hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
協応構造の組織化に着目した運動発達プロセスの研究

本研究の目的は、人の身体に備わっている協応構造の組織化に着目し、キャリングビークルを用いることで「巧みな運動」と呼ばれる高度な運動をモデル化することにある。今年度は、主に以下の3点について重点的に研究を行った。1点目は、COLUMNと呼ばれるキャリングビークルの内部状態やコントローラからの入力に対して、挙動と操作者の意図(ゴールの設定など)の差異を時系列的に整理した点である。その結果、移動方法に数種類のパターンが見られるものの、ある種の文脈がそれぞれのパターンにおいて存在することがわかった。なお、COLUMNの状態とタイミング、操作の順序を再現することで、COLUMNの任意の移動に成功している。これらの結果は、IJSRにて査読中であり、またHCII2015にて発表予定である。2点目は、COLUMNの制御を行うためのリカレントニューラルネットワーク(RNN)の構築である。COLUMNの制御に従来のRNNを直接用いることは可能ではあるが、そこに協調のモデルといった要素を共在することはできないため、既存の運動モデルと併用可能なRNNの改良が必要であった。こうした課題を解決するため、特定の運動モデルと共存可能なRNNを、学習則に遺伝的アルゴリズムを介在することで実現するアプローチを行った。構築したRNNについて、未だいくつかの評価が必要であるが、その結果についてはJSAIに投稿予定である。3点目は、キャリングビークルINAMOを用いたものである。本年度は、人とINAMOが「遊び」を媒介に関係を構築し、人-ロボットが一体となって一つのシステムを作り出すメカニズムについて議論を行ってきた。制約条件や振る舞いを工夫することで、COLUMNと同様に多人数協調を扱うキャリングビークルとしての用途、あるいはユーザーとロボットとの間で創発的な「遊びの場」を作り出すといった研究プラットフォームとしての可能性について議論を行い、EC2014及びHAI2014にて発表を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、人の身体に備わっている協応構造の組織化に着目し、キャリングビークルを用いることで「巧みな運動」と呼ばれる高度な運動をモデルすることにある。初年度は、人と人との協調によってCOLUMNと呼ばれる多自由度を内包したキャリングビークルを思い通りに操作できるようになるまでの過程について、フィールド調査・分析を行った。具体的には、操作者間のコミュニケーション内容とCOLUMN内のパラメータから、思い通りの操作が確立されるまでの過程について分析を行った。その結果、操作者=自由度となってCOLUMNを操作する関係において、自由度同士のタイミングと位置関係が複雑に影響し合っているものの、同じようなシチュエーションにおいていくつかのパターンの存在が示された。これらの結果は、APCHI2012で発表した。また、操作者間の「会話」や「間の取り合い」の構築、あるいはグループ内のリーダーによる「指揮」が、COLUMNを思い通りに操作するために必要であることが分かった。これらの結果は、ヒューマンインターフェースシンポジウム2012、HAIシンポジウム2012で発表した。さらに、人と人とを繋ぐ社会的なメディエータとしての観点からCOLUMNを運用した際の研究成果を、HRI2012で発表した。なお、ヒューマンインターフェースシンポジウム2012では【優秀プレゼンテーション賞】を受賞した。また、HAIシンポジウム2012では【HAI-2012 Impressive Experience Award】を受賞した。また、HRI2013では【HRI2013 Best Demonstration Honorable Mention Award】を受賞した。今年度は、主に3点について重点的に研究を行った。1点目は、キャリングビークルCOLUMNを通じて構築される操作者間の協調について詳細に分析を行った点である。具体的には、操作者同士の「操作の衝突」に着目し、協調の構築にどのような影響を及ぼしているか、いくつかの観点から考察を行った。その結果、初心者の操作には「操作の衝突」が頻繁に確認されるものの、熟練者の操作では少なかった。「操作の衝突」が消える前後において、操作者間の操作は「頻度」「強さ」「タイミング」を中心に似ることが確認されており、「操作の衝突」の有無が初心者と熟練者の境界になっていることが示唆された。また、熟練者の操作では、いわゆる「コツ」が共有されているものと推測される。こうした「コツ」は人の身体内において組織化されるため一般的には数値化することが困難であるが、COLUMNを通じて分析することで「巧みな運動」実現への足掛かりとなることが期待される。2点目は、COLUMNを用いて、構成的に運動のモデルを構築する試みである。昨年度までの研究においては主に操作者からの視点においてCOLUMNの運動を分析してきたが、COLUMNをうまく移動させるための条件を整理した結果、COLUMN単体での任意の移動に成功した。今後は操作者側からの分析とCOLUMN側の運動モデルとのすり合わせを行っていく。3点目は、IN側0という離合集散牽繰り返すパネル型ロボットを用いた、人-INAMO-環境の間で自己組織される共創型インタフェースの提案である。INAMOはCOLUMNと同様に、身体を取り巻く環境によって、その振る舞いが制約され、結果として参与者及び環境に応じて形態を変化させるロボットである。ダイナミカルシステムの観点から見ると、「環境の変化に応じて形状(形態)を変化させる」という点において、COLUMNとINAMOは近しい振る舞いを見せることから、「自由度の制約による自己組織化」というメカニズムの解明を行う上で重要な役割を担うものと期待される。

本研究の目的は、人の身体に備わっている協応構造の組織化に着目し、キャリングビークルを用いることで「巧みな運動」と呼ばれる高度な運動をモデル化することにある。今年度は、主に以下の3点について重点的に研究を行った。1点目は、COLUMNと呼ばれるキャリングビークルの内部状態やコントローラからの入力に対して、挙動と操作者の意図(ゴールの設定など)の差異を時系列的に整理した点である。その結果、移動方法に数種類のパターンが見られるものの、ある種の文脈がそれぞれのパターンにおいて存在することがわかった。なお、COLUMNの状態とタイミング、操作の順序を再現することで、COLUMNの任意の移動に成功している。これらの結果は、IJSRにて査読中であり、またHCII2015にて発表予定である。2点目は、COLUMNの制御を行うためのリカレントニューラルネットワーク(RNN)の構築である。COLUMNの制御に従来のRNNを直接用いることは可能ではあるが、そこに協調のモデルといった要素を共在することはできないため、既存の運動モデルと併用可能なRNNの改良が必要であった。こうした課題を解決するため、特定の運動モデルと共存可能なRNNを、学習則に遺伝的アルゴリズムを介在することで実現するアプローチを行った。構築したRNNについて、未だいくつかの評価が必要であるが、その結果についてはJSAIに投稿予定である。3点目は、キャリングビークルINAMOを用いたものである。本年度は、人とINAMOが「遊び」を媒介に関係を構築し、人-ロボットが一体となって一つのシステムを作り出すメカニズムについて議論を行ってきた。制約条件や振る舞いを工夫することで、COLUMNと同様に多人数協調を扱うキャリングビークルとしての用途、あるいはユーザーとロボットとの間で創発的な「遊びの場」を作り出すといった研究プラットフォームとしての可能性について議論を行い、EC2014及びHAI2014にて発表を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。おおむね計画通り研究は進んでいるが、ロボットの不具合に伴う整備などに時間を割かれ、成果の中間発表となる論文投稿が遅れている。しかしながら、この点は近々解決する見通しであるため、ここでの達成度を「おおむね」と評価した。また本研究の内容を、国内学会、国際会議、外部展示などにおいて発表した際に、多数の受賞を頂いていることからも、順調に進んでいると評価できる。制御モデルの構築、個人間協調の中で見いだされたコツの整理、キャリングビークルへの応用などを鑑みると、本年度の達成度としては、おおむね順調に進展していると判断できる。これまでの研究成果を発達ロボティクス、及びソーシャルメディエータという観点から整理し、投稿論文にまとめる。
オーロラ紫外スペクトルのオーロラ加速域情報から探る木星・土星電磁圏ダイナミクス

