hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非対称分裂時の細胞板配置機構の解明

ヒメツリガネゴケの茎葉体形成を対象とし、細胞板配置の仕組みの解明を目的とした。1)ヒメツリガネゴケの初期茎葉体、成熟した茎葉体のライブ観察を通して、分裂期直前に細胞質中に微小管形成中心が一時的に現れることを見出した。この形成中心が紡錘体の形成や配向、ひいては細胞板の位置や向きを規定していることが示唆された。これは高等植物の多くの細胞種の皮層で観察されるPPB(プレプロフェーズバンド)とは異なる微小管形成中心であり、「ガミートソーム(gametosome)」と名付けた。2)微小管重合阻害剤oryzalinを一過的に加える実験により、ガミートソームは紡錘体の形成自体には必須ではなく、正しく配向させるために必要であることがわかった。一方、阻害剤を用いた実験からは、アクチンは細胞板配向に必要ではないことが示された。3)ガミートソーム形成には微小管重合核形成因子γチューブリンが必要であることをRNAi実験で示した。一方、紡錘体や高等植物の細胞表層でγチューブリンを活性化するのに必要なオーグミン複合体はガミートソームの形成に必須ではなかった。最後に、これらの結果が高等植物にも当てはまるかどうかを調べるため、タバコ培養細胞を用いた微小管一過的脱重合実験を行った(共同研究)。タバコ細胞ではガミートソーム様の構造体が現れることはなかったが、PPB消失後、分裂期進入直前の核に集積する微小管(polar capと呼ばれる)が、ガミートソーム同様に紡錘体の配向に必要であることが示された。これらの結果は、進化の過程で中心体を失った植物では、紡錘体や細胞板の正しい配向を保障するために非中心体性の微小管形成中心が発達したことが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。・茎葉体の細胞膜、細胞板に局在するマーカータンパク質を同定し、初期茎葉体を立体的に捉えることが可能なマーカーラインを確立した。初期茎葉体の分裂面が厳密に制御されていることがわかった。・茎葉体で発現する微小管系マーカーライン、アクチンマーカーラインを作製し、初期茎葉体において紡錘体形成からフラグモプラスト形成に至るライブ観察に成功した。特徴的な分裂期前微小管形成中心の出現を見出した。・初期茎葉体において、微小管重合阻害剤を添加・除去する実験に成功し、分裂期前微小管形成中心の分裂面決定における寄与を明らかにした。当初の期待どおり、顕微鏡観察を通じて、ヒメツリガネゴケ初期茎葉体における細胞板の配置機構について、微小管の寄与を示すことができたため。当初の計画どおり、ライブ顕微鏡観察により成熟した茎葉体における細胞板配置機構について解析を進める。
高偏極スピンSTMの開発と分子磁性体の観察

金(111)面をマイカ上にエピタキシャルし、それを基板として、超高真空中でコバルトフタロシアニンを蒸着した。78Kの低温STMの観察により、コバルトフタロシアニンは、ベンゼン環が、基板の[1-10]軸方向に配向し、3層目まで正方格子を組んでエピタキシャル成長していることが確認された。1層目の分子は基板に平行に配向しているが、2層目、3層目の分子は僅かに傾いていることが示唆された。正方格子の1辺は、1.4nmであり、分子は、歯車が噛み合うようにパッキングしている。分子はベンゼン環方向に僅かにシフトしてスタッキングしている。1層目の分子は、バイアス依存性もなく、分子内微細構造が明瞭ではないが、2層目、3層目の分子は、微細構造が確認され、バイアス依存性も観察された。これは、1層目では基板の影響により、軌道が広がったのに対し、2層目、3層目では、分子軌道が明瞭に観察されたためと思われる。銅(100)単結晶清浄面にコバルトフタロシアニンを単分子相当量蒸着し、4Kの極低温で、dI/dV観察を行った。HOMO-LUMOギャップ内に、Local Density of Statesが観察された。金属上のC60膜でも同様のstateは観察されており、基板との相互作用により現れたものと考えられる。中心金属上あるいはベンゼン環上では異なったdI/dV特性を与えた。今後は、スピン偏極探針を用いて、測定を行うことにより、分子のスピン状態に関する知見を得ることを目指す。本年度は、極低温走査型トンネル顕微鏡(LT-STM)の立ち上げと基本データの集積を行った。シリコン(100)および(111)面を評価試料として用い、4Kの極低温中、5Tの磁場印加環境下で安定した原子像が観察できることを確認した。さらに、Au(111)基板上に配列したコバルトフタロシアニン分子(CoPc)のエピタキシャル膜を作製し、LT-STM観察を行った。Au(111)基板は、マイカ基板上にAuを真空蒸着することにより作製し、さらに超高真空中でスパッタリングおよびアニーリングによって表面の洗浄化を行った。このAu(111)表面上にCoPc分子をKnudsen-cellより超高真空中で蒸着した。その後真空を破ることなくすみやかに冷却し、LT-STM観察を行った。STM探針として白金/イリジウム合金ワイヤーを使用した。79Kの低温下で観察したところ、CoPcが表面全面を覆っており、分子間距離1.5×1.5nmの正方格子を組んでいることがわかった。分子は分子面を基板に平行にして配列し、分子の凸部分が隣の分子の凹部分に入り込み、歯車が組み合わさるように稠密にパッキングしていることが確認された。部分的に2層目、3層目の分子膜が成長している箇所があり、STM像から、下地との相対位置関係が明らかとなった。探針および試料に印加するバイアスにより、中心のコバルト原子およびフタロシアニンπ電子系の明るさのコントラストが変化し、基板上での分子の電子状態の解析を進めている。
ミオシンATPaseの遷移状態を形成する複合体の^<19>F-NMRによる解析

