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オーラル・ヒストリー（聞き書き）を用いた教育実践に関する国際比較研究

本研究では、オーラル・ヒストリー(聞き書き)を用いた国内外の教育実践について横断的に調査し、それぞれの教育実践の共通性と特殊性を国際比較によって明らかにした。具体的には、1アメリカ合衆国ジョージア州の公立学校レイバン・カウンティ高校およびNPO法人Foxfire Fund, Inc.によって取り組まれているフォックスファイヤープロジェクト、2NPO法人共存の森ネットワークが主催する「聞き書き甲子園」、3筑波大学附属坂戸高等学校の科目「環境調査」で行われている聞き書きの授業を対象に、三者の影響関係や同異を明らかにした。本研究の目的は、オーラル・ヒストリー(聞き書き)を用いた国内外の教育実践について横断的に調査し、それぞれの教育実践の共通性や特殊性を国際比較によって明らかにすることである。具体的には、1アメリカ合衆国ジョージア州の公立学校レイバン・カウンティ高校およびNPO法人Foxfire Fund, Inc.によって取り組まれているフォックスファイヤープロジェクト、2NPO法人共存の森ネットワークが主催する「聞き書き甲子園」、3筑波大学附属茶華道高等学校の科目「環境調査」で行われている聞き書きの授業、これら3つの学校・組織で行われているオーラル・ヒストリー(聞き書き)を調査・研究の対象とした。平成25年度は、上記1のアメリカ合衆国ジョージア州の公立学校レイバン・カウンティ高校およびNPO法人Foxfire Fund, Inc.のフォックスファイヤープロジェクトについての現地調査、および文献研究を中心に研究を遂行した。現地調査に関しては、6月22日から7月30までアメリカ合衆国ジョージア州レイバン郡に滞在した。NPO法人Foxfire Fund, Inc.を訪問し、関係者への聞き取り調査や関係者との意見交換を実施した。また、滞在中はFoxfire Fund, Inc.が主催するワークショップに参加した。これにより、フォックスファイヤープロジェクトの背後にある教育思想や教育論についての理解を深め、疑問点についてはワークショップのファシリテーターに直接確認することができた。文献研究については、オーラル・ヒストリー(聞き書き)の理論について、またそれを教育に活かした事例について、国内外の資料を収集し、検討した。その中には、上述の現地調査により収集した、日本国内では入手できない資料も含まれている。本研究の目的は、オーラル・ヒストリー(聞き書き)を用いた国内外の教育実践について横断的に調査し、それぞれの教育実践の共通性と特殊性を国際比較によって明らかにすることである。具体的には、1アメリカ合衆国ジョージア州の公立学校レイバン・カウンティ高校およびNPO法人Foxfire Fund, Inc.によって取り組まれているフォックスファイヤープロジェクト、2NPO法人共存の森ネットワークが主催する「聞き書き甲子園」、3筑波大学附属坂戸高等学校の科目「環境調査」で行われている聞き書きの授業、これら3つの学校・組織で実践されているオーラル・ヒストリー(聞き書き)を調査・研究の対象としている。平成26年度は、上記の1フォックスファイヤープロジェクトに関する文献研究と、2「聞き書き甲子園」についての現地調査および文献研究を中心に研究を遂行した。1に関しては、平成25年度の現地調査で入手した資料を中心に、分析を行った。2に関しては、8月11日(月)14日(木)の4日間にわたって実施された、第13回目となる聞き書き甲子園の「聞き書き事前研修」に参加し、調査を行った。聞き書き事前研修では、講師である作家の塩野米松氏と聞き書き甲子園OBによる「聞き書きの理論についての講義」を高校生と一緒に聞いた。また、高校生がグループに分かれてインタビューを行い、聞き書きレポートを執筆する様子を観察・記録した。さらに、塩野氏によるレポート講評に出席し、聞き書きレポートを作成する際の注意点について、情報を収集することができた。セッションの合間には、NPO法人共存の森ネットワークの事務局長にインタビューし、研究課題に関する情報収集を行うとともに、事務局が独自に作成している聞き書きについての資料を収集した。これをもとに、文献研究を行い、資料の整理と分析を行った。本研究の目的は、オーラル・ヒストリー(聞き書き)を用いた国内外の教育実践について横断的に調査し、それぞれの教育実践の共通性と特殊性を国際比較によって明らかに知ることである。具体的には、1アメリカ合衆国ジョージア州の公立学校レイバン・カウンティ高校およびNPO法人Foxfire Fund, Inc.によって取り組まれているフォックスファイヤープロジェクト、2NPO法人共存の森ネットワークが主催する「聞き書き甲子園」、3筑波大学附属坂戸高等学校の科目「環境調査」で行われている聞き書きの授業、これら三つの学校・組織で行われているオーラル・ヒストリー(聞き書き)を調査・研究の対象とした。平成27(2015)年度は、主として、上記1の教育実践に関する資料の整理および分析と、2の教育実践に関する現地調査を実施した。1の教育実践に関する文献研究に関しては、アメリカ合衆国におけるオーラル・ヒストリーを用いた教育実践について広く調査し、それらの諸実践とフォックスファイヤープロジェクトの同異について分析した。これにより、フォックスファイヤープロジェクトの特徴を明確にすることができた。2の教育実践に関する現地調査の概要と成果はつぎのとおりである。平成27年8月11日から14日にわたって開催された「第14回聞き書き甲子園」に参加し、参与観察に加えて、関係者への聞き取り調査や関係者との意見交換を行った。平成25年度の本研究の開始時から継続的に毎年現地調査を行ったことで、2の教育実践に関する平成27年度の新たな試みについても把握することができた。これは、ひとつの教育実践を通事的に調査・研究してこそ得られる成果である。1アメリカ合衆国ジョージア州の公立学校レイバン・カウンティ高校およびNPO法人Foxfire Fund, Inc.によって取り組まれているフォックスファイヤープロジェクト、2NPO法人共存の森ネットワークが主催する「聞き書き甲子園」、3筑波大学附属坂戸高等学校の科目「環境調査」で行われている聞き書きの授業という、3つの研究対象のうち、1と2に関しては順調に研究を進めているものの、3に関しては研究が遅れているため、やや遅れている、とした。

