hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固定化不要な電気化学アプタマーセンサの開発

本研究の目的はターゲット分子を含む溶液中に分子認識素子であるDNAアプタマーとシグナル変換素子である白金錯体を混合するだけで,高感度計測可能な電気化学システムを構築することである.本研究では,アプタマーにインターカレートしている白金錯体が電解還元されず,「ターゲット分子の認識により初めて白金錯体を遊離してシグナル変換」することができるワンステップ化と白金錯体の電解還元による電極表面上への白金のナノ粒子を析出によるプロトン触媒還元能の付与による高感度化を実現した計測システムを提案している.ITO電極の活性化による電子移動反応速度の向上について調査した.ITO電極に負電位を印加すると大きな還元電流が流れるとともに,電極の色が無色透明から茶褐色に変化した.また,この電極を用いた電気化学活性種の酸化還元応答は,ピークセパレーションの小さい理想的な酸化還元電流応答が得られた.XPSおよびSEM観察より,インジウム酸化物が金属インジウムに還元され,薄膜を形成する粒子サイズが増加し表面が粗くなった.さらに,この活性化ITO電極を用いて,白金の電解還元に伴うプロトンの触媒還元反応を用い,トロンビン検出の高感度化を行った.また,アプタマー修飾微粒子の誘電泳動を利用したトロンビンセンサの開発を行った.微粒子の表面電荷量(表面導電率)と交差周波数の関連を調査し,理論と一致することを示した.さらに,微粒子に固定化したトロンビンアプタマーにトロンビンが結合すると微粒子表面の電荷量が減少し交差周波数が低周波数側にシフトした.微粒子サイズの減少に伴い,計測できるトロンビンの濃度領域を低濃度化できることがわかった.認識素子として,多様な標的分子への認識能を有する抗体の使用について検討を開始することができた.本研究の目的はターゲット分子を含む溶液中に分子認識素子であるDNAアプタマーとシグナル変換素子である白金錯体を混合するだけで,高感度計測可能な電気化学システムを構築することである.本研究では,アプタマーにインターカレートしている白金錯体が電解還元されず,「ターゲット分子の認識により初めて白金錯体を遊離してシグナル変換」することができるワンステップ化と白金錯体の電解還元による電極表面上への白金のナノ粒子を析出によるプロトン触媒還元能の付与による高感度化を実現した計測システムを提案する.まず,白金錯体の電解還元による白金微粒子の析出に伴うプロトン触媒還元電流を利用した白金錯体の検出を行った.プロトン触媒還元能のないグラッシーカーボン(GC)電極を用いて白金錯体を電解還元すると電極表面上に白金ナノ微粒子が形成された.この電位においてプロトンは白金微粒子表面上で触媒還元され,白金ナノ微粒子の形成および成長に伴う還元電流とプロトンの触媒還元電流が同時に観測された.プロトンの触媒還元電流は,白金錯体の還元電流と比較して数十倍大きく高感度な白金錯体の検出ができることがわかった.この計測は,GC電極,ダイヤモンドライクカーボン電極,インジウムスズ酸化物(ITO)電極を用いて行うことができた.特に,ITO電極を用いた場合の電流増幅が大きい.トロンビンアプタマーとその相補的配列を有する1本鎖DNAを混合した場合の触媒還元電流を評価できた.アプタマーの存在下においてプロトン触媒還元電流が変化することから,アプタマーを計測することが可能となった.また,アプタマー白金錯体の解離定数を評価できた.さらには,溶液を加温・冷却することにより2本鎖の形成とインターカレーションする白金錯体量が増加することにより再現性が増加した,現在,トロンビン存在下におけるプロトン触媒還元電流の評価を最優先で行っている.当初予定していた研究実施項目について,すべてに着手し遂行することができた.一部は,現在も研究中であるが,当初予定の研究以外にも成果が出ており学会発表も行った.したがって,平成28年度に行われた研究は,おおむね順調に進展していると判断している.白金錯体の電解還元による触媒電流応答の調査では,高感度な白金錯体の検出およびアプタマー存在下における電流応答の検出を達成しており,トロンビン計測へと展開できている.平成29年度には,この検出原理を利用したトロンビン計測,さらには,平成29年に予定していた「低分子センシングシステム」への展開が可能な段階に達した.これにより,競争法を用いない低分子計測が可能になり,本研究で提案する新規計測システムの構築が現実的となる.当初予定していた研究以外の成果として,電気化学活性種で修飾したアプタマーを用いたコカインセンサの開発を行った.この方法は電極にアプタマーを固定化しなければならないが,測定対象物質であるコカインのアプタマーへの結合による電気化学反応の増加を原理としているため,結合した測定対象物質と結合していない測定対象物質を洗浄により分離する必要のない簡便なセンサの開発に成功した.また,インジウムスズ酸化物(ITO)電極を用いた電解還元により,電極の電気化学特性を大きく変化させることができる可能性を見出し,次年度の新たな展開が期待できる.平成28年度は,トロンビンをモデルターゲットとした高感度な電気化学計測法の開発において大きな研究進展があり,今後の固定化不要で競合法を用いない低分子センサの開発体制を整えることができた.本研究の目的はターゲット分子を含む溶液中に分子認識素子であるDNAアプタマーとシグナル変換素子である白金錯体を混合するだけで,高感度計測可能な電気化学システムを構築することである.

