hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
過分極で活性化される陽イオンチャネルの構造と機能に関する研究

過分極で活性化されるという他のチャネルと違った性質を持つイオンチャネルである陽イオンチャネル(Ihチャネル)の構造と機能の関係を明らかにする目的で研究を行った。4種類のクローン化されたIhチャネルのなかで、HCN1が過分極による活性化の速度が一番速く、HCN4の速度が一番遅い。前年度に、HCN1とHCN4との間で様々な約20種類のキメラを作製し、哺乳細胞発現系(COS7)とwhole cellパッチクランプ法を用いて、その活性化速度を測定し、活性化速度に大きく影響を与える領域が第一膜貫通領域であることを明らかに、さらに点変異を導入して、活性化速度に影響を与えるアミノ酸残基を決定した。しかしながら、脱活性化速度を比べると、HCN1はHCN4より脱活性化の速度が約7倍遅いが、活性化速度に大きな影響を与えた第一膜貫通領域だけでは、脱活性化速度にはほとんど影響を与えなかった。今年度は、さらなるキメラを作製し、脱活性化速度を測定したところ、膜電位感受性部位と考えられている第4膜貫通領域とイオンを通すと考えられているポアー領域を含む第3膜貫通領域から第6膜貫通領域までの部位は脱活性化速度にも活性化速度にも全く影響を与えず、N末やC末領域が大きく影響を与えることを明らかにした。今までの電位依存性カリウムチャネルで知られているのと違って、サブタイプよる性質の違いがN末やC末によって決定されることを明らかにした。Ihチャネルは過分極で活性化されるにもかかわらず、脱分極で活性化される電位依存性のカリウムチャネルとほぼ同様な6回膜貫通領域と一つのイオン透過性部位を持ち、その活性化機構は興味を持たれていたが、本研究によって、Ihチャネルにおいてはチャネル全体の構造変化が活性化および脱活性化速度に重要であることが示唆された。過分極で活性化される陽イオンチャネル(Ihチャネル)は、心臓の洞房結節や神経細胞において重要な役割を果たしていることが知られている。IhチャネルはHCN1,2,3,4と呼ばれている4種類のcDNAが哺乳類においてクローン化されている。そして、それぞれのサブタイプによって過分極による活性化の速度が違うことが知られており、その活性化速度の違いはそれぞれのサブタイプの役割の違いをもたらしていると考えられている。サブタイプで一番活性化速度の速いのはHCN1で遅いのはHCN4であり、その違いは20倍にもなる。その違いを引き起こす構造的な差異を見つけるためにまずはHCN1と4とのキメラチャネルを作製し、哺乳細胞発現系とホールセルパッチクランプ法を用いその活性化速度を測定した。その結果、まずは第一膜貫通領域付近を入れ替えると大きな活性化速度の違いが起き、さらに第六膜貫通領域とサイクリックヌクレオチド結合部位との間を入れ替えると活性化速度に変化が見られた。このことから、二つの領域の違いがサブタイプ間の活性化速度の違いを引き起こしているものと考えられた。さらに、第一膜貫通領域では数個のアミノ酸残基によってその活性加速度が大きく影響を受けることを明らかにした。Ihチャネルは構造的には、電位依存性のカリウムチャネルと同様の6回膜貫通領域と一つのポアー領域を持つ基本構造を持っているが、過分極で活性化されるという特徴的な性質がある。今回明らかになった活性化速度に影響する二つの部位は、電位依存性カリウムチャネルではほとんど機能に影響を及ぼさなかった部位であり、このチャネル特有なもので、過分極で開くというこのチャネル独自の性質の分子的メカニズムの解明にヒントを与えるものであるかもしれない。
関節炎の発症及び進展における腸内細菌叢の役割の解明

腸管細菌がリウマチの発症、進展に関与する可能性が示唆されており、抗生剤長期投与がリウマチモデルマウスであるIL-1 ra欠損マウスの腸内細菌叢、及び関節炎に与える影響を検討した。生後すぐに抗生剤を投与したところ、腸内細菌DNAは8%に減少し、関節炎が改善したが一時的であった。関節の好中球、マクロファージの減少が認められ、関節内のケモカインCXCL1、MIP-1β、RANTES濃度が有意に低下した一方、IL-17A濃度に変化は認めなかった。10週齢から抗生剤を投与した群では関節炎は改善しなかった。抗生剤による腸内細菌の修飾を関節炎に治療応用するには投与時期、期間も重要であることが示唆された。WT、IL-1ra-/-マウス、IL-1ra-/-CCR2-/-マウス、CCR2-/-マウス、またこれらマウスで関節炎発症前から発症後までのgermに変化がないかを検討するため、Balb/cマウスで報告されている主要な糞便中の細菌についてPCRで半定量した。7グループの細菌群(Bacteroides、Firmicutes、Lachnospiraceae、Clostridium coccoides、Clostridium leptum、Lactobacillaceae、Segmented filamentous bacteria、Bifidobacterium)について特異的プライマーをもちいたPCRで半定量を行い、各細菌グループのDNA比率を検討した。この結果、IL-1ra-/-CCR2-/-マウスにおいて、WT、CCR2-/-マウスと比較してBacteroidetes、Firmicutesの比率が減少、Clostridium coccoidesは増加していた。しかし、WTとCCR2、IL-1ra-/-とIL-1ra-/-CCR2-/-マウスとの間で一致した変化が認められた菌は同定できなかった。20週齢のIL-1ra-/-マウスとIL-1ra-/-CCR2-/-マウス各10匹の関節炎スコアと糞便中細菌DNAの比率とに相関があるか検定をおこなった。結果、今回半定量したいずれの菌のDNAも関節炎スコアと相関は認められなかった。Segmented filamentous bacteriaのDNA比率が高いマウスは関節炎スコアが高い傾向があったが、p値は0.066であった。20週齢マウス腸管細胞をフローサイトメトリーで検討した。WTとCCR2-/-マウスでの検討では、CCR2-/-マウスではF4/80+マクロファージ、CD3+Tリンパ球の減少が認められた。抗生剤投与による関節炎の予防及び治療実験平成26年度に糞便よりDNAを抽出し、16SrRNAに対するPCRを行った。この結果、WT、CCR2-/-マウス、IL-1ra-/-マウス、IL-1ra-/-CCR2-/-マウスの腸内細菌叢には明らかな変化は認められなかった。このため当初は次世代シーケンサーを用いて狭いスペクトラムの抗生剤にて選択的に腸内細菌を操作し、関節炎の経過に変化がないかフォローする予定であったが、まず広域抗生剤にて腸管細菌叢を劇的に変動させ、それで関節炎の経過が改善するかどうかを検討した。あらかじめ予備実験にて腸内細菌を1/1000以下に減らすことができることを確認した抗生剤カクテル(ドリペネム+バンコマイシン)を自由飲水で投与した。予防投与については生後4週から、治療投与については生後10週から抗生剤の投与を行い、継時的に関節炎の臨床スコア、骨密度、病理組織をモニターした。この結果、1抗生剤を関節炎発症前の早期から投与した群では早期に関節炎の軽減があるが、その後生後14週辺りからその差はなくなること、2関節炎発症後(10週)から抗生剤を投与した群では改善が得られないこと3IL-1ra-/-CCR2-/-マウスではIL-1ra-/-マウスと比較してこの傾向はあまりはっきりしないという結果を得た。この結果をもとに、現在関節組織内の炎症細胞サブセットを免疫染色及びフローサイトメトリーにて評価を行っている。また、腸管組織については大腸全長の組織標本を作成し、免疫染色での評価を予定している。糞便の細菌DNAの評価抗生剤を初期に投与した群で認められる一時的な関節炎の改善について原因を検討するため、継時的に糞便を採取し、DNAを抽出した。途中で菌交代が起きて関節炎が増悪したのか、腸内細菌に変化はないのかを検討するためメタゲノム解析で検討予定である。次世代シーケンサーを用いた菌叢解析までまだ至っていない。抗生剤投与後20週まで細菌叢のDNAをフォローしているが、16SrRNAのPCR結果からは、菌交代を疑うようなDNA量の増加は認めておらず、一貫して著明な菌量の低下が認められている。このため次世代シーケンサーを用いて解析しても原因菌の推定が困難である可能性が高い。研究費の問題もあり、次世代シーケンサーを用いた細菌叢の解析を行う前に、腸内細菌を劇的に減少させた後の腸管免疫、腸間膜リンパ節、関節組織などにおける免疫応答の変化を優先して検討する予定を考えている。【目的】関節炎を自然発症するIL-1ra-/-

