hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
炎症性サイトカインによる歯周病原性細菌の増殖促進機構の解明

その結果、供試した7菌属19菌種の中で強い結合性が認められたものは次の3菌属であった。供試した3株のA.a.(Y4,29522,29523)はIL-1alpha、IL-1betaおよびIL-6と結合し、その強さはIL-6>IL-1beta>IL-1alphaの順であった。また供試した4株のFusobacterium(F.nucleatum,F.periodonticum,F.simiae,F.mortiforum)はIL-1betaおよびIL-6に対し同程度の結合性を示した。IL-1betaおよびIL-6への結合性の強さはFusobacteriumに比べA.a.の方がやや強い値を示した。一方供試したP.gおよびP.i.の中で3株(P.g.W50,W83,P.i.25611)がIL-1alphaおよびIL-1betaと結合性を示したが、その結合性は顕著ではなかった。1.ヒトサイトカインレセプターとの相同性の比較:これまでの結果からある種の歯周病原性細菌が炎症性サイトカインと結合している可能性が示唆されたので、細菌表層に存在するサイトカインレセプターがヒトサイトカインレセプターと相同性があるか否かを遺伝子レベルで検討した。Log phase状態にある菌体からゲノムDNAを抽出し、ヒトIL-1R(I),(II)及びIL-6レセプター特異的プライマーを用いてPCRによりDNAの増幅を行った。IL-R(I),(II)の発現はActinobacillusにのみ認められ、その他のPorphyromonas,Prevotella,Fusobacterium及びCapnocytophagaでは発現は認められなかった。一方、IL-6の発現はいずれの供試菌においても認められなかった。細菌に対するオートクリン機構の検討:レセプターを有する細菌がIL-1又はIL-6様生理活性物質を産生しているか否かを検討する目的で細菌培養液中のIL-1α,β及びIL-6活性を測定した。IL-1αの産生はFusobacteriumとCapnocytophagaで僅かに認められたがその値は有意でなかった。IL-1βの産生はすべての供試菌に微量の検出が認められ、中でもActinobacillusは高い値を示した。IL-6の産生はすべての供試菌で認められなかった。以上の結果をまとめると歯周病原性細菌の中でもActinobacillus属はIL-1α,β及びIL-6の添加で発育が促進し、更にIL-1α,β及びIL-6と結合した。また、その細胞表層にIL-1Rを発現し、更にIL-1βを産生している可能性が示唆された。それ故、ActinobacillusやFusobacterium等の歯周病原性細菌が歯周組織細胞を刺激してIL-1をより高率に分泌させ、分泌されたIL-1を利用して細菌が更に増殖し再びIL-1の産生を誘導するという新しい調節機構が一部証明されたことになる。今後、レセプターの所在、構造を明らかにすることで上記の仮説の裏付けを行う。
血管局所の11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase活性-高血圧発症への関与-

11β-hydroxysteroid denydrogenase type2(11β-HSD2)はコルチゾール(ラットではコルチコステロン)をその不活性体コルチゾン(11dehydro-コルチコステロン)に変換する酵素である。ミネラルコルチコイド(MC)受容体はコルチゾールおよびアルドステロンに対し同等の親和性を有するので、濃度的に1001000倍過剰なコルチゾールのMC作用が顕在化しないよう腎臓などのMC標的臓器で11β-HSD2は防御的に機能している。以前より、本態性高血圧症患者の一部や高血圧自然発症ラットの抵抗血管でのこの活性の低下が知られていたが、高血圧発症への関与は必ずしも明らかではなかった。本研究は本態性高血圧発症に果たす11β-HSD2活性の病態生理的意義の解明を目的としている。平成12年度はラット血管抵抗におよぼす11β-HSD2活性の影響をin vivoにて検討した。1012週齢のWisterラットならびに高血圧自然発症ラットを11β-HSD2活性の阻害剤であるグリチルリチン酸含有食にて1週間飼育し、腸間膜動脈の血管径を計測した。さらに以上の条件下で灌流用カテーテルよりの持続注入コルチコステロンと血管径との用量反応曲線を観察した。その結果、コルチコステロンの血管トーヌス亢進作用が11β-HSD2活性の低下時に増強されることが明らかになった。従来、11β-HSD2活性の障害により惹起される血圧上昇は腎でのMC過剰に由来すると考えられてきた。しかし、本研究により血管壁での11β-HSD2活性の低下それ自体が血管トーヌスを増加させることで、血圧上昇を引き起こすメカニズムと成り得ることが明らかになった。11β-hydroxysteroid dehydrogenase type2(11β-HSD2)はコルチゾール(F)をその不活性体コルチゾンに変換する酵素である。ミネラルコルチコイド(MC)受容体はFおよびアルドステロンに対し同等の親和性を有するので、濃度的に1001000倍過剰なFのMC作用が顕在化しないよう腎臓などのMC標的臓器で11β-HSD2は防御的に機能している。平成11年度はまず、血管平滑筋細胞における11β-HSD2の遺伝子発現、酵素活性をそれぞれRT-PCR、薄層クロマトグラフ法を用いて確認した。FはアンジオテンシンII(AngII)などの血管収縮性物質の受容体数を増加させることにより血管トーヌスを亢進させることが知られている。そこで次に、このF作用に及ぼす11β-HSD2活性の影響を検討した。あらかじめアンチセンスDNAにて特異的に11β-HSD2を低下させておくと、生理的濃度のF負荷によりAngII結合能は約2.5倍に増加することが明らかになった。その増加の約70%はグルココルチコイド受容体、残り約30%はMC受容体を介して行われていた。以上の結果はFの血管トーヌス亢進作用が11β-HSD2活性の低下時に増強されることを示している。しかし、本研究により血管壁での11β-HSD2活性の低下それ自体が血管トーヌスを増加させることで、血圧上昇を引き起こすメカニズムに成り得ることが明らかになった。
宇宙X線背景放射に関わる活動銀河核の研究

