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哺乳動物が環境光を感知するためのメラノプシンの分子特性の解明

哺乳類は、他の多くの動物と同様に、外界の光環境に応じて、概日時計の調節などを行う。このような哺乳類における、「視覚外」の環境光受容には、網膜内の視細胞と共に、網膜神経節細胞が関わることが知られている。この網膜神経節細胞の光受容は、メラノプシンというタンパク質が担っている。本研究では、哺乳類メラノプシンが、環境光受容を担うために特徴的な分子特性を持っているのではないかと考え、種々の哺乳類メラノプシンと分子系統的に近縁な他の光受容タンパク質との間で分光学的・生化学的な性質を比較した。その結果、哺乳類メラノプシンが、環境光を受容するために適した分子特性を持つことを示唆する結果を得た。哺乳類は、他の動物と同様に、光情報を視覚のみならず、体内(概日)時計の調節など「非視覚」の用途にも用いている。体内時計を光によって調節する場合、それぞれの動物が活動している環境がどの程度の光強度にあるのかをうまく感知する必要がある。哺乳類の場合、そのような光環境の感知にメラノプシンと呼ばれる光受容タンパク質が関与していることがすでにわかっている。本年度は、種々の哺乳類が持つメラノプシンについて、それらが環境光を感知するためにどのような分子特性を持ち、その分子特性がどのようにして生み出され、調節されているのかを分光学的・生化学的手法を用いて解析した。具体的には、ヒトとマウスのメラノプシンの分子特性を比較したところ、両者の安定性が大きく異なることを見出した。この結果は、昼行性のヒトと夜行性のマウスでは大きく異なる光環境で活動していることと連関していると考えられた。さらに、両メラノプシンに対して、部位特異的変異を導入した実験から、異なる安定性が、細胞外領域のアミノ酸配列の違いによってもたらされることを示唆する結果を得た。すなわち、ヒトとマウスが進化の過程で異なる光環境で生活するようになったことに応じて、メラノプシンの安定性に違いが生まれるようなアミノ酸配列の置換が起こったと示唆された。さらに、ヒト以外の霊長類が持つメラノプシンについても安定性を比較し、比較的近縁なアミノ酸配列を持つ霊長類メラノプシンの間でも、安定性が顕著に多様化していることも見出した。哺乳類は、光環境を知覚することで、概日時計の調節や瞳孔反射などを行う。このような哺乳類における環境光受容は、桿体・錐体視細胞とともに、光感受性網膜神経節細胞によって行われれ、この光感受性神経節細胞においては、メラノプシンが光を受容する。メラノプシンは、オプシンファミリーに属する光受容タンパク質であり、レチナールを発色団として結合することで、光を受容できるようになる。これまでに、哺乳類のメラノプシンがどのような分子特性を持つことで、環境光受容に寄与しているのか明らかにするため、精製したメラノプシンを分光学的・生化学的に解析してきた。前年度までに、哺乳類のメラノプシンでは、発色団であるレチナールとの結合が弱く、自発的にレチナールとの結合が切断されることを明らかにした。また哺乳類の種間のみならず霊長類の種間においても、レチナールとの結合強度が大きく異なることも明らかにした。今年度は、部位特異的変異によって霊長類のメラノプシンが、高いアミノ酸配列の一致度を示すにもかかわらず、発色団レチナールの結合の強さが大きく異なるのかを部位特異的変異タンパク質を用いて解析した。その結果、特定の部位のアミノ酸残基が置換することでレチナールとの結合の強さが変わっていることを見出した。また、ヒトを含めた類人猿のメラノプシンは、分子進化の過程でレチナールとの結合を不安定化するアミノ酸残基を獲得・保持してきたことが示唆された。また、ヒトメラノプシンを発現させたカエル卵母細胞の電気生理的解析から、細胞内でもヒトメラノプシンから自発的にレチナールが放出されることを確認した。哺乳類メラノプシンが自発的に発色団との結合を切断することは、光感受性網膜神経節細胞における光受容能を持ったメラノプシン分子の数を減らすことで、光感受性網膜神経節細胞の光感度を下げるはたらきを持つと考えられる。光生物学これまで、哺乳類メラノプシンがどのようにして環境光の受容に適した(あるいは適していない)分子特性を実現しているのかについては、ほとんど知見はなかった。しかし、本年度の研究から、哺乳類メラノプシンが「非視覚」の光受容にどのようにして寄与しているのかについて理解するための端緒となる結果を得ることができたのは、当初の計画より順調に進んでいることを示している。今後は、これまでの解析から明らかになった、哺乳類メラノプシンの分子レベルでの特性が、実際にどのような細胞レベルでの光応答に関与しているのかを明らかにすることを目指す。

具体的には、異なる特性を示すメラノプシンを発現させた細胞に対して、電気生理学的手法を用いて、光応答特性を解析し、分子レベルの特性と細胞レベルの特性の相関を明らかにすることを目指す。「現在までの達成度」に述べたように、今年度は計画以上の進展があり、その進展に基づき次年度にさらに研究を発展させるために、平成25年度の予算の一部を平成26年度に移して執行することが必要であるため。平成25年度執行から繰り延べた研究費と合わせた平成26年度執行の研究費を用いて、「今後の推進方策」に述べたような、メラノプシンを発現させた細胞の光応答特性を、より詳細かつより広範囲に検討することを可能にする。
膜タンパク質‐脂質二重膜複合体の構造モデリング法の開発

