hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
眼表面ムチン機能とオキュラーサーフェス疾患に関する分析研究

具体的には、人工関節の摩擦係数を測定するための振り子式摩擦測定装置をSCL使用に改良し、実際に各SCLの摩擦係数を測定することが可能となった。また、SCLの表面に各種溶液(人工涙液、ヒアルロン酸、ムチン溶液)を添加する際の摩擦係数の変化を計測し検討し、興味深い結果を得ることができた。上記について、学会報告および論文作成を行った。眼表面ムチンの重要な機能である水濡れ性および摩擦軽減について評価する実験系を構築した。水濡れ性に関する検討では、接触角計を用いた眼表面の水濡れ性の評価を行い、ムチン溶液等をソフトコンタクトレンズ(SCL)上に滴下した際の接触角を測定し、滴下溶液やSCLの素材による接触角の違いにより水濡れ性の評価が可能になった。眼表面摩擦に関する検討では、眼球の摩擦係数を計測するための振り子式摩擦測定装置を開発した。涙液に見立てた各種潤滑剤を(人工涙液、ヒアルロン酸、ムチン溶液)を添加する際の摩擦係数の変化を検討した。本実験系は眼表面の摩擦研究に有用であり、今後も眼表面摩擦研究を続行していく予定である。現在、先行研究でコンタクトレンズ装用における装用感と涙液破壊時間、眼表面温度との相関をみる研究を行っている。この結果と、現在進行中の接触角測定および摩擦係数測定との関連をしらべる研究を行っていく予定である。そのためには、豚眼などを用いてよりvivoに近い実験系の構築を行う。H28年度に行った正常人における涙液破壊時間、眼表面温度との相関の検討を発展させて、ドライアイ患者において同様の研究を行う予定である。眼表面ムチンが正常および眼疾患において、水濡れ性と眼表面摩擦にどのように関与していくかを検討する予定である。眼科学所要額に比べて111,468円下回ったが、これは次年度の設備費に使用するために昨年12月以降は科研費での使用を控えたためである。差額22,177円のため、おおむね予定通りの研究計画で行うことができた。次年度は、設備費で検査機器(摩擦計)の購入を予定している。差額は、H29年度の研究費(消耗品)に使用する。
植物におけるDーアミノ酸の生理機能 コケ植物葉緑体分裂を中心に

細菌のペプチドグリカン(PG)は、生物では例外的にD-アミノ酸を必須要素とする。我々はヒメツリガネゴケのPG合成系が葉緑体分裂に関わることを示してきた。本研究ではD-アラニン:D-アラニンリガーゼ(PpDdl)の解析を行った。PpDdlの遺伝子破壊ラインでは巨大葉緑体が出現し、この形質がD-アラニル-D-アラニンの添加で相補されたことから、PpDdl遺伝子がD-アラニル-D-アラニンの合成を介してヒメツリガネゴケ葉緑体分裂に機能することを明らかとした。本研究では真核植物におけるD-アミノ酸の生理機能について解析を進めている。我々は、藍藻に由来すると考えられるペプチドグリカン合成系がコケ植物で葉緑体分裂とかかわることを明らかにしてきた。細菌のペプチドグリカン合成にはD-アミノ酸(D-アラニンおよびDグルタミン酸)が使われているため、コケ植物葉緑体分裂へのD-アミノ酸の関与について解析を進めた。ペプチドグリカン合成系においてD-アラニンの重合を行うDd1は、細菌では必須の遺伝子である。ヒメツリガネゴケのDdl遺伝子について解析を進め、遺伝子発現解析等から機能しているDd1遺伝子は1つだと推定できた。そこで、ヒメツリガネゴケで用いることができる遺伝子破壊技術を用い、このPpDdl遺伝子領域を欠失したPpDd1遺伝子破壊ラインの作成を行った。現在、葉緑体分裂阻害が生じたラインにおけるDd1ゲノム領域について解析中である。また、全ゲノムが決定されているヒメツリガネゴケからBlastにより遺伝子探索を行った。D-アラニン合成に関わるアラニンラセマーゼについては推定できなかったが、Asp/Gluラセマーゼ、セリンラセマーゼおよびDアミノ酸アミノトランスフェラーゼと相同性のある遺伝子を見いだした。ヒメツリガネゴケでは、これらの遺伝子産物を用いてD-アラニンを合成しているかもしれない。ラセマーゼ遺伝子については大腸菌等の発現系を用いてその酵素活性についても解析を進める予定である。生物ではD-アミノ酸の使用は例外的であり、特に真核生物ではその生理機能はほとんどわかっていない。D-アミノ酸を必須要素とする細菌の細胞壁成分ペプチドグリカンは、細菌に物理的強度を与えると共に分裂時の隔壁形成にも関わる。我々はヒメツリガネゴケに葉緑体型ペプチドグリカン合成系が存在しており、これが葉緑体分裂に関わることをPbp等の合成系遺伝子の破壊実験により示してきた。本研究ではコケ植物葉緑体分裂におけるD-アミノ酸の機能を調べるため、ペプチドグリカン合成系のD-アラニン:D-アラニンリガーゼ(Dd1)のヒメツリガネゴケ相同遺伝子の解析を行った。ヒメツリガネゴケゲノムデータベースには3つのDd1遺伝子が登録されていたが、ゲノミックPCRとRT-PCRで増幅されたのは1つだけであり、これをPpDd1とした。PpDd1の予測葉緑体移行配列とGFPとの融合タンパク質を細胞内で発現させたところ、GFP蛍光は葉緑体で観察された。ヒメツリガネゴケで用いることができる遺伝子破壊法を使ってヒメツリガネゴケのPpDd1遺伝子破壊ラインを作出し、このラインを観察したところ、野生型の細胞では45個程度存在する葉緑体が2個まで減少しており、それに伴って葉緑体が巨大化していた。このことは、PpDd1が葉緑体内でD-アラニル-D-アラニン合成を介して業緑体分裂に関与していることを示唆しており、植物においてもD-アミノ酸が機能していることが推測される。本研究ではコケ植物葉緑体分裂におけるD-アミノ酸の機能を調べるため、ペプチドグリカン合成系のDーアラニン:Dーアラニンリガーゼ(Ddl)のヒメツリガネゴケ相同遺伝子(PpDdl)の解析を行った。PpDdlの細胞内局在を調べるため、PpDdlの予想葉緑体移行配列65アミノ酸にGFPをつなぎ、CaMV35Sプロモーターで発現させるプラスミドと自己プロモーターで発現させるプラスミドを作製した。作製したプラスミドを導入したヒメツリガネゴケプロトプラストでは、二種類ともで葉緑体にGFP蛍光が観察され、PpDdlが葉緑体に局在していることが示唆された。PpDdlの遺伝子破壊ライン(ΔPpDdl#3)では葉緑体分裂が阻害され、巨大葉緑体が出現することを前年度に見いだしている。

