hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
触媒反応を利用する超微量金属成分の状態分析システムの開発

1.触媒活性状態の特定o-フェニレンジアミン存在下、銅イオンを触媒して溶存酸素によりアスコルビン酸を酸化させる反応を利用して銅を吸光光度定量する方法を検討した。シュウ酸の添加濃度と反応性銅(定量できる銅)の存在率との関係を調べ、平衡定数から算出した種々の銅(II)シュウ酸錯体の存在率と比較した結果、反応性銅はCu^<2+>とCu^<II>L_n(Lが単座配位子の場合はn≦2、二座配位子の場合はn=1)であることが明らかになった。2.状態分析システムの構築上記の反応を利用して銅を流れ分析する場合、流路であるテフロン細管の内壁に銅が吸着し損失することが問題となったが、各反応試薬溶液の流路を独立させ、キャリヤー溶液にアルミニウムを添加することによって抑制できた。本測定システムにより、分析時間10分、定量誤差1ng/mlで銅が定量できるようになった。このシステムに、フローインジェクション方式でフミン物質を同時蛍光測定する機能を組み込んだ。フミン物質は、フミン酸として定量誤差10ng/ml、200ng/mlまで定量できた。3.実際試料への応用本研究では、銅全量の測定システムも組み合わせる予定であったが、フミン物質を測定した流れを原子吸光分析装置などに導けば測定可能と思われたので、この段階で実際試料へ応用し、本システムの有用性を確かめた。擬似河川水(Cu^-フミン酸-Fe-Si溶液)を試料として、アルミニウムを添加したときの銅とフミン酸の濃度の経時変化を本分析システムで調べ、それらの状態分析を試みた。アルミニウムの添加開始から反応性銅とフミン酸の濃度は減少し、鉄(アルミニウム)フミン酸の凝集によって凝集体内部のフミン酸からは蛍光が測定できなくなり、同時に銅も内部に取り込まれ反応性を失うことが示唆された。アルミニウムイオンと大過剰のフッ化物イオンを添加した場合についても同様の状態分析を試みた。1.触媒活性状態の特定銅イオンを触媒して溶存酸素によりアスコルビン酸(AA)をデヒドロアスコルビン酸(DAA)に酸化する反応と、生成したDAAと_<o->フェニレンジアミンの縮合による発色反応とを組み合わせて銅を定量することにした。銅溶液と各反応試薬溶液を試験管内で反応させ(手操作バッチ法)、定量条件などを検討した。触媒作用(触媒活性状態)を示す銅の化学的形態を特定するため、錯化剤としてシュウ酸イオンを加え、シュウ酸濃度と反応性銅の存在率(定量可能な銅濃度/全銅濃度)との関係を調べ、平衡定数から算出した種々の銅(II)シュウ酸錯体の存在率と比較した。その結果、シュウ酸イオンが1つ配位した状態は反応性を示すが、二つ配位すると非反応性を示すことが分かった。これより、二座配位子としてAAが配位できる状態の銅イオンが触媒活性を示すことが明らかになった。従って、本法で定量できる反応性銅はCu^<2+>とCu^<11>L_n(Lが単座配位子の場合はn≦2、二座配位子の場合はn=1)であることが分った。2.状態分析システムの構築本システムは、銅全量の測定システム、反応性銅の測定システム、フミン物質の測定システム(等)の3つの測定システムで構成する。

上記の結果を基に、反応性銅の測定システムとして、各反応試薬をポンプでテフロン細管に流し、これに銅溶液を試料として注入して反応させ、フローセルで反応生成物の吸光度を測定するシステムを作製した。反応条件や装置条件を様々検討したが、分析感度が極めて悪かった。その原因を調べたところ、細管内壁への銅の吸着損失によることが分った。そこで、反応試薬等を独立した流路でセルに送り、セル内で反応させるフローシステムを作製した。これにより、手操作バッチ法と同程度の分析感度が得られるようになった。本状態分析システム全体の構築は次年度に継続する。1.状態分析システムの構築触媒反応を利用して反応性銅を流れ分析する場合、流路として使用したテフロン細管の内壁に銅が吸着損失して分析感度が著しく低下したので、反応試薬等を独立した流路でセルに送る方式を採用した(前年度研究)。しかし、測定を繰り返すと徐々に損失が見られるようになったので、損失を防ぐ方法を検討し、アルミニウムの添加によって防ぐことに成功した。本測定システムでの反応条件、反応温度の制御、全自動化についても検討した結果、分析時間10分、定量誤差1ng/mlで銅が定量できるようになった。次に、蛍光測定に基づくフミン物質の測定機能を上述の銅の測定システムに組み込んだ。フミン酸としてフミン物質を定量する場合、銅のような吸着損失の影響が見られなかったので、フローインジェクション方式で測定できた。本システムにより、フミン物質は、銅と同時に測定でき、フミン酸として定量した場合、定量誤差10ng/mlで200ng/mlまで定量できた。本研究では、さらに銅全量の測定システムを組み合わせる予定であったが、フミン物質を測定した流れを原子吸光分析装置などに導けば測定可能と思われたので、この段階で実際試料へ応用し、本システムの有用性を確かめることにした。2.実際試料への応用フミン酸の存在状態がある程度推定できる擬似河川水(Cu-フミン酸-Fe-Si溶液)を試料として、アルミニウムを添加したときの銅とフミン酸の濃度の経時変化を本分析システムを使って調べ、それらの状態分析を試みた。アルミニウムの添加によって銅とフミン酸の濃度は時間とともに減少した。アルミニウムイオンがフミン酸を凝集させ、それにより凝集体内部のフミン酸からの蛍光は測定できなくなり、同時に銅も内部に取り込まれ反応性を失うことが示唆された。アルミニウムイオンと大過剰のフッ化物イオンを添加した場合についても同様の状態分析を試みた。
α2アドレナリン受容体作動薬徐放薬を用いた神経障害性疼痛の治療

