hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放課後生活空間評価尺度の作成と活用

小学生から中学生、高校生、大学生までの放課後の生活空間を評価できる信頼性・妥当性のある尺度を作成した。これらの尺度は、放課後の生活を自己点検評価できるように作られた。また、調査や面接、観察によって、各学校段階における放課後の生活を明らかにした。調査対象は、小学生の保護者1621名、小学生・中学生・高校生・大学生の計980名であった。小学生と保護者の回答間には、概ね有意な正の相関があった。放課後は将来を見据えたキャリア教育の場という意味合いがあるが、学年が上がるほど、学習時間が減少していた。地域の関係する成人への面接調査から、活動環境づくりが重要であることも明らかとなった。本研究の当初目標(1.タッチパネル式アンケート装置作成,2.放課後生活空間評価尺度作成,3.放課後実態把握,4.育ち効果のエビデンス収集)のうち,初年度では主に4を行ったが,本年度(25年度)はそれ以外のものを中心に行った。1.については,本年度は放課後生活空間アンケートアプリケーションをタブレット端末だけではなくスマートフォンでも利用できるように開発を行った。タブレット端末は画面が大きいため年少の児童本人でもアンケートに回答可能という長所があるが,所有している家庭が少なく,調査が困難であった。スマートフォンでのアンケートアプリケーションは画面が小さく,児童本人による回答は困難であるため,保護者と児童が共同して回答を行うものに修正した。2.については,放課後生活空間評価尺度に焦点化して,尺度の全体像を構築し,尺度完成に向けた本調査を実施した。また,前年度に実施した放課後子ども教室を利用する保護者のインタビューを整理し,放課後生活空間尺度の有用性を向上するために現状と問題点を再検討した。また,それらの研究結果を自治体(行政)が開催する放課後子ども教室の委員会で報告すると共に妥当性を確認するために結果を評価してもらった(北原・蓮見・川嶋・佐藤・生駒,2013)。3.については,上記の尺度の質問項目を使って,小学生,中学生,大学生の放課後生活の実態把握を行った。4.については,放課後子ども調査の3年間縦断データについての集計,分析を進めた。その結果,学童期対象の保護者用,低学年児童用,高学年児童用の3種と中学生対象の中学生用,大学生対象の大学生用の放課後生活空間評価尺度案が作成され,大規模調査を行った。それらを集計し,因子分析などにより質問項目を精査し,尺度の妥当性,信頼性についての統計的検討を行い,各尺度の完成を目指す運びとなった。本研究は主に4つの研究から構成されている。24年度における研究実績は以下の通りである。1川嶋・蓮見・北原(2013)では先に開発した子ども自身が行いうる放課後生活空間自己点検評価システムの実施上のトラブルを精査した。集団場面でのタッチパネルアンケートトラブルは,機器のトラブルと子どもの行動によるトラブルの2つに分類され,アンケート実施者は常にトラブルに対処する必要があり,効率的ではなかった。そこで24年度では家庭で携帯型タブレット端末(Apple社製iPad)を用いて毎日実施可能な携帯型アンケートアプリケーション(児童用・保護者用)を開発した。2子どもの放課後生活空間を評価できる信頼性・妥当性のある放課後生活空間評価尺度を作成し、それらを使って、放課後の生活空間を明らかにすることをめざした。今年度は、小学生低学年用・保護者用、及び大学生用の放課後生活空間尺度を作成した(蓮見・北原・川嶋、2012)。大学生用では、120名に質問紙調査を実施し、放課後の生活実態と大学生用の尺度試案を完成させた。3「放課後子ども教室」の育ち効果のエビデンスを検証するために、500組に及ぶ低学年児童およびその保護者に質問紙調査を実施した。24年度は、低学年児童が質問紙法によって放課後生活評価を行う場合、どのような課題が生じるかについて、まず手続き上の課題を探った。45学級分の実施状況報告を分析し、併せて1年生2学級では実際の回答場面の観察も行った。その結果、1年生では「アンケート用紙を封筒から出す」「先生が読んでいるところを見る」「消しゴムを使う」など作業上の困難が多々あり、配慮を要することが明らかとなった。4放課後生活空間の質を向上するために「放課後子ども教室」を利用する保護者と運営するスタッフ双方から現状と問題点についてインタビューを実施した。小学生から大学生までの放課後の生活空間を評価できる信頼性・妥当性のある放課後空間評価尺度を作成し、それらを使って、各学校段階における放課後の生活空間を明らかにした。調査対象としたのは、小学校低学年の保護者930名、低学年児童207名、小学校高学年の保護者682名、高学年児童177名、中学生247名、高校生200名、大学生149名であった。尺度の妥当性については、児童自身による放課後生活評価および他尺度との関連性を調べた。

この結果,中程度の相関がみられた。児童回答と保護者回答には、概ね有意な正の相関があったが因子構造が異なっていた。保護者回答では4因子構造からなる包括的な尺度を構成することを提案した。また、全国を対象としたウェブ調査を行い、一般性の検証を行った。さらに、中学生、高校生について放課後生活を自己点検できる尺度を開発するために全国を対象としたウェブ調査を行った。これらのアンケート調査に加え、放課後子ども教室に関わっている地域の成人ボランティアへの面接調査も行った。小学生の放課後過ごし方については、女児に比べて男児は仲間と一緒に遊んだり、身体を動かすことが多かった。また、高学年(5,6年生)では身体活動が減っていた。さらに、子どもの豊かな放課後環境づくりには、「大人関係者の活動環境づくり」が重要であることが明らかになった。一連の調査研究の全体総括として、学校での勉強以外で得られる「まなび」の姿について広くとらえることをテーマとして、日本心理学会においてシンポジウムを主催した。学習および環境を扱う理論的枠組みを整理したうえで、本研究で扱ってきた子どもの放課後活動に加え、高齢者の音読計算、チンパンジーの遊びなど、多様な学びの調査研究者から話題を得た。3年間のまとめとして、「放課後のまなび事例をもとに調べる・考える・広げる」という題名の報告書を作成した。教育心理学1.について:スマートフォン用のアプリケーションでは保護者向けの機能もさらに追加する予定であり,完成には至っていない。最終年である平成26年度は数組の母子にモニターになってもらい,アプリケーションの使用感や改善意見を得て,アプリケーションを完成する予定である。2.3.4について:放課後生活空間評価尺度については,相互の全体構想が築かれた。すなわち,小学生・中高校生・大学生に区分した3対象を妥当としたうえで,本研究の中心的調査対象である小学生については,「保護者用尺度32項目」「小学生用尺度(低学年)16項目」「小学生用尺度(高学年)32項目」の3種を用意した。さらに,中高生尺度(32項目),大学生尺度(28項目)も作成・実施した。全5放課後生活評価尺度においては,対象者の認知発達の程度と生活環境状況に応じて質問項目の数や表現は変化しても,「具体的な行動への焦点化」「共通の活動概念(交流・運動・安息など)」によって,尺度相互の関連づけがイメージできるよう構想した。さらに小学生に対しては,「安全安心」など本人では評価が難しい環境評価も含めるべきだろうという考えから,保護者が評価を行う放課後活動サポート尺度21項目も構想した。縦断的分析では,放課後子ども教室の設置と連動するかたちでの生活空間評価の変動を認めないという結果が得られた。以上の構想の元で,小学生対象については5小学校約1200組の保護者ー児童を対象に放課後アンケートを実施し,妥当性・信頼性検討に向けて,得られた親子回答を対応づけしてデータベースを作成した。保護者版については,確認的因子分析と既存尺度(学校適応,シャイネス,QOL)回答との相関分析を完了した。
上海日本人住宅地の形成に関する研究―近代上海に成立した国際社会の視点から

