hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
異種ネットワーク相補的連携による超大規模IoTノード群への高速アクセス方式

本研究は、産業・社会変革が世界的に期待され、研究開発や投資が進んでいるIoTにおいて、これまでのネットワークでは未想定の超大規模IoTノード群に対する高速アクセス性能や柔軟な運用管理、および社会に対して利益の高い実用性や効率性の確保を目指したものである。手法の根幹として、異種ネットワークの相補的連携方式により、ネットワーク機能面から開発する新しいアーキテクチャの開発を行うものである。異なるネットワークの連携・併用により、単一のネットワークでは達成が困難なネットワーク特性(平均経路長の短縮や頑健性の確保等)を具備したネットワークの実現を目指す。研究は、モデル設計、シミュレータによる特性解析、通信方式の開発、さらなる評価と実証実験という流れで進める。平成29年度は、前述の目的を達成するにあたり、通信方式の設計と、通信方式の中核を担うハードウェアの設計およびプロトタイプ機器の開発を実施した。まず、長距離ネットワークと短距離ネットワークを相補的に連携させることを基本的な特徴とする異種ネットワーク連携方式において、長距離ネットワークにLTE網を用いて、短距離ネットワークには無線マルチホップネットワークを利用する。これを踏まえて、通信方式の設計においては、昨年度から継続的に実施中のLTE網の通信特性の調査・分析に関する成果として、時刻や利用場所によって安定的に利用できるチャネルや通信効率が影響を受ける場合があることから、LTE網の通信環境計測とチャネル制御による安定化方式を設計した。無線マルチホップネットワークの安定的制御については、長距離ネットワークが利用できるノードが複数近隣に存在する場合に、どのノードを利用すれば良いかについて、ノードの負荷状況に応じた選択方式についてモデル化を行った。次に、LTE網の利用チャネルを状況に適応的に制御可能なプロトタイプハードウェアを設計・開発した。平成29年度は、昨年度の成果である異種ネットワークの相補的連携によるネットワークモデルについて、実現に向けた実施課題の整理と解決方式の提案を中心に研究を実施した。昨今、IoTに対する注目の高まりから、IoT関連の製品や通信サービスが多く登場している。特に通信サービスについては、LPWA(Low Power Wide Area)に属するものが多くサービスインし、実際に利用できる状況にある。特に日本では、LoRaWANとWi-SUN、NB-IoT規格が利用しやすい。この時流を勘案し、本提案の長距離ネットワーク側でLPWAの利用についても検討を進めた。しかしながら、通信容量と通信可能距離と、双方向性のあるデータ通信ができるという条件を重視する方針を採った場合にLTEが優れていると判断し、LTEを中心に研究を進めた。実用化を意識した研究開発を進めるにあたり、様々な通信条件を試せる通信プラットフォームの存在は必要不可欠である。そこで、通常はブラックボックス化されており制御が難しい通信デバイスについて、チャネル固定や通信状況の調査・処理機能などを備えた、長距離ネットワーク側のハードウェアを開発した。Linuxベースの組み込みシステムとSierra Wireless社のLTEモジュールを主な構成要素とするハードウェアである。プログラマブルに上記の機能を利用できるようにしている。このプラットフォームにより、昨年度から実施しているLTEの通信環境調査から得られた成果を考慮した通信制御方式を実証できる環境が整ったと考えている。さらに、短距離ネットワーク側においても、通信効率を向上するためのマルチホップネットワークの制御モデルを開発したことで、提案方式の実現に向けた方式の準備が整ったと考える。今後の研究は、次の2種類を軸に進める。(1)長距離ネットワークと短距離ネットワークの併用を特徴とするネットワークアーキテクチャの開発と評価基本的な通信制御方式の検討が完了しているため、開発した方式を結合したハードウェアの開発を予定している。また、開発したハードウェアを用いて簡易的なネットワークを組み、実測による性能評価も行う。性能評価については、大学キャンパス内を中心に実施する予定であるが、LTEの調査研究を実施したエリアが時刻による通信効率や安定性の変動が観測されているため、場所利用の調整が済めばこの場所での評価も行いたいと考えている。(2)大規模ネットワークエミュレータを用いた評価検証大規模なプロトタイプシステムを実空間に展開して評価することは難しいため、大規模システムのシミュレータおよびエミュレータ等を用いた性能検証を行う。性能検証は、提案モデルと、実機によるプロトタイピングにより得られた知見を反映させた提案モデルの改訂版の両面から行うことで、理想的な状況と現実的な性能の両面から評価したいと考えている。本研究は、産業・社会変革が世界的に期待され、研究開発や投資が進んでいるIoT(Internet of Things)において、これまでのネットワークでは未想定の超大規模IoTノード群に対する高速アクセス性能や柔軟な運用管理、および社会に対して利益の高い実用性や効率性の確保を目指したものである。異なるネットワークの連携・併用により、単一のネットワークでは達成が困難なネットワーク特性(平均経路長の短縮や頑健性の確保等)を具備したネットワークの実現を目指している。平成28年度は、前述の目的を達成するにあたり、モデル設計と特性解析を主に実施した。モデル設計については、昨今のIoTにおける研究開発が多様性を見せていることから、Sinkノードにデータを中継伝搬するセンサネットワークモデル、電力管理のためのスマートグリッド、車両・船舶の情報収集、FinTech等のシェアリングエコノミーへの適用について検討・設計した。また、提案モデルは長距離リンクの通信特性が非常に重要になる。そこで、長距離リンクとして利用を想定している方式の1つであるLTEに関する調査実験も併せて実施した。次に、これまでに開発しているシミュレータソフトウェアの性能向上を実施した。開発済みシミュレータは、設計面では膨大数のノードのシミュレーションへの拡張は容易だが、シミュレーション実行端末の処理性能面の問題で処理完了までに数日を要するという課題があった。

