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近世仏教と民衆宗教の救済ネットワークに関する研究

【2他信仰と対峙しながら自らの世界観を作り上げた過程を描く】以上の秋葉信仰の研究をもとにして、如来教が説教の中で、秋葉を語る場面に注目し、同時代的な社会環境に柔軟に対応しながら、民衆宗教が自らの世界を再構成していく様を明らかにした。その他、同じく民衆宗教とされる大本研究者、金光教研究者と交流し、また信者階層や民衆性において共通項を持つ修験道文書調査への参加を通して、方法論と視野の拡大をはかった。本年度の成果をまとめたものとして論文「「渇仰の貴賤」の信仰としての如来教」を執筆し、年度内に投稿したが、査読の結果、改稿の必要が生じ、その作業をしていたため。そして、そのため、予定していたよりも論文発表時期が遅れるため。また、次の課題として1800年前後の「心」への注目、および在地の信仰(特に講組織の動向)と如来教の関係を検討しようと計画しているが、目論んでいた以上に史料の収集状況が芳しくないため。現在は名所図会や商家史料、農村史料を用いて調査中。27年度が最終年度であるため、記入しない。次の課題として1800年前後の「心」への注目、および在地の信仰(特に講組織の動向)と如来教の関係を検討しようと計画している。前者の課題に対しては、心学や曼荼羅とその絵解きなどを史料としたい。そのために、名古屋城下での両者の動向について調査中である。後者については、名古屋城下の仏教、民間信仰の講の史料を収集したい。現状としては、日蓮宗、(少し時期はずれるが)浄土真宗の講に関する史料を収集済みである。今後は秋葉信仰や金毘羅信仰、熱田社関連の講史料を収集したいと思っている。ただし、難航しているので、他の信仰に関する史料があれば、そちらを使うこととしたい。
知的障がいのある子どもたちの基礎数学学習へのデータベースに基づく臨床的教育介入

先行研究では,発達障がいや知的な障がいがある「数と計算」の学習に困難(つまずき)がある子どもたちは,手続き的な学習より概念的な学習がむしろ必要であることを教育介入による臨床的な方法で実証してきた。そして,その臨床データをWEBデータベースにし,教育・研究の関係者に公開する準備を進めてきた。本研究では,概念的な学習が難しいと思われてきた(だから手続き的な介入が繰り返され,しかし,学習を停滞させていた)知的な障がいのある子どもたちに焦点を当て,その学習達成の可能性を実証的に示すとともに,そのデータベース化を進める。そして,データベースに基づいて,概念的に学習を進める教材例を開発・作成・公開する。
脳の老化機構に関する分子細胞生物学的研究

人類の歴史上類をみない急速なスピードで長寿社会を迎えつつある我が国で、老化の問題は社会的にも大きな関心を集めている。特に脳の老化の問題は高度に発達した大脳を有する人類にとっては重要であり、高齢化とともにその頻度の増えるアルツハイマー病を含めた老人性痴呆の原因解明は焦眉の急であるといえる。本研究では、平成元年度発足の重点領域研究で予定されている、脳の老化による神経精神機能とくに病的老化であるアルツハイマー病における精神機能の障害を起こす機構を分子細胞生物学的に解明し、その障害因子の除去と機能の回復、可能性を探り、その結果として脳の老化の本体を明らかにするためのストラテジーを検討した。そのために、現在この方面の研究の最前線で活躍している研究者、とくに重点研究で班長に予定されている方々に集まっていただき、研究方針、企画および公募研究の方針などに関する打ち合わせを行った。その結果、この研究は次の項目について計画研究を進めることになった。1.アルツハイマー病の脳に沈着する異常物質の生化学的解析とその処理機構2.アルツハイマー病の脳における伝達機構障害3.アルツハイマー病の脳における神経細胞死4.アルツハイマー病に関連した遺伝子異常の解析本研究では、これらの研究項目の研究者の組織化、発表の方法(研究会、シンポジウム、公開セミナー、PR)についても検討し、その結果、重点領域研究として出発するための準備が十分に整ったと考えられる。
学習制御のロバスト性における忘却ファクタ-の役割の解明

本研究では、ロボットの運動に少しのゆらぎや、運動初期化の誤差,および測定誤差を許したとき、制御入力が繰返し学習によって理想の入力の近傍の収束していくための力学的メカニズムを明らかにした。すなわち、測定値として各関節の速度を用い、学習則に微分を取らないP型学習制御について考察するとき、忘却ファクタ-の導入によって、学習のロバスト性と収束性が成立することを理論的かつ実験的に明らかにした。また、数回から十数回の繰返し練習を1セットとするインタ-バル練習法を提案した。この方法では、各セット終了後、長期記憶に貯えた制御入力を短期記憶のそれで更新することにより、学習の速度が著しく加速されることをシミュレ-ションと実験によって確認した。また、誤差ベクトルに関するある2乗誤差積分(誤差のエネルギ-量に相当)の意味で最適である制御入力をテンポラリ-メモリ-に常に貯え、各セットの終了後に、長期入力をこの最適入力で更新する方法を提案し、これを選択的学習制御法と名づけた。そして、この方法により、学習制御の収束性を理論的に証明した。これは、人間の場合にエネルギ-レセプタ-の存在を仮定することに対応しており、こうして、テンポラリ-と短期および長期の三種の異るメモリ-と忘却因子の果す役割が理論的に解明された。また、ロバスト性や収束性の証明にはロボットのダイナミクスの受動性と誤差ダイナミクスに関する指数関数的受動動性が本質的に効いていることが示された。人間の場合にも、力学系にこのような受動性が想定できるなら、運動の学習の本質には受動性が重要な働きをしていることが示唆される。
植物の誘導抵抗反応に対する昆虫の対抗適応の分子基盤

