hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インターロック構造をもつ柔軟な多核遷移金属錯体の合成と応用

パラジウム部分をもつ環状の分子を合成した。この分子は合計24個の炭素原子と酸素原子による環骨格をもつ。この環状分子の2分子内孔に、線状の有機化合物を貫通させて、環状分子2分子と線状分子1分子が絡まった分子集合体を合成した。この分子集合体は2つの環状部分がそれぞれ1つづつパラジウムを含む。これを触媒として用いると特徴的な選択性を示し、通常では生成しにくい環状化合物をより高い収率で与えた。パラジウム錯体部分を含むクラウンエーテルの合成を行った。具体的には{1,2-ビス(ピリジルエチニル)ベンゼン}部分を含む[24]クラウン-8-エーテルを合成し、これにジクロロ(シクロオクタジエン)パラジウム(II)錯体を反応させて含パラジウム錯体クラウンエーテルを合成した。合成した大環状化合物は各種分光学的手法および質量分析、元素分析によって構造を決定し、さらに単結晶X線構造解析の結果から、クラウンエーテルの1,2-ビス(ピリジルエチニル)ベンゼン部分の二つの窒素原子はパラジウムに対してトランスの位置関係で配位した構造を取っていることを明らかにした。また、合成したクラウンエーテルを環状分子として用いて、ロタキサンの合成を行った。軸状分子としては末端オレフィン部分を有する二級ジアルキルアンモニウム塩を用いた。合成ではまず、軸状分子と合成した含パラジウムクラウンエーテルとを塩化メチレン溶媒中で混合し、擬ロタキサンを発生させた。この状態で軸分子のオレフィン部分と、嵩高い置換基を有するアクリレートとのクロスメタセシス反応によって軸分子の末端を修飾して、ロタキサンを合成した。さらに類似の反応をアクリレートが存在しない状態で進行させることで、軸分子部分のホモメタセシス反応を進行させ、一つの軸状分子が二つの環状分子の内孔を貫通した構造を有する[3]ロタキサンを合成した。生成するロタキサンは核磁気共鳴法などの分光学的手法や、質量分析等をもちいて構造を決定し、そのスペクトル解析から、環状分子の酸素原子と軸状分子のアンモニウム部分との問には水素結合が働いている事を明らかにした。前年度までに合成した{1,2-ビス(ピリジルエチニル)ベンゼン}パラジウム錯体部分を有する24員環クラウンエーテルを均一系錯体触媒として用いた。具体的には溝呂木-ヘック反応の触媒としてこれを用いた。クラウンエーテルに導入されたパラジウム錯体部分の反応活性は、ロタキサンを形成した状態であっても損なわれることはなかった。特に触媒反応で反応点が2つある物質どうしの1:1の反応を検討することによって、反応が1:1で環化した生成物を与えるか、それとも分子間反応を繰り返したポリマーを与えるかを検討した。その結果、特に触媒として、パラジウム錯体部分を含むクラウンエーテル2分子の内孔を、1分子の二級アルキルアンモニウム塩で貫通させた複核錯体構造を有するロタキサンを形成させたものを用いると、単核構造をもつパラジウム錯体触媒を用いた場合よりも1:1で環化した生成物を与えやすことがわかった。この結果は、ロタキサンの内部においては、環状分子が自由に動きつつ、2つのパラジウム部分が環化反応をおこすのに適切な位置関係をとることを示している。以上のように本研究では、ロタキサン構造を利用した複核遷移金属錯体触媒を開発することに初めて成功した。これは錯体化学に対して、あたらしい複核金属錯体の構築方法を提案したという意義がある。なおかつこのコンセプトによって合成された錯体が、実際に触媒反応において特徴ある性質を示す、という重要な知見を得るに至った。
母体血中RNAを用いた癒着胎盤の発症予知法の開発

母体血漿中cell-free RNAや細胞成分cellular RNAを用いてhPL, hCGの遺伝子発現を定量すると、hPL遺伝子は、妊娠経過に伴い漸増する。母体血漿中RNAの半減期は32分で、分娩後、24時間で検出されなくなる。細胞成分RNAの半減期は200分で血漿中RNAに比較して長く、分娩後24時間でも検出されつづける。しかし、これらの遺伝子発現はそれぞれの血中蛋白濃度と相関しており、母体血漿中RNA・細胞成分RNAを用いて胎盤の機能的な変化がモニターできると考えられる。しかしながら、癒着胎盤については、妊娠初期に600例以上の検体採取をおこなったが、その症例に癒着胎盤は発生しておらず、至適マーカーの同定には至らなかった。癒着胎盤については、発症率が極端に低いが、分娩時には大量出血を惹き起こし、母体死亡の原因にもなる重要な疾患である。今後も根気強く検体採取を継続し、その予知マーカーの開発につなげていきたい。そこで、妊娠高血圧症候群(PIH)に対象を拡大し研究を継続した。まず、母体血漿中cell-free RNAについてPIHを発症した妊婦とコントロール妊婦血中cell-free RNA及びcellular RNAで血管増殖関連因子や抗酸化ストレス因子などの遺伝子発現量を検討した。その結果、PIH患者血漿中でVEGF, FLT1, endoglinなど8種類の遺伝子発現量は、全て有意に増加し(p<0.001)、その発現量は、分娩後に急減した。さらに、各発現は、収縮・拡張期血圧、蛋白尿の重症度と有意に相関した。また、cellular RNAの検討でも、HO-1、HO-2、Catalase、VEGF、PlGFの遺伝子発現は低下、FLT-1、endoglin(ENG)、TGF-β1の遺伝子発現は有意に増加した。そこで、妊娠中期の臨床症状がない時期に682例から採血し、その後にPIHを発症した症例(n=62)としなかった症例(n=310)を1 : 5マッチで無作為に抽出し、母体血漿中RNAと細胞成分RNAを用いて、血管増殖関連因子や抗酸化ストレス因子などの遺伝子発現量を比較し、発症予知の可能性を検討した。その結果、cell-free RNAでは、VEGF, FLT1, endoglinなど7遺伝子の発現量が妊娠中期に既に有意に高値を示していた。ROCカーブを用いた発症予知の検討で、FLT1、次いでEndoglinが最もPIHの予知率が高く、7種類を組み合わせで予知率が更に高まり、5%の偽陽性率で、PIHの84%が予知できることが分った。さらに、cellular RNAの検討でも、FLT1、ENG、P-selectin、PLAC1は妊娠高血圧症候群をその後に発症した群で高値を示し、逆に、PlGFとHO-1は低値を示した。TGF-β1、VEGF、SODには有意な変化は見られなかった。ROC curveを用いて妊娠高血圧症候群の発症予知の可能性について解析したところ、ENGが、次いで、FLT1が特に優れた妊娠高血圧症候群の予知マーカーであることが分かった。さらに、ENG、FLT1、PlGFと経産か否かの4因子の組み合わせで、妊娠高血圧症候群の66%が、疑陽性率10%で予知可能であることがわかった。このように母体血中を循環するcell-free RNA及びcellular RNAともに胎盤の機能的な変化を鋭敏に反映し、胎盤の機能変化をモニターするツールとして有用であると考えられた。

