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医療供給体制整備における国家行政・地方自治・機能自治の交錯

医療給付水準・内容といったサービス水準の決定は必ずしも地方公共団体でなければ行えない訳ではなく、また事業活動それ自体も区域を有さない者も行える。すなわち、これらは機能自治団体でも、さらには民間事業者でも行える。このことは、区域を有することに特質を持つ地方公共団体でなければ処理できない事務としての空間管理の内実をさらに詰めなければならないことを、しかしその際には、地方自治と機能自治の比較、様々な団体の協働という観点から考察することが今後も有益であることを示していると言える。このほか、地方公共団体の活動に関する統制手段として重要な機能を有する住民訴訟につき、それを通した個人責任追及の限界をいかに設定すべきかの問題、行政活動をどのように認識するのか、特に社会を対象とする行政活動の特色は何かといった問題に関する研究も行われ、成果が公表された。今回の研究は、医療供給体制整備に関する国家行政・地方自治行政・社会保険団体及び医療提供集団の機能自治の交錯を研究するものであった。特に今回は、地方公共団体が、機能自治団体や他の民間活動主体と異なって区域を有し、空間管理権能を持つことに着目した研究が行われた。しかし同時に、医療などのサービス提供体制整備に当たっては、区域に住所を有さない非住民をも考慮に入れた体制整備が求められること、このサービス提供活動は、区域を持たない主体も行いうることから、空間管理としての供給体制整備という点で満足するのではなく、その内実にさらに踏み込んだ分析が必要となることが明らかとなった。制度それ自体に関する論考は公表されていないにせよ、それを分析するための基本的視角に関する研究は進展し、すでに一部、論考も公表されているので。当初の計画通り、現在把握されている制度の特色を押さえ、評価するための理論的な反省作業を行いたいと考えている。とりわけ機能自治においても処理しうる事務と地方自治でなくては処理しえない事務の性質の違いが一つの手掛かりを与えるであろう。もっとも、当初予定していた基本権や民主政原理からの分析という視角との統合をいかに行うかの問題が生じており、この部分への研究が優先されることになるかもしれない。また、以上の諸作業が、これが外国法との比較研究という形で公表されるか、日本法に関する分析として示されるかは、各研究分担者の選択に委ねられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。行政法従来の計画どおりに行う。医療供給体制整備に係る考察を公表できれば望ましいかもしれないが、分析なしの論考では紹介にしかならないので、高い必要があるわけでもない。メンバーの理論的関心に沿った分析視角から検討を深めることがヨリ重要であろう。海外旅費として割り当てた予算が、スケジュールの都合上、来年度に延期にせざるをえなくなった、あるいは発注した資料が予定通りに出版されなかったなどが主たる理由である。一部は、発注した本の出版が遅延するなどの理由に基づくもの、一部は、スケジュールの都合により次年度以降の出張のために繰り越したものである。延期された海外出張を行い、また資料の入手を急ぐなど、使用計画に従った執行を行う。
天然代替甘味物質の発がん予防作用に関する研究

生活習慣病の中で、肥満・糖尿病及びその合併症は、最も深刻な問題であり、ショ糖代替甘味物質の研究はきわめて重要な研究課題である。そこで、天然代替甘味料として広く利用されているステビア葉のジテルペン配糖体steviosideについて、抗発がんプロモーター作用を明らかとし、次いで中国広西壮族自治区の特産植物Momordica grosvenoriの果実・羅漢果に含有されるcucurbitan型のトリテルペン配糖体mogroside Vにも同様の強い抗発がんプロモーター作用が認められることを明らかとした。更に、糖尿病患者血清中に高濃度に出現するAdvanced Glycation Endproducts(AGE)が、顕著な発がんイニシエーターとなることに着目し、これら天然代替甘味料の抗発がんイニシエーション作用を検討することにより、発がん予防作用に関する研究を行なった。その結果、羅漢果に含有される11-oxo-mogroside Vには、AGEにより誘起される発ガンイニシエーション作用に対する顕著な抑制効果があることを明らかとした。また、UVBの照射、窒素酸化物などによる発がんイニシエーション作用に対しても顕著な抑制効果があることを明らかとした。従って、天然代替甘味物質には発がん予防物質として有効なテルペン類が数多く存在することが明らかとなり、機能性を有する代替甘味物質として今後の有効利用が期待される。羅漢果含有の甘味配糖体はショ糖の数百倍の甘味を有することが明らかとされ、中国政府により、羅漢果は同地区のみで栽培が許可され、極めて厳重に保護政策が布かれているが、これらの資源に関して、中国内での栽培状況を明らかとした。これらテルペン誘導体に関連し、既に抗発がんプロモーター作用が顕著であるとされる海洋生物由来のジテルペンsarcophytol類についても、発がん予防作用を詳細に検討し明らかとした。中国広西壮族自治区にのみ栽培されるウリ科植物Momordica grosvenoriの果実は、羅漢果と称され、咽頭痛や扁桃腺痛などの緩和を目的とし、また小児の緩下剤として民間薬に用いられている。本生薬に含有される主成分は、ククルビタン型トリテルペン配糖体であり、極めて強い甘味(ショ糖の数百倍)を呈することが知られ、代替甘味料としての可能性が期待されている。我々は、天然甘味物質の機能性を明らかとするため、本生薬から得られる甘味物質の発がん予防作用を検討した。新鮮果実のエキスより、4種の甘味配糖体mogroside IV(1),V(2),11-oxo-mogroside V(3),siamenoside I(4)を単離し、抗発がんプロモーター検索の一次スクリーニングであるEpstein-Barr virus活性化抑制試験を行った。その結果、いずれの化合物にもグリチルレチン酸より強い抑制作用が認められ、in vivoにおける発がん抑制作用が期待された。そこで、主成分である化合物2並びに3について、マウス皮膚二段階発がん実験(DMBAをイニシエーター、TPAをプロモーターとする)を実施し、いずれの化合物にも顕著な抗発がんプロモーター作用があることを明らかとした。さらに、過剰なNOラジカルなどの窒素酸化物の生成が発がんの引き金となることから、peroxynitrite(ONOO-)をイニシエーターとするマウス皮膚二段階発がん実験を行った。この際、化合物1,2は共にイニシエーション処理前後2週間のみ経口的に摂取させることとしたが、対照群と比較し、両化合物摂取群とも10週以上の発がん遅延効果を有し、腫瘍個数においても50%以上の抑制効果を示すことが明らかとなった。本研究により、羅漢果含有の甘味物質は、発がん予防物質としての作用を有することが明らかとなった。

