hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨塩量測定による青年期骨格系の基礎的調査と体育・スポ-ツの身体的影響

本共同研究は骨格系完成時期である青年期初期において体育スポ-ツがどの程度骨格系に影響を及ぼし得るものであるかについて、昭和63年から平成2年にかけて青年期骨格系骨塩量(正常値)及び体育スポ-ツによる骨塩量の動態について検討したものである。青年期の発育発達はほぼ終わっているが骨塩量は増加を示し30歳代にほぼ最大に達っする。これを最大骨塩量(PeakBone,Mass)とよぶ。骨粗鬆症の予防にはまずこの最大骨塩を高めておく必要がある。最大骨塩量は運動、栄養などのライフスタイル及び遺伝的な要因、ホルモンのバランスに大きく関与している。そこで日常生活上影響をおよぼしていると思われるいくつかの因子について検討を行なった。骨格系の骨塩量測定にはLunar社制のDP3およびDEXAを用い、主として大腿骨と腰椎について測定した。アンケ-ト調査はスポ-ツ歴の有無、食事量、牛乳の嗜好度、その他女子については初潮年齢、生理の規則性などについて調べた。体力テストは静的筋力を中心に握力、背筋力、脚筋力等の項目について実施した。体格は身長、体重、脂肪率LBM等について求めた。その結果、本報告書では、1.習慣的な運動が青年期の骨塩量に及ぼす影響、2.多変量解析による青年期骨塩量の評価をとりあげ、骨塩量測定による青年期骨格系の基礎的資料を得、また運動の身体的影響について分析・考案した。1)対象調査対象は本学学生で男子22名、女子21名の合計43名である。年令、身長、体重の男女別平均値は各々20:20歳、168:156cm、60:52kgである。スポーツ群及び非スポーツ群に属する内訳は男子が11:11名、女子では8:13である。2)方法骨格系の骨塩量測定にはLunar社製のDP3を用い、主として大腿骨と腰椎、一部下腿骨について測定した。アンケート調査はスポーツ歴の有無、食事量、牛乳の嗜好度、その他女子については初潮年令、生理の規則制などについて調べた。3)結果i)男子における骨塩量では腰椎1.29g/cm^2大腿骨頚部1.05g、女子では腰椎1.20g、大腿骨頚部0.92gであり、この値は日本人青年期骨塩量の正常値の目安と考えられた。ii)腰椎での男女差は統計上有意ではなかったが、大腿骨頚部では男子の方が有意に高い骨塩量を示した。iii)男女ともに、骨塩量は運動群のほうが非運動群よりも有意に高い傾向にあった。iv)男女別、運動・非運動別では、男子運動群、女子運動群、男子非運動群、女子非運動群の順となり、男女別では男子が高いにもかかわらず運動の有無により、女子運動群が男子非運動群よりも高い骨塩量を獲得していることは非常に注目された。v)青年期骨格の骨塩量を増やす手段として、スポーツが有用であり、加齢的骨塩量減少を軽減する一方法として期待される。骨塩量の増減には,物理的負荷、ホルモンのバランス、Caの摂取などが大きく関与している。今回の分析では、前回の結果に引き続き、青年期の骨塩量において日常生活上影響をおよぼしていると思われるいくつかの因子についての検討を行なった。その結果、男性の場合、体重、測定部近傍の筋力、スポ-ツ歴が骨塩量獲得に強く影響をおよぼしていた。また女性の場合は、体重、スポ-ツ歴および生理の規則性が骨塩量獲得に深くかかわっていることが判明した。つまり男女とも体重による重力、また男性の場合は筋肉による圧迫力が骨に物理的負荷となって影響をおよぼしており、スポ-ツ活動によってそれらの物理的負荷を多く頻回に与えることによって、さらにその影響力を強め骨塩量の増加に関与しているものと考察された。反面、女性の場合、筋力が弱くそれのみでは骨塩量との有意な相関は得られなかったものと思われる。

生理の不規則な女性は規則的な生理の女性に比べて有意に低い骨塩量を示し、女性の骨塩量に対しては閉経期同様に性ホルモンが深く関与しているためと考えられた。一方Caの摂取に関しては、簡便に牛乳摂取量からhighCa群、lowCa群に区分して比較した結果、両群間に何らの有意の差を認め得なかった。この点に関しては今後、Ca摂取の定量的栄養調査と併行して分析する必要がある。1)対象調査対象は沖縄県内在住の大学生18歳から25歳までの男子11名、18歳から22歳までの女子10名であった。身長、体重の男女別平均値は各々171:158cm,66:53kgであった。2)方法DPA装置はScanner typeのLUNUR DP3を用いた。併用してx線を使用するDPXを用い、骨塩量および体組成の測定を行った。筋力測定は静的筋力を代表する握力、脚筋力、背筋力の3項目を選択した。3)結果(1)大腿骨頚部、大腿骨WARD三角、大腿骨大転子部、腰椎2ー4、について加齢との関係を求めた。腰椎2ー4=0.0316X+0.6138(r=0.395p<0.05N=29Female)腰椎2ー4のみ低い相関があったが他の相関は得られなかった。従って、腰椎2ー4以外は加齢にともなう成長が止まり、ほぼピ-クに近い値を示していると思われる。(2)体格、筋力によるTーBMDの推定について変数選択法を適用して重回帰式を得た。説明変数は体重、身長、脂肪量、除脂肪量、握力、脚筋力、背筋力の項目である。男子のTーBMDを推定する重回帰式は次のようになった。TーBMD=-0.00856A+0.01027B+0.00335C+1.79670(A;身長B;体重C;脚力)重相関係数0.938、F_0=17.14>F^3_7(0.01)=8.45同様に女子のTーBMDを推定する重回帰式は次のようになった。TーBMD=-0.01259A+0.00614B+0.00001C+0.71027(A;握力B;脚力C;LBM)重相関係数0.929、F_0=12.79>F^3_6(0.01)=9.78であるからそれぞれ回帰は有意で3つの変数はTーBMDの予測に役立つと言える。TーBMDの値は男子1.28g/cm^2、女子1.23g/cm^2であった。
量子スピン液体の準粒子励起を反映した非平衡磁気ダイナミクス

本研究では量子スピン液体における準粒子形成に係る過渡的なダイナミクスを調べることで、そのメカニズムを明らかにする。さらに準粒子の存在を確実なものとする実験方法を提案し、ポンプ・プローブ分光実験やパルス磁場実験などの実験グループと連携して、その検証への道筋を作る。準粒子形成プロセスという非平衡過程の新たな側面に着目することで、創発準粒子の存在実証だけでなく、それに由来した強相関非平衡系の新たな分野を開拓することができる。
遺伝子工学的手法を用いたグース型リゾチームの触媒機構の解明