マウスにおいて抗生剤で腸管細菌叢を修飾することにより、関節炎の発症、全身免疫への影響を検討した。また抗生剤を長期投与及び投与開始時期の違いによる関節炎に与える影響も検討した。【方法】3週齢あるいは10週令のIL-1ra欠損マウスをドリペネム0.25g/L及びバンコマイシン0.5g/Lで給水し、自由飲水とした。抗生剤を24週齢まで継続し、経時的に、盲腸内容物の細菌量の定量的PCRでの測定、継時関節炎症状・関節内病理像の評価、骨密度測定、関節内サイトカイン濃度の測定を行った。【結果】3週齢からの抗生剤投与で、4週齢以降で腸内細菌DNA量は8%に減少し、8週から15週まで関節炎スコアが改善し、関節周囲骨密度低下も抑制された。12週齢において、好中球・樹状細胞・マクロファージの関節への浸潤の減少とともに、関節内のCXCL1、MCP-1、MIP-1β、RANTES濃度も有意に低下した一方で、IL-17A濃度に変化は認めず、糞便中SFBのDNA量も変化を認めなかった。16週齢以降は抗生剤非投与群と関節炎に差を認めず、関節内細胞分画、サイトカイン濃度についても差を認めなかった。10週齢から抗生剤を投与した群では関節炎は改善せず、好中球増加と一致してCXCL1の増加が認められた。12週齢でMCP-3、MIP-1α、MIP-1βが抗生剤非投与群と比較して上昇していた。【結語】離乳直後からの広域抗生剤の投与のみで、一時的に関節炎は抑制された。腸内細菌の修飾を関節炎の治療に応用する場合、投与時期と長期経過に注意する必要があることが示唆された。腸管細菌がリウマチの発症、進展に関与する可能性が示唆されており、抗生剤長期投与がリウマチモデルマウスであるIL-1 ra欠損マウスの腸内細菌叢、及び関節炎に与える影響を検討した。生後すぐに抗生剤を投与したところ、腸内細菌DNAは8%に減少し、関節炎が改善したが一時的であった。関節の好中球、マクロファージの減少が認められ、関節内のケモカインCXCL1、MIP-1β、RANTES濃度が有意に低下した一方、IL-17A濃度に変化は認めなかった。10週齢から抗生剤を投与した群では関節炎は改善しなかった。抗生剤による腸内細菌の修飾を関節炎に治療応用するには投与時期、期間も重要であることが示唆された。平成26年度の計画として、1マウス糞便細菌叢のPCR法による定量、2マウス関節炎の評価、3次世代シーケンサーによる系統分類解析、4腸管免疫担当細胞の構成及び機能評価をあげていた。1についてはそれぞれのgenotypeについてサンプル数が6-10とやや少なく、このため細菌群のDNAの差が得られなかった可能性がある。8週、12週、16週のサンプルも含め解析を検討する。2についてはおおむね達成されたと考えており、今後のDNA解析と対比を行う。3について、現在のところ細菌叢DNAと関節炎や腸管機能の関連についての関連データが不十分と考えられ、まず抗菌薬投与実験による細菌叢の変化と関節炎の関連についてのデータも集積した上で次世代シーケンサーによる検討を行う予定とした。4について、CCR2-/-マウスでは樹状細胞、マクロファージ、T細胞の比率が減少していると考えられた。
rasp21類似GTP結合蛋白質のcDNAと抗体の有効利用・特に病態、診断への応用

私共はrasp21類似低分子量G蛋白質やその活性調節蛋白質を精製するとともにそのcDNAをクロ-ニングし、これらの蛋白質の機能や種々の病態との関係について解析を進めている。これらの低分子量G蛋白質にはGDP結合型の不活性型とGTP結合型の活性型が存在し、不活性型と活性型の転換を制御する蛋白質が存在すると考えられている。私共は低分子量G蛋白質の活性制御蛋白質として、smgp21とrhoAp21に対するGTPase活性促進蛋白質(GAP),smgp25Aとrhop21に対するGDP解離促進蛋白質(GDS)を見出した。さらに、smgp25AGDI,rhoGDI,smgp21GDSのcDNAを単離してそれらの一次構造を決定するとともに、その特異抗体を作製した。最近rasp21は、翻訳後、C末端のCysーAーAーXのCys残基にファルネシル基が結合し、次いでAーAーX部分が除かれ、さらにCys残基がメチル化を受けることが知られている。私共はC末端の構造がCysーAーAーXであるsmgp21BとrhoAp21の翻訳後修飾はrasp21と基本的には同じであるが、Cys残基にはファルネシル基とは異なるゲラニルゲラニル基が結合していることを明らかにした。また、C末端の構造がCysーXーCysであるsmgp25Aでは、少なくとも一方のCys残基にゲラニルゲラニル基が結合していることも明らかにした。これらの翻訳後修飾は低分子量G蛋白質の細胞膜への結合や活性調節蛋白質との結合に必要であった。また、種々の組織中のファルネシルトランスフェラ-ゼやゲラニルゲラニルトランスフェラ-ゼを測定するアッセイ法を開発した。一方、低分子量G蛋白質そのものについては、smgp21が血球細胞の分化やある種の白血病の成因と係わり合っていることを示した。また、smgp25Aが神経細胞の分化マ-カ-あるいは神経由来の腫瘍マ-カ-として有用である可能性も示した。以上の結果を得たことにより、本研究の研究計画はほぼ達成できたと考えている。私共はウシ大脳よりrasp21に類似した全く新しいGTP結合蛋白質(G蛋白質)を2種類精製し、smgp25、smgp21と命名している。これらのG蛋白質は細胞内情報伝達系の重要な一員であり、その機能の解析が種々の病態を理解し、治療法を見出すために必須であると考えられる。これまでに私共はsmgp25とsmgp21のcDNAを単離し、その一次構造を決定している。また、smgp25のmRNAが神経組織に大量に発現しており、PC-12細胞やNB-1細胞の神経様細胞への分化に伴い増加することを見出している。本研究において、私共はsmgp25とsmgp21に対する特異抗体を作成することに成功した。この抗体を用いて、これらのG蛋白質の組織内分布、細胞内分布を検討した結果、smgp25は神経細胞のシナプスや内、外分泌細胞のゴルジ体、分泌顆粒に特異的に分布し、本G蛋白質が、神経伝達物質の放出のみならず、エキソノエンドサイト-シスに深く関与していることが判明した。

