hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転写因子Hes1による関節疾患発症の制御機構の解明

Notchシグナルの下流に位置する転写因子Hes1が変形性関節症発症(OA)に寄与するメカニズムを解明するために、タモキシフェン誘導性に軟骨細胞特異的にHes1をノックアウトするマウスを作成し、外科的OAモデルを作成したところ、OAの発生は抑制されていた。Hes1によって誘導される因子であったADAMTS5は配列内のHes1の応答領域が特定された。Hes1の補因子として知られているCaMK2δは変形性関節症の発症に従い発現が増加していた。Hes1はCaMK2δと共同して軟骨細胞において軟骨基質分解酵素を誘導し、変形性関節症の発症に寄与していることがわかった。今年度は変形性関節症と炎症性関節疾患におけるHes1の発現解析をおこなった。まずHes1の発現が関節軟骨の変性過程、炎症過程において、どのように変化するかHes1の発現パターンの解析を行うために、マウスの正常膝関節をコントロールとして、マウス変形性関節症モデルまたはマウス炎症性関節疾患モデルのサンプルのほか、附属病院で行われる人工関節置換術の際、得られるヒトサンプルを用い、免疫組織染色や関節軟骨direct samplingによるリアルタイムRT-PCRにより、Hes1の発現解析を行った。次に、マウスの正常および変形性関節症モデル、炎症性関節疾患モデルの膝から採取した軟骨細胞を用いてHes1のmRNA発現をリアルタイムRT-PCRにより解析し、さらに炎症マーカー、軟骨変性マーカーのmRNA発現との相関を解析した。その結果、炎症性シグナルNfkBシグナルとの相関があることが明らかとなった。時期特異的にHes1をノックアウトできるマウス(Col2a1-CreERt2;Hes1-flox)を交配、作成を開始した。今後はこのマウスを用いて、変形性関節症モデル、炎症性関節疾患モデルを作成する予定である。今年度予定であった、発現解析のサンプル収集、掛け合わせるマウスが入手でき、これまで研究室で既に確立している解析ツールを用いることで、順調に解析をすすめることができている。今年度は関節軟骨で時期特異的にHes1をノックアウトできるマウス(Col2a1-CreERt2;Hes1-flox)を用いて、変形性関節症モデルの解析を行った。In vitroではHes1の下流の標的遺伝子の探索のために、Hes1の強制発現系のアデノウイルスまたは、Creアデノウイルス(Hes1-flox遺伝子を持つ細胞ではCreウイルス感染でHes1の発現がノックアウトされる)をHes1-floxマウスの関節軟骨細胞に感染曝露し、それぞれTotal RNAを回収後、cDNAマイクロアレイを行い、遺伝子発現プロファイルを取得するための予備的検証を行った。マイクロアレイのデータが得られたら、統合的に解析し、Hes1の転写標的遺伝子を解明する。さらに変形性関節症への関与が疑わしいものについては、発現ベクターやsiRNAを準備して機能解析に備える予定である。マウスを用いた実験に関しては、すでにマウスの交配がすすすんでいたため、すぐにモデルの作成と解析に取り組むことができた。アデノウイルスなどのベクターに関してもこれまで研究室で既に確立している解析ツールであったので、順調に解析をすすめることができている。昨年度作成した、関節軟骨で時期特異的にHes1をノックアウトできるマウス(Col2a1-CreERt2;Hes1-flox)と関節軟骨最表層を時期特異的にHes1をノックアウトできるマウス(Prg4CreERt2; Hes1-flox)を作出し、昨年度同様、変形性関節症モデルの解析を行い、Hes1の軟骨組織の最表層部と軟骨層部での組織学的解析の比較を行った。これには前年度、Notchシグナルが関節軟骨最表層では保護的に働くことが報告されたことより我々も下流のターゲットHes1が関節軟骨最表層では保護的に働くのではないかと仮説を立て、Prg4CreERt2; Hes1-floxマウスの解析を行うこととした。現在、DMMモデル(内側半月板を脛骨に繋ぎ止めているmeniscotibialligamentを切離することによって膝関節に不安定性を与える)を用いて、関節軟骨最表層を特異的にダメージを観察できる期間とマウスの週齢を最適化し、解析を行っている。In vitroの解析ではHes1の下流の標的遺伝子の探索のために上記のマウスライン(Col2a1-CreERt2;Hes1-floxとPrg4CreERt2; Hes1-flox)から関節軟骨最表層細胞SFZと軟骨細胞DZをとりわけ、最適化した濃度の水溶性タモキシフェンを投与することでHes1SFZ特異的ノックアウト細胞とHes1DZ特異的ノックアウト細胞を安定的に培養できた。それぞれコントロール群を含めた4群のTotal RNAを回収後、現在関連マーカーを検討している。今後はcDNAマイクロアレイを行い、遺伝子発現プロファイルを取得する。今後は、Hes1の共役分子や標的遺伝子をLC/MSやマイクロアレイデータを用いて探索する予定である。

この解析によって、関節軟骨におけるHes1/Notchシグナルの作用の全貌解明ができると予想されるマイクロアレイのデータが得られたら、統合的に解析し、Hes1の転写標的遺伝子を解明する。さらに変形性関節症への関与が疑わしいものについては、発現ベクターやsiRNAを準備して機能解析に備える予定である。この解析によって、関節軟骨におけるHes1/Notchシグナルの作用の全貌解明ができると予想される。整形外科学当初計画していた、発現解析のサンプル収集、掛け合わせるマウスが入手でき、これまで研究室で既に確立している解析ツールを用いることで、順調に解析をすすめることができたため。おおむね研究が順調に進んだため、必要以上の支出を抑えることができた。Hes1の共役分子や標的遺伝子をLC/MSやマイクロアレイデータ解析にかかる試薬、諸経費。Hes1の転写標的遺伝子の解析、機能解析にかかる費用
川崎病血管炎は脳血管障害のリスク因子となりうるか?

