hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コロイド化学的手法による舗装材料の性状評価

アスファルトは有機溶媒との親和性が高いため、始めに有機溶媒に分散させたアスファルテン懸濁液のコロイド化学的性質を検証した。その結果、有機溶媒の種類によってゼータ電位が異なることが明らかとなった。これは誘電率の違いに起因するものと考えられる。また、これらの懸濁液は長時間分散した状態を保っており、有機溶媒中ではアスファルテンが安定した状態で存在することが示唆された。水系におけるアスファルテン懸濁液のコロイド安定性を検証するために、適切なバルク条件から検討した。バルクにエタノールを混合することで、水系のアスファルト懸濁液を調製することが可能となった。pHをパラメータとしてゼータ電位を測定したところ、pHが高いほどゼータ電位は負の値を示し、pHが小さくなるにつれて正の値を示す傾向が得られた。また、中性に近いpH領域ではゼータ電位は0に近い値を示した。この傾向は、一般的なコロイド粒子の荷電特性と類似したものである。また、アスファルテン懸濁液の目視観察から、中性近傍において凝集、沈殿しており、高pH下にて分散している状態が見られた。しかし、低pHの場合、分散・凝集状態にばらつきが見られた。低pH下においてアスファルテンの帯電状態が不安定であり、わずかな荷電の差異で分散・凝集挙動が変化することが示唆された。以上の結果から、アスファルテンの有機溶媒への親和性を利用することで、水系でのコロイド安定性を検証することが可能であることが明らかとなった。また、一般的なコロイド分散系と比べて、類似した荷電特性の傾向が見られるが、特に低pHでの分散・凝集挙動については更なる検証が必要である。アスファルトの構成成分であるアスファルテンのコロイド化学的性質を把握するため、分散・凝集挙動の観察やゼータ電位の測定を実施した。アスファルテンのゼータ電位のpH依存性から、アスファルテンの荷電特性が一般的なコロイド分散系と類似していることが明らかとなった。その一方で、低pH下での分散・凝集挙動にばらつきがあり、低pH領域においてアスファルテンが不安定化しやすい傾向が見られた。一方、アスファルテンと同様に、アスファルトのコロイド化学的性質を左右しているとされるレジンについては、同様条件での測定が困難であり、分離方法や測定条件についてさらなる検討が必要である。アスファルテンのコロイド化学的の把握が進んでいるため、研究目的の1つである劣化によるアスファルトの物理性状や化学性状とアスファルテンの荷電特性の関係について検証した。実道での劣化を想定した紫外線照射による促進劣化や屋外暴露によってアスファルト中のアスファルテンやレジンが増加することを確認した。また、アスファルテンの増加により、アスファルトが硬化する傾向にあった。アスファルテンの荷電特性を検証したところ、劣化に関わらず、ゼータ電位に大きな差は見られなかった。一方、分散・凝集挙動については、低pHにて劣化後のアスファルテンが凝集、沈殿挙動が変化することを確認した。したがって、劣化によって荷電状態に何らかの変化が生じていることが示唆された。
植民地中南米における「間文化的アイデンティティ」の美術

本研究は、イスミキルパン修道院聖堂壁画の作例を象徴的な事例とする、ヌエバ・エスパーニャ副王領の布教区聖堂装飾美術における「先住民的」なモチーフ群が、スペイン人統治者・宣教師の「エキゾティシズム」的な関心と、その「エキゾティシズム」をも利用しつつ自らの新たなアイデンティティを構築した先住民首長層の、相互的な関与のもとで生まれた「間文化的」な表象群であることを、植民地で制作された挿絵手稿本や、同時代のヨーロッパにおける新世界に関わる図像イメージの分析をとおして解明した。16世紀をとおしてメキシコにはおよそ300のミッション聖堂が建設された。その全体を総覧する包括的なカタログ研究はいまだなされていないが、おおむね100を上まわる聖堂が現存し、断片的なものも含めれば、その多くに当初の聖堂装飾が残される。今年度は、まず先住民芸術家の関与が最も色濃い壁画装飾に関して、現存作品一覧の作成に着手した。聖堂壁画は、宣教師や副王領政府の関与のもと、先住民画家が制作した挿絵手稿本と図像上深い関わりがある。今年度は、関連する史資料の収集とその検討に努めた。なお、本研究の追加採択内定(10月28日)までの期間に、独自に進めていた研究の進捗により、本研究において中心的に取り上げることを計画していたイスミキルパン修道院壁画に関し、1)その図像源泉のひとつとして挿絵手稿本『フィレンツェ絵文書』が想定されること、また、2)この挿絵手稿本を入手したフランチェスコ・デ・メディチがウッフィッツィ宮(フィレンツェ)に描かせた壁画に、メキシコの布教区修道院壁画と並行関係をもつ多くの図像がみられることを明らかにした。この成果をもとに、イタリアに出張し、このウッフィッツィ宮壁画と、やはり数多くの新大陸モチーフを描いたローマ・ヴァティカーノ宮所在のジョヴァンニ・ダ・ウディネのフレスコ壁画を調査する。今年度は、先住民芸術家の関与が最も色濃い壁画装飾に関して作成した現存作品一覧をもとに、そのモチーフの系統的研究を進めた。同時に、宣教師や副王領政府の関与のもとで、先住民画家が制作した挿絵手稿本についてもモチーフの分類整理を進め、両者の対応関係を検討した。その研究の焦点は、イスミキルパンのアウグスティノ会修道院聖堂やマリナルコの同会修道院回廊の壁画装飾にみられる、新大陸風物ないし先住民モチーフとグロテスク文様の組み合わせがいかなる経緯で成立したかという問題である。この点について、ヨーロッパから輸入された書物の装丁装飾に倣った植民地時代の絵文書の装飾が、両者のリンクをなすことを実証する多くの材料を発見・確認した。植民地時代絵文書の多くは、植民地の統治と司牧の中核を担った副王や托鉢修道会が、先住民エリート層の子弟を教育動員して新世界の自然や文化を記述・描写させたものであり、その視覚媒体の「間文化的」な性格こそが、「エキゾティック」なモチーフと、類型的装飾としてのグロテスクを結びつけたのである。とはいえその一方で、ルネサンス期においてグロテスク文様に与えられた、「遠い古代」と結びついた幻想性は他者の表象と極めて親和的なものであり、「エキゾティック」なものとの関係性はたんに偶然のものではない。この現象は、南米アンデスの聖堂装飾美術にも並行関係を見いだすことのできるものであり、植民地という特異な文化的環境における視覚文化を系統的に理解する重要な糸口となる。この点を踏まえ、計画最終年度の来年度に向けて成果を公にしたい。4月にアメリカ合衆国に出張し、コロンビア大学ヒスパニック・インスティテュート(ニューヨーク)において、メキシコ植民地時代美術の研究者アレサンドラ・ルソ助教授と共同で研究セミナーを開催した。このセミナーにおいて、キリスト教聖堂の美術装飾に深く関与した植民地の先住民エリート層が、ヨーロッパ由来の図像文化を用いて、どのような視覚的メッセージを発していたのかを論じた。この場での議論も踏まえ、研究の最終年度となる本年は、研究成果の最終的な取りまとめを行った。その主なポイントは、1)イスミキルパン(メキシコ、イダルゴ州)のアウグスティノ会修道院聖堂やマリナルコ(同、モレロス州)の同会修道院回廊の壁画装飾などにみられる、新大陸風物ないし先住民モチーフとグロテスク文様の組み合わせが、いわゆる大航海時代以降、ヨーロッパで形成されつつあったエキゾティックな新大陸表象の図像の類型と深く関わっていること、2)その境界領域的な図像は、植民地化後の先住民エリート層が、みずからの貴族としての地位を確保するため、新たな支配者たるスペイン国王に盛んに請求した、紋章の図案や、宣教師・副王らの先住民文化に対する関心に基づいて盛んに制作された挿絵入り手稿本codiceの図像体系と重なる部分が多い、ということである。

