hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有機カルコゲン化合物の新機能開発とその利用

キラルセレノキシドの不斉合成に関しては、基本的な方法論を既に確立済みであるが、より広範囲のアルキル、アリール、ビニール基を有するセレニドを合成、その不斉酸化により光学活性セレノキシドを合成しその化学的、物理的性質の検討を行った。得られた各種セレノキシドからキラルハロセレヌランを合成するとともに、ハロセレヌランの求核置換反応によりアルコキシ、アシルオキシ、アルキルセレヌランを不斉合成した。また、活性メチレン化合物とセレノキシド、ハロセレヌランとの反応により各種のキラルセレノニウムイリドを不斉合成した。B)キラルテルル化合物の不斉合成と物理、化学的性質の検討各種のキラルハロテルランの合成に成功し、これらを基礎として、各種のキラルテトロキシドおよびテルロニウムイリドの合成検討を行った。C)カルコゲン原子を含む不斉場を用いる不斉反応の開発上記で合成した各種化合物の内、アリールセレノキシドを用い、新規な不斉プロトン化反応開発へと展開、パラアニシルセレノキシドを不斉プロトン化剤とし、2-ベンジルシクロヘキサノンの亜鉛エノレートを気質とした場合に89%eeが得られた。また、アリルセレノキシド、アリルセレニミドを用いる2,3-シグマトロピー反応を行い、最高で90%eeが得られている。
プロホルモン変換酵素群の発現に基づく新しいがん関連前駆体分泌タンパク質の探索

本研究では、プロホルモン変換酵素群(PCs)の機能を指標に、プロテオミクスを駆使し、腫瘍マーカー候補となる生理活性ペプチド前駆体タンパク質を見出すことを計画した。小細胞肺癌をはじめとした各種がん細胞株ならびにがん患者の臨床検体を用いて、遺伝子発現及びエクソーム解析により、各PC遺伝子の発現、配列ならびにコピー数を明らかにした。これらのデータベースはプロテオーム解析に向けた基盤となる。さらに、臨床検体の遺伝子発現とコピー数データを用いて、オンコジン64遺伝子を含むがん関連遺伝子820種に対する発現亢進と増幅を認めたケースを抽出し、腫瘍マーカーあるいは創薬候補となるドライバー遺伝子を見出した。がんの診断学では、血中腫瘍マーカーの開発はその簡便性や低浸潤性により多大な期待感がある。本研究では、血中に分泌され、かつ安定的に存在し、ELISAで定量可能な新規腫瘍マーカーとなる物質を見出すことを目標に、生理活性ペプチド前駆体タンパク質を標的として探索を行うことを計画した。本計画の背景には、申請者らにより見出された小細胞肺癌に対する腫瘍マーカー候補物質であるニューロテンシン前駆体(proneurotensin/proneuromedin N, proNT/NMN)、ならびに既存の腫瘍マーカーであるガストリン放出ペプチド前駆体(progastrin-releasing peptide, proGRP)の存在がある。生理活性ペプチドは、前駆体タンパク質がプロセシングを受けることにより生じるが、その過程にプロホルモン変換酵素群(prohormone convertasesまたはproprotein convertases, PCs)の関与が示唆されている。こうした経緯から、本研究では、9つあるPCsの働きの違いにより、proNT/NMNやproGRPのような前駆体タンパク質が腫瘍特異的に血中に存在するのではないかと考え、PCsの活性を指標に、プロテオミクスを基盤技術として、腫瘍マーカー候補となる前駆体タンパク質を見出すことを計画した。具体的には、1小細胞肺癌をはじめとした各種がん細胞株におけるPCsの遺伝子発現や配列解析、2proNT/NMN放出細胞株におけるPCs活性を基にした培養細胞上清液中の生理活性ペプチド前駆体タンパク質解析、3候補タンパク質に対するELISA系の確立、4マウスXenograftモデル血中における候補タンパク質の安定性の検討である。計画2年目に当たる平成27年度では、小細胞肺癌細胞株6種、ならびに肉腫関連株20種について、PCsをはじめとした遺伝子発現のデータを取得した。これらは次年度計画するプロテオーム解析に対する基盤データとなる。本研究では、血中に分泌され、かつ安定的に存在し、ELISAで定量可能な新規腫瘍マーカーとなる物質を見出すことが目標である。具体的には、生理活性ペプチド前駆体タンパク質とそのプロセシングに関わるプロホルモン変換酵素群(PCs)活性に注目し、1ニューロテンシン前駆体(proNT/NMN)放出小細胞肺癌をはじめとした各種がん細胞株におけるPCsの遺伝子発現や配列解析、2proNT/NMN放出細胞株におけるPCs活性を基にした培養細胞上清液中の生理活性ペプチド前駆体タンパク質解析、3候補タンパク質に対するELISA系の確立、4マウスXenograftモデル血中における候補タンパク質の安定性の検討を計画した。平成27年度では次の3つの計画を予定した。1)がん細胞株におけるPCsの発現及び遺伝子変異の状態の確定。proNT/NMN細胞外分泌性が明らかな小細胞肺癌細胞株6株(陽性・陰性各3株)に加えて、肉腫細胞株20種についてマイクロアレイによる遺伝子発現データを得た。また、公共DB(CCLE, expO)を参考に、それぞれ細胞株と腫瘍における発現データを検討した。2)細胞株におけるproNT/NMNの細胞外分泌性と発現状態の関連性の検討。これらの関連性からプロテオーム解析用の細胞株を選択する計画である。検討中の段階である。3)がん細胞の培養上清中に分泌されるタンパク質のプロテオーム解析。発現とproNT/NMN細胞外分泌の関連性から絞り込んだがん細胞株について、培養上清液画分に含まれるタンパク質のプロテオーム解析を行う計画である。本解析は、質量分析装置の更新時期と重なったため、あえて古い装置(Hitachi NanoFrontier)での分析を行わず、次年度に高スペックな新しい装置(Thermo Fisher Scientific Q Exactive HF)で行うことにした。