グース型リゾチームはニワトリ形リゾチームと比較して極めて研究が遅れており,その触媒機構や基質結合様式等殆ど明らかでない.グース卵白リゾチーム(GEL)のX線解析からは,Glu73が触媒基であると予測されているが,その証明はなされていない.平成16年度においては,ダチョウ卵白由来グース型リゾチーム(OEL)のGlu73をGln, Asp, Alaに置換した変異体(E73Q,E73D,E73A)の酵素学的性質を調べた.各変異体の溶菌活性を測定した結果,E73QとE73Aは活性を完全に消失し,E73Dでは約9%にまで活性が低下した.この活性測定の結果は,N-アセチルグルコサミンの5量体と6量体を用いて活性測定を行った結果とも一致し,またE73Dの反応タイムコースの反応生成物の量は野生型酵素と同じであった.これらの変異体の基質結合力やCDスペクトルには変化が無いことから,グース型リゾチームのGlu73はプロトンドナーとして働く触媒基であることが証明できた.興味深いことに,Alaに置換した変異体E73Aは,酵母での発現量が極端に低下し,変性剤であるグアニジン塩酸に対する熱力学的安定性が大きく低下したグース型リゾチームの立体構造から,分子内部に位置する3つのヘリックス(H5,H7,H8)がコアー構造を形成し,タンパク質の構造維持に寄与していることが予測されている.触媒基Glu73はH5に位置し,その側鎖のカルボキシル基はH8に位置し種間で完全に保存されているTyr169の側鎖の水酸基と水素結合を形成している.したがって,グース型リゾチームのGlu73は,触媒基としての働きだけでなく,タンパク質の安定性やフォールディングにも重要な働きを有することが明らかとなった.この結果は,Tyr169をAlaに置換した変異体の発現量や安定性が大きく低下することからも証明された.さらに本年度では,ダース型リゾチームで完全に保存されている2つのS-S結合の役割についても検討した.Cys残基をSerに置換した変異体を作製し,活性および安定性を調べた.その結果,グース型リゾチームの活性や基質結合力には変化が無かったものの,安定性が大きくした.したがって,2つのS-S結合は,構グース型リゾチームの安定性および構造維持に重要であることが明らかとなった.グース型リゾチームは細菌の細胞壁多糖類を加水分解する溶菌酵素である.本酵素は同じ溶菌酵素であるニワトリ型リゾチームと類似した立体構造を有するにもかかわらず,その酵素学的性質(基質特異性や反応特異性)が異なっている.グース型リゾチームはニワトリ型リゾチームと比べて研究が極めて遅れており,基質結合様式,基質特異性および触媒機構など殆ど解明されていない.本研究は,ダチョウ卵白由来グース型リゾチーム(OEL)をモデルタンパクとし,遺伝子工学的手法を用いてグース型リゾチームの糖加水分解機構を解明することを目的としたものである.平成15年度においては,まず,OELの活性部位で完全に保存されている3つの酸性アミノ酸(Glu73,Asp86,Asp97)を置換した変異体を酵母の分泌発現系を用いて作製し,活性への影響を解析した.Glu73をGlnとAspに置換した変異体(E73Q, E73D)の溶菌および(GlcNAc)_5に対する活性測定の結果E73Qは完全に活性が消失し,E73Dでは9%にまで大きく活性が低下した.同様にAsp86とAsp97に関する4種の変異体(D86N, D86E, D97N, D97E)についても解析し,D86EとD97Eでは約36%,D86NとD97Nでは約12%に活性が低下した.Glu73,Asp86,Asp97に関するいずれの変異体も,野生型酵素と比較して,CDを用いた主鎖構造,キチンアフィニティーカラムに対する基質結合力および変性剤であるグアニジン塩酸に対する安定性に変化が見られなかった.以上のことから,Glu73はプロトンドナーとして作用するOELの触媒残基であることが明らかとなり,Asp86とAsp97の側鎖のカルボキシル基も触媒反応に重要な役割を果たすアミノ酸であることが推定された.現在,触媒活性を完全に消失した変異体E73Qと(GlcNAc)_6との複合体の結晶化条件を探索中であり、構造面から触媒機構や基質結合様式を検討予定である.グース型リゾチームはニワトリ形リゾチームと比較して極めて研究が遅れており,その触媒機構や基質結合様式等殆ど明らかでない.グース卵白リゾチーム(GEL)のX線解析からは,Glu73が触媒基であると予測されているが,その証明はなされていない.平成16年度においては,ダチョウ卵白由来グース型リゾチーム(OEL)のGlu73をGln, Asp, Alaに置換した変異体(E73Q,E73D,E73A)の酵素学的性質を調べた.各変異体の溶菌活性を測定した結果,E73QとE73Aは活性を完全に消失し,E73Dでは約9%にまで活性が低下した.

この活性測定の結果は,N-アセチルグルコサミンの5量体と6量体を用いて活性測定を行った結果とも一致し,またE73Dの反応タイムコースの反応生成物の量は野生型酵素と同じであった.これらの変異体の基質結合力やCDスペクトルには変化が無いことから,グース型リゾチームのGlu73はプロトンドナーとして働く触媒基であることが証明できた.興味深いことに,Alaに置換した変異体E73Aは,酵母での発現量が極端に低下し,変性剤であるグアニジン塩酸に対する熱力学的安定性が大きく低下したグース型リゾチームの立体構造から,分子内部に位置する3つのヘリックス(H5,H7,H8)がコアー構造を形成し,タンパク質の構造維持に寄与していることが予測されている.触媒基Glu73はH5に位置し,その側鎖のカルボキシル基はH8に位置し種間で完全に保存されているTyr169の側鎖の水酸基と水素結合を形成している.したがって,グース型リゾチームのGlu73は,触媒基としての働きだけでなく,タンパク質の安定性やフォールディングにも重要な働きを有することが明らかとなった.この結果は,Tyr169をAlaに置換した変異体の発現量や安定性が大きく低下することからも証明された.さらに本年度では,ダース型リゾチームで完全に保存されている2つのS-S結合の役割についても検討した.Cys残基をSerに置換した変異体を作製し,活性および安定性を調べた.その結果,グース型リゾチームの活性や基質結合力には変化が無かったものの,安定性が大きくした.したがって,2つのS-S結合は,構グース型リゾチームの安定性および構造維持に重要であることが明らかとなった.
T細胞の疲弊を制御する分子メカニズムの解明

