hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子組み換え作物中DNA分子の土壌生態系における挙動・影響を探る

既往の文献では、DNAの土壌粒子への吸着実験にはTris緩衝液がよく使用されている。これはTris緩衝液中でDNAが安定に存在することに依拠しているが、土壌粒子へのDNA吸着にTris分子が与える影響については不明であった。数種の粘土鉱物、腐植酸、土壌へのDNA吸着にTris分子が与える影響を調査したところ、幾つかの粘土鉱物と土壌では、Tris分子存在下でDNA吸着量が有意に増減した。このため、土壌へのDNA吸着実験にはTris緩衝液は不適切であることが判明した。土壌からのDNA抽出効率は、土壌中の腐植含量に大きく影響されるが、DNAの腐植物質への親和性や吸着機構に関しては一致した見解が得られていない。そこで、黒ぼく土から精製した腐植酸と市販の腐植酸へのサケ精子DNAの吸着・脱着実験を実施した。腐植酸にDNAは強く吸着しており、用いた4種の抽出剤では殆ど脱着しなかった。土壌中でのDNA動態に腐植物質が与える影響は、土壌pH、腐植物質含量などによって変化するものと予想された。日本に広く分布する黒ぼく土からDNAを抽出する際は、スキムミルクの添加が必須であるが、その機序は不明である。スキムミルクの成分であるカゼインに注目し、カゼインが、黒ぼく土や腐植酸、アロフェン、ゲータイトへのDNA吸着に与える影響を検討した。カゼイン添加により黒ぼく土やアロフェン、ゲータイトへのDNA吸着量は減少したが、腐植酸では、カゼインの添加量が少ない場合はDNA吸着量は増加し、溶液中のカゼイン濃度が1mg/mL以上になるとDNA吸着量は低下した。この結果より、黒ぼく土からDNAを抽出する際にスキムミルクの添加が必須であるのは、粉砕した微生物体から放出されたDNAが土壌成分、とくに腐植物質へ吸着するのをカゼインが妨害することによると推察された。作物の細胞からDNAが単独で放出されるわけではないので,他の生体高分子化合物と共存した状態でのDNA挙動を考えなければならない.そこで,共存する有機物の例として,生体高分子物質を扱う実験に広く使われているTris (hydroxymethyl)-aminemethane hydrochlodire (Tris-HCl)緩衝液を供試した.土壌粒子へのDNA吸着に関する研究にも,Tris緩衝液がバックグラウンドとして使われている(例:Cai et al.2006a ; 2006b).最近,タンパク質の金属への吸着に対して,Tris緩衝液が正の影響を与えると報告された(Wei et al.2009).黒ボク土および各種土壌構成成分へのDNA吸着に対するTris緩衝液の影響を調べた.黒ボク土,天然および合成アロフェン,ゲータイト,ギブサイト,カオリナイトで,0.1 M NaCl溶液(pH7.0)の場合に比べて,0.1 M Tris-HCl (pH7.0)緩衝液でDM吸着量が有意に大きかった(p<0.05).対照的に,モンモリロナイトでは,Tris緩衝液でDNA吸着量が有意に少なかった(p<0.05).総括的に,Tris分子は,黒ボク土等の変異荷電土壌粒子へのDNA吸着に対して有意に影響したことが分かった別の実験として,供与DNAとして土壌に吸着させた抗生物質(アンピシリン)耐性のプラスミド,受容細菌としてE.coliを使用し,黒ボク土に吸着された遺伝子DNAの自然形質転換頻度を評価することを試みた.しかし,抗生物質が土壌に吸収されたためか,形質転換発現の判別がうまくできなかった.新たに、抗生物質等の生体由来高分子化合物の土壌構成成分への吸着を調べる必要性を認識した既往の文献では、DNAの土壌粒子への吸着実験にはTris緩衝液がよく使用されている。

この結果より、黒ぼく土からDNAを抽出する際にスキムミルクの添加が必須であるのは、粉砕した微生物体から放出されたDNAが土壌成分、とくに腐植物質へ吸着するのをカゼインが妨害することによると推察された。
変分問題に関連する自由境界問題の数理解析

変分問題の中心課題の一つである自由境界問題の研究を行ってきた。視点としては、変分構造により、解の特異点等「定義域より低い次元の集合」をコントロールしている問題として統一的に捉えている。この特異集合の位置、正則性の理論の構築、数値解析プログラムの作成を行うことが目標であった。研究は補助金のおかげと、研究分担者の協力により、大きな進歩をみせた。変分汎関数の積分領域が動く自由境界問題では、非線形楕円型の場合で空間次元が2であるとき、自由境界の法線がヘルダー連続であることが示された。また、双曲型の時は、1次元の場合に、初期値と境界値にある種の関係が成り立てば、強い解(自由境界は2階連続微分可能)の構成を行うことができた。さらに、この数値解析法の開発も行い、高い精度が期待できる結果を得た。また、低温超伝導のモデル方程式であるGinzburg-Landau方程式の数値解析法(楕円、放物、双曲型)の開発も行った。この問題は、vortexと称する渦状の高エネルギーの場所が生ずるのが特徴である。特に、波動方程式では、vortexが粒子のように運動するという結論を得た。我々の用いた手法は、液晶の数値解析にも使用可能である。以上の成果を、学術誌掲載(予定も含む)5報、国際会議議事録(レフェリー付き)2報、投稿中のプレプリント1報にまとめることができた。今後の課題として、より高次元の問題への対処、より特異性の高い問題への拡張、安定性の議論などの整備が考えられる。本研究は、自由境界もつ汎関数の最小化問題の解法の開発と、離散的勾配流を用いた数値解法の開発を目標としている。これは、最近の変分問題の興味の一つである、変分構造が、特異点等の「定義域よりも低い次元の集合」を支配する問題に該当している。これらの結果はGinzburg Landau問題の数値解法の開発と併せて行われ、楕円型、放物型については、一応の結果を出した。(小俣:業績の項参照)手法は、離散勾配流を用いたもので、最小化の技法によっている。また、球対称解との比較も一部で行い結果の信頼性は高いと判断している。また、時間依存の場合の双曲型方程式の自由境界問題についても研究対象とし、解法の開発を行ってきた。空間1次元の問題については、信頼性の高い解法プログラムの開発が完了したが、2次元以上の問題については、自由境界条件の設定がうまくいかず、完成に至っていない。さらに、真の解の構成では、空間1次元の場合に、強い解の存在する十分条件が得られ現在投稿中である。弱い解についてはまだ、適当な関数空間が見つかっていない。研究は補助金のおかげと、研究分担者の強力により、大きな進歩をみせた。変分汎関数の積分領域が働く自由境界問題では、非線形楕円型の場合で空間次元が2であるとき、自由境界の法線がヘルダー連続であることが示された。また、双曲型の時は、1次元の場合に、初期値と境界値にある種の関係が成り立てば、強い解(自由境界は2階連続分可能)の構成を行うことができた。

