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死後硬直の遅延に基づく生鮮魚の新流通法の開発

わが国ではマダイやヒラメといった高級魚はしばしば活魚で輸送される。他方、市場では活けじめ処理した死後硬直前の鮮魚が活魚と同等な価値で取りひきされる。しかしながら活けじめ魚の死後硬直の進行と貯蔵温度の関係については不明の点が多い。本研究はマダイやヒラメなどを対象にこの点を明らかにし、死後硬直の遅延を計ることによって、活魚輸送より経済的で大量輸送が可能な"活けじめ輸送"の実現を目指したものである。1.マダイ、ヒラメ、ブリ(ハマチ)を活けじめ後、直ちに0°および10°Cに貯蔵したところ、死後硬直の開始時間および完全硬直に達する時間は、いずれも10°C貯蔵で遅延した。これに関連してクレアチンリン酸やATPの消失速度、さらには乳酸の蓄積速度は、いずれも10°C貯蔵のもので小さかった。2.マダイ普通筋筋形質タンパク質中に占めるクレアチン・キナーゼの割合は、13%前後で主成分の1つと認められた。マダイおよびヒラメ普通筋のクレアチン・キナーゼ活性は、測定温度の低下とともに漸次低下した。3.マダイおよびヒラメ普通筋筋原線維のMg^<2+>-ATPase活性は微量のCa^<2+>によって著しく賦活された。死後硬直の進行速度の温度依存性との比較から、0°C貯蔵で筋肉内のCa^<2+>濃度が上昇してATPase活性が増大し、結果的にATPの消費速度が増大し、死後硬直の進行が促進されるものと考えられた。4.ニジマス普通筋の解糖系中間体中、グルコース-6-リン酸およびグルコース含量が高かったが、死後の変化に一定の傾向はみられなかった。5.活けじめヒラメにつき島根県から大阪府まで17時間を要して、0°Cおよび10°Cでの輸送試験を行ったところ、10°Cのものでは大阪の市場で高い評価を受けた。他方、和歌山県から大阪府まで6時間を要して輸送した活けじめマダイについては、10°C輸送でも硬直がみられ、輸送温度の違いによる市場評価の差は明確にできなかった。わが国においてはマダイやヒラメなどの高級魚は活魚で輸送されることが多い。他方、市場では活けじめ処理した死後硬直前の鮮魚は、活魚と同等な価値で取りひきされる。しかしながら魚類の死後硬直の進行と貯蔵温度の関係には不明の点が多い。本研究はマダイやヒラメなどを対象にしてこの点に検討を加え、死後硬直の遅延を計り、活魚輸送より経済的で大量輸送が可能な"活けじめ輸送"の実現を目指したものである。1.マダイやヒラメとならぶ有用魚類のブリ(ハマチ)を活けじめ後、直ちに0°および10°Cに貯蔵したところ、両貯蔵温度ともに2時間以降に硬直し始めた。他方0°C貯蔵では9時間後に、10°C貯蔵では16時間後に完全硬直に達し、マダイやヒラメの場合と同様に、10°C貯蔵で死後硬直の進行の遅くなることが明らかとなった。さらにクレアチンリン酸やATPの分解速度、また乳酸の蓄積速度は、10°C貯蔵で小さかった。

2.ヒラメおよびマダイ普通筋につき、クレアチン・キナーゼ活性を測定したところ、測定温度の低下に伴って低下した。なおクレアチン・キナーゼは、両魚種とも筋形質タンパク質中の主成分と認められた。3.ヒラメ普通筋筋原線維につき、Mg^<2+>ーATPase活性に及ぼすCa^<2+>の影響を調べた。その結果、0°Cにおいて何らかの理由で筋細胞内のCa^<2+>濃度が増大し、Mg^<2+>ーATPase活性が賦活されることによりATPの消費速度が大きくなることが示唆された。4.ニジマス普通筋中の解糖系中間体を調べたところ、グルコースー6ーリン酸、フルクトースー1,6ービスリン酸の各含量が高かったが、死後の変化には一定の傾向がみられなかった。5.活けじめ天然マダイにつき、大阪魚市場への輸送試験を実施した。ヒラメの場合とは異なり、10°C、6時間輸送でも硬直がみられ、輸送温度の違いによる市場評価の差は明確にできなかった。
17世紀後半の英国演劇にみられる王位空位期間の演劇の影響と都市の表象

王位空位期間(インターレグナム)と呼ばれる、チャールズ一世の時代と1660年の王政復古期との間に、どのような演劇が上演または執筆ざれ流通したのかを考えることにより、17世紀後半以降の演劇と政治との関わりをあきらかにするとともに、王政復古以降の演劇研究のあり方に新しい視点を与えることを目的とした。その過程で特に注目したのが50年代のProtectorate(護国卿政治期:1653-59)に数多くの劇作家・詩人によって書かれ、回覧またはプライベートで上演された悲喜劇(tragicomedy)である。昨年の研究において、王政復古をはさむ前後にフレッチャーなどによる悲喜劇が頻繁に上演されたことを確認したが,王位空位期間には悲喜劇が王党派の文人達により極めて政治的な意味を付与することのできるジャンルとして繰り返し使用されてきた。Naocy Klein MaguireはRegicide and Restoration:English Tragicomedy,1660-1671において、王政復古期と王位空位期間の悲喜劇の流行と王の処刑との関係に注目しているが、それでは王の処刑(1649年)以前に書かれた悲喜劇と50年代に書かれた悲喜劇との類似性を無視することになる。王の処刑という悲劇的現実が、王政の復活という喜劇的な結末によって回収される悲喜劇を、王党派にとっては現実にはありえない願いを満たしてくれる現実逃避的、あるいは国の本来あるべき姿を提示する作品とみなすのではなく、チャールズ一世の君主としての再興を望めないと同時に望まない王党派の現実への妥協の可能性を探る場として考えるべきである。本年度は、以上の点を具体的に検証するために、WilliamCartwrightの作品The Royal SlaveにThe Lady Errantを取り上げた。清教徒革命と王政復古以降、またチャールズ一世の処刑の前と後とにみられる演劇における隔たりを埋める可能性が、Cartwrightの作品に垣間見られた。申請者(南)は、2年間の研究費交付期間に、これまでの17世紀後半演劇研究が見過ごインターレグナムしてきた王位空位期間の演劇の影響を、主に喜劇における他人を中傷誹謗する際の性的な比喩を含む言語表現と都市の表象を中心に考察し、1660年代から70年代の演劇が持つ広い意味での政治性が1690年代になり演劇の質とともにどのように変容していったかを、ここの作品の細かな分析を通して明らかにしようと考えた。またその際、実際の上演がどのように行なわれ、またどのように受容されたかということが、戯曲の分析とともに重要な意味を持つことを改めて示そうと考えた。初年度にあたる平成9年度は、Derek HughesがEnglish Drama 1660-1700で採用した時代区分を基に1660年から1700年までの演劇作品を5つの時代区分に分け、とくにその初期の演劇のあり方について考察しようと試みた。これは、研究対象を絞り込む方が、いわゆる王政復古期全体に目をやるよりも申請者の意図する問題をより明確化できると考えたためである。そのために申請者は、王政復古直後の劇場における演劇活動の再開にともない頻繁に上演されたBeaumont and Fletcherの作品に注目した。ジェイムズ朝からチャールズ朝にかけて人気を博したこの二人による作品が、インターレグンナムを経たいわゆるCaroloan dramaとしてどのように舞台で再演されたのか。これらの作品がどのように改変されたのかということに注目することにより、清教徒革命以前と以後のイギリス演劇の性質の違いを明確化し、その中からインターレグナムの影響と考えられるものを、主に作品の精読とテキストの分析から導き出そうとした。
Thymosin beta 4遺伝子導入による歯原性上皮細胞の作製