HIV等の慢性型感染症では、T細胞の疲弊が病原体の排除を困難にしていることが知られている。そこで本研究では、T細胞疲弊が誘導されるメカニズムを解明するため、マウスモデルを用いた解析を行った。腫瘍抑制因子Meninを欠損させたマウスを解析した結果、細胞内寄生細菌であるリステリアの感染により活性化した抗原特異的CD8 T細胞において、T細胞疲弊が誘導されることを見出した。Meninの欠損により、活性化CD8 T細胞では終末型エフェクターへの分化亢進や抑制性受容体の高発現が観察されることから、Meninはエフェクター分化を制御し、T細胞疲弊の抑制に働いている可能性が示唆された。慢性型感染症では、持続的な抗原刺激により誘導されるT細胞の疲弊が、病原体を排除する上で大きな問題となっている。しかしながら、どのようなメカニズムでT細胞の疲弊が誘導されるか、その分子機能については理解が進んでいない。本研究の目的は、T細胞疲弊メカニズムを感染マウスモデルを用いて解明し、疲弊に基づくT細胞機能不全を抑制、あるいは解除する手法の開発を目指すものである。今年度は、本研究のT細胞疲弊モデルである腫瘍抑制因子Menin欠損マウスを用いて詳細な解析を行った。リステリア感染後、Menin欠損CD8陽性T細胞において、抑制性受容体PD-1の高発現や細胞死の誘導など、慢性型感染症で見られる特徴的な疲弊現象が早期に誘導され、同時に、T細胞分化マーカーであるKLRG1の高発現とCD27の低発現が観察されたことから、effectorへの分化促進と疲弊との関連を示唆する結果を得た。また、Meninとの相互作用が疑われる細胞内エネルギー代謝に関与する蛋白FoxO1やFoxO3aの発現をCD8陽性T細胞で比較したところ、両蛋白の発現量が野生型と比べ、Menin欠損T細胞で低下することが明らかとなった。さらに、メタボローム解析から、Menin欠損T細胞において、グルタミン代謝経路の亢進が見られ、エネルギー代謝異常を示唆する結果を得た。これらの結果から、Menin欠損CD8陽性T細胞に見られる疲弊が、T細胞における分化促進、およびエネルギー代謝異常によって引き起こされる可能性が示唆され、今後のT細胞疲弊抑制・解除する研究にとって重要な成果が得られたと考えられる。HIV等の慢性型感染症では、T細胞の疲弊による機能低下が病原体を排除する上で大きな問題となっており、感染症克服にはこのT細胞疲弊の抑制が重要と考えられる。しかしながら、活性化したT細胞が疲弊に至るメカニズムについては不明な点が多いのが現状である。そこで本研究では、感染マウスモデルを用いてT細胞疲弊誘導メカニズムを解明し、疲弊を抑制あるいは解除する手法の開発を目的とする。これまでの我々の研究から、腫瘍抑制因子であるMeninを欠損させたマウス由来のCD8陽性T細胞において、リステリア感染による抗原特異的活性化後、抑制性受容体PD-1の高発現や増殖低下、細胞死の誘導など慢性型感染症で見られる特徴的なT細胞疲弊現象が、早期に誘導されることを見出している。これをT細胞疲弊モデルとして疲弊メカニズムの解析を行ったところ、活性化したMenin欠損CD8陽性T細胞において、分化マーカーであるKLRG1の高発現とCD27の低発現が観察され、終末型エフェクターT細胞への分化亢進が見られた。さらに、細胞内エネルギー代謝に関与する蛋白質FoxO1やFoxO3aの発現がMenin欠損T細胞で低いことから、メタボローム解析を行ったところ、Menin欠損T細胞において、グルコース代謝経路やグルタミン代謝経路の過剰活性が見られ、Meninの欠損による細胞内エネルギー代謝異常を示唆する重要な結果が得られた。以上の結果から、Meninが終末型エフェクターT細胞への分化およびエネルギー代謝を制御することにより、T細胞疲弊を抑制している可能性が明らかとなった。当初の予定通り、Menin欠損マウスにおけるCD8陽性T細胞の分化と疲弊の解析を行い、腫瘍抑制因子Meninが終末型エフェクターT細胞への分化制御とT細胞疲弊の抑制に働くことを示す結果を得た。また、細胞内エネルギー代謝について調べるため、メタボローム解析を行ったところ、Menin欠損CD8陽性T細胞においてグルタミン代謝経路の過剰活性など細胞内エネルギー代謝異常が見られ、エネルギー代謝異常と疲弊の関連を示唆する結果を得た。さらに、Menin欠損CD8陽性T細胞で異常が見られるエネルギー代謝経路の阻害剤を用いて疲弊が抑制されるか観察したところ、疲弊マーカーである抑制性受容体PD-1の発現低下を確認した。また、予定した通りMeninが感染過程のどの時期に働くかについても明らかにするため、薬剤依存的Menin欠損マウス(Meninfl/fl Rosa-CreER)を作製し、感染前後に薬剤を投与したところ、感染後4日目の投与でも疲弊が誘導されることから、感染によるT細胞活性化後にMeninが疲弊抑制に働くことを示す結果を得た。これまでの研究から、腫瘍抑制因子の1つであるMeninを欠損させたT細胞において、抗原刺激による活性化後早期に、抑制性受容体の高発現や増殖の停止など疲弊現象が誘導されることを見出した。そこでMenin欠損マウスが、T細胞疲弊研究の良いモデルになると仮定し、リステリア感染に対するCD8 T細胞の感染免疫応答に関して以下の2つの重要な知見が得られた。1.T細胞の感染免疫応答におけるMeninの役割について明らかにするため、T細胞特異的Menin欠損マウスを用い、リステリア感染に対する抗原特異的CD8 T細胞の免疫応答を経時的に解析した。

