hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発達障害の病態解明・治療法開発に資するPET分子イメージングプローブの開発

発達障害の子どもは、学校・社会生活において困難を抱えており、親や支援者を含め社会全体で解決する必要がある。しかし、発達障害の原因は未だ明らかとなっておらず、有効な治療法がないのが現状である。その中でも特に注意欠陥・多動性障害(ADHD)と自閉症スペクトラム障害(ASD)の病態解明や新規治療法の開発が社会的に求められている。そこで、この社会的要請に応えるためにはPET分子イメージング法が有効であると考え、「ADHDやASDの病態解明や新規治療法の開発に最適なプローブは何か」という学術的な問いを設定し、これを解明するための計画を策定した。具体的には、それぞれの障害との関連が報告されているノルエピネフリントランスポータ(NET)とオキシトシン受容体(OXTR)をイメージングするプローブを合成し、その有効性について評価し、最適なプローブを開発することを目的とする。本年度はNETプローブとしてF-18を導入したプローブの設計を行い、その非放射性体の合成を行い、そのプローブのNETに対する親和性を検討した。その結果、NETに対して非常に高い親和性を有していることが確認できた。次年度にF-18標識法の検討を行い、放射性プローブとしての性質を検討する予定である。OXTRプローブとしては、既存のアンタゴニストを母体化合物として2種類の化合物の合成を行った。またこの化合物のOXTRへの親和性を測定するためにOXTRと3種類のバソプレッシン受容体をそれぞれ安定的に発現する細胞株の作製を開始した。次年度にこの安定細胞株を作製した後に、合成した化合物の親和性と選択性を確認する予定である。NETプローブに関しては、F-18標識法の検討まで行いたかったが、そこまで到達できなかった。OXTRプローブに関しては、OXTRと3種類のバソプレッシン受容体を安定的に発現する細胞株の作製時に、遺伝子を導入した細胞での発現量が低いという結果になり、進捗がやや遅れている。ただし、導入する遺伝子の準備はできているので、導入する細胞を精査し、作製を進めて行く予定である。NETプローブに関しては、これまでにnisoxetineおよびreboxetine骨格の化合物におけるNET結合に重要な部位を見いだしてきた。戦略1:NETとの結合に重要な部位に、F-18を直接導入あるいは生体内脱フッ素反応に強い官能基を導入する、戦略2:NETとの結合に関連しない脱フッ素反応を受けにくい部位にF-18を導入するという2つの戦略により、候補プローブを合成する。戦略1に関してはある程度進んでいるのでこのまま進め、戦略2についても設計合成を行って行く。OXTRイメージングプローブに関しては、最適な母体化合物が存在せず、導入する最適な放射性核種も決定していないのが現状である。そこで放射性核種としてはC-11、F-18、Br-76などのPET核種を導入した候補プローブを設計、合成する。C-11標識プローブに関しては、最近報告されたOXTRに結合する数種類の化合物を母体化合物とし、その構造を変化させずにC-11を導入したプローブを設計・合成したので、これらのプローブは標識法を確立後、in vivo評価を行い、その有効性を確認する。F-18、Br-76プローブに関しては、C-11プローブと同じ母体化合物にこれらの核種を導入したプローブを設計・合成を行ったので、続くin vitro評価によりOXTRに対する高親和性化合物を探索する戦略をとることとする。OXTRのin vitro評価のための適切なassay系が存在しないので、OXTR発現細胞の作製を最優先に進めて行く。候補化合物合成後は、候補プローブの脂溶性や安定性などの物理化学的な性質から、NETおよびOXTRに対する親和性および選択性を検討することにより、候補プローブの基礎的な性質を評価する。

NETプローブに関しては、F-18標識法の検討まで行いたかったが、そこまで到達できなかった。OXTRプローブに関しては、OXTRと3種類のバソプレッシン受容体を安定的に発現する細胞株の作製時に、遺伝子を導入した細胞での発現量が低いという結果になり、進捗がやや遅れている。ただし、導入する遺伝子の準備はできているので、導入する細胞を精査し、作製を進めて行く予定である。NETプローブに関しては、これまでにnisoxetineおよびreboxetine骨格の化合物におけるNET結合に重要な部位を見いだしてきた。戦略1:NETとの結合に重要な部位に、F-18を直接導入あるいは生体内脱フッ素反応に強い官能基を導入する、戦略2:NETとの結合に関連しない脱フッ素反応を受けにくい部位にF-18を導入するという2つの戦略により、候補プローブを合成する。戦略1に関してはある程度進んでいるのでこのまま進め、戦略2についても設計合成を行って行く。OXTRイメージングプローブに関しては、最適な母体化合物が存在せず、導入する最適な放射性核種も決定していないのが現状である。そこで放射性核種としてはC-11、F-18、Br-76などのPET核種を導入した候補プローブを設計、合成する。C-11標識プローブに関しては、最近報告されたOXTRに結合する数種類の化合物を母体化合物とし、その構造を変化させずにC-11を導入したプローブを設計・合成したので、これらのプローブは標識法を確立後、in vivo評価を行い、その有効性を確認する。F-18、Br-76プローブに関しては、C-11プローブと同じ母体化合物にこれらの核種を導入したプローブを設計・合成を行ったので、続くin vitro評価によりOXTRに対する高親和性化合物を探索する戦略をとることとする。OXTRのin vitro評価のための適切なassay系が存在しないので、OXTR発現細胞の作製を最優先に進めて行く。候補化合物合成後は、候補プローブの脂溶性や安定性などの物理化学的な性質から、NETおよびOXTRに対する親和性および選択性を検討することにより、候補プローブの基礎的な性質を評価する。
MRIを用いた心筋症における心筋血流量および冠血流予備能の検討

