hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミズアオイ科水田雑草の種子発芽に対するイネの促進作用の解明

(2)ヌカの100kg/10a程度の施用はコナギの発生を著しく促進したが、300kg/10aの施用は土壌の還元化も加わり発生を抑制した。(3)モミガラは、湛水土壌中の深い位置に存在するコナギ種子に二次休眠を誘導した。(4)イネのワラ、ヌカをメタノール抽出後、酢酸エチルで分画した時、水溶性区は種子を誘導したが、高濃度では阻害した。(5)除草剤のビアラホス、グルフォシネートやグリホサートなどは湛水土壌からの発生を顕著に促進した。3.イネに含まれるコナギ種子発芽刺激物質イネの種子やワラなどに含まれる発芽刺激物質は単一ではなく、各種アミノ酸とリン酸が侯補化合物として示唆され、これらが共存することによって発芽刺激活性が発現するようであった。平成16年度に得られた成果は以下の通りである。1.湛水土壌からのコナギの発生をコメヌカ(100kg/10a)の全面施用が強く抑制したが、局所施用はむしろ促進した。このことから出芽抑制は阻害物質によるものではなく、トロトロ状態を作ることによる酸素不足などの物理的要因によることが示唆された。2.イネ以外のイネ科雑草(メヒシバ、タイヌビエなど)のワラもイネワラと同様に乾燥したものは湛水土壌からのコナギの出芽を促進した。3.除草剤のなかには、標準使用量の1/5-1/10の使用で堪水土壌からのコナギの出芽を促進するものがあった。そのなかで、グリホサートの出芽促進作用はアミノ酸のグリシンによることが分った。4.肥料成分の中で尿素が堪水土壌からのコナギの出芽を顕著に促進した。アンモニア体窒素と硝酸体窒素も促進する傾向を示した。5.イネのヌカ、ワラ、モミガラには水溶性のコナギ発芽誘導物質の存在が確認された。また、イネ科雑草のワラにも水溶性の発芽誘導物質の存在が示唆された。6.これまでの研究からイネの種子とワラに含まれるコナギ種子発芽誘導物質は単一ではなく、各種アミノ酸とリン酸との共存が発芽刺激をもたらすことが強く示唆され、物質の特定が急がれる。平成17年度に得られた成果は以下の通りである。1.前年までの研究からコナギの発芽誘導物質は水溶性物質であり、各種アミノ酸とリン酸との共存により発芽刺激がもたらされることが示唆されたが、本年の研究では、完全滅菌条件下でこれらの組み合わせによる効果が発現しなかった。これまでのところ、このような微生物の発芽誘導作用は、コナギ種皮の消化による物理的破壊、発芽阻害物質の分解代謝、発芽誘導物質の合成等による可能性が考えられる。2.既存の植物ホルモン類および植物生理活性のなかでは、コチレニンのみが発芽誘導活性(暗所)を示した。3.カロテノイド生合成阻害剤のフルリドンとノルフルラゾンは、低温・明所下でのコナギの発芽を促進し、二次休眠の覚醒促進及び導入阻害作用を示した。フルリドンなどにジベレリン様の生理作用があるためと考えられる。4.湛水土壌でのコナギの出芽に対する肥料の影響は、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニュウム及びカルシュウムシアナミドで促進効果が大きく、硝酸アンモニュウムと硝酸カリウムはやや促進効果を示したが、硝酸ナトリウムでは促進効果が認められなかった。これらのことからアンモニア体窒素の存在がコナギの出芽のシグナルとしても働くことが示唆された。5.湛水下土壌からのコナギの出芽数は尿素施肥(110kg/10a)により増加したが、その生長はイネ幼苗により相乗的に促進された。6.アンモニア態窒素と尿素は10^<-4>10^<-5>Mで低温下でのコナギ種子発芽を促進したが、その要因として、これらがACCからエチレンへの反応を促進し、さらにエチレン感受性を高めることが示唆された。
コンピュータによるチョーサーの『薔薇物語』諸刊本の計量的比較

チョーサー(Geoffrey Chaucer)の『薔薇物語』(The Romaunt of the Rose)諸刊本のテクストデータ入力を行い、その共通点・相違点について包括的に整理するという研究計画に基づき、本研究課題を実践した。整理のためにパーソナル・コンピュータ(以下パソコンと略す)を利用し、下記のように研究を進めた。(1)Benson版(The Riverside Chaucer(Boston : Houghton Mifflin,1987)),(2)Robinson版(The Works of Geoffrey Chaucer(Boston : Houghton Mifflin,1957)),(3)Variorum Edition版(A Variorum Edition of The Works of Geoffrey Chaucer, Vol.VII The Romaunt of the Rose(Norman : U of Oklahoma P,1999))のテクストデータを比較分析するために、各編集テクストの入力が終了した。それぞれのテクストが容易に比較できるようにパソコンでテクスト処理をした。つまり、各テクストの顕著な特徴をパソコンによって十分に把握することを可能にするために、まず各行が対応しているテクストを作成し、前研究(コンピュータによるチョーサーの『善女列伝』諸刊本の計量的比較)で開発済みのテクスト比較プログラムによって一覧表を作成した。各テクストを行単位で出力し、単語が共通するところと違うところが一目で把握できるような最終的な研究報告書を完成した。(1)Benson版(The Riverside Chaucer(Boston : Houghton Mifflin,1987)),(2)Robinson版(The Works of Geoffrey Chaucer(Boston : Houghton Mifflin,1957)),(3)Variorum Edition版(A Variorum Edition of The Works of Geoffrey Chaucer, Vol.VII The Romaunt of the Rose(Norman :U of Oklahoma P,1999))のテクストデータを比較分析するために、各編集テクストの入力が終了した。つまり、各テクストの顕著な特徴をパソコンによって十分に把握することを可能にするために、まず各行が対応しているテクストを作成し、前研究(コンピュータによるチョーサーの『善女列伝』諸刊本の計量的比較)で開発済みのテクスト比較プログラムによって一覧表を作成するところまで漕ぎ着けた。各テクストを行単位で出力し、単語が共通するところと違うところが一目で把握できるような最終的な一覧表は、平成18年度に作成する予定である。(1)Benson版(The Riverside Chaucer (Boston : Houghton Mifflin,1987)),(2)Robinson版(The Works of Geoffrey Chaucer (Boston : Houghton Mifflin,1957)),(3)Variorum Edition版(A Variorum Edition of The Works of Geoffrey Chaucer, Vol.VII The Romaunt of the Rose (Norman : U of Oklahoma P,1999))のテクストデータを比較分析するために、各編集テクストの入力が終了した。
可積分アルゴリズム：正値性をもつ高精度計算基盤

