hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二枚貝の斃死原因赤潮藻Heterocapsaの赤潮形成阻止のための分子生態学的研究

本研究は、二枚貝を特異的に斃死させ、水産業に大きな被害を与えているヘテロカプサによる赤潮を、赤潮海域に分布する「赤潮原因藻を殺藻・溶藻する海洋細菌(殺藻細菌)」によって防除するバイオレメディエーション技術の開発の基礎を確立することを目的とした。まず、広島県江田島湾において、表層水・低層水・低泥を対象にヘテロカプサ殺藻細菌の細菌数の調査と殺藻細菌の分離を行った。その結果、調査期間を通じてヘテロカプサ殺藻細菌数は非常に低い値で推移したが、ハテロカプサ殺藻細菌を1株分離することに成功した。本株(EHK-1株)は、プロテオバクテリアγサブグループに属する海洋細菌であり、これまで分離された殺藻細菌とは異なる新奇な細菌であることが示された。EHK-1株は、ヘテロカプサ栄養細胞・テンポラリーシストのどちらも完全に溶藻する強力な殺藻活性を示し、その殺藻機構は、熱に安定な分子量3,000未満の殺藻物質によってヘテロカプサを溶藻するものであることを明らかにした。さらに、殺藻細菌を用いた赤潮防除の実用化に向けた技術開発を行った。これまでの研究により、殺藻細菌は高密度で存在するときにのみ殺藻が観察されることが示されている。したがって、殺藻細菌を現場に散布しても、速やかに拡散してしまい殺藻能力が発揮できないと予想される。そこで、殺藻細菌を高分子ゲルに包括固定化することで、作用させたい海域に高密度で保持できるのではないかと考え、包括固定化法の適用について検討した。その結果、寒天ゲルに殺藻細菌を包括固定した場合、殺藻能力を失わず、またゲル中で長期間生存することが示された。このことから、包括固定化法が殺藻細菌を現場に適用する際の有効なツールになりうることが明らかとなった。平成11年度は、Heterocapsa circularisquama発生海域である広島県江田島湾(6月10月)及び非発生海域である広島県因島沖(5月10月)において海水、底泥を採取し、H.circularisquama殺藻細菌の探索を行った。その結果、(1)H.circularisquama赤潮の発生、非発生に関わらずH.circularisquama殺藻細菌数は低い値で推移し、本年度は本藻の消長と殺藻細菌数との間に関連性は認められなかった。(2)江田島湾の表層水中からH.circularisquama殺藻細菌を1株分離することに成功した。本株(EHK-1)は、H.circularisquamaを宿主として殺藻する世界で初めての殺藻細菌である。(3)EHK-1は、初期接種密度10^6cells/mlでH.circularisquamaを2時間以内に殺藻する強力な殺藻活性を持つグラム陰性の長桿菌であった。EHK-1の16SrRNA遺伝子の塩基配列のほぼ全長を決定し、分子系統解析によりProteobacteria-ν-subdivisionに属すること、およびこれまで分離された他の赤潮藻の殺藻細菌とは全く異なる系統の細菌であることを明らかにした。(4)EHK-1は、菌体外に分子量3000以下の低分子物質を放出してH.circularisquamaを殺藻する「殺藻物質分泌型」の殺藻作菌であった。来年度は、(1)引き続いて、現場におけるH.circularisquamaと殺藻細菌の関係を解明するために、江田島湾において調査を行う。

(2)EHK-1によるH.circularisquamaの殺藻機構を宿主藻類と殺藻細菌の両面から解明する。(3)新たなH.circularisquama殺藻細菌の分離を行い、それら殺藻細菌に特異的DNAマーカーの開発を行う。平成12年度は、Heterocapsa circularisquama発生海域である広島県江田島湾(6月10月)において海水を採取し、H.circularisquama殺藻細菌の探索を行った。また、平成11年度に分離した殺藻細菌EHK-1によるH.circularisquamaの殺藻機構の検討を行った。得られた成果の概要を以下に示す。1.平成12年度も11年度と同様、環境海水中のH.circularisquama殺藻細菌数はH.circularisquama赤潮の発生、非発生に関わらず低い値で推移し、本藻の消長と殺藻細菌数との間の関連性は低く、環境水中における本藻殺藻細菌数は極めて少ないことがわかった。2.江田島湾の表層水中から分離した殺藻細菌EHK-1は、「殺藻物質分泌型」の殺藻細菌であり、その殺藻物質は分子量3000以下で熱に安定であること、および増殖ステージに関わらず殺藻物質を常に産生していることが明らかになった。3.H.circularisquamaと殺藻細菌EHK-1の二者培養ろ液を、酢酸エチルで抽出し、ヘキサン/90%メタノールで分画したところ、90%メタノール画分に殺藻活性が確認された。活性画分を、Wakogel100C18を用いたカラムクロマトグラフィー、Inertsil ODS-3を用いたHPLCによりさらに分析し、3つの活性ピークが存在することを明らかにした。これらの殺藻活性を示すピークは、新奇な殺藻物質であることが示唆された。来年度は、これらの成果をもとに、EHK-1によるH.circularisquamaの殺藻機構を、殺藻細菌が産生する殺藻物質と、殺藻物質による藻類の死滅機構の両面から解明し、H.circularisquama赤潮の効率的阻止に向けての基礎を確立する。平成13年度は,本課題の成果として平成11年度に分離した殺藻細菌EHK-1株によるH.circularisquamaの殺藻機構の解析,および,殺藻細菌による赤潮防除の実用化に向けての基礎となる包括固定化法の検討を行った。前年度,H.circularisquamaとEHK-1株の二者培養ろ液中に殺藻物質が存在することを明らかにしたが,その由来がEHK1株であることを確認した。EHK-1株の単者培養液を,二者培養液から殺藻物質を分離した手順で分画したところ,二者培養液において殺藻活性が存在した同じ画分に活性が存在した。2.細菌による殺藻機構の違いについて1.の結果より,EHK-1株は,自身の生産する低分子の殺藻物質によってH.circularisquamaを殺藻する機構を持つと考えられるが,珪藻殺藻細菌Pseudoalteromonas sp. A25株は,プロテアーゼ様の物質で珪藻の自殺物質を誘導する殺藻機構を持つことが示唆された。これら殺藻機構の違いは,特定の有害赤潮藻を選択的に殺滅する際に有効に利用できると考えられる。3.殺藻細菌の包括固定化法による赤潮防除法の開発の試み殺藻細菌を現場に適用する際に,細菌の拡散が問題となるが,殺藻細菌を包括固定化することで効果的な利用が可能になると考えられる。
ダイバーシティにおけるワークプレイス研究－多様性の中で、共に働くこと

