hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
顎下腺の増殖と分化におけるシグナル伝達の研究

齧歯類の顎下腺の生後発達において、腺房部の増殖・分化は自律神経(βアドレナリン作動性)に、顆粒性導管の分化はホルモン(アンドロゲン)に依存するが、その細胞内シグナル伝達系は明らかでない。本研究で次のことが明らかになった。1)ラット生後初期での顎下腺腺房細胞の増殖および思春期での顆粒性導管細胞の分化の両方において、細胞核に一過性に転写因子であるCREBが発現し、必須の役割を持つことが免疫組織化学およびアンチセンス抑制法により示された。2)腺房の増殖が終了する生後34週に、腺房中心部の未分化細胞が腺房細胞に分化するとき、低分子量ストレス蛋白質である27kD熱ショック蛋白質(Hsp25)が一過性に発現することがわかった。3)腺房細胞における蛋白分解酵素阻害物質であるシスタチンS(cystatin S)の発現は、βアドレナリン作動性薬剤であるイソプロテレノール(IPR)の投与により誘導されることが知られている。下垂体切除ラットの顎下腺において、IPRによるシスタチンSのmRNA増加が著明に低下していること、これにテストステロン、エストラジオール、グルココルチコイド、チロキシンなどを投与すると、IPRの効果が著明に回復することが分かり、シスタチンS発現が神経と下垂体の2重支配を受けることがわかった。4)マウス顎下腺において、がん遺伝子産物で転写因子として働くJunDの発現は導管系細胞の核のみに局在すること、雄より雌マウスで発現が高いことがわかった。雌マウスにテストステロンを投与すると、JunD発現が線条部導管細胞で一過性に上昇した後、顆粒性導管細胞への分化とともに消失することが示され、導管系の分化にJunDが関与することがわかった。以上の結果から、齧歯類の顎下腺における腺房および導管系の増殖や分化において、様々な細胞内シグナル伝達系の間に相互作用(クロストーク)があることが示唆された。低分子量熱ショック蛋白質(Hsp27)は細胞の増殖、分化やアポトーシスにおいて重要な役割を果たすことが知られてきている。齧歯類の顎下腺では生後発達の過程で腺房細胞の大規模な増殖と分化が起こる。そこで生後各年齢のラット顎下腺におけるHsp25の発現と局在を免疫組織化学的に解析した。生後2週ではHsp27免疫活性は顎下腺全体に分布した。3週では免疫活性は大部分の腺房と導管の細胞から消失したが、腺房中心部において強い免疫活性の局在が見られた。この免疫陽性細胞の大部分は、腺房細胞の前駆細胞である終末導管(TT)細胞(I型細胞)であった。4週になると、腺房中心部のHsp27免疫陽性細胞は数が減少し、またその細胞種も主に未熟腺房細胞(II型細胞)に変わった。免疫陽性細胞の一部は分泌顆粒を持つ未熟な介在部導管(ID)細胞であり、またわずかながらアポトーシス細胞も含まれていた。5週以降になると腺房はすべて成熟腺房細胞で占められ、Hsp27免疫活性は消失した。3週のラットにイソプロテノールを7日間投与して成熟腺房細胞への分化を促進させたところ、4週での免疫陽性細胞の数は有意に減少し、成熟腺房細胞においてHsp27の発現が下方制御されていることがわかった。

これらの結果から、ラット顎下腺の生後発達において3週4週でTT細胞が増殖を停止して腺房細胞および介在部導管細胞への分化を開始すること、また一部の細胞はアポトーシスに陥ることが示唆された。Hsp27はこの細胞分化における決定的な時期において腺房中心部のTT細胞に一過性に発現し、その分化に何らかの役割を果たすことが考えられる。1)顎下腺腺房系におけるシスタチン遺伝子発現誘導へのテストステロンの影響シスタチンSは顎下腺の腺房細胞から分泌される蛋白質分解酵素阻害物質である。シスタチンS遺伝子はサイクリックAMP反応部位(CRE)を上流に持ち、特異的な結合蛋白質(CREB)を転写因子とする発現調節を受ける。CREBはβアドレナリン作動性物質の膜受容体への結合によるサイクリックAMP上昇により活性化するので、シスタチンS発現は神経性の調節を受けていると考えられる。ところが下垂体切除ラットにβアドレナリン作動性物質であるイソプロテレノールを投与した場合、シスタチン遺伝子発現誘導は正常ラットよりもはるかに低かった。下垂体切除ラットに各種のホルモンを補充したところ、イソプロテレノールによるシスタチン遺伝子発現誘導が回復し、その効力はテストステロン、甲状腺ホルモン(T3)、エストラジオール、デキサメサゾンの順に強かった。この結果は、顎下腺腺房におけるシスタチン遺伝子誘導に関して、これらホルモンの核内受容体によるシグナル伝達と、サイクリックAMPによるシグナル伝達との間に相互作用があることを示唆した(論文準備中)。2)顎下腺導管系における顆粒性導管細胞分化へのテストステロンの影響転写因子AP-1複合体の要素であるJunDのマウス顎下腺における発現を局在を、抗体を用いた免疫ブロット法と免疫組織化学により研究した。JunDは雄マウスより雌マウスの顎下腺ではるかに豊富に発現し、導管系に局在した。導管系においてJunDは介在部および線条部遠位の細胞の核に局在したが、雄マウスで発達している顆粒性導管細胞の核には存在しなかった。生後発達において、雄マウスの顎下腺で45週にかけて線条部導管から顆粒性導管が分化するのにともなって、それらの核からJunDが失われた。雌マウスにテストロンを投与して導管系の分化を誘導するとJunD陰性だった線条部の細胞の多くに投与後6時間から24時間にかけて一時にJunDが発現し、それらが顆粒性導管細胞に分化した48時間後には消失した。この結果は、マウス顎下腺の導管系の分化にJunDが関与すること、JunDを含む転写因子AP-1複合体とアンドロゲン/アンドロゲン受容体系との間でシグナル伝達の相互作用があることを示唆した(論文準備中)。
多面体積のホモトピー型の研究

