hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
局所脳冷却による大脳神経生理機能の解明と制御-臨床応用をめざして-

本研究は「温度による脳機能の制御:Thermal neuromodulation」という新たな治療パラダイムを構築し、難治性てんかんだけでなく、難治性疼痛,重傷頭部外傷および脳卒中などの治療に局所脳冷却を応用することを目的とした。てんかん重積発作の抑制は15°C20°Cの脳冷却で認められた。冷却時の脳血流は低下、代謝面ではグルタミン酸が減少、脳保護作用も示唆された。また脳冷却による組織学的影響は認められなかった。てんかん患者においても術中に1520°Cで脳冷却した結果、異常放電の抑制が確認された。さらに脳冷却により侵害受容性疼痛が抑制されることが明らかとなった。今後体内埋め込み型の冷却装置の開発により種々の神経難病が治療できる可能性が示唆された。本研究では、脳の機能情報解析や治療における手段を「電気」から「温度」ヘパラダイムシフトさせることをゴールとする。具体的には、(1)脳の「機能情報」、「循環・代謝」パラメーターの温度による変化を総合的に理解する、(2)冷却による脳保護閾値を解明し、新たな治療法を開発、(3)「温度」(冷却)による脳機能情報制御法の開発と臨床応用を目的とする。まずペルチエ素子からなる局所脳冷却装置を試作した。(1)ラットを全身麻酔下に開頭を行い、脳表(運動野)に冷却装置、温度計プローブを留置。脳表を-5°C、0°C、5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、36°C(control)の温度で1時間冷却後閉頭。冷却後の運動機能評価及び冷却部皮質の組織学的検索を行った。その結果-5°C冷却時にのみ運動障害および組織損傷を認めた。今後はグルコース代謝測定や運動関連電位や体性感覚電位などの神経生理学的検査をおこない、正常脳組織への影響をさらに研究する。(2)ラットを全身麻酔下に、皮質または海馬に冷却装置・温度計および脳波電極を設置する。カイニン酸を注入してんかん放電(ED)を誘発、冷却によるED抑制効果を検討した。その結果、温度制御システム、放熱装置、脳波解析システムを組み込むことで、EDを感知するとともに冷却が行われ、EDの抑制が確認された。今後は頭部外傷モデルおよび脳虚血モデルを用い、局所脳冷却の保護効果を検討する。さらに臨床において、てんかん症例でもてんかん発作抑制効果の有無を検討する。(3)脳腫瘍の覚醒下手術に際し、不可逆的変性を来さない温度まで脳表を冷却させ、運動野、言語野の局在が同定できるか否かについて今回開発した冷却装置を用い検討する。1.冷却装置の開発:大脳冷却実験に対応できるような冷却装置、神経外傷および脳虚血に対する保護効果を研究する冷却装置を試作,また手術時に使用する脳機能マッピング用冷却装置を試作した。局所脳冷却が正常脳機能に及ぼす効果(神経症候、神経生理、病理、脳循環代謝からの評価):成長雄ラットを全身麻酔下に開頭、脳表(運動野)を-5°C、0°C、5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、36°C(control)の温度(n=5)で1時間冷却し、運動機能および組織学的変化を検討した。結果は-5°C群においてのみ運動機能障害および不可逆的組織変化が認められたが、0°C以上では異常を認めなかった。また冷却後に行った体性感覚誘発電位検査では15°C以下において有意な潜時延長が認められた。3局所脳冷却の臨床てんかんへの応用:山口大学医学部倫理審査委員会の承認を得た後、難治性てんかんの手術に際し、冷却前後における脳表温および脳波の変化について検討した。慢性硬膜下電極留置によりてんかん原性域を同定、焦点切除術を施行する際、切除範囲内にペルチエ素子からなる冷却装置(冷却面40×40mm、厚さ4mm)および脳波記録用針電極を設置した。冷却装置に1Aの電流を流すと、脳表温は2分後に20°Cまで低下した。それに伴い冷却前に認められたてんかん性放電は著明に抑制され、抑制効果は復温後もしばらく持続した。同時に測定され脳血流量および神経伝達物質に関しては、冷却中の脳血流量低下、グルタミン酸および乳酸の低下が確認され,てんかん放電の抑制に関与していることが示唆された。4脳損傷治療への応用:頭部外傷および脳虚血における局所脳冷却の保護効果を検討するため、成長雄ラットを全身麻酔下に、percussion法により頭部外傷モデルを作成した。

脳損傷を加え,損傷部脳表を10°C、15°C、20°C、3時間局所冷却、1週間後に弾頭、脳損傷の範囲を組織学的に検討した。現在データを解析中である。本研究は「温度による脳機能の制御:Thermal neuromodulation」という新たな治療パラダイムを構築し、難治性てんかんだけでなく、治療困難な難治性疼痛,重傷頭部外傷および脳卒中などの中枢神経の治療に局所脳冷却を応用することを目的とした。1.冷却装置の開発てんかん治療用冷却装置はべッドサイド型と完全埋め込み型の2種を試作した。前者は緊急治療が必要なてんかん重積発作を対象とし、頭蓋開頭後に柔軟なパウチ型冷却部を設置後ベッドサイドで発作を抑制する目的で開発、後者はてんかん焦点に冷却部を埋め込み、患者の自由行動を妨げずに発作を抑制する目的で開発した。動物用に試作した冷却装置を用い以下の結果が得られた。てんかん重積発作の抑制は脳表の15°C20°Cの冷却で認められた。冷却時の脳循環は低下したが、代謝面ではグルタミン酸が減少し脳保護作用が示唆された。神経学的には15°C冷却で感覚・運動機能の低下が軽度生じた以外に影響はなかった。また冷却装置を埋め込み,1カ月間連続して20°Cに冷却したが、軽度のグリオーシス以外に組織学的影響は認められなかった.ヒト埋め込み型冷却装置を用い山口大学倫理委員会の許可を得て臨床実験を行った。難治性てんかん患者のてんかん焦点部位を術中に1520°Cで冷却した結果、異常脳波の抑制が確認された。グルタミン酸が減少し脳保護作用がみられ、心電図、血圧にも異常は認められなかった。2.難治性疼痛への効果本年度は脳局所冷却の疼痛に対する緩和効果を検討した。オスラットSI-MI野を局所的に冷却した時の疼痛抑制効果を調べた。侵害受容性疼痛の評価は52°Cの熱刺激を上下肢に与えた際の逃避行動の潜時測定にて行った。結果は脳表の15°C冷却により右上下肢と比較し左上下肢に潜時の有意な延長が観察され、脳の直接冷却により侵害受容性疼痛が抑制されることが証明された。
密度汎関数法によるゼオライト触媒の電子構造と反応性に関する研究