本研究では、「ひさき」宇宙望遠鏡で観測された木星オーロラ・スペクトルからオーロラ電子パラメータを導出する方法を、ハッブル宇宙望遠鏡の観測との比較を通して確立した。さらに、スペクトル情報と加速理論を組み合わせ、磁気圏粒子パラメータ(加速前のプラズマ密度・温度)の変動量を導出した。それらを用いて、木星磁気圏の内因(自転に伴う磁気圏ダイナミクスおよび衛星火山活動)・外因(太陽風)それぞれの変動に対するオーロラ降り込み電子および磁気圏環境の応答を明らかにした。また、オーロラ・スペクトルのH/H2比情報を用いた低エネルギー電子降り込みの解析を、土星に加えて木星にも適用し、惑星間の比較・考察を行った。本年度は、オーロラ電子のエネルギー-フラックス関係を用い、外部(太陽風)・内部(自転)起因の木星電磁圏変動の起源と過程の調査に取り組んだ。木星オーロラ発光を引き起こすオーロラ電子のエネルギーやフラックス値は、メタンによる水素の紫外吸収断面積が異なる波長帯の発光比を指標にして、オーロラ観測から見積もることができる。本研究では、JAXAの「ひさき」宇宙望遠鏡に搭載された観測器EXCEEDの波長範囲と特性に特化した、新しい発光比を定義し、オーロラ電子のエネルギーとフラックス、全流入エネルギー等を推定する手法を確立した。オーロラを空間分解する「ハッブル」宇宙望遠鏡データを用いた解析とも比較し、空間積算や異なる波長を参照する本手法の、妥当性と制約を評価した。この手法を用い、「ひさき」宇宙望遠鏡によって観測された木星オーロラおよびオーロラ電子の時間変化の調査を行った。木星位置における太陽風変動として、モデル計算結果を参照した。太陽風動圧増大に伴う数日にわたる増光と、太陽風静穏時の自転周期(10時間)以下の短時間の増光が検出された。増光時のオーロラ電子エネルギーの変化は小さく、オーロラ発光強度変化は電子エネルギーよりも電子フラックスの変化が主要因であることが、本研究から明らかになった。オーロラ加速理論をもとに、磁気圏粒子パラメータ(加速前のプラズマ密度・温度)の変動量を導出した。これらの観測結果を説明する、磁気圏ダイナミクスに伴う断熱的加熱効果、および、主要な発光を担うオーロラ位置の変化、のモデルを提唱した。(1)平成27年度の実施計画である木星オーロラの解析に加え、加速理論と組み合わせた特徴解釈まで進めることができた。この成果発表論文は、米国地球物理学会誌のエディターの推薦を受け、spotlightで紹介された。(2)エネルギー-フラックス関係からのオーロラ領域の特定について、空間積算や利用波長の制約上難しいことが判明した。しかし、この制約の中、明らかな変動と特徴を抽出し、それらの理解と定量的評価を行うことができた。(3) 2015年の観測では、衛星イオ火山活動増大に伴い、オーロラ発光およびオーロラ電子・磁気圏変動に特長的な変化がみられた。同手法を適用し、その解釈と評価も進めている。オーロラ粒子加速理論をもとにした、磁気圏粒子パラメータとオーロラ電子の対応付けを行った。オーロラ粒子加速理論として、線形関係のKnight理論の他、高速回転によるプラズマ磁気赤道拘束効果[Ray et al., 2009JGR]や数100 keVのオーロラ電子の相対論効果[Cowley, 2006AnnGeo]を考慮した加速域の理論モデルとの対応を比較・評価した。また、「ひさき」宇宙望遠鏡の木星オーロラ・スペクトルからのオーロラ電子パラメータ導出方法を、解析期間を拡張して解析を行った。特に、2015年1月の衛星イオ火山活動の活性化に伴う変化を調べた。オーロラ電子エネルギーの指標であるH2発光強度比は数ヶ月の期間を通して小さく、短時間増光は非常に大きな電子数フラックス増大を伴うものであった。この結果は、オーロラ電子の起源である磁気圏の数keVのプラズマ増大を示唆する。ハッブル宇宙望遠鏡で観測された木星オーロラに、H/H2発光強度比を用いたオーロラ電子エネルギーとフラックス評価の解析を適用した。低エネルギー電子に感度があるH/H2発光強度比と、>20 keVのエネルギー電子に感度があるH2発光強度比の相関ははっきりしなかった。エネルギー・フラックス関係式について、エネルギー増大と共にフラックスが減少する特徴が見られた。土星オーロラのエネルギー-フラックス関係式が、低エネルギー(<数keV)ではエネルギーが増大するとフラックスが減少し、高エネルギー(>数keV)ではエネルギーが増大するとフラックスが増大することとの相違について、起源となる磁気圏プラズマの温度・密度の違いや、この手法が網羅するエネルギー帯の違いを考察した。オーロラのH/H2比解析について、木星オーロラへの適用を行い、両惑星の相違から、惑星環境および手法の双方の観点で、理解を深めた。最終年度において、「ひさき」宇宙望遠鏡の木星オーロラ・スペクトルからのオーロラ電子パラメータ導出方法を適用して、2015年1月の衛星イオ火山活動の活性化に伴うオーロラおよび磁気圏変化を調べた結果を、論文に投稿し、受理された。さらに、このオーロラ観測結果を、Juno探査機搭載のプラズマ計測器による直接その場観測と比較した。両者に相違点を、オーロラの解析で仮定する大気分布の観点から考察し、数値実験による裏づけを行った。これは、極域の大気モデルを制約する意義を持つ。また、ハッブル宇宙望遠鏡で観測された木星オーロラに、水素原子線と水素分子線の発光強度比(H/H2)によるオーロラ電子エネルギー導出法を適用してエネルギーとフラックス評価を行い、土星オーロラとの相違を比較・考察した結果についても、論文に投稿し受理された。期間全体を通して、「ひさき」