2011年度は、日本外務省や上海日本総領事館による日本人の利権獲得、居住環境の向上について、上海での現地調査、イギリスと日本での文献調査の結果、下記のような成果が得られた。1890年代から、日本人による上海進出はすでに英米人より50年間も遅れたため、多くの日本人は公式な外国人共同租界に居住出来ず、租界外の北四川路周辺に集住するようになった。しかし、北四川路日本人住宅地は、公式な外国租界のように路面電車、上下水、電気、治安維持といった公共サービス、及び建築規則、衛生基準の適応方法が整っていなかった。そのために、日本外務省と上海日本領事館は、上海にいた外国租界の英米人官僚と常に交渉していた。その交渉過程に関する英語文書の解読から、日本外務省、上海日本領事館が日本人住民のバックアップとして、官民一体で上海日本人住宅地の権利を確保していた実態がわかった。一方、上海日系企業の場合は、1870年代から上海に進出した三井物産が、租界外の浦東日本海軍の軍用地を借用し、自らの工場地と社宅地を建設していた。しかし、後発の内外綿株式会社は、英米人主導の社会に入るために、英米人と交渉せざるを得なかったのである。同社は、英国人地主から、租界内にあった生産や流通に便利な小沙渡地区の土地を購入し、直接出資して英米人官僚と協力しながら、道路、電気、上下水の敷設を行い、上海における大規模な紡績工場地を建設した。上記のように形成された上海日本人住宅地と工場地は、共同租界のように諸外国と中国政府との間の正式な協定に基づき、設定されたものではなく、共同租界の内部と外部に分散して立地していたことが判明した。2010年度の研究成果と合わせ、上海日本人住宅地の形成は、英米人により建設され供給されたことを第一歩とし、日本外務省と日本人が自らの生活習慣にあった居住形態、各種公共権利を確保したことがその第二歩であったことを明らかにした。2010年度は、本課題の目的、実施計画に沿って、日本、中国、イギリスでの調査を行い、以下の成果を上げた。1)1890年代から上海に進出していたイギリス商社、イギリス人建築家と組織事務所、日本人開発業者が上海での不動産経営に着目し、日本人対象を含んだ住宅開発の実態を明確にした。それらは、住手が日本人、西洋人、中国人の関係なく、一筆の土地を入手した後、まず、社内の不動産部門で戸建て、二戸建て、長屋の家賃ランクを設定し、収益度合いを基準に、それぞれの土地に関する各種住宅の配置プランを開発していたことが分かった。更に、なるべく多くの家屋を一筆の土地内に収めるために、住宅団地内の路地の幅、建物の向きの変更を行っていたことを明らかにした。これにより、上海日本人住宅地の形成の過程が明確となった。2)北四川路地区を対象として旧日本人地区の形成過程、空間特性と住居形態を探った。1890年から、英米人主導の工部局による英租界から租界外へと伸びる北四川路の開発により、その両側に、住宅地と各種都市施設が建設されるようになった。最初は、アメリカ人がこの地区に集住していたが、日本人の居住と増加につれ、アメリカ人が仏租界へと転出し、この地区は日本人地区として変容していた。日本人は英米人が開発した住宅に住み、自らの生活に合わせ、ベランダの室内化、和室の導入により、当初の住宅を改造していた。この地区は、上海の英、米、仏租界及び中国人県城から、遠く離れていた北部に存在していたが、事実上、北四川路は英租界に直接入り、四川路となり、その両側に、日系の大手企業、銀行がぎっしりと建ち並んでいた。更に、四川路は仏租界に入り、天堂街となり、県城の新北門に通じていた。これにより、北四川路地区は、英租界の日系企業に通勤していた日本人にとって、仏租界や中国人県城からも便利で、立地の良いベットタウンであることが明確になった。上記の発見により、上海旧租界の市街地に現存する近代住宅、旧日本人街の開発経緯と空間特徴が明らかになったと同時に、近代、日本人における海外での居住形態も明確になった。これらの研究成果は、現時点において、建築学会及び建築史学にて投稿中である。また、その概要を研究分担者陳が口頭発表した。さらに、これらの地域での建物の保存・再生が現況の重要課題であり、それに関する口頭発表を研究代表者西澤がおこなった。

しかし、後発の内外綿株式会社は、英米人主導の社会に入るために、英米人と交渉せざるを得なかったのである。同社は、英国人地主から、租界内にあった生産や流通に便利な小沙渡地区の土地を購入し、直接出資して英米人官僚と協力しながら、道路、電気、上下水の敷設を行い、上海における大規模な紡績工場地を建設した。上記のように形成された上海日本人住宅地と工場地は、共同租界のように諸外国と中国政府との間の正式な協定に基づき、設定されたものではなく、共同租界の内部と外部に分散して立地していたことが判明した。2010年度の研究成果と合わせ、上海日本人住宅地の形成は、英米人により建設され供給されたことを第一歩とし、日本外務省と日本人が自らの生活習慣にあった居住形態、各種公共権利を確保したことがその第二歩であったことを明らかにした。
脳の構築と神経回路形成における細胞移動の役割

