hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海洋生物毒の活性発現と精密分子構造

海洋生物毒は強力で特異的な活性発現をし注目される。本研究では申諸者の単離構造決定した海洋生物毒および新しく発見したものを使い標的生体高分子とのintactな相互作用を有機化学的に解明し、新しい分子認識機能発見を目指す。パリトキシンとNa,K-ATPaseの相互作用をプロテオリポソーム上で検討した。その結果、イオンチャンネル形成とNa,K-ATPase阻害と2種類の作用が存在することが判明した。プロティンホスファターゼ2Aとの相互作用にはflexible cavityの存在が重要であり、カルボキシル基とC24位水離基とで酵素と結合して阻害がかかると推定される。この推定を化学反応および立体配発解析で研究した。C24位水酸基の反転により活性は66分の1に低下し、メチルエステル体の活性とほぼ等価であると判明した。さらにC7位、C27位のエピ体も得たので活性を試験する予定にしているが、この場合にはまったく活性が変化しないと考えている。また、NMR実験において結合定数、NOEデータをもとにしてJEOL社製分子像解析システム(Molskop)で検討したところ、アルコール溶媒中でもこのflexible cavity構造をしてことが明らかとなった。さらに現在、オカダ酸自身のX線結晶構造解析を進めている、一方C1位カルボキシル基とC24位水酸基とで非天然型ラクトンを構築して、その活性を現在検討中であるが、このラクトンを酵素認識するかどうか大変興味が持たれている。さて、新規の海洋生物毒としてピンナトキシンA,B,Cを得た。いずれも海洋産の2枚貝毒で分子量は722と小さな分子であるが、従来にない構造を有しているので新しい有機化学の発見が期待できる。
天然由来レチノイン酸受容体アゴニストの探索と免疫・アレルギー疾患への応用

多彩な免疫調節作用が期待されるレチノイン酸受容体(RAR)アゴニストの探索を漢方方剤繁用生薬、薬用植物を用いて行った。その結果、これまでに報告のない新しい骨格を持った天然由来RARアゴニストとして、3つのジテルペンと1つのキサントフィルを単離した。それらの遺伝子発現プロファイルは既存のRARアゴニストであるall-transレチノイン酸とは異なっていた。新規RARアゴニストを単離した生薬抽出エキスは食物アレルギーを抑制したが、純度の高い化合物では抑制作用が観察されなかった。本研究で見出した新規RARアゴニストはATRAと異なる作用を示すことより免疫系疾患の予防・治療への応用が期待された。本年度は昨年度に引き続き、天然由来retinoic acid receptor (RAR)アゴニストをさらに探索するために、本研究室で使用している生薬メタノール抽出液ライブラリー以外の創薬資源として、富山大学から提供していただいた120種類の生薬熱水抽出エキスをHEK293細胞を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイ法でスクリーニングした。殆どの生薬熱水抽出液は活性を示さなかったが、マンケイシのみがコントロールの3倍以上の活性を示し、その活性はRARアンタゴニストで阻害された。また、マンケイシの比較を行ったところ、マンケイシの販売元数社のうちU社から販売されているマンケイシにのみRARアゴニスト活性が見出され、現在活性成分の単離同定を進めている。これまでにドッカツからRARアゴニストとして単離同定したpimaradienoic acid (PDA)に関してそのRARアゴニストの特性を解析してきた。そこで、大量のPDAを分取するのは困難であったため、PDAを高濃度(約80%)含有する抽出画分を用いて、食物アレルギーモデルマウスを作製しPDA抽出画分の効果を検討した。食物アレルギーマウスモデルは、オブアルブミン(OVA)及び水酸化アルミニウムゲルを0日目、10日目に腹腔内投与した後、次にOVAを21日目より3日ごとに6回胃内強制投与して作製した。PDA抽出画分はOVAを胃内強制投与(PDA量として15 mg/kg of BW)する3日前の18日目よりを胃内に強制投与した。その結果、コントロール群では3回目のOVA投与より下痢が観察されるようになり、5回目の投与後には殆どのマウスが下痢を発症し、食物アレルギーが惹起されたことが確認できた。しかし、PDA抽出画分の投与により著しい改善効果は観察されなかった。1)平成23年度、24年度を通して270種類の生薬抽出エキスを用いて、retinoic acid receptor (RAR)アゴニストの探索を行ってきた。しかし、all-transレチノイン酸に匹敵するような強いRARアゴニストは見いだせていない。そこで本年度は新たに薬用の有無に関わらず多様な植物エキスの調製を行い、24種のエキスについてRARアゴニスト活性の探索を行った。その結果、多くのエキスの細胞毒性が観察された。RARは生体内において細胞増殖抑制やアポトーシスに関わることから、毒性の見られた植物エキスにRARアゴニスト活性を有する可能性の考え、細胞生存率80%を超える濃度を設定し、ルシフェラーゼレポーターアッセイ系で検討した。その結果、ハリグワの根皮とカヴァの地下部にRARアゴニスト活性を見出した。現在、活性化合物の単離同定を進めている。2)昨年度RARアゴニスト活性を見出したマンケイシから活性成分の単離を試みたが、シリカゲルクロマトグラフィー、Sep-pak C18カートリッジ、Sephadex LH-20カラムにより活性成分の濃縮が効率良く行えず、逆に活性が消失してしまうことより活性成分の単離には至らなかった。3)本研究で見出した化合物、抽出エキスに食物アレルギーの改善作用が観察されなかったので、RARアゴニストの新たな利用方法として、抗肥満、抗糖尿病作用を考え、脂肪細胞の分化抑制活性を検討した。その結果、クコシなどに含有されるRARアゴニストであるβ-クリプトキサンチンがall-transレチノイン酸とは異なる機序で3T3-L1前駆脂肪細胞の分化を抑制する作用を示すことを見出した。その作用の一部は、分化に重要な役割をしているc/EBPβの転写を抑制している可能性が示唆された。150種類の生薬抽出エキスを用いて、新規retinoic acid receptor (RAR)アゴニストを探索した。その結果、ドッカツ、ソウハクヒ、ジコッピなどに比較的強い活性を見出した。活性成分の単離を行ったところ、ジッコピより2つの化合物(特許申請を考慮中)にRARアゴニスト活性を見出した。次に、これまでにRARアゴニストとしてドッカツより単離したpimaradienoic acid(PDA)のアゴニスト特性を検討した。