本研究の目的は、オーラル・ヒストリー(聞き書き)を用いた国内外の教育実践について横断的に調査し、それぞれの教育実践の共通性や特殊性を国際比較によって明らかにすることである。具体的には、1アメリカ合衆国ジョージア州の公立学校レイバン・カウンティ高等学校およびNPO法人Foxfire Fund, Inc.によって取り組まれているフォックスファイヤー・プロジェクト、2NPO法人共存の森ネットワークが主催する「聞き書き甲子園」、3筑波大学附属坂戸高等学校の科目「環境調査」で行われている聞き書きの授業、これら3つの学校・組織で行われているオーラル・ヒストリー(聞き書き)を調査・研究の対象とした。現地調査および文献研究の結果、三者の影響関係や同異を明らかにした。すなわち、2「聞き書き甲子園」は、1フォックスファイヤー・プロジェクトの影響を受けて成立していた。しかし、両者は、オーラル・ヒストリー(聞き書き)の対象と方法において、相違点が見られた。3「環境調査」は、2「聞き書き甲子園」に影響を受け、その内容を参考にしていた。実際、オーラル・ヒストリー(聞き書き)の対象と方法については、1フォックスファイヤー・プロジェクトよりも、2「聞き書き甲子園」との共通点が多かった。1フォックスファイヤー・プロジェクトと3「環境調査」は、グループワークを多用していること、教師がファシリテーターとして学習者を手厚くサポートしていることなど、教育方法に共通点が見られた。その一方で、2「聞き書き甲子園」と3「環境調査」はいずれも、1フォックスファイヤー・プロジェクトの一番の特徴でもあり、精神でもある「学習者の選択」(Learner choice)という原理を体現していないことも明らかになった。本研究では、オーラル・ヒストリー(聞き書き)を用いた国内外の教育実践について横断的に調査し、それぞれの教育実践の共通性と特殊性を国際比較によって明らかにした。具体的には、1アメリカ合衆国ジョージア州の公立学校レイバン・カウンティ高校およびNPO法人Foxfire Fund, Inc.によって取り組まれているフォックスファイヤープロジェクト、2NPO法人共存の森ネットワークが主催する「聞き書き甲子園」、3筑波大学附属坂戸高等学校の科目「環境調査」で行われている聞き書きの授業を対象に、三者の影響関係や同異を明らかにした。
在宅入浴サービスが高齢身障者の生体に及ぼす影響

1.研究方法(1)前年度実施した比較的健康な高齢者群(A群,男6例)と在宅身障老人群(B-a群,男3例,女3例, B-b群,男5例,女5例)に加えて,友部町管内の在宅身障老人群(B-c群,男4例, 68, 82, 83, 85歳,女2例, 61, 85歳)を加えて前年度と同様に,身体計測,肺機能,血圧,心電図,血液生化学(含ホルモン),皮膚温,室温・湿度・湯温等の測定を経時的に実施し,総合的に入浴安全基準の判定資料とした.(2)今年度は単に細菌学的な安全基準を追求する目的で, B-c群の実施に際して,浴槽,給湯水,浴槽中の湯水等ついて,一般細菌,大腸菌,ブドー球菌,真菌について定量培養を実施した.その検索時期は, <1>湯水については結湯前の原水,入浴前,入浴後の浴槽中の湯, <2>浴槽壁については,入浴前,入浴後の浴槽壁各3カ所, <3>入浴後の浴槽の消毒効果については,入浴直後,洗剤のみの洗浄後,さらに逆性石鹸洗浄後の3時点とした.2.研究成績(1)環境変化・生体反応について:<1>湯温,室温,湿度は入浴前後でかなりの変動がみられ,温度計,湿度計による常時観察を要する.<2>露出部皮膚温の低下が高頻度にみられる.<3>血圧,脈拍の動揺強い例あり,とくに入浴終了後に上昇をみることがあり入浴後1020分の経過観察が必要. <4>心電図,呼吸機能は今回の症例では変化はみられなかったが,更に例数を重ねて検討の要あり.<5>肝機能,腎機能,電解質,脂質,血算等は入浴前後で変化を認めなかったが,コルチゾールは入浴後低下を示す例が多く,ストレス解消を思わせたが,反対にかなり上昇した例もみられた.(2)細菌学的検査成績:入浴前の給湯水には一般細菌,大腸菌とも殆んど認めず,入浴後両者とも1ml中に10^310^5に上昇,石鹸と水洗でかなり減少し,さらに逆性石鹸による消毒で入浴前と同様に清浄化された.真菌は入浴前浴壁に微量に認めたが入浴後消失した.〔目的〕高齢身障者の在宅入浴サービスに伴う生理的および生化学的生体反応,精神的影響,日常生活動作に及ぼす影響等を調査するとともに、入浴前後の環境諸条件の管理を含めて入浴サービスの安全基準作りを目的とした。〔研究方法〕1.検査対象:以下のA,B2群の高齢者を対象とした。A群:比較的健康な高齢者群,男6例(61,66,73,74,87,88歳)B群:在宅身障老人群a.土浦市管内:男3例(66,77,80歳),女3例(62,69,86歳)b.日立市管内:男5例(71,74,78,82,89歳),女5例(76,83,85,86,89歳)2.検査項目:A,B両群について、可能な限り以下の項目を測定した。(1)身体計測→入浴前後。(2)肺機能→入浴前,中,後。(3)血圧→入浴前,入浴中23回,入浴後。(4)心電図→入浴前,後は12chで。又、入浴準備の時から入浴中および帰室までは、水中でも可能は端子を装着して、テレメーター心電計で持続的に測定。(5)血液生化学(含ホルモン)→入浴前後。(6)皮膚温→電子体温計で入浴前,中,後随時。(7)室温,湿度,湯温→持続的に。〔研究成績〕1.湯温,室温,湿度:湯温は10分の入浴中にかなり低下、湿度の急上昇の例あり常時観察の要がある。2.皮膚温:湯から露出部で低下するが舌下温は不変。3.血圧:湯につかっているのみなら血圧はかなり低下するが、洗う動作で上昇する例あり。4.呼吸数,心拍数:入浴後にかえって増加する例あり要注意。5.心電図:入浴前すでに虚血性所見示す者でも悪化例はなかった。6.呼吸機能:有意の変化なし。7.血液生化学:肝機能,腎機能,電解質,脂質,血算等に変化はなかったが、ホルモンの中、コルチゾールは低下傾向を示してストレス解消を思わせる例が大部分であったが、A群B群共一部の例では上昇した者もあり、心拍,血圧の動揺例と考え合せ、入浴後20分間は要観察である。1.研究方法(1)前年度実施した比較的健康な高齢者群(A群,男6例)と在宅身障老人群(B-a群,男3例,女3例, B-b群,男5例,女5例)に加えて,友部町管内の在宅身障老人群(B-c群,男4例, 68, 82, 83, 85歳,女2例, 61, 85歳)を加えて前年度と同様に,身体計測,肺機能,血圧,心電図,血液生化学(含ホルモン),皮膚温,室温・湿度・湯温等の測定を経時的に実施し,総合的に入浴安全基準の判定資料とした.