本研究では、エスノメソドロジー・会話分析の知見を用いた「ワークプレイス研究」の射程を、障害者や非母語話者と共にある、ダイバーシティにおけるさまざまな共同作業の実践に適用することにより、その社会的相互行為やローカルな秩序における「実践の論理」を明らかにすることを目的とする。そのうえで、本研究は「共に働く実践」の「ワークプレイス研究」によって、同質性を前提とした社会組織を考察するのではなく、多様性のある現場を前提として、それをいかに共同作業の実践の中で、偏在するリソース(言語、身体、道具、環境など)を調整しながら共に働いていくかという現代的課題に取り組むものである。
精密質量分析を用いた農薬塩素処理物からの変異原性物質の探索

農薬は、田畑などで散布された後、一部が加水分解などを受けて変化体(Pesticide Transformation Products in Water environments: PTPWs)となる。PTPWsは、浄水場で塩素処理を受けて、さらなる変化体を生成する可能性がある。生成した変化体の中には、変異原性を示す物質が存在すると考えられる。そこで本研究では、有機リン系殺虫剤fenitrothionのPTPWである3-methyl-4-nitrophenol (3M4NP)を塩素処理した際に生成する副生成物を探索し、その一部を同定した。本研究では、殺虫剤fenitrothionの加水分解物である3-methyl-4-nitrophenol(3M4NP)が浄水場で塩素処理された際に生成する物質を検討している。同定された物質の毒性(変異原性)を測定することによって、浄水場で農薬由来の変異原性物質が生成され得ることを証明することを目的としている。昨年度、3M4NPを塩素処理したサンプル中に含まれている物質を高分解能のLC/MSを用いて探索した結果、chloro-5-hydroxy-2-nitrobenzoic acid(C5H2NB)などの生成が示唆され、衝突誘起解離(CID)により構造を解析したが結論には至らなかった。そこで本年度は、LC分離を実施して構造解析を進めた。その結果、C5H2NBは4つ以上の異性体が存在していることが示唆された。次に、2-picolylamine(PA)を用いて選択的誘導体化を実施し、官能基情報を得ることとした。その結果、質量誤差-2.3820.305 ppmでm/z 306.0287のイオンが塩素、炭素および窒素の天然同位体ピークを伴って観察され、いくつかの異性体はC5H2NBであることが明らかになった。残りの同位体がベンズアルデヒドであると予想し、2,4-dinitro-phenyl-hydrazine(DNPH)によるformyl groupの誘導体化を行い、benzaldehydeの存在を検討した。しかし、誘導体化方法、イオン化方法、移動相の非水化を検討してもbenzaldehydeは検出されなかった。このことから、3M4NP塩素処理物中のm/z 215.9705にはCD2NBは含まれず、C5H2NBとその異性体から構成されていると考えられる。変異原性物質の単離は、異なる分離モードのLCカラムを用いた多次元LC分離により行った。得られた画分の純度をLC/MSで検討した結果、ほぼ単離を達成できたため、1H-NMRの測定を実施した。しかし、積算回数の増加などを行っても、有意な強度で信号を得ることができず、収率不足でった。C5H2NBの合成を検討したが、実験時の安全上の問題から合成を断念した。C5H2NB以外のイオンの検討については、様々な種類の多変量解析を検討し、3M4NPを塩素処理した際に発現する変異原性強度と相関関係の強いイオンを発見することができた。3M4NPを塩素処理したサンプル中に含まれている物質を高分解能のLC/MSを用いて探索した結果、異なる質量電荷比の物質が数物質発見された。本年度は、イオン強度が高く、比較的高濃度で存在している可能性がある4つのイオンに着目して解析を行った。精密質量分析の結果から、chloro-5-hydroxy-2-nitrobenzoic acid(C5H2NB)などの生成が示唆された。そこで、C5H2NBと予想されたイオンを衝突誘起解離(CID)により開裂させ、フラグメントイオンのパターンを解析した。C5H2NBの市販が確認されなかったため、5-ヒドロキシ-2-ニトロ安息香酸(5H2NB)を購入し、そのフラグメントイオンのパターンをあわせて解析した。その結果、当該イオンはC5H2NBであることが支持された。5H2NBの変異原性および変異原性物質生成(MFP)を測定した。その結果、5H2NBから有意な変異原性は確認されなかったが、有意なMFPが観察された。5H2NBのMFPの比活性と3M4NPのMFPの比活性をモル基準で比較したところ、ほぼ同程度の比活性となった。一方、3M4NPを塩素処理したサンプル中に含まれている変異原性物質の分画・単離を目指し、リサイクル分取液体クロマトグラフィーを用いた実験を行ったが、変異原性活性の回収率が低く、今後の課題となった。そこで本年度は、多次元分取によりC5H2NBの単離・精製を試みたが、3M4NPの塩素処理におけるC5H2NBの収率が低く、単離・精製することができなかった。

