hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
聴覚障害者への相談支援における文化モデルアプローチの研究

研究計画のうち「ろうあ者相談員を対象とした量的調査」に関しては、当初はアンケート調査(郵送)による量的調査を計画していたが、別の調査方法に変更し継続中である。本研究は、聴覚障害者の「ろう文化」を基盤としたストレングス視点に基づく「文化モデルアプローチ」が、聴覚障害者への相談支援における支援モデルとして有効であることを実証し、且つ、理論化することを目的としている。4年間の研究計画の最終年度として、以下の研究を実施した。1.「ろう文化」に関する研究:初年度から継続して先行研究をレビューしているが、本年度は、本研究と同様に「ろう文化」を基盤とするアプローチをおこなっている先行研究の情報収集をおこなった。その中で「ろう文化」を理解することの重要性に関する先行研究として、1バイリンガル・バイカルチュラルによる早期介入2デフ・メンター3メンタルヘルス4カウンセリング領域での研究内容を紹介した。これらの研究は、聴覚障害者の独自のろう文化を重視することが、聴覚障害児の成長発達面においても、聴覚障害者のメンタル面においても重要であることが示されており、文化モデルアプローチが相談支援における支援モデルとして有効であることの根拠となった。2.聴覚障害者への相談支援をおこなっているソーシャルワーカーを対象にした質的調査:初年度から継続して3年間にわたりインタビュー調査を実施した。その結果について質的調査分析をおこない、研究論文としてまとめた。3.海外のろう文化や相談支援に関する調査:シンガポールで開催された「第5回世界ろう連盟(アジア会議)」に出席し、特にアジア地域のろう文化事情について情報収集をおこなった。4.文化モデルアプローチによる有効性の検証:聴覚障害者に関わっている専門職を対象に、文化モデルアプローチを導入することで、聴覚障害者をポジティブに捉えることができることを、ワークショップを通じて実証し、その結果を論文にまとめた。聴覚障害者の生活上の諸問題に関わる相談支援(聴覚障害ソーシャルワーク)において、マイノリティである聴覚障害者をポジティブに且つストレングス視点で介入するには、ろう文化視点を基盤とした「文化モデルアプローチ」が有効であることを実証するために調査研究をおこなった。具体的な研究成果は、以下の3点である。1.聴覚障害者の独自の文化であるろう文化の理論的構築と、ろう文化視点に基づく文化モデルアプローチの有効性2.文化モデルアプローチによる介入は、聴覚障害者へのストレングス視点が容易であること3.ネガティブに捉える傾向のある「聴覚障害者の特性」との相違と、文化モデルアプローチの理論的枠組みの生成研究期間は4年間であるが、2年目の「研究目的」の達成課題については、概ね予定通りに進んでいる。研究計画の「ろうあ者相談員を対象にした量的調査」に関してはまだ完了していないが、この研究課題は当初から3年目にも継続予定としている。
リン脂質代謝異常からみた糖尿病での白血球機能低下の解析

糖尿病における白血球の機能低下の機構を知るため、ストレプトゾドシンによって誘発した糖尿病ラットより好中球を調整し、種々なメディエーターの前駆体となるアラキドン酸の代謝の変動について検討した。その結果以下の点について明らかとなった。1)糖尿病誘発ラットの各臓器、白血球、血小板マクロファージ、いずれの細胞において、リン脂質中のアラキドン酸の減少がみられた。2)A23187で活性化した好中球のリン脂質から放出される遊離アラキドン酸量を測定したところ、糖尿病ラット好中球では遊離アラキドン酸は正常に比較して著しく少なく、正常の約50%であった。3)アラキドン酸より生成するリボキシゲナーゼ産物であるロイコトリエンB4、また5-HETEの産生も糖尿病では有意に減少していた。4)A23187による好中球の凝集を調べたところ、正常に比較して糖尿病ラット好中球では明らかに低下していた。好中球の凝集はアラキドン酸,LSB4でも惹起された。アラキドン酸による白血球の凝集能は正常、糖尿病で違いは見られなかったことから、凝集能の低下は遊離アラキドン酸生成の減少による事が明らかとなった。これらの結果より、糖尿病ラット好中球ではアラキドン酸が減少しており、このアラキドン酸の減少がLTB4などのメディエーター産生の低下させ、さらに凝集などの白血球の機能低下を引き起こすことが明らかとなった。本年度においては、ストレプトゾドシン(STZ)によって誘発した糖尿病ラットを用いて、各組織、細胞でのリン脂質、脂肪酸組成の変動について検討した。糖尿病誘発後、8週間のラット肝臓、腎臓、心臓、脳、脾臓、血小板、赤血球、マクロファージ、好中球の脂質組成を調べたところ、いずれにおいてもリン脂質組成に有意な変化は認められなかった。しかし、脳を除いた、組織、細胞においてはリン脂質の脂肪酸組成に大きな変化がみられ、共通した変化として、リノール酸の増加、アラキドン酸の減少がみられた。特に、心臓のコリン型リン脂質(CGP)のアラキドン酸の減少が著しく、正常の約50%であった。糖尿病でのCGPからのアラキドン酸の減少の経時変化を調べたところ、肝臓が糖尿病誘発1週間で有意なアラキドン酸の減少がみられ、続いて、心臓、腎臓では2週間で減少がみられた。好中球、アクロファージでは4週では変化はみられなかったが、8週間で著しいアラキドン酸の減少がみられ、免疫担当細胞での変化は他の組織に比較して遅いものであった。糖尿病誘発8週のラット好中球リン脂質のアラキドン酸の減少はCGPで45%であり、イノシトール型リン脂質(IGP)では25%であった。好中球をA23187で活性化し、リン脂質より遊離されるアラキドン酸量を螢光HPLCで測定した。活性化好中球では遊離アラキドン酸のみが生成し、他の遊離脂肪酸の蓄積がみられないことから、リン脂質より選択的にアラキドン酸を放出する経路が存在することが分かった。糖尿病との比較を行うと、正常の好中球ではA23187により1.3nmole/10^7cellsの遊離アラキドン酸が生成したが、糖尿病の好中球では0.7nmole/10^7cellsと著しく減少していた。これらの結果より、糖尿病ラットの好中球ではアラキドン酸代謝に異常が生じ、好中球の機能発現に深く関わるアラキドン酸の生成が強く抑制されていることが明かとなった。昨年度において、ストレプトゾドシンによって誘発した糖尿病ラットの好中球ではアラキドン酸が減少しており、A23187により活性化されたとき、リン脂質よりのアラキドン酸の遊離は著しく抑制されていることを明らかにした。本年度は糖尿病ラット好中球の遊離アラキドン酸の生成の抑制が機能に及ぼす影響について検討した。

