hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜結合型増殖因子EGFファミリーのカルボキシ末端断片シグナリングの解析

また、ヒト胎盤由来耐熱性アルカリフォスファターゼを細胞外領域に融合したAP-HB-EGF等4種を同様に検討した結果、同等の結果を得た。以上のことから、TGF-αのsheddingはメタロプロテアーゼとγ-セクレターゼ依存的であり,他の種はγ-セクレターゼ非依存的であることが示唆された。更に、sheddingによって産生されるCTFをそれぞれの特異抗体で免疫沈降し,Western blotによって解析した結果、HB-EGF, ampbiregulin, epiregulinの各CTFは膜貫通領域を保持した大きさであることが示唆された。一方、TGF-α-CTFは数本のバンドとして検出されたことから、γ-セクレターゼによって膜貫通領域で切断を受けていることが示唆された。以上の結果から、EGFファミリーメンバーのCTF産生機構は少なくといも2種以上の分子機構が関与しているものと考えられる。各CTFの機能については現在解析を進めている。細胞増殖因子シグナルの下流に位置し、細胞分裂促進に必須の転写因子c-mycの遺伝子発現がPLZFにより抑制されることが報告されている。HB-EGF-CTFがPLZFの機能を解除することから、HB-EGF-CTFシグナルが増殖因子によるc-Myc遺伝子発現誘導シグナルの中間に位置するのではないかと考え、Kb-egf-/-繊維芽細胞を用いてbFGF, EGF, PDGFによるc-Myc遺伝子発現誘導を解析した。まず、野生型繊維芽細胞(Hb-egf+/+)でbFGF, EGF, PDGF刺激により内在性のHB-EGFのsheddingが誘導され、HB-EGF-CTFは核移行することを確認した。また、上記各増殖因子受容体からのシグナルはMAP-kinase ERK1/2の活性化で見る限り、Hb-egf+/+およびHb-egf-/-繊維芽細胞で変化は無かった。次に、Hb-egf+/+および-/-繊維芽細胞を上記各増殖因子により刺激し、c-Myc遺伝子発現をRNA protection assayと定量PCRにより解析した。その結果細胞増殖因子シグナルにより誘導されるc-Myc伝子発現はHb-egf-/-繊維芽細胞では顕著に抑制されることが明らかとなった。また、Hb-egf-/-繊維芽細胞では、Hb-egf+/+繊維芽細胞に比べて、EGFとbFGF増殖因子による細胞周期S期への進行が有意に抑制されることが明らかとなった。一方PDGFによる繊維芽細胞の増殖促進には有意さを持った細胞周期S期進行の遅延は認められなかった。さらに、Hb-egf-/-繊維芽細胞にHb-egf遺伝子を導入し発現を回復させることで上記各増殖因子によるc-Myc遺伝子発現ならびに細胞周期S期進行への遅延が回復することを示した。これらの結果からHB-EGF-CTFシグナルが少なくともEGFならびにbFGFによるc-Myc遺伝子発現誘導においてPLZF等の転写抑制因子の解除に重要な機能をはたしていることを明らかにした。
LC/MS/MSを用いた次世代メタボロミクス研究のための基盤技術開発

近年,遺伝子・タンパク質から生成される代謝産物(メタボローム)が生体の恒常性維持に深く関わっていることを強く示唆する報告が相次いでおり,質量分析を用いたノンターゲットメタボローム解析の重要性が高まってきた.しかしながら,質量分析より得られる複雑なビッグデータを解析するための手法,および得られる質量スペクトル情報を紐解き化合物構造を推定する手法が開発されてこなかったため,得られる代謝物情報が極端に少ない(数十種類)という問題があった.本研究により開発されたデータ解析ソフトウェアにより円滑な解析を可能にしただけでなく,1000種類を超える化合物種の一斉解析が可能となった.質量分析において,もっとも解析が難しいとされていたdata independent MS/MS acquisition(以下,DIA法)より得られるデータを解析するプログラム,MS-DIALの開発を行った.これにより,LC/MS/MSで取得される代謝物由来イオンすべてに対してMS/MSを対応付けることが可能となり,分析におけるMS/MSスペクトルの網羅性を担保することができるようになった.また,生体を構成する主要なグリセロ脂質に対するin silico保持時間・MS/MSを全77,962分子種に対して構築し,15分の分析時間と開発した同定戦略により合計1,023化合物を藻類から同定することに成功した.さらに,9種類の藻類について,同定した1,023個の化合物それぞれの有無0, 1の値を持った「脂質フィンガープリント」を用いて分類した結果,古典分類学の系統樹と完全に一致する結果を得た.当時,藻類株UTEX2341はクロレラ種に属するかナンノクロロプシス種に属するか議論が分かれていたが,脂質フィンガープリントによる系統樹から明確にクロレラ種に属することが示唆された.共同研究者の協力もあり,計画通りに研究が遂行している.平成29年度では,主に2点の技術開発を行った.1.標準品のマススペクトルが無く,「未同定」として検出される低分子化合物に対して,構造推定を行うためのMS-FINDERソフトウェアを開発した.このプログラムではまず,構造未知のイオンのプリカーサーイオンから組成式の推定を行い,そこから考えられうる構造式候補をオンラインデータベースであるHMDB・KNApSAcKなどに検索を行う.その後,「水素再配置則によるマスフラグメンテーションの解釈法」を用いて,MS/MSスペクトルから最も妥当性が高いと考えられる化合物構造式を割り出す.本手法は現在,およそ60%の確率で正解構造を割り出すことに成功しており,上位5つの候補の中に正解構造が含まれる確率はおよそ85%という精度で構造推定が可能なプラットホームの構築に成功している.これら水素再配置則によるマスフラグメンテーションの解釈ならびにMS-FINDERソフトウェアは,Analytical Chemistry 2016, 16, 7946-7958にその成果を掲載した.2.スフィンゴ脂質(スフィンゴミエリン・セラミド分子種)のin silico MS/MSスペクトルを構築した.これにより,以前までに構築が完了していたグリセロ脂質(中性脂質・リン脂質などの極性脂質)だけでなく,スフィンゴ脂質も同一LC-MS/MSの分析系で同定することができ,より網羅的なノンターゲットリピドミクスが可能となった.HeLa細胞・HEK 293細胞,およびマウスの皮膚・肝臓サンプルを用いたテストサンプルの結果では,ネガティブイオンモードのLC-MS/MS分析系で検出される脂質由来イオンのうち,415種のユニークな脂質構造を同定することに成功した.本研究は,Journal of Cheminformatics, 2017, 9:19にその成果を掲載した.共同研究先である理化学研究所メタボローム研究チーム(有田誠チームリーダー)およびUC Davisオリバー・フィーン研究室との連携がスムーズに進み,質量分析の計測データが円滑に取得できたことが研究の推進に寄与したと考えられる.本年度は主に,2018年に掲載が確定したNature Methods 15, 53-56, 2018の内容について報告する.本内容は,これまで報告の無かった未開拓の代謝物群を「エピメタボライト」と定義し,そのエピメタボライトを同定するための3つの新しい「質量分析ケムインフォマティクス(化学情報学)」技術を開発したものであり,以下にその詳細を記載する.1つ目は,既知および未知代謝物の発現量やマススペクトル情報を納めたメタボロームデータベース(BinBase)から,エピメタボライト候補を抽出するプログラム「BinVestigate」の開発である.本研究では,構造が未解明,かつ特定の検体で有意に発現しているという条件での検索により,乳がん,糞便,微生物,光合成生物,特定の薬を投与した臨床検体のそれぞれにおいて特異的に発現する代謝物を合計五つ,エピメタボライト候補として抽出した.2つ目は,MS-DIALを改良し,どのタイプの装置からでも,高精度のマススペクトルを抽出できる技術を開発した.これにより,エピメタボライト候補の高精度スペクトルを円滑かつ高解像度で抽出でき,化合物同定の精度を飛躍的に向上させることに成功した.3つ目は,MS-FINDERの改良である.今回,メチル化やアセチル化といった修飾を含むエピメタボライト構造を検索可能にし,未知のスペクトルに対して妥当性の高い候補化合物を効果的に絞り込む手法を構築することで,エピメタボライトの構造候補を絞り込みに大きく貢献した.予測された構造は実際に標準品の合成をすることで確認し,本手法の有効性の検証を行った.本研究により,これまで報告がなかった乳がん特異的に検出されるN-methyl UMPや腸内細菌が産生すると考えられるN-methyl alanineなど五つのエピメタボライト発見に成功した.