後脳の小脳前核細胞をモデルとして、神経細胞の移動、その結果形成される神経核、そして神経核形成と神経回路形成の関係を検討した。その結果、神経核形成の分子機構としてネトリンによる誘引の他に、N-Cadherinによる接着、さらにはSDF-1による誘引など、様々な分子機構の関与があることが判明した。そしてSDF-1をノックアウトすると橋核が異所性に形成されることを利用して、神経回路形成と神経核形成の関係について検討したところ、神経核が異所性に形成されても正常な回路形成が起こることが明らかになった。シナプス結合の形成は、シナプス前要素である軸索の適切な部位への誘導と同時にそれを受けるべきシナプス後細胞の適切な部位への配置が協調的に起こることで実現する。そのシナプス後細胞の適切な部位への配置、すなわち適切な層構造や神経核の形成は神経細胞の整然とした移動がおこることによって実現される。よって神経細胞がどのようにして適切な場所に移動するのかという問題の解明は脳の形態形成のみならず、脳の領域に特異的な性質を持った神経回路の構築を解明するのに不可欠な重要な問題である。本研究では神経細胞の移動の基本原理の解明を行うとともに、その後おこる神経回路形成にどのように寄与をするのかを明らかにすることを目指している。本年度は以上の研究の第一歩として後脳小脳前核細胞群の核形成の研究を行った。そのため、マウスの胎仔標本を用いて、後脳背側部の菱脳唇に片軸性にexo utero電気穿孔でEYFP遺伝子を導入することによって菱脳唇由来の小脳前核細胞の前駆細胞をin vivoで標識し、その運命を追うことにより、橋と延髄において小脳前核を形成する4つの神経核の移動と核形成の過程を可視化することに成功した。その結果、これまでの報告に反して橋核と橋被蓋網様核の神経細胞の一部は正中線を交叉して移動することが明らかになった。また外側網様核と外楔状核の神経細胞が正中線を越えて移動することが明らかになった。興味深いことに小脳前核細胞の前駆細胞は何れも移動の最終段階において方向転換をし、脳室方向に向かって移動する様子が観察された。ラディアル線維を選択的に染める抗ネスチン抗体を投与したところ、脳室方向に向かって移動する細胞はネスチン陽性繊維に沿うように分布していた。また電子顕微鏡を用いて観察をおこなったところ、ラディアル繊維に移動細胞が接触している様子が観察された。脳に於ける神経細胞の移動は、放射状方向の移動と接線方向の移動に大別される。大脳皮質に代表される層構造は特異的神経回路と密接な関係があるが、その形成には前者が重要な役割を果たしている。また、同様な意味で重要な神経核の形成には接線方向人の移動が重要な働きを果たしている。本年度は後者の焦点を当て、後脳小脳前核細胞群をモデル系とし、核形成の研究を行った。そのため、マウスの胎仔標本を用いて、後脳背側部の菱脳唇に片側性にexo utero電気穿孔でEYFP<enhanced yellow fluorescent protein)遺伝子を導入することによって菱脳唇由来の小脳前核細胞の前駆細胞をin vivoで標識し、その運命を追うことにより、橋と延髄において小脳前核を形成する4つの神経核の移動と核形成の過程を可視化することに成功した。興味深いごとに小脳前核細胞の前駆細胞は何れも移動の最終段階において接戦方向から、法線方向へと移動方向の転換をし、脳室方向に向かって移動する様子が観察された。以上の結果は神経核形成においてもラディアル繊維に沿った細胞の移動が重要な役割を果たすことを示している。適切なシナプス結合の形成は、シナプス前要素である軸索の適切な部位への誘導と同時にそれを受けるべきシナプス後細胞の適切な部位への配置が協調的に実現することにより両者はシナプスを形成することができる。そのシナプス後細胞の適切な部位への配置、すなわち適切な層構造や神経核の形成球神経細胞の整然とした移動がおこることによって実現される。

そこで本研究では神経細胞の移動の基本原理の解明を行うとともに、その後おこる神経回路形成にどのように寄与をするのかを明らかにすることを目指している。本年度の成果は下記の通りである。1)核形成のイメージング昨年度までの研究で小脳前核細胞の移動と核形成の過程の動態の一部を明らかにしたが、本年度はそれを発展させ、発生後期(E15.5以降)のイメージングを進め、後期に神経核形成の過程においても法線方向への移動が重要な役割を果たすことを示唆する知見を得た。2)移動・核形成とカルシウムシグナリングこれまでの我々の研究で移動中の小脳前核細胞細胞にはカルモジュリン遺伝子が発現しており、移動と核形成にカルモジュリンが重要な役割を果たしていることが示唆されていたが、RNAi法を用いることでその機能的役割がさらに確かなものとなった。適切なシナプス結合の形成は、シナプス前要素である軸索の適切な部位への誘導と同時にそれを受けるべきシナプス後細胞の適切な部位への配置が協調的に実現することにより両者はシナプスを形成することができる。そのシナプス後細胞の適切な部位への配置、すなわち適切な層構造や神経核の形成は神経細胞の整然とした移動がおこることによって実現される。よって神経細胞がどのようにして適切な場所に移動するのかという問題の解明は脳の形態形成のみならず、脳の領域に特異的な性質を持った神経回路の構築を解明するのに不可欠な重要な問題である。本年度は整然とした層構造があることが知られている小脳皮質に着目し、その発生と分子機構の解明を目指して研究を行った。まず小脳を構成する神経細胞を可視化するため、胎生12.5日目のマウスの胎仔の脳室に蛍光蛋白質GFPの遺伝子を電気穿孔法で導入し、生後に脳を取り出して観察を行った。その結果、プルキンエ細胞とゴルジ細胞がGFPの蛍光によって観察された。次に発生期の小脳の脳室層に特異的に発現している免疫グロブリンスーパファミリーのNEPH3に着目し、shRNAを作製してGFPと同時に導入し、生後の小脳の観察をおこなったところ、プルキンエ細胞の位置、形態、数に変化が認められた。このことはNEPE3がプルキンエ細胞の発生に深く関与していることを示唆している。シナプス結合の形成は、シナプス前要素である軸索の適切な部位への誘導と同時にそれを受けるべきシナプス後細胞の適切な部位への配置が協調的に起こることで実現する。本研究では神経細胞の移動の基本原理の解明を行うとともに、その後おこる神経回路形成にどのように寄与をするのかを明らかにすることを目指して研究をおこなった。そのため後脳菱脳唇に由来し、橋核を形成する神経細胞をモデルとし、核形成の過程をタイムラプス解析した。実験にはマウスの胎仔を用い、神経細胞の標識は子宮内電気穿孔法を用い、蛍光分子の遺伝子を菱脳唇のprogenitorに導入することでおこなった。
相転移時の動的ゆらぎの観察と機構の解明

研究の概要相転移によって引き起こされる挙動を動的ゆらぎと位置付け、ミクロ・メゾ・マクロの視点で直接観測し、多角的・複眼的観点から相転移ダイナミクスを議論する。具体的には、比較的遅い相転移を示すイオン液体を試料として、以下の「4つの問い」に解答を与える実験(超高感度熱量測定、Raman散乱と熱量の同時測定、NMRによる緩和時間測定)を行う。(1)相転移を引き起こすトリガーは?;(2)局所的相転移場での熱エネルギーの出入りは?;(3)相転移時の構成分子やイオンの構造変化は?;(4)変化の時間スケールは?研究の概要相転移によって引き起こされる挙動を動的ゆらぎと位置付け、ミクロ・メゾ・マクロの視点で直接観測し、多角的・複眼的観点から相転移ダイナミクスを議論する。(1)相転移を引き起こすトリガーは?;(2)局所的相転移場での熱エネルギーの出入りは?;(3)相転移時の構成分子やイオンの構造変化は?;(4)変化の時間スケールは?
傾斜機能性を有する骨組織再生用多孔質複合材料の力学特性と細胞増殖性に関する研究