歯の再生にはエナメル質を作る歯原性上皮細胞と象牙質や歯髄などを作る歯原性間葉細胞が必須である。しかし、歯原性上皮細胞の作製報告は殆どみられない。そこで本研究では、Thymosin beta 4(TMSB4X)の遺伝子導入で歯原性上皮細胞の作製およびそのメカニズムを解明することを目的とした。その結果、TMSB4Xをヒト角化細胞に導入したところ、エナメル質様硬組織形成能およびエナメル基質蛋白の発現能を認める歯原性上皮細胞様に形質転換した。また、そのシグナル経路としてSmad、PI3K-Akt経路が示唆された。TMSB4X過剰発現細胞株にsiRNA法によるTMSB4X発現阻害を行いながら石灰化誘導培養の結果、石灰化物の生成は減少した。この結果から、TMSB4Xが石灰化に重要な働きを示していることが示唆された。Thymosin beta 4, X-linked(TMSB4X)過剰発現HaCaT細胞の解析により、TMSB4XがRunx2を介して歯原性因子の発現調節を行っていることが強く疑われた。このシグナル伝達経路を解明すべく、今回はマウスTMSB4X過剰発現細胞および歯原性上皮細胞株(mDE6細胞)を用いて検索を行った。その結果、TMSB4X過剰発現HaCaT細胞およびmDE6細胞においてTMSB4Xの発現によりp-Smad1/5やp-Aktの蛋白発現が上昇することが認められた。またmDE6細胞においてTMSB4XをsiRNA法により機能阻害を行うと、前述の因子の発現量は減少した。さらにmDE6細胞をTMSB4X機能阻害下で石灰化誘導培養を行ったところ、わずかではあったが、コントロールと比較して有意な石灰化の減少が認められた。これらの結果より、TMSB4XはSmad、PI3K-Akt経路を介してRunx2発現調節、さらには歯原性因子の発現や石灰化形成を調節していることが示唆された。TMSB4X過剰発現HaCaT細胞でも同様の傾向は示唆された。しかし、HaCaT細胞では、Tet-oneシステムを用いたTMSB4X調節発現系細胞樹立の方法で行う予定であったが、実験期間内での終了が難航したため、mDE6細胞を用いての解析のみ発表することとなった。なお、本結果は「Thymosin beta 4 is associated with RUNX2 expression via the Smad and Akt signaling pathways in mouse dental epithelial cells.(Int. J. Mol. Med. 35: 1169-1178)」にて発表された。口腔病理学申告時の計画に沿って計画が進み、本研究で得られた結果を一部含めた形で論文発表ができたので、達成度は概ね順調であると考えられる。今後の予定は、まずマイクロアレイ解析より得られた遺伝子データと過去に我々が報告した歯胚の発生・発育に関連した因子との関連性について検討する。そして、網羅的解析により得られた因子の特徴によるTMSB4Xにより発現が制御されるシグナル伝達機構を解明する。その手法の1つで、siRNAを用いたTMSB4X阻害実験を行う予定であったが、レスキュー実験を兼ねた実験も必要と考え、Tet-Oneシステムを利用したTMSB4X調節発現系を用いた実験に一部変更した。現在この調節発現系の細胞樹立を行っている最中である。
強度近視における血管新生黄斑症の分子機構解明と治療法の確立

わが国は世界有数の近視国であり,近視による視覚障害は常に失明原因の上位を占める重要な疾患である。強度近視の視覚障害の原因は,眼軸延長により後極部眼底に生じる様々な近視性眼底病変であるが,中でも黄斑部に生じる脈絡膜新生血管(CNV,Fuchs斑)は視覚障害の原因として最も重要である。研究代表者は長年,強度近視患者の診療に携わってきたが,近視性CNVの分子機構は未だ不明であり,また視機能上重要な黄斑部に生じるため,従来の治療法では視力改善が得られず,有効な治療法は確立されていない。わが国における近視人口の多さを考えると,従来の経験的治療法ではなく,近視独自のCNV発生機序を解明し,分子機構に基づいた治療法を開発することが社会上急務である。強度近視の本態は眼軸の延長であり,それにより網膜にかかる機械的ストレスがCNV発症の原因であると考えられる。そこでまず生体内に近い状態をin vitroで再現するために,ヒト培養網膜色素上皮(RPE)細胞をlaminin-coated dish上でbasic FGF含有培地で培養し文化誘導を行った。このRPE細胞が分化形質を発現していることはcobblestone状の形態,色素の産生,CRALBP,RPE65などの分化マーカーの発現をもって確認した。つぎに,RPE細胞に対し,強度近視の病態を模して機械的伸展を負荷した際に生じる遺伝子発現変化調べた。刺激としては培養細胞伸展装置Flexer Cellを用い,予備実験から15%の伸展強度で30分間隔のパルス状刺激を選択した。RPE細胞に伸展刺激を負荷し,24時間後にmRNAと培養上清を施行し,realtime PCRとELISAを施行した。その結果,伸展刺激によりRPE細胞におけるVEGF,MCP-1の発現がmRNAレベル,蛋白レベル共に上昇していた。一方,血管新生抑制因子であるPEDFの発現は蛋白レベルで低下していた。以上から,機械的伸展によりRPE細胞において生じるこのような血管新生関連因子のバランスの崩れが近視性CNVの発生に大きく関与していると考えられる。また近視性CNVの発生,進展に関与する臨床研究を施行し,CNVの進展に関与する因子を眼循環の側面から解析した。わが国は世界有数の近視国であり,近視による視覚障害は常に失明原因の上位を占めている。強度近視による視覚障害の原因は,眼軸延長により後極部眼底に生じる様々な近視性眼底病変であるが,中でも黄斑部に生じる脈絡膜新生血管(CNV)が頻度も高く最も重要である。しかし近視性CNVに対する有効な治療法は確立されておらずまた発症原因も明らかではない。そこで本研究では近視性CNV発生の分子機構解明を目的とした。本年度はヒト網膜色素上皮(RPE)細胞を,細胞進展培養装置(Flexer cell)を用いて機械的伸展を負荷した培養を行った。予備実験により伸展強度15%でもRPEは培養皿から剥離せず,以降伸展強度15%で24時間の刺激を行った。パターンとしては30分間パルス状のストレッチと,連続ストレッチの2種類を選択した。機械的伸展を負荷していないヒト

