hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
視神経軸索投射の層・カラム特異的認識メカニズムの分子基盤

Fmiの機能解析をサナギ初期において初めて行ったところ、Fmiはフィロポーディアの形成と伸長を促進する機能を持っていることがわかり、Gogoはこれを抑制する機能を持っていることが分かった。このGogoの機能が、サナギ初期でR8軸索どうしが距離を一定に保つことにつながっている。サナギの後半でGogoの発現が弱くなると、Fmiのフィロポーディア伸長のスイッチが入り、R8がM3に到達することになる。これは、軸索どうしの一定間隔の維持に、フィロポーディアの活動を抑制するというGogoの機能が深く関係していることを示唆している。ショウジョウバエの視神経系を用いて、神経回路形成の分子メカニズムを解明する。我々は今まで新規膜受容体タンパク質であるGogoを同定し、その機能解析を行ってきた。Gogoはカドヘリンの一種であるFlamingoと強調して視神経の脳内の層特異的な投射を制御していることを明らかにした。それに加え、Gogoは脳内のカラム(柱)状構造を認識し、規則正しく投射させる機能も担っていることが分かっている。まずGogoリガンドを同定することを目的として研究を推進した。まず、カイコ細胞にGogoの細胞外ドメインを大量発現させるバキュロウィルスの系を立ち上げた。プラスミドを構築し、大量発現を試みた。GogoとFmiのC末端部にGFPを挿入し、細胞特異的にGogoとFmiとGFPの融合タンパクを形成するようなコンストラクトをハエのゲノム上にノックインした。これを使って、内在性のタンパク質の細胞内の局在を追うことが出来るようになった。Gogoはカドヘリンの一種であるFlamingoと協調して視神経の脳内の層特異的な投射を制御していることを明らかにした。それに関連して、LAR、Ptp69D、unc5、Netrinなどが密接に相互作用をしながら層特異的な投射をコントロールしていると考え、その全貌を明らかにしたいと考えている。それに加え、Gogoは脳内のカラム(柱)状構造を認識し、規則正しく投射させる機能も担っていると考え、その分子メカニズムを解き明かすことを目的に研究を進めた。まず、Gogoリガンドを同定することを目的としてカイコ細胞にGogoの細胞外ドメインを大量に発現させるバキュロウィルスの系を立ち上げたが、発現精製がうまくいかず、カリフォルニア工科大学に依頼して、大量発現と精製を行ってもらった。その結果、試行錯誤の結果、なんとかGogoの結合相手の発現パターンを胚の中枢神経で明らかにすることが出来た。また、生きた脳をそのまま切り、その断面を染色する方法も開発した。その副産物として、LARやPtp69Dの細胞外ドメインを用いて、そのリガンドの発現パターンを発生途中の脳で可視化することが出来るようになった。これを使って、候補となる変異体にバインドさせる染色に取り掛かることが出来る。また、GogoタンパクのC末にGFPを融合させ、GFPの局在を追うことによって、Gogoの局在が詳細に分かるようになった。その結果、Gogoの発現はサナギ中期までは認められるが、それ以降は発現が消滅していると考えられる。少数のGogoのクローンを作成すると、サナギの中期までは相当数細胞が見られるのに、大人になるまでにメダラ内に残っているgogo変異体R8が激減する。カラム内に侵入するのに競争原理が働くことが示唆され、それにGogoが関与していることが分かった。(理由)Gogoの発現・局在を細胞特異的に詳細に解析することが出来るようになり、GogoはM1層での固着・認識に関係しており、M3層への投射には関係ないことが分かり、新たな知見を得ることが出来た。やはり、Gogoはカラムのポケットのような入り口を認識することがその重要な役割だと認識を新たにした。最終年度はGogoの機能的な解析に力を入れて、彷徨うGogo変異体の軸索の行方をしっかりと追跡し、カラム認識機構の普遍的な原理を見出すことを目標とする。その目標に向かって、概ね順調に研究が進んでいると言える。ショウジョウバエの視神経系を用いて、神経回路形成の分子メカニズムを解明する目的のため、我々は新規膜受容体タンパク質であるGogoを同定し、その機能解析を行ってきた。今までの研究の流れとは少し視点を変え、原点に立ち戻り、R8視神経特異的なGogo変異体を作成した。この変異体では、R8軸索がサナギ初期の段階で、M1層に整列してとどまることが出来ず、一時的に深く潜り込んでしまう。さらに、軸索同士の距離を保つことが出来ずにお互いにくっついてしまうR8が頻出した。しかし、ここまでは今までのGogoの変異体の解析からある程度予想されていたことではある。Gogoのこの二つの機能を解くカギは、Fmiの過剰発現体と変異体の解析に潜んでいた。

Fmiの機能解析をサナギ初期において初めて行ったところ、Fmiはフィロポーディアの形成と伸長を促進する機能を持っていることがわかり、Gogoはこれを抑制する機能を持っていることが分かった。このGogoの機能が、サナギ初期でR8どうしがくっつかないように距離を一定に保つことにつながっていると考えられる。サナギの後半でGogoの発現が無くなると、Fmiのフィロポーディア伸長という機能にスイッチが入り、R8がM3に到達することになる。これらのことは、層特異的な軸索投射も、軸索どうしの一定間隔の維持にも、フィロポーディアの活動を抑制するというGogoの機能が深く関係していることを示唆しており、GogoとFmiの真の機能が層・カラム特異的に重要な役割を果たしていることを明らかにしたと考えている。このGogoの機能が、サナギ初期でR8軸索どうしが距離を一定に保つことにつながっている。サナギの後半でGogoの発現が弱くなると、Fmiのフィロポーディア伸長のスイッチが入り、R8がM3に到達することになる。これは、軸索どうしの一定間隔の維持に、フィロポーディアの活動を抑制するというGogoの機能が深く関係していることを示唆している。まずGogoリガンドを同定することを目的として研究を推進した。まず、カイコ細胞にGogoの細胞外ドメインを大量発現させるバキュロウィルスの系を立ち上げた。プラスミドを構築し、大量発現を試みた。GogoとFmiのC末端部にGFPを挿入し、細胞特異的にGogoとFmiとGFPの融合タンパクを形成するようなコンストラクトをハエのゲノム上にノックインした。これを使って、内在性のタンパク質の細胞内の局在を追うことが出来るようになった。大量発現がうまくいけば、計画を順調に進めることが出来るので、概ね順調に進行していると言える。Gogoの変異体の継時的で網羅的な解析を再びやり直し、カラム形成の継時的なイベントの詳細な解析を通して、興味深い点を洗い出す。特異な分子遺伝学的アプローチをとりいれつつ、Gogoの細胞外ドメインの染色によるGogoリガンドの探索を本格的に行う。まずは、候補遺伝子を幾つか試して、スクリーニング法の確立とリガンドの同定を目指す。Gogoとunc5の協調性にも着目し、unc5変異体の作成や発現の解析も行う。これらの科学的・技術的な総力を結集して、研究全体が結実するように強力に推し進めていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。神経生物学大量発現系を試みたが、色々とノウハウが分からないので、外部機関のサービスを使って大量発現することを試みている。消耗品を最終年度に予定以上に使用する必要が出てきたため。ショウジョウバエの飼育費など、消耗品費により多く使用していく。
中学校理科教育における無線LANに接続したタブレットPCを用いた指導方法の開発

