hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
極低温表面反応により生成した分子の原子核スピン温度の測定

低温表面で生成したH_2O分子の原子核スピン温度と氷生成時の表面温度との関係を調べた. 8Kの表面にH_2O氷を生成させ,昇温しH_2O分子を熱脱離させることで原子核スピン温度を測定したところ,氷生成時の温度(8K)より高くほぼ高温極限の値を示した.彗星から熱脱離するH_2O分子の原子核スピン温度は,太陽系形成初期に氷が生成したときの塵表面温度を保存していると提唱されているが,以上の結果はその解釈に一石を投じるものである.低温表面で生成したH_2O分子の原子核スピン温度と氷生成時の表面温度との関係を調べた. 8Kの表面にH_2O氷を生成させ,昇温しH_2O分子を熱脱離させることで原子核スピン温度を測定したところ,氷生成時の温度(8K)より高くほぼ高温極限の値を示した.彗星から熱脱離するH_2O分子の原子核スピン温度は,太陽系形成初期に氷が生成したときの塵表面温度を保存していると提唱されているが,以上の結果はその解釈に一石を投じるものである.表面反応で生成した分子の原子核スピン温度についてはまだ明らかになっていない部分が多いため,現在行われている理論研究や天文観測研究からだけでは彗星で観測される分子の原子核スピン温度が持つ意味を正しく解釈することは難しい.この現状を改善するために,低温表面上のH_2O分子の原子核スピン温度を測定する実験を行った.本年度は以下1.2.の実験を行った.1.超高真空槽中に設置した低温アルミ基板(10K)上に,室温のH_2Oガスを蒸着させる.生成したH_2O氷を150K付近まで加熱することで昇華させ,その原子核スピン温度を共鳴多光子イオン化法により測定した.2.原子核スピン温度を変化させるために必要なオルソ/パラ変換反応が固相で起きるがどうかの確認するために,1.で生成させたH_2O分子を低温表面で1週間保持したあとに,過熱を行い基板上のH_2O分子を昇華させ,その原子核スピン温度が1.で測定した温度と異なるかどうかを調べた.その結果,1.2.どちらの実験においても,観測されたH_2O分子の原子核スピン温度は基板温度10Kよりも高い統計重率比3(>50K)をとることがわかった.これは室温のH_2Oガスを基板に蒸着させたとき,そのH_2O分子の原子核スピン温度が少なくとも50K以上であることを示している.さらに,固相におけるH_2O分子のオルソ/パラ変換反応は10Kでは,少なくとも1週間では起こらないことが明らかとなった.彗星中のH_2Oは分子雲で生成したと考えられているため,来年度は,分子雲中のH_2O生成を模擬的に再現し,その原子核スピン温度の測定をおこなう.具体的には,低温基板(10K)上にO_2分子を蒸着させ,マイクロ波放電によりH原子を照射することで,基板上にH_2O分子そのものを生成させ,その原子核スピン温度を共鳴多光子イオン化法により測定により測定する.「氷を蒸着したときの温度と,その氷が熱脱離したときのH_2O分子の原子核スピン温度の関係」を調べるために,真空チャンバー内のアルミ基板(8K)にH_2Oガスを蒸着させて氷を生成し,150Kまで昇温させ熱脱離したH_2O分子の原子核スピン温度を共鳴多光子イオン化法により測定した.結果として,原子核スピン温度は30-150K以上を示し,氷蒸着時の温度(8K)より高かった.また,紫外光を照射した場合や,常磁性体である0_2分子を試料氷に添加した場合などについても調べてみたが,結果に変化はみられなかった.次に「化学反応により氷(固体H_2O)が生成したときの表面温度とその氷が熱脱離したときのH_2O分子の原子核スピン温度の関係」を調べるために,基板にCH_4:O_2混合ガスを蒸着させ,紫外光ランプを照射し光反応により基板上にH_2O分子を生成させた.このようにして低温表面上で生成したH_2O分子を熱脱離させて原子核スピン温度を測定する実験を行ったところ,原子核スピン温度はH_2Oガスを蒸着させたときと変わらず30-150K以上を示し,氷生成時の温度(8K)より高かった.彗星など氷でできた天体から熱脱離するH_2O分子の原子核スピン温度は,太陽系形成初期に氷が生成したときの塵表面温度を保存している「過去の温度計」であると提唱されているが,以上の結果は「原子核スピン温度は過去の温度計である」という天文観測研究にみられる前提に一石を投じるものである.このような結果が得られた原因として,オルソ・パラ変換反応が固相では分子間の相互作用により劇的に加速され,氷が150Kに昇温されるあいだに,H_2O分子の原子核スピン温度が高温へ変化した可能性が考えられる.この可能性を評価するためには,本研究で用いた昇温脱離法(熱平衡プロセス)ではなく,レーザー光照射などによる非熱平衡プロセスでH_2O分子を氷から脱離させ,原子核スピン温度を測定する必要があることがわかった.
磁気ビーズを能動的に分散させる新たな手法の提案と実証

