hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロトン感知性受容体による慢性気道炎症の制御

研究協力者の岡島史和教授(群馬大学生体調節研究所)より供与されたプロトン感知性受容体OGR1ノックアウトマウスを用いて、卵白アルブミン(OVA)感作によるアレルギー性気管支モデルを作成し、野生型マウスと比較検討を開始した。ノックアウトマウスはBlack 6マウスであり、Black 6マウスではBalb/cマウスに比べてOVA感作気管支喘息モデルを作成した場合、気管支肺胞洗浄液中への好酸球、リンパ球の集積、メサコリン吸入による気道抵抗によって評価される気道反応性(気道過敏性)の亢進の程度がいずれも軽度である。そのため、OGR1ノックアウトマウスをBalb/cマウスとの交配を繰り返し、Balb/cマウスのOGR1ノックアウトマウスを得て、現在、野生型マウス(Balb/cマウス)とOGR1ノックアウトマウスを比較している。また、ヒト気管支平滑筋細胞では、細胞外液を酸性にするとIL-6が産生された。この作用はOGR1のsiRNAを導入し、OGR1の発現を阻害することにより抑制され、気道平滑筋細胞においてOGR1がサイトカイン産生に直接関与する可能性が示唆された。これらの研究と併行して、抗炎症作用を有する脂質メディエーターとして最近注目されているResolvin E1(エイコサペンタエン酸由来の脂質)のアレルギー性気管支モデルにおける効果について検討した。その結果、Resolvin E1はOVA感作マウスにおいて、気管支肺胞洗浄液中や気道組織への好酸球、リンパ球の集積、気道上皮の杯細胞形成、気道過敏性を抑制することを見出し、その作用機序の一部としてOVA特異的IgE産生の減少、IL-13の産生抑制がみられることを証明した。研究協力者の岡島史和教授(群馬大学生体調節研究所)より供与されたプロトン感知性受容体OGR1ノックアウトマウスを用いて,卵白アルブミン(OVA)感作によるアレルギー性気管支モデルを作成し,野生型マウスと比較検討を開始した。ノックアウトマウスはBlack6マウスであり,Black6マウスではBalb/cマウスに比べてOVA感作気管支喘息モデルを作成した揚合,気管支肺胞洗浄液中への好酸球,リンパ球の集積,メサコリン吸入による気道抵抗によって評価される気道反応性(気道過敏性)の亢進の程度がいずれも軽度である。そのため,OGR1ノックアウトマウスをBalb/cマウスとの交配を繰り返し,Balb/cマウスのOGR1ノックアウトマウスを得て,現在,野生型マウス(Balb/cマウス)とOGR1ノックアウトマウスを比較している。また,ヒト気管支平滑筋細胞では,細胞外液を酸性にするとIL-6が産生された。この作用はOGR1のsiRNAを導入し,OGR1の発現を阻害することにより抑制され,気道平滑筋細胞においてOGR1がサイトカイン産生に直接関与する可能性が示唆された。これらの研究と併行して,抗炎症作用を有する脂質メディエーターとして最近注目されているResolvin E1(エイコサペンタエン酸由来の脂質)のアレルギー性気管支モデルにおける効果について検討した。その結果,Resolvin E1はOVA感作マウスにおいて,気管支肺胞洗浄液中や気道組織への好酸球,リンパ球の集積,気道上皮の杯細胞形成,気道過敏性を抑制することを見出し,その作用機序の一部としてOVA特異的IgE産生の減少,IL-13の産生抑制がみられることを証明した。
口腔癌における反復配列RNAの発現と機能の解明

口腔癌のほとんどは扁平上皮癌であるが、これらは臨床的、組織学的に多彩な像を呈しており、その発生過程や生物学的な性質も様々である。これら口腔癌の多様性については遺伝子変異のみでは説明が困難であり、epigeneticな要因が大きく関与していることが推察される。本研究課題はnon-coding RNAの中でこれまであまり重要とされてこなかった反復配列RNAに着目し、口腔癌およびその前駆病変における反復配列RNAの発現と機能の解明を目的として計画したものである。初年度の計画は反復配列RNAの転写の確認で、ヒト口腔扁平上皮癌およびその前駆病変のサンプルではRNA in situ hybridization、ヒト口腔扁平上皮癌細胞株およびマウスの舌扁平上皮癌およびその前駆病変ではRNA in situ hybridizationとNorthern blotにて行うことを計画したが、サンプルの採取に手間取っており計画した解析が行えていない。今年度はヒト口腔扁平上皮癌細胞株に焦点をしぼって解析を進め、反復配列RNAの転写を確認する。次にその生物学的意義の解明につながる解析として、HSATIIを強制発現するコンストラクトを作製しヒト表皮keratinocyteに強制発現させ、腫瘍性形質の獲得について観察する。腫瘍性形質の指標としてContact inhibitionの消失、Mitotic errorの増加、軟寒天コ口ニー形成能による足場非依存性の増殖能およびヌードマウスへの可移植性の解析を予定している。人事異動により勤務先が変わったことで研究に十分な時間がとれなかった。共同研究者との連絡を密にする。研究の遂行に十分な時間がとれなかったため。研究分担者と密に連携して限られた時間内で効果的に研究を遂行する計画を立てる。
ヤマトヒメミミズ再生幹細胞に発現する遺伝子grimpのタンパク質機能解析

