hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超高圧低温下における混晶の局在状態に関する研究

また前者混晶に於いては通常の混晶に比し非常に鋭くMnに捕らえられていると考えられる発光が観測され、この温度変化により束縛は弱く無輻射遷移が支配的であると推論した。吸収端発光の観測される位置はほぼMn濃度にほぼ比例し増加し、Mn^<2+>に起因する発光の位置はMn濃度に依存せず一定である。Mn^<2+>に起因する発光が2eVに見られる。発光位置の圧力依存性において、吸収端発光についてはCdMnTeにおいてもCdTeとほぼ同じで6.3meV/kbar(Mn5% 30K)、8.4meV/kbar(Mn50% 30K)である。またMn^<2+>イオンのd-d遷移発光(3d^5:^4Ti→^6Ai)の圧力依存性、混度依存性を測定した。圧力により-5meV/kbarで低エネルギ-側にシフトしている。また励起子発光の混度依存性は、半導体のバンドギャップの経験側とほぼ一致している。これに対して、Mn^<2+>発光の温度依存性(X=0.45)は60K付近に極小を持つ。この変化は測定を行ったすべてのMn濃度について同様に観測された。吸収端発光は温度依存性と圧力依存性に矛盾がないが、Mn^<2+>のd-d遷移について、温度依存性は圧力依存性と相いれない変化をしている事が判った。種々のMn濃度のCdMnTeの発光の温度依存性、圧力依存性、線膨張計数の温度依存性、光学格子振動モ-ドのラマン散乱の温度依存性等の測定を行なった。励起子発光の温度依存性、圧力依存性にはあまり異常な振舞いはない。その温度依存性は格子間隔と電子格子相互作用によりほぼ説明される。しかしMn^<2+>のdーd遷移の発光と考えられている2.1eVの発光は60Kで最小となり異常な振舞いをする。また励起子発光の位置の圧力依存性dE_<ex>/dPはほとんど温度に依存しない。しかしMn^<2+>のdーd遷移の発光の位置の圧力依存性は2次関数的に80Kまでで4割ほどその値を大きくし以後室温まで単調に減少する。線膨張係数の温度依存性はMn濃度に対し多少その変化の割合を大きくするがMn^<2+>のdーd遷移の発光の位置の温度依存性を説明するほど大きくは変化しない。この混晶に於けるマラン散乱の光学モ-ドの自己主張型であり、CdTeとMnTeのモ-ドが存在するが、それらのモ-ドは共に異常な振舞いを示さない。これらによりMn^<2+>のdーd遷移の発光の温度依存性はMnの局所的な変化によるものと考えられる。この発光の形はPoisson型であり。これは配位座標模型で基底状態及び励起状態の最低点がずれている状態間の遷移であると考えられる。またこのモデルで発光帯の幅の温度依存性は80K以下でよく再現できる。しかし80K付近以上で、幅や位置の温度依存性がこのバンド間エネルギ-が変化しない配位座標模型では説明できなくなる。これらのことによりTe正四面体中心のMnが電子励起にともない低温では0.2A^^°の変位を示すが、80Kから300Kにかけてその変位が0.1A^^°程度まで減少すると考えられる。半磁性半導体CdMnTeのd電子の励起状態と格子緩和を明らかにした。およそ2eVの発光ピ-クはほぼ対称なガウス型でその温度依存性は吸収端発光と違い異常な振舞いをする。80以下では配位座標モデルでほぼ発光の形、幅を再現出来る。しかし80Kより高温で配位座標模型の推測から大きくずれている。スト-クスシフトの大きさも高温になると小さくなる。このことより低温と高温では励起状態にあるMnの安定点が異なっていると推測される。
分泌型HB-EGF遺伝子導入による肝再生促進療法に関する研究

HB-EGFが初代培養肝細胞に対し強力な増殖促進作用を有し、部分肝切除後の残存肝において他の増殖因子と異なりDNA合成に先立ち発現することから、肝再生早期に重要な役割を果たしていることを報告してきた。今回、マウスに対する分泌型HB-EGFの静脈内投与により正常肝においてHB-EGFのシグナルであるNF-kBおよびSTAT-3の活性化が惹起され、肝細胞の増殖が促進されることを明らかにした。これらの成果は分泌型HB-EGFが肝再生促進療法に応用し得ることを示していると考えられる。さらに、HB-EGFのトランスジェニックマウスを用い、膜結合型から分泌型HB-EGFへのプロセッシングの阻害剤投与により肝再生が抑制されることを見出した。これは分泌型HB-EGFが肝再生に必要であることを示唆している。分泌型HB-EGF遺伝子導入の肝再生能に及ぼす促進作用を検討するため、まず分泌型HB-EGF発現ベクターを作成し、培養細胞に導入し、発現量を検討した。その結果、mRNAおよび蛋白の発現亢進が明らかになった。この結果を受けて発現ベクターを大量に精製した。HVJ-リポソームのマEEス門脈および肝動脈内への注入でASTに有意な変化は無く、また肝組織学的にも肝障害が無いことを確認し、in vivoへ応用し得ることを示した。さらに、HVJ-リポソーム封入分泌型HB-EGF発現ベクターをマウスの筋肉内に局注し、血中濃度の有意な上昇を認めた。今回の検討でHVJ-リポソームを用いた分泌型HB-EGFの遺伝子導入による肝再生促進療法の可能性が示された。また、マウスに対するHB-EGFの静脈内投与で正常肝においてHB-EGFのシグナルであるNF-kBおよびSTAT-3の活性化が惹起され、肝細胞の増殖が促進されることを明らかにした。これらの成果はHB-EGFが肝再生促進療法に応用し得ることを示していると考えられる。その結果、mRNAおよび蛋白の発現亢進が明らかになったた。次にin vivoへの投与にさきがけ、HVJ-リポソームのマウス門脈内投与の肝障害性の有無を明らかにするため、ベクターのみを封入したHVJ-リポソームをマウス門脈より注入した。その結果、ASTに有意な変化は無く、また肝組織学的にも肝障害が無いことが明らかになった。この検討により、門脈内HVJ-リポソーム注入による遺伝子導入が可能であると判断した。現在、分泌型HB-EGFのin vivoでの発現量を検討するため、HVJ-リポソーム封入分泌型HB-EGF発現ベクターをマウスの筋肉内に局注し、その後の経時的な血中濃度の変化を検討中である。HB-EGFが初代培養肝細胞に対し強力な増殖促進作用を有し、部分肝切除後の残存肝において他の増殖因子と異なりDNA合成に先立ち発現量ることから、肝再生早期に重要な役割を果たしていることを報告してきた。

