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腹壁ヘルニアにおける自己の腹膜を用いたリサイクルメッシュ作成の基礎的研究

腹壁ヘルニアは人工メッシュによる修復法が一般的な治療法であるが、手術の際に不要となる腹膜を再利用(リサイクル化)する新たな手術方法の考案を本研究の目的とした。腹膜の固定方法や強度を検証した。さらに手術用ロボットの使用で今まで行えなかった手技が可能となり、低侵襲で安全かつ正確な手術が可能となった。ロボット手術を用いることでリサイクルメッシュの臨床応用に重要であると考え、臨床応用のへの検証を行った。本研究は腹壁から取り出した腹膜を固定剤を用いて固定することで、ヘルニアを修復することを目的としている。そのため、本研究の第一段階は架橋による腹膜の固定の強度を測定することとした。まず実験動物を全身麻酔を施行し腹部を正中切開し腹膜を切り出した。次にグルタルアルデヒドを取り出した腹膜に30分、1時間、2時間静置し架橋固定を行った。グルタルアルデヒドは5%25%のうち、最適の固定を有するものを検証した。最後に腹膜を生理食塩水で6分間の洗浄を3回行い、リサイクルメッシュ表面から固定液を除去した。リサイクルメッシュの評価は以下の通りである。引張試験機での引張強度を検証した。リサイクルメッシュの架橋率を測定した。測定方法はトリニトロベンゼンスルホン酸および塩酸処理を行い、345nmの波長で吸光度を計測した。走査型電子顕微鏡検査(白金コーティング後、加速電圧を加える)でコラーゲン繊維の走行を検査した。遠心ポンプにて持続的にリサイクルメッシュに圧負荷をかけた。その後に再度、メッシュに上記の引張試験および電子顕微鏡検査を行った。圧負荷に対して、引張強度の変化、またコラーゲン繊維の伸展や走行に乱れを評価を行った。◎架橋剤の種類や濃度、静置時間での強度の変化を評価した。現在、結果に関しては解析中であり、最も短時間で有効な強度を有する固定方法を検討中である。第二段階としては、その固定した腹膜を再度、実験動物に再固定する。その麻酔から覚醒させ、、数週間後に再度麻酔を行い、固定した腹膜を評価する実験を行う。本研究は、ヘルニアによって生じた不要な膜を再利用(リサイクル)し、ヘルニアが治療可能かどうかを評価することを目的としている。第1段階はリサイクルメッシュの固定方法および固定後の強度の検証を行った。切り取った膜は、脆弱であり、そのまま用いることはできないため、固定液を用いて固定しリサイクルメッシュの強度を増加させる。これらの固定液を用い、どの固定法がヘルニア修復に最適であるかを検証することが本法の研究の第一目標である。第2段階は固定されたリサイクルメッシュを実験動物に用い、より臨床に即した状態で短期および中期のIn Situの検証を行いる。肉眼的なルニアの再発の有無、引張試験による耐久性を検証する。またリサイクルメッシュが免疫反応を惹起せずに、生体に生着しているかを検証していき、生体に使用できうるものであるかを評価する。現在は第二段階の動物実験で、膜の採取から固定、そして再移植を行う過程を行っている。感染症が起きたり、膜がはがれてしまったりと、想定外に生体への固着が悪い状態である。そのため、縫合方法を再検討する必要がある。腹壁ヘルニアは人工メッシュによる修復法が一般的な治療法であるが、手術の際に不要となる腹膜を再利用(リサイクル化)する新たな手術方法を考案することを本研究の目的とした。第一段階で腹膜の固定方法や強度を検証した。その結果、グルタールアルデヒドでの固定が重要であることが検証できた。続いて第二段階である動物実験を行うこととした。しかし、実験動物は小さく、動物実験での立証および実験継続は難しいと判断した。実際、臨床での治療を検討した際に、手術の低侵襲化を図るため、内視鏡での手術が臨床応用に必要不可欠と判断した。ヘルニア手術は、疼痛軽減および早期回復、美容面で内視鏡手術が近年盛んに行われ始めている。術後の成績に関しても、従来の手術と比べそん色ないものとなっている。内視鏡手術には術者による熟練した技術が必要である。そのため、内視鏡鉗子の取扱いに十分習熟する必要がある。そのため内視鏡鉗子を用い、内視鏡下での技術習熟を行った。また近年、内視鏡手術の中でも、手術用ロボットの使用はさらなる低侵襲および安全性が期待されており、da Vinci Surgical System(Intutive Surgical社、米国)(以下:da Vinci)を用いることにより、腹腔および骨盤領域での手術が安全かつ正確に可能であると考えられた。da Vinciが提供する高解像度3次元映像および7自由度を有するロボット鉗子が,今まではその困難さゆえに行えなかった縫合操作や剥離操作を実現したことが考えられる.このda Vinciを用いることでより正確な運針によるリサイクルメッシュを用いたヘルニア修復術が可能であると考えられた。国内および海外研修を受講したことで、da Vinciの取扱いに習熟が可能となり、現在、リサイクルメッシュの臨床応用に向けて、今後の臨床応用への検証を進めていくことで研究を終了とした。

さらに手術用ロボットの使用で今まで行えなかった手技が可能となり、低侵襲で安全かつ正確な手術が可能となった。ロボット手術を用いることでリサイクルメッシュの臨床応用に重要であると考え、臨床応用のへの検証を行った。現在、腹膜の固定の検証は順調に進んでおり、検証の最終段階にある。この検証が終了すれば、第二段階の動物実験に進む予定である。第二段階では、固定した腹膜を実験動物に再固定し、その強度をin situに検証することとしている。膜の採取方法や縫合方法に関しては、最近内視鏡が外科領域では主流となり始めている。それは技術の進歩により低侵襲が進んでいるためである。そのため、内視鏡による手術手技を確立させるべく、縫合方法を検討しさらにロボット支援下での縫合を検討している。外科学研究がまだ中期段階であり、今後技術を検討する必要がある。研究開始の初期の段階で、文献的な検索を再度必要とした。そのため、実験の開始がやや遅れたが、現在は順調に進んでいると判断できる。内視鏡による技術の向上、ロボット支援下での手術を検討している。今後は、第二段階の実験を適宜行っていきたい。また、国内または海外での学会発表や論文発表を行っていく所存である。
ポリオウイルスレセプターは細胞間認識に関与するか?

