hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
結び目の位置と曲面

(1)高尾和人氏との共同研究において、橋数が4である極小な橋位置を持つ3橋結び目の存在を示した。(2)石井敦氏、岸本健吾氏との共同研究において、境界既約な外部を持つハンドル体結び目は、イソトピー及びアニュラス移動を法として、局所的な1ハンドルを分解する2分解球面が一意的に存在することを示した。Mario Eudave-Munoz氏との共同研究において、トンネル数1の種数2ハンドル体結び目の特徴付けを与えた。古宇田悠哉氏との共同研究において、種数2ハンドル体結び目外部の本質的ディスク・アニュラス・トーラスの分類を与えた。(3)一様に捩じれた結び目がNeuwirth予想を満たすことを得た。また、下川航也氏との共同研究において、3次元球面内のハンドル体及び閉曲面に対して、ザイフェルト曲面を定義し、デーン手術との関係を明らかにした。この結果の系として、Foxの再埋め込み定理を得ることができる。この共同研究の結果は、3つの研究集会`東北大学「東北結び目セミナー2013」, 2013年10月26日'、`Universita di Pisa「Seminari di Geometria」, 2014年2月19日'、`学習院大学「日本数学会2014年度年会」, 2014年3月15日'で発表し、プレプリント「Dehn surgery and Seifert surface system」としてまとめている。研究実績の概要の1に関して、高尾和人氏との共同研究を継続しており、前回の結果を拡張した結果を得ている。前回の結果は、極小な4橋分解と最小3橋分解を持つ結び目の構成であったが、今回得られた結果は、3より大きい任意の自然数nに対して、極小なn橋分解と最小3橋分解を持つ結び目を構成したことである。これにより、前回の論文で提起した二つの問題についての解答を与えた。更に、今回の論文で提起した問題について、小林毅氏と張娟姫氏により、Casson--Gordonの構成方法を利用すると、解決できることを示唆頂いた。これを切欠として、今回の共同研究は、この4人で進めることとなった。研究実績の概要の2に関して、ほぼ満足できる結果を得ている。ただ、論文の微修正が遅れており、その為、ジャーナルにまだ投稿できていない。研究実績の概要の3に関して、予想外の研究の進展があった。ケーブリング予想に関連して、「結び目外部が本質的4つ穴開き球面で、境界スロープが整数であるようなものを含むか?」という問題が残り、種数2のハンドル体外部の本質的アニュラスの分類が最後までできていなかった。この問題は、Cameron Gordon氏により解決され、appendixとして、共著論文に載せることが許可され、種数2のハンドル体外部の本質的アニュラスの分類を完成させることができた。研究実績の概要の4に関して、論文の完成が遅れた為、投稿が遅くなってしまった。一度、Osaka J. Mathに投稿したがリジェクトとなってしまった(レフリーの誤読と思われる)。その後、J. Math. Soc. Japanに投稿した。研究計画の「1.研究の学術的背景」で記述したように、結び目の位置は大きく正則表示とMorse位置の二つに分類される。「研究実績の概要」で記述した研究成果は、Morse位置に関するものである。この点で、正則表示に関する研究目的は十分に達成できていないと言える。しかしながら、研究の手法として橋表示のwell-mixed conditionを用いており、橋表示は正則表示でもあるので、この点では正則表示の研究であるとも言える。総括すると、狭義の研究計画通りに進んでいないが、広義の研究計画通りには順調に進んでいるとしたい。平成23年度に挙げた大きな成果として、Math. Proc. Cambridge Philos. Soc.に投稿中の論文(A locally minimal, but not globally minimal bridge position of a knot, arXiv:1203.1119)がある。この論文の主定理では、3橋結び目の4橋位置で安定化されていないものを新たに与えた。この結果は、3橋結び目に対して強既約な4橋球面が入ることを意味している。研究課題「結び目の位置と曲面」について、結び目の橋位置と橋球面に関する重要な結果を挙げることができたと自負している。1.結び目の極小橋分解にについて、高尾和人氏、小林毅氏、張娟姫氏との共同研究を続けていきたい。この共同研究は、Casson--Gordonによる無限個の強既約なヒーガード分解の構成に基づき、無限個の極小橋分解を構成する方針で進められている。

3.ハンドル体のn-分解について、現在のところ、1-分解や2-分解ですら一意的であるかどうか一般的には分かっていない。これを大きな目標としたい。この目標の第一ステップとして、石井氏、岸本氏との共同研究、および、古宇田氏との共同研究において、knotted handle 2-分解は一意的であることを示した。先ずは、この延長線上にある問題、knotted star n-分解に取り組みたい。空間グラフにおいて、イソトピーで移り合う為の必要十分条件が、blowing-up/downであることが知られており、これは、knotted star n-分解に対応する。期待できる予想としては、knotted star n-分解の一意性である。5.今年度前期は埼玉大学の非常勤があるので、毎週下川航也氏と議論を交わす予定である。そこで、特に結び目のABC予想について考えたい。「研究実績の概要」で記述したように、結び目の橋位置については十分に満足のいく成果を挙げられたと自負している。高尾和人氏との共同研究における手法は、橋表示と橋位置との相互関係に着目した潜在的な可能性を持つものであり、今後の研究の発展が大いに期待される。従って、今後の研究は橋位置に関するものを中心に考えていきたい。既に、論文(A locally minimal, but not globally minimal bridge position of a knot, arXiv:1203.1119)で挙げた問題「整数n>3に対して、局所的に最小であるが大域的に最小でないn橋位置を無限に生成できるか?」に対して、研究の方針は立っている。橋表示のwell-mixed conditionを調べることで、ある整数n>m>2に対して、m橋結び目の局所的に最小のn橋位置を構成できると期待している。また、今後は結び目だけでなくその拡張であるハンドル体結び目についても研究を進めていきたい。既に、石井敦氏(筑波大学大学院数理物質科学研究科)と岸本健吾氏(大阪工業大学工学部)との共同研究が進行しており、ハンドル体結び目の2分解の存在性と一意性についての結果を得た。現在、論文(Knotted handle decomposing spheres for handlebody-knots)としてまとめている途中である。また、平成23年8月15日から24日の期間、メキシコ国立自治大学のMario Eudave-Munoz教授と研究打ち合わせをし、トンネル数1かつ種数2のハンドル体結び目で、2分解を持つものの特徴付けをした。この成果についても現在論文(Composite tunnel number one genus two handlebody-knots)としてまとめている途中である。2013年8月12日から16日にかけて、東京女子大学において国際研究集会「International Workshop on Spatial Graphs 2013」を開催予定である。外国人招聘の為、旅費・滞在費として30万円程使用する。その他の残額は、研究打ち合わせの為の費用やパソコンソフト・周辺機器などに使用する。
幹細胞の分化能を改善する因子の同定 : 単為発生細胞の性質改善技術の応用

