hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｉｎ　ｖｉｖｏ細胞イメージングモデル開発による集団細胞移動機構の解明

集団細胞移動機構は“細胞間シグナル相互作用"を含めた解析が必要であるが、集団細胞挙動解析に適した可視化モデルは十分とはいえない。我々は、集団細胞移動のモデルとしてin vivoでの細胞挙動観察が容易なゼブラフィッシュの側線原基を利用し、細胞挙動可視化トランスジェニックラインを作製と細胞内シグナルおよび細胞骨格制御との相互関係の統合的解析を行った。さらに、ゼブラフィッシュでの遺伝子機能解析の新手法として、BNA/DNAキメラオリゴマーを用いたアンチセンス法を確立した。集団細胞移動機構は、単一細胞の細胞移動解析研究だけでは、解明することができず、異なったパラダイム"細胞間シグナル相互作用"を含めた解析が必要である。しかしながら、集団細胞挙動解析に適した可視化モデルは十分とはいえない。そこで、集団細胞移動のモデルとしてin vivoでの細胞挙動観察が容易なゼブラフィッシュの側線原基を利用する。本年度は、側線原基細胞集団全体で発現するGal4ラインとして、ClaudinBプロモータ-下流で、Gal4と赤色蛍光タンパク質RFPの融合タンパク質発現させるトランスジェニックラインを複数作成したが、目的通りの側線原基での発現が見られるラインの確立には至っていない。一方、エンハンサートラップ法によって、Gal4がランダムにゲノム中に挿入されたトランスジェニックラインから、側線原基の一部でGal4が発現するラインを複数得る事ができた。また、細胞間シグナルとして重要なNotchシグナルの変異体mibでは、側線原基の移動が遅れることから、Notchシグナルが側線原基の移動に関与する事を明らかにした。また、細胞挙動可視化トランスジェニックラインとして、Lifeact-GFPをGal4転写因子の応答配列であるUASの下流に配置したUAS; Lifeact-GFPを作成し、ラインとして確立中である。Notchシグナル変化における側線原基細胞挙動の詳細を解析するため、このラインをMib変異体との交配を行っている。本年度は、連携研究者である川上浩一国立遺伝研教授との共同研究により、Gal4がランダムにゲノム中に挿入されたトランスジェニックラインの中から、側線原基にGal4の発現が認められるラインを入手し、トランスジェニックラインを系統確立した。さらに、細胞間シグナルの可視化モデル動物の系統確立・解析として、Notch応答性プロモータ配列TP-1プロモータを用い、その下流にGFP遺伝子をつなげたレポーターを持つトランスジェニックモデルを確立した。そのレポーターの発生期での発現経時変化を解析した結果、主な発現部位として嗅覚系細胞や心臓が認められたが、神経系での発現は見られなかった。また、側線原基細胞移動を時空間的に解析するための細胞骨格挙動イメージングモデル開発として、アクチン挙動をライブ可視化するため、UAS配列下流にF_Actinを認識するペプチドLifeact-GFPトランスジェニックラインを確立した。さらに、Notchシグナル変異体バックグラウンドでの側線原基細胞のアクチン挙動を観察するため、このトランスジェニックラインとNotchシグナル変異体とを交配し、次世代を生育中である。集団細胞移動機構は、単一細胞の細胞移動解析研究だけでは、解明することができず、異なったパラダイム“細胞間シグナル相互作用"を含めた解析が必要である。本研究では、集団細胞移動のモデルとしてin vivoでの細胞挙動観察が容易なゼブラフィッシュの側線原基を利用する。他方、細胞挙動の可視化を選択的かつ高感度で行うための手段として、すべての組織器官での細胞移動観察にも利用可能な汎用性が高い、細胞挙動可視化トランスジェニックラインを開発する。また、集団細胞移動に必須の細胞間シグナル相互作用の一つがNotchシグナルである可能性を検討し、細胞内シグナルおよび細胞骨格制御との相互関係の統合的理解を目指す。本年度は、計画目標2)細胞内・細胞間・細胞骨格挙動イメージング動物モデルの作製と計画目標3)側線原基細胞集団全体のライブ観察動物モデルと細胞内・細胞間・細胞骨格挙動イメージング動物モデルを用いたin vivoでの細胞間シグナルによる集団細胞移動制御機構の解明を行った。計画目標2)として、昨年度に引き続き、細胞骨格の挙動をライブ観察を可能にするトランスジェニックラインの系統確立を行った。F-Actinを認識するペプチドLifeactや微小管に結合するタンパク質MAP, EB1の融合蛍光タンパク質などをUAS配列プロモータ支配下で発現するトランスジェニックラインを確立した。計画目標3)上記で作製したゼブラフィッシュトランスジェニッククラインを用いて、Notchシグナルを変化させた場合、Notch細胞内領域過剰発現による活性化、Notchシグナル変異体、アンチセンスオリゴによるNotchシグナル関連遺伝子群の機能阻害を行い、Notchシグナルによる集団細胞移動制御の関与を明らかにした。

上記過程でBNAアンチセンスオリゴのゼブラフィッシュでの有用性を明らかにした。23年度に終える予定であった、微小管に結合するタンパク質MAP,EB1などと蛍光タンパク質GFPを結合させた融合タンパク質を発現する細胞骨格挙動可視化トランスジェニックラインの確立が現在も進行中である。。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、計画目標2)細胞内・細胞間・細胞骨格挙動イメージング動物モデルの作製と計画目標3)側線原基細胞集団全体のライブ観察動物モデルと細胞内・細胞間・細胞骨格挙動イメージング動物モデルを用いたin vivoでの細胞間シグナルによる集団細胞移動制御機構の解明を行う。Notchシグナル関連遺伝子群の機能阻害、gammasecretase阻害剤など)に、側線原基細胞の細胞骨格挙動や細胞内シグナル活性化に変化が見られるかどうかを調べる。側線原基細胞集団全体と集団内個別細胞、両者を統合的に解析し、Notchシグナルによる集団細胞移動制御の仕組みを明らかにする。
骨格形成におけるRunx2によるFGFシグナル調節機構の解明