今回HB-EGFのトランスジェニックマウスを用いHB-EGFのプロセッシング阻害剤投与により肝再生が抑制されることを見出した。これはプロセッシングを受けた分泌型HB-EGFが肝再生に必要であることを示唆している。分泌型HB-EGF遺伝子導入の肝再生能に及ぼす促進作用を検討するため、まず分泌型HB-EGF発現ベクターを作成し、培養細胞に導入し、発現量を検討した。その結果、mRNAおよび蛋白の発現亢進が明らかになった。この結果を受けて発現ベクターを大量に精製した。HBJ-リポソームのマEEス門脈および肝動脈内への注入でASTに有意な変化は無く、また肝組織学的にも肝障害が無いことを確認し、in vivoへ応用し得ることを示した。さらに、HVJ-リポソーム封入分泌型HB-EGF発現ベクターをマウスの筋肉内に局注し、血中濃度の有意な上昇を認めた。今回の検討でHVJ-リポソームを用いた分泌型HB-EGFの遺伝子導入による肝再生促進療法の可能性が示された。
トンネル構造の座屈安定性に関する研究

山岳トンネルの1次支保やシールドセグメントには地山からの土圧を受けて大きな圧縮力が発生する.多くの場合,部材の厚さが十分にあり,圧縮力による座屈破壊に対しては安全とされることから,その確認や照査はされない.しかし実際には,膨張性地山におけるトンネルにおいて支保や覆工が座屈に近い破壊をしている例も見られる.これまでトンネル構造の座屈についてはあまり検討されていなかったが,上記のようにトンネルアーチの部材厚さに対して大きな荷重が作用する場合には,当然,それに対する安全性の評価が必要となる.ここでは特に,コルゲートカルバートトンネルを想定し,座屈解析を実施した.この部分については土木学会論文集に発表した.そこで次に,トンネル支保工模型を用いた座屈検証実験を実施し,周辺地盤により安定化するトンネル支保工のような構造物であっても座屈を生じ得るか検討するとともに,数値解析を行うことで,座屈解析手法の実現象への適用性を検証した.また,座屈前後の支保工模型の挙動について,実験結果及び解析結果について考察した.部材厚が0.1mm,形状が円形の場合には,周辺地盤の条件に関わらず天端からの土被り高さH=230490mmで支保工模型は座屈した.この結果から,トンネルのように周辺地盤により安定化している構造物であっても,部材厚に対して作用する荷重が大きい場合には,座屈し得ることが確認された.ただし,座屈時の土被り高さはばらつきの大きい結果となったが,これは周辺地盤から必ずしも一様な地盤反力が得られていないためと考えられる.すなわち,座屈挙動のような不安定現象では地盤条件のわずかな違いが実験結果に大きく影響すると考えられる.また,座屈前には支保工模型はほとんど変形していないことが確認され,一般的に安定と考えられてきた内空変位の生じていない支保工であっても,座屈する可能性があり,注意を要するといえることがわかった.山岳トンネルの1次支保やシールドセグメントには地山からの土圧を受けて大きな圧縮力が発生する.多くの場合,部材の厚さが十分にあり,圧縮力による座屈破壊に対しては安全とされることから,その確認や照査はされない.しかし実際には,膨張性地山におけるトンネルにおいて支保や覆工が座屈に近い破壊をしている例も見られる.これまでトンネル構造の座屈についてはあまり検討されていなかったが,上記のようにトンネルアーチの部材厚さに対して大きな荷重が作用する場合には,当然,それに対する安全性の評価が必要となる.ここでは特に,コルゲートカルバートトンネルを想定し,座屈解析を実施した.この部分については論文を投稿し,審査を終えた.コルゲートカルバートトンネルはこれまでトンネル断面積の小さいものが中心であったが,近年,中規模断面のものにも適用が検討されている.コルゲート状の部材ではあるが,部材厚はあまり大きくなく単独で地表に置かれた場合にはかなり柔軟な構造物である.これが地盤内では作用する土圧と適度な相互作用を生じ,構造が容易に変形することによってより等方的な荷重分布を作りだしている.すなわち,曲げによる応力はあまり生じないが圧縮力である軸力はかなり大きくなるという構造特性を有している.したがって座屈に対する安全性が大きな課題となる.そこでここではトンネルアーチ部分に対する線形座屈解析を実施するとともに室内実験として行なわれたコルゲートアーチに対する載荷試験結果との比較を行ない,その座屈安定性を検証した.この部分については論文を投稿準備中である.山岳トンネルの1次支保やシールドセグメントには地山からの土圧を受けて大きな圧縮力が発生する.多くの場合,部材の厚さが十分にあり,圧縮力による座屈破壊に対しては安全とされることから,その確認や照査はされない.しかし実際には,膨張性地山におけるトンネルにおいて支保や覆工が座屈に近い破壊をしている例も見られる.これまでトンネル構造の座屈についてはあまり検討されていなかったが,上記のようにトンネルアーチの部材厚さに対して大きな荷重が作用する場合には,当然,それに対する安全性の評価が必要となる.ここでは特に,コルゲートカルバートトンネルを想定し,座屈解析を実施した.この部分については土木学会論文集に発表した.そこで次に,トンネル支保工模型を用いた座屈検証実験を実施し,周辺地盤により安定化するトンネル支保工のような構造物であっても座屈を生じ得るか検討するとともに,数値解析を行うことで,座屈解析手法の実現象への適用性を検証した.また,座屈前後の支保工模型の挙動について,実験結果及び解析結果について考察した.部材厚が0.1mm,形状が円形の場合には,周辺地盤の条件に関わらず天端からの土被り高さH=230490mmで支保工模型は座屈した.この結果から,トンネルのように周辺地盤により安定化している構造物であっても,部材厚に対して作用する荷重が大きい場合には,座屈し得ることが確認された.ただし,座屈時の土被り高さはばらつきの大きい結果となったが,これは周辺地盤から必ずしも一様な地盤反力が得られていないためと考えられる.すなわち,座屈挙動のような不安定現象では地盤条件のわずかな違いが実験結果に大きく影響すると考えられる.また,座屈前には支保工模型はほとんど変形していないことが確認され,一般的に安定と考えられてきた内空変位の生じていない支保工であっても,座屈する可能性があり,注意を要するといえることがわかった.
インターロイキン2受容体γ鎖の発現と機能

血球系細胞を始め種々の体細胞はサイトカイン等の細胞外刺激によって増殖、分化、致死化あるいは不死化の制御を受けている。我々はこれまでTリンパ球の増殖因子であるインターロイキン2(IL-2)の受容体の構造および機能の解析を行ってきた。その中で、我々が遺伝子単離したIL-2容体γ鎖はβ鎖と共に機能的なIL-2受容体に必須の構成分子であることをすでに証明している。本研究では抗γ鎖単クロン抗体を作製して末梢血球細胞におけるγ鎖の発現を調べ、全ての末梢血球細胞にγ鎖が発現していることを見いだした。他方、γ鎖遺伝子変異が伴性重症複合免疫不全症(X-linked severe combined immunodeficiency:XSCID)の原因であることが分かり、我々は3名のXSCID患者由来のB細胞株より変異γ鎖を分離してこの点を確認すると共に、XSCID患者由来の変異γ鎖の機能を検討した。その結果、これらはIL-2結合能のない変異、および細胞内シグナル能のない変異であることを明らかにした。IL-2の機能不全ではXSCIDの発症を説明できない、つまりγ鎖はIL-2以外のサイトカインの受容体サブユニットでもある可能性が考えられていた。我々は抗γ鎖単クロン抗体をもちいて、γ鎖がIL-4受容体のサブユニットであることをすでに明らかにしていたが、さらにγ鎖がIL-7、IL-9の受容体に共通のサブユニット(γc鎖)でもあることも証明した。γc鎖にはキナーゼ等の酵素活性はなく、どのような機序で増殖あるいは分化のシグナルが核内へ伝達されるかは不明である。最近、我々はIL-2受容体β鎖とγc鎖にJAKIとJAK3キナーゼがそれぞれ結合していることを証明した。
計算科学シミュレーションによるＣＴＤの構造特性から探る転写調節機構