これらの点に関する実証的議論を元に、本研究は、宣教師・植民地統治者側の好奇のまなざしと、それを内面化する先住民エリートとの間の屈折した相互作用の中で、植民地美術の核心をなす「間文化的」アイデンティティの美術/図像表象文化が構築されたことを明らかにした。
三軸応力下における岩石試験片からの水の出入りの観察と透水係数の推定

強度回復に伴う透水係数の変化を実験的に調べた.岩盤内空洞の長期挙動の評価に際しては,強度の回復とともに透水係数の回復(減少)も重要である.試験片を厚肉円筒に入れて破壊させる.強度破壊点を過ぎると応力は次第に下がっていくが,厚肉円筒中の内壁に破壊した試験片が接触しだすと応力は上昇を開始する.この開始しだした直後における透水係数を測定したが,予測したとおりで,透水係数は非常に大きな値を示した.また,次第に強度回復していく過程における透水係数を測定したが,興味深いことに,透水係数は急激に低下していくことがわかった.強度回復に伴う透水係数の変化を実験的に調べた.岩盤内空洞の長期挙動の評価に際しては,強度の回復とともに透水係数の回復(減少)も重要である.試験片を厚肉円筒に入れて破壊させる.強度破壊点を過ぎると応力は次第に下がっていくが,厚肉円筒中の内壁に破壊した試験片が接触しだすと応力は上昇を開始する.この開始しだした直後における透水係数を測定したが,予測したとおりで,透水係数は非常に大きな値を示した.また,次第に強度回復していく過程における透水係数を測定したが,興味深いことに,透水係数は急激に低下していくことがわかった.可視化三軸ベッセル甲で,孔付きのアクリル製エンドビースを岩石試験片に密着させて三軸圧縮試験を行い,試験片を出入りする間隙水の様子を観察した.最初にピストンの変位を固定して試験片に周圧を加えるとほぼ静水圧状態となる.この時点で試験片からしみ出した間隙水は上下のエンドピースの孔にたまっており,その様子が容易かつ明瞭に観察できた.その後,ピストンをベッセル内に押し込んで載荷すると,ピーク強度に達する時点までは,上下いずれのエンドピースの孔でも次第に水量が増えた.ピーク強度以降は,孔にたまった間隙水が徐々に試験片へと戻っていく.水を含んだ試験片で変位速度切換試験を行った場合,透水係数が高い場合は水の出入りは自由であり,変位速度が速くても遅くても歪の増加分に比例した水量変化が期待できる.一方,透水係数が低い場合は水の出入りに時間がかかるので,同じ歪増分に対して変位速度が速い時の水量変化は比較的少なくなる.このような試験結果から,透水係数を推定できる.この試験の特徴として,間隙水の様子が目視できること,そのため大きな間違いが生じる可能性が低いこと,変形・破壊特性と透水性の情報が同時に得られることなどが挙げられる.平成20年度の研究では,何種類かの岩石を用いて変位速度切換試験を精度良く実施し,それらの強度,ボアソン比,粘弾性的性質などを測定するとともに,水の出入りを観察して透水係数を定性的に推し量ることができることを示すことができた.この試験方法の応用の一つとして,トンネルや坑道周辺にできる緩み領域における透水係数の経時変化の測定が考えられるが,その測定に関する準備を整えた.平成21年度の研究では,新しい方法で透水係数を求めるとともに,クロスチェックのために従来方法でも透水係数を求める予定である.また,研究にあたっては,新しい方法の特徴を生かした応用分野に注目して研究を進める予定である.1.透水係数の測定法従来の方法で得られた透水係数と本研究で開発した方法により得られた結果とを比較・検討した.従来の方法としては,一定量の水を試験片の上部に設置した円筒中に入れてその経時変化を見る変水位法と,試験片に一定流量を流し続けて圧力が一定となったときの圧力を測定する定流量法とを採用した.5種類の岩石について比較試験をおこない,新旧の方法から得られた結果を比較検討した.□測定精度を高めるとともに適用範囲を広げるために種々の検討をおこなった,三軸ベッセル中の岩石の観察方法,変位・圧力の測定方法など考えられる限りの重点項目について見直しをおこなった.その結果,かなり安定した結果が得られるようになった.□本方法の適用範囲は今のところ比較的透水係数が大きくて,水が流れやすい岩石にとどまる.透水係数が小さな岩石では,透水係数のオーダーはわかるが精度は今ひとつといえる.今後は,このような岩石に対しても実用的に必要な精度を確保する手法を検討する.2.様々な応用範囲の検討今回提案した試験方式は,三軸圧縮応力下における試験中に(1)試験片の変形が直接観察できる,(2)試験片からの物質の出入りが直接観察できる,(3)試験片の時間依存性挙動が把握できる,等の特徴を有しており様々な用途に応用できる可能性がある.そこで,試料,試験装置,試験方法を変えてその可能性を探ることにした.例えば,一度破壊した岩石をもう一度押し固めてその強度回復をみる実験をおこなった.破壊した岩石が押し固められていく課程の各段階における透水係数の変化を測定することに成功した.この研究は,長期間にわたる岩盤内構造物の性能評価に重大な意味を持つにもかかわらず,既存のデータがほとんどない分野である.また,適宜,構成方程式とシミュレーションプログラムの改良をおこないつつ,数値シミュレーションを平行しておこない研究の効率化を図ることに成功した.一軸圧縮応力下に関する岩石の特性に関しては,多数の研究がなされてきており基礎的なデータも積みあがってきている.

