hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シート型自律神経機能モニタリングシステムの研究開発

本研究では、申請者が世界に先駆けて開発した【ウルトラフレキシブル生体信号計測シート(Nature2013, Nature Mater.2010, Science2008, Nature Comm.2014)】を用いて、自律神経機能を定量的に無線計測できる“パッチ式センサシステム"を開発する。更年期障害に不安を抱える女性の“日常生活時、および睡眠時に装着感なく"「脳波」、「心電(心拍)」、「体動」、「発汗」を同時計測できる新しい家庭内医療診断に資するセンサ開発である。さらに、更年期障害関連の生体BIG DATAを解析する手法を情報処理科学の観点から開発することで、膨大に生まれる情報を“可視化"する。更年期症状の把握、疾病程度を包括的に計測、解析することで、更年期障害の定量的診断、早期発見、ホルモン療法などの早期治療への医療基盤を作り出す。特に更年期障害簡易スクリーニング法の開発、潜在的な更年期障害の検出方法を確立することを本研究の目的とする。これまでの取り組みにより、シート型心電計測、体動計測、発汗計測システムのプロトタイプを完成させ、シート型脳波センサとの連動を行ってきた。最終年度は、医学部とのより緊密な連携を行うことで、医療ニーズに即した計測持続時間の実現とユーザー目線での実用開発と検証を行ってきた。具体的には、システム全体としての低消費電力化アルゴリズムの開発と、システム全体の軽量化を行うことで、24時間以上の常時計測を実現する取り組みを進めてきた。一連の取り組みを通して、脳波ー心電ー体動ー発汗の包括的な計測を長時間可能にすることに成功するとともに、そのデータの解析手法を医師とともに開発することに成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、関谷らが世界に先駆けて開発した【ウルトラフレキシブル生体信号計測シート(Nature2013, Nature Mater.2010, Science2008, Nature Comm.2014)】を用いて、自律神経機能を定量的に無線計測できる“パッチ式センサシステム"を開発する。初年度(平成28年度)にはプロトタイプの試作、ノイズキャンセリングアルゴリズム、医学部とのチーム連携方針の確認を中心に取り組んできた。以下、取り組んできた内容と成果。研究項目1:更年期症状のパッチ式常時計測シートの開発と計測精度の最適化。2016年度の成果:脳波、心電、体動、発汗の同時計測が可能なプロトタイプの試作と性能評価。研究項目2:更年期症状に関連する脳波、心電、体動、発汗の統合的情報処理技術の開発。2016年度の成果:全生体データのリアルタイム計測と逆位相ノイズキャンセリング手法による低ノイズ化。研究項目3:自律神経に関する情報処理とアルゴリズム化、臨床に適したソフトウェアの開発。2016年度の成果:医学部チームとの連携による更年期症状の可視化についての検討初年度に予定していた以下の研究開発項目においていずれも予定していた以上の進展があった。研究項目1:更年期症状のパッチ式常時計測シートの開発と計測精度の最適化2016年度の成果:脳波、心電、体動、発汗の同時計測が可能なプロトタイプの試作と性能評価。2016年度の成果:医学部チームとの連携による更年期症状の可視化についての検討これらは順調に成果をあげることが出来たほか、実際に予備的な生体計測を医学部との連携において実施することが出来た。これは、予定していた以上の成果であり、実際の生体計測により新たに様々な生体ノイズの除去アルゴリズムの開発に着手することが出来た。

更年期症状の把握、疾病程度を包括的に計測、解析することで、更年期障害の定量的診断、早期発見、ホルモン療法などの早期治療への医療基盤を作り出す。特に更年期障害簡易スクリーニング法の開発、潜在的な更年期障害の検出方法を確立することを本研究の目的としている。昨年度に開発してきたプロトタイプを、今年度は医師とともにハードウェア、ソフトウェアともに最適化する取り組みを進めてきた。より具体的には以下の取り組みを進め、成果を得た。計測用システム及びソフトウェアに関しては、医学部チームと連携し、病院にて使用を開始し、医学的有用性の検証を行い、医師より高い評価を得た。特に大阪大学産婦人科の澤田医師(婦人科)との連携を新たに開始し、この取り組みを加速した。ここでは、更年期症状に関連する脳波、心電、体動、発汗の統合的情報処理技術の開発、信号同期アルゴリズムの確立、更年期症状に関連するデータマイニング・モデリング手法の開発を進めた。今後さらに、自律神経に関する情報処理とアルゴリズム化、臨床に適したソフトウェアの開発と、可視化ソフトウェアのプロトタイプ試作、および最適化に取り掛かる準備を整えることができた。当初の予定通り、研究開発はおおむね順調に推移している。産婦人科における計測も開始しており、今後更に医師の協力を得て、計測事象を増やしていくことで、センサシステムおよび信号処理アルゴリズムの精度を上げていく。本研究では、申請者が世界に先駆けて開発した【ウルトラフレキシブル生体信号計測シート(Nature2013, Nature Mater.2010, Science2008, Nature Comm.2014)】を用いて、自律神経機能を定量的に無線計測できる“パッチ式センサシステム"を開発する。更年期障害に不安を抱える女性の“日常生活時、および睡眠時に装着感なく"「脳波」、「心電(心拍)」、「体動」、「発汗」を同時計測できる新しい家庭内医療診断に資するセンサ開発である。さらに、更年期障害関連の生体BIG DATAを解析する手法を情報処理科学の観点から開発することで、膨大に生まれる情報を“可視化"する。特に更年期障害簡易スクリーニング法の開発、潜在的な更年期障害の検出方法を確立することを本研究の目的とする。これまでの取り組みにより、シート型心電計測、体動計測、発汗計測システムのプロトタイプを完成させ、シート型脳波センサとの連動を行ってきた。最終年度は、医学部とのより緊密な連携を行うことで、医療ニーズに即した計測持続時間の実現とユーザー目線での実用開発と検証を行ってきた。具体的には、システム全体としての低消費電力化アルゴリズムの開発と、システム全体の軽量化を行うことで、24時間以上の常時計測を実現する取り組みを進めてきた。一連の取り組みを通して、脳波ー心電ー体動ー発汗の包括的な計測を長時間可能にすることに成功するとともに、そのデータの解析手法を医師とともに開発することに成功した。
匂いに対する行動・生理学的な恐怖反応を相乗的に引き起す脳内神経回路

