hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
毒素型食中毒に対する植物成分の制御機構の解明とその応用

植物抽出物とその含有ポリフェノール類136試料の毒素活性および産生抑制効果を検討した。その結果、136試料中26試料がブドウ球菌エンテロトキシンA (SEA)と結合親和性を有した。また、重合度の高いリンゴ由来プロアントシアニジン(AP)はSEAと結合し、低いAPは結合せずに毒素活性を阻害した。カテキン類では、ガロイル基3位の水酸基がSEAとの結合親和性に関与していた。しかし、ガロイル基4位の水酸基をメチル化したカテキンにおいても毒素産生および活性抑制効果が認められたことから、SEAとの結合がこれら阻害活性に必ずしも関連しているわけではないことが示唆された。【方法】昨年度、毒素活性阻害能および毒素産生抑制能が認められた食品抽出物より抽出、精製したポリフェノール類28試料を試験に供した。各試料を添加した培地で黄色ブドウ球菌SEA産生株を培養し、産生されたSEAをWestern blotで定量(一次スクリーニング)した。活性が認められた試料について、SEA分子と試料との結合親和性をWestern blot解析(二次スクリーニング)およびHPLCを用いて調べた。SEA分子と結合親和性を示した試料は、マウス脾臓細胞を用いて毒素活性阻害能を、SEA分子と結合親和性が認められなかった試料については、SEA遺伝子発現に対する影響をリアルタイムRT-PCR法を用いて調べた。【結果・考察】Western blot解析およびHPLCにより、ポリフェノール系既存食品添加物4試料、リンゴ由来プロアントシアニジン(AP)の五量体以上の画分、エピカテキンおよび3"-メチル化カテキンを除くカテキン類は、SEAとの結合親和性を示し、いずれも毒素活性を有意に阻害した。また、AP (三量体から五量体の画分)およびカテキン類を含むSEA分子と結合親和性が弱い試料についてSEA遺伝子発現に対する影響を調べたところ、いずれもSEA遺伝子発現の抑制効果を示した。これらの結果より、重合度の高いAPはSEAと直接結合し、低いAPはSEAと結合せずに毒素活性を阻害するという2つの阻害機構があることが示唆された。また、毒素産生抑制能にAPの重合度は関連していないことが推察された。カテキン類においては、ガロイル基の3位の水酸基がSEAとの結合親和性に関与していたが、ガロイル基の3または4位の水酸基をメチル化したカテキンの両者において、毒素産生および活性抑制効果が認められたことから、SEAとの結合がこれら阻害活性に必ずしも関連しているわけではないことが示唆された。【方法】植物食品の熱水および溶媒抽出物88試料、植物食品由来のポリフェノール類32試料、計120試料を試験に供した。抗菌活性を示さない試料の濃度を決定するために、各試料における抗菌活性について液体希釈法を用いて調べた。次に、決定した濃度の試料を添加した培地で黄色ブドウ球菌staphylococcal enterotoxin A (SEA)産生株を培養し、SEAをWestern blotで定量した(一次スクリーニング)。一次スクリーニングで活性が認められた試料について、SEA分子と試料との結合親和性をWestern blotによって調べた(二次スクリーニング)。さらに、二次スクリーニングによりSEA分子と結合親和性を有した試料については、マウス脾臓細胞を用いて毒素活性阻害能を、SEAタンパク質のバンド強度が変化しなかったSEA分子と結合親和性が弱い試料については、SEA遺伝子発現への影響をリアルタイムRT-PCR法により調べた。【結果】抗菌活性を示さない濃度の試料を添加した培地で黄色ブドウ球菌SEA産生株を培養し、SEAをWestern blotで定量した結果、用いた120試料中25試料においてSEAのバンド強度の減弱または消失が認められた。これら25試料について、SEA分子と試料との結合親和性をWestern blot解析によって調べた結果、23試料でSEAと結合親和性を有する可能性が示唆された。これら23試料にコリラギンおよびオイゲニンを加えた計25試料について、毒素活性阻害能を調べた結果、全ての試料がSEAの毒素活性を有意に抑制した。また、アップルポリフェノール、EGCgおよびメチル化カテキンについて、SEA遺伝子発現への影響をリアルタイムRT-PCR法により調べた結果、いずれの試料においてもSEA遺伝子発現の抑制が認められた。本年度中に、同定した毒素産生抑制成分及び毒素活性阻害成分に共通する構造について探索する予定であったが、予想以上に多くの植物食品抽出物で効果が認められたため、一部の抽出物で成分の同定まで至らなかった。今後、毒素産生抑制及び毒素活性阻害効果のあった植物食品抽出物について、分画・精製し、効果のあるポリフェノールの構造を明らかにした後、毒素産生抑制成分及び毒素活性阻害成分に共通する構造について検討を行う予定である。

本研究より、食用、飲用習慣に裏付けられた安全性の高い植物食品および植物由来ポリフェノール類は、食中毒菌の毒素活性を阻害する、または毒素の産生を抑制するという、新たな作用を有する可能性が示唆された。今後、これらの活性物質による毒素活性阻害能および毒素産生抑制能について、その作用機序を明らかにすることで、新たな食中毒制御法が開発されることが期待される。そこで、その作用機序を明らかにするために、主に以下の3つについて研究を進めていく予定である。1ポリフェノール類とSEAが結合しているのか確認する(HPLC法)。2ポリフェノール類とSEAが結合していることが毒素活性抑制効果につながっているのか確かめる(マウス脾臓細胞を用いた細胞生存性試験)。3ポリフェノール類とSEAが結合している場合、SEAの催吐およびスーパー抗原活性に関係する領域に特異的に結合する抗体を作成し、結合部位を明らかにする。毒素産生抑制及び毒素活性阻害効果が認められた抽出物について、随時、活性成分の最小添加量や活性成分のpH安定性・熱安定性等の評価を行うため、インキュベーターとpHメーターを購入する予定であった。しかし、予想以上に多くの植物食品抽出物で効果が認められたため、先に活性成分を同定する方が研究の効率が良いと考え、昨年度は、活性成分の分画・精製を中心に研究を進めた。そのため、本年度、昨年購入予定であったインキュベーターとpHメーターを購入し、毒素産生抑制成分及び毒素活性阻害成分の評価を行う際に使用する予定である。また、本年度は、得られた活性成分とSEAの相互作用を分子間相互作用解析装置(QCM)を用いて測定し、その作用機序について明らかにする予定であるが、QCMではSEAとポリフェノールの結合親和性を高感度に測定することが困難であることがわかった。そこで、Biacoreを用いて、SEAとポリフェノールの生物物理学的相互作用解析を行うことを検討している。そのため、研究費の一部は、Biacoreの消耗品費等に使用する予定である。
