hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺発がんドライバー変異であるがん遺伝子融合の発生機構の解明

肺腺発がんドライバー変異であるがん遺伝子融合やそれを有する肺腺がんの発生機構を明らかにすることを目的とした。ALK, RET, ROS1融合陽性肺腺がんでは、Cancer-census遺伝子の異常が少なく、遺伝子融合を主体として発がんに至ることを見出した。この結果は、融合陽性例では、融合遺伝子産物を標的とした分子標的治療が選択されることをサポートする結果である。ALK, RET, ROS1遺伝子座には、数-Kbの切断ホットスポットが存在し、非相同末端結合とsynthesis-dependent end-joiningによる切断断端の誤った再結合が遺伝子融合の発生機序であることを明らかにした。本研究は、RET,ALK,ROS1遺伝子融合と感受性多型危険アレル保持状態との関連、他のCancer Census遺伝子群の体細胞変異との関連、遺伝子融合のゲノム切断点・結合部位の構造把握を起点としたゲノム不安定化機序の理解を通じて、発生機序の解明を行うものである。今年度の成果は以下の通りである。A)RET,ALK,ROS1遺伝子融合と感受性多型危険アレル保持状態との関連解析:既知多型の関連解析を終了した。その結果、既知多型は融合陽性肺がん有意に上昇させるという結果は得られなかった。今後、多型の組み合わせや他の候補多型の解析を継続して行う必要があると判断した。B)融合陽性・陰性がんにおけるCancer Census遺伝子群体細胞変異の比較解析:高速シークエンサーによる変異検出を終了した。その結果、融合陽性肺がんでは、他の肺がんと比べて、がん関連遺伝子の異常が少ないことが示唆された。また、NRG1融合の見られる浸潤性粘液腺がんについても、高速シークエンサを用いた併発変異の探索に着手した。C)ゲノム切断点・結合部位の構造解析を起点とした遺伝子融合の機序の推定:融合の種類をRETだけでなく、ALK, ROS1に拡大し、融合がん遺伝子の全エクソン・イントロンゲノムDNAをゲノムキャプチャー法で捕捉し、高速シークエンサー解析を行うことによりゲノム切断点・結合部位のゲノム構造解析を進めた。その結果、どの融合にも大きさ数-kbの切断ホットスポットが存在すること、非相同末端結合が融合発生に中心的な役割を果たす切断修復機構であることを明らかにした。本研究では、肺腺がんの体細胞変化と胚細胞変化(遺伝子多型)の情報を組み合わせることにより、いまだ解明されていない肺腺発がんドライバー変異であるがん遺伝子融合やそれを有する肺腺がんの発生機構を明らかにすることを目的としている。以下三つのテーマからなる。A)融合陽性例、陰性例、非がん対照群について、血液等非がん組織DNAから抽出したDNAを用いて、肺腺がん感受性遺伝子座の多型アレル分布を比較し、危険アレル数の蓄積が融合陽性がんのリスクとなるかを全ゲノムレベルで比較を行った。しかしながら、既知の肺がん感受性遺伝子座やTP53などDNA切断修復やチェックポイントに関わる遺伝子座の関連が融合陽性例で特異的に強いという傾向は見られなかった。一方、EGFR変異がんでは、特異的な感受性遺伝子座が見られた。ただし、例数の差である可能性もあり、さらに検討を続ける。B)融合陽性例では、Cancer-census遺伝子の異常が少なく、遺伝子融合を主体として発がんに至る結果を得て、学術論文として発表を行った。これに合致して、融合陽性例特異的な遺伝子異常は見られないという結論を得た。C)ALK, RET, ROS1の遺伝子座には、数-Kbの切断ホットスポットが存在すること、また、遺伝子融合をもたらす切断DNAの再結合には、非相同末端再結合とsynthesis-dependent end-joiningという二つの切断DNA修復機構が関与していることを見出した。また、CRISPR法を用いて、実際のがん試料で同定された遺伝子融合ゲノム切断点で人工的なDNA切断を生じさせ、ヒト細胞内での融合を発生させる実験系の構築に着手した。テーマがA-Cと3つ存在するうち、テーマBについては研究を終了した。よって、思ったよりも研究は早く進行している。本研究では、肺腺がんの体細胞変化と胚細胞変化(遺伝子多型)の情報を組み合わせることにより、いまだ解明されていない肺腺発がんドライバー変異であるがん遺伝子融合やそれを有する肺腺がんの発生機構を明らかにすることを目的とした。具体的には、1RET,ALK,ROS1遺伝子融合と感受性多型危険アレル保持状態との関連、2他のCancer Census遺伝子群の体細胞変異との関連、3遺伝子融合のゲノム切断点・結合部位の特徴からのゲノム不安定化機序の理解を通じて、発生機序の解明を行うものであった。1に関しては、融合陽性例、陰性例、非がん対照群について、多型アレル分布を比較したが、既知の肺がん感受性遺伝子座やTP53などDNA切断修復やチェックポイントに関わる遺伝子座の関連が融合陽性例で特異的に強いという傾向は見られなかった。2に関しては、平成27年度に終了している。すなわち、融合陽性例では、Cancer-census遺伝子の異常が少なく、遺伝子融合を主体として発がんに至る結果を得て、学術論文として発表を行った。3に関しては、遺伝子融合をもたらす切断DNAの再結合には、非相同末端再結合が主要な経路として関与していることを患者試料のゲノム解析で見出した。CRISPR法を用いて、実際のがん試料で同定された遺伝子融合ゲノム切断点で人工的なDNA切断を生じさせ、ヒト細胞内での融合を発生させる実験系を構築した。

