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B細胞系列への運命決定を制御する転写ネットワークの解明

B細胞を含むすべての血液・免疫細胞は造血幹細胞から作られる。その過程で多能性の造血幹細胞は徐々に分化能が限定されていき、最終的にB細胞にしかなれない前駆細胞に運命決定される。E2A、EBF1、PAX5など様々な転写因子がB細胞への運命決定に関わっているが、詳細は明らかでない。特にこれらの転写因子同士がどのようなネットワークを形成し、B細胞への運命決定を制御しているのか不明である。申請者らは最近このB細胞への運命決定に必要な転写ネットワークを調べる新しい分化誘導系を開発した。そこで本研究では、培養細胞の遺伝子発現を網羅的に解析し転写因子間ネットワークのモデルを構築することを目的とした。本年度は研究計画に基づき、多能前駆細胞株(iLS細胞)からB細胞系列へ分化誘導後の経時サンプルを用いて網羅的な遺伝子発現解析(RNA-seq)およびエピジェネティック解析(ChIP-seq)を行った。さらにこのデータを元にバイオインフォマティクス解析を行った。RNA-seq解析から転写因子の発現パターンによっていくつかのクラスターに分けられることが明らかとなった。培養0.51時間で誘導される転写因子(Nfil3, Nr4aなど)、培養24時間で誘導される転写因子(Tead1, Sox9など)、更にその後に誘導される転写因子(Ebf1, Pax5など)が存在することが明らかとなった。すなわち、Ebf1やPax5などB細胞特異的転写因子が発現する以前に、転写因子群が一過的かつダイナミックに次々と誘導されることが明らかとなった。これらのいわば転写カスケードがB細胞への運命決定を制御していると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。そこで培養細胞の遺伝子発現を網羅的に解析し転写因子間ネットワークのモデルを構築することを目的とする。Ebf1, Pax5などB細胞特異的転写因子はB細胞へ分化誘導後、48時間後から急激に発現が上昇した。逆に、多能性を維持するために必要なMeis1, Gfi1などは徐々に発現が減少した。ChIP-seq解析によりヒストンの修飾を調べると、Ebf1, Pax5などのプロモーター領域では分化誘導前には抑制マーカーであるH3K27me3が多く見られたが、分化が進むに従って減少した。逆に、活性化マーカーであるH3K4me3は発現の上昇に伴い増加した。一方、他の系列に特異的な遺伝子の発現は抑制され、プロモーター領域にH3K27me3が多く認められた。これらの結果からB細胞への運命決定が起こる際にはエピジェネティックにB細胞プログラムが活性化されると同時に、別の系列の分化プログラムが抑制されることが示された。

本年度の研究計画のとおり、多能前駆細胞(iLS細胞)を用いてB細胞系列への決定過程における網羅的な遺伝子発現およびエピジェネティック解析を行った。この解析により転写因子を含めた系列特異的遺伝子の発現がエピジェネティックに制御されることによりB細胞系列への運命決定が促進されることが明らかとなった。研究はほぼ実験計画通りに進んでいる。今後は論文にまとめることを念頭に必要な実験を行なっていきたい。
タンパク質をコードしない RNAによる、精巣の幹細胞制御機構の解析

精巣幹細胞が自己複製能を喪失して前駆細胞へ移行する際に、形態学的視点から核内での変化を詳細に観察するとヘテロクロマチン化が急速に進行していた。さらに、この移行時に遺伝子発現を比較すると、大きく遺伝子発現パターンが変化していることを見出した。このような変化の一因として、最近蛋白質をコードしないRNAが関与していることが示されている。本研究では、精巣の幹細胞、前駆細胞それぞれに特異的に発現しているmiRNAや核内長鎖non-coding RNAを探索し明らかにした。次世代シークエンサーの出現後、蛋白をコードしないNon-coding RNAが次々に明らかにされ、これらが遺伝子発現や蛋白質翻訳、DNAメチル化やヒストン修飾に密接に関与していることが明らかとなりつつある。しかし、精巣の幹細胞分化機構におけるNon-coding RNAの関与はほとんどその実体が明らかにされていなかった。そこで、精巣幹細胞、前駆細胞特異的に発現している遺伝子の遺伝子座にGFPをノックインしたマウスを用いて、精巣の幹細胞・前駆細胞を、蛍光細胞分取装置を用いて純化した。これを材料に精巣幹細胞、前駆細胞それぞれに発現しているNon-coding RNA、特に、既知のlong non-coding(lnc)RNAや、小分子RNAの中でも蛋白の翻訳に関与しているmiRNAに焦点を絞り探索した。平成24年度は、昨年度まで回収細胞数が少なく達成できないでいた精巣幹細胞分画におけるlncRNA、miRNAの解析に成功し、その結果、既知のlncRNAは、幹細胞に比べ前駆細胞分画で多くの分子が発現していることが分った。一方、miRNAは、幹細胞、前駆細胞それぞれに高発現しているものをリストアップすることに成功した。精巣幹細胞に特異的に10倍以上高く発現してるmiRNAは25分子、逆に前駆細胞で10倍以上高く発現しているmiRNA分子は58個同定された。特に、前駆細胞において、幹細胞に比べ、100倍以上強く発現しているmiRNAが9分子同定された。現在、これらlncRNAとmiRNAの候補分子のなかから、幹細胞で発現が高いもの、前駆細胞で高い発現を示すものをそれぞれ10分子選び、新たに調整したRNAを材料に定量的に正しいか否か確認を行っており、おおむね再現性が取れていることがわかった。現在、in silicoで標的となる下流遺伝子の同定などを順次行っているところである。タンパクをコードしないnon-coding RNA、特に"micro-RNA"と"核内長鎖non-coding RNA"の2つが、幹細胞の特性と遺伝子発現パターンの決定にどのように関わっているか、幹細胞と前駆細胞の2つの細胞分画に分けて比較解析している。まず平成23年度は、Neurogenin-3 promoter下に蛍光緑色蛋白GFPを持つトランスジェニックマウス(以下Ngn3-GFPマウス)を材料に、精巣のmitosis期の精原細胞を、自己複製能がある幹細胞と、それを喪失し精子形成へ向けて分化をスタートさせた前駆細胞に、セルソーター(蛍光励起細胞分取装置=以下FACS)を用いて分画化、純化した。このレポーターマウスからは、Kitを発現している前駆細胞については、micro-RNAの次世代シークエンサーを用いた大規模シークエンスに必要な細胞数を回収する事に成功した。同時にpositive control用micro-RNAの同定と決定も行った。具体的には、我々が同定している、Post-transcriptionalに蛋白量が制御されていると考えられるゲノム修飾酵素3種類について、その3'-UTRに結合すると予測されたmicro-RNAの発現を、幹細胞、前駆細胞の各分画で比較し、発現量が著しく変動するものを同定した。次に、集まった前駆細胞において本年度、次世代シークエンサーIlluminaにおいて解析を行って解析結果を得た。具体的には、micro-RNAなどが特異的に濃縮されるように、15-35bpのRNAフラクションを選択的に精製し解析に供した。幹細胞分画は、用いたNgn3-GFPマウスでは収量が少ないため、初年度内に解析に必要な細胞数の約半分程度の回収が終了した。前駆細胞分画の解析については、初年度において目標としているところまで到達することができた。特にmicro-RNAについて、既知のmicro-RNA分子で、予備実験において前駆細胞に発現していることが確認された分子が、次世代シークエンサーを用いて得たデーターにおいても再現がとれており、実験系全体として問題なく動いていると考えられる。一方、幹細胞分画については、予想以上に細胞数が集まらなかった。これは、細胞をFACSを用いて分取する際に、必ず集まった細胞の一部を用いてRT-PCR法にて純度の検定を行うため、収量が少ない場合かなりの無駄となる。従って、自己点検による進捗状況は、やや遅れているとした。これに対しては処理するマウスの数を増やすなどして対応している。また、幹細胞分画をより多く回収できる別のGFPレポーターマウスも準備中である。

