hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵疾患とアポトーシスに関する実験的研究

アポトーシスを回避する機構に関与していることが知られている癌遺伝子であるbc1-2の産物を免疫組織染色で検討したところ,導管系細胞にのみ過剰に発現していることが判明した.また組織抽出物のWestern blotting法でもBc1-2蛋白の過剰発現が確認された.3.外科手術で得られた慢性膵炎膵組織のBc1-2蛋白免疫組織染色でもPDLモデルと同様の所見が得られ,慢性閉塞性膵炎の病態に上記のシークエンスが関与していることが示唆された.慢性膵炎モデルであるラット膵管結紮モデルを作成し外分泌膵の変化を検討した.膵腺房細胞は膵管結紮早期からアポトーシス(TUNEL法と電気泳動法で確認)によって死滅・萎縮し,導管系細胞の増生が見られたが内分泌膵には変化が認められなかった.アポトーシス調節癌遺伝子産物であるBcl-2蛋白の推移をみると,アポトーシス誘導性Bcl-2蛋白であるBaxとBcl-XSが膵腺房細胞に過剰発現し,アポトーシス抑制蛋白であるBcl-2,Bcl-XLとMcl-1が導管系細胞に過剰発現していた.一方,外科膵切除標本の解析では,慢性膵炎の一型である腫瘍随伴性膵炎においても,ラット膵管結紮モデルでみられた腺房細胞のアポトーシスと導管系細胞の増生が認められ,導管系細胞のBcl-2,Bcl-XLとMcl-1の過剰発現が観察され,Bcl-2蛋白とアポトーシスが慢性膵炎の発症進展機序に大きく関与していることが示唆された.一方,浮腫性急性膵炎モデルであるラットセルレイン膵炎モデルとラット温阻血再灌流モデルでの観察では,急性膵炎回復期に膵腺房細胞のアポトーシス(電顕,TUNEL法と電気泳動法で確認)とBaxとBcl-XSの発現が認められた.また白血球涸渇処置を実施したラットでは,セルレイン膵炎の炎症程度が軽減するとともにアポトーシス誘導が著明に増強していた.したがって,急性膵炎モデルにおける腺房細胞のアポトーシスは「周囲に炎症という迷惑をかけない」自己防衛的反応であって,浸潤白血球は炎症の増悪因子として作用していることが推察された.さらに,膵癌細胞株での抗癌剤や放射線照射によるアポトーシス誘導を検討したが,これらのDNA損傷により時間用量依存性にBaxの誘導を伴うアポトーシスが誘導され,膵癌細胞株のBax/Bcl-2比が各々の細胞株の抗癌剤や放射線の感受性と密接に相関していることが明らかとなった.
歯周疾患を併発した骨粗鬆症患者におけるIGF結合蛋白の存在様式について

歯周疾患の罹患の程度、骨吸収量やアタッチメントレベル、DISEASE ACTIVITYと骨粗鬆疾患とは相関があったという報告も認められるものの、一方で関係が認められないとする報告もある。これは、骨粗鬆症には閉経後あるいは老人性に認められる原発性骨粗鬆症と甲状腺機能亢進や糖尿病などで認められる続発性骨粗鬆症などがあり、歯槽骨の骨塩定量を行う適当な方法が確立されていないため、その診断が難しいところに起因していると考えた。そこで現在、日本大学松戸歯学部付属病院歯周科で加療中の歯周疾患罹患患者の骨粗鬆症の程度の診断を行っているが、その判定が難しく、DXAやpQCTを用いた診断方法だけで解明できない部分について、血清中Ca、P、IRMA法によるオルテオカルシン(BGP)やTRAP、EIA法による骨型ALP(BALP)を用いて骨粗鬆症の臨床的スクリーニングを行っている。一方、血清中のインスリン様物質(IGF)の大部分はIGF結合蛋白(IGFBP)と結合して存在しており、そのIGF作用を調節しているIGFBPについても検索を行っているが、現在までに歯周疾患罹患患者および歯周組織の健常者を被験者として空腹時に採血した血液検体を遠心分離によって血清を分離し、細胞増殖抑制因子IGFBP-3をIRMA法で測定した。今後はWB法によってIGFBP-4を定量して、それらのIGFBPと骨吸収の程度とアタッチメントレベルを指標とする歯周疾患の病変の程度あるいはDISEASE ACTIVITYと関係があるかどうかを検索する予定にしている。
関節運動および不動化が実験的異所性骨化におよぼす影響

最初に牛骨皮質から抽出・精製・凍結乾燥し粗製骨形成因子(BMP)を得た。乾燥重量は約800mgとなり今回の移植実験には十分の量を確保した。この粗製BMPをAKRマウスの筋内に移植し、3週間後にsoftex撮影によりBMPが骨誘導能を有し、かつ移植用量依存性に新生骨を形成することを確認した。次いで、この粗製BMPを10mgずつAKRマウスの大腿四頭筋内に移植した。すべてのマウスに対し、体幹から移植肢にかけて、股関節伸展、膝関節伸展位でプラスチック・ギプスで関節固定を施行した.これらのマウスを早期運動群、中期運動群、後期運動群の3群に分け、早期群には移植翌日から7日間、中期群には第2週目、後期群には第3週目に強制運動負荷を与えた。強制運動負荷は、持続的他動運動装置(CPM装置)を用いて1日につき20分間、膝関節および股関節を最大他動屈伸させ、その他の時間帯はギプスにて体幹から移植肢まで関節固定した。移植3週間目に、すべての移植肢大腿四頭筋内に新生骨の形成(異所性骨化)を認めた。これらの移植部分を周囲の軟部組織とともにサンプリングし、新生骨の灰分重量を求めた。また、一部は病理組織学的検討に回した。結果は早期群で5.8±1.8mg、中期群で2.6±1.8mg、後期群で4.4±3.2mgの灰分重量となり、早期群と中期群の間に有意水準5%の危険率で有意差が認められた.他の群間には有意差は認められなかった。病理組織学的検討では、多くのサンプルにおいて移植1週目にはBMP周辺部の筋組織に未分化の筋管細胞(myotube)が出現し、周辺の間葉組織が脱分化を呈している所見が認められた。また、早期群は後期群に比べBMP境界部の軟部組織の脱分化範囲が広い一方で軟骨組織への成熟度は低かった。移植21日目の組織像では早期群は、後期群に比べ骨化の範囲は広い一方骨への成熟度は低かった。いずれの群においても既に新生骨髄組織が形成され始めていた。以上より強制運動の負荷の時期が実験的異所性骨化の新生骨形成量に影響を与えることが判明した。また、病理組織的には運動時期が早いとBMPと周辺組織との密着性が低く広範囲に浸潤するために骨化の範囲が広く。なり、強制運動負荷が遅いとその逆の現象が生じていると考えられた。今後、生化学的検討や分子生物学的検討あるいは異所性骨化の予防・治療的研究も残されている。本研究の目的は、リハビリテーション医学や整形外科学領域において著しく治療の障害になる異所性骨化の発症原因や病態の解明のために、粗製骨形成因子をマウスの大腿四頭

