hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代型フラボノイド系抗酸化剤の開発

本研究は天然資源として植物中に大量に存在しているフラボノイドを利用した創薬化学であり,天然型フラボノイドを誘導化することによって医療への積極的な利用が可能な化学予防物質を開発することを目的とする.我々は代表的なフラボノイドであるカテキンの立体構造の平面固定化に成功した.本方法は天然カテキンにアセトンを反応させる1ステップ反応であり,得られた平面型カテキンはガルビノキシルラジカルに対して天然カテキンと較べて約5倍のラジカル消去能を示し,さらに、抗酸化剤の毒性として報告されているプロオキシダント効果は非常に弱いことを明らかにした.この平面化の反応はカテキン以外の様々なフラボノイドにも応用でき,また,アセトンの代わりに様々な置換基を有するケトンを導入することによって、フラボノイドの機能を大きく変化させることが可能である.すなわち,1)天然型フラボノイドの平面構造を固定化することによるラジカル消去能の増加,また,2)平面固定化の際、アセトンの代わりにアルキル側鎖を有したケトンを導入することによる膜透過性の向上,3)ケトンに標的部位に高親和性な置換基を導入することによる分子標的剤としての誘導化が可能である.そこで次に,長さの異なるアルキル側鎖(R=C_1C_9)を有する平面型カテキン誘導体を合成した.ルミノール法を用いてAAPH由来ペルオキシルラジカルに対するラジカル消去能を測定した結果,アルキル側鎖が長くなるに従ってラジカル消去能が増強し,R=C_3,C_4で最も強力なラジカル消去能を示した.一方,さらに長くなるとラジカル消去能の低下がみられた.ヒドロキシルラジカル(Fenton反応)による酸化的DNA損傷反応に対しては,R=C_4C_6で特に顕著な抑制効果を示した。他の生物活性についても検討した結果,平面型カテキンには抗ウイルス作用,およびβ-グルコシダーゼ阻害作用があることがわかった.本研究は天然資源として植物中に大量に存在しているフラボノイドを利用した創薬化学であり,天然型フラボノイドを誘導化することによって医療への積極的な利用が可能な化学予防物質を開発することを目的とする.我々は代表的なフラボノイドであるカテキンの立体構造の平面固定化に成功した.本方法は天然カテキンにアセトンを反応させる1ステップ反応であり,得られた平面型カテキンはガルビノキシルラジカルに対して天然カテキンと較べて約5倍のラジカル消去能を示し,さらに、抗酸化剤の毒性として報告されているプロオキシダント効果は非常に弱いことを明らかにした.この平面化の反応はカテキン以外の様々なフラボノイドにも応用でき,また,アセトンの代わりに様々な置換基を有するケトンを導入することによって、フラボノイドの機能を大きく変化させることが可能である.すなわち,1)天然型フラボノイドの平面構造を固定化することによるラジカル消去能の増加,また,2)平面固定化の際、アセトンの代わりにアルキル側鎖を有したケトンを導入することによる膜透過性の向上,3)ケトンに標的部位に高親和性な置換基を導入することによる分子標的剤としての誘導化が可能である.そこで次に,長さの異なるアルキル側鎖(R=C_1C_9)を有する平面型カテキン誘導体を合成した.ルミノール法を用いてAAPH由来ペルオキシルラジカルに対するラジカル消去能を測定した結果,アルキル側鎖が長くなるに従ってラジカル消去能が増強し,R=C_3,C_4で最も強力なラジカル消去能を示した.一方,さらに長くなるとラジカル消去能の低下がみられた.ヒドロキシルラジカル(Fenton反応)による酸化的DNA損傷反応に対しては,R=C_4C_6で特に顕著な抑制効果を示した。他の生物活性についても検討した結果,平面型カテキンには抗ウイルス作用,およびβ-グルコシダーゼ阻害作用があることがわかった.近年,カテキンやケルセチン等のフラボノイド系天然抗酸化剤は,がんや心臓病などの予防薬として注目を集めている.また,空気清浄機におけるカテキンフィルターにみられるように,エアフィルターの効果を高める目的にも利用されている.今年度は天然型カテキンのラジカル消去作用の増強を目的として,カテキン構造を平面に固定した平面型カテキン(1H)を合成し,ラジカル消去能と酸化的DNA傷害に対する抑制効果について検討した.Oxa-Pictet Spengler反応を利用して,カテキンをアセトン中,BF_3Et_2Oを添加することにより1Hを合成した.X線構造解析により,1Hは分子全体が平面に固定されていることがわかった.1Hのラジカル消去能を酸素ラジカル種としてgarvinoxyl radical (G・)を用いて紫外可視分光法により解析し,1HからG・への水素移動速度定数(k_<HT>)を1.12×10^3M^<-1>s^<-1>と決定した.同様のラジカル消去能はカテキンの場合,k_<HT>=2.34×10^2M^<-1>s^<-1>となり,最も強力な天然抗酸化剤であるケルセチンの場合はk_<HT>=1.08×10^3M^<-1>s^<-1>と決定された.このことから,1Hのラジカル消去能はカテキンと比べて飛躍的に増強し,ケルセチンと同程度であることがわかった.

次に,ヒドロキシルラジカル(Fenton反応)による酸化的DNA損傷反応に対する影響について検討したところ,カテキンやケルセチンはDNA切断反応を促進するのに対して(prooxidant効果),1Hは濃度依存的にDNA切断反応を抑制した.以上,1Hは非常に優れたラジカル消去剤であることが明らかとなった.(J. Am. Chem. Soc. 124,5952-5953,2002)本研究は天然型カテキンのラジカル消去能を化学修飾によって増強させた初めての例であり,現在,医療および環境因子による健康被害の防止を目的として1Hの抗ウイルス作用,糖タンパク質の輸送阻害作用,放射線傷害予防作用について検討している.なお,1Hの酸化還元挙動と電子分布状態についても明らかにした(Chem. Res. Toxicol. 16,81-86,2003).本研究は天然資源として植物中に大量に存在しているフラボノイドを利用した創薬化学であり,天然型フラボノイドを誘導化することによって医療への積極的な利用が可能な化学予防物質を開発することを目的とする.昨年度は天然型カテキンのラジカル消去作用の増強を目的として,カテキン構造を平面に固定した平面型カテキン(1H)を合成し,ラジカル消去能と酸化的DNA傷害に対する抑制効果について検討した(J.Am.Chem.Soc.124,5952-5953,2002,Chem.Res.Toxicol.16,81-86,2003,ibd.17,26一31,2004).この平面化の反応はカテキン以外の様々なフラボノイドにも応用でき,また,アセトンの代わりに様々な置換基を有するケトンを導入することによって、フラボノイドの機能を大きく変化させることが可能である.すなわち,1)天然型フラボノイドの平面構造を固定化することによるラジカル消去能の増加,また,2)平面固定化の際、アセトンの代わりにアルキル側鎖を有したケトンを導入することによる膜透過性の向上,3)ケトンに標的部位に高親和性な置換基を導入することによる分子標的剤としての誘導化が可能である.そこで今年度は,長さの異なるアルキル側鎖(R=C_1C_9)を有する平面型カテキン誘導体を合成した.ルミノール法を用いてAAPH由来ペルオキシルラジカルに対するラジカル消去能を測定した結果,アルキル側鎖が長くなるに従ってラジカル消去能が増強し,R=C_3,C_4で最も強力なラジカル消去能を示した.また,さらに長くなるとラジカル消去能の低下がみられた.ヒドロキシルラジカル(Fenton反応)による酸化的DNA損傷反応に対しては,R=C_4C_6で特に顕著な抑制効果を示した。他の生物活性についても検討した結果,平面型カテキンには抗ウイルス作用,およびβ-グルコシダーゼ阻害作用があることがわかった。
インフルエンザウイルスをプローブとした宿主細胞遺伝子の網羅的解析

