hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトヘルペスウイルス6の宿主細胞へのエントリー機構の解明

ヒトヘルペスウイルス6(HHV-6)は、Tリンパ球向性のウイルスであり、βヘルペスウイルスに属する。現在では、塩基配列や抗原性の違いにより、二つのバリアントに分けられている(HHV-6A,HHV-6B)。HHV-6Bは突発性発疹の原因ウイルスであるが、HHV-6Aに関してはその病態は不明である。本研究は、HHV-6の宿主細胞へのエントリー機構に関わる因子を探索し、その機序を解析することを目的とする。本年度の成果を以下に記す。1.HHV-6ウイルスエンベロープを構成するコレステロールを薬剤処理によって除去することにより、HHV-6の細胞内への感染およびHHV-6が引き起こす細胞膜融合が阻害された。しかし、ウイルス粒子自体の細胞への結合は完全には阻害されなかった。gH/gL/gQ1/gQ2複合体(HHV-6リガンド)のヒトCD46(宿主レセプター)への結合も完全には阻害されなかった。2.薬剤処理によってもウイルスエンベロープに存在する糖タンパクの複合体(gH/gL/gQ1/gQ2およびgBの二量体)に変化は認められなかった。3.以上の結果より、ウイルスエンベロープを構成するコレステロールはウイルスの宿主細胞への侵入過程、特にウイルスエンベロープと細胞膜の融合過程に重要な役割を果たしていることが示唆された。この機序としてコレステロールを除くことにより、エンベロープに存在する糖タンパクの基盤が緩みウイルスの宿主細胞への結合後に起こる糖タンパクの構造変化が起こらず、そのため膜融合ができなくなる可能性が考えられた。ウイルス粒子上のコレステロールの宿主細胞への侵入過程での重要性が示唆され、本結果は、HHV-6感染症の治療法開発に繋がる可能性があり、意義深いと考えられる。ヒトヘルペスウイルス6(HHV-6)は、Tリンパ球向性のウイルスであり、ふたつのバリアント(HHV-6A,HHV-6B)に分けられる。HHV-6Bは、小児の突発性発疹の原因ウイルスであるが、HHV-6Aに関してはその病態は不明である。我々は、HHV-6AがHHV-6の宿主レエプター、ヒトCD46を発現するすべての細胞において細胞膜融合を引きこすことを見いだした。また、この現象は、HHV-6Bでは認められなかった。さらに我々はヒトCD46に結合するウイルス側リガンドがHHV-6A gH/gL/gQ複合体であることを見いだした。しかし、HH-6BのgH/gL/gQ複合体はヒトCD46に結合しなかった。また、gQは、スプライスの違いにより大きく分けて二つのタンパクをコードしていることが判明し、我々はgQ1,gQ2と命名した。gQ1,gQ2は、小胞体あるいはゴルジ装置で二量体を形成し、複合型N型糖鎖の修飾を受けた後、ゴルジ装置でgH/gL/gQ1/gQ2の四量体を形成し、成熟したウイルス粒子に取り込まれることが判明した。一方、我々は、gH/gLのさらなる複合体gH/gL/gOがHHV-6ウイルス粒子上に存在することを見いだした。また、この複合体はgH/gL/gQ1/gQ2とは独立してウイルス粒子に存在し、ヒトCD46には結合しなかった。故にgH/gL/gO複合体は、HHV-6の宿主細胞への侵入過程にgH/gL/gQ1/gQ2とは異なった役割を果たしている可能性が示唆された。これらの複合体は、HHV-6A,HHV-6Bの両バリアントに存在しており、バリアント間の細胞向性の違いに関与している可能性も示唆された。またこのように二種類のgH/gL複合体がウイルス粒子上に存在するというのは他のヘルペスウイルスでは報告がなく、HHV-6は、他のヘルペスウイルスとは異なった侵入方法をとる可能性も示唆された。

この機序としてコレステロールを除くことにより、エンベロープに存在する糖タンパクの基盤が緩みウイルスの宿主細胞への結合後に起こる糖タンパクの構造変化が起こらず、そのため膜融合ができなくなる可能性が考えられた。ウイルス粒子上のコレステロールの宿主細胞への侵入過程での重要性が示唆され、本結果は、HHV-6感染症の治療法開発に繋がる可能性があり、意義深いと考えられる。
アドレノメデュリンと関連ペプチドの特徴的作用の解析と治療応用