RPE細胞は細胞間が明瞭で敷石状の分化した形状を呈していたが,15%負荷を24時間施行したRPEは,連続ストレッチでは敷石状の形状が崩れ,やや細長い形状に変化した。パルスストレッチでは連続ストレッチよりも線維芽細胞様に細長い形状に変化していた。つぎにRPE細胞からmRNAを抽出し,real time PCR法により解析したところ,機械的伸展を負荷していないRPEに比較し,特にパルスストレッチを負荷したRPE細胞において,血管新生促進因子である血管内皮増殖因子VEGFの発現が上昇し,血管新生抑制因子である色素上皮由来因子PEDFの発現が低下していた。同時に培養上清を用いたELISA法,Western blotting法でも特にパルスストレッチを負荷したRPE細胞においてVEGFの産生が上昇しPEDFの産生が低下していた。以上の結果から,RPE細胞に眼軸延長を模して機械的伸展を負荷するとin vitroでは血管新生を促進する方向に作用することが示された。In vitroで強度近視の病態を再現するために,細胞伸展培養装置(Flexer cell)を用いて網膜色素上皮(RPE)細胞に機械的負荷を行った。RPEに対し,強度の伸展をパルス状に行った場合と持続的に行った場合の2種類を設定し,それぞれの条件下で伸展強度は5%,10%,15%を施行した。以上の条件下で機械的負荷12時間後にRNAを抽出,24時間後に培養上清を採取した。位相差顕微鏡で観察した細胞の形態は,持続的負荷の場合には殆ど変化がみられなかったが,パルス状の負荷で特に15%の伸展強度で負荷した場合にはRPEの特徴的な分化形態である敷石状の形態が崩れ,線維芽細胞様の細長い形態に変化していた。つぎに血管新生に関連する因子に対して,Real time PCR法とELISA法を用いて遺伝子発現を検討すると,特に15%強度でのパルス状負荷において,マクロファージ走化因子(MCP-1),血管内皮増殖因子(VEGF)の発現がmRNAレベル,蛋白レベルともに上昇していた。つぎに血管新生抑制因子である色素上皮由来因子PEDFの発現をreal time PCR, Western blotting法を用いて解析したところ,PEDF mRNAの発現は機械的負荷により変化しなかったが,PEDF蛋白レベルの発現が機械的負荷により低下していた。機械的負荷により誘導される上記の遺伝子発現の変化が強度近視眼において血管新生を誘導する原因である可能性が示唆された。
肺移植患者における免疫抑制剤の血液中濃度の変動解析に基づく個別投与設計法の確立

【研究目的】免疫抑制剤であるタクロリムス(FK506)は臓器移植や造血幹細胞移植後の拒絶反応を抑制するために汎用されるが、血液中の有効濃度域が狭く、薬物動態の個体差が大きいため、TDMの実施が必須である。肺移植は一般的に他の臓器よりも移植後の拒絶反応が強いことに加え、FK506の投与量は他の臓器移植よりも多くなりやすいため、肺移植患者では他の臓器移植患者よりもより慎重なFK506の投与設計が要求される。近年、本邦では肝移植患者を対象にFK506の血中濃度の変動要因について解析されているが、肺移植患者におけるFK506の血中濃度の変動についてはほとんど解析されていない。そこで、本研究では肺移植患者を対象としたFK506の個別投与設計法を確立することを目的に、母集団薬物速度論の手法を用いてFK506の血中濃度推移の変動要因について解析した。【方法】遡及的解析は岡山大学病院呼吸器外科で肺移植を実施し、術後FK506を経口投与され、TDMを実施された肺移植患者を対象とした。FK506の血中濃度推移は吸収相のない1-コンパートメントモデルに従うと仮定し、非線形混合効果モデル(NONMEM)法によりFK506のクリアランス(CL/F)の母集団平均値を推定した。なお、分布容積は文献値(Fukatsu et al., Eur.J.Clin.Pharmacol., 57, 479-484, 2001)に固定して解析した。【結果・考察】母集団解析の結果、CL/Fと術後経過日数(POD)の関係について検討したところ、CL/Fは術後10日まで経日的に上昇し、その後、術後30日まで低下することが明らかとなった。また、血中総ビリルビン濃度(TBil)が2.0mg/dl以上の場合にCL/Fが低下することが示された。更に、POD、TBilの影響を考慮したモデルを用いて各患者におけるFK506の血中濃度の予測精度を評価したところ、術後10日までは全体的に実測値と予測値に乖離が認められたが、術後10日以降ではこうした乖離は小さくなり、精度良く予測可能であることが示された。本研究成果はFK506を投与している肺移植患者に対し従来よりも適切な個別投与設計を実施するための有用な情報を提供できると考える。
新規含硫黄導電性化合物のレドックス特性の研究とその応用

