hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
結び目の解消トンネルと双曲構造

(1)錐角π以上の錐多様体の研究.Jorgensenの方法を用いることにより(代表的なGenus1,1-bridge knotである)(-2,3,7)型Pretzel結び目補空間を底空間にもち,その解消トンネルを錐軸とする双曲的コーン多様体の連続族を錐角が0から2πの範囲で具体的に構成した.錐角がπ以下の錐多様体については,都合の良い様々な性質が成立することが証明されており,それらを用いることによりThurstonの軌道体幾何化定理が証明されていた.しかしながら錐角がπ以上となった時にどのような現象が起こるのかまだ殆ど何もわかっていない状況であるので,この具体例を手掛かりに錐角π以上の錐多様体に対する一般論を展開するのが今後の課題である.(2)3次元多様体上の向き保存周期写像の手術表示.向き保存周期写像fを持つ任意の有向閉3次元多様体Mは周期的絡み目Lのデーン手術により構成され,しかも周期写像fはLの周期性を与える周期写像が自然に誘導するものと共役であることを証明した.これは,任意の有向閉3次元多様体は3次元球面内の絡み輪のデーン手術により得られると言うWallaceとLickorishによる古典的結果の同変版といえる.この結果の応用として9交点以下の双曲的2成分絡み目補空間の全ての等長写像を"視覚化"した.1.離散性判定アルゴリズム.昨年度の研究により解明,拡張したJorgensen理論を精密化することにより,次の問題に対する効果的なアルゴリズムを得た.(1.a)穴開きトーラス群のPSL(2,C)表現が擬フックス群になるかどうか.(1.b) 2つの楕円的変換により生成される群がRiley Sliceの元になるかどうか.更に,上の結果を用いてRiley-Sliceを複素平面上にRlley Sliceをコンピュータグラフィックで描いてみせた.2. 2橋結び目補空間の双曲構造の具体的構成とそのフォード領域の決定.2つの楕円的変換により生成される自由離散群に関するJorgensen理論を錐多様体に対する理論へと拡張した.その理論を用いることにより,Riley Sliceの有理境界点から出発して2橋結び目補空間に到達する錐多様体の連続族を構成し,同時にそのフォード領域を決定した.しかし,基本的な概念(錐多様体のフォード領域など)の整備がまだ不十分なため,証明を書き下すまでには至っていない.これらは,来年度はじめに早急に整備する予定である.3. Riley Slice、2橋結び目に対するMcShaneの恒等式.穴開き群トーラス群,および円周上の穴開き群トーラスに対して証明されていたMcShaneの恒等式の類似がRiley Slice内の群及び,特別な2橋結び目群に対しても成立することを証明した.また,一般の2橋結び目群に対しても,McShaneの恒等式の類似が成立するための組み合わせ群論的な必要十分条件を与えた.1.2橋結び目補空間の双曲構造の具体的構成とそのフォード領域の決定.穴開きトーラス群に関するJorgensen理論を錐多様体に対する理論へと拡張し,その理論を用いることにより,擬フックス空間の有理境界点から出発して2橋結び目補空間に到達する錐多様体の連続族を構成し,同時にそのフォード領域を決定した.この着想は昨年度までの研究で得ていたが,次の研究成果を併せることにより証明の細部を詰めることができた.2.Poincareの定理の拡張と整備.多面体の概念を一般化し,(一般化された意味の)多面体の張り合わせで錐多様体が構成できる条件を求めた.3.円周上の双曲的曲面束の標準的分解.A'Campoが提案した組み合わせ的調和形式を単純化し,その単純化された組み合わせ的調和形式を穴開きトーラス束及びある種の2橋結び目補空間に対して決定した.この計算をもとにして,そのような2橋結び目補空間の内ファイバー構造を持つものに関しては,標準的分解の任意の辺はファイバー曲面上の単純孤に全同位であるという観察を得た.この予想はJorgensenn理論を一般の曲面に対するものへ一般化するための手掛かりを与えてくれていると思える.(1)錐角π以上の錐多様体の研究.Jorgensenの方法を用いることにより(代表的なGenus 1,1-bridge knotである)(-2,3,7)型Pretzel結び目補空間を底空間にもち,その解消トンネルを錐軸とする双曲的コーン多様体の連続族を錐角が0から2πの範囲で具体的に構成した.錐角がπ以下の錐多様体については,都合の良い様々な性質が成立することが証明されており,それらを用いることによりThurstonの軌道体幾何化定理が証明されていた.しかしながら錐角がπ以上となった時にどのような現象が起こるのかまだ殆ど何もわかっていない状況であるので,この具体例を手掛かりに錐角π以上の錐多様体に対する一般論を展開するのが今後の課題である.(2)3次元多様体上の向き保存周期写像の手術表示.向き保存周期写像fを持つ任意の有向閉3次元多様体Mは周期的絡み目Lのデーン手術により構成され,しかも周期写像fはLの周期性を与える周期写像が自然に誘導するものと共役であることを証明した.これは,任意の有向閉

3次元多様体は3次元球面内の絡み輪のデーン手術により得られると言うWallaceとLickorishによる古典的結果の同変版といえる.この結果の応用として9交点以下の双曲的2成分絡み目補空間の全ての等長写像を"視覚化"した.
急性呼吸窮迫症候群に対するCO遊離分子投与療法においてマイトファジーが果たす役割