双対殻化可能複体(dual shellable complex)に対するモーメントアングル複体は、球面の1点和にホモトピー同値になることが我々の研究で明らかになっているが、そのホモトピー同値写像が高次ホワイトヘッド積によって与えられることを証明することができた。これは、我々自身のシフティッド複体に対する研究結果の拡張でもあり、Grbic-TheriaultのMF-複体に関する研究結果の拡張ともなっている。この結果は、ロシアの研究グループに興味を持たれ、モーメントアングル複体が球面の1点和にホモトピー同値で、その同値写像が高次ホワイトヘッド積によって与えられる単体複体のクラスの研究を喚起した。彼らは、この2つのクラスに違いがあることを証明し、今後のこの分野の研究が待たれているところである。また、研究分担者はイギリスの研究者との共同研究において、次のような成果を得た。まず、多面体積は単体複体に対して定義された空間であるが、これを任意の基点つき順序集合に拡張した。次にその空間のコホモロジー群が多面体積の場合と同様に、個々の構成空間のコホモロジー群の逆極限として得られることを証明した。この結果をさらに拡張し、多面体積に対して成り立つ多くの事柄をこの拡張された多面体積について成り立つことを証明した。この結果は、多面体積をより広い観点から考察する手段を与えるもので、今度の発展が期待されている。当初予定していた通りに研究が進んでいるわけではないが、これまでに多くの成果を得る事ができた。当初の研究計画では、2017年度までに「Golod複体は強いGolod性をもつか?」という問題の解決を与えることであったが、これは研究代表者と学生との共同研究で否定的に解決することが出来た。研究を始めた当初は肯定的に解決されることを予定して研究計画を立てたため、2018年度の研究計画が非常に難しい研究を行うことになってしまい、結局、2018年度は計画通りには研究を進められなかった。しかし、上記に記したとおり、それ以外の多面体積に関する多くの結果を得ることが出来た。我々の研究結果を受けてロシアの研究者達が始めた単体複体の2つのクラスの差についての研究を推し進める。我々は双対殻化可能複体より広いクラスの単体複体に対して、モーメントアングル複体が球面の1点和とホモトピー同値になることを証明している。これらに対して、そのホモトピー同値写像が高次ホワイトヘッド積によって与えられるかどうかは非常に興味あることである。今年度は、この問題を手がかりに研究を進める。本研究は多面体積のホモトピー型を決定することを目標としている。26年度当初、一般に多面体積が懸垂空間のとなるためには、実モーメントアングル複体の胞分解が自明であることが必要であることが証明できていた。その後1年間の研究でこの条件が十分条件でもあることが証明でき、理論を非常にすっきりした形に整理することが出来た。また、Golod性を強めた形でホモトピーGolod性の概念が定義できるが、一般に多面体積が懸垂空間になるとき、その単体複体はホモトピーGolod性を持つことが証明できた。これによって、一般に多面体積が懸垂空間になるための条件とGolod性が直接的に結びついていることが証明でき、この方面のホモトピー論的な側面は大体解決することが出来た。他方、組み合わせ論的な観点からは、未解決な問題が多く残されている状態である。26年度当初は、幾つかの一般的に多面体積が懸垂空間となるような単体複体が幾つか見つかっていたが、順序的Cohen-Macaulay複体以外は散発的な例しかなく1つのまとまりのあるクラスをなしていなかった。これについても、この1年間の研究で高い隣接性をもつ単体複体のクラスは一般的に多面体積が懸垂空間となることが証明でき、散発的に見られた単体複体が1つのまとまりのあるクラスを作ることが証明できた。以上のようにこの1年間に大きく研究が進展し、当初の予定と比較すると、2年間を予定していた研究が1年間で達成できることが出来、大きな研究の進歩があったと考える。単体複体Kに対して古くより代数的にGolod性が定義されている。これに対して2004年前後に、KがGolodである必要十分条件はKに対するmoment-angle complexのコホモロジー環のMassey積が消えていることであることが示された。これにより、トポロジーを用いて単体複体KのGolod性を研究することが可能となった。その方面の研究が始まった当初は、「KがGolodである必要十分条件は、Kに対するmoment-angle complexが懸垂空間の1点和にホモトピー同値であるか。」という疑問を解くことを中心に研究が進められてきた。そして、本研究もこの疑問を解決することを研究指針として研究を進めてきた。平成27年度の研究によってこの問題は否定的に解決された。実際、Golod単体複体Kでそれに対するmoment-angle complexが懸垂空間の1点和にホモトピー同値でないものを構成することが出来た("A Golod complex with non-suspension moment-angle comoplex" arXiv:1601.03472)。従って、今後の研究はGolod複体のmoment-angle complexが懸垂空間の1点和にホモトピー同値であるような十分大きなクラスを見つけることに進む。

我々の研究によってこのクラスは、dual sequentially Cohen-Macaulay複体を含むことが分かっている単体複体に対して古くより代数的にGolod性が定義され研究されてきた。これに対して2004年前後に、単体複体KがGolodである必要十分条件はKに対するmoment-angle complex (以下、Z(K)と略記する)のコホモロジー環のMassey積が消えていることであることが示された。これにより、トポロジー、特にホモトピー論を用いて単体複体のGolod性を研究することが可能となった。一昨年度までの2年間の研究で、Golod性に関する研究は一応の解決(「KがGolodであるための必要十分条件は、Z(K)が懸垂空間の1点和にホモトピー同値であるか?」と言う問いに否定的な解を与えることが出来た。)をつけることができたと考えられる。そこで、昨年度からは次に構造が簡単と考えられる単体複体に付随するmoment-angle複体のホモトピー型の研究に着手した。我々が昨年度実施した研究は球面の三角形分割Kに対するmoment-angle complexの研究である。この場合、Z(K)は多様体になることが証明されており、その中で最も構造が簡単なものとして、球面の直積の連結和になるものが知られている。しかし、これまで知られていた例では、球面の直積として球面が2個しか現れず、3個以上の球面の直積があられるかどうかが問題となっていた。我々は昨年度実施した研究で、3個の球面の直積と幾つかの2個の球面の直積の連結和となっているZ(K)が存在することを証明した。当初5年間で「単体複体KがGolodである必要十分条件は、Kに対するmoment-angle complex Z(K)が懸垂空間の1点和にホモトピー同値であるか?」と言う問いに答えを与えることであった。しかし、研究開始後2年間の研究でこの問題を否定的に解決することが出来た。現在はそれを越えた研究に着手しており、計画以上に進展している。単体複体に対して古くから代数学の立場からGolod性が研究されてきた。これに対して2004年前後に、単体複体KがGolodである必要十分条件はKの持ってる情報を用いて作られる図形(Kに対するmoment-angle coplexと言い、これを以下ではZ(K)と記す)のコホモロジー環のMassey積が消えていることであることが示された。これにより、トポロジー、特にホモトピー論、を用いて単体複体のGolod性を研究することが可能となった。過去3年間の研究により、当初の目的(Golod性を持つことが知られている単体複体、例えば、shellable complexの双対複体、のmoment-angle complex Z(K)のホモトピー論的な特徴付けや、「KがGolodである必要十分条件は、Z(K)が懸垂空間である」と言う予想の否定的解決など)は一応の解決をつけることができ、本年度はその成果を2本の論文として発表することができた。
円偏光超短パルスによる生体関連高分子の低振動ラマンスペクトル

