hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
市街地域における「水路空間」の利用形態の研究

本研究の目的は,集落や,市街化地域を流通する水路空間の利用形態に着目し,その空間構造を解明することにある。本研究でいうところの「空間構造」とは,水路断面,流水要件,水路配置システム,そして利用行為空間の4要素である。本研究は,これら4要素を,アンケ-ト調査,現地調査等によって情報を収集し各種の分析をおこない,4要素間に存在するシステムや,関関性,特性等を抽出する方法を実施した。調査の特色は,全国(各県12地区を対象とする)50水路を抽出し,全水路を現地調査を実施したことである。本研究の成果は,大別して、(1)配置システムの類型化,(2)利用行為と属性との相関性の2領域にわたって解析結果を得たことにある。(1)の配置システムでは、5タイプに50の水路類型化し,そのなかでCータイプが全体の46%を占めることを明らかにしている。(2)の利用行為と属性との関連性については,得られたデ-タ-を5ブロックに区分し,各ブロック毎にクラスタ-分析法(ウォ-ド法)をもちいてグル-ピング化をおこない判読をおこなった。その結果,現在利ブロックと「流量」の大・小のあいだに明確な相関性があるのを検出することができた。昭和62年度(第1年次)の研究実施計画書に示した作業内容は,ほぼ計画どおり進めることができた.3ヶ年(交付期間)で調査都市(サンプル母数)は,都,道,府県ごと1都市以上で約50都市を現地調査する方針をかためたため,本助成・申請書提出時より約10数都市増加することになった.そのため,現地調査費用(旅費)を優先的に廻すよう2・3年次は変更する予定である.サンプル数を多くした主な目的は,可能なかぎり,全国を平均的に取得したかったからである.62年度に現地調査を終了した都市は,表ー1のとおりである.調査都市を約50と定めたことから,全調査都市の水路網配置図をいそぎ作成した.この作業のなかでは,この水路ネットワークシステムの分類作業にエネルギーをそそぎ3年次の最終報告書には「水路システムの分類」に関するものをまとめ添付する予定である.表ー1現地調査終了の都市NO県名調査都市1宮城白石2茨城常陸太田3栃木宇都宮4埼玉熊谷5千葉市原6東京日野7神奈川小田原8富山高岡9山梨都留10徳島阿南11宮崎都城12鹿児島川内※現地の水路利用の情報を得るため上記の都市以外に16都市へ予備調査した.1.昭和63年度(第2年次)の計画調書に示した作業内容は、ほぼ計画どおり進めることができた。2.当研究では、全国に点在する都市のなかを流れている水路の情報を得て現地調査することが要点であるため、現地調査作業にウェイトをかけてきた。3.本年度において現地調査を実施した都市は、表-1に示す。4.第3年次に68都市の水路保有都市の調査が実施できれば、研究目標のサンプル母数50を確保できるので各セクションの集計作業が進展する予定である。5.本研究の骨格をなすのが「水路システムのタイプ別分類」である。現在、その情報の整理と図化作業を優先的に進めているため、最終報告書にはそれを提示できる予定である。本研究の全体的方法は、集住地を流通している水路を全国から抽出し、現地調査による情簿(測定値や写真記録を含む)の収集、および情報の分析作業を実施して研究結果を得るものである。本年度は、その研究の3年次に該当する。水路利用形態要素のなかでは、本研究の要点項目(行為形態、配置システム、断面形状、水状態ーこれを4要素と称す)の分析(類型化、相関性など)作業は、あらかた終了した。残っている作業は、分析結果を整理し、作図・表、作文等をおこない論文のていさいにする作業がある。昨年度(昭和63年度)に成果公表したものは下記に示したとおりである。

記1,水路護岸の素材の傾向性について2,水路形状の傾向性について発表方法;日本建築学会・学術講演梗概集(6056)3,集住地域を流通する水路空間の断面形状の研究発表方法;日本建築学会・関東支部研究報告集(1989ー5)上記の実績と現地情報が多数得られたことは本研究補助金によるバックアップの賜である。
オリゴメタラシルセスキオキサンの新規触媒機能の開発

不均一系と均一系の中間的な性質を有する金属種含有オリゴシルセスキオキサンは、「厳密な構造決定や制御が容易である分子化されたシリカ担持触媒」として極めて興味深い分子であり、全く新しい概念に基づく触媒系の構築の可能性が考えられる。本研究では、金属種含有オリゴシルセスキオキサンについて新規分子の創製を試みるとともに、酸化反応に対する触媒機能を新たに開拓することを目的として検討を行い、以下の成果を得た。(1)チタン含有シルセスキオキサンを前駆体とする新規多孔質複合酸化材料の創製チタン含有シルセスキオキサンの新規誘導体を合成し、これを乾燥空気気流中、823K付近で焼成したところ、比較的均一に制御されたミクロ細孔を有する多孔質酸化物が得られることを初めて見出した。XPS等から,シロキサン骨格内に微少なTi-Oクラスターが分布しているものと推察された。一方、シリカに担持したチタン含有シルセスキオキサンを焼成することにより、より高分散なチタン種を有し、担体より大きな比表面積を示す多孔質酸化物が得られた。(2)バナジウム含有シルセスキオキサンを前駆体とする高活性不均一系触媒の創製シリカ担持バナジウム含有オリゴシルセスキオキサンを焼成することにより、担体よりも高比表面積を有し、ミクロ細孔およびメソ細孔に富んだ特異的な細孔構造を有する酸化物触媒材料が得られることを初めて見出した。本触媒はメタンの光酸化反応によるホルムアルデヒドの高選択的合成に特に有効であり、通常の含浸法触媒には見られない高活性を示した(TON9.0,at493K,1h)。(3)均一系触媒としてのバナジウム含有シルセスキオキサンの光酸化活性の検討均一系触媒としてのとしての有効性を検討するため、液層光酸化反応に対するバナジウム含有シルセスキオキサンの触媒活性を検討したところ、シクロヘキサンの光酸化反応に特に有効であり、シクロヘキサノールおよびシクロヘキサノンが高収率で得られることを見出した(TON16.at・305K.6h)。
タンパク質・細胞インタラクション電子伝達性アミノ酸配列組込みプローブの構築

