返し曝露によるアレルギー性炎症の増悪化モデルを用いて、その炎症増悪化に重要なTSLP標的細胞がCD4T細胞であることを条件付きTSLP受容体欠損マウスとCD4T細胞移入実験を用いて証明した。今後さらにTSLPが作用したCD4T細胞の皮膚炎重症化メカニズムを調べるために以下2点からおこなう。(1)CD4T細胞上のTSLP受容体発現と相関するIL-4と炎症増悪化の関係を解析するために、IL-4欠損マウスやIL-4レポーターマウスを駆使して、TSLPを介したCD4T細胞のIL-4産生能の重要性について解析する。(2)ほかのアレルギー性皮膚炎におけるCD4T細胞上のTSLP受容体の重要性について解析することで、TSLP標的細胞としてのCD4T細胞の意義を高める。TSLP標的細胞であるCD4T細胞の解析が順調にすすんでおり、優先して研究を進める予定である。アレルゲンによって(主に)非免疫細胞から産生されるThymic StromalLymphoPoietin(以下TSLP)は、遺伝子発現解析やゲノムワイド解析から、ヒトアレルギー性皮膚疾患と強い相関関係にある。最近、抗TSLP抗体を用いたアレルギー性疾患に対する臨床試験が進められており、良好な成績を上げている。TSLPの機能は、ヒト細胞とマウスを用いた解析から、アレルギー性皮膚疾患の発症開始に重要であると報告されている。しかし一方で、炎症発症後から増悪化していく過程におけるTSLPの役割は十分に解明されていない。そこで本課題では、皮膚炎症の増悪化におけるTSLPの役割を明らかにするために前年度までにTSLP依存的に皮膚炎が増悪化されるマウスモデルを作製し、また条件付きTSLP受容体欠損マウスを入手した。それらを使用することで、炎症の増悪化過程におけるTSLPの役割についての解析をすすめた。炎症開始後、多数の炎症性細胞の浸潤が観察される事実からTSLPの標的となる細胞がその炎症性細胞の中に存在すると仮定した。過去の試験管内実験等の報告から特にCD4細胞に注目し、CD4抗原特異的にTSLP受容体を欠損させたマウスを作製した。上記モデルを用いて、皮膚炎の増悪化の程度を皮膚の肥厚や炎症性細胞浸潤によって評価したところ、CD4細胞のTSLP受容体を欠損させたマウスでは顕著に炎症の増悪化が抑制されることが明らかとなった。この結果は、これまで考えられていた以上に、主に上皮細胞から産生されるTSLPが、獲得免疫の主体であるCD4細胞に直接作用することがアレルギー性皮膚炎症の増悪化過程に重要であることを示唆している。

今後、TSLPが作用したCD4細胞の重要性をさらに証明するとともに、TSLPが直接作用したCD4細胞がもつ、炎症増悪化をもたらす中心的な役割についてのさらなる解析が期待される。TSLP依存的にアレルギー性皮膚炎症が増悪化されるモデルを、CD4特異的TSLP受容体欠損マウスに対して用いたところ、炎症性細胞の浸潤やサイトカイン産生が顕著に減少し、皮膚炎の増悪化が抑制されることを示す結果が得られた。一方、CD4特異的TSLP受容体欠損マウスに急性皮膚炎症モデルを用いたところ、皮膚炎の減少は観察されず、野生型と同程度に誘導された。これらの結果は、CD4細胞がこれまで考えられていた以上に皮膚炎の増悪化に重要なTSLP標的細胞であることを示唆している。また、TSLPレポーターマウスを用いることで新たなTSLP産生細胞の同定を試みた。レポーターと抗原の相性の問題から、上記と異なるが同様の性質をもつ抗原を用いて炎症を誘導し、フローサイトメトリーを用いて1細胞レベルでの解析を実施したところ、MHCIIを発現する抗原提示細胞の一部がTSLPを発現していた。しかし、レポーターを発現する細胞が想定より少なく、さらなる解析には、実験方法等を改善していく必要がある。アレルゲンによって発現誘導されるThymic StromalLymphoPoietin(以下TSLP)は、ヒトアレルギー性皮膚疾患と強い相関関係にあることが知られている。これまでの解析からTSLPはアレルギー性皮膚疾患の発症開始に重要であると考えられている。一方で炎症発症後から重症化していく過程におけるTSLPの役割は十分に解明されていない。本課題では、皮膚炎症の増悪化におけるTSLPの役割を明らかにするために、前年度までに既存の皮膚炎モデルを新規改変したTSLP依存的皮膚炎が増悪化するマウスモデルと条件付きTSLP受容体欠損マウスを用いて解析をおこなった。その結果、炎症の重症化にはTSLPによるCD4T細胞の活性化が重要である可能性が高いと考えられた。本年度はとくにTSLPによるCD4T細胞の活性化を介した炎症重症化への関与を検討する研究をおこなった。免疫したマウスから回収した野生型もしくはTSLP受容体欠損CD4T細胞をTSLP受容体欠損マウスに移入後に皮膚炎を重症化させた。その結果TSLP受容体欠損CD4T細胞移入マウスよりも、野生型CD4T細胞を移入したマウスでは皮膚の肥厚や浸潤するCD4T細胞などの増加、組織内Th2サイトカイン量の増加など確認された。さらにそれらのCD4T細胞を用いた競合実験では、炎症組織浸潤CD4T細胞の約7割が野生型CD4T細胞であり、TSLP受容体欠損CD4T細胞は細胞死をおこしている細胞が増加していた。これらの結果は、炎症の重症化にはTSLPが直接CD4T細胞に作用することが炎症の重症化に重要であり、TSLPがCD4T細胞の死を抑制することがその作用の一端を担っていると考えられた。
癌細胞の増殖機序と情報伝達系の解析-蛋白リン酸化酵素を中心に-