申請時に予定していなかった研究も追加して行っている。既知の核内長鎖non-coding RNAが含まれているDNAアレイが、入手、使用可能となった。そこで、幹細胞と前駆細胞に関し、既知の核内長鎖non-coding RNAのDNAアレイ解析を行い、それぞれの分画に特徴ある発現を示すものが同定された。代表者は、これまでmiRなどmicro-RNAを実験材料として用いたことが無かったが、初年度の実験で、micro-RNAの純化法や、パイロット実験で同定したmiRの、ターゲットとなるmRNAのレポーターアッセイなど、2年目の実験で必要となる解析法に関して、1年目において方法論的に習熟することが出来た。また、それらに必要な研究材料なども集める事ができた。従って、2年目は1年目より、より効率的に仕事が進められると考えられる。2年目前半で、幹細胞分画についてのmicro-RNAの次世代シークエンサーを用いた解析を終了させる。これにより幹細胞と前駆細胞の2つの分画で差のある発現を示すmicro-RNAを同定することが初めて可能となる。その後は、予定通り以下の研究を行う。発現が幹細胞と前駆細胞で変化するTop30の個々のものについて、発現の変化が間違いないか再度純化した細胞を集め確認を行う。次にTargetScanを用いて、これらmicro-RNAが結合するターゲットとなるRNAを同定する。次に、実際にターゲットと予測された分子の蛋白の発現、mRNAの発現が、幹細胞と前駆細胞で変化するか確認を行い、絞り込みを進めて行く。方法論としては、qRT-PCR、Wetern blotting法を行う。絞り込みの優先順位は、ゲノム修飾に関わるものを第一とする。絞り込まれた分子については、そのターゲットとなる3'-UTRを結合させたルシフェラーゼレポーター遺伝子を用い、ルシフェラーゼアッセイ法にてルシフェラーゼ活性の変化を調べ、変化をもたらすmicro-RNAを同定する。これらの実験系は初年度に確立済みである。最後に、同定された特にmicro-RNAについて、長期in vitroで培養可能となったマウス培養精原細胞株(以下GS細胞)を材料に、レンチウイルスを用いてmicro-RNAの過剰発現を、また、安定性の高い市販のanti-sense oligoを用いmicro-RNAの機能抑制実験を行なう。結果として予測される変化として、GS細胞の増殖スピード、生存などの変化が挙げられる。また、変化のあったGS細胞を精細管移植することにより、長期の幹細胞維持に対する変化や細胞分化能についても検討する。初年度に幹細胞分画の次世代シークエンサー解析を行わなかったので消耗品代が若干余る結果となったが、2年目に行うため消費することとなる。予算のほとんどが、次世代シークエンサーの消耗品代、明らかとなったmicro-RNAの機能アッセイの試薬などを購入する消耗品代となる予定である。
スミレ属における繁殖様式の進化に関する生態遺伝学的研究

これまでの研究により、北海道と東北地方に生育するオオバキスミレには、開放花と閉鎖花による種子繁殖を行う“種子繁殖集団"が存在する一方、閉鎖花をつけずに開放花のみ形成し、かつその開放花においてもほとんど種子を結実せず、主に地下部の根茎を横走させる“栄養繁殖集団"が存在することが明らかになってきた。最終年度は、オオバキスミレの本州集団の調査地点の拡充のほか、分布域の異なる近縁種(キスミレ・ダイセンキスミレ)の繁殖特性についても調査を行った。また、繁殖特性が明らかになった個体の核と葉緑体DNAの塩基配列を決定し、分子系統解析を行った。野外調査の結果、本州地方のオオバキスミレの繁殖様式は集団ごとに異なり、栄養繁殖集団は主に日本海側に、種子繁殖集団は太平洋側に分布する傾向が示された。また、静岡・熊本県に生育するキスミレは、栄養繁殖を行わず、閉鎖花をつけずに、開放花のみによる種子繁殖を行うことが明らかになった。さらに、山陰地方に生育するダイセンキスミレは、開放花と閉鎖花を形成すると共に、根茎による栄養繁殖を行うことが明らかになった。分子系統解析の結果、オオバキスミレとキスミレ・ダイセンキスミレは遺伝的に区別され、オオバキスミレは単系統性を示した。また、オオバキスミレの種子繁殖集団と栄養繁殖集団からは異なる遺伝子型が検出され、集団間の繁殖様式の違いと対応していた。したがって、オオバキスミレの種内および種間で異なる繁殖様式の進化は、開放花と閉鎖花の形成だけでなく、分布域や遺伝子型にも影響を与えたことが示唆された。さらに遺伝子型ネットワーク解析より、遺伝的に同一な個体を形成する栄養繁殖集団において、種子繁殖集団よりも多くの遺伝子型が認められた。この結果は、集団が維持されている時間の長さを反映していると考えられ、種子繁殖集団と栄養繁殖集団は異なる進化的背景を持つことが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。1.オオバキスミレにおける繁殖戦略の種内変異の解明顕花植物の中には、蕾から開花し、主に送粉昆虫を介した他家受粉を行う「開放花」と、蕾のまま開花せずに自家受粉を行う「閉鎖花」を1個体内で形成する植物が、様々な分類群で知られている。本研究では開放花と閉鎖花を介した種子繁殖を行うオオバキスミレを対象として、北海道内の複数の生育地を対象として、集団維持に関する繁殖戦略の基礎的な調査を行った。その結果、開放花と閉鎖花の形成パターンが集団間で明瞭に分化しており、開放花と閉鎖花を形成する集団と、閉鎖花を全く形成せず、開放花のみを形成する集団が、それぞれ複数存在することが明らかになった。また、集団問で開放花の結実率を比較した結果、開放花のみを形成する集団の結実率が低い傾向が認められ、クローン繁殖が集団の維持に機能していることが示唆された。以上より、オオバキスミレ種内には、2タイプの繁殖戦略が存在することが明らかになった。2.オオバキスミレに存在する繁殖戦略の二型の分子系統学的解析オオバキスミレ集団には、2タイプの繁殖戦略(開放花・閉鎖花タイプと開放花・クローンタイプ)が存在する。本研究では、オオバキスミレに見られる2タイプの繁殖戦略が系統関係を反映しているかどうか明らかにするため、これまで調査を行ってきた北海道内の13集団を対象に葉のサンブリングを行い、核および葉緑体DNAを用いた分子系統解析を行った。その結果、核と葉緑体DNAの双方で開放花・閉鎖花タイプの単系統性が支持され、開放花・クローンタイプと遺伝的に分化していることが示された。さらに葉緑体DNAに着目すると、開放花・閉鎖花タイプよりも、開放花・クローンタイプのハプロタイプ多様度が高いことが明らかになった。これらの結果は、オオバキスミレ種内に存在する2タイプの繁殖戦略が、遺伝的に分化した系統群であることを示すものである。オオバキスミレにおける繁殖様式の進化に関する課題として、(1)開放花と開放花を形成する集団と開放花のみを形成する集団の受粉様式(2)北海道及び東北集団の繁殖様式の調査と集団間の分子系統解析を行った。(1)に関する調査では、両集団の開放花に対して受粉実験を行った。その結果、開放花と開放花を形成する集団の開放花は強制受粉でも十分結実し、さらに自動自家受粉を行うことが明らかになったが、開放花のみを形成する集団の開放花では、強制受粉でも種子生産が十分に行われず、自動自家受粉も行わないことが明らかになった。さらに開放花のみを形成する集団では、地下部の根茎を介した栄養繁殖が集団の維持に寄与していることがわかった。したがってオオバキスミレの開放花の受粉様式は集団間で明瞭に分化しており、閉鎖花を形成せず開放花でも十分な種子生産が行われない集団は、主に栄養繁殖によって集団が維持・形成されていることが示唆された。(2)に関する調査では、開放花と閉鎖花による種子繁殖を行う“種子繁殖集団"と、閉鎖花をつけずに開放花のみ形成し、その開放花でも種子を殆ど生産せず、栄養繁殖を介して維持されている“栄養繁殖集団"の分布域を調査するため、北海道及び東北に生育する集団の繁殖特性を調査した。その後、調査集団から採取した個体の核と葉緑体DNAの塩基配列を決定して分子系統解析を行った。その結果、本種の種子繁殖集団と栄養繁殖集団は、北海道及び東北地方の広範囲に分布していることが明らかになった。

