hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
前駆脂肪細胞分化誘導能レベルによる思春期の健康評価と予後推定

とりわけ、この傾向が思春期において強く認められているため、ADIPとROMおよびBAPによる複数の指標を用いることにより、若年期における生活習慣および肥満性疾患リスクの評価を中心とした予後の健康評価に適用できる可能性が窺われた。以上についての成果は、現在投稿中の学術論文2編とともに、学術学会への発表も、既に5報を数えている。一方、ある程度のポジティブな成果が得られた一方、当初の仮説が検証できずネガティブデータに帰している部分もあり、同時並行作業として、ADIPの測定・分析のプロトコールの改良も行ってきており、使用する細胞の培養や測定精度を向上させることもできた。主に、用いている細胞培養のための試薬のロット生産が遅れたりすることが多かったため。また、研究協力対象校の事情が年度あるいは時期によって変動すしたこと、などによる。ADIPはROMやBAPと有意な相関を示し、中性脂肪(TG)、総コレステロール(T-Chole)、LDLとも有意な関連性を示した。単変量分析では、ADIPはTGよりもT-Chole、LDLと強い関連程度を示しており、ADIPは、生活習慣の良し悪し、そして脂質代謝異常に関する評価指標として有用であることを示唆する結果が導かれた。この傾向は、思春期にて、またADIPとROMおよびBAPによる複数の指標を総合的に評価することにより、若年期における生活習慣および肥満性疾患リスクの評価を中心とした予後の健康評価に適用できる可能性が窺われた。以上の成果は、投稿中の学術論文とともに、学術学会への発表も、6報を数えている。ADIPの測定・分析のプロトコールの改良も行った。上述のごとく、現在、一部の対象者からの試料収集ができていないため、遂行スピードを上げていく必要がある。対象者側と綿密に協議を重ね、可及的速やかに実施をしていきたい。ただし、極めて軽微ながらも侵襲を伴うため、スピード実施にだけ傾注することはせず、安全・健康管理において十分な準備を第一義にして実施していきたい。平成29年度は、安全・健康を間違いなく保持した標本の収集とともに、正確な研究を実施していく所存である。酸化ストレス関係の指標の測定および疫学的調査の分析は順調に進んでいるので、今年度も同様に進めていくことに加え、血清検体を用いた脂肪細胞分化誘導能レベルの測定・評価に特に注力したい。これら分析を滞りなく終え、学術論文の執筆および学術学会の発表を行っていく所存である。ADIPの測定・分析の精度を向上させることを企図しつつ、より多くの年代層の協力者を得ることが頑健性の高い結果に繋がると推測されるので、研究協力者の確保・拡大を試みる。いうまでもなく、倫理遵守も含め、対象者の健康と安全を十全に確保する。その上で、今後の本研究を更に推進するための方策は、ADIPの測定・分析精度を現状に甘んじず向上させることである。また現時点では、いわゆる精神心理的健康レベルとの関連性に有意性を認めていないが、心の健康レベルを反映する、もしくは予測する指標であるのか、ということにも着目して重点的な検討をする。上述のように、倫理審査の承認が遅れたため、その分、一部の研究対象者からの試料収集ができなかった。これにより、予定では使用するはずであった物品費や人件費を使用しなかったため次年度使用額が生じた。
NAD+（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）による新規癌免疫療法の研究開発

現時点において、NAD+投与の癌に対する治療効果をターゲットとして可否を検討したデータは発表されていない。本研究では、担癌マウスにおいてNAD+による免疫機構の賦活による抗腫瘍効果を確認し、その免疫学的解析を行う。研究期間内に次の3点を明らかにする。・NAD+投与によるマウス膀胱癌に対する抗腫瘍効果を明らかにする・担癌マウスにおけるNAD+投与時の免疫学的変化を明らかにする。・BCG膀胱内注入療法と比較して臨床応用への可能性を明らかする。
固液界面における単分子の局在電場応答

金属ナノ構造体の異方性の制御とその構造体の形成するプラズモン場を利用した増強ラマン散乱測定を行った。散乱光を詳細に検討することによって分子内の異方的な光応答性の存在の定量的な評価を達成した。分子と金属間での相互作用が示唆され、より詳細に評価するために、分子のラマン散乱応答性の計算だけではなく、実験的にも導出した。構造が方位に対して均一である検出分子単結晶の作成と偏光ラマンスペクトル測定を行い、ラマンテンソルを決定することに成功した。これらから、増強電場中にて生じた異方的な増強の化学的な要因を決定づけた。溶液内における単一分子接合の電気伝導度特性の解明、および金属ナノ構造体を用いたプラズモニック構造体の構築と、それによる増強ラマンシグナルの取得を目的として研究をおこなった。単一分子のラマン計測から、異方的な光散乱は、金属と分子間に生じる電荷移動に起因することが明らかとなった。生じる光励起状態は、物質の共鳴エネルギーよりも低いエネルギーでの励起を可能とする。平成25年度はこれら相互作用をさらに高め、物質と光の間に生じる強い結合状態を構築することを目指した。光励起には金属ナノ構造体の形状を微細に制御して、プラズモン共鳴と物質間の相互作用をさらに高め、強い結合を生じる系の構築を目指した。金属ナノ構造体の形状をナノメートルオーダーにて制御することによって共鳴波長を変調可能な系を構築した。作成した基板に色素分子の水溶液を滴下乾燥することによって、分子に生じる励起子と金属ナノ構造体に生じるプラズモン共鳴間の相互作用を誘起する系とした。物質の励起子のエネルギーとプラズモン共鳴が近接する際にエネルギーの混成が生じ、安定化もしくは不安定化する励起エネルギーが形成することを見出した。この手法を利用することによって局在化した光を有効に利用し、物質固有の励起状態を自在に変調可能な系の構築に成功した。(抄録なし)物質の持つ固有のエネルギー状態は分子や原子などそれ単体の情報にとどまらず系全体における相互作用に関する情報を強く含む。それを解明してゆくことこそ真の化学的、物理学的、生物学的な情報の取得と現象の理解となり、実際に応用へと還元できる基礎研究になり得ると考える。その中でも多くの現象の観測環境である常温常圧下における固液界面の情報取得と制御は極めて重要となる。ラマン分光法はSTM,AFM,X線回折などの構造を明らかとする手段には無い、分子の同定が非破壊かつin-situで界面において可能となる手段である。ラマンスペクトルは通常微弱であるために、高感度にて測定するために、金属構造体を精妙に制御し、測定することが必要となる。申請者は高感度という点だけではなく、その励起方位を制御し測定可能となる金属ナノ構造体を作成し、固液界面の情報取得を行った。入射光偏光方位の制御により金属表面上における分子の吸着配向ダイナミクスがin-situにてわかり、散乱光偏光を詳細に検討することにより分子内の異方的な光応答性の存在が示唆された。さらに、金属と分子の吸着によりその間に電荷移動が生じることによる化学的因子の影響が存在することが示唆された。さらに、構造が均一である検出分子単結晶の作成を行い、その偏光ラマンスペクトル測定をし、実験的に分子の偏光ラマン応答性を測定することに成功した。DFT計算のみならず、実験的にラマンテンソルを取得することが出来、双方の整合性を確認した。また、界面状態の差を考慮した測定を行う為に、金属の原子レベルでの平滑面の作成が必要不可欠となるが、その作成に成功した。物質の持つ固有のエネルギー状態は分子や原子などそれ単体の情報にとどまらず系全体における相互作用に関する情報を強く含む。さらに電子線リソグラフィー技術、金属スパッタリング技術を用いて、金属ナノ電極を作成した。金属ナノ電極を機械的に破断し、さらに同時に電気伝導度測定を同時に行える系を構築した。金属ナノ電極間の電気伝導度より、金属電極の構造や、観測に関与する分子数の決定が可能となる。単一分子レベルの電気伝導度にて同時ラマン計測を行うことによって、分子数を担保した上でのラマン計測を可能とする。本年度は伝導度計測が十分に行えることを確認した上で、分子数を制御可能とすることを明らかとした。また、電気伝導度測定を行いながら、in-situにてラマン測定を行える系を作成した。観測分子存在下での電気伝導度、ラマン測定を行うことにより、計算より予測されるシグナルよりも大きな増強が観測されることが明らかとなった。