肥大型心筋症患者における心筋微小循環に関する病態を明らかにするために、ジピリダモール負荷前後における冠静脈洞内を通過する血流量を高速フェーズコントラストMRIを利用して定量計測した。さらに、左室心筋重量を高速シネMRIから求め、負荷前後における総冠血流量、心筋1gあたりの冠血流量などを定量的に評価した。肥大型心筋症28例における安静時の総冠血流量は152±92ml/min(平均±SD)であり、正常群の値(92±32ml/min)と比較してかなり高かった。一方、安静時心筋1gあたりの冠血流量は正常群0.74±0.23ml/min/g、肥大型心筋症患者群0.62±0.27ml/min/gと両群間に有意差は認められず、肥大型心筋症では心筋重量の増加(243±79g vs. 125±34g,p<0.01)に対応して安静時総冠血流量が増加しているものと考えられた。一方、ジピリダモール負荷後の総冠血流量は正常群268±103ml/min、肥大型心筋症244±126ml/minと両群にあまり差は見られず、その結果、肥大型心筋症群における心筋1gあたりの冠血流量(1.03±0.40ml/min/g)は正常群(2.14±0.51ml/min/g)と比較して著しく低く(p<0.01),心筋血流予備能にも有意の低下が認められた(肥大型心筋症群1.72±0.49、正常群3.01±0.75、p<0.05)。本研究により、これまでサーモダイリューションカテーテルなどの侵襲的手法やポジトロンエミッションCTを用いなくては計測できなかった左室全体や心筋1gあたりの冠血流量を、MRを利用して非侵襲的に定量計測できることが示された。MRIによる冠血流計測は、心筋症における微小循環障害の病態を非侵襲的に掲示し、臨床的にも価値が高いと考えられた。位相法を利用したMRIを用いて冠静脈洞の血流量を計測し、心筋1gあたりの冠血流量を非侵襲的に定量評価した。対象は正常ボランテア9例及びHCM患者15例である。冠静脈洞の高速Velocity encoded cine MRIをジピリダモ-ル投与前後で呼吸停止下に撮像し、冠静脈洞内の平均血流速度×面積を積分して冠血流量を求めた。心筋重量は心尖部から心基部までの高速シネMR像を撮像し、心筋面積の積分値と心筋比重の積から求めた。MRIによる正常例の心筋1gあたりの安静時冠血流量(0.74±0.23ml/min/g)は従来報告されているPETによる値(0.76-0.93ml/min/g)と近い値を示した。HCM患者の冠血流量(0.54±0.18ml/min/g)は安静時から正常例よりもやや低下していた(p<0.05)。一方、ジピリダモ-ル負荷後のHCM群における冠血流量は、正常例(2.14±0.51ml/min/g)と比較してかなり低い値までしか増加せず(0.98±0.36

ml/min/g,p<0.01)、HCM群のCFRは正常と比較して有意に低下していた(1.87±0.50vs 3.01±0.75, p<0.05)。これらの結果は、従来PETないしカテーテル法を必要とした心筋血流に関する定量的情報をMRIが非侵襲的に提供し得ることを示している。昨年度から実施してきた位相法を利用したMR冠血流量計測をより多くのHCM患者を対象に実施し、結果の統計的精度の向上をはかった。対象はHCM患者28例である。冠静脈洞のVelocity encoded cineMRIをジピリダモール投与前後で撮像し、左室心筋血流量を示す指標としての冠静脈洞血流量を求めた。HCM群の心筋重量(213±65g)は、正常ボランテア群の心筋重量(125±34g)よりも有意に高かった(p<0.01)。負荷前の心筋1gあたりの冠血流量は正常群(0.74±0.23ml/min/g)、HCM患者(0.62±0.27ml/min/g)であり、2群間に有意差は認められなかった。しかし負荷後の心筋1gあたりの冠血流量は、正常群(2.14±0.51ml/min/g)と比較して、HCM群(1.03±0.40ml/min/g)では著しく低く(p<0.01),HCM患者のCFR平均値(1.72±0.49)も正常心筋(3.01±0.75)と比較して有意に低下していた(p<0.05)。本研究により、これまでサーモダイリューションカテーテルなどの侵襲的手法やPETを用いなくては計測できなかった左室全体や心筋1gあたりの心筋血流量を、MRを用いて非侵襲的に計測できることが示された。MRIによる冠血流計測は、心筋症における微小循環障害の病態を非侵襲的に提示し、臨床上価値が高いと考えられた。平成9年度から実施してきた位相法を利用したMR冠血流量計測に関する研究を継続し、Velocity encoded cine MRIを用いて左室心筋血流量を示す指標としての冠静脈洞血流量を求め、ジピリダモール負荷前後における総冠血流量や心筋1gあたりの冠血流量を定量評価した。さらに、一部の症例については心筋パーフュージョンMRIを実施し、局所心筋血流分布を画像化し、微小循環障害の画像的評価も行った。肥大型心筋症における安静時の総冠血流量は152±92ml/minであり、正常群の値(92±32ml/min)と比較してかなり高く、冠動脈血流速度も高い値を示し、心筋重量の増加に対応して安静時血流量が増加しているものと思われた。一方、ジピリダモール負荷後の総冠血流量は正常群268±103ml/min、肥大型心筋症244±126ml/minであって両群に有意差はなく、冠動脈血流速度にも有意差は認められなかった。これらの結果から、肥大型心筋症における血流予備能の低下には安静時冠血流量の増加が大きな影響を及ぼしているものと思われた。また、肥大型心筋症の症例の一部に心筋パーフュージョンMRIを実施したところ、ジピリダモール負荷後のダイナミックMRIにおいて心内膜側を中心とした心筋血流低下が認められた。このように、MRIを用いた冠血流計測および心筋パーフュージョン評価は、心筋症における微小循環障害の病態を非侵襲的に提示し、診断や治療効果の判定等を行う上で有用な診断法になるものと思われた。
レーザー・ドップラー法を用いた血流計による喉頭血流の臨床的検討

血流を真に測定できる唯一の手段であるレーザー・ドップラー血流計を用いて、今まで生体では計測不能であった喉頭表面の実際の血流を測定し、喉頭良性疾患の成因の一端である炎症による血流の変化を究明し、また、喉頭悪性疾患である喉頭癌においては腫瘍部分と非腫瘍部分の血流を綿密に計測することで、その進展範囲や進達程度を究明することを目的として本研究を施行した。まず、基礎実験として成犬の声帯粘膜の血流測定を施行し、さらに同動物の声帯に薬剤や直接操作さによって炎症や疑似腫瘤を惹起させ、経時的に血流の変化を測定した。測定後に咽頭を摘出・法埋固定し、血流分布と炎症程度などを観察した。次に、本研究に賛同が得られた喉頭疾患患者に対し、通常の詳細な診察の後に喉頭軟性ファイバー下に病変部位や正常部位の血流を反復測定した。現在まで研究は進行中であり、悪性腫瘍症例ではまだ測定は施行できていない。しかし現時点までの検討では、炎症の程度やその内容によって血流はかなり異なっており、一義的に血流低下が炎症遷延化などを指しているとは結論出来なかった。しかし、明らかな疑似腫瘤病変などでは血流の低下が確認され、その進展範囲を知る上で有効な手段と思われた。今後は基礎・臨床いずれも症例を重ねてさらに検討を試みる必要があり、声帯の物性を検討する手段として有用性があると思われた。
乳癌個別化治療を目指したHOXB9によるEMT誘導とDNA修復メカニズムの解明

