hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
健康長寿社会の実現に向けた都市部における自助・互助・共助・公助の連携に関する研究

今後は、上記第一次調査の状況を踏まえ、調査協力いただけた対象者像を分析していく。また、新規の対象者を増やすことに加え、より多様な心身機能の対象者をリクルートできるように工夫していくことが課題と考えている。特に、介護保険の要支援高齢者について、協力が得られる事業者等を増やし、要支援者のデータも蓄積していきたい。そして、引き続きおよそ6カ月ごとに、対象者の心身機能について継続調査を実施し、どのような対象者の心身機能が維持・向上しているのかを明らかにしていく。今後は、現在協力を得ている対象者に対し、引き続き心身機能のフォローアップ調査を実施し、心身機能の変化に影響する要因を整理していきたい。特に、介護予防事業の再編により影響を受けている「要支援者」のデータが不足している。現在、要支援者へのサービスの一部が自治体の介護予防事業(新しい総合事業)に移行しているため、これまでデータ収集している自治体の事業で「共助」の評価につながるデータ収集ができないか模索している。応用健康科学平成27年度(初年度)は、データ処理等のために使用するパソコンやソフト、周辺機器について計上していたが、データ入力等の作業が遅れているためパソコン等の購入は次年次に繰り越すこととした。平成27年度に計上していたパソコンおよびソフトウエアを購入したが、身体機能測定時の補助人員の人件費(アルバイト代)が当初見込みよりも少額で押さえられたことが起因している。平成27年度(初年度)に予算計上していたパソコンやソフト等は平成28年度に購入する予定である。対象者のフォローアップ調査が今後も実施され、最終年度はその回数が増えるものと考えられるため、そこでの人件費として支出される見込みである。
PAX6―SOX2―DNA複合体の塩基配列特異的な構造変化と遺伝子スイッチ機能

発生過程を制御する転写因子群のくは、DNA上で超分子複合体をつくって作用する。多様なパートナー因子と複合体をつくるSOX転写因子群が代表例である。パートナー因子の切換えがSOX因子の転写制御標的遺伝子を変化させて(遺伝子スイッチ機能)細胞分化を進行させる。SOX2とPAX6がδ-クリスタリンDC5配列上でつくるPAX6-SOX2-DNA複合体は塩基配列特異的な構造変化をし、それが遺伝子スイッチ機能に必須である。SOX2-PAX6-DC5複合体のマクロな3次元構造を電子顕微鏡像から再構成することを目指し、その複合体の最小構造であるSOX2-HMGドメイン、PAX6-Pairedドメイン、DC5-DNAの組み合わせで出発した。しかしSOX2-HMGドメインが凝集しやすいこと、複合体のサイズが解析の限界にという問題が明らかになった。そこで、SOX2,PAX6の全長蛋白質を用いることにした。PAX6と類縁であるが制御標的に違いがあるPAX2も解析の対象に含めた。これらの転写因子を大量合成・精製する準備をした。cDNAのコドンの発現細胞に応じた最適化、ペプチドタグ配列の付加、PAX因子のPairedドメインの2システイン残基のグルタチオン化を避けるためのセリンへの置換などである。以上の研究と平行して、DC5-DNA上でのSOX2、PAX6の間の相互作用の構造モデルを検討した。この相互作用において、SOX2側では(1)HMGドメインのα3 helixの中のC末端側、あるいは(2)それにつづく領域が、そしてPAX6側はN末端近傍にある可動性を持った小さなβ-sheet領域が関与することが想定された。(1)の場合には、SOX2-PAX6のアミノ酸側鎖間での静電的な相互作用が主となること、(2)の場合には、疎水結合を主とした、特異性がゆるやかな相互作用が予測された。転写制御因子複合体の塩基配列に選択的な結合によって、ゲノム中の特定の遺伝子が選別されて転写が活性化される。PAX6-SOX2が制御標的配列上で協同的に結合するときには、PAX6が塩基配列特異的に構造変化をし、SOX2とコンパクトな複合体を形成して、転写活性化能を発現できるようになる。PAX6力弐単独で強い結合をするいわゆるロンセンサス配列に結合すると、複合体としての転写活性可能を示さないが、クリスタリンエンハンサーDC5などコンセンサス配列から隔たった配列に結合してはじめて高い転写活性化能を示す。本研究では、PAX6の結合塩基配列に依存したPAX6-SOX2複合体の構造変化の実体を明らかにする。まず電子顕微鏡を用いた複合体のマクロな構造変化の解析から研究を出発して、順次解析の空間解像度を上げて研究をすすめる。PAX6、SOX2の大腸菌の中での合成を試みたが、全長蛋白質は大腸菌内で分解されるために成功せず、PAX6、SOX2のDNA結合ドメインと2蛋白質の相互作用に必要な最小限の領域からなる蛋白質を合成して、これらの蛋白質とDNAとの結合状態を、ネガティヴ染色像として観察している。特にSOX2の標品を用いた場合に、DNAに依存しない凝集体の形成が認められたため、その凝集を緩和する条件を検討している。しかし、電子顕微鏡によるPAX6-SOX2複合体の構造変化の計測のためには、PAX6、SOX2の全長を用いることが望ましい。In vitroの蛋白質合成系を用いて、PAX6、SOX2の全長を合成する作業をあわせて進めている。PAX6-SOX2複合体形成のための相互作用の核となる、DNA結合ドメイン近傍のアミノ酸配列を予測した。PAX6、SOX2のこれらのアミノ酸配列が具体的にどのような分子間相互作用に関与するのかを、3次元モデル構築によって検討している。

この相互作用において、SOX2側では(1)HMGドメインのα3 helixの中のC末端側、あるいは(2)それにつづく領域が、そしてPAX6側はN末端近傍にある可動性を持った小さなβ-sheet領域が関与することが想定された。(1)の場合には、SOX2-PAX6のアミノ酸側鎖間での静電的な相互作用が主となること、(2)の場合には、疎水結合を主とした、特異性がゆるやかな相互作用が予測された。
わが国コンテンツ産業における組織デザイン:プロデュ-サー・システムの検証と一般化