動物の生存にとって、危険に対して恐怖を感じて適切に対応することは重要である。マウスは、天敵の匂いを嗅ぐと行動・自律神経・内分泌性の恐怖反応を示す。本研究では、我々が同定したオオカミの尿に含まれるピラジン化合物を用いて、恐怖反応の誘発・制御機構の解明を試みた。その結果、ピラジン化合物の匂い情報は脳内の主嗅覚系および鋤鼻系の両方の神経回路を活性化することで初めて様々な恐怖反応を同時に引き起こすことが示唆された。また、これらの嗅覚系は脳内の分界条床核および視床下部前核において領域特異的な活性化を引き起すことが示唆された。被捕食動物は、天敵の匂いに対して本能的に恐怖を感じて様々な行動・内分泌・自律神経の変化を示す。このような恐怖反応は、主嗅覚系と鋤鼻系の2つの主な嗅覚系によって制御されると予想されているが、現在のところ物質レベルでこれを証明した報告はない。我々が見出したオオカミの尿に含まれる恐怖誘発物質である3種のピラジン類を混合して提示すると、マウスは忌避やすくみ行動などの恐怖反応を示す。また、その嗅覚一次中枢である嗅球において主嗅球だけでなく副嗅球でも神経活動に応答して誘導されるc-Fosタンパク質の発現が見られる。このことから、ピラジン類に対する恐怖反応は、主嗅覚系と鋤鼻系の両嗅覚系を介して引き起されることが示唆される。そこで、これら2つの嗅覚系の恐怖反応に対する機能的役割について調べた。そのために、硫酸亜鉛の鼻腔内投与によって主嗅覚系を遮断したマウスと、鋤鼻器を外科的に切除して鋤鼻系を遮断したマウスを用意し、これらの処理をしたマウスにおいて恐怖反応がどのように変化するかを調べた。行動(忌避、接触、すくみ、毛繕い、立ち上がり、危険確認)、内分泌(血中コルチコステロン・ACTH濃度)、自律神経(心拍、血圧、体表面温度)のそれぞれの変化について合計11種の恐怖反応について測定した。その結果、いくつかの恐怖反応は、どちらかの嗅覚系を遮断することによって見られなくなった。また、立ち上がりや危険確認行動は、どちらか片方の嗅覚系を遮断すると見られなくなった。このことから、2つの嗅覚系が恐怖反応の誘発の際に異なる役割を担っており、両方の嗅覚系が相互作用することによって様々な恐怖反応が正常に引き起されることが明らかになった。両嗅覚系の相互作用システムの解明につながる重要な知見である。概ね研究実施計画に記載したスケジュール通り研究が進行しており、新たに派生した研究課題についても取り組み始めているので。我々が見出したオオカミの尿に含まれる先天的な恐怖を誘発する物質(カイロモン)であるピラジン化合物は、主嗅覚系と鋤鼻系の2つの嗅覚系を介してマウスに行動・内分泌・自律神経性の様々な恐怖反応を引き起こすことを既に見出している。平成28年度は次のような成果を得た。1.主嗅覚系を遮断すると、行動性の反応の一部は観察されなくなり、その反応の出力に関与する中脳水道周囲灰白質での神経活性が低下した。2.鋤鼻系を遮断すると、自律神経性の反応は起こらなくなり、その反応に寄与する視床下部前野や縫線核での神経活性が低下した。3.両方の嗅覚系を遮断することで初めて、内分泌性の反応は阻害され、その反応に関わる視床下部室傍核での神経活性が低下した。4.どちらか一方の嗅覚系を遮断するだけで、危険確認行動は見られなくなった。以上のことから、2つの嗅覚系が恐怖反応の誘発の際に異なる役割を担っており、両方の嗅覚系が相互作用することによって様々な恐怖反応が正常に引き起されることが明らかになった。動物が生存していく上で、危険に対して恐怖を感じて適切に対応することは重要である。マウスは、天敵の匂いを嗅ぐと、逃避やすくみなどの危険を回避する恐怖行動を示すだけでなく、ストレスホルモンの分泌や血流の変化などを伴う生理的な恐怖反応も示す。このような生理的な恐怖反応は呼吸系や代謝系などを変化させることで、恐怖行動がより効率的に行えるようにすると考えられる。つまり、恐怖行動は恐怖反応によって増強された効果を発揮するといえるが、その脳内機構については不明な点が多い。我々がオオカミの尿から見出した天敵の匂い成分であるピラジン化合物は、マウスに様々な恐怖行動や恐怖反応を引き起こすこと、またこの化合物はマウスの2つの主な嗅覚系である主嗅覚系および鋤鼻系を介して脳神経を制御していることを過年度までに明らかにしている。最終年度である平成29年度は次のような成果を得た。1.生理的恐怖反応であるストレスホルモン(コルチコステロン)の分泌は、主嗅覚系を機能阻害しても維持されたが、鋤鼻系の阻害により6割程度に低下した。2.生理的恐怖反応である抹消血管の収縮は、鋤鼻系を機能阻害しても維持されたが、主嗅覚系の阻害により見られなくなった。

同様の変化は、末梢血管の収縮と相関して生じると考えられる体表面温度の低下についても起こった。3.忌避やすくみなどの恐怖行動は、2つの嗅覚系のいずれか片方を阻害すると減弱もしくは検出されなくなった。また阻害時には、脳内の分界条床核および視床下部前核における神経活性が領域特異的に減弱した。以上のことから、生理的な恐怖反応は、これらの脳の特定領域の神経活動を活性化し、恐怖行動を増強すると示唆される。動物の生存にとって、危険に対して恐怖を感じて適切に対応することは重要である。マウスは、天敵の匂いを嗅ぐと行動・自律神経・内分泌性の恐怖反応を示す。本研究では、我々が同定したオオカミの尿に含まれるピラジン化合物を用いて、恐怖反応の誘発・制御機構の解明を試みた。その結果、ピラジン化合物の匂い情報は脳内の主嗅覚系および鋤鼻系の両方の神経回路を活性化することで初めて様々な恐怖反応を同時に引き起こすことが示唆された。また、これらの嗅覚系は脳内の分界条床核および視床下部前核において領域特異的な活性化を引き起すことが示唆された。ほぼ予定通り進行しているので研究の大幅な変更はないが、計画していた研究から派生した研究課題について今後取り組んでいく。感覚生理学次年度使用額が生じた理由は、新たに派生した研究課題に取り組むために、当初の研究計画を変更したためである。次年度使用額が生じた理由は、新たに派生した研究課題に取り組むために、当初の研究計画を変更したため。本研究を遂行するための設備・装置はほぼ揃っている。そこで、試料調製・解析のために必要な免疫組織化学染色実験および薬物の脳内微量注入実験に関連する試薬や消耗品を購入する。また、研究成果発表のための交通費・宿泊費や論文投稿費として使用することを計画している。脳内神経回路の機能解析のために行う薬理遺伝学および光遺伝学実験に必要な物品を購入する。
象牙接着システムの開発および再検討