また核と葉緑体DNAの系統解析の結果、種子繁殖集団と栄養繁殖集団は異なる遺伝子型を持ち、繁殖様式の違いに対応した遺伝的分化が認められた。したがって本種内では、北海道及び本州で種子繁殖集団と栄養繁殖集団に分化しており、何らかの選択圧によって繁殖様式の異なる集団間に遺伝子流動が制限され、遺伝的分化が生じていると考えられた。これまでの研究により、北海道と東北地方に生育するオオバキスミレには、開放花と閉鎖花による種子繁殖を行う“種子繁殖集団"が存在する一方、閉鎖花をつけずに開放花のみ形成し、かつその開放花においてもほとんど種子を結実せず、主に地下部の根茎を横走させる“栄養繁殖集団"が存在することが明らかになってきた。最終年度は、オオバキスミレの本州集団の調査地点の拡充のほか、分布域の異なる近縁種(キスミレ・ダイセンキスミレ)の繁殖特性についても調査を行った。また、繁殖特性が明らかになった個体の核と葉緑体DNAの塩基配列を決定し、分子系統解析を行った。野外調査の結果、本州地方のオオバキスミレの繁殖様式は集団ごとに異なり、栄養繁殖集団は主に日本海側に、種子繁殖集団は太平洋側に分布する傾向が示された。また、静岡・熊本県に生育するキスミレは、栄養繁殖を行わず、閉鎖花をつけずに、開放花のみによる種子繁殖を行うことが明らかになった。さらに、山陰地方に生育するダイセンキスミレは、開放花と閉鎖花を形成すると共に、根茎による栄養繁殖を行うことが明らかになった。分子系統解析の結果、オオバキスミレとキスミレ・ダイセンキスミレは遺伝的に区別され、オオバキスミレは単系統性を示した。また、オオバキスミレの種子繁殖集団と栄養繁殖集団からは異なる遺伝子型が検出され、集団間の繁殖様式の違いと対応していた。したがって、オオバキスミレの種内および種間で異なる繁殖様式の進化は、開放花と閉鎖花の形成だけでなく、分布域や遺伝子型にも影響を与えたことが示唆された。さらに遺伝子型ネットワーク解析より、遺伝的に同一な個体を形成する栄養繁殖集団において、種子繁殖集団よりも多くの遺伝子型が認められた。この結果は、集団が維持されている時間の長さを反映していると考えられ、種子繁殖集団と栄養繁殖集団は異なる進化的背景を持つことが示唆された。野外における生態学的調査から、オオバキスミレ種内において、種子繁殖集団と栄養繁殖集団が北海道および本州の広い範囲に分布していることが明らかになった。また分子系統学的アプローチから、オオバキスミレは単系統性を示し、近縁種と遺伝的に明瞭に区別されるクレードを形成した。また、種子繁殖集団と栄養繁殖集団は異なる遺伝子型を持ち、北海道南部の隣接集団間においても、繁殖様式の違いに対応した遺伝的分化が認められた。さらに本研究では、遺伝的に同一な個体を形成する栄養繁殖集団から、種子繁殖集団よりも、多くの遺伝子型が検出されるという興味深い結果が得られた。3年目はこれら結果を踏まえ、オオバキスミレだけでなく、近縁種の繁殖様式を調査することで、日本産スミレ属に見られる異なる繁殖様式の進化的背景に迫る。27年度が最終年度であるため、記入しない。現在、オオバキスミレだけでなく、近縁種であるダイセンキスミレおよびキスミレのサンプルを収集し、調査および解析の範囲をさらに広げることで、オオバキスミレの繁殖様式と系統関係の比較解析を行っている。今後は、新たに日本産キスミレ類の分布域全体を網羅した集団遺伝学的な調査および解析を行う予定である。
突発性難聴およびベル麻痺における新規病因の探索