この点を、ソフトウェア技術による高速化により解決を図った。平成28年度は、本提案に先行して実施していた研究である、異なる通信手段を相補的に連携・併用することで単一のネットワークでは達成が難しい特徴を実現する手法を、IoT(Internet of Things)で求められる大規模ノードに適用するためのモデル化を行った。本研究課題では、膨大なノードからの効率的かつ低遅延な情報収集の達成を目標としている。この目標の達成にあたり、端末が具備する短距離無線通信手段のみを利用するマルチホップネットワークでは、ノード数の増加に比例して中継する必要のあるデータが増加することから、end-to-endの伝送遅延時間と処理負荷の増大という問題がある。そこで、提案手法である、長距離リンクも利用できるハイブリッドノードをばらまくことで、ノード数の増加に応じた伝送遅延時間と処理負荷増大の抑制を可能とする通信モデルの基礎を設計した。また、近年のIoTに対する注目は、様々な適用事例案やNB-IoTやLPWAといった長距離無線通信手段が登場している。そこで、設計した基礎モデルをこれらの事例や長距離通信手段に適用した場合について、多面的な検討を行った。さらに、実際の長距離無線通信の振る舞いを把握するために、LTE通信の通信品質評価を実施した。次に、提案モデルの効果検証のためのシミュレータについて、これまでに開発したシミュレータの機能改善を図った。先行研究で開発したシミュレータは、ソフトウェア機能としては大規模ノードやモデルの評価に最適化したシミュレーションが可能であるが、シミュレーション実行端末の処理性能面の問題で処理完了までに数日を要するという課題があった。これに対して、提案モデルにおいて処理時間を要すると考えられる部分を見直し、処理時間の改善を行った。本研究は、産業・社会変革が世界的に期待され、研究開発や投資が進んでいるIoTにおいて、これまでのネットワークでは未想定の超大規模IoTノード群に対する高速アクセス性能や柔軟な運用管理、および社会に対して利益の高い実用性や効率性の確保を目指したものである。手法の根幹として、異種ネットワークの相補的連携方式により、ネットワーク機能面から開発する新しいアーキテクチャの開発を行うものである。
蛍光ナノビーズ追跡法によるE-カドヘリンの集合と接着構造形成の分子機構の研究

培養皮膚細胞の細胞膜上のE-カドヘリン分子を特異的に標識する蛍光ビーズ(直径30nm)を用いてカドヘリンの集合過程を追跡する方法を開発した。E-カドヘリンに対する単クローン抗体をビーズに吸着させる際の、ビーズと抗体の量比、溶液のイオン強度の最適化を行った。また吸着反応後、ビーズの凝集体、抗体の吸着した単分散ビーズ、吸着しなかった単分散ビーズ、未反応の抗体をHPLCを用いてゲル濾過で分離し、抗体の吸着した単分散ビーズを精製する方法を開発した。この方法で作製した蛍光ビーズは培養皮膚細胞の細胞膜のE-カドヘリンを特異的に認識し、細胞外カルシウム濃度上昇によるカドヘリンの細胞間接着部位への集合を阻害しないことを確認した。この蛍光ビーズを我々が以前開発した超高感度カメラを用いて観察したところ、50%の蛍光退色が起こるまでに、500枚以上の蛍光画像が撮影できることが明らかになり、カドヘリンの集合過程を追跡するに充分な蛍光強度が得られることがわかった。撮影した蛍光画像からビーズの運動を計測するソフトウェアを開発した。重心検出により、5nmの空間精度でビーズの位置を測定することが可能になった。今後は、この方法を用いてカドヘリンの集合を追跡していく。同時に、蛍光画像と微分干渉像を同時観察するための新しい蛍光顕微鏡を開発した。全ての光学系を光学ベンチの上に直線的に配置することにより光学特性を向上させると共に、偏光板の替わりにグラントムソンプリズムを用いて偏光特性を従来の100倍程度上昇させることができた。この顕微鏡により、微分干渉像でビーズの運動を測定し、同時に蛍光で細胞骨格系を観察することが可能になった。
生活習慣病に関連した小胞体フォールディング酵素の機能解析

昨年度構築したモデル系を用いて、パルミチン酸によって小胞体ストレスを惹起させたHepG2細胞では、小胞体分子シャペロンであるER-60およびBiPのmRNA量が増加している事を明らかにした。またこの増加は、エネルギーセンサーであるAMPKの阻害剤Compound Cによって抑制されることを示した。オレイン酸あるいはドコサヘキサエン酸をパルミチン酸と共添加すると、小胞体ストレスは緩和されたが、ER-60やBiPのmRNA量は低下しないことを明らかにした。また、昨年度作製したER-60を肝臓特異的にノックアウトしたマウスに高脂肪食を4週間摂取させたところ、血中トリアシルグリセロールの量が野生型マウスと比べて低下していることを見出した。さらに30週間の高脂肪食を摂取させると、体重増加が野生型と比べて10%程度抑制されていたが、脂質代謝の指標となる成分には差がないことを見出した。さらに、エネルギー代謝調節ホルモンであるレプチンと脂質代謝及びタンパク質代謝の中心オルガネラである小胞体機能との関係という新規な視点で研究を行った。レプチン欠損(ob/ob)マウスにレプチンを腹腔内投与する事で、脳におけるER-60を初めとした小胞体分子シャペロン(ER-60,ERp72,PDI,P5,BiP)のタンパク質量およびmRNA量は、いずれも増加する傾向があることを見出した。一方、脳室内投与すると、脳および肝臓におけるER-60等の小胞体分子シャペロンのタンパク質量およびmRNA量には変化がないことを見出した。小胞体分子シャペロンの発現が低下しているレプチン欠損(ob/ob)マウスでは、野生型マウスと比較して小胞体ストレス応答の指標の一つであるPERKのリン酸化が増加しているが、小胞体分子シャペロンの発現を調節するXBP1のスプライシングやATF6の量には差が見られないことを明らかにした。フォールディングに関するタンパク質の発現がレプチンのシグナルによって調節されていることを示した。肝臓由来培養細胞HepG2において、小胞体ストレス応答の指標としてXBP-1のスプライシングを用いて、パルミチン酸により小胞体ストレスが惹起されるモデル系を構築した。この構築した系を用いて、ドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸がパルミチン酸によって誘導された小胞体ストレスを緩和することを明らかにした。また、小胞体フォールディング酵素の一つであるER-60の強制発現及び特異的ノックダウンに成功した。この系は、パルミチン酸による小胞体ストレス惹起とER-60の発現量との関係を検討する実験において、必要不可欠である。また、Cre recombinant系を用いて、肝臓特異的にER-60を欠損したマウスの作出に成功した。肝臓特異的に小胞体フォールディング酵素を欠損した初めての動物であり、肝臓障害や脂質代謝異常と小胞体機能との関係を追求していく上で画期的な実験系となることが期待できる。レプチン欠損マウスであるob/obおよびレプチン受容体欠損マウスであるdb/dbでは、野生型と比較して肝臓および脳における小胞体フォールディング酵素ER-60の発現が低いことを見出した。またob/obにレプチンを腹腔内投与すると、肝臓および脳におけるER-60の発現が増加することから、レプチンが一部のER-60の発現調節を行っている可能性が示唆された。フォールディングに関するタンパク質の発現がレプチンのシグナルによって調節されていることを初めて示した。小胞体分子シャペロンの発現が低下しているレプチン欠損(ob/ob)

マウスでは、野生型マウスと比較して小胞体ストレス応答の指標の一つであるPERKのリン酸化が増加しているが、小胞体分子シャペロンの発現を調節するXBP1のスプライシングやATF6の量には差が見られないことを明らかにした。フォールディングに関するタンパク質の発現がレプチンのシグナルによって調節されていることを示した。
ミクログリアに発現する温度感受性分子の探索と同定