RNAポリメラーゼの最大サブユニットRpb1のC末端領域(CTD)は52回リピート(ヒト)するコンセンサス配列(YSPTSPS)がダイナミックなリン酸化修飾を受け、転写の開始、伸長と終結に関わる様々な因子をリクルートして転写過程に関わる。しかしその分子構造レベルの転写因子認識機構は未だ解明されていない。CTD分子構造レベルの知見は転写サイクルの統一的理解を飛躍的に進展させる可能性があり、その解明が求められている。本研究では、拡張アンサンブル法の一種であるマルチカノニカル分子動力学(McMD)法を活用してCTDの構造特性を詳細に研究した。McMDは温度を反応座標として有効ポテンシャルの構築によって構造探索能力を著しく向上させる手法であり、CTDのようなフレキシブルな構造を持つ分子の構造分布探索研究に必須の手法である。これまでの研究成果として1) CTDのMcMDシミュレーションを実施した。その解析結果から、リピート配列中の2,5,7番目のセリン残基のリン酸化によって局所的なベータ構造が誘起されて、結合因子のリクルートを制御する事を明らかにし、さらに2) CTD配列でセリン残基に続くプロリンのシス状態への異性化が局所的なベータ構造形成を強く抑制してCTD転写制御に関わる事を明らかにして、Pin1等のプロリン異性化酵素がCTDを介して転写制御に関わる事(リン酸化と異性化のクロストーク)を示し、成果を論文発表する(J.PhysChem.B 2014)等の研究成果をあげることができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度はCTD特有のコンセンサス配列が一回繰り返すペプチドを計算対象としてマルチカノニカル法による分子動力学計算を実施した。分子シミュレーションは、2番目のセリン残基及び5番目のセリン残基が様々にリン酸化した状態で、全てのプロリン残基がトランス状態として実施した。これに加えて6番目のプロリンのみシス状態であるCTDペプチドでも同様な分子計算を実施した。その結果、リン酸化はCTDペプチド構造空間を著しく制限すること、さらにリン酸化された部位の周りでプロリンを中心とする特徴的なベータターン構造を取る傾向を増す事が明らかとなった。このベータターン構造は転写因子とCTDの結合に深く関与している事が強く示唆される。さらに6番目のプロリン残基がシス状態を取る時にはこのベータターン構造が構造的に強く阻害されることを見出した。これはPin1等のプロリンシスートランス異性化酵素がCTDの転写過程に深く関わる可能性を明らかに示している。本年度は、研究計画予定どうりにCTDコンセンサス配列が一回繰り返すペプチド構造のマルチカノニカル分子動力学シミュレーションを完了して、セリン残基に特異的なリン酸化がCTD構造に及ぼす影響が特徴的なベータターン構造を構成して転写因子のリクルートに深く関わることを明らかにした。これに加えて、6番目のプロリン残基のシス状態への異性化がセリン残基のリン酸化による特異的なベータターン構造を強く阻害する効果を示すことを明らかにできたことは大きな成果であった。これらの成果を論文として発表した事も順調な計画進捗を示している。今後は当初の研究計画どうりに、より多くの回数繰り返す長さのCTDペプチドを分子シミュレーションの計算対象としてマルチカノニカル計算シミュレーションを実施し、コンセンサス配列が多数回繰り返す現実に即したCTDの構造と転写機能の相関をより一層明らかにする。さらにCTDコンセンサス配列に留まらず、様々な機能を持つと思われるノンコンセンサス配列の構造と機能の相関、及びCIDとCTDの結合様式を分子シミュレーションで検証する等の計算科学研究を展開してCTDの転写機能の詳細をその構造特性から明らかにする。加えてCTDの構造特性に関する実験を提案する等の試みを通じて、実験研究者との共同研究展開にも積極的に関わりたい。
PM2.5構成成分の複合胎仔期曝露による出生仔雄性生殖系・免疫系に及ぼす影響

本研究ではPM2.5構成成分の複合曝露による影響を解明するために、LPSおよび加熱PM2.5 (H-PM2.5:粒子本体)を胎仔期に複合曝露し、雄性出生仔マウスの免疫系・生殖系への影響を検討した。ICR系妊娠マウス20匹をH-PM2.5+LPS群と対照群に分け、H-PM2.5+LPS群1匹あたりH-PM2.5 0.2mgとLPS 200ngを妊娠7、14日目に投与した。出生仔マウスが、5週齢、15週齢の時点での免疫系、雄性生殖系への影響を検討した。なお15週齢における免疫系への影響は、2%卵白アルブミン(OVA)を計8回の経気道曝露することで気管支喘息病態モデルを作成し、アレルギー増悪作用についても検討を行った。気管支肺胞洗浄液(BALF)中の細胞数、造精機能、肺および精巣における遺伝子発現等で評価した。胎仔期H-PM2.5+LPS複合曝露による出生仔免疫系への影響を検討したところ、BALF中の細胞数が5週齢のH-PM2.5+LPS群において対照群と比べて2.2倍に増加した(p<0.05)。また15週齢の気管支喘息病態モデルにおいてH-PM2.5+LPS+OVA群はOVA群と比較して細胞数は2.0倍増加した。また増加した細胞のほとんどがマクロファージであったことからH-PM2.5とLPSの胎仔期複合曝露は出生仔に慢性炎症症状を惹起する可能性が示唆された。雄性出生仔生殖系への影響を検討したところ、一日精子産生能(DSP)が15週齢のH-PM2.5+LPS群で対照群と比較して22%有意に低下した(p<0.05)。また精細管の変性割合は5週、15週齢でそれぞれ1.7倍、1.6倍に有意に増加した(p<0.05, p<0.05)。これらのことより、胎仔期のH-PM2.5とLPSの複合曝露は出生仔の雄性生殖系へ悪影響を及ぼすことが示唆された。当初計画していた研究計画が実施でき、年度内に解析も完了しているため。当初予定したとおりに研究を推進する(研究計画に変更は無い)。PM2.5構成成分の一つである有機化学物質(OC)と粒子本体の複合曝露による影響を解明するために、OCおよび加熱PM2.5 (H-PM2.5:粒子本体)を胎仔期に複合曝露し、雄性出生仔マウスの免疫系・生殖系への影響を検討する。ICR系妊娠マウス20匹をH-PM2.5+OC群と対照群に分け、H-PM2.5+OC群1匹あたりH-PM2.5 0.2mgとOC 200ngを妊娠7、14日目に投与する。出生仔マウスが、5週齢、15週齢の時点での免疫系、雄性生殖系への影響を検討する。なお15週齢における免疫系への影響は、2%卵白アルブミン(OVA)を計8回の経気道曝露することで気管支喘息病態モデルを作成し、アレルギー増悪作用についても検討を行う。気管支肺胞洗浄液(BALF)中の細胞数、造精機能、肺および精巣における遺伝子発現等で評価する。胎仔期H-PM2.5+LPS曝露による出生仔免疫系・雄性生殖機能への影響とH-PM2.5+OCによるそれらへの影響を比較し、より寄与の高い複合曝露を明らかにし、その影響発生要因の解明を試みる。