アドレノメデュリン(AM)とProadrenomedullin N-terminal 20peptide(PAMP)は、同一の前駆体から産生されるが、相互に異なる作用を有する。本研究では、AMとPAMPの特徴的な作用を解析して、治療薬としての有用性の検討した。その結果、血管新生作用、心筋線維化抑制作用、併用降圧作用、大腸潰瘍治癒促進作用、血圧上昇抑制機能が明確になり、血管新生と大腸潰瘍治癒促進の作用機序についても解明された。また、大動脈疾患の発症進展の機序に関する新たな知見も得られた。本研究の結果を基盤として、AMとPAMPの臨床治療学的応用のための研究展開が可能である。腹部大動脈瘤(AAA)の発症進展におけるAMの病態生理学的役割:手術時に得られたAAA組織におけるAMの発現を、免疫組織学的に検索した。また、細胞培養実験では、肥満細胞株とAAA組織より得られた線維芽細胞を用いて、線維化の指標として、コラゲナーゼ感受性プロリン取り込みを測定した。AAA組織の肥満細胞に高いレベルのAM免疫活性が観察され、AAAを認めない大動脈と比較すると、AAAでは肥満細胞の数が増加していた。細胞培養実験では、肥満細胞からのAMの産生と分泌が観察され、AAA由来の線維芽細胞との共培養下において、AMはコラゲナーゼ感受性プロリン取り込みを抑制した。すなわち、AAA組織中の肥満細胞がAMを産生し、産生されたAMがAAA組織の線維化を抑制する可能性が判明した。今後、AMがAAA拡大抑制的に機能しているか否かを、動物モデルを用いて明確にする必要がある。高血圧の新規発症におけるAMの役割:地域住民における高血圧新規発症と降圧因子AMの血中濃度の関連を検討した。基本健康診査を受診した正常血圧の地域住民220名を対象に、血中AM濃度を測定して、3年間の追跡調査を行なった。追跡し得た177名を解析対象とし(追跡率80.5%)、収縮期血圧140mmHg以上または収縮期血圧90mmHg以上を認めた場合を高血圧発症とした。血中AM濃度の中央値により、高AM群と低AM群の2群に分けて解析したところ、3年間の追跡期間中、高AM群からの高血圧発症(27.8%)は、低AM群(11.5%)より有意に(P<0.01)高頻度であった。すなわち、高血圧発症に先行して血中AM濃度上昇が観察され、AMが血圧上昇に対して抑制的に機能しているという我々の仮説を支持しており、内因性のAMの機能を上昇させる手段が高血圧に対する治療応用につながる可能性を示唆している。高血圧ラットにおけるアドレノメデュリン(AM)とproadrenomedullin N-terminal 20peptide(PAMP)の併用効果:AMとPAMPは、同一の前駆体から産生されるペプチドであり、共に降圧作用を発揮する。しかし、2種類のペプチドが同一前駆体から産生されることの生物学的意義は明確でない。本研究では、高血圧ラット(SHR)に、AMまたはPAMPの単独または併用投与して降圧効果を観察することにより、異なった2種類の降圧ペプチドが同一前駆体から産生される意義について考察した。15週齢のSHRに、AMまたはPAMPを単独または併用にて4週間皮下投与し、血圧と心拍数を無麻酔無拘束下に持続的にモニターした。AMとPAMPの併用投与により、単独投与と比較して、より強力な降圧作用が観察された。すなわち、AMとPAMPは相互に降圧作用を増強することが判明し、同一の前駆体から産生される異なった2種類のペプチドが血圧の上昇に拮抗すべく、協調して機能している可能性が示唆された。心筋梗塞ラットにおけるアンジオテンシン受容体拮抗薬(ARB)とAMの併用効果:本研究代表者らは、心筋梗塞ラットの急性期にAMを投与すると、慢性期の心筋リモデリングが抑制されて、心機能低下が抑制されることを報告した。一方、梗塞後心筋リモデリング抑制におけるARBの有用性が実証されている。本研究では、ARBにAMを併用することにより、より有効なリモデリング抑制効果が得られるかを検討した。ラット左冠動脈結紮により急性心筋梗塞モデルを作成して、急性期より、AMを腹腔内に1週間、ARBカンデサルタンを経口にて9週間、それぞれ投与した。ARB単独投与は、心筋リモデリングを抑制して、心機能の低下を抑制した。急性期におけるAM併用は、ARB単独投与に比較して、非梗塞左室心筋の線維化をより効果的に抑制し、左室収縮能と拡張能は改善傾向を示した。すなわち、急性心筋梗塞後リモデリング抑制を目的とした、AMの併用治療薬としての有用性が示唆された。AM受容体に関する検討:RAMP2とRAMP3は、CRLRを細胞膜に輸送しAM受容体を形成する。

RAMPの細胞外領域のヒスチジン(His, H)と細胞内領域(C末)の役割について、Hisのアラニン(A)置換またはC末欠失変異体を用いて検討した。RAMP2のH124AとH127Aは、CRLRを細胞膜に輸送しなかった。RAMP3のH97AはCRLRを細胞膜に発現させたが、AMの結合性・反応性及びCRLRの細胞内移行を低下させた。一方、RAMP2のC末を欠失させると細胞膜発現が低下したが、RAMP3ではAM依存性の細胞内移行を促進させた。RAMP2とRAMP3の3のHis及びC末は、CRLRの機能や細胞内動態において異なった役割を果たしていると考えられた。高血圧ラットにおけるAMとproadrenomedullin N-terminal20petide(PAMP)の併用効果:15週齢のSHRに、AMまたはPAMPを単独または併用にて4週間皮下投与し、血圧と心拍数を無麻酔無拘束下に持続的にモニターした。とPAMPの併用投与により、単独投与と比較して、より強力な降圧作用が観察された。すなわち、AMとPAMPは相互に降圧作用を増強することが判明し、同一の前駆体から産生される異なった2種類のペプチドが血圧の上昇に拮抗すべく、協調して機能している可能性が示唆された。心筋梗塞ラットにおけるアンジオテンシン受容体拮抗薬(ARB)とAMの併用効果:ラット左冠動脈結紮により急性心筋梗塞モデルを作成して、急性期より、AMを腹腔内に1週間、ARBカンデサルタンを経口にて9週間、それぞれ投与した。ARB単独投与は、心筋リモデリングを抑制して、心機能の低下を抑制した。急性期におけるAM併用は、ARB単独投与に比較して、非梗塞左室心筋の線維化をより効果的に抑制して、血中ANP濃度は低下傾向を示し、左室収縮能と拡張能は改善傾向を示した。すなわち、急性心筋梗塞後リモデリング抑制を目的とした、AMの併用治療薬としての有用性が示唆された。
自由境界問題と単調性等式

個体燃焼理論等に現れる現代的自由境界問題の現象を研究し、その解析に役立つ新しい方法を示した。平成18年度には,下記の結果が得られた.1.放物型Bernoulli自由境界の正則性の自由境界がフラットな点の近傍においてなめらかになることを示した.2.2相幕問題H.Shahgholian氏(王立工科大学,ストックホルム)とN.Uraltseva氏(サンクトペテルブルク)と「2相幕問題」を考察した.任意の次元で自由境界の正則性を示した.論文はInt.Math.Res.Not.にアクセプトされた.プロジェクト「自由境界と調和解析」D. JERISON氏(マサチューセッツ工科大学,ボストン)と,ベルヌリ条件の自由境界の調和測度について結果を得た.調和測度の台の次元が最大n-1であることを示したことである.方法は新しい振動数等式に基づいている.プロジェクト「Mumford-Shah問題における特異点」ここではよく知られているMumford-Shah予想への一歩として,「crack tip」という特異点における解のふるまいを研究した.ある増大条件を仮定し,crack tipの次元,そして解のcrack tipにおけるふるまいを示した.プロジェクト「時間依存2相幕問題」H. Shahgholian氏(王立工科大学,ストックホルム),N. Uraltseva氏(サンクトペテルブルク)と時間依存の2相障害物問題について研究した.ただし,ここでは係数は正のリプシツ連続関数でる.高次元で自由境界が各「分岐点」の近傍において2つのリプシツグラフの和集合であり,空間変数に関して連続微分可能であることを示した.反例により,時間変数に関するリプシツ連続性がオプティマルであることも示した.1プロジェクト「転移ダイナミックス」では,パリのCERMICS(数学,コンピュータ,科学的計算教育研究センター)のR. Monneau氏と転移ダイナミックスから導き出されたnonlocalHamilton-Jacobi方程式を考察した.位相的変化まで転移曲線の長さ評価を示した.2プロジェクト「Mumford-Shah問題における特異点」では,二次元のMumford-Shah問題と同値な問題を導き出し,その問題について単調性等式を示した.なお、こちらの方法は表面張力のついて水面波にも適用することが可能である。3プロジェクト「4階楕円型方程式におけるblow-up」ではJ. Andersson氏(ユバスキュラ大学,フィンランド)と4階半線形楕円型の自由境界問題を考察した.新しい単調性等式を用いることにより,解の増大を示した.4プロジェクト「金属シート変形の数学」では, R. Grzibovski氏(ザールランド大学,ドイツ)と金属シート変形の際に現れる,面積保存変形問題を研究した.数値計算のために4階の勾配流を導き出した.
地上部光環境による植物根圏共生微生物群集の制御機構の解明

