hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Nanodiscとセルフリー合成系による創薬基盤技術の構築

人工的に調製した平面膜nanodic(ND)を加えた無細胞タンパク質合成系(cell-free系)でモデルG-protein coupled receptor (GPCR)であるバクテリオロドプシン(bR)を合成し、bRが膜挿入したND(bRND)を調製した。これをベイトととし、ランダムなアミノ酸(AA)配列を持つ10AAペプチドのプールから特異的に結合する配列を選択した。ランダムなペプチドプールは、bRNDを合成した時と同じcell-free系を用いて合成した。選択された配列のDNA情報からさらに次サイクルのライブラリーを作製し、同じセレクションを4-6回繰り返したあと、選択された配列をNGSにより解析した。その結果、サイクルを重ねるごとにコピー数が増加した配列が入手できた。これらのDNA配列をアミノ酸配列に変換し、ペプチド合成を行った(外注)。現在入手したペプチドの中からターゲットのbRに特異的に結合する配列の裏付け実験を行なっている。ベイトとなるbRNDの調製法や、ライブラリーのデザイン、mRNA-peptide複合体のcell-free合成と単離精製、バインディングアッセイ、RT-PCR条件等、多くのwet実験の条件を詰めてきた。これにより、「Nanodiscとセルフリー合成系による創薬基盤技術」の基礎を築くことができた。今後はbRNDに対して特異的に結合するペプチドの評価を行いう。強く結合するペプチドについては表面プラズモン共鳴法等によりカイネティクス解析を行う。抗体医薬は、従来の低分子医薬とは異なり、身体が持つ免疫システムを利用し、ガン細胞など特定の細胞を狙い打ちする画期的な医薬品である。本研究の狙いは、抗体作製に関わる主要プロセスを全てin vitroで行い、ハイスループット化によるシステマティックな生産・解析基盤を構築することである。Nanodiscを調製するため、membrane scaffold protein 1(MSP1)(HisTag付き)をアフィニティークロマトグラフィー、及びゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。この精製産物を、リン脂質と界面活性剤存在下で混合した後、界面活性剤濃度を低下させることで、Nanodiscを自己集合的に形成させた。最後に再びゲル濾過カラムを通すことで純度の高いNanodiscを調製した。最終精製したNanodiscを280nmの吸光度から濃度を定量した。調製したNanodisc(ND)を無細胞タンパク質合成系に投入し、ND存在下でモデル受容体膜タンパク質であるbacteriorhodopsin(bR)を合成した。合成後、NiNTAマグネットビーズで処理することで、Nanodiscを反応液中から単離した。これをさらにanti-HAtag抗体マグネットビーズで処理することで、bRを含んだNanodiscのみを単離した。またbRが膜上で正しい立体構造を維持し多ことを示唆する呈色反応が観察された。ランダム配列を持つライブラリーの作成するため、mRNAディスプレイ用と、リボソームディスプレイ用の27アミノ酸のランダム配列を含む鋳型DANをデザインした。これまでに、ライブラリー投下による無細胞系内でのペプチド合成と反応液からの単離に成功している。抗原となる、bRのin vitro合成と、2種のタグによる2ステップの単離精製には成功した。しかし抗体配列のプールとなるランダム配列の操作について、当初考えていたよりも時間がかかっている。用いる手法として、mRNAディスプレイとリボソームディスプレイを採用しているが、前者に関してはin vitro転写後のタグ配列の付加効率と翻訳産物の同定について、後者に関してはランダム配列のベクターへのligation効率とゲルからの切り出し効率について多くの条件検討を繰り返している。mRNAディスプレイ系に関しては、しかしながら、合成産物の同定と、反応液からの単離に成功した。これらの結果から、本研究は概ね順調に進展していると言える。モデルGPCRであるバクテリオロドプシン(bR)を人工脂質膜であるNanodiscを添加した無細胞合成系で合成し、膜挿入率100%の状態で単離した。これを抗原と見立て、ランダムな20アミノ酸のプールから得意的に結合する配列を選択した。ランダムアミノ酸のライブラリーはNNB配列を20回反復させることで、stopコドンの出現を抑えた。また翻訳後の複合体形成を保てるよう、ランダム配列の下流に安定した立体構造をとる既知の配列を配置した。蛍光標識されたPuroタグをアニーリングしたところ、約80%以上の効率でラベル化することに成功した。さらに無細胞系で合成した産物をゲル泳動で確認したところ、鋳型mRNAよりの泳動度が短いバンドが検出された。これは、ランダムなペプチドを提示したとみられる、mRNA-Puroタグ-ランダムペプチドの複合体の形成を示唆するものである。さらにこのバンドをStrepタグを認識する抗体を用いてウエスタンブロッティングしたところ、泳動度が同じウエスタンのバンドが検出された。これらの結果から、20アミノ酸のランダムペプチドが系内で正しく合成され、その遺伝型であるmRNAと複合体を形成していることが確認できた。この状態でmRNAディスプレイのセレクションサイクルを回し、RT-PCRによるバンド出現のサイクルパターンを解析することで、ターゲットに強く結合する配列が濃縮されるタイミングを待っている。ランダムな20アミノ酸がが正しく合成されていること、合成後にきちんと複合体を形成していることが確認できた。また高純度でNanodisc-膜タンパク質複合体を単離することができている。そのためおおむね順調に進展していると言える。

これをベイトととし、ランダムなアミノ酸(AA)配列を持つ10AAペプチドのプールから特異的に結合する配列を選択した。ランダムなペプチドプールは、bRNDを合成した時と同じcell-free系を用いて合成した。選択された配列のDNA情報からさらに次サイクルのライブラリーを作製し、同じセレクションを4-6回繰り返したあと、選択された配列をNGSにより解析した。その結果、サイクルを重ねるごとにコピー数が増加した配列が入手できた。これらのDNA配列をアミノ酸配列に変換し、ペプチド合成を行った(外注)。現在入手したペプチドの中からターゲットのbRに特異的に結合する配列の裏付け実験を行なっている。ベイトとなるbRNDの調製法や、ライブラリーのデザイン、mRNA-peptide複合体のcell-free合成と単離精製、バインディングアッセイ、RT-PCR条件等、多くのwet実験の条件を詰めてきた。これにより、「Nanodiscとセルフリー合成系による創薬基盤技術」の基礎を築くことができた。今後はbRNDに対して特異的に結合するペプチドの評価を行いう。強く結合するペプチドについては表面プラズモン共鳴法等によりカイネティクス解析を行う。無細胞タンパク質合成系により得られたランダム配列と、先に合成したbRナノディスクを混合し、bRに特異的に結合する配列を選択する。使用しているマグネットビーズに非特異的に結合するmRNAが確認されたたため、デコイのRNAにより前処理をおこなうことで、これらの非特異結合を軽減することを狙う。また、リボソームディスプレイ法に関しても、ライゲーション効率と切り出し精製効率の向上化を目指し、無細胞系によるランダム配列合成が行える状況を目指す。これまでに、高度好塩菌由来のバクテリオロドプシン(bR)をモデル受容体膜タンパク質として系を走らせてきた。しかしbRは、脂質膜外のドメインが非常に小さく、ランダムライブラリーからセレクションするには困難なモデルである可能性が出てきた。また、人の疾患に直接関わるタンパク質ではない。そのため、人由来の重要疾患に関わる受容体膜タンパク質にターゲットを移し、よりペプチドを選択しやすいモデルで系を確立させることを今後の方針とする。2017年度に国際共同研究加速基金に採択された。これに伴い、海外の研究室で一定期間研究を行うことが義務づけられている。そのため、国内で本課題を進める時間が削られたため、消耗品試薬の消費が大幅に減った。このため、次年度使用額が生じた。次年度では、合成遺伝子発注等の実験消耗品費として使用することを計画している。
ツツジ属植物における葉緑体DNAの遺伝性の分子生物学的解明と遠縁交雑育種への応用