糖尿病ラットの好中球における、リボキシナーゼ産物であるロイコトリエンB4(LTB4)および5-ヒドロキシエイコサテトラエン(5-HETE)生成の変動の有無について検討したところ、糖尿病ラットの好中球ではLTB4、5-HETEの生成量は正常に比較して、有意に減少していた。糖尿病、正常ラット好中球のリボキシゲナーゼの活性には違いが見られなかったことから、LTB4,5-HETEの産生の減少はそれらの前駆体である遊離アラキドン酸の供給の低下によるものと考えられた。A23187による好中球の凝集を調べたところ、正常に比較して糖尿病ラット好中球では明らかに低下していた。好中球の凝集はアラキドン酸,LTB4でも惹起され、またA23187による凝集はリボキシゲナーゼ阻害剤で抑制されることから、活性化された好中球の凝集は同時に生成したLTB4により引き起こされることが明らかとなった。また、アラキドン酸による白血球の凝集能は正常、糖尿病で違いは見られなかった。これらの結果は糖尿病ラット好中球の凝集の低下は活性化とともに生成された遊離アラキドン酸、さらにLTB4などのメディエーター産生の低下によるものと考えられた。
ニコチン刺激下にて各種インプラント表面性状が破骨細胞に与える影響

ニコチン刺激下のもと破骨前駆細胞(RAW264.7)の分化過程をTRAP染色し,13の基質においてTRAP陽性反応の巨細胞を確認した.また培養7日後に細胞の表面形態を走査形電子顕微鏡(SEM)にて細胞を観察した結果,細胞の配列はgrooveと平行方向に楕円形を呈したものが多く,ニコチンによる影響は顕著に認めなかった.さらに各基質上の細胞でのfocal contactの形成への影響を検索するために培養7日目にproline-rich tyrosine kinase 2(Pyk2) mRNAの発現を定量的RT-PCR法で行ったが,これもニコチンの濃度による影響は顕著に認めなかった.ニコチン刺激下のもと破骨前駆細胞(RAW264.7)の分化過程をTRAP染色し,13の基質においてTRAP陽性反応の巨細胞を確認した.また培養7日後に細胞の表面形態を走査形電子顕微鏡(SEM)にて細胞を観察した結果,細胞の配列はgrooveと平行方向に楕円形を呈したものが多く,ニコチンによる影響は顕著に認めなかった.さらに各基質上の細胞でのfocal contactの形成への影響を検索するために培養7日目にproline-rich tyrosine kinase 2(Pyk2) mRNAの発現を定量的RT-PCR法で行ったが,これもニコチンの濃度による影響は顕著に認めなかった.1.新たな培養基質の作製破骨細胞の培養に用いる基質を新たに2種作製し、検討することにした。基質の作製は、Dr.Brunetteらの方法に従い、従来型のブラストエッチング処理(SLA)に対して、サイズの異なるMicro-Gapを有するBox型のチタンレプリカを作製し、それぞれ電子顕微鏡で観察した。これらの基質のほうが研究計画で記した基質と比較してもMicro-Gapを有するBox型を連続させて配列させているため、破骨細胞の動態に有意な差を認めると考えた。なお、コントロールには滑沢(smooth)なチタンレプリカを用いた。2.細胞培養と培養条件の検討細胞培養はマウスマクロファージ様破骨前駆細胞(RAW264.7)を10%FBS、D-MEMを用いて100mmのスタンダードディッシュ中に播種した。その後、増殖した細胞を回収し、10%FBS、α-MEMを用いて6ウェルマルチプレートに1穴あたり1×104個の細胞密度で播種し、50ng/mlリコンビナントマウスRANKL蛋白(rmRANKL)、M-CSF50ng/mlの存在下において5日間培養し、破骨前駆細胞に分化、促進させた。現在は破骨細胞に成熟したことを確認するためにコントロール基質におけるTRAP染色を実施し、成熟の程度を観察している。H25は破骨細胞の培養に用いた基質はコントロールには滑沢なsmooth基質とし、他に各種のGroove基質を用いた。1不規則で粗い溝が一定方向に付与された深さ0.2-0.4μmのmicro-achieved(micro) 21μmの溝、2μmのridge、深さ1.5μm(narrow)32μmの溝、4μmのridge、深さ1.5μm(wide)の3種類とした。これらに細胞動態に有意な差を与えるために2種類の基質をブリティッシュコロンビア大学のDr.Brunetteらの方法に従い、4ブラストエッチング処理(SLA)5Micro-Gapを有するBox型(micro-box)を対象とし、研究計画に追加した。細胞の培養条件は破骨前駆細胞(RAW264.7)を10%FBS、1%ペニシリンとストレプトマイシン添加のD-MEM培地で100mmのディッシュに4×105個を播種した。細胞増殖後に1×104個を6ウェルプレートに播種し、50ng/mlのrmRANKL、50ng/mlのM-CSFの存在下で7日間培養し、破骨細胞に分化、促進させた。なおニコチン濃度は培養上清に(0、10-5、10-4、10-3M)で添加、刺激した。破骨細胞分化の確認はTRAP染色し、光学顕微鏡で観察した。各種ニコチン濃度において13の基質において紫色の多核を有するTRAP陽性反応の巨細胞を確認した。H26は細胞の表面形態、微細構造を観察するために培養から5日、7日後に走査形電子顕微鏡(SEM)にて各基質上の細胞を観察、撮影した。各種ニコチン濃度における13のGroove基質上では細胞の配列はgrooveと平行方向に楕円形を呈したものが多く,ニコチンの濃度による影響は見受けられなかった。なお細胞周辺部のfilopodiaはsmooth基質上の細胞に比べて多い傾向にあった。さらにSmooth基質と13のgroove基質上の細胞でのfocal contactの形成への影響を検索するためにproline-rich tyrosine kinase 2(Pyk2)のmRNAの発現を定量的RT-PCR法を培養7日目に行ったが、これもニコチンの濃度による影響は見受けられなかった。4と5の基質の検討は今後の検討課題とした。口腔インプラント破骨細胞に分化、促進に適切なRANKL、M-CSFの濃度と培養条件の検討は概ね良好であるが、さらに安定した培養条件の獲得のためにまだ検討する余地があるため、今年度内の研究予定より遅れている。ニコチン刺激下における破骨細胞の培養条件の確立を得ることでほぼ実験は軌道に乗ると考えられる。よってこの部分のおける実験遂行を最優先に進める。また培養条件が安定しないようであればRANKL、M-

CSF試薬がキット化されている破骨前駆細胞の使用も検討する。次年度は研究に用いる試薬がQーPCR、それに伴うPCRプライマーの作製、またSEMなどの高価な試薬を消耗する予定のため、次年度使用額が生じると考えられる。研究の消耗試薬のなかでも高価なQーPCRの試薬、共焦点レーザー顕微鏡の際に用いる1次、2次抗体の購入を優先的に検討する。
プロテインホスファターゼＰＰ２Ａによる新たな骨芽細胞分化機構の解明

