hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生態相互作用と融合した省電力型な動物装着型センサ・ネットワーク機構

センサネットワーク本務多忙のため、H27年度課題である「動物間ネットワークシステムの構築」について、[A-3]動物間ネットワークシステムを用いた広域鳴き声情報の取得機構の設計の箇所について遅れが発生したため次年度使用額519,770円が生じた。H27年度実施予定だった[A-3]動物間ネットワークシステムを用いた広域鳴き声情報の取得機構の設計の箇所については、H28年度4月に実施する。
RAS阻害剤の耐性化機序の解明及びsiRNAを用いた新規RAS阻害剤の開発

RASは低分子量G蛋白の一種であり、細胞表面レセプターチロシンキナーゼ、3量体Gタンパク質共役型レセプター、あるいはCMLにおけるBCR-ABL融合蛋白のような細胞内チロシンキナーゼからの細胞増殖シグナルを下流に存在するRaf、PI3-キナーゼ、Ral GDS等の蛋白質に伝達する仲介役を果たしており、細胞増殖、細胞分化、細胞骨格制御、アポトーシス誘導などの遺伝子発現を制御している。慢性骨髄単球性白血病(CMML)の65%、骨髄異形成症候群(MDS)の1030%,急性白血病(AMLおよびALL)の約25%でras遺伝子(主にN-ras)の変異によるRasの活性化が認められるとの報告があり、Rasの活性化は腫瘍細胞の生存にとって重要な過程で、RAS阻害剤は点突然変異などにより恒常的に活性化されたRas自身、あるいはRasの上流の異常により増加したシグナルも阻害することによる抗腫瘍効果を期待され、開発された薬剤である。このようにRAS阻害剤は血液腫瘍に対しても有効であると考えられる。本研究ではK562低濃度のSCH66336と長期間培養することによって、BCR-ABLからのシグナルを核に伝えるRASを介さない経路の細胞内情報伝達分子を網羅的にプロテインチップによって解析を行った。SCH66336 10μM耐性K562細胞株ではp42/p44 MAPキナーゼ活性化亢進、HSP70の過剰発現が確認された。さらに新規Ras-Rafキナーゼ阻害剤、sorafenibのK562細胞株に対する抗腫瘍効果を検討した。Sorafenibは用量依存性に抗アポトーシス分子であるMCL-1の発現を抑制しK562細胞に対して抗腫瘍効果を発揮することが確認された。慢性骨髄性白血病急性転化細胞株K562はRASの上流にあるBCR-ABLキメラ蛋白よりの恒常的なシグナルが腫瘍性細胞増殖の原因となっているが、これまでの我々の研究より、代表的FTIのひとつであるSCH66336によって容量依存的にK562細胞の増殖速度は抑えられ、アポトーシス誘導は増加されることが見いだされた(Molecular Cancer Therapeutics. 2:219-24,2003)。本研究ではK562低濃度のSCH66336と長期間培養することによって、BCR-ABLからのシグナルを核に伝えるRASを介さない経路の細胞内情報伝達分子を網羅的にプ解析する。(1)SCH66336耐性株の作成:慢性骨髄性白血病急性転化細胞株K562を低濃度で8週間培養し、メチルセルロース法にてコロニー採取を行った。N-RAS変異を有する急性骨髄性白血病細胞株HL-60についても同様にSCH66336耐性株を作成した。SCH66336 10μMにても増殖可能になった場合SCH66336耐性株と判断し、K562-SCH-R細胞株、HL-60-SCH-R細胞株を樹立した。(2)SCH66336耐性株における細胞内情報伝達系分子の解析:RASは低分子量G蛋白の一種であり、細胞表面レセプターチロシンキナーゼ、3量体Gタンパク質共役型レセプター、あるいはCMLにおけるBCR-ABL融合蛋白のような細胞内チロシンキナーゼからの細胞増殖シグナルを下流に存在するRaf、PI3-キナーゼ、Ral GDS等の蛋白質に伝達する仲介役を果たしており、細胞増殖、細胞分化、細胞骨格制御、アポトーシス誘導などの遺伝子発現を制御している。
中世後期キリスト教における聖者崇拝

中世ヨーロッパのキリスト教は,唯一神信仰であるといえ,実態から見れば多信心的である.それは人間の祈りを神にとりついでくれる存在として聖人たちを想定し,彼らを,ある程度専門化された利益(りやく)の給付者と見ないしていたからである.聖人と殉教者および証聖者から成るとされるが,実際には正確な縁起不明の多くの聖人が存在する.このような聖人信仰は3, 4世紀ごろから観察され,カトリック信仰の拡大とともに西欧に波及していった.現在残存している聖者伝の数量からいって,聖者崇拝は中世後期の都市においてもきわめて活発であったことが知られる.都市民の信仰心に大きな影響力を持っていた托鉢修道会はこうした聖者崇拝を積極的に利用していた.また俗人大衆も,それ以前の時代に比べて,より能動的に聖者崇拝の発展に関与していた.このことが兄弟団と都市宗教劇の検討から明らかとなる.兄弟団は世俗的連帯を基礎としつつ,宗教活動を通じて精神的連帯を強化する組織であるが,その宗教対象としては,イエスやマリアの聖史のエピソードと並んで,多数の聖人が選ばれている.特定の聖人とその利益(りやく)に対する信仰が,構成員を結合していたのである.また宗教激の素材として,聖人の生涯がしばしばとりあげられている.もちろん上演団体の性格と,主人公である聖人は密接に関係していた.たとえば兄弟団や職業団体がその守護聖人の劇を上演する場合である.これは上演を通じて,その団体の威信を発揚するという意味を持っていた.さらに都市の守護聖人の劇は,都市民全体の自覚と団結を高める効果を持っていたのである.このように聖者崇拝は,中世高貴の都市社会において,人びとの連帯の核として重要な意味を持ちつつ,俗人たちをカトリック信仰に統合する手段として機能していたといえよう.中世ヨーロッパのキリスト教は,唯一神信仰であるといえ,実態から見れば多信心的である.それは人間の祈りを神にとりついでくれる存在として聖人たちを想定し,彼らを,ある程度専門化された利益(りやく)の給付者と見ないしていたからである.聖人と殉教者および証聖者から成るとされるが,実際には正確な縁起不明の多くの聖人が存在する.このような聖人信仰は3, 4世紀ごろから観察され,カトリック信仰の拡大とともに西欧に波及していった.現在残存している聖者伝の数量からいって,聖者崇拝は中世後期の都市においてもきわめて活発であったことが知られる.都市民の信仰心に大きな影響力を持っていた托鉢修道会はこうした聖者崇拝を積極的に利用していた.また俗人大衆も,それ以前の時代に比べて,より能動的に聖者崇拝の発展に関与していた.このことが兄弟団と都市宗教劇の検討から明らかとなる.兄弟団は世俗的連帯を基礎としつつ,宗教活動を通じて精神的連帯を強化する組織であるが,その宗教対象としては,イエスやマリアの聖史のエピソードと並んで,多数の聖人が選ばれている.特定の聖人とその利益(りやく)に対する信仰が,構成員を結合していたのである.また宗教激の素材として,聖人の生涯がしばしばとりあげられている.もちろん上演団体の性格と,主人公である聖人は密接に関係していた.たとえば兄弟団や職業団体がその守護聖人の劇を上演する場合である.これは上演を通じて,その団体の威信を発揚するという意味を持っていた.さらに都市の守護聖人の劇は,都市民全体の自覚と団結を高める効果を持っていたのである.このように聖者崇拝は,中世高貴の都市社会において,人びとの連帯の核として重要な意味を持ちつつ,俗人たちをカトリック信仰に統合する手段として機能していたといえよう.
成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫におけるエピジェネテイック異常の１細胞解析

