hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アジア大陸の大陸変形現象を中国に探る

[無変形地域]A隊:湖北省の随州市周辺にひろがる白亜紀の赤色砂岩層を研究対象に選び,2000年9月15日より9月25日のあいだ調査をおこなった。公安塞層から17箇所170個の赤色砂岩を採取した。[変形地域]B隊:タリム盆地の南北地域,コンロン山脈の北麓とテンシャン山脈の南麓を研究目的地域と選び,2000年9月25日より10月27日のあいだ調査をおこなった。コンロン山脈の北麓の東和と且末周辺に分布するジュラ紀の巴工布蘭沙層群の赤色砂岩を,テンシャン山脈の南麓の庫車北方に分布するジュラ紀の阿合層,陽霞層,克攻勒努爾層の砂岩を古地磁気学研究のための岩石とした。46箇所で380個の試料を採取した。C隊:中国貴州省平塘周辺と独山の西部を研究対象地域として,2000年11月1日より11月18日のあいだ調査をおこなった.下部石炭系上司段/中部石炭系黄龍詳・中部石炭系黄龍群・下部ペルム系最上部茅口組中部-最上部、下部ペルム系最下部栖霞組・上部ペルム系中部下部ペルム系最下部栖霞組から石灰岩・ドロマイトを研究対象岩石として,計545個の岩石試料を古地磁気学のために採取した.[測定]神戸大学において,採取した岩石の古地磁気測定を行っている.今年度は二つの地質調査・岩石採取隊を組織し中国とロシアに赴いた。2001年8月、中国、祁連山山脈の北麓を研究目的地域と選び,3週間に足りわたり地地質調査・岩石採取をおこなった。甘粛省の玉門の西南でジュラ紀の砂岩を10箇所から,酒泉の南で白亜紀の赤色砂岩を13箇所から採取した.2001年9-10月、ロシアのウスリー川ビキン地域を研究調査域と選び、2週間にわたり地質調査・岩石採取をおこなった.ビキン地域から、下部白亜紀より砂岩層から3箇所、溶結凝灰岩層から7箇所、上部白亜紀の砂岩層より2箇所の岩石を、計13箇所から採取した。岩石を神戸大学理学部の超伝導磁力計で測定してしる.昨年度までに採取してきた岩石から、つぎの事柄がわかってきた。(1)インドシナブロックにある雲南省の雲龍地域で採取した白亜紀・赤色砂岩層は、32度の時計周りの回転がインドシナブロックでおこったことを明らかにした。一方、雲南省の蘭平地域に分布する第三紀層の赤色砂岩は90度の時計周り回転がおこったことを明らかにした。小ブロックが断層で分断され、小ブロックごとの回転運動がおこったらしいことを示唆した。白亜紀・古第三紀の伏角データともに、インドシナブロックが1000km以上の南下を経験したことをあきらかにした。(2)揚子ブロックの四川盆地から採取したジュラ紀の赤色砂岩が初生磁化を保存していることを明らかにしたあと、このデータを北中国地塊の磁化と比較し、揚子ブロックと北中国地塊の接合はジュラ紀後期にはいまだ完成していないことが判明した。
イメージング技術を駆使した炎症性骨破壊と修復過程の評価―治療薬開発を目指して―

骨粗鬆症や歯周病での炎症性骨破壊は、加齢にともなって発症する骨代謝疾患である。現在、健康寿命延伸を目的に、失われた骨組織を修復して、骨折を予防するための補助療法として薬物治療が行われている。しかし、臨床現場で使用できる治療薬は骨吸収抑制薬を主体としていることから、骨代謝回転低下により骨の再生・修復を遅らせること、すなわち、硬くて脆い骨になることが危惧される。本研究で新規開発を目指したMPMBPはビスホスホネートのひとつであり、P-C-P基本骨格による骨への高い親和性を介した確実な骨吸収抑制作用に加えて、側鎖が肝代謝を受けて生成するチオール基に由来する抗酸化作用をもつことを特徴とする化合物である。一方、酸化ストレスは破骨細胞を活性化するとともに、骨芽細胞を抑制することが証明されている。このため、高齢者や糖尿病・腎不全などの生活習慣病において、骨密度低下の原因となっている酸化ストレスを軽減することにより、骨代謝回転が正のバランスとなり、健全な骨を増加させる可能性が示される。そこで、本研究では、ラットおよびマウスに、MPMBPまたは、強い抗酸化作用をもつ植物由来成分であるアントシアニンを投与した場合の骨形成促進作用についてイメージング手法を用いて調べ、骨代謝疾患治療薬としての有用性を評価した。研究成果から、MPMBPは骨吸収抑制作用と骨形成促進作用に加えて、抗炎症作用を併せ持つことが示され、アントシアニンは、in vitro, in vivoのいずれの実験系においても、骨芽細胞を活性化することにより、骨密度低下を改善することが確認された。これらの結果から、酸化ストレスを軽減する薬物は、in vitro, in vivoのいずれにおいても、骨アナボリック作用をもつこと、それにより新しい骨を造る治療薬として臨床応用できる可能性が示された。超高齢社会である我が国において、要介護の大きな原因となっているロコモティブシンドロームを効果的に予防・治療するために、炎症性骨破壊の発症メカニズム解明と治療薬開発を目的として研究を行っている。骨破壊を起こす唯一の細胞種である破骨細胞は、造血幹細胞に由来し、活性調節因子およびその受容体を免疫・炎症に関与するその他の造血系細胞と共有するため,炎症性骨破壊の病態は極めて複雑である。このように複数の細胞種が相互に関連する病的骨破壊機構を解明するために、生きたままの動物でバイオイメージング手法を用いて研究を行った。その結果、炎症性骨破壊モデルマウスに全身投与した破骨細胞前駆細胞が、起炎物質投与3日後に炎症部位に観察され、5日後には、同部位に骨破壊が起こることが示された。また、イメージング実験終了後に採取した頭蓋冠組織を解析した結果、ドナー由来の細胞が炎症局所でTRAP陽性細胞に分化して吸収窩が形成されることが示された。すなわち、全身循環中に存在する破骨細胞前駆細胞が炎症部位で産生される何らかの分子からの情報を感知して、同部位に遊走して重篤な骨破壊を惹き起こすと考えられる。また、共同開発中の新規ビスホスホネートを骨破壊モデルマウスに投与したところ、破骨細胞前駆細胞の遊走および骨破壊反応が完全に抑制されたことから、病的骨破壊治療薬としての有用性が示された。さらに、我々の従来の研究で骨保護作用が確認されている植物由来成分アントシアニンの作用機序および吸収性骨代謝疾患治療効果について検討した。その結果、培養骨芽細胞においてNFkBの核移行を阻害することにより石灰化を促進すること、RANKL全身投与により作製した骨粗鬆症モデルマウスに一定期間前投与することで骨密度改善作用がみられたことから、吸収性骨代謝疾患の発症予防に役立つ可能性が示された。共同開発中の新規ビスホスホネートおよび植物由来成分であるアントシアニンはいずれも強い抗酸化作用を有するという共通点がある。一方、骨粗鬆症や歯周病での炎症性骨破壊などでは、抗酸化物質の働きにより病態が改善されることが予想される。我々は、このような観点から治療薬開発を目指して研究を進めているが、本研究計画で申請した「イメージング技術」を応用することで、学内および学外(他大学、研究施設)との共同研究により、おおむね良好な結果を得ることができた。今後、少しでも早期に臨床応用することを念頭におき、特に歯科疾患での局所適用の有用性についての検討を展開する道筋がみえてきた。本研究で骨代謝疾患治療薬としての有効性を検討している新規ビスホスホネートMPMBPと植物由来成分であるdelphinidinはいずれも強い抗酸化作用を有するという共通点がある。一方、骨粗鬆症や歯周病での炎症性骨破壊などでは、酸化ストレスにより惹起される病態であることが解明されつつある。本年度はin vitro(細胞培養)およびin vivo(RANKL誘導性およびOVXによる骨粗鬆症モデルマウス)両面から基礎的研究を行った。MPMBPとdelphinidinは、破骨細胞前駆細胞とMC3T3-E1細胞でNFkBの核内移行を抑制すること、そのため、骨吸収作用を抑制するだけでなく、NFkBで分化が阻害される骨芽細胞に働きかけることで骨形成を促進することが示された。

