hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血流下での血管内皮細胞の応答機構と血液凝固第VIII因子の機能発現

HUVECsをFLOW CHAMBER内に播種したのちに層流、乱流のパターンで、3日間血流下培養を行った。パラホルムアルデヒドで細胞を固定したのち、免疫染色を行なった。細胞形態を評価する(bright fieldおよびphalloidin染色)と同時にFVIII, VWFの細胞内に存在する量を得られた画像からintensityをパラメータとして解析した。【結果-1】1)層流では細胞形態の変化が血流に沿っておきていたが、乱流では一定の方向性をみなかった。2)VWF量は静止下に比べて層流で増加していたが、乱流では静止下と同等であった。3)FVIII量は静止下<層流<乱流という結果であった。血流がVWFとFVIIIの発現に影響を与えており、かつそれぞれ別の様式を取ることが示唆された。VWFは乱流では減少していたが、これは発現量が低下しているのか、発現しているが血流の刺激で放出されて結果として減少している可能性も考えられた。このことを検討するために培養で使用した培養液を濃縮してVWFFVIII量を測定した。【結果-2】1) VWFは血流パターンにより変化を認めなかった。2)FVIIIはいずれも培養液中で測定感度未満となり評価できなかった。FLOW CHAMBER内の細胞数が限られるため、VWFやFVIIIの変化量は微量であり、検査感度としては低いと考えざるを得なかった。血流下培養の実験系が立ち上がり、安定してデータを得ることができた。FVIIIとVWFの血流に対する影響の違いを検討するためにTFやNFΚBなどを評価していく予定である。HUVECsを用いて層流、乱流のパターンかつ流速がhigh, lowのパターンで,血流がHUVECsに及ぼす影響を、血流下培養後に固定したのち、免疫染色を行ない、1)細胞形態変化の観察2)細胞骨格の変化の観察3)FVIII, VWFの発現量、発現形式の検討を行なった。【結果】1)層流では細胞形態の変化が血流に沿っておきやすく、乱流では一定の方向性をみない。おそらく乱流方向に沿って変形していると思われる。層流でも血流がhighの方がlowに比べてその傾向が顕著であった。2)形態変化にともない、細胞骨格の変形が認められた。細胞が一見変化していなくても、lowの血流であっても、血流がかかる事により細胞骨格の変化は認められた。これは骨格の変化が先におこり、その後目視できる形態変化に繋がるものと思われた。3)FVIII、VWFは層流では血流が速いほど発現が増加した。一方乱流では発現が消失していた。これは発現が低下していた可能性もあるが、発現したものの、血流の刺激で血管内皮細胞からタンパクが放出された可能性も考えられた。循環ポンプの動作不良の為に繰り返し実験の中断をせざるをえなかった。しかし現在ようやく血管内皮細胞を長期に培養するシステムが確立された。生体内での様々な血管の環境を想定して、highの血流の中でもhighに加えてvery highも検討する。血管内皮細胞からのFVIII, VWFの発現、分泌の状況を把握する為に、培養液中のFVIII、VWF濃度も測定する。またFVIII, VWFだけでなく組織因子やトロンボモデュリンなどの細胞の「向」および「抗」血栓性の性質を評価していく事で、さらなる血流に対する血管内皮細胞の応答様式を解明していく。
慢性関節リウマチおよび変形性関節症の関節破壊に対する遺伝子治療法の開発

近年の分子生物学的進歩により慢性関節リウマチ(RA)の関節破壊機序が徐々に解明されつつあり、中でもTNFa, IL-1b, IL-6を中心とした炎症性サイトカインとMatrix Metalloproteinase(MMP)-1,3,9,13等のタンパク分解酵素はその中心的な役割をしている。我々は以前からこれらのchemical mediaorの上流に位置する転写調節因子NFκBに注目しRA患者や実験的関節炎モデルの増殖滑膜でNFκBの活性が上昇していることを報告し、NFκBの転写活性部位への結合を阻害する、おとり型核酸医薬(デコイ)を開発した。また一方でHVJ(Hemagglutinating Virus of Japan)の細胞膜融合能を利用した遺伝子導入法、HVJ-Liposome法を確立し関節内滑膜細胞、軟骨細胞を対象に高効率で遺伝子導入が可能であることを示した。これらの背景から、本研究ではRAのモデルとしてラット・コラーゲン関節炎(CIA)を発症させ、関節内にHVJ-Liposome法を用いてNFκBデコイを導入した。その結果NFκBの活性化とTNFa,IL-1b,の発現が抑制され、組織学的にもCIAによる関節破壊を抑制することに成功した。さらに将来の臨床応用を目指し霊長類での関節破壊抑制効果および安全性を評価した。カニクイサルにCIAを発症させ、NFκBデコイをnakedで関節内投与しても有効な関節破壊抑制効果と安全性が確保されることが判明した。また変形性関節症のモデルとしては、ラット膝関節前十字靱帯切除モデル(ACLT)を確立し、膝関節内にnaked NFκBデコイを関節内投与したところ、組織学的に軟骨の変性が抑制された。これらのNFκBデコイの炎症性サイトカインを介した軟骨変性抑制効果は既存のヒアルロン酸製剤と比較してもさらに優れたものであった。NFκBデコイ核酸医薬はRA患者の関節破壊予防を目指した治療に応用可能なだけではなくOAの予防にも有効であることが示唆された。今年度はサルコラーゲン関節炎モデルを使用し、naked NFκB decoyによる関節破壊抑制効果および安全性を評価した。カニクイサルをbovine TypeII collagenにて感作し、一週間後より膝、手、足関節にnaked NFκB decoyを直接関節内投与した。一関節当たり10-30mgのnaked NFκB decoyを使用した。投与は2ないし4週間間隔で投与した。経時的に生化学的、X線学的検討を行い初回感作後14週間で組織学的検討を行った。関節拘縮をきたした関節はnaked NFκB decoy投与群で4/20(20%)、未治療群で16/20(80%)であった。一部のサルではnaked NFκB decoy関節内投与後関節滑膜を採取しELISAにて滑膜中のIL-1β,TNFαを定量した。naked NFκB decoy投与関節において未治療群やscrambled decoy投与群(コントロール群)に比し有意にIL-1β,TNFα発現は抑制されていた。naked NFκB decoy投与群ではX線学的検討および組織学的検討において未治療群やscrambled decoy投与群に比し明らかに関節破壊は抑制されていた。