成人T細胞白血病・リンパ腫(ATL)はとくに病期の進んだ症例の予後は大変不良であり、このような難治性リンパ腫・白血病をどのように扱うかは焦眉の課題となってきている。ATLはHTLV-Iを原因ウイルスとする疾患であるが現在のところ有効な治療法が確立されていない。本研究では、患者検体、培養細胞、動物モデル等の様々な実験系によりATLにおけるエピジェネテイック異常の発症機構について包括的網羅的解析法を駆使しながら様々な角度から総合的且つ詳細に解析した。とくに新たに開発したメチル化DNA結合蛋白MBD-EGFPによるDNAメチル化ライブイメージング法を用いて内部環境及び外部環境の変化に応答するDNAメチル化の動的変化をライブ解析し、HTLV-Iの感染がどのように異常DNAメチル化を誘導し、ATL発症にいたるか詳細に解析した。我々はHTLV-I tax遺伝子ONの後、一過的なグローバルDNA脱メチル化誘導の後、引き続き異常DNAメチル化が起こることを確認し,多数のhyper-methylation focusが新たに形成されていることを観察した。更にHTLV-I tax遺伝子発現ONにした後、細胞のDNAメチル化レベルの変動パターンの経時的変化を追跡し、異常DNAメチル化がおこるのに必要とされる時間依存性をさらに詳細に解析した。フローサイトメトリー(FCM )解析で観察されるグローバルDNAメチル化レベルの変動解析と平行して網羅的遺伝子発現解析を行い、個々の遺伝子レベルでDNAメチル化と遺伝子発現のダイナミックな変動が捕らえられた。フローサイトメトリ(FCM)を用いた細胞周期解析方法と細胞周期変動に応じたDNAメチル化レベルの変動をMBD-EGFP蛍光検出により同時計測をした。我々はHTLV-1tax遺伝子ONの後、一過的なグローバルDNA脱メチル化誘導の後、引き続き異常DNAメチル化が起こることを確認し,多数のhyper-methylation focusが新たに形成されていることを観察した。更にHTLV-Itax遺伝子発現ONにした後、細胞のDNAメチル化レベルの変動パターンの経時的変化を追跡し、異常DNAメチル化がおこるのに必要とされる時間依存性をさらに詳細に解析した。FCM解析で観察されるグローバルDNAメチル化レベルの変動解析と平行して網羅的遺伝子解析発現解析を行い、個々の遺伝子レベルでDNAメチル化と遺伝子発現のダイナミックな変動が捕らえられた。また共焦点レーザー顕微鏡及び超高解像度STED顕微鏡によるメチル化DNAのhyper-methylation foci,Tax蛋白質の時間・空間局在分布変動を1細胞レベルで詳細に検討することにより新たにDNAmethylationが起こっている現場でどのようなことが起こっているのか解析を行った。今後FCM解析で観察されるグローバルDNAメチル化レベルの変動解析と平行して共焦点レーザー顕微鏡及び超高解像度STED顕微鏡によるメチル化DNAのhyper-methylation foci,Tax蛋白質, DNMT1,3a,3bなどDNAメチル化蛋白,Tet1,2,3等DNA脱メチル化蛋白、ポリコーム遺伝子群蛋白発現の時間・空間局在分布変動を1細胞レベルで、新たにDNAmethylationが起こっている現場でどのようなことが起こっているのか詳細に解析を行う。また白血病細胞の長期ライブイメージングによるエピゲノム状態の経時変化の定量化を行う。更に次世代シーケンス技術を用いることにより、DNAメチル化のBisulfite sequencing,及びRNA sequencingによりどのようなターゲット遺伝子が時間依存的にDNAメチル化変動・発現変動を起こしているか、それがどのように細胞の生理学的、病理学的変化に結びついているか詳細に検討する。ATLはHTLV-Iを原因ウイルスとする疾患であるが、現在のところ有効な治療法が確立されていない。このような臨床病理学的特徴がどのような分子基盤によって成り立っているか明らかにするためにATL患者検体、培養細胞、動物モデル等の様々な実験系によりエピジェネテイック異常に焦点を当てATL発症機構について包括的網羅的解析法を駆使しながら様々な角度から総合的且つ詳細に解析する事を目的としている。我々はHTLV-Itax遺伝子発現のON/OFFがコントロールできる培養細胞においてDNAメチル化を定量的に計測するライブイメージングシステムの構築を試み成功している。既に予備実験よりtax遺伝子ONの後、一過的なグローバルDNA脱メチル化が誘導された後、異常DNAメチル化が起こることを確認し,その際多数のhyper-methylation fociが新たに形成されることを発見した。この実験系を用いて生きた状態で細胞内部環境及び外部環境の変化に応答してエピジェネテイック状態がどのようにダイナミックに変化するか解析をする。とりわけDNAメチル化ライブイメージング法及びトランスジェニックマウスを用いて内部環境及び外部環境の変化に応答するDNAメチル化及びヒストン修飾の動的変化を1細胞レベル及び組織レベルでライブ解析し、HTLV-I感染がどのように異常DNAメチル化を誘導するのか、また悪性腫瘍形質の獲得及びATL発症の機構を詳細に解析する。そのことにより,ハイリスクHTLV-Iキャリアの同定し、ATL発症及び低悪性度ATLから高悪性度ATLへの進展の早期発見・早期診断技術の開発、また有効な新規治療法の開発につなげる事を目指す。フローサイトメトリ(FACS)を用いた細胞周期解析方法と細胞周期変動に応じたDNAメチル化レベルの変動をEGFP蛍光検出により同時計測をした。我々は既に予備実験よりHTLV-I tax遺伝子ONの後、一過的なグローバルDNA脱メチル化誘導の後、引き続き異常DNAメチル化が起こることを確認し,多数のhyper-