(2)今年度は単に細菌学的な安全基準を追求する目的で, B-c群の実施に際して,浴槽,給湯水,浴槽中の湯水等ついて,一般細菌,大腸菌,ブドー球菌,真菌について定量培養を実施した.その検索時期は, <1>湯水については結湯前の原水,入浴前,入浴後の浴槽中の湯, <2>浴槽壁については,入浴前,入浴後の浴槽壁各3カ所, <3>入浴後の浴槽の消毒効果については,入浴直後,洗剤のみの洗浄後,さらに逆性石鹸洗浄後の3時点とした.2.研究成績(1)環境変化・生体反応について:<1>湯温,室温,湿度は入浴前後でかなりの変動がみられ,温度計,湿度計による常時観察を要する.<2>露出部皮膚温の低下が高頻度にみられる.<3>血圧,脈拍の動揺強い例あり,とくに入浴終了後に上昇をみることがあり入浴後1020分の経過観察が必要. <4>心電図,呼吸機能は今回の症例では変化はみられなかったが,更に例数を重ねて検討の要あり.<5>肝機能,腎機能,電解質,脂質,血算等は入浴前後で変化を認めなかったが,コルチゾールは入浴後低下を示す例が多く,ストレス解消を思わせたが,反対にかなり上昇した例もみられた.(2)細菌学的検査成績:入浴前の給湯水には一般細菌,大腸菌とも殆んど認めず,入浴後両者とも1ml中に10^310^5に上昇,石鹸と水洗でかなり減少し,さらに逆性石鹸による消毒で入浴前と同様に清浄化された.真菌は入浴前浴壁に微量に認めたが入浴後消失した.
グローバルエコノミーにおける分離と総合の問題-民俗問題からのアプローチ-

(1)本研究は、グローバルエコノミーと民族の問題の関係を論ずる視点から、さしあたってハプスブルク帝国の多民族問題を素材に、「分離と統合」の問題を考察するものである。この点、中欧の復活がうたわれている今日、帝国の民族問題の解決に真摯に取り組んだ、オット-・バウアーらオーストロ・マルクス主義の理論家たちの構想の重要性が本研究を通して改めて確認された。今後、オーストリアでの現地調査を通してこの研究を継続する必要がある。(2)本課題を果たすために、洋書、和書の購入、北海道大学の付属図書館並びに国家図書館を中心に、不十分とはいえ文献資料の収集に努めた。(3)北海道、福岡での研究会で社会思想史学会、経済学史学会における民族問題に関心のある研究者の交流を行い、また、経済学史学会大会のフォーラム「民族問題と経済学」で、「オーストロ・マルクス主義と民族問題-オット-・バウアーを中心に」を報告した。(4)本研究の成果は、上記の学会報告で、これに基づき、共著『民俗理論の系譜』(ナカニシヤ出版、1997年出版予定)の1章を分担執筆することになっている。また、平成8年度いっぱい、学術振興会の派遣研究者としてオーストリアで民族問題の実地調査に取りかかる予定である。これらの研究に今回の科学研究費補助金の助成は、まことに役立ったと言える。
アミロイド沈着に起因する神経難病の分子遺伝学的解析

本研究においてはアミロイド沈着を起因とする神経疾患としてアルツハイマ-病、及び家族性アミロイド-シスをとり挙げ、そのアミロイド形成のメカニズムを分子レベルで解決した。以下に主要な成果を列記する。1、βアミロイド前駆体(APP)からβアミロイドが形成される過程はアルツハイマ-病発症の主要メカニズムのひとつであることが明らかとなった。即ち、APP遺伝子の717ValがIleに変異したためにアルツハイマ-病の発症する家系を発見した。717位はβアミロイド領域のすぐ近傍にあり、βアミロイド形成のプロセッシングの過程にこの変異が影響を与えていると考えられる。2、APP遺伝子に変異のない家族性アルツハイマ-病家系では21番染色体上の別の遺伝子(未知)が関与していることが示唆されている。この遺伝子の同定を目指して21番染色体のこの領域の物理地図の作成、及びYACなどにクロ-ン化されたDNAの分離を行った。3、βアミロイド沈着のモデル動物の作成を目指し、APP遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作成した。C末端の100アミノ酸を持つトランス遺伝子を導入したケ-スが有効なことが示唆された。4.家族性アミロイドーシスの病因たん白はトランスサイレチン(TTR)の変異体で、最も主要なものは30位のValのMetへの変異である。従ってアミロイド形成の主因は野生型と変異体の物性の差の中にあると思われる。この目的のため変異体TTRを大量に生産する大腸菌のシステムを完成した。このシステムを用いMetー30TTRを大量に純化し、結晶化することに成功した。現在これを用いてX線解析が進行中である。アルツハイマ-病、アミロイド-シスなどアミロイド沈着を伴う神経疾患の発症のメカニズムを解明することを目的として、アミロイド形成の原因となる蛋白質の構造的特色を遺伝子工学の手法を用いて解析した。先づ家族性アミロイド-シスの病因であるトランスサイレチンの変異体(8種類のものが知られている)を大腸菌を用いて大量に生産させるシステムを開発した。このシステムにより従来は得ることのできなかった変異型トランスサイレチンの精製品をうることができるようになった。このシステムで生産されたトランスサイレチンは天然のものもと同様に4量体を形成し、サイロキシン(T4)の結合活性及びレチノ-ル結合蛋白との結合能を持っていた。現在、これらの蛋白の結晶化を試みている。これらをもとに野性型と変異型との物性の相異を明らかにする。アルツハイマ-病アミロイドの主成分は42アミノ酸から成るβアミロイド蛋白(BP)である。我々はこのBPの前駆体の特性を知るため、その遺伝子の全構造を決定した。その結果、BP前駆体遺伝子は18のエキソンから成り、βアミロイド蛋白は16と17エキソンに渡って存在していた。この結果はβ蛋白が、蛋白のプロセッシングによって生成されることを示している。また、β蛋白がひとつの機能ドメインとして働いている可能性が低いことも示唆された。次に、β蛋白の発現の特性を調べるためHelaの細胞を用いて、熱ショック及びフォルボ-ルエステル(TPA)の影響をノ-ザ-ン法で解析した。その結果、TPAによりβ蛋白遺伝子の発現が著しく促進されることが示された。現在、トランスジェニックマウスの手法によってβ蛋白遺伝子の特性を解析中である。アルツハイマ-病の著名な病理的変化である老人斑の主成分βアミロイド蛋白の発現と生成のメカニズムを解明するため、ヒト及びマウスのβアミロイド蛋白前駆体(BPP)遺伝子の構造的的特色と発現制御について解析を行なった。その結果、以下のような成果がえられた。(1)ヒト