ドラッグデリバリーなど生体内での利用が期待されている磁気ビーズ(微粒子)を能動的に分散させる新たな手法を提案し実証することを目的として検討を行った。その結果、ビーズとして磁気異方性の大きな材料を用い、そこに回転磁界を与えることによりビーズの個々の回転トルクを利用してビーズを分散させることに成功し、微粒子の分散を制御できる新たな手法を初めて見出した。○微粒子の作製:磁気ビーズを生体内で使用することを前提として、異方性を有するフェライト系材料で微粒子を新たに合成した。その手法として、化学合成法を選び、粒径分布を制御した微粒子を作成した。また、用いる磁性微粒子の磁化量や異方性の大きさは重要なパラメタであるため、後述の理論考察と連携して遂行した。○ラージスケールモデルでの検討:想定するミクロンサイズでの実験に先だってミリからサブミリサイズの永久磁石材料を用いて、粒子の回転運動を利用した吸着と分離に関する検討を行った。その際、高粘性液体中で実験を行うことにより0.01程度のレイノルズ数環境を実現し、ミクロンサイズの粒子の動きを模擬した。永久磁石の強い吸着力に打ち勝って分離できる条件を確立し、磁気ビーズの凝集・分散条件を確立した。これを踏まえ、微小な粒子の分散制御のための基礎検討を開始した。○理論的考察:研究代表者らの確立した流体抵抗の算出手法を基にして本研究では、粒子が吸着した際ならびに分散した際に液体から受ける抵抗を算出し、それが吸着した微粒子を分散させるに十分な量となるための条件を算出した。検討が必要なパラメタとして、粒子表面の摩擦、磁気的な吸引力、材料の磁化量、外部磁界の大きさ、回転磁界の周波数、液体の粘性、などを用い、総合的に整理した。○粒子表面のコーティングに関する検討:粒子同士の吸着力は磁気力であり、粒子間距離に大きく依存する。そこで本研究では粒子表面のコーティング厚さで粒子間距離を制御することを試みた。まずはシリカによるコーティングを検討し、微粒子表面を均一にコーティングする技術について検討した。さらに、コーティング材料として生体安全性の高い材料の探索と評価を行った。磁気ビーズは、外部から与えた磁界によって凝集・移動させることが可能であり、ドラッグデリバリーなど生体内での利用が期待されている。本研究は、磁気ビーズ材料の新たな機能として、ビーズを能動的に分散させる新たな手法を提案し、生体内で磁気ビーズを自由に凝集分散させる手法を確立することを目的として検討を行った。その結果、ビーズとして磁気異方性の大きな材料を用い、そこに回転磁界を与えることによりビーズの個々の回転トルクを利用してビーズを分散させることに成功し、この手法を用いて微粒子の分散を制御できることを実証した。この結果は、磁気ビーズの生体中利用に関してきわめて有用な知見である。しかしながら同時に、ビーズ同士の凝集力を制御するためにコーティングが必要であり、その厚さを薄くできないことも明らかとなり、本手法の適用限界も示された。結論として本研究は新たな磁気微粒子の分散凝集制御手法を提案し、その適用限界を物理的に明らかにすることで今後の医用応用に向けたアプリケーションの選択を可能としたものであり、新たな学問領域を開く大きな一歩を踏み出したものといえる。磁気工学前述の実績欄に記したように、ラージスケールモデルによる実験に成功し、吸着力と回転トルクとのバランスによる粒子分離条件を明確にできており、おおむね順調に進展していると判断される。○分散実験:平成25年度に作製された微粒子を用いて分散実験を行う。微粒子を種々の粘性を持つ液体中に懸濁させ、そこに回転磁界を与えることにより分散する様子を観察する。回転磁界印加装置は極めて特殊な装置であるが、申請者が本研究のために自由に使用可能である。観察には動的な観察が不可欠であるため、マイクロスコープやレーザー顕微鏡などを用いた粒子の直接観察に加え、懸濁液の光透過特性を評価する方法など複数の手法を利用して分散の様子を精密に観測する。その結果は微粒子作製ならびにコーティング実験にフィードバックする。○粒子微細化の限界に関する検討:粒子を小さくしてゆくと、ある臨界直径以下で磁性体の持つ物性的特性(超常磁性の出現)により磁化が大幅に低減する。これはスピン間の交換相互作用が熱擾乱に乱され、強磁性体としての特性を失うためである。この臨界直径が本申請で提案した手法が適用できる最小限界のサイズとなることから、その具体的サイズに関する検討を行う。それに加えて、粒子が超常磁性の出現する臨界サイズ近傍で凝集と分散を制御することで、磁気特性を大幅に変えることができると考えられ、磁気物理ならびに磁性材料応用分野における極めて重要な知見が得られる可能性がある。このテーマは、次の新たな学問分野の構築につながる可能性を秘めた新たな挑戦への第一歩としてとらえている。
分子認識機構の超微小解析に基づく新規プロテインフォスファターゼ阻害剤の合成と応用

オカダ酸とトートマイシンは,1型および2A型プロテインフォスファターゼ(PP1およびPP2A)の高親和性阻害剤であり,それらの酵素に対して正反対の相対親和性を示す。本研究では,酵素結合に伴う阻害剤分子の超微小コンフォメーション変化の解析を行い、そのデータに基づいて天然物以上の有用な特性を持った新規阻害剤の設計・合成を行うことを目的として実験を遂行した。1.本研究では高純度の酵素が繰り返し必要になった。そこで、大腸菌による大量発現の方法を採用、発現酵素の精製には,一般の液クロ操作に加え,等電点電気泳動の原理に基づいた精製法を導入し,結晶化が可能な程度に高純度の酵素を十分量,確保する方法を確立した。2.トートマイシン分子中,いくつかのn位-n+3位炭素ペア(C_n-C_<n+3>)を通常の^<12>Cから^<13>Cに完全に置換えたものを合成した。それらの酵素阻害作用性が,置換前のものと異ならないことを,精製プロテインフォスファターゼ標品を用いて確認した。3.これらの^<13>C置換体単独のNMRスペクトルをとり,J_<Cn,Cn+3>カップリング定数から,C_n-C_<n+1>とC_<n+2>-C_<n+3>との間の角度φを測定した。さらに、等モルよりやや過剰の酵素を加えて,同様にφを測定し,酵素を加える前の値と比較する実験を行った。酵素蛋白分子には圧倒的に多くの炭素が存在するが,阻害剤側の注目する炭素ペアは^<13>Cで置換えてあるので,このような測定が可能となる。また,トートマイシンやオカダ酸は,酵素に極めて高親和性に結合する(解離定数はpM-nMオーダー)ので,酵素を添加した際には,^<13>C置換体は,遊離したものをほとんど残さず,ほぼ100%酵素と結合して存在するため,解析感度上、極めて有利である。4.二種類のタンデム質量分析システム(MALDI-TOF MSとQ-ESI MS/MS)を用い,酵素単独および阻害剤結合体の質量分析を行った。これにより,阻害剤が酵素蛋白全体,またはその断片に結合した状態でのスペクトルを観察した。5.得られたデータに基づきいくつかのトートマイシン誘導体を合成した。原物質より高親和性のものは今のところ得られていないものの、これら誘導体における酵素親和性の変化の検討から、トートマイシンのC1-C16セグメントの立体化学が本毒素に特徴的なPP1とPP2Aへの親和性の違いを決定する主要な因子であることを示すことが出来た。