象牙質接着における試作デンチンプライマー成分の各種アミノ酸誘導体の効果とボンディング材中に添加したフッ素徐放性フィラーの効果およびその接着メカニズムを明らかにする目的で、2種の合成した4-メタクリロキシヘキルトルメリット酸無水物(4-MHTA)と4-メタクリロキシデシルトリメリット酸無水物(4-MDTA)を用いて、デンチンプライマーと4-MHTA含有ボンディング材および4-MDTA含有ボンディング材の接着システムに対する剪断接着強さ試験を行い、比較検討を行った結果、次のような結論を得た。1.60wt%HEMA水溶液に脂肪族系アミノ酸(18種)と芳香族系アミノ酸(15種)をそれぞれ0.5mol%を添加したAプライマーとAプライマーとに4-MHTAモノマーあるいは4-MDTA5wt%含有ボンディング材をそれぞれ塗布し、光重合型コンポジットレジンを充填した場合の剪断接着強さでは、Bプライマーの方が同一アミノ酸の系でAプライマーより高い接着性を示し、その値は約1.5倍以上であった。また、BプライマーよりCプライマーの方が同一アミノ酸の系で約1.1倍以上高い値を示した。2.Cプライマーの接着システムでは、接着強さが20MPa前後と高い値を示したアミノ酸は、脂肪族系で8種、芳香族系で5種あった。3.合成した2種の4-MHTAとでは、メチレン鎖が長い4-MDTAの方が接着強さは大きくなる傾向であった。4.試作ボンディング材中に5wt%フッ素徐放性フィラーを添加しても接着強さは、低下しなかった。5.接着強さが高い象牙質接着システムの接着メカニズムは、4-MDTAの(COO^-)_2が水中でリガンドモノマーとして象牙質中のハイドロキシアパタイトのCa^<2a>とキレート結合を形成するとともにコラーゲンのアミノ基と分子間水素結合を形成するものと考えられる。本研究の目的は,根面う蝕や歯頚部う蝕などの治療処置に対して、従来のリン酸水溶液などの酸処理を施すのではなく、象牙質の無機成分を脱灰させないで象牙質管がスメアーキャッピングしたまま管周象牙質にも接着する象牙質接着システムを開発するとともにそれらの接着メカニズムを解明することである。そこで,本年度は、デンチンプライマーとして、2-ヒドロキシエチルメタクリレート60重量部・蒸留水40重量部からなる水溶液に15種類の芳香族アミンと18種の脂肪属アミンをそれぞれ0.5mol%を添加した33種のプライマー(Aプライマー)およびAプライマーにそれぞれ合成したカルボン酸基を有するモノマー10重量部を添加したプライマー(Bプライマー)の計66種のデンチンプライマーを調製した。また、比較対照として37%リン酸水溶液を用いて、抜去牛歯研磨象牙質面にそれぞれ30秒間処理を行い、エア-ブロ-乾燥後、IR分析とSEM観察を行った。IR分析結果では、未処理象牙質は、1656cm^<-1>にコラーゲンのカルボニル基、1035、601および581cm^<-1>に無機質成分のカルシウムのピークを示した。1656cm^<-1>のカルボニル基に対する1035cm^<-1>のリン酸基のピーク比は、AおよびBプライマーの場合、未処理象牙質とほとんど同じであるのに対して、リン酸水溶液では約50%低下していた。このことは、前者が後者よりも無機質成分の脱灰がほとんど無く、変質が少ないことを示唆している。一方、SEM観察結果では、リン酸水溶液の場合、試料作製時の600番の耐水紙により生じたスメア-層は除去されていたのに対し、Aプライマー群ではいずれも研磨の際に生じた条痕が観察され、スメア-層が残存していた。また、Bプライマー群の場合、象牙細管内がキャッピングされ、管周象牙質が露出しているものが多く観察された。

4.試作ボンディング材中に5wt%フッ素徐放性フィラーを添加しても接着強さは、低下しなかった。5.接着強さが高い象牙質接着システムの接着メカニズムは、4-MDTAの(COO^-)_2が水中でリガンドモノマーとして象牙質中のハイドロキシアパタイトのCa^<2a>とキレート結合を形成するとともにコラーゲンのアミノ基と分子間水素結合を形成するものと考えられる。本研究の目的は,根面齲蝕や歯頸部齲蝕などの治療処置に対して、従来のリン酸水溶液などの酸処理を施さなくても、象牙質の無機質成分を脱灰させないで象牙細管がスミヤ-キャツピングしたまま管周象牙質にも接着する象牙質接着システムを開発するとともにそれらの接着メカニズムを解明することである。そこで、本年度は、昨年度に試作した66種類のデンチンプライマ一:33種のAプライマー(2-ヒドロキシエチルメタクリレート60重量部・蒸留水40重量部からなる水溶液に15種類の芳香族アミンと18種類の脂肪族アミンをそれぞれ0.5mol%添加したプライマー)および33種のBプライマー(33種のAプライマーに合成したカルボン酸基を有するモノマー10重量部をそれぞれ添加したプライマー)を用いて、抜去牛歯象牙質に対する剪断接着強さ試験を行った。すなわち、各プライマーを象牙質面にそれぞれ30秒間処理し、15秒間エアー乾燥した後、試作した1液性ボンディング材(フッ素除放性フィラーを5wt%含有したボンディング材)それぞれ塗布し、30秒間光照射を行い、次いで可視光線重合型コンポジットレジンを充填し、試験体を作製し、24時間後に試験を行った。その結果、剪断接着強さが33種のAプライマーでは10.513.4Mpaの範囲であったのに対して33種のBプライマーでは15.220.8Mpaの範囲となった。カルボン酸基を有するモノマーを添加させたプライマーの方がモノマーを添加しなかったプライマーより象牙質接着に有効であることが分かった。また、高い剪断接着強さを示したBプライマーのSEM観察では象牙質・レジン接着界面付近にlμm以下の樹脂含浸層が生成され、象牙細管にレジンタグの形成が認められた。しかも、レジンが管間象牙質および管周象牙質に密着して接着している像が観察された。象牙質接着における試作デンチンプライマー成分の各種アミノ酸誘導体の効果とボンディング材中に添加したフッ素徐放性フィラーの効果およびその接着メカニズムを明らかにする目的で,1種の合成した4-メタクリロキシデシルトリメリット酸無水物(4-MDTA)を用いて,デンチンプライマーと4-MDTA含有ボンディング材の接着システムに対する剪断接着強さ試験を行い,昨年度合成した4-メタクリロキシヘキシルトリメリット酸無水物(4-MHTA)の接着システムと比較検討を行った結果,次のような結論を得た。1.剪断接着強さでは,60wt%HEMA水溶液に脂肪族系アミノ酸(18種)と芳香族系アミノ酸(15種)をそれぞれ0.5mol%を添加した水溶液に4-MDTAのモノマーをそれぞれ10wt%添加したCプライマーでそれぞれ処理した後,4-MDTA5wt%含有ボンディング材をそれぞれ塗布し,光重合型コンポジットレジンを充填した場合の接着システムの方が昨年度合成した4-メタクリロキシヘキシルトリメリット酸無水物(4-MHTA)の接着システムより同一アミノ酸の系で約1.1倍以上高い値を示した。2.Cプライマーの接着システムでは,接着強さが20MPa前後と高い値を示したアミノ酸は,脂肪族系で8種,芳香族系で5種あった。3.合成した2種の4-MHTAとでは,メチレン鎖が長い4-MDTAの方が接着強さは大きくなる傾向であった。
粒子法を用いた微量水銀の動態予測モデルの開発

