hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微気象観測と生理学的実験手法を用いた、南極陸上生物の生理生態の解明

最終年度においては野外の観測データと生理学実験データを併せた解析を行い、生育地が近接しているにも関わらず上記3生物の南極での活動時期が大きく異なっている可能性と、光障害の波長依存性の違いが極域での光合成生物の生態学的な振る舞いに大きく影響を与えている可能性を明らかにした。年度内に完成に至らなかったが、上記の結果を元に論文執筆を進めている。今後も3生物の生育微気象環境のモニタリングデータの蓄積と環境変動の観測が期待され、研究目的としていた環境変動が各生物に与える影響を解析していくための基盤を築くことができた。植物生理生態本研究での大きな柱の一つであった生育環境の通年微気象観測は成功したと言える。もう一つの柱である生理学的解析は、これまでにタンパク質合成阻害剤を用いて光阻害が起こる過程についての測定を行った。光阻害は進行の速度と回復速度のバランスで進行速度が決定されるため回復系の活性測定を行う必要があるが、まだ測定が終了していない状態である。また、これまでの光合成活性の測定はPAMクロロフィル蛍光測定法を用いてきたが、光合成の純生産量を求めるために炭酸固定量と呼吸量の測定が終了していない状態である。この測定にはクロロフィル蛍光測定に比べて多量の試料が必要であり、希少な南極の試料でどのように測定を進めるか検討を行っていた。クロロフィル蛍光の測定結果と併せることで最小限の測定を行うこととし、早急に実験を行う予定である。本研究で最も重要であった南極での微気象観測のための機器設置作業を順調に行うことができ、夏期のデータを取得することができた。また生育環境での実際の光合成活性の測定も予定通りに行う事ができ、生理学実験に用いるための試料採集も十分に行う事ができた。今後の微気象観測データの回収は平成26年1月以降になる予定であったが、越冬期間中に一度データを回収して頂けることになったため、申請時に予定していたよりも早くシミュレーションを用いた解析に取り掛かれると考えている。生理学実験に関しては、地衣、蘚類、緑藻の乾燥時における光阻害の波長依存特性の違いを明らかにすることができ、光阻害という生理学的性質の面から生態の違いに迫るという目的に沿って順調な結果が得られている。研究対象の一つにしていたシアノバクテリアは、冷凍保存されていた試料の活性が正常に戻らなかったため今回南極観測に同行した際に改めて採集を行った。平成24年度は日本に生育している同種のシアノバクテリアを用いて細胞外多糖の除去法を検討し、次年度の生理学的解析に向けた準備を行った。研究対象とした生物のうち光阻害を起こしやすいことが分かった緑藻のP. crispaで、生育環境下での光障害の程度と光障害が及ぼす生育範囲への影響についてモデルの構築と、野外データを用いてのシミュレーションを試みる。モデルの構築に際して、既に得られている阻害過程の数式モデルに回復過程の影響を組み込むため、生理学実験により温度と光強度に対する光障害からの回復速度を測定する。回復速度は主にPS II反応中心の量子収率の回復から求めるが、非光化学的消光(NPQ)による量子収率の低下を差し引くためにタンパク質合成阻害剤で処理した場合としない場合の差を求める。地衣類と蘚類に関してはタンパク質合成阻害剤処理下においても光阻害はほぼ見られなかったため、本研究課題では光障害の影響を考えず温度と光強度に対する光合成速度と呼吸速度の測定から生育環境下での活動期間と光合成の純生産量を推定する。
グローバル・エコノミーと民族の問題-多民族国家ハプスブルク帝国の解体に至る経験

(1)本研究は、グローバルエコノミーと民族の問題の関係を論ずる視点から、さしあたってハプスブルク帝国解体の歴史的経験を考察するものである。この点中欧の復活がうたわれている今日、帝国の民族問題の解決に真摯に取り組んだ、オットー・バウアーらオーストリア社会民主党の理論家たちの構想の重要性が本研究を通して改めて確認された。(2)本課題を果たすために、洋書、和書の購入、北海道大学、東京大学等の付属図書館並びに学部図書さらに国家図書館を中心に、不十分とはいえ文献資料の収集に努めた。(3)中京大学の丸山敬一教授をはじめ、民族問題の専門的研究者と情報交換と交流を深めた。また、平成6年3月末の民族問題の研究交流会では、本研究の成果として「オットー・バウアーの民族理論」の研究発表を予定している。(4)本研究の成果として、平成6年10月に刊行予定の拙著『民族問題の理論と思想』(平成5年刊行を目指したが計画の変更上平成6年に延期したもの)の草稿を作成した。この著書の出版に、今回の科学研究費補助金の助成は、まことに役立ったと言える。
病院の看護をつくる実践知の記述的研究

本研究は、総合病院における看護の実践知を、現象学及びエスノメソドロジーの方法を用いて記述的に探究することを目的とした。調査場所は、急性期病棟、看護部、救命救急センター病棟であった。調査はフィールドワーク及び継続的な個別インタビューによって実施した。データは、看護師たちの視点から、協働実践がいかに成り立っているのかを分析した。分析結果より、患者の痛みの理解、緩和ケア、音の経験、時間経験、急変の編成、新人看護師の実践、管理の実践等々は、事象を生み出す文脈の中で、複数人の看護師の協働として成り立っていた。こうした協働実践によって、一人ひとりの看護師による患者のケアが実現していた。H23年度に引き続き、H24年度は総合病院において2週間のフィールドワーク、及び縦断的に個別インタビューを行った。フィールドワークは、看護管理部門及び呼吸器循環器内科病棟において行った。看護管理部門では、看護部長、及び3名の副看護部長に同伴しつつ管理の実践を観察した。観察時に気になったこと等々について、非構造化インタビューを行った。看護部主催の師長会やその他の委員会へは、了解を得てこれに参加し、審議場面を録画した。病棟では、主に病棟管理者(師長、係長)とチームリーダの実践に同伴しつつ、病棟を管理する実践について参加観察を行い、気になったこと等々については、個別インタビューを行った。ナースステーション内の状況は、朝の申し送りから昼のカンファレンスまでを録画した。縦断的に行っている個別インタビューには、病棟管理者に参加をしてもらい、1年間の病棟の変化やその都度の出来事などを聞き取った。調査によって得られた音声データ及びVTRにて撮影した映像から逐語記録を作成し、フィールドノーツと併せて、協働実践がいかに編成されているのかを分析した。分析結果は、第38回日本保健医療社会学会大会、18th Qualitative Health Research Conference等で口頭発表した。また、『看護研究』『現象学年報』『メルロ=ポンティ研究』等に論文を発表した。今後は、病院の入り口でもある救急病棟での調査を予定している。本年度に、病棟管理者との打ち合わせ及び事前調査を行い、具体的な調査方法について検討した。H25年度は、H23年度、H24年度に引き続き、総合病院において2週間のフィールドワーク、及び複数回の個別インタビューを行った。フィールドワークは、病院の全ての病棟が注意を向ける救命救急センター病棟、及び救命救急センター外来において実施した。調査参加者は、了解の得られた師長1名、係長1名、看護師約30名であった。具体的には、看護師の実践への伴走、ビデオカメラによる看護管理室の録画、ICレコーダーによる看護管理室の会話の録音、看護師個々人への非公式の非構造化インタビューを行った。公式の個別インタビューは、副看護部長、急性期病棟の係長などに行った。調査によって得られた情報は、その全てを逐語記録に起こし、フィールドノーツと併せて、看護師たちの協働実践の成り立ちを分析した。分析結果は、師長の方針と病棟の協働実践、新人看護師が病棟の看護師になること、協働実践としての緩和ケアと痛みの研究等々として、第39回日本保健医療社会学会、第45回日本医学教育学会大会、2013 IIEMCA Conference、第23回日本保健科学学会、19th Qualitative Health Research Conferenceにおいて口頭発表した。また、『現代思想』等にて論文を発表した。H23年度からの一連の研究において、総合病院の看護は、救命救急センター病棟のベッドの空き具合に関心を向けつつ、看護部、病棟の管理の実践をその支えとして、一人ひとりの患者へのケアが成り立つという、重層的な構造が明らかになった。研究代表者が所属する施設内の研究倫理委員会の承認を得て、東海近県の約500床の総合病院に研究協力を依頼して、調査を開始した。調査への参加者は、病院の副院長/看護部長、副看護部長、師長、係長、及び急性期病棟の看護師約20名であった。調査場所は、主に、看護部管理室と1つの急性期(呼吸器・循環器内科)病棟であり、約2週間にわたって、調査者2人が看護師に伴走をしつつフィールドワークを行い、出来事の詳細をフィールドノーツに記録した。調査期間中には、看護部が主催する師長会や各種委員会、病棟のカンファレンスなどに参加をして、音声データと映像を記録した。フィールドワーク中に気になったことは、調査期間中、及び不定期に病院を訪問して、個別インタビューによって聞き取った。得られた音声データ、及び映像は、逐語記録におこして整理した。逐語記録及びフィールドノーツをもとにして、各部局において協働実践がいかに編成されているのか、そこにはいかなる知が組み込まれているのかを、現象学、及びエスノメソドロジーの考え方を手がかりにして複数の視点から分析している最中である。

