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アレクサンドリアのフィロンの倫理思想：聖書学的・思想史的考察

今後の研究では、フィロンの思想の中に見られる旧約的・ヘブライ的真理概念とギリシア的な真理探究とがどのような関係にあるのかを調べてみたい。フィロンにおいて両者の要素は並存するだけで十分に統合されていないのか、それとも両者が結合して統一体を作っているのかを研究を通して明らかにしたい。平成29年度は本研究の初年度であったので、アレクサンドリアのフィロンの著作の原典の校訂版や、主要な二次文献の収集・整備に努め、本格的な研究を行う上での基盤を整えた。また、主要なフィロン研究書に目を通し、従来の研究によって解明されたことと、まだ十分に解明されていないことの両方を確認した。従来の研究は哲学的・宗教史的視点からのものが多く、主要用語の使用例を詳しく調べる語学的分析が十分になされていないことが確認できた。モーセ五書に関するフィロンの一連の哲学的注解に目を通し、思想や表現の全体的特色を把握した上で、フィロンの倫理思想の考察に取りかかった。古代のユダヤ人哲学者であるフィロンの倫理思想を考える際には、旧約・ユダヤ教的な要素とヘレニズム的要素がどのように結び付いているかを調べることが重要である。本年度はフィロンの倫理思想の中核にある正義の観念を聖書学的・思想史的観点から分析した。具体的には、正義を表す代表的ギリシア語であるディカイオシュネーのフィロンにおける用例をすべて調べた上で、その語学的・思想的特色を吟味した。また、正義と徳との関連についてのフィロンの発言や、正義と人類愛の関係についての発言を思想史的視点から検討した。この分析の結果、フィロンは正義の源泉を神の義に求める旧約・ユダヤ教的理解から出発しているが、ギリシア的な徳(アレテー)や人類愛(フィランスローピア)の観念を導入することによって、正義の観念をより普遍化していることが明らかになった。この研究成果は、「フィロンの正義理解」という題の論文として、フェリス女学院大学キリスト教研究所編『フェリス女学院大学キリスト教研究所紀要』第3号、2018年3月、5-18頁に掲載された。本研究はアレクサンドリアのフィロンの諸著作に関する文献学分析であり、語学的分析の基礎の上に、思想史的な考察を行うことを基本としている。ただし、アレクサンドリアのフィロン研究に関しては既に多くの優れた先行研究の蓄積があるので、二次文献を批判的に吟味しながら、一次資料であるフィロンの原典の解析に取り組み、新しい解釈を提案することが大切になる。特に、研究の初期段階では、積み重ねられてきた先行研究に丹念に目を通して、内容をよく咀嚼した上でそれらに対して適切な評価や位置付けを与えると共に、未解決の重要課題が何であるかを見極めることが大切となる。平成29年度は当該研究プロジェクトの初年度であるので、まずは参照すべき重要な参考文献を古典学関係および聖書学関係のデータベースによって検索し、一次資料と二次文献を網羅した文献リストを作成した。次に、必要な資料の入手のための手配を順次行った。関連文献に日本語で書かれたものは少なく、ほとんどが英語またはドイツ語で書かれた文献であった。その一部は手持ちの資料や所属機関所有の資料で間に合わせることができたが、多くは資料を所蔵する国内の研究機関から取り寄せたり、新規購入するために取り次ぎ書店を通して海外に発注しなければならなかった。フィロン研究に必要な資料を検索し、収集する際に、国内の研究機関所蔵の資料は相互利用のシステムを通して比較的迅速に入手することができたが、一部は海外の出版社への発注による購入であったので、資料発注から入手まで数ヶ月を要することも度々あった。
萎縮筋における機械刺激による収縮機能改善のメカニズム解明

骨格筋に加わる機械刺激の変化に応じて、その細胞内タンパク質合成系の働きが制御されて、筋が萎縮・肥大することが示唆された。これは、ラットの除神経筋萎縮や培養骨格筋細胞の実験結果によるものである。さらなるメカニズム解明に必要な、マウスの廃用性筋萎縮モデルを確立できた。これらの成果を、筋の萎縮・肥大に関連する細胞・分子メカニズムと筋収縮力改善との関連を解明することに繋げたい。本研究は、廃用性に萎縮した骨格筋における萎縮・収縮力の回復に、機械刺激が有効であることを細胞・分子レベルで明らかにすること目的とする。動物モデルに加え、培養骨格筋細胞を用いることで、個体・組織における現象のみならず、刺激に対する細胞・分子の応答メカニズム(細胞内シグナル)をも解明することに挑む。本年度は、既に使用経験のあったモデル動物である除神経ラットの萎縮筋を用いて、組織化学及び生化学の検出系を確立した。主に筋組織の抗体組織染色、筋断面積の測定、筋組織の全抽出物に関する電気泳動、ウェスタンブロットを実施した。除神経後の筋に対して他動的伸張運動を行うと、萎縮が緩和され、この緩和に細胞内シグナル経路の1つであるPI3K/Akt/TOR経路が関連することが分かった。さらに培養骨格筋細胞に他動的伸張刺激を加える実験系を確立した。その細胞に関する細胞染色などの細胞生物学的検出系や、前述同様の生化学系も確立した。本系で、トリ胸筋初代培養による筋管細胞(筋線維様細胞)が肥大し、この肥大にもPI3K/Akt/TOR経路が関連することが分かった。次年度以降は、新たなモデル動物として尾部懸垂マウスを確立する予定である。非荷重による後肢筋の萎縮である為、廃用性筋萎縮のモデルとして除神経モデルより適切である。また一般に遺伝子解析という点では、ラットよりマウスの方が有利とされる。この点を勘案して動物種を変更する。筋萎縮完成後、後肢へ再荷重させることで、萎縮筋に機械刺激を加える。そのマウス下肢筋(長指伸筋、ヒラメ筋など)にっいて、電気刺激による最大収縮力を測定し、確立済みの組織化学、生化学を実施することで、萎縮・収縮力の回復と再荷重の関連や、関与する細胞内シグナルを解明する。さらに、その細胞内シグナルの機械刺激に対する応答性を、培養細胞を用いて解明する。昨年度までに、除神経ラットの萎縮筋を用いて、組織化学及び生化学の検出系を確立した。さらに培養骨格筋細胞に他動的伸張刺激を加える実験系を確立して、細胞染色などの細胞生物学的検出系や、前述同様の生化学系も確立した。本年度は、新たなモデル動物として尾部懸垂マウスを確立した。この点を勘案して動物種を変更した。次年度に、筋萎縮完成後に後肢へ再荷重させることで、萎縮筋に機械刺激を加える。そのマウス下肢筋(長指伸筋、ヒラメ筋など)について、電気刺激による最大収縮力を測定し、確立済みの組織化学、生化学を実施することで、萎縮・収縮力の回復と再荷重の関連や、関与する細胞内シグナルを解明する。動物モデルに加え、培養骨格筋細胞を用いることで、個体・組織における現象のみならず、刺激に対する細胞・分子の応答メカニズム(細胞内シグナル)をも解明することに挑むものである。前年度までに、ラット除神経筋萎縮モデルや、トリ骨格筋初代培養細胞の他動的伸張刺激による肥大モデル用いて、組織化学、細胞生物学、生化学の検出系を確立した。これらの筋萎縮や筋肥大と、細胞内シグナルPI3K/Akt/TOR経路の関連が示唆された。さらに前年度より、廃用性筋萎縮モデルとしてより適切な尾部懸垂マウスを導入した。

