hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
仮想患者を用いた口内法Ｘ線撮影実習・評価システムの開発

そのデータについて今年度は当教室所蔵の乾燥頭蓋骨を用いることとした。この乾燥頭蓋骨をCTで撮影し、歯・顎骨のデータとして抽出した。抽出した三次元データを仮想空間内に当てはめ、仮想空間内での歯科用X線撮影装置の位置と仮想患者・仮想フィルムの相対的な位置関係把握し、その数値を元に得られるべき口内法X線画像を計算で求めるプログラムルーチンを開発した。また、この仮想空間の表示システムとしては通常のパソコン用モニタを用いる方法やヘッドマウントディスプレーを用いる方法が考えられる。これらの利点・欠点の評価することができるよう仮想空間構築にあたっては、パソコン用モニタ、ヘッドマウントディスプレーのいずれでも使用できるようにプログラムを作成した。本年度の研究は、昨年度試作した口内法X線撮影訓練システムを臨床実習の学生に試用してもらい、アンケートおよび聞き取り調査で本システムの利点・欠点を明らかにすることにあった。この点は元々本年度に行う予定であったので、本研究はおおむね順調に進んでいると考えられる。本年度の研究は、口内法X線撮影訓練用の仮想空間の構築ができることが主目標であった。この仮想空間はほぼ構築できており、この部分は予定通り進んでいる。この仮想空間について予備的にボランティアに使用してもらいその有効性や改善点を評価することは本年度中にはできなかった。この点は元々本年度から次年度にかけて行う予定であったので、本研究はおおむね順調に進んでいると考えられる。次年度以降は、本年度の調査結果を基に研究費の範囲内で改良できる点は改良する予定である。また、結果を世界に向けて公表する予定である。また、シミュレーションで作成されるX線写真を評価する方法を検討する次年度以降は、本年度作成された仮想空間を用いた口内法X線撮影訓練システムを同意の得られた歯学部学生によって試用する。学生はこれから臨床実習を開始する学年する。試用した学生にアンケートのより調査を行い、本システムの改善点を検出し改良を行う。特に、ヘッドマウントディスプレーとパソコン用モニタの使用感の違いを検討する。また、シミュレーションで作成されるX線写真を評価する方法を検討する次年度は今年度までの成果を世界に向けて公表するため、国際歯科放射線会議での発表のために使用する予定である。本年度の研究費では仮想空間を用いた口内法X線撮影訓練システムがおおよそ完成したので、その改善と、特にヘッドマウントディスプレーとパソコン用モニタの使用感の違いを検討するために、本年度は購入できなかったパソコン用3Dモニタを購入する。
超高周波帯マイクロウェル電極による循環腫瘍細胞の早期検出とその高感度化

世界各国で高い死亡率をもたらす疾患として悪性新生物が挙げられるが、その生存率を上げるためには悪性新生物の超早期発見が要求される。循環腫瘍細胞(CTC)は各腫瘍組織から遊離し、血液中に浸潤した癌細胞であるが、CTCを同定し、細胞の持つ情報を精査することで癌の進行状態などの評価が可能となる。一方、血液中に含まれるCTCの数は血球と比べ極めて少量であることから、CTC検出は困難で高度な技術が必要となる。我々のグループではCTC検出の初期検討として、各細胞が所持する固有の誘電定数に着目し、平行電極にリング共振器を並列に装荷したリング共振器型電極を用いて、細胞固有の誘電定数を共振周波数として測定する手法を考案し検討してきた。そこで平行電極にB, Tリンパ球を挿入し共振周波数を計算した結果、共振周波数に差異が生じ細胞同定が可能なことを数値的に確認したが、細胞や血液による損失が大きいため共振時のQ値が乏しいことが課題となった。そこでさらなる検出感度向上を目指し、負性抵抗素子を本電極上に装荷し、その負性抵抗値を制御することでQ値の改善を目指した。負性抵抗素子としては、エサキダイオードやキャパシタンスを帰還回路として接続したFETを使用し、その有用性を回路シミュレーションで検討した。さらに、FETを負性抵抗素子として接続したリング共振器型電極を実際に作成し、この電極の性能を精査するため、細胞の代わりに純水やチタン酸バリウム粒子を用いて共振周波数を測定した。以上の検討の結果、共振周波数が各状態においてMHzオーダで分離し、負性抵抗素子により本電極のQ値は負性抵抗を実装していない場合と比べ24倍向上し、負性抵抗よりリング共振器型電極の損失を抑制可能であることを実験より確認、検出感度が向上することを確認した。血液中はマイクロ波にとって高損失媒質であるが、これを負性抵抗素子を利用することで感度を向上させることに成功した。これにより、組織固有の比誘電率の差異に起因する共振周波数の分離が明確になり、当初困難が予想されたCTC検出感度が大幅に改善されたと考えられる。なおCTCを検出するための微細電極作成に関しても、昨年度研究室にクリーンルームを構築でき、暗室作業を可能にするための各種設備も2019年度8月中旬には完成予定であり、これらを踏まえると、本研究は一層の加速が期待できる。今後は以下の事項を推進する計画である。1)単一細胞電極の実験:ヒト肺癌由来細胞株(PC-9)を用いて試作電極の有効性検証を行い、PC-9の誘電分散など基本的な誘電特性を把握後、実際にCTCを検出を試みる2)エレクトロローテーション検査結果との相関推定:本電極に多相超高周波信号を印加することで発生するエレクトロローテーションを活用する。これにより細胞が自転する角速度は細胞固有の誘電特性に起因することから、画像処理技術により得られたCTC検査結果と1)の実験結果の相関を自己組織化マップを用いて評価し、CTCの検出感度を高める技術を確立する。また実際の臨床現場を踏まえ、AIを導入してCTCの検出確度を向上させる。3)マトリクス状細胞電極の基礎検討:細胞電極をマトリクス状に配置し、対向する上下電極に印加する信号をスイッチにより時系列に掃引することで約百万個の細胞を迅速に評価するための基礎研究を開始する。

これにより、組織固有の比誘電率の差異に起因する共振周波数の分離が明確になり、当初困難が予想されたCTC検出感度が大幅に改善されたと考えられる。なおCTCを検出するための微細電極作成に関しても、昨年度研究室にクリーンルームを構築でき、暗室作業を可能にするための各種設備も2019年度8月中旬には完成予定であり、これらを踏まえると、本研究は一層の加速が期待できる。今後は以下の事項を推進する計画である。1)単一細胞電極の実験:ヒト肺癌由来細胞株(PC-9)を用いて試作電極の有効性検証を行い、PC-9の誘電分散など基本的な誘電特性を把握後、実際にCTCを検出を試みる2)エレクトロローテーション検査結果との相関推定:本電極に多相超高周波信号を印加することで発生するエレクトロローテーションを活用する。これにより細胞が自転する角速度は細胞固有の誘電特性に起因することから、画像処理技術により得られたCTC検査結果と1)の実験結果の相関を自己組織化マップを用いて評価し、CTCの検出感度を高める技術を確立する。また実際の臨床現場を踏まえ、AIを導入してCTCの検出確度を向上させる。3)マトリクス状細胞電極の基礎検討:細胞電極をマトリクス状に配置し、対向する上下電極に印加する信号をスイッチにより時系列に掃引することで約百万個の細胞を迅速に評価するための基礎研究を開始する。残額378円は次年度消耗品費として使用する予定
肺腺がんにおけるROR1によるカベオラ形成を標的としたEGFR-TKI耐性の克服

