hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オーダーメイド治療を目指した日本人白血病細胞株バンクの整備と抗がん剤感受性の解析

解析:72株の日本人由来BCP-ALL細胞株において、小児ALLに対する基本薬8剤(ステロイド・ビンクリスチン・ダウノルビシン・ロイナーゼ・エンドキサン・キロサイド・メトトレキセート・ロイケリン)に対する感受性を解析してデータ・ベースを構築し、同一の72株を対象にした遺伝子多型(SNP)の網羅的アレイ解析のデータ・ベースと連結化した。その結果、小児ALLに対する基本薬8剤の感受性に関するGWAS解析を行うことが可能になった。3.ゲノム編集技術を活用した薬剤感受性遺伝子およびSNPの解析体制の構築;CRISPR-Cas9によるゲノム編集技術を活用して、白血病細胞株において解析対象の遺伝子をノック・アウトさせて薬剤耐性への関与を検証する実験系を確立した。また、CRISPR-Cas9と相同組み換えを活用して、白血病細胞株において遺伝子の変異や多型を導入して薬剤耐性への関与を検証するための実験系を確立した。4.個別化治療を目指したASNS遺伝子のメチル化状態の評価;ALLに対する中心的な化学療法剤の1つであるロイナーゼ(L-asparaginase)に対する感受性が、ALL細胞におけるASNS遺伝子のメチル化状態と強く相関し、ALL細胞のASNS遺伝子のメチル化状態が、各症例のロイナーゼ感受性を予見する指標となりうることを明らかにして、将来的に個別化治療へと発展させうる可能性を見出した。2.日本人由来のB前駆細胞型ALL細胞株の72株を対象に行ったGWAS解析のためのSNP array解析の結果を二次利用し、各細胞株によるarray CGH解析によるdigital karyotypingを行った。その結果、TCRおよびIg遺伝子再構成に伴う欠失も検出できる高精度でゲノムの増幅・欠失をデータ・ベース化することが出来た。3.次世代シーケンサーによってゲノムの変異解析を行った。このうち、代表的な予後不良因子であるTP53遺伝子変異において、MDM2阻害剤に対する感受性との関連性を確認し、薬剤感受性解析における細胞株バンクのモデル実験系としての有用性を明らかにすることができた。4.薬剤感受性との関連性が示唆されたSNPを細胞遺伝学的に検証するために、CRISPR-Cas9を用いた相同組み換えによるゲノム編集技術を応用して、SNP型の組み換えを試みたが、成功しなかった。その背景として、白血病細胞株における相同組み換えのための遺伝子修復機構の破綻が考えられた。そこで、PARP1阻害剤に対する細胞株の感受性を指標に、相同組み換えのための遺伝子修復機構を機能的に評価したところ、相同組み換えに失敗した細胞株はいずれもPARP1阻害剤に高感受性であることが判明した。そこで、PARP1阻害剤に耐性を示し、相同組み換えのための遺伝子修復機構が機能的に保たれていると想定される細胞株を対象として、改めてゲノム編集技術による遺伝子への変異導入を試みたところ成功した。
ヘルペスウイルス感染に伴う宿主への影響の評価

ヘルペスウイルス感染症の皮膚病変部ではウイルスは複製しやすい環境の維持と発現する抗原を最小限にするなど宿主に認識されにくい環境を形成している.一方,宿主はウイルスを排除するために細胞傷害性T細胞を中心とした炎症細胞の浸潤・ウイルス感染細胞の細胞死(アポトーシス)の誘導をきたす.健常人では両者のバランスにより,限局した小水疱を形成している.免疫抑制状態では宿主側の反応が弱くなり,大型の水疱など重症化をきたす.ヘルペスウイルス感染症の皮膚病変部ではウイルスは複製しやすい環境の維持と発現する抗原を最小限にするなど宿主に認識されにくい環境を形成している.一方,宿主はウイルスを排除するために細胞傷害性T細胞を中心とした炎症細胞の浸潤・ウイルス感染細胞の細胞死(アポトーシス)の誘導をきたす.健常人では両者のバランスにより,限局した小水疱を形成している.免疫抑制状態では宿主側の反応が弱くなり,大型の水疱など重症化をきたす.1)ヘルペスウイルス感染に伴う宿主側の防御反応の解析:単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘・帯状疱疹ウイルス(VZV)感染における宿主細胞の細胞内シグナル変化について検討した。HSVが宿主細胞に感染すると、宿主のDNAダメージシグナルが強く誘導された。一方、VZVが宿主細胞に感染すると、宿主のDNAダメージシグナルを抑制させるメカニズムが認められることが判明した。つまり、これらのシグナルによってHSV,VZVの効率的なウイルス複製が維持される。2)ヘルペスウイルス感染と皮膚局所における樹状細胞の動態の解析:単純疱疹(HSV感染症)、帯状疱疹(VZV感染症)の皮膚病変部の組織を用いて、検討した結果、病変部のランゲルハンス細胞は単純疱疹・帯状疱疹ともに正常皮膚より減少していることが分かった。つまりウイルスが宿主の免疫に認識されにくいメカニズムを局所的に作り上げていることが考えられた。3)健常者,免疫抑制患者間での宿主免疫応答・増悪因子の解析:単純疱疹・帯状疱疹の皮膚病変部の組織を用いた検討において、免疫不全者は健常者と比較してアポトーシスの機構不全があることが示唆された。また免疫不全者は健常者に比べ、皮膚病変部に炎症細胞浸潤が少ない上に、細胞障害性T細胞(CTL)の浸潤割合が低いことが判明した。つまり、免疫不全状態では、アポトーシス誘導因子およびCTL関連細胞傷害性分子の発現低下が認められており、これらの原因により病変が拡大、重症化し、難治の原因となることが考えられた。EBVの潜伏感染からの再活性化(溶解感染)は予後不良の疾患群の病変部組織で誘導されるが、EBV関連リンパ増殖症の多くは再活性化過程が途中で阻止されるためウイルス粒子として産生されない.これは強い抗原性をもつ溶解感染関連蛋白に対する細胞傷害性T細胞(CTL)が病変部に浸潤してくることが一つの要因である.また、CTL浸潤に関連したサイトカインにより伝染性単核症類似の全身症状を引き起こす.潜伏感染の維持に関して、LMP-1発現のon/offを同一個体の中で調節されており、宿主免疫に認識されにくいメカニズムを形成している.2単純ヘルペスウイルス(HSV)と水痘・帯状疱疹ウイルス(VZV)の免疫回避機構の解析HSV感染によりATMとH2AXのリン酸化が惹起され、二本鎖DNA損傷(DSBs)シグナルが誘導される.このシグナルがHSV複製に必要であるが、途中でDSBsシグナルが阻害されるためアポトーシスに至らない.VZV感染では効率的なウイルス複製を得るためにDSBsシグナルの誘導自体を阻害し、アポトーシスを抑制する.病変部におけるCTL浸潤の程度は宿主免疫状態と比例することが判明し、遺伝子発現解析で、免疫不全者はアポトーシスの機構不全(特にBax/Bcl-2・Fas/FasL)をきたす.つまり、HSV、VZVはウイルス複製を効率よく行うために、ウイルス粒子を産生するまではアポトーシスを起こさないようにDSBsシグナルをうまく調節している.免疫不全状態では、アポトーシス誘導因子およびCTL関連細胞傷害性分子の発現低下により病変の拡大や難治性をきたす.サンプル採取、サンプルを用いた解析などは順調に行えており、データ解析、総合的な評価を残す状態となっている。24年度が最終年度であるため、記入しない。サンプル採取はほぼ終了しているため、今後はデータ解析が主体となる。また、データ解析時に新しく得られた知見に関しては、さらに研究を新しく進めていく。
クチコミの経済的価値に関する研究

