hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超高感度磁気センサを用いた新しいイミュノアッセイシステムの構築

今回用いたDNA試料は2本鎖であったので、今後、1本鎖DNAを用いて、反応させる方法の検討をすすめる。抗原抗体の検出には、酵奉標識検出法(ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay)が最も広く使用されている。この方法は、抗体がアルカリ性のフォスファターゼ酵素によって標識され、酵素と反応した基質からの光の吸収を検出することによって測定される。しかし、ELISAには高いバックグラウンドが存在し、また、退色が生じるので長時間の観察が出来ないなどの欠点がある。近年、超伝導現象を利用したSQUID (Superconducting Quantum Interference Device)磁気センサーの研究開発が進展し、液体窒素を冷却材として利用できるものも開発されている。SQUID磁気センサーは非常に高感度であり、抗原抗体反応の検出に利用できると思われる。我々は従来法である酵素標識検出法に代わる高温超伝導SQUID磁気センサーを用いた新しい抗原抗体反応検出法の検討を行っている。昨年度までにDNA断片の固定法の検討を行ってきたが、今年度はナノサイズの磁性微粒子の交流磁界下での挙動に注目して分析をおこなった。その結果、交流磁界下においては磁気モーメントのみが回転するのではなく、微粒子が物理的に回転することが判明した。また、固定法に付いてもさらに効率の良い方法を検討し、従来用いていたビオチン・アビジン反応を用いず、直接DNAをチオール基で修飾する方法を見いだした。
EGFR変異肺癌におけるTOPKの役割の解明

T-LAK cell-originated protein kinase (TOPK)は、免疫系細胞などの増殖や分化に関与する蛋白キナーゼである。正常組織には殆ど存在せず、がんの増殖に関わっていることが報告されている。久留米大学で手術を受けた非小細胞肺癌210症例について、肺癌組織におけるTOPKの発現を解析した。TOPKの発現は152例で認められ、陽性率は全体の72.4%であった。女性、非扁平上皮癌患者、EGFR遺伝子変異陽性の患者でTOPKの発現が多かった。TOPKが発現している患者群では、発現していない患者群と比較して、統計学的には有意ではないものの、生存期間が短い傾向が認められた。2.肺癌患者組織検体におけるTOPK発現と、EGFR変異を含む臨床病理学的特徴および予後との関連の検討非小細胞肺癌患者の手術検体、265例について臨床情報、病理学的所見を収集した。現在、これらの組織検体から4μm厚の未染スライドを作成中である。これらのスライドを用いてTOPKの免疫染色を行い、TOPKの発現と、EGFR遺伝子変異や臨床病理学的特徴、および予後との関連について解析する。免疫染色のための抗体の入手に時間を要した。2.肺癌患者組織検体におけるTOPK発現と、EGFR変異を含む臨床病理学的特徴および予後との関連:臨床情報を収集した265例の非小細胞肺がん手術症例のうち、病理組織の保存検体が存在し、TOPKの発現を免疫組織学的に解析可能であった症例が218例であった。それらの症例においてTOPKの発現を免疫染色を用いて解析を行った。TOPK発現例では、非発現例よりも予後が不良な傾向が示された。また、TOPKの発現は、EGFR遺伝子変異陽性例において、統計学的有意に多く認められ、申請者の仮説に沿った結果であった。現在、1EGFR阻害薬耐性株におけるTOPK発現、2EGFR陽性およびEGFR野生型肺癌細胞株に対して、EGFR阻害薬(Gefitinib、Erlotinib)で処理を行い、survival signal(Akt、Erk、mTOR、S6)とともにTOPKの発現が抑制されているか、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、リアルタイムPCRによる解析、3TOPKをノックダウンした場合のEGFRのシグナルの変化、を解析中である。平成27年度に得られた結果をもとに、計画に従って研究を推進していく。肺がん若干の進捗状況の遅れにより、平成27年度に購入予定であった試薬・抗体の購入を延期したため。進捗状況に従い、平成28年度に試薬・抗体を購入し、実験を遂行する。
赤外分光による不安定分子種の電子構造の研究

超音速自由噴流中にのみ存在するラジカルやクラスター等の不安定な分子種についての赤外分光を試みた。ラジカルやカチオン等の分子種については、赤外吸収の観測には至らなかったが、ピリジンやフェノール等のフッ素誘導体と水との水素結合クラスターについて赤外吸収の測定を、超音速自由噴流中において行った。実験結果及び分子軌道計算の結果より、2-フルオロピリジンの1:2,1:3クラスターは環状構造をとることがわかった。さらに、CH伸縮振動のスペクトル構造はピリジン環の周りの環境に非常に敏感であった。さらに、水素結合した水の変角振動の倍音がクラスターサイズを大きくすると強く現れた。2,6-ジフルオロフェノール-水クラスターの電子スペクトル及び赤外吸収スペクトルを観測した。基底状態において、フェーノール-水クラスターの構造とほとんど同じであった。フェノール-水の1:2クラスターについては、電子励起状態において赤外吸収は観測することはできないが、これは環状構造が鎖状構造に構造変化するためとされている。2,6-ジフルオロフェノール-水クラスターについては電子励起状態における赤外吸収も観測することができた。その結果、フェノールのOH基の酸素と結合した水のOH伸縮振動の振動数が電子励起状態において、基底状態に比べ高くなっていた。これは、この間に働く水素結合が電子励起により弱くなっていることを示している。従って、比較的水素結合の弱いフェノール-水クラスターは電子励起により環状構造が安定ではなく、鎖状構造に構造変化するという推測を裏付けた。さらに、分子軌道計算により、1:2クラスターはかなり歪みがかかった構造であり、これが電子励起状態における構造変化の原因になっていることが結論された。今年度は、生体物質として重要なピリジンの誘導体である2-フルオロピリジン(FP)-水及び2,5ジフルオロフェノール(DFP)-水の2つのクラスターについて実験を行った。今回測定対象とした分子は通常の状態では全く存在せず、超音速自由噴流中のみで存在できる不安定な分子種ある。FP-水クラスター分子の電子スペクトルは、これまですでに観測されていたが、今回水素結合した水の吸収スペクトルを測定することにより、水が確かにピリジンの窒素原子の孤立電子対に結合することを明らかにした。また、2個目の水分子は1個目の水分子に結合することが分かり、2個目の水が結合することによって、水と窒素原子との水素結合が強くなることが結論された。これらの結果は分子軌道計算の結果からも裏付けられ、ピリジシ分子の水素結合について、初めてミクロな立場から水素結合の様子を明らかにした。これまでフェノール-水の水素結合体について様々な研究がなされておりフェノールに水が2個結合した分子については、水を含んだ3個のOH結合により環状構造をとるといわれてきた。今回DFPと2個の水が結合したクラスターのOH伸縮振動の赤外吸収スペクトルを測定したところ、フェノールの場合とは異なる赤外吸収スペクトルが得られ、フェノールの場合と異なる構造であることが示唆された。この構造は3個のOH基が環状になるのではなく、水分子が線状に結合した構造になるのではないかと考えているが、現在分子軌道計算を並行して行い、この構造について研究を行っている。当初、不安定な分子種であるラジカル等の分光を目指したが、ラジカル生成の際の放電発光によるノイズのため、ラジカル等の電子スペクトルの観測には成功したが、赤外スペクトルの測定には至らず、超音速分子流中においてのみ存在する分子クラスターを中心に研究を行った。特に、水が水素結合において水素供与体として振る舞う2-フルオロピリジン、及び水が水素受容体として振る舞うジフルオロフェノールについて水クラスターの赤外吸収を測定した。2-フルオロピリジンの1:1,1:2,1:3クラスターの赤外吸収を観測した。