細菌の感染と共生における消化管の糖脂質受容体と細菌の糖脂質抗原の役割

免疫不全scidと対照マウスの腸内乳酸菌は全く異なっており、scidはL. murinus、対照マウスはL. johnsoniiであった。対照マウス盲腸、結腸内容物は固形であるのに対し、scidは水分が多く、下痢状であった。抗原糖脂質を解析したところ、LJはGalα1-6結合を持つLacTH-DGとLacTetH-DG、LMはGlcβ1-6結合を持つLacβTH-DGを含んでいた。LacTH-DGとLacTetH-DGに対する自然抗体の結合活性はABO血液型糖脂質に匹敵していた。一方、LMが優勢菌種となっているscidではGA1のフコシル化が促進しており、LJの結合が妨害されていた。マウス消化管上皮に高濃度に分布するGA1は細菌感染によってフコシル化を受け、FGA1に変換されることが知られている。この現象はα1,2フコース転移酵素遺伝子の転写によってもたらされるが、細菌による宿主遺伝子の転写誘導であるのか、あるいは宿主免疫システムの細菌感染に対する応答であるのかが明確になっていない。そこで、免疫不全マウスを用いて、消化管のGA1とFGA1の含有量およびフコース転移酵素の活性を対照マウスと比較した。免疫不全マウスとして、T細胞B細胞不全Scidと対照CB17マウス、T細胞不全nudeマウスと対照Balb/cマウス、IgA分泌不全pIgR(-/-)と対照(+/+)マウスを用いた。MRS乳酸菌培地で生育できる細菌は、ScidとpIgR(-/-)がLactobacillus murinus、対照CB17とpIgR(+/+)はL. johnsoniiであり、nudeはEnterococcus feacalis、対照Balb/cはLactococcus garvieaeであった。いずれの免疫不全マウスにおいてもFGA1の含有量とGA1を基質としたα1,2フコース転移酵素活性は増加しており、細菌感染によるFGA1の誘導には免疫システムは関与せず、細菌による転写誘導であることを示していた。FGA1とFGM1の濃度に関しては、nudeマウス回腸、盲腸、結腸のフコシルGA1は対照マウスの1.62.5倍であったが、Scidマウスのこれらの部位の濃度は対照マウスの46倍に達していた。盲腸のフコシルGM1濃度はnudeマウスが対照マウスの1.4倍、Scidマウスが対照マウスの0.5倍であることから、盲腸におけるGA1のフコシル化はGM1のフコシル化に比べて亢進している事が分かった。消化管上皮糖脂質は細菌受容体活性を持ち、また消化酵素で分解されないことから、細菌を結合したまま体外に排泄されることを示している。受容体糖脂質は消化管内で細菌の拡散を防ぎ、速やかに体外に送り出す役割を担っている可能性がある。T細胞B細胞免疫不全マウスScidと対照CB17マウス、およびT細胞免疫不全ヌードマウスと対照Balb/cマウスの消化管における糖脂質発現は部位特異的であった。対照マウス共通に、GA1とスルホGA1は十二指腸、空腸、回腸に、フコシルGM1は胃と盲腸に、スルファチドは盲腸に含まれていた。Scidマウス盲腸にはスルファチドが含まれていない点を除き、これらの部位特異的糖脂質の発現量は免疫不全と対照マウスの間で大きな違いは見られなかった。一方、フコシルGA1はフォルスマン抗原同様、消化管全域に発現していたが、その発現量はどの部位においても免疫不全マウスの方が高濃度であった。ヌードマウス回腸、盲腸、結腸のフコシルGA1は対照マウスの1.62.5倍であったが、Scidマウスのこれらの部位の濃度は対照マウスの46倍に達していた。盲腸のフコシルGM1濃度はヌードマウスが対照マウスの1.4倍、Scidマウスが対照マウスの0.5倍であることから、盲腸におけるGA1のフコシル化はGM1のフコシル化に比べて亢進している事が分かった。小腸においてGA1α1,2-フコース転移酵素は細菌感染によって誘導される性質を持っているが、この酵素誘導は細菌に対する免疫応答の結果ではなく、細菌によって引き起こされている事を示している。事実、免疫不全マウスと対照マウス糞便中の乳酸菌選択培地で培養可能な細菌の種類は全く異なっていた。消化管共生細菌のうち、グラム陽性細菌は、リン脂質としてホスファチジルグリセロールとカルジオリピンを、糖脂質としてグリセロ型糖脂質を細胞膜成分として含んでいる。