ポリオウイルスは霊長類(ヒト、サル)にのみ感染する。ヒトやサルの細胞表面には免疫グロブリンスーパーファミリーに属するポリオウイルスレセプター(PVR)という分子が存在し、ポリオウイルスが細胞に吸着する際の受容体として機能することが分かっている。しかしながら、このポリオウイルスレセプターの本来の生理的な機能は全く分かっていなかった。多くの免疫グロブリンスーパーファミリーに属する分子が細胞間の認識に関与している。本研究では、ポリオウイルスが細胞間の接着分子ではないかと考え、細胞凝集活性を指標にこの仮説を検討した。まず、ヒトPVR、サルPVRあるいはマウスPVRホモログ(マウスPVR)をマウスL細胞に大量に発現しているステーブルトランスフォーマントを作製した。これら細胞株の細胞凝集活性を測定したところ、マウスPVRを発現したL細胞が非常に強い凝集活性を示した。また、この細胞凝集は(1)抗マウスPVRモノクローナル抗体やリコンビナントマウスPVRタンパクで阻害されること、(2)2価カチオン非要求性であること、(3)同種の細胞間(すなわちマウスPVRを導入した細胞間でのみ)で観察された。また、(4)マウスPVRタンパクの細胞上での局在を調べてみるとマウスPVRはもっぱら細胞間のジャンクションに存在していた。以上の、結果からマウスPVRは細胞間のホモフィリックな接着タンパク質であることが分かった。ヒト、サルPVRに関しては今のとこと接着活性を検出しておらず今後の課題である。
火山活動による火砕流および火山泥流災害発生規模の予測に関する研究

模型実験の結果によれば、火砕流の見かけの摩擦係数は0.154となり、普通の土砂の摩擦係数に比べるとかなり小さくなる。これを水蒸気圧の発生からみた場合、およそ50%90%の有効応力の減少が起こることが明らかになった。しかし火砕流も地形的要因の影響をかなり強く受けることが明らかとなった。火砕流礫の冷却時間はほぼ礫径の3乗に比例することがわかった。雲仙普賢岳では上流裸地斜面と下流の土石流堆積域、および森林植生域に明確な火山灰の堆積特徴がみられることがわかった。霧島においては高千穂・新燃岳・韓国岳・飯盛山を結ぶ構造線上の韓国岳、高千穂、山田町の崩壊分布密度が圧倒的に高い。構造線の南側については、地震直後の影響を強く受けることがわかった。新燃岳火口では1822年の旧火孔一帯の相対温度が最も大きく、硫黄谷でも10以上の高い異常部がみられた。さらに新燃岳火山灰は水を含むとせん断抵抗が約1/10に低下し、また流動時のせん断抵抗も極端に小さく、今後奮火があった場合、大規模な火山泥流の発生する危険性が高い。1991年6月30日の水無川の大規模土石流を流体力の面から検討した結果全般的にF*≧1となった。1992年8月8日の火山泥流(土石流)の流速はほぼ6m/sec9m/secであったと推定される。植生と火山活動に関するRVIによる画像解析の結果、雲仙普賢岳では1991年4月から1年後において植生活性レベルは次第に高くなりつつあるのがわかった。一方霧島では一旦火山爆発によって森林が破壊されると、それが回復するには、80年180年の時間が必要であることがわかった。つぎに桜島では土石流の発生が主として表面流に起因していることが明らかとなった。しかし西道川流域における降水量の8082%が実際には消失量となり、かなりの降雨雨量が深層透過量として消費されていることもわかった。
アタッチメントの投影的測定方法開発に関する基礎的研究

アタッチメントの投影的測定方法(PARS)を開発し、成人のPARSの結果と既存のアタッチメント測定方法の結果を比較した。自覚的な側面を測る日本語版ECRとの関連より、無自覚的な内的作業モデルの働きも捉えるAAIとの関連が多く認められたことから、防衛的な情報処理過程も捉えうる成人アタッチメント測定法としてのPARSの妥当性が認められた。アタッチメント投影的測度である親子場面刺激画(親子状況ピクチャー;PARS)については、欧米で開発途上のアタッチメント投影測度に関する研究の動向を踏まえ、刺激画をいくつか改定した。これを、大学・短大生90名(男性25名、女性65名)(平均年齢19.31歳、SD0.76)に施行し、PARSへの反応結果と、「成人愛着スタイル尺度(日本語版ECR)(中尾・加藤,2004)」との関連を検討した。日本語版ECRの26項目について因子分析を行ったところ、固有値の推移状況と解釈可能性とから2因子解が妥当と判断した。Varimax回転を行い、因子負荷量がいずれかの因子に.35以上の項目を選択した。各因子に含まれた項目は、中尾・加藤(2004)と全く同じであった。2因子による累積説明率は65.2%であった。中尾・加藤(2004)にならい、第1因子を"親密性の回避"(17項目)、第2因子を"見捨てられ不安"(9項目)とした。"親密性の回避"の平均値は3.22(SD1.05)、"見捨てられ不安"の平均値は3.97(SD1.26)で、ECRの2尺度の平均値に性差は認められなかった。PARSと日本語版ECRとの関連については、日本語版ECRで親密性の回避も見捨てられ不安も低く自己評定する者は、PARSへの反応において絵の登場人物を親子以外の設定にするなど、アタッチメント欲求の直接的表出を回避するような反応が認められた。これらは、投影的測度であるPARSと、意識的な自己評定質問紙である日本語版ECRとの関連であり、今後は、IWMの無意識的・防衛的情報処理過程をも扱うAAI(成人アタッチメント面接)との関連を検討する予定である。現在、AAIについては、大学生・短大生27名に実施済みであり、今後逐語録を作成し分析する予定である。また、子どものいる成人男女についても研究協力者を募り、PARS、AAI、IA(Insightfulness Assessment)を実施しているところである。IAについては、18年7月に開発者であるD.Oppenheimらによる講習(専門的知識の提供)を受けて、現在、分析の信頼性テストに臨んでいる。アタッチメント投影的測定方法として作成したPARS(親子状況ピクチャー)を、大学・短大生(以下、大学生)と乳幼児を育児中の親(以下、親)とに実施した。まず、PARSの作成過程(刺激画の選定の理論的背景を中心に)と、大学生のPARSへの反応傾向を四天王寺国際仏教大学紀要に発表した。反応傾向については、ストレスや要求が表出され調整されるという標準的な反応をする群、ストレスや要求の表出がない群、刺激画場面にしては強すぎるストレス反応をする群が認められた。また、少数であるが、登場人物を親子以外に設定するなどといった独特の反応群もあった。これらの差異がアタッチメントに関するIWMとどう関連するのかを検討することが課題となった。大学生のPARSの反応傾向と、日本語版ECRとの関連については、日本心理学会で発表した。ここでは、意識的な自己評定によるECRで親密性の回避や見捨てられ不安を低く報告する者に、PARSで親子場面以外の設定をする独特の反応群が多く、情緒的対人情報処理における回避的なIWM方略ではないかと考察した。最後に、PARSへの反応について、大学生と親との反応傾向を比較し、発達心理学会で発表した。親データは、現在育児中であるという現実に影響を受けるためか、大学生データとは異なる反応傾向が認められたが、それでも、アタッチメントに関するストレスや要求の扱い方という視点では、大学生と共通する反応パターンが抽出できた。今後は、年代差や性差もふまえながら、PARSの個人差とAAIとの関連を検討する予定である。PARSの反応傾向については、(a)葛藤や苦痛の表出が少ない反応パターン、(b)子どもは要求を表出し親がそれに応答する反応パターン、(c)葛藤や苦痛の表出が強い反応パターンに要約できた。乳幼児育児中の養育者と大学・短大生とで、性差と年代差を比較したところ、養育者は性差が少なく、(b)反応パターンが多かった。大学・短大生では、男性に女性より(a)(c)反応パターンが多く、父親が育児することへの戸惑いや、男の子は強くあるべきといった、伝統的性役割の影響が伺えた。大学・短大生を対象に、PARSと既存のアタッチメント測度との関連を検討したところ、日本語版ECRとめ関連よりAAIとの関連が多く認められた。自覚的な側面を捉える質問紙の日本語版ECRと、投影的手法のPARSとはアタッチメントの異なる側面を測定している可能性を考察した。