この研究は、コンテンツ産業の製作組織であるプロデューサー・システムを構成するプロデューサーやディレクターの方々にインタビュー調査を行うことで、プロデューサー・システムの一般的な理論モデルを導出するのが狙いである。理論モデルを導入して、コンテンツ産業を比較検討した結果、各産業の製作組織の組織デザイン上の差異を記述することができた。本研究は、映画、TVドラマ、アニメーション、ゲーム産業などのコンテンツ産業において、作品であり商品でもあるコンテンツを製作する製作組織を捉える一般的な理論モデルを提示することを研究目的としている。今日、経済産業省から国を挙げてのコンテンツ産業のビジネス振興が強調される一方で、コンテンツがどのような製作組織で作られているのか、その製作組織はプロデューサー・システムと一般的に言われるけれども、どの産業でもそのシステムは同じで違いはないのか、といった学術的な視点での研究蓄積はなされていない。これまでの研究成果からいえば、各コンテンツ産業の各製作組織には共通部分、プロデューサー、ディレクター、出資者が中心的役割を果たしていることが存在するものの、その3者の役割内容については差異が見受けられる。本年度はTVドラマのプロデューサーの方々にインタビュー調査を行ったが、たとえばTVドラマでは映画と比べてディレクターには作家性が要求されておらず、作品の内容についてはプロデューサーが中心となって決定していた。他にも、安定した視聴率の確保のために出資者の意向を重視するという放送局側の事情で、映画と比べてプロデューサーにとって作ってみたい作品が作りづらい環境にあることが分かった。各産業の各ビジネスモデル、作家性と資金回収のどちらに比重を置いているか(作品か商品か)といったことによって、組織デザイン上に差異が生じてくるのである。本研究はこうした視点も含めて研究していく予定である。本年度は前記のようにTVドラマのプロデューサー・システムのモデルの検証を中心に行った。また、成果の発表としては6月に組織学会で発表を行った。また、本年度は資料の収集と来年度調査予定のインタビュイーの確保に注力した。映画・TV番組・アニメ・ゲームといったコンテンツを扱う産業において、作品であり商品でもあるコンテンツは、プロデューサーを中心としたプロデューサー・システムと呼ばれる製作組織によって作られている。本研究の目的は、プロデューサー・システムの主プレーヤーであるプロデューサーやディレクターの方々にインタビュー調査を行い、質的データを重ねて取得していくことで、コンテンツ産業の製作組織を捉える一般的な理論モデルを導出することにある。一般モデルが提示されると、それを基準として、各産業の各製作組織の違い、つまり主プレーヤーである出資者・プロデューサー・ディレクターの分業と調整のパターン(組織デザイン)の相違点を記述することが可能となる。こうした組織デザイン上の相違点を比較検討していくことで、資金回収を重視したモデル、資金回収よりも作品の芸術性を重視したモデルといった組織モデルを提示することが可能となる。本年度はテレビの人気長寿バラエティ番組のプロデューサーの方およびニュース番組のニュースデスク・放送部長といった方々にインタビュー調査を行った。バラエティ番組の方では、長寿番組で安定した視聴率をとっているだけあり、主たる視聴者層が知らないような若いゲストを何度も呼ぶなど挑戦的な試みをプロデューサー判断で行っていることが分かった。これはTVドラマが保守的な作品作りを強いられている状況とは対照的である。また、ニュース番組の方では、編集責任者の役割が重要で、他作業でいうプロデューサーに近い役割を果たしていることが分かった。編集責任者は、取り上げるニュースの取捨選択・順番・時間などを事細かく視聴率を意識した上で決定し、制作をされており、そこには作家性が見受けられた。その他の成果としては、研究発表として12月にDML(立命館大学)で招聘発表を行った。また、来年度のインタビューの確保も行うことができた。本年度の主な調査成果としては、1ある絵本を原作としたアニメのプロデュース過程、2萌えイラストやアニメコンテンツを使った町おこしビジネス、がある。1では、原作絵本が人気であることが、原作者の意向が強く反映されたアニメ化となり、製作組織内のプレーヤーの力関係を左右するものとなっていた。また、原作が人気であることが、資金拠出の決め手の1つとなっていることも分かった。つまり、資金回収を重視したモデル・組織デザインとなっていた。2では、ビジネスの仕掛け人は、キャラクターデザイナーと発信したい地方資源との良い相性を考えているなど、プロデューサー的な役割を担っていることが分かった。また、アニメコンテンツを用いた町おこしにおいては、タイアップ商品そのもので儲けを出そうと考えているのではなく、アニメの認知度を上げることを目的としていること、商品をネット上でのファン向けのネタとしていることなどが分かった。

現在まで、本研究が研究対象にしているコンテンツ業界の方々に概ね順調にインタビューを行うことができており、またインタビュー対象者の確保も順調に進んでいる。総じて、研究目的を達成するための調査は概ね順調と言える。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度までの調査によって、概ね質的データが揃って来ており、ようやく一般性のある理論モデルを提示できるまで進んできた。来年度は本研究課題の最終年度であり、研究成果を査読論文数編という形で公表したい。
シェイクスピア後期作品群における女性表象の政治性について

本課題は四部構成だが、そのうち第一部と第二部の調査・分析を終え、シェイクスピアの『ペリクリーズ』、『冬物語』、『テンペスト』のテクスト分析を行うことができた。第三部、第四部に取り組む。本研究で展開する議論の精度を高めるため、適宜研究成果を国内外の諸学会で発表してフィードバックを受ける。海外での調査を次年度に行うことになったため、そのための費用を次年度に請求する予定である。
福島第1原子力発電所事故後の仏米におけるマスメディアへの情報発進の現状分析

フランスの原子力関係機関の広報部門へのインタビューの結果、以下を明らかにした。フランスには記者クラブ制度はなく、原子力事業者からマスメディアに対する情報伝達のプロセスは日本とは異なっていた。フランスでは記者が広報スタッフと直接、コミュニケーションするしくみがある。こうした両者の関係醸成により、広報スタッフが記者の認知を理解し記者からの信頼を得ようとするようになってきたことが分かった。この背景には、フランスは総電力量の約8割弱を原子力にゆだね、マスメディアから原子力の必要性について理解を得やすいという環境がある。両者の関係を見ると、記者と広報スタッフとのコミュニケーションがニュース制作の起点であった。記者個人の原子力に対する認知が、原子力報道の論調へも影響すると広報スタッフは認識していた。福島原発事故はフランスにおいてもマスメディアによりクローズアップされ、記者にとりニュース価値が高かったことを広報スタッフの回答を通して理解することができた。福島原発事故は地理的な隔たりと、情報の伝わる速さが相関関係にないことを示す事例であった。原子力事業者はマスメディアへの情報伝達について、国内のみならず海外にも目を向け、海外の原子力関係機関からも情報提供を求められることを認識しなければならない。また、他国の原子力施設等で事故・トラブルが発生する場合には、すみやかに関係情報を収集する体制を整え、自国のマスメディアへの情報を伝える努力が求められる。さらに、本調査結果からはマスメディアによる原子力事故報道が頻繁になれば、その分だけ人々のリスク認知も高まるというCombs & Slovicの提唱を想起できる。原子力関係機関からマスメディアへスムーズに情報を伝えることも有効なリスク・コミュニケーションの一つと言える。
破骨細胞が分泌する新規骨形成誘導因子の同定