研究成果は、1つの学会誌(科学研究費補助金基盤研究(C)、課題番号19592441の発展研究として成果を報告)、2つの学会、及び複数の学会や研究会のシンポジウム等において、"準備性""音の経験""時間の編成""時間の区切り""師長の実践"などの視点から、協働実践の編成のされ方について報告した。多分野の研究者と議論を交わし、多くの示唆を得ることができた。本研究は、病院という組織において看護がいかに形作られているのかを、事象をその内側から探究する現象学、及び人々の方法論を探求するエスノメソドロジーをもとに記述的に探究することを目的としている。これまでの調査では、総合病院の看護を幾つかの側面ー病棟での実践、看護部という管理部門の実践、及びこれらの間でいかに情報が交換、あるいは伝達されて協働実践が編成され、患者へのケアに結びついているのかを、フィールドワーク、及び個別インタビューを通して探求してきた。上述の調査から得られたデータの分析をもとに、これまで「患者へのケアが行われる看護場面」、「患者へのケアに向かう看護チームの協働実践」、「新人看護師の実践を成り立たせる協働実践」、「チームリーダによる実践の編成」、「急変を先取りした協働実践」、「緩和ケアの協働実践」、「病棟管理者である師長の実践」等々を記述し、学会や雑誌で報告した。現在、看護管理部門における管理実践の分析を進めており、さらに、患者にとって入り口となる救急病棟の調査の仕方を調整している。これらの調査とそれを分析した記述によって、病院の看護が、その入り口から出口までの流れにおいていかに形作られているのかを示すことができ、本研究の目標を達成できる。今年度の研究では、看護部管理部門と1つの病棟をそれぞれ調査しつつ、両者の関係をみていくことを予定していたが、看護部管理部門への各病棟からの報告を聞いたり、副看護部長とともに全病棟をラウンドすることを通して、病医全体の患者の状態や看護実践の状況を把握する方法を体験することができた。それによって、本研究で目指している「病院の看護」の編成のされ方を分析する手がかりを得ることができた。また、それらを知りつつ病棟の調査を行うことによって、看護部からの伝達事項がいかに活かされたり浸透したりするのかを把握することができた。複数の学会や研究会でこれらの成果を発表する機会を得て、多分野の研究者や実践家と議論をすることができ、分析のヒントを得ることができた。さらに、国際学会での議論を通して、他国の実践のあり方との比較をすることができた。加えて、学会発表等の議論をもとに、論文を投稿する準備を進めることができた。H25年度は、引き続き総合病院において約2週間のフィールドワーク、及び継続的に個別インタビューを実施する予定である。フィールドワーク(参加観察、個別インタビュー、VTRでの映像の録画)は、主に救急病棟において実施する予定である。さらに、病院の看護管理者(看護部長、副看護部長)、病棟管理者(師長、係長)への個別インタビューを、継続して実施していく。分析結果については、国内外の関連学会や書籍等において発表する予定である。
線虫における神経回路形成の分子機構

(A)UNC-51のキナーゼ(リン酸化)活性のin vitroにおける証明と解析1. unc-51cDNAの全長、全長のcDNAでキナーゼドメインにK→M変異をもつもの、キナーゼドメイン、C末側ドメインのそれぞれのC末側にMyc tagを付しpUcD2SR αMCSベクターに挿入した。これらをCOS7細胞に導入し、融合タンパクの一時的発現を粗抽出液と抗Myc抗体で調べた。2.細胞の粗抽出液を抗Myc抗体結合ビーズによって処理し、後者に結合した分画を用いて、in vitroでキナーゼ活性を調べた。この結果、全長のUNC-51及びそのキナーゼ領域のcDNAを導入した場合には、外から加えたヒストンH1及び内在性のいくつかのタンパク質のリン酸化が示された。3.上記の発現系では発現が不充分であると考えて、現在pCAGGSベクターによる発現を試みている。これを用いて、UNC-51の自己リン酸化とその部位を明らかにする予定である。(B) UNC-51とUNC-14の相互作用及びこれらと相互作用する因子の解析1. UNC-51、UNC-14のそれぞれにつき、抗原性があり得る3つの部分ペプチドを合成し、ウサギに免疫して、抗血清及び精製抗体を得た。これらにより、in vivoでのUNC-51とUNC-14の共存と結合を証明したい。2. UNC-51と相互作用すると考えられるタンパク質のcDNAの中でTHB28はEB1ホモログをコードし、このタンパクはtwo hybrid系においてUNC-14とも相互作用することが示されている。またTHB7,THB47はそれぞれ哺乳動物のMSK及びJNK kinaseのホモログをコードしている。UNC-51の基質も含めて、UNC-51.UNC-14と相互作用する因子を明らかにするため、これらの遺伝子の解析を行っている。(A) UNC-51のキナーゼ(リン酸化)活性のin vitroにおける証明と解析1. unc-51cDNAの全長、全長のcDNAでキナーゼドメインにK→M変異をもつもの、キナーゼドメイン、C末側ドメインのそれぞれのC末側にMyc tagを付しpUcD2SR αMCSベクターに挿入した。
多種感覚情報の認識と統合の神経機構と計算原理

