hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ネットワークRPGを使用した社会的共有認知研究

平成16年度は、ネットワークRPG実験を引き続き実施してデータの集積を行った。さらにゲーム過程の画像の記録方法について改良を行い、対人相互作用画像分析システムCHAO2を用いた分析を行った。研究の目的は、視覚的な場を共有できる課題とできない課題を対比させて、各課題状況に対する集団の行動を分析することであった。チャットログ、質問紙、画像上でのキャラクターの行動などをデータとして相関分析を行った結果、次の結果が見いだされた。課題解決に必ずしも場面が共有される必要はないが、場面が共有されないとプロトコルでの相互作用が行われにくい。チャットがなくても、行動レベルでの協調的相互作用が可能であり、相互作用量はむしろパフォーマンスを低下させる。しかし、プロトコル上に非共有情報が早く出現したチームほど、パフォーマンスが高く、役割構造の認知が共有されていた。また、今年度もCMC上の模擬陪審実験を実施した。昨年度の共有情報量(高・低)×情報の種類(有罪方向・無罪方向)の実験計画に加えて、評決主導条件と証拠主導条件を追加した。この結果に対して、テキスト方データ解析ソフトを用いて、討議中のチャットログの構造分析を行った。実験の結果、認知的スキーマに合致する方向の情報に関しては非共有情報を持つメンバーの、合致しない方向の情報に関しては共有情報を持つメンバーの影響力が高くなる結果が示された。平成15年度は、平成14年度科研の実験結果を統計的に検討するために、データの集積を行った。そのために、9名までしか参加できない実験室状況を18名まで参加できるように拡張する施設整備を行った。平成14年度中に制作したゲームファイルを用いてデータの集積を行った。また、メディア教育センターで開発された対人相互作用画像分析システムchaoを用いて、ゲーム過程のチャットログを画像を同期させながら分析する試みが行われた。しかし、ゲーム過程の画像を外部機器に出力しないで、パソコン内部で記録するとゲームパフォーマンスが落ちるため、記録方法について改良が必要である。この記録・分析システムはさらに平成16年度にさらに開発を行う予定。また、FTF(対面場面)ゲームとNRPGゲームの差を検討することを目的として、FTFの模擬社会ゲーム(Gamson、1990)を実施した。公的・私的自己意識が模擬社会ゲームとNRPGゲームに及ぼす影響の比較、そして、模擬社会ゲームとNRPG状況における社会的リアリティの認知の比較を行った。結果は分析中。平成15年度に新たに計画した研究として、コンピュータ・コミュニケーションを使用した討議実験が実施された。これは、NRPGとしてではなく、模擬陪審員状況を用いた社会的共有認知の実験として行われた。共有情報量(高・低)×情報の種類(有罪方向・無罪方向)の4種類の情報紙を用意し、4名の討議メンバー間にそれぞれの情報紙を与えて、発言量、チャットログの内容、討議後の対人認知に与える影響を分析した。実験の結果、集団決定の方向に逆らう非共有情報を多く所有していたメンバーは影響力が低いが、その原因がメンバーのパーソナリティと認知されていた。チャットログの内容分析は続行中で、共有情報と非共有情報がチャットログ中に出現した後の反応確率、反応時間、発言内容の違いなどを量的・質的に分析する予定である。

昨年度の共有情報量(高・低)×情報の種類(有罪方向・無罪方向)の実験計画に加えて、評決主導条件と証拠主導条件を追加した。この結果に対して、テキスト方データ解析ソフトを用いて、討議中のチャットログの構造分析を行った。実験の結果、認知的スキーマに合致する方向の情報に関しては非共有情報を持つメンバーの、合致しない方向の情報に関しては共有情報を持つメンバーの影響力が高くなる結果が示された。
褐藻の機能性ポリフェノールである高分子フロロタンニンの精密構造解析法の確立

フロロタンニンは褐藻類に特有のフロログルシノールの酸化的重合物であり、重合のしかたによってさまざまな構造をとりうる。本研究はそれらの詳細な構造解析を行う予定で以下の成果を得た。エゾイシゲ(Silvetia babintonii、ヒバマタ科,8.00kg)を70%メタノールで抽出した。抽出物を水と酢酸エチルで溶媒分画したところ、両画分にフロロタンニンが検出された。構造解析が容易な低分子量フロロタンニンの含まれる酢酸エチル可溶部をセルロースカラムクロマトグラフィーで分画して、水で溶出する画分を集めた。本画分はフロロタンニン以外の低極性不純物を含んでいたため、酢酸エチルと水で再度溶媒分画して精製をおこなった。水可溶画分がフロロタンニン混合物と同定できた。得られたフロロタンニン混合物の分子量を測定するために本年度は質量分析(MS)を行った。まず、ESI-MS(-)を測定したところ、高マスユニット側にm/z919を与えた。フェルラ酸をマトリックスとしてMALDI-TOF-MS(+)を測定したところ、m/z984を与えた。これらはフロログルシノールのヘキサマーあるいはヘプタマー程度の大きさである。しかし、単純なフロログルシノールの酸化的カップリングに対応するマスユニットを与えておらず、何らかの置換基が存在するようである。この置換基の解明には至らなかった。解明に至らなかった原因に得られたフロロタンニンが容易に不溶化してしまったためである。これまでの研究成果から、MS法ではフロロタンニン混合物のうち低分子量側の一部が測定されているのみと推察される。今後測定法の工夫が必要である。供試しようとしたフロロタンニンがほとんど不溶化してしまったため、計画にあったフロロタンニン中の遊離ヒドロキシル基の定量、低分子化分解物の構造解析および立体配向性の解明を行うことができなかった。褐藻に含まれる機能性分子であるフロロタンニンは、フロログルシノールが酸化的フェノールカップリングしている構造を特徴とするポリマー分子である。本年度は高分子フロロタンニンの精密構造解析法の確立を目指して、(1)海藻からフロロタンニンの効率的抽出・精製、(2)フロロタンニンの分子量測定、(3)遊離フェノール性ヒドロキシル基の定量、(4)高分子フロロタンニンの低分子化の検討を行う予定にした。本年度の成果は以下のとおりである。(1)フロロタンニンの抽出には、採集・乾燥後に、チップ状に粉砕して真空包装した試料を用いた。本試料から、これまで検討したなかで最も抽出効率の良かったメタノール:水=6:4(v/v)の溶媒で、フロロタンニンの抽出を数度にわたって検討した。しかし、フロロタンニンはごく少量しか抽出されなかった。この理由は、乾燥粉末化後に真空包装した試料では、フロロタンニンの重合化や共存タンパク質や多糖類との非可逆的な吸着が促進したため、抽出ができなかったと予想される。来年度は再度効率良くフロロタンニンを抽出するための条件を確立したいと考える。(2)本年度の抽出で得られた水溶性フロロタンニンを使用して分子量の検討を行った。分子間相互作用を最小限にするためにフェノール性ヒドロキシル基の保護を検討した。加熱条件下で行った無水酢酸・ピリジン法によるアセチル化では、フロロタンニンとは異なる生成物を得ることができたが、濃い褐色に着色しており、生成物の分離精製が困難だった。硫酸ジメチル-水酸化ナトリウム法によるメチル化では、部分的なメチル化で終り、完全にメチル化を行うことができなかった。フロロタンニンの誘導体の調製は来年度さらに検討を要する。(3)および(4)は、(1)および(2)の検討が予定よりも遅れたため、来年度の研究計画に組み入れる。

