hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リーリン切断酵素を標的とした、精神神経疾患の新規治療法の確立

巨大分泌タンパク質リーリンは、胎生期における脳神経細胞の移動に必須な分子として同定され、成体期においては樹状突起の成熟やシナプスの形成・機能を制御することが知られている。また、リーリンの機能低下がアルツハイマー病や統合失調症を含む精神神経疾患の発症や増悪化に寄与する。我々はこれまでに、脳でリーリンを特異的に切断・不活化する酵素ADAMTS-3を同定した。しかし、ADAMTS-3欠損マウスの表現型がリーリン以外の基質を介している可能性や、リーリン切断阻害が精神神経疾患の病態を改善できるのか等の課題や疑問が生じた。本研究では、リーリンの特異的切断の生理的意義の解明や切断阻害によるリーリン機能増強効果の検証を目的とする。リーリンの切断部位に変異を導入したPD-KIマウスを作製・解析した結果、このマウスの大脳皮質と海馬では、胎生期から成体期まで顕著にリーリン切断が抑制されることを明らかにした。また、このマウスの脳では、リーリンの下流シグナルが活性化していること、神経細胞の樹状突起の分岐増加および伸長が生じていることを見いだした。これらPD-KIマウスの表現型は、ADAMTS-3欠損マウスの表現型と類似する。また、ADAMTS-3欠損マウスとPD-KIマウス、リーリンヘテロ欠損マウス、Dab1(リーリンの下流分子)ヘテロ変異マウスの大脳皮質において、オリゴデンドロサイト前駆細胞の数や配置に変化がみられることがわかった。アルツハイマー病態型モデルマウスとADAMTS-3欠損マウス、PD-KIマウスをそれぞれ交配させ、大脳皮質におけるAβ沈着を、抗Aβ抗体を用いた免疫染色により観察した結果、大脳皮質を占めるAβの割合が減少した。従って、脳でリーリン切断を抑制すれば、大脳皮質におけるAβの沈着を抑制あるいは遅延できることが示唆された。遺伝子改変マウスの解析が概ね計画通りに進展しており、グリア細胞に対するリーリンの新規効果についても順調に解析できているため。今後は、初代培養オリゴデンドロサイトを用いて、リーリンがオリゴデンドロサイトの発達に対して直接的に機能するか否か、またその分子機構の解明を目指す。脳の形成と機能を司る分泌タンパク質リーリンの機能低下は、統合失調症やアルツハイマー病を含む精神神経疾患の発症や増悪に関与する。リーリンは特異的な切断により不活化されるが、リーリンの切断阻害が精神神経疾患の病態に与える影響は未解明である。昨年度までに、リーリンはADAMTS-3によって特異的に切断され、不活化されることを見出した。本研究では、リーリンの特異的切断による不活化について、生理的意義の解明、及び、切断阻害によるリーリン機能増強効果の検証を目的とする。これまでのADAMTS-3欠損マウスの解析結果がリーリン機能依存的かを検証するため、リーリンの切断部位に変異を導入した非切断型リーリンノックインマウスを作製した。このマウスにおいても、リーリンの切断が抑制され、その機能が増強することを見出した。また、ADAMTS-3欠損マウスと非切断型リーリンノックインマウスの大脳皮質を用いて遺伝子発現解析を行ったところ、これまでにリーリンとの関連性がほとんど報告されていない遺伝子の発現が変化することを見出した。また、リーリン切断抑制がアルツハイマー病態を改善するか否かを調べるため、アルツハイマー病態型モデルマウスとADAMTS-3欠損マウス、及び、非切断型リーリンノックインマウスを交配させ、次年度以降の解析に供するマウスを準備した。加えて、ADAMTS-3阻害化合物を、マウス大脳皮質の初代培養神経細胞に添加したところ、リーリンの切断が抑制されることを確認した。遺伝子改変マウスの作製、準備が概ね計画通りに進展しており、プロテアーゼの欠損マウス、非切断型リーリンノックインマウス、ADAMTS-3阻害化合物を用いて多角的な研究を行うことができているため。また、ADAMTS-

3欠損マウスとPD-KIマウス、リーリンヘテロ欠損マウス、Dab1(リーリンの下流分子)ヘテロ変異マウスの大脳皮質において、オリゴデンドロサイト前駆細胞の数や配置に変化がみられることがわかった。アルツハイマー病態型モデルマウスとADAMTS-3欠損マウス、PD-KIマウスをそれぞれ交配させ、大脳皮質におけるAβ沈着を、抗Aβ抗体を用いた免疫染色により観察した結果、大脳皮質を占めるAβの割合が減少した。従って、脳でリーリン切断を抑制すれば、大脳皮質におけるAβの沈着を抑制あるいは遅延できることが示唆された。遺伝子改変マウスの解析が概ね計画通りに進展しており、グリア細胞に対するリーリンの新規効果についても順調に解析できているため。今後は、リーリン機能増強マウスで発現が変化していた遺伝子について詳細な解析を進め、リーリン切断の生理的意義の解明を目指す。また、リーリン切断抑制がアルツハイマー病態に及ぼす影響を解析し、リーリン切断抑制の病態への効果を検証する。今後は、初代培養オリゴデンドロサイトを用いて、リーリンがオリゴデンドロサイトの発達に対して直接的に機能するか否か、またその分子機構の解明を目指す。
エゾサンショウウオにおける温度依存的な性決定・性分化機構の解析