冠動脈瘤残存例(A群:27例)、冠動脈瘤退縮群(B群:12例)、冠動脈正常群(C群:10例)、対照群(D群:17例)を対象として,頚動脈エコーにて右頸動脈の拡張期のintima-media thicknessと、同時に測定した血圧を元に、StiffnessとDistensibilityを測定,またレーザードップラー血流計を用いて皮膚血流計の計測を行い血管内皮機能が正常かどうか、特に心臓や脳血管障害のリスク因子となりうるのかを検討した.研究期間に脳血管障害を発症した症例はいなかったが,A群は収縮期血圧, Stiffnessが優位に高く, Distensibilityは優位に低値であった.またTime to MaxPUが他の群よりも有意に延長していた.これらの結果から冠動脈瘤退縮例や冠動脈正常例では内皮機能を含めた末梢血管は正常と考えるが、脈瘤残存例では血圧が高く頸動脈血管壁は硬く拡張性に乏しく、血管機能障害の存在が示唆された。今回の検討では全症例の年齢が若く,頸動脈のelastic propertyの変化が壮年期の脳心血管病の基礎となるのか,薬物療法などがこれを改善させ得るのかなどは今後長期間の検討が必要と考える。研究課題である血管機能の評価のため,初年度にレーザドップラー血流計測システム(PeriFlux System5000)を使用して、川崎病後遠隔期に冠動脈病変を持つ症例25例(CA群),冠動脈病変消退例13例(Re群),急性期より冠動脈病変を持たない症例15例(No群),年齢を合わせリスク因子のない対照20例(Con群)における微小血管機能の評価を施行し,このシステムの有用性を明確にすることを目標とした。またこれらの症例全例に血液検査を施行し,他のリスク因子がないことを確認し,今後の研究に参加できるかの意志確認などを初年度に行った.現在までの結果では,CA群とRe群,No群Con群では安静時のperfusion unit(安静時PU)その後、腕帯を200mmHgまで加圧し、3分後に急速に減圧し、最大時のperfusion unit(最大PU)を記録したかぎりでは有意差を認めていない.しかしながら最大PUに達するまでの時間が、CA群においては有意に長く(CA群:Re群:No群:Con群=37.4±30.5秒:27.0±14.8秒:15.0±11.8秒:17.0±10.8秒,p<0.05),Re群とNo群,Con群では有意差を認めていないが,Re群では最大PUに達するまでの時間が長い傾向にあった.これらのデータは川崎病罹患後に冠状動脈瘤をもつ症例において、冠動脈以外にも微小血管を含めた末梢血管機能が傷害されている可能性を示唆している。またレーザドップラー血流計測システムの有用性を示していると考える。次年度はさらなる症例を増やし冠動脈病変消退例が本当に末梢血管機能が正常なのかを明らかにし,同時に眼動脈のエコー,頸動脈エコー,眼底所見との比較検討を進めていき,川崎病遠隔期の血管機能が,将来の脳血管病変のリスク因子となりうるのかを明らかにしていく予定である.研究課題である血管機能の評価のため,本年度も引き続きレーザドップラー血流計測システム(PeriFlux System5000)を使用して、川崎病後遠隔期に冠動脈病変を持つ症例25例(CA群),冠動脈病変消退例13例(Re群),急性期より冠動脈病変を持たない症例15例(No群),年齢を合わせリスク因子のない対照20例(Con群)における微小血管機能の評価を施行し,このシステムの有用性を明確にすることを目標として研究を続行した。またこれらの症例全例に血液検査を施行し,他のリスク因子がないことを確認し,今後の研究に参加できるかの意志確認を行った.昨年度までの結果では,CA群とRe群,No群Con群では安静時のperfusion unit(安静時PU)その後、腕帯を200mmHgまで加圧し、3分後に急速に減圧し、最大時のperfusion unit(最大PU)を記録したかぎりでは有意差を認めていない.しかしながら最大PUに達するまでの時間が、CA群においては有意に長く(CA群:Re群:No

群:Con群=37.4±30.5秒:27.0±14.8秒:15.0±11.8秒:17.0±10.8秒,p<0.05),Re群とNo群,Con群では有意差を認めていないが,Re群では最大PUに達するまでの時間が長い傾向にあった.これらのデータは川崎病罹患後に冠状動脈瘤をもつ症例において、冠動脈以外にも微小血管を含めた末梢血管機能が傷害されている可能性を示唆している。現在、別の指標での統計を行い、新しい指標で優意差を認めるかの統計解析を施行している。最終的にはレーザドップラー血流計測システムの有用性が確認できるかを検討予定である。最終年度はさらなる症例を増やし冠動脈病変消退例が本当に末梢血管機能が正常なのかを明らかにし,同時に眼動脈のエコー,頸動脈エコー,眼底所見との比較検討を進めていき,川崎病遠隔期の血管機能が,将来の脳血管病変のリスク因子となりうるのかを明らかにしていく予定である.研究課題である血管機能の評価のため,レーザドップラー血流計測システム(PeriFlux System5000)を使用して、川崎病後遠隔期に冠動脈病変を持つ症例27例(CA群),冠動脈病変消退例15例(Re群),急性期より冠動脈病変を持たない症例17例(No群),年齢を合わせリスク因子のない対照25例(Con群)における微小血管機能の評価を施行し,このシステムの有用性を明確にすることを目標として研究を続行した。またこれらの症例全例に血液検査を施行し,他のリスク因子がないことを確認し,今後の研究に参加できるかの意志確認を行った.安静時のperfusion unit(安静時PU)を計測、その後、腕帯を200mmHgまで加圧し、3分後に急速に減圧し、最大時のperfusion unit(最大PU)を記録したかぎりでは4群間での有意差を認めていない.しかしながら最大PUに達するまでの時間が、CA群においては有意に長く(CA群:Re群:No群:Con群=37-4±32.5秒:27.2±24-2秒:20-5±17.7秒:17.1±12.3秒,p<0.05),Re群とNo群,Con群では有意差を認めていないが,Re群では最大PUに達するまでの時間が長い傾向にあった.これらのデータは川崎病罹患後に冠状動脈瘤をもつ症例において、冠動脈以外にも微小血管を含めた末梢血管機能が傷害されている可能性を示唆している。頸動脈エコーが計測できた症例(冠動脈瘤例では内膜肥厚している症例を認めた)との比較検討を進めていき,川崎病遠隔期の血管機能が,将来の脳血管病変のリスク因子となりうるのかを明らかにしていき、また血流計での計測値の傾きや変化率、体表面積との関連などでの検討を施行しているが、まだ統計学的な差はあきらかではない。レーザドップラー血流計測システムの有用性については今後も検討が必要ではあるが、非侵襲的であり、様々な部位での計測が可能であることから、今後も研究対象や疾患の拡大が期待できると考える。これらの結果から冠動脈瘤退縮例や冠動脈正常例では内皮機能を含めた末梢血管は正常と考えるが、脈瘤残存例では機能障害の存在が示唆された。よって今後も長期の経過観察が必要と考える。
熱ショック蛋白の細胞保護効果を利用した移植臓器長期保存法の開発

