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シナプスにおけるMunc18の機能とその異常によるてんかんの分子生理学的研究

難治性てんかん(大田原症候群)の分子病態を解明する目的で、てんかん患者で同定されたヒトMunc18-1遺伝子変異を導入した線虫モデルを作成し、表現型解析を行った。これらの動物モデルは、運動麻痺、けいれんなどの行動異常とシナプス伝達異常を示すことが明らかになった。また、生体イメージングおよびオプトジェネティクス技術を用いて、神経機能の定量的評価法を確立した。本研究で開発された動物モデルと光学的技術は、難治性てんかんの分子病態解明と創薬開発に貢献することが期待される。Munc18は神経終末からの神経伝達物質放出を制御する重要な因子であるが、開口分泌過程における生理機能と作用機構については未だ不明な点が多い。近年、乳幼児期に発症する難治性てんかん「大田原症候群」患者において、ヒトunc-18(Munc18)遺伝子のエクソン内に点変異が同定され、Munc18変異とてんかん発症との関連が示唆されている(Saitsu et al.Nat Genet 2008)。本研究では、患者で同定されたMunc18変異を導入した線虫モデルを作成し、行動薬理学的解析および神経筋回路のカルシウムイメージング解析により興奮性・抑制性シナプスにおけるMunc18の生理機能と作用機構を明らかにするとともに、Munc18異常によるてんかん発症の分子機構の解明を目指す。平成22年度は研究実施計画に基づき以下の実験を行なった。大田原症候群の患者でヒトMunc18のエクソン内に4つのミスセンス変異(V84D,C180Y,M443R,G544D)が同定されている。C180YとG544Dは線虫のホモログ(unc-18)においても保存されており、それぞれの変異を持つ線虫トランスジェニック系統を作成した。これらの株をunc-18ヌル型変異体と交配し、てんかんモデルの遺伝子改変動物を確立した。次にアセチルコリンエステラーゼ阻害剤に対する行動薬理学的解析を行なった。これらの遺伝子改変動物はアセチルコリンエステラーゼ阻害剤に対する感受性が野生型と比較して有意に低く、コリン作働性ニューロンにおける伝達物質分泌が阻害されていることが示唆された。現在蛍光カルシウムセンサーを発現する遺伝子改変動物を作成し、レーザー顕微鏡を用いた光学的測定法で定量的に筋神経活動を測定する系を確立している。Munc18はシナプスにおける神経伝達物質放出を制御する重要な因子である。近年、難治性てんかん「大田原症候群」患者のMunc18遺伝子に変異が同定されたが、てんかん発症との関連はよくわかっていない。本研究では、分子-回路-行動レベルの解析を統合的に行なうことが容易な線虫を用いて、Munc18変異を導入した疾患モデルを作成し、行動薬理学的解析および神経筋回路のイメージング解析により興奮性・抑制性シナプスにおける作用機構を明らかにするとともに、Munc18異常によるてんかん発症の分子機構の解明を目指している。平成23年度は研究実施計画に基づき以下の実験を行なった。(1)ヒトMunc18で同定された変異を線虫unc-18ゲノムクローンに導入した線虫トランスジェニック系統を作成した。(2)アセチルコリンエステラーゼ阻害剤およびGABA受容体の作用を遮断する痙攣誘発剤に対する遺伝子改変動物の行動薬理学的解析を行なった。これらの薬剤に対する感受性を定量的に解析した結果、コリン作働性およびGABA作働性ニューロンにおける伝達物質分泌がいずれも阻害されている可能性が示唆された。(3)変異による神経機能異常をより詳細に解析するため、蛍光カルシウムセンサーを発現する遺伝子改変動物を作成し、筋神経活動を光学的手法で定量的に測定する系を開発した。大田原症候群は小児難治性てんかんの一つで、Munc18-1に多くの変異が発見されているが、Munc18-1の異常とてんかん発症の詳細な分子メカニズムはよくわかっていない。本研究は、線虫をモデル動物として用い、大田原症候群で同定されたMunc18-1の点突然変異を導入した疾患モデル動物を作成するとともに、変異と神経機能異常の関係をシナプスー回路ー行動のレベルで統合的に解析し、分子病態を明らかにすることを目的としている。本年度は、研究実施計画に基づき実験を行い、以下の結果を得た。1線虫Munc18-1ホモログにミスセンス変異を導入し、変異タンパク質を発現する遺伝子改変動物を樹立した。2ニューロンでの変異タンパク質の発現安定性を調べるため、2Aペプチドを利用して、変異タンパク質ーGFP融合タンパク質と赤色蛍光タンパク質を等モルずつ発現する系を構築した。赤色蛍光タンパク質を発現している神経細胞について融合タンパク質の発現を調べた結果、シナプスでの発現の低下および細胞体での封入体の形成が認められた。3行動薬理学的解析により、コリンエステラーゼ阻害薬、痙攣誘発剤等に対する感受性を検討した結果、正常個体と比較して感受性異常を示し、シナプス伝達の異常が示唆された。また、アミノ酸置換によって表現型の重篤度に差が認められた。

4シナプス伝達異常を詳細に解析するため、シナプス前ニューロンを光刺激し、シナプス後細胞での応答をイメージングする系の開発を試みた。運動ニューロンにチャネルロドプシンを発現させることにより、光刺激依存的に筋の収縮・弛緩を誘発する系と筋活動を蛍光カルシウムセンサーにより定量的に測定する系を構築した。大田原症候群の患者で同定されたMunc18-1の4つのミスセンス変異(V84D,C180Y,M443R,G544D)を導入した遺伝子組み換え動物を作成し、行動および薬理学的解析が行なわれており、当初計画通り、おおむね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。蛍光カルシウムセンサーを利用した光学的測定法で定量的に筋神経活動を測定する系を確立し、作成した疾患モデル動物に応用することにより、変異と神経機能異常の関連を明らかにする。
細胞内分子の選択的・リアルタイムイメージングが可能な非線形ラマン顕微鏡の開発