散乱光を詳細に検討することによって分子内の異方的な光応答性の存在の定量的な評価を達成した。分子と金属間での相互作用が示唆され、より詳細に評価するために、分子のラマン散乱応答性の計算だけではなく、実験的にも導出した。構造が方位に対して均一である検出分子単結晶の作成と偏光ラマンスペクトル測定を行い、ラマンテンソルを決定することに成功した。これらから、増強電場中にて生じた異方的な増強の化学的な要因を決定づけた。溶液内における単一分子接合の電気伝導度特性の解明、および金属ナノ構造体を用いたプラズモニック構造体の構築と、それによる増強ラマンシグナルの取得を目的として研究をおこなった。単一分子のラマン計測から、異方的な光散乱は、金属と分子間に生じる電荷移動に起因することが明らかとなった。生じる光励起状態は、物質の共鳴エネルギーよりも低いエネルギーでの励起を可能とする。平成25年度はこれら相互作用をさらに高め、物質と光の間に生じる強い結合状態を構築することを目指した。光励起には金属ナノ構造体の形状を微細に制御して、プラズモン共鳴と物質間の相互作用をさらに高め、強い結合を生じる系の構築を目指した。金属ナノ構造体の形状をナノメートルオーダーにて制御することによって共鳴波長を変調可能な系を構築した。作成した基板に色素分子の水溶液を滴下乾燥することによって、分子に生じる励起子と金属ナノ構造体に生じるプラズモン共鳴間の相互作用を誘起する系とした。物質の励起子のエネルギーとプラズモン共鳴が近接する際にエネルギーの混成が生じ、安定化もしくは不安定化する励起エネルギーが形成することを見出した。この手法を利用することによって局在化した光を有効に利用し、物質固有の励起状態を自在に変調可能な系の構築に成功した。本研究目的は固液界面における分子の異方的な電場励起方位をラマン散乱測定によって明らかとするというものとなる。これには、計算との比較だけではなく、実験的に分子が偏光した光を感受、散乱光を励起する過程を測定することが必要となる。現在、金属の相互作用がない環境での、分子の偏光応答性について成功している。さらに原子レベルにて平滑な金属表面の作成に成功している。これらを用いることよって、固液界面での測定が十分に達成できるものと考えられるためにこの区分とした。本研究目的は分子数を伝導渡決定可能な系を構築することだった。この系を構築出来れば、単一分子と分子数を規定した状況で、固液界面での測定が十分に達成できるものと考えられる。計画以上にラマン散乱測定まで完了したためにこの区分とした。金属表面上に分子の自己組織化単分子膜を作成し、全反射減衰法を用いたラマンスペクトル測定を行う。これによって規則配向系における測定が可能となる。Agダイマー構造体によって測定したSERSにおける散乱光の各偏光成分について分子の単結晶ならびに実験的に得られた情報を用いて評価を行う。単一分子の測定可能な系を用い、伝導度-SERSスペクトル測定により分子数のモニタリングと同時に偏光SERSスペクトル測定を行う。さらに単一分子架橋系の形成と同時に偏光ラマンスペクトル測定を行う。これによって、単一分子接合の形成、ならびに同時偏光SERSスペクトル測定が可能となる。
規則性メソ多孔体内での毛管凝縮の研究

界面科学上の課題のひとつとなっている毛管凝縮および吸着ヒステリシスの全容の解明を目指して、細孔形状がよく規定された規則性メソ多孔体に対する窒素などの吸着・脱離等温泉を測定した。3重点から臨界点近くまでの広い温度領域における吸着等温線を測定するため、20300Kの温度範囲で最大30気圧までの測定が可能な低温高圧吸着装置を作製した。インクボトル型細孔をもつSBA-16規則性多孔体への窒素、酸素、アルゴン、二酸化炭素の吸着・脱離等温線は低温でIUPAC分類のH2型ヒステリシスを示した。温度の上昇とともにヒステリシスは縮小して、バルク臨界温度よりかなり低い温度で消失した。毛管凝縮および蒸発圧を相対圧で表して、換算温度T/Tcに対してプロットすると、4種類の気体のデータはほぼひとつの曲線に乗ることがわかった。球状細孔内での気体の吸着および脱離過程を球状細孔に束縛された液滴内での気泡の消滅および形成と捉えて、自由エネルギーの変化を計算した。その結果、細孔の内壁を濡らす吸着膜と毛管凝縮液体との間にエネルギー障壁が存在することがわかった。この現象論的理論から求めた相転移圧は測定データをよく再現した。したがって、インクボトル型細孔内での吸着ヒステリシスの原因は、気体と共存する吸着膜の状態(気体)と凝縮液体状態との間の自由エネルギー障壁が存在することにある。したがって、吸着ヒステリシスが消失するヒステリシス温度は細孔臨界性とは直接的な関係をもたないことが分かった。次に、シリンダー状細孔内における吸着ヒステリシスの原因を解明するために、独立したシリンダー状細孔をもつMCM-41やSBA-15に対する窒素および二酸化炭素の吸着等温線を測定した。インクボトル型細吼に対する結果と違って、吸着ヒステリシスの温度依存性は2つの気体の間で異なった。このことは、ヒステリシスの機構が細孔形状によって変化することを示している。シリンダー状細孔が3次元的に連結したネットワーク構造の細孔をもつMCM-48に対する窒素の吸着ヒステリシスの測定から、ほぼ同じ大きさおよび形状の細孔が連結しても吸着ヒステリシスにほとんど影響を与えないことがわかった。多孔性固体の細孔内における気体の毛管凝縮およびそれに伴う吸着ヒステリシスは、1800年代末から知られているにもかかわらず未だに全容が解明されていない問題である。1980年代末に発表された統計力学理論から細孔内の気液平衡の臨界温度はバルクの値よりも低いこと、また吸着ヒステリシスは細孔内臨界温度で消失することなどが示された。しかし、われわれはごく最近、シリンダー状細孔をもつ規則性メソ多孔体への各種気体の吸着・脱着等温線を温度の関数として測定することにより、細孔内臨界温度と吸着ヒステリシスの消失する温度とが異なることを示した。これらの結果を確かめ、さらに吸着ヒステリシスと細孔内臨界温度との関係を明らかにして、毛管凝縮現象の全容を解明するために、より広範な細孔径および形状を有する規則性メソ多孔体に対してバルク臨界温度に達する高圧領域での吸着等温線を測定する必要がある。