小腸組織に予め熱ショック蛋白(hsp-70)を誘導しておくと、冷保存傷害が軽減することを、これまで見出してきた。そこで、本研究では、この冷保存傷害抵抗性獲得機序を、培養小腸粘膜細胞(IEC-18)を用いて検討した。まず、IEC-18細胞を対象とし、予め温熱刺激(43°C、30分)してhspを誘導した群(Group1)と、非加温群(37°C、30分)(Group2)とを作製した。University of Wisconsin(UW)液で24時間冷保存後、再度37°Cで2時間培養した際の傷害程度と24時間培養後のアポトーシスの程度を、それぞれ比較検討した。その結果、(1)抗hsp-70NT22抗体を用いて、冷保存後のhspの発現を検討したところ、Group2に比べGroup1で増強していた。また、Group1における、hspの発現は、保存前に比べ冷保存後に軽度増強した。(2)細胞傷害性の程度をHE染色で調べたところ、Group1ではGroup2に比べ軽減していた。(3)MTT法で解析した細胞生存率も、Group2に比べGroup1で高かった。(4)アポトーシスの程度をDNA-ladderで調べたところ、Group2に比べGroup1で軽減していた。(5)LDHの放出量は、Group1に比べGroup2で多かった。以上の結果から、予めhspを誘導しておくと、IEC-18細胞に冷保存傷害抵抗性が惹起されることが明らかになった。さらに、IEC-18細胞の冷保存傷害抵抗性獲得機序として、hsp誘導によるアポトーシスの抑制が示唆された。熱ショック蛋白(hsp-70)を誘導すると、冷保存傷害が軽減することから、この抵抗性の発現がhsp自体による直接作用か否かを検討した。体重200-300gの雄性Lewisラットを用いて以下の実験を行った。まず、Sodium arsenite(SA)処理でhspを誘導後10、20、30時間冷保存した小腸群(1)と、SA+quercetin処理によりhsp発現を抑制し、10、20、30時間冷保存した小腸群(2)および、無処理後10、20、30時間冷保存した小腸群(3)を作製し、冷保存傷害の程度を比較検討した。(1)群の10、20時間冷保存小腸では、明らかな傷害軽減効果が認められ、この効果はhsp自体による直接作用であることが示唆された。つぎに、SA投与後24時間目に3時間虚血再灌流した群(1')と、SA+quercetin処理によりhsp発現を抑制し、同様に24時間後に3時間虚血再灌流した群(2')および、無処理後24時間目に3時間虚血再灌流した群(3')を作製し、再灌流傷害程度を検討した。(1')群のみに再灌流傷害軽減効果が認められ、この効果はhsp自体による直接作用であることが示唆された。また、(1')群で、NO、TNF、IL-8の産生抑制、IL-10の産生亢進が認められ、(2')群では逆にIL-10の産生が抑制されたことから、hsp誘導による小腸の再灌流傷害抵抗性獲得機序に、サイトカインおよびNOが関与していることが示唆された。一方、培養小腸粘膜細胞(IEC-18)を用いて、予め温熱刺激(43°C30分)によりhspを誘導し6時間培養後、10、20時間冷保存し、傷害程度を比較検討した。培養小腸粘膜細胞を用いた実験においても、hsp誘導による冷保存傷害抵抗性獲得が認められた。

小腸組織に予め熱ショック蛋白(hsp-70)を誘導しておくと、冷保存傷害が軽減することを、これまで見出してきた。そこで、本研究では、この冷保存傷害抵抗性獲得機序を、培養小腸粘膜細胞(IEC-18)を用いて検討した。まず、IEC-18細胞を対象とし、予め温熱刺激(43°C、30分)してhspを誘導した群(Group1)と、非加温群(37°C、30分)(Group2)とを作製した。University of Wisconsin(UW)液で24時間冷保存後、再度37°Cで2時間培養した際の傷害程度と24時間培養後のアポトーシスの程度を、それぞれ比較検討した。その結果、(1)抗hsp-70NT22抗体を用いて、冷保存後のhspの発現を検討したところ、Group2に比べGroup1で増強していた。また、Group1における、hspの発現は、保存前に比べ冷保存後に軽度増強した。(2)細胞傷害性の程度をHE染色で調べたところ、Group1ではGroup2に比べ軽減していた。(3)MTT法で解析した細胞生存率も、Group2に比べGroup1で高かった。(4)アポトーシスの程度をDNA-1adderで調べたところ、Group2に比べGroup1で軽減していた。(5)LDHの放出量は、Group1に比べGroup2で多かった。以上の結果から、予めhspを誘導しておくと、IEC-18細胞に冷保存傷害抵抗性が惹起されることが明らかになった。さらに、IEC-18細胞の冷保存傷害抵抗性獲得機序として、hsp誘導によるアポトーシスの抑制が示唆された。
膵の多段階発癌に対する制御機構に関する研究

本研究の目的は、各班員の得意な手法を用いて分子レベルから生体レベルに至る多方面より総合的に追求し、膵における多段階の発癌機構を解析し、その各段階における制御機構を解明することにある。膵発癌に関与するDNA異常については、スターの膵管癌発生過程で、前癌病変とされる異型過形成巣と膵管内癌にてc-K-rasの点突然変異が検出され、このDNA異常は膵管上皮細胞の悪性化に関与するものであることが示唆された(小西)。ヒトの膵管癌症例にはては、c+K+rasの点突然変異は13/24例(54%)にみられ、p53の変異は11/23例(49%)で、これらの変異の重複は9/24例(38%)であり、症例の臨床st ageの解析からc-K-rasの変異は、膵癌発生過程での比較的早期の異常であり、p53のそれは後期の異常であることが示唆された(関谷)。更に、膵性膵火10例の膵管上皮過形成巣にてもc-K-rasの変異は高率に検出され、この点突然変異を検出しても膵癌とは診断しえないことが示された(柳沢)。ハムスターの膵発癌に対するcholecystokininの促進効果は否定され、又、ras recision geneを誘導し、活性化rasの機能を抑制化するとされるアザチロシンの膵発癌抑制効果は否定された(小西)。合成抗マラリア剤で膵に親和性を持つquinacrineの膵発癌に対するプロモーション作用が見い出され、喫煙は、膵発癌のイニシエーションを抑制する傾向が見い出され、プロモーションに対する促進効果は否定された(高橋)。ハムスター膵に対する発癌物質であるニトロソ化合物の突然変異原性は、一次及び二次胆汁酸と膵液処理により増強することが示された(森)。雑種成犬の膵管内へハムスターにおける膵発癌物質を投予すると膵液を介して膵管癌の発生することが示唆された(鎌野)。膵癌におけるDNA異常を高率に検出し得るligase chain reactionを開発中である(三輪)。ハムスター膵発癌のイニシエイションにラ氏島細胞の関与が示唆された(石川)。
脳マラリア発症に関わる宿主因子の同定と病態メカニズムの解明

マラリアは今もなお年間2億人が感染し、50万人もの死者を出す世界最大規模の感染症である。マラリアのコントロールのためにはその病態を詳細に理解する必要があり、これまでにもマラリア患者の解析やマウスモデルを使って多くの知見が集積されてきた。しかし、ヒトとマウスで共通してマラリアの病態や防御に重要な分子はあまり知られていない。本研究では、マラリア患者の血漿を網羅的に解析し、重症化因子と防御因子の候補を抽出し、これらの候補分子の関与をマウスモデルで検討する。候補分子の重要性が確認できたら、その分子の働きを明らかにし、最終的にはマラリアの病態のメカニズムの全貌を明らかにすることを目的とする。
ハイスループットゲノム解析を用した小児脳腫瘍における標的チロシンキナーゼの解析