生化学的検討ではnaked NFκB decoy投与による明らかな異常値の出現は認められず、間接以外の他の主要臓器においても組織学的な明らかな異常は認めらなかった。さらに安全性試験としてnaked NFκB decoy40mgを静脈内投与して検討したが明らかな異常は認められず、naked NFκB decoy関節内投与における副作用の出現は検討した範囲では認められなかった。変形性関節症モデルとしてラット膝関節前十字靭帯切除モデルを作成した。術後一週より膝関節内にnaked NFκB decoy及び低分子ヒアルロン酸をそれぞれ単独あるいは混合して投与した。コントロールとしてscrambled decoyを用いた。経時的には関節腫脹はnaked NFκB decoy投与あるいは低分子ヒアルロン酸との混合投与群でscrambled decoy投与群や未治療群に比し有意に抑制された。平成14年度に組織学検討を施行する予定である。平成14年度は関節リウマチ(RA)および変形性関節症(OA)モデル動物の関節滑膜に対する関節局所のデコイ型核酸医薬導入による関節破壊抑制を分子生物学的、免疫組織学的に検討するとともに、この実験系で得られた組織をタンパクレベル、分子レベルで評価検討した。RAモデルとしてカニクイサルにコラーゲン関節炎を発症させた。膝関節内にベクターを用いずにNFκBデコイを2週毎に計6回注射を繰り返し、関節内の滑膜炎の程度、関節軟骨の状態を関節鏡を用いて経過観察したところ、対照のスクランブル・デコイ(NFκBと結合しない合成核酸)を用いた群と比較して、滑膜炎の程度、範囲は軽く、関節軟骨のびらん変性も抑制されていた。発症後13週での関節滑膜、関節軟骨の組織学的評価でもNFκBデコイは関節破壊を抑制していた。また滑膜組織、軟骨組織を採取しRT-PCR、ELISAでIL-1b, TNFa, MMP1, MMP3の発現を検討したところこれらの炎症性サイトカインやタンパク分解酵素がNFκBデコイ投与群で有意に減少していた。OAモデルとしてはFisherラットの膝前十字靭帯を切除しNFκBデコイ、スクランブル・デコイ、ヒアルロン酸(HA)、PBSを各々週1回、6回連続で関節内注射し組織学的評価したところ、NFκBデコイ群では他群と比較し、OAで特徴的な関節軟骨内のプロテオグリカンの減少が有意に抑制されており、OAの進行が抑制されていると判断した。また関節内滑膜と関節軟骨を回収しIL-1b、TNFaの発現レベルをRT-PCRとELISA法を用いて確認したところNFκBデコイ群でこれらの炎症性サイトカインの産生が低下してした。
日本亜熱帯産コウヤクタケ科および類縁科菌類の種多様性の解析

担子菌門、同担子菌綱の新たな分類体系を構築するための"かぎ"となるコウヤクタケ科および類縁科菌類のわが国における種多様性の解析を目的として、とくに調査の遅れている亜熱帯地域に焦点を絞り、(1)コウヤクタケ科および類縁科菌類に関して、分子生物学的手法を含む各種の研究に使用しうる標本試料および子実体(または基質)から分離菌株を収集し、(2)収集した標本試料および分離菌株について形態学的、遺伝生理学的、分子生物学的手法等による分類学的研究を行い、わが国の亜熱帯地域におけるコウヤクタケ科および類縁科菌類フローラを明らかにし、さらに(3)亜熱帯地域のコウヤクタケ科および類縁科菌類フローラの成立の解析に必要な情報を現地調査によって得られた情報を加え、本邦亜熱帯地域の種多様性の解析を行った。本研究を通して、子実体標本425点、分離菌株235株、およびDNA解析用子実体試料100点を収集することができた。現在までに行った形態学的、遺伝生理学的、分子生物学的解析により、マングローブの1種であるマヤプシキのみを気質とする新属Haloaleurodiscusを見出し、新種としてH. MangroveiおよびAsterostroma macrosporumを発見した。さらに、Gloeocystidiellum monilifformeなどの日本未報告種10種を含む45属93種を明らかにした。特に、従来ほとんど調査がされていないわが国のマングローブにおいて当該菌群のフローラをほぼ明らかにできた。しかし、未検討の標本試料等も数多くあり、今後さらに研究を発展させることにより、本邦亜熱帯地域のコウヤクタケ科および類縁科菌類フローラの全容を解明できるものと確信する。沖縄本島の億首川河口付近、西表島の相良川・後良川河口付近、船浦に分布するマングローブ林、および沖縄本島の名護岳、西表島の大富、古見、南風田の亜熱帯林において、コウヤクタケ類および類縁菌類(担子菌門)のフロラを明らかにするために発生子実体の収集を行い、種多様性の解析と生息菌類の生理的機能を調査するために分離菌株および腐朽材を収集した。本調査期間中に150点の子実体標本を得ることができ、これらの内70点については多胞子分離、子実体組織分離あるいは基質材から分離菌株を得、純粋培養後液体窒素凍結保存を行った。また、調査した4箇所のマングローブ林については、調査区を設定し、発生きのこ種の調査および腐朽材片を150点採取し、各材片から腐朽菌類の分離培養を行った。分離培養菌株については純粋培養後、現在DNA解析を進めている。また、各材片の一部は直接DNA解析用に供試する予定である。今回の調査採集で得られた子実体乾燥標本については順次、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡を用いて分類学的同定を行い、現在までに沖縄本島および西表島マングローブ林生息種として9属16種のコウヤクタケ類を同定し、新たに日本未報告種として、Cerocorticium molle (Berk. & M.A. Curtis) Julich、Gloeocystidiellum moniliformis Sheng H. Wu、G. wakullum Burds.,Nakasone & G.W. Freeman、Hyphoderma ayresii (Berk.)Boidin & Gilles、Phaenerochaete tropica (Sheng H. Wu) HjortstamおよびPhlebia acanthocystis Gilb. & Nakasoneの5属6種を見出した。

