hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水中分子変換を実現する高分子担持銅触媒の創製

「地球資源の有効活用」,「環境調和」を共に満たした次世代分子変換プロセスの確立を目指し,両親媒性ポリスチレン-ポリエチレングリコール共重合(PS-PEG)レジンに担持した不均一系銅錯体触媒の創製および,得られたポリマー担持触媒を用いた一連の有機分子変換反応(水中反応・不斉反応など)について詳細に検討を加えた。近年、社会要請が高まるグリーンケミストリーおよびアトムエコノミーの観点から地球資源の有効活用および環境調和の案件を満たす次世代環境調和型遷移金属触媒反応システムの確立が急務とされている。本研究課題では、上記案件を共に満たす水中有機分子変換反応を実現する高分子担持銅触媒の創製を目指し、研究を展開している。本年度において得られた成果を以下に示す。(1)3座配位子であるトリアザシクロノナン配位子を担持した両親媒性ポリスチレン-ポリエチレングリコール(PS-PEG)レジンおよびその銅錯体の合成およびそのキャラクタリゼーションを行った(2)得られたPS-PEGレジン担持トリアザシクロノナン-銅錯体を触媒とする水中における各種カップリング反応(アリルボロン酸とイミダゾール類およびアリルハライドとアンモニアなどのカップリング)を実施した。その結果として、空気存在下、担持トリアザシクロノナン銅(II)錯体はパラメチルフェニルボロン酸とイミダゾールの反応を効率良く触媒し、75%の収率でそのカップリング生成物を与えた。(3)銅触媒による水中不斉分子変換反応の実現を目指し、一連のアミノ酸由来の置換基を導入した不斉トリアザシクロノナン配位子の合成を行った。得られた配位子を用いて調製した銅錯体を用いた種々の不斉分子変換反応(不斉シクロプロパン化,不斉銅-カルベノイド挿入反応など)を実施し、その配位子の不斉導入能について検討・評価を行った。本研究課題では、上記案件を共に満たす水中有機分子変換反応を実現する高分子担持銅触媒の創製を目指し、これまで研究を展開してきた。本年度は、昨年度で達成した両親媒性ポリスチレン-ポリエチレングリコール(PS-PEG)レジン担持トリアザシクロノナン配位子の銅錯体の創製の知見に基づき、不斉有機分子変換反応を実現できる高分子担持銅触媒の創製を目指し、ポリマーへの固定化が期待できる不斉配位子の検索、その不斉銅錯体を用いた不斉有機分子変換反応について検討を行った。我々がこれまでに開発してきたキラルイミダゾインドールフォスフィン配位子と銅(I)イオンと作用させることにより銅(I)-キラルイミダゾインドールフォスフィン錯体を調製した。一連の反応条件スクリーニングにより、このキラル銅(I)錯体が、種々のフェノール誘導体とα-ジアゾカルボニル化合物との反応を効率良く触媒することを見出し、その反応の目的化合物であるフェノールO-H結合挿入化合物が最高67%収率、91% eeで得られた(Organic Letters 2012, 14, 194-197)。本研究成果により、キラルイミダゾインドールフォスフィン配位子が銅触媒による不斉有機分子変換反応に有効であることが明らかとなったので、高分子担持不斉銅触媒の創製を目指し、両親媒性ポリスチレン-ポリエチレングリコール(PS-PEG)レジン担持キラルイミダゾインドールフォスフィン配位子の合成を行った。現在は、その銅錯体の調製および、高分子担持銅触媒を用いた不斉有機分子変換反応の検索へと研究が発展している。
癌幹細胞の分子機構の解明と分子標的治療への展開

ヒトサンプルにおける癌幹細胞の存在を証明し、それを対象とする抗がん剤のスクリーニング法を確立した。ん幹細胞は、大腸がんではCD133陽性細胞と位置づけられているが、肝臓間質細胞(星細胞)存在下CD133陰性細胞から、CD133陽性細胞が誘導され、この細胞ががん幹細胞であることを示している。結果、非がん幹細胞からがん幹細胞への転換がおこうことを発見し、その過程を抑制する新規がん治療の方法を提案した。I.大腸癌幹細胞が本当に実体として存在するのか?実体として存在するが、誘導できることがわかった。(1)星細胞によってtumor initiationできた。(2)他の間質細胞では、できなかった。2)CD133+大腸癌細胞の癌幹細胞としての再現性(1)CD133+細胞では、tumor initiationし、CD133-細胞では、できなかった。(2)星細胞との共培養によって、CD133-細胞でコロニー形成能を誘導した。(3)CD133-細胞と星細胞の共培養にて、CD133+細胞が誘導された。II.癌幹細胞の分子標的治療は可能か?2)薬剤パネルを用いて、上記の実験で抑制効果を示す薬剤を選択した。AMD3100が選択された。3)podoplanin+間質細胞とpodoplanin-間質細胞をマイクロアレイ解析にて比較し、癌幹細胞誘導因子候補を抽出した。詳細はまだ明示しない。III.肝臓への転移モデルへの応用1)肝転移モデルの確立(1)HCT116大腸癌株を用いたモデルで、AMD3100が肝転移を抑制した。[重要性]癌幹細胞の存在と、間質細胞による誘導型の癌幹細胞の存在を明らかにした。iPSと同様の現象が発癌過程にもあるかもしれないことが示唆され、意義は大きい。また、この研究では、その過程が転移において起こっていることが示された。転移抑制薬を選択する概念を提示した重要性も大きい。【目的】(1)大腸癌幹細胞が本当に実体として存在するのか?間質細胞との関係。(2)癌幹細胞の分子標的治療は可能か?【実績】(1)手術によって摘出されたがん組織から、がん細胞株を4種樹立した。いずれのがん細胞株からもCD133+細胞およびCD133-細胞をFACSによって分離した。CD133+細胞は、ヌードマウスへの移植性を示すにも関わらず、CD133-細胞はその移植性が認められなかった。よって、実際のヒトからのサンプル内にもがん幹細胞が存在することが示された。さらに、CD133-細胞と間質細胞を同時に移植すると移植性を示すことがわかった。これは、CD133-の非がん幹細胞から、間質細胞の作用によってがん幹細胞へと転換することを示すものである。(2)大腸がん転移in vivoモデルを用いた。CD133+細胞、CD133-細胞いずれも肝臓転移することが示された。CD133-細胞の転移巣にも、CD133+細胞が存在する。つまり、これは(1)の結果によるCD133-細胞からCD133+がん幹細胞への転換がおこったことを示す。このモデルにおいて、ケモカインSDF-1阻害剤によってがん転移が抑制される。このことから、がん幹細胞生成に対する分子標的として、SDF-1は標的候補となることが示唆される。【意義】大腸がんの幹細胞の実体を明らかにした。また、がん幹細胞には、1次的に存在するものと、2次的に誘導されるものがあることがわかった。分子標的として、がん幹細胞生成プロセスが標的となることが示唆され、SDF-1はその1つの候補である。【目的】(1)がん幹細胞とがん化学療法臨床のつながり:化学療法抵抗性のメカニズム(2)非がん幹細胞からがん幹細胞への転換のメカニズム【結果】(1)1次がん幹細胞として、CD133+細胞を分離培養した。また、2次がん幹細胞として、CD133-細胞を分離し、in vitroで間質細胞と共培養した。それら培養系に、大腸がんの標準治療薬である5-FU,オキサリプラチン(Oxali),5-FU+Oxaliを投与した。1次がん幹細胞は、5-FU+Oxaliによって、標準投与量ですべて死滅した。一方で、2次がん幹細胞は、5-FU+Oxaliによって死滅に至らなかった。これは、化学療法抵抗性の出現と、2次がん幹細胞の生成が関連することを示唆する。(2)上記(1)の系において、現在までに我々が2次がん幹細胞生成プロセスに対する分子標的であることを示してきたSDF-1の阻害剤+5-FU+Oxaliを投与すると、2次がん幹細胞も死滅した。結果、非がん幹細胞からがん幹細胞への転換のメカニズムにSDF-1が必須であることがわかった。