出血性ショックでは、一旦、蘇生に成功しても肺に炎症反応が惹起され、急性呼吸窮迫症候群に陥ることがある。現在、肺保護換気療法などの保存的療法はあるものの、炎症反応そのものを抑制する決め手となる薬物療法は未だない。一方、一酸化炭素(CO)は有毒ガスであるが、極低濃度では抗炎症作用を有することが報告されている。私たちもラット出血性ショック蘇生モデルを用いて250 ppm,3時間のCO吸入が蘇生後急性肺傷害を軽減することを報告した。このCO濃度は極めて低濃度であり、ラットになんら副作用をもたらさなかったが、血中COヘモグロビン濃度がヒトで有害反応を起こしうるレベルまで上昇していた。最近、この問題を解決するために水に溶解させると微量のCOを遊離するCO遊離分子が開発された。そこで、本研究では出血性ショック蘇生モデルにCO遊離分子を投与し蘇生後急性肺傷害に対する治療効果を検討した。肺組織所見やwet/dry比、肺胞蛋白濃度は、蘇生後に有意な悪化を認めたが、CO遊離分子投与で改善した。CO遊離分子は、炎症性サイトカインやTUNEL染色陽性細胞、アポトーシス実行因子:カスペース-3の発現を抑制し、抗炎症性サイトカインIL-10の発現を増加させることにより、抗炎症、抗アポトーシス的に作用した。また、CO遊離分子による血行動態や酸素化への有害作用は認めなかった。以上より、ラット出血性ショック蘇生後急性肺傷害モデルで、CO遊離分子の投与は抗炎症、抗アポトーシス作用を介して肺傷害を軽減し、明らかな有害事象を及ぼさなかった。現在、抗炎症作用のさらなるメカニズム-炎症のプラットフォーム:インフラマソーム活性化とその抑制、マイトファジーが抗アポトーシス作用に及ぼす影響ーを明らかにするために研究を続行している。CO遊離分子が抗炎症作用・抗アポトーシス作用を介してラット出血性ショック蘇生後急性呼吸窮迫症候群に対して治療効果を発揮することを明らかにした。しかし、研究当初の目標であるCO遊離分子の抗アポトーシス作用におけるアポトーシス促進因子を遊離する傷害ミトコンドリアの除去作用ーマイトファジーの関与を明らかにする研究が完遂できていない。以上が、本研究がやや遅れていると判断した理由である。ラット出血性ショック蘇生後急性肺傷害モデルに対するCO遊離分子の急性肺傷害改善効果のメカニズムを明らかにする。炎症のプラットフォーム:インフラマソームでは受容体: NLRP3がDAMPsを認識し、活性化したNLRP3がアダプター蛋白:ASCを介して酵素:Caspase-1を産生する。続いて、Caspase-1は、IL-1βの前駆体を切断してIL-1βを成熟化させる。したがって、NLRP3, ASC, Caspase-1の発現をWestern blot法により、IL-βの発現増加をELISAで測定することにより、ショック蘇生後肺におけるインフラマソーム活性の上昇を捉える。一方、CO遊離分子がこれらの蛋白の発現を抑制することによりインフラマソーム活性化を抑制することを明らかにする。さらに、CO遊離分子の抗アポトーシス作用のメカニズムを解明するために、細胞障害を、膨化したミトコンドリアからのチトクロームc遊離、DNA断片化によるアポトーシス惹起の経路で検討する。一方、CO遊離分子の投与はアポトーシスカスケード活性化を阻害し、その阻害メカニズムがマイトファジーによることを、電顕による傷害ミトコンドリアのオートファゴゾームへの取り込み、傷害ミトコンドリアの標的化蛋白Parkinのミトコンドリアでの発現増加、オートファゴゾームマーカーLC3蛋白の発現上昇で示す。平成28年度の研究ではラット出血性ショック誘発急性肺傷害モデルへの蘇生時のCO-releasing molecule-3 (CORM-3)の投与が、副作用を来たすことなく肺の炎症反応を抑制することにより肺傷害を改善するかについて検討した。雄性SDラットを大腿動脈よりの脱血により、30 mmHg / 60分間の出血性ショック状態に陥らせ、その後、血液を戻すことによりラット出血性ショック蘇生(Hemorrhagic shock and resuscitation : HSR)モデルを作成した。蘇生時にCORM-3:4 mg/kgを尾静脈より投与し、蘇生後肺傷害と炎症に及ぼす影響を検討した。ラットはSham ope群, CORM-3投与HSR群,inactive CORM(iCORM)-3投与HSR群, vehicle投与HSR群の4群に分けた。vehicle投与HSR群とiCORM-3投与HSR群では蘇生後12時間にうっ血、浮腫、細胞浸潤をともなう著しい肺傷害が組織学的に認められた。また、気管支肺胞洗浄液のタンパク濃度の上昇と肺wet/dry ratioの上昇により肺血管透過性の亢進と浮腫の増大が確認された。さらに、蘇生後3時間後には、炎症性性サイトカインである肺tumor necrosis-alpha, inducible nitric oxide synthase, interleukin-1betaのmRNAレベルが有意に増加した。一方、CORM-3投与HSR群では肺傷害が著しく改善し、肺血管透過性の亢進・肺浮腫の有意な抑制と肺炎症性サイトカインmRNAレベルの有意な低下が認められた。尚、CORM-3投与は血液中のCOヘモグロビンを有害レベルまで上昇させず、循環系の副作用も認めらなかった。以上よりCORM-3の蘇生時投与は出血性ショック蘇生誘発急性肺傷害を抗炎症作用を介して改善することが示唆された。

申請者らは、これまでラット出血性ショック蘇生モデルを確立し、蘇生後の炎症反応に起因する急性肺傷害に対して、低濃度の一酸化炭素( 250 ppm )吸入が炎症反応を抑制することにより、肺傷害を軽減することを明らかにしてきた。しかし、CO吸入ではCOヘモグロビンレベルがヒトにおける許容範囲を超えてしまう。そこで、CO-releasing moleculeの静脈内投与がCOヘモグロビンレベルを有害レベルまで上昇させることなく、出血性ショック蘇生後急性肺傷害を改善するかについて検討した。その結果、「研究実績の概要」にも記したように、4mg/kgのCO-releasing moleculeの出血性ショック蘇生時の投与は、有害作用を起こすことなく、肺傷害・炎症ともに抑制した。このように、平成28年度は本研究計画通りに進んでいることから、おおむね順調に進展していると考えられる。申請者らは、出血性ショック蘇生後急性肺傷害に起因する炎症による酸化ストレスがミトコンドリアを傷害し、傷害されたミトコンドリアから遊離したカスパーゼなどのアポトーシス実行因子がアポトーシス経路を活性化することにより、急性肺傷害が発生させることと、一方。、蘇生時のCORM-3の投与が傷害されたミトコンドリアの除去(マイトファジー)を介する抗アポトーシス作用により急性肺傷害の改善に寄与するのではないかとの仮説を立てている。平成28年度にはラット出血性ショック蘇生モデルにCORM-3を静脈内投与し、COヘモグロビンレベルを有害なレベルまで上昇させることなく、炎症反応を抑制することにより蘇生後急性肺傷害を改善することを明らかにした。平成29年度はさらに一歩進んで肺傷害を改善させるメカニズムにアポトーシスが関与することを明らかにしたことから、おおむね順調に進展していると考えられる。出血性ショックでは、一旦、蘇生に成功しても肺に炎症反応が惹起され、急性呼吸窮迫症候群に陥ることがある。現在、肺保護換気療法などの保存的療法はあるものの、炎症反応そのものを抑制する決め手となる薬物療法は未だない。一方、一酸化炭素(CO)は有毒ガスであるが、極低濃度では抗炎症作用を有することが報告されている。私たちもラット出血性ショック蘇生モデルを用いて250 ppm,3時間のCO吸入が蘇生後急性肺傷害を軽減することを報告した。このCO濃度は極めて低濃度であり、ラットになんら副作用をもたらさなかったが、血中COヘモグロビン濃度がヒトで有害反応を起こしうるレベルまで上昇していた。最近、この問題を解決するために水に溶解させると微量のCOを遊離するCO遊離分子が開発された。そこで、本研究では出血性ショック蘇生モデルにCO遊離分子を投与し蘇生後急性肺傷害に対する治療効果を検討した。肺組織所見やwet/dry比、肺胞蛋白濃度は、蘇生後に有意な悪化を認めたが、CO遊離分子投与で改善した。CO遊離分子は、炎症性サイトカインやTUNEL染色陽性細胞、アポトーシス実行因子:カスペース-3の発現を抑制し、抗炎症性サイトカインIL-10の発現を増加させることにより、抗炎症、抗アポトーシス的に作用した。また、CO遊離分子による血行動態や酸素化への有害作用は認めなかった。
網膜色素変性に対する分子遺伝学的研究