本研究の目的は、顧客の購買行動の分析に社会的な要因を組み込むことによって、各顧客とその顧客が持つ友人・知人ネットワークの経済的価値を測定することである。顧客はクチコミを発信し、新しい顧客を企業にもたらす。こうした友人招待は、多くのビジネスにおいて推進力となっている。本研究の成果としては、クチコミが新規顧客獲得にもたらす影響の検討、クチコミが広まりやすい環境の分析、クチコミのプラットフォームとしてのソーシャルメディアへの理解、ソーシャルメディア上の行動の価値測定と、行動促進要因の検討が挙げられる。本研究の目的は、消費者の購買行動における対人影響のメカニズムを解明し、クチコミの経済的価値を明らかにすることである。平成24年度の研究実績は以下のとおりである。2.山本晶「経営を読み解くキーワードソーシャルメディア」,『一橋ビジネスレビュー』, 60(1), 90-91, 2012年6月.3.山本晶・松村真宏「ソーシャルメディア上のエンゲージメント価値の測定」,『日本マーケティング・サイエンス学会第91回研究大会』, 2012年6月.1においてはペイドメディアとアーンドメディアの顧客獲得への効果を検討し、クチコミ受発信が行われる場としてのアーンドメディアの価値を検討した。2においてはクチコミの受発信が行われるソーシャルメディアの学術的な定義を明らかにし、活発なクチコミ行動が行われる条件について論じた。3においてはエンゲージメント行動の価値測定の方法を提案した。本研究における「エンゲージメント」とは、サイトとそこに集まるユーザーへの積極的な関与を示す行動を指し、具体的にはコミュニティをつくる、ブログを書く、記念写真を撮影するなどの活動で測定する。そして、エンゲージメント価値EVはユーザーのサイトにおける各活動の総和として定義する。エンゲージメント価値の測定においては、顧客一人の価値に注目するのではなく、顧客のネットワークにも着目し、ソーシャルネットワーク上の友人の価値を含めた各顧客のエンゲージメント価値の測定を目指した。本研究の主題であるクチコミは、消費者の自発的参加行動の一形態である。平成25年度はクチコミを含めた消費者の自発的参加行動のメカニズムに関して検討を進め、論文や学会発表としてその成果を発信した。自発的参加行動を説明する新しい概念として、仕掛学がある。研究成果1では消費者による自発的参加行動を仕掛学とマーケティングの接点で捉えなおし、整理した。また、研究成果3では、自発的参加行動をブランド・リレーションシップ、行動経済学、ヒューマンコンピュータインタラクションといった既存研究の理論的枠組みのなかで位置づけ、自発的参加行動の発生要因に関する理解を深めたうえで、カンヌ国際クリエイティビティアワードの受賞作品から、企業のマーケティング活動としての仕掛の分類を試みた。最後に、インターネット上のクチコミの経済的価値を測定する上で、ウェブ上の大量の行動履歴データの分析は不可欠である。研究成果2ではクチコミの経済的価値の測定のアプローチとして大量データの分析に言及し、マーケティング活動への応用について述べた。研究成果1:山本晶「マーケティングと仕掛学」『人工知能学会誌』28(4) 601-606, 2013年7月研究成果2:山本晶「ビッグデータでマーケティング手法は変化するのか」『季刊企業経営』(123) 8-11 2013年7月研究成果3:山本晶「消費者の自発的参加行動を促すメカニズムに関する考察」『第46回消費者行動研究コンファレンス』2013年6月3日本研究の目的は、顧客の購買行動の分析に社会的な要因を組み込むことによって、各顧客とその顧客が持つ友人・知人ネットワークの経済的価値を測定することである。こうした友人招待は、多くのネットワークビジネスにおいて推進力となっている。本研究ではクチコミによって新規顧客獲得をもたらす顧客に着目するものである。平成24年度は、論文を執筆する過程で対人影響に関するマーケティングおよび消費者行動の分野の文献サーベイを実施することができた。また、クチコミとマーケティング活動の相互作用と新規顧客獲得に関する実証分析(研究成果1)においては、本研究の主題であるクチコミの経済的価値とROIを検証した。また、研究成果2においてはエンゲージメント価値に取り組むことができた。平成25年度はさらにクチコミの経済的価値に関する研究を進め、国内外で発信する予定である。研究成果2:山本晶・松村真宏「ソーシャルメディア上のエンゲージメント価値の測定」,『日本マーケティング・サイエンス学会第91回研究大会』,2012年6月.今後は先行研究から得られた知見をもとに本研究の仮説を精緻化し、調査・実験を行う。調査の実施にあたっては、量的調査のみならずインタビューなどによる質的調査も実施し、相互に分析結果を補完できるような工夫を施す。こうした質的調査は消費者の購買意思決定における心理的側面を把握するためにも必要となる。また、クチコミを含めたエンゲージメント行動の促進要因について、更なる検討をすすめる。調査から得られた知見を用いて、クチコミ行動を含めた各消費者のエンゲージメント行動の経済的価値と企業のマーケティングROIをシミュレートする。

この際に、工学の分野の研究協力者を募る。こうした異分野の研究者との共同研究は、応募者の過去の研究(科研費若手(B)課題番号20730284)でも行っている。本研究では工学系の高度なシミュレーション分析とマーケティングの消費者行動分析を組み合わせることによって、クチコミ伝播のメカニズムと消費者の購買行動を把握し、クチコミおよび顧客の価値と、それによってもたらされる企業のROIを予測するモデルを目指す。こうした研究成果は日本国内のみならず、国際会議や学術誌において発信していく予定である。今後は先行研究から得られた知見をもとに本研究の仮説を精緻化し、調査・実験を行う。調査の実施にあたっては、量的調査のみならずインタビューなどによる質的調査も実施し、相互に分析結果を補完できるような工夫を施す。こうした質的調査は消費者の購買意思決定における心理的側面を把握するためにも必要となる。調査から得られた知見を用いて、クチコミ伝播とマスメディアの役割を考慮したシミュレーション・モデルを構築し、メディアから各消費者への影響と、消費者間のクチコミの影響をモデル化したうえで、各消費者の経済的価値と企業のマーケティングROIをシミュレートする。次年度も調査・実験を設計するため、引き続き先行研究サーベイを行う。これにより、既存手法の優れた点を本研究に取り入れ、既存手法の課題を発見し、本研究で解決する糸口とする。したがって、文献の購入や国内外の学会、研究会における情報収集が必要となる。また、質的・量的調査の設計を行うに当たってコンピュータ、ソフトウェア、プリンタが必要となる。さらに、実務的貢献の高い量的調査を行うためには調査に協力する企業が不可欠である。こうした企業とのやりとりのために事務用品などの消耗品のほか、会議費、通信費、複写費などの費用に研究費を使用する。さらに、先行研究から得られた知見をもとに本研究の仮説を精緻化し、調査・実験を行う。このため調査回答者への謝金や、記録用機器が必要となる。
生活習慣病遺伝子からみたモンゴロイドの自然史