また精細管の変性割合は5週、15週齢でそれぞれ1.7倍、1.6倍に有意に増加した(p<0.05, p<0.05)。これらのことより、胎仔期のH-PM2.5とLPSの複合曝露は出生仔の雄性生殖系へ悪影響を及ぼすことが示唆された。当初計画していた研究計画が実施でき、年度内に解析も完了しているため。当初予定したとおりに研究を推進する(研究計画に変更は無い)。PM2.5構成成分の一つである有機化学物質(OC)と粒子本体の複合曝露による影響を解明するために、OCおよび加熱PM2.5 (H-PM2.5:粒子本体)を胎仔期に複合曝露し、雄性出生仔マウスの免疫系・生殖系への影響を検討する。ICR系妊娠マウス20匹をH-PM2.5+OC群と対照群に分け、H-PM2.5+OC群1匹あたりH-PM2.5 0.2mgとOC 200ngを妊娠7、14日目に投与する。出生仔マウスが、5週齢、15週齢の時点での免疫系、雄性生殖系への影響を検討する。なお15週齢における免疫系への影響は、2%卵白アルブミン(OVA)を計8回の経気道曝露することで気管支喘息病態モデルを作成し、アレルギー増悪作用についても検討を行う。気管支肺胞洗浄液(BALF)中の細胞数、造精機能、肺および精巣における遺伝子発現等で評価する。胎仔期H-PM2.5+LPS曝露による出生仔免疫系・雄性生殖機能への影響とH-PM2.5+OCによるそれらへの影響を比較し、より寄与の高い複合曝露を明らかにし、その影響発生要因の解明を試みる。
腎不全時のカルシウム/リン比を維持し、骨に導く先導分子の同定

骨へのリン・カルシウムの先導的因子の同定を目指したものである。骨細胞死滅マウスにおいて、リン・カルシウムの蓄積の異常が認められた。さらに尿中リン排泄、リン負荷における応答性の異常が認められた。そのメカニズムを検討するため骨のDNAマイクロアレイ解析によりいくつかの候補分子を見いだした。これらの因子が骨へのリン/カルシウムの蓄積を制御すると考えられたため、今後さらに研究を進める。生体構成成分は、食事成分と共通であり(グルコース、コレステロールなど)、生体はその構成成分を絶えず入れ換えている。しかしながら、生体が食事から新しい栄養成分をどのようにして自らの古い構成成分と区別し、交換しているのかについては全くといっていいほど明らかにされていない。腎不全/透析患者にみられるミネラル代謝異常(高リン血症等)や合併症(異所性石灰化)は、腸管から吸収された栄養素が、本来なら各臓器代謝を経て、腎臓から排泄されるはずが、上述した入れ換え機構の異常により生体のあらゆる組織に蓄積することが原因と考えられる。カルシウム/リン比の制御機構の解明、また食事から摂取したカルシウム/リンを骨に導く先導因子(LPP)の同定を行い、さらにLPPにより制御される、新規リン利尿因子を同定する。これらの分子が腎機能を低下のマーカーや、リン代謝異常改善物質として利用可能かを検討することを目的とした。今年度は、腸管より分泌されるリン吸収調節因子(LPP)候補分子の同定を目指した。1)シグナルシークエンストラップライブラリーのスクリーニングにより得られたをLPP候補分子として既知のものでシグナルシークエンスを持つ分子、膜タンパク質であるが、細胞膜上で切断され、分泌される分子を見出した。また機能は未だ詳しく同定されていない分子も候補とした。次年度はこれらの候補分子を、培養細胞系(腎臓細胞)に導入し、リン吸収への影響を確認する予定である。2)骨細胞のないモデルマウスの食事性リン応答の解析を行った。骨細胞のみを死滅させることのできるトランスジェニックマウスの食事性リン応答を腸管上皮細胞刷子縁膜を利用し、リン輸送活性を測定することで明らかにした。このマウスのリン輸送活性の変化よりLLPが腸管から分泌していることが強く支持する結果を得た。次年度は1)で絞ったLLP候補分子の発現量の変動を検討する。腎不全/透析患者にみられるミネラル代謝異常(高リン血症等)や合併症(異所性石灰化)は、腸管から吸収された栄養素が、本来なら各臓器代謝を経て、腎臓から排泄されるはずが、入れ替え機構の異常により生体のあらゆる組織に蓄積することが原因と考えられる。これらの分子と腎不全モデル動物の重症度および異所性石灰化との相関を解析し腎機能を低下のマーカーとしてまた、リン代謝異常改善物質として利用可能かを検討ことを目的としている。前年度にLLPの候補分子として既知、未知の分子を見出したため、本年度はそれらの分子からさらにLLP分子候補の絞り込みを行い、生理活性について検討した。LLP分子の候補遺伝子を腎臓培養細胞に過候補分子過剰発現させた。アイソトープラベルをした無機リン酸の取り込み活性を変化させる分子を見出した。さらに、骨細胞のないマウスを作製したので、そのマウスの腸管における、LLP候補分子の発現量の変動を検討した結果、腎臓培養細胞でリン輸送活性を変動させた分子と一致するものを見出した。絞り込んだ候補分子について、次年度はマウスに過剰発現させリン吸収、リン排泄への影響を検討する。過剰発現させる方法として、Nakid DNAをマウス尾静脈より投与する予定である。その中でさらに候補を絞り込み、生理機能を明らかにする。さらに腎不全モデルマウスでのLLP分子の変動を詳細に検討する。生体構成成分は、食事成分と共通であり、(グルコース、コレステロールなど)、生体はその構成成分を絶えず入れ替えている。しかしながら、生体が、食事から新しい栄養成分をどのようにして自らの古い構成成分と区別し、交換しているのかについては全くといっていいほど明らかにされていない。腎不全/透析患者にみられるミネラル代謝異常(高リン血症等)や合併症(異所性石灰化)は、腸管から吸収された栄養素が、本来なら各臓器代謝を経て、腎臓から排泄されるはずが、上述した入れ替え機構の異常により生体のあらゆる組織に蓄積することが原因と考えられる。そこで、カルシウム/リン比の制御機構の解明を行い、また食事から摂取したカルシウム/リンを骨に導く先導因子の同定を目的とし、研究を行った。申請者が開発した骨細胞を任意の時期に特異的に死滅させることの出来るトランスジェニックマウスを用いて、カルシウム/リンの体内での動態を詳細に検討した。結果、骨細胞破壊マウスは骨量が著しく低下し、破骨細胞の分化および機能の活性化、骨芽細胞機能抑制を生じる事が明らかになった。