本研究の目的は、低体温療法の脳保護作用の分子基盤を明らかにするため、中枢神経系のグリア細胞であるミクログリアに発現する温度感受性分子を探索し、同定することである。これまでに申請者は、培養マウスミクログリアの動きに温度依存性があり、その動きは温度感受性TRPチャネルTRPM4の阻害剤9-phenthrolで抑制されることを見出していた。TRPM4活性化がミクログリアの動きの温度依存性に関与するか否かを検討するため、平成29年度にRNA干渉法によるTRPM4遺伝子ノックダウンを試みたところ、細胞状態の悪化のため解析に適さず、実験継続を断念した。平成30年度は、その代替法としてCRISPER/Cas9システムを用いたTRPM4遺伝子欠損マウスの作成に着手し、第1世代を得た段階である。平成31年度に、遺伝子欠損マウスを用いた実験を予定している。また、マウス蘇生後脳症モデルとして総頚動脈閉塞再灌流モデルを作成し、蘇生後脳症でのTRPM4の発現様式の検討のための免疫組織学的評価を予定している。これらと並行して、生理学研究所富永真琴教授の協力のもと、2光子励起顕微鏡を用いてマウス大脳ミクログリアの動きを異なる温度条件で連続的に観察できるタイムラプスイメージングシステムを構築し、生きた個体レベルでのミクログリアの活動の温度変化による影響を検討した。その結果、ミクログリアの突起の動きは37度より33度の条件で可逆的に抑制され、温度依存性があることがわかった。以上の結果から、ミクログリアの動きの温度依存性は、細胞レベルだけではなく、生きた個体レベルで見られる現象であることを見出した。計画遂行が遅れている要因としては、RNA干渉法を用いた遺伝子ノックダウンを断念し遺伝子欠損マウスを作成する方針としたため、CRISPER/Cas9システムによるゲノム編集技術の習得及び環境整備に時間を要したこと、及びゲノム編集技術の習得のために平成30年度当初に予定していた免疫組織学的検討やタンパクレベルでの発現検討が着手できなかったことが挙げられる。2光子励起顕微鏡を用いた生きたマウス大脳ミクログリアの異なる温度条件下でのタイムラプスイメージングについて、TRPM4活性化の関与を検討するために、薬理学的検討(抑制剤の併用条件下での観察)を予定する。以上は生理学研究所富永真琴教授の協力のもとすすめる。また、TRPM4遺伝子欠損マウスのラインを確立し、遺伝子欠損マウスを対象にした蘇生後脳症モデル作成、野生型と対比した組織学的評価、神経学的評価、行動学的評価実験を予定する。得られた研究結果に基づき、学会発表および論文投稿を行う。本研究計画において、マウスミクログリアの動きに温度依存性があること、マウスミクログリアにはいくつかの温度感受性TRPチャネルが発現することをすでに見出していた。平成29年度は、すでに見出した候補である温度感受性TRPチャネルTRPM4について、解析を行った。TRPM4活性化阻害剤として市販されている9-phenanthrolの作用選択性について、パッチクランプ法で検討したところ、他の温度感受性イオンチャネルの活性も抑制することがわかった。現在までに選択的なTRPM4活性化阻害剤は見つかっていないため、TRPM4の活性化がミクログリアの温度依存的な動きに関与していることを薬理学的に証明することは困難であると考え、遺伝子ノックダウンを検討した。単離培養マウスミクログリアに対してRNA干渉法を用いてノックダウンを行い、タイムラプスイメージングを用いてミクログリアの動きを比較したところ、コントロールと比較して動きに有意差は見られなかった。この理由として、RNA干渉法の手技自体がミクログリアの状態に悪影響を及ぼしている可能性が考えられた。また、申請者は、個体レベルでミクログリアの動きの温度依存性について検討するため、ミクログリア特異的に蛍光タンパク質のGFPを発現しているマウスを用いて、生きているマウスの脳温度を変化させることができ、かつミクログリアの動きを2光子励起顕微鏡で観察できる実験条件を検討し、確立した。当初の予定であった単離培養ミクログリアを用いたTRPM4の発現同定について、TRPM4活性化阻害剤の作用選択性の検討実験及びRNA干渉法の試用及び発現検討に予想以上の時間が必要であったため、特異的抗体を用いた免疫染色によるタンパクレベルでの発現検討が着手できなかったことが、当計画がやや遅れていることの理由にあげられる。また、当初の予定では個体レベルでの検討は平成30年度以降に計画していたが、申請者が発見したミクログリアの温度依存的な動きについて個体レベルで観察検討するため、生きているマウスを対象とした2光子励起顕微鏡によるリアルタイムイメージングの実験系の構築を平成29年度に開始したため、一部実験計画を変更したこともその要因にあげられる。

平成30年度は、その代替法としてCRISPER/Cas9システムを用いたTRPM4遺伝子欠損マウスの作成に着手し、第1世代を得た段階である。平成31年度に、遺伝子欠損マウスを用いた実験を予定している。また、マウス蘇生後脳症モデルとして総頚動脈閉塞再灌流モデルを作成し、蘇生後脳症でのTRPM4の発現様式の検討のための免疫組織学的評価を予定している。これらと並行して、生理学研究所富永真琴教授の協力のもと、2光子励起顕微鏡を用いてマウス大脳ミクログリアの動きを異なる温度条件で連続的に観察できるタイムラプスイメージングシステムを構築し、生きた個体レベルでのミクログリアの活動の温度変化による影響を検討した。その結果、ミクログリアの突起の動きは37度より33度の条件で可逆的に抑制され、温度依存性があることがわかった。以上の結果から、ミクログリアの動きの温度依存性は、細胞レベルだけではなく、生きた個体レベルで見られる現象であることを見出した。計画遂行が遅れている要因としては、RNA干渉法を用いた遺伝子ノックダウンを断念し遺伝子欠損マウスを作成する方針としたため、CRISPER/Cas9システムによるゲノム編集技術の習得及び環境整備に時間を要したこと、及びゲノム編集技術の習得のために平成30年度当初に予定していた免疫組織学的検討やタンパクレベルでの発現検討が着手できなかったことが挙げられる。TRPM4がミクログリアの温度依存的な動きに関与することを明らかにするため、当初の計画ではRNA干渉法を用いて、TRPM4の遺伝子発現を選択的に抑制し、ミクログリアの動きを観察検討する予定であった。しかしながら、RNA干渉法では細胞の状態が非常に悪くなり、動きを観察する実験には適さないと判断したため、今後の計画では、代替案として(1)アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた個体レベルでの遺伝子ノックダウン、あるいは(2) Cre-loxPシステムを用いた遺伝子欠損マウスの作成を検討する。申請者はすでに温度条件を可変できる2光子励起顕微鏡を用いたリアルタイムイメージングの実験系を確立したため、個体レベルでのミクログリアの動きの検討をすすめる予定である。加えて、野生型マウスを用いた蘇生後脳症モデルを作成し、TRPM4の発現様式の検討や異なる温度環境下でのリアルタイムイメージングを用いたミクログリアの動きの解析を行う。2光子励起顕微鏡を用いた実験は、研究協力者である富永真琴教授(生理学研究所、愛知県)の協力のもと進める予定である。2光子励起顕微鏡を用いた生きたマウス大脳ミクログリアの異なる温度条件下でのタイムラプスイメージングについて、TRPM4活性化の関与を検討するために、薬理学的検討(抑制剤の併用条件下での観察)を予定する。以上は生理学研究所富永真琴教授の協力のもとすすめる。また、TRPM4遺伝子欠損マウスのラインを確立し、遺伝子欠損マウスを対象にした蘇生後脳症モデル作成、野生型と対比した組織学的評価、神経学的評価、行動学的評価実験を予定する。得られた研究結果に基づき、学会発表および論文投稿を行う。
カリウムチャネル内向き整流特性に果たすポリアミンの役割

