hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗サイログロブリン自己抗体の新しい超高感度免疫測定法の実用化

血清中の抗サイログロブリンIgGの超高感度測定法を実用化するために種々の面から研究を行った。1)研究代表者らが創案した免疫複合体転移測定法を種々改変し、次の高感度で簡便な方法を開発した。2,4ージニトロフェニル(DNP)化サイログロブリン、抗サイログロブリンIgG、酵素標識サイログロブリンの3者を同時に反応させて、形成された免疫複合体を抗DNP抗体不溶化固相上にトラップする。固相を洗浄した後、DNPーLーリジンにより免疫複合体を固相から溶出して(抗ヒトIgGγ鎖)抗体不溶化固相に移しかえ、最後の固相に結合した酵素活性を測定する。2)Nーsulfosuccinimidylー6ー[6ー((2,4ーdinitrophenyl)amino)hexanoylamino]hexanoateを合成し、上記の免疫複合体転移測定法で用いるDNP化サイログロブリンを簡便に調製できるようにした。3)測定を迅速化するため、検出時間の短いeuropium標識をテストした。DNP化europium標識サイログロブリンと血清を反応させ、免疫複合体を抗DNP抗体不溶化固相の上にトラップし、洗浄後、溶出して(抗ヒトIgGγ鎖)抗体不溶化固相の上に移しかえた。測定時間は短縮されたものの、感度と再現性の点で課題を残した。4)1)に記載の方法で血清と過剰のサイログロブリンをあらかじめ反応させても、固相に結合するβーDーガラクトシダ-ゼ活性が充分低下しない場合があり、低濃度の抗サイログロブリン抗体の測定の障害となった。被検血清を遺伝子組みかえ不活性βーDーガラクトシダ-ゼと反応させ、抗βーDーガラクトシダ-ゼ抗体を除去した結果、過剰のサイログロブリンによりバックグラウンドが充分低下し、自己免疫性甲状腺疾患ばかりでなく、健常者の殆どすべてにも抗サイログロブリンIgGが検出されるようになった。したがって、バックグラウンドを低下させるために当初計画した実験の多くは不要となった。血清中の抗サイログロブリン自己抗体(以下抗体と略す)を超高感度で、しかも簡便、迅速に測定するために、免疫複合体転移測定法の開発を試みた。(1)2,4ージニトロフェニル(DNP)化抗原を抗体と反応させ、形成された複合体を抗DNP抗体不溶化固相の上にトラップし、固相を洗浄した後、酵素標識第二抗体と反応させた。(2)DNP化抗原、抗体、酵素標識抗原の3者を同時に反応させ、形成された複合体を抗DNP抗体不溶化固相の上にトラップした。固相を洗浄した後、DNPーリジンにより、複合体を固相から溶出して、第二抗体不溶化固相に移した。(3)(2)のDNP化抗原と第二抗体不溶化固相の代りにDNP化ビオチン化抗原とストレプトアビジン不溶化固相を用いた。(4)DNP化酵素標識抗原を抗体と反応させ、形成された複合体を抗DNP抗体不溶化固相の上にトラップし、固相を洗浄した後、DNPーリジンにより、複合体を固相から溶出し第二抗体不溶化固相に移し換えた。

高感度でしかも比較的簡便、迅速な(2)と(3)を採用するとともに、複合体の溶出と次の固相へのトラップを同時に行うことにより一層の迅速化を計った。標識の検出に要する時間を短縮するため、europiumを用いることを検討したが、検出感度が10amolとやや低いことと原因不明の測定値の変動があり、今後検討すべき課題を残した。抗原として用いるヒト・サイログロブリンを(抗ヒトIgG)IgGーセファロ-ズ4Bのカラムにより精製し、再現性よくバックグラウンドが低下するようにした。従来Sーアセチルメルカプトサクシニックアンハイドライドによりチオ-ル基を導入したサイログロブリンと、Nーサクシニミジルー6ーマレイミドへキサノエ-トによりマレイミド基を導入したεNーDNPーリジンを反応させ、サイログロブリンにDNP基を導入していたが、DNPカルボン酸の活性エステルを合成し、直接DNP基を導入できるようにした。新しい形の固相を開発することを検討したが、試作品が250万円と高価なため発注を見合せた。
看護基礎教育におけるコミットメント能力の育成と評価法

