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天然ガスを主燃料とする二元燃料ディーゼル機関の燃焼特性改善

一方、120 kPaを超える過給圧のもとで二元燃料運転を行った場合では、CNG供給比率の増加にともないHCエミッションの大幅な増大が生じ、正味熱効率は顕著に低下した。この要因として、噴霧束外予混合気が過給により希薄化したことが関与していると考えられた。また、CMEB燃料の着火遅れは過給により短縮し、機関性能ならびに燃焼特性が顕著に改善された。最終年度においては、CMEおよび軽油を着火燃料とする二元燃料運転にクールドEGRと機械式過給を適用した。その結果、CNG供給比率40%/過給有り(120 kPa)の条件下でEGR率を26%(酸素濃度17%)まで拡大しても、正味熱効率を悪化せずに、NOxとSmokeとのトレードオフを大幅に改善し得ることがわかった。その効果はCMEの方が高く、NOx:0.5 g/kWh以下、Smoke濃度(オパシティ):10%以下の燃焼性能が得られた。本研究は,圧縮天然ガス(CNG)を吸気管に供給しディーゼル燃料を噴射して着火,燃焼を行う方式の二元燃料ディーゼル機関の燃焼特性改善を目的とする.実験はココナッツ油メチルエステル(CME)および軽油を着火燃料に用い,クールドEGRと機械式過給を併用した.研究の結果,CNG供給比率40%,過給あり(120 kPa)の条件において,EGR率を26%(吸気酸素濃度17%)まで拡大しても正味熱効率を悪化せずにNOxとSmokeとのトレードオフを大幅に改善することができた.その際の効果はCMEの方が顕著であった.上述のように、本研究では二元燃料ディーゼル機関の燃焼特性を改善するための要件として、1排気再循環(EGR)の適用、2過給の採用、3含酸素燃料の着火燃料への適用、4DME(ジメチルエーテル)のCNG(天然ガス)への予混合、を取り上げ、最適燃焼条件を解明することを最終目標としている。昨年度は、目標達成がもっとも困難であると予想された2過給の採用、を優先的に取り上げ、実験システムを構築するとともに一連の予備的実験を行った。本年度は、過給を適用した二元燃料運転に対して3含酸素燃料を着火燃料に適用し、系統的な実験を実施した。一連の研究の結果、原料油が異なる3種のバイオディーゼル(RME、SME、CME)は、軽油燃料とおおむね類似した二元燃料ディーゼル燃焼特性を示すことが明らかになった。一方、CMEと1-ブタノールとの混合燃料(CMEB)を用いた場合では、過給により着火遅れが著しく改善するという有用な知見を得ることができた。また、排ガスの一部を過給機上流側に還流する方式のEGRシステムを予定どおり構築することができた。通常のディーゼル運転による予備的実験を行った結果、所要のNOx低減効果を有していることが確認できた。工学二元燃料ディーゼル機関から排出されるNOxを低減するためにEGR(排気再循環)を適用する。CNG供給比率の増加とともに着火遅れは漸増し、これにともない予混合的燃焼が活性化する。このため、NOx濃度は通常のディーゼル運転に比べ相対的に高い。そこで、NOx低減対策の基本技術であるEGRを適用する。この際、過給機前段に排気を還流する方式(Low Pressure EGR)を採用する。実験は定格出力から1/4出力まで変化させ、吸気の酸素濃度(EGR率)を2117%程度まで変化させる。CNG供給比率は0%(通常運転)から安定運転限界まで広範囲に変化させ、着火燃料には3種のバイオ燃料(RME、SME、およびCME)、ならびにJIS 2号軽油を使用する。
進行性神経芽腫に対するＧＤ２特異的キメラ抗原受容体を用いた遺伝子改変Ｔ細胞療法

PiggyBacトランスポゾン技術とヌクレオフェクション技術を用いてキメラ抗原受容体(CAR)を非ウイルス的に簡便且つ安全にT細胞に導入し、その遺伝子改変T細胞を無血清培地内で効率良く大量増幅することに成功した。GD2特異的CAR-T細胞は、in vitroでGD2陽性腫瘍株(神経芽腫、網膜芽細胞腫、髄芽腫、膠芽腫)に対して様々な程度で細胞死を誘導した。さらに、薬物Aの添加によってCAR-T細胞の抗腫瘍効果は飛躍的に増強した。非ウイルス遺伝子導入法の簡便性、安全性、経済性も考慮して、トランスポゾン遺伝子改変GD2特異的T細胞療法は、小児神経原性腫瘍に対する新たな治療法となりうる。米国では、進行性神経芽腫に対してGD2特異的遺伝子改変T細胞療法が臨床実施されているが、その治験ではGD2特異的キメラ抗原受容体(CAR)遺伝子の導入に発がん性のあるレトロウイルス法が、CAR遺伝子改変T細胞の培養に動物血清および腫瘍細胞株が使用されている。本研究では、安全性の高いCAR遺伝子改変T細胞療法の開発を試みた。まず、健康ドナーのT細胞に、非ウイルス遺伝子導入技術piggyBacトランスポゾン法を用いてGD2特異的CAR遺伝子を導入し、その後血清フリー、動物材料フリー、腫瘍細胞株フリーの培養システムを用いて、CAR遺伝子改変T細胞を培養した。その結果、末梢血10mlから約7x10e7個までのCAR遺伝子改変T細胞が得られた。本法で樹立されたGD2特異的T細胞は、GD2陽性腫瘍株に対し、従来法で樹立されたGD2特異的T細胞と同等の抗腫瘍活性を発揮した。ヒトT細胞に対する本遺伝子導入法および培養法は、臨床応用の際に安全性および費用対効果の点で特に有用と考えられた。また、本研究中に、GD2陽性神経芽腫に対するGD2特異的T細胞の抗腫瘍効果が、細胞株によって一様でないことが明らかとなった。その要因として、神経芽腫では、GD2抗原の発現頻度・強度が細胞株毎大きく異なること、共刺激分子の発現が低下・消失していること、腫瘍免疫の感受性に関わるカスパーゼ8の発現が消失していることが確認された。本結果は、神経芽腫がT細胞免疫に対して感受性が低い腫瘍であることを示唆した。そこで、神経芽腫の免疫感受性を高める試みとして、神経芽腫株培養液中にヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤を添加し、その後GD2特異的T細胞を加える実験系を構築した。その結果、HDAC阻害剤添加群において、GD2特異的T細胞の抗腫瘍効果が増強されることが明らかとなった。これまで、T細胞へのキメラ抗原受容体(CAR)の導入にはレトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターが用いられてきた。また、CAR遺伝子改変T細胞の体外増幅には通常、動物血清や腫瘍細胞株が用いられる。それに対し、本研究ではpiggyBacトランスポゾン技術とヌクレオフェクション技術を併用することによって、CAR遺伝子を非ウイルス的に簡便且つ安全にT細胞に導入する方法を確立した。非ウイルス的に遺伝子改変されたT細胞は、インターロイキン15を含有する無血清培地内で効率良く増幅した。増幅されたT細胞の80%以上にセントラルメモリーマーカーが発現し、全体の約40%の細胞表面にCARの発現が認められた。体外増幅されたGD2特異的CAR-T細胞は、GD2陽性腫瘍株(網膜芽細胞腫2株、神経芽腫1株、髄芽腫2株、膠芽腫1株)との混合培養において、様々な程度でGD2陽性腫瘍細胞に細胞死を誘導した。一部の細胞株では、GD2特異的CAR-T細胞に対する抵抗性が認められたが、混合培養の培地中に試薬Aを添加することによって、GD2特異的CAR-T細胞の抗腫瘍効果は飛躍的に増強した。非ウイルス遺伝子導入技術の簡便性、安全性、および経済性も考慮して、piggyBacトランスポゾン遺伝子改変GD2特異的T細胞療法は、神経原性小児がんに対する新たな治療法になる可能性が示唆された。今後、細胞製剤化を目指した前臨床試験に取り組みたい。進行性神経芽腫の予後はきわめて不良であり有効な治療法の開発が期待される。近年米国から、GD2ガングリオシドを標的とした人工T細胞受容体(キメラ抗原受容体;CAR)を用いた、進行性神経芽腫に対する遺伝子改変T細胞療法の優れた臨床成績が報告されている。しかし、その遺伝子導入にはレトロウイルスベクターが使用されており、本邦における臨床実施の妨げとなる。本研究の目的は、抗神経芽腫効果の高いGD2.CARと研究代表者が開発した非ウイルス遺伝子改変技術を組み合わせた、進行性神経芽腫に対する新規治療法を開発することである。平成23年度には、piggyBac遺伝子改変したGD2.CAR発現T細胞の大量培養法の開発を試みた。