我々の用いた手法は、液晶の数値解析にも使用可能である。以上の成果を、学術誌掲載(予定も含む)5報、国際会議議事録(レフェリー付き)2報、投稿中のプレプリント1報にまとめることができた。今後の課題として、より高次元の問題への対処、より特異性の高い問題への拡張、安定性の議論などの整備が考えられる。
吸血性昆虫由来のNO合成酵素NOキャリアー蛋白の性状および構造の解析

オオサシガメ唾液線由来の血液凝固インヒビター、プロリクシンS、をバキュロウイルスをもちいて昆虫細胞で大量発現させた。この組み替え蛋白を用いて種々の凝固因子との結合実験、再構成系での酵素活性阻害実験をおこない、プロリクシンSの凝固阻害機構をほぼ完全に解明することができた。1、プロリクシンSは凝固第IX因子および活性化後のIXa因子に特異的に結合する。2、この結合には生理的濃度のカルシウムイオンの存在が必須である。3、プロリクシンSの凝固第IX因子への結合は、XIa因子及びVIIa/組織因子/リン脂質複合体による活性化を阻害する。4、IXa因子へのプロリクシンSの結合はリン脂質への結合を阻害し、これによりIXa/VIIIa/リン脂質複合体(Xase complex)の形成が阻害される。以上の結果(3、4)よりプロリクシンSは内因系凝固ばかりでなく外因系凝固も同時に阻害することが新たに明らかになった。5、IX因子から細胞膜結合部位であるGlaドメインを除くとプロリクシンSが結合できなくなった。このことより、プロリクシンSの結合部位がGlaドメインであり、カルシウムイオンの結合によるこのドメインの構造変化を認識して結合することが推測された。今後、プロリクシンS/Glaドメイン複合体を結晶化する予定である。すでにGlaドメインを化学合成した。これとバキュロウイルスをもちいて大量発現させたプロリクシンSを用いてプロリクシンSの構造と機能のさらに詳しい解明をおこないたい。1, prolixin-Sをrecombinant GST-fusion proteinとして発現し活性のある組み換え蛋白であることをかくにんした。この蛋白を用い数種類の凝固因子とbinding assayを行い、prolixin-Sがfactor IX/IXaと特異的に結合することを明らかにした。またこの結合にカルシウムイオンの存在が必要であることを明らかにした。2、prolixin-Sはfactor IXと結合することによりfactor XIaによるfactor IXの活性化をほぼ完全に阻害することを明らかにした。3、prolixin-Sはfactor IXaとカルシウムイオンの存在下で結合させると、非常に強力なXaseのinhibitorとして作用することが明らかになった。またこの作用は、prolixin-Sが結合することにより、factor IXaが膜表面に結合できなくなることに由来することが、phospholipid vesicleを用いたscattering assayによって明らかになった。4、以上の結果からprolixin-Sがfactor IX/IXaのGla domainに、そのカルシウムイオン結合による形状変化を認識して結合している可能性が高いことが示唆された。5、現在、prolixin-Sのデリーションクローンを作成中である。これを用い機能的最小単位となる構造を明らかにしてた後、factor IXのGla domainと結合させた状態で結晶化したい。

このことより、プロリクシンSの結合部位がGlaドメインであり、カルシウムイオンの結合によるこのドメインの構造変化を認識して結合することが推測された。今後、プロリクシンS/Glaドメイン複合体を結晶化する予定である。すでにGlaドメインを化学合成した。これとバキュロウイルスをもちいて大量発現させたプロリクシンSを用いてプロリクシンSの構造と機能のさらに詳しい解明をおこないたい。
CD1d-iNKT 系が妊 娠に及ぼす影響につ いての検討

抗炎症作用をもつω3脂肪酸を高濃度に発現するfat-1マウスを用い、NKTを標的とした流早産モデルに応用することでω3脂肪酸の抗炎症作用を解明し、流早産の治療法の糸口を見出すことを目的とした。妊娠したfat-1マウスにNKT細胞を賦活化させる物質(AGC)を投与し流早産率をコントロール群と比較したところ、fat-1マウスで有意に流早産率が低率であることがわかった。また同時に脾臓細胞のサイトカイン誘導性の違いを評価したところ、fat-1マウス由来の脾臓細胞でIL-4の分泌が増加していた。このことからω3脂肪酸優位な体内環境ではiNKT細胞がTh2優位な免疫誘導をすることが示唆された。申請者は絨毛細胞-母体リンパ球間の相互作用についての研究を進めている。今年度は不育症の患者血清を用いた絨毛細胞-iNKT細胞の共培養実験の確立をめざし、患者血清ならびに妊娠組織検体の収集を主におこなった。検体の収集後、絨毛細胞との共培養系の確立を進めていく。また本研究に関連して、申請者が以前に論文発表した絨毛細胞上のオートタキシン(ATX)に関連した報告をおこなった。主にオートタキシン(ATX)により産生されるリゾフォスファチジン酸(LPA)は細胞膜受容体を介して多様な生理機能に関与し、不育症や妊娠高血圧症候群に関連すると考えている。ATX産生低下の意義を調べるため、LPA受容体の一つであるLPA3に着目し、胎盤における発現パターンを検討した。また絨毛細胞由来株にLPA3を強制発現させた上でアゴニストによる刺激を行い、血管新生関連因子の発現を検討した。免疫染色法によりヒト胎盤におけるATX、LPA3の発現分布を確認した。絨毛細胞由来株HTR-8/SVneoにLPA3を遺伝子導入し、強制発現されることを確認した。その上でLPA3特異的アゴニストT13による刺激を行い、血管新生関連因子の発現を定量的PCR法を用いて同定した。ATXはすべての絨毛細胞に発現していたが、LPA3の発現は分化したsyncytiotrophoblast、extra-villous trophoblastに限局していた。LPA3を強制発現したHTR-8/SVneoをT13にて刺激すると、血管新生関連因子の中でCOX-2、VEGF、IL8の発現が誘導された。ATXの産生低下は胎盤局所の血管新生関連因子の発現低下を通じて胎盤発育不全をもたらし、不育症や妊娠高血圧症候群の発症につながる可能性が示されたと考える。申請者は絨毛細胞ー母体リンパ球間の相互作用に関する研究を進めている。fat-1マウスは抗炎症作用を持つω3脂肪酸を高濃度に発現するトランスジェニックマウスで、すでに複数の研究結果によりω3脂肪酸がもつ抗炎症作用があらゆる疾患モデルに対しても有効である可能性が示唆されてきた。またNKT細胞は、絨毛細胞上のCD1dを介して賦活化され炎症状態を惹起することは申請者がすでに報告している。fat-1マウスを、NKTを標的とした流早産モデルマウスに応用することにより、NKTを標的とした炎症状態に対するω3脂肪酸の新たな抗炎症作用を解明することを目的として、研究を行った。妊娠したfat-1マウスにNKT細胞を賦活化させるα-GalCerを投与し、流早産率をコントロール群と比較した。流産群は投与72時間後に子宮内の胎仔の数、および流産の痕跡を確認した。早産群は、分娩までの日数を確認し、分娩終了までを観察した。流産群ではC57BL/6マウスは流産率が90%と高率であったのに対し、fat-1マウスでは27.2%であった(P=0.0010)。早産群ではC57BL/6マウスの早産率が72.7%であったのに対し、fat-1マウスでは20.2%であった(P=0.016)。本研究の結果、fat-1マウスの流早産率がC57BL/6よりも有意に低率であることがわかった。これはNKT細胞が関与する流早産の予防にω3脂肪酸が有効であることを示唆するものである。申請者は絨毛細胞ー母体リンパ球間の相互作用に関する研究を行っている。またNKT細胞は、絨毛細胞上のCD1dを介して不活化され過剰な炎症状態を惹起することは申請者がすでに報告している。昨年までにfat-1マウスに、NKTを賦活化させるαGalCer(AGC)を投与し、コントロール群と比較したところ、fat-1マウスでは有意に流産率が低率であることを報告した。今年度は、fat-1マウスにAGCを投与した流産群(妊娠中期に投与)、早産群(妊娠後期に投与)とWT群をもちい脾臓細胞でのサイトカイン誘導性の違いをELISA法と定量的リアルタイムPCR法で評価した。AGC投与後の流産率、早産率はともにfat-