転写因子HOXB9は上皮間葉転換(EMT)を誘導する因子であり、これにより乳腺上皮細胞にEMTを生じることで放射線照射への耐性が生じた。これは、ATMのリン酸化を介したDNA修復機構がHOXB9陽性細胞では早期に生じ、結果としてγH2AXおよび53BP1のfoci形成が早期に促進されていた。これら現象はsmad4経路を抑制することで阻害されるため、このEMTを介した放射線耐性誘導機序にTGFβ経路の活性化が必須であることが示された。乳癌における放射線治療は残存乳房における局所再発防止や骨転移に対する治療に汎用されている。我々の現在までの研究成果により、転写因子HOXB9がEMTを通じて乳癌の転移や浸潤に関わる予後因子であることが示されると同時に、DNA損傷・修復の過程に作用し放射線や抗癌剤耐性の獲得に重要な役割を持つことが示唆されている。これらの知見をもとに、乳癌におけるHOXB9発現による放射線耐性獲得のメカニズムを明らかにすることによって、乳癌に対する個別化治療に対するバイオマーカーの確立を目指し、臨床への応用を試みることを目的として研究を行った。in vitroにおけるHOXB9の放射線照射耐性に対するメカニズムの検証のため、放射線照射後のpATMやMDC1などの発現量を免疫蛍光染色にて計測し、HOXB9を導入していないコントロール細胞と比較検討した結果、γH2AXや53BP1の上流とされるpATMはHOXB9導入細胞においてより亢進していることが示された。またMDC1はHOXB9導入細胞において発現量の増加が観察され、これは53BP1と同様に誘導される分子であることから、DNA修復の経路が亢進していると考えられた。さらに、HOXB9導入細胞においてTGFβ経路の活性化が生じることは既知の事項であるが、これにshSmad4をさらに導入した細胞を準備し、shSmad4によってMET(間葉上皮移行)を引き起こし、さらに放射線感受性がshSmad4導入細胞で上昇することが確認され、HOXB9によるATM経路の活性化メカニズムが主にTGFβ経路を介していることが示された。現在臨床検体における検証が進められており、これら基礎的知見と合わせることで、今後EMTによる放射線耐性化メカニズムが解明されると考えられる。ヒトゲノム上に存在するHOX遺伝子ファミリーの一つである転写因子HOXB9は、乳癌の約40%に高発現を認め、その発現量は核異型度と相関し、TGFβ経路を活性化することでEpitherial-Mesenchymal Transition(EMT;上皮間質移行)を誘導する。これにより細胞の遊走能・運動能を亢進すると同時に、組織微小環境において血管新生を亢進することを我々は示し報告した。これに続いて、当該年度の研究の成果から、HOXB9の発現がATM経路に影響を及ぼし、γH2AXや53BP1の発現調節を行うことで、放射線によるDNA損傷からの効率的な修復と細胞周期の早期回復において重要な役割を担っていることが示唆されている。乳癌の放射線耐性獲得メカニズムに関する報告は散見されるが、臨床応用に至っているものは非常に少ない。特に乳癌の予後因子として既に我々が報告を行ったHOXB9とこれによるTGFβ経路の活性化、DNA修復に働くATM経路らの関連性に着目し、放射線耐性のメカニズム解明を意図した研究は未だかつて無い。EMT誘導を行うHOXB9と放射線耐性のメカニズムの解明により、治療困難な転移性乳癌に対する、新たな治療戦略が確立されることが期待されると同時に、これら一連の研究成果から、HOXB9が乳癌における個別化治療のマーカーとなり、温存乳房再発予防や転移性乳癌の予後改善のために、最終的に臨床へ応用していくことを目指す。我々はまずin-vitroにおけるHOXB9の放射線照射耐性に対するメカニズムの検証を行うため、正常乳腺上皮細胞MCF10AおよびHMECにレンチウイルスを用いてHOXB9の導入を行い、EMTを誘導することで放射線感受性が低下することを確認した。その際のγH2AXと53BP1の両因子の発現量の変化を免疫蛍光染色にて計測したところ、HOXB9導入細胞では放射線照射する前に、既にそれらの発現量が高く、照射後早期(10分)にさらなる発現亢進と両因子によるfociの形成が認められ、EMT誘導された細胞ではDNA修復機構が速やかに働くことが示された。これらのDNA修復機構の亢進には、ATMの活性化が必須であることを、そのfociの形成とリン酸化の検討から示し、さらにATM阻害剤やDNA-PKc阻害剤を添加することで、これらHOXB9によるEMT誘導によって生じる放射線耐性獲得が阻害されることを示すことが可能であった。HOXB

9発現によりATM経路が活性化されることは示唆されたが、更なる詳細なメカニズムの解明のため、ATM経路における他の因子であるMDC1, BRCA1の放射線照射による経時的変化の検討を行ったが、MDC1においてpATMと同様に放射線照射後早期のfoci形成が認められ、放射線耐性に関与していることが示唆された。さらに、これら放射線耐性メカニズムを解明すべく、HOXB9によって活性化されるTGFβ経路がpATM・MDC1等の活性化に影響を与えることを示すため、smad4のノックダウン細胞を既に構築し、これを用いて次年度に解析する体制を整えることが可能であった。本年度はin vivoにおけるHOXB9の放射線照射耐性獲得を確認することを目標とする。乳腺上皮細胞MCF10Aだけでは免疫不全マウスに腫瘍を形成させることは困難なため、あらかじめActivated H-ras/V12を導入しさらにそこへHOXB9を導入した細胞を準備した。それによりHOXB9/H-ras MCF10Aマウスは、コントロールであるLacZ/H-ras MCF10Aマウスと比較して経時的な腫瘍径、肺・肝転移ともに増大するが、このモデルに放射線を照射して、経時的に腫瘍を摘出し、γH2AXやpATMの発現量を比較検討する。さらに、外科手術によって切除された臨床乳癌検体からRNAを抽出し、得られたRNAからリアルタイムPCR法を用いてHOXB9の発現量とγH2AXや53BP1とを比較検討する。当科では、乳癌生検及び切除検体を、癌部・非癌部ともにOCTコンパウンドに凍結保存し、これを直ちにLaser Capture Micro-Dissectionを行ってRNA抽出を施行し、cDNAライブラリーの構築を行っている。このライブラリーは臨床病理学的因子を記載したデータベースと匿名連結化し、一括管理されているため、上記の発現検討を即座に臨床情報と比較検討することが可能である。また上記データベースを用いて、臨床検体141例について、HOXB9の発現検討を既に施行済みであり、これらデータを本研究課題に用いることが可能である。上述のin vivoと臨床検体での結果により、HOXB9による放射線耐性メカニズムを解明し、今後はHOXB9を放射線感受性のバイオマーカーとして臨床応用を目指すと共に、TGFβ阻害剤などを利用して放射線感受性を上昇させ、残存乳房再発の予防や乳癌全体の予後改善のためHOXB9発現を定量していくことを検討する。本研究費は主として消耗品費と国内・外国旅費、謝金、印刷代、研究成果投稿料、会議費などに利用される予定であり、設備備品費を申請する予定はない。当研究室及び、医学部中央機器室には、別記のごとく本研究に必要な研究設備は全て整っており、新規の設備投資は必要とせず、また高額な外注実験等に研究経費を使用する予定はない。従って、直接研究及び機器操作に関わる実費・謝金等上記活動に関わる経費のみを支出する予定である。
海洋放線菌インベントリー構築と新種推定株の保全