薬剤の作成が上手くいかず、計画を変更した。神経障害性疼痛における内因性鎮痛機構に主眼を置き、神経障害性疼痛モデルラットに三環系抗うつ薬を投与し、減弱した内因性鎮痛経路が回復することを明らかとした。具体的には、神経障害性疼痛モデル作成から5週間経過した時点でアミトリプチリンを5日間連続で腹腔内投与し、作成から6週間の時点でラット前肢にカプサイシンを投与して内因性疼痛の評価方法であるnoxious stimulus induced analgesia(NSIA)を調べた。神経障害から6週経過するとNSIAは減弱するが、アミトリプチリン投与によりNSIAの回復が見られた。α2アドレナリン受容体作動薬は、脊髄後角に作用して神経障害性疼痛に抑制し、欧米では鎮痛薬として使用されている。申請者らのグループはこれまでにDrug Delivery Systemを応用し、生体内分解材料を用いて徐放化局所麻酔薬を作成してきたが、2010年頃よりシート状のクロニジン徐放薬を作成している。今回はクロニジン徐放薬の鎮痛効果や副作用について、ラット神経障害性疼痛モデルを用いて検討することを主たる目的とした。並行して臨床応用を念頭に置き、より注入しやすい小型の粒子状の徐放薬の開発を進めている。長期の鎮痛を必要とする患者に対し少ない投与回数で、効果的で副作用の少ない治療法を確立することを目指す。・クロニジン徐放薬の神経障害性疼痛への効果クロニジン徐放薬をラット神経障害性疼痛モデル(spinal nerve ligation: SNL)の硬膜外腔に投与してアロディニアや痛覚過敏に対する長期効果(投与後28日まで)を調べた。また、クロニジン徐放薬の硬膜外投与後の鎮痛作用がある時点でα2受容体拮抗薬を髄腔内投与し、その効果がα2受容体を介するものであることを調べた。効果としては1週間程度の鎮痛効果を認め、α2受容体拮抗薬投与により鎮痛効果が拮抗された。・クロニジン徐放薬の効果・副作用クロニジン徐放薬の副作用については、徐放薬を動物モデルに硬膜外投与した後に、過鎮静、過度の血圧低下などの循環動態への影響がないか、もしあればどのくらい持続するかどうか調べたが、過度の鎮静効果や血圧低下、脈拍数の低下は認められなかった。α2受容体作動薬は脊髄後角のα2受容体に作用し、神経障害性疼痛を抑制するため、欧米では鎮痛薬としても使用されている。申請者らのグループはこれまでに生体内分解材料を用いて徐放化局所麻酔薬を作成してきたが、2010年頃より、シート状のクロニジン徐放薬を作成している。作成したクロニジン徐放薬の鎮痛効果や副作用について、ラット神経障害性疼痛モデルを用いて検討することを主たる目的としている。それと並行し、臨床応用を念頭に置き、より注入しやすい小型の粒子状徐放薬の開発も進めている。長期間の鎮痛を必要とする患者に対し、より少ない投与回数で、効果的で副作用の少ない鎮痛法を確立することを目指している。・作成した徐放薬の徐放曲線作成したクロニジン徐放薬をPBS溶液に溶解し、1,3,6,12,24,48,72,120,168時間でサンプルを回収し、高速液体クロマトグラフィーにより濃度測定を行った。1週間かけて徐々に放出される薬剤が作成できた。・クロニジン徐放薬の鎮痛効果と副作用ラット神経障害性疼痛モデルの硬膜外腔にクロニジン徐放薬を投与し、アロディニアや痛覚過敏に対する長期効果(投与28日後まで)を調べ、1週間程度持続する鎮痛効果を確認した。また、その鎮痛後がα2受容体を介するものであることを確認するため、α2受容体拮抗薬であるイダゾキサンを投与し、鎮痛効果が拮抗されることも確認した。また、過鎮静、血圧低下・徐脈等循環動態への影響を調べたが、そういった副作用は認められなかった。α2受容体作動薬は脊髄後角のα2受容体に作用し、神経障害性疼痛を抑制するため、欧米では鎮痛薬として使用されている。申請者らのグループはこれまでに体内分解材料を用いて徐放化局所麻酔薬を作成してきたが、2010年頃より、シート状のクロニジン徐放薬を作成している。また、その鎮痛効果がα2受容体を介するものであることを確認するため、α2受容体拮抗薬であるイダゾキサンを投与し、鎮痛効果が拮抗されることも確認した。

また、過鎮静、血圧低下、徐脈等、循環動態への影響を調べたが、そういった副作用は認められなかった。薬剤作成がうまくいかないため研究自体が進まなくなってしまった。α2受容体作動薬は脊髄後角のα2受容体に作用し、神経障害性疼痛を抑制するため、欧米では鎮痛薬として使用されている。申請者らのグループは、これまでに体内分解材料を用いて徐放化局所麻酔薬を作成してきたが、2010年頃よりシート状のクロニジン徐放薬を作成してきた。作成したクロニジン徐放薬の鎮痛効果や副作用についてラット神経障害性疼痛モデルを用いて検討した。それと並行し、臨床応用を念頭におき、より注入しやすい小型の粒子状徐放薬の開発も進めてきた。長期間の鎮痛を必要とする患者に対し、より少ない投与回数で、効果的で副作用の少ない鎮痛法を確立することを目指した。しかし途中から薬剤作成が上手く進まなくなったため、計画の変更を余儀なくされた。神経障害性疼痛における内因性鎮痛経路の回復機構に主眼をおき、神経障害性疼痛モデルラットに三環系抗うつ薬を投与し、内因性鎮痛経路が回復することを明らかとした。具体的には、神経障害性疼痛モデル作成から5週間経過した時点でアミトリプチリンを5日間連続で腹腔内投与し、作成から6週の時点でラット前肢にカプサイシンを投与して内因性鎮痛の評価方法であるnoxcious stimulus induced analgesia(NSIA)を調べた。神経障害から6週経過するとNSIAは減弱するが、アミトリプチリン投与によりNSIAの回復が見られた。また、アミトリプチリン投与群ではカプサイシン投与時に脊髄後角でのノルアドレナリンの放出も増加しており、脊髄後角でのノルアドレナリンの関与も明らかとなった。薬剤の作成が上手くいかず、計画を変更した。神経障害性疼痛における内因性鎮痛機構に主眼を置き、神経障害性疼痛モデルラットに三環系抗うつ薬を投与し、減弱した内因性鎮痛経路が回復することを明らかとした。具体的には、神経障害性疼痛モデル作成から5週間経過した時点でアミトリプチリンを5日間連続で腹腔内投与し、作成から6週間の時点でラット前肢にカプサイシンを投与して内因性疼痛の評価方法であるnoxious stimulus induced analgesia(NSIA)を調べた。薬剤作成がうまくいっていないために研究が進んでいない。しかし薬剤作成が軌道にのれば計画通りに進行できると考えている。当初の予定では脊髄での免疫染色もおこなう予定であったが、薬剤作成がうまくいかないため、これまでのデータだけで論文作成を行うこととする。もちろん今後も実験は継続してやっていく予定である。疼痛学計画書の通りに進行できるよう、徐放薬の作成を安定させる。今年度までに達成できなかった徐放薬投与後のクロニジン血中濃度測定、脊髄後角の免疫染色、投与部位周辺の病理学的検討を行う。臨床応用しやすいよう、小型の粒子型徐放薬の作成も進めていく。さらに可能であれば、デクスメデトミジンの徐放薬作成を開始する。ラットで鎮痛効果があり、有害な副作用が起こらないことが確認でき次第、ヒトへの応用も検討していく。当初の計画では鎮痛効果の確認のために脊髄後角における免疫染色を行う予定であったが、徐放薬の作製が思い通りに行かず計画が滞ってしまった。徐放薬作成がうまくできるようになれば今後の計画も順調に進むと考えらる。薬剤作成がうまくいかなくなってしまった。
NCマウスを用いた感染症とアレルギー疾患に共通する分子基盤の解析