小児中枢神経系腫瘍は小児がんの中で白血病に次いで頻度が高い。悪性度の高い髄芽腫や脳幹部に発生する腫瘍は予後不良であり、また星細胞腫などの良性腫瘍でも占拠病変によってはしばしば重篤な後遺症を伴う。そこで本研究では、小児中枢神経系腫瘍に対する有効かつ副作用の少ない新たな治療法を開発する目的で、髄芽腫10例、神経膠腫5例およびPNET20例、計35例の小児中枢神経腫瘍につきSNP array CNAG/AsCNARによる網羅的ゲノムコピー数の解析を行った。一方、IDH1、IDH2がコードするイソクエン酸デヒドロゲナーゼは、脳内におけるNADP^+からNADPHへの還元を触媒する機能を有するが、WHOグレードIIまたはIIIの成人神経膠腫445個のうち、70%でこれら2つの遺伝子のいずれい一方が変異していることが明らかになった。そこで、IDH1およびIDH2のシークエンス解析も合わせて行ない、小児中枢神経腫瘍の発症にこれらの遺伝子が関与しているが否かを検討した。網羅的ゲノムコピー数の解析では、髄芽腫における染色体2pの高度増幅、1pの欠失、神経膠腫における11qのgain、10pの欠失、PNETにおける1pの欠失および19pのgainが比較的高頻度な領域であることが判明した。これらの領域内にはそれぞれの腫膓の発症に関与する標的分子が存在する可能性が示唆された。またIDH1、IDH2のcoding regionのシークエン解析の結果、神経膠腫1検体でIDH2V8G変異が検出された以外、変異は検出されなかつた。IDH2V8G変異が代謝産物に及ばす影響につき、キャピラリー電気泳動-飛行時間型質量分析計(CE-TOFMS)を用いて測定したところ、成人腫瘍で見出された機能獲得作用は観察されなかった。従って、小児中枢神経系腫瘍の発症に、IDH1、IDH2の関与は少ないと考えられた。
フタル酸ジ-2-エチルヘキシルの毒性メカニズムの解明とメカニズムを基にしたリスクアセスメント

フタル酸ジ-2-エチルヘキシル(DEHP)の毒性発現に種差があることは既に知られている。この種差の原因としてまず第一にDEHPの代謝の種差を見当した。その結果、リパーゼの活性の種差(キネティクスの種差)が大きく、マウスとマーモセットの間には150倍以上の差が認められた。今回はDEHPのダイナミクスの種差を明らかにするために、DEHPの代謝物のMEHPが配位するPPARαの標的遺伝であるミトコンドリアのmedium chain acylCoA dehydrogenase(MCAD)等とペルオキシゾームのperoxisomalthiolase(PT)等のDEHP投与による誘導を検討した。1.8週齢の雄CD-1マウスとSDラットを、コントロール群とDEHP2.5mmol/kgb.w.投与群に分け2週間経口投与した。3ヶ月齢の雄マーモセットは、コントロール、DEHP0.25,1.25,6.25mmol/kgb.w.投与群に分け、15ヶ月経口投与した。これらの動物を解剖後、肝臓を用いてRNA単離、Oligo(dT)_<12-18>プライマーでcDNA合成した。プライマーは、マウスMCAD GI6680617,ラットMCAD GI202688,マウスPT GI18700003,ラットPT GI6978428の塩基配列を参考に、またマーモセットに関してはマウスとヒトの配列の共通部分からmRNAの一部分の配列を読み取り作成した。2.マウス、ラットではMCADの誘導が見られたが、マーモセットでは1.25,6.25mmol/kgb.w.で減少傾向が見られた。これらの結果はウェスタンブロット法(蛋白の発現量)での結果と一致する傾向が見られた。3.PTはラットで最も強く誘導され、マウスでも誘導が見られたが、マーモセットでは1.25,6.25mmol/kgb.w.で減少傾向が見られた。しかしウェスタンブロット法で蛋白の発現をみると、PTの誘導はラットとマウスの間に大差なかった。DEHPのカイネティクスより、PPARα標的遺伝子発現の誘導はマウス>ラット>マーモセットであるとの仮説をたてて実験を行った。しかし、実際はこのような単純な仮説だけでは説明できず、DEHPのダイナミクスの種差にはカイネティクスの種差の関与もあるが、これだけでは説明できないダイナミクスの種差もみられることが判明した。マウス、ラット、マーモセットの肝、小腸、腎、肺におけるDEHPの代謝に関わる酵素、リパーゼ、UDP-グルクロニルトランスフェラーゼ(UDPGT)、シトクロムP450 4A(CYP4A),アルコール脱水素酵素(ADH),アルデヒド脱水素酵素(ALDH)の活性の種差を、in vitroの代謝実験から検討した。リパーゼの活性は生成するモノ-2-エチルヘキシルフタル酸(MEHP)のシラン誘導体を既設の機器GC-MSで測定することにより評価した。UDPGTは代謝物を既設のHPLCで測定、CYP4Aはwestern blot分析、ADHとALDHの活性はNADHの生成速度から評価した。リパーゼの活性はどの臓器においてもマウス>ラット>マーモセットであり、それぞれの動物間に10倍以上の活性の差がみられた。すなわち、マウスとマーモセットの活性の差は150倍もあった。MEHPに対するUDPGTの活性は非常に低いが認められ、種差がみられたが、そのマウスとマーモセットの差はたった2倍であった。CYP4Aは抗体で発現量を検討した。抗体の親和性の種差を除外すると、ラット>マウス>マーモセットであった。MEHPの代謝物と、リパーゼによる加水分解生成物の2-エチルヘキサノールに対するADHとALDHに関しては、一般にマーモセットあるいはラットの活性が高く、マウスの活性は低かった。しかしこれらの種差は5倍程度の差であった。以上の結果から、各臓器におけるDEHPの代謝の種差を総合的に判定すると、リパーゼの活性の種差が著しく大きく、この活性の種差がDEHPの活性代謝物であるMEHPの内部曝露量に大きな影響を与えることが予想される。通常リスク評価はDEHPの外部曝露量を参考に行われる。しかしこのような代謝の種差が大きい化学物質に関しては、活性代謝物の内部曝露量からリスク評価を行うべきと思われる。

これらの動物を解剖後、肝臓を用いてRNA単離、Oligo(dT)_<12-18>プライマーでcDNA合成した。プライマーは、マウスMCAD GI6680617,ラットMCAD GI202688,マウスPT GI18700003,ラットPT GI6978428の塩基配列を参考に、またマーモセットに関してはマウスとヒトの配列の共通部分からmRNAの一部分の配列を読み取り作成した。2.マウス、ラットではMCADの誘導が見られたが、マーモセットでは1.25,6.25mmol/kgb.w.で減少傾向が見られた。これらの結果はウェスタンブロット法(蛋白の発現量)での結果と一致する傾向が見られた。3.PTはラットで最も強く誘導され、マウスでも誘導が見られたが、マーモセットでは1.25,6.25mmol/kgb.w.で減少傾向が見られた。しかしウェスタンブロット法で蛋白の発現をみると、PTの誘導はラットとマウスの間に大差なかった。DEHPのカイネティクスより、PPARα標的遺伝子発現の誘導はマウス>ラット>マーモセットであるとの仮説をたてて実験を行った。しかし、実際はこのような単純な仮説だけでは説明できず、DEHPのダイナミクスの種差にはカイネティクスの種差の関与もあるが、これだけでは説明できないダイナミクスの種差もみられることが判明した。
NOAA,MOSー1,国土数値情報デ-タを用いた融雪出水機構に関する研究