亜熱帯島嶼の近海では赤土の流出により土壌に由来すると考えられる微生物群が海洋に流出していると考えられる。本年度は石垣島の海域から分離された放線菌のうち、新種と考えられる相同性を示したBlastococcus属2株、Streptomyces属3株、Nocardia属2株の計7株について系統解析を行った。【生理性状試験】分離株Blastococcus sp. ROH108株はロイシンアリルアミダーゼを含む5種類の酵素活性が陽性であり、エステラーゼリパーゼを含む3種類の酵素活性は微弱な陽性反応を示し、アルカリフォスファターゼを含む11種類の酵素活性は陰性であった。近縁種と比べ3%NaClを含有する培地において特に生育が良いことが分かった。一方、分離株Streptomyces sp. ROI102株は40°Cでの生育、5%NaCl含有培地での生育、硝酸塩の還元、硫化水素の発生などにおいて近縁種S.avicenniaeと明確に区別する事ができた。亜熱帯島嶼では赤土流出により大量の土砂と土壌微生物が海洋へ流入し、海洋生態系の多様性をかく乱している可能性がある。本年度は赤土として沖縄県石垣島の轟川上流のサトウキビ畑の土壌を用いて、海水浸漬による放線菌の生残性と放線菌の分離を行った。さらに轟川の河口付近の沿岸域の海底泥からの放線菌の分離を行った。【赤土の海水浸漬】赤土の海洋流出を想定し、赤土試料を人工海水(ダイゴ)で浸漬し、エアーポンプで曝気しながら1週間の静置を行った。その後、土壌試料からの放線菌数の測定を行ったところ、土壌放線菌は海水に浸漬されても50%から80%は生残することが分かった。生残する放線菌については16S rDNAの塩基配列を決定し、属種の簡易同定を行ったところ、Streptomyces cyaneusやStreptomyces spinoverrucosus、Streptomyces deccanensis、Streptomyces wuyuanensisに近縁であることが分かった。【沿岸域からの放線菌の分離】実際に赤土の流出が度々報告されている轟川河口付近の沿岸域の海底泥から放線菌の分離を行った。その結果、赤土の堆積報告が多い底泥は堆積報告が少ない底泥と比べ10倍以上の放線菌数を示していた。分離株の属種の同定を同様に行ったところ、S. deccanensisとS. wuyuanensisが赤土流出株と重複していたことから、これらについては赤土に由来すると考えられる。【沿岸分離株の海水要求性】海洋放線菌の定義である「生育に海水を要求」する分離株は僅か37株中1株しか存在しなかった。さらに、海水依存的に抗菌活性を発現するのかを調査したところ、1株のみではあるが海水添加時のみでA. nigerやS. cerevisiaeに対して新たに抗菌活性を示した。赤土の海水浸漬実験では循環型の実験装置を構築したが不具合が起き、定置型の実験装置に切り替えて実験を行った。沖縄でのサンプリングについてはオーピーバイオファクトリーに委託することでスムーズな試料の収集を行うことができた。また、轟川河口およびその沿岸域である白保はWWFによる赤土流出の定点調査が行われているためサンプリング地として選定した。当初の予想通り、赤土に生存している放線菌は海水浸漬では最大50%ほどしか減少しないことから、赤土流出は海洋に陸生放線菌を流入させると考えられる。また、赤土堆積報告の多い沿岸底泥には陸生と考えられる放線菌が多く分離された。本年度の目標は赤土及び沿岸域の放線菌の分離であるため、当初の予定通りに実験が進められた。本年度は石垣島の海流を考慮し、リーフ内とリーフ外における放線菌の分離を行った。放線菌の分離には、HV培地とISP2培地に人工海水(ダイゴ)を添加した培地を用いた。【石垣島リーフ内外の放線菌】HV培地および人工海水入りISP2培地を用いた場合、Micromonospora属が多く分離されており、なかでもM. marinaは多数分離されていた。この傾向は沿岸(赤土流出あり)と同様であった。このことから、M. marinaは海洋のみに生息する放線菌ではない事が示唆された。一方、既知の海洋放線菌であるSalinispora属は人工海水入りISP培地を用いた時だけ、リーフ内外のみから分離されていた。このことから海洋放線菌の分離には海水と類似した生存環境で培養する必要があると考えられた。また、新種と考えられるBlastcoccus属の分離株をリーフ外のみから見出す事ができた。【放線菌分離株の海水要求性】ISP2培地と人工海水入り培地でISP2培地に同時接種したところ、人工海水入り培地でISP2培地でのみ生育するのは、沿岸から2株、リーフ内から5株、リーフ外から1株であった。リーフ内の5株のうちStreptomyces属2株、Nocardia属1株については新種と考えられる相同性を示した。これらの菌株については新種提案するための分離学的な研究を進めていく。【その他海域の放線菌】

高知県土佐市の五色浜沖からは多数のSalinispora属が分離され、この他にもStreptomyces属が分離された。一方、岩手県大槌湾からはMicromonospora属が多く分離されており、土壌流出の影響が未だ残っている可能性が示唆された。本年度の沖縄でのサンプリングについてはオーピーバイオファクトリーに委託することでスムーズな試料の収集を行うことができた。また、石垣島周辺の海底地形はリーフ内とリーフ外でかなり異なっており、陸地からの距離や水深などの違いがある。分離株の収集も順調に行う事ができ、比較対象として高知県土佐市の五色浜沖や岩手県大槌湾からのサンプリングも行った。分離株は16S rDNAの塩基配列を決定し、相同性検索の結果から、いくつもの新種と考えられる放線菌株を取得する事ができた。この中から海水を生育に要求する株はごく僅かであった。本年度の目標は沖合海域からの放線菌の分離であるため、当初の予定通りに実験が進められた。次年度はこの貴重な菌株について新種提案を行う予定である。亜熱帯島嶼の近海では赤土の流出により土壌に由来すると考えられる微生物群が海洋に流出していると考えられる。本年度は石垣島の海域から分離された放線菌のうち、新種と考えられる相同性を示したBlastococcus属2株、Streptomyces属3株、Nocardia属2株の計7株について系統解析を行った。【生理性状試験】分離株Blastococcus sp. ROH108株はロイシンアリルアミダーゼを含む5種類の酵素活性が陽性であり、エステラーゼリパーゼを含む3種類の酵素活性は微弱な陽性反応を示し、アルカリフォスファターゼを含む11種類の酵素活性は陰性であった。近縁種と比べ3%NaClを含有する培地において特に生育が良いことが分かった。一方、分離株Streptomyces sp. ROI102株は40°Cでの生育、5%NaCl含有培地での生育、硝酸塩の還元、硫化水素の発生などにおいて近縁種S.avicenniaeと明確に区別する事ができた。今後は、沖合の底泥から放線菌の分離を行い、轟川河口から離れた場所で、赤土の流出の影響が少ない場所でのサンプリングを行う予定である。海洋放線菌の定義は「生育に海水を要求する」とあるが、創薬資源である放線菌においては「海水に依存する抗生物質生産がある」ことも重要な要素である。今後は、分離株の生理活性を海水あり、なしで評価を行うことで、海洋放線菌の新たな評価基準として提案していければと思う。海洋からの放線菌の分離方法は一定の分離方法があるわけではないため、より普遍性の高い分離培地や前処理方法の工夫などを行う予定である。今後は、新種の候補となった分離株については一部NBRCに寄託し、菌株の保全を行う。更に、詳細な16S rDNAの系統解析から近縁種を選抜し、生育温度幅やpH生育範囲などの性状試験、糖の資化性や各種酵素活性、電子顕微鏡による形態観察を行い、化学分類学的試験としては脂肪酸やメナキノン、リン脂質、細胞壁ジアミノピメリン酸、全菌体糖組成を調査する予定である。抗生物質生産性試験については海水の存在に依存する活性が存在するのかを調査する予定である。少額であり、計画の進捗に大きく影響しないため、予定通りに使用する。
空気圧式剛性可変フィンガを有するバルーン駆動型ロボットハンドの開発