この結果、CH結合がわずかではあるが水と相互作用し、クラスター構造を形成する上で重要であること、さらにCH伸縮振動の赤外吸収スペクトルはピリジン環の周りに存在する水の構造を敏感に反映することが示された。さらに、freeの水分子では強度の弱い変角振動の倍音がクラスター形成により非常に強く出現し、これはクラスター形成により変角振動の非調和性が大きくなるためであると結論された。フェノール-水の1:2クラスターは励起状態において素早い構造変化のために励起状態における赤外吸収は観測されない。同じようなクラスターの構造をとると考えられる、ジフルオロフェノール-水の1:2クラスターの励起状態における赤外吸収を測定したところ、このクラスターは1:1クラスターに比較して、励起状態において水素結合はあまり強くならないことが分かった。これは、1:2クラスターは環状構造をとるためかなり歪みがかかった構造であり、環が開いた構造とのエネルギー差は非常に小さく、フェノールの励起状態において、安定エネルギーが基底状態と逆転するため構造が変化すると結論された。
カルシウムシグナルによる心肥大誘導メカニズムの解析とその制御法の確立

心肥大に関与する転写因子NFATファミリーとその活性化因子カルシニューリンについて、特異的阻害剤の開発およびNFATサブタイプ特異的な機能の解明をおこなった。アルファースクリーン法による、NFATとカルシニューリンとの結合を定量的に、かつ迅速に解析するシステムを構築した。このシステムを用いて、カルシニューリンとNFATの結合を阻害する、NFAT由来のペプチドや、低分子化合物のスクリーニングをおこなった。スクリーニングの結果複数の低分子化合物が結合阻害活性を示した。さらに、レポーターアッセーを用いて、NFAT依存的転写誘導活性に対する効果を検討したところ、その中の複数の化合物は、転写誘導活性を阻害した。リンパ球において、内在性のNFAT制御遺伝子の発現が抑制されることも確認された。NFATのカルシウム制御領域に見いだされるカルシニューリン結合領域(CNBR;Calcineurin Binding Region)として、N末に位置し、各サブタイプで保存されているCNBR1とC末に位置し、CNBR1より保存の程度が低いCNBR2の解析を行ったが、これらの結合領域では、サブタイプによる差異は見いだされなかった。新たにCNBR1とCNBR2にはさまれた部分に存在し、核局在シグナルを含む領域が、第3のカルシニューリン結合領域であることを見いだした(投稿準備中)。この結合領域の配列を含むペプチドは、NFAT1およびNFAT2のカルシニューリンに対する結合は阻害するが、NFAT3およびNFAT4の結合は阻害せず、サブタイプ特異的な結合領域であることが示された。各NFATサブタイプのカルシウム制卸領域とカルシニューリンの結合を、増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ法(パーキンエルマー社アルファスクリーンシステム)により測定する実験系を樹立した。その結果、すでに一部のNFATサブタイプで報告されているように、NFATカルシウム制御領域のN末側とC末側の部分に、カルシニューリン結合活性を露めたが、さらに多数のリン酸化されるセリン残基を持つ、中央部分にも結合活性が検出された。NFATとカルシニューリンは少なくとも3種類の異なる領域を介して結合していることが明らかとなった。各結合領域のカルシニューリンに対する結合親和性を詳細に解析しており、すでに報告されている結合配列より、さらに親和性の高い結合配列の同定を試みている。Structure-based drug designの手法を利用して、予想されるNFATとカルシニューリンの結合領域に結合できる、低分子化合物候補を予測し、それらの結合阻害活性を我々の樹立した実験系で検討し、結合阻害活性を持つ分子を複数同定した。この探索を継続するとともに、心筋に対して、細胞レベル、個体レベルでのこれらの低分子化合物の活性を検討する予定である。心筋細胞への遺伝子導入法として、アデノウイルスベクターよりウイルス作製が簡単で短時間で完了するレンチウィルスベクターを試みたところ、充分高い効率で遺伝子導入できることを見いだした。NFATサブタイプ特異的なsiRNAを多数作製し、リンパ球細胞株において、効果の高いものが得られた。今後心筋細胞での効果を検討する。心筋細胞へは、レンチウイルスベクターを用いて遺伝子導入をおこなった。GFPを発現するベクターで、導入効率を検討したが、導入遺伝子の効果を解析できるのに必要な導入効率が得られなかった。

NFATのカルシウム制御領域に見いだされるカルシニューリン結合領域(CNBR ; Calcineurin Binding Region)として、N末に位置し、各サブタイプで保存されているCNBR1とC末に位置し、CNBR1より保存の程度が低いCNBR2の解析を行ったが、これらの結合領域では、サブタイプによる差異は見いだされなかった。新たにCNBR1とCNBR2にはさまれた部分に存在し、核局在シグナルを含む領域が、第3のカルシニューリン結合領域であることを見いだした(投稿準備中)。この結合領域の配列を含むペプチドは、NFAT1およびNFAT2のカルシニューリンに対する結合は阻害するが、NFAT3およびNFAT4の結合は阻害せず、サブタイプ特異的な結合領域であることが示された。
小児肝癌に対するRNA干渉によるβ-カテニン発現抑制と抗腫瘍効果に関する研究