一方、CD133-非がん幹細胞に、SDF-1を投与してもがん幹細胞への転換は得られなかった。そこで、このプロセスを詳細に調べるために、1次がん幹細胞、非がん幹細胞、2次がん幹細胞の差異を比較することにした。これら細胞の発現解析のために、microarray解析を行った。現在、その差異を形成する遺伝子群の候補を挙げることができた。【意義】がん幹細胞の能力を決める遺伝子候補が明らかになった。新規抗がん剤、特に抗転移薬の開発に繋がる可能性がある。
ポリマーナノデバイスの作製・機能解明と開拓

飛行機製造業ではよく知られた原理であるが、設計した模型をそのまま比例拡大して得た実物大のシステムは機能しない。これは、物体の表面積と大きさ(体積)が異なる次数、すなわちそれぞれ2乗則と3乗則に従って増加するからである。同様の原理が、マイクロ/ナノメートルのサイズに縮小させたときにも働く。例えば、デバイスをmmからnmまで縮小すると、表面積/体積比は10^6倍も増加する。そのためナノ領域では、体積と慣性力はもはや重要ではなくなり、一方、複雑な物理的、力学的または電気的な特性、例えば圧力、張力、熱伝導などがこれまでの経験とは全く異なる法則としてとどまり、それらが支配的となる。現在のマシンの設計・駆動の原理はナノサイズでの複製には応用することができない。そこで本研究では、溶液中で駆動する数100nm径のポリマーの螺旋ワイヤーによるマイクロバネを作製し、その剛性を温度を変化させながら測定することでその相転移温度を測定した。その結果ポリマー名のワイヤーの径を450nmから150nmまで減少させると、それに比例して転移温度が約40°C低下した。これまでに、ポリマーにおける転移温度のサイズ依存性は、厚さ100nm以下のPMMA薄膜においていくつかの報告例がある。本研究結果は、フリースタンディングなワイヤー形状でのポリマーのサイズ依存性を実験的に観察した初めての結果であり、薄膜での報告例に比べて大きなサイズで転移温度のサイズ依存性が現れることがわかった。平成17年度の主な研究目的は、50nmの加工分解能の達成とデバイス加工への応用であり、本研究は計画に従って加工システムと材料との両面から以下のように行った。ラジカルの拡散の影響とレーザーナノ加工法の加工分解能の関係を調べるため、光硬化性樹脂の温度を低温から高温まで変化させたときの光重合反応の振る舞いを調べた。実験では、窒素冷却型の顕微鏡用冷却・加熱ステージ(LK-600、ジャパンハイテック株式会社)を我々が独自に開発したレーザーナノ加工装置に導入したシステムを構築した。開口数0.55の対物レンズを用いて近赤外フェムト秒レーザー光を光硬化性樹脂SCR-500(JSR(株)製)に集光し、入射光強度一定の元で樹脂の温度を-60°Cから80°Cまで変化させながら点硬化させた。露光時間が32ms以上の場合、樹脂の温度上昇に伴い硬化スポットのサイズが減少した。これは樹脂の温度上昇によって、ラジカルの連鎖移動反応に伴う重合停止反応が支配的になったためだと考えられ、ラジカルの拡散の影響が加工分解能に影響することが確認された。しかし、実験で検証した温度領域ではいずれの温度下でも、レーザーの照射時間の最適化によって得られた最小の硬化スポットのサイズは約100nmで変化がなかった。この結果は、系の温度は加工分解能には大きな影響を与えないことを示唆している。また、ナノデバイスの光駆動メカニズムの検証のため、ガルバノミラーセットを用いたレーザー走査システムを構築した。デバイスのレーザー捕捉・駆動のためのレーザー光源とガルバノセットミラーによる高速走査系を備えた光学顕微鏡システムからなり、デバイスの駆動の様子はハロゲンランプの照明とCCDカメラの観察によりビデオレートで観察・記録できる。今後、レーザーナノ加工装置によって作製したナノデバイスを光駆動し、マイクロ/ナノスケールでの力学の解明を目指す。2光子重合で形成されたナノサイズの重合樹脂は、バルクの樹脂に比べ弾性率が3桁程度低いことを実験的に見いだした。この原因は、(1)2光子重合では重合度が低い、(2)おなじ樹脂であってもナノサイズまで微細化すると弾性が変わる、(3)そのほか重合樹脂表面で生じる周囲媒質との相互作用、などが考えられる。(1)の要因について検証するため、2光子光重合加工法によって作製される直径100nm以下の重合樹脂の重合度をラマン顕微分光法によって評価した。炭素間2重結合はモノマー分子に含まれており、ラマンスペクトルでは1640cm-1にピークを示す。重合反応が生じると結合の一方が切れて2重結合が消滅するため、このピークが重合反応の進行度の指標となる。

