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日本のオペラ団体による公演活動の変遷―藤原歌劇団と日本オペラ協会の活動検証から

本研究では、1934年に創立された藤原歌劇団の活動を中心にしながら、音楽専用ホールや劇場が整備される過程とあわせて検証することにより、オペラ受容とオペラ創作の両活動と、上演環境整備の状況との連関を明らかにした。上演会場の変化と共に上演作品が変わっていく過程、制作に関わる人材が与えたオペラ制作のあり方の変化等の検証によって、オペラ団体を軸にしながら公演会場や人材との関わりを検証する手法が、日本のオペラ史研究に有効となることが示された。平成24年度の研究の過程において、現在活動中の日本のオペラ団体の中で、最も古い歴史を持つ藤原歌劇団が、わが国においてオペラ公演に果たした役割を明確にするために、大規模な舞台、多くの人材が必要となるワーグナー上演の歴史に関して考察する手法をとるという着想を得た。その発想のもと、平成25年度は、初期のワーグナー上演において、藤原歌劇団が中心となって、日本におけるその上演史の中核となって活動していた経緯を明らかにした。その際に関わった公演は戦時下にあった世界状況の影響を受けていることなどが明確になった。その後、我が国において、劇場が建設され、公的助成が時代と共に変化してきていた状況なども、同時に提示可能となった。これらの成果の一部を日本音楽芸術マネジメント学会にて発表するに至った。この点は、本研究において、作品の上演史から、オペラ団体の活動と、劇場の建設や文化政策も含めた上演環境整備の関係を明らかにするという手法を確実にする大きな一歩となった。同時に、わが国におけるワーグナー上演の歴史研究は、国外のワーグナー上演に目が向きがちであった状況に一石を投じるものとなったと考えている。初年度研究を開始するにあたって、まず昭和音楽大学オペラ研究所所属の研究代表者、研究分担者(2名)および研究協力者1名を中心に、今後の方向性について、資料等の状況把握、および進行手法について検討した。それをもとに、日本オペラ振興会所属の研究協力者およびプログラム等保管の担当者と、具体的な研究方針の確認を行った。そのうえで、オペラ研究所に保管されている藤原歌劇団と日本オペラ協会の資料状況を確認する作業に入り、資料の種類、保存状況が異なっていることなどの状況も概要を把握した。作業は1名のアルバイトの方により、昭和音楽大学オペラ研究所所属の研究協力者が中心となって、資料の保存状況の確認、整理を行った。この作業には十分に時間をかけている。これらの資料には、プログラム、チラシ等の印刷物が大半ではあるものの、オープン・リール、ビデオなどの資料も含まれていることがわかった。そのうえで、これらの資料内容を確認し、何をどの範囲までデータ化するのかについて検討した。データ化の範囲と手法とは、本研究の根幹をなすものである。これにより、オペラ公演制作の社会と関係(主催、共催、後援、協力、協賛等の組織の変遷)が明確になるうえに、公演会場の変化、出演者、スタッフの関わり方の変化なども昭かになる。この基礎研究が、オペラ公演およびオペラ団体運営、オペラ公演制作のあり方に関する歴史研究、現代の運営研究などの研究成果を生むことになる。現在も活動している組織の中で、最も歴史の長いオペラ団体の一つである藤原歌劇団と日本オペラの上演をつづけている日本オペラ協会の活動を通じて、我が国のオペラ制作に関する歴史的検証を行った。まず、第二次世界大戦前後の上演において、ヨーロッパからの亡命音楽家の存在が大きかったことを検証した。さらに、戦前および戦後間もなくの、海外での日本人アーティストの公演に関する資料調査などにより、当時の社会情勢とオペラ公演等との関連などを研究する端緒となった。また、その後オペラ団体による公演が劇場や音楽堂等のそれに先行して行われてきたことが、上演する「演目」「会場」「日程」のほか関わる「スタッフ」「キャスト」に複雑な影響を与えたことも検証した。それにより、日本でのオペラ公演制作過程におけるワーグナー作品などの大規模な作品の舞台上演、招聘オペラ公演のほぼ全容を把握したことも成果である。最終年度においては、これらのオペラ公演制作の流れが、さらに一歩進んで、日本のオペラ作品創作に影響を与えたことに関しても研究の範囲が広がった。舞台芸術政策本研究の主たる手法であるオペラ公演史研究を通じて、藤原歌劇団の運営および公演の「現状」と「過去」の差異が明確になってきている。この成果は、わが国におけるオペラ公演の歴史がオペラ団体によって担われてきた経緯を具体的に示しているだけでなく、劇場整備の歴史とも相まって、わが国における複雑な公演環境の状況を明らかにすることにも役立っている。また、これらを解き明かすために行っているデータ整備によって明示される結果となった、わが国におけるワーグナー上演の歴史が、オペラ団体と劇場建設の関係の歴史等に直接影響を受けてきた経緯の提示は、重要な成果となっている。3年間の研究のうち、資料の状況把握、整理、データ化の作業量が多く、時間と人手がかかることを予測している。そのために1年目は資料整理に関する作業を中心に行うことにしていた。それに関しては、ほぼ順調に進展していると考えている。さらに、データ化する内容についても検討をすすめ、本研究に必要となる項目の洗い出しも行っている。