性転換個体の遺伝的な性を判別するためのW染色体特異的分子マーカーを作製するため、雌雄個体から抽出したゲノムDNAを20数種類の制限酵素で消化し、電気泳動で検出された雌特異的な反復配列のクローニングを行った。しかし、W染色体特異的分子マーカーを作製することができなかった。そこで、雌雄のゲノムDNAをテンプレートとして使用しランダムプライマーを用いてPCRを行うRAPD解析を行い、アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により、メス特異的に検出されたDNAバンドからW特異的なフラグメントのクローニングを試みた。300通りのプライマーの組み合わせを行ったが、この実験でもメス特異的なバンドを検出することができなかった。次に、本研究での発現解析のためにクローニングした、性分化関連遺伝子のサンショウウオホモログの染色体マッピングを行うことで、エゾサンショウウオの性染色体連鎖遺伝子を同定し、その遺伝子のZ染色体連鎖ホモログとW染色体連鎖ホモログの塩基配列を詳細に解析することで、新たな性判別マーカーを作製することができるのではないかと考えた。しかしながら、単離されたすべての性分化関連遺伝子はエゾサンショウウオでは常染色体にマップし、性染色体連鎖遺伝子を同定することができなかった。今後はまだ単離していない性分化関連遺伝子などの機能遺伝子のサンショウウオホモログのクローニング・染色体マッピングを行い、新たな性連鎖遺伝子を同定することで、性判別マーカーの作製を試みている。しかしながら、サンショウウオの染色体標本は非常に難しく、現在の方法では良好な染色体標本を数多く得ることが困難である。したがって、今後は染色体標本作製における細胞培養方法を新たに確立する必要がある。21年度の春に北海道厚田村にて採集した、エゾサンショウウオの卵塊を20°Cで孵化させた。その後、孵化した幼生を20°Cで飼育する対照群と、孵化後15日から30日にかけて28°Cの温度条件下で飼育する高温処理群に分け、性腺の分化段階によって10のステージ(孵化後0、10、15、20、25、30、35、40、45、60日)に分けた幼生個体のサンプリングを行い、それぞれの個体の肝臓からDNAと生殖腺からRNAを抽出した。また、性転換個体の遺伝的な性を判別するためのW染色体特異的分子マーカーを作製するため、雌雄のゲノムDNAを制限酵素で消化し、電気泳動で検出されたメス特異的バンドのクローニングを行った。FISH法を用いて、得られたDNAクローンの染色体マッピングを行った結果、制限酵素SacIで消化して得られたDNAフラグメントにおいて、メスでW染色体と1対の常染色体にシグナルが検出された。しかし、この反復配列のシーケンス解析からはメス特異的な塩基配列は検出できなかった。現在、ゲノムDNAをテンプレートにしてRAPD解析を行い、メス特異的に検出されたDNAバンドからW特異的なフラグメントのクローニングを試みている。RAPD解析でもW特異的なフラグメントが得られなかった場合、AFLP解析を用いることを検討している。また、発現解析を行う性分化関連遺伝子のサンショウウオホモログの単離を平行して行っている。
高脂肪食摂取下の前立腺癌進展における腸内細菌と脂肪炎症による癌浸潤免疫細胞制御

前立腺癌マウスモデルを用いて動物性脂肪摂取による癌増悪・進展に腸内細菌叢、脂肪組織炎症、血清サイトカイン変化、癌周囲免疫担当細胞浸潤が関連するかを検討し、得られた知見をマウスモデル、細胞実験およびヒト検体を用いvalidationする。癌増殖に対する腸内細菌の関与や、有望な関連分子が同定できたら再びマウスモデルを用いて、癌治療効果を検討する。1動物モデルによる仮説検討2動物モデル、細胞実験、臨床検体による検証3動物モデルによる治療効果確認の3部構成である。
歯痛受容機構の免疫学的・電気生理学的研究

これまでの研究で明らかになったことは以下の3点である.まず第一に,歯髄細胞(主に象牙芽細胞)を生活性を失わずに単離することに成功した.これにより抗体産製のための抗原を高密度で確保することができ,かつ電気生理学的なアプローチが可能になった.第二に,In vitro immunization法を用いて、象牙芽細胞と樹状歯髄細胞を同定できるモノクローナル抗体産生に成功した.幾千もの産製抗体から4種類を選択した.すなわち(1)象牙芽細胞の細胞質とミエリン鞘を染めるIgG抗体,(2)象牙芽細胞のplasmamembraneを特異的に染めるIgG抗体,(3)象牙芽細胞の核と細胞質および象牙芽細胞層下層の細胞の核を染めるIgG抗体,(4)象牙芽細胞,dendritic cell,血管内側のendothelial cellを染めるIgM抗体である.これらを独自にあるいは組み合わせて使用することにより、cryostat標本上でも単離細胞においても象牙芽細胞とその下層の樹枝状細胞の同定が可能になった.歯科領域でのin vitroimmunization法と象牙芽細胞へのpatch-clamp法応用は世界初の試みであり、この研究は歯髄細胞機能を解明する出発点となりうると考えられる。
モデル動物を用いたHTLV-I発がんおよび関連疾患発症機構の解析

HTLV-Iの発がん性を含むHTLV-I関連疾患の発症機構解明を目指し、我々が樹立した胸腺腫発生Ick-pXトランスジェニックラットや膠原病発症env-pXトランスジェニックラット、HAM/TSP発症HTLV-I持続感染ラットをモデルとして、それぞれに発症する疾患について解析し、以下の諸点を明らかとした。1.Ickプロモーターを利用したIck-pXトランスジュニックラットの胸腺腫では、胸腺でのpXの発現量がその発生頻度に関係する。この胸腺腫ではpXの高発現とTax蛋白の発現を見る。胸腺腫細胞は培養可能である。胸腺腫発生以前より胸腺上皮/間質細胞にpXが高発現している。Ick-pXトランスジェニックラットの骨髄細胞を移入した正常同系ラットは高率に胸腺腫を発生する。この誘導した胸腺腫はpXmRNAやTax蛋白を発現する。2.関節炎をはじめ種々の膠原病発症env-pXトランスジェニックラットのそれぞれ疾患では、疾患発症に関わるenv-pX遺伝子が重要となる組織は異なる。関節炎局所浸潤T細胞はオリゴクローナルであるが個体間で共通クローンの増殖やTCRVβCDR3領域に共通のアミノ酸モチーフは認めない。本ラットはII型コラーゲンを接種により容易に関節炎を発症する。ほとんどの疾患は正常ラット脾細胞の投与で発症が抑制できる。本ラットではその成熟段階で脾臓のCD4CD25陽性細胞の動態が正常ラットとは異なる。3.HAM/TSP発症ラット(HAMラット)の脊髄では、HTLV-Iはミクログリア/マクロファージ系細胞を主体に感染している。このラット脊髄でのオリゴデンドロサイトのアポトーシスの出現時期に先立ちpXの高発現とともにTNF-αの発現やbcl-2の一過性の発現抑制を見る。この現象は非発症系感染ラットには認めない。bcl-2の発現抑制はオリゴデンドロサイト特異的である。HAMラット脊髄からの分離オリゴデンドロサイトは非発症系や正常ラットに比ベアポトーシスを起こしやすい。HTLV-I発がんおよび関連疾患発症機構解明を目指し、作製した各種疾患発症HTLV-Iトランスジェニックならび感染モデルラットの解析を行い、以下の諸点を明らかとした。1.リンパ球特異的発現1ckプロモーターによりHTLV-IpX遺伝子を発現する1ck-pXトランスジュニックラット5系統中4系統に胸腺腫の発生を認めた。しかし、その発生率はさまざまで導入遺伝子のコピー数とは関係なく、胸腺でのpX遺伝子の発現量と相関を示す傾向にあった。2.種々の膠原病発症env-pXトランスジェニックラットの末梢T細胞は疾患発症前からCD80/86やICAM-1など活性化を示す分子の発現やin vitroでの種々の刺激による高反応性を示した。また、TCRVβmRNAのRT-PCR-SSCPの結果、炎症局所の浸潤T細胞は比較的オリゴクローナルであるが、異なる個体では必ずしも共通してはいなかった。env-pXトランスジェニックラットと正常ラット間での骨髄や脾細胞移入実験では、疾患によりリンパ球、標的組織あるいは胸腺などリンパ球の成熟に関わる組織のいずれの組織での導入pXの発現が重要かは異なり、少なくとも3通り発症機構が関与した異なる疾患が存在することが示唆された。