現在生活習慣病の中で、肥満・糖尿病及びその合併症は、最も深刻な問題であり、ショ糖に代わる、代替甘味物質の研究はきわめて重要である。植物由来の天然物で、低カロリーの甘味としては、従来、パラグアイ産キク科植物ステヴィアの葉から得られるditerpenoid glycosideであるstevioside類が多く利用されてきている。一方、中国広西壮族自治区の特産植物であるMomordica grosvenoriはウリ科植物であり、その完熟果実は、羅漢果と称され、現地では咽頭痛、扁桃腺痛などの緩和、小児に対する緩下剤として古来利用されてきた民間薬の一つである。この羅漢果にはcucurbitan型のtriterpenoid配糖体が多量に含まれ、ショ糖の数百倍の甘味を有することが知られている。我々は、本年度広西壮族自治区以外で市販される乾燥羅漢果を調査し、明らかに別種のものが同名で市販されていることも明らかとした。さらに、同自治区産の新鮮果実より4種の配糖体(mogroside IV, V,11-oxo-mogroside V, siamenoside)を単離し、それらの抗発がんプロモーター作用を比較した。なかでも、11-oxo-mogroside Vには顕著な抗酸化作用と共に、peroxynitriteにより誘起されるマウス二段階発がんにおける、発がんイニシエーションに対する抗発がんイニシエーター作用が明らかとなった。また、糖尿病患者の血清中に高濃度に出現し、それ自体が発がんイニシエーターとなるAdvanced Glycation Endproduct(AGE)に対する抗発がんイニシエーター作用についても、対称群と比較し、40%以上の抑制効果と発がん遅延効果が顕著であることを明らかとした。本研究により、羅漢果含有甘味成分が、発がん予防物質としての可能性を有することが明らかとなった。生活習慣病の中で、肥満・糖尿病及びその合併症は、最も深刻な問題であり、ショ糖代替甘味物質の研究はきわめて重要な研究課題である。そこで、糖尿病患者血清中に高濃度に出現するAdvanced Glycation Endproducts (AGE)が、顕著な発がんイニシエーターとなることに着目し、天然代替甘味料の抗発がんイニシエーション作用を検討すると共に、これら天然代替甘味料の発がん予防作用に関する研究を行なってきた。中国広西壮族自治区の特産植物Momordica grosvenoriの果実・羅漢果にはcucurbitan型のジテルペン配糖体が各種含有され、ショ糖の数百倍の甘味を有することが明らかとされている。一方、中国政府により、羅漢果は同地区のみで栽培が許可され、極めて厳重に保護政策が布かれているが、中国各地の市場で羅漢果と称するものが市販されている。しかしながら、形態、味、臭い共、同自治区で調製・販売されている羅漢果より、品質上劣ることが明らかである。更に、羅漢果に含有されるジテルペン11-oxo-
イギリスにおける新自由主義の展開

19世紀後半20世紀初頭のイギリス自由主義は、旧自由主義(自由放任,議会改革,節約,自助)から新自由主義(国家干渉,社会政策立法)への転換として把えられて来た。研究代表者は、このシェーマの検討と新自由主義の実態を探るために、新自由主義の第一世代(1880年代のグリーンやチェイムバリンら)と第二世代(世紀末前後のホブハウス,ホブスンやアスクィスら)の実態・異同を検証すべきであると考え、本年度は理論的祖、グリーンと自由党の政策との関連を解明して、以下の新知見を得た。1.グリーンは、大学と国政の自由主義的改革を求める大学人リベラルの一員であった。2.ブライト賛仰者として彼の外交政策・議会改革・米国北軍支持に賛同したグリーンは、急進派ではあってもマンチェスター派自由放任論の支持者ではなかったし、後年、教育・禁酒問題で国家の介入を強く要請してブライトと著しく相違した。3.グリーンはグラッドストンの議会改革・外交政策・土地法を支持して止まなかったが、教育法や禁酒法については非国教派圧力団体と同調し、微温的ミルとも異なった。4.チェィムバリンの〈国民教育連盟〉〈全国自由党連合〉の政策や運動を支持したグリーンは、禁酒問題では〈全英禁酒同盟〉路線に忠実で、その現実的実現可能案を構想し、政治的論戦に加った。5.グリーンは国教会廃格には反対で、包活的・民主的改革を要求した。6.グリーンもチェィムバリンも直接、社会政策立法へ言及したのは、82・83年であり、その内容は過渡期的提言に留まった。7.グリーンは大学内やオクスフォード市他若干でしか知られていない地方自由党員で、自由党の転換に直接又は多大の影響は及ぼし得なかった。次に転換点、1891年自由党綱領について発表予定であり、続いてグリーンと第二世代ホブハウスとの関連を追求して、新自由主義の実相を解明することを計画している。
間葉系幹細胞を用いた軟骨細胞が分泌する新規骨芽細胞分化調節タンパク質の同定

私たちは、骨髄間葉系幹細胞を用いて、骨芽細胞分化の指標である石灰化を、調整する分子を検索した。その結果、軟骨細胞から分泌される分子というよりもむしろ、その元となる間葉系幹細胞の死細胞が石灰化に重要であることを見いだした。私たちの結果は、in vitroで骨芽細胞による石灰化に、間葉系幹細胞のアポトーシスとネクローシス細胞が関与し、石灰化の核形成過程に死細胞の膜が関与することを示唆した。軟骨培養細胞の培養上清に含まれる骨芽細胞分化調節タンパク質を同定するため、本研究課題の目的は、第一に、軟骨細胞分化の前後で培地中に含まれるタンパク質の中で顕著に量的変化を示すタンパク質を検索し、同定することである。この研究の過程で、私たちは軟骨細胞の培地中よりもむしろ分化中にできる死細胞に、骨芽細胞の分化を調節するタンパク質があることを発見した。死細胞を間葉系幹細胞へ添加して、骨芽細胞分化培地中でインキュベートすることで骨芽細胞マーカー遺伝子であるオステオカルシンが時間依存的に誘導された。さらに、石灰化についても、Arizarin red Sにより検出すると、死細胞非添加では8日目から石灰化を開始するのに対して、死細胞添加により石灰化開始時間が2日となり、強く促進された。死細胞中のタンパク質をトリプシン処理により分解してもその石灰化に抑制作用を示さず、死細胞のタンパク質は重要ではないことが示唆された。また、パラホルムアルデヒドによる固定によってもその作用の低下は認められず、死細胞タンパク質が重要ではないことが示唆された。死細胞の膜フラクションと細胞質フラクションの石灰化活性を調査したところ膜フラクションにその活性が認められた。さらに、膜フラクション中のリン脂質が必要かTritonやMetOHを用いて細胞の脂質を除いたところ抑制作用は認められなかった。以上の結果から死細胞が誘導する石灰化において、死細胞のタンパク質、リン脂質以外の因子が重要であることが明らかとなり、骨芽細胞の分化と石灰化の機構の解明の足掛かりを見つける意義のある成果が得られた。間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化には、転写因子Runx2が関与しており、これが、骨シアロタンパク質(骨形成マーカー)の発現を調節することが解明されている。申請者らは、軟骨内骨化の組織学的解析から、骨芽細胞は、死滅した肥大軟骨細胞のまわりの軟骨基質を選択的に骨化し、生存している軟骨細胞のまわりの軟骨基質を骨化してないことに、着目した。私たちは、軟骨細胞が、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の阻害分子を分泌している可能性を考え、研究を開始した。この研究の過程で、私たちは軟骨細胞の培地中よりもむしろ分化中にできる死細胞に、骨芽細胞の分化を調節する分子があることを発見した。前年度までに、死細胞が誘導する石灰化において、死細胞の膜画分が重要である事を示した、当該年度では、PI染色とカルセイン染色により添加した死細胞が石灰化の中心となることを示した。さらに、その死細胞は、カスパーゼ依存的に誘導されるものとそうでない、おそらくネクローシス様の死細胞が混在することを示した。また、この細胞死では、オートファジー関連分子の変化が認められたものの、細胞死はオートファジー阻害剤によって抑制されず、オートファジックな細胞死ではない事が示唆された。以上の結果は、in vitroで骨芽細胞による石灰化に、間葉系幹細胞のアポトーシスとネクローシス細胞が関与し、石灰化の核形成過程に死細胞の膜分子が関与することを示唆する。間葉系幹細胞は骨芽細胞や軟骨細胞へ分化し、これらの細胞が骨の石灰化を調節することが明らかである。申請者らは、軟骨内骨化の組織学的解析から、肥大軟骨細胞が死滅した周囲の基質が石灰化し、生存している軟骨細胞の周りでは石灰化してないことに着目した。私たちは、生存している軟骨細胞が、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の阻害分子を分泌している可能性を考え、研究を開始した。この研究の過程で、私たちは骨芽細胞の分化中にできる死細胞に、石灰化を調節する機能が有る事を発見した。前年度までに、in vitroで骨芽細胞による石灰化に、間葉系幹細胞のアポトーシスとネクローシス細胞が関与し、石灰化の核形成過程に死細胞の膜分子が関与することを示した。当該年度では、この細胞死の過程で、活性酸素の生成が誘導されることを明らかにした。抗酸化物質により、細胞死が抑制され、同時に石灰化も抑制されることが明らかとなった。さらに、この死細胞の石灰化を間葉系幹細胞の培養上清が有意に抑制する結果を得た。以上の結果は、石灰化の過程に活性酸素が重要な働きを持つ事を示唆し、さらに、生存している間葉系幹細胞は、死細胞仲介性の石灰化に対する阻害因子を放出していること示唆した。
肺がん患者の術後不快症状に対するセルフケア促進のための看護支援方法の検討