2年目からは、具体的にそれらのデータを活用しながら、研究代表者および研究分担者(2名)と研究協力者を中心に、藤原歌劇団、日本オペラ協会の公演活動、および公演制作が日本のオペラ公演にどのように位置づくのか、どのような変遷をとげていったのか、社会状況などとの連関をふまえながら、研究を進めていく予定である。平成26年度は、これまでの研究成果をもとに、今年度はイタリアで開催される欧米中の劇場が集まるオペラの国際会議に招待されての発表をはじめ、新たな視点で進めている研究成果の発表を国内学会でも行うこととしている。さらに、所属学会以外の学会からの招聘により、海外の劇場運営に関するシンポジウムのコメンテーターとして招聘される予定であることなど、国内外のオペラ公演の歴史と現状研究に直接役立つ成果を上げ、そのことが外部機関や研究者からも認められ始めている。これらの機会を活用することにより、わが国のオペラ公演の歴史研究の状況とそこから読み取れる事象にかかる複雑な事由といった研究成果を発表していきたい。2年目は、1年目に行った資料整理をもとに、徐々に開始したデータ化を推し進めていく。このほかの資料整理も継続して実施する。データ化を進める中で出てくることが予測される課題については、研究代表者と研究協力者(ともに昭和音楽大学オペラ研究所)を中心として、研究分担者とも協議をしながら、課題解決を行っていくこととする。最終年度につなげるための研究整備につとめる。データ化の作業などのために、アルバイトの方の謝金を予定していたが、進行が予定よりも早く、謝金の部分が余剰となったため。次年度は多角的なデータ化等の作業が必要となることから、謝金の支出がふえる予定となっている。主として、アルバイトの方の謝金として使用する予定である。データ化とその確認など、人的な力が必要になるため、これらの作業に対する研究費の使用が中心となる。他には謝金等が発生する予定はない。この他には、物品を若干購入する予定にしている(研究分担者の物品購入など)ほか、資料調査のために交通費が必要となる可能性がある。(1年目は藤原義江記念館(下関)に資料の現状や今後の運営方針などのヒアリングを行ったため、交通費が発生した)
アクティブラーニングへの転換をはかる教材の作成および授業動画の公開

本研究では物理の定性及び定量的理解両方の定着を目的としたデジタル教科書を作成し、それを用いた授業をネット上において公開し、その後、これらを用いた授業により従来型の一斉授業から、アクティブラーニングへ授業形態の転換を行い、その効果について検証を行った。研究の対象学年を3年生とし、4月から6月までの『電磁気学』の分野でデジタル教科書を作成した。デジタル教科書に含む内容としては以下の4点を掲載することとした。1.物理における基本的な内容2.教科書の行間に相当する補足説明3.定性・定量的理解を助けるための問題とその解答4. 1・2・3の補足となるマルチメディアコンテンツ8月の夏季補習を用いて、デジタル教科書を用いた授業を撮影し、既に運用している自宅サーバに動画を公開した。9月からは、公開された授業動画およびデジタル教科書を用いて、生徒たちが自宅で予習をおこない、教室では、授業動画で得た知識の定着およびその活用に重点をおいた『反転学習型のアクティブラーニング』を行った。授業については、本校は学習院大学教授佐藤学氏の提案する『学びの共同体』に取り組んでいるため、グループでの活動が中心となった。動画を予習として見ているため、校内での授業では、その単元で問題となる現象についての議論や、問題練習といった理解の定着についての活動をおこなうことができ、反転型のアクティブラーニングは、生徒にとっては理解の助けになったと考えている。3月におこなった生徒アンケートでは、授業の動画が公開されていることで、予習だけでなく復習に取り組みやすかった等の意見があり、独自のデジタル教科書及び動画公開による学習効果は充分にみられた。
手がかり付き再認の提唱とそれに関わる検索プロセスの検討

再認時にターゲット以外に周辺情報を加えることが記憶成績にどのように影響するのかを検討するために手がかり付き再認の実験パラダイムを考案した。そのために,基本的に記憶の自己選択効果と記憶結合エラーという既存の実験パラダイムを応用した。その結果,周辺情報の有無および周辺情報が学習時に提示されたものか未提示かによって再認率が異なることが示された。特に,学習時に未提示であった情報を再認テスト時に付加するとターゲットへの再認率は落ちた。手がかり付き再認の標準的実験パラダイムの確立とテータ収集,および,これに関与する検索プロセスの検討に着手した。前者については,雛形の実験パラダイムを確立する前段階として,記憶の自己選択効果の実験パラダイムを用いたソースモニタリングテストを実施した。意味的に関連性のある記銘候補2単語を対提示し,自己選択条件では参加者が,強制選択条件では実験者が,どちらか一方を記銘語として選択した。テストでは,テスト単語が選択語なのか,選択しなかった単語なのか(どちらもold),あるいは新奇単語(new)なのかを参加者に弁別させた。その結果1自己選択条件では非常に高い弁別率が得られたが,強制選択条件では選択しなかった単語の弁別率が低かった。現在は選択時の単語間の意味的関係性を希薄にした刺激を用いても同様の結果が得られるかどうかの実験を行っている。こうした実験は,対にした2つの事象の意味的関連性の強弱が個々の事象に対する記憶痕跡だけでなく,一方がもう一方の想起にどれほどの影響を与えるのかを考える上で重要で,本研究のテーマである手がかり付き再認テストを考えていく上で直接関係がある。また,実験と並行して,ソースモニタリングテスト時の検索プロセスについて,月元・平野(2009)のPDP-θモデルを応用する形で模索している。PDP-θとソースモニタリングテストの検索プロセスはどちらもテスト項目が3種類という点で同等であるが,前者は反応がold/newの2種類であるのに対し,後者は3種類に弁別させる。従って,まずは(1)PDP-θでの反応候補を3種類に増やした場合のモデル作りを模索し,(2)そのうえでソースモニタリングテストに応用していく。現在は(1)に着手している。当該年度では,記憶の自己選択効果の実験パラダイムを利用して,新たに手がかり付き再認の標準的な実験パラダイムを確立するための基礎的な実験を行った。具体的には,2つの意味的に類似した記銘候補をペアで提示し,それを選択・記銘させ,その後,再認テストを行った。このテストではold項目として記銘語単独(single),記銘時と同じペア(intact),記銘語+新奇語(feature),そして記銘語+その記銘語と異なる非記銘語(conjunction)を,new項目として未提示語単独(new-single),未提示語同士のペア(new-pair)を含ませ,これらを参加者にランダムに提示した。ペアで提示されたテスト項目については,指定された方(oldペアの場合は全てold項目の方)が学習時にあったかどうかを判断させた。この結果,参加者は極めて高い弁別率を示した。こうした結果は,特にold判断において,記銘時の付加的な情報が選択語の再認に寄与することはほとんどないこと(intact, conjunction),再認テスト時に"余計な"情報を加えることによる判断のperplexが発生しないこと(feature)を示す。ただし,この実験パラダイムには次の問題点も指摘できる。すなわち,ペアを再認する時,テストされるべき単語の指定の後でペアが提示される。この手続きでは参加者は指定されない方の単語を意識的に見ないままold/new判断している可能性がある。また,new判断の対象がnew-singleとnew-pairのみで少ない。こうした手続きやテストリストの構成では参加者は比較的簡単に再認判断ができると思われる。従って,考えうる再認判断の際の検索プロセスもRecollectionとFamiliarity以上に想定する必要はない。そこで,次年度はこうした問題点を改良した実験パラダイムの確立を目指す。本年度はより基礎的なアプローチを試みた。すなわち,前年度に採用した記憶の自己選択効果の実験パラダイムや,単語ペアの使用を避けた。その代わり,記銘材料を4文字名詞および名詞句に変え,記憶テストの際にはそれらの一部を再認テストさせた。また,記銘材料を人物とした背景による再認判断への影響も検討した。どちらも,記銘時と同じ項目を提示してその一部を再認させるintact条件,再認対象のみ提示するsingle条件,そして再認の対象に新奇の情報を加えたfeature条件を設定し,各条件に対応するnew項目も用意した。実験の結果,材料による違いに関係なく,intact条件,single条件,feature条件の順で再認成績は高かった。このことは再認テストの対象となる情報にどのような情報を加えるかが結果に影響することを示しており先行研究と一致するものである(e.g.,Light&Carter-Sobell,1970)。

