hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゲノムワイド解析による進行肺がんの治癒実現へ向けた基盤研究

本研究の目的は、極めて良好な治療経過をたどったIV期肺がん症例の全貌を検討し、IV期肺がんを臨床的治癒に結びつける要因を明らかにすることで、肺がんのさらなる個別化医療実現へ向けた基盤の確立を目指すことである。本研究では、化学療法が著効し長期間無治療で寛解が維持されているIV期肺がんまたは中皮腫の症例を対象とし、以下の検討をおこなう。(1) IV期肺がん・中皮腫長期寛解維持症例から採取した検体を用いて全エクソーム解析にて遺伝子変化を網羅的に検索する。それらの臨床的特徴(組織型、治療反応性等)との統合解析を行い、IV期肺がん・中皮腫の治癒に関与する分子プロファイル・マーカーを探索的に検討する。(2)分担/連携研究者の所属する共同研究施設における症例についても同様の検討を行う。(3)同定した治癒に関与する遺伝子変異等の分子プロファイル及びマーカーを細胞株モデルにおいて検討し、創薬へ向けての橋渡しとなる前臨床データを取得する。これまでに化学療法が著効し、無治療で無再発が2年間以上維持できている検討候補症例を4例同定した。本研究は現在研究計画の倫理承認待ちである。この間に本研究の基盤研究である肺がん手術症例を対象とした大規模分子疫学研究を完遂し報告した(Kawaguchi, J Clin Oncol, 2016)。本研究に関連して肺がんのドライバー遺伝子異常と受動喫煙に関する国際共同研究を完成し論文化した(Kubo, Clin Lung Cancer, 2017)。本研究対象症例の選択基準は、1)病理学的確定診断のあるIV期肺がんまたは中皮腫、2)年齢20歳以上、3)化学療法が奏効し(完全寛解CRまたは部分寛解PR)、最終治療終了後2年以上無治療で寛解が維持されていること、4) DNA抽出が可能な治療前の腫瘍検体があること、5)末梢静脈血の提供が可能であること、6)研究参加への書面によるインフォームドコンセント、である。適格症例は過去10年間で自験4例が同定され、詳細な臨床情報を得ている。平成28年度は、自験例4例における次世代シーケンスを用いた網羅的遺伝子解析を実施する予定であった。しかし研究計画書の完成に時間を要し未だ倫理承認に至っていない。そのため候補症例からの書面同意、検体採取ができず、28年度研究の主体であった網羅的遺伝子解析は次年度に繰り越しとなった。「IV期肺がんにおいて治癒は見込めない」と考えられている一方で、非常にまれながら臨床的治癒に近いIV期症例が存在する。そのような症例を体系立てて集積し、その臨床的特徴とゲノム解析等で同定される分子生物学的特徴を比較検討した試みは無い。本研究の目的は、化学療法が著効し臨床的治癒に近い経過を示したIV期肺がんまたは中皮腫症例の全貌を検討し、IV期肺がんを臨床的治癒に結びつける要因を明らかにし、肺がんのさらなる個別化医療実現へ向けた基盤の確立を目指すことである。本研究では、以下の検討をおこなう。(2)共同研究施設における症例についても同様の検討を行う。
大学職員の内発性に基づく役割モデルの再構築に向けた日・韓・台比較研究

研究計画1年目では、学会大会等で研究の趣旨と研究計画について報告(口頭発表2回、ポスター発表1回、分科会1回)するとともに、研究実施計画の具体化を行った。当初計画では韓国の実地調査を予定していたが、連携協力学会との調整により、2回にわたり台湾の9大学及び教育部を訪問し、現地教職員へのインタビューと意見交換を行った。調査大学における職員および職員組織の特徴として、1)ジョブを特定して契約、2)一部大学での(定期またはアドホックの)人事異動、3)事務組織のトップは教員、が挙げられた。台湾では「大学法」及び人事・会計関連法の規定により、会計と人事担当部署については専門職(教員含む)であることが必要であり、特に国立大学では考試院(日本の人事院)により任用され、教育部直轄の人事が行われている。さらに1990年代までは教務長及び学生事務長も教員を充てるとされていたことから、国立、私立大学とも、事務部署のトップは教員が兼務することが一般的とのことであった。これ以外の、契約によって採用される一般職員の多くは女性であり、給与も低いとのことであった。また日本の大学に一般的に見られる学内組織としての「事務局」は存在しないことが指摘された。研究計画作成段階ではあまり重視していなかったが、職員が学内に職員のみで構成され人事権も持つ独自組織を有しているという点は、日本の大学ガバナンスを考えるうえで重要なファクターではないかという認識を得ることが出来た。当初計画では訪問調査を1回としていたが、関連学会・研究会との共同により、日本台湾教育センターの支援を得て、2回にわたって現地訪問調査ができた。これにより、台北地区と台中・台南地区の9大学での教職員とのインタビューと意見交換、さらに教育部でのミーティングができたことによって、台湾の大学における職員および職員組織の特徴について詳細な知見を得ることができたため。研究計画2年目においては、韓国の大学を訪問して職員および職員組織について現地教職員と意見交換を行う。既に関連学会・研究会との共同により、慶煕大学校に調査コーディネートを依頼して、ソウル地区の数大学を招聘して国際研究集会(8月)を開催する予定である。台湾・韓国と日本との比較においては、大学ガバナンス全体における事務組織の役割、権限、職員の処遇、ジョブ型採用とメンバーシップ型人事異動の組合せがどの程度一般的か、その場合の職員の「能力」とはどのようなものか、高等教育政策上の職員や事務部門の位置付け等について、さらなる調査、検討を行うこととする。研究分担者である北海道大学・光本滋准教授に台湾での調査出張(2018年12月)への同行を依頼し、分担金を配分していたが、同日程に本務大学の用務出張が入り、本科研課題による出張ができなかったため。翌年度使用額は、2019年度に予定している韓国調査出張にて使用する計画である。
卵・精子成熟誘起ホルモン生成の分子機構