(1)a.ATPアナログ2-[(4-trifluoro-methyl-2-nitrophenyl)amino]ethyltriphosphate(TFNTP)を用いて形成させたミオシン/TFNDP/AIF_4BeFn or Vi複合体の^<19>F-NMRスペクトルの化学シフトはそれぞれわずかであるが、異なっていた。TFNDPに非常に近い性質を持つ光架橋性のMant-2-N_3-ATPを用いた各複合体の光親和標識の実験結果は、各複合体においてプロテアーゼ消化によって得られる同じペプチドに架橋することが示されたので、活性部位において大きなコンホメーションの差はないと思われる。しかしTFNDPの^<19>F-NMRスペクトルはアミノ酸レベルでの小さな変化をとらえていることが示唆された。b.フッ素で標識した平滑筋ミオシン制御軽鎖のmutant(F22W)を遺伝子操作を用いて直接フッ素標識して^<19>F-NMRの測定を行なった。標識された制御鎖のスペクトルはフリーのものと異なる化学シフトを示し、特異的に標識された部位の構造をモニターできることが示唆された。またnativeミオシンと効率良くexchangeすることができた。今後、このミオシンを用いて複合体を形成させて^<19>F-NMRを測定する予定である。(2)ミオシン/ADP/AIF_4(BeFn,Vi)複合体を形成するミオシン頭部,Subfragment-1(S-1)の全体的な構造を調べるために、X線小角散乱法を用いて各複合体におけるS-1分子の慣性半径を小角領域のギニエプロット(散乱曲線を、強度の対数を縦軸に散乱ベクトルの大きさの二乗を横軸にプロットしたもの)の勾配から求めた。各複合体ともATPが結合したときと同程度の構造変化を起こしており、ミオシン頭部で折れ曲がりを示すような構造をすることが示唆された。また活性システイン残基Cys707(SH1)が存在する部位での、局所的な構造変化を調べるために、あらかじめ蛍光試薬ABDFで標識したミオシンを調製して、ADPと各リン酸アナグロを加えて各複合体形成に伴う構造変化を調べた。いずれの複合体においても同程度の構造変化を示していることが示された。各複合体はATPが結合したとき、遷移状態形成に近い構造変化をミオシン頭部全体及びSH1領域で起こしていることが示された。しかしながら、活性リジン(Lys83)の反応性はそれぞれ異なっていることから、これらの複合体は収縮サイクルにおいて遷移状態付近に類似しているが、わずかにずれたステップを示していると考えられる。
葉緑体分裂装置の構造と機能に関する研究

本研究の目的は,葉緑体分裂装置の構造と機能を調べる事によって葉緑体の分裂機構を明らかにすることである。本年度は,シゾンから葉緑体分裂装置とともに,ミトコンドリア分裂装置の解析を行った。色素体とミトコンドリアはそれぞれシアノバクテリアとαプロテオバクテリアの祖先が原始真核生物へ細胞内共生したことによって誕生した。そのため,これらのオルガネラは独自のゲノムを持ち,分裂によってのみ増殖することが出来る。我々のこれまでの研究から,色素体とミトコンドリアの分裂はFtsZ、Dynamin、PD/MDリングなど,複数のタンパク質から構成される色素体・ミトコンドリア分裂装置によって行われている事が分かっている。しかしながらミトコンドリア分裂装置に関しては,その超分子構造や構成タンパク質,特に内側の構成タンパク質は殆ど明らかになっていない。今回,我々は新たにミトコンドリア分裂装置を無傷に単離することに成功した。単離したミトコンドリア分裂装置は色素体分裂装置と同様に超螺旋(螺旋)状,リング状構造をとることが明らかになり,その構造や動作機構は色素体分裂装置と極めて共通する機構であることが示唆された。また,単離した分裂装置のディファレンシャルプロテオミクスによって新規ミトコンドリア分裂装置構成タンパク質ZEDを同定し,その機能解析を行った。ZEDはFtsZ1とともにZED-FtsZ1リング複合体構造を形成する他,幾つかのバクテリア分裂タンパク質の特徴を有しており,宿主細胞核がミトコンドリアの細胞内共生に伴いこれらバクテリア分裂タンパク質の機能を統合・転換するため,ZED遺伝子が創られた可能性が示唆される。本研究の目的は、葉緑体分裂装置の構造と機能を調べる事によって葉緑体の分裂機構を明らかにすることである。本年度は、シゾンから葉緑体分裂装置の単離することを第一目標として研究を進め、以下の結果を得る事が出来た。葉緑体分裂を完全に同調させたシゾンから無傷な分裂期葉緑体を大量単離し、単離した分裂期葉緑体に対して非イオン性活性剤による処理を行うことで、無傷な葉緑体分裂装置画分を得た。単離した葉緑体分裂装置画分をSDS-PAGEもしくは2-DEと、MALDI-TOF/MSによる分析を行う事によって無傷の葉緑体分裂装置を得た。単離した葉緑体分裂装置はリングの形状以外にも、らせんや超らせん状をとるものがあった。このことは、葉緑体分裂装置自身が分裂のための収縮力を発生している事を示唆した。細胞生物学的な解析によって、らせん構造をとるためにはダイナミンが必要である事が分かったが、その機構は光ピンセット法による1つの葉緑体分裂装置の解析によって明らかになった。らせん状の分裂装置は光ピンセットによって元の4倍まで引き伸ばされ、離すと元の形状へと収縮した。しかしながらダイナミンが遊離した分裂装置では、このような伸縮反応は一つも確認できなかったため、ダイナミンが葉緑体分裂装置の起動力を発生させていることが分かった。更に免疫抗体電子顕微鏡法によって、ダイナミンは葉緑体分裂を2つのステップで行っている事が明らかになった。葉緑体分裂の前期では、葉緑体分裂装置に組み込まれたダイナミン分子は外側のPDリング繊維の間隙に結合し、スライディングさせることによって収縮力を発生させる。葉緑体分裂の後期では、葉緑体分裂装置の外側に結合していたダイナミン分子は内側へと移動し、葉緑体膜へ直接作用して膜のくびり切りを行う。このような葉緑体分裂装置による2段階での制御によって、葉緑体の分裂は行われている事が明らかになった。葉緑体は、シアノバクテリアの祖先が細胞内共生したことによって誕生した。このため、葉緑体は独自のゲノムを持ち、分裂によってのみ増殖する。葉緑体の分裂にはバクテリア分裂タンパク質であるFtsZリングや、真核生物特有であり膜のくびり切りなどに働くGTPaseタンパク質であるダイナミン関連タンパク質、さらには分裂面の内側と外側に二重のリング構造を作る葉緑体分裂リングが含まれることが分かっている。しかしながら、葉緑体分裂装置を構成するタンパク質としては、現在までにこれら3種の以外にはほとんど明らかになっていない。このため、本年度はシゾンから単離された葉緑体分裂装置のプロテオーム解析を行い、その構成タンパク質を明らかにすることを目標として研究を進め、以下の結果を得た。単離した葉緑体分裂装置をSDS-PAGEや二次元ゲル電気泳動によって展開し、MALDI-TOF/MSによるプロテオーム解析を行った結果、50スポットを同定することに成功した。これらのタンパク質のうち、おおよそ20から30種類のタンパク質が分裂装置を構成しているものと推定された。実際に、今回新たに同定された分裂装置関連遺伝子の抗体を作成し間接蛍光抗体法によって解析した結果、確かに分裂装置に局在することが明らかになった。