感染症は人類の脅威であるが、ウイルス感染症に対する我々の武器はワクチンと抗ウイルス薬がわずかにあるばかりで、対処療法が主である。一方、DNA二十螺旋の発見に始まる遺伝子の時代は種々のゲノム・シークエンスの解読を完了し、そこから明らかとなった未知遺伝子の機能解析へと新たな段階を迎えている。それら未知遺伝子の中には抗ウイルス薬のターゲットが含まれる可能性もある。そこで、本研究はインフルエンザウイルスをプローブとしてウイルスの増殖に必要な宿主細胞の遺伝子産物を同定し、その機能を解析することを目的とする。昨年度は人工的に薬剤で変位を導入することでインフルエンザウイルスに極めて低い感受性を示す細胞(W57/1)の作出に成功した。そこで、本年度はW57/1細胞について解析を進めた。これまでに、W57/1はレセプターであるシアル酸の発現量は親株と同程度であることがわかった。また、ウイルスの細胞への吸着・進入から核移行までは正常に行われているが、ウイルス蛋白質の合成は極度に減少していることがわかった。W57/1細胞は調べた全てのインフルエンザウイルスに対して親株よりも感受性が低いが、ウイルス株によってその程度は異なった。そこで、W57/1細胞が極めて低い感受性を示すインフルエンザウイルス(WSN)と比較的感受性を示すインフルエンザウイルス(Mem/88)とでリアソータント(間の子ウイルス)を作製し、W57/1細胞の感受性に関与している細胞側因子と相互作用するウイルス側因子の同定を試みた。その結果、ウイルスポリメラーゼ蛋白質のPB1とPB2が細胞側因子と関与していることが示唆された。一方、DNA二重螺旋の発見に始まる遺伝子の時代は種々のゲノム・シークエンスの解読を完了し、そこから明らかとなった未知遺伝子の機能解析へと新たな段階を迎えている。まず、染色体の多くを片方しか持たない株化細胞(CHO-K1細胞)に遺伝子変異剤であるICR191を50%致死量で5回処理し、これらの細胞の遺伝子に変異を導入した。次に得られた変異細胞集団にinfluenza A/Mallard/New York/76を接種し生き残った細胞をクローニングした。得られた細胞クローンは72種類あったが、いずれもウイルスレセプターのシアル酸の発現量が著しく減少していた。そこで、レセプター以外の新しい宿主細胞遺伝子産物を同定すべく、選択に用いるウイルスをVSVG(HA)GFP(NA) virus (Watanabe et al.,2003,J.Virol.77;10575-83)に変更し同様の過程を行い、97種の細胞クローンを得た。これらの細胞クローンは親株のCHO-K1細胞と比較して1/3から1/10,000程度にウイルス感受性が減少していた。このうち最も感受性が低くなったW57/1細胞について解析を進めている。今後、W57/1細胞にCHO細胞のcDNAライブラリーを導入し、欠損しているウイルス増殖に必要な宿主細胞因子を同定するとともに、その遺伝子産物と相互作用するウイルス因子を同定する予定である。
超高速OCTを用いたOCTエラストグラフィーの研究開発

1.3μm帯の超高速オプティカル・コヒーレンス・トモグラフィー(OCT)を用いて、断層像と同時に生体試料の組織弾性率といったメカニカルな特性を抽出するOCTエラストグラフィーの研究開発を目的とする。動脈硬化性プラークや腫瘍部位などの組織は、健常な組織と比べると硬いため、ひずみや硬さの分布を見るエラストグラフィーを用いることでその個所の特定が可能となる。OCTエラストグラフィーは数μm数十μmの画像分解能を有しており、超音波やMRI法などのでは判別不可能なミクロンレベルでの生体組織の評価が期待される。
心理力動理論から見たアスリートの身体症状の心理学的意味