PP2Aは細胞の分化・増殖やアポトーシスに関与するセリン/スレオニンプロテインフォスファターゼである。PP2Aは触媒サブユニット(PP2A Cα)を中心に三量体を形成し、様々な蛋白質の脱リン酸化に関与する。本研究では骨芽細胞の分化や機能におけるPP2A Cαの役割について、主にPP2A Cα発現を特異的に抑制した骨芽細胞を樹立し解析を行った。PP2A Cαは、Osterixを含む骨関連因子の発現を介して骨形成および骨芽細胞の分化・石灰化能を調節する重要な因子であることが分かった。さらに、骨芽細胞のPP2A Cαは、破骨細胞分化誘導能に関与することが分かった。前年度に樹立したPP2A発現抑制骨芽細胞(shPP2A)を用いて以下のことを明らかにした。1.shPP2A細胞はコントロールの細胞に比べて、破骨細胞分化誘導に関わる因子sRANKL/OPG比が有意に低下していた。2.shPP2A細胞の培養上清で処理した骨髄由来マクロファージ細胞では、RANKLにより誘導される転写因子NFATc1の核内移行、破骨細胞マーカー因子の発現およびTRAP染色反応が抑制された。以上の結果、PP2Aは骨芽細胞の分化・石灰化能を調節するだけでなく、破骨細胞の分化を調節する重要な因子であることを報告した。骨は骨格運動系の中心であるだけでなく、カルシウム代謝調節器官であり、造血幹細胞の維持・血球系細胞の分化増殖を支える免疫組織でもある。つまり、骨の恒常性は局所の硬組織疾患だけでなく、全身の代謝・循環器疾患にも影響を与える重要な要素と考えられる。様々な細胞種における現象と同様、間葉系前駆細胞の分化・機能は蛋白質リン酸化酵素(プロテインキナーゼ)と蛋白質脱リン酸化酵素(プロテインホスファターゼ)による蛋白質のリン酸化・脱リン酸化により厳密にコントロールされている。PP2Aは真核生物において必須のセリン・スレオニンプロテインホスファターゼであり、細胞分裂、シグナル伝達や代謝などに必要な酵素である。骨芽細胞におけるプロテインホスファターゼの役割について骨に必須の転写調節因子との関連を中心に研究を行った。その結果、プロテインホスファターゼPP2AのCサブユニットαアイソフォーム(PP2A Cα)が、骨芽細胞の分化・石灰化能において重要な役割を担うことを見出し、論文報告した。さらに、骨芽細胞のPP2A Cαが破骨細胞の分化にどのような役割をもつか検討した。PP2A Cα発現を特異的に抑制した骨芽細胞(shPP2A)では、破骨細胞分化促進因子RANKLの発現が低下し、破骨細胞分化抑制因子OPGの発現が増加していた。破骨細胞前駆細胞であるRAW264.7をshPP2A細胞由来の細胞上清で処理したところ、破骨細胞分化に必須の転写調節因子NFATの核移行と活性が抑制された。さらに、破骨細胞分化マーカーであるCathepsin KとOSCARの発現も抑制された。shPP2A細胞由来の細胞上清で処理したRAW264.7をTRAP染色したところ、TRAP-positiveな多核の細胞の数はコントロールに比べて優位に減少した。これらの結果は、骨芽細胞のPP2A Cαが破骨細胞の分化に重要な役割をもつことを意味している。結果の一部を論文公表した。様々な細胞内外の現象と同様、骨芽細胞の分化は蛋白質リン酸化酵素(プロテインキナーゼ)によるリン酸化とプロテインホスファターゼによる脱リン酸化により厳密にコントロールされている。本研究は、骨芽細胞の分化と機能における蛋白質脱リン酸化酵素(プロテインホスファターゼ) PP2Aの役割を解明することである。本年度の研究の結果、以下のことを明らかにした。1. PP2A阻害剤による骨形成への影響マウス頭蓋冠部皮下にPP2A阻害剤であるオカダ酸(1 nM)を2週間連続投与しin vivo骨形成におけるPP2Aの役割を検討した。頭蓋冠を摘出し、マイクロCTを用いて骨量・骨密度の測定を行った。2.骨関連遺伝子の発現および石灰化能におけるPP2Aの役割in vitroで石灰化するマウス骨芽細胞MC3T3-E1細胞にPP2A特異的shRNA発現ウイルスを用いて、PP2Aの発現を恒常的に抑制する骨芽細胞を構築した。リアルタイムPCR、ウエスタンブロットやルシフェラーゼアッセイを用いて骨関連因子の発現や転写活性能について調べた。さらにALP染色およびvon Kossa・Alizarin red染色により骨芽細胞の分化・石灰化能を評価した。オカダ酸投与群ではコントロール群に比べて、骨量・骨密度の増加が認められた。また、骨添加量も有意に増加していた。PP2A

発現を抑制した骨芽細胞では、(1) Osterix, Bone sialoprotein, Osteocalcin等の骨分化マーカーの発現が増加した。(2) OsterixおよびRunx2のプロモーター活性が増加した。(3) ALP活性および石灰化能が亢進した。以上の研究から、PP2Aが骨芽細胞の分化を負に制御することで骨形成に重要な役割を持つ因子であることを解明し、結果の一部を論文公表した。交付申請書に記載した本年度の目的は、骨芽細胞におけるPP2A発現が破骨細胞分化に与える影響について調べることであった。具体的には、(1)マウス骨髄からの細胞の採取骨髄中には骨芽細胞と破骨細胞およびそれらの前駆細胞が存在し、互いに発生・分化に影響を与えている。この機構を調べるモデルとしてPP2A発現を抑制あるいは増加した骨芽細胞の培養上清と骨髄由来の血液系幹細胞を使って破骨細胞分化に与える影響について検討する。マウス長管骨より骨髄内の細胞を採取し、浮遊細胞を回収する。細胞をM-CSF処理してディッシュに定着した細胞を実験に用いる。(2)破骨細胞分化マーカーの発現の検討PP2A発現を抑制または増加した骨芽細胞から回収した培養上清を骨髄由来の細胞に作用させる。TRAP染色を用いて、破骨細胞分化に与える影響について評価する。同様に処理した血液系幹細胞からRNAを回収し、リアルタイムPCRで破骨細胞の分化マーカーであるカルシトニンレセプターやDC-STMPの発現を調べる。TRAP染色の結果と共に骨芽細胞のPP2A発現と活性が破骨細胞の分化に及ぼす影響について評価する。予想外の結果が出た場合はRANKL以外の因子や各種サイトカインによる影響についても調べて包括的に検討することであった。予定していた実験は全て行うことができた。研究結果を年度内に論文公表できたこと、次年度の課題である骨芽細胞のPP2Aと相互作用する因子について実験を開始していることから、「当初の計画以上に進展している。」とした。交付申請書に記載した本年度の目的は、1.骨形成に対するPP2Aの役割をin vivoにおいて調べる。(1)マウス頭蓋冠部へのPP2A阻害剤投与と(2)形成された頭蓋骨の骨量・骨密度の測定と評価2. PP2Aが骨関連遺伝子の発現および石灰化能に関与する機構について調べる。(1) PP2Aの発現・活性を増加した骨芽細胞の構築と(2)骨芽細胞分化マーカーの発現および石灰化能の評価予定していた実験は全て行うことができた。研究結果を年度内に論文公表できたこと、次年度の課題である骨芽細胞のPP2Aが破骨細胞分化に与える影響について実験を開始していることから、「当初の計画以上に進展している。」とした。本研究の目的は、骨芽細胞の分化と機能における蛋白質脱リン酸化酵素(プロテインホスファターゼ) PP2Aの役割を解明することである。今年度の研究計画は予定通り遂行できたので、次年度の研究推進方策に主な変更点はない。具体的には、-骨芽細胞においてPP2Aと相互作用する因子について解析する。Flagタグを融合したPP2A蛋白質(Flag-PP2A)を発現するレンチ
キネシンスーパーファミリーKIF4の細胞内における機能解析