そこで、妊娠中期の臨床症状がない時期に682例から採血し、その後にPIHを発症した症例(n=62)としなかった症例(n=310)を1 : 5マッチで無作為に抽出し、母体血漿中RNAと細胞成分RNAを用いて、血管増殖関連因子や抗酸化ストレス因子などの遺伝子発現量を比較し、発症予知の可能性を検討した。その結果、cell-free RNAでは、VEGF, FLT1, endoglinなど7遺伝子の発現量が妊娠中期に既に有意に高値を示していた。ROCカーブを用いた発症予知の検討で、FLT1、次いでEndoglinが最もPIHの予知率が高く、7種類を組み合わせで予知率が更に高まり、5%の偽陽性率で、PIHの84%が予知できることが分った。さらに、cellular RNAの検討でも、FLT1、ENG、P-selectin、PLAC1は妊娠高血圧症候群をその後に発症した群で高値を示し、逆に、PlGFとHO-1は低値を示した。TGF-β1、VEGF、SODには有意な変化は見られなかった。ROC curveを用いて妊娠高血圧症候群の発症予知の可能性について解析したところ、ENGが、次いで、FLT1が特に優れた妊娠高血圧症候群の予知マーカーであることが分かった。さらに、ENG、FLT1、PlGFと経産か否かの4因子の組み合わせで、妊娠高血圧症候群の66%が、疑陽性率10%で予知可能であることがわかった。このように母体血中を循環するcell-free RNA及びcellular RNAともに胎盤の機能的な変化を鋭敏に反映し、胎盤の機能変化をモニターするツールとして有用であると考えられた。母体血漿中RNAを用いてhPL, hCGの遺伝子発現を定量すると、hPL遺伝子は、妊娠経過に伴い漸増し、分娩後、24時間で検出されなくなる。これらの遺伝子発現は血漿中のそれぞれの血中蛋白濃度と相関しており、母体血漿中RNAを用いて胎盤の機能的な変化がモニターできると考えられる。そこで、PIHを発症した妊婦(n=43)とコントロール妊婦(n=41)の血漿を分離し、PIH患者血中で蛋白濃度が増加することが報告されているVEGF, VEGFR1, endoglinなど8種類の遺伝子を標的に、RT-PCR法で発現量を測定した。その結果、PIH患者血漿中で上記8種類の遺伝子発現量は、全て有意に増加し(p<0.001)、その発現量は、分娩後に急減した。さらに、各発現は、収縮・拡張期血圧、蛋白尿の重症度と有意に相関した。次に、妊娠中期の臨床症状がない時期の血液を用い(n=372)、その後にPIHを発症した症例(n=62)としなかった症例で、これらの発現量を比較し、発症予知の可能性を検討した。その結果、CRHを除く7遺伝子の発現量が妊娠中期に既に有意に局値を示していた。ROCカーブを用いた発症予知の検討で、VEGFR1、次いでEndoglinが最もPIHの予知率が高く、7種類を組み合わせで予知率が更に高まり、5%の偽陽性率で、PIHの84%が予知できることが分った。母体血漿中遺伝子を定量することで、胎盤の機能的な変化を無侵襲に評価できることを示した。癒着胎盤については、現在、検体採取を継続中であり、検体が集まった段階で、測定を開始する予定である。母体血漿中cell-free RNAを用いてhPL, hCGの遺伝子発現を定量すると、両遺伝子は血中蛋白濃度と強い正の相関を示す。また、hPL遺伝子は、妊娠経過に伴い漸増し、分娩後、24時間で検出されなくなる。
生体内での異性化反応およびプロトン移動反応における選択性の発現機構

平成12年度までに研究助成を受け、実験を行った結果として、平成13年度には以下の成果を発表することができた。フェムト秒蛍光分光法を用いて視物質ロドプシンや古細菌の光センサーであるフォボロドプシンの励起状態からの蛍光を実時間で観測することに成功し、レチナールが光受容して起こる超高速異性化反応の速度を決定するとともに、蛋白質という反応場の特異的な役割を明らかにすることができた。バクテリオロドプシンの低温偏光赤外分光を用いた構造解析から、プロトン移動の受容体であるAsp85と水素結合を形成するThr89はスイッチを構成しないことがわかった。古細菌の光センサーであるフォボロドプシンは、バクテリオロドプシンと異なって光を情報へと変換するが、伝達蛋白質が存在しないと低い効率でプロトンをポンプすることが知られている。そこで低温赤外分光を用いたフォボロドプシンとバクテリオロドプシンの比較研究を開始し、類似のレチナール発色団構造や特異な水分子の水素結合構造などを明らかにした。古細菌ロドプシンと同様に、鍵物質レチナールを発色団とする視物質ロドプシン、ニワトリの赤感受性色素、緑感受性色素に対して低温赤外分光を行い、それぞれに特異な蛋白質構造を明らかにした。我々は光駆動プロトンポンプであるバクテリオロドプシンや視物質であるロドプシンを対象として、生体での異性化反応やプロトン移動反応のメカニズムを明らかにするために研究を行っている。特に、効率や選択性、方向性といった生体がもつ特異性がどのように発現されているのか、その機構を蛋白質の構造や光反応ダイナミックスと結び付けて明らかにすることを目指す。分光学的な手法を用いて本年度は以下のような成果が得られた。バクテリオロドプシンの異性化に伴う蛋白質の側の構造情報を得るため、偏光赤外分光法を初期異性化過程に対して適用した測定系を構築した。その結果、異性化反応に伴う発色団の構造変化によって、水分子を含む水素結合ネットワークに大きな歪みが生じていることがわかった。一方、バクテリオロドブシンがプロトン輸送の方向性を発現するためには、蛋白質内部に方向性を規定するスイッチのようなものが過渡的に生じることが必要であろう。我々は最も大きく構造変化をした中間体であるN中間体における水分子の構造変化を測定することに成功し、後期プロトン移動に関与していると考えられる水分子の水素結合変化を解析した。さらにN中間体に対する偏光赤外分光から、スイッチに伴う蛋白質骨格の構造変化に現れる新しい振動バンドを見出した。さらにシステインのS-H伸縮振動が他の振動から離れた領域に存在することに着目し、水素結合ネットワークの動的な構造変化のプローブとして、システインの導入を提案した。視覚の光センサーであるロドプシンは、超高速異性化を行う結果高い光感度を得ていることが知られている。我々はフェムト秒アップコンバージョン法を用いて、ロドプシンからの蛍光をはじめて実時間で捉えることに成功した。また赤外分光法を用いて活性中心や細胞質側領域に水分子が存在することを明らかにした。視物質であるロドプシンの機能は、光によってG蛋白質を活性化することである。我々は複合体の形成に伴う赤外スペクトルの変化を捉えることに成功し、さらにトランスデューシンにおける相互作用部位であるC末端のペプチドを用いて同様の測定を行うことにより、ロドプシンとトランスデューシンに由来する信号を帰属した。我々は前年度、バクテリオロドプシンの光異性化反応における蛋白質側の構造変化を詳細に捉えるため、偏光赤外分光を用いた測定系を構築した。

