hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
院内感染菌MRSAに対する生薬成分からの新規抗菌薬の開発研究

世界各国から採集した昆虫及び生薬植物に含まれる抗菌活性成分について,ヒト株化細胞に対する細胞毒性とメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)臨床分離株に対する抗菌活性をスクリーニングし,槐花(Sophora japonica)等8種の生薬生物から抽出した画分は,ヒト株化細胞に対する細胞毒性は無いかあっても極めて低いが,供試したMRSA株全てに対して極めて低濃度でその増殖を完全に阻止することを発見した.この発見は,これらの生薬成分には,MRSAに対して選択的に強力な抗菌力を発揮する抗菌物質が含有されていることを示している.そこで,上記生薬の抽出画分から有効成分を単離精製し構造決定を行った.その結果,訶子からはgallic acidとethyl gallate,蒼耳葉からはxanthatin,そして半枝蓮からはapigeninとluteolinが抗菌活性成分として同定された.さらに,これら抗菌活性物質の作用メカニズムについてその解明を試み,下記の画期的な発見を世界に先駆けて行った.1.メチシリンの最小発育阻止濃度(MIC)1,000μg/ml以上を示す高度耐性MRSAにおいて,各種のβ-ラクタム剤に対する感受性をMIC-0.53.9μg/mlまで誘導する化合物(apigenin,luteolin,kaempferol,flavone等)を生薬成分等の中から発見し,これらの薬剤に対し"β-ラクタム剤-感受性誘導薬"と名付けた.2.MRSAに対する"β-ラクタム剤-感受性誘導薬"の新しいスクリーニングシステムの開発.世界各国から採集した昆虫及び生薬植物に含まれる抗菌活性成分について,ヒト株化細胞に対する細胞毒性とメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)臨床分離株に対する抗菌活性をスクリーニングし,槐花(Sophora japonica)等8種の生薬生物から抽出した画分は,ヒト株化細胞に対する細胞毒性は無いかあっても極めて低いが,供試したMRSA株全てに対して極めて低濃度でその増殖を完全に阻止することを発見した.この発見は,これらの生薬成分には,MRSAに対して選択的に強力な抗菌力を発揮する抗菌物質が含有されていることを示している.そこで,上記生薬の抽出画分から有効成分を単離精製し構造決定を行った.その結果,訶子からはgallic acidとethyl gallate,蒼耳葉からはxanthatin,そして半枝蓮からはapigeninとluteolinが抗菌活性成分として同定された.さらに,これら抗菌活性物質の作用メカニズムについてその解明を試み,下記の画期的な発見を世界に先駆けて行った.1.メチシリンの最小発育阻止濃度(MIC)1,000μg/ml以上を示す高度耐性MRSAにおいて,各種のβ-ラクタム剤に対する感受性をMIC-0.53.9μg/mlまで誘導する化合物(apigenin,luteolin,kaempferol,flavone等)を生薬成分等の中から発見し,これらの薬剤に対し"β-ラクタム剤-感受性誘導薬"と名付けた.2.MRSAに対する"β-ラクタム剤-感受性誘導薬"の新しいスクリーニングシステムの開発.1.キュラソ-アロエ等6種の生薬生物からのMRSAに対する抗菌物質の単離精製:(1)生薬生物粉砕品からの粗抽出画分の調製:計画した6種の生薬生物のうち,現在4種について粗抽出画分の調製を終え,残る2種は現在調製中である.(2)抗菌物質の単離精製:MRSAに対する抗菌活性を指標として精製を進めた結果,現在までに調製を終えた粗抽出画分のうち,2種の生薬生物由来の粗抽出画分から既に3種の抗菌物質を単離精製した(訶子から2種と蒼耳薬から1種).その他の生薬生物由来の粗抽出画分については現在進行中である.2.抗菌物質の化学構造の決定:現在までに単離精製した3種の抗菌物質について,既にその化学構造を決定した.すなわち,訶子から単離精製された2種の抗菌活性物質は,gallic acidとethyl gallateであり,また蒼耳薬から単離精製された抗菌活性物質は,xanthatinであることがわかった.3.抗菌スペクトルと細胞増殖抑制効果:現在までに構造決定した抗菌物質についてその抗菌スペクトルを検討した結果,すべての抗菌活性物質にグラム陽性球菌のなかでも特にブドウ球菌に対して強い抗菌活性を示すという特徴が認められた.一方,gallic acidとethyl gallateについては,ヒト細胞に対しては毒性が無いか、あるとしてもその毒性は著しく低いという成績を得た.この成績は,申請者らが志向したヒトに対して低毒性でMRSAに対して強い抗菌活性を有する薬剤の創製という命題に合致している.I)抗菌物質の化学構造の決定:半枝蓮の粗抽出画分から単離精製した抗菌物質2種の化学構造について,Apigenin,Luteolinと同定した.II)抗菌スペクトルの作成:ApigeninのStaphylococcus aureus標準株に対するMIC値は供試27株中21株において3.915.6μg/ml,他の6株は250μg/ml以上であった.Luteolinについては菌株による差はなく,62.5125μg/mlであった.また,MIC値以下の濃度のApigeninにより,MRSAに対するmethicillinの抗菌作用が著しく改善されることを見出した.III)MRSAに対する抗菌物質の作用機作の解析:MRSAに対するGallic Acidの作用機作について解析を行い,以下の事実を明らかにした.

1)Gallic Acidの化学構造と抗菌活性との関係について,カルボニル基,ならびにそれとパラ位の位置にある水酸基が重要であることを明らかにした.2)Gallic Acid抵抗性であるS.epidermidisがS.aureus共存下では感受性を示すことを見出し,S.epidermidisに対するGallic Acidのこの抗菌作用が,S.aureus菌体外分泌物質との共同作用によるものであることを明らかにした.また,この結果に基づいて,S.aureusに対するGallic Acidの選択的な抗菌作用発現には,S.aureus菌体外分泌物質との共同作用が重要な役割を演じていることを示唆した.生薬植物である半枝蓮からMRSAに対して選択毒性が認められる有効成分を単離精製し構造決定を行うとともに,抗菌活性の作用メカニズムの解明を試み,下記の画期的な発見を世界に先駆けて行った.2.MRSAに対する"β-ラクタム剤-感受性誘導薬"の新しいスクリーニングシステムの開発.申請者らの発見は,β-ラクタム剤に対するMRSAの耐性機構を解明するうえで学術的に極めて重要な発見であるだけでなく,抗生物質の中で最も副作用の少ないβ-ラクタム剤に対する高度耐性MRSAの感受性を200倍から2000倍にも高めることができることを示しており,このような例は未だかつて見出されたことがなく極めて独創的で先駆的な発見と言えよう.
細胞内ATP濃度が免疫応答制御を介して腸管炎症に寄与するメカニズムの解明