本研究では,アプタマーにインターカレートしている白金錯体が電解還元されず,「ターゲット分子の認識により初めて白金錯体を遊離してシグナル変換」することができるワンステップ化と白金錯体の電解還元による電極表面上への白金のナノ粒子を析出によるプロトン触媒還元能の付与による高感度化を実現した計測システムを提案している.昨年度は,トロンビンアプタマーを用いた固定化不要で競合法を用いないトロンビン計測を行った.白金錯体を含む溶液中で電解還元を行うと,電極表面で白金錯体が還元され電極表面上に金属白金が析出し,プロトンの触媒還元電流が観測された.ここに,トロンビンアプタマー溶液を添加すると,白金錯体がアプタマーに配位し,白金の電解還元析出が阻害され触媒電流は観測されなかった.さらに,トロンビンを添加すると,触媒還元電流の増加が観測された.これは,アプタマーがトロンビンと結合し,白金錯体が遊離されたためである.添加したトロンビン濃度の増加に伴い,プロトン触媒還元電流が増加した.本測定系の検出下限濃度は数十nMレベルであり,溶液を混ぜるだけの簡便な測定法である.さらに,アプタマー修飾微粒子を用いた誘電泳動によるトロンビンの簡易計測法を開発した.微粒子に固定化されたアプタマーにトロンビンが結合することにより,微粒子表面の表面電荷量(表面導電率)が減少し,負の誘電泳動から正の誘電泳動に切り替わる交差周波数が低周波数側にシフトした.この交差周波数を計測することによるトロンビンの簡易定量を可能にした.トロンビンアプタマーに白金錯体が結合した複合体に,トロンビンを添加するだけで,トロンビンを計測できる測定法を開発できた.トロンビンの添加により,トロンビンアプタマーに結合していた白金錯体が遊離し,プロトンの触媒還元電流が増加することを利用している.この手法により,競争法を用いない低分子計測が可能になり,本研究で提案する新規計測システムの構築が可能となる.本件については,昨年度の電気化学会にて学会発表を行った.初年度に引き続き,電気化学活性種で修飾したアプタマーを用いたコカインセンサの開発を行った.測定対象物質であるコカインのアプタマーへの結合による電気化学反応の増加を原理としているため,結合した測定対象物質と結合していない測定対象物質を洗浄により分離する必要のない簡便なセンサを開発できた.この手法は,法規制分子であるコカインのような危険ドラッグ類を,あらかじめ仕込んでおかなければならない競合法ではないことが大きな利点となる.ITO薄膜電極を用いた白金錯体の電解還元では,ITO表面上に金属白金が析出しプロトン触媒電流が観測される.しかし,白金錯体が存在しない場合には,電解還元により電子移動反応速度の向上が観測された.現在,この現象について詳細に調査中である.当初予定していた研究以外の成果として,アプタマー修飾微粒子の誘電泳動を利用したトロンビンセンサを開発した.この方法では,アプタマーを修飾した微粒子の誘電泳動挙動が,トロンビンの添加に伴うトロンビンの結合による大きな変化を利用している.
骨組織学を用いた中生代―新生代四足動物の成長戦略の解明

報告者は,中生代-新生代四足動物の骨形成の進化の解明に関連して,様々な環境に適応した現生および化石四足動物の肢骨内部構造の観察を行っている.2011年度は特に,化石水生四足動物における肢骨内部構造の進化の解明に焦点を当てた.研究手法としては,マイクロフォーカスCTスキャン(国立科学博物館,東京大学総合研究博物館,Universitat Bonn)を用いた骨内部構造の撮像,3Dレンダリングソフトを用いた3次元骨内部構造の構築および観察,骨組織切片の薄片検鏡による微細構造の観察を用いている.哺乳類の骨内部構造の進化に関する研究:前年度に引き続き,水棲適応した哺乳類である鰭脚類(食肉類),水棲適応者とされているが骨内部構造の情報が欠如している束柱類(アフリカ獣類)の肢骨,肋骨の骨内部構造の観察を行った.その結果,(1)鰭脚類においては,陸棲食肉類と比較して骨内部の腔隙が失われ,特に骨幹部で骨緻密度の増加が確認された.また,(2)比較的原始的な束柱類に関しては現生のマナティーに似た骨内部構造の極端な緻密化が起こっているのに対し,派生的な束柱類デスモスチルスに関しては,現生の高度な水棲適応者に見られる長骨内部の海綿質化が起こっていること,さらに(3)これらの傾向は頭骨を除く全身の骨にあてはまることが明らかとなった.これらの内容に関しては,First International Symposium on Paleohistologyおよび71th Annual Meeting of the Society of Vertebrate Paleontologyにおいて発表を行った.カメ類の骨内部構造の進化に関する研究: 30種余りの現生・化石カメ類の肢骨について内部構造の比較観察を行った.従来の研究では生息環境と骨内部構造に関連性が見られないとされてきたカメ類でも,3次元内部構造観察を踏まえて肢骨の最も緻密な断面で比較することにより,(1)陸生適応者では管状に近い構造を持つこと,(2)水生適応者では緻密骨が海綿質化しやすく,水棲適応度が高くなるほど骨が海綿質化すること,(3)半水棲カメ類では緻密骨が海綿質化しないこと,および(4)原始的化石カメ類のプロガノケリス(陸生)およびモンゴロケリス(半水棲)でも,生活スタイルと骨内部構造の関係が現生カメ類と同様に成り立つことが示された.これらの内容に関しては,First Intemational Symposium on Paleohistologyおよび71th Annual Meeting of the Society of Vertebrate Paleontologyにおいて発表を行った.標本提供を依頼していた複数の博物館から予想以上に好意的な協力を得たため,現生哺乳・爬虫類だけでなく,多くの化石動物のデータから解析結果を得ることができた.これをもとに,前年度までは主に現生脊椎動物から得ていた解析結果を,化石動物と合わせることで各系統での骨内部構造の進化の全容が明らかになった.カメ類だけではなく,化石爬虫類における水棲適応と骨内部構造の関係の普遍的法則性とそのメカニズムを明らかにするため,様々な系統で独立に水棲適応した爬虫類(メソサウルス,ホバサウルス,コリストデラ類,タラットサウルス類,鰭竜類,魚竜類,モササウルス類)について,カメ類と同様の3次元骨内部構造の解析を行う.また,陸生四足動物の典型とされる,軽量化した管状の長骨構造の起源を明らかにするため,原始的四足動物についても同様の解析を行い,生息環境の変化に伴う骨内部構造の進化の全容を明らかにすることを目指す.報告者は,中生代-新生代四足動物の骨形成の進化の解明に関連して,様々な環境に適応した現生および化石四足動物の肢骨内部構造の観察を行っている.2010年度は特に,生息環境が極端に異なる動物間の骨形成様式の差異を明らかにするために,水棲四足動物と陸棲四足動物を対比して比較を行うことに焦点を当てた.研究手法としては,マイクロフォーカスCTスキャン(国立科学博物館,東京大学総合研究博物館,Universitat Bonn)を用いた骨内部構造の撮像,3Dレンダリングソフトを用いた3次元骨内部構造の構築および観察,骨組織切片の薄片検鏡による微細構造の観察を用いている.哺乳類の骨内部構造の進化に関する研究:水棲適応者とされているが骨内部構造の情報が欠如している束柱類の骨内部構造の観察を行った.その結果,比較的原始的な束柱類に関しては現生のマナティーに似た骨内部構造の緻密化が起こっているのに対し,派生的な束柱類Desmostylusに関しては,現生の高度な水棲適応者に見られる長骨内部の海綿質化が起こっていることが示された.これらの内容に関しては,SVPCAおよび日本古生物学会第160回例会において発表を行った.爬虫類の骨内部構造の進化に関する研究:30種余りの現生・化石水棲爬虫類の肢骨について内部構造の比較観察を行った結果,(1)カメ類の中でも深海への潜水を行うオサガメだけが極端な骨海綿質化を起こしていること,(2)その他の水棲・半水棲爬虫類および・陸棲カメ類については一般的に髄腔が発達しにくく,再吸収の割合が非常に小さいことが明らかになった.この内容は2010年9月SVPCAおよび日本古生物学会第160回例会で発表した.報告者は,中生代-新生代四足動物の骨形成の進化の解明に関連して,様々な環境に適応した現生および化石四足動物の肢骨内部構造の観察を行っている.

