hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
反射性循環調節の複合作用とそのトレーニング効果に関する研究

ハンドグリップ運動時の循環反応に着目して検討した。1)姿勢変化時における末梢動脈血流の調節には、動脈圧受容器反射調節のみならず、血管の自己調節が顕著に作用していることが示唆された.さらに、頭上げ姿勢により血管の自己調節の反応の働きが強まる一方,頭下げ姿勢時によりその働きが弱まる可能性が示唆された.2)運動中の息止めによって動脈血圧が顕著に増加するが、このことに活動筋での筋代謝受容器反射亢進が関与していることが明らかとなった。3)筋代謝受容器刺激時における心拍反応の個人差には,主に心臓副交感神経の応答の個人差、さらに、動脈圧反射の感受性変化の個人差が関与していることが示唆された.ハンドグリップ運動時の循環反応に着目して検討した。3)筋代謝受容器刺激時における心拍反応の個人差には,主に心臓副交感神経の応答の個人差、さらに、動脈圧反射の感受性変化の個人差が関与していることが示唆された.姿勢変化時には、心肺圧受容器や動脈圧受容器反射が共に働くことから、それらの相互作用が循環調節に大きな影響を及ぼすと考えられる。また、血圧や血管抵抗は自発性の変動をしていることが知られており,これらを解析することによって,血圧の変動に対してどのように循環調節が行なわれているかを評価できると考えられる.近年,このような自発性変動に着目する手法を用いた報告において,起立姿勢時の全身の末梢動脈血管においては,循環調節として血管の自己調節が主な役割をはたす可能性が示唆された.姿勢変化時には,末梢動脈、特に下肢において,心臓との静水圧差が変化するため,これによる経壁圧の変化によって循環調節の状況が変化する可能性があるが,姿勢変化時に上肢や下肢といった末梢動脈について自発性変動に着目して循環調節を検討した報告は見あたらない.そこで本研究では,まず、交感神経、種々の部位での血管反応(上肢、下肢、大動脈、頸動脈、脳血流)、血圧、心拍数、筋酸素化動態などを連続的に同時測定できるシステムの構築と、それらのデータを用いて自己回帰分析する方法を確立し、それらを利用して姿勢変化時の上肢および下肢の循環調節について,自発性変動に着目して検討した.その結果,姿勢変化時の自発性の血圧変動に対する血管抵抗の変動は,上肢および下肢の動脈血管においても,血管の自己調節と同じパターンの変動をしていることが示された.頭上げ姿勢により下肢血管に静水圧が加わった場合には,血管の自己調節の反応時間が短縮する可能性が示唆された.また,頭下げ姿勢時により下肢血管に対する静水圧が減少した場合には,血管自己調節の働きが弱まる可能性が示唆された.50人の健康な成人の被験者に対して,筋代謝受容器を刺激するために、1分間の静的ハンドグリップ運動を行い、運動終了直前5秒前から4分間の前腕止血を続けて行った。この4分間の止血期間(PEMI)は、運動によって生じた代謝産物を運動後も筋に保持しているため筋代謝受容器を選択的に刺激する期間と考えられる。止血期間における、動脈血圧(SAP)変化、呼吸反応、心電図RR間隔(RRI)変化等を測定し、それらの変化の相互関係を検討した。特に、心拍数、動脈血圧の変動をそれぞれ周波数解析するとともに、血圧反応や心拍反応に対する遅れ時間や反応の生ずる確率などをそれぞれ解析し、筋代謝受容器反射と動脈圧受容器反射との連関を検討した.その結果、PEMIによるRRIの変化量とSDR-R,高周波(HF)パワーの変化量との問に有意な正の相関関係がみられたが,RRIの変化量と低周波(LF)パワー,LF/HFの変化量との間に有意な相関関係はみられなかった。SDR-R,およびRRI変動のHFパワーは心臓副交感神経活動の指標であり,RRI変動のLFパワーには心臓交感・副交感神経活動の両方が関与し,LF/HFは心臓交感神経活動の程度を反映すると考えられている.これらのことから,筋代謝受容器刺激時におけるHR反応の個人差には,主に心臓副交感神経の応答が関係することが示唆される.また,PEMIによるRRIの変化量とLF-Gainの変化量との間に有意な正の相関関係がみられた.SAP-RRIのLF-Gainは動脈圧受容器反射のHR調節の感受性(BRS)の指標とされている.したがって,筋代謝受容器刺激時におけるHR反応の個人差には,BRSも関与していると考えられる.息止め運動時の昇圧反応に、筋代謝受容器反射が関与していることを明らかにすることを目的とした。13名の健康な男女を被験者とした。半仰臥位姿勢での膝伸展運動を用い、HRが約100拍/分になるよう被験者ごとに負荷を設定した。被験者は息止めあり(BH)となし(C)の2条件で実験を行い、BHでは運動を始めて4分後に吸気止めを限界まで行ない、呼吸再開と同時に大腿の付け根に巻いたカフで阻血を行った。Cでは呼吸を止めることなくBHと同じ条件で測定を行った。

この時HR、平均血圧(MAP)、一回拍出量(SV)、CO、動脈血酸素飽和度(SpO2)、総末梢血管コンダクタンス(TVC)を測定した。また、上記の実験とは別に超音波ドップラー法により大腿動脈(活動筋)血流量(LBF)、下肢血管コンダクタンス(LVC)を測定した。息止め前運動時の平均値をベースラインとし、息止め運動により最も反応が大きく出た1拍をピーク値とした。運動中に息を止めることによって(1)顕著な徐脈反応、(2)SpO2の低下、(3)CO及びSVの低下、(4)TVCの低下、(5)LBF及びLVCの低下、(6)顕著な血圧上昇が生じた。さらに、(7)運動終了後の阻血時のMAPは、Cよりも20.6mmHg高くなった。阻血中は運動を終了しているため、セントラルコマンドや筋機械受容器反射は働いておらず、筋代謝受容器のみを選択的に刺激していると考えられる。したがって、息止めありとなしの2条件下のMAPの差は、筋代謝受容器由来の昇圧反応であると考えられる。これらのことから、運動中の息止めによってLBFは安静時値近くまで低下して、これに伴いエネルギー生成が無酸素性に傾き、活動筋内に代謝産物が蓄積され、筋代謝受容器反射が働き血圧が上昇したと考えられる。本研究より、筋代謝受容器が運動時の息止めにより引き起こされる血圧上昇に対する貢献割合は、24割程度であることが示唆された。
現代日本における免許返納高齢者の地域特性と生活圏形成に関する研究