(目的)細胞の癌化には癌遺伝子の活性化および遺伝子産物の質的、量的異常の関与が明らかにされている。遺伝子産物の多くはプロティンキナーゼ(以下PK)活性を示すが、癌細胞の増殖、分化における各種PKの相互の関連や発現機序には不明の点が多い。われわれは癌細胞のモデルとしての白血病細胞につきPKの相互関連、発現様式や内在性基質を解析することを目的とした。(対象と方法)(1)対象は症例の白血病細胞、ヒト培養白血病細胞(HL-60、K562、MT-1など)とEJ-H-ras導入マウス線維芽細胞とそのflat ravertant RIの増殖期のものを用いた。(2)方法;各種PK活性測定はNishizuka's Kuoらの方法に準じ、蛋白質定量はBrandford法によった。リン酸化蛋白はKatohらの方法に準じ、オートラジオグラムで検討した。(結果と考察)(1)症例の白血病細胞、培養細胞、EJ-ras/NIHおよびRI細胞のPK活性はPK-C(Cキナーゼ)が主たるPKであり、次いでチロシンPK(T-PK)であったが、A-PK、G-PK、カルモデュリン-PKは極めて低値であった。ATL由来のMT-1ではいずれのPKも検出し難かった。(2)MT-1以外の各種細胞はPK-C阻害剤および阻害因子により、増殖は抑制され、DNA合成も阻害された。更にHL-60などでは、T-PK阻害剤により増殖は抑制されたが、PK-C活性は保持されていた。従って細胞の増殖や分化ではPK-CとT-PKは異なった発現様式にあることが示唆された。(3)内在性基質蛋白では、PK-Cにより80K、40K、36K、33Kなどがリン酸化され、EJ-ras/NIHでは40K、36Kが特徴的であった。T-PKでは110Kのリン酸化がみられ、PK-CとT-PKでは細胞増殖での基質蛋白の異なることも示唆された。(4)以上より、白血病細胞の増殖、分化にはPK-CおよびT-PKが密接に関連し、PK-CとT-PKとは細胞種や分化度により発現様式が異なることが示唆され、更に検討中である。
新しいカルチュラル・スタディーズの基礎理論構築―残滓としての英国批評を活用して

本研究の目的は、近年の批評理論・文化理論の展開をふまえ、エドマンド・バークからレイモンド・ウィリアムズまでの近現代英国批評を国際的に再検討することで、人文学研究、とりわけ文化に関わる研究に独自の貢献を行うことであった。その際、英国批評のなかで「残滓的」とみなされている批評家および著作に注目し、英国批評の伝統と歴史の中心に位置する「文化をめぐる思想」を系譜学的に考察しつつ、カルチュラル・スタディーズの基礎的方法論構築の作業を行った。その結果、英国の文化批評の系譜が、同国における産業化の経験とそれへの反応と不可分であることが明らかとなった。本研究は基盤研究B(一般)「構造主義の残滓としての英国批評の国際的再検討」(2010年度2012年度)で蓄積した調査・研究を基礎とし、それを定期的な研究会、シンポジウムなどによって共同の検討に付すという手順をさらに改善しつつ行った。また本研究課題遂行者はこれまで「Raymond Williams研究会」という形で定期的な研究会を行ってきたが、この研究会を基礎としつつ、研究水準の維持・向上のため、海外研究者を招いた国際シンポジウムを開催した。併せてWilliams研究会の機関誌として『レイモンド・ウィリアムズ研究』第4号を編集、刊行した。本研究課題遂行者は、レイモンド・ウィリアムズ研究会を基礎としつつ、2014度は前年度の国際シンポジウムと資料調査の結果を受けて各自および集団的に研究内容を検討し、同時に専門家を招聘しての小規模なレクチャーやセミナー、また個別の研究発表を適宜実施した。なお、エドワード・サイードなどポストコロニアル批評の研究動向を踏まえる必要があるとの認識から、2014年度よりこの方面を専門とする西亮太(中央大学助教)を新たに研究分担者として加え、共同研究の幅を広げた。専門家の招聘についてはモダニズム文学、批評理論について十分な実績を有する二人の研究者Dr Ramon Del Castillo (Universidad Nacional de EducacionaDistancia)とDr Dougal McNeill (Victoria University of Wellington)を招聘の上、2014年9月にThe Im/possibility of Realism and Utopia: Jameson, Williams, and Fictionと題する連続講演会とセミナーを大阪大学と成蹊大学で開催し、本課題に密接に関わる「リアリズム」と「ユートピア」の批評的可能性についてウィリアムズとフレドリック・ジェイムソンの著作をとおして考察・検討する機会とした。また国内からは社会学、イギリス思想史の専門家を招聘して2014年9月と2015年3月に臨時レイモンド・ウィリアムズ研究会を開催した。加えて、資料調査については、British Libraryほか、海外図書館、アーカイヴで調査をおこなった。また課題遂行に必要とされた資料については、国内外図書館所蔵のものを含め、各自収集と分析を進めた。文献研究(国内外の図書館・アーカイヴにおける調査、また著述家の伝記および作品世界に関連した実地調査を含む)を基礎とし、それを定期的な研究会、シンポジウムなどによって共同の検討に附すという手順をさらに改善しつつ研究を進めた。代表者の川端は2015年4月と2016年3月の二度にわたり、英国に出張し、研究発表およびRaymond WilliamsとWilliam Morris関連の調査を行った。また本研究の代表者および分担者4名(山田、遠藤、河野、大貫)が翻訳に関わったR.ウィリアムズ『想像力の時制ー文化研究2』を2016年2月に刊行した。