また、RANKL誘導性およびOVX誘導性骨粗鬆症モデルマウスにMPMBPまたはdelphinidinを投与することで骨量増加が認められた骨試料について、X線マイクロCTおよび蛍光2重ラベルにより骨形態計測を行った結果、破骨細胞数、吸収面積が減少する一方、骨芽細胞数と骨形成速度が有意に上昇することが示され、骨代謝回転のアンカップリングにより骨形成優位となっていることが示された。さらに、正常新生仔ラットにMPMBPを投与し、窒素含有ビスホスホネートであるzoledronateとの比較を行ったところ、両薬物とも、脛骨近心端において用量依存的な骨量増加作用を示した。一方、zoledronate投与では長管骨伸長抑制および歯牙萌出遅延が観察されたのに対し、MPMBPではこれらの有害作用は軽微であった。zoledronateは強い骨吸収抑制作用により骨リモデリングを抑制するが、MPMBPでは骨吸収抑制が中等度であり、加えて骨形成促進作用があるために、幼若動物においても有効かつ安全な骨代謝疾患治療薬となる可能性が示された。超高齢社会である我が国において、要介護の大きな原因となっているロコモティブシンドロームを効果的に予防・治療するために、炎症性骨破壊の発症メカニズム解明と治療薬開発を目的として研究を行っている。破骨細胞は、造血幹細胞に由来し、活性調節因子およびその受容体を免疫・炎症に関与するその他の造血系細胞と共有するため,炎症性骨破壊の病態は極めて複雑である。複数の細胞種が相互に関連する病的骨破壊機構を解明するために、生きたままの動物でバイオイメージング手法を用いて研究を行った結果、全身投与した破骨細胞前駆細胞が、起炎物質投与3日後に炎症部位に観察され、5日後には、同部位に骨破壊が起こることが示された。イメージング実験終了後に採取した頭蓋冠組織を解析した結果、ドナー由来の細胞が炎症局所でTRAP陽性細胞に分化して吸収窩が形成されることが示された。すなわち、全身循環中に存在する破骨細胞前駆細胞が炎症部位で産生される何らかの分子からの情報を感知して、同部位に遊走して重篤な骨破壊を惹き起こすと考えられる。さらに開発中の新規ビスホスホネートMPMBPを骨破壊モデルマウスに投与したところ、破骨細胞前駆細胞の遊走および骨破壊反応が完全に抑制されていた。この実験で治療効果が確認された骨試料について、X線マイクロCTおよび蛍光2重ラベルにより骨形態計測を行ったところ、MPMBPやdelphinidinを投与した動物では、骨吸収が抑制されている状態でも骨形成促進が観察されることから、骨代謝回転のアンカップリングが起きていることが示された。これらの結果から、強い抗酸化作用をもつMPMBPやdelphinidinは、窒素含有ビスホスホネートとは異なり、顎骨壊死や非定型大腿骨折などが起こりにくい骨代謝疾患治療薬として使用できる可能性が示された。骨粗鬆症や歯周病での炎症性骨破壊は、加齢にともなって発症する骨代謝疾患である。現在、健康寿命延伸を目的に、失われた骨組織を修復して、骨折を予防するための補助療法として薬物治療が行われている。しかし、臨床現場で使用できる治療薬は骨吸収抑制薬を主体としていることから、骨代謝回転低下により骨の再生・修復を遅らせること、すなわち、硬くて脆い骨になることが危惧される。本研究で新規開発を目指したMPMBPはビスホスホネートのひとつであり、P-C-P基本骨格による骨への高い親和性を介した確実な骨吸収抑制作用に加えて、側鎖が肝代謝を受けて生成するチオール基に由来する抗酸化作用をもつことを特徴とする化合物である。一方、酸化ストレスは破骨細胞を活性化するとともに、骨芽細胞を抑制することが証明されている。
溶融成型によるポリビニルアルコール繊維の高次構造制御

ポリビニルアルコール(PVA)は、融点が分解温度以上であるため熱可塑性ではない。本研究の目的は、PVAとホウ酸B(OH)_3との可逆的な錯体形成による融点低下を利用して溶解成形を可能とし、高次構造制御された高性能PVA繊維(フィルム)を製造するための基礎的知見の集積にある。本年度は、試作した小型溶融紡糸機(最小試料量5g)を用いて、最適なアルキルボロン酸R-B(OH)_2の検索(フェニルボロン酸(PBA)、並びに、アルキル鎖長の異なるメチルボロン酸(MBA)、ブチルボロン酸(BBA)、ヘキシルボロン酸(HBA))と錯体形成条件の最適化並びに溶融成型可能な最低のアルキルボロン酸導入率の検討を行い、以下の知見を得た。1.ボロン酸の添加量、すなわち、錯体の形成量が増加するに伴い融点は低下するが、ボロン酸の導入量が10mol%を超えると、PVAの結晶化が阻害されることが判明した。2.できるだけ少量のボロン酸の導入で錯体の融点を低下させるためには、PBAが最も有効であった。しかし、その溶融成型性は低く、溶融成型性の観点からはアルキルボロン酸の方が効果的であることが判明した。3.錯体形成による融点降下に及ぼすアルキル鎖長の影響を調べた結果、10mol%添加した場合ブチル基が最も効果的であった。
皮膚吸収性物質N,N-ジメチルアセトアミドの取扱い作業者の新規リスク評価法の開発