本研究は、砕片分離と再生による無性生殖を行うヤマトヒメミミズEnchytraeus japonensisにおいて、再生初期に再生芽先端付近および中胚葉系列幹細胞に発現する新規遺伝子grimpに着目し、そのタンパク質の性質と再生における機能を明らかにすることを目的とする。grimpに対する抗体を作成し、組織蛍光抗体染色により、grimpタンパク質が再生芽およびその周辺の中胚葉系細胞に局在することを示した。また、RNAレベルでは再生6ー12時間で発現していたが、タンパク質レベルでは再生24時間でも発現が見られた。ウェスタンブロッティングにより、予想分子量付近に抗体と反応するバンドが認められた。本研究は、砕片分離と再生による無性生殖を行うヤマトヒメミミズEnchytraeus japonensisにおいて、再生初期に再生芽先端付近および中胚葉系列幹細胞に発現する新規遺伝子grimpに着目し、タンパク質レベルでその性質と機能を明らかにすることを目的とする。また、grimpタンパク質と相互作用するタンパク質、およびgrimp遺伝子の影響下にある他の遺伝子との関係を調べ、再生開始機構および再生幹細胞の実態の解明を目指す。これまでに、RNAiによるgrimp遺伝子の発現抑制が再生を阻害することを明らかにしているが、さらに直接的にgrimpの再生における役割を証明するために、タンパク質レベルの機能解析を行う。平成25年度は、grimp遺伝子をHisタグ付きベクターに組換え、大腸菌にてIPTGによるタンパク質発現誘導と金属カラムによるアフィニティ精製を行った。精製したgrimpタンパク質に対する抗体を作成準備中である。抗体を用いてタンパクの同定(プロセシングの有無)、タンパクレベルの局在(細胞の種類、細胞内局在)を示すと共に、機能阻害実験や免疫共沈降を用いた相互作用タンパク質の同定などを行う。また、grimp-GFP(N端およびC端)融合ベクターを作成し、従来の哺乳類間葉系幹細胞株に加えてヒト肝臓上皮癌細胞株HepG2に強制発現させ、細胞増殖および細胞分化への影響について検討した。この細胞でも融合タンパクが発現し蛍光を発したが、細胞増殖に対する影響は見られなかった。間葉系幹細胞株中ではgrimp-GFP融合タンパク質が分解されやすいことが示唆されているので、その分解過程について、細胞種による差やメカニズムも含めて検討する。一方、作成した融合タンパク質を精製後再生芽に顕微注入し、タグに対する抗体やGFPの蛍光を利用してその局在を調べている。平成26年度は、grimp遺伝子をHisタグ付きベクターに組換え、大腸菌にてIPTGによるタンパク質発現誘導と金属カラムによるアフィニティ精製を行った。精製したgrimpタンパク質を電気泳動で分離し、抗Hisタグ抗体によるウェスタンブロッティングにより確認の後、該当する融合タンパク質バンドを切り出して保存した。このタンパク質に対する抗体を作成準備中である。この融合タンパク質についても電気泳動で分離し、抗GFP抗体によりウェスタンブロッティングにより確認の後、該当する融合タンパク質バンドを切り出して解析中である。さらに、このGFP融合タンパク質をミミズの再生芽に顕微注入し、GFPの蛍光を利用してその局在を調べている。また、grimpタンパク質と相互作用するタンパク質、およびgrimp遺伝子の影響下にある他の遺伝子との関係を調べることで、再生開始機構および再生幹細胞の実態について解明をめざす。これまでにRNAiによるgrimp遺伝子の発現抑制が再生を阻害することを明らかにしているが、さらに直接的にgrimpの再生における役割を証明するために、タンパク質レベルの機能解析を行う。平成27年度は、前年度に行った組換え大腸菌のIPTGによるタンパク質発現誘導、および金属カラムによるアフィニティ精製とゲル電気泳動による分離を行って集めたHisタグつきgrimpタンパク質を用いて、業務委託によりポリクローナル抗体(ウサギ)抗体作成を行った。この他に、grimpの予想アミノ酸配列より、適切な箇所2カ所を選んでペプチド合成をし、これにキャリアをつけてウサギに免疫したポリクローナル抗体も作成した。納品された抗体を用いて、ドットブロットにより、精製タンパク質に対する抗体が作成されたことを確かめた。ウェスタンブロットにより、抗体の標的タンパク質のサイズを確認している。一方、grimp-GFP(N端およびC端)融合ベクターを作成し、ヒト肝臓上皮がん細胞株

HepG2に強制発現させ、生成した融合タンパク質を電気泳動で分離後、抗GFP抗体によるウェスタンブロッティングにより確認した。このタンパク質についても精製を行い、ミミズの再生芽に注入してその挙動を観察している。平成27年度は夏期に3ヶ月、大学の海外派遣研究員(公務出張)により英国に滞在した。ヤマトヒメミミズを国外に持ち出すことはできないことから、英国滞在時の研究テーマは本テーマと異なるほ乳類の筋肉再生幹細胞と疾患(筋ジストロフィー)に関するテーマであった。その期間分若干遅れが生じたため、抗体作成は完了したが、その後の詳細な解析がまだできていない。平成28年度に引き続き実施する。本研究は、砕片分離と再生による無性生殖を行うヤマトヒメミミズEnchytraeus japonensisにおいて、再生初期に再生芽先端付近および中胚葉系列幹細胞に発現する新規遺伝子grimpに着目し、タンパク質レベルでその性質と機能を明らかにすることを目的とする。また、grimpタンパク質と相互作用するタンパク質、およびgrimp遺伝子の影響下にある他の遺伝子との関係を調べ、再生開始機構および再生幹細胞の実態の解明を目指す。これまでに、RNAiによるgrimp遺伝子の発現抑制が再生を阻害することを明らかにしているが、さらに直接的にgrimpの再生における役割を証明するために、タンパク質レベルの機能解析を行う。最終年度は、前年度に業務委託により作成したポリクローナル抗体(ウサギ)抗体(grimp遺伝子をHisタグ融合タンパク質に対する抗体および合成ペプチドに対する抗体)を用いて、タンパクレベルの局在(細胞の種類、細胞内局在)について検討した。ヤマトヒメミミズのホールマウント標本を用いた蛍光抗体染色により、いずれの抗体を用いた場合でも、grimpタンパク質が再生芽およびその周辺の中胚葉系細胞に局在することが示された。また、RNAレベルでは再生6ー12時間で発現しそれ以降は消失するが、タンパク質レベルだと再生24時間でも発現が見られることがわかった。以上の結果より、grimpはタンパク質レベルでも発現し、アミノ酸翻訳の読み枠は予想通りであることが明らかになった。一方、ウェスタンブロッティングにより検討したところ、予想分子量付近に抗体と反応するタンパク質のバンドが認められた。また、より低分子のバンドも確認できたところから、タンパク質としてのプロセシングの有無について検討している。さらに、抗体や融合タンパク質を用いた再生機能阻害実験を行っている。
出血性ショック時の肺障害の重症度判定・死因診断における好中球の評価

