hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カーボンナノチューブ量子ドットと電磁波の相互作用に関する研究

カーボンナノチューブ量子ドットの超高感度電荷計としての特徴、人工原子としてのエネルギースケールがその微細性を反映してテラヘルツ領域にあることに着目し、テラヘルツ波との相互作用を調べた。その結果、単一量子ドットにおいてテラヘルツ光アシストトンネル(THzPAT)を観測した。2重量子ドットをゲートを用いて作製するプロセスを開発し、THzPATに関する予備的な結果を得た。さらに、GaAs/AlGaAs2次元電子ガス基板上に作製したカーボンナノチューブ単電子トランジスタを用いた新たなTHz検出メカニズムを発見した。本研究では、カーボンナノチューブ量子ドットと電磁波の相互作用を調べる。それにより、新たなメカニズムを持った超高感度・高機能電磁波検出器へ発展させることを目的としている。これまでの研究でわかってきた事実に、カーボンナノチューブ量子ドットの人工原子としてのエネルギースケールがミリ波からテラヘルツ帯にあることがある(0.1-10THz)。このことに着目して、開発が遅れている電波と光の中間に位置するテラヘルツ帯での新しい検出メカニズム研究の特に注目する。本研究では、マイクロ波からテラヘルツにわたる広い周波数の電磁波とカーボンナノチューブ量子ドットのユニークな相互作用を調べることを目的としている。周波数帯によって調べる現象は異なるが、マイクロ波からミリ波帯では2重結合量子ドットとの相互作用を利用することにより、電荷型量子ビットへの展開をはかる。テラヘルツ帯では、テラヘルツ波との相互作用の基礎現象を調べ、コヒーレント量子操作とともにテラヘルツ波との量子的な相互作用を観測することを目指し、この周波数帯での新しい検出器への応用を目指す。本年度は、デバイス構造としては最も簡単な単一量子ドットとテラヘルツ波の相互作用について調べた。実験は、液体ヘリウム温度でカーボンナノチューブ単一量子ドットの単電子輸送特性がテラヘルツ波の照射によりどのように変化するかを調べた。その結果、テラヘルツ波の照射によって本来電流が流れないゲート電圧領域に、新しいピークを観測し、それが周波数を変えると移動することを見いだした。テラヘルツ波を照射しないときに現れるクーロン振動ピークと新しく現れたサイドピークの間のエネルギーは、照射した周波数に一致することから、このピークの起源は量子ドットの中の電子がテラヘルツ波の光子を吸収してドレイン電極にトンネルしたことによる、いわゆるテラヘルツ光アシストトンネルによることがわかった。また、サイドピーク高さとメインピーク高さのテラヘルツ強度依存性を調べたところ、強度の増加とともにメインピーク高さは減少し、サイドピーク高さは増加するという、超伝導接合でよく知られた光サイドバンドの形成を予言したTien-Gordonモデルで定性的に説明できることがわかった。テラヘルツ波光子の量子ドットによる検出(量子応答)はこれが始めてである。1電子帯電エネルギーがテラヘルツ領域にあるという、カーボンナノチューブ量子ドットの特長を生かした成果である。カーボンナノチューブ量子ドットは、人工原子としてのエネルギースケールが、その微細性を反映してテラヘルツ領域にあることが大きな特徴である。テラヘルツ波は電磁波と光の中間に位置し、環境や医療方面の診断技術としての重要性が認識されているにもかかわらず発振器や検出器の開発が遅れている領域である。本研究では、カーボンナノチューブのエネルギースケールに着目し、電磁波の中でも特にテラヘルツ波との相互作用をしらべた。実験ではカーボンナノチューブ量子ドットの電気伝導特性が周波数や強度の異なるテラヘルツ波を照射するとどのように変化するかを調べた。その結果、テラヘルツ波を光子として検出する光アシストトンネルの観測に量子ドットでははじめて成功した。また、周波数特性や強度依存性も調べ、この効果がマイクロ波領域でよく知られているTien-Gordonモデルで基本的には説明できることを明らかにした。これまでの実験では、特にテラヘルツ波を効率的に受信するためのアンテナ構造を有していなかった。本年度は、この結果をさらに発展させるため、アンテナ構造をもったカーボンナノチユーブ量子ドットの作製技術の開発を行った。アンテナ構造としては、ボウタイアンテナを用いるが、電子線描画の際のドーズ料の最適化が重要であることがわかった。すなわち、ボウタイ構造は大面積描画を行うことになるので、カーボンナノチューブ量子ドットの微小な部分が、ドーズ量の近接効果をまともに受けることになる。このことを避けるためのパターン構造を最適化することが必要である。今年度は、カーボンナノチューブ量子ドットを用いた独自のテラヘルツ波検出技術について研究を行った。また、テラヘルツ波を効率的に受けるためにデバイスにアンテナ構造をつける技術の開発も行った。研究成果は以下の2点である。カーボンナノチューブ単電子トランジスタを、GaAs/AIGaAs2次元電子ガス(2DEG)基板上に作製したデバイスの低温(液体ヘリウム温度)、強磁場下におけるテラヘルツ応答を調べた。なお、このデバイスにはアンテナ構造はついていない。その結果、カーボンナノチューブ単電子トランジスタのクーロン振動ピークが、テラヘルツ照射下で、磁場とともにシフトすることを見いだした。