PDAはRARを活性化したが、retinoid X receptor, liver X receptor,peroxisome proliferator-activated receptor γとδは活性化せず、PDAはRARに選択的なアゴニストであった。構造活性相関を調べたところ、pimaric acidとabietic acidが同様の活性を示すことを見出した。しかし、abietic acidのカルボン酸にアミノ酸(アラニン等)をアミド結合させることにより活性が消失した。PDAが細胞に及ぼす効果を調べたところ、PDAはF6細胞のRAR標的遺伝子(Cyp26a1他)の転写を活性化し、レチノイン酸と同様にHL-60細胞の顆粒球への分化を促進し、細胞レベルでRARアゴニストとして作用していることがわかった。そこで、卵白アルブミンを用いた食物アレルギー疾患動物モデルを作製し、ドッカツ抽出エキスを経口投与して食物アレルギーに及ぼす効果を調べた。その結果、ドッカツ抽出エキスは20、100、500 mg/kgの用量で用量依存的に食物アレルギーによる下痢を抑制し、500 mg/kgでは全く下痢は観察されなかった。以上のこれまでに得られた結果より、RARアゴニストを含有する生薬が食物アレルギーに対して有効である可能性が示唆された。本研究の目的である、「天然由来RARアゴニストの免疫・アレルギー疾患の予防・治療への応用」を目指すために、レチノイン酸とは特性の異なるRARアゴニストを多く単離同定必要がある。しかし、RARのリガンド結合領域がperoxisome proliferator-activated receptor (PPAR)とは異なり体積的に小さいため、予想と異なり天然由来RARアゴニストを見出すことがかなり難しく、時間がかかっているこれまでのところRARアゴニストの探索を精力的に行っているが、PDAとその関連化合物であるピマール酸及びアビエチン酸にしか活性を見出していない。しかし、それらの活性はかなり弱いものであり、現時点ではin vivoでの活性は観察されていない。一方、アッセイ系に関しては、OVAを用いた食物アレルギーマウスモデルの作製と評価方法は確立できた。さらに、In vitroでの制御性T細胞の誘導及びその評価方法は現在も検討中であり、レチノイン酸より弱いあるいは特性の異なるRARアゴニストによる効率の良い制御性T細胞の誘導及び評価方法を確立に時間がかかっている。新規RARアゴニストの探索、アゴニストの特性解析、食物アレルギー疾患動物モデルの作製と評価方法の確立を平成23年度に計画した。新規RARアゴニスト探索は2つの生薬より活性成分の単離同定に成功している。しかし、活性の示すいくつかの残りの生薬からの新規RARアゴニストの単離が現在も進行中である。これまでに単離同定したPDAのアゴニスト特性の解析は、かなり進んだが、各種細胞に対するRARアゴニスト活性及びレチノイン酸との遺伝子活性化プロファイルの比較検討は今後の重要課題である。
リッチメディアアーカイブのためのメタデータ特性に基づく暗示的関係の発見とその応用

(1)付与者特性に基づくメタデータ間の関係抽出方式投稿映像サイトや,講義コンテンツアーカイブといったリッチメディアアーカイブの蓄積したデータをもとに,メタデータ間の関係モデルをメタデータの付与者特性に基づき構築し,リッチメディアアーカイブ中のコンテンツに対し,関係を自動的に検出するアルゴリズムを開発した、このなかで,投稿映像コンテンツにおいては,映像に対して視聴者が付けたコメントを利用者付与メタデータとして分析を行い,シーン検索を行うアプリケーションを作成し評価した.一方,講義コンテンツに関しては,教科書に対する下線付与とった利用者付与メタデータと,参考書のような参照情報との対応付けから,利用者の学習パターンを判定し,適切な問題文を関係づける技術の開発を行った.(2)メタデータ間の関係に基づく利用者行動を用いた暗示的な注目メタデータの発見方式リッチメディアコンテンツに対する利用者の検索,視聴・閲覧行動を蓄積し,視聴者行動と(1)で開発した関係モデルを用いて注目度の抽出モデルを構築した.リッチメディアとして,講義コンテンツや地図コンテンツを用いて研究を行った.講義コンテンツにおいては,スライドの閲覧行動をモデル化し,閲覧行動とスライド間の関係を用いてユーザが暗示的に注目しているキーワードを自動的に抽出する事でスライド検索をするプロトタイプを作成し,実データを用いて評価した,地図コンテンツにおいては,ユーザの地図および周辺検索行動をモデル化し,ユーザが暗示的に注目している地理的な特徴や店舗のカテゴリを推定し情報推薦する手法を構築し評価した.さらに地図の作成意図を判定する事で,地図中における暗示的な注目オブジェクトを判定し,そのオブジェクトの空間的整合性や説明文との整合性によるコンテンツの信悪性を分析するシステムを開発し評価した.(1)付与者特性に基づくメタデータ間の関係抽出方式投稿映像サイトや,講義映像アーカイブといったリッチメディアアーカイブにおける,コンテンツ作成者付与メタデータおよび利用者付与メタデータを抽出し,蓄積するシステムの開発を行った.次に,メタデータ間の関係モデルを付与者特性に基づき構築し,リッチメディアアーカイブ中のコンテンツに対し,関係を自動的に検出するアルゴリズムを開発した.このなかで,投稿映像コンテンツにおいては,視聴者が付けたコメントを利用者付与メタデータとして分析を行った.一方,講義映像コンテンツに関しては,講演者が行った説明をコンテンツ作成者付与メタデータとして扱い,スライドに書かれた説明と説明者の発話による説明という構造の異なるメタデータの分析を行った.(2)メタデータ間の関係に基づく利用者行動を用いた暗示的な注目メタデータの発見方式リッチメディアコンテンツに対する利用者の検索,視聴・閲覧,コメント付与行動を蓄積するシステムの開発を行った.次に,蓄積した視聴者行動と(1)で開発する関係モデルをもとに得られた知見を用いて注目度の抽出モデルを構築した、リッチメディアとして,講義映像や地図コンテンツを用いて研究を行った.講義映像においては,スライドの閲覧行動をモデル化し.閲覧行動とスライド間の関係を用いてユーザが暗示的に注目しているキーワードを自動的に抽出する事でスライド検索をする方式を開発した.地図コンテンツにおいては,ユーザの地図および周辺検索行動をモデル化し,ユーザが暗示的に注目している地理的な特徴や店舗のカテゴリを推定し情報推薦する手法,さらに地図の作成意図を判定する事で,地図中における暗示的な注目オブジェクトを判定し,そのオブジェクトの空間的整合性や説明文との整合性によるコンテンツの信憑性を分析する手法を開発した.(1)付与者特性に基づくメタデータ間の関係抽出方式投稿映像サイトや,講義コンテンツアーカイブといったリッチメディアアーカイブの蓄積したデータをもとに,メタデータ間の関係モデルをメタデータの付与者特性に基づき構築し,リッチメディアアーカイブ中のコンテンツに対し,関係を自動的に検出するアルゴリズムを開発した、このなかで,投稿映像コンテンツにおいては,映像に対して視聴者が付けたコメントを利用者付与メタデータとして分析を行い,シーン検索を行うアプリケーションを作成し評価した.一方,講義コンテンツに関しては,教科書に対する下線付与とった利用者付与メタデータと,参考書のような参照情報との対応付けから,利用者の学習パターンを判定し,適切な問題文を関係づける技術の開発を行った.(2)メタデータ間の関係に基づく利用者行動を用いた暗示的な注目メタデータの発見方式リッチメディアコンテンツに対する利用者の検索,視聴・閲覧行動を蓄積し,視聴者行動と(1)で開発した関係モデルを用いて注目度の抽出モデルを構築した.リッチメディアとして,講義コンテンツや地図コンテンツを用いて研究を行った.講義コンテンツにおいては,スライドの閲覧行動をモデル化し,閲覧行動とスライド間の関係を用いてユーザが暗示的に注目しているキーワードを自動的に抽出する事でスライド検索をするプロトタイプを作成し,実データを用いて評価した,地図コンテンツにおいては,ユーザの地図および周辺検索行動をモデル化し,ユーザが暗示的に注目している地理的な特徴や店舗のカテゴリを推定し情報推薦する手法を構築し評価した.さらに地図の作成意図を判定する事で,地図中における暗示的な注目オブジェクトを判定し,そのオブジェクトの空間的整合性や説明文との整合性によるコンテンツの信悪性を分析するシステムを開発し評価した.
LC/MSによる体組織中薬毒物分析法の開発と法医鑑定への応用