・研究目的タブレットPCは画面にペン等で直接書き込んで入力することができる情報機器である。紙などに書くのと同じような感覚で操作できるため、思考したことを表現する場合は非常に自由な活動が期待できる。和歌山市では2007年より小学校の国語と社会を中心にタブレットPCの活用方法の検討が始まっているが、中学校理科における検証はまだ行われていない。そこで本校の理科で大切にしている「科学的に考える力を養うため授業」や本校の研究課題である「言語活動を充実させる授業」という観点で、主に発表の場面でのタブレットPCの有効な活用方法について検証した。・研究方法中学校3年生理科において、生徒機として4人の班にタブレットPCを1台を割り当てて、無線LANによるネットワーク環境を用いながら授業を行った。・研究成果科学的に考える力を養うためには、実験観察の結果を客観的に分析して、自分なりの意見をしっかりと持たせ、他者と意見を交流させることが大切だと思われる。タブレットPCを用いると話しあいながら、紙に書く感覚で自分たちの考えを練り上げることができ、そのまま発表へとスムーズにつなげることができた。無線LANの環境をうまく使うと、班で発表するときにプロジェクタの大画面と実験机にある残りの9台のPCの画面に同時に映すことができるため、説明を聞く側も近くの画面で見られて、画面に書き加えながら説明するという使い方もできた。こうした聞き手を意識した説明やまとめる作業を繰り返すことで、自然と表現力や思考力が高まっていくと考えられる。ただ、タブレットPCは独特の操作感もあるため使いこなすにも継続的な使用が必要なようである。
採食行動の進化における腸内細菌の役割

窒素固定酵素は窒素分子の三重結合を開裂する作用を有するが、青酸(シアン化水素)に含まれる炭素窒素間の三重結合も開裂することが知られている。窒素固定酵素は窒素固定細菌によって生産されるため、窒素固定細菌も青酸を分解することが可能であると考えられる。そこで、当教室に保管されている窒素固定細菌が青酸を分解することができるかどうかを検討するため、第一に青酸分解を簡便に判別することが可能な青酸分解判定培地を作製した。本培地は、青酸を勇逸の窒素源とし、またその他に糖、ミネラル、ビタミンを含有し、かつ培地のpHを示すpH指示薬ニュートラルレッドを含む。青酸分解をpH指示薬の変化をもって簡便に知ることができる。その変化は以下の通りである。培養初期において、細菌は培地中の糖を資化することによって培地のpHを下げる。それゆえ、pH指示薬ニュートラルレッドは黄色を呈する。その後、青酸分解を窒素源として利用可能な状態では窒素代謝の結果培地のpHはアルカリ側に傾くため、pH指示薬は赤からオレンジを呈する。同時に、窒素固定遺伝子を欠損させた変異株を作製し、野生株と変異株を上記培地に供試し、培地のpH指示薬の変化を観察した。その結果、野生株では最終的に培地はオレンジ色を呈したが、変異株では黄色のままであった。呈色変化の強い株を選択し、以降の実験に用いることとした。また、窒素固定酵素は数多くの構成遺伝子や制御遺伝子の働きの結果生産され、これらの遺伝子はひとまとまりとなってゲノムに存在する。本窒素固定細菌において、正の制御遺伝子を欠損させた場合、上記の呈色変化は認められなかった。研究実績の概要に記されるように、おおむね順調に進展しているといえる。得られた菌株を動物実験に供試可能かどうかの予備的検討を行う。次年度使用額が生じたが、その額は次年度に請求される助成金の10余%程であり、次年度の計画に大きな変更をもたらすことはない。いくつかの試薬を年度末以降に購入したため。
既存住宅の平均寿命の推移から推測する今後の住宅ストックの動向

大阪府内3地域の固定資産台帳による木造専用住宅の調査結果を用いて次の3点、(1)1975年以降における木造専用住宅の平均寿命の推移とその傾向、(2)除却家屋の建設時期・除却時期による寿命や延床面積と社会背景との関係性、(3)従来よりも高精度の算出方法を用いて2030年までの木造専用住宅のストック数の推移、を把握することで、今後の木造専用住宅ストックの動向とその対応を考察する方向性を示す。本研究は、固定資産台帳の調査から得られたデータから既存住宅の平均寿命の推移を明らかにすること、その結果から今後の住宅の着工棟数及び除却棟数の推計を行うことで2030年までの住宅ストックの動向を明らかにすることを目的としている。なお、平成19年度の研究範囲は今日までの住宅に平均寿命を算出することであったが、現時点で以下の3項目の成果を得られた。1.固定資産台帳に基づき、建物の中でも比較的規模などが均一で棟数が多い木造専用住宅の建設年別に平均寿命を算出した。2種類の平均寿命の算出手法を用いて、1950年から1975年までの平均寿命の推移と1970年から2006年までの平均寿命の推移が明確になった。平均寿命の推移から住宅の質・量の現状を把握・分析する重要な指標の一つとして活用可能である。2.建物の滅失実態は、構造・用途等の建物属性に関する論議が中心であり、社会・経済状況の観点より論議されたものは少ない。そこで統計手法を用いて今後の住宅ストックの動向予測のための資料となる建物の滅失棟数と社会・経済状況の関係が明確になった。住宅事情の分析ばかりでなく、今後の住宅産業の動向を考察する上での一つの方向性を提示することができた。3.木造専用住宅の延床面積と寿命の関係、特に年次別に見た延床面積と寿命の関係について分析を行った研究は少ない。そこで1951年以降に建設された木造専用住宅を対象とし、延床面積と寿命の関係について詳細に分析を行い、住宅の延床面積と寿命の関係には地域差が大きな影響を与えていることが明確になった。今後の住宅産業や住宅政策を考察する上で、重要な視点を提示することができた。なお、平成20年度の研究範囲は2030年までの木造専用住宅ストックの動向を明らかにすることであるが、現時点で以下の3項目の成果を得られた。1.本年度も昨年度に引き続き固定資産台帳に基づき、建物の中でも比較的規模などが均一で棟数が多い木造専用住宅の建設年別に平均寿命を算出した。2種類の平均寿命の算出手法を用いて、1975年から2007年までの平均寿命の推移が明確になった。2.これまでの平均寿命の算出結果を基に、3地域における木造専用住宅の2030年までのストックの動向を算出した。なお現時点では、研究成果について学会等で発表を行っていないが、現在結果をまとめて近日中に日本建築学会計画系論文集、同生産シンポジウムなどに投稿する準備を行っている。3.今後の住宅ストックの動向は、立地(地域)によって大きく傾向が異なることが判明したが、木造専用住宅については2030年頃がストック数のピークであると考えられる。また、住宅の寿命に影響を与えている延床面積についても社会指標を用いて回帰式で予測することが可能であることが判明した。以上の結果、今後の住宅産業や住宅非策を考察する上で、重要な視点を提示することができた。
コンピュータを用いた視標追跡眼球運動の定量解析とその応用