そのピークシフトはある一定の磁場で最大となり、さらに磁場を印可すると反対方向へ戻るようにシフトする。テラヘルツ周波数を変えても同様のピークシフトが観測されたが、最大ピークシフトを与える磁場が異なることが観測された。データを解析すると、最大ピークシフトを与えている磁場では、2DEGのサイクロトロン共鳴条件が満たされていることがわかった。このことは、テラヘルツ波はカーボンナノチューブ単電子トランジスタに作用しているのではなく、その下にある2DEGに作用しており、サイクロトロン共鳴により電子が上のランダウ準位へ励起されることにより電荷分布が変化し、超高感度エレクトロメータとしてのカーボンナノチューブ単電子トランジスタがそれを検出しているという機構で説明できる。このようなテラヘルツ検出機構はこれまで全くなく、超高感度なテラヘルツ検出器への応用が期待できる。なお、ボータイアンテナを基板上に作ることを試みたが、大きな領域を電子線描画する際にレジスト内で散乱され手拡散する電子がカーボンナノチューブにダメージを与えることを突き止め、電子線描がプロセスの改良を進めている。カーボンナノチューブ(CNT)量子ドットと電磁波の相互作用において、特に開発が遅れているテラヘルツ領域の電磁波との相互作用に焦点を絞り、将来の高機能検出器への応用を目指して新しい検出メカニズムの研究を行った。これまでの研究で、量子ドットを電荷を高感度に検出する単電子エレクトロメータとして用い、テラヘルツ波により基板の量子ドット近傍に励起された電荷の変化を読み取ることが可能であることがわかったことにヒントを得て、それを積極的に利用する試みを行った。すなわち、基板上に焦電材料であるPZTをスパッタ蒸着し、テラヘルツ波の照射によって生じる局所温度上昇による誘電分極を、CNT単電子トランジスタのクーロン振動のピーク位置の変化として読み取る方法である。今年度は、PZTのスパッタ蒸着とその上にCNT単電子トランジスタを作製するプロセスの開発を行った。スパッタにより成膜したPZT層は、成膜直後は圧電性の弱いパイロクロア相であるため、600度以上で高温アニールを行い、強い圧電性を示すペロブスカイト相を得た後に、その表面へCNT量子ドットを作製した。CNT量子ドット直下に存在するPZT層により、外部電界印加方向に依存したクーロン振動のシフトを観測するとともに、数ヘルツにチョッピングされたテラヘルツ波照射によっても、同様なクーロン振動のシフトを観測することに成功した。これは成膜したPZT層が示す分極・焦電特性による微小表面電荷の変化を、高感度電荷センサーであるCNT量子ドットを介して検出する事に成功したものであり、本研究で作製した素子が、テラヘルツ波の検出に対して有効であることを強く示唆した研究成果である。
日本人英語学習者の弱点を集中的に個別矯正するリスニングプログラムの開発と実践研究

ネイティヴスピーカー同士が話す簡単な日常会話さえ正確に聞き取れないという問題を克服するために、聞こえてきた単語と文脈から内容を理解するトップダウンではなく、言語知識をもとに理解するボトムアップアプローチの割合を上げるためのe-ラーニング用プログラムを開発し、実践研究を行った。1)音韻分析がうまくいかず、リエゾンや弱音が聞き取れない問題に関して、我々がすでに実験を開始している英語リスニング・システムの有効性を実践研究により確認した。2)英語リスニング・システムの効果をさらに高めるために、会話対に対応できるシャドーイング用練習プログラムを開発した。3)1)・2)に関して、06年、07年に外国語教育メディア学会全国研究大会で発表し専門家の評価を仰いだ。4)現在のリスニング・システムを長期間にわたる使用に対応させるため、1,000センテンス以上の英文を作成し、男女二人の声で、クリア、ナチュラルの2段階で録音を行った。5)今後は、項目応答理論に基づいた問題、ディクテーションスタイルの問題など複数のスタイルを併用しながら、より信頼性の高い「リスニング力計測システム」の構築に、ウェブベースで取り組んでいく。6)「ナチュラルな会話スピードに学習者の統語分析スピードが追いつけない」という問題を克服するため、あらゆる英文テキストに対応でき、学習者の読書スピードを自動的に計測し、記録するウェブベースの「読書能力の計測・記録システム」を構築した。7)今後は、このリーディング・システムを利用し、我々が立てた仮説「読書能力・リスニング力の学習スパイラル理論」の検証を行っていく。8)6)・7)に関して、08年8月開催の国際学会WorldCALL 2008で発表予定である。2006年度は、以下のように研究を進めた。1.e-ラーニング用プログラム開発本研究課題の目的として挙げた二つのポイント:(1)音韻分析がうまくいかず、リエゾンや弱音が聞き取れない問題、(2)ナチュラルな会話スピードに学習者の統語分析スピードが追いつけない問題、に対応するため2種類のe-ラーニング用プログラムの開発を行った。(1)に関しては映画英語リスニングシステムの実践的運用成果の検証と、それに伴うリスニング力判定のための音声教材の見直しを行った。新プログラムの運用は2007年度後期を予定している。(2)に関しては「読書における統語分析スピードを上げることによって、リスニングにおける聴き取り率も向上する」という仮説を検証するための速読対応型リーディングプログラムの開発を行った。このプログラムの実験的運用は2007年度前期から開始される。さらに、個々のレベルに合わせた教材を提示するため、リーダビリティを踏まえた適切な教材選択方法を検討した。2007年度前期から確度を挙げるためのデータ収集を開始する。2.研究発表(1)外国語教育メディア学会第46回全国研究大会(2006年8月3日京都産業大学)において、本研究の重要なプログラムの一つ、映画英語リスニングシステムが、アセスメントテストの結果から学習者個人の音素レベルの弱点を洗い出し、個々の学習者に見合った演習を自動的に作成する画期的なプログラムであることを発表。さらにサーバーに保存された演習記録と適宜行うステージ・チェックの結果等、具体的な数値を示しながら学習者にフィードバックすることが可能であることを検証し、システム開発の経過と実際の授業での実践的運用成果を報告した。(2)2006年度都留文科大学外国語教育研究センター授業報告発表会(2007年2月3日都留文科大学)において、都留文科大学のCALL教室における授業実践の中から、オリジナル・リスニングプログラムの映画英語リスニングシステムを利用した授業実践について、授業方法、プログラム内容、学生の反応、成果などについて報告した。

1)音韻分析がうまくいかず、リエゾンや弱音が聞き取れない問題に関して、我々がすでに実験を開始している英語リスニング・システムの有効性を実践研究により確認した。2)英語リスニング・システムの効果をさらに高めるために、会話対に対応できるシャドーイング用練習プログラムを開発した。3)1)・2)に関して、06年、07年に外国語教育メディア学会全国研究大会で発表し専門家の評価を仰いだ。4)現在のリスニング・システムを長期間にわたる使用に対応させるため、1,000センテンス以上の英文を作成し、男女二人の声で、クリア、ナチュラルの2段階で録音を行った。5)今後は、項目応答理論に基づいた問題、ディクテーションスタイルの問題など複数のスタイルを併用しながら、より信頼性の高い「リスニング力計測システム」の構築に、ウェブベースで取り組んでいく。6)「ナチュラルな会話スピードに学習者の統語分析スピードが追いつけない」という問題を克服するため、あらゆる英文テキストに対応でき、学習者の読書スピードを自動的に計測し、記録するウェブベースの「読書能力の計測・記録システム」を構築した。7)今後は、このリーディング・システムを利用し、我々が立てた仮説「読書能力・リスニングカの学習スパイラル理論」の検証を行っていく。8)6)・7)に関して、08年8月開催の国際学会World CALL2008で発表予定である。
セプチン複合体の分子作用機構解析