グリセロ型糖脂質の糖鎖は強力な抗原性を発揮し、中でも、ヒトやマウスの腸内乳酸菌として知られているL. johnsoniiの3糖LacTH-DG (Galα1-6Galα1-2Glcα1-3'DG)および4糖LacTetH-DG (Galα1-6Galα1-6Galα1-2Glcα1-3'DG)に対する抗体は、ヒト血中にも自然抗体として検出される。共生細菌の糖脂質に対する免疫応答は免疫システムを介した共生関係の成立に重要であると考えられるため、同様にヒト血中に含まれるABO血液型や動物種特異的糖脂質に対する自然抗体との反応強度をTLC免疫染色法を用いて比較した。LacTH-DG、LacTetH-DGに対する自然抗体を持つA型、B型、AB型、O型ヒト血清のうち、ELISA抗体価の最も高い血清について調べた結果、ABO血液型に関わりなく、すべての血清に含有され、その反応強度は、A型糖脂質Aa、Ab、およびB型糖脂質B-I、B-IIに対する強度に匹敵していた。さらに、動物種特異的スフィンゴ糖脂質に対する抗体として、共通にIV3Galα-nLc4Cer、Gg4Cerに対する抗体が含まれていて、これらの糖脂質に対する抗体の反応強度もLacTH-DG、LacTetH-DGに対する反応強度に匹敵していた。ABO血液型や動物種特異的スフィンゴ糖脂質に対する抗体は、類似糖鎖を持つ細菌に対する免疫反応の結果生成されていると考えられ、乳酸菌LacTH-DGとLacTetH-DGに対する抗体生成と同じ仕組みと思われた。Staphylococcus属StaDH-DGおよびGg3Cer、IV3GalNAcα-Gb4Cer(フォルスマン糖脂質)に対する抗体に関しては持っていないヒトがあり、感染履歴を反映していると考えられた。強い免疫応答によって拒絶するよりも免疫応答が可能な細菌と弱く持続的な免疫反応を行うことで共生関係を結んでいる可能性がある。生物学糖鎖特異的抗体を用いた免疫検出法により、抗原糖脂質を定量的に検出するための検量線を作製した。Lactobacillus属、Staphylococcus属、Streptococcus属より分離した糖脂質の構造解析の結果、細菌属特異的2糖糖脂質として、それぞれGalα1-2Glcα1-3DG、Glcβ1-6Glcβ1-3DG、Glcα1-2Glcα1-3DGを決定した。Lactobacillus属については、2糖糖脂質に糖鎖修飾を受けた3糖および4糖糖脂質が含まれていた。腸内細菌はGalαがα1-6結合、発酵食品の細菌はGlcβがβ1-6結合した構造であった。腸内細菌の検出には、4糖糖脂質Galα1-6Galα1-6Galα1-2Glcα1-3DGを用いて検量線を作製した。代表的な腸内細菌Lactobacillus johnsoniiに含まれる4糖糖脂質の含有量は1億個当たり0.22 μgであった。10250 ngの抗原量を測定できるようになったことから、より簡便に定量化でき、計画は順調に進んでいる。糖鎖特異的抗体を用いた免疫検出法により、抗原糖脂質を定量的に検出するための検量線を作製した。
タンガニーカ湖の河口域生物群集の研究(調査研究総括)

タンガニカ湖の集水域24万km^2の60%の流域をもつマラガラ河口域について,その陸水学的特性と生物群集について研究を行った.1.河口域の水貭は河川内と湖内で大きく異なり,特にSio.ナ_<2.ニ>は河川水中では13mg/l程度含まけているものが湖に流入すると急激に減少し0.10.4mg/lとなっていた.これらのことから調査時期のタンガニーカ湖においてはSio.ナ_<2.ニ>によって基礎生産力が制限されている可能性が示唆された.2.河口域の水生植物群落は湾入部に発達しており,抽水植物5種,浮葉植物5種,淡水植物8種が確認された.純群落を形成していた5種の水生植物の現存量は生重量で3.25.6Kg/m^2であり,最大はセキショウモの5.6Kg/m^2であった.このセキショウモ群落には小型の淡水エビ(Limnocaridina tanganyikae)が大量に生息していた.3.L.tanganyikaeの繁殖形質について検討し,他の淡水エビ類との比較を行った.その結果卵の大きさと拘卵量との関係において明らかに差のあることがわかった.4.河口沿岸域の水生植物には前記エビ類の他に大量の付着微生物が生息し,沖合の生物相とは異なり,ワムシ類の多いことが特徴である.また,甲殻類としてはDaphnia類は見られずDiaptomus JimplexなどCopepada類が優占していることが再確認された.5.マラガラシ河口域において採取した魚種は15科56種であり,岩礁域に多く,タンガニーカ特有の魚類群集であるchichlidceはおよそ10種と少なかった.河川内では10科26種,湖沿岸域では10科27種が得られ,両者に共通する種は10種にすぎない.以上のことから,沿岸域の生態的,陸水的性格がタンガニーカ湖内といくつかの点で異なることがわかり,今後は沿岸域の生態系,特に河口域のそれがタンガニーカ湖全体の生態系にどのような役割を果しているかを解析したい考えである.タンガニカ湖の集水域24万km^2の60%の流域をもつマラガラ河口域について,その陸水学的特性と生物群集について研究を行った.1.河口域の水貭は河川内と湖内で大きく異なり,特にSio.ナ_<2.ニ>は河川水中では13mg/l程度含まけているものが湖に流入すると急激に減少し0.10.4mg/lとなっていた.これらのことから調査時期のタンガニーカ湖においてはSio.ナ_<2.ニ>によって基礎生産力が制限されている可能性が示唆された.2.河口域の水生植物群落は湾入部に発達しており,抽水植物5種,浮葉植物5種,淡水植物8種が確認された.純群落を形成していた5種の水生植物の現存量は生重量で3.25.6Kg/m^2であり,最大はセキショウモの5.6Kg/m^2であった.このセキショウモ群落には小型の淡水エビ(Limnocaridina tanganyikae)が大量に生息していた.3.L.tanganyikaeの繁殖形質について検討し,他の淡水エビ類との比較を行った.その結果卵の大きさと拘卵量との関係において明らかに差のあることがわかった.4.河口沿岸域の水生植物には前記エビ類の他に大量の付着微生物が生息し,沖合の生物相とは異なり,ワムシ類の多いことが特徴である.また,甲殻類としてはDaphnia類は見られずDiaptomus JimplexなどCopepada類が優占していることが再確認された.5.マラガラシ河口域において採取した魚種は15科56種であり,岩礁域に多く,タンガニーカ特有の魚類群集であるchichlidceはおよそ10種と少なかった.河川内では10科26種,湖沿岸域では10科27種が得られ,両者に共通する種は10種にすぎない.以上のことから,沿岸域の生態的,陸水的性格がタンガニーカ湖内といくつかの点で異なることがわかり,今後は沿岸域の生態系,特に河口域のそれがタンガニーカ湖全体の生態系にどのような役割を果しているかを解析したい考えである.