このため、C5H2NB以外の塩素処理副生成物の探索を行った結果、negative ion modeの測定においてm/z219.9574のイオンの生成が確認され、精密質量解析と天然同位体パターン解析の結果、dichloro-3-methyl-4-nitrophenolであった。そこで、3M4NPの部分電荷をGaussian 09W(B3LYP/6-31G(d))で推定して塩素の置換位置を推定したところ、2,6-dichloro-3-methyl-4-nitrophenolと推定され、1H-NMRによりこれを確認した。さらに、2,6-dichloro-3-methyl-4-nitrophenolの試薬が市販されていたため、LC/MSにより衝突誘起解離実験を行い、カラムリテンションタイムおよび2nd generation production spectrumが一致すること、1H-NMRが一致することを確認して同定に至った。同物質の変異原性を評価したところ非変異原であったが、本技術で塩素処理副生成物の同定が可能なことを証明することができた。環境化学平成24年度の計画は、1)当該変異原性物質の分子式候補を絞り込む、2)HPLCにおける分離条件を検討する、3)APCIで分析することの必要性を検討する、4)構造式を推定することを主な目標として掲げていた。平成23年度および平成24年度において、上記の目標をすべて達成した。また、平成25年度の計画である5)CIDによる確認については、平成24年度で達成した。さらに、当初計画にはなかった選択的誘導体化を行い、成果を得ている。以上より、当初の計画以上に進展していると判断した。目標としていた変異原性物質の単離や合成には至っていないが、予定していた検討はすべて実施することができた。さらに、多次元LC分離や1H-NMRの測定など、当初検討対象としていなかった、より寄与率が高いイオンの検討など、年度途中で新たに発生した検討項目、新たな着想による問題回避を試みたため、おおむね順調に進展していると判断した。平成23年度の計画は、1) 3M4NP塩素処理サンプルのリサイクル分取液体クロマトグラフィーによる分画、2)各画分の変異原性強度のAmes試験による評価(変異原性物質が含まれているフラクションの特定)である。本年度は、以上の検討に加えて、平成24年度の研究計画である3)当該変異原性物質の分子式候補の絞り込み、平成25年度の研究計画である4) CIDによる解析を前倒しして実施した。変異原性物質の単離には至っていないので、その単離を目指す。同時に、生成が予想されているC5H2NBの合成を試みる。以上のように標品の入手を試み、NMRによる生成・精製の確認を行った後、標品に基づき構造を決定する、また、標品の変異原性試験とサンプル中の濃度測定を行い、3M4NPの変異原性物質生成能に対する当該物質の寄与率を求めることを目指す。さらに、C5H2NB以外のイオンについて検討を進める。精製不足・回収率不足が問題となったため、これを解決すべく多回精製を実施する。また、衝突断面積の測定に目処がたったため、衝突断面積の測定による構造推定を検討する。平成23年度の研究おいて、リサイクル分取液体クロマトグラフィーによる変異原性物質の分画を行った際、変異原性活性の回収率が低いことが課題としてあげられた。また、先行して実施したLC/MSを用いた変異原性物質の探索において、未検討のイオンが存在した。
大域最適化手法による分数計画問題の実用的なアルゴリズムに関する研究

研究発表(裏)に順でまとめる.2.(Linear Programs with an Additional Separable Concave)分離可能な凹関数で定義される実行可能領域の上で,線形関数の最大化を考えた.我々はその分離可能な関数より小さくなる線形近似線形関数を生成し,ある領域の上での緩和問題を作成する.これにより,元問題の上界値が得られる.分子限定法による収束する点列を生成し,問題を解決する.この問題の双対問題を考え,パラメータを導入する.その双対問題がパラメータに対して単調であるので,双対問題の値がゼロになるようにアルゴリズムも提案した.Falk-Solandの分子限定法を大いに参考している.4.(Fractional Programming : The Sun-of-Ratios Case)幾つかの分数の和の最適化手法をまとめる研究である.分数計画問題の中でももっとも困難とされている問題に対する様々な解法が提案されている.その中に体表的なアルゴリズムを分析し,それぞれの利点短点を試みである.研究発表(裏)に順でまとめる.2.(Linear Programs with an Additional Separable Concave)分離可能な凹関数で定義される実行可能領域の上で,線形関数の最大化を考えた.我々はその分離可能な関数より小さくなる線形近似線形関数を生成し,ある領域の上での緩和問題を作成する.これにより,元問題の上界値が得られる.分子限定法による収束する点列を生成し,問題を解決する.この問題の双対問題を考え,パラメータを導入する.その双対問題がパラメータに対して単調であるので,双対問題の値がゼロになるようにアルゴリズムも提案した.Falk-Solandの分子限定法を大いに参考している.4.(Fractional Programming : The Sun-of-Ratios Case)幾つかの分数の和の最適化手法をまとめる研究である.分数計画問題の中でももっとも困難とされている問題に対する様々な解法が提案されている.その中に体表的なアルゴリズムを分析し,それぞれの利点短点を試みである.本研究は次の最適化問題に関して実用的な算法とその応用問題を研究する:ご存知のように分数計画の研究は1962年Charnes-Cooper(1962)の論文以来今日まで一千あまりの研究論文が発表された(Schaible(1995))が、その中に殆どは分数と分母共に線形関数であることと、分数項はただ一つであることを仮定している。近年、計算機の進歩に伴い、分数と分母共に非線形関数に対しての研究論文も僅かであるが見られることになった。分数項数は通常問題の次元に変換して処理するため、現段階では分数と分母が特徴な関数(例えば凸関数)であることを仮定した上で、実用的な時間内で最適化を解く事ができるのはその分数項数が10-20程度である。これに対して本研究では目的関数にある分数項をd.c.関数に変換して等価問題を作って、等価問題は(n+α)(nは問題(1)にある変数xの次元、αは等価変換に必要とする追加変数の数で、10以下の定数と考える)次元の空間の上でアルゴリズムが提案している。その結果、いままで、$p$(分数項の数)次元空間の等価問題に置き換えより、n<<pの場合問題(1)に対して効率なアルゴリズムを設計することができる。その効率性についてただいま計算機実験を行っているところである。まだ、共同研究で一般の分数計画問題に対しても双対性と最適条件も記べた。幾つかの結果は今後論文で発表する。研究発表(裏)に順でまとめる.2.(Linear Programs with an Additional Separable Concave)分離可能な凹関数で定義される実行可能領域の上で,線形関数の最大化を考えだ.我々はその分離可能な関数より小さくなる線形近似線形関数を生成し,ある領域の上での緩和問題を作成する.これにより,元問題の上界値が得られる.分子限定法による収束する点列を生成し,問題を解決する.この問題の双対問題を考え,パラメータを導入する.その双対問題がパラメータに対して単調であるので,双対問題の値がゼロになるようにアルゴリズムも提案した.Falk-Solandの分子限定法を大いに参考している.4.(Fractional Programming : The Sum-of-Ratios Case)幾つかの分数の和の最適化手法をまとめる研究である.分数計画問題の中でももっとも困難とされている問題に対する様々な解法が提案されている.その中に体表的なアルゴリズムを分析し,それぞれの利点短点を試みである.
セラミックス一体型多極キッカー入射技術の次世代極低エミッタンスリング適用開発

近年,極低エミッタンス放射光リングの計画・建設が国内外で進んでいる。これまでと比べ,エミッタンスを1桁以上小さくし,回折限界領域まで輝度を高めた高コヒーレンス度の放射光を用い,これまでにない高精度・高空間分解能の実験を可能にする。このリングではビームの光学系を決める短い磁極長で強い電磁石を数多く配置する必要があり,その狭小スペースに適合し,更に蓄積ビームの振動を起こさずリング性能を損なわない,ビーム入射用キッカーの開発が必要である。本研究は,世界初となるセラミックスチェンバ壁にコイルを埋め込んだ一体型多極キッカーによる,多極パルス電磁石入射の有効性の実証を目的とする。
動的計画法による次世代最適経路探索アルゴリズムの研究