農業における有用根圏共生微生物の安定的・効果的な利用促進のため、光受容体遺伝子の変異体植物や多様な光環境制御下で栽培された植物の根圏共生微生物群集の多様性や機能性を調べる。それらの結果をもとに、地上部の光環境を通した植物による根圏共生微生物の制御機構を解明し、地上部の光環境に応答性を持つ微生物群を特定する。メタゲノム解析やゲノム解析を通して地上部の光環境に応答するための根圏共生微生物(群集)に特徴的な機能性遺伝子や形質、接種効果等を明らかにする。以上の知見を集積し、地上部の光環境制御を通した根圏共生微生物群集の制御技術や、有用な根圏共生微生物の安定的・効果的な利用技術開発の基盤を構築する。
開放動学的一般均衡モデルによる日本経済の分析

申請書に記述した「1.開放モデルによる日本経済分析」を完成させ、「2.国際的な資本移動に関する実証分析」、「3.日本の財政赤字の分析」及び、「4.香港におけるデフレーションに関する分析」に取り組んだ。2本の論文が専門雑誌に掲載あるいは採択され、国内外の学会7件において成果を発表した。1.に関しては、前年度中にまとめた研究成果を多くの学会において発表し、指摘された点の修正を経て研究を完遂した。今後国際専門誌に投稿予定である。本研究が分析対象とする日本の経常収支は2011年に黒字が大幅に減少し、その動向が世界的に注目されている。日本の経常収支の決定要因と今後の動向予測を行うことは、日本経済の今後の動向や必要とされる施策を検討する上で、不可欠な要素である。このことに正面から取り組んだ本研究は有意義な成果を上げる事が出来た。2.は、1.の研究成果を踏まえ本年度より新たに取り組んだ試みである。近年中国の経常黒字が拡大し、米国の経常赤字が膨らむなど、世界的に資本移動の偏りが指摘されている。背景にはどのような経済変化があるのかを、1.と同様のアプローチを用いて分析を行った。現在データの構築が終わり、シミュレーション分析に今後取り組む予定である。3.に関しては、日本の財政赤字はなぜ急増したかという課題を検証した。この成果は後述雑誌論文の1件目として国際学会誌に掲載された。4.に関しては、昨年度に和文の研究成果が国内専門誌にされた。これを英文にまとめなおし、加筆修正を施した研究成果が後述雑誌論文の2件目として専門誌に掲載される。申請書に記述した1開放モデルによる日本経済分析に加え、2日本の財政赤字の分析及び、3香港におけるデフレーションに関する分析を行い、計4本の論文を執筆した。いずれも人口高齢化、政府債務の増大、デフレといった、日本経済が現状で抱える重大な課題を対象とした研究であり、今後の政策運営への含意を提供することを目的とした研究に一貫して取り組んだ。1に関しては、日本の経常収支が高齢化・90年代以降の景気低迷・中国等の国々の急成長といった諸要因からどのような影響を受けていたのかを分析した。成果は"The Japanese Current Account : Why It Still Remains High?"としてまとめ、今後二件の国内学会での発表が決定しており、国際学会誌に投稿中である。世界的にデフレーションへの警戒が高まる中、有益なケーススタディーを提供することを目的に、3では、90年代の香港で起こったデフレーションの要因分析を行った。この研究結果は後述雑誌論文にまとめ、国内専門誌に掲載される。
四量体構造-機能相関解析に基づく癌抑制タンパク質p53の機能修復

癌抑制タンパク質p53は様々な遺伝毒性ストレスに応答して活性化し、下流の種々の標的遺伝子の転写を活性化させて細胞周期停止・アポトーシスを誘導する。四量体形成はp53のDNA結合、翻訳後修飾、安定化に必須である。p53の変異はヒト悪性腫瘍で最も多く認められる異常であり、癌遺伝子治療の重要なターゲットの一つである。本研究では、四量体形成ドメインおよびDNA結合ドメインに変異を持つ変異型p53の機能回復を目指し、『四量体形成ドメイン変異型p53の構造を安定化させる新規化合物の開発』および『DNA結合ドメインの変異に対する非ヘテロオリゴマー形成性の改良型p53の開発』を目的としている。前年度までに、二種のカリックス[6]アレーン誘導体を合成し、イミダゾリル基を持つイミダゾールカリックス[6]アレーンがp53-R337H変異体の四量体構造を安定化させることを明らかにしている。細胞内p53転写活性を解析する蛍光レポーターシステムを用い、カリックス[6]アレーン誘導体がp53の転写活性に及ぼす効果を解析した。その結果、四量体構造の安定化効果を示すイミダゾールカリックス[6]アレーンにより細胞内のp53-R337Hの転写活性を増加させることに成功した。また、R337H四量体構造の安定化を示さなかったピラゾールカリックス[6]アレーンでは転写活性に変化が見られなかったことから、イミダゾールカリックス[6]アレーンによる転写活性の増加は四量体構造の安定化を介した活性増加であることが示唆された。このカリックスアレーン誘導体による転写活性の増加は、p53の四量体構造を安定化した事による機能修復の初めての例である。変異型p53の四量体構造を安定化させる新規化合物のターゲットとして、四量体構造界面に存在する6個のGlu残基を選択した。この部位に特異的に結合する化合物の基本骨格には6価の官能基を配置することが可能なカリックス[6]アレーンを選択し、現在までに官能基としてピラゾリル基およびイミダゾリル基を持つカリックス[6]アレーンの合成を完了した。合成した化合物を変異型p53TDペプチドに加え、四量体構造の安定性変化をCDスペクトルにより解析した結果、ピラゾリル-カリックス[6]アレーン,イミダゾリル-カリックス[6]アレーン共に変異型ペプチドF328V,R337Hを安定化した。さらに、安定化剤や変異型により安定化効果に差が見られ、他の変異型ペプチドに対する効果を解析することにより安定化機構の解明が期待される。前年度に合成し、R337H、F328Vに対する安定化能を持つピラゾリル-カリックス[6]アレーン、イミダゾリル-カリックス[6]アレーンの変異型ペプチドR337L、L348S、E339K、E343Gに対する安定化効果の解析を実施した。ピラゾリル-カリックス[6]アレーンおよびイミダゾリル-カリックス[6]アレーンR337L、L348Sを安定化した。さらに、R337H,F328Vではカリックスアレーン誘導体の官能基によって安定化能に違いが見られたのに対し、R337L、L348Sでは官能基による安定化効果の違いが見られなかった。一方、カリックスアレーン誘導体が相互作用する部位と予想されるGlu残基の変異体E339K、E343Gでは、安定化が見られず、不安定化することが明らかとなった。今後他の変異型ペプチドに対する効果を解析することにより安定化機構の解明が期待される。