本研究の目的[B]に沿って,データ行列の主成分分析のための特異値問題について様々なアプローチを行った.並列化効率の高い櫻井・杉浦法は左特異ベクトルのみを用いて計算を行うため直交QD法と相性が良い.そこで,櫻井・杉浦法に組み込むことを念頭において,その前段階として,直交QD法を実装して高い相対精度で微小な特異値や零空間が計算するコードを開発し,研究室のウェブページにて公開して数件のダウンロードがあった.さらに,目的[B]に関連して,スパースな大規模データ行列の部分特異対を計算するため,リスタートによってランチョスベクトルの直交性と悪化を防ぐ改良型陰的リスタートランチョス法による2重対角化の研究を行った.従来法であるハウスホルダー反射行列によるQR分解を利用せずに,部分行列の左右の特異ベクトルの直交性を保つアルゴリズムを開発した結果,単精度計算においては,従来法より計算時間を短縮するとともに,部分特異値分解の精度を向上させることができた.また,箱玉系の拡張ルールとして玉に番号をつける拡張,運搬車の容量を制限する拡張があるが,本研究の目的[A]として,この両方の拡張を持つ,既知のものとはまた別の一般化を導入することができた.これによって帯幅が2以上のTN行列の固有値に収束するフローをもつ非自励離散可積分系とその非自励離散KP格子や非自励離散2次元戸田格子との関係の理解が進んだ.[A]帯幅が2のTN行列の固有値に収束するフローをもつ非自励離散可積分系の探求について継続して研究している.[C]可積分アルゴリズムによるランチョスパラメータの計算においてはゼロ割に起因するブレイクダウンが発生しても高次の離散可積分系によって特異点を回避できることを確認するという成果が得られている.[A]TN帯行列としての4重対角,および5重以上のヘッセンベルグ行列を取り上げ,dhToda型可積分系の解構造に着眼して陽的な原点シフト法を導入して高速・高精度な新しい可積分アルゴリズムを開発する.[B]ハウスフォルダー2重対角化で前処理しQR法で特異ベクトルを計算する従来法と,ハウスフォルダー2重対角化で前処理しdqds法で特異値を直交QD法で特異ベクトルを計算する提案手法の比較を櫻井・杉浦法に組み込んで比較検討する.[C]ランチョス法に基づく連分数展開とハンケル行列のコレスキー分解の高速計算法であるランチョス・フィリップスアルゴリズムに注目し,その可積分アルゴリズムとしての性質を明らかにするとともに,ティープリッツ行列のLU分解の高速計算法としてランチョス・フィリップス型アルゴリズムを定式化することで,単位円周上の直交多項式やローラン双直交多項式を通じて,ブレークダウンを回避したパデ展開の計算法を開発する.本研究の目的[B]に沿って,データ行列の主成分分析のための特異値問題について様々なアプローチを行った.並列化効率の高い櫻井・杉浦法は左特異ベクトルのみを用いて計算を行うため直交QD法と相性が良い.そこで,櫻井・杉浦法に組み込むことを念頭において,その前段階として,直交QD法を実装して高い相対精度で微小な特異値や零空間が計算するコードを開発し,研究室のウェブページにて公開して数件のダウンロードがあった.さらに,目的[B]に関連して,スパースな大規模データ行列の部分特異対を計算するため,リスタートによってランチョスベクトルの直交性と悪化を防ぐ改良型陰的リスタートランチョス法による2重対角化の研究を行った.従来法であるハウスホルダー反射行列によるQR分解を利用せずに,部分行列の左右の特異ベクトルの直交性を保つアルゴリズムを開発した結果,単精度計算においては,従来法より計算時間を短縮するとともに,部分特異値分解の精度を向上させることができた.また,箱玉系の拡張ルールとして玉に番号をつける拡張,運搬車の容量を制限する拡張があるが,本研究の目的[A]として,この両方の拡張を持つ,既知のものとはまた別の一般化を導入することができた.これによって帯幅が2以上のTN行列の固有値に収束するフローをもつ非自励離散可積分系とその非自励離散KP格子や非自励離散2次元戸田格子との関係の理解が進んだ.[A]帯幅が2のTN行列の固有値に収束するフローをもつ非自励離散可積分系の探求について継続して研究している.[C]可積分アルゴリズムによるランチョスパラメータの計算においてはゼロ割に起因するブレイクダウンが発生しても高次の離散可積分系によって特異点を回避できることを確認するという成果が得られている.[A]TN帯行列としての4重対角,および5重以上のヘッセンベルグ行列を取り上げ,dhToda型可積分系の解構造に着眼して陽的な原点シフト法を導入して高速・高精度な新しい可積分アルゴリズムを開発する.[B]ハウスフォルダー2重対角化で前処理しQR法で特異ベクトルを計算する従来法と,ハウスフォルダー2重対角化で前処理しdqds法で特異値を直交QD法で特異ベクトルを計算する提案手法の比較を櫻井・杉浦法に組み込んで比較検討する.[C]ランチョス法に基づく連分数展開とハンケル行列のコレスキー分解の高速計算法であるランチョス・フィリップスアルゴリズムに注目し,その可積分アルゴリズムとしての性質を明らかにするとともに,ティープリッツ行列のLU分解の高速計算法としてランチョス・フィリップス型アルゴリズムを定式化することで,単位円周上の直交多項式やローラン双直交多項式を通じて,ブレークダウンを回避したパデ展開の計算法を開発する.
ゾウリムシ発生初期過程における生殖核と栄養核の核膜分化の研究

ゾウリムシの単離大核を抗原として得られた大核核膜特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ(MAC-MEN-1)の抗原の性質について、下記のことが明かになった。1.SDS-PAGEのイムノブロットで、70kDa、25kDa、20kDaの3本のバンドが抗原性を示した。低分子の2本はマイナーなバンドなので、分解産物の可能性がある。2.70kDaのバンドをCBB染色したSDS-PAGEゲルからゲル断片を切り出し、1N NaOHで抗原タンパク質を抽出し、1N HC1でpHを中和して精製した。この試料をSDS-PAGEに再びかけ、CBB染色と免疫染色した結果、70kDaの1本のバンドが現れ、精製できたことが確認できた。3.細胞抽出液をNative-PAGEし、免疫染色すると、200kDa以上の高分子にバンドが現れることから、nativeの状態では、抗原は他の分子と結合して存在することが示唆された。4.間接蛍光抗体法で、核分化過程での抗原の出現時期を調べると、形態的に大核原基の分化が始まるとほぼ同時に抗原が大核原基核膜に出現した。無小核株の大核にも抗原が存在するので、抗原は大核遺伝子の発現でできることが分かった。5.免疫電顕で抗原の局在性の詳細を調べようとしたが、抗原性が失われて観察できなかった。精製した抗原をマウスに注射して、別のエピトープを抗原決定基とするモノクローナル取りを試みている。
化学的刺激応答型ナノポーラス錯体の創製