本研究では大脳皮質形成時の神経細胞遊走を解析モデルとして精神・神経疾患関連分子であるSeptinファミリー分子の作用機序解明を遂行した。1)生化学的手法による分子機能検証、2)分散培養および大脳皮質内での神経細胞の動態・形態観察というふたつの手法にて検証した結果、Septinファミリー分子の一部がヘテロダイマーを形成し、異なる機能を持つふたつのF-actin結合タンパク質、cofilin-1およびdrebrin-1の「足場」として機能することを見出した。生物における神経組織構築においては、1)神経細胞の分化、2)個々の神経細胞の適切な領域への分布、3)神経細胞同士もしくは神経-投射先組織間での適切なシナプス形成が必須となる。本研究では精神神経疾患との関連が遺伝学的に示唆されているタンパクであるSeptinファミリー分子(Sept1Sept14)に着目し、その分子機能および作用機序の解析を行う。これまでに研究代表者らは特定のSeptinファミリー分子、Sept4とSept14が大脳皮質興奮性神経細胞の遊走過程に機能的に関与することを明らかにしている(Shinoda et al, 2010)。また予備的な結果として、F-actin結合タンパクであるDrebrin-1およびCofilin-1をそれぞれSept4およびSept14の相互作用候補分子として見出している。平成23年度には、大腸菌組み換え体タンパクを用いた結合実験で、これら候補分子と各septin分子の相互作用を検討した。その結果、Drebrin-1のADF motifがSept4と直接結合することを見出した。またCofilin-1がSept14と直接結合することも確認できた。この結果はSept4-Sept14複合体が異なるF-actin結合タンパク間の分子足場として機能する可能性を世界に先駆けて示唆している。がまたADF-motifはF-actinとの結合に関わる領域であり、またCofilin-1の全長と高い相同性を持つ。このことからF-actin結合タンパクとSeptinの結合により、そのF-actinへの結合親和性に何らかの影響を及ぼすという作業仮説のもと、検証実験を行っている。またSept4およびSept14の結合分子の網羅的生化学スクリーニングも実施し、複数の有力な候補分子を見出している。このような神経回路構築の過程での異常が統合失調症などの精神神経疾患、もしくは自閉症(広汎性発達障害)の一因である可能性が現在示唆されつつある状況である。本研究では精神神経疾患との関連が遺伝学的に示唆されているタンパクであるSeptinファミリー分子(Sept1Sept14)に着目し、その分子機能および作用機序の解析を行った。また予備的な結果として、F-actin結合タンパクであるDrebrin-1およびCofilin-1をそれぞれSept4およびSept14の相互作用候補分子として同定し、Drebrin-1のADF motifがSept4と直接結合することを見出した。この結果はSept4-Sept14複合体が異なるF-actin結合タンパク間の`足場'として機能する可能性を示した。また誕生・異動過程の興奮性神経細胞でDrebrin-1の発現抑制実験を行った結果、Drebrin-1がSept-4, Sept-14,cofilin-1と同様にその遊走過程において重要な役割を果たしていることを見出した。

このことからF-actin結合タンパクとSeptinの結合により、そのF-actinへの結合親和性に何らかの影響を及ぼすという作業仮説のもと、検証実験を行っている。またSept4およびSept14の結合分子の網羅的生化学スクリーニングも実施し、複数の有力な候補分子を見出している。新たな所属機関での研究は順調に進行しており問題は無い。また新規の細胞観察機材によってデータのクオリティが著しく上昇したため、細胞運動に関する全く新規の現象を見出しており、こちらも鋭意解析中である。平成23年9月より研究代表者の所属研究機関を変更したため、研究立ち上げなどに予想外の時間を費やした。しかしながら新たな所属機関では主にハード面で充実しており、研究は順調に進行している。研究期間内での研究遂行については問題はないといえる。各Septin分子とその相互作用分子(Drebrin-1, Cofilin-1)の結合が、その分子機能にいかなる意義を持つのかを検証する。またスクリーニングで見出された新規のSeptin結合分子群が大脳皮質発生においていかなる機能を持ちうるかを検証する。また神経疾患関連の別のseptinファミリー分子についても相互作用分子スクリーニングを実施し、新規結合分子を見出しつつある。当初の研究計画におよび前頁に記述のように、各Septin分子とその相互作用分子(Drebrin-1, Cofilin-1)の結合が、その分子機能にいかなる意義を持つのかを検証する。研究費の年度別使用予定内訳に基づき適正に使用予定である。申請時に提出した研究費の年度別使用予定内訳に基づく。具体的には実験動物の購入、国内外での学会発表における旅費、論文の別刷り費用などに使用予定である。
冠動脈硬化巣におけるEcto‐ATPDase/CD39の発現と機能

CD39/ecto-ATPDase(CD39)は血管内皮細胞上に発現し、細胞外ATP、ADPを分解することにより血小板凝集を抑制することが知られている。近年、CD39は血液凝固以外に炎症や免疫反応にも関与することが報告されているが、動脈硬化症や急性冠症候群との関係は明らかでない。我々は、(1)狭心症患者から採取された冠動脈アテレクトミー(DCA)およびヒト剖検症例冠動脈標本を用いて動脈硬化巣におけるCD39蛋白/mRNA発現の有無、活性およびその局在を検討する。(2)培養血管平滑筋細胞とラット血栓症モデルにアデノウイルスベクターを用いてCD39遺伝子を導入して血小板凝集・血栓形成の抑制作用について検討し動脈硬化の進展と急性冠症候群の予防に繋げること、を目標に掲げて研究を遂行した。(研究成果)不安定狭心症(UAP)20例および安定狭心症(SAP)17例のDCA標本と剖検例15例におけるCD39蛋白とmRNA発現について免疫染色、RT-PCR法、In situ hybridization法による検討を行った。冠動脈硬化巣において、CD39発現は中膜・内膜の平滑筋細胞、内膜新生血管および冠動脈内腔側の内皮細胞に分布していた。また硬化巣の進行度によりあるいは同じ進行度の病変内においても、その局在と発現量に差異を認め、硝子化あるいは大きなプラークを有する病変では発現の低下を認めた。また狭心症患者のDCA標本におけるCDD39陽性細胞率は、SAPに比しUAPで有意に低値を示した(Am J Cardiol 95:632-635,2005)。培養平滑筋細胞とラット血栓症モデルによる検討ではCD39遺伝子導入により血小板凝集と血栓形成の抑制作用を認めた(Circulation 111:808-815,2005)。以上の結果よりCD39発現の減弱は硬化巣の進展と急性冠症候群の発症に関与する可能性が示唆され、またCD39遺伝子導入によりそれらを予防しうる可能性が示された。近年、CD39は血液凝固以外に炎症や免疫反応にも関与することが報告されているが、動脈硬化症や急性冠症候群(心筋梗塞、不安定狭心症、心臓性突然死)との関係は明らかでない。我々の研究目的は(1)狭心症患者の冠動脈アテレクトミー(DCA)標本およびヒト剖検症例冠動脈標本を用いて動脈硬化巣におけるCD39蛋白/mRNA発現の有無、活性およびその局在を検討し、(2)培養血管平滑筋細胞とラット血栓症モデルにアデノウイルスベクターを用いてCD39遺伝子を導入して血小板凝集・血栓形成の抑制作用について検討し動脈硬化の進展と急性冠症候群の予防に繋げること、である。現在までに、不安定狭心症(UAP)20例および安定狭心症(SAP)17例のDCA標本と剖検例15例におけるCD39蛋白とmRNA発現について免疫染色およびRT-PCR法による検討を終了している。冠動脈硬化巣において、CD39発現は中膜・内膜の平滑筋細胞、外膜毛細血管・内膜新生血管の内皮細胞および冠動脈内腔側の内皮細胞に分布していた。