本年度は,昨年度作成した微量水銀の動態予測モデルの構築のために必要となる基礎コードを用いて八代海および有明海の潮汐・潮流特性を解析した.特に,実際に水銀汚染が生じた1960年以前の八代海についてはその流動は知られておらず八代海沿岸の干拓,さらには実測データの解析も行ない検討を行った.有明海および八代海では,排水不良の改善や農業振興のため古くから干拓が進められてきた.干拓による地形の変化は湾の固有周期を減少させ,共振潮汐が卓越する両海域の潮汐・潮流現象に影響を及ぼす.Manda and Matsuoka (2006)は1940年代と90年代の潮流の比較し,現在までに生じた有明海奥部での潮流減少の大部分は諫早湾干拓事業以前の干拓によるものであることを示した.しかし,潮汐の長期変動に関しては,現在までに詳細な検討は行われていない.そこで,本研究では実測潮位データの解析と数値シミュレーションによって,有明海および八代海の潮汐振幅の長期変動を調べた.実測データの解析から,近年の有明海・八代海では1930年以降で最もM2潮振幅が小さいことが示された.また,海岸線の変化が潮汐へ与える影響を数値シミュレーションで評価した結果,1900年以降実施されてきた干拓の影響により,潮汐振幅は湾奥で減少,湾口で増加してきたことが分かった.また,諌早湾干拓事業以前の干拓による影響と諫早湾干拓事業による影響は同程度であることが分かった.さらに,潮汐データの解析と数値シミュレーションの結果から,過去80年間に生じたM2潮振幅の減少の大部分は,干拓などの海岸線の変化ではなく,外海のM2潮振幅の減少によるものであることが示された.本年度は,微量水銀の動態予測モデルの構築のために必要となる基礎コードの作成を行い,それを用いて八代海および有明海の潮汐・潮流特性を解析した.特に,実際に水銀汚染が生じた1960年以前の八代海についてはその流動は知られておらず八代海沿岸の干拓,さらには実測データの解析も行ない検討を行った.有明海および八代海では,排水不良の改善や農業振興のため古くから干拓が進められてきた.干拓による地形の変化は湾の固有周期を減少させ,共振潮汐が卓越する両海域の潮汐・潮流現象に影響を及ぼす.しかし,潮汐の長期変動に関しては,現在までに詳細な検討は行われていない.そこで,本研究では実測潮位データの解析と数値シミュレーションによって,有明海および八代海の潮汐振幅の長期変動を調べた.実測データとして,熊本県の三角検潮所の潮位データ(1931年6月2007年12月,1時間毎)を用いた.解析は最小二乗法による調和解析で,分解期間を29日間として10分潮に分解して,15日間隔で経時変化を調べた.また,29日間の中にデータの欠測か1つでもあるものは除外して整理した.数値シミュレーションには海洋の研究で広く用いられているPrinceton Ocean Model(POM)に干潟モデルを組み込んだものを用い,南側の開境界に振幅75cmのM_2潮を与えた.また,過去から現在までの潮汐変動を比較するために1900年代,1960年代,1980年代,2000年代の4パターンの地形を作成し,解析を行った.その結果,有明海湾口の口之津では干拓が進むにつれて振幅は増加傾向に,増幅率は減少傾向にあることが分かった.また,八代海では振幅・増幅率共に増加傾向にあることが分かった.本年度は,昨年度作成した微量水銀の動態予測モデルの構築のために必要となる基礎コードを用いて八代海および有明海の潮汐・潮流特性を解析した.特に,実際に水銀汚染が生じた1960年以前の八代海についてはその流動は知られておらず八代海沿岸の干拓,さらには実測データの解析も行ない検討を行った.有明海および八代海では,排水不良の改善や農業振興のため古くから干拓が進められてきた.干拓による地形の変化は湾の固有周期を減少させ,共振潮汐が卓越する両海域の潮汐・潮流現象に影響を及ぼす.Manda and Matsuoka (2006)は1940年代と90年代の潮流の比較し,現在までに生じた有明海奥部での潮流減少の大部分は諫早湾干拓事業以前の干拓によるものであることを示した.しかし,潮汐の長期変動に関しては,現在までに詳細な検討は行われていない.そこで,本研究では実測潮位データの解析と数値シミュレーションによって,有明海および八代海の潮汐振幅の長期変動を調べた.実測データの解析から,近年の有明海・八代海では1930年以降で最もM2潮振幅が小さいことが示された.また,海岸線の変化が潮汐へ与える影響を数値シミュレーションで評価した結果,1900年以降実施されてきた干拓の影響により,潮汐振幅は湾奥で減少,湾口で増加してきたことが分かった.また,諌早湾干拓事業以前の干拓による影響と諫早湾干拓事業による影響は同程度であることが分かった.さらに,潮汐データの解析と数値シミュレーションの結果から,過去80年間に生じたM2潮振幅の減少の大部分は,干拓などの海岸線の変化ではなく,外海のM2潮振幅の減少によるものであることが示された.
表面2倍波発生を用いた分子性結晶表面の研究

分子性結晶の表面で発生する第二高調波(SHG)を用いて結晶表面での分子配向を研究することを目的とした。基本波にYAGレ-ザ-からの1.06μmを用い、530nmの光を検出するシステムをつくった。信号があまり強くないことに加えてレ-ザ-の不安定からくるゆらぎがあるので、今回購入したトランジェント・デジタイザを用いて信号の積算平均を行い,よい結果を得ることができた。色素薄膜についてはSHGの入射用依存性,SHGの位相,全反射によるSHGのエンハンスメント,多層膜構造にした際の干渉効果などをしらべ,色素分子の基板に対する配向を議論するデ-タを得た。結果の一部は平成2年12月に行われた「固体・表面光化学討討会」(於大阪大学)にて発表した。また単結晶の表面からのSHGを検出する試みにも成功し,P-ニトロアニリン,Pーシアノニリンなど,分子としての非線形性は大きいが結晶の対称性によってバルクのSHGが禁制になっているような結晶を用いて表面SHGの対称性をしらべている。予備的な結果を得て、現在さらに詳細な測定を行っているところである。デジタル・ディレイ・ジェネレ-タ-は二台以上のレ-ザ-の同期を必要とする測定に非常に有効であった。レ-ザ-自身がもっている同期不安定性(YAGレ-ザ-では1ns以内,エキシマレ-ザ-で510ns)以内に同期を保つことができることがわかった。
多チャンネル重イオンビームプローブの開発による電位構造形成過程の研究