この研究は種類の異る活動銀河の性質を調べ活動銀河の共通性と宇宙X線背景放射の起源について追及をすすめた。1型のセイファート銀河ではOVIIやOVIIIの吸収線を示す高温のガスが充満していることがほぼ共通の性質として見つかった。しかし、2型セイファート銀河ではこの吸収線が見つかっていない。このことはOVIIやOVIIIの吸収を起こす高温ガスは活動銀河核の中心近くにあるため、2型セイファート銀河に特有な濃いガスが中心核近くを隠しているためと解釈される。このことは、Circinus銀河と言う2型セイファート銀河のX線観測で特徴づけられた。Circinus銀河のX線スペクトルは6.4keVの鉄の輝線が強くスペクトルはフラットで、主として散乱と蛍光のX線から成っていると解釈された。このスペクトルは連星X線パルサーのX線スペクトルのうちパルサーが隠された散乱と蛍光のみから成るスペクトルに酷似している。一方、強い電波をだすクエサ-で距離の遠いもの(z>1)に限って10個のX線スペクトルを調べたところ7つのクエサ-でそれ自身が比較的強いガスで覆われていることがわかった。つまりX線のスペクトルから吸収ガスの柱密度をだしたところ、7割が21センチ波で決められているわが銀河系内ののガスよりも大きな吸収を受けていることが分かった。吸収をうけたX線スペクトルは一般に冪指数が小さくなる。これらを足し合わせるとX線の背景放射のスペクトルが説明できる。X線冪指数の小さい活動銀河核の数の分布とX線光度の分布を調べて、X線背景放射の構成要素となる活動銀河は比較的X線光度の弱い活動銀河で吸収を受けて冪指数が小さくなっているか、それ自身冪が小さい活動銀であるとの結論を得た。
災害形態が企業の事業継続に与える影響評価システムの開発

企業の事業継続は,刻々と変化する社会ニーズへの対応が求められていると同時に,顧客への供給責任を果たすために災害等の予期せぬ事態への備えが欠かせない.本研究は,災害形態による企業の事業継続への影響を,事業所拠点と取引先の立地から量的に把握し,企業が事業継続戦略を立案する際に利用可能な影響評価システムの開発を目的としている.研究2年目である当該年度においては,研究対象地域である香川県に所在する事業所にとって最悪の被災シナリオを明らかにすることを目的とした.具体的には,研究1年目に明らかにした間接被災と直接被災による産業別影響シナリオに基づき,香川県内企業の立地地域・産業毎の影響を把握する.手法は,香川県が実施した被害想定結果のうち,人的被害(死者,負傷者,避難者数)に各産業の労働者数と労働生産性(円/人)を乗じることによって量的に明らかにした.また,地域間産業連関表を用いて事業所の立地地域・産業別の影響を取引額全体の割合に対する取引先地域(地方ブロック単位)への比率で評価した.得られた評価結果を用いて,高松市内の事業所をユーザーとして想定したケーススタディを実施した.結果,自社の立地地域や香川県内の取引先が南海トラフ地震により経済的にどのような影響があるのか量的に,かつ,他の産業や香川県内他地域の状況と相対評価が可能となった.また,自社産業の消費地について,香川県内の総生産量が地方ブロック単位でどのブロックで消費されているのか,全体に占める比率として把握可能となった.本評価結果は,企業が自社の操業上の自然災害に対するリスクを把握する上で有用な情報であるといえる.本研究の実施は3ヵ年を予定している.申請当初の予定通り調査を実施しており,研究計画は概ね順調に進展している.研究最終年度である次年度は,香川県内企業の利用を想定した事業継続影響評価システムを開発する予定である.研究実施にあたっては,プロトタイプの開発によりモデル企業を対象としたケーススタディと運用テストを行う予定である.企業の事業継続は,刻々と変化する社会ニーズへの対応が求められていると同時に,供給責任を果たすために災害等の予期せぬ事態への備えが欠かせない.本研究は,災害形態による企業の事業継続への影響を,事業拠点と取引先の立地から量的に把握し,企業が事業継続戦略を立案する際に利用可能な影響評価システムの開発を目的としている.研究初年度である今年度においては,災害が社会経済に与える影響を企業の視点で被災形態別に明らかにした.被災形態は,香川県をモデル地域に今後発生が懸念されている南海トラフ地震等の海溝型で広域な被害が想定される災害と,直下型地震等の狭域で甚大な災害を対象とした.具体的には,まず,調査対象を香川県内企業とし1香川経済同友会会員327社(主に大企業,中堅企業)と2高松商工会議所・香川県商工会会員企業889社(主に中小企業)へ防災対策・事業継続計画(BCP)策定状況のアンケート調査を実施した.調査結果の内,1は過年度の2012年(東日本大震災後)に実施した調査結果と比較し,東日本大震災と熊本地震による香川県内企業への影響を量的に明らかにした.結果,防災対策やBCP策定は,組織規模の大きな企業では着実に進展しているものの,中小企業(特に小規模事業者)においてはBCPの策定率は低く,加えて耐震対策や安否確認対策等の防災対策の整備は十分でないことが明らかとなった.次に,経済産業省か公開しているウエブシステムRESASから香川県内17市町毎・産業別経済指標を抽出し,間接被災と直接被災別に産業に与える影響シナリオを明らかにした.本研究の実施は3ヵ年を予定している.申請当初の予定通り調査を完了しており,研究計画はおおむね順調に進展している.企業の事業継続は,刻々と変化する社会ニーズへの対応が求められていると同時に,顧客への供給責任を果たすために災害等の予期せぬ事態への備えが欠かせない.本研究は,災害形態による企業の事業継続への影響を,事業所拠点と取引先の立地から量的に把握し,企業が事業継続戦略を立案する際に利用可能な影響評価システムの開発を目的としている.研究2年目である当該年度においては,研究対象地域である香川県に所在する事業所にとって最悪の被災シナリオを明らかにすることを目的とした.具体的には,研究1年目に明らかにした間接被災と直接被災による産業別影響シナリオに基づき,香川県内企業の立地地域・産業毎の影響を把握する.手法は,香川県が実施した被害想定結果のうち,人的被害(死者,負傷者,避難者数)に各産業の労働者数と労働生産性(円/人)を乗じることによって量的に明らかにした.また,地域間産業連関表を用いて事業所の立地地域・産業別の影響を取引額全体の割合に対する取引先地域(地方ブロック単位)への比率で評価した.得られた評価結果を用いて,高松市内の事業所をユーザーとして想定したケーススタディを実施した.結果,自社の立地地域や香川県内の取引先が南海トラフ地震により経済的にどのような影響があるのか量的に,かつ,他の産業や香川県内他地域の状況と相対評価が可能となった.また,自社産業の消費地について,香川県内の総生産量が地方ブロック単位でどのブロックで消費されているのか,全体に占める比率として把握可能となった.本評価結果は,企業が自社の操業上の自然災害に対するリスクを把握する上で有用な情報であるといえる.本研究の実施は3ヵ年を予定している.申請当初の予定通り調査を実施しており,研究計画は概ね順調に進展している.