アスリートの競技ヒストリーの中での身体症状や動きの変化の深層心理学的な意味を、事例研究法や修正グラウンデットセオリーを用いて、心理力動的な観点から検討した。その結果、身体症状・反応が「安全弁」、その時の「限界」や「壁」を示しており、それによって競技からの離脱、あるいは「乗り越えるべき課題」となり競技力向上や人間的成長につながっていた。身体症状・反応が≪こころとからだの悲鳴≫となり、「過負荷による身体症状」「心身のアンバランス」「パフォーマンスの変動」となり、それが成長につながるときと、離脱に至るときとがあったのである。彼らの「身体化」は根源的な苦悩との戦いがあることを示していると考えられた。アスリートの伝記や競技雑誌の記事、およびアスリートの心理サポート事例を収集し、彼らの競技人生(ストーリー)の中でのケガや病気等に関わるエピソードを検索し、整理した。そして、ケガや病気等の身体症状の深層心理学的意味を心理力動理論から検討した。その結果、アスリートのケガや病気などの身体で表現されたことが心の動きと同期することが明確になった。そのような身体反応が「問題解決」や「安全弁」などの心理的な意味を持つことが示された。アスリートの相談事例及び伝記や雑誌記事に示されている、彼らの競技ヒストリーの中での身体症状(病気やケガ)や動きの変化の意味を事例研究法によって、カナー(1974/1972)の症状論やユングの無意識論を援用して心理力動的観点から検討した。カナーは症状には5つ意味があるとし、「入場券」、「信号」(シグナル)、「安全弁」、「問題解決の手段」、「厄介物」を挙げている。また、ユング心理学では身体症状に無意識的な意味が包含されていることが知られている(山中、1993)。その中で「安全弁」「問題解決の手段」、そしてユングの「コンステレーション」からアスリートの身体症状や動きの変化の意味を検討したのである。その結果、勝利を追求するアスリートは厳しいトレーニングを課すことになるので、心身の限界ギリギリのところまで自分自身を追い込むことになり、それによってケガや病気、動きの悪さが生じるときがあり、それは心も体もそれ以上壊れないように心身を調整する「安全弁」の働きという意味があることが示された。また、ケガや病気あるいは動きの悪さはそのときの「限界」や「壁」を示しており、それによってこれ以上向上は望めないという限界を感じさせることで競技からの離脱につながる場合と、「乗り越えるべき課題」となり、それを乗り越えることによって競技力向上や人間的成長につながる場合があった。つまり、その時の心理状態と身体症状や動きが心理的に布置(コンステレーション)されていることが示された。アスリートの身体症状や動きの変化は身体だけでなく、心の動きとも共時的に存在しているのである。事例的検討によってアスリートの身体症状に意味は明らかになったが、より明確にするためにさらに質的な検討が必要である。アスリートの相談事例などから彼らの身体症状・反応の深層心理学的な意味について、修正グラウンデッドセオリーに基づいて質的に検討した。その結果、《こころとからだの悲鳴》をコアカテゴリーとして、その他に<強迫性><他者懸念><パフォーマンスの変動>という合計4つのカテゴリー、「過負荷による身体症状」「心身のアンバランス」など13の概念があることが示された。そしてそのときに、アスリートは身体症状・反応による苦悩を乗り越え、洞察、そして成長に至る場合と、競技離脱に至る場合とがあることが示された。真面目に、強迫的に競技に取り組むアスリートは心身ともに限界に挑戦しながら競技生活を送ることになり、それは常に身体症状・反応として問題が表出し、競技休止や離脱の危険性を伴う。そのような彼らのからだが示す反応は単なる肉体の事象ではなく、こころとからだの総体としての人間の事象であること示唆された。このようなアスリートの身体症状・反応の心理学的な意味を理解することは、心理サポートをより有効にすることにつながっていく。そのため、本研究課題につながるものとして、支援を求めてくるアスリートの身体的訴えの背景にある心理的課題を見立てることの重要さ、実践を通しての研究につながる事例研究の積み重ねの必要性などについて示唆した。アスリートの身体症状を心理力動的な側面から理解するために、アスリートの伝記、雑誌記事、心理サポート事例から資料を収集し、おおむね研究の目的を達成したが、もう少し多くの資料に当たる必要がある。また、彼らの描画からの検討も資料がやや不足しているため、もう少し時間が必要である。アスリートの相談事例、伝記や雑誌記事、描画について資料を引き続き収集すると共に、修正グラウンデットセオリーに基づいて質的検討を行う。また、3年間の研究をまとめ、国内外で発表する。スポーツ心理学(スポーツ臨床)

アスリートの伝記、雑誌記事、心理サポート事例、描画についての資料を収集し、26年度に引き続いて心理力動的観点から身体症状の意味を検討する。また、一般のアスリートにアンケート調査を実施し、競技人生のなかでのケガや病気の発生についての心理力動的な意味を検討する。収集した資料の集計に手間取り、まとめるまでには至らなかった。そのため、まとめるに当たって協力を得るための予算が残額となった。資料収集がやや不足していたため、そのための物品費と旅費が残額となった。収集した資料を質的分析するための協力を得るために支出する。資料収集の不足を補うために使用する。
自己診断・自己再生型エネルギー蓄電池ユニット

開発した鉛蓄電池回復機は、12V、24V、48V機と3つのタイプを開発した。通常市販の鉛蓄電池回復機は0.1Cで充電するところ、瞬時電流0.20.3C程度の定電流充電と1C程度の短パルス大放電を組み合わせた間断充電を利用して、劣化鉛蓄電池の再生を試みた。また定電流充電の効果を高めるために、300Hzのパルス充電にして1.3倍の電流を注入している。これまで別機器として購入されていた放電試験機、充電機の機能を付加した多機能型劣化鉛蓄電池回復機になっている。本機をシリアルケーブルでパソコンに接続することによりインターネットを介して、電流電圧モニタ、遠隔制御、制御プログラムの変更が可能である。そのため蓄電設備に本機を組み込むと、現地に赴かなくても劣化鉛蓄電池の再生・放電試験が可能である。本装置には、鉛蓄電池回復モード、充電モード、放電試験モードと、再生から試験検査まで一つの装置で済ますことができる。装置は、定電流充電を行うための直流電源と電流フィードバックを掛けるための電流検出及び制御回路、放電を行うための負荷抵抗、これらを組み合わせて回復モード、定電流充電もしくは定電圧充電および定電流放電が可能である。また任意の電流電圧値設定および時間設定、繰り返し充放電のループ条件設定のプログラム制御が可能である。実際に10年間使用した48Vフォークリフト用中古バッテリーを再生した。端子電圧が40.2Vに降下するまで40A放電試験を行った。再生前は100Ah前後の放電容量だったのが、200Ahまで大幅に回復した。新品の電池でも400Ah程度なので、当初25%放電容量だったのが50%まで回復したことを示している。また100A放電では、45分間放電時間が確保された。放電終止電圧付近になると、24個の中の劣化電池セルは、顕著に電圧降下が生ずるので不良セルを取り除くことが出来る。エネルギー備蓄用ディープサイクル型鉛蓄電池に対して、放電時間の長短とインピーダンス変化との関係を明らかにした。測定システムは、充電完了電圧、放電電流および放電終了電圧が任意に設定できて、自動的に充放電を繰り返しながらインピーダンス測定ができるシステムを構築した。本システムを用いて、サルフエーション劣化による放電時間の推移とインピーダンス変化の関係を明らかにした。インピーダンス測定回路は、周波数掃引と振幅制御可能な発振器で構成される交流定電流源と電圧差動アンプから成り立っている。交流電圧と定電流の関係(インピーダンス=定電流/印加微小交流電圧)から、インピーダンスを測定する。交流信号を用いているので同期検波回路は、cosΘの位相差がゼロの場合は出力が1となり、位相差が大きくなるに従い出力が小さくなっている。ディープサイクル型鉛蓄電池に対して、放電時間が短くなるにつれてインピーダンスが高くなっていくことが分かった。これはエンジン始動型鉛蓄電池の場合も当てはまるが、ディープサイクル型の場合、通常の充放電の繰り返しだと劣化に至るまで6か月程度要するので、今回は放電後12時放置状態で劣化を促進させて実験を行った。これらは、車載用鉛蓄電池ではライトをつけっ放しでエンジンを切った状態、もしくは長期間乗車せずに自己放電で蓄電池を上げてしまった状況に酷似している。これを数回行うと、蓄電電池の活物質の反応が悪くなりいわゆる"バッテリーあがり"の状態になる。ディープサイクル用の電池においても実験では数回の充放電・放置後で、インピーダンス値は数ミリオームが上がり、劣化の状況が確認できた。一方、本研究で提唱している間断充電方式(定電流+たんパルス放電+インターバル)では、十分劣化が抑えられることが分かった。28年度は、インピーダンスおよび繰り返し充放電自動測定システムの構築を目指しており計測システムは予定通り完成した。また本システムにより実験を行うことにより、精度も十分であり、性能評価的にも優位性を確認した。測定対象の電池もエンジン始動用から、ディープサイクル用電池まで幅広い電池の種類に対応することからも汎用性を確認できた。また再現性は、製造メーカーが同じであり型番が同じであれば誤差範囲内での測定になり、再現性も確認できた。実験結果として、エンジン始動用電池が適応していた放電時間と内部インピーダンスの関係も、ディープサイクル型の蓄電電池にも適用することが確認できた。そのため間断充電による鉛蓄電池再生方法に確信がもてた。あとは、電池容量および電池用途(エンジン始動型かディープサイクル型か)に応じて、定電流電流値、インターバル、一時放電電流値、放電時間の設定パラメーターを最適化すれば、鉛蓄電再生システムの構築に結び付けることができるため、おおむね順調に推移していると判断した。深い充放電用ディープサイクル鉛蓄電池に対して、放電時間の長短とインピーダンスの位相変化の関係を明らかにし、劣化指標を明らかにした。測定に関しては自動充放電インピーダンス測定システムを構築した。特に交流定電流源の測定周波数を変化させて劣化とインピーダンス(位相角度)の関係を明らかにした。これらの装置を用いて間断充電方式による再生効率の最適化を図るため、放電パルスの電流値と放電時間の設定パラメータを変えて実験を行った。評価は鉛蓄電池の繰り返し充放電による放電時間の長短を調べる。装置は定電流電源を用いて、蓄電池4019タイプ(12V電荷