我々はこれまでに、破骨細胞分化因子(RANKL)のデコイ受容体であるオステオプロテゲリン(OPG)遺伝子欠損マウスにおいては、骨吸収の亢進とカップルして骨形成活性も促進していることを報告してきた。そこで、骨誘導因子(BMP)ペレットをOPG欠損マウスに移植し、異所性骨形成を観察したところ、移植3週後に骨密度は最高に達し、その後は破骨細胞性の骨吸収が著しく進行した。そこで今回、破骨細胞が存在しない大理石骨病マウスにおけるBMP誘導性の骨形成について検討した。4週齢のM-CSF遺伝子欠損マウス(op/op)、c-fos遺伝子欠損マウスの背筋筋膜下に、rhBMP-2含有コラーゲンペレットを埋入し、異所性骨形成を誘導した。その結果、op/opマウスにおけるBMP誘導性の骨形成は、正常マウスと比較して約3倍の促進が認められた。これらの巨大な異所性骨の外面は大変粗雑な形態を呈していた。一方、c-fos欠損マウスにおける異所性骨形成は、正常マウスと比較して亢進は認められなかった。c-fos欠損マウスにおける骨組織や脾臓においては、正常マウスやop/opマウスにおいて存在するRANK陽性の破骨細胞前駆細胞が認められなかった。RANK陽性の破骨細胞前駆細胞が骨形成シグナルを正に調節している可能性が示唆された。その骨形成シグナルが伝達された際に出現する破骨細胞は正常な骨の形態形成に重要な役割を果たしている可能性が示された。骨吸収が起こったあと、骨形成は起こる。この現象は骨代謝共役と言われる。しかし、骨吸収によって骨基質から遊離したサイトカインが骨形成を誘導するか?破骨細胞が自ら分泌するサイトカインが骨形成を誘導するか?その分子機構は明らかでない。本年度は、破骨細胞が骨形成因子を分泌するという仮説に基づき、骨形成因子の探索を行った。(1)RT-PCR法により、破骨細胞がWntを発現するか検討した結果、破骨細胞は、Wnt2,Wnt5a,Wnt10a mRNAを強く発現していた。(2)骨髄間質細胞株であるST2をWnt/β-カテニンシグナルを活性化するWnt3aで刺激すると、アルカリホスファーターゼ活性が強く誘導される。そこでレトロゥィルスを用いてST2細胞にWnt2,Wnt10a cDNAを遺伝子導入した。Wnt2およびWnt10aの遺伝子導入は、ST2細胞におけるアルカリホスファーターゼ活性を強く誘導した。つまり、破骨細胞が発現するWntが骨芽細胞への分化を誘導することを意味する。(3)培養系で形成した破骨細胞が骨芽細胞の分化を誘導するか?破骨細胞とST2細胞の共存培養実験を行った。純化した破骨細胞上にST2細胞を播種し、ST2細胞のアルカリホスファーターゼ活性の誘導をこころみた。しかし、純化した破骨細胞は生存期間が短く、ST2細胞にアルカリホスファーターゼ活性を誘導できなかった。エタノール固定した破骨細胞とST2細胞の共存培養か破骨細胞の細胞抽出液を用いるなど実験系の改良が必要である。
染色体導入による転移抑制遺伝子の同定

我々は、未知の転移抑制に関わる遺伝子のマッピングとクローニングを行うために、Y染色体を除く全ての正常細胞由来の染色体を微小核細胞融合法を用いて、マウスメラノーマ高転移株(B16-F10)へ移入し、ヌードマウスにおける造腫瘍性およびin vitro増殖特性の変化に対して抑制効果を示さないマイクロセルハイブリッド(MH)クローン(3番、4番、6番、8番、12番、13番、18番、X染色体)を選別した。分離した23種類の異なったヒト染色体移入クローン、計230クローンは、染色体解析により移入染色体の確認を行った。完全な移入染色体が高率に認められたMHクローンを用いて、転移抑制染色体を同定するための一次スクリーニングとして、ヌードマウスにおける造腫瘍性およびin vitro増殖特性についての検索を行い、これらのがん形質に対して抑制効果を示さない染色体移入クローン(3番、4番、6番、8番、12番、13番、18番、X染色体)を選別した。さらに、これらの染色体移入クローンは、以下の2種類の方法により転移能を検索した。さらに、選別した染色体移入クローンの転移能の抑制効果を受精鶏卵への注入による胎児肝転移を指標にした受精鶏卵法およびマウスへの静脈内注入による肺転移を指標にした手法により検索した。受精鶏卵法は、受精鶏卵漿尿膜上の血管へ5×10^5個の細胞を移植後、embryoの肝臓への転移結節を観察する。親細胞においては肝臓への平均転移結節数が74.6個で、その他の臓器(心臓、胃など)にも多数の転移結節が認められた。一方、18番染色体移入クローン(#18-1,9)においては、肝臓および他臓器に対して著しい転移結節数の減少が認められ、平均転移結節数は3.1および7.9であり、統計的に有意差が認められた(P<0.05)。他の3番、4番、6番、8番、12番、13番、X染色体移入クローンにおいては、親細胞と同様に高い転移能を示した。これらのことより、18番染色体上に転移抑制に係わる遺伝子の存在が示唆された。一方、マウスへの静脈内注入による肺転移を指標にした手法においては、3番、8番染色体移入クローンに、顕著な転移形成の低下が認められた。以上の結果から、(1)3番、8番染色体上にも転移抑制遺伝子が存在し、(2)受精鶏卵法での結果との相関を示さなかったことより、異なる転移能検索法を用いることが、複数の転移抑制遺伝子の検索に有効であることが示唆された。我々は、未知の転移抑制に係わる遺伝子のマッピングを行うために、ヒト正常細胞由来のY染色体を除く全ての染色体を微小核細胞融合法を用いて、マウスメラノーマ高転移細胞株(B16-F10)へ導入し、各々のマイクロセルハイブリッド(MH)クローンを単離した。これらのクローンのうち、3、4、6、7、8、12番染色体移入クローンにおいては、ヌードマウスにおける造腫瘍性およびin vitroの増殖特性の抑制効果が認められなかった。従って、これらの染色体上に、転移抑制に係わる遺伝子の存在する可能性が示唆され、以下の研究のための資材を得ることができた。1.抑制効果を示さない染色体移入クローンを用いて、ヌードマウスの静脈内投与による肺および肝臓転移を指標にした手法、受精鶏卵への注入による胎児肝転移を指標にした手法、試験管内浸潤法による転移検索能などにより、マウスメラノーマ細胞の転移抑制に係わる遺伝子の存在するヒト染色体の同定を行う。2.造腫瘍性はあるが転移能の低下が認められたクローンを継代培養し、まれに出現する転移能を再獲得したクローンを分離する。また、まれに出現した転移部位からも細胞を得る。こうして分離したクローンについて染色体解析を行い、導入染色体の有無を確認する。3.サザンブロットおよびPCR解析により、転移能を再獲得したクローンに共通する欠失領域を決定し、転移抑制遺伝子クローニングのための資材とする。4.転移抑制遺伝子の存在が推定されるヒト染色体の特定領域を含むA9細胞を材料に、すでに当研究室で確立した手法を用いて、転移抑制に係わる特定ヒト染色体領域を保持したマウスA9細胞を作製する。この特定領域の導入を行うことにより、より直接的な実証を試みるとともに転移抑制遺伝子のクローニングのための資材とする。1.高転移能をもつB16-F10細胞にpSV2neoあるいはpSV2bsr遺伝子で標識した正常細胞由来のY染色体を除くすべての染色体を微小核細胞融合法により導入転移抑制遺伝子マッピングの1次スクリーニングであるヌードマウスにおける造腫瘍性およびin vitroの増殖特性の実験を行った。2.その結果,3番,4番,6番,12番,17番,18番,X染色体移入クローンは親細胞と同様に高い造腫瘍性が認められた。3.受精鶏卵法は,受精後10日目の受精鶏卵漿尿膜上の血管へ5X10^5コの細胞を注入後17日目(注入から7日目)に鶏卵の中から胎児を取り出し,胎児の肝臓への転移結節を観察した。