また、smgp25はPC-12細胞やNB-1細胞の神経様細胞への分化に伴い増加するが、GOTO細胞のグリア様細胞への分化の際には増加しないことから、本G蛋白質が神経系の腫瘍のマ-カ-となる可能性が明らかとなった。一方、smgp21は血小板に大量に分布しており、巨核芽球性白血病(CMK)細胞の血小板様への分化に伴い増加することから、本G蛋白質が血球系細胞の分化マ-カ-となる可能性も明らかとなった。一方、本研究の過程において、私共はsmgp25の活性を制御する全く新しいタイプの蛋白質(smgp25GDI)を発見した。すでに、私共はsmgp25GDIのcDNAを単離し、一次構造を決定すると共に、その特異抗体を作成することにも成功している。今後、これらの抗体やcDNAを用いてsmgp25、smgp21、smgp25GDIと腫瘍の悪性度や組織型との関連を解析する予定である。以上本年度は、予想以上の成果を上げることができた。私共は分子量2万余りの低分子量GTP結合蛋白質(G蛋白質)(cーKiー<ras>___ーp21,<rho>___ーA p21,<rho>___- B p21,<smg>___ーp21A,<smg>___ーp21B,<smg>___ーp25A)やその活性調節蛋白質を精整している。昨年度の本研究において、私共はこれらの活性調節蛋白質として、<smg>___ーp21に対するGTP ase活性促進蛋白質(GAP)および<smg>___ーp25Aに対するGDP解離抑制蛋白質(GDI)を見出した。本年度の研究において、私共は新しい種類の活性調節蛋白質であるGDP解離促進蛋白質(GDS)を<smg>___ーp21と<rho>___ーp21に対して見出した。さらに、<smg>___ーp21 GDSのcDNAを単離してその一次構造を明らかにするとともに特異抗体を作整した。今後、<smg>___ーp21 GDSのcDNAや特異抗体を用いて種々の病態と<smg>___ーp21 GDSとの関係を解析する必要がある。一方、<ras>___ーp21のC末端のCysーAーAーXのCys残基にファルネシル基が結合し、次いでAーAーX部分が除かれ、さらにCys残基がメチル化を受けることが明らかになっている。そこで、私共はC末端のアミノ酸配列がCysーAーAーXである<smg>___ーp21Bと<rho>___ーA p21の翻訳後修飾を解析して、両低分子量G蛋白質のC末端側のCys残基にはファルネシル基とは異なるゲラニルゲラニル基が結合し、AーAーX部分は取り除かれ、Cys残基がメチル化を受けることを明らかにした。また、<smg>___ーp25AのC末端側はCysーXーCysと<smg>___ーp21とは異なっているが、少なくとも一方のcys残基にはゲラニルゲラニル基が結合していることも明らかにした。さらに、これらの翻訳後修飾が低分子量G蛋白質の細胞内局在や、GDIやGDSなどの調節蛋白質との結合に重要な役割を果たすことを示した。また、種々の組織中のファルネシルトランスフェラ-ゼやゲラニルゲラニルトランスフェラ-ゼ活性を測定するアッセイ方法を開発した。これらの酵素活性の変動が種々の病態と関連している可能性があり、今後、この点について解析を進めていく予定である。以上の成績を得たことにより本年度の研究計画はほぼ達成することができた。
ヒトがん細胞株を用いた抗がん剤感受性予測システムの構築

がん細胞の抗がん剤感受性の予測マーカーとなる遺伝子群を同定する目的で、研究代表者らは、39種類のヒト培養がん細胞株(ヒトがん細胞株パネルJFCR39)について約100種類の抗がん剤に対する感受性と約1万種類の遺伝子発現を測定してデータベース(DB)化し、このDBを利用して抗がん剤感受性と統計学的に有意な相関が認められた遺伝子群を抽出した。つぎに、認められた相関の一般性を検討するために、米国国立がん研究所(NCI)が公開している60種類のヒト培養がん細胞株(NCI60)についての薬剤感受性・遺伝子発現DBを利用して相関の検証をおこなった。JFCR39、NCI60の両DBで比較可能な782遺伝子の発現データと51抗がん剤の感受性データを利用して解析したところ、JFCR39のDBにおいて有意な相関が認められた抗がん剤と遺伝子の組み合わせうち、NCI60のDBにおいても同様な相関が認められるものが19%存在した(P<0.05)。この割合は、ランダム(2.5%)に比べ有意に高いことから、JFCR39のDBを利用した解析で相関が認められた抗がん剤-遺伝子の組み合わせは、JFCR39のDBにオーバーフィッティングしていて普遍的ではないものが数多く含まれているものの、本質的に関連があるものが濃縮されているものと推察された。また、JFCR39、NCI60の両DBで有意な相関が認められた抗がん剤-遺伝子の組み合わせは、本質的に関連があるものがより多く濃縮されていることが期待された。以上のことから、これらの遺伝子は、組み合わせの相手の抗がん剤の感受性予測マーカーとして利用できる可能性が示唆された。相関が認められた抗がん剤-遺伝子の組み合わせ例として、トポテカン-SFN(耐性)、PLK1(感受性)が挙げられるが、これらの遺伝子を用いて精度の高い感受性予測システムを構築することが今後の課題である。がん細胞の抗がん剤感受性予測マーカーとなるような遺伝子を同定する目的で、研究代表者らはこれまでに、39種類のヒトがん細胞株について約65種類の抗がん剤に対する感受性と約1万種類の遺伝子発現を測定し、抗がん剤感受性と統計学的に有意な相関が認められた遺伝子群を抽出した。これらの遺伝子群は、抗がん剤感受性予測マーカーとして利用できることが期待される。そこで、種々の抗がん剤感受性と正の相関を示したAKR1B1遺伝子と、負の相関を示したCTSH遺伝子に着目し、新たに収集した12種類の胃がん細胞株を利用して予測性の検証をおこなった。最初に、胃がん細胞株12系について65種類の抗がん剤感受性をスルフォローダミンB (SRB)アッセイにより測定した。つぎに、39細胞株を用いた解析で23種類の抗がん剤の感受性と正の相関を示したAKR1B1遺伝子と、27種類の抗がん剤の感受性と負の相関を示したCTSH遺伝子についてRT-PCR法により発現解析をおこなった。これらのデータを利用して、AKR1B1、CTSH遺伝子それぞれについて、12細胞株を高発現している細胞株と、発現していない、または発現量が低い細胞株に分割し、二群間において抗がん剤感受性に有意な差があるかをマン・ホイットニー検定により検討した。その結果、AKR1B1遺伝子高発現細胞株は低発現株に比べて23剤中21剤について有意に感受性が高かった(P<(0.05)。CTSH遺伝子については27剤中8剤について高発現株での耐性が確認された(P<0.05)。以上の結果から、AKR1B1遺伝子とCTSH遺伝子は抗がん剤感受性予測マーカーとして利用できる可能性が示された。現在、これらの2遺伝子以外の遺伝子についても解析を進めており、より正確な感受性予測システムが構築されることが期待される。相関が認められた抗がん剤-