本研究では、血中に分泌され、かつ安定的に存在し、ELISAで定量可能な新規腫瘍マーカーとなる物質を見出すことを目標に、生理活性ペプチド前駆体タンパク質を標的として探索を行うことを計画した。本計画の背景には、申請者らにより見出された小細胞肺癌に対する腫瘍マーカー候補物質であるニューロテンシン前駆体(proNT/NMN)、ならびに既存の腫瘍マーカーであるガストリン放出ペプチド前駆体(proGRP)の存在がある。生理活性ペプチドは、前駆体タンパク質がプロセシングを受けることにより生じるが、その過程にプロホルモン変換酵素群(prohormone convertasesまたはproprotein convertases, PCs)の関与が示唆されている。こうした経緯から、本研究では、9つあるPCsの働きの違いにより、proNT/NMNやproGRPのような前駆体タンパク質が腫瘍特異的に血中に存在するのではないかと考え、PCsの活性を指標に、プロテオミクスを基盤技術として、腫瘍マーカー候補となる前駆体タンパク質を見出すことを計画した。具体的には、小細胞肺癌をはじめとした各種がん細胞株におけるPCsの遺伝子発現や配列解析をもとに、PCs活性を基にした培養細胞上清液中の生理活性ペプチド前駆体タンパク質の存在を検討することである。計画1年目では小細胞肺癌細胞株6種、計画2年目では肉腫関連細胞株20種について、PCsをはじめとした遺伝子発現のデータを取得した。計画最終年度の3年目では、さらに消化器系のがん細胞株を中心に55株について遺伝子発現のデータを取得した。これら細胞株に加えて、臨床検体におけるPC遺伝子の発現、配列ならびにコピー数データをもとに、プロテオーム解析に向けた基盤データベースを作成した。本研究では、プロホルモン変換酵素群(PCs)の機能を指標に、プロテオミクスを駆使し、腫瘍マーカー候補となる生理活性ペプチド前駆体タンパク質を見出すことを計画した。小細胞肺癌をはじめとした各種がん細胞株ならびにがん患者の臨床検体を用いて、遺伝子発現及びエクソーム解析により、各PC遺伝子の発現、配列ならびにコピー数を明らかにした。これらのデータベースはプロテオーム解析に向けた基盤となる。さらに、臨床検体の遺伝子発現とコピー数データを用いて、オンコジン64遺伝子を含むがん関連遺伝子820種に対する発現亢進と増幅を認めたケースを抽出し、腫瘍マーカーあるいは創薬候補となるドライバー遺伝子を見出した。
1993年/94年夏の異常気象の解明

日本において1993年の異常な冷夏多雨と1994年の異常な暑夏少雨が連続して起こった要因を、詳細なデータ解析による実態解明と気候モデルによる理論的な検討から明らかにし、また気候の長期的な変動の中での位置づけを行った。解析的研究により、1993・94年において熱帯の大気海洋系はおおむね対称的なアノマリー分布を示しており、特に熱帯域の子午面循環が大きく異なっていることから、この両年の異常天候には熱帯からの影響が大きいことがわかった。これに対しユーラシア大陸の積雪量や土壌水分および北極海の海氷は、この両年の天候には直接影響していない。1993年については、熱帯からの影響に加えてシベリアの下層大気における亜寒帯ジェット気流の発生とオホーツク海におけるプロッキング高気圧の発達が日本付近への寒気流入の引き金となって気温が著しく低下したことが明らかとなり、1991年のビナツボ火山の噴火の影響も示唆された。同年の多雨については、日本付近の南北の気温傾度が大きいため8月まで梅雨前線が持続強化していた結果であることが示された。いっぽう1994年については、チベット高気圧の東偏とローカルな地表面の乾燥が気温の上昇を増幅させたことが明らかになった。これらの解析的結果は、大気大循環モデルによるこの両年のシミュレーションによりおおむねを支持されるが、とりわけ西部熱帯太平洋域における海面水温の微妙な空間分布の違いがこの両年の天候に影響していることが示された。長期的なデータを用いた解析からは、195060年代および1980年以降に日本の夏季気温の変動幅は大きいことが明らかとなった。また1980年代以降と1970年代以前では日本の夏季気温に影響する大気海洋結合システムが異なること、および北太平洋におけるこのシステムの十数十年スケールの変動がこれに関連していることを示唆する結果を得た。本研究は,93年,94年夏の異常気象の実態をまとめると共に,関連する大気,海洋,陸面等の状態について,現在の知見をまとめた。この結果,93年,94年共,大気大循環の変動パターンに関連した直接的な要因として,熱帯の大気・海洋系,特に海水温,海流系の異常がありそうなこと,同時にユーラシアから北極域での循環場に非常に大きなアノマリーがあり,熱帯の上記の状況と相互作用した結果が現れている可能性などが示唆されている。また,近年の年々変動の振幅が,特に夏を中心として大きくなっていることも,これら2年の対照な異常気象と関連していることも示唆された。過去数十年の日本の大部分の地域で最も低温を記録した1993年冷夏と、最も高温を記録した94年暑夏の2年続きの夏の異常気象について、大気循環、気温・降水量などの大気の状況と、関連する海洋の状況や積雪・海氷などの状況について、ローカル、グローバルの両方の立場からデータ解析を行うと同時に、大気大循環モデル(GCM)を用いた数値実験により、そのメカニズム解析を試みた。また、この2年続きの異常気象が都市気候や植生(光合成活動)に与えた影響なども、同時に調べた。その結果、両年とも、西部熱帯太平洋の海水温と対流活動は、対称的なアノマリーを示しており、熱帯の大気・海洋系の状況が、何らかの役割を果たしていることを示唆している。しかしながら、特に93年冷夏の状況は、熱帯の大気・海洋系のみならず、ユーラシア大陸・北極域の大気循環が作用している結果が示された。特に異常に発達していた極渦がジェット気流の異常をもたらし、さらに偏西風の波の活動に影響を与えることにより、日本付近に寒冷な気団を南下させる循環場を創り出していた。

また、94年には、チベット高気圧の日本付近への張り出しが、下降気流と乾燥した対流圏下層の大気状態を作りだし、乾いた地表面での顕熱加熱が、さらに高温状態を強化したことが明らかになった。さらに、日本付近の海水温も、海流系の長期変動に関連して高温偏差が維持されており、これが大気下層の高温状態の維持にプラスに働いていた可能性も指摘された。大気大循環モデルによる数値実験の結果、ENSOに関連した亜熱帯高圧帯の風(東西成分)を変化させ、この風のアノマリーが、エクマン効果を通して、日本付近の夏の海水温偏差に影響し、さらに気温に影響することが示唆された。筑波大学水理実験センターの圃場での熱収支、炭酸ガス収支と生態学的観測をこの2年で連続して行った結果、冷夏と暑夏の応答して、1年生草本のC3植物とC4植物の分布が変化したことなども報告された。詳しい総合報告は、現在準備中である。
受精と着床に関する基礎研究と応用基盤の構築