2011年度は特に,化石水生四足動物における肢骨内部構造の進化の解明に焦点を当てた.研究手法としては,マイクロフォーカスCTスキャン(国立科学博物館,東京大学総合研究博物館,Universitat Bonn)を用いた骨内部構造の撮像,3Dレンダリングソフトを用いた3次元骨内部構造の構築および観察,骨組織切片の薄片検鏡による微細構造の観察を用いている.哺乳類の骨内部構造の進化に関する研究:前年度に引き続き,水棲適応した哺乳類である鰭脚類(食肉類),水棲適応者とされているが骨内部構造の情報が欠如している束柱類(アフリカ獣類)の肢骨,肋骨の骨内部構造の観察を行った.その結果,(1)鰭脚類においては,陸棲食肉類と比較して骨内部の腔隙が失われ,特に骨幹部で骨緻密度の増加が確認された.また,(2)比較的原始的な束柱類に関しては現生のマナティーに似た骨内部構造の極端な緻密化が起こっているのに対し,派生的な束柱類デスモスチルスに関しては,現生の高度な水棲適応者に見られる長骨内部の海綿質化が起こっていること,さらに(3)これらの傾向は頭骨を除く全身の骨にあてはまることが明らかとなった.これらの内容に関しては,First International Symposium on Paleohistologyおよび71th Annual Meeting of the Society of Vertebrate Paleontologyにおいて発表を行った.カメ類の骨内部構造の進化に関する研究: 30種余りの現生・化石カメ類の肢骨について内部構造の比較観察を行った.従来の研究では生息環境と骨内部構造に関連性が見られないとされてきたカメ類でも,3次元内部構造観察を踏まえて肢骨の最も緻密な断面で比較することにより,(1)陸生適応者では管状に近い構造を持つこと,(2)水生適応者では緻密骨が海綿質化しやすく,水棲適応度が高くなるほど骨が海綿質化すること,(3)半水棲カメ類では緻密骨が海綿質化しないこと,および(4)原始的化石カメ類のプロガノケリス(陸生)およびモンゴロケリス(半水棲)でも,生活スタイルと骨内部構造の関係が現生カメ類と同様に成り立つことが示された.これらの内容に関しては,First Intemational Symposium on Paleohistologyおよび71th Annual Meeting of the Society of Vertebrate Paleontologyにおいて発表を行った.標本提供を依頼していた複数の博物館から予想以上に好意的な協力を得たため,現生哺乳・爬虫類だけでなく,多くの化石動物のデータから解析結果を得ることができた.これをもとに,前年度までは主に現生脊椎動物から得ていた解析結果を,化石動物と合わせることで各系統での骨内部構造の進化の全容が明らかになった.カメ類だけではなく,化石爬虫類における水棲適応と骨内部構造の関係の普遍的法則性とそのメカニズムを明らかにするため,様々な系統で独立に水棲適応した爬虫類(メソサウルス,ホバサウルス,コリストデラ類,タラットサウルス類,鰭竜類,魚竜類,モササウルス類)について,カメ類と同様の3次元骨内部構造の解析を行う.また,陸生四足動物の典型とされる,軽量化した管状の長骨構造の起源を明らかにするため,原始的四足動物についても同様の解析を行い,生息環境の変化に伴う骨内部構造の進化の全容を明らかにすることを目指す.
ヒト抗体産生細胞における抗体軽鎖交換機構の解明と抗体の機能改変に関する研究

ヒト抗体産生細胞における抗体軽鎖交換現象(Light chain shifting)を解明するため、Light chainshiftingの誘導に影響を与える因子の探索およびその作用機構の検討を行った。まず、遺伝子組み換えを触媒する酵素RAG-1およびRAG-2が、Light chain shiftingが誘導される細胞に発現していることを明らかにした。B細胞に特異的に感染するEpstein-Barr virusの構成タンパク質の一種であるEBNA-1が、RAG-1、RAG-2の発現を誘導し、別の構成タンパク質であるLMP-1が逆にその発現を抑制することが報告されていることから、Light chain shifting誘導性の抗体産生細胞におけるこれら遺伝子の発現を検討したところ、EBNA-1は発現していたが、LMP-1は発現していなかった。こうした遺伝子の発現が、本来発現しないとされる抗体産生細胞においてRAG-1、RAG-2が発現している原因のひとつではないかと考えられた。また、ヒト抗体産生細胞HB4C5をcaffeineで刺激することによりLight chain shiftingが誘導できることを明らかにした。そこでcaffeincによる軽鎖交換誘導の原因を探るため、抗体遺伝子の組み換えが起こるために必要十分と考えられている条件、組み換え酵素RAG-1、RAG-2の発現量と、組み換え前の遺伝子座からの未熟な転写(胚型転写)の活性を検討したところ、RAG-1およびRAG-2、胚型転写物のいずれの発現量もcaffeineにより顕著な変化は認められなかった。以上の結果から、caffeineによる軽鎖交換の誘導には、これまで抗体遺伝子の組み換えに必要十分であるとされてきたRAG-1.RAG-2の発現や胚型転写活性以外の因子が関与し、それがcaffeineによって活性化された可能性が示唆された。様々な問題点を持った既存の手法で得られたヒト型モノクローナル抗体の低い結合活性を改善する手法を検討していく過程において、ヒト抗体産生細胞が植物レクチンの刺激により本来産生していた抗体軽鎖を消失し、代わりに新たな軽鎖を産生する細胞が高頻度に出現する軽鎖交換現象を見い出した。軽鎖交換を起こした細胞より産生された抗体は、いずれも本来の抗原結合性を大きく変化させていることを明らかにしてきた。もし、軽鎖の変換を自由に制御することが可能になれば、抗体の抗原結合機能を目的に応じて改変でき、従来法によるヒト型モノクローナル抗体作製において大きな問題点の一つである、交叉反応性や親和性の低さの克服が期待できる。そこで、本研究では、このヒト抗体産生細胞における軽鎖交換の制御機構の解明を行い、さらに軽鎖交換機構を利用したヒト型モノクローナル抗体の機能改変を試みた。まず軽鎖交換によって発現した軽鎖遺伝子の構造解析を行い、その発現パターンを検討したところ、二つの重要な特徴が明らかとなった。その一つは、可変領域にN領域を有する軽鎖が高頻度に発現していることである。N領域は通常、重鎖の可変領域にのみ存在し、その多様性の増大に大きく頁献している。一方、軽鎖には通常存在せず、軽鎖の多様性が重鎖に劣る原因の一つとなっている。もう一つの点は、軽鎖発現において発現するV遺伝子に大きな偏りがあることである。また、その偏って発現するV遺伝子は生体内ではあまり発現しないマイナ-なものであることである。一方、抗体の機能改変に関しては、軽鎖交換を高頻度に生じる細胞株に改変したい重鎖遺伝子を導入発現させ、様々に発現する軽鎖と組み合わせた抗体として発現させることのより親和性を増大させることに成功した。
バイアンテナ型糖鎖の準安定構造に関する構造生物学的研究