重症度の異なる4群の出血性ショックモデルを作製し,同ショック時の肺障害の重症度と好中球の出現頻度との関係について検討を行った。出血後,炎症性サイトカインであるtumor- necrosis factor(TNF)-αおよびinterleukin(IL)-1βのmRNAの肺実質における発現および肺静脈血中濃度が出血量の増加に応じて強く上昇し,出血5時間後の肺実質における好中球の出現頻度も増加した。また,機能的肺障害を反映するpartialpressure of arterial oxygen (PaO_2)およびalveolar-arterial oxygen tension difference (A-aDO_2)は出血量に応じて増悪し,器質的肺障害を反映する血清lactic dehydrogenase-3 isozyme (LDH-3)濃度は出血量の増加に応じて上昇した。出血5時間後では好中球の出現頻度と血清LDH-3濃度とに正の相関関係が認められ,出血性ショック後の肺障害の重症度と好中球の出現頻度との関連性を明らかにすることができ,出血量の増加に応じた炎症性サイトカインの上昇が一連の病態に関与することが明らかとなった。ラットの総頚動脈にカテーテルを挿入し,出血させないSham群ならびに全血液量の17.5%,25%および33%をいずれも20分かけて出血させる群の出血1,3,5時間後における肺組織中のTNF-αおよびIL-1βのmRNA発現,肺循環血中LDH分画,動脈血液ガスの測定を行い,炎症反応の程度と肺障害の重症度との関係を検討した。肺組織中のTNF-αおよびIL-1βの皿RNA発現量は,Sham群では変化を認めなかったが,出血群では出血1時間後に有意に増加し,その程度は出血量に応じて高度であった(1時間後のTNF-αmRNA Sham群:1.0±0.09,17.5%:2.03±0.34,25%:3.79±0.61,33%:4.03±0.36;IL-1βmRNA Sham群:1.0±0.09,17.5%:2.81±0.89,25%:3.47±0.75,33%:4.36±0.91)。そして,肺障害マーカーのLDH-3分画および動脈血酸素分圧(PaO_2)は,Sham群では変化を認めなかったが,出血群ではいずれも出血5時間後に肺障害パターンを示し,その程度は出血量に応じて高度であった(5時間後のLDH-3分画Sham群:7.6±1.4,17.5%:13.0±2.1,25%:32.6±8.5,33%:47.4±12.6IU/l;PaO_2 Sham群:99.7±1.6,17.5%:87.8±3.1,25%:87.8±3.5,33%:61.9±4.5mmHg)。これらの結果から,出血性ショック時のサイトカインの発現およびそれによって活性化される好中球の出現の程度と肺障害の重症度との関連が明らかとなり,肺の好中球の出現頻度が出血性ショック時の肺障害の重症度判定・死因診断に応用できる可能性が示唆された。昨年度までに,重症度の異なるラット出血性ショックモデル(出血させないSham群ならびに全血液量の17.5,25および33%をいずれも20分間かけて出血させる計4群)を用いて,出血後の肺におけるTNF-αおよびIL-1βなどの炎症性サイトカインの発現量と肺の機能的障害の重症度とが関連していることを明らかにした。この結果を踏まえ,今年度は出血1,3および5時間後の各時点において肺を採取し,肺の器質的障害の程度を病理組織学的に,炎症性サイトカインによって活性化される好中球の発現頻度を免疫組織学的に観察して,出血性ショックの重症度との関連について検討を行った。出血早期には肺の組織学的障害や好中球の優位な上昇を確認できなかった。

出血5時間後には肺水腫や肺出血などの器質的障害および血管腔や肺実質内での好中球の優位な上昇を認め,さらに好中球の出現頻度は出血量が増加するにつれてより高度となり(Sham群:0.25±0.07個/250μm^2,17.5%群:2.21±0.9個/250μm^2,25%群:3.44±1.01個/250μm^2,33%群:5.07±1.93個/250μm^2),器質的肺障害のマーカーの一つである血清LDH-3濃度と好中球の出現頻度との間に正の相関関係(r=0.96)があった。この結果から,出血性ショックにおける肺の機能的・器質的障害の重症度と好中球の出現頻度との関連性を明確にすることができ,出血性ショック後の肺において好中球の免疫組織学的定量が肺障害の重症度判定・死因診断の有用なマーカーとなりうる可能性が明らかとなった
どのような分子によって大脳皮質神経細胞の移動終了は制御されるのか?

本申請では、大脳皮質神経細胞の移動終了を制御する分子機構を解明するために、神経細胞の移動終了過程に特異的に発現する分子の同定と、マウス生体内で迅速に遺伝子を機能解析する評価系の開発を行った。平成16年度は、1)神経細胞の移動終了過程にある神経細胞が多く含まれる皮質板上層部に高発現する遺伝子426個を同定し、2)Cre/loxP組み換え系を利用したsiRNA置換型ベクターの開発を行った。そこで、平成17年度は、426個の遺伝子の中から、大脳皮質神経細胞の移動終了を制御する分子を同定するために、1)in situ hybridization法によって、発生期を通し、常に皮質板上層部に特異的に発現する42遺伝子を同定した(本結果は、第28回日本神経科学大会、横浜、2005年で報告を行った)。2)これらの遺伝子の中で、神経細胞の移動終了過程にある神経細胞に特異的に発現する遺伝子を同定するため、in utero electroporation法でGFP遺伝子をマウス胎児に導入して移動終了過程にある細胞を標識した後、in situ hybridization法で遺伝子の発現を確認して、神経細胞の移動終了過程にある神経細胞に共局在する6個の新規及び既知遺伝子を同定した。3)抗体を用いた免疫組織化学染色によって3遺伝子について移動終了過程にある細胞での局在を確認した。4)当該遺伝子をsiRNA置換型ベクターに適用するために、生体内で発現を阻害することが可能な配列を、in utero electrophoration法を用いて検討した結果、2遺伝子について効果的な配列を同定した。5)これらの遺伝子に関してsiRNA置換型ベクターのES細胞への導入を行い、キメラマウスを作出しつつある。本研究で、大脳皮質神経細胞の移動終了過程を制御する候補遺伝子の同定と、生体内で機能検証を行うことが可能なsiRNA置換型ベクターの開発を行った。本申請では、神経細胞の移動終了過程を制御する遺伝子の同定を目的として、マウス生体内で迅速に遺伝子を機能評価する解析系の開発を行った。平成16年度は、1)神経細胞の移動終了過程に特異的に発現する遺伝子群の同定と、2)Cre/loxP組み換え系を利用したsiRNA置換型ベクターの開発を行った。1)神経細胞の移動終了過程に特異的に発現する遺伝子群を同定するために、皮質板上層部に高発現する遺伝子をGeneChip法を用いて、426遺伝子同定した。これらの遺伝子のうち、In situ hybridization法で320遺伝子について解析を行い、発生時期を通じて常に皮質板上層部に発現し、神経細胞の移動終了過程に関与すると考えられる31遺伝子を同定した(本結果は、第27回日本分子生物学会年会、神戸で報告した。)2)siRNAベクターをES細胞に組み込むために、siRNA置換型ベクターの構築を行った。siRNA置換型ベクターを高率にゲノムDNAに組み換えるために、変異型loxP配列とピューロマイシン耐性遺伝子から構成されるsiRNA置換型ベクターを作成して、ES細胞に短期間に高率に組み込むことに成功した。次に、siRNAによる発現阻害効果によって、ES細胞の多分化能の喪失や大脳皮質形成以前の発生阻害を防ぐために、テトラサイクリン誘導型H1プロモーターを使用して、siRNAの発現をドキシサイクリンで任意に調整出来るように構築した。また、キメラマウス個体内でsiRNAベクター置換型ES細胞を、宿主側の細胞集団と区別するために、siRNA置換型ベクターは、緑色蛍光蛋白質EGFPの遺伝子を組み込み、siRNAによる遺伝子の発現阻害が起こっている細胞を容易に同定できる工夫をした。次に、本ベクターをマウス胎児の大脳皮質へin uteroelectroporation法によって導入して、大脳皮質神経細胞内でベクターが機能することを確認した。現在、本系を個体レベルで機能評価するために、神経細胞の移動終了過程に特異的に発現するUnc5に対するsiRNA置換型ベクターを作成して、キメラマウスの作成しつつある。平成17年度は、Unc5に対するsiRNA置換型ベクターの有効性をキメラマウスで確認した後、神経細胞の移動終了過程に発現する31遺伝子について、ES細胞にsiRNA置換型ベクターを組み換え、キメラマウスを作成して、神経細胞の移動終了過程を制御する遺伝子群を同定する予定である。