AAIのアタッチメント軽視型(抽象的・全般的なレベルでは両親を肯定的に報告するが、それを具体的エピソードで裏付けられない、あるいは矛盾するような否定的なエピソードが語られる「理想化」という防衛が特徴的)は、安定自律型より、PARSで典型的な(b)パターンの反応が少なく、ほとんどの場面で葛藤や苦痛を強く表現する(c)パターンが多かった。これにより、おそらく拒絶的な体験を背景として「理想化」のような防衛を用いた語り方が顕著になるAAIアタッチメント軽視型は、PARSのような投影法において、否定的な養育者像をそのまま投影しやすいと考察した。以上より、無意識的な内的作業モデルの情報処理過程にも迫りうる成人アタッチメント測定法としてのPARSの妥当性が認められた。この結果を8月に世界乳幼児精神保健学会(WAIMH)で発表し、他の研究者がPARSを用いた研究を始めた。また、PARSのさらなる精緻化のためのコメント、臨床場面での利用可能性についてのコメントを受けることができ、これらを今後の課題としている。
SV40TS遺伝子導入による不死化カテコラミン産生細胞株の開発と脳内移植への応用

胎仔あるいは新生仔ラットの脳幹細胞、線条体細胞及び副腎細胞を、SV40T/TS遺伝子を導入したψ2細胞シート上あるいは同細胞条件培養液添加培地中で培養し、SV40T/TS遺伝子の導入を行い、in vitroで増殖能をもつ細胞をえた。遺伝子導入後の増殖期に、培地中にEGF,FGFあるいは線条体細胞条件培養液を加えると、導入細胞の増殖が促進された。上記細胞を増殖させた後(4週間)、G418でセレクションし、8種類のG418耐性の脳幹細胞(MS-1,2,3)、線条体細胞(STR-1,2)及び副腎細胞(AD-1,2,3)をえた。各細胞は33°Cでは増殖能をもち(doubling time,約4週間)、39°Cでは増殖を停止した(温度変異性)。MS-1及びAD-1をパーキンソン病モデルラットの線条体に、STR-1,2を脳虚血モデルラットの線条体にそれぞれ移殖した。各細胞ともに移殖2週間後迄は生着したが、4週間後には免疫活性が低下し、機能の改善をもたらる迄には至らなかった。本研究で開発した細胞が脳内で長時間生着できない理由は、現在のところ不明である。移殖細胞をとりまく種々の環境因子による修飾、あるいは温度変異性を合せもつので、生存・生着が阻害されやすいのかもしれない。遺伝子の導入により開発した細胞の移殖によって、障害された脳機能の改善を計るためには、移殖細胞が脳内で安定して生着することが前提となる。これには、長期にわたる安定した遺伝子発現を可能とする内在性のプロモーターの探索・選択が必要である。機能修復を計ることを最終目的とし、脳内移植に用いるカテコールアミン産生細胞の不死化株を開発するため、以下の研究を行った。1.SV40T/TS遺伝子を導入したφ2細胞を33°Cで培養し、セミコンフルエントとなった段階でマイトマイシンを処置し、分裂を止めた。2.胎仔ラット脳幹ニューロン(E14日)及び新生仔ラット副腎髄質細胞サスペンジョンをpolybrene存在下で1の細胞シート上に播き、37°Cで3日間培養しカテコールアミン産生細胞へのSV40T/TS遺伝子の導入を行った。3.その後、標準培地で3週間培養し、4週間後よりG418培地で耐性株をセレクションした。4.以上の結果、TH陽性の耐性株を4種類えることができた。しかし、えられた耐性株は分裂能が弱く、2カ月以上にわたって培養下で維持することができていない。一方、TH陰性の耐性株には増殖能が強いものがあるが、これは混入したグリア細胞あるいは線維芽細胞が不死化したものと考えられる。5.研究はほぼ計画通りに進んでいるが、最終目標である移植に提供できるカテコールアミン産生細胞株は、現在まだえられていない。6.今後は、(1)幼若で分裂能のより盛んなE12日細胞へのSV40T/TS遺伝子の導入、(2)φ2細胞条件培養液中での細胞調整、(3)導入後の増殖を活性化するため、線条体/副腎髄質条件培養液やEGFの処置などの操作を加え、viabilityの高いカテコールアミン産生細胞株を開発する。1.胎仔(E14-15)ラット脳幹及び新生仔ラット副腎より得た組織を酵素処理後細胞浮遊液とし、SV40T/TS遺伝子を導入されたpsi2細胞シート上あるいはpsi2細胞条件培養液添加培地で培養し、脳幹ドーパミン参謀及び副腎髄質細胞にSV40T/TS遺伝子を導入した。2.SV40T/TS遺伝子導入後の増殖期(4週間)に、培地にEGF,FGFあるいは線条体細胞条件培養液を加えると、1の細胞の増殖が促進された。

3.遺伝子導入及び増殖後にG418でセレクッションし、G418耐性の脳幹細胞(MS-1,2,3)及び副腎細胞(AD-1,2)を得た。4.これらの細胞は、33°Cでは34週間でほぼ倍増した(doubling time34週間)。また38°Cでは増殖不能であった(温度変異性)。5.チロシン水酸化酵素(TH)免疫染色性は、MS-1とAD-1が陽性であった。MS-2,3はneurofilament及びGFAPともに陽性であった。6.MS-1及びAD-1をパーキンソン病モデルラットの線条体に移植した。両細胞ともに移植後2週間迄は生着したが、4週間後にはTH免疫活性が低下し、運動機能の改善をもたらす迄には至らなかった。以上、脳幹ドーパミン細胞及び副腎髄質細胞にSV40T/TS遺伝子を導入し、in vitroで増殖能をもつ細胞を得ることができた。しかしこれらの細胞は脳内移植後は長期にわたり安定して生存することができず、機能修復を得る迄には至らなかった。これらの結果は、脳内移植後、機能改善をもたらすような細胞株を得るには、in vivoにおいて長期にわたり安定した遺伝子発現を可能とする内因性(native)のpromoterの選択が不可欠であることを意味する。現在、この点について探索中である。
“痛み”体験に特異的な脳活動パターンの開発と機能性疼痛の病態評価への応用