3.HAM/TSP類似脊髄症を発症するHTLV-I感染ラット(HAMラット)の脊髄ではPCRを利用したin situ hybridizationで少なくともミクログリア/マクロファージ系細胞にHTLV-Iが感染していることを証明した。また、このHAMを発症するWKAH系ラットでは脊髄症発症約6か月前の潜伏期間中から出現するオリゴデンドロサイトのアポトーシスの出現時期に一致してpX遺伝子の高発現とともにTNF-αの発現やbcl-2の一過性の発現抑制を見た。しかし、HAMを発症しない系統のHTLV-I感染ラットではこれらの変化は見られなかった。HTLV-Iは腫瘍原性のあるウイルスとして成人T細胞白血病(ATL)の原因であるほか、多岐に亘る自己免疫類似疾患を含む炎症性疾患をも引き起こす。これらの疾患発症機構解析のため、我々はHTLV-I感染およびトランスジェニックモデルラットを作製し、それらに発症する疾患について、今年度は以下の点を明らかにした。1.胸腺腫発生1ck-pXトランスジェニックラットでは、胸腺腫発生以前より分離した胸腺上皮/間質細胞にリンパ球より強い導入pX遺伝子の発現を確認した。この1ck-pXトランスジェニックラットの骨髄細胞を致死量の放射線照射した正常同系ラットに移入しても高率に胸腺腫を発生した。したがって、本ラットに発生する胸腺腫は骨髄細胞由来の細胞が胸腺に移住し、pX遺伝子の高発現を伴って腫瘍化した可能性が考えられる。2.膠原病発症env-pXトランスジェニックラット関節炎局所浸潤T細胞はオリゴクローナルであるが個体間で共通クローンの増殖やTCRVβCDR3領域に共通のアミノ酸モチーフは認めなかった。本ラットにII型コラーゲンを接種すると同系正常ラットとは異なり、高率に関節炎を発症した。3.HAM/TSPモデルHTLV-I感染ラットの脊髄のオリゴデンドロサイトのアポトーシスの出現時期に一致したプロウイルスDNA量の増加、pXの高発現やTNF-α発現、bcl-2の一過性発現抑制は非発症系感染ラットには見られず、HAM発症系感染ラットに特徴的であった。分離オリゴデンドロサイトの細胞死はTNF-α添加のみならず系統差やHTLV-I感染の有無に強い影響を受けた。HTLV-I関連疾患発症機構解明を目指し、いままでに作製した胸腺腫発生pXトランスジェニックラットや膠原病発症env-pXトランスジェニックラット、HAM/TSP発症HTLV-I持続感染ラット(HAMラット)を用いて、HTLV-Iの腫瘍原性およびそのほかの各種関連疾患の発症機構の解明を行い、以下の点を明らかにした。1.胸腺腫発生lck-pXトランスジェニックラット(lck-pXラット)では、胸腺腫細胞でTax蛋白の発現を確認するとともに、この胸腺腫細胞の培養株の樹立を行った。Lck-pXラット骨髄細胞を致死量の放射線照射正常同系ラットに移入して誘導した胸腺腫ではその胸腺腫細胞にpX遺伝子の存在、pXmRNAやTax蛋白の発現を確認し、胸腺腫細胞の由来が骨髄中に含まれる細胞が胸腺内に入り、Tax蛋白の発現を伴って上皮性胸腺腫を発生すると考えられた。2.膠原病発病env-pX
急速凍結-低温電子顕微鏡法によるナトリウムポンプの高次構造の研究

本研究は、ナトリウムポンプの高次構造を明らかにすることが目標であったが、部分的にではあるが達成できた。本研究では金粒子ラベルしたリガンドを用い、リガンド結合サイトを決定することも目標であったが、金粒子ラベルを導入する以前に分子の構造の概要を明らかにするため、2次元結晶を形成しているナトリウムポンプ分子の構造解析を行った。ナトリウムポンプ2次元結晶を電子顕微鏡観察用グリッド上で急速凍結したものを低温電子顕微鏡で観察し、2次元結晶像の解析用プログラムで解析した。しかし、2次元結晶格子の種々の乱れにより、解析結果の分解能が向上せず、ナトリウムポンプ分子に相当する密度の形も不自然であった。そこで、新しい試みとして2次元結晶像の解析に単分子解析法を導入したところ分解能が11オングストロームまで向上し、密度の形も以前発表したものと矛盾なく解釈でき、より詳細の見て取れるものとなった(Journal of Electron Microscopy第49巻に発表)。その結果、隣の分子との相互作用が存在することは分かったが、それが二量体かより多量体かは判然としない。そこで、立体像再構成のため、可溶化分子の観察を行い解析を開始した。解析途中では、単量体と二量体と考えられる分子が観察されていたが、個々の分子の空間的な方位を決定することが極めて難しいことから、まず膜結合型ナトリウムポンプを観察することに方針を変更せざるを得なかった。現在予備研究として、酢酸ウラニル染色した膜結合型ナトリウムポンプを観察・立体再構成している。これに急速凍結-低温電顕法によって観察した膜結合型ナトリウムポンプのデータを加えてゆき、既に撮影した可溶化分子のデータを加えれば完全な3次元構造が明らかになり、さらに金粒子ラベルによりリガンド結合サイトも明らかになる。平成11年度は、可溶化Na^+/K^+-ATPase(Naポンプ)の低温電子顕微鏡を用いた予備的な観察と、金修飾リガンドの合成および結合実験の2本立てで行い、年度内に金修飾リガンド結合したNaポンプの低温電子顕微鏡観察により、高次構造の詳細な観察を行うことを目標としていた。予備軍的な観察では、まず可溶化NaポンプをHPLCにより、単量体成分、二量体成分、そして多量体成分に分離し、それぞれを急速凍結して低温電子顕微鏡で撮影した。そのうちの少なくとも一つで4回対称を示す粒子像を得たが、像のコントラストが低いことと、データの数が少ないことから、これをNa^+/K^+-ATPaseの機能単位が四量体であるという理由にすることは難しい。今後、粒子解析が適用可能な数のデータを得るために、限外濾過装置などを用いた可溶化Naポンプの濃縮を行い、低温電顕観察を続ける。また、設備備品として購入したイオンコータを用いた電顕観察用グリッドの表面処理により、試料の吸着をよくする条件を決めることも必要と考えられる。金修飾リガンドの合成は想像以上に難航している。一方、膜結合型Naポンプ2次元結晶の低温電子顕微鏡像に単粒子解析を適用することにより、以前に発表したNaポンプ投影像の解像度を19Åから11Åに向上させることができた。この結果と可溶化Naポンプの粒子像の解析をあわせれば、高次構造に関してより進んだ知見が得られると考えられる。以上のように、当初の研究計画から遅れているが、平成12年度も引き続き研究を進めれば計画を達成することは可能であると考えている。
細胞増殖の調節における出芽酵母アデニル酸シクラーゼ結合蛋白質の機能