興奮性細胞膜に存在する内向き整流カリウムチャネルは、平衡電位よりも負電位側において細胞外から内へカリウムイオンを通すが、正電位側では内から外へ通しにくい性質をもつ。この内向き整流性の電流電圧関係の機序の一つとして、近年細胞内に普遍的に存在するポリアミンと呼ばれる有機物質によるチャネル孔の閉塞(ブロック)が明らかとなった。ポリアミンは生理的なpHでは多価の陽イオンとして存在し、細胞内で複雑な代謝経路を経て2価のプトレッシンから3価のスペルミヂン、4価のスペルミンへと順に作られる。そこで本研究ではこれらのポリアミン、およびやはり生理的な内向き整流カリウムチャネルのブロッカーであることが知られているマグネシウムイオン(Mg)について各々の内向き整流性への関与、役割を明らかにすることを目的として研究を行った。その結果、約1μMの細胞内スペルミンによるチャネルブロックが単独で強い内向き整流性を引き起こすことが示された。その場合カリウムの平衡電位(約-83mV)付近から正電位側では外向き電流はわずかにしか流れなかった。これと同時に細胞内に約1mMのMg(生理的濃度)が存在する状態で細胞を脱分極させると、より正電位側でMgはスペルミンに代わってチャネルをブロックすることが示された。このMgによるブロックは再分極(脱分極後に再び膜を分極)によって瞬時に解放されるため平衡電位付近において外向き電流を増加させた。2価のアミンであるプトレッシンもMgと同様の働きをした。この事は興奮性細胞、特に心筋細胞の活動電位において最終的な再分極を促す重要な機構であることが示唆された。
能狂言面の美術史的アプローチによる基礎的調査研究

江戸時代までに作られた能狂言面の調査を行ない、東京国立博物館所蔵の金春家伝来能狂言面についてはX線CT調査を実施した。社寺あるいは美術館所蔵の収蔵面に金春家の名物面の写しがあり、比較検討することにより、制作年代、作者、写しの関係性などについて成果があがった。室町時代に作られた古面は面裏の彫り、樹種(クスノキ、キリなど)、木取り(木心を込める、節がある)などに特色の見られることがわかった。研究開始年度である本年度は、本研究の目標のひとつである能狂言面の調査方法の確立のための試行と検証を兼ね、東京国立博物館所蔵の能面の調査を中心にすすめた。本研究では「彫刻研究の手法で能狂言面の造形について検討する」ことが前提となっている。彫刻研究の手法を能狂言面の調査に持ち込むために、調査に必要な器具、機材を検討、設計した。その器具や機材を用い彫刻研究の手法で調査及び撮影を行い、調査データ収集のテスト、データの検証及び蓄積を行った。これは従前行われてこなかったことで、今後本研究を継続するための大きな成果といえよう。検証した調査方法を用い、東京国立博物館所蔵作品を中心に計画的に調査研究を進めることができた。東京国立博物館以外では京都国立博物館、三井記念美術館、国立能楽堂、松井家所蔵の能狂言面の調査を行った。調査によって得られた作品情報を整理し、データ化することで分析を正確に行う基礎ができ、次年度以降の調査研究課題を洗い出すことができた。また、歴史史料等の収集も同時にすすめ、調査データと照らし合わせることで、これまで不明な点の多かった能狂言面の造形とその背景について検証する基礎ができた。4月6月、10月に東京国立博物館所蔵の金春家旧蔵面ほか、三井記念美術館の金剛家旧蔵面の調査、そのほか以下のとおり調査を実施した。7月に京都国立博物館で開催した特集陳列「日本の仮面人と神仏、鬼の多彩な表情」に出品された仮面34面、北村美術館4面、9月に京都国立博物館寄託個人所蔵面20面、12月に奈良国立博物館寄託奈良豆比古神社16面、正福寺8面、八坂神社1面、1月に宮城・瑞巌寺所蔵面30面、2月に京都国立博物館で壬生寺の壬生三面ほか個人寄託面15面。東京国立博物館で蛍光エックス線の調査を実験的に行ない、表面彩色の素材を検討する手段としての有効性を確認した。胡粉を示すカルシウムを多く検出する中で、鉛を検出するものがあった。鉛白を用いた可能性がある。これまで調査した面の樹種は、ヒノキ材がもっとも多く、キリ材、クスノキ材も見られる。キリは軽量化を目的に採用したと考えられるが、クスノキは重いので、あえて使用した理由を考える必要がある。調査の際は、左右斜側面、左右側面、裏面を撮影している。面裏の情報はきわめて重要で、江戸時代中期の面打大野出目家の洞白、洞水の顕著な鑿跡の特徴をはじめ、作者特定に有効な手がかりとなる。面裏を忠実に写すこともあり、銘記等の有無に関わらず、その写真の蓄積は重要である。先述した京都国立博物館における仮面の特集陳列のほか、東京国立博物館に於いても「能面女面の表情」と題して24面の女面を特集して展示した。能狂言面の調査重ねることで、徐々に突破口となりうる手がかりが見えてきた。能面全体の中で最も重要な宗家の面のうち、金春家と金剛家の面の徹底した分析を行ないながら、調査を進めることは有効で、まずは各地にある金春家と金剛家の面の写しをひとつの標的にするという方針を立てられたことも大きな進歩である。平成28年度は以下の美術館、神社等に保管される能狂言面の調査、写真撮影、X線CT撮影、蛍光X線スキャニング撮影を行った。5月2830日静岡・佐野美術館、6月27日東京国立博物館CT調査、7月1日東京国立博物館CT調査、7月4日東京国立博物館CT調査、7月7日法政大学能楽研究所文献調査、7月28日東京国立博物館蛍光X線スキャン調査、8月4日東京国立博物館CT調査、8月30日東京国立博物館CT調査、8月31日東京国立博物館CT調査、10月20・21日愛知・魚町能楽保存会、29年1月2729日愛媛・東雲神社、2月11・12日福井県立歴史博物館、同美術館佐野美術館では同館所蔵の「中将」を金春家の本面だったと判断した。写しが東京国立博物館、魚町能楽保存会、東雲神社にあるが、鼻の頭の傷が判定の根拠となった。また、東京国立博物館所蔵の別の「中将」は、焼印の過半が損傷して作者不明だったが、東雲神社の狂言面「すずめ」と焼印、面裏の鑿跡が酷似しており、「片岡政信」という近代の面打の作とわかった。東京国立博物館所蔵の能面はX線CT調査により、「父尉」の下顎が上部と樹種が異なるため後補、「大天神」は木心を込めた材から作ったこと、室町時代作の「小面」は、木裏(木心側)に彫刻していること、正中で割れたまたは割った後に、上下2箇所のホゾで接合していることが判明した。木心を込めること、木裏に彫ることは珍しいと考えられるが、CT調査を重ねていくことで時代判定の根拠になる可能性がある。また、関連作品として6月25日福井・永平寺(予備)、10月30・31日