色素体とミトコンドリアはそれぞれシアノバクテリアとαプロテオバクテリアの祖先が原始真核生物へ細胞内共生したことによって誕生した。そのため,これらのオルガネラは独自のゲノムを持ち,分裂によってのみ増殖することが出来る。我々のこれまでの研究から,色素体とミトコンドリアの分裂はFtsZ、Dynamin、PD/MDリングなど,複数のタンパク質から構成される色素体・ミトコンドリア分裂装置によって行われている事が分かっている。しかしながらミトコンドリア分裂装置に関しては,その超分子構造や構成タンパク質,特に内側の構成タンパク質は殆ど明らかになっていない。今回,我々は新たにミトコンドリア分裂装置を無傷に単離することに成功した。単離したミトコンドリア分裂装置は色素体分裂装置と同様に超螺旋(螺旋)状,リング状構造をとることが明らかになり,その構造や動作機構は色素体分裂装置と極めて共通する機構であることが示唆された。また,単離した分裂装置のディファレンシャルプロテオミクスによって新規ミトコンドリア分裂装置構成タンパク質ZEDを同定し,その機能解析を行った。ZEDはFtsZ1とともにZED-FtsZ1リング複合体構造を形成する他,幾つかのバクテリア分裂タンパク質の特徴を有しており,宿主細胞核がミトコンドリアの細胞内共生に伴いこれらバクテリア分裂タンパク質の機能を統合・転換するため,ZED遺伝子が創られた可能性が示唆される。
バクテリアべん毛蛋白質輸送スイッチの分子基盤

本研究では、X線結晶構造解析と極低温電子線トモグラフィー法による構造解析を組み合わせることで、フック完成シグナルに伴う輸送装置の基質認識モード切り替え機構を原子レベルで解明することを目指している。本年度の主な成果は以下に示す。3.サルモネラ由来のFlgNの結晶構造から、細菌の間で高く保存されているAsp-92, Asp-95, Ile-103がα3ヘリックスの同一面上に存在していた。そこで、これらのアミノ酸残基をアラニンに置換すると、FlgKに対する結合親和性が顕著に低下した。これら3残基を同時にアラニンに置換すると、FlgKに全く結合できなくなった。このことから、Asp-92, Asp-95, Ile-103がFlgKとの相互作用に直接関与していることが示唆された。さらに、FlgNのα1ヘリックスとα2ヘリックスの間に位置するループ構造がFlgNの輸送シャペロン活性を制御する構造スイッチとして働いていることが明らかとなった。4.サルモネラからべん毛蛋白質輸送活性を示す反転小胞膜の調製に成功した。クライオ電子線トモグラフィー法によりべん毛基部体MS-Cリング複合体の内部に輸送装置が存在することが確認できた。26年度が最終年度であるため、記入しない。1. FlgN/FlgK、FliT/FliDおよびFliS/FliCシャペロン・輸送基質複合体は輸送ゲート構成蛋白質であるFlhAのC末細胞質ドメイン(FlhAc)に結合する。本研究では、Biacoreを用いてFlhAcに対する各シャペロン・輸送基質複合体の結合親和性を測定した結果、FlhACに対するFlgN/FlgK複合体の結合親和性はFliT/FliD複合体に比べて僅かに高く、FliS/FliC複合体に比べては14倍程度高いことが判明した。4.極低温電子線トモグラフィー法によりin situでの輸送装置の構造解析を行った結果、FlhAcと考えられる電子密度を同定するとともに、FlhAC9量体モデルをその電子密度にあてはめて原子モデルを構築した。X線結晶構造解析により、FlgN, FlhAc(F459A)およびFliPのペリプラズミックドメインの構造は決定できた。さらに、in situでの輸送装置の構造解析および一分子蛍光イーメージング法により、FlhAの所在およびストイキオメトリーは決定できた。しかしながら、FlhAを中心としたフック完成シグナリング複合体の結晶は未だ得られていない。安定なフック完成シグナリング複合体を単離精製し、X線結晶構造解析に取り組む。さらに、FlhAcリング複合体の原子モデルの信憑性を遺伝学的および生化学的手法により評価する。
二原子分子受容体の作用メカニズム

バクテリア由来のPASドメイン含有タンパク質、BjFixL, AxPDEA1, EcDos, MtDosは、PASドメイン中にヘムを含んでいることから、ヘムがセンサーとして機能していると考えられている。そこでこれらのタンパク質のヘムドメインについてヘム配位構造を明らかにするとともに、酸素(O2)、一酸化炭素(CO)、一酸化窒素(NO)とヘムとの相互作用についても解明することを目的とした研究を行った。BjFixL以下のタンパク質のヘムドメインを大腸菌の大量発現系を利用して高純度に精製した。精製標品の電子吸収スペクトルおよび共鳴ラマンスペクトルを測定し、それぞれのヘムドメインの配位構造を解明した。その結果、EcDosは6配位低スピンであったが、他のものは5配位高スピンであった。これらのタンパク質ではヘム近傍のアミノ酸配列の相同性が高いにもかかわらず配位構造が異なっていることから、EcDosではヘムの生理的役割が他のものとは微妙に異なっていることが示唆された。次にEcDosの第6配位子を明らかにするために部位特異的変異導入法を用いた実験を行った。EcDosのメチオニン95はBjFixLではイソロイシンに相当するため、メチオニン95をイソロイシンに置換した変異体EcDosを調製し、分光測定を行った。その結果イソロイシン変異体ではヘムの配位構造は5配位高スピンであり、他のセンサーヘムタンパク質と同じであったので、このことから、EcDosの第6配位子はメチオニン95であることが示唆された。CO結合型およびNO結合型タンパク質の共鳴ラマンスペクトルからは、配位子とヘム近傍アミノ酸との相互作用を観測することができる。NO結合型EcDosの共鳴ラマンスペクトルからはNOが水素結合していることを示す情報が得られた。
再生医療を目指した神経細胞分化制御における剪断応力の影響