本研究では、生体機能を阻害せずに細胞内の特定の生体分子を選択的に観察でき、かつその分子の動態をリアルタイムで観察できる顕微鏡法の開発を目的とした。高感度で細胞の無標識イメージング可能なCARS (Coherent anti-Stokes Raman scattering)顕微鏡法に共鳴ラマン散乱効果を取り入れた装置を開発した。具体的には、試料からCARS光を発生させる際に試料へ照射するprobe光に可視光(波長: 532nm)を用いたCARS顕微鏡を試作した。これにより可視域に吸収をもつタンパク質からのCARS光を増幅し、細胞内での分布を選択的に検出すると行った応用が期待できる。そこで本実験では、530nm付近に強い吸収をもつcytochrome cを試料に用い、cytochrome cの分子振動に由来する1585cm^<-1>のバンドをターゲットとした。Pump光とStokes光にそれぞれ912nm、1064nmのピコ秒パルスレーザー光を用いてCARS測定をした。その結果、標的のCARS光を検出することに成功した。また、probe光に912nmの光を用い、同じcytochrome cの試料を測定した結果、可視光を使った方が2.8倍強い信号を示すことを見出した。しかしながらこの感度は、細胞内のcytohcrome cを検出するには十分ではなかった。今回はprobe光に可視光を用いたが、pump光にも可視光を用いることでより効果的に共鳴効果を得られると思われる。残念ながらレーザーのトラブルなどにより採用期間中にこれを実証できなかったが、本研究を通して少なくともCARS光を共鳴ラマン散乱効果で増強できることは証明でき、この成果は、今後の生体イメージングのさらなる発展に向けた一歩として意義のあるものと考えられる。(抄録なし)本研究の目的は、生体機能を阻害せずに細胞内の特定の生体分子を選択的に観察でき、かつその分子の動態をリアルタイムで観察できる顕微鏡法の開発である。、2012年度は、共鳴効果を利用したCARS(Coherent anti-Stokes Raman scattering)顕微鏡の開発に取り組んだ。CARS顕微鏡法は、試料への前処理をすることなく数秒で細胞のイメージングをできる手法として知られている。しかし、1枚の画像に複数の生体分子が同時に映り込み、何が観察できているのか解釈できない場合が多かった。そこで、特定の生体分子からのCARS信号を共鳴効果で増強させ、その分布を選択的に検出することを目的とした。今回は、基礎評価として、実際に生体分子からのCARS信号を共鳴効果で増強できることを検証した。試料として、可視光を吸収して共鳴効果を示すcytochromecを用い、1064nm、912m、532nmのピコ秒パルスレーザー光を対物レンズを介して同時に集光した。3色のレーザー光は自作のクロスコリレーターを用いて時間的に重ねた。試料へレーザー光が入射すると、まず1064nmと912nmのエネルギー差に対応するcytochromecの分子振動モードがコヒーレントに励起される。さらに、532nmのレーザー光がプローブの役割を果たし、cytochromecのCARS信号が得られた。比較として、プローブに1064nmのレーザーを用いた非共鳴のCARSの場合、cytochromecからの信号は検出されなかった。この結果は、可視域の光である532nmのレーザーを用いたことで共鳴効果が生じ、生体分子からのCARS信号が増強したことを示すため、本研究の目的において重要な意味を持つ。レーザーの故障による実験の遅れが生じたため、共鳴効果によるCARS信号の増強評価および細胞の観察に至らなかったため。共鳴効果によるCARS信号の贈強度を評価し、細胞内のcytochrome cをイメージングする。さらにマイクロレンズアレイ、音響可変フィルターを導入することで、リアルタイムでハイパースペクトラルイメージングすることを目指す。

アプリケーションとして、開発した顕微鏡を用いて、細胞にアポトーシス(細胞の自殺)を誘導した際のcytochrome cのダイナミクス観察を行う。また、アルキンタグとCARS顕微鏡を組み合わせた手法の開発も行う。(抄録なし)
ピルビン酸キナ-ゼ異常による遺伝性溶血性貧血の病因解明

ピルビン酸キナ-ゼ(PK)異常症は世界各国から300例以上が報告され、解糖系の中では最も頻度の高い酵素異常症である。われわれは既に正常ヒトL型、R型およびM_2型PKcDNAのクロ-ニングと塩基配列の決定を行っている。さらに、ホモ接合型PK異常症の1例(PK Tokyo)で単一塩基置換を決定し、この置換により不安定な変異酵素になることを明らかにしてきた。今年度はホモ接合型PK異常3例(PK Nagasaki,PK Fukushima,PK Maebashi)についての分子異常を検索した。方法はPK異常症患者網赤血球からRT・PCR法によりR型PKcDNAを単離し、全翻訳領域の塩基配列を決定した。PK Nagasakiでは既に明らかにしているPKTokyo同一の単一塩基置換である^<1151>ACG→ATGが同定され、この塩基置換によりThr^<384>からMetへの単一アミノ酸置換を引き起こす事が明らかになった。PK FukushimaとPK Maebashiでは^<1261>CAG→AAGが同定された。この変異はGln^<421>からLysへの単一アミノ酸置換を引き起こし、変異部近傍のペプチド鎖の疎水性が劇的に増加する。Gln^<421>はPK分子の進化過程でよく保存されている残基で、そのNー端側近傍に活性中心を構成するアミノ酸が、Cー端側にはPKのアロステリックな性質を規定する構造が存在する。この様に、PK FukushimaとPK Maebashiで見いだされた構造変化はPKの重要な構造に甚大な影響を与えて、PKの熱安定性や基質ホスホエノ-ルピルビン酸との親和性を低下させ、更にアロステリックエフェクタ-であるフルクト-ス-1、6-二リン酸によるPKの活性化をも障害する。以上の結果より、PK FukushimaとPK Maebashiは、活性中心に対する影響のみが考えられるPK TokyoとPK Nagasakiより重篤な貧血を伴うものと考えられる。以上、ホモ接合型PK異常症3症において単一塩基置換を決定し、その構造異常と機能異常の関係を明らかにした。
DNAナノ構造体によるナノ粒子超構造の構造制御