近年,遺伝子・タンパク質から生成される代謝産物(メタボローム)が生体の恒常性維持に深く関わっていることを強く示唆する報告が相次いでおり,質量分析を用いたノンターゲットメタボローム解析の重要性が高まってきた.しかしながら,質量分析より得られる複雑なビッグデータを解析するための手法,および得られる質量スペクトル情報を紐解き化合物構造を推定する手法が開発されてこなかったため,得られる代謝物情報が極端に少ない(数十種類)という問題があった.本研究により開発されたデータ解析ソフトウェアにより円滑な解析を可能にしただけでなく,1000種類を超える化合物種の一斉解析が可能となった.昨年度までは,質量分析生データより代謝物由来ピークを円滑に抽出してデータベースと照らしあわせ,化合物同定を精度高く行うためのプログラム開発を行った.一方,メタボロミクス最大の難関は,未知代謝物由来ピークの構造推定である.「メタボローム」として定義されている代謝物データベースはおよそ20万種類の低分子化合物を登録している一方,標準品によるマススペクトルの確認が行われているのは5,000弱と非常に少ない.そこで本年度では,未知スペクトルから組成式を予測し,複数得られる構造異性体候補の中から「理論的に」MS/MSスペクトルと最も合致する構造を抽出することで,正解構造を見つけ出すプログラムの構築にとりかかる.現在,理化学研究所統合メタボロミクス研究グループと共同で,植物中未知化合物の網羅的同定を目指したプログラム開発を行っている.この成果を,2016年に発表したMS-FINDERプログラムに搭載することで,より精度の高い構造推定プログラムの構築を行う.研究代表者が管理しているメタボローム解析用プログラムを公開するWebページ.メタボロミクス当該研究計画ではもともと,初年度に8割の予算割り振りをしていた.しかしながら,研究の進行に伴ない,次年度に持ち越すことが効率が良いと判断し,およそ30万円の使用額が生じる結果となった.今年度開催されるアメリカ質量分析学会の旅費,および投稿予定にある査読論文の校閲費に使用する.
4次元的非定常解析による児童の安定的性格形成に関連した脳機能の定量化に関する研究

本研究は、若年者における情動刺激下での脳機能変化と性格安定度との関連性について調べることを目的とした。測定方法として各種記入式質問紙と脳波、脳磁図、自律神経機能検査を用いて、情動刺激時の脳機能を測定し、時間周波数解析を用いて分析した。また、それらの脳機能反応と精神安定度との関連性について調べた。その結果、情動刺激下での脳機能反応が、性格安定度や性格傾向によって異なっていることが分かった。性格不安定群では、安定群と比較し、不快刺激時に側頭部での活動が有意に増加していたが、快刺激時には前頭部での活動が増加する傾向がみられた。これらの結果は、幼児期においても青年期においても同様にみられた。さらに、幼児期においては、視聴覚刺激後の後頭部での活動が、性格安定群では有意に上昇するが、不安定群では減少する傾向がみられた。これは、性格安定群では、幼児期より視覚イメージを容易に捉えることができるのに比べ、性格不安定群では、これらの視覚イメージを捉えることが苦手であるという可能性が示唆された。これらの結果に関連して、本研究では、立体画像の脳機能処理方法が、人のもつ心像力によって異なること、情動的ストレスが脳機能反応に与える影響が、慢性的ストレス状態の有無によって異なること、トラウマをもつ人がトラウマに関連した刺激時に特徴的な脳機能反応を示すことについても調べた。以上の結果は、人のもつ精神状態や情報処理能力により、症状や態度などの表出形のみならず、脳機能の反応様式が異なっていることを示したものであり、「気持ちの問題」として扱われてきた事柄を、脳機能の反応として定量化することが可能であることを示したものである。さらに、本研究では、脳機能の解析方法として、非定常解析、非線型解析、因子分析などを応用し、解析・可視化手法に新しい工夫をすることで、現実の脳波や脳磁図データに、より即した解析を実現した。本年度においては、幼児期から青年期における「性格安定度に関連した脳機能変化を定量的に解析すること」を目的として、次の開発・実験・解析を行った。1.脳機能データの解析手法の開発脳波および脳磁図データ解析として、従来用いられているフーリエ解析に加えて、ウェーブレット解析、独立成分分析、時系列フラクタル解析を用いて、時間的空間的変化を捉える非定常解析手法の開発を行った。開発した解析手法により、脳機能の時々刻々の変化および部位間関連性の抽出が可能となった。また、これらの解析結果をわかりやすく表示するための可視化手法を開発し、脳機能状態を多角的に捉えるためのシステム設計を行った。2.データ測定と解析結果(1)性格安定度に関連した脳機能変化脳波または脳磁図の非定常解析を用いて、情緒刺激直後の脳機能変化を調べた。その結果、性格不安定群では性格安定群と比較し、不快な視聴覚刺激直後に側頭部での活動が有意に高くなることが示された。(2)精神負荷に関連した視覚刺激時の脳機能情報処理過程に関する脳波解析幼児期から青年期の被検者に対する情緒的刺激として、テレビゲームやコンピュータ画面などの視覚刺激によるものが挙げられる。そこで、液晶ディスプレイ(Liquid Crystal Display: LCD)またはヘッドマウントディスプレイ(Head Mounted Display: HMD)を介して2次元または3次元画像を用いた視覚刺激を行い、その間の脳波活動を調べた。その結果、精神負荷の低い群では、HMD作業時にはLCD作業時と比較して、脳波活動が高くなり、イメージ力の高い群では、低い群と比較して、情報量の多い3次元画像による視覚刺激時において、脳波活動が低くなった。3.考察と課題