これまで常緑性黄色花ツツジ作出を目的として、常緑性ツツジと落葉性で黄色花のキレンゲツツジとの間で交配した場合、常緑性ツツジを種子親にした場合でしか種子が得られず、得られる実生の多くがアルビノ実生となる。実生のアルビノ化は、実生が常緑性ツツジ由来の葉緑体DNAを持つ場合に生じ、キレンゲツツジ由来の葉緑体DNAを持つ場合、つまり葉緑体DNAが父性遺伝した場合に緑色実生となることが明らかとなっている。よって、この葉緑体DNAの遺伝性の要因を分子生物学的に追求し、父性遺伝の割合を高くすることが、効率的に緑色雑種実生を獲得する方法の確立につながると思われる。そこで、本年度は、常緑性ツツジ種の総当たり交配による葉緑体DNAの遺伝性の調査を行った。PCR-SSCP法の検討を行った結果、多くの種間で葉緑体DNAの多型が得られた。この手法を用いて常緑性ツツジ種間の総当たり交配における葉緑体DNAの遺伝性の調査を行った結果、葉緑体DNAの遺伝性の要因には、種子親の関与が大きいことが明らかとなった。特にオオヤマツツジを種子親に用いると、花粉親によらず高頻度に葉緑体DNAが父性遺伝することが明らかとなった。この結果をもとに、常緑性ツツジ種間雑種とキレンゲツツジとの間で三系交配を行った結果、前述の総当たり交配で、種子親にしたとき高頻度の父性遺伝がみられたオオヤマツツジを常緑性ツツジ種間雑種の片親として用いると、緑色実生の出現頻度が高くなることが明らかとなった。これらのことから、三系交配を用いれば、効率よく緑色実生が得られることが明らかとなった。ツツジ類において亜節間交配のような遠縁交雑では,高い頻度でアルビノ実生が発生する.このアルビノ実生は常緑性ツツジの葉緑体ゲノムとキレンゲツツジの核ゲノムの不和合性により生じ,また,実生がキレンゲツツジの葉緑体ゲノムを持つ場合にのみ,緑色の健全な個体が得られることが明らかになっているが,その割合は種子親に用いる常緑性ツツジの種類によってさまざまである.本年度の研究では,オオヤマツツジを種子親にしてキレンゲツツジと交配を行ったところ,比較的多くの緑色で健全な実生が得られたので,アルビノ実生出現の回避におけるオオヤマツツジの交配親としての有効性について検討した.常緑性ツツジ5種6系統を種子親にしてキレンゲツツジとの交配を行ったところ、いずれの交配でも淡緑色実生もしくはアルビノ実生が出現した.しかしながら,ミヤマキリシマ,サタツツジおよびオオヤマツツジを用いた交配では緑色実生が得られ,その出現頻度は,種子親がオオヤマツツジの場合に19.828.8%と最も高かった。得られた緑色実生は、すべてキレンゲツツジ由来の葉緑体DNAを有していた。今回、オオヤマツツジを用いた交配では、高い割合で健全な緑色実生を得ることができたことから,ツツジ類の遠縁交雑において本種を種子親に用いることでアルビノ実生の出現を回避できる可能性が示唆された.また、これまでの報告で、オオヤマツツジを種子親に用いてウンゼンツツジと交配した場合、得られる実生の葉緑体DNAは、本実験の結果と同様に、比較的高い割合で花粉親由来となっていたことから、葉緑体DNAの遺伝は、用いる種子親による影響が強いものと思われた。ツツジ属植物において,節間など比較的遠縁な種どうしを葉緑体DNAマーカーにより簡便に識別する方法は報告されているが、同一列内のような近縁な種間を識別した報告は少ない.PCR-SSCP法は,わずかな塩基配列の違いも検出できる非常に感度がよい方法であり,比較的安価な装置で容易にできることからその利用価値は高い.本年度は,ツツジ属植物において比較的近縁な種間においても多型が検出できる葉緑体DNAマーカーの構築を目的として,PCR-SSCP法を検討した.5つの領域すべてにおいてDNAが増幅され,その断片長はPCR-SSCP法に利用可能であるおよそ250bp600bpであった.電気泳動の結果,プライマーによって37つの多型が検出された.落葉性ツツジと常緑性ツツジとの間では,R. weyrichiiで見られたtrnLのパターンCおよびatpFのパターンAを除き,共通するバンドパターンはなかった.落葉性ツツジ種間で比較すると,trnGを除く4プライマーで各種に特異的な多型が検出された.一方,常緑性ツツジでは,特異的なパターンが,trnL領域でR. transiens(パターンB)に,trnGおよびrps16領域でR. serpyllifolium(パターンBおよびパターンC, D)に,trnFでR. kaempferi var. macrogemma(パターンC)に認められた.また,バンドパターンの中には,trnFのB, rps16のBおよびatpFのBおよびCなど2種に共通して出現するパターンもあった.特に,R. transiensに見られたtrnFのパターンBおよびatpFのパターンBは,異なる亜節のR. ripenseで確認された.以上の結果より,ユニバーサルプライマーを用いた葉緑体DNA領域のPCR-SSCP法は,ツツジ属植物でも利用可能であり,今後,葉緑体DNAの遺伝性の調査や類縁関係の解析に有用なマーカーとなると思われた.しかし,近縁種間ではひとつも多型が検出されなかったものもあり,今回行わなかったプライマーに関しても検討する必要がある.