福井・永平寺の祖師像の調査を行ない、面打の家系に属する出目亀斎作の銘記を確認した。平成29年1月31日3月26日まで「奈良・金春家伝来の能面・能装束」という特集陳列を東京国立博物館で開催した。江戸時代までに作られた能狂言面の調査を行ない、東京国立博物館所蔵の金春家伝来能狂言面についてはX線CT調査を実施した。社寺あるいは美術館所蔵の収蔵面に金春家の名物面の写しがあり、比較検討することにより、制作年代、作者、写しの関係性などについて成果があがった。室町時代に作られた古面は面裏の彫り、樹種(クスノキ、キリなど)、木取り(木心を込める、節がある)などに特色の見られることがわかった。初年度に基礎となる調査方法の検証をすすめ、来年度以降の調査研究を計画的に行うことが可能になり、限られた時間の中で効率的に調査データを収集、検証できるよう整理をすすめたため。また、調査データの検証を複数名で、また必要な場合は複数回行うことで、データの正確性を期すことができたため。今年度末に東京国立博物館所蔵の金春家伝来能面を全点展示することにしており、図録も作成する。そのため、蛍光エックス線調査、X線CT調査も実施し、できる限りの情報を盛り込みたい。また、さまざまな角度の写真とともに調査を行なった面のデータを集成した報告書を編集するとともに、所蔵者の承諾が得られたものについてデータベースとして広く公開し、能面研究の活性化を図りたい。28年度が最終年度であるため、記入しない。日本彫刻史適宜撮影と撮影データの整理を進め、史料として収集した文書、付属品である面袋などから得られる情報を精査する。能狂言面の調査データとあわせて検証することで、能狂言面の造形を、総合また体系的に捉えていきたい。蛍光X線調査の予定もあり、昨年度得られた結果をさらに深く分析することが期待できる。東京国立博物館所蔵品については特集陳列で成果の一部を発表する。研究代表者が特別展を担当したため、調査のための出張回数が予定より減った。また、知人の少ない京都に赴任していたため資料整理のアルバイトを雇用できず、人件費の支出がなかった。当初計画よりも、調査に使用する各種機材の開発に時間を要したため、遠方での調査を翌年度に持ち越したため。また、機材の開発も、研究分担者を新たに加えたことで設計、制作費を抑えることができたため。研究代表者が東京に戻ったので、調査を着実に進める一方、資料整理のアルバイトを雇用し、報告書の編集、データベースの構築を進める。すでに遠方での調査が確定しており、また蛍光X線、CTなどを用いた調査の計画も立てているため、計画的に使用できる見込みである28年度が最終年度であるため、記入しない。
骨親和性及び機械的強度に優れた骨セメントの開発

1)圧縮強度実験;本セメントの圧縮強度はいずれもPMMAセメントの2倍以上の値を示し、荷重下の使用に十分な強度を持つと考えられた。また弾性係数はガラス粉体混入量に伴って増加した。2)動物実験;Contact microradiography像では、いずれのセメントでもradiopaqueな反応層の形成および骨との直接結合を認めた。混入する粉体量を増加させるに従って反応層は厚くなり、より良好な骨形成を認めた。粉体量70%のセメントの経時的変化は、2週後よりセメント表面に反応層の形成を認め、その表層で骨形成の開始を認めた。経時的に骨形成はさらに進み、26週後の標本ではセメントの周囲はほとんど新生骨によって覆われていた。SEM-EPMAにより反応層ではCaおよびPの増加を認めた。(Ca-P-rich layer)。セメントの家兎脛骨埋入による引き剥がし試験ではガラス粉体を70%混入したもので埋入10週後より3-4Kgの値を示した。一方PMMAセメントでは0.03Kgで本セメントは骨結合能を持つと考えられた。犬による大腿骨部分置換、人工関節固定の荷重下実験も行われ、PMMAセメントに比べて有意に高い結合強度を得た。これら一連の研究から操作性の向上のため、、また劣化を防ぐために無機成分のうち25%を溶融シリカとした組成の生体活性骨セメントが開発され、理想的な組成と考えられた。本セメントは良好な生体活性および物理的特性を持つため、臨床上は人工関節の固定、骨欠損部の充填材としての応用が考えられ、特に人工関節固定においてはその長期成績の向上が期待される。1.粉体配合量とセメントの持つ物理的、生物学的特性の研究;本セメントのガラス粉体配合量を変化させ、力学的強度の測定および動物実験による骨親和性を評価した。その結果、粉体配合量を30%まで減少させても本セメントはPMMAセメントの2倍以上の圧縮強度を示し、また、ラット脛骨内に埋入し、生体活性をみると生体活性ガラスフィラーを70%から30%まで減らしても生体活性がみられた。2.本生体活性セメントの生体内での経時的変化の研究;本セメントをラット脛骨に埋入し、経時的に屠殺して、組織学的検査を行った。その結果、埋入後経時的にセメント周囲の新生骨形成が進行し、また、6ヵ月までの経過観察においては、生体内劣化の所見は認められなかった。3.本生体活性セメントの荷重下での研究;犬大腿骨の中央部を金属性の骨置換材で置換し、この固定に本生体活性セメントを用いた。組織学的検査の結果、本セメントは荷重下条件でも骨と介在組織なしに直接結合を認めた。また、引き抜き試験において本セメントはPMMAより高い引き抜き強度を示した。4.プレクリニカルな実験;犬用人工股関節を本セメントを用いて固定した実験を行っている。現在進行中であるが、3カ月までの取り出した結果では、既存のPMMAより優れた固定性を示していた。本年度の研究ではこれまで我々が開発してきた生体活性骨セメントが人工関節の固定に役立つかを犬用人工関節を用いて調べ、ヒト人工関節に使用可能な、臨床に敵した操作性が得られるように最終組成を決定する事を目的に行った。ロッド状に作成したセメントをラット皮下に埋入し、経時的に取り出し強度変化を検索した。その結果A-Wガラスセラミックスの原ガラス粉末のみでは劣化が見られ1年半で、圧縮強度で50%に、曲げ強度では60%の強度に低下することが判明した。その改善としてA-Wガラスセラミックス粉末にシリカフィラーを添加した組成に変更すると劣化を防げる事が確認された。