現在の視標追跡眼球運動検査(ETT)においては,滑動性追従眼球運動(SPEM)と衝動性眼球運動(Saccade)のコンビネーションを評価しているが,これらはその特性や中枢経路からも全く別の系である.両者を分離して評価し,めまい平衡障害が,末梢性であるか中枢性であるかをより鋭敏に,簡便に鑑別可能な検査法が期待されている.われわれはこれまで従来のETTの刺激を工夫することで,この目的がかなえられる可能性を見いだした.すなわち,saccadeの影響をできるだけ少なくし,SPEM機能の評価のために,点視標とパターン視標の2種類を用い,振子様刺激した.刺激波は,正弦波とPseudorandom波の二つであり,正弦波は,0.2,0.4,0.8Hzの周波数で,振幅を種々変えたもの,Pseudorandom波は,最大角速度が一定となるような,0.2,0.4,0.8Hzの正弦波を位相についてランダムに合成したものとした.被検者として脊髄小脳変性症などの中枢性眩暈平衡障害の患者やメニエール病などの末梢性眩暈患者を対象とした.眼球運動は2D-VOGで記録し,コンピュータに取り込んだ後,我々の開発したプログラムを用いて,利得,位相を求めた.メニエール病などの末梢性前庭障害では,点視標とパターン視標で刺激の角速度による利得の有意な差は認めなかった.一方脊髄小脳変性症例において,周波数の高い刺激になると,点視標でみられるような利得低下が,パターン視標では認めなかった.ただしラクナ梗塞の症例では,こうした傾向は明らかではなかった.脊髄小脳変性症例では,saccade機能が悪いために,点視標で誘発されるSPEMが不良となるが,これに対してパターン視標刺激では,saccade機能に依存しないので,より正確なSPEM機能を評価でき,軽度の追従眼球運動障害を検出するのにMRIよりも鋭敏である症例の存在が示唆された.平成11年度はSMI社製ビデオ式眼振計測装置・2DVOGを購入し,眼球運動をデータレコーダ,ポリグラム,コンピュータに取り込むシステムを構築した.眼球運動誘発用視覚刺激装置(第一医科製)を刺激波形作成用および出力用コンピュータにより駆動するが,前者で種々の振幅と周波数の正弦波をつくった.また,0.1,0.2,0.4,0.8Hzの最大角速度が一定である正弦波を位相がランダムになるように組み合わせ,Pseudorandom波も試作し,これらの波形が実際に正確に出力,駆動されることを確認した.2DVOGは,瞳孔中心の位置の軌跡で水平,垂直2方向の眼球運動を表しており,通常の電気眼振図より計測が簡便で,侵襲が少なく,S/N比が大きいという利点がある.一方,瞳孔中心を認識する必要があるため,瞼裂の狭い被験者や瞬目が多い患者などでは眼球運動の精度に多少問題があることがわかったが,これらの点は電気眼振計での記録でも同様であり,また瞳孔中心を認識する閾値を調節することで改善されることがわかった.従来の電気眼振系ではS/N比が悪いため,小さな眼球運動とノイズと区別することが困難であり,視覚刺激として振幅の小さな正弦波やこれを含むPseudorandom波は制限されていたが,2DVOGにおいてこれらの刺激を用いても良好に眼球運動を記録することができ,眼球運動障害の分類を更に細分化することができると期待している.現時点では,正常被験者のデータを主に集積しており,これと並行して末梢性めまいの代表的疾患である,メニエール病の患者も徐々に対象として検査を行っている.向後中枢系めまい平衡障害患者に対象を広げ,追跡眼球運動の予測制御系に関した障害の有無あるいは,滑動性追従眼球運動系そのものの障害か衝動性眼球運動の障害かを明らかにする,すなわち病巣局在の鑑別の細分化が可能となることが期待される.現在の視標追跡眼球運動検査(ETT)においては,滑動性追従眼球運動(SPEM)と衝動性眼球運動(Saccade)のコンビネーションを評価しているが,これらはその特性や中枢経路からも全く別の系である.両者を分離して評価し,めまい平衡障害が,末梢性であるか中枢性であるかをより鋭敏に,簡便に鑑別可能な検査法が期待されている.われわれはこれまで従来のETTの刺激を工夫することで,この目的がかなえられる可能性を見いだした.すなわち,saccadeの影響をできるだけ少なくし,SPEM機能の評価のために,点視標とパターン視標の2種類を用い,振子様刺激した.刺激波は,正弦波とPseudorandom波の二つであり,正弦波は,0.2,0.4,0.8Hzの周波数で,振幅を種々変えたもの,Pseudorandom波は,最大角速度が一定となるような,0.2,0.4,0.8Hzの正弦波を位相についてランダムに合成したものとした.被検者として脊髄小脳変性症などの中枢性眩暈平衡障害の患者やメニエール病などの末梢性眩暈患者を対象とした.眼球運動は2D-VOGで記録し,コンピュータに取り込んだ後,我々の開発したプログラムを用いて,利得,位相を求めた.メニエール病などの末梢性前庭障害では,点視標とパターン視標で刺激の角速度による利得の有意な差は認めなかった.