オカダ酸とトートマイシンは,1型および2A型プロテインフォスファターゼ(PP1およびPP2A)の高親和性阻害剤であり,それらの酵素に対して正反対の相対親和性を示す。本研究では,酵素結合に伴う阻害剤分子の超微小コンフォメーション変化の解析を行い,そのデータに基づいて天然物以上の有用な特性を持った新規阻害剤の設計・合成を行うことを目的とする。第1年度の成果を以下に要約する:1.本研究では高純度の酵素が繰り返し必要になる。そこで,大腸菌による大量発現の方法を採用,発現酵素の精製には,一般の液クロ操作に加え,等電点電気泳動の原理に基づいた精製法を導入し,結晶化が可能な程度に高純度の酵素を十分量,確保することが出来るようになった。2.トートマイシン分子中,いくつかのn位-n+3位炭素ペア(C_n-C_<n+3>)を通常の^<12>Cから^<13>Cに完全に置換えたものを合成した。それらの酵素阻害作用性が,置換前のものと異ならないことを,精製プロテインフォスファターゼ標品を用いて確認した。3.これらの^<13>C置換体単独のNMRスペクトルをとり,J_<Cn,Cn+3>カップリング定数から,C_n-C_<n+1>とC_<n+2>-C_<n+3>との間の角度φを測定を行った。目下,等モルよりやや過剰の酵素を加えて,同様にφを測定し,酵素を加える前の値と比較する実験に進みつつある。酵素蛋白分子には圧倒的に多くの炭素が存在するが,阻害剤側の注目する炭素ペアは^<13>Cで置換えてあるので,このような測定が可能となる。また,トートマイシンやオカダ酸は,酵素に極めて高親和性に結合する(解離定数はpM-nMオーダー)ので,酵素を添加した際には,^<13>C置換体は,遊離したものをほとんど残さず,ほぼ100%酵素と結合して存在するため,解析感度上,極めて有利である。4.二種類のタンデム質量分析システム(MALDI-TOF MSとQ-ESI MS/MS)を用い,酵素単独および阻害剤結合体の質量分析を行っている。これにより,阻害剤が酵素蛋白全体,またはその断片に結合した状態でのスペクトルを観察することができる可能性がある。本研究では,酵素結合に伴う阻害剤分子の超微小コンフォメーション変化の解析を行い、そのデータに基づいて天然物以上の有用な特性を持った新規阻害剤の設計・合成を行うことを目的として実験を遂行した。本年度(最終年度)は、次のような成果を得た。1.昨年度、トートマイシン分子中,いくつかのn位-n+3位炭素ペア(C_n-C_<n+3>)を通常の^<12>Cから^<13>Cに完全に置換えたものを合成することに成功した。今年度、それらの酵素阻害作用性が,置換前のものと異ならないことを,精製プロテインフォスファターゼ標品を用いて確認した。2.これらの^<13>C置換体単独のNMRスペクトルをとり,J_<Cn,Cn+3>カップリング定数から,C_n-C_<n+1>とC_<n+2>-C_<n+3>との間の角度φを測定した。ついで、等モルよりやや過剰の酵素を加えて,同様にφを測定し,酵素を加える前の値と比較した。3.さらに、二種類のタンデム質量分析システム(MALDI-TOF MSとQ-ESI MS/MS)を用い,酵素単独および阻害剤結合体の質量分析を行った。これにより,阻害剤が酵素蛋白全体,またはその断片に結合した状態でのスペクトルを観察した。4.得られたデータに基づきいくつかのトートマイシン誘導体を合成した。
慢性疲労と抑うつの個人差を規定する遺伝子と神経・内分泌系パラメータの解析

平成18年度は,ロジスティック回帰分析による慢性疲労に関与する要因のリスク推定,ストレッサーとしての試験前後の自覚症状の変化を評価し,これらの知見を論文として公表した.平成19年度は,慢性疲労と抑うつに関与する神経系パラメータを明らかにする目的から,個人差を考慮するための生活習慣のモデル評価を行うとともに,神経系パラメータの評価方法の検討を行った.生活習慣と体調との関連を検討するために,生活習慣の内部構造について構造方程式モデルを適用し,その因果構造を検討した.群馬県の児童を対象とした調査結果,望ましい生活習慣は体調に好影響を及ぼすことが確認された.また,望ましくない生活習慣は望ましい生活習慣と関連し,それが改善されることによって間接的に生活基盤の形成に貢献すると推測された.神経系の評価方法については,自律神経系と平衡機能の観点から検討を試みた.加速度脈波による自律神経の評価では大きな個人間変動が確認され,信頼性の観点から慢性疲労との関係は充分確認できなかった.一方,平衡機能の評価方法を検討した結果,従来の平衡機能の評価に多く利用されている閉眼片足立ちは,近年活用されているトレーニングボードによる動的体平衡機能とほとんど関連が認められず,両者は異なる機能を測定している可能性が確認された.動的体平衡機能の評価変量の信頼性は概ね高いが,姿勢の規定が必要と考えられる.以上の知見は2編の論文及び3編の口頭発表で公表した.また,抑うつ及び自律神経を評価する質問紙票について,Mayo Foundationの質問項目の邦訳を検討した.本研究の目的は慢性疲労および抑うつと関連する内因性修飾因子を明らかにするために,慢性疲労,抑うつおよび疲労自覚症状と環境要因(生活習慣等)との関係を検討することである.平成17年度は下記のデータ解析及び成果発表と今後の調査研究の計画立案を行った.福井県の全ての高校に調査を依頼し,3105名中有効回答2944名の資料を得た.調査における質問紙は基本属性と疲労自覚症状(SF),生活ストレッサー(Str)および生活習慣等の質問内容から構成された.疲労自覚症状の調査は青年用疲労自覚症状尺度SFS-Yを利用した.生活ストレッサーは,ADES-20によって評価した.生活習慣はBreslowの健康習慣に基づき調査項目を選択した.慢性疲労の徴候については厚生省CFS調査研究班によるCFSの診断基準「PS(Performance Status)による疲労・倦怠の程度」に基づき,ここ半年間の状態について自己評価させ,2群(CF群とNCF群:徴候の有無)に分類した,PSを基準変数,疲労自覚症状,生活ストレッサーおよび生活習慣を説明変数とするロジスティック回帰分析を行った結果,男子では身体違和感(SF)と友人(Str),女子では活力低下(SF)と教師(Str)に有意性が認められた.ロジスティック回帰分析において,男女のいずれもおいても生活習慣に有意性は認められず,慢性疲労のリスクにはなりえないと推測される.CF群とNCF群間平均値差の検定結果において統計的な有意差が認められた項目であっても,単独では実質的なリスク要因としての条件を備えるものではないかもしれない.以上のことから慢性疲労に対する生活習慣の関連は認められないが,疲労自覚症状や生活ストレッサーの観察は慢性疲労の予見に役立つ可能性が示唆された.平成18年度は慢性疲労と抑うつを規定する要因として主にIRTによる疲労自覚症状の評価と平衡機能における神経機能の評価を中心に研究を展開した.以下,IRTによる疲労自覚症状の評価に関する研究結果について概要を述べる.青年用疲労自覚症状尺度(SFS-Y)の項目反応理論による尺度化(IRT尺度化)による各項目の識別力と困難度のパラメタ値を推定することを主たる目的にするとともに,多母集団ロジスティックモデルによる性差を検討した.福井県の全ての高校に調査を依頼し,調査を実施した(有効回答2944名).疲労自覚症状の調査は青年用疲労自覚症状尺度SFS-Y(Subjective Fatigue Scale for Young adults)を利用した.同尺度は6つの下位尺度(集中思考困難,だるさ,活力低下,意欲低下,ねむけ,身体違和感)24個(4項目×6下位尺度)の質問項目で構成される.反応カテゴリは直近の一週間において,項目内容を自覚したか否かの2件法で,自覚した場合に1,自覚しなかった場合に0を与えた.IRTのモデルには2パラメタロジスティックモデルを採用し,周辺最尤法により項目困難度と項目識別力を推定した.尺度は対象母集団の特性尺度値の分布の平均が0.0,標準偏差が1.0となるように原点と単位を設定した.性差の検討は多母集団ロジスティックモデルに基づき検討した.SFS-Y24項目における項目識別力パラメタの推定は「全身がだるくなる」が最も高い値を示し,「無口になっている」が最も低い値を示した.極端に低い識別力を示す項目は認められず,全体として十分な識別力を示している.一方,困難度パラメタの推定は,「話をするのが嫌である」が最も高い値を示し,「集中力がない」が最も低い値を示した.24項日中20項目が負の値を示し,本研究の対象者において自覚する頻度の高い質問項目が多いと考えられる.また,テスト情報曲線から,SFS-Yは各疲労自覚症状に対する自覚感が比較的弱い者に対してより効果的な尺度であることが推察される.各項目のパラメタ推定値で極端な値は認められず,SFS-YのIRT尺度化が可能と判断された.