上述の1次スクリーニングにより,in vitro増殖特性および造腫瘍性にたいして抑制効果を示さない,3番,4番,6番,8番,12番,13番,17番,18番,X染色体移入クローンについて転移能を検索した結果,親細胞においては,肝臓への平均転移結節が74.6個で,その他の臓器(心臓,胃など)にも多数の転移結節が認められた。一方,18番染色体移入クローンにおいては,肝臓および他臓器に対して著しい転移結節数の減少が認められ,平均転移結節数は3.1および7.9個であった。これらの値は,統計的にも,有意差が認められた(P<0.05)。他の3番,4番,6番,8番,12番,13番,17番,X染色体移入クローンにおいては,親細胞と同様に高い転移能を示した。4.さらに,完全なヒト18番染色体を保持するマウスA9細胞から微小核細胞を精製し,X線照射後再びマウスA9細胞に融合させ,薬剤耐性クローンを分離した。分離した細胞クローンについてサザンブロット解析を行い,転移抑制遺伝子の詳細なマッピングのため18番染色体の様々な領域を保持する8つのクローンを分離した。我々は、未知の転移抑制に関わる遺伝子のマッピングとクローニングを行うために、Y染色体を除く全ての正常細胞由来の染色体を微小核細胞融合法を用いて、マウスメラノーマ高転移株(B16-F10)へ移入し、ヌードマウスにおける造腫瘍性およびin vitro増殖特性の変化に対して抑制効果を示さないマイクロセルハイブリッド(MH)クローン(3番、4番、6番、8番、12番、13番、18番、X染色体)を選別した。分離した23種類の異なったヒト染色体移入クローン、計230クローンは、染色体解析により移入染色体の確認を行った。完全な移入染色体が高率に認められたMHクローンを用いて、転移抑制染色体を同定するための一次スクリーニングとして、ヌードマウスにおける造腫瘍性およびin vitro増殖特性についての検索を行い、これらのがん形質に対して抑制効果を示さない染色体移入クローン(3番、4番、6番、8番、12番、13番、18番、X染色体)を選別した。さらに、これらの染色体移入クローンは、以下の2種類の方法により転移能を検索した。さらに、選別した染色体移入クローンの転移能の抑制効果を受精鶏卵への注入による胎児肝転移を指標にした受精鶏卵法およびマウスへの静脈内注入による肺転移を指標にした手法により検索した。受精鶏卵法は、受精鶏卵漿尿膜上の血管へ5×10^5個の細胞を移植後、embryoの肝臓への転移結節を観察する。親細胞においては肝臓への平均転移結節数が74.6個で、その他の臓器(心臓、胃など)にも多数の転移結節が認められた。一方、18番染色体移入クローン(#18-1,9)においては、肝臓および他臓器に対して著しい転移結節数の減少が認められ、平均転移結節数は3.1および7.9であり、統計的に有意差が認められた(P<0.05)。他の3番、4番、6番、8番、12番、13番、X染色体移入クローンにおいては、親細胞と同様に高い転移能を示した。これらのことより、18番染色体上に転移抑制に係わる遺伝子の存在が示唆された。一方、マウスへの静脈内注入による肺転移を指標にした手法においては、3番、8番染色体移入クローンに、顕著な転移形成の低下が認められた。以上の結果から、(1)3番、8番染色体上にも転移抑制遺伝子が存在し、(2)受精鶏卵法での結果との相関を示さなかったことより、異なる転移能検索法を用いることが、複数の転移抑制遺伝子の検索に有効であることが示唆された。
適応進化を考慮した気候変動下の遺伝的多様性予測モデルの開発