methylation focusが新たに形成されていることを観察している。更にHTLV-Itax遺伝子発現ONにした後、細胞のDNAメチル化レベルの変動パターンの経時的変化を追跡し、異常DNAメチル化がおこるのに必要とされる時間依存性をさらに詳細に解析した。FACS解析で観察されるグローバルDNAメチル化レベルの変動解析と平行して共焦点レーザー顕微鏡及び超高解像度STED顕微鏡によるメチル化DNAのhyper-methylation foci,Tax蛋白質の時間・空間局在分布変動を1細胞レベルで検討することにより新たにDNA methylationが起こっている現場でどのようなことが起こっているのか詳細に解析した。成人T細胞白血病・リンパ腫(ATL)はとくに病期の進んだ症例の予後は大変不良であり、このような難治性リンパ腫・白血病をどのように扱うかは焦眉の課題となってきている。ATLはHTLV-Iを原因ウイルスとする疾患であるが現在のところ有効な治療法が確立されていない。HTLVーIウイルス感染と感染直後から始まる特定遺伝子群の異常DNAメチル化がATL発症の起点となっている可能性を強く示唆するデータを我々は得ていることより、ウイルス遺伝子産物とりわけウイルス癌遺伝子taxとターゲット遺伝子群との関連を解析する。またホストゲノムの特定のターゲット遺伝子群及びHTLV-Iウイルス自身の異常メチル化(hypermethylation)が患者様の病態とどのように相関しているか解析を行う。そのことによりどのような機構で特定のターゲット遺伝子群の異常メチル化が誘導されるのか、どのようにして多くの遺伝子が次々と異常メチル化により遺伝子発現抑制されるようになるCIMPの表現型を獲得するのか解明することが目標である本研究では、患者検体、培養細胞、動物モデル等の様々な実験系によりATLにおけるエピジェネテイック異常の発症機構について包括的網羅的解析法を駆使しながら様々な角度から総合的且つ詳細に解析した。とくに新たに開発したメチル化DNA結合蛋白MBD-EGFPによるDNAメチル化ライブイメージング法を用いて内部環境及び外部環境の変化に応答するDNAメチル化の動的変化をライブ解析し、HTLV-Iの感染がどのように異常DNAメチル化を誘導し、ATL発症にいたるか詳細に解析した。フローサイトメトリ(FCM)を用いた細胞周期解析方法と細胞周期変動に応じたDNAメチル化レベルの変動をMBD-EGFP蛍光検出により同時計測をした。我々はHTLV-1の癌遺伝子であるtax遺伝子ONの後、一過的なグローバルDNA脱メチル化誘導の後、引き続き異常DNAメチル化が起こることを確認し,多数のhyper-
味覚情報の抽出・処理・統合機構の解析

味覚は食物摂取を制御する特殊感覚であり、味覚受容機構の理解は食生活が発症に深く関与する高血圧・糖尿病をはじめとする生活習慣病の予防の観点からも重要である。先行研究でCALHM1イオンチャネルが味蕾細胞から求心性神経への神経伝達に必須であると報告したが、生体内でのCALHM1機能修飾機構が示唆されていた。本研究で、CALHM1が生体内でS-パルミトイル化修飾を受けること、さらにCALHM1のパートナー分子CALHM3を発見し、CALHM1/3チャネルが甘味・苦味・旨味・一部の塩味の神経伝達を担うことを解明した。これらの研究成果は味覚の神経伝達機構の分子理解に貢献する。本年度は、蛍光イオンインジケータによる味蕾組織中の味細胞応答記録法の構築を目指して研究を推進した。まず、味蕾細胞に蛍光Ca2+センサー蛋白質G-CaMP3を発現するマウスの作製を行った。KRT19プロモータあるいはSCNN1Aプロモータ制御下にCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウス(KRT19-CreマウスおよびSCNN1A-Creマウス)と、Creリコンビナーゼ活性によりコンディショナルにG-CaMP3を発現するAi38マウスを交配し、全味細胞もしくはENaC発現味蕾細胞選択的にG-CaMP3を発現するマウスを作製した(KRT-19:G-CaMP3マウスおよびSCNN1A:G-CaMP3マウス)。これらトランスジェニックマウスの味蕾におけるG-CaMP3の発現を免疫組織染色によって解析したところ、SCNN1A:G-CaMP3マウスにおいては先行報告と同様の味蕾細胞種に選択的にG-CaMP3の発現が確認された。一方で、全味蕾細胞にG-CaMP3を発現すると予想されたKRT-19:G-CaMP3マウスにおいては一部の味蕾細胞にしかG-CaMP3の発現が確認されず、当初の予想と異なる結果が得られた。KRT-19:G-CaMP3マウスの結果については、トランスジェニックマウス作製時のプロモータ活性が不十分であることなどが考えられる。また、味細胞応答記録のための記録システムの構築も行った。スピニングディスク型共焦点レーザースキャナとEM-CCDカメラを倒立型顕微鏡に設置し、味蕾組織中のG-CaMP3の蛍光をライブイメージングする実験系も立ち上げた。上記2点の研究実績により、世界に先駆けてG-CaMPを用いた新規味細胞応答記録法の構築が達成された。味覚は我々の食行動のコントロールに深く関与し、生存に欠かせない特殊感覚の一つとして発達してきた。末梢味覚センサーである味蕾における味覚受容・処理・統合の様式の全容を解明することは、医学・食品科学の観点からも注目されている。しかしこれまで、味蕾を構成する味受容細胞(以下、味細胞)の活動を測定することは容易ではなく、取得できる情報も限られていた。本研究では、遺伝子工学的カルシウムイオンインジケータタンパク質GCaMP3を特定の味細胞種に発現させて、舌上皮内にある正常形態を保った味細胞の活動をリアルタイムで可視化する方法論の開発を試みた。本年度は、塩味のセンサー分子であるENaCαサブユニット遺伝子のプロモーターの下流でCreリコンビナーゼを発現させるトランスジェニックマウスとGCaMP3レポーターマウスを交配して塩味細胞特異的にGCaMP3を発現するENaCα-GCaMP3マウスを作出し味細胞の塩味応答のライブセルイメージングを行った。塩味刺激に対する塩味細胞内におけるGCaMP3の蛍光輝度変化を記録できたが、S/N比が低く詳細な解析をするには不十分であったため、GCaMP3に比較して飛躍的に細胞内カルシウムイオン濃度変化への応答性が向上したGCaMP6に替えたENaCα-GCaMP6マウスの作出を行っている。以上の通り本年度は、シグナル強度の不足は認められたもののCre-LoxPシステムを用いてGCaMPバリアントを発現させることで味細胞種特異的な味刺激応答記録ができることが証明できた。GCaMP3による味細胞応答記録には成功したが、予想に反して刺激応答のS/N比が低かった。これは今後の詳細な味覚情報処理機構の詳細を研究していくうえで障害となりうると判断したため、直ちにGCaMP3に比較して応答のS/N比が飛躍的に向上した最新のGCaMP6に替えたシステムの構築を行った。このマウスを用いて、今後は当初の予定通りの研究を推進していく。本研究は、末梢味覚の生理現象の包括的理解の為の新しい技術的基盤の構築とこれによる塩味受容機構解明を目指し、以下の項目の達成を目的としてスタートした。(1)遺伝子工学的・化学合成蛍光イオンインジケータによる味蕾組織中の味細胞応答記録法の構築(2)塩味の受容・処理・統合機構の体系的解析(1)について、エレクトロポレーションによるCalcium Greenの導入・ウイルスベクターを用いた遺伝子工学的カルシウムインジケータGECIタンパクのin vivo遺伝子導入・GECIタンパクを特定の味細胞に発現する遺伝子改変マウスの作出など、様々な方法で蛍光イオンインジケータを生きたマウスの味細胞へ導入する方法を試みた。その中で、外来遺伝子をin vivoの味細胞へ導入する方法をアデノ随伴ウイルスベクターを用いて世界で初めて開発し、論文発表を行った。しかし、味細胞からのカルシウム濃度測定には遺伝子改変マウスを用いるアプローチが最も感度・効率の点で優れていた。