本研究では当初、現有の共振器内キャビティダンプ-フェムト秒チタンサファイアレーザーを用いて行う予定であった。このレーザーは4MHzの繰り返しでパルス幅13fs及び出力60nJ/パルスを発振した。ビームスプリッターを用いてこの出力を3発に分割し、位相整合条件を満足するように試料に入射し、インパルスシブ誘導ラマン散乱の装置を製作した。CS_2などの標準サンプルからの信号を観測することができたが、研究の段階でキャビティダンパーのブラッグセルが動作不能となった。そのため類似のブラッグセルを用いて動作を試みたが、出力の回復には至らなかった。そこで、新たに三つの方向性で研究を行った。すなわち、(1)フェムト秒レーザーの共振器からの出力のみを用いて低振動ラマン散乱を測定する装置を製作した。標準サンプルからの信号は観測することができたが、レーザーの出力が弱かったため(出力数nJ/パルス)水溶液の信号を得ることはできなかった。(2)そこで、チタンサファイア再生増幅器(出力数百μJ/パルス)からの出力を用いた測定系の製作を開始した。(3)一方で、生体高分子の低振動スペクトルをラマン遷移ではなく双極子遷移で観測することを行った。すなわち、フェムト秒パルスにより発生したテラヘルツ電磁波(遠赤外領域に周波数を持つ)を用いてチトクロムcやポリアラニン、ポリグリシンなどのポリペプチドの低振動領域(7-160cm^<-1>)のスペクトルを観測し、チトクロムcについては天然状態と変性状態でスペクトルが変化しないこと、また観測した生体高分子の低振動スペクトルの強度は波数の約1.5乗に比例することを見いだした。これは生体高分子の特異的な揺らぎ、集団運動を現していると思われる。
人の認知を考慮した三次元記録や評価法の確立

現在,映画やテレビの3次元表示が注目を集め,各社より3D表示可能なテレビが発売されている.また,デジタルカメラにおいても,高解像度化やオートフォーカスをはじめとする自動撮影調整など,誰もが綺麗に画像を撮影するための機能はすでに飽和状態であり,3D撮像など新しい撮像機能を模索している.この様な3Dテレビに必要な,または3D撮像で得られる自由視点画像は,小さな視点変化を持つ画像の集まりであり,それら画像の見かけはほとんど同じであるためそのデータは大きな冗長性を持つ.本研究では,3D画像表示に必要な多視点画像に含まれるデータの冗長性や特異性を特定し,それらの人の質感や奥行き認知への影響を調べる.具体的には,画像周波数や視差の誤差,物体の直接反射成分や陰影など,自由視点画像に含まれるどのような要素がシビアに人の認知を損ない,どのような要素なら削除したり演算による内挿でも視覚的に問題にならないかを特定する.その知見を自由視点画像の圧縮や復号処理に用いることで,人の知覚特性を反映した効率的な自由視点画像のデータ表現手法を提案する.本年度は,多視点画像に含まれる冗長性に着目し,透明物体の形状を記述する手法について提案した.透明物体は,屈折により背景の見かけを歪めるという特性をもつ.この屈折による歪みにより多視点画像中の対応点は,拡散反射モデルで記述される視差とは異なる視差をもつ.この視差により屈折現象を計測し,これを用いて透明物体認識する手法を提案した.24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在,映画やテレビの3次元表示が注目を集め,各社より3D表示可能なテレビが発売されている.また,デジタルカメラにおいても,高解像度化やオートフォーカスをはじめとする自動撮影調整など,誰もが綺麗に画像を撮影するための機能はすでに飽和状態であり,3D撮像など新しい撮像機能を模索している,この様な3Dテレビに必要な,または3D撮像で得られる自由視点画像は,小さな視点変化を持つ画像の集まりであり,それら画像の見かけはほとんど同じであるためそのデータは大きな冗長性を持つ.本研究では,3D画像表示に必要な多視点画像に含まれるデータの冗長性や特異性を特定し,それらの人の質感や奥行き認知への影響を調べる.具体的には,画像周波数や視差の誤差,物体の直接反射成分や陰影など,自由視点画像に含まれるどのような要素がシビアに人の認知を損ない,どのような要素なら削除したり演算による内挿でも視覚的に問題にならないかを特定する.その知見を自由視点画像の圧縮や復号処理に用いることで,人の知覚特性を反映した効率的な自由視点画像のデータ表現手法を提案する.本年度は,ネット上にアップロードされている他機関が撮影した多視点画像(17x17視点=289画像)を用いて圧縮手法の検討を行った.具体的には,これらの多視点画像から解像度を間引いたり,視点を間引くことで,仮想的に低解像度のカメラを用いた場合やカメラ台数が少ない場合の多眼カメラシステムをシミュレーションした.本年度において開発した視点や解像度の内挿手法を用いて,このシミュレーション多視点画像から,視点や解像度を復元した多視点画像を生成し,もとの画像と比較することで画像処理による解像度や視点の内挿の精度の評価を行った.さらに,画像のコンテキストに対する復元画質の劣化や復元性能の考察をおこなった.次年度で用いる実画像実験に向けてカメラアレイシステムの構築を行った.現在,映画やテレビの3次元表示が注目を集め,各社より3D表示可能なテレビが発売されている.また,デジタルカメラにおいても,高解像度化やオートフォーカスをはじめとする自動撮影調整など,誰もが綺麗に画像を撮影するための機能はすでに飽和状態であり,3D撮像など新しい撮像機能を模索している.この様な3Dテレビに必要な,または3D撮像で得られる自由視点画像は,小さな視点変化を持つ画像の集まりであり,それら画像の見かけはほとんど同じであるためそのデータは大きな冗長性を持つ.本研究では,3D画像表示に必要な多視点画像に含まれるデータの冗長性や特異性を特定し,それらの人の質感や奥行き認知への影響を調べる.具体的には,画像周波数や視差の誤差,物体の直接反射成分や陰影など,自由視点画像に含まれるどのような要素がシビアに人の認知を損ない,どのような要素なら削除したり演算による内挿でも視覚的に問題にならないかを特定する.その知見を自由視点画像の圧縮や復号処理に用いることで,人の知覚特性を反映した効率的な自由視点画像のデータ表現手法を提案する.本年度は,多視点画像に含まれる冗長性に着目し,透明物体の形状を記述する手法について提案した.透明物体は,屈折により背景の見かけを歪めるという特性をもつ.この屈折による歪みにより多視点画像中の対応点は,拡散反射モデルで記述される視差とは異なる視差をもつ.この視差により屈折現象を計測し,これを用いて透明物体認識する手法を提案した.24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度において予定していた,視点や解像度の内挿手法の提案および実装を完了した.また,シミュレーションではあるが,この手法をもちいて実際に視点や解像度の向上を行い生成した画像を比較評価した.これらのように,次年度に予定している,画質の認知実験のための準備を完了した.24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は,他機関が撮影した画像をもちいてアルゴリズムの検討を行った.また,実際に多眼画像を撮影できるシステムの構築を行った.