本研究の目的は、繊維原料などに使用され、取扱い作業者が急性肝炎を発症したN,N-ジメチルアセトアミド(DMAC)取扱い作業者のリスク評価法の開発である。DMACは皮膚からの吸収があることが指摘されており、ばく露評価として体内取り込み量が反映される尿中代謝物濃度測定が有効である。現在、米国が勧告するガスクロトマトグラフ(GC)法による尿中N-メチルアセトアミド(NMAC)をバイオマーカーにばく露評価されている。しかしながら、GC法はGCの注入口温度によりNMACの前駆物質であるN-メチル-N-ヒドロキシメチルアセトアミドが熱分解し、NMACとなることから、測定精度に問題があることが指摘されている。2017年度は上記の課題を解決した尿中代謝物4成分の同時測定法を開発した。2018年度は開発した測定法を用いて、パイロットスタディとして、DMAC取扱い作業者に対して、ばく露調査を実施した。調査項目は、個人ばく露濃度、尿中代謝物濃度、さらに、皮膚吸収の有無を確認できるバッチを用い、皮膚吸収の有無を明確に評価した。当該調査を基に2019年度は、調査事業所を増やしデータを蓄積し、個人ばく露濃度と各尿中代謝物濃度の関連性を解析する。2018年度に実施した調査事業所が1事業所であり、今後さらに、調査事業所の確保が必要なため。研究計画に従い、フィールド調査の事業所を確保し、ばく露調査を行いデータを蓄積する。個人ばく露濃度測定、尿中代謝物濃度測定、皮膚吸収確認のためのバッチテストを実施し、それらの関係について解析する。平成29年度は、申請者らが開発し、投稿準備中であった高速液体クロマトグラフ-質量分析(HPLC-MSMS)法を用いたDMAC尿中代謝物4成分の同時測定法について論文投稿を行い(Yamamoto et al. J Occup Health 2018; 60: 140-147)、精度の高い尿中代謝物測定法を確立した。また、1開発した同時測定法を検査機関で容易に活用できるように、UV検出器を用いた手法を開発すること、2実態調査のためのフィールド調査事業所の確保を計画した。測定法開発では、UV検出器を用いた測定法の条件検討(移動相条件、分析カラム、前処理手順)等を実施している。分析機器の導入に時間を要したため、測定法の確立には至っていないが、平成30年度も引き続き検討を進める。フィールド調査事業所の確保については、調査を低コストで円滑に進めるため大学近隣で調査事業所を確保するため産業医等を通じて取扱い事業所へ調査協力を打診しているが調整に時間を要し事業所確保には至っていない。分析機器の導入に時間を要し、平成29年度に計画していた分析法の確立に至っていないため。また、調査事業所の確保にも至っていないため。研究計画に従い、UV検出器を用いた測定法の開発、フィールド調査事業所の確保を継続して行う。UV検出器を用いた測定法の開発が困難な場合は、申請者らが開発したHPLC-MSMS法を用いてフィールド調査を行い、個人ばく露濃度測定、尿中代謝物濃度測定を実施し、個人ばく露濃度と各代謝物濃度の関連性を調査、解析する。また、皮膚吸収の有無を確認するバッチテストを実施する。調査事業所の確保については、調査可能エリアを広げ、引き続き産業医等を通じ調査事業所を確保し、調査を実施する。

研究計画に従い、フィールド調査の事業所を確保し、ばく露調査を行いデータを蓄積する。個人ばく露濃度測定、尿中代謝物濃度測定、皮膚吸収確認のためのバッチテストを実施し、それらの関係について解析する。次年度使用額が生じた理由は、平成29年度に購入を予定していた物品が計画していた価格より安価に購入でき、また、特注試薬の購入をフィールド調査の時期に合わせるため、購入時期を次年度以降としたため。平成30年度は、ばく露調査での個人ばく露濃度測定、尿中代謝物濃度測定および分析にかかる物品、人件費、調査への旅費に使用する。次年度使用額が生じた理由は、調査事業所が少なく、また、大学近隣であり移動費が計画よりもかからなかったため。また、成果発表のための学会も大学近隣であり、旅費がかからなかったため。2019年度は、ばく露調査での個人ばく露濃度測定、尿中代謝物濃度測定および分析にかかる物品、人件費、調査への移動費および成果発表のための学会参加旅費に使用する。
植物と根圏微生物群集の生物間相互作用の分子生態学的研究

本研究では、植物種によって根圏微生物の群集構造が異なるという現象について、(1)この違いが何によって引き起こされているのか、(2)何のために引き起こされた違いなのか、という2つの疑問を明らかにするため、以下の2つの実験を行った。1、根圏微生物群集構造の変化のメカニズムの解析根分離システムによって作物を生育し、エタノール及び水を用いて回収した根分泌物質を、エバポレーター及び凍結乾燥によって濃縮した後、LC-MC/MSによって成分分析を行った。その結果、エタノール抽出のものは作物間で波形に違いは見られなかったが、水抽出のものはいくつかの植物種特異的なピークが得られた。この波形全体を数値化し、PCAスコアによって植物種間差を求めたところ、有意な差は見られなかった。しかし、各植物の根圏土壌微生物群集構造を表す指標であるPCOスコアとの相関と調べたところ、一定の相関関係が見られた。このことから、各植物の根分泌物の組成が、根圏微生物群集構造と何らかの関係がある可能性が示唆された。2、アブラナ科根こぶ病菌の蔓延と衰退の解析根こぶ病菌が蔓延した土壌に22種の植物種を植え、回収した後に羅病作物であるハクサイを植え、ハクサイの羅病度を調べた。昨年度の圃場試験の結果から、イネ科及びユリ科の作物に被害の軽減効果が期待されたが、作物生育が不良であった為か、病害被害度に違いは見られなかった。また、根内の根こぶ病菌の量は、羅病作物であるハクサイが有意に高い値を示したが、根圏土壌においては作物間において有意な差は見られなかった。さらに、本来は根圏土壌中の根こぶ病菌量も増加するはずのハクサイにおいても根圏土壌中の病原菌量が減少していたことから、22種作物及びその後のハクサイの生育状況に何らかの異常があったと考えられる。1、根圏微生物群集構造の変化のメカニズムの解析回収した根分泌物質の組成をHPLCによって調べた結果、多くの物質が回収物に含まれており、その組成は植物によって異なることが分かった。この回収物を土壌に接種し、土壌微生物群集構造の変化をDGGE法によって調べた結果、回収物の接種によって微生物群集構造が変化することが示された。しかし、この変化は実際の根圏で見られたものとは異なっており、今後さらなる接種条件及び解析方法の検討が必要である。2、アブラナ科根こぶ病菌の蔓延と衰退の解析根こぶ病菌が蔓延した圃場にネギ・コムギ・ダイズ・ナタネを作付けし、その後に植えたハクサイの根こぶ病被害を調べた結果、ダイズ・ナタネ区では壊滅的な被害を受けた一方、ネギ・コムギ区では被害が大きく軽減された。また、各区の土壌微生物群集構造をスコア化し、根こぶ病被害との関連性について調べたところ、両者の間に高い相関関係が見られた。以上の結果から、根分泌物質によって土壌微生物の群集構造が変化し、その群集構造が植物の病害被害に影響を与えている可能性が示唆された。本研究をさらに発展させることにより、土壌微生物群集構造をコントロールすることによって、化学肥料や農薬を使用しない持続的な輪作体系を構築できる可能性を秘めている。また、土壌病害を軽減させる土壌微生物群集構造へと変化させる根分泌物質を特定できれば、効果的な土壌病害防除法の開発も期待できる。今後、さらに多くの作物種を用いて根こぶ病被害の軽減効果を検証し、土壌微生物群集構造との関連性についての情報を蓄積していく必要がある。また、根内の根こぶ