分担研究者のうち、大貫、河野の二名は2015年9月1日よりウェールズのスウォンジー大学に客員研究員として所属し、2016年3月31日までの一部期間に本研究課題に従事した。山田はStuart Hallがポピュラー文化を研究対象とする足がかりとしてミドルブラウの大衆物語を再評価したことを明らかにし、Welsh Writing in Englishに関しては、ウェールズのモダニズム小説がイングランドのそれと比べて現在時制に拘りを示している点を示した。遠藤はFredric Jamesonのマルクス主義美学をShoshana Felmanの言語行為論を通過した上でR.ウィリアムズにおけるaction概念に接続するための理論的な作業を行い、その視点からUtopia概念の再検討も行った。鈴木は世紀末のアナーキズムとOscar Wildeの審美批評との関係を、これら両者にとって密接な関係のあったフランス象徴主義文学にも目を配りながらトランスナショナルな文脈において考察し、「観照」と「行動」の対立的共存がワイルド批評に独特の政治性を与えていることを明らかにした。西はDerek Walcott論、森崎和江論、さらにはR.ウィリアムズの文化唯物論のポストコロニアル研究への介入の試みとしてポストコロニアル・エコクリティシズムの批判的分析を行った。本研究課題遂行者は、これまでレイモンド・ウィリアムズ研究会というかたちで定期的な研究会を行ってきたが、2015年は定例研究会を2015年5月10日(中央大学駿河台キャンパス)、7月19日(関西学院大学東京丸の内サテライトキャンパス)、2016年2月9日(日本女子大学目白キャンパス)と、都合3回開催した。さらに、2015年4月11日にマンチェスター大学のDr David Aldersonを講師として招聘し、特別講演“Is Capitalism Progressive (for Queers)?"を開催した(於中央大学駿河台キャンパス)。また研究誌『レイモンド・ウィリアムズ研究』の通常号(第6号)を2016年3月に刊行した。全体の業績としては、著書が1本、国内での研究発表は5本、また国際会議での研究発表も5本と、まずまずの成果を上げることができた。

翻訳書レイモンド・ウィリアムズ著『想像力の時制ー文化研究2』(みすず書房、2016年2月)の刊行によって、日本独自編集版全2巻のウィリアムズ選集を完結させることができたことも特筆したい。各研究者の文献研究を基礎とし、それを定期的な研究会やシンポジウムなどによって協同の検討に附すという手順で、概ね研究計画どおりに調査が進展した。川端(代表者)は調査全体を統括しながら、芸術と社会をめぐるウィリアム・モリスの一連の批評がモダニズム作家におよぼした影響について考察した。山田(分担者)はウェールズの作家アラン・リチャーズを中心に、スウォンジー大学アーカイヴ等で文献ならびに音声録音資料を調査した。遠藤(分担者)は、心理学的言説、特に精神分析的な見地から再定義された「情動」という文脈で各種文学テクストの解釈を試みた。その試みを支える理論的な枠組みとしてマルクス主義的な美学を採用し、その「残滓」性の精神分析的な(単なる疎外論ではない)再解釈が主目的となった。河野(分担者)と大貫(分担者)の二名は2016年4月から9月2日にかけてウェールズのスォンジー大学にリチャード・バートン・センター・フェローとして所属し、ウェールズ文学とレイモンド・ウィリアムズについての研究を進めた。9月の帰国以降は、河野はウェールズで得られた資料を検討しつつウェールズ文学についての基礎研究を進め、大貫はニューレフト第一世代の執筆活動について、ウェールズ英語文学ならびにソーシャリズム言説との関わりという観点から考察を進めた。西(分担者)はレイモンド・ウィリアムズにおけるエコロジーについて研究を進め、5月にドイツのアウクスブルクでの国際学会で発表を行った。鈴木(分担者)はオスカー・ワイルドの批評ないしは美学が、19世紀末に注目を集めていたアナキズム思想といかなる関係にあったのかを同時代の詩人マラルメとの比較を通じて考察した。また、ポール・ド・マンによる美学イデオロギー批判の検討を通じて、近代思想の源流に位置づけられるカント及びルソーのテクストがある種の「無情動」を抱え込んでいることを考察した。本研究の目的は、近年の批評理論・文化理論の展開をふまえ、エドマンド・バークからレイモンド・ウィリアムズまでの近現代英国批評を国際的に再検討することで、人文学研究、とりわけ文化に関わる研究に独自の貢献を行うことであった。その際、英国批評のなかで「残滓的」とみなされている批評家および著作に注目し、英国批評の伝統と歴史の中心に位置する「文化をめぐる思想」を系譜学的に考察しつつ、カルチュラル・スタディーズの基礎的方法論構築の作業を行った。その結果、英国の文化批評の系譜が、同国における産業化の経験とそれへの反応と不可分であることが明らかとなった。本研究課題遂行者の全員が参加しているレイモンド・ウィリアムズ研究会を併せて7回開いた。
国文学言語地図作成のための国文学研究語彙電子化辞書形成の研究