本マウスの下肢筋(長指伸筋、ヒラメ筋など)の湿重量は、先行研究と同様に、概ね1週間の尾部懸垂(廃用)で顕著に減少した(筋が萎縮した)。追加の1週間で、さらに減少するものの変化量が小さかった。今年度より、マウス筋線維の横断面積を、筋線維タイプ別に詳細に解析することに着手した。サンプル処理・解析プロトコールの概略が定まった(データ取得・解析中)。さらに尾部懸垂期間中に、短時間の再荷重をさせる群を導入した(データ取得・解析中)。どの程度の再荷重量で、萎縮が抑制できるのかという点は、臨床へのつながりを特に強く感じる。尚マウス筋について、今後、筋張力との関連にも展開したいと考えている。一方、培養筋細胞の他動的伸張による肥大とPI3K/Akt/TOR経路の関連に迫った。この関連について、世界的に意見が分かれている。薬理的阻害実験を実施した(データ取得・解析中)。また培養筋細胞への刺激入力を、生体の筋収縮に近づけるため、電気刺激を採用した。これまでの伸張刺激条件を参考にすることで、安定した筋肥大の実験系を作成できた。この系の細胞内シグナル解明に着手したところである。
精神科訪問看護におけるメタ認知トレーニング（個人用）の介入による効果の検討

当該年度では、3名の対象者(統合失調症を持ち、地域生活をしながら訪問看護を利用している方)から本研究への同意が得られ、メタ認知トレーニング(以下、MCT)を実施した(内1名は現在実施中)。実施は担当の訪問看護師が、通常の訪問時間帯に実施した(週1回約20分間、12回)。2名の対象者は、20歳代と40歳代の男性であり、MCT実施終了後に本研究者が半構造化面接を行った。面接での対象者の発言から逐語録を作成し、一つの意味内容を一単位として客観的にデータ化を行った。そこから抽出された29のデータを分類し、【訪問看護師が実施するメリット】と【変化】の2つの大カテゴリーが抽出された。【訪問看護師が実施するメリット】は「やりやすさ」「楽しさ」「安心感」の3つの小カテゴリーに分類された。【変化】は「認知」「考え方」「視野」「感情」「対処方法」の5つの小カテゴリーに分類された。これらのカテゴリーを検討した結果、対象者と顔見知りである訪問看護師の介入は、対象者の対人的な緊張を防ぎ、MCTを楽しみながら受けることにつながると考えられた。またMCTの実施において、信頼関係の構築がMCTの効果を高める可能性が示唆された。訪問看護を利用している統合失調症患者が対象者であることから、本研究の説明を丁寧に行い、研究への協力についてじっくり考える時間を提供している。そのため、本研究の進捗状況にやや遅れが生じていると考える。本研究の対象者数を増やすために、県内の訪問看護ステーションへの協力依頼が必要と考える。協力が得られた場合に課題となるのは、端末タブレットの数である。現在、1台のノートパソコンを購入して使用しているが、将来的には3台の端末タブレットの購入を検討している。実習施設として協力を得ているA精神科病院院長と同病院訪問看護ステーションスタッフに本研究の主旨を説明し、協力の同意を得た。その後、同スタッフにメタ認知トレーニングプラス(本研究で使用するツールであり、統合失調症をもつ人のメタ認知の改善を目的として開発された:以下、MCT+)の概要、実施方法の説明会を2回に分けて行い、MCT+の実施について質疑応答を行った。現在、訪問看護の利用者2名に対して、スタッフと研究者が同行訪問して研究に関する説明を行い、本研究への同意を概ね得ている。MCT+実施に必要なノートパソコンの購入も済ませ、利用者の主治医の承認後、速やかに実施予定である。2017年6月に第27回日本精神保健看護学会にて“語りを促す「メタ認知トレーニング」で患者さんの心を軽くしよう!"をテーマとしてワークショップを開催し、本研究で使用するMCT+を精神科看護に携わる専門家に紹介し普及啓発に努めた。2017年11月にWFMH(世界精神保健連盟)の国際学会がインドのニューデリーで開催され、本研究者は「地域で生活をする統合失調症患者に対するメタ認知トレーニング+の効果検討」をタイトルとしたポスター発表を行った。これは本研究につながる「地域生活を行う統合失調症患者の再発を予防する日本語版ソフトの作成と開発」(基盤研究(C)20142016、本研究者代表)の研究結果を発表したものであり、主にインドの研究者らとMCT+や統合失調症患者への認知へのアプローチについて情報交換を行うことができた。現時点で、本研究の実施体制は整っており、いつでも実施できる状態であるが、訪問看護利用者(対象者)の事情(家庭環境の変化、引越し、症状の変化等)により、本研究への協力の意思があっても実施できない状況になる等、予定通りに進展しないことが少なくなかった。また、利用者に関わる多職種専門家から、実施直前にMCT+についての説明を求められることがあった。これは極めて当然のことであり、事前に十分な説明を行うことが課題として挙げられた。

多くの職種が関わる本研究では、多職種の専門家との連携を密にしながら進めていくことが重要であることを再確認している。利用者、家族、訪問看護師、主治医、デイケアスタッフ、施設長等との情報共有と調整をしながら、対象者となる利用者、および、MCT+の実施者となる訪問看護師の精神的負担を十分に考慮することが重要である。これを踏まえながら、A病院で対象者の確保に努め、その後は他施設での協力依頼をする予定である。本研究の対象者数を増やすために、県内の訪問看護ステーションへの協力依頼が必要と考える。協力が得られた場合に課題となるのは、端末タブレットの数である。現在、1台のノートパソコンを購入して使用しているが、将来的には3台の端末タブレットの購入を検討している。先述のとおり、29年度は対象者(精神科訪問看護利用者)へのMCT+の実施ができなかったことから、計上していた謝金を支払わなかったため、次年度使用額が生じたものである。次年度使用額と30年度の助成金と合わせて、MCT+の実施に伴い、対象者および研究協力者への謝金として、随時支払う予定である。本額(961円)は次年度分の助成金と合わせて、有効に使用する予定である。
感性的微動効果を活用したリハビリテーション・ムーバの開発