受精と着床に関する基礎研究を行い、将来の応用研究の基盤構築を目指した。精子の卵丘細胞塊進入には精子の受精能獲得が重要であり、卵丘細胞塊の細胞外マトリクスと卵子透明帯は、卵子との融合までに精子のアクロソーム反応を完全に起させるためのツールであると考えられた。また、子宮と卵管の分泌液から受精能付与(促進)因子の精製を試み、その因子の添加によって精子と卵子の融合が著しく促進された。さらに、着床痕部位と非着床痕部位での着床決定の分子機構に関して調べ、着床にはERK1/2経路によるERαの活性化が重要な役割を果たしていることが示唆された。マウスでの受精と着床に関する基礎研究を行い、次のような成果を得た。(1)精子と卵子卵丘細胞複合体の相互作用の解析精子の卵子卵丘細胞塊侵入にアクロソーム反応が必要か否かを調べ、アクロソーム反応が必ずしも必要でないことが明らかになった。また、精子が卵丘細胞層通過時にアクロソーム反応するものと卵子透明帯で反応するものが見いだされた。一方、精子ヒアルロニダーゼSPAM1とHYAL5の欠損マウスを解析し、SPAM1が欠損すると卵子卵丘細胞複合体の外部辺縁部に異常に蓄積することが観察された。(2)子宮と卵管での精子受精能獲得機構の解析精子受精能獲得に関与するどのような因子が子宮や卵管から分泌され、精子細胞膜上でどのように機能しているのかをPRSS21欠損マウス精子を利用しながら調べた。性腺刺激ホルモンによる過排卵処理をしたマウス子宮と卵管から分泌液を調製し、精子受精能付与因子を各種クロマトグラフィーで精製した。現在、その化学構造の決定を行っている。(3)胚盤胞胚と子宮内膜上皮細胞の接着機構の解析胚盤胞胚が子宮内膜上皮細胞に接着・結合する際に機能する因子群を同定し、それらの機能解析によって着床の仕組みを理解することを目的として、まず、着床部位の特定方法を確立した。また、胚と着床部位上皮細胞の接着を調べるために、胚盤胞胚の透明帯を除去し胚表層のタンパク質を標識後に抽出した。それらが子宮着床部のどこで結合するかを調べたが、明確な結果を得ることができなかった。今後は、視点を変えて新しい実験系を確立させる予定である。精子の卵子卵丘細胞塊侵入に精子プロテアーゼが関与しているのかを明らかにするために、トリプシンインヒビターであるパラアミノベンザミジン存在下で体外受精試験を行った。パラアミノベンザミジンが存在すると精子はほとんど卵子卵丘細胞塊へ侵入できず、このため精子が卵子透明帯へ到達できなかった。また、SPAM1欠損精子で見られる卵子卵丘細胞塊外部辺縁部への異常蓄積は見いだせなかった。したがって、精子の卵子卵丘細胞塊侵入には、精子トリプシン様酵素が機能しており、SPAM1欠損による表現型とは無関係であることが示唆された。これらの可能性を追求するために、SPAM1とACRあるいはSPAM1とPRSS21をダブルで欠損するマウスを作製し、精子の性質を調べた。ダブル欠損オスマウスはいずれもほぼ正常な交配能力をもっていたが、体外受精試験を行うと、受精能がかなり低下していた。一方、精子の運動性には差異が認められなかったが、卵子卵丘細胞塊侵入と通過での精子の能力は、これらのダブル欠損マウスがSPAM1シングル欠損マウスよりも有意に減少していた。以上の結果から、精子セリンプロテアーゼACRあるいはPRSS21がSPAM1と協働的に精子の卵子卵丘細胞塊侵入と通過で機能していることが示唆された。子宮と卵管での精子受精能獲得および胚盤胞胚と子宮内膜上皮細胞の接着の機構に関しても検討を加え、いくつかの候補機能分子を同定したが、明確な結論を得るまでには至らなかった。受精と着床に関する応用基盤の構築を目指した基礎研究を行い、次のような成果を得た。まず、精子が卵丘細胞塊へ進入する際にアクロソーム反応が必要かどうかを調べた。野生型マウス精子を用いて受精能獲得処理中に自発的アクロソーム反応した精子をFITC標識した抗IZUMO1抗体で、また精子細胞核をHoechstで蛍光標識し、卵丘細胞塊へ媒精した。一定時間経過後に新しくアクロソーム反応した精子を免疫染色し、卵丘細胞塊表面、卵丘細胞塊の細胞外マトリクス、および卵子透明帯に存在する精子数を算出した。その結果、すでにアクロソーム反応している精子も未反応な精子も卵丘細胞塊へ進入し、卵子透明帯まで到達できることが明らかになった。次に、精子細胞膜に局在するヒアルロニダーゼSPAM

1の欠損マウス精子を使って同様の実験を行うと、すでにアクロソーム反応を起こしている精子はほとんど卵丘細胞塊へ進入しなかった。また、卵丘細胞層通過時にアクロソーム反応を起している精子が有意に見いだされた。このように、精子の卵丘細胞塊進入にはアクロソーム反応が未反応であることが必要であり、透明帯通過までにその反応が起こることが示唆された。一方、着床部位決定機構に関しても検討を加えた。経産マウスでは、子宮内に出産痕が形成されて新規着床が起こらないことを利用して、着床痕部位と非着床痕部位での着床決定の分子機構に関して調べた。結果として、経産マウスの着床にはERK1/2経路によるERαの活性化が重要な役割を果たしていることが示唆された。受精と着床に関する応用基盤の構築を目指した基礎研究を行い、次のような成果を得た。まず、精子トリプシン様プロテアーゼACRとPRSS21をそれぞれ欠損するマウスの精巣上体精子を用いて、精子の卵丘細胞塊への侵入と卵丘細胞層通過でのプロテアーゼの役割を調べた。受精能獲得後に卵丘細胞塊へ媒精し、卵丘細胞塊表面、卵丘細胞塊の細胞外マトリクス、および卵子透明帯に存在する精子数を算出した。その結果、PRSS21欠損精子は野生型精子と類似した挙動であったが、ACR欠損精子の卵丘細胞層通過が有意に遅延していることが明らかになった。また、精子ヒアルロニダーゼSPAM1とHYAL5、およびACR、PRSS21を個別に精製し、卵丘細胞層分散を指標としてそれぞれの相互作用を検討したところ、その分散速度はヒアルロニダーゼ単独の場合と比べてヒアルロニダーゼとプロテアーゼを共存させた時に著しく増加することが明らかになった。しかし、ACRとPRSS21単独では卵丘細胞層の分散はほとんど見いだせなかった。これらの結果は、卵丘細胞層に存在するヒアルロン酸が卵丘細胞同士の接着で重要であるが、その維持にはセリンプロテアーゼ感受性のタンパク質も機能していることを示唆している。一方、子宮と卵管分泌液に存在する受精能付与(促進)因子の同定とその機能の解析を行うために、マウス卵管分泌液から精製を試みたが量的な問題があり、ラットでも同様の操作を行った。精製標品をLC/MS/MSやNMRで分析したが、依然としていくつかの分子が混入しており、さらに精製が必要であることが判明した。また、この因子の機能を調べたところ、卵子と融合できない精子でも顕著に融合を促進できることが明らかになった。この研究課題の当初目的は、受精と着床に焦点を当てて、それらの基本制御機構を解明することであった。特に、精子と卵子細胞塊の相互作用、子宮や卵管での精子受精能獲得機構、および胚盤胞胚と子宮内膜上皮細胞の接着機構に焦点を絞り、それらの分子基盤を明確にすることであった。現時点で自己点検すると、精子と卵子細胞塊の相互作用、および胚盤胞胚と子宮内膜上皮細胞の接着機構については一定の成果が得られたが、子宮や卵管での精子受精能獲得機構に関する研究がやや遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。この研究計画の変更や研究を遂行する上での大きな問題点などは、特にないと考えている。子宮や卵管での精子受精能獲得機構に関する研究課題が遅れているが、これはその精製が非常に難しいためである。また、分泌液中の存在量が微量であることも原因のひとつである。しかし、受精能付与(促進)因子が子宮と卵管分泌液に存在することは明確なので、実験材料をマウスからラットへ変えて打開していく方策が考えられる。
幹細胞の可塑性を制御する遺伝子の探索