野生型と、巨大葉緑体を持つΔPpDdl#3、およびPG合成の最初の反応を触媒するMurAの相同遺伝子を破壊したΔPpMurA1/2#140をD-アラニル-D-アラニン、D-アラニン、L-アラニル-L-アラニンを添加した培地で育て植物体を観察したところ、D-アラニル-D-アラニンを添加した培地で育てたΔPpDdl#3の次頂端細胞では葉緑体数が22.9±9.8個まで回復していたが、他の場合では葉緑体の増加は見られなかった。これらの結果は、PpDdl遺伝子がD-アラニル-D-アラニンの合成を介してヒメツリガネゴケ葉緑体分裂に機能している事を強く示唆している。PpDd1選伝子の解析を通して、D-アミノ酸が植物内で生理機能を有していることを明らかにした。今後は、PpDd1遺伝子破壊ラインの解析を進めるとともに、コケ植物におけるペプチドグリカン分解系の機能等の解析も進めたい。24年度が最終年度であるため、記入しない。2011年に、シロイヌナズナでD-セリンが花粉管伸長に関わることが見いだされたこと(Michard et al.2011,Science)は、植物全般におけるD-アミノ酸の生理機能という意味で非常に興味深い。コケ植物においても、葉緑体分裂以外の現象にどのようにD-アミノ酸が関わっているのかについて、更に研究を進めていきたい。
咀嚼筋における代償性筋機能亢進に関する研究

1.目的咀嚼運動は各咀嚼筋の共同作業により行われているが、それぞれの咀嚼筋が顎機能にどのように関与しているかは必ずしも明らかではない。そこで、これまでの骨系統疾患である鎖骨頭蓋異形成症患者の咀嚼筋機能の解析にヒントを得て、本研究では実験的にウサギ咬筋に筋弛緩剤を投与し筋機能を局所的に低下させ、代償性に生じる咀嚼筋の機能変化を解析すること、すなわち筋機能低下部位と代償性機能亢進部位との関連を明らかにし、咀嚼運動に対するひとつひとつの筋の作用を詳細に解明することを目的とした。2.材料、方法日本ウサギ(雌、体重22.5Kg)を用いて全身麻酔下で、咬筋浅部にA型ボツリヌス毒素を局所投与した。A型ボツリヌス毒素は、神経筋接合部での神経細胞終末からのアセチルコリン放出を選択的に阻害し、局所選択的に長期間筋弛緩作用をあらわす薬剤である。投与後CT撮影を行い両側咬筋の大きさを比較した。3.結果片側咬筋へA型ボツリヌス毒素を10単位投与し4週後に咬筋の形態を左右比較したところ、投与側咬筋の大きさは対照側の約80%に低下しており、A型ボツリヌス毒素による筋機能抑制に伴う形態変化が示された。4.まとめ各咀嚼筋の顎運動への作用を明らかにするため、A型ボツリヌス毒素を咬筋に投与し局所的な筋機能抑制状態を示すモデル動物を作成した。咬筋機能抑制が効果的に得られる投与量と時期、筋抑制の程度について明らかにした。今後、筋電図による機能変化を測定し、咬筋機能抑制モデル動物として確立する。さらにこのモデル動物を応用し顎関節症の病態解析を実験的に行うことを予定している。これまでわれわれは、骨系統疾患である鎖骨頭蓋異形成症患者の咀嚼筋機能の解析をおこない、この疾患では頬骨弓の連続性欠如のため咬筋の発達が悪く十分な機能を発揮することができないこと、その代償作用として他の咀嚼筋に正常とは異なる筋電図パターンが観察されることを明らかにしてきた。そこで本研究ではこの知見を応用し、実験的にウサギ咬筋に筋弛緩剤を投与し筋機能を局所的に低下させ、代償性に生じる咀嚼筋の機能変化を解析すること、すなわち筋機能低下部位と代償性機能亢進部位との関連を明らかにし、咀嚼運動に対するひとつひとつの筋の作用を詳細に解明することを目的とした。2.材料日本ウサギ(雌、体重22.5Kg)を用いて、咬筋浅部にA型ボツリヌス毒素を局所投与した。A型ボツリヌス毒素は、神経筋接合部での神経細胞終末からのアセチルコリン放出を選択的に阻害し、局所的に筋弛緩作用をあらわす薬剤である。3.方法および結果1)片側咬筋へのA型ボツリヌス毒素投与最適投与量を決定するため、全身麻酔下でウサギ片側咬筋浅部に、各種濃度のA型ボツリヌス毒素を投与した。最適投与量と効果出現時期は現在検討中である。2)咬筋の誘発筋電図導出両側咬筋浅部に双曲電極を設定し、全身麻酔下で筋への直達電気刺激による誘発筋電図を記録し、最適導出方法を検討中である。

4.まとめ各咀嚼筋の顎運動への作用を明らかにするため、咬筋に局所的な筋弛緩状態を作成した。筋機能低下の程度および時期について実験を継続中である。1.目的咀嚼運動は各咀嚼筋の共同作業により行われているが、それぞれの咀嚼筋が顎機能にどのように関与しているかは必ずしも明らかではない。これまでわれわれは、骨系統疾患である鎖骨頭蓋異形成症患者の咀嚼筋機能の解析をおこない、この疾患では頬骨弓の連続性欠如のため咬筋の発達が悪く十分な機能を発揮することができないこと、その代償作用として他の咀嚼筋に正常とは異なる筋電図パターンが観察されることを明らかにしてきた。そこで本研究ではこの知見を応用し、実験的にウサギ咬筋に筋弛緩剤を投与し筋機能を局所的に低下させ、代償性に生じる咀嚼筋の機能変化を解析すること、すなわち筋機能低下部位と代償性機能亢進部位との関連を明らかにし、咀嚼運動に対するひとつひとつの筋の作用を詳細に解明することを目的とした。2.材料日本ウサギ(雌、体重22.5Kg)を用いて、咬筋浅部にA型ボツリヌス毒素を局所投与した。A型ボツリヌス毒素は、神経筋接合部での神経細胞終末からのアセチルコリン放出を選択的に阻害し、局所的に筋弛緩作用をあらわす薬剤である。3.方法および結果1)片側咬筋へのA型ボツリヌス毒素投与全身麻酔下でウサギ咬筋浅部に、A型ボツリヌス毒素を投与し、筋機能を低下させた。最適投与量について現在検討中である。2)咬筋の誘発筋電図導出全身麻酔下で咬筋浅部に双曲電極を設定し、筋電図を記録するために、最適導出方法を検討中である。また、筋機能が亢進した咀嚼筋の組織学的変化についても検討を予定している。1.目的咀嚼嚼動は各咀嚼筋の共同作業により行われているが、それぞれの咀嚼筋が顎機能にどのように関与しているかは必ずしも明らかではない。そこで、これまでの骨系統疾患である鎖骨頭蓋異形成症患者の咀嚼筋機能の解析にヒントを得て、本研究では実験的にウサギ咬筋に筋弛緩剤を投与し筋機能を局所的に低下させ、代償性に生じる咀嚼筋の機能変化を解析すること、すなわち筋機能低下部位と代償性機能亢進部位との関連を明らかにし、咀嚼運動に対するひとつひとつの筋の作用を詳細に解明することを目的とした。2.材料、方法日本ウサギ(雌、体重22.5Kg)を用いて全身麻酔下で、咬筋浅部にA型ボツリヌス毒素を局所投与した。A型ボツリヌス毒素は、神経筋接合部での神経細胞終末からのアセチルコリン放出を選択的に阻害し、局所的に長期間筋弛緩作用をあらわす薬剤である。3.結果片側咬筋へA型ボツリヌス毒素を10単位投与し4週後に咬筋の形態を左右比較したところ、投与側咬筋の大きさは対照側の約80%に低下しており、A型ボツリヌス毒素による筋機能抑制に伴う形態変化が示された。4.まとめ各咀嚼筋の顎運動への作用を明らかにするため、A型ボツリヌス毒素を咬筋に投与し局所的な筋機能抑制状態を示すモデル動物を作成した。咬筋機能抑制が効果的に得られる投与量と時期、筋抑制の程度について明らかにした。咬筋機能抑制モデル動物を応用することで顎関節症の病態解析が実験的に可能になり、意義は大きい。
バーチャルリアリティを活用した生理学的神経活動に基づく体性痛緩和の定量的評価

