hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
豚レンサ球菌の莢膜欠失による異なる病原性発現機構の解析

豚レンサ球菌は豚やヒトに髄膜炎や心内膜炎を起こす病原細菌で、近年世界中で豚と人の感染例が多数報告されている。本菌の莢膜は食菌作用に抵抗する重要な病原因子と考えられるが、莢膜を失うと組織表面への接着やバイオフィルム形成能等が亢進するなど異なる病原性を発現することも報告されている。我々は、心内膜炎分離株には莢膜保有株と欠失株の両者が混在することを見いだした。そこで、心内膜炎から分離した莢膜欠失株の莢膜遺伝子等を解析し、本菌が異なる病原性を発現するメカニズムを明らかにすることを目的とした。23年度では、血清型2型および1/2型に必須なcps2J遺伝子を保有する心内膜炎由来256株と対照として髄膜炎由来32株を用い、それらの莢膜発現を血清凝集反応と電子顕微鏡観察により調べると、髄膜炎株は全て莢膜を発現していたのに対し、心内膜炎株の86株(34%)は、莢膜を発現していなかった。次に、莢膜を発現しない43株を無作為に選び、莢膜産生遺伝子群領域全域をカバーする全21組のprimerセットを用いてPCRで各遺伝子の有無を調べた。18株では、PCRの産物が無い領域や予想とは異なる長さの断片を生じ、それらの塩基配列を決定したところ、予想通り欠失や挿入が起こっていた。この変異は、特にcps2Eおよびcps2F遺伝子領域に多く見られた。残りの25株について、cps2Eおよびcps2F遺伝子領域のみ塩基配列を決定したところ、20株が1数塩基以内の挿入・欠失変異を有していた。一方、残りの5株では、調べた範囲に変異は無かった。莢膜保有髄膜炎由来代表株と莢膜非産生心内膜炎由来株の、心内膜炎形成過程に重要な性質である、豚およびヒト血小板への接着性は莢膜非産生株が有意に高かった。これは、別な莢膜保有髄膜炎由来株とその莢膜遺伝子破壊変異株との比較でも同様であった。当初期待していた変異部位の法則性はむしろなく、どの部位にも同じ頻度で変異は起こると思われた。しかし、一部の変異が致死的となることが示唆され、そのような危険な変異を内包する莢膜形成遺伝子構成が、果たして菌にとってどういう生物学的意味を持つのかという別な方面の解析を進め、その結果、菌の集団にとっては、莢膜欠損細胞が存在することが有益となることを見出し、当初予想できなかった新たな研究展開を見たことは、大きな進展と言える。当初予定していた心内膜炎由来株および髄膜炎由来株での莢膜産生の違いを血清学的、形態学的および遺伝学的にもほぼ明らかにし、最終年度に予定していた細胞(血小板)への接着の違いを、莢膜産生能の異なる野外分離株および実験室で作製した変異株について明らかにし、心内膜炎発症にとっては、病原因子である莢膜を失うことが有利になることを示した。莢膜欠損細胞が菌集団にとって有益となることが示唆されたが、では、致死的な変異を生じた細胞は、菌集団にとってどういう意味をなすのかについて解析を進める。遺伝子変異に法則性は見いだせなかったが、特定の領域に変異が多く見られたことから、莢膜非産生株から莢膜産生株に戻ることがあるかどうか検査する。また、1数塩基以内の挿入・欠失変異を有した株で、莢膜発現に影響することが明らかでない変異もあったことから、これらの株にcps2Eまたはcps2F遺伝子を相補させて発現の回復があるかを見る。さらに、莢膜非産生株で血小板への接着に予想以上の向上が見られたことから、莢膜非産生株を利用して、血小板への接着に関与する菌表層の分子を明らかにすることを試みる。当初予定していた培養細胞に対する作用やバイオフィルム形成の解析と、そこに致死的な変異を生じて死んだ菌が存在した場合に、どうなるのかの解析を進めることから、作業としては、当初予定とほぼ同じ試薬と機材を必要とするため、予定通り研究費を使用する。
マイクロ流体と集積回路技術によるリキッドバイオプシープラットフォーム開発

本研究では、体液中のがん細胞を検出・分離し、一細胞解析を行う、次世代リキッドバイオプシープラットフォームの確立を目指す。これにより将来的には、患者の体液からがん細胞の同定・シグネチャー解析を一細胞レベルで定期的に行うことで、抗がん剤や手術などの治療効果をリアルタイムで評価できるようになるだけではなく、がんの変異的特徴の時系列変化を調べることが出来る。
高度に形態制御された結晶をコアとする革新的光アクティブファイバーの創製

高度に形態制御された結晶をコアとする革新的光アクティブファイバーの創製を目的に、新規ガラス材料の探索と、単結晶導波路形成に取り組んだ。ガラス材料は等方的な構造のため光波制御などの光アクティブデバイスとして用いることは難しい。そこで、ガラス内部に形態制御した光機能結晶を析出させることで、ガラスの特性を保持したまま結晶の機能を付与する方法が提案されている。本研究において、ガラス組成1ErF_3-3NiO-50BaF_2-25Al_2O_3・25B_2O_3 (mol比)からなるガラスを溶融急冷法により作製し、このガラス板状にレンズで絞ったYb : YVO_4レーザーを照射・掃引することでBaAlBO_3F_2単結晶からなる光導波路を形成することに世界ではじめて成功した。今回、この結晶の質を高めるため、ガラス構造を詳細に調査した。FT-IR、顕微Ramanのほか、Time of Flight(飛行時間質量分析計)を用いたガラス構造調査を試みた。光機能や結晶化においてガラスのAlやBの配位数やFの結合状態が重要であるから、Al2O_3の添加量を変化させた時のガラス構造の変化を調べた。ガラス構造はAl2O_3の添加に伴いAlの配位数が4配位から5,6配位と増加し、Bの配位数は4配位が減少し3配位が増大することがわかった。また、FはBと結合していたものが、A1の添加に伴いBaと結合を形成することがわかった。目的結晶のBaAlBO_3F_2では、Bは3配位、A1は5配位であることから、より質の高い単結晶導波路形成のためには適切なAl添加量のガラス組成を選択することが重要だということが分かった。これらの成果はガラスセラミックハイブリッド材料のさらなる高機能化にむけ大きく寄与するものである。(抄録なし)高度に形態制御された結晶をコアとする革新的光アクティブファイバーの創製を目的に、新規ガラス材料の探索と、単結晶導波路形成に取り組んだ。(抄録なし)
内耳に対するドラッグデリバリーシステムの研究

