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近現代インドにおける食文化とアイデンティティに関する複合的研究

本研究は、近現代インドにおける食文化をめぐる諸変化が、地域、宗教、カースト、ジェンダー、階級などにもとづくアイデンティティや、インドというネーション概念の構築・再構築過程とどのように関わりあっているのかを、文献資料や現地調査をもとに、具体的な事例に焦点を当てながら明らかにした。本研究の成果は国内外の学会で報告され、これらを契機として、日本・インド両国の研究者により、南アジアにおける食と身体をめぐる認識を検討するための新たな共同研究が発足した。また、論文集をとりまとめる作業が現在進行している。この他、インドの食文化史に関する連載を一般誌に寄稿するなど、広範な読者に向けた成果の発信も行っている。2011年度は、近現代インドにおける食文化の変化についての概要や、研究動向をおさえると同時に、各メンバー(井坂理穂、山根聡、篠田隆、小磯千尋)がそれぞれの具体的な研究テーマについて資料収集・分析を進めた。メンバーのうちの2名(山根、小磯)はインド、パキスタンに出張し、資料収集を行った。また、3回にわたり研究会を開催し、メンバー以外の参加者も交えて討論を重ねた。第1回研究会(6月)では、小磯、井坂がそれぞれ、インド食文化についての概説と研究動向について報告した。第2回研究会(11月)では、小磯がインド都市部のミドル・クラスにおける健康意識の高まりと、それに伴う食生活の変化を論じた。また、山根が南アジア・ムスリムの宗教的アイデンティティの再構築過程を、食文化に関するウルドゥー語文献から考察した。ここでは植民地期において、イギリス人という「新たな他者」との接触や、ムスリムの近代化、イスラーム復興をめざす動きのなかで、「食」をめぐり活発な議論が展開されたことが示された。第3回研究会(2012年2月)では、篠田が統計資料を用いながら、現代インドにおける食料消費の動向について、地域差や宗教、社会集団ごとの特質を論じた。また、研究脇力者である長谷川まゆ帆が、比較の観点から、西洋史における食文化研究の動向、18世紀フランス社会と食文化についての事例を紹介した。以上のような研究活動を通じて、近現代インドにおいて、「あるべき」食文化をめぐる認識がどのように変化したのかについての具体像が明らかになるとともに、様々な社会集団におけるアイデンティティ形成と食文化との関係が、いかに流動的かつ多様性をもつものであるのかが、複数の地域や時代の事例にもとづき実証的に示された。さらに2011年度末には、成果公開のために本プロジェクトのウェブサイトを作成した(現在メンバーのみが閲覧可能、6月に一般公開予定)。2013年度は、各メンバーがそれぞれの研究テーマについての資料収集・分析を進め、成果を論文やエッセーのかたちで公開する作業を行うとともに、国際学会(82nd Anglo-American Conference of Historians: Food in History, 2013年7月12日)における成果報告を通じて、海外の研究者との交流を深めた。この国際学会においては、井坂理穂(研究代表者)、山根聡(研究分担者)、およびRachel Berger(Concordia University)の3名がパネル(The cultural politics of food in South Asia)を組織し、各自がこれまでの研究成果を発表した。井坂は植民地期のインドにおいて食をめぐる慣習が再構築される過程について、料理人に焦点をあてて検討し、山根は植民地期のウルドゥー文学における食をめぐる記述について、洗練された語彙に着目しながら分析を行った。報告後の質疑応答や他のパネルへの参加を通じて、食の歴史を扱っている研究者たちと活発な情報・意見交換を行った。このほか、本プロジェクト主催の研究会を2013年6月および11月に行った。ここではメンバー以外の研究者を招き、インド伝統医学文献についての報告や西アジアの食文化史についての報告を聞き、近現代インドの事例と比較しながら、食文化における時代を超えた継続性や地域間での相互影響について議論した。また、篠田隆(連携研究者)による現代インドの大学寮食堂についての調査をはじめ、メンバーが現在行っている調査についての報告、情報交換もあわせて行った。2014年1月にはメンバーを中心とした打ち合わせ会を行い、今年度の研究成果の総括および来年度以降の計画について詳細に検討した。以上の活動のほかに、本プロジェクトのウェブサイトを更新し、研究会情報、食文化に関連する授業の紹介などを追加した。小磯千尋(研究協力者)や山根は一般読者向けの雑誌において、成果の一部をわかりやすいかたちで紹介した。2012年度は、各メンバーがそれぞれの具体的な研究テーマについて資料収集・分析を進めるとともに、日本南アジア学会でのセッション企画(2012年10月6日)その他を通じて成果を広く公開した。まず、日本南アジア学会で組織したセッション「近現代インドにおける食文化とアイデンティティ」では、篠田隆(連携研究者)がこれまで行ってきた統計分析をもとにインドにおける食料消費の動向と地域性について報告し、山根聡(研究分担者)が19世紀半ばから20世紀半ばのウルドゥー語文献における食文化関連の記述を紹介しながら、洗練された語彙の使用や、そこに表される都市への郷愁について明らかにした。また、小磯千尋(研究協力者)は現代インド都市中間層の食文化の変容を、外食や飲酒に焦点をあてながら論じ、井坂理穂(研究代表者)は植民地期インドにおけるイギリス人家庭と料理人との関係や、そこで生まれた諸慣習がインド人ミドル・クラス家庭に与えた影響を検討した。このほかに、本プロジェクト主催の研究会を2012年6月および2013年2月に行った。