さらに、骨細胞は生体内リン代謝調節ホルモンであるFGF-23を分泌し、腎臓からのリン排泄を促すが、このホルモンが低下しても、著しいリン排泄が促進した。またこの現象には既存のリン利尿ホルモンは関与しない事を明らかにした。そこで、これまでに申請者が想定してきた、食事から摂取したカルシウム/リンを骨に導く先導因子(LPP)の同定、さらにLPPにより制御される、新規リン利尿因子を探索した結果、いくつかの候補をマイクロDNA解析、メタボローム解析で見いだした。LPPはカルシウム/リンを正常に骨へ蓄積させるだけでなく、エネルギー代謝に関連する可能性が示唆された。さらなる詳細解析を遺伝子組み換え動物を用い検討している。
一分子精密定量計測と数理モデル化による細胞極性スケーリング機構の解明

動物の発生を考える上での古典的な問題の一つである「スケーリング」の物理的基盤を解明するために極性タンパク質PARに着目した。スケーリングの分子・物理的基盤を明らかにするために、1分子イメージングにより細胞内タンパク質動態を包括的に計測した。得られた物理パラメーターを数理モデルに導入し、非対称局在を再現することに成功した。計測結果とモデルの解析から、これまでの報告とは異なり、極性タンパク質PAR-2の非対称局在は細胞表層を拡散によって移動できないほど早い細胞膜と細胞質間の交換反応によって維持されることがわかった。今後、早い交換反応のスケーリング現象における機能を明らかにしていく。動物の発生を考える上での古典的な問題の一つに「スケーリング」がある。細胞レベル、胚レベルでのタンパク質局在の空間パターンをスケールする機構は胚発生を安定に進行させるために重要であるが、このような発生システムの定量的な特性、安定性を明らかにするためには、精密定量計測技術と数理モデル化が必要である。本研究では、線虫の胚発生において、極性タンパク質PAR-2の局在ドメインの大きさが細胞サイズに合わせて変化(スケール)する現象に着目した。初年度は、1分子観察技術を用い、PAR-2タンパク質分子の動態の解明と定量計測の技術構築と数理モデル化を行った。昨年度までの計測に基づき数理モデルを構築した。数理モデルは実験計測の結果得られた物理パラメーターにより非対称局在を維持することができた。モデル解析の結果PAR-2はそう安定性により非対称局在を維持していることが明らかとなった。このモデルは生細胞内で計測した実際のPAR-2の動態を表す物理パラメーターを基礎としているためin vivoで非対称局在を維持するパラメーターバランスを反映していると考えられる。このモデルを用い、細胞内に存在する濃度ゆらぎに細胞がどのように対応しているかを解析した。数値計算でパターンが定常状態に至った後、ランダムな値を加えることにより定常状態にゆらぎを加え、ゆらぎからの回復過程を解析した。その結果、予想外なことに細胞膜上の密度ゆらぎはすぐに細胞質に受け渡された上で、細胞質の早い拡散により一様分布に戻される回復過程の流れが明らかになった。In vivoの非対称局在においてもゆらぎからの回復に早い解離と細胞質の早い拡散が利用されている可能性を提示することができた。まず、分子遺伝学的な手法により作り出した高リン酸化状態と低リン酸化状態のPAR-2の細胞膜上での滞在時間を比較することにより、PAR-2の膜滞在時間がリン酸化状態によって制御されることを明らかにした。さらに、PAR-2は自己重合しoligomerを形成することを見つけ、PAR-2の膜滞在時間が重合度によっても制御されることを明らかにした。次に、PAR-2の胚の前から後ろにかけての平均的な滞在時間を調べると、平均滞在時間は胚の前後軸に従って非線形に変化することがわかった。これらのことから、PAR-2は、重合度合いとリン酸化状態により膜滞在時間の異なる複数の状態をとることにより、滞在時間の空間的な非線形性を作り出していることがわかった。さらに、これまでの予想と異なり、結合速度定数も胚の前側から後ろ側へ行くにつれて早くなっていた。最後に、計測により決定したパラメーターを用いると、数理モデル上で非対称局在が再現できた。このことから、PAR-2の非対称局在を形成する、解離速度定数と結合速度定数の制御の全体像を数理モデル化することに成功した。発生や進化の過程では、個体サイズや細胞サイズの大きな変化にもかかわらず、胚内または細胞内に非対称局在する“morphogen"や“細胞極性因子"が同様のプロポーションで局在する「スケーリング」といわれる現象が知られている。タンパク質の空間分布を細胞サイズの変化に応じて変化させるための分子的、物理的基盤はわかっていない。本研究では、生きた線虫胚で、極性タンパク質PAR-2の1分子イメージングに成功した。1分子動態を解析することにより、細胞膜と細胞質間の交換反応および拡散を特徴づけるパラメーターを包括的に取得した。PAR-2にはサブ秒から分のオーダーの時定数で膜から解離する複数の成分が存在していた。

点変異体およびRNAi胚でのPAR-2の動態解析から、この時定数の違いは、PAR-2のリン酸化度合いと重合度の違いによって作り出されることを明らかにした。リン酸化と重合度の違いには、PAR-2の解離時定数を極性軸に沿って非線形に変化させるために機能していた。一方、細胞質から細胞膜上に結合する速度定数は予想外にも極性軸に沿って非対称であった。膜への結合反応には正のフィードバック機構が存在することが明らかになった。最後に、計測から得られた物理パラメーターを数理モデルに導入したところ非対称局在を再現した。このことから、1分子計測で同定した成分は、非対称局在の維持に十分であることがわかった。以上の解析から、これまでの報告とは異なり、PAR-2は細胞表層を拡散によって移動できないほど早い細胞膜と細胞質間の交換反応によって非対称局在を維持していることが明らかになった。数理モデル解析から、この早い交換反応は、細胞サイズの変化や生化学反応揺らぎに対抗して、非対称局在を安定に維持するために重要な機能を持つことが示唆された。今後、本研究の成果をスケーリングのメカニズムの解明に発展させていく。発生生物物理学本年度は、これまでの成果を国際紙に発表するために、データの再現性、検証を行った。合わせて、数理モデル解析に取り組んだ。その結果、1分子の動態を観察することにより、新たに発見した膜からの解離が早い成分の働きにより、膜上の非対称局在の安定性が維持されていると言う予想外の結果を得ることが出来た。この、早い解離をする成分は、低重合度でさらにリン酸化されているformのPAR-2タンパク質であると予想された。これにより、分子1つのリン酸化修飾および重合度制御によって、異なる動態を示す複数のformのPAR-2が生み出され、結果として細胞スケールのパターン形成が可能になるという、分子から分子集団の動態が決定すること、分子集団の動態が細胞スケールのパターン形成に寄与することという階層を超えた細胞極性形成メカニズムを明らかにすることが出来た。以上のことから、発生システムに対する1分子観察技術の応用は、これまでに分子遺伝学的手法により予想されるタンパク質動態を追認して速度定数を定量計測するにとどまらず、タンパク質動態の新しい経路を同定する手法としても有効である具体例を示すことが出来た。また、非対称局在を形成するタンパク質分子を1分子解像度で観察することにより、発生システムの統計物理学的性質についても明らかにする切り口が出てきた。本年度は、本課題の第一段階である線虫受精卵における極性タンパク質の非対称局在の数理モデルの構築に取り組んだ。GFP融合PAR-2を発現する線虫胚においてPAR-2分子の動態を1分子解像度での計測に成功した。1分子の動態を観察することにより、PAR-2タンパク質の分子が膜から解離する速度、膜に結合する速度を計測により決定することが出来た。このような新たな計測法の導入により、以下の予想外な発見があった。1)PAR-2は受精卵膜上で単量体から4量体の異なる重合度の分子が存在し、重合度の異なる粒子は胚の後軸に行くに従い重合度が高くなるように非対称に局在することが明らかになった。
耐熱性酵素の動的挙動と反応性にせまる高温高分解能結晶構造解析にむけて

