hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
三次元自由エネルギー解析によるアミノ基転移酵素のプロトン移動機構の研究

1.アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AAT)の触媒反応過程で重要な意義を有している,基質結合に伴う基質から補酵素-Lys258シッフ塩基へのプロトンの移動の詳細な機構とその構造論的基盤を三次元自由エネルギー解析により明らかにした。基質結合に伴う,活性部位の蓋の構築を乱すV39F変異を導入した酵素の構造解析・速度論解析により,基質結合に伴って大小ドメインが接近するとGIy38主鎖のカルボニル基がシッフ塩基に接近するために,脱プロトン化状態にあるシッフ塩基と静電的な反発を起こすことを示した。この歪みはミハエリス複合体の不安定化を起こし,それによってk_<cat>を増大していることが本質的な意義であることが判明した。したがって,従来から言われてきた「基質結合に伴うシッフ塩基のpK_aの上昇」は「ミハエリス複合体の不安定化」の結果として起こった付随的現象であることが示された。2.さらに,いままでほとんど解明されていなかったC5基質とAATの反応を構造論的・速度論的に解析した結果,C4基質の場合とは異なり,AATとC5基質のミハエリス複合体は開いたコンフォメーションを取り,それに結合したC5基質は伸びたコンフォメーションを取っていることを示した。更に閉じたコンフォメーションに近づけるV39L変異によってk_<cat>は変わらずにK_mが上昇することは,プロトン数の座標軸の代わりにコンフォメーションの座標軸を用いる三次元自由エネルギー解析により評価を行い,C5基質のミハエリス複合体の開いた構造を不安定化することでAATがK_mを犠牲にしてC5基質に対するk_<cat>値を増大している機構を有することを示した。以上のようにして,AATにおけるプロトン移動過程を解明し,その駆動力の構造論的基盤を明らかにした。この過程で三次元自由エネルギー解析が有効なものであり,三番目の座標軸を適当に選ぶことによって様々な酵素反応の解析に応用できることを示した。1アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと正常基質との反応を時分割スペクトルのグローバルアナリシスおよび重水素同位体効果の解析を組み合わせることにより,重要な中間体間の速度定数の大部分を決定した。特に従来基質アナログとの反応でしか見られなかった「基質結合に伴う補酵素-Lys258シッフ塩基のpK_a、の上昇」を正常基質について初めて証明した。このpK_aの上昇は基質結合に伴って大小ドメインが接近するとGly38主鎖のカルボニル基がシッフ塩基に接近するために,脱ブロトン化状態にあるシッフ塩基と静電的な反発を起こすためであることをV39F変異によって示した。これを本研究の主題である「三次元エネルギー準位解析」に供したところ,Gly38の動きはミハエリス複合体の不安定化を起こし,それによってたk_<cat>を増大していることが本質的な意義であることが判明した。2アミノ基転移酵素の近縁酵素であるラセマーゼのプロトン移動過程においては触媒に必須の塩基残基間のプロトン移動過程が問題であった。基質アナログと補酵素の複合体の結晶解析に分子軌道計算を組み合わせることにより,基質カルボキシル基がこのプロトン移動を仲介し,さらに,それを可能とするように補酵素のプロトン化状態が調節されていることを示した。

3ヒスチジノールリン酸アミノ基転移酵素,分枝アミノ酸アミノ基転移酵素について単独および基質(アナログ)複合体の結晶構造を得た。1.昨年度の研究で,アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AAT)の触媒反応過程における三次元エネルギー準位図の形を明らかにした。本年度は引き続き,反応進行の道筋である「底(=自由エネルギー極小点の軌跡)」の部分の成り立ちについて更に詳細な解析を行った。V39F酵素の遊離状態および基質アナログのマレイン酸結合状態の双方において精密な立体構造解析を行った結果,V39F変異は基質結合部位周辺の構造を変化させず,活性部位の蓋の部分のパッキングのみを変化させることが判明した。これによってミハエリス複合体において補酵素シッフ塩基のpK_aが上昇する機構は,昨年度に明らかになったGly38主鎖とTyr225の相互作用に加え,Asn194と基質の水素結合によるPLPとAsn194の水素結合の減弱によるシッフ塩基の振れの部分的解消が関っていること,およびそれぞれの寄与が0.7unit,0.6unitであることが判明した。これにより,AATの触媒反応の道筋を形づくる構造的基盤の主要な部分を解明することが出来た。2.さらに,いままでほとんど解明されていなかったC5基質とAATの反応を解析した。限られたプロトン化状態を取るAAT-C4基質のミハエリス複合体とは異なり,AAT-C5基質のミハエリス複合体は様々なプロトン化状態が許容されていることが判明した。X線結晶解析の結果,AATとC5基質のMichaelis複合体は開いたコンフォメーションを取り,それに結合したC5基質は伸びたコンフォメーションを取っていることが判明し,これが種々のプロトン化状態を許容していることを説明することができた。さらに閉じたコンフォメーションに近づけるV39L変異によってK_mが3倍に上昇し,k_<cat>は同じ値を示すことを解析するために,今まで用いたプロトン数の座標軸の代わりにコンフォメーションの座標軸を用いる方法を取ったところ,C5基質のミハエリス複合体の開いた構造を不安定化する力が働いていることが示された。これはAATがK_mを犠牲にしてC_5基質に対するk_<cat>値を増大している機構を有することを説明し,三次元自由エネルギー解析が三番目の座標軸を適当に選ぶことによって様々な酵素反応の解析に応用できることを示した。
食材，道具，動作の認識を連携させた調理行動の認識

一般の動物とヒトを隔てる「知能」として,本研究では道具の使用,および論理や推論による問題解決能力を利用して行う「知的行動」の認識を目指し,題材として「キッチンでの調理」を取り上げ,道具,食材,調理動作の認識,および言語的に記述された行動の理解に取り組んだ.観測データから認識できる「表出動作」のうち,特に物体の把持・解放を中心として,レシピ中に言語的に記述された「概念的行動」の完了認識や次の行動の予測をする手法を構築した.また,テキストから扱われる食材の種類やそれに対する行動,目標状態などを概念的行動」として自動で獲得し,レシピ内でのそれらの依存関係をワークフローとして抽出する技術を構築した.本研究では,道具の使用,および論理や推論による問題解決能力を利用して行う「知的行動」の認識を目指している.この題材として調理を対象に,レシピ等の言語で表現される「概念的行動」と調理者を観測して得られる「表出動作」の関係を明らかにしてきた.まずH24年度までに調理台上や冷蔵庫内の物体を手に取る,手から離す,といった道具の使用に関する動作の認識技術を開発した.H25年度は,これらの「表出動作」に基づいて,その後に行われる「概念的行動」の予測・認識を行い,その精度と有効性を明らかにした.この応用として,予測に基づく作業の教示を行う支援システムを構築し,初期段階として「表出動作」の認識結果を手動で与えて,その予測結果を評価した.