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清末民初・文言小説の文体に関する研究

1.研究資料収集の状況(1)第一次資料清末民初の文言小説、および同時期の関連する第一次資料の収集に努めた。主なものとしてこれまで本学未所蔵だった『小説林』、『中国近代孤本小説精品』、『増注官場現形記』、『飲冰室文集点校』、『李大〓全集』などがある。(2)研究資料(1)と平行して、文体論関係の最新の理論的成果を吸収するために、和書・中国書・洋書の関連書籍および研究誌を収集した。主なものとして、これまで本学未所蔵だった『中国近代文学辞典』、『中国近現代通俗社会言情小説史』、『清末民初小説目録』、『清末民初小説年表』、Tom Guldemann, Reported Discourseなどがある。2.研究の内容(1)第一次資料の読解と用例の抽出上述の資料収集をふまえて、本年度は文言小説、および白話小説を含む同時期の関連する資料を読み込み、用例の抽出や文体特徴の検出を行った。用例の抽出にあたっては、「語りの形式」や「自由間接話法」といった点に重点をおいた。また、成果の一部を発表した。(2)理論的研究(1)と同時に理論的研究を平行して行った。本年度は主として、オリエンタリズム、ポスト・コロニアリズム、構築主義といった近年の人文・社会科学全般で注目される思潮について、広く関連文献を読み、理解に努めた。なかでも、本研究に密接に関わるLydia Liu, TranslingualPractice : Literature, National Culture, and TranslatedModernity -China, 1900-1937 (Stanford UP, 1995)は、その理論的射程の広さにもかかわらず、日本の学界では十分に知られていないため、私を含む三人の共訳により、全訳刊行をめざして翻訳中である。(3)資料の公開民国初期の代表的文言小説である『玉梨魂』初版本を、画像化して公開する準備を行った。主なものとして、これまで本学未所蔵だった、『中国近代小説大系』、『中国近代珍稀本小説』、『中国近代古本小説精品』、『清末民初小説書系』、『胡適文集』、『学衡』などがある。主なものとして、これまで本学未所蔵だった『清末小説』、『中国文論選』、Michel Hockx, The Literary Field of Twentieth-Century Chinaなどがある。なかでも、本研究に密接に関わるLydia Liu, TranslingualPractice : lLterature, National Culture, and TranslatedModernity-China, 1900-1937(Stanford UP, 1995)は、その理論的射程の広さにもかかわらず、日本の学界では十分に知られていないため、私を含む三人の共訳により、全訳刊行をめざして翻訳中である。なかでも、本研究に密接に関わるLydia Liu, TranslingualPractice : Literature, National Culture, and Translated

Modernity -China, 1900-1937 (Stanford UP, 1995)は、その理論的射程の広さにもかかわらず、日本の学界では十分に知られていないため、私を含む三人の共訳により、全訳刊行をめざして翻訳中である。(3)資料の公開民国初期の代表的文言小説である『玉梨魂』初版本を、画像化して公開する準備を行った。
遠隔操作による外部機器への身体感覚転移の解明

アンドロイドロボットの遠隔操作時の身体感覚転移錯覚に関し、大きく2点を発見した。1)ブレイン=マシンインタフェースによる遠隔操作系による実験から、運動意図と視覚フィードバックの2つが合致すれば、アンドロイドへの身体感覚転移が生じることを確認した。従来考えられていたものよりも、よりシンプルなメカニズムで自己認識が生じると考えられる。2)遠隔操作による対話時の身体感覚転移を調べた結果、対話という社会的な行為を自分が行う際に、自分が操作しているアンドロイドを相対する他者が対話相手として認識し、行動する様を見ることで、アンドロイドとの一体感が強くなることがわかった。本年度は1)ブレイン=マシンインタフェース(BMI)による遠隔操作時の身体感覚転移に関して昨年度に引き続き検証すると共に、2)遠隔操作対象の見かけの影響を検証した。まず、1)については、昨年度の実験から、固有感覚や触覚のフィードバック無しに、身体を動かそうとする意図(agency)とその視覚フィートバックのみでも身体感覚転移が生じることを確認できている。この結果をさらに詳細に検討した結果、視覚フィードバックの与え方により、転移の度合いが変わってくることが判った。即ち、BMIによる脳波の識別がうまくいっていない場合であっても、偽のフィードバックを与えてやることで、身体感覚転移の度合いが向上することが分かった。この際、脳内で生じている現象を、脳波の空間的パターンの分析により検証したところ、偽のポジティブなフィードバックを与えることで、BMIに使用する脳波の空間的な分離性が高まること、すなわちアダプティブな識別器を用いることで、徐々にBMI自体のパフォーマンスが向上することが判った。この結果から、身体感覚転移を向上させることで、BMI自体のパフォーマンスが向上し、さらにこのパフォーマンス向上により身体感覚転移が強化される、という正のフィードバックループが構成できる可能性がある。今後、さらに検証を進めたい。また、2)の外見の作用に関しては、人に似たアンドロイドロボットに加え、ロボットアーム、コンピュータグラフィックス(CG)を用いて身体感覚転移の実験を行った。その結果、ロボットアームやCGでもある程度の効果がみられることが判ったが、人に似たアンドロイドロボットと比べると、その強度はかなり低い。今後、馴化条件などを修正することで、人工物に対する身体感覚転移の強化の検証を進めたい。本年度は、1)ブレイン=マシンインタフェース(BMI)による遠隔操作時の身体感覚転移の検証および2)遠隔操作視点の影響の検証を行った。まず1)では、人に似たアンドロイドロボットの手をBMIにより被験者に操作させ、その際の身体感覚転移の度合いを計測する実験を行った。その結果、従来の身体動作を伴う遠隔操作だけではなく、BMIによる操作においても身体感覚転移が同様に発生すること、またBMI動作の「正解率」と身体感覚転移の度合いに相関があることを明らかにした。すなわち、うまく操作できればできるほど、外部機器を自身の身体のように感じることもわかった。ラバーハンド錯覚など、これまでの類似の研究では、固有感覚や触覚への入力と、視覚フィードバックとの相関により錯覚が生じると考えられていたが、この研究により、身体を動かそうとする意図(agency)とそのフィードバックのみでも身体感覚転移が生じることを確認できた。これによって、従来の脳内の身体感覚を形成するモデルを修正し、新たなモデルを構成できる可能性がでてきた。次に2)では、視覚フィードバックの視点の整合性が身体感覚転移に及ぼす影響を検証した。従来研究では、一人称視点、即ち偽の身体が自らのものであるかのように、整合した視点においてのみ感覚転移が生じるとされていた。今回の実験では、遠隔操作アンドロイドの操作時の視点を変更した実験を行い、結果、一人称、二人称(向かい合う視点)、鏡視点のいずれにおいても、同様に感覚転移が生じることを確認できた。しかし、有意な差は確認できなかったが、一人称と他の視点で主観評価、客観評価ともに異なる反応傾向もみられた部分もあった。身体感覚が生じる内部メカニズムの手がかりとなる可能性も有り、今後さらなる検証を進めていく。H24年度は研究計画書の予定通りに実施した。H25年度は、計画通り、a)遠隔操作対象の見かけの影響の検証、およびb)遠隔操作タスク種別の影響の検証を進める。身体感覚転移現象の応用を考えた場合、人に酷似したアンドロイドにしか適用できないのでは、応用がかなり限定されてしまう。この現象がより人工物らしい見かけを持つロボットや機器にも適用できれば、危険な場所で作業するロボットの遠隔操作など、様々な応用が考えられる。そこで身体感覚の転移を人間とは異なる見かけを持つ対象の操作でも生じさせることを試みる。また、本研究の遠隔操作による身体感覚転移は、操作と視覚の同期により発生するため、タスクの種別によって身体感覚転移の強さが変わる可能性がある。実際、これまでの予備的な試行では、運動すること自体を目的としたタスク(運動を意識するタスク)よりも、タスクを達成するために運動が必要なタスク(運動を意識しないタスク)の方が強い効果が出る傾向が見られている。