東北地方においては冬期の降雪は水循環を考える上で重要な要素であり,また,春の融雪出水は水資源および防災の両面から重視される.本研究では衛星デ-タを用いて,残雪面積を計測し,それから残雪量を推定する方法を提案し,さらに残雪面積情報を組み込んだ融雪出水モデルを作成した.用いたのは,国産衛星MOSー1のMESSRデ-タと東北大学で直接受信を開始したNOAA衛星のAVHRRデ-タ,および只見川上流域での水文・流量デ-タである.MOS1と国土数値情報デ-タの高度,河川,地質デ-タとを用いて,流域の地覆,地形,地質,流路網などの水文特性について流域デ-タベ-スを作成する方法について検討した.つぎに,NOAAーAVHRRデ-タより,残雪域を判別する方法について考察し,1989年から1990年までの3年間の融雪期の残雪域の変化の時系列デ-タをNOAAのデ-タより作成した.同時にダム流入量デ-タを入手し,これらを比較することにより,融雪出水の特性を考察し,残雪面積と残雪量との関係を求めた.さらに,残雪面積,降水量,温度を入力とする融雪流出タンクモデルを作成し,最適化手法で係数決定を行った.得られたモデルはトレ-ニングデ-タの再現,別の年の融雪流出予測いずれについても,満足のいく結果を与えるものであることが確かめられた.東北地方においては冬期の降雪は水循環を考える上で重要な要素であり,また,春の融雪出水は水資源および防災の両面から重視される.本研究では衛星デ-タを用いて,残雪面積を計測し,それから残雪量を推定する方法を提案し,さらに残雪面積情報を組み込んだ融雪出水モデルを作成した.用いたのは,国産衛星MOSー1のMESSRデ-タと東北大学で直接受信を開始したNOAA衛星のAVHRRデ-タ,および只見川上流域での水文・流量デ-タである.MOS1と国土数値情報デ-タの高度,河川,地質デ-タとを用いて,流域の地覆,地形,地質,流路網などの水文特性について流域デ-タベ-スを作成する方法について検討した.つぎに,NOAAーAVHRRデ-タより,残雪域を判別する方法について考察し,1989年から1990年までの3年間の融雪期の残雪域の変化の時系列デ-タをNOAAのデ-タより作成した.同時にダム流入量デ-タを入手し,これらを比較することにより,融雪出水の特性を考察し,残雪面積と残雪量との関係を求めた.さらに,残雪面積,降水量,温度を入力とする融雪流出タンクモデルを作成し,最適化手法で係数決定を行った.得られたモデルはトレ-ニングデ-タの再現,別の年の融雪流出予測いずれについても,満足のいく結果を与えるものであることが確かめられた.
LVLプレストレス木床版橋の環境適応性に関する研究

LVLプレストレス木床版の実用性を検討する目的で、木床版模型を製作し緊張力変化を実験により確認した。緊張力は木材のクリープにより減少するほか、周囲環境により変化する。本研究では、長期実験室内と屋外暴露試験での木床版模型の緊張力変化特性を目的とした。実験室内では、スギ製材とスギLVLの木床版、暴露試験ではスギ集成材とLVL木床版を対象とした。周囲環境として温度、湿度を測定し、水蒸気圧を計算し緊張力との関係を調べた。室内実験では、製材は初期緊張力に対して35%から120%の間で変化し、LVLでは30%から105%の間で変化した。実験は2年を経過したが、水蒸気圧と緊張力変化は季節変動および日々の変化ともによく対応している。これまで3度の再プレストレスを導入したが、LVLはプレストレス導入直後の減少率が製材に比べ大きいものの、再プレストレスをかけるごとにその差は縮小している。また、水蒸気圧上昇に伴う緊張力増加に関しては、LVLより製材の上昇率が大きい傾向となった。この実験よりLVLは初期において緊張力低下が大きいが、いったん締め付けられると、周囲環境変化に対する緊張力変化は小さくなることが確認できた。また、暴露試験では、床版が直接風雨や積雪の影響を受けないよう屋根構造とした。内外に設置した温湿度計からピーク時の水蒸気圧に若干差が見られるもののほとんど同様の傾向を示し、屋根の設置による環境条件の違いはないものと判断した。床版模型は実橋の約1/4の規模で、含水率変化を調べる目的で,定期的に床版重量を直接測定している。同時にLVL小試験片の重量変化も高感度の秤を使用し自動計測しているが,風の影響等で安定的な計測ができず,今後自動的に床版自身の重量を測定することを検討している。暴露試験は測定開始から約4ケ月しか経過しておらず,まだ,季節変動までのデータはそろわないが,緊張力変化と水蒸気圧は対応していることが確認されている。
変調操作CVD法による薄膜形成における初期核発生・成長過程の制御