当該年度は本研究最終年度でありながら本研究の目的である手がかり付き再認の最も基礎となる実験パラダイムに基づくデータ収集に終始したが,この結果は文脈依存効果,連合再認,記憶結合エラーといった記憶現象の解明に迫る上での重要な接合点として位置付けられる。また,single条件とfeature条件でのold判断に回想プロセスが関与する場合,それぞれ"補完"再生と"修正"再生が寄与すると考えられるが,このことは再認における再生のプロセスを考えることにつながる。また,手がかり付き再認の検索モデルについてはPDP-θからの応用を試みたが,再認の対象が項目の一部であることで,その項目全体に対するRecoやFamiに包含される形で再認対象のRecoやFamiも考慮せねばならないことが判明した。このことは少なくともPDP-θ以外からアプローチする必要があることを示している。
超音波検査による頭頸部癌頸部リンパ節転移診断基準の有効性に関する多施設研究

2019年3月31日までに7施設より55症例85個のリンパ節が登録された。最終的に参加登録可能施設が7施設(神奈川県立がんセンター、名古屋大学、鳥取大学、国立病院機構四国がんセンター、金沢医科大学、新潟がんセンター、愛知県がんセンター、)となり、それぞれの施設から18例、13例、9例、6例、4例、3例、2例、合計55症例、85個のリンパ節が登録された。クラウド型のデータベースを用い、必要な文字データおよび画像データが適切に登録されていた。検討対象のリンパ節の厚みは3mmから23mmであった。85個のリンパ節のうち偽陽性が12個、偽陰性が1個であった。偽陽性のリンパ節は厚み5mmから8mmのものが多く、偽陰性のものは厚み6mmであった。偽陽性、偽陰性ともにある特定の施設に多い傾向があり、今後の教育、指導体制を立てるにあたって、役立つ傾向がさらに明確になるものと思われた。CTにおける診断と超音波診断による診断結果を比較したところ、超音波診断の精度のほうが高かったが、CTにおいても、以前のようにサイズだけではなく造影効果または造営欠損などリンパ節の内部所見に注目するコメントが増え、より小さな転移リンパ節の診断精度が高くなっていることも分かった。さらにリンパ節の部位、原発部位、診断装置や診断環境条件なども調査項目に含まれているため、より精度の高いリンパ節転移超音波診断を目指して、さらに詳細な解析および検討を行っていく予定である。頭頸部扁平上皮癌頸部リンパ節転移診断は、正確な病期分類と治療方法選択のために非常に重要であり、小さなリンパ節転移を早期から診断できるのが超音波診断(US)である。しかし、その診断基準や標準的検査手技が規定されていないことが大きな問題点であった。USは検査費用も安価で、特別な前処置は不要で、頸部の情報を収集可能である。放射線被もなく、治療中の変化や、治療効果判定や治療後の経過観察ができるため、現在広く普及しつつある。本研究は、幅広い施設で使用可能な転移陽性診断基準を作成することを目的とした多施設共同研究である。平成25年に施行した診断基準を若干修正して作成した診断基準(ver.2)を用いた場合の正診率を出すとともに、施設・検査者間の診断成績の差やラーニングカーブを検討するものである。まず初年度の平成27年度には、多施設研究としての研究実施計画書を作成し、研究参加予定施設の倫理委員会の審査に諮るとともに、信頼のおけるデータ管理とデータ分析をするためのデータベース作成を行った。さらにデータ管理、モニタリング、統計学的処理方法、対象設定条件を明確にした。データベースは、入力やデータ管理の簡単さ、安全性、データ修正履歴の明確さを重視し、最終的なデータ保存、統計処理を前提に準備をすすめ、平成28年2月1日より症例登録、データ入力作業が可能となった。多施設から症例登録蓄積作業が開始され、現在データ蓄積作業進行中である。標準的な検査法の確立に関しては、「頭頸部超音波検査マニュアル」を現在作成中である。このマニュアルをもとに平成27年度は実技講習会を4回開催した。今後、検査手技の動画、診断基準の考え方に関する解説も含めた「頭頸部超音波検査マニュアル」の完成を目指す予定である。平成27年度の研究計画として、当初より掲げていた多施設共同研究としての研究実施計画書を作成することができた。さらに、参加各施設での倫理委員会審査に関して、現在順次審査が終了し症例登録可能な施設が増えつつある。また、多施設からの症例登録に当たり、簡便で安全性が確保されたデータベース作成、データ収集後のモニタリングやデータ解析が行いやすいように作成、改良し使用を開始したところである。研究計画の2年目として、クラウド型データベースに参加各施設よりデータ登録を施行した。データ登録に関するシステム完備のため、症例登録窓口としての事務局および登録担当責任者を配備し、データ管理や進行状況の把握を常に把握できるようにした。収集中のデータに関しては、データの入力もれがないように管理を行った。また、データセンターでは、定期的にデータモニタリングを施行しており。これまでのところとくに問題なくデータ集積ができている。画像データもデータベースにそのまま入力できる形となっており、患者個人情報等が出ていないことを確認、管理している。収集されている症例とそのデータに関して、この1年で4回の研究会を開催し、研究参加施設及び、参加希望の多施設からも参加者を募り、途中経過を報告、検討していった。さらに、登録症例の集積を続けながら、データ解析の準備として統計処理に必要なデータベース整理も施行中である。頭頸部進行癌治療での化学放射線治療の割合が増え、手術症例が少なくなる傾向があり、治療の影響がないリンパ節で、超音波診断による転移の有無判定とやリンパ節内部所見と摘出リンパ節の病理所見を対比するという本研究の対象症例データを集積することは難しくなりつつあるが、多施設研究ということで、順当に症例登録およびデータ集積が進んでいると思われる。症例登録を順調にすすめつつ、参加予定施設でのIRB審査が順次終了するのを待ちつつ研究を進めた。データ登録不備の施設には、登録を促しつつ研究継続中である。症例登録の方法、データ入力の方法をすべて一元化したため、症例集積状況が一目瞭然で順調に遂行できており、現在のところ大きな問題は確認されていない。診断基準に関する理解度や実行状況も施設間格差もないことが確認できている。