これは、従来のラバーハンド錯覚では見られない現象であるが、歩行など、日常的な行動が運動自体を意識しない方がスムースに行えることと類似している。そこで、腕ふり、ポインティング、把持など、様々なタスクを遠隔操作により行うことで、タスクの目的指向性より身体感覚転移の度合いがどのように変化するのかを明らかにする。これらの一部はすでにH24年度中に予備実験を開始している。また、H24年度に得られた結果も含め、論文投稿などの成果発表も引き続き進めて行く。該当なし
メタマテリアルミリ波アンテナを搭載したモバイルマイクロTAS実現のための基礎研究

メタマテリアルとは、材料特性(電気的又は機械的)を分散させることで、部品を組み合わせたときと同じ機能を発揮させることができる材料のことである。本研究は、メタマテリアルを用いて,化学分析や生命科学研究で用いるモバイル高機能マイクロTAS(Micro Total Analysis System)を実現するための基礎技術を開発することを目的とした。具体的には,第一に,マイクロTASに必要なポンプ・フィルター・リアクター・センサー等をすべて同じ材料・同じ駆動原理で実現するために必要な要素技術開発を行うこと,また,第二に,エネルギーの供給と分析結果の取り出しを容易にするために,60GHz帯のミリ波を利用可能にすることに関する技術開発を行うことを目的とした。後者に関しては,ホトニックバンドギャップ的な発想により,ナノ誘電体材料を分散することにより全方向性ミリ波アンテナを実現するという,新たなナノ構造制御型マイクロ材料であるメタマテリアルの材料開発およびそれを利用したミリ波デバイスの開発を行った。また,モバイル高機能マイクロTAS内での液体ハンドリングの方法として,溶液を液滴の形で扱い,これを基板上に配置した電極により駆動する新しいシステムを提案し,実験的に実証した。すなわち,表面に疎水処理をした平行ストリップ電極にを用いて,液滴を自己推進(self-propelling)的に駆動するメカニズムを発見し,このメカニズムが液滴の移動後に基板上に残る水分子の吸着層が電界をシールドすることにあることを解明,さらに,その微小化学分析システムへの応用を開発した。以上の結果,上記マイクロTASとミリ波デバイスを組み合わせることにより,容易に持ち歩くことができるマイクロTASを実現するための基盤技術が確立された。本研究課題では,ポータブルな微小化学分析システム(マイクロTAS=Total Analysis Systems)を実現するために,1)マイクロTASに必要なマイクロポンプ・マイクロフィルター・マイクロリアクター・マイクロセンサーをすべて同じ材料・同じ駆動原理で実現するために必要な要素技術開発を行い,2)分析に必要なエネルギーの供給と分析結果の取り出しを容易にするために,ナノ誘電体材料を分散することにより60GHz帯のミリ波用全方向性アンテナを実現することを目的に研究を行った。平成14年度は,これまで個々に構造と機能についての研究を進めてきた,マイクロフィルターやマイクロセパレーターを同じ素材上に作製するための研究と,低電力で動作し溶液を搬送できる,静電タイプの液滴搬送原理と圧電材料を分散させたメタマテリアルを利用した,局所マイクロポンプの2種類の搬送機構の研究を行った.圧電素子を配列し,少しずつ位相がずれた正弦波状の電圧を印加することにより,圧電素子に進行波を励起し,それをシリコンゴムで作製したマイクロ流路に外部から接触させることで流路内の壁面を変形させた.その結果,進行波により流路内の液体を搬送できることを確認した.また,進行波の方向を変えることで,搬送方向を逆転させることも可能となった.'圧電素子の薄膜化については,PZTの組成により圧電特性が変化することを利用してより高度な圧電素子を作製することが可能であることがわかった.また,チップ上での分析を行う手段として,誘電泳動を用いたクロマトグラフィー装置を開発し,DNAの分離を実験的に示した。本研究の目的は,マイクロTASに必要なポンプ・フィルター・リアクター・センサー等をすべて同じ材料・同じ駆動原理で実現するために必要な要素技術開発を行うこと,また,エネルギーの供給と分析結果の取り出しを容易にするために,60GHz帯のミリ波を利用可能にすることである。そのために,ホトニックバンドギャップ的な発想により,ナノ誘電体材料を分散することにより全方向性ミリ波アンテナを実現するという,新たなナノ構造制御型マイクロ材料であるメタマテリアルの材料開発およびそれを利用したミリ波デバイスの開発を行う。開発したマイクロTASとミリ波デバイスを組み合わせることにより,容易に持ち歩くことができるマイクロTASを実現することができる。平成15年度においては,下記の結果を得た。(1)進行波を利用したポンプのマイクロ化とそれとマイクロ流路の接続の方法について検討した。