膜タンパク質-脂質二重膜複合体の精密な構造モデリング法の確立を目指し、3つの新しい手法、(1)ボロノイ分割モンテカルロ積分法、(2)表面張力レプリカ交換法、(3)溶媒和自由エネルギー計算に基づく膜タンパク質の配向予測法の開発に成功した。これらの手法を用いることで、膜タンパク質系の分子動力学シミュレーションの精密な初期構造モデリング、シミュレーションの妥当性の判断、混合脂質二重膜に対する効率の良い構造モデリングが期待できる。本年度は主に2つの構造モデリング法の開発に成功した。(1)混合脂質二重膜系のモデリングおよびシミュレーションを行う場合、系を構成する脂質分子はとり得る状態・配置が非常に多いため、従来の手法では構造サンプリングが不足するという問題があった。そこで本研究では、混合脂質二重膜系の効率の良い構造サンプリングを実現する方法として、表面張力レプリカ交換法を開発した。本手法は、系のレプリカを複数用意し、各レプリカにおいて温度・圧力・表面張力一定の分子動力学計算を行い、あるステップ毎に表面張力をメトロポリス判定に従ってレプリカ間で交換する。本手法をDPPC脂質二重膜系に適用したところ、従来の手法と比べて脂質二重膜が急激に変形し、かつ脂質分子の側方拡散が誘起されることが分かった。本手法により、混合脂質膜や脂質ラフトのようなより複雑な生体膜系の効率良い構造モデリングが可能である。(2)膜タンパク質-脂質二重膜複合体をモデリングする上で、膜タンパク質の膜に対する位置・配向を知ることが第一に必要となる。本研究では、膜タンパク質の配向予測法として、連続誘電体モデルとエネルギー極小化計算を組み合わせた手法を開発した。本手法では、連続誘電体モデル(GBMVモデル)を用いて膜タンパク質の溶媒和自由エネルギーを計算し、自由エネルギーが極小となる位置・配向をランダムに探索して最適な構造を割り出す。手法の妥当性を検証するために12種類の膜タンパク質(ヘリックスバンドル系およびβバレル系)の自由エネルギー地形および配向を予測した。その結果、いずれの膜タンパク質においても疎水性アミノ酸が膜中の疎水コア領域に覆われた配向が得られ、予測構造はOPMデータベースの結果とも一致した。本手法により様々な膜タンパク質系の位置・配向の理論予測が可能である。膜タンパク質-脂質二重膜複合体構造の新しいモデリング法の開発を目指し、本年度は脂質表面積解析法の開発を行った。脂質二重膜の構造パラメーターの一つとして、脂質1分子あたりの表面積があるが、これは実験からも測定できる物理量であるため、シミュレーションによる脂質二重膜のモデリング構造が確からしいかどうかを判断する基準としてよく用いられる。単純脂質二重膜の場合は容易に脂質表面積を解析できるが、膜タンパク質系の場合はタンパク質近傍構造の複雑さ故、従来解析が困難であった。このような問題を解決するために、本研究では膜タンパク質系において脂質1分子あたりの表面積を解析する方法を開発した。本手法はボロノイ分割法とモンテカルロ積分法を組み合わせた方法で、脂質1分子の座標をその質量中心で近似し、それを母点としてボロノイ分割を行い、膜タンパク質近傍の脂質分子に対してはさらにモンテカルロ積分を行うことで表面積を数値的に計算する。本手法を分子動力学計算から得られたカルシウムイオンポンプ-DOPC二重膜およびタンパク質チャネルSecY-POPC二重膜系のトラジェクトリーに適用した結果、脂質表面積は十分な精度で計算できることが確認でき、また実験データとも一致する結果が得られた。本手法は脂質分子の座標近似の解像度を上げることで混合脂質二重膜系にも適用でき、脂質ラフト構造のモデリングにも極めて有用である。本研究で開発したプログラムは、研究室ホームページにおいて無償で配布している。本研究の目標は、脂質ラフトの構造モデリングに適用可能な新しい膜タンパク質-脂質二重膜複合体構造のモデリング法を開発することである。我々のストラテジーは、異なる解像度の分子モデル「陰的溶媒モデル」「粗視化モデル」「全原子モデル」を階層的につなぐことである。2011年度は3つの階層のうち、全原子モデルに注目してモデリング法の開発を進めてきた。また、陰的溶媒モデルを用いた膜タンパク質の配向予測法の開発とモデリングへの応用についてもすでに進めており、現段階で予測された膜タンパク質の配向は、全原子モデルを用いた長時間の分子動力学計算結果とも一致する結果を得ている。2年計画のうちの1年目で半分の行程まで進んでいると考えている。陰的溶媒モデルを用いたモデリング法の開発については、引き続きミシガン州立大のMichael Feig氏と連携をとる。開発した方法を用いて種々の膜タンパク質について配向を予測し、OPMやPDBTMなどの膜タンパク質の配向データベースとの比較を行う。また、方法のアプリケーションとして、カルシウムイオンポンプを対象として、複合体構造のモデリングと全原子シミュレーションも行う。未使用額が101,919円生じたが、これは研究計画の中で共同研究先のMichael Feig氏のグループのソフトウェア開発に遅れが生じ、予定していた学会(分子シミュレーション討論会)の発表に間に合わなかったことが主な理由である。

本年度は、当該研究費と平成24年度の研究費をあわせて、国内学会、海外学会の参加費および旅費に使用する。また、シミュレーションで得られたデータを保存するためのハードディスクを購入する。
レーザー照射による金属間化合物の機械的特性向上に関する研究

レーザー照射は、従来の加熱装置に比べ急速加熱し急速冷却出来ることから従来にない機能を発現する新材料の開発手段として有効である。そこで、本研究は高温強度に優れ重量比強度が高い金属化合物の合金粉末作製にレーザー照射を適用すること、及び多層膜にレーザー照射を行い金属間化合物を作製することによって機械的特性を向上させ原子力材料としての適合性を明らかにすることを目的とした。科学研究費補助金で購入した市販のチタン板とアルミ板を積層させロータリーポンプで排気したチャンバー内に固定し、3KWの炭酸ガスレーザーを試料表面が焦点面になるようにして照射した。加工ガスには、窒素ガスを用いた。レーザー直下に設置した金型に吹き付けることによって得られた合金粉末の形状を調べるために走査電子顕微鏡で観察した結果、ほぼ球形で数mumの大きさであることがわかった。合金粉末の組成を調べるためにX線回折を行った結果、Ti_3Al及びTiAl,Al_3Tiが形成していることが判明した。その合金粉末を一軸冷間プレスを行って成形し、科学研究費補助金で購入した精密低速切断装置を用いて薄片化し電解研磨の後高分解能電子顕微鏡で微細組織観察を行った。制限視野電子回折像は、デバイシェーラー環と複数の斑点を示し組織が非常に微細で複数の相が混在していることを示唆された。タンデム型加速器を用いて3MeVのAu^<2+>イオンを540°Cで約250dpaまで照射した結果、更に結晶粒は微細化しボイドは観察されなかった。今後、更に高温で照射実験を行い現在中性子照射中の試料と共に組織変化と機械的特性の変化について研究する計画である。以上、本研究においてチタンとアルミを積層させた多層膜にレーザーを照射することによってTi_3Al及びTiAl,Al_3Ti層を含む微細結晶粒の金属間化合物粉末を作製できることが明らかとなった。
海洋構造物に対するセルフパワード振動制御装置の研究