その切断点には、非相同末端再結合の痕跡が見られた。よって、融合の発生を分子レベルで証明できたといえる。肺腺発がんドライバー変異であるがん遺伝子融合やそれを有する肺腺がんの発生機構を明らかにすることを目的とした。ALK, RET, ROS1融合陽性肺腺がんでは、Cancer-census遺伝子の異常が少なく、遺伝子融合を主体として発がんに至ることを見出した。この結果は、融合陽性例では、融合遺伝子産物を標的とした分子標的治療が選択されることをサポートする結果である。ALK, RET, ROS1遺伝子座には、数-Kbの切断ホットスポットが存在し、非相同末端結合とsynthesis-dependent end-joiningによる切断断端の誤った再結合が遺伝子融合の発生機序であることを明らかにした。当初計画した、RET,ALK,ROS1遺伝子融合と感受性多型危険アレル保持状態との関連、他のCancer Census遺伝子群の体細胞変異との関連、遺伝子融合のゲノム切断点・結合部位の構造把握を起点としたゲノム不安定化機序の理解の3点について、順調に進展しているため。上記テーマ3つのうち、Bについては研究が終了したので、A,Cに重点化して研究を行う。Aについては、肺腺がん全ゲノム関連解析で得られた感受性座について検討を行い、融合陽性肺腺がんの感受性における遺伝要因の関与を明らかにする。Cについては、実際のがん試料で同定された遺伝子融合ゲノム切断点で人工的なDNA切断を生じさせ、ヒト細胞内での非相同末端再結合による融合発生を再現する実験系を構築する。28年度が最終年度であるため、記入しない。がん遺伝学肺腺がんの体細胞変化と胚細胞変化(遺伝子多型)の情報を組み合わせることにより、いまだ解明されていない肺腺発がんドライバー変異であるがん遺伝子融合やそれを有する肺腺がんの発生機構を明らかにする。A)融合陽性例、陰性例、非がん対照群について、血液等非がん組織DNAから抽出したDNAを用いて、肺腺がん感受性遺伝子座の多型アレル分布を比較し、危険アレル数の蓄積が融合陽性がんのリスクとなるか検討する。既知の肺がん感受性遺伝子座に加えて、TP53など、DNA切断修復やチェックポイントに関わる遺伝子座の関連の検討を行う。B)融合陽性例では、Cancer-census遺伝子の異常が少なく、遺伝子融合を主体として発がんに至るという予備的な結果を得ている。そこで、re-sequencing等を行い、この結果を確認する。ただし、本サブテーマは融合陽性例特異的な遺伝子異常が同定されない可能性が高いことから、H27年度からはA), B)を重点化する。C)FFPE試料等を用いたゲノム再構成の検出が簡単でないことから、次世代シークエンサーデータの解析法の改良や分子カウンティング法の活用を通じて、遺伝子融合のゲノム構造解析を加速させる。
氷河湖の形成に起因した氷河後退メカニズムの解明

氷河湖の形成が氷河変動に及ぼす影響を明らかにするため、近年その末端部に湖が形成されたスイス・ローヌ氷河において、野外観測を中心とした研究を行った。その結果、湖形成により氷の流動速度が約3倍に増加し、この流動変化によって氷河末端の氷厚減少が加速したことが明らかになった。その後、薄くなった氷河末端部は湖水の圧力によって浮上、崩壊し、著しい氷河後退が観測された。以上の結果は、湖形成に起因した氷河後退メカニズムを観測によって初めて明らかにし、今後の氷河変動予測に貢献する成果である。1.研究の概要2008年7-9月、末端に形成された湖に起因した氷河変動を調べるため、スイス・ローヌ氷河にて熱水ドリルによる掘削、流動速度の測定、底面水圧の測定、氷河底堆積物のサンプリング、融解量測定、気象観測、氷河地形の測量などを行った。観測は研究代表者の他、北海道大学の大学院生3名、スイス連邦工科大学およびベルン大学の研究者と大学院生の協力によって実施した。2.主な成果計24ヶ所で行った氷河底面までの掘削により、氷河末端付近の正確な氷厚分布が得られた。その結果、近い将来にローヌ氷河末端が湖水によって浮上し、崩壊する可能性が高いことが明らかになった。2007年と比較して増加した流動速度、2008年8月以降に観測された氷河表面の急上昇は、その予測を裏付けるものである。また流動速度の大半が底面流動によるものであり、氷底で採取された柔らかい堆積物がその流動原因である可能性が示唆された。流動速度は底面水圧の影響を受けて日変化しており、湖の拡大に伴って流動が促進されると予想される。観測地域における氷河表面高度は2007年と比較して数メートル低下しており、2000年以降氷河縮小が加速していることが確認された。これらの研究成果を、国際雪氷学会、日本雪氷学会にて発表するとともに、英文および和文専門誌に論文として公表した。3.研究成果の意義と重要性本研究で得られた成果は(1)ローヌ氷河の変動予測に必要な知見を与え、(2)氷河湖の形成に起因した氷河後退メカニズムの理解を推し進めるものである。4.特記事項1.研究内容前年度に引き続き、2009年6月から9月にかけて、スイス・ローヌ氷河において熱水掘削と氷河観測を実施した。掘削孔を使った観測によって、底面すべり速度、底面水圧、氷の鉛直歪み、底面堆積物の厚さを測定した他、堆積物のサンプリングと掘削孔カメラによる底面観察を実施した。氷河表面では、流動速度、表面融解、アルベド、表面高度の変化を測定した。掘削によって明らかになった氷河底面地形を用いて、有限要素法による氷河流動モデルを構築した。また表面融解量の観測値を数値モデルの結果と比較し、数値計算の妥当性を検証した。2.研究成果とその意義近年氷河湖が形成されたローヌ氷河末端において上記の観測を行ったことにより、(1)湖の形成による氷河流動速度の変化と末端浮上現象、(2)氷河底面の堆積物の組成とその分布、(3)氷河表面融解量の面分布、(4)過去2年間の氷河変動量、が明らかになった。氷河湖が拡大しつつある氷河における詳細な野外調査は世界にも例がなく、これらの成果は、氷河湖の形成が氷河流動に与える影響、湖によって加速する氷河後退のメカニズムを理解する上で重要な知見をもたらした。得られたデータは、今後数値モデルを用いてローヌ氷河の将来変動予測を行うために必要な入力情報となる。3.その他得られた研究成果を国内外の学会にて発表した他、査読つき英文誌に公表した。2009年9月、国際南極大学(International Antarctic Institute)のプログラムとして大学院野外実習をスイスにて実施し、8名の受講生がローヌ氷河において本研究活動に参加した。1.研究内容研究の最終年度となる2010年度は、過去2年間にローヌ氷河で取得した観測データを用いて、湖形成による氷河後退メカニズムの解明に取り組んだ。流動速度、底面水圧、氷庫、融解量、気象、底面堆積層庫などのデータを解析するとともに、有限要素法を用いた流動数値モデル、氷河融解モデルなどを用いた数値実験を行った。研究活動は、北海道大学環境科学院大学院生、およびスイス連邦工科大学の協力を得て実施された。2.研究成果とその意義解析の結果、湖の形成によって氷河末端付近の流動速度が上昇し、著しい氷厚減少の原因となっていることが判明した。さらに、縮小した氷河末端が湖水の浮力によって持ち上がり、大規模に崩壊する過程の詳細が明らかになった。これらの成果は、湖形成→流動加速→伸長流による氷厚減少→末端の崩壊、という氷河後退プロセスを初めて明らかに示したものである。本研究によって得られた氷厚分布とその変化速度を勘案すると、湖はおよそ25年後まで拡大を続け、その全長は600mに達すると推定された。