進行波マイクロポンプによるマイクロ流路内の流速分布を数値実験を用いて算出し,マイクロ領域でのポンプ性能を明らかにするとともに,新たなアクチュエータ構造について検討した。また,マイクロミキサーについても同様のアプローチを行った。その結果,進行波マイクロポンプの効率は80%以上であった。また,マイクロミキサーに関しては,流速変動を利用することによりより効率よく短距離で混合を促進できることを明らかにした。(2)液体駆動の方法として,基板上に配置した平行ストリップ状電極に電圧を印加し,ここに発生する誘電泳動により,電極ギャップに沿って水溶液を輸送する手法を開発し,熱伝導性の良い金属基板を用いることにより,1mM程度の塩溶液の搬送を実証した。(3)通信用のミリ波アンテナに関しては,誘電体を分散配置したアンテナにより発信できることまたその配置を換えることで指向性を変えることが可能なことを確認した。さらに誘電体の動的に配置を変える構造に関しては,マイクロポンプを持いる方法について検討を行った。本研究の目的は,マイクロTASに必要なポンプ・フィルター・リアクター・センサー等をすべて同じ材料・同じ駆動原理で実現するために必要な要素技術開発を行うこと,また,エネルギーの供給と分析結果の取り出しを容易にするために,60GHz帯のミリ波を利用可能にすることである。そのために,ホトニックバンドギャップ的な発想により,ナノ誘電体材料を分散することにより全方向性ミリ波アンテナを実現するという,新たなナノ構造制御型マイクロ材料であるメタマテリアルの材料開発およびそれを利用したミリ波デバイスの開発を行う。開発したマイクロTASとミリ波デバイスを組み合わせることにより,容易に持ち歩くことができるマイクロTASを実現することができる。平成16年度においては,下記の結果を得た。(1)進行波を利用したポンプのマイクロ化とそれとマイクロ流路の接続の方法について検討した。進行波用の圧電アクチュエータとして、櫛歯状にマイクロ加工したSUS基板を用い、その上に圧電薄膜であるPZTを成膜する方法を検討した。さらに作成した圧電アクチュエータを用いてマイクロポンプを作製した。また、マイクロチャネル内壁面のマイクロテクスチャーがマイクロ流路に与える影響について検討を行った。(2)通信用のミリ波アンテナに関しては,アクチュエータを用いたアンテナでは構造が複雑になることから、誘電体に熱を与えることにより、誘電率を変化させ、それを摂動として与えることにより、放射方向を変えることが可能なミリ波アンテナを考案し、実験を用いてその有効性を示した。(3)液体ハンドリングの方法として,溶液を液滴の形で扱い,これを基板上に配置した電極により駆動する新しいシステムを提案し,実験的に実証した。
微量ナノ粒子曝露が次世代の脳神経系及び生殖系に及ぼす影響の分子機構の解明

母獣の気道から投与した粒子が、次世代の脳血管周囲マクロファージの細胞内形態を変化させ、隣接するアストロサイトにおけるGFAならびにAQP4タンパク質を用量依存的に発現亢進することが明らかになった。また、銀ナノ粒子の妊娠期投与(飲水経口投与)による次世代雄性生殖系への影響は、調製した銀ナノ粒子を投与直前に凝集させても消失せず、二次粒子径に依存しない可能性が示唆された。ナノ粒子の妊娠期曝露が次世代の脳神経系、免疫系、雄性生殖系の発達に及ぼす影響メカニズムが明らかになったことにより、この影響を制御可能にする技術開発・研究が進むと期待される。本研究の目的は、ナノ粒子の次世代影響発現機序を、脳神経系及び生殖系に焦点を当てて明らかにすることである。とくに、妊娠中母体から次世代への移行経路と影響発現に関わる分子機構を、実験動物にナノ粒子を投与したときに生じる影響の経時的変化及び組織・病理学的観点(超微小形態を含む)から検討することを目指している。当該年度に得られた主な成果は次の6点である。1)二酸化チタン及び酸化亜鉛ナノ粒子の妊娠期投与(皮下投与)による次世代中枢神経系への影響を、伝達物質(ドパミン系)に注目して比較解析した結果、ともにドパミン代謝物量ならびに代謝回転が亢進する一方で、酸化亜鉛ではドパミン自体の量は変化しないことが明らかになった。2)二酸化チタンの妊娠期投与(皮下)による次世代中枢神経系への影響について、大脳皮質やドパミン神経系が主要な標的になることを遺伝子発現変動パターンからも明らかにすることができた。3)カーボンブラックナノ粒子の妊娠期投与(点鼻投与)による次世代中枢神経系への影響として、脳血管周囲マクロファージの変化をPAS染色により定量的に評価できることが明らかになった。4)ナノ粒子を多量に含むディーゼル排ガスの妊娠期曝露により、次世代中枢神経系の大脳皮質に生じる細胞分化への影響を明らかにした。5)同様のディーゼル排ガスの妊娠期曝露により、次世代中枢神経系においてDNAメチル化状態の低下する領域が多く認められ、その標的にはreceptor activityやDNA bindingに関連する遺伝子が濃縮されている可能性が示唆された。6)銀ナノ粒子の妊娠期投与(飲水経口投与)による次世代雄性生殖系への影響を検討した結果、2週間で合計10μg/bodyの投与では顕著な影響が生じないことが明らかになった。以上の成果には、ナノ粒子の次世代影響の影響評価指標として有用なものが複数含まれていると考えられる。当該年度に得られた主な成果は次の3点である。1)カーボンブラックナノ粒子の妊娠期投与(点鼻投与)による次世代中枢神経系への影響が、脳血管周囲マクロファージのPAS染色像により定量的に捉えられることに加えて、これに隣接するアストロサイトに特徴的な変化(GFAP発現亢進)として現れることが明らかになった(Onoda et al. PLoS One 2014)。2)微量の二酸化チタンナノ粒子の妊娠期投与による次世代生殖系への影響ならびに粒子移行・蓄積量の用量依存性が明らかになった(Kubo-Irie et al. K Nanopart Res 2014)。3)銀ナノ粒子の妊娠期投与(飲水経口投与)による次世代雄性生殖系への影響を評価可能にするエンドポイントが明らかになった。本研究は、ナノ粒子の次世代影響発現機序を、脳神経系及び生殖系に焦点を当てて明らかにすることを目的として行った。とくに、ナノ粒子の職業・環境的曝露としてリスク管理の優先順位の高いと思われる気道からの曝露を想定し、マウスへの投与実験を気管内投与・点鼻投与・経肺投与を中心として進めた。(成果1)母獣の気道から投与した粒子が次世代の脳の血管周囲細胞に与える影響に併せて、これに隣接するアストロサイトにおいてGFAPタンパク質だけでなく、水チャネルAQP4タンパク質も用量依存的に発現亢進することが明らかになった。(成果2)エピジェネティクスの観点でナノ粒子による次世代神経毒性評価指標を探索した結果、二酸化チタンナノ粒子の胎児期曝露群の1日齢(新生仔期)の全脳試料において、プロモーター領域のグローバルなDNA低メチル化が示唆されるとともに、Pcdh9遺伝子の有意な発現亢進が認められた。これらの毒性・臨床学的意義は未解決の検証課題である。(成果