一方,現実の地下における岩盤は,一方向のみでなく全方向から応力を受けており,当然ながら三軸圧縮応力下にある.よって,この三軸圧縮応力下における岩石の特性を解明することが重要であるが,実験をおこなう上でさまざまな困難があるので,不明な点が多く残されている.三軸応力下での現象解明がはかどらない原因の一つは,金属製容器の中で実験をおこなうので岩石試験片の観察が困難なことである.これを克服するために本研究では自ら提案した透明な容器を使用して,この中に岩石試験片をおいて試験をおこなうことにした.このようにすることによって,試験片がすこしずつ変形していく様子が観察できる。また,試験片の上下に,透明な水路を設けておき,この水路における水の出入りを観察することによって,岩石中に含まれている水の量,岩石中の水の通りやすさ,さらには岩石中にあらたにできた亀裂の体積がわかる.本研究では三軸応力下において種々の試験をおこない所定の成果を挙げたが,オリジナリティが特に高いと思われる試験結果について以下で述べることにする.トンネルをはじめとする岩盤内構造物では,掘削直後に側壁や天井が相当に痛む(多くの亀裂が入る)ことがある.その結果,この部分の強度は小さくなるとともに,透水係数が上昇してしまう.このように痛んだ岩石を三軸圧縮状態においてまわりから応力を加えると,次第に強度が増し,透水係数も減少(回復)する可能性がある.本研究では,実験室にて上記の現象をできるだけ忠実に再現するように努めたところ,予想通りに,適切な三軸圧縮応力下では,強度と透水係数が回復することがわかった.また,その回復の程度と,加えた応力,歪との関係に関する実験式を得ることに成功した.
MRI等方性ボクセルT2強調画像による高齢者へのエストロゲンの影響の解析

エストロゲンは、子宮や卵巣の骨盤ない臓器に大きな影響を与えることが知られており、MRIの撮像において評価することができる。しかし、閉経との関連の定量的評価や卵巣の腫瘍と関連させた報告はなく、今回の研究でその変化を視覚的、定量的試みた。エストロゲンと正常健常者について2015年の磁気共鳴学会で、2016年4月にホルモン産生卵巣腫瘍についてVISTA画像での有用性を、日本医学放射線学会において発表した。2016年の10月には、リスボンでの第16回ICGSにおいて、正常健常者エストロゲン産生卵巣腫瘍の患者について総合的な報告を行った。3月末に論文を2編作成しおえ、最後の修正中である。今回の3テスラMRIのT2強調画像の等方性ボクセルの画像を用いてホルモン産生腫瘍の診断を正確に評価を行うということを目的としている。今回の研究は、正常者および患者を比較していくことである。撮像方法は、従来当病院で撮像されていた脂肪抑制を使わないT2強調画像の等方性ボクセルの画像を使用し撮像する計画であったが、脂肪抑制法の撮像でartifactの少ない画像を撮像可能であることがわかり、より良好な画像でのデータ収集の道筋を確立できた。最終的には、正常健常者に対しての検査にご協力していただく撮像時間を考慮し、撮像の画像を最終決定することができた。今回の研究の計画は、正常健常者の採血における対応や募集方法で倫理委員会の承認を得るのに時間がかってしまったが、2014年4月に承認を得ることができたので、2014年5月より募集を開始し月3人を目標に約30人を本年度のうちに撮像を行いたいと考えている。また、ホルモン産生の卵巣腫瘍については、すでに症例での撮像が行われており、今後約30例のエストロゲンのデータが集まった段階で一度データの最終的な比較を行いたいと考えている。正常健常者の撮像については、5月開始であり現在まだ行っておらず、未知数な部分もある。しかし、もし募集状況が本年度中に進まない場合は、募集を本学職員にまでひろげる旨の承認を倫理委員会でいただいており、予定人数の撮像は十分可能であると考えている。今回の3テスラMRIのT2強調画像の等方性ボクセルの画像を用いてホルモン産生腫瘍の診断を正確に評価するということを目的としている。撮像方法は、従来当病院で撮像されていた脂肪抑制を使わないT2強調画像の等方性ボクセルの画像を使用し撮像する計画であったが、脂肪抑制法の撮像でartifactの少ない画像を撮像可能であることがわかり、平成25年度中に良好な画像でのデータ収集の道筋を確立できた。また、ホルモン産生の卵巣腫瘍については、すでに症例での撮像が行われており、現在すでに撮像されたデータにおいて解析準備を進めている。平成26年度4月に大学倫理委員会で正常健常者の、MRIでの撮像の承認を得て現在計画を遂行している。予定症例数は約30人であるが平成27年度8月をめどに撮像を終える計画でいる。今回の研究当初のIRB申請での撮像開始の遅れおよび申請期間内に当院のMRの急な機械の入れ替え工事などが重なりやや全体に遅れてしまい、英文の論文完成に至らなかった。しかし、今年期間延長を申請したため今後は、残り1年の延長期間内に、海外での発表および論文作成を進行させていく予定である。エストロゲンの子宮や卵巣の骨盤内臓器に対する変化は超音波を利用し主に評価されている。しかし、より明瞭に正確な評価が可能であるMRIでの評価は、詳細には検討されておらず、特にMRIでのエストロゲンの値と閉経との関連を3TのMRIで詳細に検討されたものはなく、MRIで子宮の体積と関連させた報告もほとんど行われていなかった。エストロゲンと正常健常者については2015年の第43回日本磁気共鳴学会で、2016年4月の第76回日本医学放射線学会および2016年9月第44回日本磁気共鳴医学会においてはホルモン産生卵巣腫瘍についてVISTA画像での有用性について、さらに2016年の10月リスボンでの第16回ICGSにおいて正常健常者を含めたエストロゲン産生卵巣腫瘍の患者について総合的な報告を行った。正常健常者についての今回の報告はprospective studyで行われており、いままで行われていない報告である。3月末の段階で正常健常者についての論文および卵巣腫瘍の論文を2編作成し、現在最後の修正中であり論文として報告を行う予定である。今回の検討で等方性ボクセルの画像の臨床的な有用性が確認でき通常のT2強調画像と比較しても遜色のない信号強度を得ることができており、T2強調像の等方性ボクセル画像の臨床での使用の可能性が広がったと考えている。また、今回のエストロゲンに対するMRでの子宮および卵巣のの変化については、2016年4月から毎週火曜日に行っていた研修医むけの勉強会においてT2強調像の等方性ボクセル画像での子宮卵巣の変化についておよびその有用性について教育的な内容で講演した。今回最終年度において、拡散強調像の評価も行っているが、さらに我々の施設で報告したhistogramの応用により、子宮内膜や筋層を評価すればさらに正確な評価が可能ではないかと考えており今後の研究につなげていきたい。