ヒトを含む高等動物は多種類の感覚器をもち,これらから得た情報を数百ミリ秒のうちに統合し外界の状況を認識し行動を起こすことができる.本研究は,この感覚情報統合に関する生理学実験データの神経回路モデルによる解析とサルの脳内神経活動の電気生理学計測によって,上記の神経情報処理機構について下記の結果を得た.まず,視覚課題遂行中のサル側頭葉細胞活動について,(1)細胞応答を側頭葉腹側路の解剖学生理学データに基づく神経回路モデルで再現した.すなわちモデルの上側頭溝の細胞応答はサルのそれと同様に反応開始後5ミリ秒で異なる刺激に対して有意な差を示した.(2)この上側頭溝細胞の高速識別能力は細胞の発火潜時の差による競争機構で実現されており,この競争は学習によって皮質回路内に形成された強化経路に沿って働くことをモデル上で示した.これらから,大脳皮質における数百ミリ秒の高速情報処理は学習強化された経路に沿った細胞の発火潜時の差による競争機構で実現されているとする仮説の妥当性が示された.次に,くま手で餌を取る課題実行中のサルから頭頂間溝の細胞応答を計測した.手のひらの接触に反応する細胞の視覚受容野は,(1)くま手を使用する前は手の届く範囲までであった.すなわち細胞は手の近くの餌にのみ反応した.(2)5分間くま手で餌を取る課題を実行後,受容野はくま手の届く範囲まで広がった.(3)その後3分間くま手無しで餌を取る課題を実行後,受容野は手の届く範囲に縮小した.これらは手による道具の使用を繰り返したとき道具が手と一体となる感じを生じる神経機構の一部が頭頂間溝にあることを示唆する.さらに,視覚刺激(LED)でボタン推し課題を実行するサルの体性感覚野の細胞応答と瞳孔の大きさを計測した.ボタンを推す前に指をボタンのわずか上で止めることを指示するLEDがつくだけで細胞は活動を始めその強さは瞳孔の大きさ(注意の強度)と相関があった.これは注意によって感覚神経系の感度が上昇することを示唆している.ヒトを含む高等動物は多種類の感覚器をもち,これらから得た情報を数百ミリ秒のうちに統合し外界の状況を認識し行動を起こすことができる.本研究は,この感覚情報統合に関する生理学実験データの神経回路モデルによる解析とサルの脳内神経活動の電気生理学計測によって,上記の神経情報処理機構について下記の結果を得た.まず,視覚課題遂行中のサル側頭葉細胞活動について,(1)細胞応答を側頭葉腹側路の解剖学生理学データに基づく神経回路モデルで再現した.すなわちモデルの上側頭溝の細胞応答はサルのそれと同様に反応開始後5ミリ秒で異なる刺激に対して有意な差を示した.(2)この上側頭溝細胞の高速識別能力は細胞の発火潜時の差による競争機構で実現されており,この競争は学習によって皮質回路内に形成された強化経路に沿って働くことをモデル上で示した.これらから,大脳皮質における数百ミリ秒の高速情報処理は学習強化された経路に沿った細胞の発火潜時の差による競争機構で実現されているとする仮説の妥当性が示された.次に,くま手で餌を取る課題実行中のサルから頭頂間溝の細胞応答を計測した.手のひらの接触に反応する細胞の視覚受容野は,(1)くま手を使用する前は手の届く範囲までであった.すなわち細胞は手の近くの餌にのみ反応した.(2)5分間くま手で餌を取る課題を実行後,受容野はくま手の届く範囲まで広がった.(3)その後3分間くま手無しで餌を取る課題を実行後,受容野は手の届く範囲に縮小した.これらは手による道具の使用を繰り返したとき道具が手と一体となる感じを生じる神経機構の一部が頭頂間溝にあることを示唆する.さらに,視覚刺激(LED)でボタン推し課題を実行するサルの体性感覚野の細胞応答と瞳孔の大きさを計測した.ボタンを推す前に指をボタンのわずか上で止めることを指示するLEDがつくだけで細胞は活動を始めその強さは瞳孔の大きさ(注意の強度)と相関があった.これは注意によって感覚神経系の感度が上昇することを示唆している.脳神経系は視覚情報における色や形,大きさなどの複数の異なる特徴情報を数百ミリ秒で統合し適切な行動を選択し発現できるようになる.我々はこの高速情報処理を可能にする神経機構として細胞の発火潜時の差による競争機構の仮説を提示してきた.本年度はMacLeod and Dunbar(1988)の行った色/形状視覚刺激によるストループ干渉における学習効果の実験データがこの仮説で説明できることを示した:側頭葉の色処理系と形状処理系から投射を受ける発語系のBroca野からなる神経回路モデルを構成し,その計算機シミュレータを構築した.これを用いてMacLeod and Dunbarの実験をシミュレートし実験データとシミュレーション結果を比較検討した.得られた結果は以下の通りである.(1)学習の繰り返しとともに色および形状刺激に対する応答時間が心理物理実験と同様にモデルシミュレーションでも短縮されていった.(2)学習以前は形状から色への干渉はなかったが学習後は干渉が生じるようになるという実験データがモデルシミュレーションでも再現された.(3)色から形状への干渉は学習の前後でともに生じないという実験での逆ストループ干渉がシミュレーションで再現された.(4)これらの応答時間の変化はシミュレーションでは実験データより小さかった.

これらから,大脳皮質における数百ミリ秒の高速情報処理は学習強化された経路に沿った細胞の発火潜時の差による競争機構で実現されているとする仮説の妥当性が示唆された.ヒトを含む高等動物は多種類の感覚器をもち,これらから得た情報を数百ミリ秒のうちに統合し外界の状況を認識し行動を起こすことができる.本研究は,この感覚情報統合に関する生理学実験データの神経回路モデルによる解析とサルの脳内神経活動の電気生理学計測によって,上記の神経情報処理機構について下記の結果を得た.まず,視覚課題遂行中のサル側頭葉細胞活動について,(1)細胞応答を側頭葉腹側路の解剖学生理学データに基づく神経回路モデルで再現した.すなわちモデルの上側頭溝の細胞応答はサルのそれと同様に反応開始後5ミリ秒で異なる刺激に対して有意な差を示した.(2)この上側頭溝細胞の高速識別能力は細胞の発火潜時の差による競争機構で実現されており,この競争は学習によって皮質回路内に形成された強化経路に沿って働くことをモデル上で示した.これらから,大脳皮質における数百ミリ秒の高速情報処理は学習強化された経路に沿った細胞の発火潜時の差による競争機構で実現されているとする仮説の妥当性が示された.次に,くま手で餌を取る課題実行中のサルから頭頂間溝の細胞応答を計測した.手のひらの接触に反応する細胞の視覚受容野は,(1)くま手を使用する前は手の届く範囲までであった.すなわち細胞は手の近くの餌にのみ反応した.(2)5分間くま手で餌を取る課題を実行後、受容野はくま手の届く範囲まで広がった.(3)その後3分間くま手無しで餌を取る課題を実行後,受容野は手の届く範囲に縮小した.これらは手による道具の使用を繰り返したとき道具が手と一体となる感じを生じる神経機構の一部が頭頂間溝にあることを示唆する.さらに,視覚刺激(LED)でボタン推し課題を実行するサルの体性感覚野の細胞応答と瞳孔の大きさを計測した.ボタンを推す前に指をボタンのわずか上で止めることを指示するLEDがつくだけで細胞は活動を始めその強さは瞳孔の大きさ(注意の強度)と相関があった.これは注意によって感覚神経系の感度が上昇することを示唆している.
肺の炎症や老化肺に対するビタミンDの抗炎症・組織保護効果の解明