3)公開されている脳領域ごとの遺伝子発現プロファイル大規模データ(NCBIのGEOより取得)を解析した結果、ナノ粒子の脳内分布を制御し得るタンパク質候補としてエフリンが見出された。(成果4)銀ナノ粒子の妊娠期投与(飲水経口投与)による次世代雄性生殖系への影響は、調製した銀ナノ粒子を投与直前に凝集させても消失せず、二次粒子径に依存しない可能性が示唆された。(結論)ナノ粒子が脳に、次世代を含めて分布・蓄積することが明らかになり、今後はそのメカニズムの解明と制御を可能にする技術が注目されるであろうと期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題がおおむね順調に推進できていると言える理由は、複数のナノマテリアルの次世代影響を組織学的解析、網羅的遺伝子発現解析、エピゲノミクス解析により評価し、影響評価に利用可能なバイオマーカーの探索を進められているためである。脳や精巣におけるナノマテリアルの分布、細胞内の局在についても、電子顕微鏡やX線スペクトル解析によりマテリアルごとに順次進めている。とくに、母獣の気道から投与した粒子が次世代の脳の血管周囲細胞に与える影響については、予想を上回る明瞭な結果が得られつつある。ナノ粒子の次世代影響メカニズムとして重要な遺伝子やタンパク質の発現局在、ならびに、その発現及び活性を制御し得るマイクロRNA解析も遂行する準備を整えている。本研究課題を順調に推進できていると言える理由は、複数のナノマテリアルの次世代影響を組織病理学的解析・超微小病理学的解析ならびにタンパク質発現解析から新規の知見を得ることができているためである。その成果には、ナノ粒子の次世代影響の影響評価指標として有用なものが複数含まれていると考えられる。ナノ粒子の次世代影響メカニズムとして重要な遺伝子やタンパク質の発現局在、ならびに、その発現及び活性を制御し得るマイクロRNA解析も進めている。初年度に得られたデータを基盤として、本研究課題では残りの期間(2年間)でナノ粒子の次世代影響メカニズムを包括的に捉えることを目指す。まず、粒子の職業・環境的曝露として最も一般的であるとされる気道からの曝露を想定し、ナノ粒子の曝露実験として気管内投与ならびに点鼻投与を中心とした研究を進める。併せて、ネブライザーを用いた吸入曝露による影響評価も実施する。ナノ粒子の中枢神経系への移行・分布のメカニズムを明らかにするために、種々の生体高分子(タンパク質及び脂質)を結合させたナノ粒子をマウスに投与し、体内分布、次世代への移行や分布ならびに影響解析を並行して進める。初年度に継続して、母獣の気道から投与した粒子が次世代の脳の血管周囲細胞に与える影響に併せて、これに隣接する細胞に生じる影響の詳細を解析する。ナノ粒子の移動経路や取り込み機構については、各種電子顕微鏡をはじめとする分析機器を駆使して、体内でのナノ粒子の分布の超微細なレベルでの解析を継続する。
過疎・超高齢化地域での地震による生活被害実態の解明と人間・地域の復興のための調査研究

研究目的は、i地震による生活被害の実態と人々の生活ニーズの解明、ii災害対策、被災者生活再建支援策の現状と問題点の解明、iii人々の生活再建と地域再建のための具体的政策提言を行い、能登半島被災地、更には全国の過疎・高齢社会における人間、地域の復興に資することである。第一点については、医療班、産業班、生活・福祉・住居班、コミュニティ班がそれぞれ実態調査を行った。とくに数次に渡る仮設、道下、深見地区等被災地住民からの聞き取り調査、及びシンポジウムでの発言により、今までの震災調査にない能登半島に特有な深刻な被害実態と生活ニーズを明らかにした。なお、早川和男中心に新潟及び鳥取、兵庫県の調査も実施し、比較も行った。第二点については、輪島市はじめ行政の聞き取り及びシンポジウム、報告会の開催等により、国、県、市町そして地域における被災者生活再建支援策の問題点、課題を明らかにした。第三点については、行政との意見交換、シンポジウムの場等で具体的な施策提言を行った。これら被災地の声により被災者生活再建支援法も改正され、能登半島地震にも遡及適用されることとなった。さらに、この度の調査研究を踏まえ、復興のための人材養成の拠点作りを金沢大学に提言した。金沢大学は、これを受け、2008,2009年度、文科省の特別教育研究経費の交付も受けて取り組むこととなった。
DNA多型遺伝子に基づく日本人の地域性と遺伝子頻度の地理的勾配に関する研究

mtDNAとY染色体マーカーについて調べた.すべての都道府県および5ヵ所の離島集団から計約7,000人におけるmtDNAの5ヶ所の塩基置換部位多型(16SrRNAの3010番の塩基置換,tRNAの4386番の同義置換,百寿者に有意に多く認められるND2の5178番の塩基置換,ND3の10398番の塩基置換,ATP6の8794番の塩基置換,Region Vの9bp欠損)を調査した.日本人は20種類程度のハプロタイプに分類された.各集団間における頻度には大きな差異が認められなかったことから,これらの塩基置換から見た場合,日本人はかなり均質な集団と推定された.しかし,例えばB2ハプロタイプは南西諸島では高頻度で,北に向かうに従って頻度の低下する地理的勾配を示し,韓国人で3%,中国人では観察されなかった.ハプロタイプ頻度を用いてCavalli-Sforzaのchord distnce(Dc)を求め,NJ法で系統樹を描くと,各日本人集団は一つのまとまりのあるクラスターを形成し,ついで韓国人-北中国人-南中国人のそれぞれのクラスターが連続して分布した.東アジア集団間では沖縄と南中国がもっとも遠い距離にあり,いくつかのハプロタイプで沖縄,日本,韓国,北中国南中国に頻度の勾配が見られた.DYS19、DYS389II、DYS390,DYS393の4座のSTR多型のハプロタイプ頻度に基づいてCavalli-Sforzaのchord distnce(Dc)を求め,NJ法で系統樹を描くと,mtDNAと同様に,各日本人集団は一つのクラスターを形成し,ついで韓国人-北中国人-南中国人のそれぞれのクラスターが連続して分布し,沖縄と南中国人との近縁性は他の集団に比べ低かった.mtDNAとY染色体マーカーについて調べた.すべての都道府県および5ヵ所の離島集団から計約7,000人におけるmtDNAの5ヶ所の塩基置換部位多型(16SrRNAの3010番の塩基置換,tRNAの4386番の同義置換,百寿者に有意に多く認められるND2の5178番の塩基置換,ND3の10398番の塩基置換,ATP6の8794番の塩基置換,Region Vの9bp欠損)を調査した.日本人は20種類程度のハプロタイプに分類された.各集団間における頻度には大きな差異が認められなかったことから,これらの塩基置換から見た場合,日本人はかなり均質な集団と推定された.しかし,例えばB2ハプロタイプは南西諸島では高頻度で,北に向かうに従って頻度の低下する地理的勾配を示し,韓国人で3%,中国人では観察されなかった.ハプロタイプ頻度を用いてCavalli-Sforzaのchord distnce(Dc)を求め,NJ法で系統樹を描くと,各日本人集団は一つのまとまりのあるクラスターを形成し,ついで韓国人-北中国人-南中国人のそれぞれのクラスターが連続して分布した.東アジア集団間では沖縄と南中国がもっとも遠い距離にあり,いくつかのハプロタイプで沖縄,日本,韓国,北中国南中国に頻度の勾配が見られた.DYS19、DYS389II、DYS390,DYS393の4座のSTR多型のハプロタイプ頻度に基づいてCavalli-Sforzaのchord distnce(Dc)を求め,NJ法で系統樹を描くと,mtDNAと同様に,各日本人集団は一つのクラスターを形成し,ついで韓国人-北中国人-南中国人のそれぞれのクラスターが連続して分布し,沖縄と南中国人との近縁性は他の集団に比べ低かった.
ゼオライトを出発原料とした希少元素フリー炭素質物質燃焼触媒の開発