一方脊髄小脳変性症例において,周波数の高い刺激になると,点視標でみられるような利得低下が,パターン視標では認めなかった.ただしラクナ梗塞の症例では,こうした傾向は明らかではなかった.脊髄小脳変性症例では,saccade機能が悪いために,点視標で誘発されるSPEMが不良となるが,これに対してパターン視標刺激では,saccade機能に依存しないので,より正確なSPEM機能を評価でき,軽度の追従眼球運動障害を検出するのにMRIよりも鋭敏である症例の存在が示唆された.
歯髄幹細胞による中枢神経組織再生

歯髄幹細胞の性状解析を行い神経系譜に近い性状を示す細胞集団であることを明らかにし、歯髄幹細胞を効率的にドーパミン神経細胞に分化誘導することに成功した。歯髄幹細胞を用いた神経再生医療の実現を目指し、脊髄損傷、脳室周囲白質軟化症、パーキンソン病治療への歯髄幹細胞移植による治療効果を検証した。歯髄幹細胞は骨髄間葉系幹細胞を遥かにしのぐ神経再生効果を発揮する間葉系幹細胞であることを明らかにした。脊髄損傷は損傷部位より下位に重篤な機能障害塗もたらします。その病態は複雑であり有効な治療法が開発されていません。我々は、医療廃棄物であるヒト脱落乳歯や抜去した親知らずから採取した歯髄幹細胞による新しい脊髄損傷治療の可能性を見いだしました。さらに歯髄幹細胞が3つの再生メカニズムを発揮することで中枢神経を再生することを明らかにしました。完全に切断したラット脊髄に歯髄幹細胞を移植すると下肢運動機能が回復します。移植した歯髄幹細胞は、(1)神経保護効果:神経損傷に伴う脊髄細胞の死を効率に抑制します。(2)抗-軸索伸張抑制因子効果:中枢神経の損傷部位にはグリア瘢痕が形成されます。グリア瘢痕は、神経軸索の伸張や再生を抑制する様々な分子を産生し神経再生を抑制します。歯髄幹細胞から分泌される因子は、グリア瘢痕由来の軸索伸張抑制分子の効果を掬制し脊髄神経の再生を促します。(3)細胞補給効果:中枢神経では軸索を覆う髄鞘によって神経伝達速度が維持されていますが、神経損傷によってこの髄鞘を形成する細胞(オリゴデンドロサイト)が消失します。脊髄損傷部位に移植した歯髄幹細胞は、オリゴデンドロサイトに特異的に分化し髄鞘の再生に貢献します。重要なことに治療効果(2)および(3)は他の生体幹細胞では報告のない、歯髄幹細胞に特異的な神経再生能力でした。実際、「歯髄幹細胞移植による下肢運動機能の回復効果は、骨髄由来の幹細胞より強力であることが明らかとなっています。さらに、歯髄幹細胞は不要となった生体組織から採取可能であるため幹細胞採取による生体侵襲は無視できるほどです。またラット脊髄に移植した歯髄幹細胞の腫瘍形成能は検出されませんでした。本研究成果は有効な治療法のない脊髄損傷の治療に新しい可能性を提供するだけでなく、医療廃棄物の有効利用に道を開く画期的な研究成果です。脊髄損傷は損傷部位より下位に重篤な機能障害をもたらします。歯髄幹細胞から分泌される因子は、グリア瘢痕由来の軸索伸張抑制分子の効果を抑制し脊髄神経の再生を促します。実際、歯髄幹細胞移植による下肢運動機能の回復効果は、骨髄由来の幹細胞より強力であることが明らかとなっています。歯髄幹細胞の性状解析を行い神経系譜に近い性状を示す細胞集団であることを明らかにした。歯髄幹細胞を効率的にドーパミン神経細胞に分化誘導することに成功した。ラットパーキンソン病モデルを制作し、ドーパミン産生細胞に分化したヒト歯髄幹細胞を線条体に移植し、神経機能改善を確認した。さらに未分化な歯髄幹細胞をラット完全脊髄切断モデルに移植し治療効果を検証した。

歯髄幹細胞移植群は、脊髄損傷による細胞死、軸索や髄鞘の破壊を効率よく抑制した(神経保護効果)。損傷した中枢神経の軸索は再生しないことが知られている、損傷部周囲グリア瘢痕の活性化アストロサイトが産生するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンによる軸索伸張阻害効果によるところが大きい。歯髄幹細胞は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンによる軸索伸張阻害効果に対して拮抗作用を発揮することで切断した軸索の再生を促すことを見いだした。また移植した歯髄幹細胞は脊髄損傷環境下においてオリゴデンドロサイトに特異的に分化することを見いだした。歯髄幹細胞移植による脊髄損傷ラットの機能改善は骨髄間葉系幹細胞や線維芽細胞移植群と比べて著しく優れていた。我々は、さらに歯髄幹細胞をマウス新生児脳室周囲白質軟化症モデルに移植、あるいは歯髄幹細胞の無血清培養上清をし治療効果を確認した。細胞移植でも培養上清投与でも同様の高い神経機能の回復を確認した。遺伝子発現解析から歯髄幹細胞は損傷脳の組織破壊型炎症反応を抑制することで高い治療効果を生み出すことを見いだした。完全に切断した脊髄に移植した歯髄幹細胞が3つの神経再生効果で機能回復に寄与することを報告した。この研究成果はJournal of Chnical Investigationのニュースで取り上げられただけでなく、確認しただけでも50社の以上の国内外報道機関で取り上げられる極めてインパクトの高い研究成果として発表することができた。3年前に本研究プロジェクトを立ち上げてから短時間で大きな成果を得ている。また、この発表は歯髄幹細胞の神経分化能の詳細な検討にも大きく貢献するものであった。移植した歯髄幹細胞が脊損環境下でオリゴデンドロサイトに特異的に分化することを確認している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の課題は、1)歯髄幹細胞の神経分化能の解析、2)歯髄幹細胞の培養上清を用いた治療法の開発、3)慢性脊髄損傷への治療法開発、4)霊長類モデルを使った神経再生研究に関し研究を進める。
末梢性肺腺癌の発生病理ならびに組織亜型分類に関する分子病理学的研究