ステロイド20β-水酸基脱水素酵素(20β-HSD)は前駆体17α-ヒドロキシプロゲステロンを17α,20β-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オンに転換する重要な酵素である。本研究ではまず、我々が先にクローニングしたブタの20β-HSD cDNAをプローブにアユ、メダカcDNAライブラリーから20β-HSD cDNAをクローニングした。次に、アユの20β-HSD cDNAをプローブにして、ニジマスの卵胞cDNAライブラリーより2種類の20β-HSD cDNA(A、B)を単離し、全塩基配列を決定した。両者がコードするアミノ酸の配列を比較した結果、AとBは3個のアミノ酸のみが異なることが判明した。また、ゲノミックDNAの解析から、2つの20β-HSD cDNAに対応する相異なる2つ遺伝子が存在することが明らかになった。クローンAを発現させたCOS細胞を17α-ヒドロキシプロゲステロンと培養すると17α,20β-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オンが生成されたが、Bを発現したものではその発現は認められなかった。AのNADPH結合ドメインのアミノ酸配列はブタやアユの20β-HSD cDNAのものと同じであったが、Bでは15番目のIleがThrに変異していた。ノーザンブロットおよびRT-PCRの解析から、20β-HSD mRNAは卵巣や精巣を含む種々の組織に発現していた。次に、成熟直前のニジマス卵胞から分離した莢膜細胞と顆粒膜細胞をサケの生殖腺刺激ホルモン(GTH-II)とともにO-48時間培養した後、これらの細胞標品での20β-HSD mRNAの発現をAとBを用いたノーザンブロットで解析したところ、AとBは莢膜細胞と顆粒膜細胞のいずれにおいても発現がみられたが、生殖腺刺激ホルモンによる発現の促進はAクローンのみで認められた。したがって、Aが生殖腺刺激ホルモンによる17α,20β-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オンの生成促進に重要な役割を果たしているものと結論される。しかし、BについてもAの発現調節に何らかの機能を果たしていることが考えられるので、今後さらに検討を加える必要があろう。魚の卵と精子の成熟は、脳下垂体から分泌される生殖腺刺激ホルモン(GTH)の働きにより卵巣と精巣で生成される卵・精子成熟誘起物質(配偶子成熟誘起物質)の作用で起こる。我々は先にサケ科魚類の配偶子成熟誘起ホルモンをプロゲステロン系ステロイドの一種である17 α,20 β-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン(17 α,20 β-DP)と同定した。本研究は、前駆体17 α-ヒドロキシプロゲステロンを17 α,20 β-DPに転換するステロイド代謝酵素であるステロイド20 β-水酸基脱水素酵素(20 β-HSD)の遺伝子をクローニングし、GTHによる発現調節機構を解析することを目的とする。平成8年度は、サケ科魚類(アユ、ニジマス)とメダカの20 β-HSDcDNAのクローニングを行い、以下の結果を得た。アユ、ニジマス、メダカの卵巣(あるいは濾胞組織)のcDNAライブラリーを我々が先にクローニングしたブタの20 β-HSDcDNAをプローブとしてスクリーニングし、それぞれから数個の20 β-HSDcDNAと考えられるクローンを得た。

三種の魚類から得られたクローンを用いて全塩基配列を決定したところ、いずれもブタの20 β-HSDと高いホモロジーを示した。このうちアユの20 β-HSDcDNAを大腸菌に発現させて得られた蛋白質は、前駆体17 α-ヒドロキシプロゲステロンを17 α,20 β-DPに転換する活性(20 β-HSD活性)を持っていた。さらに、この蛋白質はブタの20 β-HSDと同様にカルボニル・リダクテスの活性をも持っていた。次にアユ20 β-HSDのmRNAの発現をノウザンハイブリダイジェーションで解析した。その結果卵黄形成を完了したアユ卵胞のうちでも、より成熟が進んだ卵胞で20 β-HSDmRNAの発現が強く認められた。一方、卵黄形成を完了した直後の卵胞での発現は極めて弱かった。以上の結果により、我々が今回三種の魚類からクローニングしたcDNAはいずれも20 β-HSDをコードするものと判断した。魚類の卵と精子の成熟は、下垂体から分泌される生殖腺刺激ホルモンの働きにより卵巣と精巣で生成される卵・精子成熟誘起ホルモン(配偶子成熟誘起ホルモン)の作用で起こる。我々は先にサケ科魚類の配偶子成熟誘起ホルモンをプロゲステロン系ステロイドの17α,20β-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン(17α,20β-DP)と同定した。本研究は、前駆体17α-ヒドロキシプロゲステロン(17α-P)を17α,20β-DPに転換するステロイド代謝酵素であるステロイド20β-水酸基脱水素酵素(20β-HSD)の遺伝子をクローニングし、生殖腺刺激ホルモンによる発現調節機構を解析することを目的とする。平成9年度は、ニジマスの20β-HSDのクローニングを行い、以下の結果を得た。前年度に得たアユ20β-HSDcDNAクローンをプローブとして、ニジマスの卵胞cDNAライブラリーより2種類の20β-HSDcDNA(A、B)を単離し、全塩基配列を決定した。両者がコードするアミノ酸の配列を比較した結果、AとBは3個のアミノ酸のみが異なることが判明した。クローンAを発現させたCOS細胞を17α-Pとインキュベーションすると17α,20β-DPの生成がみられたが、Bを発現させたものでは17α,20β-DPの生成はみられなかった。AのNADPH結合ドメインのアミノ酸配列はブタやアユの20β-HSDcDNAのものと同じであったが、Bでは1個のアミノ酸が異なった。次に、成熟直前のニジマス卵胞から分離した莢膜細胞と顆粒膜細胞をサケの生殖腺刺激ホルモンあるいはフォルスコリンとともに0-48時間培養した後、これらの細胞標品での20βHSDmRNAの発現をAとBを用いたノーザンハイブリダイジェーションで解析したが、それらのグループ間における20β-HSDの発現に顕著な差は認められなかった。これらの結果は、生殖腺刺激ホルモンは直接には20β-HSD遺伝子の発現を促進しないことを示唆し、これまで我々が各種の蛋白質・RNA合成阻害剤を用いて得た結果とは異なる。
イタリア製造業センサスにもとづく産業地域データベース構築と地域間比較研究