データベース上でも、画像データを含む登録データが一覧できるが、最終的には有料のデータベースから取り出し、エクセル上で様々な検討を行う必要があり、現在、データのエクセル移行方法につき検討中である。予定の目標症例数、目標リンパ節数まであとわずかであるため、このまま研究を継続し、統計的解析手法を決定していく予定である。参加施設の多くがIRB審査に予想より時間がかかり、研究開始時期の足並みがそろわず、予定施設でそろって登録可能トンったのが予定より約1年遅れてしまったため。2019年3月31日までに7施設より55症例85個のリンパ節が登録された。最終的に参加登録可能施設が7施設(神奈川県立がんセンター、名古屋大学、鳥取大学、国立病院機構四国がんセンター、金沢医科大学、新潟がんセンター、愛知県がんセンター、)となり、それぞれの施設から18例、13例、9例、6例、4例、3例、2例、合計55症例、85個のリンパ節が登録された。クラウド型のデータベースを用い、必要な文字データおよび画像データが適切に登録されていた。検討対象のリンパ節の厚みは3mmから23mmであった。85個のリンパ節のうち偽陽性が12個、偽陰性が1個であった。偽陽性のリンパ節は厚み5mmから8mmのものが多く、偽陰性のものは厚み6mmであった。偽陽性、偽陰性ともにある特定の施設に多い傾向があり、今後の教育、指導体制を立てるにあたって、役立つ傾向がさらに明確になるものと思われた。CTにおける診断と超音波診断による診断結果を比較したところ、超音波診断の精度のほうが高かったが、CTにおいても、以前のようにサイズだけではなく造影効果または造営欠損などリンパ節の内部所見に注目するコメントが増え、より小さな転移リンパ節の診断精度が高くなっていることも分かった。さらにリンパ節の部位、原発部位、診断装置や診断環境条件なども調査項目に含まれているため、より精度の高いリンパ節転移超音波診断を目指して、さらに詳細な解析および検討を行っていく予定である。平成28年度の目標として、全参加予定施設での倫理委員会審査を終了し、予定登録症例、リンパ節数を目指してデータ収集を行っていく。今年度も定期的に、研究進捗状況と研究実施計画書内容に関して確認していく。具体的には、定期的研究会を開催し、参加施設での認識を確認し、新規参加医師への研究内容伝達を行うとともに、収集された症例の画像データ内容を検討する場を設ける。その際に、研究会の中で、診断技術と診断基準の理解を助けるための講習会を開いていく予定である。現在の方法を継続して目標リンパ節数まで症例登録をすすめデータ解析を施行する。データ解析とその結果の考察に関して、さらに参加施設での研究会、検討会を開催していく予定である。さらに集まったデータをもとに学会発表を行い、広く公表するとともにその場で出された疑問点や不明点などを解決すべく、データ検討を行っていく予定である。予定症例数にあと少しで到達するため、研究予定期間を延長したうえで予定通り遂行し、本年度中に症例が集積されたところですべてのデータを無料のエクセル上に移動し統計的解析等を施行し、最終報告を学会発表および論文発表にて公表する予定である。
グリコウイルスとシグナル増幅プローブを用いる細胞内遺伝子マニピュレーション

1.グリコウイルスを用いる遺伝子運搬50nm程度のウイルスサイズが細胞導入に最適であることを見出し、3つのガラクトース残基をもつグリコウイルスがこの目的に最適であることを明らかにした。2.セラソームを用いる遺伝子運搬表面をセラミック被覆したリポソーム(セラソーム)は核酸との結合に際し融合せず、ウイルスサイズを維持した優れた遺伝子キャリアであることを明らかにした。3.リボレギュレーターを用いる遺伝子のセンシングリボレギュレーター型のモレキュラービーコン(プローブ)は特定の遺伝子(ターゲット)の存在下で特定のレポータータンパク質を発現し、シグナル増幅型の遺伝子検出に用いえることを明らかにした。4.タンパク質へmRNAのタグ付けread-throughribosome-display法を考案し、これにより、全長のタンパク質を自身をコードしたmRNAに繋ぎとめられることを明らかにした。5.センスコドンへの非天然アミノ酸の導入アミノアシルtRNA合成酵素の阻害際を用いるとセンスコドンに非天然アミノ酸を容易に導入できることを明らかにした。(1)シグナル増幅型遺伝子診断:細胞内診断に適用できる新しいシグナル増幅可能な遺伝子診断法としてriboregulator型核酸プローブを開発した。大腸菌のタンパク合成系を利用し、特定の遺伝子の存在下に特定の遺伝子(ルシフェラーゼ)を発現させるものであり、これにより、例えばHIV関連遺伝子を負fmolレベルで検出することが可能になった。(2)グリコウイルスを用いた遺伝子運搬:エンドサイトーシスのサイズの効果を詳細に検討するためにCdSe量子ドットを糖クラスターで覆った15nmの量子ドット糖コンジュゲート(glycoQD)を作成し、50nmのウイルスサイズが最適であることが明らかになった。肝細胞への遺伝子ターゲティングのために部分的(8残基のうち3個)にガラクトース置換したグリコウイルスを作成した。このものは単量体(40nm)として存在し、高い活性と肝細胞指向性を示した。グリコウイルスの有効性はsiRNAの運搬においても顕著であることが分かった。(3)サイズ制御に基づく制癌剤の活性向上:薬物を何らかの方法で50nm領域に複合化できればサイズ許容のエンドサイトーシスにより細胞取り込みが可能となろう。このような戦略から制癌剤の複合化を検討し、乳癌や骨そそう症の治療にも用いられるイバンドロネートなどのビスリン酸系制癌剤とグリコクラスターのサイズ制御錯形成を遣唐使、その活性(細胞死滅活性)を著しく増強させることに成功した。遺伝子のマニピュレーションと運搬に関し、最終(17年度)年度は以下の課題に取り組み、下記の成果を得た。1.新しいsiRNA送達剤の開発:脂質を束ねた構造を有する大環状のオクタアミンが従来例のないコンパクトな遺伝子/siRNAの運搬体になりえること、およびその理由として、オクタアミンが曲率のために大きなベシクル(リポソーム)ではなく安定化されたミセルを形成することを明らかにした。2.伝子運搬としてのセラソームの開発:リポソーム(脂質の2分子膜集合体)は核酸(DNAやRNA)との相互作用により容易に融合(fusion)し、遺伝子運搬体としては不適な巨大な複合体を形成する。これを避けるために表面をセラミック(シリカ)被覆で強化したリポソーム(セラソーム)を用いる遺伝子運搬を検討し、セラソームがDNA(プラスミドDNA)やsiRNAとの相互作用において融合せず、従って元のウイルスサイズ(60-70nm)を維持した優れたキャリアであるとともに、毒性も極めて軽微であることが判明した。3.DNA/RNAをプローブとする触媒的遺伝子検出法の開発:標的RNAの存在により(レポーター)タンパク翻訳のオン/オフ制御が可能なmRNAプローブおよびそれをコードしたDNAを用いることにより、2重にシグナル増幅が可能な遺伝子検出システムを開発した。さらに、標的のRNAとプローブDNAとのハイブリッド二重鎖に特異的なRNA加水分解酵素(RNase H)を共存させると、非可逆的な翻訳系の活性化により、遺伝子の検出感度が大幅に向上することを見出した。
脳内fractalkine-CX3CR1シグナルの肥満病態における機能解析