乳頭状肺腺癌48例(クララ細胞型:27例、II型肺胞上皮型:7例、肺細胞型:8例、粘液非産生性気管支表面上皮細胞型:6例)を対象とし、CC10(クララ細胞分泌蛋白)、SP-A、SP-Bの発現を検討した。尚、組織亜型は下里分類に準拠した。CC10抗体は、ヒトCC10一次構造より2ヶ所(N末側:CC10(N),C末側:CC10(C)と略す)を選択、MAP法(多抗原ペプチド法)により、アミノ酸を合成し家兎を免疫し作製した。腫瘍部におけるSP-A、SP-B、CC10(N)の発現頻度は、それぞれクララ細胞優位型で、85%、96%、52%、II型肺胞上皮優位型で86%、86%、57%であり、SP-A、SP-Bの高い発現傾向が認められた。CC10の発現頻度はいずれの型でも低く、CC10の発現が癌化いん伴い抑制されている可能性が考えられた。しかし、細胞形態的には陽性細胞はいずれの型でもクララ細胞様の腫瘍細胞に発現を認め、クララ細胞様腫瘍組織形態とCC10発現がよく相関し、クララ細胞が肺腺癌の発生母細胞の一つである可能性が示唆された。次に、これらの検索対象症例48例につき、CC10,SP-A,Bそれぞれの発現態度と予後との関係について統計学的に比較検討を行った。全例については、5年生存率:60.1%、中間生存値:29か月、最長予後調査期間:103か月であった。全例ではCC10陽性例が陰性例より予後が良い傾向にあったが統計学的有意差は認めなかった。さらにクララ型とII型について検討すると、CC10陽性例が陰性例に比して予後が良好であった(P<0.05)。これら症例についてSP-A、B発現の予後に与える影響を検討するとSP-A、Bのいずれについても統計学的有意差はなかった。以上より、クララ細胞型とII型肺胞上皮腺癌について、CC10は生物学的予後因子の一つであることが明らかとなった。
組織特異的なエンハンサーにわる転写制御機構

さきに、ニワトリδ-クリスタリン遺伝子第3イントロンの中に水晶体特異的に作用するエンハンサーがあることを見出していた。本研究においては、そのエンハンサーの作用機構を解析し、遺伝子発現制御の中で果たす役割を明らかにした。1.固体への遺伝子導入δ-クリスタリン・エンハンサーを下流に持ったtkCAT遺伝子を、エンハンサーを持たないneo遺伝子とともにES細胞に導入し、それを用いて、遺伝子導入キメラマウス胚を作出した。それらの遺伝子導入マウス胚では、CAT遺伝子の発現は水晶体に限定されていた。この結果から、δ-クリスタリン発現の組織特異性は、第3イントロン内のエンハンサーだけで説明されうることが明らかになった。2.エンハンサーの分割δ-クリスタリン・エンハンサーの領域を細分して解析した。その結果、(1)δ-クリスタリン・エンハンサーにはコア領域が存在すること、(2)コア領域の重合体は純粋に水晶体特異的なエンハンサー活性を持つこと、(3)コアの上流側の領域の重合体が非特異的なエンハンサー活性を持つこと、(4)δ-クリスタリン・エンハンサーの働きが組織特異的な領域と非特異的なった領域との協同作用によるものであることが明らかになった。
配座固定ペプチドを利用したポリグルタミン病の分子機構研究

長さの均一なポリグルタミンペプチドを固相法により合成し、アミロイド染色試薬チオフラビンTを用いた染色実験に供した結果、チオフラビンT被染色性凝集体を形成する最短のポリグルタミンは7残基であることが明らかとなった。また、重水素標識チオフラビンTと^<13>Cおよび^<15>N標識グルタミンを合成し、固体NMRによるポリグルタミン-チオフラビンT複合体の構造解析を試みた。本研究の達成目標は固体NMRによるポリグルタミン毒性凝集体の構造解明である。固体NMR測定には試料を約10 mg調製する必要があるが、水、有機溶媒に不溶な凝集体を形成しやすいポリグルタミンを数十mgスケールで合成、精製することは困難であった。そこで、初年度はポリグルタミンの効率的合成および精製の検討、および凝集体形成に必要な最小ユニットの探索をおこなった。まず初めに、長さの異なるポリグルタミンを自動固相合成により調製した。側鎖アミドをトリチル基で、主鎖アミンをFmoc基で保護したポリグルタミン保護体は、有機溶媒に良い溶解性を示す。この性質を利用し、純相HPLCを用いた保護体の精製により長さの均一なポリグルタミン保護体を調製することに成功した。得られた保護体は、ピペリジン、続いてトリフルオロ酢酸による脱保護に供し、単一の長さを有するポリグルタミン試料とした。次に、長さの均一なポリグルタミンを用.いて、ポリグルタミンの長さと凝業体形成能の関係を精査した。ポリグルタミンの毒性は凝集体形成過程で発現すると考えられており、凝集体を形成しうるポリグルタミンの長さを正確に把握することは、毒性発現機構の解明に必須であった。凝集体形成の確認には、チオフラビンTによる蛍光染色実験を適用した。今回の我々の研究で凝集体形成が確認された最短のポリグルタミン長は、残基数7であった。これは一般的に認識されているポリグルタミンの毒性発現長(40残基)に比べ、はるかに短い長さである。今後は、本研究で発見されたポリグルタミン凝集体の最小ユニットを、固体NMRを用いて精密に構造解析することで、ポリグルタミン病の分子機構に迫りたい。ハンチントン病に代表されるポリグルタミン病では、正常タンパク質のポリグルタミン領域が遺伝子変異により異常延長することで細胞内凝集を起こし、その過程で知能障害や運動障害を起こすと考えられている。本研究の目的は、ポリグルタミンの形成する凝集体の精密構造を固体NMRにより決定し、ポリグルタミン病の分子機構を解明することを目標としている。昨年度までに、凝集体を形成する最短のポリグルタミンペプチドは7残基であることを明らかにした。今年度は(1)短鎖ポリグルタミンペプチドが凝集体内で形成する二次構造の同定と、(2)アミロイド様凝集体の染色試薬であるチオフラビンT(ThT)を指標とした、ThT被認識ポリグルタミン凝集体の構造解明を目的とした、^2H標識ThTの合成を行った。(1)510残基の合成ポリグルタミンの固体13C NMRを測定し、化学シフト値を調査したところ、全ての試料においてβ-sheet構造に相当するシグナルが、50%以上の含有率で確認された。この結果から、短鎖ポリグルタミンは主にβ-sheet構造を取っていることが予想され、アミロイド凝集体構造の単純化モデルとして有用であると考えられた。(2)^2H標識ThT(ThT-d_3)を市販のチアゾール誘導体とヨードメタン-d_3から4工程でThT-d_3を合成した。ThT-d_3と非標識の7残基ポリグルタミンペプチドの混合試料を用いて、^<13>C観測-^2H照射回転エコー二重共鳴(REDOR)実験を行い、ThT-d_3とポリグルタミンペプチド間に^2H-^<13>C双極子相互作用を観測した。現在、得られた双極子相互作用の解析と^<13>C-^2H原子間距離測定を進めている。
不飽和状態を考慮したローカル土の動的せん断挙動評価手法の構築