医療現場では、患者疾患による疼痛や術後痛、医療行為による注射や内視鏡等の処置において痛みを伴う場面が多く存在する。そこで本研究では、生理学的神経活動に基づいたVirtual Reality(VR)を用いた体性痛緩和効果の定量的評価を目的とし、VR環境下における選択的体性感覚神経電流刺激による体表面知覚電流閾値への影響と、それに伴う脳中枢神経活動を脳周波数解析、自律神経活動を指尖容積脈波解析により抽出する。本研究により、体性痛に対する新たな緩和治療の一つとして基盤を構築し、鎮痛薬の制限、患者処置の効率化、患者負担の軽減につながる。さらに、VRによる医療技術の促進が可能となり社会的意義が高い。
分子標的予防の考え方に基づいた新しい癌予防食素材の開発

前立腺がんの一次および二次予防の分子標的としてSrcおよびStat3が有用であるかを検証し、その両分子を標的とした新たな有効な前立腺がん一次および二次予防に有効な食素材の開発を目的とした。阻害剤を使った解析から、SrcとStat3を同時に阻害する活性成分が前立腺がん一次および二次予防成分として有望であることが推測された。実際、delta-tocotrienolを90%以上含有するannatto由来のTRFはヒト前立腺がん細胞であるPC3(二次予防モデル)およびLNCaP(一次予防モデル)に対して、SrcおよびStat3を同時に不活性化することで、細胞増殖抑制効果を示した。本研究の最終目的は、分子標的化学予防の考え方に基づき、前立腺がんの予防・治療に有効と推測される癌予防食素材を開発することである。本年度は、まずこの予防食素材をスクリーニングするための前立腺がん細胞株の選定を行った。ATCC等の細胞バンクから入手可能な前立腺細胞株を購入し、前立腺がんの有用な分子標的と考えられるSrc, Stat3の活性化レベルを指標にして、スクリーニングした結果、その活性化レベルから、ホルモン依存性のLNCaP細胞が予防モデルとして、ホルモン非依存性のPC3が治療モデルとして、各々使用できる可能性が示された。次にこの2つの前立腺癌細胞株を用いて、分子標的としてのSrcおよびStat3の有用性を検証するために、Src阻害剤であるPP2およびStat3阻害剤であるAg490の前立腺がん細胞株の細胞生存活性に対する効果をWST-1法で評価した。その結果、両方の細胞ともに、SrcおよびStat3阻害剤により統計学的に有意な抑制効果が認められ、SrcおよびStat3が前立腺がんの予防・治療における分子標的として有用であることが証明された。さらに、各々単独の阻害剤による抑制効果よりも、2つの阻害剤の併用が前立腺がんの細胞生存活性を相乗的に抑制したことから、この2つの標的分子を同時に不活性化することが前立腺がんの予防・治療により有効であることが推測された。この結果に基づき、この2つの標的分子を同時に抑制する可能性がある食素材をデーターベースを使い、検索したところ、代表的なファイトケミカルであるトコトリエノール類が有用である可能性が示唆された。前年度での絞り込みで前立腺がん予防のために有用と推定したSrcとStat3を同時に抑制する可能性があるファイトケミカルを文献データーベースの調査結果をもとに絞りこんだところ、トコトリエノール類が最有力候補としてリストアップされた。トコトリエノール類の中で最も抗がん活性が高いと報告されているdelta型トコトリエノールを多く含むアナトー由来のトコトリエノールを豊富に含む抽出分画(TRF)を用いて、ホルモン非依存性前立腺がん細胞株(PC3)およびホルモン依存性前立腺がん細胞株(LNCaP)に対する殺細胞効果をWST-1法で評価したところ、両細胞株とともに用量依存的に殺細胞効果が認められた。次に殺細胞効果が認められた用量でSrcとStat3活性に対するTRFの影響をImmunoblot法で解析したところ、両細胞株ともにSrcとStat3が同時に不活性化されていることが推定された。しかし、さらに詳しく不活性化レベルを検討したところ、PC3の方が両分子とも抑制効果が顕著であった。さらに、Srcの阻害剤(PP2)とStat3の阻害剤(AG490)を用いた検討から、その併用効果はPC3により強く認められた。また、前立腺がんの増殖マーカーであるprostate-specific antigen(PSA)を指標にして、TRFやPP2とAG490の併用効果を検証したところ、WST-1やImmunoblotと同じ傾向が認められた。以上の結果から、TRFはSrcとStat3を同時に抑制することにより、前立腺がん細胞の増殖を抑制することが明らかになった。このことはTRFがSrcおよびStat3を分子標的にした前立腺がんの新たながん予防食素材になることを示している。さらに、ホルモン非依存型の前立腺がん細胞に対する効果がより認められたことから、前立腺がんの一次予防のみならず、二次予防にも有効である可能性が推測され、今後のより詳しい検討が期待される癌病態制御学当初予定していた予定は、SrcとStat3を指標にしたスクリーニングに適した前立腺がん細胞株の選定とその細胞株を使ったSrc, Stat3を分子標的にした前立腺がんの予防・治療の有効性の判断、そして、データーベースを用いたSrc, Stat3の活性阻害作用を持つ食素材候補の絞り込みの3点であるが、これについては、上記の研究実績の概要にあるように、ほぼ当初の目的は達成できたと考える。Src, Stat3を標的分子にした前立腺がんの予防・治療成分として有効であると推測されたトコトリエノール類(アナトー色素から抽出したトコトリエノール類)を使って、その作用機序も含めて、その有効性を検証する。
サービスの視点を付与した公共施設群のアセットマネジメントに関する研究