これまでの研究成果から、MS法ではフロロタンニン混合物のうち低分子量側の一部が測定されているのみと推察される。今後測定法の工夫が必要である。供試しようとしたフロロタンニンがほとんど不溶化してしまったため、計画にあったフロロタンニン中の遊離ヒドロキシル基の定量、低分子化分解物の構造解析および立体配向性の解明を行うことができなかった。
初期未分化型胃癌の遺伝子異常の研究

初期未分化型胃癌とくに印環細胞癌の遺伝子異常はほとんど知られていなかった.平成8年度に印環細胞型の早期と進行癌を用いて,癌部のDNAを抽出し10箇所のmicrosatelliteについてPCRを施行し,microsatelliteのinstability(MSI)とloss of heterozygosity(LOH)を調べたところ,MSIと接着分子関連遺伝子のLOHは一部の胃印環細胞癌における早期からの遺伝子異常の一つであることを示した.同時にDNA ploidyを調べたところ,早期癌ではほとんど二倍体であったが,進行癌では異倍体のパターンを示した.平成9年度はcompative genomic hybridization(CGH)法を用いて早期と進行期の印環細胞癌の全染色体における遺伝子異常を検索した.その結果,早期癌ではCGH法では染色体変化は認めなかったが,進行期癌では7番染色体のコピー数の増加が検出された.一方,早期の表層拡大型印環細胞癌を対象として,X染色体不活化現象を用いてクロナリティー解析をしたところ,ほとんどの症例でモノクローナルのパターンを示した.これらの癌はほとんどが二倍体癌であった.以上から,初期未分化型癌のほとんどは二倍体癌で,しかもMSIと接着分子関連遺伝子の異常以外には明かな染色体異常がなく,モノクローナルに表層拡大性に増生し,7番染色体に存在する未知の遺伝子に異常が生じ,異倍体化し下方に浸潤性に増殖・進展していくものと考えられた.初期未分化型胃癌とくに印環細胞癌の遺伝子異常はほとんど知られていなかった.平成8年度に印環細胞型の早期と進行癌を用いて,癌部のDNAを抽出し10箇所のmicrosatelliteについてPCRを施行し,microsatelliteのinstability(MSI)とloss of heterozygosity(LOH)を調べたところ,MSIと接着分子関連遺伝子のLOHは一部の胃印環細胞癌における早期からの遺伝子異常の一つであることを示した.同時にDNA ploidyを調べたところ,早期癌ではほとんど二倍体であったが,進行癌では異倍体のパターンを示した.平成9年度はcompative genomic hybridization(CGH)法を用いて早期と進行期の印環細胞癌の全染色体における遺伝子異常を検索した.その結果,早期癌ではCGH法では染色体変化は認めなかったが,進行期癌では7番染色体のコピー数の増加が検出された.一方,早期の表層拡大型印環細胞癌を対象として,X染色体不活化現象を用いてクロナリティー解析をしたところ,ほとんどの症例でモノクローナルのパターンを示した.これらの癌はほとんどが二倍体癌であった.以上から,初期未分化型癌のほとんどは二倍体癌で,しかもMSIと接着分子関連遺伝子の異常以外には明かな染色体異常がなく,モノクローナルに表層拡大性に増生し,7番染色体に存在する未知の遺伝子に異常が生じ,異倍体化し下方に浸潤性に増殖・進展していくものと考えられた.初期未分化型胃癌とくに印環細胞癌の遺伝子異常はほとんど知られていなかった.平成8年度に印環細胞型の早期と進行癌を用いて,癌部のDNAを抽出し10箇所のmicrosatelliteについてPCRを施行し,microsatelliteのinstability(MSI)とloss of heterozygosity(LOH)を調べたところ,MSIと接着分子関連遺伝子のLOHは一部の胃印環細胞癌における早期からの遺伝子異常の一つであることを示した.同時にDNA ploidyを調べたところ,早期癌ではほとんど二倍体であったが,進行癌では異倍体のパターンを示した.平成9年度はcomparative genomic hybridization(CGH)法を用いて早期と進行期の印環細胞癌の全染色体における遺伝子異常を検索した.その結果,早期癌ではCGH法では染色体変化は認めなかったが,進行期癌では7番染色体のコピー数の増加が検出された.一方,早期の表層拡大型印環細胞癌を対象として,X染色体不活化現象を用いてクロナリティー解析をしたところ,ほとんどの症例でモノクローナルのパターンを示した.これらの癌はほとんどが二倍体癌であった.以上から,初期未分化型癌のほとんどは二倍体癌で,しかもMSIと接着分子間連遺伝子の異常以外には明かな染色体異常がなく,モノクローナルに表層拡大性に増生し,7番染色体に存在する未知の遺伝子に異常が生じ,異倍体化し下方に浸潤性に増殖・進展していくものと考えられた.
卵巣がんが疑われる患者に対する術前外来ケアプログラムの開発

卵巣がんは近年増加傾向にあるが、早期発見が難しく、術前の確定診断および治療方針が明確にされない。それゆえに、卵巣がんが疑われる患者は、治療を開始するにあたっての心身の準備が伴わないまま手術やその後の化学療法に臨むことになる。卵巣がんの初回治療は、子宮や卵巣および周囲組織の摘出が行われることから、女性のライフスタイルにも大きく影響を及ぼす。このような現状から、卵巣がんが疑われる患者の治療に向けた準備性を高めることが重要である。以上より本研究は、卵巣がんが疑われる患者を対象に、治療準備を促進する外来看護ケアプログラムを開発し、評価することを目的とする。
教育用小型ジェットエンジンおよび推力測定装置の開発

未曾有の被害をもたらした東日本大震災。2年経過した今日でも未だに、震災の爪跡を残した被災地の様子がマスコミ等で映し出されます。当研究は震災直後、陸路等の寸断で孤立した人々を映像で目の当たりにし、空路を使用し安全を考慮した無人の輸送システム,飛行ロボットを開発できないものかと思い、先ずは動力となる小型ジェットエンジンから着手しました。さらに、研究者の所属する熱工学研究室では、様々な熱機関も講義に取り入れており、学生にエンジン構造を享受するのにも役立つものと思い、この研究テーマとしました。研究者が所属する研究室に於いては、創造性豊かな技術者を育てるため、無人航空機UAV (Unmanned Aerial Vehicle)用の超小型ジェットエンジンの開発と、それを活用した民生利用UAVに、1システムの検討を創造教育に取り入れています。ジェットエンジンは手作りながら良好なアライメントが得られ(エア・コンプレッサーのエア吹きつけのみで、8000rpmを出力)、軸振れによる振動も少なく、高回転数までスムーズに運転可能となりました。またこの装置は、学生に対しても教材として活用し、熱機関,ジェットエンジンの構造を知るのに、一役を担っています。最後になりましたが、平成24年度科学研究費補助金を助成していただき、誠にありがとうございました。
時間反転不変性の破れ探索実験用高精度ミュオン偏極度測定装置の開発