本研究では、四量体形成ドメインおよびDNA結合ドメインに変異を持つ変異型p53の機能回復を目指し、『四量体形成ドメイン変異型p53の構造を安定化させる新規化合物の開発』および『DNA結合ドメインの変異に対する非ヘテロオリゴマー形成性の改良型p53の開発』を目的としている。前年度までに、二種のカリックス[6]アレーン誘導体を合成し、イミダゾリル基を持つイミダゾールカリックス[6]アレーンがp53-R337H変異体の四量体構造を安定化させることを明らかにしている。細胞内p53転写活性を解析する蛍光レポーターシステムを用い、カリックス[6]アレーン誘導体がp53の転写活性に及ぼす効果を解析した。その結果、四量体構造の安定化効果を示すイミダゾールカリックス[6]アレーンにより細胞内のp53-R337Hの転写活性を増加させることに成功した。また、R337H四量体構造の安定化を示さなかったピラゾールカリックス[6]アレーンでは転写活性に変化が見られなかったことから、イミダゾールカリックス[6]アレーンによる転写活性の増加は四量体構造の安定化を介した活性増加であることが示唆された。このカリックスアレーン誘導体による転写活性の増加は、p53の四量体構造を安定化した事による機能修復の初めての例である。
行列値作用素に対する多重スケール解析の展開:数理物理と量子力学のモデルへの応用

1次元アンダーソンモデルの局所化問題についての解析は多くの研究により現在よく理解できるようになったが、高次元問題についてはまだ未解決である。本研究では高次元アンダーソンモデルの局所化問題を扱うことを目的として、2次元アンダーソンーベルヌーイモデルや3次元モデルについてのいくつかの予想の解決を行った。第一には、高次元モデルを扱うために、連続モデルから離散化を行い、離散パラメータを無限大にしたときに発生する問題についての解析を行った。この手法により、2次元の偏微分方程式の問題を行列値常微分方程式の問題へと定式化され、局所化問題が取り扱えた。平成21年度では、今までの研究を推進し、リアプノフ指数のヘルダー連続性の証明を行った。この結果の一部をReviews of Mathematical Physicsにて発表した。行列値の場合についても3次元のあるモデルについて正則性の結果を示すことができた。局所化問題については、上記の結果を用いて、Wegner評価をえることであるが、ある条件下において、肯定的に解決することができた。現在、一般の場合の証明を与えるべく研究を発展させている。本年度は、行列値シュレディンガー方程式のインテグレーテッド状態についての研究を行い新たな正則性についての結果を得た。これは、この分野の専門学術雑誌であるReviews of Mathematical Physics 2008に発表した。この論文のなかで、本成果で得られたインテグレーテッド状態の正則性とリアプノフ指数を将来一般化して用いたい理論的枠組みの可能性についても検証できた。この手法と同様のやり方は、行列値点相互作用モデルの設定を行うことができ、それによてこのモデルについて同じような正則性の結果を得ることができた。特に、3次元の場合での特別なモデルに対する一般的な設定により、このモデルのランダムネスの伝播について興味ある現象を発見することができた。この研究期間のなかで、最初の研究のモチベーションであった、行列値作用素に対する多重スケール解析についても考察を行った。これによりAnderson localizationについて固有値問題と力学系の両方の立場からの一般的な結果をえることができた。これを応用することで、任意のN×N行列ポテンシャルの場合の行列値シュレディンガー作用素についての考察が可能となった。この結果は現在学術論文に投稿中である。
ワクチンの同時接種・筋注の安全性評価