小児肝悪性腫瘍である肝芽腫や肝癌においては、細胞内でβ-カテニン蛋白の過剰発現と核への異常集積が生じ、これが腫瘍形成に関連すると考えられている。β-カテニン遺伝子の欠失変異を持つ小児肝癌細胞株HepG2、点突然変異を有する肝芽腫細胞株Huh-6、さらにβ-カテニン遺伝子変異を有さない肝芽腫細胞株Huh-7において、RNA干渉を用いてβ-カテニンの発現抑制を得ることを試み、そうした条件下で細胞増殖能が抑制されるか否かを検討した。β-カテニン遺伝子変異を有するHepG2ならびにHuh-6では、siRNA処理によりβ-カテニンの発現はRNA、蛋白両者のレベルで著明な抑制が得られた。また。これに伴って下流の標的遺伝子であるCyclin D1、c-mycの発現が、両細胞株で低下することが観察された。細胞増殖能についても、両細胞株において、処理一日後より有意に生存細胞数の低下を認め、4日目までこの細胞数から判定した細胞増殖能についての抑制が持続した。一方、β-カテニン変異のないHuh-7においてもsiRNA処理によりβ-カテニンの発現抑制が得られたが、Cyclin D1、c-mycの発現低下や、細胞増殖能の抑制にはつながらなかった。本研究を行うことにより、小児肝悪性腫瘍である3種の肝芽腫および肝癌の細胞株において、RNA干渉の手法により著明なβ-カテニンの発現抑制が得られることが示された。またこの抑制がβ-カテニン遺伝子異常を有するHepG2ならびにHuh-6においては有意な腫瘍増殖抑制の効果をもたらすことが明らかとなり、当該小児肝腫瘍においてはβ-カテニンが遺伝子治療の特異的な標的となりうる可能性が考えられた。また。小児肝悪性腫瘍である肝芽腫や肝癌においては、細胞内でβ-カテニン蛋白の過剰発現と核への異常集積が生じ、腫瘍形成に関連すると考えられている。今回小児患者由来の肝癌細胞株HepG2を用いて、RNA干渉によるβ-カテニン発現抑制を試みる実験を行った。この細胞株ではβ-カテニン遺伝子の遺伝子内欠失変異(コドン25141の欠失)があることと、抗β-カテニン抗体を用いた蛍光免疫染色にて、この細胞にはβ-カテニンが核に異常集積していることが確認されている。次にHVJ-エンビロープを用いて、β-カテニンsmall interference RNA(siRNA)の細胞導入を行った。細胞導入後のβ-カテニンおよびWntシグナルの下流の標的遺伝子の発現量をReal time RT-PCR法ならびにWestern-blot法にて検討した。また、siRNAにて処理した細胞の細胞増殖能の変化についても観察した。結果は、siRNA処理によりβ-カテニンの発現はRNA、蛋白両者のレベルで著明な抑制が得られた。下流の標的遺伝子としてCyclin D1、c-mycの発現をとその変化を検討したところ、c-mycに於いてβ-カテニンの発現抑制に伴なって発現が低下することが観察された。細胞増殖能については、処理一日後より有意に生存細胞数の低下を認め、4日目までこの細胞数から判定した細胞増殖能をと関する抑制は持続した。よってHepG2においては、RNA干渉によりβ-カテニンの発現は著明に抑えられ、このことはWntシグナルの標的遺伝子の発現も抑制するとともに細胞増殖増殖能に対しても抑制効果を発揮しており、分子標的治療の候補としての可能性が考えられた。現在、対象細胞を肝芽腫細胞であるHuh-6(β-カテニン遺伝子点突然変異を有する)に広げて、異なる小児肝癌細胞においても同様の効果が見られるか否かを検討中である。

平成16年度にはβ-カテニン遺伝子の欠失変異を持つ小児肝癌細胞株HepG2において、RNA干渉を用いたβ-カテニンの発現抑制を行うことにより、細胞増殖能が抑制されることを示した。17年度ではさらに検討対象を肝芽腫細胞のHuh-6(β-カテニン遺伝子点突然変異を有する)に広げて、異なる小児肝腫瘍においても同様の効果が見られるか否かを、β-カテニン遺伝子変異を有さない肝芽腫細胞Huh-7との比較の上で検討した。Huh-6は、コドン34にmisssense変異を有し、変異β-カテニンは核に異常集積していることが確認されている。siRNA処理によりβ-カテニンの発現はRNA、蛋白両者のレベルで著明な抑制が得られ、これに伴って下流の標的遺伝子であるCyclin D1、c-mycの発現も、両者とも低下することが観察された。細胞増殖能についても、HepG2の場合と同様に、処理一日後より有意に生存細胞数の低下を認め、4日目までこの細胞数から判定した細胞増殖能に関する抑制は持続した。一方、β-カテニン変異のないHuh-7においては、siRNA処理によるβ-カテニンの発現抑制は、Cyclin D1、c-mycの発現低下や、細胞増殖能の抑制にはつながらなかった。これらの結果より、β-カテニンの発現を抑制することは、β-カテニン遺伝子異常を有する小児肝悪性腫瘍において、腫瘍増殖抑制の効果をもたらし、遺伝子治療の特的な標的となりうる可能性が考えられた。
場の理論における低エネルギー定理とその応用についての研究

3次元フェルミ場の理論で一般的に成立する一つの低エネルギー定理が導びかれた。電圧に直交する電流に対する伝導度が低エネルギー定理を満たす量である。引き続いて、磁場中の系である量子ホール効果の系に対して同種の議論が適用され、量子ホール効果が普遍的な性質を持っていることが示された。電流保存則から帰結されるWard-高橋恒等式を使い、ホール伝導度がトポロジー的に不変な量であり、粒子状態が局在状態にあるエネルギー領域では、相互作用等に無関係に厳密に量子化される特殊な物理論であることが示された。ホール伝導度の量子化された値への量子電気力学(QED)の高次効果からの補正の有無についてもしらべられ、高次効果からの補正は電子の電荷eを使い規格化した電流値及び電圧値を使う時には全っくなくなることが示された。ホール効果はベクトルポテンシャルによるChern-Simons項として表現される。Chern-Simons項をもつゲージ理論は通常のゲージ理論とは性質を異にする。このような理論の力学的性質をしらべつつあり、明白に共変な量子化が予質なく行なえることが示され、また理論の古典解が求められた。以上のものとは独立な仕事として、エネルギーテンソルとテンソルメソンとの結合定数をテンソルドミナンスの仮定のもとに求め、実験を比較し、テンソルグルーボールについての一つの知見をえている。3次元時空間上でのフエルミ場の理論における一般的な低エネルギー定理の証明がなされ、それの応用として強磁場下での非相対論的な電子系での量子ホール効果における、ホール伝導度の量子化の厳密性が示された。ホール伝導度のトポロジカルな性質、即ち、これが3次元運動量空間から、2点関数空間一の写像の巻き数であること、が明らかにされ、これを使って前記の証明がなされた。この証明に使われているのは、電流演算子の量子力学的な保存則であり、これは一般的に成立する関係式であるため、不純物の存在、相互作用の存在等のもとでも適用しうる。2点関数の性質は一体状態が局在しているか、または拡がっているかにより大きく異なる。この違いがトポロジカルな量に与える影響も明らかにされいわゆる伝導度がプラトーを持つことが局在と対応していることが、場の量子論的な計算のもとでも確められた。そこでの伝導度の値の量子化が、相互作用があるときにも成立することが厳密に示された。以上の計算は実時間量子論としての成果である。有限温度下での平衡状態に対するホール伝導度の量子化についても、同様のことが示された。有限温度下では一体波動関数の局在は必らずしも必要ではなく、平衡状態であるというだけで十分である。以上のように実験で得られている結果の厳密性が示されたので、量子ホール効果からの結果を使い、量子電気力学(QED)のテストがなされ得るものである。マクロな物質間の相互作用は,電子と光との基本的な相互作用である量子電気力学(QED)から導びかれる.このため,厳密な低エネルギー定理の確立の証明に際しては,これが物性現象に関する場合であっても, QEDにまでさかのぼり調べられる必要がある.このような観点のもとに, 4次元QEDより出発して, 2次元電子系を実現する半導体で観測されている量子ホール効果の厳密性,即ちσ_<x*2>=0のときの量子化されたホール伝導度の値が厳密にe2/hの整数倍となることが示された.時空4次元のQEDから出発した場合には, vintual状態に関する積分より発散項が出て来るので,くり込み理論を使い計算する.その際電荷は物質の効果を通して,真空中での値からずれることがありうるわけであるが,その効果は電圧と電流との両方にあらわれ,結局観測される伝導度にはこの補正はないことが明らかとなった.軸性アノマリーの効果は, 3次元ゲージ理論ではChern-Simon項の存在を導びく.