その結果、異性化反応に伴う発色団の構造変化によって、水分子を含む水素結合ネットワークに大きな歪みが生じていることがわかった。本年度は具体的に振動バンドを同定するため、スレオニンの水酸基を同位体に置換した試料の測定を行った。その結果、重水置換可能なO-H伸縮が89位のスレオニンであり、この部位は異性化反応に伴って水素結合が強くなることが明らかになった。さらに高波数領域全体にわたって詳細な測定を行ったところ、バクテリオロドプシンの18個のスレオニンのうちで、3個だけが異性化によって水素結合構造が変化することがわかった。興味深いことに、発色団から11A以上も離れた17位のスレオニンにも構造変化が観測されており、蛋白質内部における異性化反応には特異的な構造変化のチャネルが存在することを示唆している。さらに塩素イオンポンプであるハロロドプシン、呼吸鎖に含まれるプロトンポンプであるオキシデース、色覚色素であるアイオドプシンの赤外分光により、機能発現過程における蛋白質の側の構造変化を明らかにした。我々は光駆動プロトンポンプであるバクテリオロドプシンやロドプシンなどの視物質を対象として、生体内での異性化反応やプロトン移動反応のメカニズムを明らかにするために研究を行っている。特に本研究においては、効率や選択性、方向性といった生体がもつ特異性がどのように発現されているのか、その機構を蛋白質の構造や光反応ダイナミックスと結び付けて明らかにすることを目指した。このためには反応過程における蛋白質の構造変化を捉えることが最重要となるが、我々は低温赤外分光法を用いたこれまでにない精度の測定系を構築しており、これをもとにして、蛋白質試料の同位体標識や変異蛋白質の測定を行うことで、生体内での化学反応に伴う蛋白質の構造変化を解析した。バクテリオロドプシンの光異性化反応、プロトン移動反応に対する研究の結果、異性化反応によってバクテリオロドプシン中に存在する18個のスレオニンの中で3個だけが構造変化することが明らかになった。これは異性化によって蛋白質の大きな構造変化は起こらない、という考えを支持する実験結果である。一方、発色団から11Å以上離れた17位のスレオニンに水素結合変化が見られたことは、構造変化のための特異なチャネルの存在を示唆するものである。さらに、重水置換可能なO-H基をもつ89位のスレオニンは異性化によって水素結合が強くなるが、この水素結合はL、M中間体でも変わらないことがわかった。これは、89位のスレオニンがポンプのためのスイッチ部位を構成しないことを意味する実験事実である。さらに細菌の光センサーであるイエロープロテイン、視物質の中で色覚を担う赤感受性色素や緑感受性色素の赤外分光により、機能発現過程における蛋白質の側の構造変化を明らかにした。また、フェムト秒蛍光分光法を用いて視物質ロドプシンの測定を行い、励起状態における異性化反応過程を明らかにした。
新規分子ＺＮＦ４４９の軟骨と間葉系組織における機能解析

新規分子ZNF449の軟骨における機能解析を中心に研究を行った。成長板軟骨では広範に発現し、特に前肥大細胞層で多く発現が見られた。プロモーター解析や軟骨分化誘導系を使用したin vitroの実験では肥大分化関連因子への作用が示唆された。そこで軟骨内骨化や軟骨恒常性維持への関与をみるためにノックアウトマウスを作製した。しかしながら成長障害は見られず、マウス変形性関節症モデル、老齢化モデルでも野生型マウスと比較し大きな差は見られなかった。また筋肉や骨などの間葉系組織の解析も行ったが明らかな萎縮や骨形成の異常は見られなかった。新規分子ZNF449の軟骨における機能解析を2年間に渡って行った。初年度は軟骨や各臓器における発現確認から開始し、膵臓、軟骨、筋肉に多く発現していることが分かった。次に成長板軟骨における発現を解析し、前肥大細胞層に多く発現が見られた。そこでATDC5細胞にレトロウィルスでshRNAを安定導入し分化誘導をかけたところ肥大分化関連因子、Col10a1, Mmp13への関与が示唆された。またプロモーター解析でも同様に肥大分化関連因子の転写制御に重要な作用を有する結果が得られた。初年度よりノックアウトマウスの作製を開始し、二年目にin vivoの解析を行った。まず生後8週までの成長発達をみたところ、野生型マウスと体長、体重ともに同等であった。続いて胎生期も調べたがE15.5、E18.5でも成長障害は見られなかった。そこで軟骨恒常性への関与をみるために内側側副靭帯と内側半月板を切除する変形性関節症モデルを作製した。術後8週で評価したが、変形性関節症の進行は野生型マウスと差がみられなかった。また加齢性変化をみるために、1年間飼育したマウスの膝関節の組織切片を作製し評価したがこちらも変性の進行に差はみられなかった。軟骨への関与がin vivoで明らかとならなかったため、次に間葉系由来の組織を調べた。比較的発現の多かった筋肉や骨の解析したが、骨密度は腰椎、長管骨ともに差はなく、筋肉量も野生型マウスと差が見られなかった。まずマウス各臓器におけるZfp449の発現解析を行った。8週齢のC57B6Jマウスから組織パネルを自作し、リアルタイムPCRでmRNAの発現量を調査すると間葉系由来の組織、特に筋肉、骨、軟骨などに発現が多く見られた。続いて胎生17.5日のマウス脛骨近位成長板に自作抗体を用いて免疫組織染色を行い、四肢での発現解析を行った。広範囲に発現が認められが、特に前肥大細胞層から肥大細胞層にかけ強かった。よって四肢の発生ならびに成長に強く関与していることが示唆され解析をin vitroの解析を進めた。in vitroの実験ではまず細胞免疫染色を行い、核内に存在することを確認した。またプロモーター解析によりDNAと結合することを確認し、転写因子であることがわかった。次にATDC5の分化誘導系を用いて各分化段階での機能解析を行った。レトロウィルスを用いてshRNAを安定導入した細胞株を作製し、インスリンで分化誘導をかけたところ、後期の分化誘導は促進され、Zfp449は軟骨分化において抑制的な作用があることが示唆された。またルシフェラーゼアッセーではIhh, Pthr1を強く活性化することがわかり、これらの遺伝子との関連性を今後調査していく予定である。コンディショナルノックアウトマウスを作製するためにFloxマウスを作製中である。ターゲティングベクターを自作し、現在injectionの段階で、F0の誕生を待っている。shRNA作製に難渋したため、cDNAマイクロアレーへの検体提出が遅れているが、それ以外の実験は概ね予定通り進行中である。発現解析は自作組織パネルがうまく作製でき、良い結果が得られたと考えている。特に我々が興味を持っている運動器、特に軟骨での発現が確認されたため、当初の目的を果たすべく、実験を進めている。成長板での発現解析は免疫組織染色を行うために抗体選択に苦労し、結局自作抗体の作製を行った。現在も、市販されている抗体を使用し、さらに品質の良いものを選別中である。in vitroの実験はレトロウィルスのshRNA安定導入に難渋したが、現在は安定した細胞株の作製に成功している。現在までは抑制系を中心に解析を行っていたが、強制発現系の作製を現在行っている最中である。現在作成中の物はタンパクの発現量が少なく、発現ペクターを変更し、安定した系の確立に努めている。またマウス由来の細胞だけでなく、ヒト由来の細胞株を用いた実験を現在行っており、こちらも遺伝子導入の効率を高めるような工夫を行っている。プロモーター解析では活性の高かった遺伝子の絞り込みは比較的順調に行えたため、今後in vivoで同様の結果が再現されるか楽しみである。