キネシンスーパーファミリー(KIFs)に属するKIF4は、幼若期の組織において発現が高く、細胞内では主に核内に分布するモーター蛋白質である。これまでの結果より、KIF4はPoly-(ADP ribose) polymerase (PARP)の抑制因子であること、マウス小脳顆粒細胞においてPARPは神経活性依存的に活性化され、その活性化は神経活性依存的な生存誘導機構に重要な働きをもつこと、KIF4はPARP活性に対し抑制的な働きをすることで、同機構の制御を担っていること等が明らかとなっている。さらに去年度の研究結果より、PARPの神経活性依存的な活性化プロセスには、核内カルシウム浸透により誘導される、CAM kinaseIIによるPARPの燐酸化が関与し、この燐酸化は、これまでの解析結果より得られた、神経活性の上昇に誘導されるPARPのautomodificationと、それに伴うKIF4のPARPからの解離と核から神経突起への移行という一連の現象の最上流に位置するものであることが明らかとなった。また、発生初期での中枢神経系組織の構築におけるKIF4の機能について探るため、in utero electroporationによる大脳皮質神経細胞へのKIF4 deletion mutantの過剰発現を行った。その結果、PARP活性に対し抑制作用を持つheadless KIF4を発現させた神経細胞ではアポトーシスが誘導されたのに対し、PARP結合領域を欠失したtailless KIF4を発現させた場合では神経細胞の生存に影響がみられないことが確認された。これらのことから、発生段階におけるマウスの神経組織内において、KIF4/PARP複合体は、神経細胞の発生運命を制御している可能性が示唆された。本研究結果より、KIF4は核内酵素の一種として知られて入るPoly-(ADP ribose)polymerse(PARP)の抑制因子であることが明かとなった。またこのKIF4によるPARP活性抑制効果によって幼若期における神経活性依存的な神経細胞の淘汰機構を制御していることがES細胞のin vitroでの分化誘導により作製した中枢神経系の神経細胞を用いた種々の実験結果より明かとなった。さらに、神経細胞の脱分極化に伴いKIF4は核内より神経突起上に移行することが明らかとなったことから、神経活性依存的な生存機構を発動した神経細胞では,KIF4はPARPに対する抑制因子としての機能を失い何らかのcargoをanterogradeに輸送するモーター蛋白質として機能するようになる可能性が示唆された。次に、これらの現象がマウスの中枢神経系においても実際にみられるものであるか確認するため、小脳の顆粒細胞に着目し解析を行った。その結果、RNAi(RNA interference)法によりPARPをknock downした顆粒細胞あるいは、PARP阻害剤を投与した顆粒細胞では神経活性依存的な生存効果が抑制されることが確認された。また脱分極誘導後に、KIF4はPARP活性依存的に核より神経突起へ移行することも確認されたことから、発生段階における小脳において上述の細胞淘汰機構が存在することが示された。現在、以上の研究内容を雑誌cellに投稿し、reviewerに要求された幾つかの実験を行っているところである。
放射線耐性を持つ緩歩動物クマムシに関する研究

<研究目的>緩歩動物クマムシは、体長1mm以下の微生物で深海から陸上の苔の中まで様々な所に多様な種が分布している。その大きな特徴は乾燥状態になると、体を樽状に変化させ100年以上長生きしたり、高温、超低温、真空、高気圧やどんな放射線にも耐えうる能力を持つと言われている。水に入れると元の姿に戻って動きだす。「最強の生物」と言われるゆえんである。しかしこのクマムシの極限状態のストレス耐性について、今まであまり調査・研究がなされて来なかったのも事実であり、その真偽の方は定かではない。そこで本研究ではクマムシの放射線耐性の能力に着目して、γ線照射装置を使用してクマムシの放射線耐性能力について調査する。またその他の環境ストレスの耐性の実験を行い、極限状態でのクマムシの能力について調査・研究を行う。<研究方法>まず苔を採集して来てクマムシを探した。なかなかクマムシを発見できず大変だったが、大学内のハリガネゴケとギンゴケの中から、オニクマムシ・チョウメイムシの2種を見つける事が出来た。飼育を試みたが、困難を極め、2週間位で死んでしまうので、クマムシを見つけた苔の群落を一つの個体群として、そこからクマムシを供給して、以後の実験に使用した。クマムシを濾紙や寒天の上に乗せると乾燥状態になって体を縮め樽状に変化する。この状態のクマムシに放射線をはじめ様々な環境ストレスを与えて研究を進めた。<研究成果>γ線照射装置で樽状のクマムシに様々な強さのγ線を照射した結果、4,000Gyまで耐える事が分かった。人間の致死線量は5Gyである。またγ線照射後のクマムシは寿命が縮まる傾向がみられた。さすがのクマムシも高線量の放射線ではかなりのストレスを受けたと思われる。その他の実験では、電子レンジで3分間加熱、冷凍庫で一晩凍らせる、ドライアイスで冷やす、液体窒素に浸ける実験を行ったがいずれも樽状から元の姿に戻って元気に動き出した。研究成果としてまとめると、クマムシは4,000Gyの放射線に耐える事が出来る。長寿命と言われているが飼育は難しく飼育下では短命である。高温、超低温の環境に耐える。以上の事が解明出来た。今後はクマムシの飼育系を確立してクマムシの個体数を増やし、様々な実験を進めて行くつもりである。
ヘルス・プロモーティング・スクール国際版認証システムの構築