この結果,従来の作業教示システムでは作業中にユーザが30回,システムへ何らかの入力をしなければならないところを,平均で3.2回の入力まで減らすことができることを確認し,「表出動作」に基づく「概念的行動」の予測モデルの実用性を評価した.また,レシピテキストの言語処理による「概念的行動」の抽出に関しては,テキストのサンプルを収集し,レシピの各単語の属性を整理した.さらに,作業の半順序関係を反映するフローグラフとして表現することを提案し,実際のタグ付け作業を行った.この成果は、フローグラフコーパスとして公開している.また,レシピ全体の意味を考慮した文解析を提案し,これにより作業の流れの構造を自動解析する手法を開発した.この他,国内外の学術会議において研究成果の発表・公開を行った.「知的行動」の認識を目指し,初年度は調理中に利用される道具・食材などの物体認識,レシピで記述された「概念的行動」の抽出,及び,物理的な動きと明確に対応付け可能な「表出動作」として物体の把持に関する動作の検出を行った.物体認識のうち,食材に対しては切断時に得られる音や荷重の波形情報を利用する手法を提案した.26種類の頻出食材に対して実験を行い,一般的な物体認識で利用される画像のみを利用する場合よりも大幅に精度が向上することを明らかにした.また,道具に対しては近年様々な分野で利用されているImplicit Shape Modelを整備した.ただし,その性能評価はまだ行えていない.レシピテキストの言語処理においては,まず,無作為に抽出した100のレシピに対して言語処理の結果得られるべき構造やタグを人手で付与した.次いで,既存の一般分野で高い精度で動作する単語分割や係り受けの解析器をレシピに適応させるために,学習コーパスのプロトタイプを準備した.これらを用いて,レシピテキストの言語処理の精度を測定し,現実的な量の言語資源(コーパスや辞書)を準備することで,一般分野と同等の精度で概念的行動を抽出することが可能であることを明らかにした.表出動作の語彙については,特に調理中に行われる回数が多い,物体を取る,置くという把持に関する動作に着目した.これらの表出動作については荷重センサとカメラの組合せにより検出・認識する技術を開発した.本研究では,道具の使用,および論理や推論による問題解決能力を利用して行う「知的行動」の認識を目指している.この題材として調理を対象に,レシピ等の言語で表現される「概念的行動」と調理者を観測して得られる「表出動作」の関係を明らかにしてきた.このうち,概念的行動に関しては,H25年度までにレシピテキストから自然言語処理によって,作業の流れの構造を抽出したフローグラフのコーパスを整備した.また,表出動作については,H24年度までに調理台上や冷蔵庫内の物体を手に取る,手から離す,といった道具の使用に関する動作の認識技術を開発した.また,続くH25年度には,「概念的行動」と「表出動作」の関係をモデル化することで,物体を取る,置くといった表出動作に基づいて,その後に行われる「概念的行動」の予測・認識を行い,その精度と有効性を明らかにした.H26年度はこれまでに構築した技術を利用し,半自動でのタグの付与を行うことでデータセットの大規模化を図った.タグの付与にあたっては映像を全て人手でチェックするのではなく,手に取ったり,手から離された物体と,そのタイミングを自動で検出するH25年度までの技術を利用することで,その領域毎に物体名のタグをつけるようにタグ付けの作業を効率化した.また,それらのタイミングは動作の切れ目の良い候補と考えられることから,映像をそれらのタイミングで区切ることで,動作のタグ付けに関しても効率化ができた.また,クラウドソーシングなどによる更なる効率化を前提としたシステムを構築し,複数人による冗長性のあるタグ付けを実現し,タグ付けの高精度化についても検討を行った.また,表出動作として調理者の動きそのものに基づいた動作の自動分類を行った.道具を使った作業の特徴を考慮して動作特徴を抽出することで,概念的行動と良く対応する動作クラスタを獲得することが出来ることを確認した.

本研究では,道具の使用,および論理や推論による問題解決能力を利用して行う「知的行動」の認識を目指してきた.この題材として調理を対象に,レシピ等の言語で表現される「概念的行動」と調理者を観測して得られる「表出動作」の関係を明らかにしてきた.このうち,「概念的行動」に関しては,H25年度までにレシピテキストから自然言語処理によって,作業の流れの構造を抽出したフローグラフのコーパスを整備した.「表出動作」についてはH26年度において,半自動でのタグの付与を行うことでデータセットの大規模化を図った.H27年度はこれまでに作成した上記データセットを元に機械学習を行い,手に取られり,置かれたりした物体を画像処理により自動的に認識する識別器を作成し,その性能評価を行なった.また,これをH25年度に構築した「概念的行動」の予測を行うシステムに識別器を組み込むことで,「表出動作」に基づく「概念的行動」の認識システムを構築した.H25年度に構築した概念的行動の認識システムでは入力として,フローグラフと,直前までに行われた「表出動作」の履歴を用いた.この段階では「表出動作」の入力は手動で行なっており,認識アルゴリズムも「表出動作」の認識結果が決定的に与えられることを前提としていた.このため,識別器の誤りに対する頑健性には改善の余地があった.今回「表出動作」の入力を識別器により自動化したのと平行して,「表出動作」の認識結果が非決定的に与えられた場合を想定して,「概念的行動」の認識アルゴリズムの改良について検討を行い,対外発表を行なった.自然言語処理としては手法や語彙ラベルの見直しによるレシピテキストに対する解析精度の向上を図った.この他,本研究課題に関連する応用システムを構築し,論文として発表するなど,積極的な対外発表を行なった.一般の動物とヒトを隔てる「知能」として,本研究では道具の使用,および論理や推論による問題解決能力を利用して行う「知的行動」の認識を目指し,題材として「キッチンでの調理」を取り上げ,道具,食材,調理動作の認識,および言語的に記述された行動の理解に取り組んだ.観測データから認識できる「表出動作」のうち,特に物体の把持・解放を中心として,レシピ中に言語的に記述された「概念的行動」の完了認識や次の行動の予測をする手法を構築した.また,テキストから扱われる食材の種類やそれに対する行動,目標状態などを概念的行動」として自動で獲得し,レシピ内でのそれらの依存関係をワークフローとして抽出する技術を構築した.H26年度の3つの研究課題のうち,「3-a道具,食材の認識結果とデータセットに基づく表出動作の認識」では,道具や食材への人物の接触をきっかけとした動作クラスタリング手法を確立し,現在,国際会議のWorkshopへ投稿中である.また,「5.調理支援システムの構築と認識技術の評価,改善」についてはH25年度に前倒しして構築済みであり,H26年度は構築したシステムの評価のための追加実験や必要認識精度の検討のための実験を行った.これらの結果はH27年度に発表予定である.最後に「3-b.表出動作認識の適用による大規模データセットの作成」に関しても,作業の半自動化によるタグ付けの効率化などを行い,当初予定通りに進行している.27年度が最終年度であるため、記入しない。知覚情報処理・知能ロボティクスこれまで順調に研究が進んでいることから,当初計画案に従って各課題をすすめる.
