hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
理科学習の意義を認識させる学習指導とその効果－科学的能力の意識化を意図して－

本研究の目的は,動機づけ向上のために,「理科学習の意義」を科学的知識と日常生活との関連だけではなく,理科で身につく「科学的能力」からも認識させる方法に着目し,そのための学習指導モデルを開発することである。研究の結果,明らかにしたのは次の通りである。まず,「理科学習の意義」を「科学的能力」と認識させることは,自律的な動機づけを向上させ,他律的な動機づけを低下させること。「理科学習の意義」を「日常生活との関連」と認識させることは,自律的な動機づけを向上させる一方で,他律的な動機づけも向上させてしまうこと。これらの結果に基づく動機づけ向上に一定の効果のある学習指導モデルを開発したこと。本研究の目的は,「理科学習の意義」を「科学的知識(日常生活との関連)」だけではなく「科学的能力」からも認識させる学習モデルを開発することを目的としている。このために,H27年度は,1中学生を対象に,「理科学習の意義」の認識と「理科学習への動機づけ」との関連について,2高校生を対象に理科学習の中でもアクティブラーニング(以下,AL)の一つとして注目されている「相互評価活動に対する学習の意義」の認識と動機づけとの関連について明らかにした。その結果,次のことが明らかになった。1について,「理科学習の意義」を「科学的能力」あるいは「日常生活との関連」と捉えることは自律的な動機づけに正の影響を与え,両者のうち「科学的能力」と認識する方が自律的な動機づけに与える影響が相対的に大きいこと。また,「科学的能力」と認識することで,他律的な動機づけに負の影響を与えることが明らかになった。2について,「相互評価活動に対する学習の意義」を「科学的能力」あるいは「日常生活との関連」と捉えることは相互評価活動に対する自律的な動機づけに正の影響を与える一方,「日常生活との関連」と捉えることで相互評価活動に対する他律的な動機づけにも正の影響を与えることが明らかになった。以上の成果から,「理科学習の意義」を「科学的知識(日常生活との関連)」だけではなく「科学的能力」からも認識することで理科学習に関する動機づけを高めること,また,「科学的知識(日常生活との関連)」から認識するとALに関する動機づけを低下させてしまうことが明らかになった。これは,日常生活との関連を推し進める国内の理科教育について,その危険性を伝えるインパクトのある結果となった。当初の計画と異なっている点は対象者の違いである。当初は小学生を対象に調査を行う予定であったが,その調査内容の性質上から研究協力者との協議の結果,中・高校生を対象とすることにした。その他については,計画を達成していると判断できる結果が得られている。本研究の目的は,「理科学習の意義」を「科学的知識(日常生活との関連)」だけではなく「科学的能力」からも認識させることにより「理科学習への動機づけ」向上を志向した学習モデルを開発することを目的としている。このため,H28年度は,H27年度に明らかにした「理科学習の意義」の認識と「理科学習への動機づけ」との関連をもとに,学習モデルの開発および実践を行った。学習モデルの開発については,H27年度において「理科学習の意義」を「科学的能力」から認識させることが「理科学習への動機づけ」を向上させることを明らかにしたため,当初の予定通り,学習者に「理科学習の意義」を「科学的能力」から認識させることを意図した短期型アプローチと長期継続型アプローチからなる学習モデルを開発した。具体的には,短期型アプローチでは,理科学習を通して,どのような能力がなぜ身につくのかについて学習者に理解させるために科学史や理科授業の構造を直接教授する指導を行う。長期継続型アプローチでは,科学的能力が理科授業を通して身についていると実感させるために,普段の授業において,授業の終結場面において,能力に関する振り返りを行わせる党を中心とした指導を行う。学習モデルの実践について,開発した学習モデルに基づき,高校生を対象に短期型アプローチを1時間,長期継続型アプローチを約2ヵ月実施した。この効果検証については,(1)「理科学習の意義」を「科学的能力」から認識させることができたか,(2)「理科学習の動機づけ」を向上させることができたかの2点から行った。その結果,対象者全体としては両者ともにそれぞれ向上させることができたと判断できる結果が得られた。しかしながら,対象者の違い(進学希望生徒,就職希望生徒)によって,その結果に差が生じたため,結果が得られなかった対象者に対する学習モデルの改善を行う必要性があるといった課題も残った。当初の計画では,H28年度は学習モデルの開発と実践を行う予定であり,その計画通り研究を遂行した。また,H29年度も学習モデルの改善を計画していたため,来年度も計画通り研究を進める。本研究の目的は,「理科学習の意義」を「科学的知識(日常生活との関連)」だけではなく「科学的能力」からも認識させることにより「理科学習への動機づけ」向上を志向した学習モデルを開発することを目的とした。H28年度において,高校生を対象に,短期型・長期継続型アプローチから成る学習モデルを開発し,実践を行ったところ,(1)「理科学習の意義」を「科学的能力」から認識させること,(2)「理科学習の動機づけ」を向上させることの2点についてそれぞれ向上させることができたと判断できる結果が得られた。

以上の結果を踏まえ,本年度は中学生において,同様に実践及び効果検証を行ったところ,H28年度と同様に,(1)「理科学習の意義」を「科学的能力」から認識させることには有効であったものの,(2)「理科学習の動機づけ」を向上させることについては,十分に効果が得られたといえる結果が得られなかった。このため,「理科学習の意義」と「動機づけ」の関係について再検討を行うこととした。そして,再検討を行う際の視点を導出し,H29年度の研究を終えた。なお,再検討を行う際の視点として,対象者の特性の違いによって異なる結果が生じたことから,「理科学習の意義」が「動機づけ」に与える影響に対して媒介要因を想定すること,「理科学習の意義」に対する成長的要因を想定することの2点を導出した。本研究の目的は,動機づけ向上のために,「理科学習の意義」を科学的知識と日常生活との関連だけではなく,理科で身につく「科学的能力」からも認識させる方法に着目し,そのための学習指導モデルを開発することである。研究の結果,明らかにしたのは次の通りである。まず,「理科学習の意義」を「科学的能力」と認識させることは,自律的な動機づけを向上させ,他律的な動機づけを低下させること。「理科学習の意義」を「日常生活との関連」と認識させることは,自律的な動機づけを向上させる一方で,他律的な動機づけも向上させてしまうこと。これらの結果に基づく動機づけ向上に一定の効果のある学習指導モデルを開発したこと。H28年度は,当初の計画通り学習モデルによる実践および効果検証を行う予定である。実践校となる中学校には既に実践の了承が得られており,5月6月に実践を行う計画となっている。H29年度は,当初の計画通り学習モデルによる改善および効果検証を行う予定である。実践校となる中学校には既に実践の了承が得られており,6月頃に実践を行う計画となっている。理科教育学
植物軟腐病菌のバクテリオシンとペクチンリアーゼの発現制御と生体機能に関する研究