我々は、細胞膜にカベオラ構造が形成される上で必須なCAV1とCAVIN1との結合を、ROR1がキナーゼ活性非依存的に両者に対するスキャフォールド蛋白質として機能して、CAV1のライソソームへの移動と分解を防ぐ役割を持つことを見出した。さらに、ROR1がカベオラ構造の維持を通じて、カベオラに集積するEGFRやMET、IGF-IRなど様々なRTKからPI3K-AKTへのシグナリングを維持し、肺腺癌細胞の生存シグナルを担っていることを明らかにした。このことから、腫瘍特異性を有するROR1を分子標的とすることで、様々なRTKの活性化を一網打尽に抑制することが可能であることが強く示唆された。リネジ特異的生存癌遺伝子TTF-1によって転写活性化されるROR1は、EGFRからの肺腺癌の生存シグナルの維持に関わる受容体型チロシンキナーゼ(RTK)である。肺腺癌細胞株におけるROR1の抑制は、EGFR二重変異やMETの遺伝子増幅によるEGFR-TKIに耐性を獲得した細胞においてもアポトーシスを誘導し増殖を阻害する。そこで本研究では、ROR1による様々なRTKを介した生存シグナル制御機構を明らかにするとともに、バイパス経路によって獲得したEGFR-TKI耐性細胞株に対して、ROR1のカベオラ制御機能を標的とした極めて独自性の高い耐性克服につながる基盤的知見を得ることを目指す。平成28年度は、当初の研究実施計画に沿って、順調に進展している。これまでの結果から、ROR1はカベオラ構成分子であるCAV1やCAVIN1と直接結合することが分かり、各々のROR1に対する結合領域を特定することができた。またこれらの結合領域を欠損させたROR1欠損変異体を作製し、CAV1の発現への影響を調べたところ、両者の結合領域はCAV1発現の安定化に必須であることが判明した。さらにカベオラ形成について、急速凍結・凍結割断レプリカ標識法等による電子顕微鏡を用いた形態学的機能解析を行ったところ、ROR1の発現抑制によって有意にカベオラの形成数が低下することを観察した。またカベオラ形成に重要であるCAV1とCAVIN1の結合にはスキャフォールドタンパク質としてのROR1が必要であることが明らかとなり、ROR1発現の抑制下においては、CAVIN1は細胞質に遊離するとともに、CAV1はライソソームによって分解されることが判明した。これまでの研究によって、肺腺癌細胞株においてROR1の発現抑制はCAV1の発現低下を引き起こすこと、また様々なRTKの活性化を減弱させることが分かっていた。今年度の成果によって、新たにROR1はカベオラ構成分子であるCAV1やCAVIN1と直接結合し、CAV1の発現の安定化に関与していることが分かり、肺腺癌細胞株におけるROR1との相互作用の重要性が明らかとなった。また実際にROR1の発現抑制は細胞膜におけるカベオラ形成を阻害し、有意にその形成数を低下させることが分かり、生化学的な解析によるCAV1の発現低下と一致した。さらに、カベオラ形成におけるCAV1の発現安定化にはCAVIN1とCAV1の結合が重要であることが分かっていたが、本研究の成果からROR1がスキャフォールドタンパク質として両者の相互作用を安定化させ、CAV1がライソソームによって分解されないように防ぐ働きを有していることも判明した。これらの結果から、肺腺癌細胞株においてROR1はカベオラに局在し、CAVIN1のリクルートに寄与し、CAVIN1やCAV1と結合することで、両者の相互作用を促進し、カベオラ形成の維持に寄与していると考えられた。それによりカベオラ形成が安定化されることで、そこに集積するEGFRやMET、IGF-IRなどの様々な受容体型チロシンキナーゼの活性化やそこから伝わる生存シグナルが維持されることで、肺腺癌の生存に関与している可能性が示唆された。本研究の目的は、ROR1によるカベオラ制御を介した様々な受容体からの生存シグナル機構を明らかにするとともに、バイパス経路によって獲得したEGFR-TKI耐性細胞に対して、ROR1のカベオラ制御機能を標的とした極めて独自性の高い耐性克服につながる基盤的知見を得ることである。昨年度までの研究成果により、ROR1がキナーゼ活性非依存的に、カベオラ構成分子であるCAV1やCAVIN1と相互作用するスキャフォールド蛋白質として機能することで、カベオラ形成の安定化を促して、カベオラに集積するEGFRやMET、IGF-IRなど様々な受容体の活性化を維持し、肺腺癌細胞の生存シグナルを担うことを明らかにした。平成29年度は、当初の研究実施計画よりも概ね順調に進展した。これまでの結果から、METやIGF-IRのリガンドであるHGFやIGF-I処理に伴うバイパス経路を介したEGFR-TKI耐性条件下の肺腺癌細胞株を用いて、ROR1の発現抑制を行ったところ、有意にアポトーシスが誘導され、顕著な細胞増殖の阻害が観察された。また、同条件下でのROR1の発現抑制は、PI3K-AKT軸からの生存シグナルを著しく低下させることが分かった。バイパス経路によるEGFR-TKI耐性細胞での、カベオラ構成分子であるCAV1やCAVIN1の発現抑制においても効果的な増殖阻害が観察され、生存シグナルの低下が認められた。