本研究課題では、化学的刺激(湿度、ガス吸着、有機分子包接、イオン交換など)に応答する新奇機能性材料の化学的合成を目的としている。本年度は、セシウムイオンやアルコール分子を含むシアノ架橋型金属錯体の合成と物性評価を行った。Cs_3[W^v(CN)_8]・2H_2OとCuCl_2・2H_2Oを水中で反応させると、Cs^Icu^<II>[W^v(CN)_8]・0.5H_2O結晶が得られる。Cs^Icu^<II>[W^v(CN)_8]・0.5H_2Oは、Cu-W二重層とセシウムイオン層が交互積層した構造をとっていることがX線結晶構造解析から明らかになった。磁気物性を調べたところ、40Kで磁気相転移し、Cu-W二重層内は強磁性的にふるまっていることが分かった。また、Cu-W二重層間には、弱磁場では反強磁性相互作用が、強磁場下では強磁性相互作用が働く二次元メタ磁性体であることがわかった。二重層と二重層の間の磁気双極子-双極子相互作用を考慮した計算からも、スピンフリップ転移前後共に、層内c軸方向にスピンが向いていることが示唆された。本研究課題では、化学的刺激(湿度、ガス吸着、有機分子抱接、イオン交換など)に応答する新規機能性材料の化学的合成を目的としている。本年度は、ウルトラミクロ孔(3Å)を有するオクタシアノ錯体Cu_3[W(CN)_8]_2(pyrimidine)_2-8H_2O(CuWprm)のアルコール蒸気(1-プロパノール、メタノール、エタノール)応答性を検討した。CuWprm錯体の結晶構造は、斜方晶系(Ibam)であり、CuとWがシアノ基で交互に架橋された3次元構造をしている。c軸方向には1次元チャンネルがあり、水分子を抱接している。CuWprm錯体を室温で1-プロパノール(PrOH)蒸気にさらすと、試料の色が緑色から黄茶色に変化した。得られた錯体の組成はCu_3[W(CN)_8]_2(pyrimidine)2・3/2PrOH・9/4H_2O(CuWprm-・PrOH)であり、その後室温で飽和水蒸気にさらすことで、元の組成に戻った。CuWprm・PrOHの結晶構造は斜方晶系(Pmmn)であり、1次元チャンネル内にはPrOH分子が包接されていた。また、Cuの配位構造が6配位八面体(CuWprm)から5配位四角鑞冓造(CuWprm・PrOH)に変化することがわかった。CuWprmは9.5Kで強磁性転移するが、一方、PrOH蒸気に応答させて得たCuWprm・PrOHの強磁性転移温度は12.0Kと上昇した。また、この磁気特性変化は可逆的であつた。CuWprmとCuWprm・PrOHの磁気特性の違いは、Cuの配位構造が変化することで、Cu-W間の反強磁性的相互作用の大きさが変化することによると考えられ、これは分子磁場理論を用いた計算からも支持されている。さらに、CuWprm錯体はメタノールおよびエタノール蒸気にも応答して、結晶構造および磁気特性が可逆的に変化することを見出している。
天然変性蛋白質の多分子認識機構の熱力学

生合成される蛋白質は、そのアミノ酸配列に特有の立体構造を形成し機能を獲得する。一方、ゲノム上には、それ単独では、特異的な立体構造を形成しない「天然変性蛋白質」が多く存在する。天然変性蛋白質は、特定のリガンドと結合し、特異的な構造を形成することで機能を獲得する。本研究では、腸管出血性大腸菌O157の天然変性型病原因子であるEspBによるリガンド結合の物理化学的メカニズムを調べた。その結果、EspBによるαカテニンの分子認識反応が、EspBの4170番目のアミノ酸領域で作られる不安定なαへリックス構造を介して進行する「構造選択的結合機構」により説明されることが明らかになった。天然変性蛋白質の作用機構を生物物理学的観点により明らかにし、その生体内における役割・機能に関する分子機構を原子レベルで解明するために、天然変性蛋白質の一つである腸管出血性大腸菌O157:H7由来のEspBによるαカテニン、ヴィンキュリン認識に関する解析を実施した。昨年度までに、EspBのフラグメントを用いて、αカテニンとの相互作用領域を同定した(論文投稿中)。この領域では両親媒性のαへリックス構造が形成されていることが示唆された。そこで、該当する領域に対して、トリプトファン変異を部位特異的に導入し、トリプトファンの蛍光を用いたトリプトファン・スキャンニングを行い、αカテニンと直接相互作用する残基を確認した(論文作成中)。また、これと同時にEspBのフラグメントとαカテニンの複合体に対する結晶化を試みたが、現時点では、芳しい成果は得られていない。一方、EspBの多分子認識機構を解析するために、上記と同様な解析をヴィンキュリンについても行った。その結果、ヴィンキュリンへの結合においても、上記のフラグメント領域と同じ領域で、相互作用が起きていることが示唆される結果が得られた。このことは、少なくともEspBが、αカテニンと同じく、その両親媒性αへリックス領域を用いて、ヴィンキュリンへの結合に利用していることが示している。一方、興味深いことに、トリプトファン・スキャンニングの結果から、若干、結合に重要なサイトが、異なることが示唆された。なお、蛍光ストップトフローによる解析をしたが、反応があまりに早く、その結合を解析することが困難であることが、明らかになってきた。次年度は、超高速混合連続フロー装置による解析などを追加する予定である。生合成される蛋白質のほとんどは、そのアミノ酸配列に特有の立体構造(天然構造)を自発的に形成し機能を獲得する。一方、ゲノム上には予想以上に、それ単独では、特異的な立体構造を形成しない「天然変性蛋白質」が多く存在することが明らかになってきた。天然変性蛋白質の多くは、多様な異なるリガンドと結合し、特異的な構造を形成することで機能を獲得する。しかしながら、この反応の熱力学的・速度論的メカニズムについては、明らかではない。本研究では、腸管出血性大腸菌O157:H7(以下O157)の天然変性型病原因子であるEspBをモデルとして用いて、EspBによる多様なリガンド結合の詳細な物理化学的メカニズムを、明らかにすることを具体的な目的とした。円二色性、X線小角散乱、蛍光偏光解消及び、フラグメント断片化を組み合わせた解析の結果、EspBは41番目から70番目のアミノ酸領域が、球状蛋白質のフォールディング中間体である、プレモルテングロビュール状態に似たαへリックス構造を形成し、C末端領域は高度にほどけた構造を取ることが分かった。さらに上記のへリックス領域がEspBのリガンドであるαカテニンやビンキュリンと直接相互作用することが示唆された。以上より、EspBは、プレモルテングロビュール型の天然変性蛋白質であり、既に形成されている伸びたへリックス構造を介して、「構造選択」的な方法でαカテニンやビンキュリンと結合することが示唆された。本研究の目的は、天然変性蛋白質の作用機構を生物物理学的な観点により、明らかにするために、腸管出血性大腸菌の天然変性型エフェクターであるEspBの分子認識機構をタンパク質のフォールディング現象ととらえ、その熱力学的機構を解明することである。本年度は、EspBによる、αカテニン認識部位の同定とその結合に関する熱力学的解析を実施した。まずEspBの部分配列に相当するペプチド断片を合成し、それぞれの溶液中での立体構造を円偏光二色性スペクトルにより、観察した。その結果、アミノ酸配列上、31番目から70番目に位置するペプチド領域が高い、二次構造形成能を示すことが明らかになった。この結果は、変性領域予測ブログラムの結果とおおむね一致していた。さらに、蛍光偏光解消法を用いることで、二次構造形成を確認した領域に相当するペプチド断片が宿主のαカテニンに特異的に結合することを明らかにした。