磁場閉じ込めプラズマの閉じ込め性能を左右する電場及び揺らぎの振る舞いを理解するため、重イオンビームプローブ(HIBP)の高性能化を行った。このHIBPを用いて、(1)ヘリカルプラズマの電場が新古典理論によってよく説明できること、(2)プラズマ内部での不純物吐き出し現象は電場に起因する粒子束だけでは説明できないこと、(3)帯状流が高エネルギー粒子によって誘起され、プラズマ中心近傍に発生していること、が明らかになった。電場及びその揺動は磁場閉じ込めプラズマの閉じ込め性能に大きな影響を及ぼすため、その振る舞いを理解することは将来の核融合プラズマの性能予測を行う上で極めて重要である。現在整備を進めている重イオンビームプローブ(HIBP)を多チャンネル化することにより、それらを直接的に測定することが可能になることが期待できる。今年度は、最初に検出器の多チャンネル化のための最適化計算を行った。その結果及び現在のビームラインの状況を勘案して、1cm刻みの検出器列を3列並べる設計案を採用した。これにより、当面のターゲットと考えている電子内部輸送障壁形成時の径方向電場分布及び帯状流の径方向の構造の直接計測が可能となると考えられる。また、磁場揺動の計測ができる可能性があり、かつビーム軌道調整の精度向上による計測精度の向上が期待できるので、トロイダル方向にも4チャンネル化して設計を行った。新しく製作した検出器の単体試験は来年度前半に行う予定である。本年度、大型ヘリカル装置(LHD)用HIBP実機に予備的に設置されている縦方向(つまり径方向)3チャンネルの検出器で行った実験では、2チャンネルで等しい電位分布形状を得ることができた。これにより多チャンネル計測が原理的に可能であることが確認できた。残りめチャンネルの不具合の原因は、ビーム軌道の調整が不十分であったため、ビームの一部が欠損したことと考えられる。多チャンネル計測においては検出器だけでなく、ビーム軌道の調整精度もより向上させることが必要であることが分かった。電位を計測することのできる重イオンビームプローブ(HIBP)を多チャンネル化することにより、チャンネル間の差分から電場を直接的に測定することが可能になることが期待できる。昨年度の3チャンネル化検出器を用いた実験データの解析を進めた結果、3つのチャンネルで測定した電位分布が一致することを確認し、3チャンネル計測ができていることが確認できた。電位揺動に関しては、MHD揺動や高速イオン誘起Geodesic acoustic mode (GAM)を3チャンネルで計測できた。これらの電位分布及び揺動に対してチャンネル間の電位差、位相差を調べた結果、誤差以上の差は検出できず、電場・電場揺動は検出できなかった。このことは、これらの電場分布・電場揺動の特性長が3チャンネルの間隔(2cm)より大きいこと示している。ただし、当初目標であり、数cm程度の構造を持つ可能性のある電場の遷移領域での分布計測や乱流と乱流駆動帯状流の計測は、計測のS/N比が不十分であるためまだできていない。このため、当初計画にあった5チャンネル化改造を中止し、S/N改善のための検出器の改良を行うこととした。平成22年3月の段階で改良型検出器の製作中であり、来年度に引き続き試験を行う予定である。核融合科学研究所の大型ヘリカル装置(LHD)に導入した重イオンビームプローブ(HIBP)の改良により、従来の手法では測定できなかった高イオン温度プラズマ中の電位分布の直接計測に成功した。これまでの実験研究で、高イオン温度状態になった時にプラズマ中心において不純物イオンの吐き出し現象が見られており、この現象が電場に起因するものかどうかが注目されていた。HIBPによる計測結果に基づき、不純物の吐き出しが見られる領域では弱い負電場が形成されていることを確認し、不純物の吐き出し現象が単純な電場による吐き出しではないという結論を得た。また、計測された電場は新古典論に基づく粒子束の両極性条件によって説明できることを示した。この結果を第37回ヨーロッパ物理学会における招待講演として報告した。また、高速イオン励起モードのプラズマ内部計測にHIBPを適用した結果、プラズマ中心近傍に高速イオン励起測地線音響モード(GAM)に伴う電位揺動を観測した。このモードの空間分布計測を行い、それが電場揺動、つまり流れの揺らぎを伴っていることを初めて明らかにした。また、このGAMに伴う流れの揺らぎにより、微視的乱流を反映していると考えられる密度揺動の周波数スペクトルがGAM周波数で変調されている様子も観測された。この結果は高速イオン励起モードとバルクプラズマの結合を示している可能性もあり、この物理機構については今後引き続き詳細な研究が必要である。上記の結果を第23回IAEA核融合エネルギー会議にて報告した。
カルシウム・カルモデュリン依存性プロインキナーゼIIの細胞内局在決定機構の解析

Ca^<2+>/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII (CaM KII)は細胞内に増加したCa^<2+>とカルモデュリンの複合体により活性化される蛋白質リン酸化酵素であり、神経系に特に高濃度に発現している。CaM KIIは、4種類のα、β、γ、δサブユニットが存在しており、さらに、サブユニット間で相同性の高い触媒領域と会合領域の間に存在する可変領域のスプライシングの違いにより、それぞれ数種類のアイソフォームが報告されている。この可変領域がCaM kIIの細胞内局在に関与すると考えられている。本研究では、まず、ラット脳線条体においてCaM KIIサブユニットか細胞内のどの分画に豊富に存在するかを、細胞分画後にそれぞれのサブユニットに対する特異な抗体を用いた免疫ブロットにより検討した。さらに、CaM KIIのδ1、δ3、δ4アイソフォームの安定発現細胞株をNG108-15紳胞に確立し、それらのアイソフォームの細胞内局在について細胞分画法により検討した。ラット脳線条体において、報告されているようにαサブユニットはシナプシンIと同様の局在を示したが、β、γ、δサブユニットはそれとは異なり、それぞれ特有の局在を示した。即ち、CaM KIIサブユニットはそれぞれ、特有の細胞内局在性を持ち特異的な機能に関与していると考えられる。さらにアイソフォーム間での細胞内局在の差異について、δ1、δ3、δ4アイソフォームの安定発現細胞株を用いて検討した。δ1、δ3、δ4アイソフォームはそれぞれ異なる可変領域を有するが、それぞれ特有の細胞内局在を示した。これらの結果は、可変領域が細砲内局在決定に重要な役割を担っていることを示しており、個々のサブユニット及びアイソフォームの細胞内局在の同定は、CaM KIIの機能解明へのアプローチとして一つの有用な手段だと考えられる。
力学系の大域的分岐の研究

本年度の研究実績は(1)ベクトル場のホモクリニック倍分岐の研究,(2)特異摂動的ベクトル場の軌道の大域的構造の研究,(3)ベクトル場の標準形の研究,に大別される.(1)ホモクリニック倍分岐の問題に関してはorbit-flip型のホモクリニック軌道を持つ区分的に線型なベクトル場の族を対象として数値的また数学的な解析を行い,無限回のホモクリニック倍分岐の発生とその集積が起こりうることを示唆する結果を得た.これはホモクリニック倍分岐がある場合にFeigenbaum現象と類似の仕方で無限回繰り返して起こり集積することを示唆しており,カオス的力学系との関わりの新しい側面として興味深い.またそれを数学的に証明するための試みとして,余次元3のより退化したホモクリニック軌道からの分岐をべ,その開折により無限個のホモクリニック倍分岐が起こることを示した.(2)特異摂動的ベクトル場に関してはある種の特異摂動的な2次元常微分方程式を考え,それが適当な条件の下に無限個のヘテロクリニック軌道を持つことをConley indexの理論を用いて示した.これは今後このようなタイプの力学系の研究に有力な手法を提供することが期待される.またshadow systemと呼ばれる非線型偏微分方程式系の解空間の大域的構造についてもConley indexを用いた研究を行い,現在論文を投稿中である.(3)ベクトル場の標準形に関しては,宇敷きによって与えられた標準形の計算方法を改良し,J.Sandersの論文で未解決であった問題に部分的な解答を与えた.本年度の研究実績は(1)ベクトル場のホモクリニック倍分岐の研究,(2)特異摂動的ベクトル場の軌道の大域的構造の研究,(3)ベクトル場の標準形の研究,に大別される.(1)ホモクリニック倍分岐の問題に関してはorbit-flip型のホモクリニック軌道を持つ区分的に線型なベクトル場の族を対象として数値的また数学的な解析を行い,無限回のホモクリニック倍分岐の発生とその集積が起こりうることを示唆する結果を得た.これはホモクリニック倍分岐がある場合にFeigenbaum現象と類似の仕方で無限回繰り返して起こり集積することを示唆しており,カオス的力学系との関わりの新しい側面として興味深い.またそれを数学的に証明するための試みとして,余次元3のより退化したホモクリニック軌道からの分岐をべ,その開折により無限個のホモクリニック倍分岐が起こることを示した.(2)特異摂動的ベクトル場に関してはある種の特異摂動的な2次元常微分方程式を考え,それが適当な条件の下に無限個のヘテロクリニック軌道を持つことをConley indexの理論を用いて示した.これは今後このようなタイプの力学系の研究に有力な手法を提供することが期待される.またshadow systemと呼ばれる非線型偏微分方程式系の解空間の大域的構造についてもConley indexを用いた研究を行い,現在論文を投稿中である.(3)ベクトル場の標準形に関しては,宇敷きによって与えられた標準形の計算方法を改良し,J.Sandersの論文で未解決であった問題に部分的な解答を与えた.
新しいＲｈｏ－ｋｉｎａｓｅ阻害薬による肺高血圧治療効果の検討