高温下での銅含有亜硝酸還元酵素(CuNIR)の亜硝酸結合型構造を解析し、結果を論文として発表することができた。耐熱性酵素における基質結合様式が、低温構造と高温構造で異なることがある事実を明らかにした初めての例であり、本研究の目的を達成したといえる。亜硝酸非結合型構造もいくつか解析したが、活性中心の銅サイト上部に、楕円状の強い電子密度が常に観測された。これを精製に用いた緩衝液中の塩化物イオン由来の電子密度だと考え、塩化物イオンを含まないサンプルで構造解析を試みたがやはり同様の電子密度が観測された。CuNIRは酸素を過酸化水素へ還元する反応も触媒するため、これが酸素由来の電子密度であると仮説を立て、顕微分光とX線回折データの同時測定をおこなった。この結果、酸素分子種がX線照射によって銅サイトに結合するらしいことが明らかになった。CuNIRの酸素還元機構については30年以上不明であったが、本研究ではじめて酸素結合型構造が得られ、反応機構を提唱することができた。酸素分子種の結合がシンクロトロンX線照射によって誘起されることは、X線自由電子レーザー(XFEL)を用いた構造解析からも支持された。XFEL構造では、酸素として帰属できる強い電子密度は観測されなかった。さらにデータを詳しく解析したところ、活性部位上部に存在し、亜硝酸還元反応に必須のHis244の構造が、シンクロトロン構造とXFEL構造で異なることを発見した。この構造変化によってHis244は水素結合の相手を変えていた。別のCuNIR (AfNIR)でもシンクロトロン構造とXFEL構造を決定し、同様の構造変化を観察できた。銅サイトの還元と同時におこるヒスチジンの構造変化と水素結合の組み換えは、亜硝酸へのプロトン移動反応に関与していると考えられ、CuNIRにおけるプロトン共役型電子移動に関する新たな機構を提唱するものである。26年度が最終年度であるため、記入しない。申請書の計画通り、耐熱性銅含有亜硝酸還元酵素(CuNIR)の結晶を用いて高温(320K)で回折データ収集をおこない、基質である亜硝酸との複合体の高分解能(1.5Å)での構造決定を行った。この高温構造では、亜硝酸イオンは活性中心の銅イオンに対して、低温(100K)で収集した回折データから決定できた構造で見られた単座配位ではなく、2座配位をしていた。この結果は低温構造と高温構造で基質の結合様式が明らかになった世界で初めての例であり、現在論文投稿準備を進めている。これまで、構造生物学の世界ではモデルタンパク質として、その安定性の高さ、結晶化の容易さなどから、耐熱性タンパク質が広く用いられてきたが、こういった耐熱性のタンパク質を、低温で得られたデータをもとに構造解析した場合、本来の生理的な条件下での構造とは異なる構造が見えてしまう可能性を示唆するものであるため、本結果の意義は非常に大きいと考えられる。また、動的挙動を室温で観測する別の手法として、X線自由電子レーザー(XFEL)を用いた無損傷構造解析もおこなうことにした。耐熱性CuNIRの構造を分解能1.3ÅでCuNIRの構造を決定できた。この分解能はこれまでXFELを用いて決定されたもののうち最高分解能である(これまでの最高分解能はリゾチウムの1.9Å)。金属タンパク質の構造解析が高分解能・無損傷でおこなえるという事実が構造生物学界に与えるインパクトは非常に大きいものであり、現在論文の投稿準備を進めている。

26年度が最終年度であるため、記入しない。当初は高温高分解能結晶構造解析のための条件検討のみでかなり時間を要すると考えられたが幸いにも高温でデータ測定ができる条件を見つけられたため、研究は順調に進んだ。のみならず、当初予定していなかった新たな解析法であるXFELによる構造解析がおこなえ、これが動的挙動解析に有用であることが明らかになった。本研究でモデルタンパク質として扱っている好熱菌由来の銅含有亜硝酸還元酵素の基質結合部位は、基質が結合していない時に水が結合しているが、これがX線照射中に2原子酸素分子種に変換されてしまうのではないかという問題と、X線照射により活性中心の銅イオンが容易に還元されてしまうという2つの問題が明らかになった。そこで、高温高分解能構造解析を他のタンパク質にも応用する一方で、上記の問題を解決するため、XFELを用いた無損傷構造解析により動的挙動解析をおこなう手法にも取り組んでいくつもりである。
発情行動発現の新たな制御機構の解明：新規エストロジェン応答ペプチドに着目して

家畜受胎率の低下要因の一つに、微弱発情などの発情行動異常が挙げられる。発情行動発現の脳内機構の詳細は未だ不明な点が多い。本研究は雌ラットを用い、哺乳類メスに共通する発情行動の発現を担う神経内分泌機構を明らかにすることを目的とする。本研究の達成は、学術的な意義が高いだけでなく、本研究により明らかとなった因子に焦点をあてた育種選抜の基準開発に資するなど畜産分野に貢献を果たす基礎的知見を提供できる。
レーザーマニュピュレータを用いたマイクロX線照射装置の開発

