hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
統合的アプローチによる精神分裂病の分子基盤の解明

1.連鎖解析JSSLGとして130罹患同胞対家系について417個のSTRマーカーを用いたゲノムワイド罹患同胞対解析を行い、1q23.3,2q36.3,3q23,4q23,5q33.1,8p12,9q21.1-21.2,9q21.31,14q23.1,17q12,20q11.2にP<0.05と連鎖傾向を示す領域を見いだした。その後、先の解析に用いた122家系由来のサンプルを含む236家系について5,861個のSNPを用いた解析により、1p21.2-1p13.2(LOD=3.39)に連鎖が認められ、また14q11.2-q13.2と20p12.1-p11.2に連鎖が示唆された。2.関連解析(1)グルタミン酸受容体遺伝子群の関連解析を遺伝子領域に複数のSNPを選択し、体系的に行った。その結果GRIA4,GRIN2D,GRM3,BRM8についてハプロタイプ頻度において有意差を認めた。(2)患同胞対解析により連鎖傾向が見られ、諸外国から複数の報告がある5q33.1領域に注目し、ここに存在する43遺伝子の複数SNPについてタイピングを行った。有意差が見られたSNPについてサンプル数を追加しさらに解析を行ったところ、遺伝子型・アレル頻度で1遺伝子、ハプロタイプ頻度において1遺伝子、それぞれ疾患との有意な関連が認められた。3.モデル動物を用いた解析(1)フェンシクリジン投与ラットの大脳の5部位から、マイクロアレイを用いて発現に変化を来す遺伝子を見出した(発現亢進71個、発現低下31個)。その中で2.5倍以上の変化を来す10個の遺伝子を定量的RT-PCR法により確認した。これらの遺伝子について関連解析を行った。(2)先に関連を認めたGRIA4についてノックアウトマウスを作出し、アンパ型グルタミン酸受容体各ファミリーの発現分布を明らかにし、行動解析のための戻し交配を行った。(1)罹患同胞対解析:全染色体の1次スキャンニングが終了し5q33.1,9q21.1-q21.2,9q21.31,14q23.1,17q12,20q11.2においてLOD値1.0以上の領域が見いだされた。最も高いLOD値は20qの1.46で'ある。(2)関連解析:GRM3の関連解析でSNP4を含むハプロタイプで有意差が認められた。そこでSNP4周辺領域の連鎖不平衡マッピングを行い、SNP4を含むほぼ40kbの領域で連鎖不平衡が維持されていることを明らかにした。この領域に疾患感受性に関わる多型が存在すると考えられ現在検索中である。グルタミン酸受容体遺伝子群のなかでカイネイト型GRIK1,GRIK2,アンパ型GRIA3,GRIA4,NMDA型GRIN2D,代謝型GRM4の全領域にわたり、約50kbごとにアレル頻度10%以上のSNPを選択し関連解析を行った。

GRIA3,GRIA4,GRIN2D, GRM4についてハプロタイプ頻度において有意差が認められた。(3)覚醒剤投与ラットの解析:メタンフェタミン投与ラット大脳からdifferential displayで発現亢進を来す遺伝子の一つとしてアンフィファイシン遺伝子(AMPH)を単離し、関連解析を行ったが、罹患群と対照群間で有意差は認められなかった。メタンフェタミン投与ラット小脳から発現変化を来す遺伝子としてユビキチン系の遺伝子を単離した。(4)動物モデル作成:GRIA4についてノックアウトマウス作成を進めており、ターゲッティングが確認されたES細胞の単離が終わり、ブラストシストへのインジェクションの段階へ進んだところである。一方GRM3については現在ターゲッティングされたES細胞の単離中である。(1)既に完了した全ゲノムにわたる罹患同胞対解析の結果と、諸外国からの報告を考慮し、再現性の高い5q33.1領域について候補遺伝子を選定し、遺伝子領域内に均等に配置したSNPによる連鎖不平衡解析に基づく関連解析を行った。現在のところ、GLRA1,CSNK1A1,NMU2R, G3BP, ATOX1,SPARC, FAT2,SLC6A7解析が終了し、たが、まだ関連は見出されていない。(2)統合失調症のグルタミン酸伝達異常モデルに基づき、グルタミン酸受容体遺伝子群の系統的な関連解析を継続している。GRIN2D, GRIA1,GRIK3,GRM1,GRM7,GRM8の解析が終了し、昨年度のGRM3,GRIA4にグルタミン酸受容体の上流に位置する遺伝子の統合失調症への関連を示す報告が相次いでいるが、我々の結果もこれを支持するものである。(3)グルタミン酸伝達との関わり合いから、グルタミン酸トランスポーター遺伝子群の系統的な関連解析も開始した。EAAT2グルタミン酸トランスポーター遺伝子(SLC1A2)には関連が認められなかった。(4)メタンフェタミン投与ラットから、発現変化を来す遺伝子としてdifferential displayを用いてユビキチン活性化酵素遺伝子(UBE1)を単離し、現在SNPの検索と関連解析を行っている。フェンシクリジン投与ラットの大脳の5部位からマイクロアレイを用いて、投与1時間および4時間後発現に変化を来す遺伝子の探索を行い、発現亢進を来す遺伝子71個、発現低下と来す遺伝子31個を見出した。(5)先に関連が認められたGRM3,GRIA4についてノックアウトマウスを作成中であり、現在キメラマウスを単離した段階である。1.罹患同胞対解析から関連解析へ:既に施行した全ゲノム罹患同胞対解析の結果と、諸外国からの報告を考慮し、再現性の高い5q33.1領域について40個の候補遺伝子を選定した。連鎖不平衡解析に基づく関連解析を行い、3つの遺伝子について関連を認めた。2.ローカスワイド関連解析:グルタミン酸受容体およびグルタミン酸トランスポーター遺伝子群の系統的な関連解析を行っている。本年度は、グルタミン酸受容体遺伝子群のなかでGRIA2,GRIK4,GRIK5,GRM4,GRM5の全領域にわたり、連鎖不平衡を考慮して選択したSNPを用いて関連解析を行った。GRM5において罹患群と対照群間で特定のハプロタイプにおいて関連が認められた。またグルタミン酸トランスポーター遺伝子であるSLC1A2およびSLC1A3についても関連解析を行い、SLC1A2の特定のハプロタイプにおいて関連を認めた。なお昨年度疾患との関連を発表したGRM3について、コーカシア人および中国人集団において関連再現の論文が発表された。3.ゲノムワイド関連解析:約2万5千個のマイクロサテライトマーカーにつき、関連解析を行っており、現在6,667個のマーカーによる解析が終了し、819個において有意差を認めている。
複数の分子認識モジュールを組み合わせた超分子型人工酵素および生体内分子シャトルの創製