1.ヒト体組織中ペンタゾシンの定性・定量法の開発合成麻薬の1種であるペンタゾシンを筋柱後,急死した事例につき司法解剖(刑事訴訟法に基づく鑑定)を行う機会が有り,投与薬物の種類並びに投与量などが適正であったか否かを判定するために体組織中ペンタゾシンの分析法を開発することとなった.(1)液体クロマトグラフィー・質量分析法を用いた分析三段階液液抽出法を用いて試料を調製した後,高速液体クロマトグラフィーに高速原子衝撃質量分析計をオンライン接続した装置を用いて分析を試みた.その結果,ペンタゾシンおよび内部標準物質であるレバロルファンともマススペクトルでは擬分子イオンがベースピークとして確認され,クロマトグラム上でも標品と同一の保持時間に両者ピークが確認された.検量線は10の3乗以上にわたり直線性を示した.(2)高速液体クロマトグラフィーを用いた分析上述の方法を一般に普及している高速液体クロマトグラフで行えるよう分析条件の検討を行った.移動相にはリン酸緩衝液とアセトニトリルの混液を,検出器には蛍光検出器を用いることで試料中ペンタゾシンを高感度に分析できることが明らかになった.両法を前述の事例試料に用いた結果,投与薬物に誤りはなく,投与量も適正なものであったと判定された.2.交通事故死例に認められた特殊な頭蓋底骨折に対する受傷機転の判定口と鼻から血を流し,路傍に倒れていた男性の司法解剖を行う機会があった.薬毒物スクリーニング並びに血液中アルコールは陰性であり,薬物中毒死の可能性は否定された.頭腔を開検したところ,介達外力によって生じた頭蓋底骨折を認めた.この骨折形態はこれまでに世界で数例した報告されていない稀なものであると考えられたことから,その状況について受傷機転の推定と共に報告を行った.1.ヒト体組織中ペンタゾシンの定性・定量法の開発(1)液体クロマトグラフィー・質量分析法を用いた分析合成麻薬の1種であるペンタゾシンを筋注後,急死した事例につき司法解剖(刑事訴訟法に基づぐ鑑定)を行う機会が有り,投与薬物に誤りがなかったかあるいは投与量が適正であったか否かなどを判定するために体組織中ペンタゾシンの分析法を開発することとなった.三段階液液抽出報を用いて試料を調製した後,高速液体クロマトグラフィーに高速原子衝撃質量分析計をオンライン接続した装置を用い,定性・定量を試みた.その結果,ペンタゾシン標品及び内部標準物質のマススペクトルでは擬分子イオンがベースピークとして確認され,調製試料においても標品クロマトグラムピークと同一の保持時間に擬分子イオンと等しいm/zのイオンが確認されたことから,本事例において投与薬品の過誤は否定された.擬分子イオンを対象としてマスクロマトグラムを作成し,試料中ペンタゾシン濃度との間に検量線を作成したところ,10の3乗以上にわたり検量線は直線性を示した.本法はヒト体組織中ペンタゾシンの定性・定量に対応できるものと判断し,その成果を学会発表した.(2)高速液体クロマトグラフィーを用いた分析上述の方法を液体クロマトグラフ・質量分析計よりも安価で,一般に普及している高速液体クロマトグラフで利用できるよう改変を行った.移動相にはリン酸緩衝液と有機溶媒の混液を,検出器には蛍光検出器を用いることで,試料中ペンタゾシンを高感度に分析することが可能であることが明らかとなり,その知見について学会発表を行った.2.ヒト体組織中ガス状有機化合物・揮発性有機化合物の分析法の検討揮発性の高い農薬の服用が疑われる事例,乱用目的で炭化水素ガスを吸引後死亡したと考えられる事例などを解剖・検案する機会があり,上述成分の定性・定量法を開発すべく検討中である.1.ヒト体組織中ペンタゾシンの定性・定量法の開発合成麻薬の1種であるペンタゾシンを筋柱後,急死した事例につき司法解剖(刑事訴訟法に基づく鑑定)を行う機会が有り,投与薬物の種類並びに投与量などが適正であったか否かを判定するために体組織中ペンタゾシンの分析法を開発することとなった.(1)液体クロマトグラフィー・質量分析法を用いた分析三段階液液抽出法を用いて試料を調製した後,高速液体クロマトグラフィーに高速原子衝撃質量分析計をオンライン接続した装置を用いて分析を試みた.その結果,ペンタゾシンおよび内部標準物質であるレバロルファンともマススペクトルでは擬分子イオンがベースピークとして確認され,クロマトグラム上でも標品と同一の保持時間に両者ピークが確認された.検量線は10の3乗以上にわたり直線性を示した.(2)高速液体クロマトグラフィーを用いた分析上述の方法を一般に普及している高速液体クロマトグラフで行えるよう分析条件の検討を行った.移動相にはリン酸緩衝液とアセトニトリルの混液を,検出器には蛍光検出器を用いることで試料中ペンタゾシンを高感度に分析できることが明らかになった.両法を前述の事例試料に用いた結果,投与薬物に誤りはなく,投与量も適正なものであったと判定された.2.交通事故死例に認められた特殊な頭蓋底骨折に対する受傷機転の判定口と鼻から血を流し,路傍に倒れていた男性の司法解剖を行う機会があった.薬毒物スクリーニング並びに血液中アルコールは陰性であり,薬物中毒死の可能性は否定された.頭腔を開検したところ,介達外力によって生じた頭蓋底骨折を認めた.
血行力学的異常の自家静脈内皮細胞及び平滑筋細胞に及ぼす影響に関する研究