本研究は、主観的体験である“痛み"現象を脳活動パターンとして再現性をもって客観的にとらえられるかの検討である。痛みが慢性化した状態では、中枢での疼痛処理機構の変化が複雑に痛みを修飾する.中枢をターゲツトとした病態の解明が必要である.とくに機能性疼痛では、痛みのある部位にその原因をもとめても器質的変化がなく、診断は患者の主観的症状の訴えにもとづいて行われる.ゆえに中枢での「痛み」体験が病態形成に重要な役割を果たすと考えられている。本検討では主観的痛み体験の座を脳ととらえ、従来型の脳画像解析ではなく機械学習のアルゴリズムを応用することで、予測精度の高い痛み脳指標を作成する挑戦である。
細菌細胞膜における高度不飽和脂肪酸含有リン脂質の機能解析と応用

Shewanella livingstonensis Ac10の1-アシル-sn-グリセロール-3-リン酸-O-アシルトランスフェラーゼPlsC1とPlsC4の機能を解析し、これらがそれぞれエイコサペンタエン酸(EPA)含有リン脂質と分岐鎖脂肪酸含有リン脂質を生合成することを見いだした。PlsC1は細胞分裂部位に、PlsC4は細胞の末端付近に主として局在し、これらが細胞膜の不均一性を生み出すことが示唆された。一方、EPA含有リン脂質が膜タンパク質のフォールディングを促進することを見いだすとともに、EPAの生理機能解析に有用なプローブ分子を合成した。エイコサペンタエン酸(EPA)生産性細菌Shewanella livingstonensis Ac10における細胞分裂関連ABCトランスポーターホモログFtsEXとEPAの相互作用を解析した。野生株とEPA欠損株(ΔEPA)で、eGFPを融合したFtsEを発現させ、細胞内局在性を解析した。その結果、野生株ではFtsEが細胞分裂部位や極に局在するのに対し、ΔEPAではFtsEが細胞全体に螺旋状の構造を形成することが見いだされた。野生株とΔEPAの可溶性画分と膜画分を調製し、ウェスタンブロット解析を行った結果、野生株のFtsEは膜画分から検出されたのに対し、ΔEPAのFtsEは可溶性画分から検出された。一方、FtsXの膜局在性はEPA欠損の影響を受けなかった。これらの結果から、EPAはFtsEの局在性に影響を及ぼすことが示された。EPA含有リン脂質の有無がFtsEの膜結合性に直接影響を及ぼす可能性を調べるため、精製したFtsEを、EPA含有リン脂質を含むリボソームと含まないリポソームとインキュベートし、ショ糖密度勾配遠心法によりFtsEの膜結合性を解析した。その結果、EPA含有リン脂質の有無は、FtsEのリボソーム結合性に直接的には影響しないことが示された。次に、FtsEの膜結合性が、FtsXを介してEPAの影響を受ける可能性を検討するため、ΔEPAでFtsXを高発現させたところ、膜局在性のFtsE量が増加することが見いだされた。以上の結果から、EPA含有リン脂質は内在性膜タンパク質であるFtsXと相互作用することで、そのFtsE結合性に影響を及ぼし、EPA非存在下では、FtsXとFtsEの相互作用が弱まり、それにより細胞分裂不全が生じることが推定された。(1)高度不飽和脂肪酸の一種であるエイコサペンタエン酸(EPA)を含有するリン脂質を細胞膜成分として含む細菌Shewanellalivingstonensis Ac10において、EPA含有リン脂質が膜タンパク質のコンフォメーションにおよぼす影響を解析した。その結果、本菌の主要外膜タンパク質であるOmp74のコンフォメーションが、野生株とEPA欠損株で異なり、本タンパク質のペプチドグリカン結合部位のプロテアーゼ感受性が、EPAの有無により異なることが見いだされた。(2) EPAの細胞内での挙動を解析するツールとして、EPAのω末端にエチニル基(炭素-炭素三重結合をもつ官能基)を導入したプローブ分子eEPAを有機化学的手法により合成した。エチニル基は特徴的なラマンシグナルを持つため、eEPAをラマン顕微鏡で可視化できることが期待される。また、エチニル基はアジド基をもつ化合物と特異的に結合させることが可能であるため、そして、エチニル基やアジド基は一般に生体分子には含まれないため、eEPAを含む生体分子(eEPAで修飾されたタンパク質や脂質など)をアジド基を含む蛍光試薬によって特異的に検出したり、アジドビオチンと結合させたあとでアフィニティー精製することが可能になるものと期待される。(3) ω末端にエチニル基を導入したオレイン酸アナログeOLAを有機化学的手法によって合成し、これをリン脂質分子に導入した。得られたeOLA含有リン脂質を種々の濃度で含むリポソームを調製し、ラマン顕微鏡観察に供した結果、10 mol%以上のeOLA含有リン脂質を含むリポソームがエチニル基特有のラマンシグナルによって可視化できることが示された。同様の手法でeEPA含有リン脂質の可視化も可能になることが期待される。(1)エイコサペンタエン酸(EPA)を細胞膜リン脂質の成分として含む細菌Shewanellalivingstonensis Ac10において、EPAのリン脂質への導入反応を1-アシル-sn-グリセロール-3-リン酸-O-アシルトランスフェラーゼPlsC1が触媒すること、本酵素が細胞分裂部位に局在すること、本菌が本酵素のホモログを5種類もつことを見いだしている。PlsC1のホモログであるPlsC4について、遺伝子破壊株を作製し、リン脂質組成を解析したところ、11-メチルラウリン酸と13-メチルミリスチン酸を含むリン脂質が顕著に減少していることが明らかとなり、これらの分岐鎖脂肪酸をリン脂質に導入する反応をPlsC4が担っているものと考えられた。また、GFP融合型PlsC4の蛍光顕微鏡観察から、PlsC4が細胞の末端領域に局在することが示唆された。以上の結果から、これらの類縁酵素が特定のリン脂質を特定の部位で生合成することが、細胞膜の不均一性を生み出すことに寄与している可能性が考えられた。(2) EPA含有リン脂質はS. livingstonensis Ac10の主要外膜タンパク質Omp74のβバレル構造へのフォールディングを加速するシャペロン効果をもつ。本研究では、フォールディングへのEPA含有リン脂質の影響をより詳細に解析した。