3つの研究を主体に検討した。1)内耳培養方法の検討マウス・ヒトについて培養法の条件設定を検討した。過去のマウス内耳用の培養液などの文献に基づき、培養液を作成したが、そのままヒト前庭組織に用いる場合、組織障害が極めて強く、評価が難しいと考えられた。2)動物(生体)内耳へのドラッグデリバリーシステム(以下DDSと略)2-1)薬剤モルモット内耳に対して、ナノテクノロジーを用いたドラッグデリバリーの1つであるキトサンを内耳に局所投与し、検討を加えたところ、極めて少ないキトサンが内耳に付着した。さらに、現在モルモット内耳へナノサイズの分子と結合させ、内耳への取り込みを促進させるステロイドの局所投与を検討中であるが、ステロイドの内耳調節投与のエビデンスが乏しいため、ステロイドの効果を証明するような実験を重ねている(未発表データ)。2-2)遺伝子遺伝子組み替え実験の条件を満たした研究室で、マウスやモルモットに対してウイルスベクターの研究を行っている。リポーター遺伝子を内リンパ腔に直接投与した場合には支持細胞や血管条に遺伝子発現を認めた。また偶然であるが、中耳粘膜にも高率に遺伝子が発現することも判明した(投稿中)。外リンパ腔である鼓室階に投与した場合は主として鼓室階の線維芽細胞に遺伝子発現させることが可能であった。投与による合併症あるいは鼓室階投与ではauditory brain response(ABR)上、聴力を悪化させることはなかったが、蝸牛管投与では著しく内耳機能が低下したことをABRで確認した。3)臨床応用に向けたDDS内耳DDSを臨床応用に向けて、新しい内耳用内視鏡下の薬物投与法を検討中である。この方法が確立されれば、上記で試行されている薬剤や従来から内耳に直接投与されていたステロイドなどの薬剤を明視下にて投与することが可能になり、難聴に対する治療効果を上げることが期待できる。1)モルモット内耳に対するキトサンを用いた遺伝子デリバリーシステム非ウイルスベクターであるキトサンは合成も容易で、他臓器では既に医薬品に用いられている上で臨床応用が期待される運搬体である。今回キトサンを用いた内耳デリバリーについて検討した。GFP遺伝子を組み込んだキトサンを内耳に投与したところ、内耳蝸牛(聴覚系器官)には少数ながら遺伝子発現を認めた。脳波を用いた聴力検査(ABR)にて聴力障害を認めなかったことから、キトサン投与が聴覚機能に与える影響は小さいと結論づけられた。今後はキトサンによる遺伝子デリバリーの効率以外に、ドラッグデリバリーとしての可能性について定量し、検討する。(なお、この結果は平成15年5月日本耳鼻咽喉科学会;東京に発表した)。2)マウス前庭培養C57/B16マウスの内耳から前庭・蝸牛を摘出し、7日間器官培養を行った。アデノウイルスベクターを感染させたところ、支持細胞を中心に、らせん神経細胞にも遺伝子発現を認めた。3)ヒト内耳へのドラッグデリバリーシステムの検討内耳培養法の確立を目的として、本大学医学部病院倫理委員会の承認の元、聴神経腫瘍患者から前庭摘出が行われた。培養下条件にて7日間のヒト前庭器官培養を施行した(N=2)。培養後の組織を電子顕微鏡下にて観察した。前庭全体の組織障害が強く、神経細胞の一部は残存していたが、感覚上皮細胞の観察は非常に困難であった。これは、組織が障害されている例から摘出したこともあるが、むしろ、ヒト内耳前庭に対する培養法の検討の余地があることを示唆した。
ヒト肝細胞がんの経門脈性転移機構の解析

ヒト肝細胞癌より樹立された細胞株Li-7を、ヌードマウスへの脾注を繰り返すことにより、高率に経門脈性肝転移を生ずるサブクローン(HM)と転移しないサブクローン(NM)を株立した。これらの細胞株を用い、以下の点につき検討した。1.細胞、細胞外基質との接着能:マウス肝類洞内皮細胞(HSE)への接着はHMがNMより強く、この接着は抗sialyl-Lex抗体にて阻害が認められた。ヌードマウス肝細胞に対してもHMはNMより強い接着性を示した。一方細胞外基質との接着に関しては、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン何れに対してもNMがHMより強い接着性を示した。2.接着分子の発現:インテグリンファミリーのうち、VLA2、VLA3、VNRは共に陽性、VLA1、VLA4は共に陰性、VLA5はNMのみ、VLA6はHMのみ陽性であった。Eカドヘリンは、HMのみに陽性であり、これが上述のマウス肝細胞との接着性の差異を生じ、更には肝転移能を規定しているのではないかと考え、NMにEカドヘリン遺伝子を導入し、現在クローニングを行っている。3.2次元電気泳動を用いた差異の検討:両亜株を2次元電気泳動にて比較したところ、一方のみに認められるスポットがHMに10ケ、NMに4ケ見られた。これらのうちNM特有のスポットの1,(MW約55,000,pI約4.9)がアミノ酸シークェンスによりヒトビメンチンと同定された。他のスポットに関しても現在検討中である。以上の検討より、現在までのところ、HMは、より肝細胞的な性格を保持していることが肝転移に関与している可能性が示唆され、今後更に臨床例も用い検討する。
伝統的基礎工法の支持力特性とその適用性に関する実験的解明