健常者を含む歩行機能回復のための足首関節リハビリテーション運動装置の開発

本研究課題では「足首関節専用リハビリテーションシステム」の基本機構,利用の際に必要となるベッドなどへの接続機構や安全機構,利用のしやすさを考えた各種インターフェース,市場化の際に必要となる倫理審査を経由して臨床実験を行う研究開発を行った.寝たきりを防止するためには足首関節の健康状態を維持することが必須であり,最低限歩行動作を行えれば人間の生活のQOLを維持できる.しかし従来までこの足首関節用のリハビリテーション装置が存在してこなかった.本研究ではこの開発に世界で唯一成功しているものである.結果として,本研究の成果が直接関わる研究論文2本,国際学会7本という成果を修める事が出来た.本研究は,人間が人間らしい生活をするためには足の健康を維持する必要があるといわれている一方で,「足関節」専用のリハビリテーション装置が従来存在しなかったことから開発を行っている装置である.平成27年度は,計画通り提案装置本体1台の開発を新規に行い,初年度の目的に沿って圧力・加速度・モーションキャプチャなど各種センサーを付け,被験者の状態を正確に把握出来るようセンサシステムの構築を行った.また,筋硬度計・ゴム専用の硬度計(装置のクッション特性などを計測する目的)など客観的に足の状態を計測出来る装置を導入し,被験者の歩行機能・運動機能が装置の特性とどのような関係性を持つかの調査・研究を行うためのプラットフォームの開発を行った.本装置は,富山で開発を行っている装置であるが,H26年度から浜松の企業APマシンズ,H27年度から宮崎の企業昭和とNDAを結び共同研究を行っており,日本各地の企業が県と共に装置開発の進展をバックアップしている状態となっている.また,臨床試験に向けて富山大学医学部の倫理審査を受けている最中であり,本装置が「介入」と呼ばれる,もしもの場合には人間の体に負傷を及ぼす可能性があることも加味しながら実験のための倫理審査を受ける体制を整えつつある.これは,単に健康器具としての提案ではなく,医療器具としての働きを今後考えた上での難しい審査を受け,利用者が安心して利用出来るよう研究を進めていく事を意味している.現在までの経過としては,論文1本,国際学会4本,国内学会5本と,国内学会での1受賞という成果となっている.装置の開発などには支障はないものの,臨床試験に向けて富山大学医学部の倫理審査を受けている最中であり,本装置が「介入」と呼ばれる,もしもの場合には人間の体に負傷を及ぼす可能性があることも加味しながら実験のための倫理審査を受ける体制を整えつつある.これは,単に健康器具としての提案ではなく,医療器具としての働きを今後考えた上での難しい審査を受け,利用者が安心して利用出来るよう研究を進めていく事を意味しており,きちんと倫理審査を受けながら医療用途の器具として開発を進めていく上ではどうしても必要なプロセスと考えている.本研究課題では世界で唯一である「足首関節専用リハビリテーションシステム」の市場化を目指した基本機構,利用の際に必要となるベッドなどへの接続機構や安全機構,利用のしやすさを考えた各種インターフェース,市場化の際に必要となる倫理審査を経由して臨床実験を行っていく研究開発を行った.寝たきりを防止するためには足首関節の健康状態を維持することが必須であり,足首関節の健康を保てれば,最低限歩行動作を行えることから人間の生活のQOLを維持する上では重要な部位であり.しかしながら従来まで,この足首関節用のリハビリテーション装置が存在してこなかった.本研究ではこの開発に世界で唯一成功しているものである.結果として,本研究の成果が直接関わる研究論文2本,国際学会6本,国内学会9本という成果を修める事が出来た.幾つかの展示会などで効果を実体験して頂く機会を得,研究期間中では,浜松の企業,現在は長崎の企業が本研究のアイデアを自社商品として開発を進めている状態である.また,倫理審査などの手続きに関してはまだ終了していないものの,保険や保障に関する要因の重要さなど,倫理審査に関わる先生方と密な議論を進めることが出来,本研究のような装置を外へ出す場合にどのようなことに注意している必要があるか多面的に理解が進むこととなった.また,現在装置の改良は継続して続いており,臨床実験のための倫理審査に合計4回ほどチャレンジを続けている状態である.主に保険などの問題で引っかかる事が多く,倫理審査を通過させ,理学療法士の先生方と共同の臨床実験を行っていくことが次の課題である.本研究課題では「足首関節専用リハビリテーションシステム」の基本機構,利用の際に必要となるベッドなどへの接続機構や安全機構,利用のしやすさを考えた各種インターフェース,市場化の際に必要となる倫理審査を経由して臨床実験を行う研究開発を行った.寝たきりを防止するためには足首関節の健康状態を維持することが必須であり,最低限歩行動作を行えれば人間の生活のQOLを維持できる.しかし従来までこの足首関節用のリハビリテーション装置が存在してこなかった.本研究ではこの開発に世界で唯一成功しているものである.結果として,本研究の成果が直接関わる研究論文2本,国際学会7本という成果を修める事が出来た.今後は,倫理審査を通過した後に被験者を用いた長期間にわたる効果の検証実験を行うこととし,更に宮崎の企業昭和での製品開発を進めること,更に計画に従って数台装置を開発し,県の施設などにおいて実地的に利用のされかたや効果などのフィードバックを得て改良を行っていく予定である.ロボティクス,リハビリテーションシステム
肺癌体細胞遺伝子変異の免疫学的診断チップの開発