近年、fractalkine (FRK)-CX3CR1 systemが中枢神経系の機能を調節していることが明らかにされつつある。特に、CX3CR1受容体欠損マウスで海馬でのLTPの減少と行動薬理学的手法により学習記憶障害が報告されている。また、肥満モデル動物で学習記憶障害が報告されている。そこで、高脂肪食摂取による食事性肥満モデルマウスの学習記憶障害における脳内FRK-CX3CR1シグナルの作用を検討した。6週齢のC57BL/6Jマウスに60%高脂肪食を16週間与え、Y mazetestを行い、海馬および視床下部でのFRKおよびCX3CR1の遺伝子発現を検討した。さらに、CX3CR1アンタゴニストである18aを正常オスマウスの側脳室内に50 ng/mouse投与し、30分後にY maze testを行った。その結果、高脂肪食摂取によって著明な学習記憶障害が認められ、海馬でのFRKおよびCX3CR1の遺伝子及びタンパク質発現の有意な減少が認められた。さらに、CX3CR1アンタゴニストである18aの側脳室内投与によって、著明な学習記憶障害が誘発された。さらに、マウス初代培養神経細胞およびマイクログリア細胞を用いた実験で、FRKおよびCX3CR1の発現がBDNFおよびIGF-1により有意に増加することが明らかになった。また、マウスを用いた実験で、BDNF受容体アンタゴニスト及びIGF-1受容体アンタゴニストの投与によって海馬のFRKおよびCX3CR1の発現減少が認められた。これらの結果から、脳内FRKおよびCX3CR1の発現減少は脳内BDNFの減少および血中IGF-1の低下によることが示唆された。今回の検討の結論として、高脂肪食摂取による肥満モデルマウスの学習記憶障害に脳内FRK-CX3CR1シグナルの低下が関与している可能性が明らかとなった。中枢神経系の機能は、神経細胞とグリア細胞の相互作用によって調節されており、特に、グリア細胞の中でもマイクログリアが種々の中枢神経系機能障害に深く関わっていることが明らかになりつつある。特に、神経細胞から放出されるfractalkine(FRK)はマイクログリアに存在するCX3CR1受容体に作用し、神経細胞とマイクログリアのクロストークの重要な因子であると考えられ、最近、主要な中枢神経系機能(学習記憶、神経可塑性、神経変性、脳内炎症)の調節に関わっていることが報告されている。糖尿病は認知機能の低下を伴う代謝性疾患である。そこで、本研究課題で、ストレプトゾトシン(STZ)投与による1型糖尿病モデルマウスの学習記憶障害における海馬のFRK-CX3CR1シグナルについて検討した。STZ投与により学習記憶障害、血中コルチコステロンレベルの有意な増加および血中IGF-1の有意な減少が認められ、海馬でのFRKおよびCX3CR1発現の有意な減少が認められた。さらに、正常オスマウスにCX3CR1のアンタゴニストである18aを側脳室内投与すると著明な学習記憶障害が誘発された。Dexamethasoneの適用によって、初代培養神経細胞のFRK mRNA発現は変化せず、初代培養マイクログリア細胞のCX3CR1 mRNA発現は有意に減少した。IGF-1を適用したところ、初代培養神経細胞のFRK mRNA発現および初代培養マイクログリア細胞のCX3CR1 mRNA発現の有意な増加が認められた。次に、正常オスマウスの皮下にDEXを投与すると、血中IGF-1の有意な減少と海馬でのFRKおよびCX3CR1 mRNA発現の有意な減少が認められた。これらのことから、1型糖尿病モデルマウスの学習記憶障害に海馬のFRK-CX3CR1シグナルの低下が関与する可能性が明らかとなった。ストレプトゾトシン投与の1型糖尿病モデルマウスの解析が順調に進み、fractalkine-CX3CR1 signalingの学習障害に関わる役割を明らかにすることができた。高脂肪食摂取による肥満モデルマウスの脳内fractalkineおよびCX3CR1のmRNA発現の変化を検討し、マイクログリアでのfractalkine-CX3CR1シグナルの炎症反応に対する作用とそのメカニズムについて検討した。16週間高脂肪食を与えたマウスの海馬および視床下部でのTNF-αmRNA発現は、正常食を与えたマウスに比べて、有意に増加し、一方、fractalkineおよびCX3CR1のmRNA発現は、高脂肪食摂取によって有意に減少した。次に、マイクログリアのcell lineであるMG6 cellsを用いてfractalkineの作用を検討した。Fractalkine (100 nM)単独の適用では、炎症性サイトカイン、COX-2およびiNOSのmRNA発現に変化は認められなかった。LPS(50 ng/ml)によるTNF-α、COX-2およびIL-1βのmRNA発現増加をfractalkineは有意に抑制したが、iNOSおよびIL-6のmRNA発現増加には影響を及ぼさなかった。Fractalkineは、LPSによるp38 MAPKのリン酸化亢進を有意に抑制したが、JNKおよびNF-κBのリン酸化亢進には影響を及ぼさなかった。これらの結果からfractalkineは、p38 MAPK側のpathwayに作用してLPSの反応を抑制していることが明らかになった。今回の実験で、fractalkineはp38 MAPKの上流を抑制することによって、TLR4の活性化による炎症反応の一部を抑制することが明らかになった。

