hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
付着珪藻の生産・消費・分解機構と河口域生産力の評価

付着珪藻は干出時間に、底土1g当たりクロロフィルa量として数μgの増加が認められた。また冠水時には付着珪藻の一部は水中に懸濁することが明らかになった。3.河口域に生息している底生生物による付着珪藻の被食状況について調べた。付着珪藻は二枚貝類のほか、チゴガニ、コメツキガニ、ヤマトオサガニなどのカニ類の高い摂食圧をうけていることが新たに明らかになり、これら生物の生産構造と密接にむすび付いていることが分かった。つまり、付着珪藻の増殖メカニズムと底生生物による摂食メカニズムとの結びつき方について、現場において、どのようにとらえていくかということの検討が必要になり、予備実験を実施中であるが、観測方法については、ほぼ見通しがついた。(1)宮城県名取川河口域において、付着珪藻の現存量ならびに種類組成について調べ、平行して塩分、冠水時間底土の粒度組成などの物理化学的環境条件についての観測を行った。付着珪藻の種類組成は場所ごとに違いがみられる。川の本流の中にあって、水の流動が大きく、底質が砂れき質の場所にはAmphora ovalisやBacillaria paradoxia、小型のNavicula sp.の現存量が多い。干潮時に干出し、砂質の場所にはNavicula muticaやCymbella ventricosaなどが優占する。干潮時に干出し、含泥率が高い砂泥質の所は、Nitzschia kutzingianaなどが多く出現する。(2)付着珪藻を食物としている二枚貝類やカニ類の分布・生活様式について調べ、またこれらの生物による被食状況について調べた。二枚貝類やカニ類の胃内容物のほとんどは付着珪藻とこれらの分解物と考えられるデトライタスで占められている。また、二枚貝類およびカニ類の生活場所は少しずつ、隔たりを保ちながら、生活していることが明らかになってきた。生活場所の違いは物理化学的環境条件、とくに底質の特性によってとらえることができる。(3)名取川河口域において高密度に生息しているイソシジミによる付着珪藻の摂食量を推定するための飼育実験と摂食量と成長との関係をもとめるための飼育実験を行った。イソシジミ稚貝(殻長510mm)の場合の最大の日摂食量はクロロフィルaで25μgである。2025°Cの温度条件の下で最もよい成長が得られ、純粋培養の珪藻を食物として与えた場合、約120μm/day(湿重量で4μg/day)の成長速度が得られた。また、現場で摂食していると考えられる付着珪藻やデトライタスの混合物を食物とした場合には約80μm/day、(湿重量で2μg/day)の成長速度が得られた。これらの結果から、河口域という比較的狭い空間の中にも、物理化学的環境条件の異なる場の分化が見られ、それぞれの場所における生物の分布状態に違いがみられ、さらに、付着珪藻などの一次生産構造の違いとなって表れてくることが分かる。また、物理化学的環境条件と同様に生物の生活活動、とくに摂食と排泄の問題がこの水域における物質循環を考える上で重要であることが明らかになり、飼育実験によって確かめていく手法もほぼ確立されたと考えている。(1)河口域における有機物の分解と栄養塩類供給機構河口域干潟では有機物も沈積しやすく、バクテリアなどの微生物による分解機構を把握しておくことが重要であるが、潮汐などの水の流動に伴う栄養物質の動き方を明らかにしておく必要がある。そこで付着珪藻の増殖にとって不可欠な栄養塩類の供給機構について、水中および間隙水の栄養塩濃度の時間的変化から検討してみた。
虚血再灌流障害及びischemic preconditioning発症機序の研究―特にToll-Like Receptor4を介した細胞内シグナル伝達経路の解明

C57BL/6マウスを用いて「30分間虚血+120分間再灌流」の虚血再灌流障害モデルを作製し、左室梗塞範囲(Evan's blue及びTTCによる二重染色法)、左室心筋におけるMAPK(p38、JNK、ERK)活性(Western blotting法)、転写因子(NF-kB)活性、炎症性サイトカインmRNA発現(RPA法)の測定を行い、虚血再灌流障害の発症機序においるTLR4の関与について検討を行った。以上より、虚血再灌流による酸化ストレスがTLR-4に作用し、JNKを介した細胞内シグナル伝達系によって心筋虚血再灌流障害が発症することを示唆した。C3H/HeJ(TLR-4 mutant)マウス、及び対照群としてC3H/HeN(wild type)マウスを用いて「60分間虚血+120分間再灌流」の虚血再灌流障害モデルを作製し、左室梗塞範囲(Evan's blue及びTTCによる二重染色法)、左室心筋におけるMAPK(p38、JNK、ERK)活性の測定(Western blotting法)、転写因子(AP-1、NF-κB)活性(EMSA法)、炎症性サイトカインmRNA発現(RPA法)の測定を行い、虚血再灌流障害の発症機序においるTLR-4の関与について検討を行った。C57BL/6マウスを用いて、「30分間虚血+120分間再灌流」の虚血再灌流障害モデルを作製し、左室梗塞範囲(Evan's blue及びTTCによる二重染色法)、左室心筋におけるMAPK(p38、JNK、ERK)活性(Western blotting法)、転写因子(NF-κB)活性、炎症性サイトカインmRNA発現(RPA法)の測定を行い、虚血再灌流障害の発症機序においるTLR4の関与について検討を行った。
昭和戦中・戦後期の日本の社会史と台湾-台湾人民衆の戦争体験と日本認識の記録化