BPP遺伝子の全エキソンをクロ-ニングし、全エキソン及びその近傍のイントロン配列を決定した。その結果、Alternative Splicingをひきおこす第7、8、9エキソンについてはその上流側のSplicingのbranching pointが一般のイントロンとは配列的に幾分異なることが明らかになった。(2)ヒトBPP遺伝子上流の配列から、この遺伝子は転写活性因子APー1、熱ショック蛋白で活性化される可能性が示唆された。そこでHela細胞を用い、TPA及び熱ショック処理を試みたところ、TPAによりBPP遺伝子の発現が数倍上昇した。またラットのPC12細胞を用いた実験から、NGFによりBPP遺伝子発現が有意に上昇した。即ち、BPP遺伝子はAPー1を介する(protein kinase Cを介する)経路で活性化された。(3)BPP分子種のうち、脳特異性の高いBPP695mRNAの分布をPCR法で調べたところ、株化した神経芽腫細胞LAN5でも脳と同様にBPP695が大半であり、NGFで神経細胞へ誘導したPC12細胞でもBPP695mRNAが誘導前の4倍程度に上昇した。一方、グリア細胞系ではBPP695はほとんど認められなかった。従って、BPPmRNAのAltenative Splicingには神経細胞に特異的な因子が関与することが示唆された。(4)マウスBPP遺伝子プロモ-タ-の構造を明らかにし、ヒトとの間で高度に保存され、CATアッセイにより転写制御に重要なことが認められる領域を見い出した。本研究においてはアミロイド沈着を起因とする神経疾患としてアルツハイマ-病、及び家族性アミロイド-シスをとり挙げ、そのアミロイド形成のメカニズムを分子レベルで解析した。以下に主要な成果を列記する。1.βアミロイド前駆体(APP)からβアミロイドが形成される過程はアルツハイマ-病発症の主要メカニズムのひとつであることが明らかとなった。即ち、APP遺伝子の717ValがIleに変異したためにアルツハイマ-病の発症する家系を発見した。717位はβアミロイド領域のすぐ近傍にあり、βアミロイド形成のプロセッシングの過程にこの変異が影響を与えていると考えられる。2.APP遺伝子に変異のない家族性アルツハイマ-病家系では21番染色体上の別の遺伝子(未知)が関与していることが示唆されている。この遺伝子の同定を目指して21番染色体のこの領域の物理地図の作成、及びYACなどにクロ-ン化されたDNAの分離を行った。3.βアミロイド沈着のモデル動物の作成を目指し、APP遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作成した。C末端の100アミノ酸を持つトランス遺伝子を導入したケ-スが有効なことが示唆された。4.家族性アミロイド-シスの病因たん白はトランスサイレチン(TTR)の変異体で、最も主要なものは30位のValのMetへの変異である。従ってアミロイド形成の主因は野生型と変異体の物性の差の中にあると思われる。この目的のため変異体TTRを大量に生産する大腸菌のシステムを完成した。このシステムを用いMetー30TTRを大量に純化し、結晶化することに成功した。現在これを用いてX線解析が進行中である。
シアノバクテリアの光合成乾燥耐性機構に関する研究

1)インタクトな光化学系II標品単離の試み:前年度、細胞破砕法として、従来用いてきたガラスビーズ処理ではなくリゾチーム処理を用いることにより、Anabaenaからよりインタクトな光化学系II標品を単離できる可能性が示唆された。本年度はリゾチーム処理時のリゾチーム濃度、反応時間をさらに詳細に検討した結果、細胞の破砕率はまだ低いものの、ガラスビーズ法で単離したときよりも、酸素発生活性が高い光化学系II標品を単離することが可能になった。この標品は光化学系IIコアサブユニットに加え、これまでの結晶構造解析では検出されていないフィコビリソームを構成するフィコビリタンパク質を結合していたことから、従来の精製標品よりも大きな複合体を構成している可能性が示唆された。さらに、リゾチーム法で精製した標品はガラスビーズ法で精製した標品に比較して、光化学系IIはより多くが活性型の二量体として存在することが示唆された。2)Anabaena光化学系II標品のストレス耐性:環境ストレス耐性実験として、乾燥ストレス実験に比べ実験系がより確立している酸素発生の高温耐性について、単離した光化学系II標品を用いて、Anabaenaと同様に中温性のシアノバクテリアであるSynechocystisと比較した。Anabaena光化学系II標品はSynechocystisよりも少し低い温度で酸素発生の高温失活がおこった。一般に表在性タンパク質PsbOの解離と酸素発生の失活は相関があると考えられているが、Synechocystisでは高温失活の過程で表在性タンパク質PsbOが解離したが、AnabaenaではPsbOの解離がみられなかった。Anabaenaでは光化学系IIへのPsbOの結合様式がSynechocystisとは異なるかもしれない。本研究では乾燥ストレス処理前後の光化学系II構成タンパク質の変化を調べる必要があるが、Anabaenaからインタクトな光化学系II複合体を単離するのは困難であるため、実験条件の設定に時間がかかった。一方、その過程で、Anabaenaから従来のSynechocystisでは単離できなかったフィコビリソームの一部を含む光化学系II複合体と思われる興味深い複合体標品が単離可能になり、光合成光化学系II複合体の全体構造を明らかにする上で意義深い結果が得られつつある。Anabaenaからフィコビリソームと呼ばれるアンテナ成分を一部保持した光化学系II標品を単離できる可能性が示された。この標品は従来のシアノバクテリア光化学系IIの解析では困難であったアンテナとコアタンパク質の相互作用を解析するための有用なツールとなりうるので、引き続き、本標品の単離法の改善と解析に力を入れる。次年度は、精製法の改善と並行して、乾燥ストレスもしくは乾燥ストレスに近似した高浸透圧処理前後で光化学系II標品のタンパク質組成に変化があるかを解析する。1)細胞を用いた乾燥ストレスが光合成に与える影響の解析: AnabaenaとSynechocystisの細胞をフィルター上に静置し、乾燥処理でおこる脱水に伴う光化学系IIの活性変化をクロロフィル蛍光測定等により解析した。AnabaenaがSynechocystisに比較して、光化学系II活性の指標となるクロロフィル蛍光パラメーターFV/FMが乾燥ストレスでより容易に低下することがわかった。乾燥に強いAnabaenaの方が耐性のないSynechocystisに比べより容易に光化学系II活性が低下することから、Anabaenaが乾燥下での光酸化ストレスを回避する機構をもつことが推測された。しかし、乾燥後の吸水で光化学系II活性を回復する条件は、実験系制御の困難さから決定できなかった。そこで、乾燥処理と似た効果があり、かつ、実験条件を容易に制御できる処理である、ソルビトールを用いた高張処理の実験系を導入した。高張処理においてもAnabaenaがSynechocystisに比較して、光化学系II活性の指標となるFv/Fmおよび酸素発生活性がより容易に低下することがわかった。今後は高張処理後に浸透圧を正常化したときに光化学系II活性が回復する条件を検討する。2)インタクトな光化学系II標品単離の試み: Anabaenaの細胞破砕条件を検討することにより、よりインタクトな光化学系II標品を単離することを試みた。従来用いてきたガラスビーズ処理ではなくリゾチーム処理を用いることにより、よりインタクトな光化学系II標品が単離できる可能性が示唆された。ただし、まだ、細胞破砕率の再現性が安定しないことから、さらによい破砕条件を検討する。本標品では、SDS-PAGEで従来の光化学系II標品でみられなかったタンパク質バンドがみられたので、質量分析を用いてこれらバンドを同定する予定である。AnabaenaがSynechocystisより、乾燥処理でより容易に光化学系IIの活性が低下することは想定と異なっていたが、その急速な活性低下には乾燥から細胞を守る生理的役割があることが予測された。そこで、当初の予定通り、ストレス処理前後の細胞から各々光化学系II標品を単離し、その光合成特性を比較する研究をおこなう。また、リゾチーム処理を用いて単離したAnabaena光化学系II標品では、よりインタクトで大きな複合体を保持している可能性を示唆する興味深い知見も得られている。