平成23年度には、ネフェリン担体およびアルカリ炭酸塩触媒のカーボン酸化メカニズムの解明を行った。本系では、水洗浄耐性に優れた炭酸種が存在することがわかっている。既往の研究では、アルカリ系は高い移動性、すなわち揮発や低融点化合物の形成により高活性が発現するとされている。また、反応後に炭酸種の残留が確認できることから、炭酸種が何らかの形で反応に寄与していると考察されている。さらに、炭酸種の分解が必須とも考察されている。まず本系でのアルカリの移動性について検討し、さらに活性化エネルギー算出、酸素種推定、表面分析のための実験を行い、得られた実験結果をもとに活性サイトおよび反応経路を考察した。まず、通常の透過法と比してより詳細な表面の情報が得られる拡散反射フーリエ変換赤外分光法により、炭酸塩がカーボンあるいは酸素への電子供与体である可能性が示された。また、見かけの活性化エネルギーは、活性種が炭酸ナトリウムと炭酸カリウムの複合炭酸塩であることを示唆する。すす酸化触媒として一部実用されている銀とセリアの混合物からなる触媒は、固固反応によりすす酸化を行うとされている。カーボン酸化活性評価の結果、銀セリアの混合物はネフェリン担体およびアルカリ炭酸塩触媒とは大きく異なる燃焼反応挙動を示すことがわかった。さらに、ネフェリン担体およびアルカリ炭酸塩の系はカーボンと触媒との接触が良好でなくとも高い活性を示すことがわかっており、これは固気反応が進行していることを示唆している。不活性雰囲気下で触媒試験を行った結果、実用されているPt/CeO2-ZrO2およびカリウムをドープした酸化コバルトでは格子酸素による酸化が見られるが、本系では酸化能がないことがわかった。また、13C同位体を含む炭酸カリウムを用いた触媒活性評価の結果、触媒反応中炭酸イオンは遊離しないことが示唆された。以上の実験結果より、ネフェリン担体に安定に保持された炭酸塩のカーボン酸化反応のモデルを以下のように提案した。このモデルは4つの過程から成り、(1)非局在化している炭酸イオンの電子がナトリウムに移動し、(2)電子を過剰にもったナトリウムが気相の02分子に電子を与え、(3)02-を形成しカーボンを攻撃、(4)カーボンは02-によってCO2-となり、電子を炭酸イオンに与えてCO2となり脱離することで触媒サイクルを完成した。以上の研究成果より、アルカリ炭酸塩を用いると、ディーゼルすす燃焼において排ガス平均温度帯で有効な触媒を調製可能であることがわかった。さらに活性の高い触媒を得るためには、より活性の高いアルカリ炭酸塩を表面に出現させること、カーボン酸化反応の律速となる経路を促進させること、が考えられる。また、アルカリを助触媒や添加剤として用いることも提案し、これらの知見は貴金属フリー自動車触媒の開発につながると期待される。本研究の目的は、ゼオライトを出発原料とした希少元素フリー炭素質物質燃焼触媒を開発することである。初年はアルカリ金属担持アルミノシリケートのすす燃焼触媒反応機構の解明及びゼオライトの相転移に伴う活性種の発現メカニズムの解明を行った。炭酸カリウム担持ソーダライトは熱処理後、ネフェリンに相転移すると同時に表面に炭酸ナトリウムが出現する。Naと比べてKはすす燃焼触媒活性が高いため、Kのみを含む系で同様の実験を行うこととした。このとき、Si/Al=1でありかつ安価で入手が容易なLTA型ゼオライトに着目した。比較実験として、Naのみを含む系においても検討を行った。また、ゼオライト及びネフェリンをそれぞれ出発物質として用いた場合を比較し、活性種の発現メカニズムの知見を得ることを試みた。出発物質としてNa-LTA、K-LTA、ナトリウム型・カリウム型ネフェリンを用い、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムをそれぞれに担持した。結果、ナトリウム型ネフェリンに炭酸カリウムを担持し、熱処理を行ったものが最も優れた水洗浄耐性をもつことがわかった。Raman分光法より炭酸ナトリウムが表面に発現していることがわかった。炭酸ナトリウムをカリウム型ネフェリンに担持したものは水耐性に乏しかったため、熱処理により引き起こされる固相イオン交換によってファンデルワールスエネルギーや水和エネルギーよりも強い相互作用で表面に発現すると結論した。活性化エネルギー算出結果からは、炭酸ナトリウムと炭酸カリウムそれぞれの活性化エネルギーの中間の値をとっていたことがわかり、ナトリウム及びカリウムの複合炭酸塩となっている可能性が示唆された。さらに、安定して存在する活性種はラマン不活性ではあるが赤外活性であった。水洗浄により消失した活性種は、すす燃焼触媒反応によって生じた二酸化炭素により再び発現する。この現象は本触媒機構のさらなる理解に向けて前進したものと考えている。

また、見かけの活性化エネルギーは、活性種が炭酸ナトリウムと炭酸カリウムの複合炭酸塩であることを示唆する。すす酸化触媒として一部実用されている銀とセリアの混合物からなる触媒は、固固反応によりすす酸化を行うとされている。カーボン酸化活性評価の結果、銀セリアの混合物はネフェリン担体およびアルカリ炭酸塩触媒とは大きく異なる燃焼反応挙動を示すことがわかった。さらに、ネフェリン担体およびアルカリ炭酸塩の系はカーボンと触媒との接触が良好でなくとも高い活性を示すことがわかっており、これは固気反応が進行していることを示唆している。不活性雰囲気下で触媒試験を行った結果、実用されているPt/CeO2-ZrO2およびカリウムをドープした酸化コバルトでは格子酸素による酸化が見られるが、本系では酸化能がないことがわかった。また、13C同位体を含む炭酸カリウムを用いた触媒活性評価の結果、触媒反応中炭酸イオンは遊離しないことが示唆された。以上の実験結果より、ネフェリン担体に安定に保持された炭酸塩のカーボン酸化反応のモデルを以下のように提案した。このモデルは4つの過程から成り、(1)非局在化している炭酸イオンの電子がナトリウムに移動し、(2)電子を過剰にもったナトリウムが気相の02分子に電子を与え、(3)02-を形成しカーボンを攻撃、(4)カーボンは02-によってCO2-となり、電子を炭酸イオンに与えてCO2となり脱離することで触媒サイクルを完成した。以上の研究成果より、アルカリ炭酸塩を用いると、ディーゼルすす燃焼において排ガス平均温度帯で有効な触媒を調製可能であることがわかった。さらに活性の高い触媒を得るためには、より活性の高いアルカリ炭酸塩を表面に出現させること、カーボン酸化反応の律速となる経路を促進させること、が考えられる。また、アルカリを助触媒や添加剤として用いることも提案し、これらの知見は貴金属フリー自動車触媒の開発につながると期待される。
心血管組織におけるアンジオテンシンII局所産生機構と病態薬理