この係数に対して低エネルギー定理が成立するわけであるが,一方この項を含むゲージ理論の解析が進行中である.電荷間の力はクーロン的なものから変わり,またこの自由度は通常の波にもなっていない,等が得られておりゲージ不変る理論であっても性質は特異である.以上とは異なり,アノマリーとは無関係な近似的に成立する低エネルギー定理についての議論も展開された.テンソルメソンがエネルギー運動量テンソルと強く結合することより近似的に成立する和則を強い,スピン2のグルーボールがJ/4粒子の光を伴う崩壊で作られる確率が計算された.これよりグルーボール候補として知られているθ(1720)がグルーボールである強い証拠が得られた. O^^-のグルーボール候補とあわせて,グルーボールの存在がほとんど確かなものになり, QCDの正当性を示す直接的証拠が得られたことになる.相互作用のある系での低エネルギー定理は、系の詳細によらない値が具体的に計算可能であり、かつ実験で観測可能である量に対して成立する時特に有役でありその持つ意味は大きい。本研究で詳しく研究された3次元フェルミ場の理論で成立する低エネルギー定理は、電圧に直交する方向での伝導度に対して成立する。伝導度は観測可能であるため、この低エネルギー定理は電気伝導現象に対して適用された。磁場中の電子系に対して新しい表現法を使うことにより、定理の証明が本研究で以前なされていたが、当該年度はこの方法が改善され具体的なホール伝導度の計算が可能となった。これにより我々の方法と今までの他の方法との比較も可能となり、また磁場中での電子系の場の理論が取り扱い易いものとなった。我々の方法では、局在の問題も比較的見通しよく取り扱われる。実際局在が起きることが示された。また4次元QED量子ホール効果への補正がないことも示された。量子ホール効果に対する低エネルギー定理がほとんど確立した。また、3次元ゲージ理論の性質に関する研究も進行中であり、Chern-Simons項を持つゲージ理論の面白い古典解が得られており、また明白に共変な方法に基づく量子化が矛盾なく行なえることが示された。
Bach2遺伝子欠損マウスを用いた続発性肺胞蛋白症発症機構の解明

肺胞マクロファージにおけるBach2は、T細胞から分泌されるサイトカインによって発現が誘導され、炎症関連遺伝子や、脾臓赤脾髄マクロファージ特異的な遺伝子に結合し、その発現を抑制することで肺胞マクロファージとしての正常な機能を維持していた。Bach2遺伝子欠損マウスにおいて、CD4陽性T細胞を枯渇させると肺胞蛋白症が治癒することを見出し、T細胞を標的とした治療が肺胞蛋白症の新規治療となりうることを発見した。Bach1/Bach2二重欠損マウスは、Bach2遺伝子欠損マウスより早期から重篤な肺胞蛋白症を発症することを発見し、これら2つの転写因子が相補的に肺の恒常性を維持していることを報告した。1)肺胞マクロファージにおけるBach2の機能の解明:1-1)マイクロアレイ解析の結果、Bach2遺伝子欠損マウスの肺胞マクロファージでは、肺胞マクロファージ特異的な遺伝子発現パターンを失う一方で、脾臓赤脾髄マクロファージなどに特異的な遺伝子発現パターンを示していた。1-2)ミエロイド系細胞を用いたChIP-seqにおいて、Bach2は多くの炎症関連遺伝子や、脾臓赤脾髄マクロファージ特異的な遺伝子に結合し、その発現を抑制していた。2) Bach1/Bach2二重欠損マウスの解析:Bach1は様々な細胞や組織で発現する転写抑制因子である。Bach1遺伝子欠損マウスは肺胞蛋白症を発症しないが、Bach1/Bach2二重欠損マウスは、Bach2遺伝子欠損マウスと比較してより早期から重篤な肺胞蛋白症を発症することを発見し、肺恒常性におけるこれら2つの転写因子の相補的機能を報告した(J Biochem. 2016)。3)遺伝子改変マウスの表現型解析:3-1)Bach2/Rag2二重欠損マウス、B細胞・T細胞特異的Bach2遺伝子欠損マウスは、いずれも肺胞蛋白症を発症しなかった。3-2)T細胞特異的Bach2遺伝子欠損マウスの肺胞マクロファージにおいて、Bach2の発現が亢進していた。ChIP-seqの結果と合わせ、肺胞マクロファージにおいて、Bach2は、炎症反応に応答した機能喪失を抑えていることが明らかとなった。4)肺胞蛋白症における細胞間相互作用の解明:Bach2遺伝子欠損マウスの肺胞洗浄液中に、リンパ球の浸潤を認めた。T細胞においてBach2はIfngなどの炎症性サイトカインの遺伝子発現を抑制している。従ってBach2遺伝子欠損マウスの肺環境において、Bach2欠損T細胞で分泌されたこれらサイトカインが肺胞マクロファージの性質を変えている可能性が示唆された。計画段階では肺胞マクロファージを用いてChIP-seqを行う予定であったが、収集した肺胞マクロファージにおいて十分な量のBach2の蛋白質が確認できなかったため、代替としてミエロイド細胞株であるM1細胞を使用し、Bach2抗体によるChIP-seqを行うことに成功した。しかし、予算や時間の都合上、ヒストン修飾は調べないこととした。遺伝子改変マウスの作成や解析については順調に進行した。マウスの肺胞洗浄液を用いたサイトカインアレイを試みたが、濃度が薄いためか、当該サイトカインは検出できなかった。濃縮法を用いても検出できなかったため、サイトカインアレイは行わず、今後、T細胞特異的Bach2遺伝子欠損マウスのT細胞を用いた定量PCRで、いくつかの候補サイトカインの発現を調べる予定である。総合的な進捗状況として、一部、行えなかった実験はあるものの、代替手段をとることで解決可能と考えられ、概ね順調と思われる。また、T細胞特異的Bach2遺伝子欠損マウスの肺胞マクロファージにおいてBach2の発現が亢進していること、Bach1/Bach2二重欠損マウスにおける肺胞蛋白症の重篤化は予定外の発見であり、今後の研究の新たな方向付けとなった点で、今後の発展が期待される。1)肺胞マクロファージ(AM)におけるBach2の機能の解明:1-1)マイクロアレイを行ったところ、Bach2遺伝子欠損マウスのAMは、AM特異的な遺伝子発現パターンを失う一方で、脾臓赤脾髄マクロファージや腹腔マクロファージに特異的な遺伝子発現パターンを示していた。1-2) Chromatin immunoprecipitationsequence (ChIP-seq)を行ったところ、Bach2は多くの炎症関連遺伝子や、脾臓赤脾髄マクロファージ特異的な遺伝子に結合し、その発現を抑制していた。2)肺胞蛋白症における細胞間相互作用の解明:Bach2/Rag2二重欠損マウス、B細胞あるいはT細胞特異的Bach2遺伝子欠損マウスのいずれでも肺胞蛋白症を発症しなかった。しかし、T細胞特異的Bach2遺伝子欠損マウスの肺ではBach2遺伝子欠損マウスと同様の炎症細胞の浸潤を認め、AMにおけるBach2の発現は上昇していた。野生型のAMをIFNγで刺激すると、Bach2の発現が誘導された。以上から、AMにおいて、Bach2は、炎症反応に応答した機能喪失を抑えていると考えられた。