Al-mamun先生と共同して実施している研究は、新規Rho-kinase選択的阻害剤の作用機序、特に、我々が世界に先駆けて発見・同定した内皮機能における役割や血管平滑筋での作用機序の解明である。特にAl-mamun先生は、薬理学的な詳細な検討技術に優れており、薬剤間の作用機序の差異を検討することと、細胞増殖のシグナル機構として重要なERK1/2に関して、遺伝子改変マウスを用いた肺高血圧症の解明を進めている。さらに、血管内皮特異的遺伝子欠損マウスを作製する準備も進めており、新たな知見が得られることが期待される。Al-mamun先生との共同研究の意義としては、これらの一連の研究により、心血管系の恒常性の破綻におけるRho-kinaseの重要性が明らかになるとともに、糖尿病をはじめとした代謝性疾患における内皮機能不全の分子機構の解明や新たな治療法の開発に結びつくことが期待される。これまで肺高血圧の病態には血管平滑筋増殖にばかり注目が集まっていたが、我々や他の研究グループにより、血管内皮機能の重要性が普遍的に認められることが明らかになってきた。Al-mamun先生との共同研究で、そうしたこれまで全く知られていなかったRho-kinaseによる内皮機能の調節機構が明らかになりつつある。具体的には、以下の検討を行ってきた。(A)遺伝子改変マウス(ROCK1, ROCK2欠損マウス)を用いた動物モデルを用いた、各アイソタイプの役割に関する詳細なメカニズムの解明。(B)ヒト肺動脈構築細胞におけるRho-kinase発現とそのシグナル伝達機構(1)ヒト肺動脈血管平滑筋細胞を用いた酸化ストレス増幅系の解明(細胞実験)(2)ヒト肺動脈血管内皮細胞への炎症シグナル伝達機構の解明(細胞実験)29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。(B)ヒト肺動脈構築細胞におけるRho-kinase発現とそのシグナル伝達機構(1)ヒト肺動脈血管平滑筋細胞を用いた酸化ストレス増幅系の解明(細胞実験)(2)ヒト肺動脈血管内皮細胞への炎症シグナル伝達機構の解明(細胞実験)現在実施している研究は、上記にて述べた通り、新規Rho-kinase選択的阻害剤の作用機序を特に内皮機能における役割や血管平滑筋での作用機序に着目して解明を進めてきた。実際、薬理学的な詳細な検討技術を駆使し、薬剤間の作用機序の差異を検討を進めてきた。細胞増殖のシグナル機構として重要なERK1/2に関して、遺伝子改変マウスを用いた肺高血圧症の解明を進めている。既に、様々な新たな知見を得ることに成功している。これらの一連の研究により、心血管系の恒常性の破綻におけるRho-kinaseの重要性が明らかになるとともに、糖尿病をはじめとした代謝性疾患における内皮機能不全の分子機構の解明や新たな治療法の開発に結びつくことが期待される。そうしたこれまで全く知られていなかったRho-kinaseによる内皮機能の調節機構が明らかになりつつある。以下の検討を行ってきており、順調に進んでいる。(B)ヒト肺動脈構築細胞におけるRho-kinase発現とそのシグナル伝達機構(1)ヒト肺動脈血管平滑筋細胞を用いた酸化ストレス増幅系の解明(細胞実験)(2)ヒト肺動脈血管内皮細胞への炎症シグナル伝達機構の解明(細胞実験)Al-mamun先生と共同して実施している研究は、新規Rho-kinase選択的阻害剤の作用機序、特に、我々が世界に先駆けて発見・同定した内皮機能における役割や血管平滑筋での作用機序の解明である。特にAl-

mamun先生は、薬理学的な詳細な検討技術に優れており、薬剤間の作用機序の差異を検討することと、細胞増殖のシグナル機構として重要なERK1/2に関して、遺伝子改変マウスを用いた肺高血圧症の解明を進めている。さらに、血管内皮特異的遺伝子欠損マウスを作製する準備も進めており、新たな知見が得られることが期待される。Al-mamun先生との共同研究の意義としては、これらの一連の研究により、心血管系の恒常性の破綻におけるRho-kinaseの重要性が明らかになるとともに、糖尿病をはじめとした代謝性疾患における内皮機能不全の分子機構の解明や新たな治療法の開発に結びつくことが期待される。これまで肺高血圧の病態には血管平滑筋増殖にばかり注目が集まっていたが、我々や他の研究グループにより、血管内皮機能の重要性が普遍的に認められることが明らかになってきた。Al-mamun先生との共同研究で、そうしたこれまで全く知られていなかったRho-kinaseによる内皮機能の調節機構が明らかになりつつある。具体的には、以下の検討を行ってきた。(A)遺伝子改変マウス(ROCK1, ROCK2欠損マウス)を用いた動物モデルを用いた、各アイソタイプの役割に関する詳細なメカニズムの解明。(B)ヒト肺動脈構築細胞におけるRho-kinase発現とそのシグナル伝達機構(1)ヒト肺動脈血管平滑筋細胞を用いた酸化ストレス増幅系の解明(細胞実験)(2)ヒト肺動脈血管内皮細胞への炎症シグナル伝達機構の解明(細胞実験)今後は、我々の学説を検証・発展させる目的で、以下の検討を行う。肺高血圧患者肺組織と健常者肺組織の病理学的比較(1)ROCK1, ROCK2の肺高血圧患者肺組織での病理学的意義の解明(分子生物学的手法、免疫学的手法)。(2)ヒト肺組織を用いた組織培養Rho-kinase活性測定試験では、患者肺からの様々な炎症性サイトカイン分泌を制御していることが確認された。(3)新規Rho-kinase選択的阻害剤の作用機序、特に、内皮機能における役割や血管平滑筋での作用機序の解明をモノクロタリン誘導性肺高血圧ラットモデルで検討する。(4)患者由来血清サイクロフィリンA濃度の網羅的測定(Rho-kinase活性化で細胞外に分泌されるサイクロフィリンAに着目し、そのバイオマーカーとしての意義を確認する。)29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
輸入米の食味改良と調理特性に関する研究