病菌の量は、羅病作物であるハクサイが有意に高い値を示したが、根圏土壌においては作物間において有意な差は見られなかった。さらに、本来は根圏土壌中の根こぶ病菌量も増加するはずのハクサイにおいても根圏土壌中の病原菌量が減少していたことから、22種作物及びその後のハクサイの生育状況に何らかの異常があったと考えられる。
痴呆高齢者とその配偶者のニーズに基づくケアシステム開発への基礎的研究-介護者の自己決定とその自己認識の日米比較と病名告知後の思いに焦点をあてて-

本研究は、痴呆高齢者自身の病気の受けとめ方や病気をもつ自分についての認識を明らかにすることを目的としている。精神科外来に通院する軽度から中等度の記憶障害のある男性高齢者2名、在宅で生活し、老人保健施設のデイケアに通う男性高齢者2名、計4名を対象に彼らと彼らの配偶者からの面接によってデータを収集した。本研究の目的と方法を対象者の主治医及びケースマネージャーに説明し許可を得た。さらに、研究目的とデータ収集方法及び途中で面接をやめられる権利について本人及び配偶者双方の同意を口頭で得て、データ収集を行った。面接は1回30分程度で2-3回の面接を1ヶ月間隔で行った。病気についての思いを語ってもらいその内容を質的に分析した。面接場面には、主たる介護者である配偶者にも本人の語りを補足する目的で同席を依頼し許可を得た。面接で得たデータは、逐語で記録し、それを質的に分析しカテゴリーに分類した。これらは、"自分への情けなさ"、"自律した日常生活ができなくなることへのとまどい"と"日々生きること自体が闘い"また、"一人で悩む"、"将来への不安"である。分析過程で質的研究の専門家のスーパーヴァイズを受け分析の信頼性を高めた。対象者達は、記憶の障害を自ら認識し始めた後も、家族が気づくまで一人で悩んでいる状態が浮き彫りになった。自らが記憶障害に気づいてもすぐに適切な医療機関にかかる行動をとることは、対象者にとって困難であった。そのため、広くものわすれ外来や保健センターの機能の情報を普及させる必要性が示唆された。初期の痴呆高齢者を把握できる、地域を拠点としたサービスシステムの構築の必要性もまた示唆された。本研究は4事例と少数の事例研究であり、結果を一般化することはできないことが本研究の限界であるが、今後事例を重ねていくことで痴呆高齢者の病気の認識のプロセスを明らかにしていきたい。本研究は、痴呆高齢者とその配偶者の夫婦のみ世帯におけるケア提供の実態を明らかにし、日米の介護者の介護のパターンを見いだすこと、特に日本に特有なパターンを見いだし、日本の痴呆高齢者の在宅ケアシステムのあり方を探ることを目的とした研究である。対象者は、在宅で痴呆症状をもつ夫または妻を介護する者10名であり、半構成面接によりデータを収集した。これらのデータは、すでに米国で進行している同じ目的の研究で作成されたコードブックを基にしてコード化した。さらに日本特有の介護パターンを特徴づけるコードを新たに作成した。コードは、ケア提供の状況、ケア提供者のニーズ、ケア提供者のセルフケア、学んだ教訓の4つの側面から分析した。日米ともに、痴呆の症状をもつ配偶者との固い絆を確認しつつ、共有できる活動を楽しみ、日々に感謝するパターンが見られた。また、介護者自身が健康を維持するために、運動や気晴らしなどを心がけていた。米国に特徴的なパターンは、法的サポート、特に財産の保護などについての情報やサポートを求めていることであった。日本に特徴的なパターンとしては、夫や妻の介護をすることを自らの運命として受け入れ、介護保険等の公的サービスを受けながら介護を続けていることであった。また、日本の介護者は、常に他者との比較により介護する苦痛と折り合いをつけていた。さらに、経済的に困っていないことが、介護者が介護の肯定的側面を見いだす際に重要な要素であった。日本の介護者が他者との比較で介護を肯定的、否定的に捉えていたため、より肯定的な意識を持ちながら介護をしていくためには、介護者同士のピアサポートの充実の必要性と、専門職が介護者同士の関係づくりの橋渡しをする機能の必要性が示唆された。15年度は、痴呆高齢者本人の病気や介護者である妻や夫への思いを明らかにすることにより痴呆高齢者の在宅ケアシステムのあり方をさらに探求する。

そのため、広くものわすれ外来や保健センターの機能の情報を普及させる必要性が示唆された。初期の痴呆高齢者を把握できる、地域を拠点としたサービスシステムの構築の必要性もまた示唆された。本研究は4事例と少数の事例研究であり、結果を一般化することはできないことが本研究の限界であるが、今後事例を重ねていくことで痴呆高齢者の病気の認識のプロセスを明らかにしていきたい。
加算微分心電図を用いた分裂性QRSとJ波の定量化による心臓突然死リスクの予測法