3) Bach1/Bach2二重欠損マウスの解析:Bach1遺伝子欠損マウスは肺胞蛋白症を発症しないにも関わらず、Bach1/Bach2二重欠損マウスは、Bach2遺伝子欠損マウスより早期から重篤な肺胞蛋白症を発症することを発見し、これら2つの転写因子が互いに相補的機能を持って肺の恒常性を維持していることを報告した(J Biochem. 2016 Dec)。4)肺胞蛋白症の新規治療法の発見:Bach2遺伝子欠損マウスにおいて、抗体を用いてCD4陽性T細胞を枯渇させたところ、肺胞蛋白症が治癒することを見出した(J Biol Chem. 2017 Nov)。肺胞マクロファージにおけるBach2は、T細胞から分泌されるサイトカインによって発現が誘導され、炎症関連遺伝子や、脾臓赤脾髄マクロファージ特異的な遺伝子に結合し、その発現を抑制することで肺胞マクロファージとしての正常な機能を維持していた。Bach2遺伝子欠損マウスにおいて、CD4陽性T細胞を枯渇させると肺胞蛋白症が治癒することを見出し、T細胞を標的とした治療が肺胞蛋白症の新規治療となりうることを発見した。Bach1/Bach2二重欠損マウスは、Bach2遺伝子欠損マウスより早期から重篤な肺胞蛋白症を発症することを発見し、これら2つの転写因子が相補的に肺の恒常性を維持していることを報告した。1)続発性肺胞蛋白症の新規治療法の開発:1-1)Bach2遺伝子欠損マウスの解析や、T細胞特異的Bach2遺伝子欠損マウスのT細胞を用いた定量PCRから、肺胞蛋白症の原因となり得るサイトカインを同定し、そのサイトカインのシグナルを抑制することで肺胞蛋白症が改善するかを調べる。1-2)続発性肺胞蛋白症患者もしくは非肺胞蛋白症患者から、肺胞洗浄液と末梢血を採取する。検体中に含まれる細胞の分画を、フローサイトメトリー解析により調べる。また、検体中に含まれる炎症性サイトカインをサイトカインアレイにより網羅的に調べ、肺や全身における炎症状態を評価する。以上の結果を、肺胞蛋白症患者と非肺胞蛋白症患者の間で比較し、肺胞蛋白症と炎症反応に関連があるかを検証する。続発性肺胞蛋白症と炎症反応に関連があり、Bach2遺伝子欠損マウスにおける肺胞蛋白症改善に効果がある薬剤が同定できた場合、その薬剤の臨床応用を検討する。2)ヒト続発性肺胞蛋白症におけるBach2の機能の解明:続発性肺胞蛋白症患者もしくは非肺胞蛋白症患者の肺胞洗浄液中の細胞や末梢血を用い、免疫染色・PCRでBach2遺伝子と関連遺伝子の発現を調べ、群間比較する。29年度が最終年度であるため、記入しない。呼吸器29年度が最終年度であるため、記入しない。
低流体ノイズ弁による空気圧ベローズ微動ステージのサブナノ位置決め制御法の開発

超精密位置決めの研究はナノからサブナノへと移ってきている。本研究では、圧電素子の欠点を補うアクチュエータとして空気圧ベローズを用い、超精密位置決め用の微動ステージを製作した。これがサブナノの位置精度を達成するために、駆動する弁から発生する微小な圧力変動をすきま流れを利用して低減する低流体ノイズ弁を開発し、同時にその制御法を検討した、その結果、最高水準のサブナノの位置精度を実現した。本研究では空気圧ベローズで駆動するサーボ弁からの流体ノイズを、すきま流れを利用した絞り弁により低減することによってサブナノの位置精度を実現とすることを目的としている。しかしながら、提案するその絞り弁の特性は低圧力差領域のみ調べられているだけであり、サーボ弁に使用される圧力領域の特性については不明であった。そこで22年度は、すきま流れを利用した絞り弁の特性について明らかにし、ステージを駆動するサーボ弁を実現することを目標に研究を行った。具体的にはすきま流れを利用した絞り弁を製作し、ステージ駆動に使用される0.5[MPa]までの圧力差と流量の関係を調べた。その結果、一般的な流量特性とは異なり、明確なチョーク領域はなく圧力流量特性は一般的な絞り弁より直線的であること、その関係はすきま流れの式を用いて理論的に算出可能なこと、一般的な絞り弁とは特性が異なるもののISO6358で規定されている空気圧機器の流量特性表示式を適用可能であることなどが明らかになった。得られた特性を利用して、すきま流れを利用した絞り弁と組み合わせるノズルフラッパ弁を設計し、低流体ノイズサーボ弁の製作を行った。そのサーボ弁の入出力圧力特性、圧力流量特性についても調べた。入力に対して出力圧力は線形であることが望ましいが、すきま流れを利用した絞り弁の特性のため非線形性が大きなサーボ弁となった。しかしながら、制御系の工夫次第で問題はなく、得られた圧力流量特性と併せて目標とするステージの駆動には、十分な特性を有することがわかった。平成22年度はすきま流れを利用した絞り弁の特性を明らかにした。これに基づいて、低流体ノイズサーボ弁の設計・製作し、非線形性が多少、強いもののステージを駆動するのに十分な圧力流量特性を有するサーボ弁を実現することができた。そこで平成23年度は、この製作した低流体ノイズサーボ弁の有効性を検討すること、同時に、これまで位置精度を悪化させていたステージの案内機構を弾性ヒンジから静圧案内に変更し、その効果についても検討することを目標に研究を行った。低流体ノイズサーボ弁の有効性の検討については、先に製作した弾性ヒンジのステージで用いた。サーボ弁に用いる絞りを一般的な絞り弁と提案したすきま流れを利用したサーボ弁を用いてステージを駆動し、無制御時に流体ノイズにより発生する位置のバラツキを調べ、標準偏差を用いてその大小により定量的に評価した。このステージを一般的なサーボ弁と低流体ノイズサーボ弁を用いてステージを駆動し、静止時の位置変動振幅の大きさを統計的に評価した。その結果、製作した低流体ノイズサーボ弁により流体ノイズによる位置変動振幅を低減できることが明らかになり、低流体ノイズサーボ弁の有効性を確認することができた。また、案内機構の変更による効果の確認については、市販の静圧軸受を利用して新たなステージを製作し、位置変動の周波数解析を行った。その結果、弾性ヒンジ案内のステージに見られたような高い周波数成分は見られず、ほとんど卓越した共振周波数成分もなかった。このことから案内の変更による効果も確認できた。このためには空気圧ベローズを駆動するサーボ弁から発生する圧力脈動、すなわち流体ノイズの低減が不可欠である。そこで、すきま流れを利用した絞り弁を用いることによって流体ノイズを低減した低流体ノイズサーボ弁を実現した。平成23年度は、さらに、これまで位置精度を悪化させていたステージの案内機構を弾性ヒンジから静圧案内に変更したステージを新たに製作した。この案内変更の効果と、低流体ノイズサーボ弁の有効性を検討し、無制御時には大幅に流体ノイズの影響が改善できることが示された。そこで24年度はステージの超精密位置決め制御を行い、制御時における低流体ノイズサーボ弁と静圧軸受案内への変更の効果を検証した。そのために、まずステージの位置制御システムを構築し、駆動制御アルゴリズムを検討した。昨年度までの改善効果により、高度な制御アルゴリズムを用いなくとも、単純なフィードフォワード制御とPI制御アルゴリズムにより、目標としたサブナノの位置精度を実現できることがわかった。また、また位置精度のみならず、アクチュエータの超精密位置決めの評価項目である再現性、分解能の点からも調べた結果、高い再現性と1nmの分解能を有することが明らかになった。