4)当該遺伝子をsiRNA置換型ベクターに適用するために、生体内で発現を阻害することが可能な配列を、in utero electrophoration法を用いて検討した結果、2遺伝子について効果的な配列を同定した。5)これらの遺伝子に関してsiRNA置換型ベクターのES細胞への導入を行い、キメラマウスを作出しつつある。本研究で、大脳皮質神経細胞の移動終了過程を制御する候補遺伝子の同定と、生体内で機能検証を行うことが可能なsiRNA置換型ベクターの開発を行った。
上皮細胞が産生するIgG能動輸送タンパク質FcRnの機能解析と歯周治療への応用

本研究課題では、歯肉上皮細胞においてFcRnがIgG輸送に関与しているのか検討した。免疫組織学的染色によりヒト歯肉組織において、炎症部位では健常部位より強くFcRnの産生が認められた。In vitroの実験で、IgGが時間依存的に、またpHの濃度勾配に従って輸送された。さらに、FcRn欠失マウスではこの能動輸送が認められなかった。以上からFcRnが歯肉上皮細胞に発現しており、IgGまたはIgG融合タンパク質の能動輸送に関与していることが明らかとなった。本研究では、歯肉上皮細胞機能制御による歯周病治療法および予防法の開発を目指している。neonatal FC receptor(FcRn)は抗体(IgG)やFc receptor領域を有するタンパク質を能動輸送する。この歯肉上皮細胞が発現するFcRnによって、抗炎症作用や骨吸収抑制作用を有する抗体やタンパク質を口腔内から歯周組織内への輸送させるドラッグデリバリーシステムを構築し、歯周病治療の開発を目指す。本年度は、以下の知見を得た。1.FcRnは、IgGまたはIgGのFc領域を有するタンパク質を能動的に輸送することが明らかとされており、ヒト由来正常歯肉上皮細胞をTranswell^<[○!R]>upper wellで培養し、タンパク質がFcRnを介してlower wellに経時的に輸送されることELISAで確認した。供試タンパク質は、破骨細胞活性化因子RANKLの阻害因子である、OPG-Fcを用いた。2.in vitroの結果から、実際に口腔内でFcRnによってIgGまたはIgGのFc領域を有するタンパク質が歯肉溝から歯周組織に輸送されるのかRatの歯周炎モデルを用いて検討したところ、OPG-Fcが炎症組織で有為に歯周組織に局在していることが確認された。次年度ではさらに効果的な投与方法について検討する。Neonatal FC receptor(FcRn)は抗体(IgG)やFc receptor領域を有するタンパク質を能動輸送する。本年度は、昨年度なでの結果をもとに発展させ、以下の知見を得た。1,FcRnは、IgGまたはIgGのFc領域を有するタンパク質を能動的に輸送することが明らかとされており、ヒト由来正常歯肉上皮細胞をTranswell[○!R]upper wellで培養し、タンパク質がFcRnを介してlower wellに経時的に輸送されることELISAで確認した。2.マウス由来上皮細胞の3次元的な培養法を確立し、IgG融合タンパク質OPG-Fcの能動輸送を蛍光顕微鏡で3次元的に確認した。この能動輸送はノックアウトマウスでは認められなかった。投与方法としては通常のリン酸緩衝液では口腔内に短時間しか停滞しないため、現在検討中である、カルボキシルメチルセルロース、ゼラチン中に薬剤を溶解させ、マウス口腔内に投与予定である本研究では、歯肉上皮細胞機能制御による歯周病治療法および予防法の開発を目指している。この歯肉上皮細胞が発現するFcRnによって、抗炎症作用や骨吸収抑制作用を有する抗体やタンパク質を口腔内から歯周組織内への輸送させるドラッグデリバリーシステムを構築し、歯周病治療の開発を目指すこととし、以下の知見を得た。1. FcRnは、IgGまたはIgGのFc領域を有するタンパク質を能動的に輸送することが明らかとされており、ヒト由来正常歯肉上皮細胞をTranswell upper wellで培養し、タンパク質がFcRnを介してlower wellに経時的に輸送されることELISAで確認した。3.IgG融合タンパク質の輸送方法は、口腔内からの局所投与とし、1%カルボキシメチルセルロースに懸濁したものは、PBSに懸濁したものよりも輸送効率が高かった。4.マウスを用いた動物実験では、FcRnノックアウトマウスではIgG融合タンパク質の輸送が認められなかった。また野生型マウスにおいても、IgG融合タンパク質は、IgG領域をもたないタンパク質より、優位に多く輸送されることが明らかとなった。結果に示したように、in vitroの実験で成果が出ており、次年度は動物実験を行う予定であるため。24年度が最終年度であるため、記入しない。

今年度までの結果をもとにノックアウトマウスの使用も視野に入れて、動物実験を行っていく予定である。口腔内に薬剤を長く留めておくための工夫を検討する必要がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。
タンデムミラー端部及び高出力中性粒子ビームを用いたダイバータ・ＥＬＭ模擬研究