マウスにおけるマラリア原虫の増殖性は、マウスChr.9のPymr領域内に存在する赤血球因子に規定されている可能性が高く、有力な候補遺伝子を特定することができた。しかし、この遺伝子は脳マラリアやマラリア腎症には間接的に関与するが、皮膚炎発症には関与しないことが判明した。一方、脳マラリア抵抗性遺伝子座Cmr1とCmr2、原虫排除に関与する遺伝子座Pymr2については、いずれも皮膚炎発症への関与が示唆された。特にChr.8のPymr2領域には免疫系に重要な役割を果たすIl12rb, 1Il27ra等の遺伝子にアミノ酸置換を伴う変異が見出され、感染症とアレルギー疾患に共通する原因遺伝子である可能性が考えられた。NCマウスはアトピー性皮膚炎のモデルとして有名な疾患モデル系統である。我々はこのNCマウスにネズミマラリア原虫を感染させると、極めて高い原虫の増殖を示すうえ、脳障害(脳マラリア)やネフローゼ症候群などのヒトのマラリア合併症に見られる特徴的な病態を呈することを見出した。感染症とアレルギー疾患はともに免疫系を介して極めて密接な関係があるため、両方の病態が観察されるNCマウスには感染症とアレルギー疾患に共通する分子基盤が存在すると推定される。そこで本研究ではNCマウスを用いて、(1)原虫率に関与する遺伝子、(2)脳マラリア発症に関与する遺伝子、(3)腎不全発症に関与する遺伝子、(4)アトピー性皮膚炎発症に関与する遺伝子を同定することにより、感染症とアレルギー疾患に共通する分子基盤を見出すことを目的とする。1.P.y.17XL株感染における原虫の高増殖性について:(1)NCマウスのマラリア原虫の高増殖性に極めて六きな影響を与えることが判明しているChr.9の1.7MbのPymr領域内に存在する幾つかの遺伝子を選択し塩基配列を比較し、アミノ酸レベルの置換のある候補遺伝子を見出した。(2)(NC.129X1-Pymr×129X1)F2交配群の雌約280匹にP.y.17XLを感染させ、感染5日後の血虫率と全ゲノム領域に配置した約80個のMitマーカーについて各個体の遺伝子型を判定して連鎖解析を行い、Chr.1にsuggestiveレベルの遺伝子座を検出した。2.P.b.ANKA株感染における脳マラリアについて:脳マラリア感受性のNC.129X1-Pymrと脳マラリアを発症しない129X1のF2交配群の雌約280匹にP.b.ANKA、を感染させた後、感染3週後まで観察して各個体の感染後の生存日数(表現型)を調査した。感染前に採取しておいた尾端からDNAを抽出し、全ゲノム領域に配置した約80個のMitマーカーの遺伝子型の判定を開始した。3.P.c.AS株感染における腎不全について:P.c.AS株を感染させたNCマウスの腎臓は、PAS染色標本により糸球体を中心に尿細管部位まで重度に障害されているごとが判明した。また、免疫染色より障害部位には免疫複合体が大量に沈着しており、この腎炎の病態は膜性増殖性糸球体腎炎であることが判明した。更に感染後の経時的な調査より、感染約1週後には高脂血漿や浮腫等のネフローゼ症候群を呈する個体が出現することが判明した。4.アトピー性皮膚炎の発症について:皮膚炎発症抵抗性のNC.129X1-Pymrと皮膚炎感受性のNCのF1個体は皮膚炎抵抗性であった。そこで、このF1個体のNCへの戻し交配群の作製を開始した。1.P.y.17XL株感染における原虫の高増殖性について:(1)NCマウスのマラリア原虫の高増殖性に極めて大きな影響を与えることが判明しているChr.9の1.68MbのPymr領域内に存在する全遺伝子についてSNPデータベースを用いてNCを含む感受性系統と129X1を含む抵抗性系統間で共通してアミノ酸レベルの置換のある遺伝子を2つ見出した。(2)(NC.129X1-Pymr×129X1)F2交配群の雌約280匹にP.y.17XLを感染させ、感染14日後の血虫率と全ゲノム領域に配置した約100個のMitマーカーの遺伝子型との連鎖解析を行い、Chr.8にsignificantレベルの遺伝子座を検出した。2.P.b.ANKA

株感染における脳マラリアについて:脳マラリア感受性のNC.129X1-Pymrと脳マラリアを発症しない129X1のF2交配群の雌約280匹にP.b.ANKAを感染させ、脳マラリアの発症と全ゲノム領域に配置した約100個のMitマーカーの遺伝子型との連鎖解析を行い、Chr.1とChr.17にsuggestiveレベルの遺伝子座を検出した。3.P.c.AS株感染における腎不全について:P.c.AS株を感染させたNCマウスの腎臓は、感染4日後には既に糸球体を中心に免疫複合体が沈着しておりメサンギウム細胞の増殖が認められた。その後、血中から原虫が消失しても腎病変は進行し、感染14日後には結節性硬化病変が出現することが判明した。4.アトピー性皮膚炎の発症について:皮膚炎発症抵抗性のNC.129X1-Pymrと皮膚炎感受性のNCの戻し交配群約100匹の耳介にダニ抗原を1ケ月間(20回)塗布したときの皮膚炎の発症程度とChr.9に設定した約10個のMitマーカーの遺伝子型との連鎖解析を行ったが皮膚炎遺伝子の存在領域を特定するには至らなかったため、更に個体数を増やして解析を行うことにした。1.Chr.9(Pymr1)以外にネズミマラリア原虫(Plasmodium yoelii 17XL)感染初期に原虫の高増殖性に関与する染色体領域を連鎖解析により探索し、Chr.1のセントロメア側にPymr3を見出した。ただし、この遺伝子座の効果はPymr1と比較してかなり小さいと推定された。一方、昨年度の解析により、P.y.17XL感染後期における原虫の排除遅延に関与する遺伝子領域として見出されたChr.8のPymr2領域について、NC.129X1-Pymr系統に、抵抗性の129X1系統由来のPymr2領域を導入したコンジェニック系統を樹立した。2.昨年度の解析によりP.b.ANKA感染時の脳マラリア発症にはChr.9(Pymr)に加え、Chr.1中央部(Cmr2)とChr17(Cmr1,H2領域)が関与していることが示唆された。そこで、脳マラリア感受性のNC.129X1-Pymr系統に、抵抗性の129X1系統由来のCmr1とCmr2を導入したコンジェニック系統を樹立した。3.NC系統と比較してNC.129X1-Pymr系統では、P.c.AS感染において重篤なネフローゼ症を発症する個体の出現頻度は低下した。しかし、腎臓には両系統ともに免疫複合体の蓄積による膜性増殖性糸球体腎炎が確認された。したがって、Pymr領域は腎炎発症には直接関与しないが、原虫の増殖を抑制することによりネフローゼ症を軽減する作用があると考えられた。4.昨年度に引き続き、Pymr1領域内に存在するアトピー性皮膚炎抵抗性遺伝子の存在領域の絞り込み作業を行った。原虫の高増殖性遺伝子とは少し離れた位置に皮膚炎遺伝子が存在することが確認されたが、正確な位置決定には至らなかった。その原因は、ダニ抗原塗布による安定的な皮膚炎の誘発が難しいためであり、確実に皮膚炎を誘発できる他の方法の検討を行った。1.ネズミマラリア原虫(Plasmodium yoelii17XL)感染時の原虫増殖性に関与するPymr1(Chr.9)領域内の遺伝子について塩基配列と発現解析を進めた結果、原虫の増殖性に関与すると考えられる極めて有力な遺伝子を見出した。この遺伝子は赤血球の分化に重要な役割を持つと推定された。一方、P.y.17XL感染における原虫の排除に関与する遺伝子領域として見出されたChr.8のPymr2領域内の候補遺伝子群(I115,I112rb1,I127ra等)の塩基配列を解析した。NC系統は複数の候補遺伝子にアミノ酸置換を伴う変異を有していたが、最有力候補のI115には変異がなかった。
乳癌進展における環境化学物質の影響〜新たな除去法、治療法の開発を目指して