日本古来の木製伝統的基礎である「杭付き胴木基礎」の支持力を1G場で実験解析した.関東ローム(含水比70%)で小型模型地盤を作成し,その表面に木製基礎模型を設置した.杭付き胴木基礎模型は沈下につれて,土が胴木直下に流動して土の密度が増加し胴木-杭-直下の土が一体となって支持力を発揮することが明らかになった.そして,本実験で想定した地盤では木造家屋のような小規模構造物に対して十分な支持力が期待できた.日本古来の木製伝統的基礎である「杭付き胴木基礎」の支持力を1G場で実験解析した.関東ローム(含水比70%)で小型模型地盤を作成し,その表面に木製基礎模型を設置した.杭付き胴木基礎模型は沈下につれて,土が胴木直下に流動して土の密度が増加し胴木-杭-直下の土が一体となって支持力を発揮することが明らかになった.そして,本実験で想定した地盤では木造家屋のような小規模構造物に対して十分な支持力が期待できた.鉛直載荷実験は、地盤変形が確認できるよう1面がガラスの組立式土槽を使用し、試料土は関東ロームを用いた。模型地盤は50kPaで圧縮を行い、層状に大まかに密度一様な地盤を作製した。胴木基礎模型(塩ビ製)を用いて、杭付き胴木基礎模型を作製した。遠心加速度を徐々に上げることにより、胴木基礎模型に鉛直荷重を加えて基礎模型の沈下量を測定した。杭付き胴木基礎の沈下に伴って、基礎直下の地盤が変形する様子は、針貫入試験による地盤密度の変化とマーカーとして入れたカオリン層の変化で考察した。針貫入試験では、載荷実験後に針径2mmの丸棒を貫入速度2cm/minで貫入し、貫入抵抗と貫入変位を測定するものである。貫入箇所及び貫入量は12箇所・約6cmに設定し、比較のために基礎が設置されていない無載荷の模型地盤についても針貫入試験を行った。なお、試験結果の評価として、載荷実験後の貫入量4cmの位置での地盤の貫入抵抗値(N)を4段階に分類し、地盤密度変化は『よく締まった(◎)、軟らかくなる(△)』として評価した。その結果、杭付き胴木基礎の沈下に伴う地盤密度変化とカオリン層の変化により、杭間・胴木基礎周辺に土が流動してより締固まったことと推測された。このことは、杭付き胴木基礎は胴木基礎の特徴である格子構造を活かし、格子の中を土が通過することで土と基礎が一体化し、さらに杭の支持力により総合して沈下が軽減されるという支持力メカニズム解明の有力な手がかりが得られたと考えています。前年度の関東ロームに引き続いて、粘土地盤模型で杭付き胴木基礎の遠心実験を行って、支持力特性の解明を試みた。使用した地盤材料は藤の森粘土である。その他の実験方法、載荷方法、基礎模型などは前年度とほぼ同じである。土槽は透明なアクリル板が前面についた鋼製土槽(奥行12cm、長さ40cm、深さ30cm)である。底面には排水板を設置し、底面と排水板の間に水が通る隙間を開けるために等間隔で2mmの穴を開けた。十分に撹拌したスラリー状の藤の森粘土をベロフラムシリンダーにて30kPaで48時間圧密した。圧密終了後、基礎模型を地盤表面中央部に敷設した。荷重を鉛直に載荷し、変位計により基礎模型の鉛直変位を計測した。載荷板は胴木の交点部分での6点で点載荷した。載荷は速度制御0.01mm/secで行い、荷重-沈下量関係により、その支持力を考察した。得られた荷重沈下曲線を関東ローム地盤におけるものと比較すると、粘土地盤よりも関東ローム地盤での支持力が大きなものとなった。関東ローム地盤では基礎模型直下の土の締め固まりが支持力の発揮に寄与していることが推測された。一方、粘土地盤では基礎直下で土は全く締まっておらず、支持力も1/41/6にとどまる結果となった。このことは、軟弱な粘土地盤では、基礎直下に沈下に伴う土塊ができず杭付き胴木基礎のみで十分な支持力を発揮するのは難しいと言えるかもしれない。城の石垣基礎などでは杭付き胴木基礎に加えて、しばしば敷葉工法が併用されているのは、この理由によるものと思われる。今年度の成果として、緩いローム地盤では家屋相当荷重に対しては、十分な支持力が期待できるが、軟弱な粘土地盤では、敷葉工法を併用するなどのもう一つ工夫がいることが明らかになった。この点については、平成22年度の研究で、有限要素解析なども実施して確認することとする。最終年度である平成22年度は,盛土地盤における杭付き胴木基礎の効果解明と研究の取り纏めを目的とした.当初は軟弱地盤上の住宅などの小規模構造物を支えるエコで環境に優しい工法として,伝統的工法である胴木基礎の支持力に着目し,模型載荷実験で明らかにした.

模型地盤(奥行き12cm,長さ40cm,深さ20cm)は含水比70%に調整した関東ロームで5層に分けて作製した.胴木基礎模型は,縦5mm,横5mmの角材を使用して作成した.載荷実験の結果,杭付き胴木基礎が沈下するとともに隣接する土が胴木直下に流動し,胴木直下の土の密度が大きくなって胴木一杭一直下の土が一体となって支持力を発揮することが明らかになった.この実験では,2mmの基礎沈下に対して200kN/m_2という値が得られた.模型実験で境界の影響などの照査がさらに必要であると思われるが,本実験で用いたような地盤では十分な支持力が期待できると評価している.現実の地盤では,さらに軟弱で沈下に伴い土の流動性が増すと思われるので,敷葉工法を併用した場合の支持力の増加を実験的に解析した.注目した点は,(1)敷葉の位置と(2)敷葉の向きとその敷設方法である.その結果,載荷初期では杭の中程に位置している方が支持力は大きいが,沈下量が増加していくと杭先端に敷葉が位置している方が支持力は若干大きくなった.結果として,敷葉工法を併用することによって,支持力は約1.2倍となり,併用効果を確認できた.また敷葉は格子状に敷いて設置した場合にもっとも大きな支持力効果が発揮されることが明らかになった.本科研費で実施した載荷実験で得られた成果は,木と敷葉を材料とし,エコで環境に優しい伝統的工法である杭付き胴木基礎工法と敷葉工法を併用することで,実験室レベルではあるが住宅など小規模構造物に十分な適用性を有することが明らかになったと評価している.今後の課題としては,実際に原位置での載荷実験による実用性の更なる検証が必要と考えている.
Slc26a4ヘテロマウスの病態生理解析

本研究の目的は、過去の研究で十分な注目が寄せられていなかったSlc26a4ヘテロマウスの聴力像と病態生理を解明することで、前庭水管拡大症患者、特にSLC26A4変異が1つの対立遺伝子にしか同定されていない患者に対して、難聴の進行予防や治療につながる知見を得ることであった。平成29年度の研究目標は、Slc26a4ヘテロマウスおよびSlc26a4欠損マウスを獲得して、Slc26a4ヘテロマウス、野生型マウスおよびSlc26a4欠損マウスの聴力の経時的変化と、内耳におけるペンドリン発現の検証を行うことであった。当初、国外の研究機関からSlc26a4欠損マウスおよび野生型マウスを輸入する計画であったが、予算を超えることが判明し、国内の研究機関に譲渡を依頼した。調整のために当初の目標より時期が遅くなったが、マウスを獲得して交配し、本研究に十分な大きさのコロニーを拡大中である。以上の通り、遺伝子改変マウスの獲得およびコロニーの拡大、マウスの聴覚検査の予備実験を行い、Slc26a4ヘテロマウスの聴力像と病態生理を研究することが可能であることを確認することができた。研究代表者の退職に伴い、残りの研究計画は協力研究者によって継続される予定である。
金属-金属結合で連結した貴金属ポルフィリン-クラスター複合化合物の開発