骨組織の再生治療に用いる細胞培養のための多孔体(scaffold)として強化構造を導入したポリL乳酸PLLA系scaffoldを開発した.2種類のシェル構造(緻密体と多孔体)とビーム構造を強化材とし多孔質コア部と組み合わせることで,圧縮弾性率や強度等の力学特性を大幅に向上することに成功した.さらに,骨再生能に優れるハイドロキシアパタイトや.-TCP等の生体活性リン酸カルシウム系セラミックス微粒子をPLLAに分散させることで,細胞増殖能やALP活性および力学特性が大幅に向上することを見出した.PLLA系scaffoldより力学特性は劣るが,より生体適合性に優れる生体ポリマーのコラーゲンを基材としたscaffoldと.-TCPを複合化したscaffoldを開発し,間葉系幹細胞とのハイブリッド化による人工骨組織形成実験を行ったところ,複合化による細胞増殖能,骨芽細胞への分化能,力学特性の向上等を達成することができた.また,細胞培養中に圧縮力学刺激を加えることで,細胞増殖能やALP活性等をさらに向上させることが可能であることを明らかにした.骨組織の再生治療に用いる細胞培養のための多孔体(scaffold)として強化構造を導入したポリL乳酸PLLA系scaffoldを開発した.2種類のシェル構造(緻密体と多孔体)とビーム構造を強化材とし多孔質コア部と組み合わせることで,圧縮弾性率や強度等の力学特性を大幅に向上することに成功した.さらに,骨再生能に優れるハイドロキシアパタイトや.-TCP等の生体活性リン酸カルシウム系セラミックス微粒子をPLLAに分散させることで,細胞増殖能やALP活性および力学特性が大幅に向上することを見出した.PLLA系scaffoldより力学特性は劣るが,より生体適合性に優れる生体ポリマーのコラーゲンを基材としたscaffoldと.-TCPを複合化したscaffoldを開発し,間葉系幹細胞とのハイブリッド化による人工骨組織形成実験を行ったところ,複合化による細胞増殖能,骨芽細胞への分化能,力学特性の向上等を達成することができた.また,細胞培養中に圧縮力学刺激を加えることで,細胞増殖能やALP活性等をさらに向上させることが可能であることを明らかにした.生体吸収性高分子材料であるポリL乳酸(PLLA)は,力学特性に優れるために骨固定材料として使用されており,最近では再生医療における細胞培養のための足場材としても期待されている.足場材は細胞が増殖し組織を形成するために通常多孔質構造をとるが,骨組織の再生を試みる場合,多孔質のPLLAでは,強度や剛性が不十分である.そこで本研究では,補強構造を導入して力学特性を向上させることを試みた.導入した補強構造は層状構造であり,3種類の層状構造の作製を行い力学特性を比較した.ひとつ目の層状構造は2層構造を成す足場材であり,外層は緻密で厚さ約200μmのフィルム状層,内側は多孔質構造を形成している.もう1種は,外層のフィルム状層の力学特性をさらに向上させるために,生体活性セラミックスであるハイドロキシアパタイトの微粒子を分散させた材料であり,内部はPLLAの多孔質構造である.3種類目は,外層を厚さ約2mmのPLLAの多孔質フレーム構造としたものであり,その空隙率は内部構造より小さくなっている.これら3種類の層状構造足場材と通常の単一構造の足場材の力学特性を比較した結果,フレーム層導入の足場材の圧縮強度は,単一構造の約2倍であり,さらにPLLAフィルム層導入の足場材の強度は,フレーム層導入構造の約2倍に上昇していた.フィルム層をPLLA/HApの複合材料とした足場材の強度は,さらに上昇した結果となった.骨芽細胞様細胞MC3T3-E1を播種し細胞接着性を評価した結果,各足場材においてよい接着性が確認できた.前年度開発に成功した生分解性樹脂であるPLLAを原料とする強化構造型多孔質材料は,単一構造の材料に比べ圧縮力学特性の目覚ましい向上を示したが,生体親和性に劣っていた。そこで,本年度では,生体親和性の向上を目指して,生体活性を有する3種類のリン酸カルシウム系セラミックスの微粒子をPLLAに分散させた複合材料を作製し,骨芽細胞様細胞を用いて細胞増殖能と石灰化度の指標であるALP活性を計測した結果,著しい上昇を示し,バイオセラミックス粒子分散が効果的であることが明らかになった一方,異なる種類の骨再生用材料として3種類の多孔質セラミックス材料の動物実験を行い,骨再生能について生体力学的観点から調査を行った。μ-CT画像より3次元多孔質構造モデルを構築し,骨組織の再生が力学特性に及ぼす影響を調べた結果,吸収性材料と非吸収性材料では異なる挙動を示すことが明らかになった.

吸収性材料の方が骨再生速度が速い傾向にあり,2週間程度で巨視的弾性率は安定した状態に達する,これは,吸収されたバイオセラミックス成分(リン酸イオンやカルシウムイオン)が骨リモデリングに対して効果的に作用したものと推測される骨再生に及ぼす力学刺激の影響を調べるために,圧縮負荷を加えながら多孔質コラーゲンに骨芽細胞様細胞を播種し増殖させた結果,細胞数の増加状態とALP活性の両方において著しい効果が得られた以上の結果より,高分子材料を基材としてバイオセラミックス粒子を分散させた多孔質複合材料を作製し,さらに繰り返し圧縮刺激下で細胞を培養することで,より効果的に生体外で骨組織を再生することができることが明らかになった平成21年度と22年度に得られた研究成果は,生分解性樹脂PLLAを基材としたコア・シェル型およびビーム補強型の強化構造型多孔質材料の開発と,骨芽細胞の石灰化活性を向上させることに成功したリン酸カルシウム系バイオセラミックス微粒子分散PLLA複合材料の開発であった.そこで,平成23年度は,リン酸カルシウムとしてβ-TCPを選択し,これら研究成果により確立した材料製作技術を用いて,強化構造型PLLA/β-TCP複合系多孔質材料の作製を試みた.その結果,力学特性に優れると共に細胞活性にも優れた新規骨組織工学用材料の試作に成功した.この材料は強化構造としてコア・シェル構造を採用しており,最終的な材料の破壊は,シェル層の座屈変形挙動に強く依存するが,有限要素法による3次元数値シミュレーションにより,本材料の変形メカニズムを詳細に再現することに成功し,変形メカニズムの解明に有用となる知見を得ることができた.一方,より生体に近い組成を有する再生医療用材料の創製を目指し,代表的生体有機成分であるI型コラーゲンとリン酸カルシウム系β-TCPの微粒子を複合化し多孔質化した材料の作製を試みた.ラット間葉系幹細胞を播種し増殖・分化・細胞外マトリックス形成挙動等を調べたところ,コラーゲンとβ-TCPを複合化することで幹細胞が活性化され骨形成能が大幅に向上することが明らかになった.この研究によりコラーゲンとβ-TCPの複合化が骨形成用足場材料として有効であることが分かったために,β-TCPを焼結することで骨格構造を形成させ,その多孔質体にコラーゲンをコーティングする,あるいはコラーゲンの多孔質構造を導入する等のハイブリッド化材料の創製を試みた結果,新規複合系多孔質材料の試作に成功した.コラーゲンのハイブリッド化により,脆弱なβ-TCP多孔質体に構造安定性がもたらされ,弾性率や強度が大幅に向上することが示された.
テロメラーゼ活性調節遺伝子導入による部分移植肝容積の許容限容拡大に関する研究

