hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
窒息屍内臓うっ血の成因

次に、肺以外の臓器うっ血状態の検討の結果、脾臓の含血量が減少し、肺、腎臓の含血量が増加することが明らかになった。また、^3Hアドレナリンおよび^3Hノルアドレナリンを投与し各種臓器での分布状態を検討した。その結果窒息屍脾臓の収縮にはアドレナリン関与の可能性が考えられた。窒息時の肺以外の臓器の血管短径を画像解析装置を用い測定し、脾臓中心動脈および脾柱静脈の収縮および腎小葉間静脈および皮質、髄質毛細血管の拡張が窒息時に認められた。その収縮に関与していると思われるアドレナリンの脾臓血管における局在性をオ-トラジオグラフィあるいは免疫電顕酵素抗体法をもちいて検討しアドレナリンが脾臓では脾中心動脈、脾柱静脈および脾洞内皮細胞内に、腎臓では小葉間動脈内皮細胞内に認められた。さらに窒息屍脾洞収縮のメカニズムを検討すべくその収縮能がいわれているアクチオミオシンの存在を検討した。その結果脾洞内にアクチオシンの存在は確認されなかった。アドレナリンが脾洞内皮細胞内に取り込まれたとき杆状細胞自身がその形を変化させるメカニズムを今後検討することにより窒息うっ血時の血液貯蔵臓器としての脾臓の役割を明瞭にすることがこれら窒息屍内臓うっ血の成因解明には今後必要である。腎臓に関してはアンギオテンシンIIが関与している可能性が取り込み量の増加により考えられた。
血管壁細胞ホスホリパ-ゼA_2の多様性と調節機構の解析

血管壁細胞のうち血管内皮細胞に注目し、そのホスホリパ-ゼA_2の性状と活性調節機構、及び生理現象への関わりを明らかにすることを目的とした。1)ヒト培養血管内皮細胞(HUVEC)のホスホリパ-ゼA_2活性の検出とその同定:HUVECライゼ-トを酵素源としてホスホリパ-ゼA_2活性を測定したところ、比較的弱いながらアラキドン酸含有リン脂質を選択的に加水分解する酵素活性が検出された。本酵素活性は、抗ウサギ血小板85-kDa細胞質ホスホリパ-ゼA_2特異抗体により効率よく吸収された。しかし、抗14-kDaグル-プII型ホスホリパ-ゼA_2特異抗体とは全く反応しなかった。2)細胞外グル-プII型ホスホリパ-ゼA_2のHUVECのPGI_2産生への効果:血液凝固時あるいは全身性炎症時いずれの場合も、血管内皮細胞は高濃度のII型ホスホリパ-ゼA_2に晒されて、細胞のアラキドン酸代謝への影響を受けることが予想された。そこで、HUVECについて、(1)未刺激の細胞、(2)トロンビン処理した細胞、(3)TNF処理した細胞をそれぞれ用いて、細胞外II型ホスホリパ-ゼA_2のPGI_2産生への効果を検討した。その結果、(1)酵素単独で処理した細胞は、酵素を添加していない細胞の約2倍のPGI_2を産生し、(2)トロンビン(2U/ml)存在下、細胞を10分間酵素処理したところ、相加的なPGI_2産生の亢進が観察された。更に、(3)ヒトリコンビナントTNFα(1,000U/ml)存在下酵素処理したところ、TNF単独あるいは酵素単独で添加した細胞と比べて著しく高い、相乗的なPGI_2産生が観察された。以上より、ヒト血管内皮細胞でPGI_2産生に供されるアラキドン酸は、85-kDa細胞質ホスホリパ-ゼA_2と細胞外II型ホスホリパ-ゼA_2によって産生されると予想された。後者は、他の刺激物質と協調して、血管内皮細胞のアラキドン酸代謝を調節しているものと考えられた。
多関節協調動作としての立位姿勢制御－その発育発達・加齢低下の機序に挑む－

本研究の目的は、(1)立位バランスの多関節制御の神経機構を明らかにするとともに、(2)その発育発達・加齢低下メカニズムを解明することである。健常若齢者を対象とした研究では、立位バランスの制御は多くの関節が関与する多関節動作であることが強く支持された。同時に、中枢神経系は多関節動作中に生じる力学的効果である関節間相互作用を利用した制御方略を採用していることが示唆された。また、幼児・児童および高齢者を対象とした一連の研究からは、立位バランス制御能力の発育発達や加齢低下には、関節間運動協調の構造変化を伴っていることが明らかになった。ヒト静止立位時のバランス制御という運動課題は、これまで足関節まわりに行われる単関節動作として、過度に簡略化される形で、分析・検討される事が大半であった。本研究の目的は、この運動課題を、本来の多関節動作として扱い、関節間の運動協調に着目した分析を通じて、その制御メカニズム、発育・発達に伴う習熟、加齢・疾病に伴う機能低下のプロセスを明らかにすることであった。健常成人を対象とした研究では、逆動力学の手法を用いて、関節間に生じる力学的な相互作用に対し、中枢神経系がどのように対処しているのかについて検討した。結果、足関節と股関節における正味のトルク(筋トルク、重力トルク、角速度依存トルクの総和)は、それぞれ、足関節と股関節に同程度の大きさの角加速度を生じさせている事、両関節において、足関節と股関節の正味のトルク由来の角加速度は互いに逆位相の関係にあり、互いの運動学的な影響を相殺している事が示された。これらの結果は、ヒトの中枢神経系が、多関節動作においては不可避的に生じる関節間の力学的相互作用の性質を巧みに利用する事により、立位時の身体各関節に生じる角加速度の振幅を低減している事を示唆するものである。また、成人を対象とした研究とは別に、幼児や児童を対象として、静止立位時の床反力、キネマティクス、筋活動などを測定する実験を実施した。現在は、それらのデータ分析を進めるとともに、得られた結果は随時、国内外の学会で発表、学術誌に投稿するなどしている。静止立位姿勢のバランス制御という運動課題は、足関節のみが関与する単関節動作ではなく、冗長な多関節動作である。本研究は、多関節動作に特有の運動学的・力学的な効果に主眼を置いた測定・解析を実施する事により、静止立位姿勢の神経制御の詳細を明らかにすると同時に、その発育発達、加齢低下のメカニズムに迫る事であった。本年度は、健常成人を対象とした研究を通して、静止立位時の身体重心に対しては、これまで想定されてきた足関節や股関節だけでなく、膝関節が運動学的に顕著な影響を及ぼしていることが明らかになった。また、高齢者を対象とした研究では、下肢主要三関節間にみられる運動協調パターンの乱れが、加齢にともなう姿勢制御能力低下の一因である事が明らかになった。さらに、幼児を対象とした研究では、これまで広く用いられてきた足圧中心動揺よりも、身体重心加速度を指標として用いる事により、全身の運動協調の発達過程を的確に評価し得る事が明らかになった。今年度は新たな実験や解析は実施せず、これまでの研究成果を、学会大会や原著論文として発表した。特筆すべき実績としては、幼児を対象とした研究成果がPLoSONE誌に原著論文として掲載されたことである。高齢者を対象とした研究成果に関しては、Society for Neuroscience(北米神経科学学会)の学会大会「Neuroscience2015」において発表をし、海外の研究者らとその内容について意見交換を行った。後者は、現在、原著論文として出版するための原稿を準備中である。研究代表者が年度頭に研究機関を異動した。新たな研究環境を構築するのに多くの時間と労力を要し、本研究課題に十分なエフォートを充てることができなかったためである。研究期間最終年度には、健常若齢者を対象として、安静立位バランスの制御方略に見られる個人差と、それを適切に評価するための方法について検討を行った。その結果、身体における複数の関節間に見られる運動学的(キネマティック)な協調パターンは身体機械力学系の特性によって一意に決まってしまうため、評価指標としては適切ではないこと、力学的(キネティック)な協調パターンによって評価すべきであることが明らかとなった。この研究成果はSociety for Neuroscience(北米神経科学学会)の学会大会「Neuroscience 2016」において発表を行った。研究期間全体としては、加齢にともなう安静立位姿勢動揺の振幅増大が関節間の運動協調性の低下によってもたらされることを明らかにするとともに、安静立位時の関節間運動協調性を適切に評価するための手法を探索した。