本年度はリゾチーム処理時のリゾチーム濃度、反応時間をさらに詳細に検討した結果、細胞の破砕率はまだ低いものの、ガラスビーズ法で単離したときよりも、酸素発生活性が高い光化学系II標品を単離することが可能になった。この標品は光化学系IIコアサブユニットに加え、これまでの結晶構造解析では検出されていないフィコビリソームを構成するフィコビリタンパク質を結合していたことから、従来の精製標品よりも大きな複合体を構成している可能性が示唆された。さらに、リゾチーム法で精製した標品はガラスビーズ法で精製した標品に比較して、光化学系IIはより多くが活性型の二量体として存在することが示唆された。2)Anabaena光化学系II標品のストレス耐性:環境ストレス耐性実験として、乾燥ストレス実験に比べ実験系がより確立している酸素発生の高温耐性について、単離した光化学系II標品を用いて、Anabaenaと同様に中温性のシアノバクテリアであるSynechocystisと比較した。Anabaena光化学系II標品はSynechocystisよりも少し低い温度で酸素発生の高温失活がおこった。一般に表在性タンパク質PsbOの解離と酸素発生の失活は相関があると考えられているが、Synechocystisでは高温失活の過程で表在性タンパク質PsbOが解離したが、AnabaenaではPsbOの解離がみられなかった。Anabaenaでは光化学系IIへのPsbOの結合様式がSynechocystisとは異なるかもしれない。本研究では乾燥ストレス処理前後の光化学系II構成タンパク質の変化を調べる必要があるが、Anabaenaからインタクトな光化学系II複合体を単離するのは困難であるため、実験条件の設定に時間がかかった。一方、その過程で、Anabaenaから従来のSynechocystisでは単離できなかったフィコビリソームの一部を含む光化学系II複合体と思われる興味深い複合体標品が単離可能になり、光合成光化学系II複合体の全体構造を明らかにする上で意義深い結果が得られつつある。乾燥処理による脱水条件を実験室内で精密に制御するのは予測よりも困難であった。これが研究推進の律速になっていたので、乾燥処理に近似できるよりよい実験系を検討した。その結果、ソルビトールを用いた高張ストレスが乾燥ストレスと近似できることがわかったので、今後は高張ストレス細胞も用いて研究を進める。乾燥処理では脱水の速度を制御するのが難しく再現性を得るのに手間と時間がかかったが、高張ストレスはソルビトール濃度で容易にストレス強度を再現性よく制御可能なため、研究の推進速度を上げることができると考えられる。Anabaenaからフィコビリソームと呼ばれるアンテナ成分を一部保持した光化学系II標品を単離できる可能性が示された。この標品は従来のシアノバクテリア光化学系IIの解析では困難であったアンテナとコアタンパク質の相互作用を解析するための有用なツールとなりうるので、引き続き、本標品の単離法の改善と解析に力を入れる。次年度は、精製法の改善と並行して、乾燥ストレスもしくは乾燥ストレスに近似した高浸透圧処理前後で光化学系II標品のタンパク質組成に変化があるかを解析する。当該年度はほぼ予定通りに予算を使用することができた。
ペルオキシソーム形成の分子基盤の解明

本研究では、細胞小器官ペルオキシソーム形成機構を分子レベルで解明することを目的としている。本年度は、1)VDAC2欠損変異CHO細胞ZP114の解析及び2)ペルオキシソームターゲティングシグナル(PTS)受容体Pex5pおよびPex7pの細胞内動態をin vitro輸送系を用いた解析を行った。1)前年度までに、VDAC2欠損細胞であるZP114にBcl-xLを過剰発現させることで、VDAC2欠損によって亢進されているアポトーシス応答が抑制され、同時にペルオキシソーム形成能が回復する事を見い出した。今年度は、この結果を受けて、アポトーシス促進因子であるBakがZP114においてペルオキシソーム形成に対して何らかの影響を与えているのではないかと考え、ZP114に対して、RNA干渉法によってBakの発現を抑制した。結果、予想通りZP114において、ペルオキシソーム形成能の回復が観察された。2)Pex7pのin vitro輸送系を用い、Pex7pの細胞内動態の解析を行った。結果、Pex7pはPex5pと同様、ATP非依存的にペルオキシソームにインポートされていること、Pex7pがPex5pLを介してインポートされること、Pex7pとPex5pがペルオキシソーム上で異なった割合でペルオキシソーム上膜ペルオキシン群と複合体を形成していること等を明らかにした。さらに、Pex5pのドミナントネガディブ変異体を線虫の神経細胞に発現させ、線虫の神経細胞においてペルオキシソーム形成を阻害し、神経におけるペルオキシソームの役割を明らかにする事を試みた。結果、神経細胞にPex5pドミナントネガティブ変異体を発現した線虫は、行動に異常を示した。今後、この線虫をさらに詳細に解析する事で、神経系におけるペルオキシソームの高次機能について新規の知見を得る事ができると期待している。本年度は、1)ペルオキシソーム欠損性変異CHO細胞ZP114の相補遺伝子である、Voltage dependent anion channel 2(VDAC2)の機能解析および2)ペルオキシソームターゲティングシグナル1(PTS1)受容体Pex5pのin vitro輸送系を用いた解析を行なった。1)VDAC2はアポトーシスを抑制する事が近年報告されている。そこで、このことを当研究室で分離されたVDAC2欠損細胞であるZPI14についても検証した。結果、ZP114では、アポトーシス誘導剤であるSTS処理によって起こるミトコンドリアからのシトクロムCの放出量が野生型CHO細胞に比べて多いということが分かった。これはVDAC2がアポトーシスを抑制するという知見を支持するものである。また、Bcl-2ファミリーに属するアポトーシス抑制因子であるBcl-xLの過剰発現は野生型細胞と同様にZP114でも効率よくシトクロムCの放出を抑制することが明らかになった。このことから、VDAC2とBcl-xLは独立の経路でシトクロムCの放出を抑制することを示唆している。2)サイトソルとペルオキシソームをシャトルするPTS1受容体Pex5pの細胞内動態をin vitro輸送系を用いて解析した。今年度、AAA ATPase peroxinであるPex1p、Pex6PはPex5Pのインポートには必要ではなく、エキスポートに必要であることを明らかにした。また、Blue Native PAGEを用いた解析の結果、Pex5pは、ペルオキシソーム膜上で、Pex14p、Pex2pなどの因子と相互作用し、高分子量の複合体を形成する事を明らかにした。1)前年度から引き続き、VDAC2欠損細胞ZP114の解析を行なっている。前年度、ZP114ではSTS刺激下においてミトコンドリアからのシトクロームCの放出が野生型細胞のそれよりも亢進されていること。また、アンチアポトーシス因子であるBcl-xLの過剰発現によって、ZP114においてシトクロームCの放出が抑制されることを明らかにした。今年度はさらに、このBcl-xLの過剰発現によってZP114のペルオキシソーム形成能が回復する事を明らかにした。これより、ZP114においてVDAC2の欠損によるアポトーシス応答性の上昇と、ペルオキシソーム形成の異常には密接な関係がある事が示唆された2)Pex5pの機能解析について前年度得た成果は、論文として発表した。今年度はさらにPTS2受容体Pex7Pについても同様にin vitro輸送系の構築を試みた。結果、Pex7pは野生型CHO細胞由来のペルオキシソームへのみ輸送がみられ、変異細胞由来のものには輸送されなかった。このことから、これが機能的なin vitro Pex7p輸送系であると判断した。この系を用い、Pex7pのペルオキシソームへの輸送はPex5p依存的、ATP非依存的であることを示した。