Calhm1-Cre;Rosa26-LSL-GCaMP6sマウスおよびaENaC-Cre;Rosa26-LSL-GCaMP6sマウスの味蕾においてはそれぞれ、Calhm1発現細胞およびaENaC発現細胞に特異的に高感度GECIであるGCaMP6sを安定的に発現しており、味刺激によって味細胞内のカルシウム応答を記録することができた。(2)について、味蕾における塩味の受容は大きく分けて2つの経路が知られており、上皮型ナトリウムチャネルを介するA経路と、それ以外の未知の受容体を介するB経路が知られている。また我々は甘味・苦味・旨味・B経路の塩味について、味蕾から味神経への神経伝達物質ATPの放出を担うイオンチャネルのコア分子がCALHM1であることを明らかにした。本研究で、CALHM1とそのパラログCALHM3が新規ヘテロメリックイオンチャネルを形成し、味細胞のATP放出チャネルを構成していることを明らかにした。本研究成果は塩味の神経伝達の分子機構の一端を明らかにしたものである。味覚は食物摂取を制御する特殊感覚であり、味覚受容機構の理解は食生活が発症に深く関与する高血圧・糖尿病をはじめとする生活習慣病の予防の観点からも重要である。先行研究でCALHM1イオンチャネルが味蕾細胞から求心性神経への神経伝達に必須であると報告したが、生体内でのCALHM1機能修飾機構が示唆されていた。本研究で、CALHM1が生体内でS-パルミトイル化修飾を受けること、さらにCALHM1のパートナー分子CALHM3を発見し、CALHM1/3チャネルが甘味・苦味・旨味・一部の塩味の神経伝達を担うことを解明した。これらの研究成果は味覚の神経伝達機構の分子理解に貢献する。平成26年度の研究計画は「蛍光イオンインジケータによる味蕾組織中の味細胞応答記録法の構築」で、2つの主な達成目標があった。一つは「味細胞に蛍光Ca2+センサー蛋白質G-CaMP3を発現するマウスの作製」で、この項目についてはKRT19プロモータあるいはSCNN1Aプロモータ制御下にG-CaMP3を発現するトランスジェニックマウス(KRT-19:G-CaMP3マウスおよびSCNN1A:G-CaMP3マウス)を作製した。結果は、SCNN1A:G-CaMP3マウスが上皮型ナトリウムチャネル発現味細胞選択的にG-CaMP3を発現することがわかり、平成27年度以降の実験に有用であることが示された。一方で、全味細胞にG-CaMP3を発現すると期待されたKRT-19:G-CaMP3マウスでは一部の味細胞にしかG-CaMP3を発現せず、CreマウスあるいはGCaMPレポーターマウスの種類を変えるなどして改善されるかを試みる必要がある。もう一つの達成目標は、「共焦点レーザー顕微鏡観察下における味刺激応答記録法の確立」であるが、この項目についてはスピニングディスク型共焦点レーザースキャナとEM-CCDカメラを倒立型顕微鏡に設置し、味蕾組織中のG-CaMP3の蛍光をライブイメージングする実験系の立ち上げに成功している。味蕾の刺激装置や記録チャンバーの形状については翌年度以降の実験の中で改善が必要である。
ヒト好酸球前駆細胞の増殖・分化の長期顕微鏡ビデオ撮影による研究

本研究によって、ヒト好酸球前駆細胞は、適度の伸展状態で増殖・分化を全うし得ることが示された。1.方法:ヒト臍帯血由来単核球をrhIL-3,rhIl-5を含む培地内で、9日培養した。付着性細胞を除去した後、主として好酸球前駆細胞を含む培養細胞をフィブリン凝固層内に植え込み、カバーグラス上から、著者らが導入した細胞伸展器によって圧し、57日間培養し、倒立位相差顕微鏡ビデオ撮影を行ない、ディスクに収録した。これと平行して、位相差顕微鏡写真の撮影を随時行なった。2.結果.(1)ヒト好酸球前駆細胞の増殖:57日の観察期間に多くの前駆細胞は3回の分裂の後、盛んに遊走する成熟好酸球へ分化した。世代時間は未熟細胞の方がより短く、同一細胞に由来する2つの娘細胞の世代時間は近似する傾向がみられた。未熟細胞の世代時間は30時間前後のものが多いが、より成熟した細胞の世代時間は40時間を超えるものが多く、90時間に達するものも少数ながらみられた。細胞伸展器を用いない場合、好酸球前駆細胞の増殖は用いた場合と比較して、世代時間に差はなく、伸展の影響は少ないと考えられた。(2)ヒト好酸球の分化・核分葉・未熟細胞の成熟につれて、数個であった好酸性顆粒が増加して行くことが観察された。細胞運動の様式も未熟細胞では、全方向に向かう広く短い突起の発生のみであるが、中等度の成熟細胞では、1方向への狭い比較的長い突起の出し入れ(prodding)であり、成熟細胞では、その突出部が大きくなり、突出方向への細胞の遊走となる。この突出とともに、核も伸長し、細いbridgeでつながっている状態に見えることが観察されたが、かならずしも固定的ではなく、流動性を残しているように観察された。細胞分裂の後、再融合する細胞が観察されたが、その生物学的意義は、今後検討を要すると考えられる。当初の計画では、1,および2によって研究の基礎的条件の検討を行なってから、3によって研究目的を達成する予定であったが、1および2の検討の結果、研究目的には不十分の結果であったので、3によって直接、研究の基礎的条件を検討した。1.ヒト好酸球性白血病細胞株EoL-1 cellの培養条件の検討:培地、添加するIL-3,IL-5の濃度などの培養条件を検討したが、正常好酸球に近い分化は得られなかった。2.ヒト好酸球コロニー培養法:ヒト骨髄細胞のメチルセルロース培地でのコロニー培養法によって得た好酸球前駆細胞をヒト・フィブリン層内に移し、細胞伸展器で伸展させ、顕微鏡ビデオ撮影によって観察することができたが、採取できる細胞数が少ないので、1回の撮影で良好な条件下に観察できる細胞数が少ないため、能率が低いことが明らかとなった。3.臍帯地単核球由来のヒト好酸球前駆細胞の液体培養と長期顕微鏡ビデオ撮影:IL-3,IL-5を添加した培地で1週間培養すると、骨髄芽球、前骨髄球などが増加し、さらに1週間培養すると好酸球が多数出現することが示された。この培養1週間の細胞から、immunobeads法によって約30%混在するT細胞を除去して顕微鏡ビデオ撮影下に培養すると、好酸球前駆細胞の増殖・分化の観察が可能なことが分かった。