筋内に移植して実験的異所性骨化モデルを作成し、さらにその関節に強制他動運動や不動化の負荷を与え、新生骨化量におよぼす影響を見るものである。マウスは強制運動群、関節不動化群、自由運動群の3群に分けた。強制運動群のマウスには持続的他動運動装置(CPM装置)にて、それぞれ1日20分の膝関節強制屈伸運動を21日間にわたり負荷し、運動以外の時間帯はギプス固定とした。関節不動化群は21日間の膝関節・股関節ギプス固定のみとした。移植後21日目にsoftex撮影にて異所性骨化の状態を確認し、新生骨部を周囲の筋組織とともにサンプリングし、それを1000°C・一時間で焼灼することにより灰分重量を測定した。今までの実績にて強制他動運動群、関節不動化群、自由運動群の順で新生骨形成量が多い傾向にあることが判明している。とくに強制他動運動群と関節不動化群の間には有意な骨形成量の差が認められた。強制他動運動群の運動負荷時期を早期・中期・後期の3期に分けて骨形成量を調べたが有意差は得られなかった。病理組織標本を作製して、組織学的検討も行った。移植1週目の標本ではいずれの群においても、移植された骨形成因子の周囲の筋組織に筋管細胞(myotube)や幼若線維性組織が認められ、筋組織の脱分化が進んでいることが示された。移植2週目では他動運動群に小出血巣や血管増生を認めた。今後n数を増加させることにより、これらの事象を確証する予定である。本研究の目的は、リハビリテーション医学や整形外科学領域において著しく治療の障害になる異所性骨化の発症原因や病態の解明のために、粗製骨形成因子をマウスの大腿四頭筋内に移植して実験的異所性骨化モデルを作成し、さらにその関節に強制他動運動や不動化の負荷を与え、新生骨化量におよぼす影響を見るものである。本年度の研究として、これまでに得られた成績にn値を加え、強制運動群が他の2群に比較し有意に旺盛な新生骨形成を呈することを再確認するとともに、強制運動を移植後から7日間負荷する早期群、8日目から14日目まで負荷する中期群、15日目以降の7日間負荷の後期群の3群に分けそれぞれの新生骨形成状態を調べた。その結果、早期群では5.0mg±1.1mg、中期群では1.3mg±0.44mg、後期群では1.8mg±0.51mgの新生骨形成量の差を見た。今後はn値の増加による有意差検定と病理組織学的検討を加える予定である。粗製骨形成因子(BMP)を10mgずつAKRマウスの大腿四頭筋内に移植した。すべてに対し、体幹から移植肢にかけて、股関節伸展、膝関節伸展位でギプスで関節固定を施行した。これらのマウスを早期運動群、中期運動群、後期運動群の3群に分け、運動負荷時期による骨形成の違いを調べた。早期群には移植翌日から7日間、中期群には7日目14日目、後期群には14日目21日目に強制運動負荷を与えた。運動負荷は、持続的他動運動装置を用いて1日・20分間、膝関節・股関節を最大他動屈伸させ、その他の時間帯はギプスにて体幹から移植肢まで関節固定した。移植3週間目に、移植肢大腿四頭筋内にsoftexX-Pにて新生骨の形成を認めた。
オートファジー欠損マウス脳を用いたオートファジー制御因子の探索

オートファジーは、細胞内における主要な分解システムである。1990年代にオートファジー関連遺伝子Atg群が同定され、オートファジーの生理機能が次々と明らかになる一方で、その分子機構の詳細は未だよくわかっていない。本研究課題では、Atg5欠損マウス脳抽出液のMS解析により同定されたオートファジー関連候補因子の解析により、オートファジーの分子機構の解明に取り組む。
トリチウムオートラジオグラフによるジルカロイ表面酸化膜の水素透過機構の解明

ジルカロイ-2は高温水により酸化される際に水の解離により発生する水素を酸化膜を通して吸収する特性があり、ジルカロイに吸収された水素量が多くなると水素脆性などを引き起こすため、その吸収量の低減化が求められている。しかしながら、酸化膜中の水素の輸送経路は必ずしも明確にされておらず、水素吸収低減化の指針を得るためにはその輸送経路の特定が焦眉の問題であるとされている。水素の輸送経路の特定が難しい原因として、固体中の水素原子の空間分布を測定する機器分析としては走査型二次イオン質量分析計しか利用できず、しかもその分析感度および空間分解能があまり高くないことが挙げられる。そこで、本研究では水素同位体として放射性のトリチウムを利用して、ベータ線によるミクロオートラジオグラフを行い、水素の輸送経路を調べた。実験の詳細および得られた主な成果は次の通りである。1気圧723Kの水蒸気中で熱処理の異なるジルカロイ-2を酸化した後、陰極電解法を用いてトリチウムを導入し、生成したジルカロイ酸化膜中のトリチウムの分布状態をトリチウムミクロオートラジオグラフの手法に基づき走査型電子顕微鏡を用いて観察した。これらの実験結果より、以下の結論を得た。(1)水素の輸送経路は主としてジルコニア中の粒界であるが、酸化膜中に存在する金属間化合物が水素の輸送経路として重要な役割を果たす。(2)熱処理条件により水素吸収量が大きく変化するのは、金属間化合物の粒径が熱処理条件に大きく依存しているためである。ジルカロイー2は高温水により酸化される際に水の解離により発生する水素を酸化膜を通して吸収する特性があり、ジルカロイに吸収された水素量が多くなると水素脆性などを引き起こすため、その吸収量の低減化が求められている。しかしながら、酸素膜中の水素の輸送経路は必ずしも明確にされておらず、水素吸収低減化の指針を得るためにはその輸送経路の特定が焦眉の問題であるとされている。1気圧673Kのトリチウム水蒸気中でジルカロイー2を酸化して、生成したジルコニア酸化膜中のトリチウムの分布状態をトリチウムミクロオートラジオグラフの手法に基づき走査型電子顕微鏡を用いて観察した。トリチウムは酸化膜の表面近くに高濃度に存在しており、表面からの深さ方向に沿ってその濃度は急激に減少していた。また、酸化膜中では金属間化合物であるZr(Fe,Cr)_2およびZr_2(Fe,Ni)中に高濃度に存在していた。これらの実験結果より、水素の輸送経路として主にジルコニア中の粒界であるが、酸化膜中に存在する金属間化合物が水素の輸送経路として重要な役割を果たすことを結論した。また、熱処理条件により水素吸収量が大きく変化するのは、金属間化合物の粒径が熱処理条件に大きく依存しているためであることを結論した。