精製Omp74を8 M尿素または2% SDSで変性させ、これをリポソーム溶液と混合することでリフォールディングさせた。Omp74は尿素処理で完全に変性したのに対し、SDS処理ではN末端領域がαヘリックスを形成した部分的にフォールドした状態になることが見いだされた。EPA含有リン脂質によるフォールディングの加速効果は、SDSで変性させたOmp74についてもみられた。以上の結果から、Omp74はαヘリックスを経由して最終的なβバレル構造にフォールディングされ、EPA含有リン脂質は少なくともαヘリックス形成以降の段階においてシャペロン機能をもつものと考えられた。細菌細胞膜のリン脂質を生合成する類縁酵素群については、細胞内での基質特異性や局在性の解析において大きな進展が見られ、これらの酵素群が生体膜の高度組織化に寄与することを示唆する結果が得られた。また、EPA含有リン脂質が膜タンパク質のフォールディングにおよぼす影響についても詳細な知見が得られた。一方、エチニル基修飾型EPAを用いたEPAの動態解析においてはプローブの調製や細胞への添加条件の検討などに時間を要し、十分な情報が得られていないのが現状である。以上の状況から、「おおむね順調に進展している」と評価することが妥当と考えられる。(1)高度不飽和脂肪酸の一種であるエイコサペンタエン酸(EPA)は血管性疾患の予防効果などヒトの健康に寄与する機能性脂肪酸として注目され、また、海洋性EPA生産細菌の正常な細胞分裂に要求されることを本研究代表者らは見いだしている。これまでの研究により、EPAの機能解析に有用なプローブ分子の効率的な合成法を確立してきた。ω末端にエチニル基を導入したEPAアナログ(cEPA)およびω末端側の3つの炭素原子に結合する水素原子をすべて重水素に置き換えた重水素標識型EPAを合成した。従来のcEPA合成法は全19段階の多段階反応であり(Wittig反応を5回行うことで5つの二重結合を導入)、収率は0.0010%と極めて低かった。新しく確立した合成法では、炭素-炭素三重結合を4つ有する化合物を銅触媒を用いたカップリング反応により合成した後、P-2ニッケルを用いて三重結合を一度の反応で立体選択的に部分還元したのち、Wittig反応で1つの二重結合とω末端三重結合を導入する。全12段階の反応により収率4.4%でcEPAが得られた。同様の方法で、重水素標識型EPAの合成も行った。(2) EPA生産性細菌Shewanellalivingstonensis Ac10のEPA欠損株は、低温での生育速度が低下し、異常に伸長した細胞を形成するが、EPAを培地に添加することで、これらの生育阻害が抑制される。cEPAを培地に添加したところ、天然型EPAを添加したときと同様、生育遅延と異常な細胞伸長が抑制された。また、cEPAがリン脂質のアシル鎖として存在することも明らかとなった。以上のことから、本菌においてcEPAは天然型EPAと同様に機能すると考えられた。cEPA添加菌体の抽出物にアジドビオチン加え、クリックケミストリーの手法でcEPAをビオチン修飾したのち、タンパク質をSDS-PAGEで分離し、HRP標識ストレプトアビジンで検出した結果、cEPA修飾タンパク質と示唆されるシグナルが観察された。
第二次世界大戦下に強制収容された日系ラテンアメリカ人に対する戦後補償

2018年度は研究調査に2回出掛けた。1回目は、2018年9月17-27日まで、ロサンジェルスで戦後補償交渉に携わってこられたカルメン・モチヅキさんほか2人と再度お会いしてインタビューを行ったほか、サンフランシスコでは、アメリカで戦後補償交渉の中核となって動いていたCampaign for Justiceの代表グレース・シミズさんとのインタビューを果たした。2回目は、アメリカによりラテンアメリカで最多の強制連行者を出したペルー共和国のリマに、2019年2月20日より3月7日まで行き、国立公文書館(Archivo General de la Nacion)で第二次世界大戦中のペルーとアメリカとの国家間関係を裏付ける史料を閲覧したほか、日秘会館を拠点とし、同会館内の移民史料館において、バックグラウンドの異なる5人の日系ペルー人の方々とのインタビューを行った。さらに日秘会館内の図書館では、日本では入手困難な日系一世による自叙伝(日本語)や、第二次世界大戦中にペルーからアメリカに連行された方々、ペルーにいた方々に関する情報をも含む日系人移住史などの文献(日本語・スペイン語)、近隣のラテンアメリカ諸国で出版された日系人に関する文献(日本語・スペイン語)などを閲覧した。このほか、ペルーからアメリカのテキサス州クリスタル・シティ抑留所などに行くことを余儀なくされた方々の名簿を拝見することができ、これまでに入手した戦後アメリカに残られた方々、日本に行かれた方々に関する名簿と合わせ、その実態を明らかにする上で有益な調査であったことも大きな成果である。具体的な研究成果しては、査読論文「アメリカ政府による日系ラテンアメリカ人の強制連行と戦後補償ー市民自由法制定から30年を経た今、点から線へ(前編)」『阪南論集・社会科学編』第54巻第2号(2019年3月刊行、17ー41ページ)を刊行した。研究開始当初、突然の家庭的事情で自分自身が研究に専念できる環境を整えることができなかった。しかし、それでも少しずつ調査研究を進め、また研究成果も出すことができた。これまでに、アメリカとペルーに調査研究に出て、本研究の中核である戦後補償交渉を推進してきたキーパーソンとのインタビュー(カルメン・モチヅキさん、ヘクター・ワタナベさん、アリス・ニシモトさん、グレース・シミズさん、リチャード・カツダさんほか)を重ねることができたほか、そもそもの原因である、なぜアメリカ政府(ルーズヴェルト大統領)が日系ラテンアメリカ人をアメリカに連行したのかという点については、国立公文書館(アメリカとペルー)などに行き、関係史料を閲覧することができた。その結果、本研究課題について学会発表1回(2016年9月、日本アメリカ史学会)、インタビューに関する研究ノート3本、査読論文1本を書くことができた。ただし、戦後補償に関わられた方々で、関係者から紹介して頂いたにもかかわらず、いまだに連絡が取れていない方が少なくとも2人おられ、またこれまでに行ったインタビューのうち、これまでにまだ全てを起こすことができておらず、また史料の解読についても完全に終わっているとは言えない状況にある。そのため、当初の研究計画は5年であったが、もう1年間研究を延長させて頂き、これまでの研究でいまだ不足している史実について真相を究明し、戦後補償交渉の全容を解明するためにも、残りの1年間で本研究課題の総仕上げをしたいと考えている。本研究課題について、当初は5年計画であったが、まだ不十分な成果しか出せておらず、2019年度は研究期間を1年間延期させて頂き、その間に以下の課題を遂行したいと考えている。すなわち第1に、アメリカ(サンフランシスコ周辺)で、モチヅキさんとともに戦後補償交渉に携われた方にインタビューを申し込むこと、第2に、アメリカのクリスタル・シティ抑留所から日本に来られ、日系ペルー人として戦後補償に関わられた方へのインタビューを行うこと、第3に、この日系ペルー人であった方が保管していて、すべてを預けたとの情報がある名古屋の大学に保管される史料を閲覧しに行くこと、第4に、アメリカのメリーランド州にある議会図書館に再度行き、アメリカによる日系ラテンアメリカ人に対するアメリカへの強制連行がなぜ行われたのかという点で、不足している情報を補う史料がないかどうかを探しに行くこと、第5に、近い将来著書としてまとめるうえで、あらためて2019年現在、本研究課題に関連した先行業績をアメリカと日本に止まらず、ペルーで集めたペルーや周辺諸国で出版されたものも含め、今後、研究者が利用する上でも役立つような文献リストとしてを書き上げること、そして第6に、これまでの研究成果を公開講座などを利用して発表を行い、広く多くの人々に、史実に基づいた研究成果を知ってもらうことである。インタビューなどは相手があることなので、不確定要素もあるが、これらについてできる限り実行し、本研究課題を完成させたいと考えている。2014年度は、第二次世界大戦当時のアメリカとラテンアメリカの国際関係について研究を深めるため、図書の閲覧や論文を読み、新たに出版された書物については、先行業績として必要なため、購入準備を進めた。さらに2015年3月には1週間ほどアメリカ・ロサンジェルスに滞在し、第二次世界大戦中に強制連行された父を追って、実際にペルーからアメリカに家族とともにわたったヘクター・ワタナベさんを訪ね、ご本人がテキサス州のクリスタルティで収容されていたときの記憶やその後のアメリカ生活についてインタビューをしたほか、彼の父が遺した本研究課題にかかわるメモや政府関係の史料、補償交渉の動向などが掲載された羅府新報、クリスタルシティの収容所での生活を余儀なくされた日系ラテンアメリカ人らの名簿やその後の行先などを見せていただいた。