容量28Ah、軽四自動車エンジン始動用鉛蓄電池)の場合、充電電流は0.1C(28Ah×0.1C=5.6Ah)を規定し5分間充電後、回復用放電電流を規定してこれの繰り返しを5セット行った後、定電圧充電で注入電流が2Aになった時点で満充電とした。放電は定電流放電10Aで放電中の端子電圧が10.5Vになるまで放電した。その結果、8A定電流放電した場合、放電パルスなしと18A30秒間の場合は、初期放電時間が2.7時間であった蓄電池が、劣化した状態で放電時間が1.62時間の60%台に落ち込むまでの充放電繰り返し回数は、放電パルスなしもしくは放電電流が18A30秒間の場合、それぞれ13回目、20A60秒の場合は19回目、20A120秒の場合は23回目であった。放電パルスが2分間の場合は、放電パルスがない場合と比べて繰り返し充放電可能回数が約2倍繰り返すことができることが明らかになった。一方、放電パルスの電流値は高くて長い方が良いが、放電した分だけ補充電で補う必要があり、その分充電電流を補う必要がある。そのため回復処理に要する時間は増えるため回復効果とのバランスが必要である。本研究では、所要時間の中庸をとって放電電流を20A、放電時間は1分間が相当と判断した。初年度計画では深い充放電用ディープサイクル鉛蓄電池に対して、放電時間の長短とインピーダンスの位相変化の関係を明らかにした。測定装置に関しては自動充放電インピーダンス測定システムを構築した。特に交流定電流源の測定周波数を変化させて劣化とインピーダンス(位相角度)の関係を明らかにした。次年度では、これらの装置を用いて、間断充電における最適化ができたので、上記表記となった。開発した鉛蓄電池回復機は、12V、24V、48V機と3つのタイプを開発した。通常市販の鉛蓄電池回復機は0.1Cで充電するところ、瞬時電流0.20.3C程度の定電流充電と1C程度の短パルス大放電を組み合わせた間断充電を利用して、劣化鉛蓄電池の再生を試みた。また定電流充電の効果を高めるために、300Hzのパルス充電にして1.3倍の電流を注入している。これまで別機器として購入されていた放電試験機、充電機の機能を付加した多機能型劣化鉛蓄電池回復機になっている。本機をシリアルケーブルでパソコンに接続することによりインターネットを介して、電流電圧モニタ、遠隔制御、制御プログラムの変更が可能である。そのため蓄電設備に本機を組み込むと、現地に赴かなくても劣化鉛蓄電池の再生・放電試験が可能である。本装置には、鉛蓄電池回復モード、充電モード、放電試験モードと、再生から試験検査まで一つの装置で済ますことができる。装置は、定電流充電を行うための直流電源と電流フィードバックを掛けるための電流検出及び制御回路、放電を行うための負荷抵抗、これらを組み合わせて回復モード、定電流充電もしくは定電圧充電および定電流放電が可能である。また任意の電流電圧値設定および時間設定、繰り返し充放電のループ条件設定のプログラム制御が可能である。実際に10年間使用した48Vフォークリフト用中古バッテリーを再生した。端子電圧が40.2Vに降下するまで40A放電試験を行った。再生前は100Ah前後の放電容量だったのが、200Ahまで大幅に回復した。
肺傷害におけるβ受容体機能再生メカニズムの研究

肺傷害において肺胞上皮細胞肺水分再吸収(肺胞水分クリアランス)を促進するβ受容体機能の再生機序を研究した。RAGE(Receptor for advanced glycation end-products)ノックアウトマウスではRAGEはVentilator-inducelung injuryに関与しない。腎不全ラットではβ受容体機能は維持され、内因性カテコールアミンの分泌亢進によりβ受容体機能を亢進した。グルタミン酸により肺胞水分クリアランスは低下するため、腎不全におけるアミノ酸投与は肺胞上皮細胞機能に影響する。海水中の高マグネシウム濃度により肺胞水分クリアランス機能とβ受容体機能は変化しないため、溺水患者のおけるβ交感神経刺激薬の有用性が示唆された。ヒト肺ではアクアポリン(水チャンネル)は肺癌の増殖と転移に関与する可能性が示唆された。肺傷害におけるβ受容体機能再生メカニズムの研究は重要である。1.RAGEノックアウトマウスでの研究肺傷害におけるRAGE(Receptor for advanced glycation end-products)の役割を解明した。RAGEノックアウトマウス(N=150)を繁殖し、高濃度酸素肺傷害を発生させた。対照としてWild typeマウス(C57BL/6J)を使用した。まず、100%酸素に3日暴露した。肺傷害の程度を肺乾湿重量で決定した。次に、肺胞水分クリアランスを測定して、β1交感神経刺激薬デノパミンとβ2交感神経刺激薬テルブタミンの効果を比較した。その結果、肺湿乾重量比、肺胞水分クリアランス、テルブタリン効果、デノパミン効果ともノックアウトマウスとWild typeマウスで有為差がなかった。このことより、RAGEは高濃度酸素肺傷害に関与しない事が示唆された。3.β1受容体の役割の研究Alzet Osmotic Pumpを用いて、β1受容体遮断薬の持続注入モデルを作成した。そのポンプを使用すると約1週間の持続注入実験が可能であることが判明した。ラット肺傷害モデルでの研究腎不全肺傷害モデルを作成した。ラットを麻酔科に左右腎動脈を結紮して、24時間後と48時間後に採血し、屠殺して肺を摘出し、肺胞水分クリアランスを測定した。血清BUN、クレアチニンは時間経過に伴って上昇し、BUN値は100mg/dl、クレアチニンは8mg/dl以上に上昇した。肺胞水分クリアランスは増加した。β交感神経刺激薬により肺胞水分クリアランスは亢進した。肺を摘出し標本を作製した。その標本で、β受容体、アクアポリン1、3、5を免疫染色中である。また、肺のmRNAを抽出しており、β受容体の発現、アクアポリンの発現を測定中である。ヒト切除肺でのモデルヒト切除肺でのアクアポリンの機能を研究するため、肺癌のため切除した肺でアクアポリン1、3、5の発現を研究した。その結果は肺癌の組織型の違いによりアクアポリンの発現に相違があり、癌細胞の分化、浸潤増殖、転移に水分クリアランスの因子であるアクアポリンが重要な役割を果たしていることが示唆された(英語論文投稿中)アミノ酸が肺胞上皮細胞機能に及ぼす影響の研究ラット肺を摘出して、グルタミン酸が肺胞水分クリアランスに及ぼす影響を研究した。その結果、グルタミン酸は肺胞水分クリアランスを低下させ、肺水腫の改善が遅延させた。昨年度作成したラット肺傷害モデルでの研究と統合すると、腎不全肺傷害ラットでは。血清BUN、クレアチニンは時間経過に伴って上昇し、肺胞水分クリアランスは減少する。これにはアミノ酸代謝異常が関与している可能性が示唆された。しかし、腎不全時には内因性カテコールアミンの放出により、肺胞水分クリアランスは増加し、肺水腫の改善に寄与する。また、β交感神経刺激薬により肺胞水分クリアランスは亢進した。この研究では、腎不全肺傷害ではアミノ酸代謝異常の治療を推進するとともに、β刺激薬投与による肺水腫の治療が重要であることが示唆された。(論文作成中)マグネシウムが肺胞水分クリアランスに及ぼす影響の研究地震による津波では溺水による死亡が多い。海水にはMgが多く含まれ、溺水では肺胞内Mg濃度が上昇する。ラット肺でMgが肺水腫改善に及ぼす影響を研究した。その結果Mgは肺胞水分クリアランスを変化させない。また、β交感神経刺激薬の肺胞水分クリアランス亢進機能にも影響を及ぼさない。