この研究は、身体の運動機能に障害のある人々(主に下肢機能障害者や筋力低下が見られる高齢者)が、感性的微動運動を活用して楽しくリハビリテーションを行うことによって健康増進が図れるようなムーバ(移動機器)型のリハビリテーション機器を開発し、その感性的効果について評価するものである。本研究の成果を以下にまとめた。1.感性的微動を再現する実験ムーバの開発座面の揺動による微動と全方位移動が可能な移動機構を備えた実験ムーバを開発した。身体動作を計測しながら仮説に基づいたプログラミングにより連動制御を行うことで微動効果の検証が可能となった。2.マイミングコントローラの開発既存のスティック式コントローラでは実現が難しい活発な上肢運動でムーバを換作するマイミングコントローラの開発を行いリハビリテーション・ムーバに搭載した。コントロール時の動作部位を増やし上肢全体の運動を誘発するものである。実務的な使用には課題が残るものの、今後コントローラの特性を生かし腕や首をリズミカルに微動させることでムーバを換り楽しみながらリハビリを行うことが出来るプログラム作りに繋げてゆきたい。3.感性的微動効果の評価従来型のムーバは移動機能が中心であったが、感性に関わる移動量の少ない微動運動に焦点を当て無意識のうちに人が行っていると考えられる不快回避、覚醒維持動作の特徴をムーバ動作に取り入れた。揺動による律動と定期的な重心変化によってデスクワーク時の疲労感を減少できる可能性が示された。本研究によって、福祉機器が身体行動における感性的側面を支援するという新しい機能概念を創出できたと考えている。また、実体として検証を可能とする実験ムーバの開発により、今後の多様な感性的身体運動に関する研究の構築を可能とした。今後とも身体性を向上させるであろう様々な人の行動をムーバ動作として再現し評価を行ってゆきたい。今年度の研究実績として以下の2点が挙げられる。1.揺動運動における健常者の動作特性と感性揺動実験装置を用いて揺動の物理的インピーダンス(揺動板の回転粘性、慣性モーメント、バネ係数)の変化に伴うバランス保持運動を解析した。これにより物理的インピーダンスにより運動に対する感性について優位な違いが現れる形容詞対を抽出できた。バランスを取るという巧緻な運動要素が楽しさの創出に有用であることが確認できた(6^<th> ADCにて発表)。先に行った健常者と電動車椅子を利用した下肢障害者との動作比較実験において健常者の特に停止時、着座時における身体のささやかな動き、微動は精神活動や感性に重要な役割を果たしているのではないかということが示唆された。本研究では今後、特に停止時の身体運動を機器的にアシストする機能について注目する。来年度からより精度の高い下肢障害者、健常者動作の観察・解析から新たな微動運動の抽出を行う。また、電動車椅子を使用する下肢障害者についてインタビュー調査を行いより実務的レベルでの設計に必要な運動特性、機能についての考察をまとめる予定である。今年度重点を置いた揺動については、移動機構への搭載を行い試作モデルを設計・製作する予定である。2.動作シミュレータの開発リハビリテーション・ムーバ試作のための実験環境整備のために、身体運動とムーバの運動の関係を探るためのシミュレーションを開発した。これは、試作ムーバを製作する前段階として、座面を取り付けた揺動装置をスクリーンの事前におき、移動運動を仮想空間上に再現し動作実験を行うものである。来年度から揺動を伴った移動を行うための操作情報の抽出とマイミングコントローラによる操作シュミレーション実験を行う予定である。リハビリテーション・ムーバの開発のためには、ムーバを構成するコントローラ、微動装置、移動機構の3つの要素について研究・開発を行う必要がある。

本年度の研究はコントローラの試作及び微動の一種である揺動を再現する装置の設計・試作とそれらを搭載した試作車椅子の製作の3点からなる。(1)コントローラの試作2つの3軸加速度センサを用いて両腕の運動を感知することにより車椅子の制御ができるマイミングコントローラを設計・試作した。さらに(3)で試作したオムにホイールを用いた電動車椅子に搭載し動作テストを行った。(2)車椅子用揺動装置の設計昨年度分析をおこなった揺動運動における物理的インピーダンスの変化に対する感性特性の違いを基に、車椅子用揺動装置の仕様を決定し設計・試作を行った。(3)試作一号機製作上にマイミングコントローラ及び車椅子用揺動装置を全方位移動が可能なオムニホイールを用いた電動車椅子に搭載し実動モデルを制作した。(試作一号機)動作テストの結果、2つの三軸加速度センサによって全方位への移動、回転を制御することができた。感性に関わる微動運動を再現するためにはより多くの運動感知センサを用い身体運動を制御へのフィードバックとして用いることが必要である。また律動といったリズムを刻む微動を再現するためには応答性の改善が必要であることが示唆された。ひきつづき、試作一号機を用いて揺動による微動効果について感性と生理的変化の測定を行い評価してゆく。本年度の研究成果は以下の3点である。1.微動動作要素の抽出具体的な微動動作や発現状況を抽出するために、研究協力者の学生の参加によりブレインストーミングによる動作項目の列挙とKJ法による分類を行った。合わせてクラスター分析と数量化理論III類によるマッピングを行い健常者の日常的な動作の中に見られる微動動作が気分転換やストレス回避のために行われることが認められた。2.試作機を用いた動作実験の評価方法の検討感性的側面からリハビリテーション効果を評価するための方法について文献調査とプレ実験の結果を基に検討を行った。検討の結果、以下の3つの評価手法を妥当とし、実験計画を立てた。・ムーバの操作評価についてはNASA-TLXの設問をより適した内容に改良して用いる。・唾液中のアミラーゼを計測し、それを生理的なストレス指標として用いる。・主観評価については気分形容詞尺度法を用いる。3.試作機の開発・改良より実務的な環境で評価実験を行えるよう前年度より制作を行ってきたリハビリテーション・ムーバ試作機の改良を行った。オムニホイールによる全方位移動機構へ搭載するための車椅子用揺動装置の設計を変更し座面を旧型より低く抑えるとともにバッテリー駆動を可能とした。したがって一般的な電動車椅子と同様に通常のオフィス空間での動作評価・実験が可能となった。来年度は試作したリハビリテーション・ムーバを用い最終的な評価実験を行う予定である。
腸管におけるビタミンD受容体遺伝子の発達段階特異的発現制御機構

ビタミンDは、腸管からのカルシウム吸収を促進する因子であり、骨代謝調節機構に重要な役割を果たしている。ビタミンDの生理作用は核内受容体であるビタミンD受容体(VDR)の機能を介して発揮される。VDRは、カルシウム・リン代謝調節の役割を担う臓器に強く発現しているが、腸管でのビタミンD作用効果は発達段階において異なり、主に離乳以降において増強することが知られている。すでに我々は、ヒトVDR遺伝子のプロモーター解析により、腸管特異的エンハンサー領域を同定し、ホメオボックス遺伝子であるCdx-2がVDR遺伝子の小腸での発現に重要は働きをしていることを明らかにした。本研究では、腸管におけるビタミンD受容体遺伝子の発達段階特異的発現制御機構の解明を試みた。ラット小腸よりラットCdx-2cDNAをクローニングし、発達段階におけるCdx-2発現をノーザンブロット法により確認した結果、VDR発現は、生後4週より著しく誘導するのに対し、Cdx-2発現は離乳期前後において全く変動しないことが明らかになった。また、離乳を一週早めた早期離乳ラット小腸においては、VDRの発現誘導時期は早まるが、Cdx-2においては変化は見られなかった。さらに、同定したヒトVDR遺伝子の腸管特異的エンハンサー配列を含む合成DNA断片をプローブとし、授乳期(2週齢)のラット小腸粘膜から抽出した核蛋白質を用いてゲルシフトアッセイを行った結果、Cdx-2の結合は確認されなかった。以上のことから、VDR遺伝子の発達段階特異的発現制御にはCdx-2の発現誘導は必須でなく、授乳期においてCdx-2機能を制御する因子の存在が重要であることが示唆された。今後、酵母One-hybrid法およびTwo-hybrid法を用いた発達段階特異的発現制御因子の検索を行う予定である。
極低温下における重い電子系物質の磁気応答