固定式の海洋構造物において,地震や波浪による振動は構造及び施設の損傷原因となる恐れがあり,その対処法の一つとして振動制御技術がある.振動制御技術の一つとして,外部からのエネルギー供給が不要な省エネ装置として,セルフパワード振動制御(Self-Powered Vibration Suppression: SPVS)装置が提案されている.しかし,SPVS装置には制御系設計の既存理論が適用できず,設計難易度が高いという問題点がある.本研究では,構造最適化法を活用し,海洋構造物に対するSPVS装置の最適設計法を構築した.固定式の海洋構造物において,地震や波浪による振動は構造及び施設の損傷原因となる恐れがあり,その対処法の一つとして振動制御技術がある.振動制御技術の一つとして,外部からのエネルギー供給が不要な省エネ装置として,セルフパワード振動制御(Self-Powered Vibration Suppression: SPVS)装置が提案されている.しかし,SPVS装置には制御系設計の既存理論が適用できず,設計難易度が高いという問題点がある.本研究では,構造最適化法を活用し,海洋構造物に対するSPVS装置の最適設計法を構築した.外部からのエネルギー供給なしに優れた制振効果を生み出すセルフパワード振動制御(SPVS)装置が提案されているが,制御系設計の既存理論が適用できず,設計難易度が高いという問題点がある.本研究では,構造最適化法を活用し,海洋構造物に対するSPVS装置の最適設計法を構築することを目的とする.平成25年度は,SPVS装置の制振性能を向上させることを目的とし,数値計算でアクチュエータの最適配置を自動で導出することができる最適設計法を構築した.また,その手法で得られた最適解を,力学,制御工学の観点から再考察することで,SPVS装置の設計理論を検討した.具体的には,圧電素子は通常のアクティブ振動制御と同様に,支配的な振動モードにおける変形が大きい箇所に設置することが望ましいことがわかった.しかし,SPVS装置では,制御過程で圧電素子内において急激に電荷が変化するため,強い衝撃が発生し,その衝撃で新たな振動が励起されることもわかった.すなわち,この現象が起こるような条件下では,アクティブ制御装置の設計理論は応用できず,また,本年度で構築した最適設計法で得られた解も有効ではないことがわかった.この現象は,当初の研究計画では予見できておらず,今後これを回避するような手法の構築を行っていく必要がある.また,圧電素子以外にもコイルの特性が制御装置の性能に与える影響が大きいことがわかった.次年度においてはこれらを考慮した上で,水中での挙動に対応した,海洋構造物に応用可能なSPVS装置の最適設計法を構築していく.外部からのエネルギー供給なしに優れた制振効果を生み出すセルフパワード振動制御(SPVC)装置が提案されているが,制御系設計の既存理論が適用できず,設計難易度が高いという問題点がある.本研究では,構造最適化法を活用し,海洋構造物に対するSPVS装置の最適設計法を構築することを目的とする.前年度は,SPVS装置の制振性能を向上させることを目的とし,数値計算でアクチュエータの最適配置を自動で導出することができる最適設計法を構築し、また,その手法で得られた最適解を,力学,制御工学の観点から再考察することで,SPVC装置の設計理論を検討した.しかし,SPVC装置では,制御過程で圧電素子内において急激に電荷が変化するため,強い衝撃が発生し,その衝撃で新たな振動が励起されることもわかった.本年度はこの衝撃に対し,Shock Response Spectrum (SRS)と呼ばれる衝撃力評価指標を導入し,二次衝撃を緩和可能なSPVC装置の最適設計法を構築した.その結果,SRSを考慮した最適化においては,タワー構造の高さ方向中央部には大型の圧電素子が設置されないことがわかった.そして,それは中央部の圧電素子は,高次の振動を励起しやすく,衝撃力を増しうるためであることがわかった.また,付加水質量を用い,SPVC装置の水中での挙動を考慮した最適設計法を構築した.しかし,付加水質量が最適解に与えた影響は軽微であった.すなわち,静水中においては,陸上での装置設計指針がそのまま適用できることがわかった.今後は,装置試作および水槽での振動試験を行い,構築したSPVC装置の最適設計法の妥当性を実験的にも検証していく.構造最適化当初研究予定では,平成25年度中に水中でのSPVS装置の挙動検証を行う予定であった.しかし,研究実績の概要に記載したように,SPVS装置の設計における新たな課題が生じたため,そちらを優先した.平成26年度では,当初の研究計画にあるように,水中での挙動に対応した,海洋構造物に応用可能なSPVS装置の最適設計法を構築していく.そして,最終的には実験での検証を目指す.また,これと並行し,平成25年度に発見されたSPVS装置の問題点の対策を,対象構造物を限定しない汎用的なSPVS装置に対する研究として進めていく予定である.本研究で使用するソフトウェアの購入費用に他の研究費を充当したため,当初予算よりも支出が少なかった.次年度分研究費と合算し,実験に必要なソフトウェア及び実験試料の購入に使用する予定である.
ドメインスワッピングによるタンパク質多量化を利用した機能性分子配列

超分子は複数の分子が制御された分子間相互作用によって集合した分子である。本研究では、ドメインスワッピングによるタンパク質多量化を利用して機能性分子配列を行い、それらの構造と機能を調べた。ヘム鉄を亜鉛に置換して光応答性を付加したシトクロムcはドメインスワッピングにより多量体を形成し、単量体の構造と光化学的性質を保持したまま超分子化することが明らかとなった。また、ヘムタンパク質のミオグロビンとシトクロムc551のドメインスワップ多量体の構造と機能を明らかにした。これらの結果より、ドメインスワッピングを利用した機能性分子配列は多くのタンパク質に適用可能であることが示唆された。本研究では、光捕集アンテナのような優れた機能をもつ分子の機能発現メカニズムの解明を目標に、光応答性をもつ亜鉛置換シトクロムcの多量体をドメインスワッピング機構で形成し、その多量体の構造ー機能相関の理解を目指している。平成25年度は、(1)亜鉛置換シトクロムc多量体の活性部位構造の解析、(2)X線小角散乱測定による亜鉛置換シトクロムc多量体の溶液構造予測、(3)亜鉛置換シトクロムc多量体の光化学的特性の評価を行った。具体的な成果としては、(i)FPLCを用いて精製した亜鉛置換シトクロムc二量体と単量体の1H NMR測定より、亜鉛ポルフィリンの軸配位子と考えられているメチオニン80が二量体では外れていることが示唆された。(ii)亜鉛置換シトクロムc二量体、三量体、四量体のX線小角散乱曲線をもとに、GNOMおよびGASBORを用いて溶液中における立体構造予測を行った。その結果、亜鉛置換シトクロムcでは、三量体と四量体のコンフォメーションが無置換のウマシトクロムcとわずかに異なっていたが、溶液中で鎖状構造をとっていることが明らかとなった。(iii)亜鉛置換シトクロムc二量体、三量体、四量体の蛍光スペクトルおよび蛍光寿命測定を行い、単量体と比較したところ、多量体の極大蛍光波長および蛍光強度、蛍光寿命はいずれも単量体と類似していることが明らかとなった。以上の成果より、亜鉛置換シトクロムcは多量化すると亜鉛ポルフィリン近傍のアミノ酸残基の配置が変化するが、この構造変化が光化学的特性に与える影響は小さいことが明らかとなった。また、亜鉛置換によって、多量化したときの溶液構造がわずかに摂動を受けることが分かった。以上の結果は、光応答性タンパク質の機能発現メカニズムの解明や、光応答性タンパク質多量体の構造制御の手がかりとなると考えられる。平成24年度は、(1)亜鉛置換シトクロムc多量体の作製、(2)分光学的手法による亜鉛置換シトクロムc多量体の構造評価を行った。具体的な成果としては、1.シトクロムcをフッ化水素ピリジン溶液と反応させ、シトクロムcのヘム鉄を除去し、亜鉛イオンを挿入した亜鉛置換シトクロムcを作製した。2.エタノール添加により亜鉛置換シトクロムcの多量体を作製し、ゲルろ過クロマトグラフィーで二量体から四量体を精製した。3.亜鉛置換シトクロムc二量体、三量体、四量体の活性部位および二次構造が単量体と類似していることを吸収および円二色性スペクトル測定により明らかにした。4. NMR測定により、亜鉛置換シトクロムcの二量体が単量体と類似した立体構造をとっていることを明らかにした。5. X線小角散乱測定により、亜鉛置換シトクロムc多量体が溶液中で直鎖状構造をとっていることを明らかにした。以上の成果より、光応答性を有する亜鉛置換シトクロムcを多量化することが可能であり、単量体の構造と類似した構造をとったまま多量体を形成したことから、多量化は単量体の機能を保持したまま進行すると推測される。これは本研究手法が機能性分子の配列に有用であることを示唆している。前年度までの研究結果より、亜鉛置換シトクロムcは単量体の光化学的特性を保持したまま多量体形成が可能であり、溶液中において多量体は鎖状構造をとっていることが明らかとなった。