この研究では、海水の溺水に対してβ交換神経刺激薬治療は肺胞内水腫改善に有効であることが示唆された。(研究進行中)ヒト切除肺でのモデル肺癌浸潤部ではアクアポリン1の細胞膜発現が亢進し、癌細胞の分化、浸潤増殖、転移に水分クリアランスの因子であるアクアポリンが重要な役割を果たしていることが示唆された。(Human Pathol)
疣贅状表及発育異常症発癌における癌抑制遺伝子Rbの関与について

HPV5型および8型の塩基配列よりE6,E7を増幅するためのプライマーを設定し,合成した.これらのプライマーを用いてHPV5型のE6E,7の発現クローンを作製した.更にHPV5型についてはE1,E2の発現クローンも作製中である.また疣贅状表皮発育異常症における癌抑制遺伝子の変異の有無を調べ,p53遺伝子およびRb遺伝子に変異を認めないことを明らかにした.更に,疣贅状表皮発育異常症の病変部でproliferating cell nuclearantigen(PCNA)の発現が亢進していることを明らかにし,また,PCNA発現はHPV16型E7によって誘導されることを示した.このPCNA発現の誘導はE7とRbの結合によってフリーになったE2Fを介するものの可能性があると考えられた.今後はHPV5型E7によるPCNA発現の誘導が認められるかどうか,HPV5型E7とRbとの結合について検討を進める予定である.HPV5型および8型の塩基配列よりE6,E7を増幅するためのプライマーを設定し,合成した.これらのプライマーを用いてHPV5型のE6E,7の発現クローンを作製した.更にHPV5型についてはE1,E2の発現クローンも作製中である.また疣贅状表皮発育異常症における癌抑制遺伝子の変異の有無を調べ,p53遺伝子およびRb遺伝子に変異を認めないことを明らかにした.更に,疣贅状表皮発育異常症の病変部でproliferating cell nuclearantigen(PCNA)の発現が亢進していることを明らかにし,また,PCNA発現はHPV16型E7によって誘導されることを示した.このPCNA発現の誘導はE7とRbの結合によってフリーになったE2Fを介するものの可能性があると考えられた.今後はHPV5型E7によるPCNA発現の誘導が認められるかどうか,HPV5型E7とRbとの結合について検討を進める予定である.
G蛋白活性抑制型受容体ファミリーの発現クローニングとその情報伝達の解明

DynAR1は明確な細胞膜貫通領域を持たない。しかしながら、アフリカツメガエル卵母細胞に発現させたDynAR1は細胞膜上に発現していることがDynAR1に対する抗体(抗N末端および抗C末端抗体)を用いて免疫組織化学的に明らかになった。また、いずれの抗体を用いた場合においても、細胞膜上における発現は卵母細胞のトリプシン処理により影響を受けなかった。これらのことから、DynAR1は細胞膜上において、細胞質側にNおよびC末端を持つトポロジーを有していると考えられる。このようなDynAR1のG蛋白活性抑制の機構を調べるため、その両親媒性構造に着目した。両親媒性ペプチドは、G蛋白と直接連関することが知られており、DynAR1内のこの領域がDynAR1のG蛋白活性抑制に関与している可能性が考えられた。この点を検討するに先立ち、両親媒性ペプチドであるメリチン、マストパラン(いずれもハチ毒由来)を用いて実験系を確立した。バキュロウイルス発現系により昆虫細胞(Sf21)膜に種々のG蛋白(G_<i1>、G_<11>、G_s)を過剰に発現させ、[^<35>S]-GTPγS結合を指標にしてペプチドの効果を調べた。いずれのペプチドも3100μMの範囲において濃度依存的にG_<i1>へのGTPγS結合を促進した。G_<11>に対してはメリチンのみが促進効果を示した。こうした促進作用とは対照的に、メリチンはG_sへの結合を抑制した。速度論的解析から、メリチンのG_s抑制作用は、G_sのGDPおよびGTPγSに対する親和性の低下によるものであることが明らかとなった。これらの結果から、両親媒性ペプチドがG蛋白に対してメタボトロピックにあるいはマタボスタティックに作用することが示唆された。また、本評価系がDynAR1由来ペプチドの作用を解析するために有効であることが示された。本研究者らはモルモット小脳にG蛋白活性を抑制するオピオイドk-受容体活性を見い出し、平成5、6年度科研費一般研究Bの研究課題においてその受容体の発現クローニングに成功し、すでに報告した。本年度の研究においては、この情報伝達機構を十分に明らかにすることとともに、新しいG蛋白活性抑制型受容体ファミリーのクローニングを行うことを目的としている。クローニングされた受容体は従来の細胞膜7回貫通型とは異なり、見かけ上膜貫通構造を持たないが、特異的抗体を用いた組織学的研究の結果、細胞膜に局在することが明らかになった。しかし、細胞膜7回貫通型受容体とは異なり、卵母細胞において小胞体-ゴルジ体を介する膜輸送系を経ないで細胞質から膜に移行することが明らかになった。本受容体はアゴニスト刺激を受けG蛋白活性を抑制することが精製G蛋白(Gi1)との再構成実験により確認された。本受容体のG蛋白活性抑制に関わるペプチド領域を決定するために、20アミノ酸前後のペプチドを作成し、G蛋白活性に及ぼす影響を検討した。実験にはバキュロウイルス/昆虫(Sf21)細胞発現系に特定のG蛋白を過剰発現させ、[^<35>S]GTPγS結合活性を測定した。その結果、本受容体のアミノ末端から26-43までの18アミノ酸残基の領域にG蛋白活性抑制作用が認められた。この領域は両親媒性の性質を有し、G蛋白を直接活性化させるマストパランに対比できることが明らかになった。

