hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遠隔転移腫瘍に対する腫瘍溶解ウイルスを用いた新規治療法の開発

遠隔転移した悪性腫瘍に対する治療法は限られており、新規治療法が模索されている。我々が分離した弱毒型単純ヘルペスウイルス1型HF10は多くの腫瘍細胞でよく増殖するが、増殖可能な腫瘍細胞だけでなく増殖不能な腫瘍細胞のマウスモデルにおいても腫瘍抑制効果を示すことから、腫瘍を選ばない治療薬としての可能性を期待できる。本研究では転移性腫瘍の新規治療法開発を目的として、マウス肺転移腫瘍モデルを作製し、HF10およびIL2搭載HSVアンプリコンの抗腫瘍効果を検討した。マウス皮下ー肺腫瘍モデルへの治療効果を検討するために,まず肺腫瘍モデルを作製したが個体差による生存期間の差が顕著であった。そこで肺へ自然転移するマウス乳がん細胞株4T1-lucを用い皮下腫瘍モデルを作製し、抗腫瘍効果を検討した。様々な条件で治療したところ両側皮下腫瘍モデルの右側のみをHF10の8回治療すると対側の腫瘍成長も抑制した。IL2アンプリコン治療群では有意な生存延長効果は認めなかった。またルシフェリンを投与し発光を検討することで、HF10治療により皮下腫瘍から肺への自然転移も抑制されることが示された。皮下から肺への自然転移が抑制されるメカニズムを解析するために、HF10を2日おきに4回右側の腫瘍内に接種しHF10治療による抗腫瘍免疫について検討した。治療後のマウスから脾臓を採取し、脾細胞と腫瘍細胞を24時間共培養し上清中に分泌されたサイトカインを検討した。HF10治療群の脾細胞から分泌されたサイトカンはmock治療群と比べ、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12の増多が認められた。いずれのサイトカインも抗CD4抗体により強く抑制され、CD4陽性T細胞の関与が示唆された。以上の結果より、HF10は乳癌治療における新たな治療選択肢となる可能性が示唆された。今後は局所免疫について組織学的検討を加える。本研究では、動物モデルを作成してHF10とIL2アンプリコン(IL2amp)によるマウス転移性腫瘍への治療効果を検討した。まず皮下ー肺腫瘍モデルを作成するために、尾静脈接種により肺腫瘍が作成されるかどうか検討した。マウス扁平上皮癌細胞株SCC-VII、マウス乳癌細胞株4T1-lucを静脈注射した。マウス大腸癌細胞株CT26を用いたモデルと同様に、一定期間を過ぎるとマウスの体重減少が観察された。るいそうが著明になった時に肺を観察したところ、肺表面に腫瘍の形成が認められた。しかし、個体差による生存期間の差が顕著であった。次にSCC-VII、4T1-lucをマウス背部両側に接種し、多発皮下腫瘍モデルを作成した。皮下腫瘍が5mmに達したところで片側のみ2日おき3回腫瘍内にHF10及びIL2ampを接種した。SCC-VIIを用いたモデルでは治療側、未治療側共に、有意な腫瘍の成長効果が認められたが、いずれの治療群でも35日以後に腫瘍の増大が認められ、生存日数を有意に延長することはできなかった。4T1-lucを用いたモデルではHF10群、IL2amp群と未治療群の間に有意な皮下腫瘍の抑制効果はみられなかった。そこで28日後に肺への転移を調べたところ、偽治療群では全匹に肺転移等を認めたが、HF群では半数に、IL2amp群では6匹中1匹に肺外腫瘍を認めただけで、HF10、IL2ampが4T1-lucの自然転移を抑制していることが示唆された。SCC-VII、4T1-lucをマウス尾静脈に接種したところ、肺腫瘍の形成を認めた。しかし腫瘍形成能、生存期間には個体差が認められたため、HF10、IL2amp接種による抗腫瘍効果、生存延長効果を検討することは困難と考えられた。次にSCC-VII、4T1-lucを用いた多発皮下腫瘍への抗腫瘍効果を検討した。SCC-VIIでは治療側、未治療側共に、有意な腫瘍の成長効果が認められたが、いずれの治療群でも治療後に腫瘍の増大が認められ、有意な生存延長効果は認められなかった。また、4T1-lucを用いたモデルではHF10群、IL2amp群とも偽治療群のと間に有意な皮下腫瘍の成長抑制効果はみられなかった。しかし、マウスの肺を調べたところ、偽治療群では全例肺腫瘍等の形成が認められ、HF10群、IL2amp群において肺転移巣の減少が観察された。また、その肺腫瘍抑制効果はIL2amp群で顕著であった。以上の結果より、4T1-luc皮下腫瘍モデルマウスで自然肺転移が誘発され、HF10、IL2amp接種により、4T1-lucの自然肺転移が著明に抑制された。その抑制効果は、IL2amp接種でさらに著明であることが示された。今後は皮下腫瘍ー自然肺転移モデルを作成し、HF10、IL2ampを腫瘍内注射することによる肺転移への腫瘍抑制効果、生存延長効果などを検討する予定である。マウス皮下ー肺腫瘍モデルへの治療効果を検討するために、昨年度は肺腫瘍モデルを作製した。肺腫瘍モデルは個体差による生存期間の差が顕著であったため、今年度は肺へ自然転移するマウス乳がん細胞株4T1-lucで多発皮下腫瘍モデルを作製し、抗腫瘍効果を検討した。

