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非双曲力学系の非自明遊走領域の存在に基づく研究の新しい枠組みの構築

Colli-Vargasの非自明遊走領域に関する予想[Ergod. Th. Dynam. Sys. 21 (2001) 1657--1681]が正しいことを証明し,さらにその非自明遊走領域がヒスリック軌道を持つことを明らかにした.これはTakensの公開問題[Nonlinearity 21 (2008) T33--T36.]の肯定的な解であり,非双曲力学系の新しい発見でもある.またこれ結果はvan Strienのエノン写像系の非自明遊走領域に関する公開問題の1つ[Discrete Contin. Dyn. Syst. 27(2010) 557-588]の近似解も与えている.Smaleが提唱した力学系研究の枠組みは,与えられた力学系の不変集合での振舞いを幾何学的側面や測度論的側面から双曲性・非双曲性というキーワードを使い明らかにしていくものである.これに対し不変集合の補集合での振舞いは「自明な」ものしかないと仮定しあまり研究されてこなかった.これは自明な振舞いをもつ例しか知られていなかったことに起因する.本研究の主目的は,微分同相写像による力学系が非双曲的であるとき,不変集合の補集合に「非自明な」振舞いをもつ(具体的には非自明な遊走集合をもつ)ような微分同相写像で近似されることを証明することによってSmaleが提唱した力学系研究の枠組みを根本的に拡げることにある.Smaleの馬蹄系に代表される双曲的力学系においては不変集合以外では自明な遊走集合しかないと仮定するのは自然かもしれないが,非双曲的力学系においてそれを仮定してよいという数学的根拠はない.それどころかColli-Vargas [Ergod.Th.&Dyn.Sys. 21 (2001)]は,この例が非自明な遊走領域をもつことを証明した.このColli-Vargasの限定された対象にたいする結果をより一般的な非双曲力学系に拡張することがこの本研究の研究の核となる.具体的に証明する予定の定理は次の通りである:【定理】ホモクリニック接触を持つような任意の2次元非双曲的微分同相写像は非自明遊走領域をもつような微分同相写像でC2近似できる.現在,証明が出来上がり論文作成中である.前年度得た「Colli-Vargasの予想」の証明に加え,そこで使った議論を拡張することによって「Floris Takensの最終公開問題」に対する解を得るに至った.またこれらの系(corollary)として作成して「van StrienのHenon写像の遊走領域に関する公開問題」の解も得た.van Strien教授等のアドバイスを得て論文を修正した後,これらを全てまとめた論文をCornell Universityのプレプリントサーバに公開した.そのURLはhttp://arxiv.org/abs/1503.06258である.さらに某ジャーナルに投稿した.本研究はColli-Vargasの予想「Newhouse領域のおける非自明な遊走集合を持つ微分同相写像の稠密性」の解決が主な目的であった.我々はこの予想の肯定的な証明を与えることに成功した.具体的に「Newhouse領域の稠密部分領域に属する任意の微分同相写像は非自明な遊走集合を持つ」というのが結果である.この成果のみならず,その補題としてvanStrienの公開問題「Henon写像族は非自明遊走集合を持つか?」に対して「Henon写像族は非自明遊走集合を持つHenon-like写像族でC^r近似できる」と肯定的な解答を与えることに成功した.さらにTakensの最終公開問題「測度正の初期値の集合でその軌道がHistoric behaviorとなるようなロバストな力学系は存在するか?」に対して,その部分解も得ることができた.具体的には「初期値の開集合(すなわち測度は正)でその軌道がHistoric behaviorとなるような力学系の稠密集合が存在する」ことを証明した.以上の結果を2つの論文にまとめarXivで公開した(参照https://arxiv.org/abs/1503.06258とhttps://arxiv.org/abs/1511.05257).また今年度は完成した証明を様々な研究集会で発表し,多くの研究者と意見を交換した.具体的にはブラジルのサンパウロ大学にてColli-Vargasの予想の張本人であるVargas教授とColli教授と議論し,その成果を認めてもらった.また台湾大学で国際研究集会で報告も行った.本来の目的(Colli-Vargasの予想の解決)は果たせたのみならず,その結果を利用してvanStrienの公開問題とTakensの最終公開問題に対して解答を与えることができた.当初計画していた本科研費の研究課題を完璧に遂行することに成功した.実際,数篇の研究論文を国際的に評価の高いジャーナルから出版することに成功した.具体的には次の通りである:(1)3次元におけるGeometric Lorenzflowがrobust historic behaviourを持つ軌道を豊富に持つことを証明した.さらに,2次元の微分同相写像のホモクリニック分岐について(2)Takensの最終問題の解を与え,Colli-Vargasの予想を肯定的に証明した.さらにHenon mapに関する(3)van Strienの公開問題の近似解を得た.先行研究において,historic behaviourを持たない(すなわちSRB測度が存在する)場合は測度論的に多くあることがわかっていた.これは力学系の問題の本質がエルゴード論的問題であるという考えを支える結果である.

我々はこれとは違った立場をとり,実際にはhistoric behaviourを持つ場合も位相的には多くあることを示した.つまり, historic behaviourの存在を通しエルゴード論に還元できない未知の力学系的現象が多くあることを示し,力学系研究の枠組みを広げる成果となった.本研究成果について招待講演をブラジル・ポルトガル・台湾・東大などで行った.Colli-Vargasの非自明遊走領域に関する予想[Ergod. Th. Dynam. Sys. 21 (2001) 1657--1681]が正しいことを証明し,さらにその非自明遊走領域がヒスリック軌道を持つことを明らかにした.これはTakensの公開問題[Nonlinearity 21 (2008) T33--T36.]の肯定的な解であり,非双曲力学系の新しい発見でもある.またこれ結果はvan Strienのエノン写像系の非自明遊走領域に関する公開問題の1つ[Discrete Contin. Dyn. Syst. 27(2010) 557-588]の近似解も与えている.初年度に行った「Colli-Vargasの予想」の証明で使った方法を拡張することに成功し,それがもっと有名な「Floris Takensの最終公開問題」の解を得ることに結びついたから,当初計画していたより進展した.また,Imperial College LondonのS. van Strien教授の非常に友好的で的確な忠告を得たことも大きい.すでに本研究について論文を2本執筆し(参照https://arxiv.org/abs/1503.06258とhttps://arxiv.org/abs/1511.05257)それらを国際的に有名なジャーナルに投稿した.今後はその審査結果を待ち,その結果に合わせて活動したいと考えている.力学系研究結果を以下の研究集会で発表し,その価値を世界に問いたい:また本研究の中核部分である「Colli-Vargasの予想」を提示したブラジルのサンパウロ大学のE. Vargas氏の招待を受けているので,渡航して研究内容を説明する予定である.初年度は証明を完成させることであり,実際証明することができた.具体的には,【定理】ホモクリニック接触を持つような任意の2次元非双曲的微分同相写像は非自明遊走領域をもつような微分同相写像でC2近似できる.に証明をつけることに成功したと信じている.現在,研究分担者とその結果をまとめた論文を推敲中である.しかしながら証明の内容は非常に複雑で,査読者に納得してもらうにはなおいっそうの推敲が必要だと思っている.また,この分野のパイオニアであるブラジルのVargas氏と連絡を取り合い,我々の研究成果を理解してもらう予定でいるが,まだ連絡をつけられない状況である.購入を予定していたノートパソコンが前年度末期に新製品に替わるとニュースがあり,購入を見合わせた.
カルボキシルエステラーゼの基質特異性を考慮した臓器選択的プロドラッグの分子設計