そこで、本研究では水素同位体として放射性のトリチウムを利用して、ベータ線によるミクロオートラジオグラフを行い、水素の輸送経路を調べた。実験の詳細および得られた主な成果は次の通りである。1気圧673Kのトリチウム水蒸気中でジルカロイー2を酸化して、生成したジルカロイ酸化膜中のトリチウムの分布状態をトリチウムミクロオートラジオグラフの手法に基づき走査型電子顕微鏡を用いて観察した。トリチウムは酸化膜の表面近くに高濃度に存在しており、表面から深さ方向に沿ってその濃度は急激に減少していた。また、酸化膜中では金属間化合物であるZr(Fe,Cr)2およびZr2(Fe,Ni)中に高濃度に存在していた。これらの実験結果より、以下の結論を得た。(1)水素の輸送経路は主としてジルコニア中の粒界であるが、酸化膜中に存在する金属間化合物が水素の輸送経路として重要な役割を果たす。(2)熱処理条件により水素吸収量が大きく変化するのは、金属間化合物の粒径が熱処理条件に大きく依存しているためである。
乳癌におけるTransforming growth factor βシグナルの異常に関する研究

Transforming growthfactor β(TGF-β)は正常乳腺細胞に対しては増殖抑制に働くが、乳癌細胞では癌化の過程で増殖抑制効果からエスケープすることが知られている。また、TGF-βは乳癌細胞で多量にを分泌され、細胞外マトリックスの産生を増加させ浸潤、転移能を誘導していると考えられている。しかし、なぜ正常乳腺細胞と癌細胞でTGF-βに対する反応性に差があるのかについては、いまだ不明な点が多い。遺伝子異常は、TGF-βII型レセプター遺伝子、Smad4遺伝子にそれぞれ約8%、5%で検出された。また、Smad2、3、6、7遺伝子には多型は検出されたが、アミノ酸置換を伴うような点突然変異は検出されなかった。また、Smad4蛋白質の発現を免疫組織学的に検討したところ、正常組織では発現を認めたが、癌組織では概ね発現が低下していた。以上のことより、乳癌細胞におけるTGF-β反応性低下には、TGF-βII型受容体およびSmad4の異常が関与しているものと推測する。現在のところPCR-SSCP解析で検出された異常は、TGF-βレセプターII型遺伝子のエクソン3には2例、Smad2遺伝子のエクソン8に1例、エクソン11に1例、Smad4遺伝子のエクソン11に2例である。SSCP解析で検出された異常についてはPCR-direct sequence法によってpointmutationの確認をしている最中である。Transforminggrowth factor β(TGF-β)は正常乳腺細胞に対しては増殖抑制に働くが、乳癌細胞では癌化の過程で増殖抑制効果からエスケープすることが知られている。
植物における分化発現制御に関わるゲノムDNAメチル化部位の解析法の確立

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)存在下で脱分化的増殖をしている細胞,およびこの細胞を2,4-Dを含まない培地に移植してアントシアニン合成という代謝的分化を誘導した細胞からゲノムDNAを抽出し,これをメチル化感受性および非感受性の制限酵素を用いて切断した後,これらの制限酵素に対するアダプターをライゲーションし,放射性同位元素で標識したメチル化検出用-AFLPプライマーを組み合わせてPCR反応を行い,その反応物をシーケンス・ゲルによって分離し,バンドをX-線フィルムにて検出した。その結果,分化細胞特異的にメチル化が生じているDNA領域に対するバンドとして3本,脱分化細胞ではメチル化されているものが,分化に伴って脱メチル化されているバンドととして3本が得られた。それらをクローニングして塩基配列を決定したところ、96本中,22本が葉緑体およびミトコンドリアの遺伝子であり,残りが核内遺伝子であることがわかり,多くの核外遺伝子がメチル化されていることがわかった。また,これらの培養細胞から核DNAを抽出して,メチル化感受性制限酵素で切断した後,サザン・ブロット法により,ここで得られた核内遺伝子由来のDNA断片領域においてメチル化・脱メチル化が分化状態の違いによってどのように変化しているのか調べたところ,ここで調べた24本の中で4本において分化状態によってメチル化が変化していることが見い出されたが,その他については明瞭なメチル化の変化は見い出されたなかった。
雌性の制御性T細胞の機能と組織分布に関わる分子機構の解明に基づく代謝改善法の確立