多発皮下腫瘍モデルを作製し、腫瘍が径5mmに達してから2日おき3回HF10あるいはIL2アンプリコン(IL2amp)を右側のみに腫瘍内接種したが、皮下腫瘍の抑制効果や生存日数の延長は認められなかった。次に片側皮下腫瘍モデルを作製し、HF10あるいはIL2ampを2日おき8回接種したところ、HF10治療群では腫瘍の成長は強く抑制され、生存日数の延長が認められた。一方IL2amp治療群では有意な生存延長効果は認められなかった。そこでもう一度両側皮下腫瘍モデルを作製し、右側腫瘍のみにHF10を8回接種したところ、接種側だけでなく対側でも腫瘍抑制効果が認められ、生存日数の延長も認められた。次に、4T1-luc由来のルシフェラーゼ活性を測定するため、両側皮下腫瘍モデルを作製し、HF10を右側にのみ8回接種した。15、25,35日目にD-luciferinを腹腔内接種し、発光強度を測定した。コントロール群では15日から両側腫瘍から発光を認め、経時的に強くなった。HF10治療群では15日では接種側では認められず、対側腫瘍でのみ弱い発光が観察された。HF10治療群は35日でもコントロール群に比べ接種側では非常に抑制されていた。35日で腹側からも撮影をおこなったところ、コントロール群では肺から発光が認められたが、HF10接種群では認められなかった。マウス皮下ー肺腫瘍モデルへの治療効果を検討するために、昨年度は肺腫瘍モデルを作製した。尾静脈へ様々な癌細胞を静注し血行転移性肺腫瘍モデルを作製したが、個体差による生存期間の差が顕著であった。そこで今年度は、接種後1ヶ月で肺へ自然転移するマウス乳がん細胞株4T1-lucを用いて多発皮下腫瘍モデルを作製し、HF10、IL2ampを一つの腫瘍に接種して抗腫瘍効果を検討した。多発皮下腫瘍に対して、HF10を2日おき、3回右側の腫瘍内のみに接種したが、HF10接種終了後に腫瘍の増大を認め、明らかな腫瘍抑制効果、生存延長効果を認めなかった。次にHF10を2日おき8回右側の腫瘍内にのみ接種したところ、HF10治療群では腫瘍の成長は強く抑制され、生存日数の延長が認められた。しかし、IL2amp治療群では有意な生存延長効果は認められなかった。皮下腫瘍のルシフェラーゼ活性を測定するため、15、25,35日目にD-luciferinを腹腔内接種し、発光強度を測定した。以上により、おおむね順調に進展していると考えられる。遠隔転移した悪性腫瘍に対する治療法は限られており、新規治療法が模索されている。我々が分離した弱毒型単純ヘルペスウイルス1型HF10は多くの腫瘍細胞でよく増殖するが、増殖可能な腫瘍細胞だけでなく増殖不能な腫瘍細胞のマウスモデルにおいても腫瘍抑制効果を示すことから、腫瘍を選ばない治療薬としての可能性を期待できる。本研究では転移性腫瘍の新規治療法開発を目的として、マウス肺転移腫瘍モデルを作製し、HF10およびIL2搭載HSVアンプリコンの抗腫瘍効果を検討した。マウス皮下ー肺腫瘍モデルへの治療効果を検討するために,まず肺腫瘍モデルを作製したが個体差による生存期間の差が顕著であった。そこで肺へ自然転移するマウス乳がん細胞株4T1-lucを用い皮下腫瘍モデルを作製し、抗腫瘍効果を検討した。
超新星SN1987AのX線放射と星の進化末期の質量放出

1987年に大マゼラン星雲で爆発した超新星SN1987AをX線天文衛星「あすか」によって観測し、X線を検出した。SN1987Aの周辺は、広がったX線放射を含め多くのX線源が分布しており、「あすか」の角分解能ではSN1987Aを単独で完全に分離することはできないが、香村、宇野らがSN1993Jの解析のために開発したアルゴリズムを用いて、超新星の強度/スペクトルを評価した。1995年4月、11月、および1996年11月の超新星のX線光度は、10^34erg/秒程度で、これまでの「あすか」の解析から得られた統計誤差、系統誤差の範囲では、この間の有意な強度変化はない。X線の起源については、(1)超新星爆発の際中心に形成されたと考えられている中性子星からのパルサー放射、(2)数万km/秒の高速で膨張しつつある超新星の放出物質が、爆発前の星の質量放出によって形成された星周物質に衝突して生じる熱的放射などの可能性が考えられる。観測されたX線のスペクトルが比較的軟らかいことから、X線が中心に形成された中性子星からの放射である可能性は低い。また、パルサーの放射であれば、X線の時間変動に周期性が期待されるが、時間変動の解析の結果、周期性は検出されていない。以上のことから、X線は超新星放出物質と星周物質の相互作用によって生じていると考えられる。ROSAT衛星の観測結果からは、1991年の検出以来、一定の割合での増光が観察されており、星周物質の分布は一様であるとして矛盾ない。政井、野本の示した、均一な媒質中を膨張する超新星残骸からのX線放射に対する解析的な強度予測との比較から、星周物質の密度は30amu/cm3程度であると推定される。さらに、超新星放出物質がこのような星周物質で減速を受けつつあるとすると、ハッブル宇宙望遠鏡などによって観察された、超新星をとりまくリングに達するのは爆発から15年後程度の時期と推定される。
ニジマスの性決定遺伝子の単離及び解析

哺乳類の性決定遺伝子と考えられるSRY(Sex detremining Rigoion of Y)の転写産物は、HMGboxと呼ばれるDNA結合領域を保持しており、転写調節因子として機能していると考えられる。本研究では魚類の性決定、性分化の機構解明を目的として、ニジマスの精巣よりSRY様遺伝子(SOX-LZ)を単離し解析を行うとともに、卵巣あるいは脳下垂体より新奇のSRY様遺伝子の単離を行った。1.ニジマスSOX-LZ(1)構造解析:ニジマス精巣のcDNAライブラリーより得られたSOX-LZ遺伝子は、その構造解析より767アミノ酸をコードする読み取り枠(ORF)を有し、ヒトSRYタンパク質のHMGboxと約60%相同性のあるDNA結合領域、2量体形成に関与するロイシンジッパー(LZ)領域およびグルタミンに富む領域の3つのモチーフを特徴としている。また、これをプローブとしてマウスSOX-LZを単離し構造比較を行ったところ、アミノ酸配列全体に渡って相同性(77%)が認められた。また上述の3つのモチーフにおいてはさらに高い相同性(各90%以上)が認められ、進化的に保存された機能モチーフであることが示唆された。(2)mRNA発現特異性:各組織のノーザンブロット解析より、ニジマスSOX-LZは、精巣に特異的に発現が認められ、その中でも、後期精子成熟過程の精巣に強い発現が検出された。(3)転写調節因子としての機能解析:HMGbox領域において、ゲルシフトアッセイによる塩基配列特異的DNA結合活性能、CAT遺伝子をレポーターに用いたトランスフェクションアッセイによる転写活性能、の保持を検出した。またロイシンジッパー領域において、2量体形成能を確認した。以上に結果より、ニジマスSOX-LZは、後期精子形成過程においてロイシンジッパーを介した調節を受け、標的遺伝子の発現を促進あるいは抑制する因子として機能していると考えられる。2.新奇SRY様遺伝子の単離および構造解析ニジマス卵巣より3種類、脳下垂体より1種類の新奇SRY様cDNAクローンを単離し、構造決定を行った。さらにノーザンブロット解析を行った結果、いずれのクローンも未成熟卵巣あるいは未成熟脳下垂体で強い発現が認められた。転写調節因子としての機能解析および性分化との関連を詳細に調べることが今後の課題である。我々は、哺乳類SRY遺伝子のDNA結合領域(SRYボックス)のコンセンサスなアミノ酸配列に基づいたPCRにより、未成熟ニジマス精巣cDNAから哺乳類のSRYボックスとアミノ酸配列レベルで約60%の相同性を有するcDNA断片を得た。更に、RACE-PCR法により、SRYボックスから3′末端までの700塩基対のcDNA断片を得た。このDNAをプローブとして未成熟ニジマスの精巣、卵巣、肝臓、心臓のノーザンハイブリダイゼーションを行うと、全ての組織で約10キロ塩基のRNAが検出されるが、精巣では他に、約3キロ塩基のRNAが検出される。