分裂性QRS(fQRS)は障害心筋・線維化による心室内興奮伝播が様々な方向に変化していることを示しており、不整脈発生の基質や心機能障害の推測に有用である。またJ波は心臓興奮後の再分極早期の電位異常を示しており、致死的不整脈発生に結び付くと考えられる。fQRSやJ波がさまざまな心室頻拍・細動発生にどのように関わるかを検討し、欧米・アジア太平洋の不整脈学会誌のJ波症候群専門家会議報告や日本循環器学会遺伝性不整脈ガイドラインに成果が取りいれられた。QRS波形加算微分解析システムのソフトウェアを使用し、分裂性QRS(fQRS)およびJ波の意義を、様々な心疾患で検討した。fQRS波形は心室筋興奮伝播が障害心筋・線維化により様々な方向に変化していることを示しており、不整脈発生の基質や心機能障害の推測に有用である。一方J波は再分極早期の電位異常を示しており、再分極相の不安定性から,致死的不整脈発生に結ぶ付くと考えられる。解析ソフトによりfQRS波及び異常J波の検出感度を高め、各種心筋疾患での予後推定などに応用が可能である。J波及び早期再分極波がさまざまな心室頻拍・細動発生にどのように関わるかを検討し、Shanghaiで開催された"Expert Consensus Conference on J Wave Syndromes"での招待講演で報告した。とくに低体温で見られる心室細動発生が、J波出現のみならず、その後のST-T波形の異常と関連が強いことを報告した。低体温で見られるJ波の意義を検討したデータの一部はアジア環太平洋不整脈学会でも発表し、Best Poster Awardを受賞した。また、発熱時にのみ出現する著明なBrugada型J-ST上昇の臨床的意義を検討し、元々不整脈の症状を有さない症例でも年間0.9%の心室細動・突然死の発生が起こることを報告した(Heart Rhythm 2016, in press).Brugada症候群ではfQRSの存在が心室細動などの心事故発生と関連することは以前報告したが、fQRSの存在部位がJ点上昇が見られる心電図誘導のみならず、下側壁誘導などの他の誘導で広く見られる場合、J波が存在する場合よりも予後が悪いことを報告した(JCS 2016)。J波及びfQRSの様々な心疾患の心事故との関連についても検討を進めている。心臓性突然死の予測因子として、fQRS及びJ波の意義を、複数の国内学会のシンポジウム(6題,うち招待講演1題)、国際学会の一般演題(8題)および招待講演(2題)で報告した。この研究に関連した論文が2015年度に3本出版され、1本がacceptされている。また作成中の論文が2本あり、近日投稿予定である。さらに、2017年度での国際学会でも一般演題、招待講演で発表予定である。一方J波は再分極早期の電位異常を示しており、再分極相の不安定性から,致死的不整脈発生に結び付くと考えられる。J波及び早期再分極波がさまざまな心室頻拍・細動発生にどのように関わるかを、臨床データベースを構築し、予後との関連を検討している。データベースとして、Brugada症候群で507名(心室細動例50例)、特発性心室細動47例、QT延長症候群141例を登録し、経過観察中である。致死的不整脈イベント発生例では、発症を予測するリスク因子について検討を行っている。Brugada症候群においてfQRS検出部位の広がりについて検討を行い、右室流出路のみならず、下側壁誘導などの他の誘導で広く見られる例では、経過中の心室細動の発生と関連していることを報告した(Circulation Arrhythm Electrophysiol 2017, in press)。また不整脈の発生起源については、心室細動中の体表面電位図を解析し、fQRSが見られる右室流出路や自由壁からの反復性発火が、多形性心室頻拍・心室細動の原因であることを報告した(Circ J 2017)。この他にも、J波及びfQRSや他の心電図因子・遺伝子変異の存在の予後予測の有用性、診断基準の妥当性、電気生理学的検査の有用等を様々な心疾患の心事故との関連について検討を進めている。データベース作成は順調に進行し、症例の増加、経過観察を行っている。心臓性突然死の予測因子として、fQRS及びJ波の意義を、複数の国内外学会のシンポジウム(4題,うち招待講演3題)、国際学会の一般演題でも報告した。この研究に関連した論文及び総説を2016年度に13本発表している。また作成中の論文が4本あり、近日投稿予定である。さらに、2018年度での国際学会でも一般演題、招待講演で発表予定である。QRS波形加算微分解析システム及び12誘導心電図を使用し、分裂性QRS(fQRS)およびJ波の意義を、心疾患で検討した。

心室筋興奮伝播が障害心筋・線維化により様々な方向に変化した場合、QRS波形の多棘波を形成し、fQRSの成因となり、その存在は不整脈発生の基質や心機能障害と関連すると考えられる。J波は再分極早期の電気的異常を示しており、再分極相の不安定性から,致死的不整脈発生に結び付く。J波及びfQRS波形がさまざまな心室頻拍・細動発生にどのように関わるかを、臨床データベースを構築し、予後との関連を検討してきた。これまでにBrugada症候群で527例(心室細動例50例)、特発性心室細動49例、QT延長症候群150例を登録し,経過観察を行っている。致死的不整脈イベント発生例では、発症を予測するリスク因子について検討を行った。Brugada症候群ではfQRS検出部位の広がりについて検討し、右室流出路のみならず、下壁・側壁誘導などの他の誘導で広く見られる例では、経過中の心室細動の発生と関連すること報告した(Circulation Arrhythm Electrophysiol 2017)。Brugada症候群において、無症候性の心室細動発生予測因子としてfQRS及びT波頂点から終末部までの時間(Tpeak-Tend間隔, Tpe)が挙げられ、これらの因子は失神・心室細動例でも再発予測因子であった。下側壁誘導のJ波は失神・心室細動例での再発予測因子であったが、無症候例での心室細動発生とは関連せず、初回心室細動発作のリスク因子と再発のリスク因子が異なることが示された(J Cadiovasc Electrophysiol 2018)。遺伝性不整脈に関するfQRS及びJ波の意義は日本循環器学会の遺伝性不整脈の診療に関するガイドライン(2017年改訂版)で協力員として分担執筆を行った。分裂性QRS(fQRS)は障害心筋・線維化による心室内興奮伝播が様々な方向に変化していることを示しており、不整脈発生の基質や心機能障害の推測に有用である。またJ波は心臓興奮後の再分極早期の電位異常を示しており、致死的不整脈発生に結び付くと考えられる。fQRSやJ波がさまざまな心室頻拍・細動発生にどのように関わるかを検討し、欧米・アジア太平洋の不整脈学会誌のJ波症候群専門家会議報告や日本循環器学会遺伝性不整脈ガイドラインに成果が取りいれられた。症例登録は継続して行い、必要に応じて解析ソフトウェアの改良を行う。また当院で多い心疾患(心筋梗塞、心筋症、Brugada症候群、J波症候群など)で前向きデータの蓄積を開始し、古典的なリスク評価法と加算微分法による分裂性QRS・J波解析の各データと、致死的不整脈・心不全発生との関連性を検討する。平成28年度時は経過観察日数が十分でないため、主に後ろ向き研究で、心事故の発生等の各指標のOdd ratioを求める。一部疾患については現在論文作成中であり、終了次第peer review誌への投稿を行う。また当院で多い心疾患(心筋梗塞、心筋症、Brugada症候群、J波症候群、QT延長症候群など)で前向きデータの蓄積を開始し、古典的なリスク評価法と加算微分法による分裂性QRS・J波解析の各データと、致死的不整脈・心不全発生との関連性を検討する。平成29年度時は経過観察日数が十分な期間と考えられた症例について前向きの予後と関連するかどうかを検討し、発表、論文作成予定である。またこれまでのデータも後ろ向き研究で、心事故の発生等の各指標のリスクを検討し論文作成を行う。
クローン技術を用いた血管細胞分化機構の解明