#1近年我々は,エストロゲン(E2)受容体(ER)に対するsteroid and xenobiotic receptor (SXR)によるE2作用の増強効果を報告してきた.これに関連し,(1) MCF-7細胞においてER/ERE系に対しPCBは転写を活性化させた.この作用はSXRの存在下ではさらに増強した.(2)プロゲステロン受容体(PR)を介する転写に対してSXRは用量依存性に活性化した.一方,PCBは腎繊維芽(CV-1)細胞では転写を活性化したが,MCF-7細胞では抑制した.(3) (1)(2)の現象はMCF-7では認めたが,CV-1細胞では認めなかった.CV-1にERを発現させても同様の作用は認められず,ERの発現以外の機序が考えられた.(4) MCF-7細胞を用いて細胞増殖アッセイを行ったところ,E2存在下ではPCB用量依存性に有意な活性化を認めた.以上からPCBのE2様作用及び,PR系に対する抑制作用により乳癌の進展が強まる可能性が示唆された.#2乳癌細胞局所におけるSXRの発現が薬物代謝に関する酵素の転写活性を上げることで,耐性獲得につながる可能性を報告してきた.これに関連し,(1)MCF-7においてPCBは100pM以上からストロゲン様作用を示しER/ERE系の転写活性の上昇を認めた.この作用は,SXRの存在下ではさらに増強し,PCBおよびSXRの相加作用を認めた.この結果より,PCBの蓄積した乳癌細胞ではPCBのエストロゲン様作用により乳癌の進展が強まる可能性が示唆された.(2)この現象はCV-1では認められず,乳癌局所でPCBにより薬剤代謝が撹乱される可能性が示唆された.(3)PCBによるSXRとコファクターの結合の変化を解析したが変化は認められなかった.#1近年我々は,エストロゲン(E2)受容体(ER)に対するsteroid and xenobiotic receptor (SXR)によるE2作用の増強効果を報告してきた.これに関連し,(1) MCF-7細胞においてER/ERE系に対しPCBは転写を活性化させた.この作用はSXRの存在下ではさらに増強した.(2)プロゲステロン受容体(PR)を介する転写に対してSXRは用量依存性に活性化した.一方,PCBは腎繊維芽(CV-1)細胞では転写を活性化したが,MCF-7細胞では抑制した.(3) (1)(2)の現象はMCF-7では認めたが,CV-1細胞では認めなかった.CV-1にERを発現させても同様の作用は認められず,ERの発現以外の機序が考えられた.(4) MCF-7細胞を用いて細胞増殖アッセイを行ったところ,E2存在下ではPCB用量依存性に有意な活性化を認めた.以上からPCBのE2様作用及び,PR系に対する抑制作用により乳癌の進展が強まる可能性が示唆された.#2乳癌細胞局所におけるSXRの発現が薬物代謝に関する酵素の転写活性を上げることで,耐性獲得につながる可能性を報告してきた.これに関連し,(1)MCF-7においてPCBは100pM以上からストロゲン様作用を示しER/ERE系の転写活性の上昇を認めた.この作用は,SXRの存在下ではさらに増強し,PCBおよびSXRの相加作用を認めた.この結果より,PCBの蓄積した乳癌細胞ではPCBのエストロゲン様作用により乳癌の進展が強まる可能性が示唆された.(2)この現象はCV-1では認められず,乳癌局所でPCBにより薬剤代謝が撹乱される可能性が示唆された.(3)PCBによるSXRとコファクターの結合の変化を解析したが変化は認められなかった.#1 estrogenn受容体(ER)系に対するPCBの影響をsteroid and xenobiotic receptor(SXR)発現状態別に調べた.その結果,SXRを過剰発現させない状態において,PCB濃度100pM以上からエストロゲン様作用を示しER/ERE系の転写活性の上昇を認めた.この作用は,SXRの存在下ではさらに増強し,PCBおよびSXRの相加作用を認めた.この結果より,PCBの蓄積した乳癌細胞ではPCBのエストロゲン様作用により乳癌の進展が強まる可能性が示唆された.#2乳癌細胞株MCF7を用いてCytochrome P-450(CYP)3A4の転写制御に対するPCBの影響を調べた.その結果,PCB濃度10nM以上においてCYP3A4の転写活性増強を認めた.この現象はサルの腎繊維芽細胞(CV-1)では認められず,乳癌局所におけるPCBによる薬剤代謝の撹乱の可能性,および,MCF7内にはPCB作用を活性化する核内蛋白が存在する可能性が示唆された.PCBによるSXRとコファクターの結合の変化を解析したが有意な変化は認められなかった。#4プロゲステロン受容体を介する転写に対するPCBの影響の解析を開始したが,予備実験では低濃度で転写が活性化する結果を得た.#1近年我々は,エストロゲン(E2)受容体(ER)に対するsteroid and xenobiotic receptor(SXR)によるE2作用の増強効果を報告してきた。これに関連し,(1)MCF-7細胞においてER/ERE系に対しPCBは転写を活性化させた。この作用はSXRの存在下ではさらに増強した。

(2)プロゲステロン受容体(PR)を介する転写に対してSXRは用量依存性に活性化した。一方,PCBは腎繊維芽(CV-1)細胞では転写を活性化したが,MCF-7細胞では抑制した。(3)(1)(2)の現象はMCF-7では認めたが,CV-1細胞では認めなかった。CV-1にERを発現させても同様の作用は認められず,ERの発現以外の機序が考えられた。(4)MCF-7細胞を用いて細胞増殖アッセイを行ったところ,E2存在下ではPCB用量依存性に有意な活性化を認めた。以上からPCBのE2様作用及び,PR系に対する抑制作用により乳癌の進展が強まる可能性が示唆された。#2乳癌細胞局所におけるSXRの発現が薬物代謝に関する酵素の転写活性を上げることで,耐性獲得につながる可能性を報告してきた。これに関連し,(1)MCF-7においてPCBによりSXRによるCYP3A4の転写活性増強を認めた。(2)この現象はCV-1では認められず,乳癌局所でPCBにより薬剤代謝が撹乱される可能性が示唆された。(3)PCBによるSXRとコファクターの結合の変化を解析したが変化は認められなかった。#3乳癌細胞にもUDP-glucuronosyl transferase(UGT)が発現することから乳癌局所での排泄とSXRに関して解析した。UGT1A4とUGT2B7について(1)乳癌細胞株数種を用いてmRNAレベルの発現を調べた結果,細胞株ごとに様々な量の発現を認めた。(2)UGT1A4及びUGT2B7promoter領域におけるSXR結合部位を絞り込む目的でpromoter領域約5 kbpを上流より欠失させたレポーターコンストラクトを作成し,転写活性を解析したが,SXR単独で絞り込むことはできず,他の核内因子が必要である可能性が示唆された。
マイクロ流体アプローチによる超並列1エキソソーム解析システムの構築