さらに、バイパス経路を介したEGFR-TKI耐性を獲得した肺腺癌以外の皮膚癌細胞や咽頭癌細胞においてもROR1の発現抑制はCAV1の発現低下を引き起こし、細胞増殖を有意に阻害することを見出した。これらの研究結果から、様々な癌腫でのROR1を介したカベオラ制御機能の重要性が判明し、ROR1の抑制はEGFR-TKIに対する耐性を克服できることから、分子標的としてのROR1の有効性を示すことができた。我々は、細胞膜にカベオラ構造が形成される上で必須なCAV1とCAVIN1との結合を、ROR1がキナーゼ活性非依存的に両者に対するスキャフォールド蛋白質として機能して、CAV1のライソソームへの移動と分解を防ぐ役割を持つことを見出した。さらに、ROR1がカベオラ構造の維持を通じて、カベオラに集積するEGFRやMET、IGF-IRなど様々なRTKからPI3K-AKTへのシグナリングを維持し、肺腺癌細胞の生存シグナルを担っていることを明らかにした。このことから、腫瘍特異性を有するROR1を分子標的とすることで、様々なRTKの活性化を一網打尽に抑制することが可能であることが強く示唆された。これまでの研究成果から、ROR1がキナーゼ活性非依存的に、カベオラ構成分子であるCAV1やcavin-1と相互作用するスキャフォールド蛋白質として機能することで、カベオラ形成の安定化を促して、カベオラに集積するEGFRやMET、IGF-IRなど様々なRTKの活性化を維持し、肺腺癌細胞の生存シグナルを担っている可能性が明らかになってきた。しかしながら、ROR1はカベオラ形成以外にもカベオラの生理機能を担っている可能性も考えられ、エンドサイトーシスによって生じるエンドソームにおいて生存シグナルを制御していることも考えられる。そこで平成29年度は当初の研究実施計画の通り、ROR1によるカベオラ依存的なエンドサイトーシスの分子機序の解明を進めるとともに、シグナリングエンドソームにおける生存シグナル制御機構を明らかにする予定である。また、肺腺癌細胞株におけるカベオラ形成を標的としたEGFR-TKIの耐性の克服という観点から、平成30年度はMETやIGF-IRのリガンドであるHGFやIGF-I処理に伴うEGFR-TKI耐性条件下の細胞株を用いて、ROR1の発現抑制に加えて、CAV1やCAVIN1の抑制による、増殖への影響やアポトーシス誘導、生存シグナルについて検討を行う予定である。また、肺腺癌細胞株だけに囚われず、ROR1陽性の様々な他の癌細胞におけるバイパス経路を介した耐性機構でのカベオラ生理機能の抑制の効果を検討し、癌細胞でのROR1を介したカベオラ制御機能の重要性と、カベオラ機能の抑制の臨床的な有効性を明らかにしていく。がん生物学
細胞周期進行促進因子Cdc25Bの安定化に関わるPPaseの解明

Cdc25Bの安定性がN-末端側の85番めから103番めまでの領域のリン酸化状態に依存することを発表した。本研究では、Cdc25Bの安定化に働くPPaseの同定を目指した。Cdc25Bの安定性の検定は、GFP融合Cdc25Bを発現させ蛍光強度をモニターすることで行なう。GFP融合Cdc25B発現を指標に単離したクローンは、継代によりGFPシグナルが減弱するため現在まで求める細胞株は得られていない。オカダ酸処理による予備的な結果をもとに、当該PPaseの第一候補としてPP2Aを選択している。このサブユニットタンンパク発現ベクターを樹立しており、細胞株を樹立次第予定の研究を開始できる状態にある。本研究は、「Cdc25Bの安定化を促進するプロテインホスファターゼ(PPase)の解明」が目的である。予備実験により、オカダ酸感受性のPPaseが候補となったため、27年度はまずオカダ酸に対して最も感受性が高いPP2Aについて、以下の戦略による解析を計画した。即ち、1緑色蛍光タンパク質(GFP)融合Cdc25B発現細胞を樹立し、2制御サブユニット(Bサブユニット)が異なる種々のPP2Aを細胞中で発現させ、3蛍光強度の変動(本研究では増強)を指標に、4候補となるPP2AのBサブユニットを明らかにすることにより、5PP2AによるCdc25Bの制御機構を解明する。1については、計画通り複数のGFP融合Cdc25B発現細胞株を樹立した。しかしながら、GFP融合Cdc25B発現HeLa細胞ではGFPの蛍光強度が極めて低く、申請時において一過的発現系での予備実験で観察されたオカダ酸処理による蛍光強度の増強は、今回の安定発現細胞株では明確には観察されなかった。このため、実験系の改変ならびに作業仮説の再検討が必要となった。2についてはまず、アフリカツメガエル(Xenopus)由来の、8種のBサブユニットのcDNAを細胞へ導入し、内在のヒトの足場サブユニット(Aサブユニット)および触媒サブユニット(Cサブユニット)と複合体を形成し、PP2Aホロ酵素活性を持つことを期待した。しかしながら、免疫沈降物の酵素活性測定ならびにウエスタンブロッティング(WB)により検討では、酵素活性・WBともに再構成されたという証拠は得られなかった。以上のことから、研究の全体計画達成の第一歩として設定した3と4と5へは研究展開ができないこととなった。28年度以降はこれらの結果をもとに、作業仮説とそれに伴う研究戦略を練り直し、当初の研究目的の達成を図る。詳細は【今後の研究の推進方策等】の項に記した。当初の計画通りに研究が進展しなかった理由は、主として以下の2点と考えられる。(1)当初の計画では、Xenopus由来のBサブユニットcDNAのヒト細胞への導入により、BサブユニットはヒトのCサブユニットならびにAサブユニットとホロ酵素複合体を再構成し、PP2Aの酵素活性を生じることを期待していた。ところが、研究協力者から譲渡された8種のXenopus BサブユニットのcDNAをHeLa細胞で発現させ、免疫沈降にてBサブユニットタンパク質を回収しPPase活性を測定したが、8種類すべてのcDNAでPPase活性が検出できずまた、免疫沈降物のWBでもA、C両サブユニットとも検出されなかった。すなわち、当初計画していたXenopus由来のBサブユニットcDNAを用いた解析は本研究には不適当であることが判明した。28年度以降は、ヒトのcDNAを用いて研究を進める。(2)Cdc25Bの安定性は、GFP融合Cdc25BをGFPの蛍光強度変化を指標にして評価する計画であった。27年度は、当初の計画通りGFP融合Cdc25Bの発現細胞を複数株樹立したが、樹立した全ての細胞において、定常状態での蛍光強度が弱いうえ、細胞ごとに蛍光強度のばらつきがあり、蛍光強度の変化を可視的かつ定量的に捉えることが困難であったため、当初の研究目標の達成には至らなかった。一方、予定通りに進行した研究は以下に示される。本研究開始時に、Cdc25Bの安定化を制御する可能性がある、オカダ酸感受性のセリン・スレオニンホスファターゼとして、PP2A以外にPP4、PP5ならびに、PP6を想定していた。これらを検定するため、それぞれのPPaseのCサブユニットのヒトのcDNAを入手し、FLAG配列を付加した遺伝子の発現系を構築した。28年度は、これを用いて候補PPaseの検定を行う予定である。本研究は、細胞周期進行制御のキー遺伝子であるCdc25AとCdc25Bに不安定化を誘発するキナーゼに拮抗し、脱リン酸化によりCdc25A/Cdc25Bを安定化させるプロテインホスファターゼ(PPase)を同定することを目的として開始した。昨年度の研究により、代表的なオカダ酸感受性PPaseである、PP1とPP2AがCdc25A/Cdc25Bの安定化に関与しないかもしれないことが推定された。そこで今年度は、Cdc25A/Cdc25Bが多くの腫瘍組織で発現亢進されているという先行研究の成果に基づき、腫瘍において発現亢進の報告がある唯一のPPaseであるPPM1D/Wip1ホスファターゼを、Cdc25A/Cdc25B安定化を誘導する有力なPPaseの1つとして解析した。この研究のためにまず、テトラサイクリンの培地への添加によりPPM1Dホスファターゼを発現誘導できるTet/ONシステムを構築した。本誘導発現系の構築には、発現制御細胞の選択が容易であるレンチ