240-280g雄性ラットを用いる。ドナー肝を摘出後、4°C下UW液中またはRinger液中に保存。Kamada変法にてレシピエントへ移植後、肝切除を加える。我々の施設では30%部分肝移植後3日以内に100%死亡するモデルを確立した。1)エレクトロポレーション(EP)法を用いたテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)遺伝子導入(結果1)ヒト肝細胞初代培養株を用いてpIRES-EGFPにテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)のcDNAを組み込んだplasmidlRES-EGRP/TERTをエレクトロポレーション法にてtransfectした。結果:1)10%程度の導入効率であった。2)morphography:変化なし。3)生存期間:E-control,E-TERT群いずれも14日目まで生存したが(fibroblast出現)、TERT導入による生存期間の延長は認めなかった。問題点として1)遺伝子導入効率が低い、2)エレクトロポレーションによる肝細胞の傷害が大きいことが挙げられた。2)エレクトロポレーション(EP)法を用いた摘出肝へのEx vivo遺伝子導入法の確立(結果2)1)のラット肝移植モデルを用いた。摘出肝をUW液中4°C保存下、Luciferase DNAを門脈内投与し、加圧による導入効率、EPによる導入効率につき検討した。EPはバスタブ型電極を用い、至適条件を変えて施行した。加圧、EPにより冷保存下での遣伝子導入は可能であったが肝障害が強くラットの長期生存が得られなかった。3)エレクトロポレーション(EP)法を用いた肝癌に対する免疫抑制下IL-12遺伝子導入(論文1)C3Hマウス-MH134株の皮下肝癌モデルにおいて、Luciferase DNAを針電極でEPを用いて大腿筋へ導入した。導入条件は150V,50msec,10回とした。マウス両側皮下腫瘍モデルの右側のみにIL-12遺伝子を導入した。血中IL-12/IFN-rの上昇を認め、導入腫瘍のみならず対側無治療腫瘍の増殖も抑制した。(Cancer research 2001:61;1005-1012)本モデルを用い、FK506投与下でIL-12遺伝子を腫瘍内に導入した。播種後にFK506投与下無治療群に比べ、IL-12治療群では有意に腫瘍体積の減少を認め、CTLアッセイで腫瘍特異免疫の獲得、腫瘍内血管新生の抑制を認めた。4)Hydrodynamic法を用いた遺伝子導入法の確立240-280g雄性ラットを用いる。4)Hydrodynamic法を用いた遺伝子導入法の確立<傷害肝グラフト肝移植モデルの作成>以下の2群のモデルを作成し門脈圧、生存率を検討した。【結果】現段階では、Group Iにおいて、3日程度の生存しか得られていない。技術的には肝静脈吻合部狭窄が最大の問題点であった。

また過小グラフトに対する門脈圧が高いことも原因の1つと考え、移植前に門脈圧を低下させる目的でsplenopexyを施行Group IIとした。Group IIに部分肝移植を施行すると圧は20-23cmH2Oと低下するも、未だ高値で生存延長を認めなかった(通常10-12cmH2O)。<遺伝子導入肝グラフト作成>ラット肝移植モデル(wister rat250-300gを使用)において、冷保存中のグラフトへ肝へportalv.からNaked plasmidをUW solution(high pressure)とともにdirect injectionした場合の再灌流24時間後Luciferase活性を測定した。さらに同条件下でelectroporationの遺伝子導入効果についても検討した。以下の3群で再灌流24時間後のLuciferase活性を測定した。【結果】GroupIIで5000RLU/μgBSA, GroupIIIで10000RLU/μgBSAのLuciferase活性を得た。冷保存中の遺伝子導入は可能であり、導入効率はelectroporationにより上昇したが、加圧による肝組織障害が著しく、長期生存は不可能であった。そこで、portalV.からの加圧なしで、同様の条件にて上記3群で比較したところ、GroupII, IIIともに導入効率は約1/15へ低下した。Electroporationを用いれば冷保存中の遺伝子導入が可能であった。今後、さらにelectroporationの設定条件、保存条件などを変えて検討予定。<傷害肝グラフト肝移植モデルの作成>以下の2群のモデルを作成し門脈圧、生存率を検討した。【結果】現段階では、Group Iにおいて、3日程度の生存しか得られていない。技術的には肝静脈吻合部狭窄が最大の問題点であった。<遺伝子導入肝グラフト作成>ラット肝移植モデル(wister rat250-300gを使用)において、冷保存中のグラフトへ肝へportal v.からNaked plasmidをUW solution (high pressure)とともにdirect injectionした場合の再潅流24時間後Luciferase活性を測定した。以下の3群で再潅流24時間後のLuciferase活性を測定した。そこで、portal V.からの加圧なしで、同様の条件にて上記3群で比較したところ、GroupII, IIIともに導入効率は約1/15へ低下した。
微細藻類が生産する核内受容体活性化物質の水生動物への影響