本ペプチド領域に対して、さらにヘリカルホエールプロットを行った結果、もし、この領域全長がαヘリックス構造を形成したとした場合、両親倍性のヘリックスを形成することが示唆された。興味深いことに、円偏光二色性スペクトルを用いた熱変性解析の結果から、EspBに存在する二次構造は、通常の球状蛋白質のそれと異なり、側鎖間の相互作用が欠落した、中間状態的な構造を持つことが示唆された。現時点で、本研究は、予定通り進行しており、次年度における複合体立体構造の解析のための基本的な準備は整った。一方、分子間相互作用の熱力学的解析については、非特異的な吸着などのサンプルの性質上、QCMやITCの使用が困難であることが、実験開始の初期段階で明らかになったが、別の測定法として、蛍光偏光解消法により、これを克服できたことは、特筆すべき成果と考えて良い。なお、上記の研究成果については,現在、論文作成中である。結晶化や速度論的解析については、現時点で、芳しいデータが出ておらず、結晶化条件の検討や超高速混合連続フロー装置の活用等、今後の工夫が必要である。当該年度において、当初の目的を達成しており、本研究はおおむね順調に進展していると判断している。また、研究手法の方針転換もあったが、方法論こそ異なるが、目的を達成することができたことは、特筆すべき点であると考えられる。結晶化については引き続き、条件検討を続ける。一方、X線小角散乱による解析を実施し、構造モデルの構築を試みる。また、速度論的解析には、超高速混合連続フロー装置の活用や、さらなる変異体を作製し、反応速度を遅くするなどの工夫を行う。当初の計画通り、αカテニンーEspBの複合体の構造解析と同時に複合体形成に関する速度論的解析から、複合体形成におけるフォールディング機構の解明を進める。なお、本研究では、X線結晶構造解析だけでなく、X線小角散乱実験を行うことで、静的でかつ、詳細な構造情報と、動的で従来の手法ではとらえにくい、分子認識/フォールディングの中間状態、遷移状態の構造特性について、解明を進める。学会発表と放射光施設におけるX線結晶構造解析、X線小角散乱のために旅費と、その他の実験に対する消耗品、最終報告のための冊子作製並びに、論文発表に用いる。次年度においては、当初の計画通り、主に物品費と構造解析のための施設使用料、旅費、並びに、論文発表のための諸費用に用いる。
錯体ヘテロ接合でのシナプスを模したプロトン・イオン移動による分子メモリスタの創製

本研究の目的は、生体膜のプロトン勾配によるエネルギー生産およびニューロンのシナプスでの信号伝達にヒントを得て、pKa差およびレドックス電位差をもつプロトン共役電子移動(PCET)する錯体ナノ構造体をヘテロ接合させ、光、電子など外部摂動により界面でのプロトン移動を誘起して生成する非対称分極によるプロトン濃度差を情報としてメモリ・蓄電できる集積分子デバイスを創成する。また、様々なプロトン伝導物質を用いてプロトンの移動がメモリとなる新しいプロトンメモリスタの動作指針を探索する。さらには、本ヘテロ接合での外部信号によるメモリ・蓄電と、生体のシナプスによる記憶との等価性について考察する。
イネ根圏におけるAnammox細菌の定量及び水田窒素循環への寄与の解明

本研究では窒素の安定同位体である15Nを用いたトレーサー法により、水田土壌や河川底質におけるAnammox及び脱窒反応活性を実測し調査を行った。さらに、水田や河川においてAnammox菌の定量及び窒素除去におけるAnammox反応と脱窒反応の関係を明らかにした。その結果、湛水および落水を繰り返す畜産廃水処理水田においてAnammox反応活性が検出されず、通年湛水している谷津田水田にてAnammox反応活性が検出された。また、恋瀬川の河川底質にてAnammox反応活性が検出された。窒素除去への寄与は谷津田水田では8%未満、恋瀬川では3%未満であり、淡水環境の窒素除去におけるAnammoxの役割はわずかであることが示唆された。また、阻害試験からAnammox反応は脱窒反応に依存していることが初めて実験データで直接証明した。室内実験において採取した水田土壌を実験ポットに入れ、高浸透系及び低浸透系を作成し、飼料イネを植栽した。窒素負荷100、450、900kg-N/haで畜産排水を処理しながら、それぞれの脱窒速度及び硝化活性・Anammox活性を^<15>Nを用いて測定し、Anammox細菌の検出を試みた。高浸透系は深さ1cm、5cmともにほぼ酸化的であったことに対して、低浸透系では深さ1cm、5cmとも還元的であった。アンモニア酸化細菌数は、高浸透系、低浸透系共に追肥後に増加し、硝化活性も追肥後に高くなることが確認できた。アンモニア酸化細菌数が高浸透系と低浸透系で同程度であっても、硝化活性は高浸透系の方が高く、高浸透系では低浸透系よりアンモニア酸化菌数当たりの活性が高いことが示唆された。これは高浸透系では落水時に十分な酸素供給がされるためと考えられる。また、最大脱窒速度が高浸透系で1.0g-Nm^<-2>d^<-1>低浸透系で0.3g-Nm^<-2>d^<-1>と、高浸透系で低浸透系より高い脱窒速度が得られた。これは、高浸透系では硝化反応が促進され、脱窒反応の基質である硝酸態窒素がより多く生成されたと考えられる。一方、Anammox細菌が属しているPlanctomycetes門の細菌群集構造は、窒素負荷量よりも浸透速度に影響を受けることが明らかになった。また、PCR結果より、Anammox細菌のポジティブコントロールと同じ位置にバンドを確認できたため、Anammox菌が存在している可能性はあると考えられる。さらに、Nested PCRを改良することにより、Anammox細菌に比較的近縁な未知のPlanctomycetesを検出した。しかし、実験ポットの表層土壌を用いてAnammox活性が確認できなかった。水田土壌におけるAnammox細菌の存在場所や活性の測定について更なる検討が必要となる。来年度は実際の水田において、イネの根との位置関係が異なる水田土壌を採取し、Anammox細菌の定量や活性の測定を行う。前年度において、水田の浸透速度は硝化・脱窒速度に影響を与えることがわかった。また、実験ポットの土壌からAnammox細菌に比較的近縁な未知のPlanctomycetesを検出したが、Anmmox活性が確認できなかった。今年度において飼料イネを栽培している実際の水田においてAnmmox活性を測定した。実験系として異なる畜産排水負荷(100および600kg-Nha-1)および異なる水管理(常時湛水及び低水位管理)を設定した。Anmmox活性測定用の水田土壌は異なる窒素負荷の畜産排水を施用した水田(常時湛水)から20cmの土壌コアを採取した。採取した土壌コアを05cm、510cm、1015cmと1520cmに4層に分けて、バイアルビンに入れて嫌気的に保ち、15N標識したNH4またはNO2/NO3を添加し、ヘッドスペースガス中に生成する29N2、30N2を測定してそれぞれAnammox活性、脱窒活性を測定した。その結果、畜産排水を施用した水田土壌からAnammox反応活性を検出されなかったが、脱窒活性は土壌表層から20cmの深さまで下がる傾向が見られた。これは施用した畜産排水に含まれるアンモニア態窒素が酸素のある土壌上層部における硝化細菌に硝化され硝酸塩まで変換され脱窒反応を促進されたと考えられる。一方、畑の浸透水より常時湛水した谷津田水田から10cmの土壌コアを採取して、2cmごとに5つの層を分けて、Anammox活性及び脱窒活性を測定した。