名桜大学人間健康学部看護学科においては、学生の主体的な学習能力の育成(自己教育力の育成)をめざした小人数ゼミによる参画型教育を展開してきた。教養演習ゼミにおいて学生の成長しつづける力としてのコミットメント能力を育んできたが、これらの教育実践の評価指標について検討し、今回、ゼミ単位ごとの学生グループにSYMLOG分析を用いて学生の自己評価、他者評価をグラフ化して明示しフィードバックを行った。その結果、学生が自ら成長していくための課題の発見とその目標に向けて自己投入する能力(コミットメント能力)の測定指標としてSYMLOG分析のP-N,U-D Dimensionが有効であることが示唆された平成25年度入学生に対してSYMLOG分析を実施した。分析結果を学生個々にフィードバックしゼミ活動に活用した。その後の経過については研究者間で検討する予定である。成長エピソードに関するインタビューを実施しSYMLOG分析の結果をもとに総合的に分析してU-DディメンションのP-Nディメンションの変化から学生のコミットメント能力の評価を行った。卒業生及び在学生をシンポジストとして迎えて「学生が主人公となる学び舎づくりー参画型看護教育の評価」と題してシンポジウムを実施した。卒業生(1期生ー3期生)からは学生時代に培った「気になったらレスポンス」の合言葉で日常的に培ってきたコミットメント能力が看護の臨床現場でも役立っているとの報告があった。また学生時代に修得したポートフォーリオの技法は新人看護師としての歩みの中でも継続して実践されており、本学の学生参画型教育の中で自己教育力が確かなものとして修得されていることが確認された。今後とも卒業生へのインタビューを実施して本学の参画型看護教育の評価を行っていく予定である。看護教育における参画型看護実践の教育技法の開発とその評価を目的に参画型看護教育評価プロジェクトを立ち上げ2年間の活動の報告書を作成した。その結果、学生が自ら成長していくための課題の発見とその目標に向けて自己投入する能力(コミットメント能力)の測定指標としてSYMLOG分析のP-N,U-D Dimensionが有効であることが示唆された平成24年度の「人間関係論」の授業の「自己評価ー他者評価」の授業単元においてSYMLOG分析のためのアセスメントを実施し、研究協力者の韓国嶺南大学の朴在鎬(組織心理学教授)の分析をお願いした。また朴在鎬氏を大学に招いて、学生個々の分析結果についての説明してもらった。研究グループによる学生の分析結果について検討を行った。SYMLOG分析は学生のゼミ単位として行っており、すべてのゼミ担当者へのフィードバックが必要であるが、今年度は共同研究者のゼミについてフィードバックを行った。4年生に成長エピソードについて自由記述によるアンケート調査を行った。以下のような回答があった。「高校生の頃より自分の気持ちを相手に伝えられるようになった。交友関係の輪が広がった」「自分の考えを相手に伝えるようになった。多くの人の意見をもらって、自分の考えに根拠を持つようになった」「人に自分の思っていることを話す方ではなく、実習を通して自分の感情を振り返り、他人に話す機会が増え、自分の感情に気づき、他人に話せるようになった。同時に自分の意見を持つようになった」「話し合うとき(グループ学習)で積極的に意見を言えるようになった。自分と反対の意見を持つ人の意見を尊重して、言葉をかけたり円滑に話し合いを進めることが出来るようになった」「グループワークや実習の中で、その場面における自分自身の役割を自覚しながら、行動できるようになった。人の前で意見を言う機会が増えた。ディスカッション能力が身についた」このような成長エピソードが語られた。これらの変化をとらえる指標として、小集団における対人関係能力の変化をグループダイナミックスの変化として見ることが可能であり、学生同士の自己評価ー他者評価をもとにした360度評価)SYMLOG分析で客観的にみることができる。これまで、コミットメント能力の評価指標としてU-D Dimensionの変化に注目していたが、今回の分析を通してP-NDimenshionの変化も活用できることが明らかとなり第34回日本看護科学学会学術集会にて報告した。さらに経産省の提唱している社会人基礎力との関連で検討すると「前に踏み出す力」「チームで働く力」に関連したコンピテンシーがコミットメント概念に該当することが推測された。今後、コンピテンシーモデルとの関連でコミットメント概念を検討していくことが課題として残された。看護教育本学の小人数教育は協同学習理論にもとづいて教養演習として実践されており、その教授法も確立されつつある。1年生のゼミに複数人の2年生がチュターとして参加しており、学生同士のピアエディケーションが展開されている。その中でカードメソッドが多用されており、学生のゼミ活動へ自己投入が自然行われるという仕組みが開発されてきた。これらの教授法の開発とともに評価方法の検討がなされており、SYMLOG分析もその一つの評価法として検証されている。学生へのSYMLOG分析とフィードバックについて感想などを自由に記述してもらっていて、その内容分析を行っている。

自分が他者の目にどのように映っている(評価されている)のか多くの学生が関心を示しており、概ね肯定的な評価が行われており、また理想的な人物像への志向性も出ており、SYMLOG分析そのものは学生にとって受容されていることが明らかになった。コミットメントを集団の場における自己投入という考え方にもとづいて、集団における他者への影響力を示す指標としてSYMLOG分析のUーDdimensionを評価指標として、経年的にその変化をみていく計画である。平成25年度入学者、平成26年度入学者について研究協力の得られた学生、並びにゼミ担当教員にグループインタビューを実施する。学生の成長エピソードを聞き取り質的に分析する。その場で合わせてSYMLOGアセスメントを実施する。(担当;大城凌子、徳田菊恵、金城祥教、金城やす子)。また、研究協力の得られた卒業生へのインタビュー(グループインタビュー含む)を実施して、成長エピソードを聞き取り質的に分析する。可能ならば、同時にSYMLOGアセスメントを実施する。(担当;大城凌子、徳田菊恵)研究者会議を開催し結果について分析討議する。(担当;金城祥教、参加者:朴在鎬、金城やす子、大城凌子、徳田菊恵)研究の中間成果報告として国内外の関連学会において中間発表を行い、第3者評価を基にしながらコミットメント概念をコンピテンシーモデルとの関連で検討を進める。平成26年度は最終年度であり、平成24年、平成25年度の研究で得られたデータをもとにして綜合的な分析、検討を行い、「看護実践能力」の基盤となるコミットメント能力を看護基礎教育において育成する意義と、その教授法について報告書を作成する。(担当者;金城祥教、朴在鎬、金城やす子、大城凌子、徳田菊恵)年度毎に学生のSYMLOG分析を実施すると共に、研究協力が得られた学生の継続的(経年的)に実施して、その変化、特にUーDディメンションの変化に焦点をあてて学生の経験(成長エピソード)についてインタビュ-を行っていきたい。学生の研究参加の承諾が遅れたことから、SYMLOG分析にかかる委託費が実施できなかった。本年度は最終年度であることから会議の複数回の開催、学会発表、報告書作成に予算を執行していく計画である。SYMLOG分析を委託する朴先生への業務委託費、並びに研究協力者の朴先生に来学していただくための旅費、成果報告のための学会発表費用
移民政策の「新たな展開」 日本、オーストラリア、韓国の比較研究

今年度においては三カ国の比較研究を実施するにあたり、基礎的な資料・情報収集等を実施した。日本については、本年に出入国管理及び難民認定法が大幅に改正されたことからも、その状況について法務省入国管理局関係者より聴取した。次に、オーストラリアについては、オーストラリア国立図書館において関連の資料収集を行うとともに、移民省関係者より、経済不況後の、より選別的な技術移民政策のあり方、及び試験的導入が開始された南太平洋島嶼国からの農場労働者受け入れ政策のあり方について聴取を行った。韓国については、研究補助員を用いて、重要な政策文書である「外国人政策基本計画」の全訳を実施するとともに、基礎的な外国人関連の統計資料の入手等を実施した。以上のことから得られた知見としては、まず、日本については、「移民受入」といった意味における大幅な政策変更はないものの、今後の「在留カード」発行等によって、その方向性次第では従来とは違った展開も可能となる「インフラ整備」が行われたことが確認できた。オーストラリアについては、これまで経済好況とともに「技術移民」の実質的審査基準を緩和してきた結果、経済不況に鑑みて、より選別的な方向での受け入れを進展させていこうとすることが確認できた。一方、それとは対極的に非熟練労働者の不足という状況の中での、特定国からの農場労働者の受け入れについては、送出国からの開発的観点も含めた新たな方向性が確認できたものの、実際の効果については今後の注視していく必要がある。さらに韓国については政府の強力な主導のもとで、特に「結婚移民」を中心とした社会統合支援体制が整備されつつあることが確認できた。
非ヒストンタンパク質のアセチル化修飾を介したゲノム障害応答の制御機構解明