最終年度となる平成26年度は、(A)溶液中におけるシトクロムc多量体の環状化の検討、及びシトクロムc多量体の環状化が困難な場合への対応として(B)他のヘムタンパク質を用いた多量化とその構造及び機能特性の検討を行った。具体的には、(A)シトクロムc多量体の溶液構造の挙動を検討し、1.金属配位部位を導入した変異型シトクロムc多量体に金属イオンを添加すると多量体の溶液構造がコンパクトになることを明らかにした。また、2.分子内静電反発を減少させた変異型シトクロムc多量体においても溶液構造がコンパクトになることを明らかにした。(B)他のヘムタンパク質については、ミオグロビンおよびシトクロムc551の多量化を検討し、3.ミオグロビンは二量化後も構造及び配位子結合特性を保持しており、4.シトクロムc551は二量化後も構造及び酸化還元電位を保持していることを明らかにした。研究期間全体を通じて、シトクロムcを亜鉛置換しても多量化することが可能であり、多量化後も構造及び光化学的特性を保持していることが明らかとなった。また、溶液中において亜鉛置換シトクロムc多量体は鎖状構造を有しており、金属配位や分子内静電反発の減少によりコンパクトな構造に変化することが分かった。他のヘムタンパク質を多量化した場合も単量体の構造及び機能を保持していたことから、ヘム鉄の亜鉛置換によって光応答性をもった多量体を構築可能であることが示唆された。タンパク質科学平成25年度中に、研究室の大部分の実験空間と装置が使用不可能になるドラフト工事が計画・実施され、予定していた実験や機器購入に遅れが出たため、研究計画を1年間延長した。しかしながら、実験可能だった期間中に、(1)亜鉛置換シトクロムc多量体の活性部位構造の解析、(2)X線小角散乱測定による亜鉛置換シトクロムc多量体の溶液構造予測、(3)亜鉛置換シトクロムcの光化学的特性の評価、などを行い、光応答性タンパク質多量体の構築に重要な知見となる亜鉛置換シトクロムc多量体の活性部位構造、溶液構造、光化学的特性を明らかとし、光応答性タンパク質の構造ー機能相関について理解を深めることができた。以上の成果が得られているが、研究計画の延長が必要なことから、やや遅れていると判断した。平成24年度の研究実施計画に記載した、(i)シトクロムcをフッ化水素ピリジン溶液と反応させ、シトクロムcのヘム鉄を除去し、亜鉛イオンを挿入した亜鉛置換シトクロムcを作製。(ii)エタノール添加により亜鉛置換シトクロムcの多量体を作製し、ゲルろ過クロマトグラフィーで様々な大きさの多量体を精製。(iii)亜鉛置換シトクロムc多量体が直鎖状から環状構造に変化する溶液条件を検討。(iv)亜鉛ポルフィリンの電子的環境を吸収スペクトル、タンパク質の立体構造を円二色性、NMR、X線結晶構造解析により調べ、亜鉛置換シトクロムc多量体の構造を評価。(v) X線小角散乱測定により、様々な溶液条件下における亜鉛置換シトクロムc多量体の分子サイズと分子形状(環状または直鎖状構造)を評価。以上の実験計画のうち、最も重要な目標であった亜鉛置換シトクロムc多量体の作製と二量体、三量体、四量体の精製が達成されており、これらの多量体の活性部位および立体構造についての分光学的解析も行われた。これらの成果を考慮して、本研究は計画に沿っておおむね順調に進展していると判断した。平成24、25年度に得られた結果を基にして、平成26年度は、(1)リンカーをヒンジ領域に挿入したシトクロムc変異体の作製と多量体形成、(2)亜鉛置換シトクロムc多量体の光エネルギー移動特性の評価を行う。
粒子数選別した半導体負イオンクラスタ-と固体表面相互作用

本研究における最終目標は膜形成仮定における反応性プラズマ中のクライスタ-イオンの動的過程を分子論的立場から明らかにすることにある。そのために本研究では、クラスタ-イオンはパルスレ-ザ-光を用いたレ-ザ-スパッタ法により発生させ、高真空中にビ-ムとして取り出し、さらにパルスゲ-ト法により特定粒子数の負イオンクラスタ-だけを分離し、固体表面に衡突させる。したがって反応性化学種としてのクラスタ-イオンの粒子数制抑はもちろんのこと、運動エネルギ-の制抑、クラスタ-内部温度の制抑が可能であり、固体表面との相互作用をきわめて精密に追跡することを可能にした。本年度は上記課題を遂行するために、超高真空下で半導体負イオンクラスタ-ビ-ムを発生させる装置を開発するとともに、パルスゲ-ト法の開発も合せて行なった。超高真空下でのビ-ム発生のためには、冷却ガスを用いないクラスタ-ビ-ム源の開発に成功し、炭系負イオンクラスタ-、ケイ系負イオンクラスタ-を比較的高濃度で発生することができた。さらに特殊な高圧バルス電源を購入し、パルスゲ-ト法を開発した。この方法では通常-IKVの高電圧が発生しており、特定粒子数クラスタ-が飛行するときだけ、パルス的にゲ-トが開く(グランドポテンシャル)ようになっている。炭系負イオンクラスタ-を用いて、性能を調べたところ、完全に単一粒子数のものだけが通過することが明らかになった。さらに上記の方法で粒子数分別した炭系負イオンクラスタ-をMoS_2単結晶に衡突させ、衡突脱離で発生する電子を検出することにより、衡突脱離の粒子数依存性を見い出した。この事実はこれまで全く報告されていない事柄であり、この現象を通して、クラスタ-と固体表面相互作用に新しい手法が生まれる可能性を示している。
小児における急性脳炎・脳症の病態・診断・治療に関する研究

