hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規ビタミンＥ誘導体ＥＴＳ－ＧＳを用いた腎虚血再灌流障害への治療法の開発

腎虚血再灌流傷害の新規治療法開発を目標に、新規ビタミンE誘導体であるETS-GSを用いて、ラット腎虚血再灌流傷害モデルに対する有効性について検討を行った。生存率や血清中腎機能評価、HE所見、電子顕微鏡所見等にて検討を行い、ETS-GSの投与により虚血再灌流後の腎傷害軽減効果を証明した。また、このメカニズムのETS-GS投与による酸化ストレス抑制効果の関与が示唆された。ラットを用いて腎虚血再灌流モデルを作成し、投与群、非投与群に分けてETS-GSの腎保護効果について検討してきた。当初予想していた通り、BUN,Creatinineなどの腎機能については投与群の方が非投与群に比較して、腎傷害が抑制されている傾向が認められた。実験はまずまず順調に進んでおり、母体数も増えてはきたが、各測定値のばらつきが非常に大きかったため、今後更なる追加実験を行っていく必要があると判断している。今後は更にデータを増やし、次年度中にデータの解析に取り掛かる予定である。また、組織学的には投与群の方が非投与群に比較して、明らかに腎傷害の程度が抑制されており、今後はhistogical scoreを算出して統計学的処理を行っていく予定である。MalondyaldehydeやHydroxylradicalといった、酸化ストレスマーカーについても測定を行っており、こちらについても投与群の方が、非投与群に比較して腎傷害が抑制されている傾向が認められた。しかし、前述の通り、各測定値のバラつきが非常に大きいため、統計学的処理を行うのは、追加実験を行って更に母体数を増やしてからにしたいと考えている。以上、これまでのところ、当初の予定からは遅れをとってはいるものの、実験は順調に進んでいると考えている。今後の予定としては、データの解析が終了次第、。論文の作成に取り掛かり、更に学会発表も行っていきたいと考えている。本研究は、臨床の場面にて腎移植手術や大血管手術等の際にて不可避となる腎臓の虚血再灌流障害時における、腎保護作用をターゲットにした基礎的研究である。今回の研究において、この虚血再灌流時に生じる多量の酸化ストレス制御を目標に実験を計画した。従来の多くの研究結果や当教室での検討により、再灌流時の酸化ストレスを抑制することが、その後の腎機能を保護する上で重要であることが報告されているが、その方法として様々な薬剤の投与が試みられてきたが、臨床応用に至っていない。そこで、今回我々は、従来の抗酸化薬の欠点として考えられていた不安定性を克服すべく、抗酸化機能を有したビタミンEを核に、グルタチオンとタウリンを化学的に結合した新規の化合物ETS-GSを合成し、その効果をラット人虚血再灌流モデル用いて検討している。本研究は、3年計画であり、今年は3年目に当たる最終年度であった。昨年度までに得られた結果をもとに、総まとめの実験を行い、以下の結果を得ることができた。ラット人虚血再灌流により、腎機能の悪化と組織障害を生じるが、ETS-GSの投与によりこれらの変化を有意に抑制することができた。また、このメカニズムとして、虚血再灌流により高度に上昇した腎組織中の酸化物であるMDAがETS-GSに抑制されることや虚血再灌流後のミトコンドリア機能障害を抑制できることからETS-GSによる酸化ストレス抑制が関与していることが分かった。以上の結果から、今回新規に合成したビタミンE誘導体であるETS-GSには、高い抗酸化作用を作用機序とした虚血再灌流障害に対する保護効果が認められてたと結論図けることができ、今後、本研究をさらに進め、臨床応用に向けた取り組みを加速させていく予定である。初年度の計画としては、虚血再灌流障害時におけるビタミンE誘導体ETS-GS(ビタミンEを中心にタウリンおよびグルタチオンといった生体内に存在する抗酸化物質を化学的に結合した新規合成の化合物である。ビタミンEと異なり水溶性で安定性の高い化合物である)を投与することで、以下のポイントに沿って改善効果の有無があるかについて検討を行った。1)腎虚血再灌流後の血清中の腎機能マーカーとしてのCr,BUN値の測定し解析する。2)炎症性マーカーとしての血清中のNOx、サイトカイン量の測定をELISA Kit等を使用して解析する。3)腎組織中のROS測定を酸化ストレスマーカーを用いて検討する。これまでの基礎的検討により、腎虚血再灌流障害モデルにおいて、ETS-GSの投与は、その後の尿細管障害や糸球体障害に対して保護的に働くことが示された。また、驚くべきことに、腎虚血再灌流傷害後の生存の改善効果をもたらすことを見出すことに成功した。その詳細なメカニズムを検討するために、まず電子顕微鏡を用いて虚血再灌流後の腎細胞中のミトコンドリアの形態について検討を行うと、傷害後に認めるミトコンドリアの膨化やクリスタの破壊をETS-GSの投与は抑制することができた。また、この時の腎組織中の酸化ストレスに関しても軽減効果を証明することができた。

これら、傷害後の腎細胞保護効果にはサイトカインの抑制等のメカニズムの関与も示唆された。以上のことから今回研究に用いた新規ビタミンE誘導体ETS-GSには、腎虚血再灌流傷害後の腎組織に対する保護効果を有する可能性が示唆され、本誘導体が各種虚血再灌流傷害において有効であり、新たな治療法になりうる可能性が示唆された。実験自体は順調に進んできているが、データのバラつきが大きいため、腎虚血再灌流モデルの作成方法、投与量などについては再検討が必要であった。非投与群では死亡する場合も多く、虚血から再灌流までの時間についても再検討が必要であった。このため、当初の予定よりは、大きく遅れをとっており、今後は大幅なペースアップが必要であると感じている。当初の予定では、ROSなどの酸化ストレスマーカーや血清中のNOx、サイトカイン量を測定完了する予定であり、実際に測定は行ったものの、前述の通り、測定値のバラつきが大きかったため、追加実験を行う予定である。現在までに、基本的なビタミンE誘導体(ETS-GS)の腎虚血再灌流モデルにおける効果を検討し、良好な結果を得ることができた。しかしながら、モデルの煩雑さや測定パラメーターの多さから、実験に予想以上の時間を要してしまい、当初予定していたスケジュールに比べると遅れがちである。また、その後の解析に関しても、キット選定やその後の納品の遅れなどのために、予定通りの進行を行うことができななった。実際、初年度に予定していた一部の研究に関しては、実行することが残念ながらできなかった。計画自体はこれまで通りで変更はない。今後は更に追加実験を行って、母体数を増やし、統計解析に入りたいと考えている。昨年度までに、ビタミンE誘導体(ETS-GS)の腎虚血再灌流モデルにおける効果を検討し、良好な結果を得ることができた。そこで、本年度はこの有効性のメカニズムを調査するとともに、新規化合物であるビタミンE誘導体(ETS-GS)の安全性・安定性を基礎的に検討することで今後の臨床応用に向けた道筋をつけることを目標とする。さらに、研究がスムーズに進行し、時間的な余裕が生じた際には、当大学にてすでに合成し保有している他種の新規ビタミンE誘導体(初めに実験ターゲットとしたETS-GSはビタミンEにタウリン、グルタチオンを化学的に合成したものであるが、他にも側鎖を様々な生体内抗酸化物質に変更した化合物に対して複数種が成功している)に対する腎虚血再灌流傷害時の腎保護効果について検討を加えることで、より強力でかつ安全性の高い誘導体を模索し、最終的な臨床応用に向けた道筋を早期につけることを目標に研究を遂行する予定である。該当なし本年度においても、昨年度に引き続き、本研究に必要な大型の設備等に関しては、科学研究費を使用するのではなく、大分大学にて保有している共同使用可能な実験機器を中心に使用していくことで、消耗品を中心に購入を進めていく予定にしている。実際昨年度に使用した、アニマルモデルに関する費用や各種パラメーターの測定に必要であったキット類の費用を考えると、次年度においてもかなり高額になることが予想されるので、この点を中心に科学研究費を使用していく予定である。そして、より効率的な研究費の使用に注力していく所存である。
微小液滴の光マニピュレーションによる複雑流体のミクロ物性研究