次年度は,香川県に最も経済被害が深刻となる被害パターンを抽出し,被災シナリオを明らかにする予定である.研究実施にあたっては,研究成果の利活用イメージを見据えた被災シナリオ作成や既往災害の被害教訓に基づく減災対策を明らかにする予定である.研究最終年度である次年度は,香川県内企業の利用を想定した事業継続影響評価システムを開発する予定である.研究実施にあたっては,プロトタイプの開発によりモデル企業を対象としたケーススタディと運用テストを行う予定である.平成29年度は旅費を伴う打ち合わせ回数が当初予定より少なくて済んだことにより残金が生じた.次年度使用額については,システム開発にかかる打ち合わせや旅費を伴う学会への支出等について使用する予定である.学会開催地が近傍地であったことなどから,国内旅費が予定より小額で対応可能となり次年度使用額が生じた.
PCR-SSP法による血痕、毛髪からのHLA class IIタイピングについて

毛髪は毛根部と毛幹部に分け血痕と同様に操作し、PCRは40サイクル行った。DNA量10pg/PCR reaction mixtureで検出が可能であった。毛根部0.5cmを5本使用したときは全例、毛幹部510cmからは約半数がタイピングできた。毛髪1本では毛根鞘の多く付着したものはタイピングできた。毛幹全例が検出可能になる方法を確立することが今後の課題であるが、この研究によりPCR-SSP法で血痕、毛髪のHLA class IIタイピングが可能であることを証明した。
性ホルモン分泌調節における神経ペプチド受容体機能制御の分子基盤の解明

哺乳動物のGnRH分泌を制御するキスペプチン類やニューロキニン類の受容体に対する選択的リガンドや特異的プローブの創製を行った。まず、キスペプチン類をもとにした蛍光プローブ及び光親和性プローブ及び蛍光プローブを設計・合成し、これらのプローブがGPR54受容体の検出に利用可能であることを明らかにした。また、NK3受容体アゴニストの構造活性相関研究を行い、ペプチドミメティクス等の利用により生体内で安定な新規選択的リガンドを創製するとともに、生殖中枢の調節に利用可能であることを明らかにした。本研究は、哺乳動物の2つの異なる性ホルモン分泌様式へのキスペプチン類の寄与を精査するべく、神経ペプチド類の受容体選択性や視床下部-下垂体系における受容体分布との関連を明らかにすることを目的としている。平成23年度は、GPR54および性ホルモン分泌の制御に関わることが報告された関連GPCRの発現細胞株の調製と、受容体局在を検出するためのプローブ分子の設計と合成を行った。[受容体選択的リガンドと分子プローブの創製]全長キスペプチンのSer5, Ser10, Gln15, Ser20, Arg25, Pro30, Leu35, Lys40およびTyr45Leu52のいずれかの残基をシステインに置換し、マレイミドを介して光反応性官能基を導入することにより光反応性プローブを調製した。GPR54発現細胞株への標識実験において、Pro30, Leu35, Lys40, Tyr45, Asn46およびTrp47に標識基を導入したプローブでGPR54の認識が認められ、これらのアミノ酸残基が受容体との結合に副次的に関与していることが示唆された。同様の手順でKp-14をもとにしたプローブを作成し、Trp47に相当するアミノ酸残基に標識基を導入したプローブのGPR54への結合を確認した。[受容体活性化の分子メカニズムとキスペプチン類の生理作用の解明への応用]各種のタグ・蛍光タンパク質を融合したGPR54受容体および関連受容体の発現細胞株について、内因性リガンドの結合活性およびアゴニスト活性を評価し、一部を除いて目的の機能を有する受容体が細胞膜上に発現していることを確認した。GPR54発現細胞株では、期待されたリガンド添加による細胞内Ca2+濃度の変化が認められ、リガンド・プローブの機能評価に利用できることを確認した。平成25年度は、新たな光アフィニティープローブの創製を検討するとともに、GnRHの分泌調節に関与することが報告された2つのGPCRに対する新規リガンドの創製に向けた基礎的知見を得た。[受容体選択的リガンドと分子プローブの創製]平成24年度までの研究により得られたGPR54受容体蛍光プローブは、中枢における受容体局在の解析のためのツールとして利用するために改良が必要であることが判明した。このため、ラットKp-14の活性発現に必要ないくつかのアミノ酸を光反応性官能基を有するアミノ酸に変換した新たなプローブを設計し、GPR54受容体結合活性および関連受容体に対する選択性を評価した。また、これまでに報告されたニューロキニン-3受容体(NK3R)選択的リガンドの生体試料中での分解特性を解析するとともに、複数の高活性新規リガンドを創製した。[受容体活性化の分子メカニズムとキスペプチン類の生理作用の解明への応用]平成24年度までに創製したGPR54蛍光プローブが、リガンド添加時のGPR54受容体の局在変化の観察に利用できることを明らかにした。また、全長キスペプチンのin vivo評価を共同研究により実施し、化学合成により得られた全長キスペプチンが効果的に卵胞発育を促すことを実証した。さらに、動物種により異なるとされる中枢からのGnRH/LH分泌調節メカニズムについて精査する目的で、各種動物種の神経ペプチド受容体を発現する細胞株を新たに調製した。平成24年度は、GPR54蛍光プローブの創製と応用に加え、新たにGnRHの分泌制御に関わることが示唆されたニューロキニン受容体に関する実験系の構築を行った。[受容体選択的リガンドと分子プローブの創製]

平成23年度の研究により得られた知見をもとに、げっ歯類の中枢におけるキスペプチン受容体の局在を解析するための蛍光プローブをKp-54およびKp-14の配列に基づいて設計し、蛍光色素の異なる複数のプローブ分子を得た。新たに作成したGPR54受容体細胞株の利用により、得られたプローブが期待される受容体調節機能を有していることを確認した。また、in vivo実験での機能評価に利用する目的で各種哺乳動物種の全長キスペプチン類の調製法を確立した。[受容体活性化の分子メカニズムとキスペプチン類の生理作用の解明への応用]近年GnRHニューロンの機能調節に関与しているとの知見が報告されたGPR54以外のGPCRの機能評価を行うためのリガンド・プローブの創製に着手した。ニューロキニン受容体をはじめとする各種GPCRの安定発現細胞株を調製するとともに、ニューロキニンBの配列をもとに構造活性相関研究を展開し、受容体活性化と受容体認識の選択性に関わるアミノ酸残基を同定した。また、一部のGPCRに対する低分子リガンドの探索を目的として、京都大学薬学研究科で保有する化合物ライブラリーのスクリーニングを開始した。本研究は、各種神経ペプチド受容体に対するリガンド・プローブの創製を通して、哺乳動物における2つの異なるGnRH分泌様式に対するキスペプチン関連ペプチドやその受容体の寄与を明らかにすることを目的としている。平成26年度は、GPR54蛍光プローブの動物レベルでの機能評価を共同研究により実施するとともに、NK3受容体に対する選択的リガンドの構造最適化研究を行った。[キスペプチン関連受容体に対する選択的リガンド・プローブの創製]NK3受容体選択的リガンドの構造活性相関研究を展開し、強力な活性を維持しつつ生体成分中での安定性を向上した新規ペプチドを同定した。また、持続的な活性が期待できるペプチド性薬剤の創製を目指して、さまざまな修飾基を付与した新規ペプチドを設計した。さらに、リガンドのGnRH分泌の抑制的制御に関与すると報告されたκオピオイド受容体に対する新規選択的リガンドの創製に向けて、構造活性相関研究に適用可能な効率的な化学合成プロセスについて検討を行った。[各種受容体リガンドの機能評価と生理作用の解明への応用]平成25年度までに得られたGPR54蛍光プローブについて、ラットへの末梢投与によりLH分泌が促されることを確認した。一方で、これらのプローブは極微量でLH分泌を促すものの、蛍光プローブの脳内での集積は認められず、受容体局在の検出にはさらなるシグナルの増幅が必要であることが示唆された。また、新たに見出したNK3受容体リガンドが動物レベルで効果を示し、ペプチドミメティクスの利用によりその持続性が向上することを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。創薬化学26年度が最終年度であるため、記入しない。キスペプチン類の光反応性プローブを調製し、これを利用してキスペプチン上の受容体認識に関わる部分構造を明らかにした。また、受容体活性化のメカニズムを解析するための各種細胞株を調製し、目的の機能を有していることを確認した。得られたプローブや細胞株などのツールは、今後の受容体局在や活性化機構の解明研究の展開において有用なものである。全体を通して、4年計画の1年目で予定していた実施計画通りの進捗が達成できたと考えられる。GPR54
市民農園の法社会学的調査研究