一つの課題は、画面から成熟した好酸球が遊走し去るのを防ぐことであり、至適のフィブリン層の厚さ、濃さを検討中である。1.方法ヒト臍帯血より単核球を分離し、rhIL-3,rhIL-5を含む培地内で、9日培養した。付着性細胞を除去した後、主として好酸球前駆細胞を含む培養細胞をフィブリン凝固層内に植え込み、カバーグラス上から、著者らが導入した細胞伸展器によって圧し、細胞の微細構造の明視できる状態の下で57日間培養し、倒立位相差顕微鏡ビデオ撮影を行ない、ディスクに収録した。これと平行して、位相差顕微鏡写真の撮影を随時行なった。2.結果(1)ヒト好酸球前駆細胞の増殖:57日の観察期間に多くの前駆細胞は3回の分裂の後、盛んに遊走する成熟好酸球へ分化した。世代時間は未熟細胞の方がより短く、同一細胞に由来する2つの娘細胞の世代時間は近似する傾向がみられたが、本研究と同様の方法で観察した赤芽球に比べると差が大きかった。未熟細胞の世代時間は30時間前後のものが多いが、より成熟した細胞の世代時間は40時間を超えるものが多く、90時間に達するものも少数ながらみられた。細胞伸展器を用いない場合、好酸球前駆細胞の増殖は用いた場合と比較して、世代時間に差はなく、伸展の影響は少ないと考えられた。(2)ヒト好酸球の分化・核分葉:未熟細胞の成熟につれて、数個であった好酸性顆粒が増加して行くことが観察された。細胞運動の様式も未熟細胞では、全方向に向かう広く短い突起の発生のみであるが、中等度の成熟細胞では、一方向への狭い比較的長い突起の出し入れ(prodding)であり、成熟細胞では、その突出部が大きくなり、突出方向への細胞の遊走となる。この突出とともに、核も伸長し、細いbridgeでつながっている状態に見えることが観察されたが、かならずしも固定的ではなく、流動性を残しているように観察された。
赤外域の線スペクトルを用いた太陽外層大気の磁場診断

太陽コロナや彩層の磁場を診断するため、高感度の赤外線検出器を乗鞍コロナ観測所の25cmコロナグラフ、および京都大学飛騨天文台ドームレス太陽望遠鏡に設置し、赤外域線スペクトルの偏光分光観測を実施した.太陽の活動度がきわめて低かったため、最終目標であったコロナ磁場の検出には到達できなかったが、観測システムのセットアップや評価をおこない、太陽活動の出現に備えて準備を整えることができた.太陽コロナや彩層の磁場を診断するため、高感度の赤外線検出器を乗鞍コロナ観測所の25cmコロナグラフ、および京都大学飛騨天文台ドームレス太陽望遠鏡に設置し、赤外域線スペクトルの偏光分光観測を実施した.太陽の活動度がきわめて低かったため、最終目標であったコロナ磁場の検出には到達できなかったが、観測システムのセットアップや評価をおこない、太陽活動の出現に備えて準備を整えることができた.本研究の目的は、近赤外域に高い感度を有するセンサーを乗鞍コロナ観測所の25cmコロナグラフ及び飛弾天文台のドームレス太陽望遠鏡の大型分光器に設置し、ゼーマン効果によって太陽コロナおよび彩層の磁場を診断することである。これと太陽観測衛星ひのでによって得られる精細な光球磁場情報と組み合わせることにより、太陽大気の3次元磁場構造、さらにはそこで繰り広げられる電磁流体現象の理解を目指す。この目的に向け、平成19年度は高感度赤外線カメラの導入・性能試験を行った。まず、同型の性能評価用カメラを借用し性能試験を行ったところ、カメラの電気回路に起因する読み出しノイズが想定よりも大きく、目的の精度を上げることが困難であることが分かった。そこでノイズを低減するため電源部の改修を含んだ新たな仕様を策定し、これに基づいてカメラの購入をおこなった。納品されたカメラの性能試験を行った結果、読み出しノイズ十分に小さいことを確認した。しかし一部の撮像モードに於いでバイアス値がゼロ以下になっている問題が見つかり、現在メーカーと原因の調査中である。また、赤外カメラの導入と並行して、2つのFeXIIIコロナ輝線を同時に撮像するため、2つの離れた像をマージするためのリレー光学系を作製している。平成20年度は前年度に購入した赤外線カメラの特性評価をおこなった。また本カメラを乗鞍コロナ観測所の25cmコロナグラフ、および京都大学飛騨天文台ドームレス太陽望遠鏡に設置し、赤外コロナ輝線と彩層スペクトル線の偏光観測を実施した。カメラの特性評価では、熱雑音と読み出しノイズが想定されたレベルであり、当初目論んでいた精度での赤外測光観測が可能であることを確認したが、カメラの応答出力に無視できない非線形性があることもわかった。これはデータの処理において補正する。乗鞍コロナ観測所では、2つのコロナ輝線(13階電離鉄10747Aと10798A)のスペクトルを同時に観測するための光学系を製作し、本赤外カメラで良好に撮像できることを確認した。しかし太陽の活動性が予想外に低く、明るいコロナ領域が全く存在しなかったため、コロナ輝線の偏光検出には至っていない。飛騨天文台においては既設のドームレス太陽望遠鏡や偏光解析装置と組み合わせて、彩層起源のヘリウム10830A線の偏光観測を行い、これまでのCCDカメラと比較して一桁以上高い磁場の検出限界を実現できることを確認した。同時に偏光解析装置との時間的同期や望遠鏡の光学系による人為的偏光の補正など、観測システムの課題も明確になった。以上、赤外偏光観測の準備はほぼ整えることができたが、本研究の目標である太陽外層大気の磁場診断は、太陽活動の出現をみて今後速やかに実施する予定である。
日本人前立腺癌の特性

1.日本人前立腺癌の疫学的研究ビタミンAやβカロチン摂取不足は前立腺癌の危険因子であるが, 70才前後に分け検討すると70才以下は摂取不足と発生の関係がなく, 70才以上では前立腺肥大症との比較で2.5ー3.7倍,非前立腺疾患とは2.2ー4.8倍ではった.緑黄色野菜由来のβカロチン摂取不足による危険度上昇も70才以下ではみられず,それ以上の群で前立腺肥大症および非前立腺疾患に比較しそれぞれ2.3ー3.0倍および2.2ー2.4倍であった.果物由来βカロチンは差がなかった.2.前立腺癌の病態および組織学的分化度の国際間比較日本人の前立腺癌は米国日系人や米国人と同じ平均年令であるが,韓国人や中国人は前者より低い.臨床病期は日本人に有転移病期が多く,この傾向は韓国人にさらに著しいが,日系人や米国人は日本人より早期癌が多くみられた.中国人は米国人に近かった.組織学的分化度は日本人,日系人,米国人とも約3分の1が低分化癌であるが,後2者は高分化癌も多い.低分化癌の比率は韓国人,中国人にさらに大きくなった.3.日本人前立腺癌の内分泌環境,アンドロゲン受容体および内分泌療法に対する反応性臨床癌においては,性ホルモンおよびいくつかの下垂体ホルモンは対照と差がみられない.アンドロゲン受容体は約60%にみられ,これは内分泌療法に対する反応性が高く予後が良かった.4.アンドロゲン依存癌の特徴マウス・シオノギ癌115をモデルとして検討し,アンドロゲンは分裂の増加と,壊死の減少という両面の効果の結果増殖を促進することがみられた.1.日本人前立腺癌の疫学的研究ビタミンAやβカロチン摂取不足は前立腺癌の危険因子であるが, 70才前後に分け検討すると70才以下は摂取不足と発生の関係がなく, 70才以上では前立腺肥大症との比較で2.5ー3.7倍,非前立腺疾患とは2.2ー4.8倍ではった.緑黄色野菜由来のβカロチン摂取不足による危険度上昇も70才以下ではみられず,それ以上の群で前立腺肥大症および非前立腺疾患に比較しそれぞれ2.3ー3.0倍および2.2ー2.4倍であった.果物由来βカロチンは差がなかった.2.前立腺癌の病態および組織学的分化度の国際間比較日本人の前立腺癌は米国日系人や米国人と同じ平均年令であるが,韓国人や中国人は前者より低い.臨床病期は日本人に有転移病期が多く,この傾向は韓国人にさらに著しいが,日系人や米国人は日本人より早期癌が多くみられた.中国人は米国人に近かった.組織学的分化度は日本人,日系人,米国人とも約3分の1が低分化癌であるが,後2者は高分化癌も多い.低分化癌の比率は韓国人,中国人にさらに大きくなった.3.日本人前立腺癌の内分泌環境,アンドロゲン受容体および内分泌療法に対する反応性臨床癌においては,性ホルモンおよびいくつかの下垂体ホルモンは対照と差がみられない.アンドロゲン受容体は約60%にみられ,これは内分泌療法に対する反応性が高く予後が良かった.4.アンドロゲン依存癌の特徴マウス・シオノギ癌115をモデルとして検討し,アンドロゲンは分裂の増加と,壊死の減少という両面の効果の結果増殖を促進することがみられた.
原因理由文の歴史的研究