イタリア製造業センサス・データを利用して、イタリア製造業の地域・業種別、すなわち産業地域(Industrial Districts)別の時系列産業特性の抽出を行い、日・英・伊3カ国語で各編集データを公表した。これまで特定地域(トスカーナ州、エミリア・ロマーニャ州)に偏りがちなイタリア産業地域研究と異なり、家具や眼鏡の産地、自動車設計業など、十分に調査されたことのないイタリア国内の地域間比較、対日比較を行った。本研究は2つの大きな柱から構成される。第1に、イタリア製造業センサス・データを利用して、イタリア製造業の地域・業種別、すなわち産業地域(Industrial Districts)別の時系列産業特性の抽出を行い、日・英・伊3カ国語で各編集データを公表することである。第2に、それにより得られたデータに基づいて日本とイタリアに存在する同類製品産業集積地域の変容と、その地域の中小企業が取り組む経営革新と産業地域との関連についてフィールドウークにより比較考察を行う。この2つの研究を総合的に行うことで、特定地域(トスカーナ州、エミリア・ロマーニャ州)に偏りがちなイタリア産業地域研究とは異なり、相対的で客観的なイタリア国内地域問比較、および日伊比較研究が可能となる。初年度となる本年度では、製造業センサスの全国、20州、103県の全事業所・従業者数に関する産業中分類レベルのデータ編集・加工および公開を進めた。それらは、http://homepage2.nifty.com/censusitaly/で公開しているところである。ところが、産業地域の地理的領域の特定について、ISTAT(イタリア国立統計局)公表の最新データと前回版とで指定地域が大幅に変化しており、その確認作業が十分に行うことができていない。したがって、この部分については、今後の課題として残されている。地域間比較のためのフィールド調査は、トリノにおける自動車デザイン・設計開発支援企業(カロッツェリア)とその関連集団について実施した。企業7杜、ISTATトリノ情報センター、イタリア自動車工業会においてインタビューを実施した。第2に、それにより得られだデータに基づいて日本とイタリアに存在する同類製品産業集積地域の変容と、その地域の中小企業が取り組む経営革新と産業地域との関連についてフィールドワークにより比較考察を行う。この2つの研究を総合的に行うことで、特定地域(トスカーナ州、エミリア・ロマーニャ州)に偏りがちなイタリア産業地域研究とは異なり、相対的で客観的なイタリア国内地域間比較、および日伊比較研究ぶ可能となる。2年目となる本年度では、製造業センサス産業中分類から、県レベルの2001年従業者数の多い順番にランキングを作成し、業種別雇用集中度を公開するなど、データ編集・加工作業をさらに進展させている。フィールド調査では、フリウリ・ヴェネツィア・ジュージア州ポルデノーネ県一帯に広がる家具産地の調査を実施した。ここから、ロンバルディア州ブリアンツァ地域とマルケ州ウルビーノ地域との3大家具産地の地域的特徴と市場性が浮き彫りにできた。第1に、イタリア製造業センサス・データを利用して、イタリア製造業の地域・業種別、すなわち産業地域(Industrial Districts)別の時系列産業特性の抽出を行い、日・英・伊3力国語で各編集データを公表することである。第2に、それにより得られたデータに基づいて日本とイタリアに存在する同類製品産業集積地域の変容と、その地域の中小企業が取り組む経営革新と産業地域との関連についてフィールドワークにより比較考察を行う。この2つの研究を総合的に行うことで、特定地域(トスカーナ州、エミリア・ロマーニャ州)に偏りがちなイタリア産業地域研究とは異なり、相対的で客観的なイタリア国内地域間比較、および日伊比較研究が可能となる。具体的には、製造業センサス産業中分類から、県レベルの2001年従業者数の多い順番にランキングを作成し、業種別雇用集中度を公開するなど、データ編集・加工作業を継続して行った。フィールド調査では、昨年度に実施したポルデノーネ県一帯に広がる家具産地の調査との比較考察を念頭に、ロンバルディア州ブリアンツァ地域の調査を実施した。そこでは産業地域における製品・顧客ターゲットの差別化と、それに関連した生産組織の形成、後継者育成への取り組みなど、さまざまな面で異なることが明らかどなった。
次世代高品質画像通信システムの研究

今年度は(1)画像の計量評価尺度の研究、(2)色空間の研究、(3)メディア構造化の研究、(4)画像符号化、(5)マルチメディア処理、(6)超高精細画像の6点を中心に研究を行った。(1)計量評価尺度の研究については、前年度までに研究したPicture Quality Scaleをカラー画像に適用する方法について研究した。符号化方式を対象として、RGB及びYIQ空間の符号化/復号画像と原画像の差分をHVC空間に変換して、適当な数値演算を用いてHVC空間の差分から客観的画像品質(PQS)を求める方式を求めた。実験の結果、本手法の評価結果と主観評価値は極めて近い値をとり、本方式が符号化方式の評価法として有効なことが明かになった。なお、本手法は日米の研究者が共同研究を行なったものであり、連名での論文発表も行なっている。(2)色空間は、高品質画像符号化の基礎ともなるものであり、極めて重要な要素である。また人間の視覚より、各空間における色は原色の和で表現できることも知られている。これを等色とよぶが、今年度はハードコピー、表示デバイス等の種々の表示メディアを対象として、これらでの等色の個人差について検討を行なった。求めたデータは、画像符号化の基礎数値として使用される。(3)メディア構造化は、画像を内部の構造を意識しつつディジタル化する手法であり、単に冗調度圧縮だけでなく、画像の検索/編集に極めて有効とされている。メディア構造化を行なうためには、映像の領域分割、すなわち映像から必要な部分を自動的に取り出す方法の開発が必要となる。本年度は、研究者の一人が昨年度から研究を開始しているSampled Active Contour Modelを用いる方法の研究を更に進めた。これは、対象画像の周囲に輪郭を描くと、輪郭の各点が引力、張力に従って収縮して対象物体を抽出する方法であり、従来提案されているSNAKESに比べて、収縮時間が1/10以下になる、雑音除去の効果がある、等の長所がある。本手法の実験を行い有効性を確かめるとともに、動き物体の抽出を効率よく行なうため、速度推定法の併用も試みた。またこの過程で、従来提案されていた動き推定法の改善を行なうとともに、それらの位置付けを明確にすることができた。(4)画像符号化についてはスケーラブル符号と2値画像符号化について研究を行なった。スケーラブル符号化は階層構造を持った符号化であり、1つの画像情報から複数の解像度の画像が取り出せることを特徴としており、画像符号化の国際標準(MPEG)を検討するにあたっても重要な要素となっている。本年度は空間的にはサブサンプルとリニアフィルタリングを繰り返すことにより、異なる解像度を得る符号化方式を提案した。また、時間方向の解像度に階層構成をもたすために、MPEGの考え方に従い、フレーム内符号化画像、前方予測差分符号化画像、前後方向予測差分符号化画像を併用する方式を検討した。2値画像符号化については、エントロピー非保存の近似形高圧縮符号化方式の提案を行い、検討を進めた。(5)マルチメディア処理については、キャンパス内でマルチメディアを用いて共同作業を行なう方式についての研究が日米双方の協力により進められた。これは、ビデオコンファレンス、文書作成等のマルチメディアアプリケーションを統合したシステムの構築を目指したものであり、自らの研究のツールを作りながら研究を進めている。また、マルチメディアの同期を複数バッファを用いて行なう方式を提案して、その実験も行なった。これは、分散してネットワークを介して接続されるマルチメディアの同期に適していることが明かになった。(6)超高精細画像については、現在進めている2000x2000の画像処理システムのネットワークとの統合についての研究を更に進めた。本方式は医療情報用として極めて有望と考えられている。以上の研究は日米双方の研究者が国際会議等で会い討論を行い、また電子メールで情報交換を行いながら進めてきたが、1994年1月26日に全体会合を行い、進捗状況の報告会を行った。(3)メディア構造化は、画像を内部の構造を意識しつつディジタル化する手法であり、単に冗調度圧縮だけでなく、画像の検索/