本年度は主に、この精巣特異的な3キロ塩基のRNAのクローニングを行ってきたが、精巣ポリA-RNAをショ糖密度勾配遠心で分画し、3キロ塩基のSRY-RNAに富む分画から作製したcDNAライブラリーをスクリーニングした結果、約3キロ塩基対のcDNA断片をもつクローンを複数個単離することが出来た。塩基配列の解析から3キロ塩基のSRY-RNAは約900アミノ酸をコードしうる読み枠を有しており、SRYボックスのほかに、転写因子Sp1などに見られるようなグルタミンに富む領域をもつタンパク質をコードしていることがわかった。最近になり、PCRを用いた解析から、SRYの他にも、SRY様HMGboxを有する遺伝子の存在が明らかになった。現在では、これら一群の遺伝子はSOX遺伝子と総称されている。我々の解析中の遺伝子もSOX遺伝子群に属するもので、SRY様HMGboxに加えて、ロイシン・ジッパー・モチーフを有するので、以降SOX-LZ遺伝子と呼ぶ。(1)ニジマスの10キロ塩基のSOX-LZmRNAのcDNAクローニングニジマスSOX-LZ遺伝子からは、精巣の成熟過程の後期に検出される精巣特異的な約3キロ塩基のmRNAと、その数十分の一の量の殆どの組織で観察される約10キロ塩基のmRNAの2種が発現している。両者の機能的差異を明らかにしていくため、今年度は10キロ塩基のSOX-LZmRNAのcDNAクローンの単離を行った。10キロ塩基のSOX-LZmRNAだけを発現している肝臓のポリA-RNA150mugをショ糖密度勾配遠心で分画、各分画についてブロット・ハイブリダイゼーションを行い、SOX-LZmRNAを含む分画だけを用いてcDNAライブラリーを作製した。3キロ塩基のSOX-LZmRNAのcDNAをプローブとしてライブラリーのスクリーニングを行った結果、約9キロ塩基のcDNAを有するクローンを2つ得た。制限酵素地図の比較から、10キロ塩基のSOX-LZmRNAは概略、3キロ塩基のmRNAの3′末端側にさらに約6キロ塩基の配列が付加した構造をしていると予想された。平成6年度には、これら10キロ塩基のSOX-LZmRNAのcDNAクローンの塩基配列を決定し、2種のSOX-LZmRNAの構造を詳細に比較したいと考えている。(2)ニジマスSOX-LZに対する抗体の作製の試み大腸菌発現ベクターpETにニジマスSOX-LZのコーディング領域の全体あるいは一部を挿入し、His-Tagとの融合タンパク質としてSOX-LZを大腸菌で発現させた。ニッケル・レジンを用いて精製したSOX-LZ融合タンパク質でウサギを免疫し、抗原として使用したSOX-LZ融合タンパク質と強く反応する抗血清を得た。しかしながら、どの抗血清も特異性は低く、ニジマス精巣核タンパク質とも複数種のタンパク質と反応した。免疫染色や免疫沈降のためには、特異性の高い抗体が必要なので、今後SOX-LZのC末端部分のペプチドを用いて抗体を作製する予定である。魚類の性決定、性分化の機構解明を目的として、哺乳類の性決定遺伝子と考えられるSRYと相同性の高い遺伝子をニジマスより単離し、解析を行った。本年度は、前年度報告したニジマス精巣で特異的に発現するSRY様遺伝子であるSOX-LZの機能解析、およびニジマスの卵巣あるいは脳下垂体で発現する新たなSRY様遺伝子の単離と構造解析を行った。
独自開発したオートファゴソーム単離法を用いたオートファゴソーム膜の脂質成分解析

オートファジーは細胞内大規模分解システムである。その駆動オルガネラであるオートファゴソーム膜の脂質成分解析の報告はこれまで全くない。そこで、我々が開発したビーズを用いたオートファゴソーム単離法を用いて、脂質成分解析を実施すべく研究を開始した。我々は本方法でプロテオミクス解析を行い、いくつか興味深い分子を発見している。その方法を改良し、より多くのビーズ(オートファゴソーム)を回収可能な条件を見出すことに成功した。その条件で回収したビーズから脂質を抽出し、質量分析にて解析したが、脂質のピークは検出限界以下だった。今後はさらに改良し、脂質が検出できる条件を見出し脂質成分解析を実施する予定である。細胞内大規模分解システムであるオートファジーは、飢餓やストレスに対する機構だけでなく、近年の研究により多くの疾患発症に関わることが知られている。オートファジーを駆動するオルガネラであるオートファゴソームは、そのタンパク質成分に関しては多くの知見があるものの、主な膜成分である脂質においては全く理解されていない。そこで本研究計画では、我々が独自に開発したオートファゴソーム単離法を用いて、網羅的な脂質成分解析を行うことを目的としている。当該年度においては、まず条件検討を主に実施した。我々の単離法は遺伝子導入試薬をまぶしたラテックスビーズを細胞に取り込ませ、そのビーズを回収する極めて単純な方法である。これまではMEF細胞を用いていたが、取り込み効率が良いHeLa細胞にシフトすることにした。MEF細胞ではすでにオートファジー不全のノックアウト細胞があるが、新しいゲノム編集ツールであるCRISPR/Cas9システムを用いてHeLa細胞でもノックアウトが可能になった。そのシステムで幾つかのオートファジー遺伝子が欠損したHeLa細胞を作製することに成功した。さらに、ビーズの量や精製方法も検討した結果、現在ではオートファゴソームを最大限取得できる条件を見出している。最終年度には、これらの条件により実際にオートファゴソームを大量に精製し、リピドミクスを行う予定である。細胞大規模分解システムであるオートファジーは、飢餓ストレスに対しる機構だけでなく、近年の急速の研究進展により多くの疾患発症に関わることが知られている。オートファジーを駆動するオルガネラであるオートファゴソームは、そのタンパク質成分に関しては多くのち県があるものの、主な膜成分である脂質においてはこれまで全く理解されていない。そこで、本研究計画では、我々が独自に開発したオートファゴソーム単離法を用いて、網羅的に脂質成分を解析することを目的としている。昨年度は、オートファゴソーム単離に適する条件検討を主に実施した。結果として、1)取り込み効率のより細胞の同定(HeLa細胞)、2)適切なビーズの量やインキュベーション時間の同定、3)最大限の収量が得られるビーズの精製方法の確立、に成功した。最終年度は、実際に単離したビーズから脂質成分を抽出し、脂質研究のスペシャリストである東京大学の新井洋由教授、理研の有田誠教授との共同研究のもと、質量分析にて脂質の同定を試みた。しかしながら、単離したビーズからはほとんど脂質のピークは観察されなかった。同様な方法で単離したサンプルでは、オートファジー関連タンパク質がWestern blotにて確認できているので、単離はされていると考えられる。共同研究の先生方と試行錯誤し、様々な方法で脂質成分解析を行ったが、結果は同様ネガティブであった。原因としてははっきりとはわからないが、恐らく本方法でビーズを単離する際、タンパク質は残存するものの、脂質成分は何かしらの要因で剥がれてしまっているのではないか、と思われる。今後の課題としては、脂質がビーズに残存する条件を見出すことである。研究計画に書かれている条件検討は完了しており、後は実際にリピドミクスを行うだけである。分子細胞生物学ラテックスビーズの取り込み効率の良いHeLa細胞を用いて、1サンプルあたり10cmディッシュ5枚の細胞からサンプルを回収する。コントロールとして、オートファジー不全の細胞などを用いる。スクロース密度勾配法により、ビーズを精製し、脂質抽出を実施する。その後、共同研究先である東京大学大学院薬学系研究科の新井洋由研究室並びに理化学研究所の有田誠研究室に送付し、質量分析器を駆使してリピドミクスを実施する。
海馬と大脳皮質における相補的な学習システムのモデル化に関する研究