ナノ粒子の空間配置を高度に制御し、他の方法では成し得ない自由なナノ粒子超格子構造の設計・作成が可能となることを示した。DNA正四面体を介在させたDNA-NPの結晶化の課題では、結晶性の向上により、間違いなくダイヤモンド構造ができていることを小角散乱で示した。二次元結晶化では、イオン濃度調整のみで正方格子と三角格子を構造制御できることを示した。また、基板となるSLBの相転移・相分離が吸着DNA-NPの結晶化に与える影響を明らかにした。本研究は、DNA分子あるいは数本のDNA分子からなるDNAナノ構造体をガイドとしてナノ粒子を二次元、三次元の秩序的な構造へとプログラマブルにアセンブルし、ナノ粒子超構造を作成することを目的とする。ナノ粒子表面に被覆するDNAの塩基配列、あるいはDNAナノ構造体から生える一本鎖DNAの結合手の塩基配列を変化させることにより粒子間相互作用を制御することが可能であるため、ナノ粒子超構造の構造を制御することができる。具体的には、下記二つの項目を並行で進めた。(1)結合手を持つDNA正四面体を介在させたDNA被覆ナノ粒子(DNA-NP)の三次元結晶化(2)基板担持脂質二重膜(SLB)上におけるDNA-NPの二次元結晶化研究環境の事情によりシンクロトロンX線小角散乱装置が必要な(1)の課題よりも、ラボベースでできる(2)の課題を優先して進めたという点で申請時の実施計画からの変更が生じたが、(2)に関しては当初の計画以上の進度で進めることができた。(1)の三次元結晶化に関しては、DNA-NPと、それに結合する四本の結合手を持ったDNA正四面体が、同程度の大きさのときにダイヤモンド構造となることが確認できている。この構造決定のメカニズムを明らかにするために、本年度はDNA-NPよりも大きいDNA正四面体を介在させた三次元結晶化を行った。この大きいDNA正四面体によりダイヤモンド構造とは別の結晶構造が形成されることは確認されなかったが、ダイヤモンド構造形成にはDNA-NPとDNA正四面体の大きさの比が重要であることが確認できた。(2)の二次元結晶化に関しては、均一なSLBを製膜する技術、DNA被覆ナノ粒子をSLBに吸着・拡散・二次元結晶化する技術を確立することができた。原子間力顕微鏡測定により、結晶性の良い三角格子の結晶が確認されている。具体的には、下記二つの項目を平行で進めた。1.結合手を持つDNA正四面体を介在させたDNA被覆ナノ粒子(DNA-NP)の三次元結晶化これまでの研究により、DNAナノ構造体の一種であるDNA正四面体を介在させたDNA-NPの結晶化において、ダイヤモンド構造を示唆する結果が得られていたが、構造決定できる程の精度がなかった。本年度は、サンプル濃度、バッファーのイオン濃度の最適化を行い、構造決定のために結晶性の向上を目指した。X線小角散乱実験はNational Synchrotoron Light Source(NY)で行った。結晶化に適した濃度条件範囲を絞り込むことはできたものの、他のパラメータも結晶性に関与していることがわかったため、引き続き平成27年度も結晶性向上と構造決定に取り組む。2.基板担持脂質二重膜(SLB)上におけるDNA-NP二次元結晶化本課題は、予想外の興味深い展開があった。それに伴い、申請時の計画内容とは達成方法に変更点がある。これまで、コロイド結晶で最密充填以外の構造を作ることは困難であると考えられていた。我々は、DNA-NP表面に被覆するDNAの配列設計により、DNA-NPの超構造制御に取り組んでいた。しかしながら、同じDNA配列で、イオン濃度を変化させるだけで超構造が変化することを発見した。局所的ではあるものの、正方格子の超構造を作成することに成功した。昨年度に引き続き、本年度も下記二つの課題を平行して進めた。1.結合手を持つDNA正四面体を介在させたDNA被覆ナノ粒子(DNA-NP)の三次元結晶化本課題では、DNA-NPだけでは作成できないナノ粒子のダイヤモンド構造を、DNA正四面体を介在させることで実現した。本年度は、結晶性の良いナノ粒子のダイヤモンド超格子構造の作成に成功しただけでなく、'何故ダイヤモンド構造になったのか?'という部分を徹底的に追求した。成果はサエンス誌に掲載された。2.基板担持脂質二重膜(SLB)上におけるDNA-NPの二次元結晶化基板となるSLBの相転移や相分離が、吸着したDNA-NPの拡散・凝集状態に大きく影響し、二次元結晶化にも影響することがわかっため、結晶化過程におけるSLBの相転移・相分離、DNA-NPへの影響、吸着したDNA-NPがSLBの相転移・相分離に与える影響を詳しく研究した。また、H26年度に発見した、イオン濃度の変化によりナノ粒子の二次元配列が変化する現象をより詳しく研究した。同じDNA配列でイオン濃度を変化させ、粒子間距離、再隣接粒子数、二次元結晶構造を調べた。研究の進展により新たな発見や掘り下げて追及すべき重要課題が出てきたこと等により、本研究は申請時に記載した実験計画からいくつか変更が生じている。しかし、当初の目的'ナノ粒子の空間配置を高度に制御し、他の方法では成し得ない自由な超格子構造設計が可能であることを示す'には変更がない。

DNA正四面体を介在させたDNA被覆ナノ粒子(DNA-NP)の三次元結晶化の課題では、構造決定の要因まで解明することにより大きな成果に繋がった。基板担持脂質二重膜(SLB)上におけるDNA-NPの二次元結晶化の課題においても、イオン濃度のみで構造変化を起こさせるという、これまでの常識では考えられない現象を発見し、さらに濃度変化に伴う構造変化の過程を明らかにした。本研究では、DNAが塩基配列により選択的結合する性質を利用してナノ粒子を二次元、三次元の秩序的な構造へとプログラマブルにアセンブルし、ナノ粒子超構造を構築するとともに、その構造制御を行うことを目的として研究を行った。二次元、三次元結晶化の課題を並行して行い、下記の成果を得た。(1)基板担持脂質二重膜(SLB)を用いたDNA被覆ナノ粒子(DNA-NP)二次元結晶化研究計画当初には予想もつかなかった面白い現象を発見し、予想以上に研究を進展させることができた。具体的には、マグネシウムイオン濃度により隣接粒子数を制御できることを発見し、溶液のイオン濃度調整というシンプルな方法で二次元の構造制御に成功したこと、配列設計との組み合わせで粒子間距離も同時に制御できたことがあげられる。更に、脂質の相転移・相分離現象の解明と、SLBに吸着したDNA-NPへどのような影響を及ぼすかを解明することで、DNA-NP二次元結晶の大きさや形も制御できる可能性を示すことができたことがあげられる。欠損の少ないマイクロサイズの単結晶作成に成功し、結晶構造を反映したウルフ多面体の結晶形状を作成することに成功した。更に、陽イオン添加により格子定数の制御にも成功した。二元系の超格子構造を作製し、X線小核散乱による構造解析を行った。また、生体分子の特性から、乾燥すると構造が壊れてしまうと考えられていたが、DNA層に対するナノ粒子の体積率を調整することにより、乾燥しても構造を保てる条件を見出した。乾燥状態のDNA-NP超格子構造のX線小核散乱にも世界で初めて成功した。ナノ粒子の空間配置を高度に制御し、他の方法では成し得ない自由なナノ粒子超格子構造の設計・作成が可能となることを示した。DNA正四面体を介在させたDNA-NPの結晶化の課題では、結晶性の向上により、間違いなくダイヤモンド構造ができていることを小角散乱で示した。二次元結晶化では、イオン濃度調整のみで正方格子と三角格子を構造制御できることを示した。また、基板となるSLBの相転移・相分離が吸着DNA-NPの結晶化に与える影響を明らかにした。研究環境(シンクロトロンX線小角散乱実験が国内でできないという事情)や研究の進展に伴い申請時の計画と一部異なるものの、予想外の興味深い展開となっているため、概ね順調に進展していると判断できる。H28年度は下記二つの課題を平行して進める1.DNA被覆ナノ粒子(DNA-NP)の三次元結晶化H26年度に'基板担持脂質二重膜(SLB)上におけるDNA-NPの二次元結晶化'の課題で発見したイオン濃度変化で二次元DNA-NP超格子構造の結晶構造を変化させられる現象を三次元DNA-NP超格子構造にも応用する。イオン濃度の変化に伴うDNA-NP超格子構造の構造変化を小角散乱により測定する。
バイオマスからの低コスト高効率バイオ液体燃料生産プロセス