(1)PnlおよびCtv自然誘発細胞の検出手法の確立pnlプロモーターとGFPレポーター遺伝子の融合遺伝子を作成し、本菌の溶菌カセットまたはpnlに挿入して、共焦点顕微鏡下でGFPの蛍光でpnlプロモーターの発現をモニターする系を構築した。この細胞を用いることで、マイトマイシンCや紫外線処理をしない細胞群でも自然誘発的にpnlプロモーターが発現する細胞が存在することを明らかにした。上記融合遺伝子保有株を用いrdgA-B領域、及びrecA遺伝子をそれぞれ破壊した株を得た。これらの株においては(1)における自然誘発が観察されなかったことから、誘導処理なしで起こる自然誘発的なpnl発現もrdgA-B領域、及びrecA及びrdgA-Bの支配下にあることを確認した(3)自然誘発に関与する新規遺伝子の同定・解析トランポゾンを用いた上記融合遺伝子を発現できない挿入変異株の取得は現在進行中である。(4)rdgBノックアウトミュータント病原性の定量法の確立ジャガイモ塊茎切片を用いたrdgBノックアウトミュータント病原性の定量法を確立した。本手法は今後の自然誘発により発現する病原性遺伝子群の意義の解析に用いる。また本手法を用いてRdgBの病原性に対する意義を示すデータは申請書に記載した(2)-1Ctv、PnlのDNA傷害応答性発現制御機構の解析(Yamada K.et al.,Appl.Environ.Microbiol.投稿中)の改訂稿に反映し、本投稿論文が受理された。
レジン系歯科材料の重合及び脂質過酸化に及ぼす抗酸化剤の影響

歯科用ラジカル重合開始剤として、過酸化ベンゾイル、光重合開始剤など種々用いられている。ラジカルはメタクリレートを重合させるが、反面脂質過酸化作用により、生体膜を障害させる。抗酸化剤はこれらを保護する作用がある。光増感剤(カンファキノン、CQ;9-フルオレノン、9F)を還元剤ジメチルアミノエチルメタクリレート存在下可視光線照射し発生するフリーラジカルがヒト類表皮癌細胞にどのような影響を与えるか検討した。CQや9Fは細胞表面で活性酸素を発生させた。これは蛍光色素、5-(and6)-carboxyl-2′,7′-dichlorofluorecin diacetateを細胞表面に取り込ませておき,活性酸素による発光をACAS 570 laser cytometerで検出した。位相差顕微鏡の観察で活性酸素により障害を受けた細胞はバレーン(球形流出物)や壊死に至った細胞がみられた。9FはCQより障害性が大きかった。抗酸化剤(ラジカル捕捉剤)として、ビタミンE,ビタミンC,ハイドロキノンなどを細胞に取り込ませておき、CQや9Fに光照射しラジカルによる障害を検討した。これら抗酸化剤は著しく細胞障害性をブロックした。9Fの活性酸素発生能力はCQより大きかった。α-Tocopherol (α-Toc), β-carotene (β-car)などは生体における主要な抗酸化剤として注目されている。抗酸化剤の生体外での作用を明らかにするため、各種抗酸化剤をメチルメタクリレート(MMA)に添加して、示差走査熱量計中70°Cで加熱重合し、重合率一時間曲線から誘導期間、初期重合速度を測定し、重合挙動を解析した。α-Tocは濃度の増加に従って、誘導期間が顕著に増加し、また初期重合速度も大きく減少した。重合禁止剤として知られるフェノール性OH基をもつブチルヒドロキシトルインはα-Tocと同様な重合挙動を示したが作用は前者より大きかった。一方β-carは濃度が増すと重合反応は明らかに抑制された。そして明らかな誘導期間の減少はみられず、初期重合速度のみ、濃度の増加に伴って著しく減少した。レチノールもこれと同じ挙動を示したがβ-carより作用は小さかった。β-carはα-Tocより重合抑制効果が大きかった。フェノール性OH基をもつ連鎖切断型ラジカル捕捉剤(α-Toc)と共役二重結合によるラジカル捕捉剤(β-car)とでBPO-MMA重合に大きな差があることが明らかになった。抗酸化剤の作用をリノール酸メチルの酸化作用で調べる方法があるが、本方法は簡便で正確にラジカル捕捉効果を検討出来ることが分かった。1.MMA重合系の誘導期間による各種抗酸化剤のラジカル捕捉効果の研究ビタミンEのラジカルスキャベンジ効果を明らかにするため、重合開始剤として過酸化ベンゾイルおよびα,α-アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)を用いてビタミンE、その関連化合物,の存在下示差走査熱量計、DSCで70°C所定時間メチルメタクリレート(MMA)加熱重合を行い,DSCサーモグラムより時間重合率曲線を描記し誘導期間、初期重合速度(IRP)を求めた。BPOシステムにおいてフェノール化合物の誘導期間は濃度依存性を示し、濃度の増加に伴って、誘導期間は増加した。その値は次ぎのように減少した。ブチルヒドロキシトルエン>フェノール>ビタミンE..以上のことからビタミンEは重合遅延剤(抑制剤)と結論された。次ぎにβ-カロチン,all-trans-retinolについても同様に検討した。これらは濃度が増すと、重合反応が抑制された。明らかな誘導期間が存在せずしかも初期重合速度が大きく減少する重合挙動を示した。類似化合物のレチノールもカロチン同様の挙動を示したがカロチンより変化は小さかった。β-カロチンとビタミンEは明らかに異なる挙動を示したのは、ビタミンEのフェノール性OH基による連鎖切断型ラジカル捕捉作用とβ-カロチンの共役二重結合部へのラジカルトラップ作用の差によるものと考えられた。

2.レジン重合光増感剤のフリーラジカル生成による細胞障害性可視光線照射による増感剤(カンファキノン、CQ)と還元剤(ジメチルアミノエチルメタクリレート、の化学反応により重合開始される。これら光感受性物質により誘起される生物学的反応を検討するため、培養細胞としてA-431ヒト類表皮細胞を用いラジカルによる細胞障害の影響とそれを予防する抗酸化剤添加の影響を検討した。1)増感剤の違いによる細胞障害の影響9-フルオレノン(9),ベンゾフェノン(BP),CQの光照射による細胞障害は9F>BP>CQの順に障害性が減少した。重合禁止剤ハイドロキノン(HQ)を添加すると、細胞障害性は有意に減少した。2)各種抗酸化剤のラジカル捕捉作用におよぼす影響ラジカル捕捉剤としてビタミンE.ビタミンC,β-カロチン,L-cysteineなどについて検討した。これら非添加群の細胞生存率より有意に生存率は大きくなった。
低減速自然循環沸騰水型炉における起動時の炉心内不安定流動特性に関する研究