植物の昆虫に対する防御応答機構を解明するには、同時に昆虫の対抗適応メカニズムを知ることが重要である。本研究では、植物の間接防御応答を誘導する鱗翅目昆虫由来エリシター(volicitin)に注目し、その類縁体の構造とエリシター活性の相関を明らかにすることで、寄主植物の防御機構を掻い潜ろうと様々な分子種を作り出してきた昆虫と、それに併せて害虫識別機構を発達させてきた植物の攻防を分子レベルで明らかにした。近年、植物保護の新しいコンセプトとして植物本来の免疫システムが注目されている。植物の免疫システムには、植食性昆虫の食害に対し、ニコチンやタンパク質分解酵素阻害剤が蓄積する直接的防御と、特異な揮発成分の放出により寄生蜂が介在する間接的防御が知られている。しかしながら一方で、これらの植物側の防御機構を植食性昆虫がどのように克服しているか、すなわち昆虫の"対抗適応"については世界的にもほとんど研究が進んでいない。そこで申請者は、昆虫の唾液成分volicitinにより誘導される植物の抵抗性に対して、昆虫側の対抗適応の分子メカニズムから、特にvolicitinの構造の多様性と生合成経路の解明を目指している。・新規volicitin類縁体の同定申請者は、タバコスズメガ唾液成分をLCMS IT-TOFで詳細に分析中、MS^2分析でグルタミン酸およびグルタミンの質量数を与えるvolicitin類縁体に特徴的な二つのピークを検出した。NMRスペクトルから、脂肪酸部分の18位が酸化されたvolicitin類縁体と予想され、合成により確認した。18位が酸化されたvolicitinは新規化合物である。・グルタミン酸型volicitinの生合成機構の解明申請者らの研究により、グルタミン型volicitinは鱗翅目幼虫腸管の酵素によりグルタミン選択的に生合成されることを見出した。ところが、タバコスズメガやコオロギ腸管粗酵素抽出液を用いてグルタミン酸とリノレン酸をインキュベートしても、縮合物は確認されなかった。γ-位を15N-ラベル体窒素に置換したグルタミン型volicitinを用いた生合成実験から、コオロギでは、グルタミン型volicitinが先ず生合成された後、γ-位のアミド基のみが加水分解され生合成されることを確認した。申請者は、昆虫の唾液成分volicitin [N-(17-hydroxylinolenoyl)-L-glutamine]により誘導される植物の抵抗性に注目し、特に昆虫類に見出されるvolicitin類の構造の多様性、その生合成経路の解明および植物における反応性の違いをテーマに研究を進めている。・新規volicitin類縁体のエリシター活性平成22度申請者は、タバコスズメガ唾液成分からトウモロコシに揮発成分を放出させる新規エリシターとして、18位が水酸化されたN-(18-hydroxylinolenOyl)-L-glutamine [180H-volicitin]を同定した。平成23年度はこの新規エリシターの合成品を用い、揮発成分放出活性をトウモロコシで調べた。その結果、トウモロコシではvolicitinが180H-volicitinよりも約三倍活性が強かった。・脂肪酸-アミノ酸縮合酵素の精製申請者は、本科研費により購入したタンパク質精製システムを最大限に活用し、カイコ腸管からリノレン酸とグルタミンを縮合する酵素の精製を進めている。現在、電気泳動ゲルで2本のバンドまで精製した。それぞれを切り出し、酵素処理後ペプチド断片をLCMS-IT-TOFで解析した。MSMSイオンサーチでタンパク質Aは候補となるタンパク質が数種類得られたが、どれもアミド結合に関与するタンパク質ではなかった。一方、タンパク質Bはtrypsin-like proteaseとペプチド配列が一致したが、相同率は3%と低かった。高濃度で検出されたにもかかわらず、他に配列が一致するタンパク質は得られなかったので、タンパク質Bはデータベース上に存在しない新規タンパク質であると推定した。・脂肪酸-アミノ酸縮合物の生合成の多様性申請者らは,鱗翅目幼虫の唾液からグルタミン型縮合物を,コオロギおよびショウジョウバエ幼虫の腸管内容物からグルタミン酸型縮合物を同定している.また,鱗翅目幼虫の腸管を用いたin vitro生合成系では,脂肪酸とグルタミンが直接縮合することを見出していた.そこで今年度は,コオロギのグルタミン酸型縮合物の生合成経路を検討した.その結果,コオロギの腸管では,グルタミン酸が直接脂肪酸と縮合するのではないことを見出した.すなわち,先ずグルタミンが脂肪酸と縮合し,グルタミン酸型縮合物を生成する.その後,グルタミン型縮合物の末端のアミド基が加水分解され,グルタミン酸型縮合物に変換された.申請者は、昆虫の唾液成分volicitin [N-(17-hydroxylinolenoyl)-L-glutamine]により誘導される植物の抵抗性に注目し、特に昆虫類に見出されるvolicitin類の構造の多様性、その生合成経路の解明および植物における反応性の違いをテーマに研究を進めている。・Volicitin類縁体のエリシター活性

平成23度に、申請者らは新規エリシター活性物質18OH-volicitinを同定した。平成24年度には、18OH- volicitin、17OH-volicitinやN-linolenoyl-L-glutamineやN-linolenoyl-L-glutamic acidのエリシター活性をトウモロコシとナスで調べた。その結果、トウモロコシでは17OH-volicitinが18OH-volicitinよりも、またグルタミン縮合物がグルタミン酸縮合物よりも活性が強かったが、ナスでは活性に差は認められなかった。・脂肪酸-アミノ酸縮合酵素の精製申請者は、本プロジェクトにより購入したタンパク質精製システムを最大限に活用し、カイコ腸管からリノレン酸とグルタミンを縮合する酵素の精製を進めている。現在、カイコ中腸細胞から精製・分画した縮合活性画分に含まれるタンパク質をトリプシン消化した後、PMFにより同定を試みた。その結果、Aminopeptidase Nと推定されたが、これは4年前にタバコスズメ幼虫中腸から精製した縮合活性タンパク質と同じであった。また、データベースを要しないプロテインシーケンサーによるアミノ酸配列の同定を試みたが、目的蛋白質のN末端がブロックされていた。現在はトリプシン消化ペプチドを精製して再度プロテインシーケンサーで内部配列解読を試みている。鱗翅目ハスモンヨトウ幼虫ではグルタミン型縮合物、直翅目コオロギと双翅目ショウジョウバエではグルタミン酸型縮合物が生合成されるが、その生合成の過程はそれぞれ異なることを見出した。ハスモンヨトウ幼虫では脂肪酸とグルタミンが直接縮合し、ショウジョウバエでは脂肪酸とグルタミン酸が直接縮合する。一方、コオロギでは一旦脂肪酸とグルタミンが縮合し、その縮合物の末端のアミド基が加水分解されて、グルタミン酸型縮合仏が生合成された。また、ハスモンヨトウ幼虫の腸管からFACsの縮合酵素の精製を進めた結果、電気泳動でほぼ単一バンドの酵素を得た。MSMSを用いた分析にから、現在そのタンパク質のアミノ酸配列の解析が進んでいる。26年度が最終年度であるため、記入しない。化学生態学26年度が最終年度であるため、記入しない。新規の180H-volicitinを合成し、その揮発成分放出活性をトウモロコシで調べたところ、volicitinと180H-volicitinではエリシター活性が異なった。トウモロコシでは水酸基の位置を識別していると示唆された。一方、volcitin類の生合成の第一段階であるリノレン酸とグルタミンの縮合反応を触媒する酵素の精製方法を確立した。現時点で得られている結果では、目的の酵素は新規タンパク質である可能性が高い。今後も縮合酵素の精製を進め、同酵素のアミノ酸配列を決定する。グルタミン酸型脂肪酸縮合物のコオロギにおける生合成経路を明らかにした.昆虫におけるグルタミン酸型脂肪酸縮合物の生合成系経路解明の最初の例となった.グルタミン酸型脂肪酸
個別化医療を志向した非線形回帰法の開発と応用に関する研究