日本,シンガポール,韓国,台湾,香港等のヘルス・プロモーティング・スクール(以下HPSとする)の認証システムを調査し,その結果を基に,HPS認証プロセス(仮)を提案した。そして,幼稚園,小学校,中学校,特別支援学校各1校園全4校園に,健康的な学校づくりを実施しながら,仮に作成したHPS認証プロセスを用いて,実際に模擬認証を行った。その結果,実施した学校園,HPSメンバーから様々な意見と検討課題が上がり,その結果,最終的にHPS認証システムを開発した。ヘルス・プロモーティング・スクール(以下,HPSとする)は,ヘルスプロモーションの理念に基づいた「学校の児童・生徒,教職員,保護者,地域住民,専門家等が連携・協力のもと,身体,精神・心理,社会的健康な学校づくりを自ら行い続けることができる学校」(衛藤他2004改変)のことをいう。本研究では,HPSの推進のため,WHO/WPROが設置を目指しているHPS認証センター(優れた健康的な学校づくりを行っている学校をHPSとして認証する機関)の実現のため,世界的に用いることができる「HPS国際版認証システム(優れた健康的な学校づくりを行っている学校をHPSとして認証する基準,方法,プロセスなど)の構築」を目的とする。そのために,本研究では,今年度は、「1開発途上国のHPS状況調査、韓国並びにシンガポールの認証システムの調査を実施した。2日本については、健康推進学校等の表彰システム調査を実施した。3過去3年間の健康教育推進学校表彰校対象に、質問紙を用いた郵送調査を実施し、表彰校の実態を把握した。4認証システムにおける、重要な役割を担う、HPS評価票を改訂し、さらに、HPSプロセスモデルの開発を行った。5HPS評価票を用いた評価を附属学校(幼稚園、小学校、中学校、特別支援学校)を対象に施行した。具体的には、HPS調査票を用いて、各分掌の先生方に評価していただき、それをデータとして共有し、各学校においてグループ討議を行った。ヘルス・プロモーティング・スクール(以下、HPSとする)は、ヘルスプロモーションの理念に基づいた「学校の児童・生徒、教職員、保護者、地域住民、専門家等が連携・協力のもと、身体、精神・心理、社会的健康な学校づくりを自ら行い続けることができる学校」(衞藤他2004改変)のことをいう。本研究では、HPS推進のため、WHO/WPROが設置を目指しているHPS認証センター(優れた健康的な学校づくりを行っている学校をHPSとして認証する機関)の実現のため、世界的に用いることができる「HPS国際版認証システム(優れた健康的な学校づくりを行っている学校をHPSとして認証する基準、方法、プロセスなど)の構築」を目的とする。そのために、本研究では、今年度は、1タイ、韓国、台湾の認証システムの調査を実施した。2アジアの調査結果をもとにそれぞれの国の特徴、長所、短所等をまとめた。3日本については、健康推進学校等のインタビュー調査を実施した。5フィンランドにおいてコミュニティのHPSへの役割について現地調査を行った。そのために、本研究では、平成27年度は、(1)日本の学校を対象に、健康的な学校づくりを支援し、国際版HPS認証システム(原案)の改正のための試行(1年目)を実施した。(2)試行(1年目)を踏まえて、国際版認証システム【試行1年目・改正案】の開発を行った。(3)日本の学校を対象に、国際版認証システム【試行1年目・改正案】に対するインタビュー調査を実施した。(4)認証システムの意味、日本などに認証システムを導入するメリット・デメリット等についても、検討を行った。(5)開発途上国のHPS認証システムの開発途上国版HPS認証システムの検討を行った。学校を対象に、健康的な学校づくりを支援し、国際版HPS認証システム(原案)の改正のための試行(1年目)を実施するなど、おおむね順調に進んでいる。開発されたHPS認証プロセスの特徴は以下のとおりである。1.認証と表彰は分け,今回は,認証プロセスを明らかにした。2.審査期間:2年+@が望ましい。

日本を例にとると,申請は前年度の3月までに行い,1年間健康的な学校づくりの取り組みを行い,年度末の中間評価を経て,次の2年目の実践を行う。2年目の10か月目に最終審査とHPS認証希望の申請を行い,最終審査を得て,HPSと認証される。3.認証側からのアドバイスやサポートが受けられる。しかしながら,今後,実現化する場合,HPS認証希望校が多くなった時にコスト等の問題も生じる。4.HPS認証希望校どうしの情報交換・発表会を実施する。5.学校自らが自校を分析できるHPS自己評価チェックシートは、健康的な学校づくりの留意点が明確になる。しかしながら,本HPS認証プロセスは日本でしか試行していないため,今後,諸外国で用いて,さらに検討を行う必要がある。また,幼児教育においての,ヘルス・プロモーティング・スクールは,シンガポールや香港でも重要視され,認証を行っている。特別支援学校は,さらに検討される必要がある。日本,シンガポール,韓国,台湾,香港等のヘルス・プロモーティング・スクール(以下HPSとする)の認証システムを調査し,その結果を基に,HPS認証プロセス(仮)を提案した。そして,幼稚園,小学校,中学校,特別支援学校各1校園全4校園に,健康的な学校づくりを実施しながら,仮に作成したHPS認証プロセスを用いて,実際に模擬認証を行った。その結果,実施した学校園,HPSメンバーから様々な意見と検討課題が上がり,その結果,最終的にHPS認証システムを開発した。海外のHPS認証システム調査は、先方の都合で実施できなかった国があったが、他はおおむね順調に進んでいる。(1)日本の学校を対象に健康的な学校づくりを支援し、国際版HPS認証システム(原案)の改正のための試行(2年目)を実施する。(2)試行(2年目)を踏まえて、国際版認証システム【改正案】の開発を行う。(3)日本の学校を対象に、国際版認証システム【改正案】に対するインタビュー調査を実施する。(4)台湾、韓国等を対象にHPS認証システム【改正案】に対する及び専門家インタビューを実施する。(5)発展途上国版HPS認証システムの開発を行う。(6)HPS国際版認証システム(優れた健康的な学校づくりを行っている学校をHPSとして認証する基準、方法、プロセスなど)【最終案】の開発を行う。*台湾については、台湾アジア大学黄稚文教授、韓国については、YONSEI大学の南銀祐教授、ソウルサイバー大学の金美珠教授と共同で行う。また連携研究者として元目白大学吉田由美、千葉大学看護学部山田響子、並びに千葉大学教育学部HPSプロジェクトの協力を仰いで行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。学校ヘルスプロモーション1)引き続き、開発途上国のHPS認証システムの実態把握と開発途上国版HPS認証システムの開発を行う。次に日本ならびに諸外国(シンガポール、香港、台湾、韓国等)の認証システム調査をもとに、2)国際版認証システム原案の作成、ならびに3)それらの改訂を行う。2)の国際版認証システム原案の作成については、具体的には、各国の専門家会議にて国際版認証システム原案の開発を行う。
冠動脈硬化病変の退縮をもたらす細胞内治療法の開発