得られたステージの特性は、圧電素子で駆動するステージより長ストロークでありながらと精度は同等以上で、ストロークはと同等以上であり、空気圧ベローズによる超精密位置決めの優位性が示された。平成23年度の交付申請時の研究実施計画に記載した内容の実験を行なうことができた。低流体ノイズサーボ弁および案内を弾性ヒンジから静圧案内に変更した効果も確認でき、実験も予想通りの結果が得られた。公募時に予定した24年度に着手できることから順調に進展していると言える。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画通りの結果が得られていることから、最終年度である今年度も公募時の計画に基づいて進める。具体的にはステージの超精密位置決め制御を行い、制御時における低流体ノイズサーボ弁と静圧軸受案内への変更の効果を検証し、製作したステージの位置決め制御の評価を行う予定である。
学習者コーパスを用いた英文ライティング学習支援環境の構築

日本人大学生が産出した英文エッセイを収集し、文章としての論理展開情報と文法的な誤り情報を付与した学習者コーパスを構築した。この学習者コーパスに基づいて、日本人英語学習者にとって重要度の高い支援情報を選定し、ウェブ上に英文ライティング学習支援ツールを開発した。さらに、日本人大学生26名に本ツールを試用してもらい、ユーザビリティ評価を実施した。これにより、ツールの有用性と改善課題が明らかになった。平成20年度は、これまでに収集した日本人英語学習者(大学1年生)による英文エッセイに対して、以下の2つの課題に取り組んだ。英文エッセイには、英語母語話者による評点がつけられているため、英文ライティングの習熟度別にグループ分けできる。来年度に、習熟度に応じた英文ライティング学習支援環境の設計を行うため、その基盤となる言語資源(英語学習者によるオリジナル版と英語母語話者による添削版を対応づけ、さらに文章の情報構造に関連する言語情報を付加した英文エッセイデータ)の整備を実施した。なお、収集した手書きの英文エッセイは全て電子化済みである。(1)英語母語話者による英文エッセイの単純添削と元の英文エッセイとの対応づけ61人分の英文エッセイに対して、なるべく元の英文を活かした単純添削を英語母語話者(長年、英文添削を仕事としている英語母語話者)に依頼した。さらに、添削結果と元の英文エッセイを対応づけた電子ファイルを作成した。(2)文章の情報構造に関連する言語情報の検討と英文エッセイへの情報付加文章の情報構造に関する先行研究を調査し、文と文の間で話題がどのように推移しているかという話題の推移に着目することとした。これに基づいて、文と文の間の話題推移パターンを分類し、その分類番号を上記の英文エッセイに対して付加した。これらにより、英文ライティング学習支援環境の構築に必要な言語資源をほぼ開発できたため、今後、整備した言語資源をフルに活用した学習支援環境の設計に着手する。平成21年度は、これまでに構築した英語学習者コーパス(日本人大学生が作成した英文エッセイデータ)に対して誤り分析を行うとともに、英文ライティング学習支援環境のひとつのモジュールとして英語の語句の使用用例を検索・表示するツールを試作した。(1)英語学習者コーパスへの誤り情報の付与-学習者データのエラー分析日本人英語学習者がおかしやすい誤りを分析・特定することで、英文作成時に誤りを回避することを促す支援ツールを次年度に開発するための基礎データとした。誤りの内容を表すタグを電子化した英文エッセイに付加した。誤りタグの頻度をコンピュータで算出することで日本人英語学習者がおかしやすい誤りが明らかとなった。(2)英語語句の使用用例を検索・表示するツールの試作-KWICツールの試作英文ライティング学習支援ツールには、英語らしい表現の産出を促すための支援モジュールも搭載する予定である。この目的を達成するために、名古屋大学で構築された英語母語話者コーパスと日本人英語学習者コーパスを入手し、特定の語句を指定すると各々のコーパスから用例を検索して表示するツールを試作した。語句の使い方の差異が視覚化されるようにした。来年度は、(1)で付加した誤り情報に基づいて新規の支援モジュールを開発し、この新規モジュールと(2)で試作した支援ツールを統合する。さらに、日本人大学生に支援ツールを試用する機会を提供し、ツールとしてのユーザビリティを評価する。最後に、本課題の最終成果報告書をまとめる。最終年度にあたる平成22年度は、日本人英語学習者(大学生)が作成した英文ライティングに含まれる文法エラーを分析した結果に基づいて以下の研究を実施した。(1)頻度の高い文法エラーに関する学習支援ツールを開発前年度のエラー分析結果から出現頻度の高い文法エラーを選定し、エラーに関する説明文と複数の練習問題(解説を含む)をウェブ上に実装した。さらに、文単位のエラーだけでなく、文と文の繋がりに関する説明文と練習問題も追加した。練習問題として、従来のような独立した文単位での出題ではなく、日本人大学生にとって馴染みのある話題を扱ったパラグラフ(英語母語話者に作成依頼)を用いた(文脈情報を重要視した)点に新規性がある。(2)本研究で作成した英文ライティング学習支援ツールのユーザビリティ評価東京国際大学言語コミュニケーション学部の1・2年生26名に英文ライティング学習支援ツールを使用してもらい、使い勝手(usability)を中心としたユーザ評価を実施した。文法項目により説明文や練習問題の理解容易性に違いが生じたため、特に冠詞の使用法のように日本人英語学習者にとって難しい文法項目に関する支援方法の見直しが必要であること、文と文を繋ぐ談話構造に関しては英文ライティング授業の中で教員による説明とともにツールを使用したほうがよいこと、練習問題は難易度別に現在の問題数よりも多く提供されることが望ましいということがわかった。学習者コーパスに含まれる学習者のデータに基づいた英文ライティング学習支援ツールは、日本人英語学習者にとって重要度の高い課題を選択的に扱えるという利点を有することが明確になった。
がん化リスクのない多能性幹細胞の医療応用～新規培養法によるバイオエナメルの創製～