本研究は、アミロース含量が多い品種や輸入米を試料とし、食味上位米として1類に分類されている品種(コシヒカリ)を対照としてたんぱく分解酵素や温水による米澱粉中のアミロースを除去する等の炊飯方法を改変することにより、評価の低い米の食味の向上を得ることを目的としたものである。海外(中国、タイ、オーストラリア、アメリカ合衆国)より玄米を購入し、歩留り90%の精白米に仕上げた後、それぞれの実験に供した。各米の吸水率では、コシヒカリに比べて国産米ではムツホマレが、輸入米では中国米・タイ米がやや低かった。各米のアミロース含量ではコシヒカリに比べて中国米・タイ米がやや高かった。炊飯特性の結果、加熱吸水率が大のものはコシリカリ・中国米・アメリカ米、膨張容積が大のものはコシヒカリ・中国米・タイ米であった。ヨード呈色度は中国米・タイ米・オーストラリア米が大であったが、アミロース含量とは必ずしも一致しなかった。各米飯の物性試験や食味の官能検査の結果、コシヒカリに比べて、中国米・タイ米が粘りが少なく、好まれない結果であった。そこで米中のアミロース抽出について検討を重ねた結果、吸水後の米を6070°Cの温水で抽出する方法、一度蒸した後、温水で抽出する方法、40°Cより60°Cの温水で段階的に抽出する方法を行い、その後炊飯操作し、物性試験や官能検査を実施した結果、温水で段階的に抽出する方法が適し、さらに各米の温水処理前にプロテアーゼ(パパイン酵素)処理を施すには米に対して0.3%(3×10^5PUN)濃度が良い結果を得、米飯の光沢や粘りに改良が見られた。特に中国米が良好であった。処理後の米飯についてアミロース含量を調べてみるとやや低下の傾向はみられるものの、大きな差はなかった。これは米飯の表面付近のアミロースに影響を与えるが、内部は影響が少ないものと思われる。
無細胞ディスプレイ技術による次世代低分子抗体医薬の開発

本研究では、以前に当研究室で開発された無細胞ディスプレイ技術を応用・発展させることにより、高いエフェクター機能や二重特異性などの新たな機能を付与した次世代低分子抗体医薬を簡便かつ迅速に開発できるシステムを確立することを目指し、以下の成果を得た。(1)従来のmRNAディスプレイ法を用いて、新規のFc受容体結合ペプチドを同定した。(2)無細胞翻訳系としてPUREシステムを用いたmRNAディスプレイ法を確立し、抗GPCRヒト一本鎖抗体の試験管内選択に成功した。(3)共有結合型DNAディスプレイ法を確立し、耐熱性Fab抗体の試験管内進化と二重特異性Diabody抗体の試験管内選択に応用した。まず、FcγRIIaおよびFcγRIIIaの細胞外ドメイン(以下ecFcγRIIaおよびecFcγRIIIa)にストレプトアビジンビーズに固定するためのビオチン様タグを融合したベイトタンパク質をCHO-S細胞を用いて発現・精製し、ELISAにより、どちらもIgGとの結合活性を有することを確認した。次に、16アミノ酸残基のランダムペプチドライブラリー、および、Fc受容体と相互作用することが知られている既知のアミノ酸を保存した部分ランダムライブラリーを設計し、ビーズに固定したecFcγRIIaおよびecFcγRIIIaに対して、mRNAディスプレイ法による5ラウンドのセレクションを行った。その結果、当初はビーズ表面のストレプトアビジンに結合する配列が優先的に得られたが、そのような偽陽性配列を排除するセレクションの条件を検討した結果、最終的にFc受容体結合ペプチドの候補配列を複数得ることができた。一方、二重特異性抗体の試験管内進化では、タンデムscFvやDiabodyの効率的な試験管内選択に向けて、まず、mRNAディスプレイ法およびDNAディスプレイ法の改良を行った。これまでタンパク質のmRNAディスプレイでは小麦胚芽由来の無細胞翻訳系を利用していたが、よりRNaseが少なく、抗体の合成に適したPUREシステムをmRNAディスプレイ法に適用した。これまでPUREシステムは短いペプチドのmRNAディスプレイには適用可能であったが、それよりも大きなタンパク質では、mRNAとタンパク質の連結効率が著しく低かった。今回その原因を特定し、scFvの連結効率を向上することに成功した。また、従来のFabのDNAディスプレイでは非共有結合を介してタンパク質とDNAを連結してきたが、本研究では、共有結合を利用して連結する方法についても検討し、Diabodyと同じ二量体のFab抗体の試験管内選択系を確立した。Fc受容体結合ペプチドの試験管内選択では、前年度にFcγRIIaおよびFcγRIIIaの細胞外ドメイン(以下ecFcγRIIaおよびecFcγRIIIa)をベイトタンパク質として、16アミノ酸残基のランダムペプチドライブラリーの中から、mRNAディスプレイ法による5ラウンドのセレクションにより得られたFc受容体結合ペプチドの候補配列について検証を行った。まず、得られた候補ペプチドをEGFPに融合したタンパク質を大腸菌で大量発現し、Hisタグを利用して精製した。その後、表面プラズモン共鳴法(SPR)により親和性を評価したところ、新規のecFcγRIIa結合ペプチドを同定することができた。また、その結合の解離定数は3.9 μMであった。二重特異性抗体の試験管内進化では、まず、モデルとなる2種類の抗原に対する抗体遺伝子を組み合わせたDiabody型およびタンデムscFv型のフォーマットの二重特異性抗体を作製し、それらの機能を確認したところ、Diabody型では結合能が維持されていたが、タンデムscFv型では結合が確認できなかった。そこで、前年度に確立した共有結合型DNAディスプレイ法を用いてDiabodyの試験管内進化を行うこととし、実際に、モデル抗原を用いたDiabody遺伝子の試験管内選択の条件検討を行い、目的遺伝子が濃縮される条件を決定した。そこで、次に、既に論文・特許で公開されている配列情報を元に自己免疫疾患の標的である2種類のサイトカインおよびそれらに対する抗体の遺伝子DNAを合成し、ベイトとなるサイトカインの大量調製およびDiabody型遺伝子の構築を行なった。まず、PURE mRNAディスプレイ法(J. Biochem.印刷中)の応用として、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)に対するアゴニスト抗体の試験管内選択をおこなった。具体的には、開始コドン周辺のmRNAを不安定化する変異を導入することで翻訳量および連結分子形成効率を向上させたヒト一本鎖抗体ライブラリーおよびヒトドメイン抗体ライブラリーを作製し、GPCRの細胞外ループのアゴニストが結合する部分のペプチドをベイトとして4ラウンドの試験管内選択をおこない、陽性クローンを取得した。これらの低分子抗体の解離定数は10 nM程度を示した。大腸菌で大量発現・精製した低分子抗体を用いた免疫染色により当該GPCR発現ヒト培養細胞に特異的に結合することを確認できた。一方、共有結合型Bicistronic DNAディスプレイ法の応用として、耐熱性二量体抗体の試験管内進化をおこなった。二量体を形成する2つの遺伝子をコードするDNAにランダム変異を導入したライブラリーから、68°C10分の熱処理を選択圧として4ラウンドの試験管内進化をおこない、70°Cの熱処理後も抗原への結合活性を有する変異体を取得した。さらに、この変異体遺伝子にさらなるランダム変異を導入し、77°C10分の熱処理を選択圧として3ラウンドの試験管内進化をおこない、80°Cの熱処理後も抗原への結合活性を有する変異体を取得した。