遺伝性網膜疾患のなかで最も頻度の高い網膜色素変性は、原因遺伝子が多岐にわたり病因を特定できない現状がある。本研究では、網膜色素変性の病態解明を目標に分子遺伝学的アプローチにより原因遺伝子・病因を特定するなかでいくつか新しい疾患原因を特定し、欧米で報告されている疾患原因とはいくつか異なることを明らかにした。本研究成果は、遺伝カウンセリングなどの診療の質を高めるだけでなく、将来の遺伝子補充療法や再生医療など次世代治療の基盤研究に向け有意義なものになると確信する。網膜色素変性およびその類縁疾患は、本邦における失明原因の上位に位置し、治療法の開発が急務でありながら、現在、決定的な治療方法が確立していない難病である。網膜色素変性およびその類縁疾患の原因は多岐にわたり、原因となる遺伝子変異を特定することは困難である。本研究は、候補遺伝子の分子遺伝学的アプローチにより、原因となる遺伝子変異を検出・特定し、表現型との関連性について明らかにすることを目的とした。研究実施概要1.当科の網脈絡膜変性疾患専門外来にて、対象疾患が疑われた症例に対し、臨床診断を行った後、遺伝子診断・解析の意義について十分に説明した。遺伝子解析に対し、インフォームド・コンセントを得た後、末梢静脈血を採取した。白血球分離後、高分子ゲノムDNAを抽出後、冷蔵庫に保存し、一部は、エタノール沈殿下で半永久的に冷凍保存した。2.平成25年度は、候補遺伝子に対して、Sanger法で各エクソンの塩基配列を決定した。原因遺伝子を特定できない場合、次世代シークエンサを用い、候補遺伝子を絞り、再度、Sanger法で遺伝子変異の有無を確認した。3.その結果、常染色体優性網膜色素変性、常染色体劣性網膜色素変性、Leber先天盲で、いくつかの原因遺伝子を特定した。変異が検出された遺伝子は、ALMS1, RHO, PRPH2, C8orf37, EYS, CNGA1であった。今後は、遺伝子変異と疾患との連鎖・共分離を確認する目的で、できる限り、遺伝カウンセリングとともに家系調査を実施していく予定である。網膜色素変性は、本邦における失明原因の上位に位置し、治療法の開発が急務でありながら、現在、決定的な治療方法が確立していない難病である。2008年、RPE65遺伝子変異をもつLeber先天盲(網膜色素変性類縁疾患)に対し、網膜色素変性に対する遺伝子治療の可能性が有望視されるようになった。しかし、網膜色素変性の原因は多岐にわたり、原因となる遺伝子変異を特定することは困難である。本研究は、網膜色素変性とその類縁疾患に対し、候補遺伝子の分子遺伝学的アプローチにより、原因となる遺伝子変異を検出・特定し、表現型との関連性、ハプロタイプ、変異遺伝子の発現レベルについて明らかにすることを目的とした。平成26年度は、特に、網膜色素変性およびLeber先天盲の原因を特定するために、約20家系の発端者およびその血縁者に対して、候補遺伝子に対するSanger法に加え、次世代シークエンサを用い解析した。その結果、常染色体優性遺伝性網膜色素変性でRHO遺伝子変異をもつ2家系、常染色体劣性遺伝性網膜色素変性でC8orf37遺伝子変異をもつ家系、Leber先天盲の2家系でRPE65遺伝子変異をもつ家系を特定した。C8orf37遺伝子変異をもつ症例は重症度が高いことが判明した。また、RPE65遺伝子変異に対する遺伝子治療は欧米で現在行われていることからビタミンA代謝に重要なRPE65遺伝子に変異をもつ症例は、将来の遺伝子治療やビタミンA関連治療薬の対象になり得ると考えられた。平成27年度は、特に、網膜色素変性およびLeber先天盲の原因を特定するために、約10家系の発端者およびその血縁者に対して、候補遺伝子に対するSanger法に加え、次世代シークエンサを用い解析した。優性遺伝性網膜色素変性でRHO遺伝子変異をもつ2家系、常染色体劣性網膜色素変性でC8orf37遺伝子変異をもつ家系、Leber先天盲の2家系でRPE65遺伝子変異、PRPH2遺伝子変異を有する4家系については、特定された変異に対してハプロタイプ解析を行い創始者変異であることが判明した。優性遺伝性変異に比べ常染色体劣性変異は、重症度が高いことが示唆された。RPE65遺伝子変異に対する遺伝子治療は欧米で現在行われている。また、RPE65遺伝子はビタミンA代謝にも関連し、将来の遺伝子治療やビタミンA関連治療薬の対象になり得ると考えられる。本研究は、網膜色素変性とその類縁疾患に対し、候補遺伝子の分子遺伝学的アプローチにより、原因となる遺伝子変異を検出・特定し、表現型との関連性、ハプロタイプ、変異遺伝子の発現レベルについて明らかにすることを目的としている。

約30家系の網膜色素変性とその類縁疾患に対して遺伝子解析を行い、遺20家系異常でその原因を突き止め、また、ハプロタイプ解析では、幾つかの変異は、欧米と異なる日本固有の創始者変異である可能性が示された。遺伝子型と表現型の関連性については、ロドプシン変異をもつ優性遺伝性網膜色素変性は比較的軽症であるのに対して、常染色体劣性遺伝子変異をもつ症例は重症度が高いことが示唆された。これまで幾つかの遺伝子変異の特徴を理解するに至っている。本研究では、網膜色素変性とその類縁疾患に対し、候補遺伝子の分子遺伝学的アプローチもしくは次世代シークエンサ(NGS)を用いることにより、原因となる遺伝子変異を検出・特定し、表現型との関連性、ハプロタイプを決定することを目的とした。常染色体優性網膜色素変性の10家系に対し、NGSによる全エクソーム解析法および連鎖解析から、2家系でRHO遺伝子変異(p.W126L, p.A346P)を突き止めp.W126Lが新規変異であることを突き止め、さらにp.W126L変異をもつ変異ロドプシン立体構造について検討した結果、特に明順応下で立体構造転移を示しロドプシン機能障害を引き起こすと考えられた。次に常染色体劣性網膜色素変性の30例・発端者に対して、NGSを用いた全エクソーム解析を行った。その結果、4例でCNGA1変異が検出された。さらに69例でSanger法によるCNGA1遺伝子解析を行ったところ1例で遺伝子変異が検出され、常染色体劣性網膜色素変性全体で5.1% (5/99)がCNGA1遺伝子異常によることが示された。レーベル先天黒内障の遺伝学的特徴を明らかにする目的で、5家系に対して、NGSを用いた全エクソーム解析を行った結果、2例でRPE65変異が検出された。症例1で新規複合ヘテロ接合変異(p.H59Q and p.D62X)が、症例2でホモ接合変異(p.R515W)が検出された。本研究で、3種類のRPE65変異が日本人レーベル先天黒内障の原因となっていることを明らかにした。本研究によって、遺伝子型とその臨床像との関連性の一端を明らかにした。これらの研究成果は、遺伝カウンセリングなどの診療の質を高めるだけでなく、将来の遺伝子補充療法や再生医療など次世代治療の基盤研究に向け有意義なものになると確信する。遺伝性網膜疾患のなかで最も頻度の高い網膜色素変性は、原因遺伝子が多岐にわたり病因を特定できない現状がある。本研究では、網膜色素変性の病態解明を目標に分子遺伝学的アプローチにより原因遺伝子・病因を特定するなかでいくつか新しい疾患原因を特定し、欧米で報告されている疾患原因とはいくつか異なることを明らかにした。本研究成果は、遺伝カウンセリングなどの診療の質を高めるだけでなく、将来の遺伝子補充療法や再生医療など次世代治療の基盤研究に向け有意義なものになると確信する。本研究は、網膜色素変性とその類縁疾患に対し、候補遺伝子の分子遺伝学的アプローチにより、原因となる遺伝子変異を検出・特定し、表現型との関連性、ハプロタイプ、変異遺伝子の発現レベルについて明らかにすることを目的としている。遺伝子変異の特定については、20家系異常でその原因を突き止め、また、ハプロタイプ解析では、幾つかの変異は、欧米と異なる可能性が示唆された。
破骨細胞におけるリソソーム分泌機構の制御因子の同定と分子メカニズムの解析