本年度実施計画の下記の3項目について以下の成果が得られている。1.含硫黄ポリピロール誘導体の合成と電気化学的特性評価チオールやジスルフィドなどの有機硫黄官能基を導入したピロール誘導体を合成し、それらのモノマーを電気化学的に重合することにより、有機硫黄化合物と導電性高分子が分子内で一体化された新規高分子化合物を得た。ジスルフィド基を導入したピロール誘導体からは電気化学的活性の高い高分子薄膜を容易に電極表面に得ることができた。しかしながら、ラマン分光測定および電気化学的水晶振動子電極法を用いた結果からは、ジスルフィド結合の酸化還元反応について明確な結果を得ることはできず、硫黄化合物-導電性高分子の分子内一体化による、チオール-ジスルフィド間の電子移動反応に対する電気化学的触媒作用の増強について明確な確証を得ることはできなかった。しかしながら、本研究により得られた高い電気化学活性を有する含硫黄ポリピロール誘導体に対しては電池材料をはじめとするさまざまな応用が期待された。2.ポリチオフェン誘導体による有機硫黄化合物の酸化還元反応の触媒的加速化チオフェン環の3および4位に含酸素官能基を導入したポリチオフェン誘導体の有機硫黄化合物の酸化還元反応に対する電気化学触媒作用についても検討を行った。ポリチオフェン誘導体薄膜で修飾した炭素電極上において、有機硫黄化合物の酸化還元反応が室温においてもほぼ可逆的に進行することが確認された。3.金属ナノ微粒子を電気化学的触媒作用さらに、金属ナノ微粒子の電気化学的触媒作用についても検討を行った。その結果、導電性高分子-有機硫黄化合物コンポジット中に銀やパラジウムなどの金属ナノ微粒子を分散させることにより、電気化学的触媒作用の向上が示唆された。平成13年度は、チオール基やジスルフィド結合を含む置換基で修飾されたピロールモノマーを合成し、それらモノマーを電気化学的に酸化重合することにより、新規含硫黄ポリピロール誘導体の作成を行った。合成したいずれのピロールモノマー誘導体の電気化学的酸化重合からもポリピロール誘導体薄膜が電極表面上に得られた。しかしながら、モノマーの電解重合および得られたポリピロール薄膜のレドックス特性は、モノマーに導入した含硫黄置換基に依存して大きく異なった。ピロールの3位に1つあるいは3および4位に2つのチオメチル基(-CH_2-SH)を導入したピロール誘導体の電解重合より得られたポリピロール誘導体薄膜は、未修飾のピロールモノマーより得られたポリピロール薄膜と比較して、レドックス電位は正側に大きくシフトしていたが、レドックス活性は低かった。特に2つのチオメチル基を導入したpoly(3, 4-dithiomethylpyrrole)薄膜のレドックス活性は非常に低かった。この原因として、ラマン測定の結果より、モノマーの酸化・重合過程において、チオール基も同時に酸化され、生成したチオラジカル基とピロールラジカルの間でカップリング反応が進行し、その結果、π共役系の広がりが小さいポリピロール誘導体が生成したためと考えられた。一方、ジスルフィド結合を有する置換基を導入したピロールモノマー誘導体(1, 2-dithiano(4, 5-c)pyrrole)の電解重合からは、レドックス活性の非常に高い薄膜が効率良く得られた。また、得られたポリピロール誘導体薄膜の表面形態、レドックス特性およびLkドックス反応に伴う物質移動反応は、重合反応中に共存する電解質アニオンの影響を受けることが見出された。例えば、LiClO_4を電解質として用いて得られた薄膜の表面は顆粒状の析出物で覆われていたが、LiPF_6を用いた場合には、球状の析出物が得られた。平成14年度は、前年度に引き続きジスルフィド結合を導入したポリピロール誘導体の電気化学特性および電池材料としての特性評価を行った。

しかしながら、ラマン分光測定および電気化学的水晶振動子電極法を用いてピロール環に導入した含硫黄官能基の電気化学的活性について検討を行ったが、ジスルフィド結合の酸化還元反応について明確な結果を得ることはできず、硫黄化合物-導電性高分子の分子内一体化による、チオール-ジスルフィド間の電子移動反応に対する電気化学的触媒作用の増強について明確な確証を得ることはできなかった。しかしながら、本研究により得られた高い電気化学活性を有する含硫黄ポリピロール誘導体に対しては電池材料をはじめとするさまざまな応用が期待された。有機硫黄化合物の酸化還元反応速度を大きく加速化することが可能な導電性高分子材料として、チオフェン環の3および4位に含酸素官能基を導入したポリチオフェン誘導体についても検討を行った。その結果、電解重合法を用いてポリチオフェン誘導体薄膜を被覆した炭素電極上において、我々が高エネルギー密度リチウム二次電池の正極材料として注目している有機硫黄化合物(2,5-ジメルカプト-1,3,4-チアジアゾール、DMcT)モノマーの酸化還元反応が、室温においてもほぼ可逆的に進行することが確認された。また、ポリチオフェン誘導体により、DMcTダイマーおよびオリゴマーの酸化還元反応も加速化されることが確認された。さらに、有機硫黄化合物の酸化還元反応に対する金属ナノ微粒子の電気化学触媒作用についても研究を行った。有機硫黄化合物を金属ナノ微粒子表面に化学的に吸着(金属触媒-有機硫黄化合物の一体化)させることにより、電気化学的触媒活性が発現されることが示唆された。
吃音児者の個別の支援計画の作成と指導及び支援法の構築・展開

吃音児者の実態やニーズに即した指導及び支援法について検討するために、事例研究と調査研究を行った。事例研究では、吃音の進展した学齢児と幼児の他、合併症(構音障害、知的障害、読みや語想起の問題)のある事例、日本語習得中の中国人留学生を対象とした。直接的言語(発話)指導を核とし、カウンセリング的対応、環境調整による指導に加え、合併症に対応した指導を行った。その結果、対象者の吃音は軽快、行動・心理面も好転し、指導の効果が示唆された。調査研究として、吃音児の吃音に起因するストレスコーピング、セルフヘルプグループとの連携による吃音児支援のあり方、吃音の軽減を考慮した自己調整法等について検討を行った。吃音児の実態やニーズに即した指導及び支援法について検討するために、事例研究と調査研究を行った。1.事例研究【対象児】(1)吃音の進展した学齢児:発吃24歳代、初診(指導開始)時に811歳代の5例(吃音重症度評定尺度で重症度57、3例に間接法による受療経験あり)。(2)読みの問題のある吃音児:吃音を主訴とし、初診時に78歳代の3例。言語障害通級指導教室において指導が行われた。音読時に吃音症状と共に誤読が多くみられた。WISC-IIIによるFIQは85109、IQや群指数間に3例共に有意差がみられたが、LDや発達性読み書き障害の診断基準は満たさなかった。【指導方法】(1)柔らかな起声・声でゆっくりと母音部をひき伸ばし気味に発話(音読を含む)。後3例の読みの問題に対して、音読では主に文節ごとに意味のまとまりを意識させるよう指導、(3)カウンセリング的対応、(4)児童中心遊戯療法、(5)親面接(環境調整)。【経過】指導開始後、全8例において吃音症状は軽快(前5例の吃音重症度は04に軽快)。前5例の行動・心理面は好転、後3例の誤読も軽減。【考察】吃音の進展した学齢児に対し、関連した問題に留意しながら、直接的言語指導を核とし、多面的に指導・支援していくことの効果が示唆された。2.調査研究吃音者のセルフヘルプグループ(SSHG)と言語障害通級指導教室担当教師、言語聴覚士との連携による吃音児と保護者に対する支援のあり方について検討を行った。指導担当者67名、SSHG会員を中心とする成人吃音者91名への質問紙調査の結果から、SSHGの活動について、主に情報提供の面で吃音児支援に貢献できると思われた。SSHG会員の吃音児支援への意欲の程度については、「ある(46.2%)」「少しある(30.8%)」で、意欲の高さが示され、会員の多様な背景や経験が支援に生かされると思われた。(1)事例研究事例1(吃音が進展し構音障害を伴う子ども):発吃2歳10ヵ月の男児。初診(指導開始)時年齢5歳3ヵ月。構音の誤りあり。初診時吃音重症度6。事例2(吃音の進展したダウン症児):初診(指導開始)時年齢9歳10ヵ月(知的障害特別支援学級在籍)のダウン症女児。構音の誤りあり。会話明瞭度3、初診時吃音重症度5。【吃音の指導方法】1)柔らかな起声・声でゆっくりと母音部をひき伸ばし気味に発話(音読を含む)、2)自由会話(カウンセリング的対応を含む)、2)児童中心遊戯療法、並行して3)親面接(環境調整)。事例1についてはインリアル法のリフレクティングでも対応。【事例1の経過】月1回程度の頻度で指導。吃音の軽快をみて構音指導(口形音声模倣)実施。6歳2ヵ月時にkの構音改善。8歳1ヵ月時に吃音は消失、指導終了。【事例2の経過】月1回程度の頻度で指導。“ゆっくり"を意識した時や音読時には流暢性増加。中学校入学後、語彙の増加と言語表現の多様化、口腔運動能力の向上。会話明瞭度2に改善。構音指導や就職等の面接指導も実施。就労後、吃音が問題となることは少なくなった。【考察】吃音が進展し合併症のある子どもに対し、直接的言語指導を核としながら、ニーズを踏まえ、多面的に指導・支援していくことの効果が示唆された。(2)調査研究小学校46年の吃音児46名(吃音重症度は中度が多数)を対象に、吃音に起因するストレスへのコーピングについて調査した。吃音起因のストレスコーピングの平均得点は5年生が最も高く、他学年児に比べコーピング方略を多く用いていた。「行動的回避」では男児、「気分転換」では女児のほうが得点の高い項目があった。対象児の吃音の捉え方や自意識に応じて、選択するコーピング方略が異なることがうかがえた。