幹細胞の分化転換や可塑性はその微小環境(Niche)によって制御を受けていると考えられているがその詳しい機構は分かっていない。本研究では、この幹細胞の分化転換や可塑性の微小環境による制御機構を明らかにするため、不死化した骨髄細胞株を用いて造血微小環境を培養系で再構築し、間質細胞依存に増殖する造血幹細胞株THS119を樹立し、その制御に関わる遺伝子の探索を行った。THS119細胞株は、その細胞表面形質、血球細胞特異的転写因子の発現から極めて幼弱な血球細胞と予想され、間質細胞との共培養によりその増殖が維持され、未分化血液細胞に特徴的な敷石状のコロニーを形成して増殖する。その増殖にはc-Kit-SCF、VCAM-1-VLA4の相互作用ならびに、血清中の脂質成分が必要であることを証明した。THS119細胞は、間質細胞無しではアポトーシスが誘導されるが、間質細胞とサイトカイン共存下で継代すると、間質細胞無しでIL-3あるいはIL-7に依存し増殖するTHS119の亜株が樹立でき、これら細胞株の間質細胞依存的な増殖と、サイトカイン依存的な増殖の相違を調べることにより、間質細胞が幹細胞の維持に必要とする特異的な細胞間相互のシグナルを同定できると考えられる。そこで、これら細胞株の遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイ解析により調べ、サイトカイン依存性増殖と間質細胞依存性増殖における遺伝子発現の顕著な差から、間質細胞依存の増殖経路では、Wntシグナル系の関与を示唆する結果を得た。クローン化された間質細胞株依存的に増殖する造血幹細胞株を樹立するため、造血環境を構成する多様な間質細胞との直接的な細胞間相互作用を介して造血幹細胞が維持されるDexter型の長期骨髄培養(LTBC)をスタートとして培養を行い、クローン化した間質細胞株依存的に増殖する未分化血球細胞の培養系(DFC28)を確立した。DFC-28は、MSS62依存的にLineage-c-Kit+Sca-1low/-という表面マーカーを示す未分化な細胞として維持され、その増殖にはc-Kitとa4b1-integrin (VLA-4)のシグナルが必須であった。DFC-28はMss62との共培養下でIL-7により増殖が顕著に亢進し、BP-1+へと分化していた。一方、IL-7を産生する別の間質細胞株TBR-31-1へ移し共培養すると、BP-1+c-Kit-Sca-1+へ変化し、Pax-5,TdT, Rag-1遺伝子の発現も活性化し、初期のpro-B cell段階へ分化した。この分化は、MSS62との共培養下にIL-7+TBR31-1の培養上清(10%)添加でも誘導されなかったことから、TBR31-1との直接的な接着を介したシグナルが引き金となると示唆された。さらにTBR31-1と共培養したDFC-28を再びMSS62へ戻したところ、分化前のphenotypeに戻ることが分かり、DFC-28は、間質細胞株の選択的支持機能に依存して、その分化の過程が可逆的に制御されることを実験的に示した。この間、PKH-67で蛍光標識して調べた細胞の分裂はわずかであり、この分化能の変化は、全細胞集団がいっせいに分化転換していることが分かった。今後、この分化転換の制御機構を解析する。
視覚情報呈示により誘起される神経科学的作用に因る運動機能回復システムの開発

本研究では,我々が考案した自己運動錯覚誘起課題が,上肢下肢どちらに対しても運動錯覚を誘起することができ,それにより,皮質運動野の興奮性が増大することを示した。また,自己運動錯覚誘起課題と運動イメージ,経頭蓋直流電気刺激などを組み合わせた多重同期刺激を用いると,皮質運動野の興奮性は,長期増強様の効果を示すことが明らかとなった。平成20年度は,我々が考案した上肢の単関節運動の動画呈示による自己運動錯覚の誘起方法(自己運動錯覚誘起課題)が,下肢においても適用可能であるかどうか明らかにすることを目的として研究を行った。自己運動錯覚の評価にはVisual Analog Scaleを用い,さらに,その際の皮質脊髄路興奮性の変化を,経頭蓋磁気刺激による運動誘発電位の変化により検討した。その結果,自己運動錯覚誘起課題を用いることで,標的とした身体部位において自己運動錯覚が誘起されると同時に,皮質脊髄路興奮性は増大する傾向が認められた。このことは,下肢においても,我々が考案した方法によって,自己運動錯覚を誘起できる可能性を示唆している。その一方で,その効果は上肢を対象とした場合の方が強かったことから,自己運動錯覚の程度には身体部位依存性があるものと考えた。また,我々はこれまでに,動画によって呈示される身体の空間位置と実際の身体位置との間に不一致が生じる場合,皮質脊髄路興奮性の変化は認められないことを明らかにしている。今年度はそれに加えて,そのような状況下であっても,動画呈示された身体部位のみを注視するように視野を制限した場合に,皮質脊髄路の興奮性が高まることを明らかにした。これらの結果は,動画呈示による自己運動錯覚の誘起には,動画内の身体位置と実際の身体位置との不一致を視覚的に認識できるかどうかが重要であることを示唆している。このことは,視覚刺激による自己運動錯覚の誘起を臨床症例におけるリハビリテーションに応用するために,重要な知見である。本研究での結果は,関節固定などの身体不活動や脳血管障害による運動機能低下を予防,回復させるための治療的介入において本法を使用する際に留意すべき点に関する基礎資料となる。これまでに我々は,被験者により強く自己運動錯覚を生じさせるために,動画と被験者との身体を可能な限り現実の状態に近づけることが必要であること,さらに両者の位置関係がずれていても,それが視界に入らない状態を実現することによって自己運動錯覚を生じさせることができることを明らかにしてきた。平成21年度は,この自己運動錯覚誘起課題の実施効果を高める方法について,複数の方法を組み合わせる点に着目して検討を行った。具体的には,これまでに我々が開発してきた視覚入力による自己運動錯覚誘起方法に運動イメージ想起を組み合わせて実施した。運動錯覚誘起および運動イメージ想起ともに,実際の運動を伴わないにもかかわらず皮質運動野の興奮性は高まることが報告されている。本研究では,皮質運動野の興奮性を経頭蓋磁気刺激(TMS)を用いて誘発される運動誘発電位(MEP)によって評価した。また,運動錯覚誘起と運動イメージ想起の併用による効果を検証するために,安静状態,運動イメージ想起のみ,運動錯覚誘起のみ,運動錯覚誘起と運動イメージ想起の併用,の4条件を行い,各条件のMEP振幅値を比較した。実験の結果,安静状態よりも運動錯覚誘起,運動イメージ想起,両者を併用した条件で皮質運動野の興奮性は高まることが明らかとなった。さらに,運動錯覚誘起と運動イメージ想起を併用すると,各々を個別に実施した場合に比べて皮質運動野の興奮性はさらに高まることが明らかとなった。これらのことから,関節固定などの身体不活動や脳血管障害による運動機能低下を予防,回復させるための治療的介入において両者を併用することが一つの有効な手段になるのではないかと考えた。平成22年度は,視覚情報呈示により誘起される自己運動錯覚と,皮膚感覚入力,運動イメージ想起,さらに経頭蓋直流電気刺激(tDCS)を組み合わせる(多重同期刺激)ことで得られる皮質運動野における長期増強様効果を臨床応用するための基盤的研究行い,以下のことを明らかにした。1)多重同期刺激による長期増強様効果について多重同期刺激を介入条件として実施した後に運動誘発電位(MEP)の振幅を指標として,皮質脊髄路の興奮性変化を調べた。多重同期刺激を介入方法として用いたときには,介入終了直後,終了後30分を経過した時点まで,MEP振幅値は有意に高値を示していた。この結果から,多重同期刺激を用いることで,皮質運動野の興奮性が増大した持続時間を延長できる可能性があることが示された。2)皮膚感覚入力と運動イメージ想起を実施した際の,H波振幅の変化について皮膚感覚入力および運動イメージ想起をそれぞれ単独で行った場合にはH波の振幅は変化しなかった。しかし,両者を同時に実施することによってH波振幅は増大した。今後,随意運動出力に伴う中枢指令と,皮膚入力による求心性入力とが,どのような機構によって相互に影響しあっているかについて,検討する価値があるものと考えた。3)短期間の関節固定中に行う自己運動錯覚による介入が,運動機能低下予防へ及ぼす影響について手指を12時間固定する間に,自己運動錯覚の誘起による介入を実施した。