さらに臨床で用いるには十分な操作性と生体活性を得るとを考慮して、最終的には無機成分としてA-Wガラスセラミックス粉末73%、二酸化珪素27%、有機成分としてBis-GMA49.7%,TEG-GMA49.7%BPO.3%、DMPT.3%の組み合わせを選択した。また手で混ぜたり、インジェクションを使用したり違った操作を考慮して有機/無機比率を85/15から75/25と変化させた。また、大腿骨部を金属で置換しその固定にセメントを用いて、プロテ-シスの固着性を見た実験ではPMMA骨セメントではセメントと骨の間に軟組織の介在があるのに対して、本セメントでは骨とのダイレクトな接合が身られた。打ち抜き試験では、セメントが海綿骨とアンカリング効果で固着した部分では2つのセメントで差が見られなかったが、骨皮質と接合する部分では本セメントが経時的に固着力が増大するのに対して、PMMA骨セメントでは低下し、固着強度に統計学的にも有意な違いがみとめられた。この違いは本セメントが骨と結合する性質によると考えられた。さらに犬人工関節モデルでは現在6カ月例までのデーターが得られているが、十分な固着性があり、人工関節に応用が十分あるものと考えられた。1)圧縮強度試験;本セメントの圧縮強度はいずれもPMMAセメントの2倍以上の値を示し,荷重下の使用に十分な強度を持つと考えられた。また弾性係数はガラス粉体混入量に伴って増加した。2)動物実験;Contact microradiography像では、いずれのセメントでもradiopaqueな反応層の形成および骨との直接結合を認めた。混入する粉体量を増加させるに従って反応層は厚くなり、より良好な骨形成を認めた。粉体量70%のセメントの経時的変化は、2週後よりセメント表面の反応層の形成を認め、その表層で骨形成の開始を認めた。経時的に骨形成はさらに進み、26週後の標本ではセメントの周囲はほとんど新生骨によって覆われていた。SEM-EPMAにより反応層ではCaおよびPの増加を認めた(Ca-Prich layer)。セメントの家兎脛骨埋入による引き剥がし試験ではガラス粉体を70%混入したもので埋入10週後より3-4Kgの値を示した。一方PMMAセメントでは0.03Kgで本セメントは骨結合能を持つと考えられた。犬による大腿骨部分置換、人工関節固定の荷重下実験も行われ、PMMAセメントに比べて有意に高い結合強度を得た。これら一連の研究から操作性の向上のため、また劣化を防ぐために無機成分のうち25%を溶融シリカとした組成の生体活性骨セメントが開発され、理想的な組成と考えられた。本セメントは良好な生体活性および物理的特性を持つため、臨床上は人工関節の固定、骨欠損部の充填材としての応用が考えられ、特に人工関節固定においてはその長期成績の向上が期待される。
耳鳴軽減に東洋医学的体性感覚刺激や耳鳴反応点を用いる治療法確立のための基礎的研究

本研究は多くの国民が悩んでいる自覚的耳鳴の新しい治療法の研究基盤を確立するために行う。申請者は静かな環境下で安定して明確に聞こえる耳鳴に対して、顔面部や頚部の自動運動や経穴への圧刺激、通電刺激が耳鳴を修飾、軽減すること、耳鳴の大きさの軽減では自動運動よりも経穴への圧刺激や通電刺激が効果的であり、完骨穴を刺激した時の効果が大きいこと、刺入深度が4 mm、1.5 mm、0 mmの経穴への各鍼刺激が耳鳴を軽減、消失させる場合のあることなどを見出した。指頭での圧刺激を用いて効果的な刺激部位を簡便に検出できることもわかった。本研究では上記結果を元に簡便で安全、快適で効果的な非侵襲的治療法を更に検討する。
クライエントの「抵抗」を維持するコミュニケーションに関する臨床心理学的研究

不登校や引きこもりのケースに対して、児童相談所、病院等の医療機関等の現行の専門機関は、十分に機能しているとは言い難い現状がある。なぜならば、これらの専門機関においては、問題解決には本人の受診や相談や、本人が治療への動機付けを持っていることが前提となっているために、引きこもりや不登校のように本人の受診や相談への動機付けがないケースに対して無力にならざるを得ないからである。こうした中、不登校や引きこもりなどの子どもに「こころの家庭教師(ソリューション・ティーチャー)」を派遣し、家族の協力を得て問題解決の手助けを行う特定非営利活動法人メンタルコミュニケーションリサーチ(以下MCRシステム)は、画期的な組織体制や取り組みによって、従来の専門機関が手をこまねいてきた引きこもりや不登校等のケースにおいて成果をあげている。不登校や引きこもりの子どもに家庭教師を派遣する取り組みはこれまでにもあるが、MCRシステムが特徴的なのは、臨床心理士やカウンセラーによる両親に対するコンサルテーションが行われていることである。これによって、カウンセリングの過程でクライエントである親が、問題に対する専門的援助を求めながらも治療の手続きや進行に従うことができないという引きこもりや不登校のケースに見られがちな「抵抗」が回避されている。本研究は、MCRシステムの協力のもと、2004年4月2004年10月現在までの期間、そこで報告された引きこもり、不登校改善事例のコミュニケーション・プロセスについて実地調査研究を行った。研究Iとして、日本人に特徴的な抵抗の構造を明らかにするため、(1)投影法による抵抗測定尺度の作成、(2)観察法によるアセスメント方法の構築を行った。研究IIとして、抵抗が高い心理療法が開始された治療当初の場面における会話と、抵抗が低まる心理療法が進行した治療後期の場面における会話の、共通点と相違点を明らかにした。研究IIIとして、抵抗が軽減された実際のケースの分析から、抵抗を回避、軽減するようなコミュニケーション・パターンを整理し、解決方法の提案を行った。近年社会現象となっている引きこもりや不登校という問題は、現段階での治療機関では対応が困難な事例とされている。なぜなら、問題を抱えた本人がそこに来談することが極めて稀であることに加えて、本人の周囲にいる親等が問題の改善を求めて来談しても、実際カウンセリングが開始されると本人に変化を求めることが新たな別の問題を生むのではないかという、来談者の変化することへの強い不安から結局子どもに対して態度を変えることがでぎずに、問題が膠着化することが少なくないからである。本研究では、従来クライエント個人内の性格特性や過去の体験から解釈されてきた、こうした変化に対する「抵抗」を、問題をめぐる人々との間で悪循環化しているコミュニケーションパターンによって維持されるものではないかと捉えて、実地調査研究を進めた。研究1では、日本人に特徴的な「抵抗」の因子構造を明らかにするために、「抵抗」測定尺度の作成を目的とした。そこで、被験者間で示される変化への「抵抗」について因子分析的検討を行ったところ、コミュニケーションにまつわる6因子が「抵抗」の構造を規定する因子として抽出された。研究2では、「抵抗」が生起する心理療法場面の会話と日常的会話の共通点と相違点を明らかにすることを目的とした。そこで、不登校が改善したケースの心理面接場面を、会話分析によって時系列的に分析したところ、(1)クライアントの変化が導かれてゆく過程において、特徴的なコミュニケーションパターンの推移が示唆され、さらに発話行為にまつわる諸指標によってより詳細な分析を行ったところ、(2)独自というコミュニケーションのスタイルが、問題をめぐる人々との間で悪須環化した一コミュニケーションパターンとなっている可能性が示唆された。また文献研究として、不登校及びメンタルフレンド制度の先行研究のレビューから、現段階での援助体制の現状と課題について論じた。