また掘削孔を使った氷河内部および底面での観測(底面すべり速度・底面水圧・氷の鉛直歪み・底面堆積物の厚さ)は、氷河底が湖と氷河の相互作用に重要な役割を果たしていることを示した。この結果は、氷河底面流動機構の解明に大きく寄与するものである。3.その他得られた研究成果を国内外の学会にて発表した他、査読つき英文誌に公表した。また博士課程大学院生の学位論文としてまとめられた。2010年9月、5回目となる国際南極大学(Ihternational Antarctic Institute)プログラムの大学院野外実習をスイスにて実施し、10名の大学院生がローヌ氷河での研究活動に参加した。
血清型の混合モノクローナル抗体による同時検出法の確立

個人識別や親子鑑定に用いる血清型を容易に行なえるようにするために、混合モノクローナル抗体を用いる同時検出法を試みた。血清蛋白質をマウスに免疫し、常法によりハイブリドーマを作製し、限界〓釈法によりクローニングを行った。そして抗トランスフェリン抗体と抗α_1-アンチトリプシン抗体の二種類のモノクローナル抗体を得た。我々が以前に作った抗オロソムコイド抗体と合わせて三種類のモノクローナル抗体を混合して、血清を等電点電気泳動後、転写されたメンブランを用いて、バンドパターンを検討した。これによりポリクローナル抗体を用いた時と同様なパターンが得られた。しかし、モノクローナル抗体はポリクローナル抗体と異なり、コンタミ抗体の心配がないことおよびポリクローナル抗体にしばしば存在する他の抗原がないので、よりすぐれた方法であることが判明した。なおモノクローナル抗体には以下のような欠点もあった。つまり変異型の場合検出できるかどうか不安のあることおよび古いサンプルを用いるとポリクローナル抗体を用いた場合より、副バンドが検出されやすい傾向がみられたことである。
新奇二元機能電極触媒の性能向上と革新型一体化再生型燃料電池の実現

一体化再生型燃料電池は、水の電気分解で水素と酸素を製造し、それらで燃料電池として発電するCO2フリーの自立型発電機で、SDGsへの再生可能エネルギーの導入促進と災害対策の理由から実現が望まれている。しかし、科学的難度が高く実現に至ってない。本研究では、そのブレークスルーを目指して、代表者が開発した水素発生反応と酸素還元反応に触媒として働く新奇二元機能電極触媒の作用メカニズムを科学的に明らかにし、より高活性な触媒を開発して革新型の一体化再生型燃料電池の実現を目指す。
輸送ネットワークの地域的不均等発展に関する数理モデル研究

本研究では、輸送ネットワークの地域的不均等発展の過程を、数理モデルの構築を通して理論的に説明することが目的である。その際に、数理モデリングと地理情報システム(GIS)を結びつけて、より視覚的に現象のシミュレーションを行った。本年は、昨年に引き続き、ジャネルの「時空間収束」概念、アレン・サングリエの「自己組織化」モデルを援用しながら、輸送ネットワークの地域的不均等発展に関するシミュレーション・モデルを構築した。モデルの特徴としては、歴史の変革期においてたまたま交通革新が行われた地域で時間距離空間が大幅に収縮し、今度はその地域に含まれる諸都市が都市間競争において相対的優位性をもつために再び交通革新の投資が行われやすいという、地域的不均等発展の過程を、非線形非平衡システムのモデルとして定式化したことである。その際に、数理モデリングと地理情報システム(GIS)を結びつけて、より視覚的に現象のシミュレーションを行うつもりである。本年は、この目的の第1段階として、地理情報システムの操作に習熟すると同時に、基本的なデータ入力を行った。そして、ジャネルの「時空間収束」概念、アレン・サングリエの「自己組織化」モデルを援用しながら、輸送ネットワークの地域的不均等発展に関するシミュレーション・モデルを構築した。このモデルのシミュレーションによって、当初は地域的差異がほとんんどない空間において顕著な中心・周辺関係が生み出され、事後にはこの関係が固定化される様子を描き出すことができた。この結果を、日本の近代都市および交通の発達史と対照させながら、平成11年11月に人文地理学会で「交通網の時空間収束と都市集積のモデル研究」という題名で口頭発表した。またこの発表に付随したテーマで、雑誌『地理』誌上で、クリスタラーとレッシュの中心地理論について、現代的意義をまとめた。
臨床応用に向けた象牙質再生のための幹細胞分化促進と歯髄再生法の確立

リシン、ロイシン、または、トリプトファンによる多孔質ハイドロキシアパタイト(HA)担体気孔での骨髄幹細胞の接着は、トリプトファンが高い効果を示した。In vivoで、アルギン酸ゲル懸濁骨髄細胞を播種した多孔質HA担体の多くの気孔に骨形成を認め、外径8mmの多孔質HA担体の中空の直径が2、3、または、4mmの中で、3mmのHAが有意に骨形成効果を示した。直径8mmの円筒状HAとその中空に入れた5mm径の円柱状スポンジからなる二相性担体に骨髄細胞あるいは口腔粘膜由来細胞と線維芽細胞を播種してラット背部皮下に埋入して、HA相に骨、スポンジ相に疎な結合組織と小血管を含む歯髄-象牙質複合体を再現した。歯髄および象牙質再生のため、多孔質ハイドロキシアパタイト担体内での骨形成に重要な因子としての気孔壁に骨髄幹細胞が接着し得る化合物を検討し、ラミニンやロイシン、デキストラン、あるいは、アルギン酸による担体のコーティングが有効であることを再確認した。さらに、担体気孔内全体への硬組織の緻密な形成を実現するため、担体気孔内に播種する骨髄細胞を気孔壁に接着させる化合物を利用する方法とともに、アルギン酸ゲルに懸濁した幹細胞を気孔内に播種して骨形成を図った。幹細胞を含む骨髄細胞を懸濁したアルギン酸ゲルを多孔質ハイドロキシアパタイト担体の気孔内に満たすことで、気孔に幹細胞を確実にとどめて増殖と骨芽細胞への分化を期待したが、有意に多くの骨形成は認められなかった。ゲル状のコンドロイチン硫酸あるいはヒアルロン酸とアルギン酸ゲルとの比較から、恐らくゲル内への組織液浸潤すなわち細胞への栄養供給が不十分であったためと推察される。歯根に類似する形状の担体を開発するために、多孔質ハイドロキシアパタイト担体内を幹細胞を含むアルギン酸ゲルで満たして骨形成を検討したが有意に多い骨形成は得られなかったが、多孔質ハイドロキシアパタイト担体の中空部分に骨髄細胞を懸濁したアルギン酸ゲルで満たしてin vivoで検討した結果、骨髄細胞による骨形成量の有意な増加を認めた。その結果を踏まえて、多孔質ハイドロキシアパタイト担体の中空部分の径と骨形成量の関連を検討し、外径8mmの多孔質ハイドロキシアパタイト担体でその中空部の径が3mmであるときに有意に骨形成量の増加が認められた。この結果は、3mmの中空部径を有する多孔質ハイドロキシアパタイト担体への骨髄細胞播種で最も多い骨形成を認めた過去のin vivoでの報告と一致している。この形状の多孔質ハイドロキシアパタイトが歯根の再生にとって最も有効な担体になることを本研究で証明した。本研究の目的は、第一に、骨髄幹細胞から象牙芽細胞あるいは歯髄細胞の分化・誘導による再生象牙質での歯の欠損部の補填あるいは歯髄・象牙質複合体再生であり、歯髄除去後の根管における歯髄の再生の方途の確立である。第二に、骨髄幹細胞と線維芽細胞を混合培養して、歯髄組織および象牙質の再生を実現し、歯根膜を有する歯を再生することである。その目的に向けての歯または歯髄・象牙質複合体の再生にはin vitroでもin vivoでも担体を必要とし、多孔質ハイドロキシアパタイト(HA)担体が用いられる。そのすべての気孔に緻密に硬組織が形成されて強固な構造が得られるが、骨髄細胞を用いてのHA担体での骨形成で全体の気孔における骨形成は認められていない。骨形成タンパク質であるBMP-2あるいはデキストランによる骨髄幹細胞の分化と骨形成の促進を図って多孔質HA担体全域にわたっての気孔に緻密な骨を形成させて歯の再生治療を目指す必要がある。24年度には、多孔質HA担体をBMP-2あるいはデキストランでコーティングし、多孔質HA担体気孔内骨形成を図って、in vitroおよびin vivoでの骨髄細胞を播種した担体内の骨形成を評価した。その評価には組織化学的にオステオカルシンの定量を行った。その結果、BMP-2あるいはデキストランをコーティングしたHA担体内では非コートHA担体に比較して有意に多くの骨の形成が認められた。この研究の目的のひとつである、in vitroでのアルギン酸ゲル内骨髄細胞播種による硬組織形成、そして、多孔質ハイドロキシアパタイト担体での骨髄細胞による骨形成に及ぼすアルギン酸ゲル含有の効果を確認した。6ウェル-マイクロプレートでのアルギン酸ゲル