1.微小培養環境下での細胞の液性因子感受性について詳細に調べるための細胞培養デバイスを設計,作成し,実際に神経系の細胞に分化可能な培養細胞株SH-SY5YにWnt3aシグナルを作用させ, 1マイクロメートルあたり2.5 - 5.0 pM程度の濃度勾配を細胞が感知できることを突き止めた.これによって,細胞の運命制御において,分化する側の細胞と増殖を続ける側の細胞を制御したい場合に,どのような環境を用意することで制御できるか見込みを立てることに成功した.この内容を国際会議で口頭発表した.また, FEBS Open Bioにて学術論文として出版した.2.神経芽腫細胞の移動能力に対する剪断応力の影響について,概要環境の剪断応力条件をシステマティックに振りながらテストするデバイスを設計,作成し,神経芽腫細胞IMR2を培養し,剪断応力の影響で細胞の遊走能が上昇し,その仕組みとしてがん細胞の転移・浸潤能を司るMYCN遺伝子が関与している可能性を示した.この研究により,細胞が自ら移動することによって位置を変える際の制御機構に,流れの影響があることを示した.この内容をJournal of Royal Society Interfaceにおいて,学術論文として発表した.昨年度中までに,流れのある培養環境下での神経系細胞の運命の制御(分化シグナルを受け取る方向の制御方法の開発)、細胞移動(当初の計画とは異なる方法であるが、位置の制御法の一旦となる)などについて、マイクロ流体デバイスを用いて培養、テストを行い、細胞の左右においてどの程度の濃度差があれば分化誘導シグナルを感知すル事ができるか、また流れが細胞の動態にどのような影響を及ぼし、その背景にはどのような分子機構が見込まれるかを明らかにし、学術論文として公表することに成功した。今年度は、分化しつつある神経系細胞の突起伸長方向への流れの影響(方向の制御)について定量的な関係を明らかにし、さらに業績をまとめる方針である。主に剪断応力調整機構を持つマイクロ流体デバイスを引き続き応用して、神経系細胞に分化誘導可能なSH-SY5Y細胞株に対する、流れの細胞分化への影響を調査する。特に、科研費提案時の課題としてあげている3つの項目のうち、分化進行中の神経系細胞の方向の制御法としての流れの応用を追求する目的で、神経細胞突起伸長方向の、流れ方向に対する統計解析を行う。また、可能であれば、ライブセルイメージングで、神経突起の種類(軸索様突起か樹状突起か)を判別して、流れに沿うかどうかの統計解析だけでなく、神経細胞自体の前後を明らかにするため、EB3などの微小管結合因子を細胞に発現させ、そのたんぱく複合体の移動方向分布解析を行う事を計画している。本研究は、神経細胞分化制御機構への流れ刺激の影響を定量的に調べるためのツール開発を行い、これを用いて神経細胞分化制御機構の解明に貢献することを目指している。計画初年度である平成27年度は、ツール開発の基礎となる二つの要素技術のうちの一つ、マイクロコンタクトプリンティングのためのスタンプ作成、及び使用する細胞接着因子の選定が目標であった。これらの目標について、ソフトリソグラフィにより作成したスタンプの構造的評価、及び接着因子を用いて行った実際のマイクロコンタクトプリンティングの機能評価を、実際に細胞を接着培養することで行い、細胞の培養、及びその環境の制御に利用可能であると判断した。判断の過程で、蛍光標識した細胞膜の観察のために必要となる顕微観察用の光源を導入した。本年度の成果について、国際会議にて2件のポスター発表を行った。現在、H28年度の目標達成に向けて、第二の要素技術であるマイクロ流体デバイスの作成を開始している。様々な速さの流れのある環境と、流れのない環境の比較を効果的に行うためのデバイスデザインを考案し、試験的に作成しながら、目的の実験に適合するデバイス構造を検討中である。流速調節には、流路を流れる水について、キルヒホッフの法則が適用可能であることを利用し、抵抗を生み出す細い流路を目標の流速ごとに設置することで、複数の流速を生み出すことを計画している。同時に、デバイスのデザインには、接着因子を壊さずに培養デバイスをガラス基板に圧着する方法を採用することを計画し、そのための構造をデザインに取り入れるように検討している。計画していた要素技術のうちの一つ、ソフトリソグラフィを用いたマイクロコンタクトプリンティング用スタンプの作成と、接着因子の選定については、細胞培養環境における機能評価までを行い、想定したいた内容は行えたと考えている。ただし、今後もう一つの要素技術であるマイクロ流体デバイスの構造を具体的に決定する過程で、マイクロコンタクトプリンティングに対しても新たな性能評価が必要になる可能性が考えられるため、概ねにおいて順調であるとした。実際に行った構造評価は、レーザー顕微鏡を使用したスタンプの高さ、及び面積の評価、機能評価の際には、その前段階として、接着因子をプリントしていない培養基板において、非特異的な細胞接着を防ぐためのポリマー処理の評価、加えてマイクロコンタクトプリンティングを行った培養基板に対する、接着因子塗布面積と細胞接着面積の比較、細胞接着のあるプリントパターンと起きなかったパターン数の比較を行った。非特異的な細胞接着を防ぐための処理方法として、2種の化合物(PLL-g-PEG及びMPCポリマー)、ポリマーの接着をコントロールする方法としてプラズマ処理の有無を検討した。結果、プラズマ処理後MPCポリマー塗布を行ったケースが、最も効率良く非特異的細胞接着を防いだ。スタンプの構造評価に関しては、目標とするプリンティング面積に依存して、デザインをより正確に反映できる場合と、難しい場合があることがわかった。

特に正確にデザインを反映しやすい大きさの構造のスタンプを利用して、細胞接着因子であるラミニンをプリンティングしたところ、おおよそ80%のパターン上に細胞が接着、増殖可能であった。ただし、面積で全細胞接着面のうち、接着因子をプリントした面積がどの程度含まれているかを検討したところ、全面積の10100%と非常に広い分布を示した。平成28年度の目標であったマイクロ流体デバイスの作成について、当初予定していた、キルヒホッフの法則を流路抵抗を求める上で適用することで設計した、異なる流路長を持つ複数の流路から構成されたデバイスを作成した。このデバイスの各流路内での流速の測定をParticle Image Velocity(PIV)法を用いて計測した。この段階で、(1)安定して流速を変化させ流速を変化させる:流路長と流路内の培養液の流速の関係が理論予測と傾向を同じにすること、(2)漏れ、基盤の破損:陰圧を用いたデバイス構造で培地の漏れなどが起きないこと、を確認することができた。別に、マイクロコンタクトプリンティングで細胞接着因子を蛍光物質(FITC)とともに培養基盤にプリントし、この基盤に対して(3)陰圧を用いてPDMSを接着した際、プリントしたパターンに変化が生じないことを確認した。また、もう一つの平成28年度の目標であったデバイス内での細胞培養について、実際に細胞を流路内で培養しながら継続的に観察するため、基本の理論的な構造(各流路の流路超に変化を持たせる)を維持しながら、カバーガラスボトムの培養ディッシュに合う形状にデバイスのデザインを変更し、このデバイスを倒立型顕微鏡のステージトップインキュベータ内に置いて観察したところ、神経芽腫培養細胞SH-SY5Yの培養が24時間以上(4)細胞障害が静置培養条件と変わらない程度で行えることを確認した。これらの成果について、国際学会で口頭発表およびポスター発表を行った。計画していたデバイスの作成に成功し、デバイスの構造とデバイスの機能(異なる流路内での流速の変化)を明らかにした。また作成したデバイス内で細胞を培養可能であることを確認した。一方、独立した要素技術としてマイクロコンタクトプリンティングで細胞の接着位置と方向に意図した傾向を持たせられることを確認している。これらのことから、計画した内容をほぼその通り実行していると認識している。昨年度に続き、流路抵抗生成部を備えたマイクロ流体デバイスを用い、3つのチャネルごとに異なる流量下で培養を行い、流れのSH-SY5Yの神経突起慎重方向の分布への寄与を検討した。SH-SY5Yはレチノイン酸及び脳由来神経栄養因子を用いて分化誘導を行った。準備したSH-SY5Y細胞を培養デバイスに撒種し、静置培養の場合をコントロールとして、流路ごとに神経突起の伸長方向を計数した。取得したデータに対しベイズ統計解析を行うにあたり、神経突起方向の角度分布を説明する仮説として、灌流培養時に神経突起方向がランダムに分布するのか、または流れの方向に偏るのか、静置培養時と比較した場合灌流培養時は流れの方向に神経突起方向が偏るのか、またはその逆かを検討した。
生体蛍光顕微鏡を用いた肝阻血・再潅流における肝微小循環の解析と新しい治療法の試み