また、本研究課題のもう一つのテーマである「発育発達」に関しては、幼児期・学童期においては、発育発達とともに関節間の運動協調性が最適化される可能性があることを明らかにするとともに、上記協調性を簡便に評価するための測定・分析手法について検討を行い、その妥当性を検証した。これらの研究成果は、立位姿勢制御能力の発育発達・加齢低下のメカニズムの一端を明らかにするものであると同時に、その適切な評価方法を確立するための手掛かりとなるものである。研究成果の一部は既に原著論文として出版されており、今後は残りの研究成果を早急に原著論文化していく。昨年度までは、成人を対象とした研究に関してのみ成果がみられたが、今年度は幼児や高齢者を対象とした研究に関しても顕著な成果がみられた。また、今年度は、成人を対象とした研究成果が、Gait and Posture誌に原著論文として掲載された。今年度は本研究課題に関して得られた研究成果を、原著論文として出版することに注力する計画である。神経生理学幼児や高齢者を対象とした実験を継続するとともに、これまでに得られた研究成果を、順次原著論文にまとめていく計画である。健常成人を対象とした研究では、関節間運動協調に関する未知のメカニズムを明らかにする事ができた。この結果を原著論文としてまとめ、論文はJournal of Neurophysiology誌に掲載された。研究代表者が当該年度の初頭に研究機関を異動し、研究計画に大幅な遅れが生じたためである。研究代表者の異動の関係で研究計画に大幅な変更が生じ、研究機材の購入を先送りにしたため。既に取得したデータの解析、データの保存や、学会での成果発表、原著論文の出版のために使用する計画である。立位姿勢制御能力の発達を知るためには、幅広い年齢層を対象とした測定を実施する必要がある。現在分析を進めているデータは、保育園児を対象としたものであるが、今後は、小・中学生にまで分析の対象を拡大する必要がある。また、来年度以降は、高齢者や障害者を対象とした実験にも着手する計画である。購入を予定していた研究機材は、必要に応じて来年度に購入する計画である。研究の実施順序に変更が生じたため、当初、初年度に購入を予定していた機材を購入しなかったため。上記の機材は、研究期間の二年目以降に購入する予定である。
色素増感太陽電池の高効率化を目指した７員環構造を基盤とする機能性増感色素の開発

次世代太陽電池として注目されている色素増感太陽電池の実用化に向けて、エネルギー変換効率の向上が望まれている。この目的を達成するために、7員環構造を増感色素分子の構造中に導入することで、励起色素から酸化チタン電極への電子注入性を上げることができる、新しい色素分子の開発を行った。増感色素中に7員環構造を持つトロポロンを導入した分子では、その構造異性体である6員環構造を有する安息香酸誘導体にくらべ、短絡電流密度が著しく向上し、エネルギー変換効率は7倍に向上した。色素増感太陽電池は、製造コストに優れることから次世代太陽電池として期待されている。しかしながら、現状の光電変換効率は期待される値の1/3程度しか達成されておらず、さらなる高効率化が望まれている。色素増感太陽電池の発電プロセスは増感色素が太陽光により励起され分子内で電荷分離状態を作り電極材料に電子を注入することから始まる。そこで本研究では、これまで検討されてこなかった電荷分離構造と電極材料への電子注入の効率を向上させる増感色素による光電変換効率向上の検討を行い増感色素の新しい設計指針を見出すことを目的としている。本研究では、以下に述べる2つのアプローチによって光電変換効率向上のための増感色素の設計指針を見出す計画である。(1)増感色素中に電荷分離構造を導入し増感色素の物性と光電効率変換効率の評価。(2)酸化チタンへのリンカーとしてトロポロンリンカーの特性評価。本年度は、上記(1)及び(2)の材料設計を量子化学計算を用いて行い並行して物質合成を重点的に行った。また、量子化学計算は、Gaussian 09を用いた。設計したDonor-π-Acceptor(D-π-A)型分子の基底状態の構造最適化とTD-DFTによる励起状態計算を200種以上行い、材料のHOMOーLUMO準位、吸収波長、遷移モーメントのデータから合成ターゲットを決定した。色素分子のアクセプター部分に7員環骨格のトロポン骨格を導入した材料の合成と合わせて7員環導入の効果を検証するために、並行して類似した6員環化合物としてベンゼン誘導体、5員環化合物としてチオフェン誘導体の合成も行った。本年度の計画は、材料設計と合成が主であり、計画は、おおむね順調に進行している。本研究では、これまで検討されてこなかった電荷分離構造と電極材料への電子注入の効率を向上させる増感色素による光電変換効率向上の検討を行い増感色素の新しい設計指針を見出すことを目的としている。本年度は、昨年度に続き、上記(1)及び(2)の要件をもとに量子化学計算によって設計された材料の合成を行った。また本年度は、合成した増感色素材料を用いた太陽電池を作成しその特性評価を行った。検討結果の中で、一般的な増感色素で標準的に用いられるカルボキシル基をリンカーに持つ安息香酸誘導体に対し、その構造異性体であるトロポロンリンカーを用いた増感色素では、短絡電流密度が著しく向上し、その結果、エネルギー変換効率は7倍に向上する結果が得られた。また、比較化合物として合成したサリチルアルデヒドリンカーでも安息香酸誘導体に対して短絡電流密度が上昇しエネルギー変換効率も2から3倍に向上する結果が得られた。これらの結果から、色素増感太陽電池の高効率化のための増感色素の設計指針を得ることができた。平成24年度は、材料設計と材料合成を重点的に行う計画であり、研究計画は、おおむね順調に進行している。初めに、これまでに太陽電池デバイスとして評価されている増感色素分子と、新規にデザインした分子に関してGaussian 09を用いた量子化学計算を行った。TD-DFTによる励起状態計算を200種以上行い、材料のHOMOーLUMO準位、吸収波長、遷移モーメントのデータから合成ターゲットを決定した。また、分子設計自由度の高いDonor-π-Acceptor(D-π-A)型分子を基本材料として増感色素中に7員環構造を含む分子と、検証用の比較化合物を設計し合成を進めた結果、評価用の色素合成は、ほぼ完了している。