自家静脈を用いた末梢動脈血行再建術後の晩期閉塞は末梢run-off不良例に多発し、その原因としては末梢run-off不良のいわゆる異常血流条件(低shear stress)における移植自家静脈内皮細胞の機能異常とこれに伴う壁平滑筋細胞の能動的増殖の結果形成される内膜肥厚性病変があげられる。本研究では低shear stressの血行力学的異常が下肢動脈及び移植自家静脈内皮細胞にどの様な影響を及ぼしているかについて検討を加えると共に、動脈環境下での自家静脈内皮細胞の特性についても検討した結果、以下の知見がえられた。1)低shearstress条件下では正常血流条件下に比べ大腿動脈および自家静脈内皮細胞よりのプロスタサイクリン(PGI_2)の産生が減少している。2)低shearstress条件下の大腿動脈内皮細胞ではacetylcholine(ACH)によるEDRF(Endothelium derived relaxing factor,内皮由来血管弛緩因子)の放出反応は保たれているものの、adenosine diphosphate(ADP)によるEDRFの放出反応の低下がみられる。3)大腿動脈に移植した自家静脈内皮細胞では移植後3日目よりすでにACHに対するEDRFの放出反応の低下がみられ、低shear stress条件下ではADPやThrobinを介するEDRF産生低下がみられる。4)正常静脈と比べ動脈環境下での自家静脈グラフトではノルエピネフリンやエンドセリンによる収縮反応には差はみられなかったが、正常静脈では弛緩反応を起こすセロトニンが自家静脈グラフトでは逆に著明な収縮反応をおこすことが明かとなった。これらの実験的事実より移植自家静脈の晩期閉塞の発症要因として、静脈環境下での移植自家静脈内皮細胞のEDRF放出反応の選択的障害と低shearstress条件下でのプロスタサイクリン産生の低下が考えられた。末梢動脈血行再建術の遠隔成績向上のためには移植自家静脈グラフトの晩期閉塞の発生解明が必要である。我々はこれ迄、移植自家静脈の晩期閉塞は末梢runーoff不良例に多発し、その原因として末梢runーoff不良のいわゆる異常血流条件下における移植自家静脈内皮細胞の機能異常とこれに伴なう壁平滑筋細胞の能動的増殖の結果形成される内膜肥厚性病変が重要であることを臨床的ならびに実験的検討より見出してきた。血行力学的異常が内皮細胞および平滑筋細胞にどのような影響を及ぼしているかについての本研究の初年度に得られた成果は以下の如くである。1)末梢runoffの不良な血行力学的条件(我々の波形分類のII型)を犬後肢に作成し、これら異常血流条件下と対側の正常血流条件下の大腿動脈内皮細胞のプロスタサイクリン(PGI_2)産生能をEx vivo perfusion法により比較した。その結果異常血流条件下においては正常血流条件下に比し、著明にPGI_2産生能の低下が見られ、内皮細胞においては血流条件の変化によりPGI_2産生能が変化していることが示唆された。2)同様の犬後肢poorrunoffモデルを用い自家静脈移植を行ない、移植後1、2、4週目の内皮細胞よりのPGI_2産生能を対側の正常血流条件下のそれと比較した結果、異常血流条件下では移植自家静脈よりのPGI_2産生能は著明に低下しており、特に移植後2週目以降に正常血流条件下と比べ有意の低下がみられ、異常血流条件下における移植自家静脈バイパスグラフトの開存率の低下にPGI_2産生能の低下が重要な役割を担っている可能性が示唆された。広範な下肢動脈閉塞性病変に起因する末梢runoff不良な条件下での下肢血行再建術の成績は未だ満足すべきものとは言い難い。

我々はこれまでの下肢血行再建術症例の血行力学的解析より、末梢runoff不良の本体は血管壁壁面煎断応力(wall shear stress)の低下であることを見いだし、本研究ではこのようなshear stress低下状態における血管壁内皮細胞と平滑筋細胞の機能変化について検討しているところであり、1年目の結果としては、低shear stress条件下では、下肢動脈内皮細胞のプロスタサイクリン(PGI_2)産生能の低下がみられるという知見を得ている(Circ Res).2年目の今年度は強力な抗血小板凝集作用と血管弛緩作用を有する内皮由来血管弛緩因子(Endothelium derived relaxing factor,EDRF)の産生能と低shearstressとの相関について検討を加えた。その結果、1)低shearstress条件下の大腿動脈内皮細胞ではacetylcholind(ACH)に対するEDRFの反応は保たれているものの、adenosine diphosphate(ADP)に対するEDRFの放出反応が低下している。2)大腿動脈に移植した自家静脈内皮細胞では移植後3日目よりすでにACHに対するEDRFの反応の低下が見られ、低shear stress条件下ではADPやThrombinを介するEDRF産生の低下がみられるなどの知見を得ている。これらの実験的事実は、血管内皮細胞にはshear stressの多寡によりPGI_2やEDRFなどの生理活性物質の産生放出を調節している機序が存在することを推定させ、血行再建術後末梢runoffの不良な症例ではこのような機能低下が血栓性閉塞をおこしやすい原因と考えられた。末梢動脈血行再建術後の遠隔成績向上のためには移植自家静脈グラフトの晩期閉塞に関わる発生要因の解明が必要となる。末梢runoff不良モデルを用いた本研究のこれまでの研究成果として、1)末梢runoff不良ないわゆる低shear stressの血流条件下では、正常血流条件下(nornal shear stress)に比べ、自家静脈グラフト内皮細胞よりのプロスタサイクリン(PG12)の産生の低下がみられる。2)大腿動脈に移植した自家静脈内皮細胞では、移植後3日目よりすでにアセチルコリンに対する血管内皮由来弛緩因子(Endotheliun derived relaxing factor,EDRF)の反応の低下がみられ、低shear stress条件下ではADPやThronbinを介するEDRF産生の低下がみられることを明らかにしてきた。3年目の今年度は、移植自家静脈グラフトの特性を明らかにするためにノリエピネフリン,エンドセリンおよびセロトニンに対する反応を無処置正常静脈と比較した。又、バイパス術式別に自家静脈グラフト内皮細胞のEDRF産生能の比較を行った。その結果、1)正常静脈と比べ、自家静脈グラフトではノルエピネフリンやエンドセリンによる収縮反応に差はみられなかったが、正常静脈では弛緩反応を起こすセロトニンがグラフトでは逆に強い収縮反応を起こすことが明かとなり自家静脈グラフト内皮細胞におけるEDRF反応の選択的障害が示唆された。
遺伝子改変マウスを用いた極長鎖脂肪酸の新規機能に関する研究