宇宙望遠鏡の木星オーロラ・スペクトルを用いたオーロラ電子パラメータ導出方法を、ハッブル宇宙望遠鏡の観測との比較を通して確立した。さらに、スペクトル情報と加速理論を組み合わせ、磁気圏粒子パラメータ(加速前のプラズマ密度・温度)の変動量を導出した。それらを用いて、木星磁気圏の内因(自転に伴う磁気圏ダイナミクスおよび衛星火山活動)・外因(太陽風)それぞれの変動に対するオーロラ降り込み電子および磁気圏環境の応答を明らかにした。また、オーロラ・スペクトルのH/H2比情報を用いた低エネルギー電子降り込みの解析を、土星に加えて木星にも適用し、惑星間の比較・考察を行った。本研究では、「ひさき」宇宙望遠鏡で観測された木星オーロラ・スペクトルからオーロラ電子パラメータを導出する方法を、ハッブル宇宙望遠鏡の観測との比較を通して確立した。研究課題に大きな変更はない。平成28年度は、今年度の手法とも独立したエネルギー導出法および新たな観測データを用いるものであり、上記の制約は影響しない。H/H2比の木星・土星オーロラ解析および磁気圏波動粒子相互作用効果の評価を行う。今後の推進方策に大きな変更はない。惑星超高層・電磁圏物理平成27年度に購入を予定していた物品購入は急を要せず、適切に研究を遂行できたため。参加を検討していた国際学会を見送り、来年度分を拡充するため。物品購入が急を要さず、適切に研究が遂行できたため。平成28年度の研究進捗状況により新規に必要となった物品購入および出張、論文成果発表費用に使用する予定である。データ解析の習得や研究相談、成果発表のための出張費用を多めに必要とする。研究相談、成果発表のための出張費用、および、論文成果発表費用を多めに計上する。
線維芽細胞の表現型の修飾と歯周治療への応用に関する研究

今回、歯周再生療法に応用可能な移植材の開発を目指して、線維芽細胞にアルカリホスファターゼ(ALP)の発現を誘導する培養系の開発を試み、以下の成果を得た。アスコルビン酸(AsA)はヒト歯肉線維芽細胞にALPを誘導した。transforming growthfactor-β(TGF-β)は低濃度でAsAによるALPの誘導を促進し、高濃度でこれを抑制した。AsAによるALPの誘導はフィブロネクチン(FN)により促され、I型コラーゲン繊維との接触により抑制された。これらの結果に基づき、ALP陽性線維芽細胞から構成される培養系を開発した。すなわち、AsA/TGF-β/10%血清添加の培地で細胞をFNの沈着した細胞外マトリクス環境下で多層化させ、その後培地をAsA/TGF-βに変えて培養することでALPの発現を誘導することができた。以上の結果から、歯周再生療法に応用可能な移植材の開発の可能性が示された。線維芽細胞は創傷治癒や炎症の際にアルカリホスファターゼ(ALP)を強く発現する。今回、ALPの誘導を促進する因子を調べ、この応答に及ぼす細胞外マトリクス(ECM)の影響について検討した。アスコルビン酸2リン酸(AsAP)はヒト健常歯肉由来線維芽細胞にALP活性とタンパクの発現を誘導した。transforming growthfactor-β(TGF-β)は細胞の生存を促す低い濃度ではAsAPによるALPの発現を増強し、増殖を刺激する高濃度ではこれを抑制した。ヒト歯肉線維芽細胞をAsAP/TGF-β/10% FBSで刺激するとcollagen,fibronectin,tenascin,thrombospondin等の沈着した肉芽組織類似のECMが形成された。このモデル系においてAsAP/TGF-βはALPの発現を誘導した。一方、結合組織モデルの3次元コラーゲン・ゲル培養ではAsAP/TGF-βはALPの発現を誘導しなかった。以上の結果から、アスコルビン酸と細胞の生存を促す濃度のTGF-βの組み合わせは線維芽細胞にALPの発現を促進することが示された。これらの因子に対する線維芽細胞の応答性ECMの環境に影響される。アルカリホスファターゼ(ALP)の発現は歯根膜線維芽細胞に特徴的な表現型のひとつである。今回我々は、細胞外マトリクス成分であるフィブロネクチン(FN)とI型コラーゲンのALPの発現の誘導に及ぼす影響について検討し、以下の成果を得た。アスコルビン酸(AsA)は培養ヒト歯肉線維芽細胞にALPの発現を誘導した。この誘導はFNレセプターであるインテグリンα5β1に対する機能抑制抗体によって特異的に抑制された。FNをコートしたウェルに播種した細胞はAsAに応答してALPを発現した。I型コラーゲンゲルに播種した細胞ではALPが誘導されなかった。I型コラーゲン細線維はFNに播種した細胞のALP発現を抑制した。従って、FNは線維芽細胞がAsAに応答してALPを発現するのを促し、I型コラーゲン細線維はALPの誘導を抑制することが証明された。
バピヨン・ルフェーブル症候群表皮細胞におけるセリプロテアーゼの活性化障害

バピヨン・ルフェーブル症候群は多種のセリンプロテアーゼを活性化するカテプシンC (CTSC)の欠損により生じ、掌蹠角化、若年性歯周囲炎を特徴とする。本症に見られる掌蹠角化の発症機構を解明した報告はない。CTSCのリコンビナント蛋白を培養表皮角化細胞であるHaCaTの培地中に加えたところ、HaCaTの細胞質内のKLK8が活性化された。KLK8はセリンプロテアーゼのひとつで、角層の脱落を担っているという報告がある。また、マウスの皮膚にTPAを塗布すると、CTSCノックアウトマウスでは、野生型マウスに比し著明な表皮の過角化亢進が組織学的に明らかとなった。以上の結果は、カテプシンCの欠損によるセリンプロテアーゼの活性化障害が引き起こされ、皮膚の角化が亢進するという我々の仮設を支持するデータと考える。バピヨン・ルフェーブル症候群は掌蹠角化、易感染性、歯周囲炎、を特徴とする比較的まれな常染色体性劣性遺伝病であり、その原因は多種のセリンプロテアーゼの活性化を担うカテプシンCの欠損である。申請者のグループは本症を数例経験し、そのカテプシンC遺伝子の変異を解析している。この酵素カテプシンCは、好中球やマクロファージに多く存在し、エステラーゼやグランザイムといったセリンプロテアーゼを活性化するので、本酵素が欠損するバピヨン・ルフェーブル症候群で、易感染性が生ずることは簡単に理解できる。しかし、本症に見られる掌蹠角化の発症機構を解明した内外の報告はない。今回の研究では本症の表皮細胞に生じている分化異常が、TGF-βの発現やシグナルの異常を引き起こし、メラノサイトの癌化を促進しているのではないかと考えた。本研究では、バピヨン・ルフェーブル症候群の原因であるカテプシンCの欠損が角化細胞の脱落を障害し過角化を引き起こしているか、TGF-βの発現やシグナルの異常を誘導して黒色腫の発生に関与するのか、という2つの仮説の検証を行っている。まず、本年度は、バピヨン・ルフェーブル症候群の遺伝子解析と表皮細胞株、リコンビナント蛋白作成を行った。我々は、新たに2人のバピヨン・ルフェーブル症候群を経験している。それらの患者のDNAからカテプシンC遺伝子を増幅して遺伝子変異を確認した。また、カテプシンCによるカリクレイセリンプロテアーゼ(KLK)の分解の確認も検討した。さらに、本症患者の一人から表皮細胞を培養し形態を確認しているが、特に目立った異常は確認されていない。つぎに、培養表皮細胞に角化を誘導し、その後カテプシンC、KLK5やKLK8をくわえることにより、細胞の結合が変化するかを検討した。本年度の検討で、我々の仮説が正しい可能性ができているので、引き続き来年度も研究を継続する。バピヨン・ルフェーブル症候群は掌蹠角化、易感染性、歯周囲炎、を特徴とする比較的まれな常染色体性劣性遺伝病であり、その原因は多種のセリプロテアーゼの活性化を担うカテプシンCの欠損である。この酵素カテプシンCは、好中球やマクロファージに多く存在し、エステラーゼやグランザイムといったセリプロテアーゼを活性化するので、本酵素が欠損するバピヨン・ルフェーブル症候群で、易感染性が生ずることは簡単に理解できる。昨年度に作成したカテプシンCのリコンビナント蛋白を培養表皮角化細胞であるHaCaTの培地中に加えたところ、HaCaTの細胞質内のカリクレイン(KLK)が活性化されることがわかった。さらに、我々はカテプシンCのノックアウトマウスを作成。発癌実験においては野生型マウスとの差は現時点では得られなかったが、TPAを皮膚に塗布すると野生型マウスよりも表皮の過角化が亢進することが組織学的に明らかとなった。以上の結果は、カテプシンCの欠損によるセリプロテアーゼの活性化
混合感染が病原性クラミジアの細胞修飾機構に与える影響とその分子基盤の解明