炎症性腸疾患(IBD)は主にクローン病と潰瘍性大腸炎に大別される消化管を主体に炎症をきたす難治性疾患であり、その病因についてはいまだよくわかっていない。近年、IBDの発症・増悪にミトコンドリア機能異常が関与していると報告されてきており、炎症性腸疾患患者の腸粘膜におけるミトコンドリアの形態異常、粘膜内ATPの低下が報告されている。本研究はIBDにおいて細胞内ATP濃度が細胞・臓器の機能に与える影響について明らかにし、エネルギー産生異常の観点からIBDの病態の解明、新規治療法の開発への端緒とすることを目的とする。1.ATP濃度可視化蛋白質であるGO-Ateamを全身に発現したマウス(GO-Ateam発現マウス)を用いて炎症性腸疾患モデルマウスの作成と解析を行っている。まずGO-Ateam発現マウスに対するDSS投与によって腸炎がGO-Ateam非発現BL6マウスと同等に腸炎が発症することを確認した。次いでin vivoで蛍光実体顕微鏡と2光子励起顕微鏡を用いて消化管でのATPの挙動を観察した。また消化管のみならず、腸管所属リンパ節・肝臓・脾臓・脳などの全身他臓器におけるATPの挙動についても観察を行った。2.GO-Ateam発現マウスから得た免疫細胞などの組織を用いてATPの挙動を観察するex vivoでの実験系の確立を試みている。in vivoで観察されたGO-Ateam/DSS腸炎マウスにおけるATP濃度の変化が酸素飽和培養液還流下のex vivoでも同様に観察できることを確認した。また観察の際に酸素飽和培養液の還流速度を変化させて低栄養・低酸素環境を再現したところ、還流速度の変化によりATP濃度が速やかに変化することが確認できた。GO-ATeam/DSS腸炎モデルマウスを用いたin vivo実験についてはおおむね順調に進行している。自然に腸炎を発症するGO-Ateam/IL-10ノックアウトマウスの実験が遅れているが、作出には成功しており交配を進めて実験に必要な匹数が得られ次第解析を行う。in vivoで認められた腸炎によって生じたATP濃度変化のメカニズムの解析をex vivo実験で行っているがエネルギーの通貨であるATPは複雑な産生・代謝経路を有しており、単一の阻害剤による解糖系・ミトコンドリアの機能の解析は評価が困難であったために計画通りには進行していない。ATP濃度変化のメカニズムを明らかにするための解糖系・ミトコンドリア機能阻害薬を用いた実験について適切なプロトコールの作成を進める。細胞内ATP濃度を変化させる薬剤を投与することによるin vivoでのDSS腸炎の変化やex vivo、in vitroでの細胞・組織の機能の変化について実験を行い、免疫細胞や腸管上皮におけるエネルギー産生・代謝異常が腸炎に果たす役割や治療ターゲットとしての可能性について検討する。
好酸性細菌のrecA遺伝子の構造解析と特異株の作成

1.好酸性細菌のrecA遺伝子の構造解析A.facilisのrecA遺伝子は,354アミノ酸をコードする1062bpのオープンリーディングフレームからなり,コード領域のGC含量は62%であった。recA遺伝子の塩基配列及び制限酵素地図を参考にして,recAの構造遺伝子中のEcoR1部位にカナマイシン耐性遺伝子を挿入した変異遺伝子を作成した。作成した変異遺伝子をエレクトロポレーションによりA.facilis中に導入した後,カナマイシン耐性を示した株を選抜しrecA欠損変異株A.facilis OU1株を得た。recA変異株を用いた形質転換得られたA.facilis OU1株を宿主として,好酸性細菌用ベクター(pAH101,pAS101)による形質転換を行ったところ,定常期の菌体からもプラスミドが単離でき,組み込みを起こしていないことが判明した。本研究により,好酸性細菌Acidiphilium facilisの安定な宿主が調製できた。
脊髄運動ニューロンの老化と活動量との関係

老化仮説の一つである消耗説によると活動すればする程老化が促進されることになる。一方、脳の老化予防には脳を大いに活動させるべきであるとの考えが一般である。本研究では、全身的な影響(ホルモン系や呼吸・循環器系への影響)を極力抑さえ、運動ニューロンの活動量と老化に伴なう細胞死との関係を調べた。研究対象をラット下腿の内側腓腹筋(MG筋)を支配する運動ニューロン(MG-MNs)とし、活動量を高めるために協力筋である外側腓腹筋・ヒラメ筋・足蹠筋(何れも一側のみ)を取り除き、MG筋に掛かる負荷を大きくした。17または24ヵ月齢のフィッシャー雄ラットをネンブタール麻酔下に上記手術を行った後、通常の条件下で飼育した。24、28、30ヵ月齢に達した時点で、MG-MNsをHRPの軸索内輸送を利用して標識し、その数を数えると共に細胞体の断面積を計測した。MG筋の湿重量も測定した。HRPで標識されたMG-MNs数は月齢が進むに従って減少し、今回の実験期間に神経細胞死が起こっていることを示していた。何れのラットに於いてもMG筋の湿重量は手術側で約30%重く、行動上も手術側・無処置側に差が認められず、MG-MNsの活動量は手術側で高く維持されていたと考えられる。しかし、手術側・無処置側の間に有意差は無く、MNsの活動レベルを高めたことによる効果は認められなかった。細胞体の断面積にも手術側・無処置側間および月齢による差は認められなかった。本実験の結果は1.活動の増加による利的効果と有害な効果とが互いに相殺した、2.利的効果を現わすほど活動量が高くなかった、3.元々、老化に伴なう神経細胞死に活動量の高低は重要な因子として働いていないことなどを示唆しており、ニューロンの活動量とその老化進行との関係については、今後更に検討していく必要がある。
エネルギー代謝調節と睡眠制御の相互作用に基づく体重管理についての基盤研究