我々は、試験管内でp300とCBPによってアセチル化される複数の非ヒストンタンパク質を発見した。これらの中で、ヒトの相同組換え(HR)に関わるRAD52は、DNA二重鎖切断(DSB)部位で、p300/CBPによりアセチル化された。RAD52の13箇所のアセチル化部位を同定した。アセチル化されないRAD52は、最初はDSB部位に集まるが、途中でDSB部位から離れた。また、RAD52がアセチル化されないと、RAD51がDSB部位から途中で解離し、HRが阻害された。さらに、RAD52のアセチル化がATMシグナルとリンクしていた。このように、RAD52のアセチル化がHRに重要であることを示した。細胞内のアセチル化状態を解析するために、p300/CBPによってアセチル化されることを同定している複数のタンパク質に関して、アセチル化部位特異的抗体を作製することができた。ヒトRAD52に関しては、このタンパク質の脱アセチル化の役割について解析を行った。RAD52は、DNA二重鎖切断(DSB)後にDSB部位でアセチル化されるが、その後、Sirt2とSirt3によって脱アセチル化されることを明らかにしていた。今年度、Sirt2あるいはSirt3をノックダウンすると、DR-GFPアッセイにより、DNA相同組換えが阻害されることを見いだした。この結果から、RAD52の脱アセチル化も相同組換えに重要であることが示唆された。さらに、Sirt2やSirt3のDSB部位への局在には、ATMキナーゼが必要であることも明らかにすることができた。一方、アポトーシス制御に関わるタンパク質のアセチル化修飾の役割を解析するために、アセチル化されるリジンをアセチル化類似変異であるグルタミンに置換したタンパク質を精製した。野生型と種々の変異型タンパク質を用いたin vitroのカスパーゼアッセイの結果、アポトーシス制御タンパク質のアセチルによって、このタンパク質のカスパーゼ3やカスパーゼ9に対する阻害活性が影響を受けることを明らかにした。さらに、酵母two-hybrid法を用いたタンパク質間相互作用の実験の結果、アセチル化修飾は、このタンパク質のダイマー形成効率やNFκBの活性化に関わるTAB1タンパク質との相互作用に影響を与えることを明らかにした。ヒトRAD52タンパク質は、DNA二重鎖切断(DSB)修復において、RAD51依存的なDNA相同組換え経路とRAD51非依存的な1本鎖アニーリング経路の両方に関わる。RAD52をDSB部位で脱アセチル化したSIRT2とSIRT3は、DNA相同組換えに関わっていたが、1本鎖アニーリング経路には関わっていなかった。RAD52とSIRT2あるいはSIRT3をダブルでノックダウンしても、シングルノックダウンの場合に較べて相同組換え頻度に大きな影響が無かったことから、これらのタンパク質はDNA相同組換えの同じ経路で働いていると考えられた。精製タンパク質を用いた実験で、RAD52とCBPとの相互作用を示していたが、RAD52とp300の相互作用についても示すことができた。また、Mycタグを付加したRAD52とHAタグを付加したp300あるいはCBPとの放射線照射後の細胞内共局在を示した。さらに、タンパク質のin vivoクロスリンクと免疫沈降の手法を組み合わせて、RAD52と細胞内でもp300やCBPと特異的に相互作用することを示した。そして、細胞内のp300とCBPを同時にノックダウンすると、DSB後に誘導される細胞内のRAD52のアセチル化が阻害されることが観察された。アセチル化部位が同定できていない2つのタンパク質について、試験管内の反応によってアセチル化される部位を質量分析によって同定するために、大腸菌の発現系を用いて十分な量のタンパク質を精製した。本年度は、主にRAD52のアセチル化に関する投稿論文のリバイスのための実験を行なった。リバイスには、さらに膨大なデータを出す必要があった。指摘されたことに答えるために、予定していなかった様々な実験を行ったことで、研究成果の完成度が高まった。一方、このために、本年度に予定していた実験計画については、十分に達成することができなかった。共同研究の過程で、当初は予定していなかった新たなタンパク質のアセチル化修飾を発見し、それに関する論文を報告することができた。したがって、研究全体としては、おおむね順調に進展している。アポトーシス誘導の制御に関わる3つのタンパク質が、p300/CBPヒストンアセチル化酵素によってアセチル化修飾を受けることを明らかにしていた。この中で、アセチル化部位を同定できていなかった2つのタンパク質を大腸菌で発現させて精製し、in vitroでアセチル化させた精製タンパク質のアセチル化部位を、共同研究により、質量分析によって解析中である。また、すでにアセチル化部位を同定していたタンパク質について、アセチル化部位をすべてアルギニンに置換した変異タンパク質を精製して、in vitroのアセチル化反応を行った。その結果、アセチル化部位の置換変異によって、野生型よりもアセチル化修飾の程度は減少しているが、まだ、半分程度アセチル化修飾を受けており、同定できていないアセチル化部位があることが判明した。そこで、同定できていないアセチル部位を解明するために、共同研究により、in vitroでアセチル化反応させた野生型やアセチル化部位変異体のタンパク質を質量分析により解析している。共同研究により、RAD52のアセチル化が、このタンパク質の生化学的活性に与える影響を明らかにすることができた。様々なDNA代謝反応に関わるアセチル化修飾を受けるタンパク質に関して、アセチル化部位の1カ所あるいはすべての箇所をアルギニンまたはグルタミンに置換した発現細胞を作製した。