その結果、24cmの層においてAnammox活性が11.6nmmol/g-slurry/hrに達して、最も高いことがわかった。各層において、総窒素ガスの生成にAnammox反応の寄与率はそれぞれ13.9%、37.3%、8.1%、0.3%、0.5%を占める。以上の結果より、水田の状況によってAnammox活性が大きく異なることがわかった。H24年度において畜産排水処理水田の土壌を採取りし、バイアル瓶に入れて嫌気培養をした。それぞれの脱窒速度及びAnammox活性を15Nを用いて、Anammox及び脱窒反応活性を測定した。その結果、いずれの水田系よりAnammox反応活性が検出されなかったが、脱窒反応活性が600 kg-N/haの系が523umol-N2/vial/h、100 kg-N/haの系は366umol-N2/vial/hであり、追肥量の高い方の脱窒反応活性が高いことが分かった。Anammox反応活性が検出されなかった原因として、畜産排水処理水田では湛水落水の条件を繰り返し、水位の変動により土壌の酸化還元条件も変わったと考えられる。これに対して、我々は茨城県霞ケ浦流域の谷津田水田において調査を行った。谷津田水田において10cm深さの土壌を採取し2cmごとのAnammox及び脱窒反応活性を測定した。その結果、谷津田水田よりAnammox反応活性を検出し、活性は0.152.15 nmol-N2/g-slurry/hであり、窒素除去におけるAnammox反応の寄与は8%ぐらいであることが分かった。一方、水田土壌の脱窒反応活性は土壌の上層から下へ下がる傾向があり、Anammox反応活性もそれに伴う傾向が観察された。また、その地点の水質を解析したが、Anammox反応に使われる亜硝酸が全く存在せず、硝酸が僅かに検出された環境でAnammox活性が検出された。従って、我々は水田土壌におけるAnammox反応は硝酸の脱窒で生じた亜硝酸を利用していると考え、脱窒反応の硝酸塩から亜硝酸塩までの還元経路を阻害させ、水田土壌に阻害剤の添加有無のAnammox及び脱窒反応活性を評価した。その結果、Anammox反応は脱窒反応の硝酸の脱窒で生じた亜硝酸塩を利用していることを初めて実験データで直接証明した。当初畜産排水を施用した水田においてAnammox反応が起こるではないか予測していたが、Anammox活性がなかった。一方、畑の浸透水で湛水している谷津田水田土壌においてAnammox活性の検出ができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。Anammox細菌の増殖が遅く、棲息している環境に影響されやすい。畜産排水を施用した飼料イネ水田において、Anammox細菌に比較的近縁な未知のPlanctomycetesを検出したが、Anammox活性がなかったことがわかった。これから、Anammox活性が高い谷津田水田土壌を用いてAnammox細菌の定量及びAnammox活性の評価を行う予定。
修復機構の制御によるがん細胞の薬剤、放射線感受性の修飾

がんの放射線治療および化学療法における難治性がんの原因は抵抗性細胞の存在であり、その抵抗性はDNAの損傷の修復能である可能性が強い。われわれは細胞内cAMP濃度を上昇させるメチルイソブチルキサンチン(MIX)を処理した細胞をX線照射した場合潜在性致死損傷(PLD)の回復が起こることを見出した。細胞内cAMP濃度の上昇は一方で細胞の"分化"を促進し転写活性の高いクロマチン部位を増やすことが知られている。我々は今回DNase【I】感受性(転写活性の高い)部位がMIX処理により増えることを示した。紫外線照射された細胞では転写活性の高い部位での傷の修復がされ易いことが分かっているので、MIX処理によるPLDの回復は転写活性の高い部位が増えるために起こったのであろう。一方我々はMIXの処理がDNA架橋剤であるマイトマイシンC(MC)に対する細胞の感受性を増感することをすでに見出している。細胞内cAMP濃度の上昇により一方ではPLDの回復が起こり、他方ではMCの架橋が増大していると思われる。実際DNA上の架橋の量を定量したところ対照に比べMIXを処理することで架橋が増えることが分かった。次にMIXによる増感が他のDNAの傷についても起こるかどうか調べたところ、MIX処理はDNA架橋剤に対してのみ有効で塩基のメチル化やモノアダクトを引き起こす薬剤に対してはその増感作用は見られなかった。これらのことからcAMPの上昇によりクロマチンあるいはDNAのレベルでの変化がおき架橋剤に対してのみ攻撃を受け易くなるのであろうと解釈するに至った。現在いかなるクロマチン上あるいはDNA上の変化が架橋剤による攻撃に関係するかを追求中であるがMIXと同様酪酸によっても架橋剤に特異的な増感が起こることからクロマチン上の変化にヒストンが関与している(酪酸処理でヒストンのアセチル化が起こる)と考えている。
好塩性分子シャペロンに関する研究

当研究室では、塩田、塩蔵食品、醤油もろみ、海岸の朽ち木等から独自に多種類の好塩細菌を分離、保存しており、生育に2.5M以上の食塩を必要とする高度好塩菌と、0.5-2.5M食塩を要求する中度好塩菌に大きく分類できる。このような、特殊環境下での蛋白質のfoldingと熱ショック蛋白質の性質に興味をもち、これら、好塩菌の熱ショック蛋白質のスクリーニングを行った。方法としては、各種菌株を生育上限温度まで種々変化させた温度条件で生育させ、集菌後、菌体破砕、遠心分離で粗抽出液を調製し、直接、もしくは、ATPカラムにかけその吸着画分をそれぞれSDS-PAGEにかけ蛋白バンドの生育温度に伴う生産量の変化を調べた。その結果、高度好塩菌では生育温度の上昇とともに蓄積量が増加し、生育上限温度付近で最も顕著に蓄積され、しかもATPカラムに結合する蛋白バンドを数種類検出した。一方、種々の菌種に属する中度好塩菌においても、生育温度の上昇とともに生産が増加し、ATPアガロースに吸着する数種のバンドを検出した。顕著に合成量が変化する蛋白バンドについて、SDS-PAGE後、PVDF膜に転写し、N末端アミノ酸配列を調べたところ、Planoooocus属中度好塩菌からは、Bacillus subtilisのGroELと相同の、またAcinetobactor属,Pseudomonas属中度好塩菌からは、E.coliのそれぞれDnaK,GroELと相同のN末端アミノ酸配列を持つ蛋白を同定できた。現在Pseudomonas属中度好塩菌から、GroELホモログを精製し、その性質を検討している。sonication後の粗抽出液より、ATPカラム、DEAEカラム等を用いて均一に精製し、ATPase活性を確認した。非好塩性細菌である大腸菌のGroELとの性質の比較により、好塩菌での蛋白質のfoldingメカニズムを検討していく予定である。
暑中環境及び養生方法がコンクリ-トの物性に及ぼす影響に関する研究