本研究では複数の抗体を用いてそれらの抗原認識部位を決定し、そのアミノ酸配列情報およびコンピューターを用いた構造計算に基づいて合成したポリペプチドに新機能を持たせるのが目的である。(1)抗HIV-1 env gp41抗体の軽鎖CDR-1と抗ポルフィリン抗体の重鎖CDR-2をGly-Proで架橋した分子(CA-2)を本目的のために合成した。そして、このCA-2の免疫学的および化学的性質を調べたところ、以下の点が判明した。(1)CA-2は各種ポルフィリン類と10^410^6/Mの親和性定数で結合する。ポルフィリン類はCA-2の1分子について2分子まで結合可能である。(2)CA-2はHIV-1 env gp41の保存領域ペプチド(TP-41)と4.6×10^7/Mの親和性定数で結合する。(3)抗HIV-1 env gp41抗体軽鎖可変領域と抗ポルフィリン抗体重鎖可変領域とを繋いだscFvもTP-41を取り込む能力がある。(2)抗HIV-1 env gp41抗体の軽鎖超可変領域(CDR)-1ペプチドを免疫原に用い、抗イディオタイプ様抗体の取得を試みた。その中で、i41SL1-2抗体は他のタンパクと交差反応せず、抗原のCDR-1と5×10^9/M、CA-2と2.9×10^9/Mの親和性定数で結合した。ただこのi41SL1-2抗体がCA-2結合した時、予め結合しているポルフィリン分子を離すかどうかの実験では明確な結果が得られなかった。(3)上記の設計思想を応用して、ダイオキシンに結合できるポリペプチドの設計を行った。抗ダイオキシン抗体の超可変領域(CDR)ペプチドを用いてダイオキシンアナログとの結合性を調べた結果、22merのCDRペプチドは僅かであるが、ダイオキシンアナログである2,3,7-TCDDと相互作用を示すことが蛍光消光法の実験から明らかになった。本法により短時間でダイオキシン類の分析を可能にすることが可能と思われた。本年度は(1)基質取り込みサイト(分子モジュールA)と基質(エイズ抗原の部分ペプチド)との結合状態をスペクトルによって解析する、(2)ポルフィリン取り込みサイトである分子モジュールBとポルフィリンによる化学反応性を(1)と同様に解析する、(3)分子モジュールA,Bを連結し、(4)超分子型人工分子を構築し、この分子にエイズ抗原の部分ペプチドとポルフィリンを反応させて免疫学的性質を調べる、(5)分子シャトルとしての機能開発を行うためにモジュールAに対する抗イディオタイプ抗体の作製を行う、計画であった。(1),(2),(3),(4)についてであるが、まず抗HIV-1env gp41抗体の軽鎖CDR-1と抗ポルフィリン抗体の重鎖CDR-2をGly-Proで架橋した分子(CA-2)を本目的のために合成した。そして、このCA-2の免疫学的および科学的性質を調べたところ、以下の点が判明してた。そして、ポルフィリン類はCA-2の1分子について2分子まで結合可能である。(2)CA-2はHIV-1env gp41の保存領域ペプチド(TP-41)と4.6×10^7/Mの親和性定数で結合する。これは完全抗体の約1/100である。(3)抗HIV-1env gp41抗体軽鎖可変領域と抗ポルフィリン抗体重鎖可変領域とを繋いだscFvもTP-41を取り込む能力がある。(5)についてであるが抗HIV-1env gp41抗体の軽鎖超可変領域(CDR)-1のC末端にCysを導入してKLHとconjugateしたものを免疫原に用い、抗イディオタイプ抗体の取得を試みた。確立した9種類の抗体のうち、i41SL1-2抗体は他のタンパクと交差反応せず、また、抗原のCDR-1と5×10^9/Mの親和性定数で結合した。さらにCA-2とも強く反応し、その親和性定数は2.9×10^9/Mであった。

その中で、i41SL1-2抗体は他のタンパクと交差反応せず、抗原のCDR-1と5×10^9/M、CA-2と2.9×10^9/Mの親和性定数で結合した。ただこのi41SL1-2抗体がCA-2結合した時、予め結合しているポルフィリン分子を離すかどうかの実験では明確な結果が得られなかった。(3)上記の設計思想を応用して、ダイオキシンに結合できるポリペプチドの設計を行った。抗ダイオキシン抗体の超可変領域(CDR)ペプチドを用いてダイオキシンアナログとの結合性を調べた結果、22merのCDRペプチドは僅かであるが、ダイオキシンアナログである2,3,7-TCDDと相互作用を示すことが蛍光消光法の実験から明らかになった。本法により短時間でダイオキシン類の分析を可能にすることが可能と思われた。
Desert Hedgehog遺伝子変異による遺伝性末梢神経障害の研究

1)末梢神経周膜の発生・分化におけるDHHの役割の解明正常マウス末梢神経におけるDhh mRNA及びその受容体であるpatched 2の発現を確認した。これらの分子は神経損傷後発現が低下するが、再生過程で発現が亢進してくることを確認した。この結果、Dhh-patched 2は末梢神経周膜の恒常性に関与し、損傷後の再生過程にも重要な役割を果たしていることを見出した。2)中枢神経機能に及ぼす,DHHの役割の解明Dhhノックアウトマウスを用いて、運動・感覚機能、記憶、情動に関して行動解析を行った。その結果、Dhhノックアウトマウスでは、うつ状態、不安等の情動行動に異常が見られることが判明した。この結果、Dhhは情動行動に関与していることが明らかになった。神経生検でminifascicle形成を特徴とする末梢神経障害と46XY gonadal dysgenesisの合併の第2例目を発見し、その臨床的特徴、病理学的所見を明らかにした。この例は、先に我々が報告した症例に酷似しており、新しい疾患単位であることを確認した。Dhhシグナル経路の異常による疾患との関連を調べるために、GFAP遺伝子をプロモーターとしてDhh transgenic miceの作成に成功した。1.類似症例の発見と遺伝子解析2.Desert hedgehog(Dhh)ノックアウトマウスを用いた解析Dhhノックアウトマウスを用いて、その神経病理学的解析を行なっている。このマウスでは、神経周膜形成異常が起こり、結果としてminifascicle形成が見られる事を確認した。現在、老化に伴う神経線維の変化について追跡検討中である。また、このマウスにおける中枢及び末梢神経機能の解析を行なうための繁殖実験が終了した。国内及び国外から依頼された46XY gonadaldysgenesis患者8例におけるDHH遺伝子解析を行なったが、変異は認めなかった。4.Dhhノックアウトマウスからのシュワン細胞株の樹立マウスシュワン細胞におけるDhh遺伝子発現について培養マウスシュワン細胞におけるDhh mRNAの発現をRT-PCRで検討し、遺伝子発現を確認した。現在さらに、Dhh蛋白の分泌機構について検討を進めている。また、Dhhノックアウトマウスからシュワン細胞株を樹立することに成功した。今後、Dhh欠損シュワン細胞株を用いて、in vitroにおけるDhhの機能解析を進める。2)中枢神経機能に及ぼすDHHの役割の解明Dhhノックアウトマウスを用いて、運動・感覚機能、記憶、情動に関して行動解析を行った。Dhhシグナル経路の異常による疾患との関連を調べるために、GFAP遺伝子をプロモーターとしてDhhtransgenic miceの作成に成功した。
好中球エラスターゼ阻害剤を歯周病治療薬として用いる基礎的研究