目標としていた肺癌患者の気管支洗浄液20検体を収集した。当初の計画通り、マイクロ免疫診断チップで上皮成長因子受容体(EGFR)の遺伝子型を分析し、その結果を従来の分析法による診断結果と比較した。比較の結果、気管支洗浄液を対象とした2つの分析法の一致率は、胸水沈渣を対象とした場合と比較して低いことが明らかになった。これは、気管支洗浄液中に含まれるがん細胞数が胸水よりも非常に少ないことが原因であると考えられる。また、独自に開発したL858R遺伝子変異型EGFR抗体の性能を評価したが、市販の抗体との比較で大きな性能の差は認められなかった。本研究の目的は、胸水と比較して含まれる腫瘍細胞数は少ないが、ほとんどの非小細胞肺がん患者から採取可能な気管支洗浄液を分析し、遺伝子型EGFRを迅速(20分)・低コスト(200円)・高感度に検出することである。特に本研究は抗がん剤の一種であるEGFRチロシンキナーゼ阻害薬の治療反応性に関与するL858RおよびE746-A750欠損のEGFRを分析対象としている。遺伝子を調べる従来の方法と異なり、申請者が開発したマイクロ免疫診断チップを用いて、遺伝子変異型EGFRタンパク質を抗原抗体反応によって特異的に検出することが本研究の特徴である。目標としていた気管支洗浄液10検体の収集をすでに完了した。検体を遠心分離し、沈渣にライシスバッファーを加えて細胞溶解液を作った。ライシスバッファーの量によって総タンパク質濃度がほぼ一定になるよう調整し、マイクロ免疫診断チップにより分析を行った。まず、市販の遺伝子変異型EGFR抗体を捕捉抗体として用いたチップを作製し、これらの検体の分析を行った。総分析時間20分、コスト200円の条件で、従来法による診断結果との対比で感度100%、特異度90%を達成した。また、市販抗体では特異性が低いため、L858R特異抗体については独自抗体の開発にも着手した。まだ本診断チップを評価するためには検体数が十分ではないため、今後も検体を収集し分析を続ける必要がある。また、E746-A750欠損については、症例は少ないが欠損の範囲が異なるものなど多くのバリエーションが存在する。これらの患者にはEGFRチロシンキナーゼ阻害薬が有効な場合があるため、本診断チップでそれらを検出できるか確認することも重要と考えている。計画通りに研究が進行している。これまでに、極微量(1マイクロリットル)の臨床検体(胸水沈渣の溶解液)から、遺伝子変異型の上皮成長因子受容体(EGFR)を迅速・低コスト・高感度・免疫学的に検出するマイクロ免疫診断チップを開発したが、胸水貯留が認められる肺癌患者の割合が低いことが課題であった。本申請では、これまでの研究成果を発展させ、胸水よりも多くの肺癌患者から検体を採取できる気管支洗浄液を分析し、2種類の遺伝子変異型EGFR(Exon19欠損型とL858R点置換型)を検出することを目的としている。胸水は肺癌患者の約20%からしか採取できないが、気管支洗浄液は肺癌の確定診断に重要な気管支鏡検査において容易に採取できるため、重要な検査対象となる。本研究期間において、目標としていた肺癌患者の気管支洗浄液20検体を収集した。マイクロ免疫診断チップで分析し、その結果を従来の分析法による診断結果と比較した。その結果、気管支洗浄液を対象とした2つの分析法の一致率は、胸水沈渣を対象とした場合と比較して低いことが明らかになった。これは、気管支洗浄液中に含まれるがん細胞由来の遺伝子変異型EGFR分子数が少ないことが原因であると考えられる。また、独自に開発したL858R抗体の性能を評価したが、市販の抗体との比較で大きな性能の差は認められなかった。気管支洗浄液などの微量にしかがん細胞が含まれない検体を分析し、高精度に診断するためには、さらに診断チップの検出感度を向上させる必要がある。また、E746-A750欠損については、症例は少ないが欠損の範囲が異なるものや、挿入変異など多くのバリエーションが存在する。今後は新しく開発したL858R抗体で診断チップを作製し、特異性や感度について市販抗体と比較する計画である。マイクロ・ナノ科学
網膜芽細胞腫における癌抑制遺伝子の発現とEIA蛋白-ウィルス発癌モデルを用いた分子病理学的研究-

今年度は、研究の総括とPCNAを用いた細胞増殖とオンコジン(N-myc)の腫瘍組織内同定に関して研究した。[材料と方法]ラット新生仔硝子体腔内に10^8PFUのアデノウイルスを接種し、3時間後より経時的に眼球を摘出した。時間経過は、3,6,12,24,36,63時間ごとに検索した。組織を4%PFAで固定後、3μのパラフィン包埋切片を作成し、EIA遺伝子とヒトN-myc遺伝子をプローブとしてin situ hypridizationを行い、同時に抗p53モノクローナル抗体と抗PCNAモノクローナル抗体を用いABC法で免疫染色をした。[結果と考察]アデノウイルスEIA遺伝子のmRNAはウイルス接種後3時間から同定することができ、その後持続的に発現していることが確認された。N-myc遺伝子のmRNAは、6時間後より反応は弱いが発現していた。免疫染色では、p53の発現は全てにおいて陰性であったが、PCNAの標識率は63時間の組織では急激に増加した。このウイルス誘発実験系では、かなり早朝からウイルス初期遺伝子の発現があり、それに誘導される癌関連遺伝子N-mycの発現が腫瘍化への重要な役割を担うことが示唆された。また、癌抑制遺伝子の一つp53はこの腫瘍発生には直接関与していないものと考えられた。HEK細胞で増殖させたヒトアデノウイルス12型TW株(東京大学医科学研究所癌ウイルス研究部白木和子博士の供与)10^8PFU(感染力価)の濃縮液0.005mlをHamilton注射筒に接続した硝子毛細管により新生仔CDF系ラット(生後24時間以内)7匹の硝子体内に接種し腫瘍を誘発した結果接種後64日までに2匹の動物に腫瘍に誘発できた。本年度は実施計画の1)アデノウイルス型誘発腫瘍組織からのEIA領域DNAの発現を,ビオチン化プロ-ブを用いたサザンブロット及びin situハイブリダイゼイション法で検討した。サザンブロット法は、試料DNAを新鮮腫瘍組織より抽出、制限酵素(Eco RI)で切断し、アガロ-ス電気泳動によりDNA断片を分離して行った。ハイブリダイゼ-ションに用いるEIA領域DNAプロ-ブはランダムプライム法で調製し、フォトビオチン標識とした。In situハイブリダイゼ-ション法は、同一のプロ-ブを用いて小路らの方法に従い、4%PFA/PBSで潅流固定した凍結試料をプロテア-ゼで前処理の後、湿箱中で反応を行い酵素抗体法(ABC法)で呈色した。ヒトアデノウイルス12EIA領域cDNA断片をプロ-ブとしたin situ hybridezationでは、アデノウイルスを接種して1週間後の網膜組織において、内顆粒層の細胞中にEIAの発現が確認された。