アジア・太平洋地域の人類集団について、糖尿病・肥満・高脂血症・高血圧症などとの関連が指摘されている遺伝子多型の分布および生物学的意義を調査したところ、太平洋地域の人類集団では、インスリン抵抗性や肥満と関連する遺伝子多型が他の人類集団よりも高頻度で見いだされ、また、モンゴル人やチベット人などの中央アジアの人類集団では、遊牧生活に伴う高脂肪食に適応的であると考えられる遺伝子多型の蓄積が確認された。モンゴロイドにおける新規生活習慣病感受性遺伝子を検索する目的で、小胞体ストレス反応関連分子を含む多数の遺伝子座について、モンゴル人における2型糖尿病との関連性を調査した。その結果、FATP4遺伝子ならびにACSF2遺伝子領域内の一塩基多型(SNP)が、患者群-対照群間で有意な頻度の差を示した(P<0.005)。また、ACSF2遺伝子の当該SNPの遺伝子型は、健常者集団におけるインスリン抵抗性(HOMA-IR)との相関を示した(P<0.05)。さらに、HapMap計画で得られた4民族集団のゲノムワイドなSNP遺伝子型データに対して、VoightのiHS統計量を用いたテストを行った結果、これら二つの遺伝子を含むゲノム上の領域に、Recent positive selectionが作用した可能性が示された。上記2遺伝子はともに脂質代謝に関与していると考えられており、モンゴロイドにおけるいわゆる倹約遺伝子の候補のひとつであると考えられる。アジア・太平洋地域の5民族集団(モンゴル人、中国人、日本人、タイ人、パラオ人からなる計1878人)について、生活習慣病との関連性が指摘されている既知の106遺伝子多型の遺伝子型判定を行い、その分布比較を行うことによって、民族特異的な代謝特性の遺伝的背景の調査を行った。その結果、インスリン抵抗性と関連するTRIB3 Gln84Argバリアントが、パラオ人において高頻度で存在していることが明らかになった。ミクロネシア・ポリネシア地域の諸民族では2型糖尿病の発症率が非常に高いことが知られており、TRIB3 Gln84Argはその遺伝的背景の一端を担っているものと考えられる。アジア・太平洋地域のモンゴロイド集団の適応放散と生活習慣病関連遺伝子の多様性との関連性を探る目的で、脂質の代謝に関連する遺伝子に着目した解析を行った。第1段階として、日本人約21,000人分のDNA試料を用いて、これまでに血清脂質量との関連が指摘されていた16の遺伝子の単一塩基多型(SNP)と表現型との相関を再検証し、アジア人において血清脂質量の集団内変動に確実に影響を与えている座位を選定した。アジア・太平洋地域の5人類集団2, 311人について、これらの多型の分布調査を行ったところ、血中トリグリセリド量を強く支配するMLXIPL遺伝子のGln241His多型が、集団間で特徴的な頻度差を示すことが明らかになった。低い血中トリグリセリド量と関連するms型対立遺伝子は、モンゴル人において特に高い頻度で存在し、パラオ人では極めて希であった。Gln241Hisの遺伝子型は上記5集団中においても血中トリグリセリド量と強い相関を示した。さらにアフリカ人、ヨーロッパ系アフリカ人、中央・南・東・東南アジア人を含む14集団1,356人でのHis型対立遺伝子の頻度を調査したところ、モンゴル人に加えチベット人・ウイグル人などの遊牧を生業としてきた集団において高頻度で存在することが明らかになった。MLXIPLは肝細胞へのグルコースの流入を感知し、脂肪酸合成経路を亢進する転写因子である。His型では、グルコースを脂肪酸合成に利用する代謝経路が抑制されることによって低い血中トリグリセリド量と結びついていることが予想される。脂質がエネルギー源として優勢な遊牧民においては、グルコースは肝臓での脂肪酸合成に用いられるよりも、脳や赤血球などのエネルギー源として優先的に利用するという点で、His型に適応上の意義があったものと推測される。
ヒトレトロウイルス感染の疫学と病態

1.ロシア(カムチャッカ)カムチャッカ首府のペトロパブロフスクにあるカムチャッカ癌センターをベースにして、そこからヘリコプター、水陸両用車等を利用して少数民族の3部落エッソ、チゲル、セダンカを訪ね、診療所また各戸訪問して採血を行い、血液を持ち帰った。採血検体は以下のとおりである。エッソ185検体、チゲル138検体、セダンカ279検体またはペトロパブロフスク20検体の計622検体である。これらの検体はエベンキ、コリアク、イタルマンを主として、その他チュクカ、トクチャ、ラム-ト、アリュートといった少数民族からのものである。抗体検索の結果、1検体のみがPA、ELISAともに陽性であったが、Western blotではgag抗体のみが検出されたので、真性の陽性とは判定できなかった。但し、HTLV-1の変異株存在の可能性も考えられたので、PA、ELISA疑陽性のものも含め、現在、ウイルス分離とウイルス遺伝子の検出をPCRで行っている。またあわせてこれらのリンパ球のHLA検索を行っているところである。HIVについては全て陰性であった。2.ロシア(ウズベキスタン)タシケントにある免疫研究所の協力を得て、ブハラを中心にサマルカンドにおいて、長い間、イスラム世界で隔離されていたユダヤ人村で採血を行った。ブハラにおいてはユダヤ人241名(うち1名はmyclopathy患者)、ウズベキスタン人17名(うち15名はmyclopathyもしくは白血病患者)の計258名、またサマルカンドにおいてはユダヤ人20名、ウズベキスタン人1名の計21名、総計279名から採血し、血液を持ち帰った。抗体検索ではPA陽性1例、疑陽性4例がみつかったが、ウエスタンブロットでは4例がgagに反応した。このことから現在、ウイルス分離とPCRによるウイルス遺伝子の検出をHLA解析とともに行っている。3.中国(雲南省)雲南省昆明にある昆明ウイルス研究所をベースにして少数民族のイ族、タイ族、リス族、ナシ族、ミャオ族計150例の血清を採取した。その結果、いずれもHTLV-1、HIVともに陰性であった。また昆明ウイルス研究所に飼育されているアカゲザルから採血し、PAによる抗体測定を行ったところ6匹が陽性であり、そのうち5匹がWestern blotによる確認試験で陽性であった。また昆明郊外の西双版納にある中国霊長類センターでアカゲザル15匹から採血したところ、そのうち2匹がPA・Western blotで陽性であった。これらのことから現在、HTLV-1陽性のアカゲザル7匹のリンパ球から、ウイルス分離とPCRによるウイルス遺伝子検出を行なっている。4.タイ・マレーシア・シンガポール・インドタイ南部のリンフォーマの患者でWB陽性例がみつかった。現在遺伝子を抽出し、さらに家族より採血を計画している。マレーシアではポルネオ島のマレー領の先住民は2千人近くのスクリーニング(マラヤ大に協力)で全て陰性、以前に陽性だった華僑陽性例(WB)については病理標本よりDNA抽出を試みている。また、マレー半島の先住民の調査の糸口が見つかり、現地の医師団が採血に向かうことになった。インドでは、輸血によると思われる新たな陽性例が1例、アンドラプラデッシュ州で見つかった。シンガポール大学に保存されていたパプアニューギニアの試料、9地域1000検体をスクリーニングすることができ、9%の陽性率を見た。これらの試料からDNAを抽出し、そのウイルス間の系統関係に未だ不明の多いメラネシア型HTLVの研究に供する予定である。3.中国(雲南省)