J-PARCで予定されている「時間反転不変性の破れの探索実験(E06)」では、K中間子崩壊におけるミュオンの偏極度の精密測定を行う。その測定に必要なミュオン偏極度測定装置の開発を実施した。入射ミュオンを静止させるミュオンストッパーと崩壊陽電子を観測するドリフトチェンバー、及びミュオン磁場電磁石とが基本構成となる。シミュレーション計算に基づき、1/5サイズモデルそして実物大モデルのプロトタイプを製作し、実際にミュオンビームで試験を行った。E06実験に用いる十分な良好な性能を確認し、また重要なデータ収集を行った。(1)プロトタイプチェンバーの作成:ミュオン偏極度の測定は、偏極度計内のミュオンストパーに停止した正ミュオンが崩壊して生成する陽電子の角度分布非対称度の計測による。今年度は選定されたストッパー材料を用い、1ユニットの1/5厚さのプロトタイプチェンバーを製作した。セル形状などの詳細設計は電場解析プログラムGAFIELDを用いて行い、セルサイズは長さ2.5cm幅0.8cmのドリフトチェンバーとした。精密測定用のチェンバーとして、高い部材の加工精度や全体の組み立て精度が要求される。本プロトタイプでも、これらについて最適な条件を見つける試みを行った。完成したプロトタイプは、KEK富士実験室の電子線テストビーム(FTBL)を用い試験を実施した。細長いセルの各所で検出効率が十分に高いこと、電荷分割法によるワイヤー方向座標の位置決定精度が十分に高いことが確かめられた。また、このプロトタイプでは、数種類のワイヤーを試験し、最適なワイヤーの選定を行った。(2)ミュオン磁石の設計及び製作:ミュオン磁石はミュオンのスピン運動を左右する重要な要素となる。非常によくアラインされた磁場をミュオンストッパー上に発生し、横偏極成分を保持する。3D磁場計算に基づき、1台のプロトタイプ磁石を製作し、中心面に対する左右の磁場分布の非対称度を測定した。製作は磁極加工の精度及び巻き線の対称性などに細心の注意を払って、対称度の高い磁石とした。今回の1ユニットでの試験時では、リターンヨーク無しの条件で、左右の非対称度を検知することに重点を置いた。この目的のために左右コイルを逆方向に励磁し、中心付近の零磁場の分布を、感度の高いフラックスゲートメータで測定する新しい方法を考案した。結果は現在解析中であるが、この方法の妥当性が示されることが期待される。(1)ポラリメターチェンバー実物大モデル(FSM)の製作:J-PARC TREK実験でミュオン偏極の精密測定は、ミュオンストッパーとドリフトチェンバーが一体化された所謂アクティブポラリメターによって行う。昨年度ビームテストを行った「1/5プロトタイプ」の性能評価に基づき、TREK実験で使われるのと同じ大きさの実物大モデルを製作した。24枚のアリミ板(2.5mm厚)ミュオンストッパーと25層の間隙ドリフトチェンバーからなり、約68cm×28cm×30cmの外形寸法を持つ。センスワイヤーの数は約500本となった。電荷分割による読み出し等、基本的な仕様は1/5モデルを倣った。(2)FSMのビーム試験:このFSMチェンバーのビーム試験を、カナダTRIUMF研究所のパイオン及びミュオンビームを用いて実施した。これらのビーム(170MeV/c)をストッパーに止め、崩壊陽電子を観測することを行った。まず、今回新たに製作した読み出しASBを用いて、チェンバーとしての基本動作の確認が行われた。パイオンビームは偏極を待たない。今回、この性質を利用して、チェンバーが陽電子放出の擬似的な非対称度を持たないことの検証を行った。更に偏極したミュオンビームを用いて、このチェンバーのアナライジングパワー、すなわちミュオン偏極度への感度の決定を行った。これらの測定結果に基づき、TREK実験ミュオンポラリメータの実機設計・製作へと進むことになる。(3)ミュオン磁場電磁石の磁場測定:昨年度製作したミュオン電磁石の磁場測定を、実際に近い磁場強度で実施した。解析により磁場分布の対称性に関しての知見を得た。また、TREK実機電磁石設計・製作に向けての、必要改良点の洗い出しを行った。1)平成21年度にカナダTRIUMF研空所で実施したJ-PARC EO6(K中間子崩壊における時間反転不変性の破れ探索)実験用ポラリメータチェンバーの実機サイズプロトタイプ(FSM)のビームテストのデータ解析を行い、その性能評価を行った。ミュオンビームのデータでアナライジングパワーなどのポラリメータチェンバーとしての基本性能に関し良好な結果の確認をすることができた。また実験をする上で系統誤差の原因となり得るチェンバーの擬似的な非対称度の測定をパイ中間子ビームで行ったが、その解析を重点的に進めた。これらの結果に基づき、ミュオンチューブ方式による改良型の第2の試作機の検討・設計及び製作を行った。

現在その性能評価を続けている。(震災により実験室が使えなくなったため、この作業はやや遅れている。)2)ミュオンポラリメータと同時計測を行うCsI(T1)カロリメターの読出し方式のR&Dを実施した。3×3=9本のモジュールをAPD(アバランシ光ダイオード)で読出す試みをし、東北大学電子光理学研究センターの陽電子ビームを用いて性能評価実験を行い、エネルギー分解能や閾値等の貴重なデータを収集するとともに、この方式の有効性を確認した。3)将来ミュオンポラリメータでの本実験を行うことになるJ-PARCハドロン実験施設のK1.1BRビームラインのコミッショニングを行った。チェレンコフ検出器等を整備し、K中間子ビームのビーム調整を実施した。ほぼビーム光学に従ったビーム強度と、非常に高いK/π比を得ることができた。
好中球による究極の殺菌術,NETs形成機構の解明：自己免疫疾患の治療戦略に向けて