薄膜に播種したラット大腿骨骨髄由来細胞の培養で、デキサメタゾンの添加によってゲル内にnodule形成を認め、Noduleの形成量はオステオカルシンの定量によってアルギン酸ゲルを用いないプレートで骨髄細胞を培養した場合よりも有意に多いことが明らかになった。また、2%あるいは4%濃度のアルギン酸ゲル、そして2%あるいは4%濃度のアルギン酸ゲルにα-リン酸三カルシウムを10%加えたのちに塩化カルシウムで架橋したアルギン酸ゲルを凍結乾燥して多孔質担体を作製し、これにラット大腿骨骨髄細胞の懸濁液を浸潤させてデキサメタゾン添加培養液中で培養した。なお、α-リン酸三カルシウムは担体の強度の向上のために添加した。これらのアルギン酸ゲル由来多孔質担体の中で、10%α-リン酸三カルシウムを含む4%アルギン酸ゲルから調製された担体ではオステオカルシン量が有意に高いレベルを示した。この結果は、α-リン酸三カルシウムが細胞接着に優れた特性を有する可能性を示唆している。10%α-リン酸三カルシウムを含む4%アルギン酸ゲルに由来する多孔性スポンジ様担体が骨髄細胞を用いた骨形成に適する結果が得られた。多孔質ハイドロキシアパタイトとともにアルギン酸ゲルから作製したスポンジ状多孔質担体は歯の再生の実現に向けての応用に適した素材であり、骨髄由来幹細胞の骨芽細胞への分化を促進するために適した担体であることが証明された。歯内治療学歯根に類似する形状の担体の開発、そして、in vivoでの歯根の再現が本研究の目的である。少数の骨髄細胞で効率的に多孔質ハイドロキシアパタイト担体気孔内に骨を形成させるために円筒状の担体が有効であり、その中空部分の径が骨髄細胞による骨形成量に影響することを明らかにした。すでに担体内気孔に緻密な骨形成を得るためには外形と中空部の径の関係が重要で、歯根に類する直径8mmの円筒状ハイドロキシアパタイトにおいて3mmの中空が最も有効な形状であることを明らかにした。このハイドロキシアパタイトの形状が歯根を再現する適切な形状の担体であり、今後の歯根の再生に密接に関連する結果を得たことは間違いないと確信するからである。24年度の研究目的と研究計画では、in vitroで象牙芽細胞から象牙質形成が再現できないために多孔質のハイドロキシアパタイト(HA)担体内で骨を形成させ、それを代替としての歯の再生を目指すことにあった。多孔質HA担体内部全体の気孔に緻密に骨を形成させるためにデキストランと骨形成性タンパク質であるBMP-2とをそれぞれHA担体に浸潤させてHA担体内気孔壁をコーティングし、骨髄幹細胞の分化と骨形成の促進を図って骨の再生を試みて良好な結果が得られた。この結果は24年度の目的を概ね達したものと言うことができる。しかしながら、幹細胞を混じたアルギン酸ゲルを担体気孔内に注入してのin vitroにおける骨形成は実施できなかった。予備実験でのアルギン酸ゲル内での骨髄幹細胞の分化・増殖および骨芽細胞への分化が進まなかったためで、その原因は使用したアルギン酸にあると考えている。別のアルギン酸を用いて再実験を実施する必要がある。中空構造を持つ多孔質ハイドロキシアパタイト(HA)担体を歯根と想定して、その中空構造に幹細胞を線維芽細胞およびコラーゲンとともに混合して挿入、ラット背部に皮下埋入して異所性にin vitroで歯髄組織を再生させる。外表面には線維芽細胞を担体気孔に播種し、ラット背部において歯根膜組織の再生を図る。歯根に類似するHAハイブリッド担体を作製する。
VEGFR-3陽性単球系細胞を指標とした間質性肺炎の新規マーカーの開発と病態解明

本研究は難治症病態である間質性肺炎の新たな治療戦略を考案するための翻訳研究として肺線維症動物モデルの病態形成および組織修復におけるVEGFR-3陽性単球/マクロファージの病因論的意義とその具体的な役割を明らかにすることを目的とする。またヒトIIPsのBALFによるマクロファージVEGFR-3発現の修飾性の検討とIIPs患者の末梢血VEGFR-3陽性単球がIIPsの診断および予後マーカーとなるか検討を行い実臨床における有用性を追求していく予定である。
アリストテレス倫理学の現代的意義の研究