ブタノールはエタノールと比較して疎水性であり、ポストバイオエタノールとして非常に期待されている。ブタノールは再生可能資源と言われるバイオマスを原料としてClostridium属細菌によるアセトン・ブタノール発酵により生産されるが、ブタノール特有の強い生産物阻害により効率的な発酵生産法が確立されていないのが実状である。当該外国人研究者の母国であるベトナムを初めとする東南アジアはバイオマスの宝庫であり、サゴデンプン、キャッサバデンプンやオイルパーム等々の有用バイオマスが存在しているので、これらバイオマスを原料としたアセトン・ブタノール発酵を試みる。昨年度はClostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4を用いたキャッサバデンプンからのアセトン・ブタボール発酵について検討を行い、当菌株を用いてキャッサバデンプンを原料としたときに良好なブタノール発酵生産が可能であることを明らかとした。本年度は引き続き、その詳細な条件検討を行った。その結果、従来必要とされているデンプンの糖化行程を省略しても、十分発酵可能であることが分かった。さらに、無洗米製造時に排出される洗浄水中には多くの栄養素が含まれているためにその有効利用を試みた。米洗浄廃水をそのまま使ったところ、少量のブタノール生産が確認されたため、窒素源を添加したところ、ブタノール生産量が増加したことが確認された。本年度はClostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4を用いたキャッサバデンプンからのアセトン・ブタボール発酵について検討を行った。その結果、当菌株を用いてキャッサバデンプンを原料としたときに良好なブタノール発酵生産が可能であることが分かった。またキャッサバデンプン以外のデンプン種についてもブタノール生産の良好な発酵原料となりうることが分かった。ブタノール抽出溶剤としてオレイルアルコールの応用が従来報告されているが、水よりもブタノールへの分配係数が高く水と相分離し、かつ蒸気圧が低い抽出剤としてドデカノールを抽出剤として用いることにより、ブタノール水溶液からブタノールを抽出剤へ選択的に移行させることが可能であることを見いだした。
味覚受容体による味シグナル入力と脳での味知覚出力のギャップの解明

私たちが日常的に感じている味は、味覚受容体と味物質との結合がもたらすシグナルが味神経、大脳皮質、偏桃体などの脳神経系を介して知覚されるが、その過程で味情報は増幅・抑制等の修飾を受けていると考えられる。よって、味物質による味覚受容体の活性と官能評価を介した味の認識には乖離がある可能性が非常に高いが、そこに着目した研究は少ない。本研究では、この乖離を明らかにして、味覚受容体が受容した呈味シグナルがどのように脳まで伝達されるかを明らかにすることを目的とする。30年度は、条件反射による唾液分泌を引き起こす可能性の高い香りと、味との相互作用を生理応答を用いて評価するために、唾液分泌の測定を行った。その結果、香りを添加した味溶液による唾液分泌と静止唾液分泌の相関関係が、味と香りの組合せにより異なることを見出した。さらに、香りを添加した味溶液による唾液分泌と静止唾液分泌の相関関係と嗜好のばらつきの関係を解析した結果、相関関係が低い場合は嗜好にばらつきがある傾向があることが示され、生理応答を用いた嗜好性評価に利用できる可能性が示された。また、全ての基本味と辛味についても同様の解析を行い、酸味の相関関係が有意に低いことを見出し、酸味の生理応答が他の味と異なる可能性を示した。また、これまで得られた結果から、培養細胞に発現させた甘味受容体の感度が、動物実験、官能評価および唾液分泌をもたらす濃度と比較して概ね20100倍良いことを明らかにした。味の強さについては、甘味受容体の結果と、官能評価や唾液分泌による結果に乖離がなく、甘味受容体を用いた甘味料の評価結果は、閾値を補正することで官能評価の代替を行える可能性が示された。私たちが日常的に感じている味は、味覚受容体と味物質との結合がもたらすシグナルが味神経、大脳皮質、偏桃体などの脳神経系を介して知覚されるが、その過程で味覚情報は増幅・抑制等の修飾を受けていると考えられる。よって味物質による味覚受容体の活性と官能評価を介した味の認識には乖離がある可能性が非常に高いが、そこに着目した研究は少ない。28年度は、ヒトおよびマウス甘味受容体T1r2/T1r3を導入した培養細胞に高甘味度甘味料および種々の糖、糖アルコールによる味刺激を行い、カルシウムイメージング法により応答強度を測定した。その結果、甘味受容体の応答は、甘味物質により閾値が異なるばかりでなく、応答強度の最大値が異なることが示された。また、6種類の甘味料について官能評価を行い、甘味強度と培養細胞の応答強度の比較を行ったところ、甘味受容体による応答強度と官能評価における甘味強度に相関性があることが明らかになった。また、高甘味度甘味料と糖および糖アルコールでは、甘味受容体による応答強度と官能評価における甘味の閾値の差の関係が若干異なることも明らかになった。辛味については、2種類のヒト辛味受容体を導入した培養細胞を作成し、それぞれについて辛味物質に対する応答性を保有することを確認した。初年度に予定していた種々の甘味料に対する甘味受容体の応答強度の解析、および官能評価による甘味強度測定を終え、その相関性を明らかにしたため。29年度は、高甘味度甘味料および糖、糖アルコールの甘味刺激による唾液分泌と官能評価による甘味強度および嗜好性、甘味受容体T1r2/T1r3の応答強度とを比較した。その結果、甘味刺激による唾液分泌は、甘味強度とT1r2/T1r3による応答強度と相関し、嗜好性とは相関性が低いことが明らかになった。このことから、味刺激が無条件反射を引き起こすことを確認した。次に、条件反射による唾液分泌を引き起こす可能性の高い香りと、味との相互作用を調べる方法を検討した。味刺激によって分泌された唾液を用いて、唾液中のストレスマーカーであるアミラーゼ活性を測定したところ、いずれも刺激後1分以内で、刺激が強く嗜好性が低い酸味ではアミラーゼ活性が高くなり、嗜好性の高い甘味ではアミラーゼ活性が低くなることを確認した。また、辛味受容チャネルを発現した細胞を用いて、複数の辛味に対する濃度応答曲線の形状を比較した。29年度以降に予定していた、ヒトおよび実験動物を用いた味覚受容体の活性度と味覚感受性の関係の予測を予定通りに行った。また、他の感覚と味との相互作用を明らかにするために、新たに唾液中のアミラーゼ活性測定の最適化を行い、味の嗜好とアミラーゼ活性の相関を調べ、来年度の実験条件を確立したため。