本年度の研究計画に従い、前年度までに形成した第二次国文学研究語彙電子化辞書作成用ソフト上に登録されている概数約6万件の基準語彙からなる国文学研究語彙[一般項目]につき、前年度までの整備済み分約2万件を差し引いた残り約4万件のデータのうち、今年度は約2万件にわたる同義語・連想概念語等の追加・削除・統合等のデータ整備を、上記ソフトを搭載した端末器4台上で実施した。整備内容は、基準語のかな付け、異表記漢字列の書き込み、同義語1・2列の階層化整備、連想概念語1.2.3列の固有名詞やダブり語の削除統合、ヘボン・訓令両用のローマ字付け、部分的な英語化等である。実施した時代別語彙は、昨年度に引き続く古代・中古・中世の3部門と新たに近代を加えた4部門の語彙である。このうち、本年度の作業で、古代・中世の2時代の語彙は、ほぼ基礎的整備を終了しえた。残る中古・近世・近代のデータ整備は、次年度への課題とする。なお、作成用ソフトにおける若干の使い勝手の修正を施した。また、研究目的にであげている「将来の国文学言語地図作成のためのプログラムの基礎的開発と実験」に関しては、当館研究情報部助手相田満が研究代表者の基盤研究(A)「知識支援型汎用検索デバイスエンジン・データの構築(平成8年度11年度)」の知識支援型汎用検索デバイスエンジン上で、他の様々な国文学関係辞書との相互連動を図りつつ実施することが、本研究単独で遂行するよりも、より有効であると判断したため、当該研究と連携して具体的な利用プログラムの可能性を探ることとした。
偏極ハイパ-核の生成と崩壊の理論的研究

まず偏極ハイパ-核の生成に関しては、スピン反転成分をも含めた素過程の一般的取扱から出発して、(Π^+、K^+)反応の理論的取扱方法に対して新しい定式化を行った。これにより,従来の近似的取扱を質的に改良し、ハイパ-核生成の反応断面積のほかにスピン偏極の程度をも理論的に算定可能にした。その結果、数種類の標的原子核を例とした(Π^+、K^+)反応において、生成確率と偏極度がともに大きくなる状態がいくつか存在し得ることを示した。また、0.91.5GeV/cの大きな入射運動量の(K^-、Π^-)反応においても、同様の生成条件が得られることを定量的に予測した。これにより、ハイパ-核のスピン同定や偏極ハイパ-核の弱相互作用による崩壊の角分布など、分光学上の重要な実験情報が得られる可能性を指摘した。ハイパ-核のπ中間子的崩壊については、採用する工学ポテンシャルに矛盾なく対応した繰り込みを導入する必要性を指摘して再定式を行い、その繰り込み効果はπ中間子波の歪曲による効果はπ中間子波の歪曲による効果を抑えて結果を安定化させる役割を果たすことを示した。その上で、広い範囲のハイパ-核のπ中間子的崩壊確率を計算し、質量数100200の重い系でも1%程度の分岐比を有することを予測した。これらの他には、相対論的高エネルギ-原子核の衝突により、ハイパ-核やH粒子やK中間子原子などストレンジネスを含む系の生成確率を、主としてコアレッセンス模型に基づいて理論的に算出し意義を論じた。特に、どのようなハイパ-核が、いかなる確率で生成されるかについての理論的予測の一部は、ドブナ連合原子核研究所の最新デ-タと良く一致していることがわかった。以上、全体としてストレンジネスに関連した広範な理論的提起をし、また近未来のハイパ-核実の多様な可能性を議論した。
2;5転座型Ki-1リンパ腫発症の分子機構

t(2;5)染色体転座を認めたALCLの一症例で転座点をはさむ2.6kbのキメラcDNA(NPM/ALK)によってコードされるチロシン残基がリン酸化されたp80タンパクを同定し、この腫瘍株では高発現していることを明らかにした。このキメラcDNAを発現ベクターに組み込んでNIH3T3細胞にトランスフォームするとフォーカスを形成すること、またnucleophosmin部分を欠いたconstructではトランスフォーム活性を示さないことから、p80のin vitroにおけるトランスフォーム能にNPM部分は必須であることを示した。p80はインシュリンレセプターファミリーのLtkとキナーゼドメインで高いホモロジーをもつが膜貫通ドメインを欠き、その部分にnucleophosminが転座している。p80をCOS細胞に発現させて抗p80抗体で染色するとcytoplasmに局在していることもわかった。ALCL105症例の30%にRT-PCRでキメラcDNAが確認され、免疫染色ではp80陽性であった。p80陽性群は若年発症例に多く5年生存率の比較では予後が良いことも明らかになった。
顔のホリスティック表現の実体を顔細胞応答から探る

物体像の認識に関わる高次の大脳皮質にある顔に応答するコラムに着目し、その物体像応答からコラムが符号化している特徴を探索する方法を確立した。具体的には、自然画像の中にコラムが符号化している図形特徴の良いモデルがあると仮定し、膨大な数の自然画像断片のそれぞれについて物体像応答を推定し、実際のコラムの応答の間でもっとも高い相関を持つものを探索した。応答の推定には、画像断片と物体像の間のユークリッド距離を用いた(但し、距離は、画素空間ではなく、局所的な方位と色の空間上で測る)。この方法によって、コラム応答と高い相関を持つ画像断片を見つけることに成功した。こうして得られた図形特徴モデルから推定される顔の向きに対する選択性はコラムの神経応答から得られた選択性とよく合致した(85%の顔コラムについて統計的有意な相関を示した(p<0.05)。得られた図形特徴を解析した結果、(1)脳の中で、顔のイメージは局所的な方位と色のパターン(図形特徴)の組み合わせによって表現されている、(2)図形特徴の中には、顔のパーツの空間的な配置(configuration)を検出しているものと、局所的な特徴に応じるものの2つのグループに分けられる、(3)顔のパーツは、いわゆる目、鼻、口、というような普通の意味の特徴ではなく、それらによって作られる部分的なコントラストの境界である、(4)また、局所的な特徴も部分的な境界である、特に、髪の生え際の一部分も局所的な特徴として符号化しているコラムがあるなどの新しい知見が得られた。また、これらのコラムを組み合わせることで、見え方、例えば顔の向き、に依存しない個人の顔の弁別が可能かどうかを検討し、実際、これらのコラムを組み回せることで、個人が識別できることを明らかにした。