戦時下における台湾民衆の戦争の記憶と体験を、聞き取り調査によってその生の声を記録化し、当時の新聞、雑誌、公文書、手紙、手記などとの照合検討をとおして、これを社会史的観点から多角的かつ具体的に解明した。その成果は、「国際交流研究集会65年目の証言」(2010年)を関西大学で開催して広く社会に発信し、2011年には『看護婦たちの南方戦線帝国の落日を背負って』(大谷渡、東方出版、1-241頁)として出版した。本研究の目的は、近現代日本の社会史との関連で、台湾人民衆の戦争の記憶と体験を多角的かつ具体的に解明することである。本年度においては、従軍看護婦の出征など台湾人住民の動員についての調査を相当程度進めることができた。特に、台南陸軍病院からマニラに派遣された陸軍看護婦黄玉緞からの聞き取り調査による口述資料を手がかりに、日本各地からマニラに派遣された日本人陸軍看護婦で今も健在の方々をつきとめることができ、思わぬ成果を得ることができた。日本人と台湾人の記憶と体験を合わせて検討し、文字資料との照合による分析をとおして、彼女らの戦場体験、米軍収容所での体験、引揚げ等々の詳細を明かにし、これまで知られていない戦争の実相を解明した。この成果を広く社会に発信する目的で、2010年3月13日に関西大学おいて「国際交流研究集会65年目の証言日本人・台湾人陸軍看護婦とルソンの戦場」を開催し、『研究報告集』を編集して来場者に配布した。研究集会の開催は、『毎日新関』2月25日付朝刊、『京都新聞』3月7日付朝刊、『読売新聞』3月11日付夕刊で報じられ、開催当日には会場で読売新聞の取材があり、翌14日付同紙朝刊に「元陸軍看護婦証言生々しく関大で研究集会」の見出しで、学生・社会人の来場者180人と報じられた。『研究報告集』には、収集した写真を表紙と口絵に使用し、基調報告「問い続けたいあの戦争と平和について-日本人・台湾人陸軍看護婦とルソンの戦場-」(大谷渡)、研究報告「フィリピンにおける日米映画戦-『あの旗を撃て』の幻影-」(笹川慶子)、「戦前・戦中におけるフィリピンと台湾人」(卞鳳奎)の各論文と、史料紹介「陸軍看護婦門脇初代の戦場日記について」を収録した。当日会場では、2009年12月26日に台北において収録した黄玉緞のビデオを上映するとともに、収集した写真を映し出して解説した。研究集会は、参加者の好評を得て盛会であった。本研究の目的は、日中戦争・太平洋戦争期、および終戦まもない時期を対象とし、台湾民衆の戦争の記憶と体験を社会史的観点から多角的かつ具体的に解明することである。台湾人志願兵・軍属・従軍看護婦の出征、太平洋戦争末期の米軍空襲と台湾人住民の被害、終戦後の生活等々の実態を、口述資料と文字資料を収集し分析して記録化することにより、その歴史的意味を問うものである。空襲体験者及び、兵士・特設勤労団員・陸軍看護婦・日赤救護看護婦・篤志看護助手等として派遣された人たちからの口述資料(録音)を収集し、文章化して分析した。あわせて、手記や手紙、『台湾日日新報』『台湾日報』『台湾新報』『台湾時報』の記事、公文書などからの資料収集を並行して進め、口述資料と文字資料の照合検討を通して、台湾民衆の戦争体験の実相を明らかにし、その全体像解明のための研究を准めた。聞き取り調査は、台北・台中・台南など台湾全島、および日本国内において実施し、台湾人看護婦と日本人看護婦についての資料収集を行い、日本人看護婦と台湾人看護婦の体験を総合的に検討し解明した。台湾では国立中央図書館台湾分館や国立台湾海洋大学などにおいて、日本では防衛省防衛研究所図書館や国立国会図書館などにおいて文献調査と資料収集を行った。台湾人陸軍看護婦との関連で、日赤大阪支部および日赤福岡支部派遣の救護看護婦の調査を進め、日赤大阪支部病院救護看護婦養成所関係資料の収集も並行して行った。本年度の成果は秋に論文としてまとめ、3月に『関西大学文学論集』に掲載した。冬には日赤救護看護婦に関する論文をまとめ『大阪都市遺産研究』に寄稿しており、まもなく発行予定である。前年度と本年度の研究成果は、著書として出版を計画し、秋以降執筆を進め、本年3月末に脱稿した。出版は本年7月の予定である。本研究の目的は、戦時下における台湾民衆の戦争の記憶と体験を社会史的観点から多角的かつ具体的に解明することである。台湾人志願兵・軍属・従軍看護婦の出征、戦時下と終戦後の住民の生活等の実態を口述資料と文字資料を収集し分析して記録化し、その歴史的意味を問うものである。

本年度初めには、平成21年度と平成22年度における調査研究の成果を出版社に入稿し、7月中旬に『看護婦たちの南方戦線--帝国の落日を背負って』(東方出版)を出版した。同書は出版間もない8月に日本図書館協会選定図書となった。夏休み中に台湾での資料収集を実施するとともに、『看護婦たちの南方戦線--帝国の落日を背負って』を持参して、聞き取り調査に応じてもらった人たちに進呈し確認してもらった。さらに夏の台湾調査の折に、10月1日の関西大学における国際シンポジウム「青春と戦争の惨禍大阪日赤と救護看護婦」に、広東派遣の元台湾篤志看護助手葉蒋梅を招く準備を入念に進めた。10月のシンポジウム当日には、大谷が「帝国の落日を背負って-野戦病院と遺芳録から-」のタイトルで基調講演を行ない、台湾一陸会副会長の葉蒋梅は、「広東派遣台湾人篤志看護助手の青春」と題する特別講演を行なった。12月には、台中において、太平洋戦争中に台中農業学校及び台中商業学校を卒業し、台中師範学校在学中に学徒兵となった人たちから、戦時体験とその後についての聞き取り調査を実施し、台北では広東第二陸軍病院に派遣された元台湾篤志看護助手からの聞き取り調査を行った。8月と12月の調査の成果は、論文「記憶の中の台湾と日本(6)-統治下における戦争の体験-」として、『関西大学文学論集』第61巻第4号(平成24年2月)に掲載した。3月には台湾での補充調査を行うとともに、発表論文の抜き刷りを聞き取りに応じてもらった人たちに進呈して確認してもらった。
P. melaninogenicaの誤嚥性肺炎病原因子の同定と病態発症機序の解明