近年,がん臨床研究領域では,免疫チェックポイント阻害薬の開発が脚光を浴びており,肺癌,胃癌領域を中心に開発が進んでいる.一方で,これらの免疫療法では,作用機序の観点から,比例ハザード性の仮定を満たさない.そのため,既存の比例ハザード・モデルの適用は困難である.今年度は,比例ハザード性の仮定を満たさない状況においてレスポンダーを抽出できる生存時間樹木法を提案した.この方法では,評価基準に境界内生存期間(RMST; Restricted Mean Survival Time)を用い,交互作用樹木の一つである,QUINT法(Dusseldrop & Mechelen, 2013)のアルゴリズムを応用することで構築した.その結果,非比例性の状況においても,生存時間分布の差異が顕著なサブグループを抽出することができるとともに,responder/Nonresponderの抽出を行うことができた.とくに,樹木による表現を用いることで,各サブグループにおいて,新治療が既存治療に著効なグループ(responder),治療効果に違いが認められないグループ,既存治療が新治療に比べて有効なグループを判断することができる.したがって,治療戦略について,医師等の非統計家が分かりやすい形式での結果の提示を行うことができる.その成果は,2018年度統計関連学会連合大会において発表した.さらに,昨年度に国際学会において発表した,線形項を伴うハイブリッド型の非線形回帰モデルとして提案した,ハイブリッド型AIM(HAIM; Hybrid Adaptive Index Model)を国際誌に投稿済みであり,現在,査読中である.本研究では,生存時間研究におけるサブグループ抽出法を提案しており,国内外の学会において,その成果を公表している.他方,これらの手法について,論文化が遅れている.その理由としては,本学が臨床研究中核病院を目指していることにある.この学内プロジェクトは,当該科研費取得後に学内で決定され,当方が所属する臨床研究センターがその中心となっている.これにより,大学の臨床研究の体制整備における管理業務(とくに,今年度に限っては,臨床研究法への対応),臨床研究中核病院の能力要件を満たすための臨床試験等の医学統計家としての業務(プロトコル作成,臨床研究デザイン,論文のための統計解析等)がエフォートの大多数を割いている.これにより,研究に十分な時間を得られないことが原因である.また,昨年度末には,体調不良により,入院および療養していたこともあり,業務時間も不十分であったことももう一つの原因である.今年度は,本研究の集大成として,これまでに提案した方法,すなわち,(1)競合リスクを伴う非線形比例ハザードモデル,(2)アンサンブル学習法に基づくサブグループ抽出手法,(3)非比例性のもとでの樹木構造接近法,について論文化を行うとともに,シミュレーションによる評価を中心に行う.これまでに,提案した方法は,臨床研究において,とくに介入研究(臨床試験)を想定したものであった.一方で,近年は,ビッグデータ或いは疾患レジストリデータが脚光を浴びており,その意味では,観察研究を想定した方法の開発が必要である.そのため,新たな研究として,Tian et al.(2014)が提案した線形モデル(治療効果×共変量の交互作用を推定する方法)を非線形モデルのもとで,拡張する.具体的には,ルール・アンサンブル法の枠組みのもとで拡張する.これにより,治療×共変量の交互作用(予測因子)を高い予測確度のもとで抽出できるとともに,その結果はプロダクションルールで得ることが期待できる.2015年度は,順序カテゴリカル応答,及び競合リスクを伴う生存時間データに対する非線形回帰モデルの提案を行った.(1)順序カテゴリカル応答に対する多変量適応型回帰スプライン法:医学研究では,疾患の重症度(軽度,中程度,重度)など,順序カテゴリカル応答としてとられることが多い.一方で,非線形回帰手法の順序カテゴリカル応答に対する研究は少ないように思われる.そのため,本研究では,多変量適応型回帰スプライン法(MARS; Friedman, 1992)を順序カテゴリカル応答に拡張した.そこでは,比例オッズモデルの枠組みのもと,偏分残差を損失関数として取り扱い,線形モデルおよび樹木モデルに比べて,高い予測確度を示すことができた.(2)競合リスクを伴う生存時間データに対するルール・アンサンブル法:競合リスクとは,生存時間研究において,関心があるイベントが起きる前に別のイベントにより観測不可能となるリスクである.例えば,HIV研究において,関心があるイベントをAIDSの発症とするとき,当該患者のAIDS以外での死亡は,競合リスク・イベントになる.このとき,競合リスク・イベントを中途打ち切りにすることは,関心のあるイベントの発症リスクを甘く見積もる傾向にある.そのため,競合リスクを伴う生存時間データに対する生存時間解析が必要になる.本研究では,予測確度に優れ,かつ推定されたモデルのなかで予測に対して影響の強い要因が「IFThen」のプロダクション・ルールで解釈できるRuleFit法(Friedman & Popescu, 2008)拡張した.そこでは,部分分布ハザードモデルの枠組みを用い,その偏分残差の一次導関数を用いた樹木構築の方法を作成し,モデル刈り込み方法には,Fu et al.(2015)によって提案された,部分分布比例ハザード・モデルに対するlasso法を適用した.2015年度は,初年度ということもあり,研究の準備段階に位置付けている.そこでは,新たな計算環境を整備するとともに,資料の情報収集が順調に推移したと考えられる.研究活動については,競合リスクに対するルール・アンサンブル法の開発に着手するとともに,諸種の縮小推定の選定に関しても研究をスタートすることができた.このことは,前回の科研費で提案した方法の精緻化が可能になることを意味する.