ウイルスベクターシステムを利用した。その結果、野生型のPPM1Dならびにホスファーターゼ活性喪失型PPM1Dを誘導発現できる細胞株が複数得られた。機能的に正常なPPM1Dタンパクが誘導発現されることは、DNA損傷によりリン酸化を受けるチェックポイント制御タンパクが、野生型PPM1Dの発現により脱リン酸化されることにより確認された。現在はこのシステムをもちいて、野生型PM1D発現によりCdc25A/Cdc25Bの安定性増加が認められるか否かについて解析中である。しかしながら、細胞中のCdc25A/Cdc25Bの発現量が極めて低いため、解析が困難であることが判明したため、現在はCdc25A/Cdc25Bの発現量の変動を鋭敏に検出できるシステムの構築が必要であることが判明した。昨年度は、オカダ酸感受性プPPaseがCdc25A/Cdc25Bの安定性を誘導するという予備実験の結果に基づき、代表的なオカダ酸感受性であるPPaseのPPase1とPPase2Aの関与の可能性を検討しが、必ずしも可能性が高くないことを示唆するデータが得られた。そこで当初の作業仮説を変更し、文献的にCdc25A/Cdc25Bの安定性関与の可能性があるPPM1Dを検討することに研究計画を変更しため、新たな実験系構築を余儀なくされた。すなわち、PPM1DはDNA損傷チェックポイント関連タンパクの脱リン酸化能があることから、一過性発現では本来の細胞機能に予期せぬ異常が生じることも予想され、それが原因でCdc25A/Cdc25B発現量変化の正確な測定が困難となる可能性がある。その可能性回避のために、発現量制御を可能にするTet/ON発現誘導系を採用したことから、新たなシステム構築のために発現ベクターの作製から開始し、細胞の選択まで行なう必要が生じた。結果的に本システムの構築に4ヶ月かかり、さらに得られた細胞株の検定のために2ヶ月間消費したことから、実質的な解析期間は6か月となった。以上のような、当初の研究計画では予期できなかった問題が生じているために、全体的には研究の遂行が遅れ気味であると自己評価している。Cdc25BのN-末端側約80から100番の領域にはリン酸化の標的になりうるセリン残基が8個存在する。私達の以前の研究で、これら8個の全てのセリン残基のリン酸化がCdc25Bの不安定化に関わる可能性が強く示唆されていたため、これらのセリン残基を脱リン酸化するPPaseの同定を計画した。Cdc25Bの安定性は、N-末端側にGFPを付加し、GFPの蛍光量の増加を指標に検定できる。そこで、GFP-Cdc25Bを安定発現させたHeLa細胞を樹立し、種々のPPaseを細胞中で発現させることにより研究を進めた。予備実験で、PP2Aの阻害剤であるオカダ酸処理により蛍光量の増加が検出されたことから、まずPP2Aの分子種(A, B, Cサブユニットから構成される3量体のうち、基質特異性を決定するBサブユニット)を同定するために、A-B-Cの全てのサブユニットを全て一つの融合タンパクとして細胞で発現させる計画を立て、研究を進めたがその準備途中で研究期間が終了したため、研究は中途で終了した。
極域氷床深層コア解析による地球環境変動の復元研究

1.南極ドームふじで掘削された2500メートルの深層氷床コアを解析し、南極における過去32万年の気候・環境変動を研究した。その結果、過去32万年をカバーする3回の氷期サイクルにおける気候変動の詳細が明らかになった。さらに、この3回の氷期サイクルにおける気温変動は10万年、4万年、2万年周期の類似した変化パターンを持つこと、変動の人服が3回の氷期サイクルの中で異なることが明らかになった。さらに固体微粒子、海塩起源物質、海洋生物起源物質、大気微量気体等の濃度が気温と連動して変化することも明らかになり、その変化の詳細な解析から、氷期サイクルにおける気候変化と陸海域環境変化、大気環境変化との相互作用が明らかになった。2.ドームふじコアの火山灰の分析から、火山灰の起源を特定した。また、火山灰の多くが氷期の寒冷期、あるいは寒冷期から温暖期への移行期に堆積していることから、氷期における氷厚の変化、あるいは寒冷期から温暖期への移行期の海面変化が火山活動を誘発した可能性が指摘された。3.ドームふじコアの解析結果をグリーンランド北部で掘削された深層表層コアの分析結果と比較し、南北両極の気候・環境変動の対比を行うことにより、南北両極での氷期サイクルの同期性、位相のずれなどが明らかになった。このことから、氷期サイクルが生じるメカニズムについての知見が得られた。4.国際シンポジウムを2回開催するとともに、ニュースレターを5回、英語報告書を1冊発行し、本研究に関する情報を広く内外に発信した。また、国際シンポジウムのうちの一回については論文集を印刷中である。また、もう一回の国際シンポジウムについても次年度の発行を予定して、論文集の編集作業を進めている。1.各研究班及び総括班の情報連絡の円滑化i.メーリングリストの完備:領域の運営責任者(領域代表者、研究代表者、研究事務担当など)及び研究分担者・研究協力者のメーリングリストを作成し、情報の円滑化に努めた。ii.研究班会議・総括班会議の議事録をホームページに乗せ、情報の円滑化に努めた。2.各研究班の研究調整i.各計画研究班と協議し共通のデータベースの作成に取り掛かった。ii.各計画研究班と協議し北極グリーンランド深層氷床コアの解析を企画した。iii.シンポジウムを開催し、各計画研究班の研究の進捗状況を領域研究者に提示した。3.外部への情報発信i.ホームページの作成の準備に取り掛かった。ii.ニュースレターで領域研究の概要を外部に発信するとともに、研究組織計画表を作成し研究者間の関係を示した。4.国外連絡i.国外評価委員の意見を聴取するため、ディクレアー教授を招聘し意見交換を行った。ii.東久美子(研究分担者)を「雪氷掘削を通した研究の将来展望」、本山秀明(研究分担者)を「南極内陸地域の雪氷堆積環境」に関する情報収集のため国外研究集会に派遣した。1.各研究班及び総括班の情報連絡の円滑化i.メーリングリストの利用:領域の運営責任者(領域代表者、研究代表者、研究事務担当など)のメーリングリストを作成し、情報の円滑化に努めた。ii.ニュースレターをホームページに乗せ、情報の円滑化に努めた。2.各研究班の研究調整i.各計画研究班と協議し共通のデータベースの改良とデータ入力作成に努めている。ii.各計画研究班と協議し北極グリーンランド深層氷床コアの解析を継続している。iii.各計画研究班と協議し南極ドーム深層氷床コアの特定深度の解析を企画した。3.外部への情報発信i.ホームページを活用している。ii.ニュースレターで領域研究の概要を外部に発信した。iii.シンポジウムを開催し、各計画研究班の研究の進捗状況を極域研究に関心を持つ研究者に提示した。