小児における急性脳炎・脳症の実態調査を行った。それにより本症は、毎年約1,000例と多数の発症があることが明らかとなった。病因別では、インフルエンザ脳症が全体の約25%、HHV-6,7が約12%ついでロタウイルス脳症とムンプス脳炎が約4%であった。特に、ロタウイルス脳症が多数報告されたのは重要と思われる。今後、診断法の普及に伴い、ノロウイルスやRSVなどその他の病原体による脳炎・脳症がさらに明らかになると考えられる。本邦における病因診断体制の確立として、インフルエンザ・ロタウイルスについては岡山大学、単純ヘルペス・HHV-6.7、EBウイルス・サイトメガロウイルスについては、岡山大学、エンテロウイルス・麻疹ウイルスについては福島県立医科大学、そのほかのウイルスについては感染症情報センターがリファランスラボとして機能することが明らかとなった。また、サイントカインやケモカインなどについては、山口大学、画像診断・脳波などについては、順天堂大学が中心的な役割を果たした。病態について、サイトカインやケモカインおよびチトクロームCなどについて検討を加えた。その結果、急性脳症には様々の臨床像が認められること、痙攣重積型急性脳症においてはインフルエンザ脳症と同様にMMP-9の上昇とTIMP1の低下が確認された。すなわち、一部の脳炎・脳症においてはインフルエンザ脳症と極めて類似する病態であった。一方、ロタウイルス脳症の剖検例から明らかになったことは、ウイルスの増殖が中枢神経系内で認められず、また、肺や肝臓においてもウイルスの増殖は認められないにもかかわらず、上記の臓器において多臓器不全を生じていた。ウイルスは、消化管においてのみ増殖が確認された。これは、最近報告数が増加しているロタウイルス脳症の貴重な報告と思われる。今後、これらで明らかになった臨床像・病態からそれぞれの病因に対した急性脳炎・脳症の治療法の確立を目指したい。今年度以下の研究結果を得た。(1)単純ヘルペス脳炎の早期診断方法について、PCR法と、より簡便なLAMP法とを比較した。その結果、通常の感染診断にはLAMP法は良いが、髄液を用いた脳炎の診断においては、感度が低く、信頼度が劣ることが判明した。その他HHV6,麻疹ウイルス、エンテロウイルスなどの病因診断法も検討が進んでいる。(2)単純ヘルペス脳炎(HSE)は予後不良であることが知られているが、抗ヘルペス剤であるアシクロビルが有用である。一方、本症の病態として新生児ヘルペスにおける研究から、ヘルペスウイルスの全身感染の時、必ずしもウイルスの増殖によるnecrosisのみでなく、apoptosisも起きていることが予測されるため、現在この点の解析を進めているが、ステロイドを治療に併用した症例の予後が良い事が明らかになった。(3)インフルエンザ脳症のガイドラインが作成され(2005年11月)、広く診療に用いられているが、HHV6も小児の脳症の主な要因である。HHV6とけいれんとの関与について調査し、本ウイルスがけいれんを伴いやすいこと、脳症を起こした場合、インフルエンザ脳症と近似した病態を示すことが明らかになった。これは、インフルエンザ脳症の発症要因に、宿主のゲノムの異常(SNPsの存在)が判明しつつあるが、HHV6脳症も同様のSNPsを持つのか、あるいは別の部位の異常なのか次年度の重要な課題となる。(4)SSPEの治療として、インターフェロンとリバビリンの脳室内投与の効果と安全性について、検討を続けている。

髄液中の麻疹RNA量の推移や、臨床症状の進行の抑止を指標とするとした場合、明らかに効果を示す例もあるが、全体の評価には症例数を増やす必要がある。(5)次年度は、(1)小児の脳炎・脳症の全国疫学調査を年度早期に、(2)またHHV6やロタウイルスなどによる脳症の発症に関与するSNPsなどの検出などが重要な課題となる。(1)小児の急性脳炎・脳症の全国調査を実施した。現在、集計中の段階であるが、平成17年。18年とも500例を超える症例が報告されている(回収率約50%)。この結果から、従来推定されている小児の急性脳炎・脳症の発症数は、年役1,000例と推定可能である。内訳は、インフルエンザ脳症についで、HHV-6脳症、ロタウイルス脳症、マイコプラスマ脳症、アデノウイルス脳症、単純ヘルペス脳炎、水痘脳炎、エンテロウイルスなどが主なものであった。今後、病因による臨床像の差異について検討していく予定である。これらの報告は感染症情報センター(岡部ら)への連絡症例とも一致する部分が多いが、急性脳炎・脳症の報告義務について小児科診療現場への周知徹底が今後重要となろう。(2)細矢らによれば、エンテロウイルス71による脳炎のウイルスの遺伝子系統解析で、B-3,B-4の亜型が脳炎を起こしやすいことが明らかになった。今後、この亜型の流行が予測されれば、本症の多発に注意する必要がある。(3)木村らは、リアルタイムPCR法に複数遺伝子の検出が可能なマルチプレックスPCR法を開発した。これにより、HSV,EBV,HHV-6、VZVの他、RNAウイルス(インフルエンザ、麻疹、風疹、ロタウイルス、エンテロウイルスなど)に対しても対象を拡げることができ、病因診断を容易にする検査手段の開発と思われ今後全国に拡げれば、脳炎・脳症診断ネットワークの確立に前進する。(4)水口・奥村により、インフルエンザ脳症以外の脳症の神経症状と画像・脳波所見およびそれらに基づく臨床型分類や特殊型(両側前頭葉を障害する乳児急逝脳症)の診断基準の試みも開始されている。また、(5)サイトカインの動態など病態解析も市山・布井らにより進んでいる。(4,5)については今後予定している診療ガイドラインの作成に極めて重要と思われた。単純ヘルペス脳炎、HHV-6脳症、インフルエンザ脳症、エンテロウイルス(71など)脳炎、麻疹・風疹などに伴う脳炎、ロタウイルス脳症、など小児の急性脳炎・脳症の現状を調査し、病態を解析した。また、診断法・治療法の開発をめざした。今年度以下の研究成果を得た。1.全国調査を実施し、小児の急性脳炎・脳症が年間約1,000例発症し予後も悪いこと、インフルエンザ脳症が全体の約25%、HHV-6脳症が約12%を占める他、ロタ胃腸炎、ムンプス、マイコプラズマに伴う脳症が多発していることが明らかになった。現在、2次調査結果を解析中。2.本症の原因となるウイルス(HSV,HHV-6など)について簡便に多くの病原体を検出・定量診断できるシステム(マルチプレックスPCR)を開発した。3.全国病因診断ネットワークの設立のため、各施設間の連絡体制を構築した。4.各ウイルス毎の神経病原性の発現機序の差異を明らかにした。5.急性脳症
強磁場が有機分子のコンホメーションに考える変化