ターゲティングベクターの作製は時間を要してしまったが、現在F0の誕生を待っている。誕生し次第、成長発達を行う計画である。In vitroではcDNAマイクロアレー解析を行うとともにクロマチン免疫沈降-シーケンシング法(ChIP-seq)によって結合するゲノム領域を調べ、結合部位がクロマチンなのか塩基配列なのかを解析し、cDNAマイクロアレイの結果と照合して標的とする遺伝子をさらに絞り込む。In vivoではFloxマウスが誕生し次第、当初の予定通りCAG-Cre、Prx1-Cre、Col2a1-Creマウスと交配させ、それぞれ全身、間葉系組織、軟骨組織で特異的にZNF449をノックアウトして、解析を行う。胎児期を含めた成長曲線を調べるとともに、長管骨の長さ、頭蓋骨の形態などから内軟骨性骨化、膜性骨化の障害の有無をwhole mount stainingで解析する。免疫組織染色ではII型コラーゲン、X型コラーゲン、MMP13など分化マーカーをはじめ、PTHrP、Ihh、VEGFなどの抗体を用いて各分化段階に与える影響を検討する。またBrdUの取り込みを調べ、増殖能の解析も行う。さらに、マウスの成長板、関節軟骨、肋軟骨から細胞を採取し初代培養を行い、ex vivoにてその分化能、増殖能について詳細な定量的解析を行う。またCol1a1-CreマウスやMyoD-Creマウスなどを用いてそれぞれ骨、筋に特異的なノックアウトマウスを作出し、in vivoでの解析を行う予定である。
多様体の綜合的研究

位相多様体は,可微分多様体,代数多様体など各種の多様体を対称として,大阪大学理学部数学教室構成員の多くの参加のもとに,綜合的研究を行った.その研究実績の概要はつぎの通りである位相多様体であって,群作用をもつものについて,中岡教授,川久保助教授を中心として多くの成果をあげた.川久保助教授は昭和62年12月大阪大学において群作用をもつ多様体をテーマとする国際シンポジュムを組織して,ここでこれらの成果を発表している.可微分多様体にいいては,村上教授,坂根助教授を中心として研究を進めた,村上教授は局所エルミート対称空間のマホテロジー論について,最近の表現論を用いた新しい手法についても研究し,この理論に関する綜合報告を昭和62年フランス・クルノーブルで開催された国際会議で行っている.坂根助教授は正のリッチ曲率をもつケーラー・アインシュタイン多様体を研究し,このような多様体で群か推移的に作用しない例を大量に構成することに成功している.代数多様体については,宮西教授,角田講師の精力的に研究を進め,低次元の代数多様体の構造に関して詳しい結果を得た.池田教授をはじめとする確率論研究者は,多様体の指数定理などに新しく開発され方法を用いた説明を進め,多様体について幾何学的に詳しい構造理論を展開しつつある.位相多様体は,可微分多様体,代数多様体など各種の多様体を対称として,大阪大学理学部数学教室構成員の多くの参加のもとに,綜合的研究を行った.その研究実績の概要はつぎの通りである位相多様体であって,群作用をもつものについて,中岡教授,川久保助教授を中心として多くの成果をあげた.川久保助教授は昭和62年12月大阪大学において群作用をもつ多様体をテーマとする国際シンポジュムを組織して,ここでこれらの成果を発表している.可微分多様体にいいては,村上教授,坂根助教授を中心として研究を進めた,村上教授は局所エルミート対称空間のマホテロジー論について,最近の表現論を用いた新しい手法についても研究し,この理論に関する綜合報告を昭和62年フランス・クルノーブルで開催された国際会議で行っている.坂根助教授は正のリッチ曲率をもつケーラー・アインシュタイン多様体を研究し,このような多様体で群か推移的に作用しない例を大量に構成することに成功している.代数多様体については,宮西教授,角田講師の精力的に研究を進め,低次元の代数多様体の構造に関して詳しい結果を得た.池田教授をはじめとする確率論研究者は,多様体の指数定理などに新しく開発され方法を用いた説明を進め,多様体について幾何学的に詳しい構造理論を展開しつつある.
汎用的な生合成マシナリー発現誘導物質の検索と物質生産

本研究では、SirAの阻害活性化を持つ化合物を探索・精製し、様々な糸状菌に汎用的な二次代謝系の発現活性化物質を獲得することを目指した。まず400種の糸状菌培養抽出物のライブラリーを構築した。また、A. nidulansのSirAの組換えタンパク質を大腸菌を用いて発現・精製した。蛍光法によってSirAの活性測定が可能であったことから、この手法を用いて上記の380種のライブラリーのSirA阻害活性を測定した(1次スクリーニング)。その結果、49種の試料が強くSirA活性を阻害し、このうち10種が比較的強い活性を示した。さらに、培養・抽出のスケールアップを行い、16種の菌がSirA阻害化合物を生産することが確認できた(2次スクリーニング)。子のう菌類に属する糸状菌FT8572株をPD培地を用いて培養した培養液から、SirA活性阻害作用をもつ化合物の精製を試み、2種の化合物(CおよびC-OH)を精製した。HRMSおよび1H-/13C-NMRを用いて両者の構造を決定したところ、これらは糸状菌由来の既知化合物Cおよびその一水酸化物であるC-OHであった。本化合物がsirtuin阻害活性を有することは初めての発見である。FT8572株は、培養1週間後に、590 uMのCを培養液中に蓄積した。また、CのSirA阻害活性のIC50は87 uMであった。また、取得した培養抽出物は、sirA遺伝子の遺伝子破壊株よりも多種の二次代謝産物を大量に生産することがわかった。このことから、SirA以外の糸状菌sirtuinも糸状菌の生合成マシナリーの発現誘導のターゲットとなることが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。A. nidulansでは、sirtuin(SirA)の阻害によりヒストンのアセチル化レベルが増加し、二次代謝系遺伝子の活性化が起こる。そこで、この活性の阻害を指標に天然物をスクリーニングした。組換えSirAタンパク質(rSirA)は、大腸菌を用いて発現させ精製した。200種の糸状菌を10 mlのポテトデキストロース培地およびYeast/Malt extract-sucrose培地を用いて培養したものをそれぞれ酢酸エチルを用いて抽出した。これをターゲットとし、SIRT1/Sir2 Deacetylase Fluorometric Assay KitおよびHPLCを用いた反応産物(nicotinamide)の定量によって、rSirAの酵素活性の阻害剤のスクリーニングを行った。現在までに、400の抽出物をスクリーニング源とし、49種の培養抽出物(38菌株)にrSirAによるヒストン脱アセチル化活性の阻害作用を見出した。さらに、これらの菌の培養のスケールアップを行いrSirAの阻害活性を検証し、複数の当該活性を有する培養液が得られた。これは、通常発現していない二次代謝系が覚醒された培養抽出物ライブラリーとして有用である。また、これらの化合物を定法に従い精製・構造の決定をすすめている。また、本菌の転写因子であるAmyRとCreAによる新規生合成マシナリー制御機構についての研究を進めた。その結果、これらがステリグマトシスチン生合成遺伝子群だけでなく多くの二次代謝系の発現抑制にも関与すると考えられた。現在、これらの因子により制御される生合成マシナリーの特定をすすめており、これによって、AmyRとCreAによる転写調節の分子機構を解明可能となった。