気候変動モデルのダウンスケーリングを行い,複数のシナリオ下における降水量・気温を予測した.そして,分布型流出モデルを活用して流域内の流速・水深・水温の空間分布を予測し,MaxEntにより,各シナリオ下の水生昆虫4種の対象流域内の生息分布を推定した。さらに,ゲノムワイドの遺伝子データからBayeScanおよび自己組織化特徴マップ解析により環境選択性遺伝子座を同定した。そして,水温・流量等の変数と対立遺伝子頻度の関係を表す重回帰モデルを作成し,気候変動下の環境選択性遺伝子座と遺伝的多様性の空間分布を予測した。その結果、水温による自然選択を強く受けていた種の遺伝的多様性の著しい劣化が予想された。課題1「気候変動後の流域環境の予測」では,名取川(宮城県)流域のウルマーシマトビケラ,ヒゲナガカワトビケラ,シロズシマトビケラ,フタスジモンカゲロウの4種を対象に,遺伝的多様性をAFLP法で調査した.また,重信川(愛媛県)のカワゲラ6種を採取し,ゲノムワイドのDNAデータを解読する次世代DNAシークエンシング解析に必要なライブラリー作成を一部終了した.GCM(全球気候モデル)で流域内の気象条件を予測するために,名取川流域を対象としたダウンスケーリングを行い,複数の代表的濃度経路(RCP)シナリオの降水量・気温を予測した.そして,分布型流出モデルにより流域内の流量(流速・水深)と水温を空間分布を予測した。課題2「気候変動後の種の生息分布予測」では,気候変動後の対象種の生息分布を予測する生息度適正度指数モデルを作成した。まず,課題1で予測された流域内の水温・流速・生息環境変数に,GISベースの地形・土地利用データ等を加えて,各解析グリッドの環境特性を定量化した。これら環境特性を説明変数,課題2で現地調査した対象種の個体群密度を目的変数とする非線形生息適正度指数モデルを推定した。この生息適正度指数モデルを流域全体に演繹的に適用し,将来,気候変動に伴って流域内の環境特性が変化した後の各種の生息可能(生息度適度>0.5)な範囲を将来の種の生息分布として推定した。また,H27年度実施を計画していた課題3「流域環境と遺伝子の適応関係を定量化する連関モデルの開発」を前倒で一部実施した.課題1で得たゲノムワイドデータからBayeScan解析で環境選択性遺伝子座を同定した。そして,課題1で予測された水温・流量等の生息環境変数の中から,BayeScanで検索された各環境選択性遺伝子の遺伝子頻度と最も強い連関(相関)を示す環境変数を検索した。ヘテロ接合度(遺伝子多様度)Heと連関が認められた環境変数の関係を表す重回帰モデルを作成した。課題1「気候変動後の流域環境の予測」では,名取川(宮城県)流域を対象とした気候変動モデルのダウンスケーリングを行い,複数の代表的濃度経路(RCP)シナリオ下における降水量・気温を予測した.そして,分布型流出モデルを活用して流域内の流量(流速・水深)と水温の空間分布を予測した。課題2「気候変動後の種の生息分布予測」では,課題1で算出された気候変動シナリオ下で予測される水温・流速・生息環境変数を説明変数として,対象種の個体群密度を目的変数とするmaximum-entropy approach (MaxEnt)モデルを作成し,気候変動シナリオ下の各種の対象流域内の生息可能な範囲を将来の種の生息分布として推定した。課題3「流域環境と遺伝子の適応関係を定量化する連関モデルの開発」では,課題1で得たゲノムワイドデータからBayeScan解析で環境選択性遺伝子座を同定した。そして,対立遺伝子頻度と連関が認められた環境変数の関係を表す重回帰モデルを作成した。課題4「気候変動シナリオ下の流域内の遺伝的多様性の将来予測」では,まず,各流域の解析グリッドにおいて,課題1で予測された複数の代表的濃度経路(RCP)シナリオ下の環境変数値を入力し,課題2で導かれた生息度適正度指数モデルに基づいて,将来の種の生息分布域を予測した。また,同様に,入力した環境変数値に基づいて,課題3で導かれた環境と対立遺伝子頻度の連関モデルから,気候変動下の生息分布内の遺伝的多様性の空間分布と流域全体の遺伝的多様性を予測した。当初の予定通り,H27年度の実施を計画していた課題3「流域環境と遺伝子の適応関係を定量化する連関モデルの開発」が終了し,課題4「気候変動シナリオ下の流域内の遺伝的多様性の将来予測」を一部着手することができたので,当初の計画通り順調に進展していると評価できる.課題1「気候変動後の流域環境の予測」では,名取川(宮城県)流域を対象とした気候変動モデルのダウンスケーリングを行い,複数のシナリオ(RCP2.6、RCP4.5、RCP8.5)下における降水量・気温を予測した.そして,分布型流出モデルを活用して流域内の流量(流速・水深)と水温の空間分布を予測した。課題

2「気候変動後の種の生息分布予測」では,課題1で算出された気候変動シナリオ下で予測される水温・流速・生息環境変数を説明変数として,対象種の個体群密度を目的変数とするmaximum-entropy approach (MaxEnt)モデルを作成し,気候変動シナリオ下の各種の対象流域内の生息可能な範囲を推定した。課題3「流域環境と遺伝子の適応関係を定量化する連関モデルの開発」では,ゲノムワイドの遺伝子データからBayeScan解析およびニューラルネットワークモデルの自己組織化特徴マップ(SOM)を活用して環境選択性遺伝子座を同定した。そして,課題1で予測された水温・流量等の変数の中から,環境選択性遺伝子座と中立遺伝子座のそれぞれの遺伝子頻度と最も強い連関(相関)を示す環境変数を検索した。そして,各対立遺伝子頻度と連関が認められた環境変数の関係を表す重回帰モデルを作成した。課題4「気候変動シナリオ下の流域内の遺伝的多様性の将来予測」では,まず,課題1で予測されたRCPシナリオ下の環境変数値を入力し,課題2で導かれたMaxEntに基づいて,将来の種の生息分布域を予測した。また,同様に,課題3で導かれた環境と対立遺伝子頻度の連関モデルから,気候変動下の環境選択性遺伝子座と中立遺伝子座の遺伝的多様性の空間分布と流域全体の遺伝的多様性を予測した。その結果、環境選択性遺伝子座よりも中立遺伝子座の方が遺伝的多様性の劣化がより著しいことが予想された。気候変動モデルのダウンスケーリングを行い,複数のシナリオ下における降水量・気温を予測した.そして,分布型流出モデルを活用して流域内の流速・水深・水温の空間分布を予測し,MaxEntにより,各シナリオ下の水生昆虫4種の対象流域内の生息分布を推定した。さらに,ゲノムワイドの遺伝子データからBayeScanおよび自己組織化特徴マップ解析により環境選択性遺伝子座を同定した。そして,水温・流量等の変数と対立遺伝子頻度の関係を表す重回帰モデルを作成し,気候変動下の環境選択性遺伝子座と遺伝的多様性の空間分布を予測した。その結果、水温による自然選択を強く受けていた種の遺伝的多様性の著しい劣化が予想された。当初,H27年度の実施を計画していた課題3「流域環境と遺伝子の適応関係を定量化する連関モデルの開発」を一部前倒して実施することができたので,当初の計画以上に進展していると評価できる.課題13は概ね完了できたので,これらの研究成果を統合して最後に行う課題4「気候変動シナリオ下の流域内の遺伝的多様性の将来予測」に集中して取り組み,精度の高い遺伝的多様性予測手法を開発すると共に,研究成果をインパクトの高いジャーナルで発表する.生態工学課題13を継続すると共に,今年度は当初の計画以上に進展したので,課題4「気候変動シナリオ下の流域内の遺伝的多様性の将来予測」にもH27年度中から着手してより精度の高い詳細予測手法の開発に繋げる.今年度から予定にしていた一部の研究打ち合わせの出張を次年度に延期したため。今年度から予定にしていた一部の次世代DNAシークエンシング解析等の分子生物学的実験を次年度にまとめて集中して行う実験計画に変更したため。国内出張旅費として主に使用する計画である。分子生物学的実験の消耗品や委託解析費として主に使用する計画である。
魚類の卵を用いた核・細胞質置換系作成のための発生工学的研究

