hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
下歯槽神経切断モデルラットにおける感覚異常発生と治癒のメカニズムの解析

神経因性疼痛モデルの一種である下歯槽神経切断モデルラットの三叉神経節における複数の遺伝子発現変動を確認した。またラットの延髄部にカテーテルを留置する方法を確立し、そこから投与した抗痙攣薬Gabapentinがモデルラットに生じる感覚異常を抑制することを確認した。さらに、三叉神経節における遺伝子発現変動のうち、電位依存性カルシウムチャネルのサブユニットであるCACNA2D1の変化のみが感覚異常の症状と共に抑制されることを見出した。下歯槽神経切断モデルラットを用いて、アロディニア発生機序の解明を目的として実験を行った。下歯槽神経切断後の三叉神経節を取り出し、その遺伝子発現変動を7日後まで追った。下歯槽神経を含む3枝領域とアロディニア領域を支配する2枝領域を別々に解析した。これまでのマイクロアレイ解析の結果を参考に検討を行い、リアルタイムPCRにてCACNA2D1、GFRA1、GABRA5、SYT4について3枝領域での発現上昇を確認した。これらはいずれも三叉神経節3枝領域では発現上昇は見られたが、2枝領域では発現上昇が見られなかった。また偽処置では3日目以降は元のレベルに戻るのに比べ、切断モデルでは7日目になっても発現上昇が維持されていた。電位依存性カルシウムチャネルのサブユニットの一つであるCACNA2D1、GDNFレセプターであるGFRA1は、共にアロディニアの原因遺伝子及び治療標的の候補として報告されているが、いずれもアロディニア領域支配神経ではなく、損傷神経において発現が変動している。また他の二つ、GABRA5とSYT4についても類似の変動パターンを示すことから、アロディニアとの関連性が示唆される。アロディニア発生に伴っておきる諸現象についてはさらにいくつか検討を予定している。ヒト症例における疼痛治療法として、Gabapentinのくも膜下腔投与、交感神経切除に着目し、現在そのモデルラットを作成中である。今後、これらの治療後に上記のアロディニア関連の現象がどう変化するかを確認していく予定としている。アロディニア発生機序の解明を目的として、下歯槽神経切断モデルラット及びラットの延髄部分にカテーテルを留置するモデルを作成し、神経因性疼痛治療薬であるGabapentinの下歯槽神経切断後アロディニアに対する効果を調べた。下歯槽神経切断後には翌日から手術側上口唇における疼痛逃避閾値の低下がみられたが、延髄カテーテルを通じてGabapentin(200μg/day)を神経切断後7日目から5日間連続投与すると、低下した疼痛逃避閾値の回復が確認され、Gabapentinが下歯槽神経切断後のアロディニアにも効果があることが確認された。またこれに伴う三叉神経節神経細胞における遺伝子発現変動をreal-time PCRにて解析した。下歯槽神経切断後には3枝領域にて多くの遺伝子発現の上昇が見られることをすでに確認しているが、Gabapentin投与後に逃避閾値が回復したラットでは、これらの遺伝子のいくつかについてその発現上昇が抑制されていた。しかし、これらのモデルラットの疼痛逃避行動データと遺伝子発現変動についての相関については未だデータが不足しており、さらに解析を続ける必要がある。今後は、投与期間の長さによる影響、さらに他の遺伝子群の発現動態、投与中止後に疼痛異常が再発した場合の遺伝子発現動態、等を調べる。また、ATP受容体阻害薬やグルタミン酸受容体阻害薬の投与、神経切断時の局所麻酔薬の影響に関する解析を行う予定としている。アロディニア発生機序の解明を目的として、下歯槽神経切断モデルラット及びラットの延髄部分にカテーテルを留置するモデルを作成し、神経因性疼痛治療薬であるGabapentinおよび抗鬱薬であるAmitriptylineの効果を確認した。下歯槽神経切断後には翌日から手術側上口唇における疼痛逃避閾値の低下がみられたが、延髄カテーテルを通じてGabapentin(200μg/day)もしくは腹腔内にAmitriptyline(4mg/day)を神経切断後7日目から5日間連続投与すると、低下した疼痛逃避閾値の回復が確認され、これら薬剤はそれぞれ全く作用が異なるにも関わらず、神経因性疼痛に同様の抑制効果を持つことが示された。また、下歯槽神経切断は三叉神経節内神経細胞における様々な遺伝子の発現を上昇させることをこれまでに確認しているが、Gabapentin投与後の神経因性疼痛軽減後の組織においてもほとんどの遺伝子の発現上昇は維持されたままであった。そのなかで唯一、Gabapentinの標的分子でもある電位依存性カルシウムチャネルのサブユニットの一つ、CACNA2D1の遺伝子においてのみ、神経因性疼痛軽減後に有意に発現レベルの抑制が見られた。これはCACNA2D1遺伝子の発現が自己の活性化によるフィードバック制御を受けている可能性と共に、神経因性疼痛の維持機構において、神経損傷により発現が上昇する多くの遺伝子の中でも特にCACNA2D1の重要性、さらには末梢神経細胞におけるカルシウムシグナルの重要性を強く示唆するものである。
非晶性高分子材料の変形挙動のマイクロ・メゾ・マクロメカニカルモデルの構築