高分子・ゲル・液晶あるいは生体系のように内部に高次の秩序構造と特異な機能を有するソフる。このプロセスには液滴射出技術を用いるが、流体粒子の微小化と共に、液滴は流体のマクロな物性からでは予想できない様々な挙動を示すことが明らかとなってきた。本研究では、この微小液滴のマニピュレーション技術を用いて、ミクロな複雑流体系における高速力学物性測定法の確立や、ピコリットル化学反応の動的追跡技術の開発を目指した。直径数μ縲恊鐀10μm程度の液滴を空気中に射出し、複数の微小液滴を高速で衝突させることにより、液滴の表面張力ならびに粘弾性を精度よく測定する技術を開発した。この手法は、取替えの容易なガラス管に衝撃波を与えて微小液滴を吐出するもので、これにより粘度100cPまでのあらゆる種類の液滴の形成が実現できた。微小液滴の吐出現象は低レイノルズ数の現象であり、ストロボ法により再現性よく液滴の運動状態を観察できることを明らかにした。この液滴吐出・衝突観察技術により、1,000,000[1/秒]という高歪下におけるレオロジー測定を世界で初めて可能にした。さらに吐出後の衝突するまでの時間を変化させることにより、μ秒分解での表面張力の実時間追跡が可能になった。さらにこの技術を用いて、界面活性剤分子が、新しい表面形成後に吸着するまでの時間応答を測定することが可能となった。この手法は、広く液体の超高速物性測定への展開が期待できる。本研究は微小流体粒トラップ技術を活用し、さらに捕捉粒子の位置・形状・回転などの自由度をレーザー光を用いて制御・観察する全く新しい微小流体マニピュレーション技術を開発し、最近注目を集めているマイクロ領域における液体の物性計測という新規の研究領域を切り拓く上で有効な実験手法を確立することにある。本年度は液体微粒子を孤立保持し、さらにその位置・形状・回転状態を微細に制御して、その運動状態を観察する「流体粒子マイクロマニピュレーション技術」を開発した。先端部を微細加工したガラス細管に試料液体を挿入し、管を圧電素子で圧迫変形することにより、液体の微小粒を吐出させる。これをストロボを用いた高時間分解能実像撮影を行うことで、時々刻々変化する微小液滴の形状を高精度でモニターする装置を開発した。このとき粒子が示す共鳴振動運動を観察し、そのピーク周波数から表面張力が、ピーク幅から流体の粘性が得られることを確認した。このスペクトルはまた、申請者らが開発した光ビート分光リプロン光散乱法の光学系を利用しても測定することが確認できた。さらに複数液滴の衝突・融合による大振幅変形を観察することにより、液滴表面への分子吸着、脱離、吸着単分子膜の形成などのダイナミックな分子プロセスを調べる手法を確立した。また液滴が空気中を自由落下する様子を調べ、その粒子径を0.01μm以上の精度で決定することに成功した。さらに超音波を用いた微粒子の空中保持についての検討を行った。高分子・ゲル・液晶あるいは生体系のように内部に高次の秩序構造と特異な機能を有するソフトな材料群をマイクロプロセスに利用することによって、高度な機能が集積したデバイスを開発する試みが進められている。今年度は、直径数μ数10μm程度の液滴を空気中に射出し、複数の微小液滴を高速で衝突させることにより、液滴の表面張力ならびに粘弾性を精度よく測定する技術を開発した。

この手法は、取替えの容易なガラス管に衝撃波を与えて微小液滴を吐出するもので、これにより粘度100cPまでのあらゆる種類の液滴の形成が実現できた。微小液滴の吐出現象は低レイノルズ数の現象であり、ストロボ法により再現性よく液滴の運動状態を観察できることを明らかにした。この液滴吐出・衝突観察技術により、1,000,000[1/秒]という高歪下におけるレオロジー測定を世界で初めて可能にした。さらに吐出後の衝突するまでの時間を変化させることにより、μ秒分解での表面張力の実時間追跡が可能になった。さらにこの技術を用いて、界面活性剤分子が、新しい表面形成後に吸着するまでの時間応答を測定することが可能となった。この手法は、広く液体の超高速物性測定への展開が期待できる。
ヒートアイランドの緩和に有効な緑地の配置計画に関するシミュレーション手法の開発