本研究では,ターミナル周辺,再開発地区など施設群が都市的サービスを提供している場面に焦点を当てたアセットマネジメントの方法論の構築を試みた.このためには「サービス」の視点からの総合的な評価,可視化技術の向上などが不可欠である.そこで(1)名古屋駅地区の水防災サービスを対象としてBIM(あるいはCIM)を活用した施設群管理システムの構築を行った.(2)施設群管理の実施例に対し,業務プロセスマネジメント手法を応用した業務効率化の方法を提案した.(3)現在すべての自治体で進められている公共施設等総合管理計画の策定事例への関与を通じて施設群管理のあり方について知見を導いた.公共施設群管理システムの構築を目指し,サービス工学の考え方とCIM(construction information modeling)の手法に基づいて,地下施設群の3次元可視化モデリング,およびそのモデルを用いた浸水シミュレーション分析,避難シミュレーションを行った.モデリングについてはその制作に係る労力量を計測する,制作上の注意点をまとめる等してシステム構築の方法論の一般化を試みた.以上について一部見込みを含む形で成果を「秀島栄三,小林佑大,河原健太郎:サービスの視点を付与したアセットマネジメントに関する基礎的考察ー地下施設の浸水対応を中心に,土木計画学研究・講演集No.48,CDROM (95) pp.1-6,土木学会,2013.11.」にまとめている.他方,公共施設群管理システム構築のためには管理会計・不動産鑑定法からの考察が不可欠であるとしていたが,初年度を終えてその成果として示せるものはまだない.施設管理への会計の取り込みについては土木分野よりも建築分野の方が先に進んでいることから,日本建築学会全国大会の建築物ファシリティマネジメントに関するワークショップを聴講し,登壇した建築系研究者とその後も連絡をとりあい,アセットマネジメントに会計を取り込む際の課題点などに関する資料収集を行った.平成26年4月,総務省が自治体に公共施設等総合管理計画の策定を要請した.アセットマネジメントの広がりを求めるものであり,本研究の主題も実社会において喫緊の課題となっていると言える.・公共施設群管理システムの構築を目指し,サービス工学とCIM(construction information modeling)の考え方を参考にして地下施設群の3次元可視化モデリングおよびそのモデルを用いた浸水シミュレーション分析,避難シミュレーション分析を行ってきた.これらを通じてCIMの効果と作業量を計測し,その有効性を検証した.その成果の一部は「BIMを用いた地下街施設管理の可能性ー水害対応マネジメントを中心にー,地下空間シンポジウム論文・報告集Vol.19,pp.109-116,2014」にて公表しているが,避難シミュレーション分析のやり直し,再検証の結果を加えた成果を今後公表する.(平成26年度公表予定であったがソフトウェアの使用期限が切れたため平成27年度に延期する)・土木学会土木情報学委員会ICT施工研究小委員会に参加し,CIMの活用法およびソフトウェアに関する資料収集,他委員との意見交換を行った.・総務省「公共施設等総合管理計画の策定の要請」を受けて諸自治体では同計画を推進するためのデータベースや体制の構築を進めている.3つの自治体に関与するとともに関係者の意見等を聴取することができた.・上記以外の自治体の公共施設等総合管理計画に関与している建築分野の研究者(複数)と意見交換を行った.建築分野では本研究の主題である「サービス」についてより深い洞察がなされている.一つの意見交換会では建築物・土木構造物の両方を対象として「サービス」を前提とした管理指標について有益な議論を行うことができた.・某自治体の土木施設維持管理の業務効率化に関与した.業務プロセスを観察し,アセットマネジメントやユーザビリティの高いデータベースの構築を見据えた業務プロセス改善に関与することができた.平成27年6月に開催される第51回土木計画学研究発表会にて成果を公表する予定である.本研究では,単一種の土木施設の維持管理にとどまらない,駅,道路,地下街など複数種の施設群が都市的サービスを提供している場面に焦点を当てたアセットマネジメントの方法論の構築を試みた.このためには「サービス」の視点からの評価の枠組み,「可視化」技術の向上などが不可欠であり,具体的には事例地区を対象として諸施設による空間構成やサービス水準などを可視化するBIM(Building Information Model)を活用し,施設群が有する防災機能,アメニティ機能などを評価しながら諸施設の保全・改良を行う仕組みを構築,提案した.具体的には(1)名古屋駅地区の水防災サービスを対象として近年普及が進んでいるBIMを活用した公共施設群管理システムの構築・改良を行った.また,(2)公共施設群管理の実施例に対し,業務プロセスマネジメントの視点から業務効率化を図るための方法を提案した.これには建築学,危機管理,心理学の研究者,自治体技術職員らの協力を得た.一方,(3)総務省が平成2628年度にかけて全国の自治体に対し,公共施設等総合管理計画の策定を要請した.多くの策定事例への関与を通じて,点検とデータベースのあり方,複数種施設にわたる調整事案の解決法,公会計の見直しに向けた施設管理方法の改変などについて諸々の知見を導いた.これらの研究の成果は学会発表・論文投稿によって公表,また平成27年度には土木計画学研究発表会にて「公共施設等総合管理計画」と題するセッションを企画し,建設コンサルタント,研究者らの参加を得て概念整理を進めた.本研究では,ターミナル周辺,再開発地区など施設群が都市的サービスを提供している場面に焦点を当てたアセットマネジメントの方法論の構築を試みた.このためには「サービス」の視点からの総合的な評価,可視化技術の向上などが不可欠である.

そこで(1)名古屋駅地区の水防災サービスを対象としてBIM(あるいはCIM)を活用した施設群管理システムの構築を行った.(2)施設群管理の実施例に対し,業務プロセスマネジメント手法を応用した業務効率化の方法を提案した.(3)現在すべての自治体で進められている公共施設等総合管理計画の策定事例への関与を通じて施設群管理のあり方について知見を導いた.・CIMの有効性に関する論文を平成26年度に公表する予定であったがソフトウェアの使用期限が切れたため,平成27年度に延期する.・施設管理に係る会計のあり方について研究が遅れているが,関与している公共施設等総合管理計画においても取り上げられることから平成27年度中に挽回する.土木計画学・CIMの有効性に関する論文を投稿する.・データベース整備を伴う維持管理の業務プロセス改善の研究を終了させる.・施設管理に係る会計のあり方について研究を進める.・以上を総合して「サービスの視点を付与した公共施設群のアセットマネジメント」の方法論の構築に臨む.・国内では「公共施設等総合管理計画の策定」が進められており,本研究がこれにどれだけ呼応できるかを探りたい.その一環として6月に開催される第51回土木計画学研究発表会にてセッション「公共施設等総合管理計画」をオーガナイズする.公共施設群管理システム構築のためのCIMのモデリングとシミュレーションは次年度に予定していたシミュレーションまで着手した.他方,管理会計・不動産鑑定法からの考察については成果として示せるものはまだない.平成26年度は早急に管理会計・不動産鑑定法からの考察を進め,年度内に一定の成果を出せるようにする.シミュレーションについては論文投稿を行う.平成25年度末頃に消耗品の購入を計画したが納品が間に合わないことが明らかになったため.当該消耗品を平成26年度初頭に早急に購入する
知覚の時間的連続性を支える脳情報処理：新錯視を用いた心理物理学的分析