近年高分子材料は工業材料として多種多様な用途に広範に使われている.しかしながら,その変形応答は金属材料とは異なり,微妙な熱,変形速度等の変化に強く依存している.これは,微視的には,空間的に階層構造をなしている材料の下位の層の固有な構造に変化が生じ,それが巨視的な変形特性に影響を及ぼした結果である.したがって,本質的にこのような材料の挙動を解明しようとするとき,最も基本となるマイクロな原子レベルまで遡り,その構造の運動から変形機構を解明し,より高位のメゾ・マクロレベルの層の変形挙動を予知することは最も基本的である.本研究では,まず,変形に伴うポリマーのマイクロスケールからメゾスケールの構造の変化及び成長を走査型原子間力顕微鏡を用いて詳細に観察し,その特徴を明らかにした.次に,得られた実験・観察結果を反映する分子動力学によるマイクロスケールの変形挙動のシミュレーションモデルを構築した.さらに,マイクロスケールの変形挙動を平均化することにより,高分子鎖の変形による伸びあるいは回転に対する抵抗,あるいは高分子鎖の変形とそれをとりまく回りの物質との変形の差を検討した.また,メゾスケールの高分子鎖の回転および配向によるマクロスケールの応答の異方性,ならびに変形環境による非晶性から結晶性への相変態を含むメゾスケールの状態変化及びそれを反映したマクロスケールの高次連続体モデルを構築した.以上より,階層構造をなすポリマーの最も基本となる原子レベルからメゾ,マクロレベルの変形挙動の詳細なシミュレーションプログラムを作成することが可能となり,高分子材料の巨視的な外力及び変形拘束の下でのマイクロ・メゾ・マクロスケールの構造変化を予知することが可能となった.近年高分子材料は工業材料として多種多様な用途に広範に使われている.しかしながら,その変形応答は金属材料とは異なり,微妙な熱,変形速度等の変化に強く依存している.これは,微視的には,空間的に階層構造をなしている材料の下位の層の固有な構造に変化が生じ,それが巨視的な変形特性に影響を及ぼした結果である.したがって,本質的にこのような材料の挙動を解明しようとするとき,最も基本となるマイクロな原子レベルまで遡り,その構造の運動から変形機構を解明し,より高位のメゾ・マクロレベルの層の変形挙動を予知することは最も基本的である.本研究では,まず,変形に伴うポリマーのマイクロスケールからメゾスケールの構造の変化及び成長を走査型原子間力顕微鏡を用いて詳細に観察し,その特徴を明らかにした.次に,得られた実験・観察結果を反映する分子動力学によるマイクロスケールの変形挙動のシミュレーションモデルを構築した.さらに,マイクロスケールの変形挙動を平均化することにより,高分子鎖の変形による伸びあるいは回転に対する抵抗,あるいは高分子鎖の変形とそれをとりまく回りの物質との変形の差を検討した.また,メゾスケールの高分子鎖の回転および配向によるマクロスケールの応答の異方性,ならびに変形環境による非晶性から結晶性への相変態を含むメゾスケールの状態変化及びそれを反映したマクロスケールの高次連続体モデルを構築した.以上より,階層構造をなすポリマーの最も基本となる原子レベルからメゾ,マクロレベルの変形挙動の詳細なシミュレーションプログラムを作成することが可能となり,高分子材料の巨視的な外力及び変形拘束の下でのマイクロ・メゾ・マクロスケールの構造変化を予知することが可能となった.空間的に階層構造をなしているポリマーの,変形に伴うマイクロスケールからメゾスケールの構造の変化及び成長を,モノマーの挙動の分子動力学によるモデル化とモノマーの集合体としての高分子鎖の挙動のモデル化,ならびにメ-ゾスケールの高分子鎖の回転及び配向によるマクロスケールの異方性応答を検討し以下の結果を得た。(1)高分子鎖の結合部分,節,の外力による変化を現象論的に表現し得るメゾスケールモデルを構築することができた.数値シミュレーションと実験結果の比較により,従来のモデルにおいて表現が困難であったせん断変形に対しても適用できることが確認された.(2)一般応力状態における,高分子材料の変形挙動のシミュレーションプログラムが構築され,(1)のシミュレーションを可能とした.(3)電子顕微鏡により高分子材料の表面の性状観察を行い,マクロな変形の進行とミクロな変形挙動の関係を検討した.得られたデータの定量化を行うことにより,表面性状の変化と高分子材料のミクロな変形の関係を一部明らかにすることが出来た.(4)モノマーについて,その構造を解析し必要な原子間ポテンシャルを求めるべく準備中である.さらに,複数個のモノマーの集合体として,高分子鎖単位とそれを節で連結した高分子鎖モデルを構築中である.以上のように,当初の研究計画に対して,顕微鏡による実験的検討と現象論的考察による高分子材料のメゾ,マクロスケールのモデルの構築とその実験的検証はできたものと考える.しかしながら,分子鎖を構成するモノマーの構造とその応答,さらには,高分子鎖のメゾスケールのモデル化についての具体的な検討は行っているが,数値シミュレーションあるいは実験結果との比較検討については現在進行中である.近年高分子材料として多種多様な用徐に広範に使われている.しかしながら,その変形応答は金属材料とは異なり,微妙な熱,変形速度等の変化に強く依存している.これは,微視的には,空間的には階層構造をなしている材料の下位の層の固有な構造に変化が生じ,それが巨視的な変形特性に影響を及ぼした結果である.

したがって,本質的にこのような材料の挙動を解明しようとするとき,最も基本となるマイクロな原子レベルまで遡り,その構造の運動から変形機構を解明し,より高位のメゾ・マイクロレベルの層の変形挙動を予知することは最も基本的である.本研究では,変形に伴うポリマーのマイクロスケールからメゾスケールの構造の変化及び成長を走査型原子間力顕微鏡を用いて詳細に観察し,その特徴を明らかにした.次に,得られた実験・観察結果を反映する分子運動力学によるマイクロスケールの変形挙動のシミュレーションモデルを構築した.さらに,マイクロスケールの変形挙動を平均化することにより,高分子鎖の変形による伸びあるいは回転に対する抵抗,あるいは高分子鎖の変形とそれをとりまく回りの物質との変形の差を検討した.また,メゾスケールの高分子鎖の回転および配向によるマイクロスケールの応答の異方性,まらびに変形環境による非晶性から結晶性への相変態を含むメゾスケールの状態変化及びそれを反映したマイクロスケールの高次連続体モデルを構築した.以上の検討により,階層構造をなすポリマーの最も基本となる原子レベルから目ぞ,マクロレベルの変形挙動の詳細なシミュレーションプログラムを作成することが可能となり,高分子材料の巨視的な外力及び変形拘束のもとでのマイクロ・メゾ・マクロスケールの構造変化を予知することが可能となった.
新しいシェーグレン症候群モデルマウスにおける自己抗原の同定と臨床応用