ここではメンバー以外の研究者を招き、インド以外の地域の事例や、インド中世の食文化に関する研究についての報告を聞くとともに、近現代インドの事例と比較しながら、横断的、通時的なつながりや相互の相違について議論した。海外出張については、2013年2月に長谷川まゆ帆(研究協力者)がインドを訪問し、旧フランス領ポンディシェリを中心に、フランス料理が在地の食文化に与えた影響に関して資料収集を行った。同年3月には篠田がインドの複数の都市(コルカタ、チェンナイ、ゴア、アフマダーバード)を回り、外食産業に関する資料収集や聞き取り調査を行った。このほかに、本プロジェクトのウェブサイトを作成・更新し、研究会情報、基本的な文献の紹介、現代インドの食に関するエッセーなどを掲載した。2014年度は各メンバーがそれぞれの研究テーマについて資料収集・分析を進め、その成果を2014年12月にデリーで開催した国際ワークショップ(What Do We Eat? Food and Identity in India)で報告した。このワークショップは、デリー大学Janki Devi Memorial College歴史学部との共催で行ったものであり、日本側からは研究代表者(井坂理穂)、研究分担者(山根聡)、連携研究者(篠田隆)、研究協力者(小磯千尋)、及び加納和雄(高野山大学)の5名が報告し、インド側からは研究者6名が報告を行った。このほかに3名のディスカッサントが入り、長時間にわたって活発な議論が行われた。ワークショップを通じて、近現代インドにおける食文化とアイデンティティのあり方がより長期的な歴史の流れのなかで位置づけられるとともに、グローバルな動きとの連関が様々なかたちで明らかにされた。このほか、2014年5月、6月、2015年1月に国内で研究会を開催した。5月の研究会は現代インド地域研究プロジェクト東京外国語大学拠点との共催で行われ、海外からの研究者2名による報告ののちに、穢れの概念について議論が交わされた。6月の研究会では、プロジェクト外部の研究者2名により、インスタント・ラーメンのグローバル化とアイデンティティ、及び、インド社会の下層民の消費行動の変化についての報告が行われ、社会階層ごとの食文化に関する認識やそれらの変化について議論が交わされた。1月の研究会では嗜好品の流通経路や、インド北東部における食文化などのテーマが取り上げられ、今後発展させるべき研究テーマについてメンバー間で話し合いがもたれた。9月には研究代表者がイギリスで植民地期の食文化に関する資料収集を行った。そのほかに、本プロジェクトのウェブサイトを随時更新し、授業や市民講座などを通じて研究内容を紹介するなど、広範囲に成果を発信することを試みた。2015年6月にインドからSaumya Gupta氏(Janki Devi Memorial College, University of Dellhi)を招聘し、東京大学駒場キャンパスで国際ワークショップを開催した。
細菌由来スーパー抗原によるヒトリンパ球の免疫抑制薬耐性発現機序と各種抗菌薬の効果

免疫抑制薬は種々の難病の治療に用いられるが、効果が十分に得られない患者が存在する。本研究は、免疫抑制薬耐性発現の要因として細菌感染に着目し、その機序を解明して耐性克服の手段を講じる事を目的とした。研究の結果、細菌のスーパー抗原が免疫細胞を過剰に刺激し、インターロイキン-2(IL-2)産生を促進することで、免疫抑制薬耐性が生じることを示した。ロキシスロマイシンは、スーパー抗原刺激した免疫細胞のIL-2産生を抑え、免疫抑制薬の治療効果を高めることを明らかとした。スーパー抗原刺激によるヒト末梢血単核細胞(PBMC)の免疫抑制薬耐性発現機序の解析を目的として検討を行い、以下の結果を得た。まず、in vitroにおいてT細胞マイトゲンのコンカナバリンAで刺激した健常者PBMCとTSST-1で刺激した健常者PBMC間で、IL-2mRNA発現量を比較検討したところ、TSST-1で刺激したPBMCにおいて発現量が有意に増加した。次に、シグナル伝達経路に係わる各種キナーゼに対する特異的阻害薬と免疫抑制薬を併用した場合に、TSST-1刺激したPBMCにおける免疫抑制薬耐性を克服し得るか否かを検討した。PBMCにおいてプレドニゾロンにより誘導されるFKBP51mRNA発現の亢進はTSST-1刺激によって阻害されるが、この阻害はJNK阻害薬であるSP600125を併用することにより解除された。一方、溶連菌由来のスーパー抗原であるSPEAでPBMCを刺激するとグルココルチコイドの細胞増殖抑制効果は減弱されるが、この時マクロライド系抗生物質のロキシスロマイシンをグルココルチコイドと併用すると、PBMC増殖抑制効果が回復した。以上の検討結果から、スーパー抗原で刺激したPBMCにおける免疫抑制薬感受性の低下には、JNK活性の異常な亢進とその結果もたらされるIL-2mRNA発現量の増加がPBMCからのIL-2産生量の増加につながり、免疫抑制薬耐性を引き起こす可能性が示された。またスーパー抗原で刺激したPBMCにおけるグルココルチコイド感受性の低下は、ロキシスロマイシンの併用により回復することを示唆した。健常者及び乾癬患者の末梢血単核球(PBMC)をスーパー抗原刺激し、その増殖に対するビタミンD3誘導体(VD3)やロキシスロマイシン(ROX)の効果、およびVD3あるいはROXとベタメタゾン(BM)の併用効果を検討した。被験者の末梢血より定法に従ってPBMCを分離し、液体培地にけん濁させた後、T細胞マイトゲン(コンカナバリンA)または溶血性連鎖球菌由来スーパー抗原のSPEAおよび種々の濃度の薬物存在下に培養し、[3H]チミジン取り込み量によってPBMC増殖率と薬物の抑制効果を算定した。一方、ビーズアレイ法とフローサイトメトリー法を用い、コンカナバリンAまたは溶血性連鎖球菌由来スーパー抗原で刺激したPBMCの培養上清中に放出される10種のサイトカインの濃度を測定した。健常者及び乾癬患者いずれのPBMCに対しても、SPEAはその増殖を強く促進したが、VD3やROXはこれを有意に抑制した(p<0.05)。またこの時VD3あるいはROXにBMを併用すると、PBMC増殖はより効率よく抑制された(p<0.05)。ROXはSPEA刺激したPBMCから産生される種々のサイトカインの産生量を有意に抑制し(p<0.05)、特にIL-2産生に対する抑制効果が強かった(p<0.05)。またROXは、SPEA刺激で亢進するPBMCのc-jun活性を有意に抑制した(p<0.05)。以上の結果から、細菌由来スーパー抗原は健常者及び乾癬患者のPBMCにおけるc-junを活性化して種々のサイトカイン産生を亢進し、ROXはc-jun活性を阻害することによりこれらのサイトカインの産生を抑え、PBMCの増殖を抑制するものと考えられた。本研究の前年度までの成果から、細菌由来スーパー抗原で刺激したヒト末梢血単核細胞(PBMC)は種々の免疫抑制薬の増殖抑制効果に対して抵抗性を示すことが分かった。そこで本年度は、スーパー抗原刺激したPBMCにおける免疫抑制薬耐性の分子機序解析を目的とし、PBMCからのIL-2の分泌量やIL-2の分解系について検討した。IL-2の分泌量はELISA法あるいはビーズアレイ/フローサイトメトリー法により分析した。溶血性連鎖球菌由来スーパー抗原のSPEAで刺激したPBMCは、通常のT細胞マイトゲンで刺激したPBMCに比べて、培養上清中に多量のIL-2を分泌した。マクロライド系抗生物質のロキシスロマイシンは、SPEAで刺激したPBMCの増殖を有意に抑制すると共に、PBMCからのIL-2分泌量を有意に低下させた。