核移植前後で発現量が増加した遺伝子に対するsiRNAをそれぞれ正常受精胚性幹細胞(ES)に導入したが、in vitroでの神経細胞への分化能の変化は見られなかった。一方、核移植した細胞から発生した胎盤は、正常受精卵から発生した胎盤と同等に胎児を正常に発育させる能力を再獲得した。正常受精胚由来のES細胞にsiRNAを導入し、ノックダウンによる細胞の分化能の変化を、神経系幹細胞への分化誘導により検定した。6種類のsiRNAをそれぞれ導入した細胞で、50%異常の発現抑制効果が確認された。これらの細胞を正常なES細胞と同様の培養条件化では、細胞の増殖速度に変化は無く、また形態の異常も認められなかった。一方、単為発生ES細胞(pES細胞)を用い、Qi-Long Yingらの手法(nature biotechnology Vol21 183-186)を用いてneuroectodermal precursor細胞の樹立を試みた。この手法ではES細胞から神経幹細胞様の細胞が樹立されるが、pES細胞では、分化誘導により細胞の形態が変化した後徐々に増殖能を失い、これまでのところ目的細胞は得られていない。これまでの研究により、単為発生細胞が神経系への細胞へと分化し難いことを示してきたが、neuroectodermal precursor細胞の誘導が失敗することとの関係については不明である。それに対して核移植草為発生ES細胞(NT-pES細胞)ではpES細胞に比べて分化誘導後の増殖がやや良好であった。ただし正常ES細胞からの誘導と比較しては増殖速度は遅かった。現在このNT-pES細胞から誘導して得られた細胞がneuroectodermal precursor細胞同様に神経系細胞(グリア細胞や神経細胞)への分化能を持つかの検証を進めている。これまでの研究により、単為発生胚は胎盤が正常に発生せず、胎盤発生に重要とされるインプリンティング遺伝子Peg10の発現量が低いことが知られていたが、核移植後の単為発生胚では正常な大きさに胎盤が発生することが見いだされた。核移植後の単為発生胚を4倍体法により胎盤だけへと発生するように操作し、胚盤胞期に正常なES細胞を卵割腔へと注入したキメラ胚では、胎盤が単為発生細胞由来であるにも関わらず胎児は正常に発生し、正常な産子が得られた。このことは核移植後の単為発生胚が完全な機能を持った胎盤の形成能を獲得したことを意味する。さらにこの時、Peg10の発現量が正常な胎盤と同程度に回復していることが確認された。インプリンティング遺伝子H19、Igf2、Igf2rの制御領域のメチル化状態は核移植前後で変化していなかったが、Peg10上流のメチル化だけは正常受精胚での状態に近づいていた。一方で、正常な胚由来の胚盤胞へ核移植後の単為発生細胞を移植し、産子を得ることを試みた。核移植を繰り返すことで胎児期の発生は少しずつ改善されたが、受精後14.5日目以降まで発生することはなかった。以上の結果から、核移植を用いることにより、発生能のきわめて低い細胞に対して、その性質を改善し正常な機能をもたらすことが可能であることが示された。
ウェブサイト「(Rで)塩基配列解析」の情報更新・拡充

ウェブサイト「(Rで)塩基配列解析」は、主に塩基配列データや遺伝子発現データ解析をフリーソフトウェアRで効率的に行うための包括的な情報サイトである。本研究は、ウェブサイト(Rで)塩基配列解析の安定的な提供を目指し、1情報更新および2情報拡充を行うことを目的としている。本サイトは、膨大な情報量を1つのページで表示させているため表示に時間がかかること、R以外のコマンドも含むためRコードの動作確認の自動化が難しいという枠組み上の問題が存在した。今年度は、Rと比較的関係性の低い一部の項目を本サイトから分離し、「(Rで)塩基配列解析のサブ」に移行した。これにより、本サイトの表示にかかる時間を減らすと同時に、本サイト内のRコードの割合を大幅に上昇させ自動化の枠組みに近づけた。また、文言の表記ゆれやリンク切れの修正、新規項目や最新プログラムおよび原著論文の追加を行った。これまで本サイト上では、Rコンソール画面というコマンド入力ベースの手段でデータ解析を行う枠組みを提供していた。しかしながら現実には、コマンド入力の障壁を乗り越えられないユーザが少なからず存在する。そこでRNA-seqデータ解析をグラフィカルユーザインターフェース(GUI)を通じて行うことのできるウェブツールTCC-GUI(https://github.com/swsoyee/TCC-GUI)の開発を行い、論文公開まで行うことができた(Su et al., BMC Res. Notes, 2019)。研究計画通りに進められており、当初の予定以外の成果も得ることができた。動作確認の自動化に向けた取り組みも着実に進められた。しかしながら、完全な自動化は、現実には難しいのではという気がしはじめている。自動化に向けた取り組み自体は、全体的な文言の統一化と密接に関連しているため、今後も継続して行っていきたい。今年度は、需要が高まりつつあるシングルセルRNA-seqデータ解析のための情報提供を強化しつつ、リンク切れの修正、新規項目や最新プログラムおよび原著論文の追加などの地道な作業を継続して行っていく予定である。学術支援職員の雇用開始時期が当初予定よりもずれ込んだためである。次年度の研究成果公開費用として使用予定である。
Wntシグナルによる感覚ニューロン受容野境界決定メカニズムの解明