SLE自然発症マウスNZM2328にサイトメガロウイルスを感染させることによって、ウイルスの感染が収束した後にシェーグレン症候群に極めて類似した組織像および自己抗体の産生を認めるモデルマウスを作製した。このモデルマウスを用い、外分泌腺内の蛋白でこのマウスの血清と反応する自己抗原の同定を行った。顎下腺、舌下腺、耳下腺および涙腺中の67kDaの蛋白がこれらのモデルマウスの血清に高頻度で反応しており、これを切り出して質量分析を行い、アミノ酸配列を同定したところ、DNAK type molecular chaperoneやcytokeratinがその候補としてあげられた。リコンビナント蛋白を作製してヒト血清と反応させたところ、SS患者の中にこの蛋白と反応する血清を持った患者がおり、この自己抗原はシェーグレン症候群の病態に関与している可能性が示唆された。われわれはSLE自然発症マウスNZM 2328にマウスサイトメガロウイルスを感染させ、ウイルスが検出されなくなった後にシェーグレン症候群(SS)の病理像に類似した唾液腺炎を発症する新しいSSのモデルマウスを確立した。このモデルは遺伝的に自己免疫疾患を発症する個体にウイルスが感染することによってさらなる自己免疫反応が出現しており、実際の自己免疫疾患の発症に非常に近い状態と考えているしこの新しいモデルマウスを用いてSSの自己抗原を同定するために本年度は以下の研究を行った。1.SS様唾液腺炎を発症したマウス脾臓から採取したB細胞とミエローマ細胞SP2/0-Ag14を用いてハイブリドーマを作成した。増殖してきたクローンは培養上清を用いたHeLa細胞とヒト唾液腺細胞株HSGの染色でスクリーニングを行い、陽性クローンについてはさらにマウス顎下腺の凍結切片の染色を行った。その結果、腺房細胞の細胞質を染色する2クローンと導管上皮細胞の表面抗原を染色する1クローンが得られた。現在このクローンが認識する抗原の同定を開始している。2.マウス顎下腺、耳下腺、舌下腺、その他の臓器から抽出した蛋白を用いてウエスタンブロッティングを行い、SS様唾液腺炎を発症したマウスの血清と反応させたところ、各唾液腺のみで50kDaの蛋白との反応が認められた。また、HSG細胞株から抽出した蛋白と血清を免疫沈降させたところ44kDa、17kDaの蛋白の沈降を認めた。現在これらの蛋白についても解析を進めている。われわれはSLE自然発症マウスNZM2328にマウスサイトメガロウイルスを感染させ、感染が終息してウイルスが検出されなくなった後にシェーグレン症候群(SS)の病理像に類似した唾液腺炎を発症する新しいSSのモデルマウスを確立し、本研究ではまずこのモデルマウスの唾液腺に浸潤するリンパ球が認識する自己抗原の同定を行っている。SS様唾液腺炎を発症したマウス脾臓から採取したB細胞を用いて作製したB細胞ハイブリドーマの中で、マウス顎下腺の腺房細胞の細胞質内の抗原を認識する2クローンと導管上皮細胞の表面抗原を認識する1クローンの培養上清と、マウス顎下腺、耳下腺、舌下腺、その他の臓器から抽出した蛋白のウエスタンブロッティングとの反応では、腺房細胞の細胞質内の抗原を認識するクローンの1つの培養上清で唾液腺の50kDaの蛋白との反応が認められた。SS様唾液腺炎を発症したマウスの血清とマウス唾液腺の蛋白との反応でも50kDaの蛋白が認められており、現在2次元電気泳動を用いてこの2つの方法で得られた50kDaの蛋白を展開して得られたスポットのアミノ酸配列の決定を行っている。アミノ酸配列の決定から蛋白の同定、リコンビナント蛋白の作製、この蛋白に対するSS患者血清の反応性についての検討を次年度行っていく予定である。SLE自然発症マウスにマウスサイメガロウイルスを感染させることにより、ウイルスが唾液腺内で検出されなくなった後にシェーグレン症候群(SS)に類似した組織像を示す唾液腺炎を発症する新しいSSモデルマウスを作製した。そして、このSS様唾液腺炎を発症したマウスの唾液腺浸潤リンパ球が認識する抗原の同定を行うことで、SSの自己抗原の同定を試みた。SS様唾液腺炎を発症したマウスの中にはヒト唾液腺細胞株(HSG)の17kDa、44kDaの蛋白や主にマウス腺組織に存在する62kDa、50kDaの蛋白に反応する自己抗体が血清中に存在するマウスが高頻度にみられた。これらの蛋白の中で主にマウス腺組織に存在する62kDaの蛋白を同定し、リコンビナント蛋白を作製してヒト血清と反応させたところ、SS患者の中にこの蛋白と反応する血清を持った患者がいることがわかった。

また、この蛋白を抗原としてT細胞の反応性を検討したところ、T細胞の増殖も認めるものもあった。したがって、この自己抗原はSSの自己抗原の一つであると考えている。現在患者のSSの発症時期や増悪時期とこの蛋白に対する反応との関連を検討しており、この自己抗原蛋白がSSの発症や病態の形成にどのように関与しているかを考察している。
アミノ酸シグナルによる骨代謝調節機構

アミノ酸は、細胞機能調節因子(シグナル伝達分子)として能動的に働くことが近年注目されている。本研究では、システムA型中性アミノ酸トランスポーターであるSlc38a1の骨関連細胞(骨芽細胞と破骨細胞)特異的遺伝子欠損マウス(KOマウス)を作製し、骨表現型解析を行った。その結果、どちらの細胞特異的KOマウスにおいても、野生型マウスと比較して、骨量、骨形成・骨吸収パラメーターに著明な変化は認められなかった。また、骨芽細胞特異的KOマウスを用いて卵巣摘出による閉経後骨粗鬆症モデルを作成した。その結果、野生型マウスおよび骨芽細胞特異的KOマウスのどちらも同程度の骨量低下が認められた。本研究では、骨形成と骨吸収を担う細胞(破骨細胞及び骨芽細胞)に発現するアミノ酸トランスポーターに焦点をあて、アミノ酸シグナルによる骨代謝調節メカニズムの解明を行い、アミノ酸トランスポーターを分子標的とした骨粗鬆症に対する新規治療薬開発を展開するための研究基盤を確立する。本年度は、組織特異的遺伝子改変マウスと骨代謝性疾患モデルマウスを用いて、システムA型アミノ酸トランスポーター機能変動と骨代謝性疾患発症との関連性を明らかとすることを目的とした。まず最初に、骨粗鬆症の骨組織で発現変動するアミノ酸トランスポーターの同定を行うため、卵巣摘出術による骨粗鬆症モデルマウスを作製し、そのモデルマウスの骨組織および骨髄におけるアミノ酸トランスポーターの発現をshamマウスと比較解析した。その結果Slc38a1の発現が骨粗鬆症モデルマウスの骨組織で発現上昇していることが明らかとなった。そこで次に、Slc38a-floxedマウスとCd11b-Creおよびα1(I)collagen-Creマウスを用いて、破骨前駆細胞特異的および骨芽細胞特異的Slc38a1ノックアウトマウスの作製を行った。現在は、これらのマウスに関して、大腿骨やけい骨における骨密度をDual Energy X-ray absorptiometry法により解析を行い、また、非脱灰薄切標本を用いて骨形態計測(骨構造、骨形成、骨吸収に関するパラメーターの測定)を行っている。本研究では、骨形成と骨吸収を担う細胞(破骨細胞及び骨芽細胞)に発現するアミノ酸トランスポーターに焦点をあて、アミノ酸シグナルによる骨代謝調節メカニズムの解明を行い、アミノ酸トランスポーターを分子標的とした骨粗鬆症に対する新規治療薬開発を展開するための研究基盤を確立することを目的とした。昨年度は、破骨前駆細胞特異的Slc38a1ノックアウトマウスの作製とその解析を行った。その結果、同ノックアウトマウスでは、野生型マウスと比較して、長骨および脊椎において、骨量の著明な変動は認められなかった。本年度は、a1(I)collagen-Creマウスを用いて作製した骨芽細胞特異的Slc38a1ノックアウトマウスにおける骨表現型の解析を行った。その結果、同ノックアウトマウスと野生型マウスにおいて、骨量や骨形成(骨芽細胞数および骨形成速度)、骨吸収(破骨細胞数および破骨細胞表面)に関するパラメーターに著明な差は認められなかった。そこで、骨芽細胞特異的Slc38a1ノックアウトマウスを用いて、卵巣摘出による閉経後骨粗鬆症モデルを作成し、骨量の測定および骨形成、骨吸収に関するパラメーターの測定を行った。野生型マウスを用いて閉経後骨粗鬆症モデルを作成した場合、骨量の低下と破骨細胞の活性化が認められたが、骨芽細胞特異的Slc38a1ノックアウトマウスを用いた場合においても野生型マウスと同様の骨量低下と破骨細胞活性化が認められた。昨年度は、閉経後骨粗鬆症モデルマウスの骨組織においてアミノ酸トランスポーターのひとつであるSlc38a1のmRNA発現が著明に上昇することを確認した。そこで本年度は、Slc38a1-floxedマウスとCd11b-Creおよびα1(I)collagen-Creマウスを用いて、破骨前駆細胞特異的および骨芽細胞特異的Slc38a1ノックアウトマウスの作製とその解析を行った。その結果、破骨前駆細胞特異的Slc38a1ノックアウトマウスでは、野生型マウスと比較して、長骨および脊椎において、骨量の著明な変動は認められなかった。