本研究では、核融合炉プラズマからの高熱流粒子束を処理するダイバータの運転に必要な知見を得るために、大型タンデムミラー装置ガンマ10の高熱流束を利用したダイバータ模擬実験を行った。ガンマ10端部に熱流と粒子束計測器を設置し、1平米当たり10MW以上の高熱流の発生と、その高周波電力による高い制御性を確認した。また、端部に設置したダイバータ模擬実験モジュールを用いて、端部から流出してくる高熱流プラズマのエネルギーを低減し、非接触プラズマの形成に成功した。また、周辺プラズマから間欠的に流出するELMと呼ばれるパルス熱流束を模擬するイオンビーム入射装置を開発し、開放磁場中の収束性等基本的特性を得た。平成24年度では、ガンマ10タンデムミラー装置西端部ミラーコイルの中心から中心軸外側に向かって30cmの位置(ZEXIT=30)にあるカロリーメータと方向性プローブの複合計測器を用いて、イオンサイクロトロン周波数帯高周波(ICRF)波動生成プラズマにおいて端部ミラー出口から流出してくる端損失プラズマの熱流束密度と粒子束密度を計測した。また、同時にコイルから300cm離れた位置にあるイオンエネルギー分析器によるイオンエネルギーの直接測定も行った。これらの測定の結果からプローブとカロリーメータによって求められた端損失イオンの温度は、直接測定結果と良い一致を示し、磁力線に沿った実効的なイオン温度が100eVから400eVの範囲で高周波波動の電力によって容易に制御可能であることを見出した。また、セントラル部の密度と端損失粒子束密度の関係も調べられ、プラズマ線密度と粒子束密度がよい直線的な関係になることが判明した。この結果から、端損失粒子束密度もガスパフによるプラズマ密度の調節により制御可能であることが分かった。一方、ガンマ10の極小磁場アンカー部に、新たな高周波波動に寄る追加熱実験を行い、端損失イオン流の大幅な増強に成功した。このことから隣接するミラーセルに於けるプラズマ追加熱の有効性が確認された。更に、電子サイクロトロン加熱(ECH)をICRF生成プラズマに重畳することにより、熱流束密度が画期的に増加することが分かった。今回、380kW 5msの短パルスECHの重畳により、ITERダイバータ板の熱負荷に匹敵する10MW/m^2を超える熱流束の発生に成功した。これらの結果は、ガンマ10の端損失プラズマ流を用いたダイバータ模擬研究を進める上での、その基本的性能を明らかにし、今後の本格的なダイバータ模擬実験に向けての重要な指針を与えるものと言える。平成25年度では、ガンマ10タンデムミラー装置西側端部において流出する端損失プラズマ流の高性能化(高粒子束密度の達成)を目指して、ガンマ10極小磁場アンカー部におけるイオンサイクロトロン周波数帯(ICRF)波動によるプラズマ追加熱の効果を検証した。同部において新たな波動励起用のアンテナが増設され、セントラル部においてICRFにより生成・加熱されたプラズマの追加熱を試みられた。その結果、東アンカー部加熱時において同部のプラズマ線密度が3倍に増加し、それに伴いセントラル部密度も1.5倍に増加することが判った。これによって西側において端損失イオン流が約2倍に増加していることが判明し、アンカー部による高周波波動の追加熱が端部での粒子束密度の増加に極めて効果的であることを立証した。また,セントラル部プラズマ密度と端損失粒子束密度との関係も調べられた。端部においてで計測されたイオン流束とミラー端部出口でプローブを用いて測定した粒子束密度の相関関係を調べることによって、両者はすでにセントラル部の密度に対し、線形的に増加することが判り、そのスケーリングから1.4×10の23乗個/平方メートルの粒子束密度が端部ミラー出口で生成されていることが判った。このことから,隣接するミラーセルにおけるプラズマ追加熱の有効性が示され,ICRFを用いた更なる高粒子束密度発生への明るい見通しを示すことが出来た。昨年度より開始したDモジュールを用いた本格的ダイバータ模擬実験では,水素及びアルゴンガスの導入により、大幅な密度の上昇と放射冷却によると思われる電子温度の減少を実現し、非接触プラズマ実現に向けて大きく前進した。特に最近のキセノンガスを用いた実験では、粒子束の10分の1以下の低下も観測しており、非接触プラズマ形成を示す結果も得られており、大きな進歩が得られた。平成26年度では、イオンサイクロトロン周波数帯(ICRF)の高周波によるプラズマ追加熱実験により端損失粒子束の大幅な増加に成功した。この実験では、GAMMA 10セントラル部の両端に設置されている極小磁場アンカー部への高周波追加熱とガス導入によって、10e14 cm-2の線密度のプラズマを生成し、それによって端部のイオン流束は、2倍以上に増加し10e23個/m2 sec台の粒子束密度を達成した。また、ガンマ10タンデムミラー装置の西側端部に製作・設置したダイバータ模擬実験モジュール(Dモジュール)を用いた非接触プラズマ形成に向けた実験を精力的に進め、既に得られている水素及び希ガスの導入によるモジュール内のプラズマ密度上昇と放射冷却に伴う電子温度の低下の詳細な特性を調べた。この実験では、約150 eVの高イオン温度の端損失プラズマ流をモジュール内に導入し、水素ガスとキセノンガスを同時入射することによって、プラズマの非接触化の実験を行った。モジュール内に設置しているV字形のタングステン製ターゲットのコーナー部において計測したイオン束がガス導入により3%以下に低下していることが判り、非接触プラズマの形成を示唆する重要な兆候を得た。

一方、静電プローブを用いた電子温度計測から当初20 eVであった電子温度が2-3 eVまで低下しており、不純物ガス入射による放射冷却効果が生じていることが明らかになった。更に高速カメラを用いたHα線発光の2次元イメージ計測からも、V字コーナー部での極端な減光からもプラズマの非接触化が認められた。高エネルギー粒子ビームを用いたELM模擬研究では、平成26年度から製作を開始したイオンビームラインが完成し、イオン源の運転が開始された。約2ヶ月のコンディショニングによって、10 kV,3 Aのビーム引き出しに成功し、タングステン材からなる標的への試験照射実験を行った。今年度は、アンカー部にICRF波動(RF3)による、端損失イオン流の更なる大幅な増強を図った。その結果、東西アンカー部加熱時に両アンカー部の線密度が3倍近く増加し、それに伴ってセントラル部プラズマ線密度も1×10e14 cm-2台に上昇し、更に東側のプラグバリアECHを重畳することにより,西エンド部ミラー出口部において3.3×10e23 /m2・sの粒子束が達成された。また,ICRF加熱されたプラズマに対して5msの短パルスECH入射によるELM模擬の実験を行った際に、同部において得られた熱流束は15 MW/m2に到達し、ECHパワーの増加に伴い順調に増加していることを確認した。Dモジュールに水素や希ガスを導入して,放射冷却を増加させることにより,高温のRF生成プラズマからの非接触プラズマ化を実現し、その特性評価の実験を行った。その結果、Xeガスが熱流束及びイオン束の低減に最も効果的であり,Neはイオン束及び熱流束の両方に効果が弱いことが判った。一方、N2は低いガス圧の領域において、Arよりもイオン束の低減に効果が高いことがわかった。Xeは電子冷却でも希ガスの中では最も強い効果を示し、N2は,ArとNeの中間に位置することが判った。ELM模擬研究のためのミラー端部へのイオンビーム入射実験では、昨年度製作を完了したイオンビーム装置のコンディショニングを行い、12kV-5Aのビーム引き出しに成功し、ミラー端部出口に置かれた試料標的にビーム入射時の発光を観測した。開放端磁場によるビームの収束効果について初めてその観測に成功し、タングステンターゲットへの初期入射実験を遂行した。本研究では、核融合炉プラズマからの高熱流粒子束を処理するダイバータの運転に必要な知見を得るために、大型タンデムミラー装置ガンマ10の高熱流束を利用したダイバータ模擬実験を行った。ガンマ10端部に熱流と粒子束計測器を設置し、1平米当たり10MW以上の高熱流の発生と、その高周波電力による高い制御性を確認した。また、端部に設置したダイバータ模擬実験モジュールを用いて、端部から流出してくる高熱流プラズマのエネルギーを低減し、非接触プラズマの形成に成功した。また、周辺プラズマから間欠的に流出するELMと呼ばれるパルス熱流束を模擬するイオンビーム入射装置を開発し、開放磁場中の収束性等基本的特性を得た。
慢性関節リウマチにおける滑膜炎と関節破壊へのグリオスタチンの関与と病態解明