従来の市民農園は、地方自治体の助成措置によって都市農家が農地を提供し、市民がきわめて小面積の区画を利用するものであり、農地法の適用下における暫定的なものであった。(「入園契約方式」という)。しかし一方では市民の要望の強さと,他方における農家例の労働力不足により市民農園の発展の条件が成熟してきた.そこで1989年に特定農地貸付法が制定されて農家に農地を市民農園に提供する公的な道を開き,1990年には市民農園整備促進法が制定されてその整備の軌道が敷かれた。しかし、従来の入園方式も認められている。上記の両法律とも,ドイツのクラインガルテン法と比較すると,土地利用計画上の位置づけが弱い。したがって市民農園計画においては、他の土地利用との調整を計画者が自主的に進める必要がある。また日本の市民農園は,ドイツのように都市施設に特化しては発展の余地が少い。ドイツの場合は、都市と農村が峻別されているのに対し、日本では両者が混在する境界をはっきりさせることが困難だからである。そこで日本については,都市型,都市近効型,農村型の三類型を考え、都市の緑地保全、都市農村の交流の実現、都市民とくに子供のうるおいある生活の保障という機能が適切に果せるようにする必要がある。全国の市町村はこの問題にきわめて熱心であるが,とくにこれから大都市における過密の問題を迎えようとしている所では具体的な計画を持ち始めているところが見られる.埼玉県,神奈川県,大阪府,福岡県,北海道などがその例である。その中で、帯広市,福岡市の計画は,本格的な施設整備を伴う点で将来のモデルとしての意味が大きい。いずれにしてもこの問題は,土地利用の現状と土地所有・土地利用に対するものの考え方に規定されており,その点に対する深い配慮なしには解決が困難である。今後もこれに対する法社会学的研究が要求される。
インターロイキン8を介した末梢血幹細胞動員の分子機序の解明と臨床応用

顆粒球コロニー刺激因子で刺激した好中球と血管内皮細胞(HUVEC)を共培養し、mRNAの発現のパタンからインターロイキン-8(IL-8)産生に関与する遺伝子群を抽出した。これらの遺伝子のmRNAと、細胞表面の蛋白が発現することを確認した。これらの遺伝子のうち、Toll like receptor-2の中和抗体やシグナル伝達経路の阻害ペプチドを用いると、HUVECからのIL-8の産生は3550%に減少した。顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)投与時に、好中球と血管内皮の相互作用によってインターロイキン-8(IL-8)が産生される分子機序をin vitroで解明し、次に臨床での末梢血造血幹細胞の安全で効率的な動員方法を確立することを目的としている。これまで、G-CSFで刺激した正常好中球と血管内皮細胞(HUVEC)を2日間共培養し、好中球、HUVECを分離し、それぞれからmRNAを抽出し、アレイ法(アフィメトリクス社製GeneChip[○!R]アレイ)でmRNAの発現を測定した。アレイ法のコントロールには、個別に培養した好中球とHUVECから抽出したmRNAを用いた。二つのアレイ法の結果から、発現に差のある遺伝子をリストアップした。このうち、10は好中球で、12は血管内皮でmRNAの発現が増加していることをreal time-PCRでも確認した。さらに、それぞれ5と6の遺伝子産物が、好中球とHUVECのそれぞれの細胞膜上に存在することをFACS確認した。これらの検討で、上記の遺伝子産物が、好中球と血管内皮の相互関係によってIL-8の産生に関与する可能性があることが判明した。これらの遺伝子産物が本当にIL-8産生に関与しているかどうか更に機能実験等で確認する必要があるが、もし産生に関与していることが確定すれば、それらの分子機序の調節機構を検討することによって、健常人からのG-CSFによる末梢血幹細胞採取に応用することが可能となり、非常に重要な知見となる。方法1.健常人の末梢血を採取し、リンフォプレップによって、好中球を分離し、G-CSF存在下で培養した。2.ヒト血管内皮細胞(HUVEC)を培養し、上記で示したG-CSFで刺激した好中球とHUVECを2日間共培養した。3.共培養の後、HUVECと好中球を分離し、それぞれの細胞から、mRNAを抽出し、好中球とHUVECで上昇する遺伝子をスクリーニングした。結果1.共培養後には、Toll-like receptor (TLR)2の発現が、非共培養に比較して、3.6倍に上昇していることがわかった(mRNAレベル)。2.同様の条件で培養した好中球を用いフローサイトメトリー(FACS)でTLR2が好中球表面での発現が増加している(非共培養の1.6倍)ことを確認した(蛋白レベル)。3.次に、TLR2に対する中和抗体を、上記2の培養系に用いて、TLR2の作用を阻害した。4.培養上清を用いてIL-8の産生をELISA法で検討したところ、中和抗体を用いなかった場合(阻害しない場合)に比べて、IL-8の産生は32%に抑制された。意義重要性これまでの研究によってG-CSFで動員された好中球と血管内皮の相互作用によってIL-8が産生されることがわかっていたが、今年度の研究によって、その相互作用の分子機序が解明された。これらの分子機序がわかることで、今後これらを標的とした薬剤(末梢血幹細胞を動員する薬剤)の開発や、G-CSFで動員されない、いわゆるpoor mobilizerの同定に役立てることができると考えられ、大変重要な結果である。顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)投与時に、好中球と血管内皮の相互作用によってインターロイキン-8(IL-8)が産生される機序を解明するために、G-CSFで刺激した正常好中球と共培養した血管内皮細胞(HUVEC)を用いて、mRNAの発現のパタンからIL-8産生に関与する遺伝子の候補を前年度までに抽出した。G-CSF刺激によって、あるいは好中球との共培養によって、これらの遺伝子のmRNAの発現が増加することをreal time-PCRで、蛋白が細胞表面に発現することをFACSで確認した。今年度は、これらの遺伝子のうち、TLRに注目した。共培養を行う時に、中和抗体を用いてTLR2をブロックすると、HUVECからのIL-8の産生が50%に減少することがわかった。さらに、TLRのシグナル伝達経路を阻害するペプチドを用いて共培養すると、やはりIL-8の産生は35%に減少した。TLR2の経路を遮断することでIL-8の産生が完全になくなるわけではないので、好中球と血管内皮の相互作用によってIL-8が産生される機序には、TLR2以外の分子も関与していることが示唆される。TLR2の遺伝子多型がが、IL-