近年、癌の粒子線・放射線治療の基礎研究として、細胞組織の特定領域や単一細胞にX線やイオンビームを照射し、その生物学的影響について調べられている。本研究では、テーブルトップサイズで、ビーム径10μmのX線マイクロビーム照射装置を開発した。国内外のマイクロビーム照射実験は、イオンビーム加速器や放射光施設等の大型装置を利用して行われてきたが、開発したテーブルトップサイズのX線マイクロビーム照射装置では、実験能率が高く、より複雑な実験条件を設定することが可能である。X線マイクロビーム照射装置はマイクロフォーカスX線菅、X線導管、蛍光X線分析用X線検出器、サンプルステージ、光学顕微鏡、レーザー等から構成されている。光学顕微鏡で培養中の細胞試料を観測し、ターゲット細胞にX線マイクロビームを照射する。また、光学顕微鏡の対物レンズにレーザー光を導入し、光ピンセットによる培養中の細胞の位置操作やレーザー加工が可能となっている。蛍光顕微鏡観察において、複数のダイクロイックミラーとフィルターを調整することで、X線照射による細胞のDNA損傷に関する発光と、蛍光ガラスからのX線照射に伴う発光中心による蛍光を分離することに成功し、一回の実験でDNA損傷と線量吸収のデータを得ることが出来た。応用として、Normal human fibroblast(AG01522B)細胞を線量計測用の蛍光ガラス上で培養したサンプルを用いた。特定の単一のAG01522B細胞をX線マイクロビームで照射線量10Gyまで照射し、γ-H2AX(リン酸化型ヒストン)の免疫蛍光抗体法によるDNA二重鎖切断の測定を行った。レーザーマニュピュレータを用いたマイクロX線照射装置の開発を行った。本実験装置では、光ピンセット技術を用いて、溶液中の微粒子、細胞等を特定の位置へ移動および固定させることが可能である。マイクロフォーカスX線管とX線導管を用いて、10μmサイズのX線マイクロビームを光ピンセットで捕獲された微粒子、細胞に照射することが可能である。また、最大50keVのX線が照射された試料からの蛍光X線を高純度Si半導体検出器で分析することによって、試料の元素成分分析(^<11>Na^<92>U)が可能である。実験装置は光学定盤上に設置されており、半導体励起固体YAGレーザー光を高開口数の水浸対物レンズに入射させて、カバーガラス(0.1mm厚さ)上の溶液中の試料に焦点を調整し、光トラップを行う。同時に、キセノンランプ光源を用いて、通常の光学顕微鏡と同様にCCDカメラで試料の様子を観測することが出来る。光ピンセットの力の較正は、3μmのアクリル粒子を光トラップし、試料ステージを0.1100μm/sで水平移動させて、ストークス方程式から光ピンセットの力とレーザー強度の関係を求めた。X線マイクロビームと光ピンセットとの焦点を一致させるために、530μmのタングステンアパーチャーを用いて、蛍光X線分析マッピングと光学観測像が一致するように、システムの幾何学調整を行った。また、X線マイクロビームに関して、小型のX線電離箱を開発し、X線フラックスを測定し、蛍光X線強度を利用したナイフエッジ法によりビーム強度プロファイルを測定した。本研究では、培養液中の細胞にX線マイクロビームを正確に照射する装置を開発した。照射チェンバー内の培養細胞を、光ピンセットを利用して位置操作を行い、配列された細胞集団にX線マイクロビームを照射し、その様子を観測した。X線菅、X線導管、X線検出器は真空チェンバー内に設置されている。マイクロフォーカスX線菅からのX線はガラスキャピラリを利用して、真空窓から大気中に取り出され、最小10μmのX線ビームスポットを得ることができる。また、光学顕微鏡の対物レンズにレーザー光を導入し、培養中の細胞の位置操作や、寒天培地層のレーザー加工が可能となっている。

X線マイクロビーム照射実験には、放射線に対して高い感受性をもつ酵母細胞(rad52)を用いた。試料チェンバーは、液体培地で満たされており、X線照射のための酵母細胞が個々のマイクロピットに配置されている。照射チェンバーの底面ガラスには酸化銅、コラーゲン、寒天層が施されている。はじめに、波長532nmのCWレーザーを用いて、寒天層に直径15μm程度のマイクロピットを形成し、次に、光ピンセット用レーザー(波長1064nm)を用いて各々の細胞をマイクロピット内に移動させた。細胞集団の特定細胞にX線マイクロビームを吸収線量60Gyまで照射し、30°Cで20時間観察した。X線照射された細胞にはほとんど変化が観られなかったが、非照射細胞では成長や分裂の様子が観察された。近年、癌の粒子線・放射線治療の基礎研究として、細胞組織の特定領域や単一細胞にX線やイオンビームを照射し、その生物学的影響について調べられている。本研究では、テーブルトップサイズで、ビーム径10μmのX線マイクロビーム照射装置を開発した。国内外のマイクロビーム照射実験は、イオンビーム加速器や放射光施設等の大型装置を利用して行われてきたが、開発したテーブルトップサイズのX線マイクロビーム照射装置では、実験能率が高く、より複雑な実験条件を設定することが可能である。X線マイクロビーム照射装置はマイクロフオーカスX線菅、X線導管、蛍光X線分析用X線検出器、サンプルステージ、光学顕微鏡、レーザー等から構成されている。光学顕微鏡で培養中の細胞試料を観測し、ターゲット細胞にX線マイクロビームを照射する。また、光学顕微鏡の対物レンズにレーザー光を導入し、培養中の細胞の位置操作やレーザー加工が可能となっている。応用として、Normal human fibroblast (AGO1522B)細胞を線量計測用の蛍光ガラス上で培養したサンプルを用いた。特定の単一細胞をX線マイクロビームで照射線量10Gyまで照射し、γ-H2AX(リン酸化型ピストン)の免疫蛍光抗体法によるDNA二重鎖切断の測定を行った。蛍光顕微鏡観察において、複数のダイクロイックミラーとフィルターを調整することで、X線照射による細胞からの発光と、蛍光ガラスからの発光を分離することに成功した。
肝障害の発生・進展に果たすアポトーシスの意義解明とその阻止