エストロゲンは、子宮や卵巣の骨盤ない臓器に大きな影響を与えることが知られており、MRIの撮像において評価することができる。しかし、閉経との関連の定量的評価や卵巣の腫瘍と関連させた報告はなく、今回の研究でその変化を視覚的、定量的試みた。エストロゲンと正常健常者について2015年の磁気共鳴学会で、2016年4月にホルモン産生卵巣腫瘍についてVISTA画像での有用性を、日本医学放射線学会において発表した。2016年の10月には、リスボンでの第16回ICGSにおいて、正常健常者エストロゲン産生卵巣腫瘍の患者について総合的な報告を行った。3月末に論文を2編作成しおえ、最後の修正中である。当初の計画では正常健常者の大部分を平成26年度中に終える予定であり、2015年5月の国際磁気共鳴学会での報告を予定していた。しかし、2014年11月12月にMRIの入れ替えが行われ、3テスラMRが機種が変更されたため当院に3テスラMRがない空白期間が生じてしまった。その期間、3テスラMRの撮像が行えず、その後も一時期正常健常者の撮像が途切れてしまった。しかし、2015年4月からはすでに協力者の十分な確保がえられており、撮像は予定通り終えることが可能であると考えている。現在1名での解析結果しか得られておらず、今年2名の最終的なカッパ値を出した解析が必要となる。また、研究データが予想と異なった場合については、子宮内膜のvolumeのみの解析のため、その他の追加の撮像シークエンスでの解析が必要となる可能性もあるため、子宮内膜の信号強度をおよび同時に撮像された拡散強調像を含めた検討を行う必要が生じるかもしれない。その場合には、拡散強調像のhigh b valueをあわせて解析を進行させていく計画を検討中である。画像診断3テスラMRIのT2強調画像の等方性ボクセルの画像を用いてホルモン産生腫瘍の診断を正確に評価し、閉経後の正常健常者のエストロゲン値を含めた正確な評価ということを目的としている。現在まだ正常健常者の撮像が15人(2015年4月29日現在)しか行えていないので、早急に正常健常者の撮像を進めていくことが必要である。ただし、現在撮像予定の方で10人がおり、2015年8月末までに当初の予定撮像に到達すると考えている。2015年9月に行われる磁気共鳴学会および2016年3月に行われる欧州放射線学会において発表を行い、それと同時並行し論文を作成したいと思っている。また、機会があれば、講演会においても今回得られた結果をおりまぜて報告していきたい。当初の計画では、1年目から正常健常者の募集を開始する予定であった。しかし、倫理委員会で正常健常者の募集方法(パワーハラスメントが生じないように)および事故等に対応する保険の対応の問題があるとの指摘を受け、当院とは関係ない場所で募集を行うこととしたためにその対応で時間が経過してしまった。また、当院では初めてのMRIのこのような研究となったため、および複数施設(埼玉医科大学および埼玉医科大学国際医療センター)での倫理委員会の承認を受ける必要性が生じたため、やや遅れてしまった。しかし、2014年2月に条件付き承認となり、2014年4月には倫理委員会の承認を両施設で得られたので、遅れは回復できる範囲である。計画の軽度の遅延が生じ必要な国際学会での報告および英語論文校正における支出を計上できなかった。平成25年度の倫理委員会の承認を得るのが遅くなり、ワークステーションなどの購入の予定が平成26年度にずれこんでしまった。
IL-12レセプターを介した情報伝達機構の解明

Yeast Two-Hybrid法によりmIL-12Rβ1に会合する分子の一つとして、近年細胞内情報伝達分子であることが明らかになってきている脂質メディエーターSphingosine-1-Phosphate(S1P)を生成する酵素Sphingosine Kinase2(Sphk2)を同定した。まず、293T細胞でそれぞれの分子に異なるタグをつけて一過性に発現させ、お互いが共沈してくることを確認した。さらに、293T細胞を用いてp3xGAS-Lucのリポーターアッセイを行ったところ、Sphk2はIL-12によるStat4のTranscriptional Activationを増強することがわかった。次に、Wild-TypeおよびDominant-Negative Sphk2をTh1細胞クローン(2D6)に発現させIL-12刺激に対する反応性を比較すると、Wild-Type Sphk2はIL-12刺激によるIFN-γ産生を増強しDominant-Negative Sphk2はそれを抑制したが、いずれも細胞増殖へは影響を与えなかった。さらに、レトロウイルスベクターを用いて活性化したプライマリーT細胞へ遺伝子導入しIL-12に対する反応性を比較すると、IFN-γ産生を有意に抑制したが細胞増殖へは有意な差が見られなかった。以上より、Sphk2がIL-12Rβ1の細胞内領域に会合し、IL-12シグナル伝達の正の調節に関与している可能性が示唆された。組み換えIL1-27を作製し、ナイーブCD4+T細胞を固相化抗CD3抗体で刺激1日後、IL-27で10分間再刺激し細胞溶解液を各種JAK1,2,TYK2,STAT1-6のチロシンリン酸化抗体を用いてウエスタンブロットによりIL-27刺激でリン酸化されるJAK/STAT分子について調べた。その結果、JAK1,-2,TYK2,STAT1,-3,-5とSTAT2のリン酸化が見られた。そこで、次にSTAT1遺伝子欠損マウスを用いて検討したSTAT1遺伝子欠損マウス由来ナイーブCD4+T細胞のIL-27刺激による細胞増殖は、野生型マウス由来とほとんど変わらなかった。しかし、IL-27刺激によるT-betおよびIL-12Rβ2発現誘導や、IL-12と相乗的なIFN-γ産生もほとんど見られなかった。このSTAT1遺伝子欠損マウスでは、IL-27刺激によりSTAT1のチロシンリン酸化が見られないのみならず、STAT2,-5のチロシンリン酸化も見られなかったが、STAT3のチロシンリン酸化は野生型マウスと同様に見られた。以上より、IL-27のシグナル伝達において、STAT1は、T-betおよびIL-12Rβ2発現誘導に、STAT3は細胞増殖誘導に重要であることが示唆された。