吃音児の実態やニーズに即した指導及び支援法について検討するために、事例研究と調査研究を行った。1.事例研究【対象児】(1)吃音の進展した学齢児:発吃2歳0ヵ月、初診時年齢9歳4ヵ月のA児(吃音重症度評定尺度で重症度6、間接法による受療経験あり)。時々「学校に行きたくない」と言う。(2)軽度の知的障害を伴う吃音児:吃音を主訴とし、初診時に小学校2年(B児)と5年(C児)の2例。公立小学校言語障害通級指導教室において指導が行われた。WISC-IIIによるFIQは63(B児)と53(C児)。B児は通常の学級(他校)に、C児は知的障害特別支援学級(他校)に在籍。【指導方法】(1)柔らかな起声・声でゆっくりと母音部をひき伸ばし気味に発話(音読を含む)。B、C児の読みの問題に対して、音読では主に文節ごとに意味のまとまりを意識させるよう指導(B児)、読めない漢字に振り仮名をつけ、指でなぞりながらの音読(C児)。(3)カウンセリング的対応、(4)児童中心遊戯療法、(5)親面接(環境調整)。【経過】指導開始後、全3例において吃音症状は軽快、行動・心理面は好転。A児のコミュニケーション態度は好転、「学校に行きたくない」と言わなくなった。【考察】吃音の進展した学齢児、軽度知的障害を伴う吃音児に対し、関連した問題に留意しながら、直接的言語指導を核とし、多面的に指導・支援していくことの効果が示唆された。2.調査研究吃音者の吃音の公表について、自己隠蔽尺度を用いて検討を行った。さらに、吃音の公表に伴う心理的変化や、公表する際に聞き手に求める態度について検討した。セルフヘルプグループ会員を中心とする吃音者110名に調査を行った。対象の吃音者の多くは吃音を公表しており、公表している者は自己隠蔽性が低かった。吃音の公表後に心理面が好転した者は多く、指導・支援に積極的に生かしていくことも求められる。1.事例研究【対象児】発話時に不自然な間を呈する吃音学童:初診時に10歳5ヵ月の女児。吃音重症度評定尺度による重症度3、発話意図がありながら不自然な間を呈することが多かった(語想起に問題)。WISC-IIIによるFIQは79。言語障害通級指導教室で指導。(2)不自然な間への対応(聴覚的把持力向上のための指導、他者感情の理解、対応策の検討など)、(3)カウンセリング的対応、(4)児童中心遊戯療法、(5)親面接(環境調整)。【経過】指導開始後、自身の応答時に長い間があることに気づいた。吃音重症度2に軽快、不自然な間の頻度と持続時間は減少した。行動・心理面は好転した。【考察】吃音とともに、発話時の不自然な間へのアプローチの効果が示唆された。2.調査研究(1)吃音に起因するストレスへのコーピングについて調査し、吃音重症度や吃音の自意識、指導方法との関係について検討した。小学校46年の吃音児46名とその指導担当者に調査を行った。吃音起因のストレスコーピングの項目別の得点と、自己評定による吃音重症度、吃音の自意識間には相関のみられたものがあった。対象児の吃音の捉え方や自意識に応じて、選択するコーピング方略が異なることがうかがえた。「行動的回避」で男児、「気分転換」で女児のほうが有意に高い項目があり、性別によって使用するコーピング方略が異なることがうかがえた。(2)吃音児のきょうだいの意識について質問紙調査を通して試行的に検討した。同胞の吃音への意識等について8人から回答を得た。
ＭＲＩを用いた線維化組織の可視化に関する研究