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は大きく次のような流れになっている(1)サル高次視覚野の顔カラムの様々な視覚刺激に対する応答特性を記録し、(2)その応答特性から独自の特徴抽出法により顔カラムの符号化している図形特徴を決定する。(3)次に、これらの図形特徴を用いた心理学的実験からその妥当性を確かめ、(4)それらの図形特徴を分析することで、心理学的実験が示唆する「Holistic」な表現の実体を明らかにする。(5)図形特徴の性質から予想される認識行動を、ヒトを対象とする心理実験で確認する。この中で、本年度は(1)の刺激応答に対する記録を2頭のサルの高次視覚野から行った。そのうち、1頭からは顔領域から55サイトから、特徴抽出に十分であると考えられるおよそ2000個の刺激に対する応答を記録することができた。もう一頭からは、十分な広さの顔応答領域を同定することができなかったため、残念ながら、データとして利用できるサイトは数個しかなかった。現在、3頭目からの記録を進めている。また、(2)に関連して、これらの応答から、個々のサイトが符号化する図形特徴を抽出する手法の大枠を確立した。その手法の妥当性を評価する研究(3)をスタートしている。心理実験に先行して、抽出した特徴自体が記録したサイトを活動させるかを検討することにした。また、1頭目からの記録から、顔領域の中で顔の向きがどのようにマップされているかを明らかにすることができた。その結果、顔領域の中に、一揃いの向きの顔を表象している部分が複数あることが明らかになった。この結果は、顔領域が顔の異なる情報を表現している部分に分割できる可能性を示唆している。この結果について論文を準備中である。本研究では(1)サル高次視覚野の顔カラムの様々な視覚刺激に対する応答特性を記録し、(2)その応答特性から、独自の特徴抽出法により顔カラムの符号化している図形特徴を決定する。次に、(3)心理学的実験の被験者の応答を、これらの図形特徴が説明しうるかを確かめ、(4)それらの図形特徴を分析することで、心理学的実験が示唆する「Holistic」な表現の実体を明らかにする。最後に、(5)検証実験として、「Holistic」な表現の実体から予想される認識行動を、ヒトを対象とした心理実験で確認する。(1)に関して一昨年度に記録手法を確立した。昨年度は、これを用いて、引き続きデータの収集に当たった。(2)の顔カラムが符号化する図形特徴を抽出する手法についてさらに検討を進め、論文として発表するべく準備を行った。また、図形特徴の抽出に膨大な時間(数か月)を要するという問題があった。昨年度は、アルゴリズムを見直し、これを10倍に高速化することに成功した。(3)の心理学的実験のためには、計算によって得られた図形特徴を被験者に提示できる形に変換しなければならない。得られた図形特徴は、網膜に映る視覚像にガボールフィルターと局所的な最大値検出(MAXオペレーション)を施したものだからである。この逆変換は不良設定問題になっているが、辞書学習のアルゴリズムを適用することで逆変換を可能にした。(3)及び(5)では、心理実験が大事な要素となっている。その枠組みを作り、次年度に向けて予備実験を行った。データの収集は順調である。また、プログラムの高速化によって、仕事の一層の進展を図ることができるようになった。心理実験についてはまだ予備実験の段階にあるが、今のところ順調である。

心理学的実験が示唆する「Holistic」な表現の実体を明らかにすること、ヒトの心理実験による検証に向けて良好な進行状況である。高次視覚野の顔細胞が符号化する図形特徴を定量的に記述するアルゴリズムを確立した。このアルゴリズムでは、数多くの自然画像の断片の中から細胞が符号化する図形特徴を探索する。これによって先験的な知識を導入することなく図形特徴を推定することが可能になった。一般的に画像には数多くの可能なパターンがあって、自然画像はその中のごく一部でしかない。その意味では、自然画像断片の中から探索することは、自然画像の局所的なパターンが図形特徴であるという制約を設けていることに対応する。探索の基準は、画像断片が細胞の様々な物体像に対する応答を説明できるかどうかにおいた。具体的には、(1)様々な物体像に対する顔細胞の応答を記録し、(2)一方でテンプレートマッチングによって、各自然画像断片のそれらの物体像に対する応答を推定する。最後に、(3)実際の顔細胞の応答と自然画像断片の応答の間で最も高い相関のある画像断片を選択する。このようにして得られた図形特徴が、細胞が符号化している図形特徴であると見なしてよいかを検討するため、図形特徴の探索に用いなかった物体像に対する神経応答をどれだけよく推定できるかを検討した。この手法を65個の顔細胞に適用し、611個の視覚刺激物体の応答について、神経応答との間に統計的に有意な相関(0.55±0.08)を持つ図形特徴を抽出することに成功した。また、推定された図形特徴は、推定に用いられなかった611個の視覚刺激に対する応答についても有意な相関(0.48±0.09)を示した。今後の課題として、様々な向きの顔を含めた刺激セットについて神経応答を計測し、顔の不変的な認識の解明に向けて研究を進める必要がある。顔細胞の図形特徴を推定するアルゴリズムは完了した。計算時間がかかることは大きな課題であったが、GPUを使ったプログラムの高速化を図ることでこの問題を解決することができた。神経細胞の応答をベースにしたアルゴリズムなので、神経応答がどれだけあるかが決め手になるが、実験上の制約で多くの視覚刺激応答を計測することが困難であった。