1)前年度までに、VDAC2欠損細胞であるZP114にBcl-xLを過剰発現させることで、VDAC2欠損によって亢進されているアポトーシス応答が抑制され、同時にペルオキシソーム形成能が回復する事を見い出した。今年度は、この結果を受けて、アポトーシス促進因子であるBakがZP114においてペルオキシソーム形成に対して何らかの影響を与えているのではないかと考え、ZP114に対して、RNA干渉法によってBakの発現を抑制した。結果、予想通りZP114において、ペルオキシソーム形成能の回復が観察された。2)Pex7pのin vitro輸送系を用い、Pex7pの細胞内動態の解析を行った。結果、Pex7pはPex5pと同様、ATP非依存的にペルオキシソームにインポートされていること、Pex7pがPex5pLを介してインポートされること、Pex7pとPex5pがペルオキシソーム上で異なった割合でペルオキシソーム上膜ペルオキシン群と複合体を形成していること等を明らかにした。さらに、Pex5pのドミナントネガディブ変異体を線虫の神経細胞に発現させ、線虫の神経細胞においてペルオキシソーム形成を阻害し、神経におけるペルオキシソームの役割を明らかにする事を試みた。結果、神経細胞にPex5pドミナントネガティブ変異体を発現した線虫は、行動に異常を示した。今後、この線虫をさらに詳細に解析する事で、神経系におけるペルオキシソームの高次機能について新規の知見を得る事ができると期待している。
弦双対性の代数幾何学的側面

清水は、弦双対性に現れる代数的可積分系の中で2次元共形場理論と関わるHitchin系に備わるシンプレクティック構造を調べた。また、上野と共に4次元共形場理論(アーベル的模型)のWittenによる模型に登場するトーラスを複素構造、Riemann形式の厳密な構成をした。斎藤は、Painleve方程式を変形理論の立場から捉え直した。また、細野忍、高橋篤史と共同で、有理曲線の数え上げに関するGopakumar-Vafaの予想を有理楕円曲面の場合に確認した。小林は、シンプレクティックな回転の応用としてK3曲面の超越格子の分解と特殊ラグランジュ的なT@@S12@@E1ファイバー構造との関係やシンプレクティック複素4次元多様体の特異点に関する結果を得た。前野は、量子コホモロジー環の変形との関連でCoxeter群の量子不変多項式を研究した。1998年5月には、清水が八ヶ岳泉郷で「弦理論に関するワークショップ」を開き、タイプIIA理論とヘテロ理論の双対性のハイパーマルチプレット・モジュライに関する進展及びヤコビ形式の応用、位相的Yang-Mills理論の応用(E-string)、CFT/AdS対応の進展等のテーマについてサーベイ、討議等を行った。1998年12月には、清水が松尾泰(東大理)と共同で関西セミナーハウスに於て「弦理論に関するKSHワークショップ」を開き、主に物理学者向けのFourier-Mukai変換、楕円曲面とMordell-Weil格子、点のHilbertスキーム等に関する入門的講義と、タイプIIA理論とヘテロ理論の双対性の幾何学的対応、グロモフ・ウィッテン不変量とヤコビ形式、ブラックホールと代数曲線の数え上げ等について講演、討議等を行った。清水は、(HE/IIA)弦双対性を特殊ケーラー幾何の観点から研究した。また、上野・清水は、共形場理論(WZW模型)の相関関数の明示的表示を種数を還元する立場から研究した。斉藤は、細野忍、Jan Stienstraの協力を得て、Schoenのカラビ・ヤウ多様体のグロモフ・ウィッテン不変量の計算を完了した。小林は、楕円ファイバー構造を持つカラビ・ヤウ多様体で実点集合が実3トーラスになる例を構成した。前野は、B型の旗多様体の量子コホモロジー環の変形を量子シューベルト多項式の観点から研究した。1997年7月には、谷口シンポジウム「可積分系と代数幾何学」を神戸・京都で開催した。海外からの研究者8名、本研究の分担者を含む日本の研究者8名と大勢の参加者が集まり、最新の研究発表がなされ、研究動向が伺える研究会となった。本研究課題にも大きな助けと励みになった。1998年1月には、清水が京都でワークショップ「代数的可積分系と超弦理論」を開き、スペクトル曲線ないしブレイン(Brane)に関連する可積分系、ドナルドソン不変量に関する進展、変形量子化等のテーマについてサーベイ、討議等を行った。1998年2月には、斉藤が東京で研究集会「量子コホモロジーとその周辺」を開き、グロモフ・ウィッテン不変量の代数的基礎付け、シンプレクティックな構成法との比較、ミラー対称性の数学的定式化等について講演、討議等を行った。
上皮成長因子受容体変異陽性肺癌を対象としたTKI耐性機序の解明