マウス(m)IL-12Rの細胞内領域(cyt)をBaitに用いT細胞株由来のcDNAライブラリーをYeast Two-Hybrid法によりスクリーニングした。mIL-12Rβ1に会合する分子の一つとして、近年細胞内情報伝達分子であることが明らかになってきている脂質メディエーターSphingosine1-Phosphate (S1P)を生成する酵素Sphingosine Kinase 2(Sphk2)を同定した。まず、293T細胞でそれぞれの分子に異なるタグをつけて一過性に発現させ、お互いが共沈してくることを確認した。次に、GSTのPull-Down Assayより会合部位を調べたところ、Sphk2のProline-Rich領域を含む領域とmIL-12Rβ1cytのC末端およびBoxII領域を含む領域が会合に関与していることが明らかになった。さらに、293T細胞を用いてp3xGAS-Lucのリポーターアッセイを行ったところ、Sphk2はIL-12によるStat4のTranscriptional Activationを増強することがわかった。次に、Wild-TypeおよびDominant-Negative Sphk2をTh1細胞クローン(2D6)に発現させIL-12刺激に対する反応性を比較すると、Wild-Type Sphk2はIL-12刺激によるIFN-γ産生を増強しDominant-Negative Sphk2はそれを抑制したが、いずれも細胞増殖へは影響を与えなかった。さらに、レトロウイルスベクターを用いて活性化したプライマリーT細胞へ遺伝子導入しIL12に対する反応性を比較すると、IFN-γ産生を有意に抑制したが細胞増殖へは有意な差が見られなかった。以上より、Sphk2がmIL-12Rβ1の細胞内領域に会合し、IL-12シグナル伝達の正の調節に関与している可能性が示唆された。IL-27のシグナル伝達におけるJAK/STAT分子とその役割について調べた。組み換えIL-27を作製し、ナイーブCD4+T細胞を固相化抗CD3抗体で刺激1日後、IL-27で10分間再刺激し細胞溶解液を各種JAK1,2,TYK2,STAT1-6のチロシンリン酸化抗体を用いてウエスタンブロットによりIL-27刺激でリン酸化されるJAK/STAT分子について調べた。その結果、JAK1,-2,TYK2,STAT1,-3,-5とSTAT2のリン酸化が見られた。そこで、次にSTAT1のIL-27刺激による細胞増殖とT-betおよびIL-12Rβ2発現における役割を明らかにするため、STAT1遺伝子欠損マウスを用いて検討した。STAT1遺伝子欠損マウス由来ナイーブCD4+T細胞のIL-27刺激による細胞増殖は、野生型マウス由来のナイーブCD4+T細胞とほとんど変わらなかった。しかし、IL-27刺激によるT-betおよびIL-12Rβ2発現誘導や、IL-12と相乗的なIFN-γ産生もほとんど見られなかった。このSTAT1遺伝子欠損マウスでは、IL-27刺激によりSTAT
多分岐高分子の分子包接特性を利用した液液界面の反応制御と分光計測への応用

多分岐高分子の分子包接特性を応用した金属イオンの分離・検出反応系を開発するため、様々な金属イオンの高感度分光光度試薬として利用されている水溶性の8-キノリノール-5-スルホン酸(QS)とその金属錯体を中心に研究を実施し、第4世代アミノ末端(G4 PAMAM-NH2)およびヒドロキシ末端デンドリマー(G4 PAMAM-OH)による分子間相互作用について分光電気化学的に研究した。強い蛍光性を示すAl(III)-QS錯体と無蛍光性のQS配位子の分光特性の変化から、デンドリマー共存下ではAl(III)-QS間の錯形成が促進されることを見いだし、デンドリマーが特異な反応場として機能することを確認した。さらに、水|1,2-ジクロロエタン界面における電位変調蛍光(PMF)解析から、Al(III)-QS錯体の相間移動反応の電位がデンドリマー存在下で変化し、Al(III)-QS錯体が水相中でデンドリマーと会合して安定化されることが示された。G4 PAMAM-OH共存系では、デンドリマーとAl(III)-QS錯体のイオン会合体が電位に依存して相間移動すること、G4 PAMAM-NH2共存系では、正に帯電したデンドリマーとAl(III)-QS錯体が界面領域で相互作用することをそれぞれ確認し、デンドリマーの末端官能基の反応性に依存してAl(III)-QS錯体の界面機構が変化することが明らかになった。また、プラズモン効果による光電場増強効果を生じる金ナノ粒子表面にPAMAMデンドリマーを化学修飾することで金ナノ粒子ーデンドリマー複合体を合成し、デンドリマーによる分子捕捉とプラズモン効果を組み合わせた高感度分光試薬としての機能性について基礎検討を実施した。多分岐高分子の被包接分子に対する相互作用を比較検討するため、多分岐高分子としてアミノ末端ポリアミドアミンデンドリマー、ビス-MPAポリエステルハイパーブランチポリマー、Poly-L-Lysineデンドリグラフトポリマーを用い、フラビン化合物(リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、ルミクロム)やインドール誘導体(トリプタミン、セロトニン、5-ヒドロキシインドール酢酸)などの生理活性物質、各種イオン性薬剤分子を用いて水溶液中および電気化学的に分極した水相と有機相の液液界面における電荷移動反応を分光電気化学的に研究した。測定した多分岐高分子化合物の中でも、カチオン性のポリアミドアミンデンドリマーは、水溶液および液液界面において中性およびアニオン性のフラビン化合物と相互作用し、フラビン化合物がデンドリマーに包接された状態で液液界面を横切るイオン移動反応を生じることを確認した。一方、電荷を持たず中性種として溶存するビス-MPAポリエステルハイパーブランチポリマーは、溶液相では明瞭な相互作用を示さなかったが、液液界面においてフラビン化合物の界面吸着反応を効果的に抑制することを確認し、界面特異的に作用することが明らかになった。インドール誘導体については溶液内および液液界面ともに明瞭な相互作用や反応機構の変化は見られなかった。多分岐高分子と共存分子の相互作用は、溶液相では静電相互作用、液液界面では静電相互作用に加えて界面吸着性が大きく寄与することが明らかになった。また、多分岐高分子との複合化に用いる発光性カーボンナノドットについて、水熱合成法による作製とキャピラリーゾーン電気泳動による耐電状態の評価、液液界面における反応挙動の分光電気化学解析を行い、表面官能基に依存した耐電状態と界面吸着性の相関について検討を行った。多分岐高分子のイオンや分子に対する包接機能の評価については、溶液内だけでなく電位変調蛍光分光法や偏光変調全内部反射蛍光分光法など、液液界面で生じる反応や界面特異的に形成される化学種に対して選択性が高い測定手法を適用し、詳細に解析することに成功している。これらの結果は既に論文として公表済みである。また、多分岐高分子との複合化を計画している発光性のカーボンナノドットの作製手法の確立、分光特性や界面挙動の基礎検討を終えることができたため、スムーズな研究展開が期待できる。今年度得られた多分岐高分子と種々の化学種の相互作用に関する結果は、反応系の最適化や展開を行う上での指針となることが期待できる。多分岐高分子の分子包接特性を利用したドラッグデリバリーシステムへの応用を考慮して、生体適合性の高いポリ-L-リシンデンドリグラフトポリマー(DGL)の分子包接特性と液液界面における反応挙動を分光電気化学的に研究した。多分岐高分子との相互作用によって蛍光強度が増強されるアニオン性蛍光プローブである8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(ANS)を用い、水相における第2ー4世代のDGL-G2ーG4についてアニオン種に対する会合挙動を解析した。水相におけるDGL-ANS会合体形成に起因する蛍光強度の増強から、DGLがポリカチオン、ANSがアニオンとして存在できるpH 2からpH 10付近の広いpH領域においてDGL-ANS会合体が形成されることを確認した。会合体形成はDGLの世代にも強く依存し、高世代のDGL-G4がアニオン種とより安定に相互作用することが明らかになった。さらに、電位変調蛍光分光法による分光電気化学的解析から、液液界面における会合反応の機構を解明した。イオン移動電位のシフトから水相におけるDGLとANSの会合安定性を定量的に評価し、会合体形成によるGibbsエネルギー変化と会合定数を決定することに成功した。また、金属イオンの高感度分光検出試薬として利用するために、キレート配位子として多様な金属イオンと安定に錯形成できる水溶性8-キノリノール誘導体とカチオン性のアミノ末端ポリアミドアミン(PAMAM)