8産生、ひいてはG-CSFによる末梢血への幹細胞の動員に及ぼす影響については、今後の検討を要する。今年度の目標であった、相互作用に働く分子を同定できたことは成果であると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後としては、まず、TLR2の発現が上昇することをTLR2のシグナル伝達の観点からさらに確認する必要がある。次に、当初の計画通り、実際にG-CSF投与を受ける患者の好中球においてTLR2の発現が上昇し、それに伴いIL-8産生が増加するかを確認する。また、poormobilizerを同定する目的で、TLR2およびIL-8のプロモーター領域の多型について検討する。
数学用語標準化の調査研究

一般に、学問分野の進歩、発展およびその正しい普及ならびに学術情報の円滑な流通を計るにあたって、研究者、学生、社会一般にとって学術用語の整理統一が必要不可欠であることはいうまでもない。とくに、その学問分野が、それ自身深い内容を持つと同時に他の諸分野の基礎であり広範な応用が行われ、かつ将来にあたってさらに重要となることが確実な分野であるならば、上述の必要性はなおさら強調されねばならない。数学がこのような学問分野の一つであることは疑いがない。数学における学術用語の整理統一は昭和29年「学術用語集数学編(文部省)」が刊行され、広く一般に流布し、数多くの研究、教育、応用諸分野の発展に大きく寄与してきた。しかし、この40年間において数学自身の発達が著しいのはもちろん、数学が一つの研究主題として重要な意味を持つ分野が増大し発展してきたことにより、一部の学術用語は使用度が減ずる一方で、新たに登場し一般に使用されている学術用語も少なくない。このような現状をふまえ、数学の学術用語を大幅に収録しなおし、物理学、工学、経済学等関連する諸分野の学術用語との調整を行いつつ整理統一し、その結果を広く公表することが本研究の目標である。日本数学会の全面的協力、日本数学教育学会と日本応用数理学会の会員の協力の下、3年間に及ぶ研究の結果、約1万語の数学学術用語を収集、整理し、それを電磁的記録及び冊子として公表することができた。今後はこの成果をもとにさらなる精選と整備を続けていくことになろうが、学術用語集数学編の改定版の編集に際して、基礎となるデータが得られたことが成果である。当初の研究目的は具体的な形をもつて成し遂げられたことになる。数学用語標準化の調査研究の初年度に当たる本年度は、数学の専門諸分野の研究と初等中東教育を含めた数学教育、及び理学、工学、社会科学等他分野における応用、という観点から、研究分担者が中心となって、関連する用語の採録を開始した。現段階では昭和29年版の用語集に採録された数学用語を、アルバイトを雇用し、データ・ベース化を進め一応終了したところである。このデータ・ベースを基にして、各領域ごとに日本語及び英語の両方にわたり学術用語の採録を行っている。昭和29年版の「学術用語集」と比べて今回の改訂版はかなり大きなものとなることが予想されるが、収集採録する学術用語をだいたい一万語程度とし、準備を進めている。次年度以降の研究の円滑な推進を図るため、研究協力者全員が数度にわたり一同に会し、編集方針及び細かい手順について意志統一をはかり、全体の方針を決定した。また、分野ごとに検討を進めるため、日本数学会の年会、総合分科会の機会を利用して数学会の会員の理解と協力を求める一方で、研究分担者あるいは必要に応じて各分野の専門家を各大学に派遣し資料の収集に努めた。さらに、日本数学会の各分科会の代表者及び全国主要大学の数学教室の代表者を一同に集めて会合を開き、全体計画について、概略の了解を得た。現地点での具体的な作業は順調に進んでいる。基本的な問題として、用語の採録にあたり、とくに物理学、統計学、情報科学との関連において、どの様な規準で取捨選択するか、ということが現実的問題となった。この点については、本科学研究費の研究班のもとに、各専門ごとに小委員会を作り、現在鋭意検討を進めている。本研究課題の目標は,約四十年間にわたる数学の発展および応用部門の拡大という現状のもとで,関連分野との調整を行いつつ,数学の学術用語を整理統一し,公表することである。数学用語標準化の調査研究の二年度目に当たる本年度は,第一次用語リストの作成を目指した。昨年秋には予備リストを作成し,用語の整理,英訳の確定作業を行っている。そのために,各大学にお願いしてアルバイトによりデータの整理を行った。何分専門的知識を必要とするため,大学院生にも応分の協力を求めた。現段階は純粋数学については全24巻の基礎数学講座の総索引のデータベースがあり,さらに,これに統計学関係,情報数学関係,応用数学関係と中等教育・研究関係の用語を付け加えたものが出来つつある。用語の整理については,各専門分野の研究者の協力が不可欠であるため,日本数学会の評議員に協力を求め同学会の分科会において小委員会を構成した。一方,本研究課題の研究分担者が,解析学,幾何学,代数学のほか,数学基礎論,函数方程式と函数論,確率論,応用数学,数理統計学,情報数学および数学教育関係の諸分野において用語の統括と整理に責任を持つ体制で鋭意作業を進めている。具体的な作業は広範な大学において行われているため,研究分担者あるいは必要に応じて各分野の専門家を諸研究機関に派遣し資料の収集に努めた。今年度は研究分担者による会合を数回持ったほか,作業の都合上年度末に,各分野の小委員会の責任者が集まる会合を2回ほど持つ。そのうちの1回は既に東京でおこない,英訳やローマ字表記など細かい点についても統一をはかった。このような会合は本研究課題が完了する来年度の作業に向けて不可欠である。各分野ごとの用語の調整はもちろん異なる専門間での調整,とくに物理学,統計学,情報科学との調整は小委員会において行っているが,今年度末から来年度にかけて具体的な整理の作業を続けていく。本研究課題の目標は,約四十年間にわたる数学の発展および応用部門の拡大という現状のもとで,関連分野との調整を行いつつ,数学の学術用語を生理統一し,公表することである。