本研究では、運転免許統計および宝塚市、岐阜市、上勝町での現地調査による高齢者の生活実態記録を用いて、(1)現代日本における免許返納高齢者の地域分布の特性および(2)免許返納者を含む高齢者の生活圏形成の実態について検討した。その結果、(1)では都市化(人口集中度)と免許保有者の高齢化が免許返納割合に空間的特質を与えていること、(2)では地域性、加齢、さらには高齢者自身の運転への自信や公共交通利用習慣が高齢者のモビリティの在り方と生活圏形成に影響を与えていることが明らかとなった。・統計データの入手と単純集計:2015年度は愛知、岐阜、三重の各県警察の協力を得て、免許返納者に関する統計資料を入手し単純集計を行い、警察署別(市町村別に近い)の免許返納比率等を求めた。紙媒体でデータを入手したため、全ての入力を終えていないが、人口密度の高い地域での返納割合が相対的に高い傾向が見出された。このことは医療・商業施設のアクセス条件や公共交通利便性が免許返納を促す地域的条件になっていることを端的に示しているとみられる。・予備調査の実施:本年度は愛知県三河地方(自家用車主流の近郊農村)在住の免許返納者に対する予備調査も実施した。免許返納後の家族のサポート状況、免許返納と連動した加齢による生活範囲の縮小などが明らかとなった。ただし、調査時間や内容(過去を思い出してもらう、など)が調査対象者の負担となったこともあり、免許返納高齢者への聞き取り調査方法を修正することとした。この修正は、2016年度実施予定の愛知県内三河地方を中心に免許返納者およびその家族に対するヒアリング調査、宝塚市におけるアンケート及びヒアリング調査にフィードバックさせたい。・調査準備:調査協力状況等を加味し、当初予定していた中部地方に限定せず、大都市圏という枠組みから調査研究を行うこととした。調査協力の得られた兵庫県宝塚市の丘陵地に立地する集合住宅団地での調査準備を始めた。人口密度の高い地域においても傾斜があり交通障害となりやすい郊外団地も多くあり統計では見出せない実態も多くあるためである。自治会の協力を得て、住民へのアンケート・聞き取り調査の準備を始めた。2016年度に本調査を実施する予定である。当初計画に比べて愛知県内におけるヒアリング対象者の選定が遅れている。しかし、当初計画にはなかった郊外団地における調査の目処が立ち、研究内容をより充実させることが見込めるため。今年度は、当初の研究計画(調査方法)を変更し、免許返納者に絞り込んだ調査ではなく、高齢者の調査を進めていく中で免許返納者の生活の状態を把握することにした。これは、免許返納者数の母数が少ないこと、個人情報取り扱いや警察側の情報開示の問題による。今年度は、兵庫県にある大都市圏郊外団地において調査を準備し実施した。幸いにも自治会関係者より団地内調査の協力を得ることができた。4月以降、団地自治会関係者との打ち合わせ、団地内での高齢者サロンへの参加を複数回重ねた。この下で、10月にアンケート調査を実施し、自治会の協力を得て488世帯に配布した。回収数は63世帯79人と少なかった。しかし一方、12月から1月にかけて、ヒアリング調査を10世帯15人の協力を得て実施することができた。これらにより、大都市圏郊外における住民の生活圏の形成とモビリティとの関係、免許返納に関する経歴や意向などを把握することができた。モビリティのあり方とライフステージとの関係性についても把握することができた。調査結果の速報として、2017年3月の日本地理学会春季学術大会(筑波大学)にて発表を行った。その際には調査結果を踏まえ、日常的なバリア解消に向けた総合的な施策を検討すること、加えて免許返納等による生活変化を抑えるためにも、自家用車運転者が加齢とともに公共交通利用に一定程度慣れておくことが必要であることを提言した。また、2017年1月のヒアリング調査の際に紹介いただいた他団地自治会関係者の方に、新たに団地調査に協力していただけることとなった。このため、2月に急遽次年度に向けた調査の打ち合わせを行った。このほか、並行して進めている名古屋大都市圏研究や地方公共交通研究において、住民のモビリティ、交通インフラのあり方等について検討を行った。現地調査によって得た一次データの分析に着手できたため。次なる調査内容を展望できただけでなく、調査先を確保することもできたため。2017年度は兵庫県の大都市圏郊外において、アンケート調査(449世帯に配布、回答は65世帯88人分)およびヒアリング調査(10名)を実施した。並行して、徳島県上勝町における補足調査を行い、運転免許返納に関する最新統計を入手した。2018年3月の日本地理学会大会(東京学芸大学)にて研究成果の一部を報告した。対象期間中の研究総括は以下の通りである。1「免許返納者の地域特性」については、全国(都道府県別)および地方(愛知・岐阜・三重の3県の市町村別)の動向を、都市化度や運転免許保有者の高齢化率の関係を踏まえて統計データを分析し、日本における免許返納の先発地域と後発地域の形成が認められた。2「免許返納高齢者の生活圏形成」については、兵庫県内の大都市郊外調査結果、岐阜市郊外における(久保倫子氏(筑波大)および駒木伸比古氏(愛知大)との)共同調査結果、地方農山村(徳島県上勝町)調査結果を分析した。

加齢プロセスを考慮し、ライフステージとモビリティ再編成の観点から考察した。交通サービスや生活関連施設の立地といった都市的機能、そして高齢者自身の加齢は高齢者のモビリティ再編と生活圏の縮小を促してきたが、自分で納得できない形での運転取りやめと生活圏の縮小は高齢者の大きな心理的負担となっていた。また、本研究からの政策提言として、免許返納高齢者を含む高齢者の社会的生活を充実させるため、日常生活圏内に根付いた交通政策と商業政策との連携や高齢者モビリティマネジメントの拡充をあげた。本研究では、運転免許統計および宝塚市、岐阜市、上勝町での現地調査による高齢者の生活実態記録を用いて、(1)現代日本における免許返納高齢者の地域分布の特性および(2)免許返納者を含む高齢者の生活圏形成の実態について検討した。その結果、(1)では都市化(人口集中度)と免許保有者の高齢化が免許返納割合に空間的特質を与えていること、(2)では地域性、加齢、さらには高齢者自身の運転への自信や公共交通利用習慣が高齢者のモビリティの在り方と生活圏形成に影響を与えていることが明らかとなった。2016年度は宝塚市(郊外集合住宅団地)および愛知県三河地方(近郊農村、地方都市)における免許返納者の生活実態調査を行う。分析方法については、当初計画に挙げていた時間地理学の手法を取り入れるだけでなく、隣接諸科学の分析手法の援用可能性についても検討する。大都市圏郊外団地の調査を継続するとともに、大都市圏近郊農村での調査も進める。人文地理学前年度において、調査費用(旅費)が予算を下回り、繰り越し金が発生したため。調査に充当する。
交通を考慮した新たな地域総合環境評価モデルの開発