4.国外連絡i.国外評価委員として昨年に引き続き、ディクレアー教授を招聘し今年度の進捗状況を論議した。ii.藤井理行(研究分担員)と本山秀明(研究分担員)を中国極地研究所に派遣し、中国の南極における観測地域のデータについて議論した。将来比較研究に発展させる予定である。氷床コア研究から地球科学情報として多様かつ豊富な知見を得るためには、研究方法論の異なる分野間の研究資料の共有性、現象認識に対する同一基盤の確立が必要である。本総括班では、時系列情報としての、氷床コア中の環境・気候指標シグナルの抽出と、コア年代の決定を基本研究課題としている。総括班会議を開催し、各計画研究班の解析進捗状況を確認し、各計画研究班が担当する基本解析の実施状況の把握と計画に沿った進行調整を行った。また各計画研究班と協議し基本解析データのデータベース化を進め、各計画研究班の境界領域の研究促進を計った。気候要素のなかでも最も基本的な量である気温を指標する酸素同位体組成から、3回の氷期・間氷期サイクルとそのコア中の深度を明らかにし、氷床コア作業年代の決定を行った.この結果に基づいて他の深層雪氷コアや海底コアとの比較が可能になった。領域研究の成果などについてニュースレターやホームページなどを作成し、情報の円滑化に努めるとともに、領域研究成果の概要を外部に発信した。ベルギー国ブリュッセル大学のディクレアー教授・コペンハーゲン大学のクラウセン教授とヨハンセン教授から研究成果に関する評価を受けた。ドームふじ深層コア国際シンポジウム(International symposium on Dome Fuji ice core and related topics)を開催し、国外より本分野の代表的研究者を招聘し、国内研究者とともにこれまでの領域研究の成果と各国のコア研究の取り組み状況について議論を深めた。また氷床掘削技術に関する国際ワークショップ(IDECH2000)を開催し、コア研究の研究基盤である掘削ドリルの開発状況の意見交換を行った.研究の進行に応じて各計画研究班の要望を集約し、両極域雪氷試料の配分を行うとともにその試料を用いた国際共同研究を推進してきた。以上各計画研究班の取りまとめを行った.氷床コア研究から地球科学情報として多様かつ豊富な知見を得るためには、研究方法論の異なる分野間の研究資料の共有性、現象認識に対する同一基盤の確立が必要である。領域研究の成果などについて英文報告書を作成し、情報の円滑化に努めるとともに、領域研究成果の概要を内外に発信した。研究の進行に応じて各計画研究班の要望を集約し、両極域雪氷試料の配分を行うとともにその試料を用いた国際共同研究を推進してきた。以上各計画研究班の取りまとめを行った.
糖尿病性血管障害に先行する血管内皮細胞障害のスクリーニング検査法と治療法の開発

日本において糖尿病は急増している。糖尿病は動脈硬化を促進するため、心筋梗塞や脳梗塞などの動脈硬化性疾患の原因となっており、主たる死因にもなっている。しかしながら、糖尿病による動脈硬化の初期病変の検出は困難なため、動脈硬化をターゲットにした初期治療は現在不可能である。本研究では、動脈硬化の初期病変である血管内皮細胞障害を放射光による微小血管造影法により検出し、その早期治療を行うことが可能であることを示した。本研究の目的は、脳梗塞や急性心筋梗塞などの基礎疾患となる動脈硬化の超早期病変である微小血管における血管内皮細胞障害の早期検出法を開発することである。そのために、微小細動脈における血管内皮細胞障害の可視化を微小血管造影法を用いて行う。ラット後肢における直径100μmの微小細動脈を可視化し、アセチルコリンに対する奇異性血管反応の描出が可能であること、奇異性血管収縮反応が動脈硬化のバイオマーカーよりも鋭敏な指標となること、微小細動脈の閉塞や血管内皮細胞障害が冠動脈や中大脳動脈の閉塞や狭窄、腎臓の糸球体障害に先行し生じること、を示そうとしている。本研究では、動物実験モデルとして2型糖尿病モデルであるOLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty)ラットとそのコントロールラットであるLETO(Otsuka Long-Evans Tokushima)ラットを用いて検討を行った。本研究で行った微小血管造影法では、直径30μmの微小細動脈を動画にて可視化することが可能であった。コントロールラットではアセチルコリンによる血管拡張反応が可視化され、糖尿病ラットでは、一見血管が拡張しているような微小細動脈においても、奇異性血管収縮反応が生じることを確認することができた。また、すでに報告されている動脈硬化のバイオマーカーである血液中高感度CRP値やIL-6値と比較しても、奇異性血管収縮反応は、それらの末梢血液中における上昇よりも先んじて出現することが確認できた。本年度は奇異性血管収縮反応が冠動脈や中大脳動脈の閉塞や狭窄、腎臓の糸球体障害に先行することの証明を行った。具体的には、微小細動脈における血管内皮細胞障害が冠動脈や中大脳動脈の閉塞や狭窄、腎臓の糸球体障害に先行して生じる事を証明するために16週齢及び32週齢のラットを用いてランゲンドルフ法を用いて、心臓及び腎臓の微小血管を描出し、狭窄や閉塞の有無を確認した。また、中大脳動脈の微小血管造影も行った。微小細動脈における血管内皮細胞障害は16週齢で認められ、冠動脈や中大脳動脈の狭窄や閉塞、腎臓の糸球体の大小不同などは32週齢で認められた、奇異性血管収縮反応が冠動脈や中大脳動脈の閉塞や狭窄、腎臓の糸球体障害に先行することが証明できた。奇異性血管収縮反応がバイオマーカーより鋭敏な指標となることを証明するため、4週齢、微小血管造影を施行する16週齢と32週齢に、CBC(全血球検査)と血糖値、クレアチニンやCKなどの血液生化学的検査に加え、動脈硬化のバイオマーカーである高感度CRPやIL-6などや血管内皮細胞障害マーカーとして報告されているカドヘリン陽性血管内皮細胞由来微小粒子(CD144-EMP)、トロンボモジュリン、フォン・ウィルブランド因子(von Willebrand factor,vWF)、などを測定した。その結果、奇異性血管収縮反応が各種バイオマーカーより早期に動脈硬化性病変を検出できることを確認した。本研究の目的は、近年急増している脳梗塞や急性心筋梗塞などの基礎疾患となる動脈硬化の超早期病変である微小血管における血管内皮細胞障害の早期検出法を開発し、動脈硬化性疾患の早期治療を行うための礎となる研究を行うことである。そのために、微小細動脈における血管内皮細胞障害の可視化を微小血管造影法を用いて行った。前年度までの研究で、1.微小血管造影法を用いることにより、心臓、後肢、腎臓、肝臓、大脳などの直径30μmの微小細動脈を動画にて可視化することが可能であること、2.糖尿病のコントロールラットであるフィッシャーラット、LETO(Otsuka Long-Evans Tokushima)ラットにおいて肢の指尖部の細動脈でアセチルコリン投与による血管拡張反応が生じることが可視化されること、3.フィッシャー+STZ投与ラットやOLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty)ラットなどの糖尿病ラットでは、肢の指尖部の細動脈で血管が拡張しているような傾向があるが、アセチルコリン投与により血管が収縮する奇異性血管収縮反応が生じること、4,動脈硬化のバイオマーカーである血液中の高感度CRP値やIL-6値と比較しても、奇異性血管収縮反応は、それらの末梢血液中における上昇よりも先んじて出現することなどが明らかとなった。本年度はこれらのデータを解析し、一部論文投稿を行った。予定通りに実験が遂行できたため。生理学、総合内科学、活性酸素学、高齢医学、放射線医学、栄養学、病態生理学ほぼ予定通りに研究は遂行されたので本年度はデータ整理と論文投稿を行う。