また,困難度母数の性差の比較結果,「無口になっている」と「ねむい」の2項目は,0.5以上の差が認められ,女子は無口になりにくく,ねむくなりやすい傾向が窺えた.平成18年度は,ロジスティック回帰分析による慢性疲労に関与する要因のリスク推定,ストレッサーとしての試験前後の自覚症状の変化を評価し,これらの知見を論文として公表した.平成19年度は,慢性疲労と抑うつに関与する神経系パラメータを明らかにする目的から,個人差を考慮するための生活習慣のモデル評価を行うとともに,神経系パラメータの評価方法の検討を行った.生活習慣と体調との関連を検討するために,生活習慣の内部構造について構造方程式モデルを適用し,その因果構造を検討した.群馬県の児童を対象とした調査結果,望ましい生活習慣は体調に好影響を及ぼすことが確認された.また,望ましくない生活習慣は望ましい生活習慣と関連し,それが改善されることによって間接的に生活基盤の形成に貢献すると推測された.神経系の評価方法については,自律神経系と平衡機能の観点から検討を試みた.加速度脈波による自律神経の評価では大きな個人間変動が確認され,信頼性の観点から慢性疲労との関係は充分確認できなかった.一方,平衡機能の評価方法を検討した結果,従来の平衡機能の評価に多く利用されている閉眼片足立ちは,近年活用されているトレーニングボードによる動的体平衡機能とほとんど関連が認められず,両者は異なる機能を測定している可能性が確認された.動的体平衡機能の評価変量の信頼性は概ね高いが,姿勢の規定が必要と考えられる.以上の知見は2編の論文及び3編の口頭発表で公表した.また,抑うつ及び自律神経を評価する質問紙票について,Mayo Foundationの質問項目の邦訳を検討した.
マウスガード装着が顎筋活動に及ぼす憎悪因子について

マウスガードは、本来スポーツにおいて発生する歯ならびに周囲組織の外傷を予防する目的で作られたものである。最近ではマウスガード装着により、競技能力の向上がみられるという報告もあり、障害の予防に関する研究に加え、運動能力への影響といった研究も多数行われている。しかし、これらはすべてマウスガード装着の有用性についてのみの報告であり、マウスガード装着の為害性についての報告はみられない。このことから、本研究では、マウスガード装着により、生理的な影響が及ぼされると考えられる顎筋活動についてマウスガード装着の前(コントロール)後で、筋電図学的に検索した。顎口腔系に異常を認めない成人男子6名を対象とし、両側の咬筋、側頭筋前部および後部の6筋から筋電図を誘導、5秒間の最大咬みしめを行わせ、平均電位、非対称性指数などを比較検討した。マウスガード装着後の咬みしめ時平均電位は1名で減少したが、他のすべての被検者で著しく増強した。また、両側同名筋から求めた非対称性指数は、マウスガード装着前には咬筋、側頭筋前部および後部でそれぞれ16.5, 13.3, 16.4であったのが、装着後には14.5, 19.2, 11.3と側頭筋前部以外で減少傾向を示し、今回の実験条件下では、顎筋活動のバランスの面からみて必ずしもマウスガード装着が憎悪因子になるとは考えられなかった。今後マウスガードの材質の種類や咬合挙上の量などを変化させ、さらに詳細に検討する予定である。
環境保全型柑橘作の成立条件と持続可能な拡大方策の構築に 関する研究

本研究は、環境保全型柑橘作の経営実態と農法構成を把握するための調査指標体系「有機・環境保全型柑橘作の経営実態調査票」を開発し、愛媛県、佐賀県、熊本県、鹿児島県、和歌山県、三重県、静岡県、東京等で延べ82件(同一の調査対象に対する補足または追跡調査等を含む)の有機栽培(無農薬栽培、高水準の減農薬栽培数件を含む)農家、生産者グループ、農業法人・会社、および取引先の業者等に対して実態調査を行った。3年間の調査研究により、取組農家の生産条件、経営実態と成り立ち、化学農薬、化学肥料に代わる代替農法の構成と効果、農業経営費・資本の構成、生産物販路・流通形態・価格決定方式と水準、労働時間、革新的取組の形態、経営環境、慣行栽培から有機栽培に到達するまでのプロセスやその過程における農法転換の促進要素と制約要素等を明らかにした。研究期間において、単著1編(2012年度地域農林経済学会賞)、共著書4編、学術論文7編を公表し、14回の学会発表・招待講演等を行った。1)環境保全型柑橘作の経営実態と農法構成を把握するための調査指標体系(調査票)を開発した。従来の環境保全型農業に関する調査と柑橘作の経営分析調査を活かしつつも、それぞれの弱点を改良した。実態調査で検証したところ、極めて有効であることを確認できた。今後、これを有機柑橘経営調査のモデルとして発信し、同分野の学術発展に貢献することが可能と考える。2)愛媛県、熊本県で約50軒の有機栽培、無農薬栽培または無化学肥料栽培柑橘作農家の実態調査を実施し、成果の一部を日本有機農業学会等で発表することができた。当初計画を大きく上回る成果であり、研究計画を大きく前進させることになった。3)環境保全型柑橘作の生産物流通、取組の拡大・定着に関する地域的、組織的取組の実態調査も並行して実施し、一定の成果を収めることができた。4)実態調査と併せて環境保全型柑橘作経営に関する文献資料の収集整理を行い、次年度研究計画をよりよい形にすることができた。全体としては計画を上回る進捗であり、最終成果の形が見えてきた。この専門分野の研究空白を埋める価値ある研究成果になることはほぼ間違いない。なお、東日本大震災の影響で予定した研究事項(学会での関連情報収集等)を実行できなかったこともあり、予算の繰り越しが発生したが、平成23年度で実施することができ、研究全体の進捗への影響はなかった。1)愛媛、佐賀、鹿児島、熊本で、有機柑橘農家の実態調査を実施したほか、調査対象農家がよく使う「モグラ堆肥」の生産業者や農家グループ「マルタ」の現地調査を行った。マルタグループの生産者に対して実施したアンケート調査では、詳細な経営分析調査項目を盛り込んだ有機柑橘農家の経営調査の結果を補完し、環境保全型農業を行う生産者の考えや行動をとらえることができた。「モグラ堆肥」についての現地調査は、これまでになかった有機栽培農家の肥料に対する考えや有機質肥料の生産・流通実態を把握することができ、有機柑橘作経営の要素投入実態やその効果分析を可能にする成果の1つになった。2)環境保全型柑橘作の生産物流通、取組の拡大・定着に関する地域的、組織的取組の実態調査も並行して実施し、一定の成果を収めることができた。3)調査成果の一部を著書や論文、日本有機農業学会または各種の講演等で発表し、科研の段階的研究成果を積極的に発信するように努めた。また、調査対象農家にも有機農業への情報提供を行い、一定の評価を得た。4)実態調査や研究成果の地域還元、社会還元と併せて、研究会や学会等に出席し、環境保全型柑橘作経営に関する文献資料の収集整理な行った。全体としては、ほぼ計画通りの調査研究ができた。本研究は、この分野の研究空白を埋める価値ある研究成果になることがほぼ間違いない。柑橘作栽培は、従来から多種多量かつ多頻度の農薬散布が行われ、減農薬・減化学肥料による農薬被害軽減や経営費・労働負担軽減への要請が年々高まってきている。しかし、その要請に応えるための調査研究蓄積は少なく、環境保全型農法への転換を妨げる要因となっている。本研究は、有機栽培や減農薬栽培を行っている柑橘作農家を対象に、取組の経営実態、化学農薬・化学肥料に代わる代替農法の技術構成と経営・環境効果、慣行栽培から有機栽培に到達するまでのプロセスやその過程における農法転換の促進要素と制約要素等の解明により、環境保全型柑橘作の形成条件を明らかにすることを目的としている。