遅い時刻の夕食や朝食欠食などの食習慣は24時間のエネルギー消費量に影響しないが、24時間の平均血糖値を上昇させた(研究発表論文1)。朝食前の運動は朝食後の運動に比べて24時間で脂肪される酸化の量が多く、体脂肪増加の抑制に有効である可能性が示唆された(研究発表論文2)。また非運動性身体活動によるエネルギー消費の有無が血糖調節に影響することを明らかにした(研究発表論文3)。睡眠時無呼吸が重症化するに従ってエネルギー消費は高い傾向となり、脂肪酸化が抑制されていた(投稿準備中)。食事摂取時刻がエネルギー代謝に及ぼす影響について検討した。平成22年度には遅い時刻の夕食摂取(夕食を19時に摂取した場合と、22時30分に摂取た場合の比較)がエネルギー消費量(睡眠時エネルギー代謝の亢進)や酸化基質の経時変化(睡眠時の脂肪酸化の抑制)に影響するが、1日のエネルギー消費量の総量には影響しないことを見出した。また夕食を遅い時刻に摂取した場合には睡眠時の血糖値が食後高血糖と重なった結果上昇し、また24時間の平均血糖値も僅かに上昇することを見出した。つまり、遅い時刻の夕食摂取の急性効果(単回の効果)としては、それがエネルギー消費を減少させて肥満の原因となるという仮説を支持する結果は得られていない。しかし、平均血糖値の上昇は遅い夕食摂取を1回経験した場合に既に認められており、好ましくないと考えられていた食習慣が実際に血糖調節に悪影響を及ぼす結果を得た。これらを論文としてまとめたが(Obesity Research & Clinical Practice印刷中)、平成23年度には朝食欠食がエネルギー代謝に及ぼす影響を検討する。睡眠の質と量がエネルギー代謝に及ぼす影響を検討するために、睡眠時無呼吸のある被験者と健常人のエネルギー代謝を比較した(各8名)。睡眠の時間経過に伴なうエネルギー代謝の減少が睡眠時無呼吸のある被験者では小さい傾向が認められた。一般的に睡眠時無呼吸のある者は肥満傾向にあり、体重の異なる個体間のエネルギー消費の比較は、それを体重1k当りで比較するのか、あるいは体表面積当たりで比較するのかなどの議論があり単純ではない。そこで、睡眠時無呼吸を補正する装置(CPAP)を用いて同一個人内で睡眠時無呼吸の有無を設定する実験を開始した(現在2例目)。平成23年度には更に例数を増やして検討を進める。1)睡眠の質と量がエネルギー代謝に及ぼす影響の検討睡眠時無呼吸が認められた者の睡眠時エネルギー代謝と血糖の経時変化を5名について測定した。1人で2試行い、睡眠時無呼吸を持続陽圧呼吸療法を用いて睡眠時無呼吸の有無を設定して比較した。持続陽圧呼吸療法による睡眠の改善は認められたが、エネルギー代謝については被験者の身体的特徴の個人差(体格、合併症など)未だ一定の結論を得るまでには至っていない。今後例数を増やして検討を行う。2)食習慣がエネルギー代謝に及ぼす影響の検討健常男性12名が朝食を摂取する場合と、朝食を欠食して昼と夜の食事で1日のエネルギーを摂取する条件を設定して、エネルギー代謝と血糖値の日内変動も検討した。朝食欠食が24時間のエネルギー消費を低下させ、肥満の原因となる可能性について検討したが、1日の総エネルギー消費には差が認められなかった。しかし、朝食欠食を昼食と夕食で補うまとめ食いを行うと、食後血糖値が高く、しかも睡眠中も血糖値が高い傾向が続くため、24時間の平均血糖値が有意に上昇することを見出した。こ3)運動が1日のエネルギー代謝に及ぼす影響の検討朝食前あるいは朝食摂取後の午前中に運動を行わせ、運動の実施時刻が24時間のエネルギー代謝に及ぼす影響を検討した。朝食前の運動は食後の運動に比較して運動中に脂肪を多く酸化することを確認した。更に、24時間のに質酸化を比較しても、朝食前の運動は食後の運動に比べて脂肪の酸化が多いことが明らかとなった。この結果は平成23年11,月の国際学会で発表し、現在投稿準備を進めている。健康を支える3本柱である「運動」・「栄養」・「休養」が調節因子を共有して協調するという仮説に基づき、運動や食事による睡眠の改膳を肥満予防に役立てることを目的とした基盤研究を推進した。遅い時刻の夕食や朝食欠食などの食習慣は総エネルギー摂取量を揃えれば24時間のエネルギー消費量に影響しないが(太りやすいとの仮説は急性実験からは支持されなかった)、24時間の平均血糖値を上昇させた(研究発表論文1)。運動実施時刻が24時間の脂肪酸化に及ぼす影響について、エネルギー摂取量を揃えて検討した。

また家事などの日常生活活動が該当する、非運動性身体活動によるエネルギー消費(NEAT:non-exercise activity thermogenesis)の有無が血糖調節に影響することを、普通の生活とカロリメータ内でNEATを制限した条件下で比較して明らかにした(研究発表論文3)。睡眠がエネルギー代謝に及ぼす影響は睡眠時無呼吸患者の睡眠時エネルギー代謝を測定することから検討した。睡眠中1時間あたりの無呼吸と低呼吸の回数(AHI)により体重を揃えて群分けした睡眠時無呼吸患者を比較すると、睡眠時無呼吸が重症化するに従ってエネルギー消費は高い傾向となり、睡眠中のエネルギー消費の変動が大きく、呼吸交換比が高くなっていた(つまり炭水化物酸化が亢進し、脂肪酸化が抑制されていた)(投稿準備中)。更に睡眠時無呼吸を持続的陽圧呼吸装置(CPAP)で補正する前後でエネルギー代謝を比較することも数例で試みたが、この装置に適応できない患者や、体重増加に伴う合併症を有しているなどで、睡眠時無呼吸の有無がエネルギー代謝に及ぼす影響を明確に解析することは出来なかった。東日本大震災(平成23年3月ll日)の被害は比較的軽微であったが、間接熱量測定装置を再稼働するだけで1ヶ月、またその後、24時間のエネルギー代謝測定実験を通常に行うまでには更に2ヶ月を要した。これは主に余震のため、被験者が通常の睡眠をとる事が困難であろうとの懸念から実験再開を遅らせた。しかし、夏からは順調に研究を行うことができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。昨年11月に分担者(佐藤)と共に参加した国際会議(マストヒリト大学、オランダ)においては、エネルギー代謝が益々睡眠との関連で研究されるようになったことを実感した。
固体・液体スラグの熱伝導度とその推算式-スラグ構造と分子動力学によるアプローチ-

本研究では、2元系,3元系,4元系および実用スラグの熱伝導度を室温から1773Kの温度範囲において測定し,その温度および組成依存性を明らかにすることにより,実用スラグに適用を目指した幅広い温度域に適用できるスラグ熱伝導度の推定方法を提案することを目的とした。個体および液体状態の熱伝導度の測定には非定常熱線法を用いた。CaO-SiO_2に第3成分としてLi_2O, Na_2O, K_2OあるいはCaF_2を添加し,その熱伝導度を添加元素の濃度および温度の関数として測定した。その結果,溶融フラックスの熱伝導度はいずれも負の温度依存性を示すこと,また,Li_2O, Na_2O, K_2Oは熱伝導度を低下させ,中でもLi_2Oが最もその効果が大きいこと,一方,CaF_2は熱伝導度を増加させることを明らかにした。さらに,溶融R_2O-CaO-SiO_2(R=Li, Na, K)の熱伝導度は,液相線温度による規格化温度に対してプロットすると,SiO_2の濃度のみで整理できることを示し,この関係に基づいた溶融R_2O-CaO-SiO_2の熱伝導度の推定方法を提案した。CaO-SiO_2-CaF_2-Na_2O-Li_2O, CaO-SiO_2-CaF_2-Na_2O-Li_2O-Al_2O_3および実用モールドフラックスの熱伝導度測定を行い,その結果,Al_2O_3には溶融シリケートの熱伝導度を増加させる効果があることを明らかにした。また,これらの熱伝導度を液相線温度による規格化温度に対してプロットすることで,溶融モールドフラックスの熱伝導度は,CaO, SiO_2,CaF_2,Na_2O, Li_2OおよびAl_2O_3の6成分に主に依存することを明らかにした。固体状態の熱伝導度は結晶化にともなって上昇することを明らかにした。
脳由来の新しいプロテアーゼインヒビターの神経細胞アポトーシスにおける役割