糖鎖は単糖が重合した生命鎖で多様な配列および構造を取る。本研究の目的は糖鎖の配列と構造の相関を構造生物学的に明らかにすることであり、代表的な糖鎖としてN結合型糖鎖の一種、バイアンテナ型糖鎖を研究対象としている。2018年度はバイアンテナ型糖鎖を基質としてN-acetylglucosamine (GlcNAc)を転移する糖転移酵素、N-acetylglucosaminyltransferase-V (GnT-V)の反応メカニズムの解明に取り組んだ。GnT-Vはがん悪性化に関与する糖転移酵素として世界中で研究されているが、その詳細な反応メカニズムは不明である。興味深いことにGnT-Vの反応は、同じGlcNAc転移酵素であるGnT-IIIによって阻害される。GnT-IIIはGnT-Vと同様にバイアンテナ型糖鎖を基質とするが、異なる位置にGlcNAcを転移する。本来ならばGnT-IIIの反応はGnT-Vの反応に支障を来たさないはずである。我々は、この阻害機構はGnT-IIIによって生じる生成物糖鎖の構造がGnT-Vの基質として不適格な構造をしていることに起因すると予想した。つまり、GnT-Vの基質認識機構を明らかにすれば、本研究の目的である糖鎖の配列と構造の相関の解明に大きく寄与すると考えた。そこで我々は、GnT-V触媒ドメインについて動物細胞の発現系を用いて大量に調製し、単体および基質糖鎖との複合体の結晶構造をX線結晶構造解析によって明らかにした(Nagae et al., Nature Commuinications 2018)。得られた構造を見ると、GnT-Vの活性中心は深い溝になっており、糖鎖が溝に突き刺さるような状態で結合していた。この糖鎖構造を見るとGnT-IIIの生成糖鎖では取りにくい構造であった。つまり溝の形状によって糖鎖を選別している新しい機構が明らかになった。本研究はN型糖鎖の一種であるバイアンテナ型糖鎖を研究対象として、糖鎖の配列と構造の相関を明らかにすることを目的として平成29年4月に開始した。当初の目的は、バイアンテナ型糖鎖から糖鎖付加によって生じる三つの生成糖鎖、バイセクト型糖鎖、beta1-6分岐型糖鎖、ダイシアロ型糖鎖、それぞれの構造の違いを明らかにすることであった。2017年度に我々はバイアンテナ型糖鎖およびバイセクト型糖鎖との配列と構造の相関をX線結晶構造解析および分子動力学シミュレーションによって明らかにした(Nagae and Mishra et al., Glycobiology 2017)。さらに2018年度にはバイアンテナ型糖鎖からbeta1-6分岐型糖鎖を生成する糖転移酵素、N-acetylglucosaminyltransferase-V (GnT-V)の基質認識機構をX線結晶構造解析によって明らかにした(Nagae and Kizuka et al., Nature Communications 2018)。この研究によって、GnT-Vによるバイアンテナ型糖鎖の基質認識が明らかになっただけではなく、阻害効果を示すバイセクト型糖鎖がなぜGnT-Vに作用しないかが明らかになった。これは本研究の目標である糖鎖の配列と構造の相関が生理機能に及ぼす影響を視覚的に明らかにできた予想外の成果であった。現在はbeta1-6分岐型糖鎖に特異的に結合するレクチンであるPhytohemagglutinin-L (PHA-L)を用いてbeta1-6分岐型糖鎖との複合体の構造解析およびダイシアロ型糖鎖と複数のレクチンとの複合体の構造解析に取り組んでいる。これによって研究計画に掲げた四種類の糖鎖の配列と構造の相関が明らかになる予定であり、研究はおおむね順調に進展していると判断している。本研究はバイアンテナ型糖鎖およびその生成物である三種類のN型糖鎖、バイアンテナ型糖鎖、beta1-6分岐型糖鎖、ダイシアロ型糖鎖、の合計四種類の糖鎖の立体構造を明らかにすることである。既に2017年度および2018年度の先行研究によってバイアンテナ型糖鎖およびバイセクト型糖鎖に関する配列と構造の相関について充分なデータが得られた。そこで2019年度はbeta1-6分岐型糖鎖に特異的に結合するレクチンであるPhytohemagglutinin-L (PHA-L)を用いてbeta1-6分岐型糖鎖との複合体の構造解析に取り組む予定である。またそれと並行してダイシアロ型糖鎖と複数のレクチンとの複合体の構造解析にも取り組む予定である。これらの研究に取り組むにあたってボトルネックになるのは構造解析に必要な量の高純度な糖鎖を確保することである。我々は既に共同研究者である東北医科薬科大学の山口芳樹教授よりbeta1-6分岐型糖鎖を供給いただいている。またダイシアロ型糖鎖に関しても伏見製薬所より既に購入している。このため研究を遂行する準備は完了している。既にPHA-Lの結晶化に取り組んでおり、基質未結合ながら回折強度データ収集に適した良質な結晶の作成に成功している(未発表データ)。今後は基質との複合体の結晶化に向けて取り組む予定である。またダイシアロ型糖鎖についても結合レクチンを和光純薬工業より入手済みであり、予備実験を既に開始している。これによって研究計画に掲げた四種類の糖鎖の配列と構造の相関が明らかになる予定である。さらに研究計画には含めていなかったがバイアンテナ型糖鎖から生成する別の糖鎖であるbeta1-4分岐型糖鎖に関しても非常に興味深いデータが得られつつある(未発表データ)。