雲南省昆明にある昆明ウイルス研究所をベースにして少数民族のイ族、タイ族、リス族、ナシ族、ミャオ族計150例の血清を採取した。その結果、いずれもHTLV-1、HIVともに陰性であった。また昆明ウイルス研究所に飼育されているアカゲザルから採血し、PAによる抗体測定を行ったところ6匹が陽性であり、そのうち5匹がWestern blotによる確認試験で陽性であった。また昆明郊外の西双版納にある中国霊長類センターでアカゲザル15匹から採血したところ、そのうち2匹がPA・Western blotで陽性であった。これらのことから現在、HTLV-1陽性のアカゲザル7匹のリンパ球から、ウイルス分離とPCRによるウイルス遺伝子検出を行なっている。4.タイ・マレーシア・シンガポール・インドタイ南部のリンフォーマの患者でWB陽性例がみつかった。現在遺伝子を抽出し、さらに家族より採血を計画している。マレーシアではポルネオ島のマレー領の先住民は2千人近くのスクリーニング(マラヤ大に協力)で全て陰性、以前に陽性だった華僑陽性例(WB)については病理標本よりDNA抽出を試みている。また、マレー半島の先住民の調査の糸口が見つかり、現地の医師団が採血に向かうことになった。インドでは、輸血によると思われる新たな陽性例が1例、アンドラプラデッシュ州で見つかった。シンガポール大学に保存されていたパプアニューギニアの試料、9地域1000検体をスクリーニングすることができ、9%の陽性率を見た。これらの試料からDNAを抽出し、そのウイルス間の系統関係に未だ不明の多いメラネシア型HTLVの研究に供する予定である。
ガーリックオイルの主要成分と生体防御系機能との関連

ガーリックには抗がん作用、交感神経亢進作用、抗炎症作用、免疫調節作用等の生理・薬理効果が報告されているが、免疫調節作用については不明な点が多い。この点を明確にすることは栄養生理学や健康科学の側面からみて極めて重要である。本年度は、免疫機能を担う各種白血球系細胞数の動態に及ぼすガーリックの脂溶性の主要含硫化合物・diallyl disulfide (DADS)の影響を検討した。12時間絶食した10週齢雄性ラットにDADS(0, 10, 20,40mg/kg体重)を経口投与し、投与0,1,2,4,6時間後に尾静脈より採血し、各種白血球系細胞(総リンパ球・単球・好中球・好酸球・好塩基球)を、投与4時間後にリンパ球のサブセット(Tリンパ球・Bリンパ球・NK細胞)の数を各々測定・解析した。さらに、投与2時間後に血漿コルチコステロン濃度を測定した。その結果、DADS投与により総白血球、総リンパ球および単球の各数は投与量に比例して低下したが、顆粒系の細胞数には変動がみられなかった。また、リンパ球系のサブセットのうちTリンパ球とBリンパ球の数はDADSの投与量に比例して低下したが、NK細胞数は変化しなかった。一方、血漿コルチコステロン濃度はDADSの投与量に比例して有意に上昇した。これらの結果より、DADS投与による血漿コルチコステロン濃度の上昇は交感神経活動の亢進に伴う視床下部-下垂体-副腎系の内分泌応答カスケードの活性化によると推定できる。また、血中の白血球系細胞数の動態はグルココルチコイドによって調節されていることから、DADS投与後のTリンパ球・Bリンパ球及び単球の各数の低下作用は血漿グルココルチコイド濃度の上昇を介した現象であると推定できる。以上より、DADS投与によってラット血中の獲得免疫を担う総リンパ球とサブセット及び単球の各数が投与量に依存して低下したと結論付けられる。研究計画が妥当であり、現在まで研究が概ね順調に進展している。しかし、平成25年度には亜急性実験を予定しており、それに用いる各種の含硫化合物を購入するため、費用の一部を次年度に繰り越した。平成25年度については、交付申請書の実施計画にしたがって行う予定である。現時点では、実施計画に沿って研究を遂行できる見通しを得ている。なお、研究代表者の立屋敷かおるが上越教育大学の理事・副学長に就任したが、従前の計画通り、実際の実験は研究分担者(今泉和彦)の所属する早稲田大学人間科学学術院で実施し、研究を遂行していく。遂行に際して、困難な問題はない。また、平成25年度に、平成26年度計画しているβ2アドレナリン受容体の遺伝子発現応答に及ぼすDADSの影響を予備的に検討する予定である。それに先立って、平成24年度にβ2アドレナリン受容体に関する総説を執筆・投稿した結果、日本体力医学会の英文誌(Journal of Physical Fitness and Sports Medicine)に掲載された。平成25年度は、各種の含硫化合物の投与量を変える亜急性実験を予定している。これらの実験に用いる試料や測定の試薬や消耗品類、動物飼育の謝金等が多く見込まれるため、昨年度繰越した研究費と併せて本年度の研究費として使用し、予定の研究を達成する予定である。
曲面の離散化と可積分系