グリオスタチンは、神経栄養因子活性や血管新生活性をもつことが知られている.申請者は、関節リウマチ(RA)の滑液の細胞生物学性質を調べる過程で,RA滑液中にこのグリオスタチンが大量に存在することを見いだし(Clin.Chim.Acta 218,1-4,1993),さらにグリオスタチンのRA病態マーカーとしての有用性を確認した(Br.J.Rheumatol 36,315-321,1997).グリオスタチン組換体を雌日本白色ウサギの膝関節腔内に注入したところ,滑膜炎の発症を認め,その病理組織増はRAに類似していた(RheumatolInt 2000;20:13-19).さらにグリオスタチンの生体内での作用を調べる目的で,滑膜培養細胞をグリオスタチンにて刺激し,関節破壊に影響を及ぼすmatrix metalloproteinases (MMPs)の発現が認められるか否かを検討した(Rheumatol 38:1195-1202,1999).平成13年度にはヒト高分化型軟骨肉腫細胞系(OUMS-27)を用いて,IL-1β刺激によるグリオスタチン産生およびMMP-1,MMP-3の産生を検討し,RAにおける軟骨破壊の分子機構の解明を試みた(Rheumatol Int2001;21:45-52).また臨床応用ではRA患者の滑膜切除術前後の血清グリオスタチン濃度を測定し,その濃度が滑膜切除術の有用性の判定材料になりうることを示した(Clin Rheumatol 2001;20:331-336).平成14年度には滑膜培養細胞をIL-1β刺激しグリオスタチン発現を指標にして,抗リウマチ薬の作用機序の1つを明らかにした.さらにOUMS-27を用いてGLSのシグナル伝達系にはp38 MAPK pathwayが重要であることを示した.グリオスタチンは、神経栄養因子活性や血管新生活性をもつことが知られている.申請者は、関節リウマチ(RA)の滑液の細胞生物学性質を調べる過程で,RA滑液中にこのグリオスタチンが大量に存在することを見いだし(Clin.Chim.Acta 218,1-4,1993),さらにグリオスタチンのRA病態マーカーとしての有用性を確認した(Br.J.Rheumatol 36,315-321,1997).グリオスタチン組換体を雌日本白色ウサギの膝関節腔内に注入したところ,滑膜炎の発症を認め,その病理組織増はRAに類似していた(RheumatolInt 2000;20:13-19).さらにグリオスタチンの生体内での作用を調べる目的で,滑膜培養細胞をグリオスタチンにて刺激し,関節破壊に影響を及ぼすmatrix metalloproteinases (MMPs)の発現が認められるか否かを検討した(Rheumatol 38:1195-1202,1999).平成13年度にはヒト高分化型軟骨肉腫細胞系(OUMS-27)を用いて,IL-1β刺激によるグリオスタチン産生およびMMP-1,MMP-3の産生を検討し,RAにおける軟骨破壊の分子機構の解明を試みた(Rheumatol Int2001;21:45-52).また臨床応用ではRA患者の滑膜切除術前後の血清グリオスタチン濃度を測定し,その濃度が滑膜切除術の有用性の判定材料になりうることを示した(Clin Rheumatol 2001;20:331-336).平成14年度には滑膜培養細胞をIL-1β刺激しグリオスタチン発現を指標にして,抗リウマチ薬の作用機序の1つを明らかにした.さらにOUMS-27を用いてGLSのシグナル伝達系にはp38 MAPK pathwayが重要であることを示した.ダリオスタチンは、神経栄養因子活性や血管新生活性をもつことが知られている.申請者は,慢性関節リウマチ(RA)の滑液の細胞生物学性質を調べる過程で,RA滑液中にこのダリオスタチンが大量に存在することを見いだし(Clin. Chim. Acta 218,1-4,1993),さらにダリオスタチンのRA病態マーカーとしての有用性を確認した(Br. J. Rheumatol 36,315-321,1997).ダリオスタチン組換体を雌日本白色ウサギの膝関節腔内に注入したところ,滑膜炎の発症を認め,その病理組織増はRAに類似していた(RheumatolInt 2000;20:13-19).さらにダリオスタチンの生体内での作用を調べる目的で,滑膜培養細胞をダリオスタチンにて刺激し,関節破壊に影響を及ぼすmatrix metalloproteinases(MMPs)の発現が認められるか否かを検討した.RT-PCR法,Northen blot法,ELISA法により,グリオスタチン刺激にてMMP-1,MMP-3の産生がdose-dependentに亢進することを証明した(Rheumatol 38:1195-1202,1999).平成13年度にはヒト高分化型軟骨肉腫細胞系を用いて,IL-1β刺激によるグリオスタチン産生およびMMP-1,MMP-3の産生を検討し,慢性関節リウマチにおける軟骨破壊の分子機構の解明を試みた(Rheumatol Int 2001;21:45-52).

また臨床応用では慢性関節リウマチ患者の滑膜切除前後の血清グリオスタチン濃度を測定し,その濃度が滑膜切除の有用性の判定材料になりうることを示した(Clin Rheumatol 2001;20:331-336).グリオスタチンは、神経栄養因子活性や血管新生活性をもつことが知られている.申請者は,関節リウマチ(RA)の滑液の細胞生物学性質を調べる過程で,RA滑液中にこのグリオスタチンが大量に存在することを見いだし(Clin. Chim. Acta 218,1-4,1993),さらにグリオスタチンのRA病態マーカーとしての有用性を確認した(Br. J. Rheumatol 36,315-321,1997).グリオスタチン組換体を雌日本白色ウサギの膝関節腔内に注入したところ,滑膜炎の発症を認め,その病理組織増はRAに類似していた(RheumatolInt 2000;20:13-19).さらにグリオスタチンの生体内での作用を調べる目的で,滑膜培養細胞をグリオスタチンにて刺激し,関節破壊に影響を及ぼすmatrix metalloproteinases(MMPs)の発現が認められるか否かを検討した(Rheumatol 38:1195-1202,1999).平成13年度にはヒト高分化型軟骨肉腫細胞系(OUMS-27)を用いて,IL-1β刺激によるグリオスタチン産生およびMMP-1,MMP-3の産生を検討し,RAにおける軟骨破壊の分子機構の解明を試みた(Rheumatol Int 2001;21:45-52).また臨床応用ではRA患者の滑膜切除術前後の血清グリオスタチン濃度を測定し,その濃度が滑膜切除術の有用性の判定材料になりうることを示した(Clin Rheumato1 2001;20:331-336).平成14年度には滑膜培養細胞をIL-1β刺激しグリオスタチン発現を指標にして,抗リウマチ薬の作用機序の1つを明らかにした.さらにOUMS-27を用いてGLSのシグナル伝達系にはp38 MAPK pathwayが重要であることを示した.
非自己ゲノムを分解し、自己ゲノムを修復する組換え酵素の「一分子」遺伝学