平成23年度は,科学研究費補助金申請時の研究目的である「アリストテレス倫理学において,古代哲学研究としての水準を維持した研究成果をあげつつ,同時にその現代的意義を考察し,具体的で実効的な成果をあげ,提言を行うこと」に沿って,以下の研究活動に重視した.(1)まず,博士論文の執筆,完成,提出である.これは,アリストテレスの道徳教育論の哲学的基礎を,彼の『ニコマコス倫理学』における重要諸概念(意志の弱さ,行為,運,友愛など)の論じ方のうちに見いだすという内容である.その意義は,彼の倫理学において重視されてきたこれら諸概念が彼の道徳教育論にどのように寄与しているのか,またなぜこれらの分析が道徳教育論にとって必要なのかを明らかにした点にある.(2)ついで,脳神経科学研究と哲学研究の関係について出版される論文を,最新の研究を踏まえたものに改訂し,よりよいものにしていることである.(3)さいごに,現代の教育のあり方に対する提言を,科学技術社会論学会において,おこなったことである.この提言では,アリストテレスによる市民教育が道徳の教育であらざるをえないことの分析を踏まえつつ,また,現代の科学技術倫理の教育がおもに大学などの高等教育機関でおこなわれていることを踏まえつつ,義務教育における科学技術およびその倫理の教育のあり方を,いわゆる理科教育としてではなく道徳教育として実施する必要と意義のあることが示されている.「研究の目的」欄では,「...(1)アリストテレス倫理学・政治学を,道徳教育と市民教育の関係を見据えた「教育」の観点から捉え直す.(2/3)(1)を踏まえた上で,倫理・社会・教育の関係,脳科学の成果を含めた科学技術と市民・社会の関係,道徳の神経基盤の探求のあり方の是非など,今後検討が必要となる問題について包括的な観点から検討し,実効的な提言をおこなう.」ことを述べていた.1については博士論文として結実し,2/3については,科学技術社会論学会でのワークショップのオーガナズおよびそこでの提言として発表されたため.本研究の今後の推進方策は,今後も引き続き「道徳教育」あるいは「人としての生き方を教育するということ」の現代における問題,ありうべき形,その社会的意義を,哲学,脳神経倫理学,科学技術社会論の観点から,より総合的に考察することである.平成21年度は,科学研究費補助金申請時の研究目的である「アリストテレス倫理学において,古代哲学研究としての水準を維持した研究成果をあげつつ,同時にその現代的意義を考察し,具体的で実効的な成果をあげ,提言を行うこと」に沿って,以下の研究活動に重視した.(1)まず,古代哲学と現代哲学の接点に関する研究書の翻訳作業を行い,出版に向けての最終作業に従事している.この訳書は,現代哲学の泰斗であるDonald Davidsonの最後の論文集であり,哲学の過去・現在・将来を論じたものであり,今後の日本の哲学にとっても示唆するところの大きい論集である.(2)また,脳科学と社会の関係を,道徳の自然本性の解明の観点から論じた英語論文"Moral neuroscience and moral philosophy : interactions for ecological validity"の執筆し,学術誌に掲載した.これは,哲学(とりわけ倫理学)研究が今後どのようなあり方が可能なのかという問題を,脳神経科学との接点という観点から論じたものである.(3)当該論文についてアドヴァイスを頂いたOxford大学のDr.Kahane氏(哲学),米国NIHのDr.Moll氏(神経科学)に論文を送付し,意見交換を行った.Kahane氏とは,渡英後に直に交流する方向で予定を調整している.(4)これと関連して,「哲学書を読む脳科学者たち」と題したコラムを,中村靖子(編著)『交響するコスモス(下)-脳科学・社会科学編「ミクロコスモスから環境へ」』松籟社,2010年3月101-101頁,に執筆した.これは,当該論文を日本語で,よりわかりやすくしたものであり,人文科学と自然科学の関係の一面を紹介したものである.平成22年度は,科学研究費補助金申請時の研究目的である「アリストテレス倫理学において,古代哲学研究としての水準を維持した研究成果をあげつつ,同時にその現代的意義を考察し,具体的で実効的な成果をあげ,提言を行うこと」に沿って,以下の研究活動に重視した.(1)当年度は,オックスフォード大学にて客員研究員として一年間滞在していたため,受け入れ教員となって下さったデイヴィッド・チャールズ教授の指導をはじめとした当地での研究活動により,博士論文および今後投稿する論文の修正,改善,さらなる資料調査を行い,充実を図った.(2)現代哲学の研究書の翻訳作業を行い,『真理・言語・歴史』(ドナルド・デイヴィドソン著,柏端達也・立花幸司・荒磯敏文・尾形まり花・成瀬尚志翻訳,春秋社,2010年)として出版した.現代哲学の泰斗であるデイヴィドソンの最後の論文集であるこの著作は古代哲学と現代哲学の接点について多くの洞察が含まれ,本科研費の研究目的の遂行にも多分に寄与するものである.(3)脳神経科学と哲学の関係を道徳の自然本性の解明の観点から論じた既刊論文について,その後の調査を踏まえた加筆修正を施し,寄稿した.(4)また,脳神経科学と社会の関係をリテラシーの観点から論じたものを寄稿した.(5)さらに,科学技術者が身につける倫理について,その特徴を学習方法の点から主に理工学部生向けに論じたものを寄稿した.

平成23年度は,科学研究費補助金申請時の研究目的である「アリストテレス倫理学において,古代哲学研究としての水準を維持した研究成果をあげつつ,同時にその現代的意義を考察し,具体的で実効的な成果をあげ,提言を行うこと」に沿って,以下の研究活動に重視した.(1)まず,博士論文の執筆,完成,提出である.これは,アリストテレスの道徳教育論の哲学的基礎を,彼の『ニコマコス倫理学』における重要諸概念(意志の弱さ,行為,運,友愛など)の論じ方のうちに見いだすという内容である.その意義は,彼の倫理学において重視されてきたこれら諸概念が彼の道徳教育論にどのように寄与しているのか,またなぜこれらの分析が道徳教育論にとって必要なのかを明らかにした点にある.(2)ついで,脳神経科学研究と哲学研究の関係について出版される論文を,最新の研究を踏まえたものに改訂し,よりよいものにしていることである.(3)さいごに,現代の教育のあり方に対する提言を,科学技術社会論学会において,おこなったことである.この提言では,アリストテレスによる市民教育が道徳の教育であらざるをえないことの分析を踏まえつつ,また,現代の科学技術倫理の教育がおもに大学などの高等教育機関でおこなわれていることを踏まえつつ,義務教育における科学技術およびその倫理の教育のあり方を,いわゆる理科教育としてではなく道徳教育として実施する必要と意義のあることが示されている.「研究の目的」欄では,「...(1)アリストテレス倫理学・政治学を,道徳教育と市民教育の関係を見据えた「教育」の観点から捉え直す.(2/3)(1)を踏まえた上で,倫理・社会・教育の関係,脳科学の成果を含めた科学技術と市民・社会の関係,道徳の神経基盤の探求のあり方の是非など,今後検討が必要となる問題について包括的な観点から検討し,実効的な提言をおこなう.」ことを述べていた.1については博士論文として結実し,2/3については,科学技術社会論学会でのワークショップのオーガナズおよびそこでの提言として発表されたため.本研究の今後の推進方策は,今後も引き続き「道徳教育」あるいは「人としての生き方を教育するということ」の現代における問題,ありうべき形,その社会的意義を,哲学,脳神経倫理学,科学技術社会論の観点から,より総合的に考察することである.
鉱物油のT細胞に与える影響についての研究