前年度、ES細胞から血管内皮細胞に分化する諸段階の細胞をドナーとして除核マウス未受精卵に核移植を行い、その後の胚発生率がドナー細胞の分化とともに著しく低下することを見いだした。本年度は、ES細胞の未分化性維持に必須な因子であるOct4の発現動態に注目し、分化に伴うエピジェネティックな変化と核移植後のリプログラミングとの相関を解析すると同時に、体細胞核由来ES細胞(ntES細胞)の特性について検討した。ES細胞のOct4発現は、分化条件2.5日目で既に減少し、プロモーター領域のエピジェネティツクな変化はヒストンH3K9のメチル化→DNAの高メチル化の順に進んだ。核移植後の胚発生率はOct4の発現、ヒストンH3K9のメチル化の増加とともに低下し、DNAメチル化が変化する以前の段階でリプログラミングに対する感受性が変化する可能性が示唆された。一方、PECAM1+のES細胞由来の核移植後胚盤胞より新たにES細胞を樹立し、それらのntES細胞が血管細胞への分化指向性をもっているかどうか,分化方向の特性を有するのかを検討を行った。マーカー遺伝子の発現、胚葉体形成能にはドナーES細胞との間で差は見られなかった。さらに、血管内皮細胞、平滑筋細胞への分化効率はドナーES細胞と変わらず、ドナー細胞の特性が保持されていることを示す結果は得られなかった。以上から、核移植後のリプログラミングに対するドナー核の感受性は分化の初期にヒストン修飾の変化とともに低下すること、ntES細胞が樹立された場合、ドナー細胞による分化指向性への影響は明らかではなく、正常ES細胞と同等の分化能を有することが示唆された。核移植後のリプログラミングに対する感受性と細胞の可塑性、分化の可逆性との関連を検討することにより、細胞分化の新たな側面が明らかになると期待された。種々の細胞をドナーとして電気融合法によりマウス除核未受精卵に核移植を行い、細胞分化とリプログラミング感受性の関係を解析した。マウス胚より単離した神経堤細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞をドナーとして核移植を行うと、胚盤胞の発生率(2細胞期胚に対する)は、幹細胞としての性質を有する神経堤細胞が最も高かった。細胞の分化度とリプログラミングの関係を系統的に調べるため、ドナー細胞としてES細胞,ES細胞由来血管前駆細胞(ES-Flk1(+))(分化条件にして4日目)およびES細胞由来血管内皮細胞(ES-PECAM1(+))(同11日目)を用いて核移植を行った。未分化ES細胞あるいはFlk1(-)細胞を核移植のドナーとしたとき、胚盤胞への発生率は7割以上であったのに対し,ES-Flk1(+)細胞またはES-PECAM1(+)細胞をドナー細胞とした場合,胚盤胞への発生率は4割程度に低下した。これらの結果より、幹細胞から分化する過程で、比較的早期に核移植後のリプログラミング能が低下することが明らかになった。次に、各ドナー細胞よりクローニングされた胚盤胞より核移植由来ES細胞(ntES)細胞を樹立し、正常ES細胞と分化特性に差があるかを調べた。分化4日目に出現するFlk1(+)細胞の割合は、ntES細胞と正常ES細胞で差はなかった。またこれらntES細胞由来のFlk1陽性をOP9上で培養した結果,血管内皮細胞と平滑筋細胞への分化が観察された。さらに、胚様体を介した心筋への分化も正常ES細胞と同様に観察された。これらの結果より,胚盤胞まで発生したものから樹立したntES細胞は、中胚葉系の一部の細胞系列に関しては未分化ES細胞と同様な分化能を有することが示唆された。
Wilson 病の肝癌発症の機序とその予防

Wilson病は肝臓に銅が蓄積することにより様々な障害を引き起こす。近年、本症患者で肝がん発症の報告が散見している。本研究の目的は、本症の肝障害の発症機構を明らかにし、その予防方法を開発することである。モデルラットを用いた検討の結果、生後早期から肝臓に銅が蓄積し、ミトコンドリア障害が誘導されていることが明らかになった。また、酸化ストレス制御機構が低下している可能性が示唆された。更に、本症患者体内の酸化ストレスプロファイル(OSP)を解析した結果でも、ある種の脂溶性抗酸化物質の血清値が低下している傾向が認められた。OSP解析プロットでは、本症患者の約半数が酸化ストレス予防能の低い「低活性ゾーン」におり、これらの抗酸化物質の摂取で体内の抗酸化能を改善し、肝障害の進行及び肝がん発症を予防できる可能性が示唆された。Wilson病患者において生体内銅蓄積による様々な肝障害が認められ、治療を行ってもその進行が進む事が報告されている。本研究の目的は患者における肝障害発症メカニズムをWilson病モデルラット(LECラット)を用いて銅による活性酸素・レドックス制御機構の観点から検討することである。更にレドックス制御において活性酸素消去による生体防御に有効な抗酸化物質を明らかにすることにより予防・治療効果を検討する。本年度の研究結果として、LECラットにおける過酸化脂質、抗酸化物質量(vitamine A、C、E、coenzyme Q10)の測定、検出結果を得た。LECラット血清中において抗酸化物質であるVEは週齢とともに減少する傾向が認められた。VA、VEはその濃度が高い群と低い群に分かれた。また、VA, VEには相関関係が認められた。過酸化脂質の指標であるHELは生後4週齢より肝臓組織に認められた。脂質過酸化分解生成物のMDAを血清中及び肝臓中での検出を試みた。血清中MDAは週齢により増加を示した。組織中では週齢とともに増加する傾向が認められたが高い群と低い群に分かれた。これらのことから肝炎症状が発症する12週齢よりも前から肝細胞障害が起きていると考えられ、個体の症状の違いは8週齢以前におけるレドックス制御機構の違いが関与していると考えられた。また、アポトーシス細胞の検出、cleaved caspase-3の検出を行ったところ、生後早期4週齢と16週齢以降にその発現が肝組織に認められた。銅蓄積による細胞障害により生後早期と肝炎症状発症後にミトコンドリア障害によりアポトーシスが誘導されていると考えられた。これらの結果から今後は抗酸化作用による早期の予防・治療による肝障害が予防を試みる。Wilson病は先天性銅代謝異常症で、肝臓、脳、腎臓などに銅が蓄積し、様々な障害を生じる。治療としてキレート薬や亜鉛が有効で、長期生存例も多くなっているが、本症患者では治療が有効になされているにも関わらず、肝硬変の進行や肝細胞がん発症の報告が相次いでいる。本研究では、Wilson病モデルラットであるLECラットを用いて、銅による活性酸素産生、その消化機構であるレドックス制御機構の観点からWilson病と肝障害及び肝細胞がん発症の関連を解析し、予防および治療方法を開発することが目的である。本年度は、22年度に引き続きWilson病での肝障害・肝がんを予防する抗酸化物質を選択するために、LECラットを用いて、肝蔵内銅濃度、酸化ストレスマーカー、抗酸化物質、ROS消化酵素等を定量測定することにより、酸化物質増加・レドックス制御機能破綻と肝障害進行との関連性を検討した。LECラットの肝臓内銅濃度は、LEAラット(コントロール)/に比べ生後早い時期から有意に高い値を示した。肝臓中の活性酸素種消化酵素であるCu/Zn SODタンパク量は、LEAラットに比べLECラットにおいて低かった。活性酸素により起こる遺伝子DNA障害の生成物である8-OHdG量は肝組織内ではLECラットの方がLEAラットより高い傾向が認められた。これらの結果は、レドックス制御が不十分のため肝障害が起こりやすい環境となっていることを示唆している。銅の蓄積と肝障害の関連については更なる検討が必要であるが、レドックス制御を早期の内に正常化することにより、後に起こる肝障害を予防することの可能性が期待される。22,23年度の結果を踏まえ、今後、有効と期待される抗酸化物質を選択し、LECラットへの投与を試み効果を検証する。Wilson病(WD)は先天性銅代謝異常症で、肝臓、脳、腎臓などに銅が蓄積し様々な障害を生じる。治療としてキレート薬や亜鉛が用いられており、早期から治療を開始すると肝機能異常に対しても有効である。