1マウス群でWT群と比較し抑制された。またWT、fat-1マウスのそれぞれの脾細胞をAGC刺激したところ、fat-1マウス由来の脾細胞はWTよりも有意にIL-4のmRNAが高発現で分泌量も多かった。さらにIFN-γ/IL-4比ではfat-1由来の脾細胞はWTよりも有意に低下していた。このことから、fat-1マウスのようにω3脂肪酸優位な体内環境ではiNKT細胞がTh2優位な免疫誘導を生じることが示唆された。抗炎症作用をもつω3脂肪酸を高濃度に発現するfat-1マウスを用い、NKTを標的とした流早産モデルに応用することでω3脂肪酸の抗炎症作用を解明し、流早産の治療法の糸口を見出すことを目的とした。妊娠したfat-1マウスにNKT細胞を賦活化させる物質(AGC)を投与し流早産率をコントロール群と比較したところ、fat-1マウスで有意に流早産率が低率であることがわかった。また同時に脾臓細胞のサイトカイン誘導性の違いを評価したところ、fat-1マウス由来の脾臓細胞でIL-4の分泌が増加していた。このことからω3脂肪酸優位な体内環境ではiNKT細胞がTh2優位な免疫誘導をすることが示唆された。当初計画していたマウスモデルの作成にはいたらなかったが、これまでの研究成果より別の経路による流産モデルを用いて、流早産抑制効果の検証を進められている。不育症脱落膜内のNKT細胞が刺激を受けることにより、種種のサイトカインが放出されることはすでに報告されているが、ω3脂肪酸がNKT細胞を介した炎症経路のどこに作用しているかは明らかにされておらず今後の研究課題である。今後はさらに細胞、遺伝子レベルでの解明を行っていく予定である。検体収集が十分でなく、実験系の確立にいたっていないため。血清収集ができたところで、実験系の確立を行う。すでに共培養系に必要な細胞は準備できているので、検体収集がすすめばサイトカイン測定などを進めていけると考える。絨毛細胞上の別のリン脂質や母体胎児境界における免疫担当細胞などについても着目し、同様の実験を行っていきたい。本年度は不育症患者血清収集と、絨毛細胞-iNKT細胞共培養系の確立のための実験をおこなった。ヒト血清が十分に収集できず、共培養の安定した実験系の確立にはいたっていない。そのため、次の段階で予定している、マウスモデルの確立に関しての実験が進められていない。マウスモデルによるCD1dを介したiNKT細胞活性化とAPSの病態機序の関係性の解明のため、まず絨毛細胞-iNKT細胞の共培養系の安定化をはかる。そのうえで、マウスモデルでの実験を行う予定である。
分泌現象におけるカルシウム結合蛋白質のネットワーク

本研究の目的である分泌現象に関わるカルシウム結合蛋白質の持つ役割について、平成7・8年度の研究により次のような成果が見られた。まず、細胞内カルシウムセンサーとして機能するカルモジュリンについては、透過性膵B細胞における検討からこのカルシウム結合蛋白質が分泌過程の上流に働く可能性が示唆された。この上流における分泌調節機構解析のため、位相差顕微鏡による顆粒運動の可視化を試み、その運動評価に成功した。この分泌顆粒の運動観察によって、カルモジュリン依存性のリン酸化がこの運動調節に関係するという直接の証拠が得られた。このミオシン軽鎖のリン酸化にはカルモジュリン依存性蛋白リン酸化酵素であるミオシン軽鎖リン酸化酵素およびCaMキナーゼIIが関与することを示唆する生化学的証拠を得た。すなわち、ミオシン軽鎖のリン酸化の結果として、分泌顆粒が開口放出に適当な場所に運ばれ、分泌の増幅に関与していることが明らかにされた。さらにその選択的な阻害剤を用いた生化学的実験から、共存するカルシウム濃度によってこれらのキナーゼの役割が異なり、どちらも分泌過程におけるカルシウムシグナル伝達を担う重要なメンバーであることが判明した。現在、生理的にはどのような条件下でこの調節機構が働くかを検討している。また、我々が分泌との関連を発見したもうひとつのカルシウム結合蛋白であるカルサイクリンが分泌のインスリン分泌調節機構については、齧歯類のカルサイクリンを大腸菌に発現させ精製カルサイクリンを得、課題であったマウスカルサイクリンに対する抗体を作製した。この精製カルサイクリンを用いたアフィニティークロマトグラフィーによる結合蛋白の同定は、現在検討中である。一方、このカルシウム結合蛋白の役割をウエスタンブロット法および免疫組織学的手法を用いてこの蛋白が細胞質に局在することを明らかにした。しかし、カルサイクリンのカルシウムシグナリングにおける役割を知るためには生細胞での局在を知ることが必要なので、現在培養膵B細胞を用いて蛍光マーカーとしてGreen fluorescent proteinをカルサイクリンとフ-ジョンさせた蛋白の発現を試みている。本研究の目的である分泌現象に関わるCa結合蛋白質の持つ役割について、平成7年度の研究により次のような進歩が見られた。1)生細胞を用いた顆粒運動観察実験から、細胞内の分泌顆粒の運動もまたカルシウムで調節されていること、およびカルモジュリンアンタゴニストであるW-7がこの顆粒運動を強く抑制することが示された。この結果は、カルモジュリンが分泌顆粒の輸送過程に作用して分泌を調節することを示している。2)ミオシン軽鎖酵素のモノクローナル抗体を透過性細胞に応用した実験では、カルモジュリンの依存性蛋白燐酸化酵素であるミオシン軽鎖酵素が開口放出より近位のステップでに働く可能性が示された。3)もうひとつのカルシウムセンサーであるカルサイクリンについては、大腸菌を用いた発現系でマウスのカルサイクリンを得ているが、有用な抗体の作製には至っていない。また、カルサイクリンの部分配列をもとに合成したペプチドを抗原とする抗体についても、ネイティブのカルサイクリンに交差する抗体は得られなかった。これまでの実験結果から少なくとも既知のカルサイクリン結合蛋白質とは別の蛋白質が分泌をコントロールしているようであるが、その標的分子の実体は解明されていない。以上の結果に、SNARE蛋白の反応による分泌顆粒と形質膜とのCa^<2+>依存性のドッキングも含めると、分泌現象の中心的調節因子であるカルシウムシグナリングは分泌現象において多様な役割を果たしていることが実証された。