そこでレーザー光の強度、照射時間など、加工条件と1640cm-1でのラマン強度との関係を調べた。また、2光子重合で構造を作製・現像した後、UV光を照射し、構造内に含まれる全てのモノマーを完全に反応させた時の弾性率を評価した。UV照射によって弾性率は数倍上昇したが、バルク樹脂が持つ3桁高い値には到達しなかった。この結果から、2光子重合で形成される樹脂の重合度が低いことだけではナノサイズの樹脂が持つ低い弾性率を説明することができないことが分かった。(2)の要因について、同じ加工条件で直径の異なるスプリング構造を作製し弾性率を測定する実験を行っている。さらに、温度を変えながら弾性率を測定し、重合樹脂のガラス転移温度を測定する実験を行っている。また、アゾベンゼン系誘導体を含む光硬化性樹脂を作製し、光異性化反応によって体積変化の特性を持つ機能性樹脂の開発を行った。2光子光重合加工により材料を重合硬化し、その後UV/可視光の照射によって樹脂内のアゾベンゼン誘導体の異性化反応を繰り返し誘起することに成功した。サブミクロンのサイズのポリマーは、サイズによって相転移温度が異なることを実験的に見いだした。2光子重合加工法で直径200nmの細線で形成したポリメチルメタクリレート製のスプリング構造を加工し、顕微鏡下でレーザートラッピングの技術を用いて弾性率を評価した。試料ステージには加熱/冷却装置を導入し、温度を変化させながら弾性率測定を行った結果、2040°Cでポリマーの相転移に起因する弾性の急激な変化を観察した。細線の直径が異なるスプリングを複数個加工した。ラマン分光測定からこれらスプリングのポリマー重合度がほぼ等しいことを確認した後、それぞれについて同様の測定を行った。その結果、ポリマーの細線を450nmから150nmまで減少させると、それに比例して相転移温度が約40°C低下した。実験で測定した相転移はポリメチルメタクリレートのβ転移と考えられる。本結果から、たとえ同じ重合度の同じポリマーであってもサイズによって室温で相が異なる可能性が分かった。また、このようなサイズに依存した転移温度とそれに伴う機械特性変化は、直径が500nmを超えると顕著には現れず、ナノサイズのポリマーに特有のサイズ効果であることが分かった。機械特性のサイズ依存変化をフリースタンディングなポリマー材料で実験的に示したのはこの研究成果が初めてであり極めて興味深い。また、アゾベンゼン系誘導体を含む光硬化性樹脂を用いた体積変化特性を有する機能性樹脂では、電子顕微鏡観察によって体積変化の割合を評価した。また、3次元フォトニック結晶を作製し、光照射によって格子常数が変わりバンドギャップが変化する光機能性フォトニック結晶を作製した。
人体病理組織および硫酸転移酵素欠損マウスを用いた潰瘍性大腸炎の病態解析

潰瘍性大腸炎における単核細胞浸潤は,高内皮細静脈(HEV)様血管内腔面の硫酸化糖鎖により惹起される.この硫酸化糖鎖の生合成は,硫酸転移酵素GlcNAc6ST-1,GlcNAc6ST-2により制御される.これらの酵素を欠損した(DKO)マウスを用いて潰瘍性大腸炎のモデルを作製し,組織学的解析を行った。その結果,DKOマウスにおける多形核白血球浸潤の程度は,野生型マウスに比して高度であり,またDKOマウスの炎症部位には腸管粘膜特異的な単核細胞浸潤に関与する接着分子MAdCAM-1陽性HEV様血管が有意に多く認められたことから,MAdCAM-1が硫酸化糖鎖の機能を代償している可能性が示唆された.潰瘍性大腸炎は,粘膜固有層のびまん性リンパ球・形質細胞浸潤を病理組織学的特徴とするが,このリンパ球浸潤は,リンパ球表面のLセレクチンと,高内皮細静脈様血管内腔面の硫酸化糖鎖との結合によって惹起される.高内皮細静脈における硫酸化糖鎖の生合成は,二種類の硫酸転移酵素GlcNAc6ST-1,GlcNAc6ST-2によって相補的に制御されているが,潰瘍性大腸炎では前者が優位に働いていると考えられる.この酵素の潰瘍性大腸炎の病態形成における役割を,人体病理組織の組織学的解析,モデル動物の病態解析,モデル細胞の糖鎖解析により多層的に解析し,明らかにすることが今回の研究の目的である.平成27年度は主に,1)人体病理組織の解析に用いる硫酸転移酵素に対する抗体作製と,2)野生型マウスを用いた動物モデルの作製とその至適条件検討,3)硫酸転移酵素欠損マウスの個体化を計画していた.1)に関しては,まずモノクローナル抗体作製の一般的プロトコールの最適化を行い,完成の域に達したと判断した.引き続き抗原ペプチドの探索を開始したところ,商業ベースで抗体が入手できる可能性が出てきたので,現在,どちらに駒を進めるべきか検討しているところである.2)に関しては,概ね予定通りに進行し,デキストラン硫酸ナトリウムの至適投与量と期間を決定することができた.3)に関しては,予定通りのスケジュールで硫酸転移酵素ダブルノックアウトマウスの個体化に成功した.シングルノックアウトの作出に関しては,諸事情により保留することにした.平成27年度の最優先項目であったモデル動物の作製と硫酸転移酵素ダブルノックアウトマウスの個体化がほぼ計画通りに進んでいるため,概ね順調に進展していると判断した.潰瘍性大腸炎は,粘膜固有層のびまん性リンパ球・形質細胞浸潤を病理組織学的特徴とするが,このリンパ球浸潤は,リンパ球表面のLセレクチンと,高内皮細静脈様血管内腔面の硫酸化糖鎖との結合によって惹起される.高内皮細静脈における硫酸化糖鎖の生合成は,二種類の硫酸転移酵素GlcNAc6ST-1,GlcNAc6ST-2によって相補的に制御されているが,潰瘍性大腸炎では前者が優位に働いていると考えられる.この硫酸転移酵素の潰瘍性大腸炎の病態形成における役割を,人体病理組織の組織学的解析,モデル動物の病態解析,モデル細胞の糖鎖解析により多層的に解析し,明らかにすることが今回の研究の目的である.平成28年度は硫酸転移酵素GlcNAc6ST-1およびGlcNAc6ST-2のダブルノックアウトマウスおよびコントロールとして野生型マウスにデキストラン硫酸ナトリウム(平成27年度に最適化済み)を経口投与し,実験的大腸炎を作製した.組織学的解析の結果,両系統のマウスとも病理組織学的にヒト潰瘍性大腸炎類似(ビラン・潰瘍形成,cryptitis,crypt abscessの形成)の大腸炎を発症したが,その炎症の程度には差が認められ,その差は硫酸化糖鎖の発現量ないしは硫酸化糖鎖の足場となるキャリアタンパク質の発現量の差に起因するものと考えられた.現在,この仮説を証明すべく,定量的PCRや,硫酸化糖鎖およびそのキャリアタンパク質に対する免疫組織化学的解析,さらにはモデル細胞を用いたリンパ球接着実験を行っているところである.平成28年度研究計画の最重要項目である潰瘍性大腸炎モデル動物の作製に成功しており,また硫酸転移酵素GlcNAc6ST-1およびGlcNAc6ST-2のダブルノックアウトマウスと,コントロールの野生型マウスの間に炎症程度の差が認められていることから,概ね順調に進展していると判断した.潰瘍性大腸炎は,粘膜固有層のびまん性リンパ球・形質細胞浸潤を病理組織学的特徴とするが,このリンパ球浸潤は,リンパ球表面のLセレクチンと高内皮細静脈様血管内腔面の硫酸化糖鎖との結合によって惹起される.高内皮細静脈における硫酸化糖鎖の生合成は,2種類の硫酸転移酵素GlcNAc6ST-1,GlcNAc6ST-2によって相補的に制御されている.この硫酸転移酵素の潰瘍性大腸炎の病態形成における役割を明らかにすることが今回の研究の目的である.平成29年度は硫酸転移酵素遺伝子欠損マウスを中心に免疫組織学的解析,およびsLeX糖鎖の機能的プローブを用いた結合実験を行い,以下の結果を得た.1)野生型マウスの炎症部位に認められる硫酸化sLeX糖鎖陽性高内皮細静脈様血管は,硫酸転移酵素遺伝子欠損マウスの炎症部位には認められなかった.