Ras蛋白質のエフェクターである出芽酵母アデニル酸シクラーゼは高分子量の複合体を構成している。複合体の構成蛋白質として分子量7万のCAPと分子量5万のp50という二つのシクラーゼ結合蛋白質を同定し、その構造と機能を解析した。1.CAPに関しては、その構造及び遺伝子破壊実験の結果より、アミノ末端部分はシクラーゼとの結合に必要で出芽酵母Ras-シクラーゼの調節に関与し、カルボキシル末端部分は哺乳動物のアクチン結合蛋白質ASP-56に相同で、細胞骨格の調節の他に、栄養源の飢餓や過剰に対応した細胞増殖の調節機構に関与すると考えられた。更に、アデニル酸シクラーゼ上のCAP結合部位を詳細に解析してカルボキシル末端の小領域にマップし、それに基づいて作製したCAP非結合型シクラーゼ変異体を利用してCAPの機能を解析した。その結果、CAPがシクラーゼに結合する事は、シクラーゼとRas蛋白質との相互作用自体には影響がなく、野生型Ras蛋白質のin vivoでの機能にも影響がないが、活性型変異を持つRas蛋白質による異常な形質の発現には必要なことが判明した。即ち、酵母の染色体上シクラーゼ遺伝子をCAP非結合型シクラーゼで置換すると、活性型ras遺伝子存在下でも異常な形質(熱ショック感受性、飢餓感受性)が消失し、全く正常な増殖パターンと細胞内cAMP濃度を示すことを発見した。更に、シクラーゼCAP結合部位のみを過剰発現して内在性シクラーゼからCAPを競合して引き離すことにより、同様の活性型rasの表現型の抑制がみられた。CAPの活性型Ras特異的作用の機構については現在解析中である。2.CAP以外にシクラーゼ結合蛋白質p50を同定し、それがシクラーゼのRas蛋白質結合部位leucine-rich repeat領域に結合していることを発見した。p50を精製し部分的アミノ酸配列を決定した結果、リボゾーム大サブユニット構成蛋白質L3であることが確定した。L3蛋白質の機能は抗真菌剤トリコデルミン耐性に関与していること以外不明であるが、Ras-アデニル酸シクラーゼ系と蛋白質合成系の関連を示唆する事実として、L3とシクラーゼの結合の細胞増殖における意義を解析中である。研究はほぼ計画通り進行している。出芽酵母アデニル酸シクラーゼの結合蛋白質の一つ70kDaのCAPのras蛋白質とシクラーゼの相互作用上の意義を検討した。1.従来、CAPのアミノ末端部はras蛋白質とシクラーゼの相互作用を仲介するとの仮説があったが、CAP遺伝子破壊実験を行った結果、上記仮説は完全に否定された。2.アデニル酸シクラーゼ全域にわたる詳細な人為的変異導入実験により、シクラーゼ分子上のCAP結合部位をカルボキシル末端150アミノ酸内の特定のアミノ酸配列を特つ領域にマップした。3.上記実験で同定したCAP結合部位のみを活性型ras2^<Val19>を持つ酵母内で過剰生産したところ、活性型ras2による異常な表現型が抑制された。これは過剰生産されたCAP結合部位が、内在性シクラーゼからCAPを競合的に奪う事によっていた。4.2で作製したCAPを結合しないアデニル酸シクラーゼ変異体はras蛋白質との試験管内での反応性には変化がなかった。

更にin vivoでのCAPの機能を解析する為に、染色体上シクラーゼ遺伝子をCAP非結合型変異体で置換した株を作製した所、同株は活性型ras2^<Val19>遺伝子存在下でも異常な形質をすべて失って正常に戻っており、グルコース刺激依存性のcAMP上昇を調べても全く正常であった。この結果は、エフェクターの結合蛋白質を解離させる事により、ras蛋白質との反応性を保持したままで、活性型rasの作用を抑制できることを示す、この現象の機構については、CAPのカルボキシル末端の機能(アクチン結合活性を持つと推測されている)と考えあわせて、アデニル酸シクラーゼのフィードバック調節が関与していると推測し、現在解析中である。5.他のシクラーゼ結合蛋白位80kDaと15kDaのものについては、80kDaのものは充分量精製し、現在アミノ酸配列を決定中である。15kDaのものは現在精製中である。Ras蛋白質のエフェクターである出芽酵母アデニル酸シクラーゼは高分子量の複合体を構成している。複合体の構成蛋白質として分子量7万のCAPと分子量5万のp50という二つのシクラーゼ結合蛋白質を同定し、その構造と機能を解析した。1.CAPに関しては、その構造及び遺伝子破壊実験の結果より、アミノ末端部分はシクラーゼとの結合に必要で出芽酵母Ras-シクラーゼ系の調節に関与し、カルボキシル末端部分は哺乳動物のアクチン結合蛋白質ASP-56に相同で、細胞骨格の調節の他に、栄養源の飢餓や過剰に対応した細胞増殖の調節機構に関与すると考えられた。更に、アデニル酸シクラーゼ上のCAP結合部位を詳細に解析してカルボキシル末端の小領域にマップし、それに基づいて作製したCAP非結合型シクラーゼ変異体を利用してCAPの機能を解析した。その結果、CAPがシクラーゼに結合する事は、シクラーゼとRas蛋白質との相互作用自体には影響がなく、野生型Ras蛋白質のin vivoでの機能にも影響がないが、活性型変異を持つRas蛋白質による異常な形質の発現には必要なことが判明した。即ち、酵母の染色体上シクラーゼ遺伝子をCAP非結合型シクラーゼで置換すると、活性型ras遺伝子存在下でも異常な形質(熱ショック感受性、飢餓感受性)が消失し、全く正常な増殖パターンと細胞内cAMP濃度を示すことを発見した。更に、シクラーゼCAP結合部位のみを過剰発現して内在性シクラーゼからCAPを競合して引き離すことにより、同様の活性型rasの表現型の抑制がみられた。CAPの活性型Ras特異的作用の機構については現在解析中である。2.CAP以外にシクラーゼ結合蛋白質p50を同定し、それがシクラーゼのRas蛋白質結合部位leucine-rich repeat領域に結合していることを発見した。p50を精製し部分的アミノ酸配列を決定した結果、リボゾーム大サブユニット構成蛋白質L3であることが確定した。L3蛋白質の機能は抗真菌剤トリコデルミン耐性に関与していること以外不明であるが、Ras-アデニル酸シクラーゼ系と蛋白質合成系の関連を示唆する事実として、L3とシクラーゼの結合の細胞増殖における意義を解析中である。
剪断ストレスが骨芽細胞におよぼす影響について