歯周病は歯を支えている歯周組織(歯肉、歯根膜、歯槽骨、セメント質)に炎症が及ぶ疾患である。本研究では歯周病の特徴である歯槽骨の吸収を抑える因子として、好中球エラスターゼ阻害剤に着目した。これまでに好中球エラスターゼがまず始めに歯根膜のコラーゲン線維間基質である糖タンパク質を破壊し、これにより歯根膜の破壊が進行することを示してきた。本研究では、好中球エラスターゼが歯根膜のみではなく、組織学的に歯根膜に隣接している歯槽骨の破壊にも同時に影響していることを調べ、それが好中球エラスターゼの阻害剤によって抑制されていることを示唆した。今までに好中球エラスターゼが歯周病に及ぼす影響について調べてきた。その研究結果を踏まえ本研究では、好中球エラスターゼ阻害剤が歯周組織破壊を抑制する可能性について検討することを実験目的としている。この研究目的にある歯周組織に対する好中球エラスターゼ阻害剤の効果を検討を効率良く行うため、平成25年度にはIn Vivoにおけるマウスのマクロファージを用い、破骨細胞の分化に対する好中球エラスターゼ阻害剤の効果について実験を行った。骨吸収の抑制に好中球エラスターゼ阻害剤がどのように関与しているかについては、TRAP stainingとTRAP assayを用いて評価した。その結果、好中球エラスターゼ阻害剤を添加したマクロファージでは、破骨細胞に特異的に認められるTRAP陽性細胞の減少やTRAP活性の減少が添加したTRAPの濃度依存的に認められた。これは好中球エラスターゼ阻害剤によって、マクロファージから破骨細胞への分化が抑制されたことを示している。今までに好中球エラスターゼが骨の吸収に関与するという報告はほとんどなく、非常に興味深い結果を得ることとなった。では、どのようにして好中球エラスターゼ阻害剤が破骨細胞への分化を抑制したのか?このメカニズムを検討するため、骨の吸収に大きく関与するRANK, RANKL, OPG, Cathepsin Kなどに対する遺伝子発現について現在実験中である。またIn Vivoでは、好中球エラスターゼ阻害剤添加群の方が非添加群よりも、糸を結紮した患歯周囲の歯槽骨の骨梁が大きくなり、骨が疎になっているような所見を得た。以上のことから、好中球エラスターゼ阻害剤が骨吸収に対して抑制的な影響を与えている可能性が示唆された。歯周病に於いては歯槽骨が吸収され、歯の動揺が進行することで歯の喪失へと至る。これまでに好中球エラスターゼが歯周病に及ぼす影響を研究してきた。本研究では特に好中球エラスターゼの阻害剤が歯槽骨吸収を始め、歯周組織破壊を抑制する効果について検討することを実験目的としている。平成26年度にはマウスの脛骨から採取した骨髄細胞中に含まれるマクロファージを用いて、好中球エラスターゼが破骨細胞への分化にどのような影響を及ぼすのかについて好中球エラスターゼの阻害剤(シベレスタット)を用いて実験を行った。実際には、骨の吸収抑制に好中球エラスターゼ剤がどのように関与しているかについては、破骨細胞への分化を酵素活性で特異的に定量的・形態的に調べるTRAPassayとTRAP染色にて評価した。その結果、好中球エラスターゼ阻害剤が添加された群では、TRAP活性の減少とTRAP陽性細胞数の減少が認められた。これらの現象は好中球エラスターゼ阻害剤の濃度依存的に認められた。これらのことにより、好中球エラスターゼの阻害剤によってマクロファージから破骨細胞への分化が抑制されたことを示している。また平成26年度に好中球エラスターゼがどのようにして破骨細胞の分化に影響を及ぼしたかを調べるため、破骨細胞に特異的に発現する遺伝子発現を好中球エラスターゼ阻害剤添加群と非添加群とで比較検討した。その結果、RANK, TRAP, Cathepsin Kの発現が好中球エラスターゼ阻害剤添加群にて明らかに減少していた。これらのことより、好中球エラスターゼ阻害剤が破骨細胞の分化に影響を及ぼしていることが、遺伝子レベルに於いても確認された。これまでに歯周病治療薬として好中球エラスターゼ阻害剤を使用することを目標として、歯周病における歯槽骨吸収に好中球エラスターゼが関与しているか基礎的な研究を行ってきた。平成27年度にはこれまでに行ってきたin vitroとin vivoの研究内容を見直しつつ、これまでに予定していたが終えていなかった実験を引き続き行った。in vitroにおいては、マウスの骨髄細胞から破骨細胞へと分化させる過程に好中球エラスターゼ阻害剤を添加して培養し、破骨細胞への分化をTRAP assayとTRAP stainにて評価したところ、マウスマクロファージのcell line (RAW264.7)を用いた実験結果と同様な傾向を示した。つまり、好中球エラスターゼ添加群では破骨細胞に分化する細胞数が減少していた。またin vivoでは、好中球エラスターゼ阻害剤添加群において歯周ポケット周囲の骨吸収程度と破骨細胞数をコントロール群である非添加群と比較検討した。それにより、好中球エラスターゼ阻害剤添加群では歯周ポケット周囲に存在する歯槽骨の吸収が抑えられ、破骨細胞数が優位に減少していた。これらのことから、好中球エラスターゼ阻害剤が破骨細胞の分化抑制に影響を与えていることが確認された。