一方,腸管粘膜特異的な単核細胞浸潤に関与する接着分子MAdCAM-1を発現した高内皮細静脈様血管は,野生型マウスに比して硫酸転移酵素遺伝子欠損マウスで有意に多く認められた.2)非硫酸化sLeX糖鎖を機能的に検出するEセレクチンとIgMのキメラタンパク質は,上記のMAdCAM-1陽性高内皮細静脈様血管にカルシウム依存性に結合した.以上より,高内皮細静脈様血管上に硫酸化sLeX糖鎖が存在しない状況下でも,大腸粘膜の炎症細胞浸潤は維持され,多形核白血球の浸潤はむしろ亢進することが明らかとなった.また,この炎症細胞浸潤は,非硫酸化sLeXという非生理的なLセレクチンリガンドとLセレクチンの相互作用,あるいはMAdCAM-1とそのリガンドであるインテグリンα4β7との相互作用が,生理的な硫酸化sLeX糖鎖とLセレクチンの相互作用を代償している可能性が示唆された.潰瘍性大腸炎における単核細胞浸潤は,高内皮細静脈(HEV)様血管内腔面の硫酸化糖鎖により惹起される.この硫酸化糖鎖の生合成は,硫酸転移酵素GlcNAc6ST-1,GlcNAc6ST-2により制御される.これらの酵素を欠損した(DKO)マウスを用いて潰瘍性大腸炎のモデルを作製し,組織学的解析を行った。その結果,DKOマウスにおける多形核白血球浸潤の程度は,野生型マウスに比して高度であり,またDKOマウスの炎症部位には腸管粘膜特異的な単核細胞浸潤に関与する接着分子MAdCAM-1陽性HEV様血管が有意に多く認められたことから,MAdCAM-1が硫酸化糖鎖の機能を代償している可能性が示唆された.平成28年度は,硫酸転移酵素ダブルノックアウトマウスを用いたモデル動物の作製とその解析を優先して行い,同時に使用する抗体の決定,人体病理組織材料の解析へと進めていきたい.人体病理組織材料の解析と並行して論文執筆を進めていきたい.糖鎖病理学
ニューロン死と防御に関する細胞分子生物学的研究

パーキンソン病(PD)は静止時振戦、無動症および筋固縮を主症状とする神経変性疾患であり、アルツハイマー病とともに重篤な老人性の脳疾患である。PD発症には、脳の黒質線条体系のドパミン(DA)含有神経細胞の変性とそれに伴うDA含量の減少が認められる。ドパミン神経細胞毒である1-methyl-4-phenylpyridinuim ion(MPP^+)はパーキンソン病類似症状を引き起こすことが知られている。MPP^+は細胞膜のDAトランスポーターを介してDA神経細胞に取り込まれ細胞死を引き起こすが、その細胞死がアポトーシスあるいはネクローシスであるか、さらに、その詳細な機序は何かが不明である。そこで、今回ヒト株化ニューロブラストーマSH-SY5Y細胞を用いてMPP^+による細胞死の機序について検討した。MPP^+は濃度依存的、時間依存的に細胞死のマーカーの一つである乳酸デヒドロゲナーゼの漏出(LDH leakage)を引き起こした。さらには、アポトーシスのマーカーであるDNA fragmentationも濃度依存的に引き起こした。一方、本細胞に内在的に発現するBcl-2(細胞死抑制蛋白質)はMPP^+処理により発現が増加した。この発現量の増加はプロテインキナーゼC阻害薬のスタウロスポリンの前処理によって抑制されたことから、MPP^+が内らかのリン酸化酵素の活性化を介し、Bcl-2発現を促進することが示唆された。なお、この細胞においてBcl-2の発現はプロテインキナーゼCにより促進され、プロテインキナーゼAにより、抑制されていることも見い出した。
校長の教育的リーダーシップと学校成果の関係構造

本研究は、学校成果の向上を志向した校長のリーダーシップの組織過程及び児童への影響力と戦略的方法を、量的・質的アプローチを通して解明することを目的としたものである。報告書は4部構成であり、第I部では、教育的リーダーシップ論と媒介影響モデルの2つの観点から、校長のリーダーシップと児童パフォーマンスとの因果関係を明らかにするための理論的因果モデルを構築し、その検証を試みている。また、ここでは、理論モデルを優先し、データとの適合性を検定する分析技法の限界を指摘した上で、データを優先し、それに最も適合する理論モデルを選択する分析技法の有効性を提示している。第II部では、校長のリーダーシップの発揮は、教員によって校長がリーダーとして認知されているかどうかによるとの観点から、教員による校長のリーダーシップ認知に影響を及ぼす要因の析出を試みている。また、リーダーとしての認知レベルが高い校長と普通の校長との対比を通して、それが高い校長に特有の知識・技術の析出もあわせて試みている。第III部では、外部環境要因としての教育委員会(教育長)と保護者・地域住民から、校長や学校組織がどのような影響を受けているのかを明らかにしている。ここでは、特に、学校成果を高めるためには、教育長や保護者・地域住民とどのような関係を構築すればよいかという実践的な課題に対する示唆を提起している。第IV部では、変革型リーダーとしての校長の戦略的アプローチを記述的・解釈的に分析している。ここでは、校長が組織変革に際して、どのような戦略的方法を採用しているかを、成果の高い学校の質的データの分析を通して明らかにしている。本研究の目的は、校長の教育的リーダシップと学校成果の関係の「因果性」を数量的手法によって明らかにし、校長が学校成果を高めるために採用している戦略的「方法」をエスノグラフィー(民族誌)的手法によって明らかにすることにある。初年度の研究成果は、下記の雑誌論文(「校長のリーダシップと学校成果(School Effectiveness)の関係」『日本教育経営学会紀要』第42号、審査合・2000年6月発表予定)において報告している。事例校(小学校)において、およそ100時間の参与観察及びインタビュー、校内の全教職員に対するアンケート調査を実施したところ、次の結果が得られた。すなわち、第1は、当該校長のリーダシップが学校成果(組織パフォーマンス、教師パフォーマンス、プログラムパフォーマンス、児童パフォーマンス)に強い影響を及ぼしていること、第2は、学校成果を高める戦略的「方法」として、管理的行為への教育的意味の付与、実験性風土の形成等が採用されていたことである。この論文は、本研究課題の目的・方法に関する全体的構図を示したものである。現時点では、「交付申請書」に示した、約1000名程度の小学校教員に対する質問紙調査の実施、2つ目の事例校への参与観察も既に終了している。上記の質問紙調査の結果は、日本教育経営学会第40回大会(於:筑波大学)において報告する。質問紙調査の分析結果からは、効果的学校の校長は、学校文化に強い影響を与えていること、教師から「管理者」というよりも「教育者」であると認知される傾向が強いこと等の新たな知見が得られている。
遺伝子改編酵素群APOBECの発ガンウイルス感染における役割