Prrx1プロモーターを用いて頭蓋と肢芽の未分化間葉系細胞にRunx2を過剰発現したマウスでは、頭蓋縫合早期癒合と四肢の形成異常を呈した。これは、FGFR1, FGFR2の機能獲得型変異と類似した表現型であり、Runx2がFGFシグナルを調節している可能性を示唆している。まず、Prrx1プロモーターRunx2トランスジェニック(tg)マウスの肢芽形成過程を解析した。胎生10日および10.5日の野生型およびRunx2 tgマウスの胎児を用いて、whole mount in situ hybridizationにて、FGF10, FGF4, FGF8, Shhの発現を比較検討した。野生型マウスでは、肢芽の間葉系細胞にFGF10、AERにFGF4, FGF8, ZPAにShhを発現していた。一方、Runx2 tgマウスでは、肢芽の間葉系細胞にFGF10を発現していたが、AERでのFGF4, FGF8の発現、ZPAでのShhの発現を認めなかった。また、胎生10.5日の組織切片で、野生型マウスでは、Runx2は検出されず、AERにFGF8を検出した。またTUNEL染色でAERに少数の陽性細胞を検出した。一方、Runx2 tgマウスでは、肢芽全体にRunx2が検出され、AERにはFGF8を検出しなかった。また、AERのTUNEL陽性細胞は増加していた。次にPrrx1プロモーターGFP tgマウス(コントロール)とRunx2 tgマウスの胎生10.5日の肢芽の部分から細胞懸濁液を調整、FACSを用いて、GFP陽性細胞を集めた。RNAを抽出後cDNAに逆転写、リアルタイムPCRにて、FGFR1, FGFR2, FGFR3の発現を調べた。Runx2 tgマウスでは、FGFR1b, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3b, FGFR3cの発現上昇を認めた。したがって、Runx2は、FGFシグナルに影響を及ぼすことが明らかとなった。Runx2トランスジェニック(tg)マウスの肢芽におけるFGFの発現をwhole mount in situ hybridizationで検討した結果、その発現に異常をきたしていた。Prrx1プロモーターGFP tgマウス(コントロール)とRunx2 tgマウスの胎生10.5日の肢芽の部分から細胞懸濁液を調整、FACSを用いて、GFP陽性細胞を集めた。RNAを抽出後cDNAに逆転写、リアルタイムPCRにて、FGFRの発現を調べた。Runx2 tgマウスでは、FGFRの発現が上昇していた。さらに、初期培養骨芽細胞でRunx2の発現をsiRNAを用いて抑制するとFGFRの発現を低下させた。次にsiRNAを用いてFGFRの発現を抑制すると、骨芽細胞の増殖に影響を及ぼした。したがって、Runx2は、FGFRの発現を調節し、頭蓋縫合早期癒合の発症に関与することが示唆された。口腔外科学(2)上記の胎児の切片を用いて、Runx2, FGFR1, FGFR2のin situ hybridizationを行う。Runx2は、免疫染色で調べた。FGFR1, FGFR2の発現は、肢芽組織よりRNAを抽出、それらのアイソフォームを含めてリアルタイムRT-PCRで調べ、結果も得られた。(3) Runx2 tgマウスのトランスジーン発現細胞におけるFGF、FGFRの発現解析。Prrx1プロモーターGFP tgマウスとRunx2 tgマウスの胎生10.5日の肢芽の部分から細胞懸濁液を調整、FACSを用いて、GFP陽性細胞を集めRNAを抽出、リアルタイムPCRにて、FGF10, FGF4, FGF8, FGFR1, FGFR2, FGFR3の発現を調べた。また、アイソフォーム特異的なプライマーを用いて、FGFR1, FGFR2, FGFR3それぞれのIIIbとIIIcアイソフォームの発現を調べた。これらも結果が得られている。したがって、予定通りに進んでいる。(1)骨芽細胞におけるRunx2によるFGFシグナル調節機構の検討1新生児の頭蓋冠をコラゲナーゼ処理して集めた骨芽細胞にRunx2発現アデノウイルスを感染させ、リアルタイムRT-PCRにて、FGF10, FGF4, FGF8, FGFR1, FGFR2, FGFR3の発現を調べる。また、アイソフォーム特異的なプライマーを用いて、FGFR1, FGFR2, FGFR3それぞれのIIIbとIIIcアイソフォームの発現を調べる。2上記初代培養骨芽細胞に、Runx2のsiRNAを導入、上記で誘導された遺伝子が抑制されるか検討する。(2) FGFR1, FGFR2, FGFR3による骨芽細胞分化・増殖調節機構の解析1初代培養骨芽細胞にFGFR1, FGFR2, FGFR3のsiRNAを導入、MTTアッセイで細胞増殖に対する効果を検討する。3つのレセプター間で機能重複の可能性があるので、FGFR1, FGFR2, FGFR3単独のsiRNAの導入の他、それぞれ2つの組み合わせ(FGFR1とFGFR2等)あるいは3つ全て導入する実験も行う。2上記と同様にsiRNAを導入、アルカリフォスファターゼ染色およびvon Kossa染色により骨芽細胞分化に対する効果を検討する。また、アルカリフォスファターゼ活性およびCa量の測定により定量解析する。

さらに、RNAを抽出、骨芽細胞マーカー(Runx2、Osterix、I型コラーゲン、オステオポンチン、骨シアロ蛋白、オステオカルシン)の発現を調べる。試薬をキャンペーン期間中に購入し、当初の計画より安く入手できたため。培養実験で使用するプラスッチック器具、培養液、ディスポーザブルピペットを購入する。
急性心筋梗塞に対する再灌流後短期的迷走神経刺激治療法の確立