本研究はコンクリ-トの練混ぜから,打設・養生までの各工程における外気温の高低がコンクリ-トの諸性状に及ぼす影響を定量的に把握し,暑中環境下で製造・施工させるコンクリ-トの物性向上を目的として行ったものである。本研究では,まず,世界各地域の気温・湿度の日変化及び年変化が実験室内で再現できるシミュレ-ションシステムの開発を行い,本システムにより,実際の種々の暑中環境を精度よく再現できることを明らかにした。打設前コンクリ-トの物性に関しては,JASS5のコンクリ-ト練上り温度推定式に,練り混ぜ・運搬時間及びその時の外気温を考慮したコンクリ-トの打設温度推定式を提案し,外気温が一定の場合,外気温の変動する場合のいずれについても,コンクリ-ト温度推定値が実験値とよく一致することを示した。打設後のコンクリ-トの物性に関しては,研究を進めていく段階で,暑中コンクリ-トは強度発現性状についてはほとんど問題がなく,コンクリ-ト表層部の劣化,特に初期ひびわれ発生が深刻な問題であることがわかってきた。そこで本研究では,暑中コンクリ-トの表面ひび割れを検討するため,打設された試験体内部の温度性状について的を絞って検討を行った。暑中環境下で打設される床スラブや壁部材等,薄板部材の初期ひびわれ発生に対して,(1)外気温の高低,(2)練り上がり温度の高低,(3)外気温の変動,(4)打設時期及び(5)外気湿度の高低の影響について,試験体内部の温度性状の観点から実験,解析的に検討を行った。この2年間の研究により,暑中コンクリ-トに関する研究システムは実験・解析上ともにほぼ完成している。今後,日射の影響,風速の影響を明確にし,最も重要な最適養生方法について検討を続ける予定である。本研究はコンクリ-トの練混ぜから、打設・養生までの各工程における外気温の高低がコンクリ-トの諸性状に及ぼす影響を定量的に把握し、暑中環境下で製造・施工されるコンクリ-トの物性向上を目的として行うものである。これまで、暑中環境とコンクリ-トの諸物性の関係を定量的に明らかにするための実験及び世界各国における暑中環境の形態の文献調査を行い、以下のような成果を得ている。(1)種々の調査及び実験から暑中環境におけるコンクリ-トは強度発現に関しては、長期強度の伸びが少ないものの初期強度発現が高く大きな欠陥とはなり得ない。(2)打設初期のプラスチックひび割れが構造、美観及び防水性上大きな欠陥となり、コンクリ-トの品質を低下させる。(3)暑中環境とフレッシュコンクリ-トの性状の関係のついては、外気温が変化する場合のコンクリ-ト温度推定式を導出して、実際の工事に使用されるコンクリ-トに適用して、この式の妥当性を明らかにした。(4)世界各国の暑中環境の調査に関しては、特に東南アジアの蒸暑気候について調査を行い、本研究室(九州大学工学部建築学科、材料実験室)にシミュレ-ション装置を設置し、プログラムを開発して、これらの気候を再現し、この環境下で打設・養生したコンクリ-トの強度性状等について検討を行った。ただし、実験日数とコンクリ-トの養生期間の関係から、世界各国の暑中環境は数多くあるためすべてを再現して実験を行うことが不可能であり、暑中環境を大まかに分類し、モデル気候で実験を行うことが必要であることが分かった。将来のシミュレ-ション実験のデ-タとなるように世界各国の暑中環境の調査は今後も行う予定である。

本研究はコンクリ-トの練混ぜから,打設・養生までの各工程における外気温の高低がコンクリ-トの諸性状に及ぼす影響を定量的に把握し,暑中環境下で製造・施工されるコンクリ-トの物性向上を目的として行ったものである.本研究では,まず,世界各地域の気温・湿度の日変化及び年変化が実験室内で再現できるシミュレ-ションシステムの開発を行い,本システムにより,実際の種々の暑中環境を精度よく再現できることを明らかにした.打設前のコンクリ-トの物性に関しては,JASS 5のコンクリ-ト練上り温度推定式に,練り混ぜ・運搬時間及びその時の外気温を考慮したコンクリ-トの打設温度推定式を提案し,外気温が一定の場合,外気温の変動する場合のいずれについても,コンクリ-ト温度推定値が実験値とよく一致することを示した.打設後のコンクリ-トの物性に関しては,研究を進めていく段階で,暑中コンクリ-トは強度発現性状についてはほとんど問題がなく,コンクリ-ト表層部の劣化,特に初期ひびわれ発生が深刻な問題であることがわかってきた.そこで本研究では,暑中コンクリ-トの表面ひび割れを検討するため,打設された試験体内部の温度性状について的を絞って検討を行った.暑中環境下で打設される床スラブや壁部材等,薄板部材の初期ひびわれ発生に対して,(1)外気温の高低,(2)練り上がり温度の高低,(3)外気温の変動,(4)打設時期及び(5)外気湿度の高低の影響について,試験体内部の温度性状の観点から実験,解析的に検討を行った.この2年間の研究により,暑中コンクリ-トに関する研究システムは実験・解析上ともにほぼ完成している.今後,日射の影響,風速の影響を明確にし,最も重要な最適養生方法について検討を続ける予定である.
定常・高密度核融合炉のための振動自己補正型干渉計の短波長化