本研究の目的は好中球による殺菌システム、neutrophil extracellular traps (NETs)形成の分子機構の解明である。まずヒト好中球を用いてin vitroにNETsを誘導し、1)分葉核の喪失、2)クロマチンの弛緩、3)細胞膜の崩壊、の3段階で進行することを見出した。次に各段階のサンプルを用いてiTRAQR法による網羅的質量分析をおこない、クロマチンの弛緩に伴い急激な増加(20倍以上)が認められた約80種類のペプチド(翻訳後修飾を含み、15種類のタンパク質の断片)を見出した。特に顕著に増加した2種のタンパク質について、遺伝子欠失好中球モデルを作成して検討を進めている。本研究の目的は、好中球によるNeutrophil extracellular traps (NETs)形成の分子機構の解明である。NETsは、好中球が投網のごとく変形して微生物を包み込む殺菌システムであるが、その形成プロセスはほとんど知られていない。本年度は、その解明の第一歩として、ヒト末梢血由来の好中球およびヒト白血病細胞株を分化させた好中球モデルを利用して、in vitroにNETs形成を再構築するシステムを確立した。NETs誘導刺激として、補体受容体を介した食作用に注目し、カンジダ菌(真菌)および黄色ブドウ球菌(細菌)とそれらの死菌の貪食を検討した。カンジダ菌の場合には、好中球による食作用とともに、速やかに周囲の好中球にNETsが誘導されたが死菌では誘導されず、食作用後の殺菌プロセスがNETs誘導シグナルに変換されていると考えられた。一方、黄色ブドウ球菌の場合には、単独生菌の食作用だけではNETs誘導に至らなかった。次に、NETs誘導試薬であるPMAを用いてNETs形成課程について検討した。1)クロマチン脱凝縮の進行状況、2)活性酸素種の生成、および3)ヒストンの翻訳後修飾の経時的変化の解析、さらに最終的なNETs形成の4)電子顕微鏡による解析により、NETs形成に重要な標的分子を探索した。その結果、低分子量GTPase,Rab27AがNET形成の初期細胞内シグナルとして重要な役割を果たすことを見出した。Rab27Aノックダウン型の好中球モデルでは、(1) NADPHオキシダーゼに関わる活性酸素種の生成、(2)ヒストンのシトルリン化がほとんど起こらず、最終的なNETs形成も抑制されていた。さらに、Rab27Aノックダウン型好中球では、カンジダ菌の貪食依存性のNETs形成も抑制されており、真菌感染によるNETs誘導においても重要な役割を果たしていることが示唆された。NETsは、好中球が投網のごとく変形して微生物を包み込む殺菌機構である。近年、本来の機能である生体防御に加えて、過剰なNETs形成が様々な疾患を誘導する可能性が報告されているが、詳細な分子機構は未解明である。これまでの研究成果として、1)ヒト末梢血由来の好中球や好中球様に分化した白血病細胞株を利用するとin vitroにNETs形成を誘導できること、2)補体受容体を介したカンジダ菌(真菌)の食作用では、食作用後の殺菌プロセスがNETs誘導シグナルに変換されており、人工的なNETs誘導試薬であるPMAで好中球を刺激した場合同様にNETsが形成することを見出した。そこで本年度は、NETs形成に至るプロセスを段階に分けて解析することとした。PMAでヒト好中球を刺激し、膜透過性および非透過性の核酸染色試薬存在下で詳細に追跡したところ、以下のように進行することが確認できた。1)核の形態が変化して分葉核を喪失し(30分1時間)、その後、2)クロマチンの脱凝縮が進行して膨潤し(12時間)、さらに進んで3)核膜の崩壊が起こり、NETs成分が放出する(34時間)。これら1)3)の各段階において、秩序だった細胞内化学反応が起こることで、クロマチン構造が緩み、遺伝子である核酸DNAがほどけた網が完成すると考え、各段階においてkeyとなる反応を見出すための検討を開始した。経時的に細胞内分子の翻訳後修飾を追跡するため、各段階の細胞成分について質量分析を行いNETs形成に重要な標的分子を解析した。各種ヒストンタンパク質など多くのタンパク質において翻訳後修飾の変化を見出したが、そのNETs形成における機能についてはさらなる検討が必要である。順調な点としては、初年度に構築したNETs形成のin vitroモデルを利用してさらに詳細な解析に進むことができた。一方で、質量分析による翻訳後修飾の解析では、経過時間依存性に多くの変化を見出したが化学修飾に偏りが認められた。好中球の強い活性酸素種等により、サンプル作成過程において人工的な変化が加わっている可能性もあり、今後の標的分子の同定に向けて、多方面からの検討が必要である。平成27年度までの成果として、ヒト末梢血由来の好中球を利用して、in vitroに、PMA (Phorbol 12-Myristate 13-acetate)およびカンジダ菌を用いてNETsを誘導し、以下の段階に分けて解析する方法を確立した。

まず、1)核の形態が変化して分葉核を喪失し(30分1時間)、その後、2)クロマチンが弛緩して核が膨潤し(12時間)、最終的には、3)核膜と細胞膜が崩壊して、NETsを放出する(34時間)。そこで平成28年度は、NETsに重要な化学反応を見出すため、ヒト好中球を精製して、未刺激時およびPMA刺激後1,2,3時間のサンプルについて、iTRAQR法による網羅的質量分析をおこない、その結果を相対定量解析してNETs形成過程で有意に変動する候補タンパク質を探索した。刺激2時間後には、クロマチンの基本構造である核酸DNAとヒストンタンパク質の結合が緩んでいると判断し、2時間後に未刺激時と比して20倍以上の増加が認められるペプチド(アミノ酸の翻訳後修飾を含む)を検索した。その結果、15種類のタンパク質の断片として81種類のペプチドを見出した。これら15種類のうち、4種類が細胞骨格タンパク質であるアクチンおよびアクチン結合タンパク質であった。NETs形成時の急速な形態変化に関与すると考えている。残りの11種類のうち、4種類が、EFハンド型カルシウム結合ドメインを持つタンパク質群であった。その中でも、特に顕著な増加が認められた2種類のタンパク質については、遺伝子変異型好中球モデルを作成し、NETs形成過程における機能について検討を進めている。本研究の目的は好中球による殺菌システム、neutrophil extracellular traps (NETs)形成の分子機構の解明である。まずヒト好中球を用いてin vitroにNETsを誘導し、1)分葉核の喪失、2)クロマチンの弛緩、3)細胞膜の崩壊、の3段階で進行することを見出した。次に各段階のサンプルを用いてiTRAQR法による網羅的質量分析をおこない、クロマチンの弛緩に伴い急激な増加(20倍以上)が認められた約80種類のペプチド(翻訳後修飾を含み、15種類のタンパク質の断片)を見出した。特に顕著に増加した2種のタンパク質について、遺伝子欠失好中球モデルを作成して検討を進めている。初年度の計画であるNETs形成の再構築モデルとその解析システムの確立についてはほぼ順調に進み、標的分子としてRab27Aの重要性について証明できた点などは計画以上に進展したといえる。一方で、補体受容体を介した食作用をNETs誘導刺激とした場合、カンジダ菌ではNETs形成を誘導できたが、黄色ブドウ球菌では誘導できず、感染微生物による差異を考慮して工夫することが必要である。引き続きNETs形成過程を分子レベルで解明する研究に取り組む。とりわけ、平成27年度に開始したNETs形成過程の細胞成分をサンプルとした質量分析の検討をさらに進める。NETs形成の各段階について、重要な標的分子を選択し、遺伝子欠失型および変異型の好中球モデルを作成してその効果を検証する。並行して、感染微生物によるNETs形成において、NETsを誘導またはNETs抵抗性の菌体由来物質の探索をおこない、NETs形成とNETsの機能をコントロールするin vitroシステムの構築にも取り組む。生化学免疫学引き続きNETs形成過程を分子レベルで解明する研究に取り組む。
外乱に対する姿勢制御特性を考慮した2足歩行機械の動的総合