よって、味物質による味覚受容体の活性と官能評価を介した味の認識には乖離がある可能性が非常に高いが、そこに着目した研究は少ない。本研究では、この乖離を明らかにして、味覚受容体が受容した呈味シグナルがどのように脳まで伝達されるかを明らかにすることを目的とする。30年度は、条件反射による唾液分泌を引き起こす可能性の高い香りと、味との相互作用を生理応答を用いて評価するために、唾液分泌の測定を行った。その結果、香りを添加した味溶液による唾液分泌と静止唾液分泌の相関関係が、味と香りの組合せにより異なることを見出した。さらに、香りを添加した味溶液による唾液分泌と静止唾液分泌の相関関係と嗜好のばらつきの関係を解析した結果、相関関係が低い場合は嗜好にばらつきがある傾向があることが示され、生理応答を用いた嗜好性評価に利用できる可能性が示された。また、全ての基本味と辛味についても同様の解析を行い、酸味の相関関係が有意に低いことを見出し、酸味の生理応答が他の味と異なる可能性を示した。また、これまで得られた結果から、培養細胞に発現させた甘味受容体の感度が、動物実験、官能評価および唾液分泌をもたらす濃度と比較して概ね20100倍良いことを明らかにした。味の強さについては、甘味受容体の結果と、官能評価や唾液分泌による結果に乖離がなく、甘味受容体を用いた甘味料の評価結果は、閾値を補正することで官能評価の代替を行える可能性が示された。辛味については、閾値と辛味受容体活性の関係を明らかにする。甘味については、香りの添加による甘味増強効果と甘味受容体活性の関係を、官能評価と受容体応答活性測定の結果より明らかにする。29年度までに行ってきた受容体分子の応答測定、官能評価に加えて、唾液中のアミラーゼ活性の変化を調べることにより、複数の味質間、複数の感覚間の相互作用を評価する。具体的には、複数の味の混合、味と香りの混合による閾値および嗜好性の変化と味覚受容体の活性との関係を明らかにする。次年度使用額は、研究費を効率的に使用して発生した残額である。辛味受容チャネルによる、複数の辛味物質の評価およびその相対関係の解明が、予定していたよりも少ない試行回数で予定した評価を終えたため、次年度使用額が生じた。一方、平成30年度は、唾液中のアミラーゼ測定や官能評価などのヒト実験を予定しており、当使用額を利用して被検者を増やした測定を行う予定である。物品費として利用する。
肺癌のプログレッションを包括的に抑制するWntとTM4SFのカクテル癌遺伝子治療

Wnt抑制ベクター作製のため, shRNA配列をpBAsi-hU6 DNAプラスミドベクターに組入れ, COS-TPC法でWnt抑制shRNA発現アデノウィルスベクターを作製した. Wnt2b抑制ベクターは, in vitro実験でWnt2b高発現癌細胞株に対して細胞障害活性を認め, Wnt2b高発現癌細胞株を移植した担癌ヌードマウスによる実験でも強力な抗腫瘍効果を認めた.我々はTM4SFのメンバーであるCD9の発現誘導アデノウィルスベクターも用いて,癌転移抑制遺伝子治療の研究も行い,機能解析を行っている.Wnt抑制ベクター作製のため, shRNA配列をpBAsi-hU6 DNAプラスミドベクターに組入れ, COS-TPC法でWnt抑制shRNA発現アデノウィルスベクターを作製した. Wnt2b抑制ベクターは, in vitro実験でWnt2b高発現癌細胞株に対して細胞障害活性を認め, Wnt2b高発現癌細胞株を移植した担癌ヌードマウスによる実験でも強力な抗腫瘍効果を認めた.我々はTM4SFのメンバーであるCD9の発現誘導アデノウィルスベクターも用いて,癌転移抑制遺伝子治療の研究も行い,機能解析を行っている.我々は肺癌の遺伝子治療としてWntシグナル抑制とTM4SF誘導の両面から,腫瘍のプログレッションを包括的に抑制する癌遺伝子治療の研究を行っている.Wnt抑制ベクター作製のため,Wnt1とWnt2b1,Wnt5aに対する合成siRNA(short interfering RNA)をそれぞれ3種類作製した.リポフェクション法でこれら合成siRNAをヒト癌細胞株ヘトランスフェクションし,それぞれの遺伝子発現と蛋白発現を定量し,Wnt1とWnt2b1,Wnt5aの発現抑制に最適なsiRNA配列を決定した.次に,shRNA(short hairpin RNA)発現プラスミドベクターを作製するために,決定したsiRNA配列を元にセンス配列とループ配列,アンチセンス配列を含むshRNA配列を設計した,そしてヒトU6プロモーターを搭載したpBAsi-hU6 DNAプラスミドベクターに,これらのshRNA配列を組入れ,Wnt1, Wnt2b1, Wnt5aの発現抑制shRNA発現プラスミドベクターをそれぞれ作製した.リポフェクション法で,これらWnt抑制shRNA発現プラスミドベクターを細胞株にトランスフェクションすると,良好な発現抑制がそれぞれにみられた.更にこのshRNA発現プラスミドベクターからヒトU6プロモーターとshRNA配列を切り出し,COS-TPC法でWnt抑制shRNA発現アデノウィルスベクターを我々は作製した.これらWnt抑制shRNA発現アデノウィルスベクターの濃縮・精製も行い,担癌ヌードマウスによる遺伝子治療実験を追加検討中である.一方,我々はTM4SFのメンバーである癌転移抑制遺伝子CD9の発現誘導アデノウィルスベクターを用いて,癌転移機序の解明と癌転移抑制遺伝子治療の研究も行っている.その結果,CD9遺伝子誘導によりWAVE2発現が抑制されラメリポディアが減少することが,CD9による細胞運動抑制の一因であることを我々は示した(Huang et al, Oncogene 2006).更に我々はWnt抑制とTM4SF誘導を効率よく行うため,カクテルベクターの作製も行っている.我々は肺癌の遺伝子治療としてWntシグナル抑制とTM4SF誘導の両面から、腫瘍のプログレッションを包括的に抑制する癌遺伝子治療の研究を行っている。Wnt抑制ベクター作製のため、Wnt1とWnt2b1、Wnt5aに対する合成siRNAをそれぞれ作製した。リポフェクション法でこれら合成siRNAをヒト癌細胞株ヘトランスフェクションし、それぞれの遺伝子発現と蛋白発現を定量し、Wnt1とWnt2b1、Wnt5aの発現抑制に最適なsiRNA配列を決定した。次に、shRNA(short hairpin RNA)発現プラスミドベクターを作製するために、決定したsiRNA配列を元にshRNA配列を設計した。そしてヒトU6プロモーターを搭載したpBAsi-hU6 DNAプラスミドベクターに、shRNA配列を組入れ、Wnt1、Wnt2b1、Wnt5aの発現抑制shRNA発現プラスミドベクターをそれぞれ作製した。これらWnt抑制shRNA発現プラスミドベクターを、癌細胞株にリポフェクション法で導入すると、良好なWnt発現抑制がそれぞれにみられた。更にこのshRNA発現プラスミドベクターからヒトU6プロモーターとshRNA配列を切出し、COS-TPC法でWnt抑制shRNA発現アデノウィルスベクターを作製し、濃縮・精製も行った。in vitroの遺伝子治療実験では、Wnt2b1抑制ベクターとWnt5a抑制ベクターの導入により、それぞれの高発現癌細胞株における抗腫瘍効果がMTTアッセイで認められた。現在、担癌ヌードマウスによるin vivo遺伝子治療実験を追加検討中である。一方、我々はTM4sFのメンバーである癌転移抑制遺伝子CD9の発現誘導アデノウィルスベクターも用いて、癌転移抑制遺伝子治療の研究も行っている。そしてWnt抑制とTM4SF誘導を効率よく行うため、我々は更にカクテルベクターの作製も行っている。一方、非小細胞肺癌におけるWnt1過剰発現が、c-MycやMMP-7の発現を誘導し、悪性度の高い腫瘍を形成していることも我々は明らかにした(Liu, et. al.,Lung Cancer 2007;Nakashima, et. al.,Oncol Rep 2008)。我々は肺癌の遺伝子治療としてWntシグナル抑制とTM4SF誘導の両面から,腫瘍のプログレッションを包括的に抑制する癌遺伝子治療の研究を行っている.Wnt抑制ベクター作製のだめ,Wnt1とWnt2b,Wnt5aに対する合成siRNAを作製し,リポフェクション法でヒト癌細胞株ヘトランスフェクションし,発現抑制に最適なsiRNA配列をそれぞれ決定した.決定したsiRNA