健常ドナー3名から末梢血を15mlずつ採取し、単核球に分離後piggyBacトランスポゾン法を用いてGD2.CAR遺伝子を導入した。その遺伝子導入細胞をインターロイキン(IL)-15存在下で3週間培養した。培養液には2%自己血清を添加し、動物材料および腫瘍細胞は加えなかった。21日目に得られた細胞(GD2.CAR-T細胞)は平均6.9x107個で、その約99%がCD3陽性、約30%がCAR陽性であった。GD2.CAR-T細胞を、GD2陽性腫瘍細胞株とIL-2存在下で混合培養したところ、培養5日目までに細胞株は完全に死滅した。現在、神経芽腫細胞株をGD2高発現群、中等度発現群、低発現群の3群に分け、GD2.CAR-T細胞の抗腫瘍効果を比較検討している。GD2.CARを非ウイルス遺伝子導入法によって効率良くT細胞に発現させ、そのT細胞を低濃度自己血清存在下、動物材料・細胞株フリーの条件下で増幅させることに成功した。GD2.CAR-T細胞がGD2.発現細胞株を効率良く殺傷したことから、進行性神経芽腫に対する有効性および安全性の高い新たな治療法が創造される可能性が示唆された。実験計画に挙げていた動物実験には到達しなかったが、in vitroの実験系において、非常に有用な知見が得られたため。PiggyBacトランスポゾン遺伝子改変に基づくGD2.CAR発現T細胞の樹立・大量培養に成功した。引き続き、樹立されたGD2.CAR発現T細胞のGD2陽性腫瘍細胞株に対する抗腫瘍効果がin vitroの実験系で確認された。次年度は、平成24年度研究において得られたin vitro実験の研究成果を、ヒト神経芽腫化免疫不全マウスを用いて再現させることを第一の目標とする。特に、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤を併用した遺伝子改変T細胞療法の動物モデルはこれまで報告されていないため、本モデルの構築はきわめて有意義と考えられる。具体的には、神経芽腫細胞株を免疫不全マウスの腹腔内に接種し、接種3日後から4日間HDAC阻害剤を内服させる。細胞株接種7日後にGD2改変T細胞を尾静脈から輸注する。輸注7日後の腫瘍量および全生存期間をコントロール群と比較する。また、本研究の成果を国内外の学会で発表する。平成24年度は前年度に引き続き、樹立されたGD2.CAR発現T細胞の神経芽腫細胞株に対する抗腫瘍効果をin vitroの実験系で解析する。さらに、免疫不全マウスを用いたin vivoモデルを構築する。具体的には、10匹のNOD/SCIDマウスの腹腔に1x106個の神経芽腫細胞株を移植する(ヒト神経芽腫マウスモデル)。移植後3日目のマウス5匹にGD2.CAR-T細胞を尾静脈から輸注する。GD2.CAR治療マウス5匹と無治療マウス5匹の生存率をKaplan-Meier法で算出し、log rank検定を用いてその有意差を検定する。GD2.CAR治療マウスについては、2週間毎にフローサイトメトリー法またはPCR法を用いて輸注T細胞の生存を評価する。平成23年度及び平成24年度に得られた研究成果については、国内外の学会にて適宜発表していく。
江戸・明治期における漢文訓読語法の国語史的研究

日本において長い伝統を有し、また、欧文直訳体や翻訳語法にも大きな影響を与えている漢文訓読語法に焦点をあてることにより、江戸・明治期における語法の変遷と、現代日本語の形成過程を解明していくことがこの研究の目的である。本研究においては、江戸・明治期において刊行された漢文訓読資料を調査し、その漢文訓読語法の変遷を「訓読文集成」のような形で整理することにより、明治期の語法・文体に与えた影響を解明していく。このため、本年度は、以下の13のような調査・研究を行った。1.昨年度調査・収集した資料を整理し、補充すべき資料を購入し、また写真撮影を依頼した。2.パーソナルコンピュータを使い、漢文訓読資料に関する以下のようなデータベースを作成した。まず、このデータベースには、漢文訓読資料の名称・加点者・刊行年・所蔵場所を入力した。次に、漢文訓読資料のテキストデータベース化を試みた。江戸時代を通じて多くの資料が存在する『論語』を選び、振り仮名・返り点・送り仮名などの情報をできるだけ正確に記しながらコンピュータ入力を行っていった。(その成果の一部を、「『論語』仮名付テキストによる訓読文対照表」として、研究成果報告書に発表した。)このテキストデータベース作成段階で、江戸時代の漢文訓読資料について再調査の必要が生じたので、東京都立中央図書館等を訪問し、確認作業を行った。3.作成したデータベースを利用することにより、江戸時代から明治時代にかけての漢文訓読語法の変遷と、近代日本語の形成過程を解明していく見通しが得られた。1.先行研究、またこれまでの調査をもとに、漢文訓読語法の史的変遷を再整理し、まずは『論語』を調査対象とすることに決定した。2.漢文訓読資料を購入、また、東京大学付属図書館・東京都立中央図書館を訪ね、そこに所蔵されている江戸時代漢文訓読資料を調査し、複写可能な資料について、複写を依頼した。3.収集・調査した資料を整理するとともに、漢文訓読テキストデータベース作成の基礎作業(漢字字体・返点・振り仮名・送り仮名などの情報の処理方法の検討)を行った。なお、平成14年度には、本年度に収集・調査した資料をもとに、テキストデータベース作成作業を行い、その成果を「近世訓読文集成」として、冊子および電子形態で作成し発表する予定である。