本研究では、ショウジョウバエ感覚ニューロンをモデルとして、受容野境界が確立される分子・細胞メカニズムの解明を目指した。生体内の可視化法や遺伝学的手法を組み合わせることにより、分泌タンパク質Wnt5が境界での樹状突起伸長を適切なレベルに抑えることを見出した。さらに、Wnt5シグナルを媒介する分子としてtrioを同定した。これらの結果は受容野境界を確立する仕組みの一端を示している。感覚ニューロンは樹状突起によって構築される受容野により体外環境を感知する。受容野の「位置」「サイズ」は環境刺激の空間情報を認知するための重要な要素である。しかし、受容野形態を決定する分子・細胞メカニズムに関してはいまだ不明な点が多い。本研究では、モデル生物としてショウジョウバエを利用し、受容野の境界形成における細胞外環境の役割を明らかにすることを目的とする。具体的には、本年度は、(1)感覚ニューロン受容野の境界決定におけるWnt5の役割の解明、(2)受容野の境界決定を制御する新規遺伝子の同定を目指し研究を実施した。(1)Wnt5の役割についての解析を始めるにあたり、最初にWnt5発現細胞の同定を試みた。この目的のために、Wnt5プロモーターの下流にEGFPを配置した遺伝子改変ショウジョウバエを作製した。このハエでは、EGFPがWnt5発現細胞をラベルするレポーターとなる。これを利用して、Wnt5発現の時間空間パターンを解析したところ、受容野境界の樹状突起に接触する表皮細胞がWnt5を発現することを見出した。さらに詳しく観察すると、この発現は受容野境界が形成される前から始まり、完了するまで継続していた。これらの結果に基づき、私たちは受容野境界がWnt5の発現位置により規定されると考えている。(2)受容野の境界決定を制御する新規遺伝子の候補として、細胞内シグナルを伝達する遺伝子に着目した。特に細胞骨格系の制御に関係することが知られている約100遺伝子を中心にRNAiスクリーニングを実施した。その結果、受容野境界の形成に関与する候補遺伝子が5個単離された。現在、単離された遺伝子それぞれについて、Wnt5シグナルとのつながりに焦点を当てながら解析を進めている。感覚ニューロンは樹状突起によって構築される受容野により体外環境を感知している。このとき、受容野の「位置」と「サイズ」は体外環境の位置情報を特定するために極めて重要である。しかし、受容野が形成される位置とそのサイズが、どのような分子・細胞メカニズムで決定されているかに関しては、未だ不明な点が多い。本研究では、受容野サイズの謎に迫るために、モデル生物としてショウジョウバエを利用し、受容野サイズ決定における細胞外環境の役割を明らかにすることを目的とする。具体的には、本年度は、(1)感覚ニューロン受容野のサイズ決定における細胞表面分子Rykの役割の解明、(2)受容野のサイズ決定を制御する新規遺伝子の同定を目指し研究を実施した。(1)昨年度までにRykの変異体では、受容野サイズが拡大することを発見していた。そこで、最初にRyk発現を再現するGAL4レポーター系統を利用して発現細胞を解析し、Rykが感覚ニューロン特異的に発現することを見出した。一方、受容野が構築される表皮細胞層では発現が検出されなかった。さらに、Rykに蛍光タンパク質GFPをタグ付けしRykの細胞内分布を解析した。GFP結合型Rykは樹状突起内に分布しており、Rykが樹状突起内にて機能することが強く示唆された。(2)細胞内シグナルを伝達する遺伝子約100種類のRNAiスクリーニングを実施し、細胞骨格の再構成因子であるtrioを同定した。trioはWnt5と遺伝学的相互作用を示し、感覚ニューロン特異的なノックアウトにより受容野サイズの拡大を示した。これらの結果より、Wnt5がRykとtrioを介して作用する可能性が考えられるが、今後この可能性をさらに追及していく。生物学1、受容野境界形成を制御する分泌因子Wnt5のダイナミックな役割の解明を目指すプロジェクトについては、Wnt5発現細胞の詳細な同定が進んでいる。この結果に基づき、Wnt5分子の位置が受容野境界を規定する目印となっていることが示唆された。2、受容野境界決定において樹状突起の振るまいを制御するメカニズムの解明を目指すプロジェクトについては、境界形成直前から形成完了までの時期にわたって、樹状突起の振るまいを生体内観察した。このとき、正常個体とWnt5機能欠損個体の比較実験を行うことができた。現在、この比較実験から境界形成時に特徴的な樹状突起の振るまいについての解析を進めている。3、受容野境界決定シグナルを伝達する受容体下流の細胞内分子ネットワークの解明を目指すプロジェクトについては、細胞骨格系を制御する遺伝子を中心にRNAiスクリーニングを実施しており、候補遺伝子を5個単離している。既に、これらの遺伝子の突然変異体を利用した遺伝学的解析を開始しており、来年度には具体的な分子メカニズムの解明が期待される。1、生体内におけるWnt5分布を観察するために、mCherry標識Wnt5ノックイン系統を作製する。

この系統を利用して、Wnt5の細胞外分布と受容野境界の関係を解析する。一方、Wntファミリー分子群の細胞外分布は細胞外マトリックス(ECM)によって規定されることが報告されている(Lin, development (2004) 131: 6009-6021)。Wnt5分布のダイナミクスがどのECM分子によって制御されるかを明らかにするために、へパラン硫酸プロテオグリカン、ラミニン、コラーゲンなどを含めたECM分子の組織内局在同定、及びECM遺伝子変異体を用いた機能解析をおこなう。2、Wnt5がどのようにして退縮・方向転換などの受容野境界近傍における樹状突起の振るまいを制御するかを解明するするために、ライブイメージングを用いて野生型とWnt5変異体の樹状突起を比較解析する。3、樹状突起内部において、どのような細胞内分子ネットワークが受容野境界決定における樹状突起の形態変化を制御するかについて明らかにするために、全遺伝子の網羅的スクリーニングを実施する。ここではDishevelledなどWntシグナルに関与する遺伝子を優先的に検証する。これと並行して、Srcキナーゼなどの細胞内シグナル分子やアクチンなどの細胞骨格分子との相互作用に着目して単離された遺伝子を解析する。最終的に、同定された遺伝子群の解析により、受容野境界決定を制御する分子間ネットワークを同定し、その作動原理を明らかにすることを目指す。
インドシナ半島における古代国家の形成：ベトナム・チャーキュウ遺跡からのアプローチ