配列を元にshRNA(short hairpin RNA)配列を設計し,pBAsi-hu6 DNAプラスミドベクターに組入れ,発現抑制shRNA発現プラスミドベクターをそれぞれ作製した.そしてshRNA発現プラスミドベクターからヒトU6プロモーターとshRNA配列を切出し,COS-TPC法でWnt抑制shRNA発現アデノウィルスベクターを作製し,濃縮・精製を行った.Wnt2b抑制ベクターによる実験では,in vitro実験でWnt2b高発現癌細胞株に対して強力な細胞障害活性が認められた.更にWnt2b高発現癌細胞株を移植した担癌ヌードマウスによるin vivo遺伝子治療実験でも,Wnt2b抑制ベクターは強力な抗腫瘍効果を認めた(AACR2009).現在,Wnt1抑制ベクターとWnt5a抑制ベクターについて追加検討中である.我々はTM4SFのメンバーである癌転移抑制遺伝子CD9の発現誘導アデノウィルスベクターも用いて,癌転移抑制遺伝子治療の研究も行い,機能解析を行っている(Huang et al, Oncogene2006).そしてWnt抑制とTM4SF誘導を効率よく行うため,我々は更にカクテルベクターの作製にも取り組んでいる.一方,非小細胞肺癌におけるWnt1過剰発現が,c-MycやMMP-7の発現を誘導し,悪性度の高い腫瘍を形成していることも我々は明らかにした(Huang et al, Eur J Cancer 2008).
ゲノム編集用一体型アデノベクターとヒト型マウスの開発による遺伝子治療モデルの構築

本申請では、先天性代謝異常の一つであるフェニルケトン尿症(PKU)を標的とし、ゲノム編集により、安全で効率よく遺伝子治療できるアデノウイルスベクター開発のための技術基盤を構築する。実際には、オフターゲット切断が少ないCas9 nickaseと2個のガイドRNA、ドナーDNAを保持する新しい一体型アデノウイルスベクターの開発を進め、変異型ヒトPAH遺伝子を導入したヒト化PKUモデルマウスを組み合わせることで、肝臓における遺伝子治療試験が可能なヒト型治療モデル系を確立し、ゲノム編集治療用ベクターのヒトへの応用の可能性を探る。
生物分子モーターの多様性と同一性

細胞移動、細胞内輪送、細胞分裂、細胞分裂時の染色体移動、DNA複製、転写など力が必要なあらゆる場面で、生物分子モーターと呼ばれるタンパク質が活躍している。この分子モーターは、ATPなどに蓄えられた化学エネルギーを、数ピコニュートンという微小な力や滑り運動に変換する。その多様な機能を反映して、細胞内には驚くほど多彩な生物分子モーターが存在している。たとえば、ミオシン・ファミリーは、細胞質分裂や細胞移動に、キネシン・ファミリーは細胞内物質輸送や染色体分配に、そしてダイニン・ファミリーはべん毛運動や染色体分配に、核酸モーターはDNAの転写や複製にかかわっている。「動く」という生物にとって基本的な機能を代表するこれら生物分子モーターは、細胞生物学、生物物理学、生化学の分野で最も集中的に研究されているタンパク質となっている。こうした生物分子モーターの多様性と同一性を分子レベルで明らかにするには、どのような戦略をとるべきかを研究班を組織して検討した。
アドホックネットワークにおけるデータ利用性向上のための複製管理に関する研究