院内学級における同時双方向遠隔授業の実用的方法の開発

病院内に設置された病気を持つ児童が療養しながら学習する教室において情報通信技術を活用することによりリアルタイムかつ等身大な映像により、対面性を高めた遠隔授業、異文化コミュニケーションを可能とすること、ソーシャル・ネットワーキング・サービスを導入することにより教諭と入院児童、およびその家族、退院した児童などに対するコミュニケーションの場とするともに、他の院内学級との連携の場を構築した。病院内に設置された病気を持つ児童が療養しながら学習する教室において情報通信技術を活用することによりリアルタイムかつ等身大な映像により、対面性を高めた遠隔授業、異文化コミュニケーションを可能とすること、ソーシャル・ネットワーキング・サービス(SNS)を導入することにより教諭と入院児童、およびその家族、卒業した児童などに対するコミュニケーションの場とするともに、他の院内学級との連携の場を構築することを目的としている。22年度においては、院内学級において、日常的に利用できるリアルタイムな映像を送受信するためのコミュニケーションシステムをPolycom・HDX7001により構築した。また、ベッドサイドティーチングを念頭において、モバイルコンピューティングを利用したノート型PCと小型カメラによりテレビ会議システムと連携できるシステムの検討を行った。上記のシステムを用いて、院内学級と北海道大学北京オフィスとの間で遠隔授業を行った。本研究ではこの授業を「中国の文化を知ろう」プロジェクトと名づけ、数年間継続し、異文化理解・環境・コミュニケーション・各教科の発展的補完の総合的な取り組みとする予定である。今年度においては、漢字・熟語の意味の相違や食文化の違いなどをクイズ形式で学びながら、異文化理解と自国文化の再認識、各教科の今後の学習の動機付けとなるべく授業を構築した。なお、この授業の様子は実験的に国立特別支援教育総合研究所にも中継した。今後は同研究所の支援を得て、さらに他機関にも中継地点を増やしていき、ネットワーク上で壁を取り払ったオープンな学習スペース構築について、その意義や効果、今後の展望などについて検証する予定である。この他に、モバイルシステムを用いて、北海道大学博物館からの遠隔授業等も数度試行し、運用可能性を検討した。23年度においては、院内学級において、日常的に利用できるリアルタイムな映像を送受信するためのコミュニケーションシステムを用いて、前年度実験的に行った北海道大学北京オフィスとの遠隔教育により異文化教育を進めた。漢字・熟語の意味の相違や食文化の違いなどをクイズ形式で学びながら、異文化理解と自国文化の再認識、各教科の今後の学習の動機付けとなるべく授業を構築しさらに進めた。同研究所の支援を得て、さらに実験的に他大学を含めることにより、ネットワーク上で壁を取り払ったオープンな学習スペース構築を試みた。今後、他大学の院内学級とも連携し、その意義や効果、今後の展望などについて検証する予定である。この他に、モバイルシステムを用いて、北海道大学博物館、円山動物園などからの遠隔授業等も数度試行し、運用可能性を検討した。前年度までに院内学級において、日常的に利用できるリアルタイムな映像を送受信するためのコミュニケーションシステムをPolycom・HDX7001により構築した。今年度は上記のシステムを用いて、院内学級と北海道大学北京オフィスとの間で遠隔授業を行った。本研究ではこの授業を「中国の文化を知ろう」プロジェクトと名づけ、異文化理解・環境・コミュニケーション・各教科の発展的補完の総合的な取り組みと位置づけ、漢字・熟語の意味の相違や食文化の違いなどをクイズ形式で学びながら、異文化理解と自国文化の再認識、各教科の今後の学習の動機付けとなるべく授業を構築した。さらに中国に加えてサウジアラビアからの遠隔授業を行い、文化、宗教が異なる人達との交流を行った。この授業の様子は国立特別支援教育総合研究所と連携し、大阪大学病院院内学級にも中継し、北大病院院内学級の遠隔授業に参加してもらい、ネットワーク上で壁を取り払ったオープンな学習スペースについて、その院内学級における意義や効果について検討した。院内学級に入級している児童の健康状態や、依頼した国外在住の講師の都合などにより予定していた遠隔授業が行えないことが何度かあったたため24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後は国立特別支援教育総合研究所の支援を得て、実験授業の増加、さらに他大学を含めることにより、多地点にわたる中継を試行し、ネットワーク上で壁を取り払ったオープンな学習スペース構築を試み、意義や効果、今後の展望などについて検証する24年度が最終年度であるため、記入しない。
「領域・教科を合わせた指導」の指導案及び授業改善のための継続的実践事例研究

本研究は、知的障害教育の指導形態である領域・教科を合わせた指導の指導案改善及び授業改善を継続的な事例研究により検討することを目的として実施した。領域・教科を合わせた指導の指導案を分析し、その改善と授業改善を行った。これらの結果に基づいて、領域・教科を合わせた指導の指導案を作成する上でのポイントを整理し、「『領域・教科を合わせた指導』指導案作成のポイント(試案)」を作成した。「領域・教科を合わせた指導」を継続して実施している知的障害特別支援学校1校を研究対象校とした。そこで行われる「領域・教科を合わせた指導」の指導案分析及び授業分析を継続的に行い、その結果に基づき、指導案中の手立ての記述の改善を図ると共に、実際の授業場面での授業改善につなげるために以下を実施した。研究対象校における対象授業指導案の個別の手立ての記載を、テキストマイニングにより分析した。個別の手立てのデータ数は、11件であった。これらをデータ中の形容詞句及び動詞句に着目して分析し、手立ての意図の傾向を検討した。検討では、個別の手立てのデータに対して、「意図の読み取り」「感性分析」「行動分析」を行った。意図の読み取りでは、「見通し」「自力」「情意」「正確さ」の4観点で意図を分類した。感性分析は、印象を表す形容詞句に対し、どのような名詞句が係っているのかに注目し、その名詞句に対する印象の特徴を分析するものである。この分析を通して授業者の記述の意図が検討できる。11件のデータ中、形容詞句は9句であった。そのうち、感性分析の対象となった印象を表す形容詞句は4句であった。行動分析は、動作を表す動詞句に対し、どのような名詞句が係っているのかに注目し、その名詞句に対する行動を分析するものである。この分析によって、授業の中で何に対してどのような行動をとることが期待されているかを検討できる。11件のデータ中、動詞句は31件であった。そのうち、行動分析の対象となった動作を表す動詞句は16句であった。続いて、授業記録ビデオ3回分を、分析カテゴリーにより授業分析した。対象児童の指導案記述に基づき、「中断」「継続」「補助」「道具等調整」の4カテゴリーを設定してインターバルレコーディング法により、分析を行った。以上の結果を、中間報告的な意味も含め、報告書にまとめた。ほぼ計画通りにデータ収集分析等が行われたため。平成27年度に引き続き、研究対象校(知的障害特別支援学校)小学部3年学級(児童数6人、授業者4人)が実践した生活単元学習における製作活動部分を対象授業として研究を行った。