平面内の折線に対して、その離散時間発展を考える。本研究では、差分コルテヴェーグ・ド・フリース方程式にしたがうような平面折線の離散時間発展を与え、それを周期性の観点などから観察した。詳しく述べる。以下では1次元格子から平面への写像を平面折線と呼ぶ。平面折線の"曲率"をKで表すと、Kは1次元格子上の函数となるが、離散時間発展によって2次元格子上の函数と見なすことができる。このとき、差分コルテヴェーグ・ド・フリース方程式の解が、函数Kと2次元格子の格子間隔(2つの定数)から定まるような3重対角行列の行列式の比として表示できる。ただし、この文脈で現れる差分コルテヴェーグ・ド・フリース方程式は、独立変数の取り方がいわゆる(廣田の)差分コルテヴェーグ・ド・フリース方程式とは少しく異なり、廣田氏の用語によれば「逆超離散箱玉系」とも呼ばれる2変数の差分方程式である。以上のことは、2次元格子の格子間隔をそれぞれ独立変数の任意函数にして議論しなおすことができ、その場合には、不等間隔差分コルテヴェーグ・ド・フリース方程式とその解の不等間隔差分による行列式表示が得られる。とくに平面折線が周期3をもつ(すなわち平面折線が3角形をなす)場合、周期性を保ったまま離散時間発展するためには、格子間隔が不等間隔でなくてはならず、このもっとも簡単な例によって不等間隔差分(あるいは差分商ともいう)の重要性が確認できる。一般に平面折線が周期性をもつとき、対応する不等間隔差分コルテヴェーグ・ド・フリース方程式の解もまた周期性をもつ(ただし両者の素周期が一致するとは限らない)が、この逆は成立しない。差分ソリトン方程式をさらに離散化することにより、独立変数と従属変数がともに離散の値をとるソリトン系が得られる(ような場合がある)。たとえば、廣田良吾と高橋大輔は2005年に出版された論文で、差分ツィツェイカ方程式を超離散化することにより超離散ツィツェイカ方程式を導いた。一方、差分ツィツェイカ方程式は差分アファイン球面を記述することが知られている(ボベンコとシーフによる1999年の論文)。そこで本研究では、超離散ツィツェイカ方程式に対応する"超離散アファイン球面"を定義すること、を目標とした。今年度の成果は、差分ツィツェイカ方程式の自明解が記述する差分アファイン球面を、通常の手続きによって超離散化したことである。これは、差分アファイン球面の超離散的な対応物が存在することの傍証である、とも期待できるが、しかし、一般の差分アファイン球面の超離散化の仕方は、まだ分からない(このことは超離散ツィツェイカ方程式のラックス表示すらも分かっていないことに対応していると思われる)。また、中心アファイン平面曲線の適当な発展はコルテヴェーグ・ド・フリース方程式を与える(ピンカールの1995年の論文)ことが知られているが、このことの差分化、すなわち差分コルテヴェーグ・ド・フリース方程式にしたがうような折線の離散時間発展、を得た。なお、超離散コルテヴェーグ・ド・フリース方程式も得られている(辻本諭と廣田良吾による1998年の論文)が、やはり、そのラックス表示は分かっておらず、これらの超離散ソリトン方程式に幾何的な解釈を与えるのは今後の課題である。詳しく述べる。
有機化合物の不斉結晶化に基づく不斉反応場の構築

1)不斉結晶化したベンゼンスルホンアニリドが不斉リガンドとして機能するかどうかについて、カルコンを基質とし、銅トリフラート触媒存在下、ジエチル亜鉛によるエチル基の付加反応をモデル反応として検証を行った。しかし、有意な不斉誘導は見られなかった。2)不斉結晶化を示す他のスルホンアミドの探索を行った。合成の原料として、ラセミ化の速度が遅くなり、また金属との配位能が高くなるようσ位にエーテル基などを持つ置換ベンゼンスルポニルクロリドおよび置換アニリンを原料とし、40種のスルホンアミドを合成した。その結果、不斉結晶化を示す化合物として新規に5種の化合物を得た。3)上記項目と平行して、より短時間で不斉結晶化を示す化合物の探索を行うことができるプロトコルの改良を行った。塩基として樹脂担持ピリジンを用いて縮合反応を行い、反応後ろ過により樹脂を取り除き、ろ液を撹拌下乾固させた後、生じた微結晶を少量とってKBr錠剤として固体CDスペクトル測定を行うことにより目的の化合物の迅速な探索が可能となっている。実際、12種類の組み合わせについて本操作を行ったところ、4化合物において分裂型のコットン効果がみられ、不斉結晶化していることを見出した。本項目について、現在投稿論文を作成している。4)結晶化の際不斉が誘起される条件について、円偏光の照射下、結晶のキラリティーに偏りがでるどうか検討を行った。これについては有意な差は得られていない。5)多くの芳香族スルホンアミドの結晶構造解析を行うなかで、芳香族スルホンアミドが例外なく普遍的に+synclinal型をとることを実証し、これにより第二級スルホンアミド結合を2つ持つ化合物が、結晶中で二重の水素結合による無限連鎖構造をとることを示した。本項目について、現在論文投稿中である。本年度は主にスルホンアミド結合を有する化合物について検討を行った。スルホンアミド結合は、医薬品や生体関連物質にしばしば見られる構造単位である。それらの立体構造は、活性発現において重要な因子の一つであると考えられるが、芳香族スルホンアミドの立体化学に関する詳細な研究は少ない。本研究から得られた結果により、まず、芳香族スルホンアミド化合物の立体化学を生理活性物質などの機能を持つ分子のデザインに適用することが可能となった。また、これまでの研究成果から予想されたように、o-phenylenediamineおよびanilineのスルホンアミド誘導体は芳香族アミドと同様、異常に高い確率で不斉結晶化を示すことがわかった。従ってこの骨格を用いることにより、不斉配位子としての「不斉結晶化を示す化合物」を効率的に合成することができるようになった。しかしながらこれらの骨格を持つ化合物がなぜ高い確率で不斉結晶化を示すかについては未だ明らかではない。さらに不斉結晶化という現象がどのように起こるかについても今後の課題である。不斉結晶化は結晶核形成過程における不斉増殖であると考えられる。不斉結晶化を示した芳香族スルホンアミド類のうちのいくつかは溶液中数分子のクラスター構造を形成していたことから、これらの化合物ではそのクラスター構造がすでにキラルであるということも考えられる。結晶のキラリティがどの段階で決まるのかについても含め、来年度の課題とする予定である。

そこでスルホンアミドをリガンドとしたより低温で進行する反応を調べると共に、不斉結晶化を示す他のスルホンアミドの探索を行った。合成の原料として、ラセミ化の速度が遅くなり、また金属との配位能が高くなるようo-位にエーテル基などを持つ置換ベンゼンスルホニルクロリドおよび置換アニリンを原料とし、40種のスルホンアミドを合成した。その結果、5種の化合物が新規に不斉結晶化を示す化合物として得られた。現在、これらが不斉リガンドとして機能するかどうかの検討を行っている。2)上記項目と平行して、より短時間で不斉結晶化を示す化合物の探索を行うことができるプロトコルの改良を行った。塩基として樹脂担持ピリジンを用いて縮合反応を行い、反応後ろ過により樹脂を取り除き、ろ液を撹拌下乾固させた後、生じた微結晶を少量とってKBr錠剤として固体CDスペクトル測定を行うことにより目的の化合物の迅速な探索が可能となっている。実際、12種類の組み合わせについて本操作を行ったところ、4化合物において分裂型のコットン効果がみられ、不斉結晶化していることを見出した。本項目について、現在投稿論文を作成している。3)結晶化の際不斉が誘起される条件について、円偏光の照射下、結晶のキラリティーに偏りがでるどうか検討を行った。これについては現時点では有意な差は得られていない。しかし、考え得る様々な条件について、統計的に有意な偏りを示し得るだけの数の固体CDスペクトルを測定することは個人では難しい。この点については、上記の不斉結晶化を示す化合物の効率的な探索法の開発に加え、さらに効率的なCDスペクトル測定用KBr錠剤の成型法を開発中である。
重水素化PAHの実験・観測・理論からの総合的アプローチ