本研究課題では,データの利用性を向上させることを目的として,アドホックネットワークにおける消費電力を考慮した複製管理に関する研究を推進した.まず,データの利用性を損なわず,データ転送に要するトラヒックの削減により移動体の生存時間を長くすることを目的として,マルチキャストを用いたデータ転送方式を提案した.提案方式では,各移動体が,データの取得時間のデッドラインを設定して,データを要求している環境を想定する.一方,要求されたデータをもつ移動体は,複数の移動体からのデータ要求を一旦保留しておき,後からマルチキャストを用いてまとめて転送する.提案したデータ転送方式の有効性を,ネットワークシミュレータQualNetを用いたシミュレーション実験により詳細に検証した.結果より,提案方式は,マルチキャストを用いてデータをまとめて転送することで,即座にデータをユニキャストで転送する場合と比較して,トラヒックを約半分に削減することを確認した.また提案方式では,転送されるパケット数が減少することで,電波干渉により損失するパケット数も減少し,データの利用性が向上することを確認した.さらに,移動体がデータの複製を配置する環境では,オリジナルのデータをもつ移動体だけでなく,複製をもつ移動体も要求されたデータを転送することで,移動体の生存時間をさらに長くしつつ,データの利用性も向上できると考えられる.そこで上記で提案したデータ転送方式を,これまでに提案した複製配置方法と併用するための要件や併用した場合の問題点を洗い出した,実現のために検討すべき課題について詳細に検討した.本研究では,データの利用性を向上させることを目的として,アドホックネットワークにおける消費電力を考慮した複製管理に関する研究を推進した.まず,データの利用性の向上と移動体間の消費電力の均一化を目的として,移動体が,他の移動体からアクセスされる回数を均一化しつつ,自身や周囲の移動体が頻繁にアクセスするデータの複製を優先的に配置する複製配置方式を提案した.また,電力を使い果たす移動体の発生を抑制するため,データ転送に用いる経路を経路長および経路上の移動体の電力残量に応じて選択するデータアクセス方式を提案した.さらに,これらの方法を併用したシミュレーション実験による性能評価を行い,移動体間の消費電力をさらに均一化することを確認した.次に,ユニキャストを用いたデータ転送では,頻繁にアクセスされるデータがネットワーク上を何度も転送され,移動体の消費電力が大きくなるため,マルチキャストを用いたデータ転送方式を提案した.提案方式では,移動体からのデータ要求にデータの取得時間のデッドラインが設定されている環境を想定し,移動体は,データ要求した移動体がデッドラインの時間内にデータを取得できるよう,データ転送を開始する時刻を決定する.また,同じデータを要求している複数の移動体でデータ転送木を作成し,これらの移動体にデータをまとめて転送する.これにより,データ転送によるトラヒックを削減し,データの利用性を損なわずに移動体の生存時間を長くする.今後は,データ転送方式の性能をシミュレーション実験によって評価し,その有効性を検証する.また,データアクセスや複製配置との併用による提案方式の拡張について検討を行う.例えば,移動体が,取得したデータの複製を作成し,他の移動体から要求されたデータを転送することで,転送に要する時間やトラヒックを削減できるものと考えられる.本研究課題では,データの利用性を向上させることを目的として,アドホックネットワークにおける消費電力を考慮した複製管理に関する研究を推進した.まず,データの利用性を損なわず,データ転送に要するトラヒックの削減により移動体の生存時間を長くすることを目的として,マルチキャストを用いたデータ転送方式を提案した.提案方式では,各移動体が,データの取得時間のデッドラインを設定して,データを要求している環境を想定する.一方,要求されたデータをもつ移動体は,複数の移動体からのデータ要求を一旦保留しておき,後からマルチキャストを用いてまとめて転送する.提案したデータ転送方式の有効性を,ネットワークシミュレータQualNetを用いたシミュレーション実験により詳細に検証した.結果より,提案方式は,マルチキャストを用いてデータをまとめて転送することで,即座にデータをユニキャストで転送する場合と比較して,トラヒックを約半分に削減することを確認した.また提案方式では,転送されるパケット数が減少することで,電波干渉により損失するパケット数も減少し,データの利用性が向上することを確認した.さらに,移動体がデータの複製を配置する環境では,オリジナルのデータをもつ移動体だけでなく,複製をもつ移動体も要求されたデータを転送することで,移動体の生存時間をさらに長くしつつ,データの利用性も向上できると考えられる.そこで上記で提案したデータ転送方式を,これまでに提案した複製配置方法と併用するための要件や併用した場合の問題点を洗い出した,実現のために検討すべき課題について詳細に検討した.
授業実践力を形成する臨床的な学生協同参画による「校内授業研究方法」の開発

本研究は,学校教育現場における校内授業研究会において,暗黙知である教育技術に焦点をあて,その伝達可能化をはかり,現職教師及び養成段階の学生の授業実践能力の形成に寄与することを目的とし,実施された。その結果, (1)全員参加型で,多様な視点からの授業実践力の向上を目指すものとして,ワークショップ形式の校内研修会が効果的である(2)学生参画は,実際の校内研修会をモニタしながらそれに対して大学教員等が解説やコメントできる「ミューチュアル・エントリー授業」を活用した実践が効果的であるとの知見を得,その方法を提案している。本研究は,ベテラン及び中堅の教師が授業,とりわけ他者の教育技術をどのように捉えているかという視点の構造を明らかにし,それをもとに,現職教師及び養成段階の学生の授業実践能力の形成に寄与することを目的としている。教師の本務である児童・生徒との関わりを通した学習指導における授業研究体制を提案し,授業改善に資するところに特徴がある。具体的には,1)学校教育現場における校内研修会等における質の高い授業研究体制の提案2)養成段階の大学院生及び学生が協同参画し,授業研究する体制の提案3)そのために教師自らの授業実践上の問題点を実践的に解決するカの形成4)暗黙知である教育技術に焦点をあて,その伝達可能化等を目指すものである。本年度は,まず,秋田県内小中学校の新任研究主任及び授業実践力向上を目指した研修講座に参加した教諭を対象に,アンケート調査を行った。その結果,1)校内研修体制において,学校規模が大きくなるほど,管理職の助言等への期待度が低くなっている2)自己の力量向上を望む領域は「教材開発」「教科の専門事項」「生徒指導理解」にウエイトが大きく,「授業実践力」への関心はどちらかと言うと低い(3)とりわけ,「教材開発や単元開発の方法」については経験年数が少ない者ほど希望が強いが,「生徒理解指導」は経験と共に希望が強くなる等の傾向を見いだした。また,小中規模校での校内研修会に参画し,実際の話題等についても実態調査した。その結果,「授業実践力」に関する議論が少ない実態を見いだし,その改善にはワークショップ形式の研修会が効果的であることが把握できた。さらに,視聴覚メディアに関する専門的な力量形成を目指す研修についてのケーススタディも試みた。具体的には,1)学校教育現場における校内研修会等における質の高い授業研究体制の提案2)養成段階の大学院生及び学生が協同参画し,授業研究する体制の提案3)そのために教師自らの授業実践上の問題点を実践的に解決する力量の形成4)暗黙知である教育技術に焦点をあて,その伝達可能化等を目指すものである。本年度は,(1)学校校内研修会に継続的に参画(2)継続的な訪問が難しい場合,一度で効果的な体験ができる校内研修会の持ち方(3)小学生によるワークショップ型の授業実践(4)公開研究会等における校外者との協同の研究会の持ち方等について,実践的な試みを行った。その結果,(1)については,研修の経験をもとに,(4)において指導的な役割を果たせることが確認できた。また,(2)については次年度において,実践を継続したい旨の感想が多く認められた。(3)についても,高い評価が得られた。ワークショップ型の授業研究会は,複数校が参観し合う研修会での評価は高く,特に,小中連携を意図した研修会では高い評価を得た。一方,日常的な校内でのコミュニケーション状況が良好であるような小規摸校での場合には高い評価を得られない場合もあった。本研究は,ベテラン及び中堅の教師が授業やそこでの教育技術をどのように捉えているかという視点をもとに,現職教師及び養成段階の学生の授業実践能力の形成に寄与することを目的としている。とりわけ,次の視点にもとづき,学習指導における授業研究体制を提案し,授業改善に資するところに特徴がある。1)学校教育現場での校内研修会における質の高い授業研究の方法とその体制づくりの提案2)養成段階の大学院生及び学生が参画し,授業研究をする体制の提案3)教師自らの授業実践上の問題点を実践的に解決する力量の形成方法4)暗黙知である教育技術に焦点をあて,その伝達可能化最終年度は,主として次の4つの枠組みで研究を進めた。(1)校内授業研修会の持ち方に関する意識調査を実施し,分析した。その結果,全員参加型かつ多様な視点から教師の働きかけ等の授業実践力の向上を目指すものとして,ワークショップ形式の校内研修会が効果的であるとの知見を得た。