また、合成された化合物に関しては、溶液中での可視紫外吸収スペクトルとサイクリックボルタンメトリーによる酸化電位を測定し、色素材料の吸収波長、バンドギャップ、HOMOーLUMO準位を見積もった。また、これら結果を計算値との比較検討を行ったところ、絶対値は一致していないが傾向と序列は一致していることが確認できた。今後は、この差分を加味することで、より精度の高い分子設計を行えると期待できる。24年度に合成したD-π-A)型分子の合成と物性に関して日本化学会第93回春季年会にて報告(ポスター1件)を行った。また、酸化チタンへのリンカーとしてのトロポロンを導入する分子に関しても分子設計を完了し、合成を進めている。これまでのところ材料合成はおおむね順調であると考えている。25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度は材料合成に加え合成された色素に関して太陽電池特性の評価も推進していく。太陽電池の作成及び評価方法、評価設備に関しては同所属の研究協力者の協力の基、遂行していく。初めに、研究協力者のもとで、既存材料を用いた太陽電池素子を作成、評価し安定した素子作成技術を確立したのちに、本研究の合成材料に関して評価を行う計画である。また、材料評価と並行して、新しいリンカーとして7員環構造を持つトロポロンを含む増感色素の合成を行う。トロポロンは配位能を有する含7員環化合物であり、7員環構造から電子を配位金属側に押し出す効果が期待されるため、電子の注入効率が高い新しい機能を有するリンカーとして期待できる。7員環構造導入の効果を検証するために、並行して類似した6員環化合物を合成し、物性の比較を行う。類似した6員環化合物としては、トロポロンの構造異性体である、安息香酸、サリチルアルデヒドについて並行して合成を行う。現在報告されている酸化チタンへのリンカーのほとんどがカルボキシル基であり、トロポロンやサリチルアルデヒドのようなこれまでにないリンカーの太陽電池特性への影響を検証することで、リンカーユニットの新しい分子設計指針がえられると期待でしている。これらの酸化チタンへのリンカーとしての評価も、材料物性、量子化学計算の結果、太陽電池特性を総合して評価を行っていく予定である。また、上記検討によって得られた結果を考察、評価し、外部発表を行っていく予定である。
腫瘍拒絶抗原の生化学的解析と癌化における役割

われわれはこれまでに、マウス白血病RL♂1細胞の腫瘍特異的細胞傷害性T細胞の標的抗原分子は、PI3キナーゼを介したシグナル伝達に深く関与しているプロト癌遺伝子産物Aktの変化したものであることを明らかにした。腫瘍細胞におけるAkt分子の発現量、及び、細胞内局在などの生化学的な解析を行い、悪性形質発現における役割について検討した。1、Akt分子の変化、発現量、及び、細胞内局在などの生化学的な解析(1)合成ペプチドを家兎に免疫して抗体を作成した。(2)ウエスタンブロットによる解析の結果、RL♂1細胞からは正常細胞に検出される56KのAkt蛋白以外に、59Kの蛋白(RL-Akt)が正常Aktに比べて数十倍強発現されていることが判明した。(3)RL-Akt蛋白は細胞質および細胞膜分画にウエスタンブロットで検出され、細胞質および膜に存在することが判明した。2、抗原遺伝子RL-AktをNIH3T3細胞にトランスフェクトし、形質の変化を調べた結果、(2)RL♂1細胞およびトランスフェクタントにおいて血清要求度が低いことが判明した。(3)トランスフェクタントでのRL-Akt蛋白は、RL♂1細胞同様細胞質および膜に存在することが確認された。(1)RL♂1細胞よりRL-Akt抗原欠失株,中等度発現株および強発現株を樹立した。(2)樹立した各腫瘍細胞株を、BALB/cマウス側背部に摂種し腫瘍の増殖速度を調べた結果、RL-Akt抗原量に比例した増殖が認められた。4、各腫瘍細胞でのAtk分子の解析(ウエスタンブロット法)これまでに調べたマウス白血病、ミエローマ、メラノーマ、肥満細胞腫、および正常組織でAkt分子の変化は認められなかった。以上の結果より、RL-Aktの過剰発現および膜への局在は、PDGFレセプター→PI3キナーゼ→Akt→の経路での効果的なシグナル伝達をもたらし、in vitroでのRL♂1細胞の血清低要求性およびin vivoでの増殖性などの悪性形質発現に大きく関与していることを示唆している。今後、免疫系の反応との関係を検討する予定である。われわれはこれまでに、マウス白血病RL♂1細胞の腫瘍特異的CTLの標的抗原の由来蛋白はAkt分子であることを明らかにした。Akt蛋白はPI3キナーゼを介したシグナル伝達に関与しているが、RL♂1細胞の腫瘍抗原として発現したAkt分子の変化、発現量、及び、細胞内局在などの生化学的な解析を行い、悪性形質発現における役割について検討する。1、Akt分子の変化、発現量、及び、細胞内局在などの生化学的な解析を行うために、(1)合成ペプチドをKLHをキャリヤ-とし、家兎を免疫して、ウエスタンブロットおよび免疫沈降可能な抗体を作成した。(2)得られた抗体を用いたウエスタンブロット法による解析の結果、RL♂1細胞からは正常胸腺細胞に検出される56KのAkt蛋白以外に、遺伝子解析より推定された分子量と一致する59Kの蛋白(RL-Akt)が検出された。また、RL-Akt蛋白は正常Aktに比べて、蛋白レベルで数十倍多く発現されていることが判明した。