本年度の結果より、情緒刺激下での脳機能反応は、被検者の性格安定度、精神負荷の感じやすさ、イメージ力といった素質によって異なることが分かった。次年度では、これらの差異について詳細に解析、分類を行う予定である。本研究は、若年者における情動刺激下での脳機能変化と性格安定度との関連性について調べることを目的とした。測定方法として各種記入式質問紙と脳波、脳磁図、自律神経機能検査を用いて、情動刺激時の脳機能を測定し、時間周波数解析を用いて分析した。また、それらの脳機能反応と精神安定度との関連性について調べた。その結果、情動刺激下での脳機能反応が、性格安定度や性格傾向によって異なっていることが分かった。性格不安定群では、安定群と比較し、不快刺激時に側頭部での活動が有意に増加していたが、快刺激時には前頭部での活動が増加する傾向がみられた。これらの結果は、幼児期においても青年期においても同様にみられた。さらに、幼児期においては、視聴覚刺激後の後頭部での活動が、性格安定群では有意に上昇するが、不安定群では減少する傾向がみられた。これは、性格安定群では、幼児期より視覚イメージを容易に捉えることができるのに比べ、性格不安定群では、これらの視覚イメージを捉えることが苦手であるという可能性が示唆された。これらの結果に関連して、本研究では、立体画像の脳機能処理方法が、人のもつ心像力によって異なること、情動的ストレスが脳機能反応に与える影響が、慢性的ストレス状態の有無によって異なること、トラウマをもつ人がトラウマに関連した刺激時に特徴的な脳機能反応を示すことについても調べた。以上の結果は、人のもつ精神状態や情報処理能力により、症状や態度などの表出形のみならず、脳機能の反応様式が異なっていることを示したものであり、「気持ちの問題」として扱われてきた事柄を、脳機能の反応として定量化することが可能であることを示したものである。さらに、本研究では、脳機能の解析方法として、非定常解析、非線型解析、因子分析などを応用し、解析・可視化手法に新しい工夫をすることで、現実の脳波や脳磁図データに、より即した解析を実現した。
近代日本における「他者」認識としての中国観

本研究は、明治後半から昭和初期にかけての知識人を対象に、近代日本の中国認識を明らかにした。内藤湖南を中心にすえ、吉野作造を比較の軸におきながら、中国ナショナリズムの理解、日本と中国の「文化」理解を分析し、中国ーアジアという「他者」への向き合い方のありようを追究した。近代日本は、アジアに対して「他者」感覚を欠落させがちなまま歴史を積み重ねてきたことは否めず、それがゆえに、東亜協同体論、大東亜共栄圏が唱えられ侵略が正当化されていくことにもつながった。当該年度は、『内藤湖南とアジア認識ー日本近代思想史からみるー』山田智・黒川みどり編著、勉誠出版、2013年5月、総307頁)を刊行した。内藤の中国観に対する評価、特にアジア・太平洋戦争後の内藤の中国観に対する批判およびそれに対する反批判の展開については、本論集所収の各論考の中で説明しているが、これまで内藤の中国観をめぐる議論は、主として中国史などの中国を対象とする学問領域の担い手によってなされてきた点だけは確認しておきたい。そのため内藤の思想形成についての検討もその漢学的な素養の形成が中心となり、そこから導かれる結論は、「漢学者」あるいは近代においてその後継者と位置づけられた「支那学者」としての内藤の思想の正統性に留まるものであった。しかし内藤が生きたのは漢学の全盛期である江戸時代ではなく、西欧で育まれた近代社会科学思想を積極的に摂取することを国是としていた近代の日本である。その近代日本を舞台に展開された、内藤のある種異様ともいえる中国観・文明観は、日本近代思想史の文脈の中での学問的検討を経てこそ、正当に評価されうるのではなかろうか。このような問題意識を共有しながら、日本近代史と中国古代史とをそれぞれ専門としている者によって本論集を編んだことの意味は大きく、書評会などをとおして反響も出始めている。それをまとめた後は、他者認識の有りようを原点に立ち返って点検するべく、丸山眞男の著作などを研究会でとりあげ、議論してきた。1.研究会の開催・テキストの講読のためにメンバー全員がほぼ月に一度研究会に集い、『内藤湖南全集』(全14巻、筑摩書房、196976年)の購読を行うとともに、研究中間報告として論集を作成するために、その各自の分担論文の報告と討論を積み重ねた。8月には静岡大学で論集執筆に向けての合宿研究会も行い、相互の関連なども確認しあった。2.後半は各自が論文執筆に勢力を注ぎ、年度内に論文を提出し終えている。論集は、山田智・黒川みどり編『内藤湖南とアジア認識』(勉誠出版)として、2013年5月に刊行を予定している。3.吉野作造記念館(宮城県)と秋田県鹿角市の内藤湖南生家、先人歴史資料館に史料調査に出かけ、吉野作造関係、内藤湖南関係(生い立ちに関わる部分が中心)の史料調査・収集を行った。それらの成果の一部は、刊行予定の論集に反映されている。以上の研究、とりわけ論集の執筆をつうじて、内藤湖南の思想形成から、内藤の『支那論』『新支那論』に代表される中国認識のありようを世に問うた。内藤の中国観に対する評価をめぐる議論は、主として中国史などの中国を対象とする学問領域の担い手によってのみなされてきたため、たとえば内藤の思想形成についての検討もその漢学的な素養の形成が中心となり、そこから導かれる結論は、「漢学者」あるいは近代においてその後継者と位置づけられた「支那学者」としての内藤の思想の正統性に留まるものであった。しかし内藤が生きたのは漢学の全盛期である江戸時代ではなく、西欧で育まれた近代社会科学思想を積極的に摂取することを国是としていた近代の日本であり、その近代日本を舞台に展開された、内藤のある種異様ともいえる中国観・文明観を日本近代思想史の文脈の中での学問的検討を経て提示できたと考えいる。それは中国ナショナリズムへの理解を欠いた内藤の中国「文化」理解にも通じるものであり、その点において吉野との違いは明白である。また、日本文化と中国文化は異質であるとの認識を持つ津田左右吉の存在は内藤と対蹠的であるが、津田もまた日本の中国侵略の徹底した批判者とはなりえなかった。そうした比較検討をつうじて、内藤・吉野のほかに津田なども組み込むことで、再度アジア観の系譜をたどり直し、また竹内好が注目した「アジア主義」という枠組みについても考察してきた。