論文投稿の際に必要であれば追加実験も再考する。おおむね予定通りに研究を行うことができたが、血管内皮細胞障害が冠動脈や中大脳動脈の閉塞に先行することの証明が、十分な動物数を用いて検討できなかったため。動物飼育費を抑えることができたため。奇異性血管収縮反応が冠動脈や中大脳動脈の閉塞や狭窄、腎臓の糸球体障害に先行することの証明:微小細動脈における血管内皮細胞障害が冠動脈や中大脳動脈の閉塞や狭窄、腎臓の糸球体障害に先行して生じる事を証明するために16週齢及び32週齢のラットを用いてランゲンドルフ法を用いて、心臓及び腎臓の微小血管を描出し、狭窄や閉塞の有無を確認する。また、中大脳動脈の微小血管造影を行う。微小細動脈における血管内皮細胞障害は16週齢で認められるため、冠動脈や中大脳動脈の狭窄や閉塞、腎臓の糸球体の大小不同などが16週齢で認められず、32週齢で認められた場合には、奇異性血管収縮反応が冠動脈や中大脳動脈の閉塞や狭窄、腎臓の糸球体障害に先行することの証明となる。血管造影後には採血を行い、併せて大脳、心臓や腎臓などを摘出し、病理学的にも臓器障害の検討を行う。奇異性血管収縮反応がバイオマーカーより鋭敏な指標となることの証明:4週齢及び微小血管造影を施行する16週齢と32週齢に、CBC(全血球検査)と血糖値、クレアチニンやCKなどの血液生化学的検査に加え、動脈硬化のバイオマーカーである高感度CRPやIL-6などや血管内皮細胞障害マーカーとして報告されているカドヘリン陽性血管内皮細胞由来微小粒子(CD144-EMP)、トロンボモジュリン、フォン・ウィルブランド因子(von Willebrand factor,vWF)、などを測定し、奇異性血管収縮反応が各種バイオマーカーより早期に動脈硬化性病変を検出できることを明らかにする。上記従来の研究計画に加え、血管内皮細胞障害が冠動脈や中大脳動脈の閉塞に先行することの証明も追加して研究を行う。データ整理には論文校正と画像データ解析のために特殊技術を要するため補助となる人件費代を追加して計上する。画像解析ソフトなどの購入も検討する予定である。血管内皮細胞障害が冠動脈や中大脳動脈の閉塞に先行することの証明が、十分な動物数を用いて検討できなかったため。実験動物代となる消耗品代やその他に加え、十分な動物数をこなすため補助となる人件費代を追加して計上する。
減圧式UASBによる下水の嫌気性処理に関する研究

本研究では、嫌気性微生物処理の処理水質向上を目指し、最初沈殿池越流水を対象として減圧式上向流嫌気性スラッジブランケット(UASB)型リアクターによる下水処理実験を実施した。また、後処理として栄養塩類除去実験も実施し、トータルシステムとしての検討を行った。UASB型リアクターは容積7.9Lで、そのうち1系列目は対照系、2系列目は微量金属添加系、3系列目は減圧運転系(約0.08MPa)とした。水温930°C、滞留時間2時間前後で数ヶ月間運転した結果、流入水水質の変動の大きさ、リアクター内に蓄積した汚泥の突発的な流出などもあり、処理方式間の差を判断しづらかったものの、対照系に比較して減圧素および微量金属系では平均処理水質が優れていた。このような短滞留時間ではUASBは浮遊物質除去装置として主に機能し、減圧系および微量金属系は脱気や凝集作用により汚泥浮上を抑制しやすいと考えられた。循環式硝化脱窒と鉄材を用いた脱りんを組み合わせた後処理は、無酸素ろ床(容積5L、容積の30%相当のスポンジ担体)、好気タンク(同10L、鉄製金網1kg)および沈殿池(同6L)からなるものであった。滞留時間は無酸素ろ床約2時間、好気タンク約4時間で、循環量は約100%、返送汚泥量は約50%、好気タンクDO濃度は23mg/Lになるように調節し、汚泥の引き抜きはほとんど実施しなかった。84日間の実験の結果、水温は27°Cから7°Cまで低下したが、好気タンクの処理水質はBOD、TOCおよびSSがほとんどの場合10mg/L以下と良好であった。水温が低くなるとNH_3-Nが増える傾向にあったものの、ほぼすべての分析についてT-N10mg/L以下、T-P1mg/L以下が達成された。嫌気性微生物処理が適切な後処理プロセスと組み合わされることによって、有機物のみならず窒素・りんの同時除去が可能なことが実証されたと思われる。本研究では、下水の最初沈殿池越流水を対象とし、上向流嫌気性スラッジブランケット(UASB)型リアクターによる処理実験をほぼ1年間にわたって実施し、低濃度排水の嫌気性微生物処理の可能性について検討した。UASB型リアクターには直径10cm、容積約8Lのアクリル樹脂製のものを3基用い、種汚泥には産業排水の実規模UASBから得られたグラニュールを約6L使用した。リアクター温度およびpHの制御は行わず、水理学的滞留時間HRTは、春から秋にかけては約2時間、水温の低下した秋から冬にかけては約4時間を採用し、後半の負荷量を半減させた。3基のリアクターは、1)コントロール系、2)微量金属系および3)減圧系と条件を変え、減圧操作の有無および微量金属添加の有無の影響を検討した。圧力については、高濃度排水について効果が明らかになっている約0.08MPaを採用した。また、微量金属については、Takashima and Speece (1989)の結果を参考にFe:0.008mg/L、Ni:0.0014mg/L、Co:0.0011mg/L、Zn:0.007mg/Lとなるような混合液で添加した。