(1)細胞核を移植するための宿主胚の作成: Hoechst33342で核を顕在化し、卵膜を除去した卵より、蛍光顕微鏡下でマイクロインジェクタ-を用い核の除去を行った。針先を細胞質に挿入せず、卵黄膜表面に密着させ細胞質ごと核を吸引することで無核胚が得られた。受精卵の第1卵割に中期に核除去を行うと胚発生が進行しないが、前期と後期に除核をした卵は卵割し、胞胚程度まで発生が進行した。しかしながら、正常胚では上皮層、深層細胞、周縁質と3層に分化する胞胚が無核胚では3層に分化しなかった。(2)卵核除去卵への外来核導入法としての電気細胞融合法の検討:卵同士の接着を誘起する高周波パルスは、今回購入した装置の設定範囲では非常に弱く融合の前段階の処理には用いることが出来なかった。融合へ導くパルスは、0.18Mショ糖、1.8mMCaCl_2溶液中では、電圧を高めるかパルス幅を広げるほど、卵の急激な収縮を引き起こすことが示された。この収縮は電気融合法の適用の阻害要因であった。胚盤が形成されるまでの卵の収縮は、融合パルスにより培養液中のCa^<2+>イオンの卵内への流入により収縮が引き起こされることが判明した。受精後30分以内の卵ならば50100μM程度の低濃度のキレ-ト剤存在下で、750V/cm,10μsのパルス処理により卵同士の融合は誘起された。胚盤の形成された卵ではこの条件下でも収縮が起こり、卵同士の融合は不可能であった。(3)Donor細胞としての分離胚細胞の調整:核を提供する細胞として桑実期から胞胚期間での胚細胞を100μM程度のキレ-ト処理により分離することが出来た。またこれらの分離した胚細胞は、250V/cm,10μs程度の電気的処理により容易に細胞融合することが確認された。(4)分離胚細胞と未受精卵との電気的細胞融合:未受精卵と分離胚細胞をレクチンで架橋し、電気的細胞融合を試みたが、例数が少なく現在まで融合は確認されていない。A.細胞核移植用の無核胚の作成と無核胚の性質:50μg/ml Hoechst 33342,0.4% urea-0.5% NaCl溶液中でキンギョの卵を受精、核の顕在化をしたのち、卵膜を除去し、プロトプラスト化した卵を得た。この卵をagaroseで作成しchamberへ移し、蛍光顕微鏡下で核の動態を観察しながらmicro injectorで核を吸引した。針先を鋭利にし卵細胞質へ針先を挿入する方法は、卵膜の柔軟性のために挿入が困難で除核には適さなかった。針先を平坦にして卵黄膜に付着させ、injectorにて核を細胞質ごと吸引することにより比較的容易に核除去卵が得られた。第1卵割の各ステ-ジと2細胞期で除核、10時間培養した後、パラフィン切片とし、DAPI染色、H&E染色を施し組織学的な観察を行った。その結果、第1卵割の中期に除核処理を施した卵ではその後の卵割が進行せず、無核胞胚は得られていなかった。第1卵割の前期と後期で除核を行った。卵からは、正常胞胚程度にまで卵割の進んだ無核胚が得られた。2細胞期の片方の核を除去した場合、有核、無核の細胞とも卵割が進むことが確認された。この様にして得られた無核胚の各割球はその大きさや形態の点で正常胚とは著しく異なっていた。B.外来各導入法としての卵融合法の検討:卵同士の接着に関わる高周波パルスは、今回購入した装置の設定範囲では非常に弱く融合の前段階処理にはチャンバ-を特殊化するなどの改善が必要であった。融合へ導くパルスは、電圧を高めるほと、またパルス幅を広げる程、卵の急激な収縮を引き起こすことが示された。溶液へのサイトカラシンBの添加や低温処理により細胞骨格を弱める処理を施しても収縮を抑えることはできなかった。受精直後の卵ほどこの収縮は弱く、時間の経過に伴いより強く収縮が起こることが観察された。卵が収縮を起こすと卵同士の接着部分が離れ、融合にはいたらなかった。

この収縮は電気融合法の適用の阻害要因であった。胚盤が形成されるまでの卵の収縮は、融合パルスにより培養液中のCa^<2+>イオンの卵内への流入により収縮が引き起こされることが判明した。受精後30分以内の卵ならば50100μM程度の低濃度のキレ-ト剤存在下で、750V/cm,10μsのパルス処理により卵同士の融合は誘起された。胚盤の形成された卵ではこの条件下でも収縮が起こり、卵同士の融合は不可能であった。(3)Donor細胞としての分離胚細胞の調整:核を提供する細胞として桑実期から胞胚期間での胚細胞を100μM程度のキレ-ト処理により分離することが出来た。またこれらの分離した胚細胞は、250V/cm,10μs程度の電気的処理により容易に細胞融合することが確認された。(4)分離胚細胞と未受精卵との電気的細胞融合:未受精卵と分離胚細胞をレクチンで架橋し、電気的細胞融合を試みたが、例数が少なく現在まで融合は確認されていない。
粒子線増感法による新規低侵襲型粒子線がん治療法の基礎的検討