社会の高齢化、肥満の増加、各種心疾患の治療の進歩に伴い、心不全の患者数は増加の一途をたどっている。心不全の基礎疾患には心筋梗塞が最も多く、心筋梗塞後にいかに心不全の発症を防止するかが、重要な課題となっている。本研究は、急性心筋梗塞に対する再灌流治療後に実施する短期的迷走神経刺激治療法を確立することを目的とした。ウサギおよびイヌにおいて、均質な虚血領域の作成が可能な新しい虚血再灌流モデルを確立した。急性心筋梗塞に対する再灌流治療後に3日間の経皮経血管的迷走神経刺激を行うことにより梗塞サイズを縮小させることができた。ウサギの右頸部迷走神経に神経刺激用電極を植え込み、2週間後に、左室弁輪部にナイロン糸をかけて左冠動脈回旋枝を閉塞し、1時間後に再灌流を行った。迷走神経刺激治療群と非治療群に無作為に振り分けて、治療群では再灌流後30分より迷走神経刺激(心拍数を710%低下させる強度で1分間に10秒の間欠刺激)を3日間行った。心筋梗塞後3日間、心電図連続記録を行ったが、平均心拍数および心室性期外収縮の発生数は、治療群と非治療群に有意差を認めなかった。心筋梗塞28日後、心臓カテーテル検査による血行動態に治療群と非治療群に有意差を認めなかった。心筋梗塞28日後の梗塞サイズの評価でも、梗塞領域/リスク領域(治療群:30.1±9.7%、非治療群:36.2±16.5%)、梗塞領域/左室(治療群:8.7±2.6%、非治療群:8.4±4.1%)と治療群と非治療群に有意差を認めなかった。これらの結果はこれまでの研究結果(迷走神経刺激によって梗塞領域が縮小する)と一致せず、各群内での梗塞サイズに大きなばらつきが認められることから、モデルの不均一性が一因と考えられた。このため、均一なウサギ虚血再灌流モデルの確立を目指して検討を行った。外径1.22mmのポリエチレンチューブを用いて冠動脈造影を行い、梗塞作成手技によって閉塞される血管を確認した。ウサギ冠動脈は前下行枝、回旋枝、左室枝に大きく分岐し、左室枝が弁輪部付近を走行するものと弁輪部から離れて走行する個体が存在した。左室弁輪部にナイロン糸をかける手技では、回旋枝のみが閉塞される個体と、回旋枝と左室枝が閉塞される個体が存在した。均一な梗塞サイズを作成するためには、前下行枝を対象とするか、回旋枝と左室枝を閉塞するために弁輪部から左室基部1/3程度を一塊としてナイロン糸をかける必要があり、必要に応じて冠動脈造影によって閉塞を確認すべきであることが明らかとなった。予期せずに、これまでに報告されてきた研究結果を再現できなかった。このため、実験モデルについて基礎的検討を行った。その結果、これまでに広く報告されているウサギの回旋枝結紮による心筋梗塞モデルでは梗塞サイズのばらつきが非常に大きいことが明らかとなった。このため、均一な梗塞サイズを作成できる実験モデルを確立する必要が生じ、予定通りに研究を実施するに至らなかった。しかしながら、本年度の研究により冠動脈造影を併用したウサギの虚血再灌流モデルを確立し、これまで広く用いられてきたウサギ虚血再灌流モデルよりも確実で均質な虚血再灌流モデルでの実験が可能となった。H28年度は、確立した均一な梗塞サイズを持つウサギ虚血再灌流モデルを用いて、H27年度に実施した【迷走神経刺激による初期リモデリング抑制効果および不整脈抑制効果の検討】を再度実施し、実施予定であった【迷走神経刺激が心筋梗塞後の炎症反応やその後の治癒過程(線維化・心筋再生等)に及ぼす影響の検討】を実施する。H28年度に実施予定であった【迷走神経刺激が心筋梗塞後の電気生理学的性質に及ぼす影響の検討】については、内容を一部削減し、虚血再灌流後の迷走神経刺激の影響についてのみ検討を行うこととする。H29年度は予定通りの研究を実施する。循環器病学試薬の購入量が予定より少なかったために生じたが、差額はわずかであり、ほぼ予定通りに執行した。生じた次年度使用額はH28年度に試薬の購入にあてる。
機能的磁気共鳴画像と磁気刺激の併用法によるヒト基底核-皮質ループの可塑性の研究

MRIとTMSを組み合わせた研究を継続すると同時に、パーキンソン病類縁疾患での脳可塑性を検討した。また、加えて、TMSによるヒト脳可塑性を検討するなかで、正常者において年齢とともにM1可塑性が低下する傾向をもつことを発見した。ドパミンと線条体の神経可塑性の密接な関連が報告されているが、従来は他の部位での神経可塑性との関連は未解明であった。われわれは、ヒトを対象として運動皮質可塑性がドパミンによって調節される現象を初めて報告した(Ueki, et. al., 2006)。この研究を発展させ、多系統萎縮症(MSA)2名と皮質基底核変性症(CBD)2名について、運動皮質可塑性を検討する実験を行った。これらの疾患でもパーキンソン病と同様に運動皮質可塑性が低下していたが、パーキンソン病ではドパミン投与で可塑性が回復したのとは対照的に、可塑性低下はドパミン製剤の投与によって改善しなかった。この実験結果からは、ドパミンの有無そのものではなく基底核-皮質ループの機能障害とM1可塑性に関連性があることが示唆された。TMSによる連合性ペア刺激を用いた可塑性の研究をすすめるなかで、神経疾患だけではなく、正常のagingの影響だけでも脳可塑性が変化する可能性に思い至った。20から70歳の正常被験者40名での連合性ペア刺激による脳可塑性と年齢との間に統計的に有意な相関(R = 0.33)を得た。このagingの影響がM1での皮質内回路の変化によるものか、基底核-皮質ループに関連したものか、は不明で、今後の検討が必要である。M1での可塑性とドパミンとの関連について、基底核-皮質ループの機能障害との関連性を示すことができた。また、正常被験者においてagingによって可塑性が低下することも示された。今後の展開としては、患者群でのMRI-TMS同時記録で、可塑性のメカニズムと基底核-皮質ループの関連についてさらに研究を進めることを目標としている。我々は、平成17年度研究成果として、パーキンソン病患者では、反復経頭蓋的磁気刺激法(rTMS)によって誘導される運動皮質可塑性が低下していることを報告した(Ueki et al.,2006)。平成18-9年度では、この研究テーマを発展させ、rTMSとMRIの併用法という新しい手法を用いて、運動皮質だけでなく、基底核-皮質ループの可塑性を解明しようとしている。BOLD信号変化を検出する通常のfMRIではなく、臨床にも応用されているMRI拡散強調画像法(DWI)によって、脳の可塑的変化を非侵襲的に解明する手法を開発中である。DWIは、細胞内水分子の拡散運動の程度を測定して脳細胞内の変化を評価する特徴がある。我々はこのDWIの特性に着目し、脳内水分子拡散能の変化を通してrTMSによる可塑性変化(低頻度の1Hz刺激では刺激部位の活動性が抑制される)を可視化できるか検証した。rTMSによるヒト脳内の水分子の分布パターンの変化を検出するため、健常人に対して、左一次運動野に10分間のrTMS(1Hz)を施行し、前後にDWI画像を撮像した。脳機能画像統計処理ソフトSPM2を用いてrTMS前後を比較した。一次運動野およびその投射部位にrTMS後も持続性のDWI信号変化を認めた。その分布は一次投射部位よりもむしろそれを介した投射部位に大きな変化を認める傾向があった。この結果で示された脳細胞内の水分子の動態変化が神経可塑性のどのようなメカニズムを反映しているのかについては今後の検討が必要である。

M1での可塑性とドパミンとの関連について、基底核-皮質ループの機能障害との関連性を示すことができた。また、正常被験者においてagingによって可塑性が低下することも示された。今後の展開としては、患者群でのMRI-TMS同時記録で、可塑性のメカニズムと基底核-皮質ループの関連についてさらに研究を進めることを目標としている。
Wurtzite型窒化物圧電体の熱力学的安定性と材料設計指針