近年の標的分子の探索と分子標的薬の開発は、特定の肺癌の治療成績を格段に向上させたが、感受性とともに耐性機序の解明とその克服が大きな課題である。上皮成長因子受容体。(EGFR)の耐性機序に関して、適切な臨床試験から得られる。EGFR-TKI治療前後の肺癌組織試料、特にほぼ完全に耐性化した細胞だけが残存していると考えられる試料を解析することで、既知・未知の耐性機序の解明を行い、バイオマーカーを指標にしたBiomarker Based Medicineを確立し、より安全で適切・確実な薬物療法を含めた肺癌の集学的治療を構築することが大きな目標である。九州肺癌研究機構LOGIKにおいて行われる2つの第II相試験の付随研究(LOGIK1102とLOGIK1105におけるバイオマーカー探索に関する付随研究)の研究計画書を作成し、平成26年度に開始できる予定である。これにより、EGFR-TKI治療前、EGFR-TKI治療後PD時、化学療法を上乗せしたEGFR-TKI治療後に再燃が確認された時点、での3ポイントでの組織検体が今後収集可能となる。上皮成長因子受容体(EGFR)の活性型遺伝子変異症例には、そのチロシンキナーゼ阻害剤(EGFR-TKI)が奏効するが、通常1年程度で獲得耐性が出現する。EGFR-TKI治療前(耐性前)後(耐性後)の生体試料から耐性機序の解明を行い、バイオマーカーを指標にした医療(Biomarker Based Medicine)を確立することが本研究の大きな目標である。EGFR変異陽性患者に対してEGFR-TKI (gefitinib)が投与され、奏効した後に耐性となった5名の患者の再燃腫瘍を解析し、獲得耐性として、EGFR T790Mを2例、小細胞癌への転化を1例認めた。小細胞癌への転化症例について、免疫組織化学的に神経内分泌のマーカー(NCAM, Synaptophysin)を検索した結果、TKI治療前の癌組織において、ごく少量の神経内分泌産生細胞を有していることを見出した。すなわち耐性となる素因が早い時期から存在し、このような原発癌の多様性が、癌治療の耐性機序に関与していることを示唆した。さらに、TKI治療前と耐性後の癌組織を次世代シークエンサーにて解析した結果、TP53の変異率の増加を認め、コピー数の増加を5q, 9p, 14q(AKT1), 17q(ERBB2), 19pに、コピー数の低下を8qに認めた。以上から、薬剤の耐性機序には、癌の多様性が、大きく関与していると推察され、多様性と遺伝子変異の量およびDNA修復の観点から、解析を推進する予定である。呼吸器外科臨床試験(付随研究)の承認が遅れているため、全体の研究がやや遅れている。九州肺癌研究機構LOGIKにおいて行われる「EGFR-TKIにより病勢コントロールが得られた非小細胞肺癌症例を対象としたEGFR-TKI継続投与の意義を検討するランダム化第II相試験(LOGIK1102)」と「EGFR遺伝子変異陽性高齢者未治療進行非小細胞肺癌を対象としてゲフィチニブにより病勢コントロールが得られた後ゲフィチニブ継続投与の意義を検討する無作為化第II相臨床試験」の2つの臨床試験の付随研究(LOGIK1102とLOGIK1105におけるバイオマーカー探索に関する付随研究)を推進し、EGFR-TKI治療前、EGFR-TKI治療後PD時、化学療法を上乗せしたEGFR-TKI治療後に再燃が確認された時点、での3ポイントでの組織検体の採取を加速させる。当研究施設に保存されている実地臨床で得られた切除肺癌組織検体(初回)、再発検体、EGFR-TKI療法が行われた症例の治療後で組織検体、についての遺伝子解析を、次世代シークエンサーを用いたゲノミクス解析(AmplSeq Cancer Hotspot Panel v2など)にて用いて行い、既知、未知の耐性遺伝子変化を検出する。また、種々のタンパク発現解析を免疫組織学的に行う。臨床試験の付随研究の承認遅れに伴い、研究計画の一部を平成26年度に繰り越すことになった。平成25年度分を平成26年度分とする予定である。
膜脂質保護薬におけるアポトーシスの抑制

神経細胞死が膜の情報伝達系を介して細胞質の蛋白質リン酸化酵素を活性しDNAの異常を起こし、組織学的にはアポトーシス小体や核の断片化などの所見からアポトーシスの現象として認められている。生体膜では細胞内小胞輸送や情報伝達の機能をもったタンパク質の周りにはスフィンゴ脂質やコレステロールが集積し、効率よくその機能を発揮す「rラフト」が注目されている。このラフトの機能を支える脂質二重層にはコレステロールとメフィンゴ脂質(SM、ガングリオシドなど)が密にパッキングされてる。本研究は虚血負荷における脂質二重膜の膜リン脂質、スフィンゴ脂質の代謝過程を検討し、この結果から虚血に対する神経細胞死の保護を目的として保護物質、低体温や虚血耐性による効果を脂質生化学的に研究した。1)L-PDMPの膜脂質の保護作用-スフィンゴ糖脂質の合成促進をするL-PDMをラット中大脳動脈の永久閉塞モデルを作製し1週間後から14日間投与した。Penumbra領域の大脳皮質ではガングリオシド生合成の中間代謝産物のグルコシルセラミドが1.5倍に増加し、記憶や学習の機能をもつ海馬では2倍に増加したスフィンゴ脂質の増加は膜の受容体であるラフトの構成脂質を保護し、効率よく機能させた。その結果としてモリスの水迷路実験では、L-PDMP投与ラットで学習の習得時間が短縮した。2)低体温におけるアポトーシスの抑制-砂ネズミの一過性前脳虚血を用い、低体温が虚血・再潅流時の遊離脂肪酸、特にアラキドン酸の変動(減少速度)にどのように影響するかを検討した。虚血低体温群の再開通後のアラキドン酸の減少が抑えられていることは、血流再開による活性酸素発生に伴うフリーラジカルやロイコリエンの産生を、低体温が抑制して遅発性神経細胞死の保護作用に関与していることを示唆した。3)虚血耐性による細胞死保護-虚血耐性を獲得した砂ネズミでは、虚血による遊離アラキドン酸量が抑制されていたが、耐性獲得によって上記遊離脂肪酸の放出に関する機構に変化が起こり膜保護作用をしめしたと考えられる。以上アポトーシスを抑制する機構について障害されたラフトの再生にL-PDMPの効果が認められた。さらにアラキドン酸の遊離の抑制に非致死的な虚血が有効であり、低体温ではアラキドン酸の過酸化を抑え、ラジカルによるDNAの損傷を保護しアポトーシスを抑制したと考えられた。細胞の成長促進や抑制にスフィンゴミエリン・サイクルが関与すると言われている。砂ネズミの海馬の遅発性神経細胞死についてスフィンゴミエリンの変動を検討した。砂ネズミをフローセン麻酔下に体温を37.4±0.4°Cに保ち両側総頚動脈を5分間クリップし再開通0,15,30,90分、48、96時間にマイクロウエーブで処理し、Folch法にて脂質抽出後、HPTLCとGLCで定量した。定量にはC-17脂肪酸が酸アミド結合したスフィンゴミエリン、セラミドを内部標準とした。