平成30年度にはベトナムのクァンナム省とアンザン省において現地調査を実施した。その具体的内容、意義、重要性は以下の通りである。(1)研究代表者・山形と研究分担者・鈴木がベトナム人研究協力者とともに、クァンナム省の世界遺産ミーソン遺跡E1祠堂周辺から出土した瓦の資料調査を実施した。ミーソンE1は8世紀初頭の建立とされ、人面紋瓦当が出土しているが、チャーキュウ遺跡の人面紋瓦当とは意匠、形態、瓦の葺き方に違いが認められた。インドシナ半島の古代瓦研究を大きく前進させる資料である。(2)チャーキュウ遺跡内の水田で農民が耕起を行い、遺跡を破壊した箇所から獅子像彫刻2点を含む大量の遺物が出土した。美術史家によれば獅子像はチャンパ彫刻でも初期の作例であり67世紀にさかのぼる。チャンパ考古学において編年上の空白となっている時代であるため、山形と鈴木が遺物群の整理と分析を進めている。(3)研究分担者・中山がチャーキュウ遺跡とクァンナム省博物館において植物圧痕レプリカの採取を行った。日本国内では平成29年度にベトナム南部で採取した圧痕レプリカを走査電子顕微鏡観察する一方、現生イネの野生種と栽培種の籾構造の違いに関する検討を行い、研究論文の作成を行った。(4)研究分担者・重枝がミーソン遺跡における近年の修復事例を調査し、その手法に対する検証を行った。ベトナムとインドのチームが進めている修復は観光客のための整備を主眼としており、研究の進展がほとんどみられない現状を整理した。(5)研究分担者・久保は日本において、アンザン省オケオ遺跡で平成29年度に採取した堆積物試料の分析を進め、34世紀の年代測定値を得た。オケオの都城外でおこなったハンドオーガーにより、深度4.85mで約16000年前(更新世)の年代測定値も得られた。昨年度にはオケオの古代運河沿いの発掘地点において試料採取と断面観察を実施した。平成30年度にチャーキュウ遺跡東城壁の小規模な再発掘をベトナム側に提案したが、実現に至らなかった。その理由は、共同研究機関であるベトナム南部社会科学院がオケオ遺跡の発掘調査を実施中であるため、別遺跡の調査のために彼らが割くことができる日程と人員が限られる。さらには旧正月後の半月間は土地を掘り起こすことを忌避する慣習もあり、研究代表者が大学業務の合間をぬってベトナムに渡航できる日程と、ベトナム側の都合を合致させることができなかった。さらに、昨年秋にチャーキュウ遺跡内の水田で農民による遺跡破壊(水田の深い耕起)が発生したため、現地行政機関が遺跡の現況を変えることに敏感になっているという現状も影響した。発掘調査の実施を見送ったが、チャーキュウ遺跡、ミーソン遺跡、オケオ遺跡において研究を前進させるべき課題は山積しており、現時点で実施可能な調査を優先しながら本研究課題に取り組んでいる。本研究課題の今後の方向性について、以下のように考えている。(1)最近2年の間に思いがけない新出資料があったことを踏まえ、それらの整理と研究、報告を行う。すなわちミーソン遺跡Eグループならびにチャーキュウ遺跡内水田の出土資料であり、いずれも考古学的研究が進んでいない後5世紀から8世紀に属する可能性が高い貴重な資料であると予測している。(2)ミーソン遺跡管理委員会と我々の調査団との連携が深まっていることから、ミーソン遺跡とチャーキュウ遺跡を関連付けるような研究と博物館展示、さらにはミーソン遺跡の修復手法などの問題について、ミーソン遺跡管理委員会に提言を行っていきたい。(3)チャーキュウ遺跡において発掘調査の実施が困難である状況を受け入れ、城壁外部を巡っていた環濠の存在を確かめることを当面の目的とし、ボーリング調査を実施する。環濠は城壁の建設年代や手法と密接に関連するため、その存在について議論するための基本情報を得ることを目指す。(4)ベトナム側共同研究機関によるオケオ遺跡の発掘調査が2019年末まで継続する。我々の調査団としてはオケオ遺跡とチャーキュウ遺跡の土器比較研究、土壌堆積物分析にもとづく旧水路と遺跡との関連、植物圧痕分析、オケオ遺跡の大規模レンガ建築遺構に関する建築史学的考察など、複数の研究分野でベトナム側と協力し、研究成果をあげていく方針である。(5)本研究課題の成果報告を刊行する。本研究はインドシナ半島の初期国家・林邑の王都に比定されるベトナム中部・チャーキュウ遺跡を主たる研究対象とする。チャーキュウ遺跡の研究に際し、同じくインドシナ半島に勃興した初期国家・扶南の外港に比定されるベトナム南部・オケオ遺跡との比較を重視している。平成29年度には両遺跡において調査を実施した。まず林邑に関しては、チャーキュウ遺跡現地の博物館と教会が収蔵している出土瓦の悉皆調査を実施した。その過程で、林邑(チャンパ)の宗教的中心であったミーソン遺跡(ユネスコ世界遺産)において、ベトナムによる修復事業に先立って行われた数年前の発掘で大量の瓦が出土していたことを確認した。ミーソン管理委員会の許可を得て、それらの初歩的調査を実施することができた。瓦は8世紀初頭の建立とされるミーソンE1祠堂に由来する可能性があり、チャーキュウと同様に人面(鬼面)を瓦当紋様とする。ミーソンE1はチャンパ建築史・美術史上の画期となった重要な建物である。

チャーキュウとの比較にもとづいてミーソンE1瓦の年代と、実際に葺かれた手法を追求することは、林邑史の解明に新たな視点を導入することにつながる。考古学的には山形と研究分担者・鈴木朋美が、建築史と美術史の方面からは研究分担者・重枝豊と研究協力者チャン・キー・フォンが、ミーソンE1の研究を深化させる計画である。オケオ遺跡では現在、国家的調査研究プロジェクトが進行中である。その一環として、ベトナム南部社会科学院がオケオ遺跡で発掘調査を実施中であり、本科研は彼らの調査と連携している。研究分担者・久保純子は発掘予定地点で土壌堆積物分析のためのボーリング調査を実施し、研究協力者・中山誠二はオケオ遺跡出土土器に残された植物圧痕のレプリカ採取と分析を実施した。山形は出土土器と瓦について、チャーキュウ遺跡などのベトナム中部出土遺物との比較をもとに編年研究に着手している。平成29年度の調査研究については、ミーソン遺跡E1祠堂出土とされる瓦の調査など、思いがけず新たな展開があった。しかし、ここで「やや遅れている」とした理由は、本科研費調査のベトナム側共同研究機関であるベトナム南部社会科学院が、国家的事業としてのオケオ遺跡調査プロジェクトに専念していることに起因する。私たちがベトナム中部でチャーキュウ遺跡の調査を実施するために、長期間にわたって南部社会科学院から考古学者を派遣してもらうことは難しい状況にある。そのため、本年度はチャーキュウ遺跡において発掘や測量などのベトナム側人員を多く必要とする調査ではなく、遺物の資料調査を優先した。平成30年度にはベトナムのクァンナム省とアンザン省において現地調査を実施した。その具体的内容、意義、重要性は以下の通りである。(1)研究代表者・山形と研究分担者・鈴木がベトナム人研究協力者とともに、クァンナム省の世界遺産ミーソン遺跡E1祠堂周辺から出土した瓦の資料調査を実施した。ミーソンE1は8世紀初頭の建立とされ、人面紋瓦当が出土しているが、チャーキュウ遺跡の人面紋瓦当とは意匠、形態、瓦の葺き方に違いが認められた。インドシナ半島の古代瓦研究を大きく前進させる資料である。(2)チャーキュウ遺跡内の水田で農民が耕起を行い、遺跡を破壊した箇所から獅子像彫刻2点を含む大量の遺物が出土した。美術史家によれば獅子像はチャンパ彫刻でも初期の作例であり67世紀にさかのぼる。チャンパ考古学において編年上の空白となっている時代であるため、山形と鈴木が遺物群の整理と分析を進めている。(3)研究分担者・中山がチャーキュウ遺跡とクァンナム省博物館において植物圧痕レプリカの採取を行った。日本国内では平成29年度にベトナム南部で採取した圧痕レプリカを走査電子顕微鏡観察する一方、現生イネの野生種と栽培種の籾構造の違いに関する検討を行い、研究論文の作成を行った。(4)研究分担者・重枝がミーソン遺跡における近年の修復事例を調査し、その手法に対する検証を行った。ベトナムとインドのチームが進めている修復は観光客のための整備を主眼としており、研究の進展がほとんどみられない現状を整理した。(5)研究分担者・久保は日本において、アンザン省オケオ遺跡で平成29年度に採取した堆積物試料の分析を進め、34世紀の年代測定値を得た。オケオの都城外でおこなったハンドオーガーにより、深度4.85mで約16000年前(更新世)の年代測定値も得られた。
糖尿病における動脈硬化症危険因子の血管分子生物学:酸化ストレスと高インスリン血症