本研究では標記研究課題に基づき、(1)重い電子系CeRu_2Si_2のメタ磁性と体積効果、(2)Ce_xLa_<1-x>B_6の磁気相図、(3)重い電子系超伝導体の混合状態における磁気応答について研究を行った。以下に結果を報告する。(1)重い電子系CeRu_2Si_2のメタ磁性と体積効果CeRu_2Si_2のメタ磁性磁化と磁歪を極低温下(100mK)で同時測定し、熱力学関係式を使って1パラメータースケール則を検証した。その結果、スケール則は低温でも良く成り立っていることがわかった。またスケール則を使って等体積磁化過程を評価したところ、等積過程でもメタ磁性を示すことがわかり、体積効果以外のメタ磁性機構の存在が確認された。La濃度50%75%の試料の磁化過程を詳しく調べ、詳細なH・x・T相図を得た。その結果、ゼロ磁場における反強四重極秩序はLa濃度70%付近で突然消失し、替わって反強四重極秩序を伴わない反強磁性相が出現することがわかった。(3)重い電子系超伝導体の混合状態における磁気応答CeRu_2の超伝導相におけるピーク効果について、純良単結晶を用いて詳細な磁化測定を行った。その結果、磁化ヒステリシスを平均して得られる熱平衡磁化にはピーク効果近傍で異常がなく、この系のピーク効果が何らかの磁束系の相転移によるものではなく、ピニング機構における何らかの異常によるものであることが判明した。
細胞内低酸素センサーの人為的調節による臓器プレコンディショニング獲得への基礎研究

酸素濃度感知性転写因子であるhypoxia-inducible factor 1(HIF-1;低酸素誘導性因子1)と低酸素センサーの活性を指標に明らかにあるために培養細胞を用いた実験系とラットや遺伝子改変マウスを用いた実験系を用い酸素供給と需要のバランスで決定される酸素ホメオスターシスを分子生物学を援用しリアルタイムでモニターする実験系をin vitroまたin vivoで構築し、低酸素応答性の遺伝子発現またその結果としての細胞、組織の表現型と合わせて評価することが本申請の目的であった。昨年度の研究成果を受けて今年度は以下の研究成果を得た。#1 in vitro細胞酸素消費測定系の確立クラーク電極を用いた酸素分圧測定を使い、培養細胞の酸素消費量、細胞内ATP濃度、細胞培養上清中の乳酸・ピルビン酸の濃度の実験系を確立した。各種のミトコンドリア電子伝達系の阻害薬を用いた検討により細胞の種類により酸素消費量のミトコンドリアへの依存率に差がある事が判明した。静脈麻酔薬であるpropofol, thiopental, thyamilalがHIF-1活性を阻害することにより解糖系主体の代謝経路の抑制がおこり細胞内ATP濃度が減少することを見いだした。#2低体温が生体の低酸素誘導性の遺伝子発現に及ぼす影響を検討するため培養細胞とマウスを用いた実験系を構築して以下の様な結果を得た。摂氏32度程度の低温は4時間以内では培養細胞、脳における低酸素誘導性のHIF-1活性化やその下流遺伝子発現に大きな影響を及ぼさない。一方24時間にわたる低温への暴露によりHIF-1の活性化が阻害された。#3マウス個体を低酸素環境下で飼育し薬剤を処理を施し脳、肝臓、心臓、肺、筋肉など各種臓器のHIF-1活性化をアッセイする実験系を確立した。低酸素センサー酵素の活性を生体に無害な低分子化合物を用いて調節することによりhypoxia-inducible fact1(HIF-1;低酸素誘導性因子1)を介した低酸素誘導性遺伝子応答を制御し生体の酸素ホメオスターシスを調節し、低素・虚血、また再酸素化・再潅流による臓器、細胞障害の予防法を確立するための細胞生物学的検討、実験小動物をちいた基礎実験と臨床応用への準備を行うことが本申請の目的である。すでに提出している研究計画に基づき本年度は以下の研究成果を得た。#1.培養細胞、細胞抽出液を用いたin vitro実験#1-a樹立細胞株であるHep3B細胞、HEK293細胞を用いた初期実験においてn-propyl gallate(nPG)がHIF-1の強い誘導常酸素環境下でもたらすことを見いだしているが、誘導のタイムコース、また有効時間などの因子についての検討をった。#1-b上記の検討を様々な組織由来の初代培養細胞(血管内皮、血管平滑筋、)を用いて行い、初代培養細胞においもnPGが強いHIF-1活性化作用を有する事を見いだした。このnPG活性は細胞内低酸素センサーへの直接作用によるもである事を示した。#2.実験小動物を用いたin vivo実験さらにマウスにnPGを経口投与する事により腎臓においてエリスロポエテンのmRNA、血中のエリスロポエチン濃度の昇が起こる事を見いだした。以上の研究成果を公刊した。
HLAの関与する解熱鎮痛薬誘因性重症薬疹の初期発症メカニズムの解明