マウスに鉱物油を投与すると、自己免疫疾患特異的自己抗体が誘導されると同時に、肝癌モデルマウスに鉱物油を投与すると、発癌が抑制される事から、本研究では、鉱物油の自己抗体誘導のメカニズム、および抗腫瘍効果について、細胞表面レセプターの変化を中心に解析し、自己抗体誘導のメカニズム、及び抗腫瘍効果の発現機構を解析する。解析の結果より自己免疫疾患の原因解明へのヒント、及び新たな抗腫瘍薬へのヒントを得ることがこの研究の概要である。
細胞質型癌遺伝子産物Cblの細胞内機能解析

細胞質型癌遺伝子産物Cblの細胞内機能を解明するため、EGF受容体刺激後のp120^<cbl>の動態に関し解析を加えた。まず野生型Cblあるいは変異型CblをMDCK細胞に発現し、ネオマイシンにて選択し、これらの遺伝子を発現したMDCK細胞系を樹立した。変異Cblとしては、543-548の6連続プロリンをアラニンに変異したプロリンリッチ領域の変異Cblを用いた。野生型Cblおよび変異Cb1の発現量は、ほぼ同様であった。これらの細胞系を用いて、EGF受容体刺激後のCblを中心とする細胞内情報伝達カスケードに関して、比較検討を行った。p120^<cbl>は、多様な細胞において、顕著にチロシンリン酸化される基質であることがすでに知られている。またin vitroやin vivoにおいてアダプター分子であるGrb2と会合する物質の一つであり、Grb2のN末端側のSH3ドメインを用いて会合することが知られている。Sos1と同様に、Grb2との会合に重要なプロリンリッチ領域を有するが、CblとSos1とは会合しないことが知られているので、CblとGrb2およびSos1とGrb2は別々の複合体と考えられている。前述のように、Grb2のN末側のSH3ドメインとCblは会合するが、今回の研究で、Grb2との結合に重要な領域をin vivoにおいて詳細に同定した。即ちプロリンリッチ領域の543から548までの6プロリンのアミノ酸部位が変異した細胞系では、Grb2との会合が認められず、この部位が結合に重要であることが証明された。また同部位のプロリンリッチ領域を変異させた細胞系において、EGF受容体からの刺激後、MAPKのリン酸化が遷延することも合わせて証明した。本研究は、平成11年度および平成12年度の2年計画の研究であり、今年度はその1年目である。今年度は、外来変異遺伝子の導入効率を考慮し、マスト細胞のかわりにMDCK細胞を使用し、主としてEGF受容体からの細胞内情報伝達系を用いて研究を行った。また変異遺伝子として、70ZCblと306番目のアミノ酸を変異させたCblのみならず、主としてSH3ドメインを有する細胞内情報伝達分子との結合に重要と考えられるプロリンリッチ領域の変異もあわせて検討した。まず306番目のアミノ酸を変異させたCblおよびプロリンリッチ領域の変異CblをPCR法を用いて作成し、オートシークエンサーを用いて塩基配列を確認した。当初は外来変異遺伝子をトレンジエントに細胞内に導入する系で検討を行ったが、種々の理由により、外来変異遺伝子を恒常的に発現させた細胞株を樹立させ、検討を行うこととした。Cbl、306番目のアミノ酸を変異させたCblおよぴプロリンリッチ領域の変異Cblをほぼ発現させた複数個の細胞株の樹立に成功したが、それらの中で外来遺伝子の発現量が等しい細胞株を今後の実験に用いることとした。EGF受容体からの刺激により、チロシンリン酸化を検討したところ、予想通り著明な相違が得られた。特にCblと複合体を形成するある分子のチロシンリン酸化は著明に変化していた。現在それらの詳細について検討を行っているとろであり、今後さらにMAPキナーゼなど下流の分子への影響もあわせて検討し、2年計画の研究を完結させる予定である。過去2年間にわたる本プロジェクトでは、主として増殖に関与する受容体であるEGF受容体からの情報伝達系を用いて、野生型Cblを種々の変異Cblと対比させて、その細胞内機能の解析を行った。細胞としては、EGF受容体を強く発現しているMDCK細胞を用い、それに野生型のCblおよび2つのCbl変異体を発現させた細胞系をテトラサイクリンシステムを用いて樹立した。

変異Cblとしては、SH3ドメインなどを有する種々の分子との結合に重要なプロリンリッチ領域の変異体および線虫のEGF受容体システムの研究からその機能発現に重要であると証明されているG306の変異体を作成した。これらの細胞系を用いて、Cblの細胞内機能の解析を試みた。Cblのプロリンリッチ領域の変異体を発現させた細胞内では、CblとGrb2との会合が全く認められず、この部位がCblとGrb2との結合に重要であることが再確認された。しかしながら、その一つの下流と考えられるMAPKなどのリン酸化は、野生Cblを発現した細胞と比べ相違は認められなかった。またEGF受容体情報伝達系では、CblとGrb2の結合はリン酸化に全く依存しなかった。この研究過程で、Cblがユビキチンリガーゼであり、Cblがユビキチンリガーゼとして作用するためには、Cblのリングフィンガードメインが必須で、この部位のチロシン残基の一つがリン酸化されることが必要であるとの重要な報告がなされた。しかしながら、我々は野生Cblと変異Cblを対比した解析から、Cblのプロリンリッチ領域もEGF受容体のユビキチネーションに必須であることを見出した。
統合失調症患者の病識に関する臨床的研究