本研究は,臨床肝切除およぼ肝移植に伴う肝阻血・再潅流における肝微小循環の動態を,生体蛍光顕微鏡を用いて解析し,同時に,循環障害に対する新しい治療法を試みることを目的とする。研究方法として,実験動物(ラット)を用いて,肝常温阻血モデルおよび長時間冷保存肝の移植モデルを作成し,術後に,生体蛍光顕微鏡下に肝の微小循環の変化を観察することにより,微小循環を動的に解析することが,本研究の中核である。平成8年度および平成9年度は,肝類洞内の血行動態の変化および炎症担当細胞(好中球,単球)の血管内皮への膠着状況を観察,定量化し,病態を解明するための,動物モデル,即ち,肝阻血,肝移植モデルを完成させ,さらに予備実験として,生体内での肝細胞索の染色(FITC)によるコントラストから,肝類洞内の血流の観察,白血球の生体内染色(Rhodamine 6G)によるこれらの細胞の血管内皮への接着状況を生体蛍光顕微鏡下に観察した。平成10年度は治療による血流改善効果について検討した。長時間保存肝(18時間保存)の移植後の肝臓の観察では,白血球の類洞内皮細胞および最小肝静脈への接着が有意に増加していたことから,免疫抑制剤であるFK506あるいは抗接着分子抗体(anti-CD11b/CD18抗体)静脈内投与による阻血肝障害に対する治療を行った。FK506および抗体投与群では,肝微小循環の改善,白血球の類洞内皮細胞および最小肝静脈への接着の有意な抑制が観察され,生存実験においても,有意に術後の生存率の改善が観察された。これらの結果から,臨床肝切除およぼ肝移植に伴う肝阻血・再潅流障害において,血管内皮細胞への白血球の接着が重要な役割を担っていることが示されたと同時に,従来の薬剤治療に加え,免疫抑制剤や白血球接着分子に対する抗体による治療が,新しい有効な治療となりうることが示唆された。本研究は,臨床肝切除およぼ肝移植に伴う肝阻血・再潅流における肝微小循環の動態を,生体蛍光顕微鏡を用いて解析し,同時に,循環障害に対する新しい治療法を試みることを目的とする.研究方法として,実験動物(ラット)を用いて,肝常温阻血モデルおよび長時間冷保存肝の移植モデルを作成し,術後に,生体蛍光顕微鏡下に肝の微小循環の変化を観察することにより,微小循環を動的に解析することが,本研究の中核となる.平成8年度は,肝類洞内の血行動態の変化および炎症担当細胞(好中球,単球)の血管内皮への膠着状況を観察,定量化し,病態を解明するための,動物モデル,即ち,肝阻血,肝移植モデルを完成させた.さらに,予備実験として,生体内での肝細胞索の染色(FITC)によるコントラストから,肝類洞内の血流の観察,白血球の生体内染色(Rhodamine 6G)によるこれらの細胞の血管内皮への膠着状況を生体蛍光顕微鏡下に観察し,9年度以降に行う予定の,薬剤による血流への影響を検討するための基礎的手技を確立した.9年度以降は,臨床応用を前提として,protease inhibitorあるいは抗接着分子抗体を用いた,阻血肝障害に対する治療の試みを行い,特に,肝微小循環への影響を中心に観察し,その結果を収集する予定である.

本研究は,臨床肝切除およぼ肝移植に伴う肝阻血・再潅流における肝微小循環の動態を,生体蛍光顕微鏡を用いて解析し,同時に,循環障害に対する新しい治療法を試みることを目的とする.研究方法として,実験動物(ラット)を用いて,肝常温阻血モデルおよび長時間冷保存肝の移植モデルを作成し,術後に,生体蛍光顕微鏡下に肝の微小循環の変化を観察することにより,微小循環を動的に解析することが,本研究の中核となる.平成7年度および平成8年度は,肝類洞内の血行動態の変化および炎症担当細胞(好中球,単球)の血管内皮への膠着状況を観察,定量化し,病態を解明するための,動物モデル,即ち,肝阻血,肝移植モデルを完成させ,さらに予備実験として,生体内での肝細胞索の染色(FITC)によるコントラストから,肝類洞内の血流の観察,白血球の生体内染色(Rhodamine 6G)によるこれらの細胞の血管内皮への接着状況を生体蛍光顕微鏡下に観察した.平成9年度は治療による血流改善効果について検討した.長時間保存肝(24時間保存)の移植後の肝臓の観察では,白血球の類洞内皮細胞および最小肝静脈への接着が有意に増加していたことから,抗接着分子抗体(anti-CD11b/CD18抗体)静脈内投与による阻血肝障害に対する治療を行った.抗体投与群では,肝微小循環の改善,白血球の類洞内皮細胞および最小肝静脈への接着の有意な抑制が観察され,生存実験においても,有意に術後の生存率の改善が観察された.これらの結果から,臨床肝切除およぼ肝移植に伴う肝阻血・再潅流障害において,血管内皮細胞への白血球の接着が重要な役割を担っていることが示されたと同時に,従来の薬剤治療に加え,白血球接着分子に対する抗体による治療が,新しい有効な治療となりうることが示唆された.本研究は,臨床肝切除およぼ肝移植に伴う肝阻血・再潅流における肝微小循環の動態を,生体蛍光顕微鏡を用いて解析し,同時に,循環障害に対する新しい治療法を試みることを目的とする.研究方法として,実験動物(ラット)を用いて,肝常温阻血モデルおよび長時間冷保存肝の移植モデルを作成し,術後に,生体蛍光顕微鏡下に肝の微小循環の変化を観察することにより,微小循環を動的に解析することが,本研究の中核となる.平成8年度および平成9年度は,肝類洞内の血行動態の変化および炎症担当細胞(好中球,単球)の血管内皮への膠着状況を観察,定量化し,病態を解明するための,動物モデル,即ち,肝阻血,肝移植モデルを完成させ,さらに予備実験として,生体内での肝細胞索の染色(FITC)によるコントラストから,肝類洞内の血流の観察,白血球の生体内染色(Rhodamine 6G)によるこれらの細胞の血管内皮への接着状況を生体蛍光顕微鏡下に観察した.平成10年度は治療による血流改善効果について検討した.長時間保存肝(24時間保存)の移植後の肝臓の観察では,白血球の類洞内皮細胞および最小肝静脈への接着が有意に増加していたことから,抗接着分子抗体(anti-CD11b/CD18抗体)静脈内投与による阻血肝障害に対する治療を行った.抗体投与群では,肝微小循環の改善,白血球の類洞内皮細胞および最小肝静脈への接着の有意な抑制が観察され,生存実験においても,有意に術後の生存率の改善が観察された.これらの結果から,臨床肝切除およぼ肝移植に伴う肝阻血・再潅流障害において,血管内皮細胞への白血球の接着が重要な役割を担っていることが示されたと同時に,従来の薬剤治療に加え,白血球接着分子に対する抗体による治療が,新しい有効な治療となりうることが示唆され,この結果は学会発表を行い,現在,論文準備中である.
癌性腹水微小環境が及ぼすγδ型T細胞の増殖抑制解除を目指した新規免疫細胞療法開発