スティーブンス・ジョンソン症候群(SJS)および中毒性表皮壊死症(TEN)は免疫系を介する重篤副作用である。近年、被疑薬毎にSJS/TEN発症と関連するヒト白血球抗原(HLA)多型があることが明らかとなってきた。低分子薬物が異常免疫応答を誘導する機序としては、薬物が体内のタンパク質に結合し抗原性を得るというハプテン仮説の他に、薬物が免疫系の受容体と直接相互作用するというp-i仮説、薬物がヒト白血球抗原に提示されるペプチドの種類を変えるというAltered peptide repertoire仮説が提唱されている。本研究では、SJS/TEN発症機序の解明を行うことを目的とし、HLAとの関連が明らかとなっている複数の被疑薬とHLAの組み合わせについて、1)被疑薬と関連HLAタンパク質との分子間相互作用解析装置Octetを用いた親和性評価、及び2)可溶性HLA発現C1R細胞とLC-MSを用いたHLA提示ペプチドの網羅的解析を行った。その結果、複数の被疑薬と関連するHLAタンパク質との組み合わせについて、その解離定数を比較評価することができた。また、可溶性HLAを発現するC1R細胞から、HLA-B2M-ペプチド複合体を精製するプロトコルを確立した。この系を用いて、HLA-A*02:06、HLA-B*15:02、HLA-B:51:01提示ペプチドをそれぞれ1,000種類以上同定した。HLA-B*02:06提示ペプチドに対してアセトアミノフェンまたはロキソプロフェン処理の影響を、HLA-B*15:02、HLA-B*51:01提示ペプチドに対して抗てんかん薬処理の影響を、それぞれ解析した。その結果、特定の薬剤とHLAたんぱく質の組み合わせにより、特殊なペプチドの提示が誘導されることを見出した。本研究では、HLAとの関連が明らかとなっている複数の被疑薬とHLAの組み合わせについて、発症機序の解明を行うことを目的とした。今年度は、1)分子間相互作用解析装置Octetを用いた関連HLAタンパク質と被疑薬との親和性評価、及び2)可溶性HLA発現C1R細胞とLC-MSを用いたHLA提示ペプチドの網羅的解析を行った。まず分子間相互作用解析に供するため、リコンビナントのHLA及びβ-2-Microglobulin(B2M)にペプチドをFoldingさせ、安定な複合体を得た。この複合体と薬物を用いて、Octetによる薬物-HLA複合体相互作用解析プロトコルを確立した。薬物処理により、提示ペプチドの各ポジションに配置される各アミノ酸の頻度が変化するか否かを検証した。また、薬物処理により特徴的なペプチドが提示されるようになるか否かを検証した。その結果、特定の被疑薬とHLAの組み合わせでは、薬物依存的に、異常なペプチド提示が誘導されることを示唆する結果を得た。低分子薬物が特定のHLA型を介し異常な免疫応答を誘導する分子機構として、薬物が免疫系の受容体と直接相互作用するというp-i仮説、薬物がヒト白血球抗原に提示されるペプチドの種類を変えるというAltered peptide repertoire仮説が考えられる。このうち、分子間相互作用解析によりp-i仮説を、可溶性HLA発現C1R細胞を用いた実験によりAltered peptide repertoire仮説を検証することが出来た。また当初の予定では、重症眼障害併発性解熱鎮痛剤誘発性SJS/TENについて、関連HLAタンパク質との親和性評価や提示ペプチド解析を行う計画であったが、解熱鎮痛剤以外の薬剤を原因とするSJS/TEN発症機構についても研究が進み、興味深い結果を得た。

また、可溶性HLAを発現するC1R細胞から、HLA-B2M-ペプチド複合体を精製するプロトコルを確立した。この系を用いて、HLA-A*02:06、HLA-B*15:02、HLA-B:51:01提示ペプチドをそれぞれ1,000種類以上同定した。HLA-B*02:06提示ペプチドに対してアセトアミノフェンまたはロキソプロフェン処理の影響を、HLA-B*15:02、HLA-B*51:01提示ペプチドに対して抗てんかん薬処理の影響を、それぞれ解析した。その結果、特定の薬剤とHLAたんぱく質の組み合わせにより、特殊なペプチドの提示が誘導されることを見出した。HLAと薬物の分子間相互作用解析については、特異的な結合が確認できていない。この結果から、p-i仮説以外のメカニズムが示唆される。しかしながら、本実験では、特定のペプチドとFoldingさせたリコンビナントHLAを用いている。そのため、ペプチドの配列に依存的な現象を見逃している可能性が残る。この可能性を排除するため、今後は、他の配列のペプチドを用いてFoldingさせたHLAを用いて検証実験を行う。Altered peptide repertoire仮説の検証実験では、SJS/TENの原因薬物により、HLAタンパク質が特殊なペプチドを提示しうることを示唆する結果を得た。今後、この結果を検証するとともに、実際に薬物により特徴的なペプチド提示が起こることを大腸菌から精製したHLAタンパク質と合成ペプチドを用いてin vitroで検証する。HLA提示ペプチド解析の条件検討において、当初の予定では、繰り返し条件検討を行う予定であったが、想定していたよりも早い段階で良好な結果を得ることができたため、質量分析に関わるカラム等の支出を抑えることが出来た。本年度行った実験から、薬物依存的に特殊ペプチドの提示が誘導される可能性が示唆されたため、繰り越し分については、HLAの特殊ペプチド提示能をin vitroで検証する実験に使用する。
転写制御のアーキテクチャー:マルチ亜鉛フィンガーの構築と機能解析

天然制限酵素の認識よりも広い2030塩基対程度の非対称配列の認識を達成するため、1つの亜鉛フィンガーモチーフ当り3塩基を認識するSp1由来のCys_2His_2型亜鉛フィンガーモチーフを6つおよび9つ導入すると共に、N末端側にDNA切断部位としてトリペプチドGGHをも導入した新規2Sp1GGHを設計・創製した。一般に大腸菌中で発現させた蛋白質のN末端はメチオニンになることが知られているので、トリペプチドGGHをN末端側に制限プロテアーゼ因子Xaの切断部位を含む形で、6つあるいは9つの亜鉛フィンガー部分のN末端に導入した。その結果、予想通り制限酵素類似の機能を示した。ショウジョウバエから単離された亜鉛フィンガー蛋白質GF2のフィンガー5は天然には珍しくAT塩基を認識している。そこで、Sp1のフィンガー2における位置にCF2のフィンガー5で見られるアミノ酸V、Y、Kをそれぞれ導入したSp1-亜鉛フィンガー変異体(Sp1VYK2)やSp1とCF2のキメラ亜鉛フィンガー蛋白質など、新しいAT認識型の亜鉛フィンガー蛋白質の分子設計を行った。得られた蛋白質を用いて、5'-GGG-TAT-GGG-3'のようなDNA配列への高選択的結合能などを評価した結果、予想通り標的DNAへの高い結合性が認められた。転写因子Sp1の3つの亜鉛フィンガードメインを基にポリグリシンで連結した新規6-亜鉛フィンガー型蛋白質を設計・創製した。その結果、4個のグリシンをリンカーとして連結させた6-亜鉛フィンガー蛋白質はDNAを湾曲化させることは出来なかったが、7個あるいは10個のグリシンをリンカーとして連結させた6-フィンガー蛋白質はDNAを大きく湾曲化させた。これらの新しい人工分子は、遺伝子機能の制御に新しい概念と手段を与えるものであり、近い将来、人工遺伝子制御分子としての開発が期待される。DNAの情報をRNAに伝えるいわゆる転写は、生体反応において重要な位置を占めている。転写には、DNA結合タンパク質のDNA特定塩基配列への結合やそれに伴うDNA構造変化、中でも湾曲が大きく関与している。それ故、特定の塩基配列に結合し、DNA湾曲を誘発する人工分子は、新しい転写機能制御因子として期待される。代表的なDNA結合モチーフの1つである亜鉛フィンガーを複数個連結させることにより、長い塩基配列を認識することが可能である。転写因子Sp1の三つの亜鉛フィンガードメインを基にポリグリシンで連結した新規6-亜鉛フィンガー型タンパク質を設計・創製した。その結果、4個のグリシンをリンカーとして連結させた6-フィンガータンパク質はDNAを湾曲化させることは出来なかったが、7個あるいは10個のグリシンをリンカーとして連結させた6-フィンガータンパク質はDNAを大きく湾曲化させた。このDNA湾曲の誘起は、遺伝子機能の制御に新しい概念と手段を与えるものであり、近い将来、人工遺伝子制御分子としての開発が期待される。転写因子Sp1の三つの亜鉛フィンガードメインを基にアルギニンやグルタミン酸など電荷の異なったアミノ酸残基で連結した新規6-亜鉛フィンガー型タンパク質を設計・創製した。その結果、アルギニンおよびグルタミン酸で連結させた6-亜鉛フインガータンパク質は同じようにDNAを湾曲化させたが、DNA結合の動力学では、両タンパク質で大きく相違していた。