本研究は、都市のヒートアイランドの緩和に有効な緑地の計画を扱った研究である。広域的な都市環境情報を解析するのに有用なランドサットデータを用い、ヒートアイランドの緩和に有効な緑地形態、すなわち種類、規模、分布形状について明らかにし、ヒートアイランドの緩和に資する緑地の配置計画の手法を提示、特にシミュレーション手法の開発を目的とした。そこで世界のどの地域のデータも入手可能でありシミュレーションの提示ができる人工衛星によるリモートセンシングの有用性をいかし、急速な都市開発による都市環境問題が引き起こされているアジア地域を対象として研究を遂行した。本研究は事例研究による実証的研究の方法をとっていることから、これまでにソウル市、北京市、上海市、バンコク市、マニラ市を事例としてランドサットデータを入手し、画像解析を行い緑地分布図と地表面温度分布図を作成し、両図面の比較検討から、各都市に見られる特性を明らかにした。本年度は特に都市開発の著しい北京市を対象に緑地分布と地表面温度との関係を解析し、緑地形態による地表面温度推定手法を検討してきた。さらに、東京地域を対象に緑地分布と気温との関係を解析し、緑地による気温推定手法を導出した。その結果から得られた緑地からの気温推定式を用いて計画した緑地によるヒートアイランドの変化をシミュレーションの形で提示し、ランドサットデータをベースとしたヒートアイランドの緩和に資する緑地の配置計画手法を提案した。そこで世界のどの地域のデータも入手可能でありシミュレーションの提示ができるランドサットデータの有用性をいかし、急速な都市開発による都市環境問題が引き起こされているアジア地域を対象として研究を遂行した。本研究は事例研究による実証的研究の方法をとっていることから、本年度は台北市を事例としてランドサットデータを用いたヒートアイランドの緩和に資する緑地の配置計画の手法を提示し、特に計画した緑地によるヒートアイランドの変化をシミュレーションの形で示した。すなわち、本研究の目的を明らかにするために以下の4つの課題を明らかにした。(1)台北市を対象にランドサットTMデータによる地表面温度と緑地分布との関係を解析し、ヒートアイランドの緩和に有効な緑地形態について検討した。(2)緑地分布と地表面温度との関係を解析し、緑地形態による地表面温度推定手法を検討した。その検討の結果、得られた地表面温度推定式から地表面温度推定図を作成し、その地表面温度推定図とランドサットTMデータによる地表面温度分布図とを比較照合した。(3)地表面温度推定式を用いて計画した緑地によるヒートアイランドの変化をシミュレーションの形で提示した。(4)台北市におけるランドサットTMデータをベースとしたヒートアイランドの緩和に資する緑地の配置計画手法を提案した。本研究は事例研究による実証的研究の方法をとっていることから、本年度はソウル市、北京市、上海市、バンコク市、マニラ市を事例としてランドサットデータを入手し、画像解析を行い緑地分布図と地表面温度分布図を作成した。5つの都市の緑地分布図と地表面温度分布図との比較から、各都市に見られる特性を明らかにした。特に北京市では内陸に位置することから水辺が少なく、さらには河川の断流がみられ、他の都市に比べて緑地の減少が著しい。今後5つの都市におけるランドサットデータによる地表面温度と緑地分布との関係を解析し、ヒートアイランドの緩和に有効な緑地形態について検討し、緑地分布と地表面温度との関係を解析し、緑地形態による地表面温度推定手法を検討したい。その検討の結果から得られた地表面温度推定式から計画した緑地によるヒートアイランドの変化をシミュレーションの形で提示し、アジア地域におけるランドサットデータをベースとしたヒートアイランドの緩和に資する緑地の配置計画手法を提案したい。

さらに、東京地域を対象に緑地分布と気温との関係を解析し、緑地による気温推定手法を導出した。その結果から得られた緑地からの気温推定式を用いて計画した緑地によるヒートアイランドの変化をシミュレーションの形で提示し、ランドサットデータをベースとしたヒートアイランドの緩和に資する緑地の配置計画手法を提案した。
有害化学物質(鉛を含む)に対する個体の感受性評価に関する研究

有害化学物質暴露による健康影響の発現には相当の個体差(感受性差)が認められる.そこで,この様な個体差が如何なる宿主要因によってもたらされるかを,職業的な鉛暴露集団並びに喫煙,コークス炉作業,ディーゼルエンジンの排ガス等による多環芳香族炭化水素(PAH)暴露集団を調査対象として解析した.その結果,以下のことが明らかとなった.[1]鉛暴露の場合:最近,一部の研究者の間で,赤血球デルタアミノレブリン酸脱水酵素(ALAD)の遺伝子多型が鉛暴露によるポルフィリン代謝異常発現の個体差に部分的に関与しているのではないかと言われている.そこで,この事実を再確認するために,約200名の鉛作業者を対象として,ALADの遺伝子多型性と血液中鉛量,尿中デルタアミノレブリン酸(ALA)排泄量,ALAD活性の阻害度との関連を検討したが,一定の傾向は認められなかった.[2]多環芳香族炭化水素(PAH)暴露の場合:PAHの代謝中間体とDNA塩基との共有結合により生ずるDNA adducts(付加体)の体内増加は発がん,特に肺ガン等のリスクを高めると言われている.しかし,ヒトリンパ球のDNA adducts量にはかなりの個体差が存在するため,この個体差が如何なる宿主要因によりもたらされるかを解析した.その結果,リンパ球DNA adductsレベルは,環境要因としてのPAH暴露量の他に,遺伝要因としての薬物代謝酵素,特にCYP1A1やGSTM1等の遺伝子多型性に影響されることが明らかとなった.有害性の高い環境化学物質への暴露による健康影響の発現程度にはかなりの個人差が存在する.この個人差がいかなる宿主側要因によってもたらされるかを,本年度は特に鉛暴露を例に取り解析した.鉛に暴露されると特異的に且つ早期にポリフィリン代謝異常が発現するが,この発現の程度に赤血球δーアミノレブリン酸脱水酵素(ALAD)の遺伝子多型がどの様に関与しているかを分子疫学的手法により解析した.対象者として,主に陶磁器関連の鉛取り扱い作業に従事している労働者(男73.女128計201名)を選んだ.これらの鉛作業者は,血液中鉛量から判断して,かなり低濃度の暴露群に相当した.ALADの遺伝子多型(1/1,1/2,2/2)はWetmurの方法に準拠して検出した.ポルフィリン代謝異常の評価指標には,赤血球ALAD活性の阻害度及び尿中δーアミノレブリン酸(ALA)排泄量を用いた.結果として以下のようなことが明らかとなった.1.今回の鉛作業者(201名)におけるALAD遺伝子多型(1/1,1/2,2/2)の人数は,それぞれ168,32,1であり,2型遺伝子の頻度は0.085となった.どちらかと言えば女性の方が2型の頻度が高い傾向(女性;0.102,男性;0.055)を示したが有意差はなかった.2.ALAD活性は1型群において高い傾向が見られたが,統計的な有意差は認められなかった.3.尿中ALA排泄量に関しても,1型の方が高い傾向を認めたが,有意差はなかった.以上より,今回の低濃度鉛暴露群の解析では,個体差の宿主要因を明確にすることは出来なかった.今回は,高濃度暴露群において同様の解析を試みたい.有害化学物質暴露による健康影響の発現には相当の個体差(感受性差)が認められる.そこで,この様な個体差が如何なる宿主要因によってもたらされるかを,職業的な鉛暴露集団並びに喫煙,コークス炉作業,ディーゼルエンジンの排ガス等による多環芳香族炭化水素(PAH)暴露集団を調査対象として解析した.その結果,以下のことが明らかとなった.[1]鉛暴露の場合:最近,一部の研究者の間で,赤血球デルタアミノレブリン酸脱水酵素(ALAD)の遺伝子多型が鉛暴露によるポルフィリン代謝異常発現の個体差に部分的に関与しているのではないかと言われている.そこで,この事実を再確認するために,約200名の鉛作業者を対象として,ALADの遺伝子多型性と血液中鉛量,尿中デルタアミノレブリン酸(ALA)排泄量,ALAD活性の阻害度との関連を検討したが,一定の傾向は認められなかった.[2]多環芳香族炭化水素(PAH)暴露の場合:PAHの代謝中間体とDNA塩基との共有結合により生ずるDNA adducts(付加体)の体内増加は発がん,特に肺ガン等のリスクを高めると言われている.しかし,ヒトリンパ球のDNA adducts量にはかなりの個体差が存在するため,この個体差が如何なる宿主要因によりもたらされるかを解析した.その結果,リンパ球DNA adductsレベルは,環境要因としてのPAH暴露量の他に,遺伝要因としての薬物代謝酵素,特にCYP1A1やGSTM1等の遺伝子多型性に影響されることが明らかとなった.最近わが国では,肺がんを中心とした呼吸器系のがんによる死亡率の増加が一途を辿っており,これはタバコの煙や自動車の排気ガスに含まれる発がん性の化学物質,とりわけベンゾピレンやニトロピレンに代表される多環芳香族炭化水素(PAH)への長期暴露が主たる原因ではないかと考えられているが,その詳細は不明である.さらに,この様な発がん物質に長期間暴露されても,具体的には長期に渡って高度な喫煙を続けても全く肺がんに罹患しない者が多数居ることも事実である.