こうした研究を遂行することで当初の予想を上回る成果が得られられるように取り組む所存である。糖鎖は運動性が高く、溶液中で複数の準安定構造の動的な平衡状態として存在する。糖鎖は配列に固有の準安定構造と分布を持つと考えられるが、「配列と立体構造の相関」に関する研究は蛋白質や核酸と比較して遅れている。本研究の目的は、代表的なN型糖鎖であるバイアンテナ型糖鎖の「配列と構造の相関」を明らかにすることである。本年度はバイアンテナ型糖鎖に特異的な植物レクチンであるOrysataレクチンとバイセクト型糖鎖に特異的な植物レクチンであるCalsepaレクチンを用いて、フロンタルアフィニティー、X線結晶構造解析、分子動力学シミュレーションを組み合わせることで、特異性決定のメカニズムを多角的に調査し、結果をGlycobiologyに論文としてまとめた。具体的には、二つのレクチンについて産総研の舘野博士のご協力によってフロンタルアフィニティーを行い、一連のN型糖鎖について親和性の測定を行った。その結果、Calsepaレクチンに対しては以前の報告通りバイセクト型糖鎖に高い親和性を示した。一方Orysataレクチンは1-6アームが伸長したバイアンテナ型糖鎖に高い親和性を示した。そこで二つのレクチンとバイアンテナ型糖鎖との複合体のX線結晶構造解析を行い、それぞれ糖鎖との認識様式を原子分解能で明らかにした。得られた構造はCalsepaレクチンについては親和性解析の結果と一致したが、Orysataレクチンについては親和性解析を綺麗に説明できるものではなかった。そこで結晶構造を基に分子動力学シミュレーションで溶液挙動を調べた。その結果、結合エピトープではない部分の糖鎖がエントロピー項に大きな影響を与え、結果として親和性に寄与するということがわかった。本年度はバイアンテナ型糖鎖に特異的な植物レクチンであるOrysataレクチンとバイセクト型糖鎖に特異的な植物レクチンであるCalsepaレクチンを用いて、フロンタルアフィニティー、X線結晶構造解析、分子動力学シミュレーションを組み合わせることで、特異性決定のメカニズムを多角的に調査し、結果をGlycobiologyに論文として報告することができた。この結果は、レクチンとの相互作用に寄与しない部分、非エピトープ領域の構造の安定化がレクチンとの相互作用という大きな系全体のエネルギーに大きな影響を与えることを示しており、柔らかい糖鎖の溶液挙動の本質的な側面を明らかにしたと考えている。また当初提唱していたエントロピー駆動型の特異性決定機構を部分的に証明できたと感じている。研究当初はラベル化糖鎖を用いたNMR測定を想定していたが、糖鎖とレクチンとの複合体をリガンドを変えながら分子動力学シミュレーションすることによって、熱力学的なパラメータを定性的に比較することが可能であることが明らかになった。これは予想外の収穫であり、今後のさらなる展開が可能になった。また現在進行形のテーマとして分岐構造を生み出す糖転移酵素Xの結晶構造解析も行っている。この酵素はN型糖鎖の構造を精密に認識することが以前から示唆されており、基質認識メカニズムを明らかにすることは、本研究の目的である「糖鎖の配列と機能の相関」を明らかにすることにつながると考えており是非とも進める予定である。
ガロア拡大の整教論

1.等質空間の玉河数に関する公式を得,アデ-ル幾何における平均値定理を完成させた。これは,先行するSiegel,Weil,小野らの仕事を、精密化、一般化したものである。これについて論文2編を発表した(1編は発表予定)。2.種数2のタイヒミューラー・モジュラー群の“非トレリ型"部分群のある系列を、そのJones表現を用いて得た。これは幾何学的には、種数2のコンパクト・リーマン面のモジュライ空間上、ガロア群が有限体上の特殊ユニタリー群である。ガロア被覆の系列で、レベル構造付きの主編極アーベル多様体のモジュライ空間のトレリ写像によるpull-backでは、得られない被覆、を構成したことになる。これについてpreprint1編.1.等質空間の玉河数に関する公式を得,アデ-ル幾何における平均値定理を完成させた。これについてpreprint1編.
Th2細胞分化におけるSTAT5a標的遺伝子の網羅的解析

近年、Th2細胞の分化・活性化には、Stat6非依存的経路が存在することが明らかとなった。一方、本研究者らは、これまでの研究により、Stat6とStat5aを同時に不活化するとTh2細胞分化とアレルギー性気道炎症が完全に抑制されることを見いだし、Stat5aがStat6非依存的Th2細胞分化に必須であることを明らかにした。これらの研究成果は、Stat5a経路をターゲットとしたアレルギー性疾患治療の可能性を示唆するが、Stat5aの下流でTh2型免疫応答を選択的に誘導する分子はいまだ不明である。そこで本研究では、転写因子と標的遺伝子との結合を直接検出可能なクロマチン免疫沈降法(ChIP法)を用いてStat5aが制御する遺伝子群の同定を試みた。その結果、ICOS (inducible costimula tory molecule)の遺伝子近傍にStat5aの結合が確認された。そして、CD4陽性T細胞をIL-2で刺激しするとStat5a依存的にICOSの発現が充進すること、ICOSはTh1細胞に比し、Th2細胞に高発現していることを明らかにした。さらにICOSはリンパ節においてTFH細胞上に発現し、T細胞依存的B細胞応答に重要な役割を果たしていることより、抗体産生におけるStat5a/ICOS経路の役割をStat5a欠損マウスを用いて検討した。その結果、Stat5a欠損マウスでは、TFH細胞におけるICOSの発現が低下していること、抗原特異的抗体産生が低下していることを明らかにした。以上の結果より、Stat5aはICOSの発現を誘導することによりT細胞依存的B細胞応答を誘導している可能性が示唆された。一方、本研究者は、これまでの研究により、Stat6とStat5aを同時に不活化するとTh2細胞分化とアレルギー性気道炎症が完全に抑制されることを見いだし、Stat5aがStat6非依存的Th2細胞分化に必須であることを明らかにした。近年,Th2細胞の分化・活性化には,Stat6非依存的経路が存在することが明らかとなった。一方,本研究者らは,これまでの研究により,Stat6とStat5aを同時に不活化するとTh2細胞分化とアレルギー性気道炎症が完全に抑制されることを見いだし,Stat5aがStat6非依存的Th2細胞分化に必須であることを明らかにした。これらの研究成果は,Stat5a経路をターゲットとしたアレルギー性疾患治療の可能性を示唆するが,Stat5aの下流でTh2型免疫応答を選択的に誘導する分子はいまだ不明である。そこで本研究では,転写因子と標的遺伝子との結合を直接検出可能なクロマチン免疫沈降法(ChIP法)を用いてStat5aが制御する遺伝子群の同定を試みた。その結果,ICOS(inducible costimulatory molecule)の遺伝子近傍にStat5aの結合が確認された。そして,CD4陽性T細胞をIL-2で刺激しするとStat5a依存的にICOSの発現が亢進すること,ICOSはTh1細胞に比し,Th2細胞に高発現していることを明らかにした。さらにICOSはリンパ節においてT_<FH>細胞上に発現し,T細胞依存的B細胞応答に重要な役割を果たしていることより,抗体産生におけるStat5a/ICOS経路の役割をStat5a欠損マウスを用いて検討した。その結果,Stat5a欠損マウスでは,T_<FH>細胞におけるICOSの発現が低下していること,抗原特異的抗体産生が低下していることを明らかにした。以上の結果より,Stat5aはICOSの発現を誘導することによりT細胞依存的B細胞応答を誘導している可能性が示唆された
静脈注射が可能なW/O/Wエマルジョンの開発とその薬物担体としての応用