北一輝らアジア主義者の論攷を読み、現在は竹内好の中国認識を捉え返す試みを行っている。日本近現代思想史当該年度に、代表者と分担者1名が共同編者となり、分担者・協力者全員が参加して『内藤湖南とアジア認識』(勉誠出版)を刊行した。研究途中で内藤湖南を軸にしながら論文集を世に問えたこと、そしてその内容は、当初考えていた以上に進展をみたものと評価している。内藤湖南の位置づけについて、むろんまだ課題は残るものの、我々の見解を一定程度提示し得たものと考えている。上述したように、この段階でひとまず中間報告として論集を刊行できたことは大きな成果であると考えている。ほぼ1920年代までの内藤湖南のアジア認識については、独自の見通しを提示できており、先行研究に投げかける問題提起としても大きいものがあると考える。先にも述べたように日本近代思想史の文脈のなかで内藤を学問的に位置づけた研究はこれまで存在しなかったとみてよく、そこに新たな境地を切り開くと共に、中国史を中心に東洋史研究者が抱いてきた内藤像を大きく切り崩したと思われる。また、朝鮮認識という点からも、それを欠いたまま構築された内藤のアジア認識の問題性を指摘し、かつ史学史の観点からも内の東洋史の限界性について指摘を行った。内藤を軸にした研究をまとめたので、一方ではこのあとの内藤湖南についての研究を進める一方で、対象を広げて新たな視角を打ち出すべく研究会で議論を重ねて模索しながら、研究を進めていきたい。当面、近代日本のアジア認識について再度研究史を整理すること、その上で、近代のナショナリズムをどのように理解するかについて検討を重ねること、そしてそれにふさわしい研究対象を設定することであると考えている。内藤湖南に関する研究は、まだ後半半分程度を残してはいるが、一定の見通しをつけることができたので、今後は、対象を広げながら近代日本の中国認識を問う研究を行っていきたい。現時点で取り組みを開始しつつあるのは、従来から参照軸としている吉野作造に加えて、津田左右吉、橘樸、白鳥庫吉といった人々である。今回刊行した論集の執筆メンバーにも加わっていただいた松本三之介氏は、近代日本の中国認識を眺望した研究をまとめており(松本『近代日本の中国認識』以文社、2011年)、それを参考にしながら他の知識人の中国観をできるかぎり射程に入れながら、内藤の『支那論』『新支那論』の評価を再検討し、さらに1930年代以後の彼の中国をめぐる言説がどのような意味を持ち得たのか、議論を深めていきたいと考えている。その上で、内藤を軸に据えながら、近代日本の中国認識についての新たな見取り図を提示したい。東洋史学に軸足を置いた内藤を中心に据えることで、これまでの研究では従前ではなかった、日本史と東洋史、あるいはその際の西洋史をも射程に入れた歴史認識の枠組みの問い直しにもつなげることが可能であると考えている。当該年度に中国の環境悪化等を踏まえて中国への調査旅行を延期し、国内調査に切り替えたことによる。次年度は台湾または中国への調査旅行を計画している。本年度も、これまで同様、メンバーが頻繁につどい、共通テキストを読み、議論を行うことを基本にしているため、約月1回の東京での研究会開催のために、名古屋、静岡等居住者の旅費が必要になる。また、内藤以外の思想家の研究を進めるためにそれらの文献を購入、収集したいと考えている。
アルカンの水酸化を触媒するミオグロビン創製への挑戦

シトクロムP450は不活性なC-H結合の水酸化に対して触媒作用を示す酵素である。一方で、酸素貯蔵能を有するミオグロビンは同じ補因子であるヘムを有するにもかかわらず、水酸化反応の触媒活性を示さない。本研究では、ヘムをポルフィセンマンガン錯体に置換した再構成ミオグロビンのC-H結合水酸化触媒能に注目し、更なる高機能化をめざした。高分解能の結晶構造を明らかにし、分光学的手法により活性種の同定を行った。得られた知見に基づき、変異体を設計し、エチルベンゼン水酸化の不斉選択性の向上を達成した。また水酸化の困難なヘキサン等に対しても水酸化触媒能を示し、高活性な人工金属酵素の創製のための知見が得られた。チトクロムP450は不活性C-H結合の活性化を介した水酸化反応を触媒するヘム酵素として広く生体内に存在する。一方、酸素結合をつかさどるミオグロビンは同じ補欠分子ヘムを有するものの、水酸化反応に対する触媒活性を全く示さない。本研究ではミオグロビンの補欠分子の置換とヘムポケットの変異を施し、酸素貯蔵機能タンパク質から、過酸化水素を酸化剤として駆動するアルカンの水酸化反応触媒への機能変換に挑戦する。この研究を通じて、錯体化学の観点から水酸化反応の触媒活性に必要な因子を把握し、メタルオキソ種を経由するC-H結合の活性化反応機構を改めて検証する。さらに、MD計算結果をもとに、遺伝子工学手法に基づくヘムポケットの立体構造の改変を通じて、生成するアルコールの立体制御(不斉合成)をめざす。初年度は、まずミオグロビンの人工補欠分子としてマンガンポルフィセンを選び、その合成とアポミオグロビンへの挿入、および得られた再構成タンパク質の同定と構造解析を実施した。また、このマンガンミオグロビンを用いて、過酸化水素を酸化剤とするエチルベンゼン、トルエンおよびシクロヘキサンの触媒的水酸化を試み(室温・中性条件下)、それぞれ目的とするアルコールの生成をガスクロマトグラフィーを用いて検出した。特に、トルエンについては重水素化基質を用いることにより、同位体効果を観測し、反応の律速段階が不活性C-H結合の水素引き抜きであることを明らかとした。また、基質のC-H結合の結合エネルギーと水酸化反応に1次の相関があることを確認した。さらに、エチルベンゼンにおいては、生成物のアルコールの光学活性純度(不斉合成)についても、検討を開始している。チトクロムP450は不活性C(sp3)-H結合の活性化を介した水酸化反応の触媒として働くヘム酵素として広く生体内に存在する。一方、酸素分子の貯蔵をつかさどるミオグロビンは同じ補因子ヘムを有するものの、水酸化反応に対する触媒活性を全く示さない。本研究ではミオグロビンの補因子ヘムの非天然ヘムへの置換とヘムポケットの変異を施し、酸素貯蔵機能タンパク質から、過酸化水素を酸化剤として駆動するアルカンの水酸化反応触媒への機能変換に挑戦する。さらに、MD計算結果をもとに、遺伝子工学手法に基づくヘムポケットの立体構造の改変を通じて、エナンチオ選択的アルコールの合成が目標である。昨年度(平成27年度)は、引き続きミオグロビンの人工補欠分子としてマンガンポルフィセンを選び、その合成とアポミオグロビンへの挿入、および得られた再構成タンパク質の同定と構造解析を実施した。特に、ミオグロビンのヘムポケットの幾つかの箇所にアミノ酸の変異導入を遺伝子工学的に実施し、基質のエナンチオ選択的水酸化を試みた。特にエチルベンゼンを基質として、生成物の1-ヒドロキシエチルベンゼンの光学活性(ee%)について、詳細な評価を行った。生成物の光学活性は、ヘムポケットのアミノ酸残基の配置に大きく依存し、アルコールのキラル中心も、変異導入の様式によってR体、S体のそれぞれの立体配座が得られた。基質のヘムポケット内への接近をMD計算を用いて見積もった結果は、実際に得られた光学活性とある程度の相関も得られた。初年度は、ミオグロビンの人工補欠分子であるマンガンポルフィセンの合成、アポミオグロビンへの挿入と再構成タンパク質の調製を行った。さらに、この再構成ミオグロビンが、水酸化反応を触媒するチトクロムP450酵素と同様の補因子を有するミオグロビンでありながら困難とされてきた外部基質の水酸化反応を初めて達成した。さらに、触媒回転率は、それほど高くないが、P450酵素反応機構として提唱されている触媒的な基質の不活性結合(C(sp3)-H結合)の活性化と、水素引き抜きをともなう水酸化反応をミオグロビンヘムポケット内で展開できた。さらに、昨年度(平成27年度)は、得られるアルコール生成物の光学純度をキラルカラムを装着したガスクロマトグラフィーによって求めた。特に、基質が結合するヘムポケット(遠位側)の構造に起因したエナンチオ選択的アルコール生成に焦点をあて、幾つかのアミノ酸の変異導入を行い、それぞれのミオグロビン変異体におけるアルコール生成物の光学活性を算出した。エチルベンゼンを基質とした場合、1-ヒドロキシエチルベンゼン生成物は、天然のミオグロビンを触媒とした際には、15%ee(S)であるが、His64をAla64に置換すると、48%eeで、立体配座もS体からR体に変化した。一方、His64はそのまま残し、Phe43をAlaに、Val68をPheに変換すると、50%ee(S)が得られた。