本研究では、エステル型及びアミド型プロドラッグの代謝活性化に重要な役割を果たしているヒトカルボキシルエステラーゼ(hCES)の基質特異性を解明した後、これらの情報と酵素の臓器分布を利用し、特定の臓器で代謝活性化されるプロドラッグモデルの設計及び合成を行うことを目的とした。前年度までに得られたhCES1とhCES2の基質特異性に関する情報を利用し、今年度は肝臓または小腸で選択的に代謝活性化されるインドメタシンプロドラッグの合成を試みたところ、エステル近傍のアルコキシ基側の大きさ及び電子密度を調節することでヒト肝臓ミクロソーム中で選択的に代謝活性化されるプロドラッグモデルを合成することができた。次に、エステル近傍のアシル基側の大きさや電子密度を変更したハロペリドールプロドラッグモデルを合成し、代謝活性化能の評価を行った。その結果、アシル基の隣接部位(2位)の立体障害を調節することにより代謝活性化速度を制御できることが判明した。また、ハロペリドールのアルコール部位にプロドラッグ修飾基を導入すると、hCES2によって代謝活性化されやすく、ケトン部位にプロドラッグ修飾基を導入すると、hCES1によって代謝活性化されやすいことがわかった。したがって、同じ化合物であってもプロドラッグ修飾基を導入する部位によって代謝活性化酵素を変えることが可能であることを見出した。本研究結果を応用し、アルコールエステル型及びエノールエステル型の2種の作用持続型ハロペリドールプロドラッグの合成に成功した。本研究では,医薬品の代謝やプロドラッグの代謝活性化に重要な役割を果たしているカルボキシルエステラーゼ1 (CES1)およびCES2の基質特異性を詳細に調査した後,その結果と本酵素の臓器分布を考慮し,特定の臓器で選択的に代謝活性化するプロドラッグ修飾鎖を設計および合成することを目的とした.当該年度は,アトルバスタチンとインドメタシンの2種を親化合物として,立体的および電子的性質の異なる修飾鎖を導入したプロドラッグモデルを合成し,ヒト肝ミクロソーム,ヒト小腸ミクロソーム,hCES1,hCES2溶液中における加水分解速度をそれぞれ測定した.その結果,hCES1溶液中ではアルコキシ基の隣接部位(1位)に置換基が存在すると加水分解速度が大きく低下したが,置換基の位置が離れるとともに加水分解速度の低下は抑えられ,4位に置換基が存在しても無置換のものとほとんど加水分解速度に差がないことが判明した.エステルの隣接部位の立体障害を調節することで代謝活性化速度も調節できる可能性を見出した.また,不斉中心を有するエステルはエナンチオマー間で代謝速度が大きく異なることがわかった.次に,hCES2溶液中ではアルコキシ基の電子密度の低下によって加水分解速度の大幅な上昇が認められた.なお,hCES1に比べ,hCES2は置換基による立体障害の影響を受けにくいことがわかった.また,これらの結果は親化合物の構造に依存せず,アトルバスタチンとインドメタシンの両者において同様の結果が得られた.今後は,更に詳細な調査および得られた知見をもとにヒト肝臓または肺で選択的に代謝活性化されるプロドラッグ修飾鎖の設計および合成を行う.アトルバスタチンプロドラッグについては十分に検討されているものの,インドメタシンについては代謝物の分析条件の検討に時間がかかり,加水分解活性の評価がやや遅れている.化合物の合成方法や分析方法などの条件検討は当該年度でほぼ終了したので,次年度以降で成果が期待できる.本研究では、エステル型及びアミド型プロドラッグの代謝活性化に重要な役割を果たしているヒトカルボキシルエステラーゼ(hCES)の基質特異性を解明した後、これらの情報と酵素の臓器分布を利用し、特定の臓器で代謝活性化されるプロドラッグモデルの設計及び合成を行うことを目的とした。hCES1およびhCES2に関する詳細な調査は今まで通り継続する.得られた結果をもとに,それぞれのアイソザイムによって選択的に加水分解されるプロドラッグ修飾鎖を設計および合成し,順次評価を行う予定である.
Ｇｅｍｉｎｉｎタンパク質制御を介した造血幹細胞の活性制御機構の解析