W/O/Wエマルションは、その薬物担体としての応用が期待されながらも生体に投与可能な剤型としての製造法は確立されていない。そこで今年度は静脈注射が可能となる条件として(1)生体に有害な界面活性剤や油脂を含まない(2)粒子径を可及的小さく均一化する(3)剤型としての安定性を持たせるという条件設定の許に、エマルションの製造法について研究を行った。油相としては大豆油、ゴマ油、オリーブ油、紅花油、綿実油、とうもろこし油、けし油、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸エチル等について、また界面活性剤としては卵黄レシチン、大豆レシチンという安全性の確立したものと、ポリグリセリン縮合リシノレインならびにプルローニックF-68(ポロクサマー)を用いた。製造法としては当初は大豆油・卵黄レシチンのみの系で2段階乳化(超音波ホモジナイザー、ポリトロン、高圧ホモジナイザー)を試み、その可能性を確認した。しかし生成率ならびに封入率が低く、また粒子径の均一化の為の分離技術もむつかしく、将来の実用化には困難が予想された。オレイン酸エチルは製造法上最も容易な油脂であったが、W/O/Wエマルションを静注した段階で、肺塞栓(粒子は0.3μ平均と小さいにもかかわらず)を併発することが判明した。他の植物油とレシチンのみの系で2重乳化を試みたが、大豆油と大同小異であった。従って、レシチンのみでの乳化法は困難と判断し、ポリグリセリン縮合リシノレインとレシチン、更に親水性の界面活性剤としてポロクサマー(0.010.5vol%)を使用する系で、一応静脈注射が可能な条件を満たす乳化法が判明しつつあり、現在は超音波で一次乳化高圧ホモジナイザーで2次乳化を行っている。試験的にこれらの内水相に塩酸ドーパミン、アドリアシンを封入して、薬物動態研究ならびに実験腫瘍VX-2を用いたターゲッティング療法を検討中である。
保育実践による幼児の数量概念の発達-応答的環境としての保育者-

本研究は,社会的文脈における幼児の数的発達を幼児の自発的行動に対する大人の適切な応答と展開により促されるものと捉え,幼児の数的発達に対する保育者の支援の働きを明らかにすることを目的としたものである。本年度は,次の2点を行った。第1に,私立幼稚園7園14クラスの1年間の保育活動でみられた数的活動の種類と頻度,およびそのような活動における保育者の支援の具体的方法について,主に幼児の自由遊び場面を対象に,より詳細な分析を行った。その結果,幼児は幼稚園での自由遊び場面において,特に空間幾何領域,数領域に関わる活動に,頻繁に関与していることが明らかにされた。幼児の数的発達に対する保育者の支援は,幼児の自発的な数的活動を観察し,それに対して反応すること,幼児が行っている活動に数的要素を挿入することなどの方法で行なわれた。教師が数的活動自体を方向付け・誘導することは殆どなかった。第2に,保育者の数的支援を支える信念について明らかにするため,保育者を対象に実施した質問紙およびインタビューのデータについての詳細な分析を進めた。前年度までの研究では,日本の幼稚園における保育者主導の活動では,数的指導を目的とした保育は殆ど行われておらず,数的活動は日常の保育活動に埋め込まれる形で頻繁に行われていることが明らかにされてきた。本年度の自由遊び活動の分析でも同様の傾向がみられたことから,日本の保育者は,意図していないにも関わらず(榊原・波多野,2004),幼児の自発的興味を尊重する形で保育活動に「埋め込み型」の数的支援を行っていることが実証的に示された。日本の幼児の数的能力は国際的に優れているといわれるが(Stevenson, Lee, & Stigler,1986),本研究でみられたような保育者の促進的な支援が,日本の幼児の数的発達において重要な役割を果たしていることが示唆された(榊原,2006)。本研究は、幼稚園・保育所での保育実践を縦断的観察を通して幅広くとらえ、それを幼児の数量概念の発達と関連付けることで、日本の保育実践における保育者の支援の働きを実証的に捉えることを目的としたものである。本年度は、次の3点を行うことで本研究の目的についての知見を深めた。第1に、幼稚園・保育所12園21クラスにおいて収集された1年間の集団保育活動の記録(105回)についての分析を行った。第2に、幼児の数量概念の発達について、観察対象クラスの幼児220名を対象に数量能力を総合的に評価した。具体的には年度始めと年度末の2回にわたり実施されたChild Math Assessment (Starkey et al.,2002)の分析を行った。Child MathAssessmentは数、算術、空間幾何学、計量、パターンの領域にわたる17課題で構成された。第3に、観察対象クラスの保育者を対象に実施した質問紙調査とインタビューの分析を進め、保育実践における数的支援についての方針を探った。以上3点で得られた知見から、日本の保育活動では幼児の数量学習を直接的な指導の目的としたものはほとんど認められず,幼児の数量行動への支援は集団保育活動全般にわたり分散的に,しかし比較的頻繁に生じることが示された.保育者は、保育活動での数量学習の支援は直接的な指導ではなく、生活の中に自然に取り込む形で,特に幼児の興味・関心を捉えることを重視するべきであると考えているようだ.今後は幼児の興味を尊重するような保育者の信念と実際の支援との関係を検討することに加え、保育者の支援の働きのプロセスについて詳細に検討することが課題とされるだろう。本研究は,日本の保育実践を縦断的観察を通して幅広くとらえ,それを幼児の数量概念の発達と関連づけることで,保育者の支援の働きを実証的に捉えることを目的としたものである。本年度は,次の3点を行うことで本研究の目的についての知見を深めた。第1に,私立幼稚園7園14クラスにおいて収集された1年間の保育活動の観察記録をもとに,自由遊びにおける幼児の数的活動と保育者の支援について検討した。その結果,自由遊びにおいて,幼児は多様な数的活動(例:砂場遊び,ブロック遊び)に自発的に関与していることが明らかにされた。自由遊び時間に観察されたほぼ全て数的活動は幼児主導の活動であった。保育者の数的支援は,保育者が幼児の活動に参加し,その活動に埋め込まれている数的要素をとり上げることを通して行われた。自由遊びにおいても集団活動と同様に,幼児の数的学習/指導を目的とした数的活動は観察されなかった。第2に,私立幼稚園における集団保育活動の観察記録およびそれらのクラスに在籍する幼児の数的能力の評価をもとに,幼児の数的発達に対する保育者の数的支援の効果ついて検討した。その結果,幼稚園において保育者から多くの数的支援を受けている幼児は,数的支援が中程度や少ないクラスの幼児に比べて,数領域の能力が優れている傾向が示された。日本の保育者は,体系だった指導に頼らずに,幼児の数能力を効果的に促進していることが示唆された。第3に,幼児の数的発達における助数詞の役割を検討するため,3-5歳児153名を対象に個別面接を行った。その結果,幼児は助数詞の処理は困難だが,集合数は正しく理解・使用する傾向が示された。また,数のみの計数が出来る幼児はそうでない幼児に比べ,助数詞を伴う質問において集合数を正しく処理する傾向が示された。