現在、わが国で使用されているワクチンをマウスに筋注し安全性を評価した。現行ワクチン製剤はかつての筋拘縮症のような筋組織の壊死、瘢痕化を起こすことはなく安全に使用できることが明らかとなった。接種部には炎症性肉芽腫が認められ接種3時間後から接種部位に炎症性サイトカイン(IL-6, IL-β, TNF-α)やIL-4, G-CSFが産生され7日後には検出できなくなる。接種部位には好中球が遊走し炎症反応を惹起し獲得免疫を誘導する。ワクチン接種後の副反応として発熱を認めた児ではG-CSFが高値を示し、ワクチン接種後の免疫応答に炎症反応が重要な役割を担っていることが明らかとなった。1)同時接種の安全性肺炎球菌(PCV)を含んだ同時接種で発熱率が高くなる原因を検索した。ヒト末梢リンパ球をPCVで刺激するとIL-1β、Hibで刺激するとIL-6産生を刺激し、PCV/Hib/DPTの3種類のワクチン刺激でIL-1β,IL-6, TNF-αの産生能が増強した。同時接種後発熱例(61例)と発熱を認めなかった例(18例)の血清中のサイトカインを検討しIL-1β,IL-6, TNF-αの炎症性サイトカインは通常の健康児よりは高いが両群では差は認めなかった。一方、G-CSFが発熱児では高値を示した。2)ワクチン筋注と皮下接種1960年代から抗菌剤と解熱剤の混注による筋拘縮症が問題となり、ワクチン接種では問題はなかったが、筋注の医療行為は封印された。広範な筋組織の破壊と萎縮が認められヒトの所見は実験動物で再現できる事から、ワクチンの筋注が筋拘縮症の病態を起こさず、現在行われている皮下接種と同等の安全性を有する事を証明するために現行のワクチンをBALB/cマウスに接種し検討した。アルミを含まないワクチンは接種後極めて軽度の限局的な炎症所見を認めるか、何も所見を認めない。アジュバントを含有したワクチン接種では炎症性肉芽腫を形成し結節は数ヶ月から1年は残るが,局所の炎症所見は1カ月をすぎると治癒機転にあることが明らかとなった。すべての有効なワクチンは自然免疫系に刺激を入れてサイトカインを誘導することが知られておりワクチン接種48時間後まで筋組織内、および血清中のサイトカインを測定した。アルミとMPLの複合アジュバントを用いたサーバリックスは48時間までに非接種側の数10倍から数100倍高いIL-1β,IL-6, G-CSFを産生しており他のワクチン接種でも5倍近く増加しているがTNF-αは変化が認められなかった。ワクチン接種後の副反応として接種直後に発熱を認めた乳幼児での血清中のサイトカインを検討した。発熱児では血清中のG-CSFが高値を示し、炎症性サイトカインは発熱を認めなかった児の血清と優位差は認めなかった。しかし、ワクチン接種児では正常児と比較すると高値のサイトカインガ検出された。小児のリンパ球を不活化ワクチンで刺激し複数のワクチンの組み合わせで検討すると肺炎球菌ワクチンを含んだ2種類、3種類の同時刺激で高いサイトカインの産生が認められた。ワクチンの種類によりサイトカインの誘導能は異なっており、同じワクチンでもメーカーにより差が認められる。現在、ワクチンの接種はかつて大腿四頭筋拘縮症が問題となって以来、皮下接種で行われているが、アジュバントを含んだワクチンは外国では筋注で接種されている。ヒトパピローマワクチンは筋注で認可され定期接種化されたあとで、接種後の慢性疼痛が社会的問題となりワクチンの筋注の安全性が懸念されたところから我が国で使用されているワクチンをマウスに筋注し、皮下接種と比較した。アジュバントを含んだワクチンは炎症性肉芽腫を形成するがアジュバントを含んでいないワクチンでは炎症性肉芽腫は認めず、筋注の組織所見はかつての筋拘縮症に認められた筋組織の変性、壊死、線維化は認めず皮下接種と同等であった。炎症性肉芽腫は6カ月から縮小傾向を認めるが、1年を経過してもも結節は残っている。接種部位には最初に好中球が集まり、変わってマクロファージに取り囲むようになり局所の炎症性サイトカインは1週で軽快することが明らかとなった。接種部位でどのような免疫応答が起きているのかを知るために2社のHPV, 2社のDPT/IPV 4混、4社のDPT, Hib, PCV13接種後4週間、更に再接種後1週まで経時的に筋組織でのサイトカイン産生能を検討した。サーバリックス接種3時間後からIL-1β, IL-6, G-CSF, MCP-1が産生され、7日以降では炎症性サイトカインは検出されなかった。再免疫2日後では同様にこれらのサイトカインが増加したが5日後では減少していた。ガーダシル接種後では、5-7日後にIL-4の産生が認められ、再接種後でも同様であった。TNF-αの産生は7日後にピークを示した。DPT単独接種後とDPT/IPV 4混接種後のサイトカイン産生は同様のプロファイルを示した。IL-1β, IL-6, G-CSF, MCP-1が接種5日後に検出され、IL-4産生能は5-7日後にピークを認めた。

PCV13接種後では5-7日後にIL-1β, IL-4, G-CSFの産生がみとめられHib接種後では炎症性サイトカインの顕著な変化は認めなかった。アルミアジュバントを含んだワクチンは接種3-6時間後から炎症性サイトカインが産生されワクチンの種類によってサイトカインプロファイルが異なることが明らかとなった。アジュバントを含んだワクチン接種3-6時間後から接種局所に産生されたG-CSFにより好中球が遊走し好中球は自己融解し(Neutrophil extracellular traps: NETs)をおこし、自然免疫系のdamage associated molecular patterns (DAMPs)にシグナルが入り炎症性サイトカンを産生する。ワクチン接種後のG-CSFは好中球を誘導し炎症反応を惹起し炎症性サイトカインを誘導することで免疫応答と共に発熱等の副反応に関連している。現在、わが国で使用されているワクチンをマウスに筋注し安全性を評価した。現行ワクチン製剤はかつての筋拘縮症のような筋組織の壊死、瘢痕化を起こすことはなく安全に使用できることが明らかとなった。接種部には炎症性肉芽腫が認められ接種3時間後から接種部位に炎症性サイトカイン(IL-6, IL-β, TNF-α)やIL-4, G-CSFが産生され7日後には検出できなくなる。接種部位には好中球が遊走し炎症反応を惹起し獲得免疫を誘導する。ワクチン接種後の副反応として発熱を認めた児ではG-CSFが高値を示し、ワクチン接種後の免疫応答に炎症反応が重要な役割を担っていることが明らかとなった。ワクチンの同時接種による発熱に関連するサイトカインとしてG-CSFが高値を示すことが明らかとなった。ワクチンの筋注の組織所見の1年間の推移を検討し皮下接種と同等の安全性を確認できた。ワクチン接種3時間で炎症性サイトカインが産生されG-CSFも産生され接種後早期に好中球が動員されマクロファージに変わり炎症は修復することが明らかとなった。小児科学ワクチン筋注後の組織の検討が終了したが血清のサイトカインの検討が残っている。また、G-CSFが初期に好中球を動員し炎症性肉芽腫を形成するが発熱との関連性が不明である。動員された好中球は自己融解するところまで明らかとなったが、発熱、疼痛にかかわる因子を解明する。1)同時接種2010年に認可されたHib, PCV, DPTの組合わせによるリンパ球のサイトカイン産生能を検討し。PCVを含む同時刺激で炎症性トカインの産生が上昇した。このことから同時接種後発熱を呈した例では炎症性サイトカインが高値を示すことが予測された。発熱症例を集めて血清サイトカインを検討するために2011年から小児科臨床医との共同研究を開始した。ワクチン接種後に発熱を認めた61例、発熱を認めなかったコントロール18例の48時間以内の血清のサイトカインを測定した結果IL-1β,IL-6, TNF-αには差がなくG-CSFのみが発熱児では高値を示し、発熱のバイオマーカーとなる可能性が示唆された。2)筋注と皮下注2013年Hib, PCV7, HPVが定期勧奨接種のワクチンとなったが、HPVワクチン接種後の失神、慢性疼痛が問題となりHPVワクチンの接種は一次中断されている。現行の勧奨接種のワクチン接種後の筋組織の病理所見を検討しかつての筋拘縮症の所見はない事を明らかとした。一連の研究の中でHPVのワクチン接種後の検討も始めておりサーバリックスは他のワクチンと異なり1カ月後でマクロファージ結節を形成し急性期の48時間のサイトカインの動態を明らかにした。
レドックス制御・炎症性サイトカインからみた内耳性難聴の病態解明と治療への応用