DNA複製制御因子でありクロマチンリモデリング制御因子でもあるGemininは、造血幹細胞の活性を支持するポリコーム複合体1やHoxタンパク質(Hoxb4/Hoxa9)によりタンパク質発現の制御を受けている。本研究では、レトロウイルスベクターを用いたGeminin発現制御系と造血幹細胞におけるGemininの発現動態を可視化することのできるGeminin-EYFPノックインマウスを作製し、造血幹細胞制御におけるGemininの分子生物学的役割を明らかにした。本研究では、レトロウイルスベクターを用いたGemininの過剰発現系やGemininの恒久的なshRNAノックダウンシステム系を確立した。これらの実験系を用いてGemininの発現量を低下させることにより造血前駆細胞や造血幹細胞の活性を増幅させることに成功した。また、Hoxa9が、従来知られてきた転写制御因子としての機能だけではなく、Roc1-Cul4a-Ddb1コアE3ユビキチンリガーゼ複合体と結合し、DNA複製ライセンス化制御因子であり幹細胞の未分化性維持因子でもあるGemininに対するE3ユビキチンリガーゼを構成し、Gemininタンパク質を分解に導くことを生化学的に証明し、Hoxa9の過剰発現による造血幹細胞や造血前駆細胞の活性化においてHoxa9によるGemininのユビキチン化を介したタンパク質発現減少が、重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらに、もう一つのGemininに対するE3ユビキチンリガーゼであるポリコーム複合体1のサブストイキオメトリック構成要素であり、ポリコーム複合体1に対してGeminin結合部位を提供するScmh1を含むポリコーム複合体1が、Hoxa9/Hoxb4遺伝子の転写をヒストンH2A第119番リジン残基のモノユビキチン化を介して抑制することで直接的・間接的にGemininのタンパク質レベルを維持し造血ホメオスタシスを保っていることを明らかにした。そして併行して、造血幹細胞におけるGemininの発現動態を可視化するためにGeminin-EYFP(黄色蛍光タンパク質)ノックインマウスを作製し、次年度の解析に使用できるようにホモ接合体マウスの繁殖体制を整え、血液学的解析を行うための予備実験を完了した。平成25年の助成金を受け、Geminin-EYFP融合タンパク質を発現するノックインマウスのホモ接合体を作成し、Gemininタンパク質発現を蛍光タンパク質にて可視化することに成功し、EYFPの輝度がGemininの発現量とよく相関していることを確認した。Geminin-EYFPノックインマウスホモ接合体は、正常の寿命を持ち、ホモ接合体同士での交配が可能であり、発生学上の異常を認めなかった。そして、このノックインマウスの骨髄細胞を用いた様々な血液学的解析方法を確立した。特に、造血幹細胞分画であるCD34-KSL (c-Kit+Sca1+Lin-)細胞の中にGeminin-high細胞群を見つけ、それを、FACSAriaIIセルソーターを用いて分画し、致死的放射線照射を施したマウスに移植すると長期骨髄再構築能を示す細胞が存在することを明らかにし、このノックインマウスを使うことで自己複製中の造血幹細胞を同定することができるということを示した。これらの自己複製中の造血幹細胞は、5-FUの投与により、その存在比率が著明に増加することも明らかにした。また、Hoxb4やHoxa9遺伝子を、各種赤色蛍光(RFP; DsRed Express2、tandem Tomato (tdTomato)、humanized Kusabira Orange (hKO)など)をマーカーに持ったレトロウイルスベクターにつなぎ、従来使用していたGFPマーカーと異なりノックインマウスのEYFPと容易に区別が可能なRFPをマーカーとして持った造血幹細胞を移植することを可能にし、造血幹細胞におけるHoxb4やHoxa9の発現とGemininの発現動態との相関を解析する実験系を作製した。申請者は、Accell siRNA導入システム(Thermo)を用いて、マウス骨髄細胞においてGemininの一過性ノックダウンを行なうと、コロニー形成能すなわち造血前駆細胞の増殖活性が著しく上昇することを見出した。しかも、このコロニー形成能の上昇は、3回まき直しても維持された(PNAS 2010)。そこで申請者は、レトロウイルスベクターを用いたshRNA導入による恒久的Gemininノックダウンシステムにより、造血幹細胞や造血前駆細胞のGemininの発現を低下させることで造血幹細胞や造血前駆細胞の活性の上昇を導こうと考えた。上記のGemininノックダウンに成功した4種類のsiRNAの配列を参考にオリゴヌクレオチドをデザインし、これらをshRNA導入用のレトロウイルスベクター(pSIREN-RetroQ-ZsGreen, Clontech)に挿入した。このベクターを、レトロウイルスパッケージング細胞であるPlatEにリン酸カルシウム法にて遺伝子導入し、培養上清中のレトロウイルス粒子を回収し遠心濃縮の上、以下の実験に使用した。

野生型骨髄細胞に上記Geminin-shRNA導入用レトロウイルスを感染させて、FACSAriaIIによるソーティングにより感染細胞を集め、これをメチルセルロース培地でのコロニー形成能を調べるアッセイに供した。コロニー形成能が上昇する配列をもつshRNAを導入するレトロウイルスベクターに着目して、LTC-IC (long-term culture-initiating cell)コロニー形成能や競合的骨髄再構築能を調べたところ、Gemininノックダウンにより造血前駆細胞のみならず造血幹細胞活性も上昇することが明らかになった。レトロウイルスベクターを用いたshRNA導入によるGemininの恒久的なノックダウンシステムを確立し、Gemininの発現量を低下させることにより造血前駆細胞や造血幹細胞の活性を増幅させることに成功した。また、造血幹細胞におけるGemininの発現動態を可視化することのできるGeminin-EYFP(黄色蛍光タンパク質)ノックインマウスの作製に成功し、次年度の解析を行う準備を整えることができた。また、Geminin発現のタイムリーな制御を可能にするために、レトロウイルスベクターを用いたGeminin-MER(modified estrogen receptor)発現システムを作成し、Gemininの細胞内局在を変化させることに成功した。しかし、その細胞内局在の変化を反映した細胞活性の変化は未だ検出できておらず課題を残した。造血幹細胞におけるGemininの発現動態を可視化するために作製したGeminin-EYFP(黄色蛍光タンパク質)ノックインマウス由来の造血幹細胞に対して、前年度までに確立したGeminin発現制御系を応用することにより、造血幹細胞の自己複製制御におけるGemininの役割を解明する。具体的には、セルソーターを用いて、ノックインマウスの骨髄細胞を免疫学的表現系から、造血幹細胞、多分化能性造血前駆細胞そして造血前駆細胞に分画し、それぞれの分画におけるGeminin-EYFPの発現強度を調べる。次に、造血幹細胞、多分化能性造血前駆細胞のそれぞれについてGeminin-EYFPの発現強度により亜分画に分けシングルセルソーティングを行ない、それぞれの細胞における造血活性(コロニー形成能、LTC-IC活性、競合的長期骨髄再構築能)やそのコロニー細胞やドナー由来の再構築細胞の性状を免疫細胞染色やフローサイトメトリーで調べ、Gemininの発現と造血幹細胞活性、特に自己複製能との相関を明らかにする。さらにGemininの発現を操作することにより自己複製能を含めた造血幹細胞の活性をex vivoで増幅させるストラテジーを模索する。前年度に作成したレトロウイルスベクターを用いたGeminin-MER(modified estrogen receptor)発現システムにより変化した細胞内局在を反映した細胞活性の変化を検出する実験系の確立を行う。
炎症性腸疾患関連癌の発癌関連性因子と生物学的特性解明のための基礎的検討