平成16年7月に沖縄本島の億首川河口付近、西表島の相良川、後良川および船浦河口付近、および石垣島名蔵および野底付近に分布するマングローブ林、および本島の恩納村、西表島の船浦、石垣島の野底の亜熱帯林においてコウヤクタケ科および類縁菌科の発生子実体について、その状態、基質の樹種、発生部位、腐朽様式など、可能な限りの生態的性質を記録するとともに乾燥標本を作製した。本調査において200点の子実体標本を得ることができ、これらのうち110点については多胞子分離、子実体組織分離あるいは基質材から分離菌株を得ることができた。分離菌株は純粋培養後、液体窒素凍結保存を行った。また、分離培養を行った55点の子実体標本から直接DNAを得るために各子実体組織のエタノール浸漬標本を作製した。分離菌株および子実体について、現在DNA解析を進めている。今回の調査および前年度の調査で得られた子実体乾燥標本についても順次分類学的同定を進めており、新たに日本未報告種としてResinicium friabile Hjortstam & Melo、Tofispora repetospora Langer & Ryvarden、Asterostroma muscicola (Berk. & M.A. Curtis)Masseeの3属3種を見い出した。さらに、マングローブの1種であるマヤプシキ枯木に特異的に発生するコウヤクタケ類の1種について、その子実体標本の形態的特徴、詳細な生態的調査結果、分離培養菌株の生理的性質(耐塩性、酵素活性)、さらに18Sおよび25SrDNAの系統解析に基づき、本種が新属新種であることを明らかにした。平成16年7月に西表島および石垣に分布するマングロブ林を含む亜熱帯林においてコウヤクタケ科および類縁菌科の発生子実体について、その状態、基質の樹種、発生部位、腐朽様式など、可能な限りの生態的性質を記録するとともに乾燥標本を作製した。本調査において75点の子実体標本を得ることができ、これらのうち55点については多胞子分離、子実体組織分離あるいは基質材から分離菌株を得ることができた。また、分離培養を行った45点の子実体標本から直接DNAを得るために各子実体組織のエタノール浸漬標本を作製した。分離菌株および子実体についてDNA解析を行い、平成14年度および15年度収集子実体、菌株を含めて、現在までに120子実体(菌株)について18rDNAおよびITS領域の解析を終了した。これらの解析結果および形態学的研究成果に基づき、Asterostroma属の1新種および日本末報告種2種を見出した。さらに、本年度実施した現地調査および従来の調査で得られた未同定のコウヤクタケ類標本の分類学的同定を行うために、イエテボリ大学植物研究所標本館(スウェーデン)において標本調査を行った結果、少なくともHypochnicium、Sistotrema、Treshisporaに所属する5種を新種とするのが妥当であると判断した。また、西表島マングローブ林に設定した調査区の1回の調査において、調査区内マングローブ生立木および枯死木腐朽部から得られた担子菌類分離株のDNA解析を行った結果、調査時期を異にする3回の調査において調査区内に出現する担子菌類子実体の形態学的研究によって認められた種以外に、少なくとも未知種として3種以上の分布が認められた。この結果は、材上生担子菌類相の多様性解析に腐朽部より得られた分離菌株のDNA解析の併用が有用であることを示唆する。
エストロジェン感受性細胞の増殖調節における転写因子CREBのはたす役割

4 forskolinあるいはestradiolの単独投与はプロラクチンプロモーター活性を増加させ、その併用投与はさらにプロモーター活性を増強させた。Ad-TRE/bgalの感染ではプロラクチンプロモーター活性の基礎活性レベルおよびforskolinによるプロラクチンプロモーター活性の上昇は影響を受けなかったが、Ad-TRE/MCREB.Tagの感染では基礎活性レベルおよびforskolinによる活性上昇が一部抑制された。5forskolin投与によって細胞内cyclic AMP濃度の著明な上昇が認められたが、IGF-1投与では有意の変化が見られなかった。forskolinによって投与20分から9時間後においてリン酸化CREB陽性プロラクチン産生細胞の割合は著明に増加した。一方、IGF-1投与では20分および1時間後において軽度のリン酸化CREB陽性プロラクチン産生細胞の割合の増加が起きていた。4プロラクチンプロモーター活性もcyclic AMPによって促進されるので、Ad-Prl/LucとAd-TRE/MCREB.Tagを重感染させた細胞を用いてforskolinによるプロラクチンプロモーター活性促進へのCREBの関与を調べた。Ad-TRE/bgalの感染ではforskolinによるプロラクチンプロモーター活性の上昇は影響を受けなかったが、Ad-TRE/MCREB.Tagの感染によるMCREB発現はforskolinによる活性上昇を一部抑制した。エストロジェン感受性細胞であるプロラクチン産生細胞において、エストロジェンによってcychc AMP response element-binding protein(CREB)が活性化されるかに関して、さらにプロラクチン遺伝子の発現調節に関与するかに関して調べた。1 17β-estradiol、vehicleあるいはcAMP増加剤であるforskolinを投与した培養下垂体細胞を、リン酸化CREB(pCREB)を認識する抗体およびプロラクチン抗体を用いて2重免疫染色した。positive controlであるforskolinによって投与3、24時間後にはpCREB陽性プロラクチン細胞の割合は著明に増加したが、estradiol投与では3および24時間後においても変化が認められなかった。CRE-luciferase遺伝子を持つadenovirus vectorを感染させた細胞においてCRE転写活性を測定すると、pCREB陽性プロラクチン細胞の割合の結果と同様に、forskolin投与によってCRE活性が増加し、estradiol投与では3時間後には変化がなかったが、24時間後にはわずかに増加した。2プロラクチンプロモーター-luciferase遺伝子を持つadenovirus vectorを感染させることによってプロラクチンプロモーター活性を測定すると、fbrskolinあるいはestradiolの単独投与はプロラクチンプロモーター活性を増加させ、その併用投与はさらにプロモーター活性を増強させた。CREBのdominant negative mutantであるMCREBを発現するadenovirus vectorを感染させた下垂体細胞では、基礎およびforskolinによるプロラクチンプロモーター活性が著明に抑制されていた。
革新的な単球・マクロファージ系細胞制御法開発への挑戦