次年度では,この多視点画像撮影システムを利用して,さらに様々な多視点画像を撮影して入力として用いる.また,本年度の様な客観的画質評価尺度にとどまらず,実際に被験者による認知実験をおこなうことで,生成画像の画質の認知的評価を行う.
小麦アレルゲンエピトープを消化する麹由来プロテアーゼの同定とその応用

本研究は、小麦依存性運動誘発アナフィラキシー(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis: WDELA)患者が安全に摂取できる低アレルゲン化小麦製品を開発することを目的とした。これまで我々は、WDEIA患者血清を用いた小麦抗原の解析から、小麦グルテンの構成タンパク質中のω-5グリアジンが主要な抗原であることを明らかにした。さらに麹抽出液中にω-5グリアジンを消化する酵素活性を見出している。そこで、小麦ω-5グリアジンを分解するプロテアーゼを麹より精製し、その生化学的特徴、及び、ω-5グリアジンの分解活性について検討した。麹粗抽出液より、3種類の精製ステップを経て、ω-5グリアジンのIgE結合エピトープペプチドを分解するタンパク質を部分精製した。部分精製したプロテアーゼは、アルカリセリンプロテアーゼに特徴的な生化学的性質を有していた。部分精製したタンパク質のうち、35kDaのタンパク質のN末端アミノ酸配列はEETTEKNAPXGL(Xは同定できなかったアミノ酸)であった。このアミノ酸配列はゲノム配列が明らかなAspergillus oryzaeRIB40のOpen Reading Flame000517(Subtilisin様セリンプロテアーゼファミリー)のN末端領域12アミノ酸とほぼ一致した。また、部分精製したプロテアーゼを用いて、小麦構成タンパク質の分解活性を検討したところ、WDEIAの主要な原因抗原であるω-5グリアジンを分解する事が明らかとなった。以上の結果より、部分精製したプロテアーゼの1つは分子量35kDaのSubtilisin様セリンプロテアーゼであり、このプロテアーゼを用いて小麦ω-5グリアジンを分解することにより、低アレルゲン化した小麦製品を開発できる可能性が示された。食物依存性運動誘発アナフィラキシーは食物アレルギーの重篤な特殊病型である。小麦が全体の原因食品の約6割をしめ,本邦での臨床的特徴となっている。我々は,小麦による食物依存性運動誘発アナフィラキシーと確定診断された15例の患者について,小麦精製蛋白質と血清を用いた免疫ブロットを行い,患者の約80%がω-5gliadinに,残りの約20%が高分子量gluteninに最も強く反応することを見出した。さらに患者血清とペプチドアレイを用いてIgE結合エピトープを解析した結果,ω-5gliadinのIgE結合エピトープはQXXPQQQ,高分子量gluteninのIgE結合エピトープはQQPGQXQおよびQXSGQXQであることを明らかにした。また,ω-5 gladinのDNAクローニングを行い,大腸菌による発現システムでリコンビナント蛋白質を調製した。さらに,本リコンビナント蛋白質を用いて小麦による食物依存性運動誘発アナフィラキシーの診断キットを作製したところ,従来法に比べて感度および特異度が飛躍的に向上していることが明らかとなった。現在本診断キットはPhadia社より欧米にて発売されている。一方,食の安全に対する意識が高まる今日,アレルギー発症の予防に,または患者が摂取可能な食品の作製のために低アレルゲン化食品への関心も高まってきている。本研究では低アレルゲン化小麦製品を開発する目的で,エピトープを特異的に消化する酵素を探索した結果,麹菌培養液にQXXPQQQ配列を消化する酵素活性があることを見出した。また本酵素の生理学的性質を調査した結果,至適pHが7.6-8.8,熱安定性40°C(1hr),数種の阻害剤を用いた酵素活性部位阻害検討によりメタルプロテアーゼかセリンプロテアーゼに属する酵素だという事が明らかとなった。本研究は、小麦依存性運動誘発アナフィラキシー(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis: WDEIA)患者が安全に摂取できる低アレルゲン化小麦製品を開発することを目的とした。

これまで我々は、WDEIA患者血清を用いた小麦抗原の解析から、小麦グルテンの構成タンパク質中のω-5グリアジンが主要な抗原であることを明らかにした。さらに麹抽出液中にω-5グリアジンを消化する酵素活性を見出している。そこで、小麦ω-5グリアジンを分解するプロテアーゼを麹より精製し、その生化学的特徴、及び、ω-5グリアジンの分解活性について検討した。麹粗抽出液より、3種類の精製ステップを経て、ω-5グリアジンのIgE結合エピトープペプチドを分解するタンパク質を部分精製した。部分精製したプロテアーゼは、アルカリセリンプロテアーゼに特徴的な生化学的性質を有していた。部分精製したタンパク質のうち、35kDaのタンパク質のN末端アミノ酸配列はEETTEKNAPXGL(Xは同定できなかったアミノ酸)であった。このアミノ酸配列はゲノム配列が明らかなAspergillus oryzaeRIB40のOpen Reading Flame000517(Subtilisin様セリンプロテアーゼファミリー)のN末端領域12アミノ酸とほぼ一致した。また、部分精製したプロテアーゼを用いて、小麦構成タンパク質の分解活性を検討したところ、WDEIAの主要な原因抗原であるω-5グリアジンを分解する事が明らかとなった。以上の結果より、部分精製したプロテアーゼの1つは分子量35kDaのSubtilisin様セリンプロテアーゼであり、このプロテアーゼを用いて小麦ω-5グリアジンを分解することにより、低アレルゲン化した小麦製品を開発できる可能性が示された。
単結晶ダイヤモンド工具による鋼類の超精密切削に関する研究