平成29年度は、通常型大腸癌手術症例の切除標本よりサンプルを採取し、自然リンパ球(ILC)の解析を行った。切除標本の正常粘膜部・癌部より腸管粘膜および癌組織を採取し、酵素処理を行って細胞を単離し、腸管粘膜固有層単核球(LPMCs)および癌浸潤単核球を採取した。これらをFACSにて解析し、Lineage(CD3, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD20)-CD45+のT細胞・B細胞とは異なるリンパ球集団が存在することを確認した。さらに、この集団をCD56、CD127、CD117、CRTH2、NKp44といった表面抗原マーカーを用いて解析し、ヒト正常腸管粘膜および癌間質には様々な分画のILCが存在することが確認できた。正常大腸粘膜のILC分画の分布は、ヒト末梢血や腸間膜リンパ節、脾臓におけるILC分画の分布と全く異なっており、中でもCD127+CD117+NKp44+ ILCsが特異的に多く存在することがわかった。サイトカイン産生をRT-PCRを用いて評価したところ、同分画では高いIL-22のmRNA発現を認めた。平成30年度は、大腸正常粘膜部および癌部に存在するILC分画の比較を行った。癌部では、正常大腸粘膜と比較し、CD127-CD56+ ILCsおよびCD127+CD117+NKp44+ ILCsの割合が大きく減少し、CD127+CD117- ILCsの割合が増加していた。また、潰瘍性大腸炎(UC)の炎症部では、非炎症部と比較し、CD127+CD117+NKp44+ ILCsの割合が減少し、CD127+CD117-ILCsの割合が増加する同様の変化が認められた。現在、大腸正常粘膜部、癌部、UC炎症部粘膜・非炎症部粘膜より各分画を単離しFACSを用いて採取し、RNAを抽出して、RNAシークエンスによる遺伝子解析を行っている。炎症性腸疾患(IBD)関連癌の中でも、UC関連大腸癌に着目し解析を進めているが、頻度が少なく、十分なペースで標本を採取できていないため、解析がやや遅れている。通常型大腸癌症例を用いた正常大腸粘膜および癌部、IBD症例に関しては、症例数が蓄積されてきており、分画やサイトカイン産生の変化が明らかとなってきている。手術切除標本よりリンパ球を分離・採取し、FACSを用いて解析することで、ヒト正常大腸粘膜および癌間質、IBD腸管に存在するILC分画を確認できた。正常大腸粘膜には、特異的なILC分画が存在し、各分画間におけるサイトカイン産生の変化も確認できた。また、通常型大腸癌症例における正常大腸粘膜と大腸癌間質では、ILC分画の分布が大きく異なっていた。今後は、蓄積した症例におけるILC分画と臨床病理学的因子の関連を検討する予定である。IL-22 pathwayに関しては、通常型大腸癌においては、IL22を高発現するCD127+CD117+NKp44+ ILCsが癌部で減少していることがわかった。今後、腫瘍深達度によるIL22産生能の変化を、FACSを用いた細胞内染色や、RT-PCRで評価する予定である。また、IBD関連癌症例に関しても、非癌部・癌部におけるILC分画やサイトカイン産生能を、通常型大腸癌の非癌部・癌部と比較し、評価していく。遺伝子発現に関しては、現在、通常型大腸癌症例の大腸粘膜部・癌部およびUC炎症・非炎症粘膜からILC分画を採取し、RNAシークエンスによる解析中である。症例を蓄積して、UC関連大腸癌の癌部に存在するILC分画についても解析の追加を検討中である。平成28年度は、手術症例の切除検体よりサンプルを採取し、自然リンパ球(ILC)を中心とした腸管免疫細胞の解析を行った。通常型大腸癌症例の正常粘膜部・癌部より腸管粘膜および癌組織を採取し、Collagenase、Dispase、DNaseを用いて酵素処理を行い細胞を単離した後、Percoll密度勾配遠心分離を用いて腸管粘膜固有層単核球(LPMCs)および癌浸潤単核球を分離・採取した。これらをFACSで解析し、Lineage(CD3, CD14, CD16, CD19, CD20)-CD45+のT細胞・B細胞でないリンパ球集団を展開した後、この中からILCのマーカーであるCD127陽性集団を確認した。ILCsはNKp44、HLA-DR、CCR6といった表面抗原マーカーを用いてさらに細かい分画に展開できた。NKp44+ILCsおよびNKp44-ILCsのサイトカイン産生をRT-PCRを用いて評価したところ、NKp44+ILCsで高いIL-22のmRNA発現を認めた。正常型大腸癌においては、正常粘膜部(n=10)と癌部(n=10)を比較すると、全リンパ球中のILCsの割合に差は認めなかったが(0.64% vs 0.38%, p=0.209)、細胞数は癌部で有意に多かった(3423 cells/g vs 13885cells/g, p<0.01)。一方、癌部においては正常部と比較しILCの分画の変化が見られ、NKp44+ILCsの割合が減少していた(39.9% vs 18.4%, p=0.011)。

クローン病症例の切除検体の炎症部粘膜からも同様の手法でLPMCsを回収し解析した結果、非炎症性腸疾患(IBD)症例の正常粘膜部と比較し、リンパ球におけるILCsの割合に差は見られなかったが、ILCsにおけるNKp44+ILCsおよびHLA-DR+ILCsが減少傾向にあった。平成28年度は、手術症例の切除検体よりサンプルを採取し、自然リンパ球(ILC)を中心とした腸管免疫細胞の解析を行った。通常型大腸癌症例の正常粘膜部・癌部より腸管粘膜および癌組織を採取し、Collagenase、Dispase、DNaseを用いて酵素処理を行い細胞を単離した後、Percoll密度勾配遠心分離を用いて腸管粘膜固有層単核球(LPMCs)および癌浸潤単核球を分離・採取した。これらをFACSで解析し、Lineage(CD3, CD14, CD16, CD19, CD20)-CD45+のT細胞・B細胞でないリンパ球集団を展開した後、この中からILCのマーカーであるCD127陽性集団を確認した。ILCsはNKp44、HLA-DR、CCR6といった表面抗原マーカーを用いてさらに細かい分画に展開できた。NKp44+ILCsおよびNKp44-ILCsのサイトカイン産生をRT-PCRを用いて評価したところ、NKp44+ILCsで高いIL-22のmRNA発現を認めた。正常型大腸癌においては、正常粘膜部(n=10)と癌部(n=10)を比較すると、全リンパ球中のILCsの割合に差は認めなかったが(0.64% vs 0.38%, p=0.209)、細胞数は癌部で有意に多かった(3423 cells/g vs 13885cells/g, p<0.01)。一方、癌部においては正常部と比較しILCの分画の変化が見られ、NKp44+ILCsの割合が減少していた(39.9% vs 18.4%, p=0.011)。平成29年度は、通常型大腸癌手術症例の切除標本よりサンプルを採取し、自然リンパ球(ILC)の解析を行った。切除標本の正常粘膜部・癌部より腸管粘膜および癌組織を採取し、酵素処理を行って細胞を単離し、腸管粘膜固有層単核球(LPMCs)および癌浸潤単核球を採取した。これらをFACSにて解析し、Lineage(CD3, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD20)-CD45+のT細胞・B細胞とは異なるリンパ球集団が存在することを確認した。さらに、この集団をCD56、CD127、CD117、CRTH2、NKp44といった表面抗原マーカーを用いて解析し、ヒト正常腸管粘膜および癌間質には様々な分画のILCが存在することが確認できた。正常大腸粘膜のILC分画の分布は、ヒト末梢血や腸間膜リンパ節、脾臓におけるILC分画の分布と全く異なっており、中でもCD127+CD117+NKp44+ ILCsが特異的に多く存在することがわかった。サイトカイン産生をRT-PCRを用いて評価したところ、同分画では高いIL-22のmRNA発現を認めた。平成30年度は、大腸正常粘膜部および癌部に存在するILC分画の比較を行った。癌部では、正常大腸粘膜と比較し、CD127-CD56+ ILCsおよびCD127+CD117+NKp44+ ILCsの割合が大きく減少し、CD127+CD117- ILCsの割合が増加していた。
乳幼児突然死症候群(SIDS)におけるうつぶせ寝が覚醒反応の発現に及ぼす影響