本年度は「あかり」衛星の近赤外線スリット分光データの精度をあげることを目標に、データ整約手法の改善に取り組んだ。特に暗電流の評価を新しい手法で行い、検出器固有のパターンを除去し、分光スペクトル中の偽のフィーチャーの評価を行った。この手法により大幅に分光データの信頼性をあげることができた。この整約法を適用し、「あかり」衛星で観測されたオリオン星雲とM17の近赤外分光観測データを評価した。これらの領域はISOによる観測により、PADのバンドの存在が示唆されている。「あかり」はこれらの領域でPADのバンドは有意に検出されず、少なくともISOの結果より1/10以下の強度であることがわかった。しかし、これらの領域では電離ガスの輝線がPADのバンド位置と重なっており、その除去の精度に結果が依存する。このため、銀河面のスペクトルで、電離ガスからの輝線のみられない領域のデータを探し、PADのバンド強度を評価した。これらのスペクトルにも有意にPADのバンドはみられない。以上のデータを総合して、PADとPAHのバンド強度比は少なくとも3%以下であると結論した。この結果をPAH中の重水素比に焼き直すには、振動子強度比と励起状態を評価する必要がある。しかし少なくとも今回の結果は3.3μmバンドを放射しているバンドキャリア中の重水素が、紫外線観測から予想される3%よりも少なくとも1桁は少ないことを明確に示した。本結果は、3.3μmを放射していない大きなPAH中に重水素が大量に存在する可能性は否定できない。しかし,実験から予想される12-15μmのPADの構造が有意に検出されえていないことから、この可能性も低いと推定される。本年度はQCC製造装置の整備をまず行った。電気通信大学から移設した後、再設置を行い、空気を使用してマグネトロンが正常に発振すること、プラズマが生成されるところまで確認した。また重水素の割合を変えたメタンガスを用意し、次年度の実験に進める準備をほぼ整えた。一方、「あかり」の分光データ解析を進め、惑星状星雲のデータについては取得したデータの一次解析をほぼ終了し、50を超える惑星状星雲の3ミクロンのPAHバンドについての初めてのデータを得た。現在、さらに詳細な解析を進めている。これと平行して、分光データのスペクトルレスポンスの再評価を標準星の観測を用いて行った。この結果、ヘリウム消失後の感度が約30%落ちたことを確認するとともに、平滑化処理を効率的に行うことにより、波長分解能は劣化させずにS/Nを挙げるレスポンスカーブを導出した。新しいレスポンスカーブは、特に本研究で必要とする弱いバンドの検出に非常に有効であることを確認した。またスリット分光によるHII領域、原始星、PDR領域のデータ解析を行った。この結果、スリット分光では検出器の列の特性に関わる固定パターンが10%のレベルで生じる領域があることがわかった。この部分は、丁度重水素を含むPAHのバンドが期待される領域でもあるため、慎重な解析が必要である。現在この固定パターンを補正する手法の検討を進め、重水素化PAである可能性のあるバンドの検討を進めている。これまでのところ予想される範囲には有為なバンドが検出されていないが、さらに詳細な検討が必要である。
胸腺髄質上皮細胞による負の選択制御機構の解析

胸腺上皮細胞に発現するAire遺伝子の負の選択(自己反応性T細胞の除去)における役割を2種類の抗原モデルマウスを用いて検討した。胸腺上皮細胞が発現する抗原は、(1)上皮細胞自身によって自己反応性T細胞に提示される、もしくは(2)骨髄由来の抗原提示細胞(樹状細胞など)によって提示され、自己反応性T細胞を除去すると考えられている。今回の研究によって(1)の負の選択にはAireが必要なく、(2)の負の選択にAireが必要であることが示唆された。つまり、Aireは胸腺上皮細胞自体の抗原提示能には影響せず、抗原の受け渡し等のメカニズムを介して骨髄由来細胞の抗原提示を制御していると考えられる。AIREが負の選択機構に関わり、その障害が自己免疫病態をもたらすことに、もはや疑問の余地は無いが、そのメカニズムについては、依然、不明であると言わざるをえない。当初、AIRE欠損マウスの胸腺髄質上皮細胞(mTEC)では様々な自己抗原遺伝子(例:インスリン遺伝子など)の発現低下が観察されたことから、AIRE欠損に伴う負の選択の障害もAIREによる自己抗原遺伝子の発現低下によるものと考えられた。しかしながら、mTECでモデル自己抗原のovalbumin(OVA)を発現するトランスジェニックマウス(Tg)を用いた実験では、AIRE欠損状態でも、mTECにおける自己抗原(OVA)の発現低下は観察されなかった。さらに、私どもはAIRE欠損マウスにおける標的臓器の対応自己抗原を同定したが、その場合にもAIRE欠損マウスのmTECにおける当該自己抗原の発現低下を認めなかった。以上のことから、mTECにおける自己抗原の発現調節によってAIREが自己寛容の成立に寄与するという単純なモデルでは、AIRE欠損に伴う負の選択の障害を説明することは出来ない。この点について、私どもはAIRE欠損マウスにおける自己抗原遺伝子の発現低下は、AIRE欠損にともなう胸腺上皮細胞の分化障害による二次的な現象であり、AIREは自己抗原の発現調節以外の別の機能によって負の選択、ひいては自己寛容の成立に寄与するというモデルを提唱している。本年度の研究では、mTECでOVAを発現するTgモデルとして、AIRE+ mTECがOVAを発現するノックインマウスを樹立し(AIRE/OVA-KI)、OVA特異的TCR-Tgとの交配によって、負の選択が起こることを確認した。すなわち、本年度はAIRE+ mTECの発現する自己抗原は、実際に負の選択を誘導出来ることを確認することが出来た。我々が樹立したAire/mOVA-KIマウスをAire-KOマウスと掛け合わせて解析したところ、mOVA-KIマウスにおけるOT-IおよびOT-II T細胞の負の選択はAire欠損状態でも障害されなかった。また、OT-II TgでかつMHC classII-KOマウスの骨髄をAire/mOVA-KIに移植したところ、胸腺髄質上皮細胞(mTEC)の抗原提示のみで負の選択を誘導でき、このmTECによる負の選択もAire欠損によって障害されなかった。この結果は、Aireの有無はmTECの抗原提示能に影響しないことを示唆している。Aire欠損下における骨髄由来APCの抗原提示能の評価をRIP/mOVA-Tgの胸腺におけるmOVA/MHC classIIの提示は主に骨髄由来APCによって担われている。加えてRIP-TgにおけるOT-II T細胞の負の選択がAire欠損によって障害されることから、Aireは骨髄由来APCの抗原提示能を制御していることが推察される。しかし、RIP-TgやAire/mOVA-KIなどのモデル抗原発現系を用いた場合、mTECの抗原提示を完全に排除した状態で負の選択を評価することは極めて困難である。そのために、mTECのみがMHCを欠損した新しいモデル動物を樹立しなければいけない。そこでOVAを提示しているDCを移入して負の選択を誘導する実験系を用い、その負の選択がAire欠損によって障害されるかどうかを検討した。すなわち、Aire-KOマウスにCD45.1マウス/OT-II Tg(CD45.2)マウスのmixed BMTを行い、2週後OVAペプチドを添加したsplenicDCをBMTレシピエントに投与した。さらにその3日後、各レシピエントマウスの胸腺細胞をFACSで解析し、AireがmTECからDCへの抗原受け渡しを制御しているかどうかを評価した。その結果、RIP-TgではmTECからDCへの抗原の受け渡しが必要であるのに対して、我々の樹立したAire/mOVA-KIマウスではmTECから抗原が直接提示され、T細胞の負の選択が誘導出来るモデルであることが判明した。我々が新規に樹立したAire/mOVA-KIはモデル自己抗原であるOVAを発現し、OVA特異的T細胞の負の選択に寄与することが明確になった。今後は、本モデルマウスを用いて、より詳細な研究を行う。