慢性閉塞性肺疾患(Chronic Obstructive Pulmonary Disease: COPD)は、加齢に伴い進行し高齢者で多発する老年呼吸疾患である。肺の老化とも関連するCOPDでは、ビタミンD血中濃度低下が、肺機能低下や重症度と相関することが分かってきている。しかし、ビタミンDの補充がCOPDの進行を抑制するかは明らかになっておらず、今回、動物モデルを用いて、ビタミンDシグナルの抗炎症・組織保護作用を検証した。申請者は、SP-Cプロモーター下にビタミンD受容体(VDR)を発現させ、肺特異的にビタミンD受容体を過剰発現するマウスを作製した。肺特異的VDR過剰発現トランスジェニックマウスにおける肺組織では、野生型(WT)マウスと比較し、RT-PCR、免疫組織染色にて、MIP-1α、IP10、MCP-1、MIP-2などのTh1サイトカイン抑制が有意に認められた一方、IL-4、IL-10、IL-13などのTh2サイトカインには有意な差は認められなかった。TGマウスにおける肺組織では、RT-PCRや免疫組織染色にて、WTマウスと比較し、MMP1やMMP12などのproteinaseの低下が認められた。さらに、ビタミンD受容体の抗炎症効果を検討する上で、肺胞II型上皮細胞におけるビタミンD受容体をknock downし、Th1サイトカイン(MIP-1α、IP-10、MCP-1、MIP-2)の動態について定量的RT-PCRにより検証したところ、これらは増加していることが認められた。このことから、VDRを介したビタミンDシグナリングは、肺組織における抗炎症効果の観点から、高齢者COPDの肺機能改善に寄与する可能性が期待されると考えれる。また、肺におけるビタミンD受容体の発現量の差異が、肺の慢性炎症に影響するのであれば、肺においてビタミンD受容体の発現量を減少させる因子は、COPDの増悪因子となる可能性がある。まず肺組織におけるVDRを介したビタミンDの機能を検討すべく、肺特異的VDR過剰発現トランスジェニックマウスを作製し、肺組織におけるVDRによる抗炎症効果と組織保護効果について検討した。肺特異的VDR過剰発現トランスジェニックマウスにおける肺組織では、野生型マウスと比較し、RT-PCR、免疫組織染色にて、MIP-1α、IP10、MCP-1、MIP-2などのTh1サイトカイン抑制が有意に認められた一方、IL-4、IL-10、IL-13などのTh2サイトカインには有意な差は認められなかった。また、肺胞上皮細胞におけるタバコ煙によるVDRの発現制御や、VDR発現量と炎症性サイトカインとの関連性についても明らかにすべく、胞基底上皮腺癌細胞(A549)を用いて、タバコ煙水抽出液(CSE: cigarette smoke extra)を負荷し、VDR発現量に関してRT-PCRを施行したところ、濃度依存的にCSE負荷によりVDRの発現量の低下が認められ、MIP-1α、IP10、MMP12の発現量の増加を認めた。また、A549を用いてVDR siRNAによるVDR遺伝子抑制を行ったところ、これらの発現量の増加を認めた。以上より、VDRは肺組織局所において抗炎症効果を示し、喫煙はVDR発現量の抑制を介して炎症を修飾する可能性が示された。肺組織におけるビタミン受容体Dの役割とその特性を解析するため、肺特異的VDR過剰発現トランスジェニックマウスを作製し、VDR発現量と抗炎症効果の関係を示すことができた。また、29年度の予定である細胞実験を行うこともでき、VDR発現量と抗炎症効果、また喫煙とVDR発現との関連を示し、特にVDR発現量の抑制を介して、喫煙が炎症を修飾する可能性も示すことができたため。ビタミンDの摂取不足や血中濃度の低下は、COPDの増悪や肺機能低下と関与していることが報告されているが、肺組織におけるビタミンD受容体(VDR)を介したビタミンDの機能やVDRの発現量の制御については不明な点も多い。肺組織におけるビタミンDの役割とその特性を解析するため、肺特異的VDR過剰発現トランスジェニック(TG)マウスを作製した。肺組織における炎症性サイトカインとして、Th1サイトカイン(MIP-1α、IP10、MCP-1、MIP-2)、Th2サイトカイン( IL-4、IL10、IL13)、MMP1、MMP12、TIMP-1について、RT-PCRおよび免疫組織染色を行い、抗炎症効果および組織保護効果を検証した。さらに、ラットII型肺胞上皮細胞を用いて、タバコ煙水抽出液(CSE)を負荷した際におけるVDRの発現量に関して、RT-PCRを施行した。TGマウスでは、Th1サイトカイン(MIP-1α、IP10、MCP-1、MIP-2)の発現低下が認められ、免疫組織染色でも同様の傾向が認められた。なお、Th2サイトカインには、TGマウスとWTマウスに変化はなかった。さらに、in vitroで、II型肺胞上皮細胞におけるCSE負荷により、VDR発現量の低下が確認された。肺組織では、VDRを介して、Th1サイトカインの抑制による抗炎症効果とMMP産生抑制による肺組織保護効果が認められた。また、CSE負荷によるVDR発現量の負の制御が認められたことから、COPD患者における禁煙治療の重要性が示唆された。