電気化学手法を利用した簡便で低コストに細胞をセンシングのために電子伝達性擬似糖質ペプチドと糖質認識タンパク質あるいは糖タンパク質を利用したシステムを開発した。大豆由来レクチン(SBA)はガラクトース認識タンパク質の一つであり電子伝達性擬似糖質ペプチド(Y4C)とも結合する。アシアロフェツイン(ASF)は糖鎖末端にガラクトース残基を有するためSBAと複合体を形成する。これらの背景に基づきヒト骨髄性白血病細胞(K562細胞)のセンシングを実施した。SBAのガラクトース結合サイトにK562細胞表面のガラクトース残基とY4Cとを競争反応によりペプチドの電流値が変化するため、100個/mlオーダーでの測定ができた。一方で、ASFレセプタをもつヒト肝臓ガン細胞(HepG2細胞)とASF、Y4Cをインキュベーションした後、電流値を測定することで50個/mlでのHepG2細胞の検出が可能となった。本システムの測定結果はELISA法によって得られた値と一致しており上記目的が達成されている。6つのヒスチジン残基にY4Cを導入したペプチドをASFに結合させたタンパク質を合成し、タンパク質へのペプチドの修飾数とタンパク質における修飾位置に関する研究を実施した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析の結果、ペプチド1分子程度の質量数の高質量側へのシフトが観察されており、複数のペプチドはタンパク質に修飾されていないことが見出された。さらに、タンパク質へのペプチドの導入位置を解析するためプロテアーゼでペプチドフラグメントに切断しLC-MS/MSでの測定では、タンパク質のN-末端に結合している可能性が示唆されている。本研究で提案するペプチド修飾タンパク質はターゲットタンパク質のセンシングフローブとして構造がシンプルでありタンパク質間結合の評価プローブとしても期待される。1.細胞膜透過性/アポトーシス誘起/電子伝達性ペプチドを合成し、ペプチドの電極応答の変化からU937細胞のセンシングを行う新たなシステムを考案した。この多機能性ペプチドはU937細胞膜を選択的透過してアポトーシスをもたらすプロテグリンの配列の一部をアルギニン残基に置換し、電子伝達性ペプチドをそのC-末端に導入したものである。その特性として、プロテグリン/電子伝達性ペプチドに比較し作製したペプチドでは細胞膜透過性が向上しており、U937細胞の検出感度を改善することができた。また、本ペプチド配列は抗がん剤としての働きを有しており、ドラッグデリバリーとしての応用が期待され、細胞膜透過性の評価法としても重要である。2.オボアルブミン(OVA)の電気化学的センシングするためにOVA分子認識/電子伝達性ペプチドを固定化したマイクロ磁性ビーズを設計した。そのねらいは、OVAと上記ペプチドとの相互作用に基づき高感度でありつつビーズの再生使用が容易なOVA検出ツールを構築することであった。その結果、ビーズ表面上の電子伝達性ペプチドが電極表面と接触することで酸化応答が得られることを見出した。また、OVAがビーズに濃縮されるために、その電極応答が減少を測定することで10ー13 Mレベルの検出を可能とした。一方、使用したビーズをタンパク質変性剤で処理することで再利用をすることも可能であった。血清においてOVAの添加回収実験を行ったところマトリックスからの影響も少なく、優れたOVAセンシングツールを開発することができた。細胞膜透過性/アポトーシス誘起/電子伝達性ペプチドプローブによるU937細胞のセンシングに関しては、電子伝達性ペプチドの新たな特性が明らかとなり蛍光プローブに劣らない測定感度を有するものである。その有用性としては、細胞膜外のペプチドプローブを分離する操作が不要であるという利点をもつ。また、提案したペプチド配列のアルギニン残基の導入数と細胞膜透過性につても有益なデータを取得した。一方で、アポトーシス誘起ペプチドと電子伝達性ペプチドとの組み合わせは新規性が高く、プローブすべてアミノ酸で構成されていることも医学的分野にも波及効果が高い。さらに、細胞へのドラックデリバリーのモニタリング法として興味深い知見が得られており初年度の結果としては評価できるものと考える。マイクロ磁性ビーズ表面上にオボアルブミン(OVA)分子認識/電子伝達性ペプチドを修飾したツールによるOVAの検出に関する研究については、タンパク質のビーズへの濃縮効果を利用し高感度化を試みた。すでに、均一反応でのオボアルブミンーペプチドプローブ間相互作用によるターゲットタンパク質の測定については報告しているが、今回の研究で測定感度を一桁向上させることに成功した。加えて、実試料における共存物の干渉を測定の溶液を交換しることで除去できる可能性をもっている。先に述べたが、タンパク質を変性させることでビーズに固定化されたペプチドからの除去ができ、再利用の特性を持っている。この視点からもタンパク質のセンシング法としての新たなアプローチとなるといえる。以上、本年度の成果から判断しておおむね順調と判断した。電子伝達性擬似糖質ペプチドを修飾した磁性ビーズをツールとしてガラクトース認識タンパク質の電気化学的センシングを実施した。このツールの特長は、固定化したペプチドが電極応答を示しつつターゲットタンパク質を分子認識するという2つの機能を有していることである。基本的ペプチド配列はチロシン残基から成りC-末端にはシステイン残基を結合したペンタ-、ヘキサペプチドである。その配列の一部にはアラニンやセリンを導入したペプチドも調製しタンパク質に対する選択性および測定感度を評価した。ガラクトース認識タンパク質として大豆由来レクチンをモデルとしたところ、架橋剤を介してチロシン残基を4残基含むペンタペプチドを導入した磁性ピーズにおいて高機能性を示すことを見出した。

アラニン、セリン残基の効果としては親水性を高める導入位置によって測定感度を左右するものであった。また、磁性ビースはタンパク質を濃縮することができ、再生可能なツールとしても有用であった。それゆえ、考案した電気化学的測定システムはガラクトース認識タンパク質のシンプルで簡便な測定手法となるものである。糖タンパク質にHisタグー電子伝達性ペプチドを導入したプローブタンパク質を作製して、ターゲットタンパク質との相互作用の電気化学的モニタリングとセンシングを試みた。糖鎖の末端にガラクトースを有しているアシアロフェツインのN-末端あるいはリジン残基にHisタグー電子伝達性ペプチドを結合させることでプローブタンパク質とした。ターゲットタンパク質には大豆由来レクチンを選択した。アシアロフェツインはターゲットタンパク質と反応させることで、ガラクトース認識による相互作用をもつ。結果として、Hisタグー電子伝達性ペプチドはタンパク質間相互作用からの影響を受けることから電極応答が変化するものであり大豆由来レクチンの検出が容易に達成できた。ガラクトース認識タンパク質を検出するための電子伝達性擬似糖質ペプチド固定化磁性ビーズを構築することで次のような知見が得られている。ヒト血清中にターゲットタンパク質を添加した場合、その回収率は100%前後であり共存物の影響が小さいことが分かった。また、修飾したペプチドとの結合によってビーズ表面への選択的な濃縮によりターゲットタンパク質の高感度な測定が可能となった。ビーズに結合したタンパク質は尿素などの変性剤を添加することで、容易に除去され5回程度、再利用できるものであった。ペプチド配列に関する情報についても、ペンタ-、ヘキサペプチドにおけるアラニン、セリンの導入位置によりペプチドの特性が変化することを明らかにしている。さらには、ペプチドを磁性ビーズにペプチド修飾する際の架橋剤ならびにビーズの粒径の差異による電流値への効果についても考察しており、タンパク質センシングのための新たな取り組みとなっている。Hisタグ/電子伝達性ペプチド導入糖タンパク質をセンシングプローブとして考案し、糖タンパク質の糖鎖と結合するターゲットタンパク質を電気化学的に測定する手法は新規性の高いコンセプトになっている。金属イオンや補酵素を有する酵素、シトクロームなどを除いて酸化還元部位を有するタンパク質は稀である。今回、提案したHisタグ/電子伝達性ペプチド導入糖タンパク質は糖質とアミノ酸残基から構成されておりシンプルなセンシングプローブである。その観点から、多くのタンパク質へのラベルとしての幅広い展開が期待できる。これらの成果は平成29年度に計画にしたがって進めてきたものであり、本プロジェクトはおおむね良好に進展している。次年度もプローブタンパク質の特性や機能について継続して研究を展開する予定である。
lpr突然変異遺伝子の機能の解析:新しい方法論の確立に向けて