材料として需要度の高い鋼類の超精密切削にはダイヤモンド工具一般に適さないとされる。一方、断続切削となる超音波楕円振動切削では鏡面切削が可能で、工具摩耗が抑制されるという結果を背景に、断続切削で平面加工が可能なフライカット方式と微小曲面創成が可能な高速主軸を用いたマイクロ・ダイヤモンド・エンドミルによる超精密切削法の可能性を検討し、実用的な金型鋼の鏡面切削が可能であることを明らかにしている。ダイヤモンド工具による鋼類の超精密切削時における摩耗機構について、SUS304の断続切削を行い、フライカット方式で条件検定を目的として切削温度に大きな影響を持つと考えられる切削厚さおよび工具形状の工具摩耗に及ぼす影響につい検討を行った。切削厚さを小さくすれば単位切削距離あたりの工具摩耗は小さくなること、適当な逃げ角では工具摩耗が小さくなることを明らかにした。フライカット方式による超精密切削法の開発については、実用的な金型鋼SUS420J2(HRC40)を対象として、フライカットにおける1回毎の接触時間を摩耗抑制が可能な条件として0.02msと設定し、工具形状及び切削温度への大きな影響を持つと考えられる切削厚さの検討を行った。工具逃げ角1545deg.の範囲で仕上げ面精度が良くなる工具逃げ角が存在すること、及び切削厚さは可能な限り小さくすれば仕上げ面精度、工具摩耗が改善されることを明らかにしている。切削面積2x5mmに対して40nmRzの表面粗さが得られ、金型鋼が実用的にダイヤモンド工具加工可能であることを示した。また、マイクロ・ダイヤモンド・エンドミルによる超精密マイクロ・ダイヤモンド切削加工法の開発としてエンドミルの工具形状を対象として基礎的な検討を行った。ダイヤモンド先端の工具剛性が表面粗さに大きな影響を持つことが分かり、工具形状を再検討ずるとともに、超高速スピンドルについてはエンドミル工具では工具先端が主軸端から離れることによる振れの大きさより、振れの安定性が現在大きな問題となることなどが得られている。これらの結果の改善により、実用化に向けた工具形状の開発及び条件選定を次年度に進める予定である。ダイヤモンド工具による鋼類の超精密切削加工の実用化を目的とし、マイクロ・ダイヤモンド・エンドミルによる超精密マイクロ・ダイヤモンド切削加工法の検討を行った。実用的な金型鋼SUS420J2(HRC40)を対象として、切削面積2x5mmのマイクロ金型を想定し、100,000rpmの超高速スピンドルを使用した。板状のダイヤモンドを利用したエンドミル工具を製作し、工具形状(工具回転半径、逃げ角)、切削油剤使用の有無、摩耗抑制の重要な要因となる1回転毎の接触時間に関係する切削条件の影響について実験検討を行った。工具回転半径を大きくすると、工具摩耗は大きくなるが、表面粗さは明らかに改善されること、また、工具逃げ角を大きくすることによる工具摩耗への影響については、刃先後退量は大きな変化はなく、表面粗さは顕著に改善されることを明らかにしている。また、切削油剤としてミストの使用では摩耗量は若干改善されるが、表面粗さへの効果はほとんどないことがわかった。工具回転半径2mm、工具逃げ角20°のエンドミル工具で、100nmRzの表面粗さの鏡面が得られた。切削開始時で表面粗さが60nmRz程度であり、加工による逃げ面摩耗量は4μmであり、この摩耗の表面粗さへの影響は40nmRz程度であり、切削開始時で表面粗さが大きな影響を持つことが理解された。工具の振れを検討した結果、振れ幅の変動が60nm程度あることから、加工機の主軸系の精度に大きな課題があると結論付けられた。従って、マイクロ金型を40nmRz程度の表面粗さに仕上げることが可能であると推定された。
体細胞モザイク誘導系を用いた脳内光受容体の同定

昨年度はショウジョウバエ脳内に存在する概日リズム同調に関与する光受容器の同定を目指し、植物やマウスで見つかっている、cryptochrome-likeなタンパクをコードする遺伝子のPCRによる検索を行い、複数の増幅断片を得た。この断片の解析を進めていたところ、京都大学の藤堂助教授のグループが、同様の手法ですでにショウジョウバエcryptochrome遺伝子(以下cryと略)のcDNA全長のクローニングに成功しているとの情報を得て、共同研究を開始した。cryは唾液線染色体の92A1-2にマップされ、そのmRNAはembryoの時期を除き、発生の全段階を通じて発現していた。また、成虫では頭部でも体幹でも発現が見られた(以上は藤堂助教授のグループによってすでに得られていたデータである)。概日リズムに関与する遺伝子はそのmRNAや蛋白質が量的に概日変化を示すことが知られている。そこで、頭部でのcry mRNAの概日変動をRNaseProtection Assay法によってモニターした。明暗条件では昼にピークを持つ明瞭な概日振動が観察された。恒暗条件では、1日目には概日振動が観察されたが、以降は急速な振動の減衰がみられた。無周期突然変異のper^<01>やtim^<01>では、明暗条件下であってもcry mRNAには変動が見られなかった。このことから、cry mRNAの転写は概日時計の支配を受けることが推察される。次に、cryの概日系光受容への関与を調べるために、cryの異所的強制発現系を用いた実験を行った。cryをcytoplosmic actinのプロモーターによって強く発現させた後、光パルスに対する位相反応を調べた。その結果、cry強制発現系統では主観的夜の前半に起こる光パルスによる位相後退が著しく阻害されることがわかった。このことから、cryが概日時計の光受容に関与することが示唆された。これらの結果は論文にまとめられ、Genes to Cellsに掲載予定である。ショウジョウバエ脳内に存在する概日リズム同調に関与する光受容器の同定を目指し、以下の2つの実検を行った。1.植物やマウスで見つかっている、cryptochrome-likeなタンパクをコードする遺伝子のPCRによる検索。cryptochromeは、植物では青色光受容にかかわり、発色団としてフラビンを利用する。構造的には、DNA修復酵素に類似し、配列上の特徴としてフラビン結合部位とtropomyosin-likeな部位が存在する。植物やラン藻、マウスで保存されているこれらのアミノ酸配列を元にdegenerateprimerを作製して、ショウジョウバエのgenomeと頭部cDNAでPCRを行ったところ、複数の増幅断片を得た。これらに関して、現在塩基配列の同定を進めている。2.脳内の特定部位でのみ染色体組換えを誘導し、モザイクを作るための系統の作製。脳内の限定された場所でモザイクを誘導するための新たなGal4-UASシステム用のベクターを作製を試みた。この系では、酵母に於けるtwo hybrid法と同じく、Gal4蛋白をDNA結合ドメインと活性化ドメインに分割し、各々を含むベクターをショウジョウバエ染色体にランダムに挿入する。各ドメインはベクター挿入部位近傍の遺伝子の発現をモニターする様に発現する。たまたま、2つのドメインの発現が重なった組織では各々のドメイン後方に融合されているSV40T antigenとp53タンパクの結合によりGal4の機能が回復される。これが脳内の限定された組織でのFlipaseの発現を誘導し、染色体の組換えを誘発する。本年は、これらの2つのGal4ベクターの作製を行った。来年度は、これらベクターをショウジョウバエにinjectionして組換え体の作製、発現のチェック、それら系統をバックグラウンドとした突然変異誘発を行う予定である。
血流による嗅球ニューロンのスクラップ＆ビルド