さらに、非脱灰薄切標本を用いて、骨形成(骨芽細胞数および骨形成速度)、骨吸収(破骨細胞数および破骨細胞表面)に関するパラメーターの測定を行った結果、ノックアウトマウスと野生型マウスにおいて、両パラメーターともに著明な変化は認められなかった。したがって現在は、破骨前駆細胞特異的Slc38a1ノックアウトマウスと野生型マウスを用いて、閉経後骨粗鬆症モデルを作成し、骨量の測定および骨形成、骨吸収に関するパラメーターの測定を行っている。交付申請書に記載した「研究の目的」に記載した内容について、完全には完了をしていないが、完了予定時期が明らかとなっている。25年度が最終年度であるため、記入しない。現在進行中の研究内容に関して、これまでと同様に着実に完了させる予定である。
体液診断技術を応用した肉腫における新規バイオマーカーの開発と実用化への展開

【目的】近年、悪性腫瘍におけるliquid biopsy技術の開発が世界的な注目を集めており、患者体液を用いた新しい診療ツールとして開発されつつある。本研究では、エクソソームおよび分泌型microRNAの測定技術を応用し、腫瘍由来microRNAやエクソソーム由来タンパクの同定を行い、骨軟部肉腫における新たな診断治療への応用を目指す。【方法】今年度は、滑膜肉腫細胞からの腫瘍由来エクソソーム及び分泌型microRNAの抽出と網羅的解析を行った。抽出されたmicroRNAについて、滑膜肉腫細胞株および、滑膜肉腫患者血清を用いてvalidation studyを行い、滑膜肉腫特異的microRNAを見出した。これらのmicroRNAについて、滑膜肉腫細胞株における機能解析と滑膜肉腫細胞皮下移植モデルマウスを作成し、マウス生体内におけるバイオマーカーとしての有用性を検討した。【結果】滑膜肉腫における分泌型microRNAを患者血清および肉腫細胞株培養上清の網羅的解析から特定し、患者群および滑膜肉腫細胞株で発現が高く、患者群において術前よりも術後に発現が低下するmicroRNAとして4つの候補が選出された。候補microRNAのうち、miR-92b-3pのみがhMSCと比較し、全ての滑膜肉腫細胞株の培養上清内で発現が上昇していた。マウス皮下腫瘍モデルにおいては、血中miR-92b-3pは腫瘍サイズと相関を示し、良好な感度・特異度を示すことを確認した(R = 0.776, p < 0.05)。また滑膜肉腫患者血清の検討では、術前後の比較で血清中microRNAの発現が有意に低下しており、腫瘍の存在を示すバイオマーカーとしての可能性が示された。本研究において特定された滑膜肉腫細胞由来のmicroRNAは、新規バイオマーカーとしての有用性が示された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。【目的】Exosomeは当初、細胞の不要物的な存在としか認知されずその機能や存在意義は不明であった。しかし近年、exosome内に核酸や蛋白が内包されていることが分かり、関連研究が加速している。また患者体液を用いたliquid biopsy(体液診断)技術が悪性腫瘍の新しい診療ツールとして開発されつつある。Exosome自体がliquid biopsyの標的として機能することが大腸がんなどの上皮がんで示唆されているが、肉腫における知見は報告されていない。我々はexosome膜表面タンパクに焦点をあて、Ewing肉腫に対するliquid biopsyへの応用可能性について検討した。【方法】Ewing肉腫細胞株3種とヒト間葉系幹細胞の培養上清から超遠心法でexosomeを抽出した。このexosomeに対してLC-MS/MS解析を行い、Ewing肉腫細胞由来exosomeで共通して高く発現し、正常細胞では発現のないタンパクを選出した。このうち解析可能であったタンパクに対して、Ewing細胞由来exosomeを用いてELISA及びWestern blotによる膜タンパク抗原の検出を行った。【結果】Ewing肉腫細胞株由来exosomeで共通して発現し正常細胞で発現のない上位15種の候補が抽出された。この中にEwing肉腫の免疫組織学的診断で一般的に用いられる細胞膜発現CD99が含まれており、ELISAおよびWestern blotにより細胞株由来で発現が検出可能であった。細胞株および患者血清由来のエクソソームのプロテオーム解析により、バイオマーカーの候補となるエクソソーム表面タンパクを選出することができた。近年microRNAやexosomeといった体液中を循環する分子を用いて、腫瘍の状態を監視することができるliquid biopsyという手法が盛んに研究されている。既に大腸がんなどで腫瘍由来exosomeの検出が既存のマーカーよりも有用である可能性が報告されているが、肉腫における知見は報告されていない。本研究では特に血液中に循環するエクソソームの表面に存在するタンパクを用いて骨軟部肉腫患者のモニタリングや治療奏功性を判断することのできるバイオマーカーの開発を目指す。今年度は、昨年度報告したEwing肉腫に特徴的なCD99をエクソソーム表面に存在することに加え、プロテオーム解析からCD99以外の候補蛋白を抽出し、Ewing肉腫細胞株および患者血清由来エクソソームを用いて体液診断への応用の可能性を検討した。(方法)候補蛋白をwestern blotでcell lysateとエクソソームにおける発現を確認した。次にEwing肉腫担癌マウス血清由来exosomeにおける候補蛋白の発現をEVSECOND法によって分離したエクソソームを用いて、サンドイッチELISAにより確認した。同様の方法で、Ewing肉腫患者血清由来exosomeについても検討した。(結果)候補蛋白のうちprotein-Aの発現を細胞内とエクソソームで強く認めた。また候補タンパクのprotein-AはEwing肉腫担癌マウスにおいて担癌状態を識別することができ、臨床検体によってもその有用性を確認できた。プロテオーム解析から候補タンパクを選択し、サンドイッチELISA法を用いて、Ewing肉腫担癌マウス血清や患者血清において発現を確認できた。