また,競合リスクを伴う生存時間データに対するルール・アンサンブル法の開発は,その過程において,樹木モデル(基本学習器)の新たな提案を行う必要があることを発見した.競合リスクを伴う生存時間データに対する樹木モデルは,Callaghan(2008)及びIbrahim et al.(2008)によって提案されているものの,ふし間不均一性測度に基づくCART法による樹木モデルは提案されておらず,競合リスクを伴う生存時間データに対するルール・アンサンブル法の開発の中で,新たに提案した.この樹木モデルの提案自体も,新たな研究の一つであり,副産物的な知見であったと考えている.研究成果では,前回の科研費(文部科学省科研費(若手B),癌臨床研究におけるレスポンダーおよびシグナル検出のための統計的機械学習法の開発)の継続研究として,順序カテゴリカル応答に対する多変量適応型回帰スプライン法が日本計算機統計学会誌に掲載された.また,統計関連学会連合大会において,競合リスクを伴う生存時間データに対するルール・アンサンブル法の提案を発表した.さらに,日本行動計量学会において,これまでの非線形回帰手法(樹木構造接近法)の研究が評価され,「日本行動計量学会,2015年度優秀賞(林知己夫賞)」を受賞した.臨床試験では,試験群と対照群に分けられ,それぞれに試験薬(試験治療),対照薬(対象治療)を実施するが,個々の患者にフォーカスを当てると,試験群の被験者に対する対照薬投与(対照治療実施)によるアウトカム,対照群の被験者に対する試験薬投与(試験治療実施)によるアウトカムは不明である.提案手法では,それらの不明なアウトカムの推定に一般化ブースティング手法を用い,個々の被験者に対する効果量(effect size)を推定した.そして,効果量の推定値の差が最大になるサブグループをアソシエーションルールの類推から構成される新たなアルゴリズムを開発したうえで適用した.その結果,提案手法では,サポート(試験全体での被験者数に対するサブグループに含まれる被験者数の割合)に対するサブグループのプロファイリングが可能であった.本手法では,一般化ブースティング及び新たなサブグループ同定手法を用いるが,前者は,一般化線形モデル及びCox比例ハザード・モデルに対する非線形回帰モデルによって構成されており,後者は効果量を定義することができれば,どのようなアウトカムにも適用できることから,アウトカムが連続量,2値,そして生存時間といった様々な場合に適用することができる.本手法は,日本計算機統計学会第30回シンポジウム,日本計量生物学会2016年度大会において発表した.平成27年度は,競合リスクに対する非線形回帰モデルの開発,平成28年度は,サブグループ同定手法の開発について研究を実施した.これらの手法の数理的解析及びプログラミング,簡単な数値検証は実施しており,学会発表にてその成果を公表している.ただし,これらの手法についての論文化が若干遅れている.
半導体マイクロデバイス表面の生体分子アーキテクチャーり構築

本研究はバイオターゲッティング分子をマイクロデバイス上の、特定の2次元微細パターン上、さらには3次元構造の特定部位に効果的に機能発現できるように提示する技術の開発を究極の目的とする。本年度は2次元微細パターン上への位置及び配向選択的な抗体分子のアーキテクチャー構築技術の開発を目的とした。すなわち複数種の抗体分子をホトリソグラフィーの技術を応用して段階的に光パターニングを行いながら抗体を固定化していく方法を検討した。まず段階的にホトリソグラフィーを行うための光反応性膜材料を検討した。その結果、ポジ型のレジストであること、現像条件が温和であること、抗体の吸着性が低いこと、という3条件を満たす技術としてオクタデカンチオールの単分子膜を採用した。次に金薄膜への抗体の固定化法を検討した。抗体の結合量、抗原との反応時の応答の大きさ、センサの安定性の3つの視点から8種類の方法を評価したところ、メルカプチド形成法とプロティンG・抗体架橋法が最も良い結果であったが、これらの方法でも応答性は十分ではなかった。そこでビオチンとアビジンのようなアフィニティリガンドを利用した自己集積化に基づく抗体固定化法を検討した。今回は予備実験として、システィンで金薄膜を修飾してアミノ基を導入し、グルタルアルデヒドで活性化してアビジンを結合させ、そこへビオチン標識抗体を固定化した。この方法で抗ヒトIgGを固定化したセンサでヒトIgGの測定が可能であった。
局地的大雨予測のための雲レーダー同化手法の開発

「ゲリラ豪雨」とも呼ばれる局地的大雨は、河川の急な増水や道路の浸水などを通じて時には人的被害をも引き起こすため、その予測手法の開発は重要な研究課題である。局地的大雨の一時間以内の短時間予測技術の一つとして、高解像度気象数値モデルを用いた数値予測が挙げられる。数値予測による局地的大雨予測の鍵は、観測に近い適切な初期値を作成することであり、これはデータ同化という技術によって行われる。本研究では、局地的大雨を引き起こす積乱雲の発生段階の雲を観測することできる雲レーダーの同化技術を開発することで、局地的大雨に対して短時間の数値予測の精度向上を目指している。本年度は局地的大雨予測に対する雲レーダー同化による雲領域加湿(定性的同化)のインパクトを調査した。具体的にはナッジングと呼ばれる同化手法により、雲レーダーで観測されたレーダー反射強度が指定した閾値を超える(雲が存在する)領域に対して相対湿度が100%に近づくように加湿を行いモデルの初期値を修正した。このようなデータ同化を行うために、雲解像数値モデル(CReSS)の同化プログラムを高度化し、雲レーダー同化プログラムを開発した。2018年8月に3台の雲レーダーのセクタースキャンによる特別観測を行い、局地的大雨を引き起こした積乱雲の発生段階の3次元構造を1分毎という高時間分解能で捉えることに成功した。このデータを用い、積乱雲の発生段階に対してナッジングにより同化(加湿)を行い、ナッジング後の1時間先まで予測を行った。雲レーダー同化を行わなかった場合、降水が予測されなかったのに対し、雲レーダー同化を行った場合は強雨が予測された。この結果から、雲レーダーによる雲領域加湿(定性的同化)だけでも局地的大雨の予測精度が向上しうることが示された。本年度予定していた雲レーダーによる定性的同化(雲領域加湿)のインパクト調査のためのプログラム開発を行うことができ、雲レーダーによる定性的同化だけでも局地的大雨の予測精度を向上しうることを確認できたため。本年度行った雲レーダーによる定量的同化(雲領域加湿)の結果を国際学会等で発表するとともに、論文化を行う。さらに、雲レーダーの反射強度から雲水量を定量的に推定し、雲水量やそれから推定される熱量を定量的に同化する手法の開発に着手する。本年度は雲レーダー同化プログラム作成に注力し、国際学会での発表を1件見送ったため海外出張旅費を次年度に持ち越した。次年度は国際学会等で積極的に成果を発表するため、その旅費として使用する予定である。
犬脂肪由来幹細胞が肝星細胞を中心とした肝細胞癌の腫瘍微小環境に与える効果の解析