今回、我々は流体剪断応力が骨芽細胞に与える影響を調べる試みとして、in vitroでヒト骨肉腫細胞株:SaOS-2に流体剪断応力を与え、各種成長因子、サイトカインの発現を調べた。バイオメカニクスモデルから生理的強さと考えられる1.7Pa(パスカル)の流体剪断応力をSaOS-2に経時的に与えた。まず、Northern解析を行った。骨形成促進因子と考えられるTGF-β1のmRNAの発現は3時間後をピークに、対照に比べ約3倍の増加をみた。一方、骨吸収促進因子と考えられるIL-11のmRNAの発現は6時間後をピークに、対照に比べ約5倍の増加をみた。次に、培養上清についてELISA解析を行った。TGF-β1は24時間後には対照に比べ約3倍の増加をみた。一方、IL-11は24時間後には対照に比べ約7倍の増加をみた。SaOS-2に24時間流体剪断応力を与えると、その培養上清中には骨吸収因子の方がより産生されている結果を得たため、SaOS-2に24時間流体剪断応力を加えた後の培養上清を、ヒト前破骨細胞株:FLG29.1を用いた破骨細胞誘導アッセイ系に加え、破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ(TRAP)陽性細胞の誘導について、対照のストレスを与えなかた培養上清と比較した。対照に比べ、流体剪断応力を与えた培養上清は約2倍のTRAP陽性細胞の誘導を見た。更に、抗IL-11中和抗体の添加により、この誘導促進作用は有意に抑制された。この結果、骨に荷重がかかると、流体剪断応力が骨芽細胞系に作用し、骨芽細胞はまず骨形成促進因子であるTGF-β1を産生して、骨形成を行い、次に骨吸収促進因子であるIL-11を産生して破骨細胞を誘導し、骨吸収を行うサイクルがある可能性が示唆された。運動量不足下ではこのサイクルが失われ、低回転性の骨量低下をきたすと考えられる。現在、象牙片を用いた骨吸収窩形成アッセイ、更にラットの初代培養骨芽細胞、破骨細胞を用いた同様の系にて解析中である。今回、我々は流体せん断応力が骨芽細胞に与える影響を調べる試みとして、in vitroでヒト骨肉腫細胞株:SaOS-2、MG63、OST、MNNG、U2OS、及び大腿骨頭より採取したヒト骨芽細胞様細胞にcone-viscometerを用いてそれぞれ流体せん断応力を与え、各種成長因子、及びサイトカインの発現について調べた。各種細胞を10%FCS含有DMEM/F12培地を用いて100mm dishに単層高密度培養し、FCS非含有DMEM/F12培地に交換して1日後にそれぞれ、1、3、6、12、24時間、バイオメカニクスモデルから生理的強さと考えられる1.7Pa(パスカル)の流体せん断応力を与えた。流体せん断応力を与えなかった群をこれらの対照とした。まず、これらの細胞からAGPC法によりmRNAを採取してNorthem解析を行い、TGF-β、PDGF-A、IL-6mRNAの発現について調べた。ヒト

骨肉腫細胞株:SaOS-2においては、TGF-βmRNAは6時間後をピークに、対照に比べ約3倍のmRNAの発現の増加をみた。他のヒト骨肉腫細胞株においてはTGF-βmRNAの発現の増加に一定の傾向を示さなかった。一方、PDGF-A、IL-6mRNAの発現はみられなかった。また、大腿骨頭より採取したヒト骨芽細胞様細胞については、流体せん断応力を与えた後の採取細胞数が少なく、Northem解析に必要な量のmRNAが採れなかった。現在、この細胞については実験継続中である。次に、各培養上清にELISA解析を行ったところ、ヒト骨肉腫細胞株:SaOS-2においては、TGF-β1は24時間後には対照に比べ約3倍の増加をみた。更に、陽イオンチャンネルブロッカー:TEA、Gadolinium、Verapamilをそれぞれ作用させて同様の実験を行ったところ、ヒト骨肉腫細胞株:SaOS-2においては、上記全ての陽イオンチャンネルブロッカーによってTGF-βmRNAの発現の増加は完全に阻害された。今回、我々は流体剪断応力が骨芽細胞に与える影響を調べる試みとして、in vitroでヒト骨肉腫細胞株:SaOS-2に流体剪断応力を与え、各種成長因子、サイトカインの発現を調べた。バイオメカニクスモデルから生理的強さと考えられる1.7Pa(パスカル)の流体剪断応力をSaOS-2に経時的に与えた。まず、Northern解析を行った。骨形成促進因子と考えられるTGF-β1のmRNAの発現は3時間後をピークに、対照に比べ約3倍の増加をみた。一方、骨吸収促進因子と考えられるlL-11のmRNAの発現は6時間後をピークに、対照に比べ約5倍の増加をみた。次に、培養上清についてELISA解析を行った。TGF-β1は24時間後には対照に比べ約3倍の増加をみた。一方、lL-11は24時間後には対照に比べ約7倍の増加をみた。SaOS-2に24時間流体剪断応力を与えると、その培養上清中には骨吸収因子の方がより産生されている結果を得たため、SaOS-2に24時間流体剪断応力を加えた後の培養上清を、ヒト前破骨細胞株:FLG29.1を用いた破骨細胞誘導アッセイ系に加え、破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ(TRAP)陽性細胞の誘導について、対照のストレスを与えなかった培養上清と比較した。対照に比べ、流体剪斬応力を与えた培養上清は約2倍のTRAP陽性細胞の誘導を見た。更に、抗lL-11中和抗体の添加により、この誘導促進作用は有意に抑制された。この結果、骨に荷重がかかると、流体剪斬応力が骨芽細胞系に作用し、骨芽細胞はまず骨形成促進因子であるTGF-β1を産生して、骨形成を行い、次に骨吸収促進因子であるlL-11を産生して破骨細胞を誘導し、骨吸収を行うサイクルがある可能性が示唆された。運動量不足下ではこのサイクルが失われ、低回転性の骨量低下をきたすと考えられる。現在、象牙片を用いた骨吸収窩形成アッセイ、更にラットの初代培養骨芽細胞、破骨細胞を用いた同様の系にて解析中である。
CLM諸国の住宅部門における温室効果ガス削減手段の適用効果に関する研究