人間と共存する環境におけるロボットハンドにおいては対人環境に対する安全性や親和性が要求される.また,日常生活の支援動作を行う場合は,それらに加えて,器用な操り動作や,柔軟な対象物の把持,および摩擦を利用した動作など,様々なタスクが求められる.そこで本研究では空気圧剛性可変フィンガを有する腱駆動ロボットハンドの開発を行った.本フィンガは,タスクに応じて空気圧を調整することにより表面剛性や摩擦係数を自在に変化可能であり,また,力制御に予測機能制御系を適用することにより,風船のような柔軟物においても,容易に力制御可能なことが実証された.本研究は,操り動作と柔軟把持動作,および摩擦力を利用した動作と滑り動作に対してそれぞれ存在する,相反する要求仕様の問題を解決するために、フィンガの表面剛性をタスクに応じてアクティブに変化させることのできる表面剛性可変型ロボットハンドの開発を目的とする。当該年度は以下の研究を実施した.1.空気圧バルーン型腱駆動フィンガの把持力制御系の開発:空気圧バルーンアクチュエータを用いた1リンクフィンガを製作し,本フィンガの把持力制御系の開発と評価を行った.制御系には予測機能制御を適用し,定値制御特性および追従制御特性の評価を行った.実験の結果,両特性ともにPID制御を適用した場合と比較して良好な制御性能が得られ,特に追従性能において顕著な差が見られた.2.表面剛性可変型腱駆動フィンガの把持力制御系の開発:空気圧バルーンアクチュエータを用いたフィンガのフィンガ部を3リンクの表面剛性可変型フィンガで構成し,フィンガの表面剛性が把持力制御特性に及ぼす影響を実験により検証した.実験の結果,定値制御特性については,フィンガ表面の剛性を変化させても制御特性への影響はほとんど見受けられず,本制御系が高いロバスト安定性を有することが確認できた.また,ロボットハンドによる操り動作を想定した,sine波を目標値として与えたときの特性については,目標値の立ち上がり時に若干の遅れが見受けられるものの,フィンガの表面剛性に関わらず全体的に比較的良好な追従性能を示した.本研究は,操り動作と柔軟把持動作,および摩擦力を利用した動作と滑り動作に対してそれぞれ存在する,相反する要求仕様の問題を解決するために、フィンガの表面剛性をタスクに応じてアクティブに変化させることのできる表面剛性可変型ロボットハンドの開発を目的とする。当該年度は,主にフィンガの把持力制御系および関節角度制御系の開発・評価を実施した.把持力制御系に関しては,前年度においてPredictive Functional Control系を用いた力制御系を開発したものの,速応性および追従特性に問題があった.そこでそれらを解決するために外乱オブザーバ併用型のPredictive Functional Control系を新たに開発した.制御実験の結果,外乱オブザーバを付加することによって,速応性については,整定時間に関して30%以上の向上が見られ,また,追従特性については,追従誤差に関して50%以上の向上が確認され,提案手法の有効性が示唆された.また関節角度制御系に関しては,無駄時間補償型のPredictive Functional Control系を用いた角度制御系を開発した.スミス補償型PID制御系との比較実験を行った結果,速応性に関しては約50%の向上を確認,また高い非線形補償特性を示し,本ロボットハンドにおける,PID制御に対するPFC制御の優位性を実証した.人間と共存する環境におけるロボットハンドにおいては対人環境に対する安全性や親和性が要求される.また,日常生活の支援動作を行う場合は,それらに加えて,器用な操り動作や,柔軟な対象物の把持,および摩擦を利用した動作など,様々なタスクが求められる.そこで本研究では空気圧剛性可変フィンガを有する腱駆動ロボットハンドの開発を行った.本フィンガは,タスクに応じて空気圧を調整することにより表面剛性や摩擦係数を自在に変化可能であり,また,力制御に予測機能制御系を適用することにより,風船のような柔軟物においても,容易に力制御可能なことが実証された.本研究は,操り動作と柔軟把持動作,および摩擦力を利用した動作と滑り動作に対してそれぞれ存在する相反する要求仕様の問題を解決するために、フィンガの表面剛性をタスクに応じてアクティブに変化させることのできる表面剛性可変型ロボットハンドの開発を目的とする。当該年度は以下の研究を実施した.1.剛性可変フィンガの設計と試作評価:シリコーンラバーと強化繊維で構成された表面剛性が変化可能なフィンガの機構を提案し,設計・試作・評価を行った.また実験により,フィンガ内部の印加圧力の調整により表面剛性が容易に変化可能であることを示した.2.剛性可変型ロボットハンドの設計と試作評価:剛性可変フィンガを用いたロボットハンドの設計・試作評価を行った.