さらに、Ala43/Ile64/Phe68トリプル変異体を用いると、69%ee(S)までエナンチオ選択的にアルコールが生成した。これらの結果は、別途MD計算から求めたヘムポケットへの基質結合の安定性とある程度の相関があり、基質が着実にヘムポケットに結合した状態で、水酸化反応が進行することが確認された。生体内では、様々な高難度反応が酵素の働きによって、スムーズかつ選択的に進行している。たとえば、不活性なC(sp3)-H結合を温和な条件下で水酸化するチトクロムP450は多くの代謝過程や生合成過程に存在するヘム酵素として広く知られている。一方、酸素分子貯蔵をつかさどるミオグロビンは同じ補因子ヘムを有するものの、水酸化反応に対する触媒活性を全く示さない。本研究ではミオグロビンに着目し、補因子であるヘムを非天然ヘムへの置換し、さらにヘムポケットの変異を施し、単純な酸素貯蔵機能タンパク質から、過酸化水素を酸化剤として駆動するアルカンの水酸化反応触媒への機能変換を目標とした。この研究を通じて、錯体化学の観点から水酸化反応の触媒活性に必要な因子を把握し、メタルオキソ種を経由するC-H結合の活性化反応機構を改めて検証した。さらに、MD計算結果をもとに、遺伝子工学手法に基づくヘムポケットの立体構造の改変を通じて、エナンチオ選択的アルコールの合成をめざした。昨年度(平成27年度)に引き続き、基質のエナンチオ選択的水酸化を試みた。エチルベンゼンを基質として、生成物の1-ヒドロキシエチルベンゼンの光学活性(%ee)について、詳細な評価を行い、変異導入の様式によってR体、S体のそれぞれが得られ、現時点では約70%eeまでエナンチオ選択性が向上した。さらに、最近では、n-ヘキサンも2位及び3位が触媒的に水酸化されることを明らかとした。TONも12程度まで、条件検討によって上昇した。さらに、ガス状の基質であるプロパンも、簡易型オートクレーブを用いることにより、2位のC-H結合が活性化されて2ープロパノールに誘導されることを示した。今後、反応条件の検討、ヘムポケット内のアミノ酸の配置の検討を実施することにより、さらなる反応性の向上とエナンチオ選択性の向上が期待される。シトクロムP450は不活性なC-H結合の水酸化に対して触媒作用を示す酵素である。一方で、酸素貯蔵能を有するミオグロビンは同じ補因子であるヘムを有するにもかかわらず、水酸化反応の触媒活性を示さない。本研究では、ヘムをポルフィセンマンガン錯体に置換した再構成ミオグロビンのC-H結合水酸化触媒能に注目し、更なる高機能化をめざした。高分解能の結晶構造を明らかにし、分光学的手法により活性種の同定を行った。得られた知見に基づき、変異体を設計し、エチルベンゼン水酸化の不斉選択性の向上を達成した。また水酸化の困難なヘキサン等に対しても水酸化触媒能を示し、高活性な人工金属酵素の創製のための知見が得られた。初年度は、計画通りミオグロビンの補欠分子であるマンガンポルフィセンの合成、アポミオグロビンへの挿入と再構成タンパク質の調製の準備が順調に進み、触媒反応の検討まで実施することができ、おおむね順調に進展していると判断した。
同腫末梢血幹細胞由来高純化樹状細胞による腫瘍選択的抗癌免疫細胞治療