本研究は、我々の最終ゴールである未来の歯科インプラント“再生歯インプラント"に向けたエナメル質の再生、すなわち「バイオエナメル」による歯冠の再生を実現することを目的とした。本手法は、iPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞と新規器官培養技術を融合し、がん化・腫瘍化を生じることがない新しい再生医療技術である。本研究によって、器官培養のプロトコールの検証と改良にあわせて、ミニブタ胎生期エナメル上皮細胞株の樹立と歯性間葉系幹細胞を活用したバイオエナメルの創製法の確立を着実に進めた。本研究は、懸滴培養から灌流培養に移行する新規器官培養システムにより多能性幹細胞から胚子様モンスターを作製し、同組織に存在する歯胚原基からエナメル質形成細胞の分離を目指している。三胚葉に由来する組織から構成される胚子様モンスターを体外で作出できる本技術は、同モンスターがES細胞に由来する組織でありながら腫瘍化・がん化がみられない手法であり、多能性幹細胞からの機能性細胞の獲得法として新たなアプローチを提供している。本年度は、懸滴培養による胚様体形成から灌流培養に移行する一連の培養システムについて再検証を行い、さらに安定的に胚子様モンスターの形成ができるような培養プロトコールの改良を図っている。また、多能性幹細胞の医療応用を目的とした上記の研究と並行して、エナメル質の形成を担うエナメル芽細胞の特異的なキャラクターの解析のため、in vitroにおける安定的な細胞材料を得ることを目的とした細胞株の樹立を進めている。本年度は、クラウン系ミニブタ胎仔の歯胚の初代培養を通じて、エナメル上皮組織に由来する上皮細胞の分離と同定について報告した(Nakahara T et al. In Vitro Cell Dev Biol Anim 2015)。この実験は、歯胚組織から遊走してコンフルエントに達した初代培養から、目的の細胞集団を選択的に分離できる細胞操作技術“セル・フィッシング法"によって、敷石状を呈する細胞集団を分離した。その後、様々な解析に基づいてエナメル芽細胞の特徴を有する上皮細胞であることを明らかにした。以上のように、多能性幹細胞からのエナメル質形成細胞の誘導と細胞株の樹立、さらにヒトに準ずるミニブタのエナメル芽細胞株の活用によって、再生エナメル質「バイオエナメル」の創製を目指し、歯の再生を切望する患者や社会に貢献できる“安全な"再生医療技術の開発に努める。多能性幹細胞を用いたエナメル質形成細胞の分化誘導と細胞株樹立にあたり、懸滴培養による胚様体の形成から灌流培養に移行して胚子様モンスターを形成する高度な培養技術が必要となる。将来的なヒト多能性幹細胞の応用と臨床応用を視野に入れた場合、患者のiPS細胞などを用いた胚子様モンスターの高い形成効率が望める培養法の確立が求められる。そのため、細胞の個体差や培養条件に左右されることなく胚様体と胚子様モンスターが形成できるように一連の培養法の改良を進めている。さらに、多能性幹細胞からエナメル質形成細胞の誘導が奏功した場合、次に求められるのは同細胞のキャラクターを把握した細胞操作とエナメル質の形成法の開発である。しかし従来の研究では、生涯エナメル質が形成されつづけることで知られるマウスやラットの切歯に由来する細胞株が広く使用されてきた。常生歯と呼ばれるげっ歯類に特有な歯は、常生歯をもたないヒトの歯とは決定的な差異が存在することが考えられる。現状、ヒト由来のエナメル芽細胞を用いた研究は困難であるため、ヒトに準ずる高等哺乳類であるミニブタ由来のエナメル芽細胞の分離・同定を報告した本年度の研究成果の意義は大きい。また、同細胞の選択的な分離培養を可能とした“セル・フィッシング法"は、我々の研究グループが有するユニークな細胞分離技術である。本技術は、多能性幹細胞由来の胚子様モンスターから目的の細胞集団を選択的に分離することにも活用できるため、懸滴培養から灌流培養に移行する新規器官培養システムとあわせて、本研究独自のアプローチを提供する。以上の進捗状況を踏まえて、本研究課題の自己点検による評価は、「おおむね順調に進展している」とした。本研究は、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞を安全に医療応用するための新たな培養システムの開発を目的とする。その手法は、多能性幹細胞を用いて、懸滴培養から灌流培養に移行する新規培養システムによって器官培養を行う。それによって三胚葉性組織で構成された胚子様モンスターを作製し、同組織に存在する歯胚原基からエナメル質形成細胞の分離を行い、将来のバイオエナメル(再生エナメル質)の創製に供することを目指している。本手法は、三胚葉性胚子様モンスターを体外で作出することができ、同モンスターが多能性幹細胞に由来する組織でありながら、腫瘍化・がん化を生じることがない新しい培養技術である。これまでに、懸滴培養による胚様体形成から灌流培養に移行する一連の培養システムの再検証を行い、より確実に胚子様モンスターの形成ができる培養プロトコールの改良を図ってきた。また、エナメル質の形成を担うエナメル芽細胞の特異的なキャラクターの解析のため、in vitroにおける安定的な細胞材料を得ることを目的とした細胞株の樹立を進めている。昨年度には、ミニブタ胎仔歯胚の初代培養を通じて、エナメル上皮組織に由来する上皮細胞の分離と同定を報告した(In Vitro Cell Dev Biol Anim 2016)。