これまで常緑性黄色花ツツジ作出を目的として、常緑性ツツジと落葉性で黄色花のキレンゲツツジとの間で交配した場合、常緑性ツツジを種子親にした場合でしか種子が得られず、得られる実生の多くがアルビノ実生となる。実生のアルビノ化は、実生が常緑性ツツジ由来の葉緑体DNAを持つ場合に生じ、キレンゲツツジ由来の葉緑体DNAを持つ場合、つまり葉緑体DNAが父性遺伝した場合に緑色実生となることが明らかとなっている。よって、この葉緑体DNAの遺伝性の要因を分子生物学的に追求し、父性遺伝の割合を高くすることが、効率的に緑色雑種実生を獲得する方法の確立につながると思われる。そこで、本年度は、常緑性ツツジ種の総当たり交配による葉緑体DNAの遺伝性の調査を行った。PCR-SSCP法の検討を行った結果、多くの種間で葉緑体DNAの多型が得られた。この手法を用いて常緑性ツツジ種間の総当たり交配における葉緑体DNAの遺伝性の調査を行った結果、葉緑体DNAの遺伝性の要因には、種子親の関与が大きいことが明らかとなった。特にオオヤマツツジを種子親に用いると、花粉親によらず高頻度に葉緑体DNAが父性遺伝することが明らかとなった。この結果をもとに、常緑性ツツジ種間雑種とキレンゲツツジとの間で三系交配を行った結果、前述の総当たり交配で、種子親にしたとき高頻度の父性遺伝がみられたオオヤマツツジを常緑性ツツジ種間雑種の片親として用いると、緑色実生の出現頻度が高くなることが明らかとなった。これらのことから、三系交配を用いれば、効率よく緑色実生が得られることが明らかとなった。
複雑系のダイナミクスと制御に関する基礎的研究

本研究では,以下のように,大気や海洋,生命,経済システムなどの複雑系のダイナミクスと制御に関する基礎的な研究として,これらのモデルと考えられる連成振動系に対する非線形現象の理論解析手法およびその有効なカオス制御法を確立した.1.外力を受ける一般的な2自由度散逸系を取りあげ,外力と共振する周期軌道のホモクリニックおよびヘテロクリニック挙動を解析するための手法を提案し,発生するカオス現象のメカニズムを明らかにした.2.サドル・センターを有するハミルトン系を取りあげ,サドル・センター近傍の周期軌道に対するホモクリニック挙動,不変トーラスに対するホモクリニックおよびヘテロクリニック挙動を解析するための手法を提案した.これらの手法を適用し,減衰力と外力が作用しない座屈ばりで複雑な挙動が起こることを理論的に明らかにした.3.平均法の高次近似理論を適用するための数式処理パッケージ,ホモクリニックおよびヘテロクリニック挙動を数値解析するためのドライバーを開発し,具体的な適用例を示してこれらのソフトウェアの有用性を確認した.4.周期外力の作用する単振子および連成振子で起こる非線形現象を理論解析し,数値シミュレーションおよび実験により理論結果の有効性を検証した.また,2関節ロボットアーム制御系において複雑な非線形現象が起こることを理論および数値シミュレーションにより明らかにした.5.従来の方法を改良して遅れフィードバックと外部フィードバックを適用し,強制力の作用する単振子および連成振子のカオス制御を行って,ノイズの影響が無視できないような場合に対してもこれらの制御法が有効であることを実験および数値シミュレーションにより明らかにした.本研究では,以下のように,大気や海洋,生命,経済システムなどの複雑系のダイナミクスと制御に関する基礎的な研究として,これらのモデルと考えられる連成振動系に対する非線形現象の理論解析手法およびその有効なカオス制御法を確立した.1.外力を受ける一般的な2自由度散逸系を取りあげ,外力と共振する周期軌道のホモクリニックおよびヘテロクリニック挙動を解析するための手法を提案し,発生するカオス現象のメカニズムを明らかにした.2.サドル・センターを有するハミルトン系を取りあげ,サドル・センター近傍の周期軌道に対するホモクリニック挙動,不変トーラスに対するホモクリニックおよびヘテロクリニック挙動を解析するための手法を提案した.これらの手法を適用し,減衰力と外力が作用しない座屈ばりで複雑な挙動が起こることを理論的に明らかにした.3.平均法の高次近似理論を適用するための数式処理パッケージ,ホモクリニックおよびヘテロクリニック挙動を数値解析するためのドライバーを開発し,具体的な適用例を示してこれらのソフトウェアの有用性を確認した.4.周期外力の作用する単振子および連成振子で起こる非線形現象を理論解析し,数値シミュレーションおよび実験により理論結果の有効性を検証した.また,2関節ロボットアーム制御系において複雑な非線形現象が起こることを理論および数値シミュレーションにより明らかにした.5.従来の方法を改良して遅れフィードバックと外部フィードバックを適用し,強制力の作用する単振子および連成振子のカオス制御を行って,ノイズの影響が無視できないような場合に対してもこれらの制御法が有効であることを実験および数値シミュレーションにより明らかにした.本研究の目標は,大気や海洋,生命,経済システムなどの複雑系のダイナミクスと制御に関する基礎的な研究として,これらのモデルと考えられる速成振動系に対する非線形現象の理論解析手法およびその有効なカオス制御法を確立することである.今年度は以下の研究成果が得られた.(1)実際的な場合さまざまなノイズの影響を無視することができないことを考慮して,従来の方法を改良し,比較的大きなノイズのある場合でも適用可能なカオス制御法を提案した.さらに,フィードバック制御された単振子で起こるカオス現象を制御する場合を取りあげ,実験装置を製作し,数値シミュレーションおよび実験によりその有効性を検証した.(2) 2つの振子からなる達成振動系に対して,数値シミュレーションを行い,さまざまな分岐現象やカオス現象,同期現象が起こることを確認した.そのうちのいくつかの現象に対して研究代表者がこれまでに提案している手法を用いて理論的な考察を行った.(3)外力を受ける一般的な2自由度系を取りあげ,従来の手法では困難であった,外力と共振する周期軌道のホモクリニックおよびヘテロクリニック挙動を解析するための手法を提案し,発生するカオス現象のメカニズムを明らかにした.また,具体的な適用例を示して,このようなメカニズムで発生するカオス現象を数値シミュレーションにおいて確認した.本研究の目標は,大気や海洋,生命,経済システムなどの複雑系のダイナミクスと制御に関する基礎的な研究として,これらのモデルと考えられる連成振動系に対する非線形現象の理論解析手法およびその有効なカオス制御法を確立することである.今年度は以下の研究成果が得られた.(1)サドル・センターを有する2自由度ハミルトン系を取りあげ,サドル・センター近傍の周期軌道の安定多様体と不安定多様体が横断的に交差してカオス現象が起こり,系が非可積分となることを証明するための解析手法を提案した.さらに,本手法を適用してサドル・センターを有するある広いクラスの2自由度ハミルトン系が非可積分となることを示した.(2)(1)の結果を多自由度ハミルトン系の場合に拡張し,サドル・センター近傍の不変トーラスの安定多様体と不安定多様体が横断的に交差してカオス現象が起こり,系が非可積分となることを証明するための解析手法を提案した.さらに,本手法を減衰力と外力が作用しない座屈ばりの任意自由度の離散モデルに対して適用し,この系が非可積分であることを示した.(3)2つの振子からなる連成振動系を取りあげ,研究代表者が提案している手法を適用するなどしてさまざまな分岐現象,カオス現象および同期現象が起こることを理論的に明らかにした.