将来型軽水炉として有望視されている低減速自然循環沸騰水型炉の概念の成立性を評価するために,起動時に稠密炉心およびチムニーにおいて発生することが懸念されている熱水力学的諸問題(ガイセリング,密度波振動,チムニー内における二次流れによる流動不安定性)に関して,実験及び解析の両面より検討を行った.ガイセリングおよび密度波振動に関しては,低減速自然循環沸騰水型炉の炉心を模擬した沸騰流路を用いて,発生機構・安定限界を調べるととともに, RELAP5をベースに開発した解析コードを用いて抑止策の検討を行った.また,起動時の低ボイド率条件下において発生することが懸念されているチムニー内の二次流れ現象に関しては,チムニー内流路を模擬した矩形流路を用いて,ボイドや液相の挙動を詳細に追跡することが可能なワイヤー・メッシュ・トモグラフィー(WMT)や超音波パルス・トモグラフィ法(UVT)を用いて,その発生機構を詳細に明らかにするとともに,抑止策の検討を行った.以上より,低減速自然循環沸騰水型炉の最適且つ合理的な起動手順および炉心構造の提案を行った将来型軽水炉として有望視されている低減速自然循環沸騰水型炉の概念の成立性を評価するために,起動時に稠密炉心およびチムニーにおいて発生することが懸念されている熱水力学的諸問題(ガイセリング,密度波振動,チムニー内における二次流れによる流動不安定性)に関して,実験及び解析の両面より検討を行った.ガイセリングおよび密度波振動に関しては,低減速自然循環沸騰水型炉の炉心を模擬した沸騰流路を用いて,発生機構・安定限界を調べるととともに, RELAP5をベースに開発した解析コードを用いて抑止策の検討を行った.また,起動時の低ボイド率条件下において発生することが懸念されているチムニー内の二次流れ現象に関しては,チムニー内流路を模擬した矩形流路を用いて,ボイドや液相の挙動を詳細に追跡することが可能なワイヤー・メッシュ・トモグラフィー(WMT)や超音波パルス・トモグラフィ法(UVT)を用いて,その発生機構を詳細に明らかにするとともに,抑止策の検討を行った.以上より,低減速自然循環沸騰水型炉の最適且つ合理的な起動手順および炉心構造の提案を行った本研究は、超音波流速分布計とワイヤー・メッシュ・トモグラフィを大口径管内の気泡流の多次元流動特性計測に適用して、解析コードの検証用データベースを確立するとともに二次流れ特性を解明し、チェムニの最適な分割に必要な知見を提供するとともに、低減速自然循環沸騰水型炉の成立性に大きな影響を与える起動時の炉心内不安定流動特性、特に、不安定流動、チェムニ内の二次流れ、並びに、狭隘流路における熱流動特性を解明することを目的として,以下の知見を得た.(1)現有の自然循環沸騰二相流実験装置の出入口プレナム間の2本の並列沸騰流路から構成されるテスト部を、加熱部の下流側の非加熱ライザー長を0m、0.25m、0.5m、0.75mに変更できるように改造した。そして、入口サブクール度は10Kと固定し、系圧力を大気圧から0.7MPaまでパラメトリックに変化させ、ガイセリングの発生領域を投入熱流束に対して求め、ガイセリングの発生領域に与える系圧力と非加熱ライザー長の影響を定量的に解明した。(2)気泡流の多次元流動特性を計測する新しい技術として、超音波パルス・トモグラフィ法を開発し、従来本研究グループが開発してきた超音波パルスのドップラ効果を利用した計測技術(UVP)を用いた計測と併用することにより、測定精度を検証した。現有のUVPは他の研究に使用するため、本研究に専用できる新しい1台を購入する必要がある。また、昨年度までにドイツのロッセンドルフ研究所と共同開発を行い完成させたワイヤー・メッシュ・トモグラフィ(WMT)の計測技術を実験装置の下流側に設置し、UVPとWMTにより計測した結果を比較して二相流計測の精度を明らかにした。(3)大気圧下の空気-水を作動流体とする大口径二相流循環装置を、低減速自然循環沸騰水型炉の炉心部とチェムニ部を模擬して、設計し、製作した。炉心部は半径方向の出力分布に合わせて空気注入量を変えられるような構造を設計する。また、チェムニ部は次年度以降の分割チェムニに変更できる構造を採用した。また、分割チェムニの場合は、ガイセリング発生の抑止策とこの間隙での横流れ防止との観点から、炉心上端部と分割チェムニの下端部の間隙に最適値が存在する可能性があるため、次年度以降この研究が可能な構造とする。(4)以上の準備が完了して実験装置を完成させた後、低減速自然循環BWRの起動時のチェムニ内の低ボイド率条件を模擬するため、液相を低流速で循環させ、流路中央部に気泡を注入する実験を行い、大口径管内の気泡流の二次流れ特性を調べる実験を行った。本研究は、超音波流速分布計とワイヤー・メッシュ・トモグラフィを大口径管内の気泡流の多次元流動特性計測に適用して、解析コードの検証用データベースを確立するとともに二次流れ特性を解明し、チェムニの最適な分割に必要な知見を提供するとともに、低減速自然循環沸騰水型炉の成立性に大きな影響を与える起動時の炉心内不安定流動特性、特に、不安定流動、チェムニ内の二次流れ、並びに、狭隘流路における熱流動特性を解明することを目的として,以下の知見を得た.

(1)テスト部において加熱部の下流側の非加熱ライザー長を前年度に引き続き0m、0.25m、0.5m、0.75mと変更し、入口サブクール度は10Kと固定し、系圧力を大気圧から0.7MPaまでパラメトリックに変化させ、ガイセリングの発生領域を投入熱流束に対して求め、ガイセリングの発生領域に与える系圧力と非加熱ライザー長の影響を定量的に解明した。(2)前年度に引き続き超音波パルス・トモグラフィ法(UVT)を開発するとともに、超音波パルスの発射から反射波の受信までの経過時間を10,000回以上計測して、そのデータを統計処理することにより、流れを気泡流、スラグ流、チャーン流、環状噴霧流の流動様式を判別する計測技術を確立した。(3)前年度に引き続き、気泡流の多次元的流動特性と液相内の乱流構造に及ぼす気泡径の影響を解明する実験を継続するとともに、気泡流の乱流についてモデルを構築した。(4)大口径二相流循環装置を用いた低減速自然循環沸騰水型炉のチェムニ部を模擬した実験を本格的に実施し、大口径流路内での気泡の挙動並びに二次流れ特性を解明する研究を実施した。計測に当たっては、UVP、WMTと現有の画像処理計測システムを用いるが、(2)におけるUVTの開発状況によっては、本年度からUVTも1年間前倒しでテスト部に取り付けて実験を行った。(5)二流体モデルとドリフト・フラックス・モデルに基づく過渡二相流数値解析コードを脈動流に適用して、不適切性と数値粘性の関係を解明する研究を継続するとともに、ガイセリングの発生限界に及ぼす系圧力を調べる研究結果に適用して、ガイセリングの発生機構と発生抑止策を解明した。(6)粒子-流体モデルに基づく気泡流の多次元流動解析コードを垂直円管流路内の気泡流の発達特性に関する実験結果に適用できるように改良し、シミュレーションして気泡流の発達特性を支配する物理現象を解明した。本研究は、超音波流速分布計とワイヤー・メッシュ・トモグラフィを気泡流の多次元流動特性計測に適用して、解析コードの検証用データベースを確立するとともに二次流れ特性を解明し、チェムニの最適な分割に必要な知見を提供するとともに、低減速自然循環沸騰水型炉の成立性に大きな影響を与える起動時の炉心内不安定流動特性、特に、不安定流動、チェムニ内の二次流れ、並びに、狭隘流路における熱流動特性を解明することを目的として,以下の知見を得た.(1)前年度までに実施したガイセリングの発生領域に与える系圧力と非加熱ライザー長の影響を調べる実験結果を検討し、入口サブクール度もパラメータとした実験を行い,それらの影響の普遍性を高めた。(2)並列沸騰流路のテスト部を1本の流路に変え、系圧力をパラメータとして、非加熱ライザー部の気泡の合体過程を画像処理計測し、非加熱ライザー部での気泡合体による気泡の単一化が系圧力との関係を解明した。(3)年度に引き続き、超音波パルス・トモグラフィ法(UVT)を利用した流動様式判別計測システムを完成させるとともに、金属配管の外壁に超音波センサーを取り付けた場合の超音波パルスの金属壁透過に関する基礎研究を合わせて実施し、最終的には現有の沸騰二相流実験装置に取り付け、金属流路内の二相流の流動様式が計測できるシステムとして完成させた。(4)前年度までに得られた成果を基に、ガイセリングの数値解析には二流体モデルあるいはドリフト・フラックス・モデルに基づく過渡二相流数値解析コードが適するかを判断し、その解析コードを用いてガイセリングの発生限界に及ぼす非加熱ライザー長と系圧力の関係を調べる実験結果に適用して、ガイセリングの発生機構を解明するとともに、発生が抑止できる起動運転手順と炉形状を検討した。
精子鞭毛波形制御におけるカルシウムイオンとcAMPの役割の解明