各種サンプルを攪拌させながら上方から照射した後,照射サンプルの光励起による蛍光測定を行い,PDT用薬剤の有無によって活性酸素種の発生が促進されていることが確認できた。肺がん上皮細胞(A-549)とビスダインを用いて,X線照射(5 Gy)を行ったところ,ビスダインを添加していないコントロール群に比べ,細胞の生存率が低下し,放射線照射と光増感剤との併用により,殺細胞効果が向上することが見出せた。本年度は本研究に関する調査,活性酸素種を同定するための基礎的なデータの収集を行った。まず,PDT用薬剤の粒子線励起による放射線化学的及び放射線力学的性質の基礎的なデータを取得し,本治療システムで腫瘍組織を死滅させる役割を果たす活性酸素種の発生を定性的に評価した。基礎的なデータの取得のため,サンプルは濃度分布が均一な水溶液中において重粒子線(炭素220MeV@JAEA高崎・TIARA)を照射した。使用したPDT用薬剤は,実際にPDTに用いられているフォトフリンやビスダインなどのポルフィリン系の光感受性薬剤及び臨床応用が予定されている光感受性薬剤のうちビスダインを使用した。イオンビームとPDT用薬剤との相互作用によって発生する活性酸素種を同定するため,活性酸素種を効率よく検出するための市販の蛍光試薬(活性酸素プローブ)を使用し,サンプルはPDT用薬剤に活性酸素プローブを添加したものを使用し同定した。重粒子線照射は,イオンビームの大気中照射が可能な日本原子力研究開発機構のTIARAのAVFサイクロトロンの垂直ポートに接続した深度制御種子照射装置を利用した。220MeV(18MeV/u)の炭素イオンビームを,磁場によりX-Y2軸独立走査したイオンビームを厚さ30μmのチタン箔を介して大気中に取り出し,水平に置いたサンプルを攪拌させながら上方から照射した。その後,照射サンプルの光励起による蛍光測定を行い,PDT用薬剤の有無によって活性酸素種の発生が促進されていることが確認できた。基礎的なデータの取得のため,サンプルは濃度分布が均一な水溶液中において重粒子線(炭素220MeV@JAEA高崎・TLARA)を照射した。PDT用薬剤には加齢黄斑変性症に使用されているビスダイン(ベルテポルフィン)を採用し,蛍光プローブは一重項酸素用としてSinglet-Oxygen Sensor Green,活性酸素(主にOHラジカル)用としてHydroxyphenyl Fluorescein及びAminophenyl Fluorescein,ラジカル捕捉剤として,アジ化ナトリウム,ジメチルスルホキシド,マンニトール,一重項酸素の長寿命化用として重水をそれぞれ採用した。PDT用薬剤の濃度は薬剤の標準投与量15mg,循環血漿量基準値48mL/kg,仮想体重60kgとした時の最高血中濃度5.2x10^<-3>mg/mL(ビスダイン:7.2x10^<-6>M)を用いて照射実験を行った。続いて,これらの知見をもとに,肺がん上皮細胞(A-549)とビスダインを用いて,X線照射(5Gy)を行ったところ,ビスダインを添加していないコントロニル群に比べ,細胞の生存率が低下し,放射線照射と光増感剤との併用により,殺細胞効果が向上することが見出せた。
骨髄間葉系幹細胞を用いた血管柄付き自家骨置換型人工骨の開発

再生医療技術に基づき、ラットを用いた動物実験にて将来的に自家骨に置換し得る人工骨beta-tricalciumphosphate(βTCP)を担体とする血管柄付き人工骨移植モデルを作成し、間葉系幹細胞(MSCs)の添加により血管・骨形成が変化するかを検討した。ラット大腿動静脈を血管茎として移植した人工骨モデルにおいて血管茎と人工骨の境界部にMSCsを高濃度で含有した骨芽細胞シートを配置する事により移植血管束周囲から人工骨内に旺盛な血管新生および骨新生が獲得できた。本技術を臨床的に応用する事により難治性偽関節治療における有用な治療戦略となりえる事が示唆された。経時的に自家骨に置換し得る人工骨としてβTCPを担体とする血管柄付き骨膜移植モデルにおいて、間葉系幹細胞(MSCs)の添加により骨形成が変化するかを検討した。Fischer344系ラット(7週齢)の大腿骨より骨髄液を用いて骨髄間葉系幹細胞を培養分化させた。二次培養後、回収した細胞を人工骨(βTCP)に播種し、その表面および気孔内で骨芽細胞に分化誘導因子および生物活性物質を添加しながらin vitroにて培養した。F344系ラット(7週齢)の脛骨内側面の骨膜を伏在動静脈を血管茎として挙上し培養人工骨をラッピングした後、大腿内側の皮下に移植した(MSCs添加群)。またコントロールとしてはMSCsを含まないβTCPを血管柄付き骨膜で巻いたものとした(C群)。MSCs添加群、C群とも各々8検体を作成した。移植後1週、2週、4週に移植人工骨を摘出し骨形成の評価(組織学的所見・ALP活性・オステオカルシン量)を行った。組織学的検査では両群ともにHE染色標本にて良好な骨形成が確認できた。ALPおよびオステオカルシンの上昇はMSCs添加群にて大きいが両群ともに旺盛な骨形成が認められ、両群間で明らかな差は認められなかった。以上の結果からラットを用いたβTCPに血管付き骨膜を付加したモデルにおいてはMSCsの添加の有無にかかわらず良好な骨再生能が認められることが判明し、実験モデルの一部変更を行った。今までの実験モデルでは血管付き骨膜を有する事が旺盛な骨形成能に大きく影響していると考え、新しいモデルでは骨膜を含めずに血管束(動静脈)のみを挙上して、βTCPブロックに作成した溝に血管束を付加した。現在、このモデルを用いて前回と同様に培養細胞播種βTCPに血管束を付加した群(MSCs+V群)、コントロールとしてはMSCsを含まないβTCPに血管束を付加した群(CV群)を用いて実験を継続している。昨年度の実験結果から、実験モデルを一部変更した。【方法】7週齢Fischer344(F344)ラットの大腿骨からMSCsを採取し、標準培地(15%FBS含有MEM)を用いて初期培養を行った。2週間後に10cm径培養皿に播種し、デキサメサゾン(10nM)、アスコルビン酸(82μg/ml)添加標準培地で二次培養(14日間)を行い、骨芽細胞シートを採取した。11週齢F344ラットの大腿動静脈を顕微鏡下に挙上し、これらの血管束を円柱状βTCP(直径6mm、厚み10mm、気孔率75%:PENTAX社製SUPERPORE)に作製した幅2mmの側溝に通した。人工骨に血管束を通すのみの血管単独群(n=8)と血管束と人工骨の間に骨芽細胞シートを充填した骨芽細胞シート群(n=8)の2群を作製した。移植4週後に移植人工骨を周囲組織から剥離し、血管束とともに摘出し、組織像、アルカリホスファターゼ(ALP)、オステオカルシン(OC)、血管内皮増殖因子(VEGF)のmRNA量を測定し骨形成能の評価を行った。【結果と考察】ALP、OC、VEGFは全てにおいて、骨芽細胞シート群が血管単独群と比較して高値であり、統計学的に有意差を認めた(p<0.05)。また、組織像において、骨芽細胞シート群では人工骨内に血管束から放射状に新生血管を認めたが、血管単独群では血管束と人工骨の周囲に軟部組織が介在しており、人工骨内の新生骨および新生血管をほとんど認めなかった。骨芽細胞シートを用いることによって、人工骨内部への新生血管の誘導および、血管束と人工骨の間を新生骨で充填できることが確認できた。血管束と人工骨の間を架橋できる骨芽細胞シートは、血管柄付き人工骨作製において有用である可能性が示唆された。7週齢