1.ブタ大腿動脈のバルーン傷害後、同部ではRho-kinaseのmRNA発現および活性の亢進が生じることを認めた。また、adenovirusをvectorとした変異型Rho-kinaseの遺伝子導入により、バルーン傷害後の内膜肥厚が抑制されることを認めた。2.ブタ冠動脈を外膜側からMCP-1と酸化LDLで慢性に刺激すると、内膜肥厚・収縮性血管リモデリングを伴う冠動脈硬化病変が形成されることを認めた。このモデルでは、外膜に出現したマクロファージが経時的に内膜方向へ遊走し泡沫細胞化することを認めた。このモデルに、Rho-kinase阻害薬であるfasudilを経口投与したところ、動脈硬化病変の形成が著明に抑制された。また、Rho-kinase活性やマクロファージの遊走が抑制されていることを確認した。3.ブタ冠動脈を外膜側から代表的炎症性サイトカインであるIL-1βで慢性に刺激すると、同部に収縮性血管リモデリングと過収縮反応を伴う冠動脈硬化病変が形成される。このモデルにfasudilを経口投与したところ、興味深いことに、血管リモデリングが退縮し、冠動脈過収縮反応も消失した。この作用は、休薬後も引き続いて認められ、Rho-kinaseの長期抑制により、冠動脈硬化病変の形態的・機能的退縮が生じることが確認された。4.上記の現象をさらに確認する目的で、IL-1β治療部位に変異型Rho-kinaseを遺伝子導入したところ、やはり、同様に、冠動脈硬化病変の形態的・機能的退縮を認めた。上記のように、Rho-kinaseを長期間抑制することにより冠動脈硬化病変の退縮が惹起されることが示され、同分子が新たな動脈硬化治療の標的になりうる可能性が示された。1.代表的炎症性サイトカインであるインターロイキン-1β(IL-1β)をブタ冠動脈外膜側より慢性投与すると、同部に内膜肥厚・血管リモデリング(血管断面積の減少)を伴う冠動脈硬化病変が惹起され、また冠攣縮性反応も生じることを明らかにした。2.上記の炎症性冠動脈病変では、低分子量G蛋白Rhoおよびその標的蛋白であるRho-kinaseの発現が増加していた。RhoおよびRho-kinaseは血管平滑筋の収縮に関与するだけではなく、炎症細胞の接着・浸潤や他の遺伝子の発現にも関与している可能性が最近の研究で指摘されている。したがって、Rho・Rho-kinaseの発現の増加が血管平滑筋の過収縮だけではなく、動脈硬化病変の形成・維持にも重要な関与をしていると考えた。3.我々は、我が国で開発された蛋白リン酸化酵素阻害薬であるfasudilが生体内で代謝されて生じるhydroxyfasudil(HF)が選択的Rho-kinase阻害作用を有することを見い出した。実際にHFの前投与は、IL-1β投与部位において生じるセロトニン誘発性冠攣縮を用量依存性に抑制した。4.選択的Rho-kinase阻害薬であるHFの長期投与が冠動脈硬化病変の退縮を惹起するか否か、検討した。IL-1β投与2週間後、冠動脈造影にて動脈硬化病変の出現を確認した後、動物(ブタ)を無作為に2群に分け、一群にはHFを慢性投与し、他の一群は対照群とした。8週間後、HFの投与を中止しさらに1週間の休薬期間後に冠動脈造影および組織学的検討を行ったところ、HF群では冠動脈硬化病変の著明な退縮を認めた。

1.代表的炎症性サイトカインであるインターロイキン-1β(IL-1β)をブタ冠動脈外膜側より慢性投ると、同部に内膜肥厚・血管リモデリング(血管断面積の減少)を伴う冠動脈硬化病変が惹起され、また冠攣縮性反応も生じることを明らかにした。2.上記の炎症性冠動脈病変では、低分子量G蛋白Rhoおよびその標的蛋白であるRhoーkinase発現が増加していた。RhoおよびRho-kinaseは血管平滑筋の収縮に関与するだけではなく、炎症細胞の接着・浸潤や他の遺伝子の発現にも関与している可能性が最近の研究で指摘されている。したがって、Rho・Rhoーkinaseの発現の増加が血管平滑筋の過収縮だけではなく、動脈硬化病変の形成・維持にも重要な関与をしていると考えた。3.我々は、我が国で開発された蛋白リン酸化酵素阻害薬であるfas udilが生体内で代謝されて生じるhydroxyfasudil(HF)が選抜的Rhoーkinase阻害作用を有することを見い出した。実際にHFの前投与は、IL-1β投与部位において生じるセロトニン誘発性冠攣縮を用量依存性に抑制した。4.選択的Rhoーkinase阻害薬であるHFの長期投与が冠動脈硬化病変の退縮を惹起するか否か、検討した。IL-1β投与2週間後、冠動脈造影にて動脈硬化病変の出現を確認した後、動物(ブタ)を無作為に2群に分け、一群にはHFを慢性投与し、他の一群は対照群とした。8週間後、HFの投与を中止しさらに1週間の休薬期間後に冠動脈造影および組織学的検討を行ったところ、HF群では冠動脈硬化病変の著明な退縮を認めた。5.Dominant hegativeRho-kinaseをadenovirusをベクターとしてブタ動脈に生体内で遺伝子導入を行うと、バルーン傷害後の内膜肥厚やIL-1βモデルにおける病的血管リモデリングが著明に抑制されることを見い出した。1.ブタ大腿動脈のバルーン傷害後、同部ではRho-kinaseのmRNA発現および活性の亢進が生じることを認めた。また、adenovirusをvectorとした変異型Rho-kinaseの遺伝子導入により、バルーン傷害後の内膜肥厚が抑制されることを認めた。2.ブタ冠動脈を外膜側からMCP-1と酸化LDLで慢性に刺激すると、内膜肥厚・収縮性血管リモデリングを伴う冠動脈硬化病変が形成されることを認めた。このモデルでは、外膜に出現したマクロファージが経時的に内膜方向へ遊走し泡沫細胞化することを認めた。このモデルに、Rho-kinase阻害薬であるfasudilを経口投与したところ、動脈硬化病変の形成が著明に抑制された。また、Rho-kinase活性やマクロファージの遊走が抑制されていることを確認した。3.ブタ冠動脈を外膜側から代表的炎症性サイトカインであるIL-1βで慢性に刺激すると、同部に収縮性血管リモデリングと過収縮反応を伴う冠動脈硬化病変が形成される。このモデルにfasudilを経口投与したところ、興味深いことに、血管リモデリングが退縮し、冠動脈過収縮反応も消失した。この作用は、休薬後も引き続いて認められ、Rho-kinaseの長期抑制により、冠動脈硬化病変の形態的・機能的退縮が生じることが確認された。4.上記の現象をさらに確認する目的で、IL-1β治療部位に変異型Rho-kinaseを遺伝子導入したところ、やはり、同様に、冠動脈硬化病変の形態的・機能的退縮を認めた。上記のように、Rho-kinaseを長期間抑制することにより冠動脈硬化病変の退縮が惹起されることが示され、同分子が新たな動脈硬化治療の標的になりうる可能性が示された。
化合物半導体MIS界面準位に関するピンニング・スポット面内分布モデル