本研究では、免疫系の効果分子APOBECとヒト腫瘍ウイルスの代表であるパピローマウイルス(HPV)やB型肝炎ウイルス(HBV)との関係性を調べた。その結果、APOBECはHPVの粒子形成プロセスに干渉し、感染性を低下させ、あるいはウイルスDNAに変異を作る事が明らかになった。またAPOBECがHBVのウイルスRNAを破壊する活性を持つ事がわかった。これらの研究により、免疫系の持つHBVやHPVに対する感染防御力の一つにAPOBECという宿主酵素群が関与する可能性が浮上し、その機構の一旦が明らかになった。B型肝炎ウイルス(HBV)は感染を起こすと肝炎は肝硬変を起こしまた肝癌を主要な原因の一つである。HBVのような腫瘍ウイルスが起こす発癌の機構は不明な点が多い。本研究では、宿主の抗ウイルス因子であるAPOBECファミリー蛋白が、これらウイルスの起こす病態にどのように関わるか検討する。APOBECタンパクは、DNAやRNA上のシトシンをウラシルに変換する一連の酵素群でヒトでは、11種類がファミリーメンバーに含まれる。内外のこれまでの研究より、AIDや7種類あるAPOBEC3が、HBVやHPV16に作用する事が試験管内での実験により示されてきた。特にAPOBEC3GについてはHBVに対して抗ウイルス活性が示唆されてきた。我々はこれまでAIDがHBVのRNAゲノムに作用しC-to-Uの変換を起こす事やウイルスDNAに高頻度突然変異を導入しウイルス複製を抑制する可能性を示してきた。また既にAIDがサイトカイン(TGFb)刺激により、ヒト肝細胞株に発現する事が示されていたので、サイトカイン刺激で発現誘導されるAIDに着目した研究を展開した。HBVを持つ肝細胞株にTGFbを投与するとAIDが誘導され、ウイルスのRNA量とDNA量の両方が減り、TGFbはウイルス複製を抑制する事が判明した。次にAID発現を抑制させるとTGFbによるウイルス複製抑制効果が消失し、またTGFb処理をしなくともAIDを強制的に発現させるとウイルス複製抑制が観察された事より、TGFbのウイルス複製抑制効果はAIDに依存する事がわかった。さらに詳細に解析を進めると、AIDはウイルスRNAと複合体を形成し、RNA分解複合体(RNA exosome)を呼び寄せる事によりウイルスRNAを破壊する事が判明した。一連の研究はPlos Pathogensに受理された。これまで遺伝子改編酵素群APOBECの抗ウイルス活性を検討してきた。APOBECはヒトでは11種類からなり、DNA上のシトシン塩基をウラシル塩基に変換する活性を持つ酵素である。ヒトパピローマウイルス(HPV)とAPOBECの関わりについて、試験管実験系を用いて、核内ウイルスDNAへの高頻度変異(多数の変異が蓄積する現象)やウイルス粒子形成の阻害作用を報告してきた。そこで今年は、臨床検体を用いてヒトの感染がおこっている生体内でのAPOBECの役割を研究した。APOBECはその活性が発揮されるとウイルスゲノムに高頻度変異が起こるので、それを臨床検体を中心に解析した。まずAPOBEC3の発現レベルを健康およびHPV16陽性子宮頸部サンプルを用いて調べたところ、ほとんどのAPOBEC3の発現が見られ、HPV16陽性サンプルの方にてAPOBEC3発現が高い傾向が観察された。次にHPV16陽性前癌サンプルにてウイルスDNA上の高頻度変異の蓄積を3D-PCR法という特殊検出法で検討したところウイルスDNA上の高頻度変異が検出された。さらにはウイルスゲノムDNAについて次世代シークエンス法で変異解析を行った。その結果、シークエンスした全領域について高頻度変異が確認できたが、それは必ずしもランダムに起こっている訳ではなく、一定の変異の偏りを検出しその変異パターンから、その変異を作った因子はAPOBEC3である事が示唆された。従って、これらの知見は、APOBEC3がヒト感染病態においてもHPVウイルスゲノムを標的にしている証拠であり、また変異蓄積の分子メカニズムの特徴の一旦を明らかになった。今後、HPV16誘発性発癌の様々な局面でのAPOBEC3の役割をさらに明らかにしてく必要がある。また宿主ゲノムDNAの変異解析は行なっておらず、今後ウイルスDNAと宿主ゲノムDNAの同時解析が望まれる。HIVやHBVで、抗ウイルス活性が注目されたAPOBECタンパク群のHPVウイルス感染症における役割を決める事が、本研究の重要な研究目標の一つであった。本年度は、APOBECタンパクのHPV16における役割を多面的に解析した結果、in vitroの実験よりAPOBECがウイルス粒子集合プロセスに干渉すること、患者病態でもAPOBECが高頻度変異を導入する事を明らかにした。我々はこれまで遺伝子改編酵素群APOBECタンパクがB型肝炎ウイルス(HBV)DNAに高頻度変異を起こし、ウイルス複製を阻害することを示してきた。またパピローマウイルス(HPV)は、HBVと同様に核内episomeを形成するが、HPVのepisomeもAPOBECの標的になる事を報告している。本研究では、代表的ながんウイルス(HBVとHPV)感染におけるAPOBECタンパクの役割を解明する事を目標にしている。今年度は、主に臨床検体を用いたアプローチで新規知見を見いだし情報発信している。HPV16感染は子宮頸がんを起こす事で有名だが、近年咽頭がんを起こす事でも知られる様になった。我々は頭頸部外科の共同研究者とともに中咽頭がんの臨床検体をHPV16陽性群と陰性群に分けて解析した。その結果、陽性群はAPOBEC3の発現が上昇している事を明らかにした。