最適経路探索は自動車ナビゲーションシステムの重要な機能である。従来では経路探索を行う場合は出発地と目的地を考慮し経路探索を行うことが多い。しかし、利用者によっては特定の場所を通りたくないや複数の立ち寄り場所を経由して目的地まで行きたいなど様々な要望がある。本研究ではこのような利用者のニーズに対応するための経路探索アルゴリズムの開発をしている。特定の場所を通りたくない問題は簡単に対応できるために、複数の立ち寄りをして目的地まで行く経路探索を中心にして研究を行った。複数の立ち寄り地を経由して目的地まで行く経路を効率的に探索する手法を提案している。シミュレーションで提案手法の性能評価を行い、提案手法が従来の手法より効率的にいい解を見つけることができることを明らかにした。観測した道路交通は渋滞回避や本研究で提案しているボルツマン分布を用いた経路探索などさまざまなことに応用している。しかし、機械的や通信的などさまざまな理由で観測した情報の中に欠陥データが存在する。観測した道路交通情報をいろいろなことに効率的に応用展開するために欠陥データでできた穴を埋める必要がある。そこで、本研究では欠陥している交通量を推測する手法を提案している。提案手法では、交通流バランスに基づき遺伝的アルゴリズムで複数の欠陥交通量データを同時に推測する手法を提案している。提案手法は交通シミュレータを用いて性能評価を行い、平均的に実際の交通量と近い値を推測することができることを明らかにした。これらの研究で得た結果を国際学会で発表をした。
慢性疼痛(線維筋痛症)における脳機能画像および睡眠に関する研究

目的:線維筋痛症患者の機序と関連する脳領域の同定する。方法:アメリカリウマチ学会による線維筋痛症の診断基準を満たす10名の患者を対象とした。患者群と年齢のマッチした健常者10名との間でSPM解析を行った。結果:線維筋痛症では中側頭回での代謝の低下が認められた。考察:今回の結果は、線維筋痛症での疼痛機序として示されていた体性感覚野ではなく、認知機能に関する領域の関与が示唆された。線維筋痛症患者群と正常コントロール群に対して^<99m>Tc-ECDを用いたPatlakプロット法に基づいた測定法にて脳血流シンチグラフィー(SPECT)を施行し、SPM解析を加え検討を行った。これまで線維筋痛症のSPECT研究の報告はわずかであり、一貫した結果は得られていない。今回、SPECT結果と薬物治療効果を含めた臨床症状との相関解析を行い、今まで注目されていなかった脳内のdefault mode network領域の関与を示唆する結果を得ており、Arthritis Research & therapyに論文発表を行った。これは、これまでの慢性疼痛(線維筋痛症)に対する考え方を一新するものであり、大変重要かつ有意義であった。また現在、線維筋痛症患者群と正常コントロール群に対して、PET (positron emission tomography)を施行し、^<18>F-FDGを用いて糖代謝を測定したデータを収集中であり、さらに、対象患者群に対し、PETと同時に疼痛スケール、睡眠質問票、眠気尺度を用いて、痛みと睡眠状態の評価を行なっており、疼痛に対する治療前後での脳機能画像所見と睡眠状態の変化に関するデータ収集を行っている。これまでの研究で得た知見とあわせ、解析していくことで、線維筋痛症の病態解明につながる研究を行っていく予定である。今後は痛みを伴った糖尿病性神経障害、帯状疱疹後疼痛、などの他の慢性疼痛患者群についてもデータを収集し、同様に解析していく予定である。線維筋痛症は全身の疼痛を主症状として不眠、全身の疲労感や種々の精神神経症状を伴う原因不明の疾患である。しかし、一般的に用いられている米国リウマチ学会(ACR)の線維筋痛症の診断基準のみでは診断が困難であるためと考えられる。そこで補助診断として客観的データである画像診断を用いることが可能となれば臨床現場での混乱を防ぎ、効率的な診断システムが構築出来、病態解明につながると考えられたため、本研究を施行した。ACRの1990年の診断基準を満たした線維筋痛症患者群と正常コントロール群に対して^<99m>Tc-ECDを用いたPatlakプロット法に基づいた測定法にて脳血流シンチグラプィー(SPECT)を施行し、SPM解析を加え検討を行った。今回、SPECT結果と薬物治療効果を含めた臨床症状との相関解析を行い、今まで注目されていなかった脳内のdefault mode network領域の関与を示唆する結果を得ており、Arthritis Research&therapyに論文発表を行った。また、ACRの1990年の診断基準を満たした線維筋痛症患者群と正常コントロール群に対して、PET(positron emission tomography)を施行し、^<18>F-FDGを用いて糖代謝を測定したデータにSPM解析を加え検討を行った。これまで線維筋痛症のPET研究の報告はわずかであり、一貫した結果は得られていない。本研究では今まで注目されていなかった新たな領域である、中側頭回の関与を示唆する結果を得ており、これをまとめた論文は現在投稿中である。さらに、アメリカリウマチ学会で2010年に出された予備診断基準の本邦での検証を行い、その、有用性を確認し、modern rheumatologyに論文発表し、第3回線維筋痛症学会で発表した。
細菌リポ蛋白質の輸送装置による基質認識機構の解明