末梢血から得たiPS細胞を用いて、造血幹細胞からさらに単球へ分化を誘導する系を確立した。単球から樹状細胞への分化系を作成し、また活性型(M1)Mφ、抑制型(M2)Mφへの誘導を試みた。原因未知の単球分化異常症では体系的遺伝子解析によって責任遺伝子を明らかにした。患者からはiPS細胞を樹立し、また平行してknock inマウスを作成し、単球や樹状細胞への分化について検討を行った。応用的な研究として、既知の真菌抗原からのoverlapping peptidesを用いて、真菌特異的CD4T細胞を誘導することに成功した。本研究ではiPS細胞を用いて単球の分化過程を分子レベルで明らかにし、未知の単球分化異常症の原因を明らかにすると共に、活性型(M1)・抑制型(M2)マクロファージの誘導と制御法を検討し、応用研究として真菌特異的T細胞の誘導によるマクロファージの活性化の実現性を検証することを目的としている。本年度はまず分化過程における特性解析に先駆けて、ヒト骨髄細胞における分化経路について、東京医科歯科大学難治疾患研究所樗木博士Gの支援を得て、詳細な検討を行った。その結果、単球-樹状細胞前駆細胞(MDP)、顆粒球-単球前駆細胞(GMP)、共通樹状細胞(DC)前駆細胞(CDP)、共通単球前駆細胞(CMoP)などを表面抗原の差異で分離することができるようになった。それを用いて各分画の単離と、体系的発現解析に向けての準備を整えた。単球・DC欠損症患者から、新規責任遺伝子が同定されたことが本年度の研究の成果である。本患者で分化系の解析を行い、さらに責任遺伝子産物の機能について多角的に検討を行った。実際には、患者由来EBV形質転換B細胞株を用いての体系的転写プロファイリングや、RiboClusterProfilerを用いての転写後遺伝子発現制御などを解析した。さらに同遺伝子の機能についてはKnock in miceの作成や、iPS細胞の作成に着手をした。iPS細胞については、申請段階においてはOP9細胞を用いる分化系と、feeder freeシステムの両者を考えていたが、東京大学医科学研究所大津真博士との共同研究により、サイトカイン及び生理活性物質にのみ依存した分化系を用いることとした。患者由来iPS細胞の樹立に着手すると共に、Knock in iPS細胞のデザインも開始した。研究は順調に経過しているが基盤技術となるiPS細胞からの単球、DCへの分化系にはまだ改良と工夫が必要である。実際には現在分化可能なものは、CD14陽性細胞であり、単球系の解析においては代表細胞とできるものの、DCは通常CD14陰性であり、DCのさらなる特性解析が必要となる。また分化過程においては少なくとも3-5ステップのサイトカインの切り替えが必要となっているが、その鍵となるポイントで、正常の骨髄における分化を模倣しているかは、今後の検討課題である。いずれにしても今回同定した新規責任遺伝子異常による単球・DC欠損症の解析は、同細胞分化における鍵となる分子を明らかにするものと期待される。これらからのiPS細胞の樹立は着手したところであるが、本異常症以外の単球・DC欠損症の検体も入手しているところである。いずれにしても、もう1つの重要な部分である、ヒト骨髄における単球・DC系の分化の解析についてはほぼ確立され、またコロニーアッセイも行える状況となっている。一方、これらの分化系における体系的遺伝子発現解析や、後成的変化の解析は、世界的にも情報が統一されておらず、独自にsorting、RNASeqを行う準備を整えている。本年度に予定していたMo-Mφ活性化による真菌感染症制御に向けた免疫制御法の検討については、それぞれの真菌類における抗原とペプチドについて、リストアップを行っているところであり、まだ実際にペプチド刺激によるex vivo増幅の可能性については検証できていない。本研究でiPS細胞を用いて単球及び樹状細胞の分化過程を分子レベルで詳らかにし、原因不明の単球系分化異常症の責任遺伝子と病態を明らかにすることと共に、最終的には活性型、抑制型マクロファージの制御方法を探索することを目的としている。最終年度にあたり、私たちが同定した新規遺伝子変異を有する単球・樹状細胞(DC)欠損症患者の分化異常を中心に解析した。これらの患者は同一の表現型を呈し、かつ同一遺伝子にヘテロ変異をもっている。本分子はtype Iインターフェロンの制御に当たるとされているが、患者由来のEBV形質転換B細胞や、組換え変異タンパクを用いた解析では、機能異常が描出されない。本年度は最終的に、保存された末梢血単核球を用いて、iPS細胞を樹立することに成功した。健常者からの単球・DC分化系も確立し、樹状細胞はCD14陽性とはなるが、iPS sac形成後の分化段階におけるRNA発現解析も行った。またiPS細胞を用いて、患者においての分化異常を再現した。平行してゲノム編集により患者由来の変異をwild typeに戻す研究を進めた。一方knock inマウスでは表現型が再現されず、感染による分化異常を検討開始した。応用研究としては真菌特異的T細胞の誘導によるマクロファージの活性化の実現を課題としてあげた。本研究に関しては、Aspergillus fumigatusの複数抗原及びCandida albicansのMP65を標的としてoverlapping peptideを用意し、健常者の末梢血単核球を刺激して、IFN-γ産生を細胞内染色(FACS)及びELIspotアッセイで検討した。

0.5%未満ではあるが明らかな集団が検知され、これらと単球の共培養により、単球の活性化が認められるかについての検証を開始した。末梢血から得たiPS細胞を用いて、造血幹細胞からさらに単球へ分化を誘導する系を確立した。単球から樹状細胞への分化系を作成し、また活性型(M1)Mφ、抑制型(M2)Mφへの誘導を試みた。原因未知の単球分化異常症では体系的遺伝子解析によって責任遺伝子を明らかにした。患者からはiPS細胞を樹立し、また平行してknock inマウスを作成し、単球や樹状細胞への分化について検討を行った。応用的な研究として、既知の真菌抗原からのoverlapping peptidesを用いて、真菌特異的CD4T細胞を誘導することに成功した。萌芽的研究の括りの中で、今後進めていくべき課題は山積している。1年目に行った解析により、より基盤的な技術の改良と、それを用いた基本的データの収集が重要であることを再認識している。今後はそのような中で、単球分化異常を呈する患者由来iPS細胞を用いたMo-Mφ分化系の検討に注力したいと考えている。具体的には、健常者由来、新規責任遺伝子異常症、GATA2異常症患者から樹立したiPS細胞を用いて、単球・DC系に分化させ、ステップ毎における遺伝子発現解析を行うことで、鍵となるタンパク(転写因子、翻訳制御因子など)を詳らかにしたいと考えている。また同検証の中では、患者からiPS細胞を樹立するだけではなく、健常者由来のiPS細胞を用いてゲノム編集を行い、knock in細胞を作成する予定である。これにより基盤が一致した解析が可能になると考えている。未知遺伝子異常による単球・DC欠損症では、責任遺伝子探索を行うと共に、上記手法を駆使して、病態に迫る予定である。M1, M2マクロファージについては、現在も様々な亜集団の報告が次々となされている状態である。今後の検討においては、今までの報告のあるそれぞれの亜集団の発現解析を元に、鍵となる転写因子やシグナルを探り、それをiPS細胞にも応用する予定である。現時点において、Mo, Mφ, DC活性化に関係するシグナル伝達因子や、転写因子を抑制する、siRNAやタンパクについては、用意を進めているところであり、一旦系が確立すれば、それらを用いて、単球やマクロファージの制御について検討を行いたい。さらに、現在解析中の新規・未知責任遺伝子は活性化等にも関与する可能性があり、その操作による制御についても模索したい。小児科学、免疫学
UMS技術を用いた超高周波SAWデバイス用単結晶基板表面の評価技術の開発