内耳性難聴は病態は不明の点が多く、治療法もいまだ確立されていない。疾患の原因や発症のメカニズムは不明であるが環境要因や遺伝要因含めた多因子疾患であると考えられる。内耳性難聴の代表的疾患である突発性難聴の症例とコントロールでレドックス制御、酸化ストレス、炎症に関連する遺伝子多型について検討を行ったところ、一酸化窒素合成酵素(NOS)3とuncoupling protein (UCP)が突発性難聴のリスクとなることがわかった。内耳性難聴は症例数の多い疾患であるが、その病態は不明の点が多く、治療法もいまだ確立されていない。本研究では、臨床的研究として内耳性難聴症例でのレドックス制御、酸化ストレスの観点から、遺伝子多型や内耳MRI画像での内耳血管透過性亢進を中心とした所見を評価し、病態の分類や予後の検討をめざすものである。突発性難聴症例において、葉酸関連、一酸化窒素合成酵素(NOS3)、カベオリン、メラトニン受容体など7種類の遺伝子多型を調べ、コントロールと比較したところ、一酸化窒素合成酵素(NOS3)の多型(rs1799983)が疾患のリスク(オッズ比2.1)と関連することがわかった。また突発性難聴の聴力の予後と各遺伝子多型のアレル頻度を比較したが、予後良好群と予後不良群でアレル頻度に差は認めなかった。内耳MRI(3D-FLAIR)では、造影前高信号は内耳液タンパク質濃度の上昇もしくは微量の内耳出血を、造影効果ありは内耳の血管透過性亢進・血液迷路関門破綻をそれぞれ示唆する。突発性難聴症例では、3D-FLAIR MRI造影前高信号ありの群と高信号なしの群で各遺伝子多型のアレル頻度を比較したが、両群間でアレル頻度に差は認めなかった。また造影効果ありの群と造影効果なしの群で同様に各遺伝子多型のアレル頻度を比較したが、両群間でアレル頻度に差は認めなかった。NOは血管内皮より産生され血管拡張に関連する。NOS3の遺伝子多型によりNOの産生が障害されると、赤血球の変形能に影響を与え血液の粘度が増す可能性がある。レドックス制御・炎症性サイトカインの内耳における働きを検証するための、症例血清サンプルでのサイトカインの検討がさらに必要なため。内耳性難聴症例について、遺伝子多型の検索をさらにすすめ、レドックス制御、酸化ストレスの観点から、リスクの検討、治療効果の検討を行い、病態の分類をめざす。医歯薬学成果を学会発表および論文で公表できているため。研究結果を論文作成し、投稿しているが、現在までのところ受理にいたっておらず、その経費が未使用である。またレドックス制御・炎症性サイトカインの内耳における働きを示唆するデータも一部出ているが、その検証のため、症例血清サンプルでのサイトカイン測定のための経費が未使用であるため。論文修正し投稿を行う。レドックス制御・炎症性サイトカインの内耳における働きを示唆するデータも一部出ているが、その検証のため、症例血清サンプルでのサイトカイン測定の追加を行う。内耳性難聴症例において、さらにレドックス制御、酸化ストレスの観点から、病態の分類、病態別治療が行えるような炎症性サイトカインなどのマーカーの検索を行う。今年度は内耳性難聴症例での一部の遺伝子多型の研究をおこない、それに関し次年度以降の予定であった成果発表まで行ったため、それ以外の予定の研究を施行できなかったため。内耳性難聴症例でのサイトカイン関連マーカーの検索や動物モデルでの内耳の形態的、生理学的実験を行う予定である。
神経変性疾患に対するHumaninの治療効果の検討