炭素数が20より長い脂肪酸である極長鎖脂肪酸は,長鎖脂肪酸と比較して存在量は少ないが,多彩な生理機能を持ち,様々な疾患と関連していることが明らかになりつつある。涙液の表層に存在する油層はマイボーム腺から分泌される脂質(マイバム脂質)から成り,ドライアイの防止に重要である。マイバム脂質の主成分はコレステロールエステルとワックスエステルであり,これらの脂質には極長鎖脂肪酸が豊富に含まれる。本研究では,脂肪酸伸長サイクルの律速段階を触媒し,極長鎖脂肪酸の生合成に関与する脂肪酸伸長酵素ELOVL1のノックアウト(KO)マウスを作製し,マイバム脂質における極長鎖脂肪酸の役割を明らかにすることを目的とした。ELOVL1 KOマウスではマイバム脂質の長さが減少し,涙液蒸発亢進型のドライアイを発症することが明らかとなった。このことから,マイバム脂質の「長さ」がドライアイの防止に重要であることが示された。マイバム脂質の極長鎖脂肪酸にはイソ型およびアンテイソ型の分岐鎖極長鎖脂肪酸が豊富に存在する。今年度は,分岐鎖極長鎖脂肪酸の生合成経路の解明に取り組んだ。ELOVL1を含む7つのELOVLアイソザイム(ELOVL1-ELOVL7)について,分岐鎖脂肪酸に対する伸長活性を測定したところ,ELOVL1,ELOVL3,ELOVL7が顕著な伸長活性を示すことを明らかにした。また,マウスの主要組織における分岐鎖脂肪酸の存在量について調べた結果,分岐鎖脂肪酸はほとんどの組織に存在することおよびマイボーム腺に最も豊富に含まれることを明らかとした。国際共同研究として,ELOVL1遺伝子変異を持つ皮膚神経疾患患者の脂質分析およびELOVL1変異体の活性測定を行い,極長鎖脂肪酸の減少と変異体の活性低下を明らかにした。極長鎖脂肪酸は炭素数が20より長い脂肪酸であり,多彩な生理機能や様々な疾患との関連が近年明らかになっている。涙液は表面から油層,水層,ムチン層の3層で構成され,油層を構成する脂質に極長鎖脂肪酸が豊富に含まれることが知られているが,その役割は不明である。本研究は,遺伝子改変マウスを利用したドライアイにおける極長鎖脂肪酸の役割の解明および極長鎖脂肪酸を涙液の機能脂質へ変換する代謝経路の解明を目的としている。平成28年度は,極長鎖脂肪酸の合成に関与する脂肪酸伸長酵素ELOVL1をコードする遺伝子のノックアウト(KO)マウスを作製した。Elovl1 KOマウスは野生型マウスと比較して瞬目頻度の増加および眼表面からの水分蒸発の亢進を示した。一方,涙液量はElovl1 KOマウスと野生型マウスの間で違いは無かった。さらに,Elovl1 KOマウスは生後5ヶ月齢以降において,角膜の肥厚や層構造の乱れ,血管形成,表皮化などによる角膜混濁を示した。Elovl1 KOマウスはドライアイの約80%を占める蒸発亢進型のドライアイモデルとして位置付けられる。涙液油層の脂質は眼瞼のマイボーム腺から分泌されるマイバムに由来する。Elovl1 KOマウスのマイバム脂質を分析した結果,コレステロールエステルの脂肪酸およびワックスエステルの脂肪族アルコールの長さが有意に減少していた。特に,融点の高い飽和脂肪酸/飽和脂肪族アルコールの鎖長が顕著に減少していた。これらの結果は,油層に含まれる飽和の極長鎖脂肪酸/脂肪族アルコールが涙液のバリア機能に重要であることを示している。スフィンゴ脂質の脂肪酸型を制御するメカニズムとして,哺乳類に6つのアイソザイムが存在するセラミド合成酵素CERS(CERS1-6)のうち,CERS2-6の活性がリン酸化により正に制御されていることを明らかにした。平成28年度の研究計画では下記の3項目を予定していた。1.Elovl1ノックアウトマウスのドライアイモデルマウスとしての位置付け2.ドライアイ症状に関与する極長鎖脂肪酸の同定3.スフィンゴ脂質の“脂肪酸の長さ"によるエクソソーム形成・分泌の制御このうち,3.については,平成29年度以降に予定していた4.スフィンゴ脂質の脂肪酸型を制御するメカニズムの解明を前倒しで実施したため,平成29年度以降に解析を行う。全体としておおむね順調に進展していると評価した。脂肪酸の多くは炭素数16や18の長鎖脂肪酸であるが,一部は小胞体において脂肪酸伸長酵素により伸長され,炭素数が20より長い極長鎖脂肪酸に変換される。近年,極長鎖脂肪酸の合成に関与する酵素の遺伝子変異が様々な疾患で見つかっており,極長鎖脂肪酸は長鎖脂肪酸では代替できない機能を持つことが明らかになりつつある。本研究では,これまでに脂肪酸伸長酵素ELOVL1のノックアウト(KO)マウスがドライアイ症状を示すことを明らかにした。今年度はELOVL1 KOマウスの解析をさらに進め,涙液に含まれる極長鎖脂質の機能と生合成経路の解明に取り組んだ。涙液の脂質は眼瞼のマイボーム腺から分泌され,おもにコレステロールエステルとワックスエステルから成る。これらの脂質は飽和あるいは一価不飽和の極長鎖脂肪酸・アルコールを豊富に含む。ELOVL1 KOマウスのマイボーム腺の脂質を分析した結果,飽和の脂肪酸・アルコールの長さが顕著に短くなっていた。一方,一価不飽和の脂肪酸・アルコールの長さは一部減少したものの,飽和のものほどではなかった。

この違いが生じる理由を明らかにするため,一価不飽和脂肪酸を基質として脂肪酸伸長活性を測定した結果,ELOVL3,ELOVL4,ELOVL7が一価不飽和脂肪酸に対して有意な活性を示すことを明らかとした。ELOVL3とELOVL4はマイボーム腺で高発現しており,ELOVL1と重複して一価不飽和脂肪酸の伸長に関与することが示唆された。ELOVL1 KOマウスは生後5ヶ月齢以降,角膜混濁を示した。角膜で顕著な炎症マーカーの誘導は見られなかったが,角膜マーカーであるKRT12の発現が減少し,代わりに表皮マーカーのKRT1,KRT10,LORの発現が増加していたことから,涙液脂質の機能低下が角膜の慢性的な乾燥につながり,角膜の表皮化を引き起こしたことが示唆された。本研究では,極長鎖脂肪酸が涙液の構成成分として眼の乾燥を抑え,ドライアイを防止するという新規機能を持つことを明らかにし,この点については当初の計画以上の進展が得られた。一方,ELOVL1 KOマウス由来線維芽細胞を用いた解析により,エクソソーム形成・分泌への関与については,極長鎖脂肪酸の関与を明らかにできなかったことから,総合的におおむね順調な進展とした。炭素数が20より長い脂肪酸である極長鎖脂肪酸は,長鎖脂肪酸と比較して存在量は少ないが,多彩な生理機能を持ち,様々な疾患と関連していることが明らかになりつつある。涙液の表層に存在する油層はマイボーム腺から分泌される脂質(マイバム脂質)から成り,ドライアイの防止に重要である。マイバム脂質の主成分はコレステロールエステルとワックスエステルであり,これらの脂質には極長鎖脂肪酸が豊富に含まれる。本研究では,脂肪酸伸長サイクルの律速段階を触媒し,極長鎖脂肪酸の生合成に関与する脂肪酸伸長酵素ELOVL1のノックアウト(KO)マウスを作製し,マイバム脂質における極長鎖脂肪酸の役割を明らかにすることを目的とした。ELOVL1 KOマウスではマイバム脂質の長さが減少し,涙液蒸発亢進型のドライアイを発症することが明らかとなった。このことから,マイバム脂質の「長さ」がドライアイの防止に重要であることが示された。マイバム脂質の極長鎖脂肪酸にはイソ型およびアンテイソ型の分岐鎖極長鎖脂肪酸が豊富に存在する。今年度は,分岐鎖極長鎖脂肪酸の生合成経路の解明に取り組んだ。ELOVL1を含む7つのELOVLアイソザイム(ELOVL1-ELOVL7)について,分岐鎖脂肪酸に対する伸長活性を測定したところ,ELOVL1,ELOVL3,ELOVL7が顕著な伸長活性を示すことを明らかにした。また,マウスの主要組織における分岐鎖脂肪酸の存在量について調べた結果,分岐鎖脂肪酸はほとんどの組織に存在することおよびマイボーム腺に最も豊富に含まれることを明らかとした。国際共同研究として,ELOVL1遺伝子変異を持つ皮膚神経疾患患者の脂質分析およびELOVL1変異体の活性測定を行い,極長鎖脂肪酸の減少と変異体の活性低下を明らかにした。極長鎖脂肪酸のドライアイへの関与については当初の研究計画に沿って進める。
メタ認知的知識の構造変容を測度にした読解指導プログラムの開発