介入疫学研究によって口腔ケアが誤嚥性肺炎の予防に有効であることは、現在広く認知されているが、誤嚥性肺炎の原因となる特定の細菌種に関する病原因子の解析に関する細菌学的な報告はあまりない。そこで本研究では誤嚥性肺炎の起炎菌の一つであるグラム陰性嫌気性桿菌のPrevotella melaninogenicaに注目した。P. melaninogenicaは、歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalisやTanerella forsythiaなどと同じくBacteroidetes門細菌に属し、これらのBacteroidetes門の細菌種ではプロテアーゼなどの病原因子の分泌に関与するタイプIX分泌システム(T9SS)を有することから、P. melaninogenicaも同様にT9SS遺伝子(porK)を有することが予想された。そこで本研究では、P. melaninogenicaのゲノムデータベースからporK遺伝子を同定し、P. melaninogenicaのporK欠失変異株を相同組換えにより作成した。porK欠失変異株では、赤血球凝集とバイオフィルム形成が減少した。乳成分を含有する培地で培養した場合、porK欠失変異株で形成されるハロの直径は、バクテリア細胞外にプロテアーゼ分泌するプロテアーゼが減少するため、野生株が形成するハロの直径よりも小さかった。さらに野生株とporK欠失変異株の培養上清を二次元電気泳動により解析したところ、porK欠失変異株で検出される分泌タンパクのスポットが減少していた。また、マウスへの感染実験では、porK欠失変異株のマウスの死亡率は、野生株の死亡率よりも統計的に有意に減少した。これらのことから、P. melaninogenicaのT9SSを介した病原因子の分泌が本菌種の病原性に関与し、誤嚥性肺炎の増悪に関与することが示唆された。これまで誤嚥性肺炎の原因となる細菌種はどれかという網羅的な報告は存在するが、特定の菌種のどの病原因子が誤嚥性肺炎を誘発し、病態を増悪させるかという細菌学的側面からの研究はあまりない。そこで特定の細菌種の誤嚥性肺炎の病原因子の同定を行うために、誤嚥性肺炎の起炎菌の一つとされるPrevotella melaninogenicaに注目した。この菌種はβ-ラクタマーゼ産生株も存在し、β-ラクタム系抗菌薬に高い抵抗性を示すため、特に注意が必要な菌種で、口腔に常在する偏性嫌気性桿菌で誤嚥性肺炎との関連が強く指摘されている。歯周病原性細菌であるPorphyromonas gingivalisやTanerella forsythiaなどのBacteroidetes門細菌に属する細菌は、T9SSと呼ばれるタンパク分泌機構を有し、この機構が菌体表層への歯周病原因子の輸送に関わることが示唆されている。同じくBacteroidetes門に属するP. melaninogenicaもタンパク分泌機構T9SSを有し、これを介して病原因子を輸送していることが想定され、その輸送される病原因子にの中に誤嚥性肺炎に関与するものも含まれると考えられる。そこで、本研究ではまずP. melaninogenicaのもつT9SSをデータベース上に存在するBacteroidetes門細菌のT9SS関連遺伝子(porK, L, M, N)を参考にして遺伝子配列を決定し、そのノックアウト変異株を作成することで、細菌学的・生化学的表現型からこれを介して分泌される病原因子が何か?また、接種実験によって病原性は低下するか?さらにはゲノムのシークエンスを行ってこの経路を介して分泌される誤嚥性肺炎の病原因子の候補となるものの同定を行い、さらにはマウスでの誤嚥の実験を行うことで誤嚥性肺炎の病原因子の決定を行うことが本研究の概要となる。本年度はまずP. melaninogenicaのTS9SS core complexをコードする遺伝子porK, L, M, Nのうち、porKに対する変異株を相同組換えにより作成することとした。まずデータベースより他のBacteroidetes門に属する細菌種のTS9SS core complexをコードする遺伝子を抽出してこれを参考に、P. melaninogenicaのporK, L, M, Nに対応する遺伝子を決定した。この結果に基づき、porKに対するtargeting vectorを作成し、相同組換えによりporK変異株を作成した。その結果、P. melaninogenica野生株は血液寒天培地上で黒色コロニーを形成するが、変異株のコロニーは乳白色を呈し、ヘムの蓄積が起こらないと考えられた。また、スキムミルク含有の培地上ではハローの形成が減少したことから、プロテアーゼの産生が減少したと考えられた。ウサギ脱線血を用いた赤血球凝集性に関しては、野生株では認められたが、変異株では認められなかった。生菌のマウスへの摂取試験では、野生株が80%の致死率であるのに対し、変異株では20%と低下した。さらに培養上清の二次元電気泳動では検出されるスポットが野生株と比べると変異株では大幅に減少するのが確認された。以上の結果から、P. melaninogenicaはporKをノックアウトすることで全体的な病原性が低下していると思われるので、T9SSを介した誤嚥性肺炎の病原因子も存在すると思われた。本研究のここまでの成果は平成29年4月22、23日に開催された第14回日本口腔ケア学会で報告した。

介入疫学研究によって口腔ケアが誤嚥性肺炎の予防に有効であることは、現在広く認知されているが、誤嚥性肺炎の原因となる特定の細菌種に関する病原因子の解析に関する細菌学的な報告はあまりない。そこで本研究では誤嚥性肺炎の起炎菌の一つであるグラム陰性嫌気性桿菌のPrevotella melaninogenicaに注目した。P. melaninogenicaは、歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalisやTanerella forsythiaなどと同じくBacteroidetes門細菌に属し、これらのBacteroidetes門の細菌種ではプロテアーゼなどの病原因子の分泌に関与するタイプIX分泌システム(T9SS)を有することから、P. melaninogenicaも同様にT9SS遺伝子(porK)を有することが予想された。そこで本研究では、P. melaninogenicaのゲノムデータベースからporK遺伝子を同定し、P. melaninogenicaのporK欠失変異株を相同組換えにより作成した。porK欠失変異株では、赤血球凝集とバイオフィルム形成が減少した。乳成分を含有する培地で培養した場合、porK欠失変異株で形成されるハロの直径は、バクテリア細胞外にプロテアーゼ分泌するプロテアーゼが減少するため、野生株が形成するハロの直径よりも小さかった。さらに野生株とporK欠失変異株の培養上清を二次元電気泳動により解析したところ、porK欠失変異株で検出される分泌タンパクのスポットが減少していた。また、マウスへの感染実験では、porK欠失変異株のマウスの死亡率は、野生株の死亡率よりも統計的に有意に減少した。これらのことから、P. melaninogenicaのT9SSを介した病原因子の分泌が本菌種の病原性に関与し、誤嚥性肺炎の増悪に関与することが示唆された。介入疫学研究によって口腔ケアが誤嚥性肺炎の予防に有効であることは、現在広く認知されている。しかし、誤嚥性肺炎は口腔内に常在する細菌によって引き起こされる感染症であるという認識はされているものの、誤嚥性肺炎の原因となる特定の細菌種に関し、どの病原因子が誤嚥性肺炎を誘発し、病態を増悪させるかという細菌学的側面からの研究報告はあまりない。本研究では、誤嚥性肺炎の原因となる特定の細菌種に関し、どのような病原因子が誤嚥性肺炎を誘発し、病態を増悪させるかという細菌学的側面からの研究を行うことを目的とした。そこで誤嚥性肺炎の起炎菌の一つとされるグラム陰性嫌気性桿菌のPrevotella melaninogenicaに注目した。Prevotella melaninogenicaは、歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalisやTanerella forsythiaなどと同じくBacteroidetes門細菌に属する。こうしたことからこれらのBacteroidetes門の細菌と共通した表層タンパクやタンパクの分泌機構などの構造や機構を持つことが予想される。さらにそれらの歯周病原性細菌ではこれらのタンパクが病原因子となっていることから、Prevotella melaninogenicaにおける同様のタンパクが誤嚥性肺炎を発症させる病原因子となることが想定される。
音声ドキュメントの高精度認識と整形・要約および高速・高精度音声検索に関する研究