糖尿病患者における動脈硬化症は、非糖尿病者に比べて約10年若年から発症し、諸危険因子(高脂血症、高血圧症、喫煙)を補正しても依然として非糖尿病者に比べて2-3倍高頻度であり、患者の生命予後決定因子となっている。そこで糖尿病に特徴的な動脈硬化危険因子(高血糖、酸化LDL、インスリン抵抗性)がどのような機構で動脈硬化発症・進展に関与しているかを血管分子生物学的方法にて検討することは、今後の予防・治療の戦略を検討する上で重要である。既に我々はこの2年間文部省科学研究費を受け以下の点を明らかにしてきた。1)高血糖条件での酸化ストレスの亢進:高血糖状態では、血管内皮細胞での活性酸素処理系としてのグルタチオンレドックス(GR)サイクルが低下し、活性酸素産生の亢進により酸化ストレスが亢進する(Diabetologia 1994, Diabetes 1995, Diabetes 1996)。2)高血糖状態に伴う血管内皮細胞の細胞間接着因子(ICAM-1)発現増加・高血糖状態では、血管内皮細胞における細胞接着因子のうちICAM-1が特異的に増加し単球との相互作用が亢進した(Life Science 1994)。3)酸化LDLとMCP-1遺伝子発現:酸化ストレス状態で産生される酸化LDLにより血管内皮細胞の動脈硬化促進性サイトカインとしてMCP-1mRNAが誘導される(Metabolism 1996)。この活性は血管内皮細胞を抗酸化剤にて処理することにより完全に正常化し、またその誘導機構として転写因子-NF-kBの活性化が関与していることが明かとなった(Diabetologia, in press)。4)インスリン抵抗性機構の解明:インスリンによる細胞増殖の調節は、インスリン受容体チロシンキナーゼとプロテインチロシンホスファターゼ(PTPase)により調節を受けている。本研究では非受容体型PTPaseであるPTP1BとSHP2について検討した。高血糖下におけるインスリン作用異常はPTP1Bの活性化によるインスリン受容体脱燐酸化によった(End. J 1995, BBRC 1994)。更にインスリン感受性増強剤により高血糖下PTPase異常は改善した(J Biol Chem 1995)。一方、促進性PTPaseとしてSHP2が存在し、このPTPaseドメインを欠損した変異遺伝子を線維芽細胞に導入したところ、インスリン情報伝達系の障害が認められた(BBRC 1994, FEBS lett 1994, J Biol Chem 1996, BBRC 1996)。5)血管平滑筋細胞におけるインスリン抵抗性と細胞増殖シグナル:培養平滑筋細胞(SMCs)を用いて、インスリン作用を検討した。SMCsのインスリン作用はShc、Ras-MAP系情報伝達は認められず、PI3キナーゼの活性化が主な経路であった。このインスリン情報は慢性高インスリン状態にて脱感作され(Atherosclerosis 1995)、アミノ酸輸送系(A system)の活性化に関係した(Circ Res 1996)。

一方、促進性PTPaseとしてSHP2が存在し、このPTPaseドメインを欠損した変異遺伝子を線維芽細胞に導入したところ、インスリン情報伝達系の障害が認められた(BBRC 1994, FEBS lett 1994, J Biol Chem 1996, BBRC 1996)。5)血管平滑筋細胞におけるインスリン抵抗性と細胞増殖シグナル:培養平滑筋細胞(SMCs)を用いて、インスリン作用を検討した。SMCsのインスリン作用はShc、Ras-MAP系情報伝達は認められず、PI3キナーゼの活性化が主な経路であった。このインスリン情報は慢性高インスリン状態にて脱感作され(Atherosclerosis 1995)、アミノ酸輸送系(A system)の活性化に関係した(Circ Res 1996)。インスリン非依存型糖尿病における動脈硬化症発症の危険因子として酸化LDL産生、高インスリン血症の意義が検討されている。本研究では、糖尿病患者血清中LDLに酸化変性LDLが増加しているかどうかをLDL酸化修飾の指標であるLysophosphatidylcholine(LPC)濃度を測定し、LPC濃度と臨床的指標との関連を検討し、更にLPCによる血管内皮細胞遺伝子発現の修飾とその調節に関して明らかにした。一方インスリンの血管平滑筋細胞増殖作用について平滑筋細胞増殖におけるインスリン作用の特徴を明らかにした。更にLPCによりMCP-1mRNA発現が増加し、培養液中にMCP-1が40%増加した(Metabolism,1996 in press)2.高血糖による内皮細胞機能異常:高血糖では活性酸素分解能が低下し、血管内皮細胞は酸化障害を受けやすくなる事、その機構としてグルタチオン還元サイクルに連結した五炭糖リン酸回路の活性化異常が明らかとなった。(Diabetologia 1994,Diabetes 1995)更に高血糖では血管内皮細胞における接着分子の発現が増加した(Life Science 1996,in press)。3.血管平滑筋細胞におけるインスリン作用:生理的濃度インスリンによりインスリンは、直接的細胞増殖促進作用はないが、IRS-1,PI3 ́キナーゼの活性化によりアミノ酸輸送系が促進される(Atherosclerosis 1995,Circulation Res,submitted)。糖尿病患者における動脈硬化症は、非糖尿病者に比べて約10年若年から発症し、諸危険因子(高脂血症、高血圧症、喫煙)を補正しても依然として非糖尿病者に比べて2-3倍高頻度であり、患者の生命予後決定因子となっている。そこで糖尿病に特徴的な動脈硬化危険因子(高血糖、酸化LDL、インスリン抵抗性)がどのような機構で動脈硬化発症・進展に関与しているかを血管分子生物学的方法にて検討することは、今後の予防・治療の戦略を検討する上で重要である。既に我々はこの2年間文部省科学研究費を受け以下の点を明らかにしてきた。1)高血糖条件での酸化ストレスの亢進:高血糖状態では、血管内皮細胞での活性酸素処理系としてのグルタチオンレドックス(GR)サイクルが低下し、活性酸素産生の亢進により酸化ストレスが亢進する(Diabctologia 1994,Diabctcs 1995,Diabctcs 1996)。2)高血糖状態に伴う血管内皮細胞の細胞間接着因子(ICAM-1)発現増加-高血糖状態では、血管内皮細胞における細胞接着因子のうちICAM-1が特異的に増加し単球との相互作用が亢進した(Life Science 1994)。
若年者の教育・職業の移行とキャリア形成に関するコーホート研究