編集に極めて有効とされている。メディア構造化を行なうためには、映像の領域分割、すなわち映像から必要な部分を自動的に取り出す方法の開発が必要となる。本年度は、研究者の一人が昨年度から研究を開始しているSampled Active Contour Modelを用いる方法の研究を更に進めた。これは、対象画像の周囲に輪郭を描くと、輪郭の各点が引力、張力に従って収縮して対象物体を抽出する方法であり、従来提案されているSNAKESに比べて、収縮時間が1/10以下になる、雑音除去の効果がある、等の長所がある。本手法の実験を行い有効性を確かめるとともに、動き物体の抽出を効率よく行なうため、速度推定法の併用も試みた。またこの過程で、従来提案されていた動き推定法の改善を行なうとともに、それらの位置付けを明確にすることができた。(4)画像符号化についてはスケーラブル符号と2値画像符号化について研究を行なった。スケーラブル符号化は階層構造を持った符号化であり、1つの画像情報から複数の解像度の画像が取り出せることを特徴としており、画像符号化の国際標準(MPEG)を検討するにあたっても重要な要素となっている。本年度は空間的にはサブサンプルとリニアフィルタリングを繰り返すことにより、異なる解像度を得る符号化方式を提案した。また、時間方向の解像度に階層構成をもたすために、MPEGの考え方に従い、フレーム内符号化画像、前方予測差分符号化画像、前後方向予測差分符号化画像を併用する方式を検討した。2値画像符号化については、エントロピー非保存の近似形高圧縮符号化方式の提案を行い、検討を進めた。(5)マルチメディア処理については、キャンパス内でマルチメディアを用いて共同作業を行なう方式についての研究が日米双方の協力により進められた。これは、ビデオコンファレンス、文書作成等のマルチメディアアプリケーションを統合したシステムの構築を目指したものであり、自らの研究のツールを作りながら研究を進めている。また、マルチメディアの同期を複数バッファを用いて行なう方式を提案して、その実験も行なった。これは、分散してネットワークを介して接続されるマルチメディアの同期に適していることが明かになった。(6)超高精細画像については、現在進めている2000x2000の画像処理システムのネットワークとの統合についての研究を更に進めた。本方式は医療情報用として極めて有望と考えられている。以上の研究は日米双方の研究者が国際会議等で会い討論を行い、また電子メールで情報交換を行いながら進めてきたが、1994年1月26日に全体会合を行い、進捗状況の報告会を行った。本年度は(1)画像符号化の基礎となる色空間の選択、(2)画品質の客観的評価法、(3)マルチメディアネットワーク、について検討を行った。(1)については、今後は画像入出力器の特性に依存しないデバイスインディペンデント符号化が重要であるとの認識のもとに、従来表示系で用いられていたRGB,YIQ,印刷系で用いられていたYMCK,均等色空間であるHVC,LAB等を選択してこれらの特徴を比較検討した。
植物の環境適応分化型の固体統御機構を支えるホルモン・光情報伝達システムの解析

サイトカイニン(CK)は、細胞分裂、分化、シュートの形成など、植物の成長・分化の様々な場面に関わる重要な植物ホルモンである。CK情報伝達における初発の応答は、AHK(CK受容体)→AHP→Type-B ARR(転写因子)からなるリン酸リレー系により制御されている。シロイヌナズナにはType-B ARRが11種存在することが知られているが、これらの機能重複や機能分担に関しては不明な点が多い。我々は、T-DNA挿入変異によるType-B ARRの多重欠損変異体を作製し、CK情報伝達におけるType-B ARRの機能に関する遺伝学的な解析を行った。その結果、arr1-4 arr10-5 arr12-1三重欠損変異体は根の伸長阻害、カルスからのシュート分化、CK応答性遺伝子発現等においてCK非感受性を示した。また、種子の肥大、主根形成不全と不定根の形成、根の維管束分化の異常、茎頂・根端分裂組織領域の減少が観察された。これらの表現型はCK受容体(AHK)三重欠損変異体(ahk2/3/4)に極めて類似していた。以上の結果より、7種類のType-B ARRの中で、ARR1、ARR10、ARR12がCK初期情報伝達経路において必須の役割を担っていることが示唆された。今後、これらの制御分子を利用してサイトカイニン情報伝達が活性化されている領域を変化・調節することにより分化を規定するための細胞間情報伝達におけるサイトカイニンの役割について知見を得たいと考えている。
新規アプローチによる骨再生誘導法開発

歯牙を失った後の欠損部の修復に、インプラント治療は予知性のある治療法である。欠損部には骨が不足することが多く、侵襲の少ない骨再生誘導法の開発が求められている。本研究では、細胞外に存在するタンパク質G11(von Willebrand factor C domain containing 2, Vwc2)により、骨欠損部に骨を回復する可能性を検証した。結果として、骨様組織の添加量の差は不明であったが、添加の仕方に違いを認めた。G11により異所性に骨を添加できる可能性があるため、タンパク量や投与方法によっては効果的な骨再生誘導の可能性が示唆された。審美回復と機能回復が求められる現在の補綴臨床において、インプラントによる欠損部修復は最も予知性の高い治療法の一つである。しかし、欠損部の顎堤の形態はインプラント埋入に対して理想的な形態をしていることは稀であり、埋入手術前あるいは同時に骨移植を必要とする場合が多い。患者に対する侵襲が少なく、特別な技術を必要としない骨再生誘導法の開発は多くの臨床家の望むところであり、高齢化社会においてインプラント治療を希望する患者にとって期待度も非常に大きい。新規細胞外蛋白質であるG11は、顎骨の骨芽細胞から発現され、骨芽細胞の機能を抑制する分子である可能性がる。"G11に対する抗体は、骨芽細胞の活性化を促進させ、また局所的な骨再生誘導に応用できる"という仮説に基づき次の研究目標を挙げた。1.マウスG11のモノクローナル抗体を作製する。2. In vitroにおいて、G11抗体に対する骨芽細胞の表現型を解析する。2-(1)骨芽細胞の石灰化が促進されるかを検証する。2-(2)骨芽細胞の増殖・分化においてどのような変化があるかを明らかにする。3. In Vivoでの骨再生誘導に対し、G11の抗体が効果的かを検証する。H21年度の実施計画として、マウスG11抗体の作製と骨芽細胞を石灰化させる細胞培養系の確立を挙げていた。G11抗体は海外の研究協力者から購入した。また、現在骨芽細胞を石灰化させる系を確立中であり、確立次第G11抗体の骨芽細胞石灰化に対する影響を観察していく予定である。新規細胞外蛋白質であるG11は、顎骨の骨芽細胞から発現され、骨芽細胞の機能を抑制する分子である可能性がある。2.In vitroにおいて、G11抗体に対する骨芽細胞の表現型を解析する。3.In Vivoでの骨再生誘導に対し、G11の抗体が効果的かを検証する。H22年度の実施計画として、In vitroにおけるG11抗体に対する骨芽細胞の表現型の解析と、マウスの頭蓋骨に円形の骨欠損を作製する実験系の確立を挙げていた。G11抗体により、骨芽細胞の石灰化促進が示唆された。また、現在マウス頭蓋骨に骨欠損を作製する実験系を確立中であり、確立次第G11抗体により、In Vivoで骨再生誘導の効果があるかを検証する予定である。現在の補綴臨床において、インプラントによる欠損部修復は予知性の高い治療法の一つである。侵襲が少なく、特別な技術を必要としない骨再生誘導法の開発は、高齢化社会においてインプラント治療を希望する患者にとって期待が大きい。新規細胞外蛋白質であるG11(von Willebrand factor C domain containing 2,Vwc2)は、顎骨の骨芽細胞で発現され、骨芽細胞の機能を抑制する分子である可能性がある。"G11に対する抗体は、骨芽細胞の活性化を促進させ、また局所的な骨再生誘導に応用できる"という仮説を立てた。H23年度の実施計画として、マウスの頭蓋骨に円形の骨欠損を作製する実験系を確立することと、その欠損回復がG11抗体により促進され、in vivoでの骨再生誘導の効果をレントゲン的観察と組織学的観測で検証することを挙げていた。