一般にNMRスペクトル装置は非破壊的分析装置であるといわれている。また、NMRスペクトルで決定された分子形は、外力の影響を受けないそのままの形であるというのが常識である。しかし、NMRスペクトルは極めて強い磁場の中に化合物をおき、強い電磁波(パルス)を照射することで応答シグナルを測定する装置である。このような条件下で分子の形がゆがむかどうかについては明確な実験事実が無い。本研究は強い磁場中におかれた有機分子が、分子形をどのように変化させるかを知るためのものである。例えば、環状に連結したπ電子系を有するベンゼン環は、強磁場中におかれると誘起磁場を発生する。この誘起磁場はNMRスペクトルにおいて異方性効果として観測することができる。このような誘起磁場を発生する官能基は磁場中で磁化していると見なすことができる。複数個のベンゼン環を有する有機化合物では、磁化したベンゼン環同士が磁気的な相互作用をすることにより分子形(コンホメーション)の変化をもたらすことが期待される。このような観点からいくつかの化合物の合成を試みた。当初は環状の化合物で比較的分子形が固定されているものについて実験を行ったが、結局、直鎖状の二級アルコールに光学活性な2-naphthylmethoxyacetic acidを縮合させたものに強磁場による分子形の変形が観測された。合成したエステルのプロトンNMRスペクトルを200,400,500,600MHz NMR装置を用いて測定した。磁場の強度とナフタレン環の分子内での平均存在率に差があることを認めた。本研究は極めて強い磁場中におかれた有機分子が、その分子形をどのように変化させるかを知るためのものである。本年度は、本研究に最も最適である化合物のデザインを行い、モデル化合物を合成することを行った。シス-スチルベンにジメチルカルベンを作用させ、1,1-dimethyl-2,3-cis-diphenylcyclopropaneを合成した。この化合物中では、隣り合った2個のベンゼン環が強制的に面と面が重なるように配置しており、ベンゼン環の磁化により2個のベンゼン環の方向が強磁場中と無磁場中とでわずかに異なる可能性がある。この化合物中には4級メチル基が2個あり、それらは磁気的に非等価である。すなわち2個のメチル基は化学シフトが異なる2本の鋭い単一線を示す。化学シフトはベンゼン環の異方性効果に大きく支配されるので、2本のシグナルの化学シフトの差は、磁場強度に相関して変化するはずである。合成した化合物のプロトンNMRスペクトルを200,400,500,600MHz NMR装置を用いて測定した。化学シフトは温度の影響を受けるため、各装置のプローブ内の温度を完全に等しくしなければならない。そのため、5mm NMRサンプル管に挿入できる特製のミクロ温度計を作製し、同一の温度計を用いて各装置の温度差をなくすことに成功した。現在、こうして得られたデータの解析を行っている。
外力作用条件が実大鉄筋コンクリート部材のひび割れ進展メカニズムに与える影響評価

本研究の目的は,実地震を想定した外力作用条件における実大鉄筋コンクリート造建築構造部材の損傷量進展メカニズムを解明し,損傷量評価手法へと展開させることである。平成30年度は,載荷実験に適用する損傷量計測システムの開発にあたり,その予備的検討として,RC造スラブを有するS造部分架構の実大動的載荷実験を実施した。その際,これまで培ってきた画像計測技術のノウハウを用いて,動的載荷時にも適用可能,かつ,A.I.を用いたひび割れ検出技術への展開も踏まえた画像計測システムの構築を検討した。計測環境が厳しい振動台上においても設置・運用が可能な汎用アクションカムを用いたステレオカメラの構築については,平成30年度中の開発には至らなかったが,固定具に関する課題解決に向けた方向性を明らかにすることができた。また,上述の計測システム開発と同時並行して,鉄筋コンクリート造建築構造部材の損傷量進展メカニズムの解明にむけた解析的研究を進めた。これまでの研究において,柱部材および梁部材については,幾何学的部材変形法により簡易な(通常の耐震設計で用いるような)解析モデルでもひび割れ進展過程を大まかに推定できる可能性は明らかになっていたが,平成30年度はせん断ひび割れが卓越する壁部材についても,幾何学的部材変形法を簡易な解析モデル(修正圧縮場理論)に適用することで,大まかなひび割れ進展過程の推定が可能であることを示した。特に,柱部材,梁部材,壁部材とも,幾何学的部材変形法においては,平均ひび割れ間隔の設定が重要なパラメータとなっており,ひび割れ定常状態(それ以上新たなひび割れが発生せず,既発ひび割れが拡幅するだけの状態)に至るまでの,ひび割れ間隔の推移を適切にモデル化することが,ひび割れ量進展の推定精度に大きく影響することを明らかにした。これまで培ってきた画像計測技術のノウハウを用いて,動的載荷時にも適用可能な画像計測システムの構築を検討したが,汎用アクションカムを用いたステレオカメラの構築については,平成30年度中の開発には至らなかった。しかし,あくまで予備的実験の段階でありながら,目的を達成するための課題を明らかにできたことで,次年度以降の計測装置開発に向けた改善点・改良点を抽出することができ,研究進捗が滞る状態にまでは至らなかった。なお今年度も,RC造壁試験体の静的載荷実験における損傷量計測,および,RC造スラブ付き部分架構の動的載荷実験を予定しており,改良型計測システムを導入することで,さらなる損傷量進展過程の実験データ収集を進める予定である。また,同時並行で進めた解析的検討においては,線材モデル化される柱部材,梁部材だけでなく,壁部材への幾何学的部材変形法の適用方法を示すことができ,架構全体の損傷量評価への展開に道筋がついた。このことは,本研究課題が概ね順調に進んでいるものと判断できる根拠のひとつと考えられる。さらに,解析的検討により平均ひび割れ間隔の設定が重要なパラメータとなることが明らかとなったが,このメカニズム検討においては,コンクリート表面のひずみと内部鉄筋のひずみ差を計測すべく,DIC(画像相関法)を用いた実験データの取得が必要になる。これについても,その適用範囲や妥当性検証を平成30年度中に終えている。今年度以降の実験的検討においては,RC造壁試験体の静的載荷実験における損傷量計測,および,RC造スラブ付き部分架構の動的載荷実験を計画しており,前年度までに課題を抽出した計測システムを改良し,改良型計測システムを導入することで,損傷量進展過程の実験データ収集を進める。なお,損傷量データの分析にあたっては,従来より検討されている画像処理手法(最終的には二値化した画像のピクセルカウント)による損傷量計測だけでなく,深層学習(A.I.)を用いたひび割れ領域抽出により,二値化の閾値設定問題による損傷量計測の難点を克服した画像解析技術についても検討を進める。また,今年度以降の解析的検討においては,柱部材,梁部材,壁部材への幾何学的部材変形法の適用だけでなく,柱梁接合部の損傷量進展における幾何学的部材変形法の適用可否についても検討を進める。既に,過去に実施された柱梁接合部の損傷進展過程を撮影した写真データを入手しており,これをもとに画像解析を進め,簡易な損傷量進展モデルを構築する。