真核生物の鞭毛・繊毛は、精子運動・体内の水流制御など細胞運動やシグナル受容において非常に重要な器官であり、その構造・機能は進化を通して高度に保存されている。真核生物の鞭毛・繊毛運動制御機構を明らかにするため、本研究では材料として扱いやすく反応が顕著に観察できる海産生物精子を用いて、「鞭毛波形制御におけるカルシウムイオンとcAMPの役割」に着目し、申請者が持つ鞭毛に関する独自性の高い運動解析・イメージング技術を駆使し、鞭毛・繊毛運動制御に重要なシグナル因子の解析とその機能の全容解明を目指す。本研究により細胞生物学分野においての基礎的知見が得られるとともに、不妊治療や繁殖分野への応用なども期待される。
糖尿病性腎臓病の腎組織を用いたトランスクリプトーム解析－新規治療法探索へ向けて－

結節病変(NL)を有するDKDの予後は不良である。近年の技術的革新により、生体組織を用いたOmics解析により、未解決課題を克服できる可能性が示されている。これまで、我々も、ヒトの腎生検組織を用いたトランスクリプトームを行うための技術開発を行い、既に研究基盤を確立させた。本研究では、NLを有するDKD症例のうち、予後不良“通常例"と予後良好“特殊例"の既存腎生検組織を用いたトランスクリプトーム解析を行い、これまで判明していないNLの進行・抑制因子の同定を試みる。将来的には現在治療困難(未解決課題)であるNLを有するDKDへの有効な治療法開発や、バイオマーカー開発へ発展することが期待される。
抑制性シナプスにおける逆行性伝達物質の作用およびその役割

1.逆行性伝達物質がシナプス伝達の可塑的変化に重要な役割を担っている可能性が指摘されているが、抑制性シナプスでの研究はまだ少ない。そこで、抑制性シナプス伝達の可塑的変化の一つである"DSI"という現象(シナプス後ニューロンの脱分極により誘発される抑制性シナプス伝達の一過性抑制)における逆行性伝達物質の役割を明らかにすることを試みた。2.ラットの培養海馬ニューロンを用い、DSIに関与する逆行性伝達物質の同定およびその放出・作用メカニズムについて調べたところ、以下のことが判明した。(1)脳スライス標本で観察されているDSIという現象は培養系で再現可能である。(2) DSIの誘導には細胞外のカルシウムイオンが必要である。(3) DSIには電位依存性カルシウムチャネルが関与する。(4) DSIはシナプス前終末からの伝達物質放出量の減少による。(5) DSIはプロテインキナーゼC活性化剤であるホルボールエステルにより抑制される。(6) DSIにはカルシウム/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII(CaM kinaseII)の活性化が必要である。(7) DSIはまわりのシナブスにも広がりうる。3.以上の結果より、DSIのメカニズムとして以下のようなモデルを考えた。シナプス後ニューロンの脱分極により電位依存性カルシウムチャネルが開口し、細胞内カルシウム濃度が上昇し、CaM kinaseII依存性の機構により逆行性伝達物質が放出される。それが抑制性シナブスのシナプス前終末部の受容体に結合し、ホルボールエステル感受性の機構を介し、伝達物質の放出が抑制される。今後はこのモデルを検証したい。そこで、抑制性シナプスにおける逆行性伝達物質の作用を調べるのに適した実験系を確立し、逆行性伝達物質の同定およびその放出メカニズム・作用メカニズムを明らかにすることを試みた。具体的には、小脳および海馬スライスで報告されている"depolarization-induced suppression of inhibition(DSI)"という現象を、培養海馬ニューロン間の抑制性シナプスにおいて再現し、逆行性伝達物質の関与について詳しく解析した。2.新生仔ラットの培養海馬ニューロンを用い、シナプス後ニューロンの脱分極により抑制性シナプス電流(IPSC)が一過性に減少するという現象(DSI)が観察された。このDSIの性質を調べたところ、以下の結果を得た。(1)DSIの誘導には細胞外液のカルシウムイオンが必要である。(2)DSIはシナプス前ニューロンからの伝達物質放出量の減少による。(3)DSIは、プロテインキナーゼCの活性化剤であるボルボルエステルで抑制される。(4)DSIは、希にではあるが、脱分極したニューロン上のシナプスのみならず、周りの他のシナプスにおいても発生する。(5)DSIは、オピオイド受容体阻害剤やGABA受容体阻害剤で抑制されない。3.以上の結果は、これまで脳スライス標本で観察されていたDSIという現象が培養系で再現可能であることを示す。また、この実験系を用いて、DSIのボルボルエステル感受性やDSIが周りのシナプスにも広がりうること、などの新知見を得た。逆行性伝達物質の実体については、オピオイドやGABA以外の可能性について今後検討する予定である。1.抑制性シナプス伝達の可塑的変化の一つである"DSI"という現象(シナプス後ニューロンの脱分極により誘発される抑制性シナプス伝達の一過性抑制)における逆行性伝達物質の役割について詳しく検討した。2.昨年度は、海馬スライスで報告されている"DSI"という現象を、ラットの海馬ニューロンの培養系で再現することに成功した。本年度は、DSIに関与する逆行性伝達物質を同定し、その放出メカニズムおよび作用メカニズムを明らかにすることを試みた。