この様な発がんの感受性差がいかなる宿主要因によりもたらされるかを明らかにするために,喫煙群における生活習慣,特に喫煙量,ビタミンEやβ-カロチンの摂取量,並びにPAH等の発がん物質の代謝に関与する薬物代謝酵素,特にシトクロムP450(CYP1A1),グルタチオンs-トランスフェラーゼ(GSTM1,GSTT),N-アセチルトランスフェラーゼ(NAT2),アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALAD2)の遺伝子多型とリンパ球DNAadductsの生成量(これはPAH等による遺伝子損傷のbiomarkerの1つと考えられている)との関係を解析した.その結果,PAHに暴露される喫煙群のリンパ球DNAadductsレベルは非喫煙群よりも有意に高く,且つこのレベルはCYP1A1とGSTM1の遺伝子多型性に影響され,特にGSTM1欠損でしかもCYP1A1のval/val型の喫煙者で特に高くなる傾向が認められた.また,喫煙群のDNAadductsレベルはβ-カロチン摂取量の多い人ほど低くなる傾向が見られた.喫煙群のリンパ球DNAadductsとビタミンE摂取量との関係については一定の傾向は認められなかった.ベンゾピレンに代表される多環芳香族炭化水素(PAH)に暴露されると体内で代謝活性化されその中間代謝物がDNAの塩基と共有結合し,いわゆるDNA adducts(付加体)を形成することが知られている.DNA adductsの体内レベルは生成と分解(修復)とのバランスの上に立っているがこのDNA adductsの増加は発がん,特に肺がんなどのリスクを高めると言われている.しかし,ヒトの末梢血からリンパ球DNAを抽出し,これに含まれるDNA adductsを検出してみると,同レベルのPAH暴露量と推定される対象者の間でも相当の個人差が認められる.そこで,この様な個人差が如何なる宿主要因によってもたらされるかを,特に2,3の薬物代謝酵素の遺伝子多型と関連させて検討した.その結果,以下のことが明らかとなった.(1)PAHへの暴露が高いと考えられる高度喫煙群やコークス炉作業者群におけるリンパ球DNA adductsレベルは対照群よりも有意に高く,且つそのレベルはCYPlAlとGSTMlの遺伝子多型性に影響され,特にGSTMl nullでCYPlAlval/val型の対象者において最も高い.(2)喫煙群におけるDNA adductsレベルはβ-カロチン摂取量の多い人ほど低くなる傾向がある.(3)N-acetyltransferase(NAT2)またはAldehydedehydrogenase(ALDH2)の遺伝子多型とリンパ球DNA adductsとの間には一定の傾向は認められない.これらの結果から,ヒトリンパ球のDNA adductsレベルは,多環芳香族炭化水素(PAH)類への暴露量の他に,遺伝要因としての薬物代謝酵素,特にCYPlAl,GSTMl等の遺伝子多型性の影響を受けることが明らかにされた.
実世界ポインティングによる音声情報支援システムの研究

本研究では、ユーザのポインティングによって動作する光空間通信システムを提案した。このシステムは、実世界に複数設置された光送信器のうち、ユーザがポイントした送信器から発せられた光信号だけを選別して受信することが出来る。本研究で行われた一連の実験では、広く普及している携帯電話を使用してシステムを組み上げ、このシステムが1)ユーザのポイントによって送信器を選定できるだけの十分な空間分解能を持つこと2)音声情報を送信するために十分な速度で変調された光信号を扱う事が出来ることの2つの機能を両立していることが実証された。また、ユーザの眼球を組み込んだシステムも実装し、両者がほぼ同じ性能を持っていることも実証された。本研究は、平成20年度において、PointSpeechシステムの実装とその評価を行った。PointSpeechはさまざまなイメージセンサ(眼球を含む)に取り付けることで動作する実世界ポインティングデバイスの一種である.PointSpeechは、実世界に設置された光信号を発するタグを、「指さす」ことで選択することが出来る。このタグからは音声を光信号の形で発せられている。ユーザがタグを指さすと、光信号が受信され、この光信号をスピーカに入力することで音声が聞こえてくる仕組みである。本研究では、タグに狙いを付ける際に使用するイメージセンサとして、眼球と携帯電話のCCDの2種類を便用して性能評価を行った。タグに指をかざした際に光信号が受信できる領域を、視角で測定した。その結果、距離2-3メートルの場所にあるタグを視角にして2-3°で識別することができ、音声信号を受信することができた。また、2つのシステムでほぼ同じ結果を得ることができることも確認された.PointSpeechは光信号を利用した光空間通信装置の構造をとるが、実際の性能から考えると、2次元コードなどのビジュアルタグと比べて遜色の無い空間分解能を実現されたことが確認された。それに加え、データの変調周波数として10MHzを超えるボーレートの信号を送受信することが出来ることも確認された.PointSpeechの意義は、ユーザの視野を用いて実世界ポインティングを行うことが可能である点に加えて、ポインティングシステム、データ転送システムと考えても高精度、高速度な性能を持つことが実証された。本研究では、指差すことによって情報支援を得ることのできる、VisionCommunicatorシステムの開発を申請した。VisionCommunicatorシステム(VC)は光通信システムを応用した情報配信システムで、複数の光信号を発するタグのうちの一つを指差すと、そのタグから送られている信号を受信する機能があることが特徴である。この特徴は、本研究で新規的に提案された光信号の変調方式によるものである。本予算では、VCを利用して、ユーザがタグを指差すと音声支援を得ることが出来る情報支援システムの構築を目指し、アプリケーションシステムの構成と、1.ポインティング精度2.ユーザビリティ3.通信の品質を計測・評価すること目標とした。本予算の成果として、アプリケーションシステムの構成に成功し、1.3.の各項目について成果を得ることができた。1.2.および3.の一部のデータを用いて博士論文を執筆した。1.ポインティング精度は、VCおよび、類似の構造をもつRECシステムにおいて同一条件下でほぼ同じ精度を示すことが分かった。この結果は、同一受光器を使用すれば、どのような装置構成をしても同じような精度で使用できる事をしめし、本方式の高い堅牢さを示すものである。選択精度は実用的な範囲で視角2→3°の範囲に収まることがわかった。この精度は理論値とほぼ同じ節囲であった。また、この視角はポイントの際の人差し指の視角の2-3倍に相当し、「指しやすさ」という点から評価するとほぼ十分な値であることがわかった。2.指の先端をタグに重ねる動作(テレクリック)は普通の指差しに似ているが、厳密には異なる動作である。両者のポインティングに要する時間と、VCにおけるディスプレイ越しのポインティング時間を比較し、また比較対象としてレーザポインタによるポインティング時間を測定した。この結果、最も早いポインティング方法はレーザポインタによるポインティングで、テレクリックと自然な指差しはそれよりも若干遅く、どちらもほぼ同じ時間で指差していることが分かり、ディスプレイ越しの場合はその約1.5倍の時間がかかることが分かった。3.本予算ではPWM信号での音声の通信を行い、音声周波数帯では人間が十分に識別可能な品質での情報転送が可能であることがわかった。現在は、より高速な周波数帯を用いた変調方式による情報転送や、デジタル通信によるBERの測定作業に入っている。
肺高血圧症の病態に、インスリン分泌促進ホルモン、およびその分解酵素は関与するか？