対象学級は平成27年度における研究対象学級と同一である。対象授業は、製作活動を中心とした生活単元学習であり、単元の目標では、平成27年度における対象授業と同様に、「精一杯」「力を合わせて」「楽しく」といった主体的な姿が期待されていた。単元期間は11月の3週間(実施月は平成27年度における対象授業と同一。単元期間は1週間長い)で、授業回数は13回(平成27年度における対象授業は8回)である。本単元において指導案及び授業記録の対象とした活動が展開される授業時間は10:4511:30であり、平成27年度における対象授業と同一であった。研究対象校には平成27年度の研究から導かれた指導案の改善点を報告し、それに基づく指導案作成を依頼、改善指導案を平成27年度の研究と同じ方法でテキストマイニングで分析した。その結果、記載の不明確な部分の改善がテキストマイニングからも示された。また対象授業のビデオ記録を平成27年度の研究と同じ回数で分析カテゴリーによる授業分析した。その結果、指導案上の手立てが講じられた後に、活動の継続性が向上したことが示唆された。指導案の改善が精度の高い成果をあげていることが考えられた。活動の継続は、児童の主体的な姿の指標でもあり、その点、テキストマイニング、分析カテゴリーいずれの検討においても、授業改善が図られたことが示されたと考えられる。平成27年度の研究より1年を経ての授業実施であることから、多様な要因による対象児童の成長があることは言うまでもない。その中で、分析カテゴリーによる授業分析が示した手立てとの関係での活動の向上は、手立ての有効性を示唆する側面を指摘することは可能であると考えられる。本研究では、研究対象校である知的障害特別支援学校A校において2年間にわたり、指導案分析及び授業研究を行い、授業改善を進めた。その結果に基づき、「『領域・教科を合わせた指導』指導案作成のポイント(試案)」を作成した。このポイントでは、「授業の目標に即した意図を指導案で明確に示す。」「手立ての意図は、一文に一つとして絞り込んだ記述をする。」「手立ての分類整理には、授業の目標に即した観点を採用することが有効である。」の3点を提示した。これら3点は、2年間にわたるA校での指導案分析及び授業研究の成果に基づくものである。ポイントを実際の授業計画・指導案作成の流れに沿って配列したことで、教員の授業づくりの流れに沿って参照できるようにした。また、ポイントを3点に絞り込み、さらに1ポイントあたり1つの内容にすることで、実践現場での活用を容易にした。活用のしやすさは本研究の実践研究という性格上、重要である。

「『領域・教科を合わせた指導』指導案作成のポイント(試案)」は、A校の教職員に配布した。併せてA校には「『領域・教科を合わせた指導』指導案作成のポイント(試案)」作成の根拠となっている2年間の研究をまとめた報告書も配布し、内容理解をしやすいように配慮した。また、本研究の成果を日本発達障害学会第52回研究大会(2017年8月)においてポスター発表「『各教科等を合わせた指導』の指導案改善のための事例研究」として公表した。本研究は、知的障害教育の指導形態である領域・教科を合わせた指導の指導案改善及び授業改善を継続的な事例研究により検討することを目的として実施した。領域・教科を合わせた指導の指導案を分析し、その改善と授業改善を行った。これらの結果に基づいて、領域・教科を合わせた指導の指導案を作成する上でのポイントを整理し、「『領域・教科を合わせた指導』指導案作成のポイント(試案)」を作成した。平成28年度における計画と方法は以下の通りである。平成27年度において報告書にて整理した、指導案記述の課題を研究対象校に提示し、指導案改善を行う。これによって改善された指導案及び授業を平成28年度の研究対象とする。改善された授業を、平成27年度と同じ方法により、テキストマイニングによる指導案分析、分析カテゴリーによる授業分析により検討し、改善等を検討する。平成29年度における計画と方法は以下の通りである。平成27年度、平成28年度における研究成果を踏まえ、研究対象校に報告を行うと共に、特別支援教育関係学会で成果を報告する。特別支援教育研究対象校への訪問日程を当初予定より減らしたため、旅費相当額が支出されなかった。計画通りに研究活動を行ったが、旅費の実費が予算より少額であったため。平成28年度において、研究対象校への訪問調査にかかる旅費として使用する予定である。平成29年度に予定する、当該研究成果を発表する学会発表旅費にあてる。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを使用した感染症迅速診断システムの開発

MALDI-TOF-MSを応用し尿中の細菌を迅速同定するシステムを開発した。尿中細菌を検出する最低必要な菌数は10万個/mLでありグラム染色と同等であった。属レベルの同定一致率は、グラム陰性桿菌90%以上、グラム陽性球菌65%程度であった。全行程20分以内に完了した。さらに分離培養集落を用いてカルバペネマーゼの産生を検出する方法の開発を試みた。カルバペネマーゼを産生するクローン由来のカルバペネマーゼ消化後のペプチドは60%以上回収できた。しかし、臨床分離株の多くは他の夾雑蛋白質の影響により検出ができなかった。本件については継続して研究を遂行する。【はじめに】Matrix-assisted laser desorptionionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)は細菌集落の迅速同定法として臨床微生物検査室へ普及しつつある。本法を応用することで臨床材料中に含まれる病原性細菌を検体が検査室に提出されてから30分足らずで同定を可能とするシステム開発を試みた。さらに細菌集落を用いて臨床的に重要視されている抗菌薬耐性因子であるカルバペネマーゼのペプチド解析による迅速同定法の開発を試みた。【方法】MALDIバイオタイパーver.3.1(Bruker社)を使用した。1尿中細菌の迅速同定:膿尿かつグラム染色で単一菌感染症と判断した106検体を使用した。菌塊を砕く超音波処理を実施後、低遠心法とフィルター法の二法を使用して白血球と細菌の分画を行った。二法の性能を分離培養で得た同定成績と比較した。2カルバペネマーゼ産生株の迅速同定:PCRでIMP-1構造遺伝子を増幅しpETベクターにクローニングした。IMP-1を精製後、トリプシン消化しMALDIでIMP-1ペプチド断片を検出した。これを陽性コントロールとして臨床分離株からの直接検出法を検討した。【結果および考察】1の成績:検出感度は10^510^6 CFU/mLであった。属レベルの同定一致率はグラム陰性桿菌は低遠心法92%、フィルター法93%、グラム陽性球菌は低遠心法65%、フィルター法67%であった。前年度の実験で菌塊形成菌は回収率が30%程度と低かったが、超音波処理の追加で検出率は大きく向上した。すべての工程は20分程度で完了した。2の成績:クローンからのIMP-1特異ペプチドは80%以上回収できた。一方臨床分離株の多くはペプチド断片を検出できなかった。引き続き新たな前処理法を検討する必要があった。