本研究のテーマは、心血管組織におけるアシジオテンシン(Ang)II産生の病態生理学的意義の解明を行うことであった。従来、アンジオテンシン変換酵素(ACE)がAngIをAngIIへ変換すると考えられてきたが、最近ヒトの心血管組織ではキマーゼも同様に変換を行うことが明らかになった。従って、ヒトの局所AngII産生系の役割を解明するのはヒト同様にアンジオテンシンIIを産生するキマーゼを持つ動物種を用いて解析する必要がある。初年度および2年度に、サルキマーゼの精製およびクローニングを行い、その特徴およびアミノ酸一次配列がヒトキマーゼと極めて類似していること、そしてサル高脂食負荷動脈硬化モデルの作製を行い、血管動脈硬化部位において、アンジオテンシン(Ang)II産生が増加し、その産生酵素であるアンジオテンシン変換酵素(ACE)およびキマーゼのmRNAも有意に上昇している事実を報告した(FEBSLett.,412:86-90:1997)。これらの結果を参考に、サル動脈硬化におけるACE阻害薬とAngII受容体拮抗薬の効果を検討した。ACE阻害薬投与群およびAngII受容体拮抗薬投与群では顕著な動脈硬化病変の抑制が確認された(Athcroselerosis,138:171-182:1998)。本研究に用いたACE阻害薬およびAngII受容体拮抗薬は、血漿中の脂質レベルに影響せず、また血圧にも影響を与えない濃度であった。従来の抗動脈硬化薬は血液中脂質レベルや血圧を下げることにより、有効であると考えられてきたが、ACE阻害薬およびAngII受容体拮抗薬は血漿中の脂質レベルや血圧に影響を与えずに動脈硬化病変を抑制することより、組織におけるAngII産生の増加が動脈硬化の進展に深く関与することを示唆した。本研究は血管局所で産生されるアンジオテンシンII(Ang II)の病態生理学的意義を解明することであり、特に我々が発見した従来のレニン-アンジオテンシン系に属さない酸素、キマ-ゼを介するAng II産生系の意義を明確にするものである。本年度の研究対象であるカニクイサルの6ヶ月動脈硬化モデルを現在作製中である。また、本モデルのキマ-ゼ動態を解析するには、サルキマ-ゼの精製およびその遺伝子のクローニングを行い、その実体を明らかにしておく必要がある。本年度、上記モデル作製と併せてカニクイサルの血管組織よりキマ-ゼを完全精製し、そのアミノ末端のアミノ酸配列からサルマキ-ゼのcDNAクローニングに成功した。精製サルキマ-ゼは、これまでに我々が報告してきたAng IIを産生するイヌやハムスターのキマ-ゼより、さらにヒトキマ-ゼに近いAng II産生に特異性を示す酵素であることが判明した(現在投稿中)。また、cDNAからの予測全アミノ酸一次配列より、ヒトキマ-ゼ特異的と考えられてきたフリーのSH基や糖鎖がサルキマ-ゼには存在し、構造的にも極めてヒトキマ-ゼと類似していた。このcDNAからの情報をもとにサルキマ-ゼの特異的プローブを作成し、組織中のmRNA量をRT-PCRにて定量する方法を確立した。現在組織におけるマキ-ゼ抗体による免疫組織染色およびin situハイブリダイゼーションを用いた解析法の確立を行っている。来年度以降は、サル動脈硬化モデルの脂質代謝を中心とした病態の組織学的、生化学追跡に加えて、病態組織におけるAng II産生機構をマキ-ゼを中心に解析し、レニン-アンジオテンシン系の阻害薬並びにマキ-ゼの阻害薬による薬物療法の理論的確立を追求する。本研究は血管局所で産生されるアンジオテンシンII(AngII)の病態

生理学的意義を解明することであり、特に我々が独自に発見した従来のレニン-アンジオテンシン系に属さない酵素、キマ-ゼを介するAngII産生系の意義を明確にしようとするものである。昨年度(平成8年度)、カニクイサルの6ヶ月動脈硬化モデルを確立するとともに、サルキマ-ゼの精製およびその遺伝子のクローニングを行い、酵素学的性質および構造がヒトキマ-ゼと極めて類似していることを報告した(血管:20,207-211)。このことは、サルを用いてヒトキマ-ゼの病態生理学的意義を研究することが有用であることを示唆している。本年度(平成9年度)はサル動脈硬化モデルの生化学的解析を行った。本モデルでは血液中AngII産生酵素であるACEとキマ-ゼ活性に変化はなかったが、血管組織内のACEとキマ-ゼのmRNAレベルおよび活性は正常のサルに比して、約2-3倍有意に上昇していた(FEBS Lett.:412,86-90)。また、血管組織内のAngII量はラジオイムノアッセイ法を用いて定量した結果、動脈硬化モデル群が正常群に比して有意に上昇していた(現在投稿中)。これらの結果から、血管組織におけるACEとキマ-ゼの発現上昇に伴う局所アンジオテンシンII産生の上昇が動脈硬化病変と密接に関連することが示唆された。来年度以降は、本モデルの動脈硬化病変に対するレニン-アンジオテンシン系の阻害薬(ACE阻害薬とAngII受容体拮抗薬)並びにキマ-ゼの阻害薬の薬効評価を行い、動脈硬化病変形成における血管組織AngII産生の関与をさらに明確にするとともに薬物療法の確立を探求する。平成8年度、サルキマーゼの精製およびクローニングを行い、その特徴およびアミノ酸一次配列がヒトキマーセと極めて類似していることを報告し(血管,20:207-210:1997)、平成9年度はサル高脂食負荷動脈硬化モデルの作製を行い、血管動脈硬化部位において、アンジオテンシン(Ang)II産生が増加し、その産生酵素であるアンジオテンシン変換酵素(ACE)およびキマーゼのmRNAも有意に上昇している事実を報告した(FEBS Lett.,412:86-90:199-7)。これらの研究をふまえ、本年度は動脈硬化病変における薬物療法の可能性について検討した。まず、カニクイサルを高脂食を負荷させる群、高脂食負荷+ACE阻害薬を投薬する群、高脂食負荷+AngII受容体拮抗薬を投薬する群、そして普通食群の4群に分類し生化学的、組織学的解析を行った。高脂食負荷群では昨年度の報告と同様に動脈硬化病変部位における有意なACEおよびキマーゼのmRNAの上昇が観察され、局所AngII産生も増加していた。ACE阻害薬投与群およびAngII受容体拮抗薬投与群では顕著な脂肪沈着抑制と血管内膜肥厚の抑制が確認された(Atherosclerosis,138:171-182:1998)。本研究に用いたACE阻害薬およびAngII受容体拮抗薬は、血液中の脂質レベルに影響せず、また血圧にも影響を与えない濃度であった。ACE阻害薬はAngIIの産生抑制以外にブラジキニンの産生増加を促すため、ACE阻害薬の機序を考える場合、2つの可能性を考慮する必要があるが、本研究ではAngII受容体拮抗薬も有意に動脈硬化病変を改善したことより、組織局所でのAngII増加が動脈硬化形成に重要であることが示唆される。
アルツハイマー病モデルラットにおける口腔領域の痛覚異常の解明