【研究計画1】lpr変異遺伝子によるリンパ節腫大移入モデルの応用。既に確立したlpr表現型移入モデル(Immunobiology,186:449,1992)において、lpr遺伝型発現には、移植宿主の放射線照射が必須であること、移植lprリンパ節は腫大している必要の無いこと、lpr骨髄の移植は必ずしも必要ではないこと、等が明かとなった。なお、MRL/lpr系に加え、MRL/+系のThy1-congenic lineを樹立した。【研究計画2】野性型Lpr遺伝子の生理的機能を解析するための実験法の開発。及び【研究計画4】未知遺伝子の生体内での異常及び正常機能を同定する方法論の確立。lpr変異遺伝子がFAS遺伝子のloss-of-function mutantであることが、Nagataらにより報告された。即ち、Lpr遺伝子がFAS遺伝子あることが偶然に明らかにされた。この事実と、これまでの実験的アプローチから得られた結果を総合して、新しい方法論の開発の作業中である。【研究計画3】ALYマウスを用いて骨髄移植、リンパ節移植を行い、ALYマウスにおけるリンパ節欠損はリンパ節原基における環境細胞(非リンパ球)の(機能)欠損に基づく事を強く示唆する結果を得た。副産物として、ALYマウスでは、骨髄におけるBリンパ球の亜分画に重大な欠損が存在することを見出した。更に、この欠損は造血細胞側ではなく造血環境側に内在することが示された。即ち、野性型Aly遺伝子は、リンパ節原基環境及び造血環境を構成する細胞群で発現され、リンパ節の形態形成やBリンパ球亜群生成に必須の機能を担っていると考えられる。
大規模科学技術計算を指向したプロセッサアーキテクチャの研究

申請者が提案している処理方式"スライドウィンドウ方式に基づく擬似ベクトルプロセッサ(以下PVP-SWと呼ぶ)"の利点は,レジスタ/キャッシュを共有したスカラ処理とベクトル処理の融合を実現する点である.従来のベクトル計算機もスカラ処理とベクトル処理の両方を実現するが,レジスタ/キャッシュを共有しないため,スカラ処理したデータにベクトル処理を施す場合にデータの受け渡しが必要となり,性能が低下する.このような計算の代表として,リストベクトル処理を取り上げ,PVP-SWの有効性を定量的に評価した.まず,PVP-SWと,比較対象として,キャッシュプリフェッチ機構のみを採用するものの2つのプロセッサの詳細なモデルを決定した.その後,命令パイプラインレベルのシミュレーションを行なって評価を行った.評価結果より以下の点がわかった.1.単純にベクトル化できるリストベクトル処理においては,PVP-SWは,キャッシュプリフェッチ機構のみを持つものよりも23倍高速である.2.単純にはベクトル化できないリストベクトル処理においても,PVP-SWは,キャッシュプリフェッチ機構のみを持つものよりも約50%高速である.また,PVP-SWのクロック周波数が従来のベクトル計算機より約10倍遅いと仮定しても,PVP-SWはベクトル計算機並みの実効性能を達成することがわかった.以上のことから,単純なベクトル化が可能か否かに関わらず,提案するPVP-SWが有効であることがわかった.また,単純にベクトル化できない場合は,レジスタ/キャッシュを共有したスカラ処理とベクトル処理の融合が重要であることもわかった.提案するPVP-SWを実際にVLSIに集積実装する際のコストの見積り,PVP-SWの性能をさらに向上させるために追加すべき機構の検討,の2点は今後の課題である.申請者が提案している処理方式"スライドウィンドウ方式に基づく擬似ベクトルプロセッサ(以下PVP-SWと呼ぶ)"の利点は,レジスタ/キャッシュを共有したスカラ処理とベクトル処理の融合を実現する点である.従来のベクトル計算機もスカラ処理とベクトル処理の両方を実現するが,レジスタ/キャッシュを共有しないため,スカラ処理したデータにベクトル処理を施す場合にデータの受け渡しが必要となり,性能が低下する.このような計算の代表として,リストベクトル処理を取り上げ,PVP-SWの有効性を定量的に評価した.まず,PVP-SWと,比較対象として,キャッシュプリフェッチ機構のみを採用するものの2つのプロセッサの詳細なモデルを決定した.その後,命令パイプラインレベルのシミュレーションを行なって評価を行った.評価結果より以下の点がわかった.1.単純にベクトル化できるリストベクトル処理においては,PVP-SWは,キャッシュプリフェッチ機構のみを持つものよりも23倍高速である.2.単純にはベクトル化できないリストベクトル処理においても,PVP-SWは,キャッシュプリフェッチ機構のみを持つものよりも約50%高速である.また,PVP-SWのクロック周波数が従来のベクトル計算機より約10倍遅いと仮定しても,PVP-SWはベクトル計算機並みの実効性能を達成することがわかった.以上のことから,単純なベクトル化が可能か否かに関わらず,提案するPVP-SWが有効であることがわかった.また,単純にベクトル化できない場合は,レジスタ/キャッシュを共有したスカラ処理とベクトル処理の融合が重要であることもわかった.提案するPVP-SWを実際にVLSIに集積実装する際のコストの見積り,PVP-SWの性能をさらに向上させるために追加すべき機構の検討,の2点は今後の課題である.
ニッケル錯体を触媒とするアルカンの選択的水酸化反応