原因不明の内耳疾患であるBell麻痺・突発性難聴において、発症時の患者の生体反応を遺伝子・蛋白質レベルで網羅的に捉えることにより、これら疾患における発症病態・新規病因を解明することを目的とし研究をおこなった。その結果、Bell麻痺においては自然免疫に関与する抗菌性小ペプチドであり、抗ウイルス作用を有することが判明しているα-defensinがベル麻痺の発症に関与していることが推定された。◎ベル麻痺患者におけるDNAマイクロアレイを用いた解析初診時と発症23週後の末梢血単核球よりそれぞれRNAを抽出後、T7-based RNA増幅を行った後、ヒト遺伝子約3万個が搭載されたオリゴDNAマイクロアレイを用いて解析を行った。4症例において両病日間で発現差異のある遺伝子を選び出したところα-defensinが同定された。◎ベル麻痺患者におけるreal-time PCRを用いた解析初診時と発症23週後の末梢血単核球よりそれぞれRNAを抽出後、real-time PCRを用いてα-defensinの発現を両病日間で比較した。その結果24症例中8例において発症後にα-defensinの発現が5倍以上に上昇していた。以上から、α-defensinがベル麻痺の発症に関与していることが推定された。今後症例をさらに増やし、また血漿中のα-defensinの発現をELISA法で解析する検討も加える予定である。また、他の因子についてもプロテインチップで解析する予定である。◎Bell麻痺患者における血漿中α-defensin発現のELISA解析健常人10名とBell麻痺患者22名の血漿中α-defensinの発現をELISA法を用いて調べた。健常人においては23週をおいて2回測定した。その結果、1名(10%)においてのみ2回目に採取した血漿でα-defensinの発現が測定感度以上に上昇していた。他のサンプルにおいては測定感度以下であった。患者群では22例中6例(27%)において血漿α-defensinが測定感度以上に発現していた。そのうち、1例においては初診時と発症23週後の2回の血漿ともに発現が上昇していた。残りの5例においては、発症23週後の血漿においてのみα-defensinの発現上昇がみられた。この5例中4例においてreal-time PCRで末梢血単核球のα-defensinの発現を測定できたが、遺伝子レベルにおいても同様にα-defensinの発現が上昇していた。つまり末梢血単核球と血漿中のα-defensin発現が相関していることが示された。◎末梢性顔面神経麻痺におけるヘルペスウイルス感染診断の現状と限界末梢性顔面神経麻痺におけるヘルペスウイルス感染の早期ウイルス診断には唾液を用いたPCR検査が有用である。しかしPCRの検出限界、麻痺発症パターンの多様性から早期診断には限界も存在することを明らかにした。また、ステロイドと抗ウイルス剤併用療法の普及により、従来の血清診断基準では診断できないzoster sine herpete例が増える可能性について明らかにした。
ウニに生殖腺刺激ホルモンはあるのか？

ウニ生殖巣の肥大化メカニズムを研究するツールとして,生殖巣器官培養系を確立し,これを用いて生殖巣の肥大に重要な主要卵黄タンパク質(MYP)の合成を誘起する因子を探索した。仮説としてウニ体腔液中の因子と核内受容体に結合する脂質を設定し,ウニ生殖巣が肥大した時期の体腔液および肥大したウニ生殖巣から抽出した総脂質を添加して生殖巣を培養し,MYP mRNA量を定量PCRにより測定したが,どちらも優位な変動は認められなかった。本研究期間において,ウニ生殖巣中のMYP mRNAの発現を誘起する因子の決定はできなかった。今後,MYPの合成に関与する核内受容体を特定しそのリガンドを添加する実験が必要である。ウニ生殖巣の肥大化メカニズムを研究するためのツールとして,ウニ生殖巣を用いた器官培養系の確立を目指し,5日間生殖巣が生理学的に生存可能な生体外培養系を確立した。次に,培養による生殖巣肥大化の進展具合を判定するための指標(分子マーカー)を得るため,ウニ生殖巣の肥大に伴い発現量が増加する遺伝子群を次世代シークエンスサーを用いたランスクリプトーム解析により特定した。それらの内,コレステロール合成の最終段階の酵素,コレステロールを代謝するP450,ステロイドホルモン合成の律速遺伝子でコレステロール輸送に関わるStAR-likeのmRNA発現量がウニ生殖巣肥大に伴い実際に発現量が増加することをqPCR法により確認した。そこで,これらの遺伝子群を分子マーカーとして,磯焼けウニ生殖巣を最も生殖巣が肥大した時期のウニの体腔液で培養することで,体腔液中に生殖巣の肥大化を促す因子が存在するかどうかを検定した。その結果,上記の遺伝子群の発現量が増加したこのことから,ウニの体腔液中にはコレステロール合成を促進する物質が存在することが示された。また,体腔液を加熱処理,分子量篩を用いて分画することで,上記遺伝子群の発現を誘導する物質の特性を解析したところ,誘導因子は熱安定で分子量1万以下であったため,ウニ生殖腺刺激ホルモンはペプチドであると推定された。しかし,本研究ではウニ生殖巣の肥大に関わるタンパク質である主要卵黄タンパク質(MYP)の合成は誘導されなかった。ウニ生殖巣の肥大化メカニズムを研究するツールとして、ウニ生殖巣を用いた器官培養系を昨年度までに確立した。しかし、操作が煩雑であるうえ、測定結果が安定しないなどの問題が大きかったため、あらたに簡便な操作でおこなえる新規器官培養系の検討を行った。その結果、3日間であるならば生体内における代謝を反映していると予想される、短期間器官培養系の確立に成功した。この方法を用い、ウニ生殖巣の肥大に最も重要なタンパク質である主要卵黄タンパク質(MYP)の合成を誘起する成分が生殖巣中に存在するかどうか、の検討をおこなった。昨年度までに、ウニ生殖巣の肥大に伴い、生殖巣中で発現が誘導される核内受容体(=生殖巣の肥大を制御する可能性がある核内受容体)を特定したところ、脂溶性物質をリガンドとする核内受容体であることが明らかとなった。そこで、MYP合成を誘起する物質のターゲットを脂溶性物質に絞った。磯焼けウニの生殖巣(=生殖巣が小さく、MYP合成も活性化していない)を材料とした上記器官培養系に、生殖巣が肥大し、MYP合成を活発におこなっていると予想される時期のウニ生殖巣から抽出した脂溶性物質を培養液に添加した結果、1日後にMYPが誘導される可能性が得られた。しかし、得られる結果が不安定であり、さらに検討を続けて安定した結果が得られるかの確認が必要であった。特に、脂溶性物質を溶解する溶媒(本実験ではエタノールを用いている)の影響が考えられたため、今後は、器官培養に与える影響がなるべく小さい溶媒の検討を行う必要がある。ウニ生殖巣の肥大に関与している核内受容体、MYPmRNAのqPCR法による発現定量系が確立できた。また、昨年度確立した生殖巣器官培養系を簡便化した培養系の確立を実施し、ウニ生殖巣中の成分がMYPmRNAの発現を誘起している可能性が示された。このため、標記の評価となった。ウニ生殖巣の肥大化メカニズムを研究するツールとして、ウニ生殖巣器官培養系を確立した。ウニ生殖巣の肥大には主要卵黄タンパク質(MYP)の合成・蓄積が重要であることは既に明らかにされている。このMYPの合成を誘起する因子の探索を確立した器官培養系を用いて実施した。これまでに、ウニ体腔液中にその因子があると推測し、ウニ生殖巣が肥大した時期の体腔液を用いてウニ生殖巣を培養し、0、1、3、5日後の生殖巣中のMYPmRNA量を定量PCR(qPCR)により測定したが、変動は認められなかった。古くからウニMYPは核内受容体によって発現調節されている可能性が示唆されていたため、次世代シークエンス解析によりウニ生殖巣肥大に伴い発現量が増加する核内受容体を特定した。その結果、レチノイドおよび脂肪酸をリガンドとする核内受容体がMYPの合成に関与している可能性が示された。そこで、肥大したウニ生殖巣から総脂質を抽出し、確立した培養系を用いて培養液に総脂質を異なる濃度で添加し、培養3日目の生殖巣を用いてMYPmRNAの発現量を定量した。その結果、培養開始時および無添加の生殖巣と比較し優位なMYPmRNAの増加は認められなかった。本研究期間において、ウニ生殖巣中のMYPmRNAの合成を誘起する因子の決定はできなかった。