本研究では,生理学,解剖学,神経心理学などの知見に基づき,海馬と大脳皮質を含む神経回路網のモデル化を行い,両者における相補的な学習の仕組みについて,その可能性を計算機シミュレーションによって調査した.その結果,海馬の構造自体が類似したパターンの類似度を下げ,記憶の形成を容易にする働きがあること,海馬における神経新生がそれをさらに顕著にすること,海馬のカオス想起が大脳皮質における破局的忘却を抑制することなどを明らかにした.脳における宣言的記憶の形成では,海馬が一時的な記憶の貯蔵庫,大脳皮質が最終的な記憶の貯蔵庫として機能していると考えられている.本研究では,生理学,解剖学,神経心理学などの知見に基づき,海馬と大脳皮質を含む神経回路網のモデル化を行い,両者における相補的な学習の仕組みを主に計算機シミュレーションによって明らかにすることを目的としている.海馬のモデル化にあたっては,近年になって発見された,海馬歯状回における顆粒細胞の発生・死滅現象に関する知見を採り入れ,この現象が海馬の機能にどのような役割を果たしているのかを明らかにする.一方,これまでの生理学並びに神経心理学的な研究から,海馬と大脳皮質において相補的な学習が行われているとする理論(CLS : Complementary Learning Systems理論)が提唱されている.CLS理論では,一時的な記憶の貯蔵庫である海馬が大脳皮質の神経回路網に対して教師として働き,長期記憶と構造的な知識の形成に関与していると示唆しているが,その具体的なメカニズムはまだ解明されていない.本研究では,生理学,解剖学,神経心理学などの知見に基づき,海馬と大脳皮質を含む神経回路網のモデル化を行い,両者における相補的な学習の仕組みについて,その可能性を計算機シミュレーションによって調査した.その結果,海馬の構造自体が類似したパターンの類似度を下げ,記憶の形成を容易にする働きがあること,海馬における神経新生がそれをさらに顕著にすること,海馬のカオス想起が大脳皮質における破局的忘却を抑制することなどを明らかにした.脳における宣言的記憶の形成では,海馬が一時的な記憶の貯蔵庫,大脳皮質が最終的な記憶の貯蔵庫として機能していると考えられている。本研究では,生理学,解剖学,神経心理学などの知見に基づき,海馬と大脳皮質を含む神経回路網のモデル化を行い,両者における相補的な学習の仕組みを主に計算機シミュレーションによって明らかにすることを目的としている。本年度の研究では,まず,詳細な研究が多く行われているげっ歯目を中心に,海馬全般並びに歯状回の神経細胞の発生・死滅現象に関する生物学的研究の調査を行った。また,ここで得られた知見を元に,2種類の海馬プロトタイプモデルの構築を行った。構築したモデルの1つには,歯状回における神経新生の知見を採り入れ,神経新生が記憶の形成に果たす役割の調査を行った。その結果,神経細胞の入れ替わりによって,通常では学習困難な類似した記憶の形成が容易になること,少ない学習回数で記憶の形成が可能になること,追加学習性能が向上することなどが明らかになった。一方,最新の解剖学・生理学的知見により,海馬CA3における回帰側枝の投射範囲がニューロンの存在位置によって変化していること,並びに,生体の神経回路網の学習則であるスパイクタイミング依存性シナプス可塑性が樹状突起上の位置によって対称・非対称という2つのプロフィールに変化することが明らかになっている。もう一方のモデルではこうした知見を採り入れ,計算機シミュレーションを行った結果,これらが,部分的に重複する複数のエピソードを記憶する際に問題となる曖昧性の解消に寄与している可能性があることを示すことができた。脳における宣言的記憶の形成では,海馬が一時的な記憶の貯蔵庫,大脳皮質が最終的な記憶の貯蔵庫として機能していると考えられている.本研究では,生理学,解剖学,神経心理学などの知見に基づき,海馬と大脳皮質を含む神経回路網のモデル化を行い,両者における相補的な学習の仕組みを主に計算機シミュレーションによって明らかにすることを目的としている.本年度の研究では,まず,宣言的記憶の形成に関する海馬の関与について,神経心理学的知見の調査を行った.また,歯状回における神経新生を取り入れた海馬モデルの特性について,昨年度に引き続き,より詳細な調査を行い,海馬構造自体が類似したパターンの類似度を下げる働きがあること,また,神経新生がそれをさらに顕著にする役割を持つことなどを明らかにした.そして,ここで得られた知見を元に,海馬をヒントにした新しい連想記憶モデルの構築を行った.