試作したハンドは総重量が0.27kgと成人男性の人間の手より軽量である.また,把持動作やつまみ,手掌支え動作等が可能であることを実験により示した.本ハンドは,フィンガ内への空気圧が無印加時にはシリコーンチューブで構成された柔らかな体節により柔軟な把持が可能であり,ヒトの手で把持した場合と同等の接触面積が得られることを実証した.また,空気圧の印加によって表面剛性を変化させることにより,フィンガ表面の静止摩擦係数が調節可能であることを実証した.3.空気圧バルーン型腱駆動アクチュエータの力制御系の構築:本研究のロボットハンドのアクチュエータである,空気圧バルーン型腱駆動アクチュエータの力制御に予測機能制御系を適用し,PID制御と比較することでその有用性を示唆した.実験では,バルーン型腱駆動アクチュエータを用いた1リンクフィンガを製作し,フィンガ先端の力制御特性の評価を行った.実験の結果,PID制御よりも予測機能制御を適用した場合の方が,特に過渡特性について良好な結果が得られることを示した.当初の現在までの計画は,「ロボットハンドの設計と試作評価」であったが,当該年度の成果としては,「ロボットハンドの設計と試作評価」および「フィンガの把持力制御系の開発」まで終了しているため,当初の計画以上に進展している.当初の目的は「フィンガの設計・試作・評価」であったが,当該年度の成果としては、「フィンガの設計・試作・評価」,さらに「ロボットハンドの設計・試作・評価」「アクチュエータの制御」であり、当初の計画以上に進展している.今後は,ロボットハンドによる表面剛性に応じた把持・操り制御の技術開発を行う.今後は,剛性可変フィンガの予測機能制御を用いた力制御系の開発を行う.またロボットハンドの表面剛性可変に必要なセンサの設計・開発を行う.さらにロボットハンドによる表面剛性に応じた把持・操り制御の技術開発を行う.本年度は411,197円の未使用額が発生したが,これは当初予定していた学会発表が次年度に変更になったためと,センサや樹脂材料の購入のタイミングが遅れてしまったためである。次年度は,ロボットハンドの改良に必要なポリアセタール樹脂,ABS樹脂および圧力センサを購入する.また,ロボットハンドの把持実験に必要な力センサ,ポテンショメータ,試験治具,その他消耗品,およびアクチュエータ製作に必要なシリコーンチューブを購入する.また、論文投稿に必要な,英文校正料,論文投稿料,別刷料および学会発表に必要な交通費・宿泊費・参加料などにも使用する.本年度は343,574円の未使用額が発生したが,これは当初予定していた学会出張(海外)の予定が次年度に変更になったためと,ジュラコン樹脂の購入のタイミングが遅れてしまったためである。そのため次年度は,本年度発生した未使用額により予定が変更になった学会出張およびジュラコン樹脂の購入を行う.また次年度分の研究費により,剛性可変フィンガの力制御実験に必要な力センサ,動ひずみ計,試験治具,コンプレッサ,電源装置,その他消耗品、およびアクチュエータ製作に必要なシリコーンチューブ,さらに,剛性可変フィンガ製作に必要なシリコーンゴムを成型するための定温乾燥機,ロボットハンド製作に必要なポリアセタール樹脂,圧力センサを購入する.また、論文投稿に必要な,英文校正料,論文投稿料,別刷料および学会発表に必要な交通費・宿泊費・参加料などにも使用する.
ガストリン刺激による胃被蓋上皮細胞ガストリン受容発現増加機序の研究

申請者らは胃被蓋上皮に対するガストリンの長期作用の解明には高ガストリン血症モデル動物の観察が必要と考え、非神経内分泌細胞にも発現する前駆体蛋白切断酵素furinにより切断される変異ガストリン前駆体遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作成した。このマウスは、慢性萎縮性胃炎患者に観察される高ガストリン血症に匹敵する高ガストリン血症となっていることが確認された。高ガストリンマウス胃粘膜では被蓋上皮細胞の増殖が観察された。さらに、高ガストリン血症マウスと正常マウスの特異的ガストリン結合部を^^<125>I標識ガストリンを用いて観察したところ、正常マウスでは胃被蓋上皮にガストリン受容体の発現を認めなかったが、高ガストリン血症マウスの幼弱被蓋上皮にはガストリン受容体の高発現部位を認めた。一方、胃粘膜培養細胞GSM06を通常の培養条件で培養した後、ガストリン受容体mRNA発現をRT-PCR法で、ガストリン受容体蛋白の発現を125I標識ガストリンを用いた結合実験でそれぞれ観察したが、ガストリン受容体の発現は確認できなかった。しかし、GSMO6をガストリンとともに12時間以上incubateしたところ、時間依存性のガストリン受容体発現がmRNA、蛋白の両者で確認された。生体、培養細胞での上記結果は、長期間のガストリン刺激が胃被蓋上皮細胞上のガストリン受容体をup-regulateした可能性を示している。従来ガストリン受容体の存在が明らかにされている壁細胞、Enterochromaffin-like(ECL)細胞ではなぜガストリン受容体のup-regulationが起こらないのかについては、高ガストリンマウスの胃体部粘膜の壁細胞、ECL細胞近傍にソマトスタチン(D)細胞が増加している像が観察されるため、壁細胞、ECL細胞上ではソマトスタチンを介した何らかの抑制機構が働いているためではないかと考えられ、現在、詳細を観察中である。
通信波長帯用ギガヘルツ繰り返し単一光子検出器の開発と量子鍵配布への応用

都市圏量子鍵配送の実現に向けて、高速、高効率かつ低暗計数を有する通信波長帯用(1550nm帯)単一光子検出器の研究開発を行った。開発目標であった2 GHz動作が可能であることを実証した。この繰り返し速度は、InGaAs/InPなだれフォトダイオードを用いた通信波長帯単一光子検出器においては世界最速記録となる。また本検出器の信号雑音比(S/N)比は世界最高クラスである。以上のように、今回開発した光子検出器は実用的な半導体ベースの単一光子検出器ながら、高い性能指数を有することを明らかとした。都市圏量子鍵配送の実現に向けて、高速、高効率かつ低暗計数を有する通信波長帯用(1550nm帯)単一光子検出器の開発を行った。インジウム・ガリウム・砒素/インジウム・砒素(InGaAs/InP)のなだれフォトダイオード(APD)を-50°Cまで冷却し、これを正弦電圧ゲート動作させた。そして、それの単一光子検出能力を本研究の目的であるギガヘルツ帯の繰り返し周波数において測定した。最大ゲート繰り返し周波数1.5GHzを低アフターパルス雑音(3%以下)にて実現した。この最大繰り返し周波数は、APDを用いた単一光子検出器においては、現時点で世界最速である。また、光子検出効率10%時における暗計数確率は10^<-7>オーダーと極めて低いレベルまで低減された。本光子検出器を量子鍵配送へ応用した場合、そのような低雑音特性は100km越える最大伝送距離を実できる光子検出回路の徹底的な低雑音化を行つた結果、ゲート動作(大電力交流信号が印加された状態)であるにわらず、最終的な子光子検出信号ラインの雑音レベルは熱雑音限界に到達しているこの結果、現在、必要とされるAPDの内部利得はゲート繰り返し1.5GHzの測定を行った時点よりもさらに低減されている。よって、更なるアフターパルス雑音の抑圧が見込まれ、最終的に最大のゲート繰り返し周波数は2GHzを越える見込みである。都市圏量子鍵配送を実現可能な高速単一光子検出器が簡便なAPDベースで実現した意義は大きい。また、本研究で開発した光子検出器は近赤外域の高感度光検出器の代替としても使用できるため、今後、多方面への応用が期待できる。前年度の成果から、2GHzの繰り返し動作が可能であることが示唆されたが、本年度の実験において、実際に2GHz動作が可能であることを実証した。また、検出効率10%、暗計数確率6×10^<-7>を得ており、本検出器の信号雑音比(S/N)比は従来の通信波長帯光子検出器においては世界最高クラスである。開発した高速単一光子検出器を量子もつれ配送実験に応用した。タイプII型の周期分極反転ニオブ酸リチウム導波路から発生する通信波長帯直交偏光量子もつれ光子対を開発した単一光子検出器を使用して測定し、高純度量子もつれ状態の共有実験に成功した。ここで、純度の評価は光子検出器の不完全性の補正は一切行っていない。また、10.5kmの分散シフトファイバーを通した長距離量子もつれ配送実験も行い、量子もつれ純度を劣化させることなく伝送する実験にも成功した。本成果は、量子もつれを利用した長距離量子鍵配送(BBM92プロトコル)への重要な足がかりとなる。
ゴンドワナ分布裸子植物Podocarpus(マキ科)における系統進化学的研究