1)酵母ミトコンドリア型態制御遺伝子mmm1,mdm10の哺乳動物細胞への導入:酵母胞でミトコンドリア(ミト)形態を制御し、その欠損によりミト巨大化が報告されているmmm1,mdm10のプライマーを用いRT-PCR法で増幅し、HAプローブを組み込ませて発現ベクターを作成し、Lipofection法によりRL-34,MDCK両細胞に導入した。現在、細胞内局在を同定中。Permancell lineが確立できたら、これを用いてミト巨大化条件下でミト形態変化を検討する。2)培養栽培系でのミト巨大化実験モデルの確立と、ミト巨大化へのフリーラジカルの普遍的関与の証明:初代培養肝細胞系でのミト巨大化モデルの確立につづき、RL-34,IAR-20,Cos1細胞でミト巨大化を確立すると共に、H_2O_2でもミト巨大化する事を見出しフリーラジカルの関与を一層実なものとした。3)ミトコンドリア(ミト)巨大化によるapoptosis(AP)誘導機序の解明:培養細胞系を用い、freeradicals(FR)存在下で形成された巨大ミトが、引き続きFRに曝されると、巨大ミト膜のメガチャネルが開放され、その結果巨大ミトは膨化、膜電位低下、チトクロムcのミトからの流出、細胞内ATP量低下をもたらし、巨大ミト存在下の培養細胞はAPに陥る事を明らかにした。又、膨化巨大ミトの酸素消費量の著名低下がFR産生能低下の原因である事をつきとめた。膨化巨大ミトのFR産生能低下が顕著で、細胞内FR量減少をもたらす場合には巨大ミトは構造・機能共に正常に戻るが、効果がなければAPに陥る事になる。即ち、これまで不明であったミト巨大化現象の細胞病理学的意義が明らかになると共に、APの発生・進展にミトの"膨化"が注目されているが、新たに"巨大化"が加わることになり、AP研究に大きく貢献するものと思われる。4)培養細胞系を用いたミト巨大化のCoQ_<10>による阻止:培養ラット肝細胞を用い、cycloheximide,CoQ_<10>によりヒドラジン、クロラムフェニコールによるミト巨大化阻止に成功した。同時に、ミト膜電位、細胞内フリーラジカル量増加も抑制された。さらに、クロラムフェニコールによるマウス肝巨大ミトの回復過程が、CoQ_<10>、cycloheximideにより著明に促進されることを突き止めた。5)新規合成TEMPO誘導体Apoptosis(AP)の阻止:様々な病的環境下でのミトコンドリア(ミト)の巨大化に続くAPが、4-OH-TEMPOにより阻止される事を既に報告したが、in vivoで体重減少・神経毒などの副作用を示すので、ポーランド・グダニスク医大との共同研究により新規合成した6種のTEMPO誘導体を用い、培養細胞でのミト巨大化AP阻止を目安として検討。4-OH-TEMPOが2-4mMで有効なのに対し、4-octanoyl-,4-lauroyl-TEMPO50-100μMの低濃度でH_2O_2,t-butylhydropeeroxideによる細胞障害をより有効に阻止する事を見出した。6) Leflunomide(LF)の新しい作用:LFは、ミト内膜に存在するdehydroorotate dehydrogenase(DHODH)の阻害剤であり、最近リウマチの治療剤として用いられている。DHODHはdehydroorotateをorotateに変えるがこれと共役してO_2が産生される。培養細胞系を用いてLF投与時のミト酵素ラジカル産生への影響を検討する過程で、LFがミト新生を促進することをつきとめた。引き続きその機序を検討中。

即ち、これまで不明であったミト巨大化現象の細胞病理学的意義が明らかになると共に、APの発生・進展にミトの"膨化"が注目されているが、新たに"巨大化"が加わることになり、AP研究に大きく貢献するものと思われる。4)培養細胞系を用いたミト巨大化のCoQ_<10>による阻止:培養ラット肝細胞を用い、cycloheximide,CoQ_<10>によりヒドラジン、クロラムフェニコールによるミト巨大化阻止に成功した。同時に、ミト膜電位、細胞内フリーラジカル量増加も抑制された。さらに、クロラムフェニコールによるマウス肝巨大ミトの回復過程が、CoQ_<10>、cycloheximideにより著明に促進されることを突き止めた。5)新規合成TEMPO誘導体Apoptosis(AP)の阻止:様々な病的環境下でのミトコンドリア(ミト)の巨大化に続くAPが、4-OH-TEMPOにより阻止される事を既に報告したが、in vivoで体重減少・神経毒などの副作用を示すので、ポーランド・グダニスク医大との共同研究により新規合成した6種のTEMPO誘導体を用い、培養細胞でのミト巨大化AP阻止を目安として検討。4-OH-TEMPOが2-4mMで有効なのに対し、4-octanoyl-,4-lauroyl-TEMPO50-100μMの低濃度でH_2O_2,t-butylhydropeeroxideによる細胞障害をより有効に阻止する事を見出した。6) Leflunomide(LF)の新しい作用:LFは、ミト内膜に存在するdehydroorotate dehydrogenase(DHODH)の阻害剤であり、最近リウマチの治療剤として用いられている。DHODHはdehydroorotateをorotateに変えるがこれと共役してO_2が産生される。培養細胞系を用いてLF投与時のミト酵素ラジカル産生への影響を検討する過程で、LFがミト新生を促進することをつきとめた。引き続きその機序を検討中。1)酵母ミトコンドリア形態制御遺伝子mmm1,mdm10の、哺乳動物細胞への導入:酵母胞でミトコンドリア(ミト)形態を制御し、その欠損によりミト巨大化が報告されているmmm1,mdm10のプライマーを用いRT-PCR法で増幅し、HAプローブを組み込ませて発現ベクターを作成し、Lipofection法によりRL-34,MDCK両細胞に導入した。現在、細胞内局在を同定中。permancell lineが確立出来たら、これを用いてミト巨大化条件下でミト形態変化を検討する。2)培養細胞系でのミト巨大化実験モデルの確立と、ミト巨大化へのフリーラジカルの普遍的関与の証明:初代培養肝細胞系でのミト巨大化モデルの確立につづき、RL-34,IAR-20,Cos-1細胞でミト巨大化を確立すると共に、H_2O_2でもミト巨大化する事を見出しフリーラジカルの関与を一層実なものとした。3)フリーラジカルスカベンジャーによるエタノールによるミト巨大化の阻止:4-OH-TEMPOによりエタノールによるラット肝ミト巨大化の阻止及び肝障害の軽減に成功すると共に、ROS上昇の一部はxanthine oxidaseの亢進による事を見出した。
都市の垂直方向の温湿度分布実測と省エネルギーに関する基礎的研究

1実測大阪の高層ビルを利用して鉛直方向の温度・湿度の観測を、夏期3週間、冬季2週間行い、そのデータ記録を解析した。測定ポイントには梅田・難波・京橋・弁天町など市街化が進んだ地域を選び、それらとの比較のために郊外の大東市(住道中学)、沿岸部の南港地区を測定地点として選んだ。測定ではビル自身の上昇気流による影響を除くため、可能な限り対角に2箇所、同時観測した。観測値の誤差の標準偏差は0.20.3[K]程度であり、十分な精度が得られた。2測定結果測定結果は、観測時系列を年周成分、日周成分、確率成分に分離し、基本となる大阪管区気象台のデータと比較した。この分離する方法は既に研究者本人が開発した方法である。気温は市街地のいずれの地点も高度1mにつき夏は0.0106[K]、冬は0.0089[K]、線形に低下することが判った。これは都市域の期間平均的な境界層厚さは200m以上あることを示す。平均値は乾燥断熱減率0.0098[K/m]に等しい。市街域内の地点差は予想に反し少なくかなり均質であった。沿岸部の地上気温は市街地より低温だが、上空は市街地との差が少ないことが判った。湿度は市街域では気温の傾向とほぼ同じで、かつ鉛直方向の分布も見られなかった。ただし、夏期は郊外(住道中学)と沿岸(南港)は明かに湿度が高かった。土壌地や海の影響と思われ、市街が乾燥していることが判った。ただし冬期にこの傾向は確認できなかった。また、上空の湿度は沿岸部であっても市街地と同じであることが判った。3高度による熱負荷の差観測結果に基づき、高層ビルの熱負荷を試算し、高度が熱負荷に与える影響を考察した。今までに検討されたことのない高層ビル上部の熱負荷について実測に基づく量的な知見が得られた。今後の都市の高層ビルの設計情報として有益な情報を提供することができた。