SPEAで刺激したPBMCの培養系にさらにIL-2を添加し、その量を経時的に追跡したところ、IL-2が培地中に長時間存在していることを確認した。次に、IL-2分解酵素のカテプシン活性を阻害するベプスタチンの存在下または非存在下に、SPEAで刺激したPBMCからのIL-2の産生量を検討した。しかしながら、ペプスタチンはIL-2濃度に有意な影響を及ぼさなかった。SPEAで刺激したPBMCに対するロキシスロマイシンの細胞増殖抑制作用は、ベタメタゾンとの併用により増大した。以上の結果から、SPEAはPBMC培養上清中のIL-2量を増加させるが、その機序にはIL-2分解系は関与せず、IL-2の産生量を促進させるものと考えられた。ロキシスロマイシンは、スーパー抗原刺激したPBMCからのIL-2産生を抑制し、PBMCの増殖を抑えるものと考えられた。さらに本年度の研究から、細菌感染を併発する自己免疫疾患患者に対する、ロキシスロマイシンの有用性が支持された。
癌細胞選択的にアポトーシスを誘導するTRAIL様自己集積型人工デスリガンドの創製

TRAIL(tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis-inducing ligand)は、TNFファミリーに属するデスリガンド(DL)の一種で、亜鉛を中心に有するホモ三量体を形成することにより、がん細胞に異常発現するデスレセプター(DR)に結合し、がん細胞選択的にアポトーシスを誘導する。従って、TRAILとDRを介するシグナル伝達経路は、副作用の少ない抗がん剤開発のための標的経路として注目されている。本研究の目的は、亜鉛とビピリジンとの1:3錯体(Zn^<2+>(bpy)_3)生成に基づくC_3対称性自己集積体の構築を特徴としたTRAIL様人工デスリガンドの創製である。本年度は、水溶液中におけるZn^<2+>(bpy)_3錯体の低安定性の改善を研究目的とし、ビピリジン骨格に疎水性相互作用部位を導入した多点相互作用型人工デスリガンドを設計・合成し、亜鉛との集積体生成評価を行った。具体的には、ビピリジンと疎水性相互作用部位として8-キノリノールをメチレン鎖で連結したリガンドを合成した。合成したリガンドに対し、亜鉛を添加した場合のUV-Vis、ESI-MS、^1H-NMRスペクトルを測定したところ、定量的な1:3錯体の生成には至らなかったものの、ビピリジンそのものと比べ、より安定な錯体を生成した。疎水性相互作用部位として、8-キノリノールを7-キノリノール、エチルベンゼン、ドデシルベンゼン、ニトロベンゼンやジオクチルアミンに置き換えたリガンドについても設計・合成し、亜鉛との集積体の評価を行ったが、8-キノリノールを有するリガンドと亜鉛との錯体の安定性改善には至らなかった。現在、ビピリジン骨格に異なる配位結合部位を導入し、亜鉛と2:3錯体の生成を期待するリガンドの設計・合成に取り組んでいる。
平滑筋細胞特異的接着分子Hic-5欠損マウスの解析

Hic-5は約15年前に過酸化水素とTGF-βに応答し発現誘導される遺伝子としてクローニングされた。本研究では、作製したhic-5ノックアウトマウスを用いてHic-5の動脈硬化病変形成過程への直接的な関与を検討した。具体的には、大腿動脈にバルーン血管障害モデル術を行ったところ傷害部位の中膜平滑筋層の回復抑制、および血管内腔側に形成される新生内膜肥厚が促進という変化が現れた。その理由として、ノックアウトマウス血管病変では、慢性期に入っても持続的にアポトーシスが起きていたことが挙げられる。本研究で解析を行ったHic-5遺伝子は、ECMと細胞の接着点にある細胞接着斑タンパク質をコードし、同じLIMドメインファミリーに属するパキシリン(Paxillin)と高い相同性を示すアダプター蛋白質である。我々はこれまでにHic-5蛋白質がマウスおよびヒト組織では、血管、消化管、子宮などの平滑筋細胞特異的に発現が観察される分子であることを明らかにした。さらに興味深いことに、ラット総頚動脈ヘバルーン血管障害モデルの手術を行う際にアデノウイルスベクターを用いて血管壁の細胞にhic-5遺伝子を発現させ、新生内膜肥厚度の変化を検討したところ、Hic-5の強制発現により病変組織である新生内膜の肥厚抑制が観察され、Hic-5の動脈硬化病変形成過程への関与が示された。そこで本年度は、作製に成功したHic-5遺伝子のホモ欠損マウスを用いて動脈硬化病変形成に関する研究を行った。具体的には、Hic-5欠損マウス大腿動脈にヒト血管拡張療法(PTCA)の術後再狭窄モデル術を施行して血管を損傷させ、病変部の詳細な解析を行った。その結果、Hic-5欠損マウスでは、傷害部位の中膜平滑筋層の病状悪化、および血管内腔側に形成される新生内膜肥厚が促進した組織像が観察された。さらにその原因として、慢性期の血管壁構成細胞のアポトーシス頻度上昇、血管中膜および新生内膜組織の平滑筋細胞分化マーカーの発現量低下が見いだされている。また新生内膜の構成成分が野生型マウスとは異なり血栓像が多く見られた。Hic-5は以前、巨核球から血小板への最終分化過程で発現が急激に上昇し、成熟血小板内に発現することが報告されている。今後はHic-5の血管恒常性維持への関与と、血管障害度の変化を中膜平滑筋層と血小板血栓形成能という側面からの検討を視野に入れる。動脈硬化発症過程に深く関与する血管中膜平滑筋細胞は、周囲を豊富な細胞外マトリックス(ECM)に取り囲まれ、病変部の細胞外環境変化により容易に脱分化する特徴を持つためECMの重要性が認識されている。本研究で解析を行うH202-inducible clone-5 (Hic-5)は、細胞外マトリックス(ECM)と細胞の接着点にある細胞接着斑アダプター蛋白質である。この遺伝子は約15年前に過酸化水素とTGF-βに応答し発現誘導される遺伝子としてクローニングされた。その後我々は、Hic-5はマウスおよびヒトの血管平滑筋細胞に発現し、平滑筋細胞の細胞収縮制御に関与する事を明らかにした。またアデノウイルスベクターを用いた血管壁へのhic-5の強制発現により血管傷害部位の新生内膜肥厚が抑制されることを報告した。本年度は並行して作製を行ってきたhic-5ノックアウトマウスを用いてHic-5の動脈硬化病変形成過程への直接的な関与を検討した。さらに分離培養平滑筋細胞を用いた結果から、このアポトーシスはメカニカルストレスが原因であることが示唆された。またノックアウトマウス病変部の平滑筋細胞では、接着斑マーカーであるvinculinが通常の接着斑内局在を見せず、細胞質中に拡散していた。
層間修飾無機イオン交換体をホストとする分子識別反応場の設計と応用