乳幼児突然死症候群(Sudden Infant Death Syndrome : SIDS)の病因はいまだ解明されていないが、近年、うつぶせ寝による覚醒反応低下との関連が示唆されている。睡眠中のpacifierの使用により覚醒反応の閾値が低下することが知られているが、この際に交感神経系の賦活化を伴っているかどうかの検討はなされていない。pacifierの使用による交感神経系の賦活化の有無、さらにうつぶせ寝がpacifier使用時の交感神経系の賦活化に及ぼす影響を明らかにすることによりSIDSの予防対策をたてる上で重要な情報が得られるものと思われる。今回の研究ではあおむけ寝にて睡眠中の新生児において安静覚醒時およびNon-nutritive sucking(NNS)負荷時のsucking圧、心電図、胸郭呼吸波形をポリグラフモニターを用いて測定し、心拍変動のスペクトル解析を行い、suckingが自律神経賦活化に及ぼす影響について検討し、さらにあおむけ寝とうつぶせ寝でのNNSmmS負荷時のデータを比較することで睡眠時体位による影響を検討した。心拍変動のスペクトル解析はTime Series Analysls System(NCU版)によるComplex demodulation解析を用いた。安静覚醒時と比較しNNS時ではHF powerの低下、LF/HFの増大を認めた。通常HFは副交感神経系活動を、LF/HFは交感神経系活動を表すことが知られており、今回の検討からNNS負荷により副交感神経抑制あるいは交感神経賦活化の状態が惹起されることが明らかになった。またNNS時のHF powerの低下、LF/HFの増大はあおむけ寝とうつぶせ寝で差を認めなかった。したがって、NNS時の交感神経系の賦活化に対して睡眠時体位は影響を及ぼさないものと思われたが、うつぶせ寝とSIDSの関連についてはさらなる検討が必要と思われた。乳幼児突然死症候群(Sudden Infant Death Syndrome:SIDS)の病因はいまだ解明されていないが、近年、覚醒反応とうつぶせ寝との関連からうつぶせ寝により覚醒反応が低下することが示唆されている。pacifierの使用により交感神経系の賦活化がおこり覚醒反応が起きやすくなること、さらにうつぶせに寝かせた場合にあおむけに寝かせた場合よりpacifier使用時の覚醒反応の発現が低下することになればSIDSの予防対策をたてる上で重要な情報が得られるものと思われる。今後、今回のsupineのデータにproneでのNNS時のデータを加えて比較検討することで、睡眠時体位が交感神経系の賦活化に及ぼす影響を明らかにすることができると思われる。【目的】乳幼児突然死症候群(Sudden Infant Death Syndrome : SIDS)の病因はいまだ解明されていないが、近年、うつぶせ寝による覚醒反応が低下との関連が示唆されている。

pacifierの使用による交感神経系の賦活化の有無、さらにうつぶせ寝がpacifier使用時の交感神経系の賦活化に及ぼす影響を明らかにすることによりSIDSの予防対策をたてる上で重要な情報が得られるものと思われる。【対象と方法】あおむけにて睡眠中の新生児において安静覚醒時およびNon-nutritive sucking(NNS)負荷時のsucking圧、心電図、胸郭呼吸波形をポリグラフモニターを用いて測定し、心拍変動のスペクトル解析を行い、suckingが自律神経賦活化に及ぼす影響について検討した。さらにあおむけ寝とうつぶせ寝でのNNS負荷時のデータを比較することで睡眠時体位による影響を検討した。心拍変動のスペクトル解析はTime Series Analysis System(NCU版)によるComplex demodulation解析を用いた。【結果と考察】安静覚醒時と比較しNNS時ではHF powerの低下、LF/HFの増大を認めた。通常HFは副交感神経系活動を、LF/HFは交感神経系活動を表すことが知られており、今回の検討からNNS負荷により副交感神経抑制あるいは交感神経賦活化の状態が惹起されることが明らかになうた。またNNS時のHF powerの低下、LF/HFの増大はあおむけ寝とうつぶせ寝で差を認めなかった。したがって、NNS時の交感神経系の賦活化に対して睡眠時体位は影響を及ぼさないものと思われた。
プロトンポンプ阻害剤とCYP2C19遺伝子の腎不全患者に与える影響