Tregは肥満に伴う内臓脂肪(VAT)の慢性炎症を抑制する。我々は肥満マウスのVATにおいて、雄性では減少するTregが雌性では増加することを見出した。そこでT細胞特異的エストロゲン受容体α欠損マウス(KO)を作製し解析した。KOのTregは免疫抑制能を有するが、エストラジオール(E2)による抑制能への影響は低下していた。KOは食事性肥満と妊娠糖尿病病態下でのTregのVAT局在が低下し慢性炎症の増悪を認めたが、糖代謝への影響は軽度であった。Tregの脂肪組織局在に関わるケモカインシグナルの関与が明らかになり、これらの制御による脂肪組織慢性炎症抑制の治療戦略に向けた基礎的な基盤成果が得られた。内臓脂肪蓄積に伴い、脂肪組織では慢性炎症が進展しインスリン抵抗性が誘導される。近年、肥大化脂肪組織では、免疫抑制能を有する制御性T細胞(Treg)が減少し慢性炎症が促進される結果、肥満に伴う糖代謝の悪化が助長されることが雄性マウスを用いた検討により報告された。一方エストロゲンはTregの分化を促進し、Tregを増加することから、肥満に伴うTregの変化が糖代謝に及ぼす影響とこれらにかかわる因子の同定を目的に研究をすすめた。雄性、雌性および卵巣摘出による偽閉経マウス(OVX)に3か月間の高脂肪食負荷(HFD)を行い、脾臓と内臓脂肪におけるTreg数、慢性炎症および糖代謝を評価した。脾臓のTreg数は、雌雄差、OVXおよびHFD負荷による影響を認めなかった。一方、内臓脂肪のTregは、雄性では減少し、雌性では逆に増加が認められた。このHFDによる雌性のTreg増加は、OVXマウスでは認められず、何らかの性ホルモンの影響が考えられた。内臓脂肪のTregにおける遺伝子解析を行ったところ、内臓脂肪のTreg数の変化に一致して、雌性のHFDマウスではPPARgとST2の増加傾向を認めた。その他、脂肪にTregを局在化させる可能性のある分子の変動を認めており、今後本因子に関する検討を継続して行う。Treg移植実験の実験条件を検討する目的で、閉経肥満マウス(OVX-HFD)に対し、Tregの自家移植を行った。その結果Treg移植は脂肪組織の慢性炎症を十分には抑制しなかったが、耐糖能を改善する傾向が認められた。今後も引き続きTreg移植の条件検討を行う。エストロゲンのT細胞とTregへの作用を生体で検討するため、新たにT細胞特異的ERa欠損(TKO)およびTreg特異的ERa欠損マウス(TregKO)の作製を施行している。現在これらのマウスの繁殖を行っており、今後もマウスの作製を継続して行い、検討可能な個体数が得られ次第、表現型の解析を実施する予定である。遺伝子改変マウスTKOおよびTregKOの作製、繁殖に苦慮している。エストロゲンの免疫細胞における作用は受精・着床や妊娠の維持に重要であることが報告されており、その結果繁殖が遅れていると考えられる。今後も継続してTKOとTregKOの繁殖に努め、研究を行う予定である。また糖脂質代謝の検討を実施した後には、不妊症や不育症の観点でエストロゲン作用を検討する予定である。肥満による内臓脂肪の増大により、脂肪組織にはマクロファージを主体とする様々な免疫細胞が浸潤し、慢性炎症の進展を導く。雄性マウスにおいて、制御性T細胞(Treg)はこれらの炎症細胞の機能を抑制し慢性炎症を改善することが示されているが、我々は雌性マウスの脂肪組織において、高脂肪食負荷(HFD)による肥満では逆にTregが増加することを見出した。妊娠時に増加するエストロゲン(E2)はTregの分化と機能を亢進し免疫寛容機構を示すことから、雌雄で異なる脂肪組織のTregの増減の際にT細胞におけるE2作用の関与を想定し、T細胞特異的ERa欠損マウス(TKO)を作製し、本マウスに3か月間のHFD負荷を行いその代謝におよぼす影響を検討した。雌性のTKOは通常食(Chow)、HFD負荷ともにコントロールのERa floxmouse(FL)と比較し酸素消費量や自発運動量に差異を認めず、同等の体重増加及び体脂肪蓄積を認めた。糖負荷試験による耐糖能にも差異を認めなかったがインスリン負荷試験によるインスリン感受性は改善する傾向が認められた。一方HFD負荷マウスにおいて、内臓脂肪組織のTregはKOではChowと比べHFDにより優位に減少し、またHFD負荷FLに比べてもKOで減少する傾向が認められた。しかしHFD負荷下の内臓脂肪組織におけるTNFa発現はKOで低下傾向、IFNgは優位な低下が認められた。以上より、雌性のTKOではHFDにより内臓脂肪のTregが減少したことより、脂肪組織でのTreg誘導におけるE2作用の重要性が示唆された。慢性炎症に対する影響に関しては、今後結果を再検討し詳細な機序の解明を行う必要性を認めた。遺伝子改変マウスの繁殖に苦慮している。E2の免疫作用は受精・着床や妊娠の維持にも重要であることが報告されており、繁殖はできるが通常のマウスと比べ個体が得にくい状況が続いている。今後も継続して繁殖に努め研究を遂行する。肥満に伴い内臓脂肪では慢性炎症を来すが、制御性T細胞はこれらの炎症を抑制する。雄性では肥満に伴う内臓脂肪のTreg減少が、肥満病態で慢性炎症が進展する一因とされてきた。

一方、我々は雌性では逆に内臓脂肪Treg数が高脂肪食(HFD)負荷で増加すること、およびこの増加は卵巣摘出偽閉経マウスでは認められないことを見出した。さらに偽閉経HFD負荷マウスに性周期を模倣してエストロゲンを投与することで、内臓脂肪Tregの減少が認められなくなることから、雌性での脂肪組織Treg局在化にエストロゲン作用が関与することを明らかにした。次に、作製したCD4-Cre, ERa-floxedマウス(T細胞特異的エストロゲン受容体α欠損マウス;TKO)を用いて、T細胞におけるERa欠損がHFD負荷による内臓脂肪の炎症におよぼす影響を検討した。本マウスはHFD負荷に対し、内臓脂肪のTregが減少する傾向を認めたが、内臓脂肪組織の炎症自体は軽減する傾向が認められた。また、TKOマウスは体重や体脂肪蓄積、および糖負荷・インスリン負荷試験の成績に明らかな変化を示さなかったことから、T細胞におけるERa作用がHFD負荷による肥満病態での糖代謝におよぼす影響はわずかと考えられた。そこで、生理的にエストロゲン濃度が高まる妊娠糖尿病病態下でのTKOの表現型を解析した。現在も検討中のため、preliminaryな結果であるが、アロ妊娠ではシンジェニック妊娠と比較し、糖負荷試験の血糖が高い傾向にあることを見出した。現在TKOと対照マウスに4週間のHFD負荷ののちに交配させ、その後もHFDを給餌する妊娠糖尿病モデルを適応し、糖代謝とTregを含めたT細胞分化への影響、内臓脂肪の慢性炎症、および糖代謝への影響を検討しており、成果がまとまり次第、論文として報告予定である。Tregは肥満に伴う内臓脂肪(VAT)の慢性炎症を抑制する。我々は肥満マウスのVATにおいて、雄性では減少するTregが雌性では増加することを見出した。そこでT細胞特異的エストロゲン受容体α欠損マウス(KO)を作製し解析した。KOのTregは免疫抑制能を有するが、エストラジオール(E2)による抑制能への影響は低下していた。KOは食事性肥満と妊娠糖尿病病態下でのTregのVAT局在が低下し慢性炎症の増悪を認めたが、糖代謝への影響は軽度であった。Tregの脂肪組織局在に関わるケモカインシグナルの関与が明らかになり、これらの制御による脂肪組織慢性炎症抑制の治療戦略に向けた基礎的な基盤成果が得られた。マウスの内臓脂肪組織において雌雄でTreg数に差異を認めた。Tregの脂肪組織局在化に関連する可能性がある因子について、今後さらに検討を継続し、その機能の実証にむけて研究を継続する。また遺伝子改変マウスTKOおよびTregKOの作製、繁殖を継続し、これらの解析を行う。さらにマウスの雌雄差がエストロゲン受容体の欠損でも再現できるかを検討することで、T細胞に対するエストロゲン作用が糖代謝調節に与える寄与とそのメカニズムの解析を行う。本年度の成績により、雌性での脂肪組織へのTreg誘導にE2作用が重要であると考えられたが、慢性炎症に対する影響はTregの挙動のみでは説明できないため、今後同様の検討を再検し詳細な機序の解明を行う。またHFDでより顕著に肥満が誘導される雄性においても同様の検討を行い、若干異なった結果が得られていることから、今後雄性での影響も詳細に検討する。
ルイス酸を用いるフェノール類の新しい光化学反応の開発とその合成化学的利用