研究対象の2足歩行機械は足部の運動を創成する脚機構と歩行機械の動的安定性を維持する姿勢制御機構からなり,本年度の研究では外乱作用時の脚機構の反射運動の決定および姿勢制御機構の運動決定を行った.まず,歩行機械腰部上に振興方向に両脚支持期間終了時刻に瞬間的に比較的大きな外力が作用する場合について,外乱を検知して定常歩行運動から切換えて転倒を防止させる脚機構の反射運動パターンの決定を行った.すなわち,反射運動の目標歩幅を種々に変えてシミュレーションを行い,両脚支持期間終了時刻における歩行機械腰部の角速度の大きさに応じて反射運動の目標歩幅を段階的に切換えることで,次の両脚支持状態に遷移可能であることが確認された.そして,股関節および膝関節にアクチュエータをもつ2足歩行機械を試作し足部の接地状態と歩行機械腰部の角速度をもとに脚機構の運動パターンを迅速に選定する反射制御系を構成して実験を行ったところ,角速度に応じて反射運動の選定が適切に行われ,初期の両脚支持状態へ遷移した.つぎに,歩行機械腰部の左右方向軸まわりに作用する比較的小さな外力モーメントに抗して脚運動を変更することなく安定な歩行を維持するように,姿勢制御機構の運動決定を行った.すなわち,腰部上に搭載される姿勢制御機構を含めた歩行機械を,摩擦により歩行面と拘束される足部を有する下部振子と姿勢制御機構からなる二重倒立振子にモデル化し,下部振子の予め定められた姿勢角における角速度に応じた姿勢制御機構の運動のフィードフォワード情報を,足部と歩行面のすべりおよび駆動源の発生速度・発生力の制約条件を考慮して決定することを可能とした.二重倒立振子による実験により,その有効性が確認できた.研究対象の2足歩行機械は足部の運動を創成する脚機構と歩行機械の動的安定性を維持する姿勢制御機構からなり,本年度の研究では外乱作用時の脚機構の反射運動の決定および姿勢制御機構の運動決定を行った.まず,歩行機械腰部上に振興方向に両脚支持期間終了時刻に瞬間的に比較的大きな外力が作用する場合について,外乱を検知して定常歩行運動から切換えて転倒を防止させる脚機構の反射運動パターンの決定を行った.すなわち,反射運動の目標歩幅を種々に変えてシミュレーションを行い,両脚支持期間終了時刻における歩行機械腰部の角速度の大きさに応じて反射運動の目標歩幅を段階的に切換えることで,次の両脚支持状態に遷移可能であることが確認された.そして,股関節および膝関節にアクチュエータをもつ2足歩行機械を試作し足部の接地状態と歩行機械腰部の角速度をもとに脚機構の運動パターンを迅速に選定する反射制御系を構成して実験を行ったところ,角速度に応じて反射運動の選定が適切に行われ,初期の両脚支持状態へ遷移した.つぎに,歩行機械腰部の左右方向軸まわりに作用する比較的小さな外力モーメントに抗して脚運動を変更することなく安定な歩行を維持するように,姿勢制御機構の運動決定を行った.すなわち,腰部上に搭載される姿勢制御機構を含めた歩行機械を,摩擦により歩行面と拘束される足部を有する下部振子と姿勢制御機構からなる二重倒立振子にモデル化し,下部振子の予め定められた姿勢角における角速度に応じた姿勢制御機構の運動のフィードフォワード情報を,足部と歩行面のすべりおよび駆動源の発生速度・発生力の制約条件を考慮して決定することを可能とした.二重倒立振子による実験により,その有効性が確認できた.
腸管抗原提示細胞によるサイトカイン誘導と腸炎制御メカニズムの解明

わが国の炎症性腸疾患罹患者数は急激に増加しているが、未だに病因が明らかではなくその病態解明及び新規治療法の開発は極めて重要な課題である。申請者は、Interleukin(IL)-1ファミリーに属する新規サイトカインIL-36の発現が炎症性腸疾患患者で有意に亢進していることを報告し、腸管のLy6c+炎症性マクロファージにおいてIL-36が高発現しIL-36受容体/MyD88/NFkB経路を介してTh9細胞の分化を誘導する一方、制御性T細胞の誘導を抑制することを見出した。本研究課題では、ex vivoでの組織培養を行うとともに遺伝子改変マウスを用いて実験腸炎モデルを作製し検討を行った。腸管の組織培養でIL-36はIL-23及びIL-22を強力に誘導していることが明らかとなり、これらIL-23/IL-22の誘導はIL-36受容体欠損マウス由来の組織培養では著明に低下していた。またIL-12p19及びIL-12p40の中和抗体によりIL-36によるIL-22の誘導は著明に抑制されたことから、IL-36によるIL-22の誘導にはIL-23の発現が重要であると考えられた。またbatf3欠損マウス及びCD11c特異的Notch2欠損マウスを用いた組織培養による検討から、Notch2依存性に誘導されるCD103+CD11b+樹状細胞がIL-36によるIL-23の誘導に必須であることが明らかとなった。さらに、IL-36受容体欠損マウスにおいて観察されたS100A8やReg3gといった抗菌ペプチドの発現の低下がIL-23の投与によって回復することを示し、腸管バリア機能の維持においてIL-36/IL-23/IL-22のサイトカインネットワークの果たす役割が明らかとなった。腸管マクロファージに発現するIL-36を発端とするサイトカインネットワークについてT細胞、樹状細胞を中心に解析を行い報告した。炎症性発癌モデルを用いた実験計画に関しては順調に進行している。当初の実験計画から使用する遺伝子改変マウスの変更が多少あるが基本的な骨子については変更なく進めている。
無侵襲内視鏡治療用超柔軟高機能細径赤外伝送路の開発