慢性閉塞性肺疾患(Chronic Obstructive Pulmonary Disease: COPD)は、加齢に伴い進行し高齢者で多発する老年呼吸疾患である。肺の老化とも関連するCOPDでは、ビタミンD血中濃度低下が、肺機能低下や重症度と相関することが分かってきている。しかし、ビタミンDの補充がCOPDの進行を抑制するかは明らかになっておらず、今回、動物モデルを用いて、ビタミンDシグナルの抗炎症・組織保護作用を検証した。申請者は、SP-Cプロモーター下にビタミンD受容体(VDR)を発現させ、肺特異的にビタミンD受容体を過剰発現するマウスを作製した。肺特異的VDR過剰発現トランスジェニックマウスにおける肺組織では、野生型(WT)マウスと比較し、RT-PCR、免疫組織染色にて、MIP-1α、IP10、MCP-1、MIP-2などのTh1サイトカイン抑制が有意に認められた一方、IL-4、IL-10、IL-13などのTh2サイトカインには有意な差は認められなかった。TGマウスにおける肺組織では、RT-PCRや免疫組織染色にて、WTマウスと比較し、MMP1やMMP12などのproteinaseの低下が認められた。さらに、ビタミンD受容体の抗炎症効果を検討する上で、肺胞II型上皮細胞におけるビタミンD受容体をknock downし、Th1サイトカイン(MIP-1α、IP-10、MCP-1、MIP-2)の動態について定量的RT-PCRにより検証したところ、これらは増加していることが認められた。このことから、VDRを介したビタミンDシグナリングは、肺組織における抗炎症効果の観点から、高齢者COPDの肺機能改善に寄与する可能性が期待されると考えれる。今後は、A549を用いて、ビタミンD受容体のknock downとして、ビタミンD受容体siRNAを用いて、ネガティブコントロールsiRNAとの比較より、CSE負荷およびCSE非添加における炎症性サイトカインの発現量および細胞死数を比較検討し、ビタミンD受容体による抗炎症効果・細胞保護効果を評価する。さらに肺特異的VDR過剰発現トランスジェニックマウスとその野生型同腹仔をケタミンとキシラジンにて麻酔後、大腸菌由来のリポポリサッカライド(LPS)もしくは、コントロールとしてのPBSを気管内に投与し、急性肺損傷モデルを作製する。投与8時間後と24時間後に、気管支肺胞洗浄液(BAL)中の細胞数、細胞分画と蛋白濃度を評価する。定量的RT-PCR、免疫組織染色により、肺組織におけるTh1サイトカイン、Th2サイトカイン、MMP-1、MMP-12、TIMP-1の発現量を解析し、肺組織の炎症を評価する予定である。また、25 cmH2Oの一定圧を気管内にかけながら伸展固定した肺の組織像を評価する。この組織を利用して、上記抗体の組織免疫染色を行う予定である。これらの評価により、急性炎症としてのビタミンD受容体による組織保護、抗炎症効果を検討する。肺特異的VDR過剰発現TGマウスの生存曲線の解析や、BALFの施行、肺組織については、あらゆる染色も検証してく予定である。実験内容が多くなり、人件費を中心とした支出となりました。次年度での調整を図る予定です。
抗てんかん薬カルバマゼピンが骨代謝に与える影響

抗てんかん薬カルバマゼピンの慢性投与が骨代謝に与える影響について、骨密度を指標として検討した。その結果、カルバマゼピンの慢性投与により、脛骨海面骨領域において、有意な骨密度の増加を引き起こすことが明らかになった。このことは難治性てんかん治療において、骨代謝改善薬を併用することなく抗てんかん薬のみで骨量減少を抑制できる可能性について検討するための有用な情報となるものである。すでに抗てんかん薬フェニトイン、ゾニサミドあるいはバルプロ酸ナトリウム慢性投与で引き起こされる薬物誘発性骨減少症モデルラットの実験系を用いて、抗てんかん薬カルバマゼピン(以下CBZ)の慢性投与が骨代謝に与える影響について、骨密度を指標として検討した。4週齢雄性wistar strain ratを用い、それぞれvehicle(0.5%tween80), CBZ25mg/kg, CBZ50mg/kg, CBZ100mg/kg, CBZ200mg/kg, CBZ400mg/kgと設定し一日一回、背部皮下注にて投与し、期間は35日間とした。飼育終了後、過剰麻粋により致死させた後、脛骨を摘出し、軟X線写真撮影を行い、その解析により骨密度の算出を行った。その結果、CBZの慢性投与により、脛骨海面骨的領域において、対照と比較して有意の骨密度の増加を認めた。増加率はCBZ25mg/kgで19%、CBZ50mg/kgで29%、CBZ100mg/kgで23%、CBZ200mg/kgで16%であり、CBZ投与による骨密度の増加はCBZ50mg/kgでピークとなったのち、以後は用量依存的に減少した。本実験系ですでに検討した抗てんかん薬フェニトイン、ゾニサミド、バルプロ酸ナトリウムは骨密度の減少を来たしたがCBZにおいては増加することが明らかになった。この事実は、薬物誘発性骨減少症を考察する上で極めて有用な情報となり、どのような薬物が骨量を減少させ、また、今回検討したCBZの、どの構造あるいは作用機序が骨量を増加させるのかを明らかにすることで新たな骨代謝改善薬としての可能性を持つものである。また、カルバマゼピン400mg/kgの群において、飼育開始後の体重増加が著しく抑制されたため、飼育開始後7日をもって当該群のエンドポイントとした。昨年度の検討により、抗てんかん薬カルバマゼピンの慢性投与は骨減少症を引き起こすのではなく骨量増加作用を有することが明らかになったことから、今年度は、すでにその慢性投与により骨減少症を引き起こすことが明らかになっている抗てんかん薬フェニトインとカルバマゼピンとの併用投与で、フェニトインのもつ骨減少作用を抑制できるのか否かについて検討を行った。フェニトインは20mg/kg、カルバマゼピンは25mg/kgならびに50mg/kgの用量で投与した。投与量は昨年度の検討より骨量増加作用を有し、かつ成長曲線に影響のない用量をもって決定した。これらの薬物は0.5%tween80溶液に用事にsuspendして用い、投与は一日一回背部皮下注射にて行い、餌と水は自由摂取とした。投与期間は離乳直後の4週齢(体重75g程度)から5週間にわたり行い成長期終了後である9週齢(体重220230g程度)をもって飼育終了とした。成長期終了後に過剰麻酔下で致死させた後、脛骨を摘出し近位骨梁骨における骨密度の評価を行った。その結果、フェニトインの作用による骨密度の減少は7%程度認められたが、カルバマゼピンを併用することでフェニトイン誘発性骨減少症の発症は抑制される傾向を示した。また、各群における成長曲線に有意な違いを認めなかった。これら知見は多剤併用投与が珍しくない難治性てんかん治療において、骨代謝改善薬を併用することなく抗てんかん薬のみで骨量減少を抑制できる可能性について検討するための有用な情報となるものである。
癌細胞のＯ-グリカン修飾変化によるCTL腫瘍免疫逃避機構の解明