認知症は高齢者にみられる主要な疾患で、口の健康とも関連性が強い。歯科臨床上、認知症患者は自ら口腔領域の不調を訴えることは少ない。一方、口腔ケアや歯科治療などの歯科的介入を強く拒否することも多い。これらの拒否行動が認知症に伴う中核症状や周辺症状の現れとも解釈できるが、口腔領域の痛覚、特に痛覚の認知に変化が生じている可能性も否定できない。認知症の治療薬としてアセチルコリンやNMDA受容体に作用するドネペジルやメマンチンが有効であることは、認知症患者の脳内での神経伝達に何らかの変調が起こっていることを示唆している。本研究の目的は、認知症が口腔領域の痛覚に及ぼす影響を検討することであり、認知症モデルラットを用い、上口唇へのホルマリンテストを行い、疼痛関連行動、および三叉神経脊髄路核でのc-FOS発現から検討する。認知症モデルとしては、アルツハイマーモデルラットを用いる。ラットの両側海馬に、Aβ1-40、および興奮性アミノ酸のイボテン酸を注入することで作製し、行動実験及び免疫組織学的手法を用いてモデルの評価を行う。その後、口腔顔面領域の痛覚への影響を検討するため、上口唇へのホルマリンテストを行い、疼痛関連行動の評価及び免疫組織学的手法を用いて対照群と比較検討する。Aβおよびイボテン酸を投与して作製したモデルラットにおいて、モリス水迷路及びY字迷路試験において学習能力の障害が認められた。免疫染色においては神経細胞障害およびAβの沈着を確認することができた。次に、作製した認知症モデルラットを用いて上口唇にホルマリンテストを行った結果、第二相において疼痛関連行動の減少が認められた。また、免疫染色の結果、AD群では対象群と比較してVcの浅層におけるc-FOS発現陽性細胞数の有意な減少が認められた。以上の結果より、認知症モデルラットの口腔領域の痛覚は鈍麻している可能性が示唆された。現在までに、アルツハイマーモデルラットの確立、口腔顔面領域へのホルマリンテストの実施が完了しており、おおむね順調に進展している。ホルマリンテストの結果から、口腔顔面領域における炎症性刺激に対する痛覚は鈍麻していることが判明した。しかし、口腔顔面領域以外の痛覚への影響も調べる必要があるため、同様に作製したモデルラットにおいて、下肢へのホルマリンテスト等を行い、痛覚異常の評価を行い、体全体における痛覚の認知への影響を評価する。さらに、アルツハイマー病モデルラットとして報告されている別のモデルでの検討も考慮する予定である。研究目的:認知症は高齢者にみられる主要な疾患である。臨床上、認知症患者は自ら口腔領域の不調を訴えることは少ない。これらの行動が認知症に伴う中核症状やBPSDの現れとも解釈できるが、口腔領域の痛覚に変化が生じている可能性も否定できない。本研究では、アルツハイマー病モデルラット(ADラット)を作製し、痛覚への影響を検討する。(1)モデルの作製:ADラットはAβ1-40およびイボテン酸を両側海馬へ注入することで作製する。(2)モデルの評価方法:認知機能の評価は、空間学習能力を評価するモリスの水迷路及び短期記憶を評価するY字迷路試験を行う。モリスの水迷路では、獲得試行としてプラットフォームを水面下10mmに設定し、手術日から15日後より1日2試行、7日間連続して行い平均逃避時間を測定する。次に保持試行として最終獲得試行の24時間後にプラットフォームを除去し、プラットフォームを取り除いた状態でラットを泳がせた時のプラットフォーム通過回数で記憶の保持能力を評価する。Y字迷路ではラットをY字のいずれかアームの先端に置き、8分間迷路内を自由に探索させ、進入したアームの回数をカウントし、連続して異なる3本のアームに進入した組み合わせの数(交替行動数)を調べ、交替行動率(%)を算出し、探索した際に認められる自発的交替行動を短期記憶として評価する。すべての行動実験が終了後、ラットの脳をを灌流固定し、神経細胞の脱落とAβの海馬内への沈着を確認する。(2)痛覚異常の評価:ADモデルラットの左側上口唇に4%ホルムアルデヒド0.05mlを注射し、5分ごとの顔面こすり行動、行動の回復様式を90分観察した。注射より120分後に脳を潅流固定し、免疫組織学的手法を用い、三叉神経脊髄路核でのc-fos発現陽性細胞数を計測する。(1)ADモデルラットの確立ADモデルラットはアルツハイマー病の原因とされるAβ1-40、および興奮性アミノ酸のイボテン酸を両側海馬へ注入することで作製した。モリスの水迷路およびY字迷路試験にて認知機能の評価を行ったところ、空間学習及び記憶の障害が認められた。さらに免疫組織化学的にもラットの脳の海馬の神経脱落やAβの蓄積が観察された。したがって、今回用いた方法により、ADモデルラットが確立されたものと考えられる。(2)口腔領域の痛覚への影響作製されたADモデルラットの左側口唇に4%ホルムアルデヒド0.05mlを注射し、5分ごとの顔面こすり行動(疼痛関連行動)、行動の回復様式を90分観察した。その後、注射より120分後に潅流固定を行った。60μmごとの凍結切片を作製し、免疫組織学的手法を用い、三叉神経脊髄路核でのc-fos発現陽性細胞数を計測、比較検討を行った。

現在、ホルマリンテストに対する、疼痛関連行動と三叉神経脊髄路核におけるc-fos発現陽性細胞数をADラットとコントロールラットで比較検討しているところである。認知症は高齢者にみられる主要な疾患で、口の健康とも関連性が強い。歯科臨床上、認知症患者は自ら口腔領域の不調を訴えることは少ない。一方、口腔ケアや歯科治療などの歯科的介入を強く拒否することも多い。これらの拒否行動が認知症に伴う中核症状や周辺症状の現れとも解釈できるが、口腔領域の痛覚、特に痛覚の認知に変化が生じている可能性も否定できない。認知症の治療薬としてアセチルコリンやNMDA受容体に作用するドネペジルやメマンチンが有効であることは、認知症患者の脳内での神経伝達に何らかの変調が起こっていることを示唆している。本研究の目的は、認知症が口腔領域の痛覚に及ぼす影響を検討することであり、認知症モデルラットを用い、上口唇へのホルマリンテストを行い、疼痛関連行動、および三叉神経脊髄路核でのc-FOS発現から検討する。認知症モデルとしては、アルツハイマーモデルラットを用いる。ラットの両側海馬に、Aβ1-40、および興奮性アミノ酸のイボテン酸を注入することで作製し、行動実験及び免疫組織学的手法を用いてモデルの評価を行う。その後、口腔顔面領域の痛覚への影響を検討するため、上口唇へのホルマリンテストを行い、疼痛関連行動の評価及び免疫組織学的手法を用いて対照群と比較検討する。Aβおよびイボテン酸を投与して作製したモデルラットにおいて、モリス水迷路及びY字迷路試験において学習能力の障害が認められた。免疫染色においては神経細胞障害およびAβの沈着を確認することができた。次に、作製した認知症モデルラットを用いて上口唇にホルマリンテストを行った結果、第二相において疼痛関連行動の減少が認められた。また、免疫染色の結果、AD群では対象群と比較してVcの浅層におけるc-FOS発現陽性細胞数の有意な減少が認められた。以上の結果より、認知症モデルラットの口腔領域の痛覚は鈍麻している可能性が示唆された。現在までに、アルツハイマーモデルラットの確立、口腔顔面領域へのホルマリンテストの実施が完了しており、おおむね順調に進展している。現在、歯科疾患を想定しているため、ADモデルラットの上口唇(眼窩下神経領域)へのホルマリン注射(炎症性の侵害刺激)を行い、痛覚への影響を検討している。今後さらに、口腔顔面領域の触覚に対する影響をフォンフライテストにより検討する。さらに、最終的には全身的な痛覚への影響も検討する必要があると考える。ホルマリンテストの結果から、口腔顔面領域における炎症性刺激に対する痛覚は鈍麻していることが判明した。しかし、口腔顔面領域以外の痛覚への影響も調べる必要があるため、同様に作製したモデルラットにおいて、下肢へのホルマリンテスト等を行い、痛覚異常の評価を行い、体全体における痛覚の認知への影響を評価する。さらに、アルツハイマー病モデルラットとして報告されている別のモデルでの検討も考慮する予定である。認知機能を評価するためのモリス水迷路の実験装置の納品が7月を過ぎ、そのため実験の開始が遅くなった。そのため研究の全体的な進行に後れを生じ、物品費として約20万円が次年度に繰り越された。次年度はその遅れを取り戻すべく、研究を行っていく予定である。
B型肝炎ウイルスが引き起こす肝組織構成細胞の変化と癌化の解明