本研究では、フェノール誘導体のルイス酸存在下における新しい光化学反応を見いだし、容易に得られる芳香族分子を出発物質とする斬新な炭素骨格構築法を開発した。1.3-メトキシフェノール(1)が臭化アルミニウム存在下の光照射により、4-メトキシビシクロ[3.1.0]ヘキセノン(2)に良好な収率で変換できることをみいだした。2.1-ナフトール(3)をハロゲン化アルミニウム存在下で光照射すると、環縮小したハロメチルインダノン(4)が良好な収率で得られることを見いだした。4は塩基と処理することによりほぼ定量的に含三員環化合物5に変換できた。3.すでに2-ナフトール(6)がエチレンとルイス酸存在下で光[2+2]付加を行うことを見いだしているので、6と他のオレフィンやルイス酸を用いる光化学反応を行い、それらの影響について検討した。4.1-ナフトール(3)およびその誘導体とエチレンとのルイス酸存在下における光反応は、置換基によって著しく異なることが分かった。即ち、無置換体および3-メチル体は高収率で[2+2]付加体7を与えるのに対し、2-アルキルおよび6-メトキシ置換体の場合、環縮小したインデノン構造をもつ付加体8が主生成物として得られることをみいだした。本研究では、フェノ-ル誘導体のルイス酸存在下における新しい光化学反応を見いだし、容易に得られる芳香族分子からの移環状脂肪簇への斬新な炭素骨格変換法を開発した。1.3ーメトキシフェノ-ルの光異性化これまでメチル置換フェノ-ル類のハロゲン化アルミニウムやプロトン酸存在化でのルミケトン型光異性化は知られていたが、メチル置換体以外の誘導体については同様の変換は報告されていなかった。本研究では3ーメトキシフェノ-ル(1)が臭化アルミニウム存在下で4ーメトキシビシクロ[3.1.0]ヘキセノン(2)に良好な収率で変換できることを見いだした。またそのメチル置換体についても検討したところ、2ーメチル体において同様の変換が起こることを見いだした。得られた(2)はベ-タメトキシエノン部という合成化学的に有用な官能基を有しているので、種々の含5員環化合物に変換が可能である。2.1ーナフト-ルの光環縮小反応1ーナフト-ル(3)においても上記と同様のルミケトン型異性化が期待できる。しかし、(3)の光反応をハロゲン化アルミニウム存在下で行なうと、形式的にはルミケトン型生成物(4)にハロゲン化水素が付加した形の環縮小体であるハロメチルインダノン(5)が良好な収率で得られた。また、同様の環縮小反応は2ーアルキル及び6ーメトキシ置換体でも起こることを見いだした。おそらくルミケトン型生成物に至る中間体にハロゲン化水素が付加したものと思われるが、反応機構の詳細については明らかではない。(5)は塩基と処理することによりほぼ定量的に(4)に変換できたので、形式上二段階でルミケトン型の異性化を達成したことになる。1.2-ナフトールとオレフィンとのルイス酸存在下における光反応すでに2-ナフトールがエチレンと[2+2]付加を行うことを見いだしているので、エチレン以外のオレフィンとの反応について検討した。その結果、アレンが[2+2]付加体1を与えることを見いだしたが、他の電子豊富アルケンの場合、ルイス酸触媒によるフリーデル-クラフツ型の反応が競争的に起こるため、反応は複雑となり明確な結果は得られなかった。2.1-ナフトールとエチレンとのルイス酸存在下における光反応1-ナフトールおよびその誘導体とエチレンとの反応は、置換基によって著しく異なることが分かった。即ち、無置換体および3-メチル体は高収率で[2+2]付加体2を与え、2-ナフトール以外の基質でも[2+2]付加が進行することを見いだした。ところが、2-アルキル置換体の場合インデノン構造をもち環縮小した付加体3が主生成物として得られ、[2+2]付加体は生成しなかった。同様に6-メトキシ体からもインデノン4が得られた。

このような環縮小を伴う付加反応はこれまで全く前例の無い反応であり、反応機構の詳細や置換基の効果については十分理解されていないが、ナフトール類の合成化学的利用について新しい局面を拓く可能性を示唆するものである。
イネの耐湿性及び耐乾性に寄与する根の外皮特異的なスベリン蓄積制御機構の解明

本研究課題では、イネの根の外皮への誘導的なスベリン蓄積が、酸素漏出(ROL)バリアとアポプラスティックバリアとして働き、イネの耐湿性と耐乾性に貢献しているという仮説を検証するために、本研究では転写因子OsNAC34を用い、外皮特異的なスベリン蓄積が、イネの耐湿性や耐乾性に与える影響を明らかにすることを目的とした。本年度は、OsNAC34-GFP融合タンパク質を発現する形質転換体を用いたChlPアッセイの立ち上げを行った。また、マイクロアレイ解析等の解析から予想されたOsNAC34の制御下にある可能性の高い遺伝子について、複数のレトロトランスポゾンTos17系統の入手を行い、それらの栽培を行い後代種子の確保を行った。年度の途中で辞退した為、目的の完遂までは達成できなかったが、これまでの研究からOsNAC34がイネのスベリン蓄積に対し何らかの影響を持ち、それは直接的もしくは間接的な根の外皮特異的なスベリン生合成関連遺伝子の制御によることを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題では、イネの根の外皮への誘導的なスベリン蓄積が、一酸素漏出(ROL)バリアとアポラスティックバリアとして働き、イネの耐湿性と耐乾性に貢献しているという仮説を検証するために、本研究では転写因子OsNAC34を用い、外皮特異的なスベリン蓄積が、イネの耐湿性や耐乾性に与える影響を明らかにすることを目的とした。本年度はまず、OsNAC34-RNAi系統、OsNAC34-GFP融合タンパク質を発現する形質転換イネの作出を行ない、今後の解析に必要な材料の整備を行った。次に、イネの野生型とOsNAC34過剰発現体を用いたマイクロアレイ解析を行い、ROLバリア形成時に機能するOsNAC34の下流の遺伝子を探索を行った。その結果、ROLバリア形成時に発現し、かつOsNAC34過剰発現系統において発現が高い遺伝子の選抜を行い、OsNAC34の下流の遺伝子である可能性が高い候補遺伝子を選抜した。そして、野生型とOsNAC34過剰発現体を材料に、OsNAC34の耐湿性形質への関与を明らかにするために、外皮のスベリン蓄積と酸素の透過性について解析を行った。その結果、OsNAC34過剰発現体イネは、野生型に比べてスベリンが染色される頻度が高い傾向が見られ、スベリンの蓄積が誘導されている可能性が示された。また、根からの酸素漏出量の評価を行ったところ、OsNAC34過剰発現がROLバリアの形成を促進する傾向が見られた。本研究課題において、当年度の研究計画をほぼ予定通りに遂行出来ている。現時点で得られている研究成果についても、学会誌への発表には未だ追試が必要な点があるものの、概ね期待通りだった。本研究課題において、現時点では研究計画の大きな変更は予定していない。今後も引き続き、当初の予定通り野生型と、OsNAC34形質転換体の表現型の解析を継続し、スベリンの蓄積がアポプラスティックバリアとして機能し、イネの耐湿性に貢献するかどうかの評価を行っていく予定である。
生理的抗凝固物質による感染宿主炎症応答制御の分子機構の解析