Sc添加AlN固溶体の薄膜は高い圧電性能を有し、モバイル通信用の高周波フィルタに利用されている。一方、Scは高価であるため代替元素が切望されているが、圧電性を示すWurtzite相を安定に生成させることが困難な場合が多い。薄膜における添加元素の固溶挙動は、基板との界面ひずみエネルギーや表面エネルギーなどの影響を受けるため複雑である。本研究では、このような薄膜材料固有のエネルギーを第一原理計算や統計熱力学手法により評価する。これにより薄膜の相平衡をシミュレートする熱力学データベースを構築する。
骨粗鬆症の防御に対する難消化性多糖類の有効性に関する研究

近年、高齢社会を迎えて、骨形成や骨の栄養に関する研究が日本人の栄養上特に緊急の課題となってきた。一方、難消化性多糖類や少糖類の中にカルシウムを始めとするミネラル吸収を促進し、骨形成を促進するものがあることが報告されている。このような骨代謝に対する難消化性多糖類や少糖類の効果の詳細な検討は、高齢者社会における食生活に非常に有意義であると考えられる。そこで本研究ではまず第一に、難消化性多糖類のうち微生物産生のプルランならびに植物由来のペクチンについて、ラットにおけるカルシウムその他のミネラルの吸収に対する影響、および骨の健康への影響を検討した。その結果、5%のペクチンならびにプルランを飼料に投与した場合、ラットにおける消化管内でのCa吸収、血中Ca濃度、骨量ならびに骨塩量、および骨代謝に影響しないことが示唆された。次に、日常摂取する食品であるタマネギはオリゴ糖が多く含まれ、その骨の健康への影響について関心がもたれる。そこでタマネギによる骨の健康への影響をin vivo, in vitroの両面から検討した。in vivoの研究ではラットにタマネギ食を投与した場合のCa吸収率への影響や骨の代謝ならびに発育への影響を検討した。その結果、玉ねぎの水溶層・残渣いずれにも骨のカルシウム・リンの含有量を増加させる効果を認めた。またそのメカニズムとしては、カルシウムの腸管内での吸収を促進するのではなく、骨吸収を抑制することによるものと推察された。続いて実施した骨細胞を用いたin vitroでの研究では、タマネギに含まれるフラボノイドに着目し、タマネギフラボノイドのケルセチンによる骨芽細胞の増殖、骨形成への影響について検討した。その結果、ケルセチン、ケンフェロールのようなフラボノールにダイゼイン、ゲニステインと類似の、骨芽細胞の骨形成を促進する効果が認められ、これらの結果より、タマネギによる骨の健康への効果が示唆された。可溶性の難消化性多糖類による食餌中Caの吸収や利用性、骨の健康への影響を解明するために、本年度はペクチン、プルランの投与による幼ラットにおけるCa吸収や骨塩量への影響を検討した。3週齢のSD系雄ラットを5%セルロース食群、5%ペクチン食群、5%プルラン食群に分けて8週間飼育した。各飼料のカルシウム含量は0.3%とした。血中Ca、Caの見かけの消化吸収率、尿中へのCa排泄量を測定した。また大腿骨の重量、灰分含量、ミネラル(Ca,P)含量を測定し、さらに尿中ピリジノリンと血中オステオカルシンを測定した。その結果、各群の体重、飼料摂取量、Ca摂取量、飼育期間中の血中Ca濃度、に有意差はみられなかった。Caの見かけの吸収率についても有意差が見られなかった。尿中へのCa排泄量に差はなかったが、P排泄量はペクチンやプルラン投与で有意に高値(p<0.05)を示した。大腿骨中のCa含量はペクチン群が有意に高値(p<0.05)を示し、プルラン群も有意ではないがやや高い値で、骨塩量増大に有効な可能性が示された。しかし、骨重量、灰分含量には各群間での有意差は見られなかった。尿中のピリジノリン排泄量は他群に比べてペクチン群が低い傾向であった。近年、タマネギによる骨代謝への影響も示唆されている。タマネギはオリゴ糖が多く含まれ、また日常多く摂取する食品でもあるので、その骨の健康への影響についても検討した。その結果、タマネギ食投与により、コントロール食群に比べて血中Ca濃度、Caの見かけの吸収率、尿中へのCa排泄量に有意差が認められなかった。

しかし大腿骨のCa含量はタマネギ食群では有意に高い値になり、骨の健康への有効性が示唆された。これらのin vivo研究とともに、来年度に骨細胞を用いるin vitroでの研究に発展させるために、研究設備を整えて予備実験を開始した。本年度は前年度に続いて、日常的に摂取する食品である玉ねぎについて検討した。玉ねぎはオリゴ糖が多く含まれその骨量への効果が期待されるばかりでなく、ケルセチンのようなフラボノイド含量が多く、その骨量への効果も期待される。そこで、実験1では玉ねぎを添加した飼料をラットに投与した場合の、カルシウムの吸収、生体内における骨代謝に対する影響を調べた。まず、若齢期(11週齢)の雄性SDラットにコントロール食(0.5% Ca,5%セルロース)、低カルシウム食(0.1% Ca,5%セルロース)、タマネギ食(0.1% Ca,5%タマネギ乾燥粉末)をそれぞれ投与して4週間飼育した。その結果、低カルシウム食群ではコントロール食群に比べてCaの見かけの吸収率の増加、尿中へのCa排泄量の減少、大腿骨重量の低下が認められた。しかし低カルシウム食群とタマネギ食群ではそれらの測定値に有意差が認められなかった。さらに、離乳期(4週齢)の雄性SDラット8週間飼育した場合についても玉ねぎの影響を調べた、その結果、離乳期ラットでもタマネギ食投与により、コントロール食群に比べて血中Ca濃度、Caの見かけの吸収率、尿中へのCa排泄量に有意差が認められなかった。しかし大腿骨のCa濃度はコントロール食群に比べてタマネギ食群では有意に高い値であった。実験2では、玉ねぎの成分中であるケルセチンの骨芽細胞への影響について他のフラボノイド及び大豆イソフラボンと比較検討した。細胞の増殖に対する影響と、細胞による骨形成に対する影響を調べた。骨形成の程度は骨形成マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性を測定し、石灰化の指標としてCa結晶形成量を測定した。その結果、大豆イソフラボンよりは劣るものの、ケルセチンにも骨形成促進作用があることが認められ、玉ねぎによる骨形成促進の可能性が示唆された。
日英語の名詞節化形式の意味と談話機能の派生メカニズムに関する理論的・実証的研究