富栄養化した淡水湖沼に発生するアオコ(cyanobacterial waterblooms)に核内受容体の一種であるレチノイン酸受容体(Retinoic Acid Receptor, RAR)に結合してアゴニスト(Agonist)として働く物質が存在することを見出し、その物質を単離し、その構造を明らかにした。本物質は7-Hydroxy retinoic acidで、Retinoic acidの新奇アナログであった。本物質は通常4種の異性体の平衡関係にあった。UV-Aの照射に対してはall-trans retinoic acid (ATRA)よりははるかに安定であった。また、活性はATRAの約半分程度であった。UV-Aに安定な7-hydroxy retinoic acidはアオコ発生水域で魚類や両生類のRARに作用し、アオコ発生水域で観察されるカエルや魚の奇形を誘発する一因の可能性が示唆された。研究の目的:富栄養化した湖沼で大量発生する微細藻類が水生動物細胞のレチノイド系やステロイド系の核内受容体を活性化する物質(リガンド)を多量に生産していることを見出した。本研究では微細藻類の生産する核内受容体活性化物質の化学構造の解明とそれらの水生動物へめ影響を明らかにすることを目的とする。初年度である本年は藍藻類に多く見られるRetinoic Acid Receptor(RAR)の活性化物質の化学構造を決めることを目標とした。研究方法:RAR活性の強い藍藻類を調査し、活性が強く、しかも増殖し易い藍藻をNIES株から選抜した。培養にはMicrocystis aeruginosa NIES-44およびSpirulina sp.(TU-3)を用いた。半年間の培養で約500gの乾燥藻体を得た。酵母にRAR遺伝子と活性化因子およびb-ガラクトシダーゼの遺伝子を組み込んだアッセイ系を用いて活性画分を分画した。分画はフロリジルおよびケイ酸カラムで分画し、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで活性本体を得た。検出はPDA(350nm)で行った。結果:活性本体は逆相カラムで4つのピークとして現れた。最大活性ピークを分取りし、再クロマトを行うと、最初と同じ4つのピークになったことから、活性本体は4種類の異性体が平衡関係にあると考えられた。本化成本体のTOFMSデータから本化合物はC20H2803と確定した。また、水素添加した場合はC20H3803であった。これらのLC-MS/MSデータから本活性物質は7-hydroxy retinoic acidであると推定された。本物質はRARの本来の活性化物質であるalltrans retinoic acid(ATRA)よりUV-Aに対して安定であった。本研究では微細藻類の生産する核内受容体活性化物質の化学構造の解明とそれらの水生動物への影響を明らかにすることを目的とした。三年目である本年度は藍藻類の主要レチノイン酸が7-ヒドロキシレチノイン酸であり、4異性体の平衡関係にあることから、これらの異性体の同定と7-ヒドロキシレチノイン酸の光安定性の関係の解明およびレチノイン酸受容体(RAR)の本来の生体内リガンドであるトランスレチノイン酸(ATRA)は過剰曝露により、催奇形性があることが知られていることから、藍藻類の7-ヒドロキシレチノイン酸による水界生態系生物への催奇形性を調べる試験法の構築を行った。研究方法:7-ヒドロキシレチノイン酸の4異性体を逆相系カラムを用いた液クロで分離し、それぞれの異性体のλmaxと分子吸光係数から異性体の構造と平衡状態を推定した。毒性試験用は魚類の中で比較的受精から孵化までの時間の短いゼブラフィシュの魚類胚・仔魚期毒性試験法によるATRA曝露による催奇形性を検証した。結果:7-ヒドロキシレチノイン酸の4異性体はcis-transの異性体であり、異性化はC-7におけるketo-enol互変異性が関与しているものと推定された。光による分子の安定化は異性化による平衡によるものと推定された。本催奇形性試験法により、催奇形性を有するATRAは比較的低濃度である320ng/Lの6日間曝露観察でも外観異常(奇形)を引き起こすことから7-ヒドロキシレチノイン酸も同程度の濃度で生態系動物の奇形への影響が示唆された。

7-ヒドロキシレチノイン酸の全合成についてはまだ完成していない。2011年3月11日に発生した東北地方大震災により茨城県つくば市に立地する筑波大学、国立環境研究所も甚大な影響を受け、建物、実験設備、実験器具はほとんど使用不能になった。これらの復旧、修理に6カ月以上を費やした。本格的な実験を再開したのは昨年10月からであった。本来ならば、2年目である2011年は昨年度同定したRAR活性化物質の本体である7-hydroxyretinoic acidを合成し、水生動物への影響も調べる予定であった。当初6カ月間程度あった遅れは、現在2カ月間程度に縮まってきた。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度である次年度は2カ月の遅れを取り戻し、当初の研究計画通りに研究を進める予定である。最終年度は藍藻類に存在する核内受容体活性化物質が水生動物の個体や生態に、特に生殖に与える影響を調べ、アオコの水生動物への影響を明らかにする。
岩澤主予想の精密化

本年度の研究ではまず,Abel体のイデアル類群の円分Z_p拡大に沿った族の射影極限によって定まる岩澤加群の偶指標部分の高次Fittingイデアルの研究を行った.(本研究では,偶指標に「位数がpと素である」等の「標準的な条件を課している.)申請者は前年度までの研究において,円単数のEuler系を用いて岩澤代数のある「解析サイド」のイデアルを構成し,この解析サイドのイデアルが然るべき意味で高次Fittingイデアルの「上界」を与えることを証明していた.本年度の研究では,B. Mazur氏とK. Rubin氏のKolyvagin系の理論とEuler系のツイストの手法を援用することで,この解析的イデアルが然るべき意味で高次Fittingイデアルの「下界」にもなることを示し,この解析的イデアルが高次Fittingイデアルの良い近似を与えることを明らかにした.本研究の結果により特に,円単数を用いて構成したイデアルによって,岩澤加群の偶指標部分の擬同型類や生成元の最小個数が決定できることが分かった.これまでの研究で得られた結果と合わせると,今回の高次Fittingイデアルに関する結果はMazur氏とRubin氏の結果の精密化と見做すことも出来る.更に,この研究結果の系として,岩澤加群の偶指標部分が擬零である場合は,第0次のFittingイデアルと零化イデアルが一致することが示された.本年度の研究では更に,上記の結果のRubin型のEuler系を持つような一般のGalois表現の場合への一般化を試みた.この研究では,上記の研究の手法を修正・拡張することで,上記の円単数の場合と同様に,Euler系を用いて構成した解析サイドのイデアルが然るべき意味で高次Fittingイデアルの「下界」を与えることを証明した.私は本年度の研究の目標を「岩澤加群の高次Fittingイデアルの決定」を目標としていた.本年度の研究では,この目標を完全に達成することは出来なかったが,この研究により,前年度までの高次Fittingイデアルに関する研究結果を大幅に精密化する大きな進展が得られた.私は,本年度の研究成果は非常に意義深いものであると考えている.Mazur氏とRubin氏のKolyvagin系の理論により,適切な条件を満たす"Selmer構造"に関するSelmer群の群構造を完全に決定することが出来る.今後の研究では,これらのSelmer群の情報を"張り合わせる"という新しい手法を用いて,岩澤加群の高次Fittingイデアルを更に精密に記述することが出来ないか検討する.私は,この手法は肥田変形の「通常肥田変形の岩澤理論の精密化」等,これまでの私の従来の手法では扱うことが出来なかった研究にも有効であると考えており,この新しい手法に期待している.また,最近,栗原将人氏により,楕円曲線のSelmer群・Tate-Shafarevich群の群構造の研究に進展があり,この手法を"楕円曲線の岩澤理論の精密化"に応用することが出来るかどうかを,今後の研究で検討する.平成22年度の研究において,私はイデアル類群に関する岩澤主予想の高次Fittingイデアルを用いた精密化を目標として,整数論,特に岩澤理論の研究を行ってきた.高次Fittingイデアルは,岩澤主予想で記述される岩澤加群の不変量"特性イデアル"よりも,加群の構造に関するより深い情報を持つ不変量である.栗原将人氏は"Gauss和"のEuler系を用いて"高次Stickelbergerイデアル"なる岩澤代数のイデアルを構成し,これが総実代数体の岩澤加群の奇指標部分と一致することを証明した.私は栗原氏のアイデアを基に,栗原氏のケースとは異なるタイプの岩澤加群の高次Fittingイデアルの研究を行っている.私は平成21年度の研究において,(2以外の素数及び特殊な偶指標に対して)有理数体の岩澤加群の偶指標部分の高次Fittingイデアルの"上界"を与えるイデアル("高次円分イデアル"と呼ぶことにする)を円単数のEuler系を用いて構成した."高次円分イデアル"は栗原氏の"高次Fittingイデアル"の類似物であるが,岩澤加群の偶指標部分は奇指標部分よりも構造が複雑であるため,高次円分イデアルが高次Fittingイデアルと一致するかという問題については,現時点でも未解決である.以上を踏まえて平成22年度の研究を行い,以下の結果が得られた.(1)平成21年度の研究結果を任意の素数及び任意の偶指標のケースに拡張した:この一般的な場合でも,円単数のEuler系を用いて"高次円分イデアル"を構成し,これが有理数体の岩澤加群の偶指標部分の高次Fittingイデアルの"上界"を与えることを証明した.また,(弱い結果であるが)高次Fittingイデアルが(許容可能な誤差を除いて)高次Fittingイデアルと一致するための十分条件を与えた.(2)虚二次体の(Z_p拡大及び{Z_p}^2拡大)に伴うイデアル類群の高次Fittingイデアルの研究を行った.この場合も,素数及び指標に関するある条件下で,高次Fittingイデアルの"上界"を与えるイデアルを楕円単数のEuler系を用いて構成することに成功した.