今回の研究から、犬の脂肪由来幹細胞(ASCs)は肝星細胞(HSC)の活性化や増殖を促進することが明らかとなった。また、ASCsの培養上清のみを添加した環境下においても同様の変化がみられたことから、ASCsの分泌する液性因子がHSCの変化を誘引していると考えられた。また、犬肝細胞癌細胞の増殖能や浸潤能も犬ASCsの液性因子によってup-regulateするだけでなく、腫瘍形成にかかわる因子の発現量にも増加がみられたことから、犬ASCsは肝細胞癌の増殖や浸潤を促進することが示唆された。本研究の結果より、犬ASCsは肝細胞癌の微小環境も含めて、腫瘍形成を促進すると考えられる。本研究の目的は、肝細胞癌の新たな治療ツールとして脂肪由来幹細胞が有用であるのかを検討することである。そのために、肝星細胞を中心とする腫瘍微小環境に対して犬の脂肪由来幹細胞が与える効果を検討している。本年度は、犬の脂肪由来幹細胞が肝星細胞に与える効果と肝細胞癌細胞に与える効果を次の点から検討した。1肝星細胞の増殖に与える効果について:健常な犬の肝臓より分離培養した肝星細胞を用いて、脂肪由来幹細胞の培養上清と共培養することで、増殖能の変化をMTT assayにより検討した。その結果、培養上清を含んだ条件では、肝星細胞の増殖能に増加が認められた。2肝星細胞に発現するマトリックスプロテアーゼ(MMP)の変化について:腫瘍の微小環境構築に重要や役割をはたすMMP2とMMP9については、脂肪由来幹細胞の影響によって、ともに発現量の増加が認められた。3肝細胞癌細胞に与える効果について:犬の肝細胞癌のcell lineを用いて、脂肪由来幹細胞との共培養下における、増殖能、浸潤能、および様々な成長因子の発現量の変化について検討を行った。その結果、肝細胞癌の増殖能および浸潤能については、脂肪由来幹細胞の培養上清を30%含んだ条件において、最も増加が認められた。また、肝細胞癌細胞に発現する成長因子の多くに発現量の増加が認められた。犬の肝細胞癌細胞に与える影響については、すでに学術雑誌へ投稿中であり、肝星細胞へ与える直接的な効果についても、現在結果をまとめている段階であり、次年度に補足的な実験を追加したうえで海外誌へ投稿する予定である。次年度は犬の脂肪由来幹細胞が肝細胞癌の腫瘍微小環境に与える影響について、さらに多面的に検討を行う予定である。本研究計画では、本年度に肝星細胞からのサイトカイン産生能の変化について検討する予定であった。本年度は測定を実施していないが、サイトカイン産生能を検討するためのサンプルはすでに揃っているため、当初の研究計画から大きな遅れはないものと考えている。本年度で、肝細胞癌に与える影響については終了したことから、次年度は腫瘍微小環境の構築に関連している因子に与える影響を中心に研究を実施できる状況である。また、現時点では、研究の進行を妨げるような予期しないトラブルや大きな問題は発生しておらず、おおむね順調に進展していると考えられる。そのために、肝星細胞を中心とする腫瘍微小環境に対して犬の脂肪由来幹細胞が与える効果を検討した。今回の研究から、犬脂肪由来幹細胞は肝星細胞の活性化や増殖を促進することが明らかとなった。また、脂肪由来幹細胞の培養上清のみを添加した環境下においても同様の変化がみられたことから、脂肪由来幹細胞の分泌する液性因子が肝星細胞の変化を誘引していると考えられた。肝星細胞とともに肝細胞癌の腫瘍微小環境の重要な因子である血管内皮細胞の血管形成能も犬脂肪由来幹細胞によって活性化することが明らかとなった。犬肝細胞癌細胞に与える犬脂肪由来幹細胞の効果について検討した結果、肝細胞癌細胞の増殖能や浸潤能は犬脂肪由来幹細胞の液性因子によってアップレギュレーションすることが明らかとなった。また、腫瘍形成にかかわる因子(TGF-beta, HGF, EGF, PDGF-beta, VEGFA,IGF2, MMP2)の発現量も犬脂肪由来幹細胞の液性因子によって増加がみられたことから、生体内においても犬脂肪由来幹細胞は肝細胞癌の増殖や浸潤を促進することが示唆された。本研究の結果より、犬脂肪由来幹細胞は肝細胞癌の微小環境も含めて、腫瘍形成を促進すると考えられる。そのため、獣医学分野に限らず医学分野においても様々な疾患に対する脂肪由来幹細胞の治療効果が検討されているが、肝細胞癌に対しては腫瘍形成を促進する効果がみられるため、適用すべきでないと考えられる。

次年度の研究計画としては、脂肪由来幹細胞が犬の肝細胞癌における腫瘍微小環境について与える影響について、さらに検討を進める予定である。そのため、腫瘍微小環境を構築する次の因子に与える影響を中心に研究を行う予定としている。1血管内皮細胞の血管形成能に与える影響2マクロファージに与える影響3免疫担当細胞の発現に与える影響13の検討を行うにあたり、1は犬の肺組織、23は末梢血単核細胞から分離したものを利用する予定である。犬の脂肪由来幹細胞が腫瘍微小環境の構築に重要や影響を与えるそれぞれの因子にどのような効果を与えるかについて検討する。獣医学本年度の研究計画が順調に進行したため、本年度未使用額がわずかに発生した。本年度未使用額については、昨年度の研究計画において終了していない実験項目を実施するための費用として使用する予定である。
植物由来ステロイド配糖体のミトコンドリア非依存的アポトーシス誘導メカニズムの解明

本研究は、腫瘍細胞に対してミトコンドリア非依存的にアポトーシスを誘導する植物由来化合物の作用メカニズムの解明を目的としている。応募者が見出した化合物は既存の化学療法薬とは異なり、ミトコンドリア非依存的にアポトーシスを誘導することを明らかにした。このことから既存の化学療法薬とは異なる作用メカニズムを有するがん治療薬開発の契機になることが期待される。この化合物の詳細な作用メカニズムの解明を検討する。
世界初の機能亢進型GNAS生殖細胞変異の同定と新規GNAS機能低下発症機序の解明