ポルフィリン上に金属-金属結合をもつ化合物を展開した。予備段階として金属-炭素多重結合の化合物例としてカルベンルテニウムポルフィリン及びカルベンオスミウムポルフィリンを合成した。得られた化合物について単結晶構造を明らかにした。前者においては第六配位座のルイス塩基の及ぼすトランス影響について考察し、後者においては結合距離からオスミウムの酸化状態を推定した。上記をもとにアルキルと等電子構造のイリジウム-14族結合をもつ化合物を展開した。THF中の金属カリウム還元によりイリジウムポルフィリンアニオンを発生、シリルクロリド、スタンニルクロリドと反応させる方法で、一連の化合物を合成した。結晶構造解析を行ったところ、Ir-Sn, Ir-Si距離はそれぞれの共有結合半径の和よりもやや短いことがわかった。このことはIr5d軌道電子のSn5d, Si3d軌道への逆供与によるdπ-dπ相互作用に起因すると考えられる。UV-visスペクトルにおけるSoret帯吸収のε_<max>いずれもアルキル化合物に比べて約1.5倍になっていること、Soret帯が双こぶに分裂していることからも,この相互作用の存在が裏付けられた。さらにヒドリドと等電子構造のロジウム-金結合をもつ化合物を合成した。上記イリジウム化合物同様の方法でロジウムポルフィリンアニオンを発生させ金(I)化合物と反応させた。結晶構造解析、各種分光測定の結果、この化合物はロジウム-金単結合を持っていることがわかった。以上により金属ポルフィリンアニオンを用いる方法は様々な金属-金属結合の形成に有用であることを実証した。シリルロジウムポルフィリン,シリル及びスタンニルイリジウムポルフィリンを2つの方法で合成した。得られた化合物についてIr-Si, Ir-Sn, Rh-Si距離と共有結合半径の和との比較し,ケイ素に結合した置換基によるRh-Si結合への影響を考察した。まずTHF中、金属カリウム還元でイリジウムポルフィリンアニオンを発生,シリルクロリド,スタンニルクロリドと反応させる方法で,一連のイリジウム化合物を収率30%前後で得た。この方法をシリルロジウムポルフィリンに適用したが,ケイ素に結合するフェニル基が多くなると収率が低下し,10%以下となった。そこでシリルカリウムとロジウムポルフィリンの反応を試み,SiMe_2PhCl, SiMePh_2Clで約10%の収率で目的化合物を得た。熱安定性を調べるため,トルエン中数時間加熱還流したところ,Ir(ttp)SnMe_3 2a, Ir(ttp)SnPh_3 2dは一部分解,Ir(ttp)SiMe_3 1a, Rh(ttp)SiMe_2 Ph3b, Rh(ttp)SiMePh_2 3cについてはほとんど分解は見られなかった。上記化合物について結晶構造を明らかにした。既知のアルキル金属ポルフィリン中Ir-C, Rh-C距離は共有結合半径の和と同程度であり,単結合と考えられるが,Ir-Sn, Ir-Si, Rh-Si距離はそれぞれの共有結合半径の和よりもやや短いことがわかった。このことはIr5d, Rh4d軌道電子のSn5d, Si3d軌道への逆供与によるdπ-dπ相互作用に起因すると考えられる。UV-visスペクトルにおけるSoret帯吸収のε_<max>が1a,3b,3cはいずれも[Ir(ttp)CH_3],[Rh(ttp)CH_3]に比べて約1.5倍になっている,2a,2dのSoret帯は双こぶに分裂していることからも,この相互作用の存在が裏付けられた。本研究ではアニオン性金属ポルフィリンにAuPPh_3を反応させ,金と異種金属間に結合をもつ花合物を合成,その性質を調べた。(1)ロジウム(1)ポルフィリン

K[Rh(por)]とAuClPPh_3との反応不活性雰囲気下THF溶液にて合成を行った。反応温度が高いとPPh_3の解離が起こり,ホスフィン錯体が生成する。そのため氷冷下反応を行った。エタノール抽出により[(por)RhAuPPh_3]が単離できた。この化合物は結晶構造解析により構造を確認できた。Rh-Au結合距離は2.5264(4)Åであり,共有結合半径から単結合であると考えられる。CH_2Cl_2,CHCl_3,ベンゼン,トルエンによく溶け,エタノールにはわずかに溶けるが,ヘキサン,アセトニトリル,メタノールにはほとんど溶けなかった。空気中CHCl_3溶液では原料のポルフィリン錯体に,PPh_3を含むベンゼン溶液ではPPh_3錯体に分解した。Ph_2Sを添加すると数日かかって分解したが,分解生成物の特定はできなかった。HC≡CPhやシクロオクテンの存在下では変化しない。トルエン溶液を100°Cに加熱すると18時間以内に完全に分解,金属金とポルフィリンを含む化合物に分解したが,結晶を10^<-3>Torrで180°C,5時間加熱しても一部が分解したのみであり,金属金の生成は確認できなかった。またホスフィン置換体をPMe_3,P(OMe)_3,PEt_3で合成した。(2)オスミウム(0)ポルフィリンK_2[Os(por)]を原料とする金属-金属結合形成の試み(1)同様,K_2[Os(por)]にAuClPPh_3,Au(NO_3)PPh_3,SnPh_3Cl, SnMe_3Clを反応させた。特に後3者の場合,反応溶液の色調は暗緑色から暗赤色に変化,沈殿物が生成したが,生成物の溶解度は低く,NMRなどの分光測定によって金属-金属結合の形成を確認することはできなかった。
メッシュ分析による風景画を生かした緑景観に関する研究

本研究は、長年に渡って評価されてきた浮世絵風景画「東海道五十三次」「木曾街道六十九次」を分析対象として、(1)「緑」の要素の配置手法を分析することにより緑化計画の示唆を得ること、(2)景観の構図の典型タイプを導き出すこと、(3)景観設計手法における一般的な指標を導き出すことを目的としている。平成7年度には、樹木の配置手法を分析することによって自然景観における緑化計画の示唆が得られた。平成8年度は、画面内での「緑」の配置傾向を検討するために、浮世絵風景画を縦9*横9の81メッシュに分割し、オーバーレイ法によって、描かれた樹木の樹種、植生形態、機能について分析し、さらに描かれた樹木の画面内の距離景別分布状況を調べた。平成9年度は、これまでの「緑」に関する検討の成果をもとに、東海道及び木曾街道の宿場町を対象として宿場とその周辺の景観を調査し、宿場町の景観構成を明らかにするとともに、景観設計手法における一般的な指標のひとつとして道の奥行きを表す視線停点間距離を提案し、その測定方法を開発した。本研究は、長年に渡って評価されてきた浮世絵風景画「東海道五十三次」「木曽街道六十九次」を分析対象として、(1)「緑」の要素の配置手法を分析することにより緑化計画の示唆を得ること、(2)景観の構図の典型タイプを導き出すこと、(3)景観設計手法における一般的な指標を導き出すことを目的としている。平成7年度は、まず浮世絵に描かれた樹木、草地等の「緑」の構成要素について、風景画から判断できる範囲内で樹種を調査し、植物学体系の分類で5種類、目立った特徴により、3種類、存在形態によって8種類、景観タイプについて7種類、樹木の実用的機能について9種類、樹木の構図的機能について3種類に分類した。つぎに、樹木の高さと道幅の比(h/w)、並木道の樹木の間隔と道幅の比(l/h)等を浮世絵風景画の画面上で、人物の平均身長との比較により測定することによって、(1)樹種では、全体的にアカマツが多く描かれ、これに加えて「東海道五十三次」では、クロマツ、タケ類、スダジイが多く描かれ、一方「木曽街道六十九次」ではヒノキが多く見られること、(2)全体的に緑の少ない「東海道五十三次」では、花・果実樹が多くみられるなど、緑を重要な構成要素として捉えていることが伺えること、(3)中景の緑は横主視線上に多く描かれており、重要な構成要素であると考えられること、(4)集落の入口には、目印としての機能を果たすために、比較的樹高の高い樹木を植えていたと考えられること、(5)集落の外から眺めたときに集落の中、あるいは背後に見える緑があり、その高さは、建物高さの約1.7倍となっていること等が明らかになり、本研究の目的である(1)描かれた構成要素のうち「緑」の要素に着目し、樹木の配置手法を分析することによって自然景観における緑化計画の示唆を得ること、(2)画面内の「緑」の位置を分析することによって景観の構図の典型タイプを導き出すことの一部が達成された。本研究は、長年に渡って評価されてきた浮世絵風景画「東海道五十三次」「木曾街道六十九次」を分析対象として、(1)「緑」の要素の配置手法を分析することにより緑化計画の示唆を得ること、(2)景観の構図の典型タイプを導き出すこと、(3)景観設計手法における一般な指標を導き出すことを目的としている。平成8年度は、画面内での「緑」の配置傾向を検討するために、浮世絵風景画を縦9*横9の81メッシュに分割し、オーバーレイ法によって、描かれた樹木の樹種、植生形態、機能について分析し、さらに描かれた樹木の画面内の距離景別分布状況を調べることにより、(1)額縁的機能、片寄せ機能、画面分割機能、連続的機能などの景観構図的な役割があること、(2)中景の緑が横主軸線上に多く描かれることから、重要な構成要素であること、(3)単独樹木よりも林や森などの緑のかたまりが重要な構成要素であること、(4)比較的に緑の少ない東海道では、緑を貴重な景観資源としてとらえ、構図の中心に描く傾向があること、等が明らかになった。本研究は、長年に渡って評価されてきた浮世絵風景画「東海道五十三次」「木曾街道