今年度は、高圧対応型極低温冷凍機システム、真空排気装置、高精度圧力計などを購入して、30気圧まで使用可能な自動化低温・高圧吸着装置を作製した。現在、装置の性能試験を兼ねて直径4.2nmのシリンダー状細孔を有する規則性メソ多孔体に対する窒素の等温線を低温側からバルク臨界温度に向けて順次測定している。この細孔径に対するヒステリシス消失温度は78Kであった。しかし、1次の気液相転移である毛管凝縮はこれ以上の温度でも生じることがわかった。また、装置の製作と平行して、より大きなシリンダー状細孔を有するSBA-15や細孔入口が狭まったインクボトル型細孔を有するMCM-41などの規則性多孔体を合成している。SBA-15では、合成条件により液体窒素温度での窒素の吸着ヒステリシスが非常に大きな試料が得られた。吸着ヒステリシスが温度の上昇とともにどのように変化していくか興味深い。今後、これらの細孔形状と大きさが明確な規則性メソ多孔体に対する各種気体の等温線を順次測定していく予定である。界面科学上の課題のひとつとなっている毛管凝縮および吸着ヒステリシスの全容の解明を目指して、いろいろな細孔径をもつ規則性多孔体のMCM-41、SBA-15および三次元チャンネル構造を有するMCM-48への窒素の吸着・脱離等温線を3重点と臨界点の間の広い温度領域で測定した。MCM-41とSBA-15はともに一様な大きさのシリンダー状の細孔を有する。吸着等温線の温度依存性から、いずれの多孔体においても温度の上昇とともに吸着ヒステリシスが縮小していき、やがて消失することがわかった。この温度はヒステリシス臨界温度と呼ばれるが、細孔内における液体と気体間の臨界温度より低温側に存在した。細孔臨界温度は吸着ステップの勾配の温度依存性から求めた。ヒステリシス臨界温度と細孔臨界温度を細孔径の逆数に対してプロットすることにより、バルク臨界温度から低下量は両者の温度とも細孔径に逆比例することを明らかにすることができた。ただし、ヒステリシス臨界温度は大きな細孔においてはこの逆比例の関係から外れ、細孔臨界温度に接近することがわかった。このことは,準安定状態と安定状態間のエネルギー障壁が大きな細孔では大きくなりすぎて、安定状態への移行が臨界温度まで実現できないことを示している。細孔臨界温度の低下量と細孔径との逆比例関係は微視的統計力学論の結果と一致した。さらに、毛管凝縮および毛管蒸発圧力の温度依存性から、毛管蒸発が必ずしも平衡状態で起きると限らないことが分かった。この結果は現在のこの研究分野で流布している一般的な見解を覆すものであり、細孔径分布の解析方法に大きな影響を与えるものと思われる。MCM-48の三次元チャンネル細孔構造は吸着ヒステリシスや細孔臨界性にほとんど影響しないことがわかった。界面科学上の課題のひとつとなっている毛管凝縮および吸着ヒステリシスの全容の解明を目指して、インクボトル型細孔をもつSBA-16規則性多孔体への窒素、酸素、アルゴン、二酸化炭素の吸着・脱離等温線を広い温度領域で測定した。SBA-16は直径9.2nmの球状細孔が直径2.3nmの狭い窓を通して体心立方配列した細孔構造をもつ。いずれの気体の吸着等温線も低温でIUPAC分類のH2型ヒステリシスを示した。温度の上昇とともにヒステリシスは縮小して、バルクよりかなり低い温度で消失した。毛管凝縮および蒸発圧を相対圧で表して、換算温度T/Tcに対してプロットすると、4種類の気体のデータはほぼひとつの曲線に乗ることがわかった。
U_3P_4の磁気構造と電子構造の理論

立方晶NaCl型結晶構造を持つセリウム・モノプニクタイト(CeX,X=P,As,Sb,Bi)が示す異常磁気異方性を説明するめに導入されたp-f混成模型は、その後この系の種々の異常物性の解明に使われ、大きな成功を収めている。CeXの参照系LaXは、価電子帯がプニクトゲン(X)のp軌道、伝導帯がLaのd軌道より成り、これらのバンドが僅かに重なった半金属である。CeXでは、占有されたf状態と価電子帯との混成(p-f混成)により、価電子帯のトップが押し上げられキャリヤ-数が急激に増加することによる非線形効果が、異常磁性の起源である。本研究ではp-f混成模型のアクチナイド系への拡張として、U_3P_4に代表されるウラン・プニクタイト(U_3X_4)の研究を始めた。非磁性参照系Th_3As_4は電気抵抗より0.44eVのギャップを持つ半導体であり、Thの一部をUで置換すると急激にキャリヤ-数が増加することから、やはりp-f混成効果が重要な系と考えられる。Th_3P_4及びTh_3As_4の電子構造を自己無憧着APW法で求めた。満たされた価電子帯はプニクトゲンのp軌道で、空の伝導帯はThのd軌道で形成され、これらのバンド間にギャップが生じる。計算で得られたギャップの大きさは各々0.0068、0.050eVと非常に小さいものであり、この不一致の原因は良く知られた局所密度近似の不備によるものである。U_3P_4、U_3As_4の磁気秩序は強磁性ではあるが、non-collinearな複雑な構造である。現在この様な複雑な磁気構造下での電子構造を求める計算プログラムの開発中である。最近ウラン3元系UNiSnが反強磁性秩序と共に、半導体(常磁性)-金属(反強磁性)転移を示し多くの興味を集めている。参照系ThNiSnの電子構造を求めたところ、ギャップの大きさ0.484eVの半導体となった。このことより常磁性状態ではUは4価で存在し、磁気秩序に伴いp-f混成効果により価電子帯が押し上げられ金属状態に転移するこが理解される。
ＮＭＲによる折り畳み及びアミロイド形成前駆状態の特性化