今年度の研究の目的は、第一に、諸方言や現代共通語を視野に入れ、原因理由表現を対照言語学的に考察すること、第二に、原因理由表現の歴史に関するこれまでの成果と、上に述べた対照言語学的考察から得られた成果とを有機的に関係づけることであった。このような見通しの下、今回明らかになった知見は次の通りである。1広島方言・岡山方言には終助詞ケンと言うべき形式が認められ、これは原因理由を表す接続助詞ケンを起源とする。2原因理由を表す形式の用法を、歴史的ないし対照言語学的な観点から記述する際には、少なくとも、因果用法(前件の事態が後件の事態の原因理由となるもの)・判断用法(前件が後件で述べられる判断の根拠となるもの)・終助詞用法の区別が必要である。3歴史的にみると、原因理由を表す形式は「因果用法>判断用法>終助詞用法」といった順序で用法を拡張する。4現代共通語を含め諸方言の原因理由を表す形式の用法を見渡してみると、終助詞用法の獲得の度合いについてバリエーションが存する。広島方言は終助詞化が相当に進んだ言語と考えられる。5上代語の原因理由表現の一つである語法の構文的性格を説明した。その一環として、上代語と古代琉球方言の格標示体系について考察を加えたが、両者は現代共通語の格標示体系とは異なり、類似関係にあると言える。本年度は、「平成17年度科学研究費補助金交付申請書」に示した当初の計画に従い次の四つの目的を達成すべく研究を行った。1.歴史上の文献から言語データを広範に収集する。2.収集したデータを処理し、原因理由表現の歴史を再構する。3.原因理由表現の観点から、古代語と近代語とを比較考察し、それぞれの特徴づけを行う。4.以上のことを、成果として論文にまとめ、公表する。言語データの収集に関して補足の必要を感じてはいるが、研究は概ね順調に進んでいる。具体的な成果として、第30回大会関西言語学会(2005年6月4日、於関西大学)におけるワークショップで「節の構造変化と接続助詞の形成」と題した口頭発表を行った。また、日本語文法学会の機関紙『日本語文法』に「ホドニの意味拡張をめぐって--時間関係から因果関係へ--」と題した論文を公表することができた。さらには、論文集「日本語の構造と文法化(仮題)」(ひつじ書房、2006年12月刊行予定)でも、成果を示すこととなっている。今後も現段階で得られているデータをさらに整理・分析し、研究を進展させていく予定である。
動的連続再結晶と超塑性に関する研究

加工度約70%の冷間圧延を施した7075アルミニウム(Al)合金に適切な温間加工を施すと,高温下で長時間安定に存在できる未再結晶組織が生じること,これに高温変形を加えると中間ひずみ速度域で超塑性が発現することを見いだし,その発現原因と超塑性機構を調査し,次の諸結果を得た.1.未再結晶組織から数μm径の微細粒が生じて超塑性が発現するが,一方,その動力学特性の解析結果より,微細粒組織の無い変形初期から粒界すべりが活発に働くことが結論できる.2.冷間薄板圧延材の引っ張り方向縦断面内の組織は,冷間圧延によって導入された高密度の初期高傾角粒界を有する層状粒組織であり,これは高温加熱によって回復するが,長時間未再結晶のまま安定に存在できる.3.冷間圧延で導入した層状粒組織は高密度の高傾角粒界を有し,高温変形下でそこでの粒界すべりが活発に生じると,微細粒の形成と共に超塑性が発現すると結論できる.4.前もって施す冷間圧延加工率を数種類に変化させて,層状結晶粒組織の高傾角粒界密度を変化させれば,変形下で生じる結晶粒径が変化し,それに伴い超塑性特性が変化することを確認するための実験を遂行中である.加工度約70%の冷間圧延を施した7075アルミニウム(Al)合金に適切な温間加工を施すと,高温下で長時間安定に存在できる未再結晶組織が生じること,これに高温変形を加えると中間ひずみ速度域で超塑性が発現することを見いだし,その発現原因と超塑性機構を調査し,次の諸結果を得た.1.未再結晶組織から数μm径の微細粒が生じて超塑性が発現するが,一方,その動力学特性の解析結果より,微細粒組織の無い変形初期から粒界すべりが活発に働くことが結論できる.2.冷間薄板圧延材の引っ張り方向縦断面内の組織は,冷間圧延によって導入された高密度の初期高傾角粒界を有する層状粒組織であり,これは高温加熱によって回復するが,長時間未再結晶のまま安定に存在できる.3.冷間圧延で導入した層状粒組織は高密度の高傾角粒界を有し,高温変形下でそこでの粒界すべりが活発に生じると,微細粒の形成と共に超塑性が発現すると結論できる.4.前もって施す冷間圧延加工率を数種類に変化させて,層状結晶粒組織の高傾角粒界密度を変化させれば,変形下で生じる結晶粒径が変化し,それに伴い超塑性特性が変化することを確認するための実験を遂行中である.
重い電子系超伝導体UPd_2Al_3における磁性と超伝導の相関の研究

重い電子系超伝導体UPd_2Al_3の超伝導状態に関し、以下の事が明らかとなった。1)クーパー対はスピンー重項である。2)異方的エネルギーギャップが存在する。これらは、上記物質の単結晶を用いた。比熱、上部臨界磁場等の実験によっている。さらに、他の多くのグループとの共同研究により、次の事も判明した。1)NMRの実験も、上記1)2)と矛盾しない。2)中性子散乱の実験より、磁気構造が同定され、磁気モーメントは、a軸方向を向いている。また、磁性と超伝導の相関は弱いが、存在する。3)高磁場磁化の測定より、磁場がC面内にある時、磁化の大きなトビがある。以上の実験事実は、今までに発見されている他の3種の重い電子系超伝導体(ウラン化合物)と質的に異なるもので、ユニークである。これらの実験事実を基にして、超伝導の発現機構(磁性との相関)が明らかにされることと期待される。
複合金属酸化物材料から構成される単結晶ナノワイヤの創成と熱電変換素子