本研究の目的は、III-V化合物半導体metal-insulator-semiconductor(MIS)構造の界面準位分布に関する「ピンニング・スポット面内分布(Dps)モデル」を、理論解析とSi超薄膜界面層(Si ICL)構造を用いた実験により定量的に検証することにあり、次の成果を得た。(重)従来界面準位は、面内で均一分布すると仮定されてきた。DSPモデルでは、界面準位分布は面内でナノスケール尺度の不均一性をもち、強いフェルミ準位ピンニングを引き起こすスポット状の領域「ピンニング・スポット」と、ピンニングが弱くバイアスにより電子蓄積層や反転電子層が形成され得るピンニング・フリー領域が共存すると考える。このモデルから期待されるMISアドミタンスのバイアス・周波数・温度依存性を定式化し、コンピュータを用い数値計算を行った。(2)化合物半導体およびsi ICLをMBE成長し、そのsi ICL一部をラジカル窒化したGaAsおよびInGaAsのSi ICL制御MIS試料を作製し、そのアドミタンスのバイアス・周波数・温度依存性を測定した。(3)SiICLMIs試料について、バンド端フォトルミネセンス(PL)量子効率の励起光強度依存性を非接触測定し、その結果をポーランド・シレジアン工科大学物理学科のアダモヴィッチ教授の協力を得てコンピュータ解析し、マクロな界面準位密度(D_<it>)分布を決定した。(4)C-V法とPL法によるマクロなD_<it>分布がよく一致する一方、MISアドミタンスのバイアス・周波数・温度依存性は、通常のSi Mos理論では全く説明できず、DPSモデルではじめて定量的に説明可能であることを見出した。(5)MBE成長III-V表面やSi成長表面の走査プローブSTM/STS測定も、試料のナノスケールでのDitの面内不均一分布を直接的に示した。(6)GaAsでは、ピンニング・スポット発生を最小化するSi ICLのMBE成長最適膜厚は、5-6monolayer(ML)であるが、スポット発生は完全には抑制できない。一方、InGaAsでは、5-6MLのSiICLにより、スポットがほぼ完全に除去できることが判明した。この差異は電荷中性準位の位置の違いで説明できる。
リウマチ患者の生活の質向上を目指したオーダーメード薬物療法の開発

慢性疾患である関節リウマチ(RA)は、完治することは困難であり、生涯にわたって治療を必要とすることが多い。進行したRAでは関節の可動性が失われ、特に高齢患者においては寝たきりとなることも少なくない。RA患者のQOLを向上させるためには、罹病早期から適切な治療を行い、RAの進行を遅らせることが重要である。Methotrexate(MTX)は優れた抗RA薬として広くRA患者に用いられてきたが、副作用を否定できない死亡例も報告されている。また、MTXは薬効や副作用の発現において個人差が大きな薬物の一つである。また、本研究では、RAにおける新たな疾患活動性マーカーとして、血中ホモシステインに着目して、RA患者において解析を行った。CRP、ESR、MMP-3等のRAマーカーの値が上昇するにつれて血中ホモシステイン値も高値を示した。また、RA患者における血中ホモシステイン値は、葉酸代謝系酵素であるmethylenetetrahydrofolate reductaseをコードするMTHFR遺伝子の多型により異なることが明らかとなった。Methotrexate (MTX)は優れた抗RA薬として広くRA患者に用いられてきたが、副作用を否定できない死亡例も報告されている。平成21年度は、前年度に引き続き、MTXの抗炎症効果の指標としてCRPに対する葉酸代謝系タンパクの遺伝子の一塩基多型(SNPs)を含む生体内因子の影響を評価した。RFC 80AA遺伝子型とGCH-401Tアレルを持つ患者ではGGH-401Tアレルを持たない患者より、MTXへの反応が減弱していることを明らかにした。また、MTXの標的分子であるDHFRをコードする遺伝子のイントロン1に存在する19 bp deletionの多型が日本人では、他の民族と比較して、deletion型が多いことを明らかにした。この19 bpの配列には転写因子Sp1の結合部位が含まれており、deletion型ではDHFRの発現が低下していることが報告されている。今回得られた結果は、日本人RA患者においてMTXの薬効・副作用を予測する上で、重要な情報となることが考えられる。
「MR拡散テンソル画像による多系統萎縮症の白質線維の評価」

<目的>拡散テンソル画像は、水分子の拡散を3次元的に評価することにより白質線維の線維密度を非侵襲的に評価しうる新しい方法である。拡散テンソルにおける異方向性anisotropyを定量的に計測する指標としてfractional anisotropy(FA)がある。今回、多系統萎縮症(MSA)において、小脳遠心系および求心系線維のFA値を評価することによって、萎縮などの形態変化をきたす前に白質線維変性の評価ができないか検討した。<方法>MSAと診断された患者11人とage-matchさせたコントロール群10人を対象としてMR拡散テンソル画像を撮像し、小脳求心系線維(中・下小脳脚)と小脳遠心系線維(上小脳脚)、脳梁にROIをおいてFA値を測定した。また、協調運動スコアであるICARSを用いて臨床症状の重症度を評価し、FA値との相関関係について解析した。<結果>解析対象は、多系統萎縮症11名、疾患コントロール10名である。1.MSAにおけるFA値:MSA群のFA値は、下小脳脚0.696、中小脳脚0.648、上小脳脚0.868、脳梁0.868であった。コントロール群のFA値と比較すると、下小脳脚・中小脳脚で有意にFA値が低く、その一方で上小脳脚や脳梁のFA値は両群間に差を認めなかった。2.MSAにおける中小脳脚/脳梁比とICARSとの相関:ICARSスコアを横軸に、中小脳脚/脳梁FA値の比を縦軸にとってプロットしたところ、ICARSと中小脳脚FA比との間には、負の相関が見られた。<考察>多系統萎縮症で病理変化の見られる中小脳脚や下小脳脚でFA値の有意な低下を認めたことより、FA値が白質線維密度を反映している可能性が示唆された。また、中小脳脚のFA値が臨床的な失調スコアと負の相関を示したことより、FA値を測定によって白質線維の病理変化を評価できる可能性が示された。以上の研究成果について2003年神経学会総会で発表した。現在、この研究成果について論文投稿中である。また、拡散テンソルに関連した研究として、共著論文2編を論文発表した。拡散テンソルにおける異方向性anisotropyを定量的に計測する指標としてfractional anisotropy (FA)がある。<方法>MSAと診断された患者9人にMR拡散テンソル画像を撮像し、小脳求心系線維(中・下小脳脚)と小脳遠心系線維(上小脳脚)、脳梁にROIをおいてFA値を測定した。<結果>解析対象は、多系統萎縮症9名、疾患コントロール5名(SDAT5名)である。1.MSAにおけるFA値:MSA群のFA値は、下小脳脚0.722、中小脳脚0.673、上小脳脚0.866、脳梁0.859であった。疾患コントロール群のFA値と比較すると、下小脳脚・中小脳脚で有意にFA値が低く、その一方で上小脳脚や脳梁のFA値は両群間に差を認めなかった。

コントロール群のFA値と比較すると、下小脳脚・中小脳脚で有意にFA値が低く、その一方で上小脳脚や脳梁のFA値は両群間に差を認めなかった。2.MSAにおける中小脳脚/脳梁比とICARSとの相関:ICARSスコアを横軸に、中小脳脚/脳梁FA値の比を縦軸にとってプロットしたところ、ICARSと中小脳脚FA比との間には、負の相関が見られた。<考察>多系統萎縮症で病理変化の見られる中小脳脚や下小脳脚でFA値の有意な低下を認めたことより、FA値が白質線維密度を反映している可能性が示唆された。また、中小脳脚のFA値が臨床的な失調スコアと負の相関を示したことより、FA値を測定によって白質線維の病理変化を評価できる可能性が示された。以上の研究成果について2003年神経学会総会で発表した。現在、この研究成果について論文投稿中である。また、拡散テンソルに関連した研究として、共著論文2編を論文発表した。
海洋性マンガンクラスト上の微生物生態系の解析