実験の結果、HRT2時間で運転した実験前半では、コンロトールに比較して減圧系および微量金属添加系では若干だが処理水質が優れていた。減圧系の場合には脱気による反応効率の改善と汚泥流出の抑制、微量金属系の場合には微生物活性化と金属による凝集作用が考えられた。その後の滞留時間を長くした実験後半では、最初沈殿池越流水中のSS濃度が種々の理由で高まったこともあり3条件の間で明確な差が認められず、ほとんどろ過作用によって処理水質が決まったと考えられた。したがって、高負荷条件時ほど減圧や微量金属の効果が出やすく、これらの運転方法を採るメリットが生まれると推察された。本年度は、嫌気性微生物処理を組み合わせた都市下水の有機物・窒素・りんの同時除去について実験的に検討した。下水の最初沈殿池越流水を処理対象とし、嫌気性微生物処理にはアクリル樹脂製、容積約8Lの上向流嫌気性スラッジブランケット(UASB)型リアクターを3基用い、種グラニュール汚泥には昨年度使用していたものをそのまま継続して使用した。リアクター温度およびpHの制御は行わず、水理学的滞留時間HRTは実験前半は約1時間、水温が低下した実験後半は約2時間を採用した。前年度と同じように、3基のリアクターの条件をそれぞれ1)コントロール系、2)微量金属系(Fe:0.008mg/L、Ni:0.0014mg/L、Co:0.0011mg/L、Zn:0.007mg/L)、3)減圧系(圧力約0.08MPa)と変えることによって、減圧操作の有無および微量金属添加の有無の影響を検討した。実験の結果、コンロトールに比較して減圧系および微量金属添加系では若干だがSS除去能力に優れ、処理水質の優れていたことが多かった。UASB型リアクターの処理水は、無酸素槽+好気槽によって有機物、窒素およびりんの仕上げ処理を行った。無酸素槽は容積5Lでスポンジ担体(ポリウレタン製12x12x15mm)を全槽に充填してある上向流型固定床であり、好気槽は容積10Lの浮遊型活性汚泥法に鉄製金網(約1,000g)を充填したものである。滞留時間は無酸素槽約2時間、好気槽約4時間で、好気槽混合液の無酸素槽への循環は約200%、返送汚泥量は約50%に設定した。水温277°Cの間で84日間運転したところ、処理水のT-N10mg/L、T-P1mg/Lをほとんどの期間で達成できた。嫌気性微生物処理は、メタンガスとして下水の有するエネルギーを回収できるというメリットを持つものの、窒素・りんの富栄養化物質を除去できないという欠点を有していた。しかしながら、適切な処理方式を組み合わせることによって、都市下水についても有機物・窒素・りんの同時除去が可能なことが本研究で実証されたと思われる。
回折点光源・位相シフト干渉法を応用した平担面の超高精度絶対形状計測法の検討

PS-PDIは計測の基準面が球面であるために、直接の計測対象は球面形状あるいは、球面に非常に近い非球面形状に限られる。しかし、非常に高精度の計測が要求されるのは球面ばかりではなく、平面、放物面、双曲面など様々な形状にわたっている。ただし、このような任意の形状に対してPS-PDI装置を適用するのは簡単なことではない。我々は、まずPS-PDIによって形状を計測した凹面鏡を用いて、比較的簡単な光学系によって平面の形状を得ることができる新たな計測法を評価した.球面を計測する際の光学系に平面ミラーを挿入した光学系によって干渉縞を得た。球面形状の計測の際と同様に、光源側で位相シフトさせ、この干渉縞を解析する。これによって得られた位相情報は、球面ミラーの形状情報に平面ミラーの形状情報が重畳した数値であるから、この位相情報から球面ミラーの形状を差し引くことによって平面ミラーの形状が得られると考えた。ただし、この時注意しなければならないことが2点ある。それは次の通りである。(a)球面ミラーの形状は平面における反射のために干渉縞中には左右反転して含まれることになるため、差し引く際には球面ミラーの形状を左右反転して差し引かなければならない。(b)平面ミラー上では波面が2回反射するため、球面形状を差し引いて得られた形状をさらに1/2した形状が平面ミラー形状の絶対値である。われわれは,あらかじめ±300nmの精度で計測した直径50mm、曲率半径1000mmの球面ミラーを用いて、およそ直径35mm程度の広さの平面形状を計測した。なお、この平面は市販のアルミ平面ミラー(直径80mm、面精度λ/20)であった。計測結果は,面精度λ/10程度を示した.これは,形状値の誤差を解析したところ,干渉縞に平行な成分の誤差が依然として残っており,干渉計の防振対策が最終的に高精度計測のキーポイントであることに変わりなく、アクティブダンパーなどの採用が今後の課題として残った.光源側での位相シフト実施による凹面鏡形状計測の実施により,計測値のふらつきのヒストグラムのピークが0.6nm付近になり,これまでの計測結果ではベストな値を得た.大型鏡の高精度計測が実現できれば,これを基準面とした平坦面計測が可能となるわけで,大きな前進である.形状値のRMS値に至っては,0.35nm程度を示しており,0.35/632.8(5/904)λλ/180程度の再現性を示している.直径20cmのミラーについて,計測の再現性がrms値で2nmを幾分切るところまで来た.具体的には,光源となるファイバの固定をしっかりし始めたことによる高剛性化の影響と考えている.このファイバ固定にはまだ検討の余地があり,さらに振動の影響を抑える工夫を進める.再現性の向上に伴い,現状ではミラー全面を500ピクセル四方のCCDで撮影することから,データの横分解能が200mm÷500=0.4mm=400μmと低い点についての検討に入った.具体的には,CCDカメラに取り付けたカメラレンズのズーム機能を使うことで,ミラーの一部分=干渉縞の一部分を拡大撮影することで,横分解能を高められないか検討している.現状のカメラレンズのズームでは,ミラーの半径を画面一杯に映す程度までしか拡大できず,分解能は200μmまでしか上がらないことが分かった.さらにミラーの一部にズームするテストとして,接写リングの挿入を試みており,5-10mm程度の厚みのリングを使えば,さらなる空間分解能の向上が期待できると考えて,試験中である.さらに,計測後の修正加工を視野に入れて,凹面鏡を,母材であるガラス面の状態で計測することを実施するため,蒸着面の剥離を行なった.このミラー簿材のホルダーへの取り付け時に,母材とホルダーとの形状の不一致があり,母材にだいぶ応力がかかる(これまでかかっていた)ことが確認され,支持方法を改良する固音とした.具体的には,母材の3点支持の各点に直径1mm程度の鋼球を挟み,点で支持することでモーメントの懸かりを極力抑えた.さらに,干渉縞撮影用のカメラレンズ系に接写リングを挿入し,母材の一部をズームアップして計測する方法を検討し,基本的に可能なことを確認した.PS-PDIは計測の基準面が球面であるために、直接の計測対象は球面形状あるいは、球面に非常に近い非球面形状に限られる。