本研究では、エキソソームを一粒子レベルで効率よく標識することを可能とするMicrofluidic Combinatorial Indexing (MCI)法を確立し、個々のエキソソーム内のmiRNAについて網羅的解析が可能な1エキソソーム解析方法の構築を目指す。MCI法を確立するため、単一粒子を指定のマイクロウェルへ順番にトラップすることが可能なAddressable Electroactive Microwell Array (AEMA)を開発し、単一粒子の組み合わせを実現した。具体的には、各マイクロウェルの誘電泳動電極を個別に制御可能なAEMAを用いて、単一粒子を指定のマイクロウェルへ順番にトラップすることで、選択的に単一粒子の組み合わせを作ることが可能である。検証実験として、青、緑、赤色の蛍光色素で染め分けたPC 3(前立腺癌腫瘍細胞株)細胞群を、1つのマイクロウェルにそれぞれ1細胞ずつトラップすることに成功し、確実性の高い単一細胞組み合わせ方法を実現した。一方、エキソソームの単離の検証と高感度エキソソームの定量化を実現するため、単一エキソソームELISA法を確立した。具体的には、ターゲットエキソソームに対する捕捉抗体で表面修飾したマイクロビーズを用いて、マイクロビーズ上に捕捉抗体、エキソソーム、酵素標識検出抗体の3つの複合体を形成させる。各マイクロビーズを超微小液滴に封入することで、検出抗体の酵素によって反応生成物(蛍光分子)が超微小液滴中に濃縮されるため単一エキソソームの検出が可能になる。ここで蛍光信号を発する液滴の数と、発しない液滴の数を比較することで、エキソソーム単離が検証できる。また、エキソソームを単一粒子レベルで検出することによりエキソソームの高感度定量化が可能であるため、エキソソームをターゲットにする診断デバイスの開発への応用も期待できる。エキソソームを一粒子レベルで標識することが可能なMCI法を実現するため、各マイクロウェルの誘電泳動電極を個別に制御可能なAEMAを研究開発した。実証実験として異なる細胞群をマイクロウェルにそれぞれ1細胞ずつトラップし、単一細胞の組み合わせを作ることに成功した。このAEMAを用いてMCI法を実現するためには、細胞と異なる電気的な特性を持っているマイクロビーズを、誘電泳動を用いてAEMAに捕捉しなければならない。マイクロビーズを捕捉するため誘電泳動バッファーの電気伝導率と印加電圧の周波数などの捕捉条件を最適化することで、マイクロビーズを誘電泳動により電極に捕捉することが可能になった。一方、エキソソーム捕捉ビーズを用いたエキソソーム単離を検証するため、単一エキソソームELISA法を確立した。具体的には、ターゲットエキソソームに対する捕捉抗体で表面修飾されたエキソソーム捕捉ビーズにエキソソームを捕捉した後、β-galで標識された検出抗体を結合させることで、マイクロビーズ上に捕捉抗体、エキソソーム、酵素標識検出抗体の3つの複合体を形成させる。ここでマイクロビーズの個数よりターゲットエキソソームの個数が十分に少ない場合、マイクロビーズ1個につき、3つの複合体が1分子のみ結合しているか、全く結合していないかどちらかの状態になる。エキソソームを捕捉し複合体を形成したマイクロビーズに、酵素の蛍光基質を添加して懸濁液を作成し、疎水性材料で製作したマイクロウェルへ入れた後、オイルを入れることで自動的に微小液滴が形成される。これにより各マイクロビーズを油性液体でマイクロウェルに封入できる。3つの複合体を結合したマイクロビーズを含む液滴のみが蛍光を発するので、蛍光信号を発する液滴の数をカウントすればエキソソームの数が得られる。これにより単一エキソソームの定量化を実現し、ELISA法を確立した。MCI法を用いたエキソソーム内RNA解析を実現するために、インデックス配列を含むDNAライブラリープールを生成する。まず、それぞれ別のインデックス配列を含むRNAライゲーションアダプターを表面修飾したRNA捕捉ビーズを作成する。RNA捕捉ビーズを、1つのマイクロウェルに封入し、エキソソームの破砕、アダプターライゲーションを行い、エキソソームから取り出したRNAをRNA捕捉ビーズに捕らえることで、各エキソソームからのRNAを標識する。その後、RTーPCRを行うことでインデックス配列を含むDNAライブラリープールを作成する。得られたDNAライブラリーを次世代シーケンサーにてシーケンスし、そのデータを解析することで単一エキソソーム毎に識別された核酸の網羅的な情報を得ることができる。各エキソソームことにインデックス配列で識別されているため、単一エキソソーム解析が可能になる。本研究では、2種類のインデックス配列の組み合わせによりエキソソームを標識することが可能なMicrofluidic Combinatorial Indexing (MCI)法を確立し、各エキソソームを識別することで単一エキソソームの解析を可能にする「超並列1エキソソーム解析法」の確立を目的とする。具体的には、単一エキソソームと、インデックス配列を含むアガロースビーズの組み合わせを単一粒子レベルで区画化することで、各エキソソームの標識と解析を実現する。平成29年度では、高効率で単一粒子の組み合わせを可能にするAddressable Electroactive Microwell Array (AEMA)の開発を行った。Electroactive Microwell Array(EMA)はマイクロウェルの底面部分に電極を配置することで、単一細胞を誘電泳動によって効率よくトラップし、解析が可能な技術である。