平成18年度に引き続き横断面的調査を行い、計91の患者の評価を行った。また、短期フォローアップ・転帰調査として、退院時に評価した患者を継続的に観察し、1年後に再び評価した。計47名の患者に対して1年後評価を行うことができた。評価結果はデータベースに随時入力し、統計学的解析を行った。(1)横断面的調査の結果陽性症状(PANSS)が悪いほど全般的病識項目(SUMD)が不良であったが、陰性症状とは有意な関連を示さなかった。精神症状(特に陽性症状)が悪いほど過去の陽性症状の自覚(SUMD)に乏しかった。主観的ウェルビーイング(SWNS)が良好であるほど現在の精神障害の自覚や社会的結果の自覚(SUMD)が乏しかった。主観的苦痛(SEDS,SWNS,SQLS,BDI)が強いほど現在の精神症状を自覚(SUMD)しており、陰性症状を精神障害によるものと帰属していた。全般的病識項目が良好であることと服薬態度(DAI-30)の良さが有意に相関していた。社会機能(LSP)が良好であるほど精神障害による社会的結果をより自覚していた。現在の陰性症状の帰属不良(SUMD)といくつかの神経心理学的検査(CPT,TMT,Stroop test)の悪さが相関していた。抗精神病薬の用量や病名告知状況と病識の有意な関連は見出せなかった。病識と複数の臨床尺度との関連を調査でき、特にさまざまな主観的体験と病識との関連については新しい知見となった。(2)短期フォローアップ・転帰調査の結果退院時の病識の乏しさと1年後の再入院率、機能的予後の悪さが関連していた。統計学的なパワーを高めるため、今後も症例を積み重ねた上で再度統計学的解析を行う予定である。平成18年度に予定していた横断面的調査として、北海道大学病院精神科神経科で入院治療を行った統合失調症患者の病識や主観的体験、その他の臨床尺度を退院時に調査した。現在までで63名の患者の評価を行い、データベースを作成し、収集した情報を随時入力した。また、平成1819年度に予定していた短期フォローアップ、転帰調査を行っており、現在までで31名の患者について退院一年後の評価を行った。横断面的調査の結果を統計解析し、結果の一部に関しては学会で発表した。(1)病識(SUMD)と精神症状(PANSS)の関連を調査し、第26会日本精神科診断学会にて報告した。PANSS総得点とSUMDの過去の服薬による効果の自覚や過去の症状に対する自覚と帰属,現在の陽性症状の帰属,過去の陽性症状の自覚得点が有意な正の相関を認めた。PANSS陽性尺度得点は,現在,過去の精神障害の自覚や過去の服薬の効果の自覚,過去の服薬の必要性の自覚,過去の精神障害による社会的結果の自覚,過去の症状に対する自覚,現在の陽性症状の帰属,過去の陽性症状の自覚の得点と有意な正の相関を認めた。PANSS陰性尺度得点は,現在,過去の症状の帰属や過去の陽性症状の自覚得点と有意な正の相関を認めた。(2)薬物療法に対する主観的反応(SWNS, DAI-30)と他の臨床尺度(PANSS, DIEPSSなど)との関連を調査し、第2回日本統合失調症学会にて報告した。SWNSとDAI-30との間に有意な相関を認めなかった。SWNS総得点とDAI-30総得点は、PANSS総得点や各下位尺度、DIEPSSと有意な相関を認めなかった。治療期間が長いほどSWNS総得点が有意に低く、入院期間や教育年数が長いほどDAI-30総得点が有意に高かった。
嗅覚刺激と感覚繊毛内分子カスケードの連携

嗅覚はナノスケールの感覚神経(嗅繊毛)でスタートする。嗅覚情報伝達カスケードにおいて、Caイオンの役割は信号非線形増幅(Cl(Ca)チャネル開口)、信号制御(adaptation)に代表されるように多様かつ重要である。本プロジェクトは、嗅覚システムの分子挙動を実時間でモニターすることによって、従来から残されてきた問題を解決し「香り感覚受容」という生理学的システムを空気中の匂い分子の到達過程から嗅繊毛内で構成される分子の実体と挙動の観点から説明した。我々の香り感覚は、鼻腔内、嗅覚粘膜に約1億本存在するナノチューブ構造の繊毛において知覚され、細胞内ではcAMPを仲介して生体信号へと変換される。近年、QOLの向上により我々、ヒトの行動・情動に嗅覚が深く関与することがわかり、にわかにその科学的寄稿に注目が集まっている。本研究では、心理学的あるいは細胞生物学的、さらにはナノテクノロジー的に嗅覚の分子寄稿を知る研究を展開する。本エンドは、ナノチューブ繊毛1本における匂いの感受性、その増幅率、あるいは、繊毛内における匂い感受の空間特性や空間加算効果について実験調査を行い、世界的に新規性のある研究成果を得た。すなわち、1本の繊毛では、長さ数10ミクロンのどこの部位でも匂い分子を感知することが出来、また匂いの濃度は少なく、応答が小さいとき、それぞれの部位の微小応答は独立な事象として取り圧くあれることにより、空間的線形和を構成している。匂いの受容部位と細胞興奮に関与するイオンチャネルはともに体外環境との言うべき繊毛に存在して情報変換を達成しているので、臨床的あるいは産業応用的に嗅覚を増幅するなどの可能性を考える場合には、体内制御を就職するよりも、体外環境からアクセスするのが効率的であることがわかった。さらに、これらの分子的アプローチによる実験と並行して心理物理学的あるいは匂い分子の化学的特性の研究行い、それらの相互関係について検討を始めている。嗅覚のスタートはナノ嗅繊毛を有する感覚神経細胞で行われる。本研究プロジェクトでは、単離培養細胞、嗅覚刺激、電気生理学とUVレーザー光学的手法を組み合わせ、従来技術的に困難とされてきた微小器官内での分子挙動計測、分子制御を行う点に新規性をおき、嗅覚順応、マスキングに関する研究を行った。嗅覚の特性には、a.匂い識別様式、b.信号増幅の分子機能、c.嗅覚順応の分子機構、d、嗅覚マスキングが挙げられるがその分子機構には未知の点が残される。そこで我々の開発した新規システムを用い、ナノ構造体としての嗅覚システムを観察し、繊毛内部の分子を制御し、分子挙動を実時間レベルモニターして、従来から残されてきた問題を解決し、「香り感覚受容の諸特性」を、物理化学的分子実体と挙動の観点から説明した。嗅細胞の匂い情報変換は、Gタンパク、細胞内cAMPによって仲介され、CNGチャネルの開口によって電気信号発生する。さらにここを通って流入するCaが細胞内側から即座に興奮性のClチャネルを開口することによって、情報を非線型に増幅することが分かっている(Kurahashi & Yau,1993Nature)。また、Caイオンは嗅覚順応を制御する(Kurahashi & Menini,1997Nature)。このように細胞内ではcAMPとCaイオンが嗅覚の情報変換に密接な役割を演じているが、従来の研究においては、ナノメートル領域の細胞空間が実験調査の進展を阻んでいた。本研究では、細胞内cAMP制御、cAMPモニターに加えて、従来からなぞとされた、嗅覚マスキングの分子機構がCNGチャネルの閉鎖によって起こることを世界に先駆けて発表した。また、繊毛内Caに対して実時間制御を行った結果、情報変換過程における繊毛内で応答は空間的に独立であり、少なくとも2マイクロメートル以上の距離間ではcAMPやCaイオンの拡散が起こらないこと、また、従来の仮説を覆し、CNGチャネルとCl(Ca)チャネルが繊毛上に一様に分布していることを明らかにした。本プロジェクトは、嗅覚システムの分子挙動を実時間でモニターすることによって、従来から残されてきた問題を解決し「香り感覚受容」という生理学的システムを空気中の匂い分子の到達過程から嗅繊毛内で構成される分子の実体と挙動の観点から説明することが最終目的である。本研究では、電気生理学と光学的手法を組み合わせ、従来技術的に困難であった微小構造体内での分子挙動の実時間での制御・可視化、分子移動のシミュレーション検証に新規性をおいて、実験を計画・遂行した。実験対象である嗅繊毛直径は100nmという限られた微小空間であるため、内在している分子の挙動を実時間で測定するために、パッチクランプ法による電流測定と蛍光インジケータ(Fluo4)による可視化を使用した。