(3)RL-Akt蛋白は細胞質分画および細胞膜分画各々にウエスタンブロットで検出され、細胞質および膜に存在することが判明した。2、抗原遺伝子RL-AktをNIH3T3細胞にトランスフェクトし、形質の変化を調べた結果、(2)RL♂1細胞は1%血清濃度下で増殖がみられ、血清要求度が低いが、トランスフェクタントにおいても、同様に血清要求度が低いことが判明した。以上の結果より、RL-Aktの過剰発現および膜への局在は、PDGFレセプター→PI3キナーゼ→Akt→---の経路での効果的なシグナル伝達をもたらし、RL♂1細胞の血清低要求性などの悪性形質発現に大きく関与していることを示唆している。われわれはこれまでに、マウス白血病RL♂1細胞の腫瘍特異的細胞障害性T細胞の標的抗原分子は、P13キナーゼを介したシグナル伝達に深く関与しているプロト癌遺伝子産物Aktの変化したものであることを明らかにした。腫瘍細胞におけるAkt分子の発現量、及び、細胞内局在などの生化学的な解析を行い、悪性形質発現における役割について検討した。1、Akt分子の変化、発現量、及び細胞内局在などの生化学的な解析(1)合成ペプチドを家兎に免疫して抗体を作成した。(3)RL-Akt蛋白は細胞質および細胞膜分画にウエスタンプロットで検出され、細胞質および膜に存在することが判明した。2、抗原遺伝子RL-AktをNIH3T3細胞にトランスフェクトし、形質の変化を調べた結果、(2)RL♂細胞およびトランスフェクタントにおいて血清要求度が低いことが判明した。(3)トランスフェクタントでのRL-Akt蛋白は、RL♂1細胞同様細胞質および膜存在することが確認された。(1)RL♂1細胞よりRL-Akt抗原欠失株、中等度発現株および強発現株を樹立した。(2)樹立した各腫瘍細胞株を、BALB/cマウス側背部に摂種し腫瘍の増殖速度を調べた結果、RL-Akt抗原量に比例した増殖が認められた。4、各腫瘍細胞でのAkt分子の解析(ウエスタンブロット法)これまでに調べたマウス白血病、ミエローマ、メラノーマ、肥満細胞腫、および正常組織でAkt分子の変化は認められなかった。以上の結果より、RL-Aktの過剰発現および膜への局在は、PDGFレセプター→P13キナーゼ→Akt→の経路での効果的なシグナル伝達をもたらし、in vitroでのRL♂1細胞の血清低要求性およびin vivoでの増殖性などの悪性形質発現に大きく関与していることを示唆している。今後、免疫系の反応との関係を検討する予定である。
ナノ多孔質遷移金属の開発と3次元構造解析

Pd基金属ガラスから電気化学脱成分腐食法により多孔質Pdを合成した。多孔質Pdの形状は脱成分腐食法の条件と母体のPd合金の混合率によって調整出来た。そして作製したPd多孔質の主な形状を断面から捉え、孔の深さや大きさ、母層の厚さなどの表面形状を走査電子顕微鏡や電子顕微鏡により測定した。また、ナノ多孔質金の形成メカニズムについて系統的に研究を行い、腐食温度と時間を制御することで、5nmから30nmまで孔サイズを制御できることがわかった。系統的な研究から、孔サイズの粗大化メカニズムは、金の表面拡散が支配因子であることを明らかにした。ラマン増強散乱特性は、金節サイズが小さくなるにしたがって改善され、10-7.mol/Lの希薄なロンダミン6G高分子を検出することに成功した。表面増強ラマン散乱特性はナノ多孔質金の破面上によっても得られることがわかり、5nmの曲率半径を持つ先端部での電磁場が有効な因子であることがわかった。ナノ多孔質金の表面に無電解析出法によりAgの1-2nmの均一の厚さで電着することに成功し、表面増強ラマン散乱特性を改善することに成功した。銀の膜厚は反応時間によって制御でき、光学特性について系統的に調査を行った。ナノ多孔質金の、ランダムな3次元構造の特徴を与える一周期長さ(Characteristic length scale)の簡便な測定法について、走査電子顕微鏡や電子顕微鏡をもちいるフーリエ変換法を応用する方法を考案した。・厚さ約100nmのナノポーラス構造は,定量電子線トモグラフィーにより3次元的に開口であり,連続体となっていることがわかった.形態とナノ孔と金の梁のサイズは統計的に同一である.硝酸中でのエッチング条件を変化させ,作製された孔サイズと種々の温度における腐食時間の関係を求めた.この結果、孔サイズは腐食時間と温度があがるにつれ単調に増加し,この増加傾向は温度に著しく依存していることがわかった.よってエッチング時間と温度を厳密に調整する事で多孔質金の孔のサイズを微調整する事が可能である事が本研究からわかり,孔サイズを100nmから5nmの範囲で調整する事に成功した.・作製した各サイズのナノ多孔質金上に赤色蛍光着色料(rhodamin 6G)を吸着させ,ラマン分光法により観測した.すると孔のサイズが小さくなるのに比例してラマンピークが増加するのが確認出来た.即ちこれは孔のサイズが小さくなるほど表面曲率と孔の数が増加し,それに伴い高分子の吸着サイトの増加,さらにラマン散乱光が増幅される為だと考えられる.加えて,ナノサイズの孔と金の梁の減少が,隣り合う金の梁同士の間に電磁気場の交差を引き起こし,ラマン散乱の効果に寄与している事も要因だと言える.さらに吸着物質に対する感度を調べる為に,異なる濃度の赤色蛍光着色料溶液中に多孔質金を浸した.その結果ナノ多孔質の孔の直径が5nm程度まで小さくなると,着色料の検知濃度が5x10^<-10> mol/Lまで上昇する事が確認出来た.これは今までに知られている全ての金基板よりも単一分子の検知能力が優れている事を意味する.Pd基金属ガラスから電気化学脱成分腐食法により多孔質Pdを合成した。
薬剤排出トランスポーターの分子・原子構造と作動機構

院内感染の主要起因菌である緑膿菌は3成分から成る薬剤排出トランスポーターを発現する事によって多剤耐性となる。そこでこのトランスポーターの性質を明らかとすべく次のような研究を行った。(i)MexAB-OprMトランスポーターサブユニットの結晶構造解析:MexA,MexB,OprMを各々に結晶化し、その構造解析を行った。MexAは細長い蛋白質で主として4個のドメイインから成っており、OprMとMexBを連結する構造である事が明らかとなった。OprMは外膜を貫通し、ペリプラズムに大きく突出した構造を有しており中には大きな空洞が存在した。しかしその外膜側の端は極度に狭く、またペリプラズム側の先端は完全に閉塞状態でありこの空洞を抗生物質が透過する事は可能でないと解釈した。(ii)トランスポーターの基質認識部位:3成分トランスポーターの基質認識部位を、βラクタムを選択するMexBとアミノグリコシドを認識するMexYのキメラ蛋白を構築し特定化した。その結果基質は膜貫通ドメインではなくペリプラズムドメインで認識される事が明らかとなった。(iii)MexAB-OprM及びMexXYトランスポーターの発現調節:各々の発現調節因子MexR及びMexZを精製し各々のオペレーター・プロモーターDNAとの結合実験を行った結果、各々のオペロンの発現調節の機序が明らかとなった。(iv)3成分トランスポーターのアッセンブリー機序:3成分のうち一つのサブユニットのみを標識し、他の2成分を釣り上げる方法により3成分が細胞膜内で相互に結合している事を確認した。またMexAとOprMの相互作用部位は各々のαヘリックス部位である事を遺伝的な実験により証明した。(v)MexB及びMexYの大量発現系の構築:これらのトランスポーターの大量発現は菌にとって致死的である。そこでこれらに種々の遺伝的操作を加え、また発現に用いる宿主を選ぶ事によって野生株に較べ50-100倍の発現を可能とした。その他の研究結果も含め多くの成果を得る事ができた。緑膿菌はMexAB-OprM排出トランスポーターを発現することによって複数の構造的に関係の薄い抗菌物質に耐性となる。このポンプサブユニットのうちMexBがポンプの本体であろうと考えられており、このサブユニットが抗生物質を選択し、これをエネルギー依存的に排出をしているものと考えられている。先に我々はこのMexB蛋白の膜トポロジーを決定したところ、このトランスポーターは膜を12回貫通する型のポリトピックトランスポーターであることを決定した。更に膜貫通部分(TMS)に5個の荷電を有するアミノ酸を有することから、これらはプロトンの通り道、もしくは抗菌物質の通り道を形成しているものと想定した。今年度はこの膜貫通領域に存在する荷電を有するアミノ酸残基の役割を明らかとする実験を行った。先ずTMS-7に存在するD407をD407K,D407A,D407Nに置換したところポンプは全く機能しなくなった。D407Eの変異体は野生株の約20%の活性を保持した。従ってこの残基はAspであることが必須であった。D408もD407と同様負の荷電を中性もしくは正の荷電に変異させると全く機能しなくなった。しかしD408Eは約80%の機能を保持した。