本研究の最終目標は,三遠南信地域における交通,経済,土地利用,環境負荷の統合モデルを作成し,三遠南信地域の総合的環境評価モデルを開発することにある。研究期間中に2種類のモデルを構築した。1つは部分均衡型の応用都市経済(CUE)モデルであり,他方は一般均衡型の空間経済(SCGE)モデルである。本研究では対象地域における道路ネットワークを独自に設定し,CUEモデルを用いてゾーン別経済集積の変化,交通量変化,経済効果,環境負荷変化,土地利用変化をシミュレーション分析できた。SCGEモデル分析では愛知県,静岡県西部,長野県南部を対象として,対象地域を31ゾーンに分割した。三遠南信自動車道の完成を想定し,その経済効果を計測した。研究期間を通じて当初の研究目的はほぼ達成されたものと言える。本研究では日本の三遠南信地域(愛知県東三河地域,静岡県西部地域,長野県南部地域,人口約200万人)を対象地域としている。環境共生型地域を「環境負荷を最小にし,かつアメニティを最大化する」ような地域形態と定義し,交通を考慮した新たな総合的環境評価をモデル分析によって行おうとするものである。本年度の研究は3つの方向にまとめられる。第1は都市形成に関する理論的研究である。これは平面上の都市を想定し,偏微分方程式を用いて,どのような形態の都市が形成されるのかを考察した。第2は三遠地域(愛知県東部と静岡県西部)を対象として,経済-交通-環境モデルを構築した。このモデルにより,対象地域での道路整備により,どのような経済便益が発生するのか,またCO_2,NO_x,SO_x,浮遊粉塵などの環境負荷変化をシミュレーションした。第3は対象地域の拡大を目指した新たなモデル概念の考察とデータ収集である。本年度のモデルでは財市場,労働市場が均衡しておらず,正確な便益が計測できているわけではない。財市場,労働市場,土地市場が均衡するような新たなモデル概念を構築することができた。また対象地域としては名古屋市の影響も考慮できるように,拡大する予定である。そのため愛知県,静岡県,長野県について町丁目別に人口,産業別従業者数,土地利用,環境負荷原単位をGIS上で整備した。本年度は初年度にもかかわらず,交通を考慮した総合的環境評価モデルの成果を出せたことの意義は大きい。第1は都市形成に関する理論的研究の再考である。昨年度に理論をほぼ完成させたが,土地市場均衡条件に若干の不備がありこれを修正した。第2は三遠地域(愛知県東部と静岡県西部)を対象として,経済-交通-環境モデルを構築しているが,交通配分方法を確定均衡から確率均衡の考え方に変更した。このモデルを用い対象地域での道路整備により,どのような経済便益が発生するのか,またCO_2,NO_x,SO_x,浮遊粉塵などの環境負荷変化をシミュレーションし,昨年度の結果と比較検討を行った。さらにゾーン別の税収をシミュレーションし,国や自治体にどのようなメリットが在るのかも検討した。昨年度に引き続き財市場,労働市場,土地市場が均衡するような新たなモデル概念を検討した。また愛知県,静岡県,長野県について町丁目別に人口,産業別従業者数,農業データ,土地利用,環境負荷原単位をGIS上で整備した。本年度についても交通を考慮した総合的環境評価モデルの成果を出せたことの意義は大きい。本年度の研究は2つの方向にまとめられる。第1は都市形成に関する理論的研究の実証化である。昨年度の理論を改善し,成果をStudies in Regional Scienceに掲載することができた。この理論を実際のデータを用いてシミュレーションする枠組みを作り,本年の土木計画学研究発表会で発表する予定である。第2は対象地域の拡大を目指した新たなモデル概念の考察とデータ収集である。対象地域を愛知県全体と三遠南信地域(愛知県東部,静岡県西部,長野県飯田市周辺)とし,新たなゾーニングを設定した。従来は道路交通センサスBゾーンを用いていたが,この区分は小さくモデル構築が不可能と判断した。そのため愛知県西部,中部は複数市町村で区分し,愛知県東部,静岡県西部は市町村単位,南信地域は1ゾーンに設定した。このゾーニングに従い貨物流動,ゾーン間時間距離,その他社会経済データを整備した。現在コンピュータモデルを作成中である。昨年度の成果は年度末に完成したため,本年度は昨年度成果を広く学会発表した。この研究成果は国際的に多くの反響があった。本年度はこれまで三遠地域のみに行ってきたシミュレーション分析について,対象地域を拡大した。

すなわち対象地域を愛知県全体,静岡県西部,長野県南部とし,三遠南信地域全体を考察できるようにモデルを構築した。対象地域は31ゾーンから構成されている。そのうえでゾーン間の物流,人流,時間距離のデータを整備した。本年度は三遠南信自動車道完成の経済効果計測を試みた。実際の計測に当たっては,モデルを実際に計算するのではなく,交通経済学で用いられるショートカット法を用いた。この理由としてはモデルにおける立地選択確率の計算結果が極めて不安定であったため,より信頼の置ける手法を模索した結果である。ショートカット法とは一般均衡効果による交通需要曲線のシフトを考慮した消費者余剰を求めることである。計測結果は年間便益が244億円であり,年事業費は233億円から466億円の幅であった。本年度の成果は便益をやや過小評価している可能性があり,今後より精密な計測が必要とされる。
微小乳頭癌の悪性を規定する因子の探索

この研究は,前述の「MPCはエピジェネティックな変化に伴う,あるいは環境への適応の結果としての一過性の病態であり,生存能力及び浸潤転移に特化した細胞が集団発生したものである」との仮説を前提に,各種の癌腫における予後不良因子であることで知られるmicropapillary carcinoma (MPC)あるいはmicropapillary patternについて,MPCに悪性度をもたらしている条件を追求し,条件の操作によってMPCの悪性度をコントロールする方法を確立し,効果的な癌治療戦略に繋げることを目的とする。
都市高速道路橋の疲労損傷事例とその防止対策に関する研究