当初ファントム実験を1.5T、3T装置で行った後、健常ボランティアにて女性骨盤部撮影を行ったが、腸管の蠕動に伴うアーチファクトにより評価困難となる領域が広く解析可能な画像が得られなかった。このため、次年度より信号変化の確認しやすい子宮筋腫を対象に検討を行った。結果、子宮筋腫では正常筋層よりもECRは高い傾向が示され、筋腫内部の密な平滑筋細胞により、正常筋層よりも自由水が少ないことが示唆された。まだ症例数は少ないが、筋腫の変性の程度、画像ではT2強調像の信号の程度とECR値の相関をとらえることにより、今後、ECRの臨床的な意味づけが可能となると考えられる。前年度までに、1.5T装置においてファントムでの良好な画像が得られ、頭部MRIでもECR効果が確認されていた。このため、昨年度は、上記と同様のECR imaging用の特殊ファントムを用いて実験を行った。ファントム上は、1.5T同様、ECRの違いによる信号の変化が認められ、適切なシーケンスであると考えられたので、次に腹部での実験を行った。最初のボランティアにおいて、腹部手術後のボランティアにおおいて、手術創部に信号変化のある可能性が示唆されたが、創傷の範囲が小さく、ROIを囲んで測定するには値が安定しないこと、motion artifactが強いことから、評価の再現性・安定性については低い可能性が考えられた。このため、腹部における腫瘤性病変と正常組織間でECR値に違いが出るか検討を行った。対象として、子宮筋腫、腎細胞癌で撮像を行った。まだ少数であるため、統計的な値は出していないが、それぞれに腫瘤部位でのECR効果の出る可能性は示唆された。H23年度は、基礎実験として、東芝社1.5T装置にてECR imaging用に作られたファントムを用いて実験を施行し、ECR imagingが得られるか検証を行った。ファントム、及び頭部で良好な結果が得られた為、3T装置を用い、同一ファントムで実験を行った。1.5T装置に比べ、T1の短縮、susceptibility artifactの増強等の問題が挙がったが、各種撮像パラメーターの調整により、1.5Tで得られたものと同様の結果を得ることが可能となった。次に、婦人科患者で撮影ECR画像が得られるよう、事前撮影として、正常ボランティア、内膜症性嚢胞患者等において試験撮影を行った。しかし、腸管の蠕動に伴うアーチファクトにより評価困難となる領域が広いことが大きな問題で、更に対象とする線維化の範囲が非常に限られていることから、これを検討の対象とするには適切なシーケンスとはいえないと考えられた。このため、H24年度、25年度に信号変化の確認しやすい腹部における腫瘤性病変と正常組織間でECR値に違いが出るか検討を行うこととした。子宮筋腫を対象に検討を行った。問題として信号の不均一が評価の際に問題となることが多かった。3T装置は一般に磁場の均一性が問題となりやすいことも合わせ、シーケンスの最適化には慎重な調整が必要であると考えられる。既に行った1.5T装置でのファントムを用いた基礎実験と同様、3T装置においても、同じファントムによって、ECR imagingが得られるか検証を行った。3T装置は磁場が強いため、3T装置での撮影が可能となったことは、今後の症例の蓄積にとって、大きなステップアップであると考えられる。腸管の蠕動に伴うアーチファクトにより評価困難となる領域が広いことが大きな問題であり、今後の検討が必要と思われる。腹部術後の被検者においては、その創部に交差緩和率の違いが認められ、術後の線維化に伴う変化を反映した画像であると考えられた。また、内膜症患者ボランティアにおいては、卵巣内膜症性嚢胞内容液には明かな信号変化が認められず、癒着の状態の評価は困難であった。

ある程度以上の強い線維化を呈する状態で初めて交差緩和率に変化がみられると思われ、内膜症性患者においても、そのステージを考慮した上で今後の症例の蓄積が必要であると思われる。また、内膜症患者のみならず、担癌患者における検討も今後進めていく予定である。当初計画していたECR効果の評価については、上記(研究実績の概要)のような問題点があった為、線維化の評価は困難と判断した。そのため、腫瘍に対する評価へ方向転換し、そこから撮像被験者の募集を開始したため。H23年に3T装置がクエンチし、更に東日本大震災の影響が重なったために、クエンチからの復旧が遅れ、平成23年9月以降にようやく実験が可能な状態となった。このため、基礎実験、試験撮影までは可能であったが、症例検討まで至らなかった。当初計画していた線維化におけるECR効果の評価は難しい可能性があり、腫瘤の評価へ方向転換した。今後は、腫瘤(腫瘍)のある患者においてECR効果の有無、程度につき検討を行う。当大学産婦人科教室への働きかけにより対象となる患者を紹介頂き、症例での検討を進める。昨年度から今年度にかけての成果発表に対する費用今後、症例の蓄積によるデータ量の増加に伴い、データ保管用のハードディスクが必要となる予定である。
大脳皮質発生過程におけるソニックヘッジホッグ発現細胞の機能解析

本研究では、大脳皮質発生過程において分泌タンパク質であるソニックヘッジホッグ(Shh)を分泌する細胞の機能解明を目的とした。Shh-CreERT2マウスを用いて、胎生後期の大脳皮質でのShh発現細胞の同定を試みた。Shh-CreERT2マウスとZEG double reporterマウスと交配させ、E13-14にタモキシフェンを経口投与し発生過程での大脳皮質中のGFPの発現細胞を観察した結果、Shhを発現している細胞はINTERMEDIATE ZONEにある細胞である事がわかった。これらのShh発現細胞が、神経幹細胞の発生に関与するかどうかを調べるため、Shhを発現する細胞中でのみジフテリア毒素(DTA)を発現させ、Shh発現細胞の数を減少させた。その結果として神経幹細胞の分化が抑制された。以上の結果からShh発現細胞は胎生後期の大脳皮質の発生過程において神経幹細胞の分化を誘導していることが分かった。本研究提案では、大脳皮質発生過程において中胚葉である脊索前板由来細胞が背側の大脳皮質にまで移動しソニックヘッジホッグを分泌して、神経幹細胞の発生に関与し皮質の組織形成を調節する可能性を検討している。昨年度は、以下の点を明確化することを目的として研究を行った。1、脊索前板由来間充織細胞が、どのような細胞として発生しているのか?(細胞系譜実験)2、脊索前板細胞は大脳皮質の発生に関与しているのか?関与には、時期依存的(E8E12.5頃まで)、領域・領野依存的(前後・背腹軸、VZ/SVZ/中間帯/皮質板など)な違いがあるのか?(脊索前板細胞の実験生物学的、遺伝学的操作)脊索前板細胞の大脳皮質への到達について移動経路と定着位置を明らかにするため、蛍光色素DiIで胎齢7.5日のラット胚の脊索前板を標識し、それらの細胞の発生運命の検討を行った。胎齢7.5日の脊索前板の表面積は幅約50μmX縦約200μmであり、標識サイズは直径50μmとした。標識を行った胚は全胚培養器で60-72時間in vitroで培養し、脊索前板由来細胞の大脳皮質への移動並びに分布を観察記録した。その結果多くの細胞が間脳視床下部周辺に集積する一方、大脳皮質表面への移動を示す細胞も観察された。また遺伝学的に正中細胞集団の系譜を決定した。当初ES細胞を用いて脊索前板特異的な発現を示すGoosecoidの遺伝子座にタモキシフェン誘導性Creリコンビナーゼ(CreERT2)遺伝子をノックインする予定であったが施設の都合、Shh-CreERT2マウスを用いた。Shh-CreERT2マウスとZ/EG double reporterマウスと交配させ、脊索前板が発生する時期にタモキシフェンを投与し脊索前板由来の細胞をEGFPの発現で観察を行った。その結果、DiIで観察された分布と同様の結果が観察された。(3)脊索前板細胞の発現するShhタンパク質は、神経幹細胞の維持・分化制御において、如何なる意義があるのか?(神経幹細胞との相互作用)Shh-CreERT2マウスを用いて、神経幹細胞の分化や増殖が起こる時期の大脳皮質でのShh発現細胞の同定を試みた。Shh-CreERT2マウスとZ/EG double reporterマウスと交配させ、神経幹細胞が分裂・分化する時期(E11-14)にタモキシフェンを投与しEGFPの発現細胞を観察した。その結果、Shhを発現している細胞は未分化な神経幹細胞ではなく、分化決定した神経前駆細胞である事が観察された。現在これらの細胞でのShh発現が、細胞自身の分化過程に関与しているのか、あるいは未分化神経幹細胞に働きかけて、分化を促進しているのかについて解析を進めている。本研究提案では、大脳皮質発生過程においてソニックヘッジホッグ(Shh)を分泌して、神経幹細胞の発生に関与し皮質の組織形成を調節する細胞の機能解明を目的としている。昨年度はShh-CreERT