腎不全患者の予後は依然として厳しく医療者にとって、その対策は急務である。.プロトンポンプ阻害薬は全世界で広く使用されている酸分泌抑制薬であるが,内服に伴う各種弊害が近年指摘されている.一方で腎不全患者は各種合併症の併存によりプロトンポンプ阻害剤を高率に内服している.プロトンポンプ阻害剤の内服およびCYP2C19の遺伝子多型が,腎不全患者の生命予後や心血管疾患の発症に関与するか明らかにすることを目的とする。血液透析患者1350名および保存期腎不全患者450名を対象とした遺伝子解析前向きコホート研究を行っており、同コホートを対象に研究を遂行する。プロトンポンプ阻害剤とCYP2C19遺伝子の腎不全患者に与える影響について多面的なアプローチで調査を行った。平成30年度はCYP2C19遺伝子多型の解析方法をPCR-RT法で確立し、登録患者の遺伝子解析を行う道筋を立てた。次年度は研究参加者における順次遺伝子解析を進めていく。併せて登録患者の予後調査を実施し、全死亡、心血管疾患の発症、感染症などのアウトカムの確認を進めている。遺伝子解析を行い、予後調査が終了した後に、各種アウトカムとの関連性を解析する。またプロトンポンプ阻害剤が腎不全患者にどのように処方されているかを、腎臓内科医および透析医を対象に処方実態を明らかにするアンケート調査を実施し、学会発表を行った。次年度以降は遺伝子解析の結果と予後調査の結果を併せて解析し論文化を予定している。平成30年度はCYP2C19遺伝子多型の解析方法を確立し、登録患者の遺伝子解析を行う道筋を立てた。血液透析患者1350名、保存期腎不全患者450名の遺伝子解析について次年度は順次遺伝子解析を進めていく。併せて登録患者の予後調査を実施し、アウトカムの確認を進めている。透析患者においては全死亡、心血管疾患の発症、感染症に伴う入院をアウトカムに、保存期腎不全患者はCrの経年的な変化率を調査している。またプロトンポンプ阻害剤が腎不全患者にどのように処方されているかを、腎臓学会のメーリングリストなどを用いて腎臓内科医および透析医を対象に処方実態を明らかにするアンケート調査を実施した。アンケート結果については学会発表を行った。遺伝子解析の手法を確立したため、血液透析患者1350名、保存期腎不全患者450名の遺伝子解析を順次進めていく。また予後調査、経年的なアウトカムの調査は順調にデータの採取が行えている。今後は遺伝子解析の結果と合わせて解析を行い、プロトンポンプ阻害剤、CYP2C19遺伝子多型がどのように腎不全患者に影響をもたらしているか明らかにする。

次年度以降は遺伝子解析の結果と予後調査の結果を併せて解析し論文化を予定している。遺伝子解析の手法を確立したため、血液透析患者1350名、保存期腎不全患者450名の遺伝子解析を順次進めていく。また予後調査、経年的なアウトカムの調査は順調にデータの採取が行えている。今後は遺伝子解析の結果と合わせて解析を行い、プロトンポンプ阻害剤、CYP2C19遺伝子多型がどのように腎不全患者に影響をもたらしているか明らかにする。遺伝子解析の手法の確立に時間を要したため、遺伝子解析費用および蛋白解析費用について次年度使用を行う必要を要した。現在、各種研究手法の確立は行ったため今後は解析を順次進めていく予定である。
内部重力波の遷移過程における熱・運動量輸送機構の解明

本研究室で開発した温度成層風洞の測定部に初期の速度・温度乱れが小さい強安定性層流(1200K/m)を実現し、その中で内部重力波を自然発生させた。本研究では整流胴内に金属細線(直径10μm,時定数5ms)を設置し、この内部重力波に正弦波的な微小温度擾乱を与えることにより、内部重力波の発生・発達・崩壊過程の制御を試みた。これまでの研究過程で本励起手法の可能性は実証されている。本研究では、この微小温度擾乱の励起周波数や励起強度などのパラメータを変化させることにより、それらが内部重力波の発達過程に与える影響を調べた。内部重力波による熱・運動量輸送に関する諸現象を、本研究室で開発した二線式温度流速計を用いた温度・速度の同時計測を通して解析した結果、以下に述べる結論を得た。(1)微小温度擾乱を与えることによって、流れ場の初期的な平均構造を変形させることなく内部重力波の発生・発達過程を促進することが可能である。(2)内部重力波は、発生・発達過程を経て非線形干渉によって崩壊し、波動のエネルギーが高周波の乱雑変動成分へと輸送され、内部重力波の発達が乱流遷移を促進することがわかった。(3)非励起時において内部重力波を構成する基本周波数成分の内の一つが十分に卓越している場合、その構成周波数は励起周波数に依存せず、基本周波数のエネルギーレベルのみが増加し、温度・速度場の変動エネルギーは、卓越周波数成分へと輸送されることがわかった。(4)内部重力波の構成周波数は、密度成層流中の平均速度勾配や平均温度勾配などの温度・速度場の平均特性により決定される。(5)内部重力波の振幅は、必ずしも励起強度に比例して増加せず、上限値が存在する。(6)微小温度擾乱を用いて内部重力波を励起しても、鉛直方向速度変動と温度変動間の位相差には影響を与えない。
難防除害虫のハダニ類を対象としたRNAi農薬の開発