1)マクロファージ及び破骨細胞Rab27A結合タンパク質の同定Rabタンパク質は通常、種々のエフェクタータンパク質と相互作用して働く。そのために結合タンパク質の同定は、rabタンパク質を理解するうえで必要不可欠である。さらに破骨細胞では、リソソームを分泌するという特徴があるにもかかわらず、破骨細胞におけるRab結合タンパク質はこれまで同定されていない。そこでマクロファージ及び破骨細胞におけるRab27A結合タンパク質を同定する方法として以下の方法を試みた。1酵母ツーハイブリッドシステムを用いて相互作用する分子を分子生物学的に同定する方法。この方法は2つの対象タンパク質間の直接相互作用を試験するための、高感度な方法である。相互作用パートナーは、その後選択された酵母コロニーで対応するプラスミドをシークエンシングすることによって得ることができる。しかしこの方法では同定できなかった。2Rab27A過剰発現細胞を用いて、Rab27Aプルダウンアッセイを行い、結合タンパク質をプロテオーム解析により同定する方法。恒常的に活性型であるドミナント・アクティブ型、恒常的に不活性型であるドミナント・ネガティブ型を発現させて、結合タンパク質の違いがあるかどうかを解析した。3結合タンパク質がRab27Aのどの部位に結合するかを調べるために、部位特異的遺伝子変異体を用いて結合部位の同定を試みた。さらにこの実験系を用いて、結合するタンパク質を免疫沈降やプロテオーム解析により同定した。RANKLによって破骨細胞に分化できるマウスRAW264.7細胞に、マウスRab27aにDYKDDDKタグをアミノ末端に付加したコンストラクトをトランスフェクトし、ネオマイシンを用いて選択を行い、野生型および常時活性を有する変異を導入したQ78L型のRab27aを恒常的に発現するクローンを樹立した。発現確認は抗DYKDDDDK抗体ならびに抗Rab27抗体によるウエスタンブロット法に依った。RAW264.7細胞はリポフェクション法によるプラスミドのトランスフェクトが困難な細胞としてよく知られているが、トランスフェクトそのものよりむしろトランスフェクト後の薬剤選択によっても発現のないクローンが多数残るため、恒常的発現クローンの樹立に難易度の高さを感じた。また、恒常的発現クローンRAW264.7における発現量は、トランスフェクト・薬剤選択が容易なHEK293細胞における発現量の数分の1程度であった。樹立したRab27a恒常発現RAW264.7細胞抽出液より抗DYKDDDDK抗体ビーズを用いた免疫沈降を行い、プルダウンされてくる内在性のRab27a結合タンパクを質量分析ペプチドフィンガープリント法により同定を試みたが、有意なタンパク質は未だ拾えていない。並行して大腸菌にて発現させたGSTタグ付加のRab27aの精製を行った。活性を失う変異を導入したT23N型のRab27aは哺乳類培養細胞においても大腸菌においても発現が認められなかった。文献をあたってみたところ、T23N型Rab27aは培養細胞に発現しない、トランスジェニック動物を作成してもタンパク質の発現もフェノタイプも出ないという追試的な論文があることから、不活性型Rab27aは本研究での対象外とすることとした。Rab27aの恒常発現RAW264.7細胞クローンの樹立が困難であったこと。購入したタグ抗体付加磁気ビーズの吸着量が予想されるより一桁少ないので購入したディーラーを通して発売元に問い合わせたが、回答までに3か月を要したこと。Rab27a恒常発現RAW264.7細胞培養のスケールアップを行い、Rab27a結合タンパク質を抗体プルダウンと2次元電気泳動にてバンド→スポット化により切り出しゲルに含まれるタンパク質の純度と濃度を上げ、質量分析ペプチドフィンガープリント法で検出できるようにする。なお、細胞質内タンパク質は中性から酸性の等電点を有するものが多いが、他の細胞で報告されているRab27a結合タンパク質のなかにはGranuphilin 7/Slp1/Sytl1(pI=9.2)のようにアルカリ側に等電点を有するものもあるので、等電点電気泳動のストリップスにはpH3-11を用いる。大腸菌発現Rab27

a標品はRAW細胞抽出液から上記ペプチドフィンガープリント法にて拾えたタンパク質がプルダウンできることを確認する実験に用いる。RANKLにより破骨細胞へと分化誘導したRAW264.7細胞についても同様の実験を行い、破骨細胞への分化とともにRab27aとの結合が増減するタンパク質を同定する。41687円は全体に比べると少額であり、計画的な予算確保ではない。物品費に充当する。
タンパク質の安定性向上技術の開発とバイオ燃料生産への応用