進行癌に対する低侵襲性かつ有効性の高い治療法の開発を目的として、血縁健常者末梢血幹細胞より成熟樹状細胞を誘導し、細胞免疫治療の確立を試みた。平成15年度は前年度より遂行していた末梢血単核球(PBMC)より誘導した樹状細胞(DC)に各種HLA拘束性エピトープペプチドをpulseした細胞免疫治療を膀胱癌、前立腺癌、腎細胞癌を対象に継続的に実施した。各癌種においても50%以上の腫瘍の縮小効果を認めた症例が存在し、本治療の有用性が確認された(表1および表2)。また、新たな腫瘍特異抗原の同定をSEREX(serologic identification of recombinant cDNA expression cloning)法にて行い、2種の膀胱癌に高い特異性を示す癌抗原が同定に成功し、さらにその抗原に対するHLA拘束性エピトープペプチドの作成も同時に実施した(Int J Cancer,108:712-724,2004)。本研究の主目的である同種末梢血幹細胞よりの樹状細胞の誘導に関しては、磁気細胞分離システムの使用により、CD34陽性造血前駆細胞(造血幹細胞)の分離が85.3%の高純度で分離可能であり、本システムの導入により細胞調整の純度の効率化が計れることが明らかとなり、また、CD34陽性造血前駆細胞より誘導された樹状細胞が同種のドナーに与える影響を一卵性双生児とその親ならびに非血縁者とでリンパ球混合培養(MLC)と同様の方法により検討中した結果、成熟樹状細胞は非血縁者末梢血リンパ球との間のrejection試験ではstimulation indexは3.6と同種リンパ球に比較して著しい反応が認められず、敢えて同種CD34陽性造血前駆細胞の必要性が無い可能性が示された。研究初年度に当たる平成14年度、腫瘍特異抗原決定基蛋白(epitope peptide)の同定、候補症例の手術検体より癌細胞の初代培養からRNA調整を行うとともに有効な樹状細胞の誘導方法、同peptideあるいはRNA負荷による細胞障害性T細胞(CTL)の誘導能の検討を中心に行った。1)MHC class1拘束性エピトープペプチドの同定においては、精巣腫瘍あるいは尿路上皮癌において高い発現が確認されているmelanoma antigen (MAGE)-3に対するHLA A-2, A-24に対するエピトープペプチドを確立した。また前立腺癌を標的として、前立腺膜抗原(PMSA)に対するHLA A-2, A-24拘束性エピトープペプチドを新たに同定した(Clin Cancer Res. 8 : 3885-3892, 2002)。2)高率良い抗原提示能を有する樹状細胞の誘導確立の為に自己血ならびに同種末梢血を使用したCTL誘導の至適条件設定を行った。3)手術施行症例においては、患者癌組織より、癌組織の保存あるいは初代細胞培養を行い、今後のin viroでの標的細胞としての準備あるいはペプチドに替わる樹状細胞刺激自己癌細胞RNA抽出の準備を行うとともに、患者親族(両親あるいは兄妹を対象にHLA型の判定を施行し、各患者に対するHLA適合ドナーの選択を行った。4)同種ならびに宿主リンパ球機能解析のため、従来より研究者施設で施行している自己血由来樹状細胞細胞移植前後ならびに経時的変化を総括的に解析するため、患者末梢血リンパ球のサイトカイン産生能などをDNAチップ法により解析した。上記検討よりMHC class 1拘束性エピトープペプチド負荷により、より有効な患者側CTLが誘導されること、臨床的有効性が期待できることなど、本研究の臨床応用への可能性が示された。平成15年度は本研究実施の2年目にあたり、前年度より遂行していた末梢血単核球(PBMC)より誘導した樹状細胞(DC)に各種HLA拘束性エピトープペプチドをpulseした細胞免疫治療を膀胱癌、前立腺癌、腎細胞癌を対象に継続的に実施した。

各癌種においても50%以上の腫瘍の縮小効果を認めた症例が存在し、本治療の有用性が確認された。新たな使用特異抗原の同定をSEREX (serologic identification of recombinant cDNA expression cloning)法にて行い、2種の膀胱癌に高い特異性を示す癌抗原が同定に成功し、さらにその抗原に対するHLA拘束性エピトープペプチドの作成も同時に実施した。本研究の主目的である同様末梢血幹細胞よりの樹状細胞の誘導に関しては、磁気細胞分離システムの使用により、CD34陽性造血前駆細胞(造血幹細胞)の分離が85.3%の高純度で分離可能であり、本システムの導入により細胞調整の純度の効率化が計れることが明かとなった。また、CD34陽性造血前駆細胞よりの樹状細胞の誘導に関する検討を進め、樹状細胞の増殖のためにはGM-CSF, SCF, TNF-αが、樹状細胞の成熟のためにはIL-4,interferon-αの追加が必要であることが判明した。さらに本培養条件における未成熟の樹状細胞を含むマーカーであるCD86の陽性率は45%であったが、成熟樹状細胞のマーカーであるCD83の陽性率は15%であり、実際の臨床応用にあたってはCD34陽性造血前駆財房よりの成熟樹状細胞のより高率的な誘導を検討中である。また、CD34陽性造血前駆細胞より誘導された樹状細胞が同種のドナーに与える影響を一卵性双生児とその親ならびに非血縁者とでリンパ球混合培養(MLC)と同様の方法により検討中である。本研究は進行癌に対する低侵襲性かつ有効性の高い治療法の開発を目的として、血縁健常者末梢血幹細胞より成熟樹状細胞を誘導し、これを更に磁気細胞分離システムにより純化し、移植片宿主反応(GVHD)の原因となるT細胞系を主体とするドナーリンパ球を除去した上で移植することにより移植片宿主反応を最大限に抑制しかつ有効な抗原提示能を有する同種樹状細胞による免疫細胞治療の確立を目指すものである。同種末梢血幹細胞よりの樹状細胞の誘導に関しては、磁気細胞分離システムの使用により、CD34陽性造血前駆細胞(造血幹細胞)の分離が85.3%の高純度で分離可能であり、本システムの導入により細胞調整の純度の効率化が計れることが明かとなった。さらに本培養条件における未成熟の樹状細胞を含むマーカーであるCD86の陽性率は45%であったが、成熟樹状細胞のマーカーであるCD83の陽性率は15%であり、実際の臨床応用にあたってはCD34陽性造血前駆細胞よりの成熟樹状細胞のより高率的な誘導法を検討中である。また、CD34陽性造血前駆細胞より誘導された樹状細胞が同種のドナーに与える影響を一卵性双生児とその親ならびに非血縁者とでリンパ球混合培養(MLC)と同様の方法により検討中した結果、成熟樹状細胞は非血縁者末梢血リンパ球との間のrejection試験ではstimulation indexは3.6と同種リンパ球に比較して著しい反応が認められず、敢えて同種CD34陽性造血前駆細胞の必要性が無い可能性が示された。
絶縁性基板上新規ナノプロープリソグラフィの開発