もっとも重要な課題である糸状菌培養液からのカビSirAの活性阻害剤のスクリーニング系を構築し、その部分精製まで到達した点は、当初の計画を上回るものである。一方、AmyRとCreAによる二次代謝系遺伝子発現制御の分子機構に関する研究は、これらによって制御される遺伝子の網羅的解析に成功した点で一定の評価はできるが、その後のブレイクスルーを迎えることができず、やや停滞した。これらを総合的に評価し、(2)とした。1.スクリーニングして得られた糸状菌培養液から、当初の計画通り、最低でも1種について、定法に従い精製し、構造を決定し、汎用型の生合成マシナリー発現誘引物質としての利用を検証することを目標にする。2.AmyR、CreAによって制御される二次代謝系遺伝子と培養液のHPLCプロファイルの相関を明らかとする。具体的には、HPLC上で見られる化合物ピークのうち、これらによって発現抑制を受けるものを同定する。これにより、これら転写因子が制御する二次代謝産物の生合成マシナリーが明らかとなる。1,2を通して、通常は発現していない潜在的な生合成マシナリーを人為的に発現させる技術の構築を目指す。
機械的刺激(重力負荷)環境下における骨代謝変動と薬物の作用

本研究は、重力負荷が骨形成に関与する薬物の作用を増強させるか否か検討し、さらに、その作用機序を調べ、未だ著効のある薬物が見出されていない骨粗鬆症の治療への機械的刺激負荷の応用を骨芽細胞様細胞ROS17/2.8細胞を用いて考えるものである。平成10年度には、活性化ビタミンD3によるオステオカルシンの合成促進作用、植物由来の卵胞ホルモンの類縁体のKCA-098による骨芽細胞のアルカリホスファターゼ活性促進作用、副甲状腺ホルモン(PTH)によるcAMP上昇作用を重力負荷は相加的に増強することを示した。(日本薬学会第120年会発表予定)。すなわち、薬物処理に際し、機械的刺激を同時に加えることにより、その作用が増強されることを示しており、治療法への応用が期待される。平成11年度には、この共同作用の作用機構を知る目的で、重力負荷による細胞内情報伝達機構の変動について検討した。特に、研究代表者らは、重力負荷は細胞質骨格系に影響を与えるのとを示してきたので、この下流に存在すると考えられるMitogen Activated Protein Kinase(MAPキナーゼ)の関与について検討した。その結果、MAPキナーゼのインヒビターを使った結果から、MAPキナーゼはアルカリホスファターゼ活性を抑制する作用をもつこと、重力負荷はMAPキナーゼ活性を抑制すること、その結果アルカリホスファターゼ活性の抑制が解除され、その活性を上昇させることを示唆した。すなわち、重力負荷はMAPキナーゼ活性を抑制することにより骨芽細胞の分化機能を促進することを示唆した。今後は薬物がこの機構にどのように関与しているか検討し、共同作用の実態を明らかにしていく。さらに11年度にはマウス骨髄細胞の培養実験から、重力負荷は破骨細胞の形成には影響を与えないことを示した。研究代表者らは、重力負荷は骨形成を担当する骨芽細胞を活性化(アルカリホスファターゼ活性上昇、オステオカルシン合成増加、コラーゲン合成増加など)することを示してきた。この事実は、重力負荷という機械的刺激が骨組織の形成を促進することを示している。骨粗鬆症は骨を分解する過程(骨吸収)が、骨形成を上回り、全体的に骨が薄く脆くなる疾患である。しかし、この疾患に著効のある薬物はいまだに見いだされていない。したがって、機械的刺激が薬物の効果を増大させることができるなら、骨粗鬆症の治療に新しい視点を持ち込むことになる。本年度は,薬物の作用が重力負荷により増強されるか否かについて主に検討した。植物由来の卵胞ホルモンであるクメステロールの類縁体のKCA-098は骨芽細胞のアルカリホスファターゼ活性を促進することが知られているが、その作用は重力負荷により相加的に増加した。その他にもビタミンD3によるオステオカルシンの合成、副甲状腺ホルモン(PTH)によるcAMP上昇作用にも相加作用が見られた。この結果は、薬物処理に際し機械的刺激を同時に加えることにより、その作用が増強されることを示しており、治療法への応用が期待される。今後はその他の薬物と機械的刺激との協同作用についてさらに検討し、またその作用機序についても明らかにしていく。そのためにも当初目的としていて、いまだに明確な結果のでていない重力負荷で変動する細胞内情報伝達系についても同時に追求していく。研究代表者らは、重力負荷は骨形成を担当する骨芽細胞を活性化することを示してきた。

本研究は薬物の効果が機械的刺激(重力)負荷により増強されるか否かを検討し、さらに、その作用機序を調べ、骨粗鬆症への応用を考えるものである。平成10年度は、活性型ビタミンD3によるオステオカルシンの合成促進作用、植物由来の卵胞ホルモンの類縁体のKCA-098による骨芽細胞のアルカリホスファターゼ活性促進作用、副甲状腺ホルモン(PTH)によるcAMP上昇作用を重力負荷は相加的に増強することを示した(日本薬学会第120年会発表予定)。これは、薬物処理に際し機械的刺激を同時に加えることにより、その作用が増強されることを示しており、治療法への応用が期待される結果である。本年度は、この共同作用の作用機構を知る目的で、重力負荷のよる細胞内情報伝達機構について検討した。研究代表者らは、重力負荷は細胞質骨格系に影響を与えることを明らかにしてきた。そこで、この下流に存在し、細胞の増殖と分化に関与しているMitogen Activatec Protein Kinase(MAPキナーゼ)に対する作用を調べた。その結果、MAPキナーゼのインヒビターを使った実験から、MAPキナーゼはアルカリホスファターゼ活性を抑制する作用を持つこと、重力負荷はMAPキナーゼ活性を抑制し、その結果アルカリホスファターゼ活性の抑制が解除され、その活性を上昇させることを示唆した。今後は薬物がこの機構にどのように関与しているか検討し、共同作用の実態を明らかにしていく。さらに、本年度はマウス骨髄細胞の培養実験から、重力負荷は破骨細胞の形成には影響を与ないことも示した。
リー群とリー環の表現論とその応用