本研究の目的である分泌現象に関わるカルシウム結合蛋白質の持つ役割について、平成8年度の研究により次のような成果が見られた。まず、細胞内カルシウムセンサーとして機能するカルモジュリンについては、透過性膵B細胞における検討からこのカルシウム結合蛋白質が分泌過程の上流に働く可能性が示唆された。この上流における分泌調節機構解析のため、位相差顕微鏡による顆粒運動の可視化を試み、その運動評価に成功した。この分泌顆粒の運動観察によって、カルモジュリン依存性のリン酸化がこの運動調節に関係するという直接の証拠が得られた。このミオシン軽鎖のリン酸化にはカルモジュリン依存性蛋白リン酸化酵素であるミオシン軽鎖リン酸化酵素およびCaMキナーゼIIが関与することを示唆する生化学的証拠を得た。すなわち、ミオシン軽鎖のリン酸化の結果として、分泌顆粒が開口放出に好適な場所に運ばれ、分泌の増幅に関与していることが明らかにされた。さらにその選択的な阻害剤を用いた生化学的実験から、共存するカルシウム濃度によってこれらのキナーゼの役割が異なり、どちらも分泌過程におけるカルシウムシグナル伝達を担う重要なメンバーであることが判明した。現在、生理的にはどのような条件下でこの調節機構が働くかを検討している。また、我々が分泌との関連を発見したもうひとつのカルシウム結合蛋白であるカルサイクリンが分泌のインスリン分泌調節機構については、齧歯類のカルサイクリンを大腸菌に発現させ精製カルサイクリンを得、課題であったマウスカルサイクリンに対する抗体を作製した。この精製カルサイクリンを用いたアフィニティークロマトグラフィーによる結合蛋白の同定は、現在検討中である。一方、このカルシウム結合蛋白の役割をウエスタンブロット法および免疫組織学的手法を用いてこの蛋白が細胞質に局在することを明らかにした。しかし、カルサイクリンのカルシウムシグナリングにおける役割を知るためには生細胞での局在を知ることが必要なので、現在培養膵B細胞を用いて蛍光マーカーとしてGreen fluorescent proteinをカルサイクリンとフ-ジョンさせた蛋白の発現を試みている。
虚血性神経細胞死におけるカルパイン-カルパスタチン系の役割の解析

カルパスタチンは、カルパインを特異的に阻害する細胞内蛋白質である。カルシウム存在下におけるカルパインに対するアフィニティーは非常に高く、事実上stoichiometricな阻害物質である。したがって、虚血後のカルパイン活性化に対しても制御的に作用することは容易に予測される。また、培養細胞において刺激にカルパスタチンレベルの変動が見られること、また、カルパスタチン自身がカルパインの選択的基質となりうることから、組織レベルでも虚血によって何らかの変化が生じる可能性が高い。しかしながら、脳虚血におけるカルパスタチンの動態に関する検討は全く行われていなかった。その理由の一つは、カルパスタチンは一次構造上の種差が大きく、ヒトカルパスタチンに対する抗体が齧歯類由来のものには反応しないことであろう。そこで、ラットカルパスタチン特異的抗体を調製し、スナネズミ前脳短期虚血の系で検討したところ、いくつかの新知見が得られた。まず、虚血後の早い時期(4時間後)に、おもに錐体細胞において一過的にカルパスタチンレベルが上昇する。これは、虚血に対する防御的応答である可能性が考えられる。しかし、24時間後、さらに、7日後と時間を経るにしたがって、カルパスタチンのレベルは減少する。ウエスタンブロットで、低分子量の断片が確認されたことから、恐らくカルパインによって分解を受けたものと考えられる。ここで特徴的なことは、CA1に隣接していながら、虚血に対する耐性が比較的強いCA2の錐体細胞では、カルパスタチンのレベルが高いまま維持されることである。これらのことは、カルパスタチンがカルパイン活性の抑制を通して、神経細胞を虚血障害から防御する機能を有することを示唆する。脳虚血後にストレス応答としてHSP7・HSC70 APP等のレベルが上昇することが知られており、これらが虚血耐性誘導現象に関与する可能性が指摘されている。この意味で、カルパスタチンも広義のストレス応答蛋白として位置づけるべきであるかも知れない。また、カルパスタチンが分解されることは、カルパスタチンが組織内でもカルパインの基質となりうることのみならず、脳虚血によってカルパインが生理的な範囲を超えて過剰に活性化され、細胞内における制御系が破綻したことを示すとも解釈できる。
２種の抗血栓因子を用いた血管内皮細胞の可視化と発現解析を可能とするマウスの作製