近年のDNA複製、修復、相同組換え、突然変異の分子生物学的解析結果は、「ゲノムがDNA二重鎖切断による死と修復による再生をたえず繰り返している」という、ダイナミックなゲノム維持の像に収斂しつつある。ゲノムの異常により複製フォークが停止し、ゲノムの死か再生かの決断が行われる。ガン化などの逸脱へ至るおそれのあるゲノムは、DNAの二重鎖切断により自殺し、無傷な同胞ゲノムが生き残る。大腸菌では、DNA二重鎖切断からRecBCD酵素がDNAを分解して数十キロも進んでいくが、カイ配列という自己ゲノムの標識(ID)配列に出会うと、分解を停止し、相同組み換えによる複製フォークの再構成を進める。本研究では、この細菌の染色体の自己・非自己を見分けるRecBCD酵素の反応機構の詳細を、とくに「ゲノムのID配列に出会ったとき何が起きるか」に焦点を絞って解析した。また自己・非自己DNAの認識に重要な細菌の制限修飾系について、そのゲノム寄生遺伝子としての振る舞いを検証した。RecBCD酵素はゲノムのIDを認識するとそこに一時的に「停滞」することを昨年度明らかにしたが、この制御配列上での酵素の停滞が、細菌の種を越えてこの酵素に特有の現象であることを、大腸菌とは遠縁の枯草菌のRecBCD酵素のアナログであるAddAB酵素を用いて証明した(J.Biol.Chem.2006)。また、このゲノムのID配列を認識できない変異RecBCD酵素において、それが認識する新規ID配列での相同組換えを促進するRecA変異を発見し、生化学実験と遺伝学実験によってこれを解析した(J.Mol.Biol.2007)。さらに、DNAを特異的な配列で切断する制限酵素とペアで存在する修飾酵素について、超高熱耐性菌から新たに同定され単離された酵素の生化学的解析を進め、その特徴を詳細に解析した(Appl.Environ.Micro-biol.)。微生物(大腸菌)ゲノムの安定化と相同組換え初期反応に重要な蛋白質の1分子視覚化実験を行った。この蛋白質はRecBCD酵素と呼ばれ、3つのサブユニット(RecB、RecC、RecD)から成る。そのうちの1つ(RecD)に微小蛍光ビーズを付加し、その蛍光を追うことで酵素と顕微鏡下のフローセル中に光ピンセットで固定したDNAとの相互作用を観察した。RecBCD酵素はDNA巻き戻す活性とDNA分解活性をもつが、その活性は組換えの調節配列であるカイ配列(5'GCTGGTGG)で変化し、その変化がRecDサブユニットの喪失によるものという仮説が長い間信じられていた。しかしながら本研究によって、カイ配列以降もRecDサブユニットは解離しないことが明らかになった。また、この酵素がこの調節配列上で一時停滞し、その後その速度を減じることを明らかにした。最近、このRecBCD酵素の立体構造が解かれた。その構造を頼りに、この酵素のどのアミノ酸残基が実際にカイ配列を見ているのかを推定し、そのアミノ酸に変異を導入した変異酵素がカイ配列を見られなくなることを確認している。細菌の染色体DNAを切断する制限酵素は、その切断によってDNAの喪失、あるいはそれを修復する過程で欠失や逆位、重複を引き起こし、微生物のゲノムを不安定にする。III型に分類される制限酵素の働きを、細菌に感染するファージがコードする相同組換えによって抑制する現象を発見した。この現象は、組換え修復によって切断されたファージゲノムが再生するためであると考えられるが、細菌1細胞に1匹以下のファージが感染する条件(組み換えるべき相手がいない)で見出された。このことは、制限酵素の切断とDNAの複製がカップルしていることを強く示唆し、この制限酵素の生化学に新しい視点をもたらすものと期待される。

さらに、DNAを特異的な配列で切断する制限酵素とペアで存在する修飾酵素について、超高熱耐性菌から新たに同定され単離された酵素の生化学的解析を進め、その特徴を詳細に解析した(Appl.Environ.Micro-biol.)。
光造形と生体内組織形成術による自己成長可能な大血管再建用バイオチューブの開発

画期的な再生医療技術「生体内組織形成術」(体内造形)を基盤として、それによって作成された自己生体材料(膜)の臨床応用を目指す。今回は大動脈使用を目的としより高い耐圧性と耐久性を獲得するための鋳型の最適設計を行い、移植実験によって自己組織化し生着する再生能力、耐久性、成長性を調べ、待望の成長性の可能性を有する「再生型自己代用大動脈(バイオチューブ)」の安全な臨牀応用へと繋げる。さらには普及の可能性がより高い生体内組織形成術によって作成した代用大動脈(バイオチューブ)の異種間での移植を行いその実臨牀への応用に必要な脱細胞などの条件を確立する。
液晶性と磁性を合わせもつ導電性共役系高分子の開発

本研究は、共役ポリエンを主鎖とする高分子の側鎖に、液晶基と安定ラジカル基を導入することにより、液晶性と磁性を合わせもつポリアセチレン誘導体を合成し、その液晶性と磁気的性質を検討することで、自律配向能を有する強磁性有機高分子を開発することを目的とした。そこでポリアセチレンを主鎖として、その側鎖にラジカル基と液晶基を導入した二置換型ホモポリマーを合成した。安定ラジカル基としては、2,6-ジタ-シャリ-ブチルフェノキシラジカル基を用いた。このラジカルは、嵩高い置換基によりラジカル電子が保護されており、通常のラジカル化合物より安定であることが知られている。液晶基としては、フェニルシクロヘキシル系の液晶基を用いた。具体的には、シクロヘキシルフェノキシ部位をメソゲンコアーとする液晶基をもつ一置換アセチレンを合成した。これと、水酸基をトリメチルシリル基で保護したジタ-シャリ-ブチルフェノール誘導体とをグリニヤールカップリングにより反応させ、二置換アセチレン誘導体モノマーを得た。次に、これを五塩化タンタル触媒を用いて重合し、ポリ(二置換アセチレン)誘導体を合成した。さらに、側鎖のひとつであるフェノール部位の水酸基を脱保護した後、酸化剤を用いてフェノキシラジカルを得た。示差走査熱量計および偏光顕微鏡を用いて、ポリマーの液晶性を確認した。液晶温度領域において電子スピン共鳴の測定を行い、液晶側鎖の自発配向に基づくスピン強度の異方性を確認した。次に、ラジカル基と液晶基のどちらかを側鎖にもつ一置換型コポリマーを合成した。ラジカル基の割合が10%以下では160150°Cの温度範囲でスメクティック相に特有なバトネット構造が見られた。さらに液晶温度範囲においてESRのシグナル強度が増加した。これは、液晶ドメイン内での配向に伴ってラジカルスピンが配向したことによるものと結論づけられた。近年、我々は共役系ポリエンの巨視的配向を制御するため、側鎖に液晶基を持つ新規なポリ(一置換アセチレン)を合成し、剪断応力や磁場などの外部摂動により、液晶側鎖を配向させることでポリエン主鎖を一軸配向させることに成功した。この液晶性ポリ(一置換アセチレン)のもう一方の側鎖に、ラジカル基からなる常磁性置換基を導入することができれば、液晶配向に伴い常磁性置換基をも配向させることができ、巨視的レベルでのスピンの平行配列が実現できると期待される。本研究は、共役ポリエンを主鎖とする高分子の側鎖に、液晶基と安定ラジカル基を置換基として導入することで、液晶性と磁性を合わせもつ二置換ポリアセチレン誘導体を合成し、従来にない自律配向能を有する高分子磁性体を開発することを意図した。(1)フェニルシクロヘキシル部位をメソゲンコアーとする液晶基と、フェノキシラジカル前駆体とをそれぞれ置換基とする二置換アセチレン誘導体モノマーを合成した。(2)メタセシス系触媒であるTaCl_5-(n-Bu)_4Snを用いてアセチレン誘導体モノマーを重合し、ポリ(二置換アセチレン)を合成した。ポリマーはオレンジ色の粉末状で、THFなどの有機溶媒に可溶であった。しかしながら、非常にかさ高い二種類の置換基のため、重合収率は18%と低く重合度も約8程度であった。