20歳25歳にわたる5年間のパネル調査を通して、若年者の教育機関から就労等への移行をめぐる状況の詳細を明らかにすることができた。現在の非正規雇用等の若年者の中での広がりは各種政府統計でも示されているが、離学後直ちに正規雇用に就き継続している者が半数あまりに昇る一方で、離学後20代半ばまでほぼ一貫して不安定就労・無業状態を続ける者が3割近いなど、仕事への移行をめぐる格差が大きいことが明らかにされた。さらに大都市部とそれ以外の地域での格差が思いのほか大きいことなどが判明した。本研究は、大規模な社会変動を背景に、若者の学校から仕事への移行過程の現状と課題を明らかにすべく、2007年4月1日現在満20歳の若者を全国から抽出し、それぞれの移行状況やそこでの意識、直面している問題などについて、質問紙法によるパネル調査として実施しているものである。本年はその第4年度にあたる。具体的に本年行なったのは、以下の二点である。1.3年目調査結果の分析ならびに公表2009年に実施した「若者の教育とキャリア形成に関する調査(第3回)」の集計ならびに分析を行ない、分析結果は2010年8月末に広島大学にて開催された日本教育学会第69回大会において中間報告会(一般公開)として発表した。また、調査結果の概要については、ニューズレター第2号を刊行して、調査対象者・報道関係者などに送付するとともに、HPに公開した。さらに詳細な分析結果については、『「若者の教育とキャリア形成に関する調査」2009年第三回調査結果報告書』として2011年3月に刊行した。なお同報告書は間もなくHP(http://www.comp.tmu.ac.jp/ycsj2007/index.html)においても公開する予定である。2.4年目調査の実施3年目調査対象者1140名を対象に、4年目調査を実施した。回収率は88パーセントに昇るなど、若年層を対象とした調査としては高い結果となった。なお、それまでの調査から引き続き、若年層の就労・就学状況とそれと関わる意識、社会への意識と自己認識、家庭階層、社会的ネットワークなど、若年層の実態を把握すべく幅広い視点からの質問構成となっている。調査結果については、2011年度に分析を行なうとともに、同年8月に千葉大学で開催される日本教育学会大会にて公開で中間報告会を行なう予定である。本年はその第5年度にあたる。1. 4年目調査結果の分析ならびに公表2010年に実施した「若者の教育とキャリア形成に関する調査(第3回)」の集計ならびに分析を行ない、分析結果は2011年8月末に千葉大学にて開催された日本教育学会第70回大会において中間報告会(一般公開)として発表した。また、調査結果の概要については、ニューズレター第4号を刊行して、調査対象者・報道関係者などに送付するとともに、HPに公開した。さらに詳細な分析結果については、『「若者の教育とキャリア形成に関する調査」2010年第四回調査結果報告書』として2012年3月に刊行した。2. 5年目調査の実施4年目調査回答者者中あらかじめ辞退を申し出た者を除く971名を対象に、5年目調査(最終)を実施した。回収率は約92パーセントに昇るなど、若年層を対象とした調査としては高い結果となった。調査結果については、2012年度に分析を行なうとともに、同年8月に名古屋大学で開催される日本教育学会大会にて中間報告を行なう予定である。3.研究成果の発信2012年1月、アメリカ・タンパで開催された国際社会学会教育社会学・青年社会学RC合同カンファレンスにおいて研究成果を発表した。本研究は、大規模な社会変動を背景に、若者の学校から仕事への移行過程の現状と課題を明らかにすべく、2007年4月1日現在満20歳の若者を全国から抽出し、それぞれの移行状況やそこでの意識、直面している問題などについて、質問紙法によるパネル調査として実施し、さらにそのうちの一部について面接調査を行うものである。

すでにパネル調査(2011年度)、面接調査(2012年度)を計画通り完了し、最終年度に当たる本年度は以下のことを行った。1.結果の分析ならびに公表準備5年間のパネル調査結果ならびに面接調査結果について一次的分析を加えるとともに、パネル調査結果を中心とした最終報告書の公表を準備した。不安定な状況の集中している層の析出などに加え、大都市部とそれ以外など地域間の顕著な差異が浮かび上がる等重要な事実が出ている。なお最終報告書は2014年5月にHPに公開する予定である。2.国際シンポジウムの実施2013年10月国際シンポジウム「若者パネルの国際比較ー学校から仕事への移行はどれだけ不安定化したか?」を開催し、本調査成果の一部を公表するとともに、同様のパネル調査に取り組むイギリス・スイス・韓国の研究者を招き、討論を行った。ゼロアワーコントラクトなど、日本の非正規雇用と同様の不安定雇用が他の先進国にも広がっている等、移行の不安定化をめぐる共通の傾向が浮かび上がった。本研究は、大規模な社会変動を背景に、若者の学校から仕事への移行過程の現状と課題を明らかにすべく、2007年4月1日現在満20歳の若者を全国から抽出し、それぞれの移行状況やそこでの意識、直面している問題などについて、質問紙法によるパネル調査として実施し、さらにそのうちの一部について面接調査を行うものである。質問紙調査については2011年度に最終調査(5回目)を実施し、予定を上回る回収率を得ている。具体的に本年行なったのは、以下の三点である。1.面接調査の実施:5回目までの継続回答者892名のうち、面接調査に応じることを諾とした者の中から、移行上困難を抱えると推測できるものを中心に各1時間ほどの面接調査を実施した。調査ケース数は49名であった。年度内に調査を完了するとともに、聴き取り結果をすべてマニュスクリプトした。2. 5年目調査結果の分析ならびに公表:2011年に実施した「若者の教育とキャリア形成に関する調査(第5回)」の集計ならびに分析を行ない、分析結果は2012年8月末に名古屋大学にて開催された日本教育学会第71回大会において発表した。また、調査結果の概要については、ニューズレター第5号を刊行して、調査対象者・報道関係者などに送付するとともに、HPに公開した。3.質問紙全調査データの分析と最終報告書の準備:対象者の学校から仕事等への移行の全容とその課程で直面した諸課題を明らかにすべく、5回分の質問紙調査データ分析を開始した。分析結果は最終報告書として2013年度中に刊行する予定である。またその一部について、2013年4月にイギリス・グラスゴー大学で行われるYouth Studies Conference2013においては票する予定である。パネル調査回収において、調査設計時の見積もりを大きく上回る率を質問紙調査最終年度まで一貫して達成することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。また2012年度実施の面接調査もほぼ目標通りに履行することができた。
ウイルス誘発糖尿病発症機構の解明