デンドリマーの会合挙動について検討し、PAMAMデンドリマーとキレート試薬の複合体の形成条件を研究した。分子カプセルとして様々な分野で応用が進められているポリアミドアミンデンドリマーやハイパーブランチポリマーに加え、ドラッグデリバリーシステムでの活用が期待される生体適合性の高いPoly-L-Lysineデンドリグラフトポリマーについて、水溶液中および電気化学的に制御された液液界面におけるイオン性有機分子との相互作用の機構を明らかにし、成果を論文として公表した。今年度までに得られた成果により、キレート試薬の分子包接による複合化、金ナノ粒子や発光性カーボンナノドットとの複合化を通じた高感度分光検出への応用および各種薬剤分子との相互作用を利用した膜透過反応制御に必要な情報を集積することができた。多分岐高分子の分子包接特性を応用した金属イオンの分離・検出反応系を開発するため、様々な金属イオンの高感度分光光度試薬として利用されている水溶性の8-キノリノール-5-スルホン酸(QS)とその金属錯体を中心に研究を実施し、第4世代アミノ末端(G4 PAMAM-NH2)およびヒドロキシ末端デンドリマー(G4 PAMAM-OH)による分子間相互作用について分光電気化学的に研究した。強い蛍光性を示すAl(III)-QS錯体と無蛍光性のQS配位子の分光特性の変化から、デンドリマー共存下ではAl(III)-QS間の錯形成が促進されることを見いだし、デンドリマーが特異な反応場として機能することを確認した。さらに、水|1,2-ジクロロエタン界面における電位変調蛍光(PMF)解析から、Al(III)-QS錯体の相間移動反応の電位がデンドリマー存在下で変化し、Al(III)-QS錯体が水相中でデンドリマーと会合して安定化されることが示された。G4 PAMAM-OH共存系では、デンドリマーとAl(III)-QS錯体のイオン会合体が電位に依存して相間移動すること、G4 PAMAM-NH2共存系では、正に帯電したデンドリマーとAl(III)-QS錯体が界面領域で相互作用することをそれぞれ確認し、デンドリマーの末端官能基の反応性に依存してAl(III)-QS錯体の界面機構が変化することが明らかになった。また、プラズモン効果による光電場増強効果を生じる金ナノ粒子表面にPAMAMデンドリマーを化学修飾することで金ナノ粒子ーデンドリマー複合体を合成し、デンドリマーによる分子捕捉とプラズモン効果を組み合わせた高感度分光試薬としての機能性について基礎検討を実施した。多分岐高分子と共存化学種の相互作用は、溶液相では静電相互作用による効果が支配的であるのに対して、液液界面では多分岐高分子と共存化学種の界面吸着性が大きく影響していることが明らかになった。液液界面におけるイオン種の移動や吸着反応は、外部から電気化学的手法によって可逆的に制御できるため、イオン性の多分岐高分子を中心に反応系を構築し、金属イオンや薬剤分子の相間分配や界面反応の効率的な制御、高機能ドラッグデリバリーシステムの基礎検討を推進する。多分岐高分子は主に静電相互作用を通じて小分子と相互作用・包接し、イオン会合体を形成することができる。
イネ属におけるカドミウム耐性の多様性とカドミウム耐性機構の解明

イネ属の野生種は、世界各地の様々な環境に適応して自生しており、有害重金属であるカドミウムに特徴的な適応性を有する可能性が考えられる。イネ属の遺伝変異を広くカバーする系統群を用いてカドミウム耐性を解析した結果、西アフリカおよび南米に自生するO. barthiiとO. latifoliaの中に、カドミウム耐性が高いと考えられる系統が存在することが明らかにがなった。カドミウム耐性が高いと考えられたO. barthiiとO. latifoliaの系統について、RNAseqによってカドミウム耐性に関わると考えられる遺伝子を網羅的に解析した。O. barthiiの地下部では、解毒やストレス応答、代謝に関係するタンパク質をコードする遺伝子の発現量がカドミウムによって著しく増加しており、カドミウムによって生じる有害物質の解毒作用を高めることでカドミウムによる障害を軽減していることが示唆された。一方、O. latifoliaのカドミウム耐性系統で特異的に発現していた遺伝子、また、カドミウムによって発現が高まっていた遺伝子は、細胞壁に局在するタンパク質(PeroxidaseやGlycine Rich Protein)をコードしていた。このことから、O. latifoliaでは、細胞壁がカドミウム耐性を高める役割を担っている可能性が示唆された。O. barthiiで同定した還元酵素の一つ、2-Alkenal reductaseをコードする遺伝子をモデル植物のシロイヌナズナで高発現させたところ、シロイヌナズナのカドミウム耐性が向上することが明らかになった。この酵素は活性酸素を介して産生される有害物質を分解する作用を有すると考えられることから、活性酸素を介した有害物質の生成がカドミウムによる成長抑制の一因となっており、その分解によってカドミウムによる成長抑制が緩和されたものと考えられた。イネ属の遺伝変異を広くカバーする19種、133系統について、高濃度の塩化カドミウム処理によって強制的に植物体のカドミウム濃度を高めてカドミウム耐性を解析した。カドミウムによる草丈の生長抑制率(カドミウム処理後に伸長した割合)は、系統によって大きな違いがあり、イネ属の植物がカドミウム耐性において多様であることが明らかとなった。特に、野生種のO.barthii(Aゲノム)とO.latifolia(CDゲノム)には、栽培種では見られなかった生長抑制率が20%以下のカドミウム耐性が高いと考えられる系統が存在していた。O.barthiiとO.latifoliaの系統について、カドミウムに対する反応を詳しく解析したところ、O.barthiiの系統は何れも高いカドミウム耐性を持つこと、また、地上部のカドミウム濃度が急激に高まらない特徴を持つことが明らかになった。一方、O.latifoliaの系統は、地上部のカドミウム濃度が高く、系統によってカドミウムによる生長抑制の受け方が異なっていた。地上部のカドミウム濃度が100 ppmを超えても生長抑制率が20 %以下のカドミウム耐性が高い系統が存在する一方で、カドミウム耐性が弱い系統も存在することが明らかとなった。ゲノム配列が公開されているO.barthiiについて、塩化カドミウム処理によって発現変動する遺伝子をRNAseq解析で解析した。O.barthiiの地下部で発現量の増加率の高かった遺伝子の多くは、解毒やストレス応答、代謝に分類されるものであった。このことから、O.barthiiの系統では、これらの遺伝子の発現量が増加したことで、カドミウムの無毒化、液胞内への隔離により、カドミウムによる障害が軽減したと考えられた。また、地上部では膜輸送体や二次代謝の遺伝子の発現量の増加率が高く、地上部に輸送されてきたカドミウムの排出などに関与しているのではないかと考えられた。イネ属の植物がカドミウム耐性に多様であることを明らかにするとともに、カドミウム耐性の高い系統を見出すことに成功し、特に、Aゲノム種の中でO.barthiiには他の種には見られない高いカドミウム耐性を示す系統が存在することを明らかにした。当初、同一種でカドミウム耐性が異なる系統の比較を計画していたが、O.barthiiにはカドミウム耐性が高い系統のみが含まれていたため、カドミウム耐性が高い系統に共通する遺伝子に着目することにした。O.barthiiのカドミウム耐性が高い2つの系統の遺伝子発現をRNAseq法により発現解析を行なうことで、O.barthiiで共通してカドミウムで発現誘導される遺伝子を特定することに成功した。以上のように、イネ属においてカドミウム耐性に特徴ある系統を見出し、そのカドミウム耐性と関連する遺伝子の候補を見出せたことから、研究は概ね順調に進展していると考える。南米に自生するイネ野生種のO. latifoliaはCCDDゲノムを持つ4倍体で、その中には高いカドミウム(Cd)耐性を示す系統とCd感受性の系統が存在していた。このCd耐性とCd感受性の系統の転写産物をRNAseqにより比較解析することで、Cd耐性と関係する遺伝子の同定を試みた。O. latifoliaにはリファレンス配列がないため、まず、それぞれの系統についてシークエンスリードのdenovoアッセンブルを行いコンティグ配列を得た。それぞれのコンティグを用いて発現解析を行ない、Cd処理によって5%水準で有意に発現量が増加したトランスクリプトを抽出し、Blast検索により遺伝子機能の推定を行った。