今年度に予定していた離散運動錯視の特性の心理物理学解析は昨年度中に概ね完了した.その結果,この錯視には4-5 Hzの周期で動作するメカニズムが深く関わっており,それが主観的な時間の連続性を支える大きな要因であるとの推察を得た.今年度は,心理物理学実験の一部について新たな方法に基づくデータを追加し結論の正しさを確認するとともに,大規模な脳波計測実験に基づき錯視の生理学的基礎を検討した.18チャンネル脳波計(Neuroscan SynAmp2 System,東京大学進化認知科学センター共用施設)を用いて,のべ25人の健常者から,離散運動錯視を引き起こす刺激と引き起こさない刺激をそれぞれ観察中の脳波を計測し,錯覚の生起と関連する成分を様々なやり方で分析した.試行錯誤の結果,錯覚が生起するときには後頭頂葉における4-8 Hzの帯域における振動成分が有意に低減することが示された.同じ分析を,視覚刺激がステップ状に現れ消失する条件とガウス状に緩やかに提示される条件で行ない,類似の結果を得た.この結果は,後頭頂葉に現れる4-8 Hz付近のいわゆるシータが,知覚の時間的連続性の成立に関与している可能性を示唆している.これらの結果を,前年までの心理物理学実験の結果と統合する形で一つの論文にまとめることに決定し,投稿を準備した.また,本研究の成果をInternational Symposium on theScience of Mental Timeおよび第16回脳と心メカニズム(統合脳WS)において講演(招待)した.上記とは別に,昨年度に採択された視覚コントラスト感度と運動座標系に関する研究成果を国際会議VSSで発表した.また,以前より進めていた視野闘争における座標系の役割に関する論文をJ. Visionに公刊した.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。我々が新たに発見した離散運動錯視の特性を一連の心理物理学実験により検討し,以下の結果を得た.1.現象は移動する窓の中でキャリア格子が静止あるいは逆方向に一定範囲の速度で運動するときに強く生じる.2.この時空間特性は網膜座標系ではなく身体座標系において決定される.3.窓の大きさに対してキャリア格子の波長が小さいとき,あるいは窓が輝度エッジを含むときには現象は生じない.4.等輝度刺激では現象は生じない.これらの結果より,錯覚的な跳躍現象はLGN大細胞系を起源とする,比較的高次の視覚運動処理機構における窓位置とキャリア運動(により指示される位置)の信号の周期的な乖離の解消過程を反映すると考えられた.しかし,別の実験から,5.跳躍の見かけの時間周波数は刺激の時空間条件に関わらずほぼ4-5 Hzとなることが判明した.錯視は位置信号の乖離の解消を原因としつつも,その主観的な様相は脳内において一定周期で動作する未知のメカニズムにより決定されると考えられる.また,別の実験から,6.錯覚的な跳躍は刺激の時空間的な定位の正確さを低下させること,7.主観的な跳躍のリズムは他のリズミックな刺激により引き込まれること,などかわかった.加えて,8.身体座標系における位置・運動信号の相互作用を検討するため,主観的跳躍を引き起こすような刺激に対するコントラスト感度を測定した結果,その感度特性が空間周波数により定性的に異なることを見出した.1-7については国内学会の優秀賞抄録や班会議において発表し,8は国内学会にて発表,かつ優秀発表賞を受賞,また次年度の国際会議に投稿し採択された.今年度に予定していた離散運動錯視の特性の心理物理学解析は昨年度中に概ね完了した.その結果,この錯視には4-5 Hzの周期で動作するメカニズムが深く関わっており,それが主観的な時間の連続性を支える大きな要因であるとの推察を得た.今年度は,心理物理学実験の一部について新たな方法に基づくデータを追加し結論の正しさを確認するとともに,大規模な脳波計測実験に基づき錯視の生理学的基礎を検討した.18チャンネル脳波計(Neuroscan SynAmp2 System,東京大学進化認知科学センター共用施設)を用いて,のべ25人の健常者から,離散運動錯視を引き起こす刺激と引き起こさない刺激をそれぞれ観察中の脳波を計測し,錯覚の生起と関連する成分を様々なやり方で分析した.試行錯誤の結果,錯覚が生起するときには後頭頂葉における4-8 Hzの帯域における振動成分が有意に低減することが示された.同じ分析を,視覚刺激がステップ状に現れ消失する条件とガウス状に緩やかに提示される条件で行ない,類似の結果を得た.この結果は,後頭頂葉に現れる4-8 Hz付近のいわゆるシータが,知覚の時間的連続性の成立に関与している可能性を示唆している.これらの結果を,前年までの心理物理学実験の結果と統合する形で一つの論文にまとめることに決定し,投稿を準備した.また,本研究の成果をInternational Symposium on theScience of Mental Timeおよび第16回脳と心メカニズム(統合脳WS)において講演(招待)した.上記とは別に,昨年度に採択された視覚コントラスト感度と運動座標系に関する研究成果を国際会議VSSで発表した.また,以前より進めていた視野闘争における座標系の役割に関する論文をJ. Visionに公刊した.申請時の二年間の研究計画において予定していたほぼ全ての心理物理学実験と分析をほぼ完了し,かつ当初の計画にはなかった新たな実験を実施し,有益な結果を得ることもできた.

なお,実験そのものはおこなったものの発表しなかったデータも数多く蓄積されている.研究の成果は着実かつ戦略的に発表され,国内学会発表賞の受賞,および国際会議への採択へと至っている.なお,原著論文の執筆は既に開始している.27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は,これまでの結果に基づき新たに着想した心理物理学実験を続けるとともに,錯視生起中の脳波を測定することにより神経活動のダイナミクスを解析する.予備実験は既に開始しており,かなり興味深いデータが得られている.この脳波解析により,主観的跳躍の時間周波数を決定していた未知のメカニズムの実像が見えてくると期待される.また,本研究が属する新学術領域計画班の一部と共同で,脳波やMEGとfMRIを組み合わせたより大規模な脳機能イメージング実験を実施することも予定している.この研究では,離散運動錯視のみならず,それにヒントを得た新錯視も提供できることを期待している.これら心理物理・脳波のデータを合わせて,時間的連続性を支える神経計算メカニズムの全容を解明することをめざす.以上の成果は国内外の学会で発表するとともに,複数の原著論文にまとめ国際誌に投稿する.なお,統合脳ネットワーク・シンポジウムなどでの講演もすでに予定している.27年度が最終年度であるため、記入しない。
暗黒エネルギー源探索へ向けたGHz帯誘導共鳴光子衝突実験実現性の検証