また硬化巣の進行度によりあるいは同じ進行度の病変内においても、その局在と発現量に差異を認め、硝子化あるいは大きなプラークを有する病変では、発現の低下を認めた。また狭心症患者のDCA標本におけるCD39陽性細胞率は、SAPに比しUAPで有意に低値を示した。培養平滑筋細胞とラット血栓症モデルによる検討ではCD39遺伝子導入により血小板凝集と血栓形成の抑制作用を認めた。以上の結果よりCD39発現の減弱は硬化巣の進展と急性冠症候群の発症に関与する可能性が示唆され、またCD39遺伝子導入によりそれらを予防しうる可能性が示された。今後、症例数を増やし臨床情報の解析を併せて進めるとともに、CD39の生理機能の検討も進めて行きたい。CD39/ecto-ATPDase(CD39)は血管内皮細胞上に発現し、細胞外ATP、ADPを分解することにより血小板凝集を抑制することが知られている。近年、CD39は血液凝固以外に炎症や免疫反応にも関与することが報告されているが、動脈硬化症や急性冠症候群との関係は明らかでない。我々は、(1)狭心症患者から採取された冠動脈アテレクトミー(DCA)およびヒト剖検症例冠動脈標本を用いて動脈硬化巣におけるCD39蛋白/mRNA発現の有無、活性およびその局在を検討する。(2)培養血管平滑筋細胞とラット血栓症モデルにアデノウイルスベクターを用いてCD39遺伝子を導入して血小板凝集・血栓形成の抑制作用について検討し動脈硬化の進展と急性冠症候群の予防に繋げること、を目標に掲げて研究を遂行した。(研究成果)不安定狭心症(UAP)20例および安定狭心症(SAP)17例のDCA標本と剖検例15例におけるCD39蛋白とmRNA発現について免疫染色、RT-PCR法、In situ hybridization法による検討を行った。冠動脈硬化巣において、CD39発現は中膜・内膜の平滑筋細胞、内膜新生血管および冠動脈内腔側の内皮細胞に分布していた。また硬化巣の進行度によりあるいは同じ進行度の病変内においても、その局在と発現量に差異を認め、硝子化あるいは大きなプラークを有する病変では発現の低下を認めた。また狭心症患者のDCA標本におけるCDD39陽性細胞率は、SAPに比しUAPで有意に低値を示した(Am J Cardiol 95:632-635,2005)。培養平滑筋細胞とラット血栓症モデルによる検討ではCD39遺伝子導入により血小板凝集と血栓形成の抑制作用を認めた(Circulation 111:808-815,2005)。
「流域社会」再構築の可能性-流域の環境保全と地域づくりに関する理論的・実証的研究

本年度は、前年度に引き続き、ダム開発計画をめぐる環境運動および流域の環境保全活動に関する事例調査とその分析作業を中心に研究を遂行した。あわせて、歴史的・マクロ的な視点から事例を捉えるために、戦後日本の河川政策の変遷と環境運動の展開過程について文献資料を用いながら通時的に整理・検討を進めた。具体的な成果としては、まず、内発的発展論の検討を踏まえて、宮城県大川の上流地域(室根村)における地域コミュニティレベルでの環境保全活動の生成過程に関し、キーパーソンの環境認識プロセスを分析した論文(「地域づくり」の生成過程における「地域環境」の構築-「内発的発展論」の検討を踏まえて)を『社会学研究』71号に発表した。つぎに、大分県大野町の矢田ダム建設問題を取り上げ、住民がいかにして地域再生に向けた活動を展開したのかについて、コンフリクト過程における住民の認識や意味づけに焦点を当てて検討した論文(大型公共事業計画中止後の「地域再生」の可能性-新たな「地域づくり」の展開とその二重の機能)を『社会学年報』31号に発表している。さらに、宮城県気仙沼市の新月ダム建設問題に関するフィールドワークにもとづき、ダム建設をめぐるアクター間の対立構図の変容過程を考察し、受益圏・受苦圏論を再検討した論文(ダム建設計画をめぐる対立の構図とその変容-運動・ネットワーク形成と受益・受苦に注目して)を『社会学評論』53巻2号にて公表した。上記の研究および過去2年度の成果を踏まえ、戦後の河川政策の変遷と環境運動の展開という、政策と運動の相互変容過程に着目し、ダム計画をめぐる地域コンフリクト過程を実証的に明らかにするとともに、ダム計画中止後に当該地域社会および環境運動が直面している諸課題、さらに、今後の住民(市民)セクターと行政との協働関係の展開に向けた条件について、実証的・理論的に考察した研究論文「河川政策の変遷と環境運動の展開-対立から協働・再生への展望」を作成した。
河川水生昆虫カワゲラの環境適応と遺伝的分化：ゲノムとタンパク質の進化