2マウスを用いて、神経幹細胞の分化や増殖が起こる時期の大脳皮質でのShh発現細胞の同定を試みた。Shh-CreERT2マウスとZEG double reporterマウスと交配させ、神経幹細胞が分裂・分化する時期(E11ー14)にタモキシフェンを経口投与し発生過程での大脳皮質中のGFPの発現細胞を観察した。その結果、Shhを発現している細胞はINTERMEDIATE ZONEに存在する分化決定した細胞である事がわかった。さらに細胞種の同定のため、マーカーとの比較検討を行った結果、IZの中でも後期のmultipolar phaseに存在することがわかった。これらの細胞でのShh発現が、細胞自身の分化過程に関与しているのか、あるいは未分化神経幹細胞に働きかけて、分化を促進しているのかについて調べる実験を実施した。Shh-CreERT2マウスをもちいて、タモキシフェン存在下でShhを発現する細胞中でのみジフテリア毒素を発現させ、Shh発現細胞の数を減少させることを試みた。現在、発生過程の皮質中におけるShh発現細胞の減少について、その減少率と幹細胞の分裂や分化への影響について解析を実施している。マウス飼育施設が研究室から遠いところにあり、飼育管理に要する時間が充分取れない。そのため実験に用いる組換えマウスの数が充分確保できず、実験回数が予想より減少している。24年度が最終年度であるため、記入しない。実験室内にマウスを飼育できるアイソレーターを設置したが、飼育できる匹数が充分でない。今後、アイソレーターを増設する、あるいは飼育できるスペースを研究室周辺に設置する等の策を検討している。
歪み集中帯の細粒鉱物混合層形成と化学効果

鉱物混合層形成と歪み弱化における化学効果を明らかにするため、かんらん石と輝石の鉱物量比を変えた多結晶体(輝石10%, 30%, 40%)を作成した。再現性のある高歪み変形実験ができるように、試料中心にニッケルを埋め込み試料内の応力不均一を軽減し、多孔質アルミナをピストンと試料の間に入れることで摩擦係数を上げピストンが滑りにくいよう実験アセンブリを工夫した。鉱物量比の異なる多結晶体を用いてねじり実験を行い、歪み速度、歪み量の違う実験を複数回行い、実験で得た力学データから変形メカニズムを推定した。実験の結果から、かんらん石70%+輝石30%、かんらん石60%+輝石40%の試料は、歪み増加に伴い応力指数(n)は減少し粒径依存型の粒界すべりクリープで変形し歪み弱化が起きることが分かった。一方かんらん石90%+輝石10%の試料は、歪み増加に伴いnはわずかにしか減少せず転位クリープで変形、歪み弱化は確認できなかった。実験試料の組織解析は、走査型電子顕微鏡(FE-SEM)と電子線後方散乱回折法(EBSD)を用いて行った。画像解析ソフトImageJと付属のマクロ(Heilbronner & Barrett 2014)を使い、粒径、粒界長さ、結晶方位の相互関係を解析した。得られた結果から、歪み量増加に伴う変形組織と力学データの変化を解析した。予定していた変形実験は終わり、組織解析を進めている。研究はおおむね順調に進展していると考える。既存の鉱物物性値と粒径モデルから、地球深部のどの温度・圧力条件で歪み集中が発現するのかを明らかにする。変形に伴いどのように元素が移動し細粒鉱物混合層を形成、歪み弱化に至るのかを明らかにするために「変形の少ない古い大きな粒子」と「変形により新しくできた小さな粒子」の微量元素の化学組成の違いを分析する。島根大学に既設の電子線マイクロアナライザー(FE-SEM, EPMA)を用いて、変形に起因した物質拡散による化学組成の違いを明らかにする。上記の結果がまとまりしだい、論文としてまとめ、投稿する。アメリカ地球物理への旅費(航空券+滞在費)で差額が出たため。
生合成における酵素的Diels-Alder反応-----その証明と反応機構

Diels-Alder反応は非触媒的に基底状態で起こることが知られ、軌道対称性保存則に従い高い立体選択性を示すため、天然物全合成において多用される反応の一つである。近年、[4+2]付加反応(Diels-Alder反応)により、生合成されたと予想される天然有機化合物が数多く見い出されてきているが、生体内(酵素)反応の実在することを証明した例はない。今回生体反応としては未だ例のない新しい型の炭素-炭素結合形成反応である本反応が実在することを証明するため、植物毒素solanapyrone A(1)を対象として選び研究を行った。重水素標識した仮想前駆体2の短段階合成経路を確立した。さらに標識化合物の菌への取り込み実験により直鎖状トリエンが実際にsolanapyrone A(1)に変換されることを確認するとともに、標識された1に光学活性なアシル基を導入し、一方のジアステレオマーにのみ重水素が保持されることを^2H-NMRにより確認した。これにより本環化は非酵素的に起きているのではなく、酵素的[4+2]付加環化反応により進行することを明かにし、Diels-Alder反応が生合成に関与することを世界で始めて立証することができた。また無細胞系で酵素活性を検出するためのHPLCを用いた検定法を確立できた。これにより20ug/mlと微量の1を検出することが可能となった。
地域の高齢者におけるうつ病の頻度および危険因子に関する疫学的研究