その結果,示指最大外転筋力は,固定群で明らかに低下したが,介入群では筋力の低下を予防することができた。しかし,筋出力調節課題の成績が低下することを防ぐことはできず,運動機能検査の性質に依存した効果であることが推察された。自己運動錯覚を臨床症例に応用するにあたり,ポジティブな結果であると考えた。
高圧合成法による新しい有機電導体の構築

本研究の目的は、ダイヤモンドアンビルセルを使った高圧下での有機電導体の合成とその物性の測定である。そのうち、合成に関しては、テトラチアフルバレン(TTF)とクロラニル(CA)やヨ-ダニル(IA)とのCT錯体を、高圧下において、再結晶法で合成したが、得られた結晶は常圧下で合成したものと同じであり、現時点では新しい結晶は得られていない。しかしながら、物性測定に関してはいくつかの成果が得られた。TTFとIAとのCT錯体には1:1組成のものと2:1組成のものが存在し、それらのFT-IRスペクトルの圧力依存性を測定した結果、両者とも圧力誘起中性-イオン性相転移を起こすことがわかった。このように、同じドナ-とアクセプタ-の組み合せから、中性-イオン性相転移を示す2種類のCT錯体結晶が合成されたのは初めてのことであり、本研究における重要な成果の一つである。TTF-IAの結晶構造はTTF-CAのそれとほとんど同じであり、中性-イオン性転移の性格も、本質的にはTTFーCAの場合類似している。相違点としては前者の方が転移圧力が高いこと、また結晶格子の二量化に伴なう電荷移動量の不連続な跳びが小さく、連続的に中性相からイオン性相へと変って行くこと等であるが、これらはいずれもアクセプタ-のハロゲンを塩素から、より大きな原子半径と分極率を持つヨウ素に変えたことの影響が現れたものである。一方、(TTF)_2IAの中性-イオン性相転移の性格は、1:1CT錯体のものとは異なり、新しい種類の相転移といえる。転移圧力以上の領域でTTF分子のC-S伸縮振動の赤外バンドが2本に分裂する現象が見出され、これは高圧相において2:1錯体を構成する2個のTTF分子のC-S結合が歪んで、互いに不等価な構造となっていることを意味する。
意味論・行動論の手法にもとづく自然神学の現代的再構成

死生観をめぐる文化史的思想史的アプローチにより、古代ギリシアにおける宗教儀礼の問題が考察され、こうした原始宗教の層の上にたつ様々な死生観が順次分析されることにより、それが現代の複雑な死生観(臓器移植や尊厳死の構想)の祖型をなすことも明らかになった。同時に「死後の世界」を物語として語るプラトン哲学の論理が究明された。また4世紀に頂点を迎える教父の「創世記」解釈史を辿ることにより、コスモロジーと倫理との関係も従来の哲学史教理史にはない複線的な幅をもって考察されることになった。(荻野)。近世哲学史の場面では、カントから前期フィヒテにかけての展開にあって、従来等閑視されてきた言語論の正確な評価を試み、現代英米哲学おける行為論との対話を開く新たな展望を得つつある。同時に新カント派のエーミルラスクの論理学を再評価することで、科学と形而上学の関係についても従来の科学哲学とは異なる視座を提供しようと考えている。(大橋)。またルソーの原罪論を再考し、シェリングの神話的思考の評価やヘーゲルと聖書解釈の関係など、従来日本人研究者によってはふれられなかった問題意識に立って、啓蒙主義と宗教思想の対立をめぐる単純な図式を修正した。ロマン主義と人文主義の関係を正確に見て取ることにより、またチャールステイラーやルネジラールなど現代哲学との対質によって、自然神学刷新という課題の核心にふれる試みが開拓されつつある(オルバーグ)。今世紀の哲学思想の分野では、ハイデガーにおける「自由」の概念が再考され、また同時期の哲学者ウィトゲンシュタインとの比較を通じて、この問題に関する新たな考察の深まりを期待させるものがある(丹木)。さらにフッサール現象学の基本概念である「エポケー」を軸に「虚構」の概念の分析により、芸術や宗教的表象の現象学を開拓し、さらに「エポケー」概念の歴史的沿革を辿ることにより、古代的懐疑主義の理念から、19世紀オクスフォード運動のニューマンの信仰論、さらにはオカルトなど疑似科学の分析にまで至る展望を開きつつある(塩川)。また近年注目を集めている特異な思想家、ヴァルターベンヤミンの歴史哲学と芸術をめぐる問題をかなり集中的に追うことができた(柿木)。(荻野)。(大橋)。研究計画の第一年目に当たる本年度は予定通り、主として西洋古代・中世から近世にかけての歴史的研究に重点を置いた。(1)アウグステイヌスを代表とする4世紀のギリシア・ラテン教父に見られる聖書解釈理論の発展史的研究(荻野担当)。ギリシア的自然学から解釈学的意味論的な探究への座標軸の変更が重大な意味を持っている点について、中世哲学会の国際シンポジウム(96年11月)での発表「被造性の意味をめぐって」に一応の結実を見た(来年度の学会誌に掲載予定)。またこれらの問題群については、従来の「内在的なテキスト意味論」のみならず、最近の聖書学の領域で注目されている「物語論的テキスト効用論」の研究成果をも参照すべきであるとの見通しを新たに得た。(2)ルソーからヘーゲル、シェリングに至るドイツ観念論における原罪の理解の問題(オルバーグ担当)。