このほかUCLAのResearch Libraryにおいて、コーデル・ハル国務長官の関連史料や戦時下のアメリカとラテンアメリカ諸国との関係、日系ラテンアメリカ人に対する補償交渉について書かれた論文や補償交渉について触れられた論文などを閲覧した。これらについて、今後の研究期間内に行う成果発表に備え、できるかぎり文章としてまとめた。2015年度には、本研究課題の前提である、なぜアメリカ合衆国がラテンアメリカ諸国から日系ラテンアメリカ人を本国に強制送還したのかについて、11月にアメリカ・ワシントンDCおよびメリーランド州のNational Archivesにおいて、主としてState DepartmentおよびWar Departmentの史料(Record Group 59およびPacific Warのファイル)を閲覧し、また当時のアメリカとラテンアメリカ諸国との国際関係を記した専門書を購入し、史料などを分析する際に参照した。国務省史料は想像以上に膨大で、その中から特にアメリカ政府高官の日系ラテンアメリカ人への対応と、強制送還された人々の大半が収容されたテキサス州クリスタル・シティにおける日系ラテンアメリカ人の収容生活に的を絞り、優先順位をつけて史料を閲覧したが、それでもなお閲覧を完了するには至らなかった。また収容者の生活については、プライバシーの観点から当該者でないと閲覧できない史料もあることがわかった。入手できた史料によれば、アメリカはWWII以前からラテンアメリカ各国で特異な行動を取る日系人について継続的に報告を上げ、必要に応じて注意を喚起しているほか、特に強制送還された日系ラテンアメリカ人の8割を占めた日系ペルー人については、INSによるAlien Enemy Detention Facility Filmの中で、「Peruvian Japaneseの多くは特別な問題があることがわかっている」と捉えており、国務省内のだれがどのような考えを基に強制送還の必要性を説いていたのかといった具体的な構図がこれらの史料により見えてきた。今回閲覧並びに収集した重要な史料についてはデジカメで撮影し、2016年5月8日現在、年表や各国における要人同士の相関関係図を作成するとともに、史実を分析し続けている。5年計画の2年目を終わった段階で、アメリカにおける史料収集により、アメリカによる日系ラテンアメリカ人を強制送還するという政策の具体的な内容が把握できた。ただし、本研究課題のもう一つの柱である、こうしたアメリカ政府による人権侵害の誤った行動に対するアメリカ政府に対する戦後補償交渉について、当初インタビューを予定していた収容者のうちの重要なお一人が亡くなられてしまったという事実を確認した。今後両者を両立させながら研究を加速させていく必要性があると考えている。
生体膜/半導体アクティブデバイス基本構造の提案

本研究では生体膜/半導体アクティブデバイスの基本動作のデモンストレーションとして、生体膜に光照射をして任意の位置に相分離ドメインの形成を行った。特にレーザー光照射によるパターニングを行うために、より効率的にパターニングが生じるための蛍光脂質組成および拡散係数の制御を行った。さらに、タンパク質凝集の可能性を調べるために、Annexin Vを導入したところ、ドメインの位置とAnnexin Vの存在位置が一致し、ドメイン制御によるタンパク質凝集制御が可能であることを示唆した。本研究では、最終的には局所発光制御可能なドットマトリクス型半導体発光デバイスを用い、その上に膜タンパク質を含んだ脂質二重膜を形成することで、ラフト構造を介した膜タンパク質輸送・凝集のアクティブ制御の実現を目指している。当該年度は、最初の段階として、局所光照射による相分離構造凝集制御を行い、次に相分離構造をコレステロールを含むラフト構造の制御へと発展させた。本研究開始前において、比較的広範囲の光照射による相分離構造・ラフト構造の凝集制御まではできていたが、数ミクロン数十ミクロン径の局所的光照射による制御はできていなかった。まず、その原因を調べたところ、生体膜における光エネルギーの吸収効率が非常に低いことと、生体膜中の脂質分子の拡散係数が小さいことが原因であることがわかった。前者に関しては、生体膜にドープする蛍光脂質量の制御することで、後者に関しては、生体膜を保持するバッファ液のイオン濃度制御および膜中の欠陥抑制によって改善した。その結果、半導体レーザーによる局所光照射による相分離構造凝集制御に成功した。さらに、これらをラフト構造に適用するために、脂質組成にコレステロールを加えて実験を行った。その結果、光によるラフト構造制御についても確認した。さらに凝集過程を詳細に調べるために、蛍光顕微鏡と原子間力顕微鏡を同時にリアルタイムに観察するシステムも構築し、光照射領域とラフト構造形成位置との相関をより詳細に調べる体制も整った。昨年度は、最初の段階として、局所光照射による相分離構造凝集制御を行った。特に、脂質二重膜における拡散係数制御を膜を保持するバッファ液のイオン濃度制御および膜中の欠陥抑制によって改善した。本年度は、局所光照射によるドメイン凝集技術はおおむね確立した。本年度は、ドメインへのタンパク質凝集の確認をメインに行った。マイカ基板または表面を熱酸化した後、親水化処理を行ったSi基板上に、ベシクルフュージョン法で平面脂質二重膜を作製した。脂質組成はDMPS/DOPC(=20:80)にTR-DHPEを1mol%加えたものを用いた。蛍光顕微鏡を用いてその膜を観察した。光照射によるパターニングは、膜を45度に保持して1分間光照射をした後、温度を5度に下げることで行った。ドメインと蛋白質との結合を検証するためにPSと選択的に結合する蛍光色素(AlexaFluor488)付きの蛋白質Annexin Vを用いた。光照射領域の縁に多くのドメインが形成した。ドメインが形成した膜にAnnexin Vを加え、TR-DHPEとAlexa Fluor 488のそれぞれを蛍光観察したところ、黒く観察されたドメインが、Alexa Fluor 488を励起すると明るく観察された。これにより、酸性リン脂質(DMPS)のドメインが形成され、そこにAnnexin Vが選択的に結合することが証明された。これは、Annexin Vの代わりにセプチンのような蛋白質を加えれば、ドメインが形成した領域の形状が選択的に変化する可能性を示唆する。
吹雪の物理モデルによる流域内積雪及び大気への影響予測に関する研究