研究IIとして、抵抗が高い心理療法が開始された治療当初の場面における会話と、抵抗が低まる心理療法が進行した治療後期の場面における会話の、共通点と相違点を明らかにした。研究IIIとして、抵抗が軽減された実際のケースの分析から、抵抗を回避、軽減するようなコミュニケーション・パターンを整理し、解決方法の提案を行った。
看護リハ職チーム生活支援による入院患者生活動作、認知症、業務負担、医療安全の研究

入院患者は病気が治っても日常生活動作の低下や、認知症進行のため、満足できる退院ができない。それに対応する医療スタッフも肉体的精神的負担が大きい。我々は今まで、院内デイケアシステム運営と、リハビリテーションを併用して入院患者の生活を支援すると、その日常生活動作および認知症の悪化予防につながることを見いだしている。本研究では、本システム導入により、認知症の行動心理症状に対して、改善効果が時間経過とともに得られることと、その症状改善人ほぼ平行して、病棟看護師の負担軽減がみられることを見いだした。入院中患者を、コントロール群、院内デイケア施行群、リハビリ施行群、院内デイケアとリハビリの併用群の3群に分類し、それぞれの群でのFIM(機能的自立度評価法)、MMSE(認知機能検査)、コグニスタット(認知機能検査)、NPI-NH(BPSD評価)、VASによる看護師業務負担を調査した。調査時期は、開始時、3週後、6週後の3ポイントである。本調査は前年度より継続調査しており、ほぼ目的症例数に達した。今年度はデイケア施行群と、非施行群で比較解析したところ、デイケアを施行した群では、看護師の以下の事項が徐々に負担軽減に結びつくことがわかった。1)気が休まらない、2)怒りたくなる、3)イライラする、4)行動障害があり手がかかる、5)動作障害があり手がかかる、6)いつも頭から離れない、7)時間をとられて業務が進まない。一方、以下の項目では変化が見られなかった。1)受け入れられない、2)言っていることが伝わらない。昨年度までで、院内デイケアとリハビリの併用群ではFIM(機能的自立度評価法)において、有意に移動能力低下を予防できることを見いだしているが、今後もリハビリ群、院内デイケア群、併用群それぞれに焦点をあて、比較解析することにより、日常生活動作、認知症、看護業務負担に関し詳細に項目を分けて量的解析を行い、根拠あるデータを提示できるようにしたい。患者は入院するとおおむね臥床状態となるため、日常生活動作能力および認知機能低下が発生することがある。入院目標の疾患の治療ができても、日常生活動作能力および認知機能が低下してしまえば、満足な退院はできない。そこで、本研究では、院内デイケア、個別対応リハビリの介入により、入院患者の日常生活動作能力低下、認知機能低下の予防に関する研究を行う。本研究では、N病院およびT病院の2施設の研究調査を行い、調査結果の信頼性を増すことを目指している。すでにN病院では、院内デイケアシステムがある程度できあがっており、研究調査が進んでいる。1)院内デイケア参加かつ個別対応リハ実施群、2)院内デイケア参加かつ個別対応リハ未実施群、3)院内デイケア不参加かつ個別対応リハ実施群、4)院内デイケア不参加かつ個別対応リハ未実施群の4群を、開始時、開始後3週時、開始後6週時に調査を行い、各群ともおおむね対象患者を得ることが出来た。調査項目としては、看護師による評価項目として、FIM(機能的自立度)、NPI-NH(入院中認知症患者の周辺症状および介護者負担評価)、バーンアウトスケールを得た。また、作業療法士の評価項目として、MMSE(認知機能評価)、コグニスタット、NMスケールの評価も出来た。また、T病院に関しては病院の建て替え(病棟の建て替え)ということもあり、当初の計画通り、開始時期を遅らせたが、同様の研究内容を予定通り行っている。本研究は、入院患者の病院内での看護職およびリハビリ職によるチーム対応により、患者の日常生活動作の維持および認知症の進行予防、そして、働く職員の負担軽減、および入院中の医療安全を立証するものである。最終年度で、認知症予防の成果と、それに付随する行動心理症状の軽減、および、職員の負担軽減に関するエビデンスを高めることができた。この研究成果を進行させ、認知症の街づくりにつながる重要な提案をするに至った。病気にかかり、入院治療した場合、認知症が進んだ人が退院した際に、急な認知機能低下による行動心理症状、特に徘徊などが出現することがあり、その予防に本研究の成果が貢献する。さらに、退院からスムーズな地域への交わりにおいて、街づくりの重要性を示唆することができた。この成果は、平成26年に開催された4つの学会(日本医療福祉学会、日本保健医療学会、日本ビジネスマネジメント学会、日本商学研究学会)による合同全国大会での合同企画、特別招待講演で学術報告する機会を得、多くの医療福祉介護保健専門職や経営関係の専門職に本研究の成果を伝えることができた。研究は概ね目標を達成し、本研究成果を実用化させるためにも、今後は費用対効果についての研究を進めることとする。実用という意味では、現在の医療経済事情を鑑みると、医療費のデータを追加することは必須であり、具体的な費用対効果提示に結びつく研究成果が必要となろう。日本保健医療学会総合賞受賞看護管理調査作業はほぼ目標に達成したことと、ADL(日常生活動作能力)、看護業務負担で量的解析ができ、結論を報告できるレベルに達したこと。認知症周辺症状に対する効果も見通しがたった。N病院では、調査対象:

1)院内デイケア参加かつ個別対応リハ実施群、2)院内デイケア参加かつ個別対応リハ未実施群、3)院内デイケア不参加かつ個別対応リハ実施群、4)院内デイケア不参加かつ個別対応リハ未実施群の4群それぞれでおおむね30人ずつと集めることができ、予定通りの進行である。各調査項目としては、FIM、NPI-NH、バーンアウトスケールは順調にデータ取得で、目標完了に近い。MMSE、コグニスタット、NMスケールにおいても同様で、データ取得は完了し、データ整理(入力)の最中まで進行している。現時点のデータで、院内デイケア参加かつ個別対応リハ実施群は院内デイケア不参加かつ個別対応リハ未実施群に比較し、6週間でFIM総得点(機能的自立度)が統計学的に有意によいことを示すことができ、研究計画の一目標を達成することが出来た。また、FIMを詳細に解析し、FIM大項目の移動能力が統計学的に有意によいことを見いだした。研究成果は看護分野の学会発表をし、日本老年看護学会第17回学術集会(金沢)で報告した。今後は入院患者の認知症中核症状に対する効果を解析する。多くのデータを得ることができたので、それ以外にも量的解析により種々の視点からの解析をすすめ、学会報告、学術誌で発表する。N病院の調査を完了させ、最終解析に入る。N病院においての研究成果を学会報告、学術雑誌報告する。T病院は病棟の完成を迎えるので、本格的調査・解析に入る。ある程度データが得られた段階で、もう一つの研究目標である複数施設での結果を比較検討し、効果の普遍性を実証したい。N病院においての研究成果報告のための学会報告や学術雑誌投稿に関係する旅費、消耗品などの諸費用に研究費を使わせていただく。T病院の調査解析が本格的に始まるので、調査に必要な環境を整えるために必要な物品、消耗品などの諸費用に研究費を使わせていただく。ただし、すでに調査・解析は始まっているので、ある程度の物品、消耗品は整っている。また、調査に協力して頂いた病院職員には謝礼などの人件費などに研究費を使わせていただく。
再構成ＲＮＰ複合体を用いたインフルエンザウイルス分節化ゲノム選択的集合機構の解明

インフルエンザウイルス分節化RNAゲノムータンパク質複合体(vRNP)の選択的集合機構を解明するため、人工vRNP再構成系を構築し共沈降実験により分節同士の結合を実証しようと試みた。また、モデルウイルスゲノムを用いた競合パッケージング実験により、分節末端に存在する分節集合/パッケージングシグナル配列の同定を試みた。その結果、vRNPが選択的に集合するためには膜表面へ繋留され側方拡散する必要があり、試験管内系でそのような状況を再現することは困難であることが判明した。また、分節末端には分節集合に寄与する配列とパッケージングの可否を決定する配列が混在する可能性が示唆された。本研究課題では、[1]インフルエンザウイルスリボヌクレオプロテイン複合体(vRNP)の人工再構成系と試験管内vRNP共沈降実験系の構築による分節集合シグナルの同定(A型)を主課題とし、[2]モデルウイルスRNA (vRNA)の競合パッケージングによる、分節集合シグナルの検証(A型)および[3] B型ウイルス選択的分節集合様式の決定(B型)を副課題としている。[1]について、野生型vRNA配列を有する人工vRNPの再構成系を構築した。その際にウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)のポリシストロニック発現ベクターを用いることで、比較的高純度の人工vRNPが再構築可能であることを確認した。しかしこの発現系では、一部サブユニットの発現量が低下し、物理的相互作用の検証に用いる十分量の人工vRNPを調製する事が困難であった。単純な塩基置換あるいはアミノ酸変異では解消できなかったが、単独発現ベクターの共トランスフェクションによりある程度は補償可能であることを確認した。一方、当初計画ではRdRp恒常発現細胞を樹立しvRNP再構成に用いる計画であったが、ルシフェラーゼアッセイなどに必要なRdRp量は恒常的に得られるものの、やはり十分なタンパク質量を確保することが困難なため、一過性発現系を用いることにした。[2]についてはホタルまたはウミシイタケのルシフェラーゼ遺伝子どちらかを用い、野生型・変異型の分節集合/パッケージング配列を有するモデルゲノムの構築をおこなった。現在、様々な変異モデルゲノムを用いて、競合パッケージング系の構築を行っている。[3]についてB型インフルエンザウイルス株ゲノムのクローニングを行い、可能な限り均一な遺伝子配列を有する組換えウイルスの作成を試みたが、現時点で安定作成に成功していない。プラーク単離した野生株を用いた検出系の最適化を並行して試みている。[1]インフルエンザウイルスvRNPの再構成系と試験管内vRNP共沈降実験系の構築による分節集合シグナルの同定(A型)について、vRNP再構成系の構築に成功し、現在は再構成・回収効率を可能な限り高めるための最適化を試みている。当該年度の目標はほぼ達成できた。精製した人工vRNPを用いて他分節との相互作用検証に着手したが、当初想定したような選択的分節集合を示唆する強い相互作用は現時点で確認できていない。vRNP共沈降実験系についても、必要因子の追加や共沈降条件の最適化などが必須であり、当初計画で想定したよりも困難である可能性が考えられる。[2]モデルvRNAの競合パッケージングによる分節集合シグナルの検証(A型)については、モデルvRNAの作成が終了しており、これを用いた競合パッケージングの条件検討を進めている。概ね順調に進行中。[3]選択的分節集合様式の決定(B型)については、おそらく手技的な問題にすぎないと思われるが、組換えB型インフルエンザウイルスの作成がうまく行かず、分節集合の検証には至っていない。[1]について前年度構築したvRNP共沈降実験系の最適化に取り組んだが、2分節vRNP同士の相互作用は想定よりかなり弱く、アフィニティ担体を用いた標準的な手法では物理的な結合を安定検出できないと結論した。選択的分節集合が起きるためには輸送小胞の膜上すなわち平面上で側方拡散可能な状態にvRNPを配置する必要があるという作業仮説を補強する結果ではある。[2]については、前年度作成した野生型・変異型の分節集合/パッケージング配列を有するモデルウイルスゲノムを用いて、競合パッケージング系の最適化を行っている。非競合条件の場合は変異型配列をもつモデルゲノムが出芽粒子に取り込まれにくいことを確認した。ただし、モデルゲノムの細胞内コピー数が多ければ、分節集合/パッケージング配列に依存せず偶然パッケージングされやすくなる傾向を見いだした。配列依存的なパッケージングが安定して検出できるよう最適化をすすめている。[3]について前年度クローニングしたB型インフルエンザウイルス株ゲノムの微修正を行い、MDCK細胞で増殖可能な単一配列の組換えウイルス作成に成功した。プラーク単離した別の非組換えB型臨床分離株と共に分節近接頻度の測定を進めている。[1]について、人工vRNPを作成しアフィニティ担体を用いた共沈降実験を行ったが、安定な2分節複合体は得られなかった。アフィニティ担体を用いた共沈降系では原理的にbait分節の移動自由度が制限され、prey分節の自由度は上昇する。