蛋白質は折り畳み反応やアミロイド線維形成初期に中間状態をとることが知られている。中間状態構造の理解は、折り畳みやアミロイド線維形成過程を理解するうえで重要な情報である。一般的に中間体は不安定であるため、単離しての構造解析は難しい。しかし、NMRのいくつかの方法で中間体の構造情報を得ることができる。そこで、これら方法を用い、(A)折り畳みや(B)アミロイド線維形成中間体の構造情報を得ることを本課題の目的とした。(A)βラクトグロブリン(βLG)の折り畳み中間体の構造解析:βLGは折り畳みの過程で折り畳み中間体が表れ、アミノ酸変異を導入するとこの中間体構造が変化することが分かっている。そこでこれら変異体の天然状態の安定性、折り畳み中間体構造、折り畳み初期の構造形成部位の同定のためにそれぞれ、重水素交換実験、パルスラベル重水素交換、尿素変性条件の緩和速度測定を行った。その結果、天然のβLGは折り畳みが特定の部位から秩序だって形成されているのに対し、変異体ではその秩序が崩れ、結果として折り畳み効率が減少していることが分かった。(B)β2ミクログロブリン(β2m)フラグメントの運動性とアミロイド線維形成能の相関:申請者の研究室では以前、β2mの酵素消化により得られた9種類のフラグメントのうち、2つの領域でアミロイド線維形成能を持つことを報告した。そこでこれらのペプチドの緩和解析から中間体の構造を調べ、凝集性の関係を明らかにすることを目的とした。安定同位体標識されたβ2mを発現、酵素消化し、各フラグメントを得たのち、NMRを用いて得られたフラグメントの運動性の尿素濃度依存性を測定した。その結果、アミロイド形成能を持つペプチド配列は、高い尿素濃度の時点で運動の束縛が見られることが分かり、運動性とアミロイド線維形成能の相関があることを示した。24年度が最終年度であるため、記入しない。中間体は一般的に不安定であるため、単離しての構造解析は難しい。一方、ある条件下で中間体は変性状態や天然状態と平衡にあることが示されている。現在はこのような条件下でNMRの緩和解析と呼ばれる方法測定を行うことで、中間体の構造情報を得られる。そこで、この方法を用い、(A)折り畳みや(B)アミロイド線維形成中間体の構造情報を得ることを本課題の目的とした。(A)βラクトグロブリン(βLG)の折り畳み中間体の構造解析βLGは折り畳みの過程で、折り畳み中間体が表れることが知られており、さらにアミノ酸変異を導入するとこの中間体構造が変化することも分かっている。そこで、これら変異体の中間体の構造情報および天然状態の安定性を調べる実験を行った。まず安定同位体標識したβLGを発現精製した。天然状態の安定性を調べるために、重水素交換実験を行った。続いて中間体構造を調べるために、パルスラベル重水素交換と呼ばれる実験を行った。現在は当初予定していた緩和解析実験のための条件検討を行っている段階である。(B)β2ミクログロブリン(β2m)フラグメントの運動性とアミロイド形成能の相関申請者の研究室では以前、β2mの酵素消化により得られた9種類のフラグメントのうち、2つの領域でアミロイド形成能を持つことを報告した。そこでこれらのペプチドの緩和解析から中間体の構造を調べ、凝集性の関係を明らかにする実験を行っている。昨年度は安定同位体標識されたβ2mを発現、酵素消化し、各フラグメントを得た。昨年度終盤から順次、得られたフラグメントの運動性測定を行っている状況である。

その結果、アミロイド形成能を持つペプチド配列は、高い尿素濃度の時点で運動の束縛が見られることが分かり、運動性とアミロイド線維形成能の相関があることを示した。24年度が最終年度であるため、記入しない。本課題の遂行は予定に比べ遅れていると考えている。その主な理由は昨年度蛋白質の発現、精製の収量が低くなる問題が生じ、本課題のベースであるNMR測定が進まなかったからである。そのため、中間体構造の情報を議論できるようなデータが十分に得られていないのが現状である。上の項目で述べた通り、今年度は試料調製に対して細心の注意を払っていく必要がある。試料の安定供給を図ったうえで予定通りの実験を行い、データ取得と解析をすすめていく。なお、本課題にはパルスラベル重水素交換や緩和解析といった専門的な測定方法が含まれる。申請者の共同研究者にそれらの測定の専門家がいるため、今年度はこれらの共同研究者とより連絡を密にし、効率的にデータ取得が進むよう実験計画をたてていくことを考えている。
受容体からの分化と腫瘍化のシグナル

サイトカイン受容体下流に存在する新規抗アポトージス分子Anamorsin(AM)についての解析を行った。AM欠損マウスは胎生致死で、肝臓、脾臓の造血組織が萎縮し、著明な貧血を呈した。AM欠損胎児肝において、造血幹/前駆細胞や未熟赤芽球分画の絶対数は減少していなかったが、分化に伴い造血細胞のアポトーシス亢進により、二次造血が障害され造血不全をきたすと考えられた。造血器腫瘍細胞におけるAMの発現について、組織レベルでの蛋白発現を調べると、白血病やリンパ腫の一部に高発現していることが明らかとなった。また、NotchやHOXB4は造血幹細胞の増幅に関与していることが知られている。Notch 1やHOXB4によりc-mycの転写の亢進が認められ発現が誘導されたことから、c-mycを造血幹細胞に導入し造血幹細胞への効果を検討した。c-mycにより造血幹細胞のコロニー形成能が増加し、放射線照射マウスに移植すると造血再構築能が上昇していた。また、造血幹細胞の自己複製過程においてPBX1はHOXB4の活性を負に制御している。そこで、内因性のHOX/PBX1複合体の活性を変化させ得るPBX1との結合領域部分のHOXタンパクのdecoyペプチドを設計、合成し、ヒト臍帯血造血幹細胞に導入し造血幹細胞の自己複製能や多分化能に及ぼす影響について検討を行なった。その結果、HOXタンパクのdecoyペプチドは、細胞周期制御因子の発現調節を介して造血幹細胞の自己複製を亢進させた。1)c-kit恒常的活性化変異は、様々な細胞内シグナル伝達分子を活性化させるが、その腫瘍原性にはras、PI3K、STAT5などの各種シグナル分子の協同作用が重要であり個々のシグナル伝達系を抑制することにより造血因子非依存性増殖能は減少した。また、AG1296チロシンキナーゼ阻害剤により、野生型KITやkinase領域変異KITに比べjuxtamembrane領域変異KITの活性をより低濃度で阻害した。2)巨核球への分化誘導にはTPOによるrasの長期活性化が重要であるが、rasによる巨核球分化には細胞内に転写因子GATA-1が存在することが必須であった。また、GATA-1は、骨髄系や単球系細胞の分化に関与する転写因子PU.1やc-mybと相互に結合し、その機能を抑制することが明らとなった。さらに、AIM-1とSTK15(AIK)は共にG2/M期特異的に発現するセリン・スレオニンキナーゼである。巨核球の多倍体化機構におけるこれらの分子の機能について検討を行ったところ、巨核球が多倍体化する際にはAIM-1の持続的な発現低下が重要であることが示唆された。3)細胞周期制御の破綻は、細胞の腫瘍化や逆にアポトーシスをもたらすことが知られている。マウス骨髄性細胞株M1をモデルとして、細胞周期制御の破綻が細胞増殖・分化・死にどのような影響を与えるかについて解析を行った。その結果、過剰な細胞周期の進行は細胞内にROSを蓄積させ種々のアポトーシスに対する感受性を亢進させることが明かとなった。1)c-kitレセプターチロシンンキナーゼ(KIT)を介する細胞運動には、KIT-Tyr567からSrc型チロシンキナーゼ-P38MAPキナーゼ-Erk1/2を介する系と、KIT-Tyr719からPI3キナーゼを介する系が重要であることを明らかにした。また、Ablチロシンキナーゼ阻害剤STI571は、野生型KIT-WTのリガンド依存性活性化は0.3-1.0μMの濃度で抑制した。一方、juxtamembrane領域の恒常的活性化変異KIT-G559はKIT-WTの場合より低濃度のSTI571により活性化が阻害されたが、kinase領域の恒常的活性化変異KIT-V814はSTI571に対して耐性であった。2)E2F-1を過剰発現させたクローンでは血清存在下では高い増殖能を示したが、血清除去などのストレスにより活性酸素種ROSが蓄積されアポトーシスが誘導された。血清除去によりROSの蓄積が生じると、NFκBが活性化されMnSODの発現が誘導され過剰のROSが消去される機構が存在するが、過剰発現したE2F-1は、NFκBのp65 subunitに結合することによりNFκBによるMnSODの発現誘導を阻害し、ROSの蓄積を引き起こしアポトーシスの感受性を高めると考えられた。3)マウスIL-3非依存性細胞株Ba/F3-AdのcDNAライブラリーより、IL-3非依存性形質を惹起することを指標に新規遺伝子をクローニングしanamorsin(AM)と命名した。AMは既知の抗アポトーシス分子とは類似性を示さず、メチルトランスフェラーゼ(MT)ドメインを有する新規遺伝子であり、IL-3除去により誘導されるアポトーシスを阻害した。また、AMは、白血病や悪性リンパ腫などの造血器腫瘍細胞に強く発現が認められた。1)c-kit遺伝子のkinase領域のAsp816(マウスでは814)コドン変異によるKITの恒常的活性化には、kinase insert部位に存在するTyr(Y)719のチロシンリン酸化とそれに引き続き生じるPhsphatidylinositol-3(PI3)-キナーゼの結合の結合が必須であると考えられた。