数学用語標準化の調査研究の最終年度に当たる本年度は,平成6年度に完成した第一次用語リストに基づき,第二次用語リストを作成することを目指した。本研究課題の研究分担社が,解析学,幾何学,代数学,確率論,数理統計学のほか,応用数学,情報数学,数学教育の諸分野に亘っているので,このメンバーを中心に第二次用語リストを作成した。これはプロッピ-・ディスクとして,昨年度来構成されている小委員会で検討し,改良した。小委員会は分野はもちろん地域的にも広範なので,集中的な審議を通して研究協力者を含めた全体会議,各分野ごとのグループ会議等を行い意見統一をはかった。この段階での意見交換,データの検討には電子メディアを利用している。すなわち,この作業の過程において,用語リストの記録のみならず通信媒体として,早い段階からコンピュータを使用しており,最終的な報告書も印刷物としてだけでなく,いろいろな形態での公表が可能である。この用にして得られた成果は,現在すでに学術用語集数学編第一次原稿として印刷し,日本数学会,日本教育学会,日本応用数理学会など関連学会の会員にできるだけ広く配布し検討をお願いしているところである。また,他分野の学術用語集等,すでに公表されている学術用語を参照しつつ修正を行っている。また,数学全体,他分野との関連を考慮しつつ,英語に対する日本語の的確性,日本語に対する英語の正確性について等,細部にわたるチェックを行っている。なお,計画全体を通し,必要に応じて広範な分野の研究者からの意見聴衆などを活発に行った。また,この成果を得るに当たって,コンピュータによるデータの管理,整理等のためのアルバイトの協力は不可欠であった。一般に、学問分野の進歩、発展およびその正しい普及ならびに学術情報の円滑な流通を計るにあたって、研究者、学生、社会一般にとって学術用語の整理統一が必要不可欠であることはいうまでもない。とくに、その学問分野が、それ自身深い内容を持つと同時に他の諸分野の基礎であり広範な応用が行われ、かつ将来にあたってさらに重要となることが確実な分野であるならば、上述の必要性はなおさら強調されねばならない。数学がこのような学問分野の一つであることは疑いがない。数学における学術用語の整理統一は昭和29年「学術用語集数学編(文部省)」が刊行され、広く一般に流布し、数多くの研究、教育、応用諸分野の発展に大きく寄与してきた。しかし、この40年間において数学自身の発達が著しいのはもちろん、数学が一つの研究主題として重要な意味を持つ分野が増大し発展してきたことにより、一部の学術用語は使用度が減ずる一方で、新たに登場し一般に使用されている学術用語も少なくない。このような現状をふまえ、数学の学術用語を大幅に収録しなおし、物理学、工学、経済学等関連する諸分野の学術用語との調整を行いつつ整理統一し、その結果を広く公表することが本研究の目標である。日本数学会の全面的協力、日本数学教育学会と日本応用数理学会の会員の協力の下、3年間に及ぶ研究の結果、約1万語の数学学術用語を収集、整理し、それを電磁的記録及び冊子として公表することができた。今後はこの成果をもとにさらなる精選と整備を続けていくことになろうが、学術用語集数学編の改定版の編集に際して、基礎となるデータが得られたことが成果である。当初の研究目的は具体的な形をもつて成し遂げられたことになる。
神経変性疾患発症に関与するＰＫＣリン酸化基質タンパク質の同定と創薬への応用

パーキンソン病治療薬の開発を目指し、線条体におけるPKCgの基質の同定を行った。その結果PKCリン酸化モチーフを持つタンパク質、Connexin-43, Disk1, MADD, CSPa, Calnexin, Stathmin, bPIX, NogoA, Adducinを同定した。さらに、1bPIXはPKCgによりSer583, Ser340がリン酸化を受けDA遊離に関与すること2Connexin-43, MADD, Calnexin, Adducinもそのリン酸化がドパミン遊離の調節に関与すること3PKCgによるCSPaのSer10リン酸化は細胞生存について重要であることを示した。プロテインキナーゼCgamma(PKCgamma)のナンセンス変異を持つAS/AGUラットはパーキンソン症状を呈する。我々は、AS/AGUラットがPKCgammaノックアウト(KO)であること、PKCgammaKOマウスが線条体ドパミン(DA)放出や黒質DA神経細胞変性などのパーキンソン症状を呈することを示したことから、我々はPKCgammaKOマウスがパーキンソン病のモデルになることを提唱した。しかしながら、PKCgammaKOマウスは、黒質線条体系以外でも多くの神経情報伝達機構の異常をもたらしているため、PKCgammaKOマウスをパーキンソン病のモデルとして、薬物スクリーニングに使用することには問題があった。そこで、黒質線条体のPKCgammaの基質がリン酸化されなくなることがパーキンソン症状の原因であるという仮説を考え、PKCgammaKOと野生型(WT)のマウス線条体を用い、PKCgammaの基質の同定を目的として、リン酸化プロテオーム解析を行った。まず、Ion intensityを用いた半定量的解析により、PKCリン酸化モチーフを持つ9個のタンパクを同定した。本年度は、このうちbetaPIXに着目し、集中的にその解析を行った。betaPIXは、Ser583はin vitro, in vivoで、Ser340はin vivoでPKCgammaによりリン酸化された。また、PC12細胞でのDA遊離測定では、betaPIXノックダウンによるDA遊離低下をbetaPIX WTで回復できたのに対して、betaPIX Ser340Ala, Ser583Ala変異体では、DA遊離は回復しなかった。以上のことより、線条体におけるPKCgammaの基質候補として9個のタンパクを同定し、その中のbetaPIXについてPKCgammaによりSer583, Ser340がリン酸化を受け、DA遊離に関与することを示した。これらの結果は、betaPIXが黒質線条体におけるPKCgammaの基質であり、DA遊離に関与することを示唆している。プロテインキナーゼCg(PKCg)のナンセンス変異を持つAS/AGUラットはパーキンソン症状を呈する。我々は、AS/AGUラットがPKC&#61543;ノックアウト(KO)であること、PKCgKOマウスが線条体ドパミン(DA)放出や黒質DA神経細胞変性などのパーキンソン症状を呈することを示したことから、我々はPKCgKOマウスがパーキンソン病のモデルになることを提唱した。しかしながら、PKCgKOマウスは、黒質線条体系以外でも多くの神経情報伝達機構の異常をもたらしているため、PKCgKOマウスをパーキンソン病のモデルとして、薬物スクリーニングに使用することには問題があった。そこで、黒質線条体のPKCgの基質がリン酸化されなくなることがパーキンソン症状の原因であるという仮説を考え、PKCgKOと野生型(WT)のマウス線条体を用い、PKCgの基質の同定を目的として、リン酸化プロテオーム解析を行った。我々は、AS/AGUラットがPKCgノックアウト(KO)であること、PKCgKOマウスが線条体ドパミン(DA)放出や黒質DA神経細胞変性などのパーキンソン症状を呈することを示したことから、PKCgKOマウスがパーキンソン病のモデルになることを提唱した。Ion intensityを用いた半定量的解析により、PKCリン酸化モチーフを持つ9個のタンパク質、Connexin-43, Disk1, MADD, CSPa, Calnexin, Stathmin, bPIX, NogoA, Adducinを同定した。昨年度は、これらのうちbPIXに着目して研究を行い、その結果、bPIXについてPKCgによりSer583, Ser340がリン酸化を受け、DA遊離に関与することを示した。本年度は、さらに検討を加え、bPIX以外にもConnexin-43, MADD, CSPa, Calnexin, Adducinもそのリン酸化がドパミン遊離の調節に関与することを見出した。これら候補タンパク質の中で神経伝達物質遊離とシナプス機能維持に重要な働きをするシナプス小胞のシャペロンであるCSPaに着目し、詳細な検討を加えた結果、CSPaはPKCgによりin vitroで、classical PKCにより細胞レベルでリン酸化された。さらに、in vitroでのリン酸化部位はCSPaのSer10であった。PC12細胞を用いたドパミン遊離測定ではCSPaはドパミン遊離に重要であったが、Ser10リン酸化は関係なかった。一方、細胞生存については、Ser10のリン酸化が重要であった。