(その成果の一部を、「『論語』仮名付テキストによる訓読文対照表」として、研究成果報告書に発表した。)このテキストデータベース作成段階で、江戸時代の漢文訓読資料について再調査の必要が生じたので、東京都立中央図書館等を訪問し、確認作業を行った。3.作成したデータベースを利用することにより、江戸時代から明治時代にかけての漢文訓読語法の変遷と、近代日本語の形成過程を解明していく見通しが得られた。
細胞間情報交換におけるストレス応答マイクロRNAの役割

本研究では、環境ストレス(電離放射線、紫外線、温熱、Hypoxia)に対する細胞応答に際してのmiRNAの役割を知るため、既知のmiRNAの検索、さらにライブラリーを作製して網羅的に解析しようと試みた。さらにギャップ結合をポイントにして解析すると我々が長年研究してきたcPLA2αの有無に依存することが明らかとなった。完全にcPLA2αをノックアウト(KO)したマウスを得るため、我々でconditional KOマウスを作製することにした。ストレス応答に関わる物質についてギャップ結合を介してのmiRNA(マイクロRNA)に求めた点は独創的な研究といえるのではないだろうか。miRNAはこれまで1個の細胞内での生物学的機序の同定は行われてきたが、細胞集団における働きは未だ認識されていない。最初に細胞を様々なストレス下に置くことにより発現が大きく変化するmiRNAを同定することを試み、その手掛かりを求めるため、アレイ法による既知のmiRNAの検索、さらにライブラリーを作製して網羅的に解析しようとした。しかし、量があまりにも膨大なのが問題となった。以前に我々の研究室では、温熱ストレスに対する細胞の反応性を、ギャップ結合をポイントにして比べた事がある。その研究で分かったことは細胞は細胞間のコンタクトがなくなると途端に温熱に対する感受性が高くなるということである。この結果は我々が長年研究してきたcPLA2αの有無に依存した。よって、スクリーニングを試みる細胞はcPLA2αが欠損している細胞とその正常細胞を比較して用いることがその突破口になると考えた。簡便なやり方としてsiRNAなどを用いる方法があるが、完全にノックアウト(KO)することはできず、ストレス応答の再現性に問題点が残る。よってcPLA2αのKOマウス由来の細胞を用いることが最善策であると考えた。以前、共同研究でcPLA2αのKOマウスを使ったことがあるが、継代することが因難で実験材料として使うには労力が大きく、相手の研究室への依存度が大きすぎる。従って、我々でconditional KOマウスを作製することにした。世界的にもこのようなマウスは存在せず、ソースとしての貢献も副産物として得られ、遠回りではあるが最も早く目的に近づく実験であると考えている。今年度は導入するTargeting vectorを作製した。次年度は共同研究して作製する。以前に我々の研究室では、温熱ストレスに対する細胞の反応性を、ギャップ結合をポイントにして比較した実験を行っていた。以前、共同研究でcPLA2αのKOマウスを使ったことがあるが、継代することが困難で実験材料として使うには労力が大きく、相手の研究室への依存度が大きすぎる。昨年度は導入するTargeting vectorを作製した。今年度は共同研究してES細胞からマウスを作製する。本研究では、環境ストレス(電離放射線、紫外線、温熱、Hypoxia)に対する細胞応答に際してのmiRNAの役割を知るため、最初に細胞を様々なストレス下に置くことにより発現が大きく変化するmiRNAを同定することを試み、その手掛かりを求めるため、アレイ法による既知のmiRNAの検索、さらにライブラリーを作製して網羅的に解析しようとした。これまで1個の細胞内での生物学的機序の同定は行われてきたが、細胞集団における働きは未だ認識されていない。

よって、スクリーニングを試みる細胞はcPLA2αが欠損している細胞とその正常細胞を比較して用いることがその突破口になると考えた。簡便なやり方としてsiRNAなどを用いる方法があるが、完全にノックアウト(KO)することはできず、ストレス応答の再現性に問題点が残った。よってcPLA2αのKOマウス由来の細胞を用いることが最善策であると考えた。以前、共同研究でcPLA2αのKOマウスを使ったことがあるが、継代することが困難で実験材料として使うには労力が大きく、相手の研究室への依存度が大きすぎた。従って、我々でconditional KOマウスを作製することにした。世界的にもこのようなマウスは存在せず、ソースとしての貢献も副産物として得られ、継続して飼育する場合には非常に有効である。遠回りではあるが最も早く目的に近づく実験であると考えている。昨年度、導入するTargeting vectorが完成した。今年度は共同研究によってconditional Knock Out mouseを作製可能になった。マウスのラインが確立すれば目的の実験を行うことが可能となる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は作製したTargeting vectorを用いてES細胞にインジェクションを行い、conditional KOマウスを作製する。共同研究によって行う。マウスが完成したら、継代は容易になるので初代培養細胞の供給が豊富になり、実験が行いやすくなる。完成まで時間がかるが、予備実験的にsiRNAをトランジェントに導入した細胞での実験を行い、条件などを決めていく予定である。
マルチコンポーネント型薬剤排出ポンプの機能と複合体形成機構の解明