構造活性相関から、G蛋白活性抑制に必要最小限のペプチド領域を決定し、その推定cDNA配列からPCRにより、抗体作成からライブラリーのスクリーニングを試みつつある。一方、L-ドーパがラット線条体のGTPase活性を抑制することを見い出したので、同様に、卵母細胞発現クローニングを試みつつある。DynAR1は明確な細胞膜貫通領域を持たない。しかしながら、アフリカツメガエル卵母細胞に発現させたDynAR1は細胞膜上に発現していることがDynAR1に対する抗体(抗N末端および抗C末端抗体)を用いて免疫組織化学的に明らかになった。また、いずれの抗体を用いた場合においても、細胞膜上における発現は卵母細胞のトリプシン処理により影響を受けなかった。これらのことから、DynAR1は細胞膜上において、細胞質側にNおよびC末端を持つトポロジーを有していると考えられる。このようなDynAR1のG蛋白活性抑制の機構を調べるため、その両親媒性構造に着目した。両親媒性ペプチドは、G蛋白と直接連関することが知られており、DynAR1内にこの領域がDynAR1のG蛋白活性抑制に関与している可能性が考えられた。この点を検討するに先立ち、両親媒性ペプチドであるメリチン、マストパラン(いずれもハチ毒由来)を用いて実験系を確立した。バキュロウイルス発現系により昆虫細胞(Sf21)膜に種々のG蛋白(G_<i1>、G_<11>、G_S)を過剰に発現させ、[^<35>S]-GTPγS結合を指標にしてペプチドの効果を調べた。いずれのペプチドも3100μMの範囲において濃度依存的にG_<i1>へのGTPγS結合を促進した。G_<11>に対してはメリチンのみが促進効果を示した。こうした促進作用とは対照的に、メリチンはG_Sへの結合を抑制した。速度論的解析から、メリチンのG_S抑制作用は、G_SのGDPおよびGTPγSに対する親和性の低下によるものであることが明らかになった。これらの結果から、両親媒性ペプチドがG蛋白に対してメタボトロピックにあるいはメタボスタティックに作用することが示唆された。また、本評価系がDynAR1由来ペプチドの作用を解析するために有効であることが示された。
イヌ乳腺癌の長鎖ノンコーディングRNA標的療法のためのターゲット候補RNAの探索

ヒトにおいて胎生期や様々な癌で発現することの知られる長鎖ノンコーディングRNAであるH19が、6種類のイヌ乳腺癌細胞株のうちのCIPpで高発現していた。CIPpは上皮系マーカーE-cadherinの発現が非常にダウンレギュレートしており、代わりに間葉系マーカーのN-cadherin、Vimentin、S100A4、Snail、TWIST2、幹細胞マーカーNestinがアップレギュレートしている細胞株である。また癌の進展に関わる代表的なlncRNAの1つであるHOTAIRは、NV-CMLで高発現していた。NV-CMLもE-cadherinの発現がダウンレギュレートしており、N-cadherin、Vimentin、Nestinが比較的高い発現を示した。このようにイヌの乳腺腫瘍で初めて長鎖ノンコーディングRNAの発現が確認された。特にH19は癌の悪性度に関わる遺伝子群の発現と相関しており、癌の進展に重要な役割を果たしている可能性がある。予定していたDNA Microarryよりも詳細な解析が可能な次世代シークエンサーを用いることに変更したためやや進行が遅れているが、当初の計画よりも豊富なデータが得られる見込みである。今後は、今回イヌの乳腺腫瘍培養細胞での発現が初めて確認された長鎖ノンコーディングRNA H19とHOTAIRおよび次世代シークエンス解析により候補にあがるRNAの、乳腺腫瘍組織での発現の確認と細胞実験による機能解析を行う。計画していたDNA Microarrayからより詳細な解析が可能な次世代シークエンスに手法を変更したためやや進行と支払いが遅れているが、2019年度には予定通りの額を使用する予定である。
高照度光療法を用いた術後せん妄回避手法の効果に関する研究

術後せん妄は術後の回復過程を阻害する。術後せん妄の発症を予防するために、無作為化比較試験によって高照度光療法を実施しその効果を明らかにすることを目的とした。対象は55名で、介入群には術後3日間光療法を実施し、コントロール群には通常のケアを実施した。術後1日目の日本語版ニーチャム混乱・錯乱状態スケール(J-NCS)得点と睡眠覚醒リズムで介入群が良好な結果を示し、術後早期の光療法の実施は効果があることが明らかになった。手術を受けた患者の10から30%に起きる術後の一過性の精神障害、所謂術後せん妄は、一旦引き起こされると、術後の回復過程を遅延させ、入院期間の長期化、転倒などの二次合併症を引き起こす。従来看護師は術後せん妄症状の一つである睡眠覚醒リズムの障害(昼夜逆転)に対し、患者が太陽光を浴びることによる昼夜逆転のリズムを正常な体内リズムに調整させるブライトケアを実施してきた。しかし、その方法の有効性については症例研究として報告されているものの、エビデンスの構築までには至っていない。そこで、本研究は術後患者に高照度光照射を用いたブライトケアの術後せん妄発症回避手法としての介入効果を明らかにすることを目的とした。今年度は8月からA総合病院外科病棟にてデータ収集を開始した。対象は予定開腹手術を受ける患者とし、研究実施前に同意を得た患者であり、精神疾患および眼科疾患の現病歴を持つ者を除外した。高照度光療法の実施の有無は封筒法によって介入群とコントロール群を1対1に無作為に割り当て、現在までに30名のデータ収集を行った。介入群には術後1日目から3日目の朝、対象の起床時間に約2時間、1.500Lux前後の光を照射し、適正照度が照射されていることを照度計で測定した。一方、コントロール群には病棟で通常行われているケアのみとした。また、対象患者全員の病室に高照度光装置を設置することにより、アウトカムを評価する研究者が、介入実施の有無がわからないよう盲検化を行った。現在までに高照度光照射によって副作用が生じた対象者は0名で、ベッドサイドで光療法を実際に行うことができることを確認した。統計使用上有効な対象数まで到達していないため、次年度もデータ収集を継続し、介入群と非介入群のoutcomeについての差を検討予定である。【目的】術後患者の不眠は術後せん妄の発症要因になることから早期に対処する必要がある。本研究は高照度光療法を用いて術後患者の主観的な睡眠感への効果を検討した。【研究方法】研究実施病院における研究倫理審査委員会の承認を得て、無作為化比較試験であること、高照度光療法の副作用とその出現率などについて術前に文書を用いて説明し、病棟への同意書の提出によって研究参加の同意を確認した。対象は上下部消化器疾患により予定手術を受ける患者27名であった(平均年齢66歳)。高照度光を照射する介入群と病棟で通常為されるケアのみ受けるコントロール群への割り当ては封筒法で行った。睡眠感は主観的睡眠感を測定する5因子(全16項目)から構成されたOSA睡眠調査票(MA版)(以下OSAとする)で評価し、経験年数5年目以上の病棟看護師が術後1日目から3日目までの午前中に実施した。高照度光療法は光装置をベッドサイドに設置し、介入のみ実施する研究者1名が術後1日目から3日目までの朝2時間の照射(1.500Lux前後)を行った。【結果および考察】対象者27名のうち14名(男:女=10:4)が介入群へ、13名(男:女=9:4)がコントロール群に割り当てられ、介入群の中で高照度光療法による副作用を呈した対象はいなかった。平均年齢は両群で有意差はなかった(p=0.07)。睡眠感の因子得点の平均値(±SD)を術後日数別に比較すると、術後1日目の因子I<起床時眠気>と因子IV<疲労回復>で、介入群がコントロール群に比べ有意に得点が高かった。因子II<入眠と睡眠維持>および因子III<夢み>、因子V<睡眠時間>では有意差は見られなかった。術後1日目は最も睡眠覚醒リズムが障害される時期であり、この時期に高照度光療法群で因子Iと因子IVが有意に高かったことは、高照度光療法によって術後せん妄の発症を回避できる可能性が示唆された。
超高強度・耐摩耗性炭窒化ホウ素の気相合成法開発