本研究では、血管内皮細胞に発現する2つの抗凝固蛋白質、トロンボモジュリン(TM)とプロテインC受容体(EPCR)に着目し、これらを発現する細胞を異なる蛍光色素で可視化すると共に、細胞内で翻訳中のmRNAのトランスクリプトーム解析を実施可能なTM-BacTRAPマウス(EGFP-L10aを発現)およびEPCR-BacTRAPマウス(mCherry-L10aを発現)を作製した。しかし、作製したBacTRAPマウスはEGFPおよびmCherryの発現量が予想に反して低かったため、詳細な解析は困難であると判断した。これまでの多くの研究から、血管内皮細胞では動静脈や組織部位による不均一性が指摘されているが、その実態は不明の点が多い。本研究では、血管内皮細胞に発現する2種の抗凝固タンパク質、トロンボモジュリン(TM)と血管内皮細胞プロテインC受容体(EPCR)を用いて、内皮細胞を蛍光標識しライブでイメージングを行い、かつ細胞内で翻訳中のmRNAのトランスクリプトーム解析を行なう。このため、Bacクローンを用いたTM遺伝子プロモーターおよびEPCR遺伝子プロモーターの制御下で、蛍光タンパク質とリボソームタンパク質L10aの融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作製する。これらのマウスを用いて時間軸および臓器特異性を考慮した動静脈での血管内皮細胞の不均一性を解析する。このため、研究の1年目にTM遺伝子およびEPCR遺伝子のプロモーターの下流に蛍光タンパク質GFPとリボソームタンパク質L10aの融合タンパク質EGFP-L10aをコードするcDNAを組み入れたBacベクターを構築し、TM-Bac-TRAPおよびEPCR-Bac-TRAPマウスを作製した。TM-Bac-TRAPマウスは6コピーが挿入されていた。EPCR-Bac-TRAPマウスは1コピー、2コピー、15コピーが挿入された3ラインを樹立した。これらを掛け合わせ12コピー挿入TM-Bac-TRAPマウス、および30コピー挿入EPCR-Bac-TRAPマウスを樹立した。血管内皮細胞には動静脈や組織部位による不均一性が指摘されているが、その機能的意義や疾患との関係についてはほとんど明らかにされていない。2種類のマウスの心臓および肺でのEGFPおよびmCherryとL10a融合タンパク質の発現をウエスタンブロットにて確認した。融合タンパクの発現が確認できた系統のマウスを用い、EGFPもしくはmCherry抗体を用いた免疫沈降を行い、心臓および肺から翻訳中のRNAを抽出した。抽出したRNAを用いて、目的分子のコピー数濃度を直接算出できるデジタルPCRを行い、EGFP、mCherry、TMおよびEPCRの発現量を確認した。その結果、予想に反して、EGFPおよびmCherryの発現量が少ないことが分かった。さらに、TM、EPCR発現細胞での翻訳中RNAの網羅的解析を行うために、マイクロアレイ解析を実施した。免疫沈降前(組織全体)に比べて、免疫沈降後サンプルでの内皮細胞特異的マーカー発現は約2-3倍しか増加していなかった。組織学的にEGFPおよびmCherry発現細胞を観察するため、免疫組織化学染色を試みたが、陽性染色像を確認することができなかった。今回作製したBacTRAPマウスはEGFPおよびmCherryの発現量が予想に反して低かったため、詳細な解析は困難であると判断した。医歯薬学本研究では、ロックフェラー大学のHeintz教授らが開発したBAC-TRAP法(Cell, 2008)を用いて、血管内皮細胞を蛍光標識し、かつ細胞で翻訳中のmRNAのトランスクリプトーム解析を行う。Heintz教授からEGFP-L10a融合タンパク質をコードするDNAが挿入された組換えベクター(S296.EGFP-L10a)とRecAベクター(pSV1-RecA)を恵与された。マウスTM遺伝子およびマウスEPCR遺伝子を含むBacクローンを持つ大腸菌は購入した(ダナファーム社)。Bacインサート両端とTM遺伝子およびEPCR遺伝子のシークエンスを確認し、遺伝子のATG直前の配列(開始ATG直前の552 bp)をPCRで増幅後、組換えベクターのEGFP-L10a融合タンパク質をコードするDNAの直前に挿入し、組換えベクター(S296.TM-EGFP-L10a, S296.EPCR-mCherry-L10a)を作製した。次いで、Bac含有大腸菌に組換え酵素RecA発現ベクターをCaCl2法で導入し、この大腸菌に組換えベクターをエレクトロポレーション法で導入した。

5'側および3'側の組換え部位でPCRを行うなどの方法で、マウスTM遺伝子直前にEGFP-L10aおよびマウスEPCR遺伝子の直前にmCherry-L10aが挿入されたBac DNA(TM-EGFP-Bac-TRAP, EPCR-mCherry-Bac-TRAP)をもつ大腸菌をスクリーニングし単離した。次いで、約500個の受精卵にBac DNAをマイクロインジェクションした。F0でPCR法を用いて遺伝子が挿入されたことを確認後、F1マウスを使ってサザン解析を行いコピー数を算定した。その結果、1ラインのTM-EGFP-Bac-TRAPトランスジェニックマウス(6コピー挿入)および6ラインのEPCR-mCherry-Bac-TRAPトランスジェニックマウス(13コピー、2コピー、1コピー挿入の3ライン)の作製に成功した。これらのマウスをBac-TRAPマウスと呼ぶ。本年度の計画は、TMおよびEPCRのBac-TRAPトランスジェニックマウスの作製が目標であったので、この目標を到達することができた。肺はTMが高発現し、動脈はEPCRが高発現すると報告されている。そこで、TMおよびEPCRのBac-TRAPマウスの肺と動脈からそれぞれライセートを調製し、抗GFP抗体および抗mCherry抗体を用いて免疫沈降し、EGFP-L10aもしくはmCherry-L10a含有リボソームと翻訳中のmRNAを含むポリソームを回収する。回収したポリソームからmRNAを精製し、GeneChipシステム(国立循環器病研究センターに設置済み)を用いて翻訳遺伝子を網羅的に解析する。これにより、Bac-TRAPマウスを用いた翻訳遺伝子プロファイルのシステムが完成する。TMおよびEPCRの発現部位は免疫染色法で検討されているが、発生期での発現は検討されていない。生体での検討も十分ではない。そこで、平成25年度に得られた結果を基にして、TM-Bac-TRAPマウスおよびEPCR-Bac-TRAPマウスの利点を活かし、胎児ホールマウントや成体各組織切片のEGFPおよびmCherryの蛍光観察により、EGFPおよびmCherry産生細胞を特定する。EGFP(すなわちTM)およびmCherry(すなわちEPCR)発現がみられた細胞(組織)については、抗GFP抗体と抗mCherry抗体を用いた免疫染色とウエスタンブロットを行い、結果の再現性を確認する。次に、深部組織を観察可能な2光子励起共焦点顕微鏡(国立循環器病研究センターに設置済み)を用いて、血管でのTMおよびEPCR発現量の変化をin vivoでライブイメージングする観察系を確立する。研究は順調に進展し、当初の予定通りにTM-EGFP-Bac-TRAPトランスジェニックマウスおよびEPCR-mCherry-Bac-TRAPトランスジェニックマウスを作製した。この間プラスティック製品や試薬などの消耗品の節約に努め、年度末には経費を次年度に持ち越すことができた。
ALPPSと脱細胞化技術を組み合わせた新規in situ肝再生法の開発

本研究提案では、近年開発された新術式である二期的肝切除術(ALPPS)、臓器から細胞をすべて洗浄・除去し、細胞外マトリックスの骨格のみを残す脱細胞化技術、そして脱胞化された臓器に細胞を充填する再細胞化技術を組み合わせることにより、生体内で自身の臓器の一部を脱細胞化すると共に外部から健康な細胞を大量に移植・生着させ肝臓を再生するといった、これまでにないコンセプトの肝再生医療技術の開発を目指す。本課題では、最も重要な基盤技術となる生体内での部分的な肝脱細胞化法、生体内での部分的な肝再細胞化法の2つの手法の確立を目指す。
生物源粒子フラックス-物質循環と気候変動