この研究では,(1)文章読解についての児童の読解方略を調べること,(2)教師の読解指導についての信念を調べ,読解に関するメタ認知的知識との対応関係を検討すること,(3)これらをもとに,読解にかかわるメタ認知的知識の構造変容を測度とした指導プログラムを開発することを目的とした。読解方略質問紙を作成し,小学校4,5,6年生を対象に方略使用と方略の重要性認知についての調査を実施した。経験年数の異なる教師を対象に,教室での方略指導やそこでの自身の思考,判断等についてインタビューを実施した。本研究の目的は,読解に関する児童・生徒のメタ認知的知識の構造変容に着目し,これを効果測定の尺度にした指導プログラムの開発を行い,実践場面での有効性を検討することである。第2年度においては,以下を実施した。1.児童の文章読解についてのメタ認知的知識の構造変容を把握するための測度を構成するため,27項目からなる読解方略質問紙を作成し,小学4・5・6年生を対象に予備調査を実施した。次年度に向けて,メタ認知的知識の次元性の抽出及び尺度の妥当性について,分析・検討を進めているところである。2.教師が読解指導についてもつ信念とメタ認知的知識の構造との対応関係を調べるため,小学校4・5・6年の各1学級を対象に,国語科読解指導場面での教授学習指導の実際について授業観察を行った。次年度の読解指導プログラムの開発に向けて,教師に対するインタビューデータと合わせて,教師の指導行動及び児童の学習活動の特徴を明らかにすべく分析・検討を行っているところである。3.図表を伴う説明文についての読解方略を収集し,その構造を明らかにするとともに,作成した読解方略リストの妥当性の検証のため,読解効力感尺度との関連について検討した。因子分析の結果,従来の読解方略に加えて,イメージ化したり図表の視覚的情報を参照する方略や,図表と文を統合理解する方略が見出された。また,本リストにより読解効力感の個人差による読み方の違いが測定できることから,基準関連妥当性も満たしていることが示された。これらの内容については学会発表を行う予定である。初年度として,以下を実施した。1.児童の文章読解についてのメタ認知的知識の構造変容を把握するための測度を構成するため,読解方略質問紙(犬塚,2002)をもとに,28項目からなる質問紙を作成し,小学46年生を対象に調査を実施した。次年度に向けて,メタ認知的知識の次元性の抽出を中心に分析を進めているところである。2.教師が読解指導についてもつ信念とメタ認知的知識の構造との対応関係を調べるため,教職経験520年の教師8名を対象に,読書指導及び読解指導場面で行ってきた教授学習指導の実際,それが児童に及ぼす影響,そこでの教師の思考などについてインタビューを実施した。次年度の読解指導プログラムの開発に向けて,教師が児童の読解を深めると考えている知見や学習活動の特徴を明らかにすべく分析を行っているところである。3.手順を説明する手続き的説明文の読解方略の使用と読み手の特性との関係を検討した。自由記述で手続き的説明文の読み方を収集し,それに因子分析を適用し,図表の活用,意味明確化,標識の活用,メタ認知的な活動,既有知識活用という読解方略の5つのカテゴリーを得た。説明文の読解直後における5カテゴリーの読解方略の使用を測定し,これと読み手の特性(言語性作動記憶と空間性作動記憶の容量の個人差)の関係を検討した。その結果,図表の活用方略の使用には空間性作動記憶が関わっており,意味明確化および既有知識活用方略は,二種類の作動記憶容量の高低によって読解方略の使用に交互作用の傾向が見られた。これらの内容は論文にまとめるとともに,一部は学会での発表を行った。本研究の目的は,読解に関わる児童のメタ認知的知識の構造変容に着目し,これを効果測定の尺度にした指導プログラムの実践場面での有効性を検討することであった。そのために,(1)児童の文章読解についてのメタ認知的知識の構造把握のための測度を構成するとともに,(2)指導履歴の異なる教師間の読解指導に関わるメタ認知的知識の内容について検討した。(1)小学46年生を対象に読解方略に関する質問紙を実施し,メタ認知的知識の次元性の検討を行った。同時にメタ認知水準が高い大学生でも読解方略調査を行った。その結果,大学生では一定程度の特徴が見出されたのに対し,児童では次元得点の変化をメタ認知的知識の構造変容の測度として用いることの限界が示された。

(2)教師8名を対象に,読書指導や読解指導に関する場面での指導の実際,それが児童に及ぼす影響,そこでの自身の思考や判断などについてインタビューを行ない,4・5・6年の各1学級で国語科指導場面での授業観察を行った。その結果,明確な特徴や類型化できるような一貫した傾向は見出されず,諸方略が導く児童の思考活動や情報処理過程についての注意の配分が限定的で,結果として方略の指導やその評価も十分ではない可能性が示唆された。最終年度は(1)について,各児童の方略得点,読解テストの成績,読解レベルについての担任教師評定の3者の関連を検討したが,有意な対応関係は得られず,効果測定に組み込む指標の再考を要する結果が示された。(2)については,メタ認知水準が高い大学生を対象に,理科教員志望群とその他教員志望群で方略使用の違いを検討した。前者では,内容を図式化・イメージ化する読み方が強かったが,一方で指導における重要度評定では差はなく,自身の読み方との解離が見られた。メタ認知的知識と読み方のコントロールは一致せず,このズレを規定する要因の検討を要することが明らかになった。社会科学データの収集と分析はおおむね順調に進展しているが,成果のまとめと発表が滞っているため。初年度の計画として,次の2つをあげた。(1)児童生徒の文章読解についてのメタ認知的知識の構造把握のための測度の構成。(2)指導履歴の異なる教師間の読解指導についてのメタ認知的知識の構造の比較。後者については,定量的レベルでのデータは得られなかったが,一連の調査の実施により,計画はおおむね達成されたと考えられるため。データの収集と分析を継続して進めるとともに,成果のまとめと発表を行うことにより,とりわけ教室学習場面への還元を図る。調査で得たデータの分析を継続して進め,成果のまとめと発表を行うことにより広く成果を公表する。支払い処理上の都合のため。当初の計画通り使用する。次年度使用額は支払い処理の都合により生じたもので,研究は当初の計画通り行う。
DNA微量分析のための走査型化学力顕微鏡の開発