六十九次」を分析対象として、(1)「緑」の要素の配置手法を分析することにより緑化計画の示唆を得ること、(2)景観の構図の典型タイプを導き出すこと、(3)景観設計手法における一般的な指標を導き出すことを目的としている。平成7年度には、樹木の配置手法を分析することによって自然景観における緑化計画の示唆が得られた。平成8年度は、画面内での「緑」の配置傾向を検討するために、浮世絵風景画を縦9*横9の81メッシュに分割し、オーバーレイ法によって、描かれた樹木の樹種、植生形態、機能について分析し、さらに描かれた樹木の画面内の距離景別分布状況を調べた。平成9年度は、これまでの「緑」に関する検討の成果をもとに、東海道及び木曾街道の宿場町を対象として宿場とその周辺の景観を調査し、宿場町の景観構成を明らかにするとともに、景観設計手法における一般的な指標のひとつとして道の奥行きを表す視線停点間距離を提案し、その測定方法を開発した。
電離圏電子密度モニターを目指した衛星搭載真空紫外シュミットカメラの開発

真空紫外シュミットカメラの要となる非球面MgF_2補正板を高精度ダイレクト研削により試作し、干渉計を用いて製作精度を検証した。試作した非球面補正板の面精度は観測波長135.6nmに対し、約λ/3(PV)という値を達成できた。この面にさらに磁性流体研磨による仕上げ加工を加えれば、λ/4以下の高い面精度の達成が期待できる。また、面粗度はおよそλ/100が達成されており、こちらは十分に実用レベルであると考えられる。真空紫外シュミットカメラの製作方法を確立するために、MgF_2シュミット補正板の研磨技術を開発する。平成21年度の成果は以下の4点である。1.過去に実施したダイヤモンド研削+磁性流体研磨によるMgF_2平面研磨試験で、研磨面に原因不明の十字模様の残差が現れた。この十字模様の残差の原因を詳しく調査した結果、材料の結晶構造に起因することが判明した。ただし、この十字模様の残差の絶対値は面精度の許容範囲内である。2.これまではダイヤモンド研削+磁性流体研磨で平面の研磨試験を行ってきたが、より最終目的の非球面に一歩近づいた球面の研磨試験を実施した。その結果、同様の技法で目標の面精度を達成できることがわかった。研磨回数を増やすと始めは面精度が向上していくが、先に述べた十字模様の残差の影響である回数からは逆に精度が悪くなる現象が見られた。別に行った試験で、ダイレクト研削でもほぼ目標面精度が得られることも確かめられた。3.シュミット補正板評価のための、ヌルレンズ系を設計した。ガラス屈折率の製造誤差、レンズ製造公差、レンズの軸ずれを考慮しても、設計上ヌルレンズ系に必要な光学性能が達せられることを確認した。4.計画を前倒しして、MgF_2シュミット補正板の試作に取りかかった。直径は実物の1/2スケールであるが、面スロープの最大傾斜は実物と同程度になるように設計した。同時にそれに合わせたヌルレンズを設計した。ヌルレンズの製造は予算の関係で次年度とした。昨年度の研究で、MgF2の平面と球面の加工については要求される面精度と面粗度を達成できることがわかった。今年度は、真空紫外シュミットカメラの要となる非球面MgF2補正板の製造技術を確立するため、非球面レンズの加工精度を試作により検証した。非球面の製作は面の傾斜が最も大きいところ及び研削量が最大になるところが特に困難となる。そこでフライトモデルの補正板と同程度の傾斜と研削量をもち、直径が60mmの補正板を設計した。それと同時に、試作した補正板を干渉計で評価するために、非球面補正板と組み合わせることで入射した平行光線を平行光線として出射するレンズ系を設計した。非球面補正板の製作には、昨年度の試験で平面及び球面の製作で精度と効率の点から有効性が確かめられた高精度ダイレクト研削を用いた。面評価にはHe-Neレーザー光を用いたフィゾー型干渉計を使用し、できあがった非球面補正板の面精度と面粗度を測定した。その結果、面精度は観測波長135.6nmに対し、約λ/3(PV)、λ/25(rms)という値を達成できた。今回の試作は高精度ダイレクト研削のみを施したが、この面にさらに磁性流体研磨による仕上げ加工を加えれば、λ/4(PV)以下の高い面精度の達成が期待できる。今回はフライトモデルの36%の面積を持つ補正板の試作に成功したので、フライトモデルの補正板製作は加工時間すなわちコストだけの問題である。今年度までの研究で本研究の目標とする、真空紫外シュミットカメラの非球面補正板を製作する技術は確立できた。酸素原子が放射するOI135。6nm夜間大気光の放射強度は電離層F層の電子密度の二乗にほぼ比例する。静止衛星を利用してOI135。6nm大気光を撮像すれば、電離圏におけるプラズマバブルや伝搬性電離圏擾乱といった電子密度変動現象の全体像を捉えることが可能である。中高緯度でのOI135。6nm大気光の発光強度は10R程度であり、静止軌道から電離圏での水平距離100kmの空間分解能で撮像する場合、露出時間20分で1000カウント得るためには0。075cts/s/R/pixelの感度が必要である。真空紫外シュミット光学系を実現するにあたり、最も技術的に困難な要素は真空紫外光を透過するMgF_2などの結晶材料を基板とした非球面補正板の製作である。まず、MgF_2を補正板材料として用いたシュミット光学系を設計し、MgF_2の精密加工技術を確立するために、磁性流体研磨と高精度ダイレクト研削の二通りの方法で球面を試作した。

干渉計を用いて面精度を評価した結果、両者ともに0。5λPV(peak-to-valley)@135。6nm程度の面精度を達成できた。加工時間を考慮すると高精度ダイレクト研削が適することがわかった。次に、フライトモデルのシュミット補正板と同程度の最大傾斜、サグ量と60%の直径(=60mm)を有する小型MgF2シュミット補正板を設計し、高精度ダイレクト研削を用いて試作した。その結果、面精度は0。53λPVとなった。高精度ダイレクト研削を用いて補正板を製作したと仮定して、シュミット光学系全体の性能を評価したところ、要求される空間解像度を十分に満たしていることが確かめられた。本研究の目標とする真空紫外シュミットカメラの非球面補正板を製作する技術は確立できた。最終年度は、前年度までに得られた成果を論文としてまとめて公表した。
遺伝性皮膚疾患の責任遺伝子の同定