平成78年度に行われた本研究では、北太平洋亜寒帯(Station SA)およびベーリング海(StationAB)にて1990-1995年の期間中に得られた時系列セディメント・トラップ試料を用いた分析を推進した。トラップ試料中のC,H,N,CaCO_3,オパール等の科学分析に付け加え、珪藻、円石藻、レデイオラリア、浮遊性有孔虫等各群集の生物源粒子フラックスに関する実験室での計測を進めた。珪藻に関しては、本格的な計数を推進することができた。円石藻に関しても主要種の計数を進めた。また、レデイオラリアおよび浮遊性有孔虫に関しては、群集組成の解析に留まらず、上記植物性プランクトンとの定量的比較をするために、重量計測も行った。これらの研究結果を化学分析の結果と合わせて解析を進め学会・論文発表を行った。地球環境の温暖化等の変化は、人類の今後の盛衰をも支配する懸念がある。全海洋面積に占める割合も大きく、地球環境にとって重要な外洋域の中で、生物生産性および炭素や珪素の物質循環に深く関わる海域で粒子フラックスの挙動を研究は重要である。本研究では、中部北太平洋亜寒帯およびベーリング海において生物原粒子フラックスを測定したが、その結果以下のことが明らかになった。これらの海域ではバイオロジカルポンプが効果的に働いている。大気中の炭酸ガスは海洋表層に取り込まれ、その炭酸ガスは植物性プランクトン(主に珪藻)により固体有機物質となり、やがて深海に沈降して下向きの物質輸送を行う。従って、現在懸念されている地球温暖化の観点から、これらの海域での今後の物質循環の動向を正しく把握することが、地球環境の未来を予想する上からも重要である。初年度の平成7年には、北太平洋亜寒帯(Station SA)およびベーリング海(StationAB)にて1990-1994年の期間中に得られた時系列セディメント・トラップ試料を用いた分析を推進した。主に化学分析に勢力を集中した。粒子フラックスの基礎パラメータであるC,H,N,CACO_3,オパール等の分析に関しては1990-1993のサンプルの分析をほぼ終了うぃた。このうち1990-1992の全量フラックス、C,H,Nに関しては、北大グループですでに値が一部出されており、本研究グループとのインターカリブレーションが行なわれた。この結果、両研究グループで個別に出したデータはお互いに非常に良く類似しており、お互いに信頼性の高いものであることが判明した。さらに上記化学分析の他、今年度は珪藻、円石藻、レデイオラリア類等の生物源粒子フラックスに関しても実験室での計測を開始しており、基礎データの一部が蓄積された。縁辺海であるベーリング海のStation ABでは、年間を通してフラックス値が外洋域のStation SAに比較して約2倍の高さで維持されていることが判明した。すなわち、これはベーリング海の高生物生産性を意味するものである。一般にスラックス極大値は春と秋に起こり、大きな年変動が観察された。また、アラビア海の3定点(West, Central, East)各2層から得られた1986-1987年のセディメント・トラップ試料を用いて、レデイオラリア類のフラックスを求めた。上記の北太平洋とインド洋の研究結果等の初期論文の発表を行なった。本研究2年目の平成8年度は、北太平洋亜寒帯(StationSA)およびベーリング海(StationAB)にて1990-1995年の期間中に得られた時系列セディメント・トラップ試料を用いた分析を推進した。

今年度はC,H,N,CaCO_3,オパール等の化学分析に付け加え、珪藻、円石藻、レデイオラリア、浮遊性有孔虫等群集の生物源粒子フラックスに関する実験での計測を進めた。珪藻に関しては、本格的な計数を推進することができた。円石藻に関しても1990-1994年までのプレパラートおよびSEM用試料の準備が完了しており、主要種の計数を進めた。また、レデイオラリアおよび浮遊性有孔虫に関しては、群集組成の解析に留まらず、上記植物性プランクトンとの定量的比較をするために、重量計測も行った。これらの研究結果を化学分析の結果と合わせて解析を進め学会・論文発表を行った。地球環境の温暖化等の変化は、人類の今後の盛衰をも支配する懸念がある。全海洋面積に占める割合も大きく、地球環境にとって重要な外洋域の中で、生物生産性および炭素や珪素の物質循環に深く関わる海域で粒子フラックスの挙動を研究は重要である。本研究では、中部北太平洋亜寒帯およびベーリング海において生物原粒子フラックスを測定したが、その結果以下のことが明らかになった。これらの海域ではバイオロジカルポンプが効果的に働いている。大気中の炭酸ガスは海洋表層に取り込まれ、その炭酸ガスは植物性プランクトン(主に珪藻)により固体有機物質となり、やがて深海に沈降して下向きの物質輸送を行う。従って、現在懸念されている地球温暖化の観点から、これらの海域での今後の物質循環の動向を正しく把握することが、地球環境の未来を予測する上からも重要である。
水平的・垂直的政府間競争に関する研究

H13年度には,以前からの公共投資研究の継続及び科研テーマの分野についての関係文献の収集,検討を精力的に行った.これらの文献は,諸外国の政府間財政関係を理論的・制度的に扱ったものである.これらの検討を通じて,中央・地方の間の機能分担,税源割り当て,支出分野の棲み分け等の実態を網羅的に把握するのみならず,各国での現状の財政システムと歴史的・政治的背景との因果関係をも理解することで,より現実に即した理論の構築に向けて検討を重ねてきた.そして,2つの論文トピックを選択して具体的な理論モデルの構築・検討,並びに他大学での研究報告を行った(明治学院大学・名古屋大学).トピックは(1)脱税の可能性が存在する場合の政府間競争の影響,(2)公共部門が債券発行あるいは財政余剰を蓄積する場合を想定した政府間競争の影響である.H14年度では,これらの論文作成作業を進め,(1)については学会での研究報告(日本財政学会)を行った.(2)については,理論的洞察を得るのが困難であるため,計算ソフト(Mathematica)を購入して理論モデルの数値計算を行った.この作業を通じて,政府間競争が行われている場合には,各政府が債券発行という政策手段を歪めて活用する可能性を見いだすことができた.今後は以上の成果を踏まえて,論文の完成・専門雑誌への投稿を行っていきたい.H13,14年度を通じては,科研テーマ自体に関しては論文作成の基本的作業に忙殺される結果となったが,公共投資に関しては2本の論文が海外の専門雑誌に掲載され,一定の成果を収めることができた.本年度は,以前からの公共投資研究の後始末にかなりの時間を費やしたが,科研テーマの分野についての関係文献の収集,検討を精力的に行った.収集した文献は主として,諸外国の政府間財政関係を扱ったものである.中央・地方の間の機能分担,税源割り当て,支出分野の棲み分け等の実態を網羅的に把握するのみならず,各国での現状の財政システムと歴史的・政治的背景との因果関係をも理解することで,より現実に即した理論の構築に向けて検討を重ねてきた.純粋理論的側面からは,専門雑誌に掲載された地方財政関係論文を収集,検討してきた.そして政府間競争の理論の基本構造に加えて,この分野で達成された研究成果の整理を行ってきた.この作業の途上で,従来の研究では扱われていない,かつ論文としての具体性を持ちうる(つまり査読付き雑誌への投稿に耐えうる)トピックの選定に注意を払ってきた.目下のところ,垂直的政府間競争について,2つの基本的アイディアを得た.いずれも他大学での報告・討論を通じて,理論モデルの基本構造の構築は完了しており,そのうち1つの論文作成が最終段階に達している.残りの1つについてはモデルの数値計算を行う必要があり,数値計算ソフトの購入を含めて,具体的研究進行プランを検討中である.なお,科研費受領以降に2本の論文が海外雑誌に掲載された.いずれも,政府間競争とは直接関係がないが(公共投資及び情報非対称性の分析),これらは元々将来の政府間競争分析への拡張を想定して作成されたものである.H13年度には,以前からの公共投資研究の継続及び科研テーマの分野についての関係文献の収集,検討を精力的に行った.これらの文献は,諸外国の政府間財政関係を理論的・制度的に扱ったものである.これらの検討を通じて,中央・地方の間の機能分担,税源割り当て,支出分野の棲み分け等の実態を網羅的に把握するのみならず,各国での現状の財政システムと歴史的・政治的背景との因果関係をも理解することで,より現実に即した理論の構築に向けて検討を重ねてきた.そして,2つの論文トピックを選択して具体的な理論モデルの構築・検討,並びに他大学での研究報告を行った(明治学院大学・名古屋大学).トピックは(1)脱税の可能性が存在する場合の政府間競争の影響,(2)公共部門が債券発行あるいは財政余剰を蓄積する場合を想定した政府間競争の影響である.H14年度では,これらの論文作成作業を進め,(1)については学会での研究報告(日本財政学会)を行った.(2)については,理論的洞察を得るのが困難であるため,計算ソフト(Mathematica)を購入して理論モデルの数値計算を行った.この作業を通じて,政府間競争が行われている場合には,各政府が債券発行という政策手段を歪めて活用する可能性を見いだすことができた.今後は以上の成果を踏まえて,論文の完成・専門雑誌への投稿を行っていきたい.H13,14年度を通じては,科研テーマ自体に関しては論文作成の基本的作業に忙殺される結果となったが,公共投資に関しては2本の論文が海外の専門雑誌に掲載され,一定の成果を収めることができた.
直線偏光を利用した分子の多電子励起状態の対称性の研究