マキ科は裸子植物の中でその形態や生態が最も多様化したグループである.その中でもマキ属(Podocarpus)はマキ科の中でも最大の属であり大部分が南半球に分布しているために植物地理学的な研究対象として適している.本研究ではマキ科全体の構成属を含めて系統解析を行って,マキ属の範囲や混乱してきた分類を検討した.そしてマキ属の系統進化について考察を進めた.葉緑体DNA上のmatK遺伝子塩基配列等を基にして系統解析を行った結果,マキ属はこれまでに提唱されてきたAfrocarpus, Nageia, Retrophyllum, Decussocarpusと単系統群を形成しており,マキ属を広義に捉えても問題はないことが判った.その系統関係は((Afrocarpus, Nageia), (Retrophyllum, Decussocarpus))であった.また,これまでマキ属の中に含められることもあったParasitaxus, Prumnopytis, SundacarpusはProdocarpusとは系統的に異質であり,マキ属の内部に入れる分類体系は棄却されることが判明した.マキ属内部の系統はde Laubenfels (1969,1985)による2亜属: subgenusPodocarpusとFoliolatusへの分類は支持されて,狭葉・広葉の形態の別や気孔周辺のFlorin ringの有無が系統を反映していることが示唆された.また,マキ属はゴンドワナ大陸が分裂を終えた中生代中後期(白亜紀)までにこの亜属レベルでの進化は終えており,亜属ごとに地域的に種分化と分布域拡大を起こしたことが判明した.北半球にまで分布するアジアと北米の種群はそれぞれオセアニア+マレシア地域と南米地域の種群から分化したことが示された.マキ科は裸子植物の中でその形態や生態が最も多様化したグループである.その中でもマキ属(Podocarpus)はマキ科の中でも最大の属であり大部分が南半球に分布しているために植物地理学的な研究対象として適している.本研究ではマキ科全体の構成属を含めて系統解析を行って,マキ属の範囲や混乱してきた分類を検討した.そしてマキ属の系統進化について考察を進めた.葉緑体DNA上のmatK遺伝子塩基配列等を基にして系統解析を行った結果,マキ属はこれまでに提唱されてきたAfrocarpus, Nageia, Retrophyllum, Decussocarpusと単系統群を形成しており,マキ属を広義に捉えても問題はないことが判った.その系統関係は((Afrocarpus, Nageia), (Retrophyllum, Decussocarpus))であった.また,これまでマキ属の中に含められることもあったParasitaxus, Prumnopytis, SundacarpusはProdocarpusとは系統的に異質であり,マキ属の内部に入れる分類体系は棄却されることが判明した.マキ属内部の系統はde Laubenfels (1969,1985)による2亜属: subgenusPodocarpusとFoliolatusへの分類は支持されて,狭葉・広葉の形態の別や気孔周辺のFlorin ringの有無が系統を反映していることが示唆された.また,マキ属はゴンドワナ大陸が分裂を終えた中生代中後期(白亜紀)までにこの亜属レベルでの進化は終えており,亜属ごとに地域的に種分化と分布域拡大を起こしたことが判明した.北半球にまで分布するアジアと北米の種群はそれぞれオセアニア+マレシア地域と南米地域の種群から分化したことが示された.本年は瀬戸口が台湾へ,朝川がボリビア,チリ,インドネシアヘサンプリングに出かけて研究材料を確保した。また,海外の協力者(ケニア,コロンビア)から研究材料の供与を受けた.結局,本年度は約40種(一部に未同定種を含む)のサンプルからDNAを抽出して,葉緑体DNAのmatK遺伝子とrbcL遺伝子の塩基配列を決定した.現在のところ,この2遺伝子の解析だけで統計的検定に十分耐えうるデータが得られているので,今後もこの2つの葉緑体DNAの遺伝子を解析対象に用いる計画である.これまでのデータをまとめると,Podocarpus属はまず2亜属に大きく分かれる結果が得られている.すなわち,葉が広葉・針状という形態や気孔の配列に基づいて大きく2グループに分岐すること,その2グループが各々独立に各地域へ分布域を広げながら進化したことが明らかになった.この2グループ内部においては,それぞれアジア地域,マレシア地域,オセアニア地域,南米地域というような地域的まとまりが認められ,特にオセアニア地域のニュージーランドの固有種が最も原始的な位置にある.来年度はさらに解析対象の種数を増やしてデータを重ねていく計画である.マキ科のイヌマキ属(Podocarpus)は約90種が知られるマキ科最大の属である.その大部分が南半球に分布しており,一部ではアジアとメキシコで北半球に入り込んでいる.本研究では1.マキ属の範疇と外群を明らかにするためにマキ科の分子系統を行うとともに,2.入手できたマキ属構成種45種を対象にして葉緑体DNAのmatK遺伝子を解析して種間の系統関係を明らかにした.その結果マキ属は,これまでに提唱されてきたAfrocarpus, Nageia, Retrophyllum, Decussocarpusと単系統群を形成しており,マキ属を広義にとらえても狭義に捉えても問題はないことが判明した.