遺伝子の組み合わせ例として、トポテカン-SFN(耐性)、PLK1(感受性)が挙げられるが、これらの遺伝子を用いて精度の高い感受性予測システムを構築することが今後の課題である。
現代の食習慣の特徴と非アルコール性脂肪性肝障害の発症・進展との関連性に関する研究

現代の生活習慣の欧米化に伴って、NAFLDが急増しており、肝臓癌や心血管病による死亡率の増加に繋がっているが、未だ病因の解明には至っていない。研究代表者らのこれまでの研究により、生活習慣病の主因と考えられるtoxic AGEs (TAGE)は、食後高血糖、果糖及び食事性AGEsの過剰摂取により体内で生成されることが明らかになりつつある。今回の研究により、現代の食生活習慣の特徴が、肝細胞や心筋細胞内でのTAGEの生成・蓄積を促進して各病態の発症・進展に強く関与し、さらに血中TAGEレベルがその病態の程度を反映することから、本研究成果が生活習慣病予防対策の新たな概念になることが期待される。これまでの研究から、生活習慣病の主因と考えられるtoxic AGEs(TAGE)が食後高血糖、果糖および高AGEs飲食品の過剰摂取により体内で生成されることが明らかになりつつあるが、肝臓内でのTAGEの生成・蓄積/分解・除去と非アルコール性脂肪性肝障害(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)の発症・進展に関する研究は全く検討されていない。我々の研究から、果糖の過剰摂取が肝臓内でのTAGEの生成や蓄積につながっていることが推定されている。また、果糖の過剰摂取は、NAFLDの発症・進展のみならず、心血管系の病態にも影響を及ぼすことが知られている。そこで、平成25年度は、果糖の過剰摂取が肝細胞や心筋細胞に及ぼす影響について検討した。1.ヒト肝癌細胞株Hep3Bを用い、高密度培養下、5日間の果糖暴露を行った結果、二次元電気泳動後のウエスタンブロット解析実験の結果から、高濃度の果糖を暴露させた細胞ではコントロール細胞と比較して細胞内にTAGE化した蛋白質(等電点8.5-9.0、分子量70-80 kDa)のスポットが数個検出された。すなわち、果糖によるNAFLDの起因や進行にTAGE化された肝細胞内蛋白質の機能変化が関与している可能性が示唆された。現在、検出されたTAGE化蛋白質のスポットを同定中である。2.ラット初代培養心筋細胞にTAGE前駆体のグリセルアルデヒド(GLA)を添加すると、GLA濃度依存的な心筋細胞の拍動停止ならびに細胞死が観察された。現在、生成した細胞内TAGE量の微量検出系を確立すべく、種々の条件検討を行っている。また、果糖曝露による心筋細胞内TAGE生成・蓄積と細胞障害の関連性も検討中である。そこで、平成26年度は、果糖の過剰摂取が肝細胞や心筋細胞に及ぼす影響について検討した。1.ヒト肝癌細胞株Hep3Bを用い、高密度培養下、5日間の果糖暴露後、二次元電気泳動により展開し、TAGE抗体と特異的に交差するスポットをMALDI-TOF-MSで分析した結果、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M (hnRNPM)が同定された。これらの結果は、既に論文に公表した(World J. Gastroenterol. 21: 1784-1793, 2015)。2.ラット初代培養心筋細胞にTAGE前駆体のグリセルアルデヒド(GLA)を添加すると、心筋細胞内TAGE量の増加に伴った心筋細胞の拍動停止ならびに細胞死が観察された。さらに、電顕により心筋細胞内の変化を検討すると、小胞体の変化に引き続きオートファジーの活性低下が観察され、現在、論文を作成中である。果糖の過剰摂取が非アルコール性脂肪性肝障害(NAFLD)の発症・進展のみならず、心血管系の病態にも影響を及ぼすことが知られている。一方、これまでの研究から、果糖の過剰摂取が肝細胞や心筋細胞内でのtoxic AGEs(TAGE)の生成や蓄積につながっていることが推定されているが、NAFLDとの関連が明らかにされていない。そこで、平成27年度は、1.肝細胞や心筋細胞を用いて、果糖ブドウ糖液糖(HFCS)及びその代謝物のグリセルアルデヒド(GA)による細胞障害、2.HFCSの過剰摂取が正常ラットの各組織に与える影響、3.ヒト血中TAGEレベルの変動とNAFLDの発症・進展との関連について検討した。1.肝細胞や心筋細胞にGAを添加すると、TAGEの生成・蓄積に伴った肝細胞障害や心筋拍動の停止がみられ、これは基礎的オートファジーの活性低下から細胞内TAGEの除去機能の低下が原因であることが明らかになった。また、電顕像から小胞体異常に引き続いてミトコンドリア異常が引き起されることが示された。さらに、肝細胞を高果糖条件下で培養するとRNA結合蛋白質のTAGE化が同定され、小胞体ストレスに関与する遺伝子の減少などが示された。