その結果、野生型で細胞数がピークとなる感染7日目にMenin欠損型では細胞数が減少し、効率よくリステリア排除出来ないことが分かった。また、感染5日目のT細胞について解析したところ、Meninの欠損により、抑制性受容体の高発現と共に、増殖の低下や細胞死が誘導されることが明らかとなった。2.T細胞疲弊との関連が疑われる細胞内エネルギー代謝についてメタボローム解析を行ったところ、Menin欠損型T細胞ではグルタミン代謝活性が過剰亢進しており、エネルギー代謝活性の異常が、T細胞疲弊を引き起こす可能性が示唆された。そこで、同定された疲弊に関与する細胞内エネルギー代謝系の阻害剤を用いたところ、Menin欠損型T細胞において、抑制性受容体の発現が低下することが明らかとなった。これらの結果、腫瘍抑制因子Meninは、細胞内エネルギー代謝を調節することによりT細胞疲弊を制御していることが示唆された。今後は、これらの成果をもとに、Meninとエネルギー代謝の関係を中心に分子レベルで疲弊制御メカニズムを解明し、Meninあるいはその下流の標的因子を制御することで、感染症対策を目的とした養子免疫療法などへの応用を目指す。HIV等の慢性型感染症では、T細胞の疲弊が病原体の排除を困難にしていることが知られている。そこで本研究では、T細胞疲弊が誘導されるメカニズムを解明するため、マウスモデルを用いた解析を行った。腫瘍抑制因子Meninを欠損させたマウスを解析した結果、細胞内寄生細菌であるリステリアの感染により活性化した抗原特異的CD8 T細胞において、T細胞疲弊が誘導されることを見出した。Meninの欠損により、活性化CD8 T細胞では終末型エフェクターへの分化亢進や抑制性受容体の高発現が観察されることから、Meninはエフェクター分化を制御し、T細胞疲弊の抑制に働いている可能性が示唆された。当初の予定通り、Menin欠損CD8陽性T細胞におけるT細胞分化と疲弊の解析を行い、腫瘍抑制因子Meninが、effectorへの分化制御とT細胞疲弊の抑制に働いていることを示唆する結果を得た。Meninと相互作用をする蛋白として見出したFoxO1やFoxO3aに関する解析を行い、両蛋白の発現維持にMeninが重要な働きを示す結果を得た。さらに、当初予定がなかったメタボローム解析から、Menin欠損T細胞のグルタミン代謝経路が野生型よりも活性化しており、細胞内エネルギー代謝異常が、疲弊を誘導する可能性を示す結果を得た。現在は、Meninが感染過程のどの時期に重要かについて明らかにするため、薬剤依存的Menin欠損マウス(Meninfl/fl Rosa-CreER)を作製し、予定通り、感染後のMeninの役割について解析を行っている。平成27年度の成果を念頭において、Menin欠損マウスを用いた細胞内エネルギー代謝異常に焦点を絞り、疲弊誘導メカニズムを明らかにする。具体的には、まず初めにエネルギー代謝活性とT細胞疲弊の関係を明らかにする。
根分岐部骨部欠損に対するBMPの影響

本研究はの目的は,髄床低の穿孔などにより生じた骨欠損部位に,TGF-βスーパーファミリーの中でも骨誘導能に優れているBMPおよび骨形成に関与すると言われているTGF-β1を投与することで,骨を効率良く形成することである.実験方法生後8周齢のラット第一臼歯にラバーダム防湿を施し,歯冠部より無菌的に骨欠損を作製した.実験群にはBMPおよびTGF-β1を投与し,対照群にはキャリアーのみを投与した後,厳密に仮封を行った.一定器官飼育後屠殺し,取り出した顎骨を通法に従い固定脱灰後,パラフィン切片を作製し,組織学的に検討した.結果および考察キャリアーにコラーゲンを使用し,1ヵ月間飼育した実験群では,根分岐部骨欠損に骨の再生が認められた.しかし,対照群でも同様な骨の再生が認められ,組織学的に有意な差を認めなかった.現段階では,飼育期間を短くすることにより,BMPなどの骨誘導能が有意に発現している期間を検討中である.また,BMPの局所濃度を有効に維持することができるようなコラーゲン以外のキャリアーを実験に用いることも検討中である.本研究はの目的は,髄床低の穿孔などにより生じた骨欠損部位に,TGF-βスーパーファミリーの中でも骨誘導能に優れているBMPおよび骨形成に関与すると言われているTGF-β1を投与することで,骨を効率良く形成することである.実験方法生後8周齢のラット第一臼歯にラバーダム防湿を施し,歯冠部より無菌的に骨欠損を作製した.実験群にはBMPおよびTGF-β1を投与し,対照群にはキャリアーのみを投与した後,厳密に仮封を行った.一定器官飼育後屠殺し,取り出した顎骨を通法に従い固定脱灰後,パラフィン切片を作製し,組織学的に検討した.結果および考察キャリアーにコラーゲンを使用し,1ヵ月間飼育した実験群では,根分岐部骨欠損に骨の再生が認められた.しかし,対照群でも同様な骨の再生が認められ,組織学的に有意な差を認めなかった.現段階では,飼育期間を短くすることにより,BMPなどの骨誘導能が有意に発現している期間を検討中である.また,BMPの局所濃度を有効に維持することができるようなコラーゲン以外のキャリアーを実験に用いることも検討中である.
細胞複製制御の分子生物学的研究

本重点領域研究は、原核生物並びに真核生物細胞複製における制御の仕組みを分子レベルで総合的に理解することを研究目的としている。そのために「ゲノム複製開始の制御」、「ゲノム複製の終結と分配の制御」、「細胞複製制御の遺伝子発現」の3課題について班員33名からなる計画研究班を組織し、公募研究15課題と共に領域研究の重点的推進をはかった。先ず6月に総括班会議を開催し本年度の活動方針を決定した。ついで3班合同の班会議を3月に開催し班員の研究の理解と連携をはかった。又9月に東京で公開シンポジウム「細胞周期をコントロ-ルする仕組み」を開催、10題の演題によりこの研究分野の一般へのアピ-ルを行った。領域研究の推進、人材発掘、若手研究者の育成などのために、「DNA複製ワ-クショップ」(10月)、「細胞制御ワ-クショップ」(1月)、「染色体ワ-クショップ」(2月)を主催及び共催した。又班員間の連携と情報交流のために7月、10月、12月の3回サ-キュラ-を発行した。2月には各班員の研究の進展状況をまとめた報告集を作り、全班員の配布し、研究の相互理解を深め、かつ来年以降の総括班の運営資料とした。3月に第2回総括班会議を開催し、本年度の活動の総括、反省と来年度の計画の検討を行った。幹事会は5回開催しきめ細かい総括班の活動につとめた。研究拠点となる研究室には下記の大型機器を設置し、研究の推進に大いに役立った:細胞並びに細胞成分の分離精製解析のためにベックマン社製、超遠心機、卓上型超遠心機、エルトリエ-ション遠心機、高速液体クロマトグラフィ、細胞微細構造解析用にオリンパス製位相差顕微鏡及びカ-ルツアイス社製倒立顕微鏡、又、事務処理と研究連絡デ-タ処理を円滑に行うためのパ-ソナルコンピュ-タ-などである。本年度の班員による出版、英文論文総数は83編にのぼり、大きな成果があがった。
気候変動、災害、食品安全、伝染病から見る「グローバル・イシューの安全保障論」