本研究は、昭和62年度から平成元年度の3年間にわたり、最近、重要な課題となってきている都市高速道路橋の疲労損傷の実例を調査するとともに、それらを未然に防止するための対策について一連の調査・研究を行ったものである。まず、初年度の昭和62年には、高速道路橋の疲労損傷の実例を調査するため、文献や報告書などを多数捨集して、それらの実例を分類・整理した。また、同時に、疲労損傷が起こった原因を究明するためには、どのような手法で解明すべきであるかについて検討を加えた。つぎに、昭和63年度には、疲労損傷の発生の要因の一つである応力集中現象を、有限帯板法や有限要素法を用いて解析する手法を開発し、実橋の発生応力を推定するために有用であることを示した。また、一方では、道路橋に作用している実働応力の実体をシミュレ-ションし、疲労損傷の解明に供しうる手法を開発した。さらに、鋼橋支承部のソ-ルプレ-トに、近年、頻繁に起こっている疲労損傷は、その原因の究明が急がれているので、これを実例として疲労損傷を防ぐための研究を行った。最後に、平成元年度には残された課題である疲労損傷を未然に防ぐための研究に取り組んだ。そのため、各機関で規準化されている構造詳細の標準図を集め、これについて疲労の面からどのような形式のものが好ましいかを検討した。また、鋼橋の設計・製作技術者を対象としたアンケ-ト調査を行って、疲労損傷を防止する構造詳細について種々な考察を行い、これらを今後の研究の資料に供することができるように、一冊の報告書としてまとめた。1.初年度である62年度は,学術雑誌および学術論文で公表されている疲労損傷事例の調査を行うとともに,各公団・公社の御協力のもとに都市高速道路橋に実際に発生している疲労損傷事例についても調査した結果,以下のような箇所に事例が発生していることがわかった.(1)横桁および対傾構と主桁腹板との取り付け部(ウェブ・ギャップ部)(2)横構および対傾構と主桁腹板との取り付け部(引張測)(3)桁端部切り欠き部腹板(4)鋼製橋脚の梁部材と柱部材との結合部(5)支承部のソールプレート端部のフランジプレートと腹板(6)桁端部のガセットプレート(7)桁中央部にあるガセットプレート(8)鋼床版とトラフリブおよび横桁との接合部(9)ランガー橋の吊材(風琴現象によるもの)(10)対傾構の下支材(とくに斜橋で発生)(11)アーチ橋のアチリブと端横桁との取り付け部(12)枝桁の分岐腹板部(13)標識柱の下端部および二股分岐点2.以上の損傷事例のうち,(1),(2),(6),(7),(10)の損傷原因を明かにするため,横溝,対傾溝および床版の効果を考療に入れた桁橋の構造解析プログラムを完成した.1.昭和63年度には、昭和62年度に調査した疲労損傷事例の原因を究明するため、以下の研究を行った。(1)鋼工桁橋の二次部材、あるいは、主桁と対傾構・横構及び横桁との取合部のガセット・プレートやウェブギャプ・プレートに発生する疲労亀裂の原因を明かにし、今後のこれらの構造詳細部の設計に役立てるために、床版や二次部材を含めた橋梁全体の挙動を考慮して、これらの部位の局部応力を精度よく解析できる一解析手法を開発した。(2)この解析手法を用いて、本年度には、横構および対傾構と主桁の垂直補剛材との取合部の局部応力解析を行った。(3)さらに、疲労強度を評価する上で重要となる応力レベルとその頻度について検討するために、実働荷重による橋梁部材の断面力をシミュレートするプログラムを開発した。

(4)また、現在、実橋において採用されている構造詳細図をもとにして、疲労設計という面から、これらの得失について議論を行い、問題点を抽出したり、改良案の提案などを行った。2.さらに、現場における実際上の問題点を摘出するために、橋梁製作メーカーを対象にして、種々の構造詳細の疲労強度に関する設計、施工、および補修上の現状と問題点についてのアンケート調査を行った。アンケート結果の整理については、平成元年前期に行う予定である。最終年度にあたる平成元年度には、この研究のもう一つのメインテ-マである都市高速道路橋の疲労損傷を未然に防止するための研究に取り組んだ。まず、建設省や各公団・公社、あるいは橋梁建設業協会で規格化されている構造詳細の標準図を入手して、それらに対し、これまで蓄積されてきた疲労に関する基礎知識にもとづき、今後、望ましい構造詳細について検討を加えた。つぎに、今まで鋼橋に採用されたことのある構造詳細を、もう少し広い立場から分類・整理しなおし、それらをもとにして、実際に鋼橋を設計したり、製作している技術者から、疲労損傷の実例とその補修方法、および今後の疲労損傷の防止方法に関する知見をアンケ-ト調査を行うことによって聴取した。そして、それらを疲労損傷防止の観点から分析のうえ、種々な考察を加えて一冊の報告書としてまとめた。なお、引きつづき研究すべき今後の課題としては、以下のものがあげられる。(1)疲労損傷の補修事例を通じて、種々な経験が積み重ねられているので、それを今後の資料とするため分類・整理する必要がある。(2)その際、現在までの疲労に関する研究成果を利用すれば、よりよき構造詳細に改良できるものがあるので、それに関する検討が必要である。(3)また、疲労損傷を防止するため、鋼構造技術者がもっている数々のアイデアをこの機会に聴取して検討する必要がある。(4)しかしながら、それらを含めて、都市高速道路橋の疲労損傷については、今後まだ検討を加えるべき点が多々ある。(5)たとえば、疲労の面からよい補強法であっても、座屈の面からは、よくない補剛法もあるので、両面から検討する必要がある。
要介護者への口腔ケアを修得させる介護マネキンと実習プログラムの開発・活用・評価

本研究は、要介護者の口腔内および全身を再現した介護マネキンを用いて、要介護者への口腔ケアの技能を修得するための実習プログラムを開発することを目的としている。これまでに、平成28年度は介護マネキン実習の導入に向けた準備として、以前に試験的に実施した介護マネキンを使用した実習にて得られた学生と教員からの評価を元にして、本マネキンを用いた要介護者への口腔ケアの手技を学ぶための動画教材を作製した。平成29年度は、対象者の学年や学習状況に合わせて動画教材の内容を修正し、改良を行った。また、改良した動画教材を用いた実習プログラムを立案し、実習を実施した。本実習プログラムの中では、動画教材視聴前にプレテスト、動画教材の視聴と実習の終了後にポストテストを実施し、動画教材および実習プログラムに関する評価を得た。多くの学生より、動画教材からは要介護者の口腔ケアの手技に関して多くの理解が得られたこと、さらに相互実習を通してより具体的な方法や注意点を体験的に学べたことなど、高い評価が得られた。平成30年度は、前年度に対象者から得た実習プログラムの評価について、プレテスト、ポストテストの結果から本実習プログラムによる学生の理解度を評価し、実習プログラムの学習効果を検討した。さらに動画教材の評価についても、動画から理解できたこと、その後の相互実習で理解、修得できたこと、また理解が不十分であったこと等について、詳細な評価を抽出した。実習プログラムに関しては、これらの評価結果をもとに改善点をリストアップし、次年度以降のプログラム実施に向け、対象者に合わせて適宜内容を調整できるよう準備を行った。作製した動画教材を用いて、介護者への口腔ケアの技能を修得するための実習プログラムを立案し、平成29年度に歯科衛生士養成機関2年生の学生30名を対象に実習プログラムを実施した。その際、実習の前後にプレテスト、ポストテストを実施し、動画教材および実習プログラムに関する評価を得た。得られた評価結果から、動画教材および実習プログラムの改善点を確認し、今後のプログラム実施に向けて内容を検討した。なお、当初研究対象者としていた学生のカリキュラムに変更が生じ、当初の計画通りの研究遂行が困難となったため、研究計画や対象者については予定を変更して実施した。また、研究者の勤務形態が非常勤雇用となったことも踏まえ、今後の研究遂行に際しては計画を再度検討中である。研究遂行計画の再検討:当初研究対象者としていた学生のカリキュラムに変更が生じ、当初の計画通りの研究遂行が困難となったため、今後の研究遂行にあたって対象者を再度検討する必要が生じた。本実習プログラムの実施方法の見直しとともに、研究対象者についても再度検討を行う。動画教材の改良開発:作製した動画教材について、視聴した学生からの評価結果をもとに、必要な資材を購入の上、改良や追加を行う。実習プログラムの修正:過去のプログラム実施において得られた評価結果をもとに、プログラムの修正を行う。特に、平成29年度の実施時には介護マネキンを使用した実習プログラムでなく、相互実習をプログラム内に組んでいたが、双方の実習を取り入れたプログラムの必要性についても再度検討する。この際、今後の研究対象者となる学生の学習状況やカリキュラムに合わせた内容とする必要があり、対象者に合わせたプログラムを構築する。平成28年度は、介護マネキン実習の導入に向けた準備として、以前に試験的に実施した介護マネキンを使用した実習にて得られた学生と教員からの評価より、本マネキンを用いた要介護高齢者への口腔ケアの手技を学ぶための動画教材を作製した。以前に使用した試験段階の介護マネキンは、口の開閉の調整が困難であること、口腔粘膜の硬さや質感が実際と異なることなどが改善点として挙がっており、これらの改良を計画していたが、その後、メーカーによる改良によりこれらの点が改善されたため、改良後のマネキンを使用することとした。動画教材の作製においては、以前に試験的に作製した動画教材の改善点として、全体の動きが分かる映像と、手元の細かな動きが分かる拡大像、さらには口腔内の正面からは見えない部分の拡大像があるとよいとの意見が挙がり、これらの点について改良を行えるよう、教材の素材となる動画像を撮影した。全体像では、口腔ケア時の立ち位置や実際の行動がわかるよう工夫した。また、口腔内での清掃用具の使用方法について、具体的な動作がわかるよう、口腔内の模型はマネキンから取り外した状態で細部への清掃用具の当て方や動かし方がわかるように撮影した。これらをマネキン上での操作時の手元映像と組み合わせて編集し、教育用の動画として一連の動き、細部の動作がわかるように工夫して動画教材を作製した。また、映像のみでわかりにくい場面にはテロップを挿入し、解説を加える工夫を行った。平成28年度は、計画していた動画教材の作製を行うことができた。当初の計画では、作製した動画教材を用いて実習プログラムを作成し、学部学生の授業にて実習を実施する予定であったが、実施予定の学科にてカリキュラム改正があり、それに伴う授業担当教員の変更等により、今年度は学生実習での活用には至らなかった。しかし、既に実習にて使用する予定の動画教材は作製済みであり、実習を行うための準備は進んでいる。また、動画教材に関して、その素材となる映像は様々な内容を撮影しており、実施者の評価に合わせて若干の修正をできる準備は整っている。今後の実習プログラムの実施にあたり、他の教育機関での実施に変更することも含めて実施場所を検討中であり、今後の実施に向けての準備は行えている。