GNASは、Gタンパク質共役型受容体の細胞内シグナル伝達を介在し、腎集合管を含む多くの組織では両親性発現を示すが、腎近位尿細管などではA/B-DMRの制御により母性発現を示す。本研究の目的は、(1)われわれが常染色体優性の抗利尿不適合性腎症候群を呈する2家系で同定した新規GNAS変異が、世界初の機能亢進型生殖細胞変異であることを示すこと(研究項目1)、(2)われわれが常染色体優性の偽性副甲状腺機能低下症を示す2家系で同定した過去に報告の無いGNAS-STX16領域のゲノム構造異常やレトロトランスポゾン挿入が、A/B-DMR単独のエピ変異を発症する機序を解明すること(研究項目2)である。(研究項目1)抗利尿不適合性腎症候群発症に直結するAVPR2を用いたルシフェラーゼ解析を終了し、p.F68_G70delとp.M255V変異が軽度機能亢進作用を有することを見出した。また、p.F68_G70delを導入したモデルマウスが、患者と同様、腎からの自由水排泄障害を呈することを見出した。さらに、p.M255Vを導入したモデルマウスが在胎時では生存するものの生後間もなく死亡することを明らかとした。これは、ルシフェラーゼ解析でp.M255Vがp.F68_G70delよりやや活性が強く、生殖細胞由来では胎生致死であるMcCune-Albright症候群を発症するp.R201H/Cより弱いことに一致する。(研究項目2)新規GNAS機能低下発症機序の解明では、GNAS遺伝子内の50-bp重複が原因であることを明らかとた。SVA型レトロトランスポゾン挿入家系では、これがNEP55にexonizationされることを示すために皮膚線維芽細胞を樹立しmRNAを解析した。患者においてA/B遺伝子の高発現が確認されたが、NEP55の発現が軽微であるため、exonizationの証明には至っていない。[研究項目1]世界初の機能亢進型GNAS生殖細胞変異の実証。われわれは、上記のように、抗利尿不適合性腎症候群を有する家系1と2で同定しえたp.F68_G70delとp.M255V変異が経度機能亢進作用を有することを、in vitro機能解析、モデルmouse解析、さらに蛋白構造解析においても証明した。これにより、機能亢進型GNAS生殖細胞変異の存在を実証し、新規遺伝性疾患を樹立した。さらに、家系の表現型から、多くのG蛋白受容体の中で、AVPR2がGNAS機能亢進に最も感受性が高いことを明らかとした。これらの成果は、世界初のものであり、GNAS遺伝子を介する疾患発症機序の解明や治療法の開発に貢献すると期待される。本成果は論文として発表された。[研究項目2]新規GNAS機能低下発症機序の解明。われわれは、GNAS遺伝子内の50-bp重複が偽性副甲状腺機能低下症を発症することを世界で初めて明らかとした。これは、われわれによる2016年度におけるGNAS-STX16領域のゲノム2.5回重複の同定に続き、新しい偽性副甲状腺機能低下症発症機序の解明となる成果である。また、GNAS挿入されたSVA型レトロトランスポゾンがA/B遺伝子の発現亢進を伴うことを見出したことは、確かに、このレトロトランスポゾン挿入が病因であることを示す成果である。令和元年では、以下の研究を行う。[研究項目1]世界初の機能亢進型GNAS生殖細胞変異。家系において経度甲状腺機能亢進が認められたことから、ルシフェラーゼ解析をTSHRを用いて行い、AVPR2の結果を比較する。これにより機能亢進変異効果の受容体特異性を明らかとする。また、p.M255Vを導入したモデルマウスが在胎時では生存するものの生後間もなく死亡する原因を、このマウスの形態解析・遺伝子発現解析から明らかとする。これは、より強い変異を有するMcCune-Albright症候群患者の病因解明や治療法開発に貢献すると期待される。これに関して残された課題は、GNAS-STX16領域に挿入されたSVA型レトロトランスポゾンがNESP55にexonizationされることの証明である。このために、以下の2つを開始している。(1) A/BやNESP55はiPS細胞において高発現を示すことが報告されている。そこで、われわれはすでに患者皮膚線維芽細胞からiPS細胞の樹立を開始しており、これを用いてexonizationを検討する。(2) dCas9-VP64を用いた転写活性化人工的な転写活性化装置を用いてNESP55を強制的に発現させる実験を開始している。これを用いてexonizationを検討する。GNAScoding exons 1-13は、Gタンパク質共役型受容体の細胞内シグナル伝達を介在するGsalphaタンパクをコードし、腎集合管を含む多くの組織では両親性発現を示すが、腎近位尿細管などではA/B-DMR(メチル化可変領域)の制御により母性発現を示す。

本研究の目的は、(1)われわれが常染色体優性の抗利尿不適合性腎症候群を呈する2家系で同定した新規GNAS変異が、世界初の機能亢進型生殖細胞変異であることを示すこと、(2)われわれが常染色体優性の偽性副甲状腺機能低下症を示す2家系で同定した過去に報告の無いGNAS-STX16領域のゲノム構造異常やレトロトランスポゾン挿入が、A/B-DMR単独のエピ変異を発症する機序を解明することである。これにより、ヒト疾患発症におけるGNASの多様な役割を明らかにすると共に、新規ヒト遺伝性疾患の確立ならびに新規ヒト疾患発症機序の解明を目指す。平成29年度、抗利尿不適合性腎症候群発症では、この発症に直結するAVP受容体であるAVPR2を用いた解析を終了し、予想通り、p.Phe68_Gly70delとp.Met255Val変異が軽度機能亢進作用を有することを見出した。また、p.Phe68_Gly70delを導入したモデルマウスを作出し、このマウスが患者と同様、腎からの自由水排泄障害を呈することを見出した。また、新規GNAS機能低下発症機序の解明では、挿入されたSVA型レトロトランスポゾンがNEP55にexonizationされることでA/B-DMRの低メチル化を招くと推測されることから、mRNAを採取する目的で患者および対象から皮膚線維芽細胞を樹立した。平成29年度における進捗状況は以下の通りである。[研究項目1]世界初の機能亢進型GNAS生殖細胞変異の実証。われわれは、抗利尿不適合性腎症候群を有する家系1と2で全エクソーム解析を行い、家系1でGsalpha p.Phe68_Gly70delを、家系2でGsalpha p.Met255Val変異を同定した。このデータは、この変異が世界初の機能亢進型GNAS生殖細胞変異であることで説明される。またAVP受容体が機能亢進型変異に最も鋭敏なGタンパク質共役型受容体であることを示唆する。われわれは、まず変異タンパク構造解析を行い、これらの変異タンパクが機能亢進として作用しうることを明らかとした。次いで、抗利尿不適合性腎症候群発症に直結するAVP受容体であるAVPR2を用いたルシフェラーゼ活性によるin vitro機能解析を終了し、予想通り、p.Phe68_Gly70delとp.Met255Val変異が軽度機能亢進作用を有することを見出した。さらに、この機能亢進の程度がMcCune-Albright症候群を生じるGNAS体細胞変異のそれよりも低いことを明らかとし、これにより何故GNAS生殖細胞由来変異を有する個体が生存可能であるかを明らかとした。さらに、われわれはp.Phe68_Gly70delを導入したモデルマウスを作出し、このマウスが患者と同様、腎からの自由水排泄障害を呈することを見出した。[研究項目2]新規GNAS機能低下発症機序の解明。われわれは、挿入されたSVA型レトロトランスポゾンがNEP55にexonizationされることでA/B-DMRの低メチル化を招くと推測される家系において、mRNAを用いた解析を可能とするため、同意をのもとに患者および対象から皮膚線維芽細胞を樹立した。GNASは、Gタンパク質共役型受容体の細胞内シグナル伝達を介在し、腎集合管を含む多くの組織では両親性発現を示すが、腎近位尿細管などではA/B-DMRの制御により母性発現を示す。本研究の目的は、(1)われわれが常染色体優性の抗利尿不適合性腎症候群を呈する2家系で同定した新規GNAS変異が、世界初の機能亢進
非線形解析による歩行ダイナミクスの評価とその臨床的応用に関する研究