これは本年度の研究のうちで最も自然神学の核心にふれる課題であるが、欧文の著作Die verlorene Einheitにおいて、啓蒙主義と宗教の対立をめぐる単純な図式を修正し、従来の研究の欠落を埋める成果が発表された。ルソーについてはすでに日本語でも発表され、ヘーゲルについては次年度早々にも日本語で公表される。(3)カントから前期フィヒテにかけてのドイツ観念論の展開において、従来等閑視され、誤解に晒されていた「言語論」の正確な評価を試み、日本カント協会で発表した(大橋担当)。これによって近世哲学史の見方を是正すると共に、超越論哲学と英米における主流である分析哲学の新たな架橋が可能になりつつあることも重要な成果である。(4)テクスト・データベースの活用による新たな確実性と包括性を備えた文献研究については、まだ十分まとまった成果を見ず、次年度以降の課題としたい。研究計画の第二年目に当る97年度は、前年の成果を深化させる方向で、全般に着実な進展を見た。(1)アウグスティヌス研究では、4世紀に至る教父的聖書解釈(特に創世記)の発展史的研究が現代聖書学の方法との対比によってまとめられ、ほぼ結論に達した。同時に、死生観に関して『告白』における<二人称の死>(この表現は柳田邦男『犠牲』による)の問題が新たに開拓され、現代の生命倫理学と対話する場面が開かれつつあり、詳細は次年度に東京大学出版会より共著として刊行される予定である。(以上荻野担当)(2)西洋近代の個人主義の伝統と対比されがちな没論理的現代日本の倫理状況については、坂口ふみ『個の誕生』(岩波書店)を素材に個人倫理の構成における論理の機能が分析され、近代的自我の両義牲が強調された。新カント主義論理学の1920年代ドイツにおける展開を踏査することが次年度の課題である。(以上大橋担当)(3)近世哲学史における自然神学の歴史的研究の分野では、新たにヘーゲル『精神現象学』冒頭の6章分を、創世記J資料の堕罪物語の註釈として読むという斬新な構想を示し、哲学と神学の関係に新たな照明を当てる研究として、ヘーゲル研究者の間で反響を呼んだ。(以上オルバーグ担当)(4)現代の現象学的人間論の分野では、フッサール現象学の基本的方法である「還元」の構造を究明し、エポケ-との類似性をもつ懐疑、及び美的中立変様と比較しつつ、真実/虚偽、現実/虚構などの様相転換を通して、現実を反省する態度が生じる契機を考察した。還元の特異性は「対象」とその「現出」の二項図式を超える点にあり、芸術の虚構的表現の分析が今後推進されるべき問題の焦点である。(以上塩川担当)(5)テクストデータベースの活用については、荻野が96年8月に上智大学の学内共同研究の一環として新規ホームページを開設し(http://pweb.cc.sophia.ac.jp/h-ogino/html)、内外の研究者との連絡を図る。特に米国タフツ大学のPerseus-projectとリンクを張り、また国内の多言語入力方式を模索するmule-projectとも連絡を取っている。研究計画のまとめに当たる98年度は当初の予定通り、現代哲学の動向の中からいくつかの注目すべきトピックとの対話を通じて、自然神学の体系的展開の可能性を探り、当面の成果をとりまとめる方向で研究の進展を図った。(1)形而上学と脱構築の関係をめぐるテクスト、エクリチュールの問題に関して、これまで顧みられなかった視角からプラトン哲学とプラトン主義との関係を再考。思想内容ではなく「テクストとしての形而上学」の可能性を改めてギリシア哲学の思想圏に探った。
日本的生産システムの再編期における小集団活動の研究

1980年代半ばに最盛期にあった日本の小集団活動は、長期不況や製造拠点の海外展開、新たな経営手法への転換などにより、1990年代以降に実施する企業が少なくなった。しかし現在でも根強く小集団活動を続ける企業がある。そのような企業は従業員が継続的に改善をおこなうことに意義を認めている。普及団体や実施企業も産業構造の変化を敏感に捉えて、新たなニーズを発掘しながら多様な形態での小集団活動を模索している。本研究は日本企業の小集団活動の現状を調査することを目的としている。小集団活動は日本の製造現場を中心に、現在も活発に展開されている。具体的には以下のことがらを明らかにしたい。(1)現在活発に小集団活動を展開している企業は、どのような特徴をもち、それにどのような効果を期待しているのだろうか。(2) 1990年代以前の活動の特徴とどのような異同があるのだろうか。(3)技能者を対象とした能力開発体系において、小集団活動はどのように位置づけられているのだろうか。(4)製造現場の技術革新の進展や雇用形態の多様化のなかで、小集団活動はどのような影響を受けているのだろうか。(5)小集団活動に関与する労働者は、その活動に対してどのような意識をもっているのだろうか。(6)いわゆる「2007年問題」にともなう技能伝承において、小集団活動はどのように活用されているのだろうか。(1)雑誌論文の執筆平成19年度は、日本における小集団活動の誕生とその後の展開について、一般読者(企業の管理職層)を対象にした雑誌論文を執筆した。社会科学系の研究者がおこなった、小集団活動に関する研究は一般にはそれほど知られていないため、社会科学的視点から見た小集団活動を企業関係者に触れてもらうにはよい機会を得た。(2)普及団体の関係者を対象とする聞き取り調査小集団活動の著名な普及団体(1団体)で活躍する外部研究者と事務局を対象に、1990年代以降の動向について聞き取り調査を実施した。その結果、1990年代および2000年代を通じて、小集団活動の活動形態や普及団体の支部の普及形態が、1980年代と比較して大きく変化していることがわかった。1)小集団活動の活動形態1980年代は製造現場を中心とする継続的・同一職場型の活動が中心であった。1990年代以降は事務部門や開発部門を巻き込んだ、プロジェクト的・職場横断型の活動の比重が高まってきた。かつては製造業を中心に普及してきた活動だが、福祉・医療産業にもこの活動が普及している。また、職場の既存の問題解決を目的とする改善活動だけでなく、新たな職場の課題の達成を目指す活動も増加している。2)普及団体の支部の活動形態1990年代以降の人員削減や製造拠点の海外移転の結果、日本各地の普及団体支部で普及啓発をおこなう企業関係者の数が減っている。しかしそれは小集団活動の意義が減じたことを意味しない。企業不祥事の相次ぐ中、どう小集団活動の普及と底上げを図るのかが、課題のひとつとして浮上している。(1)普及拠点の企業関係者への聞き取り調査平成20年度は地域における小集団活動の普及拠点である4団体に、近年における小集団活動の変化について聞き取り調査を実施した。1990年代の長期不況によって企業の教育訓練費用が削減されたこと、それによって各社の小集団活動関連費用も削減されたこと、小集団活動を実施する企業が減少することによって、企業を超えた推進者間の協力体制にも支障が生じたことである。従来は各地域の拠点を代表する幹事長会社に、企業間協力のための運営業務が集中していた。運営に協力する企業が減少したため、この運営方式では幹事長会社の負担が過大に増加した。各社とも人員削減や経営改革により、少ない要員で業務をおこなってきたが、小集団活動の推進者にもこの影響が及んだ。2000年の前後に各社が分散して運営業務を担当することにより、企業を超えて小集団活動の活性化を継続する試みがなされた。調査を通じて企業関係者とも交流を深めたことも、成果のひとつである。(2)学会での発表1)国際学会で日本の小集団活動が、労務管理上どのような意義があるのかについて報告した。海外に日本的経営について部分的に知ってもらうよい機会を得た。2)国内学会シンポジウムのパネリストとして、(1)について.報告した。近年の小集団活動について近い分野の研究者にもあまり知られていないため、知見を共有するよい機会となった。平成21年度は、小集団活動実施事業所の推進担当者に聞き取り調査を実施するとともに、雑誌論文に2本執筆し、学会大会報告を1本おこなった。自動車産業の小集団活動を実施する2事業所(それぞれ別の企業)に、その実施状況と近年の変化について聞き取り調査をおこなった。小集団活動は1990年代以降に停滞している。そのなかにおいて、両事業所とも小集団活動を継続してきた。