さらにAPOBEC3高発現サンプルでは、ウイルスDNAにAPOBEC3の活性産物である高頻度変異を検出し、実際、変異のパターンはAPOBEC3の生化学的特徴に合致するものであった。次世代シークエンシングでは、ウイルスゲノム配列を解析することでも高頻度変異を検出できた。感染初期や発がんに至らないときは、ウイルスDNAは感染細胞にepisomeとして存在している。一方、発がんに至る過程でウイルスDNAは細胞のゲノムに挿入されると考えられており、その分子機構は不明である。我々が、臨床検体のウイルスDNA挿入指標とAPOBEC3の発現レベルを比較したところ、APOBEC3の一つであるAPOBEC3Aの発現が高いとウイルスDNA挿入指標も上昇する事を見いだし、APOBEC3Aがウイルスゲノム挿入を介して発がんを進めている可能性がある事を突き止めた。以上の結果は、APOBECがHPV発がんに寄与する事を示した重要な研究として評価されている。本研究では、免疫系の効果分子APOBECとヒト腫瘍ウイルスの代表であるパピローマウイルス(HPV)やB型肝炎ウイルス(HBV)との関係性を調べた。その結果、APOBECはHPVの粒子形成プロセスに干渉し、感染性を低下させ、あるいはウイルスDNAに変異を作る事が明らかになった。またAPOBECがHBVのウイルスRNAを破壊する活性を持つ事がわかった。これらの研究により、免疫系の持つHBVやHPVに対する感染防御力の一つにAPOBECという宿主酵素群が関与する可能性が浮上し、その機構の一旦が明らかになった。H26年度は、実績の概要欄で紹介したAIDの新規ウイルスRNA分解機構の発見という大きな進展があった。この業績は、HBV感染におけるAIDの抗ウイルス活性の証明をしたとして一つの到達目標を達成したと言える。スペースの都合で紹介できなかったが、H26年度はHPV16についても進展があった。HPV16は、初感染の時は、多くは患者が気づく事なく感染が終結しており、自然治癒する感染症とされている。しかし、実際にはHPV16は何らかの免疫系の作用によりウイルスが排除されていると考える方が妥当であるが、その免疫系の実態は謎である。H26年は、HPV16ウイルス粒子が組み上がる局面に注目し、APOBEC3が存在するときとそうでない時とでウイルス粒子形成効率を比較した。その結果、APOBEC3CやAPOBEC3Aが共存するときはウイルス粒子形成能が、極度に低下する事を明らかにした。この結果は、APOBEC3ファミリーの抗HPV16作用の一つを示すものであり、これも到達目標の一つが達成された一例といえる。最終年度であるので、研究を取りまとめる方向と、可能性やポテンシャルの高低により、ある程度研究の集約化を行う。B型肝炎ウイルスの研究については、これまで明らかとしたAIDのHBV RNA分解誘導活性について、分子生物学的にさらに機序解明に取り組む。またマウス肝炎モデルを用いてAIDのHBV RNA分解誘導活性をしめせるか検討を行う。
周期的極小曲面の変形空間の研究と応用

(4)名城研究集会「多様体上の種々の幾何構造の融合」で連帯研究者の庄田氏に講演「SchoenのI-WP曲面に対する幾何学的量について」をしていただき、同時に研究打ち合わせを行った。前年度に立てた今後の研究の推進方策の進捗状況について(2)rGfamily, tGfamilyに属する極小曲面のCMC安定についてはまだ計算ができていないことが、おおむね順調に進展しているとした理由である。(4)研究打ち合わせをして研究を深める。4次元平坦トーラス内の種数4のhyperelliptic minimalsurfaceの変形空間を構成した。従って、江尻によって与えられたアルゴリズムを用いてindex, nullityが計算できることとなった。応用として、3次元平坦トーラスには種数4のhyperelliptic minimalsurfaceが存在しないことから庄田(連帯研究者)が考えた問題への解答を与える4次元平坦トーラス内の種数4の正則曲線でないhyperelliptic minimalsurfaceの存在を示せたのは、大きな意義がある。また初めてindexが2である例が構成できたことも興味深い。それは江尻の考えたhyperelliptically stableの例でもあるからであり、新たな問題を引き起こす重要な例となったからである。その一部は論文としてN. Ejiri and T. Schoda, On hyperelliptic minimalsurface witheven genusとして発表されている。平成27年度の目標(1)(5)について。(1)については論文を作成中である。(2)について論文を準備中である。(3)については、数値計算以外は、論文を準備中である。(4)については、Meeks予想との関連で研究中であり、少しずつでは結果が得られた。(5)については予定通りの研究打ち合わせができた。(6)についてはまだ文献が収集が進んでいない。(2) 2016年10月22日水戸研究集会にて、16:30--17:30江尻典雄(名城大学)「トーラスの極小曲面に関するWeierstrass data空間の構造」を講演した。Weierstrassdata空間の構造の研究は、種数3の場合のWeierstrass data空間からのreal period mapに関するMeeksの50番目の予想(既に解決されている)と関連があり、PirolaによるWeierstrass data空間の研究とあわせ、Meeksの50番目の予想を発展させたものであることを述べて、研究の意義と重要性を示した。(3)名城研究集会「多様体上の計量と幾何構造」で連携研究者の庄田氏に講演「Abel-Jacobi写像による極小曲面の変形族の構成について」をしていただき同時に研究打ち合わせを行った。現在、3重周期極小曲面の研究に関して3つの論文(研究計画・方法の平成27年、平成28年(4)に関して、平成27年度及び平成28年度(6)に関して)を投稿中であり、2つの論文(研究計画・方法の平成27年度(1)に関して、平成27年度(2)及び平成28年度(1)に関して)の投稿を考えている。2つは準備中である。トーラスのCMC安定極小曲面に関しては、研究時間の不足から若干の遅れがある。(3)庄田敏宏氏との共同研究として、3次元トーラスのtPfamily, tDfamily, rPDfamily, H familyのCMC stableについての研究は、研究目的の3次元トーラス内のCMC stable embedded minimalsurfaceについての研究である。IWP minimalsurfaceの変形空間とindex, nullityについての研究、hyperelliptic minimalsurfaceのindexについての研究、rGfamilyとtG familyのindexとnullityについての研究は、研究の目的である、indexとnullityの計算を具体的に行ったものである。これらは論文としてそれぞれまとめ、現在投稿中である。(4)名城研究集会「種々の幾何構造と幾何構造の深化」で連帯研究者の庄田氏に講演「種数2の閉曲面上におけるLaplacianの第一固有値に対するYang-Yauの不等式について」をしていただき、同時に研究打ち合わせを行った。トーラスのminimalsurfaceのCMC安定の研究においてMathematicaによる数値計算が必要であったが、それまでは、うまく評価ができず研究が滞っていたが、プログラムの工夫により計算できた。平成29年度、30年度の研究実施計画の中のtP family,tDfamily, rPDfamily, H familyのCMC安定に関する研究として3つの論文としてまとめることができた。さらにIWP surfaceの変形空間を構成しindex, nullityの評価を得るなど、平成28年度からの研究実施計画に記述された課題について十分な進捗があり、論文として投稿ができたことである。平成28年度の目標(1)(6)について。(1)は平成27年度の目標(2)である。(2)が新たに加わった平成28年度の目標である。(3)(6)は変わらない。平成27年度目標(1)で作成した論文を投稿する。平成27年度目標(2)で準備中の論文を完成させる。平成28年度の目標