本研究は、本研究代表者らが発明・開発した超音波マイクロスペクトロスコピー(UMS)技術を超高周波(SHF)帯の弾性表面波(SAW)デバイス用LiNbO_3、LiTaO_3単結晶基板の均一性とその表面加工層・変質層の問題に適用し、その定量的解析・評価技術の確立を目指して行った。1.LFB-UMCシステムにより測定される漏洩弾性表面波(LSAW)伝搬特性の相対的・絶対的測定精度を向上させた。2.LiNbO_3とLiTaO_3単結晶のコングルエント組成比付近における音響関連物理定数の化学組成比依存性を決定し、任意の化学組成比の結晶に対するLSAWおよびSAWの伝搬特性の理論値の計算を可能にした。3.LiNbO_3とLiTaO_3単結晶基板に対して、LSAW速度、キュリー温度、格子定数などの諸特性値間の実験的関係(検量線)を求め、各特性値をLSAW速度により統一的に評価できるようにした。4.市販の光学用LiTaO_3単結晶インゴット内のLSAW速度による化学組成分布評価を通して、結晶育成条件の改良法を提案し、より均一な結晶育成に成功した。5.表面加工層モデル試料として、プロトン交換層、分極反転層を有するLiTaO_3基板を取り上げ、作製・評価を行った。LSAW速度による表層厚に対する分解能はナノメーターオーダーであることを明らかにした。6.走査型非線形誘電率顕微鏡システムの分解能を向上させた。7.LSAW速度測定により予め化学組成比分布を把握したLiTaO_3ウェハ基板に対し、0.5、1.2GHz帯のSAWフィルタを作製し、その中心周波数およびSAW速度を測定した。その結果、特に高周波において、LSAW速度(化学組成比)分布に起因する変化以上の中心周波数のばらつきや、SAW速度の計算値からのずれが大きくなる傾向を捉えた。これは表面加工層に起因する問題を捉えたものと考える。本研究では、本研究代表者らが発明・開発した超音波マイクロスペクトロスコピー(UMS)技術を超高周波(SHF)帯SAWデバイス用LiNbO_3とLiTaO_3単結晶基板の表面加工層・変質層の問題に適用し、その定量的解析・評価技術の確立を目指している。平成12年度の研究成果を要約すると以下の通りである。1.直線集束ビーム(LFB)計測システムの高周波化:広い周波数範囲(100MHz1GHz)をカバーする複数個の集束超音波デバイスを開発した。また、高周波帯における速度測定精度を維持するため、複素量測定システムに拡張した。2.試料A(圧電単結晶(LiNbO_3,LiTaO_3)基板表面上における表面加工層モデル試料(同一結晶材料に対し、異なる研磨工程を経て作製した試料))、および試料B(ガラス(合成石英)基板表面における表面加工層モデル試料(試料Aと同様に加工工程を変えて作製したもの))に対するLFBおよびバルク計測システムによる実験的手法を確立した。そして、試料Aに対して、LFB計測システムによりLSAW伝搬特性の周波数依存性を測定した。また、バルク超音波計測システムによる表面粗さの評価を行った。3.材料表面近傍の超微細(原子サイズ)領域の分極分布を観測するため、走査型非線形誘電率顕微鏡をサブナノの分解能に改良した。4.超精密格子定数測定(ボンド法)用X線回折装置による表面解析・評価を行うため、システムの測定分解能を7桁以上に向上させた。

本研究では、本研究代表者らが発明・開発した超音波マイクロスペクトロスコピー(UMS)技術を超高周波(SHF)帯SAWデバイス用LiNbO_3とLiTaO_3単結晶基板の表面加工層・変質層の問題に適用し、その定量的解析・評価技術の確立を目指している。平成13年度の研究成果を要約すると以下の通りである。1.直線集束ビーム(LFB)超音波材料解析システムの高精度化表面加工層・変質層による音響特性のわずかな変化を捉えるために、LFBシステム精度の検討を行った。これにより、複数の試料を連続的に測定することが可能となった。また、高精度な標準試料を作成することにより、LFBシステムの絶対精度を向上させた。2.表面加工層モデル試料の評価表面加工層モデル試料として(A)プロトン交換、および熱処理により作製したZ-cut LiTa0_3、および(B)プロトン交換および熱処理により作製したLiTa0_3分極反転層を取り上げ、評価を行った。LFBシステムにより測定したLSAW速度に対して、膜厚の分解能は(A)の試料に対して0.0041μm、(B)の試料に対して0.0080μmとなり、本システムの分解能がナノメーターオーダーであることを明らかにした。3.Bond法によるLiNbO_3、LiTaO_3単結晶基板の超精密格子定数測定法の検討本研究では、本研究代表者らが発明・開発した超音波マイクロスペクトロスコピー(UMS)技術を超高周波(SHF)帯SAWデバイス用LiNbO_3とLiTaO_3単結晶基板の表面加工層・変質層の問題に適用し、その定量的解析・評価技術の確立を目指している。平成14年度の研究成果を要約すると以下の通りである。1.直線集束ビーム超音波材料解析(LFB-UMC)システムを高精度に絶対校正するための適切な標準試料の選択法を見出した。被校正試料と同一材料、カット面、伝搬方向を有する標準試料を選択することにより、LSAW速度におけるシステム間の校正誤差を測定再現性程度の±0.004%以下に、また、その絶対精度として±0.02%以下にすることができた。さらに、この適切な標準試料の選択法により、他の伝搬波モードの影響による解析上の誤差を同時に除去できた。2.LiNbO_3とLiTaO_3単結晶のコングルエント組成付近における音響関連物理定数の化学組成比依存性を決定し、任意の化学組成比の結晶に対するLSAW伝搬特性の理論値の計算が可能になった。3.LFB-UMCシステムによる200MHz帯でのLSAW速度測定により、あらかじめ化学組成比分布を把握したLiTaO_3単結晶ウェハ基板に対し、0.5、1、2、3、5、7.5、10GHz帯のSAWデバイスを作製し、その中心周波数を測定した。その結果、LSAW速度(化学組成比)分布に起因する変化以上の中心周波数のばらつきが捉えられた。さらに、SAWデバイスの周波数が高くなるに従い、中心周波数のばらっきが大きくなる傾向があった。これは、超高周波SAWデバイス作製における歩留り低下が、基板の化学組成比分布やデバイス作製プロセス上の問題以外に、ウェハ基板表面状態(表面加工層)に起因していることを捉えたものと考える。
活性化NK細胞療法の臨床応用に関する研究