肺がん患者の術後不快症状に着目し、退院後の生活も患者自身が主体的な療養生活を継続する力を高めることができる看護支援方法を検討することである。肺がん手術療法後の患者は、複数の不快症状を抱えており、術後5日目までの不快症状の程度と日常生活への影響は、術後1日目と術後2日目で有意に高く(P<0.05)、創部以外の不快症状として、肩部疼痛を経験していることが明らかになった。また術後6ヵ月を経過しても治療に伴う不快症状を抱えながら日常生活を送っており、退院時と比較しても主観的回復感はそれほど上昇しないことが明らかになった。平成21年度は、肺がんに関連する文献検討や学会への参加を行うことで肺がん患者の術後症状、治療、セルフケア、QOL等、最新の肺がんに関連する治療や研究動向等について情報収集を行った。肺がんに関連する文献レビュー等を参考に、肺がん患者の術後の不快症状に関する調査票を作成し、プレテストを行い調査票の検討を行った。本研究は肺がん患者の術後不快症状について入院中だけでなく、退院時の不快症状に対する日常生活への影響について経時的に調査し、出現する症状とQOLとの関連を明らかにするため、長期に渡る調査期間を要する。そのため本年度は、作成した調査票をもとに24名の肺切除術患者の不快症状とその要因について分析したところ、患者は複数の不快症状を抱えていることが明らかになり、その要因として肩部やドレーン部、そして咳が患者の睡眠状態と関連が見られた。また、18名の手術を受けた肺がん患者の退院時と術後1ヵ月後の術後不快症状について分析を行ったところ、退院時と術後1ヵ月ともに最も多かった不快症状は創部表面で、次に多かったのは創部内部であった。2つ以上の不快症状がある患者は、退院時は16名、術後は13名で多くの患者が複数の不快症状を抱えていた。そして退院時と術後1ヵ月後の不快症状の変化は創部表面、創部内部、ドレーン挿入部が減少し、肩部の不快症状と睡眠状況の悪化、息苦しさがあることによる生活への影響は増加していたが、いずれも統計的差は見られなかった。今後も引き続き調査を行い、患者が体験している不快症状及び日常生活の状態と患者の属性やセルフケアの状態との関連を明らかにしていく必要がある。平成22年度は、学会への参加や文献検討により、最新の肺がんに関する治療や研究の動向について情報収集を行った。そして昨年度から継続して肺がん患者の術後不快症状について、調査票をもとに、入院中と退院後の患者における術後の不快症状体験(疼痛、肩こり、咳漱、労作時の息苦しさなど)とそれらが日常生活に及ぼす影響と主観的回復感について実態調査を行った。本研究あ目的は、肺がん患者の術後不快症状について入院中だけでなく退院後の不快症状の実態と日常生活への影響を縦断的に調査し、看護支援の方法を検討することである。しかし縦断的調査のため調査期間中に再発する患者もおり、現在60名中51名の患者に同意が得られたが、退院時と術後6ヵ月の全時期調査できた患者は21名(有効回答率41%)であった。分析の結果、退院時より減少傾向にあるものは、創部(表面)の疼痛と創部に関連する疹痛や咳があることでの日常生活への影響であった。また肩の不快症状(両側)と労作時の息苦しさは増加傾向にあり、これは日常生活範囲の拡大が起因していると予測される。また、退院時と比較すると、術後6ヵ月では、創部に関連する不快症状の程度と日常生活への影響(創部関連)は有意に低下し、患者の主観的回復感は有意に上昇したが.(P<0.05)、術後6ヵ月が経過しても7.6に留まった。そして術後1ヵ月後は3名(14.3%)、術後6ヵ月は1名(4.8%)禁煙ができていない患者がいた。以上より、次年度は退院後のQOLを維持するために、患者のセルフケアの状態とともに、術後残存した不快症状を抱えた患者の退院後の生活に対する不安要因や不快症状に対する対処について明らかにする必要がある。肺がん患者の術後不快症状に対するセルフケア促進のための看護支援方法の検討を行うために、肺がんで手術治療を受けた患者の術後症状経過と日常生活への影響について、退院時から術後6ヵ月までの経月的推移について調査した結果、肺がん手術療法後の残存した不快症状の1つとして、肩部不快症状が存在し、患者の日常生活へ影響を及ぼすことが明らかになったことから、急性肩部症状と影響要因について、第17回国際がん看護学会(the 17th international conference on cancer nursing:プラハ)に参加し、研究発表を行うとともにがん患者に関する研究の動向や情報収集を行った。