しかし、長期治療患者で、肝硬変の進行や肝細胞がん発症の報告がある。また、WDモデルラットであるLECラットは高率に肝細胞がんを発症する。銅は遷移元素であるので、細胞内の過剰銅はフェントン反応により活性酸素種を生じると考えられる。そこで本研究では、WDモデルラットであるLECラットを用いて、銅による活性酸素産生に伴う酸化的ストレスとその消化機構であるレドックス制御機構の観点から、WDと肝障害及び肝細胞がん発症との関連を解明することを目的とした。22,23年度の研究成果で、LECラットでは肝障害発生前にミトコンドリア障害によるアポトーシスが出現し、抗酸化作用のあるビタミンEの血清値が経時的に減少する傾向が認められた。24年度は、研究計画でのLECラットを用いた検討に加え、酢酸亜鉛製剤治療を続けている本症患者(8名)及び健常者(2名)の血清および尿を採取し日研ザイルに依頼して、酸化ストレスプロファイル(OSP)を解析した。その結果、本症患者において、脂溶性抗酸化物質に分類されるルテイン+ゼアキサンチンおよびα-トコフェロール(ビタミンE)値が、健常人平均値より低値である傾向が認められた。本症患者で血清中α-トコフェロール(ビタミンE)値が低い傾向は、LECラットでの結果と一致ており、体内の抗酸化能が低下している状態であると考えられた。さらに、OSP解析プロットでは、本症患者の約半数が抗酸化能力の低い低活性ゾーンにおり、抗酸化物の摂取などで抗酸化能を改善できる可能性が示唆された。すなわち、本症患者にルテイン、ゼアキサンチン、ビタミンEを投与することの肝障害に対する有効性が示唆された。LECラットの血清・組織中の抗酸化物質や過酸化脂質の測定結果には個体差が認められたので、ラットの検体数を増やす必要があったが、交配が順調に進まないことなどにより充分な匹数を確保するのが難しい時期があり、当初の計画よりやや遅れている。しかし、徐々にではあるが、実験に供したラットの検体回収も進んでおり、研究は確実に進行している。24年度が最終年度であるため、記入しない。22,23年度の研究結果に基づき、Wilson病での肝障害・肝がん発症に対する予防効果が期待される抗酸化物質を選択し、LECラットへの投与を試みる。そして、投与量、長期投与による効果および副作用の有無を検証する。個体差の問題を解消すべく、LECラットの十分な検体数を確保できるように配慮する。24年度は本研究の最終年度なので、サンプリング後保存してある検体の分析、データ解析を推進し、研究結果の総括を行う。
酵素基質複合体の構造ダイナミクス解析に基づく反応方向制御機構の解明

Ferredoxin(Fd)とNAD(P)+/H間の酸化還元反応を触媒するFerredoxin-NAD(P)+酸化還元酵素(FNR)は,可逆である酸化還元反応を生理的方向へ反応が進行するように反応方向を制御すると考えられる.この制御が酵素基質複合体形成に伴う構造ダイナミクスの変化に起因すると考えられるため,類似した構造を持つが異なる方向性を示すFNRを用いた比較研究により,方向制御を実現する構造的要因と制御機構の解明を目指した.紅色非硫黄細菌FNRとNADP+/H間の酸化還元反応では,NADP+還元方向とNADPH酸化方向のヒドリド転移反応速度がほぼ等しく,可逆的に進行することが明らかになった.この結果は, NADP+還元方向の速度がNADPH酸化方向に比べて著しく低下している緑色硫黄細菌FNRとは対照的である.還元型の紅色非硫黄細菌FNRの紫外可視域の吸収スペクトルにおいて,緑色硫黄細菌FNRでは観測されなかったFADのS0→S1遷移に伴う吸収帯が確認されたことから,還元状態におけるFADのイソアロキサジン環周辺の環境が両FNRでは異なると考えられ,還元時のFADと周辺アミノ酸残基との相互作用が方向制御の鍵を握ると推察された.そこで紅色非硫黄細菌FNRの結晶構造中で見いだされた,FADのイソアロキサジン環re面にスタックしているTyr328残基を置換した変異体を発現・精製し,NADP+/Hとの反応時の挙動を測定した.変異によりNADP+とNADPHに対する親和性は増加した一方,ターンオーバー速度は減少した.前定常状態での測定では,いずれの変異体においてもNADP+/Hの解離と再結合速度が低下していたことから,Tyrがニコチンアミド環のスタックを阻害することで,NADP+/Hの解離を促進してターンオーバー速度を上昇させていると推察される.前年度に引き続き,速度論的研究と酵素基質複合体構造に関する研究を進めた.速度論的研究では,野生型並びにC末端部を削除した緑色硫黄細菌FNRの変異体とNAD(P)+/H間の酸化還元反応を同細菌Fdの存在下で測定し,Fdの存在が方向性制御に及ぼす影響の検証を進めている.嫌気下での化学的処理により4Fe-4S型に再構成したFd存在下でのNADPH酸化速度の測定を実施した結果では,C末端部を削除した変異体と野生型でFd非存在下と同様な結果が得られており,測定データの解析を進めている.Fd存在下での還元型FNRによるNADP+還元の測定を実施し,2つの基質に対する濃度依存性の検証を進めている.また還元型Fdによる酸化型FNRの還元速度と,還元型FdによるFNRを介したNADP+還元速度の測定に向けて,適切な基質濃度とFdの還元状態を保持できる測定条件の検討を進めている.酵素基質複合体構造に関する研究では,FNRの酵素基質複合体の結晶構造解析を目指し,枯草菌由来の2つのflavodoxinと枯草菌FNRとの複合体結晶化条件の検討を連携研究者の協力の元進行している.紅色非硫黄細菌FNRの速度論的研究の結果から,還元型FNRにおけるイソアロキサジン環のコンホメーションが反応方向制御に影響を及ぼすことが示唆されたため,還元型の緑色硫黄細菌FNRと紅色非硫黄細菌FNRの結晶化条件の検討を研究協力者の元で進めている.NMR分光法によるFNR-基質複合体の構造情報の取得のために,インテイン融合蛋白質を用いた蛋白質編集法による部分同位体ラベル試料の作成を進めた.N末端側のFNRの主要な部分を含む融合蛋白質は,大腸菌内でFADが結合した状態で発現・精製できている.C末端側の断片は,インテイン融合蛋白質として発現しているものの,発現状態もしくは精製法に問題があり断片の回収法を検討している.反応方向の制御を実現する要因と制御機構の解明を,FNRのC末端部に重点的に変異導入してFdの共存下での挙動を速度論的研究を実施し,変異の影響を評価することで進める.