本研究の目的は、「気候変動」、「災害」、「食品安全」、「伝染病」という四つの事例を通じ、グローバル・イシュー安全保障論の分析枠組みを構築することである。従来の視点では、脅威の主体が明確であるか、或いは脅威を受ける客体が何らかに固定化されていた。そのため、今回着目する四つの事例のように、主体が明確ではない場合の脅威すなわち「リスク」や、リスクを受ける客体が複雑に関係し合うグローバル・イシューには対応できていなかった。また、これらの課題に対しては単一の分野における分析視点では不十分である。本研究は、従来の安全保障学的な観点に立ちながらも多分野・多視点な学際的分析を実施することであり、リスクの主体と客体の関連性を領域横断的に明確化することで枠組みの構築を目指す。平成30年度(2018年度)本年度は国内の研究チームを中心に研究会を開催し、文献サーベイを踏まえた本研究の分析枠組み・仮説の導出と研究課題の洗い出しを行った。そのため、文献と事例研究のための予備調査のほか、海外の研究協力者(中国浙江大学)を講師として招き、ヒアリング調査を実施して、その調査結果を整理・分析した。なお、研究代表者(鄭)、研究分担者(大塚)と研究協力者(雷)を中心に事例研究に向けた予備調査と比較研究に向けた問題点について、研究会の開催などを通じて議論を行いながら課題を明確にしている。事例研究については、予備的調査を行ったうえで、国外の研究協力者とともに国外ヒアリング調査の実施も開始しようとした。その結果については研究会で共有・検討するほか、研究代表者・分担者・協力者が各々の所属学会で研究発表を行い、本研究に対する客観的な批判・コメントを受けた。研究代表者は2018年8月から育児休業から復帰して、様々な研究活動に取り組んできた。まず、メンバー内では理論的枠組みを検討するため、研究会を5回開催し、今年度及び次年度以降の詳細な研究作業工程を確定した。また、中国の浙江大学の先生を講師として迎え、人間の安全保障について聞き取り調査を行った。なお、人間の安全保障における理論的枠組みについてインタビュー調査を行い、全体の理論的視点を精緻化する作業に取り組むことができた。令和元年(2019年度)は文献サーベイ及び各事例研究においては、各国政府及び国際機関・団体による政策文書や調査報告書や、学術研究成果として発表されたペーパー、専門書などを国内外の政治学、環境学、経済学などに関連する文献データベースを活用しながら、チームメンバーが分担して収集する。2020年度においては、本研究課題に関する文献サーベイを引き続き行うとともに、各事例研究のための国外でヒアリング調査を実施する。またヒアリング調査の際には現地にて研究協力者を中心にした小規模な研究集会を持ち、最新情報の収集と関係者との意見交換を行う。また、国内もしくは海外にて研究会を年4回程度開催し、文献サーベイ及び各事例研究のヒアリング調査に関する中間成果を共有、検討する。ヒアリング調査を通じた仮説の検証と、調査成果に基づく分析枠組みを精緻化し、研究成果の執筆に取り掛かる。さらに各年度とも研究メンバーが国内のそれぞれの所属学会で研究発表を行う。最終年度となる2021年度は、文献分析とヒアリング調査の結果を踏まえ、分析枠組みを注意深く修正した上で、学術的、実務的な観点を提示する。この枠組みと各分野での事例研究との比較から、「グローバル・イシューの安全保障論」について総括し、研究成果を完成させる。年4回程度の研究会を開催するほか、年度後半に国外研究協力者を日本に招聘し国際ワークショップを開催して知見の統合を図るとともに、国民に広く成果を発表する。研究の最終成果は上記国際ワークショップや研究代表者・分担者・協力者が国内外の所属学会で発表をする以外、英語または日本語の論文の執筆を行い、翌年度の出版を目指す。

研究代表者は2018年8月から育児休業から復帰して、様々な研究活動に取り組んできた。まず、メンバー内では理論的枠組みを検討するため、研究会を5回開催し、今年度及び次年度以降の詳細な研究作業工程を確定した。また、中国の浙江大学の先生を講師として迎え、人間の安全保障について聞き取り調査を行った。なお、人間の安全保障における理論的枠組みについてインタビュー調査を行い、全体の理論的視点を精緻化する作業に取り組むことができた。令和元年(2019年度)は文献サーベイ及び各事例研究においては、各国政府及び国際機関・団体による政策文書や調査報告書や、学術研究成果として発表されたペーパー、専門書などを国内外の政治学、環境学、経済学などに関連する文献データベースを活用しながら、チームメンバーが分担して収集する。2020年度においては、本研究課題に関する文献サーベイを引き続き行うとともに、各事例研究のための国外でヒアリング調査を実施する。またヒアリング調査の際には現地にて研究協力者を中心にした小規模な研究集会を持ち、最新情報の収集と関係者との意見交換を行う。また、国内もしくは海外にて研究会を年4回程度開催し、文献サーベイ及び各事例研究のヒアリング調査に関する中間成果を共有、検討する。ヒアリング調査を通じた仮説の検証と、調査成果に基づく分析枠組みを精緻化し、研究成果の執筆に取り掛かる。さらに各年度とも研究メンバーが国内のそれぞれの所属学会で研究発表を行う。最終年度となる2021年度は、文献分析とヒアリング調査の結果を踏まえ、分析枠組みを注意深く修正した上で、学術的、実務的な観点を提示する。この枠組みと各分野での事例研究との比較から、「グローバル・イシューの安全保障論」について総括し、研究成果を完成させる。年4回程度の研究会を開催するほか、年度後半に国外研究協力者を日本に招聘し国際ワークショップを開催して知見の統合を図るとともに、国民に広く成果を発表する。研究の最終成果は上記国際ワークショップや研究代表者・分担者・協力者が国内外の所属学会で発表をする以外、英語または日本語の論文の執筆を行い、翌年度の出版を目指す。研究代表者は平成30年度の途中から復帰したため(育児休業)、当初実施予定の活動を2019年度に変更する必要がある。2019年度には、ワークショップの開催費用(6月)、講師謝金・旅費(6月)、国内学会において分科会を企画するとその参加費用(11月)、代表者、分担者と協力者の現地調査旅費(年度中随時)、インタビュー調査後のテープ起こし費用(1月3月)などに充てる予定である。
弁当箱法の実践的活用による糖尿病食事療法における目安形成過程支援モデル開発・評価