【方法】今年度は、滑膜肉腫細胞からの腫瘍由来エクソソーム及び分泌型microRNAの抽出と網羅的解析を行った。抽出されたmicroRNAについて、滑膜肉腫細胞株および、滑膜肉腫患者血清を用いてvalidation studyを行い、滑膜肉腫特異的microRNAを見出した。これらのmicroRNAについて、滑膜肉腫細胞株における機能解析と滑膜肉腫細胞皮下移植モデルマウスを作成し、マウス生体内におけるバイオマーカーとしての有用性を検討した。【結果】滑膜肉腫における分泌型microRNAを患者血清および肉腫細胞株培養上清の網羅的解析から特定し、患者群および滑膜肉腫細胞株で発現が高く、患者群において術前よりも術後に発現が低下するmicroRNAとして4つの候補が選出された。候補microRNAのうち、miR-92b-3pのみがhMSCと比較し、全ての滑膜肉腫細胞株の培養上清内で発現が上昇していた。マウス皮下腫瘍モデルにおいては、血中miR-92b-3pは腫瘍サイズと相関を示し、良好な感度・特異度を示すことを確認した(R = 0.776, p < 0.05)。また滑膜肉腫患者血清の検討では、術前後の比較で血清中microRNAの発現が有意に低下しており、腫瘍の存在を示すバイオマーカーとしての可能性が示された。本研究において特定された滑膜肉腫細胞由来のmicroRNAは、新規バイオマーカーとしての有用性が示された。臨床へも応用可能な候補タンパクの探索と解析プラットフォームの確立を目指していく。具体的にはEwing肉腫細胞株移植マウスを用いた解析、患者血清を用いた解析等を行い、最終的には臨床応用を目指した検出プラットフォームを確立する。今後は症例を増やして臨床検体におけるバイオマーカーとしての有用性を確認していく。またサンドイッチELISA法で検出を行っているが、より簡便なExoscreenによるタンパク検出の開発を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
十六世紀英仏の伝統的な政治学が宗教内乱に対応できなかった理由について

本研究は、十六世紀のイングランドとフランスの政治学の双方に亘る調査を行おうとするものであるが、イングランド関係の調査を行った昨年度に続き、今年度は、フランス側の調査を、フランソワ・オトマン(Francois Hotman)を対象に行った。具体的な調査の対象としたのはオトマンのFrancogallia(1573,1576, 1586)であった。オトマンはいわゆるモナルコマキの一人とされ、ユグノーによる武装抵抗に積極的に関わった人物であるが、彼のFrancogalliaは、ローマの属領となる以前のガリアから15世紀にフランス国制史を叙述した作品であり、紙幅の大半は、カエサル、タキトゥス、アイモン、トゥールのグレゴリウス、シゲベルトなど歴史家の引用とその解説に費やされており、抵抗権の正当性を理論的に論じた、他のモナルコマキのパンフレットとは様相を異にする。オトマンは、publicum conciliumが歴史上、一貫して保持したsummum auctoritasがカペー朝の下で失われ、senatusの後身たるparlamenta juridicialiaが優位に立つに至ったとし、父祖の国制への復帰を説く。この議論の中心は、mos mairorumnostrorumとrex個人の対比にではなく、むしろ、conciliumの中心を(populusでなく)proceresと捉え、senatusを構成するconsiliariiに対比し、もって自由人と家畜の対比に重ねるところにある。つまり国制の最終的な支柱は慣習よりも貴族集団であり、武装抵抗の発動にあっても、オトマンはproceresの判断とconciliumによる判断との間に区別だてをしようとしない。よって、タイラントに対する貴族の抵抗についてはその正当性を吟味する理論的装置が一切備わっておらず、この点が、十七世紀の主権論者から(内乱に対応し得なかったと)批判された原因であると思われる。本研究は、十六世紀のイングランドとフランスの政治学の双方に亘る調査を行おうとするものであるが、二年の研究期間のうちの初年度に当たる今年度は、主としてイングランド関係の文献の収集と、それに基づく調査を行った。特に、具体的な調査の対象としたのはトマス・スミス(Sir Thomas Smith)とフィリップ・シドニー(Philip Sidney)であった。まず、スミスはDe Republica Anglorumにおいて、イングランドの最高権力(the most high and absolute power)を議会に認めつつ、その一方で、君主こそは、イングランドのあらゆる権威(the authoritie)の源であるとし、一見、矛盾した議論を展開している。ところが、スミスはその矛盾の克服に何ら神経を使ってはおらず、むしろそのことがスミスの政治観の著しい特徴である。すなわち、君主と議会との協同は当然に約束されているということである。また、シドニーは、Arcadiaという文芸作品の中で、たとえ君主自身が残虐でなくとも、宮廷内の追従によって君主政は容易にティラニ-に転落する危険性を持っていることを繰り返し警告している。ところが、こうして君主政の欠陥を指摘する一方で、共和政を現実の選択肢として考えることはなく、イングランドが君主政をとることを当然の前提としている。以上、エリザベス朝の両者に共通するのは、イングランドを一つの政治体としてとらえることと、その中心に君主が存在することとが不可分一体であるという政治観である。これは、ティラニ-に対する二類型(残虐型と私利私欲優先型)が顔を出す点もあわせ、遠く聖トマスに遡る問題であるという見通しを抱かせるに至っている。
膵管狭細型膵炎および胸腺摘出自己免疫性膵傷害モデルマウスの免疫学的研究

CAII、lactoferrinはともにムチン蛋白の分布する臓器と同様の唾液腺、胆管、膵臓、腎尿細管に分布している。本疾患において、抗CAII抗体や抗lactoferrin抗体を高率(90%)に検出したことは、CAIIやLFが自己臓器に対する標的抗原の候補になりうるものと推測された(Gastroenterology:2000)。更に、CAII,lactoferrinを免疫した胸腺摘出マウスでは高率に唾液腺・膵にリンパ球浸潤や細胞変性を認めた(米国消化器病学会:2000)ことより,自己免疫膵炎の発症にはこれらの抗原系に対する自己免疫学的機序の関与する可能性が考えられた。一方、自己免疫(関連)性膵炎では、健常群やコントロール膵炎群に比し、HLA-DR抗原陽性のTh1型CD4陽性細胞が増加していたが、Th2型細胞は差違を認めなかった(Gastroenterology:2000)。患者膵の免疫組織学的検討では膵管上皮細胞および腺房中心細胞にHLA-DRの強い発現を認めるとともに、その周辺に活性化CD4陽性T細胞の優位な浸潤を認めた(Am.J.Gastroenterol:1998,Am.J.Gastroenterol:2000)。更に、CAII,lactoferrinを免疫した胸腺摘出マウスでも、IFN-gの発現増強を認めた。以上より、Th1型CD4陽性活性化T細胞がエフェクター細胞として病態生理に深く関与していると考えられた。現在、CAII,lactoferrin免疫マウスを用い、T細胞株を作成中でありいくつかの候補も得られつつある。自験例の臨床像を解析し,自已免疫疾患の合併、自己抗体の存在,高γグロブリン血症,びまん性膵腫大,主膵管の不整狭窄,膵頭部腫瘤の形成による総胆管狭窄,組織学的にリンパ球浸潤を伴う線維化,ステロイドに対する良好な反応などをその臨床的特徴として報告した(日本消化器病学会:2000年、米国消化器病学会:1999,2000年,Gastroenterology誌)。更に、その病態生理を解明すべく、本疾患では膵組織に存在するCAIIおよびlactoferrinに対する免疫応答の存在することを報告し(米国消化器病学会;1999,2000年)、胸腺摘出マウスを用いた自已免疫性膵傷害モデル動物の作成を試みた(米国消化器病学会;1999,2000年)。以上より、Th1型CD