音声認識の高精度化と音声認識結果の整形化、音声ドキュメントからの検索語の高速・高精度検索法の研究を行った。音声認識の高精度化に関しては、従来のHMMを越える新しい音声認識モデルを提案し、その有効性を示した。音声認識結果の整形に関しては、話し言葉音声の音声認識結果からの書き言葉への整形のための確率モデルを提案し、その有効性を示した。音声ドキュメントからの検索語の高速検出に関しては、音節のnグラムインデックスに基づく手法を提案し、その有効性を示した。音声情報の有効活用のためには、高精度な音声認識法、認識結果を読み易くするための音声整形法、音声要約法、大量の音声ドキュメントからの検索キーワードの高速検索法の技術開発が必要である。本年度は、現在の世界的標準となっている音声認識モデルであるHMMを包含する隠れニューラル確率場モデルによる音声認識技術を開発し、HMMと同等以上の性能を得る見込みを得た。音声認識の言語モデルに関しては、音声認識対象単語の直前の数十単語のコンテキストを用いてトピックを同定し、トピックに依存した言語モデルによる音声認識法を開発し、パープレキシティの減少、音声認識の向上を達成した。また、認識辞書に登録されていない未知語に対する言語モデルの構成法を提案し、有効性を示した。音声ドキュメントの高速検索法として、音声認識の置換誤り、挿入誤り、脱落誤りに頑健な音節のnグラムインデックスによる方法を提案し、その有効性を示した。検索精度の向上を図るために、音節認識結果のmベストを利用する方法を提案した。基本的な手法である音節列向上の連続DPマッチング法と比較し、約200倍の検索速度で同等以上の検索精度を得られることを示した。本手法は、音声認識誤りや音声認識用辞書に登録されていない未知語に対しても頑健に動作する。H23年度は、音声認識の高精度化と音声ドキュメントからの検索語の高速・高精度検索法の研究を行った。まず、音声認識の高精度化に関しては、従来の世界的な標準手法であるメルケプストラム係数の混合正規分布(GMM)による特徴パラメータのモデルと隠れマルコフモデル(HMM)による音響モデルのGMM-HMMに代えて、多層ニューラルネットワーク(DNN)による特徴抽出・事後確率計算と隠れニューラル確率場を音響モデルとして用いるDNN-HCNFを提案した。これは、従来のGMM-HMMを包含する強力な枠組みであり、これによって、従来の音声認識率を向上させることが出来た。例えば、日本語音声認識の標準テストデータである新聞読み上げ音声に対して、現在、最も良いとされている世界標準のトライフォンに基づくGMM-HMMの識別学習モデルを用いて、音素誤り認識率が12.4%であったのが、提案手法により12.1%に改善できた。英語音素認識に対しても、音素誤り認識率を27.6%から24.3%に改善出来た。音声ドキュメントからの検索語の検出に関しては、従来から我々が提案している音節のトライグラムインデックスに基づく手法を改善した。すなわち、音節列間のマッチングにおける置換誤り・挿入誤り・脱落誤りの距離の厳密化を行った。これらの誤りは、音声認識で避けられないものである。特に、置換誤り対策用に導入したダミー音節と検索語の音節との距離の定義を厳密化した。これにより、検索精度が向上し、ベースラインである音節列同士のDPマッチングによる手法の精度を上回ることが出来た。また、検索速度は、DPマッチング法の約50倍の速度を達成した。インデックスのメモリ量が多いのが難点であるが、音節認識結果の候補数を削減することで、メモリ量も削減することができることを示した。H24年度は、音声ドキュメントからの検索語の高速・高精度検索について研究を行った。まず、従来から我々が行っていた音節のトライグラムのインデックス化を、トライグラム、バイグラム、ユニグラムを併用する方法に改善した。これは、例えば、ABCDEの5音節からなる検索語に対して、従来法では、ABCとCDEの二つのトライグラムで検索していたが、この場合、音節Cが、2重に検索されており、厳密な5音節としての検索距離が求められていなかった。そこで、今回は、ABCのトライグラムとDEのバイグラムの検索結果を統合する手法に改善した。また、従来は、検索結果の検索語の長さの相違による正規化係数として、分割したトライグラム数で正規化していたのを、音節数に変更した。以上の改善・変更により、検索精度が向上した。例えば、従来44時間の講演音声ドキュメントに対して、未知語の検索に対して、F値は、従来法で0.611であったのが0.681まで向上した。また、ベースラインである、音節列同士のDPマッチングによる方法では、0.591であり、ベースラインを大きく上回ることが出来た。ただし、これにより、検索時間が遅くなったが、依然DPマッチング法よりは高速で、17倍である。次に、検索語を音声入力で行う方法を検討した。まず、検索語の音声を音声認識で音節列に変換する。

その第一候補の音節列を、従来のタイプ入力による検索語と見做して、検索を行った。提案法は、今回の検索語の音節の認識率が検索対象の音声ドキュメントの音節認識よりも悪く、十分な検索性能を得られていないが、ベースラインのDPマッチングによる性能を上回っている。これにより、検索語の音声入力による問題点(脱落誤りの影響が大きい。第一候補だけでは、音節認識の性能が低く、検索性能も低い)が明らかになった。音声認識、整形、検索に関して、すべて目標以上に進んだと言える。まず、音声認識では、従来の世界的標準に代わる手法として提案したDNN-HCNFは、研究者間で、既に高く評価されている。多層ニューラルネットワークは、世界的にその有用性は認められているが、我が国でいち早く実証した。また、HCNFは、HMMを越える手法として世界的に注目されているHCRFを包含する手法で、将来性のある認識モデルである。評価実験でも、英語と日本語の音素認識率において、従来法を上回る結果を得た。認識結果の整形に関しては、確率モデルで統一的に整形する手法を提案した。これも時流に沿った枠組みで、代表的な手法になりうるものである。ただ、データ不足もあり、確率モデルの一部は、具体的なパラメータ推定は手つかずで、ヒューリステイックに手動で与えていて稼動させている状況である。音声検索に関しては、順調に成果が得られた。既に、我々の研究に触発された手法が提案されてきている。従来の我々の提案手法の音節間距離を厳密化・改善することにより、ベースラインの音節列同士のDPマッチング手法を上回る性能を得たことは、大きな成果である。ただ、インデックスサイズが大きいこと、検索速度が厳密化・改善する前よりも、遅くなったことが欠点として挙げられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。音声要約に関しては、要約システムの改善を続けてきて、一応重要文抽出による要約については、完成している。人間による重要文抽出と遜色ない結果が得られている。音声認識に関しては、我々が提案しているDNN-NCNFの継続研究を行う必要がある。第一は、大語彙連続音声認識に適用できるように拡張することである。これは、重み付き有限状態変換器に基づく音声認識デコーダを開発しているので、これで実装する予定である。第二は、種々のデータベースに対して、本提案手法の有効性を評価することである。音声ドキュメントに対する音声検索については、音節認識結果のトライグラムをインデクスにしていたのを、バイグラムおよびユニグラムのインデックスにも拡張し、任意長の検索語に対して、トライグラム、バイグラム、ユニグラムの併用で検索でききるように改善する必要がある。また、検索語をタイプ(テキスト)で入力していたのを、音声で入力できるように拡張する必要がある。
亜鉛応答性転写因子MTF-1による細胞機能調節機構の解析