Chlamydia trachomatis(以下、性器クラミジア)は性感染症の原因菌であり、性器クラミジア感染症は世界中で数百万人が感染し、不妊の原因ともなっている。しかし、感染機構や病態形成機構などは未知な部分が多く、膣粘膜面には多数の微生物が存在し、性器クラミジアの病態形成機構をより複雑化している。クラミジアは偏性細胞内寄生性細菌であり、遺伝子変異株作製方法が十分に確立されておらず、クラミジア病態形成機構解明研究は、他の病原体に比べて立ち後れている。そこで、混合感染による性器クラミジアの細胞修飾機構に与える影響とその分子基盤を解明するために、性器クラミジアの遺伝子変異株を作製し、緑色蛍光蛋白質GFP発現性器クラミジアを確立した。しかしながら、クラミジアのタンパク質(IncA, OmpA)をコードする遺伝子領域をプラスミドに付与し、クラミジアに導入しても、通常の局在と異なっており、他のタンパク質についても同様に導入を試みたが、GFP発現を確認できなかった。一方、男性泌尿生殖器にも性器クラミジアは感染する。男性泌尿生殖器は基本的に無菌であるが、サンプル数が少なく、比較された論文はこれまでに存在しなかった。そこで、我々は特に外環境に接している外膜タンパク質に差が生じるのではないかと考え、男女分離株の多型性外膜タンパク質PmpFの遺伝子多型を検討した。結果、男性分離株のPmpF配列多型は女性分離株に比べて乏しく、株間での変異が少ないことを明らかにした。また、男性分離株の内で、眼疾患株に特有の血清型を持つStrain 54株のドラフトゲノム解析をし、Pmps(A-I)の配列を解析したところ、PmpB配列にユニークな多型が見られた。このことから、混合感染などによって、外膜タンパク質遺伝子に多型が生じ、クラミジアの病態形成機構や細胞修飾機構に対し有利に働いている可能性が示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。Chlamydia trachomatis(以下、性器クラミジア)は性器クラミジア感染症の起原因であり、本感染症は世界で数百万人が感染し、不妊の原因となり、再感染も容易であることから、感染拡大の防止が望まれている。しかし、その感染様式や細胞修飾機構などは不明な点も多い。さらに、感染局所の女性生殖器粘膜面には多数の常在菌や他の病原性細菌が存在することにより、その病態形成機構をより複雑化している。加えて、近年女性生殖器粘膜面に存在するウレアプラズマやマイコプラズマが他の病原性細菌の感染に様々な影響を与えている可能性が示唆されている。また、我々の以前の研究で、性器クラミジアとウレアプラズマの混合感染が健常女性の膣粘膜面において高頻度に検出された。そこで我々はウレアプラズマ同時感染時における性器クラミジアの動態について細胞・分子レベルでの研究を行なうに至った。平成25年度はウレアプラズマが性器クラミジアの細胞内増殖に与える影響の解明に努め、性器クラミジアの主要宿主防御因子であるIFN-γ存在下で、ウレアプラズマ刺激によってクラミジアの生存性を高めている可能性を見出した。また、IFN-γによる性器クラミジア感染防御機構は、IDO (indoleamine2,3-dioxygenease)の発現上昇によるトリプトファンの枯渇である。しかしながら、ウレアプラズマ刺激ではIDOの発現に影響は見られなかった。この成果は、Journal of Infection and Chemotherapy (Yamazaki T et al. 2014)に採択されている。(2014年4月21日現在、未出版)以上の結果から、臨床での性器クラミジア感染症の複雑な感染様式の一部にウレアプラズマが関わっている可能性を示唆した。しかし、その分子機構についてはいまだ不明な点が多く、さらなる研究が必要である。クラミジア・トラコマチス(以下、性器クラミジア)は性器クラミジア感染症の原因菌であり、世界中で数百万人が感染し、不妊の一因であり、再感染も容易であるため、感染拡大の防止が望まれている。しかし、その感染様式などは未だ不明な点が多い。さらに、感染局所である女性生殖器粘膜面には多数の常在菌や他の病原性細菌が存在し、病態形成機構をより複雑化している。そこで、我々は性器クラミジアとウレアプラズマの混合感染が健常女性の膣粘膜面において高頻度に検出され、性器クラミジアの主要宿主防御因子であるIFN-γ存在下で、ウレアプラズマの同時感染によってクラミジアの生存性を高めている可能性を見出し発表した。詳細な修飾に関わる分子機序は未だ明らかではないが、III型分泌装置を介して宿主細胞に打ち込まれる未知エフェクター分子がその一役を担っていると強く考えられる。そこで、DNAマイクロアレイ解析とIII型分泌エフェクター予測ツールを用いて、新規エフェクター候補遺伝子の選別作業を行い、数個の遺伝子を同定した。一方、クラミジア属の様な偏性細胞内寄生性細菌に対する遺伝子変異株作製法は未だ十分に確立されていないため、容易ではなく、世界的にも数例しか報告されていない。それ故、クラミジアの病態形成やその修飾機序の解明研究は、他の病原体と比較して立ち後れている。そこで、性器クラミジアの潜在的プラスミドを利用した遺伝子変異株を作製し、緑色蛍光蛋白質GFPを性器クラミジア菌体内で発現させることに成功した。これにより、クラミジアの遺伝子操作研究がさらに発展し、病態形成機構の解析が進むと予測される。今後は、新たに見つかったエフェクター候補の性器クラミジア遺伝子変異株に応用し、性器クラミジアの病態形成に与える影響について調査していく。