卵巣癌は癌性腹水を有する進行癌で見つかることが多く、予後不良であり、難治性腹水に対する新しい治療方法が求められている。申請者は、腹水濾過カラムより腹水中の細胞を回収し、卵巣癌に対し内因性ピロリン酸モノエステル依存性の抗腫瘍活性を示すγδ型T細胞の培養に成功している。しかし、末梢血γδ型T細胞と比較して、腹水中γδ型T細胞の増殖能は著しく損なわれており、癌性腹水微小環境が影響を及ぼしていると考えている。そこで本研究を通してその増殖抑制因子を明らかとし、γδ型T細胞の増殖能を回復させる事で、本来は破棄される腹水中の細胞を利用した患者負担の少ない新規癌免疫細胞療法の開発が可能であると考えている。
ミセルを反応場に用いた新規高感度イオン分析法の確立

ミセルは水溶液中で有機錯体を安定化する特異なナノ空間を形成することが知られており、我々はそのナノ空間を活用した蛍光分析法の開発を目指した。Sr蛍光プローブBICを合成しそのSr(II)錯体の安定度定数を調べたところ、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液中で安定度定数が一桁高くなることを見出した。EXAFS及びNR法を用いた構造解析により、Sr-BIC錯体はミセル界面でSr(BIC)(SDS)の3元錯体を形成して安定化していることが明らかとなっており、ミセルはSr-BIC錯体と強い相互作用を形成することで水溶液中で安定化し、その結果として蛍光検出能が向上したとの結論に至った。(1)SAXS法の結果について:ミセル粒子の構造が錯体の存在の有無にかかわらず変化しないことを示す結果が得られており、Sr(II)-BIC錯体はミセル粒子内に取り込まれていない可能性が示唆された。(2)XAFS法の結果について:Sr(II)がBIC及び界面活性剤分子と溶液中で配位結合を形成していることが明らかとなっており、従ってSr(II)とミセルの間に強い相互作用が存在すると断定されている。上記のように、ミセル粒子の構造・Sr(II)錯体の局所構造の理解が進んでおり、一部の結果は国際会議等にて報告している。2017年度は、BICの重水素化とそれに伴う中性子反射率実験により更に多くの構造化学的情報を得ることで、ミセル溶液内における錯体の構造的特徴を明らかにし、イオン分析法としての基盤となる方法論と技術の確立を目指す。当初の計画通り、試料合成と重水素化合成装置の製作は順調に進んでおり、その後のXAFS実験やSAXS実験も開始している。ここまではほぼ予定通りであるが、試料(BIC)の重水素化が途中段階であり、中性子反射率実験の準備が整っていない状況である。一方で、重水素化していないBICでの中性子反射率実験のテストを行っており、BICの重水素化が不調の場合に代替の実験ができるように準備を進めている。総合的に見て、研究の進捗状況はおおむね順調に進展しているといえる。本研究は、ミセル溶液中においてSr(II)蛍光センサーN-(2-hydroxy-3-(1H-benzimidazol-2-yl)-5-methyl-phenylmethyl)-1-aza-18-crown-6-ether (BIC)のSr(II)検出限界能が大幅に向上する現象を構造化学的観点から解明することで、ミセル内ナノ疎水空間が分子のイオン認識反応に与える影響を構造から理解することを目的としている。2017年度に実施した研究項目、(1)XAFS法による錯体の局所構造解析、(2)中性子反射率(NR)法によるミセルへの錯体吸着構造解析の結果について、具体的な内容を以下に示す。(1)XAFS法の結果について: Sr(II)が界面活性剤Sodium dodecyl sulfate及びSodium laurate(LaNa)とミセル溶液中で直接的な結合を形成していることが判明しており、また、Sr(II)検出を行う実験条件下でも界面活性剤分子の結合が示唆されている。このことから、Sr-BIC錯体はミセル溶液内において界面活性剤分子と配位結合を形成することで化学的に安定な錯体を形成し、その結果として検出限界能が大幅に向上したものとの結論に至った。(2)NR法の結果について:LaNaミセルの模擬薄膜試料をSi基板上に形成し、その薄膜へのSr-BIC錯体の吸着状態を調べた。その結果、Sr-BIC錯体はLaNa分子の疎水部には吸着せず、親水部の部分に選択的に吸着していることが明らかとなった。この結果は(1)の結果を支持するものであり、従って、ミセル溶液中で蛍光検出能を高めるための鍵となるポイントは、蛍光プローブ錯体とミセルとの相互作用の強さによるものとの結論に至っている。上述した通り、試料(BIC)の重水素化とそれに伴う中性子反射率実験が次年度の重要なポイントとなる。2017年度前半は、XAFS実験・解析、試料重水素化、中性子反射率実験・解析が研究活動の中心となる見込みである。なお、試料重水素化についてはオーストラリア国立研究所(Australian Nuclear Science and Technology Organisation、ANSTO)の重水素化研究所に協力を依頼しBIC重水素化の問題解決に取り組む予定であり、その見通しは明るい。2017年度後半には研究を総括し、イオン分析法としての方法・技術論の確立と論文の執筆・投稿を行いたいと考えている。錯体化学
β-アミラーゼのタンパク質工学