本研究では歯周病の特徴である歯槽骨の吸収を抑える因子として、好中球エラスターゼ阻害剤に着目した。これまでに好中球エラスターゼがまず始めに歯根膜のコラーゲン線維間基質である糖タンパク質を破壊し、これにより歯根膜の破壊が進行することを示してきた。本研究では、好中球エラスターゼが歯根膜のみではなく、組織学的に歯根膜に隣接している歯槽骨の破壊にも同時に影響していることを調べ、それが好中球エラスターゼの阻害剤によって抑制されていることを示唆した。平成25年度に既にファージのcell lineを用いて好中球エラスターゼの阻害剤が破骨細胞の分化に及ぼす影響についてTRAPassayとTRAP染色にて評価したが、この結果が今までに報告されていない興味深いものだったので、平成26年度には生体から採取した細胞で再確認を行った。この実験系は当初の予定には組み込まれていなかった。また、好中球エラスターゼが影響を与えているであろう、破骨細胞に特異的な蛋白を限定するために遺伝子レベルでの検討を優先させたため、組織切片を用いての評価を行うに至らなかった。医歯薬学好中球エラスターゼが破骨細胞の増殖と分化を抑制することは今までの研究で明らかになってきているが、過去にこのようなことは報告されていないので、さらに確認を取るために破骨細胞の活性化も好中球エラスターゼが抑制するのかどうかを象牙質のスライス表面を破骨細胞が分解するのかを調べることであきらかにする。また歯周病に罹患すると、実際に生体で好中球エラスターゼが集積するのか否か、またその集積は歯周組織のどこに現れるのかについて組織学的に調べる。さらにそれらの炎症反応は好中球エラスターゼ阻害剤によってどのような影響を受けるのかについても形態学的検討を行う。さらには歯周病に罹患した歯周組織内において、骨吸収に関与する因子が好中球エラスターゼの阻害剤添加によって、生体内でどれぐらい抑えられるのかどうかについても免疫染色などを用いて評価する。歯周組織を構成する細胞:歯肉、歯根膜、セメント質、歯槽骨に対する好中球エラスターゼ阻害剤の作用を調べ始めたが、その実験途中で歯周組織構成細胞の検討を中断し、方向転換をしたことは実験の進行を遅らせた。平成25年度に行った実験により、好中球エラスターゼ阻害剤が歯根膜細胞の石灰化に影響を及ぼさないという事が分かった。それにより、歯周組織の細胞への好中球エラスターゼ阻害剤の効果を調べる前に、好中球エラスターゼ阻害剤が破骨細胞への分化に影響を及ぼす可能性について調べることとした。また、組織切片を用いた実験においても同様の見解を得た。組織切片を好中球エラスターゼ抗体で染色してみたところ、陽性染色部位が認められたものの、その染色部位に一貫性が認められなかった。そのため、まずIn Vitro実験にて好中球エラスターゼ阻害剤が歯周組織の細胞に対して、どのようなメカニズムで働きかけているのか?を探求することに方向転換した。これらの実験結果に基づく実験の進行方向の転換が研究目的の達成度をやや遅らせていることに影響している。実験の内容を方向転換し、前年度使用していた試薬など、そのまま転用できたため試薬の購入に費用がかからなかったため。また予定していた組織切片の評価に用いる抗体を購入しなかったので、予定よりも試薬に費用がかからなかったため。
極低温ロケット上段推進系における気液二相熱伝達特性と数値的予測手法の総合的研究

極低温ロケットを想定した加速度環境における自由表面流を対象とし、極低温推進薬のスロッシングによって促進される界面熱伝達と相変化が引き起こす密閉容器内部の圧力変動と界面張力が卓越する微小重力環境に置かれた液体貯蔵容器あるいは少流量管路での流動特性について、実験的手法と独自の数値流体解析の両方を用いて考察し、宇宙機の推進薬管理に有用な学術的知見を獲得するとともに、定量的予測手法の構築を行った。低重力環境で回転に伴う外乱加速度を受ける環境における、容器内液面挙動観察実験を実施した。具体的には、東京大学の落下塔(東京都文京区,落下時間:1秒)での予備実験に続き、(株)植松電気の微小重力実験塔(北海道赤平市,落下時間3秒)をそれぞれ使用し、低重力環境(10-3G以下)を獲得したうえで、落下筐体(カプセル)には、鉛直軸(ロール軸)に対する回転ステージを搭載し、鉛直方向加速度がほぼ消失した環境で、回転に伴う遠心方向加速度を与えることで、ボンド数条件をパラメータとした実験も行った。実験では、単純円筒容器の場合に加え、金属網(メッシュスクリーン)による捕獲デバイスを追加艤装した場合についても実験を行った。その結果、供試液体の表面張力係数とメッシュ幅により与えられるボンド数により概ね整理できることや、開口比の影響を受けることなど、定量的な知見を得ることができた。他方、次年度以降に実施する、極低温スロッシング実験の実施へ向けた準備も進めた。実験で使用される高荷重電動加振機は、密閉容器(ポリカーボネート製・直径100 mm程度の円筒形)を格納した観測窓付きの真空断熱槽と連結され、従来は正弦波形の水平方向加振のみを印加できる構成となっていた。これに対し本研究では、電動アクチュエータの任意波形出力を可能とする制御装置を増設することで、実機ロケットの増速飛行中に推力変動を受ける状況にも対応した加速度環境を模擬できるように改良を行い、任意波形加振の実験データを取得できた。数値解析手法の構築においても、複雑形状を有する物体内部の解析を可能とするべく、多領域接続に対応した圧力ポアソン方程式解法の新規導入を行った。落下塔実験では、試験装置の工夫により、低重力環境で回転に伴う容器内部の液体挙動を観察することに成功した。地上での極低温スロッシング実験では、加振装置の調整に苦労したものの、任意波形加振が可能な実験装置を構築することができた。数値解析手法の高度化も順調に進めることができた。極低温スロッシング実験では、実験手順を工夫することにより、液面付近に形成される液温成層(飽和温度に近い温度の境界層)の厚みを変化させることに成功した。これを利用し、加振開始時に液温成層厚を様々な変化させた実験を行った。その結果、スロッシングに伴うタンク圧降下の原因が、液温成層の破壊と、深層に存在していたサブクール液と気相の接触に伴う凝縮促進により説明できることの確証が得られた。また、一般にスロッシングの流動を減衰させる邪魔板から発生する乱れにより、液温成層の破壊が促進される結果、タンク圧降下がむしろ促進される場合があることが見出された。落下塔を用いて獲得される低重力環境での液体挙動観察実験では、連携研究者の協力を得て、円筒容器の軸方向スライダを搭載した落下筐体を制作した。約2秒間の微小重力環境において、予め決められた通りに駆動されるスライダに円筒容器を搭載し、液体ロケットの段間分離時あるいは衛星分離時の加速度環境を相似に再現した。円筒容器の内部では、軸方向加振を受けて液柱が立ち上る様子が明瞭に捉えられた。自由表面流の数値解析では、複雑形状流れ場を対象とするための改良を継続した。具体的には、多領域に対応した高速行列解法を導入した。これを用いて、非定常加速度を受ける直円管内プラグ流の数値的模擬を行い、加速度の変動により流動様式がプラグ流と層状流の間で遷移する場合、それに伴って管路の圧力損失も大きく変化することなどが再現された。極低温スロッシング実験において、実験手順の工夫により、再現性が向上したことに加え、液温成層を入力条件として制御できるようになり、流動と伝熱と相変化がタンク圧降下を引き起こしていることが明確になり、数値計算の検証に有用なデータの蓄積が進んだ。極低温スロッシング実験では、真空断熱槽(クライオスタット)の内部に設置した小型透明の密閉容器に極低温液体と常温気体を封入し、スロッシングと温度場が連成する流れ場を実現した。真空断熱槽を電動加振機に連結し、水平方向に任意波形の非定常加速度を与える試験装置を完成させた。液面変形が線型応答を呈する場合から、砕波を生じる強非線形応答を呈する場合まで、容器内部での熱交換と相変化に起因する圧力変動を計測した。初期条件として、液温成層厚を様々に変更した実験により、スロッシングに伴う液温成層の破壊が、密閉容器内の圧力降下の直接原因であることを明らかにした。落下塔実験については、着地衝撃に耐える昇降ステージを搭載した落下筐体を用いた実験(平成27年度に実施)に対応した数値解析を実施。スクリーン(金網)を用いた液体捕獲デバイスを含め、低重力環境で界面張力が卓越する場合の液面挙動を精度よく再現でることを示すとともに、今後の課題を明確化できた。