中空ファイバによる赤外光の伝送が可能になり、赤外光は内視鏡治療にその応用が展開されようとしている。極細径(内径320 μm)中空ファイバ製作に見通しが立ってきた。本研究では、曲げ半径15 mm、曲げ角270°で使用可能な内径320 μm、長さ2 mの細径中空ファイバの製作と、高出力赤外レーザ光(Er:YAGとCO2レーザ光)と可視ガイド光が伝送可能な超柔軟高機能中空ファイバの開発を目的とする。2019年度には、銀中空ファイバの製作技術を確立する。2020年度以降は、赤外レーザ光ならびに可視ガイド光が伝送可能な低損失化用ポリマーを成膜し、内視鏡対応型超柔軟高機能細径中空ファイバの製作を図る。
がん細胞の増殖,浸潤機構と脂質ドメイン

膜脂質の正確な局在をナノメートルレベルで決定することは膜生物学だけでなく,細胞増殖,細胞運動など種々の現象を分子レベルで理解するために重要である。しかし,通常の化学固定剤は脂質に作用せず,また様々な刺激が局在変化を惹起する可能性があるため,膜脂質に関する理解は進んで来なかった。我々は今回の研究により急速凍結と凍結割断レプリカ標識法を組み合わせることにより,膜脂質を物理的に固定し,局在を決定する方法を開発した。その方法を用いて,細胞骨格,小胞輸送などの制御に重要な役割を果たすフォスファチジルイノシトール4,5二燐酸(PIP2)の挙動を明らかにした。PIP2は線維芽細胞の平坦な膜領域ではごく弱いクラスターを形成するのみであったが,カベオラ開口部,コーテッドピット辺縁部には高度な集中を示した。Angiotensin II刺激後,平坦な膜領域では10秒でPIP2標識密度は最低レベルに低下し,2分までに徐々に回復した。カベオラのPIP2は10秒では変化せず,40秒で最も低下し,2分で静止期レベルに回復した。コーテッドピットは10秒でやや減少したが,その程度は平坦な膜領域に比較してごく軽度であった。PIP2の集合は,カベオラではカベオリンに,コーテッドピットではepsin, dynaminなどのエンドサイトーシス関連蛋白質に結合することによって生じると考えられる。今回の結果は,3つの異なる挙動を示すPIP2のプールが形質膜に存在することを明確に示した。本研究で開発した方法は高い空間解像度を持ち,任意の細胞に応用することができる。動物体内の細胞など,多くの実験系への応用が考えられ、癌細胞の挙動解析にも重要なツールとなる。フォスファチジルイノシトール4, 5二燐酸(PIP2)はイオンチャネル,トランスポーターの活性,細胞骨格,小胞輸送などの制御に重要な役割を果たす膜脂質である.上記の多様な機能は,独立した膜領域にあるPIP2が異なる挙動を示すことで相互に干渉することなく発揮されると推測されてきた.この仮説を検証するため,我々はこれまでの研究で開発した膜脂質の物理的固定・標識法を用いて, PIP2のナノ局在を定量的に決定した. PIP2は形態的に分化していない平坦な膜領域ではごく弱いクラスターを形成し,アクチンを脱重合することでクラスターは解消した.カベオラ開口部,コーテッドピット辺縁部にはPIP2の高度な集中が認められた.Angiotensin II刺激後,平坦な膜領域では10秒でPIP2標識密度は最低レベルに低下し, 2分までに徐々に回復した.カベオラのPIP2は10秒では変化せず, 40秒で最も低下し, 2分で静止期レベルに回復した.コーテッドピットは10秒でやや減少したが,その程度は平坦な膜領域に比較してごく軽度であった.一方,イオノマイシン処理では, 1分後にカベオラのPIP2が先行して減少し, 5分で平坦な膜領域でも顕著な減少が見られた. PIP2の集合は,カベオラではカベオリンに,コーテッドピットではepsin, dynaminなどのエンドサイトーシス関連蛋白質に結合することによって生じると考えられる.今回の結果は, 3つの異なる挙動を示すPIP2のプールが形質膜に存在することを明確に示した.本研究で開発した方法は従来の方法に比較して空間解像度にすぐれ, PIP2濃度を正確に判定することができるため,多くの実験系への応用が期待される.膜脂質の正確な局在をナノメートルレベルで決定することは膜生物学だけでなく,細胞増殖,細胞運動など種々の現象を分子レベルで理解するために重要である。
肝細胞インターフェロン応答遺伝子ライブラリーの作製と新規抗肝炎ウイルス薬の探索

ヒト肝細胞キメラマウスを用いてC型肝炎ウイルス(HCV)感染マウスを作製し、インターフェロン(IFN)-αの投与によって生じるヒト肝細胞の遺伝子発現プロファイルの変化について、マイクロアレイ法とRT-PCR法にて解析を行なっている。さらに、再現性の確認と、宿主側の要因による遺伝子発現の違いを検討するため、1回目とは異なったヒト肝細胞を移植したキメラマウスを12匹用意し、同様の条件で追加検討を行った。1.IFN投与に伴う遺伝子発現の変化の検討では、移植肝の違いによる差は認められず、発現量が有意に増加、または減少する遺伝子は同様であった。2.HCV感染に伴う遺伝子発現の変化では、移植肝の違いによって発現が変化する遺伝子が認められた。これまで、宿主の違いによる反応性の差がはっきりと示されたことはなく、重要な結果であると考えられ、追加実験中である。3.HCV感染群とHCV非感染群の比較においては、IFNによって誘導される多くの遺伝子が、HCV非感染群に比べてHCV感染群で誘導が抑制されていた。HCV感染に伴ってIFNによる誘導が減少していることが考えられた。感染によって誘導が減少している遺伝子が治療効果と関係すれば、新薬の開発へと発展されうる可能性があり、今後もこれらの遺伝子の解析を行なっていく予定である。マウス肝臓が高度にヒト肝細胞に置換されたヒト肝細胞キメラマウスに用いてC型肝炎ウイルス(HCV)陽性ヒト血清を投与し、HCV感染マウスを作製した。HCV非感染マウスまたはHCV感染マウスに7000単位/gのインターフェロン(IFN)-αを投与後、マウス肝臓より採取したヒト肝細胞を用いて、cDNAライブラリーを作製した。作製したcDNAライブラリーを用いて、遺伝子発現プロファイルの変化をマイクロアレイ法にて解析した。1.HCV感染に伴う遺伝子発現の変化HCV感染により、有意に増加した遺伝子を149個、有意に低下した遺伝子を16個認めた。2.IFN投与に伴う遺伝子発現の変化HCV非感染群において、IFN投与後、投与前に比べ、有意に増加した遺伝子を80個、有意に低下した遺伝子を29個認めた。増加した遺伝子には既報のIFN誘導遺伝子以外の遺伝子も多く含まれていた。3.HCV感染に伴う、IFN投与による遺伝子発現の変化IFN投与後、HCV感染群において、HCV非感染群に比べ、有意に増加した遺伝子を27個、有意に低下した遺伝子を68個認めた。HCV感染やIFN投与により多くの遺伝子の発現が低下または増加することが確認された。さらにはIFN投与後、HCV感染群では非感染群に比べ95個の遺伝子の発現が増加または低下していた。もし、これらの遺伝子発現の変化がIFNの治療効果と関連があるのであれば、これらの遺伝子を阻害または過剰発現させることによりC型慢性肝炎患者に対するIFN治療効果を増強させ得る、さらには新薬の開発へと発展され得る可能性がある。今後、HCV培養細胞系やHCV感染マウスを用いてこれらの遺伝子の機能解析を行っていく。昨年度に引き続き、ヒト肝細胞キメラマウスを用いてC型肝炎ウイルス(HCV)感染マウスを作製し、インターフェロン(IFN)-αの投与によって生じるヒト肝細胞の遺伝子発現プロファイルの変化について、マイクロアレイ法とRT-PCR法にて解析を行なっている。