Cuイオン交換ZSM-5触媒によるNO分解反応の機構を調べるため、ZSM-5の結晶構造から切り出した4つのモデルに基づいて、密度汎関数法による計算を行った。このうちSi2原子をAl2原子で置き換えた6員環モデルにCu1原子を入れた場合は,予想通りCuが2価のイオンになるためNOは吸着しないが、2原子を入れたモデルでは吸着する。しかし、Cu^<+1>価イオンはd^<10>電子配置であるため、そのダイマー構造は不安定であり、強い立体規制がないと反応中に分解してしまう。立体反発の高いエネルギー状態においては、2NO→N_2+O_2の分解反応をシミュレーションすることができた。このモデルを改良するために“余分の(extra)"酸素原子をダイマー構造に配位させたモデルを考えた。この酸素原子がCu^<+1>ダイマーから電子を取り去ることによりダイマー構造は安定化されることが確かめられた。ZSM-5の結晶構造をそのまま用いた周期モデル計算を行うために、プログラムの修正、拡張を行った。基本的方法は巨大な単位胞を用いた、Г点での1点計算であり、最近接の単位胞(3次元では27個)との相互作用のみを考慮する。メモリおよび使用ディスク容量を節約するようにプログラムの書き換えを行った。さらに、計算の規模を小さくするために基底関数系の選択などを行った上で、ZSM-5結晶の単位胞(288原子)を用いた計算を行い、状態密度や原子上の電子密度などを情報を得た。
新しいタイプのGタンパク質共役受容体の機能解析

Gタンパク質共役受容体(G protein-coupled receptor, GPCR)の中には、そのリガンドが不明のオーファン受容体が未だ数多く存在する. Adhesion GPCRに属するGPR56もオーファン受容体であり、ヒト大脳皮質形成および細胞のがん化に関与することが示唆されているが、その機能やシグナル伝達はほとんど不明であり、その解析を行った.その結果、アゴニスト様に働く抗GPR56抗体の作成に成功し、その抗体を用いてGPR56がGタンパク質のG12/13からRhoを介する経路を活性化して、神経前駆細胞の遊走に対して抑制的に働くことを明らかとした.Gタンパク質共役受容体(G protein-coupled receptor, GPCR)の中には、そのリガンドが不明のオーファン受容体が未だ数多く存在する. Adhesion GPCRに属するGPR56もオーファン受容体であり、ヒト大脳皮質形成および細胞のがん化に関与することが示唆されているが、その機能やシグナル伝達はほとんど不明であり、その解析を行った.その結果、アゴニスト様に働く抗GPR56抗体の作成に成功し、その抗体を用いてGPR56がGタンパク質のG12/13からRhoを介する経路を活性化して、神経前駆細胞の遊走に対して抑制的に働くことを明らかとした.細胞膜を7回貫通する構造を特徴とするGタンパク質共役受容体(G protein-coupled receptor, GPCR)は、ホルモン、神経伝達物質、光、匂いなど数多くの細胞外シグナルを認識して、そのシグナルを細胞内へ伝える重要な役割を担っている。ゲノム解析から、ヒト全遺伝子の数%を占める1000近いメンバーからなるGPCRスーパーファミリーの存在が明らかとなったが、そのうちリガンドが不明のオーファン受容体が200以上残っている。オーファン受容体の中にAdhesion GPCRと呼ばれる一群のファミリーが見出され、その中の一つGPR56が大脳皮質形成に関与することが示唆されている。本研究では、この新しいタイプのGPCRであるGPR56の構造と機能の解明を目指して研究を実施した。まずGPR56の細胞外ドメインをSf9/昆虫細胞発現系を用いて調製したのち、それを抗原として抗体を作成した。一方GPR56を過剰発現させるアデノウイルス、およびGPR56をknock downさせるためのsmall hairpin GPR56 RNA発現アデノウイルスを構築した。抗GPR56抗体を用いてGPR56タンパク質の発現を組織、細胞レベルで調べたところ、神経幹細胞、神経前駆細胞の細胞膜表面に細胞外領域の膜近傍にあるGPSドメインで切断を受けた成熟フォームとして存在していることが明らかとなった。また、GPR56が3量体Gタンパク質G12/13を介して低分子量GTP結合タンパク質Rhoの活性化、そしてアクチンフィラメントの再編成、SRE、NF-kBを介した転写を活性する能力を有することが判明した。実際に、神経前駆細胞を用いた実験から、GPR56がG12/13-Rhoのシグナル経路を介して神経前駆細胞の遊走を負に制御することが明らかとなった。さらに調製した抗GPR56抗体がリガンドの代役となるアゴニスト活性を有する機能抗体であることを見出した。このようにオーファンGPCR受容体に対してアゴニスト様に働く抗体作成が有用であることが初めて明らかにしたことは、今後のGPCRの研究およびGPCRを標的とした創薬に大きな貢献を与えるものと思われる。Gタンパク質共役受容体(GPCR)は数多くの細胞外シグナルを認識して、そのシグナルを細胞内へ伝える重要な役割を担っている。ゲノム解析からヒト全遺伝子の数%を占める1000近いメンバーからなるGPCRファミリーが明らかとなったが、そのうちリガンド不明のOrphan受容体が200以上残っている。Orphan受容体の中にAdhesion GPCRと呼ばれる一群のファミリーが見出され、その中の一つGPR56が大脳皮質形成に関与することが示唆されている。本研究では、このGPR56の構造と機能の解明を目指した。まずマウスGPR56の細胞外ドメインを抗原としてウサギに免疫し抗体を作成した。またGPR56を過剰発現させるアデノウイルス、knock downさせるためのshRNA発現アデノウイルスを構築した。抗GPR56抗体を用いて調べたところ、神経前駆細胞の細胞膜表面にGPSドメインで切断を受けた成熟フォームとしてGPR56が存在していることが明らかとなった。また脳構造異常を示すGPR56変異体はいずれも細胞膜へ移行せず細胞内で貯留していた。またGPR56がG12/13を介してRhoの活性化、そしてアクチンフィラメントの再編成、SRE、NF-κBを介した転写を活性化する能力を有することが判明した。さらにGPR56がG12/13-Rhoのシグナル経路を介して神経前駆細胞の遊走を負に制御することが明らかとなった。また抗マウスGPR56ポリクローナル抗体がリガンドの代役となるアゴニスト活性を示す機能抗体であることを見出した。抗ヒトおよび抗マウスGPR56モノクローナル抗体も作成して、それらが機能抗体として働くかどうか検討を進めている。またリガンドをマウス胎児脳を出発材料としたアフィニディカラムによる精製とMass解析から検索し、いくつかの候補分子を同定した。
骨置換型アパタイトセメントへのアプローチ