気候勾配に沿った札幌・仙台・岐阜・松山の4地域の河川から,45種・1457個体の水生昆虫カワゲラの幼生個体を採取した。また,現地で補足的に行った成虫のサンプリングにより,12種から成る89個体の成虫個体も採取した。RADシークエンシングにより,42種の計384カワゲラ個体から,合計約160億塩基のゲノムワイドのDNA塩基配列データを収集することに成功した。解読されたゲノム上の約300万塩基において,気候勾配に沿って設定した調査地域間における一塩基多型(SNP)が検出され,気候勾配に沿った遺伝的変異がゲノム上の広域で起きていることが解明された。タンパク質レベルのプロテオーム解析では,2次元電気泳動によるタンパク分画解析から,気温の季節間変動が大きな札幌と岐阜では,他地域よりも多様なタンパク質を発現していることが分かった.解析をした7種のカワゲラのうち,Nemoura sp. ,Rhabiopteryx japonica ,Eucanopsis sp. ,Perlodini incertaeの4種は4地域で最も温暖な松山で特異的に発現したタンパク質数が他の地域より多いことから,温暖な地域に適応的な種である可能性が示された.一方,Amphinemoura sp.とHaploperla japonicaの2種は札幌で特異的に発現したタンパク質数が多いことから,寒冷な地域に適応的な種と推察された.さらに,各地域に固有に発現していた計111種類(スポット)のタンパク質を選択して,更に高度なアミノ酸配列情報等を取得するMALDI-TOF/TOFを行い,タンパク質を同定した.ゲノムワイドのmRNAの発現をトランスクリプトーム解析で調べた。7種の計46個体のカワゲラから,合計約6300万塩基のゲノムワイドのmRNA塩基配列データを収集し,411個の遺伝子のうち11個はもっとも寒冷な札幌で特異的に検出されていることがわかった.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は以下3つである。1)河川水生昆虫カワゲラを対象として,水質・水温・流速等の様々な環境因子の自然選択を受けた環境選択性遺伝子をゲノム中から発見する。2)発見された環境選択性遺伝子を対象に,環境変化に伴う遺伝的多様性劣化メカニズムをゲノム進化とタンパク進化の双方の観点から解明する。3)上記メカニズムの理解を通じて,「河川環境の人為的悪化→環境選択・適応的進化→遺伝的多様性の劣化」のフローを仮説として,河川環境と遺伝的多様性の定量関係をモデル化する。研究期間の初年度となる平成25度では,まず文献調査や日本産カワゲラの専門家との議論を通して,環境勾配と適応分散の関係が見られることが期待される種を選定した。その後,愛媛県,岐阜県,宮城県,北海道の日本広域の複数流域を対象に,気候,標高,土地利用などの環境条件が異なる地点を選定して日本産水生昆虫カワゲラを定性的サンプリングした。調査地点は17河川の23地点に及び,最終的に1806個体のカワゲラを採取した。実験室で形態同定を行った45種の採取が確認された。現地調査では,生物標本のサンプリングと並行して,水温,流速や河床条件などの物理的環境,藻類・浮遊粒状性有機物・底生動物などのカワゲラの潜在的餌資源などの環境条件を調査した。フィールド調査の後に開始した分子生物学的解析では,得られた生物試料を使って,ゲノムスケールの塩基配列情報を取得するRADシークエンシングの最適な実験条件を見つけることに成功した。一部個体については,発現解析用のRNAを抽出し, cDNAの合成(逆転写)が終了した。また,タンパク抽出および二次元電気泳動を使ったタンパクライブラリーの作成も一部終了することができた。日本の気候勾配に沿った札幌,仙台,岐阜,松山の4地域で採取したカワゲラ標本を使って,ゲノム,タンパク質,RNAの各レベルにおける進化パターンを探る分子生物学的解析を実施した.まず,ゲノムレベルの解析では,次世代DNAシークエンサーを使ったRADシークエンシングにより,26.5Gbにも及ぶ96個体分のゲノムワイドのDNA塩基配列情報を収集できた。タンパク質レベルの解析では,2次元電気泳動によるタンパク分画解析から,気温の季節間変動が大きな札幌と岐阜では,他地域よりも多様なタンパク質を発現していることが分かった.さらに,各地域に固有に発現していた計21種類のタンパク質を選択して,更に高度なアミノ酸配列情報等を取得するMALDI-TOF/TOFを行い,すべての実験が完了した.また,RNAレベルの解析では,ゲノムワイドのmRNAの発現解析(トランスクリプトーム解析)を次世代DNAシークエンサーを使って行い,12 GBに及ぶ46個体分のmRNA配列情報を取得した.このmRNAの配列情報に基づく簡易な遺伝子検索により,411個の遺伝子領域がアノテーションされ,そのうち131個はもっとも寒冷な札幌で特異的に検出されていることがわかった.気候勾配に沿った札幌・仙台・岐阜・松山の4地域の河川から,45種・1457個体の水生昆虫カワゲラの幼生個体を採取した。

解読されたゲノム上の約300万塩基において,気候勾配に沿って設定した調査地域間における一塩基多型(SNP)が検出され,気候勾配に沿った遺伝的変異がゲノム上の広域で起きていることが解明された。タンパク質レベルのプロテオーム解析では,2次元電気泳動によるタンパク分画解析から,気温の季節間変動が大きな札幌と岐阜では,他地域よりも多様なタンパク質を発現していることが分かった.解析をした7種のカワゲラのうち,Nemoura sp. ,Rhabiopteryx japonica ,Eucanopsis sp. ,Perlodini incertaeの4種は4地域で最も温暖な松山で特異的に発現したタンパク質数が他の地域より多いことから,温暖な地域に適応的な種である可能性が示された.一方,Amphinemoura sp.とHaploperla japonicaの2種は札幌で特異的に発現したタンパク質数が多いことから,寒冷な地域に適応的な種と推察された.さらに,各地域に固有に発現していた計111種類(スポット)のタンパク質を選択して,更に高度なアミノ酸配列情報等を取得するMALDI-TOF/TOFを行い,タンパク質を同定した.ゲノムワイドのmRNAの発現をトランスクリプトーム解析で調べた。7種の計46個体のカワゲラから,合計約6300万塩基のゲノムワイドのmRNA塩基配列データを収集し,411個の遺伝子のうち11個はもっとも寒冷な札幌で特異的に検出されていることがわかった.計画通り,ゲノム,タンパク,RNAの3つのレベルにおけるカワゲラの適応的進化を調べるための分子生物学的解析を完了することができたので,順調に進展していると評価できる.27年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度はデータ解析と論文執筆を中心に進めて,研究成果をまとめる作業に力点を入れる予定である.予定通り日本広域からの数多くのカワゲラ標本を採取し,ゲノム解析やRNA登現解析の実験条件の最適化を行うことができた上に,予定を前倒してタンパク多型解析も一部行うことができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。予定通り,採取した生物試料のゲノム解析,発現解析,タンパク解析を同時並行で進めて,ゲノム・RNA・タンパクの3レベルと河川環境条件の適応的進化条件を探る。
高齢者歩行支援情報の抽出を目的とした接近する携帯端末利用者への反応の工学的解析