ダイヤモンドとc-BNの中間の性質を持つと期待されるBCN系材料への注目が集まりつつある.本研究では,電磁気フィルタを用いて高エネルギーのイオンを抽出することのできるFiltered Cathodic Vacuum Arc (FCVA)装置を開発し,BとCの混合ターゲットと窒素ガスを用いてBCN系膜を合成し,その構造及び組成が機械的特性にどのような影響を及ぼすかを詳細に検討した.その結果,N量が2-7at.%の場合に,比較的高硬さで,トライボロジー特性に優れ,耐酸化性を有するBCNコーティングを実現出来ることを明らかにした.最高の膜硬さは,Nを含まないBC膜で得られ,67.1GPaに達した.黒鉛及び黒鉛とB4Cからなる原料固体ターゲットを真空アーク放電銃により蒸発・イオン化させ,イオンビームとして基板に照射する装置を試作し,アモルファス炭化ボロン膜の作製を試み,作製した膜に対してBoD試験およびUV-VIS測定を行い,機械的・電気的特性を評価した.その結果,以下のことがわかった。GD-OES分析により異なるバイアス電圧で作製したアモルファス炭化ボロン膜中にB原子が存在しており,各膜のB原子に起因するピーク強度から,-100 V,-200 V,-400V,-300 Vの順にB含有量が少なくなっていることがわかった.また,ラマン分光分析により膜の構造分析を行った結果,基板へのバイアス電圧を変化させて作製したすべてのアモルファス炭化ボロン膜において,1525カイザーにG-bandピークが,1340カイザーにD-bandピークが存在し,膜中にアモルファス炭素膜と同様の構造を有していることがわかった.また,アモルファス炭素膜よりもアモルファス炭化ボロン膜において大きいId/Ig値を示すことがわかった.FT-IR分析により膜中の結合状態を分析した結果,基板へのバイアス電圧を変化させて作製したすべてのアモルファス炭化ボロン膜において1200 cm-1付近のB-C (st.)に起因するピークが存在することがわかった.また,2400 3600 cm-1の間にB-OH (st.)に起因するブロードなピークが確認された.さらにNEXAFS分析によりバイアス電圧を変化させて作製したアモルファス炭素膜のsp2/(sp2+ sp3)比を算出した結果,バイアス電圧の増加と共に膜中のsp2/(sp2+ sp3)比が増加していることがわかった.-100Vのときに45%の高いsp3比の得られることがわかった。本研究は,ダイヤモンドを凌駕する超耐摩耗性コーティングを実現することを目的とするものである.黒鉛と六方晶窒化ホウ素からなる原料固体ターゲットを真空アーク放電銃により蒸発・イオン化させ,3元イオンビームとして基板に照射する装置により,成膜実験を行った.昨年度は,15GPa程度の硬さの膜が得られたので,今年度は,まずグラファイトターゲットから炭素のみの高硬さの膜を作製することに注力し,基板バイアス-100V,アーク電流50 A,成膜速度3.3 nm/mの条件において,テクスチャ構造を適用することにより,500nmの比較的厚い膜を硬さ62GPaと,ダイヤモンドの60%以上を示す膜を作製出来ることを明らかにした.テクスチャ構造を適用しない場合には,400nmの膜厚までしか作製出来ず,500nmの厚さでは,内部応力により剥離した.連続構造膜の内部応力は膜厚によらず,1213 GPa程度であり,テクスチャ構造膜のみかけの内部応力は,連続構造膜と比較して一様に減少し,その値は9 GPa10 GPaであった.連続構造膜の内部応力値に対して,テクスチャ構造膜で測定された内部応力値は,5 %前後の差はあるものの,およそ25 %前後減少している.一方,本研究で採用したテクスチャ構造は被覆率が75%程度であり,この構造をとることにより,被覆率は連続構造膜の約75%となる.被覆率は約25%減少しており,これは内部応力の減少割合と同程度である.以上のことから,高硬さを保ちながら厚膜を形成する手法を開発することが出来た.ついで,グラファイトターゲットの一部をボロンで置換し,上述の成膜条件を参考として成膜を行った.ボロンを導入することで硬さは大きく減少し,テクスチャ構造化の有無にかかわらず19GPa程度となった.この際の膜中ボロン濃度を分析したところ,約0.5%であった.BCN系膜は高い硬さと耐摩耗性を持つと予想され,機械的応用が期待できる.しかし薄膜としては高温高圧下での合成で得られるような高硬さのBCN膜は得られていない.そこで本研究では,高硬さを有するBCN膜を得ることを目的として,磁気フィルターを用いた真空アーク放電により,Hを含有しないBCN膜を作製し,その構造および組成を明らかにした上で,機械的特性を評価した.まずBC膜を作製するために最適なターゲットを調べるために,3種類のホウ素系粉末充填ターゲットを用いてBC膜を作製し,その構造評価及び機械的特性評価を行った.「ターゲットAにホウ素粉末を詰めたもの」をターゲットとして用いることで,窒素含有率が最大で0.75 at.%である上に平均硬さ67.1 GPa,平均ヤング率675.7 GPaと極めて高い硬さを有するBC膜が作製できることを明らかにした.