Chlamydia trachomatis(以下、性器クラミジア)は性感染症の原因菌であり、性器クラミジア感染症は世界中で数百万人が感染し、不妊の原因ともなっている。しかし、感染機構や病態形成機構などは未知な部分が多く、膣粘膜面には多数の微生物が存在し、性器クラミジアの病態形成機構をより複雑化している。クラミジアは偏性細胞内寄生性細菌であり、遺伝子変異株作製方法が十分に確立されておらず、クラミジア病態形成機構解明研究は、他の病原体に比べて立ち後れている。そこで、混合感染による性器クラミジアの細胞修飾機構に与える影響とその分子基盤を解明するために、性器クラミジアの遺伝子変異株を作製し、緑色蛍光蛋白質GFP発現性器クラミジアを確立した。しかしながら、クラミジアのタンパク質(IncA, OmpA)をコードする遺伝子領域をプラスミドに付与し、クラミジアに導入しても、通常の局在と異なっており、他のタンパク質についても同様に導入を試みたが、GFP発現を確認できなかった。一方、男性泌尿生殖器にも性器クラミジアは感染する。男性泌尿生殖器は基本的に無菌であるが、サンプル数が少なく、比較された論文はこれまでに存在しなかった。そこで、我々は特に外環境に接している外膜タンパク質に差が生じるのではないかと考え、男女分離株の多型性外膜タンパク質PmpFの遺伝子多型を検討した。結果、男性分離株のPmpF配列多型は女性分離株に比べて乏しく、株間での変異が少ないことを明らかにした。また、男性分離株の内で、眼疾患株に特有の血清型を持つStrain 54株のドラフトゲノム解析をし、Pmps(A-I)の配列を解析したところ、PmpB配列にユニークな多型が見られた。このことから、混合感染などによって、外膜タンパク質遺伝子に多型が生じ、クラミジアの病態形成機構や細胞修飾機構に対し有利に働いている可能性が示唆された。性器クラミジアの病態形成機構に寄与すると考えられるIII型分泌装置の新規エフェクター候補遺伝子を見出した。また、性器クラミジアの潜在的プラスミドを利用した遺伝子変異株を作製し、性器クラミジア菌体内で緑色蛍光蛋白質GFPを発現させることに成功したことから、研究のさらなる発展が望まれるため、おおむね順調に進展しているとした。27年度が最終年度であるため、記入しない。作製したGFP発現性器クラミジア遺伝子変異株の構築を応用して、昨年度に同定した新規エフェクターの性器クラミジア遺伝子変異株を作製し、性器クラミジアの病態形成に与える影響について調査する。また、混合感染時の新規エフェクターの動態についても精査していく。今現在ではGFPの発現量やタイミングは性器クラミジアの増殖サイクルに対して一律であるが、エフェクターの発現タイミングを薬剤投与量に応じて変化させ、性器クラミジアの細胞内増殖サイクルに依存せず、実験者の任意に調節する機構も作製していく。クラミジア属の様な編性細胞内
多雪地域の森林における大気－積雪層・土壌間の温室効果ガス動態の解明とその定量評価

地球温暖化に伴い森林の温暖化緩和機能が注目されている。温室効果ガスの吸収・放出量は地温や土壌水分に応じて変動する。多雪地域では冬期の土壌は低温で、微生物活性が低いことから、実観測やそれに基づく評価例は数少ない。故に、降雪・積雪・融雪による物理化学的プロセスを加味した大気-積雪層・土壌間の温室効果ガス動態の解明が必要である。本課題では安比高原ブナ林にて積雪・融雪過程と各種温室効果ガス動態の関係解明を目的に、大気-土壌・積雪層間のガス動態を解析した。その結果、積雪は温室効果ガス動態の抵抗層となっていること、融雪期の大量の融雪水は積雪層・土壌内のガス濃度分布に大きな影響を与えることが明らかとなった。冬期に森林内で形成された積雪層や融雪水が大気-積雪層・土壌間における温室効果ガス収支へ及ぼす物理化学的な影響を解明するために、安比森林微気象観測共同試験地において小型・低コストCO2濃度計を積雪層および土壌層内に設置し、各層内空気のCO2濃度変動の連続自動観測を開始した。その結果、積雪に伴い土壌空気中CO2濃度が上昇し、積雪層がガス拡散抵抗層になっていることがデータから明らかとなった。同時に、同一層における空気を、シリンジを用いて採取し、採取したガス試料をガスクロマトグラフ(島津製作所:GC-14A)にて分析した。ガス試料のガスクロによる分析結果から試算した積雪層内CO2濃度分布は小型・低コストCO2濃度計による出力結果と同様な傾向を示しているが、出力データの絶対値に差がみられた。小型・低コストCO2濃度計は赤外線センサーによる濃度測定であることから、積雪層内に存在する水蒸気、すなわち相対湿度が赤外線センサーの出力に何らかの影響を与えている可能性が示唆された。両データの整合性に関しては、今後、ガスクロによる分析結果と小型・低コストCO2濃度計による観測データを比較し、検討していく予定である。また、積雪層表面にアルミ製円筒チャンバーを設置して積雪面からのガスフラックスを観測した。その結果、CO2、N2Oフラックスの積雪影響はあまり明瞭でなく、CH4フラックスのみ積雪によって大気からのガス供給が阻害され、積雪の影響を受けている傾向が観測できた。気候変動へ及ぼす温室効果ガスの影響を高い精度で予測するには、年間通じた温室効果ガスの動態メカニズムの解明とその収支バランスの定量評価が不可欠である。本研究は、地温が低く土壌微生物活性がわずかであると考えられ、従来は重要視されていない厳冬期の大気ー土壌間におけるガス収支に焦点を当てる。本課題では、冬期に森林内で形成された積雪層や融雪水が大気ー積雪層・土壌間における温室効果ガス収支へ及ぼす物理化学的な影響を解明することを目指す。昨年度より、冬期に森林内で形成された積雪層や融雪水が大気ー積雪層・土壌間における温室効果ガス収支へ及ぼす物理化学的な影響を解明するために、安比森林微気象観測共同試験地において小型・低コストCO2濃度計を積雪層および土壌層内に設置し、各層内空気のCO2濃度変動の連続自動観測を開始した。本年度は、当該観測を継続するとともに、得られたデータの解析を行った。その結果、融雪末期の概ね1週間程度で土壌CO2濃度が510分の1のレベルまで急激に低下することが明らかとなった。積雪層が土壌ガスの抵抗層であるとともに、融雪期に大量に発生する融雪水が土壌内部を通過する際に、水への溶解性が高い土壌内部のCO2に対して何らかの影響を及ぼしていることが示唆された。2013年度に掘り出して、再設置した小型・低コストCO2濃度計に関しては、2012年度に見られた土壌中および積雪層中CO2濃度のデータ振り切れもなく、順調に観測データの記録が進行した。ここで得た土壌中および積雪層中CO2濃度の季節変動と、積雪深、雪質、雪温、雪密度、積雪含水率などの積雪環境、および積雪層下の地温、土壌含水率などの土壌環境との関係を解析するため、2012年秋2013年春の期間における調査観測データを各調査時系列ごとに整理を行い、それらの解析を開始した。その結果、土壌空気中のCO2濃度は積雪開始(概ね12月初旬)より上昇し始め、12月下旬から1月上旬には土壌20cm深における土壌空気のCO2濃度は10000ppm余りに達すること、そしてそれは積雪層が消失する融雪末期(4月下旬5月上旬)まで持続することが明らかとなった。一方、積雪層中空気のCO2濃度は積雪深の増加とともに上昇し、特に積雪層と地表面の境界における積雪層中空気におけるCO2濃度は最大積雪深達成時(2013年3月3日、積雪深223cm)には4000ppm余りを示したこと、そして積雪層中空気におけるCO2濃度は融雪に伴う積雪深の低下とともに減少することが明らかとなった。最終年度に向け、積雪環境下における他の温室効果ガスの動態評価と併せて、成果報告に向け、データ解析を進めている。地球温暖化に伴い森林が持つ温暖化緩和機能が注目され、森林土壌由来の温暖化ガス動態の観測が各地で行われている。主要な温暖化ガスのうち、森林土壌では、二酸化炭素と亜酸化窒素は放出源、メタンは吸収源である。温暖化ガスの吸収量、放出量は地温や土壌水分量に応じて変動する。