[1]ニッケル錯体の調製とキャラクテリザーション各種ピリジルアルキルアミン系およびフェノール系の配位子とニッケル(II)塩を作用させて対応する単核および二核のニッケル(II錯体を調製した。得られた錯体については結晶構造解析を行い構造の詳細を明らかにすると共に、各種分光学的特性、磁気的特性、酸化還元電位などを明らかにした。[2]ニッケル錯体を触媒とするアルカンの水酸化反応合成した各ニッケル錯体を触媒として用い、アルカンの水酸化反応について詳細に検討を行った。まず始めにモデル基質としてシクロヘキサンを、また、酸化剤としてH_2O_2、ROOH、m-CPBAなどを用いて反応のスクリーニングを行った。ここで得られた結果を基にして反応条件の最適化(酸化剤の種類、溶媒、触媒量など)を行い、効率的な触媒系を築した。次に最適化した反応条件下で各種基質(アルカン)のスクリーニングを行い、反応の位置選択性(1級炭素vs.2級炭素vs.三級炭素)や、官能基選択性などについて検討した。[3]酸化活性種の同定と反応機構の解明低温紫外可視吸収スペクトル、低温FT-IR、ESR、ESI-MS、低温ラマンスペクトルなどの各種分光学的手段を駆使してニッケル錯体と酸化剤との反応を追跡し、反応の活性種や反応機構などについて考察を加えた。
膵腸相関から解き明かす膵癌の難治性機構とその克服

膵発がんとその進展過程において、腸管の恒常性維持機構との密接な繋がりが存在すると考えられる。この「膵腸クロストーク」の全貌解明を目的として、膵癌前駆病変を自然発症するモデルマウスを用いて、膵炎の負荷に伴う病変の進展という膵癌初期発生過程の擬時間を再現し、腸内環境の変化について解析を行った。次世代シーケンサーにより糞便由来DNAの16SrRNA遺伝子解析を行った結果、膵組織の変化に伴って生じた特異的な腸内微生物叢プロファイルが見出された。また、モデルマウスにて腸管および小腸パネト細胞の形態と膵癌前駆病変の悪性化の関連性を示唆する結果が得られた。膵特異的に変異型KRASを発現する遺伝子改変マウスPdx1-Cre;LSL-KrasG12D(PanINモデル)のコロニーを得た。まずはじめに、生後1218週で既報の通りに膵癌前駆病変に類似するPanINの発生をみることを確認した。次にこのモデルマウスを6週齢でSPF環境からconventional環境へ順化させ、8週齢でCaerulein処理(50 ug/kgを1時間毎に計6回、2日間腹腔内投与;CA群)することにより慢性膵炎が誘導され、その8週後(16週齢)には著しい間質増生を伴うPanINの進展、浸潤癌形成がみられることを確認した。PanINモデルならびに野生型マウスに対し、CA群と対照群(PBS腹腔内投与)を各12匹と設定し、経時的に糞便回収を行い、16週齢にてsacrificeのうえ膵、消化管の組織材料を得るプロトコールを設定した。糞便(凍結乾燥処理)を用いて腸管自然免疫、腸内細菌叢の変化を追跡中である。自然免疫の指標として、Cryptdin-1/4 ELISAを用い(Nakamura K, et al. Anal Biochem 2013)、16S rRNAメタゲノム解析による菌叢解析は、細菌種の可変領域のうちいずれかを含め400bp程度の増幅領域を複数設定した(Ion Torrent PGM)。メタゲノム解析については、異なるプラットフォーム(Mi-seq)において整合性ある結果が得られるかについても検証する。平成27年度の研究計画は達成された平成27年度に取得した、膵特異的に変異型KRASを発現する遺伝子改変マウスPdx1-Cre;LSL-KRASG12D (PanINモデル)と、野生型マウスより採取した糞便(凍結乾燥処理)を採集する経時的サンプルリングを本年度も継続して行った。PanINモデルマウスでは生後6-8週齢で発生する膵前癌病変が発生し、さらに8週齢でCaerulein(CA)薬剤を腹腔内投与することにより膵炎を誘発しPanINの悪性度が進展する条件が加わることが確認されている。PanINモデル並びに野生型マウスに対しCA群と対照群を各12匹と設定し、経時的に糞便回収を行った上で16週齢にてsacrificeの上で膵、消化管の組織材料を得た。取得した糞便よりDNAを抽出・精製の上、CA投与直前、投与後4週、8週のサンプルを中心として次世代シーケンサーを用いて腸内細菌に関する16S rRNAメタゲノム解析を行い、各群の腸内細菌叢に関して群間比較を行った。また、取得した糞便を用いて腸管自然免疫の変化を追跡した。自然免疫の指標として、研究チームが独自に開発したCryptdin-1/4 ELISAの系を用いた。これら取得されたデータとおよび腸管の膵組織内変化などの取得組織形質データとあわせ、PanIN形成やその悪性化と腸内環境との関連を比較検証する。マウス糞便、組織サンプルの取得が完了し、シーケンスメタゲノム解析、腸内自然免疫測定も完了しており、ほぼ研究計画通りに進行している。膵前癌病変であるPanINを自然発症する遺伝子改変マウス(Pdx1-Cre;LSL-KrasG12D;以下PanINマウス)を用いて、野生型マウスより採取した糞便(凍結乾燥処理)を採取する経時的サンプリングを行った。同マウスでは、膵特異的に変異型KRASを発現させることで、生後8-12週でPanINの多発をみるが、薬剤セルレインを腹腔内に投与することにより膵炎を惹起すると悪性度が進展する条件が加わる。昨年に継続して、PanINマウス並びに野生型マウスに対しセルレイン付加群・対照群を設定し、糞便のサンプリングによって得られたDNAに関して、次世代シーケンサーによる16S rRNAメタゲノム解析における腸内細菌の比較を行った。その結果、セルレイン投与したPanINマウスにおいて特異的な腸内微生物叢プロファイルが存在していることが明らかになった。また、16週齢にて解剖の上取得した膵・消化管組織の観察データから、小腸パネト細胞の形態と、PanINの異型度・膵間質に関連が見られた。今後は、得られたデータと合わせ、「腸から膵へ」「膵から腸へ」の因果関係を証明するため、PanIN形成やその悪性化と遺伝子プロファイル、腸内環境との関連を引き続き比較検証する。