ウシ中枢神経系において、我々がクローニングした新しいセリンプロテアーゼインヒビター蛋白B-43は、中脳から脊髄に至る脳部位で神経細胞に高発現していることが、免疫組織化学的な検討によって明らかになった。これらのB-43陽性神経は、橋・延髄の運動性神経核、脊髄前角の運動神経、大脳皮質錐体細胞、海馬CA3-CA4領域の錐体細胞、線状体の大型神経細胞などを含んでいた。また、GFAP陽性の星状膠細胞も陽性であった。B-43のマウスにおけるホモログ蛋白SPI-3のcDNA断片をRT-PCR法で得て、これをクローニング・シークエンス後、cRNAを合成し、in situ hybridization、Northem blottingに使用した。マウス脳では、B-43/SPI-3は生後2日目から発現を認め、10日過ぎにピークに達した後低下し、成塾マウスでは低い発現レベルであることがわかった。生後高発現する脳部位として海馬錐体細胞層、大脳皮質錐体細胞層V、三叉神経運動核、顔面神経核がどうていされた。この神経発達とB-43/SPI-3発現の開係は、B-43/SPI-3が、神経回路網形成を含む脳の生後発達に重要であることを示唆している。一方、成塾マウス脳を両側総頚動脈結札により一過性脳虚血とすると、Northem blottingで虚血後3時間をピークとし48時間以上持続するB-43/SPI-3の発現上昇を認めた。この条件の脳虚血により、海馬領域には典型的な遅発性神経細胞死をきたしており、in situ hybirdizationで同部に発現上昇を認めた。GST-B-43融合蛋白は、トロンビン、トリプシン、α-キモトリブシンの活性を抑制したので、脳虚血時における発現変化は、細胞内に存在する類似酵素の活性調節を介してB-43/SPI-3が神経細胞アポトーシスに関与することを示唆している。これらのB-43陽性神経は、橋・脊髄の運動性神経核や脊髄前角の運動神経を含んでいた。その他、大脳皮質錐体細胞、海馬CA3-CA4領域の錐体細胞、綿状体の大型神経細胞などが、陽性細胞として同定された。マウス脳では、B-43/SPI-3は生後2日目から発現を認め、10日過ぎにピークに達した後低下し、成熟マウスでは低い発現レベルであることがわかった。この神経発達とB-43/SPI-3発現の関係は、B-43/SPI-3が、神経回路網形成を含む脳の生後発達に重要であることを示唆している。一方、成熟マウス脳を両側総頚動脈結札により一過性脳虚血とすると、Northem blottingで虚血後3時間をピークとし48時間以上持続するB-43/SPI-3の発現上昇を認めた。この条件の脳虚血により、海馬領域には典型的な遅発性神経細胞死をきたしており、in situ hybridizationで同部に発現上昇を認めた。

この結果は、B-43/SPI-3が神経細胞アポトーシスに関与することを示唆している。GST-B-43融合蛋白は、トロンビン、トリプシン、7SNGF、プラスミン、α-キモトリプシンとインキュベーションすると、SDS安定性の複合体を形成し、抗B-43抗体でプロッチングを行うと高分子量域に対応する複合体が見い出された.GST一B-43融合蛋白はまた、トロンビン、トリプシン、α-キモトリプシン活性を抑制したが、複合体を形成しなかったエラスターゼは抑制しなかった。これらの結果は、トロンビン、トリプシン様セリンブロテアーゼがB-43の標的プロテアーゼとなりうることを示唆している。トリプシン、α-キモトリプシンの豊富な膵臓における局在を免疫組織学的に検討したところ、膵臓腺房細胞に高濃度存在することがわかった。このことは、B-43が腺房細胞内で活性化されたチモーゲンのインヒビターとして働く可能性を示唆する。B-43はreactive siteの前後にメチオニン残基を有しており、かつ、B-43のnative蛋白を活性保持したまま精製することが非常に困難であったので、α1-antitrypsinの場合のように、メチオニン残基の酸化が活性消失に関与している可能性が考えられた。そこで、これらメチオニン残基の変異体(M→A)蛋白を作製し、プロテアーゼインヒビター活性に及ぼす効果をin vitro translation法で作製した[35S]標識変異体とトロンビンの複合体形成能を指標に解析した.その結果、何れの変異体にも同程度の活性があり、また、野性型をhypoxanthine-xanthine oxidaseで酸化処理した場合にも活性は残存した。これらの知見は、B-43のセリンプロテアーゼインヒビター活性にreactive site周辺のメチオニン残基が関与しないことを示している。脳虚血時における発現変化は、細胞内に存在する類似酵素の活性調節を介してB-43/SPI-3が神経細胞アポトーシスに関与することを示唆している。
ほ場の特異性を考慮できる高汎化型作物成長モデルの開発