このEMAに基づいて、各マイクロウェルの誘電泳動電極を個別に制御可能なAEMAを開発し、単一粒子を指定のマイクロウェルへ順番にトラップすることで、選択的に単一粒子の組み合わせを作ることが可能なマイクロ流体デバイスを開発した。試作したデバイスを用いた検証実験では、青、緑、赤色の蛍光色素で染め分けたPC 3(前立腺癌腫瘍細胞株)細胞群を、1つのマイクロウェルにそれぞれ1細胞ずつトラップすることに成功した。各々の細胞群をマイクロ流体デバイスへ流入させ、指定の電極へ電圧を印可し、指定のマイクロウェルにトラップすることで、確実性の高い単一細胞組み合わせ方法を実現した。本成果はマイクロ流体分野で注目を集め、MicroTAS2017でoral presentationとして採択され発表を行った。また、日本の化学とマイクロ・ナノシステム学会(CHEMINAS36)で優秀研究賞を受賞した。各マイクロウェルのsingle cell occupancyratioは90%以上と高い効率が得られたが、組み合わせの効率は38%と高くなかった。その理由として、細胞を流入する際に、マイクロ流体デバイス内の水流が不安定になり、トラップされていた細胞が流出してしまうことが考えられる。例えば、すでに指定のマイクロウェルにトラップされた緑PC3細胞が流出してしまうことで同じマイクロウェルへ赤PC3細胞、または青PC3細胞がトラップされる確率が上がるため、違う種類の単一細胞の組み合わせができなくなってしまう。この問題を解決するためには、一度細胞がトラップされた時に流が不安定になったとしても、先にトラップされていた細胞が流出しないような、安定的な細胞トラップが必要となる。安定的な細胞トラップのためEMAの改良が必要であるため、アガロースビーズの作成やトラップの検討が少し遅れている。本研究では、エキソソームを一粒子レベルで効率よく標識することを可能とするMicrofluidic Combinatorial Indexing (MCI)法を確立し、個々のエキソソーム内のmiRNAについて網羅的解析が可能な1エキソソーム解析方法の構築を目指す。MCI法を確立するため、単一粒子を指定のマイクロウェルへ順番にトラップすることが可能なAddressable Electroactive Microwell Array (AEMA)を開発し、単一粒子の組み合わせを実現した。具体的には、各マイクロウェルの誘電泳動電極を個別に制御可能なAEMAを用いて、単一粒子を指定のマイクロウェルへ順番にトラップすることで、選択的に単一粒子の組み合わせを作ることが可能である。検証実験として、青、緑、赤色の蛍光色素で染め分けたPC 3(前立腺癌腫瘍細胞株)細胞群を、1つのマイクロウェルにそれぞれ1細胞ずつトラップすることに成功し、確実性の高い単一細胞組み合わせ方法を実現した。一方、エキソソームの単離の検証と高感度エキソソームの定量化を実現するため、単一エキソソームELISA法を確立した。具体的には、ターゲットエキソソームに対する捕捉抗体で表面修飾したマイクロビーズを用いて、マイクロビーズ上に捕捉抗体、エキソソーム、酵素標識検出抗体の3つの複合体を形成させる。
酸化物半導体ナノ結晶と金属ナノ結晶を共析出した結晶化ガラスの創製と物性評価

TiO2やZnOナノ結晶が選択的に析出した透明な結晶化ガラスの作製条件を検討するとともに、誘電体ナノ結晶と金属ナノ粒子の共析出した結晶化ガラスの作製をおこなった。選択的なナノ結晶析出と母ガラス組成における構造ユニットとの関連を調査し、表面配向結晶化(ZnO)、析出結晶相の選択(TiO2)を達成した。一方で、ガラスの溶融条件と構造との関連を調査し、白金ナノ粒子が析出したガラス、および、結晶化ガラスの作製にも成功した。これらの結果より、モノリシックな結晶化ガラスにおいて、ナノサイズの異相構造が自己組織的に形成できることを明らかにした。ナノマイクロサイズの異相構造を自己組織的に発現させた結晶化ガラスは、薄膜材料、あるいはゲスト・ホスト型の複合材料とは一線を画する、新規バルクガラス材料である。本研究は、酸化物半導体ナノ結晶と金属のナノ結晶を共析出した結晶化ガラスを種々の方法を用いて創製し、その物性を評価することにより、新規機能性結晶化ガラスとして発信することを研究目的とする。初年度は、ガラス中における金属と酸化物結晶の共析出のために、金属を析出する作製条件検討をおこなった。通常、ガラス中に析出する金属は、還元剤を用いて、出発原料である酸化物を還元させ生成させる。そのため、本年度は、従来の金、銅などの11属元素を含む種々の金属酸化物を含有するガラスを作製し、還元剤と析出可能な元素についての検討をおこなった。その結果、典型金属元素であるビスマス、アンチモンを金属としてガラス中に析出させる手法として、窒化物やアンモニウム塩の添加が非常に有用であることを見出した。しかしながら、これらの金属が析出した酸化物ガラスの中には、肉眼において検出可能な試料も存在し、透明性と金属微結晶析出を両立できうる手法の確立には至らなかった。そのため、今後、溶融温度・還元剤・酸化物ガラス系に関するデータを広範囲で収集し金属ナノ結晶を析出可能な手法の確立をおこなう予定である。一方で、ナノ金属が析出したガラスは、析出していないガラス系に比べてより低温での熱処理により結晶化が達成されることを見出した。金属結晶と酸化物ガラスの界面を利用した構造形成は、酸化物ガラスにおける結晶化挙動の制御の鍵となる重要な知見であると考えられる。ナノマイクロサイズの異相構造を自己組織的に発現させた結晶化ガラスは、ゲスト・ホスト型の複合材料とは一線を画する、機能性バルクガラス材料である。これまでの結晶化ガラスの報告例は、ガラスから誘電体結晶を析出するものがほとんどであるが、金属と誘電体という異なる誘電特性を有するナノ結晶が共析出した材料が作製できれば、機能性ナノ結晶を含有する新規機能性無機材料として魅力的である。本研究は、酸化物ナノ結晶と金属ナノ結晶を共析出した結晶化ガラスを種々の方法を用いて創製し、その物性を評価することにより、新規機能性結晶化ガラスとして発信することを研究目的とする。平成23年度は、溶融急冷法により作製したガラスを再溶融し、白金ナノ結晶が析出したガラスの作製、及び、白金析出ガラスを熱処理することにより、従来報告された温度よりも約40°C以上も低温において、白金ナノ結晶と非線形光学結晶Ba_2TiGe_2O_8結晶が共析出した結晶化ガラスの作製に成功した。溶解した白金が、再溶融プロセスの初期段階のみ白金ナノ結晶子として析出し、さらに、白金ナノ結晶が長時間溶融後において、ガラスメルト中に再溶解し均一なマトリックスを与えることは本研究で得られた新しい知見である。再溶融時間が短い試料中のみに析出した白金ナノ粒子は、坩堝から溶出した白金が還元反応により析出したものであり、メルト中に溶解している白金はガラス中の核生成サイトとなることを確かめた。ガラス中の不均一性が、その結晶化に強く影響を与えることは、多くの研究者が示唆していることであり、今回の結果は、ガラス中における核生成サイトとして溶存白金を利用し機能性材料設計に応用することが可能であることを示すものである。ナノマイクロサイズの異相構造を自己組織的に発現させた結晶化ガラスは、ナノサイズの微粒子が均一に分散した材料であり、従来のゲストホスト型バルク体材料とは一線を画する無機材料である。ガラスにおける熱力学的転移は一般的に過冷却液体からの結晶化であるが、過冷却液体中における酸化還元状態を制御することにより、金属と誘電体という異なる誘電特性を有するナノ結晶が析出した材料が作製可能になる。平成24年度は、溶融急冷法により作製した酸化物ガラスにおけるナノ粒子形成を検討した。