本研究では、酵素を用いた蛋白質の安定性向上技術の開発を行った。本研究ではタンパク質連結酵素Sortaseに注目し、この酵素を用いて目的タンパク質のN末端とC末端を連結することで、タンパク質を安定化させる技術の開発を試みた。EGFPをモデルタンパク質として用いて両末端を連結させ、熱安定性を向上させる事ができた。さらに、効率的な連結のためには、両末端におけるリンカー配列が重要であることも示された。本年度は酵素を用いたタンパク質の安定化技術について検討を行った。モデルタンパク質として赤色蛍光タンパク質EGFP、及び抗EGFR抗体を用いた。これらのN末端及びC末端に酵素の基質配列となるタグ配列を導入した発現ベクターを構築し、大腸菌発現系を用いて発現、精製を行った。また、タグを付加した発現タンパク質は、蛍光及び抗原結合能を維持していることが確認され、タグの付加はタンパク質の機能に影響を与えないことが明らかとなった。その結果から、これらのタグ配列付加タンパク質を大量生産する事に成功した。続いてこれらのタンパク質をタンパク質連結酵素を用いて連結した。反応はタンパク質と酵素を混合するだけであり、非常にシンプルである。連結されたかどうかをSDS-PAGEにより確認したところ、酵素を添加したときにのみ低分子量のバンドが確認された。タグを付加しないタンパク質、及び酵素が存在しないときではバンドの移動は見られなかった。これより、酵素を用いてタンパク質を環状化することに成功した。また、この環状化されたタンパク質はその後も蛍光を維持しており、昨日を維持している事が明らかとなった。更に、これらのタンパク質を大量生産し、酵素を添加する事で環状化タンパク質を大量に調製する事にも成功した。これらのタンパク質の安定性評価について、現在CDスペクトル及び蛍光測定、抗原への結合活性を指標として評価を行っているところである。前年度に引き続き本年度は酵素を用いたタンパク質の安定化技術について検討を行った。モデルタンパク質として抗EGFR抗体を用いた。酵素を用いて環状化したこのタンパク質の熱安定性をCDスペクトルを用いて評価した。この評価より、抗EGFR抗体の熱安定性をわずかながら向上させることに成功した。抗原結合能についても同様に評価したところ、結合能についてはほとんど差が見られなかった。環状化に伴う機能向上は達成できなかったが、機能を失うこと無く環状化できた点は特筆すべきである。本技術の汎用性を示すべく、多量体タンパク質であるストレプトアビジン、及びセルラーゼであるβグルコシダーゼを用いて環状化タンパク質を調製した。同様にN末端及びC末端に酵素の基質配列となるタグ配列を導入した発現ベクターを構築し、大腸菌発現系を用いて発現、精製を行った。ストレプトアビジンにおいては、コールドショック発現系を用いることで可溶性画分への発現に成功した。これらのタンパク質はいずれもそれぞれの機能であるビオチン結合能、及び酵素活性を有していることが確認された。連結されたかどうかをSDS-PAGEにより確認したところ、ストレプトアビジンにおいては酵素を添加したときにのみ低分子量のバンドが確認された。しかし、βグルコシダーゼにおいては環状化反応は見られなかった。そこでタグ配列の間にリンカーを挿入したタンパク質を調製し、再度環状化反応を行った。これより、βグルコシダーゼにおいてもわずかに環状化反応を進めることに成功し、リンカー配列の重要性を明らかにした。これらのタンパク質の安定性評価について、現在CDスペクトル及び酵素活性を指標として引き続き評価を行っていく。
トーリック環の幾何的および組合せ論的変形操作に関する理論の構築

トーリック環の幾何的および組合せ論的変形について研究し、多面体の積などの基本的な操作の一般化である入れ子配置について、トーリック環に纏わる多くの性質が遺伝することを証明した。また、整数行列に対して、中心的対称配置を定義し、もとの整数行列が単模行列ならば、そのトーリック環は非常に良い性質(正規、ゴレンシュタインなど)を持つことを示した。その他,切断多面体の正規性が、有限グラフのマイナー、クリーク和に関して閉じていることを証明した。トーリック環およびトーリックイデアルは,可換環論のみならず,整数計画問題,分割表の検定(統計学),符号理論など,幅広い応用が知られており,国内外の研究者によって盛んに研究されている。当該研究では,トーリック環の生成系をなす単項式集合の組合せ論的な変形,あるいは,生成系に対応する整数ベクトル集合の凸閉包に対する幾何的な変形によるトーリック環およびトーリックイデアルの環論的性質の変化について研究し,これらにまつわる様々な予想の解決を目指している。当該年度の研究では,研究の出発点として,配置の凸閉包に対して,どのような変形が考えられるか検討した。第一に,多面体の積などの基本的な操作の一般化である「ネストされた配置」を考え,トーリック環の正規性やvery ample性,および,トーリックイデアルの生成系,グレブナー基底の構造について解析を行い,多くの性質が対応するトーリック環,トーリックイデアルに遺伝することを証明した。第二に,重要な多面体のクラスである,有限グラフに付随する切断多面体の正規性についても考察し,正規切断多面体全体の集合が,有限グラフのマイナーを取る操作,および,クリーク和を取る操作に関して閉じていることを証明した。(辺の縮約に関して閉じていることは,多面体の面を考えることになることから,既に知られていた。)この結果は,Sturmfels-Sullivantによる予想「有限グラフに付随する切断多面体が正規であることと,5次の完全グラフをマイナーとして持たないことは同値である」の解決に向けて大きな寄与が期待できる。トーリック環およびトーリックイデアルは,可換環論のみならず,整数計画問題分割表の検定(統計学),符号理論など,幅広い応用が知られており,国内外の研究者によって盛んに研究されている。当該年度の研究では引き続き,配置の変形操作として,多面体の積などの基本的な操作の一般化である「ネストされた配置」を考え,トーリック環の正規性,トーリックイデアルの生成系,グレブナー基底の構造について解析を行った。特に,もとの配置のグレブナー基底を用いた,ネストされた配置のグレブナー基底の効果的な構成法を発明した。これは,次数2の場合に限定したAoki-Hibi-Takemura-Ohsugiの結果を,一般の次数に拡張したものであり,さらには,もとのイニシャルイデアルたちがスクエアフリーならば,構成されるイニシャルイデアルもスクエアフリーであるという意味で,画期的な改善に成功している。なお,この結果は生成系についても同様である。また,応用例として,3×3輸送多面体の研究に関連し,3次のバーコフ多面体の膨らましに付随する配置をネストされた配置として解釈し,上記の結果を得た際の議論と同様の議論を行うことによって,2倍以上に膨らませると対応するトーリックイデアルに対して,2次のグレブナー基底が存在することを証明した。トーリック環およびトーリックイデアルは,可換環論のみならず,凸多面体,整数計画問題,分割表の検定(統計学),符号理論など,幅広い応用が知られており,国内外の研究者によって盛んに研究されている。当該年度の研究では,変形操作として,整数行列の中心的対称配置について研究した。特に,有向サイクルの隣接行列に対して中心的対称配置を考え,付随するトーリックイデアルの,ある逆辞書式順序に関するグレブナー基底を理論的に構成した。対応するイニシャルイデアルはスクエアフリーであり,このイニシャルイデアルを用いて、対応するゴレンシュタイン・ファノ凸多面体のエルハート多項式を計算することができる。これらのエルハート多項式の根を詳細に調べたところ、頂点数が十分大きい場合は、Beckらによる予想「次元dの凸多面体のエルハート多項式の根の実部は-d以上d-1以下である」の反例となっていることが判明し、貴重な凸多面体(非特異ファノ凸多面体)で上記予想の反例が得られた。

(東谷氏によっても反例は得られている。)そのほか,根が興味深い性質をもつようなゴレンシュタイン・ファノ凸多面体の構成や,完全グラフの辺凸多面体などのエルハート多項式の根の実部について結果を得た。
瞬間的な火山爆発噴火の災害予測モデル提案