本研究では,1.進化型多目的最適化手法によるモデルパラメータの最適解群の導出,2.作物収量予測にとって重要なターゲットパラメータの精緻化と逐次バイアス補正手法の開発により,高い汎化能力を持つイネ生長モデルの開発を目的としている.平成30年度は,引き続きこれまで行ってきたイネ生長モデルの開発を進めると同時に,東京農工大学FM府中本町圃場において,コシヒカリおよびアキタコマチの生育調査(草丈,SPAD)を約2週間間隔で実施し,時系列の地上部における器官別乾物重測定を実施した.収穫時には収量調査および収量構成要素調査の測定を実施した.同様に気象・光環境のデータ収集と土壌の物理的および化学的特性の測定を実施した.昨年度に実施した生育調査および外部環境データと合わせることで年次反復データの整備を行った.以上で得られた野外圃場での実測データを用い,これまで実装を目指してきたイネ生長モデルへの適用を実施し,モデルの汎用性向上と高精度化を行った.また,モデルの高精度化に必要な個葉の光合成能力の時系列変化に着目し,昨年度に実施した光合成速度と葉内二酸化炭素濃度(A-Ci)の関係から得られた最大カルボキシレーション速度と最大電子伝達速度に着目し,コシヒカリおよびアキタコマチの個葉光合成能力の生育ステージ別の変化および葉窒素濃度との関係に関する査読付き論文を発表した.本成果は作物生育モデルの汎用性の向上に大きく寄与するものである.本研究では,高い汎化能力を持つイネ生長モデルの開発を目指しているが,予定していた生育調査をほぼ失敗することなく行うことができた.代表者が海外留学していたため,一部の調査を実施することができなかったが,想定の範囲内である.一方で,得られたデータの一部を用いた査読付き論文の発表を行うことができたため,研究計画はおおむね順調に進捗していると判断した.2019年度はこれまでに得られた時系列生育データ,収量データを開発したモデルに適用し,モデルによるイネ生長の再現性を確認する.また,実施できなかった器官別の窒素濃度測定を進める.得られた成果の国際学会やワークショップ等での発表を行う.さらに,年次反復測定データ結果を使い,作物成長モデルに関する査読付き英文誌への投稿を行う.具体的には,今年度中に5本程度の論文の投稿を目指す.以上により,気象などの外部環境とイネ生長との関係を生理学的に明らかにするとともに,モデルに関する知見を積み上げていき,外部環境の変動から作物生長の動きを定量的に説明でき,そして予測することができるような物理型モデルを世界に成果を発信していくことを予定している.本研究では,1.進化型多目的最適化手法によるモデルパラメータの最適解群の導出,2.作物収量予測にとって重要なターゲットパラメータの精緻化と逐次バイアス補正手法の開発により,高い汎化能力を持つ作物成長モデルの開発を目的としている.平成28年度は,多目的個体群進化をベースとするモデルパラメータ最適化アルゴリズムを作物成長モデルに実装し,計4種の誤差評価関数をそれぞれ目的関数として,これらを同時に満足させるパラメータ最適解群を求めることが可能な機能をモデル内部に実装した.トレードオフの関係にある複数の誤差評価関数を用意することにより,それらを同時に最小化する多目的最適化問題を設定することが可能となった.一方,東京農工大学試験ほ場に気象観測ステーションを設置し,気温・相対湿度・光量子・日射・雨量計の連続観測を開始した.また,作物の成長調査として,東京農工大学試験ほ場で栽培したヒノヒカリの器官別の地上部乾物重,水質(計16種)の時系列計測を実施した.以上の結果を用い,構築したモデルを東京農工大学ほ場を対象に適用した結果,デフォルト(初期)パラメータを採用した際に得られた収量の再現精度と比較して,多目的最適化手法によりモデル内主要パラメータを最適化した場合,収量の再現精度が約20%向上した.計算コストを抑えながら,解の収束効率を改善させたり,各目的関数の重み付けが成長と環境の関係に与える影響については現在検証中である.これらの研究により,ほ場内におけるイネ成長量の空間的ばらつきを定量的に確認できたことから,モデリングにおいては,パラメータの不確実性を十分に考慮する必要があることがわかった.平成28年度には,野外ほ場での気象観測およびイネの成長量計測を順調に実施することができた.また,これらのデータは時系列で取得できたため,今後の収量予測モデルの更なる精緻化に寄与できるものと考える.一方,多目的個体群進化をベースとするパラメータ最適化技術をほ場の特異性に応用するためには,モデル基礎式のコンパートメント化とパラメータ縮約が必要であり,これらに関しては一部遅れが生じた.平成28年度に得られた成果の一部は国内学会において口頭発表を実施し,また国際英文学術誌へ数編の論文を投稿した.これらを総合的に自己点検評価し,現在までの進捗状況をおおむね順調に進展していると判断した.本研究では,1.進化型多目的最適化手法によるモデルパラメータの最適解群の導出,2.作物収量予測にとって重要なターゲットパラメータの精緻化と逐次バイアス補正手法の開発により,高い汎化能力を持つ作物成長モデルの開発を目的としている.平成29年度は,昨年度に続き,多目的個体群進化をベースとするモデルパラメータ最適化アルゴリズムを作物成長モデルに実装を行った.計4種の誤差評価関数をそれぞれ目的関数として,これらを同時に満足させるパラメータ最適解群を求めることが可能な機能をモデル内部に実装した.トレードオフの関係にある複数の誤差評価関数を用意することにより,それらを同時に最小化する多目的最適化問題を設定することが可能となった.

また,作物の成長調査として,東京農工大学試験ほ場で栽培したコシヒカリ及びアキタコマチの生育調査および器官別の地上部乾物重,葉面積指数,葉のCNの時系列計測を実施した.モデルの高精度化に向けて,得られた圃場データの利用を開始した.LAI,作物体N濃度の時系列測定を予定通り実施することができた.また,これらの時系列変動関数をモデルを構成する方程式として組み込む作業を行い,パラメータの校正を客観的に行う手法の開発に着手している.以上のことから,本研究は研究実施計画通りに進展していると判断した.本研究では,1.進化型多目的最適化手法によるモデルパラメータの最適解群の導出,2.作物収量予測にとって重要なターゲットパラメータの精緻化と逐次バイアス補正手法の開発により,高い汎化能力を持つイネ生長モデルの開発を目的としている.平成30年度は,引き続きこれまで行ってきたイネ生長モデルの開発を進めると同時に,東京農工大学FM府中本町圃場において,コシヒカリおよびアキタコマチの生育調査(草丈,SPAD)を約2週間間隔で実施し,時系列の地上部における器官別乾物重測定を実施した.収穫時には収量調査および収量構成要素調査の測定を実施した.同様に気象・光環境のデータ収集と土壌の物理的および化学的特性の測定を実施した.昨年度に実施した生育調査および外部環境データと合わせることで年次反復データの整備を行った.以上で得られた野外圃場での実測データを用い,これまで実装を目指してきたイネ生長モデルへの適用を実施し,モデルの汎用性向上と高精度化を行った.また,モデルの高精度化に必要な個葉の光合成能力の時系列変化に着目し,昨年度に実施した光合成速度と葉内二酸化炭素濃度(A-Ci)の関係から得られた最大カルボキシレーション速度と最大電子伝達速度に着目し,コシヒカリおよびアキタコマチの個葉光合成能力の生育ステージ別の変化および葉窒素濃度との関係に関する査読付き論文を発表した.本成果は作物生育モデルの汎用性の向上に大きく寄与するものである.本研究では,高い汎化能力を持つイネ生長モデルの開発を目指しているが,予定していた生育調査をほぼ失敗することなく行うことができた.代表者が海外留学していたため,一部の調査を実施することができなかったが,想定の範囲内である.一方で,得られたデータの一部を用いた査読付き論文の発表を行うことができたため,研究計画はおおむね順調に進捗していると判断した.計画どおり,ほ場の特異性を評価することが可能な作物成長モデルの開発を進める.加えて,コムギ・イネの光合成特性の測定を実施する予定としている.また,群落の光環境測定を実施することにより,個体および群落における同化量をモデルに組み込むことで,ほ場での成長のバラツキに関する情報を考慮することが可能なモデリングの実施を行う予定である.得られた計測データを十分に活かした研究成果の内外への発信を実施する.得られた成果を速やかに発表及び学会誌に投稿するため,データの整理とモデルの開発を一層進めていく.2019年度はこれまでに得られた時系列生育データ,収量データを開発したモデルに適用し,モデルによるイネ生長の再現性を確認する.また,実施できなかった器官別の窒素濃度測定を進める.得られた成果の国際学会やワークショップ等での発表を行う.さらに,年次反復測定データ結果を使い,作物成長モデルに関する査読付き英文誌への投稿を行う.
内因性ジギタリスの同定とその水・電解質・血圧調節に占める役割の検討