絶縁基板におけるナノプローブリソグラフィを目的とし、そのレジスト膜の選定を行った。高精細なナノ加工を実現するためには、シングルナノメートルオーダーの超薄膜である必要がある。そこで本研究では、超薄膜でかつ一様性の高い自己集積化単分子膜(self-assembled monolayer ; SAM)に着目し、その特性を評価した。基板として、代表的な酸化物である酸化アルミニウムを用い、それを被覆可能なSAMとして、アルキルホスホン酸SAMに着目した。アルキルホスホン酸SAMは、原料分子を含むエタノール溶液に基板を浸漬する方法(液相法)により作製した。製膜濃度・温度の最適化により、欠陥がほとんどなく、かつ平坦性の高い高密度なSAMを得ることに成功し、アルキルホスホン酸SAMのレジスト膜としての有用性が確認された。絶縁基板におけるナノプローブリソグラフィにおいて、そのレジスト膜の選定はきわめて重要である。そこで本研究では、超薄膜でかつ一様性の高いレジスト膜として、自己集積化単分子膜(self-assembled monolayer ; SAM)に着目し、その特性を評価した。SAMは一般にその膜厚が分子長(23nm)程度と極めて薄く、かつ配向性も高い。基板として、代表的な酸化物である酸化アルミニウムを用い、それを被覆可能なSAMとして、アルキルホスホン酸SAMとアルキルシランSAMを比較した。一方、アルキルシランSAMは、150°Cの環境下において、原料分子を含む蒸気に基板をさらす方法(気相法)により作製した。SAMの欠陥評価には、アミノシラン分子と金ナノ粒子を組み合わせて用いた。欠陥が存在すれば、SAM構成分子よりも小さなアミノシラン分子がそれに吸着し、さらにアミノ基と親和性の高い金ナノ粒子を吸着させることで、欠陥位置・密度を高精度に評価できる。製膜濃度・温度の最適化により、アルキルホスホン酸SAMについては欠陥がほとんどなく、かつ平坦性の高い高密度なSAMを得ることに成功した。その手順はアルキルシランSAMで用いた気相法と比較して簡便であり、アルキルホスホン酸SAMのレジスト膜としての有用性が確認された。
記述式テスト設計・開発のための実証研究－出題方法及び評価方法の検討－

本研究は,高校2年生303名を対象に,国語の大学入試問題を用いて,記述式問題における字数制限が受検者の回答にどのような影響を及ぼすかを検討した。設問1では,A:50字以内で説明せよ,B:字数制限なし,設問2では,A:70字以内で説明せよ,B:字数制限なしの設問(回答欄)を設定した。その結果,設問1では,字数制限のない条件の方が,正答に必要な2つの内容を回答している受検者が多かった。また,設問2の得点率は,字数制限のない条件の方が高かった。以上より,字数制限の有無が受検者の回答に影響を及ぼす可能性が示された。本年度は,国立大学における個別選抜試験の国語を対象に,記述式問題の出題方法に関する分類基準の検討を行った。分類基準に関しては,公立高校入試問題の記述式問題を分類した安永・齋藤・坂本・石井(2015)を参考に,分類の側面を「設問の種類」,「設問内容」,「回答方法」の3つに分け,それぞれの分類内容について,国立大学における平成27年度(以下,H27と表記)と平成28年度(以下,H28と表記)の個別選抜試験問題を踏まえて検討した。基準を作成する際に対象とした大学は,東京大学(H27),名古屋大学(H27,H28),東北大学(H27),九州大学(H27),筑波大学(H27),神戸大学(H27)であった。検討した結果,まず「設問の種類」は,1「通常問題」:設問の内容が文章で記述されており,その問いに回答する設問と,2「条件付き問題」:「通常問題」に特定の条件が付いた(例えば,AとBを対比させながら説明しなさい)の2つに分けられた。次に「設問内容」は,1「理由を問う設問」:なぜそのように言えるのか,それはなぜか,というような傍線部分に関する理由を問う設問,2「言い換えを求める設問」:とはどういうことか,どのような,といった傍線部分に関する言い換えを求める設問,3「状況説明を求める設問」:傍線部分に関係する状況の説明を求める設問の3つに分けられた。最後に「回答方法」は,1○字以内で説明しなさい,2○字以上○字以内で説明しなさい,3○字で抜き出しなさい,4説明しなさい(字数制限なし)の4つに分けられた。当初は,分類基準を作成し,その観点に基づいて複数の個別選抜試験問題を分類することを計画していたが,分類基準の作成で終止してしまったため,やや遅れていると判断した。本年度は,大学入試の国語テストを用いて,高校2年生を対象に回答欄の字数制限の有無が能力評価に及ぼす影響ついて検討した。問題本文の内容は,ニホンザルやゴリラの社会を通して,人間の社会について考えるものであった。検討した設問の内容は,設問1:人間の社会とゴリラの社会にどのような共通点があるかを説明する問題,設問2:人間の社会とゴリラの社会にどのような相違点があるかを説明する問題であった。各設問について,A条件(字数制限あり)とB条件(字数制限なし)の2つの回答欄を設定した。具体的には,設問1では,A:「50字以内で説明せよ」,B:字数制限なし,設問2では,A:「70字以内で説明せよ」,B:字数制限なしの回答欄を設定した。高校2年生303名が受検し,回答時間は45分であった。分析の結果,設問1では,A条件,B条件ともに得点率が約0.8と高く,両条件に差が見られなかった。設問1に正答するためには,人間とゴリラともに,1)トラブルを勝ち負けで解決しない,2)第3者が仲裁に入ることにより対等性を維持する,という内容を記述する必要があるが,字数制限の有無にかかわらず2つの内容を回答している受検者が多かった。設問2では,A条件,B条件ともに0.4程度の得点率であり,こちらも両条件に差が見られなかった。設問2に正答するためには,1)ゴリラの社会では優劣を認知せず対等性を徹底している,2)人間の社会では相手に対し優位に立ちたいと思うこともあり対等性が徹底されていない,という2つの相違点を対比させて記述する必要がある。字数制限の有無にかかわらず,2)の内容のみの回答が多く見受けられた。その理由として,ゴリラの社会の特徴については設問1の共通点で既に述べてられていることから,多くの受検者が設問2では相違点として人間の社会の特徴のみを回答すればよいと考えたと推察された。今後は,作成した分類基準を用いて,複数の国立大学における個別選抜試験問題の分類を引き続き行う。

また,それらの分類を参考に出題方法の異なる2種類の記述式テストを作成し,出題方法の違いが受験者の回答に及ぼす影響について実証的に検討する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。教育測定学29年度が最終年度であるため、記入しない。
アフリカ睡眠病治療薬を志向したアクチノアロライド類の全合成と構造活性相関研究