これまでの素粒子散乱実験では、自然界の4つの力のうち、重力以外の3つの力のみを扱い、重力的相互作用はその弱さ故に対象外であった。高強度GHz光子群の誘導共鳴散乱による、暗黒エネルギー源となり得る新粒子探索の構想は、重心系エネルギーを変えながら未知共鳴場を探索するという素粒子衝突実験のスピリットを継承しつつも、「強結合-重質量」域の素粒子群に特化してきた荷電粒子散乱による伝統的手法とは相補的に、「超弱結合-超軽質量」域の素粒子群の地平を新たに切り拓く挑戦である。重力結合域の感度へと至るため、GHz帯光子の準平行散乱系の実装、及び、GHz帯光子の計数手法の模索を通じて、研究構想の実現性を検証する。
生体吸収性人工骨およびインプラント材の開発と歯科矯正学分野への応用

本研究では加水分解し、生体に吸収され、組織為害性がないポリ乳酸(CPLA、分子量:100,000750,000)と骨伝導能を持つハイドロキシアパタイト(HAP)、フルオロアパタイト(FAP)、α三りん酸カルシウム(α-TCP)、β三りん酸カルシウム(β-TCP)の4種の有機/無機のコンポジット型インプラント材を試作し、その理工学的性質について検討するとともに、組織親和性、生体吸収性につて病理組織学的、免疫組織学的、電子顕微鏡学的に検索する。さらに、試作インプラント(生体吸収性人工歯根)を固定源として歯の移動を行うとともに、試作スクリュー、プレートおよび人工骨を作製し、その有効性や吸収性について理工学的、病理組織学的、電子顕微鏡学的ならびに血管網の立体的微細構造について検討し、生体に調和した画期的な生体吸収性インプラント材を開発しようとするものであり、本年は次の結果を得た。1、3種のポリ乳酸とα-TCP、β-TCP、HAP、FAPそれぞれを30、50(Wt/%)の割合でブレンドし、試作インプラントロッドを作製した。2、各種インプラントロッドをラット背部皮下に埋入し、組織親和性と生体吸収性の経時的変化について病理組織学的に検索した。その結果、周囲組織に炎症性反応などの所見は認められなかった。
胆管膵管合流異常例の胆汁脂質分析による胆道癌病因の解明

膵管胆道合流異常症例に胆道癌が高率に合併することから、膵液の胆道内逆流と発癌との関連性が考慮されている。胆汁中主成分であるレシチンからフォスフォリパーゼによって生成されるリゾレシチンは、極めて細胞障害性が強い。膵管胆道合流症例では、リゾレシチンが生成され、発癌と何らかの関係があると考えられるが、膵管胆管合流異常症例において、レシチン、リゾレシチンを正確に定量した報告はない。レシチン、リゾレシチン定量は有機溶媒と薄層クロマトグラフィーにて行なわれてきたが、精度、正確度共に不十分であるため、新たに定量法を確立した。すなわち、胆汁0.10.2mlをクロロホルムーイソプロパノールで希釈後、アミノプロピル、ボンドーエリュートカラムにて抽出、高速液体クロマトグラフィーにてレシチン、リゾレシチン分画を採取、各分画中のコリンを酵素法で測定した。〔^<14>C〕レシチン、リゾレシチンの添加回収実験では、回収率は95%以上、レシチンのリゾレシチンに対する混入は1%以下で、ほぼ満足すべき結果を得た。膵管胆道合流異常症10例を本法で定量すると、リゾレシチンが全く生成されていない二例から、80%がリゾレシチンに変換された症例まで%リゾレシチンに症例により大差があった。同症例の胆汁酸をガスクロマトグラフィー(GLC)にて定量すると、胆嚢胆汁中胆汁酸濃度は正常コントロールの約1/5で、二次胆汁酸であるデオキシコール酸化率の減少を認めた。〈結論〉膵管胆道合流異常において大部分の症例で胆汁中レシチンは、膵液フォスフォリパーゼにより、ある程度リゾレシチンに変換され、しかもそのままの形でとどまっており、胆道系への慢性刺激がたえず存在することは明白である。胆道癌発癌とリゾレシチンの関係を今後さらに検討する必要があると考えられる。胆管膵管合流異常症の胆道癌合併の病因として膵液の胆管への逆流が重要視される.胆汁中主成分であるレシチンは膵液中フォスフォリパーゼにより,容易に組織刺激性の強いリゾレシチンに変換され,発癌因子,癌促進因子となる可能性がある.胆道癌病因解明の手掛りを探るため,胆管膵管合流異常症の胆汁脂質を分析した.胆汁中リゾレシチンの正確な定量法を確立した.即ち胆汁をC18ボンドエリュート又はアミノプロピルボンドエリュートに通導し,有機溶媒にてレシチン,リゾレシチン分画を抽出,高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に注入,移動相はアセトニトリル:メタノール:水(400:100:34)で,カラムはSCX(Benzene sulfonate)25cm×4mmI.D.にて分析,検出は203nm(UV)で行なった.リゾレシチンの種類により検出感度が大いに異なることが判明したため,溶出ピークを分取, Bartlett法で定量することでこの難点を乗りきった.目下,本定量法の精度確認のため〔^<14>C〕レシチンにて追加実験中である.

更に本症例の胆汁中胆汁酸をガスクロマトグラフィー(GC)にて測定した.正常例(胆石症等)と比べて,総胆汁酸濃度は約1/10で希薄であるが,癌促進因子とされる二次胆汁酸,デオキシコール酸は正常例と差がなかった.合流異常症のフォスフォリパーゼ活性を測定したところ,各症例間で大いに差があった.来年度はレシチン,リゾレシチンの正確な定量を行ない,リゾレシチンの胆道癌発生への関与を明確にする予定である.胆道癌、膵管胆道合流異常症例の内視鏡的逆行性胆道造影(ERCP)、経皮経肝胆道造影(PTCD)及び手術時採取胆汁を前年度に引き続き分析した。すなわち、胆汁をアルコール抽出後、総胆汁酸濃度、胆汁酸組成、遊離脂肪酸濃度、コレステロール濃度はガスクロマトグラフィー(GLC)、レシチン、リゾレシチンはアミノプロピルボンドエリュートで試料精製後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で各画分を分取、コリンとして測定した。フォスフォリパーゼ活性は我々がすでに報告していた方法に従って分析した。〔^<14>C〕レシチン、リゾレシチンの添加回収実験では回収率は95%以上でほぼ満足すべき結果を得た。膵管胆道合流異常症10例を本法で測定すると、リゾレシチンが全く生成されていない2例から、80%がリゾレシチンに変換された例まで%リゾレシチンに症例により大差があった。同症例の胆汁酸をGLCにて定量すると、胆嚢胆汁中胆汁酸濃度は正常コントロールの約1/5で二次胆汁酸であるデオキシコール酸比率の減少を認めた。膵管胆道合流異常症例において、大部分の症例で胆汁中レシチンは、膵液フォスフォリパーゼA_2により、ある程度リゾレシチンに変換され、しかもリゾレシチンはフォスフォリールコリンへの崩壊はされずにそのままの形でとどまっていることから、本症例では胆道系への慢性刺激が存在することが明白となった。本刺激は、胆道癌の発生に何らかの関係があると考えられる。ハムスター胆嚢へリゾレシチンを注入する動物実験を予定していたが、実験系を確立するまでにいたらず、現在継続中である。
樹木ポリフェノールの消臭活性部位に関する有機化学的研究