1層状化合物の架橋による分子ふるい性剛空間反応場の設計層状粘土化合物の層間に金属酸化物架橋体、金属超微粒子を形成させることにより三次元剛空間をもつ多孔体を合成し、その構造と物性をXRD、BET吸着、化学吸着によりしらべた。さらに、この微細空間によるホスト-ゲストの化学と分子形状認識触媒機能を検討した。その結果、空間の幾何学的サイズと層状構造と架橋体により構成する場の物理的、化学的環境により、ゲスト分子の形状、極性、化学結合などを識別にする、新規な分子認識取り込み機能と分子認識触媒を確認した。2層間インタ-カレ-ト金属錯体による可変空間反応場の設計粘土層間にイオン交換やインタ-カレ-ションで導入した金属錯体と溶媒の選択による、可変層間隔をもつ新規な取り込み場および触媒反応場を形成させ、そのインタ-カレ-ション能、触媒機能を検討した。その結果、ゲスト分子の鎖長、形状、多重結合の認識機能と部分水素化選択性に優れた触媒能を見い出した。3粘土化合物層間の化学修飾による新規反応場の設計層間の水酸基を化学修飾し、親水/疎水性、酸/塩基性の変更と、より高度な化学認識能の付与を試みた。その結果、層間隔の変化、金属錯体の化学的固定化が可能となり、オレフィン類、アセチレンの選択的水素化、共役ジエンの特異的認識などの化学構造認識に優れた反応場の特性を見いだした。[1]合成フッ素雲母の酸化物によるピラリゼーション自由膨潤性のリチウムテニオライト(LTN)、リチウムヘクトライト(LHT)に対するジルコニウムイオンの導入を検討した結果[Zr_4(OH)_8(H_2O)_<16>]^<8+>または[Zr_4(OH)_<12>(H_2O)_<12>]^<4+>として定量的に層間Li^+とイオン交換することを確認した。これらを熱分解して層間酸化物とし、比表面積700800m^2、層間隔が28A拡大した熱安定性の良い酸化物架橋雲母(PLC)を得た。現在、ピラー間隔の評価、架橋層間の物性測定、分子形状認識吸着能を検討中。[2]雲母層間担持金属微粒子の調整と形状選択触媒合成フッ素雲母の層間にイオン交換により[Pd(NH_3)_4]^<2+>、[Ru(NH_3)_6]^<2+>を導入し、水素還元して層間隔と金属粒子径のコントロール(10200A)された層間担持パラジウム触媒を調整し、オレフィンの水素化反応に対する選択性を検討した結果、層間の反応場によるオレフィンの鎖長、側鎖の有無と位置、二重結合位置を識別する選択的触媒能を見いだした。層間の拡大したPLCを担体とすると識別力が落ちることから層間構造の関与を証明した。[3]雲母層間にインターカレートした金属錯体による分子識別触媒遷移金属アンミン錯体またはトリスキレート錯体を層間に導入し、錯体の分子形状、溶媒の極性に応じ層間隔が530Aと大きく拡大し、12層のインターカレート構造の形成を確認した。このインターカレート型パラジウム錯体による各種アセチレンの水素化を検討した結果、分子形状選択性と顕著な部分水素化選択性を見いだした。[4]層間修飾による化学固定基の導入と層間担持金属錯体による分子認識触媒作用さらに安定な層間への担持の目的で層間にアミノ基を導入し、これに活性種のPd(II)錯体を固定した。この触媒も固定基の鎖長と溶媒の種類で層間隔をコントロールでき、モノオレフィン、ジエン類の水素化に顕著な形状、多重結合認識能と共役系識別能を示した。以上の分子認識触媒の成果はまだ現象的段階であるが、さらに広範な系での確認とそのメカニズムの検討、有効な反応への適用を計画している。

1.合成雲母の金属酸化物によるピラリゼ-ションと物性:合成テニオライト、ヘクトライトの層間にジルコニウム、アルミニウムニオブなどの金属ポリカチオンをイオン交換導入、焼成し、金属酸化物架橋粘土化合物(PLC)を合成した。その構造を、XRD,BET比表面積測定により検討;分子認識吸着機能を、形状と極性の異なる各種分子の吸着測定により検討し、ピラ-材料、細孔構造との関連を明らかにした。2.層間担持金属微粒子の調製と形状選択触媒機能:合成母雲の層間にイオン交換導入したパラジウム、ルテニウムのカチオン錯体を還元することにより粒子径のコントロ-ルされた層間担持金属超微粒子触媒を合成し、各種アセチレン、オレフィンの水素化反応を検討した。その結果、鎖長、側鎖、二重結合を識別する新規分子認識機能を明らかにした。3.金属錯体の層間インタ-カレ-トと分子認識触媒機能:遷移金属アンミン錯体およびトリスキレ-ト錯体をヘクトライトにインタ-カレ-トし、溶媒を選択することで0.53.0nmの可変層状空間を調製した。この反応空間の分子認識触媒反応をアセチレン化合物の水素化に関して検討した結果、顕著な形状選択性と部分水素化の反応選択性を得た。4.層間修飾による化学固定金属錯体による分子認識触媒:層間水酸基を化学修飾により鎖長の異なるアミンを導入し、Pd(II)錯体を固定して、直鎖、環状オレフィン、ジェンの水素化を行った結果、顕著な形状、多重結合認識と共役系の識別能を見いだし、新しい触媒反応空間設計への知見を提案した。
蛋白質の細胞内輸送に関与する酵母USOl遺伝子産物の解析

小胞体→ゴルジ体の蛋白輸送に関与する酵母Usol蛋白質は、1790アミノ酸よりなる親水性蛋白で、C末端側約1000アミノ酸がミオシン重鎖のようにcoiled coilのαヘリックスを形成し繊維状の二量体(予想分子量412K)となると予想されている。蛋白質輸送に関与し、やはりcoiled coil型二量体となるSec2蛋白質では、変異体の解析からcoiledcoil部分のみが重要であると報告されている。Usol蛋白質では、カルシウム結合領域と予想した配列にアミノ酸置換を導入しても機能に影響がないことを明らかにしたが、それ以外は検討していなかった。そこで、137番から509番まで372アミノ酸をフレームを合わせて欠失した変異体を構築したところ、変異蛋白質は細胞内で安定に存在するにもかかわらず、温度感受性usol-1変異を相補できなかった。このことは、Usol蛋白質の場合はcoiled coil以外の領域も機能的に重要であることを意味している。東京大学の若林研究室との共同研究により、精製Usol蛋白質を電子顕微鏡で観察したところ、2つの球状頭部と約150nmの長さの繊維状尾部からなる蛋白質であることが明らかになった。尾部には折れ曲がりやすい箇所があり、これはアミノ酸配列からcoiled coilを作りにくいと予想される位置と一致していた。これらの観察はこれまでの配列上および生化学的な解析結果を完全に支持している。細胞破砕液の分画実験からUsol蛋白質はほとんどすべて可溶性画分に回収され膜構造体画分には認められなかった。しかし、蛋白質の小胞輸送という機能から考えると、in vivoでは一時的にしろ膜構造体と相互作用することが期待される。そこで、免疫染色により細胞を観察したところ、Usol蛋白質の存在を示す蛍光は核を除く細胞質全体に均一に認められるが、その中に数個ずつの更に濃く染められている斑点がみられた。このような染色はゴルジ体と類似しており、Usol蛋白質がゴルジ体と相互作用している可能性が示唆された。
ターゲットメタボローム法を用いた網羅的薬物毒性機序の解析と新規毒性評価法の研究