次世代シーケンサーにより糞便由来DNAの16SrRNA遺伝子解析を行った結果、膵組織の変化に伴って生じた特異的な腸内微生物叢プロファイルが見出された。また、モデルマウスにて腸管および小腸パネト細胞の形態と膵癌前駆病変の悪性化の関連性を示唆する結果が得られた。当初の計画通りに研究を進める。タンパクならびにメタゲノム解析を加速するために、研究室に所属する技術員の協力を得る。最終結果を論文としてまとめる。分子生物学、臨床医学端数となった約2,700円の執行が困難であったため、次年度に使用することとした。平成28年度請求額と合わせ、物品費として使用予定。
グラム陰性桿菌におけるメタロ-β-ラクタマーゼおよび基質拡張型β-ラクタマーゼ遺伝子の解析

クラス3型インテグロン構造に担われるメタロ-β-ラクタマーゼ産生株は我が国でしか検出されていない。臨床分離カルバペネム耐性セラチアAK9373株から全DNAを抽出し、クローニングに用いる。BamHIでクローニングした約7kbのblaIMP遺伝子を持つ組み換えプラスミドpSMB731をBamHIにてファージミドベクターに組み込み、deletionクローンを作成する。これを用いて塩基配列の解析を行ない、クラス3型インテグロンの全遺伝子構造を明らかにした。さらに遺伝子解析したインテグロン構造のヌクレオチドからプライマーを設計し、臨床分離メタロ-β-ラクタマーゼ産生株約900株からのスクリーニングを行ない、新たにP.putidaからクラス3型インテグロン構造を持つ株を発見した。さらに構造解析によってAK9373株や既存のクラス1型インテグロン構造とは異なる構造が明らかとなった。これらの中には院内感染を呈していると考えられるものもあり、臨床的にも重要と考えられた。また、基質拡張型β-ラクタマーゼ産生菌に関しては、我が国における検出状況を明らかとし、CTX-M-1型、CTX-M-2型、CTX-M-9型の3タイプの遺伝子型を持つものが多いことを明らかとした。さらにCTX-M-1型のグループでは、CTX-M-3型が多く、また、Toho-1型と考えられていた株はCTX-M-2型であることが初めて明らかとなった。PFGE解析により、医療施設によっては、こうした耐性菌が、院内感染を呈しているものもあった。これらを用い、欧米に多く検出されるTEM-,SHV-型とCTX-M-タイプβ-ラクタマーゼ産生菌を阻害剤を用いたディスク拡散法を用いて分別も可能であることも明らかとし、メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌検出のメルカプト酢酸ナトリウムのディスクと組み合わせることにより、臨床現場での迅速な薬剤耐性菌の報告により正確に反映することがえきることが示唆される。近年とくにカルバペネム耐性を引き起こすメタロ-β-ラクタマーゼ産生菌や欧米ですでに院内感染などアウトブレイクが問題となっている基質拡張型β-ラクタマーゼ産生菌(ESBL)の出現が問題となりつつある。ESBL産生菌に関しては、Toho-1型や新型であるSHV-24型β-ラクタマーゼ産生株が分離されていることを報告してきた。最近CTX-M2など新たにCTX-M familyのβ-ラクタマーゼ産生菌も報告されてきているが、国内外でその疫学的実態を明らかにしたものは少ない。これらのβ-ラクタマーゼ遺伝子に共通していることは、いずれも伝達性プラスミド上に担われており、院内感染の原因となることである。チオール化合物を用いたメタロ-β-ラクタマーゼの迅速診断法およびダブルディスク法を応用しTwin testにて菌を検出する方法を開発し、それらの研究途上で国内で初めてVIM2型メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌、CTX-M-3型β-ラクタマーゼ産生菌を検出するなど成果を挙げてきている。また、この比較的国内で稀なVIM-2型産生菌のアウトブレイクも検出し、臨床に貢献した。さらに今年度、国内で初めてIMP-2型メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌を検出し、これらがクラス1型インテグロン構造に担われていることが明らかとした。この内1株は、IMP-1型とIMP-2型の両方を持っており、それぞれ独立したインテグロン構造に担われていることも明らかとすることができた。また、臨床分離カルバペネム耐性セラチアAK9373株からクローニングしたIMP-1型メタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子は、クラス3型インテグロンという日本のみに認められている構造に担われていることが明らかとなったが、その全インテグロン構造をはじめて明らかとした。今後さらに臨床分離株でのこれらの遺伝子構造の分布を解析していく予定である。

PFGE解析により、医療施設によっては、こうした耐性菌が、院内感染を呈しているものもあった。これらを用い、欧米に多く検出されるTEM-,SHV-型とCTX-M-タイプβ-ラクタマーゼ産生菌を阻害剤を用いたディスク拡散法を用いて分別も可能であることも明らかとし、メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌検出のメルカプト酢酸ナトリウムのディスクと組み合わせることにより、臨床現場での迅速な薬剤耐性菌の報告により正確に反映することがえきることが示唆される。
動物モデルを用いたサルコイドーシスの病態解明と画期的な分子イメージングの開発