患者のQOLの向上のため、手術治療も鏡視下を使用した縮小化が行われているものの、本研究において、肺がん手術療法後の患者の術後不快症状について縦断的調査を行うことで、難治性のがんである肺がん患者は、がん手術療法後も、治療に伴う不快症状が存在し、患者の日常生活に影響を及ぼしていることが明らかになった。学会への参加や発表を行うことで、手術治療のみで治療が完遂することが少ないがん患者に対して、患者の心的エネルギーの維持とともに、社会復帰に向けた回復的リハビリテーション内容の検討の必要性が示唆された。現在、患者の不快症状の対する対処の内容も踏まえた論文を作成中である。調査を縦断的に行っているため、肺がん患者の経過の特徴から全期間調査できた対象者が少ない。また、患者の不快症状に対する対応や工夫の内容の分析がやや遅れ気味である。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、縦断的に肺がん患者の術後の不快症状について調査を進めているが、患者の不快症状に対する対応や工夫の内容の分析がやや遅れ気味である。また、現在発生している問題としては患者への調査とともに医療者が対象者に行っている援助内容について、医療者から聞き取り調査を行う内容と必要性の検討である。そのため、現在までの結果を踏まえ、今後の研究遂行に際し、がん看護を専門とする教育者からスーパーバイズを受けることで、患者にとって必要かつ有効な看護支援方法が明確になるよう研究計画の検討を行う予定である。
ヒトおよびモルモット排尿筋における膀胱出口閉塞とカルシウム感受性調節機序の関連

細胞内カルシウム濃度([Ca^<2+>]_i)と張力の同時記録法および脱膜化標本(スキンド標本)による張力測定法を用い、モルモット排尿筋において膀胱出口閉塞(BOO)ならびに過活動膀胱(OAB)とCa^<2+>感受性調節機序の関連を検討中である。モルモットで尿道部分閉塞を作成した群(BOO群)と、同時期にsham手術を行った群(sham群)の両群において、術後8-12週における排尿筋を取り出し、張力と[Ca^<2+>]_iの同時測定を行なった結果、同一の[Ca^<2+>]_iレベルにおいて排尿筋のアゴニストであるカルバコール(CCh)により発生する収縮張力はBOO群において有意に高いことが確認され、CChの濃度-反応曲線はsham群に比べBOO群では左方移動していた。また、αトキシン処理による脱膜化標本を用いた張力実験からは、[Ca^<2+>]_iを外液Ca^<2+>濃度に固定した状態で、CChによるムスカリン受容体刺激により新たに発生する収縮張力の程度はsham群に比べBOO群において有意に高く、非処理標本の場合と同様にCChの濃度-反応曲線はsham群に比べBOO群では左方移動した。ウエスタンブロット法により、RhoA、Rho-associated kinase(ROCK)I、ROCKIIおよびCPI-17 proteinsの発現は両群ともに観察されたが、sham群に比べてBOO群でその発現程度が上昇していた。張力と[Ca^<2+>]_iの同時測定により、一定濃度のCChにより発生する収縮張力のうち、RhoA-kinaseの活性化に原因すると考えられる成分の割合を、本酵素の特異的阻害剤(Y27632)を用いて検討した結果からは、BOO群においてその阻害程度が有意に高く、BOO群ではRhoA-kinaseの活性が克進している可能性が示唆された。現在は、その阻害作用の濃度依存曲線を作成し阻害作用の特徴を比較検:討中である。さらに脱膜化標本を用い[Ca^<2+>]_iを外液Ca^<2+>濃度に固定した状態で、CChにより発生する収縮張力に対するY-27632の阻害作用を両群で比較検討する予定である。モルモット排尿筋に、細胞内Ca^<2+>手濃度([Ca^<2+>]_i)と張力の同時記録法およひ脱膜化標本(スキンド標本)による張力測定法を適用し、アゴニストによる膜のムスカリン受容体刺激で発生する筋収縮における、RhoA-kinase活性化機構の関与の程度と膀胱出口閉塞(BOO)との関連を検討し、BOOにおけるCa^<2+>感受性調節機序を介した収縮・弛緩の修飾機構を明らかにした。すなわち、尿道部分閉塞を作成した群(BOO群)と、同時期にsham手術を行った群(sham群)の両群において、術後8-12週に排尿筋を取り出し、αトキシン処理によるスキンド標本を作成し、等尺性張力測定を行った。1μMに[Ca^<2+>]_iをクランプした状態で、1μMのCaM(カルモジュリン)と100μMのGTP存在下に、一定濃度(10μM)のCCh(カルバコール)により発生した持続性収縮に対し、RhoA-kinaseの特異的阻害剤であるY-27632(5μM)を作用させた時の筋弛緩の程度を両群で比較した。その結果、Y-27632(5μM)によりBOO群では最大張力の43.7±2.5(%)の弛緩が得られたのに対し、sham群では弛緩が21.5±1.5(%)にとどまり、両群間に有意差を認めた。この結果、Y-27632のCCh収縮抑制(弛緩)作用はBOOにより増強されることが確かめられ、モルモット排尿筋においてBOOはRhoA-kinaseの活性を高めている可能性が示唆された。以上の結果より、BOOに伴う下部尿路機能障害ならびに下部尿路症状の治療において、RhoA-kinaseを介した排尿筋緊張の制御機構は重要なターゲットとなるものと判断された。
仔魚期における種苗評価に関する研究

飼育履歴(天然,半天然,人工継代)ならびに年齢の異なる合計7尾のクローンギンブナ親魚より得られた孵化仔魚の生物学的性状と魚体成分(乾燥重量,タンパク含量,脂質クラス組成,脂肪酸組成,核酸比,酸素消費量)を分析し,これらの測定項目と孵化仔魚の無給餌生残指数(以下SAI)および孵化後10日目の成長との関連性を調べた。その結果,SAIと各ロケットの平均卵径,平均孵化仔魚サイズおよび平均卵黄体積との間に関係は認められなかった。また,仔魚の乾燥重量,トリグリセライド含量,脂肪酸組成,核酸比とSAIについても調査したが関係は認められなかった。唯一,SAIと高い相関が認められたのは,各ロット内の卵黄体積比(卵黄体積/体長^3)の変動係数であった。これらの結果より,孵化仔魚の無給餌生残日数は仔魚のサイズや卵黄体積とは関係なく,むしろ個体毎の体サイズと卵黄との量的関係によって規定されていると考えられた。次に,各ロットより得られた仔魚を10日間飼育し,その時点での全長・体重と卵径,孵化仔魚サイズ,卵黄体積との関係を調べた結果,卵径や孵化仔魚サイズと10日目の全長には有意な相関関係が認められた。また,各ロット内での卵径や孵化仔魚サイズの変動係数と,10日目の全長の変動係数の間にも有意な相関関係が存在した。これらの結果より,比較的大きい卵より得られた種苗の成長能力は高いことと,卵径や孵化仔魚サイズの変異は後の種苗の成長変異に影響を及ぼすものと考えられた。本研究で用いたギンブナ親魚とそれら子孫は遺伝的に同一なクローンであるが,卵径や仔魚サイズは各ロット間で有意に異なった。しかしながら,卵径や仔魚サイズと親魚の年齢や飼育履歴には明確な因果関係は認められなかったことから,それらがどのような要因によって規定されているかを今後も検討する必要がある。
代謝の光制御による藍藻でのPHA生産