接種後、腫瘍を形成した動物及び腫瘍形成を認めなかった動物の網膜組織よりgenomic DNAを抽出した。このDNAを用いてサザンブロット法を行うと、対照としてラット血清アルブミンcDNAをプロ-ブとした場合、全ての抽出されたDNAとのhybridizeするbandが認められた。アデノウイルス12型EIA断片をプロ-ブとした場合には腫瘍組織より抽出したDNAにおいてのみbandが認められた。又、ヒトRb遺伝子cDNA(H3ー8領域)をプロ-ブとすると、対照動物から抽出したDNAとは反応が弱いが、すべてのDNAにおいてbandが同定された。我々の実験結果からは、ウイルス誘発網膜腫瘍ではヒト網膜芽細胞腫と同様のRb遺伝子の不活性化は証明できなかった。ヒトアデノウイルス12型TW株(東京大学医科学研究所癌ウイルス研究部白木和子博士の恵与)感染力価108PFUの濃縮液0.005mlを硝子毛細管を用いて、CDF系ラット硝子体腔内に接種して経過観察したところ1/22(4.5%)に網膜腫瘍を誘発できた。期間は118日であった。

本年度の研究計画は、この腫瘍組織と培養細胞系について1)腫瘍組織におけるE1A領域DNAの発現の有無、2)経時的にDNA発現を観察して初期変化の把握、3)細胞増殖と癌遺伝子の関連性、4)腫瘍細胞の視細胞分化を検討する。[結果]1)腫瘍組織及び対照ラット網膜組織より抽出したgenomic DNAを用いてサザンブロット法で検索すると、アデノウイルス12型E1A領域のフォトビオチン標識プロ-ブでは、腫瘍組織より抽出されたサンプルにおいてバンドが同定でき、発癌遺伝子の組み込みが確認できた。用いた制限酵素をEco R1とし、ヒトRb遺伝子(H3ー8)cDNAをプロ-ブとしてサザンブロット法を行なうと、腫瘍組織、対照ともにバンドが同定できた。即ち、発癌過程でのヒト及びラットに共通した遺伝子異常が示唆される。そこで、ヒト網膜芽細胞腫における遺伝子異常を確認するために、パラフィン包埋組織からDNAを抽出してPolymerase Chain Reaction(PCR)法にて検討した。対照してヒトプレアルブミン遺伝子のエクソン3と、RB遺伝子のエクソン4,20についてみるとエクソン20の位置で一例に欠損が示された。2)接種1週、2週後の網膜組織からのDNAの発現をみると1週後の網膜内顆粒層において既にadenovirus12ーElA mRNAの発現が確認できた。RB gene productに対する抗体(oncogene science Co.)は、基礎的検討の過程で、特異性に問題が多く、その対比検討に至らなかった。3)培養細胞系を用いて、PCNAとRB gene productに対する抗体での反応を試みたが、結論を得られなかった。4)培養細胞系を用いて、分化誘導後に抗Rhodopsin抗体による酵素抗体法で免疫染色してみると、少数の神経突起様の細胞形態に陽性像が確認された。今年度は、研究の総括とPCNAを用いた細胞増殖とオソコジン(N-myc)の腫瘍組織内同定に関して研究した。[材料と方法]ラット新生仔硝子体腔内に10^8PFU(感染力価)のヒトアデノウイルス12型TW株の濃縮液0.005mlを接種し、3時間後より経時的に眼球を摘出した。接種後、3,6,12,24,36,63時間ごとに網膜組織を4%PFAで固定後、3μのパラフィン包埋切片を作成し、ElA領域DNA遺伝子とヒトN-mycDNAをビオキン化プローブとして小路らの方法に従いブロテアーゼ前処理後、湿箱中で反応するin situ hybridizationにより発現を観察、同時に抗p53モノクローナリ抗体と抗PCNAモノクローナル抗体を用い(酵素抗体法)ABC法で免疫染色をした。[結果と考察]アデノウイルスEIA遺伝子のmRNAはウイルス接種後3時間から腫瘍細胞に確認することができ、その後持続的に発現していた。N-myc遺伝子のmRNAは、6時間後より反応は弱いが発現していた。免疫染色においては、p53の発現は全てにおいて陰性であったが、PCNAの標識率は63時間の組織では急激に増加した。前年度までに、腫瘍組織より抽出したgenomic DNAを用い、サザンブロット法で検索した結果、担癌動物にのみ発癌遺伝子の組込みが確認され、また制限酵素(EcoRI)で切断したDNA断片についてH3-8cDNAプローブでサザンブロット法を行うと腫瘍組織、対照ともにバンドが同定でき、ヒト及びラットに共通した遺伝子異常が示唆されている。
高延性を有する高強度電縫鋼管のロール成形法

近年様々の産業界で需要が高まっている高強度電縫鋼管は、高強度鋼板が難加工材であることから適切な成形工程設計の確立が困難なことで知られている。一方筆者らは、この問題を克服しうるロール成形法を提案した。そこで本研究では、高強度電縫鋼管の成形メカニズムの解明と提案したロール成形法の有効性検証を目的として研究を行った。実験および数値解析により詳細に検討した結果、基本的なロール成形メカニズムを詳細に明らかにした。また、提案したロール成形法を用いることで、従来よりも二次加工に適した鋼管が製造できる可能性を示した。ロール成形における変形メカニズムについて,有限要素法解析を用いた理論考察を中心に研究を進めた.得られた成果を以下に箇条書きで示す.1単スタント成形について解析を行い,材料強度やロール径などの成形条件がひずみ量や加工硬化に及ぼす影響を検討した.特に,周方向変形と通板方向変形に分けて分析を行った.得られた代表な成果を以下に示す.(i)板端部の通板方向膜ひずみは塑性変形開始とともに急激に増加する.そのときのひずみの最大値は強度の低い材料ほど大きい.(ii)ロール径が小さくなると,通板方向膜ひずみが大きくなる.(iii)ロール成形時の曲げ変形で生じる相当塑性ひずみは,従来用いられてきた平面ひずみ理論に基づく予測値に比べて非常に大きい.これは,上ロールと板材が密着することで,通板方向曲げだけでなく板材に作用する2軸の引張変形が影響した結果であると考えられる.この結果から,本研究で提案している新型ロールを用いることで板材に作用する2軸引張変形が低減され,それにより相当塑性ひずみを低減できる可能性が示唆された.(iv)ロール成形時の加工硬化量は,ロール径によらず低強度材の方が高強度材に比べて大きい.