本研究では、これまで研究例の非常に少ない、2050eV付近に多数存在する分子の多電子励起状態の生成およびその崩壊過程についての知見を得ることを目的とした。直線偏光したシンクロトロン放射を利用して分子の多電子励起状態を生成し、その崩壊によって生じた一対の正・負イオンを同時計測する。そして、得られた両イオンの飛行時間差スペクトルの形状を調べることにより、イオン対状態の前駆体である多電子励起状態の電子配置および対称性を明らかにしようと試みた。分子科学研究所の極端紫外光実験施設(UVSOR)のシンクロトロン放射を単色化した後、真空槽内で分子線と交差させ、生じた正・負イオン対を光軸および分子線軸の両者に直角に設置された2台の飛行時間測定型質量分析器を用いて同時計測した。まず初めにCO_2を試料として用いた。励起光エネルギーを26eVより大きくするとO^-とC^+と0を生じるような3体解離が観測された。このO^-とC^+の飛行時間差スペクトルは1つのピークを持つ山型の形状を示し、励起光のエネルギーが増加するにつれてその幅は広がった。シンクロトロン放射の偏光方向を考慮し、axial recoil近似を仮定してこのスペクトルの解析を行った結果、このイオン対状態の前駆体である多電子励起状態の対称性が明らかになった。さらに、すでに報告されているイオンの電子配置についての知見を参考にすることにより、この多電子励起状態の電子配置を推定することが可能になった。この手法は他の分子についても適用可能であり、多電子励起状態の生成およびその崩壊過程の研究が今後飛躍的に発展するものと考えられる。
膵癌特異的ゲノム変異のliquid biopsyによる超早期術後再発診断法の開発

膵癌患者血液のリキッドバイオプシーによる腫瘍特異的ゲノム異常が、術後再発転移の超早期バイオマーカーと成り得るか?との問いを検証する。併せて、術後再発高危険患者の臨床的再発確定前の治療介入を行う事が、患者個々のアウトカムを個別化治療として改善するかを検討する。さらに、得られた治療標的となりうる(actionable)変異について、膵癌細胞と正常膵管上皮細胞培養系を用いた機能解析から、膵癌術後再発・転移過程へ如何に関与するかについての機序を探索する。
森林揮散物質「みどりの香り」が発現する抗ストレス作用の脳内機構に関する研究

草木の葉由来の「みどりの香り」が心身をリフレッシュ/リラックスさせる脳内機序について齧歯類で検討した。その結果、「みどりの香り」の主成分である3Z-hexenol、2E-hexenalあるいはその混合物の香りが、(1)心理的ストレスにより亢進した脳内セロトニン及びドーパミン代謝を抑制する、(2) GABA_A受容体活性薬のように高架式十字迷路及びホールボードテストにおいて抗ストレス・抗不安作用を示す、(3)視床下部外側野(副交感神経系の中枢)ニューロンを活性化する、(4)視床下部室傍核において拘束ストレスによるcorticotropin releasing factor mRNA量の増加を抑制する、ことが示された。物理的侵害ストレス(電撃によるfoot-shock stress)を受けるラットの情動反応が周りの侵害ストレスを受けていないラットに伝播・影響し、心理的情動ストレスを与えることが知られている。そこで、心理的情動ストレスを受ける自由行動下ラットの視床下部外側野(副交感神経系の中枢)において、セロトニン及びドーパミンの代謝産物量がどのように変化するかをin vivo microdialy sis法とHPLC法で調べると共に、それら変化に対する緑葉の香気成分「みどりの香り」(青葉アルデヒド)の作用について検討した。ラットはWistar系雄7週齢で、実験はラットをコミュニケーションボックス内の150mm×150mmの区画に留置して行ったFoot-shockは床のグリッドから50分の間、30秒毎に2mAの電流を1秒流して与えた。心理的情動ストレスを受けるラットの床グリッド上にはアクリル板を置き電撃が避けられるようにすると共に、周りには4匹のfoot-shockストレスを受けるラットを配置した。青葉アルコールは心理的情動ストレスを受けるラット区画内にテフロンチューブで導入し、濃度は3%、流量は5.51/minであった。対照には青葉アルコールの溶媒であるTriethyl citrateを用いた。心理的情動ストレスを受けたラットのセロトニン代謝産物(5-HIAA)及びドーパミン代謝産物(DOPAC及びHVA)はストレス負荷後次第に増加し、約1時間で120%に達し、少なくとも2時間その値をほぼ維持した。一方、心理的情動ストレス負荷ラットを青葉アルコールの環境下に置くと、5-HIAAの動態は余り変化しなかったが、ストレス後のDOPAC及びHVAの増加は有意に抑制された。これらの結果は、緑葉の香気成分が、脳の神経活動に影響すること、また心理的情動ストレスによるドーパミン神経の活動亢進を抑制することを示唆する。高架式十字迷路は長さ30cmの壁のないオープンアームと壁のあるクローズドアームを十字状に交差させ、それを床から50cm程度の高さに設置したものである。新規なものを探索しようとする動因とアームから落ちるかもしれない危険(不安)を回避しようとする動因との平衡状態の中でアーム上の動物が示す行動様式の変化から不安の程度を定量化しようとするものである。用いた香りは溶媒のトリエチルサイトレート(対照として使用)、3Z-hexenol(青葉アルコール)0.03及び0.3%、2E-hexenal(青葉アルデヒド)0.03及び0.3%及び両者の混合臭0.03及び0.3%である。各濃度の香りが充満したケージ(20×30×20cm)内にマウス(ddy、雄)を30分間留置した後、直ちに高架式十字迷路に移し、不安様行動の指標であるオープンアームへの進入回数・滞在時間、クローズドアームへの進入回数・滞在時間、総移動距離などを5分間測定した。オープンアームへの進入回数は0.03%の青葉アルコール群、青葉アルデヒド群及び混合臭群の順で増加し、混合臭群での増加は対照群と比べ統計的に有意であった。いずれの香りの群でもオープンアームへの進入回数は0.3%群より0.03%群で多かった。オープンアームでの滞在時間は0.03%の混合臭群で増加する傾向が認められた。不安様行動の発現には脳内セロトニン系が重要な働きをしていることから、本実験の結果は「みどりの香り」、特に0.03%の混合臭が脳内セロトニン系の活動を修飾し、抗ストレス作用に加え、抗不安作用を持つことを示している。ホールボードテスト装置は40cm四方のオープンフィールド床面に、中央から等距離の位置に直径3cm、深さ10cmの穴を4カ所設けたもので、本実験では独自に開発した赤外線ビーム装置やカラービデオ・トラッキング・システムにより、動物が穴をのぞき込む(head-dipping)行動や動物の移動軌跡などを解析した。例えば、新奇なものを探索しようとする行動の一つhead-dipping行動は、動物の不安の程度と逆相関することから、head-dipping行動の変化から不安の程度を定量化することが可能である。