本研究の目的は,RNAiの誘導因子である二本鎖RNA(dsRNA)をハダニに経口投与し,遺伝子発現抑制によって殺虫するRNA農薬の開発である.このRNA農薬の開発に向け,1)dsRNAの経口投与のための摂食メカニズムの解明,2)dsRNAに頑健性を付与する担体の開発および3)標的分子(必須遺伝子)の解明に取り組む.2018年度は,1)dsRNAの経口投与のための摂食メカニズムの解明に焦点を当て,ナミハダニ(Tetranychus urticae)の消化器系を調査した.本種の消化器系は,前腸,中腸および後腸から構成される.このうち前腸および後腸は外胚葉由来で,いずれの上皮にもクチクラ層がある.一方,中腸は内胚葉由来で,その上皮にはクチクラ層はない.なお,中腸は前部と後部から構成される.中腸前部は単一の主部と,その両側に位置する一対の盲嚢から構成され,その内腔には,盲嚢の上皮細胞を離脱し,浮遊している細胞(消化細胞)がある.消化細胞は,食作用により食物を取り込み,消化する.その後,中腸後部に輸送され,最終的に糞として排出される.そのため,消化器系の要である消化細胞は,RNA農薬の標的として有望である.他方,高分子を材料とする粒子は,近年,食細胞の食作用の研究材料や,薬物輸送系の担体として用いられている.しかし,ナミハダニに粒子を経口投与した報告は見あたらず,消化細胞内への輸送が可能な粒子のサイズは不明である.そこで,直径が異なるポリスチレン製の蛍光粒子を経口投与し,消化細胞内に輸送可能な粒子のサイズの選定を試みた.その結果,直径が500750 nm以下の蛍光粒子を経口投与した個体の消化細胞から蛍光シグナルが確認された.今後は,このサイズを基準に,かつdsRNAを保護する機能を付帯させたナノ粒子/カプセルを作製し,消化細胞を標的とした安定的なRNA農薬の開発を目指す.ポリスチレン製の蛍光粒子の経口投与試験により,ナミハダニの消化細胞内に輸送可能な粒子サイズの閾値(500750 nm)が判明した.このサイズは,口針の内径(約1 um)に近い.口針は,1対ある鋏角の可動指であり,鞭のように細長く,樋状構造である.摂食時に,この1対の口針は,互いの樋状構造間で融合し,1本の中空針を形成する.この中空針を,葉の表皮細胞間や気孔から葉肉細胞内に刺入し,葉肉細胞内に唾液を注入する.本研究により,口針には,唾液注入機能だけでなく,食物(葉肉細胞の内容物)の経路としての機能もある可能性が示唆された.なお,食物の経路としての口針の機能は,長きにわたり論争中であり,従来,この検証は,解剖学的アプローチに限定されてきた.本研究は,ナノ粒子を用いて初めてこれを検証し,その成果を学術論文(Bensoussan et al. 2018, Frontiers in Plant Science 9, 1206)として発表した.ハダニの消化細胞は,消化,吸収および休眠時の貯蔵など,その生存に重要な生理機能をもつ.さらに,ナミハダニを対象とした本研究により,その消化細胞は,ポリスチレン製のナノ粒子でも取り込むことも判明した.これは消化細胞の非選択的な食作用を示唆する.そのため,dsRNAの経口投与によってRNAiを誘導し,ハダニを防除するRNA農薬において,消化細胞は極めて有望な標的のひとつである.これまでの研究により,消化細胞内で機能が示唆されている液胞型プロトンATPase(V-ATPase)を標的にしたdsRNAをナミハダニに経口投与し,RNAiを誘導したところ,食物を取り込み黒化した消化細胞が中腸全体に蓄積され,最終的に死に至ることも判明している(Suzuki et al. 2017, PLoSONE 12, e0180654).今後は,消化細胞内の液性や発現遺伝子を調査し,そこで機能する消化酵素等の解明から,V-ATPase以外に,RNAiの標的となる必須遺伝子の特定を試みる.他方,dsRNAの頑健性付帯を目的とし,特に紫外線損傷を軽減させる材料(酸化亜鉛など)を用いたRNAナノ粒子/カプセルの作製も試みる.本研究の目的は,RNAiの誘導因子である二本鎖RNA(dsRNA)をハダニに経口投与し,遺伝子発現抑制によって殺虫するRNA農薬の開発である.このRNA農薬の開発に向け,1)dsRNAの経口投与のための摂食メカニズムの解明,2)dsRNAに頑健性を付与する担体の開発および3)標的分子(必須遺伝子)の解明に取り組む.2018年度は,1)dsRNAの経口投与のための摂食メカニズムの解明に焦点を当て,ナミハダニ(Tetranychus urticae)の消化器系を調査した.本種の消化器系は,前腸,中腸および後腸から構成される.このうち前腸および後腸は外胚葉由来で,いずれの上皮にもクチクラ層がある.一方,中腸は内胚葉由来で,その上皮にはクチクラ層はない.なお,中腸は前部と後部から構成される.中腸前部は単一の主部と,その両側に位置する一対の盲嚢から構成され,その内腔には,盲嚢の上皮細胞を離脱し,浮遊している細胞(消化細胞)がある.消化細胞は,食作用により食物を取り込み,消化する.その後,中腸後部に輸送され,最終的に糞として排出される.

そのため,消化器系の要である消化細胞は,RNA農薬の標的として有望である.他方,高分子を材料とする粒子は,近年,食細胞の食作用の研究材料や,薬物輸送系の担体として用いられている.しかし,ナミハダニに粒子を経口投与した報告は見あたらず,消化細胞内への輸送が可能な粒子のサイズは不明である.そこで,直径が異なるポリスチレン製の蛍光粒子を経口投与し,消化細胞内に輸送可能な粒子のサイズの選定を試みた.その結果,直径が500750 nm以下の蛍光粒子を経口投与した個体の消化細胞から蛍光シグナルが確認された.今後は,このサイズを基準に,かつdsRNAを保護する機能を付帯させたナノ粒子/カプセルを作製し,消化細胞を標的とした安定的なRNA農薬の開発を目指す.ポリスチレン製の蛍光粒子の経口投与試験により,ナミハダニの消化細胞内に輸送可能な粒子サイズの閾値(500750 nm)が判明した.このサイズは,口針の内径(約1 um)に近い.口針は,1対ある鋏角の可動指であり,鞭のように細長く,樋状構造である.摂食時に,この1対の口針は,互いの樋状構造間で融合し,1本の中空針を形成する.この中空針を,葉の表皮細胞間や気孔から葉肉細胞内に刺入し,葉肉細胞内に唾液を注入する.本研究により,口針には,唾液注入機能だけでなく,食物(葉肉細胞の内容物)の経路としての機能もある可能性が示唆された.なお,食物の経路としての口針の機能は,長きにわたり論争中であり,従来,この検証は,解剖学的アプローチに限定されてきた.本研究は,ナノ粒子を用いて初めてこれを検証し,その成果を学術論文(Bensoussan et al. 2018, Frontiers in Plant Science 9, 1206)として発表した.ハダニの消化細胞は,消化,吸収および休眠時の貯蔵など,その生存に重要な生理機能をもつ.さらに,ナミハダニを対象とした本研究により,その消化細胞は,ポリスチレン製のナノ粒子でも取り込むことも判明した.これは消化細胞の非選択的な食作用を示唆する.そのため,dsRNAの経口投与によってRNAiを誘導し,ハダニを防除するRNA農薬において,消化細胞は極めて有望な標的のひとつである.これまでの研究により,消化細胞内で機能が示唆されている液胞型プロトンATPase(V-ATPase)を標的にしたdsRNAをナミハダニに経口投与し,RNAiを誘導したところ,食物を取り込み黒化した消化細胞が中腸全体に蓄積され,最終的に死に至ることも判明している(Suzuki et al. 2017, PLoSONE 12, e0180654).今後は,消化細胞内の液性や発現遺伝子を調査し,そこで機能する消化酵素等の解明から,V-ATPase以外に,RNAiの標的となる必須遺伝子の特定を試みる.他方,dsRNAの頑健性付帯を目的とし,特に紫外線損傷を軽減させる材料(酸化亜鉛など)を用いたRNAナノ粒子/カプセルの作製も試みる.
地方中小都市における中心市街地居住の課題と持続可能な生活環境の再構築