ラツトにエンドトキシン(ET)を静脈内投与し、微小血栓形成、肺血管内皮細胞傷害および血圧低下を惹起した。これらの病態は、白血球減少によるTNF-α産生抑制や抗TNF-α抗体投与により抑制される。アンチトロンビン(AT)や活性型プロテインC(APC)投与は、これらの病態を軽減するが、選択的なトロンビン生成抑制作用を有する不活化Xaは、凝固異常のみしか抑制しなかった。ATは、ET投与による肺TNF-αmRNA発現を抑制し、肺の誘導型NO合成酵素(iNOS)の発現を抑制した。このATのTNF-α抑制作用は、ATが血管内皮細胞によるプロスタサイクリン産生を促進することにより発現されることが判明した。プロスタサイクリンは、単球のNFκBの転写活性を抑制することで、TNF-α産生を抑制する。このATによるプロスタサイクリン産生促進は、多くの臓器に分布するカプサイシン感受性知覚神経を活性化することによる。セリンプロテアーゼであるAPCは、その酵素活性に依存して、ラツト肺のTNF-αmRNAおよびiNOSの誘導を抑制する。APCは、単球のNFκBとAP-1の活性化を抑制して、単球TNF-α産生を抑制する。トロンボモジュリン(TM)は、血管内皮細胞膜に存在する糖蛋白で、トロンビンを結合し、血中のプロテインCを活性化して、APCを生成するが、遺伝子組み替え型可溶性TM(rTM)もこの動物モデルでは、APCと同様の作用を発揮する。組織因子経路凝固インヒビター(TFPI)は、凝固第VIIa、およびXa因子を阻害するが、遺伝子組み替え型TFPI(rTFPI)も直接単球のTNF-α産生を抑制し、肺血管内皮細胞傷害やショックを抑制した。
ＨＲＭ法と次世代シークエンサーによる早期発症てんかん性脳症の新規病因遺伝子同定

早期発症てんかん性脳症(EOEE)の遺伝的原因を明らかにするため、高感度融解曲線分析(HRM)法による既知遺伝子のハイスループット変異スクリーニングと次世代シーケンサーによる網羅的解析を行った。その結果、KCNQ2変異を大田原症候群12例中3例に、SCN2A変異をEOEE328例中15例に、SCN8A変異をEOEE7例で同定した。HRM法と次世代シーケンサーの組み合わせによって、EOEEの遺伝学的原因が効率的に明らかにされた。早期発症てんかん性脳症(EOEE)は、乳幼児期に発症し頻回のてんかん発作に伴い知能障害や運動障害をきたす難治性疾患であり、新生児期発症の大田原症候群や乳児期発症のウエスト症候群が代表的な疾患である。予後が良好な家族性の特発性てんかんについてはイオンチャネルの遺伝子変異が数多く同定されたが、EOEEは孤発例が多く原因解析は進んでいなかった。我々は、ARXが、脳形成異常とウエスト症候群、大田原症候群の原因遺伝子であることを明らかにし、さらに大田原症候群の原因としてSTXBP1を同定した。しかし原因不明例もまだ多い。本研究では、最近の遺伝子解析技術であるHRM(高感度融解曲線分析)法による既知遺伝子のハイスループット変異スクリーニングと次世代シークエンサーによる網羅的解析を組み合わせた新規原因遺伝子の同定と効率的な遺伝子診断システムの構築を目的とする。昨年度は、HRM法やSanger法によってARX変異とSTXBP1変異を除外した大田原症候群12例に対し次世代シークエンサーを用いた全エクソームシークエンス(WES)を行い、3例にKCNQ2のミスセンス変異を同定した。今年度は、EOEE328例の解析(HRM287例、WESのみ6例、HRMとWES35例)を行い、大田原症候群9例、West症候群1例、分類不能5例にSCN2A変異を同定し、SCN2A変異がEOEEを引き起こすことを明らかにした。SCN2Aは電位依存性ナトリウムチャネルNavα1.2を構成し、2004年に1歳発症のEOEE1例と良性家族性新生児乳児痙攣8家系で変異が報告され、主に良性てんかんの原因と考えられていた。本研究によって、SCN2Aは大田原症候群の第四の原因遺伝子であり、良性てんかんとてんかん性脳症の原因が共通することを明らかにした。早期発症てんかん性脳症は、乳幼児期に発症し頻回のてんかん発作に伴い知能障害や運動障害をきたす難治性疾患であり、新生児期発症の大田原症候群や乳児期発症のウエスト症候群が代表的な疾患である。予後が良好な家族性の特発性てんかんについてはイオンチャネルの遺伝子変異が数多く同定されたが、てんかん性脳症は孤発例が多く原因解析は進んでいなかった。我々は、ARXが脳形成異常とウエスト症候群、大田原症候群の原因遺伝子であることを明らかにし、さらに大田原症候群の原因としてSTXBP1を同定した。本年度は、HRM法やSanger法によってARX変異とSTXBP1変異を除外した大田原症候群12例に対し次世代シークエンサーを用いた全エクソームシークエンスを行い、3例にKCNQ2のミスセンス変異を同定した。いずれも両親に変異を認めずde novo変異であった。3例とも新生児早期に全般性の痙攣発作をきたし、脳波はサプレッション・バーストを示した。7歳の2症例は重度から最重度の精神遅滞を併発した。KCNQ2は電位依存性カリウムチャネルKv7.2を構成し、1998年に良性家族性新生児痙攣の原因遺伝子として報告され、良性てんかんの原因と考えられていた。我々と同じく今年度ベルギーとオーストラリアのグループが新生児期に発症し重度の神経症状を呈するてんかん性脳症でKCNQ2変異を報告している。本研究によって、KCNQ2は大田原症候群の第三の原因遺伝子であり、良性てんかんとてんかん性脳症の原因が共通することを明らかにした。早期発症てんかん性脳症(EOEE)は、乳幼児期に発症し頻回のてんかん発作に伴い知能障害や運動障害をきたす難治性疾患である。予後良好な家族性特発性てんかんについてはイオンチャネルの変異が同定されていたが、EOEEは孤発例が多く原因解析は進んでいなかった。我々は、ARXが、EOEEの原因遺伝子であることを明らかにし、さらに大田原症候群の原因としてSTXBP1を同定した。本研究では、高感度融解曲線分析(HRM)法による既知遺伝子のハイスループット変異スクリーニングと次世代シークエンサーによる網羅的解析を組み合わせた新規原因遺伝子の同定と効率的な遺伝子診断システムの構築を目的とする。初年度は、HRM法やSanger法によってARX変異とSTXBP