平成28年度は、介護マネキン実習の導入に向けた準備として、以前に試験的に実施した介護マネキンを使用した実習にて得られた学生と教員からの評価を元にして、本マネキンを用いた要介護者への口腔ケアの手技を学ぶための動画教材を作製した。平成29年度は、以下の研究を実施した。1.動画教材の改良:実習の実施対象者の決定後、作製した要介護者への口腔ケアの手技を学ぶための動画教材について、対象者の学年や学習状況に合わせて若干の内容修正を行った。2.実習プログラムの実施:介護マネキンを用いて作製した動画教材を使用した実習プログラムを立案し、実習を実施した。当初の予定では、動画教材を視聴した後に介護マネキンを用いて実習する計画を考えていたが、学生に患者役を経験させ、口腔ケアを受ける側の体験をさせることを目的に加えたことから、動画教材視聴後に学生同士で相互実習を実施する形に計画変更して実施した。3.動画教材および実習プログラムの評価:本実習プログラムでは、動画教材視聴前にプレテスト、動画教材の視聴と実習の終了後にポストテストを実施し、動画教材および実習プログラムに関する評価を得た。多くの学生より、動画教材からは要介護者の口腔ケアの手技に関して多くの理解が得られたこと、さらに相互実習を通してより具体的な方法や注意点を体験的に学べたことなど、高い評価が得られた。平成28年度に作製した動画教材を用いて、介護者への口腔ケアの技能を修得するための実習プログラムを立案し、歯科衛生士養成機関2年生の学生30名を対象に実習プログラムを実施した。また、実習の前後にプレテスト、ポストテストを実施し、動画教材および実習プログラムに関する評価を得ることができた。本研究は、要介護者の口腔内および全身を再現した介護マネキンを用いて、要介護者への口腔ケアの技能を修得するための実習プログラムを開発することを目的としている。これまでに、平成28年度は介護マネキン実習の導入に向けた準備として、以前に試験的に実施した介護マネキンを使用した実習にて得られた学生と教員からの評価を元にして、本マネキンを用いた要介護者への口腔ケアの手技を学ぶための動画教材を作製した。平成29年度は、対象者の学年や学習状況に合わせて動画教材の内容を修正し、改良を行った。また、改良した動画教材を用いた実習プログラムを立案し、実習を実施した。本実習プログラムの中では、動画教材視聴前にプレテスト、動画教材の視聴と実習の終了後にポストテストを実施し、動画教材および実習プログラムに関する評価を得た。平成30年度は、前年度に対象者から得た実習プログラムの評価について、プレテスト、ポストテストの結果から本実習プログラムによる学生の理解度を評価し、実習プログラムの学習効果を検討した。
電気特性の変化を利用した肝障害時における肝viabilityの簡便な評価法の開発

1.目的近年、肝移植や肝切除術に際して臓器保存時の肝viabilityや虚血再潅流によって惹起される肝障害の程度の評価が希求されている。しかし、簡便な方法や装置でリアルタイムに評価できる方法は未だ開発されていない。一方、生体の誘導体としての電気特性は、臓器により異なり、また各臓器も構成単位である細胞の微細構造の変化や、細胞内液および外液の組成、および細胞膜の性質などの変化により誘電体としての特性が変化する。この変化は通電する周波数を変化させたとき電気的緩和現象の違いとなって観測される。そこで虚血再潅流にともなう肝の生化学的、組織学的変化を比較検討し、電気抵抗率と比誘電率の周波数特性の変化から肝viabilityを判定する事を目的にする。2.結果肝の虚血、再潅流を行い、周波数20Hzから1MHzにおいて、電気抵抗率を測定し、周波数特性の経時的変化を検討し、高速液体クロマトグラフィにて測定した肝組織高エネルギー燐酸化合物、経時的に測定した胆汁流量、および組織学的変化を比較した。電気抵抗率は虚血後直ちに上昇し、40分後最高値を示し、それ以降再潅流までは徐々に減少した。さらに再潅流とともに、急激に減少し、その後緩やかに減少した。比誘電率の変化は10kHz以下の低周波数域では虚血により低下し、再潅流により上昇した。虚血中の肝組織ATPは、虚血20分後まで急速に減少し、虚血前値の43.0±5.3%となり、その後は緩やかに減少し40分後には35.9±6.4%を示した。60分、120分虚血時間群では、電気抵抗率は虚血40分後に最高値をとるが、その後再潅流までの低下率が異なっていた。胆汁流量の回復率は、虚血時間が長くなるに従い胆汁流量の回復率は低値を示した。虚血中の電気抵抗率の最高値から再潅流直前値までの変化と、胆汁流量の回復率の間には、強い相関関係(r=0.997、1kHz)が認められた。虚血再潅流時の肝viabilityの評価には電気抵抗率の測定が良い指標になる可能性が示唆された。
ストップコドンリードスルーによるミエリン構成タンパク質の産生機構と機能の解明