薬毒物による事案において、その薬物が死因にどのように、またどれだけ影響したかを検討することは法医実務上重要であるが、数多くの薬毒物の内その毒性機序が明らかなものはごくわずかであり、また複数の薬物が相乗的に作用した際には、これらがどのように死因に寄与したかを推測することは大変困難である。そのため薬毒物の毒性や機序をより簡便にかつ薬物間の毒性を比較する手法の確立が法医学上求められている。そこで本研究ではターゲットメタボロミクスの手法を用いて、薬毒物によって変動するシグナル経路を特定し毒性機序を検討、さらに変動する代謝物の増減を数値化することにより毒性を評価することで、薬物間の毒性比較を行い、法医鑑定に有用な新規毒性評価法の確立を目的としている。昨年よりガスクロマトグラフGC-MS/MSでのターゲットメタボロミクスの解析法の構築が行えたことから、覚せい剤メタンフェタミン、覚せい剤と構造類似物であり覚せい剤原料に属するノルエフェドリン、その他ベンゾジアゼピン系睡眠導入剤や向精神薬など種々の薬物におけるメタボローム解析を実施した。その結果、各薬物において特徴的な代謝物の変動がみられ各薬物の毒性機序の検討に使用できる可能性が示唆された。興味深いことに覚せい剤メタンフェタミンと構造類似物ノルエフェドリンでメタボローム解析を実施し、多変量解析により分類できるかを検討したところ、構造類似物間においても明確に代謝物の変動パターンから分類することが可能であった。そのため今後は構造類似物が多く存在し、作用機序の多くが未だ不明である危険ドラッグ成分の毒性機序解析に本解析法が利用できることが期待される。薬毒物による毒性機序の解明と毒性評価は法医実務上重要であるが、数多存在する薬毒物の内その毒性機序の詳細が明らかなものは少なく、また近年では危険ドラッグ成分など未だその毒性が不明な薬物も多く存在する。そのため薬毒物の毒性および機序をより簡便にかつ各薬物間での差を比較する手法の確立は法医学上急務となっている。そこで本研究では最新のターゲットメタボロミクスの手法を用いて、薬毒物によって変動するシグナル経路を特定、さらにそれら薬毒物によって変動する代謝物の増減を数値化し毒性を評価することで、薬物間の毒性を比較し、最終的には毒性未知の薬物による細胞毒性の法医鑑定に有用な新規毒性評価法の確立を目的としている。当該年度では現在既に開発済みである解糖系、TCAサイクルなど細胞生存に係わる経路、アラキドン酸カスケードなどの生体の恒常性シグナルに関与する脂質メディエーターに加え、コレステロール、ステロイドホルモン合成経路や各種過酸化脂質など生理活性分子に対するメタボローム解析メソッドを作成を行った。また当初予定していた液体クロマトグラフ質量分析器(LC-MS/MS)に加えガスクロマトグラフ質量分析器(GC-MS/MS)も使用出来ることになったため、こちらのメソッドの構築にも着手を開始した。ここで作成されたメソッドの一部を用い、培養細胞におけるノルエフェドリンの細胞毒性にコレステロールの細胞内蓄積が関与することも明らかとなった。解糖系、TCAサイクルなど細胞生存に係わる経路、アラキドン酸カスケードなどの生体の恒常性シグナルに関与する脂質メディエーターに加え、コレステロール、ステロイドホルモン合成経路や各種過酸化脂質など生理活性分子に対するメタボローム解析メソッドを作成が進み、さらにガスクロマトグラフ質量分析器(GC-MS/MS)も使用出来ることになったため、こちらのメソッドの構築にも着手を開始できている。また、実際にノルエフェドリンの神経細胞毒性機序の一因を解析するに至った。昨年度より当初予定していた液体クロマトグラフ質量分析器(LC-MS/MS)に加えガスクロマトグラフ質量分析器(GC-MS/MS)が使用できることになったことからGC-MS/MSでのメタボロームメソッドの構築を行っており、当該年度ではLC-MS/MS同様に各種アミノ酸・糖類・脂質など生理活性物質の測定が可能となった。昨年までの研究では、培養細胞における覚せい剤原料エフェドリン類による細胞毒性においてコレステロールの細胞内蓄積の関与を明らかにしていたが、さらに当該年度において新規作成したメソッドでのGC-MS/MSメタボローム解析により、ノルエフェドリン刺激後に糖原性アミノ酸を中心とした糖代謝への影響を及ぼすことや、抗酸化効果を有するグルタチオン等への影響が明らかとなった。当初予定していたLC-MS/MSでのターゲットメタボローム解析に加え、平成29年度において新規作成したメソッドでのGC-MS/MSメタボローム解析に着手しており、実際ノルエフェドリン刺激後に糖原性アミノ酸を中心とした糖代謝への影響を及ぼすことや、抗酸化効果を有するグルタチオン等への影響が明らかとなり、ノルエフェドリンの神経細胞毒性機序の一因の解析に至っている。

薬毒物による事案において、その薬物が死因にどのように、またどれだけ影響したかを検討することは法医実務上重要であるが、数多くの薬毒物の内その毒性機序が明らかなものはごくわずかであり、また複数の薬物が相乗的に作用した際には、これらがどのように死因に寄与したかを推測することは大変困難である。そのため薬毒物の毒性や機序をより簡便にかつ薬物間の毒性を比較する手法の確立が法医学上求められている。そこで本研究ではターゲットメタボロミクスの手法を用いて、薬毒物によって変動するシグナル経路を特定し毒性機序を検討、さらに変動する代謝物の増減を数値化することにより毒性を評価することで、薬物間の毒性比較を行い、法医鑑定に有用な新規毒性評価法の確立を目的としている。昨年よりガスクロマトグラフGC-MS/MSでのターゲットメタボロミクスの解析法の構築が行えたことから、覚せい剤メタンフェタミン、覚せい剤と構造類似物であり覚せい剤原料に属するノルエフェドリン、その他ベンゾジアゼピン系睡眠導入剤や向精神薬など種々の薬物におけるメタボローム解析を実施した。その結果、各薬物において特徴的な代謝物の変動がみられ各薬物の毒性機序の検討に使用できる可能性が示唆された。興味深いことに覚せい剤メタンフェタミンと構造類似物ノルエフェドリンでメタボローム解析を実施し、多変量解析により分類できるかを検討したところ、構造類似物間においても明確に代謝物の変動パターンから分類することが可能であった。そのため今後は構造類似物が多く存在し、作用機序の多くが未だ不明である危険ドラッグ成分の毒性機序解析に本解析法が利用できることが期待される。当初メタボローム解析に使用予定であった液体クロマトグラフ質量分析器(LC-MS/MS)に加え、平成29年度ではガスクロマトグラフ質量分析器(GC-MS/MS)も使用できるようになった。そのためより広範な代謝物解析が行えるようになったのに伴い、これまで液体クロマトグラフ質量分析器で計測を行った薬毒物処理サンプルの再解析をガスクロマトグラフ質量分析器を用いて行う予定である。また当初の予定通り、ある程度毒性および機序の推測が可能な、覚せい剤(メタンフェタミン)、覚せい剤類似物(ノルエフェドリン)、抗精神薬(ハロペリドール)、局所麻酔薬(コカイン)で行い、適宜対象薬物を増やし各薬物間の代謝変動の比較を行う。最終的には危険ドラッグ成分(αPVP、ADB-FUBINACA等)などの毒性未知成分との比較検討を行い毒性機序・毒性の評価を行っていく予定である。一方で代謝物の抽出法に関しては、各代謝物で抽出効率が大きく異なることも示唆された為、今後効果的な抽出法の検討を並行して行う予定である。当初予定していた液体クロマトグラフ質量分析器(LC-MS/MS)に加えガスクロマトグラフ質量分析器(GC-MS/MS)が使用できることになった。一方でLC-MS/MS、GC-MS/MSは誘導体化の必要の有無や、測定対象物によっては検出感度の違いがあることから、分析機器間でのデータの比較を行い、対象代謝物によって適宜使用機器を使い分けることを検討する予定である。また平成30年度が最終年度となるため、当初予定していたメタボローム解析と遺伝子発現解析等を組み合わせたトランスオミクスによる細胞毒性機序の検討を行う予定である。
線維芽細胞成長因子および神経伝達物質が唾液腺細胞の分裂増殖に与える影響について