2.HFCSの過剰摂取が正常ラットの各組織に与える影響について検討し、HFCS過剰摂取ラットにおいては、組織中や血清中TAGE量の増加が観察された。現在、組織免疫染色や電顕による組織障害を検討中である。また、HFCS+食事性AGEsの影響に関しては、今後の課題である。3.非アルコール性脂肪肝炎(NASH)患者では、単純性脂肪肝や健常者に比べて血中TAGEレベルが有意に高く、また肝細胞内でのTAGE蓄積がみられている。さらに、NASHからの進展が考えられる非B非C型肝癌患者では、NASH単独患者に比べてさらに血中TAGEレベルが上昇していることが示された。現代の生活習慣の欧米化に伴って、NAFLDが急増しており、肝臓癌や心血管病による死亡率の増加に繋がっているが、未だ病因の解明には至っていない。研究代表者らのこれまでの研究により、生活習慣病の主因と考えられるtoxic AGEs (TAGE)は、食後高血糖、果糖及び食事性AGEsの過剰摂取により体内で生成されることが明らかになりつつある。今回の研究により、現代の食生活習慣の特徴が、肝細胞や心筋細胞内でのTAGEの生成・蓄積を促進して各病態の発症・進展に強く関与し、さらに血中TAGEレベルがその病態の程度を反映することから、本研究成果が生活習慣病予防対策の新たな概念になることが期待される。ほぼ、当初の計画通りに進行している。27年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定通り、平成27年度は25&26年度の研究成果をふまえ,次の2つのプロジェクトを遂行する。1.果糖ブドウ糖液糖及び食事性AGEsの過剰摂取が動物組織に与える影響(体内におけるAGEsの生成・蓄積/分解・除去・排泄機序)に関する検討、2.果糖ブドウ糖液糖の過剰摂取がNAFLDに与える影響(肝星細胞・クッパー細胞内AGEs生成・蓄積機序の解明)について検討する。果糖代謝のキー中間体であるfructose-1-phosphate (F-1-P)由来AGEs標準品の作製及び特異抗体の作製実験は、F-1-P化合物自体の販売中止により、十分量の標準品ならびに免疫原の確保が困難な状況となっており、当初の予定より遅れている。当初の予定通り、平成25年度の研究成果をふまえ,以下の3つのプロジェクトを遂行する。1)研究計画を遂行する有力なツールとしてのTAGEモノクローナル抗体の作製、2)果糖ブドウ糖液糖の過剰摂取と肝細胞内TAGE及びF-1-P-AGEsの生成・蓄積との関連性の検討、3)初代培養肝細胞を用いた細胞内TAGE分解・除去システムに関する検討なお、F-1-P化合物の受託合成等を視野に入れ、平成25年度の計画の遅れを取り戻す。
アドレメデュリンと血管リモデリングに関する分子生物学的研究

アドレノメデュリン(AM)は単に血管拡張因子としての役割に留まらず、血管系細胞において細胞増殖、遊走、アポトーシスの制御など多彩な生理活性を惹起することを明らかにした。AMは血管平滑筋細胞(VSMC)に対して、MAPキナーゼ依存性に細胞の増殖・肥大を促進するが、この機序にはCa^<2+>感受性の細胞内チロシンキナーゼ(分子量120kDa)の活性化とアダプター蛋白(Shc, Grb-2)のリクルートを介してras依存性MAPキナーゼの活性化が関与する。このチロシンキナーゼはPYK-2であることを同定した。このようにAMはVSMCに対してオートクリン・パラクリン増殖因子として作用する。一方AMは血管内皮、細胞(EC)に対してはcAMP非依存性に強力なアポトーシス抑制作用を示す。ECではAMはMax遺伝子を著明に誘導する結果、c-myc依存性アポトーシスにオートクリン・パラクリンとして拮抗することを明らかにした。さらにAMはVSMCのchemotacticな遊走をcAMP非依存性に制御することも明らかにした。RAMP(receptor activity modifying protein)/CRLR(calcitonin receptor-like receptor)系はAM受容体を構成するが、AMのVSMC遊走抑制作用はRAMP2/CRLR及びRAMP3/CRLR受容体を介して惹起され、これらの受容体を発現しないECや線維芽細胞では同様の作用はみられない。AMは当初、cAMPをセカンドメッセンジャーとする血管拡張因子として発見されたが、血管系のリモデリングにおいてはcAMPを介さない多彩な情報伝達経路が介在し、さらにAMの作用がRAMP/CRLR受容体の他に必要な細胞内構成要素の存在が示唆された。今後、RAMP/CRLR以外のAM受容体とその情報伝達系の解明が必要といえる。血管平滑筋細胞(VSMC)はアドレノメデュリン(AM)を産生、分泌すると同時にそのレセプターを持つことから、オートクリン・パラクリンとして血管トーヌス調節に関与していると考えられている。しかしAMレセプターの調節機構や細胞増殖やアポトーシスに関与するか否かは全く不明である。培養ラットVSMCを用いてAMレセプターと共役するアデニル酸シクラーゼ(AC)活性を指標にAMレセプターの調節機構を解析した結果、AM前処置によってAM再投与によるAC活性は短時間(15分以内)から減弱し、2時間後には80%まで低下し、24時間迄持続した。このようなAM前処置によるAC活性の減弱効果は用量依存性であり、βレセプターとは独立した経路であった。更にAM前処置によるAC活性の減弱効果はAキナーゼやCキナーゼ活性化物質や阻害薬によっても影響を受けなかった。したがって血管平滑筋のAMレセプターは過剰のAMの依存下では脱感作されて、作用が減弱するダウンレギュレーション機構が存在することが明らかとなった。AMは静止期にあるVSMCでは著明な細胞増殖効果を示し、この作用はAキナーゼやCキナーゼ非依存性であった。AMは著明にMAPキナーゼ活性を促進し、この作用はチロシンキナーゼ阻害薬によって抑制された。またAMは成長因子欠乏下でのアポトーシスを抑制し、このようなAMの抗アポトーシス作用にはMAPキナーゼ活性化を介していた。したがってAMは血管拡張作用だけでなく、血管平滑筋に対して細胞増殖・抗アポトーシス因子として作用し、情報伝達にはチロシンキナーゼを介したMAPキナーゼ系が重要な役割を果たしていることを証明した。

血管では平滑筋細胞(SMC)や内皮細胞(EC)でアドレノメデュリン(AM)が産生、分泌すると同時にそのレセプターを持つことから、AMがオートクリン・パラクリンとしてSMCのトーヌス制御に関わっていると考えられる。しかしAMのECに対する細胞機能は全く不明であったが、先の我々の研究によってAMが抗アポトーシス作用を持つことが明らかとなった。今回更にAMの持つ内皮生存因子として機能を分子レベルで解析した。AMは血清除去によるラットECのアポトーシスを強力に抑制するのと同時にc-Mycに影響せずにその拮抗因子であるMax遺伝子の発現を促進した。Maxの発現誘導はAMの他にカルチトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)や血清によってもみられた。血清除去によってMax発現はダウンレギュレーションされたが、この現象はAM投与によって阻害された。CGRP受容体拮抗薬や抗AM抗体投与によってMax発現は抑制され、同時に血清除去によるアポトーシスは亢進した。Max遺伝子のアンチセンスオリゴマーを細胞へ導入すると、AMによるMax発現増加と抗アポトーシス効果が阻止された。更にc-Myc-Maxの結合部位(E-box)を持つ遺伝子プロモーター活性はAMやCGRPだけでなく、MaxやMad遺伝子の共発現によっても著明に抑制された。以上の研究からAMは血清除去による内皮のアポトーシスをMax遺伝子を介して抑制することを明らかになった。したがってAMはオートクリン・パラクリン因子として内皮保護作用を持つといえる。私共はアドレノメデュリン(AM)の血管作用は単に血管拡張だけでなく、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖促進作用を持ち、AMが血管リモデリングに関与している可能性を示した。本年度はAMの作用機序の解析ならびに生体内でのAMの作用の有無の検討を行った。ラットVSMCではAMはCa^<2+>応答性に細胞質チロシンキナーゼであるPYK-2とc-Srcを活性化し、アダプター蛋白(Shc、Grb-2-Sos)をリクルートする結果、ras依存性にMAPキナーゼ(ERK1/2)を活性化することが明らかとなった。更にラット頚動脈のバルーン傷害モデルでは新生内膜のVSMCにAMが過剰発現していることを免疫組織学的に確認した。更にバルーン傷害前よりAM受容体拮抗薬のCGRP(8-37)を2週間連続投与した結果、内膜肥厚部位は対照に比較して有意に減少していた。以上の事実は生体内でもAMは内膜傷害時に血管局所で過剰に発現され、AMがVSMCの遊走・増殖に促進的に作用していることを実証した。現在AMレセプターの補助蛋白であるRAMPアイソフォームを特異的に阻害するアンチセンス導入により、AMによる血管肥厚の抑制効果が生ずるかを検討中である。アドレノメデュリン(AM)は単に血管拡張因子としての役割に留まらず、各種血管系細胞において、細胞増殖、遊走、アポトーシスの制御など多彩かつ重要な生理活性を惹起することを明らかにした。AMは血液・尿など体液中にも存在するなど、広く各種細胞系に発現する。AMは血管平滑筋細胞(VSMC)に対して、MAPキナーゼ依存性に細胞の増殖・肥大を促進するが、AM刺激によってCa2+感受性の細胞内
国際刑事裁判所規程の解釈論的研究