簡約リー群の既約addmissible表現はstandard表現の商表現として実現される。そこで緩増加でない既約指標を調べるために放物型誘導からのstandard表現によるresolution(オイラー和)を用いる。この方法はHarish-Chandra加群A_q(λ)の間の指標等式を調べるためにも、放物型部分群の有限次元表現λのresolutionがわかればコホモロジーの手法が使えるので重要と思える。基本的にはinductionであるので実階数が2の単純リー群としてsplitな群Sp(2,R),quasi-splitな群SU(2,2)の場合を先ず調べた。研究代表者にあっては,京大総合人間学部西山享氏の結果を踏まえて,(1)SU(2,2)及びSp(2,R)のstandard表現(一般化された主系列表現と離散系列表現)のK-typeとその重複度を計算した。(2)Grothendieck群レベルにとどまっているが,単位表現のstandard表現によるresolutionをK-type,無限小指標,離散系列の埋め込みを調べて求めた。有限次元表現のresolutionも単位表現のそれから導ける。(SU(2,2)は一部留保付きである。)(3)SU(2,2)のときA_q(λ)について,Blattner型公式を用いてK-typeを計算した(主にλが単位表現のとき)。Grothendieck群レベルからHarish-Chandra加群レベルに上げることは難航している。それも含め研究成果をまとめるべく鋭意準備中である。
染色体工学的手法によるコムギにオオムギ第5染色体を添加した系統の育成

まず、不稔遺伝子の染色体上での物理的位置を推定するため、オオムギ第5染色体(1H)長腕の関与する相互転座系統(3系統)とコムギとの交雑から、転座第5染色体をコムギに導入した系統を育成し、切断点と稔性との関係を検討した。その結果、第5染色体長腕の動原体から約50%までの領域を導入した系統は正常な種子稔性を示すこと、また、第5染色体の長腕の末端から5%が他の染色体(第2染色体)に転座した染色体を添加しても種子稔性は正常であることがわかった。これらのことから、オオムギ第5染色体上の不稔を引き起こす遺伝子は長腕上の5095%の領域に位置することが明らかになった。次に、第5染色体によって誘発される不稔性は、オオムギ第6染色体(6H)によって部分的に緩和されることがわかっているが、その不稔緩和遺伝子は第6染色体の長腕に存在することを明らかにした。このように、第5染色体長腕の動原体から50%の領域および末端から5%の領域をコムギに導入することに成功した。現在、導入された第5染色体領域を容易に検出できる分子マーカーを検索中である。さらに、エギロプス(Aegilops)属由来の配偶子致死染色体の持つ染色体切断作用を利用して、不稔遺伝子を除去するための実験系統を育成した。この系統はオオムギの第5及び第6染色体に加えて配偶子致死染色体を1本ずつ持ち、雌性稔性がある。現在、戻し交雑後代の細胞学的調査によって不稔遺伝子を含むできるだけ小さい部分の欠失を起こした染色体の選抜を試みている。
アイトラッカーを用いたADHDとASDの鑑別診断に関する研究

ASD(自閉症スペクトラム障害)においては、他人の心を推察する能力である「心の理論」(Theory of Mind)に障害がみられることが指摘されている。成人の高機能ASDにおいては、経験、学習などの効果などによって、通常の「心の理論」の検査課題において異常を示さないことが多いが、アイトラッカーによる視線計測においては、健常者と異なる反応を示すことが、Senjuら(2009)、Schneiderら(2013)によって報告されている。つまりASDにおいては、他者の心中への推測が十分できないために、予想とは異なる方向に視線が向けられることが明らかとなっている。けれども現時点においては、アイトラッカーを用いた心の理論の研究は十分に検討されておらず、またADHD(注意欠如多動性障害)の当事者を対象とした研究はわれわれの知る限りは報告されていない。本研究においては、成人期のASD、ADHDの当事者を対象として、トビー社のアイトラッカーを用いて、Senjuら(2009)の課題と類似の動画を注視している際の視線を計測した。健常者との比較において、ASDにおいては、誤信念を抱く場面における視線の注視部位が異なっていたが、ADHDにおいてはこのような所見みられなかった。一方、両群とも動画の顔に対する注視時間が健常者より有意に短いという点で一致していた。現在までASDに対する生物学的指標は明らかにされていないが、アイトラッカーによる視線計測が生物学的指標となる可能性を示唆している。対象のリクルート、データ解析はおおむね順調に推移しており、研究結果も当初予測した内容にほぼ一致している。ASDの結果については論文化を行ったが、今後ADHDの結果についての論文化、両群の比較についての論文化を行う予定である。本研究は単一の検査課題を用いた研究である。今後、他の類似した検査課題を用いて同様の結果が得られるか検討を行う必要がある。さらに本研究では対象者の精神症状の評価が十分とは言えなかった。今後、ADOSなどの構造化面接を用いて、さらに詳細な症状評価を行いたい。本研究は、成人期の主要な発達障害であるADHD(注意欠如多動性障害)とASD(自閉症スペクトラム障害)を鑑別可能な生物学的指標を求めることを目的としている。ADHDとASDは、生活上、行動上の問題行動やトラブルは類似している面が多く、実地臨床においては診断に悩む例も少なくなく、両者の症状が併存しているケースもみられる。しかしながら、現時点においては、両者を鑑別する生物学的な指標は得られていない。本研究は、非侵襲的な検査方法であるアイトラッカーによる視線計測を用いてADHDとASDを鑑別する臨床的な指標を求め、成人の発達障害の治療およびリハビリテーション、あるいは社会復帰に寄与することを目的としている。これまでASDにおいては、他人の心を推察する能力である「心の理論」(Theory of Mind)に障害がみられることが指摘されている。成人の高機能ASDにおいては、経験、学習などの効果などによって、通常の「心の理論」の検査課題において異常を示さないことが多いが、アイトラッカーによる視線計測においては、健常者と異なる反応を示すことがSenjuら(2009)、Schneiderら(2013)によって報告されている。われわれは本研究に対する予備的な検討として、成人期のASDの当事者を対象として、トビー社のアイトラッカーを用いて、Senjuら(2009)の課題と類似の動画を注視している際の視線を計測した。その結果、健常者との比較において、ASDにおいては、誤信念を抱く場面における視線の注視部位が異なっていた。本研究においては、ASDに加えてADHDの当事者を対象とし、同様の視線計測を行なったが、ADHDにおいては心の理論の障害はみられなかった。ASDとADHDの両者とも、健常者と比較して、動画上の顔に対する注視時間が有意に短かった。これまでADHDとASDは別個の疾患と考えられ、臨床症状は類似しているにもかかわらず、共通した病態や臨床症状が数多く認められるという観点から検討されることは少なかった。昭和大学附属烏山病院および昭和大学病院附属東病院は、発達障害の専門外来および発達障害に特化したデイケア・ショートケアを開設しており、多数のADHDおよびASDの当事者の協力を得られる環境にある。このためADHDとASDを包括的に扱えることが利点であり、これまでの研究においてはこの利点を活用できている。心の理論に関しては、これまでの研究において、ASDの当事者においては、生育過程において健常者と同様の能力を獲得していくと考えられていた。けれども、アイトラッカーを用いた研究においては、高機能のASDの当事者において、特徴的な視線の動きを示すことが明らかとなっており、潜在的な心の理論の障害を示すことが示されている。本研究ではASDにおいてこのような結果を確認できたことに加えて、新たにADHDを対象とした結果においては心の理論に異常を示さないことを明らかとした。このようにアイトラッカーを用いた「心の理論」を検査課題とすることによって、今後、ADHDとASDの鑑別診断の有力な指標を得られる可能性を示している。これまでADHDとASDは別個の疾患と考えられ、共通した病態や臨床症状が数多く認められるという観点から検討されることは少なかった。昭和大学附属烏山病院および昭和大学病院附属東病院は、発達障害の専門外来および発達障害に特化したデイケア・ショートケアを開設しており、ADHDとASDを包括的に扱うことが可能である。