また、様々な脱アセチル化酵素の発現細胞についても作製した。RAD52の投稿論文のリバイスで、要求された膨大な実験を行って投稿したにもかかわらず、不当な審査で不採択になってしまい、再び別の雑誌に投稿することになった。このような状況のため、研究期間を1年延長していただいた。一方、この研究を計画する時には予想していなかった、アセチル化修飾に依存したRAD52の新たな反応を見つけたが、それを解明するための手がかりを得ることができた。したがって、研究全体としては、おおむね順調に進展している。アセチル化修飾を受けることを明らかにしている非ヒストンタンパク質の中で、ヒトRAD52タンパク質のアセチル化修飾の役割にについて、さらに詳細に研究した。これまで、細胞内でのRAD52のアセチル化の役割を明らかにするために、CMVプロモーターによって発現が誘導されるRAD52の安定発現株を用いた解析をしてきた。タンパク質の発現量を、内在性の遺伝子発現のレベルに近づけて解析するために、CRISPR-Cas9法のゲノム編集によりRAD52のアセチル化部位変異遺伝子が本来のプロモーターにより発現するノックイン細胞を作製した。ノッイン細胞を用いてRAD52の細胞内局在を調べた結果、これまでの実験結果の通り、アセチル化されないRAD52変異タンパク質は、最初はDNA二重鎖切断(DSB)部位に集積するが、DNA修復が不完全な状態な状態で、途中でDSB部位から解離した。また、RAD51の局在をタイムコースで調べた結果、アセチル化されないRAD52変異タンパク質発現細胞では、RAD51も一度はDSB部位に局在していたが、その後途中でDSBから解離することが明らかになった。相同組換え修復の程度を定量的に調べることができるDR-GFPアッセイ用の細胞について、RAD52のノックイン細胞を作製して、相同組換え修復におけるRAD52のアセチル化の影響を調べた。その結果、相同組換えに関するこれまでの他の実験結果と同様に、このアッセイにおいても、アセチル化されないRAD52発現細胞では、相同組換え修復が阻害された。さらに、酵母two-hybrid法により、RAD52のアセチル化が、RAD51やRPAとの相互作用制御に関わることを明らかにした。これは、様々な反応ステップを必要とする複雑な相同組換え修復において、RAD52が様々な役割を果たすために必要であると考えられる。我々は、試験管内でp300とCBPによってアセチル化される複数の非ヒストンタンパク質を発見した。これらの中で、ヒトの相同組換え(HR)に関わるRAD52は、DNA二重鎖切断(DSB)部位で、p300/CBPによりアセチル化された。RAD52の13箇所のアセチル化部位を同定した。アセチル化されないRAD52は、最初はDSB部位に集まるが、途中でDSB部位から離れた。また、RAD52がアセチル化されないと、RAD51がDSB部位から途中で解離し、HRが阻害された。
発達障がい児をもつ養育期家族に対する支援プログラムの開発と効果評価

参加は13家族で、年齢は父親40.15±6.32、母親36.62±4.41、児4.62±1.33である。支援プログラムの効果は自作の「発達障がい児をもつ養育期家族の問題解決力尺度26項目(α=0.78)」で、実施前・中・直後・1ヶ月後に母親を対象として評価した。総得点の平均値は直後に上昇し(p<.05)、1ヶ月まで維持されなかった。下位尺度毎の平均値は「夫婦の協働関係」項目が直後に上昇し(P<.05)、3ヶ月後も維持された。「養育に対するコントロール感」項目は実施前と1ヶ月後、直後と1ヶ月後で上昇した(P<.01)。「社会資源を活用する力」項目は実施前と1ヶ月後に上昇した(P<.05)。家族システム論を根拠として、発達障がいの子どもをもつ養育期家族への支援プログラムを作成し、self-controlled designで13家族へ実施して効果評価を行った。プログラム内容は「親子システム(2課題)」「夫婦システム(1課題)」「地域・社会システム(1課題)」の計4課題をレクチャーとグループワークで構成した。プログラム評価は、下位因子として「夫婦の協働関係」「養育に関するコントロール感」「夫婦の役割に関する信念」「社会資源を活用する力」を有し、家族の問題解決力を測定する自作の尺度を使用した。また、実施場所は地域の子育て支援センターとし、ファシリテーターとして看護学生を起用した。その結果、プログラム実施前・直後・1ヶ月後の家族の問題解決力の変化が以下のようになった。まず、総得点の平均値による比較では、両親ともプログラム前と比較して直後に有意な上昇があった。さらに母親は、1ヶ月後も得点が維持され、プログラム前と有意差があった。次に、下位尺度毎の平均値による比較では、父親はプログラム前と直後における全ての下位尺度得点の上昇があり、特に「夫婦の協働関係」と「夫婦の役割に関する信念」では有意差があった。また、「夫婦の役割に関する信念」は、1ヶ月後も得点が上昇し、プログラム前との比較において有意差があった。一方、母親もプログラム前と直後における全ての下位尺度得点の上昇があり、特に「夫婦の協働関係」と「養育に対するコントロール感」では有意差があった。さらに「養育に対するコントロール感」と「社会資源を活用する力」は1ヶ月後も得点が上昇し、プログラム前との比較において有意差があった。過去15年の発達障害児の家族に関する国内外の先行研究を、家族の心理社会的問題に焦点を当てると、家族のストレス・QOL、家族機能・家族関係、家族支援、家族特性に分けられる。このうち、家族のストレス・QOLは、児の障がいや行動特徴から、家族のストレスやQOLの推察を可能にする研究がある。そして家族機能・家族関係は、児の障がいや行動特徴から家族機能の推察を可能にする研究がある。一方、家族支援は、ペアレントトレーニングの効果を実証する研究や、発達障害児と家族への就学支援に関する研究がある。また、家族特性は、児の診断からの時期が浅いほど、保護者が地域のサービスを利用せず、年代が若いほど家族のエンパワメントが低い傾向であると示した研究や、稀少だが、母親が障害児を養育する中で得る肯定的な経験を示した研究がある。また、家族の特性は、児の障害で親が最も葛藤する時期と、養育期家族の発達課題を達成する時期とが重なることや、児の障がいの原因を正確に認識していない親の存在、障害に対する夫婦の認識にズレのあることを示した研究がある。以上の知見や先行研究(Miyauchi&Moriyama,2011)、家族システム論の枠組みから、本研究の家族支援プログラムの内容は次の4点とする。第1は、発達障害児の行動には意味があることや発達上のアンバランスがあるゆえに有する能力があることをレクチャーする。第2は、児の持つ強みや長所を伸ばしていく大切さを家族が理解できるようにグループワークし、児との関係性を発展させる。第3は、家族内役割の認知が変化するように、養育期家族の発達課題をレクチャーし、グループワークによって夫婦の情緒的交流を促進する。第4は、社会資源の活用方法を習得できるように「学校や医療機関とのコミュニケーション」に関するレクチャーとグループワークを行う。研究方法は自己対照デザインで、参加家族は13家族(2グループ)、年齢は父親40.15±6.32、母親36.62±4.41、児4.62±1.33である。