本研究は、足立ら(2004)が開発した弁当箱法を活用して、糖尿病食事療法における患者の目安形成を意ずして行う支援モデルを導いた.弁当箱法は、食事療法を行う糖尿病患者に受け入れやすく実行しやすいが、生活様式への適合の是非が、継続においては鍵となる.患者の目安形成に向けては、弁当箱法を活用して、患者の食への関心の喚起と工夫を促すことを基軸とし、患者が実行して得た体験がベースとなって(1)食の知識が深まること(2)得られた学を1食単位から生活全体へ広がることを支援する、と示された.本研究は、足立ら(2004)が開発した弁当箱法を活用して、糖尿病食事療法における患者の目安形成を意ずして行う支援モデルを導いた.弁当箱法は、食事療法を行う糖尿病患者に受け入れやすく実行しやすいが、生活様式への適合の是非が、継続においては鍵となる.患者の目安形成に向けては、弁当箱法を活用して、患者の食への関心の喚起と工夫を促すことを基軸とし、患者が実行して得た体験がベースとなって(1)食の知識が深まること(2)得られた学を1食単位から生活全体へ広がることを支援する、と示された.1)糖尿病看護援助の介入評価視点の抽出医学中央雑誌(検索範囲:1995-2005)を用いて看護援助の介入による対象の変化が明記されている82文献から糖尿病看護援助の介入評価視点を分析した。その結果、固定的な評価視点の設定が多く、糖尿病患者の個々の生活に沿う食事療法支援の実践に向けては、それぞれが培ってきた豊かな食のあり方を多義的かつダイナミックに評価できる、根拠に基づく看護援助の評価視点の抽出が急務と考えられた。2)弁当箱法の実践的活用による糖尿病食事療法支援の導入と評価糖尿病外来通院患者6名(男性3名、女性3名、平均年齢62歳)に研究協力の承諾を得て、弁当箱法の導入を行った。弁当箱法導入時の対象者の反応は(1)食事について手軽な方法が知りたい。カロリー計算は難しくてやっていられない(2)これ以上データが悪くならないようにがんばりたい。(3)食事バランスをよくしたい(4)テレビで聞いたからなんか興味ある、などで、概ね前向きな意思が表明された。このことから糖尿病患者は、治療の基本である食事には関心をもっているが日常において実行できる容易な方法を求めており、看護者が日常生活で実践可能な方法を提示していくことは糖尿病患者の食生活の改善に向けて取り組む気持ちを喚起させる刺激となると考えられた。弁当箱法導入時の看護援助の分析からは、幾つかの支援方法が抽出された。具体的には、『生きてきた年代に特徴的な食文化を踏まえて食生活暦をアセスメントすることで、その人の弁当へのイメージを把握でき、対象者の生き方を反映させた援助課題に繋げていくことができる』等である。今後も対象者への支援を継続してデータを蓄積し、病態的評価、栄養的評価、QOLの変化を含め継続評価していく。糖尿病食事療法に弁当箱法を導入し、医師から紹介され研究参加同意が得られた6名の患者(50歳台から70歳代、男性3名女性3名、非インスリン依存性糖尿病患者6名)の反応を質的機能的に分析した。患者の反応として分析した期間は、自分の生活で弁当箱法を実施するまでの期間とした。その結果、弁当箱法を導入した患者の反応は、(1)弁当箱の具体的な作り方へ関心を示し、ルールをわかろうとする(2)負担感のない食生活を希望する(3)食生活全体への思いをめぐらす(4)弁当箱法をやってみようと決める(5)他者のサポートを得ようとする(6)弁当箱法をまずやってみたことを報告する(7)弁当箱法を通してよりよい食べ方を学ぶ(8)弁当箱法を実践し効果を実感する、が明らかとなった。これらの結果から、「弁当」が普段の生活になじみがあり、親しみやすいこと、一回の食事の全体像を把握しやすく、表面積比や調理法によって摂取カロリーや栄養バランスを学習することができ、個々の食品のカロリー計算を求める学習よりも取り組みやすいこと、ルールを完全に習得していなくてもまず実行できてしまうよさがあり、作ってみた弁当をもとに摂取量や栄養バランスについて学習進めていく展開の仕方ができること、もともと食事療法への抵抗感が強く実行する自信がない場合は受け入れがたいこと、弁当の内容を看護師と共に振り返り食文化を看護師と共有することによって、制限と思いがちな糖尿病患者の食生活に豊かさを取り戻し、その人の個別性により対応した支援になりうることが考えられた。昨年度に引き続き,継続支援を続けた対象患者は18名(男性7名,女性11名)である。4ケ月以上長期的に弁当箱法を活用した食事支援を行った患者の言動から,弁当箱法を活用した食事療法において患者がどのような目安を持っているかを,事例毎にKJ法を用いて分析した。患者Aのもつ目安は,【原因と行く末は知っている】【栄養素・調理法を`知る・知らない'】【日々の食事に歯止めをかける】【3:1:2に`遠い・近い'】【弁当箱法は工夫をすれば使いやすくて満足だ】【しっかり詰めた弁当は,お腹が空いても身体が軽くて調子いい】が抽出された。

過去に生じたこと(食べ過ぎた等)と将来に生じること(合併症等)は知っていても,今をどのようにしたらよいかが分からない患者が,弁当箱法を活用することで,実感を伴う確かなものを作りあげていくことが示された。事例Bの目安は,【血糖バランスは,実生活の中では乱れるもの】【ものさしは自分】【基本は,指示カロリー・栄養バランス・血糖バランス】【確かめる・確かにする】【骨の髄まで】が抽出された。糖尿病の食事療法を良く知り取り組む患者でも,生活状況の中で不安定になる血糖状態を整えることに弁当箱法を活用し,それによって食事の妥当さを確かめることは,同時に自分自身のあり方をも確かにしていくことが示された。弁当箱法を活用した食事支援は,糖尿病の食事療法として求められる食事の課題と,患者が今まで培ってきた食生活とに接点を作りだし,その人に確かなものを創り上げていくことに貢献することが示唆された。今後は,全事例の分析を進めることと,患者の目安形成を支援する看護援助について明らかにすることが課題である。本年度は、弁当箱法を活用した糖尿病患者への支援過程における患者の工夫ならびに看護師の教育的かかわりを分析した。21事例の患者の工夫は、【弁当の中身を満足感に向けて追及する工夫】【弁当づくりや弁当箱法の実践を、血糖コントロールに向けて活用する工夫】【日々の生活・食生活と、弁当箱法で行う弁当作りを組み合わせていく工夫】【弁当箱法の実践で得た学びを日々の生活に応用させていく工夫】が抽出された。18事例の支援過程から抽出された教育的かかわりは、【弁当箱法のルールについて、実物を見せたり体験談で具体的に示していく】【生活者としてのその人のあり様を理解し受けとめる】【負担感と満足感に注目しながら弁当箱法の実践を継続しやすい支援関係、実施ペースを作る】【弁当箱を活用して、その人にあった1食単位のエネルギー量と適切さを伝える】【患者がつくった弁当を、ルールに照らして評価し、ルールに近づく具体策を助言する】【患者が作った弁当に詰められた料理自体に関心を示し、美味しく味わう・作る楽しさを共有する】【弁当箱法の実践で得た学びを、食生活全体への活用へと助言する】【弁当箱法を実践して得た食生活と身体の変化を、患者が意識化するよう問いかけ共有する】の8カテゴリーが抽出された。結果より、弁当箱法を活用した糖尿病患者の目安形成を支える支援を検討した。
革新的プロセスを創生するプロセス強化技術のための渦動力学の体系化への挑戦