【方法】測定機器はMALDIバイオタイパー(Bruker、以下MALDI)を使用した。臨床検体は膿尿かつグラム染色で細菌を確認した59件(単独菌感染のみ)を使用した。尿中炎症細胞と細菌分画の分離は低遠心法と我々が考案したフィルター法の2法を検討した。2法の成績は分離株のMALDIの同定結果と比較した。【結果および考察】MALDIの検出感度は10^6 CFU/mLであり、原尿を使用したグラム染色による感度と類似した。尿59件について、分離株の同定菌名と一致したのは、グラム陰性菌群で低遠心法84%(37/44)、フィルター法89%(39/44)、グラム陽性菌群で低遠心法73%(11/15)、フィルター法33%(5/13)であった。フィルター法は尿を直接濾過するだけで細菌分画を抽出でき操作方法は極めて簡便であった。しかし、グラム陽性菌群の同定精度が低く、クラスターや連鎖形成をする細菌がフィルターを貫通しないことが理由であった。今回検討した方法はさらに改良の余地はあるが、新しい感染症迅速診断法として位置づけられる新手法となると判断した。臨床検体(尿材料)を直接使用した検出法の構築は、菌塊やレンサ形成をするグラム陽性菌で検出精度が大幅に低下したが、グラム陰性菌では検討した方法で良好な成績が得られることが明らかとなった。同時並行で実施していたMALDIを用いて培養集落を用いたβラクタマーゼの検出は、IMP-1産生株を使用してβラクタマーゼの精製を試みた。しかし、MALDIでの単独ピークとして特定できるに至っていない。臨床検体(尿材料)を直接使用した検出法の構築は、一部問題点が残されたため、同定精度のさらなる向上を目的として方法論の改良を試みる。改良法での成績を再度確認し、本検討を終了させる。

前年度で成果が得られなかったカルバペネマーゼ産生株の特定については遺伝子のクローニングを行った後に、再度精製を行いカルバペネマーゼの存在について検証を行う。これをコントロールして、臨床分離株について適応可能か否か検証する。また同様の方法でベロ毒素などの病原因子の検出が可能か否かについても検証する。1病原因子および耐性因子の遺伝子学的解析等、株ライブラリー作成に関する費用50万円2菌体由来病原因子および耐性因子のクローニングおよび精製、並びにMALDI解析に関する諸費用50万円3臨床材料からの病原体直接同定法について臨床データとの相関解析に関する費用10万円
細胞破壊と細胞組み込みによる新たな悪性腫瘍治療法の開発

悪性腫瘍の外科的対処として,切除した骨に液体窒素凍結などにより細胞破壊処理を加え,これを再植する方法がある.この生着率改善のため培養細胞利用の有用性について検討した.実験にはラットを用い,手術部位は下顎骨の顎角部に設定した.骨片をリン酸緩衝液(対照群),骨髄間質細胞懸濁液(実験群1),細胞培養上清液(実験群2)の各に浸漬処理し再植した.再植骨内の生細胞数の比率は術後2,4週とも対照群と比べ実験群2では有意に高かった.再植骨は術後2,4週で経時的に周囲から吸収が進み,実験群2ではさらに骨形成が認められた.細胞培養上清は細胞破壊処理骨の生着率を改善するうえで有用であることが示唆された.本年度は定量的な評価をした.下顎骨の片側を区域切除し,形成した骨片に液体窒素凍結処理を施し,それに1細胞なし,2骨髄単核細胞,3培養骨髄間質細胞のそれぞれを組み込んだうえで再植し,その後の治癒過程をX線学的,組織学的に評価した.組み込む細胞の種類,数,分化度,適用方法を変数にした条件を設定し,組み込み処理についての至適条件を,さらにその条件の組み合わせにより最適条件を求めた.具体的な実験概要は以下の通りである.1.実験動物:ラットを用いた.2.細胞培養:骨髄液を採取し,骨髄間質細胞を分離,培養し増殖させた.培養過程で細胞を蛍光標識した.3.手術および骨片等処理:術中に以下の(1)から(5)まで進めた.(1)下顎骨部分切除:下顎片側だけ下顎骨角部から骨膜を含めて部分切除をした.(2)骨片の液体窒素凍結処理:ヘパリン加生食水で洗浄し骨膜を除去した骨片に,凍結時の破折防止のため1mm間隔で皮質骨を穿孔した.骨片を液体窒素中に10分間浸漬した後に5分間の室温放置,5分間の生食水中浸漬をした.(3)骨髄単核細胞分離:骨髄液をから,percoll密度勾配遠心法により単核細胞分画を調製した.細胞は蛍光標識をした.(4)組み込み処理とその条件設定:骨片の穿孔部から次の一定量を注入した.対照群1細胞なし(リン酸緩衝液),実験群2骨髄単核細胞,3骨髄間質細胞とした.(5)再植:骨片を復位し固定し顎下部を閉創した.4.評価:術後2,4,8週でX線学的および組織学的に骨片とその周囲を観察した.蛍光顕微鏡像を画像解析し,それぞれから骨微細構造と細胞の動態を把握し,結果を評価した.形成した骨片に液体窒素凍結処理を施し,組み込む細胞の種類,数,分化度,適用方法を変数にした条件を設定し,組み込み処理についての至適条件を,さらにその条件の組み合わせにより最適条件を求めた.本年度は培養上清の応用を検討項目に加えた.骨を区域切除し,形成した骨片に液体窒素凍結処理を施し,それに1細胞なし,2培養骨髄間質細胞,3その培養上清のそれぞれを組み込んだうえで再植し,その後の治癒過程をX線学的,組織学的に評価した.組み込む細胞の種類,数,分化度,適用方法を変数にした条件を設定し,組み込み処理についての至適条件を,さらにその条件の組み合わせにより最適条件を求めた.実験概要は以下の通りである.実験動物はラットを用いた.細胞培養は骨髄液を採取し,骨髄間質細胞を分離,培養し増殖させた.培養過程で細胞を蛍光標識した.手術および骨片等処理は術中に以下の(1)から(5)まで進めた.(1)下顎骨部分切除:下顎片側だけ下顎骨角部から骨膜を含めて部分切除をした.(2)骨片の液体窒素凍結処理:ヘパリン加生食水で洗浄し骨膜を除去した骨片に,凍結時の破折防止のため1mm間隔で皮質骨を穿孔した.骨片を液体窒素中に10分間浸漬した後に5分間の室温放置,5分間の生食水中浸漬をした.(3)培養上清調製:培養に用いた無血清培地を遠心分離することにより上清を得た.(4)組み込み処理とその条件設定:骨片の穿孔部から次の一定量を注入した.対照群1細胞なし(リン酸緩衝液),実験群2骨髄間質細胞,3培養上清とした.(5)再植:骨片を復位し固定し顎下部を閉創した.評価は術後2,4,8週でX線学的および組織学的に骨片とその周囲を観察した.蛍光顕微鏡像を画像解析し,それぞれから骨微細構造と細胞の動態を把握し,結果を評価した.形成した骨片に液体窒素凍結処理を施し,組み込む細胞の種類,数,分化度,適用方法を変数にした条件を設定し,組み込み処理についての至適条件を,さらにその条件の組み合わせにより最適条件を求めた.悪性腫瘍の外科的対処として,切除した骨に液体窒素凍結などにより細胞破壊処理を加え,これを再植する方法がある.この生着率改善のため培養細胞利用の有用性について検討した.実験にはラットを用い,手術部位は下顎骨の顎角部に設定した.骨片をリン酸緩衝液(対照群),骨髄間質細胞懸濁液(実験群1),細胞培養上清液(実験群2)の各に浸漬処理し再植した.再植骨内の生細胞数の比率は術後2,4週とも対照群と比べ実験群2では有意に高かった.