東南アジアの後発途上国であるCLM諸国(カンボジア,ラオス,ミャンマー)の住宅部門におけるエネルギー消費量把握を目的として,社会経済調査データの分析を行った。なお,社会経済調査データについては昨年度に引き続き収集を行っている。また,CLM諸国との比較のため,CLM諸国以外のASEAN各国ならびに中国南部(広東,広西,雲南)各省の社会経済データの収集も行っている。CLM諸国を含むASEAN各国ならびに中国南部各省の住宅部門電力消費量(一人当たり年間電力消費量)と一人当たりGDP(PPP)との関係を分析したところ,次のような結果が得られた:ブルネイ,シンガポール,ベトナムの3か国を除き,残りの諸国と中国南部各省では,住宅部門電力消費量と一人当たりGDPとの間に強い相関が見られ,しかもほぼ同じ直線に回帰しうることが示された。CLM諸国を含めこれらの国々・地域では一人当たりGDPが1000ドル上昇するごとに電力消費量が3040kWh上昇するという関係性があることがわかった。なお,相関性はこのように明確であるが,一部の国では一人当たりGDPが電力消費量に与えるGranger因果性が不明確であり,因果関係についてはなお検討を要することもわかった。ラオスについては昨年度に引き続いて現地・首都ヴィエンチャン都の高所得層(人口の上位1割程度に対応)を対象とするアンケート調査を行い,LECSのような社会経済調査では把握しきれない部分,例えば耐久消費財の所持状況・性能,バイオマス燃料(薪炭)の入手方法・実勢価格などを把握した。これまでの調査結果と比較すると次のような違いが見られた:自動車はこれまで1台以上の保有であったのが2台以上に,TVはこれまで2台以上の保有であったのが3台以上にという状況である。これらの結果が示すような生活水準の向上に伴って,電力の消費量も伸びも確認された。CLM諸国(カンボジア,ラオス,ミャンマー)の社会経済調査データならびに電力消費量データを継続的に収集し,分析を実施している。CLM諸国を含むASEAN各国ならびに中国南部各省の住宅部門電力消費量(一人当たり年間電力消費量)と一人当たりGDP(PPP)との関係を分析した結果,アジア・モンスーン地域全体の住宅部門のエネルギー消費に共通する法則性,すなわち住宅部門電力消費量(一人当たり年間電力消費量)と一人当たりGDP(PPP)との関係を明らかにすることができた。またラオスについては昨年度に引き続いて首都ヴィエンチャン都の高所得層(人口の上位1割程度に対応)を対象とする現地調査を実施しており,住まいとエネルギー消費量の関係の現状を把握するだけでなく,将来の予測や温室効果ガス削減に関する考察を進めることができた。CLM諸国(カンボジア,ラオス,ミャンマー)の社会経済調査データおよびエネルギー消費量(とくに電力消費量)データについては引き続き,最新のものを収集する。ラオスのみならずカンボジアおよびミャンマーについても現地調査を進め,住まい,耐久消費財の所有状況とエネルギー消費量の関係について現状の把握を行う予定である。またこれらの調査および分析に加え,CLM諸国における省エネ行動,省エネ機器導入,再生可能エネルギーの活用の現状ならびに効果についても調査を行う予定である。後発途上国であるCLM諸国(カンボジア,ラオス,ミャンマー)の住宅部門におけるエネルギー消費量把握を目的として,社会経済調査データの収集を行った。カンボジアに関してはカンボジア統計局(NIS)から社会経済調査(CSES)データを,また,同国電力庁から電力消費量データを収集した。ラオスに関しては,同国統計局から社会経済調査(LECS)データを,ラオス電力から電力消費量データを収集した。ミャンマーに関しては同国政府・国連人口基金共同実施の2014年国勢調査結果を入手した。これらの統計データをもとに年次別・地域別・世帯類型別エネルギー消費原単位を算出した。ラオスについては現地・首都ヴィエンチャン都の高所得層(人口の上位1割程度に対応)を対象とするアンケート調査を行い,LECSのような社会経済調査では把握しきれない部分,例えば耐久消費財の所持状況・性能,バイオマス燃料(薪炭)の入手方法・実勢価格などを把握した。調査結果の概要は次の通りである:耐久消費財の所有状況については,自動車1台以上,TV2台以上,携帯電話5台以上,エアコン3台以上と,日本の二人以上の世帯と同じか上回る水準であることが示された。またエネルギー,とくに電力に関して,ヴィエンチャン都の高所得層は340kWh/(世帯・月),上位高所得層は1 160kWh/(世帯・月)を消費しており,日本の一般世帯の消費量の平均と同程度か上回る水準であることが示された。以上の結果は学術論文として公表した。CLM諸国(カンボジア,ラオス,ミャンマー)の社会経済調査データおよび電力消費量データを予定通り入手することができた。これにより,地域別・世帯類型別エネルギー消費原単位の経年変化を把握することができた。とくにラオスについては首都ヴィエンチャン都に住む高所得層(人口の上位1割程度に対応)を対象とする現地調査を実施し,社会経済調査では把握しきれない部分(個人および世帯収入,耐久消費財の所有状況)まで情報を集めることができた。これにより,ラオスに関しては,住まいとエネルギー消費量の関係について現状を把握するのみならず,将来の予測をも可能とした。またこの調査結果は学術論文として公表できた。

CLM諸国を含むASEAN各国ならびに中国南部各省の住宅部門電力消費量(一人当たり年間電力消費量)と一人当たりGDP(PPP)との関係を分析したところ,次のような結果が得られた:ブルネイ,シンガポール,ベトナムの3か国を除き,残りの諸国と中国南部各省では,住宅部門電力消費量と一人当たりGDPとの間に強い相関が見られ,しかもほぼ同じ直線に回帰しうることが示された。CLM諸国を含めこれらの国々・地域では一人当たりGDPが1000ドル上昇するごとに電力消費量が3040kWh上昇するという関係性があることがわかった。なお,相関性はこのように明確であるが,一部の国では一人当たりGDPが電力消費量に与えるGranger因果性が不明確であり,因果関係についてはなお検討を要することもわかった。ラオスについては昨年度に引き続いて現地・首都ヴィエンチャン都の高所得層(人口の上位1割程度に対応)を対象とするアンケート調査を行い,LECSのような社会経済調査では把握しきれない部分,例えば耐久消費財の所持状況・性能,バイオマス燃料(薪炭)の入手方法・実勢価格などを把握した。これまでの調査結果と比較すると次のような違いが見られた:自動車はこれまで1台以上の保有であったのが2台以上に,TVはこれまで2台以上の保有であったのが3台以上にという状況である。これらの結果が示すような生活水準の向上に伴って,電力の消費量も伸びも確認された。CLM諸国(カンボジア,ラオス,ミャンマー)の社会経済調査データならびに電力消費量データを継続的に収集し,分析を実施している。CLM諸国を含むASEAN各国ならびに中国南部各省の住宅部門電力消費量(一人当たり年間電力消費量)と一人当たりGDP(PPP)との関係を分析した結果,アジア・モンスーン地域全体の住宅部門のエネルギー消費に共通する法則性,すなわち住宅部門電力消費量(一人当たり年間電力消費量)と一人当たりGDP(PPP)との関係を明らかにすることができた。またラオスについては昨年度に引き続いて首都ヴィエンチャン都の高所得層(人口の上位1割程度に対応)を対象とする現地調査を実施しており,住まいとエネルギー消費量の関係の現状を把握するだけでなく,将来の予測や温室効果ガス削減に関する考察を進めることができた。CLM諸国(カンボジア,ラオス,ミャンマー)の社会経済調査データおよびエネルギー消費量(とくに電力消費量)データについては引き続き,最新のものを収集する。ラオスに続き,カンボジアおよびミャンマーについても現地調査を進め,住まい,耐久消費財の所有状況とエネルギー消費量の関係について現状の把握を行う予定である。またこれらの調査および分析結果については随時公表する予定である。
わが国主要都市におけるソフト系IT産業の立地変動と都市内部地域構造の変容