本研究は、より迅速に骨と置換するアパタイトセメントの開発の可能性を検討したものである。アパタイトセメントが骨に置換するためにはアパタイトセメントの吸収過程と骨形成過程が必要であるため、まずアパタイトセメントの吸収に関して検討を行った。従来型アパタイトセメント、迅速硬化型アパタイトセメント、非崩壊型アパタイトセメント硬化体ディスク上で破骨細胞を培養すると、対照として用いた焼結体アパタイトには全く吸収窩が形成されないのに、アパタイトセメントの場合は吸収窩が形成された。しかし吸収窩の面積は皮質骨ディスクと比較して小さく、骨置換には相当の期間がかかることがわかった。なお、アパタイトセメントの種類に依存した吸収窩面積の差異は認められず、いずれのアパタイトセメントも同様な速度で骨と置換すると考えられた。次にアパタイトセメントの骨置換速度を増大させる目的でアパタイトセメント内に炭酸イオンの導入を試みた。炭酸源として炭酸水素ナトリウムを添加するとアパタイトセメント硬化体はBタイプの炭酸アパタイトになった。炭酸イオンの添加量が6%の場合に破骨細胞による吸収活性は2倍となり最大値が得られた。一方、アパタイトセメントの機械的強さは炭酸イオンの導入に伴い低下することがわかった。アパタイトセメントは組成がアパタイトになるため骨伝導性が期待でき、吸収窩形成の後には骨が形成されると考えられる。そこで、骨伝導性の程度に関しては骨芽細胞の増殖および分化をマーカーとして細胞レベルでの検討を行った。その結果、アパタイトセメントは骨芽細胞の増殖には影響を及ぼさないものの、骨芽細胞の初期、分化、中期分化、後期分化のマーカーとして測定したI型コラーゲン、アルカリフォスフォターゼ、オステオカルシンの全ての値が、細胞培養用プラスティックシャーレはもとより、焼結体アパタイトと比較しても有意に大きな値を示した。したがって、アパタイトセメントは骨芽細胞の分化を促進することがわかった。以上の結果から、より迅速に骨と置換するアパタイトセメントの開発は可能性が高く、学術的にも興味深い知見が得られる可能性が極めて高いと結論した。本研究は、より迅速に骨と置換する骨置換型アパタイトセメントの調整を目的としたものである。これまでのアパタイトセメントの骨置換に数年という長期間が必要とされていたのは破骨細胞によるアパタイトセメントの吸収が律速段階にあると仮定し、アパタイトセメントの硬化体を、より破骨細胞に吸収されやすいと考えられる炭酸アパタイトに誘導し、試作したアパタイトセメントの骨置換速度を実験動物を用いて検討する。本年度は、実験計画の初年度として、1)アパタイトセメントの調整、2)試作炭酸含有アパタイトセメントの特性評価を計画していた。1)アパタイトセメントの調整に関しては、炭酸水素ナトリウムをアパタイトセメントの粉末部および混和液に導入し、調整できることを確認した。2)試作炭酸含有アパタイトセメントの特性評価に関しては、アパタイトセメント硬化体の組成分析、硬化時間の測定、機械的強さの測定、を行った。粉末X線回折の結果から、炭酸水素ナトリウムを添加したアパタイトセメントの基本構造はアパタイトであることがわかった。赤外分光法による分析から形成されたアパタイトは骨類似のBタイプ炭酸含有アパタイトであることがわかった。またガスクロマトグラフによる分析により、アパタイトセメント硬化体に含有される炭酸量は導入した炭酸量の一部であることがわかった。

セメントの硬化時間(ビカ-針法)は炭酸基の導入量に伴い、遅延し、また、硬化体の機械的強さは低下することがわかった。本研究は、より迅速に骨と置換する骨置換型アパタイトセメントの開発を目的とし、その第一段階としてアパタイトセメント硬化体を炭酸アパタイトに誘導した場合におけるアパタイトセメントの挙動を検討するものである。本年度はpHスタットを用い、破骨細胞が形成するラッフルボーダー内部の低pH環境を疑似した条件でセメント硬化体の溶解挙動を検討するとともに、破骨細胞を用いて細胞培養条件でのセメント硬化体の吸収性の検討を行うとともに、実験動物に試作セメントを埋入した。ラッフルボーダー内の低pH環境を疑似した条件におけるセメント硬化体の溶解挙動については、セメント硬化体内部への炭酸基の導入量の増大に伴い、溶解速度が増大した。したがって、炭酸基の導入は基本的には破骨細胞によるセメント硬化体の吸収過程を促進することが確認された。次のステップとして破骨細胞によるセメント硬化体の吸収性を検討したが、セメント硬化体作製時における気孔形成が避けられず電子顕微鏡観察では吸収窩洞と気孔との判別が困難であり、アパタイトセメント中の炭酸基導入量と破骨細胞の活性の相関性は確認できなかった。動物実験は現在も進行中であるが、ラット脛骨に炭酸基導入量6%のアパタイトセメントを埋入した場合に、コントロール(炭酸基を導入していないアパタイトセメント)と比較して術後8週の時点でより多量の骨がセメント硬化体内部に認められた。しかし、埋入期間が短いという要因があるもののコントロールと比較してもセメント硬化体と骨との置換にはオーダー的な差異は認められず、アパタイトセメントの骨置換をオーダー的に加速するにはセメント硬化体の炭酸基誘導のみでは困難であると考えられた。アパタイトセメントの骨置換速度の飛躍的増進のために次年度以降はセメントの炭酸アバタイトへの誘導と骨誘導因子との複合化等について検討する必要があると結論した。本研究は、より迅速に骨と置換するアパタイトセメントの開発を目的としたものである。本年度は炭酸アパタイトを形成するアパタイトセメントに関して検討を行った。具体的には炭酸水素ナトリウムの添加がアパタイトセメント及ぼす影響を検討した。CHNコーダーを用いてアパタイトセメントに導入された炭酸基量を分析すると、添加された全量の炭酸基がアパタイトセメントに導入されているわけではないが、炭酸水素ナトリウムの添加に伴い、形成されるアパタイトセメント中の炭酸基量が増大することがわかった。アパタイトセメント硬化体を粉末X線回折装置および赤外分光光度計にて分析した結果、アパタイトセメント硬化体はアパタイトに変換しており、アパタイトのリン酸基カラムを炭酸基が置換していることがわかった。すなわち、ヒトの骨アパタイトと同様のBタイプ炭酸アパタイトが形成されていることがわかった。アパタイトセメント硬化体の機械的強さを間接引張強さを指標として検討したところ、炭酸基の添加に伴い、硬化体の機械的強さが低下するこがわかった。
琉球孤一東シナ海の電磁気学及び熱的構造に関する研究