しかし両事業所とも90年代に活動のマンネリ化が見られた。2000年前後に両事業所とも活動方法の見直しをおこなっている。たとえば、小集団活動に財務的な改善成果を強く求めている。また活動に関与する従業員の職種を再定義している。小集団活動を実際におこなうのは、現場の小集団のメンバーであるが、推進担当者がどのような活動をしているのかは、かならずしも明らかにされてこなかった。企業上層部の理解度によって、推進担当者の活動の多忙度や推進のしやすさが変わることが明らかになった。小集団活動を理解するためには、現場従業員に焦点を当てた従来の視点だけでなく、企業上層部の理解や推進担当者の活動にも光を当てることが必要である。それは労使関係といった二分法ではなく、組織内のより複数のアクターの認識が交錯する、動的な過程として見ることが必要である。雑誌論文の執筆のうち1本は、平成20年度の学会大会報告を活字にしたものである。もう1本は、小集団活動など品質管理の専門家からなる学会の学会誌への寄稿である。調査対象をたんに調査対象と見るだけでなく、研究活動の成果を調査対象者へ還元できたことの意義は小さくない。学会大会での報告により、聴衆からさまざまな意見を聞くことができ、今後の研究の参考になった。平成22年度は前年度までに実施してきた、小集団活動の普及の仕組みや、企業での活動状況についての調査結果を、整理した。また国際社会学会(International Sociological Association)の第17回大会にて研究成果の一部を発表した。同大会での発表内容に照らして、成果を要約するとつぎのようになる。小集団活動は1980年代の日本企業で活発に展開され、国内外から注目された。日本で小集団活動が当時広く普及した要因のひとつは、日本の雇用システムの特徴に求められる。従業員に対する査定を伴う長期雇用や、ある種の柔軟な職務配置は、従業員が小集団活動へ参加する誘因を与えてきた。1990年代以降、長期不況の影響もあり日本の小集団活動が停滞するが、2000年代においても活動を継続する企業がある。これらのなかには、他企業と協力しながら小集団の普及・啓発を実施する企業がある。一見して他企業を利するような情報交換が、なぜおこなわれるのだろうか。このことは企業を単位として、雇用など企業経営を考察することに限界があることを示している。企業を超えた協力関係は、小集団活動が企業経営にとって重要だと信じる人々によって、維持されている。小集団活動の社内推進者たちは、企業に対して自分たちの活動の意義を訴えていくため、企業の境界を超えて切磋琢磨している。社内推進者は互いに競争的関係にあるというよりも、協力的関係にある。彼らにとって競争的関係(敵対的関係ではない)にあるのはむしろ、各企業における他の業務担当者や小集団活動以外の活動、ほかの経営管理的手法におかれているように思われる。
液滴振動法による高温融体の表面張力の精密測定

これまでの研究で浮遊液滴の形状,表面振動測定の技術が確立できている.今回.微小重力環境を利用して液滴形状を制御しながら液滴振動法で溶融Siの表面張力を測定し,その結果を地上で静適法で同じ雰囲気で測定した結果と比較検討した.微小重力環境で液滴の変形を縦横比1%以内に制御することによって,測定される表面張力のばらつきを±2%以内に抑えることができた.また液滴の形状が大きく変形すると,補正式を利用しても測定値がずれてくることが確認できた.従来の研究では液滴の形状を制御して液滴振動法で表面張力測定を測定している例はなく,液滴振動法による過去の測定例を参考にする場合にはこの点について注意する必要がある.液滴が球形に近い場合は液滴振動法と静適法で測定した値はほぼ一致した.液滴振動法のばらつき±2%は,静適法で測定した場合のばらつき±3%にくらべて優れているといえる.また,浮遊液滴法では融点以下約300度の過冷却状態で測定を行うことができた.このことは表面張力の温度係数を決定するには非常に有利であることを示している.今後の研究では表面張力を測定するに当って雰囲気中の酸素分圧の影響が少ないNiを試料として使い,重力の影響下で電磁浮遊法を利用した液滴振動法による測定をおこなう方法を確立していく予定である.浮遊液滴の表面振動は平衡形状を振動の中心とした球面調和関数の時間変化で記述することができ,この式から表面振動による半径の時間変化はサインカープになることがわかる.したがって,表面振動の周期の整数倍の振動データを平均することによって振動の平衡形状を算出することができる.今回の研究では浮遊液滴を透明石英管の中で浮遊させ,石英管ごしに映像を測定したので,記録した映像は石英管の曲率の影響を受けて変形したように見える.この影響を排除するために石英管の内側に大きさが既知の球形の固体試料を配置し.曲率の影響で形状がどのように変化するのかを記録して,形状の補正をおこなった.浮遊液滴が石英管の内部で移動して試料と石英管の相対的な位置が変化すると観察される形状も変化するので,固体試料を石英管の中で移動させ,位置による見え方の変化を記録して,形状の補正をおこなった.浮遊液滴の平衡形状と表面振動の関係を調べると,形状が球形の場合は表面振動は単一のモードに近づき,形状が球形からずれるほど表面振動が複雑になり振動の周波数も変化していくことが確認できた.これまでの研究で浮遊液滴の形状,表面振動測定の技術が確立できたので,今後,液滴の形状を変化させて表面張力算出のための補正式の適用範囲を明確にし,地上環境での精密な表面張力測定をおこなう予定である.これまでの研究で浮遊液滴の形状,表面振動測定の技術が確立できている.今回.微小重力環境を利用して液滴形状を制御しながら液滴振動法で溶融Siの表面張力を測定し,その結果を地上で静適法で同じ雰囲気で測定した結果と比較検討した.微小重力環境で液滴の変形を縦横比1%以内に制御することによって,測定される表面張力のばらつきを±2%以内に抑えることができた.また液滴の形状が大きく変形すると,補正式を利用しても測定値がずれてくることが確認できた.従来の研究では液滴の形状を制御して液滴振動法で表面張力測定を測定している例はなく,液滴振動法による過去の測定例を参考にする場合にはこの点について注意する必要がある.液滴が球形に近い場合は液滴振動法と静適法で測定した値はほぼ一致した.液滴振動法のばらつき±2%は,静適法で測定した場合のばらつき±3%にくらべて優れているといえる.また,浮遊液滴法では融点以下約300度の過冷却状態で測定を行うことができた.このことは表面張力の温度係数を決定するには非常に有利であることを示している.今後の研究では表面張力を測定するに当って雰囲気中の酸素分圧の影響が少ないNiを試料として使い,重力の影響下で電磁浮遊法を利用した液滴振動法による測定をおこなう方法を確立していく予定である.
新規組み換えイクオリンの創出と生理学への応用に関する研究