HCV感染に伴ってIFNによる誘導が減少していることが考えられた。感染によって誘導が減少している遺伝子が治療効果と関係すれば、新薬の開発へと発展されうる可能性があり、今後もこれらの遺伝子の解析を行なっていく予定である。
日本産サワガニ自然集団における遺伝的多様性

日本産サワガニ類にはこれまで3属15種(未記載種を含む)が知られている。そのほとんどが琉球列島の島々に生息しているが、琉球列島全域に分布している種は無く、それぞれの種は比較的近接した島々の狭い範囲に限定されて分布している。このような分布様式は、日本産サワガニに種分化と琉球列島形成との密なかかわりを予想させる。本研究では15種すべてについてmtDNAND2遺伝子領域(1,000-1,011bp)の塩基配列を決定し、それを基に種内地域集団間、種間、属間の遺伝的分化と系統関係を推定した。陸橋化、分断化を繰り返して現在に至った琉球列島形成についての地質学的知見を併せて、日本産サワガニ類の進化過程を考察した。塩基配列から構築した分子系統樹上で、サワガニ属を構成する11種は明瞭なクラスターを構成したが、ミナミサワガニ属3種の単系統性は確認できなかった。従って、サワガニ類の各属の分岐順序について未解明の部分が残るが、Ryukyum属、ミナミサワガニ続がサワガニ属に先立って分岐したことは結論してよいと思われた。サワガニ属の11種は系統樹上で4つの明瞭なクラスターを形成した。分子時計を適用し、それらを導く進化系統は200-250万年前に分岐したことが推察された。当時の琉球列島は大陸から離れて現在の北、中、南琉球に相当するいつかの陸塊に分かれていたと考えられている。従って、サワガニ属の主要な進化系統の分岐は海による地理的隔離が主要因になってもたらされたものと推察された。その後200から100万年前に琉球列島、大陸から連なる陸橋となったが、各陸塊で分化を遂げた集団はそれと共に分布拡大、適応放散を遂げ、現在のサワガニ属の多様な種が分化していったと考えられる。神奈川県とその近郊では、体色の異なるサワガニ集団(DA:黒褐色型とBL:青色型)が狭い混生域を境に即所的に分布している。遺伝的に異なる集団の混生域では、様々な進化上の出来事が生じてきたと考えられ、重要な研究対象である。本研究では、神奈川県の一つの河川である日向川に沿ったおよそ3kmの幅の16地点と、東北から九州に至る全分布域を網羅した合計144地点について体色変異、アイソザイム変異分析を行った。その結果、次のような知見を得た。日向川では神奈川の他の河川と同様に、上流にDA、下流にBLが分布しており、両者の混生域は1kmの幅のごく狭い地域に限定されていた。アイソザイム分析結果の詳細な検討から体色個体間に交雑が生じていることが確認された。体色個体間の生殖的隔離機構の発達を検討した結果、雑種の生存力の低下などの顕著な交配後隔離機構の発達は認められなかったが、交雑域で任意交配が成立していないことを示唆する結果も得られ、なお詳細な検討が必要と思われた。神奈川県以外でBL型は四国、九州の限定された地域にも非BL型と分布を違えて生息しているが、アイソザイム分析の結果から、それらの地域のBL型と非BL型との間には顕著な遺伝的分化が生じていないことが判明した。本州では、分析したアイソザイム遺伝子座は神奈川県を中心にした体色変異集団の交雑域においてのみ著しく多型的であり、他の広い地域では同一の対立遺伝子にほぼ固定しているという極めて特徴的な様相を呈していた。

本研究で調査したアイゾザイム変異分析結果と、繰り返された氷期による気候、植物相の変動などの資料から、現在のサワガニ集団の特異的な遺伝構造が形成されるに至った過程を考察することが出来た。神奈川県とその近郊では、体色の異なるサワガニ集団(DA:黒褐色型とBL:青色型)が狭い混生域を境に側所的に分布している。Aotsuka et al.(1995)はアイソザイム分析によって両体色集団間に著しい遺伝的分化が生じていることを報告した。しかし、少ない遺伝子座数による分析に止まっており再検討が必要と思われる。本研究では、mtDNA ND2領域の塩基配列とAmy遺伝子座の変異を指標に南関東に生息する体色集団の遺伝的変異性および体色集団間の遺伝的分化、さらに、混生域での遺伝的構成を調査した。BL集団4地点、DA集団7地点混生域1地点から採集した合計70個体についてND2領域427bpの塩基配列を決定した。その結果、塩基配列の異なる14のハブロタイプが識別された。これらのハプロタイプは遺伝子系統樹上で明瞭な2つのクラスターを構成した。それぞれのクラスターとそれを構成する個体の体色には完全な関連が認められ、体色集団間に大きな遺伝的分化が生じているというアイソザイム分折結果を支持した。神奈川県日向川では神奈川の他の河川と同様に、上流にDA、下流にBLが分布しており、両者の混生域は約1kmの幅のごく狭い地域に限定されている。これまでのアイソザイム分折結果の詳細な検討から体色個体間に交雑が生じていることが確認されているが、異なる体色個体間で任意交配が成立していないことを示唆する結果も得られている。本研究では混生域から、合計98個体について、mtDNAハプロタイプ、Amyアイソザイム遺伝子型、体色型を分析し、体色の異なる個体間の生殖的隔離機構の有無についてさらに詳細な検討を行った。その結果mtDNAハプロタイプとAmy遺伝子型は必ずしもランダムに組み合わさっていないことが判明した。この結果は、遺伝的に異なる体色集団の混生域では、両者が出会って間もないために遺伝的に未だ融合していないか、初期的な生殖的隔離機構が成立していることを示唆する。日本産サワガニ属(Geothelphusa)には11種が確認されており、その多くは琉球列島の島々に分布している。琉球列島全域に生息する種は無く、ほとんどの種の分布は比較的近接した2,3の島に限定されている。このような分布様式は、日本産サワガニ属に種分化が琉球列島の形成過程における島の分断と密に関わってきたことを予想させる。本研究では11種すべてについて、mtDNAND2遺伝子領域(1,008-1,011bp)の塩基配列を指標に、種間、種内集団間の遺伝的分化、種間系統関係を推定し、それらの結果と琉球列島の陸橋化、分断化等の形成過程に関す地質学的知見とを併せてサワガニ属の進化過程を考察した。分子系統樹上でほとんどの種は単系統的にまとまり、これまでの分類体系が支持された。しかし、サワガニ(dehaani)で識別された塩基配列の大きく異なるハプロタイプから成る5つのクラスターは、異種のサカモトサワガニ(sakamotoana)のクラスターを含んで単系統群を形成した。また、mineiiは、石垣島、西表島に生息し、最近まで台湾に生息するタイワンサワガニと同種とされていたものであるが、mtDNA塩基配列での両者の差異は僅かであり、他種での集団間分化程度であった。11種は系統樹上で4つの明瞭なクラスターに別れて位置付けられた。分子進化速度から、それらが分岐したのは200から300万年以前と推定されたが、その当時の琉球列島は大陸から離れて、現在の北、中、南琉球相当するいくつかの陸塊に分かれていたと考えられる。
CD38欠損マウス外分泌腺細胞でのアゴニスト誘起性カルシウム応答の解析