従ってD408には負の荷電が存在しなければならないがAspであることは必須ではない。TMS-10に存在するK939についても中性もしくは負のアミノ酸では機能せず、正の荷電を有するK939Rの変異でのみ100%の機能を保持した。TMS-2に存在するK342及びE346は共に中性のアミノ酸、逆の荷電を有するアミノ酸もしくは同じ荷電を有するアミノ酸に変換しても正常に機能した。これらの結果を総合すると、D407,D408及びK939はプロトンの透過経路を形成しているものと解釈できた。この他にも二重、三重変異体の解析結果からもこの結論は支持された。異物・抗生物質などを細胞外に排出するトランスポーターが日和感染起因菌で発現されると、菌は抗生物質に対し多剤耐性を示す様になる。そこで本研究ではこの様なトランスポーターの構造と機能を中心に研究を行った。(i)構造の解析に関してはポンプのMexA及びMexBサブユニットを結晶化しX線回析を行った。OprMに関しては結晶をSpring8の放射光施設で回析したところ結晶はrhombohedral型R32に属し、単位格子a=b=94.63Å、c=1040.19Åであった。現在重金属置換体を調成して回析を行っているところであるが、解像度はすでに2.6Å内となっている。(ii)MexBサブユニットの膜貫通領域(TMS)-4とTMS-10が近位にありエネルギー変換に重要な役割をしていることを明らかとしてきた。そこで今回はTMS-4にポンプ機能を失活させる様な変異を導入し、これから機能復帰変異株を分離したところ、2番目の変異はTMS-4に見出された。(iii)MexEF-OprMポンプをモデルとしてポンプの集合体形成の実験を行った。その結果ポンプのアセンブリーには内膜貫通蛋白であるMexFの発現が必須である。MexFが欠損もしくは変異によって機能しなくなると外膜成分であるOprNが分解されること、そしてOprNの正常な発現には機能するMexFの存在下にMexEが部分加水分離されることが必須であることが明らかとなった。(iv)薬剤排出ポンプとDNA-gyraseの変異が重なると、緑膿菌のキノロン剤耐性が高度となることなどを明らかとした。院内感染起因菌である緑膿菌は異物・薬物トランスポーターで抗生物質などを細胞外に排出する事によって多剤耐性を獲得する。本研究ではこのトランスポーターをナノマシーンとして捉え今年度は次の様な実験を行い成果を得た。(i)異物・薬物トランスポーターの基質認識ドメインの同定トランスポーターMexB及びMexYは各々に選択的にβ-ラクタム剤及びアミノグリコシドを輸送する事が知られている。そこでMexBとMexYのどのドメインが基質を認識し輸送しているのかを明らかとするため、先ずMexBの膜外ドメインとMexYのそれとを取替える実験を行った。その結果膜外ドメイン(MexB)-膜貫通ドメイン(MexY)の雑種蛋白はβ-ラクタムを選択したけれどもアミノグリコシドは輸送しなかった。この事実はこの種のトランスポーターでは細胞質膜から外側に大きく突出したドメインが基質を認識し輸送する事が明らかとなった。この結果は今日までの能動輸送の常識を覆す結果となった。(ii)
不動産リース取引の測定に関する実証的研究