現在、臨床現場において様々な多剤耐性菌が出現し、耐性菌感染症は医療従事者が直面する重要な問題である。化学療法が困難な多剤耐性菌の出現により、人類は多くの感染症の脅威に曝されている。一方で、細菌ゲノム配列が解読され、細菌染色体上には、多剤耐性因子である薬剤排出ポンプをコードする数多くの遺伝子が潜在していることが明らかになってきた。薬剤排出ポンプは抗菌薬や細胞障害性異物を菌体外に排出することにより、細菌を様々な化合物に対して耐性化させる。これまでに、細菌が保持する数多くの薬剤排出ポンプを同定してきた。マルチコンポーネント型排出ポンプは、内膜の薬剤排出ポンプに加えて、外膜チャネル、ペリブラズムに存在するmembrane fusion proteinと複合体を形成することで、一つの薬剤排出システムとして機能していることが知られている。しかしながら、ゲノム上に存在する複数の薬剤排出システムがどのような組み合わせで複合体を形成し、細菌の多剤耐性化に関与しているかは明らかにされていなかった。食中毒原因菌で、多剤耐性化が問題となっているサルモネラのゲノムにコードされる薬剤排出ポンプ9個に注目し、解析を進めた。その結果、内7個(AcrAB,AcrAD,MdsAB,MdtABC,EmrAB,MacAB)が、外膜蛋白質TolCと共役し、薬剤を排出していることが分かった。また、MdsABについては、MdsC外膜蛋白質とも複合体を形成して薬剤を排出することが明らかになった。
ファイトケミカルズによる生活習慣病の制御

生活習慣病の1つであり、メタボリックシンドロームの構成疾患でもある2型糖尿病は世界的に増加しつつある。その主徴は高血糖であるのでそれを防ぐ可能性を持つ食品成分を筋肉細胞と膵臓β細胞の培養系で探索した。見出されたいくつかの成分(大豆中のイソフラボン、ブドウ中のスチルベノイドなど)を2型糖尿病モデルマウスに投与し、生体レベルでも血糖上昇を抑制し、耐糖能異常を改善することを見出した。さらに、作用機構についても解明した。生活習慣病には、がんおよび糖尿病など代謝症候群が含まれる。日本人の糖尿病の95%は2型糖尿病であり、インスリンへの感受性低下(インスリン抵抗性)と人種的に膵臓β細胞からのインスリン分泌能が低いことが特徴とされている。そこで、体の中で最大の組織で主要なグルコース利用組織でもある筋肉のかわりにラット由来L6筋管細胞を用いて細胞内へのグルコース輸送を高める食品因子を、膵臓β細胞としてラット由来RIN-5F細胞を用いてインスリン分泌能を高める食品因子を細胞培養系で探索した。その結果、H19年度内に大豆由来のイソフラボンであるダイゼイン(D)およびエクオール(E)がL6筋管細胞によるグルコース取込みを促進することを見出した。EはDから腸内細菌によって生成され、体内へ吸収されるとされている。そこで一夜絶食させたラットヘDを経口投与し、血清中のDとE濃度の経時変化を調べたところ、D(10mg/100g体重)は投与2時間後に最大濃度となり、48時間後までその高値を維持し、一方、EはDの経口投与12間後に出現し48時間後まで上昇し続け、EとD濃度の逆転は2436間後に起こることが認められた。この投与量を参考にして、次に2型糖尿病モデルマウスに0.1%D含有食を5週間摂取させたところ、血糖値の上昇が有意に抑制された。一方、ぶどうに含まれるレスベラトロール(R)はL6筋管細胞によるグルコース取込みとRIN-5F細胞からのインスリン分泌の両者を促進することが見出された。そこで、2型糖尿病モデルマウスに0.04%R含有食を5週間摂取させたところ、血糖値の上昇が有意に抑制されるとともに,正常マウスにくらべて2倍以上に上昇する血清中のコレステロール、トリグリセリド、過酸化脂質濃度が有意に抑制された。このように生活習慣病である代謝症候群が食品成分によって制御可能であることが強く示唆され、さらなるスクリーニングと詳細な機構解析研究を続行中である。糖尿病の主徴は慢性高血糖であり、糖毒性の根源となっている。したがって、高血糖を防ぐことが糖尿病予防ひいては合併症防止の最善策と考えられる。本研究では、インスリン分泌促進食品因子、糖(グルコース)取り込み促進食品因子の探索系を、ラット膵臓β細胞由来のRIN-5F細胞とラット骨格筋由来のL6筋細胞を用いて構築した。これらの系でスクリーニングされた食品因子について2型糖尿病モデルマウスで血糖上昇抑制作用の有無を検討し、有効性の認められた食品因子については細胞培養系で作用機構をさらに詳しく検討するという戦略で研究を行ってきた。今年度も引き続き細胞培養系でスクリーニングを行い、いくつかの新たな候補因子を見いだした。昨年度に見いだされたダイゼインおよびレスベラトロールについて2型糖尿病マウス検討したところ、いずれも血糖上昇抑制効果を示した。また、ダイゼインの代謝物であるエクオールも血糖上昇抑制効果を示した。ピセアタンノールについても同様の作用が認められたが、再検討の必要性が認められた。これらのうち、ぶどうやワインに含まれるレスベラトロールについてさらに詳しく検討した。すなわち、グルコースを筋細胞内へ運び入れる輸送体GLUT4の細胞膜移行を検討したところ、レスベラトロールを作用させて数分後にはGLUT4が細胞質から細胞膜へ移行することが判明した。また、レスベラトロールは膵臓β細胞内の活性酸素種を捕捉し、膵臓β細胞を酸化ストレスから守りインスリン分泌能を高めることが示唆された。現在、他の有効食品因子によるGLUT4の細胞膜移行性を検討しているほか、新たな有効食品因子の探索も行っているところである。1.現在、日本をはじめ経済発展著しい中国やインドなど、世界中で糖尿病患者が増加している。その主徴である高血糖を食品成分によって予防することを目的として検討を行っている。体の中で最大の組織である筋肉組織の代替としてラット由来L6筋管細胞を用いて筋管細胞内へのグルコース輸送を高める食品因子を、また膵臓β細胞としてラット由来RIN-5F細胞を用いてインスリン分泌能を高める食品因子を探索してきた。2.今年度は、コーヒー中の成分のうち、トリゴネリンが培養系でインスリン分泌を促進することを見出した。トリゴネリンを2型糖尿病モデルdb/dbマウスに摂取させたところ、血糖上昇を抑制することが見出された。