われわれの体には、がん細胞の増殖、転移を抑えるための免疫(腫瘍免疫)が備わっている。ところが、がん細胞の集団の中には、この腫瘍免疫を逃避して増殖するがん細胞が存在し、そのようながん細胞が最終的にわれわれを死に至らしめる。本研究は、リンパ節に転移した膀胱癌に焦点を絞り、転移膀胱癌がどのようにして腫瘍免疫から逃避しているのか、その逃避機構明らかにすることを目的とした。研究の結果、膀胱癌細胞は、細胞表面のタンパク質に付いている糖を変化させることで、免疫細胞の攻撃から逃避していることが明らかにされた。(1)O-グリカン修飾の変化によるHLA-A分子の細胞表面表出量の比較C2GnT高発現膀胱癌細胞YTSにHLA-A24(日本人に最も多いタイプ)のcDNAを導入し、HLA-A24安定発現細胞株YTS(A24YTS)、および、C2GnT発現をノックダウンした細胞A24C2KDを作製した。両細胞のHLA-A24の細胞表面表出量を、抗HLA-A24を用いた生細胞の染色とFACS解析によって比較した結果、A24C2KDの方がHLA-A24細胞表面表出量が低いことがわかった。さらに、生細胞をビオチンでラベルしたのちにアビジン・アガロースを用いた免疫沈降を行い、細胞表面に表出したHLA-A24の量をウェスタン・ブロッティングにより比較した結果もA24C2KDの方が低いことがわかった。(2)O-グリカン修飾の変化によるHLA-A分子の細胞内輸送過程の解析A24YTSとA24C2KDで、HLA-A24分子の細胞表面への表出速度を阻害剤ブレフェルディンA(BFA)を用いて解析した結果、差がないことがわかった。次に、HLA-A24分子のエンドサイトーシス速度を阻害剤Pitstop 2-200を用いて解析した結果、A24C2KDの方がHLA-A24のエンドサイトーシス速度が高いことがわかった。研究計画に記載された平成27年度計画の実験2つを行い、それぞれ、結果を得ることができた。これは、全期間に計画した実験5つのうち2つを完遂することができたこと意味する。このため、おおむね順調に進展していると評価できる。交付期間を通じて以下の(1)(5)の研究を計画した。(1)O-グリカン修飾の変化によるHLA-A24分子の細胞表面表出量の比較(2)O-グリカン修飾の変化によるHLA-A24分子の細胞内輸送過程の解析(3)O-グリカン修飾の変化によるHLA-A24分子と抗原ペプチドとの親和性比較(4)C2GnT発現抑制膀胱癌細胞によるCTL腫瘍免疫抵抗性のin vivoにおける検討(5)HLA-A24分子のO-グリカンの構造解析。このうち、平成28年度以降の研究として(3)(5)を計画していた。この中の(3)、および、(4)についての進捗状況を述べる。(3)HLA-A24のC末端(細胞内領域)にFLAGのタグを付け、コア2O-グリカンで修飾されたHLA-A-FLAG-C2とコア2O-グリカン修飾が低下したHLA-A24-FLAGをそれぞれ調製した。各HLA-A24のMAGE3由来癌抗原ペプチドに対する親和性をBIACOREを用いて精密に比較した結果、コア2O-グリカン修飾によって、HLA-A24とペプチドとの親和性は変化しないことが示された。この結果により、コア2O-グリカン修飾は、HLA-A24の細胞表面への表出量に影響を与えるという機構が強く支持された。(4)YTS、および、YTS-C2KDを、特異的CTLとともにNOGマウス(免疫不全マウスT、B、NK細胞全てを欠く)の尾静脈から注入し、3週間の肺転移を比較した。その結果、YTSよりもYTS-C2KDの方が高い肺転移性を示した。このことから、C2GnTは、膀胱癌細胞に、CTLの攻撃から逃避する能力を与えていることが強く示唆された。このうち、平成28年度以降の研究計画として掲げた(3)(5)の、(3)、(4)の2つの実験を行った。平成27年度の結果を合わせて、(1)(4)の4つの実験を行い、ほぼ予想通りの結果が得られた。このことから、おおむね順調に進捗していると評価できる。次の(1)から(5)の研究が計画されていた。(1)O-グリカン修飾の変化によるHLA-A24分子の細胞表面表出量の比較(2) O-グリカン修飾の変化によるHLA-A24分子の細胞内輸送過程の解析(3) O-グリカン修飾の変化によるHLA-A24分子と抗原ペプチドとの親和性比較

(4) C2GnT発現抑制膀胱癌細胞のin vivoにおける転移能の検討(5) HLA-A24分子のO-グリカンの構造解析。それぞれについて行った実験の結果を述べる。(1)C2GnT発現を抑制するとHLA-A24分子の細胞表面表出量は低下した。(2)C2GnT発現を抑制するとHLA-A24分子は、速やかに細胞内に取り込まれ、エンドソーム経由でリソソームに入り、分解された。(3) HLA-A24のC末端にFLAGのタグを付け、コア2O-グリカンで修飾されたHLA-A-FLAG-C2と修飾されていないHLA-A24-FLAGをそれぞれ調製した。各HLA-A24の抗原ペプチドに対する親和性をBIACOREを用いて比較した結果、コア2O-グリカン修飾は、HLA-A24とペプチドとの親和性に影響しないことが示された。(4)NOGマウスを用いたin vivoの実験の結果、YTSよりもYTS-C2KDの方が高い肺転移性を示した。(5)トマトレクチンを用いた実験の結果から、HLA-A24-FLAG-C2のO-グリカンには、Galβ1-4GlcNAcの繰り返し構造から成るポリラクトサミン鎖が付加していることがわかった。細胞表面では、このポリラクトサミン鎖にガレクチン-3が結合し、別の細胞表面分子との間に分子格子(Molecular Lattice)を形成していた。C2GnT発現が低下した癌細胞では、この分子格子形成が起きていなかった。このため、HLA-A24の細胞表面での表出量が著しく低下していた。われわれの体には、がん細胞の増殖、転移を抑えるための免疫(腫瘍免疫)が備わっている。ところが、がん細胞の集団の中には、この腫瘍免疫を逃避して増殖するがん細胞が存在し、そのようながん細胞が最終的にわれわれを死に至らしめる。本研究は、リンパ節に転移した膀胱癌に焦点を絞り、転移膀胱癌がどのようにして腫瘍免疫から逃避しているのか、その逃避機構明らかにすることを目的とした。研究の結果、膀胱癌細胞は、細胞表面のタンパク質に付いている糖を変化させることで、免疫細胞の攻撃から逃避していることが明らかにされた。研究計画に記載された平成28年度以降の実験(3)(5)のうち、(3)O-グリカン修飾の変化によるHLA-A分子と抗原ペプチドとの親和性比較。および、(4)C2GnT発現抑制膀胱癌細胞によるCTL腫瘍免疫抵抗性のin vivoにおける検討。の2つの実験を行い、O-グリカン修飾変化によるCTL腫瘍免疫逃避機構解明に迫りたい。交付期間を通じて以下の(1)(5)の研究を計画した。(1)O-グリカン修飾の変化によるHLA-A24分子の細胞表面表出量の比較(2)O-グリカン修飾の変化によるHLA-A24分子の細胞内輸送過程の解析(3)O-グリカン修飾の変化によるHLA-A24分子と抗原ペプチドとの親和性比較(4)C2GnT発現抑制膀胱癌細胞によるCTL腫瘍免疫抵抗性のin vivoにおける検討(5)HLA-A24分子のO-グリカンの構造解析。このうち、現在のところまだ結果の得られていない(5)を行う。さらに、既に得られた(1)(4)の実験結果を見直し、補強する実験があれば行う。さらに、平成29年度に購入する顕微鏡用デジタルカメラを用いて、研究計画(2)の実験の内、未着手の実験を行い、結果を得る。すべての研究計画を完遂させた後に論文発表を行う。
半導体光触媒による人工光合成の研究-二酸化炭素からギ酸の生成-