数値解析に関しては、上述の極低温スロッシング実験、変動加速度を受ける円管内気液二相流を含め、安定に数値的模擬が可能となる手法の高度化を実装した。多領域を接続した計算を高速に実施できるように改良を行った。また、固気液界面における適切な熱伝達モデルと相変化モデルを提案した。本計算手法は、国内の液体ロケット開発に関係する機関ならびにメーカーに技術移転され、次期基幹ロケットの運用検討に役立てられるようになった。極低温ロケットを想定した加速度環境における自由表面流を対象とし、極低温推進薬のスロッシングによって促進される界面熱伝達と相変化が引き起こす密閉容器内部の圧力変動と界面張力が卓越する微小重力環境に置かれた液体貯蔵容器あるいは少流量管路での流動特性について、実験的手法と独自の数値流体解析の両方を用いて考察し、宇宙機の推進薬管理に有用な学術的知見を獲得するとともに、定量的予測手法の構築を行った。研究計画に従い、任意波形加振による極低温スロッシング実験を発展させる。具体的には、実験手順の工夫や自動化による再現性の向上に取り組んだうえで、容器内にスロッシング減衰デバイスを艤装した場合についても実験を行い、再使用ロケットの飛行に対応した大規模な外乱加速度を伴う場合についてもデータ取得を試みる。数値計算については、連携研究者との協力の下、並列計算にも適するよう改良を進め、計算手法の提案だけでなく、計算速度の向上も視野に入れた改良を継続する。獲得された実験データを参照しながら、数値解析における相変化と界面熱伝達モデルを構築する。液体窒素だけでなく、液体水素についても、地上での貯蔵容器ならびに液体ロケットの実機タンク圧データを参照し、数値解析によるタンク内熱流動の定量的な予測手法確立を目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。航空宇宙推進学29年度が最終年度であるため、記入しない。
脂質修飾タンパク質の網羅的探索に基づく新規バイオマーカーの発見と応用

N-ミリストイル化タンパク質とプレニル化タンパク質は、その変異や過剰発現ががんや神経変性疾患をはじめとする多くの疾患と関与することが知られている。本研究では、まず、主として無細胞タンパク質合成系を用いたN-ミリストイル化タンパク質、プレニル化タンパク質の網羅的探索法の確立を行い、続いて、この手法を用いて新規バイオマーカーの探索を目的として、UniProtに収集された全ヒトタンパク質の中からN-ミリストイル化タンパク質の網羅的同定を行った。その結果、171個もの新規N-ミリストイル化タンパク質が見出され、これらの中に多数のバイオマーカーとなり得る疾患関連タンパク質が含まれる事が明らかになった。本研究では、まず、平成23-25年度の科学研究費補助金の研究課題(No.23580136)において確立したヒトN-ミリストイル化タンパク質の網羅的同定法を、タンパク質C-末端に生ずる脂質修飾であるプレニル化に応用し、ヒトプレニル化タンパク質の網羅的探索法の確立を試みた。その結果、無細胞タンパク質合成系における代謝標識を用いた解析から、タンパク質N-ミリストイル化の検出とは異なり、タンパク質プレニル化の検出においてはC末端領域をモデルタンパク質C末端と置換した融合タンパク質を用いた場合には検出が不可能であり、全長cDNAを用いた解析が必要であることが明らかになった。またプレニル化の検出においては、無細胞タンパク質合成系の由来により検出結果が異なり、ヒト由来プレニル化タンパク質の検出には哺乳動物由来の無細胞タンパク質合成系の使用が好ましい事が示された。そこで、ヒトcDNAリソースからC末端にCaaXモチーフと呼ばれるプレニル化を指令するコンセンサス配列を持つ候補タンパク質を選出し、全長cDNAを用いてウサギ網状赤血球由来ライセートによる無細胞タンパク質合成系における代謝標識によってプレニル化タンパク質の同定を試みたところ、これまでに報告されていない新規ヒト由来プレニル化タンパク質の同定に成功した。またヒトN-ミリストイル化タンパク質については、これまでに確立した手法をアイソフォームを含む約46,000個のSwiss-Protに収録されたヒトタンパク質に適用して解析を行った結果、100個を超える新規N-ミリストイル化タンパク質候補を見い出した。平成27年度における本研究では、平成23-25年度の科学研究費補助金の研究課題(No.23580136)および平成26年度の本研究において確立した無細胞タンパク質合成系と遺伝子導入細胞を用いた新規N-ミリストイル化タンパク質の網羅的同定法を、Swiss-Protに収録されたアイソフォームを含む約46,000個の全ヒトタンパク質に適用した解析をほぼ完成させた。その結果、昨年度見出したものと合計すると150個を超える新規N-ミリストイル化タンパク質が見い出され、予想を超える成果が得られた。これらの中には、各種のがんや神経変成疾患との直接的な関連が示唆されているタンパク質が相当数含まれており、疾患バイオマーカーへの応用が期待できるタンパク質も含まれていた。これらのタンパク質の細胞レベルにおける機能について、培養細胞への一過的発現により解析した結果、N-ミリストイル化に依存して細胞や細胞内小器官の形態に顕著な変化を生ずるタンパク質や、N-ミリストイル化に依存して特異的な細胞内局在を示すタンパク質が見出された。さらに、これまで細胞質タンパク質に専ら生ずると考えられてきたN-ミリストイル化が多数の膜タンパク質に生じていることが明らかになった。各種のがんや神経変成疾患との直接的な関連が示唆されているタンパク質のうちいくつかについてはその細胞レベルでの機能解析が進んでおり、「全ヒトタンパク質を対象とした網羅的な解析が進行しているN-ミリストイル化タンパク質に焦点をしぼり、平成26年度の本研究で見出された新規N-ミリストイル化タンパク質候補のうち、疾患や細胞情報伝達に関与すると予測されるタンパク質について解析を行う。」という平成27年度の「研究の目的」は十分に達成されたと考える。また、ヒトN-ミリストイル化タンパク質については、Swiss-Prot収録ヒト全タンパク質の解析をほぼ完了し、2年目の研究進行状況としては順調であると考える。我々は、これまでに、N-ミリストイル化を指令するN-ミリストイル化シグナルを含むタンパク質N末端10アミノ酸の配列を用いて、無細胞タンパク質合成系における代謝標識により、簡便にN-ミリストイル化タンパク質を試験管内で同定する手法を確立した。26-27年度における本研究では、Swiss-Protタンパク質データべースに収集された、アイソフォームを含む約46,000個の全ヒトタンパク質にこの手法を適用し解析を行ってきたが、28年度の本研究ではこの解析を完了させた。その結果、最終的にヒト細胞内には300個を超すN-ミリストイル化タンパク質が存在し、そのうち171個が新規のN-ミリストイル化タンパク質であり、150個程度と考えられてきたN-ミリストイル化タンパク質は実際にはその2倍以上存在することが明らかになった。これらの新規N-ミリストイル化タンパク質中には、これまで殆ど報告がなかった膜貫通タンパク質や核タンパク質が多数含まれており、その中にはがんや神経変成疾患等の原因タンパク質が多数含まれていた。これらのうち数個のタンパク質についてその細胞レベルにおけるN-ミリストイル化の機能を培養細胞への一過的発現により解析した結果、N-ミリストイル化に依存して、核、小胞体、ミトコンドリアといった細胞内小器官の形態に顕著な異常を誘導することが明らかになった。さらに、これらの異常は、2位Gly残基のAlaへの置換によるN-ミリストイル化の阻害や、N-ミリストイル化阻害剤の添加により消失することが明らかになった。