また、ブドウやワインに含まれるピセアタンノール(PIC)がL6筋管細胞によるグルコース取り込みを促進すること、db/dbマウスにおいて血糖上昇抑制作用と耐糖能異常改善作用を示すことが明らかとなった。3.PICより水酸基が一つ少ないレスベラトロール(RES)がL6筋管細胞のグルコース取り込みとRIN-5F細胞からのインスリン分泌を促進し、db/dbマウスにおいて血糖上昇抑制作用や脂質異常症を改善することが確認できた。(1)そこで、L6筋管細胞におけるRESの作用機構を解析したところ、グルコース輸送体(GLUT4)がRES添加23分後から細胞膜へ移動すること、インスリンシグナルの下流で活性化するp38が同じくRES添加23分後よりリン酸化されることから、RESの作用はインスリンシグナル伝達経路の一部を介していることが示唆された。さらに、筋肉運動時などに活性化してGLUT4の細胞膜移行に関与するAMPKがリン酸化されることが見出され、RESはインスリンを介さないシグナル伝達経路でもGLUT4の細胞膜移行を引き起こし、血糖低下に寄与していることが示唆された。(2)次に、RIN-5F細胞を用いてRESの作用機構を解析した。グルコースはタンパク質と反応し糖化タンパク質を形成する(AGEsと呼ばれる)。試験管内でAGEsを調製してRIN-5F細胞に作用させると、活性酸素種(ROS)を発生させ、アポトーシスを引き起こしてRIN-5F細胞に障害を引き起こすことを見出した。RESはROS発生とアポトーシス誘導を抑制し、酸化ストレスから膵臓β細胞を保護し、その結果インスリン分泌能を良好に保つことが示唆された。このように複数の食品成分が糖尿病予防に有効であること、そしてその一部の作用機構を解明することができた。
光と熱によってレチニリデンシック塩基がタンパク場でおこす高速異性化運動のモデル化

レチノイドタンパクを代表するロドプシンやバクテリオロドプシンは光、熱、プロトンを基質として分子内にとりこんでおこす状態変化が1つの化学サイクルをつくる。これらの化学サイクルは、外部に有用な仕事として、H^+の濃度勾配をつくりだす1種の熱力学的エンジンである。本研究はこれら生体タンパクが行う一種のエネルギ-変換を比較的小さい分子量の環状共役系分子の行う状態変化の化学サイクルから実現するための研究である。コンホメ-ション変化が高速でおこり、その結果、特定の2状態間でプロトンの親和性が変わる化学サイクルを与えるような人工触媒分子の合成を行った。研究計画の期待通り、ジメチルアミノ〔15〕アヌレノンは、H^+、熱、光によって一巡する状態変化からなる化学サイクルをつくることが、^1H-NMRスペクトル、電子スペクトル、液体クロマトグラフィ-などの知見から明らかになった。この人工分子は興味あることに、高い量子収率で光異性体を与え、光異性体は続いて熱異性化を高速で行い、出発物質にもどる一方向への連続した異性化を高速で行うことが判った。人工サイクルの回転数を天然のバクテリオロドプシンの回転数と比較する実験を行った。この結果、本研究の人工サイクルはサイクルの回転数でバクテリオロドプシンのそれには及ばないが、サイクルの律速段階の活性化エネルギ-として12Kcal/molという高速異性化をえた。興味あることに、本研究で用いた基本環状共役系にS-アセチル基を導入した〔15〕アヌレノンはバクテリオロドプシン同様に、明暗順応がおこり、これに伴って〔15〕アヌレノン-〔15〕アヌレンチオンの原子価異性平衡を生ずるというこれまで全く報告されていない新知見をうることができた。O-アセチル〔15〕アヌレンチオンは明順応種として、S-アセチル〔15〕アヌレノンは暗順応種として存在する。^1H-NMRデ-タは購入した高速パソコンで解析できた。
混合高分子溶融体系の秩序構造

高分子溶融体などの濃厚な高分子や蛋白質に代表されるコンパクトなランダムヘテロポリマーの格子模型に対してモンテカルロシミュレーションを行なうと、鎖の長さが長くなるにつれて、特に低温での平衡への緩和が急激に遅くなり、事実上シミュレーションが意味を持たないという問題に直面する。このように緩和が遅くなる原因としては、モノマー同士の排除体積効果に起因するトポロジカルな障壁がある。そこで、本年度はこれらの系一般に対して有効となるモンテカルロシミュレーションの技法の検討を行なった。ランダムスピン系などでは、エネルギー障壁を乗り越えることによって熱平衡を得る方法として、マルチカノニカル法や交換モンテカルロ法など拡張アンサンブルの方法が有効であることが知られている。そこで、本研究では排除体積効果に関する拡張アンサンブルを導入した。排除体積効果を表す仮想エネルギーと、それを制御するための仮想温度を導入し、実温度と合わせて、二種類の独立な温度を持つ拡張アンサンブルを作る。これに対し、さまざまな温度の系を同時にシミュレーションしながら、ときどきそれらを交換するという、交換モンテカルロ法を定義することができる。実際に、正方格子上のABランダムヘテロポリマー(一本鎖)を用い、本研究で提案した新しい交換モンテカルロ法によって低エネルギー状態の探索を行なったところ、通常のモンテカルロシミュレーションでは到達不可能な低エネルギー状態を見つけることができ、本方法の有効性が確かめられた。さらに、本方法を蛋白質の折りたたみ問題に適用するための、テスト計算を行なった。
細胞性バイオマーカーを用いたインプラント疾患の診断とデバイス開発