我々は光合成によるバイオプラスチックのポリヒドロキシアルカン酸(PHA)生合成のためにラン藻PCC6803をもちいて光条件による代謝遺伝子発現制御を進めている。ラン藻細胞内代謝系の遺伝子発現の単色光による制御とPHA生産に関わる影響を調べるために昨年度に引き続きLEDパネルを用いてラン藻の単色光照射後の遺伝子発現についてRNA-Seqを用いた解析を行った。さらにcph1cph2の光受容体変異体を用いて赤色光条件下での遺伝子発現と野生株と比較する実験を行った。結果を安定させる条件として暗処理3時間、単色光処理1時間を行い、3回の繰り返しを行ない、再現性良い結果を得ることができた。単色光は、ラン藻の光受容体遺伝子の吸収スペクトルである紫外光、青色光、緑色光、橙色光、赤色光、遠赤色光を用いた。単色光による光受容体遺伝子発現については、それぞれの受容体の吸収光波長による発現の制御が観察された。一方解糖系について3回繰り返し実験を行ったところ、解糖系に関わる9つの遺伝子のうち8つの遺伝子が暗条件で他の単色光条件に比較して発現の減少が観察され、この経路が明条件で制御されていることが示唆された。pfk1遺伝子は暗所で他の単色光条件に比較して発現上昇が観察された。TCA回路は、クエン酸からオキザロ酢酸の回路を構成する7つの酵素遺伝子について調べたところ5つの遺伝子が暗所で他の単色光に比較して発現上昇が見られ、暗条件での制御が示唆された。ラン藻のPHA合成経路遺伝子は、PHA重合酵素のphbC遺伝子が、暗所および遠赤色光で発現の誘導が見られ、光合成で合成された過剰なアセチルCoAから暗条件でのPHA重合促進に関わるものと考えられた。さらにラン藻の代謝遺伝子光制御は、野生株とcph1, cph2の光受容体変異ラン藻を用いてこれらの受容体が関わる発現制御解析を進めた。我々はバイオプラスチックPHA生合成のためにラン藻PCC6803に人工のオペロンを導入し生産性の向上を進めている。本研究では、我々のこれまでの研究を発展させると共に、ラン藻細胞内代謝系の遺伝子発現の単色光による制御とPHA生産に関わる影響を調べるためにラン藻の遺伝子発現の光制御地図の作成を進めた。また、PHA生産量を向上させるためにこの代謝の光制御地図を用いてPHA合成と中間代謝物を共有する代謝経路の光抑制による生産性の向上をおこなうことを進めた。ラン藻細胞内代謝系の遺伝子発現の単色光による制御を明らかにするために、ラン藻の光応答が報告されている405, 447, 530, 590, 660, 700の6色のLEDから構成される単色光照射装置を作成した。これらの単色光は、過去の文献から生理反応に用いられている光量を用いて、ラン藻野生株に各々10umol/m2/sで30分間照射を行い、RNA抽出を行なった。また予備実験として白色光下で培養したラン藻をそれぞれ連続白色光、青色光、赤色光、遠赤色光、暗黒下で培養し、一定時間後ごとにRNAを抽出して特定の遺伝子の発現をqPCRにより比較した。その結果すでに光応答性が知られている光化学系の遺伝子psbA2や色素タンパク質遺伝子cpcAに加え、解糖系の遺伝子gap1やアミノ酸代謝系遺伝子のtrpA等が、明確な光質依存的な発現を示すことがわかり、第39回日本分子生物学会で報告を行なった。次に光レセプターの変異の影響を調べる目的で、赤色光、遠赤色光レセプターのcph1, cph2の変異体を取り寄せるとともに青色光レセプターcryptochormeの変異体を相同組み換えによる遺伝子破壊株の作成を進めた。ラン藻の細胞内の代謝を単色光によって制御するために光レセプターの吸収波長である400から700 nmにわたる6種類のLEDを同一基板上に複数配したLEDパネルを作成した。またこのLEDパネルを用いてラン藻に光照射を行い、RNAを抽出した。予備実験として単色光照射後のラン藻で光化学系遺伝子等の重要遺伝子が光制御を受けている結果を得た。さらにラン藻の光レセプターの破壊株による影響を調べる目的で、cph1, cph2の光レセプターの変異体を取り寄せるとともに、青色光レセプターの破壊株を相同組み換えで作るための作業を進めた。抽出したRNAを用いた発現解析からゲノム全体に関わる代謝の光マップの作成が可能になった。また光レセプターの変異体を用いたバイオプラスチック合成にすぐに着手できる状況まで完了したことから概ね予定通りに進んでいると判断した。我々は光合成によるバイオプラスチックのポリヒドロキシアルカン酸(PHA)生合成のためにラン藻PCC6803に人工のオペロンを導入し生産性の向上を進めている。光は、照射の有無で遺伝子発現誘導ができるためラン藻細胞の健常性を保ちつつ、より効率的な物質生産が可能である。ラン藻が持つ紫、青、緑、橙、赤、遠赤色の光受容体に対応したLEDパネルを独自に作成し、暗順化したラン藻に対して各単色光を照射した後、RNA-seqによる遺伝子発現解析を行った。