Cd耐性およびCd感受性系統の根において、それぞれ58個および111個の遺伝子の発現量がCd処理によって有意に増加していた。何れの系統においても、ストレス応答や障害応答、障害防御に関わると推定される遺伝子の発現がCd処理によって高まっており、これらはO. latifoliaがCdに対応するための共通の反応であると考えられた。一方、Cd感受性系統では、Cdの解毒に関わるとされる数多くの遺伝子の発現量が増大していたのに対し、Cd耐性系統ではそれらの多くは発現が誘導されていなかった。このことから、Cd耐性系統ではCdを解毒する必要性が低いこと、すなわち細胞内のCd毒性が高まっていない可能性が示唆された。さらに、Cd耐性系統では、細胞壁に存在すると考えられるタンパク質の遺伝子の発現が高いという特徴が明らかとなった。根の細胞壁は、植物が最初にCdに出会う組織で、その分子構造や形態がCdの吸収や輸送に重要な役割を果たしていると考えられている。Cd耐性系統で発現が増加していた細胞壁のタンパク質は、細胞壁で細胞内へのCdの輸送の制限に関わっている可能性が示唆された。イネ属の野生種の中で、CCDDゲノムを持ち南米に自生しているO. loatifoliaの中にCd耐性の高い系統が存在することを見出し、Cdで発現が誘導される遺伝子をRNAseqにより同定した。さらに、これらの遺伝子機能の解析から、O. latifoliaのCd耐性の特徴の推定することができた。一方で、昨年度、栽培イネと同じAAゲノムを持つO. barthiiにおいて、RNAseq解析で同定したCdで誘導される遺伝子について、定量PCRによる発現の詳細な解析が計画通りに進んでいないことから、研究はやや遅れているとした。イネ属の野生種でカドミウム(Cd)耐性が高いと考えられたO. barthii(AAゲノム)とO. latifolia(CCDDゲノム)の系統において、RNAseq解析で同定したCd耐性に関わると考えられる遺伝子について、リアルタイムPCRによる発現解析を行った。Cdにより著しく発現が高まるAKRとAER遺伝子のプロモーター領域をO. barthiiのゲノムDNAからクロー二ングした。また、O. barthiiのAKRとAER遺伝子およびO. latifoliaのPRXおよびGRPのcDNAの全長を増幅し、35sプロモーターおよびCd誘導プロモーターと連結したバイナリーベクターを構築した。イネ属の野生種のO. barthiiとO. latifoliaの系統において、RNAseqで見出したCd耐性と関連すると考えられる遺伝子について、リアルタイムPCRで発現パターンを明らかにし、Cd耐性に関与する遺伝子を同定した。さらに、O. barthiiおよびO. latifoliaのCd耐性と関係していると考えられた、それぞれ2種類の還元酵素の遺伝子と、細胞壁に局在する2種類のタンパク質の遺伝子について、Cd耐性における役割を明らかにするための形質転換植物を作成するためのバイナリーベクターを構築した。当初の研究計画に沿って研究が進み、最終年度に形質転換植物を作成して、遺伝子機能を解析できる状態となっていることから、研究は概ね順調に進展していると考える。イネ属の野生種は、世界各地の様々な環境に適応して自生しており、有害重金属であるカドミウムに特徴的な適応性を有する可能性が考えられる。
SARSコロナウイルスの細胞侵入機構と病原性発現に関する研究