インプラント周囲疾患の診断を目指してインプラント周囲溝滲出液(PICF)等の疾患バイオマーカーの検索と有用性の検討を行った。PICFのプロテオーム解析の結果,血液,免疫,細胞由来の蛋白や抗菌ペプチドを認めた。炎症マーカーのカルプロテクチンと骨吸収マーカーのNTxに着目し,インプラント疾患群と健常群のPICF中のマーカー量を測定した結果,両マーカーとも疾患群で有意に高いレベルを示した。両蛋白は,臨床指標である歯周ポケット深さ,歯肉炎指数あるいは歯槽骨吸収率と有意な相関関係を示し,ROC曲線分析でも適正な感度と特異度が得られ,インプラント疾患の診断マーカーとしての有用性が示唆された。インプラント周囲溝滲出液(PICF)中のバイオマーカーを用いてインプラント粘膜炎・周囲炎を診断するシステムの研究を行う。平成27年度は,PICF採取を行うために徳島大学病院臨床研究倫理審査委員会に本研究の審査申請を行い,承認を得た。これまでに18名の被験者から健常インプラント由来PICF23サンプルとインプラント粘膜炎・周囲炎由来PICF17サンプルおよび比較対照用に天然歯から11のGCFサンプルを採取し,採取部位の歯周組織検査を行った。1つのインプラント周囲炎サンプルについてSDS-PAGEにて蛋白分画を分離し,H27年度の実験計画に基づきプロテオーム分析を行った。現在,その結果について分析を行っている。また,天然歯の歯周病の炎症診断マーカーであるカルプロテクチンについてPICF中のレベルについてELISA法で測定する準備を行っている。インプラント周囲溝滲出液(PICF)採取や歯周組織検査を実施するための倫理審査に期間を要したため,研究の進捗がやや遅延している。また,PICFのプロテオーム解析を外部委託したため研究の進捗に影響が出た。本課題は,インプラント周囲溝滲出液(PICF)中のバイオマーカーを用いてインプラント疾患の診断を目指す研究である。平成28年度までに28名の被験者から69個のPICFサンプルを採取し,採取部位の歯周組織検査を行った。平成28年度は,インプラント周囲炎部位由来のPICFサンプルをプロテオーム分析し,Mascot検索を行った。その結果,複数のImmunoglobulin類, Calprotectin, Lactoferrin,コラーゲン断片や未登録の産物を含め延べ2427個の蛋白産物が検出された。また,採取した一部のPICFサンプルを用いて炎症関連蛋白であるカルプロテクチンと骨吸収マーカーであるNTxの含有量のELISA測定を行った。その結果,カルプロテクチンの平均濃度は健常部位由来PICFサンプルの83.7 ng/microLに対して,インプラント周囲炎部位由来サンプルでは264.9 ng/microLとなり,インプラント周囲炎サンプルで約3倍の有意に高い濃度を示した。一方,NTx濃度はインプラント周囲炎サンプルで4.25 ng/microL,健常インプラントサンプルで1.77 ng/microLであり,インプラント周囲炎サンプルにおいて約2.4倍の高い値を示した。さらに現在,インプラント周囲炎治療として歯周組織を切除する必要のある患者を対象に歯周組織中のmiRNA分析を行うための組織提供者を募集している。平成28年度にインプラント周囲溝(健常部位およびインプラント周囲炎部位)から採取したPICFを用いて蛋白質のプロテオーム解析を行う予定であったが,採択された研究費の都合からインプラント周囲炎サンプルの分析のみとなり,対照となる健常部位由来のPICFとの成分比較を行うことができなかった。また,Mascot検索でインプラント周囲炎サンプル中の蛋白質が非常に多数であったため(延べ2427個)最適な診断マーカーの選定が困難となった。これに伴い診断マーカーを測定するデバイス開発の基礎研究が遅れている。平成29年度までに35名のインプラント埋入患者から74個のインプラント周囲溝滲出液(PICF,健常:34個,疾患:40個)を採取した。PICF中のカルプロテクチン(炎症性マーカー)とNTx(骨吸収マーカー)のレベルをELISA測定した結果,インプラント周囲炎サンプル中のカルプロテクチン量と濃度は,健常サンプル中レベルと比較して,それぞれ約4.3倍と約2倍の有意に高い値を示した。また,PICF中のカルプロテクチン量は,プロービング深さ値(PD)や歯肉炎指数値の臨床マーカーと有意な相関関係を示した。NTxの量と濃度も,疾患部サンプルのレベルが,健常部サンプルのレベルより有意に高く,PD値やエックス線検査による歯槽骨吸収率と有意な相関関係を示した。両マーカーのROS曲線分析の結果,カルプロテクチンのカットオフ値が,60.4 ngで感度92.5%,特異度90.9%を示し,NTxでは,1.88 ngで感度82.5%,特異度63.6%を示し,それぞれインプラント周囲炎の炎症と歯槽骨吸収の指標として有用であった。一方,PICFカルプロテクチンの測定デバイスの開発については,イムノクロマトチップを用いて検討を行った結果,健常部位サンプルでの陰性率は97%であったが,疾患サンプルでの陽性率は43%と高くは無く,同チップの感度の改良が必要であることが分かった。また,インプラント周囲組織のmiRNA分析については,疾患部位組織の提供を受けてRNA抽出を行ったが,比較対象となる非炎症(健常)のインプラント周囲組織の採取には同意が得られず,miRNA分析を行うことができなかった。

インプラント周囲疾患の診断を目指してインプラント周囲溝滲出液(PICF)等の疾患バイオマーカーの検索と有用性の検討を行った。PICFのプロテオーム解析の結果,血液,免疫,細胞由来の蛋白や抗菌ペプチドを認めた。炎症マーカーのカルプロテクチンと骨吸収マーカーのNTxに着目し,インプラント疾患群と健常群のPICF中のマーカー量を測定した結果,両マーカーとも疾患群で有意に高いレベルを示した。両蛋白は,臨床指標である歯周ポケット深さ,歯肉炎指数あるいは歯槽骨吸収率と有意な相関関係を示し,ROC曲線分析でも適正な感度と特異度が得られ,インプラント疾患の診断マーカーとしての有用性が示唆された。今後,さらにインプラント疾患のPICFサンプルの採取を行うとともに,PICFのプロテオーム解析結果の分析から,PICF中のインプラント周囲炎の新たなバイオマーカーの検索を進める。また,PICF中のカルプロテクチンや骨吸収マーカーの測定を行うことによりこれらのインプラント疾患マーカーとしての可能性を検討し,PICF中マーカーの測定デバイス開発の基礎研究に繋げる予定である。平成28年度の結果からPICF中のカルプロテクチンおよびNTxがインプラント周囲炎の有用な診断マーカーである可能性が示唆された。そこで,平成29年度も継続してPICFサンプルを採取し,2つの蛋白質にフォーカスして調べる予定である。カルプロテクチンについてはELISAおよび歯周炎診断用に開発したイムノクロマト(IC)チップを用いて測定するとともに,NTxはELISA法で測定し,これらのマーカーレベルと臨床的指標との相関性について分析を行う。また,当初の計画に基づきインプラント周囲炎患者で,治療上切除されるインプラント周囲の組織の提供を受け,この組織由来のmiRNAの分析を行う予定である。歯周治療学平成27年の初年度は,インプラント周囲溝液などの生体試料採取のための臨床研究倫理審査承認に時間がかかり,サンプル採取の開始が遅れた。これに伴いELISAキットなどを用いた滲出液中マーカーの測定の実施が平成28年度に遅延したため。平成28年度後半29年度にかけてインプラント周囲炎由来の歯周組織中のmiRNA分析(委託分析)を計画していた。平成28年度は,分析に適応する歯周組織サンプルを採取することができず,当初予定していたmiRNA分析費を平成29年度に繰り越すことになったため。平成28年度の前半に,サンプル中のマーカーレベルの測定を実施し,インプラント周囲炎の疾患マーカーとしての有用性を確認後,本来の研究計画に基づき測定デバイス開発のための基礎的実験を行う予定である。平成29年度にmiRNA分析を行うためのインプラント周囲組織サンプルを採取して,miRNA分析を行う予定である。また,カルプロテクチンおよびNTxのELISA法やICチップ法での測定を進め,これらのPICF中レベルと臨床指標との相関分析を行う。また,PICF中のNTxを測定するデバイスの開発に関連し,NTxの抗原抗体反応の至適条件についてELISAプレートなどを用いて基礎研究を行う。
精子の遊泳制御におけるカルシウム調節機構の解明