本研究は,日英語の名詞節化形式の意味と談話機能の派生メカニズムについて総合的視点から検証し,両言語の普遍性と個別性を明らかにした。日本語のように補文命題の既定性を表出するために名詞化詞「の」,「こと」,「もの」,「わけ」などを発達させてきた言語や,英語のように主題表示が義務的で補文形式のみならずitの指示特性を活用しながら既定性を積極的に合図する言語など,言語により既定性の保証過程が異なることを理論的・実証的に説明した。研究成果を学術図書『「の(だ)」に対応する英語の構文』東京:くろしお出版.単著.【平成21年度科学研究費補助金(研究成果公開促進費(学術図書))課題番号215060,日本学術振興会】等にとりまとめて社会・国民に迅速かつ広範に還元することができた。本研究目的は、日英語の名詞節化形式と意味・機能がどのようなメカニズムで取り結ばれているのかを原理的に解明することである。研究初年度の本年度は実証的研究を目指し、研究対象の日英語構文に関する基礎的資料を収集、観察、分析した。また、基本的文法概念や問題点を整理しながら、本研究課題の名詞節化現象を理論的枠組みの中で分析する基礎を構築し、言語学の研究成果を英語教育に活用する方策についても検討を進めた。本年度の成果実績として、学術図書(『「の(だ)」に対応する英語の構文』(単著)356pp.ISBN:978-4-87424-464-7,くろしお出版,2009年.)を挙げることができる。本学術図書は、「の(だ)」に対応する英語構文の諸特性の解明を試みた大竹(2008)(博士(応用言語学)学位論文「「の(だ)」に対応する英語の構文」)に本研究で得られた知見を反映させて加筆修正を施し、平成21年度科学研究費補助金(研究成果公開促進費(学術図書)(研究代表者:大竹芳夫),日本学術振興会,課題番号215060)の助成を受けて刊行したものである。本学術図書は、(i)「の(だ)」と対応する英語構文を統一的な見地から比較検証することにより「の(だ)」の本質により深く迫ることができた点、(ii)従来は個別的に論ぜられてきた日英語の名詞節化形式について、両言語を共通の視点から比較・対照しながら認知や知覚の対象を言語化するプロセスの異同を原理的に明らかにした点、(iii)国内の研究者に先駆的知見を直ちに還元できるように、英語の実例すべてに対訳を付した豊富な言語資料を提供しており、英語学、日本語学、世界の諸言語研究を含む広い関連分野に対して波及性が高い研究内容である点に特徴がある。本年度の研究成果は学術論文・図書に取りまとめられて社会に迅速かつ広範に還元されており、当初の目標を達成することができた。次年度以降は本年度の知見をさらに深化、発展させながら、成果を国内外に向けて積極的に発信する予定である。本年度は、初年度の研究成果である学術図書(『「の(だ)」に対応する英語の構文』(単著)356pp.,くろしお出版,2009年.【平成21年度科学研究費補助金(研究成果公開促進費(学術図書),日本学術振興会,課題番号215060】)が増刷され、英語学分野のみならず日本語学や日本語教育等の関連分野でも引用を受けていることから、本書で示した知見が各分野でどのような意義をもち、理論的枠組みに位置づけられるのかについて検討を開始した。また、大竹(2011)では、what kind of疑問文(=(1))と、不定冠詞を伴うwhat kind of {a/an}疑問文(=(2))に用いられる名詞句の意味特性に着目しながら、両疑問文の意味と機能を考察した。(1)What kind of dinosaur is that?/(2)What kind of a dinosaur is that?具体的には、両疑問文に生ずる名詞句には特別な含意を派生しやすい二つのタイプがあることを明らかにした。"idiot"のようなタイプの名詞句を伴うwhat kind of疑問文とwhat kind of {a/an}疑問文は、直接的に愚行、醜行を認定して侮ってあざける含意を派生する。

一方、"mother"のようなタイプの名詞句を伴うwhat kind of疑問文とwhat kind of {a/an}疑問文は反語的機能をもち、名詞句の表す範疇区分に共通して認められる性質や属性を話題中の人物が有していないという話し手の意識下で発話されるため叱責や問責の態度表出といった機能、ときには世辞や褒詞の表明といった機能も帯びることを確認した。次年度は本年度の知見をさらに深化、発展させながら、得られた研究成果を国内外に向けて積極的に発信してゆく。本研究は、日英語の名詞節化形式と意味・機能がどのようなメカニズムで取り結ばれているのかを原理的に解明することを目的とする。研究最終年度の本年度は、平成21-22年度に得られた成果を検証すると同時に、比況構文It is like節構文とその否定形It is not like節構文の諸特性を明らかにした。第一に、両構文はいずれも先行する言語的文脈を受けて発話されること、主題itには先行する命題内容が話し手の知識にすでに取り込まれた既獲得情報であることを積極的に合図する働きがあることを確認した。It is like節構文の基本的意味は、「<先行することがら>はといった{感じ/印象}なのだ」というような、先行することがらから話し手が直感的に受ける感じや印象を表現することである。必然的に、like節内に提示される内容は話し手の知識や経験に頼らなければ聞き手には容易には導き出せないような喩えやなぞらえとなる。そのため、話し手はlike節内の説明が単なる思いつきやその場限りの喩えであるかの印象をできる限り排除しようとしばしば試みる。しかしその一方で、like節内に提示する喩えやなぞらえが独断的、独りよがりの言として聞き手に受け止められてしまうことを回避するために、それ以外の表現でも比況の余地があるという含みを残したり、控えめに比況表現を伝達するように話し手が努める場合もある。本研究では実例を観察しながら、両構文の意味論的・語用論的特性を解明した。第二に、本研究補助金および平成21年度科学研究費補助金(研究成果公開促進費(学術図書)課題番号215060)の研究成果として刊行された『「の(だ)」に対応する英語の構文』(東京:くろしお出版)が国内外の論考で言及され一定の評価が得られていることを確認し、本研究成果の学術的位置づけと今後の発展可能性を検証した(Horie Kaoru (2011) ("The Interactional Origin of Nominal Predicate Structure in Japanese." Journal of Pragmatics)、Kato Masahiro (2011) ("Review : Otake, Y.(2009) "No (da)" ni TaiosuruEigo no Kobun (The Japanese No (da-Construction and the Corresponding English Constructions."English Linguistics.(日本英語学会学会誌)Vol.28-2.)、牧野成一(プリンストン大学)(The 18th Princeton Japanese Pedagogy Forum, May 7-8, 2011特別講演「翻訳で何が失われるか」)等)。なお、平成24-26年度科学研究費補助金(基盤研究(C))課題番号24520534「日英語の指示表現と名詞節化形式の選択・出没の普遍性と個別性に関する総合的研究」の新規交付が内定しており、本研究で見出された基本的知見と着想を、次年度以降の研究でさらに深化、発展させながら、成果を国内外に積極的に発信する予定である。
地質野外データの現地処理に関する数理地質学的研究