二酸化炭素を還元できる酸化タンタルに注目して、研究を行った。可視光応答の研究の過程で、タンタル板を熱処理するだけで、可視光応答することを発見した。1)そこで、可視光応答の原因を調べた。空気中で熱処理したために、最初は窒素ドープが原因ではないかと考え、いろいろな条件(温度、時間、雰囲気)で熱処理を行った。酸素中で熱処理したものでも、可視光応答することから、原因が窒素ドープではないことがわかった。2)次に、タンタル板に微量の不純物として、金属成分が含まれていることから、金属ドープが原因ではないかと考えた。不純物成分で一番多いタングステンに注目し、タングステンの成分が異なるタンタル板を使って、熱処理を行い、可視光応答を調べた。その結果、不純物の成分の違いにより、可視光応答の様子が変わることがわかり、原因を解明できた。3)酸化タンタル/タンタル板の変換効率が良い条件を調べるために、熱処理の時間と温度を変えて、半導体電極を作成した。その結果、熱処理時間により、変換効率が変わることがわかった。4)酸化タンタル/タンタル板の伝導帯についてポテンシオスタットを使い調べた結果、二酸化炭素を還元できる準位にあることがわかった。二酸化炭素を飽和させた溶液で、作成した電極を使い、キセノンランプの光を照射して、溶液をHPLCで調べた結果、ギ酸が生成していることが確認できた。
神経細胞の軸索と神経回路形成機構の解明

神経細胞は、分化の過程で共通の未分化な神経突起から軸索と樹状突起を獲得する。これまでに、細胞外因子からの刺激が細胞内シグナル伝達を誘導し、軸索形成を誘導していることが明らかとなっているが詳細な解析はなされていない。我々は極性化していな神経細胞が、早生まれの神経細胞が形成した軸索とのTAG-1を介した接着と、接着に伴うRac1の活性化が、軸索形成に重要であることを明らかにした。さらに最近、CaMKsの新規基質の1つとしてGEF-H1/ARHGEF2を同定した。リン酸化されたGEF-H1は、微小管から遊離し活性化することを見出した。本研究では神経細胞の軸索と樹状突起形成機構の解明を目的とする。生体内で神経細胞は、神経成長因子をはじめとする細胞外因子や細胞接着などの外界からの局所的な情報をもとに極性を獲得すると考えられる。申請者は、神経細胞の軸索形成に関与が示唆されているMARK2、CRMP-2と細胞外接着因子TAG-1の機能解析に焦点を絞り研究を行った。本年度は、MARK2はCRMP-2を介した制御機構により微小管の動態を制御していることを明らかにした。次年度も、引き続きMARK2の機能解析を行っていく。さらに、細胞外因子のなかでも細胞同士の接着に関わる因子に焦点を絞り研究を行った。その結果、生体内で未熟な神経細胞は早生まれの神経細胞を足場として用いて軸索を形成すること、未熟な神経細胞の軸索形成には細胞接着分子TAG-1が必要であることを見いだし、細胞間相互作用が軸索形成に必要なことを明らかにした(難波、木部、船橋、中牟田ら、Neuron. 2014)。次年度は、培養神経細胞から生体までの解析を統合して行うことにより、包括的に神経細胞の軸索・樹状突起形成を解明を行う予定である。しかしながら、生体内という複雑な環境の中では、細胞外シグナルの解析は非常に困難である。前年度、細胞接着因子TAG1の機能解析を行い、生体内でのTAG-1の重要性を明らかにした。今年度は、微小管を中心とした樹状突起およびスパイン形成に焦点を絞り研究を行った。樹状突起形成に関わる因子で微小管に結合分子としてCRMP-2以外にRhoAのGEFであるARHGEF2 (GEF-H1)を同定した。さらにGEF-H1はMARK2でリン酸化された。しかしながら、MARK2とGEF-H1の関係はすでに報告されていたことから、GEF-H1をリン酸化するそれ以外のkinaseの同定を試みた。その結果、GEF-H1はCaMKIとCaMKIIの基質となることを同定した。リン酸化部位をリン酸化プロテオミクス法とIn vitro kinase assayより同定した。同定したリン酸化は、GEF-H1と微小管との乖離を誘導した。これらの結果は、神経栄養因子やNMDA等の神経伝達物質により活性化したCaMKsがGEF-H1のリン酸化し、GEF-H1と微小管との乖離を誘導することでGEF-H1の活性化を制御していることを見出した。神経科学1)CaMKI-MARK2シグナル伝達に関与する分子の機能解析カルシウムからのシグナル伝達経路が神経細胞の形態にどのように関与するのか培養細胞を使用した実験を中心に解析を行った。CRMP-2がMARK2と結合すること、MARK2がCRMP-2をリン酸化することを確認した。現在、CRMP-2のリン酸化サイトを検討中である。野生型MARK2を過剰発現することで、短いフラグメントになった微小管が増加した。さらに、これらの現象は不活性型MARK2を過剰発現することで抑制された。CRMP-2とMARK2の結合を変化されることで、微小管の形態に影響を及ぼす予備的な実験結果を得た。2)細胞外因子による軸索誘導機構の解明本年度は、細胞外物質であるTAG-1について解析を先行して進めた。細胞外接着因子の1つであるTAG-1は、生体内では軸索に多く発現することが報告されているため、TAG-1の抗体を用いた免疫染色法により細胞内局在を確認した。TAG-1は、通常散在して存在しているが、神経細胞の軸索同士が接した場所でのみ軸索に濃縮して存在することを明らかにした。