F344ラットの大腿骨骨髄から骨髄由来間葉系幹細胞(MSCs)を採取し、二次培養を行い骨芽培養シートを作成した。マイクロスコープを用いて11週齢F344ラットの大腿動静脈を血管束として挙上し、採取した骨芽細胞シートと共にβTCP(径6mm、長さ10mm、気孔率75%)に作製した側溝(幅2mm)に組み合わせたsV群、培養細胞播種βTCPと血管束を組み合わせたcV群、人工骨に血管束のみを組み合わせたV群を作製した(各群n=8)。術後4週でサンプルを摘出し、組織像およびreal time RT- PCRによりオステオカルシン(OC)、アルカリフォスファターゼ(ALP)、血管内皮増殖因子(VEGF-A)のmRNA発現量を測定し新生骨および新生血管を比較評価した。ラット大腿動静脈を血管茎として移植した人工骨モデルにおいて血管茎と人工骨の境界部にMSCsを高濃度で含有した骨芽細胞シートを配置する事により移植血管束周囲から人工骨内に旺盛な血管新生および骨新生が獲得できた。本技術を臨床的に応用する事により難治性偽関節治療における有用な治療戦略となりえる事が示唆された。平成22年度の実験結果から当初予定していた人工骨を血管柄付き骨膜でラッピングする実験モデルでは骨髄間葉系幹細胞の付加の有無による人工骨内への骨形成、血管侵入に差が見られなかった。そのため平成23年度に実験モデルの変更を行い、骨膜を含めずに血管束(動静脈)のみを挙上して、人工骨に作成した溝に血管束を付加した。以上の変更により実験の推進に予定より若干の遅れを生じている。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度の実験結果から骨芽細胞シートの血管柄付き人工骨作製における有用性が示唆されたため、平成24年度はさらに検体数を増やし、その有用背を証明するとともに、マイクロCTなどを使用して新生骨、新生血管の誘導形態や機序を解明してゆく予定である。さらにその結果について日本整形外科学会基礎学術集会および他学会にて報告予定である。
放射線発がん過程におけるカロリー制限による組織応答

カロリー制限による食事療法は、放射線被ばくによる発がんを抑制することが報告されているが、その効果には臓器特異性がみられ、発がん抑制のメカニズムは未だ完全には明らかにされていない。本研究では、カロリー制限と発がんの両方に深く関係しているオートファジーとアポトーシスのカロリー制限後の応答を肺や肝臓のような異なる臓器間で比較する事によって、発がん抑制効果に臓器特異性が生じる原因とカロリー制限による発がん抑制メカニズムを明らかにすることを目的とする。本研究では、カロリー制限と発がんの両方に深く関係しているオートファジーとアポトーシスの臓器における応答の違いが、カロリー制限による発がん抑制効果の臓器特異性に関わっていると仮定し、カロリー制限による発がん抑制効果が小さかった胸腺と大きかった肺、肝臓における放射線被ばく後のカロリー制限によるオートファジーとアポトーシスの誘導を比較することで、カロリー制限による発がん抑制効果に臓器特異性が生じる原因を明らかにすることを目的としている。本年度はオートファジー関連タンパク質(LC3、p62、Atg5、Atg7)の蛍光免疫染色に用いる抗体と至適条件を検討するため、24時間絶食したC57BL/6マウスの肝臓と生後1日齢の新生児マウスの組織切片を用いて蛍光免疫染色を行った。これらの組織切片を用いた理由は、飢餓状態にあるマウスや母親の胎盤からの栄養供給がなくなった新生児マウスにおいてオートファジーの活性が上昇することが報告されているためである。解析に使用する胸腺、肺、肝臓のサンプリングや組織切片の作成ついては、本年度はオスのB6C3F1マウスに1週齢時にX線3.8 Gyを照射し、7週齢から30%カロリー制限群と非制限群に分け現在飼育中である。今後、カロリー制限後の複数の時点で臓器のサンプリングを行い、組織切片の作成を行う予定である。また、マウスの体重については毎週測定を行っており、カロリー制限開始後2週間の時点でカロリー制限群と非制限群のマウスの体重に有意な差が生じており、カロリー制限実験は順調に進行していると考えられる。本年度は、24時間絶食したC57BL/6マウスの肝臓と生後1日齢の新生児マウスの組織切片を用いてオートファジー関連タンパク質(LC3、p62、Atg5、Atg7)の蛍光免疫染色に用いる抗体と至適条件の検討を行い、使用する抗体と至適条件を決定した。また、C3H/HeNマウスのオスと交配済みの妊娠後期のC57BL/6Nマウスを購入し、生まれたB6C3F1マウスのオスを1週齢時にX線3.8 Gyを照射した照射群と非照射群の2群に分けた。その後、7週齢から30%カロリー制限を行う制限群と非制限群に分け、4つの実験群の飼育を行っている。現在、4つの実験群ともに長期のタイムポイントである肝がん発症前の時期(28、42、57週齢)で解剖予定のマウスを飼育している。現在飼育しているマウスについては解剖予定の週齢まで引き続き飼育する。また、短期のタイムポイントであるX線照射直後(24、72時間)、カロリー制限直後(24、72時間)、胸腺リンパ腫発症開始前(8、10、14週齢)の時期に解剖するマウスの飼育を開始する予定である。また、上記のマウスが解剖予定の週齢に到達次第、臓器のサンプリングと組織切片の作成を行い、オートファジー関連タンパク質の蛍光免疫染色とウエスタンブロットによる解析を行う。

本年度は、24時間絶食したC57BL/6マウスの肝臓と生後1日齢の新生児マウスの組織切片を用いてオートファジー関連タンパク質(LC3、p62、Atg5、Atg7)の蛍光免疫染色に用いる抗体と至適条件の検討を行い、使用する抗体と至適条件を決定した。また、C3H/HeNマウスのオスと交配済みの妊娠後期のC57BL/6Nマウスを購入し、生まれたB6C3F1マウスのオスを1週齢時にX線3.8 Gyを照射した照射群と非照射群の2群に分けた。その後、7週齢から30%カロリー制限を行う制限群と非制限群に分け、4つの実験群の飼育を行っている。現在、4つの実験群ともに長期のタイムポイントである肝がん発症前の時期(28、42、57週齢)で解剖予定のマウスを飼育している。現在飼育しているマウスについては解剖予定の週齢まで引き続き飼育する。また、短期のタイムポイントであるX線照射直後(24、72時間)、カロリー制限直後(24、72時間)、胸腺リンパ腫発症開始前(8、10、14週齢)の時期に解剖するマウスの飼育を開始する予定である。また、上記のマウスが解剖予定の週齢に到達次第、臓器のサンプリングと組織切片の作成を行い、オートファジー関連タンパク質の蛍光免疫染色とウエスタンブロットによる解析を行う。