プログラムの目標は、第1が、子どもの障がいへの家族の認知を変化させる、第2が、家族内のコミュニケーションを促進する、第3が、夫婦の情緒的交流を促し養育や家事役割への認知を変化させる、第4が、社会資源の活用方法を習得して対外的な問題への家族の対処能力を高めるの4点である。実施は4回/1クール(12週間間隔)で、2クールとした。介入方法は、家族システム論の技術を活用し、問題解決に関する情報・知識の提供、円環的質問、家族の長所の強化を行った。同時に、家族が苦しむ具体的な問題に焦点を当て、反復する連鎖を突き止めてパターン化し、問題を構成している文脈を把握した。その後、問題が生じない場合や解決した例外があれば、そこに焦点を当て、うまくいかない問題状況と比較しつつ、家族と共に解決パターンを見いだした。プログラムの効果は、自作の「発達障がい児をもつ養育期家族の問題解決力尺度26項目(α=0.78)」で、実施前・中・直後・1ヶ月後に母親を対象として評価した。その結果、総得点の平均値は直後に上昇したが(p<.05)、1ヶ月後までは維持されなかった。下位尺度毎の平均値は「夫婦の協働関係」項目が直後に上昇し(P<.05)、3ヶ月後も維持された。「養育に対するコントロール感」項目は実施前と1ヶ月後、直後と1ヶ月後で上昇した(P<.01)。「社会資源を活用する力」項目は実施前と1ヶ月後に上昇した(P<.05)。今回、子どもの障がいよりも、家族の苦痛の原因を生み出している文脈(相互作用、コミュニケーションの連鎖)に着目することで、コミュニケーションの悪循環に家族自身が気づき、認知を転換させ、家族自身の問題解決力が向上したと考える。生涯発達看護学当初の計画通り、家族支援プログラム1クール4回を12週間間隔(2ヶ月間で終了)で実施できた。本研究では、発達障害児をもつ養育期家族に対する支援プログラムを開発・実践し、有効性を検討することを計画している。具体的には、以下を研究目的とする。研究目的1:先行研究で明らかにした家族の問題解決力の4因子に基づいて、発達障害児をもつ養育期家族に対する支援プログラムを開発する。研究目的2:開発したプログラムを複数家族を対象として実践し、その有効性を評価する。今年度は、研究実績の概要で先述の通り、先行研究と家族システム論を根拠とした家族支援プログラムを構築でき、研究目的1は既に達成している。実施方法についても研修会・ワークショップで研鑽していることから、介入技術の質の担保は図れている。現在は、研究対象として、関西圏で発達障害を専門とする医院と家族の会へ依頼中である。また、計画では25年度に予定していた研究倫理審査委員会の審査も既に受け、承認を得ている。自作の尺度で実施した家族の問題解決力の測定とは別に、プログラムの実施方法と内容に関する評価として、ファシリテーターである看護学生から得たデータを分析したが、今後は対象家族から得たデータも分析する予定である。平成2526年度は、開発したプログラムを家族システム論の介入技術を取り入れて実践し、先行研究で研究者作成した問題解決力測定尺度(Miyauchi&Moriyama,2011)を用いて有効性を評価し、改善点を検討する。該当なし。
不妊および流産モデルマウスの作製とヒト・家畜への外挿

スペイン産野生マウスMus spretus雄と、実験用マウスC57BL/6J雌の雑種F1は不妊となり、妊性のあるF1雌を用いて遺伝子マッピングしたところ、この不妊遺伝子はX染色体の最もテロメア側の位置にあることが同定され手いる。この位置はY染色体とのホモロジーを示す領域に含まれ、何らかの理由でペアリング(対合)異常になって減数分裂できないものと推定されている。精子形成期に含有量が多く見られるカルモジェリンの免疫蛍光抗体法による染色により、middle pachytene期で精子形成障害の起こすincomplete spermatocyte arrestの症例であることが確認された。雑種不妊遺伝子を将来クローニングするために、コンジェニック系統(N12)を作製した。このコンジェニック系統を用いて、生後530日の発生ステージでさらに詳細に解析した。異常はペアリングの完成するMI期(20日)よりも早い段階、すなわちペアリングの開始する(14日)ですでに観察された。正常タイプ雄と不妊タイプ雄精巣での形態学的な特徴の違いを利用し、正常精子発生に何らかの機能をもっているcDNAクローンを単離する目的で、発現差によるサブストラクションを試みた。得られたコロニー96個の塩基配列を決定した後、データベースにより同定を行い、カテゴリー別に分類した。未知と思われるcDNAクローンF77に関してノーザンブロット法を行った。正常タイプ雄精巣で強く発現している約4kbの転写産物が認められたが、不妊タイプ雄精巣ではきわめて少量の発現しかみられなかった。さらに生後の発生段階による解析から、F77は精巣特異的な正常精子発生に何らかの機能を持つことが示された。形態学的差を利用したサブストラクション法は、今後不妊の原因遺伝子をクローニングするのに有効な方法であることが示唆された。従来の報告通り、スペイン産野生マウスMus spretus雄と、実験用マウスC57BL/6J雌の雑種F_1雄は不妊となることを確認した。妊性のあるF_1雌を用いて遺伝子マッピングしたところ、この不妊遺伝子はX染色体の最もテロメア側の位置にあることが同定された。この位置はY染色体とのホモロジー(共通部分)を示す領域に含まれ、何らかの理由でペアリング(対合)異常になって減数分裂ができないものと推定された。雑種不妊遺伝子を将来クローニングするためコンジェニックマウスを作製している過程中で、雑種間には流産を引き起こす遺伝子も存在することが判明した。流産を引き起こす雄の精巣組織切片の観察において精子は確かに作られるがかなり少ない精子減少症であった。そして妊娠は成立するが、ほとんど流産する。また、私たちはデンマーク産野生マウスMus m. musculusと実験用マウスC57BL/6Jとの不妊現象が先程の症例とは違って2つの遺伝子が同時に関与することにより発症することを見い出した。15EA02:雑種あるいは亜種間雑種における不妊現象には単に1つの遺伝子だけでなく、2つ以上の遺伝子が関与することを確認した。雑種不妊現象は単純なメンデル遺伝に基ずくものではなく、遺伝子の相互作用と不適合に由来することが示唆された。