悪性リンパ腫などの血液悪性疾患患者末梢血をリンパ球ソースとし、全血単核球を用いてIL-2, IL-15などのサイトカインと抗CD3抗体であるOKT3、タクロリムス、ダルテパリンを用いることにより、GMPグレードの無血清培地にヒト血清を添加してNK細胞を培養増幅することが出来ました。また培養増幅したNK細胞には前感作なしで培養4時間後にK562白血病細胞株に対して強い細胞障害活性が確認されました。このような手法により再発難治悪性リンパ腫患者を対象としたリツキサン併用の自家培養増幅NK細胞療法についての臨床研究(Phase I/II)を計画することができました。健常人(健常人ドナー)あるいは悪性リンパ腫などの血液悪性疾患患者末梢血をリンパ球ソースとし、全血単核球を用いてIL-2, IL-15などのサイトカインと抗CD3抗体であるOKT3を用いて活性化NK細胞を培養増幅する有効な方法を検討しました。培養の際にT細胞の増殖を抑制する作用のあるタクロリムスの添加がNK細胞増殖に悪影響を及ぼさずにT細胞の増殖を抑制しうることが明らかとなりました。この際、ダルテパリンを添加することによって、通常使用されることの多い細胞性フィーダーを用いることなくてもNK細胞増殖効率が向上することが確かめられました。この実験は培養増幅したNK細胞を用いた細胞療法の臨床応用を最終的な目的としていますので、GMPグレードの無血清培地にヒト血清を添加したうえで培養を行いました。また培養増幅したNK細胞が有する細胞障害活性の強さを白血病細胞株であるK562を標的細胞として検討した所、前感作なしで培養4時間後に強い細胞障害活性が確認されました。さらに培養増幅前後の各種NK細胞受容体の発現を比較検討したところ、CD94, NKG2A, CD158a, CD158b, CD158e1などの抑制性NK細胞受容体とNKG2D, NKp44などの活性型NK細胞受容体の発現が亢進していることが明らかとなりました。とくに活性型NK細胞受容体の発現であるNKG2D, NKp44の発現が強く亢進していました。このように健常人ドナーのみならず血液悪性疾患患者末梢血からGMPグレードで細胞障害活性を有するNK細胞を大量に培養増幅することが可能であることが確認できました。健常人あるいは悪性リンパ腫などの血液悪性疾患患者末梢血をリンパ球ソースとし、特別な処理を行う事なく全血単核球を用いてIL-2, IL-15などのサイトカインと抗CD3抗体であるOKT3を用いて活性化NK細胞を培養増幅する有効な方法を検討し、培養の際にT細胞の増殖を抑制する作用のあるタクロリムスの添加がNK細胞増殖に悪影響を及ぼさずにT細胞の増殖を抑制しうることが明らかとなりました。またダルテパリンを添加することによって、通常使用されることの多い細胞性フィーダーを用いることなくてもNK細胞増殖効率が向上することが確かめられました。このような実験結果をふまえて、活性化NK細胞療法を臨床応用するためにGMPグレードの無血清培地にヒト血清を添加したうえで24 well plateではなく300mlバッグにてclinical scaleでの培養実験を行いました。このようにして培養増幅したNK細胞が有する細胞障害活性の強さを白血病細胞株であるK562を標的細胞として検討し、T細胞のような前感作を必要としない強い細胞障害活性が確認されました。再発難治の悪性リンパ腫の予後は不良ですが、抗CD20抗体リツキサンを抗がん剤と併用すると効果が期待されます。さらにリツキサンの抗腫瘍効果はNK細胞などによってもたらされます。そこで悪性リンパ腫患者末梢血より培養増幅した活性化NK細胞を用いた自家NK細胞療法についての臨床研究(培養増幅した活性化NK細胞の安全性に関するPhase I/II)を計画し、当院倫理委員会の承認のもと臨床研究を開始したところであります。悪性リンパ腫などの血液悪性疾患患者末梢血をリンパ球ソースとし、特別な処理を行う事なく全血単核球を用いてIL-2, IL-15などのサイトカインと抗CD3抗体であるOKT3を用いて活性化NK細胞を培養増幅する有効な方法を検討しました。また培養の際にT細胞の増殖を抑制する作用のあるタクロリムスの添加がNK細胞増殖に悪影響を及ぼさずにT細胞の増殖を抑制しうることが明らかとなりました。さらに通常使用されることの多い細胞性フィーダーを用いなくともヘパリン成分であるダルテパリンを添加することによって、NK細胞増殖効率が向上することが確認されました。この結果、NK細胞実数として培養前の約1,000倍、1x109レベルまで増幅する事が可能でした。

そこで悪性リンパ腫患者末梢血より培養増幅した活性化NK細胞を用いた自家NK細胞療法についての臨床研究(培養増幅した活性化NK細胞の安全性に関するPhase I/II)を計画し、当院倫理委員会の承認のもと臨床研究を開始しました。患者体重当たり1x106/kg 3症例に施行し有害事象はなかったため、3x106/kg 1症例に施行し有害事象は認められませんでした。今後も症例を追加して検討していく予定です。悪性リンパ腫などの血液悪性疾患患者末梢血をリンパ球ソースとし、全血単核球を用いてIL-2, IL-15などのサイトカインと抗CD3抗体であるOKT3、タクロリムス、ダルテパリンを用いることにより、GMPグレードの無血清培地にヒト血清を添加してNK細胞を培養増幅することが出来ました。また培養増幅したNK細胞には前感作なしで培養4時間後にK562白血病細胞株に対して強い細胞障害活性が確認されました。このような手法により再発難治悪性リンパ腫患者を対象としたリツキサン併用の自家培養増幅NK細胞療法についての臨床研究(Phase I/II)を計画することができました。健常人(健常人ドナー)あるいは悪性リンパ腫などの血液悪性疾患患者末梢血をリンパ球ソースとし、全血単核球を用いてIL-2, IL-15などのサイトカインと抗CD3抗体であるOKT3、タクロリムス、ダルテパリンを用いることにより通常使用されることの多い細胞性フィーダーを用いることなく、GMPグレードの無血清培地にヒト血清を添加してNK細胞を培養増幅することが出来ました。このように健常人のみならず血液悪性疾患患者末梢血からclinical scale GMPグレードで細胞障害活性を有するNK細胞を大量に培養増幅することが可能であることが確認できるとともに、自家培養増幅NK細胞療法についての臨床研究(Phase I/II)を計画することができましたので、研究目的は計画以上に達成されています。血液内科学いままでNK細胞を培養増幅することは容易ではないとされており、大量のドナー末梢血アフェレーシス試料などより磁気ビーズを用いたCD56 positive selectionによって調整されていました。本研究では我々が開発した方法によって血液疾患患者末梢血などからGMPグレードで臨床にて使用可能なレベルまで大量に活性化NK細胞を培養増幅することが可能であることが明らかとなりました。今後はこの方法をさらに発展させ確立すると共に、自家培養増幅NK細胞療法の臨床研究(Phase I/II)を行って、その安全性を検討します。将来的には同種培養増幅NK細胞療法が可能となるようにNK細胞の培養、活性化の基盤を整備しさらなる臨床応用を目指します。
癌微小環境因子としてのC5aの癌促進解析とC5a－C5a受容体標的治療法の確立