「国際刑事裁判所規程」の問題を刑事法学の視点から見た場合、主要なテーマは、(1)国際刑事裁判所において訴追される対象犯罪、(2)それに対して科される刑罰とその執行、(3)国際刑事裁判所の管轄権、(4)刑法総則規定、(5)国際刑事裁判所における刑事手続、(6)国際刑事裁判所に対する締約国の司法上の協力(犯罪人引渡し、捜査共助)等である。平成11年度と12年度には国際連合において、国際刑事裁判所規程を補充するものとして、対象犯罪についてのガイドラインと手続・証拠規則の制定のための国際会議が開催された。この会合に日本政府代表団法律顧問として出席し各国代表と意見交換を行い、その成果等を基に同規程の解釈論的研究の深化に努めた。その成果がTrifftererザルツブルク大学教授(オーストリア)等による、国際刑事裁判所設立に関与した主な研究者と実務家のほとんどが執筆した「国際刑事裁判所規程」注釈書の執筆への参加である。また国際刑事裁判所規程の解釈には、これと関係の深い、旧ユーゴ国際刑事裁判所規程との比較法的研究が必要である。そのため同裁判所(ハーグ)を訪問し、検察官等の関係者と意見交換を行った。国際刑事裁判所の管轄権の問題は、「普遍的管轄権」の問題と関連する。これをテーマとするプリンストン大学における国際会議に出席し、討議を行うと共に、採択された文書の起草に参加した。また、外務省主催の「国際人道法に関するセミナー」の「第4テーマ:人道法の履行確保と違反行為の処罰」の座長を務めた。1998年に採択された「国際刑事裁判所規程」は、前文および128条の条文から成り、その内容は、国際刑事裁判所の管轄権、刑法総則、裁判所の組織、捜査および公判、刑罰およびその執行、上訴および再審、国際協力および司法共助等から成る。本研究は、この「国際刑事裁判所規程」の解釈論的研究である。この問題を刑事法学の視点から見た場合、主要なテーマは、(1)国際刑事裁判所において訴追される対象犯罪、(2)それに対して科される刑罰とその執行、(3)国際刑事裁判所の管轄権、(4)刑法総則規定、(5)国際刑事裁判所における刑事手続、(6)国際刑事裁判所に対する締約国の司法上の協力(犯罪人引渡し、捜査共助)等である。平成11年度においては特に(4)(5)(6)の研究を重点的に行った。とりわけOtto Trifftererザルツブルク大学教授(オーストラリア)等による「国際刑事裁判所規程」の注釈書の執筆に参加した。この注釈書には、国際刑事裁判所設立に関与した世界中の主な研究者と実務家のほとんどが執筆している。また平成11年度には、数度にわたり、国際連合において、国際刑事裁判所規程を補充するものとして、対象犯罪についてのガイドラインおよび手続・証拠規則の制定のための国際会議が開催された。この会合に出席し、各国代表と意見交換を行った。本年度は、このような新たな問題の展開をも視野に入れて研究を進めることができた。「国際刑事裁判所規程」は、前文および128条の条文から成り、その内容は、国際刑事裁判所の管轄権、刑法総則、裁判所の組織、捜査および公判、刑罰およびその執行、上訴および再審、国際協力および司法共助等から成る。平成12年度においては特に(3)(5)(6)の研究を重点的に行った。平成11年度に引き続き、国際連合において、国際刑事裁判所規程を補充するものとして、対象犯罪についてのガイドラインおよび手続・証拠規則の制定のための国際会議が開催された。この会合に日本代表団法律顧問として出席し、各国代表と意見交換を行った。

また国際刑事裁判所と関係の深い、ハーグの旧ユーゴ国際刑事裁判所を訪問し、検察官等の関係者と意見交換を行った。国際刑事裁判所の管轄権の問題は、「普遍的管轄権」の問題と関連する。これをテーマとするプリンストン大学における国際会議に出席し、討議を行うと共に、採択された文書の起草に参加した。また、外務省主催の「国際人道法に関するセミナー」の「第4テーマ:人道法の履行確保と違反行為の処罰」の座長を務めた。
植物細胞の環境応答におけるミトコンドリアの動態と生理機能のイメージング解析