成体の脳では、古いニューロンが細胞死で除去されて新しいニューロンが再生する。すなわち、細胞レベルの「スクラップ&ビルド」が神経回路を再編している。申請者は、マウスの脳内を直接観察する技術を用いて、死んだニューロンの場所に同じ種類のニューロンが入力依存的に再生するメカニズムを明らかにした。本研究では、マウスの成体脳において、血流が脳細胞のスクラップ&ビルドを制御するメカニズムを解明することを目的とする。
哺乳動物における重金属、特にカドミウムとマンガンの輸送機構に関する研究

これまで本研究者は、メタロチオネイン遺伝子欠損マウス由来の細胞を用いてCd耐性細胞を樹立することにより、Cdの蓄積が抑制されることによってCd耐性になる細胞を確立した。この細胞の性状を解析する過程で、細胞へのCdの取り込みの一部に、Mnの輸送系が用いられている可能性が示唆された。そこで、本研究では、その詳細な機構を明らかにすること、Cdの細胞毒性に及ぼす影響を検討すること、また、動物レベルにおいてもCdとMnの相互作用が認められるのか、を明らかにすることを目的として研究を実施した。マウスにおけるCdの急性毒性である肝障害と精巣出血を指標に、Mn同時投与の影響を検討した結果、Cdの急性毒性である肝毒性と精巣出血は、いずれもMnの同時投与によって顕著に抑制されることが示された。しかし、肝臓中Cd濃度はMnの同時投与によって減少してはいなかった。さらに、Mn以外の様々な2価の金属のうち、Coを同時投与したときにもCdによる肝毒性と精巣出血が抑制された。しかし、Coも肝臓や精巣中Cd濃度をほとんど変化させなかった。したがって、in vivoにおいてMnとCoはCdの毒性を明らかに抑制するものの、その機構としてCd輸送は関与していない可能性が示された。MT欠損マウス由来の繊維芽細胞では、Cdの蓄積と細胞毒性は、培地に同時に添加したMnによって明らかに抑制された。しかし、MnとCdに共通の輸送系が機能していないCd-r細胞ではMnによるCd毒性の軽減は観察されなかった。したがって、少なくとも繊維芽細胞においては、Cdの細胞への取り込みと毒性発現にMnが確かに関与していることが明らかとなった。また、Cdの取り込みが抑制されている細胞と親株細胞由来のpoly(A)^+ RNAをアフリカツメガエル卵母細胞に発現させ、Mn輸送に関わる遺伝子をクローニングする準備を行った。本年度は、CdとMnの毒性、蓄積の相互作用が認められる組織、細胞の検索を中心に検討を行った。マウスにCdを皮下投与すると、24時間後に血漿中GPT活性が顕著に上昇し、精巣に強い出血が観察される。しかし、Mnの同時投与により、血漿中GPT活性はほぼコントロールレベルまで抑制され、精巣出血もほとんど認められなくなった。肝臓中、精巣中のCd、Mn濃度の変化を調べた結果、MnによるCdの急性毒性の抑制は、組織中金属濃度の変化では説明が困難であることがわかった。一方、Cd投与による精巣出血は、Mnのみならず、Coの同時投与によっても抑制されたので、CoがCdの取り込みを阻害するかどうかについても今後検討する必要がある。一方、マウス、ラット、モルモットの3種の動物種にCdを飲水から与え、同時に飲水から与えたMnがCdの蓄積に影響を及ぼすかどうかを検討したところ、モルモットの場合のみ、CdとMnを同時に摂取した群の腎臓中Cd濃度が、Cd単独投与群より顕著に少なくなっていた。また、モルモットにおいては、Cd摂取によって、腎臓中Mn濃度が減少した。従って、モルモットの腎臓へのCdの取り込みはMnによって抑制され、逆にMnの取り込みは、Cdによって抑制されることがわかった。さらに、MT欠損マウス由来の繊維芽細胞に様々な濃度のCdとMnを添加し、Cdの細胞毒性を検討した結果、Cdの細胞毒性は同時に添加したMn濃度に依存して抑制された。

また、マウス繊維芽細胞へのCdの蓄積はMnの添加量に依存して減少したことから、Cdの細胞への取り込みがMnによって阻害されたためにCdの細胞毒性が抑制されたものと考えられる。次年度以降に、モルモットの腎臓、およびマウスの繊維芽細胞において発現している遺伝子の中から、Cd/Mnの輸送体の同定を行う予定である。細胞へのCdの取り込み経路の一つとして、Mnの輸送系が用いられている可能性を検討した。昨年度の研究により、マウスにおけるCdの肝毒性と精巣毒性がMnの同時投与によって抑制されることを見いだしたので、Mn以外の2価の金属がCdの蓄積、あるいは毒性発現にどのような影響を及ぼすかをit vitro、in vitoの両方の系を用いて検討した。メタロチオネイン(MT)ノックアウトマウス由来の繊維芽細胞の培地にCdと同時に様々な2価の金属を添加すると、MnあるいはZnを添加したときのみCdの細胞への蓄積が抑制され、細胞毒性も抑制された。このことは、Mnの輸送体が確かにCdの取り込みに関与していることを示す。一方、マウスにCdを投与する際に、同時に様々な2価の金属を投与すると、MnあるいはCoを投与したときにのみCdによる肝毒性と精巣出血が抑制された。しかし、MnもCoも肝臓や精巣中のCd濃度はほとんど変化させなかった。また、Mn欠乏食で飼育したマウスにCdを投与しても、Cdの臓器蓄積と毒性発現は通常食で飼育したマウスとほとんど差を示さなかった。したがって、in vivoにおいては、MnとCoはCdの輸送に顕著な影響は及ぼしていない可能性がある。一方、マウスにMnあるいはCoを投与すると、血漿中IL-6濃度が著しく上昇することが明らかになった。また、Cdのの取り込みが抑制されている細胞と親株細胞由来のpoly(A)^+RNAをアフリカツメガエル卵母細胞に発現させ、multitracerを取り込ませたところ、Mn, Coなどの金属の取り込みが、Cd耐性細胞と親株との間で異なっていることが明らかになった。今後、この差を生じさせている遺伝子のクローニングを行う予定である。
水痘ウイルスIE62は脳由来神経栄養因子と免疫交差し帯状疱疹の痛覚過敏を起こす