心臓サルコイドーシスの診断はきわめて困難で、確定診断は心内膜下心筋生検によるが、肉芽腫の病変形成部位によっては組織を得ることは難しい。特に心臓限局性サルコイドーシスとなると生検標本で非乾酪性類上皮細胞肉芽腫が確認されない限り、真の診断とは言えない。我々は、心筋におけるマクロファージの特異的画像診断により、心臓サルコイドーシスの科学的な病態に基づいた診断をめざした。F-18 FDG PETは心臓サルコイドーシスの活動性病変部位の診断に有用とされているが、FDGは炎症細胞のみではなく、正常心筋への生理的集積や障害心筋細胞への集積があることが知られており、100%炎症細胞に集積するわけではない。我々は、マクロファージに存在するソマトスタチンサブタイプ2受容体(SSTR2)に親和性のあるpentetreotideをIn-111で標識した化合物に注目した。SSTR2は心筋細胞には存在しないためFDG PETの問題点を克服できる。4名の心臓サルコイドーシス患者にIn-111pentetreotideシンチグラフィ、心エコー図、心臓MRI、F-18 FDG PETを施行し、左室心筋の評価を行った。これらのモダリティにより活動性病変、非活動性病変、線維瘢痕化病変、正常心筋を区別可能であることが判明した。一方、心筋におけるマクロファージにIn-111 pentetreotideが集積しているかをモデル動物で検討した。ラット心筋梗塞モデルのオートラジオグラフィでは梗塞周辺領域にIn-111 pentetreotideの集積を認めた。ヒトにおいても動物モデルにおいてもIn-111 pentetreotideはマクロファージが集簇する炎症病巣に集積することが明らかとなった。今後はこの機序を確認する。臨床研究においては、4名の心臓サルコイドーシス患者にIn-111pentetreotideシンチグラフィ、心エコー図、心臓MRI、F-18 FDG PETを施行し、左室心筋の評価を行った。このことは予定通り進捗している。動物実験においては、心筋におけるマクロファージにIn-111 pentetreotideが集積しているかをモデル動物で検討した。当初はサルコイドーシス動物モデルをApoE遺伝子欠損マウスにコール酸を負荷して作製する予定であったが、apoE遺伝子欠損マウスの繁殖が予定どおりに勧められなかったので、マクロファージの心筋への集簇が認められるラット心筋梗塞モデルを用いてIn-111pentetreotideによるオートラジオグラフィをおこなった。このモデルではモデル作成7日で梗塞周辺領域にマクロファージの集簇を認め、同部位へのIn-111 pentetreotideの集積を認めた。当初の計画であるサルコイドーシスモデル動物でオートラジオグラフィが行われていないことがやや遅れているとした理由である。しかしながら、ヒトにおいても動物モデルにおいてもIn-111 pentetreotideはマクロファージが集簇する炎症病巣に集積することが明らかとなった。今後は、サルコイドーシスモデルマウスのオートラジオグラフィでIn-111 pentetreotideが病変部に集積することを確認する。また、In-111 pentetreotideが炎症部位に集積する機序の解明をおこなう。In-111 Pentetreotideの心筋の炎症部位舳の集積が非特異的でるのか、マクロファージのソマトスタチンサブタイプ2受容体への特異的集積であるのかの検討を行う。その方法として、心筋病変部位に集簇したマクロファージにソマトスタチン受容体サブタイプ2(SSTR2)が発現していることを確認する。これには、SSTR2の抗体による免疫染色とWestern blottingを行う予定である。さらにSSTRの遮断薬を前処置後にIn-111pentetreotideによるオートラジオグラフィをおこなうことを予定している。In-111pentetreotideシンチグラフィが心筋に集簇したマクロファージのイメージングが可能であることが示されれば、心臓サルコイドーシスを非侵襲的に診断が可能となり、多くの心臓サルコイドーシス患者にステロイド治療へ踏み切ることができる。In-111pentetreotideシンチグラフィはF-18 FDG PETと異なり、SPECTを施行しこうしている施設で可能で、日本において広く使用できる。原理的には、マクロファージが集簇している活動性炎症をF-18 FDG PETよりも疑陽が少なく診断できる可能性を秘めている。心臓サルコイドーシスは慢性心筋炎の特殊型であり、心不全や重症不整脈を来たし、生命予後ばかりでなく生活の質の低下を来す原因不明の難病である。早期に診断し、ステロイド治療を開始すれば予後改善が期待されるが、早期診断は容易ではない。Fluorodeoxyglucose (F-18 FDG)PET検査は心臓へ浸潤した炎症細胞を観察できるので有力であるが、原理としては糖代謝を観察しているので、心筋細胞への生理的集積の影響を完全には排除できない。さらに、PET検査は利用施設が限られる。そこでSPECT検査であり、かつ肉芽腫の主な構成成分であるマクロファージの選択的な画像化が可能となればマクロファージの関与する慢性心筋炎の病態評価に有用であるばかりではなく、心臓サルコイドーシスの診断精度向上に貢献できる。

我々は心臓におけるマクロファージの低侵襲による画像化を動物実験による病理の検討を元に臨床応用の可能性を検討した。初年度では、ラットの心筋梗塞モデルにおいて、マクロファージイメージング製剤と考えられるIn-111 Pentetoreotideのオートラジオグラフィを施行した。その結果として、梗塞部位周辺に存在するマクロファージに一致して集積を認めた。In-111 Pentetoreotideはソマトスタチン受容体サブタイプ2、5に結合する。一方、マクロファージにはソマトスタチン受容体サブタイプ2が発現している。しかしながらこのモデルにおけるマクロファージにソマトスタチン受容体サブタイプ2が発現していることは免疫染色では確認できていない。これは抗体の問題なのかあるいは染色条件に問題があるのか、心筋梗塞モデルで認められるマクロファージには発現していないのか、現在検討中である。心臓サルコイドーシス患者では4名にIn-111 Pentetoreotideの集積とF-18 FDGの集積を認めた。ラットの心筋梗塞モデルにおいて、マクロファージイメージング製剤と考えられるIn-111 Pentetoreotideのオートラジオグラフィを施行し、マクロファージイメージングの可能性を検討した。その結果として、梗塞部位周辺に存在するマクロファージに一致してIn-111 Pentetoreotideの集積を認めた。しかしながらマクロファージのソマトスタチン受容体サブタイプ2をターゲットとした免疫染色では陽性所見が得られておらず、使用する抗体や免疫染色条件を変更して試みている。心臓サルコイドーシス患者ではIn-111 Pentetoreotideシンチグラフィを4名に施行した。4名すべてにIn-111 Pentetoreotideの集積を認め、同部位にはF-18 FDGの集積を認めた。心臓サルコイドーシスの診断はきわめて困難で、確定診断は心内膜下心筋生検によるが、肉芽腫の病変形成部位によっては組織を得ることは難しい。特に心臓限局性サルコイドーシスとなると生検標本で非乾酪性類上皮細胞肉芽腫が確認されない限り、真の診断とは言えない。我々は、心筋におけるマクロファージの特異的画像診断により、心臓サルコイドーシスの科学的な病態に基づいた診断をめざした。F-18 FDG PETは心臓サルコイドーシスの活動性病変部位の診断に有用とされているが、FDGは炎症細胞のみではなく、正常心筋への生理的集積や障害心筋細胞への集積があることが知られており、100%炎症細胞に集積するわけではない。我々は、マクロファージに存在するソマトスタチンサブタイプ2受容体(SSTR2)に親和性のあるpentetreotideをIn-111で標識した化合物に注目した。SSTR2は心筋細胞には存在しないためFDG PETの問題点を克服できる。4名の心臓サルコイドーシス患者にIn-111pentetreotideシンチグラフィ、心エコー図、心臓MRI、F-18 FDG PETを施行し、左室心筋の評価を行った。
単一NIH3T3ねずみ細胞のナノ次元動的分光