1変異を除外した大田原症候群12例に対し次世代シークエンサーを用いた全エクソームシークエンス(WES)を行い、3例にKCNQ2のミスセンス変異を同定した。昨年度は、EOEE328例の解析(HRM287例、WESのみ6例、HRMとWES35例)を行い、大田原症候群9例、West症候群1例、分類不能5例にSCN2A変異を同定し、SCN2A変異がEOEEを引き起こすことを明らかにした。SCN2Aは電位依存性ナトリウムチャネルNavα1.2を構成し、2004年に1歳発症のEOEE1例と良性家族性新生児乳児痙攣8家系で変異が報告され、主に良性てんかんの原因と考えられていた。本研究によって、SCN2Aは大田原症候群の第四の原因遺伝子であり、良性てんかんとてんかん性脳症の原因が共通することを明らかにした。今年度はSCN8A変異を分類不能のEOEE6例、乳児移動性部分発作1例で同定した。本研究によってHRM法と次世代シーケンサーの組み合わせによって、EOEEの変異スクリーニングが効率的に行われることを明らかにした。小児神経学本研究計画は、研究年度全体を通してI.症例集積・臨床情報解析を行い、平成25年度にはIII.次世代シークエンサーによる新規病因候補遺伝子の選定とIV.病因候補遺伝子の変異スクリーニングを行うことであった。I.症例集積・臨床情報解析:年間50例の集積を目標とし、76例(大田原症候群8例、ウエスト症候群27例、その他41例)のDNAと臨床情報が集積された。III.次世代シークエンサーによる新規病因候補遺伝子の選定:早期発症てんかん性脳症の原因遺伝子を新たに一つ以上同定することを目標とした。大田原症候群の第4の原因遺伝子としてSCN2Aを新たに同定し、昨年度のKCNQ2とあわせて2つを同定し、目標以上に達成された。IV.病因候補遺伝子の変異スクリーニング:上記III.の次世代シークエンサーで同定されたSCN2Aの変異スクリーニングを287例に行い、9例でSCN2A変異を同定し、目標は達成された。本研究計画は、研究年度全体を通してI.症例集積・臨床情報解析を行い、平成24年度にはII.HRM法による既知遺伝子の変異スクリーニングとIII.次世代シークエンサーによる新規病因候補遺伝子の選定を行うことであった。I.症例集積・臨床情報解析については年間50例の集積を目標とし、67例(大田原症候群17例、ウエスト症候群27例、その他23例)のDNAと臨床情報が集積された。早期発症てんかん性脳症の原因遺伝子を新たに一つ以上同定することを目標とした。大田原症候群の第3の原因遺伝子としてKCNQ2を新たに同定し、目標は達成された。症例を増やして次世代シークエンサーによる網羅的な遺伝子解析を引き続き行ない、新規病因遺伝子を同定する。症例集積は当初の計画以上に進展しており問題はない。KCNQ2, SCN2A以外の既知遺伝子は当初計画した7個の遺伝子以外にも、昨年度、乳児移動性部分てんかんの原因遺伝子としてKCNT1が同定されるなど、20個異常の候補遺伝子が存在する。HRM法は少ない遺伝子数を調べるには費用対効果の高い遺伝子変異スクリーニング法であるが、調べるエクソン数に比例して、費用と労力が増加してしまう。
安価に調製した酸化カルシウム超微粒子による高効率脱硫法の開発

カルシウムをイオン交換した褐炭を脱硫剤として利用する新しい高効率な脱硫法の開発を行った。イオン交換用の褐炭として豪州産のヤルーン炭を用いた。水酸化カルシウムおよび生コンクリート製造工程から排出されるセメント廃泥をカルシウム原料としてイオン交換坦持を行った。ヤルーン炭とカルシウム原料をスラリー状で撹拌することによって10%のカルシウムを容易にイオン交換して取り込むことができた。セメント廃泥のイオン交換挙動は水酸化カルシウムの場合とほとんど変わらず、本脱硫法のための安価なカルシウム原料としてセメント廃泥が有望であることが示唆された。カルシウムをイオン交換担持したヤルーン炭の二酸化硫黄に対する脱硫特性を熱天秤で検討した。Ca/S比を14まで変えて石灰石の場合と比較したところ、イオン交換して調製したCa担持褐炭の脱硫活性は石灰石の場合に比べて著しく高く、また、セメント廃泥から調製したCa坦持炭は水酸化カルシウムを用いて調製したものと同等の活性を有することが認められた。更に、含硫黄化合物として硫化水素を用い、カルシウム坦持炭の脱硫特性を検討したところ、石灰石に比べてCa担持褐炭の脱硫性能が極めて良好であることが認められた。すなわち、還元性雰囲気下でもCa担持褐炭は脱硫反応に対して極めて高活性であることが見いだされた。更に、より実用的見地から、回分式流動層反応器を用いて高硫黄炭との混合燃焼を行ったところ、Ca担持褐炭の場合は、Ca/S=1で約80%の脱硫率が得られ、流動層反応器内でもCa担持褐炭の有効性が顕著に認められた。以上のことより、Caイオン交換褐炭は酸化性ゾーンでも還元性ゾーンでも脱硫が可能であり、石炭燃焼炉だけではなく石炭ガス化炉内での脱硫剤としても利用可能であることが示された。高効率な脱硫法を開発するため、褐炭にイオン交換して取り込まれたCaによる脱硫反応を検討している。本年度は安価なCa原料を探索するため、生コンクリート製造工程から排出されるセメント廃泥を用いて褐炭へのイオン交換実験を行い、水酸化カルシウムの場合と比較検討した。豪州褐炭のヤルーン炭とセメント廃泥を常温のイオン交換水に投入し、124時間撹拌して調製した試料中のCa含有量を定量したところ、Ca含有量は撹拌時間とともに増加し、24時間ではおよそ10%のCaをイオン交換して取り込むことができた。しかも、セメント廃泥のイオン交換挙動は水酸化カルシウムの場合とほとんど変わらず、本脱硫法のための安価なCa原料としてセメント廃泥が有望であることが示唆された。セメント廃泥を用いてCaをイオン交換担持したヤルーン炭と高硫黄炭のイリノイ炭を物理的に混合し、熱天秤内で燃焼実験を行い脱硫性能を検討した。Ca/S比を14まで変え、石灰石および水酸化カルシウムからイオン交換担持した褐炭の場合と比較したところ、セメント廃泥を用いて調製したCa担持褐炭の脱硫活性は石灰石の場合に比べて著しく高く、水酸化カルシウムを用いて調製したものと同等の活性が認められた。また、本脱硫法では脱硫剤であるCa化合物が褐炭中に取り込まれているため、基本的には炭素-Ca化合物-含硫黄化合物間の相互作用が重要となる。そこで、石炭チャーとSO_2ガスとの反応を検討したところ、SO_2ガスは炭素表面で反応し、含酸素コンプレックスを形成することが明らかとなった。今後、本脱硫法を実用化するには、炭素存在下での反応機構の解明および実際の燃焼条件下に近い条件での脱硫実験が必要となる。