PKCgがCSPaのSer10をリン酸化することにより、神経細胞生存に関与することを示したことにより、CSPaは黒質線条体系におけるPKCgの基質であり、ドパミン神経細胞生存に関与する可能性が示唆された。パーキンソン病治療薬の開発を目指し、線条体におけるPKCgの基質の同定を行った。その結果PKCリン酸化モチーフを持つタンパク質、Connexin-43, Disk1, MADD, CSPa, Calnexin, Stathmin, bPIX, NogoA, Adducinを同定した。さらに、1bPIXはPKCgによりSer583, Ser340がリン酸化を受けDA遊離に関与すること2Connexin-43, MADD, Calnexin, Adducinもそのリン酸化がドパミン遊離の調節に関与すること3PKCgによるCSPaのSer10リン酸化は細胞生存について重要であることを示した。当初、着目する分子として、bPIX、CSPa、MADDの3分子を挙げたが、それら以外にも、Connexin43, Calnexin, Stathmin, NogoA, a-adducin, b-adducinについても検討し、a-adducinが新しくPKCgの基質タンパク質として、パーキンソン症状の発症に関与している可能性を示すことができた。また、bPIXの結果を論文としてまとめ、J. Neurosci誌に掲載された。。27年度が最終年度であるため、記入しない。神経薬理学bPIX, a-adducin, CSPa変異体のノックインマウスを作製する。つまり、本年度明らかになったPKCgによるリン酸化部位に変異を導入したノックインマウスを作製し、PKCgによるリン酸化の消失により、パーキンソン様症状を示すか否かを検討する。これにより、全く新しい、パーキンソン病モデルマウスの作製を試みる。当初、着目する分子として、betaPIX、CSPalpha、MADDの3分子を挙げたが、そのうち、betaPIXについては解析を終了し、その結果をJ. Neurosci誌に投稿した結果、ほぼ受理に近い返事をもらっている。CSPalpha、MADDについてはもちろん、他のリン酸化基質分子についても、すでにドパミン遊離に与える影響についてスクリーニングを行い、興味深い結果を得ている。遺伝子組み換えマウス(モデルマウス)作製よりも、bPIX以外の他のリン酸化基質候補のスクリーニングを優先したため、マウスの作製に取り掛からず、そのための経費が掛からなかったため。他の候補となるPKCgamma基質タンパクについても、本年度と同様の解析を行い、PKCgammaによるリン酸化部位の同定とドパミン遊離に対するリン酸化の作用を検討する。betaPIX変異体のノックインマウスを作製する。つまり、本年度明らかになったbetaPIXのPKCgammaによりリン酸化部位に変異を導入したノックインマウスを作製し、PKCgammaによるリン酸化の消失により、パーキンソン様症状を示すか否かを検討する。
硬質材料の破壊靱性を破面面積から見積る方法の研究

著者らは、既に、硬質材料一般の曲げ破壊について、σ_m=ψK_<IC>S_<mf>^<1/2>式を理論的に導出している。ここで、σ_mは3点曲げ強さ、ψは理論的にV^<-1/2>φで表せる係数(Vは試片の応力負荷体積およびφは試料間でほぼ一定と考えられる係数)、K_<IC>は破壊靭性およびS_<mf>は曲げ破壊後の破片の持つ全破面の総マクロ的面積である。また、代表的な硬質材料であるWC-10mass%Co超硬合金およびSi_3N_4基セラミックスについては、同式の示す通りσ_mとS_<mf>^<1/2>との間には直線関係が成り立ち、それらの傾き(ψK_<IC>)の比は、両試料の実測のK_<IC>の比とほぼ一致すること、ψは試料によらずほぼ一定であることなどを明らかにしている。本研究は、σ_m-S_<mf>^<1/2>回帰直線の傾き(ψK_<IC>)が、上式の示す通りV^<-1/2>に比例して変化するかどうかを実験的に検証することを目的として行った。具体的には、異なるV(240640mm^3)を持ったWC-10mass%Co低炭素2相超硬合金試片を各5本作製して3点曲げ試験を行い、σ_m、S_<mf>およびK_<IC>を測定し、σ_m-S_<mf>^<1/2>関係直線の傾きのV依存性を調べた。得られた結果は以下の通りである。(1)S_<mf>は、Vの値に関わらず、σ_mが増加するにしたがって増大した。また、ある一定のσ_mの下でのS_<mf>は、Vの増大とともに大となった。(2)Vの値に関わらず、σ_mとS_<mf>^<1/2>との間には直線関係が成り立った。(3)試片間のσ_m-S_<mf>^<1/2>回帰直線の傾き(ψK_<IC>)の比は、上式により理論的に示唆される通り、試片間のV^<-1/2>K_<IC>またはV^<-1/2>の比に良く一致することが分かった。したがって、Vの値に関わらず上式が成り立つことおよびφの値がほぼ一定であることが明らかとなった。
タウ蛋白リン酸化シグナル巨大複合体を介する変性認知症の神経細胞死に関する病態解析