1990年、1991年、1992年と3回にわたり、沖縄トラフ全体にわたる電気電導度構造を求めるための海底電位磁力計による調査、地殻熱流量の測定、海底地震計ーエアガンの地震探査、海上での地磁気測定(3成分異常測定を含む)と古地磁気学調査が行われた。それぞれの結果から、次のように結論をまとめられる。1。10Maから4Maの間に琉球列島が時計回りに約19°回転した。このとき沖縄トラフが開いたとしたら、地磁気異常島模様が存在しない事から、海洋底拡大では無い拡大様式で開いた考えられる。中部沖縄トラフは回転ではなく平行移動したと考えられるが、北部沖縄トラフについては今回の研究では結論がでなかった。2。海洋底拡大で沖縄トラフが生成されなかったと考える別の論拠は、地震波地殻構造が、海洋性ではなく大陸性であるという事である。3。2Maを境に沖縄トラフの広域応力場が、東西から南北に変化した。これはフィリピン海プレ-トの琉球海溝へのもぐり込み様式の変化と対応していると考えられる。40フィリピン海プレ-トのもぐり込みによる沖縄トラフ下の岩石学的モデルから、水の解放による電気的低比抵抗(高電気電導度)の層あるいはブロックが予想される。これは現在行われている観測と解析によって明らかになるだろう。5。南部沖縄トラフの八重山グラ-べンの構造、年代、地磁気異常、熱流量などから推察すると、ここでは現在の熱水活動、火成活動が予想され、2Ma以降新たなテクトニクス(リフティング)が進んでいると考えられる。1。2。3。5。沖縄南部海域(八重山海底地溝)に於いて、計2回、延べ20日に及ぶ用船による地球物理学的調査が行われ、現在得られたデ-タの解析作業中である。1。電磁場測定:海底電位磁力計6台を、琉球海溝を横切る200kmの測線上に設置し、約2カ月間測定を行った。これまでは磁場の測定のみであったが、電場の測定をした事が特徴である。また船の走行中は船上3成分磁力計と、プロトン磁力計による磁場測定を行った。これらのデ-タから琉球弧を横切る地下電気伝導度分布と磁化構造が求められようとしている。2。熱流量測定:八重山海底地溝を横切る60kmの測線上7点で熱流量測定が行われ、地溝中央部に熱源がある事が予想された。3。地震探査:八重山海底地溝中央部に12台の海底地震計を設置し、シングルエアガンによる地震探査を行った。また6チャンネルのマルチチャンネル地震探査も行われ、地殻が海洋地殻よりも厚い事が確認された。また同じ背弧海盆である日本海に於いても日ソ共同地震探査が行われ、日本海盆では海洋地殻が確認された。4。古地磁気測定:琉球弧北部(種子島、薩摩ー大隅半島)に於いて約100個の定方位試料を採取した。このデ-タより、琉球弧と西南日本弧との接合部のテクトニクスが求められようとしている。南部沖縄トラフの電気電導度分布を磁場と電場の両方の時間変化から求めるために、1990年、1991年の調査に加えて1992年にも海底電位磁力計による調査を行った。比抵抗値の低い(電気電導度の高い)ブロックあるいは境界が、沖縄中部から南部まで連続しているかどうか、どの深さに存在するのか、そしてこれが今までの岩石学モデルからの、背弧海盆でのwater releaseと関係があるのかどうかという問題は現在鋭意解析中であり、明確な結果は近い内に発表されるだろう。地殻熱流量の測定からは、北部と南部沖縄トラフでは変わらないという結果を得た。一方南部沖縄トラフの八重山クラ-

ベンでは、熱水活動を示唆する熱流量の分布が得られた。80ー90mW/m2という値は安定な大陸地殻の熱流量よりもはるかに大きいが、熱流量が北部と南部で同じである事から、両地域が同じテクトニクスの歴史を歩んだと結論はできない。一方、海底震計ーエアガンの地震探査から、地殻全体の厚さは155ー16kmとなり、モホ面は海底下約18kmである事が判った。。この地殻構造は海洋性地殻というより大陸性地殻というべきものである。また上部地殻や堆積層の断層構造の走向、地震波速度異方性から南北伸張の応力場が考えられる。海上での地磁気測定の結果からは、地磁気異常島模様は観測されず、海洋底拡大は考えられないと結論した。又地磁気異常解析から地磁気異常原因層の上面が、音響基盤面と一致する事が判った。3成分の異常からは、南部沖縄トラフでは約2Maを境にして、東西方向の伸張応力場が南北方向に変わった事が結論された。古地磁気学の研究は、北部沖縄トラフがどのように開いたかをつきとめようとした。種子島を調査対象としたが、良好な資料を得る事ができず引き続き研究をする事になった。
多機能賦与ゼオライトによる水中の病原微生物および有害化学物質の除去

現在までに水中からの有害有機物質の吸着除去へのゼオライトの利用を目的として、四塩化珪素処理によりNa型フォ-ジャサイを脱AIし、Si/Al比10以上にすると有効であることがわかった。しかし、四塩化珪素処理は,高温で行う必要があったり、高いSi/Al比(30以上)を持つ試料が得にくい、などの欠点がある。そこで本研究では、水熱処理および酸処理により脱Alを行った。得られた試料のSi/Al比は7385であり、水中からの界面活性剤の吸着容量をドデシル硫酸ナトリウム(SDoS)を用いて調べた。窒素吸着測定により試料の細孔構造を調べると、未処理NaーY_<5.5>はゼオライトの均一なミクロ孔が存在することが明らかだが、処理試料では、25nmに細孔のピ-クが見られ2次細孔が生成している。またその細孔容積はSi/Al比の増加、すなわち処理の程度の度合いに伴って増加している。SDoSの吸着量は以下のようになる。四塩化珪素処理したSi/Al比=23の試料(NaーY_<47>)では吸着量が160mg/gとなっているのに対し、本処理試料ではSi/Al比=7程度のもの(HーY_<14>)でも吸着量が170mg/gとなり四塩化珪素処理のものよりも高くなった。またHーY_<144>は各試料中最も吸着量が高く260mg/gとなった。この結果より、水熱処理および酸処理が水中からの界面活性剤に対する吸着能を高めるのに非常に有効であることがわかった。これは水熱処理および酸処理により生成するメゾ孔が比較的大きな分子である界面活性剤の吸着の際に有利に働くためと考えられる。以上のように、水熱処理などによりSi/Al比を高めたゼオライトは表面に水酸基を有しながら、水共存下でも有機物の吸着能が高く、水処理への利用が可能である。これらのゼオライトへの銀担時による微生物殺菌能は検討中である。
廃棄物を有効利用したセメントクリンカー骨材の品質評価