本研究では、「渦の動力学」を固体集積、混合・反応促進、粒子分級、物質輸送といった渦の持つ機能構造に着目し、化学工学的に体系化することを目的として、以下の4つの課題に取り組んでいる。1)渦流動場の粒子集積過程の解明と放出制御能の探査では、2円柱非定常交互回転流動場から生じる2次元カオス混合場について、円柱の回転速度と回転持続時間を変化させて、実験と数値流体力学を用いて、カオス混合場内での粒子の分散、集積、凝集挙動を調べた。その結果、カオス混合が粒子の凝集を促進し、円柱回転の非定常性が強いほど微粒子凝集が促進され粒子径が大きくなることがわかった。2)渦内の混合・反応特性の調査では、液滴振動装置を用いて、振動周波数と振幅を変化させ、液滴内の循環流動パターンと混合過程を調べた。液滴表面の循環流動パターンは振動板の振動周波数に依存することがわかった。さらに、液滴内の混合測定では、混合が完了するまでに必要な振動回数(無次元混合時間)は、振動周波数よりも振幅に大きく依存することがわかった。3)円錐型テイラー渦流を利用した粒子分級では、晶析反応プロセス等への展開のための予備的研究として、円柱型のテイラー渦流において、懸濁粒子を含んだ非ニュートン流体を想定して伝熱特性に関する調査を行った。その結果、非ニュートン性が強いほど、テイラー渦セルの軸方向波長が大きくなり、速度境界層と温度境界層の厚さも大きくなることを見出した。4)渦の移動による剥離および、物質輸送能の調査では、シミュレーションを用いて、平行平板流の一部を上下往復振動することで剥離渦を生じさせると、渦は往復振動する平板上に沿って流れ方向を移動する現象を確認した。また、振動流とバッフルを組み合わせて発生させる渦流動を利用した分離膜モジュールの耐ファウリング性能を調べて、渦流動がファウリングを効果的に抑制することを明らかにした。課題1)においては、2次元カオス混合場における微粒子の運動挙動について概ね計画どおり実験を行い、次年度の3次元流れのカオス混合場への展開に向けて有用な知見が得られた。研究成果については、現在論文投稿の準備中である。さらにこの課題においては、国際共同研究へと発展している。課題2)においては、さらに多くの振動板の振動条件で検討する必要があるが、実験のみならず、粒子法を用いた数値流動解析も可能となり、実験と数値解析両面での解析により、詳細な検討が可能となった。さらに、この課題においても液滴のLeidenfrost現象と組み合わせた国際共同研究へと発展している。課題3)においては、円錐形のテイラー渦流による研究は、装置整備に時間がかかり、まだ十分なデータは得られていないが、円柱型のテイラー渦流において、懸濁粒子を含んだ非ニュートン流体を想定した伝熱特性に関する調査を行った予備的研究の成果が、International Journal of Heat and Mass transferに掲載された。課題4)についても、数値解析を中心として、当初の計画どおり進んでおり、この研究成果をもとに、企業との共同研究を開始した。以上各課題とも順調に研究成果が上がっており、本研究課題全体として「おおむね順調に進展している。」と自己評価した。1)渦流動場の粒子集積過程の解明と放出制御能の探査については、昨年度の2次元渦流動場から得られた知見を基に、流れ場をより実際のプロセスに近い3次元流動場に拡張して、実験および、数値流体力学により、粒子発散能を定量的に評価する。実験では、粒子濃度が高い条件でも流速測定および、粒子集積状況を調査するため、超音波流速分布計により、計測を行う。2)渦内の混合・反応特性の調査については、引き続き、液滴振動装置を用いて、振動の周期と振幅を変化させ実験を行うが、今年度は、国際共同研究先との連携のため、振動板表面に微細な溝を加工し、液滴の移動方向を制御することで、二つの液滴を衝突させ合一させることにもチャレンジする。液滴合一後の液滴内の循環流動パターンと混合パターンを、マイクロスコープを用いて調べ、振動板表面の溝形状、振動の周期や振幅を変化させることで、二つの液滴を衝突させた後の液滴内の混合特性を詳細に調べる。3)円錐型テイラー渦流を利用した粒子分級については、前年度整備した円錐型テイラー渦流装置を用いて、テイラー渦セルが自発的に上昇する流動モードにおいて、流動・固体分散機構を、引き続き詳細に調べ、さらに晶析反応など造粒プロセスに適用し、粒子の造粒・分級の制御性について検証する。4)渦の移動による剥離および、物質輸送能の調査については、今年度は数値シミュレーションを用いて、平板の形状を変化させて、発生する渦の大きさや移動速度を詳細に調べるとともに、振動流バッフル付き管型反応器を用いた晶析実験を行うことで、渦流動による反応性能の向上について検証する。

2)渦内の混合・反応特性の調査では、液滴振動装置を用いて、振動周波数と振幅を変化させ、液滴内の循環流動パターンと混合過程を調べた。液滴表面の循環流動パターンは振動板の振動周波数に依存することがわかった。さらに、液滴内の混合測定では、混合が完了するまでに必要な振動回数(無次元混合時間)は、振動周波数よりも振幅に大きく依存することがわかった。3)円錐型テイラー渦流を利用した粒子分級では、晶析反応プロセス等への展開のための予備的研究として、円柱型のテイラー渦流において、懸濁粒子を含んだ非ニュートン流体を想定して伝熱特性に関する調査を行った。その結果、非ニュートン性が強いほど、テイラー渦セルの軸方向波長が大きくなり、速度境界層と温度境界層の厚さも大きくなることを見出した。4)渦の移動による剥離および、物質輸送能の調査では、シミュレーションを用いて、平行平板流の一部を上下往復振動することで剥離渦を生じさせると、渦は往復振動する平板上に沿って流れ方向を移動する現象を確認した。また、振動流とバッフルを組み合わせて発生させる渦流動を利用した分離膜モジュールの耐ファウリング性能を調べて、渦流動がファウリングを効果的に抑制することを明らかにした。課題1)においては、2次元カオス混合場における微粒子の運動挙動について概ね計画どおり実験を行い、次年度の3次元流れのカオス混合場への展開に向けて有用な知見が得られた。研究成果については、現在論文投稿の準備中である。さらにこの課題においては、国際共同研究へと発展している。課題2)においては、さらに多くの振動板の振動条件で検討する必要があるが、実験のみならず、粒子法を用いた数値流動解析も可能となり、実験と数値解析両面での解析により、詳細な検討が可能となった。さらに、この課題においても液滴のLeidenfrost現象と組み合わせた国際共同研究へと発展している。課題3)においては、円錐形のテイラー渦流による研究は、装置整備に時間がかかり、まだ十分なデータは得られていないが、円柱型のテイラー渦流において、懸濁粒子を含んだ非ニュートン流体を想定した伝熱特性に関する調査を行った予備的研究の成果が、International Journal of Heat and Mass transferに掲載された。課題4)についても、数値解析を中心として、当初の計画どおり進んでおり、この研究成果をもとに、企業との共同研究を開始した。以上各課題とも順調に研究成果が上がっており、本研究課題全体として「おおむね順調に進展している。」と自己評価した。1)渦流動場の粒子集積過程の解明と放出制御能の探査については、昨年度の2次元渦流動場から得られた知見を基に、流れ場をより実際のプロセスに近い3次元流動場に拡張して、実験および、数値流体力学により、粒子発散能を定量的に評価する。実験では、粒子濃度が高い条件でも流速測定および、粒子集積状況を調査するため、超音波流速分布計により、計測を行う。2)渦内の混合・反応特性の調査については、引き続き、液滴振動装置を用いて、振動の周期と振幅を変化させ実験を行うが、今年度は、国際共同研究先との連携のため、振動板表面に微細な溝を加工し、液滴の移動方向を制御することで、二つの液滴を衝突させ合一させることにもチャレンジする。
NKG2Dリガンドを介したInnate Immunityによる肺癌免疫治療の開発