また,実験装置を製作し,数値シミュレーションおよび実験を行って理論結果の有効性を検証した.本研究の目標は,大気や海洋,生命,経済システムなどの複雑系のダイナミクスと制御に関する基礎的な研究として,これらのモデルと考えられる連成振動系に対する非線形現象の理論解析手法およびその有効なカオス制御法を確立することである.今年度は以下の研究成果が得られた.(1)これまでに提案した手法を用いるなどして,周期外力の作用する減衰振子で起こる,従来知られていなかった位相同期や分岐,カオスなどの非線形現象を理論的に解明した.さらに,数値シミュレーションおよび実験を行い,理論結果の有効性を検証した.(2)(1)の研究結果を踏まえ,前年度に引き続き,周期外力の作用する2つの振子からなる連成振動系を取りあげ,本研究で開発した手法を用いるなどして分岐やカオス,(位相あるいはカオス)同期など非線形現象を理論解析した.さらに,理論結果の妥当性を数値シミュレーションおよび実験により検証した.(3)カオス制御に対する新たなアプローチを提案し,本手法を(1)の強制減衰振子および(2)の連成振動系に適用し,数値シミュレーションおよび実験によりその有用性を確認した.(4)本研究で開発した手法を拡張して適用することにより,減衰力の作用しない座屈ばりの自由振動の運動方程式に対して理論解析を行い,エネルギーが保存される無限自由度ハミルトン系で起こるカオズ現象について従来知られていなかった側面を明らかにした.(5)本研究で得られた結果を総括し,自由度の大きな連成(振動)系によってモデル化されるような複雑系のダイナミクスに関して知見を得た.また,このような複雑系で起こる非線形現象に対する解析手法およびカオス制御法の基礎を確立した.
クラス構造のメタ記述による合成を許すプログラミング言語機構

オブジェクト指向はプログラミング言語において主流となる流派であり、その中で継承機構はプログラムコードの柔軟性を高めるために多くの箇所で活用されている。しかし近年、継承機構では不足する機能を補うものとして型パラメタ機構やアスペクト指向などが提案され、その結果言語が複雑化していた。本研究ではこのような複雑さを解消する方向として、少数の基本プリミティブを持ち、これを通じて継承やアスペクトなどの動作を作り出して行くような言語設計を提唱するとともに実装・評価した。当該言語においてはクラスに相当するプログラム単位に対してメソッドやその断片をメタプログラミング記述を通じて挿抜することで継承などを記述できる。平成25年度の研究においては、研究計画に基づき、まず既存の言語における抽象化単位(一般的なオブジェクト指向言語ではクラスに相当)の扱いやその複合(コンポジション)機構について、既存言語の機構について調査を行った。対象とした言語としては、Scala、CLU、C++、Java/AspectJなどが挙げられる。また、本研究と同様の目的を持つ研究についても文献調査を行った。まず文献について言えば、本研究と同様の目的を持った研究はほとんど見られなかったが、Bergmans他によるFirst-Class Compositionと称する研究において、継承に相当する抽象化単位の複合機構を記述したり、アスペクト指向に相当する複合を実現できるものが提案されていた。ただし当該研究は特殊な呼び出しモデルを持つ言語を前提としており、既存の(広く用いられている)言語のモデルとは相違していること、また強い型を持たないことが前提であり、型パラメタを扱わないことなどの点で、本研究とは目指すものが違っていた。次に既存言語の調査については、Scalaにおいて、クラス定義中に抽象記述された型を含め、サブクラスにおいてそれを具体的な型に置き換えることで継承を型パラメタの代替として使えることが分かった。ただし、継承そのものは他の言語と基本的に同じであり、本研究のように継承の中身を基本要素に分解するのとは異なっていた。これらの調査と並行して、開発予定の言語の試験実装に必要な基本部分のコーディングを行い、一般的な型検査機能までは稼働を確認している。本年度は前年度の研究結果に基づき、提案機構を持つ言語を実際に実装した。実装方式としてはコンパイラ方式であり、C言語コードを出力形式として選択した(Cコンパイラによりコンパイルすることにより実行できる)。言語自体の特色としては、クラス構造のメタ記述を行う部分はメタ言語として通常のプログラミング言語部分とは区分された構文と機能を持つ形式とした。また、本研究の目的であるさまざまなメタ構造(継承やアスペクトなどに相当する機能)を記述可能とするため、メタ言語で呼び出せるクラス構造に対する操作APIも併せて設計・実装している。これらの内容について、2015年11月の情報処理学会プログラミング研究会において発表をおこない、参加研究者と議論をおこなった。主な質問内容としては、このような言語は従来のアスペクト指向とオブジェクト指向の融合とは違うのか(解答としてはクラス構造を操作するAPIの範囲をうまく決めることで汎用的かつ実用的な言語とすることをめざしている点)、メタ言語部分による記述が「適切である」ことをどのように担保するのか(解答としては一般的な言語としての整合性の要件が組み込まれていてこれに反する場合はエラーとすること)、などがあった。研究会発表の内容に基づき、リサーチレポートを作成して筑波大学リポジトリにおいて公開するようにした。今後の研究課題としては、当初から予定しているさまざまな応用可能性の探究に加え、研究会質疑で指摘された整合性に関する部分をより形式性をもって定義できる方法の探究があるものと考える。【全体概要】本研究は、プログラミング言語(とくにオブジェクト指向言語)が持つ「継承」「アスペクト」「型パラメタ」などのクラス合成機能をより基本的な要素に分解し、汎用的な言語機構として再構築することで、新たなクラス合成機構を自由に構築できるプログラミング言語を作り出すことをめざしたものである。【最終年度に実施した研究の成果】最終年度(平成27年度)においては、前年度までに設計・試験実装したプログラミング言語を用いて新たなクラス合成機構の設計・試作の検討を行った。具体的な合成機構としては、ストリームに対して複数の処理を次々に施す「パイプライン」の合成機構、および、1つのデータを多くの処理主体に木構造に沿ってブロードキャストして葉の部分で蓄積し、その後結果を上に向かってマージしながら出力する「ブロードキャストツリー」の合成機構を検討したが、論文にまとめるには至らなかった。また3年間の研究成果のまとめとして、開発した言語およびその処理系について文書化しリサーチレポートとして公開した。【研究期間全体を通じて実施した研究の成果】研究期間全体としては、まず初年度(H25年度)の調査において既存のクラス合成機構(継承、AOP、型パラメタ)およびそれを採り入れた既存言語の機能や特徴について調査し、それに基づいて次年度(H26年度)に新たなクラス合成機能を持つプログラミング言語を設計し実装することができたのが主要な成果であるといえる。本言語については情報処理学会プログラミング言語研究会において発表するとともに、その内容をリサーチレポートとして公開している。その後の課題としてはこの研究で新たに提案した言語機構(クラス合成機能)の有用な用途を探索することが残されたが、その部分については前項で述べた通りである。