昨年度は、EGF依存的肝細胞増殖においてERK1/2活性化にMTF-1が関与することを亜鉛応答性転写因子MTF-1の機能をドミナントネガティブ体(N末端欠失体;MTFΔC)発現により阻害、もしくはsiRNAによりノックダウンすることによって明らかとした。今年度は、本作用の詳細を明らかにするため、ERK1/2の上流因子であるMEK1/2の活性化がMTF-1により影響を受けるか調べ、MEK1/2リン酸化がMTF-1活性阻害により低下することを見出した。したがって、MTF-1の作用点はより上流であることが明らかとなった。また、MTF-1活性を修飾する因子を検索する目的で、亜鉛トランスポーターおよび細胞内亜鉛量とMTF-1活性との関係を調べた。マウス初代培養肝細胞に種々亜鉛トランスポーターのsiRNAを導入して、これらトランスポーターの発現をノックダウンし、細胞内亜鉛量およびMTF-1活性への影響を調べた。細胞内亜鉛量は亜鉛蛍光プローブ、Zinquin ethyl esterにより評価した。MTF-1活性はレポータープラスミドをアデノウイルスベクターとして導入して測定した。siRNAによりノックダウンする亜鉛トランスポーターは肝細胞で比較的高発現している、亜鉛取込トランスポーターZnT-1、5および7、亜鉛排出トランスポーターとしてZIP1、2、4および7とした。その結果、細胞内亜鉛量の増加が確認されたZnT-1ノックダウン細胞でのみ、MTF-1活性の上昇が認められた。細胞内局所での亜鉛濃度の変化によってMTF-1活性が修飾される可能性を考えていたが、そのような現象を捉えることは出来なかった。本研究課題では、亜鉛応答性転写因子MTF-1をドミナントネガティブ体(N末端欠失体;MTFΔC)発現により阻害、もしくはsiRNAによりノックダウンした際の表現系からMTF-1の機能、特に細胞機能調節機構へのMTF-1への関与を明らかにすることを目的としている。本年度は、初代培養肝細胞のEGF依存的増殖に注目した研究を行い、以下の成果を得た。初代培養肝細胞は細胞接着後から無血清培養することでEGF依存的増殖が観察可能であるので、この条件を用いた。DNA合成(^3H-チミジン取り込み)を指標に細胞増殖を観察したところ、EGF添加3648時間で最も細胞増殖が盛んであった。これに対し、MTFΔC発現によりMTF-1を阻害すると細胞増殖のピークが4860時間へと遅延した。S期細胞の割合をブロモデオキシウリジンの取り込みによりを調べたところ、EGF添加36時間後においてコントロール群で50%程度であったのに対し、MTFΔC発現群では10%と割合は低下していた。次に、遅延の原因をとして、EGF依存的細胞増殖において必須のシグナル伝達系、MEK/ERKカスケードの活性化にMTF-1が関与する可能性を考えた。活性型ERK量をWestern blotにより両群で比較したところ、MTFΔC発現群で活性型ERK量が減少していた。siRNAによってMTF-1をノックダウンした場合においても、EGF依存的ERK活性化は阻害された。つまり、MTF-1がMEK/ERKカスケードを修飾することが明らかとなった。今後、今回明らかとなったMTF-1のMEK/ERKカスケード修飾作用を手がかりに、別の細胞機能調節作用を探る予定である。また、MTF-1活性と細胞内亜鉛量、亜鉛輸送・貯蔵タンパク質量、さらにこれらの細胞内分布との関係を調べる予定である。
がん浸潤転移に至る上皮組織構造の再構築

細胞接着分子nectin/Neclファミリーの中で,nectin-2,-4,Necl-5は腫瘍悪性化を促進し、Necl-1,-2,-4は腫瘍抑制活性を示すことが報告されている。本年度はafadin、LMO7、Necl-2について報告する。Afadinはadherens junction (AJ)に局在するnectinをアクチン細胞骨格に連結する蛋白質である。条件的afadin欠損マウスの表現型解析から、afadinは大腸上皮細胞においてnectin-2のAJへの局在を規定し、大腸上皮のバリア機能、炎症およびアポトーシス誘導刺激に対する恒常性の維持に貢献することが示唆された。Afadinはnectin、N-cadherinおよびbeta-acteninの海馬CA3領域のシナプス構造への集積に必須であること、また、活性型Rap1と結合しPI3K-Aktを介してVEGFおよびS1P誘導性の血管新生を促進することを明らかにした。Afadin結合蛋白質の一つであるLIM-domain only (LMO)7欠損マウスでは肺腺がんの自然発症が認められた。そこで、ヒト肺腺がん57症例の手術標本を用いて免疫組織学的にLMO7発現を比較検討した結果(高発現グループ24例、低発現グループ33例)、LMO7発現レベルはヒト肺腺がんの腫瘍進行と予後に逆相関を示すバイオマーカーとして有用であることが示唆された。Necl-2はマウス表皮幹細胞の増殖と運動を抑制的に制御して、その毛嚢内局在を調節すること、さらに、Necl-2はリンパ節内でのCD8陽性T細胞と樹状突起細胞間の相互作用に重要であり、T細胞の停留と分化を貢献することが明らかになった。現在、nectin/Necl関連遺伝子欠損ががん浸潤転移に及ぼす影響を検討するマウス実験系を構築中であり、今後の研究の展開が期待される。上皮組織構造の破綻はがん浸潤転移の初期段階であり、細胞接着因子とアクチン細胞骨格の再構成を担う低分子量G蛋白質Rho, Rac, Cdc42およびTGFβシグナリングが重要な役割を果たしている。私どもはヒト遺伝性乳がんの抑制遺伝子候補LIM-domain only(LMO7)のsplice variantがTGFβによって誘導され、培養細胞の運動能を促進することを見出した。また、LMO7がnectin-afadinを介した上皮細胞間接着に関与し、LMO7遺伝子欠損マウスは細気管支のポリープ様隆起病変と肺がんを発症することを明らかにした。本年度はLMO7遺伝子欠損マウスの表現型解析について報告した(Tanaka-Okamoto et al. 2009)。LMO7はアクチン細胞骨格、上皮細胞のadherens junctionの集合、および遺伝子発現を調節すると予想される多機能蛋白質である。LMO7はマウスの肺において高発現し細気管支上皮細胞のアピカル面に局在した。LMO7遺伝子欠損マウスはSPF環境下で生存可能であり生殖能力も保たれているが、14-15週齢付近で終末気管支上皮、呼吸気管支上皮、肺胞道において隆起性病変を発症した。さらに、90週齢を経過した頃から肺がん(腺がん)を発症する傾向が見られた。肺がんの発症率はLMO7遺伝子ホモ欠損マウスで22%、ヘテロ欠損マウスで13%であった。一方、野生型マウスでは原発性肺がんの発症は観察されなかった。肺がん細胞を培養し、多数の染色体異常を伴うこと、ヌードマウスに造腫瘍性を示すことを明らかにした。これらの研究成果から、LMO7はがん抑制遺伝子として機能し、その遺伝子欠損はマウスでは肺がんの自然発症リスクを増加させることが示唆されたLMO7はヒト肺がん発症にも関連する可能性があり、今後の研究の展開が期待される。現在、nectin/Necl
超解像ケミカルイメージングによる拘束空間下の高分子科学