1型糖尿病はインスリン産生膵β細胞が何らかの原因で破壊されることにより、インスリン枯渇に陥る。インスリンの補充がなければ生命に関わり、社会生活に重度の支障をきたす疾患である。1型糖尿病、特にそのサブタイプである劇症1型糖尿病の発症にウイルスの関与が示唆されているが、発症機序は不明な点が多い。ウイルス性1型糖尿病モデルであるマウス脳心筋炎ウイルスD株(EMC-D)誘発糖尿病の感受性には、単一の遺伝子が関与していることが示唆されているが、EMC-Dウイルス感染により糖尿病を発症するDBA/2マウスの感受性遺伝子は未同定である。昨年に引き続き、DBA/2マウスのEMC-Dウイルス誘発糖尿病感受性遺伝子の同定に向けた解析を行なった。膵β細胞における抗ウイルス反応を詳細に解析するため、EMCV-D感染マウスからFlow cytometryを用いて膵β細胞を高純度に単離し、網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、DBA/2マウスの膵β細胞はB6マウスの膵β細胞に比較し、自然免疫関連の遺伝子発現が低いことが明らかになった。遺伝子ネットワーク解析を行なったところ、遺伝子Xが発現の低下していた自然免疫関連遺伝子を制御するハブ遺伝子であると推定された。未感染状態での遺伝子X発現には差が認められなかったが、EMCV-D感染時にはDBA/2マウスの膵β細胞のみでB6マウスよりも発現が低下していた。マウス膵β細胞株Beta-TC-6細胞を用いたsiRNAによる遺伝子X発現ノックダウン実験により、自然免疫関連遺伝子の発現低下を確認した。従って、DBA/2マウスは、膵β細胞特異的な遺伝子X発現上昇の乏しさにより、膵β細胞が破壊され、糖尿病を発症する可能性が示唆された。Flow cytometryで単離した膵β細胞の解析により、EMC-Dウイルスによる糖尿病発症防御に重要なのは膵β細胞のウイルス抵抗性であることを明らかにした。また、DBA/2マウスのEMC-Dウイルス誘発糖尿病の感受性遺伝子を推定することができた。本年度の検討により感受性遺伝子と推定された遺伝子Xに対して、発現低下のメカニズムを解析する。遺伝子X欠損マウスに対してEMC-Dウイルス感染実験を行うことで、発症防御に対する遺伝子Xの意義を検討する。これらの解析により、遺伝子XがDBA/2マウスにおけるEMC-Dウイルス誘発糖尿病の感受性遺伝子であるか検証を行う予定である。劇症1型糖尿病の約70%の症例に上気道炎などの感冒症状が先行することから、ウイルス感染が発症原因の1つであると示唆されているが、その詳細は不明である。急激な血糖上昇により、時には致死的であり、患者さんの社会生活に著しい支障をきたす疾患であるため、感受性遺伝子の特定、発症機序の解明は大きな社会貢献へと繋がると考えられる。ウイルス性劇症1型糖尿病モデルであるマウス脳心筋炎ウイルスD株(EMC-D)誘発糖尿病の感受性には、単一の遺伝子が関与していることが示唆されているが、EMC-Dウイルス感染により糖尿病を発症するDBA/2マウスの感受性遺伝子は未同定である。また、雄のみが糖尿病を発症し、雌は発症しない。そこで、DBA/2マウスにおけるEMC-Dウイルス誘発糖尿病の感受性遺伝子の同定、雌の抵抗性メカニズムの解明を目的とし研究を行った。本年度は、高力価のEMC-Dウイルスを感染させたDBA/2マウスの病態解析を行った。膵臓でのウイルス量は、感染後早期に、抵抗性系統C57BL/6J雄マウスよりもDBA/2雄マウスで有意に高値であったが、その後のウイルスの排除は両者同等であった。免疫染色の結果、EMC-Dウイルス感染3日目のDBA/2雄マウスの膵島組織では、CD45陽性細胞の浸潤以前にインスリン陽性細胞が減少していた。また、1型IFN濃度依存ウイルス抵抗性が、DBA/2雄マウスの膵β細胞ではC57BL/6J雄マウスの膵β細胞よりも有意に低い知見を得た。従って、EMC-Dウイルス感染早期における膵β細胞のウイルス抵抗性が、糖尿病の発症防御に重要であることが示唆された。これまでに、雌マウスが糖尿病を発症する系の報告は無いが、自然免疫に関わる遺伝子欠損DBA/2雌マウスは、EMC-Dウイルス感染により糖尿病が誘発されることを発見した。DBA/2マウスのEMC-Dウイルス誘発糖尿病感受性遺伝子探索においては、当初の計画通り進んでいる。しかし、EMC-Dウイルス誘発糖尿病における感受性の雌雄差の検討については、自然免疫に関与する遺伝子欠損DBA/2雌マウスがEMC-Dウイルス感染により糖尿病を発症することを発見し、再現性があることを確認したが、それ以上の検討は行えていないため、この評価とした。

昨年に引き続き、DBA/2マウスのEMC-Dウイルス誘発糖尿病感受性遺伝子の同定に向けた解析を行なった。膵β細胞における抗ウイルス反応を詳細に解析するため、EMCV-D感染マウスからFlow cytometryを用いて膵β細胞を高純度に単離し、網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、DBA/2マウスの膵β細胞はB6マウスの膵β細胞に比較し、自然免疫関連の遺伝子発現が低いことが明らかになった。遺伝子ネットワーク解析を行なったところ、遺伝子Xが発現の低下していた自然免疫関連遺伝子を制御するハブ遺伝子であると推定された。未感染状態での遺伝子X発現には差が認められなかったが、EMCV-D感染時にはDBA/2マウスの膵β細胞のみでB6マウスよりも発現が低下していた。マウス膵β細胞株Beta-TC-6細胞を用いたsiRNAによる遺伝子X発現ノックダウン実験により、自然免疫関連遺伝子の発現低下を確認した。従って、DBA/2マウスは、膵β細胞特異的な遺伝子X発現上昇の乏しさにより、膵β細胞が破壊され、糖尿病を発症する可能性が示唆された。Flow cytometryで単離した膵β細胞の解析により、EMC-Dウイルスによる糖尿病発症防御に重要なのは膵β細胞のウイルス抵抗性であることを明らかにした。また、DBA/2マウスのEMC-Dウイルス誘発糖尿病の感受性遺伝子を推定することができた。本年度の研究結果により、膵β細胞のウイルス抵抗性がEMC-Dウイルス誘発糖尿病の発症防御に重要であることが示唆されたため、膵β細胞での抗ウイルス作用の詳細な解析を行う。膵β細胞を2つの色素で染色することにより、フローサイトメトリーで膵β細胞のみを高純度に単離することに成功した。この実験系を用いて、EMC-Dウイルス感染マウスから膵β細胞のみを高純度に単離し、網羅的な遺伝子発現解析を行う。得られた遺伝子発現データとSNP情報により、DBA/2マウスの感受性遺伝子候補を絞り込む予定である。また、雌マウスの膵β細胞においても詳細な解析を行う。本年度の検討により感受性遺伝子と推定された遺伝子Xに対して、発現低下のメカニズムを解析する。遺伝子X欠損マウスに対してEMC-Dウイルス感染実験を行うことで、発症防御に対する遺伝子Xの意義を検討する。これらの解析により、遺伝子XがDBA/2マウスにおけるEMC-Dウイルス誘発糖尿病の感受性遺伝子であるか検証を行う予定である。
マイタケ中の血栓溶解酵素の生体内における効果について