ウニなどの走化性を示す精子の遊泳方向は、カルシウム濃度に依存した鞭毛運動によって制御されている。我々は、カルシウム反応を頭部機械刺激により誘導し、遊泳方向変化とそれに対応するカルシウム動態を定量化することに成功した。この「機械刺激反応実験系」による解析の結果、カルシウム流入による遊泳停止が起こり、カルシウム排出初期(膜のPMCAとフラジェラシアリンの協調的働き)の段階で鞭毛波が対称となり直進遊泳を示し、NCKXによる排出で細胞内カルシウム濃度が下がると通常の非対称波へ移行することが明らかとなった。また、細胞内カルシウムストアによる細胞内の濃度調節が、運動の開始に関与することも明らかとなった。ホヤやウニなどの走化性を示す精子に見られる遊泳方向の制御は、カルシウム濃度に依存した鞭毛運動の変化によって引き起こされる。しかし、膜タンパク質を介する細胞内カルシウム濃度の調節、およびカルシウムによる鞭毛運動の制御の機構はほとんど解明されていない。本研究では、カルシウム反応を「機械刺激により誘導」するという技術的ブレークスルーにより、遊泳方向変化に対応するカルシウム動態を高精度で定量化し、矛盾する2つの説(対称波となるのは細胞内カルシウム濃度が低い時か高い時か)に決着を付ける。さらに、その全容が不明であるカルシウム流入と排出の機構について新しいモデルを提案し、その検証実験を行う。そのモデルを元に、カルシウムによる鞭毛運動制御の解明の方向性を示すことを目指す。具体的には主にウニ精子を用い、機械刺激により誘導されるカルシウム反応機構を、阻害剤などを用いた生理的解析と関与タンパク質のフラジェラシアリンを手がかりとした分子生物学的解析により明らかにする。これまでに、ウニ精子に頭部の機械刺激による鞭毛反応を誘導し、遊泳軌跡と鞭毛波形の解析と共に、fluo-4 AMを用いた細胞内カルシウム濃度変化の測定を行い、機械刺激反応実験系を確立した。カルシウム流入には電位依存性のカルシウムチャネルが、排出には、K+-dependent Na+/Ca2+exchahger(NCKX)とPlasma membrane calciumATPase(PMCA)が関与すると推測される。そこで、これらの阻害剤、およびフラジェラシアリン抗体の効果を検討した。その結果、鞭毛波が対称波となり直進遊泳を示す時には、カルシウム濃度が高い状態にあること、カルシウムの排出は、PMCAとフラジェラシアリンの協調的働きによって開始し、この段階で直進遊泳が見られ、続くNCKXの勧きにより通常の非対称波へと移行することが明らかとなった。本研究では、カルシウム反応を「機械刺激により誘導」するという技術的ブレークスルーにより、遊泳方向変化に対応するカルシウム動態を高精度で定量化し、矛盾する2つの説(対称波となるのは細胞内カルシウム濃度が低い時か高い時か)に決着を付け、さらに、カルシウム流入と排出の機構について新しいモデルを提案し、その検証実験を行うことを目指している。前年度までに、対称波が、細胞内カルシウム濃度の緩やかな減少と関連することを見いだした。今回、カルシウム流入と排出の機構の2011年発表のモデルに加えて、アクチン繊維の重合状態が排出過程に関与する可能性を示唆する結果を得た。機械刺激により誘導されるカルシウム依存性の鞭毛反応は、興味深い2つの特徴を示す。その1つは、鞭毛波形変化による遊泳軌跡の一連の変化で、底面近くでは典型的に、円軌跡C→停止反応Q→直進S→円軌跡Cを示す。アクチン繊維の重合状態を変化させると、Qが長くなる、Sが消滅するなどの排出阻害剤の効果と似た反応が誘導された。もう1つの特徴は、精子が遊泳開始後2-3分経たないと機械刺激によるこの一連の変化が起こらないことである。膜のコレステロールを破壊する薬剤処理によっても機械刺激に対する規則的反応が起こりにくくなった。従って、この反応時間の遅れは、カルシウム動態に関与する膜タンパク質が、膜内を流動し、機能ドメイン(ラフト)に集積するのに必要であるらしい。これらの結果から、カルシウム排出過程の制御には、ラフト形成とアクチン繊維の状態が関与することが明らかとなった。走化性を示す精子に見られる遊泳方向の制御は、カルシウム濃度に依存した鞭毛運動の変化によって引き起こされる。

23年度までに、対称波が、細胞内カルシウム濃度の緩やかな減少と関連すること(これまでの説とは異なる)を見いだした。今回、カルシウム流入と排出の2011年発表のモデルに加えて、カルシウムストアが精子の運動制御に関与する可能性を示唆する結果を得た。機械刺激により誘導されるカルシウム依存性の鞭毛反応は、興味深い2つの特徴を示す。その1つは、鞭毛波形変化による遊泳軌跡の一連の変化で、底面近くでは典型的に、円軌跡C→停止反応Q→直進S→円軌跡Cを示す。アクチン繊維の重合状態を変化させると、Qが長くなる、Sが消滅するなどの反応が誘導された。もう1つの特徴は、精子が遊泳開始後2-3分経たないと機械刺激によるこの一連の変化が起こらないことである。ストアへのカルシウムの取り込みを阻害する薬剤処理によって、カルシウムキレート下では、通常の遊泳開始が起こる数分間に遊泳率が低下したままとなり、さらにカルシウム存在下では、機械刺激により誘導される停止反応から運動が回復しなくなった。この反応時間の遅れや低下は、カルシウム動態制御に膜タンパク質を介したカルシウム排出のみでなく、ストアによるカルシウム濃度の調節状態が関与することを強く示唆する。機械刺激反応により精子の遊泳方向変化に対応するカルシウム動態を高精度で定量化に成功し、1)矛盾する2つの説に決着を付ける。2)カルシウム流入と排出の機構について新しいモデルを提案し、その検証実験を行う。3)そのモデルを元に、カルシウムによる鞭毛運動制御の解明の方向性を示す。という3つの目的で研究を進めてきた。これまでにこれら3つの目的の内、1)は、既に結論を得ている。2)は、新しいモデルができつつあり、その検証もほぼ終了している。3)も実験は終了しており解析を進め(平成24年度の成果)、論文として発表できれば完了する。従って、計画は、細かな点の変更はあるが、おおむね順調に進行している。25年度が最終年度であるため、記入しない。機械刺激反応により精子の遊泳方向変化に対応するカルシウム動態の高精度定量化を行い、これに基づき提示した、カルシウム流入と排出の機構についての新しいモデルについて、その検証実験を完成させる。さらに、そのモデルを元に、最終目的とする、カルシウムによる鞭毛運動制御の解明の方向性を検討し提示する。計画は、細かな点の変更はあるが、現在大きな問題はないので、おおむね予定通りに進められる。
運動時刻が中高年者の自律神経機能の概日リズムに及ぼす影響