天然型イクオリンは発光クラゲから抽出・精製されてきたが、発光クラゲが減り採取が不可能になった。井上はイクオリン遺伝子をクローニングし、大腸菌でアポイクオリンを発現させ、高純度組換えイクオリンを大量に精製する方法を確立した。本研究では、アポイクオリン分泌発現ベクターpiP-HEを用いて大腸菌に発現させ、分泌アポイクオリンを還元状態で発光基質セレンテラジンと撹拌してイクオリンを再生、精製した。組換えイクオリンの発光特性を天然型イクオリンと比較した。細胞内イオン環境類似塩溶液を作製し(150mM KCl,10mM PIPES、pH 7.0)、種々のCa^<2+>濃度溶液と、5μlのイクオリンを瞬時に混和し発光を記録した。各Ca^<2+>濃度の光信号をpCa2の光信号のピーク値で除しその対数値をpCaに対してプロットしてCa^<2+>濃度・光信号関係を得た。組換えイクオリンのCa^<2+>濃度・光信号関係は天然型と比べ、pCa5-pCa6間で感度がよく、Ca^<2+>-independent lightは低かった。組換えイクオリンの発光は、Mg^<2+>濃度を0から1mMに増加させると抑制された。最大発光は影響されず、pCa5以上で抑制が強かった。pHを変化させても(pH7.5-6.5)組換えイクオリンの発光はほとんどされなかった。組換えイクオリンをマウス左心室乳頭筋細胞内に注入し、Ca^<2+>transient(CaT)を測定した。CaTのピーク値は約3μMで天然型イクオリンでの値よりも大きかった。CaTがピークに達するまでの時間には差がなかったが、末尾のところがやや速かった。組換えイクオリンが細胞内に応用可能で、汎用できる道が開けた。細胞内Ca指示薬イクオリンを遺伝子組換えの手法を用いて新規組換え半合成イクオリンを創出して、細胞内Ca指示薬としての応用範囲を広め汎用の道を開くことを目的とする。これまでに以下の結果が得られた。1)組換えイクオリン及び半合成イクオリンの合成に着手した。アポイクオリン分泌発現ベクターpiP-HEを用いて、3L系での大腸菌内発現法を確立した。最終的に2LのLB培地を用いて培養菌体から、精製組換えイクオリン(純度95%以上)を約100mg精製した。この精製イクオリンを半合成イクオリン合成の原料とする予定である。また、より高純度イクオリンを作製するために、通常のLB培地の代わりに合成培地を用い、発現後、イクオリンを培地から精製する系を確立した。2)変異イクオリン遺伝子の作製、発現、および精製を試みた。イクオリンのX線結晶解析で得られた情報をもとに、発光基質セレンテラジンペルオキシドに関するアミノ酸残基(a)チロシン-184をフェニルアラニン、チロシン(Y184F、Y169F)、(b)ヒスチジン-169をフェニルアラニン、チロシン(H164F、H169Y)へPCR法で改変を行い、塩基配列を確認後、分泌発現ベクターpiP-HE系で発現させた。4つの変異体は発光活性を持っているが、精製過程で全て失活した。粗抽出液でのY184H変異体は、野生型に比べ発光のパターンが異なり、ゆっくり発光が減衰するタイプであった。

これらの結果を踏まえて、異なる部位の変異の導入を試みる。次年度は、作製されたイクオリンのCaイオンに対する応答性を測定する。組換えイクオリンに関して以下の実験を行った。(1)組換えイクオリンおよび半合成イクオリン:天然型組換えイクオリンの大量調製法を確立した。その結果から、半合成イクオリンは、天然型イクオリンより、発光後、セレンテラジンの誘導体(h, n, br, I, cp, e-タイプのセレンテラジン)を再生することによって、効率良く半合成イクオリンを調製することが可能となった。天然型組換えイクオリンの蛋白当たりの全発光量は、天然イクオリンと同一であった(=量子収率は同じ)。上記、半合成のイクオリンの結晶構造を決定したが、その構造はほぼ同一であった。(2)変異型組換えイクオリンは、部位特異的変異法を用いてアミノ酸を改変することにより調製した。しかし、多くの変異イクオリンは安定に存在することが出来ず、最終的にY132F(Tyrosine132をphenylalaineへ)及びH58F(Histidine58をphenylalanineへ)の変異導入イクオリンの精製に成功した。全発光量は、ほぼ天然型組換えイクオリンと同じであるが、発光強度と発光の半減期は著しく異なっており、Caイオンに対する結合能に違いが有ると推定された。(3)天然型組換えイクオリンのCa濃度一発光関係を定量的に調べた。溶液はCaを単純希釈したものと、EGTAを用いてCa濃度を調整したものとを用意し、キュベットに1mlとり、その中にイクオリンを瞬時に混合してその時の発光を記録した。組換えイクオリンは天然イクオリンに比較して、pCa4.5から6.5で発光強度比が僅かに左方に、また、pCa7以下では発光強度が低かった。Mgイオン濃度の影響を組換えイクオリンで調べたところ、1mMMgによって発光は抑制された。3mMMgは発光をより抑制したが、Ca非依存性発光に対しては大きな効果は観察されなかった。また、発光の温度依存性は天然イクオリンと大差がなかった。これらの結果から、組換えイクオリンを細胞に適用できる可能性が出てきた。組換えイクオリンを150mMKCl、1mM MgCl_2、pH7.0の溶液に溶解した。150mM KCl、1mM MgCl_2、pH7.0の溶液を作成した後、Ca^<2+>を除去するためにchelexカラムを通して発光テスト用溶液を用意した。この溶液を希釈法により20mMから0.1μMまでのCa^<2+>溶液を作った。低濃度Ca^<2+>溶液はCa^<2+>-EGTA緩衝液を使って作成し実験に用いた。キュベット内に作った溶液を1ml採り、これを発光検出器内に入れ、遮光下で0.5μlのイクオリンを瞬時に反応させた。各Ca^<2+>濃度溶液における発光強度を最大発光強度で正規化した強度比の対数値と、Ca^<2+>濃度の対数値との関係を求め較正曲線を得た。高濃度Ca^<2+>溶液中(pCa2)における発光の時間経過を測定した。組換えイクオリンのCa^<2+>濃度-発光関係は天然型とほぼ同様な関係を示したが、pCa5からpCa6の範囲でCa^<2+>に対して感受性が高かった。また、Ca^<2+>-independent lightが天然型よりも低かった。Mg^<2+>は組換えイクオリンの発光を抑制し、天然型イクオリンと同様であった。