本研究では、DNAの1分子内の塩基配列を調べるために、AFMのプローブ(探針)の先端を塩基対と結合するよう化学修飾して、特異的な水素結合を調べられるような走査型化学力顕微鏡(SCM)を開発することを目的とした。ここでは走査型化学力顕微鏡(SCM)の動作確認を単純化した系で行った。基板表面およびAFMのプローブ表面が親水的もしくは疎水的の場合、プローブに動く力がどうなるのかをフォースカーブにより調べ、そのマッピングを試みた。1.AFMのプローブをアルカンチオールで修飾するために、プローブ表面をクロム次いで金を蒸着装置にて被覆した。電子顕微鏡観察により10個に2個の割合でプローブ先端まで被覆されることがわかった。2.金で被覆されたプローブをアルカンチオール溶液に浸し自己組織膜を形成させ、プローブ表面を疎水化した。3.親水的な基板として劈開した雲母を用い、疎水的な基板としてポリスチレンキャストフィルムを用いた。裸の金表面を持つプローブでは親水性、疎水性基板ではフォースカーブに差はなかった。それに対して疎水化処理したプローブでは異なるフォースカーブを得られた。すなわち、疎水化プローブと疎水表面とは吸着力(化学力)は弱いのに対して、親水表面では強いことがわかった。4.ポリスチレン微粒子(疎水性)が雲母基板上(親水性)で点在する試料を作製した。これを疎水化プローブで、256×256点で1ポイントごとにフォースカーブを測定し、トポグラフィーおよび吸着力のマッピングに成功した。ポリスチレン微粒子はトポ像では山のように見えるものの、吸着力が雲母表面に比べ弱いことから吸着力のマッピングでは低く見えた。以上の結果より、プローブと基板表面間の特異的な化学力(吸着力)を測定することで、相補的な水素結合による化学種の検出、すなわちDNAの塩基配列の読み出しが可能であるとが示された。
前頭葉と辺縁系の脳形態発達―認知機能との関連

本研究では、乳児期から成人期初期までの脳形態画像にもとづいて、人間の認知機能の最高次の中枢といわれる前頭葉と、記憶、情動や動機づけなどの根幹的な働きにかかわるといわれる大脳辺縁系における形態学的特徴の発達を調べる。また各脳領野をつなぐ白質繊維束の同定を行ない、その方向性の強度について調べ、その発達変化も検討することが目的である。本年度は、乳児期から成人期初期までの脳磁気共鳴画像(Magnetic Resonance Imaging: MRI)の健常データベースにもとづき、とくに前頭前野の下位領域にわけて、脳形態学的特徴の発達の検討を行った。さらに、これまで測定した脳体積や神経線維束のFA値と認知機能との関連の検討を行った。その結果、背外側前頭前野灰白質体積のピーク年齢は12.1歳、背内側前頭前野灰白質体積のピーク年齢は12.6歳であった。他方、背外側眼窩前頭前野および背内側眼窩前頭前野における灰白質体積ではピーク年齢は認められず、前頭前野の部位により、発達変化が異なることが明らかになった。乳児期においては、ベイリー乳幼児発達検査による表出言語と左前頭葉体積、受容言語と左側頭葉体積、および粗大運動と前頭葉体積とが正の関連を示した。また児童期から成人までの共通した認知機能検査の結果では、単語学習、記憶の組織化および注意機能おのおのと前頭葉体積が正の関連を示した。さらに、脳梁膝部FA値と前頭葉白質体積が正の相関を認め、脳梁膨大部FA値と脳後部白質体積に正の相関を認めた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、乳児期から成人期初期までの脳磁気共鳴画像(Magnetic Resonance Imaging: MRI)および拡散テンソル画像(Diffusion Tensor Imaging: DTI)の健常データベースにもとづき、脳形態学的特徴の発達の検討を行った。MRIについては、前頭葉・側頭葉および大脳辺縁系の重要部位海馬・扁桃体の体積の検討を行なった。DTIについては、脳梁、海馬帯状束、上縦束、下縦束、の主要な交連繊維と連合繊維を各DTIで同定し、拡散異方性に関係する代表的な指標の値を各繊維束で求めた。結果、脳体積のピーク年齢は前思春期に認められ、女子では男子より12歳程度早かった。灰白質の体積は、全脳、前頭葉、側頭葉のいずれにおいても、乳児期に急激に増大した。灰白質体積が前思春期にピークを迎え、以降減少していたことは、幼児期までに過剰に形成されたシナプスの刈込みによって機能的洗練が生じるという仮説を支持していた。灰白質体積のピーク年齢が、側頭葉では前頭葉より遅かったことは、感覚・運動機能を司る部位の成長が早く、言語や記憶などの機能と関連する部位の成長が遅いという仮説を支持していた。また前頭葉と側頭葉の体積増加が、56歳を境に右側優位から左側優位に逆転したことは、言語機能の発達との関連を示唆した。さらに、神経線維束のFA値の差異が認められ,脳梁,上縦束,下縦束,海馬帯状束の順に高かった。神経線維束のFA値が最大値の90%に達した時の年齢は脳梁,海馬帯状束,上縦束,下縦束の順に低かった。

MRIとDTIの解析を比較的順調にすすめることができ、ある程度の結果を出すことができたため。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後の検討課題は以下である。1MRIとDTIの結果の関連を明らかにすることと、2可能な限り、前頭葉、とくに前頭前野に関してMRI上でより詳細な解析をし、発達特徴を明らかにすること、3乳児期から成人期までの我々の保持する認知機能の健常データベースに基づき、健常な認知機能の発達を検討する、4健常のMRI,DTI,認知機能の個々に解析された結果について、年齢との関係を統計学的に検討する、5可能な限り、統合失調症の認知機能および形態学的特徴について健常者のデータと比較検討する。とくに10代前半から20代後半にかけての患者と健常者の比較検討を、年齢をひとつの指標にしながら行なう。
海産無脊椎動物の産生する化学物質による共生渦鞭毛藻の選択と形態制御