従来の連想記憶でモデルでは,新規な情報を逐次的に追加学習しつつ,大記憶容量を実現することは極めて困難であったが,本モデルでは,海馬を模倣した構造と神経細胞置換の導入により,追加学習と記憶容量の確保の両立を改善することができた,一方,海馬の中でも特に重要な役割を果たしていると考えられているCA3については,生理学・解剖学的知見に基づいたモデルを構築し,海馬CA3が空間選択性を持つ領域と時間選択性を持つ領域に分離でき,これらが複数のエピソード記憶の曖昧性の解消に寄与していること示唆する結果を得ている.今年度の研究では,ラットの記憶実験によく用いられるT字迷路課題を想定した時系列を用いて,これら2つの選択性の相互作用が時系列の曖昧性の解消に有効であるをことを計算機シミュレーションにより検証した.脳における宣言的記憶の形成では,海馬が一時的な記憶の貯蔵庫,大脳皮質が最終的な記憶の貯蔵庫として機能していると考えられている.本研究では,生理学,解剖学,神経心理学などの知見に基づき,海馬と大脳皮質を含む神経回路網のモデル化を行い,両者における相補的な学習の仕組みを主に計算機シミュレーションによって明らかにすることを目的としている.これまでの研究では主に海馬モデルの構築を行ってきたが,今年度の研究では,海馬と大脳皮質を含む神経回路網のモデル化を行い,海馬と大脳皮質における相補的な学習の仕組みを計算機シミュレーションによって調査した.構築したモデルは,構造と学習方法の異なる2つのネットワークからなり,それぞれ海馬と大脳皮質に相当する.前者に相当するネットワークには,海馬で主要な役割を果たしていると考えられるCA3と同様に再帰的な結合を有する,相互結合型の連想記憶モデルを採用した.このモデルに忘却付きのヘッブ学習を導入することにより,海馬で行われていると考えられる,高速かつ逐次的な学習が可能となり,また,短期的な記憶として機能することがわかった.一方,後者のネットワークは,誤差逆伝播法で学習される階層型ニューラルネットワークとした.これにより,学習に時間はかかるが長期記憶を実現するための大記憶容量が実現可能となった.さらに,海馬から大脳皮質への記憶の転写においては,連想記憶モデルにカオスニューロンを導入することにより,海馬に蓄えられた記憶の抽出を可能とした.また,これを階層型ニューラルネットワークから生成された擬似パターン群とともに,改めて階層型ニューラルネットワークに学習させることで,破局的忘却を抑制しつつ長期記憶を形成できることを明らかにした.脳における宣言的記憶の形成では,海馬が一時的な記憶の貯蔵庫,大脳皮質が最終的な記憶の貯蔵庫として機能していると考えられている.本研究では,生理学,解剖学,神経心理学などの知見に基づき,海馬と大脳皮質を含む神経回路網のモデル化を行い,両者における相補的な学習の仕組みを主に計算機シミュレーションによって明らかにすることを目的としている.今年度の研究では,まず,先に構築した海馬と大脳皮質を含む神経回路網モデルの特性を計算機シミュレーションにより調査した.大脳皮質に相当するネットワークでは,新規な学習データを追加学習によって長期記憶として保存する必要がある.このとき,すでに蓄えられている学習データの破局的忘却を抑制しなければならない.従来の研究では,大脳皮質に相当するネットワークで擬似パターン群を形成し,新規な学習データとともに学習させることでこの問題に対処していた.本研究では,これらに加え,海馬ネットワークからカオス想起によって抽出されたパターンに基づく擬似パターン群も併せて用いることで,より効果的に破局的忘却を防げることを明らかにした.また,今年度の研究では,海馬の解剖学的な知見に基づき,従来の1層のみからなる単純な海馬モデルを,嗅内野,歯状回,CA3からなる多層構造のネットワークに拡張した.さらに,歯状回で発見されている顆粒細胞の発生・死滅現象に関する生理学的知見をモデルに採り入れた.計算機シミュレーションの結果,この新しい海馬モデルにより,これまでの海馬モデルでは学習が困難であった非常に類似度の高いパターンの学習が可能になるとともに,記憶容量が大幅に改善されることが明らかになっている.
抵抗性タンパク質の活性化機構と立体構造の解明

抵抗性(R)タンパク質は、重要な細胞内免疫レセプターであるにも関わらず、全長のRタンパク質を精製が困難なことから、シグナル伝達機構や活性化機構はほとんど明らかになっていない。我々はイネ由来のRタンパク質Pitがいもち病菌に対する抵抗性を誘導する重要な因子として機能していることを明らかにしていが、その分子機構は不明だった。本研究で、Rタンパク質の精製系を確立して生化学解析を行い、Pitの活性化機構の解明を試みた。その結果、PitのATP・ADPの結合の違いがPitの分子内相互作用に影響を与えることを明らかにした。さらに、PitのCCドメインが溶液中で多量体を形成していることも見出した。多くの抵抗性遺伝子は、nucleotide binding site-leucinerich repeat (NB-LRR)型のタンパク質をコードしており、細胞内型レセプターであることが明らかになった。動物のNB-LRR型タンパク質も免疫に関与する細胞内レセプターとして働くことが知られている。動物のNB-LRR型タンパク質Apaf-1では、活性化は各ドメインの分子内結合、リガンド認識後のNBドメインに結合したヌクレオチドの交換反応、分子間結合の3つの要素によって決定される。しかしながら、植物のNB-LRR型の抵抗性タンパク質の活性化と、各ドメインの分子内/間結合やNBドメインのヌクレオチドの状態との関連はほとんど解析されていない。さらに、全長の抵抗性タンパク質の立体構造解析の報告は1つもない。抵抗性タンパク質は、植物において最強の免疫応答を誘導する重要な細胞内免疫レセプターであるにも関わらず、全長の抵抗性タンパク質を精製することが困難なことから、シグナル伝達機構や活性化機構はほとんど明らかになっていない。申請者らは、イネいもち病菌の抵抗性タンパク質PitのリガンドAvrPitと下流のシグナル分子OsSpike1を同定している。本研究では、抵抗性タンパク質Pitの精製系を確立し、生化学解析と立体構造解析を駆使して、Pitの活性化機構を明らかにする。さらに、得られた知見を利用して、PitのリガンドAvrPit認識後の活性化から、下流分子OsSpike1活性化に至るメカニズムの全過程を明らかにすることを目的とする。多くの抵抗性遺伝子は、nucleotide binding site-leucinerich repeat (NB-LRR)型のタンパク質をコートしており、細胞内型レセプターであることが明らかになった。動物のNB-LRR型タンパク質Apaf-1では、活性化は各ドメインの分子内結合、リガント認識後のNBドメインに結合したヌクレオチドの交換反応、分子間結合の3つの要素によって決定される。申請者らは、イネいもち病菌の抵抗性タンパク質PitのリガンドAvrPitと下流のシクグナル分子OsSpike1を同定している。本年度は、抵抗性タンパク質Pit-1とその相互作用分子Pit-2の解析を通し、Pit-1, Pit-2による免疫制御機構を理解することを試みた。免疫沈降実験から、Pit-1がホモダイマーを形成すること、Pit-1とPit-2がヘテロダイマーを形成することを確認した。この結果から、植物細胞内でPit-1とPit-2はヘテロダイマーを形成し、ペア抵抗性タンパク質として働く可能性があると推測された。Pit-1とPit-2は異なる機能を持っており、Pit-1は免疫を誘導するが、Pit-2はPit-1の免疫を抑制する。Pit-1とPit-2の高い相同性を利用して、Pit-1とPit-2の機能の違いを生むアミノ酸残基の同定をドメインスワッピングを用いて試みた。その結果、スイッチドメインであると考えられているNB-ARCドメインのL301がPit-1による細胞死誘導に重要であることを同定した。以上のように新規の知見か&#12441;得られており、おおむね順調に進展している。