グラム陰性細菌のリポ蛋白質は細胞質で前駆体として合成され、Sec膜透過装置の作用で内膜を透過した後、内膜に存在する酵素群の作用で成熟体となる。Lntはリポ蛋白質生合成の最終段階でアミノ末端システインのアミノ基にアシル鎖を付加する酵素である。Lntはグラム陰性細菌の生育に必須であると考えられていたが、本研究ではリポ蛋白質特異的ABCトランスポーターLolCDEを過剰発現させることにより、lnt遺伝子を欠失する大腸菌を作製することに成功し、アミノ末端にアシル鎖を持たない「アポリポ蛋白質」とリポ蛋白質輸送因子(Lol因子)との相互作用を解析した。リポ蛋白質は細胞質で前駆体として合成され、Sec膜透過装置の作用で内膜を透過した後、内膜に存在する3つの酵素(Lgt、LspA、Lnt)の作用で成熟体となる。Lntはリポ蛋白質のアミノ末端システインのアミノ基にアシル鎖を付加する反応を触媒する。Lntは大腸菌の生育に必須であるが、主要外膜リポ蛋白質Lppを欠損する大腸菌変異株においてLolCDEを過剰発現したところ、lnt遺伝子を欠失する大腸菌(Δlnt株)を構築することができた。この株で発現させたリポ蛋白質は分子量が小さく、エドマン分解によるアミノ酸配列の分析が可能であったことから、アポリポ蛋白質と確認された。Δlnt株の膜画分をショ糖密度勾配遠心法によって内膜と外膜を分画し、イムノブロッティングにより検出したところ、アポリポ蛋白質は正常に外膜に局在していたが、一過的に過剰発現させたapoLppは大部分が内膜に蓄積した。Δlnt株をスフェロプラスト化した後にリポ蛋白質を合成させ、LolAに依存して培地中に遊離するリポ蛋白質を検出したところ、アポリポ蛋白質の内膜からの遊離効率は著しく低下していた。大腸菌の内膜を調製しATP非存在下でLolCDEを膜から可溶化し精製すると、輸送途中のリポ蛋白質を結合したLolCDEが得られることが知られるが、アポリポ蛋白質を結合したLolCDEは検出されなかった。ことのことからLolCDEのアポリポ蛋白質に対する親和性は低いことがわかった。以上の結果から、グラム陰性細菌のリポ蛋白質はLntによるアミノ末端のアシル化を受けることでLolCDEに対する親和性が格段に高くなり、効率よく外膜に輸送されるようになると考えられる。グラム陰性細菌は細胞質膜(内膜)の外側にもう一つの膜構造(外膜)を有している。外膜を構成する因子はすべて細胞質または内膜上で合成され、専用の輸送装置の働きで外膜へと輸送される。外膜はグラム陰性細菌の生存戦略に極めて重要な器官であり、これらの輸送装置は生育に必須である。外膜構成因子の一つであるリポ蛋白質は細胞質で前駆体として合成され、Sec膜透過装置の作用で内膜を透過した後、内膜に存在する3つの酵素(Lgt、LspA、Lnt)の作用で成熟体となる。LppはC末端のLysを介してペプチドグリカンと共有結合しており、細胞表層の頑健性維持に貢献している。Lppの内膜への誤局在は、内膜とペプチドグリカンがLppを介して融合することにより、致死的に働くことが知られている。Lppとペプチドグリカンの共有結合の形成を触媒する酵素(L-D-transpeptidase)は3種存在し、それぞれybiS,erfK,ycfS遺伝子によってコードされている。ybiS,erfK,ycfS三重欠失株においてLolCDEを過剰発現したところ、Δlnt株を構築することができた。ウエスタンブロッティングの結果、この株におけるLppの量は野生株に匹敵し、Tricine-SDS-PAGEでの泳動度は増大していることがわかった。これらの結果から、Lntを不活化した際の主要な毒性は、誤局在したLppとペプチドグリカンの共有結合からもたらされることが示唆された。
レーザー照射実験用高精度ダイヤモンドライクカーボン組成制御技術の開発

高強度レーザーを用いた実験においてターゲットとしてダイヤモンドライクカーボン(DLC)が注目されてきている。本研究ではレーザー照射実験の要求を満たす高精度DLCの組成制御技術を開発することを目的とした。研究成果として、材料ガスを変えることでDLCの局所結晶構造が変化することを見だした他、基板の金属を変えることで成膜後のDLCの安定性が増すことを見出した。さらに成膜後のDLCにYAGレーザーを照射することでグラファイト成分を増やすことができることが明らかとなった。これらは成膜中でも成膜後でもDLCの組成を変化させられることを示しており、より高度な局所結晶構造の制御の可能性が示唆されたといえる。高速点火核融合実験や電子加速実験など、高強度レーザーを用いた実験においてターゲットとしてダイヤモンドライクカーボン(DLC)が注目されてきている。DLCは水素含有量、結晶度といった組成パラメータが変わるとその性質が全く異なるため、正確なレーザー照射実験を行うためには、用いるターゲットの組成を制御する必要がある。しかしながらレーザー照射実験用ターゲットに要求される条件を満たしつつ、組成まで制御する技術はまだ確立されていない。そこで本研究ではDLCの組成制御技術を開発し、レーザー照射実験の要求を満たす高精度DLCターゲットを製作することを目的としている。本研究ではプラズマイオン注入成膜法と呼ばれる方法によりDLCを製作する。これは電極に基板を取り付け、直接負パルス電圧を印加して炭素イオンを注入する方法である。そのため、印加電圧、印加パルス長なども組成制御パラメータとなるのか確認する必要がある。平成26年度は成膜装置パラメータによるDLCの組成変化について調べた。印加電圧、印加パルス長などを変化させてDLC膜を作製し、吸収端近傍X線吸収微細構造法によりその性質を計測した。その結果、印加電圧や材料ガスによる組成変化は見られなかったが、トルエンを材料ガスとして使用し、パルス繰り返し周波数を1キロヘルツから2キロヘルツに増加させると、よりグラファイトライクなDLCが出来ている可能性を示唆するデータが得られた。この時炭素と水素の結合ピークも上昇しており、水素結合が増えたことでグラファイトライクな組成に変化したのではないかと考えられる。これは外部パラメータによる組成制御の可能性を示す重要な結果である。高速点火核融合実験の燃料シェルにとりつけるターゲットの材料候補としてダイヤモンドライクカーボン(DLC)が注目されてきている。DLCは金などに比べ電子が少ない低Z材料でありながら強度があり、高速電子を妨げることなく燃料コアに届けることが期待されるからである。DLCは水素含有量、結晶度といった組成パラメータが変わるとその性質が変わるため、正確な実験を行うためには用いるターゲットの組成を制御する必要がある。そこで本研究ではプラズマイオン注入成膜法を用い、DLCの組成を制御しながら量産可能なターゲット製作法の確立を目指している。昨年度は成膜ガスを変えることでDLCの局所結晶構造が変化することを見出した。DLCの性質を決定するためには結晶構造に加えて水素含有量の計測が不可欠であるが、今年度は研究協力を得てERDA(反跳散乱分析)法を用いた水素含有量の計測を行うことができた。その結果、水素量は16at%であり、成膜されたDLCはアモルファスカーボンに分類されることがわかった。さらに今年度は成膜法の改良を試み、基板の金属を変えることで成膜後のDLCの安定性が増すことを見出した。これによりターゲットの歩留りが向上し、より量産が容易となってきた。昨年度行うことができなかった水素含有量の計測を行うことができ、成膜したDLCの性質を決定することができた。またターゲット製作の歩留まり向上のための改善策が成功した。しかしながら装置改造の時間がとれず、プラズマパラメータの計測はできなかった。成膜ガスを変えることでDLCの局所結晶構造が変化することを見だした他、ERDA(反跳散乱分析)法により水素含有量を計測し、成膜されたDLCはアモルファスカーボンに分類されることを明らかにした。また基板の金属を変えることで成膜後のDLCの安定性が増し、基板のエッチングも容易となり、ターゲット製作の歩留りを向上させることができた。最終年度はDLCにYAGレーザーの基本波を照射して組成の変化を調べた。ラマン分光による測定の結果、DLCにレーザーを照射することでグラファイト成分を増やすことができることが明らかとなった。これは成膜後でもDLCの組成を変化させられることを示しており、より高度な局所結晶構造の制御の可能性が示唆されたといえる。