北里生命科学研究所におけるフィジコケミカルスクリーニングによって放線菌Actinoallomurus fulvus MK10-036株培養液中より単離されたactinoallolide Aはin vitroにおいて既存薬に匹敵する非常に強い抗トリパノソーマ活性を示すことが分かっている。そこで我々は、抗トリパノソーマ薬創製を目的とし、actinoallolideをリード化合物とした創薬研究を展開してきた。その中で最も基盤である天然物の全合成に着手した。複雑な天然物の合成において、電子豊富な4置換ベンゼンからβ-ケトエステルへと導く変換法はこれまでに報告例がなかったため、まず初めに単純なモデル基質を用いた本反応の検討を行った。その結果、4置換ベンゼンのバーチ還元に続く、オゾン分解を行うことで、高収率でβ-ケトエステルを構築する条件を見出した。そこで次に、本反応の実際の全合成中間体への適用を検討した。前年度までに合成を完了した全合成中間体を用いて、バーチ還元を行ったところ、望むベンゼン環部分の還元は進行しなかったものの、不要なアリルアルコールの除去とPMPアセタールの脱保護が進行し、化合物2が得られた。しかしながら、同時に環状カーボネート部位のオレフィンへの変換が起こることが判明した。種々検討の結果、バートンマッコンビー脱酸素化を用いることで、アリルアルコールの除去を行った後、環状カーボネート部位の脱保護に続く、アセトニドによるジオールの保護を行った基質を用いて、種々の条件によるバーチ還元の検討を行った。未だ、満足のいく結果は得られていないが、所望のエノールエーテルを構築した化合物が得られる条件を見出しており、本知見を活かすことで今後Actinoallolide Aの全合成が達成されることを期待する。29年度が最終年度であるため、記入しない。顧みられない熱帯病の1つであるトリパノソーマ症の治療薬創製を目的として、当研究所で見出されたアクチノアロライド類の全合成研究に着手した。アクチノアロライド類はトリパノソーマ原虫に対して、既存薬に匹敵する非常に強い抗原虫活性を有する化合物群であり、その構造活性相関の解明を目指し合成展開を行った。まず当研究室が有する天然物より半合成的アプローチによって種々の化学変換を行い、類縁体の立体構造の決定、並びに活性を評価した。その結果、わずかな構造の変化によって活性が大きく変化することを見出した。また同時進行で行っていた全合成研究においては、モデル基質を用いた鍵反応の検討を行い、その骨格構築法の確立に至った。更に、誘導体合成を指向した収束的な全合成経路の確立を目指して設定した3つのパート(レフト、センター、ライト)各々の合成を達成した。即ち、レフトパートは市販品より13工程・収率14%で合成し、センターパートとライトパートは市販品より3工程で導いた共通中間体より、それぞれ8工程・収率25%と12工程・収率20%で導いた。更に合成した各パートを用いて、種々の収束的なカップリング方法を検討した。その結果、根岸カップリングによってセンターパートとライトパートを連結させた後、レフトパートとスティルカップリングを行うことで全炭素骨格を有した鎖状全合成中間体を合成することができた。本成果については論文にて発表を行った(Tetrahedron Lett. 2016, 57, 357-360.)。現在は標的の天然物の全合成に向け、その後の分子変換の検討を行っている。全合成経路確立後は中間体を含め、網羅的に活性評価を行うことで、ファーマコフォアの解明を目指す。交付申請書における研究実施計画では、半合成的アプローチと全合成的アプローチの2つから誘導体を合成することでトリパノソーマ症治療薬の創製を目指すと記載した。即ち、当研究室の有する天然物より簡便な分子変換を行うことで構造活性相関の概略を把握し、全合成経路の確立に伴う誘導体合成でその知見を活かすことで有望な化合物を創製する戦略である。平成27年度においては半合成的アプローチによる類縁天然物の構造決定と活性評価、標的天然物の収束的な全合成達成へ向けた各フラグメントの合成法の確立、モデル基質を用いた鍵反応の検討を計画した。これら3つの計画については現在までに達成しており、研究はおおむね順調に進展していると言える。前年度までに合成を完了していた、レフト、センター、ライトパートをカップリング反応によって連結した全合成鎖状中間体より、種々の官能基変換によって標的の化合物であるアクチノアロライドAの全合成を目指した。また、同時並行にて行っていた天然物の半合成的誘導体化によって得られた情報を基に、合成中間体より派生させることで誘導体を合成した。その結果、天然物の有する側鎖部分にあたるユニットに活性があることを見出した。特にライトパートに相当する部分が活性に重要であることが示唆されたため、全合成においてはこの部分を網羅的に変換可能にするため、アクチノアロライドのマクロ環部位の骨格を形成した後に、側鎖を導入することとした。

前年度に報告した、レフト、センターパートを連結した化合物から、天然物のマクロ環上の全ての不斉中心の立体化学を構築し、更に鍵反応である光延反応を用いたマクロエーテル化によって大環状構造を形成することができた。現在はもう1つの鍵反応であるベンゼン環からβケトエステルへの変換の検討を行っており、引き続き全合成を目指す。また、全合成中間体からの誘導体合成も行うことで構造活性相関の解明を行う。平成28年度の交付申請書の研究実施計画では、前年度までに合成を達成している鎖状中間体より、天然物の全合成経路を確立すると記載した。しかしながら、鎖状中間体の合成においては、カップリング反応の収率が3割程度であり、化合物の量的供給が困難であったため、その後の分子変換の検討を行い、天然物の全合成を達成することはできなかった。そこで、まずカップリング反応の再検討を行い、化合物の量的供給可能な経路へと変更した。更にそこから天然物の有する全立体化学の構築、鍵反応の1つであるマクロエーテル化の条件を見出すことに成功した。天然物の全合成には残りのもう1つの鍵反応であるベンゼン環からのβケトエステルへの変換が重要課題であり、現在までにモデル基質を用いることで反応が進行する条件を確立しており、実際の基質への適応を検討中である。北里生命科学研究所におけるフィジコケミカルスクリーニングによって放線菌Actinoallomurus fulvus MK10-036株培養液中より単離されたactinoallolide Aはin vitroにおいて既存薬に匹敵する非常に強い抗トリパノソーマ活性を示すことが分かっている。そこで我々は、抗トリパノソーマ薬創製を目的とし、actinoallolideをリード化合物とした創薬研究を展開してきた。その中で最も基盤である天然物の全合成に着手した。複雑な天然物の合成において、電子豊富な4置換ベンゼンからβ-ケトエステルへと導く変換法はこれまでに報告例がなかったため、まず初めに単純なモデル基質を用いた本反応の検討を行った。その結果、4置換ベンゼンのバーチ還元に続く、オゾン分解を行うことで、高収率でβ-ケトエステルを構築する条件を見出した。そこで次に、本反応の実際の全合成中間体への適用を検討した。前年度までに合成を完了した全合成中間体を用いて、バーチ還元を行ったところ、望むベンゼン環部分の還元は進行しなかったものの、不要なアリルアルコールの除去とPMPアセタールの脱保護が進行し、化合物2が得られた。しかしながら、同時に環状カーボネート部位のオレフィンへの変換が起こることが判明した。種々検討の結果、バートンマッコンビー脱酸素化を用いることで、アリルアルコールの除去を行った後、環状カーボネート部位の脱保護に続く、アセトニドによるジオールの保護を行った基質を用いて、種々の条件によるバーチ還元の検討を行った。未だ、満足のいく結果は得られていないが、所望のエノールエーテルを構築した化合物が得られる条件を見出しており、本知見を活かすことで今後Actinoallolide Aの全合成が達成されることを期待する。現在までに合成を完了した鎖状中間体より、以下に示す鍵反応の条件確立を目指す。(1)マクロエーテル化による大環状構造の構築。(2)ベンゼン環より官能基選択的なβ-ケトエステルの構築。