本研究は、インスリン分泌促進ホルモンであるGLP-1、およびその分解酵素DPP-4が、肺高血圧症の病態に果たす役割を検討し、創薬への可能性を探るものである。以下に研究結果を示す。(1)生存率他;ラットにモノクロタリン(MCT)を皮下注射し肺高血圧症モデルを作成した。MCT群、MCT +リラグルチド(GLP-1受容体作動薬)、MCT +アログリプチン(DPP-4阻害薬)、MCT+リラグルチド+アログリプチンにおいて、MCT投与開始30日での生存率は、各々5%、60%、45%、65%、また心臓カテーテル検査による右室圧は、各々25.4±1.4、85.9±1.2、25.9±1.6、33.0±4.1、34.7±4.0mmHgと、治療群で著明に改善した。免疫組織化学染色では、肺小動脈において、MCT群で認めた中膜の著明な肥厚が、治療群では多数の血管で軽快した。(2)遺伝子発現;各群の肺組織を、定量PCRを用い、肺高血圧症に関与する遺伝子(35種類)の発現量を検討した。リラグルチド、アログリプチン投与群いずれも、塩基性線維芽細胞成長因子(FGF2)、プラスミノゲン活性化抑制因子がMCT群での上昇に比べ軽減した。一方で、電位依存性カリウムチャネル、カベオリン1は、MCT群に比べ軽度の減少にとどまった。またリラグルチド群では、組織因子の発現が抑制され、アログリプチン群では、CD28、CD86といったT細胞共刺激因子がMCT群で上昇、アログリプチン群で軽減した。(3)共培養;FGF2で刺激した肺動脈平滑筋細胞とJurkat-CD26細胞株を共培養したところ、Jurkat-parent株との共培養に比べ、強い細胞増殖を示した。今後は、作用機序をさらに解明するために、研究計画に基づき検討していく予定である。
ペルオキシソームのインポート機構を利用した高効率蛋白質デリバリーシステムの開発

本研究では、半中空化したペルオキシソームに細胞内で目的タンパク質を高効率に濃縮した後、細胞からペルオキシソームを高純度に分離精製する手法を確立した。また、精製ペルオキシソーム表面に特異抗体を提示させることで、標的細胞特異的に内包タンパク質をデリバリーできることを明らかにした。さらに、Fabry病の治療用タンパク質内包ペルオキシソームを用い、治療標的部位であるリソソームへの同タンパク質のデリバリーに成功した。本研究は、細胞内オルガネラへのタンパク質インポート機構に関する細胞生物学的知見と医薬分野におけるドラッグデリバリーシステム(DDS)の技術を融合することにより革新的なタンパク質デリバリーシステムを創製することを目標としており、初年度はキャリアーとして利用するペルオキシソームの中空化技術の開発に向けて、ペルオキシソーム内への2種類のタンパク質(PTS1およびPTS2)めインポートに関わるPEX5タンパク質(PEX5SおよびPEX5L)のノックダウン用shRNA発現レンチウィルスベクターの構築を行なった。PEX5S単独、もしくはPEX5SとPEX5Lの両者を同時にノックダウンするウィルスベクター(各3種類)を導入したHeLa細胞およびHEK293細胞について調べた結果、いずれの場合にもこれらのタンパク質の発現が有意に抑えられることが確認できた。さらに、PEX5SとPEX5Lの両者をノックダウンする3種類のベクターを同時に導入したところ、内在性のPEX5の発現が検出限界以下にまで減少することが明らかとなった。続いて、PTS1およびPTS2タンパク質のペルオキシソームへのインポート経路の遮断を検証するため、特異抗体を用いた蛍光免疫染色を行なった。その結果、PTS1およびPTS2タンパク質のペルオキシソームへのインポートがほぼ完全に遮断され、ペルオキシソームが中空化していることが明らかとなった。現在、この細胞を株化するためシングル化作業を進めており、ペルオキシソームの中空化技術はほぼ確立できたと考えている。本研究は、細胞内オルガネラへのタンパク質インポート機構に関する細胞生物学的知見と医薬分野におけるドラッグデリバリーシステム(DDS)の技術を融合することにより革新的なタンパク質デリバリーシステムを創製することを目標としており、本年度は以下の3項目について実施した。1.ペルオキシソームの高純度精製法の確立ヒト腎由来HEK293細胞の除核画分から分離精製したペルオキシソームを用いてオルガネラ局在性酵素の酵素活性を測定した結果、ペルオキシソーム局在性catalaseの含有率が90%以上を示し、一方、他のオルガネラ局在性酵素め混入率は何れも6%以下であることから、高純度のペルオキシソームが精製できることが明らかとなった。2.精製ペルオキシソームへの標的化能の付加技術の開発精製ペルオキシソームにNeurAvidinを介して抗HB-EGF抗体を付加し、その粒子径、ζ電位を動的光散乱法により測定した結果、抗体付加前の精製ペルオキシソームと比較し、粒子径は殆ど変化なく単一ピークであること、ζ電位は若干負になることが明らかとなった。3.モデルタンパク質内包ペルオキシソームの機能評価ペルオキシソーム反中空化細胞HEK293-PEX7KO細胞を樹立し、luciferase-SKLを一過性に過剰発現させ、精製ペルオキシソームにおけるluciferaseの酵素活性を測定した結果、PS画分に於ける同タンパク質の含有量は約65%であった。次に、分割型luciferase-SKL、内包精製ペルオキシソームに抗HB-EGF抗体を付加し、HB-EGF発現V6ro細胞へ添加後、luciferase活性を測定した。その結果、添加16時間後から有意なluciferase活性が認められ、ペルオキシソーム内包の分割型luciferase-SKLが細胞内に取込まれた。
たこつぼ症候群患者に対する運動療法の再発予防効果