本研究では樹皮および抽出物の消臭性に着目し、その効果とメカニズムに関する基礎資料を提供することを目的としている。これまでのところ、樹皮およびその抽出物のNH_3、CH_3SHに対する消臭効果について検討し、それらの高い消臭効果が認められている。また、アルデヒド類で架橋したワットルタンニンのCH_3SHに対する消臭効果は、アルデヒド類のかさ高さと深く関係しており、特にアセトアルデヒド処理物はもっとも消臭効果が高いことも明らかにした。そこで今回は架橋反応において塩酸濃度を変えて付加縮合反応を行い、その消臭効果および消臭メカニズムについて検討した。消臭試験はCH_3SH濃度約0.015%(7ppm前後)と約0.3%(110ppm前後)の2種類で行った。その結果、塩酸濃度が上がるにしたがい付加縮合物の消臭率も上昇し、12Nにおいてはほぼ完全かつ速やかにCH_3SHを消臭した。これまでの実験で、WEに対するアセトアルデヒドのモル比が高くなるにつれて消臭率の上昇が認められていたが、今回の実験では十分な量のアセトアルデヒドであっても酸濃度によって消臭率が大きく異なることが分かった。また酸濃度が上がるにつれて試料の色が濃くなり、12Nでは紫色を呈した。これは酸化による架橋の進行により生じた多くの共役系によって形成されるものと予想される。よって、求核性の高いCH_3SH分子が共役系のサイトに取り込まれることにより消臭作用が発現したのではないかと推論できる。また、色彩色差計での測定から塩酸濃度の低い試料間では大きな差が見られないが、高濃度では著しく数値が変わり、色の変化を反映した。このことから、塩酸濃度の高い条件で調製した試料では架橋が速やかに進行し、共役系サイトが多く形成され濃い色が出ているであろうと思われた。
ビクニンノックアウトマウスを用いた喘息の気道リモデリングに関する研究

【緒言】ヒアルロン酸は、気道の粘液産生や繊毛運動、T細胞や単球からのサイトカイン産生などを介して、喘息の病態に深く関与している可能性がある。それを直接的に検討するために、血清由来ヒアルロン酸関連蛋白(SHAP)の転送反応に必須なITIの構成成分であるビクニンノックアウト(BXOマウス)を用いて喘息モデルを作製し、主に気道反応性について検討した。【方法】DBA/1マウスあるいはBALB/CからBXOマウスを作製した。1日目と13日目に、卵白アルブミン(OVA)と水酸化アルミニウムで腹腔内感作した。次いで23日目から36日目までの2週間、あるいは23日目から50日目までの4週間毎日1%のOVA溶液を吸入させて気道内感作を行った。BUXCO社製のボディプレチスモグラフを用いて22目目と37日目にメタコリンによる非特異的気道反応性、26日目と33日目にはOVA吸入後の抗原特異的気道反応性を評価した。【結果】短期OVA吸入による感作期間開始3日後、あるいは10日後のOVAに対する即時型気道反応性は、野生型マウスとBXOマウス間に差を認めなかった。メタコリン吸入による非特異的気道反応性も同様であった。また血清中OVA特異IgEおよびIgG濃度にも、両系統間で差を認めなかった。気管支肺胞洗浄液の総細胞数、細胞分画、各細胞数などにも有意差を認めなかつた。OVA吸入4週間の長期吸入群においても、気道反応性は両系統間で有意差を認めなかったが血清中のIgG濃度は、BXOマウスで有意に上昇していた。【考察】今回BXOマウスでは気道反応性に特段の差異を確認できなかったが、ボディプレチスモグラフィーではなく、古典的な気管切開による挿管下気道内圧測定でも評価する必要があろう。またBXOマウスにおいて予想される組織学的変化の前提としての、HAやSHAPの量的変化が実際に実現されているか否かも検証しておく必要があろう。気管支喘息では気道のアレルギー性炎症が病態の本質である。気道炎症が長期に継続すると,気道組織の改変,すなわちリモデリングが成立し難治化の要因となると考えられている.ヒアルロン酸(HA)は,細胞外マトリックス成分として気道をはじめとする生体内に広く存在し,様々な生物活性を有する。我々は,HAがその機能を果たすために重要な結合タンパク(serum-derived hyaluronan-associated protein ; SHAP)の構成成分であるビクニンに対するノックアウト(KO)マウスを用い,気道アレルギー反応におけるHAの関与を検討した.マウスを卵白アルブミン(OA)で腹腔感作した後,OAの吸入チャレンジを2週間に亘って連日施行,チャレンジ前後におけるメサコリン(Mch)吸入に対する気道反応性の変化,及びOAそのものによる気道反応を,野生型とビクニンKOマウスとで比較した.いずれのマウスの群でも2週間のOVAチャレンジにより,Mchに対する気道反応性は亢進したが,その程度はKOマウスの方が有意に高かった.

一方,OA吸入そのものによる即時型気道反応は,両群とも同程度亢進していた.KOマウスでは,HAの生物活性が十分発揮されないと考えられるので,Mchに対する気道反応性がKOマウスでより亢進していたのは,気道内アレルギー性炎症におけるリモデリングに対してHAが何らかの抑制作用を持っている可能性が考えられた.今後,OAチャレンジ後の気管支肺胞洗浄液や気道組織の免疫組織学的検討を通じて,その機序をさらに明らかにしていく予定である.気管支喘息では気道のアレルギー性炎症が病態の本質である。気道炎症が長期に継続すると,気道組織の改変,すなわちリモデリングが成立し難治化の要因となると考えられている.ヒアルロン酸(HA)は,細胞外マトリックス成分として気道をはじめとする生体内に広く存在し,様々な生物活性を有する.我々は,HAがその機能を果たすために重要な結合タンパク(serum-derived hyaluronan-associated protein ; SHAP)の構成成分であるビクニンに対するノックアウト(KO)マウスを用い,気道アレルギー反応におけるHAの関与を検討した.DBAマウスを卵白アルブミン(OA)で腹腔感作した後,OAの吸入チャレンジを2週間に亘って連日施行,チャレンジ前後におけるメサコリン(Mch)吸入に対する気道反応性の変化,及びOAそのものによる気道反応を,野生型とビクニンKOマウスとで比較した,OVA感作により,即時型気道反応はビクニンKOマウスも野生型マウスも観察されたので,IgE等に依存した生物反応は存在していると考えられる.しかし、2週間及び4週間のOVA吸入暴露後のMchに対する気道反応性は,KOマウスの方が野生型より亢進していた。4週間OVA吸入暴露後の血清OVA特異IgG1は,ビクニンKOマウスで有意に高レベルであった。組織学的検討では感作マウスの気道炎症はビクニンXOマウスで強い傾向があったが、気管支肺胞洗浄細胞の分画や細胞数に有意差は認められなかつた。以上よりビクニンやSHAP-HAは,気道の免疫応答を減弱化し、気道れん縮を抑制することによりひいては気道リモデリングを防止する働きを持つ可能性が考えられる.今後より詳細に免疫学的・生理学的検討を加えて、その機序を明らかにしていく予定である.
生殖補助医療がヒト受精卵におよぼすエピジェネシス制御に関する検討