前年度までの2年間では、愛媛県、佐賀県、熊本県、鹿児島県、静岡県等で延べ60数件(同一農家に対する補足または追跡調査等を含む)の有機栽培、無農薬・減農薬栽培農家や生産者グループ、農業法人・会社、取引先の業者等に対して体系的な実態調査を実施し、取組の生産条件、経営実態と経緯、収入・経営費構成、代替農法の構成と効果、マーケティング(販路構成、流通形態、価格決定方式と水準等)、革新的取組の形態、取組の地域環境等について実態解明を行ってきた。平成24年度では、上記内容について愛媛県内での実態調査を継続するとともに、1和歌山県、三重県の柑橘有機栽培や愛媛県内の自然農法柑橘作農家についての実態調査、2昨年まで調査した代表的な農家、農家グループ、業者の補足調査、3企業的経営の実態、販路形成等に関する追加調査、3環境保全型柑橘作の生産物流通、取組の拡大・定着に関する地域的諸条件の継続調査を行った。また、本研究の最終年度として、43年間実態調査結果の総合整理による体系的なデータファイルの作成、5研究目的に照らした総括分析等を行い、5月末提出となっている報告書の作成を行っているところである。1,当初計画を大きく上回る数の農家実態調査ができた。2.すべての調査は、農林水産省の調査項目を上回る詳細な技術・経営データを得ている。3,今後の研究発展につながる価値ある情報を手にすることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度の推進方策は、以下のように企画している。1.データの整理と分析2,事例のまとめ3.環境保全型稲作・野菜との比較分析4.結果の総合検討、報告書の作成24年度が最終年度であるため、記入しない。
同種造血細胞移植後免疫と慢性移植片対宿主病における脂肪細胞分泌サイトカインの役割

本研究では、移植後患者において定期的な検体保存を行い、アディポカインやその他のサイトカイン等の測定を継時的に行ってきた。さらに、アディポネクチン関連物質や臓器機能に関連するたんぱく質を同定し合併症の予測や重症度に関連するバイオマーカーとしての有用性を検討している。また、上記のバイオマーカー研究と並行し、in vitroの研究として高分子量アディポネクチンを皮膚線維芽細胞に投与し、濃度依存的に線維化に関連すると考えられるfibronectin、SMAD7の増加、B細胞コロニー増加因子であるNAMPT、免疫チェック因子であるGal9の発現上昇が明らかとなり、今後移植免疫についての検証を行う予定。【目的】慢性移植片対宿主病は、移植後免疫再構築の異常に伴う同種免疫の過剰応答と考えられている。申請者は最近、脂肪細胞から分泌される生理活性物質(アディポカイン)の一つであるadiponectinが、造血細胞移植後の慢性移植片対宿主病患者で上昇していることを報告した。それに基づき、本研究では、(a)慢性移植片対宿主病の発症の有無による患者血中アディポカインの濃度の相違、(b)各アディポカインによる、同種免疫応答の担当細胞への修飾作用、(c)標的臓器(皮膚等)への修飾作用を明らかにすることを目的としている。【成果】移植後患者において定期的な(移植前、移植後1か月、2か月、3か月、半年、9か月、1年、1.5年、2年)の検体保存が行われ、随時、アディポカインやその他のサイトカイン等の測定を継時的に行っている。十分なデータが集まり次第、臨床情報(慢性移植片対宿主病の発症、重症度)との関連を統計学的に検討する。また、高分子量アディポネクチンを皮膚線維芽細胞に投与した際、濃度依存的にNAMPT、ST2のmRNAの発現上昇が認められ、一方でCD47の発現低下があることが分かった。また、低分子量アディポネクチンを正常ヒト末梢血単核球に投与すると、FoxP3の発現上昇、NAMPTの発現上昇が判明した。これらもサンプル数を増やして同現象が再現できるかを確認中である。【意義】アディポカインによる免疫応答への修飾作用の可能性が示唆され、さらに標的細胞である皮膚線維芽細胞での線維化や炎症を誘発増長する可能性が示唆された。今後、さらにサンプル数を増やして、アディポカインの慢性移植片対宿主病での役割を明らかにし、慢性移植片対宿主病の病態ネットワークを新たにとらえ直す基盤となると考えている。年度末の際に、進行を軽度調整したため。(キットの不具合の可能性があったため確認作業等あり)【目的】慢性移植片対宿主病は、移植後免疫再構築の異常に伴う同種免疫の過剰応答と考えられている。申請者は、脂肪細胞から分泌される生理活性物質(アディポカイン)の一つであるadiponectinが、造血細胞移植後の慢性移植片対宿主病患者で上昇していることを報告した。それに基づき、本研究では、(a)慢性移植片対宿主病の発症の有無による患者血中アディポカインや関連サイトカインの濃度の相違、(b)同種免疫応答の担当細胞への修飾作用、(c)標的臓器(皮膚等)への修飾作用を明らかにすることを目的とした。【成果】移植後患者において定期的な(移植前、移植後1か月、2か月、3か月、半年、9か月、1年、1.5年、2年)の検体保存が行われ、随時、アディポカインやその他のサイトカイン等の測定を継時的に行ってきた。また、高分子量アディポネクチンを皮膚線維芽細胞に投与した際、濃度依存的に線維化に関連すると考えられるfibronectin、SMAD7の増加、B細胞コロニー増加因子であるNAMPTのmRNAの発現上昇が認められ、免疫チェック因子であるGal9の増加を認めた。さらに、文献検索等からアディポネクチンにも関連するサイトカインを数種類ピックアップし、測定を開始し、合併症の予測や重症度に関よ連するバイオマーカーとしての有用性を検討している。【意義】アディポカインおよび関連サイトカインによる移植後合併症(予測、重症度)のバイオマーカーとしての有用性を検証し、これら生理活性物質による免疫応答への修飾作用と標的細胞である皮膚線維芽細胞での線維化や炎症を誘発増長する可能性が示唆された。今後、さらにサンプル数を増やして、アディポカインおよび関連サイトカインの慢性移植片対宿主病での役割を明らかにし、慢性移植片対宿主病の病態ネットワークを新たにとらえ直す基盤となると考えている。今後は、さらにサンプル数(健常ドナー、患者)を増やし、上記で得られた結果の再現性の確認および、阻害剤等の投与をin vitroで行い発現変化を確認する。また、蛍光顕微鏡等も活用し、マクロな変化も観察を行う。移植免疫造血幹細胞移植キットの不具合の可能性などがあり確認作業を行っていたため、年度をまたいでの発注および納品になる可能性があった。