4陽性活性化T細胞がエフェクター細胞として病態生理に深く関与していると考えられた。現在、CAII,lactoferrin免疫マウスを用い、T細胞株を作成中でありいくつかの候補も得られつつある。
防寒服着用時の生理反応と作業能

実際の冷凍倉庫内の環境を想定して、冷凍倉庫内の荷役作業が人体の体温調節反応やその他の生理反応にどのような影響を及ぼすかについて実験を行った。8名の被験者とし、気温20°C、相対湿度50%環境下において20分間の椅座位安静の後、マイナス25°C環境へ移動し、10分間の椅座位安静後、10分間の作業を行い(作業なし、9kg荷役作業、18kg荷役作業)、再び10分間の椅座位安静で、計30分間の寒冷暴露とし、これを3回繰り返すものであった。その結果、寒冷作業における労動量が増加することによって熱産生量が増加することが明らかになったが、四肢末梢の皮膚温においては条件間の温度差が現れた。直腸温低下は労動量の増加によって抑制されたが、直腸温変動に対するCounting比の相関では労動作業による急激なCounting比の低下が見えた。直腸温37.2°CにおいてCounting比は条件18kg荷役作業で一番高く、作業なし、9kg荷役作業の順に低くなったが、36.7°Cでは条件作業なしが一番高く、9kg荷役作業、18kg荷役作業と低くなり、逆順序になることがわかった。これは直腸温と足趾温との相関でも同様であった。血液成分では、寒冷ストレスに対して血漿ノルアドレナルリン濃度が増加した。本実験結果もこれと同様の結果であった。本実験においては、作業による熱産生の増加により寒冷ストレスは軽減されたため、作業量増加に従って血漿ノルアドレナルリン濃度の増加量が低下したと考えられた。しかし、手作業の巧緻性は重量物の荷役などの労動によってむしろ低下した。したがって、同一時間に対する作業でも寒冷環境下の重量物の取り扱いは、作業能率の低下や荷物の落下などの危険性が高まる恐れがあるため、取り扱い時の作業時間の短縮及び安全上の確保をさらに要すると考えられた。近年、冷凍倉庫内での作業は、身体各機能への影響や問題の発生を考慮して、作業者の労働量を最小限にし、同時に倉庫内作業の自動化が進められている。しかし、労働量の軽減は可能であるとはいえ、未だ無人力の完全自動化は実現できていない。そのため、作業者たちは寒冷の環境と外部の温度差によって循環機能などの健康障害を受けることが多い。また大部分の冷凍物品の重量が1020kg以上である。そこで本研究では、筋肉痛などを訴える作業者も多数に及ぶことに着目し、冷凍倉庫内の荷役作業が人体の体温調節反応やその他の生理反応にどのような影響を及ぼすのかを明らかにするために次のような実験を行った。冷凍倉庫内の荷役作業をシミューレーターして防寒服(約3.4kg.ブーツを除く)を着用した被験者8名を20°Cと-25°Cの環境に3回繰り返し暴露した。実験時間は、合計170分間であった。被験者は-25°Cの環境では3条件の作業(作業なし、9kg荷役作業、18kg荷役作業)を10分間行った。測定は直腸温、皮膚温11点、衣服内の温湿度、心拍数、血圧、体重減少量を測定し、呼気採取及び血液採取を実施した。さらに、15秒間にできるだけカウンターを多く押すCounting taskを実施した。また、心理反応として主観申告を行なった。血液データは実験前後に採取したサンプルを分析した。その結果、次のような結果が得られた。寒冷環境下での作業負荷が増加することによって深部温と体幹部皮膚温が上昇することや、拡張期血圧の上昇が抑制されることが認められた。しかし、手作業の巧緻性は重量物の荷役などの労動によってむしろ減少した。したがって、同一時間に対する作業でも寒冷環境下の重量物の取り扱いは、作業能率の低下や荷物の落下などの危険性を高める恐れがあるため、重量物取り扱い時には作業時間の短縮及び安全上の確保をさらに要すると考えられた。

本実験においては、作業による熱産生の増加により寒冷ストレスは軽減されたため、作業量増加に従って血漿ノルアドレナルリン濃度の増加量が低下したと考えられた。しかし、手作業の巧緻性は重量物の荷役などの労動によってむしろ低下した。したがって、同一時間に対する作業でも寒冷環境下の重量物の取り扱いは、作業能率の低下や荷物の落下などの危険性が高まる恐れがあるため、取り扱い時の作業時間の短縮及び安全上の確保をさらに要すると考えられた。
日本語と英語のパラレルコーパスを用いた言い淀みの対照言語学的研究

文境界,節境界にはフィラーがよく観察される。これは,文や節などの談話の切れ目では,その先の発話内容や表現を考えるのに時間がかかるためと考えられる。フィラーの出現に関係する要因に,言語間で違いがあるだろうか。これを調べるために,英語と日本語のパラレルコーパスを用い,節頭フィラーの出現確率に関係している要因を比較した。考察対象とした要因は,1直前の境界の深さ,2節中の語数,3話者の性別,4節頭の等位接続詞の有無,5節中の引用節(他の人の発言の引用)の数(英語のみ)の5つである。両言語に共通して節頭フィラーの出現確率との間に有意な関連が見られたのは,1直前の境界の深さと2節中の語数だった。節境界の深さは英語においてより強い効果が観察された。日本語では,文境界と深い節境界との効果に差はほとんど観察されなかった。どちらの言語においても,節中の語数が多いほど節頭フィラーの出現確率は上昇した。ただし,英語の方が語数の効果は大きかった。このことから,節頭におけるプラニングスパンは,日本語より英語の方が大きいことが推察された。性別の効果は日本語においてのみ観察され,日本人男性話者は女性話者よりもフィラーの使用確率が有意に高かった。フィラーのようなパラ言語的要素に対する社会言語学的要因の影響については,今後データ数を増やし,さらに研究する必要のあることが示唆された。節頭の等位接続詞の有無は,どちらの言語においてもフィラーとの関係は観察されなかった。英語において,節中の引用節数にはマイナスの効果があった。即ち,節中の語数が多くても,そこに引用節が含まれる場合,発話開始までにかかる時間はあまり上昇しないことが推測される。他者の発話の引用は,メッセージの言語化よりも認知的負荷の軽い活動であることが示唆された。構築中の英語コーパスCOPEにおいて,文境界は,これまで1名のラベラーによるマーキングを採用しており,客観性に問題があった。英語は日本語と異なり,文境界か文中の節境界かの客観的判断基準がない。そこで,3名のラベラーに,音声を聴取しながら,文境界(談話の切れ目)と判断できる節境界をマークしてもらった。そして,文境界と判断したラベラーの人数によって,境界の深さを03の4段階に分け,深さの指標とした。さらに,この情報をコーパスに組み込んだ。これによって,英語における,節境界の深さと節頭フィラーの出現確率との関連を,より明確にとらえることができた。英語においても日本語においても,節境界頭のフィラーの出現傾向と出現に影響する要因についての研究は,かなりの程度進めることができた。今後,節中フィラーの出現傾向と出現に影響する要因についての研究を進める。また,フィラーは,"um"と“uh"のように,音形が異なると出現傾向や関連する要因に違いがあるかどうかを,日英両言語で調べる予定である。