ULSIの高集積化に伴い,幅100nm程度の極微細配線を制御性良く形成できる技術の確立が求められている。本研究では,CVD法(化学気相反応法)による配線用金属薄膜,拡散防止膜(バリヤメタル)の合成において,原料ガスを周期的に交互に供給する流量変調操作手法を用いて,初期核発生の制御や薄膜物性の制御を試みた。レーザ光表面反射強度のその場観察結果をもとに,Al, Cu, WのCVD合成において初期核発生に関する検討を行った結果,W-CVDでは初期核発生に至る臨界膜厚(W吸着量)は1MLであることを見出し,初期核発生に至るまでの吸着量経時変化を詳細に実測し,これを説明するモデルを構築した。Al-CVDの系では表面反応速度の濃度依存性を詳細に解析した。得られた成長速度式をもとに3次元シミュレーションを併用して高速均一埋め込み成長の最適条件探索・設計を行ったが,表面性情が不安定なためか,核発生密度が低く,埋め込みを完成するには至らなかった。Cu-CVDでは核発生の制御性向上を目指して検討を行い,到達真空度を管理するよりはRun-to-Runの時間間隔を一定に維持すること重要であることを明らかにした。また,水蒸気を周期的に添加することにより,初期核発生だけでなく,2次核発生の促進または表面反応の促進効果により,平滑性に優れた膜を合成できることを示した。バリヤメタルの合成に関しては,TiC1_4とNH_3を原料とするTiNのCVD合成において,TiCl_4/NH_3の同時供給とNH_3のみの供給を周期的に行い,低温でも良質なTiN膜の合成に成功した。同様の手法であるALD(Atomic Layer Deposition)と比較して,本手法は成長速度が1桁以上高く,量産に適した手法であることが特徴である。これは,TiN成長表面にTiを含む吸着物が3ML程度存在し,これをNH_3のみの供給の時間にもTiNに転化しているためであることを明らかにした。従来,ULSIはデバイスサイズを縮小化することにより動作速度の向上,メモリー容量の向上などを達成できたため,比例縮小の法則はデバイス高機能化の指導原理として長らく定着してきた。しかし,ゲート幅0.25μm以降の世代では,縮小に伴う数々の弊害が顕在化し,比例縮小によるデバイス性能向上を維持するには,新規材料の導入などを余儀なくされている。例えば,多層配線ではRC遅延時間の増大に対処するため,従来のシリコン酸化膜に代わり,低誘電率層間絶縁膜を採用するとともに,Alよりも抵抗が低くエレクトロマイグレーション耐性の高いCuを利用するようになっている。このように,多種多様な材料のグローバルインテグレーションは比例縮小に代わるデバイス高機能化の指導原理となりつつある。しかし,これを実現するには,多種多様な下地表面上にステップカバレッジ良く均一に製膜するCVD技術やどのような材料でも制御性良くエッチングするドライエッチング技術の確立を要求される。特に多層配線用金属薄膜のCVD合成では,下地の材質,表面状態によって製膜初期に数ナノメートルから数十ナノメートルの縞状組織が形成されるため,連続膜形成が難しく,デバイス微細化に対する大きな課題となっていた。本研究では,このような状況に対処するため,原料ガスの交互供給など,変調操作を基本とするCVDプロセスの構築と高度化を目指している。平成13年度は,Al, Cu, WのCVD合成において,レーザ光反射強度変化のその場観察を基に,製膜初期の核発生・成長に関する解析を行った。波長670nm程度の赤色レーザ光の反射強度は製膜初期には下地基板材料の反射率に対応する値を示すが,表面に縞状組織が形成されるとその強度はいったん低下し,縞状組織が融合して連続膜化すると再び反射強度が増大する。このことを利用して,核発生に至る誘導期(Incubation Time)を同定することが可能となり,この間の表面状態変化を観測した。その結果,Al, Cu, Wいずれの系においても,製膜初期から少しずつ各製膜種が吸着し,12ML程度の吸着となった段階で核発生することが分かった。フッ酸処理などにより,Incubation Timeの変化を考察するとともに,パルス的な原料導入などが核発生段階に及ぼす影響について系統的なデータの収集を行った。これを基に,来年度は下地表面状態に依存せず安定に核発生できる変調操作を構築する予定である。

本研究では,このような状況に対処するため,原料ガスの交互供給など,変調操作を基本とするCVDプロセスの構築と高度化を目指している。平成14年度は,レーザ光表面反射強度のその場観察結果をもとに,Al, Cu, WのCVD合成において初期核発生に関する検討を行った。その結果,W-CVDでは初期核発生に至る臨界膜厚(W吸着量)は1MLであること,この膜厚は成長条件に依存しないことを明らかにした。また,ラングミュア型の被覆率時間変化を観測でき,これをもとに成長メカニズムのモデル化をした。Cu-CVDでは核発生の制御性向上を目指して検討を行い,到達真空度を管理するよりはRun-to-Runの時間間隔を一定に維持すること重要であることを明らかにした。また,水蒸気の添加により核発生を促進可能であることを見出した。Al-CVDの系では表面反応速度の濃度依存性を詳細に解析した。得られた成長速度式をもとに3次元シミュレーションを併用して高速均一埋め込み成長の最適条件探索・設計を行った。来年度はこれらの成果をもとに,多層配線形成のさらなる高度化を目指す予定である。ULSIの高集積化に伴い,幅100nm程度の極微細配線を制御性良く形成できる技術の確立が求められている。本研究では,CVD法(化学気相反応法)による配線用金属薄膜,拡散防止膜(バリヤメタル)の合成において,原料ガスを周期的に交互に供給する流量変調操作手法を用いて,初期核発生の制御や薄膜物性の制御を試みた。レーザ光表面反射強度のその場観察結果をもとに,Al, Cu, WのCVD合成において初期核発生に関する検討を行った結果,W-CVDでは初期核発生に至る臨界膜厚(W吸着量)は1MLであることを見出し,初期核発生に至るまでの吸着量経時変化を詳細に実測し,これを説明するモデルを構築した。得られた成長速度式をもとに3次元シミュレーションを併用して高速均一埋め込み成長の最適条件探索・設計を行ったが,表面性情が不安定なためか,核発生密度が低く,埋め込みを完成するには至らなかった。また,水蒸気を周期的に添加することにより,初期核発生だけでなく,2次核発生の促進または表面反応の促進効果により,平滑性に優れた膜を合成できることを示した。バリヤメタルの合成に関しては,TiC1_4とNH_3を原料とするTiNのCVD合成において,TiCl_4/NH_3の同時供給とNH_3のみの供給を周期的に行い,低温でも良質なTiN膜の合成に成功した。同様の手法であるALD(Atomic Layer Deposition)と比較して,本手法は成長速度が1桁以上高く,量産に適した手法であることが特徴である。これは,TiN成長表面にTiを含む吸着物が3ML程度存在し,これをNH_3のみの供給の時間にもTiNに転化しているためであることを明らかにした。
レイノー症状発現におけるムスカリン性アセチルコリン受容体に対する自己抗体関与

レイノー現象は寒冷刺激等で誘発される血管攣縮であるが、その発現機序は不明である。血管攣縮にはα1-、α2-アドレナリン受容体(AdrR)ムスカリン性アセチルコリン受容体(m-AchR)や、内皮細胞由来弛緩因子の関与が考えられている。レイノー現象はしばしば自己免疫疾患である結合織疾患(CTD)に発症することから、レイノー現象の発現機序に自己抗体の関与が考えられ、検討している。前年度はヒトの脳灰白質をm-AchRの材料として用い、レイノー現象陽性のCTD患者の血清IgG分画にm-AchR活性を阻害する因子の存在を明らかにした。そこで、本年度は、直接、血管由来の細胞を用いて検討を始めた。ヒト由来の細胞が望ましいが、まだ適切な細胞がえられないので、今回はブタ胸部大動脈平滑筋、および内皮由来の培養細胞(PAS20、PAE20)を用いた。抗受容対抗体の測定の準備として、これら細胞上に上記受容体の存在を検討した。その結果、m-AchRの存在は確認できなかった。しかし、α1-AdrRはscatchard plotにて一直線上に分布し、単一親和性のα1-AdrRの存在が示された。この受容体の材料を用いて患者IgG中のα1-AdrRに対する阻害活性を測定する予定である。PAE20を用いて患者血清の血管内皮細胞障害性の検討をした。細胞障害を示す死細胞率では、正常人群37.8±5.7%に比し、レイノー現象陽性CTD群71.6±22.1%(P<0.01)、血管炎群76.6±16.6%(P<0.02)と有意に高値を示した。これはCTDの血管病変に内皮細胞障害因子が関与し、またレイノー現象発現に内皮細胞由来の血管弛緩因子の関与が示唆された。以上のごとく、レイノー現象の発現機序に自己抗体の関与を示唆する知見がえられた。
周生期脳障害の抑制効果を示す機能性糖鎖の同定と作用機序の解析