2016熊本地震や2011東日本大震災などの既往の地震地盤災害において自然斜面や盛土斜面が泥状になり流下する流動性崩壊が多大な被害をもたらしている.本研究では,地震中,後の土砂中の間隙空気・間隙水そのものの挙動やせん断変形挙動への影響を明らかにし流動性崩壊の発生流動の一連のメカニズム解明,危険度評価手法の構築を目指すため,崩壊土砂中の空気・水分状態を模した不飽和土に対して非排気・非排水繰返しせん断試験を実施しせん断変形挙動の把握を行った.その結果,従来想定されていなかったようなかなり低い飽和度であっても,水分状態や気泡によっては容易に液状化し流動化する等の知見が得られた.2011東日本大震災等の既往の地震地盤災害において緩勾配の盛土斜面が泥状になり大規模に崩壊・流下する流動性崩壊の被害例がある.これらの崩壊は,人的被害や二次災害の危険性が高いにもかかわらず,崩壊土砂が不飽和状態であるため飽和地盤の液状化問題と比べ研究は進んでいない.本研究では,崩壊土中の空気・水分状態を模した不飽和土へせん断試験を実施し,未だ解明されていない地震中・後の土砂中の間隙空気・間隙水そのもの挙動やせん断変形挙動への影響を明らかにする.そして,その結果より流動性崩壊の発生流動の一連のメカニズム解明し,危険度評価手法の構築を目指す.この目標に対して本年度は,以下の内容を実施した.1.過去の地震で流動性崩壊が生じた崩壊地区からの試料採取:盛土斜面や自然斜面の流動性崩壊事例は,国内では第四紀火山灰分布地域を中心に数多く発生しており1984年長野県西部地震の御岳崩れに代表されるような大規模な崩壊事例が幾つか存在する.本研究では,栃木県県土整備部の協力のもと2011年東北太平洋沖地震において土砂崩壊が発生した栃木県那須烏山市川西地区,高根沢町上柏崎地区の崩壊現場について現場調査を行うとともに実験用試料として土砂を採取した.2.不飽和土の動力学挙動に対する間隙空気の状態や水分状態の影響の解明:採取した崩壊土砂に対して飽和繰返しせん断実験,および不飽和繰返しせん断実験を実施し,液状化強度やせん断変形挙動に対する間隙空気と水分状態の影響について調べた.その結果,両崩壊土砂の持つ液状化強度は中密な"きれいな砂"と同じ程度であり液状化抵抗が極端に小さいことが判明した.特殊土および不飽和土の繰返しせん断実験が実施可能なように装置を改良し,繰返しせん断実験を行っている.改良箇所は,せん断中における間隙空気の微小な体積変化を高精度で計測するためにせん断応力を制御するためのサーボ式空圧バルブとその制御機器,および計測精度の高い体積変化計と動ひずみアンプおよび計測センサー,制御用PCの導入である.本研究で改良した実験装置は,間隙空気圧と間隙水圧を個別計測可能であり,また任意の周波数で繰返しせん断が与えられる高精度のものであるが,実験は問題なくできている.この際に用いる土については2011年東日本大震災で崩壊した栃木県内の斜面より火山灰質土や火力発電所から排出される石炭灰など特殊土を現地から採取して実施している.得られた成果については,地盤工学会や土木学会の年次大会で発表を予定している.次年度については次のステップとして,さらに実験を追加するとともに,数値解析等にも着手する予定である.既往の地震地盤災害において自然斜面や盛土斜面が泥状になり流下する流動性崩壊が多大な被害をもたらしている.本研究では,崩壊・流動中の土砂内間隙空気,間隙水そのものの挙動やせん断変形挙動への影響を明らかにし,その結果より流動性崩壊の発生流動の一連のメカニズムを解明し,危険度評価手法の構築を試みた.研究より得られた知見は以下の通りである.1.繰返しせん断変形挙動に基づく流動性崩壊危険土砂の判別:複数の火山灰起源土や工業用硅砂を用いて繰返しせん断試験を実施し次の知見を得た.1非排気・非排水条件下で動的載荷された場合,負のダイレイタンシーによる体積収縮が起きることから,火山灰起源に関係なく通常液状化判定が必要になる土であれば,初期飽和度によっては十分に液状化に至り,崩壊する危険性を有する.2火山灰起源の有無による変形挙動の差は,特に低い含水状態時において顕著化する.他方,同一火山灰質土では,細粒分含有率が高いほうが有効応力はゼロに至り易い.2.流動崩壊中の土中間隙空気・間隙水の変形挙動への影響:流動中における土砂中の間隙空気・間隙水の挙動を明らかにするため工業用硅砂に対してコンクリート工学分野で使用される高流動補助剤である空気連行剤(AE剤)を添加させ,非排気・非排水条件下で繰返しせん断試験を実施した.得られた知見は次の通りである.1AE剤を添加し強制的に高流動化すると無添加では液状化に至らなかった外力条件でも有効応力がゼロに至り液状化する結果となった.この結果によれば,従来想定されていなかったようなかなり低い飽和度であっても,水分状態がAE剤添加時と同じ状況であれば,土は容易に液状化し流動化する.2高流動化した状態では,液状化強度のみ変化するだけでなく繰返しせん断変形挙動そのものが変化する.流動化試料の場合,繰返しせん断時の応力履歴や有効応力の挙動そのものが大きく変化する.2016熊本地震や2011東日本大震災などの既往の地震

地盤災害において自然斜面や盛土斜面が泥状になり流下する流動性崩壊が多大な被害をもたらしている.本研究では,地震中,後の土砂中の間隙空気・間隙水そのものの挙動やせん断変形挙動への影響を明らかにし流動性崩壊の発生流動の一連のメカニズム解明,危険度評価手法の構築を目指すため,崩壊土砂中の空気・水分状態を模した不飽和土に対して非排気・非排水繰返しせん断試験を実施しせん断変形挙動の把握を行った.その結果,従来想定されていなかったようなかなり低い飽和度であっても,水分状態や気泡によっては容易に液状化し流動化する等の知見が得られた.繰返し載荷実験については,今年度同様の飽和・不飽和試料を用いて実験を行う.この際には,粒度分布や粒径を変化させた実験を行い,本年度得られた結果と比較する予定である.また,得られた実験結果について土骨格・間隙水・間隙空気を扱った三相系多孔質体理論と簡易な弾塑性構成式による液状化解析法を用いて不飽和繰返し三軸試験のシミュレーションを実施し,不飽和土を対象とした動的解析上における間隙空気や水分状態の影響の程度について検討を行う予定である.なお,本年度に得られた成果については,地盤工学会や土木学会の年次大会で発表を予定している.次年度については次のステップとして,さらに実験を追加するとともに,数値解析等にも着手する予定である.地盤工学
慢性疼痛に対する選択的Nav1.9阻害薬開発を目指したNav1.9の抑制機序解明