マイタケ中に存在する血栓溶解酵素が経口摂取により、生体へ取り込まれ有効な効果をもたらすのかどうかについて検討を行うことを目的として実験を進めてきた。精製法について検討した結果、強陽イオン交換担体であるSource担体Sを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーをpH6.0で行なうことにより、より効率よく精製できることが判明した。この方法によりマウス投与に用いる本酵素の精製を進めるとともに、ポリクロナール抗体作製用のサンプルを調製した.ラビットにてポリクロナール抗体を作製し、本抗体について、ウエスタンブロット、免疫染色に用いることができることを確認した。また、イオン交換カラムクロマトグラフィー後の精製物を用い、本酵素のアミノ酸シークエンスを行ったところ,電気泳動にて2本のバンドがみられていたが、いずれも同じシークエンスであることが確認され、糖鎖などの変化によるものであると考えられた。また本酵素はJ.Biol.Chem.,272(48),30032-30039(1997)に報告されているメタロエンドペプチターゼと同一の酵素であることが明らかとなった。生体への効果をみるために、飲料水に本酵素を加え摂取させるという方法を以前から試してきたが、摂取量を正確に把握できないことから、ゾンデによる経口投与法に変え摂取させる実験を行った。6週令マウス♂C57BL/6CrSlc(n=7)に毎日200μg投与した。このマウスについて5日目に頚椎脱臼によりサクリファイ後、心臓採血し血漿についてザイモグラフィーを行ったところ体内でのマイタケの本酵素の明らかな痕跡は認められなかった。さらに投与する量や投与期間などを検討し実験を継続する予定である。我々は、平成9年11年に科学研究費補助金の交付をうけ、フィブリノーゲンザイモグラフィー法を主体として各種食物中の血栓溶解酵素を検索した結果、キノコ中に極めて強い血栓溶解酵素が存在することを明らかにした。今年度は、なかでも活性の極めて高いマイタケの生体内での挙動について検討するため、本酵素の精製を試みると共に、加熱や消化酵素に対する活性の変化について検討をおこなった。本酵素は、抽出段階でpH2.7から8の幅広いpHのバッファー中で長期間保存しても高い活性を保っていた。またトリプシンによる消化実験を行ったところ、トリプシン濃度1mg/mlで90分処理後も活性が残存していた。以上の結果などから、粗抽出液の経口摂取により体内への本酵素の移動が可能なのではないかと考えられたことから、マウスを用いた経口投与予備実験を行った。マウス(C57BL/6CrSlc、12週齢)に、本抽出液を30%混合した水を1ヶ月間自由摂取させた。飼育終了後、心臓より採血し血清中の本酵素活性をフィブリノーゲンザイモグラフィーにより検索したが、明らかな活性は検出できなかった。今回は給水により投与したことから、正確な摂取量が把握できなかったので、今後本酵素の精製を行い、投与濃度や投与方法を変えて実験を行なっていく予定である。一方、粥状動脈硬化において血栓が合併しやすく、その原因としてコレステロールが重要な役割をはたすことが知られている。特に、粥状動脈硬化の進展において、マクロファージの泡沫化が関与すること、またこの原因としてスカベンジャーレセプターにより取り込まれる酸化LDLが関与していることなどが明らかにされている。そこで、本酵素と動脈効果との関連性について、スカベンジャーレセプターの発現から検討を試みた。ヒトマクロファージ様細胞THP-1にマイタケ抽出液を加えた培養液で24時間incubateしたが、酸化LDL受容体であるSR-PSOXの発現上昇はみとめられなかった。引き続き精製物でスカベンジャーレセプターとの関連性についても検討をおこなっていく方針である。

平成9年11年に科学研究費補助金の交付をうけ、キノコ中に血栓溶解酵素が存在することを明らかにした。食品として、さまざまな生理活性を有するものが数多く報告されているが、経口摂取され、生体内で有効に働く可能性があるのかどうかについて明らかにされているものは少ない。そこで、本研究は、このキノコに存在する血栓溶解酵素の中で極めて活性の高いマイタケを用い、血栓溶解酵素としての活性を維持しながら生体内に取り込まれていくのかどうかなど、本酵素の生体内での挙動について明らかにすることを目的としている。昨年度、未精製の本酵素抽出液を用い、給水投与によるマウスへの経口投与実験をおこなったが、投与濃度および量の問題もあり明らかな結果が得られなかった。このことから、本年度は本酵素の精製を進め、比活性を高めたもので投与濃度や投与方法の検討をおこなうことを計画した。本酵素の精製や加熱や消化酵素に対する活性の変化についての検討にあたっては、従来用いてきたフィブリノーゲンザイモグラフィー法を主体として進めた。活性物質は硫安3060%沈殿画分に多く存在し、またこの画分の活性は60°C90分間加熱しても減少しなかった。さらにこの画分についてイオン交換カラムクロマトグラフィーをおこなった。条件検討の結果、強陰イオン交換体のMono QによりpH5.8で分離精製が可能であることがわかった。この液体クロマトグラフィーにより、60K付近に強い活性を有する2本のバンドに精製することができた。現在、このカラムクロマトによりマウス投与サンプルの調整を進めるとともに、精製物によりシークエンスを行っているところである。最終年度である本年は、マイタケ中に存在する血栓溶解酵素が経口摂取により、生体へ取り込まれ有効な効果をもたらすのかどうかについて検討を行うことを目的として、実験を進めてきた。精製法について、さらに検討した結果、昨年度進めてきた精製法すなわち、硫安分画後、強陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いpH5.8で分画するよりも、強陽イオン交換担体であるSource担体Sを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーをpH6.0で行ったほうが、より効率よく精製できることが判明した。この方法によりマウス投与に用いる本酵素の精製を進めるとともに、ポリクロナール抗体作成用のサンプルを調整した.ラビットにてポリクロナール抗体を作製し、本抗体について、ウエスタンブロット、免疫染色に用いることができることを確認した。また、イオン交換カラムクロマトグラフィー後の精製物を用い、本酵素のアミノ酸シークエンスを行ったところ,電気泳動にて2本のバンドがみられていたが、いずれも同じシークエンスであることが確認され、糖鎖などの変化によるものであると考えられた。また本酵素はJ.Biol.Chem.,272(48),30032-30039(1997)に報告されているメタロエンドペプチターゼと同一の酵素であることが明らかとなった。生体への効果をみるために、飲料水に本酵素を加え摂取させるという方法を以前から試してきたが、摂取量を正確に把握できないことから、ゾンデによる経口投与法に変え摂取させる実験を行った。6週令マウス♂C57BL/6CrSlc(n=7)に毎日200μg投与したところ4日目から死亡するマウスが見られ始めた。