株化乳癌4種でアナフィラトキシンC5aの受容体(C5aR)mRNA発現がみられ、C5a刺激により増殖亢進がみられた。またC5aR発現腎癌細胞株RencaではC5aによる運動性形態変化が誘導され、ERKとPI3 kinaseシグナル経路を介していた。さらに、アルザス反応による癌微小環境C5a産生誘導で癌浸潤亢進がみられた。C5aR発現胃癌細胞株でもC5aは浸潤を亢進した。この作用はsiRNAによるC5aR発現消失やC5aR拮抗剤W-54011で抑制され、RhoA活性化が関与していた。C5aは癌肺転移も促進した。これら癌進展効果からC5a-C5aR系標的治療法の有効性を示唆する。ヒト胆管癌細胞株HuCCT1にヒトC5a受容体(C5aR)を発現させたHuCCT1/C5aR細胞は、C5a 100nM添加RPMI1640培養液で24時間培養すると、増殖が約2倍になり、この効果はC5aR拮抗剤で濃度依存性に抑制された。シグナル伝達経路を種々の伝達分子阻害剤による増殖抑制で検討したが、明らかな経路の同定には至らなかった。細胞周期へのC5a効果をPIで核染色してフローサイトメトリーで調べたが、有意な差はみられず、むしろアポトーシス抑制への効果が示唆された。ヌードマウスに尾静脈から癌細胞を注入し6週間後に肺転移巣を調べた。C5a 100nMで1時間刺激したHuCCT1/C5aRはHuCCT1/mockより5倍、C5a無刺激HuCCT1/C5aRより3倍、肺転移巣が増加した。マウス腎癌細胞株RenCaにマウスC5aR遺伝子発現プラスミドをリン酸カルシウム法で導入し、ネオマイシン添加培地で選別してRenCa/C5aR細胞をクローニングした。さらに、腎臓への注射による発癌部からの遠隔転移をみる実験を行ったが手技の困難さから受容体発現と転移能を示す結果は得られなかった。I.ヒト癌細胞のC5a放出作用解明株化癌細胞がヒトC5からC5a遊離とこのC5aによるC5a受容体(C5aR)発現癌細胞の浸潤亢進作用を証明した。癌細胞が遊離した癌細胞のC5a遊離作用はアプロチニンとdRVKR-cmkで抑制されたので、kexin様の基質特異性をもつセリンプロテアーゼのC5a遊離への関与が解った。C5が生理的に存在する血漿からの癌細胞のC5a遊離作用は癌微小環境でのC5a産生を示唆し、C5aが癌を進展させる因子として重要であることが提示された。免疫染色でC5aR発現を調べると、ヒト転移性腎癌では96.7%が発現しており非転移腎癌の50.5%に比べきわめて高い頻度であった。昨年度作製したC5aR発現マウス腎癌細胞株Renca/C5aRはC5a刺激により細胞形態のダイナミックな変化をおこし、シグナル伝達系ERKとPI3Kに依存した浸潤亢進を示した。以上の結果より、腎癌でC5a-C5aR系が浸潤を高め転移に貢献していることが明らかになった。免疫染色でC5aR発現を調べると、ヒト乳癌では13%が発現しており、腫瘍サイズ、核異型度、増殖度、リンパ節転移、臨床的進行度に有意であった。さらに、女性ホルモン受容体発現とは負の、HER2とは正の相関がみられた。興味あることに、治療困難なトロプルネガティブ型で38%と高い発現率であった。C5aR陽性癌患者は生存率が有意に低く、その理由としてリンパ節転移部癌の高いC5aR発現率、C5aによるC5aR発現細胞の増殖亢進作用が明らかになった。以上より、C5a-C5aR系は乳癌進展に貢献して予後の悪さに関与していることが示された。したがって、この系は治療の標的として、とくにトリプルネガティブ型の治療に有用であると考えられる。I.アレルギー反応による癌微小環境C5a産生の癌増殖促進効果の解析マウス腎癌細胞RenCaにマウスC5a受容体遺伝子を挿入してC5a受容体を発現させたRenCa/C5aRとコントロールRenCa/mockを異なる近赤外線probeで標識し、両者を混合して抗卵白アルブミンIgGと共に同系のBalb/cマウス皮膚内に注射し、直後に尾静脈から卵白アルブミンを投与する。マウス皮膚内で浸潤する癌細胞の近赤外線を経時的に測定し、両癌細胞の広がる面積を比較する計画である。II.移行上皮癌C5a受容体発現の意義解明浸潤性尿上皮癌は根治手術後も50%近くが再発・転移を起こすため、補助療法が必要であるが、その必要性を提示する有力な予後因子は未だない。52名の根治手術を受けた浸潤性尿上皮癌患者中38名(73%)で癌細胞がC5a受容体陽性であった。C5a受容体は癌細胞膜に認められ、浸潤先端部の癌細胞で特に強く発現していた。非癌上皮細胞に発現はみられなかった。癌細胞C5a受容体発現は癌初期(T1-2)の患者では79%がC5a受容体陽性であった。

生存率はC5a受容体陽性癌患者で有意に低かった。C5a受容体発現は予後不良を予見するマーカーとして、補助療法選択の必要性を提示しており、癌初期でも陽性率が高いことはC5a受容体発現検出によって癌初期から補助療法を開始できる可能性を示唆している。C5a受容体発現胃癌細胞(MKN1, MKN7)はC5a刺激によって浸潤が亢進した。C5a受容体の過剰発現によって、C5a刺激によるRho-GDPからRho-GTPへの移行が亢進し、ストレスファイバーやフィロポディアなどの形態変化がみられた。胃癌細胞のC5a-C5受容体系はRhoA活性化を介して、浸潤亢進を促進していることが明らかとなった。マウス腎癌細胞RenCaにマウスC5a受容体遺伝子を挿入してC5a受容体を発現させたRenCa/C5aR細胞が数回の継代後液体窒素中にストックしていたが、融解して実験用に再度培養したところC5a受容体を発現する細胞の割合が数パーセントに減少していた。それで、抗C5a受容体抗体ビーズを使ってC5a受容体発現細胞を分離し、培養して増やす必要が生じたため、期間内の実験遂行ができなかった。I.アレルギー反応による癌微小環境C5a産生の癌増殖促進効果の解析マウス腎癌細胞RenCaにマウスC5a受容体遺伝子を挿入してC5a受容体を発現させたRenCa/C5aRとコントロールRenCa/mockを異なる近赤外線probeで標識し、両者を混合して抗卵白アルブミンIgGと共に同系のBalb/cマウス皮膚内に注射した。直後に尾静脈から卵白アルブミンを投与し、補体系活性化による癌微小環境へのC5a産生を誘導した。近赤外線を測定して癌細胞浸潤の広がりを調べると、2日後にRenca/C5aRはRenca/mockに比較してC5a産生誘導によって1.6倍広く浸潤した。癌微小環境でC5aが産生されると癌が進行することが明らかになり、in vivoでのC5a-C5a受容体系の癌促進作用が示された。II.移行上皮癌C5a受容体発現の意義解明52名の根治手術を受けた浸潤性尿上皮癌患者中38名(73%)で癌細胞がC5a受容体陽性であった。C5a受容体は癌細胞膜に認められ、浸潤先端部の癌細胞で特に強く発現していた。癌細胞C5a受容体発現は癌初期(T1-2)の患者では79%がC5a受容体陽性であった。C5a受容体発現は予後不良を予見するマーカーであり、C5a受容体検出によって癌患者は初期からでも補助療法施行が可能となることを示している。C5a受容体発現胃癌細胞はC5a刺激によって浸潤が亢進した。胃癌細胞のC5a-C5受容体系はRhoA活性化を介して浸潤亢進を促進しており、この系が胃癌でも促進作用を発揮することが明らかになった。株化乳癌4種でアナフィラトキシンC5aの受容体(C5aR)mRNA発現がみられ、C5a刺激により増殖亢進がみられた。またC5aR発現腎癌細胞株RencaではC5aによる運動性形態変化が誘導され、ERKとPI3 kinaseシグナル経路を介していた。さらに、アルザス反応による癌微小環境C5a産生誘導で癌浸潤亢進がみられた。C5aR発現胃癌細胞株でもC5aは浸潤を亢進した。この作用はsiRNAによるC5aR発現消失やC5aR拮抗剤W-54011で抑制され、RhoA活性化が関与していた。C5aは癌肺転移も促進した。
子宮内膜症の骨盤内慢性炎症が卵巣予備能を低下させる分子病理学的機序に関する研究