岩澤理論は整数論の一分野であり,代数体の拡大の塔(特に円分Z_p拡大)に沿った、イデアル類群や楕円曲線のセルマー群等、代数的な数論的対象の挙動(岩澤加群)と、複素解析的な対象であるL関数をp進世界で結び付ける理論である。岩澤主予想は、「岩澤加群の"特性イデアル"と呼ばれる不変量が、L関数のp進類似である"p進L関数"によって記述される」ということを主張するものである。(岩澤主予想が証明されているか否かは、代数体や数論的対象ごとに異なる。)私は「岩澤主予想の精密化」を研究課題として、特性イデアルよりも深い情報を持つ「高次フィッティング・イデアル」と呼ばれる岩澤加群の不変量の記述・評価を試みることで、博士課程に於ける研究に取り組んできた。本年度、私は主に、次の2つの研究を行った。まず第一に、前年度に引き続き,虚二次体を基礎体とする、イデアル類群から定まる(円分拡大とは限らない一般の)Z_p拡大(「一変数」),及びZ_p^2拡大(「二変数」)に関する岩澤加群の高次フィッティング・イデアルの評価に関する研究を行った。私は、前年度の研究では、楕円単数のオイラー系を用いて岩澤代数のあるイデアルを構成し、これが「誤差を許せば」岩澤加群の擬零部分群による商の高次フィッティング・イデアルの上界を与えることを証明した。本年度では、一変数の場合に限り、「誤差」の明示的な評価を与えることで、前年度の結果を精密化した。(ただし、二変数の場合は,評価の誤差が全く評価できなかったため,弱い結果しか得られていない。)この結果を論文に纏め、投稿した。第二に、本年度では「研究実施計画」に記載した「楕円曲線の岩澤理論への応用」を視野に入れ、ルビン型のオイラー系を持つような一般のガロア表現に関して、セルマー群のある部分加群から定まる岩澤加群の高次フィッティング・イデアルの研究を行った。この研究では、オイラー系のコリヴァギン微分類を用いて岩澤代数のあるイデアルを構成し、これまでの研究に於ける手法を一般化することで、「岩澤主予想」、及び「法p剰余表現が双対と同型でない」(*)等のいくつかの技術的な条件を仮定した上で、このイデアルが「誤差を許せば」岩澤加群の擬零部分による商の高次フィッティング・イデアルの上界を与えることを証明した。しかし現段階では、仮定(*)を課さなければならないため、楕円曲線のテイト加群を(指標で捻らない限り)扱うことができず、まだ改善の余地が残っている。また、第一の研究と第二の研究では共に、岩澤加群の擬零部分群の情報を完全に捨て去ったものに関する結果しか得られておらず、擬零部分の情報をどのようにして拾うかは、今後の課題である。本年度の研究ではまず,Abel体のイデアル類群の円分Z_p拡大に沿った族の射影極限によって定まる岩澤加群の偶指標部分の高次Fittingイデアルの研究を行った.(本研究では,偶指標に「位数がpと素である」等の「標準的な条件を課している.)申請者は前年度までの研究において,円単数のEuler系を用いて岩澤代数のある「解析サイド」のイデアルを構成し,この解析サイドのイデアルが然るべき意味で高次Fittingイデアルの「上界」を与えることを証明していた.本年度の研究では,B. Mazur氏とK. Rubin氏のKolyvagin系の理論とEuler系のツイストの手法を援用することで,この解析的イデアルが然るべき意味で高次Fittingイデアルの「下界」にもなることを示し,この解析的イデアルが高次Fittingイデアルの良い近似を与えることを明らかにした.本研究の結果により特に,円単数を用いて構成したイデアルによって,岩澤加群の偶指標部分の擬同型類や生成元の最小個数が決定できることが分かった.
三角関数のグラフ概念を視覚的に獲得する探究活動活動支援システムの開発研究

本研究の目的は、三角関数のグラフ概念を視覚的に獲得する探究活動支援システムを開発することである。つまり、学習者が自由にシステムを探究することにより、三角関数のグラフのメカニズムを視覚的に発見し、さらに、この視覚的イメージを公式や定理による数学的理解に結び付ける支援を行うことが本システムの開発目的である。今年度は以下の項目の開発研究を行った。1.周期的現象の実験映像の観察機能(1)教材研究:学習者が三角関数のグラフ概念を学習する動機づけとなる実世界の周期的現象を調査した。(2)映像作成及び編集:教材研究で調査した周期的現象を実際に携帯型のビデオ機材で収録し、さらにその映像をMacintosh上で編集した。2.TriGraphによるグラフの視覚的探究機能平成5年度開発したTriGraphを新たに探究活動支援システム上で実行できるように改良を行った。3.TriGraphのグラフ電卓への適用TriGraphで表していた三角関数のグラフのメカニズムをグラフ電卓上で実現できるようにした。これにより、コンピュータ環境のない一般教室においても、三角関数のグラフ概念を視覚的に探究する授業が行えるようになった。4.実験授業の設計と実施上記で開発した教材を用いた実験授業を設計し、金沢工業高等専門学校一年を対象に実験授業を実施した。授業は一斉授業形式で、教師は提示用にTriGraphとグラフ電卓を使用し、生徒は探究の道具としてグラフ電卓を使用した。現在その授業の評価を行っている。
Reg-Reg受容体系によるヒト消化器癌の増殖・浸潤能・予後の解明