金ナノ粒子は可視域に強い吸収、光散乱を示し、また化学的に安定かつ不活性であることから、化学・バイオセンサーや光学ラベルとして生物・医療分野への応用が期待されている。本研究では、単一生細胞内の局所環境プローブのための新しい手法の開発を目的に、単一金ナノ粒子の表面プラズモン共鳴を利用した細胞の分光・イメージング法の研究を行った。我々が開発したフェムト秒白色光を光源とした共焦点顕微光散乱分光装置を使用し、細胞試料にはマウス繊維芽細胞(NIH3T3)を用いた。顕微鏡ステージ上に炭酸ガスインキュベータと恒温容器をセットできるようし、細胞培養条件下で生きた細胞の非染色3次元光イメージングを数時間以上安定に測定、観察することに成功した。一方、球形金ナノ粒子(直径80nm)のコロイド細胞培養液中に添加することで、金ナノ粒子がNIH3T3細胞の表面に付着するだけでなく細胞内部に自発的に取り込まれるが確認された。さらに、金ナノ粒子を添加した試料を用いた共焦点顕微分光・イメージング測定から、細胞表面あるいは内部の単一金ナノ粒子の位置が時間とともに変化する様子をサブミクロンの3次元空間分解能で測定できることを示し、同時に金ナノ粒子のプラズモン共鳴スペクトルのピーク波長が位置によって変化することを観測した。このように、本実験手法が金ナノ粒子を光学ラベルやセンサーとして用いる新規非染色細胞分光イメージング技術として有効であることが示された。本年度は、細胞内にナノ粒子を導入する新しい手法ならびに非発光性のナノ粒子を用いた細胞イメージングのための要素技術として、顕微蛍光イメージング法による単一細胞の中と表面にある高分子ビーズの可視化技術と細胞内に取り込まれるナノ粒子のサイズを検討した。マウスNTH3T3細胞の培養液中に蛍光性高分子ビーズを添加し、共焦点顕微鏡で3次元蛍光像の観察を行った。直径40nmのビーズでは添加後数分程度で細胞内にナノ粒子が取り込まれ、細胞核周辺に多数の蛍光ビーズの発光が観測された。細胞膜染色色素も同時に添加し、2波長共焦点蛍光イメージングを行うことによって、蛍光ビーズが細胞表面でなく内部に取り込まれていることを明確に示すことに成功した。また、培養液中に糖があると多数のビーズがすばやく取り込まれる傾向にあることが分かった。一方、直径100nmのビーズの場合には、ビーズは膜表に多く吸着するが細胞内には入らないことを、同様の2波長蛍光イメージ測定から明らかにした。生きたままの細胞中のナノ粒子を膜表面と区別して可視化することに成功し、細胞が自然に取り込むナノ粒子のサイズとして、直径にして40nmと100nmの違いが非常に重要であることを実験的に示すことができた。現在我々が進めているナノ粒子をプローブに用いた細胞内局所環境センシング手法の開発を進める上で、重要な知見を得ることができた。
結晶性インフラマソーム活性化異物の認識機構とスタチンによる制御の解明

コレステロール結晶・尿酸結晶、カーボンナノチューブやアスベストなど内在性・外来性の結晶性異物はNLRP3インフラマソーム活性化によりIL-1βを産生し、動脈硬化、痛風、組織繊維化などさまざまな病態の進展に関わる。研究代表者は、マクロファージでの多層カーボンナノチューブならびに尿酸結晶によるNLRP3インフラマソーム活性化・IL-1β産生を、HMG-CoA還元酵素阻害薬スタチンが抑制することを発見した。異物の細胞への取り込み過程の低下が示唆されることから、本研究においては、これら結晶性異物の認識・貪食を担う細胞膜受容体を同定し、責任受容体のスタチンによる発現・機能の制御メカニズムを明らかにすることを目的とする。さらには結晶性異物がプライミングあるいは繊維化等のシグナルを発し、責任受容体が伝達を行う可能性を検証する。昨年度の研究において、スタチンは、臨床薬理作用に大きく関わるコレステロール結晶によるインフラマソーム活性化についても、顕著な抑制効果を発揮することを明らかにした。一方、メバロン酸経路の低下がIL-1β産生を促進する現象が論文報告されており、本研究との相反が推測される。検討を行い、報告の細胞・条件での自発的IL-1β産生のスタチンによる促進を確認した。しかしながら、その条件においても、多層カーボンナノチューブを曝露するとはるかに高いレベルのIL-1βが産生され、スタチンによる顕著な抑制効果は広く認められることを明らかにした。引き続き、多層カーボンナノチューブの認識・貪食を担い、インフラマソーム活性化をもたらす細胞膜受容体を同定するために、スカベンジャー受容体の関与を抗体を用いて解析した。他研究者による発表論文との比較検討を、今年度計画とした責任受容体の同定に先んじて行った。インフラマソーム活性化が最も顕著な多層カーボンナノチューブを結晶性異物モデルとして使用し、その認識・貪食を担い、インフラマソーム活性化をもたらす細胞膜受容体の同定を引き続き進める。様々なスカベンジャー受容体の寄与を、siRNAノックダウンならびに抗体を用いて解析し、同定されたならば、スタチンによる制御メカニズムを明らかにする。内因性異物であるコレステロール結晶や尿酸結晶の認識・インフラマソーム活性化への関与の有無を検討し、受容体を介するシグナル伝達の可能性についても検討を行う。コレステロール結晶・尿酸結晶、カーボンナノチューブやアスベストなど内在性・外来性の結晶性異物はNLRP3インフラマソームを活性化し、動脈硬化、痛風、組織繊維化などさまざまな病態の進展に関わる。研究代表者は、マクロファージでの多層カーボンナノチューブならびに尿酸結晶によるNLRP3インフラマソーム活性化を、HMG-CoA還元酵素阻害薬スタチンが抑制することを発見し、この抑制は異物の細胞への取り込み過程の低下によることを見いだしている。本研究の目的は、これら結晶性異物の認識・貪食を担う細胞膜受容体を同定し、責任受容体のスタチンによる発現・機能の制御メカニズムを明らかにする。さらには結晶性異物がプライミングシグナルを発し、責任受容体が伝達を行う可能性、繊維化シグナルを伝達する可能性を検証することにある。一方、結晶性異物の物理化学的性状の違いによるスタチン応答性の差異を示唆する知見を得たことから、本年度は、コレステロール低下薬スタチンの臨床薬理作用に大きく関わるコレステロール結晶について、インフラマソーム活性化へのスタチンの効果を検証した。コレステロール微小結晶を再結晶と超音波破砕により調製し、THP-1マクロファージに曝露したところ、濃度依存的なIL-1β産生とNLRP3のsiRNAノックダウンによる応答の抑制を確認した。さらに細胞のスタチン処理により、コレステロール結晶によるIL-1β産生の顕著な抑制が示された。この結果は、動脈硬化病巣においてコレステロール微細結晶による炎症誘導をスタチンが抑制する可能性を示唆する。研究所の移転に伴い、実験遂行が可能な時期が限定された。また、異物の物性による応答の差異が示唆されたことから、コレステロール結晶に対するスタチン応答性の検証を、今年度計画実施に先んじて行った。