再植骨は術後2,4週で経時的に周囲から吸収が進み,実験群2ではさらに骨形成が認められた.細胞培養上清は細胞破壊処理骨の生着率を改善するうえで有用であることが示唆された.本年度は定性的な評価をした.下顎骨の片側を区域切除し,形成した骨片に液体窒素凍結処理を施し,それに(1)細胞なし,(2)骨髄単核細胞,(3)培養骨髄間質細胞のそれぞれを組み込んだうえで再植し,その後の治癒過程をX線学的,組織学的に評価した.具体的な実験概要は以下の通りである.1.実験動物:ラットを用いた.2.細胞培養:骨髄液を採取し,骨髄間質細胞を分離,培養し増殖させた.培養過程で細胞を蛍光標識した.3.手術および骨片等処理:術中に以下の(1)から(5)まで進めた.(1)下顎骨部分切除:下顎片側だけ下顎骨角部から骨膜を含めて部分切除をした.(2)骨片の液体窒素凍結処理:ヘパリン加生食水で洗浄し骨膜を除去した骨片に,凍結時の破折防止のため1mm間隔で皮質骨を穿孔した.骨片を液体窒素中に10分間浸漬した後に5分間の室温放置,5分間の生食水中浸漬をした.(3)骨髄単核細胞分離:骨髄液をから,percoll密度勾配遠心法により単核細胞分画を調製した.細胞は蛍光標識をした.(4)組み込み処理とその条件設定:骨片の穿孔部から次の一定量を注入した.対照群(1)細胞なし(リン酸緩衝液),実験群(2)骨髄単核細胞,(3)骨髄間質細胞とした.(5)再植:骨片を復位し固定し顎下部を閉創した.4.評価:術後2,4,8週でX線学的および組織学的に骨片とその周囲を観察した.蛍光顕微鏡像を画像解析し,それぞれから骨微細構造と細胞の動態を把握し,結果を評価した.このフィードバックにより実験系を再構築している.研究計画に無理がなく,その内容が妥当であったためであると考える.研究計画に無理がなく,その内容が妥当であったためであると考える.平成23,24年度に得られた結果を基にして,臨床への応用および展開を視野に入れて検討する.骨片に骨膜付きの条件も設定し,生着に及ぼす影響を調べる.さらに骨以外に筋や神経,血管についても同様の試みを検討する.それらは単体のみならず,骨を中心に複合した状態も想定する.平成23年度に得られた結果を基にして,その定性的評価を継続するのとあわせて,次の定量的な評価もする.下顎骨の片側を部分切除し,形成した骨片に液体窒素凍結処理を施し,組み込む細胞の種類,数,分化度,適用方法を変数にした条件を設定し,組み込み処理についての至適条件を求める.さらにその条件の組み合わせにより最適条件を求める.また骨片に骨膜付きの条件も設定し,生着に及ぼす影響を調べる.さらに骨以外に筋や神経,血管についても同様の試みを検討する.それらは単体のみならず,骨を中心に複合した状態も想定する.さらに骨再生医療について同様の取り組みをしているドイツのフライブルク大学に,日本学術振興会特定国派遣研究者として,訪問し情報交換をする.ここで単に情報を得るだけにとどまらず,今後の共同研究に発展させることができるような基盤づくりに励む.該当なし.おもに消耗品などの物品費に,またフライブルク大学での情報収集に必要な物品にも充当する.
植物細胞内における余剰なリピッドボディの消失調節機構の解析

(1)子葉細胞内でのリピッドボディの消失調節機構について発芽後の暗所生育5日目の細胞に見られるリピッドボディを取り巻く膜構造が、小胞体であるのか、オートファジーの隔離膜であるのかを確かめるために、昨年度に引き続き、免疫電子顕微鏡解析をおこなった。その結果、この膜は小胞体である可能性が高いことが再び示唆された。そこで、子葉の発達段階に応じてリピッドボディが小胞体やその他のオルガネラとどのような相互関係を持って挙動しているのかを把握するために、いくつかのオルガネラ可視化形質転換体を用いたレーザー顕微鏡解析をおこない、同時に電子顕微鏡解析もおこなった。さらに、子葉細胞内のリピッドボディの消失が著しく遅い変異体について、その表現型解析をおこない、リピッドボディの大きさや分布異常を調べるとともに、この変異株においても野生株と同じく、リピッドボディを取り巻く膜構造が存在するのかなどを調べた。(2)緑藻細胞内におけるリピッドボディの消失機構について窒素飢餓から回復する細胞内の微細構造を電子顕微鏡で詳細に観察し、細胞内のリピッドボディの継時的な変化を調べた。さらにリピッドボディと酸性コンパートメントの位置関係をレーザー顕微鏡を用いて調べ、オートファゴゾームの蛍光検出も試みた。その結果、リピッドボディは窒素飢餓解除後速やかに消失すること、最終的には液胞の運ばれて分解されていることを確認した。また、窒素飢餓解除後におけるオートファジー関連因子の発現解析や細胞内のオートファゴゾーム検出のための免疫電子顕微鏡解析もおこなった。子葉細胞内でのリピッドボディの消失調節機構については、免疫電子顕微鏡解析の結果、リピッドボディを取り巻く膜状構造体が小胞体である可能性を示唆するデータを得た。そこで、子葉細胞におけるリピッドボディと様々なオルガネラとの相互関係についてのこれまでのデータを整理し、現在まで得られてきた結果の一部を用いてレビュー論文を作成した。また、緑藻細胞内におけるリピッドボディの消失機構についても、計画通り、細胞内の微細構造の観察とオートファジー関連因子の発現解析を行い、窒素飢餓解除後のリピッドボディ消失がオートファジーである可能性を示唆するいくつかのデータを得た。そのため、本年度の目的は概ね達成されたと考える。(1)子葉細胞内でのリピッドボディの消失調節機構について当初は、リピッドボディを取り巻く膜構造はオートファジーの隔離膜である可能性があるために、子葉細胞内の余剰なリピッドボディはマクロオートファジーによって分解されると考えていた。しかし、現在までの結果からは、注目していたリピッドボディを取り巻く膜はおそらく小胞体であると考えられる。