聖マリアンナ医科大学病院でたこつぼ症候群と確定診断された患者で、入院加療を要した者のうち、研究に参加を表明して頂けたのが、研究開始最初の1年目が3名のみであった。これは、来院時に重症心不全を合併した高齢症例で全身状態の回復が遅れたり、転院のためエントリー出来なかった症例、整形外科疾患のために運動不耐の症例も存在した。また、担癌患者のため診療科を重複できない等の理由によるものであった。エントリー出来なかった患者の多くは運動療法群に割り付けられたときに受入が厳しいため、ランダム化に至らずに退院(転院)された症例である。現在同意頂けた3名のたこつぼ症候群患者(平均72.7歳、全例女性)は全例で心尖部が無収縮となる古典的たこつぼ様壁運動異常を呈していた。全ての症例で完全な壁運動異常は改善が確認され、冠動脈においては責任血管となるような狭窄性病変を全例で認めていない。これらの症例に対して無作為化を行い、運動療法群が2名、経過観察群が1名と割り振られ、試験が開始された。現在までに運動療法の有無に関わらず、再発は見られていない。たこつぼ症候群と確定診断された患者で、入院加療を要した者のうち、研究に参加を表明して頂けたのが、研究開始最初の1年目が3名のみであった。予想以上の重症例ばかりが入院加療となったため、研究に参加出来ない症例が多いことが研究進捗の遅れにつながっている。昼夜を問わず、新規患者の情報を共有し、研究にエントリーして下さる患者確保に努める。関連施設からの患者紹介にも努める。初年度に予想以上の症例蓄積が行われなかったため、次年度以降に症例を集め、解析を行うこととする。その為、次年度以降に研究費をあてたいと考えている。次年度には本研究に関連する海外学会発表も控えており、研究費の一部を使用する予定である。
高速イオン閉じ込めに対する磁場のトロイダルリップル成分の寄与に関する研究

イオンサイクロトロン加熱を利用して特に磁場に垂直方向に大きな速度を持つ高速イオンを生成し、トーラス磁場のトロイダル方向のリップル成分を変化させ、ヘリカル系磁場閉じ込めで重要となるこの種の粒子の閉じ込めについて調べた。ヘリオトロンJ装置の磁場を制御することでトロイダルリップル(バンピネス)を変化させたところ、高バンピネスの配位で、30keV以上の高速イオンが閉じ込められていることを計測し、他の配位と比較することによって、バンピネスが高速イオンの生成・閉じ込めに有効であることを実験的に、またモンテカルロ計算によって数値解析によって明らかにした。トーラス系磁場閉じ込め装置における高速イオン閉じ込めに対し、磁場リップルの一つであるトロイダル方向のリップル(バンピネス)の依存性について実験的、理論的に明らかにすることが目的である。このリップル成分はトカマク型装置、ヘリカル型装置の双方に関連したテーマであり、ヘリカル型では特に準アイソダイナミック配位に対し、閉じ込め制御で重要なパラメータである。ピッチ角が90度に近い粒子が特にこの問題には重要であるため、磁場に垂直方向の加速を行い、且つ粒子源を有しないイオンサイクロトロン周波数帯(ICRF)の波動加熱装置を用いて生成された高速イオンを利用して研究を行った。生成された高速イオンはヘリオトロンJ装置に設置されている視線移動可能な荷電交換中性粒子エネルギー分析装置(CX-NPA)によって測定した。結果として、これまでに得られてきた高バンピネス配位での高速粒子の生成・閉じ込めの優位性を実験的に確認するとともに、プラズマ断面での分布計測も開始しその初期結果を得た。これについては来年度も継続してさらにデータを蓄積する予定である。数値解析ではモンテカルロ法を用いて、500000個のテスト粒子により20keVまでのエネルギースペクトルを計算し、実験との対比を行いエネルギースペクトルの再現が可能であることを示し、且つピッチ角に対する依存性もほぼ再現されることが分かった。ただし、ICRFのパワー吸収分布については現時点では放物線分布などを仮定しており、これらの検討は今後の課題である。ヘリオトロンJ装置で水素マイノリティ、重水素マジョリティのECHターゲットプラズマに対しICRF加熱を行った。高速粒子エネルギースペクトルは中性粒子エネルギー分析装置(CX-NPA)によって測定した。低衝突領域での高エネルギー粒子測定を行うため線平均電子密度としては0.5E19m-3以下、入射パワー0.3MW程度で、閉じ込め磁場の3種類のバンピネスに対し、高速粒子の生成・閉じ込め挙動を調べる。ここでいうバンピネスの値はB04/B00(B04がバンピー成分、B00が平均磁場成分)で表して、規格化平均半径0.67でそれぞれ0.15(高)、0.06(中)、0.01(低)である。これまでに磁気軸中心をとおる視線で、CX-NPAを用い高速イオンのバンピネス依存性を調べ、高バンピネスで高速粒子生成が最も効率的であることなどが分かっていた。しかし、最近の研究では中バンピネスにおいて、サイクロトロン共鳴層の位置を変化させると、少数イオンモード加熱であるにもかかわらず高速イオンの生成とバルクイオンの加熱効率に対して、依存性が異なっており、磁気軸コードの実験値が平均的な高速イオンの振舞いを示しているかどうかが問題であった。このため3種類のバンピネスに対しCX-NPAの水平角を変え様々なポロイダル断面での高速イオンのエネルギースペクトルの視線に対する依存性を調べた。結果として共鳴層が磁気軸を通る場合には、規格化小半径0.4より内側で高速イオンのエネルギースペクトルにはほとんど変化がないことから、共鳴面を磁気軸を通る位置にした場合の高速イオンの生成・閉じ込めに関してはこれまでの結果がプラズマ中心部全体の傾向を示していることが分かった。また、中バンピネスの場合の強磁場側に共鳴層を置いた場合には、モンテカルロ計算から高速イオンがトロイダル角に対して一様に分布していないことが分かった。ヘリオトロンJ装置のICRF加熱実験では閉じ込め磁場のコーナー部に設置した同一ポロイダル面での2本のシングルターンのループアンテナを用い、弱磁場側からの波動励起により少数イオン加熱実験を行い高速イオン閉じ込めに対するバンピネスの効果を調べた。バンピネスとしては0.15(高バンピー配位)、0.06(中バンピー配位)、0.01(低バンピー配位)の3条件で実験を行っているが、昨年から調べている2次元の視線方向の高速イオン挙動を分析するため、変化の大きい高バンピネスの場合についてアンテナの片方ずつを用いて加熱を行い、高速イオンを計測した。少数イオンの密度比は0.07から0.10である。ターゲットプラズマは約250kW、70GHzECHで生成、維持しICRFを重畳した。下側アンテナ使用時の少数・水素のエネルギースペクトルを荷電交換中性粒子エネルギー分析器視線の水平角を0°(トーラス軸方向)と6°とに設定し、それぞれの水平角に対して垂直角を変えエネルギースペクトルを観測した。