このため、研究、実験の進捗を加味した上で、経理上の締めを安全に終了させるため、研究の進みを調節し、次年度持ち越しの上使用することとした。計画として、年度明け次第、年度をまたいでの可能性のあった物品やその他検査費等の発注を行う。このため、次年度使用分の計画には大きな影響は与えず、計画通りの使用が可能。
高齢者の情報通信機器操作等に関する心身の機能に関する基礎研究

データベース班(立命館大学)は知覚・注意班の保有する注意特性に関する3分類(注意制御不全感・多重課題遂行能力・ながら作業傾向)の知見からIT機器利用特性とIT機器ユーザの注意特性の関係性を導き,IT機器ユーザの類別化と認知機能の高低に関するグループ間での比較を行うことで適切な設計指針を提案した.また,知覚・注意班(大阪大学)は,注意制御における抑制機能の観点から心理実験と質問紙の両側面を用いた加齢特性の検討を行い,高齢者による実際の行動パフォーマンスと質問紙による自己評価が必ずしも一致していないことを示した.認知(メンタルモデル)班(和歌山大学)は,高齢者の製品に対するメンタルモデルを探る2実験として,課題(インタフェース構築課題)を提示し課題達成,操作手順の記述を求めるものと,課題における被験者の戦略を行い,高齢者でのメンタルモデル構築レベルを検討した.認知(エラー)班(法政大学)は,実験室での漢字選択課題を用いたエラー反復現象の検討を行い,認知的処理負荷,特に注意切替え機能の低下が関与する可能性を検討した.併せて高齢者のメンタルモデル獲得学習支援のためのデザインについて実験的研究を行った.また,特に課題切り替えが必要な作業を行う必要性が高齢者にとってどのような影響を及ぼすのかを示した.運動・出力班(岡山大学)は高齢者にとって使い易い自動車用表示-操作系について検討し,高齢者にとって望ましい表示形式を明らかにした.また,メンタルワークロードおよび注意配分の観点から,高齢者にとって運転中の副次作業は不適切であることを示した.社会・心理班(東京都老人総合研究所)はIT・電気機器の機器使用の実態および,利用に影響する社会・心理的要因に関する調査を実施した.訪問面接調査を行い,高齢者約1100名からの回答によって得られたデータから高齢者を5群にわけ,それぞれの群における性格特性やコーピングと機器利用の関係について検討を行った.これらの知見は主に人間の知覚的・認知的機能に焦点をあてたものであり,「心的負担」と加齢による影響を明らかにしたものである.データベース班(立命館大学)は知覚・注意班の保有する注意特性に関する3分類(注意制御不全感・多重課題遂行能力・ながら作業傾向)の知見からIT機器利用特性とIT機器ユーザの注意特性の関係性を導き,IT機器ユーザの類別化と認知機能の高低に関するグループ間での比較を行うことで適切な設計指針を提案した.また,知覚・注意班(大阪大学)は,注意制御における抑制機能の観点から心理実験と質問紙の両側面を用いた加齢特性の検討を行い,高齢者による実際の行動パフォーマンスと質問紙による自己評価が必ずしも一致していないことを示した.認知(メンタルモデル)班(和歌山大学)は,高齢者の製品に対するメンタルモデルを探る2実験として,課題(インタフェース構築課題)を提示し課題達成,操作手順の記述を求めるものと,課題における被験者の戦略を行い,高齢者でのメンタルモデル構築レベルを検討した.認知(エラー)班(法政大学)は,実験室での漢字選択課題を用いたエラー反復現象の検討を行い,認知的処理負荷,特に注意切替え機能の低下が関与する可能性を検討した.併せて高齢者のメンタルモデル獲得学習支援のためのデザインについて実験的研究を行った.また,特に課題切り替えが必要な作業を行う必要性が高齢者にとってどのような影響を及ぼすのかを示した.運動・出力班(岡山大学)は高齢者にとって使い易い自動車用表示-操作系について検討し,高齢者にとって望ましい表示形式を明らかにした.また,メンタルワークロードおよび注意配分の観点から,高齢者にとって運転中の副次作業は不適切であることを示した.社会・心理班(東京都老人総合研究所)はIT・電気機器の機器使用の実態および,利用に影響する社会・心理的要因に関する調査を実施した.訪問面接調査を行い,高齢者約1100名からの回答によって得られたデータから高齢者を5群にわけ,それぞれの群における性格特性やコーピングと機器利用の関係について検討を行った.これらの知見は主に人間の知覚的・認知的機能に焦点をあてたものであり,「心的負担」と加齢による影響を明らかにしたものである.(1)基礎的知見の蓄積平成16年度においては、特に来年度以降の研究で必要となる基礎的な知見の蓄積を目的とした研究を行なった.すなわち、6人の研究者が中心となった各計画班において来年度以降予定している総括的・統合データベース作成を目指した研究が行なわれた。具体的には、データベース班(飯田)は既存のデータをもとにデータを分析するためのデータベースの形態や統計手法の開発を行なった。また、知覚・注意班(三浦)はコンピュータと質問紙の両側面がち有効視野特性の検討を行ない、認知(メンタルモデル)班(山岡)は、高齢者の参加しやすい環境を用いて高齢者のメンタルモデルと状況認識の記述を行なった。認知(エラー)班は、実験室内で高齢者の抑制機能の低下を検討するための課題を検討した。運動・出力班(村田)は高齢者による視線入力デバイスの利用における利点と欠点を明らかにするための研究を行なった。さらに、社会・心理班(権藤)は来年度に行なう予定である機器使用に関する社会・心理的要因の調査に向けた予備調査を実施し、高齢者の日常における機能評価と機器使用について検討した。具体的には,過去の生活歴と現在の利用状況の関連性を半構造化面接により情報を得た。これらの研究より、データベース構築における登録の際に有効な実験データの選定を行なっていく。(2)各研究班での研究報告による知見の統合本年度内に数度に渡って各計画班における研究の進捗状況と知見の統合を目的とした会議を行なった。その中で、計画班間における調整と、データ報告に基づいた知見の統合と相互関連性について討議された。