また、食事性肥満モデルマウスで脳内fractalkine-CX3CR1シグナルの低下が認められ、食事性肥満による脳内炎症に関与している可能性が示唆された。それぞれの実験系の設定に時間がかからなかったため。近年、fractalkine (FRK)-CX3CR1 systemが中枢神経系の機能を調節していることが明らかにされつつある。特に、CX3CR1受容体欠損マウスで海馬でのLTPの減少と行動薬理学的手法により学習記憶障害が報告されている。また、肥満モデル動物で学習記憶障害が報告されている。そこで、高脂肪食摂取による食事性肥満モデルマウスの学習記憶障害における脳内FRK-CX3CR1シグナルの作用を検討した。6週齢のC57BL/6Jマウスに60%高脂肪食を16週間与え、Y mazetestを行い、海馬および視床下部でのFRKおよびCX3CR1の遺伝子発現を検討した。さらに、CX3CR1アンタゴニストである18aを正常オスマウスの側脳室内に50 ng/mouse投与し、30分後にY maze testを行った。その結果、高脂肪食摂取によって著明な学習記憶障害が認められ、海馬でのFRKおよびCX3CR1の遺伝子及びタンパク質発現の有意な減少が認められた。さらに、CX3CR1アンタゴニストである18aの側脳室内投与によって、著明な学習記憶障害が誘発された。さらに、マウス初代培養神経細胞およびマイクログリア細胞を用いた実験で、FRKおよびCX3CR1の発現がBDNFおよびIGF-1により有意に増加することが明らかになった。また、マウスを用いた実験で、BDNF受容体アンタゴニスト及びIGF-1受容体アンタゴニストの投与によって海馬のFRKおよびCX3CR1の発現減少が認められた。これらの結果から、脳内FRKおよびCX3CR1の発現減少は脳内BDNFの減少および血中IGF-1の低下によることが示唆された。今回の検討の結論として、高脂肪食摂取による肥満モデルマウスの学習記憶障害に脳内FRK-CX3CR1シグナルの低下が関与している可能性が明らかとなった。
高密度ポリマーナノシリンダーアレイによる金属ナノ構造機能化

本研究は、ブロックコポリマーのミクロ相分離によるナノメートルスケールの高規則性ナノ構造を鋳型(テンプレート)とする金属ナノ構造の作製プロセスを開発することを目的とする。ナノ規則構造の高密度化によって飛躍的な高機能化が期待される冷陰極アレイ、情報記録メディア、ナノ電極あるいは光触媒の基本部材開発をめざし、この高分子ナノ構造をテンプレートとする金属または金属酸化物のナノ構造転写・複合化プロセスを開発した。(1)酸化ルテニウムナノロッドの作製:ミクロ相分離構造薄膜を四酸化ルテニウムの水溶液の蒸気に晒すと、数分以内にPEOシリンダーに選択ドーピングされる。さらに、この膜を60kV電子線照射することにより、高さ数十ナノメートルのRuOxナノロッドアレイが基板全面に作製でき大面積かつ超高密度の冷陰極部材として、真空"ナノ"エレクトロニクスへの展開が期待される。(2)鉛ナノロッドアレイの作製:ミクロ相分離構造薄膜に四フッ化ホウ素鉛のアルコール溶液を滴下し、洗浄後、電子線照射によって、基板全面に規則的に配列した鉛ロッドアレイが作製できた。(3)酸化チタンナノワイヤの作製:ミクロ相分離構造薄膜を四塩化チタンの蒸気に晒し、加水分解、さらに焼成によって、数ナノメートルのナノ粒子が"数珠"状に連なったワイヤが絡み合った構造が基板全面に作製できた。これは、比表面積の大きな光触媒や色素増感太陽電池の高効率電極への応用が期待される。以上、両親媒性液晶ブロックコポリマーの特異なミクロ相分離構造、垂直配向ナノシリンダーアレイ構造をテンプレートとする転写複合化プロセスを開発し、材料適用範囲の広い金属および金属酸化物のナノ規則構造の作製に成功した。今後、作製プロセスの最適化と各ナノロッドの単結晶化や配向制御を検討することにより、自己組織化プロセスを利用した量産性に優れた電子材料への応用展開が期待される。ブロック共重合体相分離構造内の金属単結晶の成長とナノ形状制御に向けて、シリンダー型のミクロ相分離ドメインに対する選択的な金属または金属イオンの導入を行う。具体的には、酸化チタン、塩化スズ、酢酸鉛を蒸着法または液層への浸漬により、金属イオン導入、還元処理、次いで結晶化を行うステップワイズ法を取り入れ、検討を行った。いずれの対象金属においても、シリンダードメインへの導入が可能であることをTEM, FE-SEM, XPS, XRDなどによる多角的な評価により確認した。結晶化においては、完全な単結晶ではなく、結晶あるいはアモルファスとの混合であることが示唆され、ナノメートルオーダーにおける金属結晶化の技術を確立するには至っていない。次年度は、この結晶化プロセスの開発と同時に得られたナノ結晶の物性評価に展開する予定である。
ワクシニアウイルス法により合成されたヒトP450によるニトロソ化合物の活性化