しかし、寒冷な多雪地域では冬期の地温が低いため、土壌微生物の活性はわずかと考えられ、実観測やそれに基づく正確な評価例は数少ないことから、積雪地域の森林において、降雪・積雪・融雪による物理化学的プロセスを加味した大気ー積雪層・土壌間の温暖化ガスの吸排出プロセスの解明と精度の高いガスフラックスの観測が不可欠である。本課題では、積雪、融雪プロセスが各種温暖化ガス動態に与える物理化学的影響を明らかにすることを目的に、安比高原ブナ林において積雪期における大気ー積雪層および土壌中の二酸化炭素、亜酸化窒素、メタン、それぞれのガス濃度の鉛直分布について経時モニタリングを行い、大気-土壌・積雪層間の二酸化炭素、亜酸化窒素、メタンの各ガス動態を解析した。その結果、以下の3点が明らかとなった。1積雪は、二酸化炭素と亜酸化窒素の放出フラックス、メタンの吸収フラックスの抵抗層となっているが、雪質(しまり、ざらめ、氷盤など)、含水率、雪密度の違いが抵抗強度の違いとしてガス濃度の鉛直分布に影響するわけではなかった。2ただし、地表面の湿雪はガスフラックスの大きな抵抗となり、二酸化炭素、亜酸化窒素は土壌に貯留され、メタンは土壌中で濃度が低下した。3大量の融雪水の通過は、積雪層内のガス濃度の鉛直分布に大きな影響を与える。これらの成果は、日本土壌肥料学会、日本森林学会、日本生態学会などを通じて研究発表を行い、成果の普及を図った。以上により、気候変動に伴い大きな影響を受けやすい、積雪環境下における温暖化ガス動態の一端が明らかとすることができた。地球温暖化に伴い森林の温暖化緩和機能が注目されている。温室効果ガスの吸収・放出量は地温や土壌水分に応じて変動する。多雪地域では冬期の土壌は低温で、微生物活性が低いことから、実観測やそれに基づく評価例は数少ない。故に、降雪・積雪・融雪による物理化学的プロセスを加味した大気-積雪層・土壌間の温室効果ガス動態の解明が必要である。本課題では安比高原ブナ林にて積雪・融雪過程と各種温室効果ガス動態の関係解明を目的に、大気-土壌・積雪層間のガス動態を解析した。その結果、積雪は温室効果ガス動態の抵抗層となっていること、融雪期の大量の融雪水は積雪層・土壌内のガス濃度分布に大きな影響を与えることが明らかとなった。観測自体は、概ね順調に進んでいる。また、補足データとして実地調査している積雪調査も順調に進み、データが蓄積された。2012年秋2013年春の観測データの解析は進めている一方で、2013年秋2014年春、2014年秋2015年春の観測データも解析の為のデータ整備の進行具合も計画通りである。以上より、課題は概ね順調に進んでいる。27年度が最終年度であるため、記入しない。森林土壌学2012年秋より実施している積雪層および土壌層内に再設置した小型・低コストCO2濃度計による各層内空気のCO2濃度変動の連続自動観測を継続する。2011年度に見られたCO2濃度の降り切れは解消された。同時に、本年同様に、同一層における空気をシリンジを用いて採取し、採取したガス試料をガスクロマトグラフ(島津製作所:GC-14A)にて分析し、データの集積を図る。併せて、冬期における積雪断面調査を行い、積雪層や土壌中の物理化学的特性に関するデータ集積に努める。集積したデータを総合して解析し、温室効果ガス動態に与える、積雪、融雪プロセスの物理化学的影響を検討、評価して、とりまとめ、成果公表を行う。
相補性に依存しない機能性RNAの研究