さらに、Asp814変異KITの腫瘍原性には、自己リン酸化部位であるTyr821、および、srcファミリーチロシンキナーゼの結合部位であるTyr567のチロシンリン酸化も関与していることが明らかとなった。2)急性前骨髄球性白血病(APL)の原因遺伝子PML/RARαとPMLのSTAT3に及ぼす影響について検討した。PMLはSTAT3と複合体を形成しSTAT3の機能を阻害した。一方、PML/RARαはSTAT3と結合せず、STAT3の転写能を亢進させ、APL細胞の過剰増殖や異常分化に関与すると考えられた。3)サイトカインにより発現が誘導され、サイトカインの抗アポトーシス作用に関与する新規分子anamorsin(AM)を見い出した。AMの生理作用を検討する目的で、AMノックアウトマウスを作製した。AM-/-マウスは胎生後期に死亡した。AM-/-embryoは有意に身体が小さく、二次造血が障害され著明な貧血を呈した。胎生期の造血組織(肝臓)では、未熟赤芽球はアポーシスに陥り、成熟赤芽球が著減していた。以上の事から、生体内においてもAMは抗アポトーシス分子として、造血などに必須の役割を担っていることが明らかになった。我々は、既知の抗アポトーシス分子とは全くホモロジーを有さない新規抗アポトーシス分子Anamorsinを同定した。Anamorsinの発現は、サイトカイン刺激により誘導され、Anamorsinを遺伝子導入した細胞はサイトカイン除去により引き起こされるアポトーシスに抵抗性を示した。Anamorsin^<-/->マウスは肝臓、脾臓の造血組織が萎縮し、著明な貧血により胎生14.5日以降に死亡した。Anamorsin^<-/->胎児肝組織では赤芽球のアポトーシスが認められ、成熟した赤芽球が減少していた。Anamorsin^<-/->胎児肝においては、造血幹/前駆細胞分画の絶対数は減少していなかったが、各種サイトカイン存在下にin vitroコロニーアッセイを行うと、Anamorsin^<-/->胎児肝細胞の造血幹/前駆細胞のコロニー形成能は著減し、特に赤血球系コロニーの形成は全く認められなった。以上の結果より、Anamorsin^<-/->マウスでは、胎児肝にある造血細胞のアポトーシス亢進と分化障害により、二次造血が障害され造血不全をきたすことが明らかとなった。さらに、各種造血器腫瘍細胞におけるAnamorsinの発現をmRNA定量法により検討した。マントル細胞リンパ腫など一部造血器腫瘍細胞においてAnamorsinの高発現が認められ、Anamorsinが造血細胞の腫瘍化に関与している可能性が考えられた。サイトカイン受容体下流に存在する新規抗アポトージス分子Anamorsin(AM)についての解析を行った。AM欠損マウスは胎生致死で、肝臓、脾臓の造血組織が萎縮し、著明な貧血を呈した。AM欠損胎児肝において、造血幹/前駆細胞や未熟赤芽球分画の絶対数は減少していなかったが、分化に伴い造血細胞のアポトーシス亢進により、二次造血が障害され造血不全をきたすと考えられた。造血器腫瘍細胞におけるAMの発現について、組織レベルでの蛋白発現を調べると、白血病やリンパ腫の一部に高発現していることが明らかとなった。また、NotchやHOXB4は造血幹細胞の増幅に関与していることが知られている。Notch 1やHOXB
クロマキー技術を活用した小学校外国語活動の単元開発と授業実践による評価

研究目的:本研究では,リアルタイムでのクロマキー合成について探り教材化を目指した。更にこの手法を用いて,日々の教育活動での活用や外国語活動での単元開発を試みた。研究方法:クロマキー合成の手法は,様々なアプリケーションとWebcamやKinectの組み合わせを試し,授業での使い勝手を考慮しながら最適なものを決めた。この方法をTrinity Valley School(TVS)国際交流履修の6年生(Texas州Fort Worth市)との動画による交流に取り入れ, 6年生対象の外国語活動で実践して,その有効性を探った。研究成果:クロマキー合成を行う方法は次の2点が適当だと判断し,実践に使用した。授業ではFort Worth市について調べ活動を行い,観光地や食べ物等の写真をクロマキー合成で背景にして班毎に英語で紹介する動画を作成した。また,背景を合成した映像を発表者がモニターできる場を整えた。背景を合成することで自然と身振りが入るのではと期待していたが,実践では背景を意識した身振りを入れた児童は4割にとどまった。単元後の意識調査では「活動の楽しさ」が高い数値を示した。これは授業毎の振り返りに「楽しい」と書いていた児童が多かったことと一致する。TVS側でもクロマキー合成を使って長岡についての動画を作成したが,授業者より児童の好意的な反応を聞くことができた。モニター上だが,仮想的にその場所にいるような映像は児童の活動への意欲を高めることが示唆された。安定したクロマキー合成の方法を得ることができたので,今後は英語を母国語としない国の交流校の開発や,クロマキー合成の活用の工夫について研究を進めていきたい。
睡眠時無呼吸の発症機序に関する基礎的研究