通常の野外地質学では,調査結果を現地で野帳につけ,宿舎でデータ整理を行い,翌日からの調査計画を立案する.この調査の過程で新しい発想を思いついたり,法則性を発見したりする.この場合,調査者の地質学に対する知識の多寡や自然を見る洞察力の鋭さが大いにものを言う.そこで,熟練者の勘に代ってコンピュータがヒントを与えてくれると,初心者には助かる.しかし,従来,地質学の分野では,コンピュータは単なる高速計算機か,あるいは調査完了後のデータ整理や結果の図化など,プレゼンテーションの手段としてしか利用されて来なかったと言ってよい.今回の研究では,視点を変え,コンピュータを野外地質学の分野で,現地で活用することにした.まず第一の例では,シラスの崩壊調査に多変量解析の手法を応用し,崩壊に寄与する要素を毎日現地で点検した.その結果,調査の早期から,特定の要素の重要性が見出されたため,その要素については翌日からの観察がより細かくなったし,あまり寄与しない要素については,調査を省略し省力化がはかられた.第二の例では,地質学科出身でない土木技術者に,シラスか否かの判別法を教授するのに,人工知能の手法を応用した.地質家が,長年の教育と経験により,一目で判別できるものでも,素人には難しい.いくつかの着目すべき要素を質問して観察させれば,比較的容易に正解にたどりつくことができた.これも野外にコンピュータが進出した成果であり,野外観察への応用と言えよう.第三の例では,断裂解析から古応力場を復元するのに,野外でのデータ入力から応力場の算出と図化,あるいは形成時代にによるフィルタリングなど,一切自動的に行うトータルシステムを開発した.また,こうした野外でのデータを収録するためのデータベースのフォーマットの試案も作成した.通常の野外地質学では,調査結果を現地で野帳につけ,宿舎でデータ整理を行い,翌日からの調査計画を立案する.この調査の過程で新しい発想を思いついたり,法則性を発見したりする.この場合,調査者の地質学に対する知識の多寡や自然を見る洞察力の鋭さが大いにものを言う.そこで,熟練者の勘に代ってコンピュータがヒントを与えてくれると,初心者には助かる.しかし,従来,地質学の分野では,コンピュータは単なる高速計算機か,あるいは調査完了後のデータ整理や結果の図化など,プレゼンテーションの手段としてしか利用されて来なかったと言ってよい.今回の研究では,視点を変え,コンピュータを野外地質学の分野で,現地で活用することにした.まず第一の例では,シラスの崩壊調査に多変量解析の手法を応用し,崩壊に寄与する要素を毎日現地で点検した.その結果,調査の早期から,特定の要素の重要性が見出されたため,その要素については翌日からの観察がより細かくなったし,あまり寄与しない要素については,調査を省略し省力化がはかられた.第二の例では,地質学科出身でない土木技術者に,シラスか否かの判別法を教授するのに,人工知能の手法を応用した.地質家が,長年の教育と経験により,一目で判別できるものでも,素人には難しい.いくつかの着目すべき要素を質問して観察させれば,比較的容易に正解にたどりつくことができた.これも野外にコンピュータが進出した成果であり,野外観察への応用と言えよう.第三の例では,断裂解析から古応力場を復元するのに,野外でのデータ入力から応力場の算出と図化,あるいは形成時代にによるフィルタリングなど,一切自動的に行うトータルシステムを開発した.また,こうした野外でのデータを収録するためのデータベースのフォーマットの試案も作成した.
高リスク小児急性骨髄性白血病における多角的な遺伝子解析を用いた分子標的の同定

小児AML64例に対し、網羅的DNAメチル化解析を施行した。網羅的DNAメチル化解析により約21,000遺伝子に配置された850,000プローブによって、遺伝子全体の99%およびCPGアイランドの96%がカバーされ、ゲノムワイドな解析が可能となる。結果として、DNAメチル化パターンより、4群に層別化されることを同定し、各遺伝子異常、遺伝子発現、予後と深い相関が認められ、既知の遺伝子異常それぞれのエピジェネティクスな変化が明らかとなった一方、既知の遺伝子異常では分類不能であった症例をメチル化解析特有の症例群として分類可能であることを同定した。遺伝子異常、DNAメチル化を組み合わせることで、より高精度な予後層別化を可能とした。具体的には、絶対的予後不良因子とされているFLT3-ITDにおいて、DNAメチル化パターンから予後良好例を抽出することが可能となり、今後、不必要な造血幹細胞移植を回避することが可能になる可能性がある。その結果、移植治療関連死亡や治療関連の後遺症、合併症を減らすことができ、QOL向上に繋がることが期待される。我々の先行研究において、予後不良群ではPRDM16ないしEVI1遺伝子が高発現を呈していることが明らかとなっており、今回の解析において、これらの群で高度にDNAメチル化が起こっていることを確認した。当初の計画ではプロテオーム解析を行う予定であったが、DNAメチル化解析の結果を受けて、ATACシーケンスによるゲノム全体のアクセシビリティの解析を優先し、小児AML5例で施行し、現在データ解析中である。さらにはCHIPシーケンスやパスウェイ解析を通してAML発症およびAMLの難治性に関わると考えられる経路で何が起きているのかを明らかにし、標的因子の同定および薬剤の開発に繋げていきたいと考えている。AMLは様々な遺伝子異常を原因とするヘテロな疾患であり、これまでに染色体分析、遺伝子変異解析、遺伝子発現解析などが行われてきた。今回、イルミナ社のInfinium Methylation Assay HumanMethylation 450を用いて、小児急性骨髄性白血病(AML)初発検体64例に対して網羅的DNAメチル化アレイを実施した。プローブは約800,000CpGサイト(約21,000遺伝子)で、遺伝子の99%およびCpGアイランドの96%以上をカバーしており、ゲノムワイドな解析が可能な手法である。今回のメチル化アレイにより、t(8;21)やMLL遺伝子再構成など、各遺伝子異常に対し、それぞれ異なったメチル化パターンが形成されていることが判明した。今後、このメチル化パターンを詳細に解析することにより、遺伝子異常と予後予測について新たな知見が得られるものと考えられ、さらにDNAメチル化変化と遺伝子発現変化が相関する遺伝子群を抽出し、DNAメチル化により発現制御を受ける候補遺伝子の同定を試みることで、新規の分子標的薬の開発につなげていきたいと考えている。現在、遺伝子相互の関連性について、クラスタリング解析、パスウェイ解析を含めたバイオインフォマティクスの手法を用いて統合的に解析を行っており、機能的に関連する候補遺伝子・ハブ遺伝子の絞り込みを行っている。また、次世代シーケンサーを用いて、分子生物学的な背景が不明な正常核型を中心に約100例の検体を用いて、クロマチン修飾関連遺伝子についてTarget sequenceを施行した。その結果、予後不良例においては有意にクロマチン修飾関連遺伝子の変異が起こっていることを同定した。今後、マイクロRNAの発現解析やプロテオーム解析を行うことで、より統合的な解析を行っていく予定である。当初の計画通り、イルミナ社のInfinium Methylation Assay HumanMethylation 450を用いて、小児急性骨髄性白血病(AML)初発検体64例に対してDNAメチル化アレイを実施した。今回のメチル化アレイにより、PRDM16やEVI1の発現の有無、t(8;21)やMLL遺伝子再構成などの融合遺伝子、KITやFLT3-ITD変異などの各遺伝子異常に対し、それぞれ異なったメチル化パターンが形成されていることが判明した。今後、より詳細にメチル化パターンを解析することにより、遺伝子異常と予後予測について新たな知見が得られるものと考えられ、さらにDNAメチル化変化と遺伝子発現変化が相関する遺伝子群を抽出し、DNAメチル化により発現制御を受ける候補遺伝子の同定を試みることで、新規の分子標的薬の開発につなげていきたいと考えており、治療ターゲットとなる分子標的の同定を目指す。急性骨髄性白血病(AML)は様々な遺伝子異常、染色体異常に伴い発生するヘテロな疾患であり、治療反応性や予後はこれらの異常に依存している。しかしながら、未だにこれらの異常が見出せない一群が存在し、それらの症例の予後を予測することは困難である。今回、小児AML64例に対し、遺伝子の99%およびCpGアイランドの96%をカバーしているイルミナ社のInfinium Methylation Assay EPICを用いて網羅的メチル化アレイを施行した。その結果、メチル化パターンから小児AMLを4群に分類することが可能となり、それらの群は遺伝子異常、染色体異常に密接に関係していた。