本研究は、RNAのポテンシャルを明らかにすることを究極の目標として、これまで注目されることがなかったRNAの「造形力」について、「作る」((1)人工RNAアプタマーの機能特性研究開発)、「見つける」((2)天然RNAアプタマーの探索研究)、という二つの視点から研究を実施して、その学術基盤の確立に寄与した。本研究では、1)試験管内進化法を用いた人工アプタマーの創成によるRNA機能の多角的研究開発と、2) ncRNAに内蔵された天然アプタマーの探索研究を実施して、相補性非依存型ncRNA研究の分子基盤を確立する。これらの研究成果を統合して、RNAの「造形力」という新概念を創成する。20万種類とも予想されるヒトのノンコーディングRNA (ncRNA)の大部分は、配列相補性に依存せずに機能するタイプと予想され、未開の大陸に等しい。これら相補性非依存型のncRNAは、タンパク質と同レベルの個性ある立体構造を形成して、様々な生体分子と相互作用するとみられる。そのような性質をもつ分子は「アプタマー」と総称される。本研究では、1)ncRNAに内蔵された天然アプタマーの探索研究と、2)試験管内進化法(SELEX)を用いた人工アプタマーの創成によるRNA機能の多角的研究開発を実施して、相補性非依存型ncRNA研究の分子基盤を確立するために研究を実施し、以下の知見をえた。1)天然RNAアプタマーの探索研究:本年度は細胞内に含まれる鎖長の異なる微量RNAを網羅的に分離するための技術開発を行い、実用的な感度と精度を確認した。この分離技術を用いて最初に既知のタンパク質(HEXIM1 & Sharpタンパク質)について複合体を形成しうるRNAのカタログ化をモデル研究として開始した。3)細胞内RNA動態解析ツールの開発:細胞内の標的RNAを可視化する新しい技術を開発する目的で、Cy3(細胞浸潤性かつ非毒性な蛍光化合物)対する特異的なRNAアプタマーを作製した。4)人工RNAアプタマー医薬の開発:炎症性サイトカインであるミッドカインに対するRNAアプタマーの作製・最適化・in vitroアッセイを完了し、これが多発性硬化症に対して優れた抑制効果をもつことをモデルマウスで確認した。20万種類とも予想されるヒトのノンコーディングRNA(ncRNA)の大部分は,配列相補性に依存せずに機能するタイプと予想され,未開)大陸に等しい。これら相補性非依存型のncRNAは,タンパク質と同レベルの個性ある立体構造を形成して,様々な生体分子と相互作用するとみられる。本研究では,1)ncRNAに内蔵された天然アプタマーの探索研究と,2)試験管内進化法(SELEX)を用いたムエアプタマーの創成によるRNA機能の多角的研究開発を実施して,相補性非依存型ncRNA研究の分子基盤を確立するために研究を実施し,以下の知見をえた。1)天然RNAアプタマーの探索研究:昨年度開発した細胞内RNAの網羅的分離技術を用いて既知のタンパク質(HEXIMI&UIA)について複合体として分離されるRNAを分離解析し,結合パートナーとして既知の7SK RNAとUIA RNAが感度,精度とも十分に分離できることを確認した。2)RNA合成生物学(synthetlc blology)的研究:アプタマーによる機能制御を介したモデル遺伝子回路を構築するため,T7 RNAポリメラーゼとSP6RNAポリメラーゼに対する活性阻害性RNAアプタマーを作製し,それらめ特性を解析した。3)細胞内RNA動態解析ツールの開発:細胞内の標的RNAを可視化する新しい技術を開発する目的で,Cy3対する特異的なRNAアプタマーを作製し最適化を進めた。アプタマーの結合によりCy3の蛍光特性が増強するという予想外の性質が明らかになった。4)人工RNAアプタマー医薬の開発:炎症性サイトカインであるミッドカインに対するRNAアプタマーの作製,最適化,invitroアッセイを完了し,これが多発性硬化症に対して優れた抑制ならびに治療効果をもつことをモデルマウスで確認した。本研究では、1)試験管内進化法を用いた人工アプタマーの創成によるRNA機能の多角的研究開発と、2)ncRNAに内蔵された天然アプタマーの探索研究を実施した。以下にそれらの成果を要約する。1)「人工RNAアブタマーの機能特性研究開発」(1)IgGアブタマー:ヒトIgGに対する高親和性アブタマヤを作出し、IgG抗体との複合体の構造を、NMR分析とX線結晶構造分析し、1.9Aの高解像度の構造を明らかにした。その結果、アブタマーRNAが複数の分子内相互作用を織りなし、IgGの形状にジャストフィットする実像が原子レベルで明らかになった。RNAの優れた造形力は驚くほどである。(2)Midkine(MK)アブタマー:炎症性サイトカインであるMidkineに対する高親和性のRNAアブタマーを作出した。最適化したRNAは、自己免疫疾患の発症抑制の薬効をモデルマウスで確認した。現在、同時に、結合機序に関する構造生物学的な研究を進めている。(2)FGFアブタマー:酸性線維芽

細胞成長因子(aFGF)に対するアブタマーを作出した。その細胞活性を試験する過程で、ヘパリン+aFGFにより細胞増殖が促進されるヒト軟骨肉腫細胞株SW-1353の増殖試験において、予想外に、取得したRNAアブタマーがヘパリンを機能的に置換することを発見した。予想外のこの結果は、RNAによるヘパリンの機能的な分子擬態(functional mimic)を示唆するため、現在複合体の共結晶解析を進めている。2)「天然RNAアブタマーの探索研究」non-coding RNAの体系的な解析に必要な探索システムの開発を継続して実施した。研究の要点は、SELEX法に用いるランダム配列の合成RNAのプールの代わりに、細胞から調整した天然のRNAプールを使用するという点である(Genomic SELEX)。最初に鎖長や量もまったく不均一な細胞のRNAを、傷つけず、微量漏らさず、分離して、SELEX用の配列加工を加える換作が予想以上に困難であったが、ようやく、そのバリアーを解決し、Genomic SELEX法を確立した。これを用いて、複数の生理活性タンパク質に対する天然アブタマーの分離を進めているが。その中で、UIA, HEXIMl、PABPlタンパク質に対する候補RNA分子種を分離、解析中である。本研究では、1)試験管内進化法を用いた人工アプタマーの創成によるRNA機能の多角的研究開発と、2)ncRNAに内蔵された天然アプタマーの探索研究を実施した。以下にそれらの成果を要約する。1)「人工RNAアプタマーの機能特性研究開発」(a)IL-17アプタマー:T細胞サブタイプTh17細胞が産生するサイトカインIL-17の発現異常は自己免疫疾患の要因となる。今年度、ヒトIL-17に対してアプタマーを作出した。その一つは解離定数50pMの強い親和性と阻害効果をもち、細胞実験ならびにマウス病態モデルにおいて顕著な薬効を示すことを確認した。(b)FGF2アプタマー:塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)に対するアプタマーを作出した。表面プラズモン共鳴(BIAcore)実験によってアプタマーによる受容体結合阻害効果を確認。さらにヒト細胞実験でFGF2によるシグナル伝達の遮断効果も確認した。次年度は動物での薬効実験を予定する。(c)IgGアプタマー:ヒトIgGに対する高親和性アプタマーを作出し、IgG抗体との複合体を、X線結晶構造分析し、1.9Åの高解像度の構造を明らかにした。その結果、アプタマーRNAが複数の分子内相互作用を織りなし、IgGの形状にジャストフィットする実像が原子レベルで明らかになった。RNAの優れた造形力は驚くほどである。2)「天然RNAアプタマーの探索研究」non-coding RNAの体系的な解析に必要な探索システムの開発を継続して実施した。
チェックポイントキナーゼによる晩発型個体発ガン抑制機構の解明