主要な認知症であるアルツハイマー型認知症(AD)あるいは、前頭側頭葉変性症(FTLD)患者脳組織には細胞内封入体として、神経原線維変化(タングル)が神経細胞核周囲および樹状突起に蓄積することが知られており、このタングルの主成分であるタウタンパク質の異常代謝が、休止期神経細胞の細胞周期再突入や変性・死滅を惹起している可能性が示唆されている。そこで本研究では、タウと細胞周期制御に関わるシグナル伝達分子との関係を明かにするべく実験を行った。種々の細胞周期関連シグナル伝達分子の特異抗体を用いて免疫組織学的解析を行った結果、AD脳においては、DNA損傷チェックポイントなどさまざまな細胞周期調節に関与していることが知られているChk1分子の細胞内局在に変化が認められ、Chk1とタングルとの共局在も観察された。また、細胞周期制御に関与し、タウのリン酸化酵素群のscaffoldして知られるタンパク質と、Chk1が結合することがわかった。種々の培養細胞を用いた実験から、Chk1の発現量やリン酸化レベルが、タウによって調節されていること、さらにタウの発現誘導もまたChk1によって調節を受けることも明かとなった。すでにタウリン酸化酵素として知られ、細胞周期調節への関与も示唆されている70-kDa S6Kについても、タングルとの関係について解析を行ったところ、PI3K-PDK1経路の標的とされているS6KのT229のリン酸化が、AD脳において、AT8陽性のタングルと共局在していること見いだした。これらの知見は、タウ/タングルが関与する病態のメカニズム解明の一助となることが期待される。その他、すでに細胞周期調節への関与が示唆され、AD脳においてタングルと共局在することが報告されているPKN1のアイソフォームであるPKN2およびPKN3について、脳における発現量を測定し、局在について検討を行った。主要な認知症であるアルツハイマー型認知症(AD)或いは前頭側頭葉変性症(FTLD)の患者脳組織にはタウ蛋白代謝異常の結果、細胞内に毒性オリゴマー或いは封入体として神経原線維変化(タングル)が蓄積し、ADの症状・神経回路障害の程度と相関が報告されている。近年、タングルなど封入体形成の有無に拘わらず進行する神経細胞死も報告され、タウ代謝初期段階に生じる機能部位のリン酸化ー脱リン酸化バランスの破綻や、その反応部位の制御異常の視点から、背景にある細胞周期制御を含む細胞内信号伝達の異常と神経細胞死との関連を検討した。タウ機能を制御する複数の蛋白リン酸化酵素や蛋白脱リン酸化酵素等と細胞内で会合し細胞機能を調節する巨大scaffold蛋白CG-NAP及び類似分子Kendrinが、免疫系の調節や微小管の形成・伸長或いはGolgi形成・中心体複製制御を介した細胞内物質輸送や細胞周期の制御機能と関連し、CG-NAPに結合してタウをリン酸化するAGCリン酸化酵素の上・下流にある機能分子がタウ蛋白代謝異常或いはタングルと関連することを明らかにしてきた。その上で、この巨大活性複合体を介した細胞内情報伝達機構の破綻と神経細胞変性・死滅の関連について形態学的・分子生物学的解析を実施し、細胞周期制御に関わるCheckpoint kinase 1 (CHK1)やタウ遺伝子転写に関わるPolypyrimidine tract binding protein (PTB)分子との相互作用を解析した。その結果、両分子とAD脳タングル形成との関連を明らかにし、CHK1については培養神経細胞を用いてタウ蛋白代謝との詳細な関連を解析しつつある。加えて皮質神経細胞特性である神経可塑性に関し、運動学習やプロソディ障害発生の機序を分析し報告した。本年度7月31日以降、研究代表者の病気休職のため一部の研究を中断している。

健常高齢者やAD患者の死後剖検脳組織を対象として、微小管結合蛋白タウの代謝に関連する重要機能分子と活性複合体との共存・結合状態や神経細胞内会合部位を生化学的および形態学的に検討すると共に、活性複合体に結合する機能分子に関する新たな知見を得、共同研究者や研究協力者と相談しながら分析を進めつつある。タウ分子リン酸化修飾に直接影響する蛋白リン酸化・脱リン酸化酵素群と巨大プラットホーム分子CG-NAPあるいはKendrinとが複数分子の細胞内会合状態の調節に関与し、同会合が特定の細胞内コンパートメントで厳密に制御され、タウ蛋白を含む重要基質分子のリン酸化状態を調節すると共に細胞内PI3K-Akt信号伝達カスケード下流のAktによりリン酸化を受ける細胞周期関連分子CHK1の制御に影響することで重要な細胞機能に関係していることを確認しつつある。我々は、細胞内の蛋白リン酸化酵素活性化カスケードのうちPI3K下流においてPI3K、PTEN、PDK1、PKN、PKC delta、p70 S6Kの変性神経細胞内局在を明らかにし、またこれら機能分子とタウ異常代謝との関連、あるいはS6Kについてアクチン細胞骨格病理との関連を発見し、中心体複製の調節に関与するKendrinの機能を明らかにしている。さらに、タウ遺伝子発現調節関連分子PTBや細胞周期制御関連分子CHK1についても解析を進め、タングル形成との関連を発見した。その後、とくにCHK1分子について改変遺伝子を導入した培養神経細胞を用いて、同分子の細胞内挙動の変化あるいは同分子とタウ代謝異常、細胞周期制御異常あるいは細胞変性ー細胞死との関係を明らかにするため、適切なcDNAのデザイン・取得を試みたが現時点では不十分な結果となり、最終的には外部の研究協力組織から適切なCHK1プラスミドを取得して実験方法を再考、改良しながら解析を進めている。本年度に得られたCG-NAPあるいはKendrinの巨大プラットホーム分子を中心とした活性複合体に関する新たな知見の解析を継続すると共に、タウ蛋白遺伝子あるいは(Akt下流で機能調節を受ける)CHK1蛋白分子の遺伝子等の活性複合体関連分子に関する改変遺伝子を導入した継代培養神経細胞を対象として、タウ分子あるいはCHK1分子の細胞内の変化を解析する。つまり、取得したプラスミド導入済み培養大腸菌からプラスミドを抽出・回収しCHK1シークエンスの解析・確認を行った後、培養神経細胞へプラスミドを導入し効率を検討する。良好な導入効率の確認後、同細胞内部のCHK1分子あるいはタウ分子の挙動を、蛋白全体あるいは特にAktリン酸化部位など種々のリン酸化部位に特異的な抗体を用いて高感度免疫組織化学法によるタイムラプス撮像など形態学的に、あるいはウェスタンブロット法など生化学的に解析し、CHK1の機能(リン酸化)状態あるいはそのタウや活性複合体に対する結合・共存状態や神経細胞内会合部位、タウ分子の状態、細胞周期変化、細胞変性を生化学的および形態学的に検討する。特にプラスミドの導入方法について再考、改良を加えながら研究を進める。