さらに,この情報をコーパスに組み込んだ。これによって,英語における,節境界の深さと節頭フィラーの出現確率との関連を,より明確にとらえることができた。英語においても日本語においても,節境界頭のフィラーの出現傾向と出現に影響する要因についての研究は,かなりの程度進めることができた。今後,節中フィラーの出現傾向と出現に影響する要因についての研究を進める。また,フィラーは,"um"と“uh"のように,音形が異なると出現傾向や関連する要因に違いがあるかどうかを,日英両言語で調べる予定である。持病の気管支喘息悪化のため,長時間のフライトと気候の大きな変化を伴う,海外での学会参加が困難だった。2019年度は国際音声学会,非流暢性ワークショップなど,関連分野での国際会議が複数開催されるため,体調を整え,それらの機会を活用して成果を発表し,情報収集に努める予定である。また,英語コーパス拡張のためのデータ収集も予定している。これらに予算を用いる。
器官ネットワーク形成における細胞の空間配置

組織や器官が正しく連携するためには、それらが体内で正しい位置に配置される必要がある。本研究では、組織や器官の体内配置の初期過程のしくみを明らかにすることを目的として、神経堤細胞(以下NC細胞とよぶ)をモデルとした解析を行った。特にNC細胞がダイナミックに移動しながら目的のポジションに辿り着く制御機構に注目し、NC由来の色素細胞と交感神経系細胞の挙動を解析した。遺伝子操作、組織移植、細胞移動ライブイメージングなどに関し多数の新規方法論を開発し、NC細胞の移動には、非NC細胞との相互作用が極めて重要な役割を担っていること、またこれらの相互作用の破綻が各組織の空間配置を乱すことなどを明らかにした。生体を構成する細胞は、それぞれが正しく分化することにより機能的な組織や器官が形成される。加えて細胞分化は、体内の正しい場所で行われることが重要である(細胞の空間配置)。たとえば生殖細胞や末梢神経の前駆細胞は、発生中の胚内で距離を移動したのちに最終分化地点にたどり着く。もしこれらの移動機構が破綻すると、たとえ生殖細胞や神経が分化したとしても、正常な生理機能の発揮は不可能である。本研究では、生体内における細胞の空間配置がどのように制御されるかを解き明かすべく、特に末梢神経前駆細胞の移動機構に注目して解析を進めている。末梢神経はそのほとんどが神経冠(堤)細胞(Neural Crest Cells ;以下「NC細胞」と呼ぶ。)に由来する。NC細胞は、神経管の形成と同時にその背側に出現し、その後神経管から遊離して胚内をダイナミックに移動する。移動後に最終地点に到達したNC細胞は、例えば体の表層では色素細胞に、また深部では自律神経(交感神経、副交感神経)や副腎髄質細胞へと分化する。これらの細胞運命地図は40年以上も前に作製されたにもかかわらず、NC細胞がどのようにして胚内を移動し、決まった地点に辿りつくかについてはほとんどわかっていなかった。今年度はNC細胞のなかでも交感神経のサブタイプに注目し、それらの背側大動脈への移動に注目した解析を行った。結果、背側大動脈が産生するBMPシグナルによってその周囲の組織内でNC細胞誘引因子が誘導されること、またNC細胞誘引因子の分子実体は、ケモカインSDF1とNeuregulinである可能性であることなどがわかった。脊椎動物の体内で始めに作られる血管である背側大動脈と、その機能を支配する交感神経をモデルとして、血管-神経パターンの確立機構を研究してきた。我々はこれまでに、ケモカインStromal cell-derived factor-1(以下、SDF-1)のレセプターであるCXCR4を欠損するマウス胚において、交感神経が激減し、かつ肋間血管の不形成が起こることから、背側大動脈-交感神経パターンの確立にSDF-1/CXCR4シグナルが重要であることを見出してきた。本研究において我々は、背側大動脈の移植実験や遺伝子強制発現実験等を通して、背側大動脈が交感神経を誘引すること、背側大動脈周辺間充織で発現するSDF-1が交感神経を誘引する責任分子であること、さらに、背側大動脈から放出されるBMPリガンドが周辺の組織にSDF-1の発現を誘導することで、交感神経が背側大動脈まで移動することを明らかにした。次に、背側大動脈壁からの肋間血管の伸長には、背側大動脈まで移動してきた交感神経が必要であることが、交感神経の除去実験から明らかとなった。さらに、この伸長過程には、肋間血管の細胞でのSDF-1シグナルの活性化と、それに伴う細胞間接着の変化が重要であることが見えてきた。この一連の研究成果は、背側大動脈と交感神経は双方向の作用を及ぼし合うことでそれぞれのパターンを協調的に作り上げること、またその相互作用を担うケモカインシグナルの重要性を提出するものである。個体レベルでの生理機能の獲得と発揮には、各器官の個別のはたらきに加え、異なる器官同士が機能的なネットワークを形成する必要がある。そのためには、器官そしてそれを構成する細胞や組織が、体内で空間的に正しく配置されなければならない。本研究では、器官ネットワーク成立に関わる細胞の空間的配置のしくみの理解にむけて、それらを支える3次元環境内での細胞挙動とその調節機構について、多角的な視点からの解明を試みた。具体的には、末梢神経系(神経堤細胞:NC細胞)や血管系の形成機構に焦点をあて、それぞれの組織成立に関わる細胞移動や両者間にみられるクロストークなどに注目した。NC細胞の両方においてリン酸化SMAD