本研究の目的は、プロテオグリカン、特にそのコンドロイチン硫酸(CS)糖鎖を利用して、周生期脳障害の新たな早期治療法への道を拓くことである。この目的に向かって、本年度は、以下の成果を上げた。1.コンドロイチン硫酸による神経系前駆細胞の機能調節神経系前駆細胞のニューロスフェアー培養系に、FGF-2と共に種々の市販CS標品を添加したところ、CS-BおよびCS-Eがヘパリンやヘパラン硫酸と同程度の増殖促進効果を持つことを発見した。さらに、驚くべきことに、神経系前駆細胞に富む胎生14日ラット胎仔脳由来のCS標品にも、FGF-2依存性の神経系前駆細胞の増殖を促進する活性が認められた。このCS標品は、CS-B由来の二糖単位(B-unit)を約5%、CS-E由来の高硫酸化二糖単位(E-unit)を2%弱含む。このことから、これら二糖単位が構成する機能領域が、胎仔脳由来のCSには存在することが示唆された。2.コンドロイチン硫酸機能領域の検索CS-BおよびCS-E多糖鎖中の、神経系前駆細胞増殖促進活性領域を同定することを目指して、CS-Bを亜硝酸/ヒドラジン分解により、また、CS-Eを精巣性ビアルロニダーゼ消化により、分子サイズの異なるオリゴ糖を調製した(弘前大学・高垣啓一教授による)。いずれのオリゴ糖も、FGF-2の活性を増強しなかった。一方、CS-BとFGF-2存在下で、CS-B由来オリゴ糖を添加した場合、二糖画分がCS-B多糖によるFGF-2の活性増強を抑制した。また、CS-EおよびFGF-2存在下で、CS-E由来オリゴ糖を添加した時には、六糖および四糖画分がCS-E多糖によるFGF2の活性増強を抑制した。この結果から、FGF-2依存性の細胞増殖を促進するためには、CS-BとCS-Eは多糖であることが心要である。しかし、その活性発現に必須な機能領域は、二六糖程度の低分子と思われる。本研究の目的は、プロテオグリカン、特にそのコンドロイチン硫酸多糖側鎖を利用して、周生期脳障害の新たな早期治療法への道を拓くことである。この目的達成のため、次の2つの方向から研究を進め、以下の結果を得た。1.新生仔ラット低酸素虚血脳におけるプロテオグリカンの発現変動生後7日齢ラットの右総頚動脈閉塞後、低酸素(8%)チャンバーに90分入れることにより、右大脳皮質に重篤な組織の損傷が生じる。この実験モデルを使用して、低酸素処理後の損傷部におけるプロテオグリカンの発現を、免疫組織化学およびWestern blot法により調べた。その結果、ニューロカン、NGCおよびN-シンデカンについては、対側大脳皮質部と比べて、免疫染色性および量ともに著変が認められなかった。ところが、ホスファカン/PTPζの免疫染色性は、24時間までに著しく亢進することが明らかとなった。2.神経前駆細胞の機能調節に関わるグリコサミノグリカンのスクリーニング胎生14日齢ラットの終脳から調製した細胞を、bFGFあるいはEGF(あるいはその両方)存在下で培養すると、神経前駆細胞がニューロスフェアーを形成する。この培養系に市販の各種グリコサミノグリカンを10μg/mlの濃度で添加し、形成されるニューロスフェアーの大きさを測定した。その結果、コンドロイチン硫酸AおよびCには、ニューロスフェアー形成促進効果は認められなかったが、デルマタン硫酸およびヒアルロン酸には、形成促進効果があることが分かった。本研究の目的は、プロテオグリカン、特にそのコンドロイチン硫酸糖鎖を利用して、周生期脳障害の新たな早期治療法への道を拓くことである。この目的に向かって、本年度は、以下の成果をあげた。1.神経前駆細胞に富む未成熟脳のプロテオグリカン/グリコサミノグリカンの同定胎生14日ラット終脳から精製したコンドロイチン硫酸は、DEAEカラムクロマトグラフィーにより2つの画分に分かれた。高塩濃度で溶出される画分には、高硫酸化二糖単位であるE-単位の存在が確認できたが、D-単位は検出できなかった。また、神経前駆細胞が形成するニューロスフェアーと呼ばれる細胞塊は、ニューロカンとホスファカンを合成分泌していることも明らかにした。一方、コントロイチナーゼABC存在下で、ニューロスフェアー培養を行うと、神経前駆細胞の培養皿への接着性が増強されることから、神経前駆細胞の周囲に存在するコンドロイチン硫酸が、神経前駆細胞の行動を調節していることが示唆された。2.周生期低酸素虚血モデルラットの脳損傷部の定量化と分子病態モデルラット脳の損傷部は、低酸素負荷後48時間で、TTC法により定量化が可能であった。網膜神経節細胞の生存を維持する効果が報告されているニプラジロールを、あらかじめ脳室内に投与し、TTC法で脳の損傷域を定量したところ、損傷域が減少する傾向が認められた。一方、脳の損傷部では、低酸素負荷後、細胞内骨格タンパクの減少(分解)とともに、ホスファカン、特に受容体型分子の減少が起きることも明らかとなった。本研究の目的は、プロテオグリカン、特にそのコンドロイチン硫酸(CS)

糖鎖を利用して、周生期脳障害の新たな早期治療法への道を拓くことである。この目的に向かって、本年度は、以下の成果を上げた。1.コンドロイチン硫酸による神経系前駆細胞の機能調節神経系前駆細胞のニューロスフェアー培養系に、FGF-2と共に種々の市販CS標品を添加したところ、CS-BおよびCS-Eがヘパリンやヘパラン硫酸と同程度の増殖促進効果を持つことを発見した。さらに、驚くべきことに、神経系前駆細胞に富む胎生14日ラット胎仔脳由来のCS標品にも、FGF-2依存性の神経系前駆細胞の増殖を促進する活性が認められた。このCS標品は、CS-B由来の二糖単位(B-unit)を約5%、CS-E由来の高硫酸化二糖単位(E-unit)を2%弱含む。このことから、これら二糖単位が構成する機能領域が、胎仔脳由来のCSには存在することが示唆された。2.コンドロイチン硫酸機能領域の検索CS-BおよびCS-E多糖鎖中の、神経系前駆細胞増殖促進活性領域を同定することを目指して、CS-Bを亜硝酸/ヒドラジン分解により、また、CS-Eを精巣性ビアルロニダーゼ消化により、分子サイズの異なるオリゴ糖を調製した(弘前大学・高垣啓一教授による)。いずれのオリゴ糖も、FGF-2の活性を増強しなかった。一方、CS-BとFGF-2存在下で、CS-B由来オリゴ糖を添加した場合、二糖画分がCS-B多糖によるFGF-2の活性増強を抑制した。また、CS-EおよびFGF-2存在下で、CS-E由来オリゴ糖を添加した時には、六糖および四糖画分がCS-E多糖によるFGF2の活性増強を抑制した。この結果から、FGF-2依存性の細胞増殖を促進するためには、CS-BとCS-Eは多糖であることが心要である。しかし、その活性発現に必須な機能領域は、二六糖程度の低分子と思われる。
心拍変動からみた日本人の自律神経活動の個人差