SLL-2のメラニン化を防ぎ、高収率の精製法を確立した。構造を精査した結果、SLL-2は分子量122Kの糖タンパク質で、それぞれ等モルのサブユニット2a、2b、2c9個から分子が構成されていることがわかった。フロンタルアフィニティークロマトグラフィーにより、SLL-2の各種糖鎖に対する結合性を調べた。その結果、SLL-2はGal α1-3(Fuc α1-2)Gal β1-4(Fuc α1-3)Glcに高いKa値を示した。また、GalNAc α1-3 GalNAcをもつForssman抗原に結合性を示したほか、Gal α1-3 Gal構造をもつ糖鎖との結合性を示した。これらのSLL-2と高い結合性を示す糖鎖はいずれも糖脂質由来のものであり、SLL-2は共生藻表面糖鎖の糖脂質と結合するものと推測された。二次元電気泳動法によりSLL-2処理して得られたSymbiodinium培養細胞のタンパク構成成分を調べたところ、培養細胞の日周変化により形成される栄養細胞のパターンと類似しており、遊泳細胞とは泳動パターンが異なることがわかった。また、SLL-2処理によって誘導された栄養細胞には培養細胞とは異なるタンパク成分が存在することが認められた。これらのタンパク質成分の本体について現在検討を加えているので、宿主内の共生藻が栄養型のまま留める機構についての知見が得られる可能性がある。一方、六放サンゴ類についてもレクチン活性と形態制御活性を検索した結果、トゲクサビライシのレクチンもSLL-2と同様の形態制御活性が示すことがわかった。また、Theonella属海綿に認められたSymbiodinium JCUCS細胞の形態制御物質の本体は既知のデプシペプチド類(TP類)であることを確認した。TP I dおよびTP1436は濃度依存的に遊泳細胞から栄養細胞へと形態を転換させ、細胞増殖の抑制を示すことが明らかとなった。この活性は可逆的で、処理JCUCS細胞は洗浄することによって正常な日周的な形態変化、増殖を回復した。そこで、各種細胞阻害剤の形態制御活性を調べたところ、Latrunculin Aなどのアクチン制御成分がTPと似た遊泳細胞の栄養細胞への形態変化を示素ことを確認できた。また、プロテインキナーゼ阻害剤であるBisindolylmaleimide Iも同様の活性を示した。いずれも洗浄によって正常な増殖過程に回復した。このことからSymbiodinium遊泳細胞から栄養細胞への転換にはミクロフィラメント構造の変化が密接に関連することが示唆された。シゲミカタトサカ中のドーパミンから形成されるメラニンが抽出物を黒変、不溶化し、レクチンSLL-2の精製効率を著しく阻害することがわかったので、チロシナーゼ阻害剤のコウジ酸を添加する収率の高い精製法を開発した。

物理化学的性状を精査した結果、SLL-2はいずれも94アミノ酸残基のSLL-2a、2bおよび2cの複数のサブユニットから構成される分子量69000のイソレクチンであることを確認した。推測されるアミノ酸配列と実測分子量との差、およそ5000の成分について詳細に検討した結果、C末端側に存在するAsp-Ser-Ser配列部分に糖鎖が結合していることをブロムシアン分解およびグリコペプチダーゼ処理したSLL-2のアミノ酸配列分析、質量分析によって確認した。また、二次元SDS-PAGEで認められたSLL-2サブユニット多型は結合糖鎖の種類によるものと推測される。一方、アミノ酸配列相同性検索から予測されたATP synthase活性は確認できなかった。また、シゲミカタトサカに共生するタイプCと同じクレードのSymbiodinium Ua#31培養株を新たに入手して遊泳細胞-栄養細胞間動態調節機能を確認した。現在、培養の容易なタイプFのCS-156株をSLL-2処理し、処理前後のSymbiodinium細胞の全RNAを調製し、遊泳細胞-栄養細胞の相互転換に伴うRNA成分変化について解析を進めている。また、SLL-2の動態変換作用はメリビオースで阻害されるが、SLL-2と同じD-ガラクトース結合性レクチンであるピーナッツレクチンはSymbiodinium細胞になんらの作用も示さず、甲殻類アカフジツボレクチンBRA-2では細胞破壊をもたらし、Symbiodiniumの動態変化はSLL-2に特有な反応であることを確認した。その他の八放サンゴ、海綿抽出物に認められた動態変換作用物質についても現在精製中である。シゲミカタトサカ・レクチンを精査し、3種の等電点の異なるSLL-2a、bおよびcがそれぞれ等モルの、サブユニット計9個からSLL-2分子(122kDa)を構成していることがわかった。次に、共生藻Symbidiniumの遊泳細胞と栄養細胞との構成成分の差異を見るために、それぞれのステージにある細胞からタンパク質画分を調製し、2次元SDS-PAGEを行ってタンパク成分を比較した。また、培養株(CS156)の遊泳細胞にSLL-2を添加して栄養細胞へ転換させた試料についても比較した。その結果、遊泳細胞には栄養細胞には認められない成分の存在を確認した。また、SLL-2添加によって得られた栄養細胞には、対照とした日周的に転換する栄養細胞には存在しない2種のタンパク成分が発現していた。一方、培養株から調製した全RNAには鞭毛ダイニン様の配列は確認できなかった。SLL-2は共生藻細胞の栄養細胞から遊泳細胞への転換に抑制的に作用すると考えられるので、形態変化を司るアクチンフィラメント、微小管などの局在部位、配列などの変化が考えられる。そこで、F-アクチンおよびβ-チューブリンの可視化を試み、これらを蛍光標識後、共焦点レーザー顕微鏡で観察する方法を確立し、両ステージの細胞を詳細に調べたところ、栄養細胞と遊泳細胞におけるチューブリン繊維の形状などに明らかな差異があることを観察できた。また、海綿Theonella種に認められたSLL-2類似の動態制御作用成分はSymbiodinium培養株(JCUCS)に対して、遊泳細胞の栄養細胞への形態転換を誘導し、そのまま栄養細胞として維持することを認めた。
大腸発癌におけるシクロオキシゲナーゼの関与とそのメカニズムの研究

大腸発がん過程におけるシクロオキシゲナーゼ(cyclooxygenase,COX)の関与とそのメカニズムに関して、動物を用いたin vivoでの大腸発がん実験と、種々の培養細胞を用いたin vitroの実験系において検討し、以下の点を明らかにした。1.Azoxymethane(AOM)誘発大腸発癌モデルを用い、COX-2及び一酸化窒素合成酵素(NOS)などの蛋白発現レベルを、Western blot法および免疫組織染色にて検討した。その結果、正常粘膜に比べ、大腸癌組織において、COX-2と誘導型NOS(iNOS)の発現が著明に増加することを見い出した。2.AOM誘発ラット大腸粘膜異常腺窩巣形成およびAOM誘発マウス長期大腸発がん実験において、COX-2の選択的阻害剤であるニメスリドが、大腸発がんに対して抑制効果を有することが示された。3.ω3型多価不飽和脂肪酸(PUFA)であるドコサヘキサエン酸(DHA)は大腸発がん抑制作用を示した。また、ω3PUFAが活性化マクロファージからのiNOSの発現を転写レベルで抑制することを見い出した。4.がん予防効果を有する生薬を検討する目的にて、LPS刺激マクロファージからのプロスタグランジンE2産生に対する抑制作用を指標にして、生細胞を用いたin vitroでのCOX-2阻害活性を186種の生薬について検討した。その結果、蒼朮、桜皮、虎杖根、桂皮、厚朴、縮砂、生姜、茵チン蒿、莪朮、甘草、山椒、芍薬、連翹、などに抑制活性を認めた。さらに、in vivoの発がん抑制作用を検討するため、AOM誘発異常腺窩巣形成の抑制作用を検討した結果、縮砂などに抑制活性を認めた。