AMLではFLT3-ITDが最も有名な予後不良因子であるが、一部には良好な経過をたどる症例が存在することが知られており、今回のメチル化アレイの結果はFLT3-ITD陽性例の予後を予測することも可能であった。また、DNAメチル化パターンは遺伝子発現パターンとは異なった群分けがなされており、両者を併用し、多角的に検討することで予後不良、予後良好な一群を高精度に抽出することが可能になると考えられた。また、網羅的に遺伝子変異解析を施行し、そのプロファイルを明らかにすることを目的に、次世代シーケンサー(超大量並列シーケンサー)を用いて、正常核型症例をを中心に分子生物学的な背景が不明な予後不良症例約100例の検体を用いて、様々ながんで報告のある343遺伝子についてTarget sequenceを施行した。しかしながら、成人で既報の遺伝子変異が少数見つかる程度で、複数例で病因となる新規の遺伝子を同定するには至らなかった。このことは、小児AMLの病因が遺伝子変異だけでは説明がつかず、融合遺伝子やメチル化、アセチル化など様々な事象が組み合わさって発症にいたることを示唆しているものと考えられた。当初の計画ではmicroRNAを平成29年度に行う予定であったが、Methlation arrayに注力したため、平成29年度の実行は困難であった。平成30年度の実施を計画している。小児AML64例に対し、網羅的DNAメチル化解析を施行した。網羅的DNAメチル化解析により約21,000遺伝子に配置された850,000プローブによって、遺伝子全体の99%およびCPGアイランドの96%がカバーされ、ゲノムワイドな解析が可能となる。結果として、DNAメチル化パターンより、4群に層別化されることを同定し、各遺伝子異常、遺伝子発現、予後と深い相関が認められ、既知の遺伝子異常それぞれのエピジェネティクスな変化が明らかとなった一方、既知の遺伝子異常では分類不能であった症例をメチル化解析特有の症例群として分類可能であることを同定した。遺伝子異常、DNAメチル化を組み合わせることで、より高精度な予後層別化を可能とした。具体的には、絶対的予後不良因子とされているFLT3-ITDにおいて、DNAメチル化パターンから予後良好例を抽出することが可能となり、今後、不必要な造血幹細胞移植を回避することが可能になる可能性がある。その結果、移植治療関連死亡や治療関連の後遺症、合併症を減らすことができ、QOL向上に繋がることが期待される。我々の先行研究において、予後不良群ではPRDM16ないしEVI1遺伝子が高発現を呈していることが明らかとなっており、今回の解析において、これらの群で高度にDNAメチル化が起こっていることを確認した。当初の計画ではプロテオーム解析を行う予定であったが、DNAメチル化解析の結果を受けて、ATACシーケンスによるゲノム全体のアクセシビリティの解析を優先し、小児AML5例で施行し、現在データ解析中である。さらにはCHIPシーケンスやパスウェイ解析を通してAML発症およびAMLの難治性に関わると考えられる経路で何が起きているのかを明らかにし、標的因子の同定および薬剤の開発に繋げていきたいと考えている。
肝修復・肝再生における肝組織幹細胞の臨床的・基礎的役割に関する基盤的研究