本研究の目的は、睡眠時無呼吸症候群の原因遺伝子の候補としてオレキシン遺伝子の本症への関与を検証することであった。まずその準備段階として、正常なマウスを用いて覚醒・睡眠状態と呼吸状態の評価を同時に行う方法を確立した。麻酔下にて野生型正常マウスの頭蓋骨・頸筋に電極埋込み手術を行い、手術後十分な回復を待ってから、脳波と頸筋筋電図、及びボディープレチスモグラフィーによる呼吸測定とを同時に行った。測定時間はマウスの非活動期である昼間の6時間とし、睡眠段階は、脳波と筋電図から判定し、覚醒期、急速眼球運動(REM)睡眠期、徐波(SWS)期の3種に分類した。2種類の睡眠時無呼吸、すなわち、post-sigh apneaとspontaneous apneaとが観察された。前者はSWS期に、後者はREM睡眠期に主に認められた。単位時間当りの睡眠時無呼吸の頻度はREM期に高かった。また、観察された全ての睡眠時無呼吸において肋間筋の活動が停止していた事から、マウスの睡眠時無呼吸は中枢型であると考えられた。マウスの睡眠時無呼吸はヒトの小児期のそれと類似している事が明かになった。次に上記の方法により、オレキシンノックアウトマウスと正常対照マウスの、睡眠時無呼吸、および睡眠覚醒状態別の呼吸化学受容器反射とを調べ比較検討した。その結果オレキシンノックアウトマウスで(1)睡眠時無呼吸の増加と(2)覚醒時の高炭酸ガス換気応答の低下とが観察された。オレキシン遺伝子の欠損は、睡眠時無呼吸の原因の一つであると結論された。本研究の目的は、睡眠時無呼吸症候群の原因遺伝子の候補としてオレキシン遺伝子の本症への関与を検証することである。本年度はマウスを用いて無麻酔無拘束条件を維持したままで覚醒睡眠状態の評価と呼吸状態の評価を同時に行う方法を確立した。麻酔下にて野生型正常マウスの頭蓋骨、頸筋に電極埋込み手術を行い電極埋込み手術後7日以上の回復を待って、脳波と頸筋筋電図、及びwhole bodyplethysmographyによる呼吸測定を同時に行った。マウスの呼級状態と睡眠覚醒状態とが同時に、しかも長時間可能となった。測定時間はマウスの非活動期である昼間の6時間とし、睡眠段階は、脳波と筋電図から判定し、覚醒期、rapid eye movement (REM)睡眠期、slow wave sleep (SWS)期の3種に分類した。2種類の睡眠時無呼吸、Post-sigh apnea、spontaneous apneaが観察された。また肋間筋筋電図と呼吸とを同時記録したところ、観察されたpost-sigh apnea、spontaneous apneaでは全て肋間筋の活動が停止しており、マウスの睡眠時無呼吸は中枢型であると考えられた。またpost-sigh apneaの頻度は、純酸素環境下では減少、低酸素(15%O2)環境で増加、高二酸化炭素(5%CO2-21%O2)環境下で減少した。現在我々が確立した上記の方法により、オレキシンノックアウトマウスと正常対照マウスの、睡眠時無呼吸、および睡眠覚醒状態別の呼吸化学受容器反射とを調べ比較検討している。その結果オレキシンノックアウトマウスで(1)睡眠時無呼吸が増加、(2)覚醒時の高炭酸ガス換気応答の低下、が観察された。更に詳細な検討を加えている。
凍土層トラップによる大気降下窒素の作物吸収の促進

大気中に放出された反応性窒素は、雨や雪と共に、エアロゾルやガスの形で地上に降下し、自然生態系や農業に与える影響が懸念されている。森林は一般に空間的に不均一で成立過程も不明瞭な地点が多いため、明瞭な結果は少ない。これに対して圃場など管理されている農地生態系では、空間的に比較的均一な地点で調査が可能であり、物質動態の定量的把握も可能である。さらに寒冷地であれば、降下窒素は積雪中に貯まるため、影響程度は大きくなると考える。このことから土壌が凍る北海道の寒冷な気象条件下で、大気からの降下窒素などの利用可能性を検証し、省資源で効率の高い作物生産を創造することを目指す。
代数多様体の射影空間への埋め込みに関する研究

射影多様体M⊆Pに対して、Mの一般の点xにMのxでのPに埋め込まれた接空間T_xMを対応させることにより得られるMからグラスマン多様体への有理写像を、射影多様体Mのガウス射という。平成6年度の研究目的は、正標数の代数閉体上定義された射影多様体のガウス射の構造を調べることであった。M⊆Pに対して、法束の双対から微分の2階対称積への自然な写像N^V_<M/P>→S^2Ω^1_Mが定まる。これはガウス射の微分を表わすもとして知られ、その像(の基底)は第2基本形式と呼ばれている。Mの各点xで第2基本形式は、xでのZariski接空間t_xMの1次元部分空間の全体のなす射影空間P_*(t_xM)上の2次のlinear systemを定めることが容易に分かるが、今年度はこのlinear system、特にそのbase locusと射影多様体の性質との関係について研究を行った。射影多様体M⊆Pの一般の点xに対してM∩T_xM={x}が成立するとき、Mを接的に非退化合ですら未解決であり、本研究課題おいても非常に重要と思われる。今年度の研究を通じて、その分類に対しても第2基本形式を調べることが有効であることが判ってきた。将来は、この問題についても研究をすすめてゆきたい。
都市の広域稠密化の進行による環境変化と住民の健康水準の将来予測モデルの開発