(b)平面ミラー上では波面が2回反射するため、球面形状を差し引いて得られた形状をさらに1/2した形状が平面ミラー形状の絶対値である。われわれは,あらかじめ±300nmの精度で計測した直径50mm、曲率半径1000mmの球面ミラーを用いて、およそ直径35mm程度の広さの平面形状を計測した。なお、この平面は市販のアルミ平面ミラー(直径80mm、面精度λ/20)であった。計測結果は,面精度λ/10程度を示した.これは,形状値の誤差を解析したところ,干渉縞に平行な成分の誤差が依然として残っており,干渉計の防振対策が最終的に高精度計測のキーポイントであることに変わりなく、アクティブダンパーなどの採用が今後の課題として残った.
植物性染色体を利用した重イオンビーム照射による染色体切断機構とLET効果の解析

植物Y染色体を標的として、重イオンビームが引き起こす突然変異を検出した。雌雄異株植物ヒロハノマンテマのY染色体に変異を生じ性転換した変異体を、γ線照射で5個体、重イオンビーム照射で15個体単離した。Y染色体の変異領域を解析するための新規STSマーカーを4つ構築した。17種類のSTSマーカーを用いて変異領域を解析したところ、重イオンビームで生じる変異はγ線に比べて小規模である傾向が見られた。重イオンビーム照射技術の更なる効率化のため、線エネルギー付与(LET)や植物の状態が変異誘発に与える影響を調査する。本課題では、照射当代で変異選抜ができる植物Y染色体を標的として突然変異を検出する。ヒロハノマンテマY染色体変異誘発の高率化・雌雄異株植物ヒロハノマンテマ吸水種子に対する生存曲線を求め、Cイオンビーム(LET=22.5keV/μm)とFeイオンビーム(LET=640keV/μm)の適正線量がそれぞれ4Gy、10Gyであることを明らかにした。Cイオンビーム照射区から無性花変異体3個体と両性花変異体1個体を、Feイオンビーム照射区から両性花変異体を1個体得た。しかし、吸水種子照射では、乾燥種子照射にくらべてキメラ変異の程度が強く、性転換変異体の固定が困難であった。現在、花粉照射の条件検討を進めている。パパイアのY染色体変異誘発の高率化ゲノム解読が進んでいるパパイアのY染色体の変異誘発を行った。乾燥種子にCイオンビームを段階照射し、適正線量が100Gyであることを明らかにした。効率的に選抜を行うため、照射個体は発芽後Y染色体マーカーを用いてPCRを行い、Y染色体をもつ個体のみを栽培した。現在、変異体選抜を進めている。Y染色体による性発現制御機構の研究:ヒロバノマンテマのSUPERMANホモログS1SUPがメス特異的に発現することを発見した。S1SUPをシロイヌナズナで過剰発現させると雄蕊(♂)の伸長が抑制され雌花様の形態を示した。Y染色体がS1SUP発現を制御してオス化するというモデルが示唆された。重イオンビーム照射が染色体突然変異に与える影響を調査するため、照射当代で変異選抜ができる植物Y染色体を標的とした突然変異検出を試みている。ナデシコ科のヒロバノマンテマ(Silene latifolia)はXY型の性染色体をもっており、Y染色体があると雌蕊(♀)が抑制され、雄蕊(♂)が発達したオスの単性花(雄花)になる。重イオンビームを照射して、雄蕊(♂)と雌蕊(♀)の両方が発達する両性花変異体や雄蕊(♂)も雌蕊(♀)も発達しない無性花変異体を誘発することにより、Y染色体に生じた変異を効率よく解析できる。前年度まで乾燥種子照射と吸水種子照射を行い、性転換変異体を選抜したが、キメラ変異体が多く変異の固定が困難であった。本年度は、キメラ変異を除くため花粉照射実験を行った。花粉にCイオンビーム(LET=22.5keV/μm)をOGyから200Gyまで段階照射し、花粉発芽培地での花粉管伸長と人工授粉後の捻率を測定し、適正線量が20Gyであることを明らかにした。照射花粉を受粉して得たM_2世代の花の形態を調査し、無性花変異体を3個体、両性花変異体を3個体、さらに薬の開裂阻害変異体を1個体得た。一方、Y染色体の塩基配列情報の収集を目的として、ヒロバノマンテマのBACライブラリーをY染色体特異的STSマーカーでスクリーニングして得た10個のY染色体由来のBACクローンを高速シーケンサー454 Titaniumで解析した。Y染色体にはレトロトランスポゾンが高頻度に蓄積していた。現在、配列情報からFISH解析のプローブに適した配列を抽出している。重イオンビームは高い線エネルギー付与(LET)をもち、飛跡に沿って高密度な電離作用を及しDNA二重差切断を高い確率で引き起こす。本課題では、重イオンビームが染色体レベルの突然変異に与える影響を調べるため、照射当代で迅速に変異選抜ができる植物Y染色体を用いた解析を行った。雌雄異株植物ヒロハノマンテマのY染色体には雌蕊(♀)の発達を抑制する領域(GSF)と雄蕊(♂)の発達を促進する領域(SPF)、葯の発達を促進する領域(MMF)がある。GSFを欠損すると雄蕊(♂)も雌蕊(♀)もつけない無性花変異体に、SPFを欠損すると雄蕊(♂)と雌蕊(♀)とをつける両性花変異体に、MMFを欠損すると葯が裂開しない変異体が出現する。本年度は、γ線、炭素イオンビーム、鉄イオンビーム照射による変異誘発を行った。

(1)ヒロハノマンテマ花粉照射では、γ線では40Gy、炭素イオンビームでは20Gy、鉄イオンビームでは4Gyが変異選抜に最適であることを明らかにした。(2)計2,500個体をスクリーニングし、無性花変異体を8個体、両性花変異体を12個体単離した。(3)Y染色体欠失をFISHで検出するため、Y染色体の配列情報からFISHプローブを単離する目的で10個のY染色体由来のBACクローン(合計1Mb)の配列を決定した。しかし、それらの大部分が反復配列であり、FISHでは全染色体にシグナルが得られた。唯一、Y染色体上の遺伝子SlAP3Yの周辺領域がプローブ化でき、FISHにより遺伝子の位置をマップすることができた。(4)17種類のY染色体特異的STSマーカーを用いて変異体シリーズの欠失領域の大きさを比較した。その結果、重イオンビームは低LET線であるγ線よりも植物Y染色体では欠失サイズが小さい傾向がみられた。