我々は以前から神経系とOLFとの関連に着眼し、中枢神経系、特に視床下部-下垂体系とOLFとの密接な関係を報告してきた。しかし現在報告されているOLF産生に関する研究は上記の様に副腎皮質に関するものと胎盤および白内障レンズからの分離のみで神経系細胞からの分離はまったく報告されていない。我々は、生体の産生したOLFを神経系細胞から分離する目的で副腎髄質の培養細胞株(PC12)を用い、fetal calf serumを除去した培養液からのOLFの分離を試みた。その結果、培養上清にOLFを認め、その産生量がprogesterone添加により増大すること、angiotensin IIやPACAP、また、低張な培地ほど産生量が高いこと、insulin-like growthfactorが産生量を増大させることなどを認め、OLF産生とその生体内原材料の存在、さらに細胞周囲の浸透圧やgrowth factorによる産生制御機構を明らかにした。この副腎髄質細胞株より得られるOLFは1種類でなく、主成分のみで、3-4種類存在する。これは、代謝産物が混在している可能性を示唆しているが、その1成分は、HPLC的にauthentic ouabainとまったく同様の挙動を示し現在LC-MSにより構造解析中である。他の成分についても同様に構造解析中である。またOLFの血中動態の一端を明らかにする目的で、我々はOLFの血液中の結合蛋白質を分離し、IgGのFc部分に極めて類似した構造の蛋白質であること、IgGのplasmin分解Fc部分(pFc)がouabain結合能を有することを認めた。また、このpFcは白血病細胞株、THP-1細胞のouabainによる増殖抑制効果を中和し、生体内でOLF結合蛋白質として機能しうることを明らかにし、内容は印刷中。冊子体の報告書には原文を載せている。本年度の主たる目的である細胞培養上清採取はほぼ予定通り進んでいる。集めた培養上清は、0.2%trifluoro-acetic acidで処理した後、4L毎にAmberlite XAD-2で除蛋白した後、分画用ODSカラムのHPLCで色素を除き、ウアバイン様物質(OLF)分画を凍結保存している。現在同定されている種々のsteroidホルモン等には血中に結合蛋白質が存在することが知られているが、OLFに関しては、ELISA阻害物質としての蛋白の存在が報告されているのみでほとんど明らかになっていない。本年度、我々は、ヒト血漿2Lからウアバイン-Sepharoseなどを用いたカラムクロマトグラフィーで結合蛋白を単離し、N末端アミノ酸配列分析の結果から本物質がplasminで分解されたIgGlのFe部分(pFc)であることを同定した。これは単離IgGlのplasmin分解でも証明でき、ウアバイン結合活性はnativeおよびaggregateのIgGlでは観察されず、pFcのみで認められることから、炎症反応などの部位でのOLFの新たな生理機能を示唆している。さらにpFcをSepharoseに固定化したカラムを作製し、細胞培養上清をapplyしたところ、OLFが吸着し、2MNaClでOLFが遊離してくることも認め、本カラムクロマトグラフィーがOLF精製に応用でき、affinity chromatographyのtoolとなることを明らかにした。OLFの活性測定法としては我々の開発した高感度ELISAの他、生物学的活性測定法としてNaポンプ阻害活性などがあるが、いずれも阻害活性の定量で、偽陽性の判定が困難であることも観察される。今回、我々はU937細胞のMAP kinase活性化反応がbuffalinで観察されることに着目し現在ウアバインおよびOLFで同等の活性測定法を確立することを試みている。

我々は以前から神経系とOLFとの関連に着眼し、中枢神経系、特に視床下部-下垂体系とOLFとの密接な関係を報告してきた。しかし現在報告されているOLF産生に関する研究は上記の楊に副腎皮質に関するものと胎盤および白内障レンズからの分離のみで神経系細胞からの分離はまったく報告されていない。我々は、生体の産生したOLFを神経系細胞から分離する目的で副腎髄質の培養細胞株(PC12)を用い、fetal calf serumを除去した培養液からのOLF分離を試みた。その結果、培養上清にOLFを認め、その産生量がprogesterone添加により増大すること、angiotensin IIやPACAP、また、低張な培地ほど産生量が高いこと、insulin-like growthfactorが産生量を増大させることなどを認め、OLF産生とその生体内原材料の存在、さらに細胞周囲の浸透圧やgrowth factorによる産生制御機構を明かにした。この副腎髄質細胞株より得られるLOFは1種類でなく、主成分のみで、3-4種類存在する。これは、代謝産物が混在している可能性を示唆しているが、その1成分は、HPLC的にauthentic ouabainとまったく同様の挙動を示し、現在LC-MSによる構造解析中である。他の成分についても同様に構造解析中である。またOLFの血中動態の一端を明らかにする目的で、我々はOLFの血液中の総合蛋白質を分離し、IgGのFc部分に極めて類似した構造の蛋白質であること、IgGのplasmin分解Fc部分(pFc)がouabain結合能を有することを認めた。また、このpFcは白血病細胞株、THP-1細胞のouabainによる増殖抑制効果を中和し、生体内でOLF結合蛋白質として機能しうることを明らかにした。
音響波プローブを用いる温熱環境モニタリング

2ヵ年に亙って基盤的研究を実施した結果、音響波プローブを用いる計測法は、数万m^2の大規模空間数十m^2の生活空問数十cm^2の温熱環境モニタリングに適していることが分った。本研究は、ダイオキシン防止等の環境問題にも貢献できるものである。得られた成果の概要は次の通りである。(1)音響波プローブによる空間測定と誤差解析,1-2)の研究発表参照D-A,A-Dコンバータを介してPCに接続された音響トランスデューサを対向させ、この間の音響波の伝搬時間を計測する音響波プローブを構成した。測定精度は4マイクロ秒であった。数m以下の短い測定基線長であっても0.5°C以下の精度の平均温度測定が可能であった。測定に要する時間は瞬時であり、熱電対など従来の測温素子に比べて23桁ほど高速であった。このプローブを複数組合わせると次の空間温度分布測定が可能となる。(2)矩形空間における温度分布測定,3)の研究発表参照日常空間の温度分布測定を目的として、12個のトランスデューサを壁面に取り付けた約25m^2の空間の温度分布を実測した。空間分解能は3×3であるが、対流や放射を考えると十分である。熱電対による測定結果と対応した結果が得られた。熱電対などによって測定する場合と違って、音響波を用いると空間の自由と美観を確保することが可能であった。(3)円形空間における温度分布測定,4)の研究発表参照大型競技場等から各種プラントにおけるパイプ内に至るまでの空間内部の非接触計測を目的として、電子的回転走査を伴う計算機トモグラフィ(CT)法を利用した温度測定を実現した。具体的には、直径約3mの円形空間の温度分布を円周上に配置した。32個の音響トランスデューサを使用して実施した実験結果は、シミュレーション結果とよく一致した。(4)遅延線発振器型超音波温度計,5)の研究発表参照狭隘な空間の温度をリアルタイムで高感度に実測するための遅延線発振器型超音波温度計を製作した。更に複数の発振器を組合わせることで、発振モードが不連続になる欠点を補い、温度測定範囲の拡大を図ることができた。また、熱電対での測定結果と比較した結果、十分な精度と感度が得られた。・平成10年度は、次の基礎的5項目について研究を実施した結果、大気汚染等の環境問題にも貢献できる温熱環境モニタリングを実施するための研究基盤を概整することができた。成果の概要を以下に示す。(1)音響波プローブの構成と測定誤差の検討:1-4)の研究発表参照D-A、A-Dコンバータを介してPCに接続された音響トランスデューサを対向させ、この間の音響波の伝搬時間を計測する音響波プローブを構成した。測定精度は、4マイクロ秒である。