得られた結果は以下の通りである。(1) DSIはシナプス前ニューロンからの伝達物質放出量の減少による。(2) DSIはまわりのシナプスにも広がりうる。(3) DSIは電位依存性カルシウムチャネル阻害剤により抑制される。(4) DSIの出現頻度はニューロンの培養日数に大きく依存する。(5)代謝型グルタミン酸受容体を介するシナプス前抑制のみられないシナプスではDSIは起こらない。(6) DSIはカルシウム/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII(CaM kinase II)の阻害剤で抑制される。3.最近、DSIに関与する逆行性伝達物質がグルタミン酸であること、および、樹状突起での開口放出にCaM kinase IIが関与していることが報告された。これらの報告、および本研究の結果より、DSIのメカニズムとして以下のようなモデルを考えた。シナプス後ニューロンの脱分極により電位依存性カルシウムチャネルが開口し、細胞内カルシウム濃度が上昇し、CaM kinase IIが活性化され、グルタミン酸が樹状突起から開口放出される。それが抑制性シナプスのシナプス前終末部の代謝型グルタミン酸受容体に結合し、伝達物質の放出が抑制される。今後はこのモデルを検証したい。
核蛋白質輸送担体変異体のX線結晶構造解析

真核細胞では細胞質と核が核膜により隔てられている。核内で機能する核蛋白質は細胞質にて合成された後、核膜表面に存在する核膜孔複合体を通じて核内へ輸送される。輸送される蛋白質の多くは核内へ局在化するために必要なシグナル構造(Nuclear Localization Signal : NLS)を自身に持つ。NLSは核蛋白質輸送担体であるimportin α(分子量58KDa)により特異的に認識され、importin αと結合し、更にimportin β(分子量97KDa)がimportin αと核膜孔複合体構成因子の両方と結合することにより、核蛋白質を3者の複合体として核膜孔ヘターゲットする。importin-βの機能を立体構造に立脚して理解することを目的として、X線結晶構造解析を行った。importin-β全長での結晶化を試みたが、結晶は得られなかったため、全長のうちN末端側の半分の領域の結晶化に成功し構造決定を行った。この領域はNLSとの結合部分は持たないが、低分子量GTPaseであるRanとの結合領域を持ち、核膜孔を通過する能力を有する。結晶解析の結果importin-βはHEATリピート構造と呼ばれるαヘリックスの繰り返し構造からなり、構造全体は超らせん構造を形成していることが明らかとなった。構造発表は外国のグループに先を越されてしまったが、既報のimportin-βとの構造比較から、importin-βがその超らせん構造が捻れることにより、他の蛋白質との相互作用を行っていることが示唆された。またαヘリックスの別の繰り返し構造であるARMリピート構造を有し核膜孔を通過するβ-カテニンの構造との類似性の比較から,核膜孔の通過にはHEAT構造やARM構造が必要とされることを提案した。Imoportin-βは細胞質と核の間で核膜孔を通じた分子輸送を担う分子量約9万7千の輸送担体である。核局在化シグナル配列を持つ核蛋白質はimportin-αにより認識され、更にimportin-βと複合体を形成し、3者の複合体として核膜孔へターゲットされる。Importin-βdeletion mutant(impβ449)(1-449残基:分子量約5万)はimportin-αとの結合領域は持たないが、核蛋白質輸送に必須の因子である低分子量GTPase Ranとの結合領域、及び核膜孔構成因子との結合領域を持ち、輸送担体として機能するimportin-βファミリーに共通の性質である核膜孔の単独通過脳を有する。輸送担体の構造と機能の解明を目的としimpβ449単独状態のX線結晶構造解析を行った。結晶構造因子の位相決定にはMetをSeMetに置換し、Seの異常散乱効果を利用したMAD法により行った。Impβ449は結晶中でダイマーとして存在し、helix-turn-helix構造を基本モチーフとするHEAT repeatが繰り返し積み重なり、ダイマー全体で巨大な超らせん構造を形成している。このダイマー形成は結晶化促進の要因となったと推察される。Impβ449は10個のHEATrepeat構造から成る。超らせん構造がもたらす立体構造の柔軟性がimpβ449がRanや核膜孔構成因子と相互作用するために重要な性質と考えられる。
簡易文章化を目指した階層型音声メニュー呈示によるP３００型ＢＣＩの開発

本研究の初年度計画を各要素の評価と応用システムの構築として実施し、次の様な成果を得た。1音声合成パラメータの検討として、本システムで刺激音声として使用予定の合成音声パラメータについて、現在使用中の音声合成ソフトウェアで調整可能なパラメータである女声/男声、音高、速度を基本として聞き分け易さの観点で評価した。成人男性を被験者としてメニュー型BCIの呈示音声として聞き間違いや迷いが起きない範囲で呈示音声を生成した。個別の音声合成ソフトウェアが所有する音源に依存する要素であるため、継続的に刺激音声として相応しい合成音声の作成方法を検討する。2メニュー型BCIにおけるメニュー外の意思表現を目的とした共通コマンドとしての中断機能等として、異質の要素刺激としてホワイトノイズを混在させたP300に関する基礎的評価を行った。メニュー刺激として与えたトーンバーストに比べ、ホワイトノイズでは音量を小さく、呈示回数も少ない条件でも有効であることが示唆された。3本研究の目的とするP300型BCIシステムとして、メニューの3階層を基本としてメニュー選択とフィードバック機能、階層的進行を構成するシステム構築を考案した。また、利用者が自主的にシステム起動を行うために、運動想起に基づいた事象関連電位を採用したシステムを設計した。システム構築の問題点として、メニュー選択時の判別手法によりリアルタイム性や利用者の負担軽減のためのワイヤレス化などがある。当初予定していたシステム構築において、被験者の負担軽減を目的としてシステムのワイヤレス化を目指しているが新たな生体アンプの導入を試みたところでシステム化の進捗に遅れが生じている。また、メニュー選択に機械学習の導入など、各種要素の評価においても被験者による評価が十分に行えていない。本研究の進捗に当たっては当初の計画を主軸として、各種要素の評価を健常被験者により実施する。初年度計画において遅滞しているシステム構築とオンライン化を急務とし、呈示音声の生成、共通コマンドの実現など検討し、フィードバック機能として反映した実用的なシステム構築を進める。
ミドリゾウリムシ－クロレラ共生系のPV膜分化機構のラマン分光法による解明