本研究では3T3細胞をfeeder layerとして用いることにより、ラット正常唾液腺細胞の選択的平面培養を確立した。培養唾液腺細胞は3T3細胞を排除しながら増殖し、コンフルエントになる段階でほぼ上皮細胞のみとなる。この細胞を継代し、以下の実験に用いた。培養された細胞はPAS染色、抗アミラーゼ抗体による免疫染色で陽性像を示し、透過型電子顕微鏡において分泌顆粒が認められた。培養細胞は形態学的に腺房細胞類似の性質を有していた。同様にヒト顎下腺細胞についても培養を行い、形態学的に類似の細胞を得ることができた。また、ラット唾液腺細胞に対するfura-2を用いた生理学的な検討では、カルバコールに対し単離唾液腺細胞と同様の反応性を示した。次にVIP、substancePがラット培養唾液腺細胞の増殖能に及ぼす影響について検討を行った。同細胞に対し、isoproterenolでは明らかな総細胞数の増加とBrdU陽性細胞の増加を示したのに対し、VIP、substancePでは有意な増殖の促進は認められなかった。ラット唾液腺細胞およびヒト顎下腺細胞を用いた実験で、FGF-2は培養4日目より有意に培養細胞の増殖を促進した。また、濃度による違いでは、100ngで最大の効果を示し、それ以上の濃度では一定となった。以上から、FGF-2においては直接唾液腺細胞に対し増殖促進に働くことが明らかとなり、将来萎縮した唾液腺に対する治療目的での投与の可能性が示された。一方、in vivoでは増殖促進作用が報告されているVIPやsubstancePにおいては、単独での直接の作用は無いかあるいはごく弱く、今後は他の生理活性物質との相互作用について解明すべきと考えられた。
ミズクラゲのストロビラ形成期に発現するホメオボックス遺伝子の同定

ホメオボックス遺伝子の多くは、動物の頭尾軸に沿った体の部分構造のパターン形成に関与する遺伝子である。現在、多種の動物にホメオボックス遺伝子が存在することが判明している。ホメオボックスによりコードされるホメオドメインのアミノ酸配列は、相同遺伝子間で、進化的に高度に保存されている。頭尾軸をもつ最も下等な動物である刺胞動物にも、ホメオボックス遺伝子の存在することがヒドロ虫類、花虫類で報告されている。刺胞動物のもう1つの類である鉢虫類に属するミズクラゲは、鉢ポリプの頭尾軸に沿った体幹部にくびれが複数個(7-8個)生じ(分節化)、ストロピラに変態する。そして各くびれ部分は各々エフィラに変態する(最も基部の部分は鉢ポリプとなる)。私はホメオボックス遺伝子がこの変態過程で発現しているのではと考えた。そこで本研究ではミズクラゲのホメオボックス遺伝子を同定することを第一目的とした。ミズクラゲポリプ個体からDNAを抽出し、ホメオボックス塩基配列特異的変性プライマーでPCR反応を行い、期待される大きさの増幅DNA断片(116bp)をベクタープラスミドに挿入し、大腸菌に感染させ、ライプラリーを得た。各プラスミドDNAを精製し、塩基配列を決定し、ホモロジー検索を行った。その結果、現在までにミズクラゲに存在する7つのホメオボックス遺伝子を発見し、DNAデータベース(DDBJ/EMBL/Genbank)に登録した。neo Scox1(DDBJ/EMBL/GENBANK No.AB037147)、Scox9(No.AB035803)、Scox3(No.AB037148)、Scox2(No.AB036330)、Scox6(No.AB036331)、Scox7(No.AB036691)、Scox8(No.AB036692)。現在、各遺伝子のCDSを明らかにしつつあり、in situハイブリダイゼーションを行う予定である。そこで本年度ではミズクラゲのホメオボックス遺伝子を同定することを目的とした。ミズクラゲポリプ個体からDNAを抽出し、ホメオボックス塩基配列特異的変性プライマーでPCR反応を行い、期待される大きさの増幅DNA断片(116bp)をベクタープラスミドに挿入し、大腸菌に感染させ、ライブラリーを得た。Neo Scox1(DDBJ/EMBL/GENBANK No.AB037147)、Scox9(No.AB035803),Scox3(No.AB037148),Scox2(No.AB036330),Scox6(No.AB036331),Scox7(No.AB036691),Scox8(No.AB036692)。今後は各遺伝子のCDSを明らかにし、in situハイブリダイゼーションを行う予定である。

各プラスミドDNAを精製し、塩基配列を決定し、ホモロジー検索を行った。その結果、現在までにミズクラゲに存在する7つのホメオボックス遺伝子を発見し、DNAデータベース(DDBJ/EMBL/Genbank)に登録した。neo Scox1(DDBJ/EMBL/GENBANK No.AB037147)、Scox9(No.AB035803)、Scox3(No.AB037148)、Scox2(No.AB036330)、Scox6(No.AB036331)、Scox7(No.AB036691)、Scox8(No.AB036692)。現在、各遺伝子のCDSを明らかにしつつあり、in situハイブリダイゼーションを行う予定である。
自己免疫性TSH受容体疾患の概念、成因および自己免疫機構の分析