NK細胞膜上に発現する受容体の中でNKG2Dは細胞内にITIMモチーフが欠損している活性型受容体である。NK細胞はNKG2Dリガンドを認識し,殺細胞効果を発揮する。そこで、この系を使った免疫遺伝子治療の可能性を検討すべくマウスモデルで以下の実験を行った。前年度にクローニングしたRAE-1βcDNAをGFPcDNAと融合させ、レトロウイルスを用いた発現系を用いて検討したが、RAE-1-GFPの発現は極めて弱く、融合蛋白が効率的に発現していないことが強く示唆された。そこで、GFPと融合させずにRAE-1βcDNAをアデノウイルス発現ベクターに組み込み、RAE-1発現アデノウイルス(AdRae-1)を作成し、ウイルスを大量に調整した。RAE-1に対するポリクローナル抗体が他施設で作成されたので、それを入手しAdRae-1ウイルス感染後癌細胞における細胞膜上におけるRAE-1発現をFACSで確認した。次に、in vitroにおいてRAE-1発現癌細胞がNK細胞に対する感受性を得、NK細胞により傷害を受けることを確認した。また、ex vivoでAdRae-1を感染させたB16をマウスの皮下に移植したところ、B16では腫瘍の増殖が37%抑えられた。これらの実験結果は、NK細胞を中心とするInnateImmunityは腫瘍の拒絶や増殖抑制に関わることを示唆しているが、その効果は限定的であった。そこで、NK細胞にも関与するCX3CケモカンであるFractalkineに注目し、アデノウイルスベクター(Ad.FKN)を作製した。C26およびB16皮下移植腫瘍内にAd.FKNを投与したところ強い腫瘍増殖抑制効果を示した。また腫瘍組織を検討したところCD4およびCD8細胞の浸潤が強く認められこれらT細胞による抗腫瘍免疫反応の誘導が抗腫瘍効果の機序と考えられた。NK細胞膜上に発現する受容体の中でNKG2Dは細胞内にHTIMモチーフが欠損している活性型受容体である。ヒトおよびマウスのNKG2Dリガンドはそれぞれ、MHCA-MICB(Science,285:727,1999)とRAE-1・H60である(Immunity,12:721,2000)。そこで、この系を使った免疫遺伝子治療の可能性を検討すべくマウスモデルで以下の実験を継続中である。まず、RAE-1遺伝子ファミリー(α,β,γ)の中で最も大きなRAE-1βに注目し、RAE-1βcDNAクローニングをマウス胎盤cDNAライブラリーよりPCR法にてクローニングを行い、シークエンスを確認した。次に、RAE-1βに対する抗体が存在しないため、RAE-1βcDNAを、標識蛋白FLAG cDNAと融合させ、Tet・Onシステムで発現する系を作成し、マウス大腸癌C26に遺伝子導入を行ったが、FLAGが発現不可で、このシステムに問題があると考えられた。そこで標識蛋白GFPを発現するレトロウイルスベクターpLEGFP-N1に組み込みRAE-1とGFPを融合蛋白として発現させる系を作成した。このレトロウイルスをC26とEL-4に感染させRAE-1-GFPを強制発現させたが、遺伝子導入後マウスに移植しても腫瘍の増殖速度が変わらず、またGFPの発現をFACSで検討したところ、RAE-1-GFPの発現は極めて弱く、融合蛋白が効率的に発現していないことが強く示唆された。RAE-1はFLAG,GFP共に融合蛋白としては効率よく発現しないことが強く示唆され、戦略の見直しが必要と考えられた。現在、GFPとRAE-1の間にIRESを組み込んだ発現プラスミッドpIRES-GFP-RAE-1を作成した。

IRESにより転写されたRNAからRAE-1とGFPは別個に翻訳され、別個の蛋白として発現されるため融合蛋白のような影響を受けないことが予想される。この発現プラスミッドをC26及びEL-4に導入し、in vivoにおける効果を検討中である。また、マウス腫瘍におけるRAE-1の発現をRT-PCR法で検討したところ、ルイス肺がん細胞、B16メラノーマには発現を認め、大腸癌C26,thymonaEL-4細胞には発現していないことを確認した。NK細胞膜上に発現する受容体の中でNKG2Dは細胞内にITIMモチーフが欠損している活性型受容体である。ヒトおよびマウスのNKG2Dリガンドはそれぞれ、MICA・MICB(Science, 285:727,1999)とRAE-1・H60である(Immunity, 12:721,2000)。NK細胞はNKG2Dリガンドを認識し,殺細胞効果を発揮する。そこで、この系を使った免疫遺伝子治療の可能性を検討すべくマウスモデルで以下の実験を行った。前年度にクローニングしたRAE-1βcDNAをGFPcDNAと融合させ、レトロウイルスを用いた発現系を用いて検討したが、RAE-1-GFPの発現は極めて弱く、融合蛋白が効率的に発現していないことが強く示唆された。そこで、GFPと融合させずにRAE-1βcDNAをアデノウイルス発現ベクターに組み込み、RAE-1発現アデノウイルス(AdRae-1)を作成し、ウイルスを大量に調整した。RAE-1に対するポリクローナル抗体が他施設で作成されたので、それを入手しAdRae-1ウイルス感染後癌細胞における細胞膜上におけるRAE-1発現をFACSで確認した。次に、in vitroにおいてRAE-1発現癌細胞がNK細胞に対する感受性を得、NK細胞により傷害を受けることを確認した。また、ex vivoでAdRae-1を感染させたEL-4及びB16をマウスの皮下に移植したところ、EL-4は腫瘍の生着が完全に拒絶された。B16では腫瘍の増殖が37%抑えられた。腫瘍組織における免疫応答を免疫組織染色を用いて検討したところ、CD8T細胞とNK細胞を浸潤が強かった。中である。これらの実験結果は、NK細胞を中心とするInnateImmunityは腫瘍の拒絶や増殖抑制に関わることを示唆しており、腫瘍免疫治療の1つとなりうることを示している。