研究対象として選ばれた9種のニトロソ化合物のうち,5種(2,6ージメチルモルフォリン,プロピルアリルアミン,モルフォリン,ピロリジン,ジーNーブチラミン)は,それらの変異原性活性化をエ-ムステストで検出できることが明らかになった。この活性化反応はラットおよびハムスタ肝臓Sq画分中に存在するチトクロ-ムP450により触媒されるが,ヒト肝臓Sq画分を用いた場合は2,6ージメチルモルフォリンとジーNーブチラミンに対して全く触媒能を示さず,ヒトとネズミの間における著しい差異が検出された。ヒト肝臓Sq画分による3種のニトロソ化合物の活性化反応は,ワクシニアウイルス法により合成されたヒトP450を用いたエ-ムステストの結果からIIE1とIIA3(又はIIA6)の2分子種により触媒されることが明らかになり,人肝中での各P450の存在量から推定するとIIE1が支配的に触媒反応を行なうことが考えられ,この類推はポリクロ-ナル抗体による阻害実験から正しいことが証明された。4種(ジメチルニトロサミン,ジエチルニトロサミン,ニトロソプロリン,ニトロソノルニコチン)の化合物の変異原性活性化はエ-ムステストで検出できないので,チャイニ-ズハムスタ-V79およびラットヘパト-マ細胞(H4IIEC3)を用いるユ-カリオ-トミュ-タジェネシス系を試験的に使用した。6チオグアニン耐性株出現の確認により,これらの化合物も主としてIIE1により活性化されることが証明された。この試験法はニトロソ化合物のみならず,DNA傷害性物質の変異原性活性化を検出する有用な方法であり,特にワクシニアウイルス法によるヒトP450の生合成と組み合わせることにより,ヒトに対する化合物のリスクアセスメントに役立つ有用法が開発されたものと思われる。
コバルト触媒による〔2+2+2〕ピリジン環化反応を用いた複素芳香環化合物の合成

そこで、研究のもう1つの概念である(R^*,R^*)-隣接ジオールによるコンホメーション制御による反応場の設計を目的とする研究を続けた。その結果、酒石酸由来の嵩高い保護基で保護した隣接ジオールに連結されたアルキンとアルカンのパラジウム触媒による分子内エン-イン環化反応において、反応の促進および立体選択性の発現を見い出した。また同様に、保護した隣接ジオールに連結されたアルケンと水酸基のオキシパラデーションによるピラン環の構築で、高い立体選択性の発現が見い出された。このようなコンホメーション制御による反応場の設計は今後の環化反応の研究における有用な知見を与えるものと期待できる。また、これらの合成手法を利用して複素環化合物の合成を行えることが期待できる。
仔馬胃潰瘍の指標となる新規バイオマーカーの検索

【はじめに】仔馬の胃潰瘍は、臨床症状が現れにくく、しばしば無症状のまま破局的な状態を迎えることから、診断の困難な生産疾患として問題視されている。本研究ではメタボロミクス解析技術を用い、仔馬胃潰瘍を早期に診断できる技術を開発することを最終的なゴールとして、まず胃潰瘍を発症した仔馬に特異的な新規バイオマーカーの検索を行った。【材料と方法】日高地区の当歳馬56頭(雄28頭、雌28頭)を実験に供与した。内視鏡によりこれらの動物の胃潰瘍検査を行い、炎症像を胃に認める個体を胃潰瘍群、また症状の認められないものを正常群として2群に分けた。なお実験に供与した動物は、いずれも採血以前に薬剤投与による治療等行っていない個体とした。先行した予備実験では、低分子化合物にバイオマーカー候補分子が見いだされたことから、分子量100から1000までの化合物にターゲットを絞り、除蛋白した血清成分を逆相高速液体クロマトグラフィ(RP-HPLC)で分離した後、飛行時間型質量分析装置(tof/MS)にて分析し、二群間で比較した。【結果】分析の結果3376ピークが検出された。これらのピークについて直交最小二乗法判別分析(OPLS-DA)による多変量解析を行ったところ、二群間に顕著な差が認められ且つ有意差のあるバイオマーカー候補分子は認められなかった。【考察と今後の方針】以上の結果から、HPLC-tof/MSによって見いだされる、胃潰瘍のバイオマーカー候補となり得る低分子化合物は、除蛋白後の血清中に存在しないか、もしくは検出限界以下である可能性が考えられた。このため、検出方法の再検討、もしくはターゲットの拡大が必要と思われる。予備試験で対象とした動物は治療中の個体が主であり、予備試験では、治療薬もしくはその代謝物が候補分子に取り上げられた可能性が高い。
感作性物質のリスト拡大と代替法による分類の確立