解糖系、TCA回路、PHA合成経路の遺伝子を中心に光制御を調べたところ、解糖系glgX, pgiが橙、赤、遠赤色で暗所より発現の抑制が見られた。TCAサイクルでは、frdA,icdが緑、燈、赤、遠赤色で暗所より発現の抑制が観察された。PHA合成系では、fabG, phbCの光誘導を観察した。しかし光照射後の遺伝子発現の再現性がよくないため光照射時間と全工程の見直しを行ない、ラン藻の暗順化を3時間行なったのちに単色光を1時間照射してRNA-Seqによる発現解析を進めた。この成果について第59回日本植物生理学会年会で口頭発表を行なった。PHAの光制御生産は、野生株とcph1, cph2の光受容体変異ラン藻を用いてPHA生産についてGC/MS計測を行なった。その結果通常の白色光条件では各系統間に差が少なく、細胞内に十分なPHAを蓄積していないことがわかった。そこで細胞内PHA蓄積を誘導する条件の検討を進めた。ラン藻細胞の光照射による遺伝子変動を調べる目的で生物学的な繰り返し実験を3回行ったが、遺伝子発現について再現性良いデータが取れていない。この問題を解決すべく、培養条件と光照射時間、RNAの抽出方法について総合的に見直しを行った。またRNA-Seqのリード数を増加させることで解析による誤差を減少させようとしている。青色光受容体の欠損変異の作成が遅れているため、光条件と代謝の関係についてcph1, cph2の2つの赤色光、遠赤色光受容体の変異を用いてこれらの光条件でのPHAの蓄積を検討した。GC/MSの計測の結果、野生株、cph1, cph2の3つのラン藻でPHA量の生産量が少なく、3つの系統間での差異が検出ができなかった。原因は、PHAが細胞内の窒素と炭素のバランスによる貯蔵物質であるため、今後これを積極的に蓄積させるための条件として窒素源の枯渇が必要であると考えられた。我々は光合成によるバイオプラスチックのポリヒドロキシアルカン酸(PHA)生合成のためにラン藻PCC6803をもちいて光条件による代謝遺伝子発現制御を進めている。ラン藻細胞内代謝系の遺伝子発現の単色光による制御とPHA生産に関わる影響を調べるために昨年度に引き続きLEDパネルを用いてラン藻の単色光照射後の遺伝子発現についてRNA-Seqを用いた解析を行った。さらにcph1cph2の光受容体変異体を用いて赤色光条件下での遺伝子発現と野生株と比較する実験を行った。結果を安定させる条件として暗処理3時間、単色光処理1時間を行い、3回の繰り返しを行ない、再現性良い結果を得ることができた。単色光は、ラン藻の光受容体遺伝子の吸収スペクトルである紫外光、青色光、緑色光、橙色光、赤色光、遠赤色光を用いた。単色光による光受容体遺伝子発現については、それぞれの受容体の吸収光波長による発現の制御が観察された。一方解糖系について3回繰り返し実験を行ったところ、解糖系に関わる9つの遺伝子のうち8つの遺伝子が暗条件で他の単色光条件に比較して発現の減少が観察され、この経路が明条件で制御されていることが示唆された。pfk1遺伝子は暗所で他の単色光条件に比較して発現上昇が観察された。TCA回路は、クエン酸からオキザロ酢酸の回路を構成する7つの酵素遺伝子について調べたところ5つの遺伝子が暗所で他の単色光に比較して発現上昇が見られ、暗条件での制御が示唆された。ラン藻のPHA合成経路遺伝子は、PHA重合酵素のphbC遺伝子が、暗所および遠赤色光で発現の誘導が見られ、光合成で合成された過剰なアセチルCoAから暗条件でのPHA重合促進に関わるものと考えられた。
GC-clamped DGGEによるパラフィン包埋ヒト腫瘍組織の遺伝子解析

GC-clampedDGGEを用いて遺伝子異常を検出する方法を確立した。この方法は、長年にわたり集積されているパラフィン包埋材料についても応用可能である。具体的にはまず、3040baseのGC-clampをつけたPCRprimerによりPCR産物の一側にGC richの配列を導入する。このPCR産物を080%の変性剤濃度勾配を水平方向に含むゲルで電気泳動すると、一定の濃度以上でGC-clamp以外は、conformation changeを起こすために泳動度が急速に遅延する。変異がある場合にはconformation changeを起こす濃度が正常とは微妙に異なるために違った泳動パターンを示す。また、変性剤濃度勾配と直角方向に泳動することにより同時に多数の試料について調べることもできる。この方法の検出感度を調べるためにk-ras codon 12にhomozygous.mutationをもつA549細胞を陽性対照とし、正常ヒトgenomic DNAとA549細胞DNAを種々の割合で混合したところ、正常16に対してmutated DNA 1の割合で存在する場合でも検出が可能であった。この方法を用いて以下の結果を得た。(1)ヒト胆管癌、胆のう癌では高頻度にk-ras codon 12の変異が検出され、この変異はglycinからserineへの変化が主であった。(2)ヒト通常型膵癌とのう胞型を比較したところ、k-ras codon 12の変異はともにほぼ全例に検出されたが,p53の変異は通常型にのみ見られた。(3)ラット肝癌細胞株ではp53変異は高頻度に検出されたが、肝癌組織では検出されず、したがって、この変異はin vitroで起こったものと考えられた。(4)ラット肝癌ではk-ras codon 12の変異が検出されたが、その頻度は肝癌を誘発する発癌剤の種類により異なった。(5)自然不死化マウス線維芽細胞およびそれらを化学発癌剤処理してtransformさせた細胞ではp53変異は検出されなかった。GC-clamped DGGEを用いて遺伝子異常を検出する方法を確立した。GC-clamped DGGEを用いて、長年に亘り集積されているヒト腫瘍のパラフィン包埋材料からその遺伝子異常を検出する方法を確立した。本年は肝癌、大腸癌、胆道癌、膵癌、粘液産生膵腫瘍についてK-ras p53遺伝子の異常を検討した。方法は、まず3040baseのGCclampをつけたPCRprimerによりPCR産物の一側にGCrichの配列を導入した。このPCR産物を080%の変性剤濃度勾配を水平方向に含むゲルで電気泳動を行ったところ、一定の濃度以上でGC-clam以外は、conforma-tion changeを起こすために泳動度が急速にな遅延することが確認された。K-ras遺伝子についてはmutation hot spotであるcodon12,13を含むexon1の範囲を検討した。まず、検出感度を調べるためにcodon12にhomozygous mutationをもつA549細胞を陽性対照とし、正常ヒトgenomic DNAとA549細胞DNAを様々の割合で混合してmutationを調べた。この結果、正常16に対してmutated DNA1の割合で存在する場合でも検出が可能であった。次にパラフィン切片から実体顕微鏡下で腫瘍細胞をくり抜き、DGGE法を用いて検討したところ、大腸癌、肝癌、胆道癌、膵癌、粘液産生膵腫瘍についてそれぞれ40%、0%,56%,91%,100%にmutationが検出された。