遺伝性皮膚疾患の原因については近年遺伝子解析技術の進歩により解明が進んでいるが、まだ多くの疾患で原因遺伝子が不明のままである。今回の研究では主に常染色体優性遺伝性疾患であるMichelin tire baby syndromeについて原因遺伝子の究明を行った。3家系より遺伝子サンプルを集積し、連鎖解析法により原因遺伝子の候補領域としてD7S2480-D7S515を同定した。本研究をベースに今後さらなる病因解明が進むことが期待される。常染色体優性遺伝形式をとる非水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症の家系については、ケラチン遺伝子異常に伴う疾患が常染色体優性遺伝性形式をとることから、責任遺伝子がケラチン遺伝子と連鎖している可能性を考え、ケラチン遺伝子の集簇する遺伝子座12q13近傍のマイクロサテライトを解析した。しかし本家系においては疾患と12q13領域に存在するマイクロサテライトは連鎖しなかった。このことから12q13領域に存在するケラチン蛋白(ケラチン1、2、5、6)遺伝子は責任遺伝子として否定的であることが示唆された。今後同様にケラチン遺伝子の集簇する17q12-q21領域や、角化関連遺伝子が集簇する1q23に存在するマイクロサテライトを解析し、連鎖の有無を調べる予定である。なお候補遺伝子として常染色体劣性遺伝型の非水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症の原因遺伝子であるTGM1遺伝子を直接シークエンスしたが、変異は見つからなかった。Michelin tire baby syndromeに関しては、過去に報告のある染色体7番における転座inv(7)(q22q31.3)や、染色体11番における一部欠失del(11)(q21q23)が候補遺伝子座として考えられたため、当該部位のマイクロサーライト解析を行った。その結果、7q22-q31.3においては連鎖がみられたが、11q21-q23においては連鎖がみられず、7q22-q31.3に責任遺伝子が存在する可能性が示唆された。候補遺伝子として、7q22-q31.3に存在する遺伝子HYAL4,SPAM1,PCOLCEを直接シークエンスしたが、変異は見つからなかった。遺伝性皮膚疾患家系からのDNA採取については、Michelin tire baby syndromeの家系が新たに2家系見つかり、本人の同意を得たうえで遺伝子採血を行った。今後マイクロサテライト解析を施行し、候補遺伝子座をさらに絞り込んでいく予定である。常染色体優性遺伝性疾患の一つであるMichelin tire baby syndromeについて、責任遺伝子の候補領域を絞り込む作業を、遺伝子連鎖解析法を用いて昨年度までに行った。その結果マイクロサテライトマーカーD7S2480-D7S515の範囲(Interval 1Mb)に疾患との連鎖を認め、この領域に責任遺伝子が存在するととが示唆された。今年度はExonic sequence法を用いて候補領域に存在する全遺伝子のエクソン領域を網羅的に調べた。その結果同領域に複数のpolymorphismが存在することが確認され、病原性をもつ可能性のあるpolymorphismについて、direct sequencingを行い検証を行ったが、疾患の原因と考えられる遺伝子変異を確認することはできなかった。Michelin tire baby syndromeの責任遺伝子を同定するに当たって、全身の皮膚の著明な皺が特徴である犬種シャーペイ犬において、ヒアルロン酸合成酵素の一種であるHyaluronan synthase 2の遺伝子HAS2に特有のSingle nucleotide polymorphismが確認されていることから、ヒトにおけるHyaluronan synthase 3種(HYAL1, HYAL2, HYAL3)の遺伝子と疾患の連鎖について解析を行い、HYAL1とMichelin tire baby syndromeに疾患関連性の存在することを昨年度突き止めた。今年度は、HYAL1のエクソン領域を直接シークエンスするとともに、イントロン領域のSingle nucleotide polymorphismについても検索したが、疾患との関連を示唆するような変異を同定することはできなかった。以上から、原因遺伝子の同定には至らなかったが、原因遺伝子の存在する候補領域として、マイクロサテライトマーカーD7S2480-D7S515があることを同定したのを最終成果とする。今後本研究をベースに、さらなるMichelin tire baby syndromeの病因解析が発展することを期待する。
確立論の総合的研究

この研究は平成7年度と8年度にわたって行った。内容については研究成果報告書にあるように我国で行われている確立論の多くの分野にわたることについて計12日の研究集会を開き,研究情報の交換を行った。特にその中でも,数学の他の分野,あるいは数学以外の分野との交流が多く持てたことに大へん意義があった。統計物理,数理生物,数理ファイナンス,数学の分野では討論,微分方程式,スペクトル理論,微分幾何,等々関連する分野の研究に親展があった。また7年度と8年度に1度づつ夏の学校を開き,若い研究者,学生に対して現在活発に進行中の話題,つまり「流体力学極限」と「エルゴ-ト理論と数論」の2つの主題について,専門の研究者に連続講演をお願いした。これは,若い世代に自分の研究の方向付けを与えるものとして非常に意義深いものであったと思う。さらに各分野を統合する研究集会を各年の12月に開催した。これにより,ともすれば狭い専門に限られて関心を広げることができたと思う。「確率論の総合的研究」では7研究集会を開催して確率論の研究ならびに研究者の交流を図った。主な研究内容は以下の通りである。1。数理物理学、数理生物学と確率論:近年発展しつつあるある無限粒子系の確率モデルから出発してその極限として流体力学の方程式を導出する流体力学極限の問題で中心的な役割を担っている研究者により、学生または他の分野の研究者向けの夏の学校を開いた。また、冬には数理生物学の研究者とも共同の研究集会を開いた。そこで集団遺伝学、生物集団の生存競争等の数学的な問題について討論した。さらに数理物理からの問題で非均質的な媒体のなかの電子の運動を記述するシュレ-ヂンガー作用素のスペクトルについてその固有値分布のポアソン性が示された。2。確率解析:数学的な問題を確率論の視点からみる立場の確率解析では無限次元解析および対称形式の専門家による研究集会と確率過程の総合的な研究集会を開いた。無限次元空間での微分作用素のスペクトルについて新しい知見が得られた。また古典的なランダムウオ-ク、ブラウン運動を現代的な観点から見直すことを試み、1次元拡散過程についてのある分布の漸近適性質についてスペクトル理論によるアプローチが可能なことが発表された。平成8年度は次の7つの研究集会を開催した。1.確率論サマースクール2.確率解析とその周辺3.フラクタルの数学的基礎4.数理ファイナンスと確率解析5.パーコレイション、無限粒子系の数理6.エルゴ-ト理論とその周辺7.確率過程とその周辺これらの研究集会を通じて確率論と他の分野・つまり、統計物理、数理経済、数理生物、数理工学等との関係がますます深まった。特に数理ファイナンスにおいては確率論研究者の間で本格的な研究が進展しており、意図の全幅関係者との交流も活発である。さらに現実的な確率モデルを通じ数理生物研究者との関係も増々強くなっており、研究集会5では多くの隣接分野からの研究者の発表があった。エルゴ-ト理論においても、数論への応用が進展している。
Fuchs角膜内皮ジストロフィの病態生理における小胞体ストレス応答の意義