申請者はβ-アミラーゼの立体構造に基づいた酵素機能変換の可能性を追求するためにダイズβ-アミラーゼ、耐熱化オオムギβ-アミラーゼ、およびBacullus cereus β-アミラーゼのX線結晶構造解析を行い、各酵素の機能の差違を与える構造上の相違を明らかにし、新機能酵素を設計、開発することを目指している。平成9年度の実施計画について以下の点を明らかにした。1.Bacullus cereus起源のβ-アミラーゼについて、その大量発現系を大腸菌を用いて構築し、大量精製を行った後、酵素の結晶化を行った。硫安とポリエチレングリコール溶液中から得られた結晶はP2_1の空間群に属し、非対称単位あたり1分子の酵素を含み、構造解析に適していた。多重重原子置換法により、初期モデルを構築し、マルトース複合体について2.1Åまで、遊離酵素について2.5Åまでのデータを用いて構造を精密化した。その結果、本酵素はダイズ酵素とほぼ共通するメインドメイン以外にC末端に約100残基のドメインを持ち、このドメインはグルコアミラーゼ、シクロデキストリン合成酵素の生デンプン吸着ドメインと類似していることが明らかになった。マルトースは活性部位に2分子、C末端ドメインに1分子、また、メインドメインの活性部位とは異なる部位に1分子結合しているのが明らかになった。後者は微生物β-アミラーゼにだけ保存され、今までに例のない新しいデンプン結合サイトであった。2.ダイズβ-アミラーゼの触媒部位の2個のグルタミン酸側鎖をグルタミンに置換した酵素と基質との複合体のX線結晶構造解析を1.9Å分解能で行った結果、Glu380Glnの変異体ではマルトースがサブサイト1-2とサブサイト4-5に結合していることが判明した。これはGln380により活性部位の水素結合の再配置のためGln380の側鎖が触媒水の近くに移動し、サブサイト2に結合するグルコース残基がβアノマーからαアノマーに変化したため立体障害によりサブサイト3にグルコース残基が結合できなくなることによる。この結果はGlu380による水分子の活性化機構を強く示唆するものであった。3.ダイズおよびBacullus cereusβ-アミラーゼの構造解析の結果から両者のキメラ酵素を作製し、植物型でC末端吸着ドメインを有し生デンプン分解活性を示す酵素の開発を試みた。この点について現在、遺伝子の発現を行っている。申請者はβ-アミラーゼの立体構造に基づいた酵素機能変換の可能性を追求するためにダイズβ-アミラーゼ、耐熱化オオムギβ-アミラーゼ、およびBacillus cereus β-アミラーゼのX線結晶構造解析を行い、各酵素の機能上の差違を与える構造を明らかにし、新機能酵素を設計、開発することをめざしている。平成8年度は以下の点について検討を行った。1.サッポロビール株式会社の吉儀らによって開発された耐熱化オオムギβ-アミラーゼの結晶化を試みた結果、正方晶の結晶が得られた。

本酵素のX線結晶構造解析をダイズβ-アミラーゼをモデルとする分子置換法により行い、2.5Å分解能での構造を明らかにすることができた。ダイズとオオムギのβ-アミラーゼは約80%の一次構造上での相同生があり、両者の立体構造もC末端部分を除いてはほぼ同様であることから、7ケ所の部位特異的変異により達成された耐熱性の構造的知見を得ることができた。2.Bacillus cereus起源のβ-アミラーゼの大量発現系を構築するために神戸大学の新家、南森らによってクローニングされた遺伝子を大腸菌での発現ベクターに組み込み、E.coliHMS174での大量発現に成功した。現在、本酵素の精製と結晶化を行なっている。本酵素のX線結晶構造解析により、植物型とは異なる至適pHおよび生澱粉分解活性についての構造的知見が得られるものと期待される。3.ダイズβ-アミラーゼの触媒残基であるGlul86、Glu380の変異体を作製し、変異酵素とマルトースとの複合体のX線結晶構造解析を行なっている。Glu380をGlnに変異した酵素の2.0Å分解能での結果から、Gln380の側鎖の位置はGlnの場合とは異なり、そのため触媒に使われる水分子が酵素に結合できず、結果としてサブサイト3にグルコース残基が結合できなくなることが明らかになった。以上の」ように種々のβ-アミラーゼのX線結晶構造解析を推進し、β-アミラーゼのタンパク質工学に必要な構造機能相関に関する知見を集積しつつある。今後、Bacillus cereusのβ-アミラーゼの構造を明らかにした上で、生澱粉分解活性を有する植物型β-アミラーゼなどの新機能β-アミラーゼの設計を行っていく予定である。申請者はβ-アミラーゼの立体構造に基づいた酵素機能変換の可能性を追求するためにダイズβ-アミラーゼ、耐熱化オオムギβ-アミラーゼ、およびBacullus cereus β-アミラーゼのX線結晶構造解析を行い、各酵素の機能の差違を与える構造上の相違を明らかにし、新機能酵素を設計、開発することを目指している。平成9年度の実施計画について以下の点を明らかにした。1.Bacullus cereus起源のβ-アミラーゼについて、その大量発現系を大腸菌を用いて構築し、大量精製を行った後、酵素の結晶化を行った。硫安とポリエチレングリコール溶液中から得られた結晶はP2_1の空間群に属し、非対称単位あたり1分子の酵素を含み、構造解析に適していた。多重重原子置換法により、初期モデルを構築し、マルトース複合体について2.1Åまで、遊離酵素について2.5Åまでのデータを用いて構造を精密化した。その結果、本酵素はダイズ酵素とほぼ共通するメインドメイン以外にC末端に約100残基のドメインを持ち、このドメインはグルコアミラーゼ、シクロデキストリン合成酵素の生デンプン吸着ドメインと類似していることが明らかになった。マルトースは活性部位に2分子、C末端ドメインに1分子、また、メインドメインの活性部位とは異なる部位に1分子結合しているのが明らかになった。後者は微生物β-アミラーゼにだけ保存され、今までに例のない新しいデンプン結合サイトであった。2.ダイズβ-
パラインフルエンザウイルス病原性の分子遺伝学的研究