本研究では、借手の観点から不動産リース取引について測定方法の検討を行い,その取引の経済的実質を明らかにし,会計理論上,その妥当な測定方法を提案することを目的の1つとしている.検討の結果,まず不動産リース取引が解約不能であるか否かで区別し、解約不能なリース取引であれば、リース期間の全キャッシュフローが確定し、各期のリース料の金銭債権・金銭債務が確定するので、借地権とリース料の現在価値との合計額を資産化・負債化すべきである。調査結果を見ると、ほとんど全ての企業が、そのリース取引はオペレーティング・リース取引であるので、リース料を全額費用計上しているが、この会計処理方法は妥当ではない。本年度は、次年度以降の実証的研究のための基礎研究として、規範理論に基づく研究を行った。2015年度において、国際会計基準審議会(IASB)と米国財務会計基準審議会(FASB)が新たなリース会計基準に関する再審議を終え、2015年後半に新たなリース会計基準が公表される見込みであったため、それを十分に検討してからでないと仮説の設定、及びアンケート調査票の作成ができなかったため、会社訪問や調査票の作成などは来年度以降に取りかかることとした。それらの作業ができない代わりに、本年度は、研究方法論なども含めて、リース取引、関連する基礎概念、会計理論、法人税法に至るまで、入念な文献研究を行った。実証研究の成否はアンケート調査票の出来不出来に大きく左右されるため入念な準備が必要であるからである。文献研究を通して、特に、近年取り扱っていなかった法人税法における借地権は、思っていた以上に内容的に奥が深く、今後さらなる検討が必要であることが判明したのは大きな収穫であった。なお、国際会計基準審議会(IASB)が公表した。IFRS第16号「リース」においては、今までと異なり、リース取引の借手は、ほとんどすべてのリース取引におけるリース財産を資産として貸借対照表に認識することになる。この改正の中心となるのは、ファイナンス・リース取引のうち解約不能条件を満たすが、フルペイアウト条件を満たさない、いわゆる解約不能のオペレーティング・リース取引である。この取引は国際会計基準、米国基準および日本基準においても規定が整備されていない分野であったが、国際会計基準において、ようやく基準が整備されたので、それとの検討が不可欠である。以上でも既に述べているが、2015年度において、国際会計基準審議会(IASB)と米国財務会計基準審議会(FASB)が新たなリース会計基準に関する再審議を終え、2015年後半に新たなリース会計基準が公表される見込みであったため、それを十分に検討してからでないと仮説の設定、及びアンケート調査票の作成ができなかったため、会社訪問や調査票の作成などは来年度以降に取りかかることとし、本年度は、研究方法論なども含めて、リース取引、関連する基礎概念、会計理論、法人税法に至るまで、入念な文献研究を行った。実証研究の成否はアンケート調査票の出来不出来に大きく左右されるため入念な準備が必要である。したがって、アンケート調査票こそ完成していないが、様々な文献研究をできたことはとても有意義であったと思う。少し心配しているのは、米国財務会計基準審議会(FASB)は、まだリース取引に関する新会計基準を公表していない点である。国際会計基準審議会(IASB)と米国財務会計基準審議会(FASB)は、現行のリース会計基準の財務報告上の問題点を改善するために、共同して検討を行い、2016年1月13日に国際会計基準審議会(IASB)がIFRS第16号「リース」を公表した。これにおいては、今までと異なり、リース取引の借手は、ほとんどすべてのリース取引におけるリース財産を資産として貸借対照表に認識することになる。この取引は国際会計基準、米国基準および日本基準においても規定が整備されていない分野であったが、国際会計基準及び米国基準において、ようやく基準が整備された。日本においては、既に2010年に公開草案「リース」が公表されており、IFRS第16号「リース」の公表に続き、新たなリース会計基準がすぐに公表されると思われたが、2016年度中に公表されることは無かった。アンケート調査は簡単にできることではないので、新たな日本のリース会計基準の発表までアンケート調査を延期した。また、それを十分に検討してからでないと仮説の設定、及びアンケート調査票の作成ができないからである。それらの作業ができない代わりに、本年度は、研究方法論なども含めて、リース取引、関連する基礎概念、会計理論、法人税法に至るまで、入念な文献研究などを行った。実証研究の成否はアンケート調査票の出来不出来に大きく左右されるからである。文献研究などを通して、特に、借地権は、底地権との交換の圧縮記帳の対象となることがあり、このことから派生して、圧縮記帳について深く検討できたことは大きな収穫であった。以上でも既に述べているが、2016年1月13日に国際会計基準審議会(IASB)がIFRS第16号「リース」を公表した。これを受けて、すでに2010年に公開草案「リース」が公表されているため、日本において、新たなリース会計基準がすぐに公表されると思われたが、2016年度中に公表されることは無かった。それを十分に検討してからでないと仮説の設定、及びアンケート調査票の作成ができなかったため、アンケート調査は来年度に行うこととした。

本年度は、研究方法論なども含めて、リース取引、関連する基礎概念、会計理論、法人税法に至るまで、入念な文献研究などを行った。実証研究の成否はアンケート調査法の出来不出来に大きく左右されるため入念な準備が必要である。したがって、様々な文献研究などを行い、交換の圧縮記帳も関連して検討できたことは有意義であったと思う。少し心配しているのは、日本のリース会計基準が、本年度早々に公開されないようであれば、日本の新リース会計基準は盛り込まないでアンケート設計をしなければならない点である。アンケート調査に関しては、当初、すべてを自分で行う予定であったが、野村総研を利用することとした。これにより、迅速なアンケート調査票の発送、回収、統計処理ができるようになるため、遅れを取り戻すことができるものと思われる。不動産リース取引の貸手である全リース会社(250社)と借手である一般企業(約250社)に対して質問調査票を送付し、不動産リース取引の実態、および新リース会計基準の運用状況、すなわちリース取引の測定方法に関してアンケート調査を行った。その結果からそれらを実証的に検証し、今までの規範理論の研究と合わせて、不動産リース取引を研究対象として,わが国における不動産リース取引の会計実務の特性を明らかにする。サンプリング方法については、民間企業が保有する企業データベースから、借地権取引を行っている一般企業250社を抽出し調査対象とした。調査手法は、郵送調査を選択した。借地権取引は、「権利金を支払い通常の地代を払う取引」と「権利金を支払わず相当の地代をリース期間にわたって支払う取引」とに分類される。理論的には、まず不動産リース取引が解約不能であるか否かで区別し、解約不能なリース取引であれば、リース期間の全キャッシュフローが確定し、各期のリース料の金銭債権・金銭債務が確定するので、借地権とリース料の現在価値との合計額を資産化・負債化すべきである。ただし、相当の地代を支払う場合には、金利水準に比べてあまりにも年率が高額であるため、リース料のうち資産化するのは、リース期間における各期の正常なリース料部分のみにすべきであることを提案する。問1と問9のクロス集計の結果を見ると、制度会計に従いほとんど全ての企業が「オペレーティング・リース取引であるとして、リース料を全額費用計上している。」となっており、「借地権と正常なリース料部分のみの現在価値との合計額を資産化・負債化している」という企業は1社のみだった。この前者の会計処理方法は理論的には妥当ではなく、企業の経済活動を適切に会計処理上に写像できておらず、今後、制度会計上、検討の余地があることを指摘する。本研究では、借手の観点から不動産リース取引について測定方法の検討を行い,その取引の経済的実質を明らかにし,会計理論上,その妥当な測定方法を提案することを目的の1つとしている.検討の結果,まず不動産リース取引が解約不能であるか否かで区別し、解約不能なリース取引であれば、リース期間の全キャッシュフローが確定し、各期のリース料の金銭債権・金銭債務が確定するので、借地権とリース料の現在価値との合計額を資産化・負債化すべきである。
光信号入力に基づき制御可能なDNA情報処理機構の開発