次に、ヒト肝臓癌・膵癌・胆道癌・胃癌・大腸癌等の消化器癌標本において、各種癌組織でのREG遺伝子、REG蛋白及びREG蛋白受容体の発現の有無を定性的に検討し、さらにrealtime Taqman RT-PCR法によりその発現の定量化を行う目的で、東北大学倫理委員会の承認を受け(承認番号2001-002)、東北大学病院肝胆膵外科・胃腸外科で同意書の得られた肝臓癌・膵癌・胆道癌・胃癌・大腸癌症例をそれぞれ約100症例収集し、この全検体よりtotal RNAの抽出及び組織切片の作成を終了した。また、臨床病理学的項目とREG遺伝子、REG蛋白及びREG蛋白受容体の発現の有無・発現量の結果との相関関係を検討する目的で、現在までに入手し得た各臨床検体について、組織型、腫瘍マーカー、進展度、脈管浸襲、リンパ節転移、再発形式、予後に関しての詳細なデータベースが完成した。さらにヒトREG遺伝子ファミリーが全体で5つの遺伝子、REG I alpha、REG I beta、REG III、HIP/PAP、REG IVから構成されるという知見に基づき、5つのREG蛋白質を識別する特異的アミノ酸配列を解析・合成し、各REG蛋白質ごとにモノクローナル抗体を作製した。得られた18クローンのモノクローナル抗体はWestern blot法で各REG蛋白質を特異的に認識することが確かめられた。現在これらモノクローナル抗体を使用し免疫染色にてREG蛋白質の発現を検討している。近年、膵ランゲルハンス島β細胞の増殖因子であるREG遺伝子が、消化器癌に発現し、癌の悪性度に関与していることが明らかとなりつつある。本研究は、消化器癌でのREG遺伝子とReg蛋白レセプターの発現の詳細を検討し、臨床病理および治療成績・予後との相関を検討し、Reg蛋白-Reg受容体系の癌細胞増殖進展への関与を明らかにすることを目的としている。平成14年度は以下のような研究実績を上げた。1)各種培養癌細胞を用いた、REG遺伝子ファミリーメンバー・Reg蛋白受容体の発現の検討ヒト消化器癌細胞株でのREG遺伝子ファミリー、REGIα,REGIβ,REGIIIα,REGIIIβ,REGIIIγおよびReg蛋白受容体の発現の検討を目的に、東北大学癌細胞保存施設に現有している各種消化器由来の培養癌細胞を入手し、細胞からRNAを抽出した。今後、ノーザンブロット法によりREG遺伝子ファミリーおよびReg受容体の発現の有無を検討する予定である。また定量的PCR装置を用いた、Reg遺伝子ファミリーおよびReg受容体の定量化に向けて、プライマーおよびTaqmanプローブの設計を行なった。2)Reg蛋白受容体に対する抗体の作成Reg蛋白に対する抗体を作成すべく、Reg蛋白受容体の抗ペプチド血清を作成している。3)各種臨床検体を用いた、REG遺伝子発現・Reg蛋白受容体の発現の検討申請者らが所有している各種消化器癌臨床検体および手術標本を用い、癌組織からRNAを抽出し、定量化PCRやノーザンブロット法による発現検討を行うべく、準備を進めた。また、Reg蛋白の発現が確認されている胆管細胞癌症例を特に重点的に、手術標本の収集に努めた。同時に凍結標本を作成し、今後のin situ hybridizationや上記抗体を用いた免疫染色を行うための準備とした。実際の臨床検体の収集の際には、患者より同意書を入手し、十分な配慮を行なった。消化器由来の培養細胞癌細胞株におけるREG遺伝子、REG蛋白質、REG蛋白受容体の発現の有無を検討するために、東北大学細胞資源センター(工藤俊雄教授)から計49種類の培養癌細胞を供与して頂き、これらからRNA,蛋白質を抽出し、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、定量PCR法、免疫染色を施行した。次いで、ヒト肝臓癌・膵癌・胆道癌・胃癌・大腸癌等の消化器癌の実際の臨床で得られた癌組織においてのREG遺伝子の発現およびREG蛋白の発現を検討するために、東北大学倫理委員会の承認を受け、東北大学病院肝胆膵外科・消化器外科で患者から同意が得られた肝臓癌・膵癌・胆道癌・胃癌・大腸癌をそれぞれ約100症例収集した。癌組織の一部を液体窒素中に保存し、一部はRNA抽出に使用し、残りの組織は免疫染色用に組織切片を作製した。

現在までに約半数の組織のtotal RNAの抽出と組織切片の作製を終了した。また、REG遺伝子の発現の有無、REG蛋白受容体の発現の有無と、予後などを含めた臨床病理学的項目との相関を検討するために、現在まで入手した症例の入院及び外来診療録、画像診断、形態病理診断、組織型、深達度、ステージ、腫瘍マーカー、再発形式、生命予後等に関して調査を加え、現在までに詳細なデーターベースを作製した。次に、ヒト肝臓癌・膵癌・胆道癌・胃癌・大腸癌等の消化器癌標本において、各種癌組織でのREG遺伝子、REG蛋白及びREG蛋白受容体の発現の有無を定性的に検討し、さらにrealtime Taqman RT-PCR法によりその発現の定量化を行う目的で、東北大学倫理委員会の承認を受け(承認番号2001-002)、東北大学病院肝胆膵外科・胃腸外科で同意書の得られた肝臓癌・膵癌・胆道癌・胃癌・大腸癌症例をそれぞれ約100症例収集し、この全検体よりtotal RNAの抽出及び組織切片の作成を終了した。また、臨床病理学的項目とREG遺伝子、REG蛋白及びREG蛋白受容体の発現の有無・発現量の結果との相関関係を検討する目的で、現在までに入手し得た各臨床検体について、組織型、腫瘍マーカー、進展度、脈管浸襲、リンパ節転移、再発形式、予後に関しての詳細なデータベースが完成した。さらにヒトREG遺伝子ファミリーが全体で5つの遺伝子、REG I alpha、REG I beta、REG III、HIP/PAP、REG IVから構成されるという知見に基づき、5つのREG蛋白質を識別する特異的アミノ酸配列を解析・合成し、各REG蛋白質ごとにモノクロナール抗体を作製した。得られた18クローンのモノクロナール抗体はWestern blot法で各REG蛋白質を特異的に認識することが確かめられた。