自己免疫性TSH受容体疾患の概念、成因および自己免疫機構について研究し、以下の成果を得た。1.自己免疫性TSH受容体疾患の概念RFLP法を用いたHLA分析で、バセドウ病と橋本病がDP領域に有意差があることを先に報告したが、ブロッキング抗体による低下症がバセドウ病の類縁であり、特発生機能低下症と著差を示すこと、バセドウ病甲状腺上皮にDPの強い発現を認めることから、自己免疫性TSH受容体疾患の概念を確立した。2.成因TSH受容体抗体産生機構を分析し、TおよびBリンパ球のエピトープの多様性を認めた。さらに、TSH受容体上のNo.355の近辺部位が受容体抗体産生に重要であること、この部位を削除したcDNAによって受容体の持続的活性化がおこることを認めた。この部位に合致する合成ペプチドを用いたモノクローナル抗体を作成し、刺激抗体およびブロッキング抗体が産生されることを認めた。3.抗体イムノグロブリン遺伝子の解析患者Bリンパ球のクローニングを行い、バセドウ病の刺激抗体とTSH結合阻害抗体が異なったリンパ球の産物であるこ、ブロッキング抗体による低下症では結合阻害抗体が全てブロック作用を示し、一部後者のみのクローンがあることを認めた。各々のイムノグロブリン遺伝子を解析し、さらに得られたV_H、V_Kをマウスミエローマ細胞に導入して、刺激抗体を人工的に作成し得た。4.自己免疫機構の分析本邦における自己免疫性TSH受容体疾患は、HLA-DPと関連が深く、これを介したTリンパ球活性化が示唆された。受容体抗体はNo. 355近辺部位が先ず感作され、次いでデタ-ミナントスプレディングがおこって刺激抗体やブロッキング抗体が産生されると推定された。本年度研究計画として提出したもののうち1)HLA-DPの意義に関する研究は、バセドウ病、橋本病および正常甲状腺細胞を用いて、HLA-DP、-DQおよび-DPの特異抗体による染色性を検討し、自己免疫性甲状腺疾患では他臓器細胞と異り-DPの発現度が高いことを認めた。2)TSH受容体上の自己抗体のエピトープ部位の研究は、合成ペプチドを用いて甲状腺刺激抗体(TSAb)にheterogeneityが存在することを明らかにし、さらに複数ペプチドの混合実験を通じ、TSAbが受容体上の複数部位を同時に認識していることを示すとともに、受容体の立体的構造を示唆する知見もえられつつある。ペプチドに対するTSAbモノクローナル抗体も作製し、これが他部位に対しても反応すると云う極めて興味深い成績も得られつつある。甲状腺機能低下症患者末梢血Bリンパ球のクローニングから、阻害型受容体モノクローナル抗体を得、この性状の分析も進められている。3)Tリンパ球に対する免疫原性部位の研究は、バセドウ病患者末梢血から受容体ペプチドに特異的反応性を示すTリンパ球ラインを作成することに成功し、Tリンパ球受容体の解析を行って、その限定的使用がみられることを示した。免疫原性部位としては、TSH受容体の細胞外ドメインのみならず、膜貫通部位にもTリンパ球増殖刺激性があることを示し、Bリンパ球の認識抗原部位とは異ることを示唆する所見を得ている。これらの研究は、いづれも独創的なものであり、その成果に大きな期待が持たれるが、初年度の成果はなお未完成なものに留まっている。平成7年度の研究成果は、以下のように要約される。(1)正常および自己免疫性甲状腺疾患の甲状腺組織標本を、HLA-DR、-DQおよび-DP抗体で染色し、-DRのみでなく、-DPが強く発現されていることを認め、HLA-DPの本症候群における特異的関与を示唆する成績を得た。

(2)TSH受容体ペプチドプチドの存在下で、バセドウ病患者末梢血Tリンパ球のライン化に成功し、T細胞受容体の限定的使用を認めた。(3)TSH受容体抗体による甲状腺機能低下症患者の末梢血Bリンパ球のクローニングを行い、TBII陽性のものは全てTSBAbを有すること、一方、TBII陰性でTSBAbのみ陽性のものがあることを明らかにした。また、IgG抗体産生クローンの作成法を検討し、有効性を認めた。(4)TSH受容体ペプチドプチドを用いて、バセドウ病患者TSAb反応性を検討しTSH受容体上に複数の抗原部位があること、これらが同時または別々にTSAbに結合すること、一患者でも多様なTSAbを持つことなどを明らかにした。(5)TSH受容体特異構造部位である317-366番のアミノ酸を欠く変異受容体cDNAをCOS-7細胞に移入し、この細胞のcAMP基礎値が上昇することを認め、この部位に対する抗体がcAMPを上昇させる機序の一端を明かにした。TSH受容体抗体のうち、甲状腺刺激活性を示すTSAbの構造と機能、さらにTSH受容体上の作用部位について研究し、以下の成績を得た。(1)TSH受容体特異構造部位(アミノ酸no.354-367)に合致するペプチドと、他の受容体ペプチドの混合実験により、受容体上の複数部位が関連してTSAbのエピトープを構成していることを認めた。(森、須川)(2)特異構造部位のペプチドに対するモノクローナル抗体を作製し、この一部がTSAb活性を持つこと、さらに、上述の他受容体部位ペプチドと交叉反応性を示すことを認め、デタ-ミントスプレディング現象と考えた。(須川、森)(3)上記部位を欠失した変異DNAを移植した細胞は、持続的活性化を示した。(小杉、森)以上の成績から、当該特異構造部位のTSAB産生上の意義が明らかとなった。(4)患者Bリンパ球をクローニングし、TSAb、TSBb産生クローンを得、この構造解析を行ったが、これによって得られたV_HおよびV_K領域DNAのリコンビネーションを行い、マウスミエローマ細胞を用いて人工的にヒトTSAbを産生する系を確立した。未発表ではあるが、TSAAbのリコンビナント作製にも成功した。(赤水、森)以上は、TSH受容体の作用、産生機序等について意義深い知見である。
異常リソソーム系モデルにおけるアミロイド蛋白生成過程の解明