本研究では,携帯端末利用者の周囲への注意度評価,姿勢制御・歩行等の解析を行った.また,歩きスマホが障害物に遭遇した際の反応・挙動を計測・解析した.携帯端末利用時には歩行速度低下,周囲障害物への接触回数増加が顕著であった.携帯端末の画面サイズやコンテンツをパラメータとして変え,画面注視の際に周辺への注意が低下する状況を分析した.高齢者が向かってくる歩行スマホに向かい合った際に取る退避行動の危険性につき調べるため,膝関節の可動制限などにより歩行機能低下状態を作り健常者により実験した.移動しながらの携帯端末利用(所謂歩きスマホ)が歩行弱者への安全に影響を及ぼすことから,各種対策が検討されているものの利用者の危険意識は低いままであり,歩行者側が多くの注意を払い危険回避せねばならない状況である.高齢者の転倒が社会的問題となり転倒予防事業が展開されるのに逆行して,歩きスマホの増加により高齢者の歩行環境は悪化している.そこで本研究では,高齢者の外出時の心配を減じる観点から,歩行支援に有用な情報整理を工学的に行う.携帯端末利用者の周囲への注意度評価,姿勢制御・歩行等の解析,生理状態計測を行う.また,歩きスマホに遭遇した際の反応・挙動を計測・解析する.身体機能の差および障害物の大きさの違いによる,歩きスマホ時の障害物への反応差を調べるための実験を行った.20mの歩行路に障害物を設置し,端末課題の有無による歩行状況を観察した.さらに,高齢者の周辺視野の狭窄の疑似を目的とした視野制限眼鏡,膝の不自由さと動作・反応低下の疑似を目的とした高齢者疑似体験セット(膝サポータ・足首おもり)を用い,視野および下肢の制限下において,同様に歩行状況を観察した.また,歩行の足底圧力に着目し,歩きスマホ歩行と通常歩行との違いを調べるため,インソール型の足圧分布計を用いて歩きスマホの歩行解析を行った.歩行速度を一定に指定した歩行,指定しない自由歩行を調査した.歩行中の蹴り出しや歩行速度に関わる足指部付け根に着目して実験を行った.本研究では,携帯端末利用者の周囲への注意度評価,姿勢制御・歩行等の解析を行う.平成27年度は,歩きスマホ時の障害物への反応差を調べるための実験,高齢者の周辺視野の狭窄の疑似を目的とした視野および下肢の制限下における歩行状況を調べるための実験を実施した.結果,いずれの条件下においても歩行速度低下,周囲障害物への接触回数増加がみられた.特に,メール使用時(端末課題)には歩行速度低下,および接触回数の増加が顕著であり,歩行面から15cm以下にある障害物,および胸の高さの障害物への接触回数が増加した.この結果を踏まえ,視野や下肢以外の身体機能の比較を行うことで,より詳細な検討ができると考えられる.また,足底圧力に着目し,歩きスマホ歩行と通常歩行との違いを調べるための実験とそれぞれの解析を行った.端末課題を付した場合の自由歩行では足指部付け根の圧力が低下する傾向が見られた.歩きスマホでは,歩行中の蹴り出しと歩行速度が低下した.以上のように,本研究に関わる基本的部分の計測システムを用意し,実際の計測と解析を進めた.移動しながらの携帯端末利用(所謂歩きスマホ)が歩行弱者への安全に影響を及ぼすことから,各種対策が検討されているものの利用者の危険意識は低いままであり,歩行者側が多くの注意を払い危険回避せねばならない状況である.高齢者の転倒が社会的問題となり転倒予防事業が展開されるのに逆行して,歩きスマホの増加により高齢者の歩行環境は悪化している.そこで本研究では,高齢者の外出時の心配を減じる観点から,歩行支援に有用な情報整理を工学的に行う.携帯端末利用者の周囲への注意度評価,姿勢制御・歩行等の解析,生理状態計測を行う.また,歩きスマホに遭遇した際の反応・挙動を計測・解析する.身体機能の差および障害物の大きさの違いによる,歩きスマホ時の障害物への反応差を調べるための実験を行った.20mの歩行路に障害物を設置し,端末課題の有無による歩行状況を観察した.また,歩行の足底圧力に着目し,歩きスマホ歩行と通常歩行との違いを調べるため,インソール型の足圧分布計を用いて解析を行った.歩行速度を一定に指定した歩行,指定しない自由歩行を調査した.歩行中の蹴り出しや歩行速度に関わる足指部付け根に着目して実験を行った.以上に引き続き,利用者が周囲に払う注意の生理学的指標による検討を継続するため,現有のウェアラブルな視点計測用アイカメラと計測システムを改良し,次の項目を実施した.視点の動線解析を実現するため奥行き情報獲得の必要があり,現有のアイカメラを両眼同時計測・記録可能なシステムに改良した.計測を通して改良を継続する.携帯端末の画面サイズやコンテンツをパラメータとして変え,画面を注視した際に周辺への注意が低下する状況を分析した.注視画面の周囲に反応用ターゲットを設定し,反応時間をパラメータとして周囲への注意に及ぼす影響を分析した.視野範囲,視線移動速度,反応時間等により注意度について検討した.本研究では,携帯端末利用者の周囲への注意度評価,姿勢制御・歩行等の解析を行う.平成27年度は,歩きスマホ時の障害物への反応差を調べるための実験,高齢者の周辺視野の狭窄の疑似を目的とした視野および下肢の制限下における歩行状況を調べるための実験を実施した.結果,いずれの条件下においても歩行速度低下,周囲障害物への接触回数増加がみられた.