炎症性疼痛や神経障害性疼痛を成因とする慢性疼痛は治療困難な例が多く、有効な鎮痛薬を開発すべく慢性疼痛の病態について研究が進められてきた。慢性疼痛発生機序に関わる多くの分子が報告されており、これらをターゲットにした鎮痛薬の開発が行われてきたが、その複雑な病態のため、難治症例に対する有効な鎮痛薬は未だ存在せず、新たな鎮痛薬の開発が強く望まれている。電位依存性ナトリウムチャネル(Nav)サブユニット、Nav1.9も慢性疼痛発生機序に重要な役割を持つことが示されているが、これに対する選択的阻害薬は未だ開発されていない。そこで、慢性疼痛に対する新たな鎮痛薬としての選択的Nav1.9阻害薬開発への貢献を目指し、Nav1.9の抑制機序に関する分子レベルでの解明を計画した。1電気生理学的手法(アフリカツメガエル卵母細胞発現系)を用いたNav1.9に対する鎮痛薬の影響解析、2電気生理学的手法と分子生物学的手法を用いた遺伝子変異型Nav1.9に対する影響解析と、Nav1.9のみを選択的に阻害するために重要な部位の同定、3Nav1.9遺伝子変異マウスと慢性疼痛モデルマウスによる鎮痛効果の解析、である。申請者はこれまでに、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて神経系に発現する多くのNavαサブユニットの機能解析や薬物の作用解析を行ってきた。しかしながら、Nav1.9の発現は全てのαサブユニットの中で最も困難であり、今年度は鎮痛薬の影響を解析するために十分な発現を得ることができなかった。そこで、Nav1.9の実験と平行して、その他のαサブユニットを用いた実験を行い、抗精神薬クロルプロマジンがNav1.2、Nav1.3、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8機能を抑制することを発見し、学術集会で発表予定である。また、今後も引き続きNav1.9に関する実験も進めていく予定である。Nav1.9の発現は全てのαサブユニットの中で最も困難であり、今年度は鎮痛薬の影響を解析するために十分な発現を得ることができなかった。その他のαサブユニットとは異なり、十分な発現を得るための特殊な条件が必要なことが想定されるが、これを習得できていないことが原因と考えられる。これまでに、電気生理学的実験によって、Nav1.9に対する鎮痛薬の影響を解析するために十分な発現を得ることができなかったため、過去の文献などを参考に、十分な発現を得るための条件(培養日数、RNAの注入量など)を模索して、試みていく。困難な状況が続けば、その他のαサブユニットに対する薬物の影響解析を行い、電位依存性ナトリウムチャネルをターゲットにした新たな鎮痛薬開発につながるような研究を平行して行っていく。(理由)

計画的に執行を進めた結果、未使用額が27,076円生じたが、購入を予定していた試薬に必要な金額に満たなかったため。(使用計画)次年度の研究費と合わせ、試薬・消耗品の購入に使用する予定。
シトクローム酸化酵素の機能発現機構の量子構造生物学的解析

本研究は,シトクローム酸化酵素(CcO)による生物機能の発現機構を,電子構造に基づいて解明することを目的として推進している。本年度は以下の研究成果を得た。1)CcOの生物機能において,ヘムaおよびヘムa3はその鍵を握る部位である。本年度は,これらをタンパク質外部に取り出し,単体で存在する場合の電子構造を計算することにより,逆にCcO内部のヘムの電子状態を解析するストラテジを提案した。その結果, CcO内部ではヘムーリガンドの結合は最安定とは異なる状態にあり, CcOの疎水性アミノ酸残基が,ヘムーリガンド結合に一種のストレスを与えることにより, CcOの機能発現に必要となる電子構造を創出している可能性が明らかになった。2)CuAサイトは,シトクロームcとの電子授受において,最初に重要な役割を果たす2核銅結合部位である。その解析のために,銅結合構造が既に詳細に解析されているアズリンをテスト系に用いて,新規に開発した我々のQM/MM計算システムの評価をまず行った。その結果,従来の第一原理計算では再現できなかったアズリンにおける銅結合構造が,本研究により初めて正確に得られることを示した。そこでこの計算システムをCuAサイトに応用したところ,正確な酸化還元電位が理論的に得られることもわかった(実験値とよい一致をみた)。さらに,「CuA単独」および「その周囲のタンパク質構造を含む場合」の両者について,電子構造計算を行い比較したところ,酸化還元電位には約2倍もの差が生じ,特にヘムに結合したプロピオン酸部分との相互作用が, CuAの機能に影響を与えることが示唆された。これは, CcO内部において各機能中心が単独で作用するのではなく,物理的な相互作用に基づく,機能中心同士のコミュニケーションが機能を制御していることを示すものである。
積乱雲に伴う突風の発生機構の解明