セメントは,製造の際に多様な廃棄物・副産物を代替の原燃料として使用しており,その総量は年間約2,800万tにも及ぶ.このことは,セメント製造が我が国における資源循環型社会の構築において極めて重要な産業であることを意味している.残念ながら,セメント生産量は1996年をピークに減少しており,対策を講じなければ今後もセメント産業での廃棄物・副産物の受入れ可能量は減少し続け,我が国の資源循環の枠組みが成立しなくなることが懸念される.本研究は,普通セメントクリンカーと比較してより多くの廃棄物・副産物を使用したクリンカーをコンクリート用骨材として利用し,その実用可能性を総合的に評価することを目的とする.セメントは,製造の際に多様な廃棄物・副産物を代替の原燃料として使用しており,その総量は年間約2,800万tにも及ぶ.このことは,セメント製造が我が国における資源循環型社会の構築において極めて重要な産業であることを意味している.残念ながら,セメント生産量は1996年をピークに減少しており,対策を講じなければ今後もセメント産業での廃棄物・副産物の受入れ可能量は減少し続け,我が国の資源循環の枠組みが成立しなくなることが懸念される.本研究は,普通セメントクリンカーと比較してより多くの廃棄物・副産物を使用したクリンカーをコンクリート用骨材として利用し,その実用可能性を総合的に評価することを目的とする.
マウス栄養外胚葉細胞の分化決定機構

本研究は、将来胎盤を形成する細胞系譜である栄養外胚葉(trophectoderm)細胞の分化決定機構について明らかにすることを目的としている。我々は着床前胚におけるtrophoblast細胞の分化のトリガーとなる転写因子Cdx2の発現局在を解析し、Cdx2の発現は胚の外側に位置する全ての細胞で開始するが、そのうち一部の細胞は内側へと移動し、未分化細胞であるICM(内部細胞塊)に寄与することをライブイメージング観察により明らかにした。一度分化誘導因子を高発現した細胞がそれを抑制し未分化状態に戻るという現象を観察したのは、当該研究が初めてであると思われる。trophoblast細胞の分化決定機構に関する2つの仮説についての検証という主目的は、Cdx2-EGFPレポーターマウス系統を使用して十分達成出来る見込みであり、ほぼ計画通りにデータを蓄積できていると思われる。さらなる知見の積み重ねを目指して、Cdx2-EGFPレポーターマウスと細胞核が赤色の蛍光タンパク質で標識されたH2BmCherryマウスを掛け合わせることで両方の蛍光シグナルを持つマウス系統を作製し、Cdx2の発現と細胞の移動、細胞分裂方向との関連などについてのデータを得るために実験観察を続けている。近年桑実胚期のマウス胚において外側から内側に押し込まれる細胞が少数であるが存在することを、我々を含めた幾つかの研究グループが確認し、注目している。そのような細胞の移動は、内側と外側の細胞数比の調節のために行われると推測されているが、その分化運命が前もって内側の細胞(=ICM)へと決定されているのか、それとも一度はtrophoblast細胞に運命決定された細胞が後に運命転換をさせられるのかということなどが議論の対象になっている。Cdx2遺伝子の発現を指標として、対象となる細胞がCdx2を発現しtrophoblastの状態へと一度は向かうのか、あるいはそもそもCdx2を発現しておらず内側の細胞になる運命であるがゆえに内側へ押し込まれるのか、といったことについて、細胞の動きとCdx2の発現を併せて観察することで検討できるのではないかと考えている。哺乳類の胚発生においては、胚を構成する細胞は当初は全て全能性を持ち、胚体と胚体外組織全ての細胞種を生み出すことが可能である。胎生3日目の着床前胚において最初の細胞分化が起こり、将来胎盤を形成する細胞系譜である栄養外胚葉(Trophectoderm; TE)、および胚体を形成する未分化細胞集団である内部細胞塊(Inner Cell Mass; ICM)の2種の細胞が出現する。現在の初期胚研究の分野では、個々の細胞が細胞接着機構により自らのポジション(外か内か)を認識する機構が働き、外側の細胞はTEに、内側の細胞はICMに分化するという説が主流であるが、この過程において外側から内側に移動する細胞がいることが観察されており、そのような細胞の移動と、細胞が自らのポジションを認識する機構があるという説の折り合いは未だついていない。我々は初期胚におけるtrophoblast / ICMの運命決定の際の個々の細胞のポジションと細胞分化の関連性を調べる目的で、TEの分化マーカー遺伝子である転写因子Cdx2の発現をGFPの蛍光によりレポートすることのできるマウスを作製し観察を行った。Cdx2-GFPマウスの胚をライブイメージングにより観察した結果、外側から内側への細胞の移動は16細胞期32細胞期前後に観察することができ、それらの細胞は外側に位置する時期には他の外側の細胞と同レベルのGFP(=Cdx2)を発現していた。内側へと移動した後は、GFPの蛍光は減衰していき、後期胚盤胞期には他の内側の細胞と見分けが付かないレベルとなった。これらの観察から、着床前胚においては当初全ての外側の細胞でCdx2が発現するが、外側→内側へと移動した細胞ではCdx2の発現は抑制されることが明らかとなった。現在これらの観察結果に加えて、外側から内側に移動しICMの一部となった細胞の、その後の細胞運命についても現在解析を行っている。マウス着床前胚は当初、等価な細胞で構成されているが、胎生3日目に外側にある細胞はtrophoblastへと分化し内側の細胞は未分化なままICMとして維持され、2つの細胞系譜が作り出される。その決定様式として細胞表面からの何らかのシグナルにより胚体内の細胞が各々の位置を認識し、外側にある細胞はtrophoblastへと分化し内側の細胞は未分化なICMとして維持されるという仮説(シグナル仮説)と、細胞分化はランダムに起こり、その後trophoblast細胞は胚の外側へ、ICMは内側へと移動するのではないかという仮説(sorting説)が提唱されている。我々は何れの仮説が正しいのかを検証するため、trophoblast細胞の分化決定を担う転写因子Cdx2の着床前胚における発現を経時的に観察する計画を立てた。