垂直角0°がほぼ磁気軸を含む視線であり、垂直角6°は規格化小半径で約0.4に接する視線に対応する。ICRF入射前のターゲットプラズマのイオン温度は0.2keV以下である。垂直角0°で高速イオンが最も多く生成・閉じ込められていることが分かった。0°から離れると高速イオンは明らかに減少する。両アンテナを用いた昨年度の結果と比較すると、水平角0°での磁気軸に対する非対称性は見られない。磁気軸付近の垂直角0°で高速イオンが多く観測された。-2°、2°の傾きはほぼ同等であった。水平角が6°の場合には、垂直角0°から6°に対してほとんど変化がない。この結果に関しては両アンテナを用いた時と同様である。下側アンテナについても調べたが、傾向は同様であり、上下の位置変化に対しては高速イオン生成・閉じ込めは変化が小さいと考えられる。ヘリオトロンJ装置で水素マイノリティ、重水素マジョリティのECHターゲットプラズマに対しICRF加熱を行った。高速粒子エネルギースペクトルは中性粒子エネルギー分析装置(CX-NPA)によって測定した。低衝突領域での高エネルギー粒子測定を行うため線平均電子密度としては0.5E19m-3以下、入射パワー0.3MW程度で、閉じ込め磁場の3種類のバンピネスに対し、高速粒子の生成・閉じ込め挙動を調べる。ここでいうバンピネスの値はB04/B00(B04がバンピー成分、B00が平均磁場成分)で表して、規格化平均半径0.67でそれぞれ0.15(高)、0.06(中)、0.01(低)である。これまでに磁気軸中心をとおる視線で、CX-NPAを用い高速イオンのバンピネス依存性を調べ、高バンピネスで高速粒子生成が最も効率的であることなどが分かっていた。今年度実験ではこれまで十分でなかった高バンピー磁場配位に対して、中心加熱条件で詳細な分布計測を行った。その結果、CX-NPAの視線がトーラス法線に近い場合には、垂直方向の視線スキャンに対して、少数イオンの高速成分分布が磁気軸に対して非対称であることが分かった。バルクイオン温度に対してはこのような非対称性が存在しないことも分かった。高速粒子の非対称性は中バンピー磁場配位でのトーラス内側加熱でも観測されたが、ポロイダル面での分布はそれと異なっていることも分かった。バルクイオンの加熱効率については、計測された範囲で高バンピーで最も良いことも確認された。高速粒子分布についてはモンテカルロ計算を3つの磁場配位に対して行い、高バンピー磁場配位の場合にトロイダル方向分布の非一様性が認められ、実験での傾向と一致していることが分かった。さらに、3次元磁場解析コードによりヘリオトロンJ磁場配位での波動伝播についての解析を開始し初期的な結果を得た。当初予定していた高速イオンのポロイダル断面でのエネルギースペクトルの分布データ取得がほぼ完了し、バンピネスに対する依存性も明らかになった。また、モンテカルロ計算も進んでいる。ハードウェアについても一系統ではあるが同軸切換器が完成し、周波数変更の際の調整も簡便になると期待される。
レシピエント骨随細胞移植によるドナー腎血管内皮細胞再生と血管内皮細胞キメラ誘導

1.臨床のABO血液型不適合腎移植、献腎移植における抗体関連型拒絶反応、虚血再潅流障害における腎微小循環障害、腎微小血管内細胞障害の機序、修復過程に関して臨床的な検討を行った。2.上記に基づいてGFP陽性ラット骨髄細胞の同系GFP陰性ラット腎障害モデルラットへの移植実験系を構成し、障害修復における血管内皮細胞キメリズムを検討した。(1)GFP陽性ラットから陰性ラットへの骨髄移植モデルの確立。GFP陰性ラットに非致死レベルの全身放射線照射を行い、GFP陽性ラットから分離精製した骨髄細胞を経静脈的に移植し骨髄移植ラットモデルを確立した。(2)GFP骨髄移植ラットに対する片腎の虚血再潅流モデルの作成。(1)のラットに片腎の虚血再潅流障害を起こさせるモデルを確立した。本実験では虚血を加えないもう片腎をコントロールに用いて解析した。(3)GFP骨髄移植・虚血再灌流障害ラットモデルにおける血管内皮再生の研究モデル動物を定時的にsacrificeし、摘出腎切片を蛍光顕微鏡で観察し、GFP陽性細胞が障害部位に入り込んでいることを確認した。さらに血管内皮細胞マーカーとの二重染色により、GFP陽性細胞が血管内皮細胞に分化していることを示唆するデータを得た。(4)再生血管の微小循環系の解析上記モデルにおいて、実体顕微鏡による腎微小循環の可視化と血流速度の定量化に成功した。測定が安定して行える条件が設定でき、さまざまな虚血条件と骨髄細胞移植の条件下で再生血管の微小循環を解析し、とくに虚血再灌流障害状態での微小循環血行動態に関してシクロスポリン投与の有無による影響を検討しデータを得ることができた。腎微小循環障害の修復過程にレシピエント骨髄由来細胞が大きな役割を果たしていることを見いだすことができ、臨床腎移植における腎保護面からの応用が期待される。腎障害モデルの確立と腎血行動態、腎血管内皮細胞障害の検討方法の確立1.生理学的手法による腎微小循環障害の解析ラットにおいて虚血再灌流障害、カルシニューリンインヒビター腎障害、抗血管内皮細胞抗体による各種腎障害モデルを作成し、今回設置したランゲンドルフ単離腎潅流液実験機器を用いて、単離腎の潅流実験を行い、潅流液中の血管作動性物質(レニン、アンギオテンシン、エンドセリン、一酸化窒素)、逸脱酵素(LDH,NAG,β2MG)を定量的に解析する方法を確立した。これにより腎微小循環障害の腎血行動態(腎血管抵抗、糸球体濾過率)の検討が可能になった。2.実時間生体顕微鏡を用いたreal time腎微小循環障害の検討腎研究施設、機能制御学分野に設置されているCSU-10を使用し、上記のモデルにおける糸球体係蹄、傍尿細管毛細血管の血流障害を定量的に検討する手法を確立した。本段階の研究は他の腎障害モデルで一部既に実施、報告済みである。3.病理組織学・免疫組織学的方法による腎微小循環障害の解析上記モデル腎の病理組織学、免疫組織学的解析を行い、腎血管内皮細胞障害の程度を、通常のHE,PAM,PAS染色による病理組織学的解析、免疫蛍光抗体法、免疫組織化学染色による血管内皮細胞マーカー、血管再生に関与するサイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体(FactorVIII,thrombomodulin,VEGF,PAF,PDGF,Flt-1)を解析する系を確立した。腎障害モデルへのGFP陽性ラット由来骨髄細胞移植の実施と解析平成15、16年度の基礎的検討結果を踏まえて以下の実験を行った。GFP陽性ラット骨髄細胞の同系