個人間変動と個人内変動は異なる意味を持っている。個人間変動は遺伝的に決定される要因と環境適応の結果である。これに対し,個人内変動は生体の示す短期的な不安定さの結果である。生理反応の個人差については,個人間変動と個人内変動を分離する必要がある。個人間変動と個人内変動を分離するには同一被験者に対して反復測定が必要となる。本研究では70-75名の男性被験者に対し,心拍変動の測定を4-8回繰り返した。また呼吸コントロール3条件,姿勢3条件の組み合わせで測定を行ったため,欠測値を除いた有効データ数で3546サンプルのデータが得られた。本研究はいわゆるshort-term HRVとしては国際的にも最大規模のものであると考えられる。本研究から得られた主な成果は以下の通りである。1.安静時心拍変動の個人間および個人内変動の定量化心拍変動の個人間-個人内変動はCV(変動係数)で40-50%と20%程度であった。対数変換した場合には14-16%と6-7%となった。2.安静時心拍変動の分布特性とデータ変換の関係LF, HF成分そのままでは分布に偏りが見られるが,対数変換もしくは全パワーに対する比率で表した場合に分布の正規性が高まった。3.呼吸コントロールによる再現性の向上4秒周期の呼吸コントロールでは心拍変動測定の再現性は向上しないことが明らかになった。4.低周波変動の定量化による脈拍測定時の誤差推定10秒や15秒などの短い測定から推定される毎分心拍数の推定精度にはLF, VLFの心拍変動の低周波成分の大きさに依存していることを明らかにした。5.各種データ変換の有効性LF, HFに対し対数変換,平方根,全変動に対する正規化などの変換を行い,分布特性や姿勢変化に対する反応性などを検討した。この結果,よく用いられる対数変換よりも平方根変換の方が有利な点があることを明らかにした個人間変動と個人内変動は異なる意味を持っている。この結果,よく用いられる対数変換よりも平方根変換の方が有利な点があることを明らかにした本課題の目標は多人数測定を可能とする心拍変動測定手法の確立と,この手法を用いてできるだけ大きな集団での心拍変動パラメータの標準値,分布特性,または他の指標との関連性を明らかにすることである。心拍変動測定は従来実験室内での比較的少人数測定が中心であったことから,大規模調査によって新たな知見が得られることが期待できる。従って本課題で開発し利用する心拍変動測定法は,個々の測定の厳密さよりも簡便さを重視し,サンプル数の大きさをもって集団的特性の推定精度を向上させることが目的である。心拍変動の測定用機器としては,腕時計型心拍計を利用することを計画していた。しかしながら多数同時に使用した場合電波障害などでやや不安定になる傾向が見られた。そこで有線式のポータブル心電計を購入し比較検討を行った。この測定機器はシンプルなので電波障害のようなトラブルは起こらないが,特注品なので今後の機器の確保が難しい。また本課題でポイントとなるのは心拍変動測定中の呼吸コントロールである。本年度は大人数が同時に実行可能な呼吸コントロール法を検討することが大きな目標であり,当初の計画ではぜん息患者の健康管理用に市販されているピークフローメータを用いた呼吸コントロールを想定していた。しかしながら予備実験の結果このピークフローメータでの呼吸コントロールはかなり困難であり,実用的でないと判断された。

これらの事情を考慮して,腕時計型心拍計を用いた呼吸リズムのみのコントロールによる大量測定と,有線ポータブル心拍計と差圧式呼吸流量計の組み合わせによる比較的少人数測定の両面で進めていくことを検討している。本課題の目標は多人数測定を可能とする心拍変動測定手法の確立と,この手法を用いてできるだけ大きな集団での心拍変動パラメータの標準値,分布特性,または他の指標との関連性を明らかにすることである。心拍変動測定は従来実験室内での比較的少人数測定が中心であったことから,大規模調査によって新たな知見が得られることが期待できる。従って本課題で開発し利用する心拍変動測定法は,個々の測定の厳密さよりも簡便さを重視し,サンプル数の大きさをもって集団的特性の推定精度を向上させることが目的である。3月に成人男性40名を対象とした実験を行った。各被験者は呼吸,姿勢条件を変えながら4回の測定繰り返しを行った。被験者は40名であるが,繰り返し数を考えると160サンプルを得られたことになり,1集団の計測としては当初の目標はほぼクリアできたと言える。またこの測定では非常に大量のデータが得られるので,データ管理やエラー修正のためのソフトウェアを開発した。本年度は比較的少人数での試験的測定を行うことのみを予定していたので,当初計画より若干先行していると言える。データは現在解析中であるが,修復不可能なエラーや完全な計測ミスは全体の2割程度であり,許容範囲内であると思われる。したがって細部に改良の必要はあるものの,技術的な面だけでなく,被験者募集の方法なども含め,心拍変動の大規模測定の手法は概ね確立できたものと考えられる。前年度までに,被験者募集の方法なども含め心拍変動の大規模測定の手法はほぼ確立されたので,本年度はさらに測定を進めた。前年度は成人男性40名に4回繰り返しの測定を行ったが,今年度は(前回とは異なる)成人男性40名に8回繰り返しの測定を行った。それぞれ呼吸条件(3)と姿勢条件(3)の組み合わせで測定を行ったので,前年度分と併せて約3600サンプルのデータが得られたことになる。1サンプルは4分のデータなので,合計240時間分の心拍変動データが得られたことになる。健常者の心拍変動の大規模測定の例としては,海外で1000名以上の測定例があり,国内でも400名以上の測定結果が報告されている。被験者数だけ見れば本研究の測定規模は特に大きいとは言えないが,繰り返しがあることや合計時間の点から見れば,現時点でも最大規模の心拍変動データが得られたと言える。このデータを用いて心拍変動の各姿勢に部ける標準値や分布特性,また個人内変動と個人間変動の比率等を明らかにすることが出来る。40名分のデータを用いた暫定的な分析では,呼吸コントロールを行っても個人内変動は減少しない結果となった。これは予想に反する結果であり,データ数を増やしたときにどのような結果になるか注目される。またこれまでに得られたデータを用いて,脈拍測定時の誤差特性に関する研究を行った。15秒間の測定では60秒間の測定結果と比較して平均2bpm,95パーセンタイルで5bpmの誤差が発生し,この誤差の大きさには心拍変動の極低周波成分が関係していることがわかった。これは本課題の本来の目標とは若干異なるが,研究の過程で派生的に得られた知見である。個人間変動と個人内変動は異なる意味を持っている。個人間変動は遺伝的に決定される要因と環境適応の結果である。