角膜移植以外に治療法がない難治性角膜疾患であるフックス角膜内皮ジストロフィ(FECD)の病態を解明し、発症予防と新規治療法の開発のための基礎的知見を得ることを目的とした研究を行った。まず初めに、FECD患者の角膜組織のaggresome染色を行い、unfolded proteinと呼ばれる変性タンパク質が患者角膜内皮細胞に過剰に蓄積されていること、角膜内皮に蓄積した変性タンパク質はI型コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスであり、小胞体に局在することを明らかにした。また電子顕微鏡による観察でFECD患者の角膜内皮細胞には小胞体の形態異常が見られることを示した。次に、研究代表者らが樹立した不死化角膜内皮細胞およびFECD患者由来の不死化角膜内皮細胞を用いた検討により、胞体ストレス応答により角膜内皮細胞に細胞死が誘導される機序を検討した。本研究により、FECD患者の角膜内皮では過剰に産生された細胞外マトリックスが変性タンパク質として蓄積し、小胞体ストレスによりCHOPを介してミトコンドリア経路が活性化され、それによって角膜内皮細胞のアポトーシスが誘導されることが明らかとなった。またTGF-β経路の活性化を抑制することによりFECDにおける角膜内皮細胞のアポトーシスが抑制されることを示すとともに、新たなFECD治療候補薬の探索に有用な薬剤スクリーニング系を確立した。本研究成果は、難治性角膜疾患であるFECDに対する点眼薬による薬物治療の可能性を示す社会的意義の高いものであり、論文として公表するとともにプレスリリースを行って研究成果を社会に発信した。本研究はドイツエルランゲン大学のFriedrich Kruse教授および英国カーディフ大学のAndrew J. Quantock教授らとの国際共同研究である。本研究は、角膜移植以外に治療法がない難治性角膜疾患であるFuchs角膜内皮ジストロフィ(FECD)の病態を解明し、発症予防と新規治療法の開発のための基礎的知見を得ることを目的とする。我々はこれまでにFECD患者由来の角膜内皮細胞用いてFECD疾患モデル細胞を樹立し、FECD角膜内皮細胞はECMを過剰に産生すること、上皮間葉系移行を制御する遺伝子群(Snail1、ZEB1)を高発現することにより、TGF-βに高い反応性を示してECMを産生することを見出した。本年度は、FECD患者の角膜組織を用いた検討により、患者角膜内皮細胞には変性タンパク質(aggresome)が蓄積されており、それらはフィブロネクチンやI型コラーゲンと共局在すること、電子顕微鏡による観察で小胞体の形態異常が見られることを示した。また、FECD患者角膜組織のマイクロアレイ解析を行い、患者角膜内皮ではTGF-β1/2、TGF受容体(I型/II型)、またフィブロネクチンをはじめとする細胞外マトリックス関連分子の発現が亢進していることを確認した。さらに、FECD疾患モデル細胞においても患者角膜内皮細胞と同様に、変性タンパク質が増加しており、フィブロネクチンやI型コラーゲンと共局在することが明らかになった。さらにFECD疾患モデル細胞では、小胞体のストレスセンサーであるIRE1、PERK、ATF6が活性化しており、ミトコンドリア経路を活性化することによりアポトーシスを生じていることを明らかにした。これらの結果より、FECDにおいてTGF-βシグナルの活性化により細胞外マトリックス関連分子が過剰に産生されることで、変性タンパク質が蓄積し小胞体ストレスによる細胞死が生じる可能性が示された。本研究はドイツエルランゲン大学のFriedrich Kruse教授、京都府立医科大学の佐藤貴彦博士らとの共同研究である。当初計画どおりに順調に進展している。角膜移植以外に治療法がない難治性角膜疾患であるFuchs角膜内皮ジストロフィ(FECD)の病態を解明し、発症予防と新規治療法の開発のための基礎的知見を得ることを目的とする。本年度は、FECDの病態として、FECD患者の角膜内皮では過剰に産生された細胞外マトリックスがunfolded proteinとして蓄積していること、さら小胞体ストレスによりCHOPを介してミトコンドリア経路が活性化され、それによって角膜内皮細胞のアポトーシスが誘導されること、またTGF-β経路の活性化を抑制することによりFECDにおける角膜内皮細胞のアポトーシスが抑制されることを論文として報告した。これらの知見は、現在はドナー角膜組織を用いた角膜移植しか治療法のない疾患であるFECDに対して、点眼薬による治療の可能性を示す社会的意義の高いものであり、プレスリリースを行って研究成果を社会に発信した。さらにFECDの病態におけるMitochondria-associated ER membranes (MAM)の関与について詳細な検討を行い、角膜内皮細胞において小胞体ストレスによりMAMが誘導されることを報告した。これらの研究により、FECDの病態解明および治療法の開発のために役立つ有意義な知見が得られ、3件の特許出願を行った。本研究はドイツエルランゲン大学のFriedrich Kruse教授らとの国際共同研究である。FECDの疾患モデル細胞を樹立し、TGF-βシグナルに着目した治療候補薬のスクリーニング系を確立するなど、当初予定よりも進展している。

まず初めに、FECD患者の角膜組織のaggresome染色を行い、unfolded proteinと呼ばれる変性タンパク質が患者角膜内皮細胞に過剰に蓄積されていること、角膜内皮に蓄積した変性タンパク質はI型コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスであり、小胞体に局在することを明らかにした。また電子顕微鏡による観察でFECD患者の角膜内皮細胞には小胞体の形態異常が見られることを示した。次に、研究代表者らが樹立した不死化角膜内皮細胞およびFECD患者由来の不死化角膜内皮細胞を用いた検討により、胞体ストレス応答により角膜内皮細胞に細胞死が誘導される機序を検討した。本研究により、FECD患者の角膜内皮では過剰に産生された細胞外マトリックスが変性タンパク質として蓄積し、小胞体ストレスによりCHOPを介してミトコンドリア経路が活性化され、それによって角膜内皮細胞のアポトーシスが誘導されることが明らかとなった。またTGF-β経路の活性化を抑制することによりFECDにおける角膜内皮細胞のアポトーシスが抑制されることを示すとともに、新たなFECD治療候補薬の探索に有用な薬剤スクリーニング系を確立した。本研究成果は、難治性角膜疾患であるFECDに対する点眼薬による薬物治療の可能性を示す社会的意義の高いものであり、論文として公表するとともにプレスリリースを行って研究成果を社会に発信した。本研究はドイツエルランゲン大学のFriedrich Kruse教授および英国カーディフ大学のAndrew J. Quantock教授らとの国際共同研究である。複数の刺激を用いたFECDの疾患モデル細胞によるin vitroの検討、FECDモデルマウスを用いた研究を計画しており、TGF-βシグナルの活性化がFECDの治療ターゲットになりうるかを検討する。公開セミナー:小泉範子:イノベーションジャパン2017,横浜, 2017.9.1,小泉範子:再生医療イノベーションフォーラム(FIRM)第4回ベンチャー創設支援セミナー,神戸, 2017.09.12.小泉範子:第35回東京新島講座,東京, 2017.11.11.新聞:京都新聞, 2017.7.27.京都新聞,朝日新聞など,2017.7.29.
光活性蛋白質単結晶の初期反応:空間分解能を持つ時間分解蛍光およびラマン分光研究