これまでアルツハイマー病(AD)脳に特有の病変と考えられてきたアミロイドβ蛋白(Aβ)の沈着が、ある種のミオパチー患者の筋病変のrimmed vacuole(RV)にも存在するという報告がなされた。RVはGomori-trichrome染色で赤色の顆粒状物質で縁取られた空胞で、周囲にはリソソーム系酵素活性の上昇が見られることより、autolysosomeの一種と考えられている。従来より、Iysosomotropicな薬剤であるクロロキンはヒトあるいは実験動物にRVを伴う類似のミオパチーを惹き起こすことが知られている。そこで、我々は右後足の坐骨神経を結紮したラットにクロロキンを投与し、ヒラメ筋の病理学的、および免疫組織学的検討を行った。クロロキン投与7日後より筋線維には大小不同、萎縮性筋線維、筋線維の局所的崩壊、筋細胞内空胞が見出された。空胞内には顆粒状構造物が見られ、Gomori-trichrome変法染色で赤色に染め出された。14日後よりこれらの病変は進行し、空胞は著明となり次第に結合織の増生が明瞭となった。電顕的観察ではdense bodyの増加、種々の電子密度の変性産物、myelin様構造、空胞およびこれらの構造物より成る集塊形成が認められ、実験動物の筋病変はヒトの筋病変と極めてよく類似していた。このミオパチーラットの筋病変に免疫病理学的検討を加え、RVにAβ、APPの各領域、APPのN端、およびC端の免疫反応性と、リソソーム酵素であるカテプシンDの局在とが一部一致することを初めて報告した。ADには動物モデルのないことが研究面で大きな制約となってきたが、異常リソソーム系により生ずるこの実験的筋病変はAPPの分解過程やAβの生成、沈着過程を解明する上で有用な実験モデルである可能性が示唆された。現在この実験モデルの筋病変とAD脳のアミロイド病変を比較するために、これまで知られているAβ以外のアミロイド関連蛋白の関与を検討中である。
細胞伸長を制御するホウ酸によるペクチン架橋の形成

植物の一次細胞壁に存在するペクチン質多糖ラムノガラクツロナンII(RG-II)はホウ酸で分子間架橋されており、接着成分として細胞伸長に必須である。ホウ酸架橋されたRG-IIが細胞壁の成分であることに加え、情報分子として植物の成長を制御する可能性が示唆されている。本研究では、「RG-II架橋率の低下がホウ素欠乏を表す指標となり、積極的な応答として成長を抑制する」仮説の検証を目指し、RG-IIのホウ酸架橋による成長の制御の分子機構の解明を目的とした。まず、ホウ酸欠乏下での主根伸長抑制が緩和・解除された「ホウ酸欠乏低感受性シロイヌナズナ変異株」を探索・単離した。EMS処理したCol-0を用い、1万2400のM2種子から22系統を単離した。原因変異のひとつが、真核生物に広く保存された機能未知のゴルジ体局在の膜タンパク質の機能欠損・発現低下であることを見出した。この変異株はペクチン修飾酵素であるPMEの阻害剤EGCGに対する感受性の低下を示し、細胞壁の構造変化に対する感受性が低下していると考察された。この結果は、ホウ素欠乏条件下において、細胞壁の構造異常に応答して根の伸長を抑制する正の因子を同定した成果と考えられた。加えて、その他の変異株の原因変異としてペクチン合成を担うと予想される酵素遺伝子群の機能欠損が見出された。架橋されたRG-IIの絶対量ではなく、相対的な架橋率が成長を決定する要因であると推察され、細胞壁構造変化が無機栄養特性の変化を起こすことが考察された。さらに、標準系統Col-0と比較してホウ酸欠乏下で主根伸長を示すシロイヌナズナのナチュラルアクセッション2系統の遺伝学解析を行ったところ、2系統でそれぞれ異なる領域に原因遺伝子がマップされた。系統によって独立かつ既知の遺伝子座とは異なる新規の遺伝子座がホウ素欠乏耐性を制御していることを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。しかし、複雑な多糖であるRG-IIのホウ酸による架橋反応の分子機構は明らかではない。また、ホウ酸架橋されたRG-IIが情報分子として植物の成長を制御する可能性が示唆されている。本研究では、(1)ホウ酸によるRG-IIの架橋反応に必要な生体分子の同定、(2)「RG-II架橋率の低下がホウ素欠乏を表す指標となり、積極的な応答として成長を抑制する」仮説の検証、を目的とした。(1)では、正常な生育に高濃度のホウ酸が必要である高ホウ酸要求性シロイヌナズナ変異株の解析を行った。変異の原因遺伝子として、病原応答の負の制御因子やビタミンB6代謝に関わる酵素遺伝子が見出された。これら変異株がホウ素依存的な生育を示す報告はなく、ホウ酸が細胞壁架橋とは異なる新規の生理機能をもつ可能性を明らかにした。また、低ホウ酸条件下においてRG-IIへの優先的なホウ酸分配に働くホウ酸輸送体を同定し、RG-IIの効率的なホウ酸架橋形成を担う分子を明らかにした。(2)では、ホウ酸欠乏下での主根伸長抑制が緩和されたホウ酸欠乏低感受性シロイヌナズナ変異株を探索・単離した。原因変異のひとつとして機能未知の複数膜貫通タンパク質の機能欠損が見出された。主根伸長抑制の緩和を示す変異株の存在は、「積極的な成長抑制応答」を支持すると考察される。さらに、同様にホウ酸欠乏下で主根伸長を示すシロイヌナズナのナチュラルアクセッションの遺伝学解析を行い、既知のホウ素栄養に関わる遺伝子座とは異なる複数の遺伝子座による形質制御を明らかにした。ホウ素欠乏土壌と予想される地域由来の株であり、局所的な無機栄養環境への新たな適応機構の解明が期待された。

架橋されたRG-IIの絶対量ではなく、相対的な架橋率が成長を決定する要因であると推察され、細胞壁構造変化が無機栄養特性の変化を起こすことが考察された。さらに、標準系統Col-0と比較してホウ酸欠乏下で主根伸長を示すシロイヌナズナのナチュラルアクセッション2系統の遺伝学解析を行ったところ、2系統でそれぞれ異なる領域に原因遺伝子がマップされた。系統によって独立かつ既知の遺伝子座とは異なる新規の遺伝子座がホウ素欠乏耐性を制御していることを明らかにした。「RG-II架橋率の低下が情報として体内/体外のホウ素栄養欠乏を表す指標となり、積極的に成長抑制応答を起こす」仮説の検証を目指した変異株探索では、ホウ酸欠乏条件下における主根伸長抑制の緩和を顕著に示す独立な複数の変異株の単離に成功した。ホウ酸欠乏低感受性を示す変異株の単離は初めての例である。これらの変異株の存在は「積極的な成長抑制応答」という仮説を支持するものであり、同定された原因遺伝子は成長抑制応答の正の制御因子である可能性が期待された。仮説証明に向けた植物材料の獲得に成功し、さらに原因遺伝子がこれまでに解析されていない機能未知の遺伝子であったことから、植物の新たなミネラル栄養環境応答のしくみの解明が期待された。27年度が最終年度であるため、記入しない。特にホウ酸欠乏低感受性変異株を対象として生理学的および遺伝学的な解析を進め、「RG-II架橋率の低下がホウ素欠乏を表す指標となり、積極的な応答として成長を抑制する」仮説の検証を進める。単離された変異株に対しては、細胞壁合成阻害剤に対する感受性の変化を観察し、細胞壁構造異常が引き起こす成長抑制応答に対する感受性の低下の有無を検証する。また、原因遺伝子を同定後には、発現および機能解析を進める。