スペイン産野生マウスMus spretus雄と、実験用マウスC57BL/6J雌の雑種F_1雄は不妊となり、妊性のあるF_1雌を用いて遺伝子マッピングしたところ、この不妊遺伝子はX染色体の最もテロメア側の位置にあることが同定され、Y染色体とのホモロジー(共通部分)を示す領域に含まれ、何らかの理由でペアリング(対合)異常になって減数分裂ができないものと昨年度までに推定されている。精子形成期に含有量が多く見られるカルモジュリンの免疫蛍光抗体法による染色により、middle pachytene期で精子形成障害の起こすincomplete spermatocyte arrestの症例であることが確認された。雑種不妊遺伝子を将来クローニングするために、コンジェニック系統(N12)を作製した。このコンジェニック系統を用いて、生後530日の発生ステージでさらに詳細に解析した。異常はペアリングの完成するMI期(20日)よりも早い段階、すなわちペアリングの開始する(14日)ですでに観察された。さらにコンジェニック系統を作製する過程で、雑種間には流産を引き起こす遺伝子も存在することが判明した。流産を引き起こす雄の精巣組織切片の観察において精子は確かに作られているがかなり少ない精子減少症であった。また、私たちはデンマーク産野生マウスMus m. musculusと実験用マウスC57BL/6Jとの不妊現象が先程の症例とは違って2つの遺伝子が同時に関与することにより発症することを見い出した。雑種あるいは亜種間雑種における不妊現象には単に1つの遺伝子だけでなく、2つ以上の遺伝子が関与することを確認した。雑種不妊現象は単純なメンデル遺伝に基づくものではなく、遺伝子の相互作用と不適合に由来することが示唆された。スペイン産野生マウスMus spretus雄と、実験用マウスC57BL/6J雌の雑種F_1雄は不妊となり、妊性のあるF_1雌を用いて遺伝子マッピングしたところ、この不妊遺伝子はX染色体の最もテロメア側の位置あることが同定されている。この位置はY染色体とのホモロジーを示す領域に含まれ、何らかの理由でペアリング(対合)異常になって減数分裂できないものと推定されている。精子形成期に含有量が多く見られるカルモジェリンの免疫蛍光抗体法による染色により、middle pachytene期で精子形成障害の起こすincomplete spermatocyte arrestの症例であることが確認された。雑種不妊遺伝子を将来クローニングするために、コンジェニック蛍光(N12)を作製した。正常タイプ雄と不妊タイプ雄精巣での形態学的な特徴の違いを利用し、正常精子発生に何らかの機能をもっているcDNAクローンを単離する目的で、発現差によるサブストラクションを試みた。得られたコロニー96個の塩基配列を決定した後、データベースにより同定を行い、カテゴリー別に分類した。未知と思われるcDNAクローンF77に関してノーザンブロット法を行った。正常タイプ雄精巣で強く発現している役4kbの転写産物が認められたが、不妊タイプ雄精巣ではきわめて少量の発現しかみられなかった。
神経細胞におけるプリオン蛋白の分子シグナルの解明

プリオン蛋白のN-末半分(PrP23-120)をプローブとして、yeast-two hybrid法によりマウス脳cDNAライブラリーをスクリーニングしPrP結合分子の同定を試みた。2回の別々のスクリーニングの結果、膜蛋白であるsynaptic glycoprotein 2(Gpsn2)のスプライシング・バリアントであるsGpsn2が同定できた。Gpsn2は、308個のアミノ酸からなり、脳以外にも様々な組織で発現している。しかし、今回我々がyeast-two hybrid法により同定したsGpsn2は、第4番エクソンがスプライシングを受けたため、N末領域の15アミノ酸が欠落していた。興味深いことに、sGpsn2にmycタグを付加し培養細胞に発現させると、著明な細胞死を誘導した。界面活性剤を用いて細胞を溶解しウェスタンブロッティングを行うと、sGpsn2は凝集体を形成しゲル内を移動できなかった。しかし、尿素で細胞を溶解しウェスタンブロッティングを行うと、この蛋白は様々に切断されたバンドとして検出できるようになった。つまりこれらの結果は、sGpsn2が細胞内で凝集体を形成し細胞死を誘導することを示唆した。このsGpsn2による細胞死または凝集体形成が15アミノ酸の欠落によるものなのか不明である。現在、正常のGpsn2の遺伝子をクローニングし解析を進めている。また興味深いことに、PrPを共発現させると、sGpsn2による細胞死を阻害することができた。プリオン病では、異常PrPが凝集体を形成し、正常PrPは減少している。今回の我々の結果は、欠損Gpsn2と同様に、異常PrPの凝集体が神経細胞死を来たし、正常PrPはその細胞死のシグナルを阻害している可能性を示した。当初の計画ではグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST) pull down法によるPrP結合分子の同定を行う予定であった。しかし、全長PrPまたはN-末半分のPrPをGSTと融合し大腸菌にて発現させると、inclusion bodyを形成し可溶化が困難であった。そのため、GST融合PrPを精製することが出来なく、GST pull down法を用いたPrP結合分子の同定を行うことを断念しなければならなかった。そこで申請者は、yeast-two hybrid法を用いてPrP結合蛋白を同定することにした。ベイト蛋白として、PrPのN-末半分(PrP23-120)とPrP特異的オクタペプチドリピート(OR)を欠損するN-末半分(PrP23-120ΔOR)を発現するコンストラクトを作製した。これらを酵母に導入した結果、ウェスタンブロッティングにてこれらの蛋白の発現を確認した。また、これらの蛋白の細胞毒性を調べた結果、細胞増殖に何ら影響がないことも分かった。さらに、レポーター遺伝子の転写活性を調べたが、これらの蛋白のみではなんら転写活性を示さなかった。次に、市販のマウス脳cDNAライブラリーが既に導入されている酵母を購入し、PrP23-120を発現する酵母と交配させスクリーニングを行った。その結果、レポーター遺伝子のリーキーな発現があり、一次スクリーニングにて約1万個のコロニーが得られた。このリーキーな発現を抑制するために、レポーター遺伝子の一つであるHISの拮抗剤である3-アミノ-1-2-4-トリアゾール(3-AT)の効果を検討した。その結果、15mM20mM 3-ATでネガティブと思われるコロニーがほとんど検出できなくなった。そこで、15mM 3-ATを用いて再度スクリーニングを開始した。

プリオン蛋白のN-末半分(PrP23-120)をプローブとして、yeast-two hybrid法によりマウス脳cDNAライブラリーをスクリーニングしPrP結合分子の同定を試みた。2回の別々のスクリーニングの結果、膜蛋白であるsynaptic glycoprotein 2(Gpsn2)が同定できた。この蛋白は、308個のアミノ酸からなり、脳以外にも様々な組織で発現している。しかし、今回我々がyeast-two hybrid法により同定したGpsn2はN末領域の15アミノ酸が欠損していた。興味深いことに、この蛋白にmycタグを付加し培養細胞に発現させると、著明な細胞死を誘導した。界面活性剤を用いて細胞を溶解しウェスタンブロッティングを行うと、この欠損蛋白は凝集体を形成しゲル内を移動できなかった。しかし、尿素で細胞を溶解しウェスタンブロッティングを行うと、この蛋白は様々に切断されたバンドとして検出できるようになった。つまりこれらの結果は、欠損Gpsn2は細胞内で凝集体を形成し細胞死を誘導することを示唆した。このGpsn2による細胞死または凝集体形成が15アミノ酸の欠損によるものなのか不明である。現在、正常のGpsn2の遺伝子をクローニングし解析を進めている。また興味深いことに、PrPを共発現させると、欠損Gpsn2による細胞死を阻害することができた。プリオン病では、異常PrPが凝集体を形成し、正常PrPは減少している。今回の我々の結果は、欠損Gpsn2と同様に、異常PrPの凝集体が神経細胞死を来たし、正常PrPはその細胞死のシグナルを阻害している可能性を示した。また我々は、Ubiquitin-conjugating enzyme E2E 2も同定することができた。この分子は、蛋白分解に関与する酵素である。この分子を神経細胞に発現させると、僅かであるが、正常PrPの分解が促進した。つまりこの結果は、この分子がPrPを特異的に分解する分子の一つである可能性を示唆した。
加圧環境を用いたニュートリノレス二重ベータ崩壊探索実験