心の理論に関しては、これまでの研究において、ASDの当事者においては、生育過程において健常者と同様の能力を獲得していくと考えられていた。けれどもアイトラッカーを用いた研究においては、高機能のASDにおいて、通常の心の理論の検査課題において異常を示さないケースにおいても、特徴的な視線の動きを示すことが明らかとなっている。このような研究結果は臨床応用には至っていないが、本研究において、ADHDとASDの鑑別に有効性が大きいことが明らかになれば、ADHDおよびASDの治療やリハビリテーションにおいて重要な役割を示すものと考えられる。これまでASDにおいては、アイトラッカーによる視線計測においては、動画を用いた課題において健常者と異なる反応を示すことがSenjuら(2009)、Schneiderら(2013)によって報告されている。今回の研究では、成人期のASD、ADHDの当事者を対象として、トビー社の機材を用いて、Senjuら(2009)の課題と類似の動画を注視している際の視線を計測した。ASDとADHDの比較においては、ASDにおいては「心の理論」に相当する障害がみられたが、ADHDではこれを認めなかった。この結果は、このような視線計測はADHDとASDの鑑別に有用である可能性を示している。現在まで当初の課題についてASDとADHDについてそれぞれ20例あまりの検討を行い、ASDの結果について論文化を行っている。今後さらにASDとADHDの比較について検討を行い、論文化を行う予定である。ASD(自閉症スペクトラム障害)においては、他人の心を推察する能力である「心の理論」(Theory of Mind)に障害がみられることが指摘されている。成人の高機能ASDにおいては、経験、学習などの効果などによって、通常の「心の理論」の検査課題において異常を示さないことが多いが、アイトラッカーによる視線計測においては、健常者と異なる反応を示すことが、Senjuら(2009)、Schneiderら(2013)によって報告されている。つまりASDにおいては、他者の心中への推測が十分できないために、予想とは異なる方向に視線が向けられることが明らかとなっている。けれども現時点においては、アイトラッカーを用いた心の理論の研究は十分に検討されておらず、またADHD(注意欠如多動性障害)の当事者を対象とした研究はわれわれの知る限りは報告されていない。本研究においては、成人期のASD、ADHDの当事者を対象として、トビー社のアイトラッカーを用いて、Senjuら(2009)の課題と類似の動画を注視している際の視線を計測した。健常者との比較において、ASDにおいては、誤信念を抱く場面における視線の注視部位が異なっていたが、ADHDにおいてはこのような所見みられなかった。一方、両群とも動画の顔に対する注視時間が健常者より有意に短いという点で一致していた。現在までASDに対する生物学的指標は明らかにされていないが、アイトラッカーによる視線計測が生物学的指標となる可能性を示唆している。対象のリクルート、データ解析はおおむね順調に推移しており、研究結果も当初予測した内容にほぼ一致している。
エネルギー代謝とラジカルスカベンジ能からみたCV-159の脳保護作用

ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬CV-159はL型Ca^<2+>チャネルの阻害作用ならびにカルモジュリン阻害作用,ラジカルスカベンジ能があるとされる。その脳保護効果について,リンを観測核とする核磁気共鳴法を用いて,エネルギー代謝の側面から検討した。CV-159の灌流液への添加(10nM-10μM)による脳虚血-再灌流負荷後のエネルギー代謝の回復には変化が認められなかった。しかし, CV-159腹腔内投与(120μg/kg)により,脳虚血-再灌流負荷後のエネルギー代謝の回復は有意に良好であった。本研究は,カルシウム拮抗薬であるCV-159の脳虚血に対する脳保護効果がそのラジカルスカベンジ能によることを,リンを観測核とする核磁気共鳴法(^<31>P-NMR)および電子スピン共鳴法(ESR)により明らかにすることを目的とする。平成21年度は以下の事項を実施した。【虚血-再灌流負荷および持続性脱分極性負荷に関する基礎的再検討】(徳丸・黒木・北野)脳虚血に対するCV-159の脳保護作用を評価するために、虚血-再灌流負荷および持続性脱分極性負荷を行う。その際の脳スライスのエネルギー状態を^<31>P-NMRにより詳細に検討した。実験に適した温度、流速、負荷時間に関する予備実験を行い、CV-159の脳保護作用に関する実験を行うにあたり最適の条件を決定した。【ESRによるedaravoneのラジカルスカベンジ能の測定】(徳丸・黒木・横井・古賀)ラジカルスカベンジャーであるedaravoneには脳保護作用があることが知られている。Edaravoneのラジカルスカベンジ能をESRにより測定し、CV-159のラジカルスカベンジ能と比較するための基礎的データを取得した。【成果の発表および関連領域の調査】(徳丸・黒木・横井)第一報の発表(虚血-再灌流負荷および持続性脱分極性負荷に関する基礎的検討)および関連する領域の調査のため、国際脳血流代謝学会(2009年6月,シカゴ)、国際生理学会(2009年7月,京都)、日本神経科学大会(2009年9月,名古屋)などに参加した。また、本課題と同様に^<31>P-NMRを用いた本研究グループの研究成果を論文発表した。【^<31>P-NMRによる脳エネルギー代謝の測定】(担当:徳丸,黒木・北野)エーテル麻酔下にラットを断頭,速やかに大脳スライスを作成し,酸素化した10mMブドウ糖加人工脳脊髄液(ACSF)で灌流し,^<31>Pを観測核とする核磁気共鳴法(^<31>P-NMR)によりスペクトルを測定した。この実験系の標本作製や灌流系,^<31>P-NMR測定について,恒常的に改良を行った。【CV-159よるに神経保護作用の脳虚血-再灌流モデルを用いた検討】(担当:徳丸・黒木・北野)ACSFに10nM10μMのCV-159を添加した群(添加群)と対照群とで,脳スライスに対する虚血-再灌流負荷前後の脳スライス中の高エネルギーリン酸であるクレアチンリン酸(PCr)の回復を比較した。いずれの濃度でも,添加群と対照群との間にPCrの回復に差は認められなかった。CV-159の濃度による回復の差も認められなかった。CV159は水に難溶性であり,灌流用チューブや試験管に吸着し易いことが原因と考えられる。【電子スピン共鳴法によるCV159のラジカルスカベンジ能の測定】(担当:横井・古賀)電子スピン共鳴法(ESR)を用いてCV-159のhydroxylラジカルスカベンジ能を測定しようと試みているが,上記のように水に難溶性であるため,未だ安定した測定ができていない。測定法を鋭意工夫中である。【ルシフェリン/ルシフェラーゼ法によるATPの測定】(徳丸・黒木)高エネルギーリン酸であるATPは^<31>P-NMRにより定量できるが,脳組織中の含有量がPCrと比較して少ないため,スペクトルのS/N比が小さく,定量が困難である。そこで代替手段としてルシフェリン/ルシフェラーゼ法のキットによるATPの測定を導入した。健常組織での測定を行い,妥当性を確認した。