また、sp1の3フィンガーを1単位として、それらを2個あるいは3個直列に連結した6-亜鉛フィンガーあるいは9-亜鉛フィンガータンパク質を設計する上で、リンカー配列を天然によく保存されているTGEKP配列から一部TFIIIA様配列に改変した。その結果、新たにリンカー配列を改変したタンパク質では、天然型リンカー配列をもつ亜鉛フィンガータンパク質とは大きく異なるDNA結合様式を与え、DNA結合において、すべての亜鉛フィンガーを使用していないことが明らかになった。このDNA湾曲の誘起やDNA結合の性質の違いは、遺伝子機能の制御に新しい概念と手段を与えるものであり、近い将来、人工遺伝子制御分子、特に、人工転写因子としての開発が期待される。
アドミセルの高機能化とバイオレメディエーションの融合による排水浄化システム設計

水中の各種疎水性有機汚染物質を、迅速かつ高効率に除去するため、アドミセルを調製した。アルミナと陰イオン界面活性剤、シリカと陽イオン界面活性剤から調製したアドミセルの内部は疎水的であり、疎水性有機汚染物質が容易に捕集された。また、水酸化アルミニウムと陰イオン界面活性剤の併用により、有機汚染物質や殺菌剤が効果的に除去できた。捕集後いくつかの汚染物質は、バクテリアにより分解されることが分かった。水中から有機汚染物質および重金属イオンを迅速に捕集するのに適したアドミセル分離媒体を、界面活性剤と固体担体の組み合わせにより設計・調製した。鉱物酸化物もしくは水酸化物の帯電表面に反対電荷の界面活性剤を吸着させると、電荷が中和され凝集性が向上した。さらに、液下部から気泡を送り込み、気泡表面に粒子を吸着させ、迅速に浮上・回収することができた(フローテーション)。蛍光分子プローブを用いる微視的環境測定を行なった結果、粒子表面に吸着した界面活性剤がアドミセルまたはヘミミセル様会合体を形成し、疎水性有機化合物の取り込みに適した疎水環境が形成されていることが分かった。そこで水中の疎水性有機汚染物質の除去を試みたところ、目的物質をアドミセル分離媒体に捕集し、フローテーションにより迅速に回収することができた。さらに、界面活性剤を栄養源として活性化するバクテリアを用いて、アドミセル分離媒体に捕集された有機汚染物質を分解することができた。一方、重金属イオンの捕集・除去については、適切なキレート試薬を添加して重金属イオンを疎水性キレート化合物とすることにより、有機物質と同様に水中から迅速に回収することができた。また、フローテーションによるアドミセル分離媒体の浮上性が試料水の塩濃度に大きく影響を受けることが分かった。以上、排水浄化システムを構築するにあたり、アドミセル分離媒体の設計指針、捕集の操作条件、有害物質の無害化方法について、次年度に向けての有用な知見を得ることができた。現在排水処理に広く用いられている凝集沈殿法は一部の金属イオンや汚濁物質の除去には効果的であるが、溶存有機汚染物質に対しては除去効率の不足が指摘されている。本研究では、界面活性剤が固-液界面に吸着して生成する分子集合体アドミセルを設計・調製し、これに水中の汚染物質を捕集することを検討した。表面が正に帯電する水酸化アルミニウム沈殿物にアニオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を吸着させた場合、トリクロサンやトリクロカルバンなどの疎水性殺菌剤に加え、マラカイトグリーンやクリスタルバイオレッドなどのカチオン性殺菌剤を効率的に捕集できた。さらに、界面活性剤を栄養源として活性化するバクテリアを用いて汚染物質を分解することを検討した。試料水中の汚染物質をアドミセルに捕集したのち、浄化水と分離し、バクテリアを作用させた。その結果、捕集・分離を行わず試料水に直接バクテリアを添加した場合に比べて、汚染物質を速やかに分解できた。また、表面が負に帯電するシリカゲルを固相担体として利用して、カチオン性界面活性剤セチルトリメチルアンモニウムクロリド(CTAC)を吸着させたアドミセルを調製した。パラオキソンなどの有機リン系殺虫剤がCTACアドミセルに捕集され、さらにこの場合はバクテリアを作用させずとも比較的速やかに分解することができた。以上、汚染物質を捕集し分解・無害化する排水浄化システムを設計するにあたり有用な知見が得られた。アドミセル分離媒体の設計と高機能化によって、疎水性有機汚染物質を迅速かつ高収率で捕集し、水中から除去する方法を確立した。今年度は、水酸化アルミニウムを担体とするアドミセルの作成とそれを用いる各種疎水性有機汚染物質の捕集を試みた。アニオン界面活性剤の吸着により、水中に細かく分散した水酸化アルミニウムは凝集し、すみやかに沈降するようになった。微視的環境プローブを用いる蛍光スペクトルの測定により、水酸化アルミニウム表面には疎水環境が形成されていることがわかった。界面活性剤吸着水酸化アルミニウムによれば、通常の凝集沈殿法によってはほとんど除去できなかった多環芳香族炭化水素、アルキルフェノール、クロロフェノール、有機塩素系殺菌剤、有機リン系農薬及びステロイドホルモンなど様々な疎水性有機汚染物質を捕集することができた。疎水性有機汚染物質を取り込んだ沈殿は静置によっても水から分離できたが、上昇気泡を用いるフローテーションによってさらに迅速かつ連続的に水中から分離・回収することができた。一方、捕集された疎水性有機汚染物質は、アニオン界面活性剤により活性化するバクテリアにより、分解された。また、有機リン系農薬は、カチオン界面活性剤を吸着させたシリカゲルに迅速に捕集され、固体表面で密に配向した界面活性剤の触媒効果によって室温で加水分解し、毒性の小さな物質に分解した。以上のように、従来の水処理技術にわずかな改良を行うだけで、多種類の疎水性有機汚染物質が効果的に除去できた。
細胞内スペックルによるＲＮＡウイルスゲノム動態制御機構の解明