本研究では,積雪の南限域に相当するモンゴル・ウランバートルの北東に位置するヘンテイ山脈Tuul川上流域に着目して,流域スケールで吹雪が積雪や大気に与える影響を解明するために多角的に研究を行ってきた.吹雪発生の地域特性,吹雪による積雪の削剥特性,近年のTuul川上流域における山岳積雪分布の実態と吹雪の動態及び積雪の有無による土壌の応答を明らかにし,吹雪による積雪の再配分過程の重要性を示した.本研究では,積雪の南限域に相当するモンゴル・ウランバートルの北東に位置するヘンテイ山脈Tuul川上流域に着目して,流域スケールで吹雪が積雪や大気に与える影響を解明するために多角的に研究を行ってきた.吹雪発生の地域特性,吹雪による積雪の削剥特性,近年のTuul川上流域における山岳積雪分布の実態と吹雪の動態及び積雪の有無による土壌の応答を明らかにし,吹雪による積雪の再配分過程の重要性を示した.吹雪が大気や積雪に対してどのような影響を及ぼすのかを明らかにするため,まず吹雪粒子からの昇華量に着目した.最終的には吹雪の物理モデルを構築して影響を予測する必要があるが,今年度は再解析データセットを入力条件として,経験式による吹雪粒子からの昇華量を全球で推定し,論文としてまとめた.地域によって昇華量は異なるが,北半球は南半球に比べて広域に昇華している様子が再現された.また,吹雪の物理モデル構築に必要な低温風洞実験に着手した・現有の1次元吹雪モデルを3次元に拡張して積雪分布を再現するためには,積雪の削剥・堆積量が風速や気温に対してどのように依存するのかを明らかにする必要がある.そこで気象条件を自由にコントロールでき,吹雪を発生させることが可能な低温風洞実験装置(防災科学技術研究所雪氷防災研究センター新庄支所雪氷防災実験棟)を利用して実験を行った.風速は8,10,12m/sと,積雪表面温度は-10,-6,-3,-2°Cと変化させた.風速が増すにつれて削剥率は増し,また雪温が高くなるにつれて削剥率が減少する傾向が見られたが,来年度はさらに実験数を増やすとともに,他の雪温における削剥率を求める必要がある.さらに,吹雪の規模は積雪深や積雪密度といった積雪物理量にも依存していることから,積雪物理量の実態を把握するために,研究対象としているモンゴル・トーレ川上流域内のナライハ観測サイトに積雪重量計を設置した.これにより自動で積雪状態を把握することが可能になった.現有の1次元吹雪モデルを3次元に拡張して積雪分布を再現するためには,積雪の削剥・堆積量が風速や気温に対してどのように依存するのかを明らかにする必要がある.そこで気象条件を自由にコントロールでき,吹雪を発生させることが可能な低温風洞実験装置(防災科学技術研究所雪氷防災研究センター新庄支所雪氷防災実験棟)を利用して,昨年度に引き続き低温風洞実験を実施した.特に,温度が吹雪時の削剥・堆積過程に及ぼす影響を調べた.実験では積雪面の一部にトレイを埋め込み,吹雪を発生させて,一定時間経過後のトレイの重量変化から削剥率を求めた.雪温は-10°C,-4°C,-2°Cと変化させた.その結果,雪温か-10°Cから-4°Cへと高くなるにつれて削剥率は小さくなる傾向が見られた.さらに-2°Cまで上昇すると逆に削剥率が大きくなったが,これはトレイの積雪面に衝突する吹雪粒子の跳躍距離が温度によって異なるためではないかと思われ,今後の課題である.これらの結果は一部論文としてまとめることができた.また,吹雪の規模は積雪深や積雪密度といった積雪物理量にも依存していることから,その積雪物理量の実態を把握するため,昨年度の秋にモンゴル・トーレ川上流域内のナライハに積雪重量計を設置したが,昨年度の積雪量は少なかった.そこで今年度は積雪重量計の再設置を秋に試みた.さらに,モデルを駆動させるためには積雪及び気象データが必要となることから,同上流域内に設置されている自動気象装置のデータを収集し,整理した.モンゴル・トーレ川上流域における地上観測結果をもとに,2003年から2009年までのいずれも2月の積雪下限標高の経年変化を算出したところ,長期トレンドを算出するには至らないが,積雪下限標高は徐々に高くなっていた.衛星データ(1967年から2004年)によると,積雪南限域に相当するモンゴルでは3月から4月の積雪の消失が早まっていることが示されており(IPCC第4次評価報告書),この傾向と整合する.トーレ川上流域の積雪下限標高が年々高くなると,将来,無積雪域が上流域の最高峰(2799m)に達すると外挿されるが,長期トレンドを議論するには年々変動の振幅を評価する必要がある.一方,流域数値モデルを通年でモンゴル・トーレ川上流域に適用したところ,潜熱は-100から250W/m^2,顕熱は55W/m^2を下回り,流出率は低く,蒸発散量は降水量に近い値となっていた.また,地温に関して,通年で現地観測とモデル結果とを比較したところ,現地観測では地表面から20cm,40cmと深くなるにつれ年間を通じて日変化が小さくなり,モデルでも同様に再現された.積雪分布の影響を調べるためにモデルで降雪量をゼロとすると,冬季はいずれの深度でも,現地観測よりモデルの方が40cm深で5°C以上も冷却する結果となった.積雪がないと土壌から大気への顕熱輸送が増大し,結果として土壌がより低温になるため,地温の日変化に違いが現れたと考えられる.