真核生物同士の共生進化のモデル系である,ミドリゾウリムシとクロレラ系の共生の鍵を握る,食胞膜からPV膜への変化に伴う分子組成変化を,ラマン分光法により解明することを試みた。銀ナノ粒子を用いた表面増強ラマンスペクトル測定は,残念ながら上手くいかなかったが,食胞膜由来と思われるラマンスペクトル成分を,クロレラのラマンスペクトルから分離して得ることができた。この結果によって,食胞膜とPV膜の分子成分をラマンスペクトル法によって比較することが原理的に可能であることが示された。ミドリゾウリムシにラテックスビーズを捕食させ,食胞膜と一緒にラマン測定を行った。ラテックス単独のラマン測定を別に実施して,差スペクトルを得ることによって,食胞膜のラマンスペクトルの測定に成功した。ミドリゾウリムシは,そのままでは繊毛による遊泳と原形質流動を行うため,アルコールによる繊毛除去とノコダゾールによる原形質流動の抑制を併用した。実験に有効なアルコール濃度やノコダゾール濃度の検討を行った。測定したラマンスペクトルは良好で,タンパク質由来,脂質由来のラマンバンドなどが明瞭に観察できた。PV膜のラマン測定のためには,アルコール濃度,ノコダゾール濃度などの条件の更なる再検討が必要である。27年度は,最適化した条件で,PV膜のラマン測定を目指す。ミドリゾウリムシの動きを更に抑制するために,東京農工大学の田中剛教授らが開発したゲル固定法を用いた手法を行う予定である。田中教授のグループとは,すでに実験打ち合わせを終了した。また,TOF-SIMS(2次イオン質量分析法)による,食胞膜とPV膜の成分分析も行っている。実験は,成蹊大学の青柳里果准教授に依頼して行った。ミドリゾウリムシと共生藻のクロレラの共生系は,両者を別々にしても単独で生存可能であることから,真核生物同士が正に共生進化を行っている途中のモデル生物として注目を集めている。両者の共生の鍵を握る,食胞膜からPV膜への変化を,これら膜の分子構造変化の点に着目して,ラマン分光法によって研究を行った。最終年度のである平成27年度は,PV膜が極端に薄く(厚さ0.1μm程度)て,その分子組成すら明らかになっていなかったために,我々は銀ナノ粒子を食胞膜とPV膜にコートした後に,表面増強ラマン分光法(SERS)を用いて,SERSスペクトルの測定を試みた。残念なながら,再現性のあるSERSスペクトルの測定ができなかったために。その後,通常のラマンスペクトル測定を行って,得られたスペクトルから,PV膜に変化する前の食胞膜に特有にラマンスペクトルを抽出することを試みることにした。非不拘束マルチベリアイト解析を行って,ラマンスペクトル成分の抽出を行った結果,食胞膜由来と推定されるラマンスペクトル成分を得ることに初めて成功した。今のところ,PV膜由来のラマンスペクトル測定は,出来ていないが,本研究によって提案した手法によって,原理的に食胞膜とPV膜のラマンスペクトルの比較が可能であることが示された。ラマンスペクトル測定とは別に,成蹊大学の青柳里果博士の協力によって,食胞膜とPV膜のTOF-SIMSスペクトルの測定も行った。この結果についても現在解析中である。PV膜のラマン測定を行うために必要なミドリゾウリムシの遊泳と原形質流動抑制が可能であることはすでに明らかにすることができた。アルコールとノコダゾールの併用によるミドリゾウリムシの固定を行って,食胞膜のラマンスペクトルは明瞭に測定できたので,26年度の研究計画はほぼ達成できた。しかし,PV膜のラマンスペクトル測定は,予想通り困難であり,研究計画申請時には想定していなかったゲル固定法の応用も行う。生命分子分光学ミドリゾウリムシの固定を行うために,アルコールとノコダゾールの濃度条件の最適化を急ぐ。ゲル固定を併用することで,27年度はこれまでよりもS/Nの高い良好なラマンスペクトルが得られると想定している。得られたラマンスペクトルをmultivariate法により成分分解して,食胞膜とPV膜の違いを明らかにする予定である。ラマン分光法だけでは,PV膜の成分分析が困難になる可能性も考慮して,TOF-SIMSを用いた画像分析も行う予定である。ミドリゾウリムシを固定するための条件検索に時間を要したために,26年度に使用予定であった試薬の一部を27年度に使用することに変更したため。26年度に使用しなかった研究経費で,ミドリゾウリムシの動きを固定する条件の探索を終了すること想定しているので,27年度中に全基金を消費する予定である。
可変フォーカス機構を用いた立体形状の計測

本研究は,1台のビデオカメラにより,フォーカスを種々連続的に変化させて画像を撮像し,それらの多数枚の画像から距離を計測する単眼視・可変フォーカス画像による3次元計測システムを構築しようとするものである。すなわち,視野内の各位置までの距離を計測するために,複数枚の画像を用いて合焦点位置の計測を行い,求められた各焦点位置の情報から,3次元距離画像の作成,3次元形状の計測など3次元環境把握を行う簡便な手法を開発しようとするものである。得られた成果の概要を以下に記す。1.ボケ量評価手法の開発合焦していない2枚の画像間でボケ量の差を画像系列から求める手法を開発し,このボケ量を用いることにより,ボケ画像上の各画素の焦点位置の推定を行う新しい手法を開発した。2.3次元形状(距離)画像高精度計測手法の提案と実験評価多重画像から求められた多重合焦位置を,各画像ごとのボケ量を考慮した重みをつけることで,信頼性と精度共に向上した1枚の距離画像を作成する手法を開発した。上記の結果を用いて簡単な形状の3次元計測実験を行い,単眼カメラシステムによる計測としては,これまでの各種の研究結果に比べて,精度のよい計測が可能であることを明らかにした。今後,撮像枚数をより多くすることで奥行き方向の距離精度を向上させるため,データの取得法などの自動化を含めての検討が必要であろう。本研究では、1台のビデオカメラを用いて、フォ-カスを種々に連続的に変えて画像を撮像し、それらの多数枚の画像から距離を計測する、単眼視可変フォ-カス画像による3次元計測システムの構築を目的としている。すなわち、視野内の各位置の距離を計測するために、合焦点位置の計測を複数枚の画像から、画像処理手法を用いて行い、それらの各焦点位置の情報から、3次元距離画像の作成、3次元形状の計測と3次元環境把握を行う簡便な手法を開発しようとするものであるが、本年度の研究実績の概要を以下に記す。1.フォ-カスずらし画像から合焦点位置を同定するために、合焦点性の評価として、微分値やラプラシアンを用いるもの、相関法を用いるもの、小領域の分散に関する量を用いるものフ-リェ変換を用いるものなどを検討した。ラプラシアンを用いるのが比較的検出精度が良いが、画像の性質により、各種方法の優劣が、異なってくるので、いくつかの方法を組み合わせて使用することにより、安定した検出を工夫する必要がある。2.連続したフレ-ムの画像を取り込むためのフレ-ムメモリシステムを設計製作した。このメモリシステムは、パ-ソナルコンピュ-タと接続して、リアルタイム連続画像取り込みが可能なので、焦点を連続的に変化させた画像系列を取り込むことができる。次年度においては、このシステムを用いて、より精度の高い合焦点位置の計測機構の開発を検討する予定である。本研究では、1台のビデオカメラを用いて、フォーカスを種々に連続的に変えて画像を撮像し、それらの多数枚の画像から距離を計測する単眼視・可変フォーカス画像による3次元計測システムの構築を目的としている。すなわち、視野内の各位置の距離を計測するために、合焦点位置の計測を複数枚の画像から画像処理手法を用いて行い、それらの各焦点位置の情報から、3次元距離画像の作成、3次元形状の計測など3次元環境把握を行う簡便な手法を開発しようとするものであるが、本年度の研究実績の概要を以下に記す。1.ボケ量評価手法の開発合焦していない2枚の画像間でボケ量の差を多数枚のフォーカスずらしの画像系列から求める手法を開発し、このボケ量を用いることにより、ボケ画像上の各画素の焦点位置の推定が可能となった。2.3次元形状(距離)画像高精度計測手法の開発多重画像から求められた多重合焦位置を、各画像ごとのボケ量を考慮した重みをつけることで、信頼性と精度共に向上した1枚の距離画像を作成する手法を開発した。3.システムによる処理実験上記の結果を用いて簡単な形状の3次元計測実験を行い、単眼カメラシステムによる計測としては、これまでの各種の研究結果に比ベて、精度のよい計測が可能であることを明らかにした。
肝細胞癌に対する細胞性免疫治療に関する基礎的研究