これらの結果から、新たに見出されたN-ミリストイル化タンパク質の中には、疾患バイオマーカー、あるいは疾患治療のための標的分子としての利用できる分子が存在することが明らかになった。N-ミリストイル化タンパク質とプレニル化タンパク質は、その変異や過剰発現ががんや神経変性疾患をはじめとする多くの疾患と関与することが知られている。本研究では、まず、主として無細胞タンパク質合成系を用いたN-ミリストイル化タンパク質、プレニル化タンパク質の網羅的探索法の確立を行い、続いて、この手法を用いて新規バイオマーカーの探索を目的として、UniProtに収集された全ヒトタンパク質の中からN-ミリストイル化タンパク質の網羅的同定を行った。その結果、171個もの新規N-ミリストイル化タンパク質が見出され、これらの中に多数のバイオマーカーとなり得る疾患関連タンパク質が含まれる事が明らかになった。申請書に記載した、「これまでに確立したN-ミリストイル化タンパク質の網羅的探索法をタンパク質プレニル化に応用し、ヒトプレニル化タンパク質の網羅的探索法を確立する」という平成26年度の「研究の目的」は達成されたと考える。また、ヒトN-ミリストイル化タンパク質については、Swiss-Prot収録タンパク質から100個を超える新規N-ミリストイル化タンパク質候補を見出す事に成功しており、初年度の研究進行状況としては順調であると考える。平成28年度には、全ヒトタンパク質を対象とした網羅的な解析がほぼ完了したN-ミリストイル化タンパク質に焦点をしぼり、本研究で見出された約150個の新規N-ミリストイル化タンパク質のうち、疾患や細胞情報伝達に関与すると予測されるタンパク質についてさらに解析を行う。即ち、各種のがん細胞株や遺伝子導入ヒト細胞を用いて、以下の[1], [2]の方法によりタンパク質機能発現におけるN-ミリストイル化の役割を明らかにし、がんを始めとする疾患との関連について解析するとともに、バイオマーカーとしての利用の可能性について検討する。[1] N-ミリストイル化を阻害した変異体、およびN-ミリストイル化阻害剤を用いたタンパク質機能発現におけるN-ミリストイル化の機能解明[2] RT-PCR法による各種臓器由来がん細胞での発現レベルの解析と、RNAi法およびN-ミリストイル化阻害剤を用いたがん化とN-ミリストイル化との関連性の解析これまでの研究成果および[1], [2]の解析により得られた実験結果を総合的に評価し、新たに見出されたN-ミリストイル化タンパク質の疾患との関連について考察し、疾患バイオマーカー、あるいは疾患治療のための標的分子としての利用の可能性について検討する。農学平成27年度には、全ヒトタンパク質を対象とした網羅的な解析が進行しているN-ミリストイル化タンパク質に焦点をしぼり、平成26年度の本研究で見出された新規N-ミリストイル化タンパク質候補のうち、疾患や細胞情報伝達に関与すると予測されるタンパク質について解析を行う。
プロテインホスファターゼ2Cによる炎症性サイトカイン応答シグナル伝達路の制御機構

今回、我々は、ストレス応答シグナル伝達路の制御因子であるPP2Cεの制御機構を明らかにする目的で、会合タンパク質を探索し、ゴルジ体に局在するACBD3が、GOLDドメインを介してPP2Cεと会合することを明らかにした。ACBD3はPP2Cεをゴルジ体と小胞体の近接領域にリクルートし、PPM1LによるCERTの脱リン酸化を亢進した。我々は既にPP2Cεが小胞体に局在する膜タンパク質であることを報告した。機能解析の結果、小胞体膜上でVAP-Aと会合したPP2Cεがセラミド輸送タンパク質を脱リン酸化することにより活性化して、セラミドの小胞体からゴルジ体への輸送を促進し、結果的にスフィンゴミエリンの生成を促す役割を果たすことを見出した。小胞体は脂質生合成以外に膜タンパク質や分泌性タンパク質の生成、さらにはタンパク質の品質管理に関わる他、細胞内のCa^<2+>の貯蔵庫としての役割を担っている。我々は最近PP2Cεが小胞体のこれらの機能の内、タンパク質の品質管理機能をも制御することを見出した。小胞体内にmisfolded proteinsが蓄積すると、防御反応として小胞体ストレス応答シグナル伝達経路が活性化される。同シグナル伝達経路の主要な因子としてIRE1αが知られているが、PP2CεはVAP-AおよびIRE1αと複合体を形成し、脱リン酸化によりIRE1αを不活性化して小胞体ストレス応答を負に制御することが見出された。IRE1αの下流でASK1が活性化されることが既に知られている。また、我々はPP2CεがASK1と会合し、これを脱リン酸化して不活性化することを既に報告している。これらの結果から、小胞体膜上ではPP2Cε/VAP-A/IRE1α/ASK1の複合体が機能単位として存在する可能性が考えられる。プロテインセリン/スレオニンホスファターゼ2C(PP2C)は少なくとも14種類の異なった遺伝子産物から成るファミリーを構成しているがが、これまでに5つのメンバー(PP2Cα、PP2Cβ、PP2Cε、PP2Cη及びWip1)が炎症性サイトカイン応答シグナル伝達路の抑制因子としての機能を担うことが我々及び他のグループにより見出された。我々は、これらの内、PP2Cβ及びPP2CεがMKKKであるTAK1を標的とすること、また、PP2CεがTNFα依存性のアポトーシスを担うMKKKであるASK1を負に制御することを報告した。さらに、P19胚性腫瘍細胞がレチノイン酸依存性に神経細胞に分化する過程で、TAK1-MKK4-JNKの活性化が必須の役割を果たすこと及びTAK1の負の制御因子であるPP2Cεが、神経分化の抑制因子として機能することを報告した。これに加えて、最近、我々はPP2Cεが小胞体(ER)膜貫通性のタンパク質であり、セラミド輸送タンパク質であるCERTを脱リン酸化することにより活性化することを見出した。内在性のPP2Cεの見かけ上の分子量は、臓器によって異なっており、脳に発現するPP2Cεの分子量が一次構造より推測される40kDaであるのに対し、肝臓のPP2Cεはより高分子量(約50kDa)を示す。肝臓より精製したPP2Cεをホスファターゼで処理しても分子量が変化しないため、この高分子量化はリン酸化によるものではないことが分かっていたがその実体は不明であった。今回我々は、培養細胞で発現させたPP2Cεをトリプシン消化後、質量分析を行うことで同タンパクがユビキチン化されていることを見出した。現在、内在性のPP2Cεもユビキチン化を受けているのかどうか、およびPP2Cεの機能におけるユビキチン修飾の役割を検討している。プロテインセリン/スレオニンホスファターゼ2C(PP2C)は少なくとも14種類の異なった遺伝子産物から成るファミリーにより構成されているが、それらのうち、これまでに5つのメンバー(PP2Cα、PP2Cβ、PP2Cε、PP2Cη及びWip1)が炎症性サイトカイン応答シグナル伝達路の抑制因子としての機能を担うことが我々及び他の研究グループにより見出されてきた。しかしながら、PP2Cεの機能がどのように調節されているかについては、解明されていなかった。