物体像の認識に関わる高次の大脳皮質にある顔に応答するコラムに着目し、その物体像応答からコラムが符号化している特徴を探索する方法を確立した。具体的には、自然画像の中にコラムが符号化している図形特徴の良いモデルがあると仮定し、膨大な数の自然画像断片のそれぞれについて物体像応答を推定し、実際のコラムの応答の間でもっとも高い相関を持つものを探索した。応答の推定には、画像断片と物体像の間のユークリッド距離を用いた(但し、距離は、画素空間ではなく、局所的な方位と色の空間上で測る)。この方法によって、コラム応答と高い相関を持つ画像断片を見つけることに成功した。こうして得られた図形特徴モデルから推定される顔の向きに対する選択性はコラムの神経応答から得られた選択性とよく合致した(85%の顔コラムについて統計的有意な相関を示した(p<0.05)。得られた図形特徴を解析した結果、(1)脳の中で、顔のイメージは局所的な方位と色のパターン(図形特徴)の組み合わせによって表現されている、
培養Schwann細胞を用いた人工神経開発のための研究

目的生体吸収性人工材料によるtubeにSchwann細胞あるいは骨髄細胞を注入し、ラットの坐骨神経の神経欠損部を架橋する実験を行い、人工材料tubeと細胞の有用性について検討した。方法実験1.スポンジ構造を持ったコラーゲンtubeを作成し、15mmの神経欠損を架橋した。結果実験1.術後8週で、全例(n=12)連続性が保たれていたが、組織学的には、中央部までの神経再生は3匹にとどまった。不良例では、スポンジ構造が消失していて、このことは神経再生の障害物となる可能性が考えられた。実験2.術後8週でPLA群、+ラミニン群では、中央部までの神経再生は認められなかったが、+ラミニン+骨髄単核球細胞群では、2例において中央部までの神経再生が見られ、1例はさらに遠位まで神経再生が見られた。実験3.術後8週で、コラーゲンゲル群、骨髄細胞群では、中央部で神経の再生を認めなかった。培養Schwann細胞群では、1例で中央部までの神経再生が認められた。結論1.神経欠損部を架橋するには、一定期間、管腔構造を維持する必要があり、その点において、われわれが開発したPLA tubeは有用と考えられた。2.大量のSchwann細胞を培養するためには、大きな神経組織が必要なため、実用的ではない。代わるものとして、骨髄単核球細胞は神経再生を促進する可能性が示唆された。ラットでSchwann細胞の培養を行った。人工素材であるPLGAmeshにcollagenをコーティングした素材(PLGA-collagen mesh)に、培養Schwann細胞を付着させることを行ったが、細胞の付着は必ずしも良好ではなかった。Collagenのコーティングが不十分である可能性が考えられた。また、PLGA-collagen meshを巻いて作成したtubeでラットの坐骨神経の15mmの神経欠損長を架橋する実験を行った。12週でPLGA-collagen meshは吸収されていたが、神経はほとんど架橋されなかった。別のモデルとして、フィブリン糊の中で培養Schwann細胞を増殖させることを行ったが、Schwann細胞は表面上では増殖するものの、内部での伸展は不良であった。今後は、コラーゲンのmicrotubeを作成し、それに培養Schwann細胞を付着させることを行う予定である。ラットの坐骨神経を摘出し、シュワン細胞の培養を行った。培養シュワン細胞をラットの尾から採取した腱を圧延した腱膜上に移植して培養した後、この腱膜をチューブ状にして、ラットの坐骨神経の欠損部(10mm)を架橋する実験を行った。コントロールとして圧延した腱膜のみを培養し、培養シュワン細胞を移植しない群を作成し、経過観察期間12週で比較評価した。筋張力測定を行った後、屠殺し、神経を摘出した。筋張力測定、摘出した神経の組織学的所見では、共に有意差は見られなかった。神経欠損部を架橋する導管として多孔性のアテロコラーゲンチューブを作成した。多孔性のアテロコラーゲンチューブで、ラットの坐骨神経の欠損部(15mm)を架橋する実験を行った。8週、12週の経過観察期間で、神経の連続性は得られていたが、組織標本では軸索再生は不良で、電気生理学的にも機能の回復は不良であった。家兎のシュワン細胞の培養を行っている。線維芽細胞の排除が不十分で、高純度のシュワン細胞の培養はなお、確立できなかった。筋張力測定器を作製した。生体材料として、ラットの尾から採取した腱を圧延したものを管腔状にして、ラットの10mmの坐骨神経欠損部を架橋する実験を行った。長期モデルとして術後6、12週において、神経の組織学的評価、筋湿重量・筋張力測定の評価を行ったが、いずれも両群間に有意差は見られなかった。

また、神経欠損長を15mmとして、術後6週で神経の組織学的評価を行ったが、15mmでは架橋部の太さが明らかに細くなってしまっているものがあり、生体材料では、欠損長が長くなると、架橋組織の形態を維持することが困難な可能性が示唆された。このことから人工材料による実験を行うこととした。壁を通して体液の交通はあるが、細胞の侵入ができないPLA tubeを作成し、架橋実験を行ったが、単独では、軸索伸長は見られなかった。コラーゲンスポンジ、PLA tube内にコラーゲンゲル、合成アルギン酸を注入したものでは、組織学的に軸索伸長は見られず、これらは軸索伸長の障害となることが考えられた。しかし、PLA tube内に培養Schwann細胞を播種したコラーゲンゲルを注入した実験では、良好な神経再生が見られ、培養Schwann細胞の有用性が示唆された。平行して、長い欠損長のモデルを作製するため、ウサギの神経からSchwann細胞を培養することを試みたが、長期に培養すると線維芽細胞が混在するため、大量培養はできなかった。このため、より現実的なモデルとして、Schwann細胞に代わる別の細胞あるいは基質を用いる実験を行った。骨髄単核球分核の細胞を血漿とともに、PLA tubeに充填したものでは、良好な神経再生が見られたが、今度は、PLAの内腔が狭小化することが問題となった。このため、内腔をPLGAでコーティングしたPLA tubeを作成した。その後、骨髄内血漿のみを入れた群で実験を行ったところ、良好な神経再生が見られたが、軸索径は前者の方が太かった。