助数詞は幼児の数操作の学習を促進,抑制することはなく,むしろ影響しないことが示唆された本研究は,社会的文脈における幼児の数的発達を幼児の自発的行動に対する大人の適切な応答と展開により促されるものと捉え,幼児の数的発達に対する保育者の支援の働きを明らかにすることを目的としたものである。本年度は,次の2点を行った。第1に,私立幼稚園7園14クラスの1年間の保育活動でみられた数的活動の種類と頻度,およびそのような活動における保育者の支援の具体的方法について,主に幼児の自由遊び場面を対象に,より詳細な分析を行った。その結果,幼児は幼稚園での自由遊び場面において,特に空間幾何領域,数領域に関わる活動に,頻繁に関与していることが明らかにされた。幼児の数的発達に対する保育者の支援は,幼児の自発的な数的活動を観察し,それに対して反応すること,幼児が行っている活動に数的要素を挿入することなどの方法で行なわれた。教師が数的活動自体を方向付け・誘導することは殆どなかった。第2に,保育者の数的支援を支える信念について明らかにするため,保育者を対象に実施した質問紙およびインタビューのデータについての詳細な分析を進めた。前年度までの研究では,日本の幼稚園における保育者主導の活動では,数的指導を目的とした保育は殆ど行われておらず,数的活動は日常の保育活動に埋め込まれる形で頻繁に行われていることが明らかにされてきた。本年度の自由遊び活動の分析でも同様の傾向がみられたことから,日本の保育者は,意図していないにも関わらず(榊原・波多野,2004),幼児の自発的興味を尊重する形で保育活動に「埋め込み型」の数的支援を行っていることが実証的に示された。日本の幼児の数的能力は国際的に優れているといわれるが(Stevenson, Lee, & Stigler,1986),本研究でみられたような保育者の促進的な支援が,日本の幼児の数的発達において重要な役割を果たしていることが示唆された(榊原,2006)。
多官能性配位子を有するカルシウム錯体の弱い配位系機能の活用

R_1R_2R_5[N(CH_2)m]nNR_3R_4(R_1R_2R_3R_4R_5;H又はアルキル)の分子式を有するアミン類を各種合成し、カルシウムイオン共存下で、アルドース類のC-2エピロリ化反応を行った結果、中心金属としてカルシウム(II)を用いた場合C-2エピマーの外にニッケル(II)の場合には見られなかったフラクトースの生成がみられた。また回収される糖質の量もニッケル(II)の場合は略々定量的に回収されるのに比べて、全体的に少なくなっており、C-2エピ化反応の外に異性化や分解反応も起こっていると考えられる。C-2エピメリ化反応についていえば、ニッケル(II)のようにアミン類の構造の違いによる明らかな差は見られなかったが、置換数の多い配位子の方が転換率が高くなる傾向がみられ、グルコースからの反応の方が、アンノースからの反応より良く進行した。配位子をジアミンからモノアミンに変えて、同様な反応を行っても高い変換率がみられた。アミンの級数の高いほど、転換率は高くなっており、ジアミンでの傾向と一致した。これまでアミンのカルシウム錯体が触媒作用を示すものとして考えてきたが、本反応ではカルシウムがアルドースと結合し、そこにアミンが作用するものと考えた方が考え易い。グルコースとマンノース間で転換率が異なるのは、糖-カルシウム錯体の配位態の差異にもとづくものであろう。更にNNテトラメチルエチレンジアミンとカルシウムによって、ガラクトースとタロースに対して反応を試みた結果、いづれの六単糖よりも、ケトースであるタガトースのみを生成することが明らかとなった。次にNN置換テトラミンについて、同様の反応を試みた結果、ニッケルの場合には、メチル鎖数により大きく変化したのに対し、カルシウムの場合には大差なく、環状テトラミンキレートとして反応に関与していないことが明らかとなった。R_1R_2(N^^<|R_5>(CH_2)m)_nNR_3R_4(R_1R_2R_3R_4R_5;H又はアルキル)の分子式を有するアミン類を各種合成し,カルシウムイオン共存下で,アルドース類のCー2エピメリ化反応を行った結果,中心金属としてカルシウム(II)を用いた場合Cー2エピマーの外にニッケル(II)の場合には見られなかったフラクトースの生成がみられた.また回収される糖質の量もニッケル(II)の場合は略々定量的に回収されるのに比べて,全体的に少なくなっており, Cー2エピ化反応の外に異性化や分解反応も起っていると考えられる. Cー2エピメリ化反応についていえば,ニッケル(II)のようにアミン類の構造の違いによる明らかな差はみられなかったが,置換数の多い配位子の方が転換率が高くなる傾向がみられ,グルコースからの反応の方が,マンノースからの反応より良く進行した.配位子をジアミンからモノアミンに変えて,同様な反応を行っても高い変換率がみられた.アミンの級数の高いほど,転換率は高くなっており,ジアミンでの傾向と一到した.これまでアミンのカルシウム錯体が触媒作用を示すものとして考えてきたが,本反応ではカルシウムがアルドースと結合し,そこにアミンが作用するものと考えた方が考え易い.グルコースとマンノース間で転換率が異なるのは,糖カルシウム錯体の配位能の差異にもとづくものであろう.更にN,N,N'N'ーテトラメチルエチレンジアミンとカルシウムによって,ガラクトースとタロースに対して反応を試みた結果,いづれの六単糖よりも,ケトースであるタガトースのみを生成することが明らかとなった.