具体的にはCdx2の発現をEGFPの蛍光で観察することのできるマウス系統を樹立し、その着床前胚を用いてライブイメージング観察を行った。その結果、trophoblast/ICMへの運命決定が起こる時期とされている桑実胚においてCdx2は外側の細胞においてのみ強く発現していることが分かり、どちらかというとシグナル仮説が真実に近いのではないかと今のところ考えられる。現在、Cdx2-EGFPマウスと全ての核が赤色の蛍光で観察できるROSA26-H2BmCherryマウス系統や、細胞膜がEGFPの蛍光で観察できるマウス系統を掛け合わせ、Cdx2の発現と核や細胞膜をも同時に観察することで細胞の系譜をより明確に追尾できるマウス系統を樹立観察し、このステージにおける細胞分化決定機構について、明確かつ信頼性の高いデータを作製したいと考えている。trophoblast細胞の分化決定機構について現在提唱されている2つの仮説についての検証という主目的は、Cdx2-EGFPレポーターマウス系統を使用してすでにほぼ達成済みである。次年度からはそれに基づいて新たな、より大きな発見をするために実験、観察を重ねたいと考えている。Trophoblast細胞の分化決定機構に関する2つの仮説についての検証という主目的は、現在手持ちのトランスジェニックマウス系統を使用して十分達成出来る見込みであり、ほぼ計画通りの進行状況であると考えられる。さらなる知見の積み重ねを目指して、Cdx2の発現と細胞の移動、細胞分裂方向との関連など、様々な角度からのデータを取得していきたいと考えている。平成24年度の間継続して行う予定であった以下の研究計画が平成24年8月11月の産前産後の休暇により一時中断してしまったため、研究活動がほぼ通常通りに行えるようになると推測される平成25年1月から、同計画を再開・実行している。1.Cdx2遺伝子のGFP-reportingマウス系統の初期胚を用いたライブイメージング観察胚の観察例数を十分揃えるため、23年度に引き続き24年度中も同実験を行う予定である。2. ES細胞の培養系を用いたCdx2遺伝子の発現制御を担う因子の探索ES細胞の培養系において、初期胚の発生過程における細胞分化のイベントをかなり正確に再現出来ることは既に良く知られている。Cdx2のreportingマウス系統の観察結果から、例えばtrophoblast細胞の分化決定が細胞表層からのシグナルにより行われていると推測されるのであれば細胞接着分子等の細胞表面分子からのシグナル、stochasticに分化決定が行われているようであれば、分泌因子の濃度の差や細胞周期などによってCdx2遺伝子の発現誘導の有無が決定されるのではないかと推測され、ES細胞の培養系を利用することで、その真偽を培養系において検証することが可能である。またCdx2-reportingマウスの初期胚から樹立したES細胞の培養系を利用して、着床前胚において発現しており尚かつCdx2遺伝子の発現を制御しているのではないかと考えられる候補分子の強制発現やノックダウン、あるいは分泌因子の培地への添加などを行い、それらの因子のCdx2遺伝子の発現誘導における役割についての検討を行う予定である。
有機メッキ法によるマグネシウム合金の表面機能化と複合化

種々の2-R-1,3,5・トリアジン4,6-ジチオールを合成し、マグネシウム合金AZ91に対して有機めっきを行い、表面に耐食性と接着性を付与することができ、その有機薄膜を簡単に除去する方法を見出したので以下にその成果を報告する。マグネシウム合金に対して有機めっきされる種々の2・ジアルキルアミノ・1,3,5-トリアジン-4,6-ジチオールの中で最も耐食性(分極抵抗値と腐食速度)に優れたものは2-ジヘキシルアミノ-1,3,5DHN)であった。皮膜の緻密性、マグネシウム合金との密着性、被膜生成速度などなら検討した結果、有機めっき温度、電流密度、DHN濃度、支持電解質の種類及び濃度などが影響することが明らかとなった。最適条件は、10°C、0.02mA/cm^2,5mmol/dm^3濃度、0.1mol/dm3-NaOH支持電解質であった。この条件で処理されたマグネシウム合金は30,00070,000Ω1cmの分極抵抗値が得られ、腐食電流の測定値から計算された腐食速度は0.001mm/yであった。この成果は磁気記録デスクMOのケースに展開し、試験段階では良好な成果が得られている。一方、ポリフェニレンサルファイド(PPS)、塗料およびゴム等とマグネシウム合金の接着性を2-ジアルキルアミノ1,3,5-トリアジン・4,6-ジチオールについて検討した結果、2-ジアリルアミノ・1,3,5-トリアジンー4,6-ジチオール(DAN)と1,3,5-トリアジン-2,4,6-トリチオール(TTN)が有効であることがわかった。塗料の場合はDANが、また接着の場合はTTNが有効であった。有機めっき皮膜の剥離は還元剤含有ジメチルアミド中で簡単に、痕跡も残さず剥離されることがわかった。また、接着物はヒドラジン水溶液中に浸漬すると剥離されることがわかり、リサイクル可能な技術であることが明らかとなった。マグネシウム合金のリサイクル使用を目的として、2-置換(R)-1,3,5-トリアジン-4,6-ジチオール(トリアジンジチオール)の有機メッキによる腐食防止、ゴム・プラスチックスの直接接着、皮膜の剥離法、ゴム・プラスチックとマグネシウム合金の分解法およびこれら混合物の分離法を研究した。まず、マグネシウム合金に対するトリアジンジチオールの有機メッキにおいてはトリアジンジチオールの重合反応とマグネシウムの酸化および水酸化反応が同時に起こり、20°C付近での有機メッキにおいて重合反応が優先した。有機メッキにおける電解質の種類と濃度、最適な重合電位と電流密度、およびトリアジンジチオールの種類(置換基Rの種類)と濃度と皮膜の性質および電気化学的耐食試験(コール-コールプロットおよび分極抵抗)関係を検討し、電解質は1M-NaOH水溶液、重合電位は1.82.0Vvs.SCE,電流密度0.20.4mA/cm^2,R=-N(C_6H_<13>)_2が最も緻密な皮膜を生成し、耐食性が向上した。特にトリアジンジチオールの置換基の影響が大きく、アルキル鎖長が長すぎても又短すぎても緻密な皮膜は得られなく、処理マグネシウム合金の耐食性も向上しなかった。置換基のアルキル鎖数も現在のところ、2本鎖が最も緻密で耐食性の皮膜を与え、副反応を抑制した。