今回、実験の都合上対象をラットに変更し、骨再生誘導の効果はマイクロCTにより観察することにした。また仮説に至る当初の予想に反し、G11タンパク質自体を投与することにより、in vitroでの骨芽細胞の石灰化促進と、ex vivoでの頭蓋骨培養で骨様組織の増加が認められたため、G11抗体ではなく、G11タンパク自体による骨再生誘導の効果を検証する実験へと変更した。頭蓋骨骨欠損にG11タンパクを染み込ませたコラーゲンスポンジを填入し、5週後のマイクロCT像を観察した。コントロール郡では周囲骨からの骨様組織の添加が認められた。それに対し、G11群では骨欠損の中央付近からも骨様組織の添加が認められた。しかし、両群を比較した骨様組織の添加量の差は不明であった。G11の骨中における分子生物学的役割は明確にはされていないが、G11タンパクにより異所性の骨様組織を添加できる可能性があり、タンパク量や投与方法によっては、効果的な骨再生誘導の可能性が示唆された。
東シナ東縁部古第三紀堆積盆の構造発達

本研究では東シナ東縁部における古第三紀堆積盆の分布と性格を広範囲な陸上調査と海洋域での文献調査から明らかにした.これらは堆積層序の発達様式と地質構造の特徴を異にする,次の3つの主要な堆積区に区分できる.日本海西部堆積区:本州西端部から北部九州に分布.下位の中期始新世から前期漸新世の火山砕屑物に富む夾炭第三系と,上位の後期漸新世初期中新世の浅海性海成層からなる.地質構造上,筑豊型の半地溝構造で特徴づけられ,日本海盆形成の初期のオ-ラコジンの可能性がある.陸棚堆積区:陸上では西九州と石垣島,海底下では魚釣り島隆起帯の西側に広く分布し,中期始新世漸新世におよぶ非海成・海成の堆積層序をもつ.局所的な半地溝,褶曲構造を伴う横づれテクトニクス下で形成された非海成・浅海成前弧海盆にあたる.前弧-海溝堆積区:四万十帯の中期始新世から初期中新世におよぶ前弧域での深海堆積物から構成される.陸棚堆積区でのシークェンス層序境界の解析から,後期始新世から後期漸新世までに3つのラヴィンメント面とタイプ1,タイプ2の層序境界が識別できた.このうち,始新世と漸新世の境界のラヴィンメント面と,漸新世中頃(約30Ma)のタイプ1境界は広域的に顕著な相対的海水準移動を示し,Haq et al., (1988)のユ-スタティック・カーブと調和する.30Ma頃の海水面低下は,東シナ海の古第三系や四万十帯(日南層群)中でも顕著で,深海チャンネルの発達やオーソクォ-ツァイト礫の産出とも軌を一にするイベントにあたる.しかし,日本海西部堆積盆では逆に海浸に伴うラヴィンメント面が形成されている.古流系資料からは,日本海西部堆積区は北東側に,陸棚堆積区では南西に開いた海盆で,海退時の河川相,デルタ相およびチャンネル相は大陸からの供給方向を示す.前弧-海溝堆積区の深海扇状地堆積物では,チャンネル,およびチャンネル-ロープ相で北西部からの側方流と,ローブ相で北東方向への顕著な軸流を示す.サブダクション・コンプレックスの成長は,背後での大陸からの大河川-デルタを有するdelta-fed fansystemの発達に関連している.始新世当時の前弧地域は海溝軸に対し高角度の拡大軸をもつフィリピン海プレートが消費し,南部で海溝浸食を伴う斜め沈み込み型,北部で直交型沈み込み型の縁辺が推定された.本研究では東シナ東縁部における古第三紀堆積盆の分布と性格を広範囲な陸上調査と海洋域での文献調査から明らかにした.これらは堆積層序の発達様式と地質構造の特徴を異にする,次の3つの主要な堆積区に区分できる.日本海西部堆積区:本州西端部から北部九州に分布.下位の中期始新世から前期漸新世の火山砕屑物に富む夾炭第三系と,上位の後期漸新世初期中新世の浅海性海成層からなる.地質構造上,筑豊型の半地溝構造で特徴づけられ,日本海盆形成の初期のオ-ラコジンの可能性がある.陸棚堆積区:陸上では西九州と石垣島,海底下では魚釣り島隆起帯の西側に広く分布し,中期始新世漸新世におよぶ非海成・海成の堆積層序をもつ.局所的な半地溝,褶曲構造を伴う横づれテクトニクス下で形成された非海成・浅海成前弧海盆にあたる.前弧-海溝堆積区:四万十帯の中期始新世から初期中新世におよぶ前弧域での深海堆積物から構成される.陸棚堆積区でのシークェンス層序境界の解析から,後期始新世から後期漸新世までに3つのラヴィンメント面とタイプ1,タイプ2の層序境界が識別できた.このうち,始新世と漸新世の境界のラヴィンメント面と,漸新世中頃(約30Ma)のタイプ1境界は広域的に顕著な相対的海水準移動を示し,Haq et al., (1988)のユ-スタティック・カーブと調和する.30Ma頃の海水面低下は,東シナ海の古第三系や四万十帯(日南層群)中でも顕著で,深海チャンネルの発達やオーソクォ-ツァイト礫の産出とも軌を一にするイベントにあたる.しかし,日本海西部堆積盆では逆に海浸に伴うラヴィンメント面が形成されている.古流系資料からは,日本海西部堆積区は北東側に,陸棚堆積区では南西に開いた海盆で,海退時の河川相,デルタ相およびチャンネル相は大陸からの供給方向を示す.前弧-海溝堆積区の深海扇状地堆積物では,チャンネル,およびチャンネル-ロープ相で北西部からの側方流と,ローブ相で北東方向への顕著な軸流を示す.サブダクション・コンプレックスの成長は,背後での大陸からの大河川-デルタを有するdelta-fed fansystemの発達に関連している.始新世当時の前弧地域は海溝軸に対し高角度の拡大軸をもつフィリピン海プレートが消費し,南部で海溝浸食を伴う斜め沈み込み型,北部で直交型沈み込み型の縁辺が推定された.平成6年度の本科研の成果として以下の事項を明らかにした.1.東シナ海ならびに隣接地域の内外の文献調査を行い、東アジア大陸東緑域の古第三紀堆積盆の分布・地質構造・堆積層序のコンパイルを行った.