次に,従来の炭素ターゲットと第3章において決定したターゲットを用いて基板近傍にN2を導入することにより,CN膜およびBCN膜を作製し,その構造および組成を明らかにした上で,機械的特性を評価した.作製したBCN膜は膜中にC-N結合を含んでおり,N2ガス流量の増加に従ってホウ素含有率が減少し,窒素含有率が上昇することを明らかにした.また,N2の流量を大きくするにしたがって硬さが減少する傾向にあることが明らかにした.結果,「ターゲットAにホウ素粉末を詰めたもの」をターゲットとして用い,N2流量を2.0 cm3/minとすることで耐熱温度が500525°C,平均硬さ62.8 GPa,平均ヤング率697.2 GPa,μ=0.3で高耐摩耗性を有するBCN膜の得られることを明らかにした.以上のことから,フィルタードカソーディックバキュームアーク法を用いて,耐熱性に優れ,高硬さを有するBCN膜を合成できることを明らかにした.ダイヤモンドとc-BNの中間の性質を持つと期待されるBCN系材料への注目が集まりつつある.本研究では,電磁気フィルタを用いて高エネルギーのイオンを抽出することのできるFiltered Cathodic Vacuum Arc (FCVA)装置を開発し,BとCの混合ターゲットと窒素ガスを用いてBCN系膜を合成し,その構造及び組成が機械的特性にどのような影響を及ぼすかを詳細に検討した.その結果,N量が2-7at.%の場合に,比較的高硬さで,トライボロジー特性に優れ,耐酸化性を有するBCNコーティングを実現出来ることを明らかにした.最高の膜硬さは,Nを含まないBC膜で得られ,67.1GPaに達した.昨年度開発した,黒鉛と六方晶窒化ホウ素からなる原料固体ターゲットを真空アーク放電銃により蒸発・イオン化させ,3元イオンビームとして基板に照射する装置により,成膜実験を行った.500nmの比較的厚い膜を硬さ62GPaと,ダイヤモンドの60%以上を示す膜を作製出来ることを明らかにしたことは今年度の大きい成果であり,特にテクスチャ構造を利用して連続構造膜に対してどの程度作製可能な上限膜厚の向上が図れるかを検討した結果,基材や中間層など,成膜に際しての諸条件が全て等しい場合,内部応力の緩和の割合に従って作製可能な膜厚を向上させることが可能であった.この膜厚向上の効果を利用して,Si(100)基材上に連続構造膜では剥離をさせずに作製することが困難である膜厚400 nmおよび500 nmの膜を作製することができた.この厚膜化によって,膜表面の比較的柔らかい層の影響が相対的に小さくなるため,ナノインデンテーション試験による硬さ値は62 GPaを記録した.テクスチャ構造と厚さ500 nm以上の厚膜化を組み合わせることにより,どのような摺動条件下でも耐摩耗性の向上が可能となる高耐摩耗性膜の作製が可能であることが示唆された.一方,ホウ素を導入した際の硬さ減少を抑制する点は明確な課題である.以上のことから,研究はおおむね順調に進んでいると判断している.27年度が最終年度であるため、記入しない。材料工学
酸化LDL受容体(CD36)を過剰に発現する動脈硬化モデル動物の開発と応用

我々はCD36欠損症患者を見いだし、世界に先駆けてその遺伝子異常を報告してきた。また、その欠損マクロファージを用いて、酸化LDLの取り込みがコントロールに比し、約50%低下し、酸化LDLによるコレステロールエステル蓄積も低下していることを明らかにし、CD36がヒトマクロファージにおいても生理的に酸化LDL受容体として機能することを報告してきた。本研究においては、さらに、このCD36がヒト大動脈動脈硬化巣のマクロファージに発現していること、また泡沫化マクロファージにCD36の発現が強いことを明らかにし、さらに従来のスカベンジャー受容体タイプIタイプIIとその免疫組織活性の分布が異なることを明らかにした。また、in vitroにおいて、マクロファージの分化とともにCD36の発現は増強し、そのリガンドである酸化LDLのマクロファージへの添加により、CD36の蛋白質及びmRNA量が増加した。これらの結果より、動脈硬化巣においても、マクロファージがCD36を介して酸化LDLを取り込み、一層泡沫化が亢進する機構が示唆された。これらの分析に平行して、トランスジェニックマウス作成のため、まず、Chicken beta actinpromotorを用いて、コンストラクトを作成し、C57BL/6の受精卵にmicroinjectionし、50匹の産仔を得た。マウスの尾より、DNAを分離し、PCR法により、遺伝子の挿入の有無を確認したところ、8匹に遺伝子の挿入を認めた。肝臓、心筋においてmRNAの発現も認めた。しかしながら、マウス尾静脈より、採血し、単核球を分離し、CD36の発現を検討したところ、単球にCD36の有意な発現は認めず、また心筋、肝臓にも免役組織活性を認めなかった。我々はin vitro及びCD36欠損症のマクロファージの検討より、CD36が動脈硬化発症に重要である知見を得ているが、さらにヒト大動脈の動脈硬化病変においてCD36がマクロファージにおいて強く発現していることを見出した(Circulation投稿中)。また、in vitroの検討においては、CD36は酸化LDLの添加により、ヒト単球由来マクロファージにおいてその発現の増強を認めること、さらに各種サイトカインのCD36発現におよぼす影響を明らかにしている(Arteriosclerosis and Thrombosis and Vascular disease投稿中)。Transgenic mouseの研究においては、すでに50匹のマウス産子から10匹においてDNAが組み込まれていることを確認し、現在発現マウスどうしを掛け合わせている。また、単球におけるCD36の発現をマウスを殺傷せず極微量(50-100ul)の血液から分析する方法を開発した。しかし、その本トランスジエックマウスの単球における発現の程度は低く、Transgenic mouseの完成には時間を要すると思われる。この系の確立後に本transgenic mouseと交配する予定のLDLレセプター欠損マウス及びスカベンジャーレセプター欠損マウスは東京大学第三内科からすでに供与され育成中である。また、次の段階としてさらに高発現のまた、マクロファージ特異的に発現するトランスジェニックマウス作製の目的で、マクロファージ特異的に発現するプロモタ-をDr.Mahleyから供与を受ける予定である。また、その欠損マクロファージを用いて、酸化LDLの取り込みがコントロールに比し、約50%低下し、酸化LDLによるコレステロールエステル蓄積も低下していることを明らかにし、CD36がヒトマクロファージにおいても生理的に酸化DL受容体として機能することを報告してきた。本研究においては、さらに、このCD36がヒト大動脈動脈硬化巣のマクロファージに発現していること、また泡沫化マクロファージにCD36の発現が強いことを明らかにし、さらに従来のスカベンジャー受容体タイプエタケプIIとその免疫組織活性の分布が異なることを明らかにした。