肝組織環境を構築するのに重要な細胞間シグナルがHBV感染とも関連することが判明したので、このシグナルに関連した分子機構の研究を行った。これはNotchシグナルと呼ばれ、ヒトのみならず各個体における様々な臓器の発生と関連が強いが、肝においては再生や癌化、胆管形成と密接に関与するとされ、肝組織構成細胞間でHBV感染と関連して疾患特異的に相互作用を呈することも予測された。まずHBV感染培養細胞および臨床肝組織のサンプルを利用して、HBVの転写因子が細胞間シグナルと密接に関連することを示した。特にNotchレセプターにおけるユビキチン・プロテアソーム系の機構がHBVの転写に作用することを示し、学会及び論文報告を行った。さらにこの細胞間シグナルはHBVに対する抗ウイルス剤である核酸アナログの作用にも影響を与えることが判明した。核酸アナログはラミブジン、エンテカビルを含むヌクレオシド類似体とアデホビル、テノホビルを含むヌクレオチド類似体との2種類があり、前者はNotchシグナルを古典的な経路で抑制させ、HBVcccDNAに作用する転写因子を抑制させるが、後者ではNotchシグナルの非古典的な活性経路依存的にmTORC2を活性化させ、HBVの複製を抑制することが判明した。これは、核酸アナログのHBVに対する逆転写酵素阻害以外の作用になることが示唆された。以上のように、HBV感染による肝組織環境の変化が細胞間シグナル経路を変化させて、複数の経路で抗ウイルス作用を呈することが判明し、HBVに関連した発癌にも作用することが予測された。これまでの研究から、Notchシグナルの亢進した細胞は癌の進展と大きく関連することが判明したため、このシグナルがHBV感染状態とどのように関わっているかについて確認を行った。NotchシグナルとHBVの転写や複製がどの程度関連しうるかについてHBV感染培養細胞やHBV感染臨床肝組織で、NotchレセプターであるNotch1の細胞内ドメインNICDがCREB誘導蛋白であるPKAを介してHBVの転写に影響することを示した。またNICDの活性化に関してユビキチン・プロテアソーム系の変化が関連することも証明し、それを制御するものとしてE3リガーゼが関与し、γセクレターゼ阻害剤やプロテアソーム阻害剤を投与して、下流標的遺伝子の変化やHBVの転写状態の変化を確認した。この実験によりNotchシグナルがHBV cccDNAの転写に大きく関与することを証明した。また、現在B型慢性肝炎患者に対し抗ウイルス治療として核酸アナログが広く投与されているが、核酸アナログの種類でNotchシグナルの活性化が異なることが示された。ラミブジン、エンテカビルのnucleosideanalogue投与下ではNotchは抑制され、転写因子を介してHBV cccDNAの転写が抑制されるが、アデフォビル、テノフォビルのnucleotide analogue投与下では逆にNotchシグナルは亢進することを示した。後者の薬剤投与下ではNotchシグナルはnon-canonicalな経路で活性化され、さらにmTORC2シグナルが活性化することが、HBV感染培養細胞および、核酸アナログ投与下のHBV感染臨床肝組織で示された。すなわち、核酸アナログのHBVに対する逆転写酵素阻害以外の作用が細胞間シグナルに対して存在し、これは代謝や免疫の関与するシグナルに肝組織環境全体に影響を与えることが示唆された。肝組織において細胞間シグナルを含めた肝組織環境を構成する細胞の相互作用がHBV感染状態と密接に関与することが判明した。以上の結果を踏まえ今後の研究の推進方策としては、以下の点を重点的に推進する。HBV感染環境下の肝組織構成細胞の機能解析を行う。肝細胞以外の肝組織構成細胞(胆管細胞、内皮細胞、星細胞など)に対してHBVを導入して発癌に関連したシグナルがどのように引き起こされるかを評価する。HBV感染培養細胞や他の肝組織構成細胞との共培養を行った実験をすすめる。HBV感染可能な培養細胞であるHepG2-NTCP-C4に効率よくHBVを感染させた際の細胞内シグナル伝達変化を観察する。また、内皮細胞や星細胞を共培養させ、細胞間シグナルに変化を来すかを確認する。HBV感染や存在と関係するバイオマーカーの応用を行う。これまで血清M2BPGiがHBコア関連抗原と組み合わせて測定し、両者が高値な症例は肝発癌の高い可能性が示され、学会および論文報告を行った。今後もHBVに関連した臨床応用が可能な血清や尿などの検体中で検出可能なバイオマーカーの探索を行う。HBV感染や癌化と関連したエクソソーム解析も行い、得られた変化が他の多くの患者でも確認できるかを評価する。B型肝炎ウイルス(HBV)を背景とする肝がん患者において、外科的手術より得られたがん組織及び背景肝組織に対し細胞分離酵素反応を行った。それぞれの肝組織内各種構成細胞が分離された状態となり、これら各細胞内の遺伝子発現を次世代シーケンサーで解析することを本研究の主目的としている。そのため、まず肝組織を一細胞に分離する至適条件の検討を行った。肝組織は他の臓器と比較してRNaseの含有が多く、かつ肝硬変等進展した慢性肝疾患においては組織内のコラーゲンも多く、サンプルの状態によっては分離が困難となることが多く、組織を迅速に処理することや細胞分離酵素を肝組織の硬度により使い分けることが重要であるとされた。また、それに関連した研究として、一細胞遺伝子解析に与する分離したサンプルを血管内皮細胞に至適な培地で培養した。