平成21年度に行った偏波レーダ観測データの解析を継続し,突風をもたらす可能性のある積乱雲内の降水粒子の判別法の改良を行ない,雷雲内の霰粒子の識別を可能にした.この降水粒子判別法を国土交通省のX-バンドマルチパラメータレーダネットワークデータや情報通信機構沖縄亜熱帯計測技術センターのマルチパラメータレーダの観測データに適用し,判別法のパフォーマンスを確かめた.また,地球水循環研究センターの偏波レーダを用いた雷雲観測に降水粒子判別法を適用し,雷の発生と大降水発生のタイミングを比較できるようにした.これらの成果を国際会議で公表した.一方,名古屋大学地球水循環研究センターのX-バンド偏波レーダを用いた,パルス繰返し数を通常の10倍にしたドップラーレーダ速度の精細モード観測から,積乱雲の発生前の湿潤な晴天大気の風向・風速を測定できることを明らかにした.また,湿った南風の場合だけでなく,それほど湿っていない北西時でも乱流成分が大きい場合には晴天時の下層風の測定が可能であることを明らかにした.この結果はレーダから10km以内では積乱雲発生前の晴天気の風の測定が可能であることを示すものである.精細モード観測で得られたドップラー速度のスペクトルデータ解析から,乱流から得られる風の成分と地形エコー(グランドクラッター)を分離することが可能であることを明らかにした.これは本研究としては派生的な成果であるが,レーダ観測上は重要な知見である.これらの研究成果は平成23年度に行われる国際レーダ会議等で公示される名古屋大学地球水循環研究センター屋上(4月12月)及び国土交通省中部地方整備局安城出張所に設置したマルチパラメータレーダー(8月12月)を用いて積乱雲の構造及び積乱雲周辺の気流系に関する観測を行った.高密度観測を含む積乱雲のマルチパラメータレーダ観測データをハードディスクに収録し解析ケースの選択を行った.当初夏期の雷雲を観測対象としたが,積乱雲の発表状況から,夏期に加えて秋期も観測を継続し比較データの取得をはかった.積乱雲の内部構造の理解のために,名古屋大学地球水循環研究センターのマルチパラメータレーダデータ及び情報通信機構沖縄亜熱帯計測技術センターのマルチパラメータレーダの取得済みデータを用いて降水粒子の判別法及び解析法を改良した.その成果を国内会議や国際会議で発表し,論文として発表した.名古屋大学地球水循環研究センターのX-バンドマルチパラメータレーダを用いた粒子判別法を改良して,下降流発生の引き金となる霰粒子の判別精度をあげることができるようにした.積乱雲の発達段階と突風の発生のタイミングとの関係を明らかにするためにマルチパラメータレーダの三次元スキャン観測に加えて鉛直断面観測を行うとともに,地上設置のディスドロメータによる雨滴粒径分布観測を行った.また,グランドクラッターによる偏波バラメータへの影響を調べた.これらの観測結果にもとづき平成22年度に行うマルチパラメータレーダの観測モードの検討を行った.平成21年度に行った偏波レーダ観測データの解析を継続し,突風をもたらす可能性のある積乱雲内の降水粒子の判別法の改良を行ない,雷雲内の霰粒子の識別を可能にした.この降水粒子判別法を国土交通省のX-バンドマルチパラメータレーダネットワークデータや情報通信機構沖縄亜熱帯計測技術センターのマルチパラメータレーダの観測データに適用し,判別法のパフォーマンスを確かめた.また,地球水循環研究センターの偏波レーダを用いた雷雲観測に降水粒子判別法を適用し,雷の発生と大降水発生のタイミングを比較できるようにした.これらの成果を国際会議で公表した.一方,名古屋大学地球水循環研究センターのX-バンド偏波レーダを用いた,パルス繰返し数を通常の10倍にしたドップラーレーダ速度の精細モード観測から,積乱雲の発生前の湿潤な晴天大気の風向・風速を測定できることを明らかにした.また,湿った南風の場合だけでなく,それほど湿っていない北西時でも乱流成分が大きい場合には晴天時の下層風の測定が可能であることを明らかにした.この結果はレーダから10km以内では積乱雲発生前の晴天気の風の測定が可能であることを示すものである.精細モード観測で得られたドップラー速度のスペクトルデータ解析から,乱流から得られる風の成分と地形エコー(グランドクラッター)を分離することが可能であることを明らかにした.これは本研究としては派生的な成果であるが,レーダ観測上は重要な知見である.これらの研究成果は平成23年度に行われる国際レーダ会議等で公示される
偏性嫌気性細菌由来のリジン脱炭酸酵素の高次構造及び活性発現調節機構の解明

グラム陰性の偏性嫌気性細菌Selenomonas ruminantiumのべプチドグリカンに共有詰合したポリアミンの一種、カダベリンは、細胞分裂に必須の構成成分である。本菌のカダベリンを合成するリジン脱炭酸酵素(LDC)はオルニチンも認識し、一次構造はオルニチンに特異的な真核生物のオルニチン脱炭酸酵素(ODC)と高い相同性を持つ。一方で、本酵素は生育の定常期初期に急激に分解される厳密な発現親節を受けている。本研究は、本酵素の構造と基質認識機構との相関の分子レベルでの解明、および分解制御機構の解明を目的にしており、今年度までに以下の成果を得た。1.本酵素と真核生物ODCとの比較から、基質認識に関与すると推定した活性中心周辺の5アミノ酸残基に変異を導入し、オルニチンに対する特異性が70倍に高まったLDC変異酵素の作製に成功した。現在、大腸菌で大量発現させた組換え体LDCを用いて結晶化のスクリーニングを続行中である。2.本菌の細胞質画分を用いた本酵素のin vitro分解活性測定系を確立し、LDCの分解にATP要求性プロテアーゼが関与すること、本プロテアーゼは活性にMgイオンおよびジチオスレイトールを要求し、セリンプロテアーゼ阻害剤PMSFにより阻害を受けることを解明した。3.本菌の細胞質画分中にLDCと親和性を持つ22kDaおよび25kDaのタンパク質を見出し、このうち22-kDaタンパク質(P22)がLDCの分解を促進する分解促進因子であること、また遺伝子解析からグラム陽性菌のリボソームタンパク質L10と高い相同性を有すること、プトレシンにより誘導を受けLDCと、ほぼ同時期に分解消失すること、菌体内存在量はLDCの1/10-1/2であることを解明した。LDCに対するP22の解離定数は8.5μMであった。現在、動物細胞ODCの分解制御因子であるアンチザイムとの関連性を検討しながら、P22とLDC分解制御機構について解析を進めている。グラム陰性の偏性嫌気性細菌Selenomonas ruminantiumのペプチドグリカンに共有結合したポリアミンの一種、カダベリンは、細胞分裂に必須の構成成分である。一方で、本酵素は生育の定常期初期に急激に分解される厳密な発現調節を受けている。本研究は、本酵素の構造と基質認識機構との相関の分子レベルでの解明、および分解制御機構の解明を目的にしており、今年度は以下の成果を得た。1.昨年度までに確立した本酵素のin vitro分解活性測定系を用い、本菌の細胞質画分にLDCの分解に関与するATP要求性プロテアーゼの存在を証明した。また、本プロテアーゼが、活性にMgイオンおよびジチオスレイトールを要求すること、セリンプロテアーゼ阻害剤であるPMSFにより阻害を受けることを明らかにした。2.本菌の細胞質画分中に、LDCと親和性を持つ22-kDaおよび25-kDaのタンパク質が存在することを見出した。このうち22-kDaタンパク質は、ポリアミンの一種であるプトレシンの培地への添加により誘導され、LDCの分解を促進する分解促進因子であることを解明した。動物細胞ODCの分解制御因子であるアンチザイムとの関連性が示唆された。3.分解促進因子22-kDaタンパク質の遺伝子および周辺領域を含む8.5kbpをクローン化して解析した結果、Clostridiumのリボソームタンパク質L10と高い相同性を有することが判明した。

3.本菌の細胞質画分中にLDCと親和性を持つ22kDaおよび25kDaのタンパク質を見出し、このうち22-kDaタンパク質(P22)がLDCの分解を促進する分解促進因子であること、また遺伝子解析からグラム陽性菌のリボソームタンパク質L10と高い相同性を有すること、プトレシンにより誘導を受けLDCと、ほぼ同時期に分解消失すること、菌体内存在量はLDCの1/10-1/2であることを解明した。LDCに対するP22の解離定数は8.5μMであった。現在、動物細胞ODCの分解制御因子であるアンチザイムとの関連性を検討しながら、P22とLDC分解制御機構について解析を進めている。