C型肝炎ウイルス(HCV)のゲノム動態を制御する因子として、ストレス顆粒因子を同定した。興味深いことにHCV感染36時間後にストレス顆粒が形成され、同時にP-body形成の崩壊が見られた。HCV48時間以後は、脂肪滴に周辺にストレス顆粒因子G3BP1、Ataxin-2、poly(A)-binding protein (PABP)1がハイジャックされることが見出された。さらにこれらストレス顆粒因子G3BP1、Ataxin-2、PABP1ノックダウン細胞において、HCV複製が顕著に抑制された。以上の結果、ストレス顆粒因子はHCV複製に関与する宿主因子であることが示唆された。P-bodyは、HCVをはじめ多くのウイルス感染の標的の場として知られているが、抗HIV-1因子であるAPOBEC3GやMOV10もP-bodyに局在する。しかしながら、これら抗HIV-1因子のP-body局在の意義やHCV生活環における役割については未だ不明な点が多い。そこで、今年度はP-bodyに局在する抗HIV-1因子APOBEC3G及びMOV10のHCV生活環における役割について解析を試みた。その結果、HCV非感染細胞では、APOBEC3G及びMOV10はP-bodyに局在したが、HCV-JFH1感染細胞や全長HCV-O RNA複製O細胞においては、APOBEC3G及びMOV10のP-body局在が撹乱され、脂肪滴周辺にリクルートされ、HCV Coreと共局在した。さらに免疫沈降法により、HCV CoreとAPOBEC3G及びMOV10が結合することも見出された。しかしながら、APOBEC3Gを強制発現しても抗HCV効果は観察されなかった。一方、内在性MOV10をノックダウンしてもHCV複製の増強は見出されなかった。以上の結果より、APOBEC3G及びMOV10はHIV-1と異なり、HCVの複製に対する制限因子として作用しないことが判明した。一方、核内のスペックル構造体に局在するがん抑制因子PMLが感染性HCV伝播に関与していることを明らかにした。PMLはHCV RNA複製には関与せず、後期ステップの感染性HCV産生に関与していることが今年度の研究成果より示唆された。C型肝炎ウイルス(HCV)に対する新規抗HCV剤開発には、HCVの生活環と関与する宿主因子の解明が必要不可欠である。これまで我々はP-body因子DDX3及びDDX6 RNAヘリケースをはじめ、ストレス顆粒因子G3BP1、Ataxin2、PABP1がHCV感染により、HCV産生の場である脂肪滴周辺にハイジャックされること、そしてこれらP-bodyやストレス顆粒因子がHCV複製に関与することを明らかにしてきた。そこで、本年度は宿主因子を分子標的とした創薬開発のため、新たにHCV複製に関与する以下の宿主因子を同定し、そのHCV生活環における役割について解析を行なった。(1)核内宿主因子DDX5 RNAヘリケース及びクロマチンリモデリング因子INI1/hSNF5がHCVの複製に必要であること、(2)核小体に局在するDDX21 RNAヘリケースがHCV複製を抑制すること、そして、(3)ストレス顆粒因子Staufen1及びUPF1がHCVの生活環に必要であることを見出した。一方、HIV-1自身はRNAヘリケースを保持してないので、宿主のRNAヘリケースのHIV-1複製における役割を解析した結果、種々の異なるDDX DEAD-box RNAヘリケースDDX1、DDX3、DDX5、DDX17、DDX21、DDX56がHIV-1 Revの機能を正に制御することが明からとなった。また、HIV-1の転写活性化因子Tatの機能制御には、少なくともDDX3が関与していることが示唆された。さらにレトロトランスポゾンLINE-1のレトロトランスポジション能をP-body因子であるMOV10及びDDX3が抑制すること、LINE-1 ORF1はP-bodyにおいてMOV10あるいはDDX3と共局在し、両者に結合が見出された。以上の結果より、P-body因子はHCVのみならず、HIV-1やLINE-1の生活環にも関与することが示唆された。今年度は、HCV感染に伴う宿主の細胞質スペックルP-body及びstress granuleの動的変化とHCV感染における役割について明らかにすることを目的として実験を行い、以下のような成果を得た。(1)HCV感染24時間までは、非感染細胞と同様にDDX6などのP-body因子はP-bodyにドット状に局在し、G3BP1などのstress granule因子は細胞質に散在していた。(2)HCV感染により、感染36時間後に宿主細胞内にstress granuleの形成が誘導された。

(2)HCV感染により、感染48時間以降、stress granule因子であるG3BP1、Ataxin2そしてpoly(A)-binding protein 1 (PABP1)はリング状の構造体を形成し、HCV Coreと共局在した。また、このリング状構造体の中心が脂肪滴であり、HCV感染に伴いstress granule因子が脂肪滴にリクルートされることが観察された。さらに、HCV感染に伴いP-body因子であるDDX6やAgo2も脂肪滴周辺にリクルートされ、Coreとも共局在した。(3)外来的なストレス(熱ショックや亜ヒ酸ナトリウム処理)に応答して、HCV感染細胞内に新規なstress granuleの形成が誘導されなかった。(4)DDX6やLsm1などのP-body因子やG3BP1、Ataxin2及びPABP1などのstressgranule因子はHCVの生活環に必要な宿主因子であることが判明した。以上の結果より、HCV感染により宿主細胞内にストレス応答が生じ、P-body因子やstress granule因子がHCV産生の場である脂肪滴周辺にハイジャックされること、そしてこれらP-body因子やstress granule因子がHCVの複製に必要な宿主因子であることが示唆された。今年度の本共同研究により、HCVが抗HIV-1因子であるAPOBEC3GやMOV10のP-body局在を破綻させ、HCV産生の場である脂肪滴周辺にハイジャックすること、そしてHCV Coreタンパク質とAPOBEC3G及びMOV10が結合することが見出された。これらの結果、HCVによるAPOBEC3G及びMOV10の機能抑制の可能性が示唆された。以上の結果より、異なったRNAウイルス間におけるP-body因子の作用機序の相違点が見出され、興味深い。しかしながら、HCVとP-body局在抗HIV-1因子であるMOV10やAPOBEC3Gが相互作用することが判明したものの、そのHCV生活環における役割については不明であるので、次年度の研究課題としたい。また、核内スペックルに局在するPMLが感染性HCV粒子産生に関与していることを明らかにし、国際会議や国際雑誌で研究成果を発表したので、現在までの達成度はおおむね順調に進展していると自己評価したい。HCVやHIV-1感染に伴う宿主細胞の細胞質スペックルや核内スペックルの局在変化とウイルス感染における役割について明らかにすることを目的としているが、本年度、HCV感染に伴いP-bodyやstress granuleの局在が変化すること、これらP-body因子やstress granule因子がHCVの生活環に関与することを明らかにすることができた。今年度の研究成果より、APOBEC3Gと少なくとも内在性MOV10はHCVの抑制因子として機能しないことが示唆された。しかしながら、HCVによるAPOBEC3GとMOV10相互作用の生理的意義の解明が今後の検討課題である。一方、我々はMOV10やAPOBEC3GがレトロトランスポゾンであるLINE-1のレトロトランスポジション能も抑制することを見出しているので、これら、P-bodyに局在する抗HIV-1因子MOV10のHCVとLINE
遷移状態におけるジェミナル結合の関与