2-ジアリルアミノ-1,3,5-トリアジン-4,6-ジチオールで処理したマグネシウム合金は種々のゴムおよびプラスチックと直接接着(接着剤を使用しない接着法)が可能であり、機能化に成功した。処理マグネシウム合金から皮膜の除去はデトラヒドロフランに浸漬することによって、剥離できる。また、ヒドラジンやNaBH4含有テトラヒドロフランに浸漬すると、皮膜が剥離され、かつトリアジンチオールの原料が回収できた。接着物は冷感破壊により混合物として分離され、磁気処理によりこれらが分別されることが分かった。平成12年度は6-置換-1,3,5-トリアジン-2,4-ジチオールを用いる有機メッキ技術によるマグネシウム合金の耐食性と接着性を中心に検討した。有機メッキとは電気化学的手法を用い、金属表面を有機物薄膜で被覆する新しいコーテング技術である。この技術は腐食性の高いマグネシウム合金に対しても有効である可能性を持っており、最近マグネシウム合金表面を機能化する観点から研究が進めれている。マグネシウム合金に対するトリアジンジチオールの有機メッキにおいてマグネシウム合金が水中で腐食し易いため電解質の選択は重要である。一般にアルカリ側で有機メッキできるが、0.5M濃度以上のNaOHを電解質として使用した有機メッキでは腐食は極度に抑制され、有効なメッキ浴となる。しかし、有機メッキ温度が高くなると、腐食が起こり、20°C以下で有機めっきを行うことが肝要である。有機メッキ中に生成する表面層は上層が有機メッキ薄膜からなり、その下に酸化被膜層、Mg(OH)2の層と続くことが分かった。有機メッキ処理マグネシウム合金は有機メッキ未処理マグネシウム合金(無機被膜:65nm)に比べて、酸化腐食が著しく抑制される。さらに、DHN濃度、すなわち、有機メッキ被膜厚さが厚いほど、飽和水蒸気中における腐食が抑制される。NaCl水溶液中での腐食においては無機被膜の成長と溶解が起こるが、30°Cでは成長が優先するが、有機メッキ被膜の効果は明らかである。有機メッキ処理マグネシウム合金とEPDM(不飽和ゴム)の接着においては膜厚が10-20nm程度で高い剥離強度(接着強度)がえられ、膜厚がこれ以上になると接着強度は減少した。有機メッキ処理マグネシウム合金とPPS(ポリフェニレンサルファイド)の射出成型接着では金型の温度が接着のために重要な因子であり、140°C以上の金型温度で母材破断の接着物が得られた。これら二種類の接着において、被膜成分と高分子材料(EPDM,PPS)の反応性が接着の重要な因子であると考えられる。平成13年度は6-ジシクロヘキシルレアミノ-1,3,5-トリアジン-2,4-ジチオールを用いてマグネシウム合金を有機メツキし、その耐食性と接着性を中心に検討した。この技術は腐食性の高いマグネシウム合金に対しても有効であることが明らかとなり、最近マグネシウム合金表面を機能化する観点から研究が進めれている。一般にアルカリ側で有機メッキできるが、1M濃度以上のNaOH電解質として使用した有機メッキでは腐食は極度に抑制され、有効なメッキ浴となることが分かった。しかし、有機メッキ温度が高くなると、腐食が起こるが、10°Cの温度が耐食性有機めっきとして有効であった。有機メッキ中に生成する表面層は上層が有機メッキ薄膜からなり、その下に酸化被膜層[Mg(OH)_2とMgO]の層と続くことが分かった。
知識人の変容とジャーナリズム―戦後フランスを事例に

本研究の目的は、「知の大衆化」という先進諸国に共通して見られる現象が戦後フランス社会においてどのように展開してきたのかを、知識人とジャーナリズムの関係性に注目しながら考察することにある。本年度も、昨年度に引き継いで、「知識人の雑誌」と称されるニュース週刊誌『ル・ヌーヴェル・オプセルヴァトゥール』を対象に研究を行った。しかし昨年度とは異なり、本年度はこの雑誌の内容よりも、企業としての側面を明らかにすることを目指した。すなわち、企業内部の論理や外部組織との関係性等を中心に経営的側面の分析を行った。特に1980年度以降、フランスでは多くの新聞社や週刊誌社が売却および買収されることで、編集面にもその影響が及んだことが知られている。それに対して、『ル・ヌーヴェル・オプセルヴァトゥール』は一貫して「経営的自立」を維持し、ある意味では、そのことが読者はもとより知識人の信頼を獲得することになった。つまり、同誌が「知識人の媒体」たり得るのは、「経営的自立」の維持が必要条件の一つであるという仮説を立てて、研究を進めた。具体的にはフランス国立中央文書館やパリ政治学院附属の現代史研究センター等で、新聞社・雑誌社に関する経営資料や国家の補助金制度に関する政府資料を閲覧し、広告主や株主等といった外部組織との関係を歴史的に把握した。それと同時に、複数の新聞・雑誌社の経営陣に聞き取り調査をし、今日のジャーナリズムが置かれている状況の理解に努めた。この調査を通じて、民主主義の一端を担うとされるメディア企業の集中化の過程を分析し、知識人とジャーナリズムの関係性の問題を再検討した。その成果は、「フランスの国家補助金制度とジャーナリズム」(『レゾナンス』第7号、2011年)や油井大三郎編『越境する1960年代-米国・日本・西欧の国際比較』(彩流社、2012年)に公表した。資料調査や聞き取り調査を遂行するなかで、当初の予定には入れてなかった重要事項を知り、研究の行程を変更したから。しかし、当然ながらそれが中期的には有用であると判断したからであり、けっして「遅れている」ということにはならない。今後は、本研究課題の成果を踏まえたうえで、「知識人」というよりは「知」全般に関わる問題系へと対象を広げ、それをジャーナリズムとの関係から捉え直すことを方策としたい。そのために、社会史的なアプローチと同様、経済史・経営史的なアプローチをも採用することによって、多角的な分析を行う。また、フランスに重点を置きながらも、各国比較研究を試み、日本が抱える今日的な社会問題へと移行する。この研究課題に取り組むべく、今年度は1)「知識人の雑誌」と称される『ル・ヌーヴェル・オプセルヴァトゥール』誌のモノグラフィー研究、2)アルジェリア戦争、68年「五月」革命、70年代前半のマイノリティをめぐる議論、70年代半ばのソルジェニーツィン事件や「メディア知識人」の誕生等、本研究に重要と考えられる出来事に焦点を当てた事例研究の二つをそれぞれ行った。1)については『ル・ヌーヴェル・オプセルヴァトゥール』社でのフィールドワークを遂行すると同時に、同誌を網羅的に精査した。加えて教育機関、政治政党、労働組合等の外部組織との関係を把握するために、各種図書館や文書館で資料収集・読解に努めた。それを通じて同誌のモノグラフィー研究を大幅に進め、本研究の基礎となる情報を整理した。2)についてはそれぞれの出来事を先行研究から分析し、同誌と知識人とが交差するポイントを明確にした。これを踏まえた上で1)と同様、関係資料を収集・読解し、先行研究との照合作業を行った。その結果、1980年代に流布する「知の大衆化」と「知識人の終焉」が同じ文脈で語られていることを把握した。しかし「知識人の終焉」をその形象の変容として理解することで、1980年代前後の時代を連続性をもったものとして仮定することができる。この仮定を検討することを来年度の主要な作業としたい。

それと同時に、複数の新聞・雑誌社の経営陣に聞き取り調査をし、今日のジャーナリズムが置かれている状況の理解に努めた。この調査を通じて、民主主義の一端を担うとされるメディア企業の集中化の過程を分析し、知識人とジャーナリズムの関係性の問題を再検討した。その成果は、「フランスの国家補助金制度とジャーナリズム」(『レゾナンス』第7号、2011年)や油井大三郎編『越境する1960年代-米国・日本・西欧の国際比較』(彩流社、2012年)に公表した。資料調査や聞き取り調査を遂行するなかで、当初の予定には入れてなかった重要事項を知り、研究の行程を変更したから。しかし、当然ながらそれが中期的には有用であると判断したからであり、けっして「遅れている」ということにはならない。今後は、本研究課題の成果を踏まえたうえで、「知識人」というよりは「知」全般に関わる問題系へと対象を広げ、それをジャーナリズムとの関係から捉え直すことを方策としたい。そのために、社会史的なアプローチと同様、経済史・経営史的なアプローチをも採用することによって、多角的な分析を行う。また、フランスに重点を置きながらも、各国比較研究を試み、日本が抱える今日的な社会問題へと移行する。
ポストゲノム科学的アプローチによる脊椎動物の排卵研究