リン酸アンモニウムを出発原料とするリン酸塩ガラスにおいて、高い非線形光学定数を持つTeナノ粒子の析出に成功した。これは、原料中に含有される還元種と原料であるTeO2とのredox反応によるものである。得られたTe析出ガラス、および、昨年度得られたPt析出ガラスを熱処理することにより、金属ナノ結晶と酸化物結晶が共析出した結晶化ガラスの作製に成功したが、透明性と選択的結晶化に課題があり、光学応用を検討する場合はより精密な結晶化プロセスの制御が必要であることが判った。特に、試料最表面近傍は通常の熱処理過程と同様、アモルファス相になっていると考えられ、この領域における制御を今後行う必要がある。将来的には、シミュレーションや分子理論計算などを用いて、ガラス中における酸化物結晶の核生成サイトおよび機能性中心としての金属ナノ粒子の更なる制御が必要である。今年度の成果として、白金ナノ結晶とBa_2TiGe_2O_8結晶の共析出を見出すなど、おおよそ順調に進行しているが、当初23年度に予定していた金属共析出結晶化ガラスにおける物性(発光・触媒能)の評価があまりおこなえていないため、今後、重点的に調査を行う必要がある24年度が最終年度であるため、記入しない。得られた結晶化ガラスの物性評価等を、他の研究機関に依頼して迅速におこなう予定である24年度が最終年度であるため、記入しない。
バキュロウイルスを用いた膜蛋白質の発現とその相互作用解析への応用

膜蛋白質は疎水性が高く凝集を起こし易いため解析が困難である。本研究では,小胞体や細胞膜に存在する調節蛋白質や膜受容体を,機能を保ったままバキュロウイルス上にディスプレイさせ,相互作用や活性を測定する系の開発と,抗体作成による疾病の診断・治療への応用を目指した。本年度はG蛋白質共役型受容体(GPCR)であるロイコトリエンB4受容体(BLT1)と3量体G蛋白質の各サブユニットのリコンビナントウイルスを共感染させ,高親和性(Kd=0.25nM)の受容体をウイルス上にディスプレイさせることに成功した。さらにGαアイソフォームを別々に作成してウイルス上で再構成させることにより,BLT1がGiおよびGoに共役して高親和性受容体となることを実験的に証明した。このことは,様々なG蛋白質リコンビナントウイルスとのコンビナトリアル共発現により共役するG蛋白質パートナーを探索することが可能になったと考えられる。またエフェクター蛋白質であるアデニレートサイクレースも共発現させるとリガンド依存性の相互作用が観察されることを確認した。アルツハイマー症の原因蛋白質と考えられているプレセニリンと複合体を構成しているニカストリンと呼ばれる膜蛋白質をウイルス上にディスプレイさせ、そのウイルスを直接ウイルス蛋白質トレランスマウス(別途開発)に免疫し、特異抗体を得ることに成功した。また同様の技術を用いてZnフィンガー蛋白質(GATA family,核内受容体スーパーファミリー)に対する特異的モノクローナル抗体を作成した。すなわちZnフィンガー部分は相同性が高いため、N端あるいはC端をgp64にフュージョンさせた蛋白質を作成し、このフュージョン蛋白質がディスプレイされているウイルスをマウスに免疫することによって特異抗体を作成した。ヒトGATAファミリー16に対する抗体を作成した。とくにGATA2はGATA3ともホモロジーが高く、特異的モノクローナル抗体は作成が困難とされており、本方法はホモロジーの高い遺伝子ファミリー蛋白質にも有効な方法として期待できる。核内受容体スーパーファミリーに対する抗体も48種類中30種類に対して終了した。核内受容体に関して、網羅的に抗体を作成している例は世界になく、また免疫染色に使用可能な抗体も得られており、今後組織分布や細胞内局在などの研究に強力なツールになると考えられる。細胞内コレステロール調節に関与するSREBP(sterol responsible element binding protein),SCAP(SREBP cleavage activating protein), HMG-CoA還元酵素などはERあるいはゴルジ装置に存在する膜蛋白質である。これらの膜蛋白質を機能を保ったままバキュロウイルスに発現させる技術を開発し,それをこれまで困難であった膜蛋白質の抗体作成および相互作用解析に応用する。本年度の研究により,発現膜蛋白質の収率をあげるための培養条件の検討では,1lのスピナーフラスコに500mlで10%のウシ胎児血清存在下に感染時新鮮培養液を用いる方法が最適であった。またSREBPはSCAPの共感染により内在性プロテアーゼによる分解が抑えられる事が判明した。SCAPはSREBPの分子シャペロンとして働いていると考えられた。内在性プロテアーゼの阻害には50μMのE64が最適であった。大量精製のための可溶化剤の検討を行ない,lysoPCおよびPFOが使用可能であった。

特にPFOはそのままNiNTAでのHisタグアフィニティー精製が可能である。G蛋白質共役型受容体であるロイコトリエンB4受容体(BLT1)はバキュロウイルス上で共感染させたGi三量体蛋白質と共役し高親和性の受容体複合体を形成することが確かめられた。バキュロウイルスを用いて,ヒトSCAPのC端部分ペプチドを発現精製し,マウス免疫後SCAP発現ウイルスを用いて抗体のスクリーニングを行なった。この結果,SCAP全長を認識する抗体の作成に成功し,ウェスタンブロット,免疫組織化学,免疫沈降に使用可能であることがわかった。バキュロウイルスのgp64に核内受容体をフュージョンさせ,マウスに免疫することによりモノクローナル抗体を作成する方法で10種類の核内受容体に対するモノクローナルを作成した。PPARのα, δ, γ_<1, 2>の各アイソフォームをウェスタンブロットで特異的に識別する抗体の作成に成功した。またこれらの抗体はゲルシフトアッセイ,免疫組織化学に使用可能であることが確かめられた。このようにバキュロウイルスの発現系を用いて,構造を保った膜蛋白質抗原の調整とスクリーニングシステムの構築が可能で,モノクローナル抗体作成に用いる事ができることがわかった。膜蛋白質は疎水性が高く凝集を起こし易いため解析が困難である。本研究では,小胞体や細胞膜に存在する調節蛋白質や膜受容体を,機能を保ったままバキュロウイルス上にディスプレイさせ,相互作用や活性を測定する系の開発と,抗体作成による疾病の診断・治療への応用を目指した。本年度はG蛋白質共役型受容体(GPCR)であるロイコトリエンB4受容体(BLT1)と3量体G蛋白質の各サブユニットのリコンビナントウイルスを共感染させ,高親和性(Kd=0.25nM)の受容体をウイルス上にディスプレイさせることに成功した。さらにGαアイソフォームを別々に作成してウイルス上で再構成させることにより,BLT1がGiおよびGoに共役して高親和性受容体となることを実験的に証明した。このことは,様々なG蛋白質リコンビナントウイルスとのコンビナトリアル共発現により共役するG蛋白質パートナーを探索することが可能になったと考えられる。またエフェクター蛋白質であるアデニレートサイクレースも共発現させるとリガンド依存性の相互作用が観察されることを確認した。アルツハイマー症の原因蛋白質と考えられているプレセニリンと複合体を構成しているニカストリンと呼ばれる膜蛋白質をウイルス上にディスプレイさせ、そのウイルスを直接ウイルス蛋白質トレランスマウス(別途開発)に免疫し,特異抗体を得ることに成功した。また同様の技術を用いてZnフィンガー蛋白質(GATA family,核内受容体スーパーファミリー)に対する特異的モノクローナル抗体を作成した。
地域支援事業の適用に向けたストレス対処力SOCの社会・認知・神経基盤の解明