トリパノソーマ原虫における薬剤耐性機序および病原性規定遺伝子に関する研究

T.evansi感染によって生じる炎症性因子を解析するため、感染マウス脾臓を用いたPCRアレイ解析法によって、炎症性因子およびその受容体の網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、急性期においてサイトカインおよびケモカインストームの発生が確認された。次に、炎症性因子の産生源となる細胞を同定するため、免疫磁気ビーズ法による細胞分画を行い、各細胞分画でのサイトカイン発現量を検討した。その結果、マクロファージが炎症性因子の主要な産生源であることが明らかとなった。一方、脾臓においてCcl8およびIl10の明らかな発現上昇が確認された。このことは、制御性樹状細胞(DCs)の分化、誘導との関連を示しているので、T.evansi感染マウスの脾臓における制御性DCsの動態を解析した。その結果、T.evansi感染マウスの脾臓において、原虫量の増加に伴い制御性DCsは増加し、一方で炎症性のDCsが減少することが明らかとなった。そこで、制御性DCsの機能を解析するため、T.evansi感染マウスへの移入試験を行ったところ、移入群において細胞数依存的な生存期間の延長および炎症性サイトカインの発現低下が観察された。さらにT.evansi感染ウシの末梢血中においてもCCL8およびIL10の発現増加が認められたことから、マウス同様にウシにおいても制御性DCsの増加が示唆された。以上の結果から、T.evansi感染動物におけう病態発生の要因である過度の炎症反応には制御性DCsの動態が深く関与することが示唆された。Trypanosoma evansiは、アフリカ、アジア、南米などに広く分布し、アブなど吸血昆虫の機械的伝播により哺乳動物に感染し、発熱や貧血を主徴とする疾患を引き起こす。90年代以降、フィリピン共和国ではT.evansiの強毒化が報告され、家畜での被害が深刻化している。本研究では、T.evansiの病原性を規定する因子の同定及びその性状解析を行い、T.evansiの強毒化の分子機構を明らかにすることを目的とする。病原性比較解析を行うため、フィリピン共和国で採材したT.evansiをクローン化した。野外で採取した原虫株を、液体培地HMI-9に馴化培養後、3度の限界希釈法によりクローン化原虫株12株を樹立した。各クローン化原虫株はBALB/cマウスに腹腔内投与して、その病原性を生存日数および体内の原虫数の変化で評価した。その結果、樹立した12株のうち、3株で特に強い病原性が、1株で弱い病原性が確認された。2.病原性規定遺伝子の同定および解析強毒T.evansiで発現が強いが、弱毒T.evansiで発現が弱い遺伝子に病原性を規定する遺伝子があると考えられる。そこで、病原性に差が認められた2つの株を用いたcDNAサブトラクション法を行った。強毒株,弱毒株からcDNAを合成後、cDNAサブトラクション法を行い、サブトラクション産物cDNAライブラリーを得た。現在、強毒株をtester、弱毒株をdriverとしたcDNAライブラリーのクローニングおよびシーケンシング解析を行っている。現在までに135クローンの解析が終了、複数の病原性規定候補遺伝子が得られた。T.evansiの病原性を規定する因子およびその機能解析の報告は非常に限られている。今後、病原性候補遺伝子の中から病原性規定因子を同定し、機能解析を行う。本研究は近年強毒化しているT.evansi原虫だけでなく、新規疾病防除法の開発など家畜衛生領域において非常に重要な基礎的知見を提供するものである。Trypanosoma evansiは、アメリカ、アジア、南米などに広く分布し、アブなど吸血昆虫の機械的伝播により哺乳動物に感染し、発熱や貧血を主徴とする疾患を引き起こす。1990年代以降、フィリピン共和国ではT.evansiの強毒化が報告され、家畜での被害が深刻化している。本研究では、T.evansiの病原性を規定する因子の同定及びその性状解析を行い、T.evansiの強毒化の分子機構を明らかにすることを目的として実施した。各クローン化原虫株はBALB/cマウスに接種して、その病原性を生存日数および体内の原虫数の変化で評価した。その結果、3株で特に強い病原性が、1株で弱い病原性が確認された。2.病原性規定遺伝子の同定および解析強毒T.evansiで発現が強いが、弱毒T.evansiで発現が弱い遺伝子に病原性を規定する遺伝子があると考えられる.そこで、病原性に差が認められた2つの株を用いたcDNAサブトラクション法を行い、サブトラクション産物cDNAライブラリーを得た。cDNAライブラリーのクローニングおよびシーケンシング解析からいくつかの病原性規定候補遺伝子を得ることができた。その後、得られた候補遺伝子を過剰発現したT.evansiをエレクトロポレーション法により作製した。過剰発現株をマウスに接種し、病原性に影響を与える変異株があるか現在、探索中である。T.