本研究では,DNA情報をその場で処理するナノ演算装置の構築をめざし,光信号入力により制御可能なDNA情報処理機構について検討した.DNAで作製した構造体により情報を符号化し,光信号に従って動作させる光DNA反応系を設計し,その基本動作を確認した.また,演算用DNAおよび入力用DNAを含む微小な液滴を光学的に操作することにより,空間局所的に論理演算を実行できることを示した.本研究では,DNA情報をその場で処理するナノ演算装置の構築をめざし,光信号入力により制御可能なDNA情報処理機構について検討した.DNAで作製した構造体により情報を符号化し,光信号に従って動作させる光DNA反応系を設計し,その基本動作を確認した.また,演算用DNAおよび入力用DNAを含む微小な液滴を光学的に操作することにより,空間局所的に論理演算を実行できることを示した.本研究では,光の並列性,制御性,プログラム可能性とDNAの多様性,自律性,微小性を利用した新しい情報技術の創出をめざし,光によるステップ動作が可能なDNA操作ユニットを実現し,これらを相互接続した光DNA演算技術を開発することを目的とする.本年度は,光DNA演算の基盤となる光DNA操作ユニットの設計と実証を行なった.具体的な成果は以下のとおりである.1.光によるDNA制御技術を洗練し,光DNA操作ユニット構築に必要な性能を得るため,開発中の光駆動型DNAナノマシン(光DNAピンセット)を対象として照射光波長や温度条件等について検討した.その結果,ナノマシンの駆動時間間隔をそれまでの1/10に短縮し,駆動効率を数%向上できた.2.光DNA操作ユニットとして,特定のDNAを入力とし光信号に従って最終構造が変化する光DNA反応系について検討した.反応系にはヘアピンDNAを採用し,その開閉構造によって内部情報を符号化するとともに,アゾベンゼン導入DNAを用いて光入力機構を実現する.2値の入力光信号(紫外光,可視光)に対し2種類の最終構造(開状態,閉状態)をとる任意の反応径路を実現する4種類の光DNA反応系を設計することができた.3.設計した反応系に対する実証実験を行なった.ヘアピンDNA,アゾベンゼン導入DNA,入力DNA等を混合した溶液に対し,紫外光または可視光を照射したあと電気泳動により最終構造の変化を観察したところ, 4つの反応系で意図した構造が得られることを確認した.これは,光信号に依存してDNA反応径路を切り換えられることを示しており,光DNA操作ユニットを実現するための重要な機能であるばかりでなく,光とDNAを用いた計算に広く応用できる点で意義は大きい.ただし,一部の反応系では反応効率が低く,反応系の修正が課題として残った.本研究では,光の並列性,制御性,プログラム可能性とDNAの多様性,自律性,微小性を利用した新しい情報技術の創出をめざし,光によるステップ動作が可能なDNA操作ユニットを実現し,これらを相互接続した光DNA演算技術を開発することを目的とする.本年度は,光DNA反応系の拡張を行なった.また,DNAを用いた論理演算を空間展開光により実行した.具体的な成果は以下のとおりである.1.前年度に構築したヘアピンDNAによる光DNA操作ユニットを拡張し,DNA格子構造における位置情報を用いたオートマトンを考案した.DNA格子構造に2つ1組のヘアピンDNAを導入しそれらの開閉を操作することにより,内部状態を符号化したDNAの位置を制御できること,および,その情報が次段の反応系に伝達されることを確認した.2.光DNA情報処理系を生体制御に適用することを想定し,しきい値特性をもつDNA変換系を設計した.しきい値設定用のDNA量を変化することにより,DNA変換のしきい値をシフトできることを確認した.この特性は,光DNA演算系を環境変化に対して安定に動作させるために重要である.3.光DNA操作ユニットを局所的かつ並列に動作するための手法として,DNA溶液を含む液滴の光操作によるDNA位置・反応制御技術を開発した.DNA溶液滴を結合することにより溶液が混合し,異なる反応を並列かつ局所的に誘起できることを確認した.また,液滴を利用したときには一般の反応チューブで行なう場合と比較して,10倍以上反応が高速に進むことを明らかにした.さらに,液滴による反応法を,DNAを用いたAND・OR演算系に適用し,適切にDNA論理演算が行なえることを実証した.これらの成果により,光信号入力に基づき制御可能なDNA情報処理機構の基盤技術を得ることができた.
食べる意欲に欠かせない風味認識の中枢神経機構の解明

日本は65歳以上の高齢者が総人口の25%を超える超高齢社会である。社会の高齢化が進むにつれ、脳神経障害を基礎疾患に持ち、摂食嚥下障害を有する患者が増加している。一方、"口から食べて満足感を得たい"という本人の希望はもとより、それを叶えてあげたいという家族の要望は根強く存在している。食に関する"満足感"の源は「おいしさ」を感じることであり、味覚および嗅覚情報の統合が深く関わると考えられている。しかし根拠の多くは食行動の観点からの報告であり、中枢神経機構に関するものは充分ではない。そこで本研究は、時間-空間解像度が高いという利点をもつ光学計測法を用い、味およびニオイ刺激に対する応答を指標にして、それらを統合する領域と考えられる島皮質および梨状皮質における化学感覚の情報処理機構を明らかにすることを目的とした。初年度には、全身麻酔を施したマウスの全脳動物標本に味およびニオイを呈示し、大脳皮質におけるフラビン蛋白の蛍光変化を測定することが可能となった。しかしながら当初、ニオイに対する皮質の応答強度と比較し、味に対する皮質応答は弱く、これらを同時に呈示した場合の応答変化を測定および判定できるか懸念があった。そのため次年度は主に、味およびニオイの呈示を同一個体に同時に行ったときの大脳皮質応答を計測するための至適条件を模索することと、同時に呈示した場合の応答計測を並行して行った。本研究成果の一部は、学術大会で発表した。今後はフラビン蛋白応答の計測例数を増やし解析を進めるとともに、応答記録の時間解像度を上げるために、膜電位感受性色素を用いた研究に移行したいと考えている。初年度の研究計画目標は、第一に、同一個体において、味およびニオイの単独呈示に対する大脳皮質応答を確認することであった。この点に関しては、全身麻酔を施したマウスの全脳動物標本に味およびニオイを呈示し、大脳皮質におけるフラビン蛋白の蛍光変化を測定することが可能となった。本年度は昨年度に引き続き、味およびニオイの呈示を同一個体に同時に行ったときの大脳皮質応答を計測するための至適条件を模索することと、同時に呈示した場合の応答計測を並行して行ったが、この検討に時間がかかった。なぜなら当初、ニオイに対する皮質の応答強度と比較し、味に対する皮質応答は弱く、これらを同時に呈示した場合の応答変化を測定および判定できるか懸念があったためである。また、味およびニオイ物質それぞれに先行論文を参考に複数種をそれぞれの濃度とともに検討をする必要があった。検討の結果、本年度はニオイ物質をアミルアセテートに限定し、同時に呈示した際の皮質応答の変化を単独呈示時と比較することとした。その後、本内容の空間分布特性の解析を行うことができたため、本研究成果の一部は、学術大会で発表した。現在は申請時に本年度の主な検討課題の一つとした基本味と数種類のニオイ物質を組み合わせて呈示し、組み合わせによる皮質応答の違いについて検討を始めている。得られたデータは,味覚および嗅覚経路を電気刺激して得られた既知の所見と併せて考察する予定である。更に申請時には本年度、島皮質周辺領域で働いていると考えられる各受容体のアゴニストやアンタゴニストを皮質表層に投与して応答変化を検討するという、薬理学的手法を用いた風味形成に関与する神経伝達機構を明らかにすることを課題として掲げていた。しかしながら、この点は進捗状況の遅れにより残念ながら実現できていないため、次年度の課題としたい。引き続き、これまでに得られた味、ニオイ単独呈示および同時呈示に対する大脳皮質応答の空間分布特性の解析を行う。本年度は、同時呈示の至適条件を模索することに時間を費やした。味およびニオイ物質それぞれに複数種を濃度とともに検討する必要があったため、本年度は同時刺激の至適条件の検討には、ニオイ物質をアミルアセテートに限定した。現在は、当初の課題である基本味と数種類のニオイ物質を組み合わせて呈示し、その組み合わせによる皮質応答の違いを検討する課題に着手している。また、応答の時間解像度を上げるために、膜電位感受性色素を用いた研究に移行したいと考えている。次に、風味形成に関与する神経伝達機構を明らかにするために、薬理学的手法を用いて検討を行う予定である。その際には、島皮質周辺領域で働いていると考えられる各受容体のアゴニストやアンタゴニストを大脳皮質表層に投与し、大脳皮質応答の変化を測定し解析する。必要に応じて、本研究において活性化した神経細胞を確認する解剖学的検索を行う。得られたデータは、味覚および嗅覚経路に電気刺激を行って得られた知見と比較検討し、考察を深める。一方"口から食べて満足感を得たい"という本人の希望はもとより、それを叶えてあげたいという家族の要望は根強く存在している。本年度の研究計画目標は第一に、同一個体において味およびニオイの単独呈示に対する大脳皮質応答を確認することであった。