水痘帯状疱疹ウイルス前初期抗原62(IE62)は、ウイルスの主要転写因子である。IE62に対する抗IE62抗体の中には、BDNFと免疫交差して、その生理活性を高めることが、神経損傷を伴う帯状疱疹の痛覚過敏やアロディニアを誘導することを確認した。そして、帯状疱疹様の皮膚病変を生じるマウスの単純へルペスウイルスの皮膚病変の重症化に従い、病変周辺の皮膚の神経終末数が増加していることを確認した。このように皮膚病変自体がケラチノサイトに神経成長因子を誘導して、神経終末数を増加させている。このように神経終末数増加は、痛点数の増加による痛覚過敏という現象を明らかにできた水痘帯状疱疹ウイルス前初期抗原62(IE62)は、ウイルスの主要転写因子である。このように神経終末数増加は、痛点数の増加による痛覚過敏という現象を明らかにできた単純ヘルペスウイルス(HSV)マウスHSV皮膚感染モデルでは、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)による帯状疱疹様皮膚病変を形成する。現在の実験計画では、このHSVによる皮膚病変に、抗VZV-IE62抗体が関与するとBDNF活性が増強され、帯状疱疹特有の疼痛を誘導すると考えられる。したがって、HSVによる帯状疱疹様モデルでの種々の因子の解析が必要であるが、特に、形態学的な因子からの解析が重要と思われた。皮膚感染モデルで皮膚組織に関する解析を始めたところ、病変の重症度に応じて、触覚と痛覚の伝導に関わるC線維密度が約10倍程度に上昇していた。C線維密度の増加は、アロディニアと相関するので、そこに関与する神経成長因子など生体因子の検討を始めた。後根神経節や脊髄後角の神経細胞の変化を捉え、それに関与する因子が解析でき、生体の因子等に対する抗体により、病変形成や回復に伴う神経組織の変化を検討する。神経組織の変化の経時的変化とこれに関わる因子の解析から、この機構に関わるメカニズムの解析を行う。水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)の前初期抗原(IE)62に対するモノクローナル抗体が、脳由来神経栄養因子(BDNF)と免疫交差し、BDNF活性を増強し、脊髄後根細胞のdendriteの形成促進し、動物モデルで痛覚過敏を起こすことを見出した(J virol,84:1616-1624,2010)。本研究では、BDNFは、神経ネットワーク形成や痛覚に関係するので、感染に伴う痛覚過敏に対するその機構の解析を目的としている。そこで、このモデル系として、単純ヘルペスウイルス(HSV)のマウス皮膚感染モデルで、感染皮膚とその近傍の免疫組織化学的観察を行った。その結果、HSVのマウス皮膚感染モデルで、感染皮膚とその近傍では、抹消神経終末数(痛点数?)の増加を認めたが、瘢痕部では減少を認めた。神経終末数の増加には、神経傷害に伴い賛成される神経成長因子(NGF)が関係するとされるので、HSVマウス皮膚感染モデルで、経時的に、HSV抗原の分布、NGFの誘導時期と分布範囲、神経終末数の増加部位と時間経過について観察している。HSVの抗原発現は、皮下にも認めているが、NGFは、ケラチノサイト等に発現を認め、神経終末数の増加と関連する時期に認めた。さらに、神経損傷を抑制するとされるビタミンB12誘導体メコバラミンをHSV皮膚感染モデル動物に投与すると、神経終末数の増加を抑制することを観察した。このような予備的結果もでているので、感染動物の皮膚の組織化学的検討を通して、神経終末数の増加の機構を明らかにする予定である。帯状疱疹の際の末梢の病変部位が痛みへの関与について検討した。単純ヘルペスウイルス(HSV)皮膚感染モデルは、帯状疱疹様の皮疹を生じる。そこで、HSVのマウス側腹部感染実験系で得られる病変の程度(水疱、びらん、小潰瘍、帯状皮疹)を、皮膚の急性期から回復期の皮膚および神経終末の形態学的解析を実施した。その結果、皮膚病変の重症度に応じて、その周辺皮膚のC線維分布密度が10倍以上に増加していた。このように、HSVの病変の進行に伴い神経終末数が増加することは知られていない。すなわち、神経終末数が増加することは、痛覚や触覚の受容体の増加を示唆し、皮膚病変近傍では痛点や触覚を感じる点の増加し、痛覚過敏などに関係すると推定された。その機序を解析するため、HSV抗原の存在と神経終末を増加させる神経成長因子(NGF)の分布について組織化学的に検討した。その結果、HSVの抗原分布と重なるように、皮膚のケラチノサイトにNGFの発現を認めた。このことから、HSVが皮膚に感染して、ウイルス感染が広がる過程で、ケラチノサイトからNGFが産生され、そのNGFが皮膚に至る神経終末から取り込まれ、神経終末数を増加させていることが示唆された。また、一方、皮膚が潰瘍化した部位では、神経終末数が非常に少なくなっていた。

このように、皮膚の神経終末数が増加する部位と、瘢痕化によって神経終末数が減少することが認められた。以上の様に、HSV皮膚感染モデルでは、帯状疱疹患者で認められる様な、痛覚の過敏な部分とそうでない部分がモザイク状に混在する様であるが、その様な病態を説明できる皮膚の神経終末の分布状況をマウスで確認した。本研究で、帯状疱疹の際の痛みは多彩であり、その後の帯状疱疹後神経痛に関わる機序に関して、BDNFの関与だけでなく、皮膚病変にも、痛みに関わる因子があることを確認した。HSVの皮膚病変の進展に伴い、神経終末数の増加という新たな知見を得ており、予定した以上の結果を得ているから。24年度が最終年度であるため、記入しない。成果の項に記載したように、HSVの皮膚感染に伴う神経終末数の増加に関して、感染動物の皮膚の組織化学的検討を通して、神経終末数の増加の機構を明らかにする予定である。
近代学校教育における「校訓」：明治期を中心にした教育勅語相対化のレトリック分析