(1)知見の蓄積6研究班でそれぞれのアプローチから実験や調査が行なわれた.データベース班(飯田)は知覚・注意班の保有する注意特性に関する3分類(注意制御不全感・多重課題遂行能力・ながら作業傾向)の知見からIT機器利用特性とIT機器ユーザの注意特性の関係性を導き,IT機器ユーザの類別化を行った.また,知覚・注意班(三浦)は抑制機能の観点から心理実験と質問紙の両側面を用いた加齢特性の検討を行い,認知(メンタルモデル)班(山岡)は,高齢者の製品に対するメンタルモデルを探る2実験を行った.1つは4つの課題(インターフェース構築課題)を提示し課題達成,操作手順の記述を求めた.もう1つは,課題における被験者の戦略が調べられた.認知(エラー)班は,認知(エラー)班は,実験室の漢字選択課題を用いたエラー反復現象の検討を行い,認知的処理負荷,特に注意切替え機能の低下が関与する可能性を検討した.併せて高齢者のメンタルモデル獲得学習支援のためのデザインについて実験的研究を行った.運動・出力班(田村)は高齢者にとって使い易い自動車用表示-操作系について検討し,高齢者にとって望ましい表示形式を明らかにした.また,メンタルワークロードおよび注意配分の観点から,高齢者にとって運動中の副次作業は不適切であることを示した.さらに,社会・心理班(権藤)はIT・電気機器の機器使用の実態および,利用に影響する社会・心理的要因に関する調査を実施した.訪問面接調査を行い,高齢者約1100名からの回答によって得られたデータの集計作業を行った.(2)各研究班間での議論4回の計画班会議を行い,研究進捗状況と知見の関連性を議論した.特に,本科研全体会議にて注意機能が研究の主要概念とされたため,本研究班での会議内においてもその観点から高齢者の認知に対する貢献を目指した.データベース班(立命館大学)は知覚・注意班の保有する注意特性に関する3分類(注意制御不全感・多重課題遂行能力・ながら作業傾向)の知見からIT機器利用特性とIT機器ユーザの注意特性の関係性を導き,IT機器ユーザの類別化と認知機能の高低に関するグループ間での比較を行うことで適切な設計指針を提案した.また,知覚・注意班(大阪大学)は,注意制御における抑制機能の観点から心理実験と質問紙の両側面を用いた加齢特性の検討を行い,高齢者による実際の行動パフォーマンスと質問紙による自己評価が必ずしも一致していないことを示した.認知(メンタルモデル)班(和歌山大学)は,高齢者の製品に対するメンタルモデルを探る2実験として,課題(インタフェース構築課題)を提示し課題達成操作手順の記述を求めるものと,課題における被験者の戦略を行い,高齢者でのメンタルモデル構築レベルを検討した.認知(エラー)班(法政大学)は,実験室での漢字選択課題を用いたエラー反復現象の検討を行い,認知的処理負荷,特に注意切替え機能の低下が関与する可能性を検討した.
転写因子のPEBP2α/AML1の点変異による機能変化とその発癌能

転写因子PEBP2/AML1は白血病に関連する染色体転座の最も高頻度なターゲットとして良く知られている.本研究ではPEBP2の機能異常による発癌の機序を明らかにするために,本因子の機能的中核をなすαサブユニットのRuntドメインに注目して,その遺伝変異を利用した機能解析およびNMRによる立体構造解析を並行的に進め以下の結果を得た1)白血病患者から同定されたRuntドメイン内に落ちる数種のPEBP2αB/AML1点突然変異体について機能解析を行い,それらがDNA結合・細胞内局在性・転写活性化等に欠陥を持つことを明らかにした.この結果に基づき,AML1遺伝子の点変異が白血病発症の有力な原因と成りうることを新たに提唱した.その後,他の臨床研究グループからも同様の変異が相次いで報告され,本説への支持と関心が高まりつつある.2)PEBP2αサブユニットのDNA結合領域Runtドメインとβサブユニットの立体構造をそれぞれNMR解析により決定することに成功した.Runtドメインはβシートを骨格とするSタイプ免疫グロブリンフォールドと呼ばれる構造を持っており,この点でP53,NF-κB,NFAT1,STAT等と共通のグループに属することが分った.また,βサブユニットもβシートバレルを中核として,その両側にαヘリックスが配置した構造を持つことが示された.これらの構造情報は,白血病や骨形成異常症(CCD)の患者で検出されたRuntドメイン変異の示す機能異常と良く符合しており,今後,こうした疾患の診断ならびに機序解明に重要な手がかりをもたらすと期待される.転写因子PEBP2/AML1は白血病に関連する染色体転座の最も高頻度なターゲットとして良く知られている.本研究ではPEBP2の機能異常による発癌の機序を明らかにするために,本因子の機能的中核をなすαサブユニットのRuntドメインに注目して,その遺伝変異を利用した機能解析およびNMRによる立体構造解析を並行的に進め以下の結果を得た1)白血病患者から同定されたRuntドメイン内に落ちる数種のPEBP2αB/AML1点突然変異体について機能解析を行い,それらがDNA結合・細胞内局在性・転写活性化等に欠陥を持つことを明らかにした.この結果に基づき,AML1遺伝子の点変異が白血病発症の有力な原因と成りうることを新たに提唱した.その後,他の臨床研究グループからも同様の変異が相次いで報告され,本説への支持と関心が高まりつつある.2)PEBP2αサブユニットのDNA結合領域Runtドメインとβサブユニットの立体構造をそれぞれNMR解析により決定することに成功した.Runtドメインはβシートを骨格とするSタイプ免疫グロブリンフォールドと呼ばれる構造を持っており,この点でP53,NF-κB,NFAT1,STAT等と共通のグループに属することが分った.また,βサブユニットもβシートバレルを中核として,その両側にαヘリックスが配置した構造を持つことが示された.これらの構造情報は,白血病や骨形成異常症(CCD)の患者で検出されたRuntドメイン変異の示す機能異常と良く符合しており,今後,こうした疾患の診断ならびに機序解明に重要な手がかりをもたらすと期待される.
次世代プロテオーム解析によるイネ初期胚パターニングの新規制御レイヤー探索