(2)については、研究を始めるために関連するリーマン面を詳しく調べる。平成28年度の目標(3),(5),(6)については引き続き進める。平成28年度の目標(4)については平成27年度に得られた結果をまとめる。トーラスの極小曲面のCMC安定の研究に関しては、Mathematicaによる数値計算が必要であり、そのプログラムを作るための時間の不足により若干の遅れがある。研究打ち合わせを利用し、そのプログラムの研究を早めたい。またlimitの研究のためにも、研究打ち合わせを何度もに行うことを考えている。(3)研究打ち合わせをして研究を深める。(4)研究打ち合わせをして研究を深める。奈良の研究集会に出張中に体調不良のため病院にかかり、その日は研究会に参加できない日となったため。日本数学会年会に平成29年3月23日から参加し次年度使用額が生じない予定でした。3月21日に本人と妻が人間ドック検査をしたところ、妻の検査結果が悪く、すぐに精密検査を受けることを言われましたので、名古屋市八事日赤病院で精密検査を受けました。検査結果はすぐに得られませんでしたので、妻の状態について見守りと看護が必要と考え、年会に参加することを止めました。そのため次年度使用額が生じたものです。関連する幾何の文献の購入に使う論文等の検討のための打ち合わせに使用します。
固相メビオールゲル中で育成させる新規タンパク質結晶化技術

溶液中で育成させることが常識とされてきたタンパク質の結晶化を、高温にさらすことなく固化したメビオールゲル中で育成させる、世界で初めての結晶化技術を開発しました。この技術によって、結晶に損傷を与えること無く、再現性のある高精度なX線回折データを得ることが可能となりました。さらにメビオールゲルは、タンパク質結晶の核発生を促進すると共に、メビオールゲル中結晶は、浸透圧ショックにも強いことが明らかとなりました。これらの成果は、固相ゲル中で育成させる結晶化技術の汎用性を高める結果となりました。薬剤とタンパク質との相互作用を、立体構造情報を基に議論し、生体内における種々の生物反応を考察することは、分子設計や創薬という観点から考えれば必要不可欠である。このような研究を行うためには、良質なタンパク質の結晶を作製する必要があるが、タンパク質結晶は豆腐のように脆く、非常に壊れやすい。そのため、技術的な問題となっていた。研究代表者は、これらの問題を解決するために、タンパク質の結晶化実験を完全に固化したアガロースゲル中(固相ゲル中)で育成させる新しい結晶化技術の開発にこれまで取り組んできた。しかし、固相ゲル中で結晶を育成させるためには、流動性のあるアガロースゾル溶液とタンパク質溶液を混合する必要があるが、アガロースのゲル化温度は通常35°C以下であるため、ゾル状態を維持できる35°C以上では、混合時にタンパク質が損傷してしまうことが問題であった。研究代表者は、アガロースゲルとは正反対のゾルーゲル温度相転移を起こすメビオールゲルを用いた結晶化技術が確立できれば、この問題が解決できると考え研究を行った。本年度は次の実験を行った。本研究に使用する4種類のタンパク質サンプル(リゾチーム、エラスターゼ、グルコースイソメラーゼ、インシュリン)の精製プロトコールを構築した。サンプル純度には購入ロット間で差があるため、研究結果の再現性に影響を及ぼすことがしばしば問題となっていた。そのため、電気泳動によって純度を確認しながら、液体クロマトグラフィーによって精製を行った。さらに、精製リゾチームについては、固相メビオールゲルを用いた結晶化実験を実施した。その結果、非常に良質な単結晶を観察することに成功した。また1.2A分解能を超える高分解能データの収集にも成功した。メビオールゲルを用いた固体中でのタンパク質結晶化実験の成功は世界初である。薬剤とタンパク質との相互作用を立体構造情報を基に議論し、生体内における種々の生物反応を考察することは、分子設計や創薬という観点から必要不可欠である。そのためには良質なタンパク質結晶を作製する必要があるが、結晶は豆腐のように脆いため、技術的な問題があった。これらの問題解決のため、結晶化実験を完全に固化したアガロースゲル中(固相ゲル中)で育成させる新しい結晶化技術の開発取り組んできた。研究代表者は、アガロースとは正反対のゾルーゲル温度相転移を起こすメビオールゲル(Mebi)を用いた結晶化技術が確立できれば、この問題が解決できると考え研究を行った。Mebiは、これまで結晶化実験に使用された例がないため、はじめに4種類のタンパク質を用いて最適なタンパク質溶液との混合方法を検討した。その結果、室温でゲル化させた後、22度で結晶化を行うことによって全てのタンパク質で単結晶を再現性良く得ることに成功した。また、結晶化条件は従来法の条件とほぼ同じであることを確認した。Mebiを用いたタンパク質結晶化実験の成功は世界初である。ゲル中で育成した4種類のタンパク質結晶を用いてX線回折実験を実施し、本技術の有効性を検証した。その結果、4種類のタンパク質結晶において、1.2A分解能を超える高分解能データの収集に成功し、それらが良質な単結晶であることを確認した。また、これらの結晶学的データは、従来法で得られた結晶の結晶データとほぼ同じであることも確認し、本技術の有効性を証明することができた。本年度の研究目標は、実験に使用する4種類のタンパク質サンプル(リゾチーム、エラスターゼ、グルコースイソメラーゼ、インシュリン)の精製プロトコールを構築し、ロット間のサンプル純度差を無くすことであった。計画通り、4種類のタンパク質サンプルの精製プロトコールを構築した。さらに、精製リゾチームサンプルについては、固相メビオールゲルを用いた結晶化実験を実施したところ、固相ゲル中で単結晶を育成させることに成功した。また、それらの結晶を使った、シンクロトロン放射光によるX線回折実験によって、1.2A分解能を超える高分解能データを収集することに成功した。

24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度では、他の3種類の精製サンプルを用いて、固相メビオールゲル中での結晶化実験を行い、最適なゲル濃度、温度コントロール、およびタンパク質溶液との混合方法を決定することを目標とし、再現性を持った固相メビオールゲル中結晶化技術の確立を目指す予定である。さらに固相ゲル中で育成したタンパク質結晶を用いてX線回折実験(SPring-8またはPFへ出張予定)を行い、本技術の有効性を検証する。具体的には、固相メビオールゲル中で育成した4種類のタンパク質結晶の評価のための指標として、X線強度データの統計値である、R-merge, Resolution, Completeness, Mosaicityに設定する。さらに、それらの値を溶液中で成長した結晶と比較することによって、固相メビオールゲル中で育成した結晶化技術の優位性を評価する。
細胞内共生現象の分子細胞生物学的研究