本研究の目的は歩行時のストライドインターバル(SI)の変動を非線形解析によって評価し、その臨床的な有用性を検討することである。非線形解析の評価パラメータは、スケーリング指数(α)と近似エントロピー(ApEn)とした。αはSIの変動の長期相関を表し、ApEnはSIの変動の規則性を表す。研究の結果、杖使用、脚長差によってαとApEnは有意に変化した。αとApEnは年齢によって有意に変化し、特に認知課題を負荷することによって、その差は顕著になった。これらは年齢による歩行中の脳内ネットワーク機能の低下によりもたらされたと考えられ、αとApEnは脳内ネットワーク機能の低下を示す有益な指標と考えられた。本研究においてストライドインターバルとは、歩行時の同側下肢の踵接地から次ぎの踵接地までの時間を意味する。本研究の目的は、ストライドインターバルの変動を定量的に評価することによって歩行障害を定量化し、臨床的応用を検討することにある。平成25年度は、1)杖使用と2)脚長差がストライドインターバルの変動に及ぼす影響を検討した。いずれの検討も対象は健常成人女性20名とした。20mの8字歩行路を快適歩行速度で10分間歩行した。C7,L3,両踵に3軸加速度センサーをつけ,ストライドインターバルを求め、その時系列データからスケーリング指数α,Approximate Entropy (ApEn)を求めた。スケーリング指数はストライドインターバルの長期相関、ApEnはストライドインターバルの変動の規則性を表す。1)の検討では、杖なし歩行,2動作杖歩行,3動作杖歩行の3条件とした。その結果、杖を使用することによってストライドインターバルの変動の長期相関は小さくなり,その規則性は向上した。また,2動作杖歩行より3動作杖歩行の方がよりその規則性が向上することが明らかになった。2)の検討では、脚長差なし、脚長差2cm、脚長差4cmとした。その結果、脚長差4cmではストライドインターバルの長期相関が低下し、ストライドインターバルの変動の規則性が乱れることが明らかになった。本研究の目的は、ストライドインターバルの変動を評価することで歩行障害を定量化し、臨床応用を検討することである。平成26年度は健常成人(20歳代、平均年齢22歳)、健常高齢者(65歳以上、平均年齢72歳)、膝関節置換術患者を対象に年齢と疾患によるストライドインターバルの変動について検討した。対象は健常成人20名、健常高齢者20名、膝関節置換術患者17名とした。L3、両踵に3軸加速度センサーをつけ、ストライドインターバルを求め、その時系列データからスケーリング指数(α)とApproximate Entropy(ApEn)を求めた。その結果、健常高齢者は健常成人に比べ、スケーリング指数(α)が有意に小さく、Approximate Entropy(ApEn)は有意な差はなかった。また、膝関節置換術前において膝関節置換術患者のスケーリング指数(α)が若年成人に比べ、その値が高いあるいは低い者もいるが、膝関節置換術後はその値が若年成人の値のレベルまで回復する傾向がみられた。一方、膝関節置換術患者のApproximate Entropy(ApEn)は膝関節置換術前後において有意な変化がないことが明らかになった。今後、膝関節置換術患者に関して術前術後の状態(膝の痛み、腫れ、筋力など)や測定時期などを再検討し、スケーリング指数(α)とApproximate Entropy(ApEn)の有効性を再評価する必要性が考えられた。膝関節置換術患者の測定時期の再検討、パーキンソン病患者のデータ収集環境を整える必要がある。歩行時の認知課題がストライドインターバルの変動に及ぼす影響を検討した。対象は健常若年成人20名(平均年齢21.2±0.9歳)、健常高齢者20名(平均年齢70.4±3.5歳)とした。歩行条件は認知課題なし歩行(Single Task Gait = STG)する条件とタブレット端末でストループ課題を行いながら歩行(Dual Task Gait = DTG)する条件とした。いずれの条件とも1周20mの8字歩行路を快適歩行速度で12分間歩行した。踵に貼付した3軸加速度センサーから歩行時のストライドインターバルを求め、その時系列データから短期及び長期スケーリング指数α(以下、短期スケーリング指数:α1、長期スケーリング指数:α2)、近似エントロピー(Approximate Entropy = ApEn、以下ApEn)を求めた。スケーリング指数αはストライドインターバルの長期相関、ApEnはストライドインターバルの規則性を表す。上記2つの歩行条件においてスケーリング指数α及びApEnの群間、群内比較を行った。その結果、群間比較でのSTGでは、健常高齢者が健常若年者よりα1、α2が有意に低下した。DTGでは、健常高齢者が健常若年者よりα1で有意に低下し、ApEnで有意に増加した。STGとDTGの群内比較においてα1、α2、ApEnで有意な差は認められなかった。ストライドインターバルの長期相関において年齢による差が認められた。認知課題を付与することによって、長期相関のみならずストライドインターバルの規則性においても年齢による差が見出された。

これらの差は年齢による歩行中の脳内ネットワーク機能の低下によりもたらされたと考えられ、スケーリング指数αとApEnは、歩行中の脳内ネットワーク機能の低下を示す有益な指標と考えられた。本研究の目的は歩行時のストライドインターバル(SI)の変動を非線形解析によって評価し、その臨床的な有用性を検討することである。非線形解析の評価パラメータは、スケーリング指数(α)と近似エントロピー(ApEn)とした。αはSIの変動の長期相関を表し、ApEnはSIの変動の規則性を表す。研究の結果、杖使用、脚長差によってαとApEnは有意に変化した。αとApEnは年齢によって有意に変化し、特に認知課題を負荷することによって、その差は顕著になった。これらは年齢による歩行中の脳内ネットワーク機能の低下によりもたらされたと考えられ、αとApEnは脳内ネットワーク機能の低下を示す有益な指標と考えられた。健常成人において杖使用及び脚長差によってストライドインターバルの変動がどのように変化するかを見定めることができた。現在,臨床応用にむけて膝関節置換術患者を対象にデータ収集と解析を行っている最中です。術前と術後の測定を行うため対象となる患者データをまだ十分に収集できていない。おおむね順調に進展しているが、今後、膝関節置換術患者の測定時期の再検討、パーキンソン病患者のデータ収集環境を整える必要がある。リハビリテーション科学・福祉工学膝関節置換術患者の患者データの収集と解析に力を注ぐ。対象患者の年齢層,術前の状態が一定になるようデータ収集を行う予定である。また,平成26年度には対象疾患をパーキンソン病患者にも広げて測定解析を行う予定です。人件費を節約し、その他の経費と合算し解析ソフトを購入した。人件費を主にセンサー購入費の物品費に回した。その分、データ収集解析が後追いになった。次年度使用額をその他の経費に計上する。人件費としてデータの収集と解析に使用する。
カルシウムセンサー蛋白を介する細胞外液カルシウムによる遺伝子発現機構