研究成果として、材料ガスを変えることでDLCの局所結晶構造が変化することを見だした他、基板の金属を変えることで成膜後のDLCの安定性が増すことを見出した。さらに成膜後のDLCにYAGレーザーを照射することでグラファイト成分を増やすことができることが明らかとなった。これらは成膜中でも成膜後でもDLCの組成を変化させられることを示しており、より高度な局所結晶構造の制御の可能性が示唆されたといえる。外部装置パラメータによるDLCの組成変化については研究を進めることができ、トルエン使用時に繰り返し周波数を上げることで通常の場合よりグラファイトライクなDLCが出来る可能性を見だした。しかしながら水素含有量計測は学外施設で行うために思うようにマシンタイムが得られず、有用なデータを得られなかった。これについては平成27年度中に、再度計測を行うことでデータを得たいと考えている。またプラズマパラメータ計測は装置改造の時間がとれずに実行できなかったが、平成27年度は行いたいと考えている。時間に限りがあるがプラズマパラメータの計測とラマン計測での組成分析のクロスチェックの少なくともどちらかは行いたいと考えている。大阪大学の高速点火実験の状況から実際のレーザー照射実験を年度内に実施することは難しいと考えられるが、状況が整い次第実施できるよう、ターゲット製作の方法を確立するよう努力する。プラズマ物理学平成26年度に見出した組成変化について、再度ラマン計測でクロスチェックを行う。また水素含有量の計測を行う。分光法によるプラズマパラメータの計測を行う。研究結果を踏まえ、実際にレーザー照射実験用ターゲットを製作する。また製作したターゲットを用い、高出力レーザーによる照射実験を行う。ターゲットへのレーザー照射で発生した電子を電子スペクトロメータで、X線をX線フレーミングカメラ、X線ストリークカメラで計測する。今年度は消耗品については他予算を使用したこと、また予定していた装置改良を行えなかったため、物品費の計上がなく、予定よりも使用額が減少した。計画時には中古の電子顕微鏡を購入する予定にしていたが、販売業者が動作保証出来ないとのことで安定した運用は出来ないと判断し、購入を断念した。代わりに新品でデジタルズーム顕微鏡制御ソフトを購入することとしたため、当初予定よりも物品費の支出が減少した。なおデジタルズーム顕微鏡を運用することにより研究への支障は最低限に抑えられた。プラズマパラメータを計測するための新たなフランジ類の購入や新たな実験環境の構築のために使用する予定である。プラズマパラメータ測定のために装置を改造する費用としたい。また水素含有量の計測は当大学では行えないため、学外で計測を行うための旅費としたい。
開発途上国における住民の治療選択行動に関する実証分析－疫学経済学からのアプローチ

パプアニューギニア村落部にて世帯調査を行い、医療サービス利用に影響を与える因子を混合ロジットモデル、マルチレベルロジットモデル、傾向スコアマッチングにて分析した。その結果、(1)小児の急性症状出現時には、重症度、咳の有無、医療施設までの歩行距離、受診にかかる総費用が関連していた。(2)三日熱マラリアの根治治療実施には医療施設までの交通距離のみが影響していた。(3)新マラリア診断治療ガイドラインの導入による医療サービス利用増加は見られなかった。調査地域における医療サービス利用向上のためには、受診にかかる費用の公費負担やビレッジヘルスボランティアなど徒歩圏内の医療サービスを強化する政策が望まれる。治療可能な急性感染症は開発途上国小児の主要な死亡原因となっており、早期有効治療を可能にする医療サービス提供および住民側の利用度向上が対策の根幹である。近年国際機関の協力の下に、開発途上国の一般住民に短期研修を行いヘルスボランティアの養成プログラムが進められている。これは、コモンな急性感染症に限って診断治療を許可するものであり、医療アクセスの改善を通じて早期有効治療を目指したものである。これらの医療サービスの利用度向上のためには、住民の治療選択行動の理解が不可欠であり、医療サービスを利用する住民の行動を医療サービス需要と捉えた離散選択モデルによる経済学的分析が有効である。また、患者の治療選択行動には、個人特性のみならず地域特性が関与していると考えられ、社会疫学分野で用いられるマルチレベル分析を併用することでより正確な要因分析が可能となる。本研究の目的は、開発途上国のコホート集団を対象として実証データを収集し、疫学と経済学の手法を併せて用いることで住民の治療選択行動さらには早期有効治療、疾病の有無に影響を与える因子を解明し、効果的な政策提言を行うことである。パプアニューギニアの調査地区では、主要な医療サービスの選択肢として、ヘルスセンター、エイドポスト、ヘルスボランティアがあることがわかっている。これまでに得られた発熱時の医療サービス選択の個票データを用いて推計を行った結果、multinomial logit/probit model、multilevel modelが比較的妥当なモデルと考えられた。また、次年度以降に実証データ収集を予定しており、それに用いる質問票の開発が必要である。本年度は、従来研究で用いられている変数を調べるために文献収集および検索を行った。また、調査地区の医療サービスの現況を把握するために予備調査を行った。治療可能な急性感染症は開発途上国小児の主要な死亡原因となっており、早期有効治療が可能な医療サービス提供および住民側の利用度向上が対策の根幹である。本研究の目的は、開発途上国の集団を対象として実証データを収集し、疫学と経済学の手法を併せて用いることで住民の治療選択行動さらには早期有効治療、疾病の有無に影響を与える因子を解明し、効果的な政策提言を行うことである。本年度は、パプアニューギニアにおける調査許可および倫理審査承認を得て、人口動態調査と質問票調査を行い実証データを収集した。(1)調査許可および倫理審査承認は、パプアニューギニア医学研究審査会、ディバインワード大学、東京女子医科大学にて得ることができた。(2)人口動態調査は、調査地域である東セピック州ダグア地区の1つのヘルスセンターの医療圏のうち沿岸部に位置する22村落、1500世帯を対象とし行い、世帯名簿、住宅地図を作成した。同時に村落の基本情報を収集した。(3)住民の治療選択行動に関連した因子について質問票を作成し、予備的な調査により妥当性を検討し質問票の改訂を行った。改訂した質問票を用いて、14才以下の小児のいる約1100世帯を対象とした質問票調査を2015年2-3月に実施した。調査への参加率は97%、小児の有病率は20%であった。同時に、医療供給者である診療所、ヘルスボランティアより診療記録情報を収集した。(4)既存のデータを用いて本研究の視点から分析を行い関連学会で発表を行った。本研究の目的は、開発途上国の集団を対象として実証データを収集し、疫学と経済学の手法を併せて用いることで住民の選択行動さらには早期有効治療、疾病の有無に影響を与える因子を解明し、効果的な政策提言を行うことである。2014年11月にパプアニューギニア保健省医学研究審査会より調査許可および倫理審査承認を得て、2015年2月ー3月および5月-6月の2回にわたって人口動態調査、質問票調査、医療施設調査を行い実証データを収集した。また、成果を学会で報告し論文を発表した。研究実績の具体的な内容は以下の通りである。(1)人口動態調査は、東セピック州ダグア地区の沿岸部に位置する22村落、約1500世帯にて行い、世帯名簿、住宅地図を更新した。さらに対象世帯の位置情報を含んだ電子地図の作製を開始した。(2)質問票調査では前年度に作成した質問票を一部改良して使用し、15歳未満小児のいる約1100世帯を訪問して病歴、病状経過、個人属性、世帯属性情報を収集した。(3)コミュニティでの採血調査は行わなかったが、血液サンプルとして医療施設で使用済みの検査キットを収集しマラリア原虫種の同定を行った。(4)医療供給施設であるヘルスセンター、エイドポスト、ヘルスボランティアより薬剤在庫状況を調査し診療記録情報を収集した。