牛パラインフルエンザ3型ウイルスの強毒M株は強い多核巨細胞形成(SI)能を持ち、マウスに致死性脳炎を起こす。弱毒SC株はSI能が弱い。しかしSI能を直接担っている膜融合タンパク質(F)は両株でアミノ酸配列が同一である。代わりに赤血球凝集(HA)活性とニュ-ラミニデ-ス(NA)活性を担うHNタンパク質と、ウイルス粒子を裏打ちする膜蛋白(M)の夫々が両株で一アミノ酸異なっている。本研究ではHNとM蛋白質のいずれの変異がSIを左右しているのかを決定するため、M株とSC株のこれらの遺伝子を単独に発現する組換えワクチニアウイルスを作製し、種々の組み合せで細胞に感染させた。その結果、FとM株のHNが同時に発現した時のみ激しいSIが観察され、HNの変異がSIを規定していることが判明した。この変異部位はHNのC末端近くにあり、HAやNAの活性中心とは離れている。しかしこの変異がHNの細胞内輸送の極性を変えている可能性は実験で否定されたので、この部分が細胞膜と何等かの反応を行っていると予想され、その解析を始めている。一方、M株からSC株同様にSIの弱いウイルス株を分離したところ、そのHNはM株のままであり、代わりにFタンパク質に一アミノ酸の変異があった。即ち、パラインフルエンザウイルスによるSIは、FとHNの双方の関与によって起こるものであり、その程度はFとHNのいずれの変異によっても影響される事が判明した。しかしこのウイルス群の更に詳しい病原性の解析には、ウイルスゲノム自体への部位特異的変異導入が必須であり、それにはゲノムRNAに相補的DNAからウイルスを回収する必要がある。このウイルス群を代表するHVJのリボヌクレオタンパク質を導入した細胞に、HVJのポリメレ-スを発現する組換えワクチニアウイルスを感染させたところHVJが回収され、目的に大きく近づいた。これは同時に、この群のウイルスのポリメレ-スを単独で発現させることに成功した世界最初の例であった。牛パラインフルエンザ3型ウィルスのM株は多核巨細胞形成(SI)能が強く、そのためマウス脳内で広く伝幡して致死的であり、SC株はSI能が弱く、そのためマウスに対して弱毒である。しかしM株とSC株ではSI能,即ち膜融合能を直接担っている膜融合(F)蛋白質の遺伝子構造は全く同一であり、その代り赤血球凝集素ニューラミニデース(HN)糖蛋白質で1アミノ酸、又、ウィルスエンベロープを裏打ちしている膜(M)蛋白質でも1アミノ酸が異っていることを既に明らかにしてきた。本年度はこのHN蛋白質とM蛋白質の1アミノ酸づつの違いのいずれによってM株とSC株のSI能が左右されているのかを明らかにしようとした。そのためこれらの遺伝子を単独に発現するワクチニアウィルスベクターを構築し、いろいろな組合せで細胞に感染させ、どの組合せがM株とSC株のSI能を再現するのかを検討した。その結果、F蛋白質単独発現ではSIは起らず、FとM株のHN蛋白質の同時発現で激しいSIが、FとSC株のHN蛋白質の同時発現で軽度のSIが起こることが判明した。HNに対するモノクローナル抗体がこれらのSIの発生を阻止すること、このSIの発生にM株やSC株のM蛋白質が無関係であることも判明した。即ち牛パラインフルエンザ3型ウィルスでは、病原性を左右するSIの誘導にはFとHNの両糖蛋白質が必要であり、SIの程度がHN蛋白質の構造によっても影響されることを明らかにした。

今後、M株とSC株のHN蛋白質の構造上の差異がSI能の程度を左右するメカニズムを解析することが必要であり、又、F蛋白質やHN蛋白質に人工的に変異を導入した場合のSI能の変化を解析し、膜融合に関するFとHNの構造と機能の関係を明らかにする必要がある。これらの研究にウィルスゲノムのCDNAからウィルスを回収する事が重要であり、これにもワクチニアベクターの利用が有効であるとの成績を得た。牛パラインフルエンザ3型ウイルスの強毒M株が強い多核巨細胞(SI)能を持ち、弱毒SC株のSI能が弱い理由を調べてきた。昨年度までの研究で、M株とSC株ではSIに直接関与するとされている膜融合(F)蛋白質のアミノ酸配列は全く同一であり、赤血球凝集ニュ-ラミニデ-ス(HN)蛋白質が1アミノ酸異なっていること、又、組換えワクチニアでこの両株に共通なFとM株のHN(MHN)を同時に細胞で発現させると激しいSIが起り、FとSC株のHN(SCHN)の同時発現ではSIが起らぬことを明らかにした。このHNの変異はC末附近にあり、赤血球凝集やニュ-ラミニデ-スの活性部位ではない。そこでMHNとSCHNでは細胞表面への移行の極性に差がある可能性を考え、MDCK細胞で調べたところ、M株とSC株でFやHNの移行極性に差は無かった。従ってMHNはC末附近の1アミノ酸の変化で細胞表面膜との反応に変化が生じたものと考えられる。このHNのC末附近はヘビの神経毒と一部構造が類似しており、この部分がHN本来のレセプタ-とは異った部位と結合する可能性がある。そこで変異点を含む部分のペプチドを合成し、これに対する抗体がSI形成に及ぼす影響を調べるため、現社ウサギを免疫中である。他方、M株からSI能の弱いSC株タイプに変異したウイルスを分離し、遺伝子解析を行ったところHNはMHNのままであり、代りにFの1アミノ酸が変異していた。このFをワクチニアウイルスに組込み、MHNを持つワクチニアと同時に細胞に感染させたとろ、もはや激しいSI形成は起らなかった。即ち、パラインフルエンザウイルスによるSI形成、従って病原性の発現にはFとHNの両者の関与が必要であり、そのいずれの変異によってもSI形成の程度が変化することが明らかとなった。研究は進展したが解析の難しい段階に来ており、今後一層の努力が必要である。
夜間定時制生徒の学校生活へのよりよい適応のために

ここ数年定時制課程が果たす役割が重要になってきているが、入学した生徒が学校に適応できているのかどうかについては議論の対象とならないことが多い。そこで私は、生徒が学校に適応し前向きな学校生活を送る方策を探るため、愛知県内の夜間定時制高校の中から5校469名を対象に「夜間定時制高校生に関するアンケート」を実施した。アンケート集計は、新入生・上級生別及び男女別に行い、次の5つのことが分かった。(1)ほとんどの生徒が「高校卒業資格」を必要とし、過半数の生徒が「働きながら学ぶこと」を受け入れていてそれなりに学習意欲があること、(2)過半数の生徒が、年配生徒が発揮するリーダーシップを好意的にとらえていること、(3)入学時の学習意欲は上級生になると減退する傾向があり、特に女子では生活面での甘さも出てくること、(4)就業率は約65%で、就業している生徒の生活においては、新入生では男女とも「仕事」に力を入れていて、上級生になると「趣味や特技」にも時間を割くようになること、(5)多くの生徒は地域社会とつながろうとする意識が低いこと。これらのことを踏まえて、次のことを提言する。1「学び直し教育」の組織的実践1年次において、組織的な体制のもとで義務教育段階における基礎基本を徹底的に身に付けさせる。2年配者の積極的受け入れ聴講生制度を活用したり、近隣地域の「広報」を利用したりして入学生募集について周知する。3資格取得支援の充実と女子生徒の学習指導学校全体で資格試験を奨励し、学校と家庭が連携して生徒(特に女子生徒)の知的好奇心の向上を図る。4就業率の向上を目指し、早期からのハローワークとの連携成長段階に応じた労働体験を重視し、ハローワークと連携を深め学校近辺の就業場所の開拓を行う。5自己肯定感の育成と学校への帰属意識の醸成生徒の特技や得意な面を生かし、学校の一員として地域のイベントに参加する機会を与える。