今回、我々は、PP2Cεの会合タンパク質を探索する過程で、ゴルジ体に局在するAcyl CoA binding domain containing 3 (ACBD3)が、GOLDドメインを介してPP2Cεと会合することを明らかにした。ACBD3はPP2Cεをゴルジ体と小胞体の近接領域であるmembrane contact siteにリクルートし、PPM1LによるCERTの脱リン酸化を亢進した。PP2Cεの調節メカニズムについて検討し、同タンパクがユビキチン化されていることを見出した。24年度が最終年度であるため、記入しない。PP2Cεの調節メカニズムについては全く不明である。同タンパクの制御機構に関して、ユビキチン化の役割を解明をユビキチン化部位の同定およびその変異体の作製を通じて明らかにしていく。
化学反応性の根源に迫りラジカル重合の基礎研究に資する新規電界ESR測定法の開発

ラジカル重合反応の基礎研究を行う。これまでにない電解電子スピン共鳴分光(ESR)装置を開発し、ラジカル重合系の反応活性種であるラジカルの酸化還元電位を測定する。この方法は電子の動きやエネルギーを詳細に調べられるのでラジカル重合の基礎研究だけでなく、予備的な実験の結果からリチウムイオン二次電池の電極反応の解明にも資することもわかってきた。化学反応は電子の状態に支配されるので反応を深く理解するためには電子の状態を詳しく知ることが不可欠である。申請者は長年にわたってラジカル重合のESRによる研究を行ってきて、直接成長ラジカルの酸化還元電位を測定できそうなところまで来ているので、これを実現する。
ウイルス回収系を利用したパラミクソウイルスM蛋白の構造・機能相関の研究

本研究では、cDNAからのセンダイウイルス(SeV)回収系を利用してM蛋白(Matrix蛋白;エンベロープ裏打ち蛋白)の分子構造と機能の関連を検討した。SeV M蛋白の5つのシステイン(Cys)残基のうち、83、106、295(番号はアミノ末端から)の変異ウイルスを回収できた。1.非還元SDS-PAGEで検討したところ、Mシステイン変異ウイルスのM蛋白は異なる構造をとっていると考えられた。さらに電子顕微鏡観察・しょ糖密度勾配遠心法でウイルス形状の変化が観察できた。M-C106Sウイルスではウイルスが小さくなり、さらに遺伝子を含まない不全粒子が多く観察された。一方、M-C295Sウイルスではウイルス粒子の大きさが広く分布して、非常に大きなものも観察された。以上の知見は、M蛋白システイン残基がウイルス形態に影響を与えることのはじめての報告である。2.培養細胞での一段階増殖を検討したところ、M-C83S・M-C106Sウイルスでは子孫粒子の細胞からの放出が阻害されていた。M-C295Sウイルスは、親株ウイルスよりもむしろ効率よく放出された。細胞での多段階増殖は細胞からの放出効率とおおむね相関していたが、M-C295Sウイルスだけは例外で、親株ウイルスよりも多段階増殖能は低かった。マウス個体での増殖と病原性は、培養細胞での多段階増殖能と相関していた。以上の結果は、M蛋白システイン残基がウイルス集合の効率・増殖効率・マウスヘの病原性に影響を与えていることを示す。M蛋白のシステイン残基を介した構造の本態を解明する必要がある。3.以上の成果について、第14回インフルエンザ研究者交流の会シンポジウム・第16回中国四国ウイルス研究会・第11回国際ウイルス学会・第47回日本ウイルス学会等で発表し、論文にまとめている。本研究では、パラミクソウイルスのセンダイウイルス(SeV)のM蛋白(Matrix蛋白;エンベロープ裏打ち蛋白)の分子構造と機能との関連を、パラミクソウイルス間で保存されているシステイン残基に着目して検討した。1. M cDNAへの部位特異的変異の導入:M蛋白にある5つのシステイン残基をひとつひとつセリン残基に置換した変異体(C83S(83番目のシステインをセリンに置換した意味。以下同じ。)・C106S・C158S・C251S・C295S)、および全てのシステインをセリンに置換した変異体(Cys(-))のcDNAを作製した。2.変異蛋白の細胞内発現:培養細胞で変異M蛋白を発現さたところ、いずれの蛋白も細胞内で安定であった。また、野生型M蛋白のシステインは、細胞ライセートを免疫沈降して処理している間に酸化されて分子内ジスルフィド結合を形成することがわかった。Cys(-)のM蛋白ではこの現象は見られず、他の変異体では部分的にジスルフィド結合の形成が見られた。尚、この現象は野生型ウイルスの精製粒子でも見られたので自然の感染サイクルでも起こっているものである。3. M蛋白変異SeVの回収:変異M cDNA断片をSeV全ゲノムDNAの相同部分へ移し、鶏発育鶏卵を用いる方法で変異MをもつSeVの回収を試みた。C83S・C106S・C295Sではウイルスが回収できたが、C158S・C251S・Cys(-)では回収できなかった。鶏発育鶏卵での効率よいウイルス増殖に158番目や251番目のシステインが関与することが疑われた。

来年度は、回収されたウイルスについて、培養細胞での増殖能、自然宿主(マウス)での増殖・病原性などについて検討する予定である。さらに回収できなかったウイルスに関しては、感染細胞と非感染細胞と混合培養する別の方法で、変異ウイルスの持続感染細胞の作出を試みる。本研究では、cDNAからのセンダイウイルス(SeV)回収系を利用してM蛋白(Matrix蛋白;エンベロープ裏打ち蛋白)の分子構造と機能の関連を検討した。SeVM蛋白の5つのシステイン(Cys)残基のうち、1・2・5(番号はアミノ末端から)の変異ウイルスを回収できた。1.非還元SDS-PAGEで検討したところ、MCys(-)ウイルスのM蛋白は異なる状態のジスルフィド結合を形成していた。さらに電子顕微鏡観察・しょ糖密度勾配遠心法でウイルス形状の変化が観察できた。Cys1(-)・Cys2(-)ウイルスではウイルスが小さくなり、さらに遺伝子を含まない不全粒子が多く観察された。一方、Cys5(-)ウイルスではウイルス粒子の大きさが広く分布して、非常に大きなものも観察された。以上の知見は、M蛋白システイン残基がウイルス形態に影響を与えることのはじめての報告である。2.培養細胞での一段階増殖を検討したところ、Cys1(-)・Cys2(-)ウイルスでは子孫粒子の細胞からの放出が阻害されていた。Cys5(-)ウイルスは、親株ウイルスよりもむしろ効率よく放出された。細胞での多段階増殖は細胞からの放出効率とおおむね相関していたが、Cys5(-)だけは例外で、親株ウイルスよりも多段階増殖能は低かった。マウス個体での増殖と病原性は、培養細胞での多段階増殖能と相関していた。以上の結果は、M蛋白システイン残基がウイルス集合の効率・増殖効率・マウスへの病原性に影響を与えていることを示す。還元状態である細胞質でのM蛋白ジスルフィド結合・変異M蛋白の膜結合能・raft結合能などを解明する必要がある。3.以上の成果について、第14回インフルエンザ研究者交流の会シンポジウム・第16回中国四国ウイルス研究会・第11回国際ウイルス学会・第47回日本ウイルス学会で発表した。現在、論文にまとめている。
AIDS治療へ応用されうるHIV-Nefタンパクのシグナル伝達の分子生物学的解析