秋田県南外村の65歳以上の在宅老人1037名を対象として,運動・スポーツ習慣,疾病状況,過去1年間の転倒状況および運動時刻,生活満足度,抑うつ度(GDS),自覚症状,食生活の規則性に関する聞き取り調査を7月に実施した.また,体格および血圧,心拍数,心電図,開眼片足立ち時間など自律神経機能に関する測定を実施した.1021名から聞き取り調査の回答を得,862名に対して自律神経機能測定を実施した.運動やスポーツの習慣がある者は,男性15.8%,女性9.1%であった.運動の内訳では,ゲートボールが62.7%と最も多く,次いで歩行や体操が10.0%,ゴルフが4.7%,その他が22.6%であった.運動時刻の内訳は,46時が1.9%,68時が1.3%,810時が13.3%,1012時が18.4%,1214時が6.3%,1416時が38.0%,1618時が10.1%,1820が13.0%,不定・その他が9.5%であった。主に実施する時刻により,10時までに行う朝群(26名),1014時に行う昼群(21名),1416時に行う午後群(39名),16時以降に行う夕群(18名),不定群(15名)に分類し,それぞれの特性について性,年齢を共変量とした共分散分析にて検討した.老研式活動能力指標得点は運動時刻に有意に関連し,性,年齢調整済み平均は,朝群11.8,昼群12.9,午後群12.0,夕群12.1,不定群12.2であり,昼群が高かった.その他の自覚症状,生活満足度,抑うつ度,および生理学的自律神経機能に関わる指標には運動時刻の有意な関連は認められなかった.老年期においては老化および性が自律神経機能に及ぼす影響の方が運動時刻の影響より大であった.昼に運動する群が老研式活動能力指標得点が高い原因については,運動効果は朝,夕より昼に運動する群で高いという報告もあり,今後追跡調査などによりその因果関係を明らかにする必要がある.秋田県南外村の65歳以上の在宅老人1037名を対象として,運動・スポーツ習慣,疾病状況,過去1年間の転倒状況および運動時刻,生活満足度,抑うつ度(GDS),自覚症状,食生活の規則性に関する聞き取り調査を7月に実施した.また,体格および血圧,心拍数,心電図,開眼片足立ち時間など自律神経機能に関する測定を実施した.1021名から聞き取り調査の回答を得,862名に対して自律神経機能測定を実施した.運動やスポーツの習慣がある者は,男性15.8%,女性9.1%であった.運動の内訳では,ゲートボールが62.7%と最も多く,次いで歩行や体操が10.0%,ゴルフが4.7%,その他が22.6%であった.運動時刻の内訳は,46時が1.9%,68時が1.3%,810時が13.3%,1012時が18.4%,1214時が6.3%,1416時が38.0%,1618時が10.1%,1820が13.0%,不定・その他が9.5%であった。主に実施する時刻により,10時までに行う朝群(26名),1014時に行う昼群(21名),1416時に行う午後群(39名),16時以降に行う夕群(18名),不定群(15名)に分類し,それぞれの特性について性,年齢を共変量とした共分散分析にて検討した.老研式活動能力指標得点は運動時刻に有意に関連し,性,年齢調整済み平均は,朝群11.8,昼群12.9,午後群12.0,夕群12.1,不定群12.2であり,昼群が高かった.その他の自覚症状,生活満足度,抑うつ度,および生理学的自律神経機能に関わる指標には運動時刻の有意な関連は認められなかった.老年期においては老化および性が自律神経機能に及ぼす影響の方が運動時刻の影響より大であった.昼に運動する群が老研式活動能力指標得点が高い原因については,運動効果は朝,夕より昼に運動する群で高いという報告もあり,今後追跡調査などによりその因果関係を明らかにする必要がある.
中緯度域の気候変動と将来予測の不確実性

日本の南岸に沿って流れる黒潮は,膨大な熱を熱帯から運びそれを日本付近で大気に放出する.この熱放出があることによって,中緯度大気が様々な影響を受けることが,最近十年間の高解像度観測データ解析および数値モデル実験で報告されてきた.しかし,この中緯度海洋が大気に及ぼす影響が異なる数値モデルでも同じように再現されるのか,またこの作用が将来の温暖化においてどのような役割を果たすのかは不明であった.そこで本研究では,これらの問題を解決することを目的として,多数の気候モデル,特に高解像度モデルデータの収集と解析を行う.日本の南岸に沿って流れる黒潮は,膨大な熱を熱帯から運びそれを日本付近で大気に放出する.この熱放出があることによって,中緯度大気が様々な影響を受けることが,最近十年間の高解像度観測データ解析および数値モデル実験で報告されてきた.しかし,この中緯度海洋が大気に及ぼす影響が異なる数値モデルでも同じように再現されるのか,またこの作用が将来の温暖化においてどのような役割を果たすのかは不明であった.そこで本研究では,これらの問題を解決することを目的として,多数の気候モデル,特に高解像度モデルデータの収集と解析を行う.
視床下部非シナプス性情報伝達機構の動態-コネクションを中心とした探求-

新たな神経系特に視床下部に発現するコネクシンを検索するために、ラット視床下部より、mRNAを採取し逆転写酵素にてcDNAを作成した。即ち、J-A Heafligerらの方法に準じてコネクシン分子においてその塩基配列が、よく保存されている膜貫通領域にてdegenerate primerを作成した。PCRにてP32-CTPの存在下において増幅されたフラグメントをポリアクリルアミドゲルに泳動してそこに現れたDNAのbandを切り出した。8本の切り出されたバンドからPCRをおこなってDNAを回収し、プラスミドベクターにサブクローンして、おのおののバンドについて10個のクローンについて塩基配列を解析した。その結果、新規コネクシンのクローンを得た。そのクローンについて現在、in situ hybridization,Northern hybridizationを用いて、神経系での発現に関して検討を加えている。また、現在までに発表されているコネクシンの塩基配列を元にしてprimerを作成し、いくつかのコネクシン分子に関してPCRを用いて部分的なcDNAを得た。それをプラスミドベクターにサブクローンして、in situ hybridizationを行った結果、コネクシン32mRNA、および、コネクシン43mRNAに関しては神経系で広範な発現を認めた。また、これらのmRNAは中枢神経を傷害することによってその発現量が著明に増大することが確認された。コネクシン26mRNA,コネクシン33mRNAに関しては、中枢神経系にて明らかな発現を認めなかった。