従来のプロテオーム解析では、プロテアーゼによりペプチドに分解されやすく、かつイオン化しやすいペプチドを量の多い順番に解析するため、試料中に微量含まれる転写因子等の制御因子に関する情報はほとんど得られない。本研究代表者はイネの胚形成機構の解明に長年分子遺伝学的手法で取り組んできた。この間、転写レベルでの制御ネットワークの重要性を多数明らかにしてきた。一方、転写ネットワークの上流で何が起きているのか全く情報は得られていない。本研究では、イネ初期胚形成過程をモデルにして次世代プロテオームプラットフォームを活用のための情報収集を行った。従来のプロテオーム解析では、プロテアーゼによりペプチドに分解されやすく、かつイオン化しやすいペプチドを量が多い順番に解析するため、試料中に微量含まれる転写因子等の制御因子に関する情報はほとんど得られない。一方、転写ネットワークの上流で何が起きているのか、全く情報が得られていない。本研究では、近年ヒトを材料に発展してきた次世代プロテオーム解析技術を導入し、これまで植物では全く手付かずの領域であった、胚形成初期に働く、転写ネットワークの上位の制御レイヤーの解明に挑む。本申請研究は、次の三つのパートからなる。1転写因子をコードするイネESTクローンからin vitro転写/翻訳系を用いて、タンパク質合成を行う。2合成したタンパク質を用いてMRMトランジション情報を取得する。3イネの野生型胚および各種変異型胚よりLMD法により胚を切り出し、MRMトランジション情報を用いた「次世代プロテオーム」解析を行う。今年度は、当初の予定通り、in vitro転写/翻訳に供する約200の転写因子の抽出をデータベース等を用いて行った。また、これら大量のESTクローンの転写/翻訳を効率よく行うことができることをこれまでに取得した約60のESTクローンを使って、検証した。その結果、約8割は容易にin vitro転写が行えることを確かめた。さらに、イネ胚をLMDにより切り出す実験を繰り返し行い、受粉後3から4日目の胚については安定的に胚が切り出せることを確認した。初年度の実験は、概ね順調に進んだが、一方で、in vitro転写まではほとんどのESTクローンでうまくいくことが確認できたが、in vitro翻訳までは一つしか試すことができなかった。このため、やや遅れていると判断した。ただ、in vitro翻訳については、共同研究者が別プロジェクトにおいて条件検討を精力的に進めているので、おそらく大きな問題とはならない。従来のプロテオーム解析では、プロテアーゼによりペプチドに分解されやすく、かつイオン化しやすいペプチドを量が多い順番に解析するため、試料中に微量に含まれる転写因子等の制御因子に関する情報はほとんど得られない。一方、転写ネットワークの上位で何がおきているのか、ほとんど情報は得られていない。本研究では、近年ヒトを材料に発展してきた次世代プロテオーム解析技術を導入し、これまで植物では全く手付かずの領域であった、胚形成初期に働く、転写ネットワークの上位の制御レイヤーの解明に取り組む。本研究は、次の三つのパートからなる。1転写因子をコードするイネESTクローンからin vitro転写・翻訳系を用いて、タンパク質合成を行う。3イネの野生型胚および各種変異型胚よりLMD法により胚を切り出し、MRMトランジション情報を用いた「次世代プロテオーム解析」を行う。これまでに、まとまった数のESTクローンを用いてin vitro転写が可能であること、LMD法によりイネの初期胚を切り出すことが可能であることを確認した。今年度は、LMD法で切り出した初期胚試料の質の確認を行なった。具体的には、LMD法により回収した胚試料からDNA, RNA,タンパク質を回収した。当初、初期胚からDNAやRNAを回収することが困難であったが、いくつかの工夫により、安定的に回収できるようになった。また、DNA, RNAについては各種イネ遺伝子をPCR法により増幅が可能であることを確かめた。このことから、LMD法で回収したイネ初期胚を比較的インタクトであることが確認された。平成28年4月に、研究代表者の異動があり、実験室等の整備を行い、実験ができる環境を作り上げるのに相当の時間を要した。また、質量分析によりMRMトランジション情報を取得する連携研究者ならびに質量分析器そのものと物理的に離れてしまい、なかなか研究の連絡や作業が以前ほど、気軽にできなくなっている。このため、当初の計画よりは、研究の進展が遅れている。申請者はイネの胚形成機構の解明に長年分子遺伝学的手法で取り組んできた。本研究では、近年ヒトを材料にして発展してきた次世代プロテオーム解析技術を導入し、これまで植物では全く手つかずの領域であった、胚形成初期に働く、転写ネットワークの上位の制御レイヤーの解明に挑む挑戦的かつ萌芽的な研究を行うことを目的とした。

具体的には、イネのESTクローンのうち、特に転写制御因子に着目し、これを鋳型にin vitro転写・翻訳を行う。翻訳産物を質量分析器にかけることにより、イネ転写因子が示す特有のMRMパターンをあらかじめ取得し、データベース化することにより、イネの転写因子のプロテオーム情報をより、充実させることを目指した。手始めに、イネESTクローンのうち、転写因子をコードするクローンを約50入手した。PCRでタグを導入したのち、効率の良いin vitro転写系で、転写物を得られるか確認した。その後、市販のin vitro転写システムを利用し翻訳産物を得た。翻訳産物が、きちんとできていることをタグを用いたウエスタン解析により明らかにした。本研究により、質量分析器により得られる情報のデータベース化に向けた、道筋ができた。従来のプロテオーム解析では、プロテアーゼによりペプチドに分解されやすく、かつイオン化しやすいペプチドを量の多い順番に解析するため、試料中に微量含まれる転写因子等の制御因子に関する情報はほとんど得られない。本研究代表者はイネの胚形成機構の解明に長年分子遺伝学的手法で取り組んできた。この間、転写レベルでの制御ネットワークの重要性を多数明らかにしてきた。一方、転写ネットワークの上流で何が起きているのか全く情報は得られていない。本研究では、イネ初期胚形成過程をモデルにして次世代プロテオームプラットフォームを活用のための情報収集を行った。当初約200個の転写因子をコードするイネESTクローンを農林水産省生物資源研究所との共同研究で無償提供を受けることを想定していたが、当該研究機関の再編などがあり、予定通り200クローンの無償譲渡ができなかった。平成28年度4月現在、当該研究機関の再編も一段落したことから、再度、共同研究のお願いをするとともに、対象を転写因子だけに絞らずに、手持ちのESTクローン(約70)等を利用して、研究を進める。今後は、in vitro翻訳と翻訳産物を質量分析器にかける実験を行う予定であるが、サンプルをある程度の数、まとめて準備するなどの工夫をして、効率良く連携研究者との共同実験を進められるよう調整する。植物遺伝学平成27年度に大量のin vitro翻訳を行う予定であったが、実際には1クローンのみをin vitro翻訳を行った。しかも、この1クローンは共同研究者のシステムで行ったため、当初予定のin vitro翻訳にかかる消耗品等の出費をせずに済んだ。また、当初大量のin vitro転写/翻訳を研究者自身が行うのは、労力的に難しいと考え、一部を技術補助等の雇用により行うことを計画したが、in vitro翻訳をほとんど行わなかったので、この分の人件費を使わなかったため、次年度使用となった。当初、平成28年度が本研究の最終年度で、研究を完了する計画であった。
熱ショック応答の分子機構と生理的役割の解明

トリのHSF3は熱ショック応答に必須であり、刺激により二量体から三量体へと転換する。高効率で相同組み替えが起こるニワトリBリンパ球系細胞株DT40を用いて、HSF3の遺伝子破壊を行いHSF3欠損細胞を作成した。その細胞に一連の欠損変異株を再導入した安定発現細胞を作成し、温熱ストレスを与えた前後の変異HSF3のオリゴマー構造を調べた。この生理的な条件下でのアッセイにより以下のことが明らかになった。(1)全長HSF3の二量体から三量体への正しい転換には分子サイズ20kDaの共有結合による翻訳後修飾が必要である。(2)議論の余地が残されていたカルボキシル末端側のロイシンジッパー様ドメインは、非ストレス下で活性型の三量体への移行を抑制することが決定付けられた。(3)活性型の三量体への転換に必須の領域を2カ所同定した。一つはDNA結合ドメインの一部であり、もう一つは核移行シグナル(NLS)と推測される部位であった。(4)NLSと推測される領域が確かにHSF3の核移行シグナルとして働くこと、さらにアミノ酸の部位特異的置換により核移行のみでなく活性型の三量体形成も妨げられることを明らかにした。