さらに、PitのCCドメインが溶液中で多量体を形成していることも見出した。本年度は、抵抗性タンパク質Pit-1とその相互作用分子Pit-2の解析を通し、Pit-1, Pit-2による免疫制御機構を理解することを試みた。本研究で、生化学的な解析とYeast-two-Hybrid解析から、Pit-1がホモダイマーを形成すること、Pit-1とPit-2がヘテロダイマーを形成することを確認した。また、イネプロトプラストでの蛍光タンパク質で標識したPit-2の一過的発現、Agroinfirtration法を用いたN.benthamianaでの一過的発現Immunoblottingにより、Pit-2はPit-1と比較して細胞内での安定性が低い可能性が示唆された。更に、Pit-1はPit-2と共発現させることで検出されるタンパク質が増加し、Pit-2がPit-1の安定性に寄与することが示唆された。また、Pit-1によって誘導される細胞死における各種Pit-2変異体の効果を検討したところ、スイッチドメインと考えられているNB-ARCドメインのMHDモチーフに変異を加えたPit-2変異体が、特異的に活性型Pit-1による細胞死誘導を抑制することを見出した。以上の結果から、Pit-1とPit-2は細胞内でヘテロダイマーを形成し、互いにタンパク質の安定性や活性を調節してペア抵抗性タンパク質として働く可能性があると推測された。以上のように新規の知見が得られており、おおむね順調に進展している。本研究では、生化学解析と立体構造解析を駆使して、現在まで不明である抵抗性タンパク質Pitのリガンド認識後の活性化から、下流分子OsSpike1活性化までの全過程を明らかにすることを目的とする。具体的には、抵抗性タンパク質Pitの全長タンパク質の精製系を立ち上げて[研究計画1]、Pitの不活性化型と活性化型のヌクレオチドの状態[研究計画2]、分子内結合と分子間相互作用を明らかにする[研究計画3].次に、抵抗性タンパク質がリガンドを認識した際に、不活性化状態から活性化状態にどのように遷移するかを明らかにする[研究計画4]。立体構造解析では、1)抵抗性タンパク質Pitの立体構造、2)PitのリガンドであるAvrPitとPitの複合体の立体構造、3)OsRac1の活性化分子でありPitの下流のシグナル分子てでもあるOsSpike1とPitの複合体の立体構造の順に明らかにする[研究計画5]。植物生物学本研究では、生化学解析と立体構造解析を駆使して、現在まで不明である抵抗性タンパク質Pitのリガンド認識後の活性化から、下流分子OsSpike1活性化までの全過程を明らかにすることを目的とする。具体的には、抵抗性タンパク質Pitの全長タンパク質の精製系を立ち上げて[研究計画1]、Pitの不活性化型と活性化型のヌクレオチドの状態[研究計画2]、分子内結合と分子間相互作用を明らかにする[研究計画3].
環境水中のレジオネラ属菌の生育環境調査と新しい分類方法の確立

河川水中のレジオネラ属菌の調査を行なった結果、リン酸イオンが検出されない地点では、レジオネラ属菌は測定されなかった。河川水中のレジオネラ属菌生育を防ぐにはリン酸イオンの制御が効果的であることが考えられる。生存率(培養法/RT-PCR法×10)は、0.10.5%であった。簡便で特異性が高い新しい分類法であるDNA解離波形解析法(Genopattern法)について検討を行った。Legionella pneumophilaの既同定株15株について、DNA解離波形パターンを測定しマスターデータを作成し、環境分離株の同定を試みた。本研究の目的は、河川水においてレジオネラ属菌が生育しない水質条件を明らかにすること、操作が簡単で特異性の高いレジオネラ属菌の新しい分類法を確立することの2点である。河川水の水質とレジオネラ属菌の生育の有無との関係を明らかにすることと、分類・同定により菌種の分布を明らかにすることは、感染予防や、感染経路を推定するための基礎的かつ重要な知見となる。山梨県内の河川や池の水、修景用水のレジオネラ属菌と水質の調査を行った結果、以下の点が明らかとなった。59調査地点中9地点で、レジオネラ属菌が検出された。レジオネラ属菌が検出された地点のBOD値は3mg/L以下で、生活環境に係る環境基準では、B類型以下に相当し、比較的きれいであった。レジオネラ菌が検出された地点のリン酸イオン濃度は0.0190.11mg/Lであった。リン酸イオンが検出されない地点では、レジオネラ属菌も検出されなかった。第一鉄イオンは、どの地点でも検出された。レジオネラの生育に必須とされる第一鉄イオン濃度が0.01mg/L以上あれば、レジオネラが生育する可能性がある。測定自体が簡便で迅速、かつ、特異性が高い新しい分類法である、DNA解離波形解析法(Genopattern法)について検討を行った。Legionella pneumophilaの既同定株19株について、それぞれのDNA解離波形パターンを測定しマスターデータを作成した。波形の有効性については、現在検討中である。山梨県内河川において、62地点のべ95回の採水を行い、レジオネラ属菌と水質の調査を行った結果、以下の点が明らかとなった。62調査地点中14地点で、レジオネラ属菌が検出され、検出率は20%であった。レジオネラ菌が検出された地点のリン酸イオン濃度は0.020.27mg/Lであった。レジオネラ属菌が検出された地点の第一鉄イオン濃度は、0.010.31mg/lであった。第一鉄イオン濃度が0mg/lの地点はなかった。第一鉄イオンはレジオネラ属菌の生育に不可欠な物質とされるが、第一鉄イオンはどの地点においてもレジオネラ属菌の生育に必要な量は足りており、他の条件が満たされれば河川水中にレジオネラ属菌が生育してくる可能性が考えられる。測定自体が簡便で迅速かつ特異性が高い、新しい分類法であるDNA解離波形解析法(Genopattern法)について検討を行った。DNA上の複数ヶ所出現する塩基配列と結合するように設計されたプライマーを用いて、Legionella pneumophilaの血清群1から15の既同定株19株について、それぞれのDNA解離波形パターンを測定しマスターデータを作成した。その結果、波形での分類に有効なプライマーが確認された。各プライマーのGC含量やHit数(レジオネラ属菌DNA上の連続した7つ以上の塩基配列がプライマー配列の中に何回あるかを示した数)と波形パターンの違いには、明らかな関係は見出せなかった。山梨県内河川において20回の採水を行い、レジオネラ属菌と水質の調査を行ない、一般的な水質項目の測定とレジオネラ属菌の検出を試みた。また、レジオネラ属菌については、培養法とリアルタイムPCR法(以下、RT-PCR法)による測定値の比較を行った。