本年度は昨年度に採取したマンガンクラストおよび堆積物、海水の微生物群集の16S rRNA遺伝子による解析を行ない、これまでの解析結果をまとめる作業を行なった。その結果、マンガンクラスト、堆積物の微生物群集は海水の微生物群集とは種の組成、微生物細胞数どちらにおいても大きく異なるということがわかった。一方、マンガンクラストと堆積物では種の組成に大きな違いは見られず、また微生物細胞数においてもマンガンクラストの方が1桁程度少ないということがわかった。これはマンガンクラストと堆積物が接しており、似た環境となり結果として似た微生物群集が形成されたと考えられる。またマンガンクラストの微生物群集同士を比較したが、水深あるいは海域ごとの微生物群集の分布の傾向はみられなかった。マンガンクラストから検出された微生物に着目すると、その検出比率の多くを占めているのはMarine Group Iに属するクローンであった。またNitrosospira属(Betaproteobacteria)に属するクローンも多くのマンガンクラストから検出された。これらの系統はアンモニア酸化菌を含むグループであること、また独立栄養性の培養株を含むことから、これらの系統群がマンガンクラストの微生物群集において一次生産者としての役割を担っていると考えられる。またマンガンクラストから検出された微生物のうち既知のマンガン、鉄酸化菌に近縁な系統群はなかった。その一方で、Bacillusの1株であるBacillus sp. SG-1に近縁なクローンが検出された。このBacillus sp. SG-1の胞子にはマンガン酸化活性があることが知られているため、この微生物細胞がマンガンクラスト形成初期の核としての役割を担っている可能性がある。現在、これらの研究成果をまとめ、原著論文として投稿準備中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。1.研究の背景、目的についてマンガンクラストは鉄とマンガンの酸化物を主成分とする鉱物である。マンガンクラストがコバルト、プラチナなどのレアメタル、レアアースを含むこと、日本の排他的経済水域中に広範囲に存在していることが知られている。しかしマンガンクラストの形成機構などはわかっていない。私たちは、マンガンクラストの形成に微生物(例えば鉄酸化細菌やマンガン酸化細菌)などが関わっていると考えている。またマンガンクラストの海底面での膨大な広がりから、マンガンクラスト上に存在する微生物は物質循環に大きな影響を与えていると考えている。本研究の目的は、マンガンクラスト表面の微生物生態系を明らかにし、マンガンクラスト形成と微生物との関係、そしてマンガンクラスト表面に存在する微生物の物質循環への影響を見積もることである。2.研究の具体的内容、結果について本研究では、拓洋第5海山と流星海山から採取したマンガンクラストおよび周辺堆積物、海水試料を用いた。それぞれのサンプルからDNAを抽出し、16SrRNA遺伝子を対象としたPCRを行い、クローンライブラリーを作成した。シークエンシングにより塩基配列決定を行い、この情報を元に分子系統学的な解析、統計学的解析を行い、どのような微生物生態系であるかを決定した。また定量PCRを用いて、微生物存在量の推定を行った。その結果、マンガンクラストと海水とでは共通している種がほとんどなかった。その一方堆積物と比較すると、マンガンクラストから検出された種のうち23割程度が堆積物と共通した種であった。また主座標分析の結果、マンガンクラストと堆積物とでは微生物生態系が異なっていること、またマンガンクラストは海山ごとに微生物生態系が異なる可能性が示唆された。そのため将来的に資源として開発することが期待されている。本研究の目的は、マンガンクラスト表面の微生物生態系を明らかにし、マンガンクラスト形成と微生物との関係について明らかにすることである。2.研究の具体的内容、結果について本研究では、拓洋第5海山と流星海山、大東海嶺、小笠原海台から採取したマンガンクラストおよび周辺堆積物、海水試料を用いた。それぞれのサンプルからDNAを抽出し、16S rRNA遺伝子を対象としたPCRを行い、クローンライブラリーを作成した。

その結果、マンガンクラスト、堆積物の微生物群集は海水の微生物群集とは種の組成、微生物細胞数どちらにおいても大きく異なるということがわかった。一方、マンガンクラストと堆積物では種の組成に大きな違いは見られず、また微生物細胞数においてもマンガンクラストの方が1桁程度少ないということがわかった。これはマンガンクラストと堆積物が接しており、似た環境となり結果として似た微生物群集が形成されたと考えられる。またマンガンクラストの微生物群集同士を比較したが、水深あるいは海域ごとの微生物群集の分布の傾向はみられなかった。マンガンクラストから検出された微生物に着目すると、その検出比率の多くを占めているのはMarine Group Iに属するクローンであった。またNitrosospira属(Betaproteobacteria)に属するクローンも多くのマンガンクラストから検出された。これらの系統はアンモニア酸化菌を含むグループであること、また独立栄養性の培養株を含むことから、これらの系統群がマンガンクラストの微生物群集において一次生産者としての役割を担っていると考えられる。またマンガンクラストから検出された微生物のうち既知のマンガン、鉄酸化菌に近縁な系統群はなかった。その一方で、Bacillusの1株であるBacillus sp. SG-1に近縁なクローンが検出された。このBacillus sp. SG-1の胞子にはマンガン酸化活性があることが知られているため、この微生物細胞がマンガンクラスト形成初期の核としての役割を担っている可能性がある。現在、これらの研究成果をまとめ、原著論文として投稿準備中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画では、昨年度中に採取したサンプルの16SrRNA遺伝子のクローンライブラリー解析を終える予定であったが、解析を終えることができなかった。9月10月、12月に3つの航海に参加したため、思うように実験することが出来なかったが、言い換えるなら、新鮮で新しいサンプルを多く得ることができた。そのため、計画に大きな遅延があるとは考えられないため、おおむね順調に進展している、とした。2度の航海(NT13-05, NT13-13航海)に参加した。昨年度はそれらの航海で採取したサンフルの解析に取り組んだ。以前のデータと併せて分子系統学的解析を行なったところ、マンガンクラストと海水それぞれの微生物群集の違いについての知見が得られた。また微生物群集の多様性と環境因子との関連についても知見が得られた。今後の研究の方針としては、採取したマンガンクラストの遺伝子解析および微生物培養に取り組む。マンガン酸化菌の培養に昨年度は取り組んだが、成功しなかった。培養条件の検討およびマンガン酸化遺伝子を用いての遺伝子解析を行う。またアンモニア酸化菌の培養、単離にも取り組んでいるが、こちらも成功していないため、条件検討を行なうと共に、バッチ培養ではなく、フロー系での培養装置を自作し、培養に取り組みたい。