本研究では、ミトコンドリア動態の制御因子であるMiro GTPaseのシロイヌナズナのオーソログMIRO1に注目し、その機能を明らかにすることで、植物の個体発生・環境応答におけるミトコンドリア動態の役割の解明を目指す。本年度の研究成果は以下の通りである。1)MIRO1相互作用タンパク質の探索:Miro GTPaseの植物ミトコンドリアにおける生理機能は明確でない。本研究では、MIRO1の相互作用タンパク質の同定を試みた。まずyeast two-hybrid法によるスクリーニングにより、MIRO1と相互作用するタンパク質の同定を試みたところ、その候補としてミトコンドリア外膜に局在するチャネルであるvoltage-gated anion channel (VDAC)が得られた。この相互作用はGFP-MIRO1融合タンパク質を発現する植物を用いた共免疫沈降においても示唆された。これらのことから、MIRO1はVDACと相互作用することが示唆された。2)VDACのミトコンドリア形態および植物の発生における寄与: VDACのT-DNA挿入変異体では、ミトコンドリアの形態異常とロゼット葉の早期黄化が見られた。これらの表現型はMIRO1ノックダウン植物でも観察されていることから、両者は同一の経路で機能することが示唆された。以上のことから、MiroはVDACと相互作用することでミトコンドリアの外膜における物質透過性の制御に寄与しており、これらの欠失はミトコンドリアの機能低下と形態異常につながるという可能性が考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、ミトコンドリア動態の制御因子であるMiro GTPaseのシロイヌナズナのオーソログMIRO1に注目し、その遺伝子の発現抑制(ノックダウン)変異体を作成することで、植物の個体発生・環境応答におけるミトコンドリア動態の役割の解明を目指す。また、植物細胞内のレドックス状態などの変化を可視化するイメージング技術の開発を試み、ミトコンドリア動態との関係を明らかにする。1)MIRO1ノックダウン植物の作成:MIRO1のノックアウト植物は胚性致死を示す。胚発生以後のMIRO1の役割を明らかにするために、人工マイクロRNAによるMIRO1ノックダウン植物の作成を試みた。得られた形質転換植物について定量PCRを行ったところ、MIRO1転写産物の蓄積が特異的に低下していた。またMIRO1の細胞質ドメインに対して抗体を作成し、ウェスタンブロット解析を行ったところ、MIRO1タンパク質の蓄積が低下していることが明らかとなった。これらの植物では、多くの個体が生育途中で枯死したが、一部は生存・継代が可能で、植物の発生に多面的な異常が見られた。また蛍光タンパク質を用いてミトコンドリアを可視化したところ、ロゼット葉にてミトコンドリアが異常な形態を示すことが明らかとなった。2)レドックス状態を検知する新規FRETプローブRedoxfluorを発現する植物の作成:Redoxfluorは酵母・動物において細胞内のレドックス状態を検出するFRETプローブとして最近開発された。本研究では、同プローブを発現する植物を作成し、その実生に過酸化水素を投与したところ、FRET効率に変化が見られたことから、Redoxfluorは植物細胞におけるレドックス変化を検出しうることが示された。本年度はMIRO1ノックダウン植物のライン確立に成功し、今後の解析の基礎を得ることができた。またRedoxfluorが植物細胞内においても外部刺激に応じて作動することを示すことができた。以上のことから、本年度は当初の計画通りに研究を遂行することができたと考えている。

1)ミトコンドリアの動態異常がもたらす植物細胞の生理的変化を解析する:次年度は、まず共焦点顕微鏡および電子顕微鏡観察などを用いて、MIRO1ノックダウンによるミトコンドリアの形態への影響を明らかにする。またこれらの系統では多面的な植物体の発生異常が観察されているが、その原因について、ミトコンドリアの機能との関係に注目しつつ明らかにする。また同時にMIRO1ノックダウンによる植物の環境応答への影響も解析する。2)植物細胞内のレドックス状態の変化を可視化する汎用的なイメージング解析法を開発する:次年度は、Redoxfluorを発現する植物を用いてさまざまな外部刺激によるRedoxfluorの応答を解析するとともに、レドックス異常を示す既知の変異株に導入し、生理条件下での応答を明らかにする。さらにこれらRedoxfluor形質転換植物において同時にミトコンドリアを可視化し、ミトコンドリア近傍でのレドックス変動について解析する。
頭頸部癌における新しい転移関連遺伝子と早期診断システムの開発

頭頸部癌の転移に関する現在までの報告されたmicroarray遺伝子発現データによるMAL(T-lymphocyte maturation-associated protein)遺伝子の発現が抑制されている.MAL遺伝子の転移に関する機能を調べるため、mRNA発現を原発性および転移性頭頸部癌にsemi-quantitative RT-PCRおよびreal-time PCRより検討した.またMAL遺伝子発現抑制のメカニズムに関してLOH、変異およびメチル化の有無も調べた.材料として35例の頭頸部癌のUT-SCCバイオ細胞シリーズおよび21例の組織を使った.35例バイオ細胞の中に20例は発現の抑制を示した。9例の原発・転移性細胞ペアーを比べると、4例の転移性細胞に発現抑制を認めた.頭頸部癌組織に対しても同様に43%のサンプルで転移性組織に発現抑制を認めた.抑制のメカニズムとして、頭頸部癌組織に38%のLOHを観察した.また、20例のバイオ細胞を脱メチル化剤5-aza-dCで処理したら、9例に発現の再現を認めた.各バイオ細胞にdirectシークエンス分析により変異を認めなかった.結論としてMAL遺伝子の発現はLOHおよびメチル化より転移腫瘍で減少した.MAL遺伝子は頭頸部癌に転移抑制遺伝子として働く可能性が示唆された.頭頸部癌の転移に関する現在までの報告されたmicroarray遺伝子発現データによるMAL(T-lymphocyte maturation-associated protein)遺伝子の発現が抑制されている.MAL遺伝子の転移に関する機能を調べるため、mRNA発現を原発性および転移性頭頸部癌にsemi-quantitative RT-PCRおよびreal-time PCRより検討した.またMAL遺伝子発現抑制のメカニズムに関してLOH、変異およびメチル化の有無も調べた.材料として35例の頭頸部癌のUT-SCCバイオ細胞シリーズおよび21例の組織を使った.35例バイオ細胞の中に20例は発現の抑制を示した。9例の原発・転移性細胞ペアーを比べると、4例の転移性細胞に発現抑制を認めた.頭頸部癌組織に対しても同様に43%のサンプルで転移性組織に発現抑制を認めた.抑制のメカニズムとして、頭頸部癌組織に38%のLOHを観察した.また、20例のバイオ細胞を脱メチル化剤5-aza-dCで処理したら、9例に発現の再現を認めた.各バイオ細胞にdirectシークエンス分析により変異を認めなかった.結論としてMAL遺伝子の発現はLOHおよびメチル化より転移腫瘍で減少した.MAL遺伝子は頭頸部癌に転移抑制遺伝子として働く可能性が示唆された.(はじめに)頭頸部癌の全生存率と無病生存率を左右する最も重要な因子は頸部リンパ節であると報告されている。リンパ節転移は原発部位によって異なるが50-80%と非常に高率である。現在まで原発腫瘍の転移能力を測定する方法はなく、転移抑制遺伝子の解明が必要であると考えられる。そこで今回我々は頭頸部癌における転移を制御する候補遺伝子としてMAL(T-Iymphocyte maturation-associatedprotein)について検討を行った。前回のpreliminaryな検討において頭頸部扁平上皮癌患者の原発と転移組織におけるmRNA発現を解析し、その結果として有意に発現の低下を観察した。(方法)実験材料として7ペアの頭頸部癌原発と転移癌原生のUT-SCC培養細胞シリーズおよび22例の頭頸部癌の転移癌原生のUT-SCC培養細胞シリーズを含め、全部で29株の培養細胞を使った。各細胞からRNAを抽出してからRTおよびPCRによってmRNA発現を検討した。また、MALプロモーター領域にCpGアイランドが存在することを確認したので、発現低下の培養細胞に脱メチル化剤5-aza-dCで72時間処理して、メチル化の影響も調べた。(結果)MAL遺伝子の発現はすべて22株の転移癌原生の培養細胞で14株(64%)に減少した。また、7ペアの頭頚部癌原発と転移癌原生の細胞の発現を比較して、5株の転移腫瘍で減少した(71%)。さらに、メチル化の影響も調べた14株の中、7株が脱メチル化剤によりMAL発現の増加が認められた。(考察)転移腫瘍においてMAL遺伝子の高頻度な発現減少およびプロモーター領域のチル化が認められた。以上のデータより,MAL遺伝子は転移抑制遺伝子として働く可能性が示唆された。(はじめに)頭頸部癌の転移に関するミクロアレイを用いた研究では、遺伝子発現データにおいてMAL(T-lymphocyte maturation-associated protein)遺伝子の発現が抑制されていることが報告されている。今回、MAL遺伝子の転移に関する機能を検討した。材料と方法: 35例の頭頸部癌のUT-SCCバイオ細胞シリーズおよび21例の癌組織を用いた。原発性および転移性頭頸部癌におけるMAL遺伝子のmRNA発現を半定量的RT-PCRおよびreal-time PCRより検討した。またMAL遺伝子発現抑制のメカニズムに関してLOH、変異およびメチル化の有無についても検討した。(結果)9例の原発・転移性細胞ペアを比べると、4例の転移性細胞に発現抑制を認めた。頭頸部癌組織に対しても同様に43%のサンプルで、転移性組織に発現抑制を認めた。抑制のメカニズムとして、頭頸部癌組織に38%のLOHを観察した。また、20例のバイオ細胞を脱メチル化剤5-aza-dCで処理後、9例に発現の再現を認めた。各バイオ細胞には直接シークエンス分析により変異を認めなかった。(考察)