本研究ではこのような複雑さを解消する方向として、少数の基本プリミティブを持ち、これを通じて継承やアスペクトなどの動作を作り出して行くような言語設計を提唱するとともに実装・評価した。当該言語においてはクラスに相当するプログラム単位に対してメソッドやその断片をメタプログラミング記述を通じて挿抜することで継承などを記述できる。現在までの研究の進捗としては、計画していた通り、試験実装を開発し動作しているので、おおむね順調であると考える。成果の公表についても、プログラミング研究会において発表を行い、また同等の内容をリサーチレポートとして公開できている。ただし、研究を通じて明らかになった課題に対応するため、試験実装自体の改良は今後必要であるといえる。計算機ソフトウェア最終年度は予定通り評価として、提案機構を持つ言語によって、その特色を行かしたどのような形のソフトウェア開発が行えるかを検討していく。また、研究会において指摘のあった、メタ記述部分の整合性に関して、より形式性があり厳密な定義を検討し、試験実装に組み込むことも検討していきたい。研究の目的は、継承・アスペクト・型パラメタに代表される抽象化単位複合機構を、継承のような「複雑な機構の決めうち」ではなく、より基本的な機能を提供し、その機能に基づいて合成可能とすることで、多様な複合が行えるような言語の可能性を実証することである。平成25年度においては、調査を中心に行った結果、既存言語や既存研究において本研究と同等の目的を達成しているものは無いことが確認された。またそれと併せて、本研究の目的達成のためにはどのような複合機構(ないしそのセット)を提供すべきかが明確となる必要があるが、既存言語・既存研究からそのヒントを得ることができた。現時点では、継承は抽象化単位間でのメソッド定義の「つけ替え操作」によって実現でき、アスペクトはこのつけ替え時に「複数メソッドの結合操作」を許容することで実現できるとの見通しを得ている。型パラメタについては型名の書き換えないし「再定義操作」によって他のケースと併せて実現できるかどうか検討中である。物品の購入金額ならびに旅費の所要金額に多少の変動があったため、次年度使用額が生じている。H26年度には、提案言語の試験実装を行う予定となっている。現在、この言語の具体的な操作記述部分(メソッド定義つけ替え操作、複数メソッドの結合操作、型の置換ないし再定義操作)について、検討を行っているが、記述方式を確定した上で実装に進みたい。実装が稼働した段階で、実際にコードの記述を行い、その結果に基づいて修正点などについて検討を進める計画である。実装方式は、とりあえずツリーインタプリタを採用する予定である。次年度使用額については、次年度の旅費使用額に追加して使用する計画である。
高分子粉体帯電特性の熱誘起電流スペクトル法による評価

試料粉体層厚熱変化を測定する装置を開発し,試料層厚熱変化により生じるTSC誤差を修正する方法を提案した.また,試料高分子粉体の特性に応じた2種類の試料容器を提案した.以上の,試料成形法,試料容器,スペクトル修正法を用いた,高分子粉体試料に対する開回路熱刺激電流スペクトル測定法を提案し,以下の系に応用した.(1)静電粉体塗装用塗料ブロキング(粉体粒子の凝集)防止の観点から,静電粉体塗装用塗料は通常35°C以下の低温で輸送・保管される.高温保管の粉体塗料のTSCスペクトルを調べると,ブロッキング発生以前に電荷安定性低下が現れることを確認した.また,粉体塗料の熱硬化反応の進行状況をTSCで評価できることを示した.(2)複写機トナー電荷制御剤の一つである4級アンモニューム塩結晶の電気的特性と結晶構造を調べた.その結果,この電荷制御剤は162°Cで非可逆的な結晶転移を起し,電気電導性が著しく増大することを見いだした.また,この電荷制御剤を添加した疑似トナーのTSCスペクトルを測定した.その結果,コロナ帯電より接触・摩擦帯電に対して,より有効に電荷制御剤が作用することが確認された.複写機のトナー・キャリヤ間の接触・摩擦帯電特性を評価する「キャリヤ落下法」を提案した.提案した方法では,トナー・キャリヤ間帯電特性が,電気的に孤立した場合と,孤立していない場合の両方の条件のもとで,調べることが可能である.また,提案した評価法は,同一キャリヤの長時間使用で問題となる,キャリヤ帯電サイト機能回復機構解明に有効であることがわかった.(3)低温粉砕ポリプロピレンポリプロピレン粉体のTSCスペクトルには,フィルム試料のスペクトルとは著しく異なり,110°C付近にピークをもつブロードなバンドが一つだけ観測された.種々の温度で熱処理した試料粉体のTSCスペクトルから,このバンドは,粉砕過程で結晶中に導入された欠陥によるものであることが明らかにされた.また,150°C以上の高温熱処理試料では,非可逆的な結晶転移(α_1-α_2)が生じていることが,TSCスペクトルから確認できた.試料粉体層厚熱変化を測定する装置を開発し,試料層厚熱変化により生じるTSC誤差を修正する方法を提案した.また,試料高分子粉体の特性に応じた2種類の試料容器を提案した.以上の,試料成形法,試料容器,スペクトル修正法を用いた,高分子粉体試料に対する開回路熱刺激電流スペクトル測定法を提案し,以下の系に応用した.(1)静電粉体塗装用塗料ブロキング(粉体粒子の凝集)防止の観点から,静電粉体塗装用塗料は通常35°C以下の低温で輸送・保管される.高温保管の粉体塗料のTSCスペクトルを調べると,ブロッキング発生以前に電荷安定性低下が現れることを確認した.また,粉体塗料の熱硬化反応の進行状況をTSCで評価できることを示した.(2)複写機トナー電荷制御剤の一つである4級アンモニューム塩結晶の電気的特性と結晶構造を調べた.その結果,この電荷制御剤は162°Cで非可逆的な結晶転移を起し,電気電導性が著しく増大することを見いだした.また,この電荷制御剤を添加した疑似トナーのTSCスペクトルを測定した.その結果,コロナ帯電より接触・摩擦帯電に対して,より有効に電荷制御剤が作用することが確認された.複写機のトナー・キャリヤ間の接触・摩擦帯電特性を評価する「キャリヤ落下法」を提案した.提案した方法では,トナー・キャリヤ間帯電特性が,電気的に孤立した場合と,孤立していない場合の両方の条件のもとで,調べることが可能である.また,提案した評価法は,同一キャリヤの長時間使用で問題となる,キャリヤ帯電サイト機能回復機構解明に有効であることがわかった.(3)低温粉砕ポリプロピレンポリプロピレン粉体のTSCスペクトルには,フィルム試料のスペクトルとは著しく異なり,110°C付近にピークをもつブロードなバンドが一つだけ観測された.種々の温度で熱処理した試料粉体のTSCスペクトルから,このバンドは,粉砕過程で結晶中に導入された欠陥によるものであることが明らかにされた.また,150°C以上の高温熱処理試料では,非可逆的な結晶転移(α_1-α_2)が生じていることが,TSCスペクトルから確認できた.実用の静電粉体塗装用塗料を,通常の保管環境で起こりうる温度領域で種々の時間熱処理して,それらの電荷保持力を等温表面電位減衰法で調べた.40°Cで熱処理した試料では,表面電位減衰は,従来より知られている表面電位-時間特性を示したが,50°Cで30分間熱処理した試料では,特異な電荷減衰特性を示した.この電荷減衰特性の保管温度依存性をさらに詳しく調べるため,TSCスペクトルを測定したところ,50°C10分問の熱処理でも,粉体塗料の電荷保持力は著しく低下することが判明した.また,塗着粉体の架橋反応による硬化過程の進行状況を知るために,種々の温度で,種々の時間熱処理した塗膜のTSCスペクトルを測定した.TSCスペクトル主バンドのピーク温度は,硬化の温度及び時間に著しく異存した.観測されたピーク温度のシフト量は,一種類の時定数で記述できるものと,2種類の時定数で表されるものがあった.これらTSC主バンドのピーク温度シフト量の解析から,塗膜の硬化をもたらす,塗料ベース樹脂の架橋反応の活性化エネルギーが求められた.