引き続き、多層カーボンナノチューブの認識・貪食を担い、インフラマソーム活性化をもたらす細胞膜受容体を同定するために、スカベンジャー受容体の関与を抗体を用いて解析した。他研究者による発表論文との比較検討を、今年度計画とした責任受容体の同定に先んじて行った。結晶性異物によるスタチン応答性の違いが示唆されることから、本研究ではインフラマソーム活性化が最も顕著な多層カーボンナノチューブSD1を結晶性異物モデルとして使用し、その認識・貪食を担い、インフラマソーム活性化をもたらす細胞膜受容体の同定を進める。同定された受容体について、内因性異物であるコレステロール結晶や尿酸結晶の認識・インフラマソーム活性化への関与の有無を検討する。計画通りクラスAスカベンジャー受容体であるMARCOならびにSR-Aの寄与を、siRNAノックダウンならびに抗体を用いて検討し、スタチンによる制御メカニズムを解析する。関与が認められない場合には、他クラスのスカベンジャー受容体の検討を行う予定である。インフラマソーム活性化が最も顕著な多層カーボンナノチューブを結晶性異物モデルとして使用し、その認識・貪食を担い、インフラマソーム活性化をもたらす細胞膜受容体の同定を引き続き進める。様々なスカベンジャー受容体の寄与を、siRNAノックダウンならびに抗体を用いて解析し、同定されたならば、スタチンによる制御メカニズムを明らかにする。内因性異物であるコレステロール結晶や尿酸結晶の認識・インフラマソーム活性化への関与の有無を検討し、受容体を介するシグナル伝達の可能性についても検討を行う。研究所移転に伴う実験計画の遅延と一部の支払が平成30年4月に繰り越されたために生じた。計画遂行のための消耗品購入に充てる予定である。実験計画の変更による。今年度の計画遂行のための消耗品購入に充てる予定である。
ゲノムワイドアプローチによる新しいグルココルチコイド作用の探索

グルココルチコイド(以下GCと略称)は膠原病、関節リウマチなど炎症性疾患をはじめとした様々な疾患の重要な治療薬である。しかし、薬理量投与時には多くの副作用が合併し、臨床的に大きな問題となることも少なくない。また、生理的な意義に関しても、とくに各臓器における標的遺伝子や役割は不明のままであった。本研究では、高効率的なGR標的遺伝子探索法を開発し、心筋、骨格筋においてゲノムワイドの解析を行った。とくに骨格筋においては、新たな標的遺伝子KLF15とREDD1を同定して、GCによる筋萎縮の分子機構解明に寄与した。さらに、各組織特異的GR遺伝子破壊マウスを作成し、これらの臓器におけるGRの役割を明確にした。かかるアプローチにより、GC-GR系の生体機能調節における意義を明らかできると考える。生体機能調節におけるグルココルチコイドGC-グルココルチコイドレセプターGR系の新たな役割を、1)GR標的遺伝子の網羅的同定、2)GRの共役因子の網羅的同定、3)共役因子の発現制御機構と機能解析、4)GR標的遺伝子の組織特異的発現制御機構とその機能の解明、から発見し、病態における意義を究明して速やかに疾患治療法開発に展開することをめざした。各はしらにおける具体的成果は以下のごとくである。1)心筋、骨格筋において、マイクロアレイ、クロマチン免疫沈降などによってGR標的遺伝子の網羅的同定を試みた。KLF15、REDD1など、多くの新規遺伝子を同定した。また、これらの標的遺伝子の各組織における機能を、siRNAによるノックダウン、アデノウイルスを用いた強制発現系を駆使して明らかにした。2)HEXIM1を共役因子として同定してそのGR抑制機構を究明し、GRとHEXIM1のタンパクータンパク相互作用の重要性を示した。3)HEXIM1遺伝子プロモーターを単離した。その変異体を作成してレポーター遺伝子を作成し、活性制御機構を解明した。4)G心筋におけるGC-GR->PLA2、COX-2、PGD合成酵素遺伝子発現誘導->PGD2産生増加の機序と心筋虚血時などにおける意義を明らかにした。また、骨格筋におけるGRによるKLF15遺伝子発現制御機構を解明し、骨格筋萎縮や糖代謝異常の治療法開発への基盤を構築した。当該年度では、とくに、骨格筋におけるGR標的遺伝子とその役割、そして骨格筋機能制御におけるGRの意義を明確にできた。具体的には下記の点を明らかにした。1.骨格筋におけるGR標的遺伝子REDD1、KLF15のプロモーター解析、クロマチン免疫沈降などによって、それらの遺伝子はGRによって直接転写レベルで誘導されることを明らかにした2.コトランスフェクション法などによってKLF15はFoxOと協調してatrogin-1、MuRF1遺伝子発現を誘導することを示した3.KLF15はBCAT2の遺伝子発現を転写レベルで誘導したとともに、KLF15発現アデノウイルスシステムを用いてKLF15が骨格筋における分岐鎖アミノ酸BCAAの異化を促進してmTORC1活性を抑制することを示した4.KLF15発現アデノウイルスシステムを骨格筋に直接注入し、KLF15は単独で筋萎縮を惹起することを明らかにした5.mTORC1はGRに拮抗し、その下流の遺伝子発現を抑制することを示した。そして、ラットにおいて、BCAAによるmTORC1活性化がグルココルチコイドによる筋萎縮を抑制することを確認した。生体機能調節におけるグルココルチコイドGC-グルココルチコイドレセプターGR系の新たな役割を、GR標的遺伝子の網羅的同定とその組織特異的発現制御機構と機能の解明から発見し、GC-GR系の病態における意義を究明して疾患治療法開発に展開することをめざした。1.骨格筋におけるGR標的遺伝子として同定したREDD1、KLF15のGRによる発現制御機構を解明した。これらの遺伝子プロモーター上にはパリンドローム型のGREが存在し、GRはホモ二量体で結合していた。2.筋萎縮エフェクター遺伝子であるatrogin-1、MuRF1遺伝子発現機構に関して、GRがKLF15とFoxOと協調して機能することを、レポーター遺伝子などを用いて明らかにした。3.骨格筋にKLF15発現アデノウイルスを注入し、筋萎縮エフェクター遺伝子発現の上昇のみならず分岐鎖アミノ酸BCAA

分解酵素活性の上昇を確認し、GC-GR軸の下流であるKLF15による筋萎縮の分子機構を解明した。4.mTORC1によるGR拮抗作用に関してGRのDNA結合抑制がその分子機構であることを突き止めた。5.これまでの動物実験における成果を臨床に展開することをめざし、GC服用膠原病患者の筋萎縮に対してmTORC1活性化療法を試みるべく、mTORC1活性化剤としてBCAA飲料を使用する際の至適化を詳細に検討し、臨床試験プロトコールを作成した。以上、1-5によってGC-GR系の新たな役割を明確にし、筋萎縮治療法開発に貢献した。