これまでの研究から、アルツハイマー病(ア病)患者後頭葉よりin vitroでア病特異的神経細胞死を抑制するペプチドHNが同定されていた(Hashimoto, et. al., Proc Natl Acad Sci USA 2001)。1、2年度の研究において我々は強力なHN誘導体、CLNを作製し、その効果をAβ脳室内投与モデル、Aβ海馬内注入モデルおよび抗コリン剤投与モデルを用いて検討した。この結果、CLNはAβ脳室内投与によって誘導される記憶障害を完全に抑制し、またAβ海馬内注入によって生じる神経細胞死も完全に抑制した。抗コリン剤であるスコポラミンや3-QNB投与によって生じる記憶障害に関してもCLNが抑制したことから、CLNはア病に関連した記憶障害や神経細胞死にin vivoでも拮抗する因子であるということが明らかとなった(Chiba, et. al., J Neurosci 2005)。今年度はCLNを臨床的に使用できる薬剤とするため、次に投与系路の最適化を検討した。これまでの検討では全てペプチドを直接脳室内に投与するという手法を用いて来たが、さらなる方法として鼻腔内投与法の開発を行った。免疫組織学的な検討から、鼻腔内に投与されたCLNが嗅球および大脳皮質で検出されることが確認された。また、蛍光ラベルしたCLNを鼻腔内投与して、in vivo蛍光イメージャー(Optix,GE Heal thcare)によって観察すると30分程で、大脳の大部分にCLNが移行していることが確認され、またこのCLNは4時間程度で大部分脳内から消失するということも明らかとなった。CLN鼻腔内投与の効果としては脳室内投与の際よりも量は必要となるものの、1 nmol程度投与すれば抗コリン剤による記憶障害を有意に改善することが明らかとなった(Yamada, et. al., Neuropsychopharmacology, Oct 2007 Epub)。この際に、CLNによって海馬神経においてSTAT3が活性化していることが明らかとなり、HNやCLNの治療効果にはJAK2/STAT3系路が重要であることが示唆された。神経変性疾患(アルツハイマー病[ア病]、プリオン病、前頭葉側頭型痴呆)に対する治療薬の開発を本研究の目的として、ヒューマニン(HN)およびその誘導体の治療効果、投与経路の検討を行った。今年度は初めに、薬効評価に特化した新規ADモデルマウス作成に着手した。その際に、げっ歯類の脳室内へ大量のAβ25-35を単回投与することにより、Y字型迷路(Y-maze)における空間的作業記憶障害が誘導されることに着目し、マウスの側脳室内にカニューラを留置して少量のAβ25-35を3週間にわたって反復投与することにより記憶障害を誘導するという、Aβの亜急性毒性をもとにした新しい薬効評価系を構築した(Yamada et al., Behav Brain Res 164:139-146:2005)。次に、このADモデルマウスを用い、HNおよびその誘導体の治療効果を検討した。我々は、脳室内投与ではなく末梢投与でも効果を発揮するような誘導体を作製したいと考え、新しい神経保護ペプチド、コリベリン(Colivelin, SALLRSIPA-PAGASRLLLLTGEIDLP[アミノ酸1文字表記])を作製した。このペプチドはHNのN末端に多量体化を促進するペプチドを結合させることによって効果が強まるという知見に基づき(Terashita et al., J Neurochem 85:1521-1538:2003)、1996年に発見されたAβの神経毒性を抑制する9アミノ酸からなる多量体化を促進できる神経保護ペプチド、Activity-dependent neurotrophic factor (ADNF)を、現在までに作製されたHN誘導体の中で最も効果の強いAGA-(C8R)HNG17のN末端に結合させて作製したものである。In vitroにおける細胞死抑制効果の検討の結果、HNGが各種のAD関連神経毒性に対して10nMで効果を示すのに対して、Colivelinはわずか100fM(HNGの1/100,000の量)で効果を示すことが確認された(Chiba et al., J Neurosci 25:10252-10261:2005)。In vivoでの効果を検討する為、上述のAβ反復投与モデルに対して脳室内投与を行ったところ、Aβによる記憶障害をHNGで報告された量の1/100程度で完全に抑制することが行動学的、組織学的に確認された。また、Aβ1-42を海馬CA1領域に直接注入するモデルを用いてin vivoにおける細胞死抑制効果を検討したところ、Colivelinの投与によって細胞死がほぼ完全に抑制されることを観察した。さらに、ムスカリン型アセチルコリン受容体阻害剤の一つである3-quinuclinidyl benzilate (3-QNB)による記憶障害モデルに対してColivelinを腹腔内投与したところ、記憶障害を統計学的有意に改善した為、Colivelinが末梢投与によっても有効であることが示唆された。神経変性疾患(アルツハイマー病[ア病]、プリオン病、前頭葉側頭型痴呆)に対する治療薬の開発を本研究の目的として、ヒューマニン(HN)およびその誘導体の治療効果、投与経路の検討を行っている。本年度は、まず初めにColivelinの投与方法の検討を行った。昨年度の研究の結果、Colivelinは脳室内投与、腹腔内投与によって、ア病関連因子の誘導する記憶障害に拮抗作用を持つことが解っている。

Coiivelinをア病治療薬として臨床応用する場合、より低侵襲な投与方法が必要となる。投与方法の候補として私達は鼻腔内投与に着目した。鼻腔内投与では、嗅神経と三叉神経を介して中枢神経系に作用することが報告されている。Aβ反復投与モデルに対して脳室内投与を行ったところ、Aβによる記憶障害を1日1nmol投与、計10回投与で効果を示した。さらに、ムスカリン型アセチルコリン受容体阻害剤の一つである3-quinuclidinyl benzilate (3-QNB)による記憶障害モデルに対してColivelinを鼻腔内投与したところ、記憶障害を統計学的有意に改善した。次に老人斑形成モデル、Tg2576に対するHN誘導体、Colivelinの鼻腔内投与による効果の検討を行った。14ヶ月のTg2576に対して2日に1回、3週間に渡りCoiivelinを鼻腔内投与し、その効果を行動学的および形態学的に検討した。その結果、行動学的、形態学的に改善効果が得られた。今後、他の神経変成疾患に対する治療効果を検討する予定である。これまでの研究から、アルツハイマー病(ア病)患者後頭葉よりin vitroでア病特異的神経細胞死を抑制するペプチドHNが同定されていた(Hashimoto, et. al., Proc Natl Acad Sci USA 2001)。1、2年度の研究において我々は強力なHN誘導体、CLNを作製し、その効果をAβ脳室内投与モデル、Aβ海馬内注入モデルおよび抗コリン剤投与モデルを用いて検討した。この結果、CLNはAβ脳室内投与によって誘導される記憶障害を完全に抑制し、またAβ海馬内注入によって生じる神経細胞死も完全に抑制した。抗コリン剤であるスコポラミンや3-QNB投与によって生じる記憶障害に関してもCLNが抑制したことから、CLNはア病に関連した記憶障害や神経細胞死にin vivoでも拮抗する因子であるということが明らかとなった(Chiba, et. al., J Neurosci 2005)。今年度はCLNを臨床的に使用できる薬剤とするため、次に投与系路の最適化を検討した。これまでの検討では全てペプチドを直接脳室内に投与するという手法を用いて来たが、さらなる方法として鼻腔内投与法の開発を行った。免疫組織学的な検討から、鼻腔内に投与されたCLNが嗅球および大脳皮質で検出されることが確認された。また、蛍光ラベルしたCLNを鼻腔内投与して、in vivo蛍光イメージャー(Optix,GE Heal thcare)によって観察すると30分程で、大脳の大部分にCLNが移行していることが確認され、またこのCLNは4時間程度で大部分脳内から消失するということも明らかとなった。CLN鼻腔内投与の効果としては脳室内投与の際よりも量は必要となるものの、1 nmol程度投与すれば抗コリン剤による記憶障害を有意に改善することが明らかとなった(Yamada, et. al., Neuropsychopharmacology, Oct 2007 Epub)。この際に、CLNによって海馬神経においてSTAT3が活性化していることが明らかとなり、HNやCLNの治療効果にはJAK2/STAT3系路が重要であることが示唆された。
有機ケイ素σ共役系イオンの生成,性質および構造の研究