肝細胞癌で発現が増加している癌抗原や他癌において報告されている癌関連抗原の細胞障害性T細胞(CTL)エピトープをもつ9-10アミノ酸からなるペプチドを合成した。次に肝細胞癌患者の末梢血リンパ球を用いてこれらのペプチドに対する免疫反応をenzyme linked immuno-spot (ELISPOT) assayとCTL assayで検討し、肝癌の免疫治療に有用と考えられるHLA-A24拘束性のCTLエピトープを同定した。具体的にはアルファフェトプロテイン(AFP)をはじめとして、14種類の癌関連抗原に対するエピトープが肝癌の免疫治療の候補となりうることを明らかにした。さらに38人の肝癌患者においてAFP特異的CTLと腫瘍因子などの臨床所見との関連を検討し、血中のAFPレベルや肝炎ウイルスの感染とは関係なくAFP特異的CTLの誘導が可能であることを明らかにした。末梢血におけるAFP特異的CTL数の検討では、これまでに報告されている大腸癌や悪性黒色腫の患者末梢血中に存在する癌抗原特異的CTL数と同等であり、免疫原性が低いとされていた肝細胞癌においても宿主の癌に対する免疫反応が存在することを証明した。またAFP特異的CTL数はTNM分類における腫瘍因子や進行度と有意な相関を示し、癌が進行した患者においてより顕著に反応が検出されるものの、肝癌発生初期には反応は弱く、このことが肝癌の伸展に関与している可能性を示していた。今回得られた知見はペプチドや樹状細胞を用いて肝癌に特異的なCTLを誘導することによって肝癌の免疫治療が可能であることを示唆するとともに、こうした免疫治療は肝癌の発生早期、もしくは既存の肝癌治療を行った後に再発を予防する目的で行うことが適当であることを予見するものであった。現在、今回の研究で同定したエピトープをもつペプチドとHLA-A24トランスジェニックマウスを用いて、免疫治療の効果と安全性を検討しており、一部のペプチドに関しては金沢大学医の倫理委員会における承認の下、肝癌患者における免疫治療の臨床試験を開始している。今回の検討では6種類の抗原において抗原特異的なインターフェロンガンマ産生T細胞と細胞障害性T細胞(CTL)の誘導が可能であった。ペプチドで誘導されたCTLはHLA-A24陽性で、それぞれの抗原を発現している肝癌培養細胞株に対しても細胞障害活性を示し、今回検出された細胞障害活性が抗原特異的な反応であり、かつHLA-A24拘束性であることが示唆された。また今回検討した38人の肝癌患者のうち4人がB型肝炎ウイルスに、32人がC型肝炎ウイルスに感染していたが、こうした肝炎ウイルスの感染とは関係なく癌関連抗原特異的なCTLの誘導が可能であった。また癌関連抗原特異的なCTLの末梢血における細胞数はTNM分類における腫瘍因子や進行度と有意な相関を示し、癌が進行した患者においてより顕著に反応が検出された。さらに肝癌における局所治療や抗癌剤による化学療法の前後において、癌関連抗原特異的なCTL数を検討したところ、肝癌の治療がこうした癌特異的な免疫反応を増強させていることが明らかとなった。また上記の如く、肝癌患者においてCTLの誘導が可能であった一部のペプチドを用いて、HLA-A24トランスジェニックマウスの免疫を行い、同マウスにおいてもペプチド特異的なCTLの誘導が可能であることと、投与の安全性を明らかにした。
T及びNK細胞の分化・機能発現におけるCD2ーLFAー3相互作用の重要性

1.ラットCD2 cDNAをプロ-ブとしてマウスCD2 cDNAを単離し、細胞質内部の一次構造がヒト、マウス間でよく保存されていることを見い出した。2.マウスCD2 cDNAを発現させた線維芽細胞との反応性を指標に、5種のラット抗マウスCD2を作製した。3.mAb及びcDNAを用いた解析により、マウスでは、全ての末梢B細胞にもCD2が発現しており、その発現は骨髄内での分化過程中、preB細胞の段階で起こることを明らかにした。4.マウスCD2を発現させた線維芽細胞とmAbを用いて、マウスCD2が細胞間接着分子としての機能を有すること、及び5個のmAbが全てこの接着機能を阻害することを示した。5.既に樹立したラットmAbを用いて精製したマウスCD2抗原でハムスタ-を免疫し、さらに数種のエピト-プに対するmAbを作製した。これらのmAbは先のラットmAbと組み合わせると、マウスT細胞の活性化を誘起することからマウスCD2を介した活性化経路の存在が示された。以上の結果から、マウスCD2はヒトCD2と同様に接着とシグナル伝達の両機能を有していることが証明された。6.CD2を有していない抗原特異的ヘルパ-T細胞株にcDNA移入によりCD2を発現させると、1/401/10低濃度の抗原とも反応するようになるが、細胞質内部を欠失したCD2分子を発現させてもこの増強作用は見られず、T細胞の抗原反応性の調節におけるCD2を介したシグナルの重要性が示唆された。7.CD2を有していないNK細胞株にCD2を発現させると、特定の標的細胞との結合が促進されるとともに細胞障害性が誘起された。細胞質内部を欠失したCD2分子を発現させると標的との結合は影響されなかったが、細胞障害性の著しい低下が見られ、NK細胞の標的認識と細胞障害性の惹起におけるCD2機能の重要性が示唆された。8.マウス胸腺内でのT細胞分化過程において、CD2はかなり早期から発現がみられたが、胎仔胸腺の組織培養系に抗CD2mAbを加えてもT細胞の成熟には影響しなかった。今年度の本研究により以下のような成果がえられた。(1)ラットCD2cDNAを用いたクロスハイブリダイゼーションにより、マウスCD2cDNAをクローニングし、核酸シークエンジングによりその一次構造を明らかにした。その結果、CD2に特有の長い細胞質内部の特にC末端側で一次構造上の保存性が高く、シグナル伝達機能を考える上での重要性が示唆された。(2)マウスCD2cDNAトランスフェクタントを用いた効率の良いスクリーニング法により、マウスCD2に対するモノクローナル抗体5クローンを樹立し、少なくとも2つのエピトープを固定した。(3)得られたマウスCD2に対するモノクローナル抗体を用い、マウスT及びNK細胞の分化過程におけるCD2の発現時期を明らかにした。(4)マウスCD2に対するモノクローナル抗体とcDNAプローブを用い、マウスにおいてはB細胞にもCD2が発現されている事が明らかとなり、CD2とLFAー3の相互作用が、B細胞の分化が機能にも関与している可能性が示唆された。