ニュートリノのマヨラナ性を検証するための次世代ニュートリノレス二重ベータ崩壊探索実験を実現するため,加圧環境下においてキセノンガス溶解度を高めた液体シンチレータを用いることで測定感度を高める開発研究を行った。特に,上記の条件を実現できる液体シンチレータの開発,現在地下実験で問題になっている容器の表面汚染を防ぐためのスーパークリーンルームの使用方法の改善,容器由来のノイズ事象を大幅に低減する事ができる発光性容器の開発と技術実証に成功した。1つ目の課題として、1.8気圧下におけるキセノン含有液体シンチレータの配合(Xe-LS-1.8)およびXe-LS-1.8を保持するバルーンの外部に満たす外部液体シンチレータ(Outer-LS)の配合、およびこれらの透過率や発光量を測定した。この結果、N-10:65%、PC:35%、PPO:2.7g/l、Xe:5.4wt%のXe-LS-1.8、Paraol 250:80%、PC:20%、PPO:1.36g/lのOuter-LSが、1.8気圧下を有効に利用し、高濃度にキセノンを溶解させた液体シンチレータとして有望であることを確認した。2つ目の課題として、加圧環境下におけるキセノン含有液体シンチレータ(Xe-LS)の密度変化について約1.8気圧(0.18MPa)まで測定を行った。一般的に、脱気した有機液体は密度と圧力に比例関係があるが、キセノンを溶解した液体シンチレータは前述した比例関係に加えて対数関係を持ち、対数関係が優位な0.05MPa以下および比例関係が優位な0.05MPa以上に分かれる事が判明した。3つ目の課題として、低バックグラウンドのままXe-LSを保持するバルーンを製作するため、クリーン環境の保持方法について検討した。現在使用可能なクラス1のスーパークリーンルームにおいて、洗浄後のナイロンフィルムを1ヶ月放置した前後で分析を行ったところ、ウラン、トリウムの含有量が約10倍になる事が判明した。この結果は静電気による埃の吸着を示唆しているため、今後この対策について検討を始めた。4つ目の課題である発光フィルムの開発は、PENフィルムがα線に対する発光量、透過率などの結果およびバルーンを製作するための物性的特徴をほぼクリアしている事が確かめられた。(1)バルーンの製作は基本的にスーパークリーンルームで行われるが、内部に持ち込んだ道具や作業員が持ち込む埃が、放射性不純物源となり表面汚染の原因となる事が判明している。このため、レーザーを用いた微粒子可視化装置を用いて埃の原因を調査した。この測定により、再使用したクリーンスーツ、クリーンパックされているのもの超純水洗浄を行っていない手袋、クリーンルーム用の不織布などが埃の原因となり、フィルムや検出器に接するものはすべて超純水で洗浄する必要がある事が判明した。その他、埃の発生しやすい体の動きや、ゆっくり動くことが埃の発生を防ぐことなど、クリーンルーム内作業における環境保持についてのデータを蓄積した。(2)表面に埃が付着したフィルムについての洗浄方法についての開発を進めた。しかし、各種洗浄前後において顕微鏡による埃の付着や放射性不純物の測定を行ったものの、現在効果的な除去方法が見つかっていない。埃が付着する前にフィルムと同素材のカバーを付けて製作を進めるなどの対策が必要であると考えられる。(3) PENフィルムを用いてテストバルーンを製作した。素材および製作の特殊性により、企業による製作は受け入れてもらえなかったため、スーパークリーンルームに溶着装置など一式準備し、学生と共に製作を行った。当初直径40cmのバルーンを製作予定だったが、フィルムの曲線の形状と溶着装置の制限により小さなものを製作するのは不可能であることが分かったため直径80cmのバルーンを製作した。また、この製作過程において、溶着時の溶着装置の圧力の掛け方により溶着にムラができやすいこと、そしてムラが出来ているところはリークが出来ている頻度が高いことが分かった。これらを改善するため、小さな溶着幅で溶着し、力をかけやすい溶着装置の開発、およびリーク箇所の補修についての開発を進めている。ほぼ計画通り進展しているものの、企業に依頼を予定していたテストバルーン製作を断られたため、研究者自身で溶着作業などを行うことになり道具の調達や作業手順の構築に手間取ることになった。また、テストバルーンを製作している中て手探りで溶着技術を確立させてきたため、リークによる補修が必要になったことなどによりもう一度テストバルーンを製作する必要がでてきたことから、おおむね順調に進展しているとした。本研究では、加圧環境下における液体シンチレータ(LS)へのキセノン溶解度の増加、低バックグラウンドのフィルムまたは発光性のフィルムを活用した二重β崩壊探索実験の基礎研究を進めている。前年までの研究により、1度ナイロンフィルムに付着した埃などの放射性不純物源を、洗浄などにより除去するのは困難であることが示されてきた。そのため、ナイロンフィルムでカバーを作り、埃の吸着を防ぐサンドイッチ構造にした上でバルーンを製作した時に放射性不純物が増加するかを確認した。解析の結果、ウランの増加についてはフィルム洗浄後の値に近く、3ppt程度の増加にとどまることが判明した。発光性のフィルムについては、補修に用いる接着剤の選定を目指した。しかし、現実的に使用可能な一層型の接着剤5種類を試したが、いずれも接着することができなかった。LSにキセノンを高濃度に溶解するにつれ発光量が落ちることが分かっている。