平成30年度の研究実績の概要は、次の通りである。地方都市のまちなか居住の実態・課題を引き続き把握するため、近年中心市街地へのタワーマンションなど集合住宅の立地が進展した岡山市の状況を現地調査した。岡山市では、経営統合したメガバンク支店の跡地が、タワーマンションに再開発された事例をはじめ、中心市街地での集合住宅の増加が進展した。その背景には買い物先、教育施設など生活関連施設が空洞化しておらず、高い生活利便性が維持されていることがあげられた。他方で、金融機関の跡地が居住地となるなど、中心市街地の都心性の高い地区での土地利用変化により、中心市街地における都心的地区の空間的縮小を招いた。このことは、岡山市の経済発展に照らした場合、長期的には大きな課題とも成り得る。過去2年間の地方都市での調査結果の特徴をより明らかにするため、東京区部におけるまちなか居住の実態・課題についても、中央区、江東区、練馬区を対象に現地調査を実施した。さらに、海外のまちなか居住の成功事例とも言える、カナダ・バンクーバー都市圏と、フランス・グルノーブル市においても現地調査を実施した。バンクーバー都市圏では、これまでバンクーバー都心部でのコンパクトで高密度な都心居住の実現が報告されていたが、近年は郊外の駅前などに多機能で高密度な駅前再開発が進展し、コンパクトなまちづくりの進展が顕著であることが現地で確認できた。これは都市圏整備計画による政策の成果であるが、他方で国の人口増加策により郊外の戸建て宅地開発が再活性化し、交通利便性の比較的低い地域にも人口集積が進展していることは課題として確認された。グルノーブル市は古くからまちなか居住を実現していたが、近年の公共交通網の拡充により、郊外での宅地開発が進行した影響などで、旧市街地の一部で衰退化が確認されるなど、新たな課題が生じていることを明らかにできた。平成28年度の研究実績の概要は、次の通りである。1地方中小都市における中心市街地の機能の現状を把握するため、金沢市、松江市、米子市などで現地踏査と各種資料収集等を行った。これらの都市の状況を相対化するために、仙台市、名古屋市などの地方大都市の公共交通などのインフラ整備の状況も調査分析し、比較検討をした。これらの比較検討を通じて、地方の大都市と中小都市との比較において、中心市街地の現状はむしろ大都市との差よりも、中小都市でも金沢レベルの中都市と米子・松江レベルの都市の間での差がより顕著であった。このことから、人口20万に満たない県庁所在都市などの中心市街地機能の再生が不可欠であることが確認できた。他方で、大都市においても郊外核となる地区では機能空洞化の兆候も認められ、郊外が日常生活の中心と化した地方中小都市とは異なる状況が確認でき、新たな課題となった。2海外都市における最新の中心市街地活性化の取り組みを検討するため、オーストラリアのパース都市圏の現地調査を行った。パースのある西オーストラリア州は、長らく鉱産資源開発が地域経済の大きな柱となっていたが、近年パース中心部のエリザベス・キー地区を中心にコンベンション施設、ホテル、商業施設のほか、複数のマンションや鉄道とバスのターミナルが整備中で、観光資源としてだけでなくまちなか居住の機能も強化され、公共交通との高い結節性と合わせて中心部の魅力が大幅に向上しつつあることが確認できた。本務校の事情により、本研究に当てるエフォートを当初の予定通りに確保できなかった。その結果、本年度当初予定していた自治体へのアンケートなどが実施できなかった。平成29年度の研究実績の概要は次の通りである。1本研究の目的である地方中小都市のまちなか居住の課題などを把握するため、岡山県岡山市、笠岡市、井原市、京都府舞鶴市、宮城県石巻市などの中心市街地の生活利便性などの環境や街なか居住の実態について現地調査した。その結果、震災復興過程の石巻市をふくめ、地方小都市の中心市街地の生活基盤が、岡山、仙台など県庁所在レベル都市と比較すると格段に脆弱であることが確認できた。2地方中小都市の中心市街地では空き家の急増が深刻化しているが、国内において高度経済成長期以後、継続して増加している高層マンションが建て替えの時期を迎えた際に、負担なく事業・生活を継続しながら住み続けるかということが課題となる。こうした課題を円滑に解決するためには自治体の土地利用政策による支援が必要となることを、検討した。3地方中小都市の中心市街地の脆弱性の原因の一つに、過度の郊外化が考えられるため、同様にモータリゼーションの進展が顕著な米国カリフォルニア州内の中小都市を訪問し、現地調査を実施した。サンフランシスコ、ロサンゼルスなどの大都市以外でも、州都サクラメントなどでも一定の中心部で中心性が維持されていることが確認できた。他方、小規模な都市では一部に中心市街地の衰退が顕著な都市もあったが、概ね生活環境は維持・確保されている都市が多く確認できた。これらの要因については、継続して分析、考察したい。地方中小都市のまちなか居住の課題は、これまでの多くの中小都市での現地調査により概ね解明できつつある。日本ではとりわけ小都市レベルの中心市街地の生活利便性が脆弱であったのに対して、カリフォルニア州の事例では極端に衰退した状況は少なかったことから、それらの相違点の要因を解明することが必要となった。

その背景には買い物先、教育施設など生活関連施設が空洞化しておらず、高い生活利便性が維持されていることがあげられた。他方で、金融機関の跡地が居住地となるなど、中心市街地の都心性の高い地区での土地利用変化により、中心市街地における都心的地区の空間的縮小を招いた。このことは、岡山市の経済発展に照らした場合、長期的には大きな課題とも成り得る。過去2年間の地方都市での調査結果の特徴をより明らかにするため、東京区部におけるまちなか居住の実態・課題についても、中央区、江東区、練馬区を対象に現地調査を実施した。さらに、海外のまちなか居住の成功事例とも言える、カナダ・バンクーバー都市圏と、フランス・グルノーブル市においても現地調査を実施した。バンクーバー都市圏では、これまでバンクーバー都心部でのコンパクトで高密度な都心居住の実現が報告されていたが、近年は郊外の駅前などに多機能で高密度な駅前再開発が進展し、コンパクトなまちづくりの進展が顕著であることが現地で確認できた。これは都市圏整備計画による政策の成果であるが、他方で国の人口増加策により郊外の戸建て宅地開発が再活性化し、交通利便性の比較的低い地域にも人口集積が進展していることは課題として確認された。グルノーブル市は古くからまちなか居住を実現していたが、近年の公共交通網の拡充により、郊外での宅地開発が進行した影響などで、旧市街地の一部で衰退化が確認されるなど、新たな課題が生じていることを明らかにできた。本務校の事情は、当面解消される見込みがないため、研究計画の一部変更が必要となるものと思われる。自治体へのアンケートに代えて、聞き取り調査などへの変更も検討するつもりである。上述した日本とカリフォルニア州の小都市レベルの中心市街地の状況の相違点の要因を解明するとともに、低未利用地の解消にむけた対応策を検討し、持続可能で住みよい居住環境をもつ地方中小都市のあり方、モデルを検討したい。本務校の業務多忙などの理由から、当初の研究計画の一部を実施できなかったため。本務校の公務多忙と冬季の天候不良のため、当初予定していた現地調査の一部が実施できず、次年度使用額が発生した。翌年度分の助成金と合わせて、年度当初より計画を繰り上げて調査を実施し、最終年度中に研究の完了できるよう、しっかりと取り組む。研究方法の一部を変更し、次年度に繰り延べて実施する計画である。