この実験系の標本作製や灌流系,^<31>P-NMR測定について,恒常的に改良を行った。【CV-159よるに神経保護作用の脳虚血-再灌流モデルを用いた検討】(担当:徳丸・黒木・北野)CV-159(120μg/kg)腹腔内投与した群(投与群)と対照群とで,脳スライスに対する虚血-再灌流負荷前後の脳スライス中の高エネルギーリン酸であるクレアチンリン酸(PCr)の回復を比較した。虚血負荷によりPCr,ATPともに検出できないレベルに減少したが,再灌流により一定のレベルまで回復した。灌流再開1時間後のPCrは,投与群で虚血負荷前の67.0±55%,対照群で50.8±3.6d%に回復していた(p<0.05)。ATPのレベルや虚血負荷中の細胞内pHには差が認められなかった。【電子スピン共鳴法によるCV-159のラジカルスカベンジ能の測定】(担当;横井・古賀)水に難溶性であり容器に付着し易いCV-159のラジカルスカベンジ能の測定には工夫を要した。現在,CV-159のhydroxylラジカルスカベンジ能をESRにより測定中である。【ルシフェリン/ルシフェラーゼ法によるATPの測定】(徳丸・黒木)高エネルギーリン酸であるATPの^<31>P-NMRによる定量はスペクトルのS1N比が小さいため困難である。代替手段として,ルシフェリン/ルシフェラーゼ法のキットにより脳スライス中のATPを定量した。投与群と対照群の組織中のATPの量に差は認められなかった。【研究のまとめ】(担当:北野,徳丸,横井,古賀)3年間の研究の結果のとりまとめを行い,国内外の学会で発表や国際雑誌への論文の投稿の準備中である。
イネにおける茎頂メリステムの維持に関わる因子の解析

dec変異体は栄養成長期の初期においてSAMが大きくなると共に、1/2互生から十字対生への葉序の転換が認められる。原因遺伝子を単離したところ、DEC遺伝子は機能未知のタンパクをコードしており、様々な組織で発現していた。dec変異体におけるマイクロアレイ解析の結果、サイトカイニンの情報伝達に関わる複数のType-Aレスポンスレギュレーターの発現量が低下していることが明らかとなった。また、変異体のサイトカイニンに対する反応性は低下していた。本研究により、サイトカイニン情報伝達に関与する新たな因子が、イネの葉序の決定に関わっていることが明らかとなった。NM1136は発芽初期に扁平なSAMを持ち、イネfsm変異体と類似した表現型を示すことから、FSM遺伝子と何らかの関係が示唆された。この原因遺伝子がCAF1の異なるサブユニットであるFAS2のオーソログである可能性が考えられたが、マッピングの結果、イネFAS2とは異なる領域に座上することが明らかとなった。また、表現型解析から葉の背腹性の異常など、fsmとは異なる表現型も示すことが明らかとなった。ndl1変異体の一部の個体ではSAMの形が扁平となり、その後の葉原基分化が停止することが明らかとなり、NDL1遺伝子はSAMの維持に深く関わっていることが推測された。一方で初期の植物体では葉が細くなると共に葉身が欠失する。イネにおいて葉身の分化に関わる知見はこれまで無いが、NDL1遺伝子はSAMの維持に加えて、葉の頂部基部軸の構築に何らかの機能を持っていることが推察された。マッピングの結果、転写制御因子をコードする遺伝子内に変異が認められ、この遺伝子がndl1変異体の原因遺伝子である可能性が高いと考えられた。茎頂メリステム(SAM)はそれ自身に含まれる幹細胞を維持するとともに、繰り返し新たな器官を分化するという植物において最も普遍的な機能を持つ組織であるが、これまでの研究からその維持機構は植物間である程度多様であることが明らかとなってきた。その多様性の機構を明らかにする為に、栄養成長初期にSAMが維持されずに枯死してしまう変異体系統を同定し、原因遺伝子の単離とその詳細な解析を進めた。本研究で解析を行ったWAF1遺伝子は小分子RNAの安定性に関わる因子をコードしており、イネ変異体ではSAMが維持できない。まずWAF1遺伝子がどのようにしてSAMの維持に関わっているのかを明らかにするために、小分子RNAの蓄積とそれらのターゲット遺伝子の発現を観察した。マイクロアレイ解析によってwaf1変異体では様々な遺伝子に発現変化が観察されたが、意外なことに小分子RNAのターゲット遺伝子の発現に劇的な変化は認められなかった。つぎに、SAMの分化・維持に関わるshoot organization (sho)変異体との二重突然変異体を作成した。sho変異体はある種の低分子RNA(ta-siRNA)の生成に関わる遺伝子の機能喪失突然変異体である。その結果、二重突然変異体の表現型はそれぞれの変異体より強い表現型を示した。これらのことから、WAF1はシロイヌナズナと同様に多くの小分子RNAの安定化に関わっていること、小分子RNAとそのターゲット遺伝子の間には発現変化を維持する複雑な制御機構が存在すること、シロイヌナズナとは異なりイネにおけるSAMの維持にはta-siRNAが重要であること、などが明らかとなった。また、変異体のスクリーニングによりSAMの維持に関わる新たな変異体を複数同定した。これらの変異体の更なる解析により、植物間でのSAM維持に関わる多様性の機構が明らかになっていくことが期待される。