ブタジエンとエチレンのDiels-Alder反応、1,5-ヘキサジエンのコープ転位、および1,3-シクロヘキサジエンの電子環状反応の遷移状態の結合間相互作用を解析することによって反応点のジェミナル位のσ結合の関与を明らかにし、1-置換ブタジエンおよび1-置換1,5-ヘキサジエンのZ体とE体の相対的反応性と5-置換1,3-シクロヘキサジエンの回転選択性を予測した。結合間相互作用の解析より、Diels-Alder反応およびコープ転位の遷移状態において、ジエンの反応点のジェミナル結合のうちZ位のσ_<C-H>結合から、それぞれエチレンおよび1,5-ヘキサジエンのもう一方の反応点のπ結合への電子非局在化は結合的であるが、E位のσ_<C-H>結合からは反結合的であることが明らかになった。また、電子環状反応において、ジェミナル結合のうち内側回転するσ_<C-H>結合からもう一方の反応点の形成されつつあるπ結合への非局在化は結合的であるが、外側回転するσ_<C-H>結合からは反結合的であることが明らかになった。これより、環状遷移状態構造の内側にあるσ結合からπ結合への電子非局在化は結合的、外側のσ結合からは反結合的であるという共通点が見出された。ジェミナル結合関与から、1-置換ブタジエンおよびヘキサジエンのZ体とE体の相対的反応性は、Z位σ結合の電子供与性が高くなるほど、反応性が高いと予測される。同様に、5-置換シクロヘキサジエンの回転選択性は、電子供与性の高いσ結合ほど、内側回転しやすいと予測される。これらの予測は、非経験的分子軌道法および密度汎関数法による反応の活性化エネルギーによって支持された。以上、ジェミナル結合関与を解明し、環状遷移状態構造の内側に電子供与性のσ結合がある方が、反応が進行しやすいことを明らかにした。我々は、遷移状態の結合モデルを提案し、ブタジエンとエチレンのディールス-アルダー反応の遷移状態における結合の相互作用解析して、その結果から、Z-とE-1-置換ブタジエンの相対的反応性を予測した。早い遷移状態では、反応物と同じ結合もつ(反応物型結合モデル)として、遅い遷移状態では生成物と同じ結合をもつ(生成物型結合モデル)として、結合の相互作用を評価した。ディールス-アルダー反応では予想通り遷移状態は早いことが確かめられ、反応物型モデルでの解析の結果、ブタジエンの反応点のジェミナル結合のうち、Z位のσ_<C-H>軌道からエチレンのπ〓軌道への電子非局在化は結合的であるが、E位のσ_<C-H>軌道からの非局在化は反結合的であることが明らかになった。この対照的なジェミナル結合関与から、1-置換ブタジエンのZ体とE体の相対的反応性を予測した。ジエンのZ位に電気陰性度の低い置換原子がある方が、Z位のσ軌道のエネルギーは高く、またσ軌道は反応点の炭素側へ分極するため、ジエノフィルのπ〓軌道との重なりも大きくなり、σ軌道からπ〓軌道への非局在化が起こりやすく、反応性が高いと予測される。理論計算によって得られたZ-およびE-1置換ブタジエンの活性化エネルギーは予測を支持した。以上から、反応点のジェミナル結合関与が明らかとなり、さらにZとE-1置換ブタジエンの相対的反応性の予測が得られた。

また、遷移状態の結合モデルの有用性が確認できた。シグマトロピー反応および電子環状反応における反応点のジェミナル結合の関与を明らかにするため、1,5-ヘキサジエンのコープ転位および1,3-シクロヘキサジエンの開環反応の遷移状態の結合間相互作用を解析した。さらに、ジェミナル結合関与によりZ-とE-1-置換1,5-ヘキサジエンの相対的反応性および5-置換1,3-シクロヘキサジエンの回転選択性を予測した。結合間相互作用の解析より、コープ転位の遷移状態においてジェミナル結合のうち、Z位のσC-H結合からもう一方の反応点のπ結合への電子非局在化は結合的であるが、E位のσC-H結合から反結合的であることが明らかになった。また、開環反応においてジェミナル結合のうち、内側回転するσC-H結合からもう一方の反応点の形成されつつあるπ結合への非局在化は結合的であるが、外側回転するσC-H結合からは反結合的であることが明らかになった。これらから、環状の遷移状態構造の内側にあるσC-H結合からπ結合への電子非局在化は結合的、外側のσC-H結合からは反結合的であるという共通点が見出された。ジェミナル結合関与から、1-置換ヘキサジエンのZ体とE体の相対的反応性は、Z位の置換原子の電気陰性度が小さいほどσ結合の電子供与性が高くなるため、π結合への非局在化が起こりやすく、反応性が高いと予測される。理論計算によって得られたZ-およびE-1-置換ヘキサジエンの活性化エネルギーは予測を支持した。同様に、5-置換シクロヘキサジエンの回転選択性は、電気陰性度の小さい置換原子が内側回転しやすいと予測され、理論計算によって得られた5-シクロヘキサジエンの回転選択性から予測の確証を得た。以上、シグマトロピー反応および電子環状反応におけるジェミナル結合関与を解明し、環状の遷移状態構造の内側に電子供与性のσ結合がある方が、反応が進行しやすいことが明らかになった。
精密分子設計に基く光合成酸素発生錯体の研究

1.マンガンポルフィリン二量体による酸素発生機能の最適化酸素発生能を有するマンガン含有錯体の一つとしてマンガンカタラーゼはマンガン2核錯体を反応中心に持ち、過酸化水素の不均化を触媒している。この錯体は光合成反応中心のにある水の酸化酵素との関連において重要である。水の酸化酵素のモデル錯体を設計するための指針を得るためにカタラーゼ活性とマンガンイオン間距離の関連を研究した。マンガンイオン間距離を堅固に固定するために各種のスペーサー分子によりイオン間距離とその相対配置を調節したマンガンポルフィリン2量体を合成した。これらを触媒として過酸化水素の不均化反応を速度を検討したところマンガンイオン間距離が5Å程度のものは極めて高活性であるが、これより長くなるとその活性はマンガンポルフィリン単量体のものと同程度の低活性であった。一方、同位体標識過酸化水素を用いた実験、速度論的解析等により、これらの2量体と反応する1分子目の過酸化水素は2個のマンガンイオンと同時に相互作用し酸素・酸素原子間がホモリシスすることにより1段階でマンガン(IV)錯体を形成していることが結論付けられた。以上の結果より水の酸化における酸素発生においてはマンガンイオンと酸素がMn-O-O-Mnの結合を形成できるような配置をとすことができるように錯体の設計を行なう必要があることが示唆された。2.マンガンポルフィリン二量体の酸化による酸素発生上記の結論をもとに植物の光合成反応中心に存在する酸素発生錯体は4核のマンガン錯体のモデル錯体としてオルトフェニレンにより結合されたマンガンポルフィリンを合成した。含水溶液中でこれらのマンガンポルフィリン2量体を触媒とし電気化学的に陽極酸化反応を行なったところ酸素発生が認められた。これらの錯体を含まない溶液中では酸素発生が認められないことからこの錯体が酸素発生を触媒しているものと結論付けられた。