単一の酸化物ナノワイヤ構造体が良好な界面と共に金属電極と接合されていること、金属電極間の温度勾配を保証するために熱絶縁された基板上、もしくはFree-Standingな状態で測定が可能であること、そして測定する金属電極間の温度差を検出するシステムがあることを主な性能とする単一酸化物ナノワイヤ構造体の熱電性を測定するシステムを構築した。熱エネルギーを電気エネルギーに変換する熱電効果は低炭素社会に向けた重要な科学技術であるが、バルク材料ではその熱電変換効率の限界という大きな原理的問題を抱えている。本研究では、自己組織化的に組みあがる複合酸化物1次元ナノ構造体を用いて理論予測されている低次元化によるゼーベック係数の向上と熱伝導率の低下を検証し、バルク酸化物材料では到達し得ない熱電変換効率を実証することを目的とする。我々の強みはこれまでに構築した熱電酸化物材料を10nm以下のナノワイヤ構造化する形成技術と単一ナノワイヤ物性測定技術にある。1本の金属酸化物ナノワイヤの熱起電力を精密に測定するシステムを構築し、その妥当性の検証に成功しているため。単一酸化物ナノワイヤ構造体の熱電物性を測定するシステムを構築した。本測定システムに要求される主な性能は以下のものである。1単一の酸化物ナノワイヤ構造体が良好な界面と共に金属電極と接合されていること、2金属電極間の温度勾配を保障する為に熱絶縁された基板上、若しくはFree-standingな状態で測定が可能であること、3測定する金属電極間の温度差を検出するシステムがあること。我々は選択的に単一の酸化物ナノワイヤ構造体を電極架橋する技術を構築しており、その良好な金属電極との接合界面形成に関する知見を蓄積している。問題点2に関しては、酸化シリコン層の厚みを系統的に変化させた。酸化層の厚みを増加させるに従って熱絶縁性は向上した。更に、Free-standing状態で単一ナノワイヤを電極架橋する手法についても検討した。問題点3に関しては、温度計に相当するナノ電極を挿入する手法と熱勾配を大きなスケールで加え金属電極間の温度差を推算する手法の両手法を用いて信頼性ある測定システムを構築した。単一の酸化物1次元ナノワイヤにおける熱電物性の検証した。物性パラメータとしてナノワイヤ径を系統的に変化させ、その熱電物性におけるサイズ依存性をHickらの理論と比較検討することにより解析した。また最近では、フォノンの平均自由行程の統計分布の重要性を指摘する報告(Rowe, CRC press 2006)もあることから、サイズがある程度大きな領域においても熱伝導性が低減し熱電性能が向上する可能性がある。ナノワイヤ表面粗さに起因する熱伝導率の低下が指摘されていることから、ナノワイヤ表面構造解析と併せて測定される熱電物性を総合的に検証した。1本の金属酸化物ナノワイヤの熱起電力測定のみならず、熱伝導率を精密に測定するシステムを構築し、従来測定技術では埋もれていた単結晶ナノワイヤ物性を抽出する。材料化学
バイオバリアにおける水理学的寿命の評価法の構築

有機塩素系化合物による地下水汚染の嫌気的な脱塩素化を行うバイオバリアの水理学的寿命、つまり透水性低下の定量的評価を目的とした。透水性低下には、微生物活動に伴うメタンなどの気泡による閉塞が微生物増殖による目詰まりよりも支配的であることが分かった。また、微生物濃度と炭素源となる物質濃度を元に時間的、空間的にどのようにバイオバリア内の透水性が変化するのかを再現可能とする透水性低減モデルを構築した。地下水中の残留有機塩素化合物に対する嫌気的脱塩素化バイオバリアでは、増殖微生物と発生ガスによる間隙の目詰まりを原因とする脱塩素化能の失活、流れの阻害によって、不完全浄化による汚染拡大、地下水位上昇による地盤支持力の低下などを招く恐れがある。バリアには浄化能および通水能の長期的持続が求められ、分解能の評価だけではなく、透水性との関係の定量的評価が重要である。つまり、微生物活動に依存するバリアの透水性低下の限界点、「水理学的寿命」の評価が欠かせない。そこで、バイオバリアにおける透水性変動の予測手法を構築することを目的として、間隙率、透水係数などの水理学的パラメータの微生物反応プロセスに伴う変動性を明らかにし、透水性と微生物輸送を関連づけた推定モデルの構築を行った。バイオバリアを模擬した、嫌気性微生物群集によるトリクロロフェノールの長期的脱塩素化カラム試験によって、堆積微生物分布および気泡捕捉量分布の計測を行い、透水係数との関係を調べた。脱塩素化活性が定常に至るまでに、透水係数が10^<-4>cm/sまで3オーダーも低減することがわかったが、占有体積では捕捉気泡が堆積微生物よりも20倍以上であったことから、透水性低減には気泡捕捉が支配的要因であることが示唆された。別途、微生物の移動遅延を考慮し、間隙率を変数としたTwo-region, three-site微生物輸送モデルを構築した。気泡捕捉量の推定には、微生物輸送・分布の推定が重要な要素であるが、Two-region, three-site微生物輸送モデルにより微生物の堆積・吸着過程を早いプロセスと遅いプロセスに分けて表現し、微生物分布変動のシミュレーションを可能とした。CXTFITを利用した部分的なパラメータ推定を導入して、モデルパラメータの推定方法を工夫し、Two-region, three-siteモデルで新規導入した吸着サイトの存在比率を表すパラメータの同定を容易に行えるようにした。これにより、バイオバリアの水理学的寿命を評価法構築の基礎が出来た。地下水帯の嫌気的脱塩素化バイオバリアでは、増殖微生物と発生ガスによる間隙の閉塞を原因とする脱塩素化能の失活、流れの阻害によって、不完全浄化による汚染拡大、地下水位上昇による地盤支持力の低下などを招く恐れがある。そこで、バイオバリアにおける透水性変動評価モデルを構築することを目的とした。嫌気性微生物群集によるトリクロロフェノールの脱塩素化カラム試験によって、電子供与体の過剰供給系における透水性に関する寿命評価を行った。安定した脱塩素化系が形成されるまでに透水係数が4オーダー近くも低減したが、カラム上流5cmの区間での捕捉気泡と堆積微生物による間隙閉塞が透水性低減に対して支配的になった。空間的分布では堆積微生物では5cmまでの堆積量が最も多く、指数関数的に低減したが、捕捉気泡ではばらつきはあるものの位置によらずほぼ一様分布となった。間隙占有体積では、微生物に対して気泡は上流部で数倍程度であるため、気泡の透水性低減効果が支配的であることが示唆された。脱塩素化能はこの領域で最も高くなっており、バリアの性能を維持する重要な役割を担っており、水理学的寿命を決める要素がバリアの脱塩素化性能に対する応答性を調べる必要があることが示唆された。一方で、透水係数変動評価に関する一次元モデルを構築した。複合的反応である脱塩素化反応系において、主たる微生物活動である有機酸分解の反応速度をMonod式で表現し、全体の微生物増殖を再現できると仮定し、併せてメタンと二酸化炭素の気泡生成を飽和度と静水圧との関係を定式化した。さらに、微生物移動に関するTwo-region,three-site微生物輸送モデルを組み合わせた。実験により決定されるパラメータである気泡捕捉率を導入して、間隙率を変数とした透水係数変動評価モデルを構築した。これにより、機能性と安全性を考慮したバイオバリアの設計に役立つと考えられる。
軟骨肉腫に対するHDAC阻害剤の至適投与方法の確立