前年度、繊毛内では2um以上の距離をCaイオン拡散が起こらないことを報告したが、狭小空間内の分子移動をシミュレートした結果、空間を構成する膜上にCaイオンが結合することで空間内拡散に制限がかかること可能性が示唆され、更にCl(Ca)チャネルが繊毛上に広く発現している点(Takeuchi & Kurahashi, 2008)とあわせると、繊毛内コンパートメントとして情報変換を行い、繊毛全体がその機能を有していることが示唆された。
種子発芽のフェノロジーを決める温度反応制御遺伝子の同定

冬型と夏型のフェノロジーを持つ植物に対照的な発芽の温度反応性をもたらす遺伝子を同定する。このため、シロイヌナズナの自然変異系統を利用したQTL(量的形質遺伝子座)解析を行う。また、既知の発芽制御遺伝子の発現に対する温度の影響を比較解析し、その共通点と相違点を明らかにする。本研究により温度による発芽制御メカニズム、発芽の季節決定に寄与する遺伝子が見出され、適応の分子レベルでの理解、気候変動が発芽に与える影響の予測と対応に寄与すると期待している。
感染部位環境に着目した評価系を用いる抗結核物質の探索と新規薬剤標的の開拓

結核菌が感染部位で示す特異な性状変化に着目したスクリーニング系を構築した。そして、活性試験の結果を指標に、海綿などの底生海洋生物の抽出エキスや海洋由来微生物の培養抽出物ライブラリーを対象に活性物質の探索を実施した。その結果、潜在状態の結核菌に有効な抗菌物質として、halicyclamine類、trichoderin類およびnybomysinを見出した。さらに、ゲノムDNAライブラリーまたは次世代シーケンス法を利用することにより、その標的分子候補の選定に成功した。一方、バイオフィルム形成を阻害する化合物として、desferrioxamine Eを単離し、その作用メカニズムを明らかにした。本年度の研究計画に従い、潜在性結核菌に有効な抗菌物質およびバイオフィルム形成阻害物質の探索を、独自に保有する底生海洋生物の抽出エキスライブラリーおよび海洋由来微生物の培養抽出物ライブラリーを対象に実施した。その結果、潜在性結核菌に有効な抗菌物質として、海綿から分離したTrichoderma属真菌の培養抽出物から、trichoderin類と命名した3種の新規aminolipopeptideを発見し、インドネシア産のHaliclna個属海綿の抽出エキスから、22-hydroxyhaliclonacyclamine Bと命名した新規の大環状アルカロイドを発見した。そして、その化学構造および各種Mycobacterium属細菌に対する抗菌活性を明らかにした。また、海洋由来真菌の二次代謝産物であるsterigmatocystin類にバイオフィルム形成阻害活性を見出した。さらに数種類の海綿の抽出エキスまたは海洋由来微生物の培養抽出物に、潜在性結核菌に対する抗菌活性またはバイオフィルム形成阻害活性を見出し、活性成分の単離に向けた精製を開始した。一方、以前に潜在性結核菌に有効な抗菌物質として見出した、インドネシア産海綿由来の大環状アルカロイドhalicyclamine Aについて、ゲノムDNAライブラリーを利用し、その標的分子の解析を行った。その結果、結核菌の機能未知遺伝子であるded Aの翻訳産物が、halicyclamine Aの作用メカニズムに関与していることが明らかとなった。本研究では、独自に構築した結核菌感染部位とその微小環境での菌の性状に着目した評価系を利用し、海綿を中心とする底生海洋生物の抽出エキスライブラリーおよび海洋由来微生物の培養物ライブラリーから、新規抗結核剤のシーズを探索する。またケミカルバイオロジーの手法を基盤にその作用メカニズム解析を行い、結核に対する新しい薬剤標的を見出すことを目的としている。今年度は研究計画に従い、Mycobacterium fortuitumとショウジョウバエ由来S2細胞との細胞感染モデルをスクリーニングに応用し、その評価系の構築ならびに活性物質の探索を開始した。また、潜在性結核菌に有効な抗菌物質およびバイオフィルム形成阻害物質の探索を継続して実施し、海洋由来放線菌の2次代謝産物であるdesferrioxamine Eおよび海綿由来のセスタテルペンheteroneminにバイオフィルム形成阻害活性を見出した。現在これらの作用メカニズム解析を進めている。また潜在性結核菌に有効な抗菌物質として、インドネシア産海綿の抽出エキスから、数種の新規化学構造を有するアルカロイド化合物を単離した。また前年度、潜在性結核菌に有効な新規抗菌物質として見出した、海洋由来真菌の2次代謝産物であるtrichoderin類に関して、その作用メカニズム解析を行った。その結果、trichoderin類はMycobacterium属細菌のATP合成を阻害することにより、抗菌活性を発現することが明らかとなった。現在これまでに見出している化合物の、多剤耐性結核菌を含む各種臨床分離株に対する活性評価を行っている。今年度は研究計画に従い、低酸素培養により潜在状態を誘導したMycobacterium smegmatisまたはM.bovis BCGに抗菌活性を示す化合物の探索、バイオフィルム形成阻害物質の探索を継続して行うとともに、前年度、M.fortuitumとショウジョウバエ由来S2細胞との細胞感染モデルを応用して構築した評価系を利用して、独自に保有するライブラリーを対象にスクリーニングを実施した。その結果、沖縄産海綿のメタノール抽出エキスから、低酸素環境下でも抗菌活性を示す新規デプシペプチドを、海洋由来真菌の培養抽出物から新規ペプタイボールを発見した。また、海綿由来のセスタテルペンophiobolin類にバイオフィルム形成阻害活性を見出した。一方、活性物質の作用メカニズム解析では、バイオフィルム形成を阻害するdesferrioxamine Eが、培地中の鉄イオンとキレートを形成することにより阻害活性を示すことを明らかにするとともに、活性天然物を利用して、鉄イオンがMycobacterium属細菌のバイオフィルム形成に必須であることを証明した。

さらに、前年度までにMycobacterium属細菌のATP合成を阻害することを明らかにしていたリポペプチドtrichoderin類については、その結合タンパク質の候補が、結核菌のATP合成酵素を構成するAtpB,E,FまたはHのいずれかであることを明らかにした。