今年度は、昨年度に引き続き、調査研究および実験研究を実施した。地域で自立した生活をする高齢者の社会関係および人間関係資源を把握するためには、ソーシャルサポートを様々な機能的・質的側面から、社会関係の豊かさを評価できる多次元的な尺度が必要となった。そこで、海外のSOC研究でしばしば利用されているSocial Provisions Scale(SPS)24項目オリジナル版を日本語訳し、地域高齢者を対象とした調査に活用しやすい様に、短縮版(6項目版・12項目版)を開発した。また、すでに短縮化されているSOC6項目版の種々の妥当性を検討するために、前述のSPS短縮版のみならず、健康的な生活習慣(主に心身の健康度や食習慣)等との関連を検討する調査に着手した。他方で、SOCがストレス反応に与える緩衝効果の認知基盤を検討するために、昨年度の高齢者40名に加えて、さらに人数を増やして、精神的負荷(スピーチおよび暗算による負荷)を与えたときの生理心理学的反応と種々の認知機能を評価した。引き続き、当該実験データが多変量解析や構造方程式モデリングに耐えうるだけの人数(100名以上)を確保するために、データ取得・実験を鋭意進めている。一部、SOC短縮版の予測妥当性の検討に関しては多少遅れているものの、全体計画の進捗状況は問題なく進められている。調査研究においてはSOC短縮版の妥当性の検証、SOCを高めるための人生経験や社会資源の探索を推進し、実験研究においては、高齢者のみならず若年者のデータ取得も取得し、ストレス緩衝効果の年代比較等も行って行く予定である。本研究は、地域支援活動の効果指標として、ストレス対処力・健康増進を表す後世概念であるSense of Coherence(SOC)の利用可能性を検証するために、今年度は、高齢者のSOC促進に関わる社会基盤の探索のために、住民調査と連動させて、SOCと関連する人間関係資源を質問紙調査によって検討した。ただし、高齢者用SOC短縮版尺度の予測妥当性を検証するためのベースラインの測定に関しては、項目に一部誤りがあり、次年度に改めて、調査を実施することとなった。あわせて、SOCがストレス反応に与える緩衝効果の認知基盤を検討するために、高齢者40名を対象に精神的負荷(スピーチおよび暗算による負荷)を与えたときの生理心理学的反応と種々の認知機能との関連を検討した。調査研究ではSOCの有用性の検証、実験研究ではSOCのストレス緩衝効果のメカニズムを中心に研究を進めているところであり、それぞれの研究成果が十分得られれば、本研究がめざす市町村が実施する地域支援事業における介護予防サービス事業の一般高齢者施策に役立つ科学的根拠に基づいた介入プログラムの開発と効果測定のための基礎資料が提供できるもと考えられる。調査研究において一部項目内容にミスが生じたため、多少の遅れがあるが、改めて調査を実施することで十分に研究スケジュールを進められるものと考えられる。調査研究においては今年度、改めてSOCのベースライン調査を行ない、23年後の縦断データを取得して分析を進める予定である。実験研究においては、より詳細な分析を進めるために、実験参加者の数を増やし、安定したデータ取得を目指す予定である。
反転対称性の破れた磁性体における非線形応答の理論

この課題では,電子スピンの流れを光によって制御する方法について研究します.電子は電荷以外にも磁石としての性質であるスピンをもちます.この電子スピンの流れの制御は次世代のエレクトロニクスとして注目されているスピントロニクスにおける重要課題です.絶縁体では,これまで熱によるスピン流の生成が代表的な方法でした.この課題では,光を用いることで熱では難しいスピン流の高速生成・制御について理論的に研究します.この課題では,電子スピンの流れを光によって制御する方法について研究します.電子は電荷以外にも磁石としての性質であるスピンをもちます.この電子スピンの流れの制御は次世代のエレクトロニクスとして注目されているスピントロニクスにおける重要課題です.絶縁体では,これまで熱によるスピン流の生成が代表的な方法でした.この課題では,光を用いることで熱では難しいスピン流の高速生成・制御について理論的に研究します.
大腸菌耐熱性エンテロトキシンIの外膜通過過程の解析

大腸菌耐熱性下痢原因毒素I(STI)ば、菌体外に積極的に分泌されるペプタイドである。これまでの研究により、STIは前駆体として生合成され内膜を通過した後、ペリプラスム酵素であるDsbAの作用を受けて活性体となること,活性体となったSTIは大腸菌外膜タンパクTolCの機能を介して外膜を通過すること,TolCを介したSTIの外膜通過にはTolCのC末側5060番目のアミノ酸領域が重要であることを明らかにした。しかし、STIの外膜通過に重要とされたTolCのC末領域のいかなる性質がその機能の発現に必要であるのかは不明である。そこで本年度は、TolCのC末側5060番目のアミノ酸領域に注目し、STIの外膜通過に必要とされる構成アミノ酸を限定するとともに、その性状について検討した。その結果、以下の知見を得た。1.TolCのC末側領域を欠損させた変異TolC産生株を用いて解析した結果、TolCのC末側の構成アミノ酸を58個欠損させてもSTIの外膜通過は低下しなかったが、59個欠損させるとその低下が認められ、60個欠損によりその機能が完全に消失した。しかし、これらの構成アミノ酸の欠損は、TolCの機能単位である三量体の形成には全く影響しなかった。このことは、TolCのC末側59番目と60番目の構成アミノ酸がSTIの外膜通過機能を発揮する上で重要であることを示唆している。2.部位特異的変異法を用いて解析した結果、STIの外膜通過にはTolCのC末端から60番目の構成アミノ酸(Leu)が最も重要な残基であり、この部位のアミノ酸側鎖が疎水性であることがその機能発現に必要であることが明らかとなった。大腸菌耐熱性下痢原因毒素I(STI)は、菌体外に積極的に分泌されるペプタイドである。これまでの研究により、STIは前駆体として生合成され内膜を通過した後、ペリプラスム酵素であるdsbAの作用を受けて活性体となること,外膜タンパクtolCが活性体となったSTIの外膜通過に関与することを明らかにした。しかし、STIの外膜通過に関与するtolCの機能部位は不明である。そこで本年度は、tolCの構造の中でペリプラスム中に露出しているC末側領域に注目し、STIの外膜通過におけるこの領域の機能を解析した。1.TolCのC末側領域を欠損させた変異tolC産生株を用いて解析した結果、tolCのC末側の構成アミノ酸を50個欠損させるとSTIの外膜通過は低下し、60個欠損させるとその機能は完全に消失した。しかし、これらの構成アミノ酸の欠損は、tolCの機能単位である三量体の形成には全く影響しなかった。このことは、tolCのC末側50番目から60番目の構成アミノ酸がtolCの三量体の形成には関与せず、STIを菌体外に排出させるポンプ機能を発揮する上で重要であることを示唆している。2.TolCのC末側60個の構成アミノ酸からなるペプタイドを産生する菌を用いて解析した結果、tolCのC末領域はSTIと相互作用している可能性が示唆された。