爆発的火山噴火における噴煙挙動の再現を目的に、3次元数値シミュレーション研究を推進した。平成30年度は、様々な瞬間的爆発噴火事例の噴煙ダイナミクスと火山灰輸送のシミュレーションを行うとともに、スケーリング則の抽出を試みた。瞬間的爆発噴火の噴煙ダイナミクス計算に関して、昨年度に引き続き、噴火継続時間、噴出率、噴出速度、火口半径を変化させた計算を行った。昨年度は、瞬間的爆発噴火の噴煙高度と噴火条件の関係がこれまでの単純なスケーリング則では成り立たないことが示唆されていた。平成30年度は、計算実行時間のかかる小規模な瞬間的爆発噴火のシミュレーション事例を増やし、昨年度得られた傾向を検証した。その結果、火口径で規格化した噴煙高度がリチャードソン数のみならず流体の循環に依存することを確認した。また、このスケーリング則が連続噴火の場合と異なる傾向を観察した。瞬間的爆発噴火の火山灰輸送シミュレーションに関して、噴煙上昇に伴う火山灰の上昇・噴煙からの離脱・風による輸送・地表への堆積の再現を試みた。桜島火山で近年頻繁に発生する小規模な瞬間的爆発噴火を対象とした大規模シミュレーションを実行した。様々な規模、噴火条件で、火山灰が粒径毎に異なる高度で噴煙から離脱し、堆積位置が異なる様子を捉えることができた。実際の噴火事例の再現を目指し、御嶽山2014年噴火事例を対象としたシミュレーションを実行した。この噴火は水蒸気爆発であり、噴出温度の推定が難しい。そこで、噴出温度を100°Cから800°Cまで変えたパラメータ・スタディを実行した。計算の結果、噴出物に含まれる水蒸気量を10質量%と仮定した場合には、噴出温度が300°C程度の時に実際に観察された火砕流発生や噴煙高度を説明できることがわかった。大型計算機を用いた噴煙の再現計算に関して、瞬間的爆発噴火の様々な事例に関して計算を行い、噴火条件と噴煙高度のおおよそのスケーリング則の傾向を掴むことができた。また、御嶽山2014年噴火事例の再現計算も実行し、本研究課題はおおむね順調に進展していると言える。様々な噴火事例のシミュレーション結果を順調に蓄積できており、今年度も大型計算機を用いた広範なパラメータ・スタディを推進する。平成29・30年度は主に火口半径や噴出速度を変えた計算結果を蓄積したが、今後は他のパラメータを変えた計算も行う。それによって、噴出条件と噴煙高度のより一般的な関係(スケーリング則)の確立を目指す。特に、本年度に捉えた流体の循環に注目したパラメータ・スタディを行う。このスケーリング則抽出の研究は、本件を基研究として平成30年度から開始している国際共同研究加速基金プロジェクトと連携している。現在進めているフランスIPGPグループとの室内実験研究と併せることで、スケーリング則の検討を行う。また、火山灰輸送データの解析を本格的に行い、噴火条件・火山灰粒径と堆積位置の関係性を明らかにする。平成29年度はより汎用性の高いモデルの開発と、瞬間的爆発噴火に関する様々な事例のシミュレーション実行に集中した。モデル開発に関して、噴火継続時間を自由にコントロールできるコード修正を行った。これにより様々な瞬間的爆発噴火の計算ができるようになった。また、気象再解析データを用いた任意の気象条件を初期入力データとして用いるコード修正を行った。特に、汎用性の高いNetCDF形式の入力ができるようになった。また、モデルの高速化に関し、5,000並列まで可能なモデルになった。瞬間的爆発噴火のシミュレーションに関して、噴火継続時間、噴出率、噴出速度、火口半径を変化させた計算を行った。これまでの単純なモデルでは、瞬間的爆発噴火の場合、噴煙高度は噴出物の総量のみでおおよそ決定すると予想されていた。パラメータスタディを行ったところ、噴煙高度は噴出物総量だけではなく噴火継続時間や噴出速度、火口半径にも依存する可能性があるという予察的な結果を得た。以上に加え、噴煙現象の一般的な性質を探るため、超巨大噴火やピナツボ火山1991年噴火事例、富士山宝永噴火事例の大規模シミュレーションも行った。特に超巨大噴火事例に関しては、噴煙高度と噴出条件の関係がこれまでの単純モデルの予測とは異なり、火砕流が発生した場合でも噴煙高度が60km以上に達する場合が有ることが新たに分かった。数値モデルの汎用性に関し、当初予定していた任意の大気条件と噴出条件の入力方法の改良を達成できた。また、モデルの高速化に関して、これまでの1,000並列から5,000並列まで並列計算規模を拡大できたことは当初の予定を超える成果である。大型計算機を用いた噴煙の再現計算に関して、瞬間的・連続的爆発噴火の様々な事例に関して計算を行い、これまでの単純モデルでは予想できなかった新たな結果が得られ、本研究課題はおおむね順調に進展していると言える。

平成30年度は、計算実行時間のかかる小規模な瞬間的爆発噴火のシミュレーション事例を増やし、昨年度得られた傾向を検証した。その結果、火口径で規格化した噴煙高度がリチャードソン数のみならず流体の循環に依存することを確認した。また、このスケーリング則が連続噴火の場合と異なる傾向を観察した。瞬間的爆発噴火の火山灰輸送シミュレーションに関して、噴煙上昇に伴う火山灰の上昇・噴煙からの離脱・風による輸送・地表への堆積の再現を試みた。桜島火山で近年頻繁に発生する小規模な瞬間的爆発噴火を対象とした大規模シミュレーションを実行した。様々な規模、噴火条件で、火山灰が粒径毎に異なる高度で噴煙から離脱し、堆積位置が異なる様子を捉えることができた。実際の噴火事例の再現を目指し、御嶽山2014年噴火事例を対象としたシミュレーションを実行した。この噴火は水蒸気爆発であり、噴出温度の推定が難しい。そこで、噴出温度を100°Cから800°Cまで変えたパラメータ・スタディを実行した。計算の結果、噴出物に含まれる水蒸気量を10質量%と仮定した場合には、噴出温度が300°C程度の時に実際に観察された火砕流発生や噴煙高度を説明できることがわかった。大型計算機を用いた噴煙の再現計算に関して、瞬間的爆発噴火の様々な事例に関して計算を行い、噴火条件と噴煙高度のおおよそのスケーリング則の傾向を掴むことができた。また、御嶽山2014年噴火事例の再現計算も実行し、本研究課題はおおむね順調に進展していると言える。モデル開発と予備的なパラメータスタディを平成29年度に順調に進めることができたため、今後は本格的なパラメータスタディを実施する。特に、様々な噴火条件の大規模シミュレーションを行い、噴火条件と噴煙高度の一般的関係を獲得する。数値シミュレーションと並行し、噴火条件と噴煙高度に関する解析的なモデルの構築を目指す。さらに、大気風を含めた大規模シミュレーションを行い、国内外で得られている観測データとの比較を行う。また、採択された国際共同研究加速基金を活用し、フランスIPGPグループによる室内実験と本研究の数値計算との比較方法について検討を進める。様々な噴火事例のシミュレーション結果を順調に蓄積できており、今年度も大型計算機を用いた広範なパラメータ・スタディを推進する。平成29・30年度は主に火口半径や噴出速度を変えた計算結果を蓄積したが、今後は他のパラメータを変えた計算も行う。それによって、噴出条件と噴煙高度のより一般的な関係(スケーリング則)の確立を目指す。特に、本年度に捉えた流体の循環に注目したパラメータ・スタディを行う。このスケーリング則抽出の研究は、本件を基研究として平成30年度から開始している国際共同研究加速基金プロジェクトと連携している。現在進めているフランスIPGPグループとの室内実験研究と併せることで、スケーリング則の検討を行う。また、火山灰輸送データの解析を本格的に行い、噴火条件・火山灰粒径と堆積位置の関係性を明らかにする。モデル開発と予備計算結果の処理に集中したため当初予定よりもデータ量が減少し、保存のためのハードディスクの購入量を減らした。
三次元器官の構築と維持を司るHippo-Yapシグナル伝達系の解析