1)ヒト副甲状腺ホルモン(PTH)遺伝子上に存在する負のカルシウム反応性DNA配列(nCaRE)に結合し細胞外液カルシウム(Ca)による遺伝子転写抑制を媒介する核蛋白nCaREBを同定した。nCaREBはレドックスファクター(Ref1)とKu抗原との複合体を含み、ref1蛋白のアミノ端120個までの部分にKu抗原との結合およびnCaREBとしての機能に必要な部分があることが判明した。また、Ku抗原を構成する2つのサブユニット(p70とp86)内にあるref1との結合に必要なコンセンサス配列を同定した。2)内因性Caセンサー受容体(CaR)の発現されていない培養細胞にこのCaR発現ベクターを一過性に導入したところ、a)導入細胞で細胞内Ca濃度が有意に上昇し、b)導入細胞で、nCaREを含むレポーター遺伝子の細胞外Caによる発現抑制が増強し、これと連動して、nCaRE-nCaREBの結合より強固となった。このことから、nCaRE-nCaREBの相互作用に基づく遺伝子転写調節系に細胞膜におけるCaRが関与しうることを示した。3)nCaREを構成する2つのDNA配列のうちの一つが細胞外Caだけでなく、浸透圧上昇やストレッチといった細胞容量を変えるような刺激による遺伝子の転写活性化を引き起こすこと、そしてその活性化にnCaREとnCaREBとの結合が減弱することが必要であることを培養細胞の系で示した。実際にこのDNA配列はPTH遺伝子ばかりでなくバゾプレッシンや心房性ナトリウム利尿ペプチドなどの遺伝子上流に種を越えて見事に保存されていることも判明し、この仮説を支持すると考えられる。内因性のCaセンサーの発現がない培養細胞に、Caセンサー発現ベクターを導入した。2)導入細胞では、細胞内Ca濃度が非導入細胞に比して、有意に変動した。b)導入細胞にnCaRE配列を含むレポーター遺伝子をさらにコトランスフェクションしたところ、レポーター活性は、外液Ca濃度にかかわらず抑制された。このことは、nCaRE-nCaREBの相互作用に基づく遺伝子転写調節系にCaセンサー蛋白が情報を与えうることを示す。c)野性株と、センサーを導入したHeLa細胞の培養液中のCa濃度を0.2mM、3.0mMの2条件にし、各々から計4種の核蛋白を抽出した。そしてそれぞれの核蛋白とnCaREとの間でDNA-蛋白結合実験を行った結果、野性株からの核蛋白でみられた細胞外液Ca濃度依存的なnCaRE-nCaREBの結合活性の増加がセンサー導入細胞からの核蛋白では消失し、低Ca濃度下でも高Ca濃度下と同様の強いnCaREとnCaREBの結合が認められた。一方、転写因子nCaREBを構成する2つの蛋白ref1とKu抗原の、それぞれの機能的ドメインを解明する目的で、ref1蛋白の種々の欠失蛋白を作り、別個に精製したKu抗原との結合をGSTカラムを用いて検討した。その結果、ref1蛋白のアミノ端120個までにKu抗原との結合およびnCaREBとしての機能に必要な部分があることが判明した。さらに、Ku抗原を構成する2つのサブユニット内にもref1との結合に必要なコンセンサス配列を見出した。以上の結果から、細胞外液Caの変化のもたらす情報が、細胞膜を経由して核内のnCaRE-nCaREB転写調節機構に至る経路の少なくとも一部分の分子機構を解明することができた。

また、Ku抗原を構成する2つのサブユニット(p70とp68)内にあるref1との結合に必要なコンセンサス配列を同定した。2)内因性Caセンサー受容体(CaR)の発現されていない培養細胞にこのCaR発現ベクターを一過性に導入したところ、a)導入細胞で細胞内Ca濃度が有意に上昇し、b)導入細胞で、nCaREを含むレポーター遺伝子の細胞外Caによる発現抑制が増強し、これと連動して、nCaRE-nCaREBの結合もより強固となった。このことから、nCaRE-nCaREBの相互作用に基づく遺伝子転写調節系に細胞膜におけるCaRが関与しうることを示した。3)nCaREを構成する2つのDNA配列のうちの一つが細胞外Caだけでなく、浸透圧上昇やストレッチといった細胞容量を変えるような刺激による遺伝子の転写活性化を引き起こすこと、そしてその活性化にnCaREとnCaREBとの結合が減弱することが必要であることを培養細胞の系で示した。実際にこのDNA配列はPTH遺伝子ばかりでなくバゾプレッシンや心房性ナトリウム利尿ペプチドなどの遺伝子上流に種を越えて見事に保存されていることも判明し、この仮説を支持すると考えられる。
心筋虚血再灌流障害発生における白血球及び血管内皮細胞の接着因子の関与について

1)虚血再灌流障害の発生機序としての血管内皮細胞と白血球のdirect interactionをin vitroの実験系において証明した。従来より用いている実際材料としてウシ大動脈培養内皮細胞、ウシ白血球、ラット大動脈平滑筋にてバイオアッセイモデルを作製した。好中球の接着分子抗体として抗ヒトCD11b抗体と抗ヒトCD18抗体を用い、まず、フローサイトメトリーにてウシ白血球とそれぞれの抗体のbinding assayを行った。両抗体ともに約6570%のsaturationを示した。これらの抗体をPMAにて活性化した白血球と30分間incubateし、低酵素化下のウシ大動脈培養内皮細胞に添加した。5分後に再酸素化し、内皮細胞障害の程度をnitric oxideの分泌能にて評価した。評価方法としてはラット大動脈平滑筋の発生張力の等尺弛緩率にて計測した。control群:51.5±2.4%、PMA-treated WBC群:8.9±1.3%、抗CD11b抗体群:24.1±3.7%、抗CD18抗体群:20.8±2.5%と両抗体群ともPMA-treated WBC群に比べ弛緩率は有意(p<0.05)に改善した。しかし、control群に比べ50%弱の改善が認められたにすぎず、その一因として異種の材料を用いているためと考え、すべての材料をヒト由来に統一することにより同様の実験を行った。2)実験材料としてヒト肺動脈由来培養内皮細胞、ヒト好中球、ヒト肺動脈平滑筋にてバイオアッセイモデルを作製した。好中球の接着分子抗体として抗ヒトCD11b抗体と抗ヒトCD18抗体を用いた。フローサイトメトリーでは好中球に対し、前者では72.4±5.6%、後者は71.8±3.9%のsaturationを示した。バイオアッセイモデルにおけるヒト肺動脈平滑筋の発生張力の等尺弛緩率はcontrol群:50.3±2.0%、LTB4-treated neutrophil群:19.7±1.0%、抗CD11b抗体群:40.9±1.0%、抗CD18抗体群:41.8±1.7%と両抗体群ともLTB4-treated neutrophil群に比べ弛緩率は有意(p<0.001)に改善した。また、control群に比べ約80%の改善を認めた。我々の今回の研究では肺虚血灌流障害の発生原因として血管内皮細胞と好中球のdirect interactionがその主であり、これは好中球の血管内皮細胞への接着分子抗体である抗CD11b抗体と抗CD18抗体により約80%は軽減できることをin vitroの実験系にて証明した。