さらに、エナメル形成には必須のイベントとなる上皮ー間葉相互作用を実験的に再現するため、抜去歯より得た歯性間葉系幹細胞のキャラクターの解析を行い、ユニークな幹細胞特性を明らかにした(Stem Cells Dev 2017, Hum Cell 2017)。以上のように、多能性幹細胞からのエナメル質形成細胞の三胚葉性組織内誘導と同細胞の分離培養、さらにエナメル芽細胞株と歯性間葉系幹細胞を活用したバイオエナメルの創製法の確立に向けた研究開発を着実に進めている。多能性幹細胞を用いたエナメル質形成細胞の新たな分化誘導法と同細胞株の樹立には、懸滴培養による胚様体の形成を第一段階とし、次いで灌流培養による胚子様モンスターの形成に移行する極めて高度な培養技術を要する。したがって、細胞株のロット差や培養条件に影響されない胚様体の形成および胚子様モンスターの作出を可能とするため、一連の新規器官培養システムの再検証と培養法の改変を進めている。また、多能性幹細胞からエナメル質形成細胞の分化誘導と細胞分離が奏功した場合、次は同細胞を用いたバイオエナメルの形成法が必要となる。われわれは、ミニブタ胎仔歯胚由来のエナメル芽細胞の分離に成功しており、ヒトに準ずる高等哺乳類に属する細胞株は、バイオエナメルの形成に貴重な示唆を与えることが期待される。さらに昨年度は、抜去歯から得られる複数の歯性間葉系幹細胞(dental MSCs)の分離培養を行い、異なる幹細胞種とそれらの初代培養法を変えることによって、採取組織の発生学的起源を反映したユニークな硬組織形成能を示す幹細胞特性を明らかにした。くわえて、再生医療には不適といわれるウシ胎仔血清(FBS)の使用を回避するため、近年のFBSを含有しない無血清培養液の開発を背景としたdental MSCsの幹細胞特性について、実践的な細胞培養法の確立に貢献する知見を報告した。以上の論文発表に基づき、in vitroにおけるバイオエナメルの創製は、高等動物の安定なエナメル芽細胞株の樹立に合わせて、ユニークな硬組織形成能を有するdental MSCsとの共培養を主体とした上皮ー間葉相互作用の試験的な再現実験を実施する研究材料が整ってきた。さらに、再生医療を想定したFBS不使用の培養環境を構築する準備も進めている。以上の進捗状況を踏まえて、本研究課題の自己点検による評価は、「おおむね順調に進展している」と判断した。本研究は、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞を安全に医療応用するため、特許技術を基盤とした新規培養システムの開発を目的とした。本手法は、懸滴培養から灌流培養に移行して多能性幹細胞の器官培養を行い、三胚葉性組織からなる胚子様モンスターを作出する。そして同モンスター内に存在する歯胚原基からエナメル質形成細胞の分離を行って、将来の「バイオエナメル」(再生エナメル質)の創製に供する斬新な新規技術である。この新手法は、多能性幹細胞を用いる培養技術でありながらがん化・腫瘍化を生じることがない新しい培養技術として特許を取得した再生医療技術である。本研究では、懸滴培養による胚様体形成から灌流培養に移行する一連の培養システムの再検証を行い、より確実に胚子様モンスターの形成ができる培養プロトコールの改良を図ってきた。また、エナメル芽細胞の特異的なキャラクターの解析のため、ミニブタ胎仔歯胚の初代培養を通じてstable cell lineの樹立を進め、エナメル上皮組織由来のエナメル芽細胞株の分離と同定に成功した。
樹木の成長と細胞壁のセルロースミクロフィブリルの性質

樹木の木部細胞壁に存在するセルロースは、結晶性のミクロフィブリルを形成し、木部の力学的特性において重要な役割を担う。本研究では、樹木が成長の過程で力学的性質の大きく異なる木部(木材)を形成する、未成熟材と成熟材の細胞壁構造を詳細に把握するため、木部の力学的性質の発現において重要な役割を担うセルロースの性質を様々な手法を用いて調べた。樹木は成長の過程で、構造の異なる木部(木材)を形成する。例えば、針葉樹等では、形成層の未成熟期に形成される髄付近の木部(未成熟材)と成熟期に形成されるその外側の木部(成熟材)では、木部の構造が異なり、その力学的性質が異なることが多い。本研究では、未成熟期と成熟期に形成される木部の細胞壁構造をより詳細に把握するため、未成熟期と成熟期に形成された木部の性質を把握するとともに、骨格成分であるセルロースの性質を様々な手法を用いて把握することを目的とした。本年度は、昨年度に引き続き、エゾマツ(Picea jezoensis)を用いた検討を行うとともに、トドマツ(Abies sachalinensis)を用いた検討を行った。トドマツの半径方向に連続した試験片を用いて、絶乾状態の繊維方向曲げヤング率と密度の測定を行った結果、両者の関係は、エゾマツと類似した傾向があった。すなわち、密度の増加に伴いヤング率が増加する一方で、髄付近の木部から採取した試験片では、ヤング率が低い傾向が観察された。エゾマツとトドマツについて、髄から樹皮側に向かい、数年輪ごとに仮道管長とミクロフィブリル傾角を測定し、測定結果を基に、未成熟材と成熟材から試料を採取した。採取した試料を、脱脂した後、ホロセルロースを調製(Wise法)し、6%水酸化カリウム水溶液に浸漬、蒸留水で洗浄・乾燥した後、各種分析に使用した。試料の粘度測定(銅エチレンジアミン法)とX線回折測定により重合度と相対結晶化度を把握した結果、両者の値の違いはわずかである傾向が観察された。木部のα-セルロース量は、成熟材に比べ未成熟材で、わずかに低い値を示す傾向が認められ、木部のセルロース量が異なることが示唆された。例えば、形成層の未成熟期に形成される髄付近の木部と成熟期に形成されるその外側の木部では、木部の構造が異なり、木部の物理的・力学的性質が異なるとされる。本研究では、未成熟期と成熟期に形成される木部の細胞壁構造をより詳細に把握するため、未成熟期と成熟期に形成された木部の性質を把握するとともに、力学的性質の発現において重要な役割を担うセルロースミクロフィブリルの性質を様々な手法を用いて把握することを目的とする。本年度は、エゾマツ(Picea jezoensis)を用いて、木部の性質の把握を行った。仮道管長の樹幹半径方向の変動を測定した結果、仮道管長は、髄からの年輪数の増加に伴い増加し、一定の年輪数以降の変化は小さくなる傾向が観察された。また、半径方向に連続した試験片を用いて、絶乾状態の試験片の密度と力学的性質の把握を行った結果、試験片の密度は、髄付近で高い傾向が認められたが、繊維方向曲げヤング率と曲げ強さは、髄からの距離の増加に伴う明確な傾向が観察されなかった。繊維方向曲げヤング率と密度の関係は、密度の増加に伴い曲げヤング率が増加する傾向が認められたが、一部の密度の高い試験片では、曲げヤング率が低い場合が観察された。繊維方向曲げ強さと密度の関係は、曲げヤング率と類似した傾向を示した。密度が高く繊維方向の力学的性質が低い傾向にあった試験片は、髄付近の未成熟期に形成された木部に一致した。本年度に予定していた物性試験を計画通りに終了した。本年度使用を予定していた分析機器に不具合が発生したため、次年度実施予定の物性試験の一部を本年度行い、分析機器による測定を次年度行うことで対応したことから、おおむね順調に進展している。本年度使用を予定していた分析機器に不具合が発生したため、次年度実施予定の物性試験の一部を本年度行い、分析機器による測定を次年度行うこととした。そのため、分析用試薬等の購入のための物品費の一部を次年度に繰り越した。今後は、本年度実施予定の分析機器による測定を行うとともに、当初の計画通り、次年度の計画に取り組む予定である。次年度に繰り越した研究費は、本年度予定していた分析機器による測定を次年度に行うため、分析用試薬等の購入のために使用する。