2種類の時定数で特徴づけられた硬化の進行の場合は,架橋反応の進行が二通りで起こっていることに対応する.このように,TSCスペクトロスコピーは静電粉体塗装用塗料の電荷保持力や複雑な硬化の進行を調べるうえで有効であることが判明した.(1)昇温に伴う試料粉体層厚の変化の熱刺激電流(TSC)スペクトルへの影響をどのようにして取り除けるか検討した。そのために、厚さ1mm程度の、種々の高分子粉体層を一定速度で昇温して、層厚変化を3μmの分解能で計測可能な測定器を作り、試料粉体層の厚さを温度の関数として測定した。この測定結果を用いて、観測されたTSCスペクトルから正しいTSCスペクトルを復元するアルゴリズムを考案した。また、これにより実際の粉体試料に対して、コンピュータにより正しいTSCスペクトルを復元できた。この成果と、これまでの研究で得られた成果により、高分子粉体試料のTSCスペクトル測定法がほぼ確立された。今後、この測定法を複写機用トナーの帯電特性など、高分子粉体試料の各種物性研究に利用するとともに、より簡便な装置の開発を進める。(2)高分子粉体層を強く圧縮すると、粉体粒子界面は部分的に一体化して、その部分の界面が消失する。この粉体粒子間界面の変化をTSCスペクトル変化から知ることが出来た。粒子間界面の一体化は粉体層の力学的強度増加につながるはずである。そこで、粉体圧縮層の剪断強度を概略値を測定したところ、その結果から推定された結論はTSCから得られたものとよい一致を示した。高分子粉体圧縮層のより精密な剪断強度測定を行うため測定器を設計し、その製作を外部に依頼する予定であったが、経費の関係で自作することにし、現在製作中である。(3)複写機用トナーに添加する電荷制御剤(CCA)の機能発現のメカニズムを理解する手始めとして、第四級アンモニウム塩タイプのCCAに対して、TSC測定を行ったところ、CCAからのTSCバンドが、室温以上の温度領域で、観測できた。このことから、CCAが電荷をトラップすることを初めて実証することが出来た。また、このCCAは162°Cで結晶転移をし、導電性が激変することをみいだした。(1)複写機2成分現像剤の帯電特性評価法として,トナー流動性因子を排除し,また,キャリヤの帯電機能回復を考慮した,「キャリヤ落下法」と名付けた新たな評価法を提案した.試作した装置では,キャリヤ・トナーの系が電気的に孤立している場合と,キャリヤがトナーと接触・剥離するたびに,キャリヤを接地した電極板に触れさせるという,電気的には孤立していない場合での帯電評価が可能である.本装置を用いて,研究室で作成した疑似トナーで帯電特性の評価を行ったところ,孤立系ではキャリヤ・トナーの接触・剥離回数の増加とともに帯電は急速に飽和した.しかし,電気的非孤立系での実験結果は,キャリヤの帯電機能の回復があり,急速な帯電飽和は観察されなかった.また,外部キャリヤメーカーの協力を得てシリコン系コート剤で被覆されたキャリヤも作成し,このキャリヤと研究室作成疑似トナーとの組み合わせでも同様の実験を行った.その結果,キャリヤ・トナーの組み合わせが変わっても,定性的には同様の結果が観測され,提案した手法は実際の複写機での現象機構を解明するうえで有用であることが確認された.
大腸発癌におけるアディポネクチンおよびインスリン抵抗性改善薬の作用解析