卵巣チョコレート嚢胞への手術により,卵巣予備能のマーカーである血中AMH濃度は,術直後に一過性に低下したのち再上昇し,続いて再下降して術後約1年で定常値となる例が多く,手術処置の卵巣への作用をAMHで評価する場合は測定時期が重要であることが示唆された.プロゲスチンを併用した2期的チョコレート嚢胞手術では,1期的手術に比較して術後の卵巣予備能の低下が緩徐であり,妊孕性温存手術に有用である可能性がある.腹水中の向炎症性サイトカインであるIL-6、IL-8およびIP-10はプロゲスチンにより半数の症例で50%以上低下した。とくにIP-10はプロゲスチンの抗炎症作用のマーカーとなりうる可能性がある.卵巣チョコレート嚢胞を有し,インフォームドコンセントが得られた例において薬物療法を併用した2期的手術を行った.コントロールとして1期的手術の症例でも腹水等の臨床検体を採取した.手術を受けた症例では,術後に超音波検査や血中AMH値の測定を行い卵巣予備能に手術操作や薬物療法が与える影響を検討した.本年度は卵巣組織中の初期卵胞と周囲間質において,顆粒膜細胞や間質細胞の活性化の状態と関連すると考えられるsteroidgenic factor 1 (SF-1)の発現動態に着目して検討を行った.また,薬物療法前後での腹腔内での炎症促進因子ならびに酸化ストレス関連因子の変化について検討する目的に,腹水中のIL-6あるいはTNFα濃度を測定して比較した.卵巣チョコレート嚢胞に対する手術後に血中AMH値はほとんどの例で一旦下降したのち,術後3ー6ヶ月後に再上昇した.なかには術前値よりも高値を示す例も存在した.その後術後12ヶ月目ごろまでに再度ゆるやかに下降を示す例が多かった.これらは,初期発育卵胞より主に産生されるAMHが,手術侵襲による発育卵胞の閉鎖・消失によって一旦下降し,そのAMHの低下によって原始卵胞のリクルートメントの亢進が促されるためAMHが再上昇するものと考えられた.一方,卵巣中で周期的に選択される原始卵胞のコホート数が手術後に再構成されたのち,卵巣予備能が保たれている例ではもとのAMH値に近い値に戻り安定することが示唆された.SF-1は顆粒膜細胞と卵細胞に局在が認められ,現在その発現動態に影響を与える因子を解析中である.腹水中のIL-6濃度はプロゲスチンにより低下したが,2回目の手術時の骨盤腔内の癒着の程度との関連は認められなかった.本年度は手術症例からの検体収集に努めたが,体液あるいは組織検体を得るためのインフォームドコンセントの取得が困難で.取得した検体数が目標に達していない.免疫組織化学的手法による卵胞周囲の間質における発現物質の評価において,必ずしも一定の結果が得られていない.得られた卵巣組織が少ないため,十分な卵巣組織由来のRNAが得られず,安定したRT-qPCRの結果が得られていない.腹水中のサイトカイン・ケモカイン濃度の検討プロゲスチンあるいはGnRHアナログによる薬物療法が腹水中サイトカイン・ケモカイン濃度に及ぼす影響を検討した。プロゲスチン(ジエノゲスト)による薬物療法を併用した2期的な腹腔鏡手術を行った8例において、初回手術および初回手術後に3ヶ月間薬物療法を施行したのちに2回目の腹腔鏡手術の際に採取した腹水における炎症惹起性サイトカイン、すなわちIL-1β、IL-6、IL-8、TNFα、MCP-1およびIP-10をマルチプレックスECLにより測定し、薬物療法の前後での変化を評価した。8例中4例においてIL-6、IL-8およびIP-10が初回手術時に比較して50%以上低下した。これまでの報告では、IL-6およびIL-8は子宮内膜症患者の腹水で上昇していることが示されており、ジエノゲストの抗炎症作用により低下していることが示唆された。また、これまでIP-10は進行した子宮内膜症I-II期に比してIII-IV期で低下したり、黄体期で低下することが報告されているが、本研究でプロゲスチン治療後に低下することが初めて示され、治療効果のマーカーになり得る可能性が示唆された。手術後の卵巣予備能の変化と治療効果1期的に卵巣チョコレート嚢胞を処置した例と薬物療法を併用して2期的手術を施行した例で術後1218ヶ月経過観察し、卵巣予備能マーカーである血中AMHの推移と臨床経過について比較検討した。AMHはいずれの手術法でも術後12ヶ月以降に安定し、術後の卵巣予備能の評価には時期が重要であることが考えられた。2期的手術のほうが1期的手術に比して術後のAMHの変化がより緩徐であり、経過観察中に4例が妊娠し、2期的手術の有用性が示唆された。2期手術の施行および組織検体を得るためのインフォームドコンセントの取得が困難で手術症例を思うように追加できておらず、腹水や卵巣組織の検体数が目標に達していない。免疫組織化学的手法による卵巣間質における発現蛋白の同定において、必ずしも一定の結果が得られていない。得られた卵巣組織が少ないため、卵巣組織由来のRNAが十分量得られず、安定したRT-qPCRの結果が得られていない。実験的子宮内膜症病変を有するマウスモデルの作出・検討を試みているが十分に検討ができていない。昨年度までに本研究で得られた結果である,プロゲスチンが腹水中