接触皮膚炎は職業性皮膚障害の中でも頻度が高い。動物福祉や時間的、コスト的な問題からin vitro試験やコンピューターを用いた定性的構造毒性相関(QSAR)モデルの代替法による評価の二ーズが高まっている。KY methods(US PatentNo.7725413, 2010)や1 model model KY methodを用いて動物実験(LLNA)データのみを根拠とするQSTRモデルや、感作性の強弱を判定やアラート構造の選択決定(フィルタリング)によるモデルを開発した。ドイツMAKにありわが国のJOHに無い感作性物質を根拠と共に許容濃度等委員会に提案し、感作性物質が追加された。日本産業衛生学会許容濃度等委員会感作性小委員会で新規感作性6物質をその提案理由とともに親委員会である許容濃度等委員会に提案し承認され産業衛生学会誌2013年9月号に暫定案として掲載された。日本職業環境アレルギー学会ガイドライン作成委員会委員として職業性アレルギー疾患の診療ガイドライン作成に関わり、協和企画より出版された。日本動物実験代替法センター(JaCVAM)皮膚感作性資料編纂委員会委員として、in vitro試験であるDirect Peptide REactivity Assay(DPRA)とKeratinoSensの評価を行った。これら報告書は日本動物実験代替法学会誌に掲載予定である。日本産業衛生学会許容濃度等委員会感作性小委員会により親委員会に提案された新規感作性物質が正式に感作性物質となった。日本職業環境アレルギー学会ガイドライン作成委員会により協和企画より出版された「職業性アレルギー疾患診療ガイドライン2013」がAllergology International誌で英文化された。喫緊の課題である皮膚感作性試験の代替法確立については、LLNAのEC3値に基づいた感作性の強弱を判定するモデルを作成した。in vitro試験の評価については、DPRAの評価がAATEX-JaCVAM誌に掲載された。職業性アレルギー疾患診療ガイドライン2016が2016年7月に刊行予定である。第157, 158, 159 160回日本産業衛生学会許容濃度等委員会に出席し、産業界における化学物質の動向を情報収集し、感作性物質についてコメントした。第161, 162, 163, 164回日本産業衛生学会許容濃度等委員会に出席し、産業界における化学物質の動向を情報収集し、感作性物質についてコメントした。職業性曝露により接触皮膚炎の症例報告のあるジエタノールアミンが皮膚感作性第2群、アクリル酸エチルが皮膚感作性第2群、イソホロンジイソシアネートが皮膚感作性第3群となった。職業性アレルギー疾患診療ガイドラインが英文化した。喫緊の課題である皮膚感作性試験の代替法の確立については、皮膚感作性物質のアラート構造の選択決定(フィルタリング)に基づくQSARモデルを開発する。皮膚感作性物質のアラート構造の選択決定(フィルタリング)に基づくモデルの作成を更に改良する。29年度が最終年度であるため、記入しない。衛生学喫緊の課題である皮膚感作性試験の代替法の確立については、LLNAのEC3値に基づいた皮膚感作性定量的構造活性相関(QSAR)モデルを開発する。皮膚感作性in vitro試験については、我国発のh-CLAT, IL-8 Luc Assayの妥当性の検証など評価を進めOECDのガイドライン化につなげる。感作性物質のリスト拡大については、許容濃度等委員会に提案された新規化学物質の感作性の評価の妥当性を検証する予定である。喫緊の課題である皮膚感作性試験の代替法確立については、動物実験データのみからなるQSARモデルを作成し予測率も以前のものに比べて改善された。in vitro試験については、DPRAとKeratinoSensについて評価を行えた。感作性物質のリスト拡大に関しても、新規感作性物質6物質をその提案理由とともに産衛誌9月号に暫定案として掲載することができた。研究計画に比べて旅費額が低くなったため。当初の予想より、旅費が低く収まった。研究計画に比べて、旅費額が低くなったため。更に充実した研修学会参加を行い使用する予定である。更に、活発に国内国外研究活動を行う。感作性物質の拡大については、ドイツの許容濃度等委員会(MAK)の感作性物質リストを参考に日本の許容濃度委員会に提案する予定である。更に充実した学会参加研修を行い使用する予定である。
ナノ粒子のプラズモンカップリングによるタンパク質構造変化計測

暗視野照明下で金ナノ粒子間のプラズモンカップリングを観測可能な,高感度CMOSカメラを備えた顕微観測系を構築した。それぞれの金ナノ粒子に対して異なるタンパク質を結合させ,そのプラズモンカップリングの観測を検討したところ,観測シグナルは時間に対して二値的に変動した。したがって,単一分子レベルでの分子の挙動を観測可能であることが示唆された。タンパク質の機能の解明には構造変化ダイナミクスの詳細な解析が不可欠である。このような解析は現在蛍光法による一分子検出により達成されているが,発色団の光退色など多くの問題点を抱えている.本研究は,蛍光法における問題点の解決を目的として,金ナノ粒子のプラズモンカップリングを利用した新たなタンパク質構造変化計測法の開発を行った.本年度は,GroEL/GroES間の相互作用を観測モデルとして,タンパク質で修飾した単一金ナノ粒子間のプラズモンカップリングを高感度で観測し,分子間相互作用が解析可能な画像解析法の構築した.まず観測実験の予備段階として,SPM測定と顕微散乱スペクトル測定より,金ナノ粒子が単分散状態で固定化される最適化密度を検討し,10個/・m^2程度以下において粒子は単分散状態でガラス表面へ固定化されることが分かった.次にGroEL/GroES間の相互作用を観測モデルとして,タンパク質で修飾した単一金ナノ粒子間のプラズモンカップリング観測を検討した.顕微暗視野観察によってGroEL/GroES間の相互作用の観測を行った際には,ガラスチップ側の金ナノ粒子-GroELに対して,溶液中の金ナノ粒子-GroESが近づくとプラズモンカップリングによって散乱光強度が増大し,散乱光強度が変化することを想定し実験系を構築したところ,当初の予想どおりに散乱光強度の変化が観測できた.散乱強度が増大している時間をGroEL/GroESの結合時間としてヒストグラムを作製したところ,約14.5においてピークを持つ山型の分布が得られた.また,ATPが過剰に存在している条件ではGroELとGroESの結合時間は約8-10sのピークが得られ,得られた値は蛍光法を利用した単一分子測定による既報のものとよく一致することが分かった.よって散乱強度変化よりGroEL/GroES間の相互作用の解析ができた.タンパク質の機能の解明には構造変化ダイナミクスの詳細な解析が不可欠である.このような解析は現在蛍光法による一分子検出により達成されているが,発色団の光退色など多くの問題点を抱えている.本研究は,蛍光法における問題点の解決を目的として,金ナノ粒子のプラズモンカップリングを利用した新たなタンパク質構造変化計測法の開発を行った.本年度は前年度に引き続き,GroEL/GroES間の相互作用を観測モデルとして,タンパク質で修飾した単一金ナノ粒子間のプラズモンカップリングを高感度で観測した。これにより分子間相互作用が解析可能な単一粒子観測をベースにした画像解析法の高精度化を行った.前年度に行った実験条件を基に実験を継続して行い,GroEL/GroES問の相互作用観測を検討した.具体的には,顕微暗視野観察によって,ガラスチップ側の金ナノ粒子-GroELに対して,溶液中の金ナノ粒子-GroESが近づき結合するとプラズモンカップリングによって散乱光強度の増大が観測されることが前年度の実験により明らかになったが,本年度は観測される情報が的確に分子間相互作用に対応するものであるかを精査するべく継続して実験を行った.観測領域には多数の粒子が輝点として観察されるため,それぞれの輝点に対して解析を行った.この1セットの観測でおよそ100点のデータが取得できた.およそ1000点程度の実験データを取得したのち,散乱強度が増大している時間がそれぞれのタンパク質に結合しているナノ粒子が近接している時間に対応するため,この時間をGroEL/GroESの結合時間,単一粒子としての光散乱が観測されている時間を解離時間としてヒストグラムを作製したところ,得られた値は蛍光法を利用した単一分子測定による既報のものと非常によく一致し,観測される情報はGroEL/GroES単一分子間での相互作用に対応するものであることが確認できた。