都市環境の変化が住民の健康水準に及ぼす影響を、小地域単位の解析、都市規模別の解析により明らかにし、健康水準の将来予測を行うためのモデルを開発した。1.まず、東京圏における地域別の600の諸指標を収集し、都市住民の健康と環境の水準の相互の関連性の解析に必要な指標のカテゴリーを検討した。以下のカテゴリーが必要な環境諸指標のカテゴリーである。健康水準は、(1)死亡特性関連指標、(2)地域内死亡格差関連指標、(3)活動的余命関連指標、(4)QOL関連指標。環境水準は、(1)人口指標、(2)居住環境、(3)都市基盤、(4)教育、(5)保健医療福祉サービス、(6)労働環境、(7)地域経済、(8)健康増進活動、(9)自然環境の各カテゴリーの指標。2.因子分析法により、健康水準の諸指標、環境水準の諸指標をそれぞれ代表する因子を抽出した。複数の地域群の解析の結果、健康水準については510の因子、環境水準については、2030の因子により、適合性の高いモデルを作成できることがわかった。3.既存の統計資料以外に、解析に必要な次の指標を新たに作成した。(1)大都市のおける地域調査に基づく、住民のライフスタイル、保健行動に関する指標。(2)衛星データに基づく、自然環境、土地利用、気象に関する指標。(3)メッシュデータのリンクデータ。4.健康水準と都市環境の諸要因との関連性を、都市の人口密度、教育水準、所得水準、職業別などに分析した。その結果、地域の社会経済要因だけでなく、土地利用を含む都市計画に関わる諸要因ならびに自然環境要因が、都市住民の健康水準の向上に寄与することが明らかになった。5.都市環境水準の諸指標を用いて、健康水準を予測するモデルを作成した。実測値と推計値の比較を行った結果モデルの適合性が高く、都市住民の健康増進のために必要な環境条件を総合的に示すための、有用なモデルを作成できることが明らかになった。都市の広域稠密化の進行による環境変化と住民の健康水準の将来予測モデルの開発都市環境の変化が住民の行動様式ならびに健康水準の変化に及ぼす影響を明らかにし、将来予測を行うためのモデルを、以下の方法で開発した。(1)まず、東京圏における地域別の約600の諸指標を収集し、重みづけ相関分析法などにより指標間の関連性を検討し、住民の健康と都市環境の水準の相互の関係を効率的に解析することが可能な指標を、カテゴリー別に選択した。その結果、約30の健康諸指標、約110の都市環境水準指標に分けられ、後者はさらに、人口指標、居住環境指標、インフラストラクチャー指標、教育指標、保健医療サービス指標、労働環境指標、財政指標、健康増進活動指標地域の8つのカテゴリーに分類された。(2)健康諸指標、都市環境諸指標のカテゴリーごとに、それぞれ複数の側面を解析モデル上で評価するために、重みづけ因子分析法により、固有値1以上の因子をそれぞれ25抽出した。抽出した因子の因子得点を、健康水準ならびに都市環境水準の諸側面を表す変数として、都市環境と住民の健康水準の関連性の解析モデルの変数とした。健康諸指標ならびに抽出された因子による健康水準変数と、都市環境諸指標から得られた諸変数との間の関連性の有無が明らかになった。(3)健康水準の諸変数と都市環境水準の諸変数の関連性を、重みづけ段階的選択法による重回帰分析、重みづけ相関分析法の結果に基づき検討し、都市環境水準が明らかにされた場合に健康水準を予測するモデルを作成した。

健康水準の実測値とモデルに基づく推計値を比較した結果、モデルの適合性が高いことが示された。(4)大都市圏における住民のライフスタイル、保健行動に関する地域調査の結果に基づき、地域の健康水準指標、健康増進活動指標、居住環境指標、財政指標を作成し、健康増進活動指標を含めた健康水準予測モデルの構築の基礎資料を作成できた。都市の生活環境の変化が住民の健康水準に及ぼす影響を、小地域単位の解析、都市規模別の解析により明らかにした。(1)平成5年度にベースラインデータとして収集した、人口1000人程度の小規模地域別の住民の健康水準、ライフスタイルに関するデータを地理情報化(GIS化)して、東京圏の小地域単位の健康特性を明らかにした。各地域に対応する、生活環境に関する諸指標を、500メートルメッシュデータ、衛星データ、町丁別データに基づき作成し、地理情報化した。生活環境要因と住民のライフスタイル、および健康水準との相互の関連性を、正準相関分析法、非線型回帰モデルにより解析した。小地域単位別の健康水準の評価とそのデータのGIS化は、都市圈においての小地域単位の健康水準の格差を具体的に表示し、地域保健水準の評価を行うために有用な手法であることが明らかになった。環境指標を小地域単位に単位ごとに得る場合には、現状では実地の環境調査を行う必要があるが、衛星データの活用、人口動態統計、国勢調査報告、住宅統計、事業所統計などの調査データのリンケージ手法の開発によって、都市住民の健康水準の解析に役立つ評価モデルを構築することができると考えられた。(2)都市環境要因と健康との関係は、都市の人口密度、都市の規模別などで異なる関係があることが示唆されたため、人口密度別、教育水準、所得水準別、職業別に分析単位を3カテゴリーに分類し、カテゴリーごとに、環境要因と健康との関係を分析した。(3)人口密度別の、都市の健康水準の予測モデルを作成し、都市の健康水準の維持、向上に必要な条件について検討した。その結果、地域の社会経済要因だけでなく、土地利用を含む都市計画に関わる諸要因ならびに自然環境条件が、都市住民の健康水準の向上に関与することが明らかになり、これらの因子を含めた都市健康水準解析モデルの有用性が明らかになった。
エピジェネティック毒性の通常毒性試験での検出を可能とするレポーターマウスの開発

エピジェネティック毒性はその重要性にも関わらず、リスク対応が進んでいない。検出の難易度が高いことが理由の一つであり、本研究では簡便な検出を可能とするレポーターマウスの開発を行った。レポーターベクターの構築が難航したが、imprint遺伝子由来のSnrpn promoterを採用し、上流にAgouti, Daz1のpromoter配列を連結し解決を図った。培養細胞に導入し、両者ともに予想されるレポーター応答を示すことを確認した。DNA脱メチル化物質に対する応答を検討し、ともにレポーター応答増強を確認した。この結果を受け、レポーターマウス作製(外部委託)に移り、作製されたマウスの詳細解析を行った。化学物質影響がゲノムに記憶されるエピジェネティック毒性の重要性が指摘されているが、そのリスクへの対応はほとんど進んでいない。その原因として、エピジェネティック毒性検出手法が高度な生化学解析技術を要するために毒性試験となじまず、毒性試験データからエピジェネティック毒性を検出することが容易ではないことがあげられる。本研究では、遺伝子組換え技術を駆使し、観察が容易なマーカーによってエピジェネティック毒性の有無を検出するレポーターマウスを開発する。それにより、通常の毒性試験時に高度な技術を必要とせずにエピジェネティック毒性の有無を判定できる「個体レベル評価システムの構築」を目指す。本研究は、1)レポーターマウス作製に必要なベクターの構築、2)培養細胞を用いた最適化、3)その結果を反映させたレポーターマウス作製、4)既知のDNA脱メチル化物質アザシチジンを用いたマウスの有用性検証、の具体的な4つのステップに分けて実施する。今年度は、本研究におけるレポーターマウス作製に必要なベクターの構築を優先的に実施した。構築が必要なベクターは、(A)CAG-loxP-STOP-loxP-TetR, (B)TRE-LexA DB-Uhrf1-IRES-DsRed, (C)LexA_BSx8-Target-GFPの3種類が主である。これらのベクターを可能な限り迅速に構築することを目指したが、DNA断片の組み込みがうまくいかないステップが生じ、完成に至らなかった。遺伝子工学的基本技術の変更が必要と判断し、従来の「制限酵素によるDNA断片の調製とライゲーションによる断片挿入」ではなく、組み換え酵素を用いたDNA断片挿入手法を試したところ、良好にベクター構築を進められることが判明した。基本技術の限界による研究進捗の遅れが取り戻せる目処が立ったので、次年度は研究の進展が期待できる。本研究では、遺伝子組み換え技術を駆使し、観察が容易なマーカーによってエピジェネティック毒性の有無を検出するレポーターマウスを開発する。本研究は、1)レポーターマウス作製に必要なベクターの構築、2)培養細胞を用いた最適化、3)その結果を反映させたレポーターマウス作製、4)既知のDNA脱メチル化物質アザシチジンを用いたマウスの有用性検証、の4つのステップに分けて実施する。本年度は、レポーターマウス作製に必要なベクターの構築に注力した。化学物質によるDNAメチル化影響をマウス組織において可視化するために提案しているシステムの原理は、DNAメチル化を受ける特定の標的配列を決定し、それを発現制御DNA領域としてGFPなどの蛍光マーカータンパク質の上流に挿入し、標的配列を能動的にDNAメチル化することで蛍光マーカータンパク質の発現を抑制することである。化学物質の影響により、標的配列のDNAメチル化が解除されると蛍光マーカータンパク質が発現し、影響が検出される。当初、標的配列としてCpG配列を複数有する完全人工配列を考えて研究を進めていたが、毒性試験への応用を考えた場合、出来るだけ全身の細胞において発現する配列を選ぶ必要があるとの認識を強くした。そのため、標的配列の選択をし直す方が賢明であるとの判断をせざるを得ず、ベクター作製も修正が必要となった。これまで、レポーターマウス作製に必要なベクターの構築に注力するにあたり、人工的に設計した標的配列に能動的にDNAメチル基を導入し続け、レポーター応答を抑える方針を採ってきた。しかしそれでは生体を反映しない特殊なDNAメチル化変化しか捉えられない可能性があることから、生体を反映した標的配列の選択をし直すこととした。