本研究では、以前に当研究室で開発された無細胞ディスプレイ技術を応用・発展させることにより、高いエフェクター機能や二重特異性などの新たな機能を付与した次世代低分子抗体医薬を簡便かつ迅速に開発できるシステムを確立することを目指し、以下の成果を得た。(1)従来のmRNAディスプレイ法を用いて、新規のFc受容体結合ペプチドを同定した。(2)無細胞翻訳系としてPUREシステムを用いたmRNAディスプレイ法を確立し、抗GPCRヒト一本鎖抗体の試験管内選択に成功した。(3)共有結合型DNAディスプレイ法を確立し、耐熱性Fab抗体の試験管内進化と二重特異性Diabody抗体の試験管内選択に応用した。研究実施計画の目標を概ね達成することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。工学まず、二重特異性抗体の試験管内進化では、前年度までに確立した共有結合型DNAディスプレイ法を用いて、実際に自己免疫疾患の標的である2種類のサイトカインに対するDiabodyの試験管内進化を行う。ベイトタンパク質の発現では、前年度までに、大腸菌、動物細胞および植物細胞を用いて検討したが、選択実験に十分な発現量が得られなかったことから、今後は、ブレビバチルスを用いた発現系の検討を行う。その後、前年度に構築したDiabody遺伝子にランダム変異を導入したライブラリーを作製し、DNAディスプレイ法による試験管内進化を行う。このとき、標的とする2種類のサイトカインを個別に固定した2種類のビーズを段階的に用いて、両者に結合する抗体を選択する。得られた二重特異性抗体について、大腸菌またはCHO細胞などの培養細胞における大量発現を行い、HisタグやFLAGなどのアフィニティー・タグを利用して精製する。その後、ELISA、ウェスタンブロッティング、表面プラズモン共鳴法などの手法を用いて、抗体の親和性・特異性・安定性などの特性評価を行う。また、PURE mRNAディスプレイ法および共有結合型Bicistronic DNAディスプレイ法の応用として、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)に対するアゴニスト抗体および超耐熱性抗体の試験管内選択についても検討する。初年度の研究実施計画の目標を概ね達成することができた。Fc受容体結合ペプチドの試験管内選択では、前年度に得られた候補ペプチドをEGFPに融合したタンパク質を大腸菌で大量発現し、Hisタグなどのアフィニティー・タグを利用して精製する。その後、表面プラズモン共鳴法などの手法を用いて、Fc受容体に対する親和性を評価する。二重特異性抗体の試験管内進化では、前年度に確立した共有結合型DNAディスプレイ法を用いて実際にDiabodyの試験管内進化を行う。まず、既に論文・特許で公開されている配列情報を元に自己免疫疾患の標的であるサイトカインまたはその受容体に対する抗体の遺伝子DNAを合成する。
キトサンおよびゲニステイン投与が引き起こすCa・骨代謝変化の分子生物学的検討

保健機能成分である食物繊維キトサン(CH)と大豆由来のエストロゲン作用を示すゲニステイン(Gen)について、骨吸収が亢進する閉経後女性のCa代謝並びに骨量に与える影響とその作用機序を明らかにする目的で、卵巣摘出(OVX)ラットを用いて投与実験を行なった。1.CHの骨量低下作用:CHを低Ca食に添加してOVXラットを40日間飼育したところ、大腿骨と椎骨の骨密度が対照群に比べて有意に減少した。CHによる骨密度低下は出納試験の成績から、食餌Caの腸管吸収を阻害するためではなく、尿中へのCa排泄を高めることが誘因になる可能性が示めされたので、Caと骨の代謝に関係する諸因子の漸定を試みた。その結果、CH摂取は骨吸収を高める活性型ビタミンD(VD)とPTHの著明な分泌亢進、小腸のVD受容体とCa結合タンパク質mRNAの有意な増加、骨吸収マーカーの尿中デオキシピリジノリン排泄増等を引き起こし、Caの小腸からの吸収能を増大させる一方で骨組織からCaの血中動員を著しく高めることが示唆された。CHによる骨量減少の発現機序は、カチオンであるCHがリン酸の腸管吸収を著しく阻害する結果、体内可溶性リン濃度が低下して活性型VDの生成が高まり、骨吸収も亢進してリンに比べ相対的に過剰になるCaの尿中排泄が増加し、遂には骨密度を減少させると推測された。実際、低リン食投与によりOVXラットの尿中Ca排泄は有意に増加した。2.Genの骨量減少抑制作用:OVXラットにGenを4週間にわたり5mg/日投与したところOVXに伴う大腿骨の骨量減少を有意に抑制したが、椎骨に対しては効果を示さなかった。Genの椎骨への作用不足を補う手段として単純歩行(W)と背中に鉛板を背負って短時間の歩行を繰り返すレジスタン子(R)運動の効果を比較したところ、R運動はOVX後の大腿骨と椎骨の骨量を有意に高めたが、W運動は椎骨には作用を示さなかった。Gen投与とR運動の併用時の骨量減少抑制は、相互に干渉しあうことなく独立して効果を発揮することが確認された。大豆ゲニステイン(Gen)と甲殻類由来の食物繊維キトサンについて、閉経女性のカルシウム(Ca)及び骨代謝に与える特異的作用の実態とその機序を明らかにする目的で、卵巣摘出(OVX)雌ラットを用いた投与実験を行った。また、単独では限定的なGenの骨量減少抑制作用を補完するのに適した運動様式を探るたの実験も行った。今期に得られた実験結果の概要は以下の通りである。1.Genの骨量減少抑制効果:低Ca(0,1%)または標準Ca食(0.5%)で飼育したラットにOVX4週後から4週間にわたりGenを5mg/日投与したところ、OVXに伴う大腿骨の骨密度低下を有意に抑制したが、椎骨の骨量減少に対しては効果を示さなかった。Genの効果は、骨代謝マーカーの推移から骨吸収を抑制することにより発現することが裏付けられた。2.持久(E)運動とレジスタンス(R)運動の骨量減少抑制効果:OVXラットに40分間走行させるE運動、ないしは後背部に鉛板を装着して1分間ずつ走行と休息を繰り返すR運動を週5回、4週間負荷した。非運動