(2) (1)の校内研修会のスタイルとしてのワークショップ形式の研修会を,秋田県内の17校, 5教育関連機関で実施し,その方式の定式化に努めた。(3)学生参画は,実際の校内研修会をモニタしながらそれに対して大学教員等が解説やコメントできる「ミューチュアル・エントリー授業」を活用した実践が効果的であるとの知見を得た。(4)学生の主体的な参画を促すためのワークショップとして,全国学力調査を素材にした子どもの学びを考察する取り組みを実践し,効果的であったとの知見を得た。なの,昨年度と同様に,ワークショップ形式の授業研究会は,複数校が参観し合う研修会での評価は高く,特に,小中連携を意図した研修会では高い評価を得た。一方,日常的な校内でのコミュニケーション状況が良好であるような小規模校では高い評価を得られない場合もあった。
in vivo実験系を用いた歯周組織再生を促進する因子の同定

私達は、ヒト歯根膜組織に由来し、骨芽細胞ならびに脂肪細胞への分化能を有したクローン化した細胞株1-11細胞株の樹立に成功した。この細胞株を用いて免疫不全(SCID)マウスの背部皮下にβTCPと共に移植した結果、βTCP周囲に歯根膜組織に特徴的なSharpey線維様の構造物を有した歯根膜様組織を構築することが明らかになった。しかしながら、この形成効率は、歯根膜組織再生因子の候補としてあげられるようになった塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)またはenamel matrix derivative(EMD)によって高めることはできなかったことから、他の因子の関与が求められることが示唆された。また歯根膜細胞を機械的刺激下においた場合、angiotensinII, TGF-beta, alkaline phosphataseの発現が促進したことから、咬合力が負荷される歯根膜において、その恒常性の維持にangiotensin IIの関与が重要であることが示唆された。さらにカルシウムには歯根膜細胞の石灰化を促進する働きがあることが明らかになったことから、歯根膜の再生の足場要素にはカルシウムの存在が重要であることが示唆された。これらの要素を複合することによって、歯根膜組織再生を促進することが可能になると私達は、ヒト歯根膜組織に由来し、骨芽細胞ならびに脂肪細胞への分化能を有したクローン化した細胞株1-11細胞株の樹立に成功した。これらの要素を複合することによって、歯根膜組織再生を促進することが可能になると生体内で歯根膜の終末は歯根あるいは骨といった硬組織に両端をおいている。すなわち歯根膜は硬組織が存在する部位では、石灰化能を有していると考えられることから、本実験に同意が得られた患者のヒト歯根膜細胞をCaCl2存在下で培養し、カルシウムが歯根膜細胞の分化に及ぼす影響について検討した。その結果、CaCl2がおよそ5mM程度で存在した場合に、オステオポンチン、オステオカルシンのmRNA合成量を促進することが明らかとなった。また同様の条件下で同じ濃度のMgCl2と培養した場合には、何も添加していないコントロールと同じ結果であったことから、カルシウムが歯根膜細胞の骨芽細胞への分化を誘導することが示唆された。さらにCaCl2が歯根膜細胞の増殖に及ぼす影響について検討したところ、カルシウムの濃度依存的に促進することが明らかになった。以上のことからカルシウムの存在が歯根膜の恒常性の維持は必要であることが示唆された。なお本研究は歯学研究院の倫理委員会にて承認が得られた上で遂行されたものである。これまでに樹立したヒト歯根膜幹細胞株1-11細胞株はβTCPと共にSCIDマウス背部皮下に移植するとβTCPの周囲にオステオカルシンを含んだ硬組織を形成し、その表層にはコラーゲン線維が陥入したSharpey線維様の構造体を構築し、さらにこの線維は歯根膜組織に認められるペリオスチンを発現していており、歯根膜様組織が形成された。以上のことから、このような組織形成をさらに促進することを目的として、近年歯根膜の再生能を持っと考えられている塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)ならびにenamel matrix derivative(EMD)をコートしたβTCPを1-11細胞株とともにSCIDマウス背部皮下に移植したが、いずれも上記にあげたような歯根膜様組織の形成がさらに促進した結果は得られなかった。以上より、歯根膜組織再生には他の因子の関与が必要であると考えられる。また、歯根膜組織再生に必要な成分としてカルシウムが重要な役割を持っていることを報告しており、その影響について検討したところ、正常歯根膜細胞はカルシウムの添加によってその増殖能が上昇し、さらに添加後12時間以内にbone morphogenetic protein2(BMP2)発現が促進し、また石灰化が誘導されることを明らかにした。一方、BMP2のantagonistであるNogginの発現に対しては、経時的にNogginの発現の上昇を認めたが、カルシウム添加当初には、発現が抑制されていた。以上のことから、歯根膜組織再生には、足場材料としてカルシウムをある一定の割合で徐放する特性が必要とされ、これにより生体内ではその周囲に石灰化組織を構築することが可能となることが示唆された。