特に,メール使用時(端末課題)には歩行速度低下,および接触回数の増加が顕著であり,歩行面から15cm以下にある障害物,および胸の高さの障害物への接触回数が増加した.また,足底圧力に着目し,歩きスマホ歩行と通常歩行との違いを調べるための実験とそれぞれの解析を行った.端末課題を付した場合の自由歩行では足指部付け根の圧力が低下する傾向が見られた.歩きスマホでは,歩行中の蹴り出しと歩行速度が低下した.平成28年度は,利用者が周囲に払う注意の生理学的指標による検討を継続して実施した.現有のウェアラブルな視点計測用アイカメラと計測システムを改良した.結果,現有のアイカメラは両眼同時計測・記録可能なシステムになった.計測を通して改良を継続する.視点の動線解析を実現できる環境となった.また,携帯端末の画面サイズやコンテンツをパラメータとして変え,画面を注視した際に周辺への注意が低下する状況を分析した.注視画面の周囲に反応用ターゲットを設定し,反応時間をパラメータとして周囲への注意に及ぼす影響を分析した.結果,画面が大きいと周囲への注意に必要な前方の有効視野を遮ること,および焦点を合わせる対象が小さいと有効視野を狭めることがわかった.視野範囲,視線移動速度,反応時間等により注意度につき検討した.以上のように,本研究に関わる基本的部分の計測システムを改良し,実際の計測と解析を進めた.移動しながらの携帯端末利用(所謂歩きスマホ)が歩行弱者への安全に影響を及ぼすことから,各種対策が検討されているものの利用者の危険意識は低いままであり,歩行者側が多くの注意を払い危険回避せねばならない状況である.高齢者の転倒が社会的問題となり転倒予防事業が展開されるのに逆行して,歩きスマホの増加により高齢者の歩行環境は悪化している.本研究では,歩行支援に有用な情報整理を目的とし,携帯端末利用者の周囲への注意度評価,姿勢制御・歩行等の解析を行った.また,歩きスマホに遭遇した際の反応・挙動を計測・解析した.高齢者の周辺視野の狭窄の疑似を目的とした視野制限眼鏡,膝の不自由さと動作・反応低下の疑似を目的とした高齢者疑似体験セットを用い,インソール型の足圧分布計にて歩行解析を行った.メール利用時には歩行速度低下,周囲障害物への接触回数増加が顕著であった.端末課題を付した場合の自由歩行では,蹴り出しや歩行速度に関わる足指部付け根の圧力に低下傾向が見られた.歩きスマホでは,歩行中の蹴り出しと歩行速度が低下した.携帯端末の画面サイズやコンテンツをパラメータとして変え,画面注視の際に周辺への注意が低下する状況を分析した.注視画面の周囲に反応用ターゲットを設定し,反応時間をパラメータとして周囲への注意に及ぼす影響を分析した.視野範囲,視線移動速度,反応時間等により注意度について検討した.大画面サイズは周囲への注意に必要な前方の有効視野を遮り,小画面は有効視野を狭めることがわかった.また,歩行中の高齢者が向かってくる歩行スマホに向かい合った際に取る退避行動の危険性につき検討するため,膝関節の可動制限などにより歩行機能低下状態を作り健常者により実験した.足底圧中心軌跡と足指部,前足部,踵部の足底圧力を測定した.本研究では,携帯端末利用者の周囲への注意度評価,姿勢制御・歩行等の解析を行った.
全ての患者で同種骨髄移植を実施することを可能にする方法の開発

家族内にHLA一致のドナーのいない両親より承諾を取ったうえ骨髄細胞を採取し、LSM^<【.encircledR.】>(Organ Teknika Corporation、比重1.077)を用いて比重遠心して単核細胞(MNC)を得た。その後Applied ImmuneSciences社のsaybean agglutin lectin(SBA)及び抗CD34抗体を共有結合した培養フラスコ(MicroCELLector)を使用してCD34陽性細胞を分離した。SBA非付着細胞の回収率は平均20%であった。CD34陽性細胞の回収率はSBA非付着細胞の5%、MNCの1%であった。この両親から得られたCD34陽性細胞を1:1の比率で混合した後遠心した沈渣に50%ポリエチレングリコール1mlを1分間かけて攪拌しながら加えた。この融合細胞に父親及び母親のHLA抗原のうち子供に発現しているHLA抗原に対する抗体を加え22°C、45分間反応させFACSにてHLA抗原を指標にして陽性細胞を分離した。例えば、父親がHLA-B44、B60、母親がHLA-B51、B67の家族では、子供である患児に発現しているHLA-B51、B60陽性細胞をFACSで分離後24時間後にその細胞のHLA-B44、B67の発現をみた。この細胞は、ほとんどの細胞がB44、B67も発現しており、HLA-B51、B60のみが発現している細胞はほとんどなかった。この結果より両親の骨髄細胞から子供の骨髄細胞と同じHLAを発現している細胞を得るためには、必要としないHLA抗原、例えばB44、B67の発現をアンチセンスRNA法などによって抑制する必要があると考えられ、現在その可能性について検討している。
GPI-アンカー型神経接着分子を介するシグナル伝達機構の解明

本研究では、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する神経接着分子で、glycosyl phosphatidilinositol(GPI)-アンカー型のコンタクチン分子群に焦点を当て、神経系の発生から老化に至る一連の過程で、これらGPI-アンカー型神経接着分子が神経発生や老化過程において果たす生理的役割、ならびにシグナル伝達の場であると考えられているlipid raft(ラフト)における存在意義について検討することを目的とした。本研究から、以下のことが明らかとなった。1)脳シナプトゾーム画分にlipid raftの存在を認めた。2)6種類認められているコンタクチン分子群の中で、検討したコンタクチン、TAG-1、NB-3はシナプトゾーム由来のラフト画分(後シナプス肥厚部)に存在することが明らかとなった。3)NB-3およびコンタクチンはシナプス後肥厚部において、間接的にPSD-95と複合体を形成し、シナプス形成あるいはシナプス伝達に関わる可能性が示唆された。4)大脳皮質由来の後シナプス肥厚部においては、加齢に伴い、肥厚部を構成するコレステロール含量が上昇する一方で、逆に存在する蛋白質量は減少することが明らかとなった。現在、加齢に伴い変動する蛋白質群の同定を行っている。上記結果から、コンタクチン分子群は、脳神経系の発生の過程で、時間的・空間的に棲み分けて発現しており、特に、シナプス形成や後シナプス肥厚部でのシグナル伝達に関わる機能分子群のクラスタリングに関与している可能性が示唆された。今後、これら分子群を中心とした分子複合体の形成等について検討すると共に、シナプス伝達に関わる機能的分子間相互作用について検討を進めて行きたいと考えている。免疫グロブリンスーパーファミリーに属する神経接着分子コンタクチン群はイノシトールリン脂質を介して細胞膜表面に結合するGPI-アンカー型の分子であり、コレステロールに富むlipid raft(ラフト)領域に存在することが知られている。本研究は、脳神経系のシナプス伝達におけるコンタクチン群の機能を明らかにすることを目的としており、本年度は、シナプス膜由来のラフトにおける局在ならびに後シナプス肥厚部(PSD)での分子間相互作用について検討した。まず、ラット大脳皮質由来のシナプトゾームからラフトを調製し、ウェスタンブロットを用いて、コンタクチン分子群ならびに各種のシナプスマーカー蛋白質のラフトへの局在の有無について検討した。コンタクチン、NB-3およびTAG-1はSrcファミリーチロシンリン酸化酵素のfyn、シナプス前マーカーであるシナプトフィジン、ならびにシナプス後マーカーであるPSD-95の一部と共にシナプスラフトに局在した。同スーパーファミリー分子である膜貫通型のL1、NrCAMはラフトより高密度領域に存在した。一方、胎生16日齢のラットの大脳皮質から調製した初代培養神経細胞を用いて抗体による二重染色を行った結果、コンタクチンおよびNB-3はシナプス部位にクラスターを形成し、PSD-95とほぼ同じ局在を示すことがわかった。さらにこのクラスターはガングリオシド合成阻害剤のfumonisn B処理により消失した。次に、これらの分子群とシナプス伝達との関連性を調べる目的で、各抗体を用いた免疫沈降実験を行った結果、コンタクチンと共にPSD-95およびコンタクチンとシス型に結合するcasprが共沈した。一方、NB-3と共にPSD-95が共沈したが、casprの存在は認められなかった。以上の結果から、コンタクチンはcasprを介してPSD-95と会合し、シナプス関連蛋白質群の複合体の形成に関与する可能性が示唆された。現在、分子間相互作用についてより詳細な検討を行っている。免疫グロブリンスーパーファミリーに属する神経接着分子コンタクチン群はイノシトールリン脂質を介して細胞膜表蔓に結合するGPI-アンカー型の分子であり、コレステロールに富むlipid raft(ラフト)領域に存在することが知られている。