その系統関係((Afrocarpus, Nageia), (Decussocarpus, Retrophyllum), Podocarpus)であった.そこで本研究ではマキ属の範疇を狭義として捉えたうえでAfrocarpus, Nageia, Retrophyllum, Decussocarpusを外群にして種間の系統解析を進めた.マキ属の系統は葉の形態(広葉・狭葉)を大きく反映しており,このグループがそれぞれ南半球各地域で適応放散を起こしたことが示唆された.これらの分化は少なくともゴンドワナ大陸が分断する白亜紀までには完了していたことになる.南米やオーストラリア,アフリカ大陸における広葉・狭葉の各グループはそれぞれの地域ごとに分化したこと,北半球側にも入り込んでいるメキシコのグループやアジアの種群は,それぞれ南米とオセアニアマレシア地域の種群から分化したことが示唆された.
尿中酵素NAGとSDS-PAGE電気泳動法による尿中蛋白分析の腎疾患への臨床応用 ―ウシおよびネコ腎症モデルと自然発症例の比較―

本研究は,尿中NAG指数の測定とSDS-PAGEによる尿蛋白の分析が動物の腎疾患診断マーカーとして有用か否かを検索する目的で実施したものであり,以下のような成果が得られた.(1)ネコとウシの腎症モデルでは、尿中NAG指数が早期から上昇し腎実質傷害の存在を示唆した。また、NAGアイソザイムはB分画の増加がみられた。(2)泌尿器病の自然発症例に対する検索では、尿中NAG指数は慢性腎不全症例、急性腎不全症例ならびに腎孟腎炎症例で明らかに高値を示した。しかし、ネコの下部尿路疾患やイヌの膀胱炎や尿道炎の症例では、尿中NAG指数は正常範囲内であった。イヌの慢性膀胱炎の症例で腎孟腎炎を併発した例では、経過途中からNAG指数は高値を示し炎症が上行性に腎孟に達したことを示した。したがって、下部尿路感染症における上行感染のモニターとして、尿中NAG指数の測定は有用であった。2次性腎疾患の症例として糖尿病と子宮蓄膿症の症例について尿中NAG指数をモニターした結果、腎機能検査値の低下を来す前にNAG指数の増加がみられたことから、2次性腎疾患のモニターとしても有用であると考えられた。(3)SDS-PAGEによる尿中タンパク質の分析では、慢性腎不全の症例ではレチノール結合蛋白などの低分子蛋白の出現が観察された。一方、下部尿路感染の症例で血尿を呈しているものでは、そのSDS-PAGE分析パターンは血清と同様のパターンを示し、腎実質の傷害を区別するのに有用であった。これらの尿蛋白分析は、尿中NAG指数の測定と組み合わせることにより、より有効であった。以上のことから、尿中NAG指数とSDS-PAGEによる尿蛋白の分析は動物の泌尿器疾患診断マーカーとして有効であることが証明された.本研究は,尿中NAG指数の測定とSDS-PAGEによる尿蛋白の分析が動物の腎疾患診断マーカーとして有用か否かを検索する目的で実施したものであり,以下のような成果が得られた.(1)ネコとウシの腎症モデルでは、尿中NAG指数が早期から上昇し腎実質傷害の存在を示唆した。以上のことから、尿中NAG指数とSDS-PAGEによる尿蛋白の分析は動物の泌尿器疾患診断マーカーとして有効であることが証明された.今年度の研究目的は以下の通りであった。1.ネコの腎疾患診断マーカーとして尿中NAGアイソザイム分析ならびにSDS-PAGEによる尿蛋白分析を応用するために、ネコ腎症モデルと自然発症例の分析を行い腎臓の病理組織学的所見と比較検討する。2.ウシ腎症モデルの作出と自然発症例おける尿中NAGならびにアイソザイム分析と尿細管由来低分子蛋白の尿中排泄との関連性を明らかにする.この目的に従って以下のような研究を実施し、研究成果が得られた.(1)ネコ腎症モデルの作成:過剰なサルファ剤・トリメトプリム合剤の経口投与によりネコの尿細管障害を作成した。このモデルにおいて尿中NAGならびにSDS-PAGEによる尿蛋白の分析を実施し、臨床所見・血液検査・尿検査、腎臓のバイオプシーによる病理組織学的検索の成績などとともに比較検討したところ、尿細管障害の初期病変に対してこれらの尿中酵素と蛋白分析値がその異常を反映して変動することが示された。(2)ウシ腎症モデルの作成と腎症自然発症例における検討:重クロム酸カリウムによる腎症モデルを作成するとともに、各種の自然発症例を収集して、尿中NAG指数とアイソザイムパターンならびにSDS-PAGEによる尿蛋白分析を実施した.その結果、腎症モデルの尿中NAG指数は健康牛と比較して明らかに高値を示し、アイソザイムパターンではB分画の増加が明らかであり、このパターンはヒトや実験動物で報告されている尿細管障害パターンと同様であった。また、尿中蛋白の分析ではアルブミンパターンを示す症例の他に低分子蛋白の漏出を示す症例が観察された。尿中NAGと低分子蛋白は尿細管から漏出してくる蛋白であるため、これらの分析はウシにおいても尿細管病変を診断する上で有用であると思われた。現在も、自然発症例を継続して収集中。

今年度の研究目的は、イヌとネコの泌尿器病症例に経時的な尿中NAG排泄のモニターと尿蛋白のSDS-PAGE分析を実施して、これらの指標の動態と病勢との関連性を検討することであり、以下のような研究成果が得られた。(1)ネコとイヌの慢性腎不全症:代償期から尿毒症期の慢性腎不全症例について尿中NAG指数を調べたところ、正常範囲内から高値を示すものまで様々であった。総じて尿中NAG指数は、代償期の症例では尿毒症期や非代償期のものに比べて高い傾向を示した。また経時的にモニターしたものではBUNや血清クレアチニン濃度の高度の上昇を認める前段階で高値を示すものが多かった。SDS-PAGEによる尿蛋白質の分析では、レチノール結合蛋白などの低分子蛋白の出現が観察された。(2)ネコの下部尿路疾患:尿中NAG指数は正常範囲かその上限を示した。SDS-PAGEによる分析では、血清と同様のパターンが観察され、これらの尿中にはスティック法で尿蛋白のほかに潜血反応が認められた。したがって、これらの症例で観察された尿の異常所見は腎後性の下部尿路からの感染に伴う出血であると考えられた。(3)イヌの腎盂腎炎:膀胱炎などの下部尿路感染症から腎盂腎炎を併発した例では、尿中NAG指数の著しい高値が観察された。これらの症例の尿中には潜血反応が認められ、SDS-PAGEによる分析では血清パターンが認められた。(4)イヌの糖尿病症例:血糖コントロールが安定せず尿糖が多量に出現していた時期に尿中NAG指数は高値を示した。このことから高濃度の尿糖が尿細管上皮に傷害を与えていることが推測された(5)イヌの子宮蓄膿症:本症例では、尿中NAG指数が高値を示すものと正常範囲のものとに分かれた。高値を示したものでは、治療のために実施された卵巣・子宮全摘出術後にBUNならびに血清クレアチニン濃度が急増して急性腎不全に陥ったものが観察された。したがって、子宮蓄膿症の症例における尿中NAG指数のモニタリングは、予後を判定する上で重要であると思われた。以上の結果がら、尿中NAG指数と尿蛋白のSDS-PAGEによる分析の組み合わせは、イヌとネコの泌尿器病の診断ならびにモニターとして有効であることが明らかとなった。