(3)偏光顕微鏡観察と示差走査熱量計の測定により、ポリマーの液晶性を検討した。その結果、昇温過程では、扇状模様のスメクティック相、降温過程では扇状模様のスメクティックA(S_A)相および筋付扇状模様のカイラルスメクティックC(S_C^*)相を示すことを見いだした。不斉炭素をもたないポリマーがS_C^*相を発現したことは、この二置換ポリマーが降温過程の特定の温度領域においてヘリカル構造を形成していることを示唆するものであり、共役系高分子の高次構造の観点から極めて興味ある結果を得た。今後、このポリマーの一方の側鎖であるラジカル前駆体を脱保護した後、酸化剤を用いて酸化し、ジタ-シャリーブチルフェノキシラジカルを得るとともに、ポリマーの液晶性の変化やスピン濃度および磁気的性質を検討する。共役ポリエンの側鎖に液晶基と常磁性基をそれぞれ導入することができれば、液晶配向に伴って常磁性スピンをも配向させることができ、巨視的にスピンの平行配列を実現できると考えられる。本研究では、従来にない自律配向能を有する磁性高分子を開発すべく、液晶性ポリアセチレン誘導体のもう一方の側鎖に安定ラジカル基を導入することで二置換ポリアセチレン誘導体を合成した。まず、フェニルシクロヘキシル系液晶基と、フェノキシラジカル前駆体(トリメチルシリル基で保護したジタ-シャリーブチフェノール誘導体)とを置換基とする二置換アセチレンモノマーを合成し、これをメタセシス系触媒のTaCl_5-(n-Bu)_4Snを用いて重合することで、有機溶媒に可溶なポリマーを得た。さらに、保護基の脱保護および酸化の後、目的とするポリマーを得た。このポリマーは、昇温過程ではS_A相、降温過程ではS_A相および筋付扇状模様を呈するS^*_X相を示した。ESRの測定から、昇温過程の液晶相においてスピン強度の増大が観察された。今後、ラジカル基の熱安定性やスピン濃度および磁化率の温度変化を検討する必要がある。本研究は、共役ポリエンを主鎖とする高分子の側鎖に、液晶基と安定ラジカル基を導入することにより、液晶性と磁性を合わせもつポリアセチレン誘導体を合成し、その液晶性と磁気的性質を検討することで、自律配向能を有する強磁性有機高分子を開発することを目的とした。先ず、シクロヘキシルフェノキシ部位をメソゲンコアーとする液晶基をもつ一置換アセチレンを合成した。これと、水酸基をトリメチルシリル基で保護したジタ-シャリーブチルフェノール誘導体とをグリニヤールカップリングにより反応させ、二置換アセチレン誘導体モノマーを得た。次にこれを五塩化タンタル触媒を用いて重合し、ポリ(二置換アセチレン)誘導体を合成した。さらに、側鎖のひとつであるフェノール部位の水酸基を脱保護した後、酸化剤(PbO_2)を用いてフェノキシラジカルを得た。示差走査熱量計および偏光顕微鏡を用いて、ポリマーの液晶性を確認した。液晶温度領域において電子スピン共鳴の測定を行い、液晶側鎖の自発配向に基づくスピン強度の異方性を確認した。しかしながら、液晶温度の高温領域である150°C以上ではラジカルは消失したため、ラジカルスピンの巨視的配向を行うには、液晶の低温領域で配向を行う必要がある。また、今後、ポリマーの収率とスピン濃度を上げるためには、水酸基をアセトキシ基で保護したアセチレン誘導体モノマーの重合や、各ユニットに液晶基と安定ラジカル基をそれぞれ持つ共重合体を合成する必要がある。
"緑の香り"発現酵素-基質複合体(超分子)の精密構造とその形成機構の解明

これまでに、ダイズ種子LOXを100mgオーダーで調製する系を既に確立した^<3)>。また、キュウリ子葉LOX^<4)>、及びキュウリ根LOXに関しては、そのcDNA単離し、大腸菌での発現系を確立した。このうちキュウリ子葉LOXは、リパーゼでよく知られているスク-ティングモードに従うキネティクスで油水界面上でのみその反応を触媒するユニークなLOXであることを明らかにした。現在、このものについては種々の変異体を調製し、油水界面認識機構の解明を目指している。一方、ピ-マン果実からHPOlyaseを大量に精製できる系を確立した^<5)>。本酵素のスペクトル分析から、本酵素がprotohemelXを補酵素とするヘム酵素であることを初めて明らかにした^<6)>。このヘムの一酸化炭素とのアフィニティーは極めて低いが、近年、植物組織で報告が増加しているCO-lowaffinity P450ファミリーに属するものと考えられる。現在、このもののcDNAクローニングを行っており、その部分的な配列解析から本酵素が分子状酵素もNADPH-cytochrome P450 reductaseも必要としない植物cytochrome P-450、アレンオキシドシンターゼ(AOS)と高い相同性を示すことが明らかとなった。AOSはHPOlyaseと同様、過酸化脂肪酸に作用し、アレンオキシドを生成する酵素である。HPOlyaseも同様にその反応には分子状酸素もNADPH-cytochrome P450 reductaseも必要とせず、これらは新規のP450ファミリーを形成していることが考えられた。このものについては現在、酵母での大量発現系の確立を目指している。