二五環式ラダーポリシランをTHF中,-70°Cでカリウムで還元すると,ラジカルアニオンが生成した.溶液はラダーポリシランの環数によって異なる色を呈するが,例えば五環式ラダーポリシラン(1)では溶液は黒くなり,近赤外領域(λ_<max>831nm)に強い吸収を示す.また,1〓のESRスペクトルではサテライトを伴うシグナルが観測された.サテライトはケイ素上のイソプロピル基のα-^<13>によるものと帰属され,スピンは分子全体に非局在化していると考えられる.このシグナルは温度を室温に上げても全く変化が見られず,室温で数か月放置しても安定に存在した(1か月後に19%減衰).これまでに報告されているほとんどのポリシランのラジカルアニオンは低温でのみ観測可能であり,1〓はポリシランのラジカルアニオンとしては極めて安定である.1はナトリウムやリチウムでも還元され,同一のラジカルアニオンを生成した.また,syn構造を有するラダーポリシランのラジカルアニオンは,異性体であるanti構造のラダーポリシランのラジカルアニオンより不安定で,例えばanti, syn形の四環式ラダーポリシランのラジカルアニオンは-70°C以上でanti, anti形の四環式ラダーポリシランのラジカルアニオンへ異性化した.一方,二五環式ラダーポリシランを塩化メチレン中,塩化アルミニウムで酸化すると,ラジカルカチオンが生成した.いずれの場合もESRスペクトルでは幅の広いシグナルが観察されるが,特に五環式ラダーポリシランのラジカルカチオンは室温で数時間程度観測可能な安定性を有することがわかった.二五環式ラダーポリシランをTHF中,-70°Cでカリウムで還元すると,ラジカルアニオンが生成した.溶液はラダーポリシランの環数によって異なる色を呈するが,例えば五環式ラダーポリシラン(1)では溶液は黒くなり,近赤外領域(λ_<max>831nm)に強い吸収を示す.また,1〓のESRスペクトルではサテライトを伴うシグナルが観測された.サテライトはケイ素上のイソプロピル基のα-^<13>によるものと帰属され,スピンは分子全体に非局在化していると考えられる.このシグナルは温度を室温に上げても全く変化が見られず,室温で数か月放置しても安定に存在した(1か月後に19%減衰).これまでに報告されているほとんどのポリシランのラジカルアニオンは低温でのみ観測可能であり,1〓はポリシランのラジカルアニオンとしては極めて安定である.1はナトリウムやリチウムでも還元され,同一のラジカルアニオンを生成した.また,syn構造を有するラダーポリシランのラジカルアニオンは,異性体であるanti構造のラダーポリシランのラジカルアニオンより不安定で,例えばanti, syn形の四環式ラダーポリシランのラジカルアニオンは-70°C以上でanti, anti形の四環式ラダーポリシランのラジカルアニオンへ異性化した.一方,二五環式ラダーポリシランを塩化メチレン中,塩化アルミニウムで酸化すると,ラジカルカチオンが生成した.いずれの場合もESRスペクトルでは幅の広いシグナルが観察されるが,特に五環式ラダーポリシランのラジカルカチオンは室温で数時間程度観測可能な安定性を有することがわかった.
マウスモデルによるHIV感染ならびに発症機構の解析

CXCR4を主に用いるT細胞指向性HIVは一般に病態の進行に伴い出現する。この種のHIVが蔓延した感染者体内のCD4陽性下リンパ球がどのような機構により減少していくのか、あるいはCXCR4指向への質的なウイルス変異が免疫不全の進行に先立って必須であるか否かの二点について依然として明確に答えることはできず、個体レベルでの発症機構解析が必要とされている。マウスは、遺伝的な背景が詳しく解析されており、この病原レトロウイルスと宿主免疫系および宿主細胞遺伝子群との相互作用を明らかにするには、優れた小動物モデル系になりうる可能性を持つ。我々は、ヒトCD4およびヒトCXCR4遺伝子をマウスCD4遺伝子の転写制御領域(CD4エンハンサー,プロモーター,およびサイレンサー)に結合させた二種のトランスジーンを作製、両コンストラクトをマウス受精卵の核内に注入し、それらが同じ染色体に組み込まれたマウスを作製した。このヒトCD4/CXCR4を発現したマウスの胸腺、牌臓および末梢血よりリンパ球を調整し、そのHIV感受性をヒト末梢血単核細胞(peripheral bloodmononuclear cells;PBMC)と比較、検討したところ少なくともin vitroにおいてはCXCR4指向性HIV-1が感染することが確認された。しかしながら、マウスのprimaryのlymphoid系細胞でのHIVの複製は依然として制限されたものであり、CD4とCXCR4のみでは実用的なHIV感染モデルにはなりがたく、さらなるヒト特異的遺伝子の導入が必要であることを明らかにした。
ヒスタミンH_1受容体を介した心筋ムスカリン性Kチャネル抑制のシグナル伝達系

モルモットよりコラゲナーゼ処理により得た単離心房筋細胞を用いて、パッチクランプ法により膜電流を測定した。ヒスタミンを投与してヒスタミンH_1受容体を刺激すると活動電位幅が延長するが、これはH_1受容体刺激によるムスカリン性Kチャネル(K_<Ach>チャネル)の抑制による。このK_<Ach>チャネル抑制作用の細胞内情報伝達系を解明するために、種々のプロテインキナーゼの修飾物質の効果を検討した。ヒスタミンによるK_<Ach>チャネル抑制作用は、Cキナーゼの阻害物質であるH-7やホスホリパーゼCの阻害物質であるNCDCの投与により抑制されず、イノシトールリン脂質代謝系は関与していない。また、8-br-cGMP存在下でもK_<Ach>チャネル抑制作用が観察され、cGMP/Gキナーゼ系の関与も否定される。さらに、セリン/スレオニン残基に結合するリン酸をはずすホスファターゼを抑制するオカダ酸を細胞に処置しても、抑制反応は修飾されず、AキナーゼやCキナーゼ、Gキナーゼなどのセリン/スレオニン・キナーゼの関与は否定された。一方、カルモジュリンの阻害薬であるcalmidazoliumはヒスタミンによるK_<Ach>チャネル抑制作用を消失させた。カルモジュリンはチロシン残基に結合するリン酸をはずすホスファターゼを活性化することが知られている。したがって、チロシン・キナーゼによるリン酸化でK_<Ach>チャネルが活性化され、H_1受容体刺激はカルモジュリンの活性化させ、これによりチロシン・ホスファターゼがK_<Ach>チャネルを脱リン酸化する経路の存在が強く示唆された。現在、Kチャネルとチロシン・キナーゼの関係をより直接的に明らかにするため、カエル未受精卵に心筋Kチャネルとチロシン・キナーゼの遺伝子を導入してその作用を検討中であるが、cRNAの作成に困難があり、今年度中に結論を得ることはできなかった。