これは,低強度材では高強度材に比べてロール接触域に対してより上流から塑性変形が始まることで,相当塑性ひずみの最大値が高強度材よりも大きくなるためと考えられる.2バウシンガー効果を考慮した材料モデルを用いて解析を行い,材料モデルが成形性に及ぼす影響を検討した.その結果,スプリングバックについてはバウシンガー効果の影響はほとんど見られなかった.この結果から,これまでのバウシンガー効果を考慮していない結果も十分妥当性があることが示された.一方材料に生じるひずみ量については,成形中の複雑な変形経路に起因して,バウシンガー効果の有無によって多少変化した.しかしその変化は,成形条件によって大きく異なった.今年度は,提案している新型ロールによるロール成形性と複数スタンド成形における次スタンドによる変形拘束の影響について,実験および解析の両面から検討を行った.得られた成果を以下に示す.1新型ロールによる変形メカニズムは以下のようである.新型ロールでは,板材を端部のみで支持して成形するため板材中央部では自由曲げに近い状態になり,その結果ロール曲率よりも大きな曲げが生じる.しかしながらその一方で成形後のスプリングバック量も大きいため,結果的にはほぼロール曲率に非常に近い成形品形状が得られる.板材中央部における成形中の曲率は上ロール径が小さいほど大きくなる傾向にあり,そのため最終成形品の曲率も上ロール径が小さいほど大きい.2新型ロールでは,従来ロールに比べて通板方向の曲げ変形を抑制できるため,成形時の相当塑性ひずみの発生を低減できる.すなわち,本研究開始当初の仮説が実証された.しかしながらその一方で,新型ロールでは板材の端部のみを支持して成形するという特性上,従来ロールに比べて管周方向での不均一さが増すことが明らかとなった.この結果より,周方向の均質性が重視されるバルジ加工用鋼管などの成形には従来ロールの方が好ましく,用途に応じた使い分けが必要なことが示唆された.3複数スタンドを用いた成形解析を行い,次スタンドによる変形拘束の影響を調査した.その結果,新型ロールではその影響は非常に小さいことが分かった.これは新型ロールでは通板方向の曲げが小さいためである.また同様の理由により,複数スタンド成形では従来ロールに比べて成形中の相当塑性ひずみの発生を大幅に抑制できることが分かった.以上のように本研究課題を通じて,提案した新型ロールの有効性とその特性を実験的および解析的に明らかにし,高張力鋼管のロール成形技術の向上に大きく貢献することができた.近年様々の産業界で需要が高まっている高強度電縫鋼管は、高強度鋼板が難加工材であることから適切な成形工程設計の確立が困難なことで知られている。本年度得られた成果を以下に箇条書きで示す.(1)ロール成形時の板材の変形メカニズムを実験的に明らかにするため,成形中に最も大きな塑性変形を受けるロール直下でのひずみ測定方法を検討した.ロールに微小な幅の溝を設けてその間をひずみゲージが通過できるようにすることで,ひずみゲージとロールが接触することなく成形中のひずみ推移を測定できる機構とした.この際の適切な溝幅やひずみゲージサイズを検討した.

種々の検討により,ひずみゲージとロールの接触を防ぎ,かつ適切にひずみを測定できる最適な実験条件を決定した.モデル実験法が確立されたことで,鋼種およびロール条件が成形性に及ぼす影響を実験的に検討することが可能となった.(2)(1)で提案したモデル実験法を用いて,鋼種の違いが成形性(ひずみやスプリングバック)に及ぼす影響を検討した.鋼種の影響については,事前の予測通り,高張力鋼板では軟鋼板に比べてスプリングバックが大きいことが確認された.これは実機でも確認される現象であり,本モデル実験法の妥当性が示された.続いてロール条件が成形性に及ぼす影響を調査した.本年度に行った条件では,上ロール径が小さいほどスプリングバックが小さい傾向であった.またいずれの条件でも,従来用いられてきた初等曲げ理論から計算されるスプリングバック量に比べて小さかった.しかしながら,これらが普遍的な結果かどうかは今後検討する必要がある.(3)高精度な有限要素解析を行うための計算モデル検討を行った.様々な観点から検討した結果,(2)で行った種々の条件に対してひずみ推移およびスプリングバック量が実験と良好に一致する計算条件を見出した.高張力鋼板ではバウシンガー効果が成形性に大きな影響を及ぼすことが知られている.そこで,高精度にバウシンガー効果を測定できる実験装置を製作した.今後,材料モデルの成形性および解析精度に及ぼす影響を検討する予定である.当初の予定どおり,今年度は従来ロールを用いたロール成形解析を行い,その変形メカニズムを明らかにした.これを踏まえて来年度は予定どおり新型ロールによる実験および解析を行い,高張力鋼板のロール成形性の向上を目指す.また,当初の予定にはなかったものの,バウシンガー効果の成形性へ及ぼす影響についても着手することができた.以上の結果を総合的に鑑みて,【おおむね順調に進展している】と判定した.当初の研究計画では,平成23年度はモデル実験法の確立と各種成形条件がロール成形性に及ぼす影響の実験検討であった.結果としてこれら二つの内容に加えて,当初の予定では平成24年度に行う予定であった"有限要素法解析条件の検討"も行うことができ,またロール成形に適した計算モデルを確立することができた.これより,平成24年度以降は当初の予定からさらに進んだ研究の展開が期待される.以上の結果を総合的に鑑みて,【当初の計画以上に進展している】と判断した.おおむね当初の予定通り研究が進展していることから,平成25年度も当初の予定通り研究を推進する所存である.具体的には,以下の項目を実施する予定である.1本研究で提案した新型ロールを用いて実験および解析を行い,その変形メカニズムの解明と有効性の検討を行う.それにより,新型ロールを用いることで高張力鋼板のロール成形性向上を達成できるか検討を行う.2これまでの検討では,主として単スタンドを想定した実験および解析を行ってきた.しかしながら実際のロール成形では,板材は複数のスタンドにより逐次成形される.またこのとき,ロール近傍での変形は次スタンドからの変形拘束が少なからず影響していることが考えられる.