大腸癌はリスクファクターとして肥満や糖尿病などが考えられており生活習慣病としての一側面を持つ.この中でも特に内蔵脂肪ACF(aberrant crypt foci)の数に対し有意な相関をもつことが明らかとされているが,内臓脂肪は単なる脂肪の貯蔵器官ではなく積極的にサイトカインを分泌し生体のホメオスタシスを調節している.アディポネクチンおよびインスリン抵抗性改善薬は大腸発がんに対し抑制的に働く結果が,発がんモデルマウスおよびヒトでのパイロットスタディーで明らかにされた.今後本邦において増加が見込まれる肥満関連大腸がんの減少を目指す.大腸癌はリスクファクターとして肥満や糖尿病などが考えられており生活習慣病としての一側面を持つ.この中でも特に内蔵脂肪ACF(aberrant crypt foci)の数に対し有意な相関をもつことが明らかとされているが,内臓脂肪は単なる脂肪の貯蔵器官ではなく積極的にサイトカインを分泌し生体のホメオスタシスを調節している.アディポネクチンおよびインスリン抵抗性改善薬は大腸発がんに対し抑制的に働く結果が,発がんモデルマウスおよびヒトでのパイロットスタディーで明らかにされた.今後本邦において増加が見込まれる肥満関連大腸がんの減少を目指す.大腸癌はリスクファクターとして肥満や糖尿病などが考えられており生活習慣病としての一側面を持つ.我々はこの中でも特に内蔵脂肪がACFの数に対し有意な相関をもつことを明らかとしてきたが,近年内臓脂肪は単なる脂肪の貯蔵器官ではなく積極的にサイトカインを分泌し生体のホメオスタシスを調節していることが示唆されている.この中でアディポネクチンは内臓脂肪量と負の相関を示し,減少することで心血管系イベントが増加することが報告されているが,癌に対し抑制的に働く可能性が示唆されている.一方、糖尿病は予備軍を含めると国民の一割を超す疾患としてその根本的対策が急がれているが,インスリンおよびインスリン抵抗性は糖尿病治療の重要なターゲットとなる.現在インスリン抵抗性改善薬が臨床応用されているが,我々はアディポネクチンがAMPKを介し大腸発癌に対し抑制的に働くことを細胞,マウスモデルを用いて解明し,さらにPPARγが大腸化学発癌予防の分子標的であることを報告してきた.インスリン抵抗性改善薬pioglitazoneの1カ月の投与によりヒトにおいてACFが減少することを見出した(投稿中).同様の傾向をAMPK活性化薬であるmetforminにおいても認めている(第68回日本癌学会学術総会,AACR 101st Annual Meeting 2010で報告した).また,アディポネクチンがヒトACFの数と逆相関することを報告した(Cancer Sci.第95回日本消化器病学会総会).肥満関連大腸発がんの分子機序としてアディポネクチンのほかIGF-1およびJNK経路の関与を見出しこれらを報告した(Gut, Int J Oncol, Mol Med Rep.)今後さらなる詳細な検討により,本邦において増加が見込まれる肥満関連大腸がんの減少を目指す.大腸癌はリスクファクターとして肥満や糖尿病などが考えられており生活習慣病としての一側面を持つ.我々はこの中でも特に内蔵脂肪がACFの数に対し有意な相関をもつことを明らかとしてきたが,近年内臓脂肪は単なる脂肪の貯蔵器官ではなく積極的にサイトカインを分泌し生体のホメオスタシスを調節していることが示唆されている.この中でアディポネクチンは内臓脂肪量と負の相関を示し,減少することで心血管系イベントが増加することが報告されているが,癌に対し抑制的に働く可能性が示唆されている.一方、糖尿病は予備軍を含めると国民の一割を超す疾患としてその根本的対策が急がれているが,インスリンおよびインスリン抵抗性は糖尿病治療の重要なターゲットとなる.現在インスリン抵抗性改善薬が臨床応用されているが,我々はアディポネクチンがAMPKを介し大腸発癌に対し抑制的に働くことを細胞,マウスモデルを用いて解明し,さらにPPARγが大腸化学発癌予防の分子標的であることを報告してきた.インスリン抵抗性改善薬pioglitazoneの1カ月の投与によりヒトにおいてACFが減少することを見出した(PPAR Res. 2010).同様の傾向をAMPK活性化薬であるmetforminにおいても認めた(Metformin Suppresses Colorectal Aberrant Crypt Foci in a Short-term Clinical Trial. Cancer Prev Res. 2010).また、アディポネクチンがヒトACFの数と逆相関することを報告した(Cancer Sci. 2010).肥満関連大腸発がんの分子機序としてアディポネクチンのほかIGF-1およびJNK経路の関与を見出しこれらを報告した(Gut, Int J Oncol,Mol Med Rep.)今後さらなる詳細な検討により,本邦において増加が見込まれる肥満関連大腸がんの減少を目指す.
同位体ナノ薄膜作製による高精度なドーピング手法の開発

^<30>Siは中性子照射に伴う核変換によりPを生成することから同位体を優れたドーパントとして機能させることが可能である。同時にこれらの素材を数nm程度まで薄膜化し、急峻な界面を作製すればナノ領域における電気特性の制御が期待される。本年度は結晶性の差異が電気特性に大きく影響することから作製する薄膜の結晶性を向上させ物性を改善させることに重点を置いて研究を進め、通常より高いRF周波数を発生させることのできる化学気相蒸着装置(CVD)を用いて以下の検討を行い、良好な結果を得た。成膜では、2.45GHzマイクロ波加熱リモート型CVD装置を用い、H_2/SiF_4流量比を210とし、基板温度を300750°Cの範囲で変化させた条件下で試みた。薄膜の評価はX線回折法、透過型電子顕微鏡(TEM)および二次イオン質量分析法を用いて行った。^<30>Siを26%程度に濃縮したSiF_4を用い、H_2/SiF_4比25、成膜時の圧力2Torr、基板温度を450°CとしてSi(111)基板上に2.5時間成膜した試料についてX線回折法により評価を行った結果、基板上に極めて配向性の高いSi薄膜が得られていることが明らかとなった。TEMによる断面観察の結果から、5μmの均一な膜厚であり、かつ膜のほぼ全体にわたって良好な結晶性を持っていることが確認された。膜中の同位体比もほぼ原料気体と一致しており、本条件で高品質な同位体濃縮薄膜が得られたことがわかった。この方法で得られた膜を用いて、これまで結晶性の問題により有為な差の認められなかったドーピング特性変化が明らかになるものと考えられる。本年度は^<30>Si同位体濃縮薄膜の作製およびその評価に重点を置いて研究を進め、以下の結果を得た。当機構の同位体分離技術により得られた^<30>Si濃縮SiF_4ガス(濃縮度630%)を用い、化学気相蒸着法(CVD)によりH_2と反応させ^<30>Si濃縮薄膜を作製した。Si(100)基板上に成膜後、透過型電子顕微鏡(TEM)により膜断面の観察を行った結果、全体に50nm程度の均一な膜厚で、かつSi基板との界面が極めて急峻なものが得られたことを明らかにした。薄膜は多くの場合非晶質となった。さらに二次イオン質量分析法(SIMS)を用いて薄膜の同位体比を評価した結果、^<30>Si濃縮度625%程度であることを明らかにした。同位体比の比較的高い原料を用いた際に若干成膜後の濃縮度が低くなる傾向が見られたが、これは原料ガスラインの改良等により改善するものと期待される。また、原料ガスに含まれることから膜中に不純物として混入する恐れの高いFについては、CVDに供給するH_2/SiF_4比を10以上とすることによって1%程度以下に抑えることができた。これと同時に中性子照射による電気特性の変化を評価するため、測定の困難な薄膜や高抵抗Siの電極を作製し、I-V特性測定等に関する検討を進めている。本年度は化学気相蒸着法(CVD)により得られた^<30>Si同位体濃縮薄膜および^<28>Si単結晶薄膜等に中性子を照射し、電気特性にどのような変化が現れるかを評価することに重点を置いて研究を進め、以下の結果を得た。^<30>Si同位体濃縮薄膜に対する中性子照射後の結果では、照射量の増加にかかわらず高い抵抗値を示したままほとんど変化が見られなかった。ICP-MSの結果からはPの生成が認められていることから、得られた結果はドーパントが充分機能せず、薄膜に含まれる不純物や結晶性の作用が大きいことを示すものと考えられる。一方、^<28>Si単結晶薄膜に中性子照射を行った場合については一定の抵抗変化がみられた。しかしながら同時に中性子照射による欠陥生成と考えられる影響が現れ、ドーピング効果との差異が明瞭ではない場合が多かった。また、同時に進めていた数十nmオーダーの高抵抗薄膜の計測については、広がり抵抗測定法を応用し500MΩ程度までの抵抗測定を20nm以下の分解能で評価することを可能とした。さらに、昨年度行ったハロゲン化ケイ素を用いた同位体シリコンの濃縮薄膜作製に関する成果を元に特許を申請した。(特願2007-149102)今後、薄膜の不純物除去および結晶性向上等を行い、ドーピング効果の検証を試みる。