(5)2015年に収集した質問票データは2015年11月に入力作業が終了した。予備的な分析結果より考察を行い研究成果を学会で報告した。(6)2011-2012年に収集した既存データを用いて、混合ロジットモデルによる医療施設選択の分析結果に基づき政策提言を行った結果をまとめて原著論文として発表した。前年度に引き続き約1100世帯もの質問票調査を施行し実証データを収集することができた。また、計量経済学で用いられている鈴選択モデルの分析手法を住民の医療施設選択行動に応用し、既存データを用いて本研究の究極的な目的である政策提言につながる原著論文を発表することができた。これらのことから、研究はおおむね順調に進展していると考えている。治療可能な急性感染症は開発途上国小児の主要な死亡原因となっており、早期有効治療が可能な医療サービス提供および住民側の利用度向上が対策の根幹である。本研究の目的は、開発途上国のコホート集団を対象として実証データを収集し、疫学と経済学の手法を併せて用いることで住民の治療選択行動さらには早期有効治療、疾病の有無に影響を与える因子を解明し、効果的な政策提言を行うことである。本年度は、2016年7-8月にパプアニューギニアにおいて、人口動態調査、住民調査、医療施設調査を行った。(1)人口動態調査では、前年度までに不足していた世帯の地理情報を携帯GPSで収集した。世帯名簿を更新し調査対象世帯のデジタルマップを完成した。(2)住民調査では、三日熱マラリアの根治治療であるプリマキン治療実施に関連する患者側因子を解明するため、対象世帯小児の受診記録を収集した。また、医療受診と栄養状態の関連を調べるため、対象小児の身体計測を行った。(3)医療施設調査では、調査日の薬剤在庫を記録するとともに、過去のプリマキン在庫状況を調査した。マダガスカルにおいては、2016年11月に聞き取り調査、2017年3月には質問票調査を行った。(4)聞き取り調査では、村落部の医療システムとヘルスボランティアの役割を関係者、当事者から情報収集するとともに施設を訪問し薬剤在庫状況等の医療の質に関する観察を行った。(5)パプアニューギニアで開発・使用した質問票の妥当性を検討するため、マダガスカル語に翻訳し予備的な質問票調査を行った。その結果、適切な回答が得られない質問項目はほとんどないことが確かめられた。昨年度までに収集したデータを分析した成果の一部は国際会議および招待講演で発表した。今年度収集したデータについては入力およびデータクリーニングを終了し分析段階である。パプアニューギニア村落部にて世帯調査を行い、医療サービス利用に影響を与える因子を混合ロジットモデル、マルチレベルロジットモデル、傾向スコアマッチングにて分析した。その結果、(1)小児の急性症状出現時には、重症度、咳の有無、医療施設までの歩行距離、受診にかかる総費用が関連していた。(2)三日熱マラリアの根治治療実施には医療施設までの交通距離のみが影響していた。(3)新マラリア診断治療ガイドラインの導入による医療サービス利用増加は見られなかった。
腎不全時のインスリン様成長因子(IGF)及びIGF結合蛋白の動態に関する検討

腎不全時のIGFs及びIGF結合蛋白(IGFBPs)の動態に関する検討を行ない以下の成績を得た。(1)慢性腎不全症例の血中IGFBP-2値をWestern immunoblot(WIB)法,IGFBP-3値をIRMA法にて測定するといずれも正常者に比し有意に増加していた。IGFBP-2値は腎移植術後14日以内には減少せず術後1年以上が経過した症例で正常化しており,血中IGFBP-2値は腎移植後早期には腎機能のみならず術後の蛋白異化亢進等の調節因子により修飾を受けている可能性がある。一方,IGFBP-3値は術後1日目に速やかに正常化したが,術後,拒絶反応が強く腎機能が悪化した症例の一部で再上昇を認めた。(2)慢性腎不全症例でのIGF-IIの血中存在様式をゲル濾過で検討すると,正常者と同様に150kDa,40kDaのIGF-IGFBP複合体が認められたが,腎不全ではこのうち40kDaのIGF-IGFBP複合体の占める比率が増加していた。また,Western ligand blot,WIBで検討したところ慢性腎不全では正常者に比し,IGF-IIと結合して40kDa複合体を形成しているIGFBP-2,-6の増加がみられた。(3)急性,慢性腎不全ラットを作製し血中IGFs,IGFBPsと臓器(肝,腎)でのIGFBPs mRNAの発現を検討した。慢性腎不全ではヒトと同様に血中IGFBP-2,-6の増加を認めたが血中IGFs,臓器におけるIGFBP-2,-6 mRNAの増加は認めなかった。急性腎不全ではIGFs,IGFBPs,IGFBPs mRNAとも明らかな変化を呈さなかった。以上の成績から慢性腎不全症例では主として腎からの排泄障害により血中IGFBPsの増加がみられるが,血中に増加したIGFBPsはIGFsと結合する能力を有し,腎不全におけるIGFsのbioavailabilityを変化させている可能性が示唆された。
シャジク藻節間細胞の濃厚K^+塩溶液中でのイオン調節能喪失の細胞生理学的研究