脊椎動物の体は複雑な三次元的形態をしており、組織や器官が正しく形作られ適切に配置されることにより初めて機能を発揮する。こうした三次元的な形態形成の場には組織張力の制御が不可欠であるが、その詳細な分子機構については不明な点が多い。これまでに私たちは、初期形態形成不全メダカ変異体の網羅的スクリーニングの過程において、体全体が扁平化するhirame (hir)メダカ変異体を見出した。これは器官サイズを制御するHippoシグナル伝達系の核内標的分子YAPの変異が原因であり、YAPがアクトミオシンネットワークの活性制御を通じて組織張力を調節し、三次元組織の構築と配置を統御していることが判明した[Nature(2015)]。しかしながら、Hippo-YAPシグナル伝達系がいかにして上皮組織を構成する個々の細胞間の力学的な相互作用を統御し、三次元的な組織構築・維持を実現しているのかという問題は未だ明らかになっていない。私たちはこうした背景を踏まえ、メダカ胚の立体組織形成・維持において、組織の力学特性を統御するYAP分子ネットワークの実体を明らかにすることを目的に、RNA-seq法によりメダカ野生型とhir変異体との間の比較トランスクリプトーム解析を行い、hir変異体において顕著な発現変動を示す複数の遺伝子を明らかにした。さらにYAPメカノ分子ネットワークの候補分子について、CRISPR-Cas9法を用いたノックアウトフィッシュの作成を遂行した。現在までに、複数のノックアウトホモ変異体フィッシュが得られており、表現型の解析を進めている。今後、ノックアウトフィッシュの詳細な表現型解析を推進することにより、YAPメカノ分子ネットワークの破綻がどのように疾患の発症・増悪へ関与するのかを明らかにできると考えている。これまでに私たちはYAPメカノネットワークの候補分子を複数見出しており、当初計画に従いこれらのノックアウトフィッシュの作出に取組んできた。現在までに、複数のノックアウトホモ変異体フィッシュを樹立することに成功している。これまでに作出に成功したノックアウトホモ変異体の詳細な表現型解析を行うとともに、モルフォリノアンチセンスオリゴを用いたノックダウン法による表現型解析を並行して進め、より効率的にYAPメカノネットワークの候補分子の機能解析を推進する。脊椎動物の体は複雑な三次元的形態をしており、組織や器官が正しく形作られ適切に配置されることにより初めて機能を発揮できる。我々はこれまでに、表現型を指標にした網羅的変異体スクリーニングにより、重力に抗した形作りができずに扁平胚の表現型を示すメダカhirame (hir)変異体を同定した。この変異体の解析から、原因遺伝子YAPがアクチンの重合制御により細胞張力を介して細胞外基質の硬さを調整し、組織の三次元形態と配置を統御することを見出した。すなわち、YAPは組織メカニクスの相補性を担いメカノホメオスターシスを統御するマスター分子の1つであると考えられた(Nature, 2015)。しかしながら、Hippo-YAPシグナル伝達系がいかにして上皮組織を構成する個々の細胞間の力学的な相互作用を統御し、三次元的な組織構築・維持を実現しているのかという問題は依然として謎に包まれている。我々はこうした背景を踏まえ、メダカ胚の立体組織形成・維持において、組織の力学特性を統御するYAP分子ネットワークの実体を明らかにすることを目的とした。本研究では、RNA-seq法によりメダカ野生型胚とhir変異体胚との間の比較トランスクリプトーム解析を行い、YAPメカノネットワークの構成因子の同定を目指した。具体的には、明確な表現型が確認できる発生期のメダカ野生型胚およびhir変異体胚から、それぞれtotal RNAの抽出を行った。3回ずつ独立して抽出を行い、最終的に合計6つのRNAサンプルを得た。これらのRNAサンプルを用いてRNA-seq解析を行った結果、hir変異体において顕著な発現変動を示す複数の遺伝子を明らかにした。本年度のRNA-seq法によるメダカ野生型胚とhir変異体胚との間の比較トランスクリプトーム解析から、YAPメカノネットワークの候補遺伝子を明らかにすることができた。本候補遺伝子の詳細な解析をさらに進めることにより、Hippo-YAPシグナル伝達系による組織の三次元構築メカニズムを理解することができると考えられる。これまでに我々は、初期胚形成不全メダカ変異体のスクリーニングの過程において、体全体が扁平化するhirame (hir)メダカ変異体を見出した。これは器官サイズを制御するHippoシグナル伝達系の核内標的分子YAPの変異が原因であり、YAPがアクトミオシンネットワークの活性制御を通じて組織張力を調節し、三次元組織の構築と配置を統御していることが判明した[Nature (2015)]。