大腸癌、膵癌などについてはこれまで他の研究室からの報告があるが、今回の結果はその中でも特に頻度の高い方に含まれ、本法の感度の高さが証明された。一方、p53については膵癌と粘液産生膵腫瘍について、hot spotを含むexon5-8の範囲について検討したところ、膵癌の20%に検出できたが、粘液産生膵腫瘍では全く認められなかった。さらに異常を認めたものについてはsequen-cingにより、mutationがexon8に集中していることが明らかになった。膵癌と粘液産生膵腫瘍は臨床的予後が大きく異なる腫瘍であり、今後、症例を重ねてこの点をさらに検討する必要がある。GC-clamped DGGEにより、病理組織切片から実体顕微鏡下でくり抜いた組織中の癌関連遺伝子の異常を検出する方法を確立した。本年度の研究成果は以下の通りである。(1)ヒト胆管癌、胆のう癌についてK-ras遺伝子exon 1のmutationを検索した。陽性コントロールとしてK-ras codon 12のmutationをhomoにもつA549細胞のDNAを用い、これに正常ヒトDNAを加えて様々の程度に希釈したところ、正常DNA 16に対して、異常DNA 1の割合に存在する場合でもmutationは検出可能であった。ヒト胆道癌では約60%にK-ras codon 12のmutationが検出され、その変異はglycineからserineへの変化の頻度が高かった。(2)ヒトのう胞性膵癌と通常型膵癌についてp53とK-ras codon 12のmutationの頻度を比較した。K-ras codon 12の変異は両タイプの膵癌でほぼ100%に検出されたが、p53の変異は通常型膵癌にのみ検出され、のう胞型膵癌には16例中全く検出されなかった。また、膵癌のp53変異はexon 8に特に多く見られた。(3)化学発癌剤で誘発したラット肝腫瘍及びラット肝細胞株についてp53,K-ras codon 12の変異を調べた。p53の変異は肝細胞株では高頻度に見られたが、腫瘍組織では全く検出できなかった。したがって、このmutationは培養条件下で生じた変化と考えられた。一方、K-ras codon 12のmutationは頻度は低かったが、3'-Me-DABまたはaflatoxin B1で誘発した腫瘍でやや多く見られ、発癌剤の種類により頻度が異なることが示唆された。(4)化学発癌剤でラットに誘発した乳癌についてp53の変異を検討したところ、変異は全く検出されなかった。この点はヒト乳癌と異なり、発癌の分子機構の違いが示唆された。GC-clamped DGGEにより癌関連遺伝子の異常を検出する方法を確立した。この方法は、病理組織切片から実体顕微鏡下でくり抜いた組織についても応用可能である。(1)ヒト胆管癌ではK-ras codon 12の変異が約56.2%に検出され、glycineからserineへの変化が多かった。また、胆のう癌でも39.1%にK-rasの変異が検出され、この結果は従来の報告と大きく異なるものであった。
日本語教員養成と日本語学習者のため双方向学習プログラムの研究

本研究の目的は、日本語教員養成と日本語学習に資するオンライン上の双方向授業において、eポートフォリオ等を活用し、双方向型授業プログラムを構築することにある。reflectivejournal(学習ダイアリー)を使用する双方向授業を生かし、海外の大学との間で日本語教員養成と日本語学習に資する双方向授業を実施し、eポートフォリオに学生が提出したreflectivejournalや教案を質的に分析することにより、双方向型プログラムの構築について研究した。研究期間は、平成28年度から平成30年度の3年間である。研究対象となる授業の試行と連携教育を3年間行い、3年目を研究完成年度とする。1年間に2種類の授業を行い、授業を通した日本語指導者の育成方法とreflective journalを質的に分析した結果から学習の有効性を検証した。reflectivejournalをeポートフォリオの一部として活用し、質的に分析した。最終年度には、従来までと同様に以下の授業等を行い、その結果を記録し、総括した。本研究の成果により、遠隔授業の一形態としての双方向型プログラムとその有効性が立証された。主役は学習者であり、双方向学習プログラムは学びを促進するツールとして活用でき、学びのネットワークの起点ともなる。本研究では、文字を使用する双方向授業、音声を使用する双方向授業を中心に、AUT(オークランド工科大学)研究者とともに学習プログラムモデルの試案を実施した。その後、学習者のreflective journal、指導案、レポートを、その他の資料とともにeポートフォリオ化して保存し、質的に分析した。最後に、プログラム有効性について検証し、さらに改良を加え、構築したeポートフォリオを活用した双方向学習プログラムが他の機関での授業モデルとなるようにまとめた。本研究の目的は、eポートフォリオの活用により、パソコンやスマートフォンを使用したオンライン上の双方向授業を中心に、日本語教員養成と日本語学習に資する授業プログラムを構築することにある。reflectivejournal(学習ダイアリー)を使用する双方向授業を生かし、海外の大学(ニュージーランドオークランド工科大学)との間で日本語教員養成と日本語学習に資する双方向授業を実施し、さらに、eポートフォリオに学生が提出したreflectivejournalや教案を質的に分析することで、その有効性を明らかにした。異文化間コミュニケーションの一形態である外国文化・外国人との接触は、一方向的なものではなく双方向的でなければならない。日本語教育・日本語学習において、双方向に有益となる学習プログラムは、今後、遠隔授業の一形態としても必要とされるものである。1.国内外の日本語教育機関間の交流形態を調査した。2.文字を使用する双方向授業、音声を使用する双方向授業を中心に、AUT(オークランド工科大学)研究者とともに学習プログラムモデルの試案を作成し、実施した。3.学習者のreflective journal、指導案、レポートを、その他の資料とともにeポートフォリオ化して保存し、質的に分析した4.AUT研究者と協力して、双方向からの視点で分析を行った。5.プログラム有効性について検証し、さらに改良を加え、構築したeポートフォリオを活用した双方向学習プログラムが他の機関での授業モデルとなるように検討している。平成28年度は、当初の計画通りに1年間のプログラムを終了した。現在は、eポートフォリオの分析と新年度のプログラムの準備をしているところである。本プログラムと同様に、海外の日本語教育機関との双方向授業を実施している大学も確認した。ただし、プログラムの実施にはBlackboardやmanabaといったオンライン上のシステムが必要なため、全く同内容のプログラムでのプログラムは確認できなかった。3.学習者のreflective journal、指導案、レポートを、その他の資料とともにeポートフォリオ化して保存し、質的に分析した。4.AUT研究者と協力して、双方向からの視点で分析を行った。5.プログラム有効性について検証し、さらに改良を加え、構築したeポートフォリオを活用した双方向学習プログラムが他の機関での授業モデルとなるように研究を進めている。平成29年度は、特に「学生の気づき」を重視した「学習者オートノミー」「自律学習」について考察を深めた。平成29年度は、当初の計画通りに2年目のプログラムを終了した。現在は、eポートフォリオの分析と最終年度に向けたプログラムを実施するべく準備を進めているところである。最終年度である平成30年度は、特に、課題の研究を推進するために、新しく「学生の気づき」を重視した「学習者オートノミー」「自律学習」についても考察を深める予定である。reflective