末梢神経髄鞘タンパクL-MPZはP0 mRNAから読み飛ばしという特殊な機序でP0と共に産生される。また、末梢神経障害患者血液に抗L-MPZ抗体が存在する。そこで本研究ではL-MPZの産生機序と髄鞘での役割、抗体と脱髄の関連性を調べた。その結果、L-MPZ産生はP0 mRNAの配列に依存すること、L-MPZは細胞接着に働くことを明らかにした。一方、L-MPZ抗体自体は脱髄を起こさず、脱髄後の修復との関連性を調べる必要性が示された。また、L-MPZとP0の産生比率は髄鞘の接着性を変化させる可能性があるため、今後遺伝病の治療にリードスルー薬を用いるときは注意が必要であることが示された。末梢神経系ミエリンはシュワン細胞によって形成され、ヒトでは脱髄を伴う免疫性あるいは遺伝性末梢神経障害が知られている。申請者らは、末梢神経ミエリン特異的タンパク質であるMyelin protein zero (P0 or MPZ) mRNAのstop codon読み飛ばしにより通常のP0より大きいL-MPZが産生され、慢性脱髄性疾患患者やモデル動物の血清中に抗L-MPZ特異抗体が高率に存在することを見出した。脊椎動物の正常組織においてstop codon読み飛ばしで単一のmRNAから複数の機能分子が産生される例は報告がない。そこで、本研究では、1,この分子の正常ミエリンにおける機能を明らかにし、2.脱髄性疾患との関連性を調べ、3.stop codon読み飛ばし機構の解析とL-MPZを用いた読み飛ばし候補化合物評価系の確立を目的とした。本年度の実績は下記のとおりである。2.患者で検出される抗L-MPZ抗体と末梢神経障害との関連性を調べる目的で、抗L-MPZ抗体を持つラットを作製し、リゾレシチン脱髄時の脱髄巣の検討を行った。その結果、抗L-MPZ抗体存在下でも、急性期における脱髄巣の大きさ自体には影響しないことがわかった。抗体は主として慢性に脱髄を生じる患者で見られることが多いため、引き続き慢性期における抗体の関わりを検討中である。3.当初目的とした、L-MPZを利用した読み飛ばし候補化合物の評価系はすでに確立した。また、この系を用いて前年度にL-MPZ mRNAのストップコドン前後の配列と読み飛ばし効率との関連性を明らかにしたため、現在、論文準備中である。申請者らは、末梢神経ミエリン特異的タンパク質であるMyelin protein zero(P0 or MPZ)mRNAのstop codon読み飛ばしにより通常のP0より大きいL-MPZが産生され、慢性脱髄疾患患者やモデル動物の血清中にL-MPZ特異抗体が高率に存在することを見出した。そこで、本研究では、1.この分子の正常ミエリンにおける機能を明らかにし、2.脱髄性疾患との関連性を調べ、3.stop codon読み飛ばし機構の解析とL-MPZを用いた読み飛ばし候補化合物評価系の確立を目的とした。1.L-MPZはP0と同様にリン酸化を介してミエリン形成に働く可能性がある。そこでリン酸化部位に変異を入れた種々のcDNAを作製し、細胞に強制発現させ、リン酸化状態および細胞接着への影響を検討できる系を準備した。また、リードスルー促進薬G418をマウス腹腔内に投与し、坐骨神経におけるL-MPZ/P0比の変化とミエリン変化を検討した。2.L-MPZ特異的ペプチドを投与した動物で神経組織を検討したが、抗体価上昇のみでは脱髄は生じなかった。3.Myc-P0 cDNAを作製し、無細胞翻訳系で反応させMyc抗体でP0とL-MPZを検出した。G418を加えL-MPZ/P0比の上昇を確認し、誘導薬の定量的解析を可能とした。また、stop codon直後の配列に変異を入れたcDNAを作製し、読み飛ばし効率を比較した結果、P0自体読み飛ばし効率が良く、特に直後のCが効率に影響することを確認した。末梢神経髄鞘はシュワン細胞によって形成され、ヒトでは脱髄を伴う免疫性あるいは遺伝性末梢神経障害が知られている。

申請者らは、末梢神経髄鞘特異的タンパク質であるmyelin protein zero (P0 or MPZ)のmRNAのstop codon読み飛ばしにより産生されたL-MPZが髄鞘に存在し、慢性脱髄性疾患患者や脱髄動物の血清中に抗L-MPZ特異抗体が高率に存在することを見出した。本研究では、1.この分子の正常ミエリンにおける機能を明らかにし、2.脱髄性疾患との関連性を調べ、3.stop codon読み飛ばし機構の解析とL-MPZを用いた読み飛ばし候補化合物評価系の確立を目的とした。3に関する成果は昨年度に報告した。1.L-MPZの髄鞘での機能を調べるため、前年度に作製したL-MPZ, P0,リン酸化部位に変異を持つcDNAを各々安定発現する細胞を用いて接着実験を行った。その結果、L-MPZ同士あるいはL-MPZとP0のヘテロ結合による細胞接着性が明らかとなった。L-MPZはP0と同じ細胞外ドメインを持つがP0に比べて接着性が低く細胞内ドメインが長いことから、P0とL-MPZの比率の違いによって髄鞘の層間の厚さや接着性が異なる可能性が示唆された。2. CIDP患者で高い抗L-MPZ抗体価が認められるが、ラットやマウスでは抗体が存在しても脱髄は生じず、血清中に抗体を持つ動物でリゾレシチン脱髄を生じさせても脱髄巣自体の大きさは変わらないことから、抗体による脱髄誘導作用は認めなかった。しかし、低抗体価ながら健常人の中にも長期間抗L-MPZ抗体陽性な一群があることからCIDP治療に用いるIgG製剤を調べたところ、製剤自体が抗L-MPZ抗体を含むことがわかった。このため今後逆の観点から抗L-MPZ抗体と脱髄疾患との関連性を調べていく必要があることが本研究で明らかとなった。分子神経生物学当初の実験計画では、1.L-MPZのミエリンにおける機能の解析、2.脱髄病態におけるL-MPZの役割の検討、3.L-MPZ産生に対する読み飛ばし機序の関与と読み飛ばし薬候補化合物評価系の確立を予定した。このうち、3に関しては、すでにmycをN末につけたP0 cDNAを前年度に作製したことにより、myc抗体を用いた読み飛ばし効率の解析が可能となったため、当初の目的に到達している。また、この系を用いて読み飛ばし効率を比較した結果、stop codon前後の配列が読み飛ばし効率に重要であることを前年度に明らかにしたため、現在、論文準備中である。1に関して、L-MPZの機能、特に細胞接着に関する機能を調べるために、前年度にコンストラクトを終え、強制発現系を用いた接着実験を行う予定であった。しかし、一過性発現系では発現効率の問題等により接着実験を行うことが困難であったため、これらのcDNAをpEB-Multiベクターに入れ替え、L-MPZあるいはリン酸化部位を変異させたL-MPZの安定発現細胞をそれぞれ新たに樹立した。このため、当初の計画から多少の遅れが出ている。2に関しては、L-MPZ抗体と脱髄との関連性に関して、引き続き実験中である。以上の理由から、一部遅れはあるものの、当初の計画どおり親展していると判断した。本年度当初の実験計画では、1.L-MPZのミエリンにおける機能の解析、2.脱髄病態におけるL-MPZの役割の検討、3.L-MPZ産生に対する読み飛ばし機序の関与と読み飛ばし薬候補化合物評価系の確立を予定した。実績に記したとおり、1.ではP0およびL-MPZの細胞内ドメインのリン酸化部位それぞれに変異を入れたコンストラクトの作製を予定どおり終了し、細胞への強制発現が可能となった。今後この系を用いて細胞接着の検討を行うことで、L-MPZの機能解析およびこの分子の機能調節部位を解析することが可能となる。
高分子ナノミセルによるドラッグデリバリーシステムを利用した婦人科腫瘍の治療戦略