この点に関しては、全身麻酔を施したマウスの全脳動物標本に味およびニオイを呈示し、大脳皮質におけるフラビン蛋白の蛍光変化を測定することが可能となった。現在は、味およびニオイの呈示を同一個体に同時に行ったときの大脳皮質応答を計測するための至適条件を模索することと、同時に呈示した場合の応答計測を並行して行っている。本研究成果の一部は、学術大会で発表した。今後はフラビン蛋白応答の計測例数を増やし解析を進めるとともに、応答記録の時間解像度を上げるために、膜電位感受性色素を用いた研究に移行したいと考えている。本年度の研究計画目標は、第一に、同一個体において、味およびニオイの単独呈示に対する大脳皮質応答を確認することであった。日本は65歳以上の高齢者が総人口の25%を超える超高齢社会である。社会の高齢化が進むにつれ、脳神経障害を基礎疾患に持ち、摂食嚥下障害を有する患者が増加している。一方、"口から食べて満足感を得たい"という本人の希望はもとより、それを叶えてあげたいという家族の要望は根強く存在している。食に関する"満足感"の源は「おいしさ」を感じることであり、味覚および嗅覚情報の統合が深く関わると考えられている。しかし根拠の多くは食行動の観点からの報告であり、中枢神経機構に関するものは充分ではない。そこで本研究は、時間-空間解像度が高いという利点をもつ光学計測法を用い、味およびニオイ刺激に対する応答を指標にして、それらを統合する領域と考えられる島皮質および梨状皮質における化学感覚の情報処理機構を明らかにすることを目的とした。初年度には、全身麻酔を施したマウスの全脳動物標本に味およびニオイを呈示し、大脳皮質におけるフラビン蛋白の蛍光変化を測定することが可能となった。しかしながら当初、ニオイに対する皮質の応答強度と比較し、味に対する皮質応答は弱く、これらを同時に呈示した場合の応答変化を測定および判定できるか懸念があった。そのため次年度は主に、味およびニオイの呈示を同一個体に同時に行ったときの大脳皮質応答を計測するための至適条件を模索することと、同時に呈示した場合の応答計測を並行して行った。初年度の研究計画目標は、第一に、同一個体において、味およびニオイの単独呈示に対する大脳皮質応答を確認することであった。
「生物」時計の解明、試験管内再構成系からのアプローチ

多くの生物の持つ概日時計機構を解明するため、シアノバクテリアを用いて解析を行った。試験管内での実験からシアノバクテリアの概日時計機構の本質は時計タンパク質KaiCのリン酸化サイクルであると考えられてきたが、本研究からリン酸化サイクルが存在しない細胞においても概日リズムは形成されることがわかった。つまり、リン酸化サイクルは唯一の振動体ではなく、細胞ではリン酸化サイクルと転写翻訳サイクルの二重の振動体が存在し、それによって安定した概日リズムが形成維持されていることが解った。シアノバクテリアの概日リズム発生にはkaiABCが必須であり、試験管内でKaiA,KaiB,KaiCを混ぜるだけで、KaiCの概日リン酸化振動が起こることから、概日時計機構の本質はKaiタンパク質であり、試験管内で解析できると考えられている。しかし、試験管内と細胞では環境が異なっている。本研究は、再構成系で得られた知見をふまえて、細胞の時計システムの構造を解析するため、以下の研究を行った。1.細胞で働く概日時計と試験管内で動く振動体KaiCリン酸化サイクルの違いの解析試験管内(in vitro)と細胞(in vivo)の時計の相違点を比較し、細胞の概日時計に特異的な反応を探索するし、生体内の時計システムにとって必要な要素を同定するため、in vitroとin vivoで表現型の異なるkaiABC変異体の探索を行った。kaiABCには様々な表現型を示す変異が同定されているため、その中から数個選び、細胞内のKaiタンパク質をウエスタンブロットで解析し、発現が確認できた変異型Kaiタンパク質を大腸菌発現系で精製を行った。in vitroで表現型を解析したところ、in vivoと異なる変異体が得られた。2.転写翻訳フィードバック制御の生体内の時計における意義リン酸化サイクルは転写翻訳フィードバック制御がなくても概日リズムを生み出すが、リン酸化サイクルのないと概日リズムが生じないかはまだ検証していないため、まずシアノバクテリアの細胞内においてリン酸化サイクルを阻害し、概日リズムの表現系を観察した。その結果、リン酸化サイクルのなくても概日リズムは形成されることがわかった。つまり、リン酸化サイクルはシアノバクテリアにおいて概日リズムを形成するための唯一の振動体ではなく、転写翻訳フィードバック制御と協調して細胞にリズムをもたらしていることがわかった。シアノバクテリアの概日リズム発生にはkaiABCが必須であり、試験管内でKaiA, KaiB, KaiCを混ぜると、KaiCの概日リン酸化振動が起こることから、概日時計機構の本質はKaiタンパク質であると考えられるが、試験管内と細胞では環境が異なっている。本研究は、再構成系で得られた知見をふまえた細胞の時計システムの構造の解析を行った。転写翻訳フィードバック制御の生体内の時計における意義シアノバクテリアの細胞内においてリン酸化サイクルを阻害する、もしくはリン酸化サイクルが存在しないKaiC変異体KaiC[S431E ; T432E]を用いて、概日リズムの表現型を測定した。その結果、リン酸化サイクルのなくても細胞においては概日リズムは形成されることがわかった。つまり、リン酸化サイクルはシアノバクテリアにおいて概日リズムを形成するための唯一の振動体ではないことがわかった。細胞で働く概日時計と試験管内で動く振動体KaiCリン酸化サイクルの違いの解析試験管内と細胞の時計の相違点の比較から細胞の概日時計に特異的な反応を探索し、生体内の時計システムにとって必要な要素を同定するため、KaiCのリン酸化を促進するKaiCを過剰に発現しリン酸化サイクルを阻害するKaiA過剰発現株を用いて解析を行った。その結果細胞の時計では、リン酸化サイクルと転写翻訳サイクルが両方存在しないと、振動周期が短周期化し、さらに振動は安定性を欠くことがわかった。