モンゴル北部は永久凍土の南限に位置している.夏(6月から8月)の降水は年降水量の60%以上を占め,冬の降水は少ないことが指摘されているものの,凍土の消長を議論するには精度のよい積雪分布を考慮する必要があると考えられる.
花粉の遺伝的特徴解析を目的とした画像自動計測システムの開発

本研究では,品種改良(交雑育種)の効率化に着目し,花粉の「形状」,「模様」,「色彩」を定量的な指標で計測量し,花粉の遺伝的な特徴を自動的に解析するシステムの実現を目的とする。(1)画像自動計測システムの構築マイクロスコープ,XYZ軸マイクロマニピュレータ,そして制御・解析用PCから構成される自動計測システムを開発した。マイクロスコープの映像はビデオ信号(実時間画像転送が可能)及び高解像度静止画像(転送時間が1秒程度)の2系統による出力を可能とした。花粉等を操作する場合には,ビデオ信号より連続的に画像処理を行い,マニピュレータを花粉等の目的の位置まで制御することが可能となった。そして花粉を解析する場合には,高解像度のデジタル画像を用いることが可能となった。花粉の遺伝的な特徴を解析する指標の計測方法については,すでに提案しており,これを本システムに実装することによって,花粉解析の自動化が実現できた。(2)花粉解析のための花粉の操作実験Ragweed及びBlack Walnutの花粉(粒径2040μm)を用いて,マニピュレータによる花粉の操作が可能かを実験した。その結果,花粉が単体で位置する場合には,自動で花粉の位置を計測し,マニピュレータで採取することが可能となった。この成果で新規的なことは,マイクロスコープの奥行き方向の距離を推定できることである。これによって,マニピュレータの先端と花粉との高さの違いを機械が認識し,自動制御で高さを合わせることができる(10μm程度の精度で位置決めが可能)。ただし,複数の花粉が密接している場合は,個別の花粉を認識すること(画像認識の分野でも大きな課題の一つ)が困難であるため,今後はこれを課題とする。なお,本研究の成果は,花粉の操作に限らず,様々なマイクロ粒子の操作に応用することが可能であり,他のアプリケーションについても検討を進める。本研究では,経験的に行われている品種改良技術(交雑育種)の効率化に着目した.育種学では,花粉の形態から,その花粉の生殖可能の有無を判断できるだけでなく,花粉の親種の特徴などもある程度判別が可能とされている.しかし「育種学」では,花粉の形状を定量的に評価することはほとんど行なわれていない.このことから,この分野では,研究者の観察的かつ感覚的な評価がなされてきた.これまで申請者は,形状モデルで表現できないような複雑な物体,粒子群の密集パターンなどを定量的に表現する方法について研究してきた.本研究では,これまで得た知見を適用し,花粉の「形状」,「模様」,そして「色彩」を定量的な指標で表わすことによって,指標と花粉との遺伝的な関係を調査してきた.これまで,ある種類の植物に関しては遺伝的な特徴の把握が可能であることを確認している.本年度のおいては,これらの指標を算出する方法を計算機に実装した.これによって,画像中にある任意の花粉を指示することによって,その花粉の形状,模様,色彩に関する指標を算出することを可能とした.ただし,入力の画像としては,(1)1600×1200以上の高解像度を有すこと,(2)色彩表現の分解能が高いこと,が不可欠である.また,なるべく注視している花粉を大きく映せるように,(3)連続的に可変な高倍率レンズが装備されていることが望ましい.以上の要求を満たす機器として,現有の顕微鏡にある自動XYステージ上に付加することが可能なマイクロスコープを選定した.これを利用して,画像から花粉解析に有用な指標を算出する装置の基本部を開発した.本年度においては,すでに提案した花粉解析のため形状,模様,色彩の指標算出法を計算機に実装し,さらに,解析に有用な画像を撮像するためのマイクロスコープを増設した.これによって,画像自動計測システムの基本部を作成することができた.本研究では,経験的に行われている品種改良技術(交雑育種)の効率化に着目し,花粉の「形状」,「模様」,「色彩」を定量的な指標を計測量とし,花粉の性質を自動的に計測するシステムの実現を目指している。本年度における研究実績の概要を以下に示す。(1)画像自動計測システムの拡張昨年度導入した本システムの本体であるマイクロスコープシステムにXYZ3軸のマイクロ・マニピュレータを設置した。本マニピュレータの制御分解能は0.1μmであり,花粉の寸法(1050μm)を制御するのには十分な精度であることを確認した。そして,本マニピュレータの先端に直径1μmの針を取り付け,花粉に接触できるかどうかの試行実験を行った。本マニピュレータはUSB接続のマウスによって位置制御を行うことが可能であり,これによる手動操作で試料花粉に接触できることを確認した。(2)三次元計測法の考案プレパラート平面上にある花粉の場合には,比較的容易にマニピュレータ先端を接触させられるが,雄しべに付着している花粉の場合には,奥行き方向の位置が定まらないために接触させることが困難であることがわかった。そこで,ズームによる視差から奥行き方向を算出する方法(「ズーム計測法と視差による不確定な領域の評価」,精密工学会誌,Vol.70,No.4,pp.512-516,2004)を試みることとした。現在のところ,ズームレンズの高精度に焦点距離を算出できるため,大まかな距離を算出できることのみを確認している。これについては来年度の課題とする。(3)花粉解析の実施例の発表本研究で提案している計測方法の妥当性を示すために,平成1617年度に測定したタンポポを例題に植物の遺伝的特徴が把握できることを査読付き論文に発表した。

本研究では,品種改良(交雑育種)の効率化に着目し,花粉の「形状」,「模様」,「色彩」を定量的な指標で計測量し,花粉の遺伝的な特徴を自動的に解析するシステムの実現を目的とする。(1)画像自動計測システムの構築マイクロスコープ,XYZ軸マイクロマニピュレータ,そして制御・解析用PCから構成される自動計測システムを開発した。マイクロスコープの映像はビデオ信号(実時間画像転送が可能)及び高解像度静止画像(転送時間が1秒程度)の2系統による出力を可能とした。花粉等を操作する場合には,ビデオ信号より連続的に画像処理を行い,マニピュレータを花粉等の目的の位置まで制御することが可能となった。そして花粉を解析する場合には,高解像度のデジタル画像を用いることが可能となった。花粉の遺伝的な特徴を解析する指標の計測方法については,すでに提案しており,これを本システムに実装することによって,花粉解析の自動化が実現できた。(2)花粉解析のための花粉の操作実験Ragweed及びBlack Walnutの花粉(粒径2040μm)を用いて,マニピュレータによる花粉の操作が可能かを実験した。その結果,花粉が単体で位置する場合には,自動で花粉の位置を計測し,マニピュレータで採取することが可能となった。この成果で新規的なことは,マイクロスコープの奥行き方向の距離を推定できることである。これによって,マニピュレータの先端と花粉との高さの違いを機械が認識し,自動制御で高さを合わせることができる(10μm程度の精度で位置決めが可能)。ただし,複数の花粉が密接している場合は,個別の花粉を認識すること(画像認識の分野でも大きな課題の一つ)が困難であるため,今後はこれを課題とする。なお,本研究の成果は,花粉の操作に限らず,様々なマイクロ粒子の操作に応用することが可能であり,他のアプリケーションについても検討を進める。