子宮頸癌はヒトパピローマウイスル(HPV)感染によって発症すると考えられる。HPVの癌蛋白であるE6はヒトの癌抑制蛋白をユビキチン化を介して分解する。プロテアソーム阻害剤はその標的蛋白の分解を阻害する。我々は、プロテアソーム阻害剤MG132内包ミセルを作成し、子宮頸癌のマウス皮下移植腫瘍に対して、このミセルが強い抗腫瘍効果を持つことを示した。この研究はドラッグデリバリーシステムをもちいた新規治療戦略となり得る。子宮頸癌の発症およびその不死化にはHPVの癌蛋白E6によるヒトの癌抑制蛋白のユビキチンプロテアソーム系による分解が深く関与している。このメカニズムをプロテアソーム阻害剤により遮断することにより子宮頸癌の進展を阻害できる可能性がある。近年のドラッグデリバリーシステムの進歩により、ミセルにこのプロテアソーム阻害剤を内包させることにより、薬剤の安定化とその効果の持続を試みた。MG132内包ナノミセルは主要組織への集積性を獲得し、その高い抗腫瘍効果が確認された。マウス移植腫瘍において、MG132内包ナノミセルはE6の分解の標的となる癌抑制蛋白の発現を回復することにより、抗腫瘍効果を示すと考えられた。我々は、プロテアソーム阻害剤であるMG132をナノミセルに内包化するシステムを東大工学部の片岡研と共同で開発した。ミセルの直径は約100nmであった。このMG132内包ナノミセルをもちいて、その血中での安定性を調べるために、ミセルに蛍光ラベルを付着させ、マウスの尾静脈から投与し、蛍光色素の発現を調べることにより、安定性を検討した。また、HPV18型陽性のHela細胞にGFPの蛍光を発現させた細胞をマウスに移植して、GFPを発現したHela細胞にミセル化したMG132が集積するかを、in vivo共焦点顕微鏡で証明した。また、移植した頸癌由来細胞の移植腫瘍がMG132内包ナノミセルにより著明に縮小することを示した。ミセル化したMG132は効率に腫瘍においてE6癌蛋白の分解の標的蛋白の発現を回復することにより、強い抗腫瘍効果がもたらされることが分かった。子宮頸癌の発症にはヒトパピローマウイルス(HPV)のE6およびE7癌蛋白による感染宿主であるヒトの癌抑制蛋白のユビキチン化を介する分解が深く関与している。E6癌蛋白はヒトの癌抑制蛋白p53を分解することでアポトーシス誘導の阻害により癌化に関わっている。この癌抑制蛋白の分解に関わる系を抑制する機能を持つものにプロテアソーム阻害剤がある。我々はプロテアソーム阻害剤であるMGI32内包のミセルによる新規ドラッグデリバリーシステムを開発した。また、E6癌遺伝子に対するsiRNAを同様にミセルに組み込むことに成功した。ヌードマウスの皮下に頸部腺癌から樹立されたHeLa細胞を移植し、マウスの尾静脈からMG132内包ミセルを投与し、ミセルの腫瘍集積性と抗腫瘍効果を検討した。また、子宮頸部腺癌の発生に関与すると考えられるHPV18型のE6遺伝子の発現を抑制し得るsiRNAをデザインし、そのE6遺伝子発現抑制効果を検討した。方法としては、E6により分解の標的となる癌抑制蛋白であるp53や膜に発現するhDlgやhScribの発現の上昇をウエスタンブロット法等で検討した。蛍光でラベルしたMGI32内包ミセルはヌードマウスの皮下に移植した頸癌の腫瘍に集積し、裸剤に比べ、強力な抗腫瘍効果を持つことが示された。投与したマウスの血中におけるミセルの安定性を調べたところ、裸剤のMG132に比べ、ミセル化したMGI32は長期にわたり、薬剤として安定であることが示された。HPV18型のE6遺伝子の発現を抑制し得るsiRNAをデザインし、HeLa細胞においてこのsiRNAをトランスフェクションしたところ、E6により分解の標的となる癌抑制蛋白であるp53や膜に発現するhDlgやhScribの発現の上昇をウエスタンブロット法や蛍光抗体染色により確認した。子宮頸癌の発症および進展にはHPVE6癌タンパクによるp53等の癌抑制蛋白のユビキチン化を介する分解が深く関与している。ユビキチン化された分解の標的蛋白はプロテアソームにおいて分解される。我々はプロテアソーム阻害剤MG132をナノミセルに包埋することにより、腫瘍へ高率に集積させる新規ドラッグデリバリーシステムを開発した。我々が開発したMG132内包ナノミセルに蛍光ラベルを加え、HPV陽性子宮頸がん由来細胞株HeLa細胞のヌードマウス移植腫瘍への集積性を証明した。マウスの尾静脈から静脈内注射したMG132内包ナノミセルは、裸剤と比べ、血中の滞留時間も延長した。MG132単独でも移植腫瘍の縮小効果を認めたが、MG132内包ナノミセルの投与により、腫瘍はほぼ消失した。裸剤およびMG132内包ナノミセルを投与した移植腫瘍において、ウエスタンブロットにてHPVE6癌