培養法でレジオネラ属菌が検出された地点では、48CFU/100mLであったのに対し、RT-PCR法で測定した値は7.6×10^23.1×10^3 CFU/100mLと、培養法での菌数より高く、生存率(培養法でのCFU/RT-PCR法でのCFU×100)は、0.10.5%であった。レジオネラ属菌が検出されなかった地点でも、RT-PCR法では4.4×10^22.7×10^3CFU/100mLのレジオネラ属菌が検出された。RT-PCR法では、測定された菌の生死は判別できないため、培地上で生育できないレジオネラ属菌が含まれている可能性も考えられる。一方、生菌数の測定には最低でも1週間を要するが、RT-PCR法では1日で測定結果が得られるものの、生菌が検出された試料での生存率は0.10.5%であり、RT-PCR法での測定結果のみを用いると、過大評価になる恐れがあるものと考えられる。レジオネラ属菌の既同定株19株のDNA解離波形解析法(Genopattern法)によるDNA解離波形パターンを測定後、マスターデータとした。浴槽水などから分離されたレジオネラ属菌株について本法による同定を試みた。その結果Y4株、Y5株はATCC33155(血清群3)である可能性が高いことが分かった。今後の改善点としては、プライマーの改良を試みるとともに、複数のプライマーを用いてクロスチェックを行なうことによりさらに信頼性の高い結果が得られるものと考えられる。
植物の表皮における細胞極性の制御機構の研究

高等植物の発生や成長において、さまざまな機能性蛋白質が細胞膜上で偏って分布し、重要な働きを担っている。クチクラの形成に関わるPEL1蛋白質は細胞膜上で外側の面に偏って局在しているが、その非対称局在に関わる制御因子は同定されていない。本研究ではPEL1蛋白質の局在制御に関わるメカニズムに関する知見を得ることを目標とし、PEL1-GFP融合蛋白質を発現するシロイヌナズナを変異原処理し、変異体のスクリーニングを行った。その結果、クチクラの形成に異常を示し、かつPEL1-GFPの分布が野生型と異なる変異体を単離した。今後、得られた変異体を解析することで新規の制御因子が見つかると期待される。植物の地上部の表皮はクチクラと呼ばれる保護物質に覆われている。クチクラは表皮細胞の外界面の側に形成されるため、その形成には表皮細胞の極性が関与している可能性があるが、表皮の極性を決める分子機構や、極性に従って外界面に物質を配置するための仕組みは不明である。本研究では、表皮細胞の外界面の細胞膜に局在するPEL1などの蛋白質に着目し、それらのタンパク質の局在制御メカニズムに関する知見を得ることを目標としている。本年度はエチルメタンスルホン酸で変異原処理をしたPEL1-GFP系統について、約1000個体のM1植物に由来するM2系統を整備した。それぞれの系統について、表皮の異常をTB染色法に検査し、クチクラ形成に異常を引き起こす変異を持つ変異系統の候補を選抜した。今後、これらの系統について、PEL1-GFPの発現や局在の様式を解析することで、表皮の分化や極性に異常を示す変異体が見つかると期待される。また、表皮で優先的に発現する可能性がある輸送関連遺伝子に着目し、5つの候補遺伝子についてYFP融合コンストラクトを作成した。今後、それらのコンストラクト用いて形質転換植物を作出し、YFP融合蛋白質の細胞内局在様式の解析などを行う予定である。植物の発生や成長には、細胞においてさまざまな機能性蛋白質が適切な場所に分布することが重要である。近年の研究により、細胞膜において偏って分布するトランスポーターなどのタンパク質が同定されており、一部のものについては非対称局在がその機能に重要であることが実験的に確認されている。クチクラの形成に関わるPEL1などの蛋白質は、地上部の表皮細胞の細胞膜上で外界側の面に偏って局在していることから、細胞極性に従って分布が制御されていると考えられる。しかし、この非対称局在に関わる位置情報や輸送因子は特定されていない。本研究ではこれらの蛋白質の局在制御に関わるメカニズムに関する知見を得ることを目的として、研究を行った。これまでに、PEL1-GFP融合蛋白質を発現するシロイヌナズナの系統について、エチルメタンスルホン酸により変異原処理を行い、約1000個体のM1個体由来のM2系統を作成した。この系統より、クチクラの形成あるいは機能に異常を示す変異体の候補を、水溶性色素を用いた検定法(トルイジンブルー法)により選抜した。本年度は、それらの系統のうちの92系統について、PEL1-GFPの局在を観察し、局在に異常を示す個体が分離する系統を同定した。今後、後代でも再現的に同様な異常を示す個体が出現するかを確認し、遺伝様式を確認することで、PEL1の局在制御因子に変異を持つ変異系統が見つかると期待される。また、変異型ARF1を発現させることにより、細胞内の膜輸送に強い異常を示す系統を作成した。今後、この系統を用いてPEL1やクチクラの配置の解析をすすめることで、細胞極性を支える分子メカニズムの理解が深まると期待される。近年、高等植物の発生や成長にとって種々の機能性蛋白質の非対称局在が重要であることが明らかになりつつある。それらの蛋白質を細胞の内外の異なる位置に配置するためには、位置情報、蛋白質の選別、輸送または繋留などのメカニズムが必要であると想像される。植物ホルモン・オーキシンの排出に関わるPIN蛋白質は細胞膜の頂端側や基部側のどちらかに偏って局在する傾向があり、その非対称局在にはエンドサイトーシスとリサイクリングが関与する。近年の研究により、PIN蛋白質の局在制御に関わる因子の実体は徐々に明らかになりつつある。一方、細胞の外側や内側に偏って局在するトランスポーターも同定されて来ている。クチクラの形成に関わるPEL1やACR4などの蛋白質は細胞膜上で外側の面や内側の面に偏って局在していることから、PIN蛋白質の非対称性とは異なるメカニズムで非対称局在が制御されていると考えられる。しかし、これらの蛋白質の非対称局在に関わる位置情報や輸送因子は特定されていない。本研究ではこれらの蛋白質の局在制御に関わるメカニズムに関する知見を得ることを目標とする。