二次嗅覚神経回路形成における軸索性細胞認識分子BIG-1の機能解析

嗅球僧帽細胞で領域特異的に発現する軸索性細胞認識分子BIG-1の機能を解明することを目的として、BIG-1遺伝子座に膜移行型蛍光蛋白質遺伝子gap-Venusを挿入した遺伝子ターゲッティングマウスを作製した。このマウスを解析した結果、BIG-1発現僧帽細胞の軸索は、lateral olfactory tract(LOT)の特定の領域を通って、前嗅核、嗅結節、梨状葉皮質などの嗅皮質に投射することが明らかとなった。BIG-1の欠失によって、この軸索投射に目立った異常は認められなかったことから、BIG-1は二次嗅覚回路形成において単独では必須な役割を持たないことが示された。嗅球僧帽細胞に発現する軸索性細胞認識因子BIG-1の発現と機能について調べるため、BIG-1遺伝子座に膜移行型蛍光蛋白質をコードするgap-Venusを挿入した遺伝子ターゲッティングマウスを作製した。このマウスのヘテロ個体を用いて、様々な発生段階においてBIG-1発現細胞の軸索の投射パターンの解析を行った。胎生期および成体マウスの脳に対して抗GFP抗体を用いた免疫染色を行い、gap-Venusの発現部位を確認した。その結果、lateral olfactory tract (LOT), olfactory tubercle, piriform cortexなどの嗅神経回路を含む脳の様々な領域に、gap-Venus陽性の軸索が検出された。gap-Venusの発現は発生期(胎生1418日)で特に強く、成体では(おそらく軸索の髄鞘化のために)検出が難しくなった。LOT中でgap-Venusの発現はventromedialの特定の領域を占め、このことからBIG-1陽性僧帽細胞の軸索は嗅覚神経回路の中で特定の領域を通って投射することが示された。また、発生期においてgap-Venusはolfactory ensheathing cell (OEC)の一部でも非常に強い発現が認められた。OECは嗅神経の嗅球への軸索投射に関与することから、BIG-1が僧帽細胞だけでなく嗅神経の回路形成にも関与する可能性が示唆された。さらに、ホモ個体の脳を用いてBIG-1欠失の表現形について調べたが、特に目立った異常は見つけられなかった。gap-Venus陽性細胞の軸索投射に関しても野生型と比べて大きな違いは見られなかった。今後はさらに詳細にホモ個体の解析を行うとともに、培養細胞系などを用いた実験によりBIG-1の機能について明らかにしていく予定である。嗅球僧帽細胞で領域特異的に発現する軸素性細胞認識因子BIG-1の機能を明らかにすることを目的として、昨年度に引き続き、BIG-1遺伝子座に膜移行型蛍光タンパク質gap-Venus遺伝子を挿入した遺伝子ターゲッテイングマウスの解析を行った。昨年度の結果より、BIG-1発現僧帽細胞の軸索はlateral olfactory tract(LOT)の特定の領域を通って、前嗅核(anterior olfactory nucleus)、嗅結節(olfactory tubercle)、梨状葉皮質(piriform cortex)などに投射することが示されている。昨年、僧帽細胞の軸索が同側の前嗅核外節(AONpE)と呼ばれる領域にtopographicに投射し、左右の嗅球間の情報交換に重要な役割を果たすことが報告された(Z.Yan et al. Neuron 2008)。BIG-1は嗅球内で領域特異的な発現勾配を示すことから、このtopographicな投射の制御に関与している可能性が示唆された。そこでヘテロおよびホモの個体を用いて抗GFP抗体による免疫組織化学を行い、AONpEにおけるgap-Venus陽性軸索の投射パターンに着目して調べたが、BIG-1の欠失による目立った異常は発見できなかった。BIG-1は僧帽細胞以外にも、発生期にolfactory ensheathing glia(OEG)で非常に強く発現している。また、硫酸亜鉛によりマウスの嗅上皮を人工的に除去すると、OEGにおけるBIG-1の発現誘導が認められた。OEGは軸索伸長や神経再生を促進する活性を持つことから、BIG-1が嗅細胞の発生および再生過程において、嗅球への軸索投射を制御している可能性が考えられた。そこで、BIG-1欠失マウスで、発生期および再生期における嗅神経細胞の軸索投射や糸球体形成に遅延等の異常が認められないかを調べたが、明らかな異常は見つからなかった。これらの結果から、BIG-1は嗅覚神経回路形成において単独では必須な役割を持たず、他の細胞認識因子などとの相互作用によりこその機能が発現している可能性が示された。今後はBIG-1と他の細胞認識因子との機能的相互作用について、ダブルノウクアウトマウスなどを用いた解析により明らかにしていくことが課題であると考えられる。
白ザケ脳下垂体ホルモン遺伝子の構造解析とこれを用いた育種への応用

脳下垂体ホルモンは、動物の行動,性殖等広範な機能調節物質として知られている。その一つであるプロオピオメラノコルチン(POMC)は種々の哺乳動物においてその遺伝子が単離され構造解析が行われている。我々はさきに魚類の一つサケにおいて、脳下垂体よりPOMCのmRNAに対するCDNAクローン-種を単離し構造を解明した。本年はさらに本CDNAクローン#17をプローブとして数種のCDNAクローンを分離しその構造解析を行い次の結果を得た。1)#17CDNAはNPP【II】,α-MSH【II】,β-MSH【II】,β-EP(エンドルフィン)【I】を含むPOMC【I】のmRNAであったが、新たに分離されたCDNAクローン#106,#199はNPP【I】,α-MSH【I】,β-MSH【I】,β-EP【II】を含むPOMC【II】のmRNAに対応するものであった。ペプチド解析の結果その存在が予想されていたPOMC【II】が、事実存在する事をmRNAレベルで明らかにしたことになる。これ等両mRNAはCoding部分で塩基配列に差があるのみならず、3 ́noncoding部分でPOMC【I】が約900塩基,POMC【II】で160と短く、その構造の類似性から哺乳類の祖先遺伝子であることを示唆した。2)哺乳類で発見されていたγ-MSHに関しては、サケには存在しない事が見出された。すなわちPOMCのN端のNPPペプチドのγ-MSHに相当するヌクレオチド配列がサケのPOMC【I】,【II】のいずれにおいても欠落していた。これは動物の進化を考える時、貴重な1例となるだろう。すなわち、動物界においてMSH様始祖遺伝子がサケ以前において重複され、魚類から哺乳類にいたる進化のどこかの過程で更にもう一度遺伝子重複が起り、哺乳類におけるγ-MSHとなったと考えられる。