免疫学RIP-OVAと我々の樹立したAire/mOVA-KIとの相違点が明確になったので、今後は負の選択機構におけるAire依存性の違いが何によるかを明確にすることで、Aireの負の選択における役割を明らかにする。さらに、Aire依存的負の選択を担うmTECのsubsetを同定する作業にも着手し、自己寛容成立機構の全貌解明を目指す。AIRE+ mTECがOVAを発現するノックインマウスを樹立し(AIRE/OVA-KI)、OVA特異的TCR-Tgとの交配によって、負の選択が誘導出来る実験系を当初の予定通り、本年度中に構築することが出来た。AIRE+ mTECが発現する自己抗原は、確かに負の選択に寄与することが明確になった。そこで、この負の選択過程にAIREがどのように関与するかを検討する目的で、AIRE/OVA-KIとOVA-TCR Tgの交配に加え、さらにAIRE欠損マウスを交配し、AIRE欠損下においても、AIRE+ mTECの発現するOVAが、負の選択を誘導できるか否かを調べる。一方、負の選択のみならず、AIRE+ mTECの発現する自己抗原(OVA)との反応によって、OVA特異的T細胞がFoxp3陽性の制御性T細胞(Treg)に分化するか否か、また、AIRE欠損によって、OVA特異的Tregへの分化が障害されるか否かを解析し、AIREによる中枢性寛容(central tolerance)の成立に、負の選択のみならず、Tregの産生も関与している可能性を検討する。すなわち、AIRE+ mTECによる自己抗原の提示が、「負の選択」と「Tregの産生」という2つの異なる細胞運命決定の振り分けに、どのように作用するかを明らかにし、「自己反応性」を「免疫制御」へと変換するための基盤作りを目指したい。
植物分子生物学に関するNU-UCB共同研究プログラム

植物の分子生物学はこの数年の間に急展開をとげ、植物の細胞機能分化の制御や個体発生と生長、形態形成などの高次の制御機構に目が向けられる一方で、作物の環境適応性や生産性の改良などの農学への応用も積極的に推し進められつつある。こうした急速に発展しつつある学問領域では、国際的な共同研究による最新の情報や技術の緊密な交換が極めて重要である。カリフォルニア大学バークレー校(UCB)のDepartment of Plant Biologyは24名のファカルティーを擁し、植物科学分野で全米で屈指の高いレベルにある。名古屋大学(NU)の農学部、理学部とUCBの植物科学分野の研究者は約20年間の長きに渡って研究交流を深めてきたが、本研究では研究者の間の交流関係を一層推進するために、植物の個体生長と細胞機能の制御機構に関わる分子生物学及びモデル植物の分子遺伝学、そしてバイオテクノロジー分野での共同研究と研究交流を推進することを目的とした。具体的に取り上げた研究項目で、以下のような成果が得られた。1)シンク機能制御とカルシウム情報伝達シンクとソース機能の制御に関して、NUの中村は糖による遺伝子発現制御にCa^<2+>-情報伝達系が関与することを示していたが、NUの杉山は葉での硝酸による遺伝子発現制御にもCa^<2+>-情報伝達系が関与することを示し、植物におけるCa^<2+>-情報伝達系解析で既に顕著な実績を挙げているUCBのJonesとの研究討論、情報交換が大いにプラスとなった。Jonesはオオムギ種子のアリューロン層の機能発現に特定のカルモジュリン分子が関与する可能性を示し、中村はタバコ葉のカルシウム依存性プロテインキナーゼ(CDPK)が多重遺伝子に支配された多型成分よりなり、糖誘導性の特異な細胞膜結合型CDPKを約1,000倍に部分精製した。2)ソース機能制御NUの杉浦とUCBのGruissemは葉緑体遺伝子のin vitro発現系に関して活発な情報交換を行い、杉浦らは葉緑体抽出液によるin vitro翻訳系を、またGruissemらはpre-mRNAプロセシング系を開発した。3)液胞機能NUの前島とUCBのJonesは相互訪問を数度行う中でCa^<2+>-トランスポーターやCa^<2+>-チャンネルに関する研究を進め、前島は後者のcDNAを同定し、Jonesは急速冷凍法による顕微鏡観察によりオオムギ種子のアリューロン層の細胞内に多様な液胞や小胞様のユニークなオルガネラを見出し、前島の調整した液胞膜特異タンパク質に対する抗体を使った研究を進めた。4)情報伝達因子CDPKやカルモジュリンに関する成果に加え、NUの町田は組織の切断が短時間の内に46-kdのプロテインキナーゼを活性化することを見出し、UCBのGruissemがイノシトールリン酸代謝酵素遺伝子を単離するなどの成果を得た。5)モデル植物(シロイヌナズナ)の分子遺伝学UCBのFischerはT-DNAタッギングラインからの胚発生に関する突然変異の解析を進め、胚発生に関与するBelll遺伝子がホメオドメインタンパク質をコードすることを明らかにし、NUの町田は生長速度が著しく遅くなった変異株を単離して原因遺伝子を同定し、中村も糖応答性が異常になった突然変異株を単離した。6)バイオテクノロジー基礎的分子生物学の育種への応用についても討議され、NUの中村の開発したイネの形質転換にも有効なベクター系がUCBのBuchanan,Lemauxに供与され、アグロバクテリウム感染によるムギの形質転換が試みられている。相互派遣計画は当初予定から多少の変更を余儀なくされたが、以上のような活発な情報交換によって共同研究は順調に進行した。それに加えて、分担者の相互訪問や公開セミナーを通して、分担者以外でそれまで交流のなかったNUとUCBの研究者の間での頻繁な情報交換、研究試料やプロトコルの交換が行われ、更に研究交流を発展させようとの機運が高まった。