測定に要する時間は瞬時であり、熱電対など従来の測温素子に比べて23桁ほど高速で、高温ガス中の瞬時温度変化をモニタリングすることも可能である。(2)少数の音響波プローブの構成と矩形空間温度分布の測定:2,4-6)の研究発表参照日常空間の温度分布測定を目的として、12個のトランスデューサを壁面に取り付けた約25m^2の空間の温度分布を実測した。空間分解能は3×3であるが、対流や放射を考えると十分である。熱電対による測定結果と対応した結果が得られた。センサ素子などによって測定する場合と違って、音響波を用いると空間の自由と美観を確保することが可能であった。(3)複合走査超音波CTによる空間温度分布の可視化:3,7)の研究発表参照空間分解能を向上させるために、波長の短い超音波を用いた実験を行った。複合走査によって取得したデータをCT法に基づいて温度分布を再構成することができた。得られた空間分解能は5mm以下であった。数cm以下の基線長での伝搬時間計測が困難であることから、遅延線発振器を構成し、その発振周波数の変化を取り出すことによって測定を行ったが、高感度な特性が得られた。(4)伝搬方向に分解能がある音響波プローブの構成=8)の研究発表参照特定の狭領域の温度勾配を測定するためのシンプルなプローブを構成した。1ラインのみの測定系でしかも伝搬方向に分解能を有している。熱電対での測定結果と比較した結果、十分な精度が得られた。(5)計測用音響トランスデューサの検討:9)の研究発表参照温度計測用のトランスデューサについても基礎的な検討を加えた。音響ホログラフィ法によって可視化したトランスデューサの振動面の音圧分布と粒子速度を再構成することができた。この結果から、駆動周波数によって測定結果に誤差を生じていた原因を解明できた。・平成11年度は、ダイナミックレンジの拡大、測定精度の向上に加え、装置のシステム化などを検討する予定である。平成11年度は、矩形・円形空間における温熱環境モニタリングの基盤的研究を実施した。成果の概要を以下に示す。(1)少数の音響波プローブの構成と矩形空間温度分布の測定:1,9,15)の研究発表参照12個のトランスデューサを壁面に取り付けた約25m^2の空間温度分布を分解能は3×3で実測できた。更に、壁面からの反射波の情報を利用する測定方法も検討した結果、トランスデューサのさらなる少数化を実現する見込みが得られた。(2)回転超音波CTよる空間温度分布の可視化:2,5,7,8)の研究発表参照直線走査と回転走査を組合わせる複合走査に代えて、電子的な回転走査のみによる直径約3mの円形空間の温度分布を計算機トモグラフィ(CT)法を利用して測定することができた。(3)回転超音波CTによる温度分布測定の高分解能化:14)の研究発表参照前項のCT法におけるデータ取得法を工夫する暫時回転走査を導入することにより、測定精度と空間分解能の向上を図ることができた。(4)遅延線発振型超音波温度計:3,4,6,10,16)の研究発表参照狭隘な空間の温度をリアルタイムで高感度に実測するための遅延線発振器型超音波温度計を製作した。更に複数の発振器を組合せることで、発振モードが不連続になる欠点を補い、温度測定範囲の拡大を図ることができた。また、熱電対での測定結果と比較した結果、十分な精度が得られた。(5)音響波の信号形式の検討:
画像解析システムCROCOを用いた国際森林健全度モニタリングの実用化に関する研究

欧米諸国における森林の健全度モニタリングでは目視によって樹冠透過度が評価されているが、観測者間の誤差が大きいことが問題となっている。本研究の目的は、開発した画像解析システムCROCOの実用化を図るため、カメラ機種および撮影時の天候条件の影響を明らかにするとともに,目視と比較したときのCROCOの精度を明らかにすることである。まず,2001年7月8月に,スイス・Birmensdorf周辺に生立するトウヒ,モミ,ブナ,ナラの4樹種,合計80本を対象に4機種(機種AD)のデジタルカメラを用いて異なる天候条件で樹冠を撮影した資料を解析した。その結果,機種Aが他の3機種と比較して晴天順光時に過小推定の傾向があった。また,機種Bでは他の3機種と比較して晴天順光時にブナについてのみ過大推定の傾向がみられ,これは,葉部の輝度が高い画像が多いことが原因であった。さらに,機種Cについてはピンぼけ画像が原因と思われる有意差がいくつかの場合でみられた。これらのことから,解像度が100万画素程度の機種AとCではバラツキが大きいため,CROCOの利用に際しては300万画素程度の解像度をもつ機種が必要であることがわかった。次に,ヨーロッパの12カ国の代表者による樹冠透過度の目視評価値とCROCOによる推定値との相関性を調べた。資料は1999年にスロバキアで行われた目視評価国際講習会で得られた画像であり,対象樹種はトウヒ,モミ,マツ,ツガ,ブナ,ナラであり,それぞれ15本が評価された。2国間の目視評価値およびCROCOとある国との相関係数および差の標準偏差を求め,各国およびCROCOの中央値を比較した結果,CROCOは目視評価よりもばらつきの小さい安定した値を与えることを明らかにした。本研究の目的は、開発した画像解析システムCROCOの実用化を図るため、画像解析に伴う誤差やカメラ機種および撮影時の天候条件の影響を明らかにすることにある。まず,スイスで撮影された80枚の写真を用いて7名のオペレータ間の比較を行った。その結果,ナラについてのみオペレータ間に有意差が見られ,その原因として,ナラでは個体識別が困難な写真が多かったことと,1名のオペレータに解析範囲の選択において特異な偏りがあることが分かった。このことから,オペレータ間の誤差の間題を解決するためには、撮影条件の悪い写真は解析しないことと,詳細なマニュアルやテストプログラムが必要であることがわかった。次に,2001年7月8月に,スイス・Birmensdorf周辺に生立するトウヒ,モミ,ブナ,ナラの4樹種,合計80本を対象に4機種(機種AD)のデジタルカメラを用いて異なる天候条件で樹冠を撮影した。また,機種Bでは他の3機種と比較して晴天順光時にブナについてのみ過大推定の傾向がみられ,これは,葉部の輝度が高い画像が多いことが原因であってさらに,機種Cについてはピンぼけ画像が原因と思われる有意差がいくつかの場合でみられた。しかしその場合でも,機種Bでみられたように樹種によってはバラツキが大きくなる可能性があることから,使用前には機種毎,樹種毎に誤差傾向を確認する必要があることが分かった。