そこで、標的配列の選択をし直し、imprint遺伝子由来のminimal promoterであるSnrpn promoterを検討したところ、近傍のメチル化状態と連動してメチル化変動しレポーター応答に反映可能である結果が得られた。本研究の最終目的は、化学物質によるDNAメチル化影響を組織において可視化可能なレポーターマウスを作製することである。本システムで用いるDNAメチル化を受ける特定の標的配列としてCpG配列を複数有する完全人工配列を予定し、必要なベクター構築を進めていたが、より生体を反映させるためには標的配列を選択し直した方がよいと判断した。今年度、いくつかの候補配列を検討した結果、Snrpn promoterを用いることで、近傍のDNAメチル化状態を反映するレポーター応答を可視化可能である結果が得られた。次はこのレポーターが化学物質に応答してDNAメチル化変化を反映した応答を示すか確認出来れば、レポーターマウス作製に移ることが出来る。予備的ではあるが、培養細胞を用いた検討で、化学物質としてDNA脱メチル化物質であるアザシチジン処理により、レポーター応答が増強する結果が得られている。よって今後順調に研究が進む可能性が見込まれたため、本区分を選択した。化学物質影響がゲノムに記憶されるエピジェネティック毒性の重要性が指摘されているが、そのリスクへの対応はほとんど進んでいない。その原因として、エピジェネティック毒性検出手法が高度な生化学解析技術を要するために毒性試験となじまず、毒性試験データからエピジェネティック毒性を検出することが容易ではないことがあげられる。本研究では、遺伝子組み換え技術を駆使し、観察が容易なマーカーによってエピジェネティック毒性の有無を検出するレポーターマウスを開発する。本研究は、1)レポーターマウス作製に必要なベクターの構築、2)培養細胞を用いた最適化、3)その結果を反映させたレポーターマウス作製、4)既知のDNA脱メチル化物質アザシチジンを用いたマウスの有用性検証、の4つのステップに分けて実施する。これまでレポーターマウス作製に必要なベクターの構築に際し、人工的に設計した標的配列に能動的にDNAメチル基を導入し続け、レポーター応答を抑える方針を採ってきた。しかしそれでは生体を反映しない特殊なDNAメチル化変化を捉えることになりかねないことから、生体を反映した標的配列を選択し直すこととした。そこでまず、imprint遺伝子由来のminimal promoterであるSnrpn promoterを検討したところ、近傍のメチル化状態と連動してメチル化変動しレポーター応答に反映可能である結果が得られた。このSnrpn promoterの上流に標的配列としてAgouti, Daz1のpromoter配列を連結し、培養細胞に導入し、Agoutiは中程度のレポーター応答、Daz1は弱いレポーター応答を示すことを確認した。そこでDNA脱メチル化物質アザシチジンに対する応答を検討したところ、ともにレポーター応答の増強を確認した。
神経特異遺伝子の転写制御と薬物による調節-神経分化と記憶に関与する新しい転写因子

本研究では、交感神経のCotransmitterであり、中枢神経に最も豊富にかつ特異的に発現するNPY遺伝子を用いて、シナプス可塑性における神経ペプチド遺伝子の転写活性化の制御機構の解明と、その転写制御因子の同定を、分子生物学的・薬理学的手法を用いて行った。現在、NPY及びENK神経ペプチド遺伝子プロモーター上のNGF反応エレメント(NGFRE)やCa/calmodulindependent kinase反応エレメント(CaRE)を同定している。これらのエレメントを含んだCATベクターやDNAアフィニティーカラムを準備し、転写実験や因子の精製に用いた。また、Southwestern法によって、神経細胞cDNAライブラリーから転写制御因子のクローニングを行った。シナプス可塑性に関わる、神経ペプチド遺伝子の発現増加がこれらの特異的反応エレメントを介した転写活性の増加である事と、それに関与する転写制御因子誘導について興味あるデータが得られている。平成8年度は、NPY遺伝子のNGFREに結合する種々の転写因子のうち、どの転写制御因子がNGFによる細胞内情報伝達を伝えているのかを、CATベクターを用いた培養神経細胞での発現実験で解析した。NGFRE結合蛋白質として26kDaのカプサイシン結合核蛋白質のNDF1をクローニングした。このクローニングした転写制御因子NDF1の発現実験から、NDF1は交感神経への分化抑制に関与している事を見出した。この因子の活性はカプサイシン等の神経作動薬の調節を受けると思われるので、その薬物の作用メカニズムも明らかにしようと試みている。平成9年度は、これら転写因子の脳内分布を調べる実験を行った。個体発生や胎生時期の発現をIn situ hybridizationで行った。その結果、26kDaNDF1 mRNAは成熟動物の中枢および末梢神経系で細胞選択的に広範に存在することを見いだした。これに反して、胎生18日ラット胎児では、中枢神経系、副腎以外にも骨髄、肝臓、腎臓に強く発現する事を見出した。このことはNDF1が神経外組織での細胞分化にも作用を有することを示唆する。今後、種々の組織特異的な細胞の培養を行い、NDF1の遺伝子導入することで神経分化や他の臓器細胞の分化に対する転写抑制因子NDF1の機能を調べたい。また、NDF1を含む、新しい転写調節因子が神経分化や神経作動薬の作用点であることを分子生物学的手法で詳細に解明することを考えている。現在、NPY及びENK神経ペプチド遺伝子プロモーター上のNGF反応エレメント(NGFRE)やCa/calmodulin-dependent kinase反応エレメント(CaRE)を同定している。また、Southwestern法によって、神経細胞ライブラリーから転写制御因子のクローニングを行った。