RNA-seq法によりメダカ野生型とhir変異体との間の比較トランスクリプトーム解析を行い、hir変異体において顕著な発現変動を示す複数の遺伝子を明らかにした。これらの遺伝子群の中にYAPメカノホメオスターシスを支える重要因子が含まれる可能性が考えられる。そこでYAPメカノ分子ネットワークの候補分子について、CRISPR-Cas9法を用いたノックアウトフィッシュの作成を遂行した。本ノックアウトフィッシュの解析をさらに推進することにより、YAPメカノ分子ネットワークの破綻がどのように疾患の発症・増悪へ関与するのかを明らかにできるものと考えている。本年度は当初の研究計画の通りYAPメカノホメオスターシスの分子基盤を支える候補遺伝子のノックアウトフィッシュの作成に着手しており、本候補遺伝子の詳細な解析をさらに進めることにより、本研究の目的である「YAPシグナル伝達系による組織の三次元構築メカニズムの解明」につながると考えられるからである。脊椎動物の体は複雑な三次元的形態をしており、組織や器官が正しく形作られ適切に配置されることにより初めて機能を発揮する。こうした三次元的な形態形成の場には組織張力の制御が不可欠であるが、その詳細な分子機構については不明な点が多い。これまでに私たちは、初期形態形成不全メダカ変異体の網羅的スクリーニングの過程において、体全体が扁平化するhirame (hir)メダカ変異体を見出した。これは器官サイズを制御するHippoシグナル伝達系の核内標的分子YAPの変異が原因であり、YAPがアクトミオシンネットワークの活性制御を通じて組織張力を調節し、三次元組織の構築と配置を統御していることが判明した[Nature(2015)]。しかしながら、Hippo-YAPシグナル伝達系がいかにして上皮組織を構成する個々の細胞間の力学的な相互作用を統御し、三次元的な組織構築・維持を実現しているのかという問題は未だ明らかになっていない。私たちはこうした背景を踏まえ、メダカ胚の立体組織形成・維持において、組織の力学特性を統御するYAP分子ネットワークの実体を明らかにすることを目的に、RNA-seq法によりメダカ野生型とhir変異体との間の比較トランスクリプトーム解析を行い、hir変異体において顕著な発現変動を示す複数の遺伝子を明らかにした。さらにYAPメカノ分子ネットワークの候補分子について、CRISPR-Cas9法を用いたノックアウトフィッシュの作成を遂行した。現在までに、複数のノックアウトホモ変異体フィッシュが得られており、表現型の解析を進めている。今後、ノックアウトフィッシュの詳細な表現型解析を推進することにより、YAPメカノ分子ネットワークの破綻がどのように疾患の発症・増悪へ関与するのかを明らかにできると考えている。これまでに私たちはYAPメカノネットワークの候補分子を複数見出しており、当初計画に従いこれらのノックアウトフィッシュの作出に取組んできた。現在までに、複数のノックアウトホモ変異体フィッシュを樹立することに成功している。今後、CRISPR-Cas9システムを用いたノックアウトメダカの作成を進めることにより、YAPメカノネットワークを支える重要分子を明らかにできるものと考えている。
第四次全国総合開発計画をふまえた北陸地方の地場産業の活性化に関する研究

1.富山県高岡市をケ-スとして、地場産業の特性を種統計資料を用いて分析した。高岡市は、銅器、漆器、捺染、アルミ、ニットなどの地場産業を有しているが、各種指標の増加率は近年横ばいである。2.第四次全国総合開発計画が、「定住」から「交流」を中心とした計画であることを考慮し、高岡市の地場産業がこうした方向性を備えているかについて、(1)地場産業の活性化の程度、(2)地場産業の人材養成の二点について、企業面接および統計資料により検討した。3.地場産業の活性化の程度については、吉田寛の地場産業活性化指標を採用し、(1)先端技術の導入程度、(2)生活関連投資の状況、(3)関連産業の立地等について検討した。高岡市の場合、江戸時代以来の産業である銅器、漆器、捺染産業においては、先端技術導入の程度は低い。生活関連の社会資本の整備については、富山県内で比較するかぎりそれほど低くはない。むしろ、富山県全体の問題として教育環境整備の問題点を有している。アルミ産業以外の産業は、同一産業内でのまとまりはあるが、関連産業を誘発するにはいたっていない。4.地場産業の人材養成については次の二つの問題点がある。第一は、伝統産業が職人型の人材を需要しており、必ずしも高等教育卒業者に期待していない点である。第二は、高等教育入学時の県外流出者のうち、先端技術関連の教育を受けた者の県内での就職が困難な点である。5.以上の研究結果から、次のような施策の実施が急務であるとの結論を得た。(1)既存産業については、研究開発部門・高次加工部門の強化、異業種との積極的融業化、第三次産業との連携により高付加価値を図るとともに、産業構造の体質改善を推進する。(2)国際化に対応した交通機能、施設、組織を整備し、国際交流に関する機能の集積を図る。(3)生活環境の整備により、高次の機能を担う人材の定着を図る。
ラン藻レクチン遺伝子の単離および種々のラン藻でのレクチン遺伝子の分布の検討

昨年度までにラン藻M228株レクチンmal遺伝子の9割の塩基配列を決定したが、そのN末端およびC末端が得られなかった。そこで、さまざまなプライマーを用いて染色体DNAを鋳型としたPCRを行ったところ、2つのmal遺伝子が存在し、その内の一方については全配列を明らかにした。MAL遺伝子は519残基よりなり、予想される分子量は55,000と予想され、SDS-PAGEより決定された分子量とよく一致した。またmal遺伝子より推定されたアミノ酸配列は既に決定したアミノ酸配列をすべて含んでおり、これがmal遺伝子であると確認した。また、C末端側には61残基からなる繰り返し配列が3個存在しており、C.beijerinckiiのα-アミラーゼと22%の相同性があったことから、この繰り返し配列が糖結合に関与すると考えられる。次に、2個のmal遺伝子の間に翻訳領域が存在したので、それらより推定されるアミノ酸配列についてデータベース検索を行ったところ、チトクロムP450および抗生物質などの合成に関与するポリケチド合成酵素と高い相同性が見られた。これらは、菌類において抗生物質の合成等に関与していることが知られており、合成に関る遺伝子は染色体上の連続した一部にまとまっていることから、mal遺伝子もポリケチドの合成に関与していると思われる。また、サザンハイブリダイゼーション法により、2種のらん藻M204株とNIES-108株でMAL類似遺伝子が存在することがわかった。糖結合特異性を示すタンパク質であるレクチンは生物界に広く分布し、抗菌活性,抗腫瘍活性など、生化学的試薬として有用な活性を示すレクチンも多く、新規な糖結合特異性や生理活性を示すレクチンの発見が期待される。我々はラン藻M.aeruginosa M228株に存在する新規レクチン(MAL)を単離しそのアミノ酸配列の一部を決定したが、既知のものとの相同性はみられず、新規の構造をもつと示唆された。そこで、MALの構造を明らかにするため、MAL遺伝子の配列を明らかにすることを目的として実験を行った。MALのアミノ酸配列の解析から繰り返し配列が存在していると示唆された。N末端配列と繰り返し配列の終端部分からプライマーを作成しPCR法を用いてDNAの増幅を行ったところ、約1.1,1.3,1.5kbpのバンドが見られた。それぞれのバンドについて塩基配列を決定したところ、これらはすべてMAL遺伝子のPCR産物であることがわかった。最も長い産物について解析したところ、このPCR産物は1506塩基からなり、3′側に繰り返し配列が3回並んでいることがわかった。この配列より推定されるアミノ酸配列についてホモロジー検索を行ったところ、繰り返し配列の部分でクロストリディウムの1種Clostridium beijerinckiiのα-アミラーゼと相同性がみられた。したがって、繰り返し配列部分が糖結合部位であると示唆された。現在のところ全体の9割の配列を決定した。上で得られたPCR産物をプローブとして、Xbalで消化したゲノムDNAのサザンハイブリザイゼーションを行った結果、7.8kbpに1本のバンドが見られた。よって、M228レクチンはゲノム中にひとつだけ存在していることがわかった。