本研究は、校訓を教育勅語の解釈であると捉えることによって、各学校における校訓は教育勅語を相対化して自校教育の中に位置づけるものであったことを明らかにすることを目的とする。本研究の達成すべき課題は(1)各学校における校訓制定に関する資料を収集・分析し、(2)明治期の勅語・詔書および校訓に関する政府と世論の動向を解明することで、(3)教育勅語をどのようなレトリックで自校教育に位置づけ相対化していったかを明らかにする。(4)更に各学校の事例をもとにレトリック分析を行い、相対化レトリックのモデルを示すこと、である。
病態マーカーとしてのin situグルタチオン化タンパク質検出法の確立と応用

前年度までに、薬理学的操作によるマイルドな慢性酸化ストレス負荷(2-cyclohexene-1-one;以下、CHX)が成熟ラットの様々な意思決定に影響を与えるが、単独では必ずしもうつ病などの特定の精神疾患を模倣しないこと、主にドパミン関連機能に影響を与えることを確認し、論文で発表した。さらに、慢性酸化ストレス負荷がコカイン慢性投与によって形成される逆耐性現象において、特に常同行動を遅発性に増強すること、線条体内で膜表面に発現するドパミン輸送体(糖鎖修飾で区別される)を増加させることを行動薬理実験及びウエスタン法で確認し、現在投稿準備中である。一方、in situ glutathionylationを可視化して検出する系の開発を目指し、ラット脳を用いて様々な条件検討を行ったところ、MPTPによる障害ラットモデルにて、血管内皮細胞に一致するシグナルを検出した。同様のシグナルはグルタチオン化タンパク質が多く存在すると予想される気管内皮細胞でも強く検出された。そこでタンパク質レベルでの追加確認のため、血管内皮細胞に存在しグルタチオン化が推定されているタンパク質(iNOS, eNOSなど)を幾つか選択し、抗グルタチオン抗体を用いた免疫沈降法を試みたが、残念ながらシグナルは検出されなかった。また、アポトーシスモデルでのin situ glutathionylation検出の試みも行ったが、期待したシグナルは得られなかった。これまでの最大の問題は成熟ラット脳内におけるポジティブコントロールとしてのグルタチオン化タンパク質が見つからないことであったが、最近ハンチントン舞踏病モデル動物及び患者脳の線条体にてカルシウムチャネルの一つであるTRPC5のグルタチオン化がin vivoで更新していることが報告された。そのため、高濃度CHX連続投与で強めの慢性酸化ストレスを負荷した成熟ラット脳を準備し、再度免疫沈降法と、in situ glutathionylation可視化法でグルタチオン化TRPC5の検出を再検討している。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は、以前報告されたin situグルタチオン化タンパク質(PSSG)検出法を脳組織で再現できるか検討を行った。PSSGの増加が予想された条件下でラット脳を4%パラホルムアルデヒドで灌流固定し、脳切片をフリーのSH基をNEMでブロックした後、Glutaredoxin 1(Grx1)でグルタチオン化したシスティン基を還元化した後にN-(3-maleimidylpropinyl)biocytin(MPB)でラベリングし、Steptoavidin-FITCでシグナル検出を試みた。しかし対照実験と比べ有意なシグナル増強は確認されなかった。また切片上でPSSGを誘導するチオール基酸化剤diamideの添加実験でもシグナルは確認されなかった。原因として1灌流固定の段階で強い還元作用を持つホルマリンにより脱グルタチオン化が起きた、2チオール基がホルマリン架橋の結果全てS-S結合に置換され、Grx1やMPB、diamideの作用部位が失われた、などが考えられた。一方、酸化ストレスが成熟ラットの認知行動に与える影響について、薬理学的に一過性に酸化ストレスを誘導するCHXを急性あるいは慢性投与し、意欲、行動の習慣化、逆転学習、コカインに対する反応性、及び強制水泳への影響を検討した。その結果、CHXの慢性投与は意欲には影響を与えなかったが、強制水泳ではCHX投与群で無動性が抑制され、抗うつ剤様の効果を示した。また慢性CHX投与群は急性コカイン誘発性の行動を抑制した。さらに各行動あるいは認知指標間の相関関係について検討したところ、複数の指標間で慢性CHX投与後に相関関係の変化が観察された。従ってCHXは必ずしもそれ自体で精神病様表現型、あるいは抗うつ剤様効果を模倣しないが、全体として脳機能のバランスを変化させると考えられた(投稿中)。

そのため、高濃度CHX連続投与で強めの慢性酸化ストレスを負荷した成熟ラット脳を準備し、再度免疫沈降法と、in situ glutathionylation可視化法でグルタチオン化TRPC5の検出を再検討している。27年度が最終年度であるため、記入しない。上記のようにin situグルタチオン化タンパク質検出法の動物脳での確立は当初の予定と異なり、やや難航している。一方、酸化ストレスそのものの成熟ラットの行動及び認知機能、病的行動への影響に関する検証は十分な進展があり、今後もさらなる発展が期待される。in situグルタチオン化タンパク質検出法に関しては、今年度は前年度の問題点を解決するため、灌流固定用PBSに予めNEMを添加して早い段階でフリーのSH基をブロックしてしまうとともに、ホルマリン固定を避け、他の固定法での切片作成を準備中である。また、最近抗グルタチオン化タンパク質抗体が市販され、免疫組織染色でも使用可能と報告されたため(Rodriguez-Rocha et al, Anotioxidants & Redox Signaling, 2012)、これとの比較を上記動物およびCHX慢性投与動物を用いて行う。この際、以前から課題とされていた同抗体がフリーの組織内グルタチオンを認識してしまう問題を避けるため、上記のようにNEMによるフリーSH基のブロックと同時に、固定後の切片におけるperoxidase活性を失活させることで、固定後も組織内でフリーのグルタチオンが産生されることを防止する。酸化ストレスそのものの成熟ラットの行動及び認知機能への影響の検証については、行動と相関するタンパク質変化について側坐核で検討中である。また、酸化ストレスが大脳基底核や中脳、前頭前野におけるカテコラミン神経の投射パターンを変化される可能性について、各神経投射系に特異的な分子マーカーを用いた免疫組織学的解析を現在行っており、この結果をまとめていく。さらに慢性CHX投与と精神刺激薬コカインの慢性投与を同時に行った行動実験を現在行っており、コカインの単独慢性投与の場合と異なる表現型が既に幾つか確認されたため(投稿準備中)、その基盤となる分子メカニズムについても解析を進めて行く。