以上のように、マウスCD2のcDNAクローニングによる一次構造の解析、及びそのcDNAトランスフェクタントを用いたモノクローナル抗体の作製は、ほぼ計画に従い進行したが、現在までに得られた抗マウスCD2抗体の中にはT及びNK細胞を活性化し得る組み合わせはなく、さらに新たな抗マウスCD2抗体を作製している途上である。またマウスではB細胞にもCD2が発現していることが明らかになったが、ヒト、ラット等の他の種では見られないマウス特有の現象であり、CD2の機能の生理的重要性を考える上で新たな局面が開かれた。1.ラットCD2 cDNAをプロ-ブとしてマウスCD2 cDNAを単離し、細胞質内部の一次構造がヒト、マウス間でよく保存されていることを見い出した。2.マウスCD2 cDNAを発現させた線維芽細胞との反応性を指標に、5種のラット抗マウスCD2を作製した。3.mAb及びcDNAを用いた解析により、マウスでは、全ての末梢B細胞にもCD2が発現しており、その発現は骨髄内での分化過程中、preB細胞の段階で起こることを明らかにした。4.マウスCD2を発現させた線維芽細胞とmAbを用いて、マウスCD2が細胞間接着分子としての機能を有すること、及び5個のmAbが全てこの接着機能を阻害することを示した。5.既に樹立したラットmAbを用いて精製したマウスCD2抗原でハムスタ-を免疫し、さらに数種のエピト-プに対するmAbを作製した。これらのmAbは先のラットmAbと組み合わせると、マウスT細胞の活性化を誘起することからマウスCD2を介した活性化経路の存在が示された。以上の結果から、マウスCD2はヒトCD2と同様に接着とシグナル伝達の両機能を有していることが証明された。6.CD2を有していない抗原特異的ヘルパ-T細胞株にcDNA移入によりCD2を発現させると、1/401/10低濃度の抗原とも反応するようになるが、細胞質内部を欠失したCD2分子を発現させてもこの増強作用は見られず、T細胞の抗原反応性の調節におけるCD2を介したシグナルの重要性が示唆された。7.CD2を有していないNK細胞株にCD2分子を発現させると、特定の標的細胞との結合が促進されるとともに細胞障害性が誘起された。細胞質内部を欠失したCD2分子を発現させると標的との結合は影響されなかったが、細胞障害性の著しい低下が見られ、NK細胞の標的認識と細胞障害性の惹起におけるCD2機能の重要性が示唆された。8.マウス胸腺内でのT細胞分化過程において、CD2はかなり早期から発現がみられたが、胎仔胸腺の組織培養系に抗CD2mAbを加えてもT細胞の成熟には影響しなかった。
斜視発症に関する分子生物学的手法による研究

間欠性外斜視の切除外眼筋におけるアグリカン量と臨床所見の関係斜視患者の外眼筋に含有される細胞外マトリックスである、アグリカン、フィブロネクチン、ラミニンの役割を検討することを目的に研究をおこなった。47例(男性21例、女性26例、平均年齢23歳)の手術中に得た間欠性外斜視の内直筋を材料に、それを液体窒素下で凍結粉砕して可溶化し,酵素免疫法を用いて上述のアグリカン、フィブロネクチン、ラミニン量を測定した。アグリカンの計測にはHuman aggrecan用測定用キット、フィブロネクチン、ラミニンの計測にはHuman fibronectin測定用キットとHuman laminin測定用キットを用いた。酵素免疫法で得られたタンパク濃度から筋肉1mmあたりのアグリカン、フィブロネクチン、ラミニンの量と患者の年齢、斜視角、および屈折異常、手術前後の眼位、両眼視、病型、家族歴、妊娠分娩時の異常のパラメータとの関連を解析した。その結果、外眼筋1mmあたりのアグリカン量は年齢と有意な相関を示し(p<0.0001)加齢とともに減少したが、フィブロネクチンやラミニン量は年齢との相関がみられなかった。間欠性外斜視の病型との比較では、アグリカン量は輻湊不全型よりも基礎型に多い傾向がみられた(p=0.0538)。この結果から、アグリカン量は間欠性外斜視の運動面に関連すると推察した。また本研究で見出したアグリカン量が加齢とともに減少する結果は、加齢にともない外眼筋の張力変化が生じること、さらに手術により強膜組織と外眼筋腱との癒着によって創傷が治癒する過程に細胞外マトリックスのひとつであるアグリカンが何らかの影響を与える可能性があると推察した。分子生物学的手法により、斜視の原因遺伝子、すなわち分子の機能を材料にその分子と形質との関連を考え、遺伝的多型を材料に斜視の形質と配列との関連を解析することを目標に、連鎖解析の手法を用いて、斜視発症の原因遺伝子の特定を行っている。現在まで1家系に多くの斜視を有する5家系、兄弟・姉妹の同胞に斜視を有する100家系を収集した。そのうち45家系については血液を採取し、さらに30家系については電気泳動までの過程を終了している。本研究で用いられる疾患同胞連鎖解析は、調査家系の数が多ければ多いほど、より正確な疾患候補遺伝子の同定ができるために、約100家系のサンプルが必要と考えている。しかしながら、多くの家系を収集するには、学内倫理委員会で承認を得て行っているわれわれの施設のみでは不可能で、したがって関連施設から協力を得て多くのサンプルを採取せざるを得ず、関連病院における研究については、それぞれの病院の倫理委員会に申請し、連携・協力を得るような計画を立てている。他方、研究遂行における技術面については、できるだけ精度の高い遺伝統計解析ソフトを使用する必要があり、そのためには国内の指導的立場にある施設(筑波大学、東京女子医大、東京大学医科学研究所など)との連携を密にしてソフト運用の指導を仰いでいる。近日中には、解析ソフトを動かして30家系分のロッド・スコアを算出する予定である。1.斜視関連遺伝子の候補領域の検索斜視関連遺伝子の候補領域を連鎖解析を用いて検索した。内斜視、外斜視の少なくとも2名の罹患同胞対をもつ30核家族の各構成員から得た10mLの血液からゲノムDNAを分離した。全染色体にわたる10cM間隔のマイクロサテライト領域(400マーカー)をPCRで増幅した。