次にNーN'置換テトラミンについて,同様の反応を試みた結果,ニッケルの場合には,メチル鎖数により大きく変化したのに対し,カルシウムの場合には大差なく,環状テトラミンキレートとして反応に関与していないことが明らかとなった.前年度、本研究における糖質のC-2位のエピメリ化反応が、(1)C-1位とC-2位の炭素の立体選択的骨格変換によること(2)この種の変換には、金属とジアミンの共存が不可欠であること(3)C-4位に連結を有する二糖類に対してはC-2位のエピ化を行いえないことを実証した。今回は置換アルキル基を有する各種アミン類を合成し、カルシウムイオン共存下でアルドースの変換を行ったが、ニッケル(II)のようにアミン類の構造の違いによる明らかな差はみられず、C-2位エピマーの外にケトースの生成が顕著であった。置換基の多いアミンを用いたときに、転換率が高くなる傾向がみられ、グルコースからの反応の方が、マンノースからの反応よりよく進行した。モノアミンによっても高い転換率を示し、アミンの級数が高い程高く二級アミンの場合には、ケトースの生成が多い傾向にある。C-2エピ化の反応はニッケルの場合と同様にC_2-グルコースとC_2-マンノースの間で特異的に行われているが、フラクトースの場合はC_1はそのままで骨格変換は起こっておらず、グルコースから炭素骨格の組替えなしで生成することを示している。以上の事実により次の推論が可能になるであろう。カルシウムは糖のいずれかの酸素部位と結合してアミンの求核攻撃を受け易くする。その結果ケトースを生成すれば、カルシウム錯体を形成して安定化する。この反応を拡大しうれば、異性化糖への人工触媒が生れる可能性がある。しかしカルシウムを用いてもニッケルと同様にC_1、C_2位の炭素骨格変換が行われた事実を無視することはできない。何故なら、恐らく両者に共通する反応活性種が存在している筈だからである。なおメタノール還流下5分という条件では、アミン、塩化カルシウム、水酸化カルシウムのその何れを単独に用いた場合には、糖質の変化は認められない。
機構を題材とする数学教材の開発

1.研究目的本研究の目的は,機構を題材に,中学校や高等学校の数学の授業において,実用性や汎用性といった数学のよさが認識でき,数学を活用しようとする態度が育つような教材の開発を行うことである。ここで,機構とは回転運動を直線運動に変換するような,機械に運動をさせる一組の物体の組み合わせのことをいう。2.研究方法先行研究や過去の授業実践を分析して「てこクランク機構」を題材とする授業を立案し,研究代表者が勤務する中学校と高等学校でそれぞれ研究授業を実施した。録画した授業の様子やワークシート,アンケートを分析するとともに,授業観察者と協議して題材の扱いや授業展開の工夫等について考察と検討を行った。3.研究成果中学校では第2学年の「図形の性質と証明」における図形の発展学習として,最も短い棒が回転する理由を考えさせる授業を行った。多くの生徒は,三角形が成立するための条件に気付き,辺の長さが満たす不等式を導いて理由を考察することができた。探究する過程では,自らすすんで活発に行う様子が見られており,数学的活動を重視した学習になったと考えられる。高等学校では第2学年の生徒に,定まった範囲の円弧を往復する棒が動く角度の範囲を求めさせた。生徒達は余弦定理を利用して,求める範囲を得ることができた。研究代表者は数学Iの授業を担当していなかったため,数学IIの授業で実施したが,数学Iの「図形と計量」における課題学習の教材になりうることが示された。
デジタル技術を応用した日韓古代彫刻資料の保存と復原に関する研究

当調査研究は、文化財の保存と修復に欠かせない基礎資料を最新の光学機器(ミノルタVIVID910デジタイザー)とデジタル技術を応用して作成し、その復原的研究をめざしたものである。国内調査は対馬・黒瀬銅造如来坐像を対象に平成14年に実施、韓国調査は磨崖仏や大型石仏を対象とした野外調査が中心であるため、文部省科学研究費補助金の支援と現地関係機関各位の協力を得て行なわれた。平成15年度調査:慶尚北道にある奉化郡物野面北枝里磨崖石仏及び栄州広域市可興里磨崖三尊仏の実測調査と3Dデジタル化作業を行った。北枝里磨崖仏は、高さ6メートルに及ぶこの地域最大の磨崖石仏で、新羅彫刻のもつ北方的要素の解明に欠かせない重要な作品と見られている。可興里磨崖三尊仏は、2003年6月下旬に起きた洪水で遺跡の一部が崩落、三尊石仏を彫刻した岩盤も背後の母岩から剥離していることから、遣跡保存に向けた総合的な科学調査の一環として、緊急調査を行った。ただし、可興里三尊仏には屋蓋施設がないため、太陽光が弱まる夕刻から夜間にかけて作業を行わなければならず、昼間に宝閣を有する北枝里磨崖石仏を、夕刻から可興里三尊石仏の実測調査を行う手順で実施した。平成16年度調査:忠清北道忠州市の中原鳳凰里磨崖石仏、及び忠清北道清州市の清原飛中里三尊石仏の実測とデジタル化作業を行った。中原鳳凰里磨崖石仏は、北の高句麗仏教の南下を示す重要な遺跡といわれるが、急峻な山腹にあるために発電機をはじめとする大型機材の搬入が難しく、光学機器を設置する足場も確保できない状況であるため、これまで大規模な調査が行われてこなかった。今回行った遺跡のデジタル化と高精細画像の収集により、写真や拓本では判読できなかった群像の詳細(菩薩半跏思惟像と脇侍菩薩の着衣や荘厳)が明らかになった。平成17年度調査:〓里廃寺址出土石造如来立像は、破損して12個の断片に分離した上半身と光背を接合した本体と台座からなる。本体は慶州国立博物館で保管され、台座は慶州市月城郡陽北面の寺址に残されたままである。博物館の調査では、如来立像の上半身部分と収蔵庫に保管されている断片3個、廃寺址の調査では高さ1.7mに達する八角台座をデジタイザーで実測した。なお〓項里廃寺には、第一層塔身の四面に仁王像を浮彫りした五層石塔が二基残っており、完形をとどめる西石塔の浮彫のデジタルデータを収集した。