外分泌腺細胞におけるcADPRの生理的重要性を見る事を主眼とし、平成13年度は顎下腺にてCa流入でのcADPRの役割を検討した。外分泌腺のCa流入は小胞体のCaが枯渇すると活性化される。CaプールはIP3とryanodine感受性の2種存在する。Ca流入における各プールの役割を見る為にCD38ノックアウトマウス(KO)を用いてACh刺激に応答するプールの分離・再構築を行った。細胞内のcADPRは存在しACh刺激で更に増加したが、KOでは検出されなかった。細胞内IP3量は刺激により増加し両タイプでの差はなかった。外液Caはそれらの産生に影響しなかった。パッチクランプ法によりCa machineryは両タイプに差がないことが分かった。外液無Ca下での正常のACh濃度-反応曲線は2相生で、低濃度側では緩やかで(第一相)100nMを境として急峻な勾配に変化した(第2相)。KOの第1相は正常と似ていたが第2相を欠いていた。これは第1相はIP3感受性プールからのCa放出、第2相ではryanodine感受性プールからの放出が加わる事を示唆する。外液Ca下で曲線は1相性になりKOも正常と一致した。外液Ni下では無Caの結果を再現した。外液無Ca下でACh高濃度刺激後KOは正常に比べ大きい流入を示し、再度刺激による反応は増加し正常と似たものになった。ryanodine処理細胞ではKOの結果を再現した。低濃度ACh刺激によるCa流入は両タイプに差はなかった。Xestospongin C処理ではAChの濃度に拘わらず流入は抑制された。以上の結果によりiCa流入はIP3感受性プールの枯渇に依存して増大するが、ryanodine感受性プールの枯渇が更に加わっても大きな影響はない。しかしryanodine感受性プールからのCa放出が阻害されるとCa流入は顕著な増加をする事が分かった。申請者らはCD38ノックアウトマウス(KO)を利用することにより、cADPRの外分泌腺細胞における生理的重要性を決定することを主眼とした。cADPRはCa動員物質である。Ca動員には細胞内プールからのCa放出と形質膜を通って流入するCa流入の2種がある。平成12年度はCa放出に焦点をあてた。まず、バックグランドを固める実験から行った。膵腺腺房細胞内のcADPR量は、正常では静止状態でも生成され、かつACh刺激により増加したが、KOでは検出されなかった。一方、細胞内IP3量は刺激により増加したが、両タイプでの差異は認められなかった。パッチクランプ法による細胞内cADPR、IP3、Ca投与では正常とKO両者共にCa依存性Cl電流の応答を誘起したので、Ca反応machineryには差異が見られないことが分った。この一連の実験でノックアウトマウスが真にcADPRのネガテイブコントロールとして使える事が証明された。fura-2を負荷した細胞を用いた蛍光顕微測光法により、AChにより誘起されるCa応答をAChの濃度を10-2000nMまでの範囲で測定し、正常とKOで比較した。正常の濃度-反応曲線は400nMを境に2相に分かれたが、KOの曲線はこの2相が両者共に抑制されていた。正常細胞は第一相でCa oscillationを示したが、KOではそれが著しく損なわれていた。第二相ではどちらのタイプの細胞もphasicな反応を示した。正常の第一相はリアノジンによって完全に抑制されたが、第二相では抑制されなかった。第一相は少なくともリアノジン感受性プールからのCa放出と示唆された。以上の結果から、膵腺腺房細胞でのACh刺激で誘起されるCa oscillationの機構には、リアノジン感受性プールからのCa放出に拘わるcADPRが決定的に関与していることが示唆された。

Xestospongin C処理ではAChの濃度に拘わらず流入は抑制された。以上の結果によりiCa流入はIP3感受性プールの枯渇に依存して増大するが、ryanodine感受性プールの枯渇が更に加わっても大きな影響はない。しかしryanodine感受性プールからのCa放出が阻害されるとCa流入は顕著な増加をする事が分かった。
生体分子の人口細胞型集合体による物質輸送過程の制御と調節

1.はじめにー主な研究費補助金の使途等について。本研究費補助金により示差走査熱量計(島津製作所製DSCー50)を購入した。熱量測定による物質の相挙動の解明は、材料開発を始め多くの分野で有力な研究手段であり、本研究に於いても生体分子の集合体形成や人工細胞型機能材料としての特性の検討に有効であった。2.今年度中に得た具体的成果並びに途中経過について。(1)生体弾性線維蛋白質エラスチンの集合体:大動脈等の組織の驚異的弾性発現の主役である蛋白質エラスチンが、温度依存性コアセルベーションにより集合体を形成する事に注目し、新規生体機能材料としての展開を検討した。エラスチン可溶化処理物を用い蛋白質液体膜としてのイオン透過特性やコアセルベート液滴安定化の条件に関する測定を行い、不明な点の多いエラスチンコアセルベート物性の一端を明らかにした。(2)イオノフォア活性を有する生体界面活性物質逆ミセルによる液体膜輸送過程の高次制御:2本鎖をもつリン脂質は1ーオクタノールを溶媒とする液体膜中で、直径約0.1μmの逆ミセル様集合体として陽イオン選択性イオノフォアとして機能している。単一分子型のイオノイフォアに対し、温度や水含有量等の集合体挙動に影響を与える因子に基づいた高次の透過特性制御が分子集合体型イオノフォアでは可能であった。(3)光重合成リン脂質とイオノフォアを用いた二重膜の透過性評価:電位応答性ベシクルの実現を目指し、パッチクランプ法によりイオノフォアを組込んだ重合二重膜のイオン透過特性を検討した。二重結合導入による炭化水素鎖配向の乱れ等の重合過程自体について検討の要がある。3.反省と今後の展望について。今回用いた生体由来分子は本質的に備わる生体適合性や特異な集合体形成能に基づき人工細胞型生体機能材料としての展開が有望である。