発達期小脳における足場タンパク質JSAP1の機能解析

哺乳類MAPキナーゼ(MAPK)経路の足場タンパク質は、シグナル伝達の特異性維持を規定する因子であり、MAPKの時空間的制御にも関わると考えられている。しかし、詳細については不明な点が多い。我々は、自らのグループが同定した足場タンパク質JSAP1を中心に解析を行った。研究成果は以下の通りである。1.Jsap1ノックアウト(KO)マウスは、生直後、呼吸不全のために死亡することが知られている。しかし、その分子メカニズムについては不明な点が多い。Jsap1コンディショナルKOマウスを用いた解析により、Jsap1 KOマウスの死亡は神経系の異常に起因することが強く示唆された(Neurosci. Lett. 2007)。2.PC12細胞をモデル系とした解析を行い、足場タンパク質JSAP1はN-カドヘリンを介した細胞間相互作用の制御に関与していることを見出した(Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007)。3.発達過程および成体マウスにおけるJSAP1の発現を詳細に検討し、JNK MAPKとJSAP1 mRNAは胎仔および成体マウスにおける発現パターンが極めて類似していることを見出した。またJSAP1タンパク質は、胎仔では未分化神経細胞、および小脳の外顆粒層で特に強く発現しており、成体マウス脳では、様々なニューロンやバーグマングリアで発現しているが、中でも小脳プルキンエ細胞で高発現していることを見出した(J.Neurochem. 2006)。4.免疫組織化学法による解析を行い、JSAP1タンパク質は発達期小脳の外顆粒層を形成する顆粒前駆細胞(GCP)、特に増殖を停止したGCPで強く発現していることを見出した。JSAP1-JNK MAPKシグナル伝達系によるGCPの増殖・分化制御機構を明らかにするため、生後4日目のマウスから小脳GCPを精製し、初代培養系を用いて解析した。その結果、JSAP1-JNKシグナル伝達系はGCPの増殖阻害、および分化促進に関わることが強く示唆された(投稿準備中)。哺乳類MAPキナーゼ(MAPK)経路の足場タンパク質は、シグナル伝達の特異性維持およびMAPKの時空間的制御に関わる因子と考えられているが、詳細については不明な点が多い。我々は、自らのグループが同定した足場タンパク質JSAP1を中心に解析を進めており、今年度の研究成果は以下の通りである。1.発達過程および成体マウスにおけるJSAP1の発現を詳細に検討し、JNK MAPKとJSAP1 mRNAは胎仔および成体マウスにおける発現パターンが極めて類似していることを見出した。またJSAP1タンパク質は、胎仔では未分化神経細胞、および小脳の外顆粒層(EGL)で特に強く発現しており、成体マウス脳では、様々なニューロンやバーグマングリアで発現しているが、中でも小脳プルキンエ細胞で高発現していることを見出した。2.発達期小脳におけるJSAP1タンパク質について、免疫組織化学法よる解析を行い、JSAP1は2層に分かれたEGLのうち、iEGLで強く発現しており、oEGLでの発現は極めて低いことを見出した。さらに、野生型あるいはjsap1^<+/->マウス同士を交配させた妊娠マウス(E18.5)の腹腔内にBrdUを投与し、増殖細胞(BrdU陽性)を定量的に解析した。その結果、jsap1 KOマウスでは増殖細胞(BrdU陽性)が有意に増加していることを見出した。

以上の結果から、JSAP1-JNKシグナル伝達系は小脳顆粒前駆細胞の増殖を負に制御することが強く示唆された。3.jsap1 KOマウスは、生直後、呼吸不全のために死亡することが知られている。しかし、その分子メカニズムについては不明な点が多い。jsap1コンディショナルKOマウスを用いた解析により、jsap1 KOマウスの死亡は神経系の異常に起因することが強く示唆された。4.小脳プルキンエ細胞特異的なjsap1 KOマウスの作出に着手した。哺乳類MAPキナーゼ(MAPK)経路の足場タンパク質は,シグナル伝達の特異性維持を規定する因子であり,MAPKの時空間的制御にも関わると考えられている。しかし,詳細については不明な点が多い。我々は,自らのグループが同定した足場タンパク質JSAP1を中心に解析を進めており,今年度の研究成果は以下の通りである。1.免疫組織化学法による解析を行い,JSAP1タンパク質は発達期小脳の外顆粒層を形成する顆粒前駆細胞(GCP),特に増殖を停止したGCPで強く発現していることを見出した。2.JSAP1-JNK MAPKシグナル伝達系によるGCPの増殖、分化制御機構を明らかにするため,生後4日目のマウスから小脳GCPを精製し,初代培養系を用いて解析した。その結果,JSAP1-JNKシグナル伝達系はGCPの増殖阻害,および分化促進に関わることが強く示唆された。3.GluRε3-CrePRマウス(Cre組換え酵素とprogesterone受容体の融合タンパク質が小脳顆粒細胞特異的に発現する遺伝子改変マウス)を用いて小脳顆粒細胞特異的にJsap1遺伝子破壊を誘導できるマウス作出した。抗プロゲステロン剤RU-486を生後1日目(P1)からP5まで5日間経口投与し,Jsap1遺伝子破壊によるGCP増殖活性の変化を検討した。しかし,この実験系ではJsap1遺伝子破壊までに時間がかかり,別の実験系を用いて調べる必要があることが判明した。そこで,小脳顆粒前駆細胞特異的かつ非誘導型Jsap1 KOマウスの作出に着手した。4.Jsap1 KOマウスは,生後まもなく呼吸不全のために死亡することが知られている。しかし,原因については不明な点が多い。そこで,神経系特異的Jsap1 KOマウスの作出、解析を行い,Jsap1 KOマウスの生直後の死亡は神経系の異常に起因することが強く示唆された。