哺乳類から魚類に至る脊椎動物には共通した内分泌メカニズムが存在する。その内分泌制御下にある生殖活動もまた,脊椎動物の種を越えて,共通のメカニズムがあると考えられる。このような考えに基づき、本研究では「脊椎動物の排卵機構」の解明を目指してきた。研究期間(3年間)の最終年度となる本年度で,下等脊椎動物のメダカを用いて,世界で初めて,排卵機構の全容を明らかにすることができた。メダカ排卵は、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)とその内在性活性阻害タンパク質(Tissue inhibitor of matrix metaroproteinases : TIMP)の協調的作用により実行され,そのメカニズムは以下のように説明できる。排卵前,不活性型のGelatinase Aが卵母細胞から分泌され,卵母細胞膜表面上に存在するMT1-MMPによって活性化される。活性型Gelatinase Aは内在性TIMP-2bによって活性阻害を受けているが,排卵時間に近づくにつれてTIMP-2bの発現量が減少し,阻害を受けない活性型Gelatinase Aが次第に増加する。これによって活性型Gelatinase Aは基底膜の4型コラーゲンを分解し始める。同時に顆粒膜細胞膜上にMT2-MMPが発現されるようになる。基底膜の分解がさらに進むと,顆粒膜細胞は濾胞の外側に移動でき,莢膜細胞層の細胞外マトリクスと接触できるようになる。この時、顆粒膜細胞表面のMT2-MMPは莢膜細胞層間の1型コラーゲンを分解し始め,濾胞細胞層に亀裂ができる。一度,亀裂が生ずると,卵母細胞の膨潤による内側からの圧力も手伝って,卵母細胞が濾胞組織から放出される。本研究によって得られた知見を基に,メダカ排卵の分子メカニズムに関するモデルを発表した。哺乳類排卵実行酵素の同定は未だに成功していない。本研究で得られたメダカの排卵機構に関する知見は,哺乳類における排卵機構の解明に有用な情報となると期待される。本研究の目的は、メダカ及びマウスを用いて、脊椎動物における排卵機構を解明することである。(1)メダカ卵巣を用いた研究では、メダカ卵巣MT2-MMPが排卵実行酵素であることを明らかするため、MT2-MMP mRNAの発現動態についてin situハイブリダイゼーション解析により調べた。その結果、MT2-MMP mRNAは排卵時に濾胞組織の顆粒膜細胞に発現し始めることが明らかになった。大(直径が1.0mm以上)、中(直径が0.51.0mm)、小(直径が0.5mm以下)のサイズのくり抜き濾胞由来のRNAでは、ノーザン解析によるmRNA検出は不可能であった。一方、メダカ卵巣のくり抜き濾胞による試験管内排卵実験系において、組織あるいは組織培養液にMT2-MMPが検出されるかどうかについて検討した。作製済みのMT2-MMP抗体を用いたウェスタンブロット解析とSDS-PAGE/gelatinzymography解析により、膜結合の活性型MT2-MMPの存在を実証できた。MT2-MMPタンパク質の出現は排卵時から認められ、mRNAの消長と同じであった。(2)マウス卵巣を用いた研究では、メダカの排卵酵素の候補として浮上してきたMT2-MMPが、哺乳類においても排卵実行MMPとなりうるかどうかについて検討するために、成熟マウスの各種組織におけるMT2-MMP発現をノーザンブロット解析により調べたところ、肺、心臓、肝臓及び卵巣に発現していることが確かめられた。

マウスMT2-MMP cDNAの断片(215bp)に対応するcRNAをプローブとして、成熟マウスの卵巣切片でin situハイブリダイゼーション解析を行ったところ、顆粒膜細胞が発現細胞であることが判明した。さらにPMSGおよびhCG処理により過排卵を誘導した幼若雌マウス(4週齢)の卵巣で、hCG処理がMT2-MMPの発現を誘導することをノーザンブロット解析で明らかにした。本研究の目的は、メダカ及びマウスを用いて、脊椎動物における排卵機構を解明することである。初年度(平成14年度)に実施した研究により、膜結合型マトリクスメタロプロテアーゼであるMT2-MMPがメダカ排卵において重要な役割を果たしていることが示されたことから、本年度においては、メダカを用いて、さらに排卵機構の詳細を明らかにすることを目指した。また、マウスにおいてもMT2-MMPが排卵に関わる可能性があるかどうかについて検討した。その結果、以下の研究成果が得られた。(1)メダカ卵巣を用いた研究MT2-MMPは、排卵時期に不活性前駆体タンパク質として合成され、速やかに活性型に変換される。この活性化のプロセスに関わる分子の探索を試みた。その結果、メダカ卵巣にフユーリン及びPC2遺伝子が発現していることが明らかになった。しかし、フユーリン及びPC2遺伝子を最も強く発現している細胞は卵細胞であるという新知見が得られた。排卵機構に関する詳細な解析を進めた結果、MT2-MMPの他にgelatinase Bの関与が明らかになった。(2)マウス卵巣を用いた研究初年度には、メダカ同様、MT2-MMP遺伝子がマウス卵巣の顆粒膜細胞に発現することを示唆す結果が得られていた。本年度では、これを確認する実験を行った。幼若雌マウスへのホルモン処理により、排卵から黄体化の時期に遺伝子発現が誘導されたことから、MT2-MMPの生理機能として、排卵のみならず黄体化における関与も示唆された。本年度の実施目標の一つとしていたMT2-MMP遺伝子のプロモータ解析は、メダカの排卵解析に重点をおいたため実施できなかった。哺乳類から魚類に至る脊椎動物には共通した内分泌メカニズムが存在する。その内分泌制御下にある生殖活動もまた、脊椎動物の種を越えて共通のメカニズムがあると考えられる。このような考えに基づき、本研究では「脊椎動物の排卵機構」の解明を目指してきた。研究期間(3年間)の最終年度となる本年度で、下等脊椎動物のメダカを用いて、世界で初めて、排卵機構の全容を明らかにすることができた。メダカ排卵は、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)とその内在性活性阻害タンパク質(Tissue inhibitor of matrix metaroproteinases : TIMP)の協調的作用により実行され、そのメカニズムは以下のように説明できる。排卵前、不活性型のGelatinase Aが卵母細胞から分泌され、卵母細胞膜表面上に存在するMT1-MMPによって活性化される。活性型Gelatinase Aは内在性TIMP-2bによって活性阻害を受けているが、排卵時間に近づくにつれてTIMP-2bの発現量が減少し、阻害を受けない活性型Gelatinase Aが次第に増加する。