本年度はブロック共重合体単分子膜のミクロ相分離構造内におけるブロック高分子鎖のコンホメーション評価を行った。ポリイソブチルメタクリレート(PiBMA)およびポリオクタデシルメタクリレート(PODMA)から成るブロック共重合体、さらにそれぞれのホモポリマー鎖をリビングラジカル重合法により合成した。近接場光学顕微鏡(SNOM)観察のためにPiBMAおよびPODMA鎖はペリレンあるいはペリレンジイミド色素によって蛍光ラベルした。得られた高分子試料をLangmuir-Blodgett法によって単分子膜とし、SNOM観察を行った。高分子単分子膜中における単一高分子鎖の蛍光SNOM観察にあたって、スピンキャスト膜中の鎖と比較して信号強度が著しく低下していることが判明した。検討の結果、単分子膜では色素分子が膜最表面に存在するために雰囲気中の酸素分子による消光の影響を強く受けることが示唆された。そこで試料単分子膜上にポリビニルアルコールを5-10nm積層することで消光が抑えられ、信号強度が数倍増強されることが分かった。SNOMによる直接観察によりミクロ相分離構造内のPiBMAブロック鎖のコンホメーションについて評価した。個々の鎖について観察された形態に対して楕円近似を行い、その長軸および短軸の長さを調べた。その結果PiBMAブロック鎖は、ホモポリマー鎖と比較して二倍以上伸張した形態をとっていることが明らかになった。ブロック共重合体のミクロ相分離においてはすべての鎖が相分離界面に存在しているため、鎖間の反発により相分離界面平行方向の自由度が制限されている。これに加え、単分子膜では高さ方向の自由度を持たず、その結果、単分子膜のミクロ相分離構造内では鎖は相分離界面法線方向の一次元の自由度しか持たない。そのためPiBMAブロック鎖は著しく伸張した形態を有しているものと考えられる。このように空間的に制限されたブロック共重合体鎖の伸張したコンホメーションが、単一高分子鎖レベルの実空間観察によって明らかとなった。本研究は、近接場光学顕微鏡(SNOM)による光の回折限界を超える空間分解能での光学計測によって、非摂動状態における広がりよりも小さな空間下に拘束された高分子鎖の構造および物性を明らかにすることを目的としている。本年度は、単分子膜中すなわち二次元平面内に束縛された高分子鎖の緩和過程を単一分子鎖観察によって明らかにした。ポリメチルメタクリレート(PMMA)をペリレンによって蛍光ラベルを施し、SNOMによって単一高分子鎖の観察を可能とした。これを水面上に展開することによって単分子膜を形成した。このときPMMA鎖は二次元平面上に束縛された状態となっている。これをLangmuir-Blodgett法によって、PMMAのバルクフィルム上にすくい取り、個々の鎖のコンホメーションのSNOM観察を行った。高さ方向(z軸方向)への広がりをほぼ完全に失った二次元の高分子鎖は、隣接した他の鎖との絡まり合いを持たず、収縮したコンポメーションをとっていることが示された。これをPMMAのガラス転移点以上である170°Cでアニーリングを行い、その緩和過程を観察した。膜の断面観察すなわちz軸方向への広がりを観察したところ、アニーリング時間とともに、表面の単分子膜層の鎖が、バルクPMMA基板内部へ拡散してゆく様子が観察された。一方、xy平面内での高分子鎖の回転二乗半径は、アニーリングによってほとんど変化しなかった。このことは一分子鎖あたりの広がりの大きさが拡大していることを直接示すものである。これは単分子膜としての平衡状態から三次元バルク平衡状態への移行に伴って、鎖同士の絡み合いが増加していることを示しており、二次元鎖状態での高分子鎖は絡み合いを形成しないという理論予測を裏付けるものである。本年度は(1)π共役系高分子であるポリ(メトキシエチルヘキソキシ-p-バラフェニレンビニレン)(MEH-PPV)の超薄膜下での単一分子レベルでのコンホメーション、および(2)ブロック共重合体が形成するミクロ相分離構造内における鎖のコンホメーションについて検討した。(1)従来の走査型近接場光学顕微鏡(SNOM)に対して偏光検出光学系を導入することで、MEH-PPV鎖全体の形態を観察するだけでなく、偏光解析により共役鎖セグメントの配向方向までを評価することを試みた。ここで使用した偏光SNOMは、試料からの信号光を偏光ビームスプリッタにより互いに直交する偏光成分に分離し、それぞれの強度比からセグメントの配向方向を見積もった。ポリスチレン媒体中に分散した分子量200万のMEH-PPV鎖は、およそ400nm程度の広がったコンホメーションをとることが示された。偏光SNOM観察により、その単一分子鎖の中でもセグメントの配向方向は異なり、ランダムな配向を示すことが分かった。この超薄膜試料表面をラビングによって摩擦を与えた後に観察を行ったところ、鎖全体の形態はラビングによって変化しないものの、ほぼ全てのPPV鎖からは摩擦方向の偏光が観察され、PPVセグメントがラビング方向に配向することが示された。このように、ラビングにより膜表面からの剪断応力を受けても鎖全体のコンホメーションを変えることはないが、鎖の一部のみが配向することが明らかとなった。(2)ブロック共重合体が形成するミクロ相分離構造内における鎖のコンホメーション評価を試みた。ポリスチレン(PS)-ポリメチルメタクリレート(PMMA)二元ブロック共重合体をフルオレセインによって蛍光ラベルすることで、SNOMによる蛍光観察を行った。