evansi感染によって生じる炎症性因子を解析するため、感染マウス脾臓を用いたPCRアレイ解析法によって、炎症性因子およびその受容体の網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、急性期においてサイトカインおよびケモカインストームの発生が確認された。次に、炎症性因子の産生源となる細胞を同定するため、免疫磁気ビーズ法による細胞分画を行い、各細胞分画でのサイトカイン発現量を検討した。その結果、マクロファージが炎症性因子の主要な産生源であることが明らかとなった。一方、脾臓においてCcl8およびIl10の明らかな発現上昇が確認された。このことは、制御性樹状細胞(DCs)の分化、誘導との関連を示しているので、T.evansi感染マウスの脾臓における制御性DCsの動態を解析した。その結果、T.evansi感染マウスの脾臓において、原虫量の増加に伴い制御性DCsは増加し、一方で炎症性のDCsが減少することが明らかとなった。そこで、制御性DCsの機能を解析するため、T.evansi感染マウスへの移入試験を行ったところ、移入群において細胞数依存的な生存期間の延長および炎症性サイトカインの発現低下が観察された。さらにT.evansi感染ウシの末梢血中においてもCCL8およびIL10の発現増加が認められたことから、マウス同様にウシにおいても制御性DCsの増加が示唆された。以上の結果から、T.evansi感染動物におけう病態発生の要因である過度の炎症反応には制御性DCsの動態が深く関与することが示唆された。
ウイルス特異的増殖プロセスの阻害を機序とする薬剤耐性回避型抗ウイルス剤の探索

新興・再興ウイルス感染症が毎年のように大きく報道および報告されているが、細菌感染症に対する抗生物質に比べ、抗ウイルス薬の開発は大きく遅れており、新規な抗ウイルス薬の開発が喫緊の課題となっている。本研究では、薬剤耐性ウイルスの出現回避を目指した、宿主の酵素によるウイルス特異的増殖プロセスを標的とした抗ウイルス薬の探索と開発を目指している。そこでウイルスコートタンパク質の糖鎖合成阻害がウイルスの感染性を大幅に低下させる事および糖鎖合成阻害がウイルス粒子の成熟を阻害することに着目し、これら糖鎖合成を司る酵素の阻害剤は薬剤耐性回避型抗ウイルス薬となると考えた。本研究では、培養細胞内で機能する糖鎖合成酵素特異的蛍光基質を合成し、化合物ライブラリから阻害剤スクリーニングを行い、抗ウイルス薬のリード化合物を得る事を目的とし研究を行なっている。本目的である酵素阻害剤を効率よくかつ確実に得るために、タンパク質の翻訳後修飾の1つであるN-結合型糖鎖合成に着目し、その最初の段階に関与する小胞体グルコシダーゼを標的酵素とした。しかし、これら小胞体グルコシダーゼ阻害剤の研究において、in vitro阻害活性と細胞レベル阻害活性の不一致が研究の進展を阻んでいた。更に、細胞レベルでの小胞体グルコシダーゼ阻害のアッセイは、ウイルスまたはラジオアイソトープを用いるため、大量の化合物からなる化合物ライブラリからの阻害剤スクリーニングには適していないという現状がある。そこで、標的酵素活性を細胞レベルで可視化する蛍光基質の開発に着手し、培養細胞で小胞体グルコシダーゼ活性のみを特異的に検出可能な阻害剤スクリーニングに適した蛍光基質が得られた。得られた蛍光基質を用いた培養細胞レベルでの標的酵素阻害剤のハイスループットな阻害剤スクリーニング系の構築は、既知阻害剤を用いることにより達成の目処がついた。平成30年度までの研究実施計画においては、「蛍光基質の分子設計と合成」と「阻害剤スクリーニング系の確立と最適化」の実施を行った。「蛍光基質の分子設計と合成」では、小胞体グルコシダーゼの詳細な基質特異性解析の結果得られた本酵素に特徴的な酵素活性である2-デオキシグルコシダーゼ活性と本来の活性であるグルコシダーゼ活性を基にした標的酵素特異的な阻害剤探索が可能な3色の蛍光基質を合成を試み、すべての基質の合成が概ね順調に推移している。「阻害剤スクリーニング系の確立と最適化」については、前述において合成した蛍光基質を用いて、標的酵素阻害剤のセルベーススクリーニング法の開発を行うために、細胞レベル阻害剤探索系の構築を試みている。いづれの基質も目的を達しているが、最適化に際してはその基質の優劣の評価が重要な課題として浮かび上がってきた。アッセイ系は、細胞培養および蛍光測定可能な96穴プレートに細胞を培養し、阻害剤または阻害剤候補化合物と本蛍光基質を加えインキュベートを行い、各ウェルの蛍光強度を蛍光プレートリーダーによって測定し、阻害活性の効率的な評価を試み概ね良好な結果を得ている。以上のことから、当初の計画通り研究がおおむね順調に進展していると判断した。しかし、本年度実施する本系の最適化には大きな課題が浮上した。昨年度、当初の計画に従いおおむね順調に研究が進展していることから、次年度以降も計画通りに研究を実施する予定である。具体的には、阻害剤スクリーニング系を完成させ化合物ライブラリからの目的物質のスクリーニングの実施を目指している。用いるライブラリは、公的なライブラリが充実しているため、特段の問題は常時無いと思われる。また、これらのライブラリは、微生物および植物の二次代謝産物から構成されており多様な分子骨格を有している。このような幅広い化合物空間を持つ多様性のある化合物ライブラリを用いることで新規阻害剤のヒット率が大きく向上すると考えられる。また、阻害剤スクリーニング研究の開始時には、化合物数が少ないハウスライブラリを用いる予定である。本課題の遂行は、博士前期課程2年(恩田桃子)を研究協力者として実施を予定していたが、本年3月に修了したため、博士前期課程1年(竹本佑平)と博士前期課程2年(小野寺千尋)を研究協力者として実施する。そこでウイルスコートタンパク質の糖鎖合成阻害がウイルスの感染性を大幅に低下させる事に着目し、これら糖鎖合成を司る酵素の阻害剤は薬剤耐性回避型抗ウイルス薬となると考えた。本目的を効率よくかつ確実に達成するために、タンパク質の翻訳後修飾の1つであるN-結合型糖鎖合成に着目し、その最初の段階に関与する小胞体グルコシダーゼを標的酵素とした。更に、細胞レベルでの小胞体グルコシダーゼ阻害のアッセイは、ウイルスまたはラジオアイソトープを用いるため、大量の化合物からなる化合物ライブラリからの阻害剤スクリーニングには適していない。そこで、標的酵素活性を細胞レベルで可視化する蛍光基質の開発に着手した。