2.浅海性前弧海盆堆積物に相当する西九州(長崎県西彼杵大島・松島地域)の非海成ならびに浅海成古第三系の堆積相・古流系の解析を通してシークェンス層序学の適応を吟味し,シークェンス境界の設定とその堆積地質学的意義について考察した.その結果,(1)始新世後期にタイプIのシークェンス境界とラビンメント面,漸新世前期にタイプIIのシークェンス境界,2つのラビンメント面,漸新世後期にタイプIのシークェンス境界が認定できた.また,(2)堆積相ならびに古流系の地域変化からは始新統はテクトニクス規制,漸新統はユ-スタティックな海水準変動規制が堆積層序の形成に関与したと推定できた.3.種子島北部の多くの泥質岩中から浮遊性有孔虫化石を見いだし,(1)熊毛層群の時代が中期始新世後期から少なくとも後期始新世に及ぶこと,さらに(2)九州の四万十帯の日向層群・日南層群がそれぞれ熊毛層群の北,南半部に対応する可能性を指摘できた.4.沖縄嘉陽層,九州日向層群の始新世四万十帯のタ-ビダイト・シークェンスについての堆積相ならびに古流系資料を収集した.これより、(1)種子島・屋久島の熊毛層群との比較から、前弧海盆の堆積システム,特に軸流・側方流運搬と堆積相との関係が見いだされ、側方流はチャンネル相に,軸流はローブ相に形成されていることが明らかとなり,(2)顕著な軸流に示される広域的な前弧海盆の軸勾配は,始新世当時,中央海盆軸で活発な拡大を伴うフィリピン海プレートの成長・沈込み過程と密接な関連性が予測できる.5.石垣島の調査から,当地域の始新統は,下部で変成岩起源の砕屑物ならびに石灰質堆積物,上部で安山岩質枕状溶岩や火山性水中火砕流堆積物が卓越する浅海性堆積物ならなる始新世の背弧海盆堆積物であることを明らかにした.八重山群島石垣島の宮良層群について以下の事実が明らかになった.下位の宮良川層の砕屑岩相は基盤の古期変成岩に由来する砕屑物からなる水中扇状地の堆積物に比較できる.斜層理から求められた古流向は北向きである.野底層は安山岩質溶岩と火山砕屑岩層から構成される.安山岩質溶岩は上下に枕状構造をもつ水中溶岩で,土石流の産状を示す水中火砕岩と火山砕屑性の土石流ータービダイトを頻繁に伴う.生痕化石や堆積相の特徴からは,かなり浅所での火山活動が想定できる.これは東シナ海海底下から報告されている始新世火山岩の一部に当たる.屋久島一湊累層の構造・堆積相解析の結果,一奏礫岩層は付加帯を覆って発達した前弧海盆中の深海渓谷に比較できた.深海渓谷は,深さが250m以上,幅1km以上の規模が見積もられ,四万十帯では最大の規模の深海渓谷であることが分かった.これには,河道充填,自然堤防,溢れだしの堆積物が識別できた.西彼杵地域の研究ではシークェンス層序境界の解析を行い,後期漸新世から後期始新世までに3つのラヴィンメント面とタイプ1,タイプ2の層序境界を識別した.このうち,始新世と漸新世の境界のラヴィンメント面と,漸新世中頃(約30Ma)のタイプ1境界は広域的に顕著な相対的海水準変動を示し、Haq et al.(1988)のユ-スタティック・カーブと調和することが明らかになった.研究の過程で,西九州と北九州-山口西部の古第三系との間に重要な堆積層序の違いが気づかれたため、芦屋層群の調査を福岡県津屋崎町と山口県下関市周辺で行い,下関市彦島周辺において堆積相と古流系の記載を行い,砂岩に卓越する浅海相の形成機構を考察した.昨年度を含めた研究を統括し,東シナ縁辺の古第三紀堆積盆を、積堆・造構作用の相違から,3つの主要な堆積区,日本海西部堆積区,陸棚堆積区,前弧-海溝堆積区に区分した.半地溝構造で特徴づけられる日本海西部堆積区は日本海形成に先行するオ-ラコジンに比較できる.また,前弧-海溝堆積区のサブダクション・コンプレックスの成長は,背後の陸棚堆積区での大陸からの大河川-デルタ有するdelta-fed fansystemの発達と密接な関連性が指摘できる。
シアリダーゼの発現が卵巣癌の腹膜播種形成に及ぼす影響とその作用機序の解明

ヒトのシアリダーゼNEU3蛋白に対するモノクローナル抗体を用いて、卵巣明細胞腺癌80症例(当院初回手術標本)の免疫組織化学染色を施行した。シアリダーゼ3(NEU3蛋白)の発現量と臨床病態との相関を明らかにする目的で解析を行った結果、シアリダーゼ3の発現量と卵巣明細胞腺癌のFIGO進行期分類や生存予後との間には相関を認めなかったものの、癌性腹膜播種の有無との間で有意な相関を認めた。免疫組織化学染色で得られた結果がin vitroにおいても再現できるかどうかを確かめるため、まず、NEU3 cDNAを導入した発現ベクター(タグとしてc-末側にGFPも導入)を作製した。つぎにRT-PCRの結果(前回報告済み)に基づいてNEU3発現がきわめて低い2種類の卵巣癌細胞株へ遺伝子導入し、おのおののNEU3高発現株を作製した。遺伝子導入株のcloning手法としては、GFPの蛍光強度を指標にflow cytometerを用いて遺伝子導入株の選別を行った。mock株(GFPのみを組み込んだベクターを遺伝子導入したもの)においても同様の手法を施行し細胞集団の選別を行った。今後は由来の異なる卵巣癌細胞株2株において作製したNEU3高発現株とmock株を用いて、われわれの実験室にてすでに開発済みのin vitro癌性腹膜播種モデルやin vivo癌性腹膜播種モデルでの比較検討を行うことと、各遺伝子導入株のシアリダーゼ活性を検討する予定である。卵巣癌由来細胞株(当研究室が所有する17種類の細胞株)におけるヒトのシアリダーゼ(NEU1,2,3,4)発現の有無をRT-PCR法にて解析した。その結果、NEU1はすべての細胞株で発現を認めたため細胞株の由来する組織型に依存した発現様式を示さなかったが、NEU3では卵巣明細胞腺癌株に特徴的な発現を認めた。NEU2、NEU4に関してはいずれの細胞株にてもその発現はみられなかった。そこでNEU3蛋白に対するモノクローナル抗体を用いて、シアリダーゼ3(NEU3蛋白)の発現量と臨床病態との相関を明らかにする目的で免疫組織化学染色を卵巣明細胞腺癌80症例に実施した。その結果、シアリダーゼ3の高発現と卵巣明細胞腺癌の進行期との間には相関を認めなかったものの、癌性腹膜播種の有無との間で有意な相関を認めた。免疫組織化学染色で得られた結果がin vitroにおいても再現できるかどうかを確かめるため、まず、NEU3 cDNAを導入した発現ベクターを作製した。つぎにRT-PCRの結果に基づいてNEU3発現がきわめて低い2種類の細胞株へ遺伝子導入しおのおののNEU3高発現株を作製した。今後は由来の異なる卵巣癌細胞株2株において作製したNEU3高発現株とmock株(空ベクターのみを遺伝子導入したもの)を用いて、われわれの実験室にてすでに開発済みのin vitro癌性腹膜播種モデルやin vivo癌性腹膜播種モデルでの比較検討を行う予定である。
感染防御を司る魚類の造血機能