今後、MYPの合成に関与する核内受容体を特定しそのリガンドを添加する実験が必要と考えられる。また、そのリガンドを合成を誘起する因子が体腔液中に存在すると考えられたため、肥大前後の体腔液成分の比較を行う必要性が残された。ウニ生殖巣の肥大化メカニズムを研究するツールとして,生殖巣器官培養系を確立し,これを用いて生殖巣の肥大に重要な主要卵黄タンパク質(MYP)の合成を誘起する因子を探索した。仮説としてウニ体腔液中の因子と核内受容体に結合する脂質を設定し,ウニ生殖巣が肥大した時期の体腔液および肥大したウニ生殖巣から抽出した総脂質を添加して生殖巣を培養し,MYP mRNA量を定量PCRにより測定したが,どちらも優位な変動は認められなかった。本研究期間において,ウニ生殖巣中のMYP mRNAの発現を誘起する因子の決定はできなかった。今後,MYPの合成に関与する核内受容体を特定しそのリガンドを添加する実験が必要である。ウニ生殖巣の器官培養系の確立に相当の時間が必要と考えていたが,培養系の確立が早急に実現できた。また,ウニ生殖巣の肥大に関わる遺伝子群の探索およびqPCR法による発現定量系も確立でき,ウニ体腔液中にこれら遺伝子群の発現量を誘導する物質の特性まで推定できた。このため,標記の評価となった。H26年度には、生殖巣器官培養系により、ウニ生殖巣の肥大に最も重要なタンパク質であるMYPの発現が誘導できなったが、H27年度ではウニ生殖巣中の脂質がMYPの発現を誘導している可能性を示すことに成功した。しかし、脂質を溶解する溶媒の影響で得られる結果にばらつきが認められた。脂質を溶解する溶媒の安定性を再確認した上で、生殖巣器官培養系を用いてMYPの合成誘導物質を詳細に探索する。水産生物生理学今年度,ウニ生殖巣の肥大に最も重要なタンパク質であるMYPの発現が誘導できなかった。そのため,MYPのmRNA発現誘導する物質を明らかにするため,さらなる器官培養系の改良と合成誘導物質の推定を行う。生殖巣で合成されるMYPの合成誘導物質は生殖巣で合成されていると推測しているので,改良した器官培養系にウニ生殖巣中の成分を様々な方法で抽出し,培養液に添加しMYPのmRNAを発現誘導するかを,これまでに確立したqPCR法を用いて測定することで,合成誘導物質の推定を行う。平成27年3月までに、消耗品としてすでに使用済みであるが、支払いが平成28年4月に行われるため。H26年3月末までに,消耗品と学会発表の旅費としてすでに使用済みであるが,支払いがH27年4月におこなわれるため。平成28年4月に物品費として支出される予定である。H27年4月に物件費及び旅費として支出される予定である。
燃焼合成法を応用した新精密鋳造TiNi形状記憶合金の特性解明/応用

TiNi形状記憶合金は現在各種産業分野,さらには医療分野に至るまで幅広く実用化されている.しかし,それらの殆どは線材あるいは薄板材としてのみの利用に限られている.その理由として,TiNi形状記憶合金特有の難加工性と鋳造時における重力偏析による材料不均一という大きな二つの問題が解決されていないためであった.そこで本研究では,重力偏析の起こらない均質なインゴット作製のために最近開発された燃焼合成法を採用し,形状の制限を解決し任意形状の製品作製のために精密遠心鋳造法を試みた.この新しい製造技術により作製したTiNi形状記憶合金の機械的性質(擬弾性特性,形状記憶特性,防振特性などなど)およびそれらの温度特性を系統的実験により調べた.また,これらの力学的特性を裏付けるため,種々の金属学的観察・評価(各種顕微鏡組織観察,化学分析:XRD, DSC)を行った.これらの結果から,この新しく提案した手法により製造されたTiNi形状記憶合金は,十分に実用化に耐え得るものであり,この新しい合金を用いた,これまでに無い複雑形状の形状記憶合金製品開発により更なる産業応用が広まるものと考える.これが平成17年度の成果であるが,平成18年度では,ここで得られた実験結果のより詳細な検証を進め,信頼性を確認すると共に,さらに(1)この新しい形状記憶合金の更なる機能改善,(2)この新しい合金の回復応力の大きさの系統的な実験による検討,(3)この新しい合金の熱・力学特性の金属学的・熱力学的検討を行った.このほか,複雑形状を持つ形状記憶合金の作製の例として,企業・医学部との共同研究において,整形外科領域において使用する骨折治療用体内固定具メネンプレートの開発を試みた.以上,本研究により,任意形状のTiNi形状記憶合金が高性能で作製可能であることが示され,このユニークな特性を持つ新素材の更なる興味ある産業応用が期待された.TiNi形状記憶合金は現在各種産業分野,さらには医療分野に至るまで幅広く実用化されている.しかし,それらの殆どは線材あるいは薄板材としてのみの利用に限られている.その理由として,TiNi形状記憶合金特有の難加工性と鋳造時における重力偏析による材料不均一という大きな二つの問題が解決されていないためであった.そこで本研究では,重力偏析の起こらない均質なインゴット作製のために最近開発された燃焼合成法を採用し,形状の制限を解決し任意形状の製品作製のために精密遠心鋳造法を試みた.この新しい製造技術により作製したTiNi形状記憶合金の機械的性質(擬弾性特性,形状記憶特性,防振特性などなど)およびそれらの温度特性を系統的実験により調べた.また,これらの力学的特性を裏付けるため,種々の金属学的観察・評価(各種顕微鏡組織観察,化学分析:XRD, DSC)を行った.これらの結果から,この新しく提案した手法により製造されたTiNi形状記憶合金は,十分に実用化に耐え得るものであり,この新しい合金を用いた,これまでに無い複雑形状の形状記憶合金製品開発により更なる産業応用が広まるものと考える.これが平成17年度の成果であるが,平成18年度では,ここで得られた実験結果のより詳細な検証を進め,信頼性を確認すると共に,さらに(1)この新しい形状記憶合金の更なる機能改善,(2)この新しい合金の回復応力の大きさの系統的な実験による検討,(3)この新しい合金の熱・力学特性の金属学的・熱力学的検討を行った.このほか,複雑形状を持つ形状記憶合金の作製の例として,企業・医学部との共同研究において,整形外科領域において使用する骨折治療用体内固定具メネンプレートの開発を試みた.以上,本研究により,任意形状のTiNi形状記憶合金が高性能で作製可能であることが示され,このユニークな特性を持つ新素材の更なる興味ある産業応用が期待された.TiNi形状記憶合金は現在各種産業分野、さらには医療分野に至るまで幅広く実用化されている。しかしそれらの殆どは線材あるいは薄板材としてのみの利用に限られている。その理由としてTiNi形状記憶合金特有の難加工性と鋳造時における重力偏析という大きな二つの問題点が解決されていないためである。そこで、重力偏析の起こらない均質なインゴット作成のために燃焼合成法を採用し、形状の制限を解決し任意形状の製品作成のために遠心精密鋳造法を試みた。本研究では、この新しい方法により作成されたTiNi形状記憶合金の機械的性質(擬弾性特性、形状記憶特性、変態温度、変態応力等など)を実験的に調べた。この製法は製品に対して通常の強加工が加えない手法であるため、その実用化を考えるとき機械的性質を詳細に調べることは非常に重要であり、本研究では種々の温度・負荷条件下で実験を行い、一定の成果を得た。また、これらの力学特性を裏付けるため、各種顕微鏡的・化学分析(XRD,DSC)的解析を行った(金属学的評価)。以上の結果から、新しく提案した手法によるTiNi形状記憶合金は、十分実用化に耐えられるものであり、これまでに無い複雑形状の形状記憶合金製品が作成でき、更なる産業応用が広まるものと考える。次年度は、ここで得られた実験結果をさらに詳細に検証するとともに、複雑形状の形状記憶合金の作成と応用を検討する。TiNi形状記憶合金は現在各種産業分野,さらには医療分野に至るまで幅広く実用化されている.しかし,それらの殆どは線材あるいは薄板材としてのみの利用に限られている.