用いた香りは溶媒のトリエチルサイトレート(対照として使用)、3Z-hexenol(青葉アルコール)0.03及び0.3%、2E-hexenal(青葉アルデヒド)0.03及び0.3%及び両者の混合臭0.03及び0.3%である。各濃度の香りが充満したケージ(20×30×20cm)内にマウス(ddy、雄)を30分間留置した後、直ちにホールボードテスト装置に移し、不安様行動の指標であるhead-dippingの回数や時間に加え1立ち上がり回数や総移動距離などを5分間にわたり測定した。head-dippingの回数は対照群と比べ0.03%の青葉アルコール群で統計的に有意に増加した(p<0.05)。head-dippingの時間も対照群と比べ0.03%の青葉アルコール群で有意に増加した(p<0.01)。いずれの香りでも、0.3%群のhead-dippingの回数や時間は0.03%群より少ないかあるいは同程度であった。立ち上がり回数や総移動距離に有意な変化はなかった。不安様行動の発現には脳内セロトニン系が重要な働きをしていることから、本実験の結果は「みどりの香り」、特に0.03%の青葉アルコールが脳内セロトニン系の活動を修飾し、抗不安作用を持つことを示している。
超高感度磁気センサを用いた新しいイミュノアッセイシステムの構築

磁性微粒子を結合させた抗体を抗原と結合させて、SQUID磁気センサで検出する方法について検討を行った。磁性微粒子は超常磁性という性質をもつのでヘルムホルツコイルにより外部交流磁界を印加して磁化することで検出を可能とした。実験結果から、抗原抗体反応させた磁性体微粒子の検出が可能であることがわかった。測定感度についてはヘルムホルツコイルを用いて、交流印加磁界を加えながらサンプルに振動を与えないバキューム方式で磁性微粒子を検出したときにもっとも良い感度が得られた。磁束の大きさに換算して2mφ_0が測定限界であり、抗原濃度420mg/100ml84mg/100ml(2倍希釈10倍希釈)の抗原抗体の検出が可能であった。現在の検出感度では、酵素標識抗体検出法の検出感度におよばず、実用化のためには検出感度の向上は必須であることが示唆された。DNA検出では金蒸着したガラス基板にビオチン→ストレプトアビジンの順で定着し、その基板にビオチンで修飾されたDNAを固定した。そして固定したDNAを磁気微粒子によって標識し、SQUID磁気センサによって検出できることを確認した。抗原抗体の検出には、酵素標識検出法(ELISA:enzyme・linked immunosorbent assay)が最も広く使用されている。この方法は、抗体がアルカリ性のフォスファターゼ酵素によって標識され、酵素と反応した基質からの光の吸収を検出することによって測定される。しかし、ELISAには高いバックグラウンドが存在し、また、退色が生じるので長時間の観察が出来ないなどの欠点がある。近年、超伝導現象を利用したSQUID(Superconducting Quantum Interference Device)磁気センサーの研究開発が進展し、液体窒素を冷却材として利用できるものも開発されている。SQUID磁気センサーは非常に高感度であり、抗原抗体反応の検出に利用できると思われる。我々は従来法である酵素標識検出法に代わる高温超伝導SQUID磁気センサーを用いた新しい抗原抗体反応検出法をの検討を行った。実験の結果、酵素法の場合は抗原(myosin)濃度が2μg/100μlから0.2μg/100μlの間で吸光度が抗原濃度に比例して低下した。そして、0.2μg/100μl以下の抗原濃度では吸光度が飽和して一定となっている。従って酵素標識検ELISAの抗原抗体反応の正確な測定範囲は、吸光度が変化してまた一定になる前の0.2μg/100μlまでであることがわかった。それに比べて、磁気標識法では、myosinの濃度と磁気反応の大きさとの間に比例関係があり、20μg/100μl0.0002μg/100μlまでの広い範囲で比例関係が見られた。これのことから、SQUIDによる磁気検出法は、酵素法より広い範囲で検出が可能であるということ示している。来年度以降、外部磁界を大きくすること、SQUIDとサンプルの距離を近づけることなど、システムを改善して磁気標識法の一層の感度向上を目指す。抗原抗体の検出には、酵素標織検出法(ELISA:enzyme-linked immunosorbent assay)が最も広く使用されている。この方法は、抗体がアルカリ性のフォスファターゼ酵素によって標織され、酵素と反応した基質からの光の吸収を検出することによって測定される。我々は従来法である酵素標識検出法に代わる高温超伝導SQUID磁気センサーを用いた新しい抗原抗体反応検出法の検討を行っている。今年度は同じ手法を用いて磁気微粒子でDNA分子を標識し、ガラス基板上に固定されたDNA分子の検出を試みた。実験の結果、DNA分子を固定した部位に特異的に高い磁束が検出され、その信号強度は試料の濃度に比例することが判明した。このことから、DNAのような微小な磁気微粒子の検出も可能であることがわかった。