活性細胞の初期形成過程における交感神経系lineage細胞の移動と分化におけるBMPシグナルとケモカイン及びNeuregulin1の関係を調べたところ、NC細胞の背側大動脈への移動には、ケモカインSDF1/CXCR4及びNeuregulin1の双方とも、細胞誘引活性をもつことがわかった。一方、NC細胞の後期移動において、交感神経と副腎髄質に分かれる際には、Neuregulin1のみが誘引因子として作用することが明らかになった。このことは、NC細胞が背側大動脈付近で細胞分化する際、周辺環境から受けるシグナル感受性が巧みに変化することを示唆するものである。末梢神経系と血管との関わりの分子実体の詳細がみえてきた。個体レベルでの生理機能の獲得と発揮には、各器官の個別のはたらきに加え、異なる器官同士が機能的なネットワークを形成する必要がある。そのためには、器官そしてそれを構成する細胞や組織が、体内で空間的に正しく配置されなければならない。本研究では、器官ネットワーク成立に関わる細胞の空間的配置のしくみの理解にむけて、それらを支える3次元環境内での細胞挙動とその調節機構の解析をおこなった。具体的には、末梢神経系(神経堤細胞:NC細胞)-血管系に焦点をあて、それぞれの組織成立に関わる細胞移動や両者間にみられるクロストークなどに注目し、細胞がどのようにして自分の空間位置を「知る」のかについて、その仕組みを解析した。NC細胞の中の交感神経系lineageが背側大動脈方向に移動する際、背側大動脈から分泌されるBMPによって惹起されるSDF1とNeuregulin1が誘引因子として働くことが明らかになった。次に、これらの細胞集団からさらに交感神経節と副腎髄質に分かれる際には、Neuregulin1が主な誘引活性をもつことがわかった(SDF1はこの活性をもたない)。さらにこれら後期Neuregulinの発現は、背側大動脈由来のBMPに依存的であった。これらのことからみえてきたことは、背側大動脈が中心となって空間ー時期特異的にさまざまなモルフォジェンを分泌/制御し、その結果としてNC細胞がある決まった場所へと移動するという新しい形態形成の概念である。NC細胞の体内移動の仕組みは、長年謎のまま残されていた。我々は独自にTOl2トランスポゾン法による遺伝子発現系を用いて、これらの問題に取り組んでいる。実験系が順調に動きはじめた今、次々に新規知見が得られるところとなり、NC細胞の研究分野への貢献が期待できるところまできた。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究推進方針を継続させる。特にNC細胞の体内移動のしくみを、それらが遭遇する多種多様な周辺環境との相互作用の観点から明らかにする研究は、当該分野に残された大きな課題であり、これらの問題に真正面から取り組むプロジェクトを発展させたい。
ヒト細胞を用いた外因性内分泌撹乱化学物質による生体毒性評価手法の開発

環境中に存在する微量汚染物質の内、変異原性を有しかつ内分泌撹乱性を有する物質(例えば、プラスチック可塑剤として多用されるDBPやDEHP)、ガソリンからの除去が進められているベンゼン(白血病誘発物質)の代謝生成物であるベンゾキノン等、数種類の物質を選択・特定し、培養ヒト細胞を用いてDNAレベルでの変異原性試験、細胞レベルでの曝露試験を実施し、発癌性物質と内分泌撹乱性物質のDNAレベルでの作用機構の共通点および相違点を把握すると共に、その影響を定量的に比較するための指標とその定量方法を提示することを目指して研究を推進した。平成12年度は、特に、ヒト細胞を用いた新しい内分泌撹乱性の検出法を開発した。この試験系は、エストロゲンレセプターにエストロゲン(様)物質が結合してから、標的遺伝子が活性化するまでのプロセスを、ヒト細胞を用いて再現しようとする、いわゆるレポーターアッセイに分類される方法である。ヒト乳ガン細胞MCF-7に、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子pGL3と、エストロゲン受容体の標的遺伝子の上流にあるエストロゲン応答配列(DNA塩基配列)EREc38を3個連結したpGL3-3 EREc38を用い、また、検出感度を向上させるために、エストロゲンレセプター発現ベクターとしてpHEGO-Hygroの利用を試みた。この試験法の適用には、(1)ヒト乳ガン細胞MCF-7にpHEGO-Hygroおよびレポーター遺伝子pGL3-3 EREc38を導入し、(2)評価対象の化学物質を曝露し、(3)発光基質を添加し、(4)発光量を測定する手順を踏むことになる(マイクロプレート使用)。17βエストラジオールを用いた試験により、既に酵母を用いる試験系にやや劣る程度の感度を確認した。環境中に存在する微量汚染物質の内、変異原性を有しかつ内分泌撹乱性を有する物質(例えば、プラスチック可塑剤として多用されるDBPやDEHP)、ガソリンからの除去が進められているベンゼン(白血病誘発物質)の代謝生成物であるペンゾキノン等、数種類の物質を選択・特定し、培養ヒト細胞を用いてDNAレベルでの変異原性試験、細胞レベルでの曝露試験を実施し、発癌性物質と内分泌撹乱性物質のDNAレベルでの作用機構の共通点および相違点を把握すると共に、その影響を定量的に比較するための指標とその定量方法を提示することを目指して研究を推進している。平成10年度は、特に、以下の課題を設定して研究を推進した。すなわち先ず、外因性内分泌撹乱化学物質およびその試験法のサーベイと試験対象物質を絞り込むために、欧米諸国で進められている環境ホルモンの毒性試験法、わが国環境庁等が進めている環境ホルモンに関する研究現況調査等、関連情報を収集した。具体的な実験を開始するために本年度は先ず対象物質として、煙草の排煙や自動車排気ガス(ガソリン)中に含まれるベンゼンの体内代謝生成物質であるパラ(p)・ベンゾキノンに注目することにした。このp-ベンゾキノンを抽出したマウスのDNA(pNY200)およびヒトDNA(pMY189)に曝露し、DNAに対する変異原性を試験し、変異原性の種による相違について検討した。また、ヒト細胞を用いた環境ホルモンの影響を検出するための試験法をサーベイすることを目指して、環境ホルモンがヒト細胞にどのような影響を及ぼすかを、DNAの変異原性を指標にして定量化する試験方法について予備的に検討した。環境中に存在する微量汚染物質の内、変異原性を有しかつ内分泌撹乱性を有する物質(例えば、プラスチック可塑剤として多用されるDBPやDEHP)、ガソリンからの除去が進められているベンゼン(白血病誘発物質)の代謝生成物であるベンゾキノン等、数種類の物質を選択・特定し、培養ヒト細胞を用いてDNAレベルでの変異原性試験、細胞レベルでの曝露試験を実施し、発癌性物質と内分泌撹乱性物質のDNAレベルでの作用機構の共通点および相違点を把握すると共に、その影響を定量的に比較するための指標とその定量方法を提示することを目指して研究を推進している。平成11年度は、特に、以下の課題を設定して研究を推進した。すなわち先ず、人の生活環境中に存在するDBP,DEHP等の内分泌撹乱性を疑われている物質の簡易測定法であるSPME法の特性を把握するとともにその分析感度や分析手順を特定し、生活環境及び屋外環境環境中の濃度並びに市街地土壌中の存在量を分析し、人への曝露量を把握する条件を整えた。また、人細胞およびマウス細胞を用いて行う変異源性試験の対象物質として、煙草の排煙や自動車排気ガス(ガソリン)中に含まれるベンゼンの体内代謝生成物質であるパラ(p)・ベンゾキノンに注目し、p-ベンゾキノンを抽出したマウスのDNA(pNY200)およびヒトDNA(pMY189)に曝露し、DNAに対する変異原性を試験し、変異原性の種による相違について検討した。同じくベンゼンの代謝生成物質であるハイドロキノンを用いた変異原性試験を予備的に実施した。環境中に存在する微量汚染物質の内、変異原性を有しかつ内分泌撹乱性を有する物質(例えば、プラスチック可塑剤として多用されるDBPやDEHP)、ガソリンからの除去が進められているベンゼン(白血病誘発物質)の代謝生成物であるベンゾキノン等、数種類の物質を選択・特定し、培養ヒト細胞を用いてDNAレベルでの変異原性試験、細胞レベルでの曝露