journal(学習ダイアリー)を使用する双方向授業を生かし、海外の大学との間で日本語教員養成と日本語学習に資する双方向授業を実施し、eポートフォリオに学生が提出したreflectivejournalや教案を質的に分析することにより、双方向型プログラムの構築について研究した。研究期間は、平成28年度から平成30年度の3年間である。研究対象となる授業の試行と連携教育を3年間行い、3年目を研究完成年度とする。1年間に2種類の授業を行い、授業を通した日本語指導者の育成方法とreflective journalを質的に分析した結果から学習の有効性を検証した。reflectivejournalをeポートフォリオの一部として活用し、質的に分析した。最終年度には、従来までと同様に以下の授業等を行い、その結果を記録し、総括した。本研究の成果により、遠隔授業の一形態としての双方向型プログラムとその有効性が立証された。主役は学習者であり、双方向学習プログラムは学びを促進するツールとして活用でき、学びのネットワークの起点ともなる。本研究では、文字を使用する双方向授業、音声を使用する双方向授業を中心に、AUT(オークランド工科大学)研究者とともに学習プログラムモデルの試案を実施した。その後、学習者のreflective journal、指導案、レポートを、その他の資料とともにeポートフォリオ化して保存し、質的に分析した。最後に、プログラム有効性について検証し、さらに改良を加え、構築したeポートフォリオを活用した双方向学習プログラムが他の機関での授業モデルとなるようにまとめた。平成29年度は、昨年度の反省を踏まえ、同様のプログラムを実施する。eポートフォリオにデータを蓄積し分析を進めたい。研究課題である「日本語教員養成と日本語学習者のため双方向学習プログラム」を確立すべく研究計画を進める。平成30年度は、3年間を一区切りとした研究内容を総まとめをする年度である。研究期間内に、以下の2点を明らかにし、研究結果をまとめることとする。(1)日本語教員養成と日本語学習者のため双方向学習プログラムモデルの構築と検証を行う。神戸女子大学学生は、双方向授業などを通し外国人の書いた日本語を読んだり、話した日本語を聞いたりすることや、実際に外国人への日本語指導を通して得た知識や指導力を、eポートフォリオの提出物から振り返る。AUT学生は、日本人学生と接して、日本語学習に対する学習姿勢にはどのように変化があったかを考える。(2)双方のreflective
VEGF欠損マウスにおける腫瘍代償機構の分子生物学的解析

本研究を実行するために米国より移入したRip Tagマウスの腫瘍形成が著しく低下したことにより、目的の検体を採取することができなかった。以前よりRip Tagマウスの腫瘍形成はバックグラウンドに依存することが知られている。そこでC57B1/6Nマウス、およびDBAマウスとの戻し交配を4代行ったところ、腫瘍形成は有意には改善しなかた。移入元でもほぼ同様の現象が起こっているため、マウスの経代中に腫瘍形成を抑制する変化が起こった可能性があり、トランスジェニックマウスの再作成を検討している。一方、保存検体の解析により、残存腫瘍の中に充実性で壊死部分を持たず、乏しいながら腫瘍内に血管が存在する腫瘍の存在が明らかになった。低酸素マーカー(pimonidazole)で染色を行ったところ、野生型の腫瘍には存在しない広範囲な低酸素領域を持つことが判明した。つまり、血管新生阻害によって腫瘍内に低酸素領域が誘導されることを明らかにした。これら腫瘍では明らかなアポトーシスの上昇は見られず、腫瘍細胞は低酸素下で適応、生存している(論文準備中)。この発見は血管新生阻害薬による治療に腫瘍細胞が適反しうることを示唆しており、今後の臨床反用での問題点になると考えられる。そこで腫瘍細胞の低酸素耐性機構について検討を行った。我々は低酸素耐性株のクローニングあるいは培養条件を選択することによって、いくつかの癌細胞株を分裂せず死にも至らない状態のまま低酸素下で長期間維持できることを見出した。低酸素下の癌細胞ではmTORシグナルが抑制されることが知られているが、その機構及び意義は未だ不明であった。我々は低酸素下の癌細胞でmTORの下流シグナル経路が抑制されることが、低酸素下における癌細胞の生存戦略であることを明らかにした。本研究を実行するためにRipTagマウスを米国より移入したが、国内で入手可能なC57B1/6Jマウス(日本クレア社)で継代を行ったところ、腫瘍形成が著しく低下する問題に直面している。以前よりRipTagマウスの腫瘍形成はバックグラウンドに依存することが知られている。使用したC57B1/6Jマウスは1986年にJacksonラボより移入され国内で維持されてきたが、その間にRipTagマウスの腫瘍形成能に影響する何らかの変化が起こっている可能性がある。現在、日本Charles River社がJacksonラボより新しく導入したC57B1/6Jマウス、および腫瘍形成能が確認されているDBAマウスとの戻し交配を行っている。研究計画にある遺伝子発現の解析を行うためには凍結切片を得る必要があるが、上述のようなRipTagマウスの腫瘍形成能の低下のため遺伝子発現の解析が滞っている。そこで以前にパラフィン包埋したVEGFノックアウトRipTagマウス膵臓標本を用いて病理学的な解析を行った。その結果、病変は大きく2つのタイプに分類されることが判明した。第一のタイプは腫瘍内部がネクローシスに陥り周辺がリング状に発達したもので、腫瘍部分には血管はまったく存在しない(輪状腫瘍)。血流の供給は周囲臓器から受けているものと考えられる。第二のタイプは充実性でネクローシス部分を持たず、乏しいながら腫瘍内に血管が存在する(充実性腫瘍)。低酸素マーカー(pimonidazole)で染色を行ったところ、野生型の腫瘍と比較して二つの腫瘍型とも広範囲な低酸素領域を持つことが判明した。最近、腫瘍が低酸素環境に暴露されることによって、さまざまな悪性化形質が誘導されることが明らかにされている。今後これらの型間で遺伝子発現を比較検討し、血管新生の代償および低酸素下での生存の両面から解析を行う。本年は低酸素誘導遺伝子群についてRipTag腫瘍由来細胞株betaTC細胞を用い、量的PCRの条件設定を行った。

本研究を実行するために米国より移入したRipTagマウスの腫瘍形成が著しく低下したことにより、目的の検体を採取することができなかった。以前よりRipTagマウスの腫瘍形成はバックグラウンドに依存することが知られている。そこでC57Bl/6Nマウス、およびDBAマウスとの戻し交配を4代行ったところ、腫瘍形成は有意には改善しなかた。移入元でもほぼ同様の現象が起こっているため、マウスの経代中に腫瘍形成を抑制する変化が起こった可能性があり、トランスジェニックマウスの再作成を検討している。一方、保存検体の解析により、残存腫瘍の中に充実性で壊死部分を持たず、乏しいながら腫瘍内に血管が存在する腫瘍の存在が明らかになった。低酸素マーカー(pimonidazole)で染色を行ったところ、野生型の腫瘍には存在しない広範囲な低酸素領域を持つことが判明した。つまり、血管新生阻害によって腫瘍内に低酸素領域が誘導されることを明らかにした。これら腫瘍では明らかなアポトーシスの上昇は見られず、腫瘍細胞は低酸素下で適応、生存している(論文準備中)。この発見は血管新生阻害薬による治療に腫瘍細胞が適応しうることを示唆しており、今後の臨床応用での問題点になると考えられる。そこで腫瘍細胞の低酸素耐性機構について検討を行った。我々は低酸素耐性株のクローニングあるいは培養条件を選択することによって、いくつかの癌細胞株を分裂せず死にも至らない状態のまま低酸素下で長期間維持できることを見出した。低酸素下の癌細胞ではmTORシグナルが抑制されることが知られているが、その機構及び意義は未だ不明であった。我々は低酸素下の癌細胞でmTORの下流シグナル経路が抑制されることが、低酸素下における癌細胞の生存戦略であることを明らかにした(Hamanaka et al.BBRC 2005)。