高効率な脱硫法を開発するため、褐炭にイオン交換したCaによる脱硫反応を検討している。本年度は還元性ガス雰囲気中でのイオン交換Caの脱硫特性を検討するため、H_2Sガスとの反応試験を行った。固定層流通式反応器にCaをイオン交換した褐炭あるいは石灰石を充填して1500ppmのH_2Sを供給し、出口ガス中の含硫黄ガスを分析したところ、石灰石に比べてCa担持褐炭の脱硫性能が極めて良好であることが認められた。すなわち、石灰石の場合は反応開始時より100ppm程度のH_2Sが流出するのに対し、Ca担持褐炭の場合はH_2Sの流出は全く認められなかった。昨年度,SO2ガスを用いた実験により、Ca担持褐炭が脱硫剤として極めて適していることを報告したが、本検討により還元性雰囲気下でもCa担持褐炭は脱硫反応に対して極めて高活性であることが見いだされた。つまり、Caイオン交換褐炭は燃焼器内の酸化性ゾーンでも還元性ゾーンでも脱硫が可能であり、また、石炭ガス化炉内での脱硫剤としても利用可能であることが示された。更に、より実用的見地から、回分式流動層反応器を用いて高硫黄炭との混合燃焼を行ったところ、Ca担持褐炭の場合は、Ca/S=1で約80%の脱硫率が得られ、流動層反応器内でもCa担持褐炭の有効性が顕著に認められた。また、炭素-Ca化合物-含硫黄化合物間の相互作用を明らかにするため、石炭チャーとSO_2ガスとの反応を検討したところ、SO_2ガス化速度および炭素表面へのSO_2の化学吸着量に対して石炭中の鉱物質が強く影響することを見出した。特に、アルカリ金属の影響が著しく大きかった。今後、本脱硫法を実用化するには、流動層反応器内での脱硫特性を更に詳細に検討する必要がある。カルシウムをイオン交換した褐炭を脱硫剤として利用する新しい高効率な脱硫法の開発を行った。イオン交換用の褐炭として豪州産のヤルーン炭を用いた。水酸化カルシウムおよび生コンクリート製造工程から排出されるセメント廃泥をカルシウム原料としてイオン交換担持を行った。ヤルーン炭とカルシウム原料をスラリー状で攪拌することによって10%のカルシウムを容易にイオン交換して取り込むことができた。セメント廃泥のイオン交換挙動は水酸化カルシウムの場合とほとんど変わらず、本脱硫法のための安価なカルシウム原料としてセメント廃泥が有望であることが示唆された。カルシウムをイオン交換担持したヤルーン炭の二酸化硫黄に対する脱硫特性を熱天秤で検討した。Ca/S比を14まで変えて石灰石の場合と比較したところ、イオン交換して調製したCa担持褐炭の脱硫活性は石灰石の場合に比べて著しく高く、また、セメント廃泥から調製したCa担持炭は水酸化カルシウムを用いて調製したものと同等の活性を有することが認められた。更に、含硫黄化合物として硫化水素を用い、カルシウム担持炭の脱硫特性を検討したところ、石灰石に比べてCa担持褐炭の脱硫性能が極めて良好であることが認められた。すなわち、還元性雰囲気下でもCa担持褐炭は脱硫反応に対して極めて高活性であることが見いだされた。以上のことより、Caイオン交換褐炭は酸化性ゾーンでも還元性ゾーンでも脱硫が可能であり、石炭燃焼炉だけではなく石炭ガス化炉内での脱硫剤としても利用可能であることが示された。
ヒト細胞DNA中の8-ヒドロキシグアニン除去修復機構に関する研究

活性酸素によって生じる8-ヒドロキシグアニン(oh8Gua)はDNA中でアデニンとも塩基対を形成するため強い突然変異原性を有する。DNA中のoh8Guaを除去修復する酵素遺伝子として、これまでに大腸菌ではmutM遺伝子が、酵母ではOGG1遺伝子が単離されている。我々は酵母OGG1と相同性の高いESTをプローブとして、HeLa細胞cDNAライブラリーからヒト相同遺伝子(hOGG1遺伝子)を単離した。hOGG1は染色体上3P26.2に位置する遺伝子であり、345アミノ酸をコードし、酵母OGG1蛋白質と38%の相同性を示した。またGST-hOGG1蛋白質は大腸菌mutMmutY欠損株の自然突然変異を抑制した。さらに、精製した蛋白質とoh8Guaを含む合成二本鎖DNAとの反応物をHPLC-ECD解析及びポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより、hOGG1蛋白質がoh8GuaDNAグリコシラーゼ活性及びAPリアーゼ活性を有することが示された。また基質特異性の検討により、oh8Guaに対合する塩基がシトシンやチミンの場合にoh8Guaが除去されやすいことが示された。更に詳細な解析のため我々はESTのデータベースを利用してマウスの相同遺伝子(mOgg1遺伝子)も単離した。予想されるアミノ酸配列はhOGG1蛋白質と85%一致した。またmOgg1蛋白質もhOGG1蛋白質と同様なoh8Gua除去修復能を有することが示された。これらの結果からhOGG1及びmOgg1遺伝子は大腸菌mutMや酵母OGG1と同様な機能を有する哺乳類相同遺伝子であることが示唆された。
血液透析患者における歯周病が心血管病に与える影響

慢性腎臓病(CKD)における心血管疾患による死亡原因は最も多く、CKDは心血管病の危険因子であることが明らかになっている。また、歯周病は、心血管病とCKDに共通する危険因子である。歯周病が予防可能、治療可能な疾患であることを考慮すると、歯周病と心血管病の関連を明らかにする意義は大きいが、歯周病とCKDの関連性を検討した臨床研究のほとんどは欧米人が対象で、コホート研究は少ない。本研究では、日本人の血液透析患者を対象とした心血管病データベースを再構築した疫学研究の成績を用いて、心血管病発症とそれによる死亡を標的として、歯周病重症度との関連を評価し、歯周病が心腎連関進展へ与える影響について検討する。