本年度はPEL1-GFP融合蛋白質を発現するシロイヌナズナ個体において、GFPシグナルが非対称に局在することを確認した。さらに、PEL1-GFP系統の種子をエチルメタンスルホン酸により変異原処理し、PEL1の局在に異常を示す変異体を探索するための準備を進めた。遺伝学的解析を補完するアプローチとして、変異体スクリーニングの準備と平行してクチクラ形成に阻害的効果を示す薬剤のスクリーニングを進めた。PEL1に対する抗体を作成し、一部の組織では非対称局在が観察されるという予備的な知見を得た。変異体のスクリーニングについて、一次スクリーニングを完了した。計画していた変異体スクリーニングの準備と抗体作成の一部を達成できた。PEL1-GFPをEMSで変異原処理し、クチクラに異常を示す変異体の候補を同定した。今後、それらの変異体について、PEL1-GFPの発現と局在の様式を解析することで、表皮の分化や極性に関わる変異体を同定する予定である。表皮で優先的に発現する可能性がある候補遺伝子について、発現パターンの解析と、細胞内局在の解析を進めるとともにT-DNA挿入変異体の解析を進め、クチクラ形成に関わる因子を同定する。変異体スクリーニングの準備が整ったため、今後はPEL1-GFPの局在に異常を示す変異体の探索を進める。また、これまでに収集した膜輸送関連変異体や、表皮の分化不全変異体等におけるPEL1蛋白質の局在を解析するために、PEL1抗体を用いた局在解析を試みる。興味深い変異体が同定できた場合には、PEL1-GFPを導入し、動態解析の準備を進める。また、PEL1の局在やクチクラ形成に影響を与える化合物の解析を進める。必要に応じて研究費を執行したため当初の見込額と執行学は異なったが、研究計画に大きな変更はない。前年度の研究費も含め、計画を進めてゆく予定である。研究遂行に必要な消耗品等の購入や、実験補助の謝金などに使用する予定である。免疫染色用の試薬や抗体、阻害剤探索のための化合物、植物育成用の消耗品などを購入する。
自動車の走行安全性を高めるタイヤ接地面の摩擦状態測定用触覚センサの開発

鉛直荷重,摩擦荷重と,摩擦荷重の方向が同時に測定可能な簡便な触覚センサを提案し,同センサをタイヤに取り付け,路面の摩擦係数を測定することを試みた.そのために,タイヤに任意方向の高荷重を負荷可能な走行模擬装置を開発した.同装置を用いて,センサを装着したタイヤを用い,摩擦係数測定実験を行った結果,タイヤの変形の影響を考慮することで,高荷重下において,広い範囲の摩擦係数を精度よく測定可能であることを確認した.本研究では,ベースとする弾性板に取り付けたウィスカと呼ぶ弾性棒の先端に作用する荷重によってベースに生ずるひずみから,鉛直および水平荷重を測定するセンサを提案し,タイヤに取り付け接地面の摩擦係数を走行時に測定可能とする.昨年度までに,ベース上に2枚のひずみゲージを貼付したセンサを製作してタイヤへ装着し,接地面の鉛直荷重,摩擦力を測定して摩擦係数を求められることを確認した.今年度は,新たに提案した任意方向の摩擦力が測定可能なセンサの検討を行った.同センサは,ベースに貼付した3枚のひずみゲージの測定値から,ウィスカ先端に作用する鉛直荷重,水平荷重とその方向を求めることができる.同センサに関して有限要素解析により,材質,寸法などを決定するとともに,鉛直荷重,水平荷重とその方向を求める実験式の基本形を導いた.同結果に基づきセンサを作成し,種々の接地面を用いて複数方向への簡便ななぞり実験を行い,得られた測定結果から,解析で得た実験式を補正して実用的な実験式を導いた.同式の妥当性をセンサ単体で確認したところ,簡単な演算で摩擦力の方向,鉛直荷重と摩擦力の大きさを精度良く求めることができた.以上のセンサの実用性を確認するため,昨年度に提案した実際の走行状態を模擬した実験を可能とする,タイヤに任意方向の高負荷を与えられる2自由度パラレルメカニズムを用いた実験装置の製作を行った.また,3軸方向の負荷が測定可能なフォースプレートを製作し,タイヤと接触させる接地面として同装置に取り付けた.同時に,タイヤを接地させ,回転させる装置を設計製作して,以上の装置と組み合わせ,これらの制御系を構築した.実際に,空気を充填したタイヤを取り付けて同装置で実験を行ったところ,高荷重下で任意方向への摩擦力を発生可能であることをフォースプレートによる測定値から確認した.これにより実際の走行を模擬した実験が可能となった.本課題では,ウィスカと呼ぶ剛体棒をベースとする弾性板に片持ちばりとして取り付け,ベースに生ずるひずみから,ウィスカの先端に作用した鉛直荷重,水平荷重と,その方向を測定できるセンサを開発し,同センサをタイヤに取り付けることで,接地面の摩擦係数が測定可能になることを示した.ベースには3枚のひずみゲージを貼付し,それぞれで測定するひずみは,ウィスカ先端に作用する鉛直荷重に対して比例し,また,摩擦力に対しては,作用方向に対して正弦波形状に変化し,その振幅は摩擦力の大きさに比例することを示した.また,これらの関係を校正実験で正弦関数として定式化した.さらに,3枚のひずみゲージの検知結果を以上の式に代入し解くことで,ウィスカ先端に作用する鉛直荷重,水平荷重と,その方向が求められることを示した.得られた水平荷重を鉛直荷重で除すれば,ウィスカ先端が接触している面の摩擦係数を得ることができる.実際にセンサ単体で,複数の面をなぞり,摩擦係数が測定可能であることを確認した.以上のセンサをタイヤに取り付け,接地面の摩擦係数を測定する方法を検討した.走行状態を模擬するため,タイヤに任意方向の高負荷を与えられる2自由度パラレルメカニズムを用いた実験装置を製作した.同装置の出力部に3軸方向の負荷が測定可能なフォースプレートを設置し,タイヤを回転させながら接触させてフォースプレートを回転軸方向に移動させ,接触面に鉛直荷重および任意方向の摩擦力を発生させるとともに,それらの値を測定した.複数の面に対して実験を行った結果,タイヤの変形が測定値に影響することを見いだし,その影響を,鉛直荷重,摩擦力と,その方向を変数として定式化した.同式を用いた補正を導入した結果,摩擦係数が約0.3から1.2の範囲において,0.2程度の分解能で測定が行え,開発したセンサは高荷重下においても精度良く測定が可能であることを確認した.鉛直荷重,摩擦荷重と,摩擦荷重の方向が同時に測定可能な簡便な触覚センサを提案し,同センサをタイヤに取り付け,路面の摩擦係数を測定することを試みた.