その理由として,TiNi形状記憶合金特有の難加工性と鋳造時における重力偏析による材料不均一という大きな二つの問題が解決されていないためであった.そこで本研究では,重力偏析の起こらない均質なインゴット作製のために最近開発された燃焼合成法を採用し,形状の制限を解決し任意形状の製品作製のために精密遠心鋳造法を試みた.この新しい製造技術により作製したTiNi形状記憶合金の機械的性質(擬弾性特性,形状記憶特性,防振特性などなど)およびそれらの温度特性を系統的実験により調べた.また,これらの力学的特性を裏付けるため,種々の金属学的観察・評価(各種顕微鏡組織観察,化学分析:XRD,DSC)を行った.これらの結果から,この新しく提案した手法により製造されたTiNi形状記憶合金は,十分に実用化に耐え得るものであり,この新しい合金を用いた,これまでに無い複雑形状の形状記憶合金製品開発により更なる産業応用が広まるものと考える.これが平成17年度の成果であるが,平成18年度では,ここで得られた実験結果のより詳細な検証を進め,信頼性を確認すると共に,さらに(1)この新しい形状記憶合金の更なる機能改善,(2)この新しい合金の回復応力の大きさの系統的な実験による検討,(3)この新しい合金の熱・力学特性の金属学的・熱力学的検討を行った.このほか,複雑形状を持つ形状記憶合金の作製の例として,企業・医学部との共同研究において,整形外科領域において使用する骨折治療用体内固定具メネンプレートの開発を試みた.以上,本研究により,任意形状のTiNi形状記憶合金が高性能で作製可能であることが示され,このユニークな特性を持つ新素材の更なる興味ある産業応用が期待された.
新規立体選択的グリコシル化反応および簡便なオリゴ糖合成法の開発

筆者らの研究室ですでに独自に見い出した種々の反応を活用し、初年度においては1-O-フェニル炭酸エステル糖およびチオグリコシドを糖供与体とする二つの立体選択的グリコシル化反応を活用してGlcβ1-6Glcβ1-6Glc構造の三糖がワンポットグリコシル化反応により高収率で得られることを明らかにした。第二年度においてはさらにより一般性の高い糖鎖合成手法を確立するために各段階のグリコシル化反応について詳細に検討したところ、2位水酸基のみをp-トルオイル基、3,4,6位の水酸基をベンジル基で保護した1-O-フェニル炭酸エステル糖が触媒量のトリチル塩で速やかに活性化され遊離の水酸基を有するチオグリコシドと反応し、対応するβ-グリコシドを高収率で与えることを見い出した。第三年度においては引き続き効率的な手法の開発を目指し検討したところ、一段階目のグリコシル化反応に関してはジエチルエーテル中、モレキュラーシーブ5Aの存在下でフッ化糖が触媒量のプロトン酸により速やかに活性化され、様々な遊離の水酸基を有する糖受容体と反応し対応するα-グリコシドが高収率で得られることを見出した。また、この反応は還元末端にエチルチオ基を有する基質を糖受容体に用いても還元末端を損なうことなく進行するので、さらに反応系内にN-ヨードコハク酸イミドと別の糖受容体を加えることで、先ほどとは結合様式の異なる構造、すなわちGlcα1-6Glcβ1-6Glc構造を有する3糖がワンポットで得られることも明らかにした。以上、筆者らは立体選択的グリコシル化反応における幾つかの新しい手法を見出し、さらにこれらを活用するワンポット3糖合成反応を開発し、優れた糖鎖合成手法を確立した。1.トリチル塩をルイス酸触媒として用いる2-デオキシ-α-ピラノシドの立体選択的合成申請者らの研究室で開発した空気中で安定なルイス酸であるトリチル塩を触媒として用い、2-デオキシピラノースのグリコシル化反応を試みたところ望みの反応が円滑に進行し、この場合には熱力学的に安定な2-デオキシ-α-ピラノシドが高い立体選択性をもって得られることが分かった。2.チオカルバモイル基を利用する2-デオキシ-β-ピラノシドの立体選択的合成上記の結果を踏まえて、これまで困難とされていた2-デオキシピラノースのβ選択的なグリコシル化反応の開発を試みた。最近、申請者らの研究室ではチオカルバモイル基の遠隔関与を利用する2-デオキシヌクレオシド類のα体およびβ体の立体選択的合成法を明らかとしている。そこで、チオカルバモイル基の遠隔関与をさらに活用することとし、2-デオキシピラノースの4位のα配向水酸基にチオカルバモイル基を導入することにより、この遠隔関与を利用して2-デオキシピラノースのβ選択的なグリコシル化反応を試みた。その結果、予期したように望みの2-デオキシ-β-ピラノシドが良好な立体選択性をもって得られ、熱力学的に安定なα-ピラノシドへの異性化を抑制しながら目的であるβ選択的な反応を行えることが明らかとなった。3.トリチル塩を用いる三糖合成反応まず第一段階としてトリチル塩の存在下、1-O-アシル糖をグリコシド供与体として用い、これにチオグリコシドをグリコシド受容体として作用させることにより対応する二糖を系内で調製した。引き続き、第二段階として系内に酸化剤を加えることによって、調製された上述の二糖をグリコシド供与体に変換した。ここに第三のグリコシド受容体を加えたところワンポットで反応が円滑に進行し、良好な収率で目的とする三糖を立体選択的に得ることができた。