本研究において、空間分解能を持つ蛍光アップコンバージョン計測装置を開発し、結晶状態の蛋白質の蛍光ダイナミクスを観測、溶液中反応との比較を行った。装置作成として3種の異なった光学系を試み、時間分解能<200fs、空間分解能<2μm、励起光強度<5μW、観測波長範囲400-750nmでの測定が可能なシステムを構築した。光応答性蛋白質PYPの野生種およびmutant(R52Q)の単結晶の蛍光ダイナミクスを測定した結果、溶液中反応とほぼ同様の挙動を示すことが分かった。この結果は、PYPの暗条件における初期構造は結晶状態と溶液中で変化がない事を示している。またマイクロラマン散乱測定を行った結果、PYP単結晶のスペクトルは溶液中のものとほぼ同様であり、結晶状態と溶液中での蛋白構造の類似性を示した。また、計測装置の応用としてフラビン蛋白質(FMN結合蛋白質)結晶についても研究を行い、結晶状態では溶液中とは大きく異なった蛍光ダイナミクスを示す事が分かった。同様に微粒子状のマラカイトグリーン分子についても光照射位置による蛍光スペクトルの変化や蛍光ダイナミクスを観測し、3種の異性体の存在を確かめた。PYPおよびそのmutant、analogueの光初期異性化で見られる低波数の発色団の分子内振動についてモードの同定を行い、2種の振動モード(50cm^<-1>、140cm^<-1>)が蛍光とカップルしている事が分かった。これらの振動モードは光異性化をトリガーし、反応を促進する役割を果たすと考えられる。また、野生種PYPおよび7種のmutant、3種のanalogueについて蛍光異方性の時間分解測定、野生種PYPおよび3種のmutantの過渡吸収測定を行った。更に、analogue(Locked Chromophore)についてAbinitio法による軌道計算を行い、野生種PYPとの比較を行った。倒立型顕微鏡システム(IX71-22PH)と蛍光アップコンバージョン測定システムを組み合わせた顕微アップコンバージョンシステムを新たに作成した。装置の分解能は時間分解能約140fs、空間分解能約30μmであった。試実験においてこのシステムのS/N比が本測定には不十分であることが判明し、現在光学系の再構築を行っている。また、光活性蛋白質PYPの単結晶および溶液でのマイクロラマン測定を初めて行った。両資料におけるスペクトルは類似した特徴を示したが、C=C伸縮モード(υ_<13>、1550cm^<-1>)等いくつかのラマンバンドにおいて励起光の偏光方向に対して散乱強度にコントラストが見られる等、単結晶試料に特徴的な挙動が新たに観測された。新規のPYP発色団(TMpCA,TML,TML rot-lock)およびアナログ体(rot-lock PYP)の蛍光ダイナミクスについて検討し、アナログ体(rot-lock PYP)において、蛍光ダイナミクスに波長依存性はみられず、また蛍光減衰はこれまで最も短寿命であった野生種PYPのものよりも更に短寿命となる事が明らかとなった。PYPアナログ体(Locked Chromohpore)における共鳴ラマン測定およびab initio MO(DFT)計算を行い、野生種のものと比較した。またPYP単結晶の偏光依存性についても同様に検証した。更に、バルス幅30fsのレーザーシステムを用いてPYPの蛍光ダイナミクスを再検討したが、これまでの時間分解能110fsでのシステムで観測された2種の振動モード(50cm^<-1>,140cm^<-1>)以外の新たな振動は観測されなかった。

このことはこれらの振動モードがPYPの異性化反応を誘起する事を示す重要な結果であると考えられる。空間分解蛍光アップコンバージョン測定装置について、励起光照射および蛍光集光部に反射型対物レンズを用いることで空間分解能、測定効率を向上させるためのシステム改良を行った結果、時間分解能約400fs、空間分解能約2μmにまで向上した。更にこのシステムによるPYP単結晶のフェムト秒蛍光ダイナミクスの観測に初めて成功した。その結果PYP単結晶の蛍光は寿命1.4ps、10pおよび長寿命成分(>20ps)の3成分指数関数により減衰することがわかった。この結果は溶液での観測値に比べ全体的に遅い減衰を示しており、特に溶液中で見られた寿命450fsの超高速減衰成分は単結晶では観測されておらず、光反応ダイナミクスは初期異性化過程においても異なっている事が初めて明らかとなった。また蛍光ダイナミクスの結晶軸に対する励起光方向依存性について検討した、蛍光ダイナミクスに変化は観測されなかったが、結晶の短軸方向の場合と長軸方向の場合で、短軸/長軸方向の蛍光強度比は6以上と大きく異なっている事がわかった。この強度比は結晶構造解析から、結晶中の発色団の配列を考慮することにより説明できた。PYP単結晶のマイクロラマン測定を行い、1000cm^<-1>-1700cm^<-1>の観測範囲においてピーク位置に溶液中との変化は見られなかったが、一部のピーク強度比に違いが観測された。また励起光偏向方向に対する散乱強度比に大きな差(8倍)がみられたが、蛍光ダイナミクスと同様結晶中の発色団の配列に依存しているものと考えられる。PYPおよびミュータント(E46Q,T50V,E46Q/T50V,R52Q,P68A,E46Q/R52Q)の溶液中における時間分解蛍光異方性ついて検討を行い、いずれも異方性は溶液中の一般的な値(0.4)であり、また時間変化も観測されなかった。この結果からPYPでは縮重励起状態の存在は否定される。空間分解蛍光アップコンバージョン測定装置について、ダイクロイックミラーおよび光学結晶の交換等の改良を加え、時間分解能(200fs以下)及び計測感度を更に向上(励起光強度5μW)させた。この計測装置によりPYP野生種およびミュータント(R52Q)単結晶のfs蛍光ダイナミクスの観測を行い、水溶液中との挙動と比較した。その結果、蛍光ピーク波長では寿命約500fsの超高速減衰を含む多成分指数関数による蛍光減衰を示し、結晶内でも超高速異性化過程が起こる事が示されたが、得られた蛍光ダイナミクスは野生種、R52Qの各水溶液中のものとほぼ同様であり、psfs領域においては水溶液中と結晶中で同様の光初期反応を示すことが分かった。同様に光誘起電子移動反応を示すFMN結合蛋白質(FMN-binding protein)結晶についてもfs蛍光ダイナミクスの観測に成功した。FBP結晶では蛍光減衰は約700fs(60%)の寿命を主成分とする2成分指数関数により減衰し、FBP水溶液での蛍光寿命(170fs)に比べ大幅な長寿命化を示した。