特に,柱部材,梁部材,壁部材とも,幾何学的部材変形法においては,平均ひび割れ間隔の設定が重要なパラメータとなっており,ひび割れ定常状態(それ以上新たなひび割れが発生せず,既発ひび割れが拡幅するだけの状態)に至るまでの,ひび割れ間隔の推移を適切にモデル化することが,ひび割れ量進展の推定精度に大きく影響することを明らかにした。これまで培ってきた画像計測技術のノウハウを用いて,動的載荷時にも適用可能な画像計測システムの構築を検討したが,汎用アクションカムを用いたステレオカメラの構築については,平成30年度中の開発には至らなかった。しかし,あくまで予備的実験の段階でありながら,目的を達成するための課題を明らかにできたことで,次年度以降の計測装置開発に向けた改善点・改良点を抽出することができ,研究進捗が滞る状態にまでは至らなかった。なお今年度も,RC造壁試験体の静的載荷実験における損傷量計測,および,RC造スラブ付き部分架構の動的載荷実験を予定しており,改良型計測システムを導入することで,さらなる損傷量進展過程の実験データ収集を進める予定である。また,同時並行で進めた解析的検討においては,線材モデル化される柱部材,梁部材だけでなく,壁部材への幾何学的部材変形法の適用方法を示すことができ,架構全体の損傷量評価への展開に道筋がついた。このことは,本研究課題が概ね順調に進んでいるものと判断できる根拠のひとつと考えられる。さらに,解析的検討により平均ひび割れ間隔の設定が重要なパラメータとなることが明らかとなったが,このメカニズム検討においては,コンクリート表面のひずみと内部鉄筋のひずみ差を計測すべく,DIC(画像相関法)を用いた実験データの取得が必要になる。これについても,その適用範囲や妥当性検証を平成30年度中に終えている。今年度以降の実験的検討においては,RC造壁試験体の静的載荷実験における損傷量計測,および,RC造スラブ付き部分架構の動的載荷実験を計画しており,前年度までに課題を抽出した計測システムを改良し,改良型計測システムを導入することで,損傷量進展過程の実験データ収集を進める。なお,損傷量データの分析にあたっては,従来より検討されている画像処理手法(最終的には二値化した画像のピクセルカウント)による損傷量計測だけでなく,深層学習(A.I.)を用いたひび割れ領域抽出により,二値化の閾値設定問題による損傷量計測の難点を克服した画像解析技術についても検討を進める。また,今年度以降の解析的検討においては,柱部材,梁部材,壁部材への幾何学的部材変形法の適用だけでなく,柱梁接合部の損傷量進展における幾何学的部材変形法の適用可否についても検討を進める。既に,過去に実施された柱梁接合部の損傷進展過程を撮影した写真データを入手しており,これをもとに画像解析を進め,簡易な損傷量進展モデルを構築する。
非線形電極過程の表面ダイナミクス

界面多電子移動は、電子授受を行う分子と表面との強い相互作用が不可欠であり、分子が表面に強く捕捉された状態から進む構造敏感な反応過程であり、時として、振動現象やパターン形成などの散逸構造の形成を伴う。フォルムアルデヒドは、白金電極表面で4電子酸化を受け、最終生成物二酸化炭素を生成する。この反応は、2つの独立な反応経路を持つ双安定な電気化学反応で、電極反応の進行とともに、電流-電圧の非線形な自励発振が観測される。この非線形反応の機構を調べるために、電気化学的な反応制御と表面選択的なレーザー分光の実験を複合して研究を進めた。その結果、白金電極表面の単原子層以下の酸化皮膜の形成・還元速度がフォルムアルデヒドの解離吸着により大きく変化する事を明らかにした。さらに、反応を行っている電極表面の原子配列の対象性を角度分解表面2次高調波発生分光で測定できる事など明らかになった。白金表面がフォルムアルデヒドが解離吸着して生成するCOで覆われると2次非線形感受率が変化する事を利用して、電極反応の進行にともなう表面の吸着分子層の変化を追跡する事を行った。
自家不和合性におけるエピジェネティックな遺伝子発現制御機構の解明

アブラナ科植物Brassica rapaの自家不和合性を制御する花粉因子SP11の対立遺伝子間の発現には優劣性の現象が見られ、優性側のSP11近接領域から作られる低分子RNA(Smi)が劣性側SP11プロモーターのメチル化を誘導し、その発現を数万分の一まで抑制することが強く示唆されている。しかし、その強力な発現抑制機構の詳細は不明であった。シロイヌナズナを用いて本優劣性現象を再現させるため、B. rapaの劣性SP11プロモーター:GUSとSmi産生領域を導入したが、GUSの発現抑制は確認されなかった。導入したSP11プロモーター領域のみでは不十分である可能性が考えられ、約1.5kb上流に位置するSP11プロモーターと高い相同性を示す3回繰り返し配列に着目した。劣性SP11プロモーター:GUSおよび繰り返し配列を含む劣性SP11プロモーター:GUSをそれぞれB. rapaに導入したところ、繰り返し配列を含む劣性SP11プロモーター:GUS導入株においてのみ、Smi存在下でGUS染色が見られなくなる程の強い発現抑制が確認された。この繰り返し配列もSmi存在下でDNAメチル化されていることが確認され、SmiによるSP11の強い発現抑制にはSP11上流の繰り返し配列を含む広範囲のゲノム領域が重要であることが示唆された。Smiで説明できる優劣性関係は一部に限られており、今回、新たな低分子RNAであるSmi2を見出し、Smi2が他の4つの対立遺伝子間の優劣性を制御していることを明らかにした。各Smi2は自己よりも劣性のSP11プロモーターと高い相同性を示しており、DNAのメチル化を誘導することで劣性SP11の発現を抑制していた。B. rapaにおける優劣性が全て低分子RNAによって説明でき、低分子RNAを介したエピジェネティックな優劣性制御が普遍的に関与していることを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。アブラナ科植物において、自家不和合性を制御する花粉因子SP11の対立遺伝子間の発現には優劣性の現象が見られる。在来ナタネBrassicarapaでは優性側のSP11近接領域から生産される低分子RNA(Smi)が劣性側のSP11プロモーターのメチル化を誘導して、その発現を数万分の一まで抑制することが強く示唆された。しかしながら、SmiがどのようにしてSP11の発現を強く抑制するのか、その分子機構は不明である。そこで、Smi依存的なDNAメチル化と発現の抑制に関わる分子群の同定とそのメカニズムの解明を目的として、シロイヌナズナを用いた優劣性モデル実験系の確立を試みた。まず、B. rapaの標的劣性S60-SP11プロモーター:GUSをシロイヌナズナに導入した。導入株では葯特異的なGUS染色が観察され、シロイヌナズナにおいてもB. rapaのS60-SP11プロモーターが機能することが明らかとなった。次に、この株にSmi産生領域を導入し、GUS発現の抑制が起きるかどうかを検証したが、GUS発現は抑制されなかった。原因として、B. rapaのSmiプロモーターがシロイヌナズナにおいて適切な時期に機能しない可能性が示唆された。そこで葯発達ステージの初期から発現誘導することが報告されているイネOsg6Bプロモーターを使用した。Osg6Bプロモーター:GUSをシロイヌナズナに導入したところ、S60-SP11プロモーターの発現に先駆けて、発達ステージのごく初期の葯から発現が誘導されていた。既にOsg6BプロモーターにSmi領域を連結したコンストラクトを作製しており、今後、本コンストラクトによる劣性S60-SP11プロモーター:GUSの発現抑制を確認する。