本研究は、近年のわが国におけるソフト系IT産業の分布状況を、都道府県レベル、市区町村レベルで把握し、次に主要都市内部における立地集積に関する諸特性を全国的な動向として考察し、東京・大阪・札幌・仙台の4都市をとりあげ、立地集積の特性とソフト系IT産業の立地形成の背景について検討を行い、さらに、立地要因や立地変動に関しても分析を行ったものである。その結果は、以下のように要約される。1.全国的な分布傾向として、東京・大阪・神奈川・愛知・福岡・北海道などの三大都市圏や広域中心都市の所在する都道府県に事業所が集中しており、ソフト系IT産業の大都市立地指向性が明瞭であり、とりわけ、東京に関しては、人口1人あたりの事業所数においても最も高い数値を示し、また、23区内での事業所数も全国比30%近くを占めており、ソフト系IT産業におけるわが国の集積拠点であることが認められる。2.主要都市内部に共通する立地傾向として、都心部および副都心にある鉄道ターミナル駅周辺への立地が顕著である。3.立地要因として、「賃料の妥当性」、「営業企業へのアクセスの良さ」、「最寄り駅へのアクセスの良さ」など、一般的なオフィスの立地条件である接触・空間・交通条件に対応する立地要因が重要であると認識されている。4.立地移動については、短距離移転の傾向が強く、移転前の立地環境に依存する傾向が窺え、これも一般的なオフィスの立地移動に関する特性と同様の傾向である。5.都市内部地域構造との関連については、主要都市内部において既存の都心部および都心周辺部、副都心への立地集積が顕著であるが、その内部においてソフト系IT産業に特化した機能的な立地分化傾向を示しつつある一方で、東京ではやや分散的な立地の兆候も求められ、今後の情報化の進展によっては、ソフト系IT産業を核とした都市内部中心地が増加する可能性がある。本年度は近年のソフト系IT産業の全国的な分布傾向と主要都市内部におけるソフト系IT産業の立地について検討を加えた。その結果、2002年のデータによれば、東京23区に全国の事業所の3割が集中しており、ついで大阪府・神奈川県・愛知県・福岡県・北海道など、大都市を有する都道府県が高い集中度を示している。しかしながら、この数年間の伸びは地方都市の方が高い数値を示している。ソフト系IT産業をインターネット・ソフトウェア業・情報処理サービスの種別にみた場合、インターネット・情報処理サービスは全国的に分散する傾向が強いのに対して、ソフトウェア業、は東京都を初めとする大都市を含む道府県への集中度が高い。このような傾向は、人口(1万人)当たりの事業所数で検討を試みても同様であった。次に、都市内部レベルにおけるソフト系IT産業の立地傾向をみると、(1)各都市の主要鉄道駅の駅周辺に集積しており、東京ではJR秋葉原・神田・御茶ノ水駅周辺、新宿・渋谷地区に集中し、大阪では新大阪・心斎橋周辺に、名古屋では地下鉄鶴舞線沿線に多く分布していること、(2)この5年間の新設・移転動向をみても、既存集積地内部およびその周辺地区という限定された範囲内での動きが大半であること、が明らかとなった。(1)・(2)の立地傾向ともに、オフィスの一般的な立地傾向と概ね一致するものであるが、異なる点はその集中度と求心性にあり、ソフト系IT産業はオフィス一般に比べてやや分散的であり、移転の範囲が比較的広域に及ぶ点である。本年度は、主要都市における都市内部レベルにおけるソフト系IT産業の立地要因と、立地変動に伴う都市内部地域構造の変容に関して、検討を加えた。その結果、立地要因に関しては、顧客への接近性や鉄道駅への利便性、賃料の妥当性、適当な業務空間の存在、通信環境のよさが指摘される。これらの立地要因はオフィス立地の一般的な立地条件である接触条件

・交通条件・空間条件に対応するものであるが、ソフト系IT産業の1つの特殊な立地因子として情報通信インフラの整備度があげられる。また、移転理由として、オフィス空間の拡張や賃料の問題があげる企業が多いが、情報サービス対象である企業オフィスの集積地から限定された空間的範囲での近距離移転が大半であり、都心部・副都心・都心周辺部という都市内部においても特定の地区への立地指向性が強いことを伺わせる。ただし、今後より高度な情報通信インフラもつような大型ビル施設が建設された場合、通信環境の問題と関連して、その場所が新たなソフト系IT産業の集積地となることが考えられる。次に、都市内部地域構造とソフト系IT産業の立地の関連であるが、サービス対象である企業・官公庁オフィスの立地する地区もしくはその近接地区に立地する場合が大半であり、ソフト系IT産業が都心部や副都心以下の都市内部中心地に立地集積する事例は、東京を除くと、ほとんど認められない。東京では既存オフィス中心地区ではない秋葉原に集積がみられるが、これは都市全体でのソフト系IT産業の集積量がある一定の値を超えた状況においてみられる特殊なケースである考えられる。東京においても渋谷・新宿・池袋等の副都心地区と港区・千代田区・中央区の中の都心周辺地区の立地集積が進行しつつある。これに対して、福岡では博多駅周辺、札幌にいても札幌駅北口周辺、名古屋では、既存の2つのオフィス業務地区の中間地区である伏見地区にソフト系IT産業の集積がみられ、都市内部中心地構造の変容に影響を与えつつある。
大腸癌におけるMTS1及び細胞周期関連遺伝子の異常と臨床病理学的背景に関する研究

外科的に切除された大腸癌についての腫瘍組織及び正常大腸粘膜組織の採取、凍結保存、核酸及び蛋白の抽出を行った。また抽出RNAからの、cyclinD、RB、CDK4、MTS1遺伝子の発現を、quontitative PCR若しくはNothern blottingにより定量化を試みた。蛋白発現については抽出蛋白の分析に加えて、腫瘍組織のパラフィン包埋切片についてp16免疫組織染色を行い検討した。今回抽出したRNAからの遺伝子発現の検討では、MTS1遺伝子の発現強度は腫瘍と正常大腸粘膜において有意な差を認めなかった。また、cyclinD、RBについても同様であり、p16蛋白発現についても免疫染色の結果は腫瘍部と正常粘膜間に明らかな差異は認められなかった。これらの遺伝子及び蛋白発現の異常が明らかとなれば、それが"p16-CDK4/cyclinD-RB" pathwayといわれる系として捉えられる異常であるのかの検討、またそれらが臨床病理学的背景との照合にて発癌、進展に関わる因子であるのか否かの検討が期待されたが、残念ながら各実験系において有意な結果が得られなかった。現在はさらに多数の症例からの核酸、蛋白抽出と実験系の検証が急務と考えられるため鋭意これらの作業を行っている。また平行して、他臓器の癌腫についての検討も視野に入れ、過去に切除され凍結保存されている組織からの試料採取を行っているところである。現在までのところ、外科的に切除された大腸癌についての腫瘍組織及び正常大腸粘膜組織の採取、凍結保存、核酸及び蛋白の抽出を行っている。また抽出RNAからの、cyclinD、RB、CDK4、MTS1遺伝子の発現をquontitative PCR若しくはNothern blottingによる定量化を平行して施行している。cyclinD遺伝子については、抽出DNAを用いたSouthern blottingを施行中である。蛋白発現については抽出蛋白の分析に加えて、腫瘍組織のパラフィン包埋切片についてp16免疫組織染色を行い検討予定である。これらの遺伝子及び蛋白の発現について正常組織との比較は平成13年度へ持ち越しとなる見通しである。これらの遺伝子及び蛋白発現の異常が明らかとなれば、それが"p16-CDK4/cyclin D-RB"pathwayといわれる系として捉えられる異常であるのかの検討、またそれらが臨床病理学的背景との照合にて発癌、進展に関わる因子であるのか否かを検討を予定している。当教室における大腸癌症例は年間概ね30例程度であり、さらに多数の症例からの核酸、蛋白抽出及び検討が必要であると考えられるため、現在過去に切除され凍結保存されている腫瘍組織及び正常組織についての試料採取を行っているところである。
多核白血球走化抑制リセプター補助因子の分離・解析