ヒラメ造血前駆細胞株を利用した魚類造血機能の解析を目指した。同一系統ヒラメおよびヒラメ孵化仔魚への本細胞株の移植を行い、移植細胞が造血組織である腎臓に生着することを確認した。造血細胞の分化評価をするために、細胞表面マーカーを識別するモノクローナル抗体を作製した。複数のマーカーを組み合わせて評価することで、未分化細胞と分化細胞の識別が行えるようになった。移植細胞の分化動態を追跡するために、蛍光発現細胞株の樹立を試みた。良好な蛍光発現を示す発現ベクターと遺伝子導入法は決定できたが、樹立には至らなかった。病原体を投与した個体の造血組織では、感作後2日3日で細胞分裂のタイミングがあることが分かった。本研究はヒラメ造血前駆細胞(YS-1 HPC)を同一雌性発生ヒラメ家系(YS-1)の生体に移植し、病原体感作後の移植細胞の分化増殖を解析することで、ヒラメの造血機能の特性について知ることを目的としている。移植細胞の追跡を可能にするために、昨年度、EGFP発現コンストラクトを構築したが、いずれも明瞭な蛍光発現を示さなかった。そこで、ハウスキーピング遺伝子であるEF-1αのプロモーター領域をクローニングし、新たに本プロモーターの制御によるEGFP発現コンストラクトを構築した。本コンストラクトのトランスフェクションにより、良好な蛍光発現は観察されたものの、移植に用いる細胞数を得ることはできなかった。本年度、YS-1家系ヒラメは、多数の孵化仔魚の奇形発生および一部の親魚の死亡により、生産できなかった。昨年度の作出個体はサイズが大きく、移植細胞は体内で拡散してしまうことが予想されたため、造血器である腎臓を体外に取出した器官培養を試み、培養組織への移植を行った。器官培養を行った腎臓は、2週間後も十分な生存率を示し、また、蛍光試薬で標識したYS-1 HPCは、移植後、生残していることが確認できた。これにより、個体を用いない器官培養による細胞分化解析も可能であると判断した。また、細胞の分化成熟度合を評価するモノクローナル抗体の作製を行い、7種のモノクローナル抗体を複合的に用いることで、リンパ球や食細胞といった細胞集団への分化評価を可能にした。感染時に必要とされる免疫細胞を供給する造血機能の特性について明らかにする。造血機能の解析は、培養維持されたヒラメ造血前駆細胞(YS-1 HPC)を同一雌性発生ヒラメ家系(YS-1)の生体に移植し、病原体の感作による細胞分化および増殖を調べることにより行う。1YS-1 HPCの移植後の生着性について調べたところ、移植2ヶ月後のYS-1腎臓(造血器)中に移植細胞の存在が確認された。本結果より、移植細胞は腎臓中に生着し得ることが分かり、長期観察のための移植試験条件を決定できた。2細胞分化を評価するために遺伝子マーカー(T細胞マーカー、B細胞マーカー、その他白血球発現遺伝子)を整備した。これらマーカーのYS-1 HPCにおける発現状態を調べ、分化解析の基礎データを得た。3移植細胞の長期観察を可能にする恒常的な蛍光発現細胞を樹立するためのEGFP発現コンストラクトを構築した。YS-1 HPCで強発現するCCL4、TLR2およびPU1遺伝子の5 ́flanking領域(25kb)および3 ́UTR(280550bp)をクローニングし、EGFP遺伝子と連結(5 ́flanking-EGFP-3 ́UTR)させた。これにより、蛍光発現細胞を樹立するための、YS-1 HPCへの本コンストラクト導入試験の準備を整えた。4細胞分化および増殖を誘導するための病原体感作条件について、ホルマリン不活化Edwardsiella tardaを用いて試験した。不活化菌をヒラメ腹腔内に接種後、チミジンアナログであるBrdUを腹腔内に注入し、増殖細胞をBrdUで標識した。BrdU陽性細胞は腎臓中で確認されたことから、病原体感作による造血細胞の増殖誘導条件が決定された。5雌性発生ヒラメ家系(YS-1)を約200尾生産し、本研究に供試した。多型解析の結果、試験魚のMHCクラス1はホモ型であることを確認した。昨年度、標準親魚の死亡および代替親魚で作出した仔魚における高頻度の奇形発生率への対策として、生体を用いない解析法(YS-1ヒラメの腎臓を用いた器官培養法)を検討した。移植細胞は、2週間後も生存していたが、多数の細胞の注入が困難であり、細胞分化の解析には不向きであることを確認した。