シャジク藻の細胞膜の機能と構造を安定に保つ上うえで、Ca^<2+>が必要であることと、細胞壁に存在するCa^<2+>が濃厚KCl水溶液中で遊離することが筆者らの研究で分かっていた。今回交付された科学研究費では、これらの問題を中心に以下の三つの課題が研究され、明らかにされた。(1)シャジク藻細胞壁からのCa^<2+>の遊離は、細胞壁中の炭酸カルシウムに由来すると考えられてきたが、本当に炭酸カルシウムだけからかどうか。(2)細胞膜を介して、膜電位差と濃度差のもとで行われるイオンの輸送現象の基礎にある、電気的中性の法則の理論的基礎を明らかにすること。この課題はさらに二つの問題に分けて、論じられた。その一(2-i)は、膜電位が発生するのは、陽イオンと陰イオンが電荷分離するためであるが、これは「電解質溶液中では、陽イオンに由来する陽電荷の総量は、陰イオンに由来する陰電荷の総量に等しい」という電気的中性の法則と表面的には矛盾する。実際にそうであるのかどうか。第二の問題(2-ii)は、細胞膜での能動輸送では、ある特定のイオンが単独で、その濃度変化が測定できるほど輸送できると考えられてきたが、電気的中性の法則からそのようなことが許されるのかどうか。(1)の課題との関係では、リン酸カルシウムと、未だ同定されていない酸性物質が、炭酸カルシウムと同時に遊離することが、明らかにされた。(2-i)の課題との関係では、膜電位の発生には陽イオンと陰イオンの電荷分離が必要であるが、その電荷分離は電気的中性が保たれていると見なしてよい程わずかでよいことが理論的に論証された。(2-ii)の課題との関係では、いくら能動輸送という機構によっても、ある特定のイオン種が単独で、その濃度変化が検出出来るほど、輸送されることはないことが、理論的に論証された。本年度は、本研究の前半部分である、K^+-麻酔法の有効性、及び限界に関して細胞生理学的基礎知見を得るため、種々の濃度のKCl,KNO_3,K^+-グルコン酸溶液中での車軸藻(ホシツリモ)の原形質流動の流速を測定した。すなわち、対イオンである陰イオンが何であれ、外液K^+濃度を上げていくと、膜電位は脱分極し、50mM以上ではゼロになることが知られている。一方、原形質流動の流速を測定すると、流速はK^+濃度の上昇と共に低下することがわかった。原形質流動の流速は、細胞質内のCa^<2+>濃度で制御されていることが、分かっている。ホシツリモは外部刺激により、興奮して活動電位を発生すると、その流動が停止する。これは、外液からCa^<2+>イオンが流入し、細胞質内のCa^<2+>濃度が上昇するためであることがほぼ確実に明らかにされている。外液にPb^<2+>イオンを共存させると、活軌電位を発生しても流動は停止しない。これは、外液中のPb^<2+>イオンが外液中のCa^<2+>イオンが細胞内へ流入するのを阻害するためと考えられている。そこで、外液K^+濃度を上げていくときにPb^<2+>イオンが存在する場合と、存在しない場合で測定したところ、共に同じような値で流速は低下した。

したがって、外液K^+濃度の上昇に伴う原形質流動の流速の低下は、主に膜電位の脱分極によると推測された。したがって、K^+-麻酔法は原形質流動の測定と一緒に用いることは無効であることが、分かった。しかし、何故膜電位が脱分極すると流動速度は低下するのかという新しい問題が、明らかにされた。このように、K^+-麻酔法には限界があるが、この方法は非常に安価で、簡便に膜電位測定に使える可能性があるので、その限界をもっと明らかにした上で、ポジテブな観点からこれからも検討を加えたい。シャジク藻の細胞膜の機能と構造を安定に保つうえで、Ca^<2+>が必要であることと、細胞壁に存在するCa^<2+>が濃厚KCl水溶液中で遊離することが筆者等の研究で分かっていた。今回交付された科学研究費では、これらの問題を中心に以下の三つの課題が研究され、明らかにされた。(1)シャジク藻細胞壁からのCa^<2+>の遊離は、細胞壁中の炭酸カルシウムに由来すると考えられてきたが、本当に炭酸カルシウムだけからかどうか。(2)細胞膜を介して、膜電位差と濃度差のもとで行われるイオンの輸送現象の基礎にある、電気的中性の法則の理論的基礎を明らかにすること。この課題はさらに二つの問題に分けて、論じられた。その一は、膜電位が発生するのは、陽イオンと陰イオンが電荷分離するためであるが、これは「電解質溶液中では、陽イオンに由来する陽電荷の総量は、陰イオンに由来する陰電荷の総量に等しい」という電気的中性の法則と表面的には矛盾する。実際にそうであるかどうか。第二の問題は、細胞膜での能動輸送では、ある特定のイオンが単独で、その濃度変化が測定できるほど輸送できると考えられてきたが、電気的中性の法則からそのようなことが許されるのかどうか。(1)の課題との関係では、リン酸カルシウムと、未だ同定されていない酸性物質が、炭酸カルシウムと同時に遊離することが、明らかにされた。(2-i)の課題との関係では、膜電位の発生には陽イオンと陰イオンの電荷分離によるイオン分布のアンバランスが必要であるが、その電荷分離は電気的中性が保たれていると見なしてよいほどわずかなアンバランスでよいことが理論的に論証された。(2-ii)の課題との関係では、いくら能動輸送という機構によっても、ある特定のイオン種が単独で、その濃度変化が検出できるほど、輸送されることはないことが、理論的に論証された。