生殖補助医療とインプリンティング遺伝子異常の増加の関連について、初期胚において、インプリンティング遺伝子の発現制御に重要な役割を果たすDNAメチル化に関する検討を行った。余剰胚の研究目的での使用に同意の得られた夫婦より提供された胚を融解、培養し、得られた良好胚盤胞よりgenomic DNAを抽出、バイサルファイト処理を行った後、H19、PEG1遺伝子のアレル特異的メチル化領域をPCRにより増幅、制限酵素切断により、メチル化アレルおよび非メチル化アレルの存在、またその存在比を求めた。結果、メチル化、非メチル化アレルの存在比はいずれも50%を有意に逸脱するものではなく、インプリントは正常であった。東京大学医学部附属病院女性診療科IVFセンターにおいて、体外受精にて得られた受精卵のうち、余剰胚の研究目的での使用に同意を得た夫婦は、科研費申請前に同意を得ていた症例を含め、2010年度末時点で35組となった。これらの夫婦より全例、血液を採取し、DNAを抽出、4つのインプリンティング遺伝子(NDN,SNRPN,IGF2,H19)のSNPをPCR-RFLPによりscreeningを行い、受精卵の発現アレルが同定可能である夫婦の抽出に取り組んでいる。4つの遺伝子のうち、NDN,IGF2は比較的PCRによる増幅が容易であり、制限酵素処理により、一部の夫婦で遺伝子型が異なり、受精卵の解析が有用であることを示唆する結果が得られている。4つの遺伝子のうち、現在、サル胚盤胞でインプリントが未完成であることが判明し、かつPCR,RFLPによるscreeningが有用であるNDN遺伝子にまず着目し、胚盤胞よりのDNA,RNA採取、PCRおよびRT-PCR,RFLPによる、発現アレル同定をすすめている。ヒト胚盤胞より、genomic DNAおよびRNAの同時抽出を試みているが、まだ抽出条件が安定していないため、夫婦の解析で解析が不要となった受精卵を用いて、安定したDNA,RNAの抽出条件の探索を行っている凍結保存胚の研究目的での使用に同意の得られた39組の夫婦、計78名より採血を行い、白血球よりDNAを抽出、PCR、ダイレクトシークエンス(もしくは制限酵素処理)によりいくつかのインプリンティング遺伝子のexonにおけるSNP(Single nucleotide polymorphism)を調べた。NDN exon1におけるMboI polymorphism、IGF2 exon9におけるApaI polymorphismについては、夫婦間の受精卵において発現アレルの解析が可能なカップルが、それぞれ10数組ずつ得られた。インプリンティング遺伝子の胚盤胞における発現を確認するため、研究参加に同意が得られたが、夫婦のインプリンティング遺伝子解析の結果、発現アレルの同定が不可能で、研究に不適とされた夫婦間の凍結胚盤胞を融解し、DNA,RNA抽出、個々の胚盤胞におけるgenomic PCR, RT-PCRを行い、NDN, IGF2のSNPを含む領域の増幅を試みた。結果、genomic DNAによりDNAレベルでの増幅は安定した結果が得られたが、NDN, IGF2の発現が確認された胚盤胞はそれぞれ20-30%程度にとどまり、安定した発現が確認できなかった。次に、DNAメチル化に関する解析の予備実験として、体外受精時に得られた廃棄前の顆粒膜細胞を用いて、genomic DNAを抽出、バイサルファイト処理を行った後、IGF2-H19のDMR領域をPCRにより増幅、制限酵素切断により、メチル化アレルおよび非メチル化アレルの存在、またその存在比を求めることに成功した。このことは、個々の胚盤胞において、制限酵素で認識される塩基のメチル化、非メチル化の程度を定量化でき、インプリンティング遺伝子発現制御の解析に大いに役立つ所見と思われる。1.凍結余剰胚の研究目的での使用に同意の得られた夫婦より提供された胚を融解、培養を行い、得られた良好胚盤胞よりgenomic DNAを抽出した。Genomic DNAにバイサルファイト処理を行った後、H19、PEG1遺伝子のアレル特異的メチル化領域(DMR)をPCRにより増幅、制限酵素切断により、メチル化アレルおよび非メチル化アレルの存在、またその存在比を求めた。H19遺伝子については12個の胚盤胞、PEG1遺伝子については13個の胚盤胞におけるDMRにおける検討を行った。凍結保存胚の研究目的での使用に同意の得られた39組の夫婦、計78名より採血を行い、白血球よりDNAを抽出、PCR、ダイレクトシークエンス(もしくは制限酵素処理)によりいくつかのインプリンティング遺伝子のexonにおけるSNP(Single nucleotide polymorphism)を調べた。

インプリンティング遺伝子の胚盤胞における発現を確認するため、研究参加に同意が得られたが、夫婦のインプリンティング遺伝子解析の結果、発現アレルの同定が不可能で、研究に不適とされた夫婦間の凍結胚盤胞を融解し、DNA,RNA抽出、個々の胚盤胞におけるgenomic PCR, RT-PCRを行い、NDN, IGF2のSNPを含む領域の増幅を試みた。結果、genomic DNAによりDNAレベルでの増幅は安定した結果が得られたが、NDN, IGF2の発現が確認された胚盤胞はそれぞれ20-30%程度にとどまり、安定した発現が確認できなかった。次に、DNAメチル化に関する解析の予備実験として、体外受精時に得られた廃棄前の顆粒膜細胞を用いて、genomic DNAを抽出、バイサルファイト処理を行った後、IGF2-H19のDMR領域をPCRにより増幅、制限酵素切断により、メチル化アレルおよび非メチル化アレルの存在、またその存在比を求めることに成功した。このことは、個々の胚盤胞において、制限酵素で認識される塩基のメチル化、非メチル化の程度を定量化でき、インプリンティング遺伝子発現制御の解析に大いに役立つ所見と思われる。当初の課題であった、胚盤胞よりのDNA, RNA抽出については、条件が安定してきたものの、肝心のインプリンティング遺伝子発現が不安定であり、多数の胚盤胞を材料とした発現アレルに関する解析が困難であることが判明した。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、RNAレベルでの発現だけでなく、DNAレベルでのエピジェネシス制御である、メチル化に焦点を当てて解析をすすめる。具体的には、余剰胚盤胞よりゲノムDNAを抽出し、バイサルファイト処理後PCR、制限酵素切断を行い、メチル化・非メチル化の比を求めて、培養条件・受精方法などによる差異を比較する。