欧米諸国における森林の健全度モニタリングでは目視によって樹冠透過度が評価されているが、観測者間の誤差が大きいことが問題となっている。本研究の目的は、開発した画像解析システムCROCOの実用化を図るため、カメラ機種および撮影時の天候条件の影響を明らかにするとともに,目視と比較したときのCROCOの精度を明らかにすることである。まず,2001年7月8月に,スイス・Birmensdorf周辺に生立するトウヒ,モミ,ブナ,ナラの4樹種合計80本を対象に4機種(機種AD)のデジタルカメラを用いて異なる天候条件で樹冠を撮影した資料を解析した。その結果,機種Aが他の3機種と比較して晴天順光時に過小推定の傾向があった。また,機種Bでは他の3機種と比較して晴天順光時にブナについてのみ過大推定の傾向がみられ,これは,葉部の輝度が高い画像が多いことが原因であった。さらに,機種Cについてはピンぼけ画像が原因と思われる有意差がいくつかの場合でみられた。これらのことから,解像度が100万画素程度の機種AとCではバラツキが大きいため,CROCOの利用に際しては300万画素程度の解像度をもつ機種が必要であることがわかった。次に,ヨーロッパの12カ国の代表者による樹冠透過度の目視評価値とCROCOによる推定値との相関性を調べた。資料は1999年にスロバキアで行われた目視評価国際講習会で得られた画像であり,対象樹種はトウヒ,モミ,マツ,ツガ,ブナ,ナラであり,それぞれ15本が評価された。2国間の目視評価値およびCROCOとある国との相関係数および差の標準偏差を求め,各国およびCROCOの中央値を比較した結果,CROCOは目視評価よりもばらつきの小さい安定した値を与えることを明らかにした。
沿岸・河川・湖沼の土壌微生物ライブラリー作製と環境ホルモンの浄化

環境ホルモンを浄化あるいは無毒化する水中土壌微生物あるいはそれらが分泌する物質の発掘を目的とし、本研究期間の2年間に環境ホルモン汚染土壌の採取とその土壌に含まれる微生物のうち環境ホルモン浄化能を有する菌体の分離培養を以下のように行った。1.環境ホルモン汚染土壌の採取環境ホルモン汚染が深刻な地域として、トリブチルスズ高含有地域としてシンガポール工業地帯の海岸、PCB、DDT高含有地域として米国アポプカ湖周辺、ノニルフェノール高含有地域として連合王国工業地帯を流れる河川周辺、さらには汚染の環境ホルモンが特定されていないものの雄の雌化やレズビアン個体出現などの影響が出ている米国カリフォルニア州サンタバーバラ島周辺を選択し、現地の複数箇所の海岸において土壌の採取を行うとともに周囲の環境や動植物の様子を撮影し(DVDビデオカメラ、デジタルカメラ)、微生物ライブラリーの情報源とした。また現地で採集した土壌は新鮮なうちに密封、冷却し日本に持ち帰り保存した。2.微生物の分離培養日本に持ち帰った土壌を炭素源として環境ホルモン以外に炭素源を持たない無機培地中で培養し、この操作を数回繰り返す事で生き残った菌を継代し、環境ホルモンを分解し炭素源として利用できる菌体としてスクリーニングした。最終的には菌体をスクリーニングに用いたものと同じ組成の寒天培地を作成し、平板プレート上で分離培養し、ライブラリーを作製した。菌体はそれぞれを培養し増殖した微生物をグリセロールストックとし、サンプリングチユーブ及び96穴プレートに分注し凍結状態で保存した。環境ホルモンを浄化あるいは無毒化する水中土壌微生物あるいはそれらが分泌する物質の発掘を目的とし、本年度の研究では環境ホルモン汚染土壌の採取とそこからの微生物の分離培養を以下のように行った。1.環境ホルモン汚染土壌の採取環境ホルモン汚染が深刻地域として、ノニルフェノール高含有地域として英国の工業地域河川(エアー川)、PCB、DDT高含有地城として米国フロリダ州アポプカ湖周辺を選択し、実際に訪れてそれぞれの複数箇所の河岸及び湖岸において土壌の採取を行うとともに周囲の環境や動植物の様子を撮影し(DVDビデオカメラ、デジタルカメラ)、微生物ライブラリーの情報源とした。また現地で回収した土壌は新鮮なうちに密封、冷却し日本に持ち帰った。2.微生物の分離培養日本に持ち帰った土壌より炭素源を環境ホルモン以外に持たない無機培地中で培養し、増殖した菌を更に同じ環境ホルモン含有無機培地で継代し、環境ホルモンを分解し炭素源として利用できる微生物の濃縮を行った。この様な条件で増殖した微生物を平板プレート上で分離培養し、単一コロニーとした。得られた微生物の形質(色、形、寒天溶解性など)の基本データをコンピュータに入力した。さらに、それぞれを培養し増殖した微生物をグリセロールストックとし、サンプリングチューブ及び96穴プレートに分注し凍結状態で保存した。また、菌の顕微鏡画像をデジタル撮影し、得られた菌に関する全てのデータがコンピュータ上で検索できるようなデータベースを作製した。環境ホルモンを浄化あるいは無毒化する水中土壌微生物あるいはそれらが分泌する物質の発掘を目的とし、昨年度の研究に引き続き環境ホルモン汚染土壌の採取とその土壌に含まれる微生物のうち環境ホルモン浄化能を有する菌体の分離培養を以下のように行った。1.環境ホルモン汚染土壌の採取環境ホルモン汚染が深刻地域として、トリブチルスズ高含有地域としてシンガポール工業地帯の海岸、汚染の環境ホルモンが特定されていないものの雄の雌化やレズビアン個体出現などの影響が出ている米国カリフォルニア州サンタバーバラ島周辺を選択し、現地の複数箇所の海岸において土壌の採取を行うとともに周囲の環境や動植物の様子を撮影し(DVDビデオカメラ、デジタルカメラ)、微生物ライブラリーの情報源とした。菌体はそれぞれを培養し増殖した微生物をグリセロールストックとし、サンプリングチューブ及び96穴プレートに分注し凍結状態で保存した。