これまで我々は、分子標的治療薬であるヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤が軟骨肉腫の分化を誘導し抗腫瘍効果を示すことを明らかにしてきた。本研究では軟骨肉腫の悪性度と分化度の相違によるHDAC阻害剤に対する感受性の影響について調べた。中高分化型軟骨肉腫細胞株であるOUMS-27と、より増殖能が高く低分化な軟骨肉腫細胞株SW1353にHDAC阻害剤であるApicidinとTrichostatin Aを24時間投与し定量的PCRをおこなったところ、軟骨細胞基質であるtypeII collagen、typeXI collagen、AggrecanのmRNAの発現はどちらの細胞でも濃度依存的に誘導されていた。一方、これらの遺伝子の発現誘導はヒト胎児腎細胞であるHEK293細胞においては観察されなかった。次に、更に分化段階が進行した肥大軟骨細胞の基質であるtypeX collagenはHDAC阻害剤の24時間投与によってOUMS-27では濃度依存的に発現が促進されたが、SW1353に関しては発現が誘導されなかった。以上の結果より、軟骨肉腫細胞の悪性度と分化度に応じてHDAC阻害剤に対する分化マーカーの発現パターンが異なることが示された。我々の先行研究においてHDAC阻害剤はOUMS-27とSW1353に対し、それぞれautophagyとapoptosisという異なる細胞死を誘導することが証明されており、軟骨肉腫の治療においては組織の悪性度と分化度に応じたHDAC阻害剤の投与方法を検討することが重要であると考えられた。
味細胞と腸管内分泌細胞に共通する甘味受容メカニズムに関する研究

本研究では、腸管や膵臓に存在するインスリン分泌ホルモンGIPの受容体(GIPR)のmRNAがマウス味細胞にも発現していることを発見した。GIPR発現細胞の約7割は甘味受容体サブセットT1R3を共発現していた。また、米国モネル化学感覚研究所に滞在し、新たな味細胞幹細胞培養系「Taste Organoid」を学び、これを帰国後所属研究室でも立ち上げた。マウス有郭乳頭基部より採取した幹細胞をマトリゲルを含む培地で培養すると、味細胞へと分化した。この時培地中にインスリンを加えると、濃度依存的に各種味細胞マーカーmRNA量が増加したことから、インスリンが味細胞の分化/増殖に関与する可能性が示唆された。味受容体は舌上だけでなく、膵臓や腸管等、様々な臓器に発現しており、腸管吸収上皮における糖輸送体の膜発現調節や、その後のエネルギー代謝、またインスリンやインクレチン(GLP-1やGIP)といった種々の消化管ホルモン分泌の分泌調整に関わっていることが示唆されている。近年、消化管で発見されたホルモンやレセプター、糖輸送体が味細胞にも発現していることが示唆されているが、その詳細や機能に関しては未だ未知の部分が多い。本研究ではT1R2/T1R3(人工甘味料を含め、甘味物質を広く受容)と、糖輸送体-KATPチャネル系(単糖のみを受容)の2つの異なる甘味受容メカニズムが味細胞に存在しているか、また消化管ホルモン分泌にどのように関係しているかを探索している。2015年度は米国モネル化学感覚研究所に出張し、味細胞の幹細胞を用いた3次元培養系「オルガノイド」の作製技術を開発者であるDr.Peihua Jiang、Dr. Wenwen Renに直接学び、これを習得し帰国した。同時に、このオルガノイドを試料として行ったRT-PCにより、オルガノイドには様々な甘味受容に関わる分子(T1R3やgustducin)および糖受容体(GLUT4, GLUT8, SGLT1)、さらに消化管ホルモンの受容体(インスリンレセプター)のmRNAが発現していることがわかった。また、このオルガノイド、及びマウス味蕾を用いた免疫組織化学的実験により、インクレチンホルモンの一つであるGIPのレセプターが甘味受容細胞中心に発現している可能性が示唆された。モネル研究所への出張で、オルガノイドの樹立法を学んだが、当地の実験設備の関係上、電気生理学的実験等の遂行は困難であったため、研究計画に盛り込んだ機能解析の部分ではやや遅れている。しかし、今後当研究室でもオルガノイド培養系を立ち上げ、マウス味蕾を用いた機能解析と併せて研究を進めていく。近年、口腔内に、元々消化管で発見されたホルモンやその関連分子が発現していることが報告されているが、その詳しい発現の分布や、生理的な意義の多くは未だ謎に包まれている。今回は腸管内分泌細胞から分泌されるインスリン分泌ホルモンであるGIPのマウス末梢味覚器における発現を調査した。その結果、GIP自体のmRNAはマウス味覚器から検出されなかったが、そのレセプター(GIPR)のmRNAは味細胞に発現していた。また、免疫組織化学的手法の結果、舌前方部茸状乳頭味蕾、後方部有郭乳頭味蕾ともに、GIPR発現味細胞の約7割は甘味受容体サブセットT1R3を共発現していた。一方酸味受容に関わる味細胞のマーカーGAD67発現味細胞にはGIPRはほとんど見られなかった。以上のことから、血中に存在するGIPは、甘味受容に何らかの影響を与えている可能性が示唆された。また、生体の糖代謝において最重要ホルモンであるインスリンに関しては、これまでにインスリンレセプター(IR)のmRNAが味覚器に発現しているという報告はされているが、その機能は明らかになっていない。今回、昨年度米国モネル化学感覚研究所のDr. Peihua Jiangより習得した味細胞オルガノイドを用いた実験系を、当研究室でも確立し、これを用いて、インスリンの機能を探索した。味細胞オルガノイドは、味細胞の幹細胞を三次元培養する最新の実験材料である。今回の実験では、様々な濃度のインスリンを味細胞オルガノイドの培地に加えて3週間培養し、real time PCRにて様々な遺伝子の発現量を相対的に比較した。その結果、インスリンは濃度依存的に糖輸送体(GLUts、SGLT1)や味細胞マーカー(T1R3、Gustducin等)mRNA発現量を増加させた。この結果は、インスリンシグナルが、味細胞の分化/増殖に関わっていることを強く示唆する。今後は、マウス味細胞より樹立した幹細胞培養系オルガノイドを当教室でも立ち上げる。

その後、オルガノイドに様々なな消化管ホルモン(インスリンやGIP)を作用させ、糖輸送体(GLUT2, GLUT4, GLUT8, GLUT9B, SGLT1)や味覚関連因子、特に甘味受容に関わる分子(T1R3やgustducin等)に対する影響を、定量PCRで評価する実験を行っていく予定である。またこれに合わせて、マウス味細胞における糖輸送体発現と甘味応答特性、消化管ホルモン分泌を、甘味受容細胞を蛍光標識したマウス(T1R3-GFP, Gustducin-GFP)と、当研究が保有する単一味細胞応答解析(loose patch clamp technique)および分泌ホルモン回収技術を用いて探索していく。28年度が最終年度であるため、記入しない。生理学28年度が最終年度であるため、記入しない。