将来の核融合炉において、核融合出力は電子密度を測定して制御する。そのため、電子密度の測定には高い信頼性と計測精度が要求される。研究代表者らは、機械振動の影響を受けにくく、フリンジジャンプを抑制可能なDispersion干渉計を開発してきた。本研究では、将来の核融合炉の条件に適した短波長のNd:YAGレーザーDispersion干渉計の光学設計、及びベンチ試験を行った。その結果、ITERやヘリカル核融合炉の条件で、2×10^18 m^(-3)の電子密度分解能を達成した。更なる分解能向上のためには、2倍高調波を発生させる非線形素子の温度安定化が有効であることを示した。機械振動を自己補正するディスパーション干渉計では、プロープ光に2倍高調波と基本波の混合波を使う。2倍高調波のパワーが計測精度を決定する要因の一つであるため、レーザー光源出力と波長変換素子の仕様の決定と試験を行った。光源には1.064nmのNd:YAGレーザー、波長変換素子には疑似位相整合型のPPMgSLTを採用した。波長は、将来の高密度大型核融合炉にて位相変化が概ね1フリンジ程度となるように決定した。レーザー出力、及び波長変換素子は、1%以下まで低下してしまう核融合炉内ミラーの反射率、及び多チャンネル化を考慮し、レーザー出力は8W、変換素子に30mm長のPPMgSLTとした。この組み合わせにより、素子内でレーザー光を半径50ミクロン程度に絞ってパワー密度を高めることで、最大0-9W程度の2倍高調波を発生可能である。この場合、一つのレーザー光源で5チャンネル程度の多チャンネル計測が見込める。上記のレーザーの伝搬特性を測定し、それに基づいて波長変換素子へ集光するための光学系の設計を行った。実際に2倍高調波の発生試験を行い、これまで0.3W程度の2倍高調波の発生パワーを確認した。計測試験を行う上では十分な発生効率を達成したが、位相整合条件を満たして2倍高調波のパワーを最大にするためには、素子温度を0.1度程度の精度で最適条件を選ぶ必要があり、その最適化を進めている。干渉計測を長時間安定に行うためには、2倍高調波の発生効率が時間的に安定していることが必要であるが、変換素子によってはレーザー光の吸収による温度変化が不安定にする場合がある。PPMgSLTでは温度制御により、懸念していた外気温変動やレーザー光吸収による素子温度変動の問題はないことが分かり、安定な2倍高調波生成が可能であることを確かめた。機械振動を自己補正するディスパーション干渉計では、プローブ光はレーザー基本波と2倍高調波の混合波である。一般的に干渉計測に用いる連続発振レーザーでは、エネルギー密度が低いため、2倍高調波の発生効率が大きくない。平成24年度では、設計した2倍高調波発生のための光学系で計測に十分な2倍高調波を発生できたものの、発生効率は理論計算の1/3程度に留まったため、平成25年度には原因究明を行った。その結果、非線形光学素子内でのビーム径と発散角が最適でなかったことが分かり、集光光学系の改良を行った。本計画で提案している位相変調型ディスパーション干渉計では、位相変調器が時間分解能の上限値を決定する。光弾性変調器(Photoelastic modulator: PEM)は、研究代表者のこれまでの他の波長域での開発で実績があり、第一候補と考え仕様を決定した。一方、光弾性変調器は変調周波数に上限があり、密度モニターとして必要とされる時間分解能は満たすものの、プラズマ中の高周波揺動を検出し、物理研究に寄与するには不十分である。そのため、変調周波数をより高くできる変調器を検討し、電気光学変調器(Electro-Optic Modulator: EOM)を用いることにし、変調信号用高圧アンプ等も含めた仕様を決定した。EOMは変調周波数の上限は1 MHzであるため、これを使用することによって既存のヘテロダイン干渉計と同程度の時間分解能が得られることが分かった。光源レーザーの短波長化に伴い、波面乱れによる計測精度劣化を考慮し、波面乱れを実測する波面センサー、及びそれを補正する可変形鏡による補償光学系を検討し、ディスパーション干渉計に追加可能な光学系の設計を行った。2種類の非線形素子を用いて、ディスパーション干渉計の計測精度の比較を行った。一つは疑似位相整合型のPPMgSLTで、2倍高調波の生成効率が高いのが特長である。真空容器内でのレーザー光の減衰が著しい核融合プラズマの測定には、好ましい素子である。もう一つは、複屈折位相整合型のBiBOであり、温度変化の影響を受けにくいという利点がある。比較的短時間(100秒間)で両者に差は無く、位相揺らぎは±0.4度であった。

これは、プラズマ中の光路長を、ITERやヘリカル装置FFHR-d1で想定される8 mと仮定した場合、線平均電子密度分解能2×10^17 m^(-3)に相当する。一方、長時間に亘る計測では両者に差が見られ、1時間の連続計測ではPPMgSLTはゼロ点変動が大きいことが分かった。BiBOでは、概ね半分程度のゼロ点変動に収まり、±2度程度であった。これは、線平均電子密度分解能では1×10^18 m^(-3)となる。想定される電子密度の運転領域は、およそ1×10^20 m^(-3)であるため、ゼロ点変動による計測誤差は、長時間に亘る計測でも1%程度に抑えられることが分かった。PPMgSLTがゼロ点変動が大きい理由は、素子周辺の温度変化が影響を与えていると考えられる。これら3年間に亘るベンチテストの成果を基に、大型核融合プラズマ装置でのディスパーション干渉計の概念設計を行った。テストで使用した比較的出力の大きい(8 W)レーザーを利用することで、真空容器内でのレーザー光の減衰を考慮しても、十分なSN比で計測できることを示した。また、ミラー類を真空容器内に設置しなくてもよく、レーザー光の減衰があまり問題にならない環境では、低出力の小型のレーザーでも測定ができる見通しが得られ、システムを小型化し、利便性を高められることを示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。核融合工学26年度が最終年度であるため、記入しない。振動自己補正型干渉計で根幹となる光源レーザー、及び波長変換素子の仕様を決定し、計画通りに2倍高調波の発生試験・最適化を行っている。これにより、平成25年度に計画している位相変調器を用いた干渉計システムの計測精度評価に進むことができる。交付申請書に記載した位相変調器の性能評価については若干の遅れがあるが、これは当初平成25年度計画のオプションとし、本格的な検討は26年度以降と考えていた波面乱れの影響を補正する光学系の検討を優先させたためである。位相変調器の性能評価については、既に申請者の以前の科学研究費補助金若手研究(B)にて原理検証を済ませている。本計画の肝となる「短波長化」を実現するためには、それによって計測精度が劣化する要因を小さくすることが必要であり、その原理検証はもちろん、概念設計も行われていないことから、緊急度は波面補正の検討・設計の方が高いと考えなおした。そのため、両者を相殺して、全体では計画は概ね順調に進展していると考えている。波長変換素子の性能を最大限引き出すために、素子温度や集光条件の最適化を継続する。EOMによる位相変調を行った場合、PEMの場合と比較して密度分解能が劣化しないか検証する。また、EOMへ入力する変調信号のノイズが、どの程度計測に影響するかを定量的に調べる。研究計画の順序を変更して設計した波面補償光学系により、計測精度を改善できるか実証する。本年度計画していた2倍高調波発生試験に関し、集光条件最適化のための光学系設計は来年度としたため、それに必要な経費は来年度に繰り越すこととした。来年度は、当初予定の位相変調器を用いた干渉計システムの精度評価の前に、波長変換の改善に関する実験を行う。
保育の質と安全を保障する、保育施設設置基準の再検討に関する調査研究