ワンポット連続的グリコシル化反応は35糖程度の糖鎖ブロックの合成に適しており、その他の手法と相補的に利用することによって糖鎖合成の効率化に大いに寄与するものと期持されている。まず申請者らの研究室で独自に見出だされた上記の反応を活用し、1-O-フェニル炭素エステル糖およびチオグリコシドを糖供与体とする二つの立体選択的グリコシル化反応を活用してGlcβ1-6Glcβ1-6Glc構造の三糖がワンポットグリコシル化反応により最高83%の高収率で得られることを明らかにした。さらにより一般性の高い糖鎖合成手法を確立するために各段階のグリコシル化反応について詳細に検討し、1段階目のグリコシル化では2位水酸基のみをp-トルオイル基、3,4,6位の水酸基をペンジル基で保護した1-O-フェニル炭酸エステル糖が触媒量のトリチル塩で速やかに活性化され遊離の水酸基を有するチオグリコシドと反応し、対応するβ-グリコシドを高収率で与えることを見い出した。また2段階目のグリコシル化反応についても新たに化学量論量のN-ヨードコハク酸イミドあるいはN-ブロモコハク酸イミドと触媒量のトリチル塩からなる活性化剤を用いるとチオグリコシドが低温で速やかに活性化され、対応するβ-グリコシドが高収率で得られることを明らかにした。さらにこれらの結果を踏まえ、ワンポット連続的グリコシル化反応を試みたところアノマーの混合物を生じることなく望みの三糖がいずれも良好な収率で得られ、基質一般性の高い糖鎖合成手法を確立することができた。ワンポット連続的グリコシル化反応は35糖程度の糖鎖ブロックの合成に適しており、糖鎖合成の効率化に大いに寄与するものと期待されている。筆者らの研究室では昨年度までに独自に見い出した種々の反応を活用し、1-O-フェニル炭酸エステル糖およびチオグリコシドを糖供与体とする二つの立体選択的グリコシル化反応を活用してGlcβ1-6Glcβ1-6Glc構造の三糖がワンポットグリコシル化反応により高収率で得られることを明らかにしている。さらにより一般性の高い糖鎖合成手法を確立するために各段階のグリコシル化反応について詳細に検討したところ、本年度は1段階目のグリコシル化に関してはモレキュラーシーブ5Aの存在下でフッ化糖が触媒量のプロトン酸により速やかに活性化され、これと遊離の水酸基を有するチオグリコシドとが反応して対応するα-グリコシドが高収率で得られることを見い出した。また2段階目のグリコシル化反応についても化学量論量のN-ヨードコハク酸イミドと触媒量のプロトン酸からなる複合系活性化剤がチオグリコシドを低温で速やかに活性することを明らかにし、これにより対応するβ-グリコシドを高収率で得ることが可能になった。さらにこれらの結果を踏まえ、ワンポット連続的グリコシル化反応を試みたところ高い立体選択性をもって望みの三糖を良好な収率で与える優れた糖鎖合成手法を開発することができた。
カルシウム拮抗薬を基盤とした心臓PET画像診断技術の開発

心不全等の心疾患は、高齢化により更なる患者数の増加が予測され、病態(ホルモン分泌量や遺伝子発現等)を把握した上での戦略的治療(プレシジョン・メディシン)が望まれる。最新のPETを用いた分子イメージング技術は、生体内での様々な分子・細胞の活動を3次元定量画像として捉えることが可能であり、治療戦略を推し進める基盤技術としては期待されている。電位依存性Ca2+チャネルは、心不全発症に至る心筋リモデリングや心臓突然死において重要な役割を果たすこが指摘されており、新たな治療標的として注目されているが、そのメカニズムに関しては不明な点が多い。本研究計画では、カルシウム拮抗薬をベースとしたPETトレーサーを開発し、心臓におけるCa2+チャネルの発現量・分布を画像化する新規分子イメージング診断技術を確立し、心不全・突然死の病態解明・臨床応用することを目指している。F18標識のPETトレーサーは、従来のC11標識のトレーサーと比較して、半減期が長く、中央サイクロトロン施設からデリバリーを受けることができる点や、撮像時間選択の柔軟性などから、申請者のグループでは、F18標識PETトレーサーを積極的に用いている。昨年度に引き続き、新規トレーサーの有用性を評価するために必須の、トレーサー標識方法の確立、細胞取込み評価法の確立、受容体結合評価法の確立、小大動物までの画像診断技術の取得といった実験の基盤作りは順調に進んだ。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度においては、新規トレーサーの有用性を評価するために必須の、トレーサー標識方法の確立、細胞取込み評価法の確立、受容体結合評価法の確立、小大動物までの画像診断技術の取得といった実験の基盤作りが主な成果となっている。新規トレーサーの開発においては、若干の遅れが生じているが、所属先の合成・F18標識に優れた研究者とのディスカッションを通して、積極的に進めていく予定である。当該年度においては、新規トレーサーの有用性を評価するために必須の、トレーサー標識方法の確立、細胞取込み評価法の確立、受容体結合評価法の確立、小大動物までの画像診断技術の取得といった実験の基盤作りは順調に進んだ。引き続き、新規18F標識PETトレーサーの合成及び基本性能評価を行っていく。基本性能評価を終えたトレーサーから、逐次、小動物を用いた心臓における機能的発現分布の画像化を進めていく。
耐風性の良好なハイブリッドLTA航空機の研究