各Smi2は自己よりも劣性のSP11プロモーターと高い相同性を示しており、DNAのメチル化を誘導することで劣性SP11の発現を抑制していた。B. rapaにおける優劣性が全て低分子RNAによって説明でき、低分子RNAを介したエピジェネティックな優劣性制御が普遍的に関与していることを明らかにした。優性側の低分子RNA産生領域と劣性側の標的プロモーター領域の一部をシロイヌナズナに導入するだけでは、標的遺伝子の発現抑制は再現されないことが明らかとなった。低分子RNA産生と標的遺伝子発現の時期的関係、低分子RNA産生領域周辺のゲノム構造、標的遺伝子周辺のゲノム構造の重要性、未知の因子の関与など複数の要因が推察され、新しい未知の仕組みが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。シロイヌナズナ優劣性モデル実験系の確立を急ぐ。Osg6BプロモーターにSmi領域を連結したコンストラクトによる劣性S60-SP11プロモーター:GUSの発現抑制を確認する。系の確立に成功すれば、本Smi依存的なDNAメチル化と既知のDNAメチル化との相関を確認するため、既知のDNAメチル化関連因子のT-DNAタグラインを入手し、SmiによりGUS遺伝子の発現抑制が見られた形質転換体に随時交配していく予定である。
褥瘡の予後予測に関する基礎研究－生体高分子マーカーを活用したツール開発に向けて－

褥瘡(いわゆる床ずれ)の予後予測につながる創部アセスメントに生体高分子の活用を目指し、褥瘡創部から採取した浸出液の中に含まれる、創傷治癒に関連すると考えられるタンパク質を検討し、それらの検出量と褥瘡創部の質的な状態について検討した。その結果、matrix metalloprotease-9およびbone morphogenetic protein-6の検出量と、褥瘡創部の臨床的所見とおよびDESIGN-Rの項目に関連性を見いだすことができた。このことから、MMP-9およびBMP-6は創の質的状態を判断するために有効な高分子マーカーであり、アセスメントツールとして活用が可能であることが示された。本研究の目的は、褥瘡創部のアセスメントツール開発に向けた基礎的研究を行うことであり、アセスメントに生体高分子マーカーの活用を目指す。今年度は、研究協力者のリクルートを継続しながら、昨年度の研究結果を参考にサンプルの作成および解析を進めた。研究協力者から採取(創傷治癒の状態別に3か所採取)した創傷液からタンパク質およびRNA抽出を行い、昨年度のリアルタイムPCRで確認したTGF-βスーパーファミリーである骨形成因子(BMP) -6について、ウエスタンブロッティング法を用いてタンパクレベルでの解析を進めた。また、これまでの研究結果より、褥瘡の発生や治癒に関与すると考えられるマトリックス分解酵素(MMP)ファミリーであるMMP-9に関しても同様に解析を行った。その結果、治癒が遅延している創部(または個所)では、MMP-9、BMP-6が共に高いレベルで検出される傾向にあった。また、創傷治癒が促進されている創部(または個所)では、MMP-9が高いレベルかつBMP-6が低中程度のレベルの傾向にあり、MMP-9、BMP-6が共に低いレベルの場合は、創傷治癒の最終段階である表皮形成が促進されている傾向にあった。このことは、MMP-9およびBMP-6のタンパク質濃度を測定することで、創部の状態を判断できる可能性を示していると考える。BMP-6と褥瘡の治癒との関連性はこれまでに検討されていないため、本研究の結果は、褥瘡治癒に関する新たな知見を見出すこととなると同時に、BMP-6とMMP-9が創傷治癒マーカーとなる得る可能性を示すことができたと考える。以上のことから、今年度の成果によって、褥瘡治癒過程における創部の状態に対するアセスメントツールとして、生体高分子マーカーの使用が可能かつ有用であることを示すことができた。平成25年度6月より、産休および育児休業のため研究を中断している。4月および5月は、これまでの実験結果の整理と文献の検索・整理・検討を行い、次年度復帰後に研究がスムーズに進むよう準備を行った。本研究の目的は、褥瘡の予後予測を行うためのアセスメントツール開発に向けた基礎的研究を行うことであり、アセスメントに生体高分子マーカーの活用を目指す。今年度は、研究協力者のリクルートを行いながらサンプルの作成および解析を進めた。研究協力者から採取した創傷液からタンパク質およびRNA抽出を行い、RNAはcDNA合成後に研究者のこれまでの研究成果を参考にターゲットを定め、リアルタイムPCRを行った。その結果、リアルタイムPCRによりTGF-βスーパーファミリーである骨形成因子(BMP) -6の存在を認めた。このことは、褥瘡の創傷液中にはBMP-6が存在し、創傷治癒に何らかの役割を果たしている可能性があることを示唆している。これまで創傷治癒にはBMP-2などが関与していることがいわれているが、BMP-6については明確に示されておらず、褥瘡への関与については検討されていない。そのため、本研究の結果は、褥瘡治癒に関する新たな知見を見出すこととなると同時に、創傷治癒マーカーとなる可能性も十分に考えられる。一方、タンパク質サンプルに対しては、マトリックス分解酵素(MMP)ファミリーをターゲットとしたウエスタンブロティング法での半定量を行い、MMP-9および13が創部の検体採取部位および採取した日により検出量が異なる、つまり創の状態により分泌されている量が異なることを確認した。この結果は、ひとつの創部においても多様性があることを示すとともに、創内の場所および創傷治癒過程の状況によってもその量が変化することを示しており、MMP-9および13が創部アセスメントツールとして有用となる可能性を示唆している。平成25年6月から平成26年7月まで、産前産後の休暇および育児休業のため研究を中断していた。研究再開後は、これまでに研究協力者から得られた褥瘡の滲出液を基に分析を進めてきたマトリックス分解酵素であるMMP-9および、骨形成因子であるBMP-6のウエスタンブロッティングの結果(タンパク質の発現を半定量したもの)と、採取した創部の質的な評価との関連性についてさらなる検討を進めた。具体的には、MMP-9とBMP-6の発現量を両者とも高い群、両者とも低い群、MMP-9は高くBMP-6は低い群、MMP-9は低くBMP-6は高い群の4群に分類し、それぞれの群に分類された創部の質的状態に類似性・特異性があるかを検討してきた。