Jonesはオオムギ種子のアリューロン層の機能発現に特定のカルモジュリン分子が関与する可能性を示し、中村はタバコ葉のカルシウム依存性プロテインキナーゼ(CDPK)が多重遺伝子に支配された多型成分よりなり、糖誘導性の特異な細胞膜結合型CDPKを約1,000倍に部分精製した。2)ソース機能制御NUの杉浦とUCBのGruissemは葉緑体遺伝子のin vitro発現系に関して活発な情報交換を行い、杉浦らは葉緑体抽出液によるin vitro翻訳系を、またGruissemらはpre-mRNAプロセシング系を開発した。3)液胞機能NUの前島とUCBのJonesは相互訪問を数度行う中でCa^<2+>-トランスポーターやCa^<2+>-チャンネルに関する研究を進め、前島は後者のcDNAを同定し、Jonesは急速冷凍法による顕微鏡観察によりオオムギ種子のアリューロン層の細胞内に多様な液胞や小胞様のユニークなオルガネラを見出し、前島の調整した液胞膜特異タンパク質に対する抗体を使った研究を進めた。4)情報伝達因子CDPKやカルモジュリンに関する成果に加え、NUの町田は組織の切断が短時間の内に46-kdのプロテインキナーゼを活性化することを見出し、UCBのGruissemがイノシトールリン酸代謝酵素遺伝子を単離するなどの成果を得た。5)モデル植物(シロイヌナズナ)の分子遺伝学UCBのFischerはT-DNAタッギングラインからの胚発生に関する突然変異の解析を進め、胚発生に関与するBelll遺伝子がホメオドメインタンパク質をコードすることを明らかにし、NUの町田は生長速度が著しく遅くなった変異株を単離して原因遺伝子を同定し、中村も糖応答性が異常になった突然変異株を単離した。6)バイオテクノロジー基礎的分子生物学の育種への応用についても討議され、NUの中村の開発したイネの形質転換にも有効なベクター系がUCBのBuchanan,Lemauxに供与され、アグロバクテリウム感染によるムギの形質転換が試みられている。相互派遣計画は当初予定から多少の変更を余儀なくされたが、以上のような活発な情報交換によって共同研究は順調に進行した。それに加えて、分担者の相互訪問や公開セミナーを通して、分担者以外でそれまで交流のなかったNUとUCBの研究者の間での頻繁な情報交換、研究試料やプロトコルの交換が行われ、更に研究交流を発展させようとの機運が高まった。本国際学術研究の採択以来、植物個体の生長制御と細胞機能制御の分子生物学的解析に取り組むNUとUCBのメンバーの間での電子メール番号の交換などによって、かねてより交流のあった者同士の間のみならず、そうでなかった者の間でも頻繁に情報交換が行われ、新たな共同研究が開始されるようになった。ソースとシンク機能の制御に係わるCa^<2+>_-情報伝達に関する共同研究について、NUの中村はタバコ葉のカルシウム依存性プロテインキナーゼ(CDPK)が多重遺伝子に支配された多型成分よりなり、糖レベルによって発現が制御される特定成分が糖による遺伝子発現制御に関与する可能性があることを明らかにし、またUCBのJonesはオオムギ種子のアリューロン層の機能発現に特定のカルモジュリン分子が関与する可能性を示唆した。また、NUの杉山は葉での硝酸による遺伝子発現制御にCa^<2+>_-情報伝達が関与することを示した。
細胞内シスプラチン輸送機構の解明と薬剤耐性との相関についての検討

プラチナ系抗がん剤であるシスプラチン(CDDP)の耐性機序を解明するため、細胞内での白金(Pt)の分布を透過型電子顕微鏡(TEM)及び走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて検索した。TEMによる解析では、いずれの細胞種においても核内部にはPtによって染色されたクロマチンが認められ、クロマチンは凝縮していた。これらはCDDPが核内部に取り込まれ、DNAへ結合していることを示唆するものであった。また、Ptが電子染色の染色剤としての役割を果たすことも示された。SEMによる分析においても、マッピング上Ptのピークを認め、細胞内でのCDDPの局在部位を明らかにした。我々は、シスプラチン(CDDP)の細胞内および細胞外への輸送機構を解明し薬剤耐性癌細胞の耐性機構を明らかにすることを目標として、研究を行ってきた。その中でCDDPの輸送機構に関与が示唆されている銅トランスポーターCTR1およびATP7Aに着目して、CDDP耐性との関連を検討してきた。銅トランスポーターの役割を明らかにするために、耐性機序の異なる細胞株A2780(CDDP感受性株)と2780CP(DNA除去修復能亢進によるCDDP耐性株)、およびKB(CDDP感受性株)とKBR/1.2(CDDPの細胞内蓄積量減少によりCDDP耐性を示す)を使用した。これまでに、ATP7AはA2780および2780CP間では発現に差が認められないが、KBに比べてKBR/1.2ではATP7Aの発現が低下していること、CTR1はA2780に比べて2780CPでは低発現しているが、KB、KBR/1.2では差が認められないことを確認した。また、CDDP投与によって、KBR/1.2では、CTR1の発現に変化は認められないが、ATP7Aが高発現することが確認された。銅トランスポーターの発現とCDDPの細胞内蓄積との関連性については、今後詳細に検討する予定である。また、電子顕微鏡を用いて細胞内のPt分布の探索を行なっている。Ptの局在を特定することは、トランスポーターのCDDP輸送システムやその他の輸送機構の詳細を解明する為の足がかりになると考える。細胞内に取込まれたPtを検出するため、様々な濃度のCDDPを224時間投与し、試料を作成した。現在、観察に最適な電顕機器(走査型もしくは透過型)および試料の処理方法を模索しているが、細胞内Ptを明瞭に検出するには至っておらず、試料の作成段階での細胞損傷の可能性が否定できない。さらなる検討を行い、電子顕微鏡上でのPt検出を目指す。我々はシスプラチン(CDDP)の細胞内および細胞外への輸送機構を解明し、薬剤耐性癌細胞の耐性機構を明らかにすることを目標として、研究を行ってきた。CDDPの輸送機構の一つに銅トランスポーターの関与が示唆されている。我々も銅トランスポーターであるCTR1およびATP7Aに着目して、CDDP耐性との関連を検討してきた。今後は銅トランスポーターの発現とCDDPの細胞内蓄積との関連性を詳細に検討する。細胞内に取込まれたPtを検出するため、160μMCDDPを数時間投与し、試料を作成した。現在、観察に最適な電顕機器(走査型もしくは透過型)および試料の処理方法を模索しているが、細胞内Ptを検出することは出来ていない。試料の脱水操作によって細胞損傷が起こり、Ptが流出した可能性を否定できない。シスプラチン(CDDP)の細胞内外への輸送機構を解明し、薬剤耐性癌細胞における耐性機構を明らかにすべく研究を行ってきた。CDDPの輸送機構には銅トランスポーターの関与が示唆されている。そこで、CTR1およびATP7AとCDDP耐性との関連を検討してきた。