生体への移植が必須となったことから、異系統間の移植を可能にするために、免疫系発達前の孵化仔魚に対する顕微移植法を確立した。各ヒラメ発達ステージを用いた試験から、発達ステージGHの変態後期に、造血組織である腎臓内へ、細胞の顕微注入が安定して行えることを確認した。本手法により移植された細胞は、移植1週間後も腎臓内に認められ、拒絶反応が生じていないことを示した。このことから、本手法は今後のヒラメ造血細胞分化の解析に有用であることを確認した。移植細胞の追跡のための蛍光発現ベクターとして、新たにCAGプロモーターを用いたEGFP発現ベクターを導入した。本ベクターは、昨年度構築したヒラメEF-1αプロモーターに比べ発現量が格段に高く、多数のYS-1 HPCを蛍光発現させられることが期待できる。依然として、蛍光発現YS-1 HPCの増殖が困難となっているが、本ベクターを用いたトランスフェクション条件を引き続き検討することで、生体内での細胞分化解析が可能になるであろう。魚類免疫学移植細胞の生体内での挙動を解析するための試験条件(1移植試験、2遺伝子マーカー、4病原体感作)を決定することができた。3恒常的に蛍光発現する細胞の樹立については、引き続き試験を進めることになるが、発現コンストラクトを既に構築していることから、おおむね順調に進展していると判断した。移植試験を可能にする雌性発生家系ヒラメYS-1の生産も順調であり、予定通り試験が進められている。解析のための試験条件が整ったことで、次年度以降、計画通り研究を実施することができる。個体を用いた移植試験に加え、器官培養を用いた移植試験も並行して進め、病原体感作後の移植細胞の分化・増殖動態を解析する。細胞分化の評価に、遺伝子だけでなく抗体の利用も可能となり、より精度の高い解析を行う。移植細胞の蛍光標識は、EGFP発現コンストラクトに代わり、一過性の蛍光標識試薬を利用する。合わせて、EGFP発現コンストラクトのトランスフェクションによる恒常的な蛍光発現細胞の樹立も引き続き試みる。当初予定した研究実施計画の通り、培養維持されている造血前駆細胞(YS-1 HPC)をYS-1個体に移植し、病原体感作後の移植細胞の増殖・分化動態を解析する。移植細胞は恒常的な蛍光発現を有したものを使用する予定であったが、現段階で蛍光発現細胞の樹立を終えていないことから、移植細胞の蛍光標識は、長期間の細胞トレースを可能にする蛍光試薬を用い、恒常的蛍光発現の代替とする。今年度の試験結果から、病原体感作による細胞増殖は510日程度で確認できることが分かったため、市販の蛍光標識試薬の使用も可能であると判断した。より長期の観察を可能にするために、恒常的な蛍光発現細胞の樹立は次年度も引き続き実施することにした。当初予定した研究実施計画に沿って、研究費を使用していく。次年度は、細胞増殖および細胞分化評価のための細胞分取および遺伝子解析に関する経費が主な研究費となる。今年度計画した恒常的な蛍光発現細胞の樹立は、発現コンストラクトの構築まで終えることができたが、当初予定していた遺伝子導入試験は実施しなかった。そのため、次年度使用予定研究費(次年度使用額313,241円)が発生した。恒常的な蛍光発現細胞の樹立は引き続き実施する予定であり、次年度実施する遺伝子導入試験に当該研究費を充当する。
活性型グリオーマワクチンの開発(免疫賦活型ワクチン誘導法の検討)

IL-10-siRNAとdouble-stranded RNAを、樹状細胞とグリオーマ細胞との融合細胞に導入した場合、MHC, CD80およびCD86を高発現するIL-10低分泌・IL-12高分泌型融合細胞が得られた。この融合細胞でCD4+T細胞を刺激したところ、コントロールに比べて著明な抗腫瘍免疫反応の誘導が確認された。従って、本研究で開発した方法により、免疫賦活型ワクチンが確実に誘導できると考えられた。樹状細胞からのIL-10分泌やIL-10の細胞内シグナル伝達を抑制し、癌免疫療法に適した免疫賦活型樹状細胞を誘導することを目的として研究を進め、19年度までに以下の研究成果を得た。まず、IL-10-siRNAやSTAT3-siRNAをヒトグリオーマ細胞に導入し、その細胞とヒト成熟樹状細胞との融合細胞を作成することで、効率的にsiRNAを樹状細胞内に導入することを試みた。グリオーマ細胞へのIL-10-siRNAの導入効率は、通常の導入法によって安定的に得られることをIL-10の定量で確認した。さらに、このsiRNA導入グリオーマ細胞と樹状細胞との融合細胞を作成し、その融合細胞からのIL-10分泌が抑制されていることを同様に確認した。STAT3-siRNAに関しては、これが過度に導入されることで、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導してしまうため、安定的な融合細胞の作成が困難であった。次に、IL-10-siRNA導入融合細胞において、細胞表面マーカー(CD80,CD83,CD86,HLA-DR)の発現を確認した。過去の報告から、IL-10の作用により、樹状細胞表面のCD80やCD86の発現が減弱することが判っているため、IL-10-siRNA導入融合細胞においてこれらの細胞表面マーカーの発現は増強すると予想していたが、実際にはコントロール細胞と比較して変化が表れなかった。siRNA非導入の樹状細胞単独あるいは融合細胞をリコンビナントIL-10と共に培養してもこれらの細胞表面マーカーに変化がないことが確認されたので、本実験系においてIL-10は細胞表面マーカーに影響を与えないと判断した。その理由は、樹状細胞が十分に成熟しているためであると考えられ、従って、本実験系において誘導された成熟樹状細胞ではSTAT3-siRNAによるIL-10のシグナル伝達抑制の必要性は低いと考えられた。研究代表者はこれまで、悪性グリオーマ患者に対する自家樹状細胞と腫瘍細胞の融合細胞を用いた免疫治療に関する研究を行い、その有効性を報告してきた。しかし、現行法では融合細胞が免疫抑制型抗原提示細胞として作用する可能性が否定できないため、確実な免疫賦活型ワクチン誘導法の開発が必要不可欠である。そこで、IL-10-siRNAを融合細胞に導入する方法を試みた。ます、樹状細胞あるいは腫瘍細胞に対しIL-10-siRNAを導入した後、両者の融合細胞を作成した。また、融合細胞を作製した直後にIL-10-siRNAを直接導入する方法も試み、定量的PCRやELISAによるIL-10・IL-12の分泌量測定や、FACSによるCD80, CD83およびCD86等の発現率を比較検討した。実験の結果、融合細胞作製直後にsiRNAを直接導入した場合が最も効率の良いことが解り、腫瘍細胞に導入した場合がそれに続いた。IL-10-siRNA単独導入の融合細胞ではIL-10の分泌抑制とCD80およびCD86の発現増強は得られたものの、IL-12分泌増強は得られなかった。double-stranded RNA (dsRNA)を用いて融合細胞を刺激したところIL-12分泌増強に加えてIL-10分泌の増加も認められた。そこで、dsRNAにて刺激した融合細胞にsiRNAを導入し、同様の検討を行ったところ、CD80およびCD86を高発現するIL-10低分泌・IL-12高分泌融合細胞が得られた。こうして得られたIL-10低分泌・IL-12高分泌融合細胞を用いて、リンパ球との混合培養によりCD4+T細胞を刺激したところ、コントロールに比べて著明なTh-1反応の誘導が確認された。すなわち、dsRNAにて刺激した融合細胞にIL-10-siRNAを導入することで免疫賦活型ワクチンが確実に誘導できると考えられた。