MAL遺伝子の発現はLOHおよびメチル化より転移腫瘍で減少することが判明し、MAL遺伝子は頭頸部癌に転移抑制遺伝子として働く可能性が示唆された。
個人の異質性を考慮した多変量順序選択モデルのベイズ推定

本研究の目的は,個人の異質性を考慮した順序選択モデルのベイズ法による推定方法の開発とその社会科学のデータへの応用である.具体的には,King et al. (2004)が開発したAnchoring Vignettesをもつ順序モデルのベイズ推定の方法を考えた.更に,順序選択モデルの構成部分(self-assessment式)とvignettesの構成部分(vignettes式)との相関を考慮したモデルを考え,そのベイズ推定法を開発した.また,順序選択モデルの拡張として,被説明変数として複数の順序変数と連続型変数が混在するモデルを考え,そのベイズ推定の方法を開発した.本研究の目的は,個人の異質性を考慮した順序選択モデルのベイズ法による推定方法の開発とその社会科学のデータへの応用である.具体的には,King et al. (2004)が開発したAnchoring Vignettesをもつ順序モデルのベイズ推定を考える.申請者の知る限り,このようなAnchoring Vignettesをもつ順序選択モデルのベイズ推定を試みた文献はなく,本研究の重要性を表す点と言える.本年度では,交付申請書に記載した「平成25年度の研究実施計画」に従って,以下の点を行った.(a)本研究を進めるにあたり必要と思われる新たなデータを収集と整理を行った.また,標本理論に基づく既存の文献を検討し,推定に関わる問題点の整理を行い,Anchoring Vignettesをもつ順序モデルのベイズ推定の開発の基本的枠組みを考えた.(b) King et al. (2004),Greene and Hensher (2010)等における標本理論を用いた推定方法を参考にして,Anchoring Vignettesをもつ1変量順序モデルのベイズ法による推定方法の開発を行った.現在,論文作成中であり,論文完成後,海外の専門誌へ投稿する予定である.(c)本研究に関連して,多変量順序選択モデルを用いて,仕事の満足度に関する実証分析を行い,2本の論文を作成中である.1本の論文は,既に,専門誌に投稿中であり,現在,査読者のコメントを基に改訂を行っている.もう1本は仕事の満足度の不平等に関するもので,実証分析の推定作業は済んでおり,論文の執筆中である.本研究の目的は,個人の異質性を考慮した順序選択モデルのベイズ法による推定方法の開発とその社会科学のデータへの応用である.具体的には,King et al. (2004)が開発したAnchoring Vignettesをもつ順序モデルのベイズ推定を考える.申請者の知る限り,このようなAnchoring Vignettesをもつ順序選択モデルのベイズ推定を試みた文献はなく,本研究の重要性を表す点と言える.本年度では,交付申請書に記載した「平成26年度の研究実施計画」に従って,以下の点を行った.(a)平成25年度に引き続き,標本理論に基づく既存の文献を検討し,推定に関わる問題点の整理を行い,Anchoring Vignettesをもつ順序モデルのベイズ推定の開発の基本的枠組みを考えた.(b) self-assessment式とvignettes式との相関を考慮したモデルを考え,そのベイズ法による推定方法の開発を行った.self-assessment式とvignettes式との相関を考慮したモデルは既存の文献にはない.また,標本理論に基づく方法によるこのモデルの推定は困難と思われるので,ベイズ法を用いる利点となる.ベイズ法による推定でも,MCMCのミキシングが遅く,よい推定値を得るのが困難であったが,Greene and Hensher (2010)のパラメータ変換を用いることで問題を解決することができた.現在,論文作成中であり,論文完成後,海外の専門誌へ投稿する予定である.(c)本研究に関連して,多変量順序選択モデルを用いて,仕事の満足度に関する実証分析を行い,2本の論文を作成した.どちらのの論文も専門誌に投稿中であり,そのうちの1本は,現在,査読者のコメントを基に第3回の改訂を行っている.もう1本はについては,査読結果を待っているところである.本研究の目的は,個人の異質性を考慮した順序選択モデルのベイズ法による推定方法の開発とその社会科学のデータへの応用である.具体的には,King et al. (2004)が開発したAnchoring Vignettesをもつ順序モデルのベイズ推定を考える.申請者の知る限り,このようなAnchoring Vignettesをもつ順序選択モデルのベイズ推定を試みた文献はなく,本研究の重要性を表す点と言える.本年度では,交付申請書に記載した「平成27年度の研究実施計画」に従って,以下の点を行った.(a)平成25年度及び平成26年度に引き続き,国内外で新たなデータの収集を行うとともに,収集したデータを本研究の分析に適合するように整理した.また,文献の収集も継続して行った.(b)平成27年度では,複数のself-assessment式とvignettes式のモデルを考え,そのベイズ法による推定方法を開発し,本研究で開発した手法を具体的な社会科学のデータを用いた分析への適用を考えた.また,Greene and Hensher (2010)「Modeling Ordered Choices」で提案された個人の異質性を取り入れた順序モデルのベイズ推定を考えた.平成27年度は最終年度にあたるので,平成25年度及び平成26年度に構築したベイズモデルの実証分析への応用に際しての問題点を検討し,その修正を行った.(c)得られた研究成果はセミナーで発表するとともに,幾つかの論文にまとめ,海外の専門誌に投稿した.