この発光量低下の回復を目指し、キセノンの発光波長から400nm程度まで波長変換を行う1.1.4.4-Tetraphenyl-1.3-butadineを0.1g/L追加し発光量を測定した。しかし、添付していないものと比べ発光量は27%となり、使用に耐えないことが判明した。発光性フィルムは400nmより短波長側で吸収がある。そのため、現在のLSを保持した場合、どの程度の光の吸収があるかを確認したところ、約50%を吸収により失うことが判明した。また、bis-MSBを0.1g/L添付し、発光波長を変換した場合についても確認したところ、4%の低下に留まることが判明した。この測定結果および発光フィルムと液体シンチレータの発光時定数の違いを用いる事で、キセノンを加圧環境下でLSに溶解させた二重ベータ崩壊探索実験における感度計算を行うシミュレーションの入力データが揃った。液体シンチレータについての測定やフィルムに放射性不純物を付着させないための対策については概ね順調に進んでいるが、容器となる発光性バルーンの製作段階で発生する微小な穴を補修する接着剤の選定が今年度中に終了しておらず、目処が立っていない。そのため、再度製作を目材していた小さなバルーンの製作が進んでいないため、やや遅れていると判断した。前年度から引き続き調査している、発光性フィルムの溶着不良箇所の補修に用いる接着剤の選定を進め、一種類使用可能な物を選定した。一方で、ウラン・トリウムの含有量が19*10^{-12}g/g、8*10^{-12}g/gと有意な数字であり、限定された箇所にしか使用できないことが判明した。上記の接着剤による補修の他に、溶着による補修を行うための装置を開発した。通常フィルムによってバルーンを製作し、フィルムが閉じた状態になってからヘリウムリークテストによる漏れを調査するが、溶着は過熱部と熱を受ける部分の間にフィルムを挟むため、リーク箇所が見つかってもこの状態からさらに溶着を加えることは難しい。そのため、小型の溶着機とバルーン内部に設置可能な熱受台を開発し、バルーン形状になってからの溶着による補修ができるようになった。本研究では、検出器の液面下数十メートルに設置したバルーン内部の液体シンチレータに、圧力の増加に伴ったキセノンガスの溶解度の増加を用いて大量のキセノンを溶かし、二重ベータ崩壊探索実験を行うことを想定している。この手法による、体積に比例するノイズ事象(宇宙線μによる原子核破砕生成物や太陽8Bニュートリノ)の低減、キセノン溶解量に伴う発光量の低下、液体密度の増加、既存の検出器内のより中心に近い場所に光電子増倍管を設置することによる集光量の増加とエネルギー分解能の向上を想定した感度計算を行った。液面下30mに設置したキセノン含有液体シンチレータのキセノン溶解度を7.7wt%、バルーンの半径1.9m、エネルギー分解能3.4%sqrt{E(MeV)}を想定した場合、5年間の観測で有効質量が20meV、半径2.24mの場合は17.5meVと見積もられた。液体シンチレータを改良し、より大きい発光量と低密度を実現する事でより高感度での探索実験を実現することができると予想される。
非可食バイオマスの直接発酵を可能とする宿主微生物の開発

研究を開始した当初、好熱菌Ureibacillus thermosphaericusのリグニン分解能を利用して遺伝子発現システムを開発することを計画していた。しかしながら、U. thermosphaericusが有するリグニン分解活性は低く、宿主微生物としての利用が困難であった。そこで、自然界より採取した種々の環境土壌を利用して広範なスクリーニングを実施した。その結果、リグニン分解活性は有していないが、貧栄養条件下で優れた増殖能を有する細菌を新たに分離した。さらに、本分離株の統学的解析や生化学的解析等を進め、本分離株が腸内細菌科に属する新属新種細菌であることを明らかにした。木質系非可食バイオマスの全主成分から有用物質の発酵生産を可能にする宿主微生物の開発を行うため、好気性好熱性細菌Ureibacillus thermosphaericusが有するリグニン分解活性を解析した。具体的には、リグニンを単一炭素源に用いて、U. thermosphaericusを培養し、U. thermosphaericusの増殖を確認するとともに培養液に含まれるリグニン分解物の同定を試みた。その結果、U. thermosphaericusの増殖は、グルコースなどを炭素源に用いて培養した場合と比べて、著しく低くなることが明らかになった。また、U. thermosphaericusの増殖能は、リグニン分解能を有する微生物のそれと比較した場合、著しく低くなった。U. thermosphaericusのリグニン分解活性を酵素・遺伝子レベルで解明するため、ゲノムシーケンスを解読した。ゲノムシーケンスの解読結果から、U. thermosphaericusにはリグニン分解に必要とされる複数種の酵素が備わっていない、またはそれら酵素の活性が低いことが示唆された。一方で、高いリグニン分解活性を有する微生物を新たに単離するため、自然界に存在する環境土壌を用いて広範なスクリーニングを行った。その結果、木質系非可食バイオマスの全主成分のうち、複数種の成分を炭素源として利用可能な微生物を腐葉土より新たに単離した。本単離微生物は、通常の微生物が増殖できないような貧栄養状態でも増殖可能な点で、優れた特性を持つ微生物であった。さらに、本単離微生物をグルコースを炭素源に用いて培養した場合、U. thermosphaericusと同様の優れた増殖速度を示した。研究を計画した当初、リグニン分解物を利用した外来遺伝子発現システムをU. thermosphaericusの菌体内に新たに構築することを計画していた。一方で、U. thermosphaericusのリグニン分解活性を詳細に解析した結果、U. thermosphaericusが有するリグニン分解活性活性は低く、その活性を利用した外来遺伝子発現システムを構築することは難しいことが判断された。また、キシロースを利用した外来遺伝子発現システムを構築するため、U. thermosphaericusの炭素カタボライト抑制の解除を試みているが、炭素カタボライト抑制が解除された株を作製できていない。U. thermosphaericusのリグニン分解活性の解析及びゲノムシーケンスの解読結果から、リグニン分解物またはキシロースを利用した外来遺伝子発現システムをU. thermosphaericusの菌体内に新たに構築することは難しいことが判断された。そこで今後は、新たに単離した微生物を利用して、外来遺伝子発現のための宿主微生物の開発を行う。単離した微生物について、系統的解析及び生理学的解析、生化学的解析を行い、単離した微生物の特性を明らかにする。さらに、発現ベクターを利用して外来遺伝子の発現を試み、単離した微生物が、宿主微生物として機能するか検討する。応用微生物学U. thermosphaericusが有するリグニン分解活性を解析した結果、そのリグニン分解活性が低く、リグニン分解物を利用した外来遺伝子発現システムを菌体内に新たに構築が難しいと判断された。また、キシロースを利用した外来遺伝子発現システムの構築にも至っていない。これらのことから、研究計画の見直しが必要とされ、当初予定していた使用計画の変更が余儀なくされた。研究計画の見直しに伴い、新たに単離した微生物の系統的解析及び生理化学的解析、生化学的解析を実施する。それら微生物の特性を明らかにすることで、微生物の種名を提唱する。さらに、単離した微生物が、外来遺伝子を発現させるための宿主微生物として機能するかを検討する。これらの研究について、当該助成金と合わせて翌年度分として請求した助成金を使用する予定である。