試料として各成分の重合度が等しいPS-PMMAを用いた。この試料が形成するラメラ状ミクロ相分離構造のSNOM観察を行い、ブロック鎖が相分離界面法線方向に配向していることを示した。本年度はブロック共重合体単分子膜のミクロ相分離構造内におけるブロック高分子鎖のコンホメーション評価を行った。ポリイソブチルメタクリレート(PiBMA)およびポリオクタデシルメタクリレート(PODMA)から成るブロック共重合体、さらにそれぞれのホモポリマー鎖をリビングラジカル重合法により合成した。近接場光学顕微鏡(SNOM)観察のためにPiBMAおよびPODMA鎖はペリレンあるいはペリレンジイミド色素によって蛍光ラベルした。得られた高分子試料をLangmuir-Blodgett法によって単分子膜とし、SNOM観察を行った。高分子単分子膜中における単一高分子鎖の蛍光SNOM観察にあたって、スピンキャスト膜中の鎖と比較して信号強度が著しく低下していることが判明した。検討の結果、単分子膜では色素分子が膜最表面に存在するために雰囲気中の酸素分子による消光の影響を強く受けることが示唆された。そこで試料単分子膜上にポリビニルアルコールを5-10nm積層することで消光が抑えられ、信号強度が数倍増強されることが分かった。SNOMによる直接観察によりミクロ相分離構造内のPiBMAブロック鎖のコンホメーションについて評価した。個々の鎖について観察された形態に対して楕円近似を行い、その長軸および短軸の長さを調べた。その結果PiBMAブロック鎖は、ホモポリマー鎖と比較して二倍以上伸張した形態をとっていることが明らかになった。ブロック共重合体のミクロ相分離においてはすべての鎖が相分離界面に存在しているため、鎖間の反発により相分離界面平行方向の自由度が制限されている。これに加え、単分子膜では高さ方向の自由度を持たず、その結果、単分子膜のミクロ相分離構造内では鎖は相分離界面法線方向の一次元の自由度しか持たない。そのためPiBMAブロック鎖は著しく伸張した形態を有しているものと考えられる。このように空間的に制限されたブロック共重合体鎖の伸張したコンホメーションが、単一高分子鎖レベルの実空間観察によって明らかとなった。
定置網におけるウミガメ混獲死亡回避装置の開発

魚捕部が海中に敷設される中層・底層定置網に迷入した海亀の混獲死亡を回避するために,入網した海亀を網外に脱出させる装置と手法を開発した。実験水槽において海亀の脱出実験を行ったところ,日本の定置網に入網する代表的な海亀種であるアカウミガメ,アオウミガメでは全ての個体が脱出に成功し,その有効性が示された。定置網における海亀混獲個体の死亡削減を目的として,箱網の天井網部に装着する脱出装置が考案されている。こうした装置に海亀を効率よく誘導するために,天井おか綱を傾斜させた実験用箱網内での海亀の行動を観察し,その行動制御の可能性を検討した。実験に用いた箱網の形状は,底面8m×8 m,高さ1mの箱型の網(以後,箱網),同網の天井網中心部を10°の傾斜で引き上げた網(以後,天井部10°網),底面8m×8mに20°で天井網を配した四角錐型の網(以後,天井部20°網)の3種類であり,これらの網を八重山栽培技術開発センターの屋外水槽(10m×10m×2.1m)に設置した。実験にはアカウミガメの飼育個体5頭(直甲長42.8cm-50.0cm)を用い,箱網内に入れたアカウミガメ1個体の行動を,網の上方から撮影したビデオカメラと背甲に装着した小型水深計(アレック電子社製)で記録した。得られた映像からアカウミガメの頭部の水平位置を5秒ごとに記録し,移動軌跡と滞在頻度を求めた。実験の結果,いずれの網においても海亀は,実験開始から5分間程度は網内の側面付近で遊泳・滞在する場合が多いものの,その後,全ての個体で頭部を上に向けて天井網を突き上げる行動が見られた。こうした突き上げ行動は,箱網および天井部10°網では網の側面付近で生じ,突き上げる位置の時間経過に伴う変化はほとんど見られなかった。一方,天井部20°網では,天井網を突き上げながら中央部(頂点)へ移動していった。天井網に傾斜をつけることで,突き上げ行動を行う海亀を誘導できる可能性が示された。本年度では,箱網の天井たに装着して海亀を網外へ脱出させる装置を考案し,試作した脱出装置を試作して海亀の脱出実験を行い,脱出の可否,および脱出時の行動を調べた。試作した脱出装置は,一辺1.5mのトリカルネット(タキロン社製N-24,以後トリカル)の中心部を一辺1.0mの正方形を切除して設けた脱出口と,これを覆う一辺1.05mの正方形の扉で構成されている。扉の装着部分の一部をトリカルに重ね合わせることで,押し開けられた扉はトリカルの復元力で自動的に閉じる。底面3m×3m,高さ約1.5mの箱型の網の天井部に,扉の重ね合わせ幅を5, 10, 20cmに設定した脱出装置を装着して実験に供した。実験にはアカウミガメの飼育個体13頭(標準直甲長48.8-81.2cm,甲幅40.1-65.3cm)を用い,網内に入れたアカウミガメ1個体の脱出の成否を記録するとともに,脱出時の行動を網の上方と測方からビデオカメラで撮影し,脱出までの経過時間を計測した。計50回の実験すべてにおいてアカウミガメは脱出に成功した。脱出時には,頭部や前肢で扉を持ち上げながら,水面へ向かって直線的に遊泳して脱出する場合,あるいはその隙間から体をひねるようにして脱出する場合が見られた。大型の個体では,頭部や前肢を用いずに,甲羅で扉を持ち上げて脱出する場合が見られた。重ね合わせ幅が小さいほど,また大型の個体ほど,脱出に要する時間は短い傾向にあった。漁獲物の逃避を防ぐために,扉の閉鎖に要する時間を短縮できる重ね合わせ幅20cmの場合においても,小型の個体は十分に脱出が可能であった。中層・底層定置網の箱網に迷入した海亀を網外に逃避させるために,脱出口とそれを覆う扉で構成される海亀脱出装置と,天井網の傾斜により本装置へと海亀を誘導する手法による海亀脱出支援システムを考案した。本研究では,アカウミガメ,アオウミガメ,タイマイを用いて,本システムを備えた実験用箱網内における海亀の行動と脱出の成否を調べた。実験には,アカウミガメ11個体(甲長67.6-75.6cm),アオウミガメ6個体(同38.6-64.4cm),タイマイ12個体(甲長45.4-57.5cm)を用いた。2m×2mのトリカルネットの中心部に設けた1m×1mの脱出口と,これを覆う長方形の脱出扉で構成される脱出装置を天井網の中央部に装着し,この天井網中央部に向かって天井網に約20度の傾斜を配した実験用箱網を屋外水槽(10m×10m×2.1m)内に設置し,実験網内に入れた海亀1個体の時刻別位置を水中および網の上方からビデオカメラで撮影し,海亀の行動と脱出の成否を調べた。