SARSコロナウイルス(SCoV)は受容体ACE2に結合後、エンドゾーム(ES)に運搬され、酸性環境下で活性を示すcathepsin L (CPL)によりスパイク(S)蛋白が解裂・活性化され、ウイルスエンベロープとES膜の融合が起こり、細胞内へ侵入する機構がBates等により提唱されている。一方、我々はS蛋白の活性化を促すトリプシンやエラスターゼなどのプロテアーゼの存在下では、受容体結合した粒子S蛋白の解裂・活性化が起こり、細胞膜から直接細胞内侵入することを報告した。また、この経路はES経路と比べ効率良く感染拡大することを明らかにした。これらのことから、S蛋白の解裂は融合活性化には不可欠であること、また、解裂型Sを持つウイルスは細胞表面から侵入できることが示唆された。そこで、本年度はS蛋白に、様々な細胞で発現されている蛋白質分解酵素フリンの認識部位を導入し、細胞内で合成された後ER-Golgiで解裂が起こる組み換えS蛋白を持つVSV pseudotypeウイルスを用いて,細胎内侵入機構について検討した。S蛋白の複数の部位にフリン認識サイトを導入し、動物細胞発現ベクターに組み入れ、発現したところ、S蛋白の798・801に変異を導入したS蛋白が細胞融合活性を示した。変異の無い親株(wt)S蛋白は、トリプシン存在下でのみ細胞融合活性を示した。これらのS蛋白を持つVSV pseudotypeウイルスを作製し、その細胞侵入機構を検討した。Wt pseudotypeの感染は、ES内の酸性化を阻害する薬剤やCPL阻害剤により阻止されたが、変異Sを持つpseudotypeはこれらの薬剤に耐性を示し、直接細胞表面から侵入することが示唆された(Watanabe et al., J. Virol. 82, 11985-91, 2008)。これまで我々が行ってきた一連の研究から、SCoVの細胞侵入機構は、Batesらにより提唱された機構と良く一致することが明らかとなった。SARSコロナウイルス(SCoV)は受容体ACE2に結合後,エンドゾーム(ES)に運搬され,酸性環境下で活性を示すcathepsin Lによりスパイク(S)蛋白が活性化され,ウイルスエンベロープとES膜の融合が起こり,細胞内へ侵入すると考えられている。一方,我々はS蛋白の活性化を促すトリプシンやエラスターゼなどのプロテアーゼの存在下では,受容体結合した粒子S蛋白の活性化が起こり,細胞膜から直接細胞内侵入することを報告した。また,この経路はES経路と比べ効率良く感染拡大することを明らかにした。本年度研究では,動物(マウス)体内でもプロテアーゼにより感染増強が認められるのか否かに関して検討した。弱毒パスツレラ菌の経鼻感染や肺炎誘導能のあるLPS投与により,肺でエラスターゼが産生され,SCoVの感染が充進することが認められた。特に,マウス馴化SCoVを用いるとウイルス感染上昇が著しく,感染マウスの多くが重症肺炎で死亡した。これらのことから,SARS重症化機構の一つの可能性として,肺でのエラスターゼによるウイルス感染増強が示唆された。今後,この感染増強機構として,培養細胞で見られたのと同様SCoVの細胞表面感染の誘導に因るものかを検討したい。また,細胞表面から侵入するマウスコロナウイルス(MHV)では,S蛋白のheptad repeatpeptide(HRP)により,効率よく感染が抑制される。これまで,SCoV感染では,HRPの効果がMHVと比べ低いことが報告されていたが,これはES経由の細胞侵入による可能性が考えられた。そこで,細胞吸着したSCoVをトリプシンで処理することにより細胞表面から感染する系を用いて,HRPの効果を検討した。通常のトリプシン非処理感染では殆ど効果は認められなかったが,トリプシン処理による系ではHRPは10から100nMで感染抑制効果を示し,MHV感染以上の効率で細胞表面からの感染を抑制することが示された。エラスターゼ存在化の肺での感染増強は,細胞表面感染による可能性が考えられ,今後HRPの抗SCoV剤としての可能性が期待される。

これらのS蛋白を持つVSV pseudotypeウイルスを作製し、その細胞侵入機構を検討した。Wt pseudotypeの感染は、ES内の酸性化を阻害する薬剤やCPL阻害剤により阻止されたが、変異Sを持つpseudotypeはこれらの薬剤に耐性を示し、直接細胞表面から侵入することが示唆された(Watanabe et al., J. Virol. 82, 11985-91, 2008)。これまで我々が行ってきた一連の研究から、SCoVの細胞侵入機構は、Batesらにより提唱された機構と良く一致することが明らかとなった。
尿路性器癌の発生分化に関与するepigeneticな遺伝子変化に関する研究

1)膀胱癌における第8染色体、第9染色体に着目し、臨床材料を用いた遺伝子解析を行った。その結果、第8番染色体短腕上に転移に関係する遺伝子座が存在すること、また第9染色体上の2つのLocusが膀胱癌発生に関与する事が判明した.この領域にある関連候補遺伝子のメチル化に関しては検討を予定している。もう一つの第9染色体上の膀胱癌関連遺伝子(DBCCR1)に関して、そのプロモータ部位のメチル化の状態に関して様々な膀胱癌細胞株に関して検討した。その結果、DBCCR1遺伝子のプロモータ部位は、種々の程度にメチル化を受けており、メチル化の状態とDBCCR1遺伝子発現とは直接関連していない事が判明した。69症例の臨床検体においては52%の症例で、異常なメチル化が検出され、このメチル化は異時性異所性の多発腫瘍間で保持される傾向にあった。2)テロメレラーゼは、染色体末端のテロメアの伸長反応を触媒し、細胞の不死化に関与するとされている。この蛋白は幹細胞や生殖細胞では発現が認められ、通常の体細胞に分化すると発現が消失する。また、癌化に伴って再び発現することから、ある種のEpigenetic mechanismが関与していると考えられる。このepigeneticな遺伝子発現に着目し、尿路性器癌における臨床的応用の可能性に関して検討した。その結果、テロメラーゼの発現を検出することで、副腎腫瘍の悪性度診断、尿を用いた膀胱癌の非侵襲的診断の可能性が示された。3)前立腺癌は環境要因と遺伝素因が影響を及ぼし合って、長期過程で発生する。前立腺上皮を取り巻く微細環境は重要な役割を担っており、間質細胞におけるEpigeneticな変化が発癌や悪性進展に影響を及ぼしている可能性がある。ビタミンD受容体(VDR)遺伝子、アンドロゲン代謝に関連する酵素をコードする遺伝子(CYP17)と、細胞接着に関与する遺伝子E-カドヘリン(E-CAD)に着目し検討を加えた。上記の検討において、VDR、CYP17およびE-CADの遺伝子多型が前立腺癌発生のリスクと相関することが判明した。p16癌抑制遺伝子は多くのヒト癌においで欠失、変異、メチル化等を含む様々な機構で不活化されていることが明かとなってきている.ヒト精巣腫瘍発生の分子機構は未だ明らかにされておらず、p16遺伝子の変異、欠失も報告されていない.精巣腫瘍におけるp16遺伝子のメチル化による不活化の関与を明らかにする目的でp16遺伝子のpromoter部のメチル化をmethylation-specific PCRを用いて解析した.正常血液、精子、数種のヒト細胞株、ヒト精巣腫瘍52例(seminom32例、NSGCT20例)より抽出したDNAをsodium bisulfiteで処理した.メチル化の有無をPCR産物の有無で判定できるようにp16遺伝子のpromoter部位にプライマーを設定し、nested PCR法を用いて検討した.Methylation-specific PCR法の特異性を確認する目的で、p16遺伝子のメチル化の状態がすでに明かとなっている膀胱癌細胞株T124等、数種の細胞株と正常ヒト血液DNA、ヒト