本年度は結晶性の差異が電気特性に大きく影響することから作製する薄膜の結晶性を向上させ物性を改善させることに重点を置いて研究を進め、通常より高いRF周波数を発生させることのできる化学気相蒸着装置(CVD)を用いて以下の検討を行い、良好な結果を得た。成膜では、2.45GHzマイクロ波加熱リモート型CVD装置を用い、H_2/SiF_4流量比を210とし、基板温度を300750°Cの範囲で変化させた条件下で試みた。薄膜の評価はX線回折法、透過型電子顕微鏡(TEM)および二次イオン質量分析法を用いて行った。^<30>Siを26%程度に濃縮したSiF_4を用い、H_2/SiF_4比25、成膜時の圧力2Torr、基板温度を450°CとしてSi(111)基板上に2.5時間成膜した試料についてX線回折法により評価を行った結果、基板上に極めて配向性の高いSi薄膜が得られていることが明らかとなった。TEMによる断面観察の結果から、5μmの均一な膜厚であり、かつ膜のほぼ全体にわたって良好な結晶性を持っていることが確認された。膜中の同位体比もほぼ原料気体と一致しており、本条件で高品質な同位体濃縮薄膜が得られたことがわかった。この方法で得られた膜を用いて、これまで結晶性の問題により有為な差の認められなかったドーピング特性変化が明らかになるものと考えられる。
赤核脊髄路-小脳におけるパーキンの発現分布および神経伝達における機能解析

パーキンソン病原因遺伝子の一つであり、ユビキチン・プロテアソーム系で働くユビキチン・リガーゼ酵素・パーキンは、神経伝達物質の受容体の一つ、イオンチャネル型ATP(アデノシン三リン酸)受容体(P2X受容体)に作用し、P2X受容体反応を有意に増強させることがわかった。また、P2X受容体のうち、P2X4を発現していない上頸交換神経節細胞ではパーキンによる増強作用が見られなかったことから、パーキンはP2X4を含むタイプの受容体(主にP2X6とのヘテロマー)に作用すると考えられた。そこで、以下のことを明らかにした。1)P2X4/6受容体サブタイプとパーキンの共発現赤核におけるパーキンおよびP2X4受容体の局在を免疫組織染色で詳細に観察したところ、小細胞・大細胞があるうち、主に25μm以上の大細胞で共発現していた。2)パーキン・P2X4受容体が発現する神経細胞と神経伝達物質パーキン及びP2X4受容体が発現する大細胞がどのタイプの神経細胞であるかを同定するため、シナプス小胞の各種神経伝達物質トランスポーターの抗体を用いて組織免疫染色を行ったところ、大細胞の多くがコリン作動性、グルタミン酸作動性であり、GABA作動性神経細胞のマーカーではあまり染まらなかった。3)パーキンとP2X受容体の機能解明赤核脊髄路・小脳におけるシナプス伝達に、多様な神経伝達物質と一緒に放出されると考えられているATPとその受容体(P2X4/6)がどのように関与しているのかを電気生理学的に検証した。ATPの還流方法は局所投与にした。大細胞に発現するP2X受容体の反応を検出できた。P2X4サブタイプに効き反応を増大させるイベルメクチンを作用させたところ、観察されたATP誘導電流は大きくなった。従って、少なくとも赤核大細胞にはP2X4を含むイオンチャネル型受容体が発現しており、機能していることが示唆された。今後、パーキン欠損マウスを使用するか、パッチ電極内にパーキン抗体を入れてパーキンを阻害することにより、観察されるATP誘導電流が小さいかどうかを検討する必要がある。そこで、以下のことを明らかにしようとした。1)P2X4/6受容体サブタイプとパーキンの共発現:赤核におけパーキンおよびP2X4受容体の局在を免疫組織染色で詳細に観察したところ、小細胞・大細胞があるうち、主に25μm以上の大細胞で共発現していた。2)パーキン・P2X4受容体が発現する神経細胞と神経伝達

物質:パーキン及びP2X4受容体が発現する大細胞がどのタイプの神経細胞であるかを同定するため、シナプス小胞の各種神経伝達物質トランスポーターの抗体を用いて組織免疫染色を行ったところ、大細胞の多くがコリン作動性、グルタミン酸作動性であり、GABA作動性神経細胞のマーカーではあまり染まらなかった。3)パーキンとP2X受容体の機能解明:赤核脊髄路・小脳におけるシナプス伝達に、多様な神経伝達物質と一緒に放出されると考えられているATPとその受容体(P2X4/6)がどのように関与しているのかを電気生理学的に検証することを試みた。赤核を含む部位の脳スライス標本でパッチクランプ法によるATP作動電流(P2X受容体電流)の観察方法は慈恵医大のグループに習った。ATPの還流方法の問題からか、大細胞に発現するP2X受容体の反応は検出できなかったが、シナプス前終末からの神経伝達物質放出を反映するシナプス後電流の頻度および振幅がATPによって増大した。従って、少なくともシナプス前終末にあるP2X受容体の機能とパーキンとの関係を探ることが可能であることが判明した。次年度は例数を増やして統計値をパーキン欠損マウスのそれと比較検討する。パーキンソン病原因遺伝子の一つであり、ユビキチン・プロテアソーム系で働くユビキチン・リガーゼ酵素・パーキンは、神経伝達物質の受容体の一つ、イオンチャネル型ATP(アデノシン三リン酸)受容体(P2X受容体)に作用し、P2X受容体反応を有意に増強させることがわかった。また、P2X受容体のうち、P2X4を発現していない上頸交換神経節細胞ではパーキンによる増強作用が見られなかったことから、パーキンはP2X4を含むタイプの受容体(主にP2X6とのヘテロマー)に作用すると考えられた。そこで、以下のことを明らかにしようとした。1)P2X4/6受容体サブタイプとパーキンの共発現:赤核におけるパーキンおよびP2X4受容体の局在を免疫組織染色で詳細に観察したところ、小細胞・大細胞があるうち、主に25μm以上の大細胞で共発現していた。2)パーキン・P2X4受容体が発現する神経細胞と神経伝達物質:パーキン及びP2X4受容体が発現する大細胞がどのタイプの神経細胞であるかを同定するため、シナプス小胞の各種神経伝達物質トランスポーターの抗体を用いて組織免疫染色を行ったところ、大細胞の多くがコリン作動性、グルタミン酸作動性であり、GABA作動性神経細胞のマーカーではあまり染まらなかった。ATPの還流方法は局所投与にした。大細胞に発現するP2X受容体の反応を検出できた。P2X4サブタイプに効き反応を増大させるイベルメクチンを作用させたところ、観察されたATP誘導電流は大きくなった。従って、少なくとも赤核大細胞にはP2X4を含むイオンチャネル型受容体が発現しており、機能していることが示唆された。今後、パーキン欠損マウスを使用するか、パッチ電極内にパーキン抗体を入れてパーキンを阻害することにより、観察されるATP誘導電流が小さいかどうかを検討する必要がある。