スフィンゴミエリンは虚血再開通30分で有意に減少し、その後90分で元のレベルに戻り、48時間では再度減少した。前脳虚血再開通モデルの海馬におけるプログラムされた細胞死にスフィンゴミエリン・サイクルの関与が示唆された。さらに薬物による細胞内のスフィンゴミエリンサイクルをコントロールする目的でスフィンゴ脂質合成を促進するL-PDMPと抑制するD-PDMPを投与し海馬と大脳皮質でのスフィンゴミエリンとセラミドの変動を検討した。砂ネズミ(60-90g)を用い、40mg/kgのPDMPを1日2回腹腔内に4日間投与し、5日目にマイクロウエーブ処理した。薬剤はD-,L-PDMPとvehicle(Tween 80)の3群で各群5匹で比較した。スフィンゴミエリン、セラミドの定量は上記の方法で行なった。L-PDMPを4日間投与後、スフィンゴミエリンは海馬において、7.83mmol/kgでvehicle(5.11mmol/kg)と比較し有意に増加したが、大脳皮質では有意差は認められなかった。またセラミドはD-PDMP投与で大脳皮質で1.6倍、海馬で1.4倍の増加が見られた。D-PDMP投与によるセラミドは大脳皮質と海馬の両部位とも増加しスフィンゴリピドの合成阻害が認められた。しかしL-PDMPによるスフィンゴミエリンの増加は海馬に多く、スフィンゴミエリンの合成促進は学習などの海馬の機能面から注目され、次年度はラット局所脳虚血モデルを用いL-PDMPを投与し水迷路での学習効果を検討する。前年度、スフィンゴ脂質の合成促進剤であるL-PDMPを砂ネズミに投与した結果、海馬と大脳皮質においてスフィンゴミエリンとグルコシルセラミドの増加を認めた。今年度は、ヒトの梗塞脳に近いモデルであるラットの左中大脳動脈閉塞モデルを作製し、虚血負荷による梗塞周辺部のペナンブラ領域の遅発性細胞死の保護と動物の学習効果についてL-PDMPを投与し比較検討した。SDラットを田村の方法で左中大脳動脈(MCA)の永久閉塞モデルを作製、1週間後からTween 80に溶解したL-PDMP(40mg/kg)とVehicleとしてTween 80のみを腹腔内に2週間投与する。学習は予めMCA閉塞モデルを作製前に5日間ウオーターメイズで学習させ、モデル作製後1週間からL-PDMPを2週間投与し、術後19、20、21日目に習得能力を時間で判定した。学習評価終了時に痲酔下でマイクロウエーブ照射後、梗塞部とその周辺部を含んだ左大脳皮質と海馬を取り出した。Folch法で抽出された総脂質からセラミド、セレブロシド、スフィンゴミエリンの定量には、おのおのC17の脂肪酸を酸アミド結合したセラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシドの内部標準を加えた。HPTLCで展開後、各部分をかきとり、5%塩酸メタノールでメタノリーシス後、セラミド、スフィンゴミエリンはヘキサン抽出しガスクロマトグラフィ(GLC)で脂肪酸量を定量した。セレブロシドの糖組成の比率(グルコース/ガラクトース)は、ヘキサン抽出した下層のメタノール層をTMS化しGLCで分析した。セラミドとスフィンゴミエリン量はL-PDMP群とVehicle群で有意差は見られなかったが、セレブロシドのグルコース/ガラクトース比はL-PDMP群で有意に増加しており、グルコシルセラミドへの合成過程が促進していた。学習評価では記憶保持には有意差は認めないが、繰り返しの学習による3日目(21日目)の習得スピードが短縮し、L-PDMP群で学習の再獲得に効果が認められた。
甲状腺ホルモンの新しい代謝調節機構:筋酵素遺伝子のスプライシングとその異常

ホルモン作用による代謝調節機構に関して、従来もっぱら転写レベルにおける遺伝子発現調節の分析が進められてきたのに対し、本研究では転写以降の重要ステップであるスプライシングに対するホルモン作用を検討することを目的とした。プリン分解のkey enzymeであるAMPデアミナーゼの筋型遺伝子(AMPD1)は、組織特異的な様式で、alternativeにスプライスされることを明らかにしている。そこで、甲状腺ホルモン欠乏ラットにおいて、同遺伝子の発現と翻訳産物の変動を分析し、1)筋内のAMPD1mRNAsは、量的に変化しなかった。2)AMPD1のalternative mRNAsの比率は、長趾伸筋(白筋)とヒラメ筋(赤筋)で著しく異なっていた。3)甲状腺ホルモンの欠乏によって、AMPD1のalternative mRNAsの比率は長趾伸筋では変化しないが、ヒラメ筋で有意に変化した。4)AMPデアミナーゼの酵素活性は、長趾伸筋では変化しないが、ヒラメ筋で有意に増加した。の成績を得た。以上、甲状腺ホルモンが、筋ファイバータイプに依存してAMPD1のalternative splicingに影響し同酵素活性を変動させることを明らかにし、スプライシングレベルでの作用を介するホルモンの代謝調節機構を示した。の成績を得た。
アシルニトロソ化合物の分子内エン反応を機軸とする生物活性海洋アルカロイドの合成

ハリクロリン及びピンナ酸は、6-アザスピロ[4.5]デカンを共通基本骨格とする特異な分子構造を有し、それぞれ細胞接着分子(VCAM-1)の産生阻害活性あるいは細胞質ホスホリパーゼ阻害(cPLA_2)活性を有することから疾病治療薬開発のリード化合物として期待されている海洋アルカロイドである。本研究は、独自の経路によるハリクロリン及びピンナ酸の全合成を目指して行われたものであり、以下に述べる成果を得ることができた。初めに、シクロペンテノン環のアリル位にアルコキシ置換基を有するアシルニトロソ化合物のanti面選択的分子内エン反応を検討することによりアザスピロ[4.5]デカン体を単一立体異性体として得る方法を確立した。このエン反応成績体よりC-5位への立体選択的エチニル基導入を経て5R^*-置換アザスピロ[4.5]デカン-13-オンにを合成した。次いでC-13位へのアリル基導入を経由して3環性ラクタムを構築の後、立体選択的水素化及びC-14メチル化を経てハリクロリン及びピンナ酸訂正式に共通する立体配置を備えた14R^*-メチル-オクタヒドロシクロペンタ[i]インドリジノンを合成した。さらに本化合物のラクタム環開環、ヒドリド還元を経て良好な収率で開環成績体である(5R^*,13R^*,14R^*)-5,13-ジ置換アザスピロ[4.5]デカンに導くことができた。本化合物を共通中間体として用い、2級アミノ基保護、官能基変換、Horner-Emmons反応などからなる5工程を経てピンナ酸の形式全合成を達成した。さらに、アザスピロデカン共通中間体より、C-5置換基のアリル基への変換、N-2-(エトキシカルボニル)-アリル化を経てジエンを合成し、オレフィン閉環メタセシスを適用すると高収率でキノリジジン環が構築された。最後にO-脱保護することによりハリクロリンの形式全合成を達成することができた。海洋生物から単離されたハリクロリン及びピンナ酸はそれぞれ、細胞接着分子の産生阻害活性あるいは細胞質ホスホリパーゼ阻害活性を有することから疾病治療薬開発のリード化合物として期待されている。アシルニトロソ化合物の分子内閉環反応による6-アザスピロ[4.5]デカン共通骨格構築を機軸とするハリクロリン及びピンナ酸の立体選択的合成法の確立を目的として本研究を行い、当該年度においては以下の結果を得た。シクロペンテン環上のアリル位にアルコキシ置換基を有するアシルニトロソ化合物のanti面選択的分子内エン反応により立体選択的に得られた6-アザスピロ[4.5]デカン体のC-5位への立体選択的エチニル化について検討したところ、オレフイン還元の後にリチウムアセチリドによる求核付加、続くヒドリド還元を行うことにより首尾よく達成することができた。さらに数工程を経て5(R^*)-アルコキシエチル-6-アザスピロ[4.5]デカン-13-オンに変換した。次いで、C-13位への(R^*)-2-アルコキシ-1-メチルエチル基の立体選択的導入について検討した。