本研究は、脳神経系のシナプス伝達におけるコンタクチン群の機能を明らかにすることを目的としており、本年度は、コンタクチン分子群とシス型に結合すると考えられるコンタクチン関連分子(Caspr)群の細胞内部分と結合するfolding蛋白質の探索を行った。Caspr分子群はCaspr1-5の5種類の存在が知られており、そのうちCaspr2-5はそのC末端部分にPDZ結合モチーフを持つ。従って、Caspr2-5のC末端部分と結合するPDZドメインを持つ蛋白質をYeast Two Hybridシステムを用いて、ヒト脳cDNAライブラリーからスクリーニングを行った。その結果、Caspr4のC末端部分に結合する蛋白質としてLnx2を得た。これはN末端部分にZinc fingerドメインを持ち、4つのPDZドメイン、さらにC末端部分にPDZ結合モチーフを合わせ持つユニークな蛋白質であることがわかった。現在、両者間の詳細な相互作用について検討中である。一方、Caspr2は、ミエリンのジャクスタパラノード部に局在し、Kチャネルのクラスター形成に深く関与することが知られる分子であるが、Caspr4と同様に細胞内部分と相互作用する分子を検討した結果、carboxypeptidase Eをはじめ、PDZドメインを持つ蛋白質を含めて、非常にユニークな興味ある蛋白質群との相互作用が認められた。現在、これらの蛋白質との詳細は機能連関、ならびにミエリン形成に関わる分子間相互作用について検討中である。
破骨細胞から分泌されるスクレロスチン発現抑制因子は骨代謝共役因子か？

骨リモデリングは破骨細胞と骨芽細胞および骨細胞の連携により行われる。骨細胞から分泌されるSclerostin(Sost)は、Wnt/β-カテニンシグナルを阻害し、骨形成を抑制する。OPG欠損マウス(OPG-KO)は骨吸収と骨形成活性が共に高い骨代謝回転を示す。OPG-KOでは、Sostの発現が著しく低下することを見出している。この所見は、骨吸収に伴い増加する因子によりSostの発現が抑制されることを示唆する。破骨細胞の培養から調整した培養上清中にSostの発現を抑制する活性を見出した。破骨細胞はサイトカインXを分泌し、Sostの発現を抑制することを明らかにした。骨リモデリングは骨を吸収する破骨細胞と骨を形成する骨芽細胞および骨細胞の連携により行われる。Wntが共受容体Lrp5に結合するとb-カテニンシグナルが活性化され、骨形成が誘導される。一方、骨細胞から分泌されるSclerostin(Sost)は、b-カテニンシグナルを阻害し、骨形成を抑制する。OPG-KOマウスでは、Sostの発現が著しく低下することを見出している。平成25年度は以下の解析を行った。1. OPG-KOおよび野生型マウスに抗RANKL抗体を投与すると破骨細胞の分化が抑制された。このときのSclerostinの発現を免疫組織化学的手法およびリアルタイムPCR法で解析した。その結果、OPG-KOで低下したSostの発現は、抗RANKL抗体の投与によって増加した。2.破骨細胞から分泌されSostの発現を低下させる因子を同定するためには、Sostを高発現する細胞を用いたアッセイ系の確立が必須である。ラットの骨肉種細胞株であるUMR106細胞と骨芽細胞株であるMC3T3E1細胞を培養し、Sost発現をタンパク質レベルで検出したところ、UMR106細胞が顕著にSostを産生することを見出した。3.骨芽細胞と骨髄細胞を共存培養し、破骨細胞形成を誘導した。この培養上清をUMR106細胞の培養系に添加すると、Sost発現の低下が認められた。また、頭蓋冠由来骨芽細胞およびMC3T3E1の培養上清でも同様な結果が得られた。しかし、ST2細胞の培養上清は、Sostの発現を抑制しなかった。以上から、破骨細胞および骨芽細胞は、UMR106細胞のSost発現を抑制する因子を分泌する可能性が示唆された。OPG-KOマウスでは、Wntシグナル抑制因子であるSostの発現が著しく低下することを見出している。平成26年度は以下の解析を行った。破骨細胞特異的Wnt5aコンディショナルノックアウト(cKO)マウスにおけるSclerostin発現解析:(1)破骨細胞特異的Wnt5acKOマウスの解析:リアルタイムPCRを用いて、脛骨におけるsclerostinの発現を解析した。その結果、Wnt5a cKOでは、sclerostinの発現が増加した。この結果はWnt5aがsclerostinの発現を抑制する可能性を示した。(2) UMR106細胞を用いた解析:平成25年度の解析で、UMR106細胞がsclerostinを高発現することを見出した。そこで、UMR106細胞の培養にリコンビナントWnt5aを添加した。Wnt5aは、UMR106におけるsclerostinの発現に影響を及ぼさなかった。つまり、Wnt5aは、sclerostinの発現を抑制しないことを示している。(3) Sclerostinの発現抑制因子の発現:平成25年度の解析から、培養破骨細胞はUMR106細胞のsclerostinの発現を抑制する因子を分泌する可能性が考えられた。そこで、クロマトグラフィーを用いて破骨細胞の培養上清から抑制因子の精製を試みた。一定な溶出画分に抑制活性は認められるものの、精製度が低いため因子の同定には至っていない。Wntが共受容体Lrp5に結合するとβ-カテニンシグナルが活性化され、骨形成が誘導される。一方、骨細胞から分泌されるSclerostin(Sost)は、β-カテニンシグナルを阻害し、骨形成を抑制する。平成27年度は以下の解析を行った。(1)破骨細胞が分泌するsclerostin (Sost)発現抑制因子の解析:ラットの骨肉腫細胞であるUMR106は、Sostを過剰発現する。破骨細胞の培養から調整した培養上清の存在下でUMR106を培養したところ、Sostの発現が抑制された。