そこで、今後はミクロオートファジーによるリピッドボディ消失機構の可能性について検証する。具体的には、暗所生育の子葉に光を当て、継時的なリピッドボディの局在の変化を調べることや、培地内の糖の有無によるリピッドボディの量や局在の違いなどを調べ比較する。また、当初計画通り、リピッドボディの消失時のオートファジー関連因子の発現解析もおこなう。(2)緑藻細胞内におけるリピッドボディの消失機構について現在のところ、窒素飢餓解除後のリピッドボディ消失にオートファジーが関与していることが示唆されている。しかし、明瞭なオートファゴゾーム構造が電子顕微鏡解析によって確認されていない。そこで、電子顕微鏡を用いた細胞内の詳細な形態解析を引き続きおこなうとともに、免疫電子顕微鏡解析によってもオートファゴゾームの検出を行う。(1)子葉細胞内でのリピッドボディの消失調節機構シロイヌナズナの発芽後5日間暗所生育させた子葉細胞内にはまだリピッドボディが多く存在している。しかし、3日間暗所生育後の子葉に光を照射すると細胞は光合成能を獲得し、細胞内からリピッドボディは速やかに消失する。この子葉の緑化に伴う余剰な貯蔵脂肪の消失には、グリオキシソームの代謝機構に依存しない消失機構が存在していると考えられる。そこで、子葉細胞内に見られるリピッドボディを取り巻く膜状構造体に着目しながら、子葉の緑化過程でのリピッドボディの消失調節機構について解析している。本年度は、まず、リピッドボディを取り巻く膜状構造体が光の照射によって誘導されて出現するのか調べた。その結果、光照射30分前後の子葉細胞において出現頻度が最も多いこと、その他の照射時間でも量は少ないがある程度出現していることが明らかとなった。また、オートファジー関連因子ATG8の抗体や小胞体にGFPが蓄積する株(GFP-h)株における抗GFP抗体を用いた免疫電子顕微鏡解析を行い、この膜状構造体が小胞体であるのか、オートファゴゾームであるのかを調べた。(2)緑藻細胞内におけるリピッドボディの消失機構緑藻細胞内における余剰なリピッドボディの消失調節機構を解析するために、本年度は、窒素飢餓により一旦形成が誘導されたリピッドボディが飢餓解除後にどのように消失するかを形態学的に調べた。ナイルレッド染色により窒素飢餓3日目には細胞内に明瞭なリピッドボディが形成されていることが確認できたので、窒素飢餓3日目および、その後飢餓解除して時間経過を追った細胞内の構造変化を電子顕微鏡で観察した。子葉細胞内でのリピッドボディの消失調節機構については、計画通り実験を行い、光照射30分前後の子葉細胞において、リピッドボディを取り巻く膜状構造体が確実に存在していることを明らかにした。

そして、この子葉細胞内に存在するリピッドボディを取り巻く膜状構造体の存在をフェリシアン化カリウムを用いた固定法によって明瞭に電子顕微鏡で捉えCytologiaのテクニカルノートに発表した。また、免疫電子顕微鏡解析からは、この膜状構造体が小胞体であることを示唆する結果を得ている。緑藻細胞内におけるリピッドボディの消失機構についても、計画通り実験を行い、現在までに、オートファジーである可能性を示唆するデータを得ていることから、初年度の目的は概ね達成されたと考える。(1)子葉細胞内でのリピッドボディの消失調節機構について発芽後の暗所生育5日目の細胞に見られるリピッドボディを取り巻く膜構造が、小胞体であるのか、オートファジーの隔離膜であるのかを確かめるために、昨年度に引き続き、免疫電子顕微鏡解析をおこなった。その結果、この膜は小胞体である可能性が高いことが再び示唆された。そこで、子葉の発達段階に応じてリピッドボディが小胞体やその他のオルガネラとどのような相互関係を持って挙動しているのかを把握するために、いくつかのオルガネラ可視化形質転換体を用いたレーザー顕微鏡解析をおこない、同時に電子顕微鏡解析もおこなった。さらに、子葉細胞内のリピッドボディの消失が著しく遅い変異体について、その表現型解析をおこない、リピッドボディの大きさや分布異常を調べるとともに、この変異株においても野生株と同じく、リピッドボディを取り巻く膜構造が存在するのかなどを調べた。(2)緑藻細胞内におけるリピッドボディの消失機構について窒素飢餓から回復する細胞内の微細構造を電子顕微鏡で詳細に観察し、細胞内のリピッドボディの継時的な変化を調べた。さらにリピッドボディと酸性コンパートメントの位置関係をレーザー顕微鏡を用いて調べ、オートファゴゾームの蛍光検出も試みた。その結果、リピッドボディは窒素飢餓解除後速やかに消失すること、最終的には液胞の運ばれて分解されていることを確認した。また、窒素飢餓解除後におけるオートファジー関連因子の発現解析や細胞内のオートファゴゾーム検出のための免疫電子顕微鏡解析もおこなった。子葉細胞内でのリピッドボディの消失調節機構については、免疫電子顕微鏡解析の結果、リピッドボディを取り巻く膜状構造体が小胞体である可能性を示唆するデータを得た。そこで、子葉細胞におけるリピッドボディと様々なオルガネラとの相互関係についてのこれまでのデータを整理し、現在まで得られてきた結果の一部を用いてレビュー論文を作成した。また、緑藻細胞内におけるリピッドボディの消失機構についても、計画通り、細胞内の微細構造の観察とオートファジー関連因子の発現解析を行い、窒素飢餓解除後のリピッドボディ消失がオートファジーである可能性を示唆するいくつかのデータを得た。そのため、本年度の目的は概ね達成されたと考える。まずは、現在行なっている電子顕微鏡解析を推し進め、確実なデータを揃えることを優先させる。また、計画書の通り、平成30年度からは、ペルオキシソームにおける脂肪酸β酸化系酵素の発現量やオートファジー関連因子の遺伝子発現量の解析、および脂質量の変化の測定に入り、これまでに得られている形態学的解析結果との考察や裏づけなどを行い、植物細胞における余剰なリピッドボディの消失調節機構について掘り下げていく予定である。