アブラムシの細胞内共生細菌ブフネラ,およびトビイロウンカの細胞内酵母様共生真菌について,大略以下の事実を明らかにした.1.若齢虫および老齢虫の菌細胞共生系における遺伝子発現をdifferential display法で比較した結果,ブフネラ,菌細胞の双方とも,共生が緊密に維持されているときにのみ特異的に発現される遺伝子を十数種類指摘した.その中には,従来の研究結果を裏づけるように,アミノ酸代謝系酵素の遺伝子が多数含まれていた.2.ブフネラはリボフラビンを合成し,宿主に供与していることを示す明確な証拠を得た.3.認識配列に多数のGCを含む制限酵素でブフネラゲノムDNAを切断し,パルスフィールド電気泳動で分析することによって,そのゲノムサイズを657kbpと同定した.このサイズは進化的に近縁であることが明らかな大腸菌ゲノムの1/7にすぎない.4. 2種の遺伝子量のドットプロット解析および細胞のDNA含量の蛍光による直接測定によって,ブフネラは単一の細胞に平均100個以上のゲノムコピーをもつきわめて特殊な細菌であることを明らかにした.また,そのコピー数は宿主昆虫のモルフおよび発生段階によって大きく変動することを示した.5.細菌としては例外的にブフネラはヒストンH1様タンパク質を保有し,それがゲノムDNAと相互作用しつつ存在するらしいことを示した.6.トビイロウンカが組織内に貯蔵する尿酸の可溶化に不可欠である酵母様共生体ウリカーゼ遺伝子のクローニングを行い,大腸菌に組み換えて,同酵素タンパク質の大量発現系の構築を行った.アブラムシの細胞内共生細菌ブフネラ,およびトビイロウンカの細胞内酵母様共生真菌について,大略以下の事実を明らかにした.1.若齢虫および老齢虫の菌細胞共生系における遺伝子発現をdifferential display法で比較した結果,ブフネラ,菌細胞の双方とも,共生が緊密に維持されているときにのみ特異的に発現される遺伝子を十数種類指摘した.その中には,従来の研究結果を裏づけるように,アミノ酸代謝系酵素の遺伝子が多数含まれていた.2.ブフネラはリボフラビンを合成し,宿主に供与していることを示す明確な証拠を得た.3.認識配列に多数のGCを含む制限酵素でブフネラゲノムDNAを切断し,パルスフィールド電気泳動で分析することによって,そのゲノムサイズを657kbpと同定した.このサイズは進化的に近縁であることが明らかな大腸菌ゲノムの1/7にすぎない.4. 2種の遺伝子量のドットプロット解析および細胞のDNA含量の蛍光による直接測定によって,ブフネラは単一の細胞に平均100個以上のゲノムコピーをもつきわめて特殊な細菌であることを明らかにした.また,そのコピー数は宿主昆虫のモルフおよび発生段階によって大きく変動することを示した.5.細菌としては例外的にブフネラはヒストンH1様タンパク質を保有し,それがゲノムDNAと相互作用しつつ存在するらしいことを示した.6.トビイロウンカが組織内に貯蔵する尿酸の可溶化に不可欠である酵母様共生体ウリカーゼ遺伝子のクローニングを行い,大腸菌に組み換えて,同酵素タンパク質の大量発現系の構築を行った.1.菌細胞内共生体においてシンビオニンが構成的,かつ多量に発現される分子機構を調べた結果、シンビオニン遺伝子の発現は大腸菌groEと同じく,転写開始因子シグマ32の支配下にあることがわかったが,共生体のシグマ32遺伝子(rpoH)は大腸菌のそれと違って,熱ショックには応答しないことが明らかになった.2.共生体内においてGroELホモログのシンビオニンからエネルギー共役的にリン酸基転移を受けるタンパク質の一つとして,ヒストンH1のホモログが同定された.3.3種の近縁なアブラムシからのシンビオニン遺伝子の構造の比較から,シンビオニンは分子シャペロン活性にとっては中立的な部位への変異を通じて,同族のGroELにみられない新たな機能を獲得したことが示唆された.4.若齢虫および老齢虫から得た菌細胞共生系における遺伝子発現をディファレンシャルディスプレーおよび定量的RT-PCR法によって比較した.その結果,宿主昆虫の加齢に伴って発現量の低下する遺伝子が共生体側にも,菌細胞側にも検出された.これらの遺伝子産物は共生系の活性が保たれるのに不可欠な機能を果たしているタンパク質であった.また,菌細胞共生系では宿主の加齢に伴って,逆に一過的に発現の高まる遺伝子のあることも判明した.このことは,菌細胞が一方では共生体のある遺伝子群を活性化し,他方ではそれのもつ他の遺伝子群の発現を抑制することによって,共生系の機能は保たれていることを示している.1.ディファレンシャルcDNAディスプレイにならびに定量的RT-PCR法によって,若齢菌細胞においてのみ積極的に発現されている遺伝子の1つとして,共生体のリボフラビン・シンターゼ遺伝子が検出された.この結果に基づいて,さまざまな実験を行った結果,宿主アブラムシの必要とするリボフラビン(ビタミンB2)は全面的に共生体によって供給されている事実が明らかとなった.2.パルスフィールド電気泳動法によって直接的に測定した結果,アブラムシ共生体のゲノムサイズは655Kbpであり,近縁の細菌である大腸菌のそれの約1/7であることを突きとめた.また,共生体にはロイシンの合成系の遺伝子を保有するプラスミドの存在することも明らかとなった.

3.アブラムシ共生体が選択的に合成しているGroELホモログ,シンビオニンの構造と機能については,遺伝子組換えによる数種類の改変型ならびに異種昆虫に存在する変異型シンビオニンを用いて調べた.その結果,自己リン酸化とリン酸基転移反応とでは,リン酸化を受けるシンビオニンのアミノ酸残基が異なることが示唆された.4.節足動物のリケッチア様細胞内共生体ボルバキアの宿主の生殖機構への干渉現象をタイワンエンマコウロギを材料として調べた.その結果,ボルバキアはこの昆虫に対して一方向性細胞質不和合をもたらすことが判った.また,ボルバキア感染雄の精子においては,ある種の塩基性タンパク質の等電点が大きく酸性側へシフトしていることが示された.アブラムシの細胞内共生細菌ブフネラ,およびトビイロウンカの細胞内酵母様共生真菌について,大略以下の事実を明らかにした.1.若齢虫および老齢虫の菌細胞共生系における遺伝子発現をdifferential display法で比較した結果,ブフネラ,菌細胞の双方とも,共生が緊密に維持されているときにのみ特異的に発現される遺伝子を十数種類指摘した.その中には,従来の研究結果を裏づけるように,アミノ酸代謝系酵素の遺伝子が多数含まれていた.2.ブフネラはリボフラビンを合成し,宿主に供与していることを示す明確な証拠を得た.3.認識配列に多数のGCを含む制限酵素でブフネラゲノムDNAを切断し,パルスフィールド電気泳動で分析することによって,そのゲノムサイズを657kbpと同定した.このサイズは進化的に近緑であることが明らかな大腸菌ゲノムの1/7にすぎない.4. 2種の遺伝子量のドットブロット解析および細胞のDNA含量の蛍光による直接測定によって,ブフネラは単一の細胞に平均100個以上のゲノムコピーをもつきわめて特殊な細菌であることを明らかにした.また,そのコピー数は宿主昆虫のモルフおよび発生段階によって大きく変動することを示した.5.細菌としては例外的にブフネラはヒストンH1様タンパク質を保有し,それがゲノムDNAと相互作用しつつ存在するらしいことを示した.6.トビイロウンカが組織内に貯蔵する尿酸の可溶化に不可欠である酵母様共生体ウリカーゼ遺伝子のクローニングを行い,大腸菌に組み換えて,同酵素タンパク質の大量発現系の構築を行った.