以下の基礎的研究、臨床的研究の成果を得られた。【研究1】NASH関連肝硬変に対する2/3肝切除を急性肝不全モデル(CDAA授与モデル)に対し行ない、そこに肝細胞移植(HT)の効果を検討したところ、術前HTによる急性肝不全防止効果が証明された。【研究2】肝切除前後の周術期肝機能評価について、GSAを用いたABC曲線が構成する結果の統計学的処理を、慢性肝炎(CH)、肝硬変(LC)等を合併した肝切除例についてその有用性をAUCにより比較検討したところGSAのHH15とLHL15の双方因子について有用性が示唆され、ABCの優秀性が伺われ、ABCは新規機能評価因子と考えられた。1.小型肝細胞特殊マーカーを用いた肝細胞評価・肝再生・修復能予知を目指した研究choline deficient食(CDAA)を12週間投与することにより、組織の23±3.45%に線維化が起こる安定した肝硬変モデルを作製した。この肝硬変ラットに対して70%肝切除を施行すると、その生存期間は2.67±0.75日であった。一方、Collagenase perfusion法により得られた新鮮肝細胞1.0×10^7個を脾臓内に移植する肝細胞移植を施行後に70%肝切除を施行すると5.11±0.78日であり、有意な生存期間の延長を認めた。以上の実験に関しては、新鮮肝細胞および肝前駆細胞とされる小型肝細胞において条件検討を行ったが、新鮮肝細胞においてより良好な結果を得た。この結果は小型肝細胞の増殖能は旺盛であるが、その幼若さゆえ、肝機能代替の面では未だ検討の余地があるものと考えられた。移植後早期においてはレシピエント肝への移植細胞の生着はわずかであったが、DPPIV活性染色および性染色体の解析により、移植細胞の経時的な増加を認めた。Ki67 indexによる細胞増殖能の解析では、肝細胞移植群の増殖能は有意に高く、またTUNEL法による解析では肝細胞移植群のApoptosis細胞数は有意に少なかった。更に、細胞内シグナル伝達因子の発現解析では、増殖に関連するPCNA、STAT3の核内蛋白発現が肝細胞移植群で増加し、アポトーシスに関連するCleaved caspase-3は、非移植群で増加していた。従って肝細胞移植は肝硬変における肝切除術に対して、肝細胞増殖を促進しアポトーシスを抑制していたことが示され、これが生存期間の延長に寄与したものと考えられた。2.肝細胞の分離およびハイブリッドキメラ動物作製に関する研究ヒト肝組織より成熟肝細胞および小型肝細胞を分離し、ハイブリッド移植実験に使用するために細胞の冷凍保存を行っている。ヒト肝細胞移植モデルとしてまず、高度免疫不全マウス3体に移植を行い、現在のところ解析中である。今後さらに移植実験をすすめ、キメラマウスの安定的作製を行う予定である。1.小型肝細胞特殊マーカーを用いた肝細胞評価・肝再生・修復能予知を目指した研究非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の増加は、臨床上の問題となっている。Choline deficient食(CDAA)はNASHの動物モデルの一つとして有用であり、これを投与することにより肝硬変が起きることを確認した。この肝硬変ラットに対し70%肝切除術を施行すると平均生存期間は2.67±0.75日であったが、新鮮肝細胞1.0X10^7個を移植した後に70%肝切除術を施行すると平均生存期間は5.11±0.78日と有意な延長を認めた。移植群においてレシピエント肝細胞における増殖能が有意に改善し、TUNEL法による細胞死は非移植群で高率に観察された。蛋白発現解析では、肝細胞移植群において細胞増殖に関連した蛋白の発現が有意に増加し、細胞死に関連した蛋白の発現は有意に減少していた。従って、肝細胞移植はNASHに関連した肝硬変における肝切除術に対して、肝細胞増殖を促進しアポトーシスを抑制することで生存期間の延長に寄与していたものと考えられた。2.肝再生能を予測する肝機能評価に関する臨床研究肝再生を予測する肝機能評価は、多岐にわたる臨床的評価指標が存在している。本研究ではクラスター解析を行い、肝機能指標は5つのクラスターに分類された。分類されたクラスターを利用し、肝機能の改善治療を評価できる因子としてBTRを基準とし、同一クラスターおよび相違クラスターからALBおよびHGFによってALB-BTRおよびHGF-BTRを各々分類すると特定のサブグループにおいて無再発生存期間が短縮していることを証明した。このことは、特殊アミノ酸による食事療法の適応決定に有用であることが示唆される。また、肝機能の画像表評価法としてアシアロシンチグラフィーにおいて継時的にGSAのスペクトカウンターを算出するソフトウェアーを開発し、AACとした新規指標を開発した。従来のHH15やLHL15と比較し、肝炎や肝硬変の診断

能としてAUCにおいて改善しおり、AACは肝機能評価法として有用であると考えている。平成24年度の研究実施計画に基づいて、以下の研究を行ない成果の概要を以下の項目別に紹介する。【研究1】肝再生置換療法の研究.成熟雌DPPIV(-)F344ラットにCDAA食を12週間給餌し、脂肪性肝炎・肝硬変に至るモデルを作成した。肝切除24時間前に分離肝細胞を脾臓に移植後、肝切除を行い、予後解析及び定点解析を行なった。移植細胞の置換率に関してはDPPIV活性染色およびSRY遺伝子のプライマーを用いてPCR解析を行なった。移植細胞による予後改善が示唆された。臨床研究では、術後肝不全とGrade IV以上の合併症を指標とし、評価指標を4段階に分け12段階にスコアリング化した。CT肝容積計測はMDCTによる4相動態解析にて行なった。ICGR15、ATIII、手術時間、修正基準スコア、損失肝容積についてAUCから術後肝不全の予測推定を検討し、一定の限界値が求められた。【研究2】幹細胞機能評価・肝再生予知に関する研究.研究1で得られた移植肝を用い、Ki67とCK8の二重染色により増殖活性を解析した。アポトーシスの解析はcleaved caspase-3、Annexin Vの発現を測定した。移植群では組織中PCNAおよびNFκBが非移植群と比較し有意に高く発現していた。TUNEL染色陽性細胞数は非移植群において有意に増加し、組織中のcleaved caspase-3、Annexin Vの発現も非移植群で発現増加していた。DPPIV活性染色とCD44又はSE-1の免疫二重染色では移植細胞がアルブミンの他、Ki67の陽性も確認した。臨床的研究では、99mTc-GSAシンチグラフィにより取得した時間放射能集積曲線から得られる領域(以下ROI)をピクセル数で計測し、ROC解析にて病理組織学的背景に対する応答性をAUCを用いて各種因子を比較したところ、LC群では多くの指標が優位に抽出された。肝硬変に対する外科治療介入に関して、短期的効果と長期的効果に関して一定の結果を得た。短期的効果に関して論文をすでに投稿した。長期的効果に関しては、肝再生置換モデルとしては非常に効率性の高いモデルを開発できた。さらに、肝幹細胞が成熟肝細胞へ分化し、肝細胞索に取り込まれていく過程と周囲実質肝細胞と細胞接着器官の発現によって詳細な機序を解明できたことは想定外の収穫となった。24年度が最終年度であるため、記入しない。ハイブリットマウスの開発と代謝性先天疾患の肝細胞置換療法の開発を目指していく。本研究では、肝細胞再生置換率は個体によって大きな違いを認めた。肝幹細胞と考えられる小型肝細胞と成熟肝細胞を比較した再生置換効率には大きな相違がない。このことは再生置換できる細胞群はどちらの分画細胞にも存在していることを示している。また、再生置換にかかる再生様式には肝細胞索に沿ってゾーンにしたがって置換再生するものと島状に集塊を形成するものとが存在するが、明らかに肝細胞索に沿って置換される法が高効率に再生置換が起きている。このことは、グリソン周囲に幹細胞が存在できるニッチの存在を示唆している。