S19リボソーム蛋白(RP S19)2量体の多核球C5aリセプターに対するアゴニスト作用をアンタゴニスト作用に切替る分子内の部位を同定した。RP S19C末端部の18アミノ酸残基からなるペプチドは単球のC5aリセプターにアゴニストとして作用して走化性を示す一方、多核球にはC5aリセプターアンタゴニストとして作用して走化性を抑制した。単球及び多核球双方にC5aリセプターアゴニストとして作用するC5aのアナログペプチドに、RP S19 C末端の12残基を接続したキメラペプチドは、多核球のC5aリセプターに対してのみアンタゴニストに変貌した。このペプチドのC末端部を1残基ずつ削ってゆくと、2残基目のLysを失ったところで、再びアゴニストに変換された。これらのペプチドを用いた実験から、RP S19 C末端部IAGQVAAANKKがアゴニストをアンタゴニストへ切替える部位であると同定した。これを確認するために、C末端4残基を欠失させたRP S19組換え体を作成し、2量体を調製したところ、この変異2量体はin vitro及びin vivoにおいて、単球のみならず多核球に対しても走化性及び浸潤反応を惹起させた。一方、野生型RP S192量体は、これまでの報告通り、単球にのみ反応を惹起させた。多核球膜に存在すると思われる上記切替え部位に結合する蛋白質(走化抑制リセプター補助因子)を解明するために、末梢血多核球分画、及び、単球分画からそれぞれmRNAを分離して、cDNAを調製し、多核球には発現があるが単球には発現のないcDNAのサブストラクション・ライブラリーを調製した。当初の計画に基づき、以下の結果を得ると共に、研究を継続している。1.C5a C末端部10残基の9番目のGlyをAspに変異させた配列に、S19リボソーム蛋白C末端部11残基を結合させたキメラペプチドを合成し、これが単球C5aリセプターにはアゴニスト、多核球にはアンタゴニストとして作用することを明らかにした。2.このペプチドのAsnl9をCysに変異させ、これに蛍光性光アフィニティ結合基を導入した場合にも上記の活性が維持できるであろうことを、非蛍光性擬似化合基を導入したペプチドを合成して確かめた。3.ところが、実際にAsnl9Cys変異ペプチドにazidocoumarine系の蛍光性光アフィニティ結合基を導入したところ、塩類溶液中での期待通りの可溶性が得られなかった。現在、可溶性を上昇させる方法を検討している。4.ヒト末血から多核球を分離し、mRNA画分を得て、ポリメラーゼ連鎖(PCR)法によりcDNAプールを調製した。単球は末血からプラスティック吸着法により調製したが、6バッチ程繰り返すことにより始めて充分量のmRNAを得ることができたので、PCR法によりcDNAプールを調製した。これから、これらcDNAプールを用いて、アビジン・ビオチン除去法により、多核球cDNAから単球cDNAを差し引いたサブトラクションcDNAライブラリーを作る予定である。当初の計画に基づく研究により以下の結果を得ると共に、その一部を学会誌、及び、国際、国内学会において報告した。1.S19リボソーム蛋白2量体分子上の、C5aレセプターへの結合部位2箇所を、S19リボソーム蛋白変異組換え体及びアナログペプチドを用いて同定し、成果を公表した。2.S19

リボソーム蛋白2量体が、単球のC5aレセプターにはアゴニストとして、逆に、多核球のC5aレセプターにはアンタゴニストとして作用することに関して、アンタゴニストへの切り替え部位が、S19リボソーム蛋白C末端部の11アミノ酸残基にあることを、S19リボソーム蛋白変異組換え体及びアナログペプチドを用いて明らかにした。3.2.の研究の過程で、GIn137以後のC末端部を除去短縮させたS19リボソーム蛋白変異組換え体は、単量体の状態で、単球及び多核球の走化性を引き起こせることを見出した。野生型S19リボソーム蛋白が走化性を発揮するのになぜ2量体化する必要があるかを明らかにするための端緒になると期待できる。4.S19リボソーム蛋白2量体のアンタゴニスト機能部位が作用する多核球側の分子の検索に関して、発現クローニングに用いるcDNAプールを調製した。このプールは、ヒト末梢血多核球cDNAプールから単球cDNAプールを、ポリメラーゼ連鎖法を用いてサブトラクションすることにより調製した。RP S19C末端部の18アミノ酸残基からなるペプチドは単球のC5aリセプターにアゴニストとして作用して走化性を示す一方、多核球にはC5aリセプターアンタゴニストとして作用して走化性を抑制した。単球及び多核球双方にC5aリセプターアゴニストとして作用するC5aのアナログペプチドに、RP S19 C末端の12残基を接続したキメラペプチドは、多核球のC5aリセプターに対してのみアンタゴニストに変貌した。このペプチドのC末端部を1残基ずつ削ってゆくと、2残基目のLysを失ったところで、再びアゴニストに変換された。これらのペプチドを用いた実験から、RP S19 C末端部IAGQVAAANKKがアゴニストをアンタゴニストへ切替える部位であると同定した。これを確認するために、C末端4残基を欠失させたRP S19組換え体を作成し、2量体を調製したところ、この変異2量体はin vitro及びin vivoにおいて、単球のみならず多核球に対してもい走化性及び浸潤反応を惹起させた。一方、野生型RP S192量体は、これまでの報告通り、単球にのみ反応を惹起させた。多核球膜に存在するど思われる上記切替え部位に結合する蛋白質(走化抑制リセプター補助因子)を解明するために、末梢血多核球分画、及び、単球分画からそれぞれmRNAを分離して、cDNAを調製し、多核球には発現があるが単球には発現のないcDNAのサブストラクション・ラィブラリーを調製した。