GFP陰性ラット腎障害モデルラットへの移植実験と、障害修復機序、血管内皮細胞キメリズムの検討(1)GFP性ラットから陰性ラットへの骨髄移植モデルの確立。GFP陰性ラットに非致死レベルの全身放射線照射を行い、GFP陽性ラットから分離精製した骨髄細胞を経静脈的に移植した。本法により安定して骨髄が生着するラットモデルを確立した。(2)GFP骨髄移植ラットに対する片腎の虚血再潅流モデルの作成。(1)で作成したラットに片腎の虚血再潅流障害を起こさせるモデルを確立した本実験では虚血を加えないもう片腎をコントロールに用いて解析した。(3)GFP骨髄移植・虚血再灌流障害ラットモデルにおける血管内皮再生の研究モデル動物を定時的にsacrificeし、摘出腎切片を蛍光顕微鏡で観察し、GFP陽性細胞が障害部位に入り込んでいることを確認した。さらに血管内皮細胞マーカーとの二重染色により、GFP陽性細胞が血管内皮細胞に分化していることを示唆するデータを得た。(4)再生血管の微小循環系の解析上記モデルにおいて、実体顕微鏡による腎微小循環の可視化と血流速度の定量化を試みた。測定が安定して行える条件が設定でき、さまざまな虚血条件と骨髄細胞移植の条件下で再生血管の微小循環を解析中である。腎障害モデルへのGFP陽性ラット由来骨髄細胞移植の実施と解析平成15、16年度の基礎的検討結果を踏まえて以下の実験を行った。GFP陽性ラット骨髄細胞の同系GFP陰性ラット腎障害モデルラットへの移植実験と、障害修復機序、血管内皮細胞キメリズムの検討(1)GFP性ラットから陰性ラットへの骨髄移植モデルの確立。(1)で作成したラットに片腎の虚血再潅流障害を起こさせるモデルを確立した。本実験では虚血を加えないもう片腎をコントロールに用いて解析した。(4)再生血管の微小循環系の解析上記モデルにおいて、実体顕微鏡による腎微小循環の可視化と血流速度の定量化に成功した。測定が安定して行える条件が設定でき、さまざまな虚血条件と骨髄細胞移植の条件下で再生血管の微小循環を解析し、とくに虚血再灌流障害状態での微小循環血行動態に関してシクロスポリン投与の有無による影響を検討しデータを得ることができた。腎障害モデルへのGFP陽性ラット由来骨髄細胞移植の実施と解析平成15、16、17年度の基礎的・応用的研究結果を踏まえて以下の実験を行った。
合成マトリゲルの創製

培養細胞の足場として汎用されているマトリゲルの主成分であるラミニンの機能を、合成ペプチドを用いて解析し、得られたラミニン由来活性ペプチドを用いた合成マトリゲル(ペプチド多糖マトリックス)の開発を目指した。研究期間中に、インテグリンと特異的に結合するラミニン由来ペプチドの探索と、レセプター特異的活性ペプチドを混合した混合ペプチド多糖マトリックスの生物活性をコントロールする方法に関して検証を行った。新たなインテグリン結合ペプチドを同定すると共に、レセプター特異的なペプチドの種類・混合比によって混合ペプチド多糖マトリックスの生物活性を促進および減少させる混合レシピを開発した。マトリゲルはラミニンやコラーゲンなどから構成される可溶化細胞外マトリックスで、近年様々な細胞工学的実験に汎用されているが、マウス腫瘍由来のため医療分野への応用は不可能である。申請者はこれまで合成ペプチドと組換えタンパク質を用い、マトリゲルの中心的成分であるラミニンの機能解析や機能部位の同定、さらにはラミニンの機能を模倣した合成ペプチド-高分子多糖複合体を開発してきた。本研究は、これまでの研究を更に推し進め、約60種類のラミニン由来活性ペプチドと物性の異なる高分子多糖を用いてファインチューニングし、実際の医療現場で応用可能な合成マトリゲルの創製を目的にしている。H25年度はマウス幹細胞の培養を開始し、ラミニン活性ペプチドー高分子多糖の幹細胞分化に与える影響の検討を開始した。これまでの検証から、ラミニンα2鎖由来の活性ペプチドを固定化した複合体が神経細胞への分化を誘導することを見出してきているが、現在、詳細を検討中である。また、マトリゲルの主要成分であるLaminin-111を構成するラミニンα1鎖、β1鎖、γ1鎖由来ペプチドを混合した場合の検証も引き続き検証中である。共同研究として、ラミニンペプチドーヒアルロン酸ゲルの開発、混合ペプチドーキトサン膜の作製に大きく関与すると同時に、ラミニンとがん細胞との相互作用についても報告した。申請者はこれまで合成ペプチドと組換えタンパク質を用い、マトリゲルの中心的成分であるラミニンの機能解析や機能部位の同定、さらにはタンパク質の機能を模倣した合成ペプチド-高分子多糖複合体を開発してきた。H24年度はラミニンα2鎖に注目し、ラミニンα2鎖のN末端に存在するインテグリンα2β1結合配列の決定を行った(Hozumi K, et al., J. Biol. Chem., 287, 2012, 25111-25122)。本報告では、これまでに結合することがわかっていたが、結合配列の決定されていなかったラミニンα2鎖N末端のインテグリンα2β1結合配列を変異導入組み換えタンパク質と合成ペプチド配列を組み合わせた方法で検証した。その結果、N末端球状ドメイン中の3つのアミノ酸がラミニンα2鎖N末端とインテグリンα2β1結合の結合に重要であることを報告した。また、共同著者として、ラミニンペプチドのがんとの相関作用、ラミニンペプチドゲルの開発、神経突起伸長活性を持つラミニンペプチドの同定を報告した。これらの研究成果は、人工マトリゲルの創製にむけ、そのツールとして利用可能なペプチドであり、次年度以降の研究に随時用いていく。また、マトリゲルの主要成分であるLaminin-111を構成するラミニンα1鎖、β1鎖、γ1鎖に注目した検討は現在進行中である。マトリゲルはラミニンやコラーゲンなどから構成される可溶性細胞外マトリックスで、近年様々な基礎研究分野で汎用されているが、マウス腫瘍由来のため医療分野への応用は難しい。申請者はこれまで合成ペプチドを用いてラミニンの機能を模倣した合成ペプチド-高分子多糖マトリックスを開発してきた。本研究計画では、動物由来の成分を含まない細胞外マトリックスとして、合成ペプチド-高分子多糖マトリックスを用いた合成マトリゲルの創製を目指した。最終年度の目標とした2つのアプローチのうち、1ペプチド混合比の最適化では、細胞および生物活性によって最適なペプチド混合比が異なることを示した。特に、インテグリンアルファ2ベータ1に接着するペプチドと、アルファ3ベータ1に接着するペプチドを混合したとき、線維芽細胞の接着活性が特異的に低下することが分かった。また、この細胞接着活性の低下は、FAKとPI3Kを介したインテグリンの活性化によってコントロールされていることを報告した(Biomaterials, 2015, Hozumiら)。