さらに、培養神経細胞では、早生まれの神経細胞の軸索への接触が、遅生まれの軸索形成を誘導することを明らかにした。細胞内の実験で同定されたTAG-1の生体内での時間空間的な局在や活性制御機構を検討するために、子宮内エレクトロポレーション法を用いてシグナル伝達に関わる分子のノックダウンを行い細胞の形態や遊走を検討した。その結果TAG-1の発現を抑制した神経細胞では、軸索の形成不全が誘発された。さらにTAG-1の下流分子としてSrc Familyを同定した。これらの仕事は、本年度の成果氏として報告した(Neuron. 2014)。1)細胞外因子による軸索誘導機構の解明本年度の研究で研究の進展が認められたCRMP-2を中心に、子宮内エレクトロポレーション法を用いて生体での軸索誘導機構の解析を中心に行う。a)軸索形成を制御するシグナル分子(CRMP-2)の可視化培養神経細胞では、はじめに複数の未成熟な神経突起が形成される。その後、複数の未成熟な神経突起のうちの1本が急速に伸長し、軸索としての性質を獲得するようになる。これまでの研究から、神経突起に濃縮する分子として、PIP3、Rap1、Cdc42、Par6/Par3、CRMP-2などが報告されており、軸索の運命決定を担うと考えられてきた。前年度の研究より、MARK2がCRMP-2を介した微小管制御に関わっていることを明らかにした。しかしながら、MARK2がいつどのようにして活性化、もしくは濃縮するのかを観察することは技術的に難しく、軸索形成との因果関係や作用機構を解析することは困難であった。最近申請者は、マイクロピペット用いて、時空間的に軸索形成分子の活性化を制御する画期的な実験方法を確立した。この方法を用いて軸索形成を制御するシグナル分子のプローブの検討を行う。2)軸索形成と負の制御機構の解明申請者は、カルシウムを介したシグナル伝達経路が突起伸長を促し軸索形成を誘導することを明らかにしてきた。そのー方で軸索や伸長中の突起からカルシウム伝播が誘引され、それが複数の軸索形成を阻害する負の制御機構として働くのではないかと仮説を立てた。そこで免疫染色法や生化学的手法を用いてこれらの分子や小胞体の分布や存在量確認する。さらに、特異的阻害剤を用いたイメージングを行い、カルシウムの伝播の頻度や大きさを解析する。CagedカルシウムやCaged IP3などのCaged化合物を用い、局所でカルシウムを上昇させることで突起伸長を誘導あるいは抑制できるかを検討する。実験機材の変更を余儀なくされたため、今年度計画していた液性因子による神経突起伸長効果を観察する研究が出来なかった。そのため、予定していた液性因子の購入が遅れ、金額の一部を本年度から次年度に繰り越した。研究の進行状況はおおむね好調であり、次年度は全ての金額を消費する予定である。実験計画で記載してたように、次年度は細胞外液性因子(WntやTGF-β、IGF-1)の解析を行う予定である。これらの試薬の購入は、次年度に予定している。使用計画として、申請者が確立した単一の神経突起にのみ刺激を与える系を用いて細胞外因子からの細胞内シグナルをスクリーニングする。WntやTGF-β、IGF-1が誘導する細胞内シグナル伝達に関与する分子の特異的な阻害剤を用いて、突起伸長を誘導する細胞内シグナル伝達経路を明らかにする。さらに、そのときの軸索の形態や形成もマーカー分子の免疫染色により解析する。
ナノギャップによるイオン閉じ込め効果の究明

本研究では,電解質溶液中のマイクロ・ナノギャップにイオンを閉じ込め,正または負のいずれかの電荷を支配的とすることで電気的中性条件の破れた液体を生成する手法を提案し,その存在を理論と実験の両面から調べた.液中の平衡状態では電気的中性条件が満たされることが一般的に知られるが,濃度差のある溶液間にイオン選択性界面を置き,陰陽イオンの透過性の差から拡散係数に差を与えることで非定常過程における電気的中性の破れが確かめられた.固体表面近傍の電気二重層よりも広範囲なイオンの拡散が生じ,液層の両端に電位差が発生することが示された.本研究は,マイクロ・ナノギャップにおけるイオン電流の応答特性に基づくイオンの閉じ込め効果について,理論モデルによる予測と実験による検証を行うことを目的としている.研究期間に,イオン交換膜を用いて帯電した溶液を生成し,マイクロ・ナノギャップの電極間に電場を印加してイオンを引き込んだ後,外部電場を除去して正負いずれかのイオン群を閉じ込める方法を提案して実証する.平成28年度は,電極間のマイクロ・ナノギャップを想定した空間一次元の非定常イオン電流について,我々が独自に開発してきた解析手法により,現象の理論予測と有効な実験パラメータの抽出を行った.電場存在下のイオン輸送において,電極間距離,塩濃度,温度および印加電圧が実験条件に含まれるパラメータとなる.現象を理解するため,イオン電流を記述するNernst-Planck方程式と,電場と電解密度の関係を与えるPoisson方程式を連立して解き,イオンが局在するための条件を調べた.これにより,電極に電圧を印加したときの応答特性と,電圧のon/offによりイオンの閉じ込めが生じることが予測された.電圧が印加された直後にイオンが一方の電極表面に集中し,続いて両電極が短絡されると,イオンがギャップに閉じ込められた定常状態が実現する.このとき,閉じ込められるイオンは,電極表面と内部電場により両壁面近傍で対称的に局在することが示された.イオンの閉じ込めを実測する前段階として,上述のパラメータの影響を調べた.特に,イオン電流の緩和時間を支配するパラメータとして電極間距離と塩濃度に注目した.ここで用いる電極は,テーパを持った同軸切頭円錐形のオス・メス型の対であることにより,電極間距離を連続的に可変とし,軸方向の変位に対して対面の電極間距離の解像度を向上させている.本年度は,電極間の微小な間隙におけるイオン電流の応答を支配するパラメータを見出すことを目標とし,理論的に予測して実験結果と比較検証することにより,現象の本質を明らかにした.Nernst-Planck方程式とPoisson方程式を連立することにより,イオン電流の非定常応答特性を理論的に調べた.切削加工により切頭円錐形の電極対を作製し,1μmから100μmまでの間隙を連続的に可変とした.イオン電流は,イオンの電気泳動と拡散によって支配され,両現象の時空間スケールは異なることが理論的に示されているが,その差異を明確にするため,電極と直列に外部抵抗をつなぎ,電極間距離と塩濃度をパラメータとして計測を行った.電極と電解質溶液からなるデバイスの持つ抵抗がおおよそ100Ωであることから,外部抵抗として10Ωと1000Ωの場合について比較した.外部抵抗を10Ωとした場合,直流電源により0.1Vの電圧を印加した直後,瞬時に電極間に0.1Vの電位差が生じてイオン電流の応答が得られた.電極間距離が小さいほど,塩濃度が高いほど応答が速いことが明らかとなった.電極間距離が短いことは,電圧印加直後の液中の一様電場が強いことからイオンにかかる力も強いことを意味する.一方,外部抵抗を1000Ωとして実験系に0.1Vの電圧を印加した場合には,印加直後には外部抵抗で電圧降下が支配的であるが,電気二重層の充電とともに電極間の電位差が上昇して0.1Vに漸近する.この場合,電極間距離が大きく塩濃度が高いほど応答が鈍くなることが示された.電圧印加直後には,熱揺動よりも小さい電位差であることから,電気泳動よりも拡散が支配的となり,塩濃度が高いほど拡散の影響を受けるイオンの数が多く応答が長時間継続するものと考えられる.当初の計画通り,微小ギャップにおけるイオンの振る舞いが理論と実験の両面から解明された.本研究は,マイクロ・ナノギャップにおけるイオン電流の応答特性に基づくイオンの閉じ込め効果について,理論モデルによる予測と実験による検証を行うことを目的としている.研究期間に,イオン交換膜を用いて帯電した溶液を生成し,マイクロ・ナノギャップの電極間に電場を印加てイオンを引き込んだ後,外部電場を除去して正負いずれかのイオン群を閉じ込める方法を提案して実証する.平成29年度は,理論モデルに基づき陰または陽イオンを分離して閉じ込める手段を提案し,実験によりその事実を確認した.さらに,ナノスケールでの実現可能性についても数値解析により検討した.具体的には,同種金属の電極間で濃度の異なる塩化ナトリウム水溶液の2層を陽イオン交換膜で分離すると,電極間に電位差が得られた.これは,陽イオン交換膜を介してイオンの濃度差があり,高濃度側から低濃度側へイオンの拡散が生じるためである.