岐阜県T市の50歳以上中高年者約2万名から無作為に抽出した500名に対して、訓練を受けた8名の面接員が訪問面接調査を実施し、1996年12月20日までに205名(40%)から回答を得た。面接には、WHOの統合国際診断面接(Comosite International Diagnostic Interview,CIDI)1.1版のミシガン大学修正版(UM-CIDI)日本語版から、全般性不安障害、大うつ病、躁病およびアルコール・薬物依存症のセクションを使用した。CIDIの面接結果から、DSM-III-RおよびICD-10診断基準に基づいた全般性不安障害(不安神経症)、うつ病(大うつ病)、気分変調症(抑うつ神経症)およびアルコール・薬物依存症の診断を行なった。また人生の主要な出来事28項目の時期とその影響の程度を構造化面接によって評価する「社会年齢調査票」を開発した。このほか基本的属性、身体的健康、社会的支援を面接により評価した。調査では同時に、自己記入式質問票によって生活満足度(PGCモラール尺度)、社会活動の程度(社会活動調査票)、過去1年間の抑うつ症状(CES-D尺度)を測定した。結果として、5064歳および65歳以上地域住民におけるうつ病の時点有病率は0.5%、生涯有病率は5.0%であった。うつ病の経験者は最近の出生コホートほど高かった。うつ病の既往者合計11名のうち1名は精神科外来に、1名は内科に受療していた。子供との死別および健康状態の悪化、特に脳血管障害および骨折を経験した者にうつ病が多かった。また、配偶者との死別を経験した者で、全般性不安障害の頻度が高かった。うつ病の既往のある者では、調査時点での主観的満足度および社会活動の程度が低く、抑うつ症状の得点が高かった。高齢者におけるうつ病の有病率および危険因子を明らかにするために、地域の50歳以上の住民からの無作為抽出標本に対する疫学調査を実施した。面接には、WHOの統合国際診断面接(Composite International Diagnostic Interview,CIDI)1.1版のミシガン大学修正版(UM-CIDI)日本語版から、全般性不安障害、大うつ病、躁病およびアルコール・薬物依存症のセクションを使用した。調査では同時に、自己記入式質問票によって生活満足度(PGCモラール尺度)、社会活動の程度(社会活動調査票)、過去1週間の抑うつ症状(CES-D尺度)を測定した。回答者におけるうつ病の時点有病率は0.5%、生涯有病率は5.0%であった。全般性不安障害の時点有病率は0%、生涯有病率は3.2%であった。診断基準を満たす躁病エピソードはなかった。平成9年度はさらに調査を継続するとともに、危険因子の解析を行なう予定である。

面接には、WHOの統合国際診断面接(Composite International Diagnostic Interview,CIDI)1.1版のミシガン大学修正版(UM-CIDI)日本語版から、全般性不安障害、大うつ病、躁病およびアルコール・薬物依存症のセクションを使用した。CIDIの面接結果から、DSM-III-RおよびICD-10診断基準に基づいた全般性不安障害(不安神経症)、うつ病(大うつ病)、気分変調症(抑うつ神経症)およびアルコール・薬物依存症の診断を行なった。また人生の主要な出来事28項目の時期とその影響の程度を構造化面接によって評価する「社会年齢調査票」を開発した。このほか基本的属性、身体的健康、社会的支援を面接により評価した。調査では同時に、自己記入式質問票によって生活満足度(PGCモラール尺度)、社会活動の程度(社会活動調査票)、過去1週間の抑うつ症状(CES-D尺度)を測定した。結果として、5064歳および65歳以上地域住民におけるうつ病の時点有病率は0.5%、生涯有病率は5.0%であった。うつ病の経験者は最近の出生コホートほど高かった。うつ病の既往者合計11名のうち1名は精神科外来に、1名は内科に受療していた。子供との死別および健康状態の悪化、特に脳血管障害および骨折を経験した者にうつ病が多かった。また、配偶者との死別を経験した者で、全般性不安障害の頻度が高かった。うつ病の既往のある者では、調査時点での主観的満足度および社会活動の程度が低く、抑うつ症状の得点が高かった。
前立腺癌における癌幹細胞同定と解明

近年の癌研究において、癌組織が正常の幹細胞システムに似た階層構造によって成り立っている"癌幹細胞(cancer stem cell)"という概念が注目されている。In vitro実験として、初代培養細胞にhTERT遺伝子導入を行い、継代培養可能な細胞株樹立、その細胞学的特性について検討した。また、アンドロゲン依存性前立腺癌のマウスモデルJDCaPを用いて、heterogenousな癌組織から癌幹細胞様細胞群を分離、これら細胞の幹細胞様性質について検討した。今後、より詳細な研究、考察が必要なのは言うまでもないが、我々の癌幹細胞の実験モデルが、癌幹細胞研究において重要な役割を果たすものと確信している。近年の癌研究において、癌組織が正常の幹細胞システムに似た階層構造によって成り立っている癌幹細胞という概念が注目されている。癌組織の中からこの癌幹細胞に相当する細胞を探し出すことは、癌化、再発、転移のメカニズムを知ることに大きく貢献する。特に、進行性の前立腺癌に対する現行のホルモン療法には耐性があり、こうしたホルモン療法に対する再燃癌のメカニズム解明や新たな癌治療開発に役立つ重要な研究である。(1)hTERT(human telomerase catalytic subnit)組み込みレンチウイルスベクターの作成前立腺癌原発組織からの自然不死化細胞株樹立報告はこれまでないため、hTERTを用いて癌細胞株を樹立することを試みる。レンチウイルスは非分裂細胞への感染が可能であり、プロウイルスゲノムが宿主染色体に取り込まれるために、外来遺伝子が安定に持続発現することが期待できる。我々は、hTERT)組み込みレンチウイルスベクターを作成した。(2)前立腺癌由来細胞株の樹立初代培養細胞に、レンチウイルスベクターを用いたhTERT遺伝子導入を行い、現在11継代まで培養可能な細胞株を得た。(3)樹立前立腺細胞株の特徴精査樹立細胞株固有の特徴、細胞株が前立腺上皮由来であることを確認する。細胞増殖曲線(倍化時間) : 36時間、アガロースゲル内コロニー生成能:なし、各種分化マーカーの発現(CK5+, CK18+, CD44+, 34βE12+, AR-, PSA-, PAP-)(4)前立腺癌細胞株から癌幹細胞と非癌幹細胞を同定これまで、CD133、CD44などいくつかの幹細胞マーカーを用いて、その存在を確認した。フローサイトメトリーにて、CD133は約0.5%、CD44は98%という率でその存在を確認した。現在、Side population法などによる他の幹細胞分離法を用いて、幹細胞の同定を図っている。特に、進行性の前立腺癌に対する現行のホルモン療法には耐性があり、癌幹細胞研究はこうしたホルモン療法に対する再燃癌のメカニズム解明はもちろん、新たな癌治療開発にも役立つ重要な研究である。In vitro実験として、我々は、hTERT組み込みレンチウイルスベクターを作成。初代培養細胞に、レンチウイルスベクターを用いたhTERT遺伝子導入を行い、15継代まで培養可能な細胞株を得た。そして、それらの細胞学的特性について検討した。また、これまでの前立腺癌幹細胞研究の多くは、in vitroでのもので、in vivoにおいて、前立腺癌幹細胞の性質は明確に証明されてはいない。当研究室では、前立腺癌の皮膚転移巣より摘出した組織を用いて、アンドロゲン依存性前立腺癌のマウスモデルJDCaPを樹立した(The Prostate, Kimura T.2009July,69:1660-1667)。このマウスモデルを用いて、癌組織から癌幹細胞を分離することを試み、これら細胞の幹細胞様性質について検討した。JDCaPの癌組織を構成する癌細胞群において、そのコロニー形成能、分裂速度、表現型(細胞表面マーカー、サイトケラチンなど)はheterogenousな細胞集団から構成されており、それらの性質は癌幹細胞様の働きを担っている可能性が示唆された。