1.変動風に対処するに十分な運動性,安定性をもつハイブリッドLTAの開発を目的とし,ラジコン模型によりその試作研究を行った。2.本研究で提案するLTAはド-ナツ形またはそれを前後に引き伸ばした長円環形のエンベロープをもつ。この形は通常の円形断面の飛行船に比べ側方面積が小さい利点をもつ。ド-ナツ形エンベロープの場合はその中央空洞部に2個の回転翼を上下に配した同軸ロータ式とし,長円環形エンベロープの場合は空洞部に2個の回転翼を前後に並べたタンデムロータ式として(何れも二つのロータは逆回転),ハイブリッドLTAを構成した。3.ヘリコプタと同様なロータブレ-ドのサイクリック・ピッチコントロールにより模型の位置と姿勢を制御する方法では制御トルクが不足するので,ロータの回転面をエンベロープとは独立に傾け,それによって位置制御を行う機構とした。旋回は,同軸ロータ式では上下のロータ回転数の差動調節により,タンデムロータ式では二つのロータの一つを横に傾けることによった。これにより,とくにタンデム式で十分な運動性が得られた。4.上記の方法ではエンベロープのロール制御ができないので,タンデムロータ式模型の中央部左右に小型の補助ロータを設けてロール制御を試みた。しかし小型ロータでは制御トルクが不足で,より強力なロータが必要なことが分かった。5.風洞実験によりエンベロープ模型の抗力と揚力を測定した。その結果,抗力係数は2次元円柱に比べて若干小さい値であった。また長円環形よりもド-ナツ形の方が抗力が僅かに小さめであった。6.本研究の結果に基づき,さらに改良を加えて研究を続けていく方針である。1.変動風に対処するに十分な運動性,安定性をもつハイブリッドLTAの開発を目的とし,偏平な外形をもつハイブリッドLTAのラジコン模型2種を試作した。一つはドーナツ型のエンベロープの中心部に逆回転する2個のロータを上下に配置した同軸ロータ式のもの,他の一つはゴムボート様の中空長円形のエンベロープの内部に逆回転する2個のロータを前後に並べたタンデムロータ式のものである。2.まずヘリコプタと同様なロータ・ブレードのサイクリック・ピッチにより模型の姿勢と位置を制御する方法を試みたが,それでは制御トルクが不足することが分かった。それで大きなエンベロープをもつLTA全体の姿勢を変えないで,ロータの回転面だけを傾けて位置制御が行えるように機構を改造した。方向転換は,同軸ロータ式では上下のロータの回転数調節により,タンデムロータ式の場合は二つのロータを左右に逆に傾ける(一つのロータを傾けるだけでもよい)ことによった。3.以上の改造により運動性が向上し,8字飛行も可能となったが,操縦性が良いとはいえなかった。なお飛行実験は屋内で行った。4.上述の実験と並行して,エンベロープの動的空気力特性を調べるために,その風洞模型とストレンゲージ式の揚力,抗力測定用天秤を製作し,風洞実験を行った。その結果,空気抗力はドーナツ型の方がやや小さかった。模型にはロータは付けていなかったが,ロータが回転すると抗力にも影響があると思われるので,なお研究の要がある。5.サイクリック・ピッチ機構による制御はヘリコプタの技術がそのまま使える利点があるが,飛行実験結果からは,それがハイブリッドLTAの制御法として最良とは考えられなかった。来年度は4個のロータの回転数調節による制御法を研究し,推進用プロペラも加えて飛行特性を向上させ,屋外の飛行実験も行えるようにする計画である。

1.前年度よりの計画に従い,エンベロープの平面形を長円環形とし,中央部に動的浮力発生用の主ロータ2個を前後に並べ,横揺れ制御用の小型補助ロータ2個を左右に置いた4ロータ方式のラジコン模型を製作した。2.操縦法は高度と旋回(片揺れ)の制御を主ロータの回転数制御により(旋回のときは差動的に増減),縦揺れと横揺れの制御をそれぞれ主ロータと補助ロータのピッチの差動制御により行った。機体の前進後退と側方移動はそれぞれ縦揺れ制御と横揺れ制御により行うが,主ロータのサイクリックピッチコントロールも併用した。3.前項の制御法を用いる場合,2個の主ロータはそれぞれが高度指令,縦揺れ(前後移動)指令,横揺れ(側方移動)指令,および片揺れ(旋回)指令の何れにも応答しなければならない。これは市販のコンピュータミキシング・プロポ装置を採用し,各指令信号のミキシングを行うことで解決された。4.飛行試験では,縦揺れ制御とそれに伴う前後移動および旋回運動は行えたが,左右補助ロータが小さかったために横揺れ制御は十分ではなかった。横揺れ制御は機体が風などの影響で傾いたときにそれを修正する目的をもつが,そのためにはより強力な左右ロータが必要なことが分かった。なお横風で流されることを防ぐには前年度用いた主ロータの回転面を傾斜させる方法が有用であり,これと左右ロータによる全機の横揺れ角制御を併用するとよい。5.本研究の結論として,4ロータ方式のハイブリッドLTAにおいては横揺れ制御用の補助ロータも主ロータに準ずる強力なものとする必要があること,変動風に十分対抗するには主ロータ回転面の傾斜角制御を併用するのがよいこと,等が挙げられれる。
寛政の改革政策と西国民衆の動向に関する研究-畿内幕領を主なフィールドとして-

幕府寛政改革に関する研究は、享保および天保のそれに比べて大きく立ち遅れていたが、1960年代に入って以降前進をとげるようになった。しかし、そこで主に分析対象とされたのは、東国幕領に対する改革農政(「名代官」による農村復興のための諸政策)であり、西国幕領に対するそれについては視野の片隅におかれ続けてきた。こうした研究状況をふまえて、本研究では、西国特に先進地畿内の幕領を主なフィールドとしてそこから幕府寛政改革を見つめなおすことを課題とし、平成8年度から10年度にかけて関係史料の調査・収集を進めた。寛政改革を主導した老中松平定信は、それまでの西高東低の経済状況を是正し、劣勢であった「東」の地位を高めようとした政治家としてよく知られている。これに関わって注目されるのは、改革農政も「西」と「東」の実状をふまえ、双方をにらんだ形で展開されていった事実である。その代表例は公金貸付政策であり、公金の貸付を媒介として「西」の経済的なゆとりを「東」の窮民の救済にあてようとする側面を有していた。これと併行して、農村荒廃が進んでいた東国の幕領に対してはその復興に力点をおいた諸政策が推進されていったが、西国特に先進地畿内の幕領では、改革政権成立当初の御料巡見使への数多くの訴願や国訴の展開からうかがえる民衆の期待や願いに反して、年貢の増徴に力点がおかれ、改革後期には勝与八郎を中心に年貢増徴をめざした政策が本格的に推進されていった。これによって、一定の増徴は実現されたが、民衆の反対の声が高まるようになり、結局十分な成果をあげえないまま、他の政治問題もかかわって、松平定信は退陣を余儀なくされるに至った。本年度は研究の初年度であり、従来の幕府寛政改革に関する研究史の整理作業を行うとともに、西国幕領のうち特に畿内幕領の関係史料の調査・収集を進めた。京都・大阪・兵庫・奈良など、主として近畿地方の各府県の図書館や資料館に赴いて、収蔵史料や関係文献の調査・収集を行うとともに、各府県内の関係史料の所在状況の把握につとめた。現史料やマイクロフィルムを見ることができたのは、摂津の江口村田中家文書・平野郷杭全神社文書、河内の太田村柏原家文書、和泉の豊田村小谷家文書、大和の東安堵村富本家文書・田原村片岡家文書・上牧村牧浦家文書、などで、寛政改革期の当該地域に対する幕政のあり方や改革前後の民衆の動向をうかがうことができる史料を収集することができた。さらに次年度に関係史料の調査・収集を進める予定である。本年度は研究の二年目であり、従来の幕府寛政改革に関する研究史の整理作業を継続して行うとともに、前年度に続いて西国幕領のうち特に畿内幕領の関係史料の調査・収集を進めた。近畿地方の各府県立の図書館のうち前年度に調査できなかった滋賀県立図書館に赴いて近江の幕領に関する関係文献を収集し、関係史料の所在状況の把握を行うとともに、奈良県御所市の東佐味・落合家文書、今住・中島家文書、桜井市の辻・辻家文書、生田・高瀬家文書、北葛城郡上牧町の南上牧・牧浦家文書、王篠市立図書館所蔵文書、大阪府東大阪市の三ノ瀬・小倉家文書、などの調査を行い、寛政改革期の当該地域に対する幕政のあり方や改革前後の地域民衆の動向をうかがうことができる史料を収集(写真撮影・筆写)した。