タンパクの分解の標的となる癌抑制タンパクの子宮頸がん組織中での回復を確認した。分解の標的癌抑制蛋白のうち、核内蛋白であるp53は核内に発現が回復し、膜蛋白であるhuman Scribbleは膜で発現が回復した。MG132内包ナノミセル投与により縮小した移植腫瘍ではアポトーシスが誘導された。また、MG132裸剤はHPV陰性の子宮頸癌由来細胞株に対しては抗腫瘍効果を示さなかったが、MG132内包ナノミセルはHPV陰性の子宮頸癌由来細胞株に対しても強い抗腫瘍効果を示した。現在、多発性骨髄腫においてはボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤が保険適応されている。今回我々の開発したMG132内包ナノミセルはその新規ドラッグデリバリーシステムを使用することにより、より効果の高い抗腫瘍効果を示すため、新たな治療戦略となり得る。子宮頸がんにとどまらず、他の癌種においても、新たな治療の選択肢を広げる可能性が示された。我々は既に全世界的にみても初めてプロテアソーム阻害剤であるMGI32のミセル化に成功した。このミセルを用いてマウスの子宮頸癌モデルにおいて、本薬剤が強力な抗腫瘍効果を持つことを示した。下記に記述するように本剤を用いて特許を取得した。24年度が最終年度であるため、記入しない。子宮頸部腺癌の発生に関与すると考えられるHPV18型のE6遺伝子の発現を抑制し得るsiRNAをテザインし、そのE6遺伝子発現抑制効果を検討しているところである。この新規のE6遺伝子をターゲットとしたsiRNA封埋ミセルが上述のMGI32封埋ミセル同様に高い抗腫瘍効果を示せば、新たな子宮頸癌の治療戦略の一つとなる。
核内受容体PXRの免疫応答における役割の解明

核内受容体のひとつであるPXRがT細胞の分化、維持においてどのよう役割を果たしているかを検討した。マウスのCD4陽性T細胞においては、いずれのサブセットにおいてもPXRの発現は確認できなかった。一方、ヒトT細胞株であるJurkatでは刺激によりPXRの発現が上昇し、刺激時にヒトPXRのリガンドであるリファンピシンを加えると、IL-2の発現が誘導された。OVA特異的T細胞レセプターを強制的に発現し、遺伝子再構成活性化遺伝子2を欠損しているDO11.10 Rag2欠損マウスの脾臓、リンパ節からCD4陽性細胞と抗原提示細胞をMACS(磁気ビーズ)を用いて精製し、抗原や各種サブセットの培養に必要なサイトカインと共にin vitroで培養した。Th1、Th2、Th17、Treg細胞等に分化後、各サブセットに特徴的な転写因子の発現を元にフローサイトメーターで精製し、精製した細胞からmRNAを抽出し、PXR発現量をリアルタイムPCRにて測定した。しかしながら、いずれの細胞においてもPxrの発現は確認できなかった。また、これらの細胞をマウスの既知のPxrリガンドであるPCNで処理したところ、Pxrによって発現誘導されることがしられているMDR1の発現に変動は見られなかった。そこで、次に、Pxrの発現に関与しており、T細胞に作用することが知られているデキサメタゾンでこれらの細胞を処理した。デキサメタゾンの受容体であるグルココルチコイドレセプターはいずれの細胞でも発現が確認された。さらに各T細胞に特徴的なサイトカインの発現が抑制されたものの、Pxrの発現誘導はみられなかった。現在、正常マウスや薬物投与マウスからMACSビーズを用いて各種免疫細胞を分画し、どの細胞群にPxrが発現しているか検討を行うと共に、免疫担当細胞ではほとんど検討されていない他の核内受容体群の発現についても並行して測定している。DO11.10 Rag2欠損マウスから採取したCD4陽性細胞と抗原提示細胞を、抗原や各種T細胞サブセットの培養に必要なサイトカインと共にin vitroで培養して分化した。精製した細胞におけるPXRの発現を測定すると、いずれのサブセットにおいてもPXRの発現はほとんど確認できなかった。そこでPXRの発現を誘導すること、T細胞に作用することが知られているデキサメタゾンで細胞を処理した。いずれのサブセットにおいても各T細胞に特徴的なサイトカインの抑制が確認されたものの、PXRの発現誘導はみられなかった。そこで、PXRを強制的に細胞に発現させて検討を行うために、PXRの発現プラスミドの構築を行うこととした。具体的には、cDNAライブラリーをテンプレートとし、PCR法によってPXRを増幅した。得られたPCR産物をクローニングベクターに挿入し、大腸菌を形質転換後、クローンよりプラスミドを調整した。シーケンシングを行い、得られたプラスミドの配列に人為的な変異が導入されていないことを確認後、哺乳動物細胞で発現させるために、哺乳動物細胞用発現ベクターへの組み替えを行った。再度配列の確認を行い、プラスミドを大量に調整した。また、P-糖タンパク質(P-gp)をコードする遺伝子であるMDR1はPXRにより発現が誘導されること、T細胞に発現していることの両方が知られていることから、きちんとPXRが発現・機能していることを確認するために、MDR1の転写制御領域のクローニングを行い、ルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだレポータープラスミドの作成を行った。本年度は、各種サブセットに分化させたT細胞におけるPXRの役割を具体的に検討する予定であったが、DO11.10 Rag2欠損マウスのT細胞においてはPXRの発現がほとんど確認できなかった。そこで、当初計画を若干変更し、in vitroにおける強制発現系を構築するために、PXRなどの核内受容体やレポータープラスミドの構築に取り組んだ。平成27年度、構築したPXR発現プラスミドを、Electroporation法により細胞にトランスフェクションしたところ、PXRの発現を確認することができなかった。更に、PXRにより発現が誘導されること、T細胞に発現していることの両方が知られているMDR1の転写制御領域をルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだレポータープラスミドと共にトランスフェクションを行い、ルシフェラーゼ活性を測定しても発現の上昇は認められなかった。そこで、PXR発現プラスミドの再構築を行った。具体的には、pEFベクターを制限酵素処理し、pEGFPのマルチクローニングサイトに挿入し、pEF-EGFPベクターを作成した。N末、C末に制限酵素サイトを付加したプライマーを用いて、初めに構築したPXRのプラスミドより、遺伝子の増幅を行った。得られたPCR産物を制限酵素処理後、pEF-EGFPに導入し、pEF-PXR-EGFPプラスミドを作成した。大腸菌に形質転換後、クローンよりプラスミドを調整した。調整したプラスミドを細胞にトランスフェクションし、その後、フローサイトメーターで蛍光強度の解析を行った。PXRをトランスフェクションした細胞では、トランスフェクションしていない細胞と比較し、蛍光強度の増加が認められた。また、抗原特異的T細胞サブセットから、薬物代謝に関連しているPXR以外の複数の核内受容体の発現を測定したところ、遺伝子Xの発現が認められ、本遺伝子がCD4陽性T細胞の機能に関与している可能性が示唆された。平成27年度、構築したPXR発現プラスミドを用いて、T細胞での役割を解析する予定であったが、遺伝子発現がうまく確認されず、計画を変更して、再検討が必要となったため。