研究の目的:女性就労の増加とともに拡大する保育需要に対応するため、保育施設の運営主体や建物の設置基準の緩和により、保育サービスの量的拡充を急ぐべきという意見がある。一方で、規制緩和とは反対に、日本の保育所の設置基準は他の先進諸国と比べ低水準にあることから、基準の改善を求める声もある。双方の議論に折り合いがつかないまま、結果として、認可保育所とそれ以外の保育施設では、その保育環境に格差が生じている。本研究では、保育者数や保育室の広さといった設置基準の各要因と、事故の発生や子どもの育ちとの関連についてデータを収集する。保育を利用するすべての子どもに、一定水準の保育環境が保障されるよう、保育の質・安全を個々の施設の課題ではなく、政策上の問題として取り上げ、規制緩和や設置基準に関する合意形成に役立つ根拠を提示したい。研究の方法:1)保育施設の事故統計・事故事例データベースの分析:関連省庁や団体・機関が公表している、保育施設の事故統計や事故事例データベースを用いて、保育中の事故に関するデータ収集を行い、事故の発生件数や発生状況を整理する。初年度は、日本スポーツ振興センターが運営する学校事故事例検索データベースの利用申請を行い、幼稚園・保育所・認定こども園の管理下でおきた事故に関して情報を得た。2)保育施設でのフィールド調査:設置基準の各要因と子どもの育ちに関する具体的な情報を収集するため、保育者を対象としたインタビュー調査や質問票調査、各保育施設が保管している保育事故記録(ヒヤリハット)などの分析を行う。初年度は、保育園看護職の専門家にヒアリングを行い、保育現場での問題意識や本研究での検討事項に関して情報を得た。本研究では、1)保育施設の事故統計および事故事例データベースの分析、2)保育施設でのフィールド調査、3)他分野での安全管理および諸外国の保育制度に関する調査、の実施を計画している。当初の計画通り、初年度に1)のデータベースの検索と情報収集、2)のフィールド調査の実施準備を進めており、今年度のフィールド調査実施を予定している。次年度は、保育者を対象にしたインタビュー調査・質問票調査を実施し、保育者が認識している事故要因や、施設の設置基準(保育者数や保育室の広さ、保育時間など)が、保育実践や安全面に与える影響について検証する。また保育施設にかぎらず、医療などの他分野においても、「ケアの質と安全」は重要なテーマとなっている。保育以外の領域や諸外国において、安全に関する基準やガイドラインがどのように作成されているのか、また事故が起きたときの対応や保障制度などについても、文献調査やヒアリングを実施して把握したい。初年度にフィールド調査(パイロット調査)を実施した場合を想定して計上していた人件費・謝金が発生しなかったため。次年度での調査実施の際に使用する。
イメージングとRNA-seqをシームレスにつなぐ光誘導性リボソーム標識技術の開発

本研究では光により活性化するタンパク質ビオチン化酵素(以下、光ビオチン化酵素)を構築し、それを用いて任意のタイミングかつ任意の細胞におけるmRNAを光照射により標識、回収するための方法を開発する。この新規細胞内mRNA標識回収法を用いることにより、ライブイメージングで同定した細胞について選択的に遺伝子発現解析を行うことが可能か、検証することを目的としている。平成30年度は光ビオチン化酵素を大腸菌由来birAならびに光変換蛍光タンパク質の一種、PhoClおよびpdDronpaを用いて遺伝子工学的に作製することを試みた。はじめにbirAの全長について、そのN末端側とC末端側の両方にPhoClとエストロゲン受容体であるERT2をタンデムに付加した融合タンパク質を構築した。PhoClは405 nmの光により光開裂するタンパク質であり、ERT2は自己阻害ドメインとして機能する。すなわち光を照射する前はbirAがPhoCl-ERT2によりケージングされており、光照射によりケージが外れてbirAが不可逆的に活性化することを期待した。構築した光ビオチン化酵素およびリボソーム構成因子の一つ、RPL10Aに被ビオチン化配列であるAvitagを付加したAvi-RPL10Aを光ビオチン化酵素の基質として培養細胞に発現させ、光照射を行った。光照射の有無でAvi-RPL10Aのビオチン化状態に違いがあるか、ウェスタンブロッティングにより検討したところ、期待に反して、光無しにも関わらず基質の大部分がビオチン化されているという結果を得た。すなわちbirAのケージングが不十分であることが示唆された。PhoCl-ERT2の代わりにpdDronpaを用いた融合タンパク質も構築し、先述の酵素同様に解析を行ったが、やはり光無しでも基質のビオチン化が起きており、birAのケージングが不十分であることが示唆された。PhoClやpdDronpaを利用した転写因子やタンパク質リン酸化酵素の活性操作系はすでに報告されており、同様のアプローチにより光ビオチン化酵素も比較的容易に開発できると当初期待した。しかしながら実際にはbirAを単純に光変換タンパク質でサンドイッチするだけでは目的の酵素を開発することはできず、birAのケージングにはさらなる工夫が必要であることが考えられた。このため当初予定よりも光ビオチン化酵素の開発に遅れが生じている。mRNAの回収法に関しては、ビオチン化を受けたAvi-RPL10Aが細胞内のリボソームに取り込まれることは平成30年度の検討により確認しているものの、未標識細胞を多数含む集団から標識細胞由来のリボソームおよびリボソームに結合するmRNAを精製・回収する方法の検討については先述の光ビオチン化酵素の開発困難性の影響を受けて未着手であり、こちらも実施が遅れている状況である。光ビオチン化酵素の開発を引き続き進めていく。今後は前年度の検討では試さなかった、birAのドメイン分割を行い、さまざまな位置で分割したbirAとPhoClもしくはpdDronpaとの融合タンパク質を作製することで、birAの十分な不活性化および光依存的な再活性化がおきる組み合わせを探索する。既に報告されている、pdDronpaを用いたタンパク質リン酸化酵素の活性操作系もドメイン分割を行ったリン酸化酵素の光依存的な再構成を利用しており、本開発方針は開発の手間自体はかかるものの、成功が見込まれる戦略であると考える。BirAに関しては野生型よりも高活性かつN末端側ドメインを削除することで分子量を元の35kDから28kDへと小さくした改変型のbirA (miniTurbo)がBranonらによって報告されている。今後はbirAに加えてこのminiTurboについても検討を行う。分子量がより小さくなったことで光変換蛍光タンパク質によるケージング/アンケージングが効率よく起きることを期待する。本研究ではリボソーム構成因子RPL10Aの光ビオチン化およびリボソーム-mRNA複合体の精製回収に基づくmRNA回収法の開発を目標としている。最近では、ビオチン化酵素のある種の変異体を用いて、標的タンパク質と近接する(相互作用する)タンパク質をビオチン化ラベルし、ビオチン化タンパク質を選択的に回収、質量分析により同定するというPL(proximity labeling)法が利用可能となりつつある。本研究で開発予定の光ビオチン化酵素もこのPL法にも原理上適用可能であるため、今後は当初計画の光ビオチン化酵素のmRNA解析への応用に限らず、タンパク質解析への可能性についても検討を行っていく。構築した光ビオチン化酵素およびリボソーム構成因子の一つ、RPL10Aに被ビオチン化