本研究の最終目標は、チェックポイントキナーゼ群が個体レベルにおいて発ガン防御機構に役割を果たしているかどうかを明らかにし、その分子機構を解明することにある。具体的には、チェックポイントに部分不全を示すChk1へテロマウスとアポトーシスに機能不全があるChk2ホモ欠失マウスを交配し、Chk1^<+/->Chk2^<-/->マウスを作製して、発ガン傾向およびその病態を解析した。Chk1およびChk2単独の変異マウスは野生型と比較して高発ガン性を全く示さないが、Chk1/Chk2二重変異マウスは野生型マウスに比較して、高率に遅発性のガンを発症した。ガンの組織学的解析から、多くはB細胞悪性リンパ腫であったが、肺ガン、あるいは軟部組織腫瘍等も見られ、マウス自然発ガンに見られる発ガン組織型とほぼ同じであった。具体的には、生後20ヶ月において野生型マウスでは全くガン発症を認めなかったが、Chk1^<+/->Chk2^<-/->マウスでは70%に、Chk1^<+/->Chk2^<+/->でも40%にガン発症を認めた。さらに、これらマウスで見られる高発ガン性の原因を明らかにする目的で、マウス胎児繊維芽細胞の解析を行った。Chk1へテロ欠失変異は、細胞周期チェックポイント異常、とりわけDNA損傷に反応したG2/M期停止の部分異常を示した。一方、Chk2の完全欠失はDNA損傷に反応したアポトーシス誘導不全をきたすことが明らかとなった。Chk2完全欠失はDNA損傷修復異常も示した。DNA損傷に反応したG1/S期停止には、Chk1およびChk2の両方が協調的にCdc25Aタンパク質の量を制御することで機能していることが分かった。興味深いことに、Chk1/Chk2二重変異マウスはゲノムストレス非存在下においてもDNA損傷の蓄積と、p53タンパク質の誘導が認められ、チェックポイントキナーゼ群の機能欠失は細胞周期進行に伴い突発的なDNA損傷を誘導すると考えられた。しかしながら、発ガン防御に重要な役割を果たしているDNA損傷に反応した早期細胞老化誘導はChk1^<+/->Chk2^<-/->マウスの胎児繊維芽細胞で維持されていた。これらの結果は、世界で初めてチェックポイントキナーゼ群が個体レベルで突発的発ガンの防御に機能を果たしていることを明らかにしたものである。DNA損傷反応を制御するチェックポイントキナーゼの個体レベルでの発ガン過程における関与を明らかにする目的で、Chk1およびChk2の二重変異マウスを作製して、発ガン率およびその原因を明らかにした。これまでの研究成果から、チェックポイントキナーゼが発ガン過程において重要な役割を果たしていることが強く示唆されているが、Chk1およびChk2単独変異マウスでは全く個体レベルでの発ガンが亢進していなかった。しかしながら、Chk1ヘテロChk2ホモ欠失のマウス個体では野生型に比較して、有意に発ガン率が亢進していた。興味深いことに、Chk1ヘテロChk2ヘテロマウスにおいても発ガン率の亢進を認めた。これらのマウスに認められる癌の病理学的解析は、Chk1/Chk2二重変異マウスで見られる癌は、悪性リンパ腫が主であり、野生型で認められる癌とほぼ同様であった。Chk1/Chk2二重変異マウス由来の胎児繊維芽細胞を用いた解析から、Chk1は主にDNA損傷あるいはDNA複製阻害に反応したG1期およびG21M期の細胞周期停止に、Chk2はDNA損傷に反応したアポトーシス制御およびDNA損傷修復に重要な役割を果たしていると考えら得た。重要なことに、現在最も効率的なガン防御機構と考えられている早期細胞老化においてはChk1とChk2のどちらも必須な役割を果たしていないことが分かった。これらの結果は、Chk1/Chk2二重変異マウスに見られる発ガン亢進は、DNA損傷に反応した細胞周期停止とアポトーシス、DNA損傷修復の重複不全により誘導されることが強く示唆された。

さらに、これらマウスで見られる高発ガン性の原因を明らかにする目的で、マウス胎児繊維芽細胞の解析を行った。Chk1へテロ欠失変異は、細胞周期チェックポイント異常、とりわけDNA損傷に反応したG2/M期停止の部分異常を示した。一方、Chk2の完全欠失はDNA損傷に反応したアポトーシス誘導不全をきたすことが明らかとなった。Chk2完全欠失はDNA損傷修復異常も示した。DNA損傷に反応したG1/S期停止には、Chk1およびChk2の両方が協調的にCdc25Aタンパク質の量を制御することで機能していることが分かった。興味深いことに、Chk1/Chk2二重変異マウスはゲノムストレス非存在下においてもDNA損傷の蓄積と、p53タンパク質の誘導が認められ、チェックポイントキナーゼ群の機能欠失は細胞周期進行に伴い突発的なDNA損傷を誘導すると考えられた。しかしながら、発ガン防御に重要な役割を果たしているDNA損傷に反応した早期細胞老化誘導はChk1^<+/->Chk2^<-/->マウスの胎児繊維芽細胞で維持されていた。これらの結果は、世界で初めてチェックポイントキナーゼ群が個体レベルで突発的発ガンの防御に機能を果たしていることを明らかにしたものである。
高分子絶縁フィルムの高電界平等電界下での電界発光現象観測用試料の試作

損失電流波形観測用に開発した拡張ガードフィルム3端子電極系を、電界発光観測用に改良する目的で、研究協力関係にあるカナダ国立研究所と共同で開発を進めた。当初、試料フィルムの両面に金蒸着電極を形成後、エポキシ樹脂モールドした試料を電界発光観測で用いることを予定していた。この場合、試料自身からの発光のみを観測するために、電極端部付近にマスク処理をする必要がある。平成13年度は、このマスク処理について、着色エポキシ樹脂をモールドする手法や黒色フィルムをマスクとして用いる方法等、様々な手法を試みた。しかし、このマスクの使用が試料作製の工程を複雑化し、エポキシ樹脂内にボイドができやすくなり、高電界下での安定した測定が困難になった。そこで、エポキシ樹脂で試料全体をモールド処理する方法から専用のセル内に金蒸着電極を形成した試料を固定し、高圧窒素ガス雰囲気中で電界発光と損失電流の同時観測を行う手法に変更した。平成14年度は、カナダ国立研究所において、専用セルの作製と電界発光観測を主に行なった。主電極とガードリング電極の間隔を狭め、良好な金蒸着電極を形成するため、金の真空蒸着時に用いる専用マスクを製作し、かつ、電界発光を行う上で適切な金真空蒸着膜の厚さについても調査検討を進めた。これらの一連の工夫により、高電界下で良好な条件で電界発光を観測することに成功した。この実験の成功により、平等電界下での電界発光観測が可能になり、より詳細な電界発光メカニズムの解明、交流電界下での空間電荷効果等、従来の手法では明らかにできなかった交流高電界下での電気伝導機構を知ることができるようになると期待される。また、カナダ国立研究所において、電界発光観測装置に改良を加え、損失電流と電界発光の同時観測に成功した。これらの研究成果は、平成15年6月に名古屋で開催される国際会議で発表する予定である。本研究の目的は、電力ケーブルの絶縁材料として広く用いられるポリエチレンフィルムの交流高電界下での電界発光現象観測用試料の開発である。従来、電界発光の観測で高電界を得やすい等の理由から針-平板電極系が多く採用されているが、本研究では電界の評価が容易なフィルム試料を用い、これを本研究室で損失電流波形観測用に用いてきたガードフィルムを用いたユニークな構造の3端子電極系試料を改良する方向で開発を進めた点が大きな特徴である。この損失電流波形観測用試料を用いることで同一条件下での実験結果を比較することが可能であり、交流高電界下での電荷の挙動、特に空間電荷効果をより詳細な検討が期待される。この目的を達成する上で、電界発光現象以外の要因による発光をどれだけ徹底的に排除できるかが鍵となった。当初、着色エポキシ樹脂を用いる方法を検討していた。しかし、秋にカナダ国立研究所において行った打ち合わせで、電界発光観測装置の技術的な理由から、直径0.1mmの極めて限られた領域の電界発光現象を観測できる試料を開発する必要性が新たに生じた。そこで、光を完全に遮断する黒色の2枚のフィルムで試料を挟み、エポキシ樹脂で試料全体をモールドする方法を考案した。電界発光現象は、この黒色フィルムの中心に開けられた直径0.1mmの極めて小さな穴から観測する。黒色フィルムを用いることは試料構造を複雑にし、フィルム間にボイドが生じやすい。このため高電界下で部分放電の発生が懸念された。この部分放電を排除するため、エポキシ樹脂モールドの際の真空脱気条件を詳細に調べ、また、試料作製用冶具の改良も行った。