具体的には,進行中である野生型及びC末端部のアミノ酸残基を削除した緑色硫黄細菌FNRを用いたFd共存下でのNADP+/H酸化還元反応の測定に加えて,Fd存在下での野生型及びC末端部のアミノ酸残基に変異を導入した枯草菌FNRのNADP+/H酸化還元反応の測定を行う.現時点で得られている立体構造情報に基づいて制御に関わるアミノ酸残基を特定することが困難なため,緑色硫黄細菌FNRと枯草菌FNR間で各ドメインを相互に入れ替えた変異体を作成し,ドメイン単位での機能に関する考察を進める.前年度に引き続き,酵素基質複合体の結晶化を進める.枯草菌FNRは,溶解度がFNRに近い枯草菌Fldを用いて複合体の結晶化条件の検討を引き続き進める.結晶構造解析による酵素基質複合体に関する構造情報が得られた場合,制御機構の詳細を明らかにするために,どのような因子が複合体構造や方向制御に関与していると考えられるか,該当するアミノ酸残基へ変異導入して検証を行う.緑色硫黄細菌と紅色非硫黄細菌FNRを対象として,還元型FNRの結晶化を昨年度に引き続き嫌気下での結晶化を実施する.NMR分光法による構造決定に向けて,C末端側ペプチドの発現・精製方法をアフィニティータグの導入を検討し進めいく.Ferredoxin(Fd)とNAD(P)+/H間の酸化還元反応を可逆的に触媒するFerredoxin-NAD(P)H酸化還元酵素(FNR)では,基質結合に伴い逆反応を抑制して生理的方向へ反応が進行するように,反応方向が制御される.この制御が酵素基質複合体形成に伴う構造ダイナミクスの変化に起因すると考えられるため,異なる方向性を示すFNRを用いた比較研究と部位特異的変異導入により,制御を実現する構造的要因と制御機構の解明を目指した。緑色硫黄細菌FNRのC末端部を削除した変異体のFNRとNADP+/H間の前定常状態反応の測定結果は,C末端部がFNR-NADP+複合体を安定化して酸化還元平衡時のFNRの相対的電位の上昇を引き起こし,NADP+還元方向へ反応が進むよう制御していることを明らかにした。紅色非硫黄細菌FNRとNADP+/H間の酸化還元反応の測定結果は,紅色非硫黄細菌FNRではNADP+/Hとの酸化還元反応が完全に可逆であることを明らかにした.他のFNRでは,NADPH酸化あるいはNADP+還元のいずれか一方向に反応が進行するように,相対的酸化還元電位などが変化するのとは対照的である.過渡吸収スペクトルにおいて,NADP+の結合からCT複合体形成に至る過程で他のFNRと顕著な差が見られたことから,還元型FNRのFADイソアロキサジン環とアミノ酸残基との相互作用が,方向制御の鍵を握ることが推察された.FNRの補酵素FADのイソアロキサジン環si面には,Tyr残基が必ず存在する.TyrがPheに置換されたFNRホモログを発見し,このFNRホモログ及びsi面のアミノ酸残基をPhe等に置換したFNR変異体を発現・精製した.NADP+/H及びFdとの酸化還元反応を測定した結果は,si面に電子供与能のある芳香族残基の存在がFNR活性に必須であることを示した.アミノ酸配列の比較と生理的機能に基づき,異なる生物種由来の3種のFNRを対象として速度論的研究と酵素基質複合体構造に関する研究を進めた.緑色硫黄細菌FNRのC末端部を削除した変異体とNAD(P)+/H間の酸化還元反応の測定結果は,C末端部がNADP+還元方向へ反応を進行させることに寄与することを明らかにした.さらに同FNRと同細菌Fdの結合が方向性制御に及ぼす影響を調べるために,同細菌Fdを大腸菌で発現させて精製した.精製Fdの鉄硫黄クラスターは3Fe-4S型であったが,嫌気下での化学的処理により生理的状態である4Fe-4S型に再構成できた.再構成Fd共存下においてNADP+還元速度の大幅な上昇が確認され,三量体形成が速度論的に反応方向制御に寄与することが示唆された.反応機構モデルの作成とその検証のために,基質濃度範囲等の測定条件の検討を進めている.枯草菌FNRを用いて比較研究を実施するために,枯草菌FNR変異体の精製を進めている.FNRと電子受容体/電子供与体蛋白質との複合体の結晶構造解析を目指し,枯草菌の2つのflavodoxin(Fld)遺伝子を発現し,産物を精製した.枯草菌FNRとFld間の電子伝達活性はFd使用時の約60%を示し,生理的条件下でFNRの電子受容体として機能することが確認された.Fldと枯草菌FNRの複合体結晶化条件のスクリーニングが連携研究者の協力の元で進行している.部分同位体ラベル試料を用いたNMR分光法によるFNR-基質複合体の構造情報の取得のために,FNR断片とインテインの融合蛋白質の発現系を構築して発現・精製を行った.融合蛋白質は大腸菌内でFADが結合した状態で発現し,アフィニティータグを利用した精製が可能であった.インテインの活性化によるペプチド切断とFNRペプチド断片の結合のための反応条件を検討している.