実験に用いた全ての個体において,頭部を上に向けて体軸をほぼ垂直にしながら天井網を突き上げる行動(以後,突き上げ)が見られ,その頻度は時間経過に伴って高くなった。アカウミガメは天井網を連続して突き上げながらより浅い方に誘導されるなどして,またアオウミガメは天井網の傾斜に沿って遊泳して脱出装置に遭遇し,全ての個体が脱出に成功した。一方,タイマイでは連続した突き上げはほとんど見られなかった。天井網の傾斜に沿って移動して脱出装置に遭遇する例は多く見られたものの,脱出扉を連続して強く突き上げることがないために,脱出に成功した個体は約半数であった。
アレルギー治療における抗原特異的ワクチン開発の研究

犬においてアレルギー疾患が多く報告されている。その中でもスギ花粉症の犬はアレルギー全体の10%程度を占め、ダニアレルギーに次いで重要なアレルギー疾患である。アレルギー治療研究の分野において乳酸菌が注目され、乳酸菌におけるTh1誘導能およびIgE産生抑制効果が示されている。本研究においてスギ花粉症に対する抗原特異的な免疫療法として、安価に製造可能なスギ花粉アレルゲン遺伝子組換え乳酸菌を用いたワクチンを開発することを目的としている。ベクターとして、乳酸菌:Lactobacillus casei(ATCC393)を用いた。L.. caseiにおける発現に成功しているLLOとの融合タンパクとして発現されるようにデザインしたプラスミドベクターを作製し、ム.oε5θグに導入した。本研究では、N末端から158-329番目のアミノ酸を含むスギ花粉アレルゲンであるCry j 1(Cry j 1_<158-329>;約20 kDa)を用いた。このCry j 1はヒトおよびBALB/cマウスのCD4+T細胞が認識するT細胞エピトープを含んでいる。LLOは、Listeria monocytonegesの菌体由来タンパクであり、LLO白体にマウスの脾臓細胞からTh1サイトカインを誘導することが明らかとなっている。LLOは溶血毒性を有するため、本研究では、溶血毒性をもたらすドメインを欠損させた変異LLOを用いた。抗LLO抗体を用いたウェスタンブロット法では、Cry j 1_<158-329>-LLO導入株で約60kDaのバンドを、LLO導入株では約40kDaのバンドを検出した。この分子量の違いはCry j 1_<158-329>(20kDa)の分子量と一致することから、導入したCry j 1_<158-329>は発現していると予想される。また、LLOからCry j 1_<158-329>にわたるシークエンスを増幅するようにデザインされたプライマーペアを用いたRT-PCRによって、Cry j 1_<158-329>mRNAの発現も確認した。これらの結果は、この組換えL.. caseiにおけるCry j 1_<158-329>の発現を示している。このリコンビナント乳酸菌によるIL-12P70誘導能をBALB/cマウスの脾臓細胞で検討した結果、LLOの発現によってIL-12の産生が増強されることが明らかになった。

ベクターとして、Lactobacillus casei(ATCC393)を用いた。この株に対してCry j 1全長をコードするcDNAを組み込んだプラスミドベクターをエレクトロポレーション法で導入した。しかし、Cry j 1の発現は確認されなかったため、既にL.caseiにおける発現に成功しているLLOとの融合タンパクとして発現されるようにデザインしたプラスミドベクターを作成し、L.caseiに導入した。すなわち、N末端から158-329番目のアミノ酸を含むCry j 1(Cry j 1_<158-329>;約20kDa)を用いた。このCry j 1はヒトおよびBALB/cマウスのCD4+T細胞が認識するペプチド断片(T細胞エピトープ)を含んでいる。LLOは、Listeria monocytonegesの菌体由来タンパクであり、LLO自体にマウスの脾臓細胞からIFN-gamma, IL-12,およびIL-18などのTh1サイトカインを誘導することが明らかとなっている。LLOは溶血毒性を有するため、本研究では、溶血毒性をもたらすドメインを欠損させた変異LLOを用いた。コントロールとして、LLOのみ導入した株と空のベクターを導入した株も作成した。今後、これらの株に関して、スギ花粉アレルゲンであるCry j 1の発現を検討する予定である。犬においてアレルギー疾患が多く報告されている。その中でもスギ花粉症の犬はアレルギー全体の10%程度を占め、ダニアレルギーに次いで重要なアレルギー疾患である。アレルギー治療研究の分野において乳酸菌が注目され、乳酸菌におけるTh1誘導能およびIgE産生抑制効果が示されている。本研究においてスギ花粉症に対する抗原特異的な免疫療法として、スギ花粉アレルゲン遺伝子組換え乳酸菌を用いたワクチン開発を目的としている。ベクターとして、乳酸菌:Lactobacillus casei(ATCC393)を用いた。L.caseiにおける発現に成功しているLLOとの融合タンパクとして発現されるようにデザインしたプラスミドベクターを作製し、L.caseiに導入した。本研究では、N末端から158-329番目のアミノ酸を含むスギ花粉アレルゲンであるCry j 1(Cry j 1_<158-329>;約20kDa)を用いた。このCry j 1はヒトおよびBALB/cマウスのCD4+ T細胞が認識するT細胞エピトープを含んでいる。LLOは、Listeria monocytonegesの菌体由来タンパクであり、LLO自体にマウスの脾臓細胞からTh1サイトカインを誘導することが明らかとなっている。抗LLO抗体を用いたウェスタンブロット法では、Cry j 1_<158-329>-LLO導入株で約60kDaのバンドを、LLO導入株では約40kDaのバンドを検出した。この分子量の違いはCry j 1_<158-329>(20kDa)の分子量と一致することから、導入したCry j 1_<158-329>は発現していると予想される。