サイト力インレセプター(IL-6,IL-11,CNTFR,LIFなど)に共通に見られるgp130分子は、サイトカイン刺激により、YXXQ及びYXXVモチーフのチロシン残基がリン酸化され、STAT3およびPTPIDが各々結合することが知られている。Nefタンパクにも共通のモチーフがあることが知られている。私は、GST-Nefフェージョンタンパクが、eph群のチロシンキナーゼで、大腸菌TB-1により、リン酸化されることを見出した。そこで、eph群のチロシンキナーゼをCos7細胞にnef遺伝子とともに導入し、リガ一ドを加えるもNefタンパクのチロシンリン酸化は確認されなかった。そこで新たに、リン酸化されたGST-Nefを用いgt IIで作られたヒト骨髄のcDNAライブラリーの発現クローニングを現在行っている。今すでにクローニングされてきたものは、Hckなと、既知のチロシンキナーゼで、新規のNefタンパクとの結合が分かっていないものは、今のところ、このスクリーニング方ではとれてきていない。Nefのリン酸化によってSTAT3の活性化が起こるがどうがをゲルシフトアッセーにて確認したが、Nefのリン酸化がin vivo,つまりCos7細胞の中で起こらなかったため確認されなかった。またPTP-IDがNefのリン酸化に伴い活性化されるがどうかを確認する実験もNefの明確なリン酸化がCos7細胞内で認められなかったため行わなかった。eph family kinaseを数種類使い、nef遺伝子と共にco-transfectionを行いcos7のライセ-ト中のNef蛋白のチロシン残基のリン酸化を検出しようと試みたが検出出来なかった。近年、Nef蛋白質によるMHC-class I分子のダウンレギュレーションが報告されており、この分子のダウンレギュレーションがCytotoxic T cellのターゲットとしての感染細胞をCytotoxic T cellの監視より見逃すメカニズムとして脚光を浴びている。HIVは脳内のグリア細胞に感染し、エイズ脳症を起こすことが知られている。この脳症にもNef蛋白が関与しているという報告がでている。また、CD4分子がNef蛋白によってダウンレギュレーションするということは、免疫系、脳神経系に存在するスーパーイムノグロブリンファミリーが、Nef蛋白により、ダウンレギュレーションする可能性がある。又、種々のスーパーイムノグロブリンファミリーの遺伝子が欠如および、変異することにより、神経異性疾患が起ることが知られている。Nefによって脳神経系のスーパーイムノグロブリンファミリーのどれかがダウンレギュレーションすることにより、脳症が発生することを来年度一年で検討していきたい。具体的には胎児脳cDNAライブラリーよりNefに結合する蛋白をファーウエスタンブロット法にてスクリーニングし、また既知の脳内に発現しているイムノグロブリンスーパーファミリーとNef遺伝子をCo-transfectして、Nefによりダウンレギュレーションを起こすものをスクリーニングする。
「完全4次元同次処理」と「ユークリッド処理」の総合比較

現在の、CADを支えている形状処理の技術には,(1)不正確さ,(2)不安定さ,(3)複雑さ,の点で避けることの出来ない限界が存在し、これらの問題はシステムの信頼性に影響を及ぼす。著者は,"諸悪の根元は除算にある"とし,除算を用いない処理方式として「完全4次元同次処理」を提案している。ここに"完全4次元"とは、"一貫して4次元による"の意である。本研究は、現行の「ユークリッド処理」と本方式との理論および実験による比較である。(1')厳密な正確さ:除算を伴う「ユークリッド処理」では、厳密な正確さは実現困難である。一方、本方式では、有理数を扱う限り、厳密に正確な演算が可能である。これは様々な実験結果により確認されている。(2')頑健性:本方式では、除算を実行しないので、除算に伴うオーバーフローなどの不安定さは存在しない。また幾何的ニュートン法において、有理式曲線・曲面を対象とするときに現れる不安定さも、本方式では原理的に存在せず、更に解の局所一意性の点でも格段に優れている。(3')簡潔性:「ユークリッド処理」は射影による切断後の図形を対象とし、また「4次元同次処理」は射影前の図形を対象とする。前者は、切断の仕方により様々な形となるので組み合わせの場合が増え、複雑さが増大する。上に見たように、上記の3点に関しては圧倒的に「完全4次元同次処理」が優れていると結論できる。更に、処理の"一般性"と"統一性"および"双対性"に関しても、本方式の優越性が分かっている。1.英文著書の完成外国諸研究機関に総合評価を依頼するにあたって、完全4次元同次処理の内容を著わした英文著書を完成した。全体は4部(27章)と付録から成り、約630ページである。第1部は、問題の提起とそれらを解決するための基礎事項、すなわち、同次座標、射影空間、2重空間について解説している。第2部は全18章から成り、完全4次元同次処理の諸技術を幾何と位相の両面にわたって論じたもので、本書の中核を構成する。第3部は、完全4次元同次処理と従来のユークリッド処理を様々な実験データにより比較し、両者を、正確さ、頑健性、簡潔性、一般性、統一性、双対性、演算能率の諸点により総合的に比較している。第4部は結論であって、完全4次元同次処理の優位性を結論付けている。2.4次元CADライブラリープログラム評価依頼先に配布するために作成した、4次元CADライブラリープログラムは以下のとおりである。(1)FPUを用いた適応的無誤差符号判定ルーチン(2)幾何要素の射影不変な干渉判定ルーチン(3)ポリゴンに対する点の内外判定ルーチン(4)同次化NURBS曲線(5)同次化NURBS曲面(6)同次幾何的ニュートン法(7)双対オイラーオペレータ(8)双対クォーターエッジデータ構造(9)多面体対象の集合演算カーネル3.和文,英文マニュアル作成上記4次元CADライブラリプログラムの和文及び英文マニュアルを作成した.「完全4次元同次処理」(以下A方式と呼ぶ)と「ユークリッド処理」(B方式と呼ぶ)の比較について、直接内外の研究者と面接し、「完全4次元同次処理」の説明を行った後、現在の処理方式すなわち「ユークリッド処理」との比較を議論した。2.調査項目:主として以下の8項目について、議論した。(1)正確性、(2)頑健性、